Устройство для пробоподготовки крови при проведении жидкостной биопсии с рекомбинантным белком

Полезная модель относится к медицине, точнее к клинической лабораторной диагностике и онкологии, и может найти применение для диагностики онкологических заболеваний.
Настоящая полезная модель касается совершенствования устройства для пробоподготовки крови с целью проведения диагностической процедуры жидкостной биопсии.
На основе проведенного поиска по патентной и научно-технической литературе по выпуску и использованию пробирок для пробоподготовки крови для проведения диагностической процедуры жидкостной биопсии выявлены следующие материалы:
Патент 2 352 636, 2007142152/13, 14.11.2007 ФГУП "АзНИИРХ". «Способ хранения ДНК», в соответствии с которым образец ДНК помещают в бидистиллированную воду, содержащую консервант в виде сульфата марганца в концентрации 0,08125-8,125 мМ, и хранят при температуре -20°С.
Патент 2 647 468, 2013154967, 27.06.2012. Патентообладатель(и): СЕЛЛЕСТИС ЛИМИТЕД (AU). Способ анализа клеточно-опосредованного иммунного ответа с повышенной чувствительностью.
Способ включает совместную инкубацию образца, включающего лимфоциты от субъекта, по меньшей мере, с двумя наборами пептидов, полученных из белкового антигена, при этом пептиды охватывают весь белковый антиген или его часть, и заключается в измерении активности клеточно-опосредованного иммунного ответа у субъекта, при этом указанный способ.
Патент HUE034488 (Т2) - 2018-02-28. [US] STRECK INC+. Устройство коллекции крови для стабилизации Cell-free ДНК-плазмы.
В патенте описаны способ и устройство для стабилизации биологического образца, включающего в себя, по крайней мере, одну циркулирующую внеклеточную нуклеиновую кислоту от субъекта. Устройство содержит консервант, антикоагулянт и гасящий агент.
Патент CN107574225 (А) - 2018-01-12. BEIJING NGS BIOTECH СО LTD+. Предохранение внеклеточной ДНК, вакуумная пробирка для сбора крови и метод изготовления вакуумной пробирки для сбора крови.
Изобретение описывает консервант внеклеточной ДНК (cell free DNA, cfDNA) из крови и вакуумную пробирку для сбора крови, состоящую из консерванта cfDNA крови, содержащего следующие компоненты по весовым частям: 1-200 частей EDTA, 1-500 частей имидазол, 1-200 частей глицеральдегида, 1-1000 частей хлорида натрия, 1-500 частей гидрохлорида гуанидина, 1-1000 частей SDS и 5000-7000 частей очищенной воды. Длительность хранения образца крови при комнатной температуре существенно продлевается, вакуумная пробирка для сбора крови достаточно удобна для транспортировки образца плазмы на большие расстояния.
Патент CN107760673 (А) - 2018-03-06. NANTONG PUHUI PRECISION MEDICINE TECH СО LTD+. Стабилизатор свободной ДНК и пробирка для отбора проб для детектирования свободной ДНК.
Стабилизатор содержит два раствора. Первый включает буферную жидкость, антикоагулянт, стабилизатор клеток, ингибитор метаболизма и растворитель; второй - буферную жидкость, антикоагулянт, биосовместимый с кровью реагент, стабилизатор свободной ДНК и консервант. В этом режиме свободная ДНК в крови может стабильно сохраняться при нормальной температуре в режиме реализации, предусмотренной изобретением.
Патент CN106701743 (А) - 2017-05-24GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY СО LTD+. Пробирка для сбора крови для защиты и стабилизации свободной ДНК.
В изобретении описана пробирка для сбора крови для защиты и стабилизации свободной ДНК, включающая герметизирующую капсулу и защитный агент из EDTA-3K, идоксуридина, глицина, bestain, AEBSF и т.д. при концентрации соответственно 50 г/л, 550 г/л, 30 г/л, 1 мг/л, 0,172 г/л, 0,24 г/л. Свободная ДНК в крови в этой пробирке может быть сохранена в течение 14 дней при нормальной температуре.
Патент CN106834101 (А) - 2017-06-13. GUANGZHOU HESHI BIOTECHNOLOGY СО LTD+. Пробирка для сбора крови для защиты и стабилизации вирусной ДНК.
Описана пробирка для сбора крови для защиты и стабилизации вирусной ДНК, содержащая добавку, которую готовят путем растворения гуанидин изотиоцианата, защитного агента вируса ДНК chelex-100, идоксуридина, глицина в воде в определенных пропорциях. ДНК вируса в крови может быть стабильно сохранена в течение 15 дней при комнатной температуре.
Результаты поиска по фирмам, выпускающим пробирки для жидкостной биопсии:

2
3
- Greiner Bio-one Preanalytics, Австрия - пробирки VACUETTE KЭДТА и VACUETTE KЭДТА для определения вирусных маркеров в венозной крови.
-  InterVacTechnology, Эстония - пробирки LIND-VAC для гематологических исследований.
- RUSTECH, Германия - пробирки с ЭДТА для гематологических исследований.
- Roche, Швейцария - пробирки для анализа внеклеточной ДНК Cell-Free DNA Collection Tube. Консервация внеклеточной ДНК за счет состава специальной формулы, предотвращающего лизис клеток.
- STRECK, США - пробирки CELL-FREE DNA ВСТ (blood collection tubes). Уникальный консервирующий состав предотвращает выброс геномной ДНК, позволяя изолировать внеклеточную ДНК высокого качества. Пробирка предназначена только для научных целей.
- Nor gen Biotech, Канада - пробирки cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes. Для венозной крови и консервации свободной внеклеточной циркулирующей ДНК/РНК. Предотвращает апоптоз клеток крови и фрагментацию геномной ДНК.
- Qiagen, Нидерланды - пробирки PAXgene Blood ccfDNA Tubes для сохранения и исследования циркулирующей свободной внеклеточной ДНК. Только для исследовательских целей.
- Guangzhou Improve Medical Instruments, Китай - ImproGene Cell Free DNA Tube. Изделие представляет собой вакуумную пробирку для сбора крови для стандартизации преаналитической фазы жидкостных биопсийных анализов с целью повышения точности лабораторных исследований. Содержит антикоагулянт и консервант, которые стабилизируют клетки крови in vitro.
На основе анализа представленных документов не обнаружено пробирок для проведения жидкостной биопсии с содержанием в них рекомбинантных белков.
В качестве прототипа для настоящей полезной модели нами взято устройство для стабилизации внеклеточной плазмидной ДНК фирмы Guangjou Improve Medical Instruments, Китай. Устройство представляет собой вакуумную пробирку со штрих-кодом и защитной крышкой фиолетового цвета в сборе с резиновой пробкой. На стенки пробирки нанесены этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) К2, 6-аминокапроновая кислота, глицин и инозитол.
Пробирка предназначена для исследования плазмы крови в различных медицинских целях, в том числе для жидкостной биопсии.
Использование нами этой пробирки показало, что заявленный химический состав для стабилизации внеклеточной ДНК не обеспечивает полного сохранения свободной внеклеточной ДНК, необходимой для проведения с нею дальнейших диагностических манипуляций.
Технический результат настоящей ПМ состоит в повышении степени сохранности свободной внеклеточной ДНК за счет содержания в устройстве рекомбинантного белка, связывающего свободную ДНК.
Этот результат достигается тем, что в известном устройстве, представляющем собой вакуумную пробирку со штрих-кодом и защитной крышкой фиолетового цвета в сборе с резиновой пробкой и нанесенной на стенки пробирки этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с последующей стерилизацией пробирки радиационным методом, согласно ПМ, оно дополнительно содержит рекомбинантный белок RecA, связывающий свободную ДНК, в концентрации от 1 до 5 мкМ.
Дополнительное использование в устройстве рекомбинантного белка RecA, выбранного нами исходя и его уникального протективного свойства в отношении нуклеиновых кислот, основанного на его фундаментальных биологических свойствах, обеспечивающих сохранность ДНК, как нами показано в проведенных экспериментах, обеспечивает лучшую сохранность свободной ДНК в течение времени.
Приводим основные свойства рекомбинантного белка RecA, послуживших основанием для его использования при проведении жидкостной биопсии.
Белок RecA является ключевым участником основного процесса гомологичной рекомбинации, обеспечивая поиск гомологичных молекул ДНК, их спаривание, и обмен одною из цепей сцепленного гетеродуплекса (на модели бактерии Е. coli).
Белок RecA в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) связывается с однонитевой ДНК (онДНК), полимеризуется из отдельных субъединиц, и формирует правозакрученный спиральный филамент.
Белок RecAEc состоит из 352 аминокислот, имеет молекулярный вес 37.842 Да, и обладает сайтами связывания с тремя нитями ДНК, АТФ и другими RecA мономерами.
У млекопитающих, в частности у человека, имеется как минимум семь RecA-гомологов. По результатам генетического и биохимического анализа этих белков и их генов, в основном проведенных на дрожжах, мыши и человеке, все RecA-гомологи можно разбить на три подсемейства (подгруппы): Rad51, Dmc1 и Rad55-57. При этом подсемейство Rad51 является истинным гомологом белка RecA в эукариотических клетках, Dmc1 подсемейство работает во время мейоза, а белки Rad55-57 играют дополнительную и регуляторную роль для двух предыдущих подсемейств. Как и белок RecA, эти аналоги так же можно использовать для обеспечения сохранности свободной ДНК в течение времени.
Для проверки заявленных свойств пробирки была проведена серия экспериментов.
В качестве референтных изделий были использованы пробирка для стабилизации внеклеточной плазмидной ДНК фирмы Guangjou Improve Medical Instruments, Китай, и пробирка LIND-VAC для гематологических исследований производства InterVacTechnology, Эстония.
Согласно данным производителя, пробирка LIND-VAC содержит консервант ЭДТА К2. Пробирка Guangjou Improve содержит ЭДТА К2 и дополнительные компоненты: 6-аминокапроновую кислоту, глицин, инозитол
Все исследуемые пробирки содержали идентичный набор компонентов, в заявляемую нами был добавлен рекомбинантный белок RecA производства Merck (Sigma-Aldrich), каталожный номер SRP2090. Конечная концентрация рекомбинантного белка с учетом заполнения пробирки венозной кровью составляла 1-5 мкМ. Эти концентрации найдены нами опытным путем. При концентрации белка RecA менее 1 мкМ улучшение сохранности свободной ДНК не достоверно, концентрация более 5 мкМ признана нами нецелесообразной.
Исследовался мультикопийный фрагмент Y хромосомы плода в крови беременной женщины методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Именно такой фрагмент ДНК отвечает всем критериям применения метода «жидкостная биопсия». В эксперименте использовался набор реактивов R1-H803-S3/9 и амплификатор DT-Prime производства ООО «ДНК-технология», Москва. В качестве биоматериала использовался архивный материал.
Всего было проведено три серии экспериментов для демонстрации эффективности использования пробирки при длительном сроке хранения образцов крови, содержащих рекомбинантный белок. Первая часть исследований была проведена непосредственно после забора крови, вторая - через 7 суток хранения при
комнатной температуре, третья - после 21 суток хранения. В каждом случае исследовались одни и те же 16 образцов крови беременных женщин. В качестве критерия оценки эффективности применения пробирки использовалось отклонение числа положительных результатов обнаружения мультикопийного фрагмента Y хромосомы плода в крови беременной женщины по сравнению с результатом, полученным в первые сутки после забора крови.
Результаты экспериментальных исследований представлены в Таблице 1.
Из таблицы следует, что в течение 7 суток хранения при комнатной температуре генотипирование мультикопийного фрагмента Y хромосомы плода в крови беременных женщин во всех 48 реакциях показало одинаковые результаты. Фрагменты Y хромосомы выявлены в одних и тех же девяти образцах, что
подтверждает пригодность всех трех типов пробирок для выполнения данного исследования в течение данного срока.
Однако, при увеличении срока хранения пробирок с кровью до 21 суток при комнатной температуре результаты генотипирования значительно различаются. Только заявляемая нами пробирка показала результаты, идентичные полученным при анализе свежих биоматериалов. В остальных случаях обнаружены ложноотрицательные результаты, что можно объяснить как деградацией свободной внеклеточной ДНК, так и чрезмерным количеством геномной ДНК лейкоцитов крови, попадающей в плазму в результате разрушения клеточной стенки. При этом свое действие продемонстрировал как белок RecA, так и его аналог Rad51. Отсутствие ложноотрицательных результатов при использовании заявляемой пробирки мы объясняем формированием нуклеопротеинового филамента из белка RecA, предохраняющего фрагменты свободной внеклеточной ДНК от внешних повреждающих воздействий.
Таким образом, использование в пробирках консервирующего состава с добавлением рекомбинантного белка, обладающего сродством к однонитевой ДНК, имеет преимущество перед консервирующим составом только с ЭДТА или с ЭДТА и добавками, предотвращающими лизис клеток.
Предлагаемое устройство по сравнению с известными аналогами имеет ряд преимуществ.
1. Повышает время хранения пробирок с забранной венозной кровью для последующих анализов методами жидкостной биопсии.
2. Обеспечивает значительно лучшую сохранность именно фрагментов внеклеточной ДНК, что особенно важно для исследований в области онкологии и перинатологии.
3. За счет использования в качестве антикоагулянта ЭДТА устройство может быть использовано в генетических исследованиях, когда требуется дополнительная точность в определении нуклеотидных последовательностей нуклеиновых кислот (например, вирусных).