Способ разведения хищных клещей путём межлинейного скрещивания
METHOD FOR BREEDING PREDATORY TICKS BY INTERLINEAR CROSSING

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к технической энтомологии - способам массового разведения полезных хищных клещей, для дальнейшего использования биоконтрольных агентов в биологической борьбе с вредителями сельскохозяйственных культур.
Известно, что гибридное потомство первого поколения, полученное от скрещивания двух и более линий (популяций), отличающихся наследственными признаками, имеет целый ряд положительных свойств: повышенную жизнеспособность, продуктивность, устойчивость к неблагоприятным экологическим факторам, т.е. проявляет гетерозис в силу обогащения наследственности [1].
Однако основным методом разведения биоконтрольных популяций хищных клещей в настоящее время является внутрилинейный инбридинг. При длительном применении внутрилинейного инбридинга происходит снижение жизнеспособности популяций членистоногих из-за накопления генетического груза и распространения неблагоприятных видов микробных симбионтов.
В сфере технической энтомологии при массовом разведении членистоногих известны различные монотрофические композиции по совместному содержанию хищных клещей-фитосейид (надотряд Parasitiformes, отряд Mesostigmata, когорта Gamasina, семейство Phytoseiidae) с растительноядными акариформными клещами (надотряд Acariformes: отряд Trombidiformes, подотряд Prostigmata, семейство Tetranychidae и отряд Sarcoptiformes, подотряд Astigmata, семейство Acaridae, семейство Glycyphagidae).
Как правило, система массового композитного разведения любого вида хищного клеща включает некий садок (контейнер) определённого устройства, в котором выращивается растительноядный клещ на определённой пищевой субстанции (например, зелёные растения, пшеничные отруби и т.д.) с добавлением каких-либо кормовых добавок, богатых биологически активными веществами.
Многолетнее выращивание поддерживается переводом части популяции хищного клеща со старой субстанции на свежую субстанцию, что обеспечивает оптимальную численность целевого объекта (конечного продукта).
Известно два основных направления по массовому разведению хищных клещей на кормах животного происхождения:
1) с использованием естественной пищи, например, растительноядных клещей из семейства паутинных клещей Tetranychidae (подотряд Prostigmata);
2) с использованием альтернативной пищи, как правило, амбарных клещей из подотряда Astigmata, либо, значительно реже, мицетофаговых клещей из семейства Tarsonemidae (подотряд Prostigmata). Известно также дополнительное направление по массовому разведению хищных клещей с использованием корма растительного происхождения, например, пыльцы хвойных и (или) высших цветковых растений.
В бинарный состав каждой из этих композиций, монотипичных по пище в отношении хищного клеща, включается популяция какого-либо одного вида растительноядного клеща (Prostigmata или Astigmata) и популяция какого-либо одного вида хищного клеща (Mesostigmata). Т.е., в качестве источника питания каждого вида хищного клеща всегда используется лишь один вид корма.
Примерами бинарной композиции первого рода (выращивание хищников на клещах Prostigmata), т.е. длительного содержания на естественном корме, являются – композиция фитосейулюса Phytoseiulus persimilis и обыкновенного паутинного клеща Tetranychus urticae [3], композиция акарифага Neoseiulus californicus и обыкновенного паутинного клеща Tetranychus urticae [4], композиция акарифага Galendromus occidentalis и Tetranychus urticae [5] и т.д.
Все бинарные композиции второго рода (выращивание хищников на клещах Astigmata) технически созданы на основе использования альтернативного корма, не являющимся естественным источником пищи в природных условиях. Ранее показано, что амбарные клещи (Acariformes: Astigmata) в качестве альтернативного корма представляют экономически выгодное решение для лабораторного содержания и промышленного разведения ряда видов хищных клещей-фитосейид [2]. Однако по определению, альтернативные источники корма не могут иметь полностью необходимый и всемерно достаточный набор питательных веществ, требуемых членистоногим (Arthropoda) какого-либо вида для полноценного осуществления популяционных функций, как то - успешного преимагинального развития, оптимальной нормы репродукции, статистически стабильного демографического выживания членов популяции данного вида в лабораторных (искусственных) условиях. При длительном многолетнем содержании таких трофических популяций происходит ослабление многих жизненных функций клещей-фитосейид, поскольку пищевой субстрат в большинстве случаев не является для них естественным, либо близкородственное скрещивание фитосейидных клещей приводит к накоплению генетического груза, либо массовое однородное разведение хищника способствует накоплению в популяции эндопаразитических или нежелательных эндосимбиотических микроорганизмов, существенно тормозящих лабораторное производство полезных клещей.
Исторически самым первым известным примером внутрилинейного инбридинга с использованием альтернативной пищи животного происхождения является монотипичная композиция хищного клеща Neoseiulus barkeri и мучного клеща Acarus farris [6-8].
Примерами такого же рода трофических линий хищных клещей также могут служить монотипичные композиции:
известна композиция хищного клеща Neoseiulus cucumeris и удлинённого гнилостного мучного клеща Tyrophagus putrescentiae [9];
известна композиция хищного клеща Amblyseius swirskii и сухофруктового клеща Carpoglyphus lactis [10, 11];
известна композиция хищного клеща Transeius montdorensis и сырного  клеща Tyrolichus casei [12];
известна композиция хищного клеща Transeius montdorensis и узкого  клеща Thyreophagus entomophagus [13];
известна композиция хищного клеща Neoseiulus californicus и волосатого разрушающего клеща Lepidoglyphus destructor [14].
Известна композиция клещей для защиты сельскохозяйственных культур, которая включает популяцию особей хищного клеща, особей клещей Astigmatid, как источник питания хищных особей, а также питательное вещество для особей Astigmatid. При этом часть особей Astigmatid является иммобилизованной, где иммобилизованную часть приводят в контакт с агентом, сдерживающим развитие грибков. Способ разведения включает получение композиции и предоставление особям хищного клеща возможности питаться особями Astigmatid. Система для разведения включает контейнер с композицией, где контейнер включает выход для подвижной стадии жизни вида хищного клеща. Способ борьбы с вредителями включает применение композиции на сельскохозяйственных культурах [15].
Известен способ борьбы с вредителями садовых культур, по которому, вначале определяют степень поврежденности растений вредителями, затем вносят на растения  хищного клеща Amblyseius (Neoseiulus) cucumeris, сразу после массового цветения культуры, при пороге земляничного клеща 3-5 особей на лист, а хищного клеща Amblyseius (Neoseiulus) cucumeris вносят в количестве 10-20 самок на одно растение, при этом насаждения обрабатывают через ряд [16].
Известен способ защиты садовых культур от паутинных клещей, по которому, хищного клеща Phytoseiulus persimilis расселяют на растения, в период конца цветения или сразу после цветения культуры, при этом хищного клеща вносят в количестве 50-100 особей на одно растение при пороге численности паутинного клеща 5-7 особей на лист у более 10% просмотренных листьев, взятых из нижнего и среднего ярусов кустов, причем хищного клеща расселяют только на нижние и средние ярусы растений [17].
Известен способ разведения полезных насекомых для использования в программах биологического контроля растительноядных клещей в открытых и закрытых агроценозах различных сельскохозяйственных культур, по которому массово производят хищную галлицу Acaroletes tetranychorum Kie (Diptera: Cecidomyiidae) на зеленых растениях сои, при этом выращивают растения, заселяют их паутинными клещами, выпускают хищную галлицу: яйца, личинки, куколки, накапливают хищника с последующим сбором полученного биоматериала: яиц, личинок, куколок [18].
В приведённых выше способах описано массовое разведение полезных хищных клещей, выращенных только на одном виде кормового клеща. Такая практика, в конечном счёте, приводит к пищевой избирательности хищного клеща, к низкому предпочтению иных видов вредных членистоногих, кроме того вида, на котором он был вскормлен, что свидетельствует об ограниченности известных способов массового разведения, приводящее в дальнейшем к малой эффективности в борьбе с различными видами вредителей сельскохозяйственных растений.
Задача изобретения состоит в разработке более оптимального способа массового разведения хищного клеща, способствующего повышению эффективности борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений, а именно с сосущими фитофагами – белокрылками (семейство Aleyrodidae), трипсами (семейство Thripidae), растительноядными клещами Prostigmata (семейства Tetranychidae, Tarsonemidae, Eryophiidae), вредящим различным сельскохозяйственным культурам на открытых и в закрытых агробиоценозах.
Задача решается за счет заявляемого способа массово производства сиблингов (полусибсов) хищного клеща, путём поэтапного межлинейного скрещивания трофических рас (линий), предварительно размножаемых на нескольких различных пищевых субстратах.
Сущностью изобретения, является создание более эффективного способа борьбы с вредителями сельскохозяйственных растений, за счет производства сиблингов (полусибсов) хищного клеща, исходно содержащегося в лабораторных условиях, путём поддержания нескольких трофических рас (линий) на разных видах кормовых клещей (Sarcoptiformes: Astigmata) с последующим межлинейным скрещиванием, обеспечивающим повышение жизнеспособности и биологической активности биоконтрольного агента.
Для массового производства межлинейных сиблингов хищного клеща используются исходные трофические расы (линии), длительное время поддерживаемые в изолированных друг от друга лабораторных помещениях, путём раздельного кормления разными видами кормовых клещей (Sarcoptiformes: Astigmata).
Осуществление заявляемого способа разведения хищных клещей путём межлинейного скрещивания, можно показать на примере трех трофических линий:
1. линия хищного клеща, выращиваемая путём кормления, например, волосатым разрушающим клещом Lepidoglyphus destructor (Schrank);
2. линия хищного клеща, выращиваемая путём кормления, например, узким клещом Thyreophagus entomophagus ( et Robin);
3. линия хищного клеща, выращиваемая путём кормления, например,  сухофруктовым клещом Carpoglyphus lactis (L.).
Осуществление способа можно, условно, разделить на несколько этапов:
I - подготовка питательного субстрата с использованием специфических пищевых добавок для каждого из 3-х видов кормовых клещей (волосатого, узкого, сухофруктового, или др.);
II - поддержания маточных культур и интенсивного размножения 3-х видов кормовых клещей (волосатого, узкого, сухофруктового, или др.);
III - поддержания маточной культуры и массового размножения хищного клеща трёх трофических линий с использованием какого-либо одного вида кормового клеща (волосатого, узкого, сухофруктового, или др.).
На фиг. показана технологическая схема получения межлинейного сиблинга хищного клеща (конечного продукта).
Общая схема по поддержанию трофических линий хищного клеща укладывается в технологически однотипные операции:
3
3
Вначале происходит заселение питательного субстрата кормовыми клещами (Astigmata), для чего используются маточные культуры определённого вида клеща (например, волосатого, узкого, сухофруктового или др. клещей – вредителей), содержащие 4-5 тысяч особей/см. Исходный субстрат с клещами смешивают с подготовленным свежим субстратом в соотношении 1:3-4 частей по объёму, что соответствует получаемой плотности популяции кормовых клещей 1000 особей/см. После заселения кормовых клещей, новый субстрат распределяют по контейнерам с оптимальной высотой слоя субстрата не более 3 см.
3
3
Субстрат с накопленными кормовыми клещами, заселяют хищными клещами (например, Transeius montdorensis) из расчета 5 самок/см. Для этого, в каждые 10 объемов субстрата, заселенных амбарными клещами, вносится 1 объем маточной культуры хищного клеща. При условии, что маточная культура хищного клеща содержит 50-60 самок/см.
Разводческие контейнеры с бинарными композициями хищного клеща и какого-либо из видов кормового клеща, содержат в температурном диапазоне 25-30 °С. Для улучшения аэрации (поддержания оптимального соотношения кислорода, углекислого газа, метаболитных газов) и повышения скважности (преодоления слёживаемости) субстрат в контейнере перемешивают 2-3 раза в течение каждой недели цикла производства.
3
Через 14 дней цикл разведения хищного клеща завершается. К концу этого периода размножения плотность популяции хищных клещей достигает 40-50 самок в см. Данный цикл подходит для каждой трофической линии хищного клеща, а каждый  новый цикл, так же возобновляют по выше приведенной технологической схеме.
Осуществление способа.
Способ разведения сиблингов хищного клеща (например, Transeius montdorensis (Schicha), Mesostigmata: Phytoseiidae), проводится путём межлинейного скрещивания. Способ можно показать на примере трехлинейного скрещивания хищного клеща (фиг.), при этом все линии выращены на разных видах кормового клеща (например, линия №1 на  волосатом клеще Lepidoglyphus destructor (Schrank), линия №2 на узком клеще Thyreophagus entomophagus ( et Robin), линия №3 на сухофруктовом клеще Carpoglyphus lactis). На первом (начальном) этапе организуется наработка биологического материала на основе промежуточного межлинейного скрещивания 1-й и 2-й трофических линий, в результате чего получают сиблингов 1-го порядка. На втором (завершающем) этапе организуется скрещивание 3-й трофической линии и сиблингов 1-го порядка, в результате чего получают сиблингов 2-го порядка, который, в данном случае, является конечным продуктом. Получаемый конечный биологический продукт, обладает повышенными качественными показателями жизнедеятельности, имеют возможность истреблять широкий спектр вредных членистоногих, в частности, различных видов растительноядных клещей (Prostigmata), трипсов (Thripidae) и белокрылок (Aleyrodidae).
Методы испытаний
Лучший способ оценки качества яиц членистоногих заключается в определении количества отрождённых личинок (в процентах) [1]. Для этого отсаживаются оплодотворенные самки, которые в течение суток откладывают яйца. Яйца помещают в термостат при благоприятных условиях (температура 25 °С и относительной влажности воздуха 75 %). После 3-х суточной экспозиции проводится подсчет числа вылупившихся личинок.
Показатель плодовитости членистоногих колеблется в довольно широких пределах, порой существенно отличаясь от потенциальной плодовитости в худшую сторону [1]. При хороших условиях питания отмечается максимальная плодовитость, тогда как при неблагоприятных условиях, в том числе трофических, плодовитость уменьшается. Такое уменьшение наблюдается у всех особей вида в течение многих поколений и зависит главным образом от обеспеченности кормом. Для определения плодовитости клещей-фитосейид используют метод индивидуального содержания оплодотворённых самок. Динамика откладки яиц в репродуктивный период сильно меняется. Для стандартизации используют самок хищного клеща в возрасте не более 1 недели. Самок содержат в течение 3-х суток, а количество отложенных ими яиц пересчитывают на одни репродуктивные сутки.
Показатель прожорливости (агрессивности) характеризует потенциал биоагента по отношению к целевой жертве. В нашем случае, таким объектом является цветочный трипс Frakliniella sp. С этой целью взрослых самок хищного клеща помещают в садок совместно с личинками трипса на 3-е суток. Среднесуточное число съеденных личинок используется как параметр биологической активности хищного клеща.
С целью проведения оценочных испытаний по качественным параметрам получаемых сиблингов проводили лабораторную оценку свойств родительских форм хищного клеща и конечной продукции – потомства клещей после межлинейных скрещиваний.
Экспериментальные данные показаны в нижеследующих примерах.
Пример 1.  Хищного клеща Transeius montdorensis длительный период выращивали при кормлении альтернативным источником пищи (Astigmata), а именно узким клещом Thyreophagus entomophagus. Была получена трофическая линия хищного клеща. Проведена качественная оценка данной расы на основе методических подходов (таблица 1).
Таблица 1. Биологические особенности трофической расы (линии) хищного клеща Transeius montdorensis, выращиваемой в монотипичной композиции с использованием в качестве альтернативной пищи  узкого клеща Thyreophagus entomophagus
Биологический параметр
Показатель качества
Отрождение из яиц (%) при температуре 25 °С иотносительной влажности воздуха 75 %
89,6
Среднесуточная плодовитость, шт. яиц, отложенных одной самкой хищника при питании личинками трипса Frankliniella sp.
2,3÷3,1
Прожорливость, шт. личинок трипса 1-го возраста, уничтоженных одной самкой хищника в среднем за сутки
6,6÷7,9
Пример 2.  Путём межлинейного скрещивания (сиблинга) хищного клеща Transeius montdorensis, выращенного на нескольких различных видах кормового клеща,  получали конечный продукт (сиблингов) для использования в практике защиты растений от вредоносных членистоногих. Проведена качественная оценка генетически улучшенных сиблингов хищных клещей-фитосейид (таблица 2) на основе методических подходов, изложенных выше.
Таблица 2. – Биологические особенности особей хищного клеща Transeius montdorensis, полученных применяя заявляемый способ:
Биологический параметр
Показатель качества
Отрождение из яиц (%) при температуре 25 °С иотносительной влажности воздуха 75 %
90,1
Среднесуточная плодовитость, шт. яиц, отложенных одной самкой хищника при питании личинками трипса Frankliniella sp.
2,8÷3,6
Прожорливость, шт. личинок трипса 1-го возраста, уничтоженных одной самкой хищника в среднем за сутки
9,1÷10,3
Результаты показывают, что воспроизводимое потомство хищного клеща Transeius montdorensis заявляемым способом (путём межлинейного сиблинга) характеризуется повышенными популяционными показателями в отношении целевой жертвы – растительноядного трипса Frakliniella sp. За счёт применения трех-линейного скрещивания трофических рас (линий) клещей-фитосейид по уникальной технологии получается конечный продукт с более высокими показателями жизнедеятельности (например, качество яйцевой продукции и репродуктивной способности), а также хищнической активности (прожорливости).
Полученный биоматериал в виде яиц, личинок, нимф и имаго энтомо-акарифага собирают в специализированные контейнеры. На основе массового производства хищного клеща заявляемым способом, обеспечивается более широкая возможность для использования в эффективном контроле численности популяций сосущих фитофагов (белокрылки, трипсы, тетраниховые клещи, тарзонемидные клещи, эриофиидные клещи), вредящих различным сельскохозяйственным культурам (огурец, томат, баклажан, перец, роза, садовая земляника).
Заявляемый способ разведения межлинейных сиблингов, позволяет повысить экологическую эффективность биологического метода борьбы с использованием хищных клещей против сосущих вредителей сельскохозяйственных культур за счет повышения хищнической активности. Такие особи хищных клещей характеризуются показателем поедания вредных членистоногих в 1,3 раза более высоким по сравнению с исходными родительскими расами, причем всеядность (политрофизм) также повышается.
Таким образом, поставленная задача, выполнена.
Список использованной литературы
1. Злотин А.З. Техническая энтомология. Справочное пособие. / Киев, «Наукова думка». – 1989. – 183 с.
2. Бегляров Г.А., Мешков Ю.И., Малов Н.И. Мучной клещ для массового разведения фитосейид // журнал Защита растений. – М. 1990. – № 10. – С. 25.
3. Бегляров Г.А. Методические указания по массовому разведению и применению хищного клеща фитосейулюса для борьбы с паутинными клещами в защищённом грунте на огурцах / М., Колос.- 1968. – 21 с.
4. Saber S.A. Biological aspects and life table parameters of the predacious mite, Neoseiulus californicus (McGregor) (Acari: Phytoseiidae) consuming food types during immature stages and after adult emergence // Archives of Phytopathology and Plant Protection. – 2012. – Vol. 45. – Is. 20. – Р. 2494-2501. – DOI: 10.1080/03235408. 2012.730887
5. Петрушов А.З., Кузнецов Н.Н., Чубинишвили Ц.И., Джавахишвили Г.Ш., Верещагина Т.К., Мацюк В.А., Большакова В.Н., Гуревич Б.И., Горшкова Е.В., Васильев А.Р., Калуцкий А.Л., Олешко Г.В., Минаев А.П. Методические указания по массовому разведению, применению резистентной к пестицидам популяции хищного клеща метасейулюса на виноградниках и испытанию эффективности в плодовых садах и на других культурах в борьбе с паутинными клещами // Министерство сельского хозяйства и продовольствия РСФСР. – Москва, 1992. – 34 с.
6. Ramakers P.M.J., Van Lieburg M.J. Start of commercial production and introduction of Amblyseius mckenziei Sch. and Pr. (Acarina: Phytoseiidae) for the control of Thrips tabaci Lind. (Thysanoptera: Thripidae) in glasshouses // Med. Fac. Landbouww. Rijksuniv. – 1982. – Gent. 47. – P. 541 -545.
7. Ramakers P.M.J. Mass production and introduction of Amblyseius mckenziei and A.cucumeris // Bull. OILB/SROP. – 1983. – Vol. 1. – N. 3. – P.: 203-206.
8. Бегляров Г.А., Сучалкин Ф.А. Методические указания по биологическому методу борьбы с табачным трипсом в защищённом грунте / ВПНО «Союзсельхозхимия. – М., 1985. – 41 с.
9. Мешков Ю.И. Массовое разведение и применение хищного клеща Neoseiulus cucumeris против земляничного клеща Tarsonemus pallidus // Материалы Всероссийского научно-производственного совещания «Экологически безопасные и беспестицидные технологии получения растениеводческой продукции». – Пущино, 1994. – С. 149-150.
10. Mite composition, use thereof, method for rearing a phytoseiid predatory mite, rearing system for rearing said phytoseiid predatory mite and methods for biological pest control on a crop // US 7947269 B2
11. Bolckmans K.J.F., Van Houten Y.M. Композиция клещей, её применение, контейнер и способы разведения хищного клеща – фитосейида и биологического контроля вредителей на культурных растениях // патент A01K 67/033 (2006.01)
12. Mite composition, the rearing thereof and methods for application of the composition in biological control systems // EP 2982242 A1
13. Method for rearing predatory mites // WIPO Patent Application WO/2008/015393
14. Bolckmans K.J.F., Van Houten Y.M., Van Baal A.E., Castagnoli M., Nannelli R., Simoni S. Mite composition comprising Glycyphagidae and phytoseiid mites, use thereof, method for rearing a phytoseiid predatory mite, rearing system for rearing said phytoseiid predatory mite and methods for biological pest control on a crop // United States Patent 8957279
15.  Патент RU 2617961; МПК A01K 67/033; A23K 10/18;  A01N 63/00; опубликовано:        28.04.2017 г.).
16. Патент RU 2201080; МПК A01K 67/033; A01N 63/00; опубликовано: 27.03.2003 г.).
17. Патент RU 2312502; МПК A01N 65/00; A01G 7/00; опубликовано: 20.12.2007 г.
18. Патент RU 2467570; МПК A01M 1/00; опубликовано: 27.11.2012 г.