Исследование противоопухолевой субстанции из триходермы

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Исследование противоопухолевой субстанции из триходермы

В. М. ПОДБОРОНОВ1, А. Е. КУЗОВНИКОВ2, А. К. ЗАЙЦЕВА2, И. П. СМИРНОВА2, Т. Т. БЕРЁЗОВ2

' Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва 2 Российский университет дружбы народов, Москва

Investigation of Antitumor Substance from Trichoderma

V. M. PODBORONOV, A. E. KUZOVNIKOV, A. K. ZAITSEV, I. P. SMIRNOVA, T. T. BEREZOV

N.F.Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow Russian University of the People's Friendship, Moscow

Изучено влияние L-лизин-а-оксидазы из гриба триходерма на функциональную активность Т-лимфоцитов. Установлено, что L-лизин-а-оксидаза в дозе 35 ЕД/кг, введённая парентерально, не оказывает супрессивного действия на функциональную активность Т-лимфоцитов. Выявлено подавляющее действие фермента на некоторые показатели функциональной активности макрофагов. Показано, что L-лизин-а-оксидаза проявляет избирательное лимфотропное действие и не обладает митостатической активностью, что выгодно отличает данный препарат от других противоопухолевых средств.

Ключевые слова: L-лизин-а-оксидаза, триходерма, Т-лимфоциты.

The effect of L-lysine-a-oxidase from Trichoderma harzianum Rifai on the functional activity of T-lymphocytes was investigated. It was shown that in a dose of 35 units/kg administered parentally the enzyme had no suppressive effect on the T-lymphocyte functional activity. An inhibitory effect of L-lysine-a-oxidase on some indices of the macrophages functional activity was observed. L-Lyzine-a-oxidase had a selective lymphotropic action and showed no mytostatic activity, which is in favour of the enzyme vs. other antitumor agents.

Key words: L-lysine-a-oxidase, Trichoderma, T-lymphocytes.

Противоопухолевый фермент Ь-лизин-а-ок-сидаза (КФ 1.4.3.) в течение ряда лет исследуется на кафедре биохимии Российского университета дружбы народов. Работами многих авторов показано, что фермент полифункционален и может быть исходной субстанцией для создания лекарственных препаратов разной терапевтической направленности [1—10].

Нами продолжены некоторые доклинические испытания новой субстанции Ь-лизин-а-оксидазы [11].

Целью настоящей работы стало изучение влияния Ь-лизин-а-оксидазы из Тгіскойггта катаным ШГаі на функциональную активность Т-лимфоцитов при парентеральном введении в дозе 35 ЕД/ кг. Весьма интересным представлялось исследование митостатической активности фермента и некоторых других его биологических характеристик.

Материал и методы

Удельную активность фермента выражали числом единиц активности на 1 мг белка или 1 мл раствора препарата. Белок определяли по методу Лоури [10]. В качестве стандарта ис© Коллектив авторов, 2011 Адрес для корреспонденции:

пользовали 0,05% раствор кристаллического бычьего альбумина («Reanal», Венгрия). L-лизин-а-оксидаза исследовалась в концентрациях от 3,5 ЕД/мл до 3,5х10-4ЕД/мл на мышах линии СВА и линии SHR, массой 18—20 г.

Митогенное и комитогенное действие препарата изучали, используя поликлональный активатор Т-лимфоцитов — конкавалин А (Кон А) в оптимальной (1,25 мкг/мл) и субоп-тимальной (0,625 мкг/мл) концентрациях.

Культивирование проводили в среде RPMI 1640 («Flow Labs», Великобритания), содержащей 10% инактивированной (56°C, 30 мин) эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («Serva», США), 2 мМ L-глутамина («Flow Labs», Великобритания), 20 мМ HEPES («Flow Labs», Великобритания), 5х10-5 М 2-меркаптоэтанола («Мегск», Германия) и 50 мкг/мл гентамицина.

Клетки культивировали в полистироловых круглодонных микропланшетах в объёме 200 мкл в атмосфере абсолютной влажности с 7,5% С02 в воздухе в течение 72 ч. За 16—18 ч до окончания культивирования в культуры вносили по 0,5 мкКи 3Н -тимидина. Клетки собирали на мембранные фильтры, обрабатывали 0,15 М HCl, 7% ТХУ, 96% этанолом и высушивали в течение 1,5 ч при 60°C. Фильтры с клетками помещали в сцинтилляционные флаконы со сцинтиллятором (PPOPOPOP-толуол) и определяли радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном счётчике SL-4000 («Roche ВюеЬйгоп-ique», Франция). Результаты выражали в имп/мин.

Результаты и обсуждение

Результаты изучения влияния L-лизин-а-ок-сидазы в опытах in vitro на функциональную активность Т-системы иммунитета, определяемой спонтанной и митогениндуцирующей пролифи-рацией лимфоцитов представлены в табл. 1.

О

Таблица 1. Митогенная и комитогенная (Кон А) активность L-лизин-а-оксидазы

Концентрация препарата в культуре, ЕД/мл Концентрация Кон А* в культуре, мкг/мл Включение 3Н-тимидина, имп/мин,/М+т p

3,5^10-4 — 697+115 <0,001*

3,5^10-4 0,625 8473+1242 >0,05**

3,5^10-4 1,25 13784+1417 >0,05***

3,5^10-3 — 54+5 <0,001*

3,5^10-3 0,625 55+5 <0,001**

3,5^10-3 1,25 46+2 <0,001***

3,5^10-2 — 72+15 <0,001*

3,5^10-2 0,625 55+4 <0,001**

3,5^10-2 1,25 46+4 <0,001***

3,5^10-1 — 58+9 <0,001*

3,5^10-1 0,625 37+3 <0,001**

3,5^10-1 1,25 53+5 <0,001***

3,5 — 45+3 <0,001*

3,5 0,625 54+4 <0,001**

3,5 1,25 62+5 <0,001***

— — 1754+131 —

— 0,625 8802+950 —

— 1,25 14885+916 —

Примечание, р* — уровень значимости различий приведён в сравнении с контролем (без Кон А и препарата); р** — уровень значимости различий приведён в сравнении с контролем (0,625 мкг/мл Кон А без препарата); р*** — уровень значимости различий приведён в сравнении с контролем (1,25 мкг/мл Кон А без препарата).

Таблица 2, Влияние введения L-лизин-a-оксидазы экспериментальным животным на функциональную активность Т-лимфоцитов

Группа животных

Концентрация Кон А в культуре, мкг/мл

0 0,625 1,25

Контроль, n=2 2981 + 154* 12326+245 22143+2213

Опыт, n=7 2852+201 12087+646 22373+1020

P >0,5 >0,5 >0,5

Примечание. * - включение 3Н-тимидина, имп/мин.

Как видно из представленных результатов, во всех испытанных концентрациях препарат фермента не обладал собственной митогенной активностью. Более того, почти во всех случаях он полностью подавлял пролиферацию сплено-цитов в культуре и лишь при использовании препарата Ь-лизин-а-оксидазы в концентрации, эквивалентной 0,01 терапевтической дозы (3,5х10-4 ЕД/мл) уровень включения метки составлял приблизительно 40% от контроля (куль-тивирвание без препарата).

Ь-лизин-а-оксидаза не обладает также и ми-тогенным действием в отношении Т-лимфоци-тов, стимулированных Кон А. Напротив, при использовании митогена в субоптимальной и оптимальной концентрациях наблюдалась та же зависимость от использованной концентрации препарата, как и в случае спонтанной пролиферации, т. е. препарат фермента полностью отменял митогениндуцированную бласттрансформацию в концентрациях эквивалентных 100; 10; 1 и 0,1 терапевтической дозы (35 Ед/кг). При использовании препарата в наименьшей из взятых в опыт концентраций (3,5х10-4 ЕД/мл) статистических значимых различий между опытом и контролем не наблюдалось.

Полученный нами результат показывает, что L-лизин-а-оксидаза обладает способностью отменять обусловленную митогеном стимуляцию лимфоцитов. При этом необходимо учитывать возможность прямого действия фермента на аминокислоту лизин, являющуюся, как известно, незаменимой аминокислотой и входящей в состав питательной среды для культивирования клеток. Именно недостаток лизина, а возможно и действие перекиси водорода, образующегося в результате ферментативной реакции, в процессе культивирования клеток могли быть причиной отсутствия про-лифирации последних.

Учитывая ингибирующее действие фермента на пролифирацию лимфоцитов в культуре клеток, были проведены эксперименты in vivo по изучению действия L-лизин-а-оксидазы на некоторые показатели функциональной активности T-лимфоцитов экспериментальных животных.

Результаты изучения влияния L-лизин-а-ок-сидазы на функциональную активность системы клеточного иммунитета (T-лимфоцитов) представлены в табл. 2. Как видно из представленных исследований, введение препарата экспериментальным животным не оказывает влияние на спо-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 3, Влияние L-лизин-a-оксидазы на активность 5'-нуклеотидазы перитониальных макрофагов мышей линии СВА

№ опыта № варианта Препарат Кол-во животных в группе Кол-во мкг фосфора на 10 клеток, мкг Р (М+т) Р* % от контроля

Опыт 1 1. Контроль п=9 79,43+2,49 — 100

2. Ь-лизин-а-оксидаза п=10 90,88+1,44 <0,05 114,41

Опыт 2 1. Контроль п=9 39,42+1,73 — 100

2. Ь-лизин-а-оксидаза п=10 45,36+2,78 <0,05 115,27

Примечание, р* — дано в сравнении с соответствующими контролями. Нативный фермент вводили в дозе Ед/кг внутривенно, пятикратно. Опыты 1,2 выполнены в разное время на животных разного привоза. Контроль — введение животным физиологического раствора.

Таблица 4, Оценка митостатической и лимфотоксической активности нативной L-лизин-a-оксидазы

Доза препарата, Среднее число эндогенных Ингибирование КОЕ, Р Среднее число Р Выживание

Ед/кг • 5* колоний на селезёнку %/ митостатический эндогенных колоний КОЕ, %/

сублетально облучённых эффект сублетально облучённых лимфото-

мышей, после мышей после введения ксический

введения препарата 106 лимфоцитов и препарата эффект

Контроль физ. раствор 12,18+2,75 — — 3,8+0,53 — 6,5

Ь-лизин-а-оксидаза 30,9+5,2 отсутствует >0,05 6,9+2,22 — 52

Примечание. * — пятикратное введение препарата и физраствора (контроль) в указанной дозе. р — даны в сравнении с контролем.

собность их лимфоцитов к спонтанной и митоген-индуцированной бласттрансформации. Показатели в контрольной (животные, не получавшие препарат) и опытной группах практически не отличались между собой.

Таким образом, нами показано, что парентеральное трёхкратное введение экспериментальным животным препарата Ь-лизин-а-оксидазы в разовой дозе 35 Ед/кг массы тела не приводило к нарушениям функциональной активности Т-системы, определяемой по спонтанной и митогениндуциро-ванной бласттрансформации Т-лимфоцитов.

Учитывая важную роль фунционального состояния макрофагов в формировании специфических реакций иммунитета и неспецифической резистентности организма, было изучено влияние противоопухолевого фермента Ь-лизин-а-оксидазы на активность эктоплазматического фермента клеточной стенки перитонеальных макрофагов 5'-нуклеотидазы.

Результаты определения активности фермента при введении нативной Ь-лизин-а-оксидазы мъттам линии СВА в дозе 35 Ед/кг внутривенно, пятикратно, показали, что исследуемый препарат достоверно повышал активность маркёрного фермента 5'-нуклеотидазы (табл. 3), что свидетельствует о супрессивном влиянии Ь-лизин-а-оксидазы на функцию макрофагов.

Нам представлялось целесообразным провести изучение влияния Ь-лизин-а-оксидазы на фагоцитарную активность макрофагов.

Результаты экспериментов, проводимые на мышах линии 8НЯ, при которых вводили Ь-ли-зин-а-оксидазу, однократно, внутрибрюшинно в дозе 35 Ед/кг показали, что препарат не оказывает супрессивного действия на систему мононук-

леарных фагоцитов. Клиренс угла контроля составлял 0,027±4,3х10-3, а при введении Ь-лизин-а-оксидазы 0,22±1,43х10-3, прир 0,05.

Отсутствие влияния противоопухолевого препарата на систему мононуклеарных фагоцитов является положительным качеством препарата.

В дальнейших экспериментах нами была проведена оценка митостатического и лимфостатического действия Ь-лизин-а-оксидазы на модели реакции трансплантат против хозяина (РТПХ). Результаты полученных экспериментов отражены в табл. 4.

Анализ данных табл. 4 показывает, что субле-тальное облучение животных Р^СВА^С^В^ приводило к миграции стволовых клеток из костного мозга. Введение физиологического раствора (контрольные животные) не приводило к ингибированию КОЕ. Введение Ь-лизин-а-оксидазы вызывало достверную стимуляцию величины КОЕ на 134%, что указывает на полное отсутствие митостатического действия. Анализ результатов оценки митостатической активности различных цито-статиков показал, что для ряда препаратов (циклофосфан) показатель ингибирования КОЕ составлял 80%.Наряду с этим, в данном тесте удалось выявить лимфотоксическое действие препарата.

Заключение

Изучение влияния Ь-лизин-а-оксидазы из гриба Триходерма позволило выявить избирательный лимфотоксический эффект на Т-лимфо-циты составлял 53%. Учитывая, что в ряде тестов выявлено иммуномодулирующее действие Ь-ли-зин-а-оксидазы, представляется целесообразным проведение дополнительных исследований с целью возможного расширения сферы применения

фермента, в качестве самостоятельного иммуномодулятора.

В последующей работе необходимо проведение экспериментальных исследований для готовой лекарственной формы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Смирнова И. П., Алексеев С. Б., Подборонов В. М. Изучение влияния гелевой формы Ь-лизин-а-оксидазы на развитие офтальмогерпеса и герпетических поражений кожи кролика. Антибиотики и химиотер 2003; 48: 11: 11—13.

2. Смирнова И. П., ДиджяпетренеЯ., Алексеев С. Б. и др. Воздействие Ь-лизин-а-оксидазы на карциному кожи мышей, индуцированную метилхолантреном. Там же 2001, 46: 4: 13—15.

3. Селищева А. А.,Алексеев С. Б., Смирнова И. П., Подборонов В. М. 9. Эффективность антигерпетического действия различных лекарственных форм Ь-лизин-а-оксидазы. Антибиотики и химиотер 2003; 48: 1: 9—12.

4. Жукова О. С.,Хадуев С. Х., Берёзов Т. Т. Влияние Ь-лизин-а-окси-дазы из ТпеНойегта 8р. на кинетику цикла культивируемых клеток лимфомы Беркитта. Экспер онкол 1985; 6: 42—44.

5. Хадуев С. Х., Жукова О. С., Добрынин Я. В. и др. Цитостатический эффект Ь-лизин-а-оксидазы из ТпеНойегта 8р. и из ТпеНойегта утйе. Бюлл. экспер биол и мед 1987; 4: 458—460.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.

6. Хадуев С. Х.,Глазкова Т. Ю.,Веса В. С. и др. Оценка противолейкоз-ной активности Ь-лизин-а-оксидазы из ТпеНойегта 8р. в химиотерапевтических опытах. Там же 1980: 10: 476.

7. Уманский В. Ю., Хадуев С. Х., Залеток С. П. и др. Антиметастати-ческий эффект Ь-лизин-а-оксидазы. Там же 1990; 5: 458—459.

8. Смирнова И. П., Алексеев С. Б., Подборонов В. М.,Гришин В. М. Влияние Ь-лизин-а-оксидазы, как ингибитора репродукции ВИЧ на специфичность синтеза клеточных белков. Аллергол и имму-нол 2005; 6: 3: 36—39.

Смирнова И. П., Гусъкова Т. А., Пушкина Т. В., Подборонов В. М. Антибактериальная и антигрибковая активность Ь-лизин-а-ок-сидазы ТпеНойегта. Сибирь-Восток специал научно-производственный мед профиля журн 2003;1: 61: 10—12.

10. Смирнова И. П., Шкинев В. М., Руднев А. В. и др. Технологии выделения и очистки Ь-лизин-а-оксидазы. Биотехнология 2010; 6: 52—60.

11. Подборонов В. М., Кузовников А. Е, Зайцева А. К., Смирнова И. П. Доклинические испытания противооухолевого фермента Ь-ли-зин-а-оксидазы. Антибиотики и химиотер 2010; 9—10: 33—36.