КОМПОЗИЦИЯ, ПОДХОДЯЩАЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
COMPOSITION SUITABLE FOR PROTECTING MICROORGANISMS

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей по меньшей мере один носитель, содержащий полисахарид, по меньшей мере один антиоксидант и по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из цистеина, лизина, аланина и аргинина. Оно также относится к применению такой композиции для защиты микроорганизмов во время сушки, хранения и/или разведения, к порошку культуры, к способу получения порошка культуры и к продуктам, содержащим порошок культуры.
Предпосылки создания изобретения
Порошки полезных культур, и в частности порошки пробиотических культур, добавляют в широкий диапазон продуктов, пригодных для длительного хранения. Заявленный срок хранения продуктов с наименьшим содержанием влаги, содержащих порошки пробиотических культур, составляет по меньшей мере 18 месяцев. В течение этого периода в продукте гарантированно должно присутствовать минимальное количество живых микроорганизмов. По этой причине дозировку порошка культуры в продукте необходимо подбирать с учетом потери жизнеспособности микроорганизмов во время хранения. Следовательно, важно найти способы защиты микроорганизмов во время обработки и хранения, способствующие их выживанию.
Во время сушки в теплых условиях бактерии подвергаются различным стрессовым воздействиям, таким как тепловое и механическое воздействие в сушильном устройстве или осмотический стресс из-за дегидратации, например, во время распылительной сушки. Эти стрессовые воздействия могут быть вредными или даже смертельными для бактерий. Путем добавления защитных агентов можно в определенной степени стабилизировать бактерии в отношении этих стрессовых воздействий. Во время хранения на бактерии действует дополнительный стресс. Кроме того, когда порошок разводят в жидкости, бактерии подвергаются осмотическому стрессу.
Защитные агенты могут стабилизировать микроорганизмы во время сушки, хранения и/или разведения. Защитное действие во время сушки по большей части сопровождается стабилизирующим действием во время хранения и разведения, поскольку, когда микроорганизмы лучше защищены во время сушки, они меньше повреждаются и, следовательно, являются более жизнестойкими во время хранения и разведения.
В научной литературе в качестве защитных агентов предлагается множество ингредиентов. Например, в JP3504365 описан защитный агент для сушки бактерий сублимацией, содержащий смесь из по меньшей мере трех ингредиентов, выбранных из аспарагиновой кислоты, аргинина, глутаминовой кислоты, пролина, лизина, лейцина и метионина. Однако сушка сублимацией и процессы сушки с использованием нагретого газа, такие как распылительная сушка, имеют совершенно разные принципы действия и подвергают биомассу воздействию разных стрессовых факторов. Следовательно, описанные защитные агенты для процессов сушки сублимацией не способствуют идентификации защитных агентов, подходящих для защиты микроорганизмов, таких как бактерии, во время процесса сушки с использованием нагретого газа, такого как распылительная сушка, и последующего хранения и разведения.
Некоторые документы относятся конкретно к распылительной сушке микроорганизмов. Например, в EP1281752 B1 описан способ распылительной сушки клеток микроорганизмов. Основное внимание уделено размеру полученных частиц порошка и низкой температуре, применяемой для процесса сушки. В этом документе также заявлено, что можно использовать общеизвестный в данной области защитный агент. В нем представлено множество примеров потенциальных защитных агентов, а именно - витамины, такие как аскорбиновая кислота; аминокислоты, такие как глутамин, глутаминовая кислота, цистеин, глицин, фенилаланин, серин или треонин; сахариды или сахарные спирты, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, маннит или мальтит; полисахариды, такие как олигосахариды, циклодекстрин или декстрин; жиры, такие как высшие жирные кислоты, получаемые из рапса, сои, арахиса и т.п.; белки, такие как получаемые из коровьего молока, сои и т.п. и деградированные белки, такие как пептиды; неорганические соли, такие как сульфат магния; и другие соединения, такие как сложный эфир сахарозы и жирной кислоты, яблочная кислота, нуклеиновые кислоты, дрожжевой экстракт, обезжиренное молоко, пептон, желатин, танин и т.п. Эти ингредиенты можно использовать по отдельности или в любой комбинации. В этом документе нет какого-либо руководства в отношении выбора конкретных комбинаций ингредиентов, имеющих оптимальную активность.
Аналогичным образом US6010725 относится к распылительной сушке микроорганизмов и их выживанию. Представленная концепция ориентирована на условия, которые должны соблюдаться во время процесса распылительной сушки. В публикации также заявлено, что можно использовать различные защитные агенты, известные из научной литературы, и в качестве примеров перечислены аскорбиновая кислота, аминокислоты и их соли, такие как лизин, цистеин, глицин и глутамат натрия, белки или гидролизаты белков, сахара, такие как лактоза, трегалоза, сахароза, декстрин и мальтодекстрин, и жиры.
Несмотря на многочисленные описания обширных списков ингредиентов, которые потенциально можно применять в качестве защитных агентов, существует необходимость в дальнейшем уточнении и идентификации комбинаций ингредиентов, имеющих оптимальную активность, для защиты микроорганизмов во время процессов сушки с использованием нагретого газа и последующего хранения и разведения.
Преимущество настоящего изобретения заключается в том, что оно решает вышеупомянутые проблемы.
Изложение сущности изобретения
В первом аспекте изобретения предложена композиция, содержащая материал-носитель, содержащий полисахарид, по меньшей мере один антиоксидант и по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из лизина, аланина, цистеина и аргинина.
Во втором аспекте изобретения предложено применение композиции в соответствии с изобретением для защиты микроорганизмов во время процесса сушки с использованием нагретого газа, во время хранения и/или во время разведения.
В третьем аспекте изобретения предложен порошок культуры, содержащий живые микроорганизмы и матрикс, содержащий композицию в соответствии с настоящим изобретением, причем массовое соотношение сухого вещества матрикс : живые микроорганизмы составляет по меньшей мере 1.
В четвертом аспекте изобретения предложен способ получения порошка культуры, включающий:
a. получение биомассы путем ферментации, осуществляемой микроорганизмом;
b. концентрацию биомассы, полученной на стадии a);
c. кондиционирование концентрированной биомассы водным раствором композиции в соответствии с изобретением; и
d. сушку кондиционированной биомассы с помощью нагретого газа для получения порошка.
В пятом аспекте изобретения предложен продукт, содержащий порошок культуры в соответствии с изобретением.
Краткое описание рисунков
Фиг. 1. Логарифм потери жизнеспособности Bifidobacterium longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6, 8 и 12 недель хранения с использованием Glucidex MD DE47, лактозы, трегалозы, мальтозы или сахарозы в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в предварительном скрининговом исследовании из примера 1.
Фиг. 2. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6 и 8 недель хранения с использованием ксилита, сорбита, маннита, лактита, мио-инозита или глицерина в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в предварительном скрининговом исследовании из примера 1.
Фиг. 3. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6 и 8 недель хранения с использованием глутамата натрия, глутамина, аргинина, аланина, лизина или цистеина в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в предварительном скрининговом исследовании из примера 1.
Фиг. 4. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6 и 8 недель хранения с использованием казеината натрия, изолята сывороточного белка, денатурированного нагреванием изолята сывороточного белка или желатина в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в предварительном скрининговом исследовании из примера 1.
Фиг. 5. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6, 8 и 12 недель хранения с использованием гуммиарабика, λ-каррагинана, пектина, гуаровой камеди или альгината в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в предварительном скрининговом исследовании из примера 1.
Фиг. 6. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6, 8 и 12 недель хранения с использованием резистентного крахмала, пшеничных волокон, рафтилозы или рафтилина в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в предварительном скрининговом исследовании из примера 1.
Фиг. 7. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6, 8 и 12 недель хранения с использованием бетаина HCL, карнитина или пролина в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в предварительном скрининговом исследовании из примера 1.
Фиг. 8. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2 и 3 недели хранения с использованием лецитина, смеси лецитина и маисового масла, смеси лецитина и подсолнечного масла или смеси лецитина и соевого масла в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в предварительном скрининговом исследовании из примера 1.
Фиг. 9. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6, 8 и 12 недель хранения с использованием вариантов A-D и эталона в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в исследовании с комбинацией ингредиентов из примера 1.
Фиг. 10. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 после распылительной сушки и через 2, 4, 6, 8 и 12 недель хранения с использованием вариантов E-H и эталона в качестве защитного агента, по данным измерений, выполненных в исследовании с комбинацией ингредиентов из примера 1.
Фиг. 11. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 через 8 недель хранения после воздушной конвективной сушки в образцах 1, 5, 6 и 7 (каждый из которых содержит L-лизин, либо отдельно, либо в паре с другой аминокислотой, выбранной из L-цистеина, L-аланина и L-аргинина), по данным измерений из примера 2.
Фиг. 12. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 через 8 недель хранения после воздушной конвективной сушки в образцах 2, 5, 8 и 9 (каждый из которых содержит L-аргинин, либо отдельно, либо в паре с другой аминокислотой, выбранной из L-цистеина, L-аланина и L-лизина), по данным измерений из примера 2.
Фиг. 13. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 через 8 недель хранения после воздушной конвективной сушки в образцах 3, 6, 8 и 10 (каждый из которых содержит L-цистеин, либо отдельно, либо в паре с другой аминокислотой, выбранной из L-аргинина, L-аланина и L-лизина), по данным измерений из примера 2.
Фиг. 14. Логарифм потери жизнеспособности B. longum BL999 через 8 недель хранения после воздушной конвективной сушки в образцах 4, 7, 9 и 10 (каждый из которых содержит L-аланин, либо отдельно, либо в паре с другой аминокислотой, выбранной из L-цистеина, L-аргинина и L-лизина), по данным измерений из примера 2.
Фиг. 15. Количество клеток Streptococcus thermophilus ST496 через 4, 8 и 12 недель хранения в вариантах I и J и в эталоне, по данным измерений из примера 3.
Фиг. 16. Количество клеток Lactobacillus rhamnosus LPR через 4, 8 и 12 недель хранения в вариантах K и L и в эталоне, по данным измерений из примера 4.
Фиг. 17. Количество клеток Bifidobacterium lactis BL818 через 15, 30, 60, 90 и 180 дней хранения в варианте M и в эталоне, по данным измерений из примера 5.
Подробное описание изобретения
Определения
«Защитный агент» - для цели настоящего изобретения под «защитным агентом» следует понимать композицию, которая эффективно улучшает жизнеспособность живого микроорганизма во время сушки, хранения и/или разведения.
«Сушка» или «сушка с использованием нагретого газа» - для цели настоящего изобретения термины «сушка» или «сушка с использованием нагретого газа» употребляются как не имеющие различий и относятся к любому процессу, приводящему к дегидратации концентрата до состояния порошка под действием газа, имеющего температуру, которая выше комнатной температуры. Газ может находиться при повышенном или атмосферном давлении. Такими процессами являются, например, распылительная сушка, атмосферная сушка, воздушная конвективная сушка или сушка в псевдоожиженном слое. В наиболее предпочтительном варианте осуществления сушка относится к распылительной сушке.
«Разведение» - для цели настоящего изобретения «разведение» относится к разведению или суспендированию порошка в жидкости, такой как вода, специальная среда разведения, используемая в аналитической микробиологии, или напиток, такой как, например, молоко или сок. Жидкость, используемая для разведения, может быть холодной или теплой. Предпочтительно это относится к разведению водой.
Композиция
Композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере один материал-носитель, содержащий полисахарид, по меньшей мере один антиоксидант и по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из цистеина, лизина, аланина и аргинина.
Предпочтительно композиция изобретения не является питательной композицией, предпочтительно она не является полноценной питательной композицией, т.е. не является напитком или пищевым продуктом, обеспечивающим баланс питательных веществ для удовлетворения потребностей в питании употребляющего ее человека или животного, предпочтительно она не является питательной композицией, заключающей в себе целый прием пищи для употребляющего ее индивидуума.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения композиция представляет собой защитный агент. Более предпочтительно она представляет собой защитный агент для живых микроорганизмов, более предпочтительно для живых бактерий, наиболее предпочтительно для живых бактерий-пробиотиков. Еще более предпочтительно она представляет собой защитный агент для защиты живых микроорганизмов, таких как бактерии, во время сушки, хранения и/или разведения. Наиболее предпочтительно она представляет собой защитный агент для защиты живых микроорганизмов во время процесса сушки с использованием нагретого газа, такого как распылительная сушка, во время хранения и/или во время разведения.
Носитель содержит полисахарид. Например, носитель может представлять собой мальтодекстрин, декстрин, циклодекстрин, крахмал, олигосахарид или целлюлозу. Предпочтительно он представляет собой мальтодекстрин. Например, можно использовать мальтодекстрин с декстрозным эквивалентом (ДЭ) от 5 до 12.
Носитель составляет основную часть композиции. Очень важно, чтобы процесс сушки был стабильным, например, в случае сушки композиции с микроорганизмом для получения порошка культуры. Носитель, например, позволяет выполнять распылительную сушку при более низких температурах и избежать слипания порошка в распылительной сушильной башне.
Носитель присутствует предпочтительно в количестве 20-60 мас.%, более предпочтительно 30-56 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества композиции. В варианте осуществления носитель содержит полисахарид, как определено выше.
Антиоксидант может представлять собой любой тип антиоксиданта, такой как, например, витамин C, витамин E, глутатион, кофермент Q10, β-каротин, ликопин, витамин A или их производное. Предпочтительно он представляет собой витамин C или его производное, наиболее предпочтительно аскорбат натрия. В варианте осуществления антиоксидант не является одной из аминокислот цистеина, лизина, аланина и аргинина, еще более предпочтительно он не является аминокислотой. Антиоксидант является необходимым компонентом композиции изобретения. При добавлении к живым микроорганизмам он способствует их защите во время сушки, хранения и/или разведения. Антиоксидант, такой как аскорбат натрия, присутствует предпочтительно в количестве 13-50 мас.%, более предпочтительно 20-40 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества композиции.
Композиция дополнительно содержит по меньшей мере одну аминокислоту, выбранную из цистеина, лизина, аланина и аргинина. Предпочтительно композиция содержит комбинацию по меньшей мере двух из аминокислот цистеина, лизина, аланина и аргинина, более предпочтительно комбинацию по меньшей мере трех из этих аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления комбинация аминокислот содержит лизин и/или цистеин. Аминокислоты предпочтительно находятся в форме L-энантиомера (L-цистеин, L-лизин, L-аланин и L-аргинин).
Аминокислоты присутствуют предпочтительно в общем количестве 3,5-37 мас.%, более предпочтительно 3,5-34 мас.%, наиболее предпочтительно от 8 до 34 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества композиции. Каждая из аминокислот лизина, аланина и аргинина присутствует предпочтительно в количестве 0-34 мас.%, более предпочтительно 8-20 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества композиции. Цистеин присутствует предпочтительно в количестве 0-12 мас.%, более предпочтительно 2-10 мас.%, наиболее предпочтительно 2-8 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества композиции. Использование цистеина в меньших концентрациях, чем концентрации других аминокислот, является преимуществом, потому что это приносит органолептическую пользу. В частности, ограничение концентрации цистеина до максимального значения 10 мас.%, предпочтительно максимального значения 8 мас.%, в расчете на общую массу сухого вещества композиции улучшает вкус композиции, что делает ее более приемлемой для потребителей.
Особенно предпочтительные комбинации аминокислот включают
- цистеин и аланин;
- цистеин, лизин и аланин;
- лизин и аргинин;
- цистеин и аргинин;
- цистеин, лизин и аргинин;
- лизин, аланин и аргинин; и
- цистеин, аргинин и аланин.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что цистеин, лизин, аргинин и аланин, предпочтительно используемые в описанных выше количествах, оказывают превосходное защитное действие при их применении в порошке культуры, таким образом приводя к снижению потери живых микроорганизмов во время сушки, хранения и/или разведения порошка.
В частности, в примере 1 показано, что цистеин, лизин, аланин и аргинин демонстрируют лучшее защитное действие по сравнению со всеми остальными отдельными ингредиентами для испытаний, включая другие аминокислоты, такие как пролин, глутамат натрия или глутамин, а также различные типы веществ и смесей, таких как сахара, сахарные спирты, белки, камеди, волокна и эмульсии. Испытания с комбинациями ингредиентов из примера 1 также показывают, что применение этих аминокислот обеспечивает наилучшие результаты.
Синергетический эффект наблюдается при комбинации аминокислот в композиции, в частности в присутствии цистеина и/или лизина. Действительно, как показано в примере 2, композиции, содержащие две аминокислоты, включая лизин и/или цистеин, демонстрируют лучшее защитное действие в отношении живых микроорганизмов во время сушки, хранения и/или разведения, чем композиции, содержащие одну аминокислоту, при той же общей концентрации аминокислот.
Материал-носитель, антиоксидант и по меньшей мере одна аминокислота, выбранная из лизина, цистеина, аланина и аргинина, являются необходимыми компонентами композиции. Композиция может содержать дополнительные компоненты. Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что улучшенное защитное действие наблюдается, когда определенные типы ингредиентов используются в ограниченных концентрациях или вообще отсутствуют. Таким образом, предпочтительной является концентрация лактозы и инозита в композиции в диапазоне 0-10 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества композиции. Более предпочтительно композиция не содержит лактозы и инозита. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что такие композиции с низким содержанием лактозы и инозита обеспечивают превосходное защитное действие в отношении живых микроорганизмов во время сушки, хранения и/или разведения. Для цели настоящего изобретения подразумевается, что инозит находится в форме любого из его стереоизомеров (мио-инозит, сцилло-инозит, муко-инозит, D-хиро-инозит, нео-инозит, L-хиро-инозит, алло-инозит, эпи-инозит и цис-инозит). Наиболее распространенной формой инозита является мио-инозит, поэтому в варианте осуществления инозит определяется как мио-инозит.
В предпочтительном варианте осуществления общая концентрация всех необходимых ингредиентов (носителя, антиоксиданта и любой одной или более из аминокислот лизина, цистеина, аланина и/или аргинина) составляет от 80 до 100 мас.%, а общая концентрация дополнительных ингредиентов составляет от 0 до 20 мас.%, эти процентные доли определяются в расчете на общую массу сухого вещества композиции.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления композиция состоит, по существу, из по меньшей мере одного носителя, по меньшей мере одного антиоксиданта и по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из лизина, цистеина, аланина и аргинина, как определено в любом из вышеуказанных вариантов осуществления, предпочтительно присутствующих в указанных количествах. Более предпочтительно композиция состоит из по меньшей мере одного носителя, по меньшей мере одного антиоксиданта и по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из лизина, цистеина, аланина и аргинина, как определено в любом из вышеуказанных вариантов осуществления, предпочтительно присутствующих в указанных количествах. Наиболее предпочтительно она состоит из мальтодекстрина, аскорбата натрия и по меньшей мере одной аминокислоты, выбранной из лизина, цистеина, аланина и аргинина, как определено в любом из вышеуказанных вариантов осуществления, предпочтительно присутствующих в указанных количествах.
Применение композиции
Композиция по любому из вышеописанных вариантов осуществления может преимущественно применяться для защиты живых микроорганизмов во время процесса сушки, такого как распылительная сушка, хранения и/или разведения. Предпочтительно хранение и/или разведение следуют за процессом сушки, предпочтительно процессом распылительной сушки. Предпочтительно защитный агент позволяет ограничить потери живых микроорганизмов во время процесса сушки и последующего хранения в течение периода 12 недель при температуре 37°C до максимум 1,5 по логарифмической шкале, более предпочтительно менее 1 по логарифмической шкале, и продлить срок хранения до 12 месяцев при комнатной температуре для продукта в форме порошка.
Абсолютное значение логарифма потери жизнеспособности может варьироваться в зависимости от штамма микроорганизма, температуры хранения, продолжительности хранения и активности воды среды во время хранения, такой как, например, продукт, в который включен этот микроорганизм. Независимо от абсолютного значения логарифма потери жизнеспособности, измеренного для одного конкретного штамма, защитное действие, обеспечиваемое настоящим изобретением, включает снижение логарифма потери жизнеспособности этого штамма микроорганизма, по сравнению с этим же штаммом микроорганизма, высушенным, хранимым и/или разведенным без применения композиции изобретения, и предпочтительно также по сравнению с этим же штаммом микроорганизма, высушенным, хранимым и/или разведенным с применением защитного агента, содержащего только носитель и антиоксидант (т.е. без аминокислоты).
Живой микроорганизм может представлять собой любой тип живого микроорганизма. Предпочтительно микроорганизмы представляют собой бактерии, более предпочтительно полезные бактерии, такие как, например, бактерии-пробиотики. Бактерии-пробиотики определяются как препараты из клеток бактерий, которые оказывают благоприятное воздействие на здоровье или состояние организма-хозяина (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y. et al. “Probiotics: how should they be defined”, Trends Food Sci. Technol. 1999:10, 107-10).
Микроорганизмы считаются «живыми», когда они способны размножаться в контролируемых условиях культивирования и образовывать колонии или суспензии или когда метаболическая активность микроорганизма и/или целостность мембраны могут быть установлены с помощью способов, известных специалисту в данной области, таких как, например, проточная цитометрия.
Приведенные в настоящей заявке примеры показывают, что композиция настоящего изобретения успешно защищает разнообразные штаммы микроорганизмов во время сушки и последующего хранения и разведения. Следовательно, действие композиции не является штамм-специфическим, и ее можно применять к широкому диапазону штаммов микроорганизмов.
Примеры бактерий, которые можно защищать с помощью композиции настоящего изобретения, включают бифидобактерии, лактобактерии, лактококки, энтерококки, стрептококки, Leuconostoc, Escherichia, пропионибактерии или их комбинации, предпочтительно Bifidobacterium longum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Lactococcus diacetylactis, Lactococcus cremoris, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis, Lactobacillus helveticus, Escherichia coli, Enterococcus faecium, Leuconostoc pseudomesenteroides, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus sakei, Streptococcus salivarius и/или их смеси, а также любые из их подвидов.
Примеры штаммов бактерий, которые можно успешно защищать, включают Bifidobacterium longum BL999 (номер в Американской коллекции типовых культур (ATCC) BAA-999), Bifidobacterium longum (номер в английской Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM) I-2618), Bifidobacterium breve (CNCM I-3865), Bifidobacterium lactis BL818 (CNCM I-3446), Lactobacillus johnsonii La1 (CNCM I-1225), Lactobacillus paracasei (CNCM I-2116), Lactobacillus rhamnosus LPR (номер в Китайском центре общей коллекции микробиологических культур (CGMCC) 1.3724), Streptococcus thermophilus (CNCM I-1422), Streptococcus thermophilus ST496 (CNCM I-4153), Lactobacillus casei (CNCM I-1518), Lactobacillus casei (номер в Коллекции молочных культур Аграрного колледжа Афин (ACA-DC) 6002), Escherichia coli Nissle, Lactobacillus bulgaricus (CNCM I-1198), Lactococcus lactis (CNCM I-4154) или их комбинации.
В варианте осуществления микроорганизм выбирают из Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999), Streptococcus thermophilus ST496 (CNCM I-3915), Lactobacillus rhamnosus LPR (CGMCC 1.3724) и Bifidobacterium lactis BL818 (CNCM I-3446).
Порошок культуры
Авторы настоящего изобретения разработали порошок культуры с улучшенной стабильностью во время хранения и/или разведения. Порошок культуры содержит живые микроорганизмы и матрикс, содержащий композицию, как определено в любом из описанных выше вариантов осуществления, в разделе под названием «Композиция». Предпочтительно порошок культуры содержит матрикс и живые микроорганизмы, причем матрикс состоит из композиции изобретения, такой как описанная выше композиция, в разделе под названием «Композиция». Наиболее предпочтительно порошок культуры состоит из матрикса и живого микроорганизма, причем матрикс содержит или еще более предпочтительно - состоит из композиции изобретения, такой как описанная выше композиция, в разделе под названием «Композиция».
Для обеспечения эффективной защиты живого микроорганизма массовое соотношение матрикс : микроорганизм в порошке культуры предпочтительно составляет по меньшей мере 1. Предпочтительно оно составляет от 1 до 1,2 для достижения подходящего защитного действия и поддержания при этом экономически эффективного количества микроорганизмов.
Предпочтительно матрикс находится в стеклообразном состоянии.
Живые микроорганизмы представляют собой определенные выше живые микроорганизмы, в разделе под названием «Применение композиции».
Количество живых микроорганизмов в порошке культуры по изобретению можно определить как колониеобразующие единицы (КОЕ). Требуемое количество живых микроорганизмов в порошке культуры может сильно варьироваться и зависит от штамма микроорганизма и предназначения порошка. Например, в случае бактерий-пробиотиков порошок культуры может содержать по меньшей мере 1E+10, более предпочтительно по меньшей мере 3E+10, а наиболее предпочтительно по меньшей мере 1E+11 КОЕ на грамм порошка культуры.
Микроорганизмы в порошке культуры по настоящему изобретению могут быть в форме сухой биомассы, содержащей микроорганизмы вместе с сухим остатком ферментационной среды. Таким образом, порошок может содержать источник азота, такой как дрожжевой экстракт, источник углерода, такой как сахар, и/или различные соли, подходящие для применения в ферментационной среде для выращивания микроорганизмов. Кроме того, он может содержать ферментированные производные источника азота и углерода, а также биоактивные ингредиенты, производимые микроорганизмами в процессе ферментации. Такие ингредиенты, как правило, присутствуют в количестве 0-60 мас.%, предпочтительно 0-50 мас.%, в расчете на общую массу сухого вещества компонента микроорганизмов (биомассы). Такие дополнительные ингредиенты присутствуют как часть фракции микроорганизмов в особенно низких количествах, если биомассу промывают перед ее смешиванием с матриксом.
Помимо микроорганизма и матрикса порошок культуры может содержать другие ингредиенты. Такие ингредиенты могут, как правило, представлять собой дополнительные носители, такие как, например, полисахариды, дисахариды или сухое обезжиренное молоко. Предпочтительно матрикс находится в стеклообразном состоянии, тогда как дополнительные ингредиенты находятся не в стеклообразном состоянии.
Способ получения порошка культуры
Первая стадия способа изобретения представляет собой получение биомассы путем ферментации, осуществляемой микроорганизмами. Способы ферментации, осуществляемые в аэробных или анаэробных условиях, общеизвестны. Специалист в данной области, опираясь на свои знания общего характера, сможет определить подходящие компоненты ферментационной среды и подобрать условия ферментации в зависимости от выращиваемого микроорганизма. Ферментационная среда, как правило, содержит
- источник азота, такой как дрожжевой экстракт,
- источник углерода, такой как сахар
- различные факторы роста (например, минеральные вещества, витамины и т.п.), необходимые микроорганизму и
- воду.
Ферментацию предпочтительно выполняют в две стадии: перед основной стадией ферментации выполняют начальную стадию ферментации. Ферментационная среда для начальной и основной стадии ферментации может быть разной или одинаковой.
Вторая стадия способа представляет собой концентрацию биомассы. Ее также можно выполнять, используя способы, известные специалисту в данной области, такие как, например, центрифугирование или фильтрование. Общее содержание твердых веществ биомассы после концентрации предпочтительно составляет от 10 до 35 мас.%, предпочтительно от 14 до 35 мас.%, в расчете на общую массу сухого вещества биомассы (т.е. общее количество ферментационной среды и полученного микроорганизма).
Необязательно может присутствовать стадия промывки, которая выполняется перед стадией концентрации или объединена с ней, для удаления остатков ферментационной среды и/или соединений, образованных в процессе ферментации. Например, промывку можно выполнять путем концентрации биомассы, повторного суспендирования концентрированной биомассы в буфере, таком как фосфатный буфер, или в аналогичной композиции и повторной концентрации биомассы.
Третья стадия способа представляет собой кондиционирование живого микроорганизма. Во время этого процесса матрикс в форме композиции настоящего изобретения приводят в контакт с живым микроорганизмом. Композиция настоящего изобретения определена в любом из описанных выше вариантов осуществления, в разделе под названием «Композиция». Предпочтительно указанный матрикс представляет собой защитный агент.
Стадия кондиционирования предпочтительно включает следующие промежуточные стадии:
a) получение водного раствора матрикса, предпочтительно имеющего общее содержание твердых веществ 40-65%, более предпочтительно 45-60%.
b) добавление водного раствора, полученного на стадии a), к биомассе, чтобы достичь концентрации матрикса 40-60 мас.%, предпочтительно 50-60 мас.%, наиболее предпочтительно 55%, в расчете на общую массу сухого вещества матрикса и биомассы (общее содержание твердых веществ);
c) поддержание биомассы в контакте с матриксом в течение периода от 20 до 150 минут;
d) доведение pH до значения от 6,5 до 8,5, предпочтительно от 6,8 до 7,2
В одном альтернативном варианте способа стадию c) выполняют перед стадией d). В другом альтернативном варианте стадию d) выполняют перед стадией c).
Желательную продолжительность контакта между биомассой и защитными агентами можно обеспечить либо периодическим, либо непрерывным смешиванием. При периодическом способе защитные агенты и биомассу смешивают в резервуаре для периодического смешивания и выдерживают при перемешивании в течение всего времени кондиционирования, необязательно в условиях охлаждения, предпочтительно при T < 10°C, чтобы предотвратить рост нежелательных микроорганизмов и прорастание спор. При непрерывном способе желательную продолжительность контакта между биомассой и защитным агентом можно обеспечить либо с помощью проточного реактора идеального смешения с соответствующей средней продолжительностью пребывания, либо с помощью реактора идеального вытеснения с соответствующей продолжительностью пребывания (аналогичной продолжительности пребывания в трубчатом выдерживателе).
После этого кондиционированную биомассу высушивают, применяя известный в данной области способ сушки с использованием нагретого газа, такой как, например, распылительная сушка, сушка в псевдоожиженном слое, воздушная конвективная сушка или атмосферная сушка, более предпочтительной является распылительная сушка. Например, условия, описанные в патенте EP0818529, который полностью включен в настоящий документ путем ссылки, можно применять к процессу распылительной сушки.
Необязательно высушенный порошок культуры можно в сухом виде смешивать с дополнительными ингредиентами. Такие ингредиенты могут, например, представлять собой дополнительные носители, такие как полисахариды, как определено выше, дисахариды или сухое обезжиренное молоко.
Продукт
В настоящем изобретении также предложен продукт, содержащий порошок культуры по любому из вышеописанных вариантов осуществления. Продукт может представлять собой любой тип продукта, в который можно включить порошок культуры, такой как продукт в форме пищевого или питьевого продукта, продукт для кормления животных, питательная добавка для людей или животных, фармацевтическая композиция или косметическая композиция. Продукт может быть предназначен для применения конечным потребителем в твердой форме (например, в форме порошка) или полутвердой форме (например, в форме пасты) или, в альтернативном варианте осуществления, для разведения в жидкости перед применением.
Пищевые и питьевые продукты включают все продукты, предназначенные для употребления людьми перорально с целью получения питания и/или удовольствия. Например, это может быть питательная композиция, такая как композиция для младенцев и/или детей младшего возраста, для беременных или кормящих женщин или для женщин, желающих забеременеть, для людей, которым необходимо специальное питание из-за неблагоприятного состояния здоровья, или для пожилых людей. Более предпочтительно питательную композицию выбирают из детской смеси, детских каш, смеси последующего уровня, молочных смесей для детей от 1 до 3 лет или молочных продуктов для беременных и кормящих женщин или для женщин, желающих забеременеть. Другие примеры пищевых и питьевых продуктов включают молочные продукты, такие как продукты на основе молока или йогурты, супы, соусы, сладкие и несладкие снеки, напитки в порошке и продукты из зерновых.
Продукт также может быть представлен в форме пищевого продукта для животных или питательной добавки для животных. Предпочтительно животное представляет собой млекопитающее. Примеры животных включают приматов (например, людей), коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, кроликов, крыс, мышей, рыб, птиц и т.п.
Питательные добавки, как правило, присутствуют в форме порошка, таблетки или капсулы. Порошковые добавки, как правило, охватывают добавки, предназначенные для растворения в воде, посыпания пищевого продукта или добавления в напиток. Такие добавки предназначены для обеспечения употребляющего их субъекта дополнительными питательными веществами и/или полезным для здоровья эффектом, а также другими полезными ингредиентами, такими как полезные микроорганизмы, например, бактерии-пробиотики. Добавку в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для обеспечения питательными веществами и/или эффектом, полезным для здоровья людей, а также животных, как определено выше. Например, питательные добавки включают порошковые добавки для добавления в грудное молоко, например, для преждевременно родившихся младенцев или младенцев с низким весом при рождении. Они также включают добавки для беременных или кормящих женщин или для женщин, желающих забеременеть.
Фармацевтические продукты включают препараты в форме порошка, таблетки или капсулы, предназначенные для лечения или профилактики неблагоприятного медицинского состояния у субъекта, которому это необходимо.
Косметические композиции, как правило, предназначены для оказания эстетического воздействия на тело и могут предназначаться для местного применения или могут вводиться перорально, в форме порошка, таблетки или капсулы.
Продукт настоящего изобретения предпочтительно содержит живые микроорганизмы, предпочтительно полезные бактерии, такие как бактерии-пробиотики, в количестве по меньшей мере 5E+06 КОЕ на грамм продукта в расчете на массу сухого вещества.
Ингредиенты матрикса можно выбирать из вышеописанных ингредиентов на основе свойств продукта, например, исходя из требований ко вкусу или нормативных требований.
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже с помощью следующих примеров.
Пример 1. Защитный агент для Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999)
Получение образца
Ферментационную среду, подходящую для выращивания Bifidobacterium longum BL999, инокулировали 2% размороженных бактерий. Ферментацию стартовой культуры осуществляли при следующих условиях:
- продолжительность ферментации 10 часов
- контроль pH на уровне 6 с помощью NaOH.
Для основной стадии ферментации применяли следующие условия:
- продолжительность ферментации 16 часов,
- отсутствие контроля pH
2
- ферментационный бульон содержали в атмосфере CO
- инокуляция стартовой культурой: 2%
После этого биомассу концентрировали посредством центрифугирования до общего содержания твердых веществ 14% (2,5E+11 КОЕ/г).
Центрифугированную биомассу кондиционировали в соответствии с описанным ниже способом. Защитный агент каждого из образцов растворяли в деминерализованной воде до общего содержания твердых веществ 55%. Затем 300 г центрифугированной биомассы переносили в химический стакан, помещенный на водяную баню со льдом. Измеряли общее содержание твердых веществ биомассы и добавляли раствор защитного агента в соотношении защитных агентов к биомассе 55/45 (в расчете на массу сухого вещества). Смесь выдерживали на водяной бане со льдом в течение одного часа при медленном перемешивании. Затем уровень pH доводили до 7.
После этого кондиционированный концентрат высушивали распылением в лабораторном распылительном сушильном устройстве (Buechi, B-290, г. Флавиль, Швейцария). Температура воздуха была 140°C, а температуру в башне доводили с помощью потока концентрата до T = 70°C. Во время сушки химический стакан, содержащий концентрат, охлаждали на водяной бане со льдом.
Предварительный скрининг
На первом этапе исследований в качестве потенциальных защитных агентов выбирали 38 ингредиентов. Влияние этих ингредиентов на стабильность Bifidobacterium longum BL999 проверяли посредством распылительной сушки биомассы с защитным агентом, содержащим мальтодекстрин DE12, аскорбат натрия и только один дополнительный ингредиент, выбранный из перечня 38 соединений, которые для скрининга присутствуют в указанных ниже концентрациях.
Таблица 2. Композиция защитного агента для предварительного скрининга
Ингредиент
Концентрация [мас.%]
Мальтодекстрин DE12
68,2
Аскорбат натрия
13,6
Отдельный ингредиент
18,2
В общей сумме
100
Получали контрольный образец с защитным агентом с содержанием аскорбата натрия 13,6 мас.% и мальтодекстрина DE12 86,4 мас.%. Этот контрольный образец использовали в качестве эталона для оценки влияния защитных агентов на стабильность Bifidobacterium longum BL999 во время распылительной сушки, хранения и разведения.
Порошки 38 культур и контрольный образец получали, как описано выше, кондиционирование выполняли с одним из 38 защитных агентов.
w
Концентрацию клеток B. longum в порошке определяли классическими способами посева. Такие классические способы посева кратко представлены в книге по микробиологии: James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7th edition, Springer Science, New York, N.Y. Подсчет клеток выполняли в концентрате перед сушкой, в порошке культуры непосредственно после сушки и через 2, 3, 4, 6, 8 и/или 12 недель хранения в климатической камере при T = 37°C над насыщенным раствором ацетата калия (a = 0,22). Количество клеток после сушки и после хранения определяли после разведения порошка средой разведения, способами, известными специалисту в данной области, который хорошо знаком с вышеупомянутыми способами посева.
Для оценки данных применяли следующую формулу:
,
0
t
0
t
где X - число микроорганизмов в момент времени t = 0, а X - число микроорганизмов в момент времени t. Если количество микроорганизмов измеряли в k репликах, то X̅ - среднее число микроорганизмов в момент времени t = 0, X̅ - среднее число микроорганизмов в момент времени t, а среднее значение логарифма потери в момент времени t выражается формулой:
.
Отдельные ингредиенты для испытаний выбирали среди нескольких групп молекул: сахара, сахарные спирты, аминокислоты и белки. Все ингредиенты для испытаний в рамках группы высушивали распылением в один и тот же день и для каждой группы в тот же день высушивали распылением эталон.
Сахара для испытаний представляли собой сахарозу, мальтозу, трегалозу, лактозу и Glucidex MD DE47. По сравнению с эталоном сахара не обеспечивали никакой защиты от летальных стрессовых воздействий, которым подвергались бактерии в распылительном сушильном устройстве. Хотя воздействие сахаров на выживание бактерий во время сушки было минимальным, было отмечено их влияние на стабильность при хранении. Наилучшую эффективность в качестве защитных агентов показали дисахариды, наиболее эффективным ингредиентом из них оказалась сахароза. Результаты представлены на фиг. 1. Для второго этапа испытаний выбирали сахарозу и лактозу.
Сахарные спирты для испытаний представляли собой сорбит, маннит, лактит, мио-инозит, ксилит и глицерин. Распылительная сушка концентрата с сахарными спиртами представляла собой трудную задачу из-за слипания порошка в башне. Во время сушки некоторые из сахарных спиртов, такие как глицерин, маннит, ксилит и сорбит, продемонстрировали светозащитный эффект. В испытании на хранение образцы порошков, содержащие глицерин, через короткое время слеживались. Большая часть бактерий в этом варианте погибала уже через две недели хранения, и испытание на хранение было остановлено. Наименьшей оказалась потеря жизнеспособности через 8 недель у вариантов, содержащих сорбит, маннит, мио-инозит и лактит. Результаты показаны на фиг. 2. Для второго этапа испытаний выбирали сорбит, лактит и мио-инозит.
Аминокислоты для испытаний представляли собой L-цистеин, L-лизин, L-аргинин, L-аланин, L-глутамин и L-глутамат натрия. В противоположность сахарам, некоторые аминокислоты стабилизируют бактерии во время хранения. В эталоне потеря жизнеспособности во время сушки составляла 1 по логарифмической шкале, тогда как в варианте, содержащем цистеин, потеря жизнеспособности составила лишь 0,2 по логарифмической шкале. Хотя как аскорбат натрия, так и цистеин, как известно, имеют свойства антиоксиданта, неожиданно было обнаружено, что цистеин характеризуется способностью защищать микроорганизм во время сушки, тогда как аскорбат натрия не оказывает значительного воздействия на выживание бактерий во время процесса сушки. Образцы, содержащие цистеин, лизин, аргинин или аланин, показали наименьшие потери во время хранения и разведения среди аминокислот, но также сравнимые со всеми остальными ингредиентами, которые испытывали на данной фазе предварительного скрининга. Эти аминокислоты выбирали для второго этапа испытаний. Результаты приведены на фиг. 3.
Белки для испытаний представляли собой желатин, денатурированный нагреванием изолят сывороточного белка (после денатурирования при T = 80°C в течение 30 минут), изолят сывороточного белка и казеинат натрия. Ни один из белков не улучшал стабильность во время сушки. Денатурированный нагреванием изолят сывороточного белка показал положительный эффект на протяжении первых шести недель хранения, но через 8 недель потеря жизнеспособности была такой же высокой, как и для эталона. Из-за слабой эффективности для второго этапа испытаний не выбрали ни один из белков. Результаты приведены на фиг. 4.
Все остальные ингредиенты для испытаний не показали защитного действия или показали очень слабое защитное действие, и их не выбрали для следующего этапа испытаний:
- камеди (гуммиарабик, λ-каррагинан, пектин, гуаровая камедь и альгинат), см. фиг. 5;
- олигосахариды (резистентный крахмал, пшеничные волокна, рафтилоза и рафтилин), см. фиг. 6.
- другие ингредиенты (бетаина HCL, карнитин) и аминокислота пролин, см. фиг. 7.
Предварительный скрининг четко показывает, что ингредиенты, упоминаемые в предшествующих источниках как потенциально оказывающие защитное действие в отношении микроорганизмов во время сушки, имеют очень разную эффективность при защите живых микроорганизмов в процессе сушки с использованием нагретого газа, такой как распылительная сушка, во время хранения и/или во время разведения. Работа авторов настоящего изобретения продемонстрировала превосходную эффективность аминокислот цистеина, лизина, аланина и аргинина в комбинации с носителем и антиоксидантом при защите бактерий-пробиотиков во время распылительной сушки, в течение 12 недель последующего хранения и во время разведения.
Испытания с использованием комбинаций ингредиентов
После выбора на стадии предварительного скрининга наиболее перспективных ингредиентов была разработана схема эксперимента для выявления самых лучших смесей защитных агентов и оптимальных профилей концентрации.
Сначала проводили исследования применимости, где определяли ограничения относительно обработки.
Общую концентрацию аминокислот необходимо ограничить значением в общей сумме 36,5 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества защитного агента. При высоких концентрациях аминокислот распылительная сушка стала практически невозможной из-за слипания порошка.
Чтобы процесс сушки был стабильным, в смесь защитных агентов необходимо включить мальтодекстрин в количестве минимум 31 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества защитного агента.
Содержание биомассы фиксировали на уровне 45 мас.% в готовом порошке, и количество защитного агента, соответственно, составило 55 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества биомассы и защитного агента.
Схема эксперимента включала 32 варианта, состоящих из различных комбинаций ингредиентов, которые в предварительном скрининговом исследовании были определены как перспективные защитные агенты. Из-за ограниченной вместимости распылительного сушильного устройства эти варианты разделяли на группы по 5 вариантов и эталон, каждую группу высушивали распылением в один и тот же день. В качестве эталона использовали смесь защитных агентов, предварительно определенную как оказывающую слабое защитное действие на микроорганизм во время распылительной сушки. Композиция эталона приведена ниже в таблице 3. Помимо 5 вариантов в каждый день исследования также высушивали распылением эталон. Эталон высушивали распылением все время в разных позициях согласно организации дня исследования, чтобы исключить эффекты, связанные с разной продолжительностью хранения биомассы. Измерения потери жизнеспособности выполняли после того, как все образцы группы были высушены распылением. Следовательно, продолжительность хранения перед измерением, выполняемым после распылительной сушки, варьировалась от 0 до 6 часов из-за времени, необходимого для высушивания распылением 5 вариантов и эталона.
Таблица 3. Композиция эталона
Ингредиент
Концентрация [мас.%]
Мальтодекстрин
50
Лактоза
20
<i>Мио</i>-инозит
9
Глутамат натрия
7
Аскорбат натрия
14
В общей сумме
100
Все варианты получали, как описано для предварительного скринингового исследования, с использованием комбинации ингредиентов вместо одного ингредиента. Затем их высушивали распылением, после сушки хранили в течение 12 недель и анализировали через 2, 4, 6, 8 и 12 недель, как описано выше применительно к предварительным скрининговым исследованиям. Для анализа данных применяли одни и те же математические формулы. Результаты по двум группам, включающим наиболее перспективные варианты, представлены на фиг. 9 и 10. Композиции вариантов, включенных в эти исследования, представлены ниже в таблице 4.
Таблица 4. Композиция вариантов A-H
Вариант
Мальтодекстрин
Аскорбат натрия
Сорбит
<i>Мио</i>-инозит
Лактоза
Сахароза
Лактит
L-лизин
Гидрохлорид L-цистеина
L-аргинин
L-аланин
Глутамат натрия
Станд.
50,0
14,0
0,0
9,0
20,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
7,0
Сравнительный
A
31,8
13,6
9,1
9,1
0,0
0,0
0,0
0,0
12,2
12,2
12,2
0,0
Изобретение
B
31,8
13,6
9,1
9,1
0,0
0,0
36,4
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Сравнительный
C
43,8
36,4
0,0
4,0
0,0
0,0
8,0
2,7
2,7
2,7
0,0
0,0
Изобретение
D
31,8
34,55
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
11,3
11,3
0,0
11,3
0,0
Изобретение
E
31,8
34,6
0,0
0,0
11,3
11,3
11,3
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Сравнительный
F
31,8
26,6
0,0
0,0
0,0
0,0
20,7
0
6,9
6,9
6,9
0,0
Изобретение
G
37,6
36,4
9,1
9,1
0,0
3,8
0,0
1,3
1,3
0,0
1,3
0,0
Изобретение
H
31,8
29,6
0,0
12,9
25,6
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0
Сравнительный
Результаты, представленные на фиг. 9, показывают, что вариант B и эталон, которые не содержат ни одной из аминокислот лизина, цистеина, аргинина и/или аланина, требуемых в настоящем изобретении, имеют гораздо более слабое защитное действие, так как логарифм потери жизнеспособности для этих двух образцов намного выше, чем для вариантов изобретения. Наиболее эффективным вариантом в данной схеме эксперимента является вариант D, имеющий три аминокислоты и не имеющий других ингредиентов (т.е. он состоит из глутамата натрия, мальтодекстрина и аминокислот лизина, цистеина и аланина). Показанное на фиг. 10 защитное действие вариантов F и G в соответствии с изобретением также намного лучше, чем у вариантов E и H (без аминокислот).
Этот пример показывает, что защитное действие обеспечивается защитными агентами, содержащими различные смеси аминокислот цистеина, лизина, аланина и аргинина, в широком диапазоне общих концентраций в диапазоне от 3,8 до 36,5 мас.% в расчете на общую массу сухого вещества защитного агента.
Пример 2. Сравнение различных соотношений аминокислот
Получали образцы порошка культуры, содержащие Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999) и матрикс, содержащий мальтодекстрин, аскорбат натрия и аминокислоты цистеин, лизин, аланин и аргинин, по отдельности или в попарных комбинациях, как описано ниже в таблице 5.
Таблица 5. Композиция аминокислот в матриксе образцов для испытаний.
№ образца
Лизин (%)
Аргинин (%)
Цистеин (%)
Аланин (%)
1
34
0
0
0
2
0
34
0
0
3
0
0
34
0
4
0
0
0
34
5
17
17
0
0
6
17
0
17
0
7
17
0
0
17
8
0
17
17
0
9
0
17
0
17
10
0
0
17
17
Процентные доли определены по массе относительно общей массы матрикса.
Получали образцы с 55% матрикса и 45% Bifidobacterium longum BL999 (ATCC BAA-999), процентные доли определены по массе в расчете на общую массу сухого вещества порошка культуры. Матрикс состоял из 33% мальтодекстрина DEX, 33% аскорбата натрия и 34% композиции аминокислот, как описано в таблице 5, процентные доли определены по массе относительно общей массы матрикса.
2
Образцы получали следующим образом. B. longum BL999 культивировали в течение 16 ч при температуре 37°C в 7-литровом ферментере (newMBR, г. Цюрих, Швейцария) в атмосфере CO в свободном пространстве ферментера, с использованием такой же ферментационной среды, как в примере 1. Уровень pH процесса ферментации не контролировали. Полученную в ферментере суспензию клеток центрифугировали со скоростью 4500 об/мин в течение 20 мин при температуре 5°C (в центрифуге Sorvall RC3C Plus). После удаления надосадочной жидкости биомассу хранили при температуре 4°C до перемешивания с защитным матриксом. Уровень pH концентрата доводили до 7,0 посредством добавления по каплям 30% NaOH перед сушкой с помощью аналитического конвективного сушильного устройства (ACD) для лаборатории (производства IVV-Fraunhofer Institut, г. Фрайзинг, Германия). Важные параметры сушки, такие как влажность воздуха, температура воздуха и скорость воздушного потока, настраивали следующим образом:
3
- воздушный поток: 40 м/ч;
- температура осушающего воздуха: 60°C;
- относительная влажность осушающего воздуха: 8%;
- продолжительность: 660 с.
Логарифм потери определяли для каждого образца, как описано в примере 1, после сушки и через 8 недель хранения при повышенной концентрации раствора ацетата натрия (aw = 0,22) в климатической камере при T = 37°C. Концентрацию клеток B. longum BL999 измеряли перед сушкой и через 8 недель хранения с применением способа, описанного в примере 1. Логарифм потери также вычисляли с использованием уравнений, описанных в примере 1.
Результаты представлены на фиг. 11-14. На этих фигурах показано, что образцы, в которых в защитном агенте использовалась пара аминокислот, показали пониженный логарифм потери жизнеспособности по сравнению с образцами, в которых использовалась только одна аминокислота. Единственное исключение составлял образец, полученный с комбинацией двух аминокислот, аланина и аргинина, который показал повышенную потерю жизнеспособности по сравнению с образцами, содержащими только аргинин или только аланин. Хотя было показано, что эффект от комбинации аланина и аргинина оказался слабее, чем от этих ингредиентов по отдельности, результаты свидетельствуют о значимом защитном действии аланина и аргинина в качестве единственных ингредиентов или скомбинированных в пару.
Эти результаты свидетельствуют о синергии между аминокислотами при их использовании в парах, в частности в присутствии цистеина и/или лизина, по сравнению с их применением в виде единственной аминокислоты, поскольку при тех же концентрациях аминокислоты в парах обеспечивают лучшую стабилизацию, чем по отдельности.
Пример 3. Защитный агент для Streptococcus thermophilus ST496 (CNCM I-3915)
Проводили сравнительный эксперимент для оценки эффективности композиции в соответствии с изобретением в отношении защиты микроорганизма Streptococcus thermophilus ST496 (CNCM I-3915) во время хранения и разведения.
Получали эталон и два образца для испытаний (варианты I и J). В качестве эталона использовали смесь защитных агентов, предварительно определенную как оказывающую слабое защитное действие на микроорганизм во время распылительной сушки. Композиция эталона приведена выше в таблице 3. Композиция защитного агента, используемого в каждом образце для испытаний, приведена ниже в таблице 6. Для всех образцов концентрация матрикса составляла 55 мас.%, а концентрация микроорганизмов - 45 мас.% в расчете на общее содержание твердых веществ.
Таблица 6. Композиция образцов I и J
Ингредиент
Вариант I
Вариант J
Мальтодекстрин DE6
55,00
50,00
Аскорбат натрия
22,32
25,00
L-лизина HCl
9,34
10,30
L-цистеина HCl моногидрат
4,00
4,40
L-аланин
9,34
10,30
В общей сумме
100,00
100,00
Эталон и все образцы для испытаний получали с применением одного и того же способа, как описано ниже. S. thermophilus выращивали в 3000-литровом биореакторе при температуре 40°C в течение 9 ч, при постоянном уровне pH, после инокуляции подходящей среды, содержащей источник азота, источник углерода и микроэлементы, стартовой культурой при 2%. В конце ферментации биомассу концентрировали путем центрифугирования и кондиционировали матриксом в течение 1 ч. После кондиционирования и доведения уровня pH до 7 биомассу и матрикс высушивали распылением в больших масштабах, используя распылительную сушильную башню, по размеру близкую к промышленной сушильной башне.
w
После распылительной сушки эталон и образцы для испытаний подвергали испытанию методом «ускоренного старения». После распылительной сушки порошка культуры его смешивали с сухим обезжиренным молоком в соотношении 1 к 100. Затем эту смесь хранили при температуре 37°C и a = 0,25 в течение 12 недель. Количество клеток измеряли в эталоне и образцах для испытаний сразу после распылительной сушки и через 4, 8 и 12 недель хранения. Количество клеток измеряли, как описано в примере 1.
Результаты показаны на фиг. 15. По графику можно видеть, что количество клеток микроорганизмов в общей сумме через 12 недель хранения и после разведения существенно выше в вариантах I и J (в соответствии с изобретением), чем в эталоне. Это показывает, что композиция изобретения эффективно защищает живые микроорганизмы Streptococcus thermophilus ST456 во время хранения и разведения после распылительной сушки. При совмещении этого наблюдения с результатами, полученными в других примерах, этот пример показывает, что защитное действие композиции изобретения не является штамм-специфическим и она эффективна в отношении широкого диапазона штаммов микроорганизмов. Кроме того, эффект достигается при различных концентрациях ингредиентов защитной композиции. Кроме того, этот пример показывает, что защитное действие также достигается при производстве порошка культуры в больших масштабах.
Пример 4. Защитный агент для Lactobacillus rhamnosus LPR (которому был присвоен депозитный номер CGMCC 1.3724)
Проводили сравнительный эксперимент для оценки эффективности композиции в соответствии с изобретением в отношении защиты микроорганизма Lactobacillus rhamnosus LPR (которому был присвоен депозитный номер CGMCC 1.3724) во время распылительной сушки, хранения и разведения.
Получали эталон и два образца для испытаний (варианты K и L). В качестве эталона использовали смесь защитных агентов, предварительно определенную как оказывающую слабое защитное действие на микроорганизм во время распылительной сушки. Композиция эталона приведена выше в таблице 3. Композиция защитного агента, используемого в каждом образце для испытаний, приведена ниже в таблице 7. Для всех образцов концентрация матрикса составляла 55 мас.%, а концентрация микроорганизмов - 45 мас.% в расчете на общее содержание твердых веществ.
Таблица 7. Композиция образцов K и L
Ингредиент
Вариант K
Вариант L
Мальтодекстрин DE6
60,00
55,00
Аскорбат натрия
19,85
22,32
L-лизина HCl
8,30
9,34
L-цистеина HCl моногидрат
3,55
4,00
L-аланин
8,30
9,34
В общей сумме
100,00
100,00
Эталон и все образцы для испытаний получали с применением одного и того же способа, как описано ниже.
L. rhamnosus выращивали в 3000-литровом биореакторе при температуре 37°C в течение 16 ч, при постоянном уровне pH, после инокуляции подходящей среды, содержащей источник азота, источник углерода и микроэлементы, стартовой культурой при 4% для получения высокого выхода. В конце ферментации биомассу концентрировали путем центрифугирования и кондиционировали матриксом в течение 1 ч. После кондиционирования и доведения уровня pH до 7 биомассу и матрикс высушивали распылением в больших масштабах, используя распылительную сушильную башню, по размеру близкую к промышленной сушильной башне.
w
После распылительной сушки эталон и образцы для испытаний подвергали испытанию методом «ускоренного старения». После распылительной сушки порошка культуры его смешивали с сухим обезжиренным молоком в соотношении 1 к 100. Затем эту смесь хранили при температуре 37°C и a = 0,24 в течение 12 недель. Количество клеток измеряли в эталоне и образцах для испытаний сразу после распылительной сушки и через 4, 8 и 12 недель хранения. Количество клеток измеряли, как описано в примере 1.
Результаты показаны на фиг. 16. По графику можно видеть, что количество клеток микроорганизмов в общей сумме через 12 недель хранения и после разведения существенно выше в вариантах K и L (в соответствии с изобретением), чем в эталоне. Это показывает, что композиция изобретения эффективно защищает живые микроорганизмы Lactobacillus rhamnosus LPR во время хранения и разведения после распылительной сушки. При совмещении этого наблюдения с результатами, полученными в других примерах, этот пример показывает, что защитное действие композиции изобретения не является штамм-специфическим и она эффективна в отношении широкого диапазона штаммов микроорганизмов. Кроме того, эффект достигается при различных концентрациях ингредиентов защитной композиции. Кроме того, этот пример показывает, что защитное действие также достигается при производстве порошка культуры в больших масштабах.
Пример 5. Защитный агент для Bifidobacterium lactis BL818 (которому был присвоен депозитный номер CNCM I-3446)
Проводили сравнительный эксперимент для оценки эффективности композиции в соответствии с изобретением в отношении защиты микроорганизма Bifidobacterium lactis BL818 (которому был присвоен депозитный номер CNCM I-3446) во время распылительной сушки, хранения и разведения.
Получали эталон и один образец для испытаний (вариант M). В качестве эталона использовали смесь защитных агентов, предварительно определенную как оказывающую слабое защитное действие на микроорганизм во время распылительной сушки. Композиция эталона приведена выше в таблице 3. Композиция защитного агента, используемого в образце для испытаний, приведена ниже в таблице 8. Для всех образцов концентрация матрикса составляла 55 мас.%, а концентрация микроорганизмов - 45 мас.% в расчете на общее содержание твердых веществ.
Таблица 8. Композиция образцов M
Ингредиент
Вариант M
Мальтодекстрин DE6
52,00
Аскорбат натрия
23,80
L-лизина HCl
10,00
L-цистеина HCl
4,20
L-аланин
10,00
В общей сумме
100,00
Эталон и образец для испытаний получали с применением одного и того же способа.
w
После распылительной сушки эталон и образец для испытаний подвергали испытанию методом «ускоренного старения» при температуре 37°C и a = 0,17 в течение 180 дней. Количество клеток измеряли в эталоне и образце для испытаний сразу после распылительной сушки и через 15, 30, 60, 90 и 180 дней хранения. Количество клеток измеряли, как описано в примере 1.
Результаты показаны на фиг. 17. По графику можно видеть, что количество клеток микроорганизмов в общей сумме через 180 дней хранения и после разведения существенно выше в варианте M (в соответствии с изобретением), чем в эталоне. Это показывает, что композиция изобретения эффективно защищает живые микроорганизмы Bifidobacterium lactis BL818 во время хранения и разведения после распылительной сушки. В образце по изобретению логарифм потери жизнеспособности (рассчитанный, как описано в примере 1) через 180 дней составлял лишь 0,24, что свидетельствует об очень высокой эффективности защитного действия.
При совмещении этого наблюдения с результатами, полученными в других примерах, этот пример показывает, что защитное действие композиции изобретения не является штамм-специфическим и она эффективна в отношении широкого диапазона штаммов микроорганизмов. Кроме того, эффект достигается при различных концентрациях ингредиентов защитной композиции. Кроме того, этот пример показывает, что защитное действие также достигается при производстве порошка культуры в больших масштабах.