Количественная оценка способности условно-плтогенных микроорганизмов к образованию биопленки в эксперименте

Таким образом, полученные результаты показали, что диагностические наборы значительно различаются по способности выявлять мутантные формы HBsAg ВГВ. Применение наборов реагентов для выявления HBsAg - Elecsys HBsAg II, Вектогеп B-HBs-антиген-стрип и Monolisa HBsAg Ultra позволяет выявлять различные сероварианты HBsAg (ayw2, adw2, ayw3varA, ayw3varB, adrq+), а также различные мутации рекомбинантного и нативного происхождения в концентрации 0,1-0,05 МЕ/мл. Показано, что тестируемые наборы реагентов способны определять мутантные формы HBsAg с аминокислотными заменами в положении 145 (G145R), 134 (T134P) и 143 (S143L) в концентрации 0,1-0,01 МЕ/мл, содержащиеся в нативных сыворотках, а также широкий спектр рекомбинантных генетических вариантов HBsAg, при этом чувствительность при определении нативных и реком-бинантных мутантных форм может различаться.

Заключение. Создание панелей, содержащих широкий спектр образцов сывороток крови с серовариантами и мутант-ными формами поверхностного антигена ВГВ, распространенными на территории Российской Федерации, необходимо для контроля аналитической и диагностической чувствительности тест-систем для выявления HBsAg. Наборы реагентов с чувствительностью 0,1-0,01 МЕ/мл позволяют выявлять разные субтипы HBsAg и его мутантные формы в низких концентрациях. Полученные результаты свидетельствуют о важности

использования панелей, состоящих не только из рекомбинант-ных, но и из нативных образцов, содержащих мутантные формы HBsAg, для оценки чувствительности наборов реагентов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Баженов А. И., Коноплева Д. А., Эльгорт А. А. и др. // Журн. микробиол. - 2007. - № 6. - С. 30-37

2. Мануйлов В. А., Осипова Л. П., НетесоваИ. Г. и др. // Молекул. генетика. - 2010. - № 4. - С. 32-36.

3. Нетесова И. Г., Swenson P. D., Калашникова Т. В. и др. // Вопр. вирусол. - 2004. - Т. 49, № 1. - С. 17-20.

4. AraujoN., Vianna C., Soares C. et al. // Intervirology. - 2008. - Vol. 51. - P. 81-86.

5. Carman W., ZanettiA., KarayiannisP. et al. // Lancet. - 1990. - Vol. 336. - P. 325-329.

6. Carman W. // J. Viral Hepatit. - 1997. - Vol. 4. - P. 11-20.

7. Carman W., ThomasH., Zuckerman A. et al. // Viral hepatitis. - 2-nd Ed. - London, 1998. - P. 141-177.

8. DuongLy T., Servant-DelmasA., BagotS. et al. // J. Clin. Microbiol.

- 2006. - Vol. 44, N 7. - P. 2321-2326.

9. Oon C., Ning C., Shiaun K. et al. // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol. 179.

- P. 259-263.

10. Wallace L., Carman W. // Viral Hepatit. Rev. - 1997. - Vol. 3. - P. 5-16.

Поступила 31.05.11

микробиология

© в. в. Леонов, 2012

удК 579.22.083.1

в. в. Леонов

количественная оценка способности условно-пАтогЕнных микроорганизмов к образованию биопленки в эксперименте

Ханты-Мансийская государственная медицинская академия

Предложена методика количественной оценки способности условно-патогенных микроорганизмов к образованию биопленки посредством измерения краевого угла смачивания ее поверхности. Определены удельные скорости образования биопленки госпитальными штаммами микроорганизмов. Показано, что P. aeruginosa лучше, чем S. aureus и C. albicans, образуют биопленку на поверхности стеклянных пластинок.

Ключевые слова: биопленка, удельная скорость образования, госпитальные штаммы, условно-патогенные микроорганизмы

V.V. Leonov

THE QUANTITATIVE EVALUATION OF CAPACITY OF OPPORTUNISTIC PATHOGENIC MICROORGANISMS TO FORM BIOFILMS IN EXPERIMENT

The article discusses the technique of quantitative evaluation of capacity of oppor-tunistic pathogenic microorganisms to form biofilm by means of measuring the contact angle of moistening of its .surface. The specific rates of biofilm formation by hospital strains of microorganisms are determined. It is demonstrated that P. aeruginosa form biofilm on surface ofglass plate better than S. aureus and C. albi-cans do.

Key words: biofilm, specific rate of formation, hospital strain, opportunistic path-ogenic microorganism

Для корреспонденции:

Леонов Вадим Вячеславович, канд. техн. наук, доц. каф. биологии с курсом микробиологии

Адрес: 628011, ХМАО-Югра, Ханты-Мансийск, ул. Мира, 40

Телефон: (3467) 357-612

E-mail:leonovvadim@yandex.ru

Формирование бактериями биопленок на поверхности медицинского оборудования, применяемого в хирургии и стоматологии, может приводить к инфицированию многих пациентов и персонала, а биопленки, образующиеся на различных эндопротезах и катетерах, являются очагом хронического инфекционного процесса в организме больного [4]. Несмотря на очевидную актуальность для практической медицины, кинетика образования и свойства биопленок оста-

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 10, 2012

ются недостаточно изученными. В настоящее время с целью количественной оценки способности микроорганизмов к образованию биопленки используют метод, предложенный G. A. O'Toole и соавт. [7], согласно которому микроорганизмы выращивают в лунках пластиковых планшетов, окрашивают и по изменению интенсивности окраски судят о способности штамма формировать биопленку. Однако чувствительность данного метода не позволяет изучить кинетику образования биопленки на всех этапах формирования с шагом менее 10-12 ч культивирования. Кроме того, адсорбция красителя пластиковым планшетом может приводить к завышенным результатам. Исходя из вышесказанного, можно говорить об актуальности разработки метода количественной оценки способности микроорганизмов к образованию биопленки с высокой чувствительностью. Такую информацию может дать метод, позволяющий следить за изменением состояния поверхности в процессе выращивания микроорганизма.

Цель работы - количественная оценка способности условно-патогенных микроорганизмов к образованию биопленки с помощью измерения краевого угла смачивания поверхности биопленки.

Материалы и методы. Для работы использовали госпитальные штаммы Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans, выделенные от пациентов с острой кишечной болезнью (ОКБ) из разных районов Ханты-Мансийска. Госпитальные штаммы идентифицировали общепринятыми методами по совокупности морфологических, тинкториальных и биохимических признаков. В качестве эталонов использовали штаммы, полученные из американской коллекции типовых культур АТСС: S. aureus 25923, P. aeruginosa 27853 и C. albicans 24433.

Биопленки получали в 10 мл мясопептонного бульона (МПБ) или бульона Сабуро (НПО «Питательные среды», Махачкала) в чашках Петри (D = 90 мм) на поверхности стеклянных пластинок 2,5 х 2,5 см). Стеклянные пластинки для эксперимента готовили следующим образом: кипятили в течение 30 мин в хромовой смеси, промывали проточной, а затем дистиллированной водой, мыли с помощью поверхностно-активного вещества (ПАВ), снова промывали проточной, а затем дистиллированной водой, подсушивали на воздухе и погружали на 5 мин в ацетон. Очищенные стекла выдерживали в течение 1 ч в сухожаровом шкафу при 170°С и стандартизовали по краевому углу смачивания (0, °) поверхности вазелиновым маслом. У всех использованных для работы стеклянных пластинок краевой угол смачивания составлял 77 + 2°. В подготовленные для посева стерильные чашки Петри с питательным бульоном и двумя стеклянными пластинками вносили 0,1 мл микробной взвеси, стандартизованной до оптической плотности 0,100-0,110 опт. ед. Чашки Петри с посевами ставили в термостат и инкубировали в течение требуемого времени при 37°С. После инкубации пластинки с выросшей биопленкой вынимали из культуральной жидкости и отмывали 10 мл стерильной дистиллированной воды от планктонных клеток и 15 мин высушивали в термостате при 37°С.

Кинетику образования биопленки изучали по изменению краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом. Измерения проводили через 3, 6, 9,12, 24 и 48 ч культивирования для бактерий и 6, 12, 18, 24, 48 и 68 ч культивирования для дрожжеподобных грибов.

Краевые углы смачивания измеряли в условиях натекания при помощи горизонтального отсчетного микроскопа марки МПБ-2 в герметичной кювете, которая позволяет рассматривать анализируемый объект в условиях равновесия. Краевые углы смачивания рассчитывали исходя из 4 опытов по 5 капель в каждом. Во всех случаях предварительно изучали кинетику растекания капли жидкости 0 = f(t) по изучаемой поверхности. Измерения 0 проводили через определенное время, соответствующее области первого плато на кинетической кривой растекания при 25°С.

Краевой угол смачивания в зависимости от размера капли рассчитывали по формуле:

0 = 2 arctg (-*-),

где h, I - высота и длина капли (в мм) соответственно.

Полученные результаты кинетического эксперимента обрабатывали в полулогарифмических координатах (ln0, t), по тангенсу угла наклона касательной к начальному участку кинетической кривой находили удельную скорость образования биопленки данного штамма = ч-1).

Все результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента [6].

Результаты и обсуждение. Погруженная в питательную среду стеклянная пластинка сначала покрывалась первичной пленкой, состоящей из компонентов МПБ и изменяющей угол смачивания поверхности стеклянной пластинки с 77 до 72°. Формирование такой пленки является первой стадией образования микробной биопленки. В связи с этим точка 72° принята за нулевую точку, т. е. точку начала образования собственно биопленки.

При визуальном осмотре биопленки, образованные изученными штаммами микроорганизмов, уже через 12-24 ч культивирования покрывали всю поверхность стеклянных пластинок, однако поверхность биопленки неоднородна. В связи с этим каплю вазелинового масла для измерения краевого угла смачивания поверхности биопленки наносили на все участки стеклянной пластинки. Независимо от визуальной неоднородности биопленки краевой угол смачивания ее поверхности не изменяется.

На рис. 1 представлены 2 кинетические кривые образования биопленки эталонными штаммами P. aeruginosa ATCC 27853 и S. aureus ATCC 25923. По ходу кинетических кривых можно проследить основные стадии образования биопленки. Первый (логарифмический) участок кинетической кривой соответствует стадии обратимой и необратимой микробной адгезии, продолжительность которой в зависимости от природы микроорганизма изменяется от 12 до 20 ч. В этой стадии клетки теряют подвижность и начинают интенсивно выделять внеклеточные полимеры, образуя полимерный матрикс [3]. Краевой угол смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом резко уменьшается по мере увеличения времени культивирования. Уменьшение угла смачивания вызвано липофилизацией поверхности стеклянных пластинок за счет увеличения содержания липидов в массе биопленки [5]. Через 24 ч кривая выходит на плато и краевой угол практически не изменяется, что говорит об образовании зрелой биопленки.

0,°

Рис. 1. Изменение краевого угла смачивания поверхности биопленки вазелиновым маслом в процессе культивирования S. aureus ATCC 25923 и P. aeruginosa ATCC 27853.

2889 2898 4922 2364 5070 27853

Рис. 2. Значения удельной скорости образования биопленки

• 10-2, ч-1) штаммами S. aureus (а) и P. aeruginosa (б).

На рис. 2 приведены значения удельной скорости образования биопленки штаммами S. aureus и P. aeruginosa. Значения

для исследованных штаммов S. aureus изменялись от 2,7 • 10-2 до 5,9 • 10-2 ч-1. Среди штаммов S. aureus способность к формированию биопленки наиболее выражена у 391 = 5,0 • 10-2 ч-1) и 352 = 5,9 • 10-2 ч-1). Наименьшее значение ^ из всех исследованных штаммов имеет 2891 (^ = 2,7 • 10-2 ч-1). Результаты, полученные на штаммах P. aeruginosa, отличаются небольшим разбросом значений ^ от 4,9 • 10-2 до 5,6 • 10-2 ч-1.

На рис. 3 приведены результаты определения ш для дрож-жеподобных грибов C. albicans. Способность к образованию биопленки наиболее выражена у штамма 583 (^ = 4,4 • 10-2 ч-1). Наименее склонными к образованию биопленки оказались штаммы 573 (^ = 1,9 • 10-2 ч-1) и 24433 (^ = 2,2 • 10-2 ч-1).

Сделана попытка количественно оценить способность к образованию биопленки условно-патогенными микроорганизмами с помощью измерения краевого угла смачивания поверхности биопленки в динамике эксперимента. Следует отметить достоверные различия по полученным значениям удельной скорости образования биопленки. Сравнительный анализ значений показал, что в целом P. aeruginosa лучше, чем S. aureus и C. albicans, формирует биопленки в условиях эксперимента. Результаты свидетельствуют о наименьшем разбросе признака биопленкообразования у P. aeruginosa, что связано со способностью этого микроорганизма к синтезу внеклеточного полисахарида альгината [1]. Штаммы S. aureus и C. albicans могут существенно отличаться по этому признаку. При сравнении значений удельной скорости образования биопленки госпитальными штаммами микроорганизмов, выделенными из разных источников и из одного источника, а также негоспитальными вариантами не обнаружили никакой закономерности.

583 160 573 463 192 24433

Рис. 3. Значения удельной скорости образования биопленки (^b • 10-2, ч-1) штаммами C. albicans.

Адгезия микроорганизмов к поверхности стекла в значительной степени зависит от гидрофильности и электростатических свойств микробной клетки [2]. Стекло как материал подложки, на которой исследовали образование биопленки, гидрофильно. В соответствии с принципом «подобное к подобному» следует ожидать, что чем выше гидрофильность микробной клетки, тем лучше она будет адгезировать на поверхности стекла и образовывать биопленку, и наоборот, чем выше гидрофобность микробной клетки, тем хуже она будет адгезировать на поверхности стекла и образовывать биопленку. Полученные результаты позволяют косвенно сделать вывод о гидрофильности исследованных микроорганизмов и выстроить их в ряд по увеличению степени гидрофильно-сти: C. albicans < S. aureus < Р. aeruginosa. При прочих равных условиях наиболее часто на гидрофильных поверхностях (стекло, большинство животных тканей) в составе моновидной биопленки можно встретить Р. aeruginosa и S. aureus, а на гидрофобных поверхностях (металл, пластик) - C. albicans.

Заключение. На основании достоверных различий ^ установлено, что способность к формированию биопленки у исследованных штаммов микроорганизмов различна. Величина ^ может служить количественной характеристикой способности штамма к образованию биопленки на данной поверхности. Простота выполнения приведенной методики делает ее доступной для любой лаборатории и позволяет изучить процесс биопленкообразования на разных поверхностях, в том числе на материалах, используемых для изготовления медицинского оборудования и имплантатов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Головлёв Е. Л. // Микробиология. - 2002. - Т. 71, № 3. - С. 293300.

2. Езепчук Ю. В. Патогенность как функция биомолекул. - М., 1985.

3. Николаев Ю. А., Плакунов В. К. // Микробиология. - 2007. - Т. 76, № 2. - С. 149-163.

4. Смирнова Т. А., Диденко Л. В., Андреев А. Л. и др. // Микробиология. - 2008. - Т. 77, № 1. - С. 63-70.

5. Тец Г. В. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками: Дис. ... канд. мед. наук. - СПб., 2007.

6. Fisher R. A. Statistical methods for research workers. - London, 1954.

7. O'Toole G. A., Kolter R. // Mol. Microbiol. - 1998. - Vol. 30. - Р. 295-304.

Поступила 31.05.11