Механизмы воздействия устойчивых к метициллину штаммов Staphylococcus aureus на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов

Механизмы воздействия устойчивых к метициллину штаммов Staphylococcus aureus на функциональное состояние нейтрофильных гранулоцитов

О. А. КОЛЕНЧУКОВА', Н. И. САРМАТОВА2

1 НИИ медицинских проблем Севера, Красноярск

2 Сибирский федеральный университет, Красноярск

Mechanisms of Influence of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus on Functional State of Neutrophilic Granulocytes

O. A. KOLENCHUKOVA, N. I. SARMATOVA

Research Institute of Medical Problems of the North, Krasnoyarsk Siberian Federal University, Krasnoyarsk

Целью исследования является оценка функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов при воздействии штаммов MSSA и MRSA. Функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов определяли с помощью люминолзависи-мой хемилюминесценции при стимуляции праймирующей дозой MRSA и MSSA. Исследование показало повышенную функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов как в ответ на устойчивые бактериальные культуры золотистого стафилококка, так и на чувствительные штаммы. Следует отметить, что интенсивность кислородзависимого фагоцитоза была выше в ответ на MRSA, чем на MSSA.

Ключевые слова: MRSA, MSSA, нейтрофильные гранулоциты.

The aim of the study was to estimate the functional activity of neutrophilic granulocytes after the contact with MSSA and MRSA. It was determined by luminol-dependent chemoluminescence with stimulation by the priming doses of MRSA and MSSA. The functional activity of neutrophilic granulocytes was shown to increase in response to either the resistant Staphylococcus aureus strains or the susceptible ones. It should be indicated that the intensity of the oxygen-dependent phagocytosis in response to MRSA was higher than that to MSSA.

Key words: MRSA, MSSA, neutrophilic granulocytes.

Метициллинорезистентный золотистый стафилококк (MRSA) — это штамм золотистого стафилококка, устойчивый к большой группе антибиотиков, в первую очередь бета-лактамов. Так, MRSA адаптировался к выживанию в присутствии метициллина, диклоксациллина и ок-сациллина. Наиболее часто именно с ним связаны внутрибольничные (нозокомиальные) инфекции. Клиническое значение метицилли-норезистентности является предметом интенсивного изучения. Известно, что уровень летальности при бактериемиях, вызываемых MRSA, достоверно выше, чем при инфекциях, обусловленных чувствительными штаммами S.aureus. Особое беспокойство вызывает практически повсеместное повышение частоты выделения MRSA [1, 2].

© О. А. Коленчукова, Н. И. Сарматова, 2014

Адрес для корреспонденции: 660022, Красноярск, ул Партизана Железняка, 3. НИИ МПС

В процессе эволюции стафилококки приобрели способность угнетать фагоцитарную функцию лейкоцитов крови путём блокирования оп-сонизирующих веществ (комплемента и иммуноглобулина О), а также путём непосредственного токсического действия на фагоциты. Нейтрофилы при нарушении окислительного метаболизма не способны к образованию интер-медиатов кислорода, вследствие чего организм становится особенно восприимчивым к золотистому стафилококку [3, 4].

Полиморфноядерные нейтрофильные лейкоциты играют очень важную роль в защите организма от бактериальных и некоторых других патогенов [5—7]. Эти клетки составляют первую линию неспецифической противомикроб-ной защиты. Они первыми мобилизуются в очаг воспаления, от их фагоцитарной активности зависит элиминация возбудителя. Цитопа-тогенное действие нейтрофилов связано главным образом с генерацией активных форм

кислорода (АФК). Под этим термином понимают резкое увеличение потребления кислорода за счёт преобразования его в АФК клетками-фагоцитами. Способность нейтрофильных гра-нулоцитов образовывать достаточное количество АФК может служить прогностическим признаком для оценки дальнейшего хода воспалительного процесса, а ответ на стандартный стимул может характеризовать активность защитных сил организма. Существуют различные способы оценки образования АФК, одним из наиболее чувствительных является хемилюми-несцентный метод [8—10].

Несмотря на интенсивность исследований в данном направлении, остается всё ещё малоизученным весь спектр происходящих внутриклеточных событий, связанных с изменением феноти-пических характеристик и функционированием нейтрофилов в норме и при патологии. Недостаточное понимание механизмов формирования дисфункций нейтрофилов при патологии в свою очередь обуславливает отсутствие патогенетически обоснованных подходов к регуляции функционирования данной клеточной популяции в эксперименте и клинике.

Целью исследования является оценка функциональной активности нейтрофильных грану-лоцитов при воздействии метициллиночувстви-тельных и устойчивых штаммов золотистого стафилококка (MSSA и MRSA).

Материал и методы

Объектами исследования служили штаммы Staphylococcus aureus устойчивые (MRSA, n=17) и чувствительные (MSSA, n=17) к действию оксациллина и нейтрофильные гранулоци-ты, выделенные из венозной крови. При взятии образцов патологического материала со слизистой оболочки носа и транспортировке их для дальнейших исследований использовались стерильные тумферы с коммерческой транспортной средой Эймса.

Для выявления метициллинорезистентности S.aureus использовали метод скрининга на агаре. Для проведения скрининга использовали агар Мюллера-Хинтон, содержащий 4% NaCl и 6,0 мкг/мл оксациллина.

Микробную взвесь готовили методом прямого суспен-дирования из нескольких однотипных изолированных колоний стафилококков в стерильном изотоническом растворе натрия хлорида и доводили до мутности 0,5 по МакФарлан-ду (1,5х108 КОЕ/мл). Инокуляцию чашек с агаром проводили с помощью стерильного ватного тампона. Культуру наносили на ограниченную поверхность (диаметром 10—15 мм). Штаммы S.aureus инкубировали при температуре 35°С в течение полных 24 часов. После инкубации чашки просматривали. Появление видимого роста на месте нанесения культуры считали проявлением устойчивости данного штамма к оксациллину (метициллину). Исследование проводили при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллера-Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуры наносили так же, как на агар с оксациллином). Параллельно с исследуемыми культурами тестировали также контрольные штаммы метициллиночувствительных и метициллинорезис-тентных стафилококков.

Функциональную активность нейтрофильных грануло-цитов оценивали с помощью хемилюминесценции по методу De Sole P. et al. (1983). Из венозной крови обследуемого пациента выделяли нейтрофильные гранулоциты. Для этого к 5 мл крови с гепарином добавляли 1 мл полиглюкана и инкубировали в течение 30 мин при 37°С для ускорения осаждения эритроцитов. Надосадочную жидкость наслаивали на двойной градиент плотности фиколл-верографин (p=1,077 — для выделения популяции лимфоцитов, p=1,199 — для выделения популяции нейтрофильных гранулоцитов) и центрифугировали при 400 g в течение 45 мин. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяли чистоту выхода нейтрофильных гранулоцитов, которая составляла 97%. Полученную суспензию нейтрофильных гранулоцитов дважды отмывали в растворе Хенкса без фенолового красного по 10 мин при 400 g. Супернатант сливали, оставшиеся нейтро-фильные гранулоциты разводили в 1 мл раствора Хенкса и получали взвесь. Подсчитывали количество нейтрофильных гранулоцитов в камере Горяева.

Для хемилюминесцентного анализа использовали 2х106 клеток. Измеряли величину спонтанной хемилюминесцен-ции (СХЛ) нейтрофилов, которая характеризует базальный уровень активации этих клеток. Для определения резервных возможностей активации нейтрофилов осуществляли стимуляцию кислородного метаболизма посредством добавления к ним бактериальной суспензии из живой культуры MRSA или MSSA в концентрации 106 КОЕ/мл. В качестве усилителей люминесценции использовали люминол в концентрации 50 мкг/мл. Оценка спонтанной и индуцированной хеми-люминесценции осуществлялась в течение 90 мин. на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе «CL3604» (Россия). Определяли следующие характеристики: время выхода на максимум (Tmax), максимальное значение интенсивности (Imax), площадь под кривой (S2). Усиление ХЛ, индуцированной зимозаном, оценивали по отношению площади индуцированной ХЛ к площади спонтанной ХЛ и определяли как индекс активации (ИА). Регистрация результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществлялись с помощью компьютера.

Для всех полученных данных определяли медиану, а также 25 и 75 перцентили. Проверку гипотезы о статистической достоверности исследуемых параметров проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.).

Результаты исследования

Активированные нейтрофильные гранулоци-ты являются мощными эффекторами, запускающими механизмы каскадных реакций, которые обеспечивают развитие воспаления. Противоин-фекционное действие нейтрофильных грануло-цитов связано, главным образом, с генерацией активных форм кислорода, а одним из методов, позволяющих оценить кислородзависимую био-цидность нейтрофильных гранулоцитов, является хемилюминесцентный анализ [7].

В результате исследования хемилюминес-центной реакции нейтрофильных гранулоцитов в ответ на воздействие живой бактериальной культуры Staphylococcus aureus, в зависимости от устойчивости к оксациллину (MRSA и MSSA), были получены следующие результаты: выявлено увеличение времени выхода на пик (рис. 1),

яш

л ùoo 25011 2000

1000 5(10 U

Sfchint)  MKSA

2430

pcOJO!

р<(). 05 ISÜ2

550

IL, fo.e)

Рис. 1. Время выхода на пик (Tmax) в спонтанном и ин- Рис. 3. Площадь под кривой (Smax) в спонтанном и дуцированном (MSSA и MRSA) хемилюминесцент- индуцированном (MSSA и MRSA) хемилюминес-

ных процессах.

центных процессах.

3S

ïït

MSSA(ehiiu)  M RS А ( ihi m) МЛ

jiHMIflfr

LS

1 llUItKi i.Kl 1. 11  : 11111

Рис. 2. Интенсивность (Imax) в спонтанном и индуцированном (MSSA и MRSA) хемилюминесцентных процессах.

интенсивности хемилюминесцентной реакции (рис. 2) и площади под кривой (рис. 3) при воздействии МЯ8Л и М88Л относительно спонтанной реакции. Также было установлено увеличение времени выхода на пик, интенсивности хемилюминесцентной реакции и площади под кривой, а также индекса активации (рис. 4) при воздействии живой культуры МЯ8Л относительно М88Л (^<0,001).

Нейтрофильные гранулоциты несут на своей поверхности широкий спектр рецепторов, часть из которых может взаимодействовать с неопсонизированными бактериями (СЯ- и То11-рецепторы) [6]. Полисахаридная капсула, которая образуется у золотистого стафилококка, препятствует распознаванию рецептором СЯ1 нейтрофилов фрагментов С3-комплемента на поверхности Б.аыгвш, что существенно снижает фагоцитоз, при этом прилипание и погло-

Рис. 4. Индекс активации (MSSA/S) и (MRSA/S) хе-милюминесцентного процесса.

щение бактерии может происходить через CR3 рецептор, поскольку он обладает лектинопо-добными свойствами и содержит поверхностные вещества, с помощью которых этот микроорганизм проникает внутрь клетки с образованием фаголизосомы [11]. Известно, что люминол способен проникать внутрь клетки и регистрировать весь пул образования АФК [8]. Установлено, что функциональная активность нейтрофилов здоровых лиц значительно изменяется при стимуляции праймирующей дозой стафилококков относительно спонтанной реакции. При индукции бактериальной культурой нейтрофильных гранулоцитов в процесс фагоцитоза включаются CR3 или То11-по-добные рецепторы, поддерживающие восприятие неопсонизированных микробных объектов, вместе с тем имеет значение и тот фактор, к какому виду принадлежат бактерии.

Заключение

Исследование хемилюминесценции нейтрофильных гранулоцитов в ответ на стимул в виде живых бактериальных культур (MRSA и MSSA) показало повышенную функциональную активность как в ответ на устойчивые бактериальные культуры стафилококка, так и на чувствительные штаммы. Следует отметить, что интенсивность кислородзависимого фагоцитоза была выше в ответ на MRSA, чем на MSSA. Обращает на себя внимание тот факт, что сте-

ЛИТЕРАТУРА

1. Shahkarami F., Rashki A.., Rashki Ghalehnoo Z, Jundishapur J. Susceptibility and plasmid profiles of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and methicillin-susceptible S.aureus. Microbiology 2014 Jul; 7: 7.

2. YangZ, Fu Y, Liu B, Zhou E, Liu Z, SongX., Li D, Zhang N. Farrerol regulates antimicrobial peptide expression and reduces Staphylococcus aureus internalization into bovine mammary epithelial cells. Microb Pathog 2013 Dec; 65: 1-6.

3. Genestet C, Le Gouellec A., Chaker H, Polack B, Guery B, Toussaint B, Stasia M. J. Scavenging of reactive oxygen species by tryptophan metabolites helps Pseudomonas aeruginosa escape neutrophil killing. Free Radic Biol Med 2014 Aug; 73: 400-410.

4. Swe P.M., Fischer K. A scabies mite serpin interferes with complement-mediated neutrophil functions and promotes staphylococcal growth. PLoS Negl Trop Dis 2014 Jun 19; 8: 6.

5. Воеводин Д.А., Розанова Т.Н., Стенина М.А. Дисбактериоз и иммунопатологический процесс. Жури микробиол эпидемиол имму-нол 2005; 2: 89-92.

6. Швыдченко И.Н. Нестерова И.В., Синельникова Е.Ю. Цитосекре-тирующая функция нейтрофильных гранулоцитов. Иммунология 2005; 1: 31-34.

пень активации ферментов нейтрофильных гранулоцитов более выражена при контакте с MRSA, что коррелирует с бактерицидной способностью фагоцитов. Поэтому мы полагаем, что вирулентные штаммы золотистого стафилококка оказывают ингибирующее действие на активность ферментов кислородзависимой системы нейтрофилов. По-видимому, это следует отнести к одному из эффектов вирулентности штаммов Staphylococcus aureus.

7. Rack C.E., Zurek O.W., Meishery D.D., Pallister K.B., Malone C.L., Horswill A.R., Voyich J.M. Differential regulation of staphylococcal virulence by the sensor kinase SaeS in response to neutrophil-derived stimuli. Proc Natl Acad Sci U S A 2014 May 13; 111: 19.

8. Рудой Б.А., Грачева T.A., Рассанов В.П. Использование метода регистрации хемилюминесценции нейтрофилов для оценки сенсибилизации лабораторных животных, иммунизированных бруцеллезной вакциной. Иммунология 2005; 3: 191—193.

9. Konai M.M., Ghosh C., Yarlagadda V., Samaddar S., Haldar J. Membrane active phenylalanine conjugated lipophilic norspermidine derivatives with selective antibacterial activity. J Med Chem 2014 Oct 21.

10. Земское A.M., Земское В.М., Земское М.А. Проблема неспецифического и специфического в индукции и регуляции иммунологических реакций. Журн микробиол эпидемиол иммунобиол 2005; 4: 105—109.

11. Коленчукоеа О.А. Функциональная и метаболическая активность нейтрофильных гранулоцитов при остром бактериальном рино-синусите. Инфекц и иммун 2013; 3: 269—274. http://elibrary.ru/ contents.asp? issueid=1145507&selid=20350050 3.