Гистохимическая характеристика гуанилатциклазы в плаценте при беременности, осложненной герпетической инфекцией

УДК 618.2:618.36:616.523:612.015.1

М.Т.Луценко, И.В.Довжикова

ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ В ПЛАЦЕНТЕ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ, ОСЛОЖНЕННОЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН

РЕЗЮМЕ

С помощью нового метода гистохимического выявления гуанилатциклазы посредством световой микроскопии обследовано 19 плацент, взятых при родах в срок, от практически здоровых женщин и беременных, перенесших обострение герпетической инфекции. Энзим определялся в виде темных гранул в области эпителия ворсин. Обнаружено увеличение активности фермента в плацентах от матерей с обострением вирусной инфекции во время беременности.

SUMMARY M.T.Lutsenko I.V.Dovgikova

HISTOCHEMICAL CHARACTERISTICS

OF GUANILATECYCLASE IN PLACENTAS OF PREGNANT PATIENTS WITH HERPETIC INFECTION

We examined 19 term placentas of healthy patients and patients with acute herpetic infection using histochemical method of detecting guani-latecyclase and light microscopy. Enzyme was seen as dark granules located in epithelial villi. Enzyme activity in placentas of patients with acute herpetic infection during gestation period was found to increase.

Циклические нуклеотиды (ЦН) рассматриваются как универсальные внутриклеточные гормоны. Они передают сигнал, поступающий на рецепторы, внутрь клетки и, таким образом, играют значительную роль в регуляции целого ряда важнейших процессов в организме. Доказано регуляторное воздействие ЦН на активность почти всех групп ферментов. Установлена роль ЦН в обмене гормонов, причем не только на этапах синтеза и секреции, но и при действии этих гормонов на клетки и органы мишени. ЦН являются регуляторами процессов дифференцировки и пролиферации клеток через активность ферментов, участвующих в синтезе нуклеиновых кислот [5, 6].

Вторым из циклических нуклеотидов был открыт гуанозин 3,5' монофосфат (цГМФ). Основным ферментом его обмена считается гуанилатциклаза (ГЦ), ответственная за накопление этого вторичного мессенджера в клетках. Ее номенклатурное название: ГТФ-пирофосфатлиаза циклизующая [8]. Целью нашей работы было освоить применение метода, позво-

ляющего дать гистохимическую оценку на световом уровне ГЦ, и оценить активность данного фермента в тканях плаценты при физиологической и осложненной герпетической инфекцией беременностью.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили 19 плацент, взятых при родах от практически здоровых женщин (8 случаев) и матерей, перенесших обострение хронической герпес-вирусной инфекции во время беременности (11 случаев).

Гистохимическое определение ГЦ основано на осаждении высвобождающегося пирофосфата при помощи ионов свинца по аналогии с методом Reik et al. (1970) в модификации Рыжавского (1979). Выявление фермента было адаптировано для анализа на световом микроскопе. Использовалась инкубационная среда Вакстайна и Майзела с нитратом свинца в качестве реагента для осаждения фосфата. Реакция проводилась на нефиксированных криостатных срезах. Специфичность выявления проверялась путем исключения субстрата из инкубационного раствора.

Результаты и обсуждение

Циклические нуклеотиды имеют большое значение в созревании и функционировании плаценты, что обусловлено их участием в регуляции клеточных метаболических процессов в самом органе и необходимостью обеспечения гомеостаза всего фетоплацентарного комплекса [5, 6].

Мы провели выявление фермента гуанилатциклазы на ткани плаценты. Как уже упоминалось, за основу была взята модификация Б.Я. Рыжавского метода J. Reik et al. В качестве субстрата использовали раствор натриевой соли гуанозинтрифосфата (фирмы ICN Biomedicals). При ферментативной реакции происходило отщепление пирофосфата:

ГТФ^туанозин 3',5' монофосфат + Фн|.

На второй стадии гистохимического выявления высвобождающийся пирофосфат осаждался при помощи ионов свинца. Для визуализации осадка его переводили в видимую (сульфидную) форму.

Фермент выявлялся в виде мелких гранул черного цвета большей частью в наружной и в меньшей степени - во внутренней мембранах трофобласта. В эпителии кровеносных сосудов и соединительнотканной строме активность энзима в наших опытах не обнаруживалась.

Мы попытались дать оценку энзиматической активности по интенсивности гистохимической реакции в баллах: 0 - нулевая (отсутствие активности), 1 - слабая, 2 - средняя и 3 - сильная, и просчитали количество ворсин хориона, имеющих ту или иную степень активности. В контрольной группе плацент от практически здоровых женщин наблюдалась следующая картина: наибольший процент составляли ворсины со слабой активностью, имеющие лишь небольшую зернистость на небольшой протяженности мембраны - 54,7±3,67%; 19,9±2,91% ворсин обнаруживали среднюю степень, то есть в их эпителии гранулы выявлялись не на всем его протяжении, а лишь частично; 8,1±1,56% ворсин имели эпителий с интенсивной гистохимической реакцией на всей поверхности трофобласта и, наконец, в 16,8±3,01% ворсин активность фермента не выявлялась вовсе.

В группе плацент от женщин, перенесших обострение герпетической инфекции, наблюдалось увеличение интенсивности реакции на гуанилатциклазу. Число ворсин с высокой степенью гистохимической реакции повысилось до 14,3±1,33%, со средней степенью - до 26,1±2,67%, процент же ворсинок со слабой активностью снизился до 41,0±2,98, а с нулевой - составил 19,3±3,24.

Оценка работы фермента ГЦ исключительно важна. Как известно, этот энзим повышает уровень такого ценного вторичного мессенджера как цГМФ, мощного регулятора метаболизма клетки, в значительной степени определяющего ее функции. И поскольку, как уже упоминалось, гуанилатциклаза является основным ферментом обмена цГМФ, то и ее биологическая роль будет определяться уровнем цГМФ и теми функциями, которые выполняет в клетке этот нуклеотид. Остановимся немного на этом. Циклический ГМФ активирует цГМФ зависимые протеинкиназы, которые фосфорилируют целый ряд субстратов, а также Са2+-АТФазу [1, 3].

Циклический ГМФ, действуя по механизму отрицательной обратной связи, ограничивает поступление ионов кальция в клетку, повышает отток этих ионов из клетки во внеклеточную среду, а также их депонирование в эндоплазматическую сеть и в митохондрии [7]. Это торможение накопления Са2+ происходит после активации синтеза оксида азота вследствие повышения уровня вышеупомянутого металла, то есть обмен цГМФ напрямую связан с обменом кальция, также являющегося вторичным мессенджером для огромного числа процессов, протекающих в организме.

Физиологическая роль гуанилатциклазы также заключается и в том, что через цГМФ и соответствующие протеинкиназы осуществляется регуляция фос-фоинозитидного цикла. Был предложен механизм его регуляции через снижение активности фосфолипазы С, приводящее к предотвращению образования 1,2-диацилглцерола. Диацилглицерол - вторичный посредник, запускающий несколько каскадных механизмов. Он является сильным активатором протеин-киназы С, катализирующей фосфорилирование ряда мембранных и цитоплазматических белков, а также цГМФзависимой киназы. Известно, что отщепляемая от диацилглицерола арахидоновая кислота и продук-

ты ее окисления - простагландины и лейкотриены способны активировать мембрано-связанную форму ГЦ [7, 8]. Естественно, одновременно происходит и снижение синтеза инозитол-1,4,5-трифосфата - еще одного регулятора клеточных процессов. Он осуществляет мобилизацию ионов Са2+ из внутриклеточного депо.

Также известно, что цГМФ связан с обменом фосфолипидов. Кроме уже упомянутого предотвращения распада фосфолипидов инозитола, этот нуклеотид влияет на освобождение арахидоновой кислоты, ингибирующей активацию фосфолипазы А2, которая в свою очередь расщепляет и такие фосфолипиды как этаноламин и холин [7, 8].

Наличие вирусного инфекционного процесса, как правило, сопровождается наличием большого количества медиаторов воспаления - простагландинов и лейкотриенов, которые, как упоминалось выше, интенсифицируют работу ГЦ. Выявленное нами увеличение активности гуанилатциклазы при обострении герпетической инфекции во время беременности будет повышать уровень цГМФ и, следовательно, оказывать соответствующее влияние как на фосфоино-зитидный цикл, так и на обмен фосфолипидов, что не сможет не отразиться на процессах метаболизма клетки и мембраны, в частности.

В литературе обсуждается участие цГМФ в качестве вторичного мессенджера различных половых стероидных гормонов, однако, в этом вопросе еще нет полной ясности [2]. Предполагается, что через цГМФ реализуют свое действие стероидные гормоны, ацетилхолин, серотонин, некоторые простаглан-дины [5, 6]. Обнаруженное нами повышение активности ГЦ при обострении вирусной инфекции во время беременности адекватно коррелирует с увеличением содержания биогенно-активных веществ и медиаторов воспаления, которое диагностируется при беременности, осложненной герпесом [4].

Таким образом, не вызывает никаких сомнений важность изучения гуанилатциклазы, способной влиять на целый блок регуляторных систем. Изменения в активности фермента, обнаруженные нами при обострении вирусной инфекции, будут иметь серьезные последствия в виде нарушения слаженности работы широкого спектра регуляторных процессов на клеточном и субклеточном уровнях. Дисбаланс обменных процессов в плаценте приведет же к развитию фетоплацентарной недостаточности [3, 6].

ЛИТЕРАТУРА

1. Экзогенные доноры оксида азота и ингибиторы МО-синтаз (химический аспект) [Текст]

/Азамасцев А.П. [и др.]//Вестник РАМН.-2003.-№12.-С.88-95.

2. Вазоактивные эффекты половых гормонов [Текст]/Караченцев А.Н. [и др.]//Проблемы эндокри-нологии.-1997.-№2.-С.45-53.

3. Протеинкиназные системы плаценты при физиологической и осложненной беременности [Текст]/Крукиер И.И. [и др.]//Акуш. и гин.-2005.-№1.-С.6-10.

4. Фетоплацентарная система при герпесной инфекции [Текст]/Луценко М.Т. [и др.].-Благовещенск,

2003.-200 с.

5. Биохимия плацентарной недостаточности

[Текст]/Радзинский В.Е [и др.].-Киев: Наукова думка, 1987.-120 с.

6. Биохимия плацентарной недостаточности

[Текст]/Радзинский В.Е [и др.].-М., 2001.-256 с.

7. Физиологическое значение гуанилатциклазы и

роль оксида азота и нитросоединений в регуляции активности этого фермента [Текст]/Реутов В.П. [и др.]//Физиол. человека.-1993.-Т.19, №1.-С.124-137.

8. Оксид азота. Роль растворимой гуанилатцик-лазы в механизмах его физиологических эффектов [Текст]/И.С.Северина//Вопросы медицинской хи-мии.-2002.-Т.48, Вып.1.-С.3-31.

п

УДК 618.2/.36:616.523-018:574.922 И.В. Довжикова

ГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕВАЛОНАТА В ПЛАЦЕНТЕ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ,

ОСЛОЖНЕННОЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

ГУ Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН

РЕЗЮМЕ

Посредством нового гистохимического метода обследованы образцы зрелых плацент, взятых при родах и ворсинчатого хориона, полученного при абортах на сроке от 4 до 10 недель от практически здоровых женщин и перенесших во время беременности обострение герпетической инфекции. Выявлен фермент, маркирующий процесс преобразования мевалоната в области хориального эпителия. Показано изменение интенсивности его окраски при активации вирусной инфекции.

SUMMARY

I.V.Dovgikova

DEHIDROCHOLESTERINE EXCHANGE ACTIVITY IN PLACENTAS OF PATIENTS

WITH HERPETIC INFECTION DURING GESTATION PERIOD

We used new histo-chemical method to study samples of term placenta and villous chorion from healthy patients with herpetic infection during different gestation periods. The aim of the study was to determine 7dehidrocholesterine. We revealed an enzyme marking this steroid transformation process in the region of chorion epithelium. It was found that histo-chemical reaction intensity changed due to virus infection. Steroid-genesis inhibition was attributed to conformation reconstruction of molecules due to virus effect.

Вирусная инфекция играет важную роль в патологии беременных, плода и новорожденного. Большое значение имеют персистирующие формы, наличие которых в организме не всегда сопровождается проявлением клинических признаков болезни, и все же с ними могут быть связаны тяжелые поражения. Особое место среди персистирующих инфекций принадлежит вирусам семейства герпес. Эти возбудители имеют тенденцию к обострению во время беременности. Вирус простого герпеса обнаруживается у 90% населения и считается наиболее распространенным среди вирусных заболеваний. Многочисленные исследования, проводимые учеными как нашей лаборатории, так и другими, позволили установить, что

обострение герпетической инфекции приводит к серьезным изменениям, в том числе и в гормональном фоне [3, 4]. Константированы значительные сдвиги в продукции гормонов, в том числе и стероидных. Возникает естественный вопрос, какова причина этих нарушений. Для ответа на него мы решили проанализировать самое начало процессов синтеза стероидных гормонов, источником которых, как известно, является холестерин. Ранее было выявлено снижение содержания холестерина, диагностируемое как при биохимических исследованиях, так и при гистохимическом изучении плаценты при беременности, осложненной активацией вирусного процесса [1]. Оценка плаценты, которая будучи посредником в создании гормонального комплекса системы мать-плод, играет значимую роль железы внутренней секреции и синтезирует гормоны, очень важна. Одну из ключевых стадий на пути создания холестерина символизирует мевало-нат, образование которого неизбежно приводит в конечном счете к синтезу этого предшественника стероидов. Целью нашей работы было выявление фермента, маркирующего процессы преобразования мева-лоната и влияние на него герпетической инфекции.

Материалы и методы

Материалом для исследования послужило 12 зрелых плацент, взятых при родах от матерей, перенесших обострение герпетической инфекции во время беременности, и не имевших таковой (5 случаев вошли в состав контрольной группы), а также 14 ворсинчатых хорионов, полученных при проведении абортов на сроке от 4 до 10 недель (8 из которых вошли в контрольную группу, а 6 имели обострение герпеса).

Для выполнения поставленной цели в лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при НЗЛ ГУ ДНЦ ФПД СО РАМН был разработан оригинальный гистохимический способ для определения мевалоната. Как известно, все вещества подвергаются биологическому окислению в тканях посредством включения промежуточных переносчиков водорода. Наш метод основан на восстановлении акцептора, в качестве которого использовался нитросиний тетразолий. Определяемый фермент условно назвали «мевалонатде-гидрогеназа». Работа выполнялась на криостатных срезах свежезамороженной ткани.