Полногеномное секвенирование и сравнительный анализ генов «Домашнего хозяйства» и вирулентности у коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидным действием

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 50, № 3, с. 332-338

УДК 579.64:577.22 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.332rus

ПОЛНОГЕНОМНОЕ СЕКВЕНИРОВАНИЕ И СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ «ДОМАШНЕГО ХОЗЯЙСТВА» И ВИРУЛЕНТНОСТИ У КОММЕРЧЕСКИХ ШТАММОВ Bacillus thuringiensis С ЭНТОМОЦИДНЫМ

ДЕЙСТВИЕМ*

В.И. САФРОНОВА, А.Л. САЗАНОВА, И.Г. КУЗНЕЦОВА, Ж.П. ПОПОВА,

С.Д. ГРИШЕЧКИНА, В.П. ЕРМОЛОВА, Е.Е. АНДРОНОВ

Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) поддерживает 37 штаммов Bacillus thuiingiensis, обладающих выраженной энтомоцидной активностью и используемых для производства препаратов фитозащитного действия (битоксибациллин, бактокулицид, бацикол). Эффективность производимых биопрепаратов зависит от качества микробного материала. Контроль за чистотой и аутентичностью коммерческих штаммов может осуществляться с помощью их молекулярно-генетической паспортизации. В настоящее время наиболее эффективной технологией доскональной генетической характеристики штаммов микроорганизмов считается полногеномное сек-венирование. Однако, несмотря на несомненную востребованность полногеномного секве-нирования для паспортизации коммерческих штаммов, ее широкое применение ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью. Поэтому для удешевления анализа и сокращения сроков его выполнения необходима разработка экспресс-методов высокопроизводительного секвенирования. Одним из решений может быть анализ не всего генома, а наиболее таксономически и функционально значимых генетических локусов (так называемого референт-комплекса). Целью нашей работы стало выявление референт-комплексов у 10 штаммов B. thuringiensis разных серотипов. После проведения высокопроизводительного пиросеквенирования штаммов и получения полногеномных последовательностей был проведен их сравнительный анализ и найдены наиболее дивергентные генетические локусы, определяющие уникальность штаммов. Использовали программу BioNumerics («Applied Maths», США); для построения дендрограмм, отражающих филогенетическое родство между исследуемыми штаммами, суммы последовательностей отобранных генов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности обрабатывали с помощью программы MEGA v. 5.0 (метод Neighbour-Joining). В результате были отобраны 10 генов «домашнего хозяйства» (glpT, glpF, pyrE, purF, purH, pta, gyrB, ftsA, panC и isd), а также 8 генов вирулентности (hblA, hblC, hblD, nheA, nheC, capA, capC и inA). Для каждого штамма сконструированы два референт-комплекса, представляющих собой сумму последовательностей отобранных локусов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности. Общий размер референт-комплексов составлял соответственно 11809 и 10094 п.н. Полученные результаты будут использованы в дальнейшей работе для создания системы праймеров с целью проведения мультиплексного анализа референт-комплексов в условиях высокопроизводительного секвенирова-ния и разработки экспресс-метода генетической паспортизации коммерческих штаммов B. thuringiensis.

Ключевые слова: Bacillus thuringiensis, полногеномное секвенирование, гены «домашнего хозяйства» и вирулентности, генетическая паспортизация.

Основу любой микробной технологии составляет штамм микроорганизма, обладающий ярко выраженным практически ценным (целевым) свойством. Культивирование штаммов при лабораторном хранении и особенно производственного процесса зачастую сопровождается потерей целевых свойств и контаминацией (загрязнением) вплоть до полного замещения контаминантом. В результате может использоваться микробный материал ненадлежащего качества, что приводит к снижению эффективности выпускаемой продукции, а также к риску использования при ее производстве патогенных микроорганизмов. Контроль за чистотой и аутентичностью коммерческих штаммов может осуществляться с помощью их молекулярно-генетической паспортизации. Для этой цели в настоящее

* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Соглашение № 14.604.21.0024, RFMEFI60414X0024).

332

время привлекаются новейшие молекулярно-генетические методы, такие как анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК (AFLP фингерпринтинг) (1), метод пульс-электрофореза (2, 3), а также высокопроизводительное полногеномное секвенирование (4-8). Указанные приемы позволяют выявить уникальные особенности культур микроорганизмов, которые могут быть использованы для создания штаммоспецифичных паспортов. Полногеномное секвенирование сейчас признано наиболее эффективной технологией доскональной генетической характеристики штаммов микроорганизмов. Однако, несмотря на несомненную востребованность полногеномного секвенирования для паспортизации коммерческих штаммов, ее широкое применение ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью. Поэтому для оперативного контроля за качеством микробного материала на базе высокопроизводительного секвенирования необходимо разработать экспресс-методы с целью удешевления анализа и сокращения сроков его выполнения. Одним из возможных решений может быть анализ не всего генома, а наиболее таксономически и функционально значимых генетических локусов (так называемого референт-комплекса).

Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Всероссийского НИИ сельскохозяйственных микроорганизмов (ВНИИСХМ) (ВКСМ) поддерживает 37 штаммов B. thur-ingiensis, обладающих выраженной энтомоцидной активностью и используемых для производства препаратов фитозащитного действия (битоксиба-циллин, бактокулицид, бацикол).

Целью работы было получение полногеномных последовательностей для 10 штаммов Bacillus thuringiensis разных серотипов, проведение их сравнительного анализа и поиск наиболее дивергентных генетических локусов для последующей разработки экспресс-метода достоверной аутентификации коммерческих штаммов этого вида.

Методика. Штаммы Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, B. thuringiensis subsp. darmstadiensis и B. thuringiensis var. israelensis культивировали на мясопептонном агаре (МПА) при 28 °С (9). Штаммы размещены в УНУ «Станция низкотемпературного автоматизированного хранения биологических образцов» ВКСМ (10). Информация о штаммах доступна в базе данных ВКСМ на сайте ВНИИСХМ (http://www.arriam.spb.ru).

Для выделения бактериальной ДНК отбирали по 3 мл ночных культур штаммов в мясопептонном бульоне (МПБ) (9), клетки осаждали центрифугированием при 13400 об/мин в течение 2 мин. Осадок промывали 1 мл буфера 1 (25 мМ TrisHCl pH = 8,0; 10 мМ EDТА) и повторно центрифугировали. Ресуспендировали осадок в 100 мкл лизирующей смеси, содержащей 960 мкл буфера 1, 3 мг лизоцима и 25 мкл РНКазы (10 мг/мл) и инкубировали 20 мин при 37 °С. Добавляли к смеси 500 мкл протеиназы К в буфере 2 (10 мМ TrisHCl pH = 8,0; 5 мМ EDТА; 0,5 % SDS) и инкубировали 30 мин при 55 °С. Приливали 60 мкл 3 М ацетата натрия и 750 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1), встряхивали на вортексе 5 мин и центрифугировали при 14000 об/мин 10 мин. Переносили супернатант в чистые пробирки, добавляли 750 мл смеси фенол:хлороформ (24:1), встряхивали на вортексе в течение 5 мин и повторно центрифугировали. Переносили супернатант в чистые пробирки, добавляли равный объем изопропилового спирта, аккуратно перемешивали в течение 5 мин и центрифугировали при 13400 об/мин 10 мин. Отделяли супернатант, осадок промывали 70 % этанолом и высушивали. К осадку добавляли 50 мкл

333

H2O MQ, перемешивали и прогревали при 65 °С в течение 5 мин. Доочистку выделенной ДНК проводили с помощью набора AxyPrep Multisource Genomic DNA miniprep Kit («Axygen», США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Концентрацию и степень чистоты ДНК оценивали на спектрофотометре SpectroStar Nano («BMG Labtech GMbH»,Германия) при четырех длинах волн — 230, 260, 280 и 340 нм. Нуклеотидную последовательность геномной ДНК определяли на пиросеквенаторе Junior GS («Roche Applied Science», Германия) в соответствии с рекомендациями производителя. Работу по сборке ридов выполняли с помощью программы CLC Genomics Workbench 7.5.1 («CLC bio QIAGEN», Германия, http://www.clcbio.com/pro-ducts/clc-genomics-workbench/).

Для выявления наиболее дивергентных локусов последовательности генов «домашнего хозяйства» и вирулентности штаммов B. thuringiensis сравнивали с помощью программы BioNumerics («Applied Maths», США). Для построения дендрограмм, отражающих филогенетическое родство между исследуемыми штаммами, суммы последовательностей отобранных генов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности обрабатывали с помощью программы MEGA v. 5.0 (метод Neighbour-Joining).

Результаты. Для изучения были отобраны коммерчески ценные штаммы B. thuringiensis, обладающие выраженным энтомоцидным действием. Биологическая характеристика штаммов приведена в таблице 1.

1. Биологическая характеристика сравниваемых штаммов Bacillus thuringiensis разных серологических групп

№

штамма

Объект выделения

Содержание

Титр спор, экзотоксина

Энтомоцидная активность ЛК50, % для L2 колорад- для L4 комара ского жука желтолихора-

________________дочного

B. thuringiensis var. thuringiensis

12 Труп колорадского

жука 2,79 3,4 0,22

20 Больная гусеница

капустной совки 2.58 4,0 0,26

40 Почва капустного

поля 2,42 4,29 0,32

800/19 Труп гусеницы

капустной белянки 2,72 3,78 0,28

B. thuringiensis subsp. darmstadiensis

79 Труп колорадского

жука 1,98 5,86 0,42

109 Личинка

колорадского жука 2,78 4,28 0,36

109/4 Реизоляция из личин-

ки колорадского жука 3,08 3,8 0,32

109/57 Реизоляция из личин-

ки колорадского жука 3,25 3,6 0,27

B. thuringiensis var. israelensis

38 Аедогенный водоем

(вода) 2,81 - -

44 Анофелогенный

водоем (почва) 3,28 - -

Прим е ч а н и е. КЖ — культуральная жидкость. Прочерки означают, что определение

0,24

0,16

не проводили.

Штаммы B. thuringiensis var. thuringiensis активны против колорадского жука и чешуекрылых вредителей сельскохозяйственных культур, в то время как B. thuringiensis subsp. darmstadiensis действуют в основном против жесткокрылых насекомых-фитофагов (колорадский жук, крестоцветные блошки, рапсовый цветоед, восточный горчичный листоед, землянично-малинный долгоносик и др.). Представители B. thuringiensis var. israelensis обладают ларвицидной активностью и действуют против комаров. Два штамма из анализируемых (109/4 и 109/57) — варианты штам-

334

ма B. thuringiensis subsp. darmstadiensis 109, отобранные в результате селекции (см. табл. 1).

После получения полногеномных последовательностей штаммов

B. thuringiensis разных серотипов был проведен их сравнительный анализ и поиск наиболее дивергентных генетических локусов. Объектами сравнения были гены, определяющие вирулентность штаммов, а также гены, необходимые для поддержания важнейших жизненных функций клеток микроорганизмов (так называемые гены «домашнего хозяйства»). В результате отобрали 10 генов «домашнего хозяйства» (gpT, gipF, pyrE, purF, purH, pta, gyrB, ftsA, panC и isd), а также 8 генов вирулентности (hblA, hblC, hblD, nheA, nheC, capA, capC и inA) (табл. 2).

2. Гены «домашнего хозяйства» и вирулентности, исследованные при сравнительном анализе полногеномных последовательностей у 10 штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью

Ген Размер фрагмента, п.н. Кодируемый белок Ссылка

glpT 1350 Гены «домашнего хозяйства» glycerol-3-phosphate permease

glpF 837 glycerol uptake facilitator protein

pyrE 633 orotate phosphoribosyltransferase

purF 1416 glutamine phosphoribosylpyrophosphate amidotransferase

purH 1536 phosphoribosylaminoimidazole carboxamide formyltransferase

pta 972 phosphate acetyltransferase

gyrB 1883 DNA gyrase subunit B

ftsA 1308 cell division protein

panC 849 pantoate-beta-alanine ligase

isd 1025 iron-regulated surface determinant protein Настоящая статья

hblA 1388 Гены вирулентности hemolytic enterotoxin hemolysin A

hblC 1340 hemolytic enterotoxin hemolysin C

hblD 1221 hemolytic enterotoxin hemolysin D

nheA 1161 nonhemolytic enterotoxin A

nheC 1080 nonhemolytic enterotoxin C

capA 748 capsular polysaccharide A

capC 768 capsular polysaccharide C

inA 2388 metalloprotease

3. Число различающихся нуклеотидов в референт-комплексах генов «домашнего хозяйства» у 10 штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью при парном сравнении

Штамм var. thuringiensis subsp. darmstadiensis var. israelensis

40 12 20 800/19 109 I 109/4 109/57 | 79 38 | 44

40

12 12

20 27 15

800/19 18 6 21

109 352 345 360 350

109/4 357 351 366 343 7

109/57 354 346 361 351 3 8

79 346 339 354 344 20 25 21

38 414 399 424 414 188 195 191 190

44 413 408 423 414 192 199 195 194 24

Указанные локусы, за исключением гена isd, использовались ранее другими авторами для генотипирования и изучения биоразнообразия штаммов B. cereus и B. thuringiensis (11-18). Высокий уровень генетической дивергенции в локусе isd был выявлен нами в проведенном исследовании. Для каждого штамма сконструировали два референт-комплекса, представляющих собой сумму последовательностей отобранных локусов «домашнего хозяйства» и отдельно генов вирулентности. Общий размер референт-комплексов составлял соответственно 11809 и 10094 п.н. Данные по числу различающихся нуклеотидов в референт-комплексах у изученных

335

штаммов B. thuringiensis при их парном сравнении представлены в таблицах 3 и 4. Можно видеть, что наиболее гомологичными по генам «домашнего хозяйства» были штаммы 109, 109/4 и 109/57 B. thuringiensis subsp. darmstadiensis (3-8 различающихся нуклеотидов), а также штаммы 12, 20 и 800/19 B. thuringiensis var. thuringiensis, имеющие от 6 до 21 различающегося нуклеотида (см. табл. 3). По генам вирулентности штаммы 109, 109/4 и 109/57, которые представляют собой варианты одного штамма, были идентичны, в то время как близкородственные штаммы 12, 20 и 800/19 имели от 3 до 12 различающихся нуклеотидов (см. табл. 4).

4. Число различающихся нуклеотидов в референт-комплексах генов вирулентности у 10 штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью при их парном сравнении

Штамм var. thuringiensis subsp. darmstadiensis var. israeiensis

40 12 20 | 800/19 109 109/4 109/57 79 38 | 44

40

12 18

20 8 12

800/19 15 3 9

109 296 300 292 299

109/4 296 300 292 299 0

109/57 296 300 292 299 0 0

79 276 279 270 277 229 229 229

38 385 389 379 386 420 420 420 394

44 383 399 389 396 429 429 429 403 29

Более наглядно филогенетическое родство исследованных штаммов B. thuringiensis демонстрировали дендрограммы, полученные на основе анализа референт-комплексов генов «домашнего хозяйства» и вирулентности (рис. 1 и 2). Можно видеть, что в обоих случаях штаммы группируются в строгом соответствии с их систематическим положением и серотипом, что свидетельствует о высокой таксономической значимости использованных локусов.

B. thuringiensis subsp. darmstadiensis 100 B. thuringiensis subsp. darmstadiensis L B. thuringiensis subsp. darmstadiensis " B. thuringiensis subsp. darmstadiensis

________________I— B. thuringiensis var. israeiensis 38

100 B. thuringiensis var. israeiensis 44 B thuringiensis var. thuringiensis 40 B thuringiensis var. thuringiensis 12 B thuringiensis var. thuringiensis 20 B thuringiensis var. thuringiensis 800/19

100

99

0,002

Рис. 1. Дендрограмма штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью, построенная на основе анализа референт-комплекса, который включает гены «домашнего хозяйства» gpT, gpF, pyrE, purF, purH, pta, gyrB, ftsA, panC и isd

100

79

100

B thuringiensis var. thuringiensis 12 ' B thuringiensis var. thuringiensis 20 B thuringiensis var. thuringiensis 800/19 B thuringiensis var. thuringiensis 40

B. thuringiensis subsp. darmstadiensis 79

| B. thuringiensis subsp. darmstadiensis 109 Юё! B. thuringiensis subsp. darmstadiensis 109/4 B. thuringiensis subsp. darmstadiensis 109/57

______B. thuringiensis var. israeiensis 38

100 B. thuringiensis var. israeiensis 44

0,005

Рис. 2. Дендрограмма штаммов Bacillus thuringiensis с энтомоцидной активностью, построенная на основе анализа референт-комплекса, который включает гены вирулентности hblA, hblC, hblD, nheA nheC, capA capC и inA.

336

Таким образом, в результате сравнительного анализа полногеномных последовательностей у 10 штаммов Bacillus thuringiensis разных серотипов выявлены уникальные гены «домашнего хозяйства» и вирулентности, секвенирование которых позволит проводить оперативную аутентификацию коммерческих штаммов этого вида для контроля за качеством микробного материала при производстве биопрепаратов эн-томоцидного действия.

ЛИТЕРАТУРА

1. Paun O., Sch о nswetter P. Amplified fragment length polymorphism: an invaluable fingerprinting technique for genomic, transcriptomic, and epigenetic studies. Methods Mol. Biol., 2012, 862: 75-87 (doi: 10.1007/978-1-61779-609-8_7).

2. Leblond P., Decaris B. Сhromosome geometry and intraspecific genetic polymorphism in Grampositive bacteria revealed by pulsed-field gel electrophoresis. Electrophoresis, 1998, 19(4): 582-588.

3. Насонова Е.С. Пульс-электрофорез: теория метода, инструментальный арсенал и области применения. Цитология, 2008, 50(11): 927-935.

4. B ull-O tt e rs o n L., Feng W., Kirpich I., Wang Y., Qin X., Liu Y., Gobejishvili L., Joshi-Barve S., Ayvaz T., Petrosino J., Kong M., Barker D., McClain C., Barve S. Metagenomic analyses of alcohol induced pathogenic alterations in the intestinal microbiome and the effect of Lactobacillus rhamnosus GG treatment. PLoS ONE, 2013, 8(1): e53028 (doi: 10.1371/journal.pone.0053028).

5. D z unkov a M., D’Auria G., P e r e z-Vil l a r r o y a D., Moya A. Hybrid sequencing approach applied to human fecal metagenomic clone libraries revealed clones with potential biotechnological applications. PLoS ONE, 2012, 7(10): e47654 (doi: 10.1371/journal.pone.0047654).

6. White J., Gilbert J., Hill G., Hill E., Huse S.M., Weightman A.J., M a h e n t h i r a l i n g a m E. Culture-independent analysis of bacterial fuel contamination provides insight into the level of concordance with the standard industry practice of aerobic cultivation. Appl. Environ. Microbiol., 2011, 77(13): 4527-4538 (doi: 10.1128/AEM.02317-10).

7. Nacke H., Th й rmer A., Wollherr A., Will C., Hodac L., Herold N., Sch о ning I., Schrumpf M., Daniel R. Pyrosequencing-based assessment of bacterial community structure along different management types in German forest and grassland soils. PLoS ONE, 2011, 6(2): e17000 (doi: 10.1371/journal.pone.0017000).

8. Petrosino J.F., Highlander S., Luna R.A., Gibbs R.A., Versalovic J. Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem., 2009, 55(5): 856-866 (doi: 10.1373/clinchem.2008.107565).

9. Сафронова В.И., Оследкин Ю.С., Свиридова О.В., Воробьев Н.И. Методы консервации коллекционных культур микроорганизмов. СПб, 2007.

10. Safronova V., Tikhonovich I. Automated cryobank of microorganisms: Unique possibilities for long-term authorized depositing of commercial microbial strains. In: Microbes in applied research: current advances and challenges /A. Mendez-Vilas (ed.). World Scientific Publishing Co., 2012: 331-334 (doi:10.1142/9789814405041_0066).

11. Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., Caugant D.A., Kolsto A.B. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group. Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70: 191-201 (doi: 10.1128/AEM.70.1.191-201.2004).

12. Barker M., Thakker B., Priest F.G. Multilocus sequence typing reveals that Bacillus cereus strains isolated from clinical infections have distinct phylogenetic origins. FEMS Microbiol. Lett., 2005, 245: 179-184.

13. Sorokin A., Candelon B., Guilloux K., Galleron N., Wackerow-Kouzova N., Ehrlich S.D., Bourguet D., Sanchis V. Multiple-locus sequence typing analysis of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis reveals separate clustering and a distinct population structure of psychrotrophic strains. Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72: 1569-1578 (doi: 10.1128/AEM.72.2.1569-1578.2006).

14. Soufiane B., Baizet M., Cote J.C. Multilocus sequence analysis of Bacillus thuringiensis serovars navarrensis, bolivia and vazensis and Bacillus weihenstephanensis reveals a common phylogeny. Antonie Van Leeuwenhoek, 2013, 103(1): 195-205 (doi: 10.1007/s10482-012-9800-5).

15. Ko K.S., Kim J.W., Kim J.M., Kim W., Chung S.I., Kim I.J., Kook Y.H. Population structure of the Bacillus cereus group as determined by sequence analysis of six housekeeping genes and the plcRgene. Infect. Immun., 2004, 72: 5253-5261 (doi: 10.1128/IAI.72.9.5253-5261.2004).

16. Rahimi E., Abdos F., Momtaz H., Baghbadorani Z.T., Jalali M. Bacillus cereus in infant foods: prevalence study and distribution of enterotoxigenic virulence factors in Isfahan Province, Iran. Scientific World Journal, 2013, 2013: 292571 (doi: 10.1155/2013/292571).

17. Kim Y.R., B att C.A. Riboprint and virulence gene patterns for Bacillus cereus and related species. J. Microbiol. Biotechnol., 2008, 18(6): 1146-1155.

18. Zahner V., Silva A.C., De Moraes G.P., McIntosh D., De Filip pis I. Ex-

337

tended genetic analysis of Brazilian isolates of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis Mem. Inst. Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro), 2013, 108(1): 65-72.

ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной Поступила в редакцию

микробиологии, 30 марта 2015 года

196608 Россия, г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3, e-mail: v.safronova@rambler.ru

Sel’skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2015, V. 50, № 3, pp. 332-338

WHOLE GENOME SEQUENCING AND THE COMPARATIVE ANALYSIS OF HOUSEKEEPING LOCUSES AND VIRULENCE GENES FROM THE COMMERCIAL STRAINS OF Bacillus thuringiensis WITH INSECTICIDAL

ACTIVITY

V.I. Safronova, A.L. Sazanova, I.G. Kuznetsova, Zh.P. Popova,

S.D. Grishechkina, V.P. Ermolova, E.E. Andronov

All-Russian Research Institute for Agricultural Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 3, sh. Podbel’skogo, St. Petersburg, 196608 Russia, e-mail v.safronova@rambler.ru

Supported by the Ministry of Education and Sciences of the Russian Federation

Received March 30, 2015 doi: 10.15389/agrobiology.2015.3.332eng

Abstract

Russian collection of agricultural microorganisms (RCAM) supports 37 strains of Bacillus thuringiensis with pronounced insecticidal activities, which are used for the production of phytoprotective biopreparations. The effectiveness of biopreparations depends on the quality of the microbial material. Monitoring of the purity and authenticity of the commercial strains can be accomplished by their molecular-genetic certification. Currently, the most effective technology for detailed genetic characterization of strains is a whole genome sequencing. However, despite the obvious demand for whole genome sequencing for the certification of commercial strains, its widespread use is limited because of considerable labour-intensive and cost. Therefore, the developing of rapid methods for high-throughput sequencing is necessary to reduce the cost of analysis and the terms of its implementation. One possible solution might be to analyze the part of genome, which includes the most taxonomically and functionally important genetic loci (referent-complexes). The goal of this work was to detect the referent-complexes of 10 B. thuringiensis strains having different serotypes. After receiving whole genome sequences the comparative analysis was carried out to search for the most divergent genetic loci that determine the uniqueness of strains. To identify most divergent loci of housekeeping genes and virulence genes in the strains, we used BioNumerics («Applied Maths», USA) program and MEGA v. 5.0 program for clustering according to Neighbour-Joining method. As a result, 10 housekeeping genes (glpT, glpF, pyrE, purF, purH, pta, gyrB, ftsA, panC and isd), as well as 8 virulence genes (hblA, hblC, hblD, nheA, nheC, capA, capC and inA) were selected. For each strain two referent complexes were constructed, representing the concatenated sequences of selected housekeeping and virulence loci taken separately. Total length of the referent-complexes was 11809 and 10094 bp respectively. In the future the sets of primers will be created for multiplex analysis of referent complexes in the high-throughput DNA sequencing and the rapid method for genetic certification of the commercial B. thuringiensis strains will be developed.

Keywords: Bacillus thuringiensis, whole genome DNA sequencing, housekeeping and virulence genes, genetic certification.

Научные собрания

10th EUROPEAN CONFERENCE OF PRECISION AGRICULTURE (ECPA) «EFFICIENT RESOURCES MANAGEMENT UNDER CHANGING GLOBAL CONDITIONS»

Организатор: ARO (Agricultural Research Organization) Министерства сельского хозяйства и развития сельскохозяйственного производства Израиля.

Тематика конференции: прецизионное сельское хозяйство как средство эффективного управления ресурсами в условиях глобальных изменений. ARO — крупнейший сельскохозяйственный исследовательский центр в Израиле. Предлагаемые здесь технологии и научные разработки способны существенно улучшить ситуацию на продовольственном рынке.

Контакты и информация: http://www.ispag.org/Events/9thECPA/

338