СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХЛОРАМФЕНИКОЛА С ПОМОЩЬЮ ПЬЕЗОКВАРЦЕВОГО ИММУНОСЕНСОРА
METHOD OF DETECTING CHLORAMPHENICOL USING PIEZOQUARTZ IMMUNOSENSOR

Настоящее изобретение относится к области аналитической химии и может быть рекомендовано для высокочувствительного определения хлорамфеникола в пищевой продукции - мясе, молоке, яйцах, меде.
Известен способ определения хлорамфеникола с помощью амперометрического сенсора (An amperometric chloramphenicol immunosensor based on cadmium sulfide nanoparticles modified-dendrimer bonded conducting polymer Dong-Min Kim, Md. Aminur Rahman, Minh Hien Do, Changill Banc, Yoon-Bo Shima, Biosensors and Bioelectronics 25 (2010) 1781-1788). Недостатком данного способа является непрямая регистрация концентрации хлорамфеникола и необходимость использования специальных меток: в пробу необходимо введение гидразина, что влияет на воспроизводимость и продолжительность анализа.
-8
Предложено определение хлорамфеникола с помощью хемилюменисцентного иммуносенсора [Development of a chemiluminescent immunosensor for chloramphenicol In-Seon Park, Namsoo Kim, Analytica Chimica Acta 578 (2006) 19-24]. Недостатком данного способа является метод иммобилизации антител на поверхность прямым погружением его в раствор, что не обеспечивает воспроизводимые результаты. Предел обнаружения составил 10 моль/л.
-6
-2
-5
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ определения хлорамфеникола с помощью пьезокварцевого иммуносенсора в проточно-инжекционном режиме [Development of new immunosensors for determination of contaminants in food Norra Adamyi, Marria Varradi, Namsoo Kim, Istvarn SzendroCurrent Applied Physics 6 (2006) 279-286]. Определение хлорамфеникола возможно в диапазоне 5·10-5·10 М, предел обнаружения равен 10 М. Существенным недостатком данного способа является прямой формат анализа: сигнал регистрируется при присоединении хлорамфеникола к антителам, иммобилизованным на поверхности сенсора. Поскольку хлорамфеникол является низкомолекулярным соединением, чувствительность определения невысока и, следовательно, нельзя проводить его определение на уровне ПДК.
Задачей настоящего изобретения является снижение предела обнаружения хлорамфеникола до 0,2 нг/мл, увеличение чувствительности определения и уменьшение продолжительности анализа.
Для повышения чувствительности определения рекомендован конкурентный формат анализа, заключающийся в пропускании пробы, содержащей антибиотик и  фиксированное количество антител, над поверхностью сенсора с рецепторным покрытием на основе хлорамфеникол-белкового конъюгата. В данном случае на изменение частоты сенсора влияет концентрация антител, не связавшихся с определяемым соединением. Измеряют значение резонансной частоты в режиме реального времени. Регенерацию рецепторного покрытия для проведения последующих определений осуществляют пропусканием 0,04 mM раствора тиоционата калия над поверхностью электрода сенсора, обеспечивая его многократное использование. Предложенный способ отличается от аналога применением конкурентного формата анализа, что способствует повышению чувствительности определения и сокращению продолжительности анализа.
Предложенный способ характеризуется:
- высокой чувствительностью определения с пределом обнаружения хлорамфеникола равным 0,2 нг/мл;
- многократностью использования (более 15 раз) иммуносенсора вследствие регенерации биорецепторного покрытия после каждого цикла измерения;
- относительно невысокой продолжительностью анализа.
Разработанный способ позволяет проводить определение содержание хлорамфеникола в пищевой продукции в диапазоне концентраций 0,5-100,0 нг/мл. Высокая селективность обеспечивается использованием специфичных иммунореагентов - моноклональных антител к хлорамфениколу и ХАФ-белковых конъюгатов. Многократное (более 15 раз) использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия обеспечивает снижение затрат на осуществление анализа.
Способ осуществляется следующим образом:
Для создания иммуносенсора используется пьезокварцевый массчувствительный резонатор АТ-среза с золотыми электродами диаметром 5 мм и собственной частотой колебаний 10 МГц. После тщательной очистки и обезжиривания поверхности золотого электрода пьезокварцевый резонатор помещают в трехэлектродную ячейку для получения полипиррольного покрытия. Свежеприготовленный полимер, высушенный в течение 30 мин, помещают на сутки в камеру с парами глутарового альдегида, затем наносят 10 мкл 5 мкг/мл раствора конъюгата хлорамфеникола и соевого трипсинового ингибитора, помещают во влажную камеру на 24 час. Перед измерением сенсор промывают фосфатным буферным раствором для удаления несвязывшихся реагентов.
Пьезокварцевый сенсор с нанесенным на одну сторону его поверхности рецепторным слоем помещают в проточную ячейку детектирования. Только одна сторона
Пьезокварцевый сенсор с нанесенным на одну сторону его поверхности рецепторным слоем помещают в проточную ячейку детектирования. Только одна сторона сенсора контактирует с исследуемым раствором в течение анализа. Проточная ячейка входит в общую систему, включающую дозатор ввода проб; перистатический насос, обеспечивающий непрерывный поток жидкости; частотомер и персональный компьютер, регистрирующий изменение частоты колебаний.
Отбирают 100 мкл пробы, содержащей хлорамфеникол, добавляют фиксированную концентрацию (17 мкг/мл) антител, соответствующую 50%-ному связыванию в иммунокомплекс и выдерживают до завершения реакции в течение 5-10 минут при 20°С.
Пробу вводят в проточную ячейку со скоростью потока 60 мкл/мин. Проведение проточно-инжекционного иммуноанализа включает:
- пропускание буферного раствора через ячейку для установления постоянного значения сигнала;
- введение в ячейку пробы, содержащей рабочую концентрацию антител и различную концентрацию хлорамфеникола;
- пропускание буферного раствор для удаления несвязавшихся антител;
- введение регенерирующего раствора тиоционата калия;
- пропускание буфера до установления постоянного значения.
Полный цикл, включая регенерацию биослоя, занимает порядка 20-30 мин. По окончанию анализа поверхность сенсора промывают буфером и помещают во влажную камеру при температуре 4°С.
В качестве аналитического сигнала пьезокварцевого иммуносенсора используют изменение частоты колебания сенсора (Δf) вследствие увеличения массы рецепторного покрытия в результате образования гетерогенного иммунокомплекса.
Сигнал рассчитывается по следующему уравнению:
m
Δf=Δf-Δf,
m
где f - частота колебаний иммуносенсора до начала измерения с предварительно нанесенным биорецепторным слоем; f - минимальная частота колебаний сенсора, соответствующая образованию гетерогенного иммунокомплекса.
После предварительной пробоподготовки определяют концентрацию хлорамфеникола в пробе по построенному градуировочному графику.
Для построения градуировочного графика готовят анализируемые растворы с конечной концентрацией хлорамфеникола 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10,0, 25,0, 40,0, 100,0 нг/мл, к которым прибавляют раствор антител с концентрацией, соответствующий 50%-ному связыванию, смесь доводят фосфатным буферным раствором до 1 мл и выдерживают до завершения реакции.
Значение аналитического сигнала обратно пропорционально содержанию аналита в пробе.
Градуировочный график для определения хлорамфеникола в жидких средах линеен в диапазоне концентраций 0,5-100,0 нг/мл.
Пример 1. В пробу, содержащую 0,25 нг/мл хлорамфеникола, вводили фиксированное количество антител и выдерживали в течение 5-10 мин до образования иммунокомплекса. Полученный раствор вводили в проточно-инжекционную ячейку и фиксировали изменение частоты в результате образования комплекса межу конъюгатом, закрепленным на поверхности сенсора, и несвязавшимися антителами. Аналитический отклик сенсора обратно пропорционален содержанию хлорамфеникола в растворе.
Регенерацию биочувствительного покрытия пьезокварцевого сенсора осуществляли нанесением на поверхность раствора KCNS 0,04 мМ. Определение концентрации хлорамфеникола осуществляли по градуировочному графику, построенному с применением стандартных образцов.
Аналитический сигнал Δf=46 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Пример 2. В пробу, содержащую 0,5 нг/мл хлорамфеникола, вводили фиксированное количество антител и выдерживали в течение 5-10 мин до образования иммунокомплекса. Далее аналогично примеру 1.
Δf=44 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Пример 3. В пробу, содержащую 1,0 нг/мл хлорамфеникола, вводили фиксированное количество антител и выдерживали в течение 5-10 мин до образования иммунокомплекса. Далее аналогично примеру 1.
Δf=42 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Пример 4. В пробу, содержащую 5,0 нг/мл хлорамфеникола, вводили фиксированное количество антител и выдерживали в течение 5-10 мин до образования иммунокомплекса. Далее аналогично примеру 1.
Δf=40 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Пример 5. В пробу, содержащую 10,0 нг/мл хлорамфеникола, вводили фиксированное количество антител и выдерживали в течение 5-10 мин до образования иммунокомплекса. Далее аналогично примеру 1.
Δf=39 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Пример 6. В пробу, содержащую 25,0 нг/мл хлорамфеникола, вводили фиксированное количество антител и выдерживали в течение 5-10 мин до образования иммунокомплекса. Далее аналогично примеру 1.
Δf=34 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Пример 7. В пробу, содержащую 40,0 нг/мл хлорамфеникола, вводили фиксированное количество антител и выдерживали в течение 5-10 мин до образования иммунокомплекса. Далее аналогично примеру 1.
Δf=27 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Пример 8. В пробу, содержащую 100,0 нг/мл хлорамфеникола, вводили фиксированное количество антител и выдерживали в течение 5-10 мин до образования иммунокомплекса. Далее аналогично примеру 1.
Δf=15 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Пример 9. Исследуемый образец 100 мкл, содержащий хлорамфеникол, вводили в проточную ячейку детектирования. Далее аналогично примеру 1.
Введено хлорамфеникола:
Найдено хлорамфеникола:
5,0 нг/мл
5,2±0,5 нг/мл
Δf=40 Гц; предел обнаружения хлорамфеникола - 0,2 нг/мл.
Данный способ позволяет существенно увеличить чувствительность определения хлорамфеникола в сложных по составу смесях, а также обеспечивает многократное использование иммуносенсора после регенерации биорецепторного покрытия, что снижает затраты на осуществление анализа. Предел обнаружения хлорамфеникола равен 0,2 нг/мл.
Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа определения хлорамфеникола в жидких средах приведена в таблице.
Таблица
Сравнительная характеристика известного и предлагаемого способа детектирования хлорамфеникола в жидких средах
Показатели
Известный способ
Предлагаемый способ
Диапазон определяемых содержаний
1,6-1600,0 мкг/мл
0,5-100,0 нг/мл
Предел обнаружения
32,3 мкг/мл
0,2 нг/мл
Объем анализируемой пробы
100 мкл
100 мкл
Вид анализа
прямой
конкурентный
Регенерация иммунореагентов
После каждого цикла измерения
После каждого цикла измерения
Продолжительность измерения аналитического сигнала, мин
40-60 мин
20-30 мин