Фитохимический анализ травы пупавки красильной

http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-3-102-106

УДК 615.322.074:582.929.4

ФИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ТРАВЫ ПУПАВКИ КРАСИЛЬНОЙ

Касьянов З.В., Непогодина Е.А., Буканова Е.В., Старикова А.Н.

ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация

Аннотация. В статье представлены результаты фитохимического анализа травы пупавки красильной, перспективного лекарственного растения народной медицины, по ряду групп биологически активных веществ. Качественными реакциями и методом тонкослойной хроматографии подтверждено наличие органических кислот, достоверно установлены винная и лимонная кислоты. Методом косвенного потенциометрического титрования определено среднее содержание органических кислот в пересчёте на лимонную, которое составило около 6%. Качественными реакциями установлено, что в траве пупавки красильной содержатся преимущественно гидролизуемые дубильные вещества. Перманганатометрически в пересчёте на танин определено содержание дубильных веществ - около 13%. По методике Кочеткова Н.К. выделен полисахаридный комплекс по фракциям, которые представляют собой аморфные порошки: водорастворимый комплекс (около 8% от массы сырья) - темно-коричневого цвета, пектиновые вещества (около 3%) - зеленовато-кремового цвета, гемицеллюлоза А (около 3%) - темно-зелёного. В состав водорастворимого комплекса входят глюкоза, галактоза и арабиноза, пектиновых веществ - фруктоза, гемицеллюлозы А - фруктоза и рамноза. Полученные данные могут быть использованы при комплексном фар-макогностическом изучении пупавки красильной с целью последующей разработки препаратов на основе её сырья. Ключевые слова: пупавка красильная, органические кислоты, дубильные вещества, полисахариды.

Интерес к терапии различных заболеваний средствами на основе сырья лекарственных растений не спадает, что связано с относительной безвредностью фитопрепаратов, а также мягким действием и возможностью длительного применения.

Пупавка красильная (Anthemis йпСопа L.) - многолетнее травянистое растение семейства Астровые (Asteraceae), встречается в Европейской части России и Западной Сибири, широко распространенное в Пермском крае [1, С. 688-689]. Пупавка обладает лекарственным потенциалом, собранные сведения народной медицины указывают, что данное растение и настои и отвары его частей применяются как антигепатотокси-ческие, гемостатические, желчегонные, антибактериальные, противопаразитарные, противопротозойные, диуретические, общетонизирующие, кровоостанавливающие, ветрогонные средства. Биологическая активность извлечений из растительного сырья обусловлена входящими в состав группами соединений, поэтому детальное изучение химического состава пупавки красильной является актуальной задачей.

Согласно проведённому ранее исследованию, сырьём, оптимальным для заготовки (с максимальным выходом биологически активных веществ), является трава, собранная в фазу цветения [2].

Целью настоящей работы явилось изучение содержания органических кислот, дубильных веществ и по-лисахаридного комплекса.

Объектом исследования явился образец травы пупавки красильной, заготовленный в июле 2016 г. в окрестностях г. Перми (д. Васильевка).

Органические кислоты. Для качественной оценки содержания органических кислот было приготовлено водное извлечение (1:5). 5,0 г измельченного сырья заливали 50 мл воды очищенной и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Извлечения фильтровали, сырье заливали снова 50 мл воды очищенной, и дважды повторяли операцию. Водные извлечения, полученные после трехкратной экстракции, объединяли и упаривали под вакуумом и доводили до 25 мл. Извлечение также было использовано для идентификации дубильных веществ и полисахаридов.

Наличие органических кислот подтверждено реакциями комплексообразования с солями металлов: меди сульфата (зеленовато-синяя окраска), кальция хлорида (белый осадок).

Обнаружение органических кислот проводили методом хроматографии в тонком слое сорбента (ТСХ) в восходящем токе растворителей на пластинках «Силу-фол UV 254» и «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» в системе: спирт этиловый 96% - раствор аммиака концентрированный (16:4,5), проявитель - спиртовой раствор бромкрезолового зеленого. На линию старта наносили 0,01 мл извлечения (соответствует 2 мг сырья). Условия разделения хроматограммы: температура - 20°С,

время насыщения камеры - 40 мин. Время хроматогра-фирования составило 30 мин. [3]

В щелочной среде детектируемые кислоты проявлялись на синем фоне в виде желтых пятен. В траве пупавки красильной достоверно идентифицированы лимонная ^ 0,1) и винная ^ 0,25) кислоты (рис. 1).

Рис. 1. Схема хроматограммы органических кислот, где 1 - извлечение; 2 - лимонная кислота; 3 - аскорбиновая кислота; 4 - щавелевая кислота; 5 - винная кислота; 6 - янтарная кислота.

Количественное содержание свободных органических кислот проводили титриметрически [4]. Аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. 5,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу объемом 250 мл, заливали 200 мл воды и выдерживали в течение 2 ч на кипящей водяной бане, затем охлаждали, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 220 мл, доводили объем извлечения водой до метки и перемешивали. Отбирали 10,0 мл извлечения, помещали в колбу вместимостью 500 мл, прибавляли 300 мл свежепрокипяченной воды и титровали 0,1 М раствором натрия гидроксида. Конечную точку титрования устанавливали потенциометрически.

Содержание свободных органических кислот в пересчете на лимонную кислоту в абсолютно сухом сырье в процентах (С, %) вычисляли по формуле:

V • 0,009605 • 220 • 100 • 100

С % =-

т • 10 •

где 0,009605 - количество лимонной кислоты, соответствующее 1 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, в граммах; V - объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшего на титрование, в миллилитрах; т - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Среднее содержание органических кислот в пересчёте на лимонную кислоту в траве пупавки красильной составило 5,76±0,41% (п=5).

Дубильные вещества. Качественное определение проводили в водном извлечении (1:5) с помощью качественных реакций: со свежеприготовленным 1% раствором желатина и кислотой хлористоводородной 10% получается муть, исчезающая от избытка реактива (дубильные вещества); с 1% раствором антипирина образуется аморфный осадок (дубильные вещества); с 10% раствором кислоты уксусной и 10% раствором средней соли свинца ацетата - бурый аморфный осадок (гидро-лизованные дубильные вещества); с 1% раствором же-лезоаммониевых квасцов - черно-синее окрашивание (гидролизованные дубильные вещества) [5].

Количественное определение дубильных веществ проводили по стандартной фармакопейной методике в пересчёте на танин, содержание составило 12,90±0,59% (п=5) [6, С. 417-420].

Полисахаридный комплекс. Идентификацию полисахаридов проводили в водном извлечении (1:5) по реакции Бертрана (кирпично-красный осадок оксида меди (I), по объёму превышающий аналогичный при определении свободных сахаров) и по добавлению трехкратного объема спирта этилового 96% (рыхлый осадок).

Полисахариды из лекарственного растительного сырья выделяли по методу Н.К. Кочеткова фракциями [7, 8].

Выделение водорастворимого полисахаридного комплекса (ВРПК). Для получения полисахаридных фракций было взято 0,2 кг воздушно-сухого сырья травы пупавки красильной. Сырьё экстрагировали

спиртом этиловым 70% для извлечения фенольных соединений. Далее полученный шрот экстрагировали горячей водой 1:20 при нагревании до 95°С в течение 2 часов при постоянном перемешивании. Повторное извлечение полисахаридов проводили дважды в соотношении 1:10 в течение часа. Растительный материал отделяли центрифугированием, а объединенные водные извлечения упаривали до 1/5 первоначального объема. С целью дополнительной очистки от фенольных соединений водные извлечения пропускали через слой полиамидного сорбента высотой 50 мм на воронке Бюхнера диаметром 300 мм. Сорбент промывали небольшими порциями воды, которые присоединяли к основной массе элюатов. После этого полисахариды осаждали трехкратным объемом спирта этилового 96% при комнатной температуре. Выпавшие плотные осадки полисахаридов отфильтровывали, промывали спиртом этиловым, ацетоном и высушивали.

Выделение пектиновых веществ (ПВ). Для получения ПВ использовали шрот сырья, оставшийся после выделения ВРПК. Шрот сырья экстрагировали смесью растворов кислоты щавелевой и аммония оксалата 0,5% (1:1) в соотношении 1:20 при 80°С в течение 2,5

часов. Повторное извлечение проводили дважды в соотношении 1:10. Экстракты концентрировали, диали-зовали и осаждали спиртом этиловым 96% (1:5). Выпавшие осадки ПВ отфильтровывали, промывали спиртом этиловым и высушивали.

Выделение гемицеллюлозы А. Шрот сырья, оставшийся после выделения ПВ, использовали для получения гемицеллюлозы А. Для этого его заливали пятикратным объемом 10% водного раствора натрия гидроксида и оставляли при комнатной температуре на 12 часов. Затем процеживали через четыре слоя марли. К полученному фильтрату прибавляли два объема кислоты уксусной. Образовавшийся осадок отфильтровывали через фильтр. На фильтре получался осадок геми-целлюлозы А в виде зеленовато-коричневой массы.

Выделенные и высушенные фракции представляют собой гигроскопичные аморфные порошки, процентное соотношение представлено в табл. 1. ВРПК представляет собой аморфный порошок темно-коричневого цвета, ПВ - порошок зеленовато-кремового цвета, гемицеллюлоза А - темно-зеленого. Все фракции хорошо растворимы в воде.

Таблица 1

Процентное содержание фракций полисахаридного комплекса травы пупавки красильной

Фракции полисахаридного комплекса, % от массы сырья

водорастворимый полисаха-ридный комплекс пектиновый комплекс гемицеллюлоза А

7,82±0,70 3,23±0,31 3,03±0,30

Кислотный гидролиз фракций. Для определения мономерного состава ВРПК, ПВ и гемицеллюлозы А проводили гидролиз кислотой серной. Навески поли-сахаридных комплексов 0,05 г помещали в ампулы емкостью 5-10 мл, прибавляли 2,5 мл раствора кислоты серной 2 М, запаивали ампулы и проводили гидролиз при температуре 100-105°С в течение 6 часов для ВРПК, 24 часов для ПВ и 48 часов для гемицеллюлозы А. Содержимое ампул переносили в стаканчики, промывали ампулы 5 мл воды очищенной, нейтрализовали бария карбонатом по универсальному индикатору до нейтральной реакции. Растворы фильтровали, фильтры промывали водой очищенной до объема фильтратов 10 мл. К полученным растворам прибавляли 3 объема спирта этилового 96% при исследовании ВРПК, ге-мицеллюлозы А и 5 объемов для ПВ, тщательно перемешивали и образовавшиеся осадки отфильтровывали через 2 ч. Фильтраты упаривали на кипящей водяной бане до получения объема около 0,5 мл (раствор А).

Гидролиз полисахаридов на мономеры подтверждали с реактивом Фелинга.

Хроматографирование нейтральных моносахаридов (раствор А) осуществляли методом восходящей бумажной хроматографии в системе н-бутанол - пиридин - вода (6:4:3) в течение 4-5 часов с образцами нейтральных моносахаридов (1% водные растворы галактоза, глюкоза, рамноза, фруктоза, арабиноза). Насыщали камеру в течение 30 мин., хроматографиро-вали около 2 ч., высушивали, затем обрабатывали ани-линфталатным реактивом и выдерживали в сушильном шкафу при 100оС в течение 10 мин.

Пятна сахаров проявлялись в виде красноватых пятен различных оттенков (рис. 2). В ВРПК травы пупавки красильной идентифицированы арабиноза (Ш 0,63), глюкоза (Ш 0,36) и галактоза (Rf 0,28); в составе ПВ - фруктоза (Rf 0,41), в составе гемицеллюлозы А -фруктоза (Ш 0,40) и рамноза (Ш 0,71).

0

I

Г)

§

о

12345 6 78

Рис. 2. Схема хроматограммы продуктов кислотного гидролиза полисахаридных фракций, где 1 - арабиноза, 2 - галактоза, 3 - глюкоза, 4 - рамноза, 5 - фруктоза, 6 - ВРПК, 7 - ПВ, 8 - гемицеллюлоза А

ния органических кислот в сборе витаминном // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016. № 1(14). С. 156-159.

[4] Тринеева О.В., Сливкин А.И., Воропаева С.С. Определение органических кислот в листьях крапивы двудомной // Вестник ВГУ. Серия Химия. Биология. Фармация. 2013. № 2. С. 215-219.

[5] Федосеева Л.М. Изучение дубильных веществ подземных и надземных вегетативных органов бадана толстолистного (Bergenia crassifolia (L.) Fitsch.), произрастающего на Алтае // Химия растительного сырья. 2005. №3. С. 45-50.

[6] Государственная фармакопея Российской Федерации: т. 2. 13-е изд. М., 2015. 1004 с. URL: http://193.232.7.120/feml/clinical_ref/pharmacopoeia_2/H TML/

[7] Бубенчикова В.Н., Азарова А.В. Состав и отхаркивающая активность водорастворимых полисахаридных комплексов девясила иволистного // Научные ведомости БелГУ. Серия: Естественные науки. 2011. Т.15, № 9-2(104). С. 189-191.

[8] Гуляев Д.К., Белоногова В.Д., Рудакова И.П. Состав и биологическая активность полисахаридов побегов и листьев малины обыкновенной (Rubus Idaeus L.) // Традиционная медицина. 2017. Вып. 4(51). С. 39-42

Заключение. В образце травы пупавки красильной, заготовленном в Пермском крае, установлены преобладающие органические кислоты (винная и лимонная) и гидролизованные дубильные вещества; содержание органических кислот в пересчете на лимонную составило 5,76±0,41%, дубильных веществ в пересчете на танин 12,90±0,59%; выделенные фракции полисаха-ридного комплекса представляют собой аморфные порошки, определено, что в составе водорастворимого полисахаридного комплекса мносахариды глюкоза, галактоза и арабиноза, пектиновых веществ - фруктоза, гемицеллюлозы А - фруктоза и рамноза.

[1]

[2]

[3]

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

Иллюстрированный определитель растений Пермского края; под ред. С.А. Овеснова. Пермь: Кн. мир, 2007. 743 с.

Касьянов З.В., Буканова Е.В. Товароведческая оценка сырья пупавки красильной, заготовленного в разные фазы вегетации // Журнал научных статей «Здоровье и образование в XXI веке». 2017. Т.19, №3. С. 132-134. Жилкина В.Ю., Марахова А.И., Станишевский Я.М. Изучение качественного и количественного содержа-

PHYTOCHEMICAL ANALYSIS OF ANTHEMIS TINCTORIAS HERB

Kasyanov Z.V., Nepogodina E.A., Bukanova E.V., Starikova A.N.

Perm state pharmaceutical academy, Perm, Russian Federation

Annotation. Article presents results of herb phytochemical analysis of some biologically active agent groups of Anthemis tinctoria as perspective herb of traditional medicine. Qualitative reactions and thin layer chromatography method have confirmed availability of organic acids, wine and lemon acids are authentically established. The method of indirect electrometric titration has determined the average content of organic acids in terms of lemon which has made about 6%. By qualitative reactions it is established that hydrolyzed tannins content in golden chamomille herb mainly. Quantitative content of tannins (about 13%) has determined by permanganate titration. The polysaccaride complex fractions which represent amorphous powders is allocated by Kochetkov N.K. technique: a water-soluble complex (about 8% of the of raw materials mass) has dark brown color, pectinaceous substances (about 3%) have greenish and cream color, hemicellulose A (about 3%) is dark green. Glucose, galactose and arabinose are in the content of water-soluble

complex, fructose is in content of pectinaceous substances, fructose and rhamnose are in hemicellulose A content. The obtained data can be used at complex pharmacognostic studying ofAnthemis tinctoria for the purpose of subsequent development of medicines on basis of its raw materials.

Key words: anthemis tinctoria, organic acids, tannins, polysaccharides.

REFERENCES [5]

[1] The illustrated determinant of Perm Krai plants; editor: Ovesnov S.A. Perm, 2007. 743 p.

[2] Kasyanov Z.V., Bukanova E.V. Merchandising assessment [g] of Anthemis tinctoria raw materials prepared in different phases of vegetation // Zhurnal nauchnyh statej «Zdorov'e i obrazovanie v XXI veke». 2017. Vol.19, №3. P. 132-134.

[3] Zhilkina V.Ju., Marahova A.I., Stanishevskij Ja.M. Study- [7] ing of the qualitative and quantitative content of organic acids in vitamin mixture // Razrabotka i registracija le-karstvennyh sredstv. 2016. № 1(14). P. 156-159.

[4] Trineeva O.V., Slivkin A.I., Voropaeva S.S. Definition of [g] organic acids in leaves of stinging nettle // Vestnik VGU. Serija Himija. Biologija. Farmacija. 2013. № 2. P. 215-219.

Fedoseeva L.M. Tannins studying of underground and elevated vegetative bodies of a leather bergenia (Bergenia crassifolia (L.) Fitsch.), growing in Altai // Himija ras-titel'nogo syr'ja. 2005. №3. P. 45-50. State pharmacopeia of Russian Federation. Vol. 3. 13th iss. Moscow 2015. 1004 p. URL: http://193.2327.120/feml/clinical_ref/pharmaco-poeia_2/HTML/ (date of address: 31.01.18) Bubenchikova V.N., Azarova A.V. Structure and expectorant activity of water-soluble polysaccaride complexes of willowleaved inula // Nauchnye vedomosti BelGU. Serija: Estestvennye nauki. 2011. Vol.15, №2 9-2(104). P. 189-191. Guljaev D.K., Belonogova V.D., Rudakova I.P. Structure and biological activity of polysaccharides of sprouts and leaves of european raspberry (Rubus Idaeus L.) // Tradi-cionnaja medicina. 2017. Vol. 4(51). P. 39-42