СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ СТАБИЛЬНОЙ МЯГКОЙ ГЕЛЕВОЙ КАПСУЛЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ МИКРОИНКАПСУЛИРОВАННЫЕ ПРОБИОТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ
METHOD OF PRODUCING STABLE SOFT GEL CAPSULE CONTAINING MICRO-ENCAPSULATED PROBIOTIC BACTERIA

[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета предварительной заявки на патент США № 61/372,350, поданной 10 августа 2010 года, полное описание которой включено здесь посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение относится к способу изготовления мягкой гелевой капсулы, содержащей микроинкапсулированные пробиотические бактерии, и к продукту, изготовляемому в соответствии с этим способом. Более конкретно, продукт настоящего изобретения является стабильным при комнатной температуре в течение по меньшей мере 24 месяцев.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Пробиотики являются диетическими адъювантами на основе микробов, которые благотворно влияют на физиологию хозяина модуляцией мукозного и системного иммунитета, а также улучшением функции кишечника и микробного баланса в кишечнике (Naidu, A.S., et al. (1999), Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB). Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 39:3-126). Различные алиментарные (питательные) и терапевтические эффекты приписывались этим пробиотикам, в том числе: модуляция иммунного ответа, снижение концентраций сывороточного холестерина, улучшение симптомов непереносимости лактозы, увеличение устойчивости к инфекционным кишечным заболеваниям, уменьшение продолжительности диареи, уменьшение кровяного давления и помощь в предотвращении рака ободочной кишки.
[0004] Однако, для проявления этих благотворных эффектов на хозяине, пробиотики должны сохранять их жизнеспособность и достигать толстой кишки в больших количествах (Favaro-Trindade, C. S., et al. (2002), J Microencapsulation 19(4):485-494)). Эффективные пробиотические бактерии должны быть способны выживать в условиях желудка и осуществлять колонизацию кишечника, по меньшей мере временно, прикреплением к кишечному эпителию (Conway, P. (1996), Selection criteria for probiotic microorganisms. Asia Pacific J. Clin. Nutr 5:10-14).
[0005] Молочнокислые бактерии или лактобациллы являются наиболее часто используемым пробиотиком для включения в такие молочные продукты, как йогурты, ферментированное молоко и ферментированные кефиры, и их применение непрерывно становится все более широко распространенным. Например, в настоящее время их добавляют в формы диетических добавок, такие как порошки, капсулы и таблетки. Бифидобактерии и стрептококки являются также обычно используемыми пробиотическими микроорганизмами. Молочнокислые бациллы обычно требуют эффективной системы доставки, которая сохраняет пробио-функциональные активности (т.е. адгезию/сохранение в кишечнике, продуцирование бактериоцинов/ферментов) после их восстановления (Salminen, S., et al. (1996), Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70:347-3581). Кроме того, в дополнение к увеличению жизнеспособности in vivo и продолжительности жизни в желудочно-кишечном тракте, пролонгированный срок хранения при комнатной температуре остается проблемой в изготовлении эффективных коммерческих продуктов. Хотя было показано, что лиофилизация пробиотических бактерий является эффективным способом консервирования и доставки пробиотиков, несколько физико-химических факторов, таких как влажность, аэрация (доступность кислорода), обработка (т.е., перемешивание) и температура могли бы ухудшать жизнеспособность клеток и, соответственно, срок хранения.
[0006] Стабильность, жизнеспособность (т.e., содержание жизнеспособных микробов) и качество продуктов, содержащих пробиотические бактерии, были проблематичными, как свидетельствовала научная литература. В одном исследовании, касающемся йогуртов, эти эксперименты показали, что 3 из 6 тестируемых продуктов не содержали следов живых микроорганизмов и два содержали лишь низкие концентрации их. Shah (2000) Journal of Dairy Science, 83(4):894-907. Сходные сообщения обнаруживались в отношении продуктов, содержащих пробиотические бактерии, распределенные в твердых лекарственных формах, таких как порошки, капсулы и таблетки. Преимущественными проблемами для стабилизации пробиотических бактерий являются активность воды, физический стресс обработки и температуры. Проблемой было также применение защитных мер, таких как покрытия, которые будут высвобождать пробиотические бактерии в подходящем участке доставки в теле и позволять пробиотику осуществлять колонизацию. Подходящая доставка и колонизация в имеющих покрытия бактериях недавно была подтверждена в недавно опубликованном исследовании (Del Piano, M., et al. (2010, Evaluation of the intestinal colonization by microencapsulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains, Journal of Clinical Gastroenterology, 44 Supp. 1: S42-6.)
[0007] Для увеличения жизнеспособности и срока хранения пробиотиков использовали масляные суспензии. Например, публикация заявки на патент США № 2004/0223956 описывает композицию, содержащую пробиотические бактерии, суспендированные в съедобном масле и, необязательно, инкапсулированные в состоящей из двух частей капсуле с твердой оболочкой.
[0008] Кроме того, специалисты, квалифицированные в данной области, пытались использовать пробиотические микросферы для увеличения жизнеспособности и срока хранения. Например, публикация заявки на патент США № 2005/0266069 описывает пробиотические микросферы, имеющие сердцевину из пробиотических бактерий и целлюлозный эксципиент, покрытый агентами для покрытия и пластификаторами.
[0009] Опыт работы давно показал, что фармацевтические средства или другие компоненты для потребления человеком или животным могут быть безопасным и удобным образом упакованы в твердую или мягкую желатиновую (мягкую гелевую) оболочку.
[0010] Заполненные неразъемные мягкие капсулы или мягкие гелевые капсулы были широко известны и использовались в течение многих лет и для различных целей и способны удерживать жидкий заполняющий материал. Более часто, мягкие гелевые капсулы используют для заключения или содержания потребляемых внутрь материалов, таких как витамины, минеральные вещества, фруктовые и ботанические экстракты и фармацевтические средства в жидком заполнителе или носителе.
[0011] Инкапсулирование в мягкую капсулу раствора или дисперсии пищевого или фармацевтического агента в жидком носителе обеспечивает многие преимущества в сравнении с другими лекарственными формами, такими как прессованные, имеющие покрытия или не имеющие покрытия твердые таблетки, или объемные жидкие препараты. Инкапсулирование раствора или дисперсии делает возможной точную доставку лекарственного средства на один прием. Мягкие капсулы обеспечивают лекарственную форму, которая легко проглатывается и не должна ароматизироваться, хороший кислородный барьер (т.е. низкую проникаемость кислорода через оболочку капсулы) и защиту от подделывания. Мягкие капсулы также более легко транспортируются, чем пищевые продукты и жидкости, такие как йогурт и молоко.
[0012] Пробиотики являются коммерчески доступными в бесшовных или мягких желатиновых капсулах. Bifa-15™ (Eden Foods, Inc., Clinton, Mich.) является бесшовной микроинкапсулированной системой доставки бифидобактерий, претендующей на содержащей, как заявлено, три миллиарда бактерий. Эти капсулы смешаны с олигосахаридами, подсластителями и ароматизаторами и представлены в упакованных индивидуально, однодозовых алюминиевых тубах. Содержимое выливают в рот при условии, что капсулы проглатываются целиком и не жуются. Ultra-Dophilus™ (Nature's Plus, Melville, N.Y.) является мягкой желатиновой капсулой общепринятого размера, содержащей два миллиарда жизнеспособного лиофилизированного L. acidophilus. Probiotocsl2Plus™ являются мягкими капсулами, содержащими 12 штаммов молочно-кислых бактерий с целью эффективности 900 колониеобразующих единиц в момент приготовления, без необходимости хранения в рефрижераторе. Хотя каждый продукт проявляет жизнеспособность во время изготовления, нет гарантии того, что заявленное в этикетке требование будет удовлетворяться после хранения при комнатной температуре, например 22-25°C, в дальнейшем. Сходные проблемы в поддержании жизнеспособности в пробиотиках, содержащихся в желатиновых капсулах, являются также очевидными из патентной литературы.
[0013] Мягкие гелевые капсулы в области хранения пробиотических бактерий были в значительной степени безуспешными. Составы мягких гелевых капсул не поддерживали желаемой жизнеспособности, часто измеряемой в колониеобразующих единицах (CFU), для требуемого срока хранения этого продукта (обычно 2 лет), особенно при комнатной температуре. Жизнеспособность пробиотических бактерий имела тенденцию слишком быстрого снижения, чтобы быть успешной. Считается, что это обусловлено, отчасти, высокой водной активностью Aw (свободной воды) в среде мягкого геля. Этот Aw-градиент связан с самим процессом изготовления мягкой гелевой капсулы (особенно с фазой инкапсулирования). Во время этой фазы некоторая часть воды, присутствующая в оболочке капсулы, мигрирует в препарат, содержащий пробиотические бактерии, свободная вода активирует пробиотические бактерии, и вскоре приводит к их гибели.
[0014] Кроме того, способ изготовления мягкой гелевой капсулы создает проблему стабильности пробиотических бактерий в этой мягкой гелевой капсуле, так как эти пробиотические бактерии могут подвергаться внешнему воздействию, даже если они покрыты оболочкой, в результате чего уменьшается жизнеспособность и стабильность.
[0015] Таким образом, имеется потребность в обеспечении увеличенной жизнеспособности и стабильности пробиотических бактерий в продуктах при пролонгированном хранении при комнатной температуре, так как это продолжает создавать проблему для промышленности. В частности, имеется потребность в стабильной мягкой гелевой капсуле, содержащей пробиотические бактерии, имеющие увеличенные жизнеспособность и срок хранения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0016] Данное изобретение относится к способу изготовления мягкой гелевой капсулы, содержащей микроинкапсулированные пробиотические бактерии, предусматривающему стадии (а) обеспечения микроинкапсулированных пробиотических бактерий по меньшей мере с одним покрытием, содержащим по меньшей мере один растительный липид, имеющий температуру плавления от 35°C до 75°C; (b) суспендирования этих микроинкапсулированных пробиотических бактерий в суспендирующем препарате с получением заполнителя; (c) смешивания этого заполнителя при низкой интенсивности и низкой температуре с получением смешанного заполнителя; (d) уменьшения агломератов микроинкапсулированных пробиотических бактерий в этом смешанном заполнителе с получением деагломерированного заполнителя; и (e) инкапсулирования деагломерированного заполнителя в мягкой гелевой капсуле, где сохраняется целостность покрытия микроинкапсулированных пробиотических бактерий. В одном предпочтительном варианте осуществления, этот процесс проводят при контроле подвергания действию кислорода, и в следующем предпочтительном варианте осуществления, мягкая гелевая капсула, содержащая микроинкапсулированные пробиотические бактерии, является стабильной в течение по меньшей мере приблизительно 24 месяцев при комнатной температуре. В одном определенном варианте осуществления, агломераты микроинкапсулированных пробиотических бактерий уменьшают измельчением смешанного заполнителя при температуре ниже приблизительно 33°C. В другом предпочтительном варианте осуществления, эти микроинкапсулированные пробиотические бактерии после инкапсулирования сохраняют средний размер диаметра частиц от приблизительно 150 до приблизительно 250 микрон, и более предпочтительно приблизительно 200 микрон, и каждая микроинкапсулированная пробиотическая бактерия имеет размер диаметра частицы менее приблизительно 500 микрон.
[0017] В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, покрытие микроинкапсулированных пробиотических бактерий содержит по меньшей мере один растительный липид, выбранный из сложного эфира полиглицерина, гидрогенизированного пальмового жира, дипальмитостеарата глицерина, полиглицерил-6-дистеарата и их комбинаций. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, суспендирующий препарат содержит по меньшей мере одно масло, суспендирующий жир или эмульгатор или по меньшей мере одно масло и по меньшей мере один материал, выбранный из суспендирующих жиров, эмульгаторов и их комбинаций.
[0018] Смешивание в способе (процессе) данного изобретения выполняют предпочтительно при комнатной температуре между приблизительно 15°C и приблизительно 32°C и при интенсивности менее приблизительно 3000 об/мин.
[0019] Данное изобретение относится также к пробиотической мягкой гелевой капсуле, изготовленной в соответствии со способом: (а) обеспечения микроинкапсулированных пробиотических бактерий по меньшей мере с одним покрытием, содержащим по меньшей мере один растительный липид, имеющий температуру плавления от 35°C до 75°C; (b) суспендирования этих микроинкапсулированных пробиотических бактерий в суспендирующем препарате с получением заполнителя; (c) смешивания этого заполнителя при низкой интенсивности и низкой температуре с получением смешанного заполнителя; (d) уменьшения агломератов микроинкапсулированных пробиотических бактерий в этом смешанном заполнителе с получением деагломерированного заполнителя; и (e) инкапсулирования деагломерированного заполнителя в мягкой гелевой капсуле, где поддерживается целостность покрытия микроинкапсулированных пробиотических бактерий.
[0020] В некоторых вариантах осуществления, пробиотическую мягкую гелевую капсулу готовят в соответствии со способом, проводимым при регуляции подвергания действию кислорода, и она является стабильной в течение по меньшей мере приблизительно 24 месяцев при комнатной температуре.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0021] Данное изобретение пытается решить проблему в данной области развитием способа изготовления стабильной мягкой гелевой капсулы, содержащей микроинкапсулированные пробиотические бактерии, которая увеличивает жизнеспособность пробиотических бактерий. Авторы настоящего изобретения разработали способ данного изобретения для изготовления мягкой гелевой капсулы, содержащей микроинкапсулированные пробиотические бактерии, которые сохраняют лучшую стабильность при комнатной температуре и средний размер диаметра частиц приблизительно 200 микрон, причем каждая микроинкапсулированная пробиотическая бактерия имеет размер диаметра частиц, меньший, чем приблизительно 500 микрон.
[0022] Первый вариант настоящего изобретения относится к способу изготовления мягкой гелевой капсулы, предусматривающий стадии: (а) обеспечения микроинкапсулированных пробиотических бактерий по меньшей мере с одним покрытием, содержащим по меньшей мере один растительный липид, имеющий температуру плавления от 35°C до 75°C; (b) суспендирования этих микроинкапсулированных пробиотических бактерий в суспендирующем препарате с получением заполнителя; (c) смешивания этого заполнителя при низкой интенсивности и низкой температуре с получением смешанного заполнителя; (d) уменьшения агломератов микроинкапсулированных пробиотических бактерий в этом смешанном заполнителе с получением деагломерированного заполнителя; и (e) инкапсулирования деагломерированного заполнителя в мягкую гелевую капсулу, где поддерживается целостность покрытия микроинкапсулированных пробиотических бактерий.
[0023] Способ первого варианта осуществления настоящего изобретения предусматривает стадию обеспечения микроинкапсулированных пробиотических бактерий по меньшей мере с одним покрытием, содержащим по меньшей мере один растительный липид, имеющий температуру плавления от 35°C до 75°C. Целью покрытия пробиотических бактерий является исключение контакта между пробиотическими бактериями и свободной водой, которая мигрирует из оболочки мягкой гелевой капсулы в препарат внутреннего заполнителя. Пробиотические бактерии могут быть покрыты с использованием любого известного способа, включающего в себя, но не ограничивающегося ими, способ с псевдоожиженным слоем, имеющим верхний и/или нижний распылитель, или другие способы на основе рН-индуцируемой флокуляции. Термин “микроинкапсулированные” означает в данном контексте “покрытые композицией”.
Обычно, имеется в виду, что микроинкапсулирование включает в себя покрытие частиц, имеющих начальный размер менее чем приблизительно один микрон, до приблизительно 200 микрон. Однако покрытие любой приемлемой толщины, предпочтительно от приблизительно 20 до приблизительно 25 микрон на слой, является подходящим, пока это покрытие является гомогенным и однородным, без каких-либо пробелов и отверстий, и образует подходящий барьерный слой. Для целей настоящего изобретения, обеспечение микроинкапсулированных пробиотических бактерий может выполняться получением микроинкапсулированных пробиотических бактерий, доступных коммерчески, или нанесением на пробиотические бактерии описанного покрытия.
[0024] Любые пробиотические бактерии могут быть использованы в данном изобретении. Пробиотические бактерии могут быть куплены из коммерческих источников или культивированы (выращены) в соответствии с известными способами. Пробиотики обычно принадлежат к родам Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Lactococcus, Pediococcus, Propionibacterium, Leuconostoc и Saccharomyces. В роде Lactobacillus, следующие виды обладают пробиотической активностью: L. acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, группа L. delbrueckii, L. salivarius, L. casei, L. paracasei, группа L. plantarum, L. rhamnosus, L. reuteri, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, L.fructivorans, L. ruminis, L. sakei и Z. vaginalis. В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения, эти пробиотические бактерии выбраны из следующих видов: L. acidophilus, L. crispatus, L. gasseri, группы L. delbrueckii, L. salivarius, L. casei, L. paracasei, группы L. plantarum, L. rhamnosus, L. reuteri, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum, B. adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, B. catenulatum, B. infantis, B. animalis, B lactis, B. longum, B. pseudocatenulatum, группы S. thermophilus, Sacch. cerevisiae и их комбинаций.
[0025] В предпочтительных вариантах осуществления эти пробиотические бактерии, используемые в настоящем изобретении, состоят из одного-двенадцати штаммов, предпочтительно из двух-шести штаммов и, более предпочтительно, трех штаммов. Эти пробиотические бактерии могут находиться в любой твердой форме. Предпочтительно, они находятся в форме дегидратированного порошка, приготовленного лиофилизацией или распылительной сушкой.
[0026] Это покрытие содержит по меньшей мере один растительный липид, который имеет температуру плавления от приблизительно 35°C до приблизительно 75°C, так что это покрытие не плавится, не размягчается или не деградируется в его целостности во время процесса (способа) изготовления мягкой гелевой капсулы, содержащей микроинкапсулированные бактерии, во время хранения этого продукта или при переносе через желудочно-кишечный тракт (желудок или двенадцатиперстную кишку), или при низком рН желудка. Теоретически, мягкая гелевая капсула будет высвобождать заполнитель, содержащий микроинкапсулированные пробиотические бактерии, в теле человека в желудке, и затем ее содержимое доставляется в кишечник; эти пробиотические бактерии будут активироваться только при доставке в кишечник, который имеет подходящий рН для высвобождения пробиотика из покрытия, и затем будут колонизироваться для оптимальной выгоды в этого хозяина. В одном предпочтительном варианте осуществления, этот растительный липид имеет температуру плавления от приблизительно 45°C до приблизительно 65°C, более предпочтительно от приблизительно 50°C до приблизительно 60°C. В предпочтительных вариантах осуществления, этот растительный липид является полиглицерилдистеаратом (таким как Plurol Stearique WL 1009), глицерилпальмитостеаратом (таким как Revel C), гидрогенизированными растительными жирами не-лауринового происхождения и гидрогенизированными пальмовыми жирами, стеарином и их комбинациями. Более предпочтительно, этот растительный липид является сложным эфиром полиглицерина, гидрогенизированным пальмовым жиром, дипальмитостеаратом глицерина или полиглицерил-6-дистеаратом CAS 61725-93-7, также известным как Plurol Stearique WL1009, или их комбинацией.
[0027] Необязательно, эти пробиотические бактерии могут быть покрыты более, чем одним слоем, т.е., двойным, тройным и т.д., причем каждый слой является отдельным и отличающимся покрытием на этих пробиотических бактериях, по меньшей мере с одним из слоев, являющимся комбинацией перечисленных выше липидов. В этом варианте осуществления, каждое покрытие наносят на пробиотические бактерии последовательно. Например, на эти пробиотические бактерии может быть нанесено двойное покрытие. Множественные покрытия могут увеличивать защиту пробиотических бактерий от свободной воды, присутствующей снаружи мягкой гелевой капсулы. Двойное покрытие дополнительно объясняется в находящейся в совместном рассмотрении заявке на патент Италии № RM2009A000104, поданной 9 марта 2009 года, которая включена здесь посредством ссылки.
[0028] Способ первого варианта осуществления настоящего изобретения предусматривает стадии суспендирования микроинкапсулированных пробиотических бактерий в суспендирующем препарате с получением заполнителя. Этот суспендирующий препарат данного изобретения может быть приготовлен в соответствии с любым способом, известным в данной области. Без ограничения какой-либо одной теорией, авторы считают, что этот суспендирующий препарат эффективно ограничивает контакт между микроинкапсулированными бактериями и свободной водой, входящей из оболочки мягкой гелевой капсулы во внутреннее окружение, приводя таким образом к увеличенной жизнеспособности и стабильности пробиотических бактерий. Этот суспендирующий препарат может корректироваться до подходящей толщины для поддержания суспензии порошка и гарантии гомогенной смеси. Специалист с обычной квалификацией в данной области сможет легко определить требуемую величину суспензии и то, как корректировать эту толщину суспензии.
[0029] В одном варианте осуществления данного изобретения, этот суспендирующий препарат содержит по меньшей мере масло, суспендирующий жир или эмульгатор. В другом варианте осуществления, этот суспендирующий препарат содержит по меньшей мере одно масло и по меньшей мере один материал, выбранный из группы, состоящей из суспендирующих жиров, эмульгаторов и их комбинаций. В одном предпочтительном варианте осуществления, суспендирующий препарат состоит по меньшей мере из одного масла и по меньшей мере одного суспендирующего жира; в другом предпочтительном варианте осуществления, этот суспендирующий препарат состоит из по меньшей мере одного масла и по меньшей мере одного эмульгатора; еще в одном предпочтительном варианте осуществления, этот суспендирующий препарат состоит из каждого по меньшей мере одного масла, суспендирующего жира и эмульгатора. В некоторых вариантах осуществления, этот суспендирующий жир используют в качестве загустителя масла и гарантии гомогенности этого суспендирующего препарата.
[0030] Масла, подходящие для применения в данном изобретении, включают в себя, без ограничения, соевое масло, масло канолы, подсолнечное масло, масло макадамии, арахисовое масло, масло из семян винограда, тыквенное масло, льняное масло, масло из семян льна, оливковое масло, кукурузное масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, хвойное масло, конъюгированную линолевую кислоту, миндальное масло, персиковое масло, абрикосовое масло, ореховое масло, рапсовое масло, малиновое масло, черничное масло, масло из семян клюквы, масло из семян граната и масла из семян других фруктов, масло облепихи крушинной, масло чии, масло периллы, диаглицериновое (DAG) масло, полученные из овощей источники омега 3, ферментированные источники эйкозапентаеновой кислоты (EPA), ферментированные источники докозагексаеновой кислоты (DHA), ферментированные источники комбинаций EPA, DHA и других омега 3, в том числе жир рыбы и жир криля, источники гамма-линоленовой кислоты (GLA) и/или стеаридоновой кислоты (SA), фракционированное кокосовое масло и их комбинации. Источники DHA, EPA и ALA включают в себя, но не ограничиваются ими, масла из рыбы, дрожжей или других микроорганизмов или одноклеточных источников, и растительные масла, прежде всего льняное масло, соевое масло и масло канолы. Источники GLA включают в себя, но не ограничиваются ими, масло энотеры, масло семян черной смородины, масло бурачника и масло эхиума.
[0031] Суспендирующие жиры, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают в себя, без ограничения, моноглицериды жирных кислот, диглицериды жирных кислот, пчелиный воск, глицерилмоностеарат, глицерилмонодиолеат, фракционированные производные пальмового масла, гидрогенизированный пальмовый жир, гидрогенизированные производные соевого масла, растительные масла, триглицериды со средней цепью (MCT) и их комбинации.
[0032] Эмульгаторы, подходящие для использования в данном изобретении, включают в себя, без ограничения, лецитин, полисорбаты, моноолеат сорбитана и их комбинации.
[0033] В некоторых вариантах осуществления, этот заполнитель предпочтительно содержит приблизительно 0,5 масс.% - приблизительно 50 масс.% микроинкапсулированных пробиотических бактерий и приблизительно 50 масс.% - приблизительно 99,5 масс.% суспендирующего препарата.
[0034] Способ первого варианта осуществления настоящего изобретения предусматривает стадию смешивания заполнителя при низкой интенсивности и низкой температуре с получением смешанного заполнителя. Это смешивание проводят при низкой интенсивности и низкой температуре, чтобы не нарушить целостности, т.е. не повредить, покрытия пробиотических бактерий, а также целостности клеток пробиотических бактерий. Поддержание целостности покрытия и размера частиц микроинкапсулированных пробиотических бактерий является ключевым аспектом увеличенной жизнеспособности и стабильности пробиотических бактерий, достигаемых настоящим изобретением.
[0035] Целостность клеточных структур пробиотических бактерий и покрытия пробиотических бактерий может анализироваться микроскопическим анализом для определения, остаются ли они интактными и неповрежденными. Комбинация интактной структуры клеток и покрытия приводит к жизнеспособным пробиотическим бактериям, которые способны к колонизации. Эта способность к колонизации может быть измерена общим счетом жизнеспособных бактерий в КОЕ/г и может подтверждаться анализом бактериального состава фекалий после обработки.
[0036] "Низкая интенсивность" относится в данном контексте к смешиванию при скорости менее чем 3000 об/мин (приблизительно 50 Гц). Термин “низкая интенсивность” относится также к выбору типа лопасти, миксера и сита для смешивания. Предпочтительно, тип лопасти, миксер и сито для смешивания выбирают для минимизации сдвигающего стресса на этой суспензии, но также для достижения стабильной гомогенной суспензии и уменьшения агломерации и размера частиц без вызывания повреждения покрытия на этих пробиотических бактериях. Специалист с обычной квалификацией в данной области легко сумеет выбрать подходящий тип лопастей, миксер и сито для смешивания для низкой интенсивности и низкого сдвигающего усилия. Интенсивность смешивания и сдвигающее усилие может регулироваться комбинацией факторов, хорошо понятных специалисту в данной области. Оборудование для смешивания, подходящее для использования в данном изобретении, включает в себя, без ограничения, например, якорные мешалки или статические contra mixing-мешалки с встроенным эмульгирующим/гомогенизирующим оборудованием или без него, и смешивающие сосуды, в том числе Becomixer и смешивающие сосуды Skermann, и миксеры Ross и Silverson, снабженные подходящими лопастями или ситами для смешивания. Термин “низкая температура” относится в данном контексте к температуре ниже приблизительно 33°C. Эту температуру поддерживают ниже приблизительно 33°C, так что пробиотические бактерии поддерживаются неактивными, так что жизненный цикл не начинается, пока эти мягкие гели не проглатываются и температура тела активирует пробиотические бактерии, когда они доставляются в предполагаемый пункт назначения. Сохранение этой температуры на низком уровне поддерживает жизнеспособность и стабильность пробиотических бактерий и покрытия. Предпочтительно, низкая температура смешивания поддерживается от приблизительно 15°C до приблизительно 32°C, более предпочтительно от приблизительно 20°C до приблизительно 30°C и наиболее предпочтительно при приблизительно 25°C.
[0037] Способ первого варианта осуществления настоящего изобретения предусматривает стадию уменьшения агломератов микроинкапсулированных пробиотических бактерий в смешанном заполнителе для получения деагломерированного заполнителя. "Уменьшение агломератов", отчасти, означает уменьшение размера частиц и отделение частиц, которые слиплись вместе. Этот деагломерированный заполнитель предпочтительно является деагломерированным, так чтобы микроинкапсулированные пробиотические бактерии были предпочтительно отделены друг от друга. Подобным образом, этот деагломерированный заполнитель является более предпочтительно гомогенным и однородным препаратом заполнителя, образуемым с регулируемым размером частиц, который позволяет эффективные инкапсулирование и доставку мягких гелевых капсул хорошего качества. Эти частицы микроинкапсулированных пробиотических бактерий должны быть деагломерированы и уменьшены до подходящего размера для инкапсулирования. Деагломерирование может выполняться любым известным способом, но должно проводиться таким образом, чтобы поддерживать целостность покрытия на пробиотических бактериях, так что пробиотические бактерии остаются защищенными от свободной воды, которая мигрировала в мягкую гелевую капсулу, и будут доставлять жизнеспособные пробиотические бактерии к предназначенному местоположению в теле человека. Этот процесс деагломерации предпочтительно проводят таким образом, чтобы поддерживать целостность клеточной структуры пробиотических бактерий, так что они остаются жизнеспособными на протяжении процесса изготовления, хранения и проглатывания и должным образом высвобождаются и активируются в желудке.
[0038] В некоторых вариантах осуществления, уменьшение агломератов выполняют измельчением. В предпочтительных вариантах осуществления, уменьшение агломератов, предпочтительно измельчение, проводят при температурах ниже 33°C и, предпочтительно, при приблизительно 25°C. Кроме того, эту стадию предпочтительно проводят в условиях низкой влажности, что предпочтительно означает влажность ниже приблизительно 20%, и, более предпочтительно, ниже приблизительно 18% влажности. В предпочтительных вариантах осуществления, это уменьшение агломератов, предпочтительно измельчение, разделяет частицы, которые могли агломерироваться в предыдущих стадиях, с получением по существу гомогенного заполнителя.
[0039] В одном определенном варианте осуществления, измельчение выполняют с использованием размалывающей установки с тремя валиками с установкой зазора и скорости, регулируемыми для получения тепла, вводимого в этот заполнитель. Любое другое оборудование, размалывающее или иное, известное в данной области, может быть использовано для уменьшения агломератов, пока температура, энергия, вхождение кислорода и воды регулируются подобным образом для создания тепла, вводимого в заполнитель. Предпочтительно, во время измельчения вхождение воды и кислорода избегается полностью. В одном определенном варианте осуществления, уменьшение агломератов является многофазовым процессом измельчения и деаэрации. Деаэрация может выполняться под вакуумом, который экстрагирует пузырьки воздуха или газа, и этот вакуум будет разрушаться в атмосфере азота или любого подходящего газа, для уменьшения воздействия кислорода. На всех стадиях обработки, описанных здесь, могут предприниматься действия для уменьшения аэрации и влажности заполнителя, для получения инкапсулированного заполнителя с высокой гомогенностью и стабильностью. Если в этом заполнителе улавливается воздух, это может вызывать проблемы окисления, уменьшенной стабильности и проблемы инкапсулирования.
[0040] Уменьшением агломератов называют стандартизацию среднего диаметра частиц микроинкапсулированных пробиотических бактерий и/или деагломерацию агломератов частиц, образуемых во время процесса изготовления. Средний размер диаметра частиц после деагломерации может быть между приблизительно 150 микрон и приблизительно 250 микрон, предпочтительно приблизительно 250 микрон, причем каждая микроинкапсулированная пробиотическая бактерия предпочтительно имеет размер диаметра частицы менее приблизительно 550 микрон, более предпочтительно менее приблизительно 500 микрон, еще более предпочтительно менее приблизительно 400 микрон и наиболее предпочтительно приблизительно 350 микрон и 50 микрон.
[0041] Способ первого варианта настоящего изобретения предусматривает стадию инкапсулирования деагломерированного заполнителя в мягкую гелевую капсулу. Инкапсулирование деагломерированного заполнителя в мягкой гелевой капсуле может выполняться с использованием любого способа или оборудования для изготовления, известного в данной области. Например, мягкие гелевые капсулы могут быть изготовлены с использованием ротационного мундштука машины для инкапсулирования. Кроме того, мягкая гелевая капсула может быть изготовлена из любого материала, известного в данной области. В качестве неограничивающего примера, эта мягкая гелевая капсула может быть изготовлена с использованием стандартной технологии с ротационным мундштуком и включением материалов оболочки для целей жевания или глотания, выбранных из смеси материалов, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, глицерин, природные или модифицированные крахмалы, источники сорбита, воду, технологии VEGICAPS™ SOFT, использующей выбор каррагенана, модифицированного крахмала, глицерина и/или источников сорбита, воды и фосфатов натрия.
[0042] В одном предпочтительном варианте осуществления первого варианта настоящего изобретения, этот способ проводят при регулировании воздействия кислорода. Это выполняется для защиты микроинкапсулированных пробиотических бактерий от окисления и увеличения стабильности этих пробиотических бактерий. Регулирование подвергания воздействию кислорода может предусматривать использование стадий без введения дополнительного кислорода, использование стадий для уменьшения количества присутствующего кислорода и использование стадий для избегания полностью кислорода в них. Эти стадии регулирования подвергания воздействию кислорода могут отличаться одна от другой для каждой стадии способа настоящего изобретения или быть одинаковыми для этих стадий в целом. Регулирование подвергания воздействию кислорода является легко понятным и может проводиться любыми способами, известными квалифицированному в данной области специалисту. В одном определенном предпочтительном варианте осуществления, каждую стадию этого способа проводят в атмосфере азота, т.е. под постоянным слоем азота.
[0043] Необязательно, этот процесс первого варианта осуществления настоящего изобретения предусматривает стадию двойной сушки заполненной мягкой гелевой капсулы. Процесс двойной сушки используют для регулирования процесса высушивания таким образом, что мягкая гелевая капсула не нагревается чрезмерно и пробиотические бактерии активируются. В одном предпочтительном варианте осуществления, двойную сушку проводят с использованием первой стадии помещения мягких гелевых капсул в барабанную сушилку с принудительной вентиляцией. В более предпочтительных вариантах осуществления, эту барабанную сушилку поддерживают при температуре приблизительно 20°C и влажности приблизительно 18% - приблизительно 30%, и предпочтительно приблизительно 20%.
[0044] В одном предпочтительном варианте осуществления, двойную сушку проводят с использованием второй стадии высушивания капсул на лотках, в сушильных шкафах или печах при температуре приблизительно 18°C - приблизительно 25°C, предпочтительно при приблизительно 20°C, и регулировании относительной влажности обычно от приблизительно 8% до приблизительно 20%.
[0045] Обычно специалист с квалификацией в данной области знает, что мягкие гелевые капсулы сушат до желаемых твердости и содержания воды оболочки, специфически подходящих для размера этой капсулы и плотности заполнителя. Эта твердость может быть определена с использованием прибора для определения твердости (твердомера) Bareiss, и содержание воды оболочки может быть определено измерением влажности с использованием способов титрования Карла Фишера.
[0046] В первом варианте осуществления настоящего изобретения, целостность покрытия микроинкапсулированных пробиотических бактерий поддерживается. В предпочтительных вариантах осуществления, агломерация частиц микроинкапсулированных пробиотических бактерий в смешанном заполнителе уменьшается без нарушения целостности покрытия или клеточной структуры пробиотических бактерий в этом покрытии. Важно поддерживать целостность покрытия для удерживания пробиотических бактерий от контактирования со свободной водой в мягкой гелевой капсуле, которое приводит к уменьшенной жизнеспособности. Поддержанием целостности покрытия называют покрытие, которое по существу не было изношено, разорвано или утончено в любом месте на нем, так что эти пробиотические бактерии могли бы приходить в непосредственный контакт с суспендирующим препаратом в капсуле. Нарушением целостности покрытия, напротив, называют покрытие, которое было утончено, изношено, сломано или повреждено любым способом, так что пробиотические бактерии могут приходить в контакт с суспендирующим препаратом в капсуле. Поддержанием целостности клеточной структуры пробиотических бактерий называют целостность клеточной структуры, которая не была деформирована или разорвана. В отличие от этого, нарушением целостности клеточной структуры пробиотических бактерий в покрытии называют деформацию, разрывание, срывание, царапание или скручивание клеточной структуры, так что она ослабляется. Эта нарушенная клеточная структура может приводить к клеткам, которые не способны образовывать колонии в кишечнике при доставке.
[0047] В одном предпочтительном варианте осуществления, микроинкапсулированная мягкая гелевая капсула является стабильной в течение по меньшей мере 24 месяцев при комнатной температуре. Стабильностью этой капсулы называют поддержание колониеобразующих единиц (КОЕ) пробиотических бактерий в капсуле после определенного периода времени. Стабильностью может называться также совпадение с пробиотической активностью (КОЕ/г), указанной на ярлыке продукта, в конце срока хранения. Стабильные мягкие гелевые капсулы сохраняют общее количество жизнеспособных клеток по меньшей мере приблизительно 10% или более первоначальной величины введения на капсулу, или, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 20% первоначальной величины введения на капсулу после приблизительно 24 месяцев при комнатной температуре. В другом варианте осуществления, стабильные мягкие гелевые капсулы сохраняют общее количество жизнеспособных клеток по меньшей мере приблизительно 10% и приблизительно 95% первоначальной величины введения на капсулу, и, более предпочтительно, между приблизительно 20% и приблизительно 85% первоначальной величины введения на капсулу, после приблизительно 24 месяцев при комнатной температуре. Эта первоначальная величина введения на капсулу находится предпочтительно между приблизительно 1 миллиардом и приблизительно 3 миллиардами КОЕ и, более предпочтительно равна 2 миллиардам КОЕ.
[0048] В настоящем документе, “комнатной температурой” предпочтительно называют температуру от приблизительно 15°C до приблизительно 30°C, более предпочтительно от приблизительно 20°C до приблизительно 25°C и влажность от приблизительно 20% до приблизительно 75%, и более предпочтительно от приблизительно 50% до приблизительно 60%. Стабильность при комнатной температуре является важной для потребителей и обычно не обеспечивается в данной области, так как большинство продуктов должны храниться в охлажденном виде для поддержания жизнеспособных пробиотических бактерий.
[0049] В некоторых предпочтительных вариантах осуществления, упаковка пробиотических мягких гелевых капсул обеспечивает увеличенную защиту против воды (влажности), кислорода, света и других токсичных воздействий. Эта упаковка поддерживает и защищает стабильность микроинкапсулированных пробиотических штаммов и других ингредиентов в заполнителе мягких гелевых капсул. Предпочтительная упаковка включает в себя, но не ограничивается ими, блистерную упаковку с подходящими барьерными свойствами, контейнеры из пластика или металла с эксикатором или без эксикатора, и стеклянные сосуды, использующие предпочтительно индукционную герметирующую крышку, с эксикатором или без эксикатора. Предпочтительная блистерная упаковка может включать в себя трехслойную блистерную пленку разных типов, такую как стандартные и высоко-барьерные пленки, включающие в себя, например, трехслойную пленку Flexafarm Sbc (например, PVC 250my+PE 25my+PVDC 150 g/mq sbc категории) и Aquaba-PVC (например, PVC 250my+AQUABA 160 g/mq), Aclar, Alu - Alu форматы, трехслойную блистерную фольгу (OPA) с мягко термообработанным алюминием в центральном положении, другими слоями PVC и полиамида, и комбинированные материалы многослойных блистеров новой генерации.
Предпочтительные пластиковые контейнеры могут быть изготовлены из любых подходящих пластиковых материалов, например, HDPE (полиэтилена высокой плотности), PP (полипропилена) и PET (полиэтилентерефталата) и могут также включать в себя интегрированные или отдельные миниупаковки или пленки дессиканта и/или абсорбера кислорода. Предпочтительные стеклянные сосуды могут быть изготовлены из цветного стекла, индукционно герметизированы, имеют пластиковую или металлическую крышку и обеспечены дессикантом или абсорбером кислорода. Предпочтительные металлические контейнеры могут включать в себя алюминиевые сосуды, пробирки или склянки, которые могут быть индукционно герметизированы, имеют пластиковые или металлические крышки и/или обеспечены дессикантом или абсорбером кислорода.
[0050] Во втором варианте осуществления настоящего изобретения пробиотическую мягкую гелевую капсулу готовят в соответствии со способом: (а) обеспечения микроинкапсулированных пробиотических бактерий по меньшей мере с одним покрытием, содержащим по меньшей мере один растительный липид, имеющий температуру плавления от 35°C до 75°C; (b) суспендирования этих микроинкапсулированных пробиотических бактерий в суспендирующем препарате с получением заполнителя; (c) смешивания этого заполнителя при низкой интенсивности и низкой температуре с получением смешанного заполнителя; (d) уменьшения агломератов микроинкапсулированных пробиотических бактерий в этом смешанном заполнителе с получением деагломерированного заполнителя; и (e) инкапсулирования деагломерированного заполнителя в мягкой гелевой капсуле, где поддерживается целостность покрытия микроинкапсулированных пробиотических бактерий.
[0051] Подробности, отмеченные выше в отношении этих стадий обработки, т.е. покрытия, суспендирования, смешивания, уменьшения агломератов и т.д., являются такими же для этого второго варианта настоящего изобретения, что и для первого варианта настоящего изобретения. Подобным образом, подробности, отмеченные выше в отношении регулирования воздействия кислорода и стабильности мягкой гелевой капсулы первого варианта, являются такими же, что и для второго варианта.
[0052] Данное изобретение не ограничивается любыми конкретными пробиотическими бактериями или суспендирующим препаратом, но и решает проблему поддерживаемой жизнеспособности и стабильности пробиотических бактерий в продуктах, и, в частности, при комнатной температуре. Следующие примеры будут иллюстрировать способ данного изобретения в некоторых из предпочтительных вариантов осуществления. Другие варианты в объеме прилагаемой формулы будут очевидными квалифицированным в данной области специалистам.
ПРИМЕР 1
[0053] Мягкую гелевую капсулу, содержащую микроинкапсулированные пробиотические бактерии, готовили в соответствии с данным изобретением. Lactobacillus plantarum LP01 и Bifidobacterium breve BR03 покрывали в виде одного слоя полиглицерилдистеаратом (Plurol Stearique WL1009) в соответствии со способом, описанным в заявке на патент Италии № RM2009A000104. Для суспендирующего препарата, пчелиный воск расплавляли в соевом масле при приблизительно 65°C. Затем к этой смеси добавляли лецитин сои и этот объединенный препарат охлаждали при менее чем приблизительно 25°C. Эти микроинкапсулированные пробиотические бактерии суспендировали в охлажденном суспендирующем препарате соевого масла, пчелиного воска и лецитина сои и смешивали при менее чем 30°C в течение 10 минут. Таблица 1 ниже показывает количество каждого компонента, присутствующего в этом заполнителе. Затем этот смешанный заполнитель измельчали с использованием машины измельчения с тремя валиками при поддержании температуры ниже 30°C в течение 10 минут и измельченный заполнитель пропускали через сито, имеющее шаг 600 микрон, под вакуумом и под слоем азота для предотвращения окисления этого препарата.
[0054] Затем этот измельченный заполнитель инкапсулировали в мягкую желатиновую капсулу с использованием стандартной машины инкапсулирования с ротационным мундштуком следующим образом: измельченный заполнитель и материал оболочки вносили в отдельные приемные устройства (ресиверы), соединенные с этой машиной. Эта машина изготовляла из расплавленного материала оболочки две полосы твердых лент, которые охлаждали и смазывали смесью MCT и лецитина. Эти полосы направляли в положение двух ротационных мундштуков, имеющих специальные карманы требуемых размера и формы для образования капсулы. Затем продолжающееся противоположное вращение двух противостоящих мундштуков образовывало герметичный шов между двумя лентами, контактирующими с мундштуками, при одновременной инжекции материала заполнителя в корпус образованной таким образом капсулы. Наконец, продолжающееся вращение этих мундштуков отрезает новообразованную капсулу от этой ленты.
[0055] Затем мягкие гелевые капсулы делили на две партии и каждую партию сушили в двух стадиях. Сначала одну партию мягких гелевых капсул сушили стандартным процессом, т.е. помещением в барабанную сушилку с принудительной вентиляцией, с воздухом, принимаемым из наружной среды, при приблизительно 20% R.H. и 20°C в течение 80 минут. Вторую партию мягких гелевых капсул сушили посредством более медленного процесса, т.е. помещали в барабанную сушилку с принудительной вентиляцией, с воздухом, принимаемым из наружной среды, при приблизительно 20% R.H. и 20°C в течение 122,5 минут. В этой второй стадии, капсулы из каждой партии помещали на лотки и укладывали стопками в сушильных шкафах, имеющих специальную вентиляцию сухим и кондиционированным воздухом при приблизительно 20% R.H. и 20°C. Эти мягкие гелевые капсулы сушили до стабилизированной твердости 10 N, измеренной с использованием тестера твердости Bareiss.
[0056] Каждую партию мягких гелевых капсул делили на три группы с одной группой, хранимой в склянках из темного стекла с алюминиевыми крышками, второй группой, хранимой в блистерных тройных мешках, и третьей группой, хранимой в совокупности (“в массе”), в том смысле, что эти мягкие гелевые капсулы хранили в непроницаемых, трехслойных целлофановых пакетиках. Эти три группы мягких гелевых капсул хранили при 25°C и оценивали параметры, которые надежно предсказывают стабильность штаммов посредством срока хранения, после 6 месяцев и после 18 месяцев хранения. Целостность клеточной структуры пробиотических бактерий и покрытия анализировали микроскопическим анализом. Если клеточная структура и покрытие пробиотических бактерий остаются интактными, жизнеспособные пробиотические бактерии способны образовывать колонии. Эту способность измеряют по общему счету жизнеспособных бактерий в КОЕ/г, и она может быть подтверждена анализом состава бактерий в фекалиях после обработки. Может быть изготовлена мягкая гелевая капсула, содержащая микроинкапсулированные пробиотические бактерии, для обеспечения мишени из 2 миллиардов КОЕ на капсулу (в виде суммы этих двух штаммов) при 24 месяцах срока хранения при комнатной температуре. Таблица 3 ниже показывает партии мягких гелевых капсул, которые были приготовлены, и таблицы 4 и 5 показывают результаты оценивания стабильности.
Таблица 1
Ингредиент
Количество на капсулу (мг/капсула)
Lactobacillus plantarum LP01(LMG P-21021) (однослойное покрытие)
5×10<sup>11</sup> КОЕ/кпс*
Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) (однослойное покрытие)
5×10<sup>11</sup> КОЕ/кпс*
Соевое масло
390,0**
Лецитин сои
2,0
Пчелиный воск
58,0**
* Это количество было измеренной эффективностью конкретной партии.** Это количество обеспечивало подходящую толщину суспензии для инкапсулирования.
ПРИМЕР 2
[0057] Измельченный заполнитель для содержания микроинкапсулированных пробиотических бактерий готовили в соответствии с данным изобретением. Lactobacillus plantarum LP01 и Bifidobacterium breve BR03 покрывали одним слоем полиглицерилдистеарата (Plurol Stearique WL1009) в соответствии со способом, описанным в заявке на патент Италии № RM2009A000104. Для суспендирующего препарата соевое масло нагревали приблизительно до 65°C. Затем к этой смеси добавляли лецитин сои и глицерилмоностеарат и этот объединенный препарат охлаждали при менее чем или приблизительно 25°C. Эти микроинкапсулированные пробиотические бактерии суспендировали в охлажденном суспендирующем препарате соевого масла, глицерилмоностеарата и лецитина сои и смешивали при менее чем 30°C в течение 10 минут. Таблица 2 ниже показывает количество каждого компонента, присутствующего в этом заполнителе. Затем этот смешанный заполнитель измельчали с использованием измельчающей машины с тремя валиками при менее чем 30°C в течение 10 минут и этот измельченный заполнитель пропускали через сито, имеющее шаг 600 микрон, в вакууме и под слоем азота.
[0058] Начальную стабильность микроинкапсулированных пробиотических бактерий в измельченном заполнителе тестировали микроскопическим анализом для подтверждения целостности покрытия и клеточной структуры этих пробиотических бактерий. Количество покрытых пробиотических бактерий рассчитывали в виде различия между общим количеством пробиотических бактерий и не имеющих покрытия пробиотических бактерий. Результаты этого теста показали сходную начальную стабильность с результатами начальной стабильности Примера 1, например, отсутствие значимого повреждения клеточной структуры пробиотических бактерий или покрытия. Таким образом, было сделано предположение, что инкапсулированный измельченный заполнитель Примера 2 имеет сходные результаты с результатами Примера 1. Таким образом, Пример 2 не инкапсулировали, или стабильность мягкого геля, содержащего такой заполнитель, исследовали дополнительно.
Таблица 2
Ингредиент
Количество на капсулу (мг/капсула)
Lactobacillus plantarum LP01(LMG P-21021) (однослойное покрытие)
5×10<sup>11</sup> КОЕ/кпс*
Bifidobacterium breve BR03 (DSM 16604) (однослойное покрытие)
5×10<sup>11</sup> КОЕ/кпс*
Соевое масло
429,0**
Лецитин сои
2,0
Глицерилмоностеарат (GMS)
27,2**
* Это количество было измеренной эффективностью конкретной партии.** Это количество обеспечивало подходящую толщину суспензии для инкапсулирования.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1
[0059] Мягкую гелевую капсулу, содержащую микроинкапсулированные пробиотические бактерии, готовили в соответствии со способом Примера 1, за исключением того, что смешанный заполнитель инкапсулировали без подвергания стадии измельчения (уменьшения агломератов). Без измельчения, эти полученные мягкие гелевые капсулы являются капсулами более низкого качества и имеют увеличенную утечку. Дополнительные стадии обработки могут быть добавлены для уменьшения утечки другими путями, но эти стадии могли бы увеличивать расходы до потенциально неприемлемого коммерчески количества.
[0060] Затем эти мягкие гелевые капсулы делили на две партии и каждую часть сушили в двух стадиях. Сначала одну партию этих мягких гелевых капсул сушили стандартным способом, т.е. помещали в барабанную сушилку с принудительной вентиляцией, с воздухом, получаемым из наружной среды, при приблизительно 20% R.H. и 20°C в течение 48 минут. Вторую партию мягких гелевых капсул сушили посредством более медленного процесса, т.е. помещали в барабанную сушилку с принудительной вентиляцией, с воздухом, принимаемым из наружной среды, при приблизительно 20% R.H. и 20°C в течение 122,5 минут. В этой второй стадии, мягкие гелевые капсулы из каждой партии помещали на лотки и укладывали стопками в сушильных шкафах, имеющих специальную вентиляцию сухим и кондиционированным воздухом. Эти мягкие гелевые капсулы сушили до стабилизированной твердости 9 N, измеренной с использованием тестера твердости Bareiss.
[0061] Каждую партию мягких гелевых капсул делили на три группы с одной группой, хранимой в склянках из темного стекла с алюминиевыми крышками, второй группой, хранимой в блистерных тройных мешках, и третьей группой, хранимой без тары. Эти три группы мягких гелевых капсул хранили при 25°C и оценивали параметры, которые надежно предсказывают стабильность штаммов посредством срока хранения, после 6 месяцев и после 18 месяцев хранения. Целостность клеточной структуры пробиотических бактерий и покрытия анализировали микроскопическим анализом. Количество покрытых пробиотических бактерий рассчитывали как различие между общим количеством пробиотических бактерий и количеством не имеющих покрытия бактерий. Если клеточная структура и покрытие этих пробиотических бактерий остаются интактными, жизнеспособные пробиотические бактерии способны образовывать колонии.
[0062] Эту мягкую гелевую капсулу, содержащую микроинкапсулированные пробиотические бактерии, готовили для обеспечения мишени из 2 миллиардов КОЕ на капсулу (в виде суммы этих двух штаммов) при 24 месяцах срока хранения при комнатной температуре. Таблица 3 показывает партии мягких гелевых капсул, которые были приготовлены, и таблицы 4 и 5 показывают результаты оценивания стабильности после 6 и 18 месяцев, соответственно.
Таблица 3
Код
Способ приготовления заполнителя
Двойная сушка
Упаковка
Перваясушка
Вторая сушка
ПРИМЕР 1
С измельчением
Стандартная сушилка
Сушильные шкафы
В массе
Стандартная сушилка
Склянка из темного стекла
Стандартная сушилка
Трехслойный блистер
Медленная сушилка
В массе
Медленная сушилка
Склянка из темного стекла
Медленная сушилка
Трехслойный блистер
ПРИМЕР 2
Только стендовое испытание
Не выполняли
Не выполняли
Не выполняли
Сравнительный пример 1
Без измельчения
Стандартная сушилка
Сушильные шкафы
В массе
Стандартная сушилка
Склянка из темного стекла
Стандартная сушилка
Трехслойный блистер
Медленная сушилка
В массе
Медленная сушилка
Склянка из темного стекла
Медленная сушилка
Трехслойный блистер
Таблица 4
Код упаковки
Способ
Т-нуль, количе-ство жизнеспособ-ных клеток(10<sup>9 </sup>КОЕ/г)
Длительная стабильность при 25°С 6 месяцев*
Все клетки (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
Покрытые клетки (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
% покрытых клеток
Полупериод выведе-ния (дни)
Пример 1 (в массе)
С измельчением/стандартная сушилка
20,3
13,8
13,05
94,6
375
Пример 1 (склян-ка)
19,2
13,2
12,9
97,7
387
Пример 1 (блис-тер)
20,1
14,7
14,5
98,6
463
Пример 1 (в массе)
С измельчением/медленная сушилка
18,9
13,3
13,05
98,1
412
Пример 1 (склян-ка)
20,6
14,8
14,36
97,0
438
Пример 1 (блис-тер)
19,5
14,2
13,6
95,8
457
Комп. Пр. 1 (в массе)
Без измельчения/стандартная сушилка
19,8
13,4
12,97
96,8
371
Комп. Пр. 1 (склян-ка)
19,3
13
12,45
95,8
367
Комп. Пр. 1 (блис-тер)
21,1
14,8
14,5
98,0
408
Комп. Пр. 1 (в массе)
Без измельчения/медленная сушилка
20,3
12,8
12,15
94,9
314
Комп. Пр. 1 (склян-ка)
19,1
13,3
12,3
92,5
400
Комп. Пр. 1 (блис-тер)
20
13,7
12,9
94,2
383
*Фактическая продолжительность хранения была 209 дней.
Таблица 5
Код упаковки
Способ
Т-нуль, количе-ство жизнеспособ-ных клеток(10<sup>9 </sup>КОЕ/г)
Длительная стабильность при 25°С 18 месяцев*
Все клетки (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
Покрытые клетки (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
% покрытых клеток
Полупериод выведения (дни)
Пример 1 (в массе)
С измельчением/стандартная сушилка
20,3
7
6,7
95,7
365
Пример 1 (склян-ка)
19,2
6,7
6,4
95,5
369
Пример 1 (блис-тер)
20,1
6,6
5,9
89,4
349
Пример 1 (в массе)
С измельчением/медленная сушилка
18,9
6,0
5,5
91,7
338
Пример 1 (склян-ка)
20,6
6,8
6,4
94,1
350
Пример 1 (блис-тер)
19,5
6,2
5,5
88,7
339
Комп. Пр. 1 (в массе)
Без измельчения/стандартная сушилка
19,8
6,1
5,5
90,2
330
Комп. Пр. 1 (склян-ка)
19,3
5,8
5,2
89,7
323
Комп. Пр. 1 (блис-тер)
21,1
5,6
5,3
94,6
293
Комп. Пр. 1 (в массе)
Без измельчения/медленная сушилка
20,3
5,8
5,3
91,4
310
Комп. Пр. 1 (склян-ка)
19,1
6,3
6,0
95,2
350
Комп. Пр. 1 (блис-тер)
20
5,5
5,2
94,5
301
*Фактическая продолжительность хранения была 560 дней.
[0063] Данные по стабильности после 6 месяцев, показанные в Таблице 4, и после 18 месяцев в Таблице 5 иллюстрируют, что стабильность пробиотических бактерий в мягких гелях после измельчения является в основном более высокой, чем стабильность пробиотических бактерий в пробах, которые не измельчались, и измельчение имеет большее влияние на стабильность, чем тип сушки. Каждый из выбранных типов упаковки обеспечивал подходящую защиту против окисления и других потенциальных вредных действий на стабильность. Таблица 4 показывает также, что при 6 месяцах остается высокий процент имеющих покрытие клеток (>90%). Подобным образом, Таблица 5 показывает, что высокий процент имеющих покрытие клеток (>88%) остается в каждом типе упаковки, тестированном при 18 месяцах. Это предполагает, что жизнеспособные клетки, присутствующие даже после 18 месяцев, были очень здоровыми.
[0064] Кроме того, результаты, представленные выше, показывают, что измельчение в соответствии с данным изобретением не вызывает большего повреждения покрытия на пробиотических бактериях, чем приготовление способом без измельчения (Сравнительный Пример 1). Поскольку измельчение является важной стадией в способе приготовления мягкой гелевой капсулы, которая является коммерчески приемлемой, например, для сохранения приемлемых расходов, уменьшения утечки и т.д., измельчение без повреждения покрытия на пробиотических бактериях является важным преимуществом данного изобретения.
ПРИМЕР 3
[0065] Мягкую гелевую капсулу, содержащую микроинкапсулированные пробиотические бактерии, готовили в соответствии со способом Примера 1, но в полном масштабе партий. Эти мягкие гелевые капсулы смешивали с использованием оборудования полномасштабного смешивания. Заполняющий материал деаэрировали в вакууме и вакуум разрушали под азотом. Этот способ облегчает избегание уловленного газа (в основном кислорода) в конечном продукте, что, в свою очередь, приводит к уменьшенному окислению любого потенциального оставшегося кислорода после инкапсулирования. Кроме того, этот способ помогает гарантировать однородность содержания дозы между капсулами. Затем этот заполняющий материал инкапсулировали и сушили с использованием стандартного способа, т.е. помещением этих мягких гелевых капсул в барабанную сушилку с принудительной вентиляцией из наружной среды, при приблизительно 20% R.H. и 20°C в течение 135 минут. Во второй стадии сушки мягкие гелевые капсулы из каждой партии помещали на лотки и укладывали в сушильных шкафах, имеющих специальную вентиляцию сухим и кондиционированным воздухом. Эти мягкие гелевые капсулы сушили до стабилизированной твердости 9 N, измеряемой при помощи тестера твердости Bareiss, и меньшей чем 20% ERH (равновесной относительной влажности).
[0066] Эти высушенные мягкие гелевые капсулы делили на три группы с одной группой, хранимой в склянках из темного стекла с алюминиевыми крышками, второй группой, хранимой в карманах трехслойного блистера, и третьей группой, хранимой в пластиковых контейнерах Duma. Эти три группы капсул хранили при 25°C в течение 3 месяцев и параметры определяли для оценивания их крепости. Целостность клеточной структуры пробиотических бактерий и покрытия тестировали микроскопическим анализом. Количество покрытых пробиотических бактерий рассчитывали как различие между общим количеством пробиотических бактерий и количеством не имеющих покрытия бактерий. Если клеточная структура и покрытие этих пробиотических бактерий остаются интактными, жизнеспособные пробиотические бактерии способны образовывать колонии. Эту мягкую гелевую капсулу, содержащую микроинкапсулированные пробиотические бактерии, готовили для обеспечения мишени из 2 миллиардов КОЕ на капсулу (в виде суммы этих двух штаммов) при 24 месяцах срока хранения при комнатной температуре.
[0067] Таблица 6 показывает обработку, сушку и упаковывание Примера 3. Для тестирования крепости партии Примера 3, брали пробы на протяжении процесса приготовления партии в полном масштабе, а также после 1 месяца и 3 месяцев хранения, чтобы показать увеличенную стабильность, полученную посредством тщательной обработки (Таблица 7) и посредством селективного упаковывания (Таблица 8). Температуру и скорости смешивания тщательно контролировали и подвергали мониторингу.
Таблица 6
Код партии
Способ
Тип первичной сушки
Тип вторичной сушки
Упаковка
Пример 3, полномас-штабнаяпартия
Измельчение и деаэрация
Медленная сушка
Сушильные шкафы
Склянка из темного стекла с алюминиевой крышкой
Пластиковая бутылка
Трехслойный блистер
Таблица 7
Используемыев способе пробы: Приготовление полномасштабной партии
Описание скорости смешивания
Измеренная скорость смешивания
Температура смеси
Теорети-ческое количество жизнеспособных клеток (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
Фактическое количество жизне-способных клеток (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
Суспензия после 10-минутного смешивания
Менее 3000 об/мин (50 гц),
25,6 Гц
23°C
20
18,7
Суспензия после 17-минутного смешивания
Менее 3000 об/мин (50 гц)
32,2 Гц
25°C
20
19,3
Суспензия после просеивания и деаэрации, верхняя часть сосуда
N/A
N/A
25°C
20
19
Суспензия после просеивания и деаэрации, нижняя часть сосуда
N/A
N/A
25°C
20
22
Капсулы после первичной сушки
N/A
N/A
N/A
20
21
Капсулы после вторичной сушки
N/A
N/A
N/A
20
21
Таблица 8
Идентификация пробы
Т-нуль, количество жизнеспособных клеток (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
Продолжительная стабильность при 25°С
1 месяц
3 месяца**
Дни хранения
Количество жизнеспо-собных клеток (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
Количество жизнеспо-собных клеток(10<sup>9</sup>КОЕ/г)
Пр. 3 (блистер)
Все клетки
21
32
19,3
16,5
Все покрытые клетки
17,1
31
16,5
14
% покрытых
81,4
-
85,5
84,8
Пр. 3 (стеклянная бутылка)
Все клетки
18,7
32
17,4
15,1
Все покрытые клетки
15
31
14,7
13,5
% покрытых
80,2
-
84,5
89,4
Пр. 3 (пластиковая бутылка)
Все клетки
19
32
17,8
15,6
Все покрытые клетки
16,1
31
15,4
13,6
% покрытых
84,7
-
86,5
87,2
** Фактическая продолжительность хранения была равна 87 дням.
[0068] Таблица 8 иллюстрирует, что после 1 месяца и после 3 месяцев хранения после увеличения масштаба полной партии остаются более 80% покрытых клеток. При сравнении процента покрытых клеток, остающихся после хранения Примера 1, показанных в Таблицах 4 и 5, с процентом покрытых клеток, остающихся после хранения Примера 3, всегда предполагается некоторое уменьшение процента при увеличении его масштаба. Результаты, достигнутые здесь, были положительными, поскольку более 80% все еще оставались после 3 месяцев хранения (Таблица 8). Таким образом, увеличение до полного масштаба партии не влияло значимо отрицательным образом на жизнеспособность пробиотических бактерий.
ПРИМЕР 4
[0069] Мягкую гелевую капсулу, содержащую микроинкапсулированные пробиотические бактерии, готовили в соответствии со способом Примера 3, за исключением того, что эти три группы с одной группой, хранимой в склянках из темного стекла с алюминиевыми крышками, второй группой, хранимой в блистерных тройных мешках, и третьей группой, хранимой в пластиковых контейнерах Duma, разделяли, каждую, на три подгруппы с одной подгруппой, хранимой при 25°C в течение 3 месяцев, второй подгруппой, хранимой при 30°C в течение 3 месяцев, и третьей подгруппой, хранимой при 33°C в течение 3 месяцев.
Таблица 9
Идентификация пробы
Т-нуль, количество жизнеспособных клеток (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
3-месячные** данные стабильности
25°С
30°С
33°С
Пр. 4 (блистер)
Все клетки
21
16,5
15,0
3,4
Все покрытые клетки
17,1
14,0
12,9
2,7
% покрытых
81,4
84,8
86,0
79,4
Пр. 4 (стеклянная бутылка)
Все клетки
18,7
15,1
13,0
4,1
Все покрытые клетки
15
13,5
11,5
3,8
% покрытых
80,2
89,4
88,5
92,7
Пр. 4 (пластиковая бутылка)
Все клетки
19
15,6
14,0
3,1
Все покрытые клетки
16,1
13,6
12,4
2,8
% покрытых
84,7
87,2
88,6
90,3
**Фактическая продолжительность хранения была равна 87 дням.
Таблица 10
Идентификация пробы
Дни хранения
Т-нуль, количество жизнеспособных клеток (10<sup>9</sup> КОЕ/г)
1-месячные данные стабильности
25°С
30°С
33°С
37°С
Пр. 4 (блистер)
Все клетки
32
21
19,3
18,2
13,9
8,4
Все покрытые клетки
31
17,1
16,5
15,7
12,6
8,1
% покрытых
-
81,4
85,5
86,3
90,6
96,4
Пр. 4 (стеклянная бутылка)
Все клетки
32
18,7
17,4
17
12,8
6,8
Все покрытые клетки
31
15
14,7
14,2
11,3
6,3
% покрытых
-
80,2
84,5
83,5
88,3
92,6
Пр. 4 (пластиковая бутылка)
Все клетки
32
19
17,8
17,3
13,4
6,3
Все покрытые клетки
31
16,1
15,4
15
12
5,9
% покрытых
-
84,7
86,5
86,7
89,6
93,7
[0070] Таблицы 9 и 10 показывают, что температура во время хранения влияет на жизнеспособность пробиотических штаммов, даже когда эффективность покрытия (%) не испытывает воздействия. Таким образом, параметры температуры и энергии во время хранения должны тщательно контролироваться. Затем должно быть понятно, что температура во время других стадий обработки, например, при измельчении, также влияет на жизнеспособность этих штаммов и должна тщательно контролироваться, чтобы оставаться ниже 33°C. Например, Таблица 7 показывает, что во время увеличения партии до полного масштаба, температура заполнителя не превышала 25°C, и этот регулируемый параметр способствовал более долгосрочной стабильности пробиотических штаммов.
[0071] На основании собранных данных, результаты увеличения партии до полного масштаба (Пример 3), подтверждают превосходную надежность способа приготовления мягкой гелевой капсулы данного изобретения. В заключение, следует сказать, что стабильность пробиотических штаммов явно связана с целостностью покрытия, как показано исследованием влияния температуры на стабильность этих штаммов (Пример 4). При повышенных температурах, не имеющие покрытия клетки деградируются и, после 1 месяца при 37°С, оставшиеся живые штаммы являются почти все покрытыми (>90%). Это покрытие предназначено для доставки пробиотического штамма в кишечник и для позволения этому штамму образовывать колонии в кишечнике при температуре тела. Увеличенные температура и влажность могут преждевременно активировать этот пробиотический штамм до того, как он достигнет предназначенного участка колонизации, что может приводить к неуспеху в колонизации в участке-мишени и, в свою очередь, к неуспеху доставки предполагаемого преимущества организму.
[0072] Таким образом, из общего анализа собранных данных следует, что удовлетворительное количество пробиотических бактерий, обработанных в соответствии с данным раскрытием изобретения, будут оставаться жизнеспособными на протяжении срока хранения. На основании этих данных можно было бы предположить, что общее количество жизнеспособных клеток по меньшей мере 2 миллиарда КОЕ на капсулу могло бы оставаться по истечении срока (1 миллиард каждого штамма). Концентрация микроинкапсулированных пробиотических бактерий, в пять раз более низкая чем количество непокрытых бактерий, способна колонизировать кишечник человека с такой же эффективностью. Кроме того, при доставке микроинкапсулированных пробиотических бактерий для предназначенной колонизации в кишечнике, они имеют в 5 раз более высокую вероятность колонизироваться, чем непокрытые пробиотические бактерии. См. Del Piano, M., et al. (201 Evaluation of the intestinal colonization by microencapsulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains, Journal of Clinical Gastroenterology, 44 Supp. 1: S42-6.
[0073] Таким образом, имеются многочисленные преимущества в способе данного изобретения. Полученная мягкая гелевая капсула, содержащая микроинкапсулированные пробиотические бактерии, имеет неожиданную стабильность, например КОЕ, и количество покрытых пробиотических бактерий для лучшей доставки пробиотических бактерий в пищеварительную систему человека.
[0074] Многочисленные изменения, модификации и вариации описанных здесь предпочтительных вариантов будут очевидными для специалистов, квалифицированных в данной области, и ожидается и рассматривается, что все они находятся в рамках идеи и объема настоящего заявленного изобретения. Например, хотя конкретные варианты осуществления были описаны подробно, специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что предыдущие варианты и вариации могут быть модифицированы для включения различных типов заместительных, дополнительных или альтернативных материалов. Таким образом, даже хотя только немногие вариации описаны здесь, должно быть понятно, что применение на практике таких дополнительных модификаций и вариаций и их эквивалентов находится в рамках идеи и объема настоящего изобретения, определенных в следующей формуле изобретения. Все заявки на патенты, патенты и другие публикации, цитируемые здесь, включены посредством ссылки в их полном виде.