Способ экспресс-диагностики воспалительных заболеваний глотки с использованием флюоресцентной спектрометрии и специального алгоритма для оценки морфометрических, метаболических, функциональных изменений тканей в динамике
METHOD FOR RAPID DIAGNOSIS OF INFLAMMATORY PHARYNGEAL DISEASES USING FLUORESCENT SPECTROMETRY AND SPECIAL ALGORITHM FOR ASSESSING MORPHOMETRIC, METABOLIC AND FUNCTIONAL CHANGES IN TISSUES IN DYNAMICS

Область техники
Изобретение относится к медицине: к оториноларингологии, и может быть использовано при проведении экспресс-диагностики воспалительных заболеваний глотки с использованием флюоресцентной спектрометрии и специального алгоритма с применением параметров-индексов, позволяющих оценить основные морфометрические. метаболические» функциональные особенности ткани в динамике и in situ, как in vivo, так и in vitro.
Способ экспресс-диагностики с использованием флюоресцентной спектрометрии и специального алгоритма заключается в применении лазерного излучения различных длин волн (405 нм, 532 нм) для регистрации метаболических, морфометрических и функциональных показателей тканей глотки в норме и при воспалительных заболеваниях в динамике. Эффект флюоресценции может быть использован для повышения эффективности диагностики воспалительных заболеваний глотки; для проведения ускоренной идентификации формы воспалительного заболевания глотки.
Способ направлен на проведение высокочувствительной, неинвазивной экспресс-диагностики воспалительного процесса в глотке in situ в динамике, как in vitro, так и in vivo.
Способ по изобретению позволяет в динамике оценивать индексы, которые иллюстрируют состояние ткани в данный конкретный промежуток времени и позволяют с высокой точностью и чувствительностью (близкой к 100%) охарактеризовать физиологические изменения, происходящие в ткани при воспалении и зарегистрировать структурные ее особенности, а также наличие определенных метаболитов в ней с целью немедленной (быстрой) диагностики и ранней идентификации патологического процесса (для проведения профилактических мер, использования данного метода в качестве скринингового, а также проведения мониторинга лечения, выбора наиболее рационального его вида, коррекции терапии на различных этапах патологического процесса).
На сегодняшний день известно множество способов диагностики воспалительных заболеваний глотки. Основными их недостатками являются относительно невысокая чувствительность, высокая продолжительность, сложность в технике проведения, неадекватность к моменту лечения (несоответствие проводимой терапии стадии воспалительного процесса), невозможность использовать ее in situ, in vivo и in vitro одновременно в данный конкретный промежуток времени и оценивать происходящие в ткани процессы в динамике в экспресс-режиме.
Уровень техники
Известен способ диагностики различных форм хронического тонзиллита (Брудастов Ю.А., Гончар-Зайкин А.П., Дюков Л.А., Рязанов В.Д., Шульга И.А., 2009, патент №2429477). Сущность данного способа заключается в том, что у пациента определяют комплекс показателей микробиоценоза кишечника: содержание бифидобактерий, лактобактерий, кишечной палочки с нормальными свойствами, кишечной палочки с гемолитическими свойствами, кишечной палочки с лактозонегативными свойствами, энтерококков, сапрофитных стафилококков, золотистого стафилококка, грибов рода Candida, сопоставляя их с показателями относительной нормы по балльной шкале. Рассчитывают индекс дисбиоза по специальной формуле. По индексу дисбиоза судят о форме хронического тонзиллита: компенсированной либо декомпенсированной.
Недостатком указанного способа является то, что о форме хронического тонзиллита можно судить косвенно, на основе функции кишечника. Кроме того, способ является довольно трудоемким в выполнении и длительным.
Известен способ дифференциальной диагностики клинической формы хронического тонзиллита, основанный на ультразвуковом исследовании регионарных лимфоузлов (Рычкова И.В., RU 2638429), который используется для проведения, дифференциальной диагностики токсико-аллергической и простой форм хронического тонзиллита с использованием ультразвуковой визуализации регионарных верхнебоковых шейных лимфатических узлов. По размерам и количеству лимфатических узлов определяют клиническую форму хронического тонзиллита, однако при всех преимуществах метода основным недостатком является возможность ошибки при Наличии других сопутствующих заболеваний, вызывающих увеличение размеров и количества лимфатических узлов, то есть, требуется дополнительное обследований пациента для уточнения диагноза; кроме того, не проводится исследования тканей глотки непосредственно in vivo с оценкой всех параметров на морфометрическом, метаболическом, функциональном уровне.
Также известен способ диагностики хронического тонзиллита (патент 2004134651/14, Ливенец В.П., 2006). Способ заключается в регистрации активного сопротивления и электрического параметра с поверхности небных миндалин, по которому проводят диагностику формы хронического тонзиллита. Способ позволяет исследовать функциональное состояние ткани миндалин. Основным недостатком является сложность выполнения техники; также чувствительность и специфичность данной методики значительно уступают таковым при использовании метода флюоресцентной спектрометрии.
Известен способ диагностики хронического тонзиллита, основанный на измерении изменений импеданса сосудистой системы в области небных миндалин (реотонзиллография) (RU 2014103 С1 от 15.06.94). В данном случае электроды накладываются на кожу в зачелюстной области в проекции небных миндалин и на твердое небо по средней линии, записывается реограмма и по величине реографического индекса определяют степень выраженности хронического тонзиллита и тактику лечения. Недостатками этого способа является опосредованное измерение импеданса, на который могут оказывать влияние пульсация со стороны близлежащих крупных сосудов. Использование одного параметра, характерного для функциональных нарушений в небных миндалинах при хроническом тонзиллите, а именно снижения кровоснабжения небных миндалин, может косвенно свидетельствовать о нарушении функции небных миндалин частично либо полностью.
Расположение электродов непосредственно на небных миндалинах при реографии не получило распространения из-за трудоемкости процесса и необходимости длительной их фиксации, необходимой для записи реограммы.
Известен способ измерения электрического параметра непосредственно слизистой оболочки небных миндалин с помощью посеребренных электродов. В данном случае проводится исследование функционального состояния ткани миндалин с целью, качественной ее оценки.
Существенным свойством данного способа является то, что накладывают пассивный, электрод под язык по средней линии, а активный поочередно на поверхность правой и левой небной миндалины и производится измерение электрического параметра. При этой методике производится исследование активного сопротивления при расположении пассивного электрода под языком по средней линии, а активного поочередно на поверхности правой, затем левой небной миндалин. При этом происходит исключение влияния изменений на кожных покровах и в сосудисто-нервном пучке, проходящем в непосредственной близости с небными миндалинами. Также импеданс определяется на частотах 1 кГц и 100 кГц. Значения активного сопротивления определяются и отображаются на цифровом индикаторе. Используются электроды, изготовленные из латуни с посеребрением и регистрирующий блок, определяющий активное биологическое сопротивление. К описанным в литературе недостаткам относятся небольшие чувствительность и специфичность метода, невозможность применения у пациентов с изменениями реологии крови (О.Я. Плепис. География в оториноларингологии, - Л.: Медицина, 1988. С. 50-62.; руководство по оториноларингологии. // Под ред. И.Б. Солдатова. М.: Медицина, 1994. 574 с.; патент RU 2014103 С1 от 15.06.94. Способ диагностики хронического тонзиллита).
Аналогом предлагаемого нового способа является также способ диагностики компенсированной и декомпенсированной форм хронического тонзиллита на основе метода инфракрасной спектрометрии слюны (Портенко Г.М. И соавт., 2005, патент №2261048). Данный способ основан на применении вероятностно-логического обучающего алгоритма бинарного дерева решений CART по показателям инфракрасного спектра слюны и относится к экспресс-методам идентификации и проведения дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита, в сочетании с вероятностной нейронной сетью по энергоинформационному показателю пробы слюны. Однако метод является косвенным в дифференциальной диагностике форм хронического тонзиллита, так как проводится исследование биологической жидкости- слюны, о биохимических изменениях, происходящих в организме, таким образом, можно судить лишь косвенно, то есть диагностика in situ биологического объекта, в данном случае, небных миндалин и других структур глотки, в данной работе не предусмотрена, что не Может нести полную информацию об исследуемом объекте.
Ближайшим прототипом предлагаемого нового способа является способ мониторинга лечения заболевания, включающий флюоресцентную диагностику заболевания, и устройство для его осуществления (Борискова Е.Ю., 2014, патент RU 2511262).
Изобретение относится к области флюоресцентного анализа, а именно к модификациям оптоэлектронного оборудования и методам исследования с его помощью биологических объектов, и может быть использовано для идентификации многокомпонентных систем, в частности, для диагностики заболевания и мониторинга его лечения на основе изменения флуоресцентного отклика биологических жидкостей.
Основным недостатком способа по сравнению с предложенным является возможность его проведения лишь in vitro, а также недостаточная точность, ввиду неполного анализа всех информативных параметров в числовом выражении, позволяющих оценить все составляющие тканей глотки (метаболические, морфометрические, функциональные) на различных стадиях воспалительного процесса и при различных его видах.
Все вышеперечисленные методы обладают значительными полезными свойствами, и преимуществами, однако основной недостаток приводимых способов заключается в трудоемкости выполнения, длительности, относительно невысокой чувствительности и специфичности, а также невозможности использовать метод одномоментно - in vivo, in vitro и in situ (внутри организма, органа и «по месту»), неинвазивно и в экспресс-режиме, в динамике оценивая все основные параметры тканей глотки (метаболические, морфометрические, функциональные).
Сущность изобретения
Предлагаемый способ флюоресцентной спектрометрии с использованием специального алгоритма и индексов является высокочувствительным и точным методом диагностики, так как позволяет регистрировать минимальные изменения в физиологии, морфометрических и метаболических показателях неинвазивно и быстро (в течение нескольких секунд). Основной сложностью является необходимость клинической интерпретации получаемых результатов с использованием данной технологии. Кроме того, данный способ является наискорейшим по сравнению с остальными методами. Заявляемый способ относится к методам экспресс-диагностики с использованием флюоресцентной составляющей и специального алгоритма диагностики с применением индексов, позволяющих оценить морфометрические, метаболические, функциональные изменения, происходящие в тканях глотки в норме и при вовлечении их в воспалительный процесс при хроническом фарингите и хроническом тонзиллите, что позволяет зарегистрировать основные характеристики исследуемых точек с целью дифференциальной диагностики.
Таким образом, способ флюоресцентной спектрометрии в диагностике форм воспалительных заболеваний глотки с использованием специального алгоритма и индексов является точным, неинвазивным, высокочувствительным, позволяющим в динамике in situ, как in vivo, так и in vitro, в экспресс-режиме оценивать характер воспалительного процесса при заболеваниях глотки, каждое из которых характеризуется определенным набором метаболических, структурных, а также функциональных изменений, что позволяет использовать метод с целью дифференциации типа патологического (воспалительного) процесса.
Метод флюоресцентной спектрометрии с использованием специального алгоритма и индексов реализуется на основе применения аппаратно-программных комплексов с длинами волн лазерного излучения 405 нм и 532 нм и программного обеспечения, в которое заложены данные показатели (индексы), позволяющие проводить дифференциальную диагностику воспалительных заболеваний глотки в экспресс-режиме. Расчет индексов подробно приводится ниже в описании. Кроме того, с использованием методики in vitro могут быть зарегистрированы спектральные характеристики микроорганизмов и/или их ассоциатов, их концентрация при воспалительных заболеваниях глотки, что является дополнительным фактором, свидетельствующим о возможности применения данного метода в диагностике воспалительного процесса в глотке, поскольку известно, что при различных формах воспалительных заболеваний глотки встречается различная микрофлора. Таким образом, дополнительно к имеющимся спектральным характеристикам тканей при воспалительных заболеваниях глотки можно определить тип метаболизма: аэробный или анаэробный; тип возбудителя и его концентрацию для назначения рациональной антибактериальной терапии на ранних сроках.
Способ экспресс-диагностики воспалительных заболеваний глотки с использованием флюоресцентной спектрометрии и специального алгоритма дли оценки морфометрических, метаболических, функциональных изменений тканей в динамике
Проблемой, решаемой изобретением, является возможность установления ранних воспалительных изменений в тканях глотки при воспалительном процессе и дифференциации вида воспалительного заболевания глотки для предотвращения заболевания на начальной его стадии, проведения профилактических мер, подбора рациональной терапии и ее мониторинга (оценки эффективности лечения) на всех стадиях воспалительного процесса. С использованием предложенного способа флюоресцентной спектрометрии в совокупности с использованием индексов, характеризующих метаболические, морфометрические, функциональные особенности тканей глотки в норме и при воспалительных заболеваниях, представляется возможным обеспечить ускорение диагностики формы воспалительного заболевания глотки, так как способ позволяет за минимальное время с высокой чувствительностью, неинвазивно, в экспресс-режиме, in situ, как in vivo, так и in vitro с использованием портативного аппаратно-программного комплекса осуществлять идентификацию природы воспалительного процесса, а также его разновидность.
Технический результат - осуществление способа дифференциальной диагностики формы воспалительного заболевания глотки с использованием флюоресцентной спектрометрии и специального алгоритма и индексов, заложенных в программное обеспечение, в совокупности с данными объективного осмотра, а также регистрацией спектральных характеристик ткани небных миндалин и задней стенки глотки в экспресс-режиме in situ, in vivo и in vitro, с использованием высокочувствительного и неинвазивного экспресс-метода.
Способ осуществляется следующим образом: для регистрации спектральных данных используется устройство раман-флюоресцентной диагностики состояния тканей человека в норме и при патологии с длинами волн лазерного излучения 405 нм для измерений in vivo и 532 нм для измерений in vitro, которое включает в себя включает лазер с лазерным фильтром, систему зеркал и линз; систему, собирающую сигнал, исходящий от исследуемого объекта, и отрезающий фильтр; спектрометр с CCD-камерой, отличающийся тем, что спектрометр содержит дополнительно специальные насадки и/или приспособления для экспресс-пробоподготовки объектов для их исследования в жидком, сыпучем, твердом состоянии и/или мазка - «отпечатка», биологической ткани. Спектрометр соединен с компьютером, на котором установлено специальное программное обеспечение, реализующее алгоритмы мониторинга, диагностики и коррекции состояния субъекта и/или биологических тканей человека в норме и при патологии, с помощью специального программного обеспечения производится калибровка, нормировка, вычитание фона и масштабирование получаемых данных и осуществляется установление диагноза состояния субъекта и/или биологических тканей человека, спектрометр соединен с лазером обратной связью, устройство также содержит волоконно-оптический кабель для воздействия лазерным излучением, микроскоп для прецизионной визуализации изображения, а также цифровой флеш-микроскоп с автофокусировкой и подсветкой для микро- и макрообъектов для одновременной визуализации изображения и картины распределения флуоресценции, для исследований in vitro и in vivo. При проведении дифференциальной диагностики форм воспалительных заболеваний глотки in vivo проводится подведение лазерного излучения с длиной волны 405 нм с использованием специального оптоволоконного световода к ткани небных миндалин и задней стенки глотки. Измерение проводится контактным способом после предварительной обработки световода раствором антисептика.
С использованием лазерного излучения с длиной волны 532 нм представляется возможным анализировать в экспресс-режиме in vitro метаболические, морфометрические и функциональные особенности тканей глотки, а также биологических жидкостей пациентов (крови, мочи, слюны и др.) и микробов, вызывающих тот или иной вид воспалительного заболевания глотки, что может быть актуально не только в оториноларингологии, но и в других направлениях клинической медицины.
Проведение способа дифференциальной диагностики формы воспалительного заболевания глотки осуществляется с использованием аппаратно-программных комплексов, работающих на основе длин волн 532 нм (in vitro) и 405 нм (in vivo), что заключается в регистрации измерений- спектральных характеристик ткани в норме и воспалительном процессе в глотке при хроническом тонзиллите (токсико-аллергической форме 1 и токсико-аллергической форме 2) или хроническом фарингите гипертрофической формы контактным, стабильным способом, без освещения, с предварительной обработкой световода. Измерения были проведены в нескольких точках небных миндалин (при тонзиллите): у верхнего полюса, у нижнего полюса, в лакуне, а также в области задней стенки глотки (при фарингите). Всего проводилось от 4 до 10 измерений для получения более точного результата и воспроизводимости спектральных характеристик. Перед каждым измерением проводилась обработка оптоволоконного световода раствором антисептика. Время экспозиции - 1-5 секунд. Затем проводятся видеорегистрация спектра и расчет показателей абсолютной интенсивности флюоресценции, спектральной полуширины, нормированного показателя флюоресценции (нормирование проводится по отношению к интактной точке), индекса аэробности (отношение длины волны 665 нм к длине волны 670 нм), индекса структурированности и состоятельности ткани, характерных особенностей пиков, регистрирующихся на определенных длинах волн и других показателей - информативных параметров для идентификации вида ткани: здоровой ткани либо ткани, пораженной воспалительным процессом, а также идентификации формы воспалительного процесса при хроническом тонзиллите или фарингите. Расчет и интерпретация каждого из вышеперечисленных показателей приводится ниже, включая полный алгоритм диагностики.
В представленном алгоритме анализируются такие показатели, как генерализованный сигнал флюоресценции, характеристики самих пиков: их форма, амплитуда, ширина, длина волны, их количество в норме и при различных формах воспалительных заболеваний глотки, индекс структурированности и состоятельности ткани, индекс аэробности, индивидуальный индекс метаболизма, а также множество дополнительных параметров, которые рассчитываются следующим образом.
На фиг. 1 представлены максимумы флюоресценции для различных флюорохромов (Колтовой Н.А., Флуоресценция в медицине. 2017).
Известно, что каждый вид химического вещества, в том числе различные флюорохромы, имеет максимум флюоресценции на определенных длинах волн, благодаря чему становится возможным идентифицировать его. Данный феномен позволяет регистрировать изменения метаболизма в ткани в динамике с использованием предложенного нового способа на основе регистрации качественного и количественного состава биологического объекта. Особенностью предложенного способа является то, что используется не только сам феномен флюоресценции в качестве диагностического критерия, но и применяются специальный алгоритм диагностики и индексы, которые позволяют охарактеризовать вид воспалительного процесса в тканях глотки в динамике.
Преимущество использования данных индексов в качестве диагностических параметров заключается в том, что они нормируются на интактную точку в пределах исследуемого индивидуума, что позволяет нивелировать систематическую ошибку, связанную с индивидуальными параметрами тканей у каждого исследуемого, что подробно будет описано ниже, после проведения статистической обработки данных исследования.
В связи с тем, что тело человека имеет метамерное строение, и симметричные области иннервируются из одних и тех же ганглиев, так что есть взаимное влияние смежных анатомических зон на кровоток и иннервацию (Александров М.Т., 2008), в качестве интактной точки была выбрана асимметричная точка на коже внутренней поверхности предплечья.
После обработки результатов выяснилось, что интактная точка, несмотря на то, что она является асимметричной, тесно взаимосвязана с исследуемыми точками, что также подтверждает возможность использования предложенного способа диагностики не только на местном, но и на системном уровнях.
На предварительном этапе мы пробовали выбрать в качестве интактных точек те, что были расположены в области головы и шеи, такие как кожа щечной области, губ и т.д., однако при соответствующих измерениях мы наблюдали интерференцию волн, в связи с чем в качестве интактной точки нами была выбрана точка в области кожи внутренней поверхности предплечья (асимметричная точка).
В предварительных исследованиях при отработке методики, было отмечено, что спектры, снятые с поверхности небных миндалин с двух сторон, имели практически идентичные характеристики спектральных кривых, что дополнительно подтверждает не только схожий характер кровотока в данной области, но и системность процесса, вовлекающего симметричные зоны в патологический процесс. Помимо интактной точки мы проводили измерения в 3 исследуемых точках в пределах одного и того же индивидуума. Точка 1 располагалась в области верхнего полюса небной миндалины, точка 2 - в области нижнего полюса небной миндалины, точка 3 - в области лакуны небной миндалины, точка 3 при хроническом фарингите - в области задней стенки глотки, у здоровых добровольцев - точка 3 - в области слизистой оболочки задней стенки глотки при сравнении с группой пациентов с хроническим фарингитом. При сравнении с группой пациентов с хроническим тонзиллитом нами были выбраны точки 1, 2, 3 в области аналогичной локализации у здоровых добровольцев, а именно, в области верхнего полюса, нижнего полюса и лакуны небных миндалин. При сравнении с группой пациентов с хроническим фарингитом точкой 3 была точка на задней стенке глотки. Таким образом, сравниваемые точки во всех группах были идентичными и зависели от локализации патологического процесса. Также в предварительно проведенных исследованиях была доказана, взаимосвязь между рассчитываемыми индексами в интактной точке и исследуемых точках, что позволило использовать данные, полученные в отношении интактной точки, также в целях диагностики.
Величины данных индексов в исследуемых точках рассчитываются следующим образом:
если спектр задается функцией интенсивности от длины волны: F=F(x),
то представленные индексы можно обозначить как интегральные индексы флюоресценции (по всему спектральному диапазону) для функций Intact и Fundus.
Условные обозначения: Intact - интактная точка, в данном случае - кожа внутренней поверхности предплечья, Fundus - точка 1 - у верхнего полюса небной миндалины, Middle - точка 2 - на слизистой оболочке небной миндалины в области нижнего ее полюса, Internal - точка 3 - в лакуне небной миндалины (в случае хронического тонзиллита) и в области задней стенки глотки (при хроническом фарингите).
В проведенных исследованиях выяснилось, что, учитывая различие морфометрической структуры тканей глотки, а также характера метаболитов при различных видах воспалительного процесса в глотке, можно использовать практически бесчисленное множество относительных индексов, характеризующих физиологию происходящих процессов в тканях глотки, однако лишь некоторые из них являются наиболее информативными для проведения диагностики.
В формулах, представленных ниже, указаны описанные обозначения. Все функции заложены в программном обеспечении аппаратно-программных комплексов, использующихся в заявляемом способе.
Представленные выше 3 индекса являются нормированными (на интегральный индекс флюоресценции в интактной точке); данные индексы флюоресценции представлены для точек 1-3: Fundus, Middle, Internal и характеризуют структурированность ткани, ее состоятельность, функциональные и метаболические изменения в ней в норме и при воспалительном процессе в глотке.
Описанные выше 3 индекса обозначены в описании как «нормированный показатель флюоресценции» (далее в тексте «НПФ» или «ИФ»).
Вышеперечисленные четыре индекса для функций Intact, Fundus, Middle, Internal (интактной точки и точек 1-3) обозначены в таблицах 2, 4, 6 как «индекс аэробности» (далее в тексте «ИА»), который позволяет оценить степень преобладания процесса - аэробного или анаэробного, степень оксигенации ткани, а также характер изменения метаболизма в интактной ткани при вовлечении ее в воспалительный процесс.
Как выяснилось в ходе исследования, для тканей глотки в норме и при воспалительных заболеваниях существует бесчисленное множество подобных индексов, на основании которых можно производить расчеты и анализировать спектральные данные, однако наиболее информативными являются вышеописанные индексы аэробности, нормированные показатели флюоресценции, иллюстрирующие степень микробной обсемененности патологического очага, структурированность и состоятельность тканей глотки, стадию воспалительного процесса, что подробно будет проиллюстрировано на примерах, представленных в разделе «Рисунки и чертежи» и описано далее.
Количество рассчитываемых индексов варьирует в зависимости от индивидуальных параметров ткани, регистрируемых на определенных длинах волн (величинах волновых чисел), однако при сравнении данных, полученных в отношении здоровых добровольцев, пациентов с хроническим тонзиллитом и хроническим фарингитом, выяснилось, что наиболее информативным является некоторое конечное число индексов, что было подтверждено в соответствующих исследованиях. Полученные результаты продемонстрированы ниже, как на конкретных примерах, так и в результате проведенной статистической обработки данных.;
Также в норме, при хроническом тонзиллите и хроническом фарингите регистрируются различные метаболиты, которые можно идентифицировать, рассчитав значения индексов по формулам, представленным выше.
Для клинициста важно не только, какие именно метаболиты или микроорганизмы играют роль в развитии воспалительных заболеваний глотки, но и какие изменения в ткани в общем возникают, причем последний аспект при анализе данных в изучаемых группах является более важным, так как позволяет оценить все процессы, происходящие в ткани на морфометрическом, метаболическом, функциональном уровнях.
Алгоритм расчета при использовании предложенного способа и интерпретация каждого из индексов заключаются в следующем (по этапам):
1. регистрация спектральной кривой в интакной точке;
2. регистрация спектральной кривой в исследуемой точке (точки 1-3 в приведенном исследовании);
3. регистрация всех диапазонов длин волн, в которых наблюдаются изменения;
4. выделение наиболее информативных диапазонов длин волн, на которых регистрируются изменения;
5. вычисление по формулам, примеры которых представлены выше, то есть, вычисление значения отношения интегралов общего флюоресцентного сигнала на определенных наиболее информативных длинах волн по отношению друг к другу и к интактной точке;
6. сравнение полученных значений в автоматическом режиме.
7. Выводы: соответствующие значения в выборке здоровых добровольцев отличаются от таковых при хроническом тонзиллите и хроническом фарингите, что подтверждается соответствующими исследованиями, подробно описанными ниже.
Все вышеперечисленные индексы позволяют судить о физиологических, морфометрических, метаболических изменениях в ткани в норме и при воспалительном процессе при хроническом тонзиллите и хроническом фарингите. Оценивая данные индексы с использованием специального программного обеспечения, становится возможным проводить моментальную диагностику типа патологического процесса в тканях ЛОР-органов при воспалительном процессе, проводить мониторинг лечения, оценивать его эффективность, проводить дифференциацию тканей на ранних стадиях заболевания.
При проведении соответствующих исследований для доказательства информативности применения методики флюоресцентной спектрометрии в совокупности со специальными индексами в качестве диагностического метода в отношении воспалительных заболеваний глотки на первом этапе был разработан клинический алгоритм диагностики воспалительных заболеваний глотки.
На втором этапе были определены чувствительность и специфичность метода, которые были близки к 100%. На третьем этапе были выявлены наиболее информативные параметры, характеризующие ткани глотки в норме и при хроническом фарингите, хроническом тонзиллите, которые представляют собой специальные индексы, рассчитывающиеся по алгоритму, описанному ранее.
Разработанный алгоритм диагностики воспалительных заболеваний глотки, позволяющий оценить морфометрические, метаболические, функциональные изменения интактной ткани и ткани, вовлеченной в воспалительный процесс при заболеваниях глотки, может быть использован с целью немедленной идентификации патологического процесса с последующим назначением наиболее рационального лечения и его мониторинга, оценки эффективности на всем протяжении терапии.
Для оценки особенностей спектральных характеристик тканей глотки у здоровых добровольцев и пациентов с хроническим тонзиллитом и хроническим фарингитом были разработаны следующий алгоритм диагностики и методика расчета и выявления информативных ее критериев в отношении воспалительных заболеваний глотки методом флюоресцентной диагностики с использованием специальных индексов для оценки морфометрических, метаболических, функциональных изменений тканей глотки в норме и при патологии:
1. Оценка чувствительности и специфичности методики ЛКД РФС.
2. Оценка показателей мощности флюоресценции в исследуемых точках в норме и при ВЗГ.
3. Оценка индекса аэробности в норме и при ВЗГ в исследуемых точках.
4. Оценка индекса структурированности тканей глотки в норме и при ВЗГ в исследуемых точках.
5. Анализ интенсивности основного сигнала флюоресценции в норме и при ВЗГ в изучаемых точках.
Если интенсивность флюоресценции во всех исследуемых точках отличается не более, чем на 5-10% от референтных значений (при отсутствии воспалительного процесса в глотке), то мы обозначаем данный результат как + (таблица 3). Если интенсивность флюоресценции во всех исследуемых точках отличается не более, чем на 20-30% от референтных значений (при отсутствии воспалительного процесса в глотке), то мы обозначаем данный результат как +- (таблица 3). Если интенсивность флюоресценции во всех исследуемых точках отличается более, чем на 31% от референтных значений (при отсутствии воспалительного процесса в глотке), то мы обозначаем данный результат как -- (таблица 3). Обозначение +++ характерно для референтных значений (таблица 3).
6. При оценке состоятельности ткани мы используем те же обозначения: «++» означает полную структурированность ткани (воспалительного процесса нет, ткань интактна), «+-» означает, что структурированность ткани частичная (процесс компенсированный), «--» используется для обозначения полного нарушения структурированности ткани (декомпенсированный процесс либо выраженные изменения, связанные с воспалительным процессом),
7. По итогам расчетов всех показателей мы оценивали индекс состоятельности тканей в норме и при хроническом тонзиллите (в работе использовалась классификация хронического тонзиллита Б.С. Преображенского - В.Т. Пальчуна), таким образом, обозначение «+++» применялось в отношении интактной ткани, которая была полностью состоятельна,«++-» и «+--» - ткань частично состоятельна, в разной степени, что наблюдается при хроническом тонзиллите токсико-аллергической формы 1 (XT ТАФ 1) и токсико-аллергической формы 2 (XT ТАФ 2) и на различных этапах реабилитации в зависимости от формы заболевания (хронического тонзиллита) и от реактивности организма; «---» - ткань полностью не состоятельна, отмечаются выраженные изменения в ее структуре и метаболической; составляющей, по сравнению с референтными значениями, кроме того, при особенно выраженном патологическом процессе, особенно при присоединении анаэробной микрофлоры, отмечается сдвиг пика флюоресценции вправо и, чем более выражен этот процесс, тем интенсивнее степень его тяжести. Представленные нами показатели закреплены в программном продукте и рассчитываются в автоматическом режиме на Принципе обратной связи в режиме «онлайн».
С использованием нового способа проводится ускоренная дифференциальная диагностика формы воспалительного заболевания: хронического тонзиллита или хронического фарингита.
Все показатели, полученные в отношении воспалительных заболеваний глотки, сравнивались с показателями интактных тканей - тканей, не вовлеченных в воспалительный процесс.
Было выявлено, что в зависимости от характера метаболических, морфометрических, функциональных изменений интактной ткани при воспалительном процессе можно провести дифференциальную диагностику формы воспалительного заболевания глотки с использованием флюоресцентной спектрометрии и специальных показателей, рассчитываемых вышеуказанным способом, и заложенных в программном обеспечении, с высокой точностью, чувствительностью, неинвазивно и в экспресс-режиме, in situ, in vitro и in vivo.
Существующие на сегодняшний день методы диагностики воспалительных заболеваний глотки являются либо длительными, либо дорогими, либо дают лишь косвенное представление о происходящих процессах в организме, не позволяя проводить диагностику in vivo in situ, либо сложными в исполнении. Также они не настолько чувствительные методы, как флюоресцентная спектрометрия, которая является не только высокочувствительной, но и неинвазивной, а также быстрой. Но наибольший акцент для обоснования использования предложенного способа проводится не на самой флюоресцентной спектрометрии, которая ранее в исследованиях многократно использовалась (Ryan K. Orosco, 2013 и др.), а на алгоритме диагностики с использованием специальных индексов, информативных в отношении экспресс-диагностики воспалительных заболеваний глотки. Наибольшее преимущество данного способа заключается в возможности оценить физиологические изменения в тканях глотки, которые возникают на более ранних стадиях, по сравнению с морфометрическими, таким образом способ можно использовать для ранней диагностики воспалительных заболеваний глотки. Кроме того, способ позволяет регистрировать многочисленные параметры в режиме реального времени, то есть, осуществлять «диагностику по месту обследования и лечения». Для определения морфологических, функциональных и метаболических характеристик тканей глотки норме и при патологии, в том числе на основе регистрации аутофлюоресцентных характеристик, необходимо выбрать наиболее оптимальный способ, к которому относится метод флюоресцентной диагностики. Разработка и внедрение представленной технологии в широкую клиническую практику являются перспективными и клинически целесообразными и позволят в дальнейшем существенно повысить качество диагностики воспалительных заболеваний глотки и своевременно назначить рациональное лечение.
4
5
Применение предлагаемого метода позволяет также обеспечить достоверное, высокочувствительное (10-10 КОЕ/мл) обнаружение этиологического фактора при различных формах воспалительных заболеваний, так как помогает выявлять вид, концентрацию микроорганизма либо ассоциатов микроорганизмов.
Результаты проведения экспресс-диагностики форм воспалительных заболеваний глотки представлены на соответствующих рисунках и в таблицах, расположенных в разделе «Графики и чертежи» и подробно описанных ниже.
Выбор метода флюоресцентной спектрометрии с использованием специального алгоритма и индексов и его программной реализации в аппаратно-программных комплексах на основе лазерного излучения с длинами волн 405 нм и 532 нм, при хроническом тонзиллите и фарингите обоснован необходимостью повышения чувствительности и специфичности, ускорения диагностики с последующей интерпретацией информативных критериев индивидуальных спектральных характеристик. Для выявления и подтверждения диагностической информативности флюоресцентной спектрометрии в совокупности с показателями морфометрических, метаболических, функциональных характеристик тканей глотки было проведено сравнение двух групп- на основании анализа спектров небных миндалин и задней стенки глотки пациентов из группы больных хроническим тонзиллитом ТАФ 1, хроническим тонзиллитом ТАФ 2, хроническим фарингитом гипертрофической формы (ХФ ГФ).
Полученные результаты представлены на рисунках, описание которых приведено ниже (см. приложение «Чертежи и рисунки»):
Дифференциальная диагностика форм хронического тонзиллита и фарингита является одной из самых важных задач, стоящих перед оториноларингологами и врачами-общей практики. С использованием метода флюоресцентной спектрометрии в совокупности с применением специальных индексов становится возможным провести анализ спектральных данных тканей глотки в норме и при воспалительных заболеваниях глотки в экспресс-режиме, неинвазивно и в динамике, на ранних стадиях. В работе использована классификация хронического тонзиллита Б.С. Преображенского - В.Т. Пальчуна.
Разделение между изучаемыми классами было близко к 100% с чувствительностью около 100% и точностью около 100% при дифференциации тканей при хроническом фарингите, хроническом тонзиллите и в норме в интактных тканях, не вовлеченных в воспалительный процесс. При дифференциации форм хронического тонзиллита с использованием предлагаемого способа высокая чувствительность и специфичность были обнаружены лишь при сравнении одной точки- в области лакуны небной миндалины: данные точки были различны во всех изучаемых группах после статистической обработки данных, что проиллюстрировано ниже.
Однако следует понимать, что проведение дифференциальной диагностики в данном случае информативнее при анализе совокупности данных, полученных в отношении форм воспалительных заболеваний глотки, а именно, объективного исследования (фарингоскопической картины и осмотра других органов), регистрации соответствующих метаболитов в плазме крови и других биологических жидкостях пациентов, оценки микробного состава патологического очага, концентрации на грамм ткани микробных тел в данный промежуток времени на соответствующей стадии заболевания, то есть необходим системный подход, который может быть осуществлен грамотным специалистом.
Системный подход с анализом вышеперечисленных показателей в динамике на различных стадиях заболевания позволит судить также о происходящих в тканях физиологических процессах, таких как кровоток и микроциркуляция, пролиферативная активность клеток, различие метаболитов, особенности морфометрических данных и т.д. Однако для клинициста не столько важно, какие метаболиты, микробы, изменения на физиологическим и морфологическом уровнях, по отдельности, происходят в тканях, сколько важны все параметры в совокупности и в сравнительном аспекте: «норма-патология», которые представлены в предлагаемом способе с использованием специального алгоритма диагностики и выражаются в графическом и цифровом виде, что удобно и информативно для клинициста. Таким образом, врач может использовать метод (в перспективе), не прибегая к огромному множеству других диагностических методов, что позволяет сократить сроки диагностики и лечения и обеспечивать рациональную терапию, однако следует понимать, что метод намного более информативен при использовании данных объективного осмотра.
Ниже представлены клинические наблюдения различных форм и стадий воспалительных заболеваний глотки (ВЗГ): исследования методом флюоресцентной спектрометрии с использованием специального алгоритма и индексов, на конкретных примерах. Исследования проводились на основе клинических наблюдений в динамике с использованием метода флюоресцентной спектрометрии. Для подтверждения полученных результатов клинической объективности метода был использован бактериологический метод.
На фиг. 2 представлены графики спектральных характеристик ткани небных миндалин здоровых добровольцев. И- спектр в интаткной точке; 1, 2, 3 - спектры в исследуемых точках на поверхности небных миндалин - точки 1, 2, 3, соответственно. По оси абсцисс-величины волновых чисел - значения, обратные значениям длин волн, единица измерения -обратные сантиметры (1/см); по оси ординат-интенсивность флюоресценции (в относительных единицах). Интенсивность флюоресценции ткани небных миндалин, не вовлеченных в воспалительный процесс, измеренная в разных точках, практически одинакова и крайне низка по интенсивности, по сравнению с амплитудно-спектральными показателями области сравнения (кожные покровы) - составляет практически 1/10 от интенсивности флюоресценции в интактной области; дополнительных пиков флюоресценции не регистрируется; структурированность ткани и ее состоятельность не нарушены; так отношение интегралов мощности флюоресценции и других параметров (индексов) - практически равно единице в пределах спектров в исследуемых точках, то есть, они практически одинаковые.
На фиг. 3 изображены спектральные характеристики ткани задней стенки глотки здоровых добровольцев. До оси абсцисс-величины волновых чисел - значения, обратные значениям длин волн, единица измерения-обратные сантиметры (1/см); по оси ординат-интенсивность флюоресценции (в относительных единицах).
Условные обозначения заложены в программное обеспечение на английском языке, расшифровка индексов представлена следующим образом: I_Intact - интенсивность флюоресценции в интактной ткани, Air Intact - индекс аэробности в интактной точке, I_А, I_В, I_С - нормированные показатели флюоресценции в точках 1, 2, 3, соответственно (НПФ1, НПФ2, НПФ3, соответственно); Air_A, Air_B, Air_C-индексы аэробности (ИА1, ИА2, ИА3) - в точках 1, 2, 3, соответственно; Infl. 1, Infl. 2, Infl. 3 - индексы микробной обсемененности ткани в точках 1, 2, 3, соответственно, рассчитываемые следующим образом:
Диапазоны длин волн 665-675 нм и 713-723 нм взяты, так как они, в данном случае, наиболее информативные в отношении регистрации спектров микрофлоры и определения ее концентрации. На рисунке по оси абсцисс-величины, обратные величинам длин волн - волновые числа, единица измерения также заложена в программное обеспечение.
Из фиг. 3 видно, что в норме (при отсутствии воспалительного заболевания глотки) интенсивность флюоресценции в области задней стенки глотки невысока (в данном случае, не более 500 отн. ед.), однако при воспалительном процессе-хроническом фарингите (гипертрофической форме) отмечается значительное повышение интенсивности флюоресценции, до 5000 отн., что проиллюстрировано на фиг. 4. При этом интенсивность флюоресценции ткани небных миндалин выше интенсивности флюоресценции ткани задней стенки глотки (фиг. 2, фиг 3), что свидетельствует о более выраженной микробной обсемененности небных миндалин на грамм ткани. Последнее положение было доказано с использованием бактериологического метода в предварительных исследованиях.
На фиг. 4 проиллюстрированы спектральные характеристики ткани задней стенки глотки при гипертрофическом фарингите, где И-спектр в интактной точке, ООС - обратно отраженный сигнал, 1, 2, 3 - спектры в исследуемых точках - 1 (верхний полюс небной миндалины), 2 (нижний полюс небной миндалины), 3 (лакуна небной миндалины), соответственно.
Как видно из фиг. 4, при гипертрофическом фарингите отмечаются нарушение структурированности ткани, значительное повышение интенсивности флюоресценции по всему диапазону частот; появляется дополнительный пик на величине волнового числа 5750/см, а также увеличение ширины обратно отраженного сигнала, что свидетельствует о нарушениях морфометрических, метаболических, функциональных параметров тканей, чего не наблюдается в норме (фиг. 3).
Приведем примеры расчета индексов структурированности и состоятельности тканей.
Фиг. 5 Спектральные характеристики ткани небных миндалин при хроническом тонзиллите, компенсированной форме. По оси абсцисс-величины волновых чисел, по оси ординат-интенсивность флюоресценции в относительных единицах.
И-спектр в интактной точке, 3 - спектр в лакуне небной миндалины. При регистрации спектра в точке 3 отмечается значительное увеличение интенсивности флюоресценции, чего не наблюдается в точке 3 у здорового добровольца (фиг. 2).
Согласно разработанному алгоритму диагностики с использованием метода флюоресцентной спектрометрии в совокупности с информативными индексами оценки морфометрических, метаболических и функциональных параметров тканей глотки в норме и при воспалительных заболеваниях глотки, можно заключить, что:
- интенсивность флюоресценции и ее мощность при хроническом тонзиллите (на рисунке обозначено цифрой 3 - обозначен спектр, снятый в области 3-ей точки - в области лакуны небной миндалины, цифрой 2 - в области нижнего полюса небной миндалины, цифрой 1 - в области верхнего полюса небной миндалины), интенсивность флюоресценции в точке 3 превышает таковую в интактной точке «И». Кроме того, отмечается дополнительный пик На величине волнового числа 6350/см, которого не наблюдается в норме (фиг. 2). Индекс аэробности в точке 1 равен, в данном случае 0,993, в точке 2-2,04, в точке 3-1,79, что проиллюстрировано в таблице под фиг. 5.
ИИ-интенсивность флюоресценции в интактной точке равна 14000 относительных единиц (ОЕ), интенсивность флюоресценции (ИФ) в ткани небных миндалин, не вовлеченных в воспалительный процесс - 1700 ОЕ (фиг. 2) - 100%, в то время, как интенсивность флюоресценции в точке 3 - лакуне небной миндалины, - равна 19000 ОЕ-х %, х=1118, повышение ИФ (интенсивности флюоресценции) в 11 раз. Таким образом, можно рассчитать индексы структурированности и состоятельности ткани в отношении всех точек:
В точке 2 ИФ равна 4200 отн. ед. - 100%, в то время как в точке 3 - 19000-х%, отсюда х=452%, то есть, в 4,5 раза больше, чем в точке 2, что говорит полностью о разобщенности и нарушении структурированности спектров (как относительно референтных значений в норме, так и в точках небной миндалины по отношению друг к другу) и состоятельности тканей глотки при хроническом тонзиллите (---).
Индекс аэробности в интактной точке 1,85, во 2-й точке - 2,04 (таблица по фиг. 5 - заложена в программное обеспечение), соответственно,
1,85-100%,
2,04-х%, отсюда х=110, то есть при хроническом тонзиллите компенсированной формы отмечается повышение ИА в точке 2 на 10% (+), что свидетельствует о компенсированности воспалительного процесса в ткани небных миндалин (об относительно небольших физиологических изменениях).
Таким образом, из фиг. 5 следует, что интенсивность флюоресценции при воспалительном процессе повышается и коррелирует с микробной обсемененностью патологического очага (ткани небных миндалин) на грамм ткани, так как наибольшая микробная обсемененность наблюдается в области лакун небных миндалин.
Также на величине 6350/см обнаруживается дополнительный пик, который не регистрируется в норме (при отсутствии XT).
На фиг. 6 изображены спектральные характеристики ткани задней стенки глотки при гипертрофическом фарингите. Основной сигнал флюоресценции регистрируется на величине волнового числа 5000/см; отмечается нарушение структурированности ткани, дополнительный пик на величине волнового числа 5750/см. Условные обозначения на рисунке: И-интактная точка, 1, 2, 3 - спектры в точках 1, 2, 3, соответственно.
Из рисунка следует, что при гипертрофическом фарингите отмечается увеличение интенсивности флюоресценции во всех исследуемых точках, структурированность ткани полностью нарушена, что можно подтвердить соответствующими расчетами:
так, в точке 1 интенсивность флюоресценции 500 ОЕ-100%, а в точке 2-3000 ОЕ-х % (600%), изменения составляют 500% (3000:500=6), что свидетельствует о нарушении структурированности ткани и ее состоятельности, чего не наблюдается в норме (фиг. 2, фиг. 3).
На фиг. 7 проиллюстрированы спектральные характеристики ткани небных миндалин до промывания лакун небных миндалин раствором антисептика (мирамистина 0,01%-ного), пациент K., 26 лет, с хроническим тонзиллитом, токсико-аллергической формы 2 (XT ТАФ 2) и хроническим фарингитом гипертрофической формы (ХФ ГФ). Цифрой 3 на фиг. 7, 8 обозначены спектры, снятые в точке 3-в лакунах небных миндалин.
Из фиг. 7 следует, что при хроническом тонзиллите ТАФ 2 на величине волнового числа 6370/см отмечается дополнительный пик, регистрирующийся при хронической гипоксии в тканях, согласно предварительно проведенным исследованиям и не наблюдающийся в норме (фиг. 2). Также отмечается нарушение структурированности ткани. ИФ в точке 3-1500 ОЕ, в точке 2-4000 ОЕ, таким образом,
1500-100%, 4000-х, х=267%, то есть, при хроническом тонзиллите, токсико-аллергической форме 2, отмечается нарушение структурированности и состоятельности тканей глотки на 167%, что говорит о полном нарушении структурированности ткани (---).
На фиг. 8 изображены спектральные характеристики ткани небных миндалин пациента К. 28 лет с хроническим тонзиллитом, ТАФ 2 и хроническим фарингитом гипертрофической формы после промывания лакун небных миндалин раствором мирамистина, дополнительный пик на величине волнового числа 6350/см сохраняется, но амплитуда его увеличивается, что свидетельствует о гибели микробов и выходе порфиринов (которые являются эндогенными флюорофорами) их клеточной стенки; после воздействия мирамистина 0,1%-ного в качестве детергента увеличивается амплитуда пика, регистрирующегося на величине волнового числа 6350/см, полученные данные подтверждаются исследованиями, проведенными отечественными учеными (Попов С.Н., 2012; Черкесов И.В., 2005).
На фиг. 9 проиллюстрированы спектральные характеристики ткани в области миндаликовых ниш пациента К. 28 лет с хроническим тонзиллитом, ТАФ 2 и хроническим фарингитом гипертрофической формы спустя 2 недели после двусторонней тонзиллэктомии.
Спектральные признаки хронического тонзиллита сохраняются: частично нарушена структурированность ткани, интенсивность флюоресценции выше значений, регистрирующихся в норме, однако более не наблюдается дополнительного пика флюоресценции на величине волнового числа 6350/см, который свидетельствует о выраженности микробной обсемененности на грамм ткани. После удаления небных миндалин хронический патологический очаг отсутствует, постепенно микрофлора глотки меняется и приближается к таковой у здоровых добровольцев, что было проиллюстрировано в предыдущих исследованиях.
На фиг. 10 изображено распределение значений индекса аэробности в изучаемых группах. Н- ИА в норме; 1- ИА при хроническом тонзиллите ТАФ 1, 2- ИА при хроническом тонзиллите ТАФ 2.
Отмечается сосредоточение средних значений ИА на определенной площади в каждой из представленных групп. Наибольший индекс аэробности наблюдается в случае нормы, однако в случае XT ТАФ 2 встречаются единичные значения ИА, превосходящие ИА в группе здоровых добровольцев, что можно объяснить с позиций попытки восстановления гомеостаза в организме, в том числе, посредством перераспределения кровотока при хроническом тонзиллите, ТАФ 2, при максимально предельной допустимой нагрузке на организм (декомпенсации XT).
На фиг. 11 отмечено соотношение НПФ в норме и при хроническом тонзиллите, ТАФ 2. XT-распределение НПФ в группе пациентов с хроническим тонзиллитом ТАФ 2. Обозначение «ХТ» на фиг. 11 - хронический тонзиллит, токсико-аллергическая форма 2.
Анализируя НПФ в динамике можно делать заключение о том, на какой стадии находится воспалительный процесс в глотке, проводить мониторинг и оценку показателей в сравнительном аспекте для назначения соответствующей адекватной терапии в данный промежуток времени, что будет подробно описано ниже, после приведения статистической обработки данных.
На фиг. 12 представлено сравнение интенсивности флюоресценции ткани небных миндалин (I max N) в норме и при хроническом тонзиллите, токсико-аллергической форме 2 (I max, декомп.), где Н - норма, 2- XT ТАФ 2.
На фиг. 12 продемонстрировано сравнение интенсивности флюоресценции в норме и при хроническом тонзиллите: при воспалительном процессе отмечается значительные повышение ИФ (в 7 раз выше по сравнению с нормой), что связано как с повышением микробной обсемененности ткани, так и с более интенсивным пролиферативным процессом в ткани небных миндалин при XT. В частности, при хроническом тонзиллите, декомпенсированной формы отмечается не только деструктуризация ткани небных миндалин, нарушение кровотока и снижение оксигенации, но и интенсивно протекающий рубцовый процесс, склероз ткани и нарушение ее функции.
На фиг. 13 продемонстрировано повышение ИФ при хроническом тонзиллите, ТАФ 1 по сравнению с тканью, не вовлеченной в воспалительный процесс, однако данное увеличение выражено менее значительно, чем в ряду норма - «ХТ ТАФ 2», что можно объяснить с позиций восстановления гомеостаза и мобилизацией ресурсов организма для борьбы с воспалительным процессом. В данном случае воспалительный процесс относительно контролируем и компенсирован. Условные обозначения на фиг 13: Н - норма, I max N - максимальная интенсивность флюоресценции в норме, 1-ХТ ТАФ1, I max комп. - максимальная интенсивность флюоресценции при ХТ ТАФ 1.
На фиг. 14 проиллюстрированы спектральные характеристики ткани небных миндалин при хроническом тонзиллите, ТАФ 2. 3 - спектр в точке 3 - лакуне небной миндалины.
Помимо нарушения структурированности ткани небных миндалин отмечается регистрация пика на величине волнового числа 6350-6400/см, а также увеличение интенсивности флюоресценции ткани небных миндалин по сравнению с референтными значениями ткани НМ здоровых добровольцев, как было подробно описано выше.
Фиг. 15 Спектральные характеристики ткани небных миндалин пациентки с хроническим тонзиллитом, декомпенсированной формы, 1-й день после вскрытия паратонзиллярного абсцесса.
На фиг. 15 видим, что при декомпенсации процесса - при токсико-аллергической форме 2 хронического тонзиллита структурированность ткани и ее состоятельность нарушена по сравнению с референтными значениями, однако дополнительных пиков не регистрируется, что связано с тем, что полость после вскрытия паратонзиллярного процесса промывается антибактериальными и антисептическим препаратами, что способствует гибели микробов.
Фиг. 6 Спектральные характеристики ткани небных миндалин пациентки с хроническим тонзиллитом, декомпенсированной формы, 6-й день после вскрытия паратонзиллярного абсцесса.
На фиг. 16 видим, что спустя некоторый промежуток времени (6-е сутки после операции), структурированность ткани постепенно восстанавливается.
Фиг. 17 демонстрирует спектральные характеристики ткани небных миндалин пациентки с хроническим тонзиллитом, ТАФ 1 до курса промывания лакун небных миндалин: отмечается увеличение интенсивности флюоресценции ткани небных миндалин, появление дополнительных пиков на величинах волновых чисел 6350-6400/см, нарушение структурированности ткани НМ по сравнению с нормальными значениями. На фиг. 17 цифрой 3 обозначен спектр, снятый в области лакуны небной миндалины - в точке 3.
На фиг. 18 (3 - спектр в точке 3- в лакуне небной миндалины) отмечены спектральные характеристики ткани небных миндалин пациентки с хроническим тонзиллитом, ТАФ 1, непосредственно после промывания лакун небных миндалин (1 минута) раствором мирамистина 0,01%-ного: отмечается значительное увеличение интенсивности флюоресценции ткани НМ, появление дополнительного пика на величинах волновых чисел 6350-6400/см, нарушение структурированности ткани небных миндалин, по сравнению с нормальными значениями, а также увеличение амплитуды регистрируемого дополнительного пика за счет увеличения концентрации порфиринов, что достигается воздействием мирамистина на клеточную стенку бактерий, в результате чего интенсивность флюоресценции повышается, как было показано в предыдущих исследованиях.
На фиг. 19 (цифрами обозначены спектры, снятые в точках 1, 2, 3, соответственно); проиллюстрированы спектральные характеристики ткани небных миндалин пациентки с хроническим тонзиллитом, ТАФ 1, непосредственно после промывания лакун небных миндалин раствором мирамистина (10 минут): отмечается значительное увеличение интенсивности флюоресценции ткани НМ, появление дополнительных пиков на величинах волновых чисел 6400/см, нарушение структурированности ткани небных миндалин по сравнению с нормальными значениями, а также увеличение амплитуды регистрируемого дополнительного пика за счет увеличения концентрации порфиринов, что достигается воздействием мирамистина на клеточную стенку бактерий, в результате чего интенсивность флюоресценции повышается, как было показано в предыдущих исследованиях, затем, по истечении некоторого времени, интенсивность флюоресценции падает.
Фиг. 20 Спектральные характеристики ткани небных миндалин пациентки с хроническим тонзиллитом, ТАФ 1, после полного курса промывания лакун небных миндалин раствором мирамистина (в течение 9 дней): отмечается значительное снижение интенсивности флюоресценции ткани НМ, дополнительных пиков на величинах волновых чисел 6400/см не отмечается, структурированность ткани небных миндалин восстанавливается, приближаясь к нормальным значениям, что свидетельствует об эффективности проведенного консервативного лечения.
После обработки всех полученных данных относительно эффективности консервативного лечения при хроническом тонзиллите ТАФ 1 (токсико-аллергической формы 1), были получены значения, представленные в таблице 1, где НПФ 1, НПФ 2, НПФ 3 - нормированные показатели флюоресценции, в точках 1, 2, 3, соответственно, ИА1, ИА2, ИА3 - индексы аэробности в точках 1, 2, 3, соответственно. Расчет представленных индексов был описан ранее.
В таблице 1 представлены данные показатели до лечения и после лечения.
Согласно данной таблице 1 отмечается, что индексы аэробности после курса лечения (промывания лакун небных миндалин растворами антисептиков, обработки слизистой оболочки глотки противовоспалительными препаратами, дополнительных физиотерапевтических процедур и др.) увеличиваются, что свидетельствует о нормализации оксигенации и микроциркуляции в тканях, восстановлении ее структуры и физиологических свойств, нормированные показатели флюоресценции, в данном случае, напротив, уменьшаются, что свидетельствует об уменьшении активности микробного (воспалительного) процесса в тканях глотки на фоне проводимой терапии.
При воспалительных изменениях в миндалинах при ХТ на графиках появляются дополнительные пики на величинах 6350-6400, 7050/см, что говорит как о регистрации патогенной флоры, так и о повышении концентрации условно патогенной флоры, что может приводить к заболеванию.
В предварительно проведенных исследованиях было показано, что чем более выражен анаэробный процесс, тем больше смещается пик вправо по оси абсцисс. Чем более интенсивен дополнительный пик флюоресценции на оси абсцисс, тем более выражен воспалительный процесс в тканях глотки.
На графиках (фиг. 20) видим, что структура ткани, оксигенация, микроциркуляция нормализовались, индекс аэробности повысился, спектральных данных в пользу патогенной флоры не визуализируется, максимальный пик флюоресценции лежит в нижней трети кривой, зарегистрированной с поверхности интактной точки, что свидетельствует о клиническом улучшении и морфологическом восстановлении ткани небных миндалин после проведенного консервативного лечения, чего не наблюдается при анализе спектров ткани небных миндалин при ХТ ТАФ 1 до проведенного лечения (фиг. 18, фиг. 19).
При оценке основных спектральных характеристик ткани в норме и при воспалительных заболеваниях глотки (ВЗГ) были проанализированы интенсивность флюоресценции в интактной точке (ИИ), интенсивность флюоресценции в точках на поверхности небных миндалин у здоровых добровольцев и пациентов с хроническим тонзиллитом, а также на поверхности задней стенки глотки у пациентов с наличием и отсутствием хронического фарингита.
Важным аспектом диагностики является не только оценка функционального состояния ткани при воспалительном процессе, но и качественный и количественный анализ микрофлоры для выбора рациональной антибактериальной терапии. Кроме того, необходимы Оценка реабилитации пациента после перенесенного инфекционного процесса, а также профилактика широкого распространения таких эпидемиологически значимых заболеваний, таких, как как воспалительные заболевания глотки.
В эксперименте на микробах также выяснилось, что у каждого микроба в зависимости от его вида, имеется определенный набор спектральных данных, который изменяется при увеличении или уменьшении концентрации их на грамм ткани, также было определено, что у тканей при воспалительном процессе глотки регистрируются дополнительные пики, смещенные вправо по оси ординат, что свидетельствует о микробном процессе, данного эффекта не наблюдается при регистрации спектров тканей глотки в норме. Для оториноларинголога, как клинициста, важен не только вид возбудителя воспалительного заболевания, но и концентрация микробов на грамм ткани, что можно зарегистрировать с использованием представленного способа.
Для оценки вклада микробного фактора в изменения в тканях, происходящих при воспалительных заболеваниях глотки, были исследованы спектры тканей глотки (ткань небных миндалин при хроническом тонзиллите; ткань задней стенки глотки при хроническом фарингите) и некоторых видов возбудителей воспалительных заболеваний глотки. Для оценки информативности применения флюоресцентных медицинских технологий в серии экспериментов in vitro и исследований in vivo были продемонстрированы основные спектральные особенности тканей глотки и некоторых колонизирующих ее микробов.
На фиг. 21 проиллюстрированы спектральные характеристики микроба Candida albicans (чистая монокультура на нефлюоресцирующих подложках).
Фиг. 22 и фиг. 23 демонстрируют спектральные характеристики микроба Candida dubliniensis (чистая монокультура на нефлюоресцирующих подложках) и спектральные характеристики микроба Е. faecalis (чистая монокультура на нефлюоресцирующих подложках, соответственно.
На фиг. 24 изображены спектральные характеристики микроба Klebsiella pneumoniae - чистая монокультура на нефлюоресцирующих подложках.
На фиг. 25 отмечены спектральные характеристики микроба Proteus mirabilis (чистая монокультура на нефлюоресцирующих подложках).
Фиг. 26 демонстрирует спектральные характеристики микроба Staphylococcus aureus (чистая монокультура на нефлюоресцирующих подложках).
На фиг. 27 изображены спектральные характеристики микроба Streptococcus pneumoniae - чистая монокультура на нефлюоресцирующих подложках.
На фиг. 28 продемонстрированы спектральные характеристики микроба Streptococcus pyogenes (чистая монокультура на нефлюоресцирующих подложках).
Из представленных фиг. 21-28 следует, что каждый вид микроба характеризуется набором определенных спектральных особенностей, которые позволяют вычислить его среди множества других. Эти спектральные данные могут быть представлены как в цифровом, так и в графическом виде, как видно на соответствующих рисунках. Также у большинства микробов выявляется дополнительный пик на величине волнового числа 6700/см, что свидетельствует о микробной составляющей воспалительного процесса, а именно, можно отметить, что подобный пик выявляется при воспалительном процессе в глотке: особенно при хроническом тонзиллите (фиг. 5, 7, 8, 14, 17, 18, 19), чего не отмечается в норме (фиг. 2). Таким образом, можно заключить, что характерные особенности спектральных кривых тканей глотки при хроническом тонзиллите и хроническом фарингите связаны, отчасти, с микробным фактором, что продемонстрировано на фиг. 21-28.
При превышении концентрации микробов на грамм ткани эти изменения становятся более очевидными, а именно, увеличивается интенсивность флюоресценции, появляются дополнительные пики на величинах волновых чисел 5350-6700/см, чем более данный пик смещен вправо по оси абсцисс, тем более выражен анаэробный процесс и тем более агрессивно протекает воспалительный процесс в глотке в целом, что подтверждается клиническим и микробиологическими данными.
В результате после обработки полученных данных статистическими методами мы получили следующие результаты.
Как выяснилось, величины ИИ (интенсивности флюоресценции в интактной точке) и ИАИ (индекса аэробности в интактной точке) положительно коррелируют, коэффициент ранговой корреляции Спирмена равен 0,231 (р<0,001), что означает, что абсолютная интенсивность флюоресценции в интактной точке взаимосвязана и зависима от индекса аэробности в этой точке у конкретного индивидуума.
На фиг. 29 данная взаимосвязь изображена более наглядно. Условные обозначения: ХФ-хронический фарингит, ИИ - по оси ординат - интенсивность флюоресценции в интактной точке, в абсолютных единицах; ИАИ - индекс аэробности в интаткной точке, в относительных единицах.
Достоверных сведений величин ИИ и ИАИ с полом и возрастом не выявлено, то есть данные величины не зависят от пола и возраста.
Из фиг. 29 следует, что самая сильная связь между изучаемыми показателями наблюдается в группе пациентов с хроническим фарингитом, в других группах она менее сильная, таким образом, между изучаемыми индексами существует корреляция.
Исследование нормированного показателя флюоресценции и индекс ааэробности в сравниваемых группах (0, 1, 2, 3) на поверхности небных миндалин у верхнего и нижнего полюса (в точках 1 и 2).
Рассматриваемые показатели распределены с заметной асимметрией и некомпактно, в связи с чем для анализа этих показателей мы будем использовать, преимущественно, методы непараметрической статистики.
В таблице 2 представлено сравнение статистических параметров исследуемых величин в подгруппах, где НПФ1, НПФ2 - нормированные показатели флюоресценции в точках 1 и 2, ИА1, ИА2 - индексы аэробности в точках 1, 2; М - среднее значение, σ - среднеквадратическое отклонение, Min и Мах - минимальные и максимальные значения; Ме - медиана, m - ошибка среднего.
Проанализировав индексы аэробности и нормированные показатели флюоресценции в изучаемых группах, мы получили достоверные различия показателей НПФ 1 и НПФ 2 во всех изучаемых группах, однако значения показателей ИА во всех группах были недостоверны (таблица 2). Таким образом, после верификации достоверности результатов по Манну-Уитни и Колмогорову-Смирнову было отмечено, что в группах «Здоровых добровольцев» и лиц с «Хроническим тонзиллитом, ТАФ 1» отмечаются различия в значениях нормированных показателей флюоресценции, различия достоверны, и в случае отсутствия воспаления (у здоровых добровольцев) данные показатели в 1,7 (НПФ 1) - 1,9 (НПФ 2) раза меньше, чем при воспалительных изменениях в небных миндалинах при хроническом тонзиллите, ТАФ 1.
При хроническом тонзиллите, ТАФ 2 значения НПФ 1 и НПФ 2 превышают таковые показатели в норме в 2,28-2,59; различия достоверны.
В группе «Хронический фарингит» отмечаются достоверные различия в показателях НПФ 1, НПФ 2, которые при наличии заболевания в 8,25-11,69 раз превышают соответствующие значения в норме.
Формы «Хронический тонзиллит, ТАФ1» и «Хронический тонзиллит, ТАФ 2» не имеют в соответствующих точках ИА1, ИА2, НПФ1, НПФ2 - достоверных различий.
Между соответствующими показателями при хроническом тонзиллите, ТАФ1 и хроническом фарингите имеются достоверные различия во всех точках: ИА1, ИА2, НПФ1, НПФ2 и показатель НПФ1 при ХФ в 4,81 больше, чем при XT 1, ИА 1 в 1,33 раза меньше при ХФ, НПФ 2 в 6,25 раз больше при ХФ, чем при XT 1, а также ИА2 в 1,279 раза больше при XT 1, чем при ХФ.
Также отмечаются достоверные различия в соответствующих точках при хроническом тонзиллите, токсико-аллергической форме 2 и хроническом фарингите, таким образом, что НПФ 1 в 3,623 раза при ХФ больше, чем при ХТ ТАФ 2, ИА 1 в 1,37 раза больше при ХТ ТАФ 2, чем при ХФ, НПФ 2 в, 5 раза больше при ХФ, чем при ХТ ТАФ 2, ИА 2 в 1,31 раза больше при ХТ ТАФ 2, чем при ХФ. Все различия в группах достоверны.
В таблице 3 представлены нормированные показатели флюоресценции, индексы структурированности и состоятельности тканей глотки у здоровых добровольцев, пациентов с хроническим тонзиллитом ТАФ 1 и ТАФ 2 и хроническим фарингитом гипертрофической формы. ИС - индекс структурированности ткани, ИСТ-индекс состоятельности ткани, НПФ - нормированный показатель флюоресценции, цифрами обозначены точки, в которых проводилась регистрация спектров.
Условные обозначения: +++- ткань полностью структурирована и состоятельна (характерно для тканей глотки здоровых добровольцев),++-- ткань частично структурирована, +-- ткань практически не структурирована; ---- ткань полностью не структурирована. ЗД - здоровые добровольцы, ХТ ТАФ 1 - токсико-аллергическая форма; ХТ ТАФ2 -хронический тонзиллит, токсико-аллергическая форма 2; ХФ ГФ - хронический фарингит, гипертрофическая форма.
При анализе данных таблицы 3 следует, что при хроническом фарингите и хроническом тонзиллите отмечается нарушение структурированности и состоятельности тканей глотки, выраженное в различной степени, в отличие от соответствующих результатов в норме, при отсутствии воспалительного процесса В глотке.
В таблице 4 представлены корреляционные связи между показателями интенсивности флюоресценции в интактных точках и у верхнего полюса небной миндалины (точка 1).
Из таблицы 4 следует, что между интенсивностью флюоресценции в интактной точке и индексом аэробности и нормированным показателем флюоресценции существует взаимозависимость. Подобная взаимозависимость прослеживается во всех исследуемых точках. Таким образом, подтверждается системность патологического процесса при воспалительных заболеваниях глотки.
Между индексами аэробности и нормированными показателями флюоресценции также существует взаимозависимость: при изменении одной группы показателей, другие синхронно изменяются.
На основании представленного моделирования (фиг. 29, таблицы 2-4), можно окончательно сформулировать основные закономерности взаимозависимости наиболее информативных параметров друг от друга:
1. Интенсивность флюоресценции, нормированный показатель флюоресценции, индекс аэробности в исследуемых точках в пределах групп пациентов взаимосвязаны;
2. В каждой из исследуемых групп наблюдается взаимозависимость данных параметров различной силы. Наиболее сильная зависимость прослеживается в группе пациентов с хроническим фарингитом;
3. В группах здоровых добровольцев, а также пациентов с хроническим фарингитом наблюдается наименьший разброс значений показателей ИФ, НПФ, ИА, как в интактной точке, таки в исследуемых точках в области небных миндалин и задней стенки глотки;
4. различия в индексах аэробности ИА 1 и ИА 2 в исследуемых группах были недостоверны;
5. нормированные показатели флюоресценции в изучаемых группах НПФ 1 и НПФ 2 во всех изучаемых группах были различны и различие было достоверно;
6. у здоровых добровольцев показатели НПФ в 1,7 (НПФ 1) - 1,9 (НПФ 2) раза меньше, чем при воспалительных изменениях в небных миндалинах при хроническом тонзиллите, ТАФ 1.
7. при хроническом тонзиллите, ТАФ 2 значения НПФ 1 и НПФ 2 превышают таковые показатели в норме в 2,28-2,59; различия достоверны.
8. в группе пациентов с хроническим фарингитом отмечаются достоверные различия в показателях НПФ 1, НПФ 2, которые при наличии заболевания в 8,25-11,69 раз превышают соответствующие значения в норме.
9. формы «Хронический тонзиллит, ТАФ 1» и «Хронический тонзиллит, ТАФ 2» не имеют в соответствующих точках ИА1, ИА2, НПФ1, НПФ2 - достоверных различий.
10. между соответствующими показателями при хроническом тонзиллите, ТАФ1 и хроническом фарингите имеются достоверные различия во всех точках: ИА1, ИА2, НПФ1, НПФ2 и показатель НПФ1 при ХФ в 4,81 больше, чем при XT 1, ИА 1 в 1,33 раза меньше при ХФ, НПФ 2 в 6,25 раз больше при ХФ, чем при XT 1, а также ИА2 в 1,279 раза больше при XT 1, чем при ХФ.
11. отмечаются достоверные различия в соответствующих точках при хроническом тонзиллите, токсико-аллергической форме 2 и хроническом фарингите, таким образом, что НПФ 1 в 3,623 раза при ХФ больше, чем при XT ТАФ 2, ИА 1 в 1,37 раза больше при ХТ ТАФ 2, чем при ХФ, НПФ 2 в, 5 раза больше при ХФ, чем при ХТ ТАФ 2, ИА 2 в 1,31 раза больше при ХТ ТАФ 2, чем при ХФ.
Измерение нормированного показателя флюоресценции и индекса аэробности в точке 3 (лакуна небной миндалины при хроническом тонзиллите и у здоровых добровольцев)
В таблице 5 представлены статистические параметры величины НПФ 3 в сравниваемых группах
Различия среднего достоверны с р=0,004
Согласно таблице 5, отмечаются достоверные различия между средними значениями НПФ 3 в группах здоровых добровольцев и пациентов с хроническим тонзиллитом, ТАФ 1: НПФ 3 в группе здоровых добровольцев в 1,7 раза меньше, чем в группе пациентов с ХТ ТАФ 1, а также в 3,6 раза меньше, чем в группе ХТ ТАФ 2, тогда как НПФ 3 в группе пациентов с ХТ ТАФ 1 в 2,2 раза меньше, чем в группе пациентов с ХТ ТАФ 2, что может быть использовано с целью проведения дифференциальной диагностики форм хронического тонзиллита.
Исследование нормированного показателя флюоресценции и индекса аэробности в точке 3 (задняя стенка глотки у пациентов с хроническим фарингитом),
Из 51 пациента данной группы значения НПФ 3 наблюдались в пределах от 0,219 до 8,38 со средним, равным 2,66±0,27 и σ=1,91.
На фиг. 30 изображены частотные распределения НПФ 3 у пациентов с хроническим фарингитом, где Mean-среднее значение, Std. Dev. - стандартное отклонение, N - количество исследуемых, Frequency - частота встречаемости, по оси ординат, в относительных единицах, НПФ - нормированный показатель флюоресценции.
Из фиг. 30 следует, что варьирование НПФ 3 в пределах рассматриваемой группы достаточно близко к нормальному распределению. В большинстве случаев НПФ 3 в данной группе находится в диапазоне от 0 до 4,5, однако может достигать и 8,5 отн. ед. Нормирование на интактную точку в данном случае приводит к нивелированию разницы между динамическим показателями ткани, характеризующими ее метаболические, морфометрические и функциональные изменения.
В таблице 6 представлены корреляционные связи величины НПФ 3 у пациентов с хроническим фарингитом с показателями индекса аэробности в интактной точке, индексов аэробности в точках 1 и 2, а также с нормированными показателями флюоресценции в точках 1 и 2 и показателем интенсивности флюоресценции в. интакной точке у пациентов из этой же группы.
Из таблицы 6 следует, что имеется взаимозависимость между НПФ 3 при хроническом фарингите с другими показателями, такими как ИИ, ИАИ, НПФ1, ИА1, НПФ2, ИА2, таким образом при изменении одних индексов можно судить о характере изменения других, а также зарегистрировать полученные данные в экспресс-режиме и в Динамике с использованием предложенного способа диагностики.
Предложенный способ и алгоритм, разработанный в ходе исследования, позволяет проводить дифференциальную диагностику между нормой и патологией при воспалительных заболевания глотки, а также оценивать основные различия и характерные особенности тканей глотки при хроническом фарингите и хроническом тонзиллите различных форм.
Таким образом, метод флюоресцентной спектрометрии в совокупности с информативными критериями зарекомендовал себя в качестве неинвазивного, высокочувствительного, высокоспецифичного экспресс-метода, позволяющего оценить набор морфометрических, метаболических, функциональных особенностей тканей в норме и при воспалительных заболеваниях глотки.
Таким образом, в соответствии с приведенными данными, можно отметить, что способ экспресс-диагностики воспалительных заболеваний глотки с использованием флюоресцентной спектрометрии и специального алгоритма для оценки морфометрических, метаболических, функциональных изменений тканей в динамике может быть использован in situ (по «месту» обследования), как in vivo, так и in vitro, для идентификации воспалительных заболеваний глотки, а также для оценки микробного фактора (как этиологического) в патогенезе воспалительного процесса. С использованием предложенного способа возможно в экспресс-режиме, с высокой чувствительностью и специфичностью, в динамике оценивать морфометрические, метаболические, функциональные особенности тканей глотки в норме и при воспалительных заболеваниях глотки, а также анализировать качественный и количественный состав микрофлоры патологического очага. Таким образом, разработка алгоритма диагностики воспалительных заболеваний глотки с использованием данного способа может быть в перспективе использована для немедленной идентификации воспалительных заболеваний глотки и, как следствие, для осуществления наиболее рационального лечения и проведения профилактических мер.