Сорбция свинца бычьим сывороточным альбумином в условиях in vitro

15. Porter N. A. Cyclic peroxides and the thiobarbituric assay / N.A. Porter, J. Nixon, I. Ranidas / / Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 441, № 3. P. 506—512.

16. Reduction of myocardial ischemic reperfusion injury by sialylated glycosphingolipids, gangliosides / N. Maulik, D. K. Das, M. Gogineni, G. A. Cordis, N. Avrova, N. Denisova //J. Cardiovasc. Pharmacol. 1993. V. 22, № LP. 74—81.

17. Schwarzmann G. Uptake and metabolism of exogenous glycosphingolipids by cultured cells /

G. Schwarzmann // Semin. Cell Dev. Biol. 2001. V. 12, № 2. P. 163—171.

18. Thioridazine induces lipid peroxidation in myelin of rat brain / G. S. Dhaunsi, B. Singh, A. K. Singh, D. A. Kirschner, I. Singh // Neuropharmacology. 1993. V. 32, № 2. P. 157—167.

19. Trisialoganglioside GTlb prevents increase in sperm membrane molecular ordering induced by in vitro lipid peroxidation / M. Gavella, M. Kveder,V. Lipovac,R. Rakos,G. Pifat //J. Androl. 2005. V. 26, No 6. P. 724—731.

20. Ulrich-Bett B. Micellar properties of glycosphingolipids in aqueous media / B. Ulrich-Bett,

H. Wiegandt // J. Lipid Res. 1984. V. 25, № 11. P. 1233—1245.

21. Yamamoto H. A. Ganglioside GTlb and melatonin inhibit brain mitochondrial DNA damage and seizures induced by kainic acid in mice / H. A. Yamamoto, P. V. Mochanan // Brain Res. 2003. V. 21,

№ 1. P. 100—106.

22. Yokoyama S. Inhibition effects of gangliosides GM1, GDla and GTlb on base-catalyzed isomerization of prostaglandin A2 / S. Yokoyama, T. Takeda, M. Abe // Colloids Surf. B. Biointerfaces. 2001. V. 20, № 4. P. 361—368.

23. Zeller С. B. Gangliosides as modulators of cell function / С. B. Zeller, R. B. Marchase // Am. J. Physiol. 1992. V. 262, № 6. P. C1341—C1355.

Поступила 04.02.08.

СОРБЦИЯ СВИНЦА БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ

1 АЛЬБУМИНОМ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

\

t

\

j М. Е. Маркова,

| Е. А. Радецкая,

/

М. А. Боровкова, И. С. Круликовский, В. Т. Демарин,

В. Ф. Урьяш

Как известно, сывороточный альбумин крови животных и человека относится к транспортным белкам [7]. Он также может эффективно взаимодействовать с металлами [6]. Поэтому представляет научный интерес и имеет практическое значение изучение сорбции бычьим сывороточным альбумином (БСА) такого распространенного токсиканта как свинец.

Для исследования процесса сорбции свинца из раствора его соли БСА рспользовали методику, описанную в работах Е. А. Степано-

1 © М. Е. Маркова, Е. А. Радецкая, М. А. Боровкова, И. С. Круликовский, В. Т. Демарин, В. Ф. Урьяш, 2008 '

3g ВЕСТНИК Мордовского университета | 2008 | № 2

вой и В. Ф. Урьяша [3-5; 9; 11] и применявшуюся для исследования процесса сорбции свинца и кадмия биологически активными веществами, выделенными из растительного сырья. Она заключается в том, что in vitro создаются условия, моделирующие процессы переваривания пищи в желудке и кишечнике человека. Указанная методика не могла в первоначальном виде применяться для БСА, поэтому необходимо было ее модернизировать. Итак, цель настоящего заключалась в разработке методики приготовления образцов

для исследования процесса сорбции свинца из водного раствора Pb(N03)2 бычьим сывороточным альбумином в опытах in vitro.

В качестве объекта исследования использовали лиофильно высушенный альбумин для вирусологических исследований, полученный из бычьей плазмы на предприятии по производству бактерийных препаратов Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии (г. Минск). Препарат представлял собой порошок белого или слегка кремового цвета. Он

I

содержал некоторое количество хлорида натрия. Было показано, что металлы при совместной сорбции биологически активными веществами оказывают влияние друг на друга [11], поэтому при исследовании сорбции свинца БСА необходимо было определить, какое количество Na+ удерживается белком в условиях нашего эксперимента.

Свинец брали в виде растворимой в воде соли Pb(N03)2, квалификации «осч». Реактивами для высаживания БСА служили спирт этиловый медицинский (ГОСТ 5962-67) и сернокислый аммоний, квалификации «чда»

(ГОСТ 3769-78).

В качестве метода исследования содержания металлов в образцах применяли атомно-абсорбционный спектральный анализ [3; 5; 8; 11; 12]. Определение массы свинца выполняли на спектрометре фирмы «Perkin-Eimer» модели 603. Количество свинца в образце рассчитывали по формуле:

га = CV — п,

где т — количество определяемого элемента, мкг; С — концентрация элемента в распыляемом растворе, мкг/мл; V — объем мерной колбы, мл (обычно 100 мл); п — дополнительное разбавление раствора. Погрешность определения массы металла составила 10 %. Относительно стандартное отклонение при определении металла равнялось 0,05.

Массовую долю катионов РЬ2+ или Na+, сорбированных альбумином в отдельном опыте (щ., мас.%) рассчитывали по формуле:

СО. = 100 • т./т.,

I i ]'

где га. — масса сорбированного РЬ2+ или Na*, г; га.— масса РЬ2+ или Na+, введенных в раствор, г. Относительная погрешность величины щ. составила 10 %. Массовую долю ионов

(щ, мае. %) определяли как среднее значение всех опытов, проведенных для этого продукта [2].

Предлагаемая нами методика приготовления образцов включала следующие операции. Сначала соль РЬ(М03)2 растворяли в 30 мл дистиллированной воды. БСА массой ~ 0,4 г вводили в раствор при перемешивании на магнитной мешалке. Путем добавления 0,5 н. раствора НС1 доводили рН смеси до значения 3,5 (как в желудке человека) и перемешивали образец 3 ч. Затем с помощью 10 % раствора аммиака изменяли рН до значения 8,5 (как в кишечнике человека) и перемешивали образец еще 3 часа. Следует отметить, что щелочную стадию проводили только при исследовании процесса сорбции так как соли свинца гидролизуются. Однако это не оказывает существенного влияния на процесс сорбции РЬ2* из раствора [3—5; 9; 11]. Необходимое

количество растворов соляной кислоты и аммиака определяли в предварительных опытах с помощью универсального иономера ЭВ-74. Было определено значение рН водного раствора БСА (0,4 г белка на 30 мл Н20). Оно оказалось равным 10,8.

Существуют два основных метода высаживания белка из раствора: спиртом и сульфатом аммония [1]. Проведенные эксперименты показали, что в наших условиях лучшим оса-дителем является сульфат аммония. При высаживании спиртом раствор лишь слегка мутнел, и выделение БСА было неполным.

Полученную суспензию фильтровали через бумажный фильтр при пониженном давлении на воронке Бюхнера. Частично обезвоженный образец промывали 20 мл дистиллированной воды. Твердый остаток сушили при 60 °С в течение 1 ч. Полученные образцы представляли собой пленки, прочно удерживаемые фильтром. Их хранили в эксикаторе над СаС12. При анализе атомно-абсорбционом методом на содержание свинца и натрия сухой остаток растворяли в концентрированной азотной кислоте вместе с фильтром. В предварительных опытах было установлено, что использованные нами фильтры задерживали 4, 5 мае. % катионов свинца. Содержание свинца и натрия определяли также в оставшемся фильтрате.

Как показали проведенные нами ранее исследования, сорбция тяжелых металлов из растворов их солей осуществляется твердым

Серия «Биологические науки*

89

остатком растительных продуктов, образую- Содержание натрия в твердом остатке и в

щимся после их кислотного и щелочного гидролиза [3—5; 9; 11].

В предварительных экспериментах была определена масса сульфата аммония, необходимая для эффективного высаживания альбумина из раствора. При этом белок проходил как кислотную, так и щелочную стадии. Исходя из растворимости ШН4)2504 [10], которая при 25 °С равна 78 г соли на 100 г воды, получили, что оптимальное количество сульфата аммония равно - 15 г (табл. 1). При этом из раствора высаживается ~ 73 мас.% белка.

фильтрате в сумме в пределах погрешности эксперимента совпадает с его количеством в исходном БСА. В белке после пребывания кислотно-основной среде остается 16.5 мас.% натрия от исходного его содержания в БСА. В результате проведенных обработок около 25— 30 мас.% белка остается в растворе, а в твердом остатке содержится ~ 0.5 мас.% (см. табл. 2).

Результаты, полученные при исследовании сорбции свинца БСА в присутствии натрия (табл. 3), показывают, что альбумин эффектив-

Так как в исходном БСА содержался ЫаС1, но связывает РЬ2+ из раствора его соли, при-атомно-абсорбционным методом спектрально- чем доля сорбированного металла практиче-

го анализа мы определили количество катионов натрия в нем. Оно составило 0,762 мг натрия в 50,8 мг белка, т. е. 1,5 мас.%. В пересчете на хлорид натрия это соответствует 1,937 мг, или 3,8 мас.% соли от массы БСА.

В табл. 2 представлены результаты определения способности БСА сорбировать после кислотной и щелочной обработки белка.

ски не зависит от его концентрации в растворе и составляет 75 ± 4 мас.%. Масса высадившегося из раствора белка в присутствии РЬШ03)2 больше, чем при сорбции Ыа+ (см. табл. 2, 3). В свою очередь, свинец влияет на способность альбумина сорбировать натрий. Содержание последнего в твердом остатке БСА уменьшается почти в 10 раз.

$

I

Таблица 1

Данные опытов по высаживанию белка сульфатом аммония

т БСА, г т (N£14)2804, г т твердого остатка БСА, г со высадившегося БСА, мас.%

0,4001 12,0000 0,1228 32,4

0,4000 15,2100 0,2933 73,3

0,4001 17,9998 0,2642 66,0

ш

\ I г

Таблица 2

Данные опытов по определению содержания натрия в образцах БСА

т БСА, 1 т твердого остатка БСА, 1 со высадившегося БСА, мас.% т Р^а4), мг (Иа4) в твердом остатке от исходного содержания в БСА, мас.%

в исходном БСА № в твердом остатке БСА в фильтрате

0,4014 0,2868 71,4 6,0 ± 0,6 0,99 5,18 16,5

6,2 ± 0,6

90

ВЕСТНИК Мордовского университета | 2008 I № 2

Таблица 3

Данные опытов по определению сорбции свинца бычьим сывороточным альбумином

Соль m БСА, г m соли, г m вводимого РЬ2+, мг m твердого остатка БСА, г m сорбиров. Pb2J", мг m сорбиров. Na+, мг co¡ сорбиров. РЬ2~, мас.% (О высадившегося БСА, мас.%

Pb(N03)2 0,4006 0,0303 18,9 0,3602 15,0 0,08 79,0 89,9

0,4003 0,0152 9,5 0,3652 6,8 0,14 71,6 91,3

ном БСА (1,5 мас.%). Получено, что в условиях эксперимента альбумин связывает 16,5 мас.% натрия от исходного его содержания в белке.

3. Обнаружено, что БСА сорбирует 75 ±4 мае. % РЬ2+ из раствора его соли, и это количество не зависит от концентрации Pb(N03)2.

4. Выявлено, что свинец влияет на способность альбумина сорбировать натрий. Содержание последнего в твердом остатке БСА уменьшается почти в 10 раз.

БИЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Автоматизация процессов фракционирования белковых растворов при получении препаратов крови / JI. И. Скобелев, А. А. Фром, М. И. Иванов, М. В. Подольский / / Химико-фармацевтический журнал.

1970. № 12. С.61—65.

2. Батунер JI. М. Математические методы в химической технике / Я. М. Батунер, M. Е. Позин. М., Л. : Госхимиздат, 1953. 447 с.

ч

3. Изучение процесса сорбции свинца и кадмия рядом, продуктов из растительного сырья /

B. Ф. Урьяш, А. Е. Груздева, Н. Б. Плетнева, Е. А. Маслова, Е. В. Потемкина, В. Т. Демарин / / Химия, технология и промышленная экология неорганических соединений: Сб. науч. тр. Пермь, 1999. Вып. 2.

C. 56—59.

4. Исследование процесса сорбции тяжелых металлов пищевыми добавками «Биофит» / В. Ф. Урьяш, Е. А. Степанова, Н. В. Гришатова, А. Е. Груздева, Н. В. Кулешова, M. Е. Безруков / / Вестн. ННГУ. Сер. Биология. 2004. № 3 (5). С. 85—91.

5. Исследование сорбции и выведения свинца биологически активными добавками к пище в опытах in vitro и in vivo / Е. А. Степанова, В. Ф. Урьяш, А. А. Силкин, В. В. Логинов^Д. Е. Груздева, Н. В. Гришатова, А. Н. Туманова / / Поволжский экологический журнал. 2005. № 1. С. 75.

6. Ландау М. А. Молекулярная природа отдельных физиологических процессов / М. А. Ландау. М. : Наука, 1985. 260 с.

7. Овчинников Ю. А. Биоорганическая химия / Ю. А. Овчинников. М. : Просвещение, 1987. 815 с.

8. Прайс В. Аналитическая атомно-абсорбционная спектроскопия / В. Прайс. М. : Мир, 1976.

355 с.

9. Сорбция свинца и кадмия продуктом "Биофит" из скорлупы куриных яиц и способности этого продукта поставлять кальций в организм человека / В. Ф. Урьяш, А. Е. Груздева, Н. В. Гришатова, В. Т. Демарин, А. Н. Туманова, В. Ф. Занозина, Е. А. Степанова / / Поволжский экологический журнал. 2005. № 2. С. 167—172.

10. Справочник химика. Т. 2. Основные свойства неорганических и органических соединений. М. ;

Л. : Химия, 1965. С. 26—27.

11. Степанова Е. А. Сорбция свинца и кадмия биологически активными добавками к пище из растительного сырья в биопрофилактике загрязнения среды обитания тяжелыми металлами : дис. ... канд. биологич. наук. / Е. А. Степанова. Нижний Новгород : ННГУ, 2006. 135 с.

12. Сырье и продукты пищевые. Методы определения свинца / ГОСТ 26932-86. М. : ИПК «Издательство стандартов», 1999. 10 с.

Поступила 04.02.08.

Выводы:

1. Разработана методика изучения способности бычьего сывороточного альбумина сорбировать катионы свинца из водного раствора его соли в присутствии катионов натрия в условиях, моделирующих процесс пищеварения в желудочно-кишечном тракте человека. Определено оптимальное количество ШН4)2804 для высаживания БСА из раствора. Оно составило ~ 15 г соли на 30 мл раствора.

2. Определено содержание в исход-

Серия «Биологические науки»

91