Молекулярно-генетическое исследование истории изменения численности популяций байкальских олигохет

Целью настоящей работы было изучение уровня тиреоидных гормонов в крови и щитовидной железе лабораторных животных в динамике аллоксанового диабета.

Экспериментальный сахарный диабет у половозрелых крыс-самцов Вистар вызывали однократным введением внутрибрюшинно после 18 часов голода диабетогенной дозы аллоксана — 17 мг на 100 г массы тела. Развитие диабета подтверждали путем измерения уровня глюкозы в сыворотке крови колориметирическим методом. Животных выводили из эксперимента через 1 и 4 недели после введения аллоксана. Для определения тиреоидных гормонов забирали сыворотку крови и щитовидную железу. Последнюю взвешивали, гомогенизировали в 1 мл 0,01 М фосфатного буфера, pH 7,4; центрифугировали 20 мин. при 2000 g; в супернатантах измеряли содержание Т4 и Т3 радиоиммуным методом. Рассчитывали массовый индекс щитовидной железы как отношение массы щитовидной железы в мг на 100 г массы тела крысы.

Концентрация глюкозы в крови в группе контрольных животных составила 6,2 ± 0,3 ммоль/л. У крыс в группе с аллоксановым диабетом этот показатель был выше в 5 раз (30,5 ± 5,8 ммоль/л).

К концу первой недели развития аллоксанового диабета отмечена тенденция к увеличению значений массового индекса щитовидной железы крыс (4,41 ± 0,54 мг на 100 г) по сравнению с контрольными животными (3,39 ± 0,15 мг на 100 г). Уровень Т4 в щитовидной железе вырос до 121 %, при этом уровень Т3 снизился до 63 % от величин этого показателя у контрольных животных.

К концу четвертой недели течения аллоксанового диабета массовый индекс щитовидной железы и уровень Т3 в железе возвратились к контрольным значениям, а содержание Т4 выросло до 181 % от значений этого показателя у контрольных животных. Полученные данные свидетельствуют о повышении функциональной активности щитовидной железы в динамике аллоксанового диабета, проявляющемся в усилении синтеза Т4.

Концентрация Т4 и Т3 в крови крыс с аллоксановым диабетом снизилась и составила к концу первой недели эксперимента 56 % и 66 %, к концу четвертой недели — 65 % и 45 % от уровня содержания соответствующего гормона у контрольных животных. Полученные данные позволяют высказать предположение о том, что при аллоксановом диабете происходит разобщение процессов синтеза и секреции гормонов в щитовидной железе. В результате формируется состояние гипотиреоза, связанное не с ингибированием синтеза тиреоидных гормонов, а с нарушением их секреции в циркуляцию.

В литературе имеются сведения о том, что при изменении физиологического состояния организма или патологии может происходить модулирование активности процессов периферического дейодирования Т4, которое осуществляется с участием тиреотропного гормона, инсулина, катехоламинов и направлено на поддержание баланса тиреоидных гормонов. Полученные результаты указывают на то, что при снижении поступления Т4 из щитовидной железы в кровь угнетаются процессы дейодирования Т4 в периферических тканях в Т3 , что и отмечено у экспериментальных животных с аллоксановым диабетом через 4 недели после индукции заболевания.

Известно, что первые фазы секреции тиреоидных гормонов — захват фолликулярными эпителиальными клетками коллоидальных капель с синтезированными гормонами, а также захват этих капель лизосомами и протеолиза тиреоглобулина с освобождением Т3 и Т4, являются энергозависимыми процессами. Нарушение энергетического обмена в организме экспериментальных животных с сахарным диабетом может отражаться и на секреции тиреоидных гормонов. При этом наработка гормонов в щитовидной железе усиливается, вероятно, по механизму обратной связи из-за сниженного содержания Т3 и Т4 в крови.

Таким образом, развитие гипотиреоидного состояния у экспериментальных животных при аллоксановом диабете не связано с истощением функциональных резервов щитовидной железы.

A.C. Муркин, Ю.С. Букин, И.А. Кайгородова, В.Г. Ливенцева

молекулярно-генетическое исследование истории изменения численности популяций байкальских олигохет

Лимнологический институт СО РАН

В настоящее время разработан ряд методов популяционной генетики, позволяющий на основе молекулярно-генетических данных оценить современное состояние популяций и понять закономерности изменения эффективного размера популяции как в прошлом, так и в будущем. Использование этого метода дает возможность оценить степень влияния антропогенного фактора, оказываемого на экосистему.

В качестве модельного объекта выбраны байкальские олигохеты, недавно описанного вида Pseudorhynchelmis alyonae (Martin et al., 1998; Кайгородова, Ливенцева, 2003, 2007), для которого известно лишь два местообитания: пролив Ольхонские ворота (экологически чистый район) и Муринская банка, находящаяся в зоне влияния БЦБК. Олигохеты играют важную роль в круговороте веществ озера Байкал, являются основным элементом пищевой цепи промысловых рыб, являются маркером экологической чистоты водоемов.

методы исследования

Геномную ДНК отдельных особей экстрагировали цетавлоном по слегка модифицированному методу Дойла-Диксона. Фолмеровский фрагмент гена mtCOI амплифицировали с использованием олигонуклеотидных праймеров, универсальных для большинства беспозвоночных. Расшифровка первичной структуры ДНК проведена с помощью реакции секвенирования двухцепочечных продуктов амплификации.

Статистический и математический анализ молекулярных данных проведен с использованием программы FLUCTUATE 1.4 (Kuhner, Smith, 2007), позволяющих оценивать эффективный размер популяции. Для оценки истории изменения эффективного размера популяции применяли GENIE v3.0 (Strimmer, Pybus, 2001).

результаты

Определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена mtCOI для 16 особей эндемичного байкальского вида P. alyonae из двух разрозненных популяций (Ольхонские ворота и Муринская банка). Филогенетический анализ полученных данных выявил неравномерность скоростей молекулярной эволюции в разных популяциях (рис. 1).

Ольхонские ворота

Рис. 1. Схема филогенетических отношений двух байкальских популяций Р. а/уопае. Максимально правдоподобное древо и оценки длин ветвей получены с помощью программы ШВООТ (Такегак\ е1 а1., 1995) при использовании модели Tamura-Nei.

Для того чтобы проверить, не связана ли пониженная скорость накопления замен в муринской популяции с неблагоприятными экологическими факторами, мы провели анализ нуклеотидных последовательностей с целью выяснения истории изменения численности обеих популяций. Для этого мы рассчитали популяционный параметр 0 = 4Ыв1, где Ыв. — эффективный размер популяции, а 1 — вероятность мутации. Учитывая, что в естественных популяциях в пределах вида вероятность мутации остается постоянной величиной, то 0 будет меняться прямо пропорционально эффективному размеру популяций. Эффективный размер популяций для организмов определяется соотношением:

№ = ^ду(^ +

где N — численность половозрелых самок, а Nm — численность половозрелых самцов.

В ходе анализа нами было установлено, что популяция олигохет, обитающая в районе Муринской банки, имеет значения параметра 0 = 0,07, скорость изменения которого д = —0,93, что указывает на то, что данная группа организмов в настоящий момент времени уменьшает свою численность. В районе Ольхонских ворот 0 = 0,32 а скорость изменения этого параметра д = 63,4, что указывает на рост численности организмов. При сравнении значения 0 в данных популяциях видно, что численность олигохет в проливе Ольхонских воротах значительно больше, чем в Муринской банке.

доля замен

доля замен

рис. 2. История изменения параметра 0 для популяций: а) Муринской банки и б) Ольхонских ворот. Шкала времени указана в долях замен нуклеотидных оснований в последовательностях ДНК гена тГС01.

Результаты анализа истории изменения численности представлены на рисунке 1, из которого видно, что с течением времени в популяции Муринской банки олигохеты сохраняли приблизительно стабильную численность. В Ольхонских воротах, напротив, произошло скачкообразное увеличение численности при доле замен в 0,027. Если учесть, что в данной группе организмов доля замен в 0,022 — 0,026 накапливается за 1 млн лет, скачок численности произошел примерно 1,06—1,24 млн. лет назад.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 08-04-98063).

литература

1. Кайгородова И.А.Исследование монофилии рода Rhynchelmis Hoffmeister, 1843 (Oligochaeta, Lumbriculidae): филогения, основанная на морфологии / И.А. Кайгородова, В.Г. Ливенцева // Электронный журнал "Исследовано в России”. —2007. — № 139. — С. 1506—1516. http://zhurnal.ape.relarn.ru/ articles/2007/139.pdf

2. Ливенцева В.Г. Филогенетический анализ родства видов рода Rhynchelmis (Oligochaeta, Annelida) / В.Г. Ливенцева, И.А. Кайгородова // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - № 7. - С. 131-132, 171.

3. Kaygorodova I.A. Molecular phylogeny of Baikalian Lumbriculidae (Oligochaeta): Evidence for recent explosive speciation / I.A. Kaygorodova, D.Yu. Sherbakov, P. Martin // Comparative Cytogenetics. - 2007. - N 1. - P. 71-84.

4. Martin P. Description of two new species of Rhynchelmis (Oligochaeta: Lumbriculidae) from Lake Baikal (Russia), using classical morphology and ultrastructure of spermatozoa / P. Martin, M. Ferraguti, I. Kaygorodova // Annls. Limnol. - 1998. - N 34(3). - P. 283-293.

Н.Л. Якимова

нЕйротоксичность неорганических соединений ртути в отдаленном Постконтлктном периоде при экспериментальном моделировании

АФ - НИИ медицины труда и экологии человека ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН

Наблюдающееся нарастание нарушений психо-неврологического статуса в отдаленном периоде у лиц, находившихся в контакте с неорганическими соединениями ртути (НСР) как на производстве, так и в быту, обусловливает актуальность выполнения экспериментальных исследований, направленных на установление патогенетических механизмов последствий ртутной интоксикации.

Целью исследования явилась сравнительная оценка нарушений поведения, нейрохимических, нейрофизиологических изменений головного мозга у лабораторных животных в отдаленном периоде воздействия паров металлической ртути и сулемы.

материалы и методы

Объектами исследования являлись беспородные белые крысы. Животных опытных групп в течение 7 недель подвергали ингаляционному воздействию парами металлической ртути или подкожному введению сулемы. Обследование проводили через 8 недель после экспозиции тестированием по методам «открытое поле», «крестообразный лабиринт», «чужак — резидент», «вращающийся стержень», исследуя ЭЭГ, а также определяя в гомогенате головного мозга показатели ПОЛ и содержание нейромедиаторов.

результаты

При анализе индивидуального поведения белых крыс установлено нарушение целостной структуры поведения при введении НСР, имеющее аналогичную направленность и общие закономерности. После экспозиции парами ртути число обследований отверстий открытого поля среди белых крыс, у которых регистрировался данный акт, было ниже по сравнению с контролем и составляло 2,76 ± 0,3 усл. ед. и 3,52 ± 0,3 усл ед. (р < 0,05). Животные с ртутной экспозицией статистически значимо дольше контрольных выполняли акты «вертикальная стойка» (2,0 ± 0,65 сек. и 0,27 ± 0,15 сек.), «стойка с упором» (3,4 ± 0,57 сек. и 1,3 ± 0,19 сек.) и «фризинг» (4,4 ± 3 сек. и 0,34 ± 0,20 сек., соответственно). Количество крыс, выполняющих акт «стойка с упором», составило 36,36 ± 8,3 % в опыте и 61,11 ± 8,1 % в контроле. Время акта «груминг» составляло 8,5 ± 2,5 сек. в опыте и 0,52 ± 0,23 сек. в группе сравнения. При воздействии сулемы у животных опытной группы достоверно увеличилось число акта «фризинг», в то время как у животных контрольной группы данный акт отсутствовал. Изменение горизонтальной двигательной активности у белых крыс, получивших сулему, проявилось в уменьшении числа «локомоций» (0,91 ± 0,31 усл. ед.) по сравнению с интактными (2,2 ± 0,77 усл. ед.). Снижение показателя локомоторного поведения и вертикальной активности в «открытом поле» является показателем поведенческой стратегии со склонностью к пассивно-оборонительной реакции на новую обстановку. Увеличение числа паттерна «груминг» в 1,6 раза у подвергнутых воздействию сулемы белых крыс может свидетельствовать об усилении состояния тревожности.