Уровень bcl-2 в неизмененном, гиперплазированном и малигнизированном эндометрии

УРОВЕНЬ bcl-2 В НЕИЗМЕНЕННОМ, ГИПЕРПЛАЗИРОВАННОМ И МАЛИГНИЗИРОВАННОМ ЭНДОМЕТРИИ

А.Л. Чернышева, Л.А. Коломиец, И.В. Суходоло

НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Исследован уровень протоонкогена bcl-2 в 185 образцах эндометрия (неизменный -15, железистая гиперплазия - 62, плоскоклеточная метаплазия - 32, атипическая гиперплазия - 42, рак эндометрия - 34). Выявлено, что клетки эндометрия характеризуются экспрессией bcl-2 протеина, однако уровень экспрессии зависит как от фазы менструального цикла, так и от характера патологического процесса в слизистой оболочке тела матки. Имеется прямая корреляционная связь между уровнем экспрессии bcl-2 и степенью нарушения пролиферации клеток эндометрия, минимальные показатели bcl-2 определяются у больных раком эндометрия, следовательно, при малигнизированном эндометрии нарушен нормальный дисбаланс между пролиферацией и апаптозом клеток.

The level of BLC-2 in unchanged, hyperplastic and malignant endometrium A.L. Chernyshova, L.A. Kolomiyets, I.V. Suchodolo Cancer Research Institute of Tomsk Scientific Center SB RAMS The level of protooncogene bcl-2 in 185 endometrial specimens (15 unchanged, 62 glandular hyperplasia, 32 squamous-cell metaplasia, 42 atypical hyperplasia, 34 endometrial cancer) has been studied. Endometrial cells have been found to be characterized by expression of protein bcl-2, however, the level of expression depends on both the phase of menstrual cycle and the character of pathologic process in uterine corpus mucosa. There is a direct correlation between the level of bcl-2 expression and the proliferation of endometrial cells, minimal values of bcl-2 are determined in patients with endometrial cancer, therefore, the normal unbalance between cell proliferation and apoptosis is damaged in malignant endometrium.

Апоптоз представляет собой физиологический процесс гибели клеток, направленный на поддержание клеточного гомеостаза в различных тканях, включая эндометрий [13]. Хотя изучение молекулярных основ апоптоза находится на начальной стадии, не исключается, что опухолевый рост может быть связан с дисбалансом между пролиферацией клеток и их запрограммированной гибелью. Об этом свидетельствует все большее число исследований, согласно которым патогенез так называемых пролиферативных заболеваний связан с угнетением механизмов регуляции гибели клеток [8].

При изучении проблем, обусловленных ги-перпластическими процессами и раком эндо-

метрия, основное внимание уделяется исследованиям пролиферативной активности эндометрия под воздействием гормонов [9]. Пролиферация эндометрия связана с воздействием эстрогенов, избыточная стимуляция которыми может сопровождаться повышением митотичес-кой активности клеток слизистой оболочки тела матки и развитием гиперпластических процессов в эндометрии [4].

Гиперпластические процессы эндометрия являются пролиферативными гормональноо-бусловленными заболеваниями, при длительном течении и частом рецидивировании они могут быть фоном, при котором возможно развитие злокачественного поражения. Резистен-тность к гибели путем апоптоза может играть

фундаментальную роль при раковом перерождении клеток [1, 3]. В связи с этим необходим поиск маркеров, позволяющих отличить нормальный рост клеток, контролируемый процессом апоптоза, от пролиферации трансформированных клеток. В регуляции процессов апоптоза участвует множество различных факторов, в том числе протоонкоген семейства bcl-2, ген р53, которые рассматриваются как биологические маркеры процесса клеточной гибели [6].

Одним из основных ингибиторов апоптоза в настоящее время считают ген bcl-2 (англ.В-cell lymphoma/leukemia-2), который впервые был описан как результат хромосомной транслокации в В-клеточной фолликулярной лимфо-ме человека [3, 10].

Bcl-2 является ведущим геном, определяющим механизм клеточной гибели при подавлении апоптоза. Он представляет собой онкоген, локализующийся в 1 S-й хромосоме человека. Этот ген кодирует образование белка, накапливающегося в митохондриях. Bcl-2 протеин служит фактором выживания клетки, защищая ее от программированной гибели, и проявляет он-когенный эффект, так как снижает апоптоз [2].

Механизм действия белка вс!-2 пока не совсем ясен. Предполагают, что вс!-2 может подавлять апоптоз путем регулирования переноса Са через мембрану эндоплазматического ре-тикулума [S]. Установлено, что вс!-2 снижает отток Са через мембрану эндоплазматического ретикулума и отменяет сигнал для входа экст-рацеллюлярного Са, предотвращая, таким образом, повышение цитозольного Са в клетке и запуск апоптоза [11].

Жизнеспособность и физиологическая активность клеток в органах и тканях женской репродуктивной системы регулируются гуморальными сигналами. Гормоны на уровне целостного организма, а цитокины - на паракрин-ном уровне действуют в качестве модуляторов митогенеза, поддерживая пролиферацию или осуществляя функцию дифференцировки клеток и тканей. Физиологическое состояние самой клетки, специфичность и своевременность получения гуморального сигнала предопределяют судьбу каждой клетки в отдельности и органа в целом. Наряду со способностью поддерживать выживание и нормальное функционирование клетки гормоны и цитокины осуществляют также регуляцию клеточного гомеос-

таза в тканях, индуцируя гибель клеток путем апоптоза [И].

Обнаружена корреляция показателей bcl-2 с наличием рецепторов эстрогенов и степенью гистологической злокачественности. Таким образом, экспрессия bcl-2 связана с факторами, указывающими на благоприятный прогноз [7]. В последнее время появились сведения о том, что высокая экспрессия bcl-2 может быть неза- I висимым показателем лучшей общей и безре-цидивной выживаемости при раке эндометрия.

В работу включены результаты обследования и лечения 185 пациенток с различной патологией эндометрия, находившихся на обследовании и лечении в отделении онкогинекологии НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН с 1998 по 2000 г.

Целью исследования было изучить уровень ; bcl-2 в неизмененном, гиперплазированном и малигнизированном эндометрии.

Все больные в зависимости от характера патологии эндометрия с учетом Международной классификации ВОЗ (1980) и клинико-морфологической классификации, предложенной Г.М. Савельевой и В.Н. Серовым (1980), были разделены на следующие группы: больные с фоновой патологией эндометрия: I группа - 62 пациентки с гистологическим диагнозом: железистая, железисто-кистозная гиперплазия эндометрия, П группа - 32 пациентки с гистологическим диагнозом: плоскоклеточная металла-зия, Ш группа - 42 пациентки с предраковыми состояниями эндометрия (атипическая гиперплазия), IV группа - 34 пациентки с аденокарциномой различной степени дифференцировки. Группу сравнения составили 15 пациенток без патологических изменений в эндометрии.

Материалом для исследования явились парафиновые блоки, содержащие образцы неизмененного и патологически измененного эндометрия.

Для определения антигенов онкопротеина bcl-2 на парафиновых срезах использовали им-мунопероксидазный метод, основанный на применении немеченых первичных антител, вторичных биотинизированных антител и заранее сформированного авидин-биотинового макро-молекулярного комплекса с пероксидазой хрена. Для иммуногистохимических реакций использовали моноклональные антитела к онкопротеину bcl-2 производства «Novocastra Laboratories Ltd» (2000). После депарафиниро-

Состояние эндометрия

Активность Железисто- Плоскоклеточная Атипическая

протоонкогена кистозная метаплазия гиперплазия Рак Контрольная

Ьс1-2 гиперплазия

Высокая (>75) S - - - S

Средняя (50-74) S2 22 S 6 7

Слабая (25-49) 2 10 24 1Б -

Отсутствие (1-24) - - 10 10 -

Всего 62 32 42 34 1S

вания срезы обрабатывали 0,01% раствором трипсина, затем подавляли активность эндогенной пероксидазы 0,3% водным раствором перекиси водорода. Для блокирования неспецифических реакций срезы инкубировали с нормальной лошадиной сывороткой («Sigma», США). Инкубацию срезов с моноклональными антителами в разведении 1:Б0 проводили 10 мин при комнатной температуре во влажной камере. Промывали в забуференном физиологическом растворе. Затем срезы инкубировали с био-тинированными универсальными антителами (1:200), использовали ABC-комплекс фирмы «Vector Lab. Ltd» (США,2001), содержащий ави-дин DH и растворы биотинированной пероксидазы хрена Н, дающие формирование комплекса в иммунопероксидазном методе. Пероксида-зу выявляли раствором диаминобензидина (ДАВ) (наборы «Vector Lab», с добавлением никелевого раствора). В качестве отрицательного контроля пропускали использование первых антител. Просмотр препаратов и микрофотосъемка проводились на световом микроскопе «Jenaval» (фирма «Carl Zeiss, Jena», Германия).

Степень достоверности полученных результатов определяли с использованием пакета программ «StATISTICA for Windows» фирмы «Stat Soft» версия S.733 и t-критерия Стьюдента.

Результаты оценки активности протоонкогена bcl-2 в неизмененном, гиперпластическом и неопластическом эндометрии представлены в таблице . Анализ результатов идентификации bcl-2 протеина у женщин контрольной группы позволил выявить экспрессию bcl-2 протеина в железах и строме нормального эндометрия.

Однако интенсивность иммуноокрашивания эндометрия была разной у женщин контрольной группы и зависела от фазы менструального цикла. У всех пациенток, эндометрий которых соответствовал пролиферативной фазе цикла, обнаружено сильное и среднее по интенсивности позитивное иммуноокрашивание Ьс1-2 протеина в эндометрии. Интенсивность окраски Ьс1-2 протеина в ранней секреторной фазе менструального цикла расценивалась как слабая цитоплазматическая реакция эндометрия (++) и была обнаружена у 4 (27%) пациенток данной группы.

У 20% больных, эндометрий которых соответствовал стадии поздней секреции, зафиксировано отсутствие реакции эндометрия на Ьс1-2 иммуноокрашивание. Таким образом, можно предположить, что железистые клетки нормального эндометрия экспрессируют Ьс1-2 на протяжении пролиферативной и, вероятно, ранней секреторной фаз, но не в период поздней секреции [12].

По уровню экспрессии Ьс1-2 в эндометрии можно судить о состоянии апоптоза в нем. Следовательно, исчезновение экспрессии Ьс1-2 в позднюю лютеиновую фазу способствует запрограммированной гибели клеток эндометрия.

У 8 пациенток с железистой и железистокистозной гиперплазией была обнаружена максимальная экспрессия Ьс1-2, что проявилось в сильном (++++) цитоплазматическом окрашивании ядер эпителиоцитов желез эндометрия. Клетки стромы слизистой оболочки тела матки при этом оказались преимущественно Ьс1-2 негативными. У подавляющего большинства больных этой группы - 52 из 62(83,8%) - наблю-

далось среднее иммуноокрашивание цитоплазмы клеток эндометрия (+++), у 2 (3,2%) пациенток было слабое окрашивание цитоплазмы.

В группе пациенток с плоскоклеточной метаплазией эндометрия также выявлена экспрессия Ьс1-2, о чем свидетельствует позитивная иммунореактивность

эндометрия, причем у 22 (70,9%) больных было обнаружено среднее по интенсивности (+++) цитоплазматическое окрашивание эндометрия с сильнопозитивными участками. У 10 (29,1%) пациенток этой группы интенсивность окраски Ьс1-2 протеина в эндометрии расценивалась как слабая (++). Зависимости интенсивности окраски эндометрия от фазы менструального цикла, на фоне которого была диагностирована плоскоклеточная метаплазия, нами не обнаружено.

У 24 (57,1%) больных с атипической гиперплазией эндометрия было установлено, что интенсивность окраски протоонкогена Ьс1-2 расценивалась как слабая (++), у 10 (23,8%) пациенток эндометрий был Ьс1-2-негативным. У 8 (19%) пациенток

определялось среднее по интенсивности (+++) окрашивание. Во всех образцах отмечалось неоднородное иммуноокрашивание железистого эпителия по сравнению с таковым при железисто-кистозной гиперплазии эндометрия. Необходимо отметить, что так же, как в случаях с железисто-кистозной гиперплазией, строма оказалась преимущественно Ьс1-2-

негативной.

В группе больных раком эндометрия обнаружено существенное снижение

экспрессии Ьс1-2, что проявилось как в снижении количества клеток эндометрия с Ьс1-2-иммунопозитивной реакцией, так и в снижении интенсивности окрашивания иммунопозитивного эндометрия.

Максимальное иммуноокрашивание (-Н--Н-) не обнаружено ни у одной больной данной группы. У 18 (55,7%) пациенток в

эндометрии выявлена экспрессия Ьс1-2, однако при этом имело место слабое цитоплазматическое окрашивание (++) Ьс1-2 протеина. У 6 (14,7%) пациенток отмечалось среднее по интенсивности им-

муноокрашивание (+++). У 10 (29,6%) больных раком эндометрий был Ьс1-2-негативным.

Анализ взаимосвязи между степенью диф-ференцировки аденокарциномы и экспрессией Ьс1-2 показал, что у 6 (50%) из 12 больных с высокодифференцированной аденокарциномой выявлено среднее иммуноокрашивание (++¥),

у остальных больных этой группы имелось слабое цитоплазматическое окрашивание клеток эндометрия (++).- У 90% больных с низкодифференцированной аденокарциномой реакция эндометрия на иммуноокрашивание отсутствовала. Только у одной больной в группе с низкодифференцированной аденокарциномой было обнаружено слабое цитоплазматическое окрашивание, в то время как в группе больных с умереннодифференцированной аденокарциномой продемонстрировано более или менее равномерное распределение по интенсивности bcl-2 цитоплазматического иммуноокрашивания

клеток эндометрия. Все 12 пациенток этой группы имели слабое (++) окрашивание цитоплазмы клеток эндометрия, однако у 3 пациенток, опухоли которых были bcl-2 - позитивными, окрашивание было неоднородным. Таким образом, со снижением степени дифференциров-ки опухолевой ткани эндометрия снижается экспрессия bcl-2 в ней.

Полученные результаты свидетельствуют, что клетки эндометрия характеризуются экспрессией bcl-2 протеина, однако уровень экспрессии зависит как от фазы менструального цикла, так и от характера патологического про- цесса в слизистой оболочке тела матки. С усилением выраженности пролиферативного процесса в эндометрии экспрессия bcl-2 протеина снижается, а при аденокарциноме иногда и BOB- се не определяется.

Во всех случаях при bcl-2-позитивной реакции эндометрия, независимо от выраженности патологического процесса, было зафиксировано преимущественно цитоплазматическое иммуноокрашивание. Полученные результаты свидетельствуют, что экспрессия bcl-2 протеина играет важную роль в регуляции физиологической гибели клеток неизмененного эндометрия и зависит от фазы менструального цикла. Железистые клетки нормального эндометрия экспрессируют bcl-2 на протяжении пролиферативной и ранней секреторной фазы. Поскольку bcl-2 является ингибитором апоптоза, исчезновение экспрессии данного белка в клетках слизистой оболочки тела матки на протяжении лютеино-вой фазы цикла способствует запрограммированной гибели клеток неизмененного эндометрия. Гибель клеток путем апоптоза представляется важным свойством нормальной физиологии слизистой оболочки тела матки с пиком ак-

тивности в позднюю лютеиновую фазу, о чем свидетельствует отсутствие экспрессии белка Ьс1-2 в эндометрии соответствующей фазы менструального цикла. Нарушение экспрессии Ьс1-2 может играть определенную роль в патогенезе эндометриальных неоплазий. При плоскоклеточной метаплазии окрашивание эндометрия наблюдалось средней интенсивности.

При железистой и железисто-кистозной гиперплазии эпителиоциты желез эндометрия одинаково сильно иммунопозитивные; при аденоматозной гиперплазии они становятся слабо-позитивными и периодически иммунонегатив-ными, тогда как при аденокарциноме экспрессия Ьс1-2 в основном слабая и обнаруживается главным образом в высокодифференцированных опухолях, в то время как низкодифференцированные аденокарциномы все Ьс1-2- имму-нонегативные.

Наши результаты показывают существенную разницу в экспрессии Ьс1-2 при гиперплазии, метаплазии и раке эндометрия. При железисто-кистозной гиперплазии эндометрия железы одинаково сильно иммунопозитивные. При атипической гиперплазии железы эндометрия становятся слабопозитивными и периодически иммунонегативными, тогда как при аденокарциноме экспрессия Ьс1-2 в основном слабая и обнаруживается главным образом в высокодифференцированных опухолях.

Существует предположение, что повышение экспрессии Ьс1-2 может играть роль на ранних стадиях развития гиперпластических изменений в эндометрии, продлевая выживание клеток эндометрия путем ингибирования их апоп-тической гибели. Приобретение в дальнейшем генетических нарушений может уменьшить зависимость выживаемости поврежденных (дефектных) клеток от Ьс1-2, что приведет к появлению Ьс1-2-негативных клонов с более агрессивным фенотипом и развитию из предраковых поражений инвазивных карцином или к более поздним стадиям заболевания. Это предположение согласуются с тем фактом, что при аденокарциноме эндометрия высокая дифференци-ровка опухоли ассоциируется с Ьс1-2-иммунопозитивностью, а низкодифференцированные раки чаще Ьс1-2-иммунонегативные.

Прогрессирующая тенденция к снижению экспрессии Ьс1-2 от доброкачественного состояния эндометрия, включая пролиферативную

стадию, плоскоклеточную метаплазию и гиперплазию, к аденокарциноме слизистой оболочки тела матки может свидетельствовать о том, что нормальный дисбаланс между пролиферацией клеток и их гибелью нарушен при малигнизированном эндометрии.

Таким образом, выявление маркеров нарушения процесса запрограммированной гибели клеток, в частности bcl-2, возможно рассматривать в качестве фактора онкологического прогноза развития пролиферативных процессов эндометрия.

Литература

1. КопнинБ.П., Сергеев С.А., Ильинская Г.В., СеменякО.Ю. Воздействие новых активностей мутантных р53 на клеточный цикл, апоптоз и чувствительность к цитостатикам // IV Российс кая онкологическая конференция. М, 2000.

2. НовикВ.Н., АгроскинЛ.С., Папаян Г.В., СолоеьееаЛ.В. II Эксперим. онкол. 2000. Т.22, № 2. С.30-33.

3. Arends M.J. Apoptosis in the endoraetrium // Histopathology. 1999. Vol. 35, №2. P.174-178.

4. Das H., Koizumi Т., Sugimoto T. et al. Quantitation of Fas and Fas ligand gene expression in human ovarian, cervical and endometrial carcinomas using real-time quantitative RT-PCR // Br. J. Cancer. 2000. Vol. 82, №10. P.1682-1688.

5. Gunther K., Horbach Т., Hohenberger W. et al. Colonic late-onset familial adenomatous polyposis combined with severe duodenal polyposis and familial endometrial cancer // Am. J. Med. 2000. Vol. 108, №8. P.681-683.

6. Hendry W.J., 3*, ZhengX., Leavitt W.W. et al. Endometrial hyperplasia and apoptosis following neonatal diethylstilb e stro l exposure and subsequent estrogen stimulation in both host and transplanted hamster uteri // Cancer Res. 1997, Vol. 57, № 10. P. 19031908.

7. Kabarity H., Nap M, Lang N. The patterns of expression of an apoptosis-related CK18 neoepitope, the bcl-2 proto-oncogene, and the Ki67 proliferation marker in normal, hyperplastic, and malignant endometrium // Int. J. Gynecol. PathoL 2000. Vol. 19, № 2. P.118-126.

8. Kolobova E.A., Zhdanov A. V., Varlamov D.A. et al. Potential activity of Ca,+/Mg2+-dependent endonuclease in endometrial hyperplasia and cancer // Biull. Eksp. Biol. Med. 1999. Vol. 127, №

6. P.683-687.

9. Maatta M., Soini Y., Liakka A., Autio-Harmainen H. Localization ofMTl-MMP, TlMP-1, ТГМР-2, andTMP-3 messenger RNA in normal, hyperplastic, and neoplastic endometrium. Enhanced expression by endometrial adenocarcinomas is associated with low differentiation//Am. I Clin. Pathol. 2000. Vol. 114, №3. P.402-411.

10. Patten S.F., Patten F.W. Cytopatology of uterine sarcomas and their differential diagnosis: Compendium on diagnostic cytology. 7-th Edition / Ed by G.L. Wied et al. Tumorials of Cytology. Chicago: USA, 1992. Р.Ш-154.

11. ShengX., SongH., HeX. Bcl-2 gene expression in endometrial carcinoma// Chung Hua Chung Liu Tsa Chih. 1998. Vol. 20,№ 5. P.365-366.

12. Shi/cone Т., Kakawa K., Yamoto M., Nakano R. Apoptosis of human ovary and uterine endometrium during the menstrual cycle // Horm. Res. 1997. Vol. 48, Suppl. 3. P.27-34.

13. Zoelen E.J., Olijve W., Wijngaard A. van den et al. Antiestrogens specifically up-regulate bone morphogenetic protein-4 promoter activity in human osteoblastic cells // Mol. Endocrinol. 2000. Vol. 14, № 5. P.623-633.

Поступила 20.01.03