СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА, АССОЦИИРОВАННОЙ С МУТАЦИЯМИ В ГЕНЕ ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗЫ (GBA)
METHOD FOR DIAGNOSING PARKINSON'S DISEASE ASSOCIATED WITH MUTATIONS IN GLUCOCEREBROSIDASE (GBA) GENE

Изобретение относится к медицине, а именно, к неврологии, клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для ранней доклинической диагностики Паркинсона (БП), ассоциированной с мутациями в гене GBA.
На сегодняшний день ключевым звеном в патогенезе БП считается накопление и агрегация пресинаптического белка альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах черной субстанции головного мозга, приводя к их гибели и развитию характерной симптоматики.
Известны способы ранней диагностики болезни Паркинсона на доклинической стадии, заключающиеся в оценке концентрации олигомерных форм белка альфа-синуклеина, описанном в патенте РФ 2657763 [1], других метаболитов (норадреналина (НА), дофамина (ДА), 3,4-диоксифениоаланина (L-ДОФА), 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОУФК), описанных в патентах РФ 2657763 [2] и патенте WO 2011152699 [3], а также уровень микро РНК в клетках крови и биологических жидкостях человека [4,5,6]:
[4] Патент: US 2020208219.
[5] Identification of blood microRNAs associated to Parkinsons disease, J. Biotechnol. 152 (3) (2011) 96-101.
[6] Convergence of miRNA expression profiling, α-synuclein interacton and GWAS in Parkinson's disease, PloS One 6 (10) (2011) e25443.
В вышеуказанных подходах к ранней диагностике БП рассматривается уровень альфа-синуклеина и микро РНК в лимфоцитах крови, а также уровень метаболитов дофамина в плазме крови.
Однако все вышеуказанные способы имеют ряд ограничений. Концентрация олигомерных форм альфа-синуклеина в лизате лимфоцитов крови крайне мала и оценка их производится на нижнем пороге чувствительности метода, а изменение уровня микро РНК как и производных дофамина в плазме крови не является специфичным для БП, и в частности для БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA (GBA-БП).
Известно, что мутации в гене GBA (наличие двух мутаций) приводит к развитию наследственного аутосомно-рецессивного заболевания, болезни Гоше. И пациенты с болезнью Гоше и гетерозиготные носители мутаций (одна мутация) имеют высокий риск развития болезни Паркинсона: Hruska K.S. et al. Gaucher disease: mutation and polymorphism spectrum in the glucocerebrosidase gene (GBA) // Hum. Mutat. - 2008. - 29. N 5. - P. 567-583 [7].
Риск болезни Паркинсона среди носителей мутаций в гене GBA увеличивает в 7-8 раз в различных популяциях в мире: Emelyanov А.K. et all «Mutation analysis of Parkinson's disease genes in a Russian data set». Neurobiol. Aging. 71: 267.e7-267.e10. 2018 [8]. Примерно у 19% из всех носителей мутаций в гене GBA развивается в течение жизни болезнь Паркинсона: R. Balestrino, S. Tunesi et all «Penetrance of Glucocerebrosidase (GBA) Mutations in Parkinson's Disease: a Kin Cohort Study», Mov. Disord, n/a (2020). https://doi.org/10.1002/mds.28200 [9]. Однако, заболевание развивается не у всех носителей мутаций.
Известно, что концентрация деацетилированной формы накапливающегося метаболита, а именно лизосфинголипида глюкозилсфингозина (GlcSph), часто оцениваемого путем измерения концентрации метаболита гексозилсфингозина (HexSph) (смесь глюкозилсфингозин (GlcSph) и галактозилкерамид (GalCer)) в сухом пятне крови методом масс-спектрометрии (МС/МС), является в настоящее время наиболее чувствительным маркером при диагностике заболевания человека, связанного с гомозиготным носительством мутаций в гене GBA, болезни Гоше: G. Polo, A. Burlina,. Plasma and dried blood spot lysosphingolipids for the diagnosis of different sphingolipidoses: a comparative study, Clinical Chemistry And Laboratory Medicine (CCLM). 57 (2019) 1863-1874. doi:10.1515/cclm-2018-1301 [10]. Данная работа рассматривается как прототип.Однако при проведении исследований авторами заявляемого изобретения было установлено, что при гетерозиготном носительстве мутаций в гене GBA у человека оценка концентрации гексозилсфингозина (HexSph) в сухом пятне крови методом масс-спектрометрии (МС/МС) не отличается в группах пациентов с GBA-БП и у бессимптомных носителей мутаций в гене GBA. Поэтому оценка концентрации гексозилсфингозина (HexSph), представляющего смесь глюкозилсфингозин (GlcSph) и галактозилкерамид (GalCer)) в цельной крови не может являться диагностическим маркером развития болезни Паркинсона у гетерозиготных носителей в гене GBA.
Вывод: маркера для диагностики начала болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA в группе носителей мутаций в гене GBA, на сегодняшний день не существует, т.к. способ-прототип также не может дать однозначного ответа.
Технический результат заявляемого способа заключается в создании маркера для диагностики начала болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA, в группе гетерозиготных носителей мутаций в гене GBA.
6
Заявленный технический результат достигается тем, что в способе диагностики болезней человека, ассоциированных с мутациями в гене GBA: болезнь Паркинсона, основанном на измерении концентрации деацетилированной формы накапливающегося метаболита в крови, а именно лизосфинголипида гексозилсфингозина (HexSph), представляющего смесь лизосфинголипидов глюкозилсфингозина (GlcSph) и галактозилсфингозина (GalSph), новым является то, что оценка метаболита лизосфинголипида гексозилсфингозина (HexSph), проводится в первичной культуре макрофагов периферической крови, полученной из моноцитов периферической крови человека, которую наносят на фильтровальные карточки в концентрации 2*10 кл/мл, и при концентрации гексозилсфингозина (HexSph) более 32.15 нг/мл диагностируют болезнь Паркинсона.
В предлагаемом подходе оценка метаболита проводится в первичной культуре макрофагов крови. Только в этом случае, как было экспериментально установлено авторами заявляемого изобретения, наблюдается статистически значимое накопление гексозилсфингозина (HexSph) у носителей мутаций в гене GBA. В том числе предложенный подход по оценке концентрации гексозилсфингозина (HexSph) в первичной культуре макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови, позволяет отличить группу пациентов с GBA-БП от бессимптомных носителей мутаций в гене GBA.
На фигуре 1 графически представлен уровень гексозилсфингозина (HexSph) в первичной культуре макрофагов периферической крови в группе пациентов с БГ, пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA, в группе бессимптомных носителей мутаций в гене GBA, а также в группе пациентов со спорадической формой БП и в контрольной группе.
На фигуре 2 представлена ROC-кривая концентрации HexSph в первичной культуре макрофагов периферической крови у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA, в группе бессимптомных носителей мутаций в гене GBA, а также оптимальное значение пороговой концентрации гексозилсфингозина (HexSph) в первичной культуре макрофагов периферической крови для диагностики GBA-БП.
Описание способа.
Способ разработан на основе проведенного исследования по оценке концентрации гексозилсфингозина (HexSph), в первичной культуре макрофагов в группе пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA (N=7, средний возраст: 62.9±3.6 лет, средний возраст начала 57.6±4.1, 1 мужчина, 6 женщин), группе бессимптомных носителей мутаций в гене GBA (N=8, средний возраст: 52.6±3.8 лет, 4 мужчин, 4 женщины), группе пациентов со спорадической формой БП (N=10, средний возраст: 61.3±3.4 лет, средний возраст начала: 56.7±2.4, 4 мужчин, 6 женщин), пациентов с болезнью Гоше (N=12, средний возраст: 39.0±4.9 лет, 5 мужчин, 7 женщин) и сопоставимых по полу и возрасту неврологически здоровых индивидуумов (N=25, средний возраст: 56.2±3.9, 9 мужчин, 16 женщин). Оценка происходит именно концентрации HexSph из-за технической сложности разделения метаболитов глюкозилсфингозина (GlcSph) и галактозилсфингозина (GalSph), а также и низкой концентраций GalSph у всех индивидуумов за исключением редкого заболевания - болезни Фабри.
При анализе концентрации HexSph в первичной культуре макрофагов периферической крови (медиана (мин-макс), нг/мл), в группе пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA (45,81 (32,15-86,66) нг/мл) было выявлено статистически значимое увеличение концентрации HexSph по сравнению с группой со спорадической формой БП (2.17 (0.31-9.79) нг/мл) (р=0.008), по сравнению с неврологически здоровыми индивидуумами (2.17 (0.31-9.79) нг/мл) (р<0.0001), а также и группой бессимптомных носителей мутаций в гене GBA (1.81 (0.21-15.93) нг/мл) (р<0.001).
Для оценки возможности использования концентрации гексозилсфингозина (HexSph) в первичной культуре макрофагов периферической крови в клинической практике, а именно, в качестве биомаркера для подтверждения диагноза БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA, а также формирования групп риска среди бессимптомных носителей мутаций в гене GBA был проведен анализ характеристических кривых (ROC-анализ) с целью установления порога концентрации гексозилсфингозина (HexSph). Оптимальное значение порога отсечения для концентрации гексозилсфингозина (HexSph) определялось на основании максимальной оценки чувствительности и специфичности теста, основанного на доле правильно классифицированных пациентов в соответствии с наибольшим значением индекса Юдена. Статистический анализ проводился с помощью встроенных библиотек R v 3.6.2. Значение порога отсечения (диагностической значимости) концентрации гексозилсфингозина (HexSph) на основании максимальной чувствительности и специфичности в соответствии с наибольшим значением индекса Юдена составило 32.15 нг/мл. Чувствительность метода составила 100%, специфичность метода - 90,0%, индекс точности метода составил: 94.40%, площадь под ROC-кривой составила 0,975 (95% доверительный интервал - 0.916-1.000, р=0.0002). Полученные данные позволили установить критерий диагностики БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA.
Для специалистов в области биологии неочевиден тот факт, что у носителей мутаций в гене GBA без симптоматики болезни Паркинсона (бессимптомные носители мутаций в гене GBA) и в группе пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA пациентов должна быть статистически значимая разница в уровне концентрации гексозилсфингозина (HexSph) в первичной культуре макрофагов периферической крови. Данный факт определен экспериментальным путем.
6
Способ осуществляют, например, следующим образом. Забор крови у пациентов проводят из вены в 3 пробирки объемом 9 мл с ЭДТА. Получение мононуклеарной фракции производят из 24 мл методом градиентного центрифугирования в растворе фиколла (р=1.077, Ficoll-Paque PLUS, GE Healthcare UK Limited, UK) при 1600 об/мин по методике, описанной в работе: Boyum, A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol. 21. - P. 1-9. [11], с последующем промыванием полученной клеточной суспензии в растворе натрий-фосфатного буфера (PBS) и центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Полученные мононуклеарные клетки ресуспензируют в культуральной среде (RPMI Medium, Gibco, USA) с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота (БиолоТ, Россия) и 1% стрептомицин-пенициллина (Penicillin Streptomycin, Gibco, USA) и переносят в чашки Петри (5 мл на чашку). Клетки культивируют в 5% СO2-инкубаторе при +37°С. Через 2 часа с момента начала культивирования неадгезировавшие клетки удаляют из чашек Петри путем промывки с помощью раствора PBS. Затем моноциты культивируют в культуральной среде с добавлением колоние-стимулирующего фактора макрофагов М-КСФ (M-CSF Gibco, USA) в конечной концентрации 10 нг/мл в течение 5 суток с ежедневной заменой среды в соответствии с протоколом описанном авторами в работе: Николаев М.А., Копытова А.Э и др. Макрофаги периферической крови человека как модель изучения дисфункции глюкоцереброзидазы. Цитология. 2018. 60(12): 1022-1028 [12]. После культивирования клетки дважды отмывают в PBS и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 минут. Созревание макрофагов периферической крови подтверждают с помощью световой микроскопии, а также проточной цитометрии с использованием специфических антител CD 14+ и CD68+. Суспензию полученных макрофагов наносят на специальные круги на фильтровальных карточках (Whatman 903 Sample Collection Cards, Germany) в концентрации 2*10 кл/мл. Подсчет клеток осуществляется с использованием камеры Горяева по формуле. Далее фильтровальные карточки, с нанесенными на них исследуемыми образцами, высушивают в течение 2 часов при комнатной температуре и хранят при +4°С до дальнейшего использования не более одного месяца. Оценка концентрации гексозилсфингозина (HexSph) проводится методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) по протоколу, описанному ранее [10] с модификациями, в частности измеряя ее в сухом пятне биоматериала.
Вывод: Как следует из представленных данных на фиг. 1, фиг. 2, при концентрации гексозилсфингозина (HexSph) в первичной культуре макрофагов более 32.15 нг/мл у носителей мутаций в гене GBA диагностируется болезнь Паркинсона.
Это позволяет рассматривать данный способ как маркер для диагностики начала болезни Паркинсона, ассоциированной с мутациями в гене GBA, в группе гетерозиготных носителей мутаций в гене GBA.
Данное исследование поддержано грантом РНФ №19-15-00315
Список литературы
1. Патент РФ 2657763. МПК G01N 33/53, приоритет 12.09.2017, «Способ диагностики болезни Паркинсона».
2. Патент РФ 2606591, МПК: G01N 33/48, приоритет 31.07.2015, «Способ ранней доклинической диагностики болезни Паркинсона».
3. Патент WO 2011152699, МПК G01N 33/48, опубликовано 12.08. 2011, «Еаrlу diagnosis of Parcinsons Disease».
4. Патент: US2020208219, МПК G01N 1/28, приоритет 07.20.2017, «Mirnas as Biomarkers for Parcinsons Disease».
5. Margis, R. Margis, C.R. Rieder, Identification of blood microRNAs associated to Parkinsons disease, J. Biotechnol. 152 (3) (2011) 96-101.
6. M. Martins, A. Rosa, L.C. Guedes, B.V. Fonseca, K. Gotovac, S. Violante, et al. Convergence of miRNA expression profiling, a-synuclein interacton and GWAS in Parkinson's disease, PloS One 6 (10) (2011) e25443.
7. Hruska K.S., LaMarca M.E., Scott C.R., et al. Gaucher disease: mutation and polymorphism spectrum in the glucocerebrosidase gene (GBA) // Hum. Mutat. - 2008. - 29. N5. - P. 567-583.
8. Emelyanov A.K., Usenko T.S., Tesson C, Pchelina S.N. et all «Mutation analysis of Parkinson's disease genes in a Russian data set». Neurobiol. Aging. 71: 267.e7-267.el0. 2018.
9. R. Balestrino, S. Tunesi, S. Tesei, L. Lopiano, A.L. Zecchinelli, S. Goldwurm, Penetrance of Glucocerebrosidase (GBA) Mutations in Parkinson's Disease: a Kin Cohort Study, Mov. Disord, n/a (2020). https://doi.org/10.1002/mds.28200.
10. G. Polo, A. Burlina, E. Ranieri, F. Colucci, L. Rubert, A. Pascarella, G. Duro, A. Tummolo, A. Padoan, M. Plebani, A.B. Burlina. Plasma and dried blood spot lysosphingolipids for the diagnosis of different sphingolipidoses: a comparative study, Clinical Chemistry And Laboratory Medicine (CCLM). 57 (2019) 1863-1874. doi:10.1515/cclm-2018-1301.
11. Boyum, A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scand. J. Clin. Lab. Investig. - 1968. - Vol. 21. - P. 1-9.
12. Николаев M.A., Копытова А.Э., Байдакова Г.В.,., Захарова Е.Ю., Пчелина С.Н. и др. Макрофаги периферической крови человека как модель изучения дисфункции глюкоцереброзидазы. Цитология. 2018. 60(12): 1022-1028.