Однодоменное антитело, специфически связывающее рецептор ErbB3 человека, без канонической дисульфидной связи
SINGLE-DOMAIN ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING HUMAN ERBB3 RECEPTOR, WITHOUT CANONICAL DISULPHIDE BOND

Изобретение относится к области биохимии, в частности к однодоменному антителу, которое связывается с человеческим рецептором ErbB3. Изобретение обладает способностью специфически связывается с внеклеточным доменом рецептора ErbB3, что может позволить блокировать активность данного рецептора, а следовательно, рост опухолевых клеток с аномальным количеством рецептора ErbB3 на поверхности. Также раскрыты ДНК-последовательность, кодирующая антитело; экспрессионный вектор, содержащий данную ДНК-последовательность, штамм-продуцент и способ получения антитела.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителам, связывающимся с рецептором ErbB3, также именуемым HER3, который относится к группе рецепторов эпидермального фактора роста (Human Epidermal Factor receptor, HER). Группа рецепторов ErbB включает в себя четыре бежа: ErbB1 (EGFR, HER1), ErbB2 (HER2), ErbB3 (HER3), ErbB4 (HER4). Все они являются рецепторными тирозинкиназами и часто аномально экспрессируются на поверхности опухолевых клеток. Первые два представителя семейства (EGFR и HER2) хорошо изучены, анти-EGFR и анти-HER2 терапии широко применяются при лечении опухолевых заболеваний. В клинике для ингибирования EGFR и HER2 используют как антитела, так и низкомолекулярные соединения. Наиболее известные среди них: цетуксимаб (cetuximab) - анти-EGFR моноклональное антитело, применяется при разных онкологических заболеваниях, в том числе опухолях мозга; трастузумаб (trastuzumab) - анти-HER2 препарат, применяется при раке молочной железы; лапатиниб - селективный ингибитор тирозинкиназ ErbB1 и ErbB2.
Долгое время считалось, что ErbB3, представитель семейства ErbB, который был впервые описан в 1990 году, не проявляет тирозинкиназную активность и, следовательно, не может участвовать в сигнальных путях опухолевой клетки. Однако в последнее десятилетие стали появляться исследования, в которых было показано, что значительная доля опухолей, которые развивают резистентность к препаратам, блокирующим рецепторы ErbB1 и ErbB2, имеют повышенную экспрессию ErbB3. ErbB3 вовлечен в развитие опухолей разной локации в том числе груди и яичника [1, 2]. В связи с этим возникает необходимость разработки терапевтических антител, блокирующих димеризацию рецептора ErbB3 и тем самым подавляющих тирозинкиназную активность гетеродимера HER2-HER3 в опухолевых клетках.
Однодоменные антитела, также известны как VHH-антитела или нанотела, впервые были выделены из сыворотки крови представителей семейства Camelidae (верблюды, ламы, викуньи, гуанако). Они представляют собой вариабельный домен тяжелой цепи. (В литературе однодоменные антитела также называют "нанотела" (nanobody), мини-антитела, нано-антитела, VHH-антитела). Несмотря на то, что неканонические VH антитела верблюда, состоящие только из двух укороченных тяжелых цепей, имеют большую гомологию с тяжелыми цепями IgG3 человека, у людей не были найдены антитела без легкой цепи. VHH-домены имеют существенные отличия в организации гипервариабельных участков (CDR) по сравнению с антителами человека. Первые и третьи вариабельные петли (CDR1 и CDR3) имеют большую длину по сравнению с классическими антителами. Как правило между вариабельными петлями одно доменных антител верблюдовых образуется дисульфидная связь (между CDR1 и CDR3, реже между CDR2 и CDR3). Репертуар паратопов (антигенсвязывающих комбинаций) однодоменных антител и классических отличается. Однодоменные антитела обладают рядом существенных преимуществ: большей термической и химической стабильностью, они могут быть клонированы и экспрессированы в бактериях, что существенно удешевляет их производство. Помимо терапевтических применений, примеры которых будут перечислены ниже, в литературе показаны способы использования нанотел в молекулярной биологии. Например, в статье [3] 2018 года однодоменное антитело против флуоресцентного белка GFP используется для визуализации короткоживущих транскрипционных факторов в живой клетке. В работах [4, 5] показаны способы применения нанотел в структурной биологии для стабилизации белков. В статье [6] продемонстрировано успешное использование однодоменных антител для иммунопреципитации и определения сайтов связывания транскрипционных факторов.
На сегодняшний день нет ни одного антитела против ErbB3, одобренного для клинического применения. Однако, более десяти подобных антител сейчас находятся на разных стадиях клинических испытаний. Все они представляют собой классические полноразмерные антитела, в том числе биспецефические, а следовательно, не нарушают патентную чистоту заявляемого изобретения. Перечислим несколько из них. Серибантумаб (seribantumab) (WO 2008100624, WO 2012116317) разрабатывается компаниями Merrimack Pharmaceuticals Inc. и Sanofi-aventis, проходит вторую стадию клинических испытаний, как один из компонентов комплексной терапии. Патритумаб (patritumab) (WO 2007077028) разрабатывается компаниями Amgen, Daiichi Sankyo Inc. и U3 Pharma GmbH, в 2018 закончена третья фаза клинических испытаний, в которых проверялась эффективность лечения немелкоклеточного рака легкого в комплексе с эрлотинибом (Erlotinib). Истиратумаб (Istiratumab) (WO 2011047180) - биспецефическое анти-ErbB1/ErbB3 антитело, разрабатываемое компаниями Dyax Corp. и Merrimack Pharmaceuticals Inc., завершена вторая стадия клинических испытаний.
В свою очередь однодоменные антитела против ErbB3 представлены в открытых источников в существенно меньшем количестве, чем классические. В охранном документе WO 2011144749 «BIOLOGICAL MATERIALS RELATED ТО HER3» приведены последовательности полипептидов, которые предположительно могут связываться с рецептором ErbB3 человека. В охранном документе RU2653443C2 представлено биспецефическое ErbB2/ErbB3 антитело, ErbB3-связывающая часть которого сконструирована на основе VHH-домена.
Технической задачей, решаемой данным изобретение является расширение круга антител, связывающихся с рецептором ErbB3, путем создания однодоменного антитела против внеклеточной части рецептора ErbB3 человека, способного ингибировать гетеродимеризацию с другими представителями семейства ErbB,
Предложенное антитело характеризуется следующими признаками:
D
a
d
-8
-1
-1
3
-1
A) Однодоменоое антитело, K=3100±200 нМ, k=7.2±0,2*10 Ms, и k=2.2±0.2*10 s, молекулярная масса 14.4 кДа
Б) Гипервариабельные полипептидные участки (CDR) имеют гомологию более 75% с последовательностями SEQ ID No: 1-3
B) Антитело содержит аминокислотную последовательность, которая имеет гомологию более 90% с последовательностью SEQ ID No 4.
Кроме того, отличительной чертой предложенного антитела является отсутствие канонической дисульфидной связи в гипервариабельных участках.
В одной реализации антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что оно является моноклональным.
Кроме того, изобретение включает нуклеотидную последовательность, кодирующую однодоменное антитело, связывающее с внеклеточной частью ErbB3 человека, характеризующееся последовательностями SEQ ID No: 1-4.
Кроме того, изобретение включает экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую однодоменное антитело в соответствии с изобретением.
Кроме того, предложенное однодоменное антитело может быть испытано в качестве составной части противоопухолевой терапии.
Кроме того, предложенное антитело может являться составной частью молекулы или молекулярного комплекса, способного связываться с внеклеточной частью ErbB3 человека.
Кроме того, изобретение предусматривает бактериальный штамм-продуцент Shuffle, трансформированный экспрессионным вектором, содержащим нуклеотидные последовательности кодирующие следующие участки одного полипептида: однодоменное антитело, характеризующееся последовательностями SEQ ID No: 1-4; сайт связывания TEV-протеазы, убиквитин-подобный белок SUMO, N-концевой полигистидиновый пептид.
На фиг. 1 представлены результаты анализа чистоты белка методом гель-проникающей хроматографии с использованием колонки Superdex 75
На фиг. 2 представлен гель-электрофорез проб однодоменного антитела после очистки.
На фиг. 4 представлены: (а) масс-спектр очищенного однодоменного антитела, полученный с применением электроспрей-ионизации; (б-в) экспериментальное изотопное распределение после деконволюции (синие кривые) и теоретические изотопные распределения (черные кривые) для восстановленной дисульфидной связи (б) и для замкнутой дисульфидной связи (в).
На фиг. 3 представлены экспериментальные кривые, характеризующие связывание предлагаемого в настоящем документе однодоменного антитела с внеклеточным доменом ErbB3. Кривые получены на установке поверхностного плазмонного резонанса Biacore Т200 (GE Healthcare).
Изобретение включает однодоменное антитело против внеклеточной части рецептора ErbB3 человека, способное ингибировать гетеродимеризацию с другими представителями семейства ErbB.
Термину «однодоменные антитела» эквивалентны термины: «VHH-антитела» или «нанотела». Термин «однодоменное антитело» используется для обозначения белковой молекулы, состоящей из одной полипептидной цепи, содержащей каркасные и гепервариабельные участки (CDR), а также способной связываться с антигеном (молекулой-мишенью).
Термином «ErbB3» обозначается третий представитель семейства рецепторов эпидермального фактора роста, ему эквивалентен термин «HER3». ErbB3 человека в международной базе Uniprot имеет шифр Р21860. ErbB3 является мембранным белком и имеет внеклеточную часть, которая может связывать лиганды, трансмембранной части и внутриклеточной части, которая обеспечивает фосфорилирование и последующее распространение сигнала. Предложенное в данном документе однодоменное антитело специфично к внеклеточной части ErbB3 человека.
Предложенное антитело характеризуется следующими признаками:
D
a
d
-8
-1
-1
3
-1
A) Однодоменное антитело, K=3100±200 нМ, k=7.2±0.2*10 Ms, и k=2.2±0.2*10 s, молекулярная масса 14.4 кДа
Б) Гипервариабельные полипептидные участки (CDR) имеют гомологию более 75% с последовательностями SEQ ID No: 1-3
B) Антитело содержит аминокислотную последовательность, которая имеет гомологию более 90% с последовательностью SEQ ID No 4.
По сравнению с классическими иммуноглобулинами, характерная молекулярная масса которых 160 кДа, предложенное антитело существенно меньше и сформировано лишь одной полипептидной цепью. Несмотря на это аффинность антитела достаточно высока, а по термической и химической стабильности оно не уступает классическим.
В некоторых вариантах реализации изобретения, аминокислотная последовательность антитела может быть изменена при сохранении гомологии вплоть до уровня 90% с последовательностью SEQ ID No 4, Такие изменения могут быть внесены в молекулу ДНК, кодирующую антитело, методами генной инженерии. Под изменениями понимается замена одних аминокислотных остатков другими, либо вставка дополнительных аминокислотных остатков, либо удаление некоторых аминокислотных остатков. При изменении аминокислотной последовательности в вышеуказанных рамках можно добиться, например, увеличения химической стабильности без потери способности связываться с первоначальным антигеном. При этом гомология двух и более последовательностей определяется стандартными биоинформатическими методами сравнения.
Кроме того, отличительной чертой предложенного антитела является отсутствие канонической дисульфидной связи в гипервариабельных участках.
В одной реализации антитело в соответствии с изобретением характеризуется тем, что оно является моноклональным.
Кроме того, изобретение включает нуклеотидную последовательность, кодирующую однодоменное антитело, связывающее с внеклеточной частью ErbB3 человека, характеризующееся последовательностями SEQ ID No: 1-4.
Кроме того, изобретение включает экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую однодоменное антитело в соответствии с изобретением.
Кроме того, предложенное однодоменное антитело может быть испытано в качестве составной части противоопухолевой терапии.
Кроме того, предложенное антитело может являться составной частью молекулы или молекулярного комплекса, способного связываться с внеклеточной частью ErbB3 человека.
Кроме того, изобретение предусматривает бактериальный штамм-продуцент Shuffle, трансформированный экспрессионным вектором, содержащим нуклеотидные последовательности кодирующие следующие участки одного полипептида: однодоменное антитело, характеризующееся последовательностями SEQ ID No: 1-4; сайт связывания TEV-протеазы, убиквитин-подобный белок SUMO, N-концевой полигистидиновый пептид.
Изобретение поясняется следующими примерами:
Пример 1
Цитоплазматическая экспрессия однодоменного антитела против ErbB3
Для цитоплазмитической экспрессии использовался экспрессионный бактериальный штамм SHuffle. В 100 мкл химически компетентных клеток было добавлено 30 нг плазмидной ДНК pSol-SUMO-VHH456. Использовался метод кальциевой трансформации. После чего клетки высеивались на чашку с антибиотиком канамицином (50 мкг/мл).
Несколько колоний с чашки были перенесены в 30 мл среды 2xYT (1.6% триптон, 1% дрожжевой экстракт, 0.5% NaCl, рН 7.2). Предкультура росла около 15 часов до значения оптической плотности на 600 нм OD=8,0 (при постоянном перемешивании 200 об/мин, 37°С,). Затем была перенесена в двухлитровую колбу, содержащую 400 мл среды 2xYT с антибиотиком канамицином (50 мкг/мл), с разбавлением в 100 раз (до OD≈0,08). По достижению оптической плотности значений OD=0.7-0.8, культура была индуцирована путем добавления L-рамнозы с финальной концентрацией 5 мМ. После индукции бактериальная культура инкубировалась при 27°С в течение 15 часов при постоянном перемешивании 200 об/мин.
После клетки были осаждены в центрифуге (5 минут при 10000g, с удалением супернатанта). Клетки были ресуспендированы в 30 мл буфера для металл-хелатной хроматографии: 50 мМ Na2HP04 рН 8.0, 0.3 М NaCl с добавлением в качестве ингибиторов протеаз 1 мМ PMSF, 1 мМ EDTA и 1 мМ benzamidine. Разрушение клеток производилось на льду с помощью ультразвуковой установки. Для удаления клеточных мембран, неразрушенных органелл и иных нерастворимых частиц получившийся клеточный лизат центрифугировали в круглодонных пробирках на 40000g в течение 20 минут при 4°С. Супернатант фильтровали через мембрану с отверстиями 0.22 мкм. Белки из полученного осветленного лизата были осаждены путем медленного добавления сульфата аммония при постоянном перемешивании. Осветленный лизат с сульфатом аммония центрифугировали 10 минут на 40000g. Осадок перерастворяли в 20 мл буфера для металл-хелатной хроматографии (50 мМ Na2HPO4 рН 8.0, 0.3 М NaCl, 1 мМ PMSF, 1 мМ benzamidine)
Пример 2
Очистка методом металл-хелатной хроматографии
Перед очисткой методом металл-хелатной хроматографии раствора белка переводили в рабочий буфер (50 мМ Na2HPO4 рН 8.0, 0.3 М NaCl, 1 мМ PMSF) с добавлением 5 мМ имидазола, а именно в течение 12 часов при 4°С диализовали 20 мл раствора белка против 2 литров рабочего буфера, используя мембрану 10K MWCO SnakeSkin Dialysis Tubing производства компании Thermo Fisher. После диализа раствор белка фильтровали еще раз через мембрану 0.22 мкм. Раствор наносили на предварительно уравновешенную металл-хелатную хроматографическую колонку complete объемом 1 мл производства компании Roche с помощью перистальтического насоса. Затем промывали колонку загруженную белком 20 мл рабочего буфера с добавлением 3 мМ имидазола. Далее элюировали целевой белок 10 мл рабочего буфера с добавлением 300 мМ имидазола, собирая фракции по 1 мл.
Содержание примесей в полученных фракциях анализировали с помощью SDS-гель-электрофореза (денатурирующие условия, 12% полиакриламидный гель, DTT в качестве восстановителя).
Пример 3
Очистка методом ион-обменной хроматографии
В качестве финальной очистки применяли методы ион-обменной хроматографии, а именно катион-обменной с использованием колонки MonoS 5/50 GL производства компании GE Healthcare. Препротивная хроматография проводилась на оборудовании NGC Discover system производства компании BioRad.
Целевое однодоменное антитело после отрезания белка-партнера (SUMO) TEV-протеазой переводили в буфер с низкой ионной силой (20 mM Na-ацетатный буфер рН 6.0), используя диализную мембрану 7K MWCO SnakeSkin Dialysis Tubing производства компании Thermo Fisher.
После загрузки образца на предварительно уравновешенную колонку с использованием 5 мл загрузочной петли колонку промывали 10 объемами стартового буфера, затем смывали целевой белок в градиенте хлорида натрия (от 0 до 0.6 М в 30 объемах) при потоке 1 мл/мин, собирая фракции равный  объема колонки. Полученные фракции анализировали с помощью SDS-гель-электрофореза [Фиг. 2] и гель-проникающей хроматографии. Фракции, содержащие целевой белок, переводили в новый буфер (20 mM HEPES рН 7.5, 50 mM NaCl). Для последующих анализов и хранения полученный белок концентрировали в ячейках 10К MWCO Amicon производства компании Millipore. Финальную концентрацию очищенного бежа определяли по поглощению на 280 нм.
Пример 4
Характеризация однодоменного антитела методом масс-спектрометрии
Перед экспериментом очищенное однодоменное антитело было разбавлено до концентрации 1 мг/мл в переведено в деионизованную воду, после чего в раствор бы добавлена муравьиная кислота, финальная концентрация которой составила 1%. Масс-спектрометрические измерения проводили на установке maXis Q-TOF производства компании Bruker Daltonik, применяя ионизацию электроспреем. 100 мкл раствора белка инжектировали при потоке 50 мкл/мин. Усредняли полученные масс-спектры используя программное обеспечение DataAnalysis 4.0 Bruker Daltonik. Дальнейший анализ, в частности фитирование изотопного распределения, проводили согласно методике, опубликованной в статье [7]. Масс-спектрометрический анализ подтвердил гипотезу об отсутствии канонической дисульфидной связи в гипервариабельных участках (Фиг. 4), что ранее было обнаружено в экспериментах с использованием реактива Эллмана.
Пример 5
Определение аффинности и кинетики связывания методом поверхностного плазмонного резонанса
Измерения аффинности и кинетики связывания очищенного однодоменного антитела и внеклеточной части рецептора ErbB3 проводили методом плазмонного резонанса на установке Biacore Т200 производства компании GE Healthcare с использованием СМ5 сенсорных чипов при температуре 37°С. Рекомбинантный внеклеточный домен ErbB3, выделенный ранее из клеток СНО, в 10 mM Na-ацетатном буфере рН 4.5 иммобилизовали на поверхности сенсорного чипа.
Очищенное антитело растворяли в буфере HBS (10 мМ HEPES рН 7.4, 150 мМ NaCl), концентрацию определяли по поглощению на 280 нм, после чего готовили серию разбавлений с добавлением БСА (бычьего сывороточного альбумина) с концентрацией 50 мкг/мл. Буфер и растворы белка фильтровали через 0.22 мкм мембраны. Измерения проводили при потоке 10 мкл/мин.
D
a
d
-5
-1
-1
3
-1
Полученные кривые связывания анализировали с использованием программного обеспеченья Biacore Evaluation (GE Healthcare), а именно определяли ключевые параметры аффинности однодоменного антитела к внеклеточной части ErbB3: K=3100±200 нМ, k=7.2±0.0002*10 Мs, и k=2.2±0.2*10 s. Экспериментальные данные и аппроксимация по уравнению Хилла представлены на Фиг. 3.
Список литературы
[1] McIntyre Е. et al. The complete family of epidermal growth factor receptors and their ligands are coordinately expressed in breast cancer // Breast cancer research and treatment. - 2010. - T. 122. - №. 1. - C. 105-110.
[2] Chiu C. G. et al. HER-3 overexpression is prognostic of reduced breast cancer survival: a study of 4046 patients //Annals of surgery. - 2010. - T. 251. - №. 6. - C. 1107-1116.
[3] Bothma J. P. et al. LlamaTags: A Versatile Tool to Image Transcription Factor Dynamics in Live Embryos // Cell. - 2018.
[4] Pardon E. et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology // Nature protocols. - 2014. - T. 9. - №. 3. - C. 674.
[5] D Cromie K., Van Heeke G., Boutton C. Nanobodies and their use in GPCR drug discovery //Current topics in medicinal chemistry. - 2015. - T. 15. - №. 24. - C. 2543-2557.
[6] Nguyen-Due T. et al. Nanobody-based chromatin immunoprecipitation/micro-array analysis for genome-wide identification of transcription factor DNA binding sites // Nucleic acids research. - 2012. - T. 41. - №. 5. - C. e59-e59.
[7] Rhoads T.W. et al. Using theoretical protein isotopic distributions to parse small-mass-difference post-translational modifications via mass spectrometry // Journal of the American Society for Mass Spectrometry. - 2013. - T. 24. - №. 1. - С. 115-124.
Однодоменное антитело, специфически связывающее рецептор ErbB3 человека, без канонической дисульфидной связи
--->
Перечень последовательностей
<110> федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования и науки «Санкт-Петербургский национальный исследовательский Академический университет имени Ж.И. Алфёрова Российской академии наук», Alferov University
<120> Однодоменное антитело, специфически связывающее рецептор ErbB3 человека, без канонической дисульфидной связи
<160> 4
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Lama glama
<400> 1
Gly Gly Pro Phe Ser Thr Tyr Leu Met Gly
1               5                   10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Lama glama
<400> 2
Ala Ile Ser Arg Ser Gly Leu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> Lama glama
<400> 3
Arg Arg Gly Gly Thr Asn Ser Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Pro Ala
1               5                   10                  15
Val Ser Asp Glu Tyr Asp Leu
20
<210> 4
<211> 132
<212> PRT
<213> Lama glama
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Gly Pro Phe Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Leu Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35                  40                  45
Thr Ala Ile Ser Arg Ser Gly Leu Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met His Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys
85                  90                  95
Ala Ala Arg Arg Gly Gly Thr Asn Ser Gly Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg
100                 105                 110
Pro Ala Val Ser Asp Glu Tyr Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<---