ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПИЩЕВОГО БЕЛКА И ЗАРЯЖЕННОГО ЭМУЛЬГАТОРА
INTERACTION OF FOOD PROTEIN AND CHARGED EMULSIFIER

Область техники
Настоящее изобретение относится к структурам, полученным в результате взаимодействия белка и эмульгатора, конкретнее, к структурам, содержащим белковое супрамолекулярное ядро, покрытое по меньшей мере одним липидным слоем. Изобретение также охватывает способы получения таких структур и содержащие их пищевые композиции.
Уровень техники
Белки являются сложными структурами, которые в растворе могут легко разрушаться под действием ряда факторов (теплота, показатель pH, концентрация соли и т.д.)
Процесс такого разрушения может контролироваться в целях получения супрамолекулярных белковых комплексов, которые являются биологически полезными структурами.
Супрамолекулярные комплексы использовались, например, в форме белковых агрегатов в пищевых применениях и все более широко используются в качестве эмульгатора и в качестве частичного заменителя жиров.
Патент США 6767575 В1 раскрывает приготовление продукта из агрегированного сывороточного белка, при этом сывороточный белок денатурируется подкислением и нагреванием. Полученные таким образом белковые агрегаты используются в пищевых применениях.
Патент Великобритании 1079604 описывает усовершенствования в области производства сыра, при этом сывороточные белки подвергаются тепловой обработке при оптимальном значении pH для получения нерастворимых сывороточных белков, которые затем добавляются к сырому молоку.
WO 93/07761 касается приготовления сухого белкового продукта в форме микрочастиц, который может использоваться в качестве заменителя жира.
Патент США 5750183 раскрывает способ получения белковых микрочастиц, пригодных для применения в качестве заменителя жира, не содержащего каких-либо жировых веществ.
В WO 91/17665 также раскрывается белковый жировой заменитель, в котором белки находятся в виде денатурированного диспергируемого в воде сывороточного белка в форме микрочастиц.
Предназначенный для применения в пищевых продуктах, получаемый из сыворотки жирозаменитель раскрывается в WO 92/18239. Он производится введением частиц в липосомную мембрану для обеспечения хорошего вкусового впечатления.
Помимо пищевых применений белки также присутствуют во многих фармацевтических и косметических композициях.
Однако при использовании этих структур могут возникать сложности, включающие среди прочего то, что они являются чувствительными к окружающей их среде, что их вкус или текстура не всегда являются желательными и что их растворимость ограничена определенными значениями pH и определенными средами (как правило, гидрофильными растворителями).
Поэтому до сих пор сохраняется необходимость в преодолении этих недостатков.
Задача изобретения
Таким образом, задачей настоящего изобретения является обеспечение белковых супрамолекулярных структур, которые могут использоваться в более широком диапазоне применений.
Раскрытие изобретения
Соответственно, в первом аспекте настоящее изобретение предлагает имеющую покрытие структуру с супрамолекулярным ядром из денатурированного белка, в которой покрытие содержит по меньшей мере один первый липидный монослой, по существу, электростатически связанный с белковым ядром.
Во втором аспекте изобретение относится к липосомоподобной структуре, содержащей супрамолекулярное ядро из денатурированного белка, покрытое оболочкой из двойного липидного слоя.
Супрамолекулярная структура в виде белкового стержня с покрытием из липидов подпадает под следующий аспект изобретения.
Кроме того, настоящее изобретение охватывает способ создания имеющего покрытие супрамолекулярного ядра из денатурированного белка, включающего этапы:
a) приготовления раствора денатурированных супрамолекулярных белковых структур;
b) регулировки pH раствора таким образом, чтобы белковые структуры являлись противоположно заряженными по отношению к липидам, используемым на этапе «с», и
c) электростатического связывания липидов с супрамолекулярными структурами для образования липидного монослоя вокруг супрамолекулярного белкового ядра.
В следующем аспекте обеспечивается способ придания белковой супрамолекулярной структуре способности к растворению в растворе, имеющем показатель pH, эквивалентный pH изоэлектрической точки белка, включающий этап:
а) нанесения на белковую супрамолекулярную структуру покрытия, содержащего двойной липидный слой, так, чтобы двойной липидный слой являлся по существу электростатически связанным с белковой супрамолекулярной структурой.
Аналогичным образом обеспечивается способ придания белковой супрамолекулярной структуре способности к растворению в гидрофобной среде, при этом указанный способ включает этап:
а) нанесения на белковую супрамолекулярную структуру покрытия, содержащего по меньшей мере один первый липидный монослой, так, чтобы липидный монослой являлся, по существу, электростатически связанным с белковой супрамолекулярной структурой.
Применение структуры по любому из пунктов 1-21 формулы изобретения в пищевых композициях, в косметических композициях и их применение в качестве связующего для биоактивных веществ также является частью изобретения.
Наконец, под другие аспекты изобретения подпадают пищевая композиция и косметическая композиция, содержащие структуру по любому из пунктов 1-21 формулы изобретения.
Краткое описание фигур
Далее настоящее изобретение описывается в отношении некоторых воплощений, проиллюстрированных сопровождающими фигурами, в которых:
- На Фиг.1 показано положительно заряженное супрамолекулярное ядро с покрытием из заряженных липидов, обеспеченным действием электростатических сил,
- Фиг.2 показывает этап образования второго покрывающего слоя, который приводит к липосомоподобной структуре,
- Фиг.3 показывает этапы образования белкового стержня, имеющего липидный монослой,
- Фиг.4 сравнивает полученные методом дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения супрамолекулярного ядра сывороточного белка без липидного слоя (верхние изображения) и с липидным слоем (нижние изображения) из сульфатированного бутилолеата при pH 4,3,
- Фиг.5 отображает поведение агрегатов сывороточного белка и отрицательно заряженных липидов при величине pH выше изоэлектрической точки белка, при pH ниже изоэлектрической точки белка и при значении pH, близком к изоэлектрической точке белка,
- Фиг.6 представляет график зависимости подвижности от концентрации липида,
- Фиг.7 является графиком зависимости диаметра структур по изобретению во время их образования от концентрации липида,
- Фиг.8 представляет полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии изображения стержней из β-лактоглобулина и DIC-изображения и изображения в поляризованном свете конечных комплексных соединений, полученных с сульфатированным бутилолеатом,
- Фиг.9 показывает DIC-изображения комплексов из β-лактоглобулинового стержня и стеариллактилата и
- Фиг.10 показывает изображения комплексов β-лактоглобулина и DATEM (сложные эфиры диацетилвинной кислоты и моноглицеридов).
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение относится к супрамолекулярному белковому ядру, которое покрыто липидами. Под «супрамолекулярным белковым ядром» понимается структура любого типа, содержащая по меньшей мере более чем одну белковую молекулу, и в которой белок находится в денатурированном состоянии. Такой белок может быть денатурирован как тепловым, так и физическим или химическим воздействием.
Из Фиг.1 и Фиг.3 видно, что белковое ядро несет заряд и покрыто оболочкой из по меньшей мере одного слоя заряженных липидов.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения имеющего покрытие супрамолекулярного ядра из денатурированного белка, включающий этапы: во-первых, приготовления раствора денатурированных супрамолекулярных белковых структур, во-вторых, регулирования pH раствора таким образом, чтобы белковые структуры оказывались противоположно заряженными по отношению к липидам, используемым на следующем этапе, и, наконец, электростатического связывания липидов с супрамолекулярными структурами для образования липидного монослоя вокруг супрамолекулярного белкового ядра.
Первый этап способа состоит в приготовлении раствора денатурированных супрамолекулярных белковых структур. В этой связи супрамолекулярное ядро состоит из комплекса денатурированных белков. Ядро может принимать форму мицеллы, агрегата (фибриллярного в виде стержня или сферической формы) или геля.
Способы создания таких супрамолекулярных структур широко известны в данной области. Они обычно включают термическую денатурацию неизмененного белка при некоторой величине pH и определенных концентрациях белка и соли для того, чтобы вызвать агрегацию или желирование белкового водного раствора. Поэтому ядро может быть белковой мицеллой, белковым агрегатом, белковым стержнем или белковым гелем.
Для образования супрамолекулярного белкового ядра по изобретению может использоваться любой белок, выбранный из растительных или животных источников. Он может включать соевый белок, белок молока (сывороточный белок, β-лактоглобулин, казеин, альбумин бычьей сыворотки и т.д.), яичный альбумин, белок мяса и т.д.
Однако предпочтительным является супрамолекулярное ядро не на казеиновой основе.
На втором этапе регулируется pH раствора, содержащего супрамолекулярное белковое ядро, таким образом, чтобы белковые структуры являлись противоположно заряженными по отношению к используемым для создания покрытия липидам. Частицы агрегированных денатурированных белков могут нести общий положительный заряд или общий отрицательный заряд. Предпочтительно частицы являются положительно заряженными при величине pH ниже pH изоэлектрической точки нативного белка, из которого они получены.
Это значение pH может отличаться от величины pH, необходимой для образования супрамолекулярного ядра. Предпочтительно pH регулируется до величины ниже 5, даже менее 4, предпочтительно до pH равного 3, в зависимости от липидов, используемых для получения покрытия на следующем этапе. При этих значениях pH супрамолекулярные структуры предпочтительно являются положительно заряженными, так, чтобы они могли образовывать электростатическое связывание с отрицательно заряженными липидами на следующем этапе.
Следующий далее этап ионного комплексообразования состоит в обеспечении раствора супрамолекулярных белковых структур отрицательно заряженными липидами.
Таким образом, получающиеся структуры содержат заряженное белковое ядро с по меньшей мере одним покрывающим липидным монослоем.
Размер белкового ядра может изменяться от 100 нм до 100 мкм, составляя предпочтительно между 100 нм и 10 мкм, и может контролироваться используемым для получения белкового ядра способом. Специалист в данной области сможет определить, какой способ следует использовать для получения ядра желательного размера. Возможность изменения размера в широких пределах представляет то преимущество, что размер ядра может задаваться соответствующим образом в зависимости от желательного применения. Ядро может иметь сферическую или стержневидную форму.
Согласно одному воплощению настоящего изобретения, структура по изобретению содержит супрамолекулярный белковый стержень, покрытый липидами. Для получения белкового супрамолекулярного ядра в виде стержня могут использоваться такие белки, как β-лактоглобулин, альбумин бычьей сыворотки или яичный альбумин. Предпочтительно использование в качестве белка β-лактоглобулина.
Способ получения таких структур включает нагревание водного раствора (pH 2), содержащего неизмененный белок в концентрации 25 г/л и хлорид натрия (0,01 М), при 80°С в течение 10 часов. В таких условиях денатурированные белки объединяются с образованием супрамолекулярного белкового стержня. Размер стержня может контролироваться регулированием условий его образования и может находиться в диапазоне от 2 мкм до 7 мкм. Согласно изобретению, стержень покрывается липидной оболочкой (как показано на Фиг.3). Предпочтительно липидная оболочка по существу электростатически связана с белковым стержнем.
Этот процесс дополнительно иллюстрируется на Фиг.8, согласно которой pH раствора стержней после образования и проведения комплексообразования с сульфатированным бутилолеатом доводится до 3. Представленные на Фиг.8 изображения в поляризованном свете и с помощью метода дифференциального интерференционного контраста (DIC) показывают осаждение комплексов стержней и сульфатированного бутилолеата (SBO) при pH 3. Фиг.9 и 10 далее демонстрируют осаждение при pH 4,2 β-лактоглобулиновых стержней со стеариллактилатом натрия (SSL) и β-лактоглобулиновых стержней со сложными эфирами диацетилвинной кислоты и моноглицеридов (DATEM), соответственно.
Из Фиг.1 и Фиг.3 видно, что заряженные супрамолекулярные комплексы являются, таким образом, покрытыми по меньшей мере одним первым липидным монослоем, по существу электростатически связанным с белковым ядром.
Для того чтобы иметь по существу электростатическое связывание, выбирается липид, несущий противоположный по отношению к белковому ядру заряд. В одном предпочтительном воплощении липиды являются отрицательно заряженными. Отрицательно заряженные липиды могут быть выбраны из сульфатированного бутилолеата, эфиров диацетилвинной кислоты и моноглицеридов, эфиров лимонной кислоты и моноглицеридов, стеарил-2-лактилата натрия, эфиров молочной кислоты и моноглицеридов, стеариллактилата кальция, лаурилсульфата натрия и т.д.
Результирующее взаимодействие между ядром и противоположно заряженными липидами является по существу электростатическим. Действительно, из Фиг.6, демонстрирующей кривую зависимости подвижности от концентрации несущего заряд липида, можно видеть, что с увеличением концентрации липида подвижность падает. Это наблюдение подтверждает, что связывание между липидным слоем и белковым ядром является по существу электростатическим. Кроме того, измерения размеров и величины заряда показали, что никаких поддающихся обнаружению взаимодействий между липидом и белковым ядром при pH выше изоэлектрической точки не происходит (исследовалось при pH 7 в случае мицелл сывороточного белка и сульфатированного бутилолеата).
Согласно одному воплощению изобретения, супрамолекулярное ядро может, кроме того, инкапсулировать вещества пищевой категории качества. Вещество пищевой категории качества, которое может удерживаться в комплексах из белковых частиц, может быть, например, вкусоароматическим веществом или может быть выбрано из любого биологически активного материала, такого как бактерии, ионы металлов, ферменты и т.д. Предпочтительно вещество является гидрофильным.
Таким образом, структуры изобретения могут выполнять функцию носителя для этих биологически активных материалов. Тем самым они могут найти применение в косметике, фармацевтике и/или пищевой промышленности, там, где требуется доставка чувствительных активных компонентов.
Покрытие белкового ядра может, кроме того, содержать второй липидный монослой. Этот второй слой обычно гидрофобно связан с первым липидным монослоем. Таким образом образуется двойной слой, который может в одном предпочтительном воплощении состоять из промежуточных монослоев. Этот двойной слой образует липидную оболочку вокруг белкового ядра (ср. Фиг.2) и придает структуре липосомоподобную функцию, так что эти структуры могут использоваться для транспортировки белков через мембраны в биологических системах, для коллоидной стабильности, для замедленного высвобождения удерживаемых частиц и т.д.
Липиды, используемые для второго монослоя, могут быть заряженными или нейтральными. Они могут быть такими же, как используемые для первого монослоя, или же они могут быть другими. Нейтральные липиды (включая липиды с цвиттерионной структурой) могут быть выбраны из фосфолипидов.
Из Фиг.7, представляющей воплощение, в котором используемые для первого монослоя липиды являются такими же, как и используемые для второго монослоя, видно, что для образования двойного липидного слоя концентрация липида должна быть увеличена. Образование двойного липидного слоя может контролироваться измерением диаметра получающихся структур или же оно может отслеживаться посредством контроля заряда комплекса из супрамолекулярного белкового ядра и липида. При некоторой концентрации липида структуры, состоящие из покрытого одним липидным монослоем белкового ядра, проявляют склонность притягиваться друг к другу, тем самым образуя более крупные структуры. Выше некоторой пороговой концентрации липида образуется двойной слой и происходит уменьшение размеров. Это определяемое гидрофобными свойствами образование второго слоя липидов приводит к ориентированию заряженных головок липида в водную фазу.
Таким образом, при использовании, согласно изобретению, двух липидных монослоев для нанесения покрытия на белковое ядро получается липосомоподобная структура (как показано на Фиг.2).
Если для второго монослоя используются заряженные липиды, то липосомоподобная структура будет иметь общую заряженную поверхность. В ином случае, если для второго монослоя используются нейтральные липиды, то поверхность липосомоподобной структуры будет электростатически нейтральной.
Второй слой или, более точно, гидрофильная головка, образованная используемым для второго слоя липидом, обеспечивает существенные признаки липосомоподобной структуры в отношении, например, коллоидной стабильности в растворе или возможности осуществления трансвекции белкового ядра через биологические мембраны. Таким образом, заряд, способность структуры липида, используемого для второго липидного слоя, испытывать пространственные затруднения, являются важным признаком, который может регулироваться для обеспечения возможности применения в конкретных целях.
С помощью липосомоподобной структуры по изобретению может быть обеспечено множество усовершенствований в области улучшения растворимости белков, сохранности сухого молочного порошка и т.п. вследствие того, что эти структуры являются структурами пищевой категории качества, получаемыми исключительно в результате самоассоциации.
Например, как показано на Фиг.4, заряженные липосомоподобные структуры могут сделать возможной солюбилизацию белков при величине pH, близкой к изоэлектрической точке белка. Для сывороточного белка эта величина составляет между 3,5 и 4,6. Действительно, белковые супрамолекулярные комплексы без покрытия (например, мицеллы) имеют тенденцию к агломерации вследствие нейтрализации зарядов на их поверхности при изоэлектрической величине pH, приводя к агрегации через преимущественные гидрофобные взаимодействия. С покрытием согласно изобретению структуры не будут флокулировать при величине pH, близкой к изоэлектрической точке белка, вследствие того, что их поверхности оказываются заряженными только положительно или только отрицательно, что приводит к отталкиванию структур друг от друга (ср. Фиг.5).
Таким образом, изобретение обеспечивает способ придания белковой супрамолекулярной структуре способности к растворению в растворе, имеющем показатель pH, эквивалентный pH изоэлектрической точки белка, содержащий этап образования на белковой супрамолекулярной структуре покрытия, содержащего двойной липидный слой, который является по существу электростатически связанным с белковой супрамолекулярной структурой.
Это может найти применение, например, в спортивных напитках, которые могут иметь низкую величину pH (около 4) и, тем не менее, обладать высоким содержанием белка без потери стабильности.
Одно преимущество настоящего изобретение состоит в том, что липидная оболочка может использоваться как защитный барьер для белкового ядра против действия влаги, кислорода, протеаз и т.д. Липосомоподобная структура по изобретению может также обеспечивать защиту против агломерации белковых порошков во время процесса сушки.
С помощью структур по изобретению становится возможным увеличение содержания белка в жировых матриксах вследствие солюбилизации белков в гидрофобных средах (масло, жировые матриксы и т.д.). Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает способ придания белковой супрамолекулярной структуре способности к растворению в гидрофобной среде, содержащий этап образования на белковой супрамолекулярной структуре покрытия, содержащего по меньшей мере один первый липидный монослой, такой, что этот липидный монослой является, по существу, электростатически связанным с белковой супрамолекулярной структурой.
Согласно изобретению, поверхностные свойства белков могут быть изменены таким образом, что для белков может быть предусмотрена более широкая область применений.
Еще одно преимущество изобретения состоит в том, что с помощью стержней по настоящему изобретения может обеспечиваться отверждение (загущение) масел. Таким образом, оно представляет альтернативу гидрогенизации липидов при производстве таких продуктов, как маргарин и т.п. Конечные продукты поэтому имеют не только пониженное содержание гидрогенизованных жиров, но также содержат значительное количество белка.
Благодаря окружающему белковое ядро двойному липидному слою может быть достигнуто ослабление вяжущего вкуса белковых супрамолекулярных структур (в частности, мицелл). Изобретение делает, таким образом, возможным улучшение органолептических свойств белков.
Резюмируя, структуры по изобретению могут использоваться в пищевых композициях.
Содержащие структуры по изобретению пищевые композиции могут включать напитки, йогурты, мороженое, замороженные десерты, корма для домашних животных, печенье, обезвоженные продукты питания, сухое молоко, растительное масло, жиры, отвержденное масло, сливочное масло, маргарин, биологически активные добавки к пище, эмульсии типа вода в масле и т.д.
Пищевые композиции по настоящему изобретению могут использоваться в широком диапазоне пищевых, фармацевтических и/или косметических применений.
Эти структуры могут также выполнить функцию нанотранспорта для инкапсулирования и доставки гидрофильных соединений.
Применение этих структур в косметических композициях и косметические композиции, содержащие эти структуры, также являются частью изобретения. Типичные косметические композиции могут быть выбраны из кремов, лосьонов, гелей, шампуней, мыла и т.п.
Далее настоящее изобретение иллюстрируется посредством следующих неограничивающих примеров.
Примеры
Получение липосомоподобной структуры
Был приготовлен раствор агрегатов сывороточного белка, подвергая в течение 15 минут раствор нативного сывороточного белка воздействию температуры в 85°С при pH 5,8. Затем агрегаты выделялись и использовались при приготовлении водного раствора, содержащего белок в концентрации 1,511 г/л и сульфатированный бутилолеат в концентрации выше 0,4 г/л. Показатель pH раствора доводился до уровня 3 при температуре 25°С. В этих условиях наблюдалось немедленное образование липосомоподобной структуры, содержащей ядро из агрегированного сывороточного белка и двойной липидный слой (сульфатированный бутилолеат), вследствие электростатической самоассоциации, происходящей между ядром из сывороточного белка и сульфатированным бутилолеатом.
Измерения подвижности и размеров
Смешанный образец, содержащий супрамолекулярный белковый комплекс (например, мицеллы) и липиды (например, сульфатированный бутилолеат), был подвергнут in situ измерениям с помощью анализатора Zetasizer Nano-ZS (Malvern, Великобритания).
Подвижность (знак которой эквивалентен заряду комплексов) определялась с помощью модуля для измерения электрофоретической подвижности (определение смещения частицы под действием приложенного электрического поля). Результаты представлены на Фиг.6.
Размеры комплексов измерялись с помощью модуля для оценки рассеяния света этого устройства (подбор автокорреляционной функции g2(t) с определением коэффициента диффузии, соотнесенного затем с величинами размеров по формуле Стокса-Эйнштейна для сферических частиц). Результаты представлены на Фиг.7.