Исследование уровня прогестерона в крови методом иммуноферментного анализа для определения сроков овуляции у сук

УДК 619: 618: 616-036

ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ПРОГЕСТЕРОНА В КРОВИ МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СРОКОВ ОВУЛЯЦИИ У СУК

Н. Г. ДАВИДЕНКО, В. П. ПОНОМАРЕНКО

Сумский национальный аграрный университет, г. Сумы, Украина, 40021

Резюме. В статье представлены результаты исследований изменения концентрации прогестерона в сыворотке крови у сук в течение полового цикла. Особенностью полового цикла у сук является постепенное повышение уровня прогестерона, которое начинается еще за несколько дней до овуляции. Поэтому измерение уровня прогестерона в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа дает возможность определить наступление овуляции у сук. Однако при уровне прогестерона 2,2-7,8 нг/мл возможны немного завышенные результаты. В статье описаны особенности использования данного метода и интерпретация полученных данных. Аргументированно обоснована целесообразность использования иммуно-ферментного теста для определения фертильного периода у самок собак. Проведенные нами исследования свидетельствуют о необходимости контрольного измерения прогестерона в день спаривания для подтверждения овуляции.

Ключевые слова: фертильность, овуляция, прогестерон, метод иммуноферментного анализа.

Summary. The article presents research findings on change in concentration of progesterone in blood serum of female dogs during ovary cycle. Gradual increase in progesterone which begins in the days prior to ovulation is a feature peculiar to the ovary cycle in female dogs. Therefore, measurement of the progesterone level in blood serum by enzyme immunoassay makes it possible to determine the timing of ovulation in female dogs. However, if the level of progesterone is 2.2-7.8 ng/ml results obtained by this research method may be slightly overstated. This paper describes the usage pattern of enzyme immunoassay method and data interpretation. Strong evidence is given in support of enzyme immunoassay for determining the fertile period in female dogs. Our studies indicate the need for control measurement ofprogesterone on mating day to confirm ovulation.

Key words: fertility, ovulation, progesterone, enzyme immunoassay method.

Введение. Эстральный цикл представляет собой последовательность взаимосвязанных изменений, происходящих как в яичниках, матке, влагалище, так и в поведении животного. Подобные изменения характерны для всех млекопитающих, они обеспечивают созревание яйцеклеток и внутриматочное развитие эмбрионов. У большинства небеременных самок домашних животных эстральный цикл включает следующие стадии: проэструс, эструс и диэструс. Если оплодотворения не произошло, наблюдается возврат к проэструсу, во время которого возобновляется развитие фолликулов, приводящее к новому эструсу, и соответственно половой охоте. У некоторых животных - свиней, крупного рогатого скота и лошадей - эструс возобновляется в среднем каждые 3 недели, но в случае возникновения беременности наблюдается достаточно продолжительный диэструс, необходимый для ее развития [3, 7, 17].

Цикл домашней собаки во многом отличается от этой общей схемы. Во-первых, его продолжительность составляет не меньше 5 месяцев; во-вторых, беременность развивается в период нормального диэструса, но не продлевает его; в-третьих, между циклами независимо от наличия или отсутствия беременности наступает так называемый анеструс, то есть продолжительный период относительного покоя яичников [3].

Анализ источников. На протяжении репродуктивного периода самки структурный состав и гормональная активность яичников постоянно меняются [2]. Гонадотропные гормоны, вырабатываемые в передней доле гипофиза в головном мозге, инициируют такие изменения. Когда фолликулостиму-лирующий и лютеинизирующий гормоны из гипофиза начинают выделяться в больших количествах во время наступления половой зрелости, яичники и фолликулы в них начинают расти. Фолликулярные клетки, в свою очередь под действием гормонов гипофиза, начинают продуцировать эстрогены [6]. Эстрогены обусловливают физиологические и социальные эффекты у суки, сигнализирующие о готовности к спариванию. За два дня до овуляции происходит всплеск секреции лютеинизирующего гормона гипофизом. Этот всплеск имеет критически важное значение для осуществления овуляции.

Повышение лютеинизирующего гормона приводит к тому, что овариальные клетки начинают секрецию прогестерона, а не эстрогена. В течение двух дней после пика лютеинизирующего гормона, фолликул достигает поверхности яичника и лопается, освобождая таким образом яйцеклетки в капсулу, которая окружает яичник. После овуляции, но до оплодотворения, яйцеклетки проходят следующую стадию мейоза и полное их созревание наступает через 2-3 дня [5]. Традиционно, суки вяжутся на 12-й и 14-й день (при двойных связках), или на 11-й, 13-й, 15-й дни (тройные вязки). Хотя эти графики вязок достаточно хорошо обеспечивают проведение спаривания и получения приплода у среднестатистической суки, не у всех сук овуляция наступает на 12-й день от начала проэструса. У некоторых самок овуляция возможна уже на 5-й день, или в конце, на 25-й день, и в этом случае использование этого стандартного графика спаривания может привести к отсутствию оплодотворения [3].

Использование поведения самки как индикатора овуляции с целью определения графика спаривания имеет много ограничений, поэтому такой подход не всегда эффективен. Некоторые суки имеют «фантомный проэструс» (незначительное проявление или отсутствие внешних признаков кровяных выделений), что затрудняет определение даты овуляции. Неудачная вязка приводит к 6-месячному ожиданию, чтобы «попробовать еще раз» и это вызывает чувство тревоги у многих владельцев собак. Кроме того, даже цитологический анализ, который может быть использован для определения начала течки, часто недостаточный индикатор овуляции [1]. Таким образом, повышение уровня прогестерона в крови, является индикатором овуляции у суки, и часто используется в ветеринарной практике [4].

Цель работы - изучить эффективность определения уровня прогестерона в крови у сук методом иммуноферментного анализа (ИФА) для установления сроков овуляции и желаемого спаривания у сук.

Материал и методика исследований. Работа проводилась в период с марта 2013 по декабрь 2014 гг. на базе клиники ветеринарной хирургии доктора Бережного, научной лаборатории кафедры хирургии факультета ветеринарной медицины Сумского национального аграрного университета и в лаборатории «Диагностика здоровья».

Было проведено определение уровня прогестерона в крови 18 самок собак в течение полового цикла методом иммуноферментного анализа. Исследование проводилось по двум схемам: каждые 2 дня с четвертого дня или ежедневно после начала первых проявлений проэструса до дня вязки.

За первый день проэструса принимали день появления слизисто-кровянистых выделений из вульвы. Одновременно учитывали другие признаки начала проэструса: покраснение и набухание вульвы, учащение мочеиспускания, беспокойство и непослушание суки [2, 10].

Для определения уровня прогестерона использовали сыворотку крови клинически здоровых животных. Кровь отбирали из подкожной вены предплечья, из которой получали сыворотку путем центрифугирования. Ее исследовали при помощи иммуноферментного анализатора <ЖТ-21000 microplatereder» с использованием тест-систем производства DGR.

На основании полученных результатов, а также учитывая данные кольпоцитологических исследований, характер выделений и поведение животного, определяли дату осеменения сук.

Результаты исследований и их обсуждение. Были сформированы две группы самок. Первая опытная группа состояла из 12 животных. У сук исследовали концентрацию уровня прогестерона ежедневно с четвертого дня от начала проэструса, включая день вязки. У всех животных первой опытной группы после осеменения был получен приплод.

Данные изменений содержания прогестерона в сыворотке крови в течение полового цикла у сук первой опытной группы представлены в табл. 1.

День повышения уровня прогестерона в сыворотке крови совпадает с повышением секреции лю-теинизирующего гормона и наступлением овуляции через 2 дня [12, 14]. Диагностическим является повышение прогестерона в сыворотке крови до 2 нг/мл [11, 16]. Как мы видим, по результатам наших исследований день «скачка» прогестерона является индивидуальным в каждом случае и составил от 5-го до 10-го дня у обследованных нами животных.

Для подтверждения факта овуляции мы проводили определение прогестерона и в день осеменения. По литературным данным, уровень прогестерона в день овуляции должен достигать 8-10 нг/мл [7, 8, 13]. По результатам наших исследований его уровень был 9,8-27,0 нг/мл. Среднее значение его составило в день осеменения 13,88±1,6 нг/мл.

Т а б л и ц а 1. Изменения концентрации прогестерона в сыворотке крови в течение полового цикла

у сук опытной группы

№ п/п Концентрация прогестерона, нг/мл День осеменения с начала проэструса

День полового цикла

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

1 0,3 0,4 0,8 1,2 1,5 3,7 3,8 5,0 6,2 9,9 - - - 13

2 0,7 0,8 1,2 1,7 2,0 2,7 5,2 5,7 6,0 7,0 12,5 - - 14

3 0,5 2,0 3,6 3,7 2,4 4,1 5,2 7,0 10,0 - - - - 11

4 2,2 4,0 8,0 11,2 17,0 27,0 - - - - - - - 9

5 0,3 0,4 0,7 0,9 1,0 1,2 4,0 4,2 6,2 7,7 9,8 - - 14

6 0,4 1,2 1,3 2,2 2,0 4,8 6,0 7,8 10,0 - - - - 12

7 0,9 1,2 2,9 3,2 3,0 3,1 3,2 5,8 8,1 8,9 10,0 12,6 13,0 16

8 2,0 2,1 3,2 5,0 5,6 6,0 8,1 10,2 - - - - - 11

9 1,2 1,8 3,5 5,1 7,0 11,0 20,0 - - - - - - 10

10 0,7 2,0 2,6 6,0 13,0 16,0 22,0 - - - - - - 12

11 1,2 2,6 2,8 4,2 6,5 7,5 9,8 10,0 12,0 - - - - 13

12 1,7 2,0 2,8 3,0 5,0 6,7 7,7 8,0 7,6 7,8 10,2 - - 14

Среднее значение 1,0 ±0,2 1,7 ±0,3 2,8 ±0,6 4,0 ±0,8 5,5 ±1,4 7,8 ±2,1 8,6 ±1,9 7,1 ±0,7 8,3 ±0,8 8,3 ±0,5 10,6 ±0,6 12,6 13,0 12,4 ±0,6

Вторая опытная группа состояла из 6 животных. Исследование крови на уровень прогестерона у них проводили на 4-й, 6-й, 8-й и 10-й дни после начала проявлений проэструса, регистрируя день повышения концентрации гормона. Изменения концентрации прогестерона в сыворотке крови этих животных представлены в табл. 2.

Т а б л и ц а 2. Изменения концентрации прогестерона в сыворотке крови в течение полового цикла у сук второй

опытной группы

№ п/п Концентрация прогестерона, нг/мл День осеменения Результат осеменения

день полового цикла

4 6 8 10

1 0,2 0,3 3,0 5,0 14 отрицательный

2 0,4 4,0 6,0 7,8 12 положительный

3 0,7 1,0 2,5 5,0 13 отрицательный

4 0,6 2,8 6,0 5,0 14 отрицательный

5 0,7 3,4 10,1 30,0 11 отрицательный

6 2,2 12,0 22,0 28,3 11 положительный

Среднее значение 0,8±0,3 3,9±1,7 8,3±3,0 13,5±5,0 12,5±0,6 -

У сук второй опытной группы в день осеменения не проводилось исследование уровня прогестерона, поэтому не удалось точно определить сроки овуляции и 4 из 6 сук остались неоплодотворен-ными (66,7 %). От двух животных был получен приплод. У троих животных исследования были прекращены на уровне прогестерона 5 нг/мл, поэтому можно предположить о проведении ранней вязки или отсутствии овуляции [15]. Также у одного животного была проведена безрезультатная вязка при уровне прогестерона 30 нг/мл, что может быть связано с наступлением диэструса. Избежать таких ошибок можно, измеряя прогестерон ежедневно, так как за два дня у одного животного уровень прогестерона увеличился с 10,1 до 30,0 нг/мл. Кроме того, проведение цитологического исследования вагинального эпителия перед вязкой может показать начало диэструса [13, 18].

Следует отметить, что у трех животных из всех 18-ти обследованных (16,7 %) отмечалось уменьшение концентрации прогестерона во время эструса, с последующим ее ростом. Полученные данные представлены на рисунке.

16 14 12 10 8 6 4 2 0

Самка 1 Самка 2 •Самка 3

2 день 4 день

6 день

8 день 10 день 12 день

Р и с. Динамика концентрации прогестерона у сук в течение полового цикла

Снижение концентрации прогестерона указывает на ложноположительный результат предыдущего теста, поскольку как только прогестерон вырос, он должен быть повышенным и увеличиваться в течение полового цикла [7, 9, 11]. Погрешности в измерении уровня прогестерона в сыворотке крови наблюдались в диапазоне 2,2-7,8 нг/мл.

Заключение. Таким образом, для определения фертильности у сук, используя исследование уровня прогестерона в крови методом иммуноферментного анализа, мы рекомендуем учитывать день повышения концентрации прогестерона и уровень прогестерона в день осеменения, что по нашим данным составляет 9,8-27,0 нг/мл. При проведении исследований следует учитывать возможность лож-ноположительных результатов, обусловленных ограниченной чувствительностью тестирования им-муноферментным анализом. Ложноположительные результаты были получены нами у 16,7 % обследованных животных. Чтобы устранить данный недостаток теста необходимо устанавливать фертиль-ный период по результатам двух последовательных исследований с высоким уровнем прогестерона.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ален, В. Э. Полный курс акушерства и гинекологии собак / В. Э. Ален. - М.: Аквариум, 1999. - 446 с.

2. Атаман, О. В. Патологчна фiзiологiя в запитаннях та вщповщях. Навчальний поабник / Видання 4-е, стереотипне. -Вшниця: Нова Книга, 2010. - С. 439-475.

3. Дюльгер, Г. П. Физиология размножения и репродуктивная патология собак / Г. П. Дюльгер. - М.: Колос, 2002. - 149 с.

4. Дубровина, Е. Опыт лечения нарушения полового цикла и его осложнений у собак / Е. Дубровина // 7-я междунар. конфер. по пробл. вет. медицины мелких домаш. животных: материалы. - М. - 1999. - С. 42.

5. Зайко, М. Н. Патолопчна фiзiологiя: тдручник / М. Н. Зайко, Ю. В. Биць, О. В. Атаман, та шш^ за ред. М. Н. Зайко та Ю. В. Биць / Кшв, «Вища школа», 1995. - С. 545-572.

6. Карпов, В. А. Акушерство и гинекология мелких домашних животних / В. А. Карпов - М.: Росагропромиздат, 1990. - 288 с.

7. Симпсон, Дж. Руководство по репродукции и неонатологии собак и кошек. / Дж. Симпсон, Г. Ингланд, М. Харви; пер. с англ. Е. Н. Смелова. - М.: Софион, 2005. - 280 с.

8. Полянцев, Н. И. Индукция овуляторного полового цикла у собак / Н. И. Полянцев // 1 -я региональная конференция: Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных на северном Кавказе: тезисы. - 1998. - С. 76-77.

9. Хамитова, Л. Ф. Нарушение полового цикла у самок и методы их коррекции: дисс. ... канд. вет. наук: 01.03.2008 / Х. Л. Фардаусовна. - Ижевск, 2008. - 145 с.

10. Фiзiологiя та патологш розмноження дрiбних тварин: навчальний поабник/ за ред. М. I. Харенко [М. I. Харенко та ш.]. - Суми: ВАТ «Сумська обласна друкарня», видавництво «Козацький вал». - 2005. - С. 152-230.

11. Abraham, G. E. Evaluation of ovulation and corpus luteum function using Measurements of plasma progesterone / G. E. Abraham. - 1984. - № 44.

12. Arthur, G. H. Veterinary Reproduction and Obstetrics. 6 Edition. G. H. Arthur, D. E. Noakes, H. G. Pearson // Philadelphia: Bailliere Tindall - 1989. - P. 45.

13. Bayard, F. Endometrlcal progesterone concentrations during the menstrual cycle / F. Bayard, M. Monrozies, A. Boulard // J. clin. endocr. - 1995. - № 41. - P. 135, 412-414.

14. Concannon, P. W. Physiology and endocrinology in the bitch / P. W. Concannon // Current Therapy inTheriogenology. -1986. - P. 491-497.

15. Israel, R. Single luteal phase serum progesterone assayasan indicator of ovulation / R. Israel, D. R. Mishell, S. C. Stone // Am. J. Obstet. Gynec. - 1992. - V. 122. - P. 1043-1046.

16. Hoffmann, B. Reproductive endocrinology of bitches / B. Hoffmann, A. Riesenbeck, R. Klein // Anim. Reprod. Sci. - 1996. -№ 42. - P. 275-288.

17. Hoist, P. A. Canine reproduction / P. A. Hoist, Colorado: Alpine Publications. - 1985. - 205 p.

18. Jones, D. E. Reproductive clinical problems in the dog / D. E. Jones, J. O. Joshua. - London: Wright. - 1984. - 230 p.