СИНТЕЗ ЭЛАСТИЧЕСКОГО ВОЛОКНА IN VIVO
IN VIVO SYNTHESIS OF ELASTIC FIBER

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к восстановлению или воссозданию эластичности ткани, тем самым улучшая внешний вид и/или функции старой или поврежденной ткани.
Предпосылки изобретения
Ссылка на какой-либо документ известного уровня техники в настоящем описании не принимается и не должна приниматься как признание или какая-либо форма предположения, что этот документ известного уровня техники входит в состав общедоступных сведений в Австралии или какой-нибудь другой стране и территории, или, что можно ожидать, на законных основаниях, что этот документ известного уровня техники специалистом в данной области устанавливает, понимает и рассматривает как релевантный.
Старение и повреждение ткани связаны с дегенерацией внеклеточного матрикса, приводящей к нарушению структуры и/или функции ткани. Дряблая кожа, вялая подкожная ткань, снижение плотности внеклеточного матрикса, образование морщин, растяжки и фиброз являются физическими проявлениями дегенерации. В зависимости от соответствующей ткани нарушение эластической функции может проявляться как снижение жизненной емкости легких или снижение способности сердца к увеличению минутного объема или снижение растяжимости и/или упругости различных клапанов и сфинктеров.
Приблизительно 20 лет программы научно-исследовательских работ пытались использовать различные молекулы внеклеточного матрикса в серии клинических и косметических вмешательств для коррекции нарушения структуры и функции ткани. Ключевыми молекулами, представляющими интерес, были молекулы, которые являются субстратом соответствующих волокон внеклеточного матрикса, а именно коллаген и эластин. Как правило, подход заключался в использовании этих биоматериалов, либо в качестве имплантатов, либо наполнителей для увеличения внешнего вида ткани путем заполнения пустот ткани или путем накачивания или заполнения ткани, или в использовании этих волокон в качестве имплантатов или наполнителей для нормализации нарушенной функции.
Некоторые исследователи считали эластин предпочтительным для этой задачи, поскольку, в отличие от коллагена, его можно использовать для образования эластических имплантатов и наполнителей. Ранние работы были сосредоточены на синтезе рекомбинантных форм тропоэластина, из которых затем формировались коацерваты и образовывались поперечные связи химическим или ферментативным путем либо до, либо после введения индивидууму, чтобы эластический имплантат или наполнитель формировался либо ex vivo, либо in vivo для заполнения пустот в тканях или для увеличения или восстановления первоначальной формы ткани. См., например, WO 1994/14958; WO 1999/03886; WO 2000/04043. В WO 2010/102337 упоминается важность концентрации твердых веществ для формирования инъекционного поперечно-сшитого биоматериала.
Если использовался in vivo ферментативный путь образования поперечных сшивок, использовали рекомбинантную или другую экзогенную лизилоксидазу. В USSN 09/498305 описывается один подход для ферментативного пути образования поперечных сшивок в мономерах тропоэластина in vivo путем введения композиции, содержащей экзогенную лизилоксидазу и мономеры тропоэластина.
Другой подход к образованию материала, напоминающего по определенным характеристикам поперечно-сшитый тропоэластин, раскрыт в WO 2008/058323, согласно которому эластический материал, содержащий тропоэластин без поперечных сшивок, образуется в щелочных условиях.
В каждом из вышеприведенных примеров для запуска образования имплантата или наполнителя используют экзогенный тропоэластин и средство, вызывающее образование поперечных сшивок, или щелочные условия. Время образования эластического конечного продукта зависит от концентрации тропоэластина, средства, вызывающего образование поперечных сшивок, и соответствующих условий, так что конечный продукт образуется в результате процесса, который происходит за пределами клеток.
Также рассматривается ряд других применений тропоэластина, включающих применение: (i) в качестве покрытия для ран (WO 94/14958); (ii) в качестве средства доставки активных ингредиентов с получением биоразлагаемых или биодиссоциируемых составов с медленным высвобождением (WO 94/14958); (iii) в качестве связывающего вещества для GAG (WO 99/03886); (iv) для противодействия отложению эластина (WO 99/03886); и (v) в местах ранения, локализациях повреждения тканей и ремоделирования, где обычно обнаруживают сериновые протеазы (WO 00/04043).
В ранних работах предполагалось, что для любого из вышеприведенных применений можно использовать множественные формы тропоэластина. См., например, WO 94/14958, где описана синтетическая форма человеческого тропоэластина, содержащая домен 26А. В WO 94/14958 описываются формы от млекопитающих и птиц для использования в фармацевтических композициях; в WO 99/03886, где описан целый ряд синтетических форм человеческого тропоэластина, в том числе формы с отсутствием домена 26А, C-концевого домена и другие. В WO 99/03886 описаны человеческие формы и формы, полученные не от человека, для использования в фармацевтических применениях. Конкретная форма, SHELδ26A, обсуждается со ссылкой на отсутствие GAG-связывающей активности; и в WO 00/04043, где описаны формы тропоэластина, имеющие пониженную чувствительность к сериновым протеазам, а именно к тромбину, плазмину, калликреину, желатиназам А и В и матриксным металлоэластазам. В WO 00/04043 описаны соответствующие формы тропоэластина, имеющие пониженную чувствительность (называемые ″производное тропоэластина с пониженной чувствительностью″), пригодные для этих применений, которые включают формы частичной и полной длины и ксеногенные формы.
В каждом примере из этой ранних работ, несмотря на то, что в ткани можно было получить имплантат с эластическими свойствами, природа имплантата и его эластические свойства не позволяли говорить о таковых, присущих ткани в норме. Например, эластические свойства, которые наполнитель или имплантат, описываемые в этих ранних работах, придают дерме или подкожной ткани, как можно видеть, явно отличаются от нормальной эластичности данной ткани. Другими словами, несмотря на то, что с помощью имплантации материала со свойствами, которые включают эластичность, ткани можно было придать эластичность, вернуть ее внешний вид или функцию, аналогичные нормальным, было нельзя.
В ретроспективе этот результат, пожалуй, неудивителен, поскольку в более поздних работах за последние 5-10 лет было выявлено, что эластическая структура данной ткани возникает в результате сложного процесса, известного как ′эластогенез′, в который вовлечены множественные факторы, кроме лизилоксидазы и тропоэластина. Эластогенез обычно понимают как физиологический процесс, который происходит от позднего эмбрионального периода жизни до раннего постнатального периода жизни, во время которого клетки, в том числе фибробласты, гладкомышечные клетки и подобные, de novo образуют эластическое волокно из мономеров тропоэластина и других соответствующих факторов. Начиная с общего набора факторов, соответствующая ткань обеспечивает тканеспецифическое взаимодействие этих факторов, что приводит к синтезу, организации и распределению эластического волокна, естественным для соответствующей ткани образом, в результате чего возникает эластическая структура ткани (Cleary E.G and Gibson М.А. Elastic Tissue, Elastin and Elastin Associated Microfibrils in Extracellular Matrix Vol 2 Molecular Components and Interactions (Ed Comper W.D.) Harwood Academic Publishers 1996 p95). Стало очевидным, что такую организацию и сопутствующую структуру нельзя воссоздать просто путем образования поперечных сшивок в экзогенном тропоэластине с помощью экзогенной лизилоксидазы как ex vivo, так и in vivo, как предлагалось в ранних работах.
Инициация процесса, напоминающего эластогенез (т.е. процесса, при котором в ткани синтезируется de novo эластическое волокно из общего набора факторов), в ткани взрослого организма является желательной целью, потому что полагают, что такой процесс будет восстанавливать эластическую структуру ткани. Например, таким образом можно восстановить эластическую структуру старой ткани, чтобы структура данной ткани напоминала структуру более молодой ткани. К сожалению, данная цель остается труднодостижимой, в первую очередь, поскольку образование de novo эластического волокна у взрослых людей крайне невелико. Хотя при некоторых сердечнососудистых заболеваниях и заболеваниях легких может происходить восстановление эластического волокна, целостность и организация эластического волокна, возникающего в результате механизмов восстановления, отличаются для волокон, возникающих в результате эластогенеза. (Akhtar et al. 2010 J. Biol. Chem. 285: 37396-37404).
В последнее десятилетие эту проблему интенсивно исследовал целый ряд исследовательских групп (Huang R et al., Inhibition of versican synthesis by antisense alters smooth muscle cell phenotype and induces elastic fiber formation in vitro and in neointima after vessel injury. Circ Res. 2006 Feb 17; 98(3): 370-7; Hwang JY et al., Retrovirally mediated overexpression of glycosaminoglycan-deficient biglycan in arterial smooth muscle cells induces tropoelastin synthesis and elastic fiber formation in vitro and in neointimae after vascular injury. Am J Pathol. 2008 Dec; 173(6): 1919-28.; Albertine KH et al., Chronic lung disease in preterm lambs: effect of daily vitamin A treatment on alveolarization. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010 Jul 299(1): L59-72: Mitts TF et al., Aldosterone and mineralocorticoid receptor antagonists modulate elastin and collagen deposition in human skin. J Invest Dermatol. 2010 Oct; 130(10); 2396-406: Sohm В et al., Evaluation of the efficacy of a dill extract in vitro and in vivo. Int J Cosmet Sci. 2011 Apr; 33(2): 157-63; Cenizo Vet al., LOXL as a target to increase the elastin content in adult skin: a dill extract induces the LOXL gene expression. Exp Dermatol. 2006 Aug; 15(8): 574-81). Широко обсуждаемая гипотеза для объяснения отсутствия образования de novo эластических волокон у взрослых людей заключается в том, что клеткам взрослого организма или соответствующей ткани, в которой они содержатся, не хватает одного или нескольких необходимых факторов и процессов, необходимых для эластогенеза (Shifren А & Mecham R.P. The stumbling block in lung repair of emphysema: elastic fiber assembly. Proc Am Thorac Soc Vol 3 p 428-433 2006). Согласно этой гипотезе: обеспечение ткани взрослого организма синтетическим тропоэластином не дает возможность клетке взрослого организма синтезировать эластическое волокно из синтетического тропоэластина.
Исследования, проводимые в настоящее время, сосредоточены на понимании механизмов и факторов, лежащих в основе эластогенеза в ранний период жизни, и на определении того, присутствуют ли они во взрослый период жизни (Wagenseil JE & Mecham RP. New insights into elastic fiber assembly. Birth Defects Res С Embryo Today. 2007 Dec: 81(4): 229-40.).
Обычно считается, что вскоре после экспрессии белка-тропоэластина он образует коацерваты в виде агрегата из сфер размером приблизительно 200-300 нм, которые затем дополнительно объединяются в частицы размером приблизительно один микрон. Эти частицы затем собираются вдоль микрофибрилл во внеклеточном матриксе, тем самым образуя эластическое волокно (Kozel BA et al., Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J Cell Phvsiol. 2006 Apr: 207(1): 87-96). Вовлечение ряда дополнительных факторов в этот процесс продолжают исследовать.
In vitro исследования различных этапов на молекулярном уровне занимались исследованием субстратов человеческого тропоэластина и тропоэластина, слученного не от человека, и ряда разных изоформ тропоэластина (Davidson JM et al., Regulation of elastin synthesis in pathological states. Ciba Found Symp. 1995; 192:81-94; discussion 94-9). В ходе этой работы было выявлено, что по меньшей мере 34 разные молекулы ассоциированы с эластическими волокнами, хотя, как было показано, только некоторые из них были структурно вовлечены в образование волокон. Они включают тропоэластин, фибриллин-1, фибриллин-2, лизилоксидазу, лизилоксидазоподобный белок-1 (LOXL1), эмилин, фибулин-4 и фибулин-5 (Chen et al. 2009 J. Biochem 423: 79-89). Одна группа рассматривает LOXL1, представителя семейства LOX, как ключевую недостающую молекулу в определенной ткани взрослого организма (см. US 2004/0258676, US 2004/0253220 и US 20100040710). Другие группы указывают на фибулин 4 и другие молекулы как через взаимодействие с лизилоксидазой, так и с другими молекулами (Yanagisawa Н & Davis EC. Unraveling the mechanism of elastic fiber assembly: The roles of short fibulins. Int J Biochem Cell Biol. 2010 Jul: 42(7): 1084-93).
В заключение, несмотря на то, что все еще отсутствует полная картина, касающаяся взаимодействия факторов при эластогенезе, исследования, проводящиеся в настоящее время, указывают на то, что в клетках и тканях взрослого организма процесс, напоминающий эластогенез, не проходит полностью, поскольку у них отсутствует один или несколько факторов. Из этого следует, что самого по себе обеспечение ткани взрослого организма только тропоэластином само по себе не достаточно для восстановления эластической структуры ткани, потому что без соответствующих факторов, необходимых для эластогенеза, ткань не может использовать тропоэластин для образования эластического волокна.
Остается потребность в восстановлении или воссоздании эластической структуры ткани, или в минимизации нарушения эластической структуры ткани.
Существует потребность в улучшении эластической структуры старой ткани, чтобы она больше напоминала структуру данной ткани на более ранней стадии жизни.
Существует потребность в улучшении внешнего вида старой ткани, в том числе ткани, подвергнутой фотостарению, например, к сведению к минимуму дряблой кожи, вялой подкожной ткани, потери плотности внеклеточного матрикса, образования морщин и растяжек.
Также существует потребность в улучшении эластической структуры рубцовой или фиброзной ткани, чтобы данная структура больше напоминала структуру соответствующей ткани, содержащей рубцовую или фиброзную ткань, до повреждения ткани.
Также существует потребность в обеспечении улучшения эластической функции старой или поврежденной ткани, чтобы она больше напоминала эластическую функцию соответствующей ткани на более ранней стадии жизни или до повреждения.
Вышеупомянутые потребности отличаются от потребностей, которые удовлетворяются имплантатами или наполнителями и их применением для заполнения ткани поперечно-сшитым тропоэластином, как в соответствующем известном уровне техники supra.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение пытается удовлетворить одну или несколько вышеупомянутых потребностей, и в одном варианте осуществления предлагает способ восстановления эластической структуры ткани индивидуума, включающий:
- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего ткань, в которой необходимо восстановить эластическую структуру;
- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;
- тем самым восстанавливая или воссоздавая эластическую структуру ткани индивидуума.
В другом варианте осуществления предложен способ минимизации нарушения эластической структуры ткани индивидуума, включающий:
- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего ткань, в которой необходимо минимизировать ухудшение эластической структуры;
- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;
- тем самым минимизируя нарушение эластической структуры ткани индивидуума.
В другом варианте осуществления предложен способ улучшения эластической структуры старой ткани, чтобы она больше напоминал структуру данной ткани на более ранней стадии жизни, включающий:
- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего ткань, в которой необходимо улучшить эластическую структуру;
- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;
- тем самым улучшая эластическую структуру старой ткани, чтобы она больше напоминала структуру данной ткани на более ранней стадии жизни.
В другом варианте осуществления предложен способ улучшения внешнего вида старой ткани, включающий:
- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего ткань, у которой необходимо улучшить внешний вид;
- введение тропоэластин индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;
- тем самым улучшая внешний вид старой ткани.
В другом варианте осуществления предложен способ улучшения эластической структуры рубцовой или фиброзной ткани, чтобы структура больше напоминала структуру соответствующей ткани, содержащей рубцовую или фиброзную ткань, до повреждения ткани, включающий:
- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего рубцовую или фиброзную ткань;
- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;
- тем самым улучшая эластическую структуру рубцовой или фиброзной ткани.
В другом варианте осуществления предложен способ улучшения эластической функции старой или поврежденной ткани, чтобы она больше напоминала эластическую функцию соответствующей ткани на более ранней стадии жизни или до повреждения, включающий:
- обеспечение присутствия индивидуума, имеющего старую или поврежденную ткань;
- введение тропоэластина индивидууму в соответствии со схемой обработки, которая была выбрана для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение периода времени, который дает возможность факторам, экспрессированным в ткани для образования эластического волокна, вступить в контакт с введенным тропоэластином для синтеза из него эластического волокна;
- тем самым улучшая эластическую функцию старой или поврежденной ткани.
В другом варианте осуществления предложен способ придания эластичности коже индивидуума, предпочтительно, придания толщины коже индивидуума, одновременно с поддержанием или улучшением эластичности кожи индивидуума, причем способ включает следующие этапы:
- обеспечения присутствия индивидуума;
- определения участка обработки на коже индивидуума, где участок обработки представляет собой участок кожи, которому необходимо придать эластичность;
- инъекции тропоэластиновой композиции в пределах участка обработки, чтобы создать количество тропоэластина в пределах участка обработки, которое увеличено по сравнению с кожей, находящейся за пределами участка обработки;
- поддержания количества тропоэластина в участке обработки в течение предварительно установленного периода времени, тем самым придавая эластичность коже индивидуума.
В другом варианте осуществления предложена тропоэластиновая композиция, описываемая в данном документе для использования в одном или нескольких из следующих применений:
- восстановлении эластической структуры ткани индивидуума;
- минимизации нарушения эластической структуры ткани индивидуума;
- улучшении эластической структуры старой ткани, чтобы она больше напоминала структуру данной ткани на более ранней стадии жизни;
- улучшении внешнего вида старой ткани;
- улучшении эластической структуры рубцовой или фиброзной ткани, чтобы данная структура больше напоминала структуру соответствующей ткани, содержащей рубцовую или фиброзную ткань, до повреждения ткани;
- улучшении эластической функции старой или поврежденной ткани, чтобы она больше напоминала эластическую функцию соответствующей ткани на более ранней стадии жизни или до повреждения.
Краткое описание графических материалов
Фигура 1. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показаны эластиновые сети, образовавшиеся через 7 дней после добавления 250 мкг/мл тропоэластина к культивируемым человеческим фибробластам, полученным от людей разных возрастных групп. А. Первичная культура фибробластов новорожденного мужского пола (NHF 8-9-09); В. 10-летнего мальчика (GM3348); С. 31-летнего пациента мужского пола с ожогами (230209А); D. 51-летнего мужчины (142BR); Е. 92-летнего мужчины (AG04064). Отложение эластиновых сетей выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.
Фигура 2. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показано отложение эластина через 7 дней после добавления тропоэластина к культивируемым фибробластам кролика и свиньи. А. Первичная культура фибробластов кожи свиньи возрастом 10 недель; В. Фибробласты кожи взрослого кролика. Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.
Фигура 3. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показано образование эластиновых волокон в первичной культуре гладкомышечных клеток дыхательных путей через 7 дней после добавления тропоэластина. А. Гладкомышечные клетки дыхательных путей (3785). В. Гладкомышечных клетки дыхательных путей, полученные от другого индивидуума (3791). Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.
Фигура 4. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показано образование эластиновых волокон в первичной культуре фибробластов новорожденного через 7 дней после добавления тропоэластина или производных. А. Тропоэластин отсутствует; В. Тропоэластин полной длины; С. Пептиды эластина человеческой кожи; D. С делецией RKRK; Е. С заменой RGDS; F. Тропоэластин от Advanced Biomatrix. Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.
Фигура 5. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показано образование эластиновых волокон в первичной культуре фибробластов новорожденного через 7 дней после добавления 125 мкг/мл тропоэластина в отсутствие (А) и в присутствии (В) 50 мкМ блеббистатина. Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.
Фигура 6. Фотографии, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, на которых показана степень образования эластиновых сетей в первичной культуре фибробластов новорожденного после повторных добавлений тропоэластина. А. Клетки; В. Клетки + добавление тропоэластина в день 10; С. Клетки + добавления тропоэластина в день 10 и день 17; D. Клетки + добавления тропоэластина в день 10, день 17 и день 24. Все образцы фиксировали для визуализации в день 31. Отложение эластина выглядит зеленым, ядра клеток выглядят синими.
Фигура 7. Автофлуоресцирующие зрелые эластиновые волокна. (А) фибробласты без добавления тропоэластина, (В) фибробласты с добавлением тропоэластина.
Фигура 8. AFM-анализ культур человеческих дермальных фибробластов. На фотографиях представлены топография культуры с наложением канала модуля упругости. (A) фибробласты без добавления тропоэластина, (В) фибробласты с добавлением тропоэластина.
Фигура 9. Образование эластических волокон дермальными фибробластами новорожденного. Тропоэластин добавляли через 12 дней после посева и образцы окрашивали с помощью DAPI, мышиного антитела к эластину и конъюгированного с FITC антитела к мышиному антителу.
Фигура 10. Ингибирование лизилоксидазы препятствует образованию эластических волокон. Образование эластиновых волокон в присутствии ингибитора лизилоксидазы BAPN. Образцы окрашены с помощью DAPI, мышиного антитела к эластину и конъюгированного с FITC антитела к мышиному антителу.
Фигура 11. Фотографии сферул тропоэластина, полученные с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения, в культуре человеческих дермальных фибробластов. (А) Масштабная шкала 1 микрон. (В) Масштабная шкала 2 микрона.
Фигура 12. Фотографии культуры человеческих дермальных фибробластов, полученные с помощью ТЕМ, через 3 дня после добавления тропоэластина.
Фигура 13. Срезы биоптатов недели 2, окрашенные по Вергеффу-Ван-Гизону (VVG). VVG-окрашивание на эластин поперечных срезов дермы кожи свиньи через 2 недели после обработки раны во всю толщину кожи с помощью конструктов, содержащих Тропоэластин. В тесте А представлена поперечно-сшитая коллагеновая матрица, поперечные сшивки которой образованы в присутствии 10% тропоэластина. В тесте В представлена поперечно-сшитая коллагеновая матрица, наложенная сверху тропоэластиновой матрицы, с поперечными сшивками с модифицированной НА. Фотографии сопоставлены с нормальной кожей свиньи и контролем, который представляет собой поперечно-сшитую коллагеновую матрицу.
Фигура 14. Срезы биоптатов кожи из дермы верхней части руки, взятых у субъектов, которых обрабатывали либо RVL, либо составами на основе эластина. (А) В коже, обработанной RVL, видно, что коллагеновые волокна дермы растянуты в разные стороны неокрашенным RVL-материалом, что делает кожу более жесткой и бугристой.
(B) В коже, обработанной составами на основе тропоэластина, имеются коллагеновые волокна дермы, разделенные имплантированным материалом, который окрашивается по VVG от синего цвета до пурпурного и черного, что указывает на то, что имплантированный материал ремоделирован в зрелые эластиновые волокна.
Подробное описание вариантов осуществления
Полагают, что ключевые результаты настоящего изобретения явились результатом новой системы для анализа, разработанной авторами настоящего изобретения и приведенной в примерах в данном документе. Для образования эластического волокна in vitro в системе для анализа используются клетки взрослого человека. Системой можно управлять, чтобы обеспечить возможность анализа каждого этапа образования эластиновых волокон и идентифицировать компоненты и процессы, необходимые для образования эластиновых волокон.
С помощью этой системы для анализа был выявлен путь синтеза эластического волокна, отличающийся от пути, как его понимали ранее, до настоящего изобретения. Ключевой результат заключается в том, что образование волокон намного больше зависит от взаимодействия клеток, чем считалось ранее.
Ключевой результат заключается в том, что система не приводит к существенному или в других отношениях значительному синтезу эластического волокна, пока в систему не добавлен экзогенный мономер тропоэластина. Это указывает на важность тропоэластина в синтезе эластического волокна in vivo.
Кроме этого, для системы показано, что образование эластического волокна не происходит эффективно, если в системе используются мономеры человеческого тропоэластина с клетками, полученными не от человека.
Кроме того, как правило, требуются мономеры, чтобы принять форму одной или нескольких встречающихся в природе изоформ. Несмотря на то, что мономеры можно синтезировать рекомбинантным путем, было обнаружено, что рекомбинантные формы, имеющие последовательность или структуру, которая не присуща физиологии человека, не обеспечивают эффективное образование эластического волокна, хотя образование волокна остается в некоторой степени возможным при условии, что отличие последовательностей эндогенного и экзогенного тропоэластина является не меньшим, чем приблизительно 65% гомология.
Кроме этого, при повторном введении тропоэластина в систему показана постоянная способность к образованию эластического волокна, что указывает на то, что лимитирующим фактором для образования эластического волокна является тропоэластин.
Полагают, что использование клеток взрослого человека и изоформ человеческого тропоэластина, встречающихся в природе, отличает данную систему для анализа от других (см., например, Sato F et al., Distinct steps of cross-linking, self-association, and maturation of tropoelastin are necessary for elastic fiber formation. J Mol Biol. 2007 Jun 8; 369(3): 841-51), и это, вероятно, является причиной того, почему указанные исследовательские группы не поняли, что человеческие клетки взрослого организма все же обладают потенциалом для синтеза эластического волокна в процессе, напоминающем эластогенез, при условии, что клетки подвергают воздействию тропоэластина.
В дополнительных исследованиях в ходе клинического испытания, приведенного в данном документе в качестве примера, доказана важность поддержания тропоэластина в ткани в течение достаточного количества времени, чтобы клетки вступили в контакт с тропоэластином. Этого можно достичь путем создания и поддержания уровня тропоэластина в участке ткани, подлежащей обработке, в течение выбранного периода времени, чтобы уровень тропоэластина в обработанном участок был выше, чем в необработанном участке. Полагают, что при условии, что тропоэластин сохраняется в ткани в течение достаточно продолжительного периода времени, необходимого для вступления клеток в контакт или, если в ткани клеток немного, для пополнения и вступления клеток в контакт, в ткани взрослого организма может происходить процесс, подобный эластогенезу, приводящий к образованию волокна и восстановлению эластической структуры ткани. Приведенные для примера периоды времени в отношении сохранения или поддержания тропоэластина в ткани дополнительно обсуждаются ниже.
Будет понятно, что эластическое волокно, образованное в соответствии с настоящим изобретением, может иметь такую же молекулярную структуру, как и эластическое волокно, наблюдаемое в природе, хотя в некоторых вариантах осуществления молекулярная и/или физическая структура волокна может отличаться. В определенных вариантах осуществления эластическое волокно может иметь физическую структуру, отличающуюся от таковой в обрабатываемой ткани, при этом цели настоящего изобретения все же достигаются.
В конкретных вариантах осуществления эластин, который синтезируется в соответствии со способами настоящего изобретения, объединяется с тканями, клетками и/или внеклеточным матриксом, тем самым восстанавливая или воссоздавая эластическую структуру, улучшая внешний вид или достигая других клинических эффектов. В этих вариантах осуществления синтезированный эластин может иметь отличающуюся физическую или молекулярную структуру по сравнению с эластическим волокном, наблюдаемым в ткани в норме, и получение конечного результата может происходить в результате взаимодействия или вступления в контакт эластина и других компонентов соответствующей ткани. Взаимодействие или вступление в контакт, очевидно, могут моделировать такие процессы, которые обычно обнаруживают у эластического волокна и тканевых элементов в соответствующей ткани.
В одном варианте осуществления эластическое волокно, образованное в соответствии с настоящим изобретением, имеет гидратированную форму, тем самым придавая волокну упругий потенциал.
Исследования, лежащие в основе настоящего изобретения, демонстрируют, что восстановление или воссоздание эластической структуры в ткани взрослого организма является возможным, потому что клетки взрослого организма, такие как фибробласты, гладкомышечные клетки и им подобные, обладают эластогенным потенциалом; это потенциал вступления в процесс, который похож на эластогенез и который, следовательно, возвращает ткани соответствующую эластическую структуру. Кроме того, потенциал реализуется при условии, что клетки взрослого организма обеспечены разновидностями и потенциально тканеспецифическими изоформами мономера тропоэластина. В дополнение, авторами настоящего изобретения было показано, что рекомбинантный человеческий тропоэластин, который содержит значительное количество примесей, не приводит к эффективному образованию эластинового волокна. В определенных вариантах осуществления тропоэластин имеет установленную степень чистоты, что касается количества тропоэластина в композиции для введения, по сравнению с количествами других белков или молекул в композиции. В одном варианте осуществления тропоэластин содержится в композиции, которая характеризуется по меньшей мере 75% чистотой, предпочтительно 85% чистотой, более предпочтительно очищен более чем 90 или 95% чистотой. Будет понятно, что в определенных вариантах осуществления тропоэластин может обеспечиваться в форме композиции, которая состоит из тропоэластина или практически состоит из тропоэластина, предпочтительно из изоформы тропоэластина полной длины. Наконец, клетки не способны использовать тропоэластин для образования эластического волокна, если тропоэластин уже содержит значительное количество внутримолекулярных поперечных сшивок.
В соответствии с настоящим изобретением схема обработки представляет собой схему, при которой тропоэластин поддерживают в пределах определенного участка обработки в ткани в течение достаточного периода времени, в течение которого клетки могут вступать в контакт и использовать вводимый тропоэластин для образования эластического волокна. Подходящая схема может включать не просто однократное введение мономеров тропоэластина, или не просто введение чистого мономера, потому что полагают, что мономеры тропоэластина характеризуются временем полужизни в пределах определенного участка обработки в ткани, которое обычно меньше времени, которое требуется соответствующим клеткам для образования эластического волокна. Более подробно, полагают, что мономеры тропоэластина, которые не вступают в контакт клетками, либо метаболизируются в участке обработки, либо исчезают из участка обработки. Из этого следует, что без выбора подходящей схемы обработки введенный тропоэластин, предположительно, может исчерпаться в определенном участке обработки до того, как его использует клетка для образования эластического волокна.
Один этап в схемах обработки, описанных дополнительно ниже, может включать однократное введение тропоэластина, при этом известно, что место, в который вводят тропоэластин, содержит значительное количество клеток. Данные о количестве или плотности клеток можно получить на основании предварительных гистологических данных ткани. Альтернативно, место введения может быть обработано заранее для индукции пролиферации клеток или пополнения в месте обработки.
Для поддержания введенного тропоэластина в ткани в течение требуемого времени в участке обработки можно принять целый ряд схем обработки. В общих чертах они заключаются в следующем:
(i) введение тропоэластина в виде состава с медленным высвобождением, который постепенно высвобождает тропоэластин в течение некоторого периода времени.
Медленного высвобождения тропоэластина в требуемом месте ткани можно достинать путем включения тропоэластина в неразлагаемые или разлагаемые средства доставки. Специалист в данной области техники может применять целый ряд таких подходов с медленным высвобождением. Предпочтительно, разлагаемый состав с замедленным высвобождением используют для того, чтобы избежать необходимости удаления средства, как только тропоэластин будет доставлен. Такие средства доставки могут состоять из полимеров, таких как полилактид (PLA) и сополимер лактида с гликолидом (PLGA). Другие средства для медленной доставки могут включать полимеры, образованные из полисахаридов, таких как гиалуроновая кислота, ксантановая камедь или хитозан. В дополнение, в определенных вариантах осуществления средство доставки можно химически модифицировать для того, чтобы связать тропоэластин посредством ионных или ковалентных связей с имплантатом так, чтобы только тропоэластин высвобождался по мере разрушения имплантата.
В определенных вариантах осуществления тропоэластин высвобождается в требуемом месте обработки в течение периода от 1 до 90 дней. В определенных вариантах осуществления тропоэластин может высвобождаться в требуемом месте обработки течение от 1 до 180 дней. В определенных вариантах осуществления тропоэластин можно составить таким образом, чтобы он высвобождался только после времени выдержки, следующим за введением имплантата, как, например, от 10 до 90 дней или от 10 до 180 дней. Другие подходящие периоды времени доставки тропоэластина включают от 1 до 30 дней, от 1 до 60 дней, от 10 до 60 дней, от 30 до 60 дней, от 30 до 180 дней или в течение от 1 до >180 дней.
3
2
3
3
3
3
Количество и концентрация тропоэластина, подлежащего доставке, зависит как от участка, так и от объема ткани, подлежащей обработке, типичных уровней эндогенного эластина, присутствующих в ткани в норме; и требуемого уровня синтеза эластинового волокна. Как правило, тропоэластин будет доставляться в ткань в количестве от 1 мкг до 1 мг на каждый см ткани. В случае кожи можно считать, что количество составляет от 1 мкг до 1 мг на см. Другие количества, которые можно доставлять, включают от 0,1 мкг до 10 мг на каждый см ткани, от 1 мг до 20 мг на каждый см ткани или от 1 мг до 100 мг на см ткани. В определенных вариантах осуществления доставляемые количества могут составлять менее 0,1 мкг или более 100 мг на см ткани. Концентрацию тропоэластина в имплантатах, подлежащих применению в обрабатываемом месте, можно изменять, чтобы обеспечить возможность доставки требуемых количеств тропоэластина, подлежащего доставке. В определенных вариантах осуществления концентрация тропоэластина в имплантатах может варьировать от 1 мкг/мл до 100 мг/мл. В определенных вариантах осуществления концентрация тропоэластина в продукте будет составлять от 0,5 мг/мл до 200 мг/мл, от 1 мг/мл до 50 мг/мл, от 5 мг/мл до 50 мг/мл или от 1 мг/мл до 25 мг/мл.
Тропоэластин, включенный в состав, должен быть по сути эквивалентным изоформе тропоэластина, которая в норме встречается в ткани, подлежащей обработке. В дополнение, Тропоэластин должен обеспечиваться в форме, которая по сути не содержит примесей. Фрагменты тропоэластина, т.е. усеченные формы изоформы тропоэластина, которые возникают непреднамеренно в ходе получения тропоэластина, в данном контексте можно рассматривать как примесь. В определенных вариантах осуществления длина тропоэластина, включенного в состав для обработки, будет составлять по меньшей мере 65% длины соответствующей изоформы тропоэластина полной длины, более предпочтительно 80% длины соответствующей изоформы тропоэластина полной длины. В других вариантах осуществления длина тропоэластина будет составлять более 85%, более 90% или более 95% полной длины. Как описано в данном документе, определенные последовательности в тропоэластине являются более важными, чем другие, например, эффективность образования волокон повышается, если окончательная C-концевая последовательность аминокислот в тропоэластине, состоящая из приблизительно 4 остатков, характеризуется гомологией или идентичностью с последовательностью тропоэластина, которая является эндогенной для соответствующей ткани.
В состав также можно включать дополнительные компоненты, чтобы способствовать активации клеток, что требуется для образования эластического волокна в ткани. Например, для обработки кожи в состав можно включать дополнительные компоненты, которые способствуют привлечению или пролиферации фибробластов в месте обработки. Такие компоненты включают семейство эпидермального фактора роста, семейство трансформирующего фактора роста бета, семейство фактора роста фибробластов, фактор роста эндотелия сосудов, колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов, фактор роста тромбоцитов, фактор роста соединительной ткани, семейство интерлейкинов и семейство фактора некроза опухоли-α.
В определенных вариантах осуществления обработка может также включать доставку клеток к месту обработки с помощью тропоэластина. В качестве примера в отношении обработки кожи, состав для обработки или процедура обработки могут включать фибробласты для содействия синтезу эластического волокна в месте обработки. Фибробласты можно получать из аллогенного источника, такого как крайняя плоть новорожденного, или получать с помощью биопсии незаметного участка кожи (например, за ухом) и использовать в качестве аутологической обработки.
(ii) введение тропоэластина, в котором области, чувствительные к протеазам, были удалены или блокированы от ферментов, присутствующих в ткани.
Тропоэластин, используемый при обработке, можно модифицировать таким образом, чтобы уменьшить разрушение его протеазами. Например, можно выбрать разновидности белка, описанные в WO 2000/04043, при условии, что они остаются по сути разновидностями тропоэластина полной длины, которые в норме обнаруживают в ткани, подлежащей обработке. Альтернативно, составы для обработки могут включать ингибиторы протеаз или молекулы, которые блокируют сигнальные пути, о которых известно, что они повышают экспрессию протеаз. Такие молекулы включают ингибиторы сериновых протеаз, ингибиторы матриксных металлопротеиназ, галактозиды, такие как лактоза, ингибиторные антитела и низкомолекулярные ингибиторы передачи сигнала, связанного с эластином.
(iii) повторное введение тропоэластина в предварительно установленные моменты времени.
В определенных вариантах осуществления для обеспечения доставки тропоэластина в форме, которую клетки могут использовать в качестве субстрата для построения эластического волокна, и сохранения в месте обработки в течение достаточного периода времени, чтобы это произошло, обработку применяют в месте обработки несколько раз.
В определенных вариантах осуществления каждый участок ткани, подлежащий обработке, будут обрабатывать трижды с помощью продукта с интервалом от 1 до 24, или от 2 до 12, или от 3 до 6 недель. Обработка может состоять из многократных инъекций по всему участку, подлежащему обработке, при этом каждая инъекция на расстоянии приблизительно 10 мм и их располагают в виде сетки. Препарат для обработки можно вводить с использованием тонкой иглы калибром, например, 27G, 29G, 30G или 31G. Иглу можно вводить в ткань с учетом угла и направления среза иглы, глубины инъекции и количества материала, подлежащего введению. Препарат для обработки можно инъецировать в ткань как болюсную инъекцию, например, объемом 10-100 мкл, 10-50 мкл, предпочтительно от 20 до 30 мкл имплантируемого продукта в каждое место инъекции. После завершения каждой инъекции иглу можно медленно извлечь. По завершении инъекции всех имплантатов, в случае необходимости, обработанное место можно мягко помассировать, чтобы дать возможность материалу имплантата принять форму, соответствующую окружающим тканям. Количество обработок, период между обработками и количество тропоэластина, доставляемого в каждое место обработки, будет регулировать в зависимости от участка ткани, подлежащего обработке, и уровня эластичности, которую необходимо восстановить.
Любой из этих подходов можно осуществлять отдельно или в комбинации, тем самым увеличивая время удержания тропоэластина в ткани.
При каждом подходе будет учитываться, что этап введения представляет собой инвазивную методику, потенциально способную вызывать обратимое повреждение тканей или клеток и инициировать различные каскады воспалительных реакций, которые возникают в ответ на такое повреждение. Авторы настоящего изобретения учитывают, что этот тип физической обработки можно применять таким образом, чтобы обеспечить условия для обратимого повреждения клеток, поскольку такие условия, по-видимому, стимулируют активацию и/или пролиферацию фибробластов. Важно, что физической обработки не достаточно для индукции фиброза.
Как обсуждается в данном документе, соображения, которыми руководствуются при выборе конкретной схемы обработки, включают природу ткани, степень разрушения или деградации эластиновую структуру и требуемый результат. Кроме того, важнейший аспект настоящего изобретения заключается в том, что для клеток обеспечивается возможность образования, восстановления или синтеза эластического волокна из предоставленного им тропоэластина. Больше возможностей для этого существует, когда из-за медленного высвобождения, защиты от разрушения или непрерывной поставки тропоэластин эффективно удерживается в ткани в течение более продолжительного периода времени. В целом, чем большей является потеря эластической структуры и чем меньше клеток содержится в ткани, тем более целесообразным является следующее: схема обработки должна обеспечить удержание тропоэластина в ткани в течение более продолжительного периода времени.
Более подробно, более короткий период времени удержания может быть подходящим, если целью является улучшение внешнего вида более молодой кожи по сравнению с таким улучшением более старой кожи. В данном случае, более подходящими могут быть повторные введения тропоэластина в предварительно установленные моменты времени согласно вышеизложенным (iii) и/или (i).
Может потребоваться более продолжительное время удержания, если ткань является рубцовой или фиброзной и по сути не содержит клеток. В данном случае будет важно предоставить достаточно времени для хемотаксиса клеток в соответствующую ткань. Схема в соответствии с (ii) и/или (i) может быть более подходящей.
Как упоминалось, результат также является важным соображением, которым руководствуются при выборе соответствующей схемы. Если результат заключается в повышении или улучшении эластической функции, может потребоваться намного более продолжительное время удержания, дающее клеткам возможность построения требуемой матрицы из эластического волокна, которая специфична в отношении функции, которая может требоваться. В данном случае более подходящей может быть форма с медленным высвобождением, как в вышеизложенном (i).
Некоторые примеры соображений, относящихся к выбору подходящих схем обработки, обсуждаются более подробно ниже:
(i) улучшение внешнего вида кожи.
(ii) увеличение содержания эластина в фиброзной и рубцовой ткани.
(iii) улучшение эластичности хрящевой ткани или сосудов.
Почти все эластические ткани млекопитающих имеют эластиновую структуру, обусловленную эластическими волокнами, содержащимися в них. Поскольку каждая различная эластическая ткань имеет разную функцию, из этого следует, что эластическая структура не одинакова у различных тканей. Например, упругость сосудов, расположенных с левой стороны тела, под действием тока крови отличается от упругости бронхиальной ткани под действием вдыхаемого воздуха. В следующей таблице описываются примеры ткани, на которую направлено настоящее изобретение, а также как можно измерить и выразить эластическую структуру каждой ткани:
Как правило, индивидуум, у которого проводят обработку в соответствии с настоящим изобретением, является человеком.
Предпочтительно ткань представляет собой ткань кожи, особенно ткань в ткани кожи индивидуума возрастом по меньшей мере 20 лет, предпочтительно возрастом от 20 до 50 лет, более предпочтительно возрастом от 30 до 60 лет.
Ткань кожи может характеризоваться разрывом или фрагментацией эластических волокон в месте контакта дермы и эпидермиса.
Ткань кожи может представлять собой ткань, подвергшуюся фотостарению.
Ткань кожи может иметь один или несколько из следующих признаков: дряблая кожа, вялая подкожная ткань, потеря плотности внеклеточного матрикса, образование морщин и растяжки.
Ткань кожи предпочтительно расположена на лице, шее или на верхней или нижней конечности.
Предпочтительно, чтобы на момент времени начала применения схемы обработки в ткани отсутствовала рана. Возможно, чтобы после завершения введения тропоэластина в соответствии с выбранной схемой обработки в ткани образовалась незначительная рана, как, например, в случаях, если осуществляют введение путем инъекции или другой физической манипуляции с кожей.
Если индивидуум является человеком, тропоэластин имеет последовательность изоформы тропоэластина, которая экспрессируется у человека. В этом варианте осуществления изоформу можно выбрать из группы, состоящей из SHEL (см. WO 1994/14958) и SHELδ26A (см. WO 1999/03886), а также устойчивых к действию протеазы производных этих изоформ (см. WO 2000/0403).
Как правило, если тканью является ткань кожи человека, то изоформа тропоэластина представляет собой SHELδ26A.
Изоформа тропоэластина может обеспечиваться в форме композиции, которая приспособлена для медленного высвобождения тропоэластина в ткань. Если тканью является ткань кожи человека, предпочтительно, чтобы композиция содержала SHELδ26A и компонент для медленного высвобождения тропоэластина из композиции, выбранный из группы, состоящей из гиалуронана, гликозаминогликанов, коллагена I типа.
Как правило, композиция для введения, включающая тропоэластин, не содержит экзогенные факторы для образования эластических волокон, особенно лизилоксидазу.
В определенных вариантах осуществления тропоэластин в соответствии со схемой обработки обеспечивается по сути в мономерной форме.
В определенных вариантах осуществления тропоэластин в соответствии со схемой обработки обеспечивается в форме практически не имеющей внутримолекулярных поперечных сшивок.
В определенных вариантах осуществления тропоэластин в соответствии со схемой обработки обеспечивается в композиции, которая состоит из тропоэластина и растворителя для тропоэластина, такого как водный раствор. Предпочтительно тропоэластин представляет собой SHELδ26A.
В определенных вариантах осуществления тропоэластин в соответствии со схемой обработки обеспечивается в композиции, которая состоит по сути из тропоэластина. В одном варианте осуществления тропоэластин представляет собой SHELδ6A.
В определенных вариантах осуществления обработка включает тропоэластин и гиалуроновую кислоту.
В определенных вариантах осуществления тропоэластин в композиции может быть поперечно сшитым с производным гиалуроновой кислоты (НА). Образование поперечных сшивок между тропоэластином и молекулой, такой как гиалуроновая кислота, может способствовать поддержанию тропоэластина в месте введения имплантата в соответствии с настоящим изобретением. Композиция может содержать от 5 до 100 мг/мл тропоэластина + от 0,1% до 2% сшивающего средства НА, предпочтительно от 10 до 50 мг/мл тропоэластина и от 0,25% до 1% сшивающего средства НА. Подходящие составы для настоящего изобретения могут включать от 10 до 30 мг/мл тропоэластина, поперечно сшитого с 0,25% - 1% сшивающего средства НА.
Важно отметить, что образование поперечных сшивок между тропоэластином и полисахаридом, таким как гиалуроновая кислота, может не приводить к образованию поперечных сшивок или вызывать образование внутримолекулярных поперечных сшивок в тропоэластине, таких как связи, которые возникают с лизилоксидазой. Более подробно, если гиалуроновая кислота разлагается гиалуронидазой (фермент кожи), тропоэластин затем может высвобождаться в мономерной форме.
В определенных вариантах осуществления обработка может включать соединения, которые повышают использование тропоэластина. Примеры включают:
- диклофенак - противовоспалительное средство (и ассоциированное с уменьшением актинических кератозов, например, см. Solaraze);
- Lys′lastine - для стимуляции эластогенеза;
- аминокислоты Gly, Val, Ala, Pro - соответствующие 75% остатков тропоэластина;
- витамины С, Е - витамин С способствует образованию нового коллагена, и оба являются антиоксидантами;
- солнцезащитный крем - ограничивает индуцированный солнцем протеолиз;
- химические активаторы - способствуют переносу компонентов через роговой слой;
- увлажняющее смягчающее средство с отрегулированным pH - для обеспечения pH в коже; увлажнение имеет значение для более старой кожи.
Если тканью является кожа, как правило, схема обработки включает введение тропоэластина в определенные моменты времени. В любой момент времени, может осуществляться одновременно введение тропоэластина.
Предпочтительно тропоэластин вводят с помощью инъекции. Если тканью является кожа, предпочтительно тропоэластин вводят в дерму.
В определенных вариантах осуществления схема обработки может дополнительно включать местное нанесение веществ, способных усиливать образование эластического волокна. Такие вещества хорошо известны специалистам в данной области техники и могут включать, но без ограничений, экстракт укропа для стимуляции экспрессии лизилоксидазы (Cenizo et al 2006 Exp. Dermatol. 15: 574-81); и крема на основе меди и/или цинка для снижения распада эластического волокна (Mahoney et al 2009 Exp. Dermatol. 18: 205-211).
В одном варианте осуществления предлагается способ придания эластичности коже индивидуума, причем способ включает следующие этапы:
- обеспечения присутствия индивидуума;
- определения участка обработки на коже индивидуума, где участок обработки представляет собой участок кожи, которому необходимо придать эластичность;
- инъекции тропоэластиновой композиции в пределах участка обработки, чтобы создать количество тропоэластина в пределах участка обработки, которое увеличено по сравнению с кожей, находящейся за пределами участка обработки;
- поддержания количество тропоэластина в участке обработки в течение предварительно установленного периода времени, тем самым придавая эластичность коже индивидуума.
Как описано в примерах ниже, способ дает возможность увеличить толщину кожи с одновременным поддержанием или улучшением эластичности кожи. Способ также дает возможность улучшить эластичность кожи или восстановить, или воссоздать эластическую структуру с одновременным сохранением гладкости (т.е. для недопущения бугристости) и естественного внешнего вида кожи.
Как правило, индивидуум является взрослым индивидуумом, который имеет проблемы с кожей, как описано в данном документе. Например, участок обработки кожи может характеризоваться фотостарением, дряблой кожей, вялой подкожной тканью, потерей плотности внеклеточного матрикса, образованием морщин и растяжками. Взрослый человек может быть в возрасте от 20 до 70 лет, например, в возрасте от 20 до 35 лет или в возрасте от 40 до 70 лет.
Как обсуждается в данном документе, предпочтительно, кожа, обрабатываемая в соответствии с настоящим изобретением, может быть расположена на лице, шее или на верхней или нижней конечности. Участки обработки могут включать всю или часть кожи в соответствующем месте. Например, если кожа расположена на верхней конечности, участок обработки может включать всю верхнюю конечность или ее часть, например, медиальную поверхность верхней конечности. Если кожа расположена на лице, участок обработки может включать всю или часть кожи около щеки, века, подбородка и т.д.
В соответствии с настоящим изобретением участок обработки представляет собой участок кожи, в котором эластическая структура является субоптимальной и/или требует улучшения или восстановления. Этот участок можно определять любым из ряда способов, известных квалифицированному специалисту. Наиболее простой из них заключается в разграничении участка кожи, которой требуется обработка, от кожи, которой обработка не требуется, путем обозначения пределов или границ участка, подлежащего обработке. Это можно осуществлять, например, с помощью маркера, индикатора, указателя или знака, который позволяет отличить участок, подлежащий обработке, от участка, который не требует обработки, например, маркера, который позволяет селективно обозначить участок, подлежащий обработке, или который селективно обозначает участок, который не требует обработки. В одном варианте осуществления участок, подлежащий обработке, можно определить за счет обозначения одной или нескольких координат, которые позволяют, соответствующим образом, установить границу участка обработки.
Определив участок обработки, тропоэластиновую композицию можно внутрикожно инъецировать в кожу, расположенную в пределах участка обработки. Цель инъекции заключается для создания или обеспечения количества тропоэластина в участке обработки, которое в норме отсутствует в участке обработки. В данном контексте количество тропоэластина, которое создают в участке обработки больше количества тропоэластина в прилегающем или соседнем участке кожи, расположенном за пределами участка обработки.
Композицию можно инъецировать в среднюю - глубокую часть дерму, в зависимости от того, где расположен участок обработки. Например, более глубокие инъекции могут больше подходить для участков обработки, где находится более толстая кожа, как, например, щеки на лице, чем для участков обработки, где находится более тонкая кожа, как, например, шея, зона декольте или вокруг глаз.
Будет понятно, что в некоторых случаях целевого результата можно достичь с помощью имплантации в гиподерму и привлечения эластогенных клеток к месту имплантации или инъекции.
Объем композиции, которая доставляется, частично зависит от локализации кожи, подлежащей обработке. Использование больших объемов является более подходящим или возможным, если кожа расположена на конечности или шее, а не на лице. Объемы каждой однократной инъекции могут находиться в диапазоне от 10 до 100 мкл, предпочтительно от приблизительно 20 до 50 мкл. Общий объем вводимого препарата для обработки будет зависеть от количества вводимых инъекций, которое в свою очередь зависит от размера участка кожи, подлежащего обработке, и расстояния между каждым из мест инъекции, которое определяют, как подходящее.
В одной особенно предпочтительной форме настоящего изобретения необходимое количество тропоэластина поддерживается в участке обработки в течение предварительно установленного периода времени с помощью повторной инъекции тропоэластина в участок обработки. Это, предположительно, создает непрерывную поставку тропоэластина в ткань в участке обработки таким образом, что в участке обработки сохраняется пороговый уровень тропоэластина для образования эластического волокна in situ, который не обнаруживается за пределами участка обработки. Полагают, что в течение курса обработки (который обсуждается ниже) это повышает вероятность вступления клеток и факторов в контакт с вводимым тропоэластином что, тем самым создавая возможность для образования эластического волокна.
В определенных вариантах осуществления препарат для обработки вводят с помощью инъекции тропоэластиновой композиции в среднюю - глубокую часть дермы инъекцией с помощью тонкой иглы. Инъекцию можно произвести с использованием гиподермальной иглы калибром 25G, предпочтительно 27G или меньше, более предпочтительно 30G или 31G. Инъекцию можно производить с использованием одного шприца и иглы путем ручного введения препарата в кожу.
В определенных вариантах осуществления однократная обработка может включать многократные инъекции в участок обработки. Если каждая обработка требует многократных инъекций, их можно вводить на расстоянии от 1 мм до 3 см.
В определенных вариантах осуществления инъекцию можно производить с использованием устройства, которое дает возможность осуществлять инъекцию в дерму кожи с помощью автоматизированных устройств, таких как пистолет для мезотерапии, или вспомогательного инъекционного устройства, как, например, инъекционного устройства компании Artiste (http://www.nordsonmicromedics.com/se/google/en/artiste-assisted-injection-system.html)или инъекционного устройства компании Anteis (http://www.anteis.com/AestheticDermatology/injectionsystem.php). В определенных вариантах осуществления можно использовать шприц или автоматизированное инъекционное устройство с адаптером, который позволяет присоединять несколько игл, чтобы можно было вводить многократные инъекции за один раз. В определенных вариантах осуществления препарат для обработки можно вводить с использованием системы с твердыми иглами, как, например, дермароллер или системы Dermapen для микроигольчатой терапии (например, как описано Kalluri, H. et al 2011, AAPS Journal 13:473-4841).
Период времени между каждой обработкой может составлять от приблизительно 3 до 168 дней. Типичные периоды между каждой обработкой могут включать от 3 до 7 дней, от 3 до 21 дней, от 14 до 28 дней, от 21 до 84 дней и от 3 до 84 дней. В целом, можно проводить от 1 до 24 или от 3 до 6 обработок. Обычно период обработки составляет не более приблизительно 1 года, предпочтительно от 3 недель до 6 месяцев, предпочтительно от приблизительно 1 до 3 месяцев.
Предпочтительные места обработки включают места вблизи, приблизительно, в пределах или рядом с щеками, глазами, шеей, зоной декольте, руками, рубцовой тканью, растяжками.
Как используется в данном документе, за исключением случаев, когда из контекста следует иное, выражение ″включать″ и варианты данного выражения, такие как ″включающий″, ″включает″ и ″включаемый″, не подразумевают исключения дополнительных добавок, компонентов, чисел или этапов.
Дополнительные аспекты настоящего изобретения и дополнительные варианты осуществления аспектов, описанные в предыдущих абзацах, станут понятными из следующего описания, приведенного в качестве примера и со ссылкой на прилагаемые графические материалы.
Будет понятно, что настоящее изобретение, раскрываемое и определяемое в данном описании, распространяется на все альтернативные комбинации двух или большего количества отдельных признаков, упомянутых или очевидных из текста или графических материалов. Все эти разные комбинации составляют различные альтернативные аспекты настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Система для анализа in vitro синтеза эластического волокна
Материалы и методы
а) Клетки
b) Культура клеток
2
5
Клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы (DMEM; Invitrogen), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Invitrogen) и 1% (объем./объем.) пенициллина/стрептомицина (Invitrogen). Среду заменяли каждые 2-3 дня. Клетки инкубировали при 37°C и 5% CO. Для оценки способности клеток к образованию эластиновых волокон производили посев 1×10 клеток на стеклянные покровные стекла в 12-луночные культуральные планшеты. Через 10-17 дней после посева тропоэластин полной длины (Elastagen) или альтернативный белок, полученный из эластина, в PBS стерилизовали посредством фильтрации и добавляли в культуры клеток. Альтернативные белки, полученные из эластина, включали пептиды эластина человеческой кожи (Elastin Products Company; HSP72), конструкт ΔRKRK с делецией С-конца тропоэластина (Weiss lab) и конструкт с заменой С-конца тропоэластина, содержащий RGDS (Weiss lab). Образование волокон также оценивали в присутствии 50 мкМ блеббистатина (Sigma). Для экспериментов, в которых оценивается эффект повторных добавлений тропоэластина, белок добавляли через 10, 17 и 24 дней после посева. Толщину клеточного матрикса определяли путем усреднения количества 0,41 мкм z-срезов, требуемых для получения изображения от расположенных вверху ядер до низа образца в десяти произвольно выбранный полях зрения.
В заданные моменты времени после добавления тропоэластина клетки фиксировали либо с помощью 3% (вес./объем.) формальдегида, либо 4% (вес./объем.) параформальдегида в течение 20 минут, и фиксацию останавливали с помощью 0,2 М глицина. Клетки инкубировали с 0,2% (объем./объем.) Тритоном Х-100 в течение 6 минут, блокировали с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина при 4°C на протяжении ночи и окрашивали с помощью первичного мышиного антитела к эластину ВА4 (Sigma) с разведением 1:500 в течение 1,5 часа и вторичного антитела к мышиному IgG-FITC (Sigma) с разведением 1:100 в течение 1 часа. Затем покровные стекла монтировали на предметные стекла с помощью фотозащитного реактива ProLong Gold с DAPI (Invitrogen).
с) Флуоресцентная визуализация
Образцы визуализировали с помощью конфокального микроскопа Olympus Fluo View FV1000. Фотографии, показанные в данном документе, строили по проекции серии z-срезов.
Результаты и обсуждение
а) Образование волокон эластина фибробластами кожи человека, полученными от разных возрастных групп
Мы оценивали способность фибробластов кожи человека к образованию эластиновых волокон и сетей после добавления тропоэластина (SHELδ26A (т.е. синтетического человеческого эластина, который не содержит домен 26А)). На фигуре 1 показано образование эластина через 7 дней после добавления 250 мкг/мл тропоэластина к фибробластам кожи, полученным от новорожденного, 10-, 31-, 51- и 92-летних доноров. У всех клеточных линий показано образование эластиновых волокон. Образование эластина не наблюдали в контрольных культурах клеток, к которым тропоэластин не добавляли (данные не показаны). Клетки более молодых доноров пролиферировали более интенсивно, как видно по увеличению количества ядер (синий). Клетки более молодых доноров образовывали обширные эластиновые сети при добавлении тропоэластина. Клетки более старых доноров все еще были способны к образованию заметных эластиновых волокон из добавленного тропоэластина, однако сеть была более редкой (фигура 1).
b) Образование эластиновых волокон клетками животных
Оценивали способность фибробластов кожи свиньи (Pig 10-10) и кролика (RAB-9) к образованию эластиновых волокон и сетей после добавления 250 мкг/мл тропоэластина. Как показано на фигуре 2, тропоэластин откладывался в матриксе всех этих клеток животных. Однако только клетки кролика были способны к образованию эластиновой сети. Различия аминокислотных последовательностей тропоэластина человека и видами животных может объяснить более низкую эффективность, отличающееся использование тропоэластина клетками животных (фигура 2).
c) Образование эластиновых волокон гладкомышечными клетками дыхательных путей
Оценивали способность первичной культуры гладкомышечных клеток дыхательных путей человека, полученных из легких больного человека, к образованию эластиновых волокон после добавления тропоэластина. На фигуре 3 показано образование эластина через 7 дней после добавления 250 мкг/мл тропоэластина. Эти клетки отличались по степени образования волокна: от минимального количества отложения сферул тропоэластина до сети эластиновых волокон (фигура 3). Результаты демонстрируют, что гладкомышечные клетки, как и фибробласты, наблюдаемые на фигуре 1, обладают способностью к образованию эластического волокна из экзогенного тропоэластина, как гладкомышечные клетки из других тканей, например, сосудов.
d) Образование эластиновых волокон при использовании производных тропоэластина
v
3
Оценивали способность первичной культуры фибробластов новорожденного (NHF8909) к образованию эластиновых сетей с использованием трех альтернативных белков, полученных из эластина. Этими белками были пептиды эластина кожи, полученные путем ферментативного гидролиза эластина кожи взрослого человека с помощью эластазы мокроты человека, а также две изоформы тропоэластина. Тропоэластин содержит мотив GRKRK на своем С-конце, который, как было показано, управляет связыванием клеток с интегрином αβ. В изоформе тропоэластина ΔRKRK была удалена последовательность RKRK данного мотива. В изоформе +RGDS была удалена последовательность RKRK и заменена на канонический домен связывания клеток RGDS. Во всех случаях добавляли 125 мкг/мл белка в первичную культуру фибробластов кожи новорожденного через 12 дней после посева.
На фигуре 4 показаны полученные в результате эластиновые сети. При добавлении в культуры тропоэластина полной длины наблюдали образование эластиновых волокон. В тоже время при добавлении в культуры производных тропоэластина образование волокон значительно ухудшалось. Отложение пептидов эластина кожи в матриксе не происходило. Вместо этого наблюдалось отложение сферул, а не волокон, из каждой из форм ΔRKRK и +RGDS.
e) Образование эластиновых волокон при нарушении сократительных способности клеток
Исследовали требование к сократительным способностям клеток при образовании эластиновых волокон путем добавления блеббистатина в культуру клеток в то же самое время, в которое добавляли Тропоэластин. Блеббистатин представляет собой ингибитор немышечного миозина II, который изменяет сократительные способности клеток и клеточную миграцию. На фигуре 5 показано, что образование эластиновых волокон существенно ухудшается в присутствии блеббистатина.
f) Образование эластиновых волокон после повторных добавлений тропоэластина
Оценивали способность первичной культуры фибробластов кожи новорожденного (NHF8909) к образованию эластиновых сетей вследствие повторных добавлений тропоэластина. Тропоэластин (250 мкг/мл) добавляли в культуры через 10 дней, 10 и 17 дней, а также 10, 17 и 24 дней после посева. Все образцы фиксировали через 31 день после посева. На фигуре 6 показано, что образование эластиновой сети существенно увеличивается вследствие повторных обработок тропоэластином. Это приводило к увеличению толщины клеточного матрикса, при этом толщина образца без добавления тропоэластина через 31 день после посева составляла 13,4±2,2 мкм, толщина образцов с одним и двумя добавлениями тропоэластина составляла 15,3±1,2 мкм и 16,9±0,8 мкм, соответственно, и толщина образца с тремя добавлениями тропоэластина составляла 19,0±2,2 мкм.
g) Эластичность волокна, образованного in vitro
2
Человеческие дермальные фибробласты высевали на чашки WillCo со стеклянным дном из расчета плотности 20000 клеток/см в DMEM (Invitrogen, 11995), дополненную 10% (объем./объем.) фетальной бычьей сыворотки и 1% (объем./объем.) пенициллина/стрептомицина. На 12 день после посева к культурам фибробластов добавляли 250 мкг/мл тропоэластина в PBS. Культуральную среду заменяли каждые 2 дня. На 19 день после посева образцы анализировали с помощью атомно-силового микроскопа BioScope Catalyst. Собственную автофлуоресценцию зрелых эластиновых волокон использовали для определения их положения в пределах культуры. Контрольные образцы с таким же временем роста без добавления тропоэластина не проявляли автофлуоресценцию (фиг. 7). Картирование топографии/модуля упругости продемонстрировало измененную эластичность культуры (фиг. 8, желтые области) после добавления тропоэластина, о чем свидетельствует преобладающая область межклеточного материала с модулем Юнга ~600 кПа, что согласуется с образованием эластиновых волокон. Неочищенный природный эластин имеет модуль Юнга ~600 кПа.
h) Динамика образования эластических волокон
2
Человеческие дермальные фибробласты высевали на стеклянные покровные стеклах из расчета плотности 20000 клетки/см в DMEM, дополненной 10% (объем./объем.) фетальной бычьей сыворотки и 1% (объем./объем.) пенициллина/стрептомицина. На 10-12 день после посева к культурам фибробластов добавляли 250 мкг/мл тропоэластина в PBS. Культуральную среду заменяли каждые 2 дня. В заданный день обычно через 1, 3 и 7 дней после добавления тропоэластина клетки фиксировали с помощью 4% (вес/объем) параформальдегида в течение 20 минут и фиксацию останавливали с помощью 0,2 М глицина. Клетки инкубировали с 0,2% (объем/объем) Тритоном Х-100 в течение 6 минут, блокировали с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина при 4°C на протяжении ночи и окрашивали с помощью первичного мышиного антитела к эластину ВА4 с разведением 1:500 в течение 1,5 часа и вторичного антитела к мышиному IgG-FITC с разведением 1:100 в течение 1 часа. Затем покровные стекла монтировали на предметные стекла с помощью фотозащитного реактива ProLong Gold с DAPI. Образцы визуализировали с использованием конфокального микроскопа Olympus FluoView FV1000. Получали серии z-срезов и преобразовывали в сжатые проекционные фотографии.
Данная модельная система на основе культуры клеток in vitro показывает, что после добавления тропоэластина в ЕСМ белок откладывается в виде сферул (фиг. 9а). В последующем образование волокон первоначально происходит с выравниванием по оси клеток (фиг. 9b) перед образованием обширной разветвленной эластической сети (фиг. 9с).
i) Вовлечение лизилоксидазы
Исследовали воздействие ингибитора лизилоксидазы BAPN на образование эластических волокон в этой системе.
Дермальные фибробласты человека выращивали в течение 12 дней перед добавлением тропоэластина, как описано. Клетки культивировали в течение дополнительных 72 часов после добавления тропоэластина. BAPN добавляли в различные моменты времени относительно добавления тропоэластина. Образцы окрашивали на эластин и ядра, как описано выше. Добавление BAPN допускает отложение некоторых сферул в ЕСМ, но предотвращает образование волокон (фиг. 10), что показывает, что клетки используют лизилоксидазу во время образования эластического волокна из тропоэластина.
j) Расположение сферул в линию
Чтобы дополнительно исследовать образование эластических волокон в модельной системе in vitro использовали микроскопию сверхвысокого разрешения. Человеческие дермальные фибробласты культивировали и фиксировали через 3 дня после добавления тропоэластина, как описано. Клетки окрашивали с помощью мышиного антитела к эластину ВА4 с разведением 1/500 в течение 1,5 часа и антитела к мышиному IgG-AlexaFluor 488 с разведением 1/100 в течение 1 часа. Образцы визуализировали с помощью микроскопа Leica SP5 cwSTED.
Сферулы, располагающиеся в линию, обнаруживают через 3 дня после добавления тропоэластина к 12-дневной культуре дермальных фибробластов (фиг. 11). С помощью антитела сферулы окрашиваются точечно. Средний диаметр сферул составляет 605±97 нм.
k) Обработка сферул
Для дополнительного исследования образование эластических волокон в модельной системе in vitro также использовали трансмиссионную электронную микроскопию, по сути как описано. Образцы обрабатывали через 3 дня после добавления тропоэластина в 12-дневную культуру дермальных фибробластов. Клетки, выращенные для анализа в отношении эластина, фиксировали с помощью 2% глутаральдегида в буфере PBS в течение 1 часа при 4°C и на следующем этапе фиксировали с помощью 0,1% тетраоксида осмия в течение 10 минут в темноте при 4°C, и немедленно промывали дважды дистиллированной водой, каждый раз в течение 5 минут. Впоследствии образцы обезвоживали в равномерно повышающейся серии этанолов, по 10 минут в каждом (т.е., в 70, 80 и 90% и дважды в 100%). Пропитку образца с помощью Epon (смолы) осуществляли посредством следующих смесей и времени инкубации: 25% Epon в этаноле в течение 4 часов, 50% Epon в этаноле на протяжении ночи и две смены 100% Epon в течение 8 часов каждая при комнатной температуре. По завершению пропитки смолой образец заключали с использованием способа двойной полимеризации Kobayashi K., et al. (2012). Подравнивали полученные в результате поверхности блоков, содержащих заключенные клетки, и ультратонкие срезы получали посредством ультрамикротома (Leica, Ultracut-7), которые дает срезы толщиной приблизительно 70 нм, которые монтировали на медные сетки с ячейкой 200 меш. Срезы окрашивали 2% водным уранилацетатом и цитратом свинца Рейнольдса в течение 10 минут каждый и тщательно промывали водой между этапами для минимизации отложений красителя. Фотографии срезов получали с использованием JEOL 2100 ТЕМ (JEOL, Japan) при 200 кВ.
Наблюдали три различные структуры, содержащие эластин (фиг. 12):
(1) Сферулы, окруженные плотной оболочкой, со средним диаметром 615±153 нм. Эти сферулы находятся в непосредственном контакте с клетками.
(2) Сферулы, которые разрываются, выпуская свое содержимое.
(3) Эластические массы, образованные из коалесцирующих разорванных сферул.
Тесная связь эластического материала с клетками и клеточными выростами позволяет предположить, что сферулы разрывают механические силы.
1) Модель на животных
Изучали воздействие на образование эластиновых волокон дермальных матриц, содержащих тропоэластин, вместе с пересадкой тонких расщепленных кожных лоскутов. В исследовании использовали двух свиней. На 0 день применяли следующие заменители кожи.
1. Контроль: только поперечно-сшитая коллагеновая матрица;
2. Тест А: поперечно-сшитая коллагеновая матрица, образованная в присутствии 10% тропоэластина;
3. Тест В: поперечно-сшитая коллагеновая матрица, которую наносили на тропоэластиновую матрицу, поперечно-сшитую с модифицированной НА
В день 0 подготавливали четыре эксцизионные раны (диаметром 5 см) на верхней части спины каждой свиньи. Две раны с одной стороны покрывали с помощью контроля. Одну рану с другой стороны обрабатывали с помощью теста А и другую рану обрабатывали с помощью теста В. В день 7 (неделя 1) меняли повязки для всех ран. В день 14 (неделя 2) собирали 4 мм биоптаты в нескольких мм от угла раны. В день 21 (неделя 3) проводили пересадку тонких расщепленных кожных лоскутов на все раны со сменой повязок. В день 28 (неделя 4) меняли повязки для всех ран. На день 35 (неделя 5) животных подвергали эвтаназии и собирали раневую ткань и нормальную кожу. Биоптаты фиксировали в формалине и заключали в парафин.
Образование эластиновых волокон оценивали с помощью окрашивания срезов по Вергеффу-Ван-Гизону (фигура 13), которое придает эластиновым волокнам пурпурный/черный цвет. Видны эластиновые волокна, окружающие волосяной фолликул, в нормальной свиной коже (отмечены кругом).
Короткие наблюдаемые спорадически волокна изредка были заметны в дерме контрольных образцов.
После биопсии образцов теста А в ткани из раны обнаруживали образованный de novo эластин в форме волокон и скоплений волокон (например, области, выделенные черными кругами).
После биопсии образцов теста В в ткани из раны обнаруживали сохранившийся тропоэластиновый матрикс, поперечно-сшитый с модифицированной НА (например, область, выделенная черными кругами), а также образование de novo эластиновых волокон (например, область, выделенная белыми кругами).
Пример 2. Клиническое исследование для оценки обработки человеческой кожи с использованием инъекционного продукта с эластином для омоложения кожи
Методы:
Проводили клиническое исследование с использованием состава на основе тропоэластина с незначительным количеством поперечных сшивок с производным гиалуроновой кислоты (как описано в PCT/AU 2011/001503, в конкретном примере 3 и примере 6) по сравнению с Restylane Vital Light (RVL - 12 мг/мл гиалуроновой кислоты, поперечно-сшитой с BDDE, Q-Med, Австралия). Обрабатывали кожу участников на внутренней части плеча путем имплантации продукта в дерму посредством инъекции с помощью тонкой иглы. Для исследования выбирали плечо, поскольку это область кожи, которая, как правило, не подвергается воздействию солнечного света и поэтому представляет собой здоровую неповрежденную ткань кожи. Исследование было направлено на оценку влияния продуктов на толщину и текстуру кожи, в том числе эластичность, и на сбор субъективных отзывов пациентов относительно внешнего вида, естественности и гладкости обрабатываемого участка поверхности кожи.
1
4
В исследование набирали здоровых субъектов, и после периода скрининга шестнадцать субъектов, которые соответствовали требованиям вступления, включали в исследование и рандомизированно разделяли с получением обработки одним из ряда тропоэластиновых составов (ELAPR002: 10-30 мг/мл тропоэластина, формирующего поперечные сшивки с производным гиалуроновой кислоты) на одной руке плюс контроль Restylane Vital Light (RVL - 12 мг/мл гиалуроновой кислоты, формирующей поперечные сшивки с BDDE) на другой руке. Всех субъектов обрабатывали такими препаратами для обработки трижды в том же месте обработки, с интервалом 3 недели. Каждая обработка состояла из многократных инъекций 20-30 мкл продукта, который доставляли с использованием иглы 300Gx/″, при этом каждую инъекцию осуществляют с интервалом приблизительно 1 см в виде сетки по всему участку плеча.
При каждом визите субъектам задавали вопросы, связанные с гладкостью, естественностью и внешним видом кожи в обрабатываемом месте, и просили предоставить отзыв посредством визуальной аналоговой шкалы (VAS) путем нанесения линии на шкале от 0-100 (причем 0 соответствует не очень хорошей гладкости, естественности или плохому внешнему виду и 100 соответствует очень хорошей гладкости, естественности и хорошему внешнему виду). Измерения эластичности кожи и толщины кожи осуществляли с использованием Dermal Torque Meter (DTM) и калиперов для кожи, соответственно. Для оценки сохранения имплантатов и уровней содержания эластина в местах обработки через 3 месяца и 6 месяцев проводили гистопатологическое исследование срезов биоптатов путем окрашивания по Вергеффу-Ван-Гизону (VVG).
Результаты:
Гистопатологий анализ мест введения имплантатов:
Оценка участка поверхности кожи по VVG выявила, что в участках кожи, обработанных с помощью RVL, видны изменения в дерме, включающие растяжение коллагеновых волокон дермы и их распространение за счет материала имплантата, как видно по неокрашенному внеклеточному пространству, которое преобладает на фигуре 14А. В отличие от этого в участках кожи, обработанных с помощью ELAPR002, видно, что материал имплантата интегрируется в ткань кожи с доказательством ремоделирования материала имплантата в эластин, о чем свидетельствует изменение цвета материала имплантата, переходящего из синего в пурпурный - черный при окрашивании VVG. Следовательно, ясно видно, что введение тропоэластина обеспечило сборку in situ и отложение эластического волокна подобно тому, как наблюдают при эластогенезе (фигура 14 В).
Измерения толщины и бугристости кожи
Толщину кожи в местах обработки измерял клиницист, проводящий исследование, с использованием калиперов для кожи. В таблице 1 показаны измерения средней толщины кожи для мест, обработанных с помощью составов на основе RVL и ELAPR, на исходном уровне и через 3 месяца. Обнаружено, что увеличение толщины кожи было значимым как для составов на основе RVL, так и составов на основе эластина (p<0,001).
Из шестнадцати пациентов, принимающих участие в исследовании, у всех шестнадцати пациентов на руках, обработанных с помощью RVL, наблюдались бугорки, которые были видны или могли прощупываться исследователем через 3 месяца. В отличие от этого только у 1 из 16 пациентов на руках, обработанных с помощью составов на основе ELAPR002, через 3 месяца наблюдались какие-либо бугорки. В связи с этим измерения толщины кожи для RVL в большой степени являются измерением бугорков RVL в коже, в то время как измерения мест, обработанных ELAPR002, более точно отражает увеличение общей толщины кожи по всему обработанному участку.
Измерения эластичности кожи
Измерения упругой деформации кожи, Ue, снимали из обрабатываемых участков поверхности кожи с использованием DTM при каждом визите для проведения оценки в течение периода клинического исследования.
Средние баллы Ue на исходном уровне и через 6 месяцев представлены в таблице 2 для RVL и ELAPR002L Как можно увидеть из данных в таблице, для участки поверхности кожи, обработанные с помощью RVL, выявили сниженную способности к упругой деформации (сниженное Ue после обработки), что указывает на то, что увеличенная толщина кожи в результате обработки с помощью RVL, делает кожу более жесткой. В отличие от этого участки кожи, обработанные с помощью тропоэластиновых имплантатов, сохранили способность к упругой деформации (Ue остается относительно стабильным), что указывает на то, что увеличенная толщина кожи достигается с сохранением эластических свойств кожи.
Оценки пациентов
Средние баллы визуальной аналоговой оценки пациентами в отношении гладкости, естественности и внешнего вида обработанного участка кожи приведены в таблице 3 для участков поверхности кожи, обработанных с помощью RVL и ELAPR002ii. Данные показывают, что пациенты высоко оценивали участки поверхности кожи, обработанные с помощью тропоэластиновых составов, в отношении гладкости, естественности и внешнего вида по сравнению с участками, обработанными с помощью RVL (более высокие баллы представляют собой положительную оценку).