ОПТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К ФОТОИНГИБИРОВАНИЮ И ФОТОДЕСТРУКЦИИ
METHOD OF VISUAL ESTIMATION OF PHOTOINHIBITION AND PHOTODEGRADATION RESISTANCE OF PLANTS

Изобретение относится к экспериментальной биологии, сельскому и лесному хозяйству и может быть использовано для оценки устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды, в частности к избыточному освещению.
Известны оптические способы определения устойчивости к фотоингибированию и фототодеструкции, основанные на регистрации флуоресценции хлорофилла до и после облучения интенсивным светом [1-5]. Недостатком известных способов с использованием флуоресценции хлорофилла является сложная и дорогостоящая аппаратура, сильная зависимость флуоресценции от температуры объекта.
2
Известные методы оценки степени фотодеструктивных повреждений заключаются в экспонировании суспензии изолированных хлоропластов или целого листа, отделенного от растения, или целого растения в течение определенного времени (от единиц минут до нескольких суток) интенсивным белым светом (плотности мощности свыше 1000 Вт/м) и последующего измерения спектров поглощения на спек-трофотометрическом оборудовании [5-9]. О степени и характере фотоповреждения судят по изменению спектров поглощения в диапазоне длин волн от 350 до 720 нм.
Для формирования необходимых для фотоингибирования и фотодеструкции высоких освещенностей используются мощные лампы накаливания, ртутные дуговые или галогеновые лампы со специальной конденсорной оптикой и тепловым водяным фильтром [3, 5, 6, 9]. При довольно больших энергозатратах, необходимых для того, чтобы на базе ламп накаливания сформировать потоки нужных интенсивностей, этот подход требует громоздкого оборудования и длительного времени на проведение эксперимента. Такие измерения носят повреждающий характер, объект нельзя использовать повторно. Известные методы не позволяют проводить исследования устойчивости к фотоингибированию и фотодеструкции целых растений в процессе вегетации, оценивать реакцию фотосинтетического аппарата на изменение условий обитания. Характерная для тепловых источников временная нестабильность спектрального распределения и его сложная форма вызывают дополнительные методические сложности при расчете реальных интенсивностей облучения. Невозможно также точно определить дозы оптического излучения, приводящие к фотоингибированию и/или фотодеструкции.
Цель изобретения - снизить трудоемкость оценок за счет сокращения длительности измерений и повысить их эффективность за счет сохранения растений для последующего изучения.
2
Способ осуществляют следующим образом. Регистрируют динамику светорассеяния фотосинтезирующих тканей растений или плодов (например, листьев и побегов растений, покровной ткани овощей и фруктов) в процессе длительной непрерывной засветки небольшого участка ткани (площадь засветки - менее 0,2 см) квазимонохроматическим оптическим излучением в диапазоне максимумов поглощения хлорофилла. При этом об устойчивости к фотоингибированию судят по кинетике и амплитуде светоиндуцированного спада светорассеяния в начальной фазе засветки, а об устойчивости к фотодеструкции - по времени наступления фазы разрушения хлорофилла, выявляемого по увеличению интенсивности светорассеяния. Количественно устойчивость к фотоингибированию оценивают параметром
cn
cn
cn
max
min
min
cn
n
УФИ=dA·T, где dA=(I-I)/I - относительная амплитуда спада интенсивности светорассеяния начального этапа засветки, T, - длительность спада; а устойчивость к фотодеструкции - параметром УФД=T - длительность времени с начала засветки до момента подъема интенсивности светорассеяния.
2
Пример 1. Листья цисуса ромболистного после 10 минутной темновой адаптации помещают в установку для измерения интенсивности светорассеяния и регистрируют динамику изменения светорассеяния в процессе непрерывной засветки монохроматическим оптическим излучением красной области спектра (630 нм) интенсивностью 1500 Вт/м при температуре +22…+25°С - это является контрольным измерением. Затем те же самые образцы выдерживают в течение 10-15 минут при температуре +55°С и проводят повторные измерения спустя 60 минут после тепловой обработки. Короткая тепловая обработка широко используется для избирательной инактивации водоокисляющего комплекса фотосистемы 2, в результате чего живая фотосинтезирующая клетка становится более чувствительной к фотоингибированию и фотодеструкции. Действительно, тепловая обработка приводит к трехкратному снижению амплитуды и десятикратному - длительности светоиндуцированного спада интенсивности светорассеяния в первые минуты засветки, а также к существенному снижению дозы облучения, приводящему к разрушению хлорофилла (фиг.1, таблица).
2
Пример 2. Листья светолюбивых (груши, яблони, березы) и тенеустойчивых видов растений (цисуса ромболистного, папоротника, смородины, актинидии) после 5-минутной темновой и тепловой адаптации при температуре +25°С помещают в измерительную установку и фиксируют динамику интенсивности светорассеяния в процессе непрерывной засветки монохроматическим оптическим излучением синей области спектра (470 нм) интенсивностью 860 Вт/м. У светолюбивых видов растений наблюдаются существенно более высокие показатели параметров УФИ и УФД (таблица).
2
Пример 3. Листья растений черной смородины и цисуса ромболистного, растущих при различных освещенностях, после 5-ти минутной темновой адаптации помещают в измерительную установку и оценивают амплитуду и скорость спада интенсивности светорассеяния, инициированного лазерным лучом длиной волны 650 нм интенсивностью 300 Вт/м. Исследовали так называемых «световые» листья, сформировавшиеся в условиях 100% освещенности, и «теневые» листья, культивируемые при 50 и 25% от освещенности на открытом месте. Рассчитанный по данным измерений параметр УФИ указывает на то, что теневые листья существенно сильнее подвержены фотоингибированию, чем световые (таблица).
Таким образом, новый способ позволяет адекватно оценить устойчивость растений к фотоингибированию и фотодеструкции, при этом позволяет существенно сократить время на проведение измерений. Благодаря малому размеру луча (от долей до единиц миллиметра) будет повреждаться весьма незначительная часть площади листа (доли процента), что позволит снять несколько десятков показаний с одной листовой пластинки или использовать одно и то же растение для всего цикла исследований при анализе влияния фазы развития листа или какого-либо внешнего фактора. Спектральная и энергетическая стабильность источников квазимонохроматического излучения (лазеры, светодиоды) позволяет точно оценивать дозы света, вызывающие фотоингибирующий или фотодеструктивный эффект.
Литература
1. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. Теоретические и практические аспекты. М.: Наука, 1990 - 200 с.
2. Мерзляк М.Н., Погосян С.И. Фотодеструкция пигментов и липидов в изолированных хлоропластах. // Биологические науки. - 1986 - №3 - С.8-20.
3. Кривошеева А.А., Дюбе С., Госселин А. Различная природа фотоингибирования фотосинтеза в листьях томатов и перцев. // Физиология растений. - 1996. - Т.43, №3. - С.467-472.
4. Лепедуш X., Вильевач М., Цезар В., Любешич Н. Оценка функционального состояния фотосинтетического аппарата у хвои ели с признаками хлороза на слабом и сильном свету по изменениям флуоресценции хлорофилла in vivo. // Физиология растений. - 2005. - Т.52, №2. - С.191-197.
5. Стриж И.Г., Лысенко Г.Г., Неверов К.В. Фотовосстановление молекулярного кислорода в препаратах фотосистемы 2 в условиях фотоингибирования. // Физиология растений. - 2005. - Т.52, №6. - С.814-821.
6. Егоров С.Ю., Красновский А.А., Кулаковская Л.И. Исследование механизма фотодеструкции хлоропластов: участие триплетного состояния хлорофилла. // Физиология растений. - 1985. - Т.32, Вып.4. - С.668-673.
7. Naoki Y., Yoshio F., Masayoshi S. Peroxidase-mediated chlorophyll degradation in horticultural crops. // Phytochem. Rev. - 2004. - V.3, №1-2. - C.221-228.
8. Kumar S.P. Photoinhibition of photosynthesis and mechanism of protection against photodamage in crop plant. // Everyman's Sci. - 2002. - 36, №4. - C.237-252. 50.
9. Мерзляк M.H., Гительсон А.А., Погосян С.И., Чивкунова О.Б., Ленимена Л., Гарсон М., Бузулукова Н.П., Шевырева В.В., Румянцева В.Б. Спектры отражения листьев и плодов при нормальном развитии, старении и стрессе. // Физиология растений. - 1997 - Т.44, №5 - С.707-716.
Объект
Параметры засветки
dA<sub>cn</sub>, от.ед.
T<sub>cn</sub>, c
УФИ
УФД
Цисус интактный
630 нм, 1500 Вт/м<sup>2</sup>
0,720
160
115,20
484
Цисус, через час после 15 мин прогрева при +50°С
-//-
0,277
15
4,15
42
Папоротник
470 нм, 860 Вт/м<sup>2</sup>
0,665
75
49,87
155
Актинидия
-//-
0,452
56
25,31
190
Смородина
-//-
0,810
90
72,87
180
Яблоня
-//-
1,086
250
271,5
450
Груша
-//-
0,873
480
419,0
610
Береза
-//-
0,864
620
535,8
2100
Смородина черная, световые листья
650 нм, 900 Вт/м<sup>2</sup>
0,805
280
275,4
630
Смородина черная, теневые листья
-//-
0,553
190
105,7
440
Цисус ромболистный, световые листья
650 нм, 300 Вт/м<sup>2</sup>
0,732
460
336,7
-
Цисус ромболистный, теневые листья
-//-
0,652
320
208,6
-