СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ ПРОТИВ СВИНОГО ЦИРКОВИРУСА
METHODS AND COMPOSITIONS FOR IMMUNISATION OF PIGS AGAINST PORCINE CIRCOVIRUS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области здоровья животных и в нем предложены способы и композиции для защиты свиней против патогенных штаммов свиного цирковируса типа 2В. Более конкретно, настоящее изобретение относится к вновь идентифицированным патогенным штаммам свиного цирковируса типа 2В, последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим эти штаммы типа 2В, и белкам, кодируемым этими нуклеиновыми кислотами. Это изобретение также относится к способам и композициям для индукции иммунного ответа к патогенному свиному цирковирусу путем введения композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного из этих свиных цирковирусов типа 2В, или нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один из этих свиных цирковирусов типа 2, или по меньшей мере один белок, кодируемый этими нуклеиновыми кислотами.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Свиной цирковирус (PCV) является мелким икосаэдрическим безоболочечным вирусом, который содержит одноцепочечный кольцевой ДНК-геном с размером примерно 1,76 т.п.н. Он был первоначально выделен в качестве контаминанта клеточной культуры линии клеток почки свиньи РК-15 (I. Tischer et al., Nature 295: 64-66 (1982); I. Tischer et al., Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226 (2): 153-167 (1974)). PCV классифицируют в семейство Circoviridae, которое состоит из трех других цирковирусов животных (вирус анемии кур (CAV), вирус болезни клюва и перьев попугаев (PBFDV) и недавно обнаруженный голубиный цирковирус (CoCV) из голубей) и трех цирковирусов растений (вирус кустистости верхушки банана, вирус увядания листьев кокосовой пальмы и вирус карликовости подземного клевера) (М.R.Bassami et al., Virology 249: 453-459 (1998); J. Mankertz et al., Virus Genes 16: 267-276 (1998); A.Mankertz et al., Arch. Virol. 145: 2469-2479 (2000); В.M.Meehan et al., J. Gen. Virol. 78: 221-227 (1997); В.M.Meehan et al., J. Gen. Virol. 79: 2171-2179 (1998); D.Todd et al., Arch. Virol. 117: 129-135 (1991)). Члены трех ранее идентифицированных цирковирусов животных (PCV, CAV и PBFDV) не имеют гомологии нуклеотидных последовательностей или антигенных детерминант между собой (M.R.Bassami et al., 1998, выше; D.Todd et al., 1991, выше). Экспериментальное инфицирование свиней вирусом PCV, полученным из клеток РК-15, не вызывает клинического заболевания, и поэтому этот вирус не считается патогенным для свиней (G.M.Allan et al., Vet. Microbiol. 44: 49-64 (1995); I.Tischer et al., Arch. Virol. 91: 271-276 (1986)). Этот непатогенный PCV, полученный из зараженной клеточной линии РК-15, обозначили как свиной цирковирус типа 1 или PCV1.
Синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS, postweaning multisystemic wasting syndrome), впервые описанный в 1991 г. (J.C.Harding and E.G.Clark, Swine Health and Production 5: 201-203 (1997)), представляет собой комплексное заболевание отъемных поросят, которое становится все более распространенным. PMWS в основном поражает свиней в возрасте 5-18 недель. Клинические признаки PMWS включают в себя прогрессирующую потерю массы тела, одышку, учащенное дыхание, анемию, диарею и желтуху. В Великобритании уровень смертности может варьировать от 1-2% до 40% в некоторых осложненных случаях (M. Muirhead, Vet. Rec. 150: 456 (2002)). Микроскопические поражения, характерные для PMWS, включают в себя гранулематозную интерстициальную пневмонию, лимфаденопатию, гепатит и нефрит (G.M.Allan and J.A.Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J.С.Harding and E.G.Clark, Swine Health and Production 5: 201-203 (1997)).
Хотя PCV1 является повсеместным у свиней, он не является патогенным для свиней. Первичным причиной PMWS обычно является патогенный штамм PCV, обозначенный как свиной цирковирус типа 2 или PCV2 (G.M. Allan et al., Vet. Rec. 142: 467-468 (1998); G.M.Allan etal., J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G.M.Allan et al., Vet. Microbiol. 66: 115-23 (1999); G.M.Allan and J.A.Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J. Ellis etal. Can. Vet. J. 39: 44-51 (1998); A.L.Hamel et al., J. Virol. 72: 5262-5267 (1998); B.M.Meehan et al., 1998, выше; I.Morozov et al,, J. Clin. Microbiol. 36: 2535-2541 (1998)). Была определена полная геномная последовательность PMWS-ассоциированного PCV2 (М.Fenaux et al., J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503 (2000); A.L.Hamel et al., 1998, выше; J. Mankertz et al., 1998, выше; B.M.Meehan et al., 1997, выше; B.M.Meehan et al., 1998, выше; I.Morozov et al., 1998, выше).
Анализы последовательностей показывают, что PMWS-ассоциированный PCV2 имеет только примерно 75%-ную идентичность нуклеотидной последовательности с непатогенным PCV1. Ген ORF2 как непатогенного PCV1, так и патогенного PCV2, кодирует главный иммуногенный вирусный капсидный белок (Р.Nawagitgul et al., Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1: 33-40 (2002); P.Nawagitgul et al., J. Gen. Virol. 81: 2281-2287 (2000)).
Из-за ее потенциального влияния на свиноводство, разработка вакцины против PCV2 приобрела огромную важность. Например, в патенте США №6287856 (Poet et al.) и WO 99/45956 описаны нуклеиновые кислоты из вируса болезни клюва и перьев попугаев (BFDV), цирковируса, который инфицирует птиц, и из свиного цирковируса (PCV). В данном патенте предложены вакцинные композиции, содержащие голую ДНК или мРНК, и описан нуклеиновокислотный вектор для временной экспрессии PCV в эукариотической клетке, содержащей цис-действующую последовательность, регулирующую транскрипцию или трансляцию, производную от энхансера или промотора немедленного или раннего гена человеческого цитомегаловируса, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты.
В патенте США №6217883 (Allan et al.) и французском патенте №2781159 В описано выделение пяти штаммов PCV из образцов легких и ганглиев, взятых от свиней, инфицированных PMWS в Канаде, Калифорнии и Франции (Бретань), и их применение в комбинации с по меньшей мере одним антигеном парвовируса свиней в вакцинной/иммуногенной композициях. Хотя белки, кодируемые открытыми рамками считывания (ORF) PCV2, состоящими из ORF1-ORF13, широко описаны в этом патенте, в нем нет никаких примеров какого-либо конкретного белка, демонстрирующего иммуногенные свойства. В этом патенте дополнительно описаны векторы, состоящие из ДНК-плазмид, линейных молекул ДНК и рекомбинантных вирусов, которые содержат и экспрессируют in vivo молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген PCV.
В некоторых других ссылках, например, патенте США №6391314 В1, патенте США №6368601 В1, французском патенте №2769321, французском патенте №2769322, WO 01/96377 А2, WO 00/01409, WO 99/18214, WO 00/77216 А2, WO 01/16330 А2, WO 99/29871 и т.д., описано введение полипептидов PCV1 или PCV2 или нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды из разных штаммов, в качестве вакцинных композиций.
Цитирование любой ссылки в данной заявке не следует понимать как допущение, что такую ссылку можно использовать в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В его наиболее широком аспекте, в настоящем изобретении предложены выделение и идентификация двух новых штаммов свиных цирковирусов типа 2 (PCV2), каждый из которых можно использовать отдельно или в комбинации для получения вакцинной или иммуногенной композиции для применения в защите свиней против инфекции патогенным PCV2 или для облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS).
Соответственно, согласно первому аспекту изобретения предложен выделенный свиной цирковирус типа 2, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты либо из SEQ ID NO:1 (обозначенную как FD07) либо 2 (обозначенную как FDJE), или геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 95%-ную гомологию последовательности с любой из SEQ ID NO:1 или 2.
В одном из воплощений два вновь идентифицированных и выделенных свиных цирковируса представляют собой свиные цирковирусы типа 2 В (PCV2B).
В одном из воплощений выделенные свиные цирковирусы имеют белок ORF2 с по меньшей мере 92%-ной идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO:3 (из FD07) или 4 (из FDJE).
В одном из воплощений выделенные свиные цирковирусы имеют белок ORF2, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:3 или 4.
Согласно второму аспекту изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая патогенный свиной цирковирус типа 2 В или кодирующая по меньшей мере один белок из указанного цирковируса, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%-ную гомологию последовательности с любой из SEQ ID NO:1 или 2.
В одном из воплощений выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность любой из SEQ ID NO:1 или 2.
В одном из воплощений выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок репликазу ORF 1 из FD07, содержит остатки с номерами 51-995 из SEQ ID NO:5, и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая капсидный белок ORF 2 из FD07, содержит остатки с номерами 1033-1734 из SEQ ID NO:5.
В одном из воплощений выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок репликазу ORF 1 из FDJE, содержит остатки с номерами 51-995 из SEQ ID NO:6, и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая капсидный белок ORF 2 из FDJE, содержит остатки с номерами 1033-1734 из SEQ ID NO:6.
В одном из воплощений выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок ORF2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 или 4.
Согласно третьему аспекту изобретения предложена иммуногенная или вакцинная композиция, содержащая по меньшей мере одно из следующего: по меньшей мере один из выделенных свиных цирковирусов типа 2В, как описано в данной заявке, или их комбинацию; по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из свиных цирковирусов типа 2В, описанных в данной заявке; по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один белок из по меньшей мере одного из свиных цирковирусов типа 2В, описанных в данной заявке; или по меньшей мере один белок, полученный по меньшей мере из одного свиного цирковируса типа 2В, описанного в данной заявке, и фармацевтически приемлемый адъювант.
В одном из воплощений вакцинная или иммуногенная композиция может содержать одно или более чем одно из следующего:
а) живой/аттенуированный или модифицированный живой PCV2B, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2;
б) убитый/инактивированный PCV2B, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2;
в) ДНК-вакцина против PCV2B (например плазмидный вектор, экспрессирующий ORF2 из PCV2B, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2); или
г) инактивированный вирусный вектор (например бакуловирус, аденовирус или поксвирус, такой как поксвирус енота; или бактерия, такая как Е. coli), который экспрессирует ORF2 из PCV2B, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2.
В одном из воплощений вакцинная или иммуногенная композиция, где ген ORF 2 получен из свиного цирковируса типа 2В из SEQ ID NO:1 или 2, может создавать перекрестную защиту против инфекций свиными штаммами типа 2А, типа 2С или типа 2D или любым другим вариантом. Введение такой вакцинной или иммуногенной композиции приводит к защите свиньи против штаммов типа 2А с низкой вирулентностью/низкой смертностью, и также приводит к перекрестной защите против патогенных штаммов свиных цирковирусов типа 2В с высокой вирулентностью/высокой смертностью. Используемую вакцинную или иммуногенную композицию можно вводить в виде одной дозы или в виде многократных доз. Введение приводит к защите свиньи от любого одного или более чем одного симптома или последствия, ассоциированного с синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS). Более того, введение вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей любое вышеуказанное воплощение, также приводит к снижению более высокой, чем средняя, смертности, ассоциированной со штаммами свиного цирковируса типа 2В с высокой вирулентностью/высокой смертностью.
В одном из воплощений иммуногенную или вакцинную композицию, описанную выше, можно использовать для индукции иммунного ответа против свиного цирковируса, или для защиты свиней против инфекции патогенным PCV2, или для облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с этим заболеванием.
В одном из воплощений иммуногенная или вакцинная композиция, описанная выше, дополнительно содержит по меньшей мере один другой микроорганизм или антиген, полученный из указанного микроорганизма, иммунный ответ против которого является желательным. В одном из воплощений иммуногенная или вакцинная композиция, описанная выше, дополнительно содержит по меньшей мере одну другую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один антиген из по меньшей мере одного другого микроорганизма, иммунный ответ против которого является желательным. Другой микроорганизм может быть выбран из группы, состоящей из вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), парвовируса свиней (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropnemoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, бактерий лептоспира, вируса свиного гриппа, антигена Escherichia coli, респираторного коронавируса свиней, ротавируса, патогена, вызывающего болезнь Ауески, патогена, вызывающего трансмиссивный гастроэнтерит свиней, и второго другого штамма свиного цирковируса. Второй другой штамм свиного цирковируса может представлять собой цирковирус типа 2А или типа 2В.
В одном из воплощений иммуногенную или вакцинную композицию вводят с адъювантом или без адъюванта.
В одном из воплощений иммуногенную или вакцинную композицию вводят одной дозой или многократными дозами подкожным, внутримышечным, интраназальным, трансдермальным, внутрипеченочным, внутрилимфоидным путем.
Согласно четвертому аспекту изобретения предложен способ иммунизации свиньи против вирусной инфекции или синдрома послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS) или предупреждения у свиньи PMWS, вызванного штаммом PCV2, или для облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с PMWS, включающий введение указанной свинье иммуногенно эффективного количества композиции, содержащей любое одно или более чем одно из следующего:
а) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного свиного цирковируса типа 2, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2, как описано в данной заявке;
б) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из свиных цирковирусов типа 2 из а);
в) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного белка, выделенного из по меньшей мере одного из свиных цирковирусов типа 2 из а); или
г) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один белок из в).
В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизации или защиты свиней против по меньшей мере одного патогенного штамма свиного цирковируса путем введения вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей нетоксический, физиологически приемлемый носитель и иммуногенно эффективное количество убитого/инактивированного свиного цирковируса типа 2 или живого аттенуированного свиного цирковируса типа 2, как описано в данной заявке, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2. В одном из воплощений способы по изобретению обеспечивают иммунизацию или защиту свиньи против инфекции свиным цирковирусом путем введения вакцинной или иммуногенной композиции, как описано выше, которая дополнительно содержит адъювант.
В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизации или защиты свиньи против патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В путем введения вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей инфекционную нуклеиновую кислоту, кодирующую свиной цирковирус типа 2, как показано в SEQ ID NO:1 или 2, где введение приводит к ослаблению одного или более чем одного симптома инфекции свиным цирковирусом.
В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизации или защиты свиньи против патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В путем введения иммуногенно эффективного количества вакцинной или иммуногенной композиции, где указанная композиция содержит по меньшей мере один белок из свиного цирковируса типа 2, как описано в настоящем изобретении, или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок из свиного цирковируса типа 2 по настоящему изобретению. В одном из воплощений белок из свиного цирковируса типа 2В по настоящему изобретению представляет собой белок ORF2. В одном из воплощений ген ORF-2, кодирующий белок ORF2 из свиных цирковирусов типа 2В по настоящему изобретению, обозначенных как FD07 и FDJE, содержит остатки с номерами 1033-1074 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5 и 6, соответственно, и белок, кодируемый геном ORF-2 из FD07 и FDJE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 или 4, соответственно.
В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизации или защиты свиньи против патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В, включающий введение вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей свиной цирковирус типа 2 или нуклеиновую кислоту, кодирующую свиной цирковирус типа 2, где свиной цирковирус кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1 или 2, их комплементарными цепями или последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 95%-ную гомологию с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.
В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизация или защиты свиньи против патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В путем введения вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один из двух новых свиных цирковирусов типа 2В, или нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один из двух новых свиных цирковирусов типа 2В по настоящему изобретению, или по меньшей мере один белок по меньшей мере из одного из двух штаммов типа 2В по настоящему изобретению, или нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один из этих двух белков, где патогенный штамм свиного цирковируса типа 2 В представляет собой штамм свиного цирковируса, который содержит капсидный белок, кодируемый геном ORF 2, который демонстрирует не менее чем 92%-ную идентичность последовательности с капсидным белком, кодируемым геном ORF 2 из по меньшей мере одного из двух штаммов свиных цирковирусов типа 2В, описанных в настоящем изобретении. Аминокислотные последовательности капсидных белков штаммов свиного цирковируса типа 2В по настоящему изобретению показаны в SEQ ID NO:3 и 4.
В одном из воплощений способы по изобретению обеспечивают иммунизацию или защиту свиньи от инфекции патогенным штаммом свиного цирковируса типа 2В, включающую введение указанной свинье вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей свиной цирковирус типа 2В, или нуклеиновую кислоту, кодирующую свиной цирковирус типа 2В или кодирующую по меньшей мере один белок из указанного свиного цирковируса по настоящему изобретению, где указанное введение приводит к ослаблению одного или более чем одного из следующих клинических симптомов:
уменьшение микроскопических поражений в одной или более чем одной лимфоидной или нелимфоидной ткани свиней, подвергнутых воздействию вирулентной формы свиного цирковируса типа 2В;
уменьшение виремии, ассоциированной с инфекцией свиным цирковирусом;
уменьшение уровня нуклеиновой кислоты типа 2А или типа 2В в одной или более чем одной ткани.
В одном из воплощений способ дополнительно включает введение иммуногенно эффективного количества второй другой иммуногенной композиции перед, в сочетании с или после введения иммуногенной композиции свиного цирковируса типа 2, как описано в данной заявке.
В одном из воплощений вторая другая иммуногенная композиция содержит иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного другого микроорганизма, который является патогенным для свиней, или по меньшей мере Одного антигена, полученного из указанного микроорганизма, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный антиген, где микроорганизм выбран из группы, состоящий из вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), парвовируса свиней (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropnemoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, бактерий лептоспира, вируса свиного гриппа, антигена Escherichia coli, респираторного коронавируса свиней, ротавируса, патогена, вызывающего болезнь Ауески, патогена, вызывающего трансмиссивный гастроэнтерит свиней, и второго другого штамма свиного цирковируса. Второй другой штамм свиного цирковируса может представлять собой цирковирус типа 2А или 2В.
В пятом аспекте изобретения предложен вектор, содержащий по меньшей мере одну экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок из свиного цирковируса типа 2А или типа 2В, где белок свиного цирковируса представляет собой белок ORF2, и где экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный белок, представлена остатками 1033-1734 из SEQ ID NO:5 или 6.
В одном из воплощений вектор представляет собой вектор на основе поксвируса енота, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один белок из свиного цирковируса PCV2A или PCV2B, как описано в данной заявке, или их обоих.
В одном из воплощений вектор дополнительно содержит одну или более чем одну экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген из микроорганизма, который является патогенным для свиней, где указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), парвовируса свиней (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropnemoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, бактерий лептоспира, вируса свиного гриппа, антигена Escherichia coli, респираторного коронавируса свиней, ротавируса, патогена, вызывающего болезнь Ауески, патогена, вызывающего трансмиссивный гастроэнтерит свиней, и второго другого штамма свиного цирковируса.
В шестом аспекте изобретения предложен способ определения того, имеет ли млекопитающее, представляющее собой свинью, синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS) или риск его развития, включающий:
(I) измерение количества нуклеиновой кислоты или белка PCV2, кодируемого указанной нуклеиновой кислотой, в образце ткани, полученном от млекопитающего, где указанная нуклеиновая кислота или белок PCV2 представляет собой:
а) нуклеиновую кислоту, содержащую любую из SEQ ID NO:1, 2, 5 или 6, или нуклеиновую кислоту, происходящую из нее;
б) белок, содержащий любую из SEQ ID NO:3 или 4;
в) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, гибридизующуюся с любой из SEQ ID NO:1, 2, 5 или 6, или их комплементарными последовательностями в условиях высокой жесткости, или белок, содержащий последовательность, кодируемую указанной гибридизующейся последовательностью;
г) нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 95% гомологичную любой из SEQ ID NO:1, 2, 5 или 6 или их комплементарной последовательности, как определено с использованием алгоритма NBLAST; или белок, кодируемый ею; и
(II) сравнение количества указанной нуклеиновой кислоты или белка в образце ткани млекопитающего, у которого подозревают наличие или риск развития PMWS, с количеством нуклеиновой кислоты или белка в образце ткани нормального млекопитающего, или с установленным стандартом для нормального образца ткани, где повышенное количество указанной нуклеиновой кислоты или белка в образце ткани млекопитающего, представляющего собой свинью, имеющего или подозреваемого в наличии PMWS, по сравнению с количеством в образце нормальной ткани или установленным стандартом для образца нормальной ткани указывает на то, что млекопитающее имеет PMWS или риск его развития.
В одном из воплощений способ определения того, имеет ли млекопитающее, представляющее собой свинью, PMWS или риск его развития, обеспечивает измерение количества нуклеиновой кислоты или белка PCV 2 В по изобретению в образце ткани, выбранной из группы, состоящей из пахового поверхностного лимфатического узла, трахеобронхиального лимфатического узла, подчелюстного лимфатического узла, легкого, миндалины, селезенки, печени, почки, цельной крови и клеток крови.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг.1. Полная геномная последовательность свиного цирковируса типа 2 В, обозначенного как FD07 (SEQ ID NO:1).
Фиг.2. Полная геномная последовательность свиного цирковируса типа 2 В, обозначенного как FDJE (SEQ ID NO:2).
Фиг.3. Аминокислотная последовательность капсидного белка ORF2 из PCV2B, обозначенного как FD07 (SEQ ID NO:3).
Фиг.4. Аминокислотная последовательность капсидного белка ORF2 из PCV2B, обозначенного как FDJE (SEQ ID NO:4).
Фиг.5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белки ORF1 и ORF2 из FD07 (SEQ ID NO:5).
Фиг.6. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белки ORF1 и ORF2 из FDJE (SEQ ID NO:6).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Перед тем, как будут описаны способы по настоящему изобретению и методология лечения, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что используемая в данной заявке терминология предназначена только для описания конкретных воплощений и не предназначена быть ограничивающей.
При использовании в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя множественные ссылки, если контекст не указывает ясно на иное. Таким образом, например, ссылки на "способ" включают в себя один или более способов, и/или стадий описанного в данной заявке типа, и/или то, что должно быть очевидным специалисту в данной области при чтении этого описания, и т.д.
Соответственно, в настоящей заявке можно использовать стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК в пределах уровня техники. Такие методы полностью разъяснены в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (в данной заявке "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984));
Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); В. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Хотя на практике или при тестировании данного изобретения можно использовать любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в данной заявке, здесь описаны предпочтительные способы и вещества. Все публикации, упомянутые в данной заявке, включены посредством ссылки во всей своей полноте.
Определения
Термины, используемые в данной заявке, имеют значения, понятные и известные специалистам в данной области, однако для удобства и полноты, конкретные термины и их значения изложены ниже.
Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которое(ая) усиливает иммунный ответ на антиген. Адъювант может служить в качестве тканевого депо, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menio Park, California, p.384). В зависимости от обстоятельств, первичное воздействие антигеном в отдельности, в отсутствие адъюванта, может не вызвать гуморальный или клеточный иммунный ответ. Адъюванты включают в себя, но не ограничиваются ими, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, такие как гидрат окиси алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные для человека адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Предпочтительно, адъювант является фармацевтически приемлемым.
"Антиген" означает молекулу, которая содержит один или более чем один эпитоп, способный стимулировать иммунную систему хозяина для индукции клеточного антиген-специфического иммунного ответа или гуморального антительного ответа, когда антиген представлен в соответствии с настоящим изобретением. В норме эпитоп будет включать в себя примерно 3-15, обычно примерно 5-15 аминокислот. Эпитопы данного белка могут быть идентифицированы с использованием любого числа методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana. Press, Totowa, N. J. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, одновременным синтезом большого числа пептидов на твердых подложках, где эти пептиды соответствуют частям белковой молекулы, и взаимодействием этих пептидов с антителами, пока эти пептиды еще присоединены к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например, в патенте США №4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, которые включены в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Аналогично, конформационные эпитопы легко идентифицируют путем определения пространственной конформации аминокислот, например, рентгеновской кристаллографией и 2-мерным ядерным магнитным резонансом. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше. Более того, для целей настоящего изобретения "антиген" относится к белку, который включает в себя такие модификации, как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по природе, но они могут быть и неконсервативными), относительно нативной последовательности при условии, что белок сохраняет способность вызывать иммунологический ответ. Эти модификации могут быть преднамеренными, как при сайт-направленном мутагенезе, или конкретных синтетических процедурах, или генно-инженерных подходах, или могут быть случайными, как при мутациях у хозяев, которые продуцируют антигены.
Термин "аттенуированный" при использовании в данной заявке описывает, например, "аттенуированный вирус" и тому подобное и относится к микроорганизму, например вирусу, который ограничен в его способности расти и реплицироваться in vitro или in vivo.
Термин "цирковирус" при использовании в данной заявке, если не указано иное, относится к любому штамму цирковируса, который подпадает под семейство Circoviridae. Например, в настоящем изобретении цирковирус является патогенным свиным цирковирусом. В конкретных воплощениях патогенный свиной цирковирус представляет собой штамм свиного цирковируса типа 2А с низкой вирулентностью/низкой смертностью или штамм свиного цирковируса типа 2В с высокой вирулентностью/высокой смертностью.
6
32
"Комплементарный" понимают в его общепринятом значении как идентифицирующий нуклеотид в одной последовательности, который гибридизуется (отжигается) с нуклеотидом в другой последовательности в соответствии с правилом А→Т, U и C→G (и наоборот) и таким образом "соответствует" его партнеру в рамках этого определения. Ферментативная транскрипция имеет измеримые и хорошо известные частоты ошибок (в зависимости от конкретного используемого фермента), таким образом, в пределах транскрипционной точности с использованием описанных в данной заявке вариантов специалист может понять, что надежность ферментативного синтеза комплементарной цепи не является абсолютной и что ампликон не обязательно полностью соответствует в каждом нуклеотиде целевой или матричной РНК. Способами при использовании условий высокой жесткости являются следующие. Предварительную гибридизацию фильтров, содержащих ДНК, осуществляют в течение периода от 8 ч до в течение ночи при 65°С в буфере, состоящем из 6×SSC, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,02% HYP, 0,02% Ficoll, 0,02% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Фильтры гибридизуют в течение 48 ч при 65°С в смеси для предварительной гибридизации, содержащий 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося (5-20)×10 имп/мин Р-меченого зонда. Промывку фильтров осуществляют при 37°С в течение 1 ч в растворе, содержащем 2×SSC, 0,01% HYP, 0,01% Ficoll и 0,01% BSA. За этим следует промывка в 0,1×SSC при 50°С в течение 45 мин перед авторадиографией. Другие условия высокой жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; см. также, Ausubel et al., eds., в серии руководств по лабораторным методам Current Protocols in Molecular Biology, 1987-1997 Current Protocols,© 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).
Надо отметить, что в данном описании такие термины, как "включает", "включал в себя", "включающий", "содержит", "содержащий" и тому подобные, могут иметь значение, приписанное им в патентном законодательстве США; например, они могут означать "включает в себя", "включен", "включающий в себя" и тому подобное. Такие термины как "состоящий по существу из" и "состоит по существу из" имеют значение, приписанное им в патентном законодательства США, например, они позволяют включать дополнительные ингредиенты или стадии, которые не отклоняются от новых или основных характеристик данного изобретения, т.е. они исключают дополнительные не перечисленные ингредиенты или стадии, которые отклоняются от новых или основных характеристик данного изобретения, и они исключают ингредиенты или стадии из предшествующего уровня техники, такие как документы в данной области, которые процитированы в данной заявке или включены в данную заявку посредством ссылки, особенно поскольку цель данного документа состоит в определении воплощений, которые являются патентоспособными, например новыми, неочевидными, изобретательскими относительно предшествующего уровня техники, например документов, которые процитированы в данной заявке или включены в данную заявку посредством ссылки. И термины "состоит из" и "состоящий из" имеют значение, приписанное им в патентном законодательства США; а именно, эти термины являются ограничивающими.
"Кодируемый" или "кодирующий" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептидную последовательность, где эта полипептидная последовательность содержит аминокислотную последовательность из по меньшей мере 3-5 аминокислот, более предпочтительно из по меньшей мере 8-10 аминокислот, и еще более предпочтительно из по меньшей мере 15-20 аминокислот, полипептид, кодируемый последовательностями нуклеиновой кислоты. Также охвачены полипептидные последовательности, которые являются иммунологически идентифицируемыми с полипептидом, кодируемым данной последовательностью. Таким образом, антигенный "полипептид", "белок" или "аминокислотная" последовательность может иметь по меньшей мере 70% Сходства, предпочтительно по меньшей мере примерно 80% сходства, более предпочтительно примерно 90-95% сходства и наиболее предпочтительно примерно 99% сходства с полипептидом или аминокислотной последовательностью антигена.
"Ген" при использовании в контексте настоящего изобретения представляет собой последовательность нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты (хромосоме, плазмиде и т.д.), с которой ассоциирована генетическая функция. Ген представляет собой наследственную единицу, например, организма, содержащую полинуклеотидную последовательность (например последовательность ДНК для млекопитающих), которая занимает специфическое физическое местоположение ("генный локус" или "генетический локус") в геноме организма. Ген может кодировать экспрессирующийся продукт, такой как полипептид или полинуклеотид (например, тРНК). Альтернативно, ген может определять геномное расположение конкретного(ой) события/функции, такого(ой) как связывание белков и/или нуклеиновых кислот (например, сайты присоединения фага), где ген не кодирует экспрессирующийся продукт. В типичных случаях ген включает в себя кодирующие последовательности, такие как полипептид-кодирующие последовательности, и некодирующие последовательности, такие как промоторные последовательности, последовательности полиаденилирования, последовательности регуляции транскрипции (например энхансерные последовательности). Многие эукариотические гены имеют "экзоны" (кодирующие последовательности), прерываемые "интронами" (некодирующими последовательностями). В некоторых случаях ген может иметь общие последовательности с другим(и) геном(ами) (например, перекрывающимися генами).
Таким образом, "гомология", или "идентичность", или "сходство" Относится к сходству последовательности между двумя пептидами или между двумя молекулами нуклеиновой кислоты. Гомология может быть определена путем сравнения положения в каждой последовательности, которое можно выровнять для целей сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято тем же основанием или той же аминокислотой, то молекулы являются идентичными по этому положению. Степень гомологии или сходства или идентичности между последовательностями нуклеиновой кислоты представляет собой функцию числа идентичных или соответствующих нуклеотидов в положениях, общих для последовательностей нуклеиновой кислоты. Степень идентичности аминокислотных последовательностей представляет собой функцию числа идентичных аминокислот в положениях, общих для аминокислотных последовательностей. Степень гомологии или сходства аминокислотных последовательностей представляет собой функцию числа аминокислот, то есть структурно родственных, в положениях, общих для аминокислотных последовательностей. "Неродственные" или "негомологичные" последовательности имеют менее 40% идентичности, хотя предпочтительным является менее 25% идентичности, с одной из последовательностей по настоящему изобретению. Поэтому "гомолог" свиного цирковируса или его фрагмента должен иметь по меньшей мере примерно 75% гомология со свиным цирковирусом или его фрагментом (предпочтительно примерно 80% гомологии, более предпочтительно примерно 90-95% гомологии и наиболее предпочтительно примерно 99% гомологии).
+
+
+
+
"Иммунный ответ" на вакцинную или иммуногенную композицию представляет собой развитие у субъекта гуморального и/или клеточно-опосредованного иммунного ответа на молекулы, присутствующие в антигенной или вакцинной композиции, представляющей интерес. Для целей настоящего изобретения, "гуморальный иммунный ответ" представляет собой антитело-опосредованный иммунный ответ и включает генерирование антител с аффинностью к антигену/вакцине по изобретению, тогда как "клеточно-опосредованный иммунный ответ" представляет собой ответ, опосредованный Т-лимфоцитами и/или другими белыми клетками крови. "Клеточно-опосредованный иммунный ответ" вызывается путем представления антигенных эпитопов в ассоциации с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса 1 или класса II. Оно активирует антиген-специфические CD4 Т-хелперные клетки или CD8 цитотоксические Т-лимфоцитарные клетки ("CTL"). CTL обладают специфичностью к пептидным антигенам, которые представлены в ассоциации с белками, кодируемыми главным комплексом гистосовместимости (МНС) и экспрессирующимися на поверхностях клеток. CTL помогают индуцировать и стимулировать внутриклеточное разрушение внутриклеточных микробов или лизис клеток, инфицированных такими микробами. Другой аспект клеточного иммунитета включает в себя антиген-специфический ответ хелперных Т-клеток. Хелперные Т-клетки действуют, помогая стимулировать функцию и фокусировать активность неспецифических эффекторных клеток против клеток, экспонирующих пептидные антигены в ассоциации с молекулами МНС на их поверхности. "Клеточно-опосредованный иммунный ответ" также относится к продукции цитокинов, хемокинов и других таких молекул, продуцируемых активированными Т-клетками и/или другими белыми клетками крови, в том числе происходящими из CD4 и CD8Т-клеток. Способность конкретного антигена или композиции стимулировать клеточно-опосредованный иммунологический ответ может быть определена различными анализами, такими как анализы лимфопролиферации (активации лимфоцитов), анализы цитотоксических клеток CTL, анализы Т-лимфоцитов, специфичных к антигену у сенсибилизированного субъекта или путем измерения продукции цитокинов Т-клетками в ответ на повторную стимуляцию антигеном. Такие анализы хорошо известны в данной области. См., например, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe et al, Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376.
10
50
10
50
Термин "иммуногенный" относится к способности антигена или вакцины вызывать иммунный ответ, либо гуморальный, либо клеточно-опосредованный, либо и тот и другой. "Иммуногенно эффективное количество" при использовании в данной заявке относится к количеству антигена или вакцины, достаточному для того, чтобы вызвать иммунный ответ, либо клеточный (Т-клеточный), либо гуморальный (В-клеточный или антительный) ответ, либо и тот и другой, как измерено стандартными анализами, известными специалисту в данной области. Эффективность антигена в качестве иммуногена может быть измерена либо анализами пролиферации, либо цитолитическими анализами, такими как анализы высвобождения хрома для измерения способности Т-клетки лизировать ее специфическую целевую клетку, либо измерением уровней активности В-клеток путем измерения уровней циркулирующих антител, специфичных к антигену, в сыворотке. Более того, уровень защиты иммунного ответа можно измерять путем воздействия на иммунизированного хозяина антигеном, который был инъецирован. Например, если антигеном, к которому желателен иммунный ответ, является вирус или опухолевая клетка, то уровень защиты, индуцированный "иммуногенно эффективным количеством" антигена, измеряют путем определения процента выживаемости или процента смертности после воздействия вируса или опухолевой клетки на животных. В одном из воплощений "иммуногенно эффективное количество" вакцинной или иммуногенной композиции относится к титру вирусных частиц в диапазоне от примерно 1 до 7 Log вирусных частиц/мл при измерении способом FAID (King et al., Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29: 85-89 (1965) и патент США номер 4824785). В одном из воплощений "иммуногенно эффективное количество" вакцинной или иммуногенной композиции представляет собой титр вирусных частиц в диапазоне от примерно 2 до 5 Log вирусных частиц/мл при измерении способом FAID (King et al., Journal of Comparative Medicine and Vet. Science, 29: 85-89 (1965) и Патент США номер 4824785). В одном из воплощений "иммуногенно эффективное количество" инфекционной ДНК-вакцины или иммуногенной композиции может варьировать от примерно 50 до 5000 мкг. В одном из воплощений "иммуногенно эффективное количество" инфекционной ДНК-вакцины или иммуногенной композиции может варьировать от примерно 50 до 1000 мкг. В некоторых воплощениях термин "примерно" означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5%.
Термин "иммуногенная композиция" относится к любой фармацевтической композиции, содержащей антиген, например микроорганизм, которую можно использовать для того, чтобы вызывать иммунный ответ у млекопитающего. Иммунный ответ может включать в себя Т-клеточный ответ, В-клеточный ответ или и Т-клеточный, и В-клеточный ответ. Композиция может служить для сенсибилизации млекопитающего путем представления антигена в ассоциации с молекулами МНС на поверхности клетки. Кроме того, антиген-специфические Т-лимфоциты или антитела можно генерировать для обеспечения будущей защиты иммунизированного хозяина. "Иммуногенная композиция" может содержать живую, аттенуированную или убитую/инактивированную вакцину, содержащую цельный микроорганизм или иммуногенную часть, происходящую из него, который(ая) индуцирует либо клеточно-опосредованный (Т-клеточный) иммунный ответ, либо антитело-опосредованный (В-клеточный) иммунный ответ, либо и тот и другой, и может защищать животное от одного или более симптомов, ассоциированных с инфекцией микроорганизмом, или может защищать животное от гибели из-за инфекции микроорганизмом.
"Иммуногенный ORF" или "иммуногенный ORF" относится к открытой рамке считывания, которая вызывает иммунный ответ, например, ORF2 кодирует иммуногенный капсидный белок.
Вакцины и иммуногенные композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или более дополнительных "иммуномодуляторов", которые представляют собой агенты, которые возмущают или изменяют иммунную систему, так что наблюдается либо повышающая регуляция, либо понижающая регуляция гуморального и/или клеточно-опосредованного иммунитета. В одном конкретном воплощении предпочтительной является повышающая регуляция гуморального и/или клеточно-опосредованного звеньев иммунной системы. Примеры некоторых иммуномодуляторов включают в себя, например, "фармацевтически приемлемый адъювант" или цитокин, среди прочих. Неограничивающие примеры "фармацевтически приемлемых адъювантов", которые могут быть использованы в вакцине по настоящему изобретению, включают в себя адъювантную систему RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), квасцы, минеральные гели, такие как гель гидрата окиси алюминия, эмульсии типа масло-в-воде, эмульсии типа вода-в-масле, такие как, например, полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN, сапонин, Quil А или другая сапониновая фракция, монофосфориллипид А и липид-аминный адъювант Avridine. Неограничивающие примеры эмульсий типа масло-в-воде, полезные в вакцине по изобретению, включают в себя модифицированные препараты SEAM62 и SEAM 1/2. Модифицированный SEAM62 представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, содержащую 5% (об./об.) сквалена (Sigma), 1% (об./об.) детергента SPAN 85 (ICI Surfactants), 0,7% (об./об.) детергента TWEEN 80 (ICI Surfactants), 2,5% (об./об.) этанола, 200 мкг/мл Quil A, 100 мкг/мл холестерина и 0,5% (об./об.) лецитина. Модифицированный SEAM 1/2 представляет собой эмульсию типа масло-в-воде, содержащую 5% (об./об.) сквалена, 1% (об./об.) детергента SPAN 85, 0,7% (об./об.) детергента Tween 80, 2,5% (об./об.) этанола, 100 мкг/мл Quil А и 50 мкг/мл холестерина. Другие "иммуномодуляторы", которые могут быть включены в вакцину, включают в себя, например, один или более интерлейкинов, интерферонов или других известных цитокинов. В одном из воплощений адъювант может представлять собой производное циклодекстрина или полианионный полимер, такой как описанные в патентах США номера 6165995 и 6610310 соответственно.
Термин "инфекционный" означает, что вирус реплицируется или способен реплицироваться у свиней независимо от того, вызывает ли он какое-либо заболевание или нет. В настоящем изобретении в качестве примера "инфекционной" ДНК показана ДНК PCV2 из SEQ ID NO:1 или 2.
Термин "выделенный" или "очищенный" означает, что вещество удалено из его исходного окружения (например, природного окружения, если оно встречается в природе). Например, "выделенный" или "очищенный" пептид или белок является по существу свободным от клеточного материала или других примесных белков из клеточного или тканевого источника, из которого происходит белок, или по существу свободным от химических предшественников или других химических реагентов при химическом синтезе. Выражение "по существу свободный от клеточного материала" включает в себя препараты полипептида/белка, в которых полипептид/белок отделен от клеточных компонентов клеток, из которых он выделен или получен рекомбинантным способом. Таким образом, полипептид/белок, который является по существу свободным от клеточного материала, включает в себя препараты полипептида/белка, имеющие менее примерно 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% или 1% (по сухой массе) примесного белка. Когда полипептид/белок получен рекомбинантным способом, тогда он также предпочтительно является по существу свободным от культуральной среды, то есть культуральная среда составляет менее примерно 20%, 10% или 5% от объема белкового препарата. Когда полипептид/белок получают химическим синтезом, тогда он предпочтительно является по существу свободным от химических предшественников или других химических агентов, то есть он отделен от химических предшественников или других химических агентов, которые вовлечены в синтез белка. Соответственно, такие препараты полипептида/белка имеют менее чем примерно 30%, 20%, 10%, 5% (по сухой массе) химических предшественников или иных соединений, чем полипептид/фрагмент белка, представляющего интерес. "Выделенная" или "очищенная" молекула нуклеиновой кислоты является молекулой, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, которые присутствует в натуральном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. Более того, "выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК или молекула РНК, может быть по существу свободной от другого клеточного материала или культуральной среды, когда она получена рекомбинантными методами, или по существу свободной от химических предшественников или других химических агентов, когда она синтезирована химическим путем.
Термины "убитый" или "инактивированный" использованы в данной заявке взаимозаменяемым образом и относятся к значительному или полному снижению инфекционности вируса(ов), используемого(ых) для получения вакцинных композиций. Киллинг или инактивацию вирусов можно оценивать в соответствии с любым способом, известным специалистам в данной области, например, способами молекулярной биологии (ПЦР), способами титрования вирусного титра, флуоресценцией, иммунологическими способами (ELISA, RIA и тому подобные), где иммуноферментные способы позволяют детектировать один или более вирусных полипептидов (Вестерн и тому подобное). Было использовано множество различных инактивирующих агентов и средств, в том числе формалин, азид, замораживание-оттаивание, обработка ультразвуком, обработка нагреванием, резкое падение давления, детергент (особенно неионные детергенты), лизоцим, фенол, протеолитические ферменты и бета-пропиолактон.
Термин "лимфоидная ткань" относится к любой ткани, которая обогащена лимфоцитами и вспомогательными клетками, такими как макрофаги и ретикулярные клетки, и поддерживается сетью соединительной ткани. Лимфоидная ткань включает в себя костный мозг, тимус, лимфатические узлы, селезенку, миндалины, аденоиды, Пейеровы бляшки и агрегаты лимфоцитов на слизистых поверхностях. "Нелимфоидная" ткань относится к любой другой ткани, которая не обогащена лимфоцитами и вспомогательными клетками, как определено в данной заявке.
При использовании в данной заявке фраза "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты" относится к ДНК, РНК, а также к любому из известных аналогов оснований ДНК и РНК или химерам, образованным из них. Таким образом, "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты" относится к фосфат-сложноэфирной полимерной форме рибонуклеозидов (аденозин, гуанозин, уридин или цитидин; "молекулы РНК") или дезоксирибонуклеозидов (дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезокситимидин или дезоксицитидин; "молекулы ДНК") либо в одноцепочечной форме, либо в двухцепочечной спирали. Возможны двухцепочечные спирали ДНК-ДНК, ДНК-РНК и РНК-РНК. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" и, в частности, молекула ДНК или РНК относится только к первичной и вторичной структуре молекулы и не ограничивает ее какой-либо конкретной третичной формой. Таким образом, этот термин включает в себя двухцепочечную ДНК, найденную, среди прочего, в линейных или кольцевых молекулах ДНК (например, рестрикционных фрагментах), плазмидах и хромосомах. При обсуждении структуры конкретных двухцепочечных молекул ДНК в данной заявке могут быть описаны последовательности в соответствии с нормальным условием указания только последовательности в направлении от 5N к 3N вдоль нетранскрибируемой цепи ДНК (то есть цепи, имеющей последовательность, гомологичную мРНК). "Рекомбинантная молекула ДНК" представляет собой молекулу ДНК, которая была подвергнута молекулярно-биологической манипуляции.
"Нуклеотид" относится к субъединице ДНК или РНК, состоящей из азотистых оснований (аденин, гуанин, цитозин и тимин), молекулы фосфата и молекулы сахара (дезоксирибоза в ДНК и рибоза в РНК).
Термин "открытая рамка считывания", или "ORF", или "ORF" при использовании в данной заявке относится к минимальной нуклеотидной последовательности, необходимой для кодирования конкретного белка или антигена цирковируса без промежуточного стоп-кодона.
Термин "парентеральный" относится к веществу, поступающему в организм или вводимому иначе, чем через пищеварительный тракт, например, посредством внутривенной или внутримышечной инъекции.
Термин "патогенный" относится к способности любого инфекционного агента, такого как бактерия или вирус, вызывать заболевание. В настоящем изобретении термин "патогенный" относится к способности свиного цирковируса, в частности, свиного цирковируса типа 2 вызывать у свиней заболевание, обозначаемое как "синдром послеотъемного мультисистемного истощения" ("post-weaning multisystem wasting syndrome") или "PMWS". Это заболевание часто характеризуется истощением или плохим состоянием поросят-отъемышей и умеренными до тяжелых лимфоидными поражениями с лимфоидным истощением и гистиоцитарной заменой фолликулов в лимфоидных тканях. Также известно, что свиньи, страдающие от PMWS, имеют респираторное заболевание, например, интерстициальную пневмонию, лимфогистиоцитарный гепатит и лимфогистиоцитарный интерстициальный нефрит. Другие состояния, ассоциированные с "патогенным" свиным цирковирусом типа 2, включают в себя спорадическую репродуктивную недостаточность, энтерит и синдром дерматита и нефропатии свиней (PDNS). "Непатогенный" микроорганизм относится к микроорганизму, который не имеет характеристик, указанных выше для "патогенных" штаммов свиного цирковируса. "Непатогенный" свиной цирковирус обычно обозначают как свиной цирковирус типа 1. "Патогенные" штаммы свиного цирковируса обычно обозначают как свиные цирковирусы типа 2. "Непатогенный" свиной цирковирус обычно обозначают как свиной цирковирус типа 1.
Таким образом, термин "процент идентичности" или "процент идентичности последовательности" относится к идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями. Могут быть использованы различные алгоритмы и/или программы выравнивания, включая FASTA, BLAST или ENTREZ. FASTA и BLAST доступны в качестве части пакета для анализа последовательностей GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.), и их можно использовать, например, с настройками по умолчанию. ENTREZ доступна через National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, Md. В одном из воплощений процент идентичности двух последовательностей можно определять с помощью программы GCG с массой бреши 1, например, каждая аминокислотная брешь взвешивается так, как если бы она представляла собой единственное аминокислотное или нуклеотидное несоответствие между двумя последовательностями.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель, одобренный руководящим органом правительства федерации или штата или другим руководящим органом или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных, включая людей, а также млекопитающих, не представляющих собой людей. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю с которым вводят фармацевтическую композицию. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе минерального, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, особенно для инъецируемых растворов Подходящие фармацевтические эксципиенты включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция, если Желательно, может также содержать небольшие количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или рН-буферных агентов. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсии, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов замедленного высвобождения и тому подобных. Композицию можно приготавливать в виде суппозитория с традиционными связующими агентами и носителями, такими как триглицериды. Пероральный препарат может включать в себя стандартные носители, такие как фармацевтические марки маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей раскрыты в "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W.Martin. Препарат должен соответствовать способу введения.
"Полинуклеотид" представляет собой полимер нуклеиновой кислоты, который в типичных случаях кодирует биологически активный (например иммуногенный) белок или полипептид. В зависимости от природы полипептида, кодируемого полинуклеотидом, полинуклеотид может включать в себя до 10 нуклеотидов, например, если полинуклеотид кодирует антиген. Более того, "полинуклеотид" может включать в себя как двух-, так и одноцепочечные последовательности и относится, но не ограничивается этим, к кДНК для вирусной, прокариотической или эукариотической мРНК, к последовательностям геномной РНК и ДНК из вирусной (например РНК и ДНК вирусов и ретровирусов) или прокариотической ДНК, а также к синтетическим последовательностям ДНК. Этот термин также охватывает последовательности, которые включают в себя любые известные аналоги оснований ДНК и РНК. Этот термин дополнительно включает в себя модификации, такие как делеции, добавления и замены (например, метилирование или кэппинг), относительно нативной последовательности, предпочтительно такие, что молекула нуклеиновой кислоты кодирует, например, антигенный белок. Эти модификации могут быть преднамеренными, как при сайт-направленном мутагенезе, или при конкретных синтетических способах, или при генно-инженерных подходах, или могут быть случайными, как при мутациях у хозяев, которые продуцируют антигены. Термины "олигонуклеотид" или "олиго" используют в данной заявке взаимозаменяемым образом.
Термины "свиной" и "свинья" использованы взаимозаменяемым образом и относятся к любому животному, которое является членом семейства Suidae, такому как, например, Свинья.
Термин "осуществление защиты" относится защите, например млекопитающего, в частности свиньи, от инфекции или заболевания путем индуцирования иммунного ответа на конкретный патоген, например цирковирус. Такую защиту обычно осуществляют после лечения млекопитающего вакцинной композицией, описанной в данной заявке.
Термины "белок", "полипептид" и "пептид" относятся к полимеру аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной продукта. Таким образом, в это определение включены пептиды, олигопептиды, димеры, мультимеры и тому подобное. Этим определением охвачены как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Эти термины также включают в себя модификации, такие как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по природе, но которые могут быть и неконсервативными) относительно нативной последовательности, предпочтительно такие, что белок сохраняет способность вызывать иммунологический ответ у животного, которому вводят этот белок. Также включены постэкспрессионные модификации, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и тому подобное.
При использовании в данной заявке термин "гомология последовательностей" во всех его грамматических формах относится к сходству между белками, которые имеют общее эволюционное происхождение, включая гомологичные белки из разных видов (Reeck et al., 1987, Cell 50: 667).
Две последовательности ДНК являются "по существу гомологичными" или "по существу сходными", когда по меньшей мере примерно 75% (предпочтительно по меньшей мере примерно 80% и более предпочтительно по меньшей мере примерно 90 или 95%, и наиболее предпочтительно примерно 99%) нуклеотидов совместимы на протяжении определенной длины последовательностей ДНК. Последовательности, которые являются по существу гомологичными, могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей при использовании стандартных программ, доступных в банках данных о последовательностях, или в эксперименте по Саузерн-гибридизации, например, в жестких условиях, как определено для конкретной системы. Определение подходящих условий гибридизации находится в пределах квалификации в данной области. См., например, Maniatis et al., выше; DNA Cloning, Vols. I & II, выше; Nucleic Acid Hybridization, выше.
Аналогично, две аминокислотные последовательности являются "по существу гомологичными" или "по существу сходными", когда более 70% аминокислот являются идентичными или функционально идентичными. Предпочтительно, сходные или гомологичные последовательности идентифицируют путем выравнивания с использованием, например, набора программ GCG (Genetic Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin).
При использовании в данной заявке "лечение" (включая его вариации, например, "лечить" или "подвергающийся лечению") относится к любому одному или более чем одному из следующего: (1) предупреждение инфекции или повторной инфекции, как в случае традиционной вакцины, (2) снижение тяжести или устранение симптомов и (3) существенное или полное устранение интересующего патогена или расстройства. Поэтому лечение можно осуществлять профилактически (до инфекции) или терапевтически (после инфекции). В настоящем изобретении профилактическое лечение является предпочтительным. В соответствии с конкретным воплощением настоящего изобретения предложены композиции и способы, которые лечат, в том числе профилактически и/или терапевтически иммунизируют, животного-хозяина против вирусной инфекции. Способы по настоящему изобретению являются полезными для придания профилактического и/или терапевтического иммунитета млекопитающему, предпочтительно свинье. Способы по настоящему изобретению можно также практиковать на млекопитающих для биомедицинских исследовательских целей.
Термины "вакцина" или "вакцинная композиция", которые используются взаимозаменяемым образом, относятся к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одну иммуногенную композицию, которая индуцирует иммунный ответ у животного. Вакцина или вакцинная композиция может защищать животное от заболевания или возможной гибели вследствие инфекции и может или не может включать в себя один или более дополнительных компонентов, которые усиливают иммунологическую активность активного компонента. Вакцина или вакцинная композиция может дополнительно содержать дополнительные компоненты, типичные для фармацевтических композиций. Вакцина или вакцинная композиция может дополнительно содержать дополнительные компоненты, типичные для вакцин или вакцинных композиций, включая, например, адъювант или иммуномодулятор. Иммуногенно активный компонент вакцины может содержать цельные живые организмы либо в их исходной форме, либо в виде аттенуированных организмов в модифицированной живой вакцине, или организмы, инактивированные подходящими способами, в убитой или инактивированной вакцине, или субъединичные вакцины, содержащие один или более иммуногенных компонентов вируса, или генно-инженерные, мутированные или клонированные вакцины, полученные способами, известными специалистам в данной области. Вакцина может содержать один или одновременно более чем один элемент, описанный выше. В настоящем изобретении вакцинные композиции включают в себя, но не ограничивается этим, живые, аттенуированные или убитые/инактивированные формы цельных химерных свиных цирковирусов, инфекционные нуклеиновые кислоты, кодирующие химерные свиные цирковирусы, или другие инфекционные ДНК-вакцины, включая плазмиды, векторы или другие носители для прямого введения ДНК свиньям.
Общее описание
Из-за ее потенциального влияния на свиноводство разработка вакцины против патогенных форм свиного цирковируса типа 2 (PCV2) представляет собой большую важность. Полагают, что непатогенный PCV1 будет иметь ограниченное применение против PCV2-инфекций.
Более того, возникли новые вирулентные штаммы PCV2, которые характеризуются, в частности, более высоким, чем средний, уровнем смертности. Эти патогенные штаммы PCV2 с высокой вирулентностью/высокой смертностью обозначены как PCV2B, тогда как патогенные штаммы с низкой вирулентностью и низкой смертностью обозначены как PCV2A. Недавно предложенная альтернативная номенклатура для этих двух штаммов обозначает штамм PCV2 как "Генотип II" или "ПДРФ 422", тогда как штамм PCV2B обозначен как "Генотип I" или "ПДРФ 321". Хотя некоторые из ранее описанных вакцинных композиций могут оказаться эффективными против патогенных штаммов PCV2A со сниженной смертностью и меньшей вирулентностью, ни одна из них не продемонстрировала, что является эффективной против патогенных штаммов PCV2B с высокой вирулентностью, характеризующихся, в частности, более высокими, чем средний, уровнями смертности.
С учетом тяжести инфекций и большего, чем средний, уровня смертности, ассоциированных с этими сильно вирулентными патогенными штаммами PCV2B свиного цирковируса, было бы выгодно идентифицировать, выделить и использовать один или более этих штаммов для получения иммуногенной или вакцинной композиции для иммунизации и защиты свиней против синдрома послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS).
Именно на идентификацию и выделение таких штаммов PCV2B направлено настоящее изобретение.
В одном из воплощений вновь идентифицированный и выделенный свиной цирковирус представляет собой штамм типа 2 В, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в любой из SEQ ID NO:1 или 2. В одном из воплощений выделенный свиной цирковирус представляет собой штамм типа 2 В, имеющий последовательность нуклеиновой кислоты, которая имеет по меньшей мере примерно 95%-ную гомологию последовательности с любой из SEQ ID NO:1 или 2. В одном из воплощений белок ORF2 вновь идентифицированных и выделенных свиных цирковирусов типа 2 В имеет по меньшей мере 92%-ную идентичность последовательности с любой из SEQ ID NO:3 или 4.
В одном из воплощений настоящего изобретения предложены способы иммунизации свиньи против патогенного свиного цирковируса типа 2А или 2В (PCV2), включающие введение иммуногенно эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей свиной цирковирус, кодируемый нуклеиновыми кислотами по настоящему изобретению.
В частности, способы по настоящему изобретению обеспечивают применение вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей одно или более чем одно из следующего:
а) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного из свиных цирковирусов типа 2, как описано в данной заявке, либо в аттенуированной, либо в инактивированной/убитой форме;
б) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из свиных цирковирусов типа 2 из а);
в) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного белка, выделенного из по меньшей мере одного из свиных цирковирусов типа 2 из а); или
г) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один белок из в).
В одном из воплощений вакцинная или иммуногенная композиция может содержать ДНК-вакцину против PCV2B (например плазмидный вектор, экспрессирующий ORF2 из PCV2B). В одном из воплощений вакцинная или иммуногенная композиция может содержать инактивированный вирусный вектор (например бакуловирус, аденовирус или поксвирус, такой как поксвирус енота; или бактерию, такую как Е. coli), который экспрессирует ORF2 из PCV2B.
Также предполагается, что вакцинная или иммуногенная композиции, как описано в данной заявке, является эффективной для предупреждения одного или более симптомов, ассоциированных с синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS). Эти симптомы могут включать в себя, например, одно или более чем одно из следующего: респираторное заболевание, микроскопические патологические изменения в одной(м) или более тканях или органах, гистиоцитарное воспаление или лимфоидное истощение.
Более того, вакцины или иммуногенные композиции, описанные в данной заявке, могут быть использованы со второй или третьей вакцинной или иммуногенной композицией, которая защищает свиней против одного или более патогенных свиных вирусов или бактерий, включая: вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), парвовирус свиней (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropnemoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, бактерии лептоспира, вирус свиного гриппа, антиген Escherichia coli, респираторный коронавирус свиней, ротавирус, патоген, вызывающий болезнь Ауески, и патоген, вызывающий трансмиссивный гастроэнтерит свиней. Например, в одном из воплощений вакцинную или иммуногенную композицию против PCV можно объединить с вакцинной или иммуногенной композицией против вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS). В одном из воплощений вакцинную или иммуногенную композицию против PCV можно объединить с вакцинной или иммуногенной композицией против Mycoplasma hyopneumoniae. В одном из воплощений вакцинную или иммуногенную композицию против PCV можно объединить с вакцинной или иммуногенной композицией против Mycoplasma hyopneumoniae и вакцинной или иммуногенной композицией против вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS).
Применение вакцин и иммуногенных композиций против PCV1-2
В настоящем изобретении предложены идентификация и выделение двух новых патогенных свиных цирковирусов PCV2B. С учетом необходимости в вакцинной или иммуногенной композиции для введения свиньям для предупреждения PMWS, вызванного патогенным штаммом свиного цирковируса, или для облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с этим заболеванием у свиней, предполагается, что по меньшей мере один из этих двух новых штаммов, или по меньшей мере одна из нуклеиновых кислот, кодирующих эти два новых штамма, или по меньшей мере один из белков, полученных из по меньшей мере одного из этих штаммов, можно приготавливать в виде вакцинной или иммуногенной композиции для доставки свинье с целью иммунизации указанной свиньи против данного заболевания, таким образом обеспечивая защиту свиней против вирусной инфекции и синдрома послеотьемного мультисистемного истощения (PMWS).
Вакцинную или иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один из вновь идентифицированных и выделенных свиных цирковирусов PCV2B, предложенных в настоящем исследовании для применения в качестве иммуногенной или вакцинной композиции, получают с использованием описанных в данной заявке способов.
Нуклеиновые кислоты по изобретению
Очищенные и выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют полноразмерный патогенный свиной цирковирус типа 2В, как описано в данной заявке, представлены в SEQ ID NO:1 и 2. Стандартные способы, которые хорошо известны в данной области, могут быть использованы для получения комплементарных цепей или нуклеотидных последовательностей, обладающих высокой гомологией, например, признанными в данной области методами гибридизации, стандартными или высокой жесткости. Очищенная и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность ДНК иммуногенного капсидного гена ДНК PCV2, представлена остатками 1033-1734 в SEQ ID NO 5 и 6.
Соответственно, любая подходящая животная клетка, содержащая описанную в данной заявке молекулу нуклеиновой кислоты PCV2B, может продуцировать живые, инфекционные свиные цирковирусы. Живой инфекционный вирус получают из клона ДНК путем трансфицирования, например, клеток РК-15, in vitro или in vivo. Как отмечено выше, один пример ДНК PCV2 представляет собой нуклеотидную последовательность, указанную в SEQ ID NO:1 и 2. Это изобретение дополнительно предусматривает, что вирус может быть получен из комплементарной цепи или нуклеотидной последовательности, имеющей высокую гомологию, по меньшей мере 80% и более предпочтительно гомологию 95-99% с этой нуклеотидной последовательностью.
Также в объем настоящего изобретения включены биологически функциональные плазмиды, вирусные векторы и тому подобное, которые содержат молекулы нуклеиновой кислоты, описанные в данной заявке, подходящие клетки-хозяева, трансфицированные векторами, содержащими клоны ДНК и иммуногенные полипептидные продукты экспрессии. В одном из воплощений иммуногенный белок представляет собой капсидный белок, кодируемый ORF2 из патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В, как описано в данной заявке. Аминокислотная последовательность этого капсидного белка в свином цирковирусе представлена в SEQ ID NO:3 и 4. Его биологически активные варианты дополнительно охвачены данным изобретением. Средний специалист в данной области обычно знает, как модифицировать, заменять, делегировать и т.д. аминокислоту(ы) из полипептидной последовательности и получать биологически активные варианты, которые сохраняют ту же или по существу ту же активность, что и исходная последовательность, без лишних усилий.
Для получения иммуногенных полипептидных продуктов по изобретению способ может включать следующие стадии: выращивание, в подходящих условиях по питательным веществам, прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, трансфицированных молекулами нуклеиновой кислоты, описанными в данной заявке, таким способом, который обеспечивает экспрессию полипептидных продуктов, и выделение желаемых полипептидных продуктов стандартными способами, известными в данной области. Предполагается, что иммуногенные белки могут быть получены другими способами, такими как, например, биохимический синтез и тому подобное.
Вакцины и иммуногенные композиции
Получение вакцин или иммуногенных композиций, содержащих патогенные вирусы PCV2B, как описано в данной заявке, и способы их применения для защиты свиней от инфекции патогенными штаммами свиного цирковируса и PMWS, также включены в объем настоящего изобретения. Предполагают, что новые изоляты PCV2B могут быть использованы в виде убитого/инактивированного препарата, или могут быть аттенуированы или генетически модифицированы для применения с целью иммунизации свиней против вирусной инфекции и PMWS. Соответственно, в настоящем изобретении предложены способы иммунизации свиней против инфекции патогенным цирковирусом или против PMWS с использованием иммуногенно эффективного количества вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один из двух новых патогенных свиных цирковирусов, описанных в данной заявке, или по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из этих двух цирковирусов, или по меньшей мере один белок, полученный по меньшей мере из одного из этих двух цирковирусов. Способ может защищать свиней, нуждающихся в защите, против вирусной инфекции или PMWS путем введения свинье иммуногенно эффективного количества вакцины в соответствии с изобретением, такой как, например, вакцины, содержащей иммуногенное количество ДНК PCV2B, клонированного вируса, плазмиды или вирусного вектора, содержащего ДНК PCV2B, полипептидные продукты экспрессии и т.д. Вакцину, как описано в данной заявке, можно вводить со второй или третьей вакцинной или иммуногенной композицией против других свиных патогенов, включая, например, PRRSV, PPV и другие инфекционные свиные агенты, выбранные из следующего: Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropnemoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, бактерии лептоспира, вирус свиного гриппа, свиной парвовирус, антиген Escherichia coli, респираторный коронавирус свиней, ротавирус, патоген, вызывающий болезнь Ауески, и патоген, вызывающий трансмиссивный гастроэнтерит свиней. Конкретные комбинации могут включать в себя вакцинную или иммуногенную композицию против PCV в комбинации с вакцинной или иммуногенной композицией против PRRSV; вакцинную или иммуногенную композицию против PCV в комбинации с вакцинной или иммуногенной композицией против Mycoplasma hyopneumoniae или вакцинную или иммуногенную композицию против PSV в комбинации с обеими указанными вакцинными или иммуногенными композициями. Иммунные стимуляторы можно давать свиньям одновременно для создания широкого спектра защиты против других вирусных или бактериальных инфекций.
Вакцины или иммуногенные композиции, используемые в способах по изобретению, не ограничены каким-либо конкретным типом или способом получения. Эти вакцины или иммуногенные композиции могут включать в себя, например, нуклеиновую кислоту, кодирующую один или более белков свиного цирковируса, инфекционные ДНК-вакцины (то есть при использовании плазмид, векторов или других стандартных носителей для прямого введения ДНК свиньям), живые вакцины, модифицированные живые вакцины, инактивированные вакцины, субъединичные вакцины, аттенуированные вакцины, генно-инженерные вакцины и т.д. В некоторых воплощениях вакцина может включать в себя инфекционную ДНК PCV2B, клонированный ДНК-геном PCV в подходящих плазмидах или векторах, таких как, например, вектор pSK, авирулентный живой вирус, инактивированный вирус и т.д., или можно использовать вирусный вектор, такой как, но не ограничиваясь этим, бакуловирусный вектор, аденовирусный вектор или поксвирусный вектор, такой как поксвирус енота, или бактериальный вектор, такой как Е. coli. Любое из указанного можно использовать в комбинации с нетоксичным физиологически приемлемым носителем и, возможно, одним или более адъювантами.
Инактивированные вирусные вакцины или иммуногенные композиции могут быть получены путем обработки вируса, полученного из клонированной ДНК PCV, инактивирующими агентами, такими как формалин или гидрофобные растворители, кислоты и т.д., путем облучения ультрафиолетовым светом или рентгеновскими лучами, нагревания и т.д. Инактивацию осуществляют способом, понятным в данной области. Например, при химической инактивации подходящий образец вируса или образец сыворотки, содержащий вирус, Обрабатывают в течение достаточно длительного периода времени достаточным количеством или концентрацией инактивирующего агента при достаточно высокой (или низкой, в зависимости от инактивирующего агента) температуре или рН для инактивации вируса. Инактивацию нагреванием осуществляют при температуре и в течение периода времени, достаточных для инактивации вируса. Инактивацию облучением осуществляют с использованием длины волны света или другого источника энергии в течение периода времени, достаточного для инактивации вируса. Вирус считают инактивированным, если он не способен инфицировать клетку, чувствительную к инфекции.
Получение субъединичных вакцин типично отличается от получения модифицированной живой вакцины или инактивированной вакцины. Перед получением субъединичной вакцины следует идентифицировать защитные или антигенные компоненты вакцины. Такие защитные или антигенные компоненты включают в себя определенные аминокислотные сегменты или фрагменты вирусных капсидных белков, которые вызывают особенно сильный защитный или иммунологический ответ у свиней; один или многие вирусные капсидные белки сами, их олигомеры и ассоциации вирусных капсидных белков более высокого порядка, которые образуют вирусные субструктуры или идентифицируемые части или единицы таких субструктур; олигогликозиды, гликолипиды или гликопротеины, присутствующие на или около поверхности вируса или в вирусных субструктурах, таких как липопротеины или липидные группы, ассоциированные с вирусом, и т.д. Предпочтительно, в качестве антигенного компонента субъединичной вакцины используют капсидный белок, такой как белок, кодируемый геном ORF2. Также можно использовать другие белки, кодируемые инфекционным ДНК-клоном. Эти иммуногенные компоненты можно легко идентифицировать способами, известными в данной области. После идентификации защитные или антигенные части вируса (то есть, "субъединицы") затем очищают и/или клонируют процедурами, известными в данной области. Субъединичная вакцина дает преимущество над другими вакцинами на основе живого вируса, поскольку субъединица, такая как высокоочищенные субъединицы вируса, является менее токсичной, чем цельный вирус.
Если субъединичную вакцину получают рекомбинантными генетическими способами, экспрессию клонированной субъединицы, такой как, например, ген ORF2 (капсида), можно оптимизировать способами, известными специалистам в данной области (см., например, Maniatis et al., "Molecular Cloning: Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Mass., 1989). Если используемая субъединица представляет собой интактный структурный признак вируса, такой как целый капсидный белок, то процедура его выделения из вируса должна быть затем оптимизирована. В любом случае после оптимизации протокола инактивации протокол очистки субъединицы можно оптимизировать перед производством.
Для получения аттенуированных вакцин из патогенных клонов адаптированный к культуре ткани живой патогенный PCV2 сначала подвергают аттенуации (делают непатогенным или безвредным) способами, известными в данной области, обычно последовательным пассированием через культуры клеток. Аттенуация патогенных клонов также может быть осуществлена путем генных делеций или вирус-продуцирующих генных мутаций. Затем аттенуированные вирусы PCV2 могут быть использованы для конструирования дополнительных вирусов PCV2, которые сохраняют непатогенный фенотип PCV1, но могут варьировать по силе иммуногенных свойств, выбранных из генома PCV2 рекомбинантными технологиями.
Дополнительные генно-инженерные вакцины, которые являются желательными в настоящем изобретении, получают способами, известными в данной области. Такие способы включают, но не ограничиваются этим, дополнительную манипуляцию рекомбинантной ДНК, модификацию или замены в аминокислотных последовательностях рекомбинантных белков и тому подобное.
Генно-инженерные вакцины на основе технологии рекомбинантной ДНК получают, например, путем идентификации альтернативных частей вирусного гена, кодирующего белки, ответственные за индукцию более сильного иммунного или защитного ответа у свиней (например, белки, происходящие из ORF3, ORF4 и т.д.). Такие идентифицированные гены или иммунодоминантные фрагменты можно клонировать в стандартные векторы для экспрессии белка, такие как бакуловирусный вектор, и использовать для инфицирования соответствующих клеток-хозяев (см., например, O'Reilly et al., "Baculovirus Expression Vectors: A Lab Manual", Freeman & Co., 1992). Клетки-хозяева культивируют, экспрессируя таким образом желаемые вакцинные белки, которые могут быть очищены до желаемой степени и приготовлены в виде подходящего вакцинного продукта.
Если эти клоны сохраняют какие-либо нежелательные природные способности вызывать заболевание, то также возможно выявить нуклеотидные последовательности в вирусном геноме, ответственные за вирулентность, и генно-инженерными способами сделать вирус авирулентным, например, с использованием сайт-направленного мутагенеза. Сайт-направленный мутагенез способен добавлять, делетировать или изменять один или более нуклеотидов (см., например, Zoller et al., DNA 3: 479-488, 1984). Синтезируют олигонуклеотид, содержащий желаемую мутацию, и производят его отжиг с участком одноцепочечной вирусной ДНК. Гибридную молекулу, которую получают в результате этой процедуры, используют для трансформации бактерий. Затем двухцепочечную ДНК, которую выделяют, содержащую подходящую мутацию, используют для получения полноразмерной ДНК путем лигирования в рестрикционный фрагмент последней, которую затем трансфицируют в подходящую клеточную культуру. Лигирование генома в подходящий вектор для переноса можно осуществлять любым стандартным способом, известным среднему специалисту в данной области. Трансфекцию вектора в клетки-хозяева для получения вирусного потомства можно осуществлять с использованием любых стандартных способов, таких как кальций-фосфатная или ДЭАЭ-декстран-опосредованная трансфекция, электропорация, слияние протопластов и другие хорошо известные способы (например, Sambrook et al., "Molecular Cloning: Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Клонированный вирус затем демонстрирует желаемую мутацию. Альтернативно, можно синтезировать два олигонуклеотида, которые содержат соответствующую мутацию. Их можно подвергнуть отжигу с образованием двухцепочечной ДНК, которую можно вставить в вирусную ДНК с получением полноразмерной ДНК.
Генно-инженерные белки, полезные в вакцинах, например, можно экспрессировать в клетках насекомых, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Генно-инженерные белки, которые можно очищать или выделять стандартными способами, можно непосредственно инокулировать свиньям для создания защиты против вирусной инфекции или синдрома послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS), вызванного PCV2.
Линия клеток насекомого (такую как HI-FIVE) может быть трансформирована вектором для переноса, содержащим молекулы нуклеиновой кислоты, полученные из вируса или скопированные с вирусного генома, который кодирует один или более иммунодоминантных белков вируса. Вектор для переноса включает в себя, например, линеаризованную бакуловирусную ДНК и плазмиду, содержащую желаемые полинуклеотиды. Линия клеток-хозяев может быть котрансфицирована линеаризированной бакуловирусной ДНК и плазмидой с целью создания рекомбинантного бакуловируса.
Альтернативно, ДНК от свиньи, страдающей PMWS, которая кодирует один или более капсидных белков, инфекционный молекулярный ДНК-клон PCV2 или клонированный ДНК-геном PCV, можно вставлять в живые векторы, такие как поксвирус или аденовирус, и использовать в качестве вакцины.
Иммуногенно эффективное количество композиций по настоящему изобретению вводят свинье, нуждающейся в защите против вирусной инфекции или PMWS. Иммуногенно эффективное количество или иммуногенное количество, которым инокулируют свинью, можно легко определять или легко титровать обычным тестированием. Эффективным количеством является количество, при котором достигается достаточный иммунологический ответ на вакцину для защиты свиньи, подвергнутой воздействию вируса, который вызывает PMWS. Предпочтительно, свинью защищают до степени, при которой от одного до всех нежелательных физиологических симптомов или эффектов вирусного заболевания значительно снижают, ослабляют или полностью предотвращают.
50
Вакцинную или иммуногенную композицию можно вводить одной дозой или повторяющимися дозами. Дозировки могут варьировать, например, от 50 до 5000 микрограмм плазмидной ДНК, содержащий инфекционный ДНК-геном (в зависимости от концентрации иммуноактивного компонента вакцины), но не должны содержать количество вирусного антигена, достаточное для того, чтобы привести к нежелательной реакции или физиологическим симптомам вирусной инфекции. В данной области известны способы определения или титрования подходящих дозировок активного антигенного агента на основании массы свиньи, концентрации антигена и других типичных факторов. Предпочтительно, в качестве вакцины используют инфекционный клон вирусной ДНК, или можно генерировать живой инфекционный вирус in vitro, и затем этот живой вирус можно подвергнуть аттенуации и затем использовать в качестве вакцины. В этом случае свинье можно дать от 100 до 200 микрограмм клонированной ДНК PCV или примерно 10000 доз живого аттенуированного вируса, соответствующих 50%-ной инфекционной дозе в культуре ткани (TCID).
Желательно, вакцинную или иммуногенную композицию вводят свинье, еще не подвергнутой воздействию вируса PCV. Вакцину, содержащую инфекционный клон ДНК PCV2 или его другие антигенные формы, можно удобно вводить интраназально, трансдермально (то есть путем нанесения на или в поверхность кожи для системной абсорбции), парентерально и т.д. Парентеральный путь введения включает в себя, но не ограничивается этим, внутримышечный, внутривенный, интраперитонеальный, интрадермальный (то есть инъецированный или иным образом помещенный под кожу) пути и тому подобное. Поскольку внутримышечный и интрадермальный пути инокуляции были успешными в других исследованиях с использованием вирусных инфекционных клонов ДНК (Е.Е.Sparger et al., "Infection of cats by injection with DNA of feline immunodeficiency virus molecular clone", Virology 238: 157-160 (1997); L.Willems et al., "In vivo transfection of bovine leukemia provirus into sheep", Virology 189: 775-777 (1992)), эти пути являются наиболее предпочтительными, в дополнение к практичному интраназальному пути введения. Хотя это менее удобно, но также предполагают, что вакцину дают свинье через внутрилимфоидный путь инокуляции. Уникальный, весьма предпочтительный способ введения включает прямую инъекцию плазмидной ДНК, содержащей PCV2, или вируса PCV2 (аттенуированного или инактивированного) свинье внутримышечно, интрадермально, в лимфоидную систему и т.д.
При введении в виде жидкости вакцину по настоящему изобретению можно приготавливать в форме водного раствора, сиропа, эликсира, настойки и тому подобного. Такие препараты известны в данной области, и в типичных случаях их получают путем растворения антигена и других типичных добавок в подходящем носителе или системе растворителей. Подходящие "физиологически приемлемые" носители или растворители включают в себя, но не ограничивается этим, воду, физиологический раствор, этанол, этилен гликоль, глицерин и т.д. Типичными добавками являются, например, сертифицированные красители, ароматизаторы, подсластители и антимикробные консерванты, такие как тимеросал (этилртутьтиосалицилат натрия). Такие растворы можно стабилизировать, например, путем добавления частично гидролизованного желатина, сорбита или культуральной среды для клеток, и можно забуферивать стандартными способами с использованием реагентов, известных в данной области, таких как дигидрофосфат натрия, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, их смесь и тому подобное.
Жидкие препараты также могут включать в себя суспензии и эмульсии, которые содержат суспендирующие или эмульгирующие агенты в комбинации с другими стандартными вспомогательными агентами. Эти типы жидких препаратов могут быть получены стандартными способами. Суспензии, например, могут быть получены с использованием коллоидной мельницы. Эмульсии, например, могут быть получены с использованием гомогенизатора.
Парентеральные препараты, предназначенные для инъекции в жидкие системы организм, требуют подходящей изотоничности и забуферивания рН до уровней, соответствующих жидкостям организма Свиньи. Изотоничность можно надлежащим образом корректировать хлоридом натрия и другими солями, при необходимости. Подходящие растворители, такие как этанол или пропиленгликоль, могут быть использованы для увеличения растворимости ингредиентов в препарате и стабильности жидкого препарата. Дополнительные добавки, которые могут быть использованы в настоящей вакцине, включают в себя, но не ограничивается этим, декстрозу, стандартные антиоксиданты и стандартные хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА). Парентеральные лекарственные формы также должны быть простерилизованы перед использованием.
В одном из воплощений в вакцинной или иммуногенной композиции может быть использован иммуногенный капсидный ген ORF2, происходящий из по меньшей мере одного из цирковирусов типа 2В, описанных в данной заявке.
Адъюванты
В настоящем изобретении предложены выделение и идентификация двух новых свиных цирковирусов типа 2В (PCV2B), кодируемых последовательностями нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1 и 2. Эти новые штаммы PCV2B были выделены из свиней, которые были заражены естественным путем, и как таковые могут быть идеальными кандидатами для применения в получении вакцинных и иммуногенных композиций. Цель изобретения состоит в использовании этих штаммов в убитой/инактивированной форме или в получении аттенуированных форм этих двух штаммов для получения вакцинных или иммуногенных композиций. Цель изобретения также состоит в их доставке с адъювантом или без адъюванта популяции свиней для предупреждения PMWS или для облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с этим заболеванием.
Соответственно, живой аттенуированный свиной цирковирус типа 2 В, или убитые/инактивированные свиные цирковирусы, как описано в данной заявке, или нуклеиновую кислоту, кодирующую эти свиные цирковирусы, или по меньшей мере один белок, полученный из этих цирковирусов, можно доставлять с адъювантом или без адъюванта. В одном из воплощений вакцина представляет собой убитый/инактивированный цирковирус PCV2B, который вводят с адъювантом. Адъювант представляет собой вещество, которое усиливает иммунологический ответ свиньи на вакцину. Адъювант можно вводить в то же время и в то же место, что и вакцину, или в другое время, например, в качестве бустера. Адъюванты также можно предпочтительно вводить свинье способом или в место, которые отличаются от способа или места, которым или в которое вводят вакцину. Подходящие адъюванты включают в себя, но не ограничивается этим, гидрат окиси алюминия (квасцы), иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неионные блок-полимеры или сополимеры, цитокины (такие как IL-1, IL-2, IL-7, IFN-α, IFN-β, IFN-γ и т.д.), сапонины, монофосфориллипид A (MLA), мурамилдипептиды (MDP) и тому подобное. Другие подходящие адъюванты включают в себя, например, сульфат алюминия-калия, термолабильный или термостабильный энтеротоксин, выделенный из Escherichia coli, холерный токсин или его субъединицу В, дифтерийный токсин, столбнячный токсин, коклюшный токсин, неполный или полный адъювант Фрейнда и т.д. Адъюванты на основе токсинов, такие как дифтерийный токсин, столбнячный токсин и коклюшный токсин могут быть инактивированы перед применением, например, путем обработки формальдегидом.
Анализы для измерения иммунных ответов
Функциональный исход вакцинации свиньи против свиного цирковируса можно оценить с помощью подходящих анализов, которые контролируют индукцию клеточного или гуморального иммунитета или Т-клеточную активность. Эти анализы известны специалисту в данной области, но могут включать в себя измерение цитолитической Т-клеточной активности с использованием, например, анализа высвобождения хрома. Альтернативно, в качестве показателя иммунной реактивности или ее отсутствия можно использовать анализы пролиферации Т-клеток. Кроме того, можно проводить исследования in vivo для оценки уровня защиты млекопитающего, вакцинированного против патогена с использованием способов по настоящему изобретению. Типичные анализы in vivo могут включать вакцинацию животного антигеном, таким как химерный свиной цирковирус, описанный в данной заявке. После ожидания в течение периода времени, достаточного для того, чтобы произошла индукция антительного или Т-клеточного ответа, обычно от примерно одной до двух недель после инъекции, животные будут подвергнуты воздействию антигена, такого как какой-либо вирус, и осуществляют мониторинг ослабления одного или более симптомов, ассоциированных с вирусной инфекцией, или выживания животных. Успешный режим вакцинации против свиного цирковируса будет приводить к значительному снижению одного или более симптомов, ассоциированных с вирусной инфекцией, или уменьшению виремии, или уменьшению числа или тяжести поражений, ассоциированных с вирусной инфекцией, или к выживанию по сравнению с невакцинированными контролями. Может быть также собрана сыворотка для мониторинга уровней антител, генерированных в ответ на инъекции вакцины, как измерено способами, известными специалистам в данной области.
Способы сравнения изолятов свиного цирковируса типа 2А и типа 2 В
Возможно, что вновь идентифицированные свиные цирковирусы типа 2В смогут быть эффективными в качестве вакцинных или иммуногенных композиций для защиты против инфекции цирковирусом либо типа 2А, либо типа 2В, которые оба являются патогенными у свиней. Штаммы типа 2А и типа 2В можно дифференцировать посредством использования анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). При ПДРФ используют ферментативное расщепление вирусной нуклеиновой кислоты (частичное или полное), которое приводит к специфической картине расщепления, которую визуализируют на геле. Если имеются различия между вирусами в сайтах ферментативного расщепления, то можно наблюдать различные картины. Этот метод фингерпринтинга обычно используют для ДНК-вирусов. Meng с соавт. (патентная публикация США 2005/0147966) описывает применение анализа ПЦР-ПДРФ с использованием рестрикционного фермента Ncol для различения между непатогенным типом 1 свиных цирковирусов и патогенным типом 2 свиных цирковирусов. Описанный в 2000 г.анализ ПЦР-ПДРФ на основе ORF2 с использованием ферментов HinfI, HinP1I, KpnI, MseI и RsaI способен различать изоляты среди PCV2 (PCV2A, В, С, D и Е) (Hamel AL, Lin LL, Sachyie С, Grudeski Е, Nayar GP: PCR detection and characterization of type-2 porcine circovirus. Can J Vet Res. 64: 44-52, 2000).
Анализ ПЦР-ПДРФ на основе ORF2 с использованием ферментов Sau3AI, BanII, NspI, XbaI и CrtI был описан недавно и способен различать 9 разных генотипов PCV2 (Wen L, Guo X, Yang H: Genotyping of porcine circovirus type 2 from a variety of clinical conditions in China. Vet Microbiol, 110: 141-146 2005). ПДРФ-анализ PCV2 показал, что в 2005 г. в Онтарио в Канаде произошло значительное изменение ПДРФ от типа 422 до типа 321 (Delay J, McEwen В, Carman S, van Dreuel T, Fairies J: Porcine circovirus type 2-associated disease is increasing. AHL Newsletter. 9: 22, 2005).
Полагают, что в дополнение к использованию анализа ПДРФ для различения между типом 2А и типом 2 В свиных цирковирусов, эти два штамма можно различать на основании анализа последовательностей.
Например, анализом последовательности можно характеризовать генетическую информацию и сравнивать изоляты друг с другом (Choi J, Stevenson GW, Kiupel M, Harrach В, Anothayanontha L, Kanitz CL, Mittal SK: Sequence analysis of old and new strains of porcine circovirus associated with congenital tremors in pigs and their comparison with strains involved with postweaning multisystemic wasting syndrome. Can J Vet Res. 66: 217-224, 2002; De Boisseson С, Beven V, Bigarre L, Thiery R, Rose N, Eveno E, Madec F, Jestin A: Molecular characterization of porcine circovirus type 2 isolate from post-weaning multisystemic wasting syndrome-affected and non-affected pigs. J Gen Virol. 85: 293-304, 2004; Fenaux M, Halbur PG, Gill M, Toth ТЕ, Meng XJ: Genetic characterization of type 2 porcine circovirus (PCV-2) from pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome in different geographic regions of North America and development of differential PCR-restriction фрагмент length polymorphism assay to detect and differentiate between infections with PCV-1 and PCV-2. J Clin Microbiol. 38: 2494-2503, 2000; Grierson SS, King DP, Sandvik T, Hicks D, Spencer Y, Drew TW, Banks M: Detection and genetic typing of type 2 porcine circovirus in archived pig tissues from the UK. Arch Virol. 149: 1171-1183, 2004; Kirn JH, Lyoo YS: Genetic characterization of porcine circovirus-2 field isolate from PMWS pigs. J Vet Sci. 3: 31-39, 2002; Mankertz A, Domingo M, Folch JM, LeCann P, Jestin A, Segales J, Chmielewicz B, Plana-Duran J, Soike D: Characterisation of PCV-2 isolate from Spain, Germany and France. Virus Res. 66: 65-77, 2000). Для дополнительного исследования возможных различий между изолятами PCV2 можно секвенировать полный геном PCV2 или секвенировать только ORF2.
Эти два штамма также различаются по патологии, клиническим симптомам и смертности, ассоциированным с самим заболеванием, где тип 2А демонстрирует менее тяжелые поражения в тканях тела и меньший уровень смертности по сравнению с более тяжелыми поражениями и более высоким уровнем смертности, ассоциированными со штаммами типа 2В. Эти клинические параметры можно измерить с использованием стандартных процедур, известных в данной области, и как продемонстрировано в настоящем изобретении.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры демонстрируют определенные аспекты настоящего изобретения. Однако надо понимать, что эти примеры даны только для иллюстрация и не предназначены быть полностью дефинитивными в отношении условий и объема данного изобретения. Надо понимать, что, когда даны типичные условия взаимодействия (например, температура, длительности взаимодействия и т.д.), также можно использовать условия выше и ниже указанных диапазонов, хотя обычно это менее удобно. Все части и проценты, указанные в данной заявке, представлены по массе, и все температуры выражены в градусах стоградусной шкалы, если не указано иначе.
ПРИМЕР 1
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДВУХ НОВЫХ ШТАММОВ СВИНОГО ЦИРКОВИРУСА ТИПА 2В
Было спланировано исследование для тестирования нового вакцинного препарата на свиньях для оценки его эффективности против свиного цирковируса и М. hyopneumoniae. Во время исследования наблюдали, что несколько свиней в контрольной и вакцинированной группах демонстрировали симптомы PMWS. Затем подтвердили, что эти свиньи перед экспериментальным заражением подвергались воздействию PCV2 из окружающей среды. Молекулярный анализ образцов крови и ткани от этих свиней показал, что они несли штамм типа 2В, который отличался от штамма, используемого для экспериментального заражения. Более того, анализ последовательности установил, что штамм PCV2B, обозначенный как FD07, и другой новый штамм PCV2B, выделенный из свиньи с фермы (обозначен как FDJE), отличались от других штаммов типа 2В, идентифицированных в других полевых исследованиях, и от штаммов, ранее идентифицированных другими исследователями. Материалы и способы для выделения и характеристики этих двух новых штаммов PCV2B раскрыты ниже.
Материалы и способы
Тестируемые животные
Для этого исследования использовали самцов и самок обычных свиней смешанной породы. Было 24 вакцинированные свиньи и 24 контроля. Свиньи во время вакцинации находились в возрасте 3 недель.
Свиней для исследования приобретали на коммерческой ферме и идентифицировали посредством бирки в ухе. Свиней получали из одного исходного стада. Во время первой вакцинации свиньи были серонегативными по PCV2, как определено в ELISA (соотношение S/P не более 0,5). Целевая популяция для исследования представляла собой здоровых поросят на откорме. Что касается их иммунной функции, то выбранные для этого исследования животные считались репрезентативными для поросят на откорме в США.
Свиней содержали в изолированных помещениях в FDAH (Fort Dodge Animal Health), Fort Dodge, IA. Вакцинированных и контрольных животных смешивали на протяжении всего исследования в сходных условиях. Поросят размещали в помещениях по пометам. Условия содержания соответствовали действующим правилам содержания животных. Свиней держали на стандартной коммерческой диете с водой и пищей, доступными без ограничения.
Свиней, требующих медицинской помощи, лечил при необходимости местный ветеринар после консультации с исследователем.
Результаты тестирования образцов сыворотки в РСУ2-ПЦР свидетельствовали о случайном/происходящем из окружающей среды воздействии PCV2 на поросят в одном из помещений перед экспериментальным заражением. PCV2 сначала детектировали в сыворотке одного контрольного поросенка через 28 суток после вакцинации и идентифицировали в качестве штамма свиного цирковируса типа 2 В (PCV2B) путем секвенирования ДНК. Этот PCV2B инфицировал дополнительно 6 поросят. У двух невакцинированных контрольных свиней развились PCV2-ассоциированные клинические признаки, и их подвергли эвтаназии через 18 суток после заражения из-за плохого состояния здоровья. Клинические признаки включали в себя, но не ограничивались этим, отсутствие аппетита, летаргию, депрессию, насморк, кашель, выделения из носа, выделения из глаз и одышку. Перед эвтаназией брали образцы тканей и крови для анализа на цирковирус и секвенирования.
Сбор и тестирование образцов
Сбор образцов
Мазки из носа
Мазки из носа собирали в 0-е сутки после вакцинации (DPV) для выделения PCV2 с целью удостовериться, нет ли PCV2-инфекции у тестируемых животных до вакцинации. Образцы мазков из носа помещали в индивидуальные стерильные пробирки, содержащие 3 мл MEM с гидролизатом лактальбумина (LAN) и гентамицином (60 мкг/мл), пенициллином (100 ед./мл) и стрептомицином (100 мкг/мл), и хранили при или ниже -50°С до тестирования.
Образцы сыворотки
У свиней брали кровь для образцов сыворотки (не более десяти мл) в DPV (сутки после вакцинации) 0, 13, 28 и DPC (сутки после экспериментального заражения) -1, 7, 14, 20 для тестирования с помощью ELISA, и в DPV 0, 13, 28 и в DPC-1, 3, 7, 10, 14, 17, 20 для тестирования с помощью ПЦР.
Образцы ткани
Всех животных умерщвляли в DPC 20/21. Срезы из трех лимфатических узлов (трахеобронхиального, подвздошного и пахового), миндалины и селезенки собирали и фиксировали в формалине для гистопатологического исследования и иммуногистохимии (IHC) на PCV2.
Тестирование образцов
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA)
Для детекции антител против PCV2 в образцах сыворотки использовали непрямой ELISA с использованием рекомбинантного капсидного белка PCV2 (экспрессирующегося в бакуловирусе) в качестве захватывающего антигена. Кратко, 96-луночный полистирольный планшет покрывали положительным захватывающим антигеном (клетки Sf9, инфицированные рекомбинантным бакуловирусом, экспрессирующим капсидный белок PCV2). Шесть лунок на каждом планшете покрывали отрицательным захватывающим антигеном (клетки насекомого SF9) в качестве контроля. После обработки планшета блокирующим реагентом планшет инкубировали с тестируемыми и контрольными образцами сыворотки. Каждый образец тестируемой сыворотки добавляли в лунки иммунологического планшета, покрытые положительным захватывающим антигеном (3 лунки на каждый тестируемый образец). Положительный контрольный образец сыворотки добавляли в шесть лунок иммунологического планшета, покрытых положительным захватывающим антигеном (положительный контроль), и шесть лунок иммунологического планшета покрывали отрицательным захватывающим антигеном (отрицательный Контроль). Затем добавляли в планшет пероксидазу хрена (HRP) конъюгированную с козьим вторичным антителом против свиньи. Наконец, добавляли ТМВ (субстрат пероксидазы) и инкубировали в течение подходящего и соответствующего времени. Развившуюся окраску количественно определяли с использованием планшет-ридера для ELISA. Каждый реагент в планшете для ELISA инкубировали вполне определенным образом и промывали для удаления избытка реагента перед каждой последующей стадией. Оптическую плотность (OD) тестируемых образцов и положительного контроля вычисляли путем вычитания средней OD отрицательного контроля из средней OD тестируемых образцов и положительного контроля. Титр сыворотки выражали как отношение S/P (образец/положительный контроль), которое представляет собой OD тестируемого образца, деленную на OD положительного контрольного образца.
Тестирование в ПЦР
Для детекции присутствия вирусной геномной ДНК PCV2 в образцах сыворотки использовали РСЛ/2-специфичное ПЦР-тестирование. Вирусную геномную ДНК очищали из сыворотки с использованием набора QIAGEN MatAttract Virus Mini и аппарата QIAGEN Biorobot. Для детекции специфических последовательностей PCV2 фрагмент размером 592 п.н. амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы ABI AmpliTaq Gold и геноспецифических праймеров: F1PCV2, 5'-ATGCCCAGCAAGAA GAATGG-3' (SEQ ID NO:7) и RPCV2, 5'-TGGTTTCCAGTATGT GGTTTCC-3' (SEQ ID NO:8). Очищенную вирусную ДНК использовали в качестве матрицы и денатурировали при 95°С в течение 10 мин. ПЦР-программа реакций состояла из 35 циклов денатурации при 94°С в течение 30 с, отжига при 59°С в течение 1 мин и удлинения при 72°С в течение 1 мин. Десять мкл ПЦР-продукта использовали для детекции ДНК-фрагмента PCV2 размером 592 п.н. посредством электрофореза в агарозном геле.
Гистопатология
Образцы ткани селезенки, миндалины и трех (трахеобронхиального, подвздошного и пахового) лимфатических узлов собирали от каждого животного при биопсии, фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине в течение 2-4 суток и погружали в парафин. Срезы толщиной четыре микрометра окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали под световым микроскопом для гистопатологической оценки.
Образцы оценивали по степени истощения по лимфоцитам/их замещения гистиоцитами. Кратко, все ткани исследовали в слепом режиме и присваивали им субъективные баллы уровня истощения по лимфоцитам и их замещения гистиоцитами. Ранжированные баллы лимфоидного истощения от О до 3 приписывали следующим образом: 0 - норма, 1 - легкое лимфоидное истощение с потерей общей клеточности, 2 - умеренное лимфоидное истощение, 3 - тяжелое лимфоидное истощение с потерей лимфоидной фолликулярной структуры. Ранжированный балл замены гистиоцитами от 0 до 3 приписывали таким же образом, как указано ниже: 0 - норма, 1 - легкое воспаление от гистиоцитарного до гранулематозного, 2 - умеренное воспаление от гистиоцитарного до гранулематозного, 3 - тяжелое воспаление от гистиоцитарного до гранулематозного с замещением фолликулов.
Гистопатологические оценки проводил сертифицированный патологоанатом в ветеринарной диагностической лаборатории в Колледже ветеринарной медицины Университета штата Айова (Ames, IA).
Иммуногистохимическое тестирование (IHC)
2
2
PCV2-специфический антиген в тканях лимфатических узлов, миндалины и селезенки детектировали иммуногистохимическим тестированием. Кратко, срезы тканей толщиной четыре микрометра помещали на стеклянные покровные стекла и обрабатывали ксилолом для удаления парафина. Депарафинизированные срезы гасили по эндогенной пероксидазе 3%-ной HO в PBS в течение 20 мин. После промывки дистиллированной водой срезы инкубировали при комнатной температуре в течение ночи с кроличьей поликлональной сывороткой против PCV2, разбавленной 1:1000 в PBS. Затем после промывки в PBS срезы инкубировали с биотинилированными козьими антителами против кроличьих IgG в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы инкубировали с конъюгатом стрептавидина и пероксидазы и "визуализировали" субстратом тетрагидрохлоридом диаминобензидина. Количество антигена PCV2 оценивали в слепом режиме на основании уровня окрашивания на антиген PCV2. Ранжированный балл приписывали следующим образом: 0 - нет окрашивания, 1 - низкий уровень окрашивания, 2 - средний уровень окрашивания, 3 - высокий уровень окрашивания. IHC тканей осуществляли в ветеринарной диагностической лаборатории Колледжа ветеринарной медицины Университета штата Айова (Ames, IA).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Выделение вируса
Мазки из носа собирали в 0-е сутки после вакцинация (DPV) для выделения PCV2 с целью удостовериться, нет ли PCV2-инфекции у тестируемых животных перед вакцинацией. Вирус не удавалось выделить из мазков из носа каждого тестируемого животного, что указывало на отсутствие воздействия на этих свиней PCV2-инфекции из окружающей среды во время вакцинации.
Титрование материала для экспериментального заражения вирусом PCV2
10
50
Результаты титрования материала для экспериментального заражения вирулентным PCV2 (штамм 40895) показаны в Таблице 1. Средний титр заражающего вируса из трех параллельных титрований составлял 4,6×LogFAID/Mn.
Серология
Результаты ELISA с PCV2-специфическими антителами показаны в Таблице 2.
В 0 DPV1 соотношения S/P в ELISA в контролях (Группа С) варьировали от -0,009 до 0,366, где среднее соотношение S/P составляло 0,135. После вакцинации титры антител в ELISA в контролях снизились до фоновых уровней 13 DPV, и все поросята оставались серонегативными до дня экспериментального заражения. Средние соотношения S/P составляли 0,049 в 13 DPV, 0,023 в 28 DPV и 0,004 в 35 DPV (-1 DPC), соответственно. После заражения PCV2 средние соотношения S/P значительно увеличились от 0,125 в 7 DPC и 0,612 в 14 DPC до 0,922 в 20 DPC.
В 0 DPV1 соотношения S/P в ELISA у вакцинированных животных (Группа V) варьировали от -0,028 до 0,364, где среднее соотношении S/P составляло 0,126. После вакцинации средние соотношения S/P составляли 0,041 в 13 DPV, 0,097 в 28 DPV и 0,167 в 35 DPV (-1 DPC). После заражения PCV2 значительный рост титров в ELISA у поросят этой группы наблюдали уже в 7 DPC, где средние соотношения S/P составляли 1,069 в 7 DPC, 1,373 в 14 DPC и 1,356 в 20 DPC.
PCV2-виремия
Детектирование PCV2-виремии посредством PCV2-специфической ПЦР в сыворотках вакцинированных животных и контролей суммировано в Таблице ЗА. Эта PCV2-специфическая ПЦР является по меньшей мере в 1000 раз более чувствительной, чем стандартный способ клеточной культуры.
В -1 сутки после заражения (DPC) неожиданно обнаружили, что 3 из 24 вакцинированных животных (свиньи #Р102, Р103 и Р104) и 6 из 24 контролей (свиньи #G197, G205, 0162, Р107, Р108 и Р110) были выявлены как положительные в отношении ДНК PCV2 в образцах сыворотки, тогда как все другие оставались отрицательными. Все 9 PCV2-положительных свиней содержались в одном и том же помещении (#12). К сожалению, шесть PCV2-инфицированных свиней (свиньи #Р102, Р103, Р104, Р107, Р108 и Р110) и две неинфицированные свиньи были перемещены в Помещение #13 и перемешаны с 8 неинфицированными свиньями из Помещения #11 в -1 DPC из-за потребностей в площади на одну голову животного. Поэтому все животные в помещениях #12 и 13 были потенциально подвергнуты воздействию PCV2 из окружающей среды.
Для выявления источника PCV2 из окружающей среды образцы сыворотки, собранные в 0, 13 и 28 DPV, тестировали с помощью PCV2-специфической ПЦР. Все свиньи были PCV2-отрицательными, за исключением свиньи #Р108 (контроль, помещение #12) с чрезвычайно сильной положительной ПЦР полосой в 13 DPV. Из этого результата следует, что случайное воздействие PCV2 из окружающей среды произошло от свиньи #Р108 и затем распространилось на других свиньей в помещениях #12 и #13. Точное происхождение этого PCV2 не известно, однако наиболее вероятно из окружающей среды или фермы, в которой свинья #Р108 была инфицирована на невыявляемом уровне до включения в исследование.
Для определения генотипа PCV2 из окружающей среды ПЦР-продукты из свиньи #Р108 клонировали для секвенирования. Анализ последовательности ДНК показал, что PCV2 из свиньи #Р108 представлял собой штамм типа 2 В, отличный от штамма #40895 (2А). Геномы этих двух штаммов PCV2 имели 95, 98%-ную идентичность последовательностей ДНК. Для дополнительной дифференциации заражения экспериментальным PCV2 (штамм #40895) от контактного заражения из окружающей среды (2 В из свиньи #Р108) ПЦР-продукты из всех PCV2-виремических свиней клонировали для секвенирования ДНК. Результаты генотипирования показаны в колонке "Заражение PCV2": "А" указывает, что PCV2B не детектировали в образцах сыворотки и что заражение происходило только экспериментальным штаммом PCV2 #40895; "А+В" указывает, что, в дополнение к экспериментальному заражению, также детектировали PCV2B, и все PCV2B были из Свиньи #Р108 вследствие идентичности последовательностей; и "А+(В)" указывает, что, в дополнение к экспериментальному заражению, свиньи были потенциально инфицированы PCV2B, поскольку эти свиньи были смешаны со свиньей #Р108 в помещении #12/13. Однако все эти свиньи были защищены от заражения PCV2.
С целью оценки влияния экспериментального и природного контактного заражений результаты ПЦР относительно PCV2-виремии рассматриваются в трех категориях: общее сравнение (Таблица 3А), экспериментальное заражение (Таблица 3В) и экспериментальное и природное контактное заражения (Таблица 3С).
Общее сравнение между группами показало, что 10/24 (41,7%) вакцинированных животных были положительными в отношении присутствия ДНК PCV2 в сыворотках, для по меньшей мере единичного положительного и неопределенных случаев. Если единичный неопределенный случай не учитывать, то положительными по ДНК PCV были 5/24 (20,8%) вакцинированных животных. Напротив, 24/24 (100%) контролей были положительными в отношении присутствия ДНК PCV2 в сыворотках для многочисленных случаев. Частота и плотность PCV2-положительной полосы в контролях были значительно выше и сильнее, чем у вакцинированных животных (см. Таблицу 3А).
Сравнение между группами, подвергнутыми экспериментальному заражению PCV2 (Таблица 3В), показало, что 1/9 (11,1%) вакцинированных животных были положительными по ДНК PCV2, судя только по одному положительному случаю. Напротив, 14/14 (100%) контролей были положительными в отношении присутствия ДНК PCV2 в сыворотках для многочисленных случаев.
Сравнение между группами, подвергнутыми экспериментальному и природному контактному заражениям (Таблица 3С) показало, что 4/15 (26,7%) вакцинированных животных были положительными по ДНК PCV2 для по меньшей мере единичного положительного случая. Напротив, 10/10 (100%) контролей были положительными в отношении присутствия ДНК PCV2 в сыворотках для многочисленных случаев.
Микроскопические поражения - лимфоидное истощение
Ткани лимфатических узлов, селезенки и миндалины исследовали посредством микроскопии на лимфоидное истощение. Суммарные результаты микроскопических поражений - лимфоидного истощения суммированы в Таблице 4А (число животных с баллами 0-3).
Общее сравнение между группами показало, что балл, свидетельствующий об аномальном лимфоидном истощении по меньшей мере в одной ткани, наблюдали у 15/24 (62,5%) вакцинированных свиней по сравнению с 23/24 (95,8%) контрольных свиней. От умеренных до тяжелых поражений, представляющие собой лимфоидное истощение, наблюдали у 4/24 (16,7%) вакцинированных животных по сравнению с 14/24 (58,3%) контролей.
Сравнение между группами, подвергнутыми экспериментальному заражению PCV2 (Таблица 4В), показало, что балл, свидетельствующий об аномальном лимфоидном истощении по меньшей мере в одной ткани, наблюдали у 6/9 (66,7%) вакцинированных свиней по сравнению с 13/14 (92,9%) контрольных свиней.
Сравнение между группами, подвергнутых экспериментальному и природному контактному заражениям PCV2 (Таблица 4В), показало, что балл, свидетельствующий об аномальном лимфоидном истощении по меньшей мере в одной ткани, наблюдали у 9/15 (60%) вакцинированных свиней по сравнению с 10/10 (100%) контрольных свиней.
Микроскопические поражения - замещение гистиоцитами
Ткани лимфатических узлов, селезенки и миндалины исследовали посредством микроскопии на воспаление от гистиоцитарного до гранулематозного с замещением фолликулов. Суммарные результаты микроскопических поражений - гистиоцитарного замещения суммированы в Таблице 5.
Общее сравнение показало, что по сравнению с 22/24 (91,7%) контролей, у 15/24 (62,5%) вакцинированных животных наблюдали балл, свидетельствующий об аномальном гистиоцитарном замещении по меньшей мере в одной лимфоидной ткани.
Иммуногистохимия
Результаты детекции количества антигена PCV2 по IHC-окрашиванию в лимфатических узлах, селезенке и миндалинах суммированы в Таблице 6 (число животных с баллом 0-3).
Общее сравнение показало, что по сравнению с 23/24 (95,8%) контролями, у 7/24 (29,2%) вакцинированных животных наблюдалось PCV2-специфическое IHC-окрашивание по меньшей мере в одной лимфоидной ткани.
Клинические наблюдения после заражения
Результаты ежедневных наблюдений клинических признаков после заражения у отдельных свиней представлены в Таблице 7. Клинических признаков не наблюдали ни у одной свиньи, за исключением 2 контрольных свиней (#Р108 и 0162).
У свиньи #Р108 наблюдали кашель в 1 DPC, диарею в 10 DPC, похудание, диарею и неактивность в 17 DPC. У этой свиньи развились очевидные клинические признаки истощения. Из-за плохого состояния этого поросенка подвергли эвтаназии в 18 DPC. Вскрытие показало очень мало подкожного жира, умеренную краниовентральную консолидацию в легких, пустой желудок и кишечник. У свиньи развилось PCV-ассоциированное заболевание, что подтверждено выявлением PCV2-виремии (чрезвычайно сильная ПЦР-положительная), тяжелого лимфоидного истощения и высокой нагрузки антигена PCV2 (по IHC-окрашиванию) в лимфоидных тканях.
У поросенка #0162 наблюдали похудание и хромоту левой задней ноги в 14 DPC. В 17 DPC у этой свиньи опять наблюдали похудание, неспособность двигаться и распухшие суставы предплюсны в задних ногах. Из-за плохого состояния этого поросенка подвергли эвтаназии в 18 DPC. Вскрытие выявило от умеренной до тяжелой консолидации легких с фиброзными спайками. Микроскопическая оценка легочных тканей показала тяжелую острую бронхопневмонию и хронический очаговый интерстициальный фиброз. У этой свиньи развилось PCV-ассоциированное заболевание, что подтверждено выявлением PCV2-виремии (чрезвычайно сильная ПЦР-положительная), тяжелого лимфоидного истощения и высокой нагрузки антигена PCV2 (по IНС-окрашиванию) в лимфоидных тканях.
Таблица 1.
PCV2 (#40895) Титрование материала для заражения
Повтор
*Титр
1
4,6
2
4,8
3
4,4
4
4,6
5
4,6
Ave±SD
4,6±0,14
*Log<sub>10</sub> FAID<sub>50</sub> на млAve ± SD = Средний титр ± Стандартное отклонение
Таблица 2.
Сероконверсия в PCV2 в сыворотках вакцинированных и контрольных свиней при измерении в ELISA с антителом против PCV2*
№ свиньи
Группа
0 DPV
13 DPV
28 DPV
-1 DPC
7 DPC
14 DPC
20 DPC
G199
V
0,029
0,022
0,425
0,883
1,298
1,367
1,358
G203
V
0,010
-0,015
-0,007
0,004
0,591
1,373
1,458
G204
V
0,038
-0,002
0,057
0,034
1,399
1,524
1,524
G289
V
0,121
0,055
0,021
0,034
0,938
1,530
1,536
G290
V
0,162
0,035
0,041
0,027
1,007
1,438
1,451
O112
V
0,222
0,062
0,059
0,017
0,520
1,145
1,127
O113
V
0,050
0,007
0,057
0,112
1,164
1,460
1,395
O117
V
-0,028
-0,010
0,381
0,608
1,264
1,334
1,282
O119
V
0,030
-0,007
0,001
-0,013
0,935
1,209
1,196
O156
V
0,058
0,008
0,158
0,272
1,434
1,438
1,416
O158
V
0,099
0,039
0,023
0,128
1,451
1,462
1,447
O159
V
0,082
0,034
0,184
0,234
1,194
1,433
1,415
Р102
V
0,108
0,028
0,026
0,017
1,199
1,307
1,321
Р103
V
0,206
0,096
0,177
0,238
1,322
1,457
1,371
Р104
V
0,139
0,046
0,023
0,034
1,351
1,438
1,394
Р109
V
0,179
0,048
0,041
0,630
1,396
1,492
1,409
Р113
V
0,113
0,026
0,039
0,011
0,980
1,251
1,368
Р115
V
0,141
0,077
0,055
0,077
1,266
1,436
1,353
Р145
V
0,069
-0,003
0,120
0,219
1,215
1,521
1,500
Р146
V
0,158
0,065
0,030
0,037
0,213
1,372
1,273
Р150
V
0,124
0,049
0,009
0,108
0,619
1,265
1,306
Р192
V
0,288
0,113
0,173
0,072
0,697
1,399
1,314
Р213
V
0,364
0,121
0,116
0,085
0,909
0,847
0,967
Р214
V
0,264
0,097
0,110
0,135
1,299
1,444
1,373
Ave (отношение S/P)
0,126
0,041
0,097
0,167
1,069
1,373
1,356
0,094
0,039
0,111
0,228
0,334
0,150
0,127
G197
С
0,072
0,005
0,017
-0,005
1,011
1,135
1,240
G205
С
0,028
-0,010
-0,003
-0,016
0,389
1,072
1,042
G293
С
0,202
0,033
0,019
-0,011
-0,017
0,376
0,949
G296
С
0,266
0,052
0,032
-0,001
0,016
0,932
1,073
O109
С
0,014
-0,007
-0,012
-0,013
0,009
0,701
1,254
O110
С
0,001
-0,015
-0,017
-0,003
-0,032
0,355
0,704
O111
С
-0,002
-0,019
-0,021
-0,033
-0,034
0,448
0,858
O114
С
-0,009
-0,014
-0,019
-0,028
-0,041
0,159
0,216
O162
С
0,219
0,040
0,039
0,032
0,216
0,536
NA
O164
С
0,057
0,018
-0,005
-0,007
0,019
0,227
0,675
O166
С
0,072
0,003
-0,003
-0,009
0,041
0,914
1,146
Р105
С
0,228
0,234
0,035
0,022
0,134
1,376
1,428
Р107
С
0,142
0,043
0,037
0,001
0,549
1,102
1,195
Р108
С
0,266
0,080
0,039
-0,029
-0,036
-0,029
NA
Р110
С
0,204
0,047
0,027
0,024
0,574
0,704
0,772
Р112
С
0,069
0,132
0,036
0,019
0,023
0,783
1,170
Р116
С
0,080
0,023
0,006
0,012
-0,005
0,338
0,841
Р147
С
0,149
0,024
0,029
-0,006
-0,005
0,199
0,597
Р148
С
0,033
0,008
0,016
-0,016
0,006
0,642
0,966
Р194
С
0,343
0,136
0,106
0,042
0,070
0,208
0,633
Р195
С
0,169
0,100
0,046
0,021
0,028
0,816
1,093
Р215
С
0,110
0,037
0,032
0,013
0,029
0,433
0,826
Р216
С
0,171
0,071
0,044
0,035
0,036
0,600
0,906
Р218
С
0,366
0,147
0,082
0,043
0,027
0,664
0,701
Ave (Отношение S/P)
0,135
0,049
0,023
0,004
0,125
0,612
0,922
0,109
0,063
0,031
0,022
0,256
0,358
0,277
*Результаты, выраженные как отношения образец/положительный контроль (S/P);Ave (отношение S/P)±SD=Среднее отношение S/P±стандартное отклонение;NA = не определено; V = вакцинированная группа; С = контроль
V = Вакцинированная группа; С = Контрольная группа; NA = не определено; Помещения 11 или 12: поросят содержали во время всего исследования (фазы вакцинации и заражения); Помещения 11-13 и 12-13: поросят содержали в Помещении 11 или 12 во время фазы вакцинации и перемещали в Помещение 13 в 0 DPC (фаза заражения).
Заражающий штамм PCV2:
А = экспериментальное заражение PCV2 #40895; А+(В) = в дополнение к экспериментальному заражению PCV2 #40895, потенциальное природное контактное заражение вследствие смешивания со свиньей #108 во время фазы либо вакцинации, либо заражения. Однако эти свиньи были защищены от заражения PCV2 и никакого ПЦР-продукта не секвенировали для PCV2B; А+В = экспериментальное заражение PCV2 #40895, природное контактное заражение из-за Свиньи #108, ПЦР-продукт был секвенирован и идентифицирован как PCV2B из того же источника (Свинья #108).
Оценка интенсивности ПЦР-полосы: - отсутствует; ± очень слабая, еле видимая ПЦР-полоса; + выражена; ++ сильно выражена; +++ очень сильно выражена; ++++ чрезвычайно сильно выражена; РСЛ/2-виремия: - = отрицательный результат; Р = положительный результат; Р* = неопределенный результат (единичный случай или две неопределенных ПЦР-полосы)
V = Вакцинированная группа; С = Контрольная группа; NA=не определено;
Помещения 11 или 12; поросят содержали во время всего исследования (фазы вакцинации и заражения); Помещения 11-13 и 12-13: поросят содержали в Помещении 11 или 12 во время фазы вакцинации и перемещали в Помещение 13 в 0 DPC (фаза заражения).
Заражающий штамм PCV2: А = экспериментальное заражение PCV2 #40895; Оценка интенсивности ПЦР-полосы: - отсутствует; ± очень слабая, еле видимая ПЦР-полоса; + выражена; ++ сильно выражена; +++ очень сильно выражена; ++++ чрезвычайно сильно выражена;
PCV2-виремия: - = отрицательный результат; Р = положительный результат; Р* = неопределенный результат (единичный случай или две неопределенные ПЦР-полосы)
V = Вакцинированная группа; С = Контрольная группа; NA = не определено;
Помещения 11 или 12: Поросят содержали во время всего исследования (фазы вакцинации и заражения);
Помещения 11-13 и 12-13: поросят содержали в Помещении 11 или 12 во время фазы вакцинации и перемещали в Помещение 13 в 0 DPC (фаза заражения).
Заражающий штамм PCV2: А+(В)=В дополнение к экспериментальному заражению PCV2 #40895 добавлено потенциальное природное контактное заражение из-за смешивания со свиньей #108 во время либо фазы вакцинации, либо фазы заражения. Однако эти свиньи были защищены от заражения PCV2 и никакого ПЦР-продукта не секвенировали для PCV2B; А+В=экспериментальное заражение PCV2 #40895, природное контактное заражение из-за Свиньи #108, ПЦР-продукт был секвенирован и идентифицирован как PCV2B из того же источника (Свинья #108).
Оценка интенсивности полосы ПЦР: - отсутствует; ± очень слабая, еле видимая ПЦР-полоса; + выражена; ++ сильно выражена; +++ очень сильно выражена; ++++ чрезвычайно сильно выражена; PCV2-виремия: - = отрицательный результат; Р = положительный результат; P* = неопределенный результат (единичный случай или две неопределенные ПЦР-полосы)
Таблица 4А.
Лимфоидное истощение в лимфатических узлах, селезенке и миндалине: общее сравнение*
Группа
Число животных с баллом**
0
1
2
3
Подвздошный лимфатический узел (IL LN)
Вакцинирован-ные животные
13
7
2
2
Контроль
4
9
3
8
Паховый лимфатический узел (IG LN)
Вакцинирован-ные животные
15
7
1
1
Контроль
5
10
6
3
Трахеобронхиальный лимфатический узел (ТВ LN)
Вакцинирован-ные животные
12
11
0
1
Контроль
2
9
9
4
Селезенка
Вакцинирован-ные животные
15
9
0
0
Контроль
7
6
8
3
Миндалина
Вакцинирован-ные животные
19
4
1
0
Контроль
10
4
7
3
*Балльные оценки лимфоидного истощения: 0 = норма, 1 = легкое, 2 = умеренное, 3 = тяжелое
Таблица 4В.
Лимфоидное истощение в лимфатических узлах, селезенке и миндалине: экспериментальное заражение PCV2 (#40895)
Группа
Число животных с баллом*
0
1
2
3
Подвздошный лимфатический узел (IL LN)
Вакцинирован-ные животные
4
4
0
1
Контроль
3
7
2
2
Паховый лимфатический узел (IG LN)
Вакцинирован-ные животные
6
3
0
0
Контроль
5
7
2
0
Трахеобронхиальный лимфатический узел (ТВ LN)
Вакцинирован-ные животные
4
5
0
0
Контроль
2
8
3
1
Селезенка
Вакцинирован-ные животные
6
3
0
0
Контроль
7
5
2
0
Миндалина
Вакцинирован-ные животные
9
0
0
0
Контроль
10
2
2
0
*Балльные оценки лимфоидного истощения:0 = норма, 1 = легкое, 2 = умеренное, 3 = тяжелое
Таблица 4С.
Лимфоидное истощение в лимфатических узлах, селезенке и миндалине: экспериментальное PCV2 (#40895) и природное контактное заражения
Группа
Число животных с баллом*
0
1
2
3
Подвздошный лимфатический узел (IL LN)
Вакцинирован-ные животные
9
3
2
1
Контроль
1
2
1
6
Паховый лимфатический узел (IG LN)
Вакцинирован-ные животные
9
4
1
1
Контроль
0
3
4
3
Трахеобронхиальный лимфатический узел (ТВ LN)
Вакцинирован-ные животные
8
6
0
1
Контроль
0
1
6
3
Селезенка
Вакцинирован-ные животные
9
6
0
0
Контроль
0
1
6
3
Миндалина
Вакцинирован-ные животные
10
4
1
0
Контроль
0
2
5
3
*Балльные оценки лимфоидного истощения:0 = норма, 1 = легкое, 2 = умеренное, 3 = тяжелое
Таблица 5.
Воспаление от гистиоцитарного до гранулематозного с замещением фолликулов в лимфатических узлах, селезенке и миндалине: общее сравнение
Группа
Число животных с баллом*
0
1
2
3
Подвздошный лимфатический узел (IL LN)
Вакцинирован-ные животные
14
2
7
1
Контроль
4
8
7
5
Паховый лимфатический узел (IG LN)
Вакцинирован-ные животные
18
3
3
0
Контроль
8
9
4
3
Трахеобронхиальный лимфатический узел (ТВ LN)
Вакцинирован-ные животные
14
7
3
0
Контроль
4
9
9
2
Вакцинирован-ные животные
20
2
1
1
Контроль
7
12
3
2
Селезенка
Вакцинирован-ные животные
20
2
2
0
Контроль
9
9
4
2
Миндалина
Вакцинирован-ные животные
21
1
2
0
Контроль
5
10
6
3
* Балльные оценки гистиоцитарного замещения:0 = норма, 1 = легкое, 2 = умеренное, 3 = тяжелое
Таблица 6.
Количество PCV2-специфического антигена, продемонстрированного иммуногистохимией (1НС) в лимфатических узлах, селезенке и миндалине: общее сравнение
Группа
Число животных с указанным баллом*
0
1
2
3
Подвздошный лимфатический узел (IL LN)
Вакцинирован-ные животные
17
2
5
0
Контроль
4
6
7
7
Паховый лимфатический узел (IG LN)
Вакцинирован-ные животные
21
1
2
0
Контроль
10
9
4
1
Трахеобронхиальный лимфатический узел (ТВ LN)
Вакцинирован-ные животные
20
2
1
1
Контроль
7
12
3
2
Селезенка
Вакцинирован-ные животные
20
2
2
0
Контроль
9
9
4
2
Миндалина
Вакцинирован-ные животные
21
1
2
0
Контроль
5
10
6
3
Балльные оценки IHC-окрашивания:0 = отсутствует, 1 = низкий уровень, 2 = средний уровень, 3 = высокий уровень