Фармацевтическая композиция для получения лиофилизата культуры клеток печени, обогащенного фактором роста гепатоцитов
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PRODUCING A LYOPHILISATE OF LIVER CELL CULTURE ENRICHED WITH HEPATOCYTE GROWTH FACTOR

Изобретение относится к области медицины, фармацевтической промышленности и биотехнологии и касается состава фармацевтической композиции для приготовления лиофилизата культуры клеток печени, обогащенной фактором роста гепатоцитов (HGF). Последний играет ведущую роль в процессе регенерации печени, например, при ее токсическом повреждении или при лечении пациентов с хронической печеночной недостаточностью.
Известно, что HGF мыши гомологичен HGF человека (Miyazawa К. и др., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163 (1989) cc.967-973; Nakamura Т. и др., Nature 342 (1989) cc.440-443; Seki Т. и др., Biochem. and Biophys. Res. Comm. 172 (1990) cc.321-327; Tashiro К. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) cc.3200-3204; Okajima А. и др., Eur. J. Biochem. 193 (1990) cc.375-381), поэтому биоматериалы мышей, вследствие идентичности действия, применяются в качестве, например, иммунотропных препаратов для человека. Также важно отметить, что проводимые работы по оптимизации методов лечения печени млекопитающих имеют своей основной целью дальнейшее их применение в клинической практике.
Процесс лиофилизации известен давно и применяется в технологии получения фармацевтических субстанций для обеспечения стабильности готовых лекарств при их хранении и транспортировке. Чаще всего лиофилизация применяется при производстве термолабильных препаратов пептидной природы, которые не переносят действия высоких температур, таких как кортексин, ингарон, спленопид, а также лиофилизированный пептид фактора роста гепатоцитов (HGF), при этом лиофилизат самой культуры клеток печени не известен.
Известны способы получения биологически активных веществ из тканей животных применяемых в медицинской практике, такие, как например, лиофилизированный препарат «спленопид», получаемый из селезенки свиней [РФ Патент №2152219 (1998), МПК А61К 35/28; А61К 38/02]. Способ получения препарата заключается в получении пептидов с мол. м. от 400 до 50000 Да из ткани селезенки посредством митогенной стимуляции клеток ткани селезенки в процессе ее отмывки, гомогенизации органа, диспергированием в дистиллированной воде и разрушением клеток замораживанием-размораживанием и ультразвуковой обработкой, отделением экстракта и его ультрафильтрации через фильтры с размером пор с границей раздела 50000 Да. При добавлении к выделенным пептидам наполнителя, препарат получают в лиофилизированной форме, стабильной при хранении в течение двух лет. В качестве биологически активного вещества выступают пептиды в количестве 10-15 мг в дозе. В качестве наполнителя используют желатиноль и раствор гентамицина.
Активным веществом препарата «спленопид» являются пептиды селезенки, которые оказывают иммуномодулирующее действие, но не оказывают стимулирующего влияния на регенерацию тканей. Недостатком лиофилизата «спленопид» является использование в качестве наполнителя раствор гентамицина, который известен широким спектром побочных эффектов в том числе ототоксическим действием вплоть до необратимой глухоты.
Известен способ получения лиофилизата состоящего из фактора роста гепатоцитов (HGF), трегалозы и одного или нескольких соединений, выбранных из группы, состоящей из аргинина, гистидина, лизина, меглюмина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, пролина, креатина, креатинина, трис(гидроксиметил)метиламина и их фармацевтически приемлемых солей [РФ Патент №2693472 (2015), МПК А61К 9/19, А61К 38/00, А61К 47/18, А61К 47/26]. В этой работе в качестве основного вещества предложена одна из аминокислот на выбор: из аргинина, гистидина или лизина. Данный способ позволяет получить лиофилизат в котором массовое соотношение фактора роста гепатоцитов и трегалозы составляет от 1:4 до 1:460, и массовое соотношение фактора роста гепатоцитов и каждого из указанных одного или нескольких соединений составляет от 1:1 до 1:50 в лиофилизированном составе. Перед лиофилизацией рН водного раствора доводят до 4,5-6,5. Фактор роста гепатоцитов в предлагаемом варианте может быть естественного или искусственного происхождения (полученный с помощью методики генной инженерии или может представлять собой модифицированный фактор роста гепатоцитов, который модифицирован с помощью замены, делеции, добавления или вставки или их комбинации с использованием одного или нескольких, предпочтительно 1-10 аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности встречающегося в природе фактора роста гепатоцитов в таком диапазоне, чтобы модифицированная аминокислотная последовательность сохраняла активность фактора роста гепатоцитов.). Модифицированный фактор роста гепатоцитов может представлять собой таковой, характеризующийся, 80% гомологией по отношению к аминокислотной последовательности встречающегося в природе фактора роста гепатоцитов. В качестве стабилизатора предлагается использовать одно, два или более из представленных веществ на выбор: аргинина, гистидина, лизина, меглюмина, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты, пролина, креатина, креатинина, трис(гидроксиметил)метиламина и их фармацевтически приемлемых солей.
Общая масса лиофилизированного состава по твердым частицам составляет 100,0 частей по массе, содержит от 0,1 до 4,5 частей по массе фактора роста гепатоцитов, от 20,0 до 95,0 частей по массе трегалозы (в пересчете на эквивалентное количество ангидрида трегалозы), и от 1,5 до 60,0 частей по массе соединения (аргинин, гистидин, лизин, меглюмин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, пролин, креатин, креатинин, трис(гидроксиметил)метиламин и/или их фармацевтически приемлемых солей). В одном варианте осуществления при том, что общая масса лиофилизированного состава по твердым частицам составляет 100,0 частей по массе, фактор роста гепатоцитов составляет от 0,3 до 4,4 частей по массе, трегалоза составляет от 30,0 до 94,0 частей по массе и соединения (аргинин, гистидин, лизин, меглюмин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, пролин, креатин, креатинин, трис(гидроксиметил)метиламин и их фармацевтически приемлемые соли) составляет от 3,0 до 59,0 частей по массе. В другом варианте осуществления на фактор роста гепатоцитов составляет от 0,3 до 4,4 частей по массе, трегалоза составляет от 30,0 до 94,0 частей по массе, соединения (аргинин, гистидин, лизин, меглюмин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, пролин, креатин, креатинин, трис(гидроксиметил)метиламин и их фармацевтически приемлемые соли) составляют от 3,0 до 59,0 частей по массе и полисорбат 80 составляет от 0,026 до 0,7 частей по массе.
К недостаткам представленного способа относится использование модифицированного фактор роста гепатоцитов, который не в полной мере гомологичен человеческому, а также то, что лиофилизат содержит, только фактор роста гепатоцитов, без культуры клеток печени. Применение HGF приводит к резкому увеличению (скачку) концентрации фактора роста гепатоцитов в органе мишени и неконтролируемому делению гепатоцитов, что ведет к истощению органа. Еще одним недостатком является наличие большого количества вспомогательных и балластных веществ, варьируемых в большом диапазоне концентраций, порядка 100, что может затруднить проведение качественного и количественного анализа основного действующего вещества. Применение в технологической линии метода фильтрации приводит к потерям активного вещества на фильтре.
Известен способ получения жизнеспособных клеток печени человека, в том числе печеночных стволовых клеток/клеток предшественников, [РФ патент №2346981 (2003), МПК C12N 5/00, C12N 5/08, А61К 35/407, А61Р 1/16, G01N 33/00, А61К 48/00, С12Р 21/02].
Согласно патенту, после забора органа, печень промывают стерильным физиологическим раствором и расщепляют перфузатором с использованием буферных растворов. Полученную клеточную суспензию обогащают живыми клетками и центрифугируют. Клетки помещают в криомешки и подвергают замораживанию. Хранят и транспортируют клетки при температуре - 120°С. Получаемая клеточная популяция содержит более 80% жизнеспособных клеток перед криоконсервацией, более 70% жизнеспособных клеток после оттаивания, из которых более 75% являются гепатоцитами.
Недостатком данного изобретения, является то, что для клеток печени предусматривают хранение в парах жидкого азота, что усложняет процедуру хранения и транспортировки данной культуры клеток. Применение возможно только в клиниках имеющих специализированное оборудование для работы с криогенным клеточным материалом. Лиофилизат культуры клеток печени авторами не исследовался.
К недостаткам также следует отнести то, что источником получения гепатоцитов является печень донора или неонатальная печень. Это усложняет процедуру по изъятию органа и является затруднительным для организации промышленного производства препарата.
Наиболее близким (прототип) является способ получения лиофилизата из гепатоцитов человека [Международная заявка WO 2012/154016, МПК А61К 35/48, А61К 35/54, А61К 35/407, C12N 5/073; Каюпов Б.А. и др. «Разработка лиофилизированного препарата из гепатоцитов человека, для лечения печеночной недостаточности» // Клиническая медицина Казахстана. - 2013. - №. 4 (30)].
Метод получения изолированных гепатоцитов был разработан в середине 60-х годов прошлого столетия, и существует большое количество методов его совершенствования. Известный способ осуществляют следующим образом: в качестве источника материала для получения гепатоцитов человека используют печень плода. Забор материала производится непосредственно после прерывания беременности. Производят аттестацию фетального материала, в соответствии международным стандартам на инфицированность тканей, используемых при проведении терапии фетальными тканями и клетками. Фетальный материал тестируют методом ПЦР на следующие возбудители: chlamydia trachomatis, chlamydia pnevmonica, ureaplasmas urelyticum, ureaplasmas parvum, mycoplasma hominis, mycoplasma genitalium, neiseria gonorrhoeae т.1, neiseria gonorrhoeae т.2, trichomonas vaginalis, cytomegalovirus, gardnerella vaginalis, HSV 1,2 (герпевирус), HSV 16 (папиломавирус), HPV 18 (па- пиломавирус), HSV 6 (герпевирус), Candida albicans, treponema pallidum, toxoplasma gondii, mycobacterium tuberculosis, hepatitis A virus, hepatitis В virus, hepatitis С virus, hepatitis D virus, hepatitis G virus, brucelle species, epshteina Barr virus, salmonella. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) фетальный материал исследуется на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В основе методики выделения фетальных гепатоцитов лежит комбинированная (механическая и химическая) фрагментация эмбриональной печени. Для дезагрегации ткань печени инкубируют в ферментном растворе, содержащем 0.25%-ный раствор трипсина и 0.05 раствор коллагеназы в соотношении 1:1 в течение 20-30 минут с последующим многократным суспендированием до получения одноклеточной суспензии, далее последнюю трижды отмывают центрифугированием при 700 об/мин. Полученную взвесь первичных диссоциированных клеток культивируют в ростовой среде RPMI+F12 (1:1), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл гентамицина, с добавлением дексаметазона 0.00125 мл/мл, до достижения клеточной культуры конфлюэнтного состояния. Жизнеспособность клеток определяли с использованием витального красителя - трипановая синь: каплю полученной суспензии окрашивали 0,1% раствором трипанового синего. Гепатоциты, подлежащие лиофилизации, выращивают в оптимальных условиях до начала стационарной фазы роста или окончания процесса культивирования в питательной среде, рост должен быть обильным. Среда, используемая для лиофилизации гепатоцитов:
1. Желатин - 1 г;
2. Сахароза - 10 мг;
3. Вода дистиллированная - 100 мл;
4. Молоко обезжиренное;
5. 6%-ный раствор желатины - 2,5 мл;
6. 10%-ный раствор сахарозы - 0,5 мл;
7. Сыворотка фетальная - 2,5.
9
10
Для успешной лиофилизации плотность в защитной среде должна быть как можно более высокой -10 -10 клеток в 1 мл. Полученную суспензию разливают в ампулы или в пенициллиновые флаконы из нейтрального стекла по 1 мл, замораживают при температуре от - 20° до -70°, затем высушивают на аппарате лиофильной сушки. В период высушивания для предотвращения выноса активных веществ добавляли в качестве структурообразователей 6%-ный раствор желатины 2,5 мл и 10%-ный раствор сахарозы 0,5 мл.
К недостатку известного лиофилизата, следует отнести то, что в качестве клеток печени использованы только отдельно выделенные гепатоциты, но не культура клеток печени. Сами гепатоциты не производят фактор роста гепатоцитов. Кроме того, согласно изобретению в качестве фактора роста авторы используют инсулин и дексаметазон, а не HGF.
Еще одним недостатком является то, что источником получения гепатоцитов является фетальная печень плода. Это усложняет процедуру по изъятию органа и является затруднительным для организации промышленного производства препарата. Для достижения терапевтического эффекта и избегания реакции отторжения клеток, необходимо сопоставление группы крови и резус фактора реципиента и донора, у которого была взята печень для получения гепатоцитов, что делает препарат узконаправленным для конкретного пациента и исключает универсальность его применения. Так как материал забирается у человека, то возникает необходимость в контроле безопасности материала (отсутствие таких возбудителей как: chlamydia trachomatis, chlamydia pnevmonica, ureaplasmas urelyticum, ureaplasmas parvum, mycoplasma hominis, mycoplasma genitalium, neiseria gonorrhoeae т.1, neiseria gonorrhoeae т.2, trichomonas vaginalis, cytomegalovirus, gardnerella vaginalis, HSV 1,2 (герпевирус), HSV 16 (папиломавирус), HPV 18 (папиломавирус), HSV 6 (герпевирус), Candida albicans, treponema pallidum, toxoplasma gondii, mycobacterium tuberculosis, hepatitis A virus, hepatitis В virus, hepatitis С virus, hepatitis D virus, hepatitis G virus, bracelle species, epshteina Ban-virus, salmonella.), что ведет к удорожанию, трудоемкости и длительности процесса производства. Использование трипсина при обработке материала для подготовки клеток ставит под сомнение наличие в лиофилизате фактора роста гепатоцитов в связи с протеолитическим действием фермента.
Задачей настоящего изобретения является составление фармацевтической композиции для получения на ее основе устойчивого при хранении лиофилизата обогащенного фактором роста гепатоцитов.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение универсального препарата-лиофилизата, стимулирующего регенерацию печени при печеночной недостаточности за счет точного дозирования и постепенного высвобождения биологически активного компонента - HGF, который как раз обеспечивает стимуляцию регенерации клеток печени.
Указанный технический результат достигается тем, что фармацевтическая композиция для получения лиофилизата пролонгированного действия, обогащенного фактором роста гепатоцитов HGF, стимулирующая пролиферацию гепатоцитов печени, содержащая клеточную популяцию, отличается тем, что в качестве клеточной популяции и источника HGF, используют культуру клеток печени, а в качестве структурообразователя и пролонгатора растворы поливинилпирролидона, сахарозы и альбумина, при следующем соотношении (масс. части, 10):
культура клеток печени, содержащая HGF
5,0
6%-ный раствор поливинилпирролидона
2,5
10%-ный раствор альбумина
2,0
10%-ный раствор сахарозы
0,5
Указанный технический результат также достигается тем, что в фармацевтической композиции, в качестве источника клеток печени используют клетки печени неонатальных крысят.
Лиофилизат со структурообразующим агентом, полученный из заявляемой фармацевтической композиции, пригоден для приготовления раствора для инъекционного применения для целей лечения печеночной недостаточности, он представляет комплекс в виде культуры клеток печени, обогащенной HGF, а при добавлении фармацевтически приемлемого разбавителя он пригоден для внутривенного введения.
Основным отличием заявляемого изобретения является то, что фармацевтическая композиция и полученный из нее лиофилизат состоят из культуры клеток печени, которые являются естественным источником фактора роста гепатоцитов (HGF), в противоположность лиофилизату, состоящему только из клеток гепатоцитов, как в прототипе. Отличительной особенностью лиофилизата культуры клеток печени является то, что биологически активный компонент лиофилизата, которым является HGF, высвобождается постепенно, тем самым удается избежать резкого скачка повышения концентрации HGF и обеспечить более долговременное действие препарата, чему также способствуют добавленные в композицию и сохранившиеся в сухом лиофилизате поливинилпирролидон, альбумин и сахароза, выступающие в качестве структурообразователя и пролонгатора, кроме того они позволяют предотвратить потерю активных веществ в процессе лиофильной сушки.
Еще одним, отличием от прототипа - лиофилизата гепатоцитов является то, что в заявляемом способе лиофилизат культуры клеток печени, обогащенный фактором роста гепатоцитов, получен из клеток печени неонатальных крысят, что позволит исключить необходимость проведение анализов на наличие заболеваний, и позволяет организовать промышленное производство препарата.
Фактор роста гепатоцитов (HGF) в лиофилизате обеспечивает стимуляцию регенерации клеток печени, универсальность применения, высокую концентрацию активного вещества, точное дозирование, стандартизацию по основному действующему веществу.
Состав компонентов предлагаемой фармацевтической композиции культуры клеток печени, обогащенной HGF, подобран экспериментальным путем и выражается в виде массовых частей (10 ч):
культура клеток печени неонатальных крысят в виде тугой взвеси содержащей
HGF
5,0
6%-ный раствор поливинилпирролидона
2,5
10%-ный раствор альбумина
2,0
10%-ный раствор сахарозы
0,5
Разработан способ получения лиофилизата культуры клеток печени обогащенного фактором роста гепатоцитов: для этого клетки печени культивируют в течение 5 дней для достижения максимальной пролиферативной активности (максимальное содержание HGF - 76,8 нг/мл), затем клетки печени суспендируют в 9 частях среды высушивания, добавляют структурообразователь и пролонгатор в соответствие с формулой и лиофилизируют.
Заявляемый лиофилизат обладает ростостимулирующей активностью обусловленной наличием в составе фактора роста гепатоцитов HGF и стимулирует пролиферацию гепатоцитов. Универсальность применения препарата достигается за счет гомологичности крысиного HGF человеческому. Терапевтический эффект достигается за счет стимуляции регенерации гепатоцитов, вырабатываемых клетками печени.
6
Для культуры клеток печени, полученной из печени неонатальных крысят, в качестве рабочей среды используют коллагеназу. Оценку жизнеспособности культивируемых клеток печени определяют по увеличению концентрации HGF в среде культивирования. Наибольшая концентрация HGF (76,8 нг/мл) в культуре клеток печени при оптимальной величине рН рабочего раствора 7,6 достигается на 5 сутки, что соответствует максимуму пролиферативной активности эмбриональных клеток печени и, следовательно, оптимальной пригодности клеточного материала. Степень жизнеспособности клеток после выделения и очистки составила в среднем 98,8%. По достижении наибольшей концентрации HGF культуру клеток готовят к лиофилизации, для этого клетки в виде концентрированной взвеси размещают в стерильные пробирки с крышкой по 5 мл. Клетки печени суспендируют в 9 частях среды высушивания, концентрация клеток в готовой суспензии должна составлять 10 об%: [5 мл суспензии культуры клеток печени, содержащей 2 × 10 клеток в 1 мл, а также структурообразователь: 2,5 мл 6% раствора поливинилпирролидона, 10%-ный раствор альбумина (2 мл) и 10%-ный раствор сахарозы (0,5 мл)]. Лиофилизацию проводят при температуре -70°С в круглодонной колбе на 50 мл, время высушивания 24 часа, используют лиофильную сушку BETA 2-8LD plus (Германия). Хранение осуществляют при температуре -70°С.
Влияние фармацевтической композиции лиофилизата культуры клеток печени пролонгированного действия, обогащенной HGF, изучали в эксперименте на крысах линии Wistar в течение 6 дней. Моделирование острого токсического повреждения печени выполнены путем подкожного введения четыреххлористого углерода чистого для анализов из расчета 0,5 мг\100 г массы животного по А. Фишеру. Опытным животным осуществляли подкожную инъекцию 0,5 мл лиофилизата культуры клеток печени через 12 часов после введения ССl4. Контрольным животным осуществляли введение физиологического раствора того же объема. Уже на 3 сутки эксперимента результаты показали, что введение лиофилизата приводит к выживанию 53,3% крыс (рфр.=0,2189), в то время как в контрольной группе выжило 40% (рфр=0,0091). К 6-м суткам исследования летальность в контрольной группе составила 100%», в то время как в опытной группе количество умерших особей не менялось с 3-го дня эксперимента, что составило 46,7%.
На фиг. 1 представлена колба объемом 50 мл для проведения лиофилизации;
На фиг. 2 показана лиофилизированная культура клеток печени, обогащенная HGF устойчивая при хранении;
На фиг. 3 приведено патоморфологическое исследование морфологической структуры ткани печени, видно токсическое повреждение печени, после введения физраствора на вторые сутки эксперимента;
На фиг. 4 - морфологическая структура ткани печени, после введения лиофилизата культуры клеток печени на вторые сутки эксперимента.
В доступной литературе отсутствуют сведения о способе изготовления фармацевтической композиции для лиофилизата культуры клеток печени, обогащенного HGF, по отличительным признакам заявляемого способа. Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с ближайшим аналогом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна». Заявляемое техническое решение обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - обеспечение возможности получения фармацевтической композиции лиофилизата культуры клеток печени, с повышенным содержанием концентрации активного вещества - HGF до 240 (198-251) нг/мл, что обеспечивает терапевтический эффект.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».
Фармацевтическая композиция и способ получения фармацевтической композиции лиофилизата культуры клеток печени, обогащенной HGF со структурообразователем, составляющие заявляемое изобретение, предназначены для использования в медицине, а именно в экспериментальной медицине, а также в фармацевтической промышленности. Возможность осуществления предлагаемого технического решениям подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию патентоспособности «промышленная применимость». Ниже приведены примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Способ изготовления фармацевтической композиции для лиофилизата культуры, клеток печени, обогащенной HGF
Неонатальным крысятам вводят внутрибрюшинно раствор тиопентал-натрия в виде 2,5% раствора и после наступления наркоза проводят срединную лапаротомию. Печень извлекают и до начала работ в клеточном боксе по получению клеток хранят в стерильной емкости с рабочей питательной средой.
В чашку Петри наливают 1 мл рабочей среды. Длинным пинцетом извлекают органы из емкости с забора в чашку Петри. Разводят коллагеназу, набирают 1 мл среды с коллагеназой в шприц, меняют иглу на инсулиновую. Придерживая ткани пинцетом, равномерно многократно инъецируют коллагеназу по всему объему ткани печени методом инфильтрации. Накрывают чашку другой (одинакового диаметра). Ставят в термостат.
С помощью малого пинцета и лезвия скользящими движениями измельчают ткань печени, пинцетом удаляют сосуды и капсулу. Добавляют раствор коллагеназы, пинцетом зигзагообразными движениями равномерно распределяют взвесь по объему среды. Ставят в термостат на 10 минут.
Извлекают из термостата. Повторно измельчают фрагменты и при помощи шприца собирают взвесь из чашки. Далее продавливают макрофрагменты ферментативно обработанной ткани через серию медных сит с постепенно уменьшающимся размером ячеек и через иглу для внутримышечной инъекции. Все клеточные элементы, прилипшие к ситам и стенкам иглы, смывают рабочей средой в пробирку для центрифугирования.
Клеточную взвесь вместе со всеми промывными растворами объединяют в пробирке для центрифугирования. Устанавливают 1700-1800 оборотов, время 5 минут. После центрифугирования при помощи шприца забирают среду с коллагеназой из пробирки. Добавляют в пробирку рабочей среды до прежнего количества, встряхивают, центрифугирование повторяют 2 раза.
Надосадочную жидкость удаляют до уровня осажденной клеточной взвеси. Повторно добавляют в пробирки рабочую среду, проводят центрифугирование при 1500 об/мин в течение 30 сек. Затем следует этап разделения в градиенте фиколла, добиваясь удаления клеточного детрита, элементов крови, крупных фрагментов. В каждую пробирку с клеточной взвесью добавляют фиколл в уменьшающейся концентрации. После центрифугирования клеточную взвесь собирают и повторно отмывают рабочей средой (5 минут при 1700 об/мин). Подсчет жизнеспособности клеток проводят с помощью теста на исключение красителя. В суспензию клеток добавляют 0,4%-ный водный раствор трипанового синего (Sigma,CIIIA) и в камере Фукса-Розенталя подсчитывают число неокрашенных и окрашенных клеток. Культивирование эмбриональных клеток печени проводят в течении 5 суток при оптимальной величины рН рабочих растворов 7,6.
Определение HGF в среде культивирования в динамике, предложенное нами, позволяет независимо от календарного срока культивирования выявить максимум пролиферативной активности эмбриональных клеток печени и, тем самым, обеспечить оптимальную пригодность клеточного материала. При оценке жизнеспособности культивируемых клеток печени по предлагаемому способу было выявлено, что содержание HGF менялось в динамике исследования:
среда после центрифугирования клеток (супернатант)- 0,76 (0,57-1,09) нг/мл;
среда культивирования через 2-е суток - 24,3 (18-25,6) нг/мл;
среда культивирования через 5 суток - 76,8 (68,4-80) нг/мл;
среда культивирования через 6 суток - 40,2 (36,1-41) нг/мл.
U
Из приведенных данных следует, что на 5-е сутки культивирования содержание HGF было максимальным. Выявлено достоверное увеличение количества регуляторного пептида на 5-е сутки до 76,8 (68,4-80) нг/мл против 24,3 (18- 25,6) нг/мл на 2-е сутки (р=0,003).
При достижении наибольшей концентрации HGF в среде культивирования оценивают жизнеспособность клеток печени и готовят клетки к лиофилизации. Степень жизнеспособности клеток после выделения и очистки составляет 98,8 (98,3-99,3)%.
После последнего промывания надосадочную жидкость удаляют и готовят клетки к лиофилизации. Клетки в виде концентрированной взвеси размещают в стерильные пробирки с крышечкой по 5 мл.
Клетки печени суспендируют в 9 частях среды высушивания, концентрация клеток в готовой суспензии должна составлять 10 об%. Клеточную суспензию дозируют во флаконы из нейтрального стекла слоем не более 1 см, закрывают стерильными резиновыми пробками и при температуре не более 8°С транспортируют к месту высушивания.
Лиофилизация фармацевтической композиции
6
Лиофилизацию проводят, используя лиофильную сушку BETA 2-8LD plus (Германия, 2013 г) с воздушным охлаждением, с каскадной холодильной установкой, мощность охлаждения 2 × 0,51 кВт, хладагент не содержащий CFC- и H-CFC-фреонов. Лиофилизацию выполняют в колбах по 50 мл - (фиг. 1). На этапе сублимационной сушки 5 мл суспензии культуры клеток печени, содержащей 2 × 10 клеток в 1 мл, а также 2,5 мл структурообразователя - 6%-ного раствора поливинилпирролидона, и 10%-ный раствор альбумина (2 мл) с 10%-ным раствором сахарозы (0,5 мл), замораживают до температуры (-70°С) в круглодонной колбе на 50 мл и помещают в рабочую камеру устройства, время высушивания 24 часа. Хранение осуществляют при температуре -70°С.
В результате получена лиофилизированная культура клеток печени, обогащенная HGF устойчивая при хранении - фиг. 2., с содержанием концентрации активного вещества - HGF до 240 (198-251) нг/мл. Проводят оценку уровня фактора роста гепатоцитов в лиофилизированных образцах. Содержание HGF в среде после 5-ти суток культивирования составляет 76,8 (68,4-80) нг/мл, в лиофилизате 240 (198-251) нг/мл. Для оценки количества HGF используют метод твердофазного иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментного анализатора Stat Fax-2000 (Awareness tehnology INC USA). В работе используют иммуноферментные наборы для специфического определения и измерения HGF (HGF ELISA Kit Biosource, Бельгия) в сыворотке крови крысы, в супернатанте, среде клеточных культур, лиофилизате, буферных растворах.
Лиофилизат имеет вид пористой массы желто-коричневого цвета, легко растворяется в физиологическом растворе или в воде для инъекций, с образованием жидкости соломенно-желтого цвета с характерным запахом.
Пример 2. Влияние препарата на летальность при моделировании острого токсического повреждения печени
Влияние лиофилизата культуры клеток печени пролонгированного действия, обогащенной HGF изучали в эксперименте на крысах линии Wistar в течение 6 дней. Моделирование острого токсического повреждения печени выполняют путем подкожного введения четыреххлористого углерода чистого для анализов из расчета 0,5 мг\100г массы животного по А. Фишеру. Через сутки после индукции острого токсического повреждения печени животных приписывали к экспериментальным группам методом случайного распределения, таким образом, в исследование вводили животных с индуцированной острой печеночной недостаточностью. Опытным животным - группа 1, осуществляли подкожную инъекцию 0,5 мл лиофилизата культуры клеток печени через 12 часов после введения ССl4. Контрольным животным - группа 2 осуществляли введение физиологического раствора того же объема. На 3 сутки эксперимента результаты показали, что введение лиофилизата приводит к выживанию 53,3% крыс (рфр.=0,2189) в группе 1, в то время как в группе 2 выжило 40% (рфр=0,0091). К 6-м суткам исследования летальность в группе 2 составила 100%, в то время как в группе 1 количество умерших особей не менялось с Зго дня эксперимента, что составило 46,7%.
В течение всего времени эксперимента определяли высокий уровень HGF в крови крыс опытной группы (Табл. 1). Уровень HGF на протяжении всего эксперимента у контрольных животных повышался в ответ на повреждение, но в дальнейшем снижался ниже нормальных значений.
Введение лиофилизата повышает выживаемость животных с моделированным острым токсическим поражением печени: Результаты проведенных исследований иллюстрируют фигуры 3 и 4, на которых приведены патоморфологические исследования морфологических структур ткани печени. Фиг. 3 токсическое повреждение печени, введение физ. раствора, вторые сутки эксперимента, где: 1 - очаги коагуляционных центролобулярных и мостовидных некрозов; 2 - участки дискомплексации балочных структур в зонах некрозов; 3 - вакуолизация гепатоцитов. Увеличение 150х. Фиг. 4 - токсическое повреждение печени, введение лиофилизата культуры клеток печени, вторые сутки эксперимента, где: 4 - митозы в гепатоцитах. Увеличение 300х. Окраска гематоксилином и эозином.
Таким образом, получена фармацевтическая композиция для лиофилизата культуры клеток печени, обогащенного HGF. Композиция получена на основе использования методов биотехнологии, и дополнительно содержит структурообразователь и пролонгатор: - 6%-ный раствор поливинилпирролидона, 10%-ный раствор альбумина, 6%-ный раствор сахарозы. Введение лиофилизата культуры клеток печени обогащенного HGF, полученного из фармацевтической композиции, при токсическом повреждении печени у животных позволяет улучшить результаты выживания. Выявлена высокая концентрация HGF в сыворотке крови животных в динамике исследования до 6 суток.