СЛИТАЯ С Fc α-ЦЕПЬ ВЫСОКОАФФИННОГО РЕЦЕПТОРА IgE
Fc FUSION HIGH AFFINITY IgE RECEPTOR α-CHAIN

Область техники, к которой относите изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к слитой с Fc α-цепи высокоаффинного рецептора IgE, которая является пригодной в качестве фармакологического продукта.
[0002] Более конкретно, настоящее изобретение относится к слитой с Fc α-цепи высокоаффинного рецептора IgE, обладающего прекрасной стабильностью при низком pH, ее медицинскому применению.
Уровень техники, предшествующий изобретению
[0003] Иммуноглобулин E（IgE） является представителем группы иммуноглобулинов, который играет роль в аллергических реакциях. IgE, который секретируется B-клетки или экспрессируется на поверхности B-клеток, связывается с высокоаффинным рецептором IgE (FcεRI), встречающимся на поверхности тучных клеток, базофилов и т.д. Когда антигенный белок связывается с IgE на рецепторе на поверхности тучных клеток, IgE принимает форму, в которой он перекрестно связывается с антигеном. Затем высвобождаются химические медиаторы, такие как гистамин или серотонин, которые хранятся во внутриклеточных гранулах. В результате чего индуцируется воспалительная реакция, и появляются симптомы аллергии I типа, такие как телеангиэктазия или повышенная проницаемость сосудов (непатентная литература 1).
[0004] Таким образом, вследствие того, что соединение или белок, который ингибирует связывание IgE с εI, ингибирует связывание IgE с εI, которое происходит на поверхности тучных клеток, базофилов и т.д., ожидают, что такое соединение или белок является терапевтическим средством для аллергических заболеваний I типа, таких как бронхиальная астма, аллергический ринит и аллергический конъюнктивит (непатентная литература 2).
[0005] В последние годы разработали не только общепринятый фармацевтический препарат, содержащий в качестве активного ингредиента низкомолекулярное соединение, но также белковый фармацевтический препарат, который прочно связывается с конкретным рецептором или т.п. в живом организме и обладает превосходными терапевтическими эффектами. Например, этанерцепт известен как терапевтическое средство для ревматоидного артрита. Такой этанерцепт представляет собой состав полностью гуманизированного растворимого рецептора TNFα/LTα, который привлек внимание благодаря роли растворимого рецептора фактора некроза опухоли (TNF) подавлять действие TNF в живом организме, а затем был разработан.
[0006] Можно ожидать, что белковый фармацевтический препарат обладает высокими терапевтическими эффектами. С другой стороны, он может вызывать проблемы, характерные для белкового фармацевтического препарата, в способе его получения.
[0007] В основном, когда антитело или Fc-слитый белок получают в форме фармацевтического препарата, применяют способ очистки с использованием белка A. В этом способе для элюирования представляющего интерес белка, который связывается с белком A, используют буфер с низким значением pH. Кроме того, для инактивации вируса представляющий интерес белок желательно обрабатывать при низком pH в течение определенного периода времени.
[0008] Белок, который обладает низкой стабильностью при низком pH, легко образует агрегаты. Если отношение агрегатов является высоким, происходит снижение эффективности очистки или количества продукции при получении белковых фармацевтических препаратов. Кроме того, в результате смешивания агрегатов в фармацевтических препаратах индуцируется иммунный ответ, и как результат с больше вероятностью возникают серьезные побочные эффекты, такие как анафилаксия.
[0009] Таким образом, нестабильность представляющего интерес белка при низком pH может вызывать проблему при получении белковых фармацевтических препаратов.
[0010] В патентной литературе 1 описан полипептид (иммуноадгезон), содержащий иммуноглобулин и внеклеточный домен. В патентной литературе 1 описан высокоаффинный рецептор IgE в качестве примера такого иммуноадгезона. Однако в этой публикации конкретно не описан слитый белок высокоаффинного рецептора IgE и иммуноглобулина.
[0011] Слитый белок (далее в настоящем описании обозначаемый как "слитый белок A") α-цепи высокоаффинного рецептора IgE (α-цепь εI; далее в настоящем описании обозначаемый как "FCER1A") и иммуноглобулина G1 (IgG1) описан в непатентной литературе 3. Однако слитый белок A, описанный в указанной выше публикации, сильно отличается от белка по изобретению настоящей заявки в отношении способа связывания FCER1A с IgG1 (Fc). Таким образом, белок по изобретению настоящей заявки содержит характерную аминокислотную последовательность в области фрагмента линкера между εI и IgG1.
[0012] В патентной литературе 2 описан слитый белок (NPB301), образуемый связыванием водорастворимого фрагмента высокоаффинного рецептора IgE (εI) с Fc-областью человека через пептидный линкер. Однако белок по изобретению настоящей заявки не содержит пептидный линкер, описываемый в патентной литературе 2. Кроме того, в патентной литературе 2 не описывают, и даже не предлагают характерную аминокислотную последовательность области фрагмента линкера по настоящему изобретению.
[0013] В патентной литературе 3 описан слитый белок FCER1A и иммуноглобулин G2 (IgG2). Однако такой слитый белок, содержащий IgG2, отличается от белка по изобретению настоящей заявки в отношении аминокислотных последовательностей области фрагмента линкера и Fc-области.
[0014] В патентной литературе 4 описан слитый белок FCER1A и IgG1 не являющегося человеком примата. Кроме того, слитый белок FCER1A и IgG1 описан в патентной литературе 5-7. Однако в этих публикациях не описана, и даже не предложена характерная аминокислотная последовательность области фрагмента линкера по настоящему изобретению.
[0015] В указанной выше непатентной литературе 3 и патентной литературе 1-7 не описан и не предложен белок по настоящему изобретению.
Список цитирования
Патентная литература
[0016] Патентная литература 1: патент США № 5565335
Патентная литература 2: международная публикация WO 2012/169735
Патентная литература 3: патентная заявка Китая, выложенная для всеобщего ознакомления, №. 101633698
Патентная литература 4: международная публикация WO 2008/028068
Патентная литература 5: международная публикация WO 2011/056606
Патентная литература 6: международная публикация WO 2008/099178
Патентная литература 7: международная публикация WO 2008/099188
Непатентная литература
[0017] Непатентная литература 1: Chisei Ra, "Allergy no Bunshi Saibo Kiko (Molecular and Cellular Mechanisms of Allergy)," BIO INDUSTRY, 2008, Vol. 25, No. 9, PP．23-39
Непатентная литература 2: Chisei Ra et al., "International Immunology," 1993, Vol. 5, No. 1, PP．47-54
Непатентная литература 3: M. Haak-Frendscho et al., "Journal of Immunology," 1993, Vol. 151, No. 1, PP. 351-358
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0018] Целью настоящего изобретения является предоставление слитой с Fc α-цепи высокоаффинного рецептора IgE, обладающей превосходной стабильностью при низком pH.
Решение проблемы
[0019] Авторы настоящего изобретения проводили тщательные исследования для получения слитой с Fc α-цепи высокоаффинного рецептора IgE, обладающей высокой стабильности при низком pH или высокой температуре. В результате, авторы изобретения выявили, что слитую с Fc α-цепь высокоаффинного рецептора IgE, обладающую высокой стабильностью, можно получать с использованием фрагмента линкера, содержащего три остатка Cys в слитом белке, содержащем α-цепь высокоаффинного рецептора IgE и Fc-область IgG1, таким образом осуществляя настоящее изобретение. В частности, настоящее изобретение является таким, как указано ниже.
[0020] Настоящее изобретение относится к следующим ниже пунктам [1]-[5] и т.д.
[1] Fc-слитый белок, содержащий:
(i) α-цепь высокоаффинного рецептора IgE; и
(ii) Fc-область IgG1, где область фрагмента линкера между (i) и (ii) представляет собой аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
[2] Fc-слитый белок по указанному выше пункту [1], содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, или аминокислотную последовательность, содержащую делецию лизина (K) на C-конце аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.
[3] Fc-слитый белок по указанному выше пункту [1] или [2], который представляет собой димер.
[4] Fc-слитый белок по указанному выше пункту [3], где остатки цистеина в области фрагмента линкера образуют три дисульфидные связи.
[5] Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента Fc-слитый белок по любому из указанных выше пунктов [1]-[4].
[0021] Настоящее описание включает содержание, как описано в патентной заявке Японии № 2015-032231 и 2015-252231, которые являются приоритетными документами настоящей заявки.
Полезные эффекты изобретения
[0022] Белок по настоящему изобретению обладает прекрасной стабильностью при низком pH. Кроме того, белок по настоящему изобретению обладает прекрасной нейтрализующей активностью в отношении IgE. Таким образом, белок по настоящему изобретению является пригодным в качестве белкового фармацевтического препарата для профилактики или лечения аллергических заболеваний I типа, опосредованных IgE.
Краткое описание чертежей
[0023] [Фигура 1] На фигуре 1 представлена активность ингибирующего связывания IgE человека. На фигуре горизонтальная ось означает концентрацию каждого лекарственного средства (моль/л), и продольная ось означает величину количества IgE, связанного с белком 1, иммобилизованным на планшете, которая приведена в виде процентного содержания (свободный IgE (процент относительно контроля)), с использованием в качестве эталона величину связывания, получаемую, когда добавляют предопределенное количество IgE. На фигуре кружок означает величину белка 1, и квадратик означает величина омализумаба, соответственно.
[Фигура 2] На фигуре 2 представлен переход изменения уровня содержания (%) агрегатов при низком pH. На фигуре горизонтальная ось означает количество суток (сутки), и продольная ось означает изменение уровень содержания (%) агрегатов. На фигуре кружок означает величину белка 1, и квадратик означает величину слитого белка A, соответственно.
[фигура 3] На фигуре 3 представлен переход изменения уровня содержания (%) агрегатов в результате тепловой обработки. На фигуре горизонтальная ось означает количество суток (сутки), и продольная ось означает изменение уровня содержания (%) агрегатов. На фигуре кружок означает величину белка 1, и квадратик означает величину слитого белка A, соответственно.
Описание вариантов осуществления
[0024] Варианты осуществления настоящего изобретения более подробно описаны ниже.
[0025] В настоящем изобретении отдельные термины имеют следующие ниже значения, если не указано иное.
[0026] В настоящем изобретении "α-цепь высокоаффинного рецептора IgE (FCER1A)" означает белок, содержащий участок α-цепи, который представляет собой внеклеточный домен высокоаффинного рецептора IgE. α-цепь высокоаффинного рецептора IgE представляет собой, например, белок, представленный в следующей ниже SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 1：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWL
[0027] Описанная выше α-цепь высокоаффинного рецептора IgE включает, например, белок, обладающий идентичностью 90% или более, 95% или более, 97% или более, или 99% или более с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, где идентичность рассчитывают с использованием BLAST (средства поиска основного локального выравнивания (Basic Local Alignment Search Tool) the National Center for Biological Information) или т.п. (например, с использованием параметров по умолчанию), и обладающий способностью связываться с IgE. Кроме того, α-цепь высокоаффинного рецептора IgE также включает белок, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую замену, делецию и/или добавление одной или более, или нескольких аминокислот (от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5 и более предпочтительно от 1 или 2 аминокислот) по сравнению с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, и обладающий способностью связываться с IgE.
[0028] В настоящем изобретении "Fc-область IgG1" означает фрагмент Fc иммуноглобулина G1, а именно константных доменов CH2 и CH3 нативного иммуноглобулина G1. Fc-область IgG1 включает все природный мутант, искусственный мутант и укороченную форму.
[0029] В настоящем изобретении "область фрагмента линкера между α-цепью высокоаффинного рецептора IgE и Fc-областью IgG1" означает область, состоящую из 14 аминокислотных остатков в диапазоне от точки соединения между описанной выше α-цепью высокоаффинного рецептора IgE и описанной выше Fc-областью IgG1 в направлении Fc-области.
[0030] В настоящем изобретении "Fc-слитый белок" означает рекомбинантный белок, содержащий α-цепь высокоаффинного рецептора IgE и Fc-фрагмент иммуноглобулина.
[0031] Белок по настоящему изобретению отличается тем, что область фрагмента линкера между α-цепью высокоаффинного рецептора IgE и Fc-областью IgG1 представляет собой аминокислотную последовательность, представленную в следующей ниже SEQ ID NO: 2.
SEQ ID NO: 2：
EPKSCDKTHTCPPC
[0032] Белок по настоящему изобретению представляет собой предпочтительно Fc-слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в следующей ниже SEQ ID NO: 3 (далее в настоящем описании обозначаемый как "белок 1").
SEQ ID NO: 3：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0033] Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 3, содержит последовательность, образованную слиянием аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 (от Val в положении 1 до Leu в положении 179 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3), аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 (от Glu в положении 180 до Cys в положении 193 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3) и аминокислотной последовательности Fc-фрагмента иммуноглобулина (от Pro в положении 194 до Lys 411 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3) в этом порядке. Такой Fc-слитый белок включает белок, содержащий аминокислотную последовательность, обладающую идентичностью 90% или более, 95% или более, 97% или более, или 99% или более с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, которая отличается от участка аминокислотной последовательности от Glu в положении 180 до Cys в положении 193, который соответствует аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, где идентичность рассчитывают с использованием, например, BLAST (средства поиска основного локального выравнивания (Basic Local Alignment Search Tool) the National Center for Biological Information) или т.п. (например, с использованием параметров по умолчанию), и обладающий способностью связываться с IgE. Кроме того, такой Fc-слитый белок включает белок, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую замену, делеция и/или добавление одной или более, или нескольких аминокислот (от 1 до 10, предпочтительно от 1 до 5 и более предпочтительно 1 или 2 аминокислоты) по сравнению с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, которая отличается от участка аминокислотной последовательности от Glu в положении 180 до Cys в положении 193, который соответствует аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и обладающий способностью связываться с IgE.
[0034] При получении рекомбинантного антитела соучаствуют случаи, когда лизин на C-конце удаляется в результате посттрансляционной модификации. Таким образом, белок по настоящему изобретению может представлять собой Fc-слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую делецию лизина (K) на C-конце описанного выше белка 1. Например, такой Fc-слитый белок, содержащий аминокислотную последовательность, содержащую делецию лизина (K) на C-конце белка 1, представленную в SEQ ID NO: 3, состоит из участка аминокислотной последовательности от положения 1 до положения 410 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3.
[0035] Белок по настоящему изобретению относится к мономеру и димеру Fc-слитого белка, образованного связыванием α-цепи высокоаффинного рецептора IgE с Fc-областью IgG1 через фрагмент линкера, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Три остатка Cys присутствуют в описанной выше области фрагмента линкера (остатки Cys в положениях 184, 190 и 193 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 3), и димер может быть образован дисульфидными связями. В основном, два мономера Fc-слитого белка образуют димер в результате образования трех дисульфидных связей между остатками Cys в тех же положениях, что и положения описанных выше трех остатков Cys, и описанных выше трех остатков Cys. Благодаря описанным выше трем дисульфидным связям димер стабилизируется, и он обладает высокой стабильностью по отношению к низкому pH и высокой температуре. Фраза "обладающий высокой стабильностью по отношению к низкому pH и высокой температуре" означает, например, что образуется только небольшое количество агрегатов в условиях низкого pH и при нагревании. Такую высокую стабильность по отношению к низкому pH или высокой температуре можно подтверждать, например, проведением обработки при низком pH или высокотемпературной обработки белка, а затем измеряя содержание агрегатов в белке гель-фильтрационной хроматографией. Например, даже если Fc-слитый белок по настоящему изобретению хранят при низкой температуре от 2°C до 8°C и предпочтительно 4°C при pH от 1 до 5 и предпочтительно при pH от 2 до 4 в течение от 1 суток до 1 месяца, предпочтительно в течение от 1 суток до 14 суток и более предпочтительно в течение от 5 до 12 суток, или даже если настоящий Fc-слитый белок хранить при температуре от 25°C до 45°C и предпочтительно от 30°C до 40°C в течение от 1 суток до 1 месяца, предпочтительно от 1 суток до 14 суток и более предпочтительно от 1 суток до 7 суток изменение уровня содержания агрегатов является небольшим. Например, когда изменение уровня содержания агрегатов в белке по настоящему изобретению рассчитывают на основании площади пика гель-фильтрационной хроматографии, оно составляет 10% или менее и предпочтительно 8% или менее. Кроме того, по сравнению с Fc-слитым белком, содержащим два или менее остатков Cys в качестве фрагмента линкера, изменение уровня содержания агрегатов в белке по настоящему изобретению является небольшим.
[0036] Белок по настоящему изобретению можно получать, например, следующим ниже способом или способом, ему эквивалентным, или способами, описанными в публикации, или способами, эквивалентными им.
[0037] Белок по настоящему изобретению можно получать способом генетической рекомбинации, который хорошо известен специалисту в данной области техники. Например, получают ДНК, кодирующую белок по настоящему изобретению, а затем конструируют экспрессирующий вектор, содержащий такую ДНК. Затем, прокариотические или эукариотические клетки трансформируют или трансфицируют описанным выше вектором и представляющий интерес белок можно выделять и очищать от культурального супернатанта получаемых клеток.
[0038] Белок по настоящему изобретению также можно получать с использованием экспрессирующих белок клеток, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, вводят в экспрессирующий плазмидный вектор млекопитающего с получением плазмиды экспрессии белка плазмиды, а затем получаемую плазмиду вводят в клетки животного, такие как клетки яичника китайского хомяка (CHO), таким образом, чтобы устанавливать стабильно экспрессирующую линию клеток. Получаемые клетки культивируют, а затем из культурального супернатанта можно получать белок по настоящему изобретению.
[0039] Белок по настоящему изобретению можно выделять и очищать по мере необходимости способами выделения и очистки, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. Примеры способа выделения и очистки включают аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, гидрофобную хроматографию, хроматографию в смешанном режиме, диализ, способ фракционного осаждения и электрофорез. Белок по настоящему изобретению также можно выделять и очищать, комбинируя эти способы один с другом при необходимости.
[0040] Белок по настоящему изобретению также можно подвергать химической модификации, которая хорошо известна специалисту в данной области техники. Примеры химической модификации включают гликозилирование, полиэтиленгликолирование (PEG), ацетилирование и амидирование.
[0041] Вследствие того, что белок по настоящему изобретению обладает нейтрализующей активностью по отношению к IgE, его можно использовать в качестве профилактического или терапевтического средства для различных заболеваний, опосредованных IgE. Например, белок по изобретению настоящей заявки является пригодным в качестве профилактического или терапевтического средства для заболеваний, связанных с аллергией I типа и т.п., таких как бронхиальная астма, эозинофильный отит среднего уха, эозинофильный синусит, аллергический конъюнктивит, аллергический ринит, сенная лихорадка, пищевая аллергия, аллергическое заболевание, вызываемое клещами, крапивница и анафилактический шок.
[0042] Белок по настоящему изобретению обладает прекрасной аффинностью к IgE. Таким образом, белок по настоящему изобретению также можно использовать в качестве " конъюгата белок-лекарственное средство", в котором используют такую аффинность, такого как конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC). Примеры такого "конъюгата белок-лекарственное средство" включают способы использования, такие как "белок 1-лекарственное средство" и "белок 1-линкер-лекарственное средство". В качестве лекарственного средства можно использовать противоаллергическое средство или т.п. Такой конъюгат можно получать способом хорошо известным специалисту в данной области техники.
[0043] Касательно фармацевтической композиции по настоящему изобретению, в зависимости от применения используют различные лекарственные формы. Примеры перорального средства включают таблетку, порошковое средство, гранулу, мелкозернистую гранулу и капсулу. Примеры парентерального средства включают инъекцию, порошки для ингаляции, жидкости для ингаляции, глазные капли, жидкое средство, средство в виде лосьона, средство в виде спрея, назальные капли, средство для капельного вливания, мазь, суппозиторий и пластырь.
[0044] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят различными способами введения в зависимости от использования. Примеры способа введения включают пероральное введение, внутривенное введение, интраперитонеальное введение, подкожное введение, местное введение и внутримышечное введение.
[0045] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают с использованием белка по настоящему изобретению и по меньшей мере одной добавки для фармацевтических препаратов. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать известным фармацевтическим способом в зависимости от ее лекарственной формы. Примеры такой добавки для фармацевтических препаратов включают эксципиент, дезинтегрирующее средство, связывающее средство, смазочное средство, разбавитель, буфер, средство придания тоничности, консервант, стабилизатор и солюбилизатор. Описанная выше добавка для фармацевтических препаратов также включает физиологический раствор и воду для инъекций. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать смешиванием, разбавлением или растворением в описанных выше добавках для фармацевтических препаратов.
[0046] Когда фармацевтическую композицию по настоящему изобретению используют для профилактики или лечения, доза белка по настоящему изобретению, который содержится в ней в качестве активного ингредиента, при необходимости определяют в зависимости от возраста, пола и массы тела пациента, степени заболевания, лекарственной формы, способа введения и т.д. Касательно дозы, применяемой для взрослого при пероральном введении, применяемую дозу можно определять, например, в диапазоне от 0,1 мкг/кг до 1000 мг/кг/сутки. Суточная доза в случае перорального введения предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг/сутки в зависимости от лекарственной формы. Такую суточную дозу можно вводить однократно или делить на два или три введения. Кроме того, дозу, применяемую для взрослого при парентеральном введении, можно определять в диапазоне от 0,01 мкг/кг до 1000 мг/кг/сутки. Суточная доза в случае парентерального введения находится в диапазоне предпочтительно от 0,1 мкг/кг до 10 мкг/кг/сутки, от 1 мкг/кг до 100 мкг/кг/сутки или от 10 мкг/кг до 1000 мкг/кг/сутки в зависимости от лекарственной формы.
Примеры
[0047] Содержание настоящего изобретения более подробно описано в следующих ниже примерах и тестовых примерах. Однако эти примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
[0048] Пример 1
Экспрессия и получение белка 1
(1) Получение вектора для экспрессии белка 1
кДНК, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, вводили в экспрессирующий плазмидный вектор млекопитающего с получением плазмиды экспрессии белка 1.
[0049] (2) Получение экспрессирующих белок 1 клеток
Плазмиду экспрессии белка 1 вводили в клетки яичника китайского хомяка (CHO) для установления стабильно экспрессирующей белок 1 линии клеток. Секрецию белка 1 в культуральный супернатант подтверждали SDS-PAGE.
[0050] Тестовый пример 1
Ингибирующая связывание IgE активность (нейтрализующая IgE активность)
(1) Подготовка аналитического планшета
Белок 1 растворяли в покрывающем буфере и добавляли на микропланшет аликвоту получаемого раствора. Микропланшет оставляли при 4°C в течение 18 или более часов, а затем промывали промывным буфером (PBS-Tween 20). Затем в него добавляли блокирующий раствор (Assay Diluent) (BD Biosciences). Микропланшет оставляли при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем удаляли блокирующий раствор. Планшет промывали промывным буфером, а затем использовали для измерения ингибирующей связывание активности.
[0051] (2) Способ измерения ингибирующей связывание активности
С использованием омализумаба (антитело против IgE человека) в качестве положительного контроля, измеряли ингибирующую связывание IgE активность белка 1 следующим ниже способом.
[0052] Определенное количество IgE человека (ANTIBODYSHOP) смешивали с белком 1 или омализумабом (Novartis) с любой данной концентрацией. Получаемую смесь добавляли в планшет, подготавливаемый, как указано выше (1), а затем его оставляли при комнатной температуре в течение приблизительно 2 часов. После отбрасывания смешанного раствора планшет промывали промывным буфером. В получаемый планшет добавляли меченное HRP антитело против IgE человека (BD Biosciences), а затем оставляли его при комнатной температуре в течение приблизительно 1 часа. Затем раствор с антителом отбрасывали, планшет промывали промывным буфером. В планшет добавляли раствор TMB (3,3',5,5'-тетраметилбензидин). Через определенный период времени добавляли в планшет фосфорную кислоту для блокирования реакции окрашивания. Затем, с использованием планшетного спектрофотометра измеряли оптическую плотность (OD450). На основании количества IgE, связанного с белком 1, иммобилизованным на планшете, оценивали белок 1 и омализумаб в отношении ингибирующей связывание IgE активности (нейтрализующей IgE активности) (фигура 1).
[0053] (3) Результаты
Белок 1 по настоящему изобретению ингибировал связывание IgE с FCER1A зависящим от концентрации образом.
[0054] Тестовый пример 2
Тест на стабильность при низком pH
(1) Получение образца
Процедуру очистки проводили с использованием AKTA Explorer 10S (GE Healthcare). Белок 1 экспрессировали тем же способом, что и способ, описанный в примере 1, а затем культуральный супернатант 2 раза разбавляли D-PBS(-) (фосфатно-солевым буфером Dulbecco). Разбавленный раствор нагружают в HiTrap rProtein A FF (GE Healthcare, 17-5079-01). Описанную выше колонку промывали D-PBS(-), а затем элюировали 100 мМ буфером глицин-HCl (pH 2,2). Фракционировали абсорбируемую белком A фракцию по 1,0 мл/пробирке. Пиковые фракции смешивали друг с другом с получением образца, обрабатываемого при низком pH (pH 2,9). Обрабатываемый при низком pH образец, который хранили при 4°C, использовали в качестве оцениваемого образца. Аликвоты по 0,25 мл отбирали из оцениваемого образца с определенными временными интервалами (от 5 доз 12 суток после хранения при 4°C) и добавляли 0,05 мл o 1 M Tris-HCl буфер (pH 9,0) к аликвоте для ее нейтрализации, таким образом, получая нейтрализованный образец.
[0055] В качестве контроля использовали слитый белок A, описанный в непатентной литературе 3. Слитый белок A экспрессировали тем же способом, что и способ, описанный в пример 1, а затем, получали нейтрализованный образец тем же способом, что и указанный выше способ. Следует отметить, что слитый белок A, используемый в данном тестировании, представляет собой белок, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в следующей ниже SEQ ID NO: 4. Аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID NO: 4, содержит фрагмент линкера, состоящий из фрагмента от Asp в положении 180 до Cys в положении 188, и число остаток Cys, содержащихся в этом фрагменте линкера, составляет 2.
SEQ ID NO: 4：
VPQKPKVSLNPPWNRIFKGENVTLTCNGNNFFEVSSTKWFHNGSLSEETNSSLNIVNAKFEDSGEYKCQHQQVNESEPVYLEVFSDWLLLQASAEVVMEGQPLFLRCHGWRNWDVYKVIYYKDGEALKYWYENHNISITNATVEDSGTYYCTGKVWQLDYESEPLNITVIKAPREKYWLDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0056] (2) Способ анализа содержания агрегатов
Касательно процедуры анализа агрегатов, содержание агрегатов подтверждали проведением гель-фильтрационной хроматографии с использованием Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, 17-5175-01), с применением AKTA Explorer 10S (GE Healthcare), а также с использованием D-PBS(-) в качестве подвижной фазы. Рассчитывали площади пиков, элюируемое положение которых явялось мономером, и пик агрегатов, элюируемых в высокомолекулярной области, и оценивали переход изменения уровня содержания агрегатов (%) в белке 1 и слитом белке A, который вызывали обработкой при низком pH (фигура 2).
[0057] (3) Результаты
В белке по настоящему изобретению повышенный уровень образования агрегатов, связанный со временем обработки при низком pH, являлся значительно меньше, чем уровень образования агрегатов в случае слитого белка A, и, таким образом, белок по настоящему изобретению обладал высокой стабильностью в отношении воздействия низким pH. Таким образом, белок по настоящему изобретению является превосходным с точки зрения стабильности при низком pH, и, таким образом, ожидают улучшение эффективности очистки и производительности в способе получения.
Тест на стабильность при высокой температуре
(1) Получение образца
Процедуру очистки проводили с использованием AKTA Explorer 10S (GE Healthcare). Белок 1 экспрессировали тем же способом, что и способ, описанный в примере 1, а затем его культуральный супернатант нагружали в HiTrap MabSelect SuRe (GE Healthcare, 17-0034-94). Описанную выше колонку промывали D-PBS(-) и 100 мМ цитратным буфером (pH 4,0), а затем адсорбируемый белок A элюировали 100 мМ буфера глицин-HCl (pH 3,3). К выделенной фракции добавляли 1 M Tris-HCl буфер (pH 9,0) в объеме 1/10 для ее нейтрализации, таким образом, получая белок A-очищенный белок. pH такого белок A-очищенный белок доводили до pH 4,0 добавлением 1н. HCl, а затем нагружали его в колонку, наполненную смолой смешанного режима для гидрофобного взаимодействия и катионного обмена. Неадсорбированный белок промывали 50 мМ ацетатным буфером (pH 4,0), а затем проводили элюирование в 100% линейном градиенте с использованием 50 мМ Tris-Hcl буфера (pH 9,0). Выделяли фракцию пика с получением очищенного белка. Получаемый белок подвергали гель-фильтрационному фракционированию с использованием D-PBS(-) в качестве подвижной фазы и с применением HiLoad 16/60 Superdex степень чистоты 200 (GE Healthcare, 17-1069-01). Выделяли фракцию пика, соответствующую мономеру, с получением очищенного гель-фильтрацией образца. Такой очищенный гель-фильтрацией образец снова доводили D-PBS(-), а затем переливали его в микропробирки с последующей инкубацией при 37°C, таким образом, получая оцениваемый образец. Отбирали аликвоту из этого оцениваемого образца с определенными временными интервалами (от 1 суток до 7 суток после хранения при 37°C), таким образом, получая a образец после тепловой обработки.
[0059] В качестве контроля использовали слитый белок A, описанный в непатентной литературе 3. Слитый белок A экспрессировали тем же способом, что и способом в примере 1, а затем получали образец после тепловой обработки тем же способом, что и указанный выше способ. Следует отметить, что слитый белок A, используемый в настоящем тесте, представляет собой белок, состоящий из той же аминокислотной последовательности, что и аминокислотная последовательность белка, используемого в тестовом примере 2.
[0060] (2) Способ анализа содержания агрегатов
Касательно процедуру анализа агрегатов, содержание агрегатов подтверждали проведением гель-фильтрационной хроматографии использованием Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare, 17-5175-01), с применением AKTA Explorer 10S (GE Healthcare), а также с использованием D-PBS(-) в качестве подвижной фазы. Рассчитывали области пика, элюированное положение которого являлось мономером, и суммарный пик, элюированный в высокомолекулярной области, и оценивали переход изменения уровня содержания агрегатов (%) в белке 1 и слитом белке A, который вызывали тепловой обработкой (фигура 3).
[0061] (3) Результаты
В белке по настоящему изобретению повышенный уровень содержания агрегатов после хранения при 37°C являлся ниже, чем уровень содержания агрегатов в случае слитого белка A, и таким образом, белок по настоящему изобретению характеризовался большей стабильностью в отношении воздействия при 37°C. Таким образом, белок по настоящему изобретению является превосходным с точки зрения стабильности с точки зрения воздействия высокой температуры, а также стабильности при низком pH, и, таким образом, ожидают улучшение эффективности очистки и производительности в способе получения.
Применимость в промышленности
[0062] Вследствие того, что белок по настоящему изобретению обладает прекрасной нейтрализующей активностью по отношению к IgE, его можно использовать в качестве белкового фармацевтического препарата для профилактики или лечения различных заболеваний, опосредованных IgE.
Свободный текст секвенирования
[0063] SEQ ID NO: 2 синтезированная
[0064] Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Kissei Pharmaceutical Co., Ltd.
<120>  СЛИТАЯ С FС АЛЬФА-ЦЕПЬ ВЫСОКОАФФИННОГО РЕЦЕПТОРА IgE
<130>  PH-6451-PCT
<150>  JP 2015-032231
<151>  2015-02-20
<150>  JP 2015-252231
<151>  2015-12-24
<160>  4
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  179
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1               5                   10                  15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20                  25                  30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35                  40                  45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50                  55                  60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85                  90                  95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100                 105                 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115                 120                 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130                 135                 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165                 170                 175
Tyr Trp Leu
<210>  2
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтетическая
<400>  2
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
1               5                   10
<210>  3
<211>  411
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1               5                   10                  15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20                  25                  30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35                  40                  45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50                  55                  60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85                  90                  95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100                 105                 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115                 120                 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130                 135                 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165                 170                 175
Tyr Trp Leu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
180                 185                 190
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
195                 200                 205
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
210                 215                 220
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
225                 230                 235                 240
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
245                 250                 255
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
260                 265                 270
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
275                 280                 285
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
290                 295                 300
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
305                 310                 315                 320
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
325                 330                 335
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
340                 345                 350
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
355                 360                 365
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
370                 375                 380
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
385                 390                 395                 400
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405                 410
<210>  4
<211>  406
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Val Pro Gln Lys Pro Lys Val Ser Leu Asn Pro Pro Trp Asn Arg Ile
1               5                   10                  15
Phe Lys Gly Glu Asn Val Thr Leu Thr Cys Asn Gly Asn Asn Phe Phe
20                  25                  30
Glu Val Ser Ser Thr Lys Trp Phe His Asn Gly Ser Leu Ser Glu Glu
35                  40                  45
Thr Asn Ser Ser Leu Asn Ile Val Asn Ala Lys Phe Glu Asp Ser Gly
50                  55                  60
Glu Tyr Lys Cys Gln His Gln Gln Val Asn Glu Ser Glu Pro Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Phe Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Ala Glu Val
85                  90                  95
Val Met Glu Gly Gln Pro Leu Phe Leu Arg Cys His Gly Trp Arg Asn
100                 105                 110
Trp Asp Val Tyr Lys Val Ile Tyr Tyr Lys Asp Gly Glu Ala Leu Lys
115                 120                 125
Tyr Trp Tyr Glu Asn His Asn Ile Ser Ile Thr Asn Ala Thr Val Glu
130                 135                 140
Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Thr Gly Lys Val Trp Gln Leu Asp Tyr
145                 150                 155                 160
Glu Ser Glu Pro Leu Asn Ile Thr Val Ile Lys Ala Pro Arg Glu Lys
165                 170                 175
Tyr Trp Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
180                 185                 190
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
195                 200                 205
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
210                 215                 220
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
225                 230                 235                 240
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
245                 250                 255
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
260                 265                 270
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
275                 280                 285
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
290                 295                 300
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
305                 310                 315                 320
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
325                 330                 335
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
340                 345                 350
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
355                 360                 365
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
370                 375                 380
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
385                 390                 395                 400
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405
<---