АНТИМИКРОБНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
ANTIMICROBIAL COMPOSITION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к антимикробным композициям, а также к их применению и способам лечения или предупреждения бактериальных, грибковых или паразитарных инфекций.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В мировых масштабах проблема бактериальной устойчивости к лекарственным средствам выросла до такой степени, что у некоторых микроорганизмов (например, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli и Staphylococcus aureus) выработалась резистентность к целому ряду различных антибиотиков. По данным Центров по контролю и профилактике болезней (англ. - CDC, от Centres for Disease Control and Prevention) в 2013 г. было зарегистрировано более 2 миллионов заражений антибиотикорезистентными микроорганизмами и более 23 тысяч случаев смерти от этих инфекций. Немногим меньше половины этих смертей (11000) произошло из-за метициллин-резистентного золотистого стафилококка S. aureus (англ. MRSA - methicillin-resistant S. aureus). Другим микроорганизмом, явившимся причиной значительного количества смертей (14000, даже больше, чем от MRSA) в 2013, была Clostridium difficile. Эта бактерия оказалась чрезвычайно устойчивой к воздействию антибиотиков. Однако резистентность С. difficile обуславливается ее способностью продуцировать споры, а не специфической резистентностью штамма (поэтому она не включена в общее годовое количество смертельных случаев от инфекций, резистентных к воздействию антибиотика).
В современной кинической отрасли большим спросом пользуются комбинации антимикробных препаратов с повышенной эффективностью. Комбинированную антибиотикотерапию используют для расширения бактериального спектрального диапазона, во избежание развития резистентности или полирезистентности и для получения лучшего клинического результата. Понимание механизма антимикробных действий и поиск потенциальных антимикробных агентов являются жизненно важными для разработки эффективного сочетания антимикробных препаратов.
Ввиду растущей проблемы устойчивости к антибиотикам необходимы новые композиции антибиотиков, которые были бы эффективными в отношении самых разнообразных микроорганизмов, в особенности, антибиотикорезистентных микроорганизмов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает новую комбинацию соединений чеснока с биофлавоноидами и/или органическими кислотами, способную обеспечивать антимикробное действие, предпочтительно, синергическое антимикробное действие, в отношении широкого спектра микроорганизмов, в том числе бактерий, грибов и паразитов.
Настоящее изобретение предлагает антимикробную композицию, включающую в себя по меньшей мере один экстракт чеснока и один или более биофлавоноид и/или органическую кислоту. Композиция может содержать по меньшей мере один экстракт чеснока и по меньшей мере один биофлавоноид или по меньшей мере один экстракт чеснока и по меньшей мере одну органическую кислоту. Композиция также может включать в себя по меньшей мере один экстракт чеснока, по меньшей мере один биофлавоноид и по меньшей мере одну органическую кислоту.
Соотношение концентраций экстракта чеснока и биофлавоноида может составлять приблизительно 1-16:16-1. Например, соотношение концентраций экстракта чеснока и биофлавоноида составляет приблизительно 1-4:4-1. Аналогично, соотношение концентраций экстракта чеснока и органической кислоты может составлять приблизительно 1-16:1-1, например, соотношение концентраций экстракта чеснока и органической кислоты составляет приблизительно 1-4:4-1. В случае, если композиция содержит по меньшей мере один экстракт чеснока, по меньшей мере один биофлавоноид и по меньшей мере одну органическую кислоту, соотношение концентраций экстракта чеснока, биофлавоноида и органической кислоты может составлять приблизительно 1-16:1-16:1-16. В качестве альтернативы, соотношение концентраций экстракта чеснока, биофлавоноида и органической кислоты может составлять приблизительно 1-4:1-4:1-4.
Экстракт чеснока может быть выбран из одного или более из необработанного чеснока, аллицина и аджоена; биофлавоноид при этом может быть выбран из одного или более из группы, состоящей из флавонов, флавонолов, флаванонов, флаванонгликозидов, флаванонолов, флаванов и антоцианидинов. Эти биофлавоноиды могут быть одним или более из акацетина, роифолина, лютеолина, апигенина, тангеритина, кверцетина, кемпферола, мирицетина, физетина, галангина, изорамнетина, пачиподола, рамназина, гесперетина, нарингенина, эриодиктиола, гомоэриодиктиола, нарингина, гесперидина, неогесперидина, катехина, кардамонина, процианидина, силибинина, генистеина или любой их комбинации. Органическая кислота, используемая в настоящем изобретении, может быть выбрана из одной или более из карбоновых кислот и сульфокислот, таких как молочная кислота, масляная кислота, пропионовая кислота, валериановая кислота, капроновая кислота, уксусная кислота, муравьиная кислота, лимонная кислота, щавелевая кислота, сорбиновая кислота, бензойная кислота, каприловая кислота и яблочная кислота или любая их комбинация.
Настоящее изобретение предлагает антимикробную композицию, которая также может включать в себя фармацевтически приемлемые носитель и/или вспомогательное вещество. Композиция может быть приготовлена с возможностью перорального, местного, внутривенного, внутримышечного, ректального (суппозиторий), ингаляционного, инфузионного, трансдермального, сублингвального, подкожного или интраназального способов введения.
Антимикробная композиция может быть антибактериальной композицией, противогрибковой композицией или антипаразитарной композицией. Композиция может применяться для лечения или предупреждения бактериальных инфекций, таких как грамотрицательные или грамположительные бактериальные инфекции, грибковых инфекций или паразитарных инфекций, в зависимости от конкретного случая.
Настоящее изобретение предлагает способ лечения или предупреждения бактериальной инфекции, где способ включает в себя введение антимикробной композиции, содержащей по меньшей мере один экстракт чеснока и один или более биофлавоноид и/или органическую кислоту. Настоящее изобретение также предлагает способ лечения или предупреждения грибковой инфекции, включающий в себя введение антимикробной композиции, содержащей по меньшей мере один экстракт чеснока и один или более биофлавоноид и/или органическую кислоту. Настоящее изобретение также предлагает способ лечения или предупреждения паразитарной инфекции, включающий в себя введение антимикробной композиции, содержащей по меньшей мере один экстракт чеснока и один или более биофлавоноид и/или органическую кислоту.
Настоящее изобретение также раскрывает применение антимикробной композиции, содержащей по меньшей мере один экстракт чеснока и один или более биофлавоноид и/или органическую кислоту, при изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения бактериальной инфекции у субъекта, либо при изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения грибковой инфекции у субъекта, либо при изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения паразитарной инфекции у субъекта.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Было установлено, что комбинация экстракта чеснока с биофлавоноидом и/или органической кислотой, как это предусмотрено в композициях по настоящему изобретению, обеспечивает необычное и неожиданное синергическое действие в отношении патогенных микроорганизмов. Этот синергический эффект композиций по настоящему изобретению был определен исходя из антимикробной активности композиций. В частности, синергизм был определен в случаях, когда антимикробная активность композиции, содержащей смесь двух или более компонентов, оказывалась выше, чем суммарная антимикробная активность каждого из компонентов по отдельности.
Без ограничения теорией есть основания полагать, что формы антимикробного действия каждого из компонентов обуславливают антимикробный синергический эффект, наблюдаемый при объединении компонентов. Например, соединения чеснока, такие как аллицин, оказывают окисляющее действие на поверхность микроорганизмов. Однако аджоен действует внутриклеточно, затрагивая ферментную функцию. Биофлавоноиды проникают через клеточные мембраны и действуют внутриклеточно. Биофлавоноиды, как известно, обладают фермент-ингибирующей активностью, они ингибируют энергетический метаболизм и, как можно предположить, нарушают целостность клеточных мембран, что приводит к ингибированию макромолекул.
С другой стороны, органические кислоты могут преодолевать клеточные мембраны, изменяя при этом внутриклеточную величину рН. Например, муравьиная кислота ингибирует ферментную активность, в особенности, ферментную активность декарбоксилазы; уксусная кислота ингибирует ферментную активность и повышает термочувствительность; пропионовая кислота влияет на ингибирование мембранного транспорта при синтезе некоторых аминокислот; молочная кислота ингибирует ферментную активность; сорбиновая кислота и бензойная кислота также ингибируют ферментную активность, поглощение аминокислот (индуцируют повреждение клеточной мембраны) и синтез РНК (англ. RNA) и/или ДНК (англ. DNA); каприловая кислота объединяется с клеточной стенкой благодаря ее липофильному характеру, что приводит к последующей протечке клеток.
Синергическая антимикробная активность композиций по настоящему изобретению может обеспечить улучшенную терапию патогенных микроорганизмов и играть важную роль в борьбе с нарастающей проблемой резистентности к антибиотикам.
Антимикробные композиции по настоящему изобретению могут уничтожать и/или ингибировать рост микроорганизмов, включая бактерии, грибы, водоросли, простейшие, вирусы и субвирусные агенты. Композиции могут быть бактерицидными или бактериостатическими и могут являться дезинфицирующими средствами, антисептическими средствами или антибиотиками. Антимикробные композиции по изобретению могут быть антибактериальными, противогрибковыми или антипаразитарными.
Чеснок, также известный как чеснок посевной Allium sativum, является разновидностью луковичных растений. Экстракты чеснока, используемые в настоящем изобретении, могут включать один или более из необработанного чеснока, аллицина, аджоена или их комбинации. Экстракты чеснока также могут быть диаллилдисульфидом (англ. DADS - diallyl disulphide) или S-аллилцистеином (англ. SAC - S-allyl cysteine). Необработанный чеснок может быть, например, в свежем или в измельченном виде, и включает в себя сок чеснока, мякоть, настойку, измельченный чеснок, дистиллят чеснока, остатки чеснока, выжимки или жмых чеснока.
Аллицин (S-2-пропенил-2-пропен-1-сульфинотиолат) является высокореакционноспособным серосодержащим соединением, получаемым из чеснока и других разновидностей Allium. Аллицин не присутствует в чесноке в естественных условиях, а образуется, когда при повреждении клеток из вакуолей высвобождается фермент аллииназа (аллиин лиаза) и взаимодействует с аллиином ((2R)-2-амино-3-[(S)-проп-2-енилсульфинил]пропановой кислотой), превращая его в аллицин. Аллицин, подходящий для использования в композициях по настоящему изобретению, может быть получен из природного, синтетического или частично синтетического источника.
Аджоен ((Е,Z)-4,5,9-тритиадодека-1,6,11-триен-9-оксид) является другим серосодержащим соединением, образующим два различных изомера (Е & Z). В настоящем изобретении он может использоваться в виде смеси двух изомеров либо может представлять собой чистый Е- или Z-аджоен. Аджоен получают при термическом разложении аллицина в особых условиях.
Композиции изобретения предпочтительно содержат по меньшей мере один экстракт чеснока и по меньшей мере один биофлавоноид, или по меньшей мере один экстракт чеснока и по меньшей мере одну органическую кислоту, или по меньшей мере один экстракт чеснока, по меньшей мере один биофлавоноид и по меньшей мере одну органическую кислоту.
Композиции согласно изобретению могут включать в себя определенные соотношения компонентов. Например, соотношение экстракта чеснока и биофлавоноида может составлять приблизительно 1-16:16-1, предпочтительно, 1-4:4-1. Аналогично, соотношение экстракта чеснока и органической кислоты может составлять приблизительно 1-16:16-1, предпочтительно, 1-4:4-1. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения, соотношение экстракта чеснока, биофлаваноида и органической кислоты может составлять приблизительно 1-16:1-16:1-16, предпочтительно, приблизительно 1-4:1-4:1-4. Один из примеров композиции из экстракта чеснока, биофлавоноида и органической кислоты имеет соотношение концентраций 1:4:2.
Биофлавоноиды (также известные как флавоноиды) представляют собой полифенольные соединения природного происхождения, вырабатываемые растениями. Химически биофлавоноиды имеют структуру 15-углеродного скелета, состоящую из двух фенильных колец и гетероциклического кольца, и подразделяются на группы в зависимости от своей основной структуры. Биофлавоноиды, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают в себя антоксантины, такие как флавоны, флавонолы, флаваноны (в том числе флаванон-гликозиды), флаванонолы, флаван, антоцианидины или любые их комбинации. В качестве альтернативы, биофлавоноиды также могут быть изофлавоноидами или неофлавоноидами.
Подходящие флавоны для использования в настоящем изобретении включают акацетин, роифолин (апигенин 7-О-неогесперидозид), лютеолин, апигенин и тангеритин. Флавонолы включают кверцетин, кемпферол, мирицетин, физетин, галангин, изорамнетин, пачиподол, рамназин, пиранофлавонолы и фуранофлавонолы. Флаваноны включают гесперетин, нарингенин, эриодиктиол и гомоэриодиктиол, а также флаванон-гликозиды, такие как нарингин, гесперидин и неогесперидин.
Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению содержат один или более из акацетина, роифолина, лютеолина, апигенина, тангеритина, кверцетина, кемпферола, мирицетина, физетина, галангина, изорамнетина, пачиподола, рамназина, гесперетина, нарингенина, эриодиктиола, гомоэриодиктиола, нарингина, гесперидина, неогесперидина, катехина, кардамонина, процианидина, силибинина, генистеина или их комбинации.
Композиции согласно изобретению могут содержать аллицин с одним или более из флавона, флавонола, флаванона, флаванонола, флавана и антоцианидина или их комбинации. В качестве альтернативы, композиции согласно изобретению могут содержать аджоен с одним или более из флавона, флавонола и флаванона, флаванонола, флавана и антоцианидина или их комбинации. Согласно вариантам осуществления изобретения, композиции также могут содержать одну или более органическую кислоту.
Органические кислоты представляют собой органические соединения, обладающие кислотными свойствами, и включают карбоновые кислоты и сульфокислоты. Подходящие органические кислоты для использования в композициях по настоящему изобретению включают, не ограничиваясь перечнем, молочную кислоту, масляную кислоту, пропионовую кислоту, валериановую кислоту, капроновую кислоту, уксусную кислоту, муравьиную кислоту, лимонную кислоту, щавелевую кислоту, сорбиновую кислоту, бензойную кислоту, каприловую кислоту и яблочную кислоту или любую их комбинацию.
Композиции по настоящему изобретению могут дополнительно включать в себя один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или вспомогательных веществ, таких как разбавители, адъюванты, вспомогательные вещества, носители, наполнители, связующие, разрыхлители, увлажняющие агенты, эмульгирующие агенты, суспендирующие агенты, ароматизирующие добавки, буферы, дисперсанты, загустители, средства для повышения растворимости, смазывающие вещества и диспергирующие агенты, в зависимости от характера способа введения и лекарственных форм.
Композиции могут иметь форму, например, твердых препаратов, включая таблетки, капсулы, драже, пастилки для рассасывания, гранулы, порошки, пилюли и капсулы; и жидких препаратов, включая гели, лосьоны, суспензии, эликсиры, сиропы, суспензии, аэрозоли, эмульсии и растворы.
Композиция по настоящему изобретению может вводиться в форме композиции, содержащей любой подходящий дополнительный компонент, такой как дополнительный антимикробный агент, биологически активная добавка или пищевая добавка.
Композиция по настоящему изобретению также может содержать такие добавки, как вкусоароматические добавки, красители, стабилизаторы, консерванты, искусственные и натуральные подсластители и тому подобное.
Композиции по настоящему изобретению могут применяться для лечения или предупреждения бактериальной инфекции. Бактериальная инфекция может быть грамположительной бактериальной инфекцией или грамотрицательной бактериальной инфекцией либо их комбинацией. Грамположительные бактерии включают, например, Streptococci, такие как S. viridans, Staphylococci, такие как S. Aureus, и Bacillus, такие как В. subtilis, В. anthracis и В. cereus.
Грамотрицательные бактерии включают, например, Е.coli, Pseudomonas, тате как P. aeruginosa, и Klebsiella, такие как K. pneumonia, K. aerogenes и K. oxytoca. Предпочтительно, инфекция является грамотрицательной бактериальной инфекцией. Композиция также может применяться для лечения или предупреждения грамположительной бактериальной инфекции.
Композиции по настоящему изобретению могут применяться для лечения или предупреждения грибковой инфекции. Грибковая инфекция может быть кандидозной инфекцией Candida, например, инфекцией с C. albicans, С. parapsilosis или С. tropicalis, либо их комбинацией.
Настоящее изобретение также предлагает способы лечения или предупреждения бактериальных, грибковых или паразитарных инфекций, при этом способы включают в себя введение антимикробной композиции по изобретению пациенту, нуждающемуся в этом.
Композиция может быть приготовлена с возможностью перорального, местного, внутривенного, внутримышечного, ректального (суппозиторий), трансдермального, сублингвального, подкожного или интраназального способов введения. Предпочтительно, композицию готовят с возможностью с перорального или местного способов введения.
Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения, композицию можно объединять с пищей или пищевыми продуктами перед пероральным применением. Препараты в твердой или жидкой форме можно подмешивать в пищу или пищевые продукты либо вносить в пищу, пищевой продукт или корм субъекта. Такие твердые формы включают порошки, гранулы, пилюли и тому подобное.
Согласно некоторым вариантам осуществления, субъектом является человек, примат, бык или корова, овца, лошадь, свинья, птица, грызун (такой как мышь или крыса), кошка или собака. Предпочтительно, субъектом является человек. Субъектом также могут быть продуктивные животные, такие как крупный рогатый скот, быки, олени, козы, овцы и свиньи, рабочие и спортивные животные, такие как собаки, лошади и пони, животные-компаньоны, такие как собаки и кошки, и лабораторные животные, такие как кролики, крысы, мыши, хомяки, песчанки или морские свинки.
Настоящее изобретение также раскрывает применение антимикробной композиции, содержащей по меньшей мере один экстракт чеснока и один или более биофлавоноид и/или органическую кислоту, при изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения бактериальной инфекции у субъекта, либо при изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения грибковой инфекции у субъекта, либо при изготовлении лекарственного средства для лечения или предупреждения паразитарной инфекции у субъекта.
Антимикробная композиция в соответствии с настоящим изобретением может применяться для лечения или профилактики против типичных патологических микроорганизмов, в особенности, широко распространенных микроорганизмов и тех из них, которые могут быть симбионтами тела человека или млекопитающих. Такие микроорганизмы могут включать в себя болезнетворные микроорганизмы, присутствующие в верхних дыхательных путях, желудочно-кишечном тракте, ротовой полости, на коже, в мочевыводящих путях или женских половых путях человека или млекопитающих.
Настоящее изобретение включает в себя признаки, содержащиеся в прилагаемой формуле изобретения, а также признаки предшествующего описания. Хотя данное изобретение описано в его предпочтительной форме с некоторой степенью конкретности, понятно, что настоящее раскрытие предпочтительной формы было сделано исключительно в качестве примера, и что можно прибегнуть к многочисленным изменениям в особенностях конструкции и комбинации и в расположении частей в пределах объема изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Далее изобретение описано с помощью конкретных вариантов осуществления со ссылкой на прилагаемые графические материалы, на которых:
На Фиг. 1 изображена реакция грамположительных бактерий (В. subtilis, S. aureus и S. viridans) (1А), грамотрицательных бактерий (Е.coli, P. aeruginosa и K. pneumonia) (1В) и дрожжей (С. tropicalis) (1С) на аллицин, а также реакция бактерий (В. subtilis, S. aureus, S. viridans, E.coli, P. aeruginosa и K. pneumonia) (1D) и дрожжей (С. tropicalis) (1Е) на аджоен.
На Фиг. 2 изображены структуры роифолина (А), акацетина (В), нарингина (С), нарингенина (D), кверцетина (Е), аллицина (F) и аджоена (G).
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ниже представлены примеры, иллюстрирующие различные аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения. Эти примеры никоим образом не предназначены для ограничения раскрытого изобретения, ограниченного только формулой изобретения.
Пример 1
Синергический тест между экстрактами чеснока и биофлавоноидами
Был проведен синергический тест, чтобы проверить, может ли антимикробная эффективность аллицина и аджоена синергически усиливаться полифенолами флавоновой (такими, как роифолин), флавонольной (такими, как кверцетин), флаваноновой (такими, как нарингенин) и флаванонгликозидной (например, нарингином) групп биофлавоноидов.
Наличие синергизма определяли путем вычитания индивидуальных результатов ингибирования для каждого соединения из результата смешанного ингибирования для соответствующих соединений и концентраций. Любой результат, превышающий 0, считали синергическим, поскольку комбинация имела больший эффект, чем сумма ее отдельных частей.
Для определения минимальной подавляющей концентрации (англ. MIC, minimal inhibitory concentration) биофлавоноидов (ВС), аллицина (AL) и аджоена (AJ) в отношении выбранных грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий и дрожжей осуществляли модифицированный анализ методом разведения в жидкой питательной среде с использованием 96-луночных планшетов, согласно Wiegand, Hilpert и Hancock (2008).
Пример 2
Приготовление культур микроорганизмов
Для тестирования использовали грамположительный вид (S. aureus), три грамотрицательных вида (Е.coli, P. aeruginosa и K. pneumonia) и дрожжи (С. tropicalis).
Микроорганизмы для исследований получали из Кардиффского университета. Культуры, использованные в исследовании, получали путем асептической инокуляции микроорганизмов из чистых культур на твердой среде в 50 мл стерильного питательного бульона. Культуры инкубировали в течение ночи при температуре 37,0°С без перемешивания. Перед использованием культуры промывали центрифугированием в настольной центрифуге при 3000 об./мин в течение 15 минут, и осадок ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе (0,85% NaCl).
Пример 3
Приготовление соединений
Для определения активности соединений по отдельности и в комбинации использовали ряд концентраций каждого из соединений в двойном разведении. Наибольшая использованная концентрация зависела от рассматриваемого микроорганизма (будь то грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии или дрожжи). Образцы с наибольшей использованной в испытании концентрацией разводили пять раз, чтобы получить по шесть различных концентраций для каждого соединения. Соединения тестировали по отдельности и в матрице концентраций, включающей смеси AL:ВС, AJ:ВС и AL:AJ:ВС. Градиенты разведения AL и AJ выполняли обратно ВС (как показано на Фиг. 1А-Н).
Идентичность соединений чеснока подтверждали с помощью анализа методом ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография, англ. - HPLC, high performance liquid chromatography), используя калибровочный метод. Биофлавоноиды приобретали в компании Sigma-Aldrich и снабжали Сертификатами испытаний для подтверждения их идентичности.
2
Образцы аллицина были водными растворами, и поэтому их разводили непосредственно водой HO. Однако аджоен был в виде масла, а биофлавоноиды - в виде порошка, ни один из которых не растворялся в воде. Перед разведением аджоен и биофлавоноиды делали растворимыми с помощью образования базового раствора, используя для этого 80% раствор ДМСО (диметилсульфоксид, англ. - DMSO, dimethyl sulfoxide).
Пример 4
Приготовление планшетов
Лунки на 96-луночных планшетах готовили в трех параллелях следующим образом: AL, AJ и ВС предварительно разводили в пробирках Эппендорфа при 10 х требуемой конечной концентрации. В каждую лунку добавляли по 20 мкл каждого разведения и получали разведения 1:10 в 200 мкл на каждую лунку. Использовали матрицу концентраций смесей аллицин: биофлавоноид, аджоен: биофлавоноид и аллицин: аджоен: биофлавоноид с градиентами разведения аллицина и аджоена, обратными биофлавоноидам. Использовали концентрации 50 мкг/мл, 25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 3,125 мкг/мл и 1,5625 мкг/мл.
В каждую лунку добавляли по 130 мкл стерильного питательного бульона (Nutrient Broth No. 3 (Sigma 70149)).
В каждую лунку (за исключением негативного контроля) добавляли по 50 мкл каждого микроорганизма, суспендированного в солевом растворе. Каждый вид микроорганизмов добавляли в два планшета, первый - для индивидуального (контрольного) анализа, а второй - для матричного исследования. Планшеты инкубировали при температуре 37,0°С в течение ночи без перемешивания.
Пример 5
Сбор и анализ данных
Планшеты сканировали индивидуально с помощью планшетного ридера Tecan при длине волны 600 нм с поглощением, записанным в файле с разделителями-запятыми, для анализа.
Поглощение каждого образца сравнивали с ростом (поглощением) контрольных культур (без обработки) для определения величины MIC (во всех значениях не учитывали негативный контроль, чтобы исключить поглощение планшета и бульона). Определяли среднее значение и стандартное отклонение для трехкратных опытов, после чего средние значения наносили на диаграммы рассеяния для сравнения.
Реакция микроорганизмов на индивидуальные соединения экстрактов чеснока зависела от дозы (концентрации), как показано на Фиг. 1. Величина MIC была достигнута при очень низких концентрациях, как отражено в Таблице 1.
Синергизм антимикробной активности определяли как любую антимикробную активность, превышающую суммарный эффект индивидуальных соединений.
Таблица 2 демонстрирует наличие или отсутствие синергизма для одной или более комбинации концентраций AL, AJ и выбранных биофлавоноидов. Полный перечень концентраций, продуцирующих синергический эффект, представлен в Таблице 3 для различных сочетаний между биофлавоноидами и экстрактами чеснока. В случаях, когда было выявлено наличие синергизма, ингибирующее действие, оказываемое комбинацией, превышало суммарный ингибирующий эффект двух индивидуальных соединений, причем для каждой комбинации данный эффект зависим от концентрации.
В Таблице 3 показано определение синергизма для различных концентраций аллицина и аджоена, соответственно, в комбинации с индивидуальными биофлавоноидами (нарингенином, нарингином, кверцетином и роифолином). В Таблице 3 приведены результаты в ряду аллицин или аджоен + биофлавоноид.
Эффект синергизма можно видеть в 20 проанализированных параметрах в случае аллицина, а также в 20 проанализированных параметрах в случае аджоена. Это свидетельствует о высокой интенсивности синергического эффекта между чесноком и биофлавоноидами в отношении протестированных микроорганизмов, в частности, в отношении выбранных грамотрицательных микроорганизмов.
Некоторые из синергических комбинаций в большей степени зависят от концентрации, чем другие, например, как видно из Таблицы 3, в отношении С. tropicalis синергическое действие было отмечено только при одной концентрации комбинаций (аллицин + нарингин) и (аллицин + нарингенин). Напротив, в отношении Е.coli синергическое действие отмечалось во всех диапазонах концентраций для всех биофлавоноидов в сочетании с аллицином.
Результаты данного исследования показывают, что эффект синергии между альтернативными вариантами может давать хорошие возможности в плане поиска решения растущей проблемы резистентности к антибиотикам. Результаты данного исследования могут дать решение этой опасной ситуации, поскольку синергические эффекты были особенно высокими в отношении протестированных грамотрицательных микроорганизмов.
Пример 6
Синергический тест между экстрактами чеснока, биофлавоноидами и органическими кислотами
Была создана экспериментальная матрица для изучения синергии между экстрактами чеснока, биофлавоноидами и органическими кислотами. В качестве примеров были выбраны:
(a) экстракты чеснока: аллицин (Al) и аджоен (Aj);
(b) биофлавоноиды: кверцетин (Q) и акацетин (Ас); и
(c) органические кислоты: лимонная кислота (С) и яблочная кислота (М).
Приготовление культур микроорганизмов, соединений, подготовку планшетов осуществляли, используя процедуры, подробно описанные в Примерах со 2 по 4. Данные собирали и анализировали в соответствии с Таблицами 4 и 5.
В Таблице 4 представлена краткая информация, касающаяся отсутствия или наличия синергических ингибирующих эффектов у различных комбинаций экстрактов чеснока, биофлавоноидов и органических кислот в отношении серии микроорганизмов, аналогичной указанной в Примере 2, т.е. S. aureus, Е.coli, Р. aeruginosa, K. pneumonia, С. tropicalis, с дополнительным штаммом грамположительных бактерий S. viridans. Таблица 5 представляет собой полный перечень концентраций, продуцирующих синергический эффект. В Таблице 5 приведены результаты соотношения концентраций в ряду (аллицин или аджоен) + (яблочная кислота или лимонная кислота) + (акацетин или кверцетин).
Высокую степень синергизма в отношении протестированных микроорганизмов, включающих грамположительные бактерии (S. aureus и S. viridans), грамотрицательные бактерии (Е.coli, P. aeruginosa и K. pneumonia) и дрожжи (С. tropicalis), проявили комбинации трех активных ингредиентов, т.е. экстракта чеснока, биофлавоноида и органической кислоты.