Способ диагностики центрального гипогонадизма у женщин
DIAGNOSTIC METHOD OF CENTRAL HYPOGONADISM IN FEMALES

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии, и предназначено для диагностики центрального гипогонадизма у женщин.
Гипогонадотропный гипогонадизм (ГГ) - гетерогенное заболевание. Встречаемость синдрома ГГ составляет 1:5000-10000 у мужчин, 1:50000-100000 - у женщин, т.е. заболевание является достаточно редким и считается орфанным. При снижении уровней гонадотропинов в крови в сочетании с низкими уровнями периферических половых стероидов диагностируется центральный, или гипогонадотропный гипогонадизм (ЦГ). ЦГ характеризуется тем, что низкие уровни периферических половых стероидов по принципу обратной отрицательной связи не вызывают физиологического ответа от гипофиза в виде повышения ЛГ и ФСГ; по этой причине нельзя исключить наличие центрального гипогонадизма у женщин в случае аменореи на фоне относительно нормальных уровней ЛГ и ФСГ.
Так, в уровне техники известен способ диагностики центрального гипогонадизма у женщин (Иловайская И.А. и др., Функциональное состояние гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы при центральном гипогонадизме у женщин, Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии, 2008, Т.7, №5, с. 22-28), включающий проведение мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение нескольких часов. Способ обладает следующими недостатками: забор крови на гормоны осуществляется многократно в течение нескольких часов, при этом референсные значения существенно различаются в различных лабораториях.
У большинства пациентов в основе заболевания лежат генетические нарушения (Achermann J.С.et al., Genetic causes of human reproductive disease, 2002, J. Clinical Endocrinol. Metabolism, V. 87. №6, p. 2447-2454, M. Bonomi, D.V. Libri et al. New understandings of the genetic basis of isolated idiopathic central hypogonadism. Asian Journal of Andrology, 2012 14, 49-56). При наличии мутаций в генах, ответственных за нормальное функционирование гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы, может развиться врожденная форма ЦГ (например, синдром Каллманна, СК - вариант ЦГ с аносмией, или нормосмический вариант идиопатического гипогонадотропного гипогонадизма - нИГГ), сопровождающийся задержкой или полным отсутствием пубертата. Также некоторые мутации обуславливают предрасположенность к развитию ЦГ при наличии таких факторов риска, как выраженный психологический стресс, быстрое и значительное снижение массы тела, интенсивные физические нагрузки, использование комбинированных оральных контрацептивов. К генам, мутации в которых приводят к развитию фенотипа данного состояния, относятся следующие (Иловайская И.А. и др., Генетическая основа гипогонадотропного гипогонадизма, Гинекология Эндокринология, №1 (89), 2014, с. 89-94) (Таблица 1).
Так, в уровне техники известен способ диагностики центрального гипогонадизма у женщин (Енева Н.Г. и др., Проблема женского бесплодия: поиск генетических маркеров, Журнал общей биологии, 2017, Т. 78, №2, с. 3-13), выбранный нами за прототип. Способ включает в себя забор венозной крови, выделение генетического материала из лейкоцитов и проведение количественного определения мРНК, характеризующего экспрессию 6 генов, отвечающих за функционирование нейроразвивающей и нейроэндокринной регуляции системы гонадотропин-релизинг-гормона, а именно генов WDR11, CHD7, DUSP6 и PROK2, GNRH1/GNRHR, а также исследование мутаций этих и еще пяти генов. Гены были выбраны в качестве исследуемых по причине наличия их мРНК в периферической крови (Tanriverdi F. et al. GnRH-I and GnRH-II have differential modulatory effects on human peripheral blood mononuclear cell proliferation and interleukin-2 receptor γ-chain mRNA expression in healthy males // Clinical & Experimental Immunology. - 2005. - T. 142. - №. 1. - C. 103-110) Недостатками данного способа являются не слишком высокая чувствительность и специфичность за счет недостаточного количества субъектов исследуемой группы и сложности способа в применении, отсутствие пороговых диагностических значений для точной диагностики центрального генеза гипогонадизма у женщин.
Таким образом, существует потребность в способе диагностики центрального гипогонадизма у женщин, лишенном вышеуказанных недостатков.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности диагностики центрального гипогонадизма у женщин за счет определения пороговых значений экспрессии значимых для диагностики заболевания генов и одновременной оценки объективного и высокочувствительного маркера - референсного значения уровня лютеинизирующего гормона.
Для достижения указанного технического результата в способе диагностики центрального гипогонадизма у женщин, включающем забор венозной крови, выделение генетического материала из лейкоцитов и проведение количественного определения мРНК, характеризующего экспрессию генов PROK2, DUSP6 и WDR11, предлагается дополнительно определять уровень лютеинизирующего гормона хемилюминесцентным методом, и при выявлении значений уровня экспрессии выше референсного по крайней мере, у двух из трех генов, а именно PROK2 более 0,009356, DUSP6 более 0,01478, WDR11 более 0,002224, а также уровня лютеинизирующего гормона менее 1,95 МЕ/л диагностировать центральный гипогонадизм.
Способ осуществляют следующим образом.
Выполняют забор крови из периферической вены, после чего кровь разделяют на фракции. Из фракции лейкоцитов производят выделение тотальной мРНК. После выделения проводят полимеразную цепную реакцию в реальном времени (real-time ПЦР, RT-ПЦР), которая обладает точностью количественного измерения. Далее результаты нормируют по референсному праймеру гена бета-актин, и по полученным численным данным строят экспрессионные профили пациентов. Способ осуществляют в несколько этапов:
- выделение тотальной РНК из лейкоцитов периферической крови пациентов и субъектов группы контроля.
Производят забор периферической венозной крови из подкожной вены руки в области локтевого сгиба в одноразовую вакуумную систему (нами была использована «BD Vacutainer» (сиреневая крышка) с антикоагулянтом (6% ЭДТА) объемом 8 мл).
Использованный метод выделения лейкоцитов основан на разделении клеточных элементов крови при центрифугировании в градиенте плотности фиколла ( A. Separation of blood leucocytes, granulocytes and lymphocytes, Tissue antigens, 1974, V. 4, №3, p. 269-274). На каждые 2 мл крови используют около 5 мл фиколла. Кровь аккуратно наслаивают в пробирку (объемом 14 мл), содержащую фиколл, не допуская смешивания жидкостей. Центрифугируют 30-40 мин при 1000 g. Удаляют верхний слой - плазму, тщательно отбирая лейкоцитарное кольцо в следующую пробирку с 10 мл lxDPBS. Центрифугируют 5 мин при 1000g. К осадку добавляют 0,5 мл реактива «тризол», переносят содержимое в эппендорф на 1,5 мл.
Производят выделение РНК (мы проводили с помощью набора фирмы «Евроген» и протокола, рекомендованного фирмой-производителем с некоторыми модификациями - добавляли в эппендорф с лейкоцитами и тризолом 167 мкл хлороформа (р-р В) и 100 мкл ацетата Na (р-р Е). Инкубировали при комнатной температуре 20 мин при периодическом перемешивании до образования гомогенной эмульсии. Полученную смесь центрифугировали при 4°С 15 мин при 16000g. Собирали супернатант и переносили в новый эппендорф, добавив 400 мкл изопропанола (р-р С). Инкубировали при -20°С 1 ч (можно оставлять на ночь для лучшего выхода РНК). Центрифугировали при 16000g при 8°С 15 мин. Осторожно удаляли супернатант, к осадку добавляли 500 мкл 70% этанола, центрифугировали 5 мин при 8°С при 16000g. Удаляли супернатант. Осадок РНК подсушивали 3 мин при 40°С (крышки эппендорфов приоткрыты). Осадок РНК растворяли пипетированием в 30 мкл деионизованной воды (H20mq). Прогревали 5 мин при 70°С). Охлаждали и отбирали 2 мкл для измерения концентрации РНК и 4 мкл для оценки целостности РНК с помощью электрофореза. Измеряли концентрацию РНК (мы измеряли спектрофотометрически на приборе NanoDrop («Peqlab»)). Растворы РНК хранят в морозильной камере при -20°С.
Качество выделенной РНК оценивали методом электрофореза в агарозном геле (для этого мы к 4 мкл раствора РНК добавляли 3 мкл краски. Электрофорез проводили в 1% агарозном геле (0,05 г агарозы, 50 мл ТАЕ [40 мМ трис-ацетатный буфер рН=7,6, 20 мМ уксусная кислота, 2 мМ EDTA]; 5 мкл бромистого этидия [0,5 мг/мл]). Напряженность электрического поля составляла 5 В/см). Пригодность РНК для дальнейшей работы определяли по наличию четко различимых полос, соответствующих рибосомальным РНК.
Далее осуществляли обработку полученного РНК ДНКазой (для этого мы перед постановкой реакции обратной транскрипции РНК обрабатывали ДНКазой I («Fermentas») для очистки от ДНК. Реакцию проводили в объеме 20 мкл.
Состав смеси (на 20 мкл):
1-16 мкл раствора РНК
2 мкл Dnase I (1 ед/мкг РНК)
2
2 мкл 10-кратного Dnase I реакционного буфера с Mg2+HOmq.
2
На стадии обработки ДНКазой проводили уравнивание концентраций проб с растворами РНК, варьируя количество РНК и HOmq. Наиболее концентрированную пробу брали в объеме 5 мкл, наименее - 15 мкл. Смесь инкубировали при 37°С в течение 40 мин. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл 25 мМ EDTA рН 8.0. DNase I инактивировали при 65°С в течение 10 мин).
- определение количественной мРНК исследуемых генов.
2
Осуществляли реакцию обратной транскрипции. (Для этого мы проводили реакцию синтеза первой цепи кДНК с помощью набора реактивов MMLV RT kit («Евроген», Россия). Готовили смесь: 1 мкл 20 мкМ случайного праймера (Random) и 3 мкл HOmq. В смесь добавляем 5 мкл РНК, обработанной ДНКазой. Прогревали смесь 2 мин при 70°С для расплавления вторичных структур РНК. Затем добавляли 11 мкл предварительно приготовленной смеси:
4 мкл 5х буфера
2 мкл dNTP (10 мМ)
2 мкл DDT (20 мМ)
2
1 мкл HOmq
1 мкл MMLV ревертаза (в последнюю очередь)
Инкубировали 50 мин при 40°С. Ревертазу инактивировали прогреванием в течение 10 мин при 70°С).
Проводили полимеразную цепную реакцию в реальном времени (RT-ПЦР) (для проведения RT-ПЦР мы использовали набор реагентов «2,5 х реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ с Taq ДНК-полимеразой и интеркалирующим красителем SYBR-Green» («Синтол», Россия). К смеси добавляли по 1 мкл праймеров PROK2, DUSP6 и WDR11 и 1 мкл кДНК.
Объем смеси составлял 25 мкл. Реакцию ставили в амплификаторе MiniOpticon Real-Time PCR System производства Bio-Rad. Программа амплификации:
1. T=95°C, 10 мин
2. Т=95°С, 30 сек
Т=55°С, 1 мин 40 циклов
Т=72°С, 1 мин)
Анализировали относительную экспрессию генов-кандидатов ИГГ, нормированную на экспрессию гена бета-актин (АСТВ).
- количественное определение концентрации лютеинизирующего гормона.
Определение концентрации лютеинизирующего гормона (LH) в человеческой сыворотке осуществляют при помощи хемилюминесцентного иммуноферментного теста (мы использовали хемилюминесцентные тесты CIA. Для проведения данного теста, калибратор LH, препарат пациента и контроли сначала добавляли в лунку, покрытую стрептавидином. Добавляли биотинилированное моноклональное антитело и антитела, меченые ферментами (направленные на различные участки эпитопа лютеинизирующего гормона), и смешивали реагенты).
Оценивают полученные уровни экспрессии генов и уровень ЛГ относительно экспериментальным путем полученных референсных значений, и при выявлении значений уровня экспрессии выше референсного по крайней мере, у двух из трех генов, а именно PROK2 более 0,009356, DUSP6 более 0,01478, WDR11 более 0,002224, а также уровня лютеинизирующего гормона менее 1,95 МЕ/л диагностируют центральный гипогонадизм у женщин.
Для того, чтобы упростить и сделать более доступным выявление этиологии ЦГ, нами впервые был предложен метод оценки уровней экспрессии определенных генов - поиск эпигенетических причин развития подобного состояния, т.е. выявление нарушений в работе генов. В группу исследуемых пациентов вошла 31 женщина с центральным гипогонадизмом, подтвержденным низкими уровнями гонадотропинов, эстрадиола и функциональными пробами. В контрольную группу вошли 35 женщин с нормальным овуляторным менструальным циклом. Нами было установлено, что для исследования особенно ценны конкретные 3 гена, экспрессирующиеся в периферической крови человека, а именно PROK2, DUSP6 и WDR11. Это существенно упрощает и уточняет определение центрального генеза гипогонадизма у женщин, поскольку прототип включал в себя качественный и количественный анализ 11 генов-кандидатов, ответственных за синтез и секрецию гонадолиберина и генов-кандидатов, функционирующих как нейроразвивающие и нейроэндокринные регуляторы, при этом четких критериев для выявления центрального гипогонадизма обозначено не было.
Собственным исследованием был обоснован диагностический уровень ЛГ - менее 1,95 МЕ/л считается одним из критериев центрального гипогонадизма. Для определения диагностического уровня были проанализированы уровни гонадотропинов у группы пациенток с центральным гипогонадизмом (46 пациенток) и здоровых женщин с регулярным овуляторным менструальным циклом (38 женщин); в ходе статистической обработки (ROC-анализ) было выявлено, что измеренный хемилюминисцентным методом уровень ЛГ менее 1,95 МЕ/л указывает на наличие центрального гипогонадизма с чувствительностью более 81% и специфичностью более 91%.
Что касается диагностического уровня ФСГ - для центрального гипогонадизма был характерен уровень менее 5,075 МЕ/л, но последний характеризовался существенно меньшими чувствительностью и специфичностью, чем диагностический уровень ЛГ. Следовательно, выявление уровня ЛГ менее 1,95 МЕ/л может считаться критерием в комплексной диагностике центрального гипогонадизма.
Предлагаемым способом в период с 2015 по 2019 г. обследовано 15 пациенток с подозрением на центральный гипогонадизм (группа контроля -21 здоровая женщина). У 4 пациенток центральный генез гипогонадизма был подтвержден низкими базальными уровнями ЛГ (0,4-1,09 МЕ/л), отсутствием пиков ЛГ при мониторинге и повышенной экспрессией всех 3 исследованных генов относительно вышеуказанных референсов. У 7 других пациенток отмечались снижение или отсутствие пиков ЛГ в ходе мониторига и повышение экспрессии 2 из 3 значимых генов, при этом у 5 из них базальный ЛГ был снижен относительно референсного значения (0,01-1,94 МЕ/л), таким образом, этим пациенткам правомочно поставить диагноз центрального гипогонадизма. 4 пациенткам из 15 обследованных удалось исключить диагноз центрального гипогонадизма: несмотря на наличие у 2 из них низких базальных уровней ЛГ (0,85 и 0,25 МЕ/л), были зафиксированы нормальные частота и амплитуда пиков в ходе мониторирования, а также нормальная экспрессия 2 из 3 значимых генов; аменорея и гипогонадизм у этих пациенток носят иной, отличный от центрального, генез. Лишь у 1 пациентки из 15 обследованных выявлены расхождения: базальный уровень ЛГ у нее составил <0,02 МЕ/л, при мониторировании не выявлено пиков секреции ЛГ - что доказывает центральный генез ЦГ; но при экспрессионном анализе у данной пациентки отклонение выявлено лишь в экспрессии 1 из 3 генов. Это расхождение вполне согласуется с чувствительностью и специфичностью предлагаемого способа.
Таким образом, при совокупном выявлении значений уровня экспрессии выше референсного по крайней мере, у двух из трех генов, а именно PROK2 более 0,009356, DUSP6 более 0,01478, WDR11 более 0,002224, а также уровня лютеинизирующего гормона менее 1,95 МЕ/л диагноз ЦГ обоснован, объективен и высокоточен.
Пример 1. Пациентка №1: женщина, 23 лет.Аменорея на фоне низкого уровня эстрадиола, центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 1,09 МЕ/л.
Совокупно выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у трех генов, PROK2, DUSP6, WDR11, уровень ЛГ составил менее 1,95 МЕ/л. Диагностирован центральный гипогонадизм предлагаемым способом.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов был подтвержден диагноз центрального гипогонадизма, в связи с низкой частотой и амплитудой пиков ЛГ.
Пример 2. Пациентка №2: женщина, 18 лет. Аменорея, на фоне низкого уровня эстрадиола. Центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 5,00 МЕ/л.
Выявлены значения уровня экспрессии выше референсного только у одного из генов, PROK2, уровень ЛГ составил более 1,95 МЕ/л. Центральный гипогонадизм не выявлен.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов диагноз центрального гипогонадизма не был подтвержден вторично, в связи с нормальной частотой и амплитудой пиков ЛГ.
Пример 3. Пациентка №3: женщина, 19 лет. Аменорея, на фоне низкого уровня эстрадиола. Центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 1,96 МЕ/л).
Выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у трех генов, PROK2, DUSP6, WDR11, однако уровень ЛГ составил более 1,95 МЕ/л. Центральный гипогонадизм не выявлен.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов диагноз центрального гипогонадизма не был подтвержден вторично, в связи с нормальной частотой и амплитудой пиков ЛГ.
Пример 4. Пациентка №4: женщина, 26 лет. Аменорея на фоне низкого уровня эстрадиола, центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 0,65 МЕ/л.
Совокупно выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у двух из трех генов, PROK2, DUSP6, уровень ЛГ составил менее 1,95 МЕ/л. Диагностирован центральный гипогонадизм предлагаемым способом.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов был подтвержден диагноз центрального гипогонадизма, в связи с низкой частотой и амплитудой пиков ЛГ.
Пример 5. Пациентка №5: женщина, 20 лет. Аменорея на фоне низкого уровня эстрадиола, центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 1,94 МЕ/л.
Совокупно выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у двух из трех генов, PROK2, WDR11, уровень ЛГ составил менее 1,95 МЕ/л. Диагностирован центральный гипогонадизм предлагаемым способом.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов был подтвержден диагноз центрального гипогонадизма, в связи с низкой частотой и амплитудой пиков ЛГ.
Пример 6. Пациентка №6: женщина, 22 лет. Аменорея на фоне низкого уровня эстрадиола, центральный гипогонадизм (?). Проведено исследование согласно предлагаемому способу. Уровень экспрессии генов составил:
При исследовании базальных уровней гонадотропинов: ЛГ 1,8 МЕ/л.
Совокупно выявлены значения уровня экспрессии выше референсного у двух из трех генов, DUSP6, WDR11, уровень ЛГ составил менее 1,95 МЕ/л. Диагностирован центральный гипогонадизм предлагаемым способом.
При проведении мониторинга амплитуды и частоты пиков секреции гонадотропинов (ЛГ, ФСГ) при многократном исследовании в течение 4-х часов был подтвержден диагноз центрального гипогонадизма, в связи с низкой частотой и амплитудой пиков ЛГ.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность диагностики центрального гипогонадизма у женщин за счет определения пороговых значений экспрессии значимых для диагностики заболевания генов и одновременной оценки объективного и высокочувствительного маркера - референсного значения уровня лютеинизирующего гормона.