Особенности изменения числа фокусов белков уН2АХ и Rad51 в фибробластах кожи человека, подвергавшихся пролонгированному воздействию низкоинтенсивного рентгеновского излучения

архиструктуры хроматина и тем самым ограничивающим доступ свободных радикалов к ДНК, является линкерный гистон Н1. Увеличение тоничности среды до концентрации, вызывающей диссоциацию лин-керного гистона Н1, приводит почти к двойному увеличению выхода повреждений ДНК.

Конфликт интересов не заявляется. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».

References

1. Folle GA. Nuclear architecture, chromosome domains and genetic damage. Mutat Res 2008; 658 (3): 172-183.

2. McArt DG, McKerr G, Saetzler K, et al. Comet sensitivity in assessing DNA damage and repair in different cell cycle stages. Mutagenesis 2010; 25 (3): 299-303.

3. Dmitrieva NI, Burg MB. High NaCl promotes cellular senescence. Cell Cycle 2007; 6 (24): 3108-3113.

4. Elia MC, Bradley MO. Influence of chromatin structure on the induction of DNA double strand breaks by ionizing radiation. Cancer Res 1992; 52 (6): 1580-1586.

5. Osipov A, Arkhangelskaya E, Vinokurov A, et al. DNA comet Giemsa staining for conventional bright-field microscopy. Int J Mol Sci 2014; 15 (4): 6086-6095.

6. Osipov AN, Smetanina NM, Pustovalova MV, et al. The formation of DNA single-strand breaks and alkali-labile sites in

human blood lymphocytes exposed to 365-nm UVA radiation. Free Radic Biol Med 2014; 73: 34-40.

7. Osipov AN, Klokov DY, Elakov AL, et al. Comparison in vivo Study of Genotoxic Action of High-Versus Very Low DoseRate gamma-Irradiation. Nonlinearity Biol Toxicol Med 2004; 2 (3): 223-232.

8. Roos WP, Binder A, Böhm L. The influence of chromatin structure on initial DNA damage and radiosensitivity in CHO-K1 and xrsl cells at low doses of irradiation 1-10 Gy. Radiat Environ Biophys 2002; 41 (3): 199-206.

9. Smetanina NM, Pustovalova MV, Osipov AN. Effect of incubation in sodium chloride hypertonic solutions on human blood lymphocyte DNA damage formation by long-wave UV-radiation. Radiats Biol Radioecol 2013; 53 (6): 620-624. Russian (Сметанина Н. М., Пустовалова М. В., Осипов А. Н. Влияние инкубации в гипертонических растворах хлорида натрия на повреждаемость ДНК лимфоцитов крови человека длинноволновым УФ-излучением. Радиационная биология. Радиоэкология 2013; 53 (6): 620-624).

10. Alipov ED, Tyrsina EG, Sarimov RM, et al. Acquired radioresistance of progeny of irradiated cells is accompanied by rearrangements in chromatin organization. Radiats Biol Radioecol 2004; 44 (2): 188-97. Russian (Алипов Е. Д., Тырсина Е. Г., Саримов Р. М. и др. Приобретенная радиорезистентность потомков облученных клеток сопровождается перестройками в организации хроматина. Радиационная биология. Радиоэкология 2004; 44 (2): 188-197).

УДК 577.32: 577.346 Оригинальная статья

ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ ЧИСЛА ФОКУСОВ БЕЛКОВ yH2AX И RAD51 В ФИБРОБЛАСТАХ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА, ПОДВЕРГАВШИХСЯ ПРОЛОНГИРОВАННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО РЕНТГЕНОВСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

И. B. Озеров — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, младший научный сотрудник; П. С. Еремин — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, биолог; А. Н. Осипов — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, заведующий лабораторией, доктор биологических наук; И. И. Еремин — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, заведующий центром, кандидат медицинских наук; А. Д. Цветкова — Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, студент; С. С. Гусева — Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, студент; К. Ю. Иванова — Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина, студент; О. И. Гавриленко — Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, студент; М. В. Пустовалова — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, научный сотрудник; Н. М. Сметанина — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, научный сотрудник; А. К. Грехова — ФгБу «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, младший научный сотрудник; Н. Л. Лазарева — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, врач-иммунолог; А. А. Пулин — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, заведующий криобанком, кандидат медицинских наук; О. А. Максимова — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, инженер; А. В. Гордеев — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, старший научный сотрудник; А. Ю. Бушманов — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, заместитель генерального директора, доктор медицинских наук, профессор; К. B. Котенко — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, генеральный директор, доктор медицинских наук, профессор.

CHARACTERISTICS OF CHANGES IN THE NUMBER OF YH2AX AND RAD51 PROTEIN FOCI IN HUMAN SKIN FIBROBLASTS AFTER PROLONGED EXPOSURE TO LOW-DOSE RATE X-RAY RADIATION

I. V. Ozerov — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Junior researcher; P. S. Eremin — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Biologist; А. N. Osipov — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Head of laboratory, Doctor of Medical Sciences; 1.1. Eremin — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Head of department, Candidate of Medical Sciences; A. D. Tsvetkova — Lomonosov Moscow State University, Student; S. S. Guseva — Lo-monosov Moscow State University, Student; K. Yu. Ivanova — Skryabin Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology, Student; O.I. Gavrilenko — Lomonosov Moscow State University, Student; M. V. Pustovalova — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Researcher, N. M. Smetanina — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Researcher; A. K. Grekhova — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Junior researcher; N. L. Lazarevа — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Physician-immunologist; A. A. Pulin — Federal Medical and Biophysical

Center n.a. A. I. Burnazyan, Head of cryobank, Candidate of Medical Sciences; O. A. Maksimova — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Engineer; A. V. Gordeev — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Senior researcher, А. Yu. Bushmanov — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Deputy Director General, Doctor of Medical Sciences, Professor; K. V. Kotenko — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Director General, Doctor of Medical Sciences, Professor.

Дата поступления — 11.11.2014 г. Дата принятия в печать — 10.12.2014 г.

Озеров И. B., Еремин П. С., Осипов А. Н., Еремин И. И., Цветкова А.Д., Гусева С. С., Иванова К. Ю., Гаврилен-ко О. И., Пустовалова М. В., Сметанина Н. М., Грехова А. К., Лазарева Н. Л., Пулин А. А., Максимова О. А., Гордеев А. В., Бушманов А. Ю., Котенко К. B. Особенности изменения числа фокусов белков yH2AX и Rad51 в фибробластах кожи человека, подвергавшихся пролонгированному воздействию низкоинтенсивного рентгеновского излучения. Саратовский научно-медицинский журнал 2014; 10 (4): 739-743.

Цель: провести сравнительные исследования особенностей репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих, подвергающихся острому и пролонгированному воздействию рентгеновского излучения с различной мощностью дозы. Материал и методы. Исследования выполнены на первичных культурах фи-бробластов, выделенных из биоптатов кожи здоровых добровольцев (женщины 29 и 30 лет). Облучение клеток проводили на рентгеновской биологической установке РУБ РУСТ-М1 (Россия) при температуре 37°C с мощностью дозы 400 мГр/мин (200 кВ, 2*2,4 мА, фильтр 1,5 мм Al) и 4 мГр/мин (50 кВ, 2*0,4 мА, фильтр 1,5 мм Al). Для анализа фокусов yH2AX и Rad51 использовали иммуноцитохимическое окрашивание белков. Результаты. Проведено одновременное исследование кинетики формирования и деградации фокусов фосфорилированно-го гистона H2AX (yH2AX) и ключевого белка гомологической рекомбинации Rad51 в клетках первичных фибро-бластов кожи человека, подвергавшихся острому и пролонгированному воздействию рентгеновского излучения с одинаковой накопленной дозой. Показано, что относительное число фокусов yH2AX в пересчете на дозу облучения убывает с уменьшением мощности дозы, в то время как относительное число фокусов Rad51, наоборот, возрастает. Заключение. Полученные данные свидетельствуют о принципиальных различиях в соотношении вкладов негомологичного соединения концов и гомологической рекомбинации в репарацию ДНК в клетках, подвергавшихся острому или пролонгированному облучению.

Ключевые слова: двунитевые разрывы ДНК, репарация ДНК, yH2AX, Rad51, фибробласты, рентгеновское излучение, низкая мощность дозы,

Ozerov IV, Eremin PS, Osipov AN, Eremin II, Tsvetkova AD, Guseva SS, Ivanova KYu, Gavrilenko OI, Pustovalova MV, Smetanina NM, Grekhova AK, Lazareva NL, Pullin AA, Maksimova OA, Gordeev AV, Bushmanov AYu, Kotenko KV. Characteristics of changes in the number of yH2AX and Rad5l protein foci in human skin fibroblasts after prolonged exposure to low-dose rate X-ray radiation. Saratov Journal of Medical Scientific Research 2014; 10 (4): 739-743.

Aim: to compare the repair process of DNA double-strand breaks in mammalian cells after acute versus prolonged exposure to X-ray irradiation with different dose rates. Material and methods. Studies were performed on primary human fibroblasts isolated from skin biopsies of healthy volunteers (women, 29 and 30 years). Cells were irradiated using an X-ray machine RUB RUST-M1 (JSC "Ruselectronics", Moscow, Russia) at 37°C temperature with a dose rate of 400 mGy/min (200 kV, 2*2.4 mA, a filter of 1.5 mm Al) or 4 mGy/min (50 kV, 2*0.4 mA, a filter of 1.5 mm Al). Immuno-cytochemical protein staining was utilized for yH2AX and Rad51 foci analysis. Results. Phosphorylated histone H2AX (YH2AX) and the key protein of homologous recombination Rad51 foci formation and disappearance kinetics were investigated simultaneously in primary human dermal fibroblasts after acute and prolonged exposure to X-ray radiation at a same dose. It was shown that the relative yield of yH2AX foci per dose reduces with decrease in dose rate, while the relative yield of Rad51 foci conversely increases. Conclusion. Our findings suggest the fundamental differences in the ratio of non-homologous end joining and homologous recombination DNA repair in acute versus prolonged irradiated cells.

Key words: DNA double strand breaks, DNA repair, yH2AX, Rad51, fibroblasts, X-rays, low dose-rate.

Введение. Воздействие ионизирующего излучения на живые клетки приводит к образованию целого спектра разнообразных повреждений ДНК, включая двунитевые и однонитевые разрывы, повреждения азотистых оснований и сахарофосфатного остова. Двунитевые разрывы составляют относительно небольшую часть этих повреждений, но именно они являются основным триггером, определяющим дальнейшую судьбу клетки [1]. Клеточный ответ на воздействие ионизирующей радиации напрямую зависит от числа накопленных ДР ДНК и может включать такие процессы, как остановка клеточного цикла, активация процессов репарации ДНК и запуск программ клеточной гибели по путям апоптоза или ав-тофагии [2].

Принципиальные механизмы индукции и репарации Др ДНК, образованных в результате воздействия острого облучения с мощностью более 200 мГр/мин, подробно изучены в широком диапазоне доз [1]. Однако клетки людей и других млекопитающих часто подвергаются длительному

Ответственный автор — Осипов Андреян Николаевич

Тел. +79154373245.

E-mail: andreyan.osipov@gmail.com

воздействию излучения с низкой мощностью дозы. В то же время данные, касающиеся индукции и репарации ДНК при пролонгированном облучении с низкой мощностью дозы, весьма противоречивы и требуют дальнейшего изучения [3, 4]. В частности, важнейшим вопросом является выявление отличий в механизмах и кинетике накопления и репарации ДР ДНК в случае пролонгированного облучения по сравнению с острым.

Цель: сравнительное исследование особенностей репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих, подвергающихся острому и пролонгированному воздействию рентгеновского излучения с различной мощностью дозы.

Материал и методы. Исследования выполнены на первичных культурах фибробластов, выделенных из биоптатов кожи здоровых добровольцев (женщины 29 и 30 лет). После подписания информированного согласия донору под местной анестезией 2%-ным раствором лидокаина проводился надрез кожи в заушной области и иссечение участка площадью 2*2 мм. Биоптат кожи помещался в транспортировочную среду ^МЕМ, содержащая 1 г/л D-глюкозы, 5% фе-тальной сыворотки крупного рогатого скота, антибиотики) и немедленно доставлялся в лабораторию.

Биоптаты подвергали ферментативной обработке коллагеназой II типа (Sigma, Австрия), и полученные суспензии одиночных фибробластов культивировали в течение 14 суток при 37°C, 5% CO2 в стандартной культуральной среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л) (StemCell Technology, США) с добавлением 2 ммоль/л L-глутамина (StemCell Technology, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (StemCell Technology, США) и 20% феталь-ной сыворотки крупного рогатого скота (Biological Industries, Израиль). В дальнейшем клетки снимали с поверхности флаконов 0,05%-ным раствором трипсина и пассеровали с плотностью 104 клеток/см2 в той же культуральной среде, но с уменьшенным до 10% содержанием фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки пассеровали при достижении культурой 80-90% монослоя. Замену среды осуществляли каждые трое суток. В работе использовали культу-ральную посуду фирмы Corning-Costar (США), реактивы фирмы Sigma (США).

Ранее заготовленные криопробирки с культурами клеток фибробластов быстро размораживали при 37°С, а затем, медленно перемешивая, добавляли по капле стандартную культуральную среду до объема 50 мл. Аликвоту клеточной суспензии отбирали для оценки жизнеспособности клеток на автоматическом счетчике клеток Countess (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. После разморозки жизнеспособность клеток во всех образцах составляла не менее 92%. Клетки культивировали в течение трех суток в полной среде.

В дальнейшем экспериментальные и контрольные культуры снимали с пластика раствором трипсина с 0,25% ЭДТА (StemCell Technology, США), инактивацию трипсина и отмывку клеток проводили в полной среде. Клетки пассеровали в 35 мм чашки Петри, на покровные стекла (SPL Lifesciences, Южная Корея). Для экспериментов использовали клетки в фазе экспоненциального роста (плотность клеточной популяции ~70%).

Облучение клеток проводили на рентгеновской биологической установке РУБ РУСТ-М1 (Россия) при температуре 37°C с мощностью дозы 400 мГр/ мин (200 кВ, 2*2,4 мА, фильтр 1,5 мм Al), и 4 мГр/мин (50 кВ, 2*0,4 мА, фильтр 1,5 мм Al). После облучения клетки инкубировали в стандартных условиях СО2 инкубатора (37°C, 5% CO2) в течение 0,25-24 ч.

Клетки на покровных стеклах фиксировали 4%-ным параформальдегидом в фосфатно-соле-вом буфере (рН 7,4) в течение 20 мин при комнатной температуре, после чего дважды промывали, рН 7,4. Пермеабилизировали 0,3% Тритон-Х100 в фосфат-но-солевом буфере, рН 7,4, содержащем 2% бычьего сывороточного альбумина для блокирования неспецифических взаимодействий. Слайды инкубировали с первичными антителами (мышиные моно-клональные антитела к белку уН2АХ (Merck-Millipore, США) в разведении 1/400 и кроличьи поликлональ-ные антитела к белку Rad51 (Merck-Millipore, США) в разведении 1/200) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4), содержащем 1 % бычьего сывороточного альбумина, в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем слайды промывали фосфатно-солевым буфером (рН 7,4) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч с вторичными антителами IgG (H+L), конъюгированными с флуорохромами (антитела козы к белкам мыши, конъюгированные с Alexa Fluor 555 (Life Technologies, США), в разведении 1/1000 и антитела козы к белкам кролика, конъюгированные с

Alexa Fluor 488 (Merck-Millipore, США), в разведении 1/600) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4), содержащем 1 % бычьего сывороточного альбумина. Для окраски ДНК и предотвращения фотовыцветания использовали содержащую DAPI заключающую среду ProLong Gold (Life Technologies, США). Визуализацию, документирование и обработку иммунноцито-химических микроизображений осуществляли на люминесцентном микроскопе Nikon Eclipse Ni-U (Nikon, Япония), оснащенном видеокамерой высокого разрешения ProgRes MFcool (Jenoptik AG, Германия) с использованием наборов светофильтров DAPI (340380 нм возбуждение и 435-485 нм эмиссия) и Y-2E/C (540-580 нм возбуждение и 600-660 нм эмиссия). Анализировали не менее 200 клеток на точку. Для подсчета числа фокусов YН2АХ использовали программу Focicounter (http://focicounter.sourceforge.net/). Подсчет фокусов Rad51 производился визуально.

Статистический и математический анализ полученных данных проводился с использованием пакета статистических программ Statistica 8.0 (StatSoft). Результаты исследований представлены как среднее арифметическое результатов трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка.

Результаты. В ходе исследования получены кинетики формирования и деградации фокусов гисто-на YН2АХ в клетках первичных фибробластов кожи человека после воздействия рентгеновского излучения в дозе 1 Гр с различными значениями мощности дозы (рис. 1). Показано, что после облучения с высокой мощностью дозы (400 мГр/мин) число фокусов YН2АХ достигает максимума через 30 мин, а затем наблюдается экспоненциальное снижение их числа практически до контрольного уровня (24 ч после облучения). При этом выделяются быстрая (до 2-4 ч), за время которой происходит уменьшение числа фокусов -на 60-70%, и медленная фазы репарации (от 4 до 24 ч). В случае пролонгированного воздействия облучения (мощность дозы 4 мГр/мин) максимума не наблюдается и происходит постепенный экспоненциальный спад числа фокусов в течение суток. Необходимо отметить, что максимальная скорость деградации фокусов при всех исследованных значениях мощности дозы наблюдается в интервале между 1 и 2 ч после окончания облучения.

С целью исследовать вклад репарации ДР по механизму гомологической рекомбинации (ГР) в клетках, облученных с различными значениями мощ-

Рис. 1. Изменение числа фокусов уН2АХ в фибробластах кожи человека, облученных с высокой (400 мГр/мин) и низкой (4 мГр/мин) мощностью дозы рентгеновского излучения

Рис. 2. Изменение числа фокусов Rad51 в фибробластах кожи человека, облученных с высокой (400 мГр/мин) и низкой (4 мГр/мин) мощностью дозы рентгеновского излучения

ности дозы, были изучены кинетики образования фокусов Rad51, ключевого белка ГР (рис. 2).

Отличительной особенностью фокусов Rad51 от фокусов уН2АХ является то, что они присутствуют не во всех клетках. В случае острого режима облучения (400 мГр/мин) среднее число фокусов Rad51 в течение 1 ч было неотличимо от контрольного уровня, но через 2 ч начинало постепенно увеличиваться и достигало максимума через 6-8 ч после облучения, а затем снижалось. В случае пролонгированного режима (4 мГр/мин) число фокусов Rad51 было повышено по сравнению с контролем сразу после окончания облучения и сохранялось на высоком уровне на протяжении 8 ч. Это наблюдение может быть легко объяснено исходя из более высокой продолжительности облучения с малой мощностью дозы. Как следствие, к моменту окончания облучения начинается репарация по пути ГР тех разрывов, которые были индуцированы на начальных сроках облучения. Неожиданным, ранее не показанным результатом является увеличение числа фокусов Rad51 с уменьшением мощности дозы. На его основе можно сделать предварительный вывод о более высокой активности репарации по пути ГР в случае пролонгированного облучения по сравнению с острым.

Помимо изменения числа фокусов Rad51 при различных значениях мощности дозы облучения была проанализирована колокализация фокусов Rad51 с фокусами уН2АХ. Число колокализованных фокусов было максимальным через 4 ч после облучения. В этот момент число фокусов как уН2АХ, так и Rad51 имеет достаточную величину. Доля фокусов уН2АХ, колокализованных с фокусами Rad51, изменялась в пределах от 2 до 9% с тенденцией к увеличению при понижении мощности дозы, что отражает уже упомянутую закономерность по увеличению роли ГР с уменьшением мощности дозы. Доля фокусов Rad51 колебалась в интервале от 30 до 50% без ярко выраженной зависимости. Интересным наблюдением в данном случае является то, что далеко не все фокусы Rad51 колокализованы с фокусами уН2АХ. Это указывает на то, что процесс дефосфорилирования гистона уН2АХ в области ДР может происходить до окончания его репарации по пути ГР.

Обсуждение. Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что снижение мощности дозы облучения приводит к уменьшению количественного выхода фокусов уН2АХ в клетках в пересчете на дозу

облучения. Ранее нами были получены аналогичные данные на фибробластах китайского хомяка линии У79 [7]. Этот эффект обусловлен тем, что облучение клеток при низкой мощности дозы происходит в течение длительного времени и число фокусов уН2АХ отражает результат двух одновременно текущих процессов: индукции ДР и их репарации. Следует отметить, что для дальнейшей судьбы клетки большое значение имеет корректность репарации ДР. Основными путями репарации ДР являются негомологичное соединение концов (НГСК) и ГР. Наибольший вклад в репарацию вносит относительно быстрый, но ведущий к образованию микроделеций процесс НГСК, ответственный за процессинг более чем 80% всех ДР, образованных в результате действия редко-ионизирующего излучения [8]. В отличие от НГСК, в процессе репарации ДР путем медленной, но более корректной ГР для восстановления поврежденного участка ДНК, содержащего ДР, в качестве матрицы используется неповрежденная сестринская хрома-тида, поэтому этот путь репарации активен только в S- и G2-фазах клеточного цикла.

Соотношение основных путей репарации, НГСК и ГР, в популяции облученных клеток является важным прогностическим параметром, который коррелирует с их радиочувствительностью. Показано, что изменение этого соотношения в опухолевых клетках может приводить к повышению их радиочувствительности [9]. По этой причине действие некоторых радиосенсибилизаторов опухолей направлено на смещение равновесия между путями репарации ДР ДНК. Кроме того, соотношение путей репарации ДР в облученных клетках коррелирует с уровнями клеточной гибели по путям апоптоза и автофагии [10]. В частности, недавно была показана корреляция между увеличением доли ГР и снижением уровня автофагии в мезенхи-мальных стволовых клетках, облученных малыми дозами рентгеновского излучения (40-160 мГр) [11]. Последнее особенно важно в свете подбора оптимальных режимов радиотерапии онкологических заболеваний. В этом случае необходимо максимизировать долю апоптоза и минимизировать уровень автофагии в популяции облученных раковых клеток, чтобы препятствовать возможному рецидиву за счет выживших автофагических клеток [12].

Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что при низкой мощности дозы клетки в большей степени склонны к выбору более точного и безопасного, но и более медленного пути репарации — ГР, в то время как при остром облучении выбор делается в пользу более быстрого, хотя и повышающего риск возникновения отдаленных генетических последствий, механизма НГСК.

Заключение. В ходе работы впервые проведено одновременное исследование кинетики формирования и деградации фокусов уН2АХ и ключевого белка гомологической рекомбинации Rad51 в клетках первичных фибробластов кожи человека, подвергавшихся острому и пролонгированному воздействию рентгеновского излучения с одной и той же накопленной дозой. Показано, что относительное число фокусов уН2АХ в пересчете на дозу облучения убывает с уменьшением мощности дозы, в то время как относительное число фокусов Rad51, наоборот, возрастает. Полученные данные свидетельствуют о принципиальных различиях вкладов НГСК и ГР в репарацию ДР ДНК в клетках млекопитающих в зависимости от мощности дозы облучения.

Конфликт интересов не заявляется. Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ 12-04-01733-а.

References

1. Vignard J, Mirey G, Salles B. lonizing-radiation induced DNA double-strand breaks: a direct and indirect lighting up. Ra-diother Oncol 2013; 108 (3): 362-369.

2. Rodriguez-Rocha H, Garcia-Garcia A, Panayiotidis M, Franco R. DNA damage and autophagy. Mutat Res 2011; 711 (1-2): 158-166.

3. Osipov AN, Buleeva G, Arkhangelskaya E, Klokov D. In vivo Y-irradiation low dose threshold for suppression of DNA double strand breaks below the spontaneous level in mouse blood and spleen cells. Mutat Res 2013; 756 (1-2): 141-145.

4. Ozerov IV, Bushmanov AYu, Anchishkina NA, et al. Induction and reparation of double-strand DNA breaks in V79 cells continuously exposed to low dose-rate Y-radiation. Saratov J Med Sci Res 2013; 9 (4): 787-791. Russian (Озеров И. B., Бушманов А. Ю., Анчишкина Н. А. и др. Индукция и репарация двунитевых разрывов ДНК в клетках линии V79 при длительном воздействии низкоинтенсивного Y-излучения.

Саратовский научно-медицинский журнал 2013; 9 (4): 787791).

5. Kotenko KV, Bushmanov AY, Ozerov IV, et al. Changes in the number of double-strand DNA breaks in Chinese hamster V79 cells exposed to Y-radiation with different dose rates. Int J Mol Sci 2013; 14 (7): 13719-13726.

6. Kakarougkas A, Jeggo PA. DNA DSB repair pathway choice: an orchestrated handover mechanism. Br J Radiol 2014; 87 (1035): 20130685.

7. Lim YC, Roberts TL, Day BW, et al. Increased sensitivity to ionizing radiation by targeting the homologous recombination pathway in glioma initiating cells. Mol Oncol 2014; 8 (8): 16031615.

8. Bitomsky N, Hofmann TG. Apoptosis and autophagy: Regulation of apoptosis by DNA damage signalling — roles of p53, p73 and HIPK2. FEBS J 2009; 276 (21): 6074-6083.

9. Alessio N, Del Gaudio S, Capasso S, et al. Low dose radiation induced senescence of human mesenchymal stromal cells and impaired the autophagy process. Oncotarget 2014 Dec 11. [Epub ahead of print].

10. Kuwahara Y, Oikawa T, Ochiai Y, et al. Enhancement of autophagy is a potential modality for tumors refractory to radiotherapy. Cell Death Dis 2011; 2: 177.

УДК 575.857 Оригинальная статья

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ БОЛЕЗНИ КРОНА У ВЗРОСЛОГО НАСЕЛЕНИЯ МОСКОВСКОГО РЕГИОНА

Д. С. Ставцев — ГБУЗ «Станция переливания крови Департамента здравоохранения города Москвы», врач КЛД лаборатории HLA-типирования; Т. А. Астрелина — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, заведующая специализированной лабораторией цитологии, генетики и иммунологии, доктор медицинских наук; М. М. Азова — РУДН, заведующая кафедрой биологии и общей генетики, доктор медицинских наук, доцент; Л. Л. Лебедева — ГБУЗ «Стация переливания крови Департамента здравоохранения города Москвы», заведующая лабораторией HLA-типирования, кандидат биологических наук; Т. В. Пухликова — ГБУЗ «Станция переливания крови Департамента здравоохранения города Москвы», биолог лаборатории HLA-типирования, кандидат биологических наук; А. А. Чумак — ГбУз «Станция переливания крови Департамента Здравоохранения города Москвы», врач КЛД лаборатории HLA-типирования, кандидат медицинских наук; О. В. Князев — ГБУЗ «Московский клинический научно-практический центр», заведующий лабораторией биотерапии отдела патологии кишечника, доктор медицинских наук; И. И. Еремин — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, заведующий центром, кандидат медицинских наук; И. Р. Гильмутдинова — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, врач-трансфузиолог специализированной лаборатории цитологии, генетики и иммунологии; К. B. Котенко — ФГБУ «Государственный научный центр Российской Федерации — Федеральный медицинский биофизический центр им. А. И. Бурназяна» ФМБА России, генеральный директор, доктор медицинских наук, профессор.

IMMUNOGENETIC MARKERS OF CROHN'S DISEASE IN ADULT POPULATION OF THE MOSCOW REGION

D. S. Stavtsev — Blood transfusion station of the Department of Health of the City of Moscow, HLA-typing laboratory, physician; T. A. Astrelina — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Head of Specialized cytology laboratory, genetics and immunology, Doctor of Medical Sciences; M. M. Azova — Peoples' Friendship University of Russia, Head of department of Biology and General Genetics, Doctor of Medical Sciences, Associate Professor; L. L. Lebedeva — Blood transfusion station of the Department of Health of the City of Moscow, Head of HLA-typing laboratory, Candidate of Medical Sciences; T. V. Pukhlikova — Blood transfusion station of the Department of Health of the City of Moscow, HLA-typing laboratory, biologist, Candidate of Medical Sciences; A.A. Chumak — Blood transfusion station of the Department of Health of the City of Moscow, HLA-typing laboratory, physician, Candidate of Medical Sciences; O. V. Knyazev — Moscow Clinical Research Center, Head of Biotherapy Laboratory of the Department of Intenstine Pathology, Doctor of Medical Sciences; 1.1. Eremin — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Head of department, Candidate of Medical Sciences; I. R. Gilmutdinova — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, transfusiologist, specialized cytology laboratory, genetics and immunology; K. V. Kotenko — Federal Medical and Biophysical Center n.a. A. I. Burnazyan, Director General, Doctor of Medical Sciences, Professor.

Дата поступления — 11.11.2014 г. Дата принятия в печать — 10.12.2014 г.

Ставцев Д. С., Астрелина Т. А., Азова М. М., Лебедева Л. Л., Пухликова Т. В., Чумак А. А., Князев О. В., Еремин И. И., Гильмутдинова И. Р., Котенко К. B. Иммуногенетические маркеры болезни Крона у взрослого населения Московского региона. Саратовский научно-медицинский журнал 2014; 10 (4): 743-749.

Цель: изучить иммуногенетические маркеры предрасположенности и протекции к развитию болезни Крона (БК) у взрослого населения Московского региона. Материал и методы. В исследование включены 53 образца периферической крови больных БК Московского региона. Контрольную группу составили 1700 образцов пупо-винной крови новорожденных условно здоровых детей. Изучение вариантов групп аллелей HLA проводили методом генотипирования с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Использовались коммерческие наборы по методу SSO (Sequence Specific Oligonucleotides) c применением специфических олигонуклеотидных зондов и по методу SSP (Sequence Specific Primer) с применением специфических праймеров (Ivitrogen). Ре-