Успешная индукция плюрипотентных стволовых клеток из нейральных стволовых клеток с помощью двух факторов

тттт

А

ш

Новости клеточных технологий

процессора, блокирующих расщепление этих при-микро-РНК [8].

Научная группа S.R. Viswanathan et al. показала, что при-микро-РНК let-7g (pri-let-7g) присутствует в больших количествах в эмбриональных стволовых клетках и процес-сируется только в ходе дифференцировки (на десятые сутки после начала дифференцировки для мышиных ЭСК). Также удалось объяснить механизм блока процессинга pri-let-7g. На первом этапе исследователи сравнили, как лизаты клеток различных типов влияют на опосредованное микропроцессором расщепление pri-let-7g in vitro. При-микро-РНК сначала инкубировали с клеточным лизатом, а затем подвергали расщеплению высокоочищенным комплексом ферментов микропроцессора. Выяснилось, что лизаты клеток эмбриональной карциномы линии P19 полностью ингибируют процессинг при-микро-РНК, в то время как лизаты дифференцированных эмбриональных фибробластов мыши никак не влияют на расщепление при-микро-РНК.

Было предположено, что существует некий специфический ингибитор процессинга, присутствующий исключительно в недифференцированных клетках. С помощью электрофореза удалось выявить присутствие в этих клетках комплекса белков, связывающих pri-let-7g. Большинство этих белков были ранее идентифицированы как компоненты комплекса Drosna [2]. Одним из них оказался высоко консервативный РНК-свя-зывающий белок Lin28. Ранее было показано, что мутации РНК-связывающего домена Lin28 приводят к нарушениям эмбрионального развития некоторых организмов [9], а также, что ген этого белка активно экспрессируется в ЭСК мыши и человека и что его экспрессия подавляется при дифферен-цировке этих клеток [10].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Denli A.M., Tops B.B.J., Plasterk R.H.A., Ketting R.F., Hannon G.J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature 2004; 432: 231-5.

2. Gregory R.I., Yan K.P., Amuthan G. et al. The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Nature 2004; 432: 235-40.

3. Chendrimada T.P., Gregory R.I., Kumaraswamy E. et al. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing. Nature 2005; 436: 740-4.

4. Chendrimada T.P., Finn K.J., Ji X. et al. MicroRNA silencing through RISC recruitment of eIF6. Nature 2007; 447(7146): 823-8.

5. Obernosterer G., Leuschner P.J.F., Alenius M., Martinez J. Post-transcriptional regulation of microRNA expression. RNA 2006; 12: 1161-7.

5.R. Viswanathan и соавт. подтвердили данные по динамике экспрессии Lin28 при дифференцировке ЭСК в составе эмбриоидных телец, а также продемонстрировали, что снижение концентрации этого белка предшествует подавлению экспрессии таких факторов плюрипотентности, как Nanog и Oct4. Также было показано, что Lin28 специфически блокирует процессинг микро-РНК let-7g и не влияет на процессинг других микро-РНК. При внесении в клетки с дефицитом экспрессии Lin28 нескольких различных при-микро-РНК все они претерпевали процессинг, образуя функциональные транскрипты. Тем не менее, эктопическая экспрессия Lin28 приводила к подавлению процессинга не только при-let-7g, но и при-let-7g - это позволяет заключить, что его специфичность может в действительности быть не абсолютной.

Гомолог Lin28 - белок Lin28B - активно продуцируется в злокачественных клетках первичных опухолей у человека, например, в клетках гепатоцеллюлярной карциномы [8]. По этой причине результаты данной работы весьма интересны с точки зрения терапии злокачественных заболеваний. Ясно, что мутации различных компонентов микропроцессорного комплекса могут приводить к нарушениям процессов развития, а также быть причиной злокачественной трансформации клеток взрослого организма. Знание механизмов активации и репрессии процессинга микро-РНК, от которых зависят, в свою очередь, активация и ингибирование экспрессии самых различных генов, участвующих в диффе-ренцировке и пролиферации клеток, необходимо для успешного поиска терапии заболеваний, связанных с нарушениями этих процессов.

6. Mineno J., Okamoto S., Ando T. et al. The expression profile of microRNAs in mouse embryos. Nucleic Acids Res. 2006; 34: 1765-71.

7. Wulczyn F.G., Smirnova L., Rybak A. et al. Post-transcriptional regulation of the let-7 microRNA during neural cell specification. FASEB J. 2007; 21: 415-26.

8. Thomson J.M., Newman M., Parker J.S. et al. Extensive post-transcriptional regulation of microRNAs and its implications for cancer. Genes Dev. 2006; 20: 2202-7.

9. Moss E.G., Lee R.C., Ambros V. The cold shock domain protein LIN-28 controls developmental timing in C. elegans and is regulated by the lin-4 RNA. Cell 1997; 88: 637-46.

10. Polesskaya A., Cuvellier S., Naguibneva I. et al. Lin-28 binds IGF-2 mRNA and participates in skeletal myogenesis by increasing translation efficiency. Genes Dev. 2007; 21: 1125-38.

Подготовила A.C. Григорян По материалам: Viswanathan S.R, Daley G.Q., Gregory R.I. Selective Blockade of MicroRNA Processing by Lin28. Science 2008; 320: 96-100

Успешная индукция плюрипотентных стволовых клеток из нейральных стволовых клеток

с помощью двух факторов

В большинстве научных исследований для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (induced pluripotent stem cells, iPS cells), независимо от использующейся исходной клеточной популяции (фетальные или взрослые кожные фибробласты, синовиоциты и др.), применяется стандартный набор факторов, включающий Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4, Nanog, Lin28, высокий уровень экспрессии которых характерен для ЭСК [1, 2]. Авторы отдают

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008

предпочтение разным индукторам с учетом их функциональной значимости, но приемлемые положительные результаты достигаются лишь с применением квартета факторов. Принимая во внимание установленный негативный эффект реактивации с-Мус в виде индукции апоптоза [4] и опухолевой трансформации iPS клеток [5], целесообразна разработка протоколов с уменьшением количества факторов, необходимых для репрограммирования. В перспективе, это позволило

I I I I I

Ш

Новости клеточных технологий

бы повысить безопасность применения культур iPS клеток, что крайне необходимо для проведения клинических испытаний.

Теоретически, сокращение количества экзогенных индукторов репрограммирования возможно при достаточной эндогенной экспрессии некоторых из них. Так, например, нейральные стволовые клетки (НСК) характеризуются высоким уровнем экспрессии Sox2 (в два раза выше по сравнению с ЭСК) [6, 7], который, регулируя активность генов, ответственных за пролиферацию и дифференцировку, поддерживает мультипотентный статус клеток [8]. Кроме того, J.B. Kim с соавт. показали практически равное содержание белка, кодирующегося геном c-Myc, в НСК и ЭСК, а также экспрессию Klf4, уровень которой в восемь раз ниже по сравнению с ЭСК. Руководствуясь этими данными, J.B. Kim с соавт. предприняли исследование, в котором выполняли репрограммирование нейральных стволовых клеток (НСК) с использованием всего двух факторов.

На первом этапе эксперимента исследователи установили возможность репрограммирования НСК посредством трансфекции ретровирусными векторами, содержащими четыре фактора: Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4. Соответствие полученных iPS клеток и ЭСК доказали по стандартному плану, предусматривающему изучение морфологии, иммунофенотипа, генетических характеристик, наличия тератом при подкожном введении. Затем авторы с целью репрограммирования вводили в НСК различные комбинации трех из четырех указанных факторов. При этом в каждом случае одним из индукторов являлся Oct4, а два других менялись. Положительные результаты наблюдались при использовании любого варианта, однако различия заключались в сроке формирования колоний iPS клеток. Так, при трансфециро-вании НСК комплексом Oct4 - Klf4 - с-Myc репрограммирование завершалось к концу первой недели, при использовании вектора Oct4 - Klf4 - Sox2 - за 2-3 нед., а в случае Oct4 - c-Myc - Sox2 получение культуры iPS клеток осуществлялось в течение более длительного времени. Указанные данные свидетельствуют о возможности репрограммирования НСК всего тремя индукторами в отсутствии любого из экспрессирующихся эндогенно (c-Myc, Sox2, Klf4), причем время получения колоний iPS клеток обратно пропорционально

эндогенному уровню экспрессии фактора, отсутствующего в ретровирусном векторе.

В дальнейшем, исследователи оценивали эффективность репрограммирования НСК различными комбинациями из двух индукторов. Оказалось, что к формированию колоний iPS клеток приводят лишь два варианта: наиболее быстро - Oct4 - Klf4, а на одну-две недели медленнее -Oct4 - c-Myc. Затем, авторы сравнивали свойства клеточных культур, полученных при использовании Oct4 - Klf4 и квартета факторов между собой, а также с ЭСК. Установили, что морфологически идентичные колонии различных клеточных популяций характеризуются сходным уровнем экспрессии генов-маркеров ЭСК [Oct4, Nanog, Sox2, Fgf4, Enas, Cfc1, Zfp42, Utf1, Dppa5a), а также были позитивны по SSEA-1. Кроме того, методом ПЦР с обратной транскрипцией было показано, что iPS клетки, полученные при использовании двух индукторов, и ЭСК характеризуются одинаковыми уровнями экспрессии эндогенных Oct4, Sox2, c-Myc и Klf4 с тысячекратным понижением активности ретровирусных факторов через 30 дней после трансфекции.

Плюрипотентность сравниваемых культур iPS клеток была подтверждена формированием эмбриоидных телец, дифференцировкой в кардиомиоциты, образованием подкожных тератом, клетки которых экспрессировали маркеры эктодермальной [Tuj1), эндодермальной [AFP) и мезодер-мальной (Flk1) принадлежности. Инъекция iPS клеток, полученных при репрограммировании двумя факторами, в диплоидные и тетраплоидные бластоцисты приводила к формированию химер, которые в первом случае были жизнеспособны. При этом клетки, являющиеся производными разных зародышевых листков, несли маркер (GFP), что указывает на их происхождение от введенной культуры клеток, геном которых содержит ретровирусный вектор, маркированный GFP.

Таким образом, показана возможность репрограммирования соматических клеток (НСК) всего двумя факторами за счет эндогенной экспрессии остальных. Особенно важно, что положительные результаты достигаются и без применения ретровирусных векторов, содержащих c-Myc, который вносит существенный вклад в опасность опухолевой трансформации iPS клеток.

flMTEPATyPA:

1. Takahashi K., Yamanaka S., Tanabe K. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell 2007; 131 (5): 861-72.

2. Yu J., Vodyanik M.A., Thomson J.A. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science 2007; 318 (5858): 1917-20.

3. Wernig M., Meissner A., Foreman R. et. al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007; 448 (7151): 260-2.

4. Sumi T., Tsuneyoshi N., Nakatsuji N. et al. Apoptosis and differentiation of human embryonic stem cells induced by sustained activation of c-Myc. Oncogene

2007; 26 (38): 5564-76.

5. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448 (7151): 313-7.

6. Episkopou V. SOX2 functions in adult neural stem cells. Trends Neurosci. 2005; 28: 219-21.

7. Kim J. B., Zaehres H., Wu G. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature 2008; 7204: 646-50.

8. Avilion A.A., Nicolis S.K., Pevny L.H. et al. Multipotent cell lineages in early mouse development depend on SOX2 function. Genes Dev. 2003; 17:126-40.

Подготовил И.Я. Бозо

По материалам: Kim J. B, Zaehres H, Wu G. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells

by reprogramming with two factors. Nature 2008; (7204): 646-50

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008