КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ДЕГУММИРОВАНИЯ МАСЛА
COMPOSITION FOR OIL ENZYMATIC DEGUMMING

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к композициям, содержащим по меньшей мере один фермент, расщепляющий фосфолипиды и по меньшей мере одну протеазу. Также изобретение относится к способу дегуммирования составов, содержащих триглицериды, с использованием композиции по изобретению, и к применению композиции по изобретению для дегуммирования составов, содержащих триглицериды.
Уровень техники
Триглицериды, получаемые из растительного сырья, в частности неочищенных растительных масел, содержат фосфатиды  (фосфолипиды), белковые и углеводные компоненты, компоненты смол, слизей и камедей, а также коллоидные вещества, которые значительно сокращают срок хранения масла и снижают выход очищенного масла. Эти вещества поэтому подлежат удалению.
В процессе очистки (рафинирования) растительных масел удаляют нежелательные вещества, при наличии которых в масле его нельзя использовать. Различают химическое и физическое рафинирование. Химическое рафинирование состоит из процессов 1) дегуммирования, в ходе которого из масла удаляются фосфолипиды и ионы металлов; 2) нейтрализации щелочами, при которой экстрагируются жирные кислоты; 3) отбеливания для удаления окрашивающих масло веществ, ионов других металлов и оставшихся компонентов смол, слизей и камедей; 4) дезодорирование, перегонка с паром, при которой удаляются прочие вещества, негативно влияющие на запах и вкус масла. При физическом рафинировании масла осуществляется щелочная очистка (снижение кислотности, удаление кислот) наряду с дезодорированием в конце процесса очистки.
2+
2+
Дегуммирование масел может осуществляться путем экстракции фосфолипидов водой или водным раствором кислоты, образующей комплексы с ионами кальция (Ca) и магния (Mg), например водным раствором лимонной или фосфорной кислоты. Часто при этом вначале осуществляется водное дегуммирование, называемое предварительным, которое удаляет водорастворимые фосфолипиды. В настоящем документе употребляется термин «гидратируемые фосфолипиды».
Вопрос о гидратируемых и негидратируемых фосфолипидах обсуждается, например, в работе Nielsen, K., Composition of difficultly extractable soy bean phosphatides, J. Am. Oil. Chem. Soc. 1960, 37, 217-219 and A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, 112, 1178-1189. В частности, в их числе фосфатидилхолин и фосфатидилинозит. По опубликованным источникам, обработка масел разбавленными водными растворами кислот, образующих комплексы с кальцием и магнием, например лимонной или фосфорной кислоты, приводит к тому, что негидратируемые фосфолипиды становятся гидратируемыми. Для пищевого применения масла должно быть продемонстрировано, что содержание фосфора в нем понижено до 10 или менее частей на миллион (в опубликованных ранее работах содержание фосфора в масле определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии, ICP-AES). В отношении масел, используемых, например, для производства биодизельного топлива, действуют еще более строгие требования. Согласно принятым в странах Европейского союза стандартам, содержание фосфора в биодизельном топливе ограничивается пределом 5 частей на миллион, и практически целесообразно осуществлять снижение содержания фосфора уже на стадии масла.
Одним из недостатков обычно практикуемых процедур дегуммирования масла является то, что как водное предварительное дегуммирование, так и обработка водными растворами кислот приводят к потере масла, обусловленной эмульгированием части растительного масла в водной фазе, поскольку фосфолипиды, оказавшиеся в воде, действуют как эмульгирующие агенты. Эти потери составляют величину порядка нескольких процентов от количества исходно взятого неочищенного масла. Эмпирически установлено, что на каждые две фосфолипидных молекулы эмульгируется одна триглицеридная молекула (по описанию в публикации WO 08/094847). Так называемое ферментативное дегуммирование позволяет избежать ряда недостатков, присущих существующим методам рафинирования и/или усовершенствовать способы экстракции.

Применение фосфолипаз, в первую очередь фосфолипазы А, для дегуммирования неочищенных масел описано, например, в Европейском патенте 0513709 B1 (метод, называемый Enzymax, предложенный компанией Lurgi, Франкфурт, Германия). Считается, что в результате расщепления жирных кислот образуется лизолецитин, который обладает значительно более низкой эмульгирующей способностью в отношении масел, а также значительно более высокой растворимостью в воде. В результате увеличиваются выход масла и растворимость в воде фосфолипидов, плохо поддающихся гидратации. Современный уровень знаний в области ферментативного дегуммирования масел суммирован в следующих статьях: A.J. Dijkstra, Recent developments in edible oil processing, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2009, 111, 857-864; A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, 112, 1178-1189. В них обсуждаются преимущества и недостатки отдельных фосфолипаз с точки зрения их использования для ферментативного дегуммирования масел, а также способы предварительной обработки различными кислотами.
С точки зрения выхода продукта (масла) в случае ферментативного дегуммирования лучше всего использовать высоко эффективную фосфолипазу С, под действием которой образуется диглицерид, растворимый в масле и фосфатидильный радикал, например при расщеплении фосфатидилхолина (из лецитина), очень легко растворяющийся в воде. Такие ферменты описаны в US 7,226,771 (корпорация Verenium). В обзорной статье на тему ферментативного дегуммирования  к недостаткам этого подхода автор (A.J. Dijkstra) относит то обстоятельство, что он не обеспечивает превращения всех фосфолипидов, а только фосфатидилхолина и фосфатидилинозита, тогда как с трудом поддающиеся гидратированию этаноламины и фосфатидные кислоты не затрагиваются. Этот недостаток побудил в последующих разработках сочетать фосфолипазу С с фосфолипазой А или же с ацилтрансферазами, действующими на липиды. Использование комбинации фосфолипаз А и С для ферментативного дегуммирования описано в WO 08/094847. В этом патентном описании утверждается, что в результате смешивания фосфолипаз А и С достигается, с одной стороны, синергический эффект в отношении выхода продукта (масла) и, с другой стороны, очень низкое содержание фосфора в масле при приемлемой продолжительности реакции.
Комбинирование фосфолипазы С с ацилтрансферазами, действующими на липиды, описано в WO 2009/081094. В этой работе также утверждается, что сочетание ацилтрансферазы с фосфолипазой С дает увеличение выхода продукта (масла). Другой вариант ферментативного дегуммирования масла состоит в том, что проводится ферментативная обработка отделенной фазы фосфолипидов и сопутствующих примесей (gum phase) после дегуммирования масла обычным путем, например с помощью воды и/или лимонной кислоты. Такая обработка позволяет выделить некоторое количество растительного масла, эмульгированного в фосфолипидной фазе. Этот способ обсуждается, например, также в обзорной статье A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2010, 112, 1178-1189, p. 1184.
Также в PCT/EP2013/053199 описывается способ, в котором неочищенное масло дегуммируют с помощью комбинации фермента, расщепляющего форсфолипиды, с гликозидазой. В другом известном в данной области техники способе, описанном в ЕР 13166529.1, в ходе дегуммирования используется фосфатаза.
2
2
Наконец, вопрос рациональности использования фосфолипаз в долгосрочной перспективе по сравнению с другими методами дегуммирования обсуждается в статье L. De Maria & J. Vind & K.M. Oxenbøll & A. Svendsen & S. Patkar, Phospholipases and their industrial applications, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:290-300, pp. 96 and 97. На примере маслозавода, переведенного с традиционного метода дегуммирования на способ с использованием фосфолипазы С, на котором проходит очистку 266 000 т масла соевых бобов в год, показано, что ферментативный метод позволяет экономить 120 000 ГДж энергии и 120 000 т эквивалентов CO в год. Такое количество эквивалентов СО соответствует его выбросу от 1600 средних антропогенных источников.
Принимая во внимание растущее мировое потребление пищевых масел и все более широкое использование растительных масел в качестве сырья для химической промышленности и в качестве топлива, существует постоянная потребность в дальнейшем совершенствовании дегуммирования составов, содержащих триглицериды, в частности растительных масел и/или фосфолипидной фазы (фосфолипидов и сопутствующих примесей) растительных масел.
Раскрытие изобретения
Авторы настоящей заявки поставили поэтому перед собой задачу разработать ферментативный способ дегуммирования, альтернативный известным в данной области техники способам дегуммирования составов, содержащих глицериды, в частности неочищенных растительных масел, который обеспечил бы дальнейшее снижение содержания фосфора в подлежащих дегуммированию триглицеридах или составов, содержащих триглицериды; повышение выхода продукта (масла) и/или увеличение скорости реакции ферментативного дегуммирования. В то же время этот способ должен дать возможность экономической выгоды при применении в промышленном масштабе.
В контексте изобретения под ферментативной активностью понимается катализирование химической реакции одним или более белками-катализаторами (ферментами). В результате такой реакции субстрат фермента превращается в один или более продуктов. Некоторые ферменты или ферментные композиции обладают одной или более ферментативными активностями. Индивидуальный фермент, например, может служить катализатором в более чем одной реакции (превращении субстрата в один или более продуктов), то есть обладать более чем одной ферментативной активностью. Многие ферментные композиции не являются биохимически чистыми продуктами и соответственно обладают несколькими ферментативными активностями. Ферментативная активность как величина связана со скоростью реакции. Эта величина показывает, сколько активного фермента имеется в ферментной композиции. Единица ферментативной активности 1U, или 1Е – это количество фермента, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при стандартных условиях (1Е = 1 мкмоль/мин).
Указанная цель изобретения достигается с помощью композиции, содержащей первый ферментный компонент, включающий по меньшей мере один фермент, расщепляющий фосфолипиды, и второй ферментный компонент, включающий по меньшей мере одну протеазу (в настоящем документе такая композиция называется композицией по изобретению).
В контексте изобретения фермент, расщепляющий фосфолипиды, - это предпочтительно фосфолипаза, способная отщеплять остаток жирной кислоты или фосфатидильный остаток или полярную группу, служащую «головой» фосфолипидной молекулы. Также фермент, расщепляющий фосфолипиды, является предпочтительно ацилтрансферазой, катализирующей реакцию, в которой отщепление жирнокислотного остатка (ацильной цепи) сочетается с переносом этой группы, после чего образуется эфир и свободный стерол в жирной фазе.
Фосфолипазы принадлежат к группе ферментов, называемых гидролазами: они гидролизуют эфирную связь в фосфолипидах. В зависимости от локализации ферментативного акта в молекуле субстрата фосфолипазы подразделяются на пять групп:
- фосфолипаза А1 (PLA1) отщепляет остаток жирной кислоты (ацильную цепь) в положении sn1 с образованием 2-лизофосфолипида;
- фосфолипаза А2 (PLA2) отщепляет остаток жирной кислоты (ацильную цепь) в положении sn2 с образованием 1-лизофосфолипида;
- фосфолипаза С (PLC) гидролизует фосфодиэфирную связь между глицериновым остатком и фосфатной группой;
- фосфолипаза D (PLD) отщепляет «голову» молекулы фосфолипида (гидролизует связь между фосфатной группой и спиртовой группой);
- фосфолипаза В (PLB) отщепляет обе (в положениях sn-1 и sn-2) ацильные цепи с образованием 1,2-лизофосфолипида.
В контексте изобретения под ацилтрансферазой понимается фермент, осуществляющий перенос ацильной группы, например остатка жирной кислоты (ацильной цепи) молекулы фосфолипида, на подходящий акцептор, например стерол, с образованием эфира.
В одном из своих предпочтительных воплощений изобретение относится к композициям, в которых первый ферментный компонент выбирают из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2, фосфолипазы С, фосфолипазы В, фосфолипазы D, ацилтрансферазы и их смесей. Эти ферменты могут природными, происходящими из любого желаемого организма (в том числе могут быть выделены, например, из какого-либо термофильного организма) или синтезированными. Эти ферменты могут быть животного происхождения, например выделены из поджелудочной железы, или растительного либо микроорганизменного происхождения, например выделены из дрожжей или иных грибов, водорослей или бактерий. В контексте изобретения возможно также, что в состав того или иного ферментного компонента входят ферменты одного типа, но разного происхождения (из разных источников или видов). Также изобретение включает обладающие соответствующей ферментативной активностью рекомбинантные химерные слитые белки, происходящие от двух или более разных видов живых организмов.
В контексте изобретения предпочтительно используются фосфолипаза А1, фосфолипаза А2, фосфолипаза С, фосфолипаза В, фосфолипаза D, ацилтрансфераза и их смеси, из следующих источников: поджелудочная железа свиньи, поджелудочная железа быка, змеиный яд, пчелиный яд, микроорганизмы родов Aspergillus, Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Dictyostelium, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia, Erwinia, Fusarium, Klebsiella, Listeria, Mucor, Naja, Neurospora, Pichia, Proteus, Pseudomonas, Providencia, Rhizomucor, Rhizopus, Salmonella, Sclerotinia, Serratia, Shigella, Streptomyces, Thermomyces, Trichoderma, Trichophyton, Whetzelinia, Yersinia.
Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus alvei, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus larvae,
Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus natto, Bacillus pasteurii, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus sporothermodurans, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseudoanthracis, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter braakii, Citrobacter farmeri, Citrobacter freundii, Citrobacter gillenii
Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sedlakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter youngae, Clostridium perfringens, Dictyostelium discoideum, Dictyostelium mucoroides, Dictyostelium polycephalum, Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Enterobacter amnigenus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter gergoviae, Enterobacter intermedius, Enterobacter pyrinus, Escherichia albertii, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia senegalensis, Escherichia vulneris, Erwinia amylovora, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia oleae, Erwinia mallotivora, Erwinia papayae, Erwinia persicina, Erwinia piriflorinigrans, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia rhapontici, Erwinia tasmaniensis, Erwinia toletana, Erwinia tracheiphila, Fusarium avenaceum, Fusarium avenaceum, Fusarium chlamydosporum, Fusarium coeruleum, Fusarium culmorum, Fusarium dimerum, Fusarium incarnatum, Fusarium heterosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium napiforme, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichiella, Fusarium tricinctum, Fusarium proliferatum, Fusarium sacchari, Fusarium solani, Fusarium sporotrichioides, Fusarium subglutinans, Fusarium tabacinum, Fusarium verticillioides, Klebsiella oxytoca, Klebsiella mobilis, Klebsiella singaporensis, Klebsiella granulomatis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, Listeria monocytogenes, Mucor amphibiorum, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor indicus, Mucor javanicus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor subtilissimus, Mucor racemosus, Naja mossambica, Neurospora Africana, Neurospora crassa, Neurospora discrete, Neurospora dodgei, Neurospora galapagosensis, Neurospora intermedia, Neurospora lineolata, Neurospora pannonica, Neurospora sitophila, Neurospora sublineolata, Neurospora terricola, Neurospora tetrasperma, Pichia barkeri, Pichia cactophila, Pichia cecembensis, Pichia cephalocereana, Pichia deserticola, Pichia eremophilia, Pichia exigua, Pichia fermentans, Pichia heedii, Pichia kluyveri, Pichia kudriavzevii, Pichia manshurica, Pichia membranifaciens, Pichia nakasei, Pichia norvegensis, Pichia orientalis, Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Pichia pseudocactophila, Pichia scutulata, Pichia sporocuriosa, Pichia terricola, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus myxofaciens, Proteus penneri, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Rhizomucor endophyticus, Rhizomucor miehei, Rhizomucor pakistanicus, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor tauricus, Rhizomucor variabilis, Rhizopus arrhizus, Rhizopus azygosporus, Rhizopus circinans, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae, Rhizopus schipperae, Rhizopus sexualis, Rhizopus stolonifer, Rhizopus artocarpi, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Sclerotinia borealis, Sclerotinia homoeocarpa, Sclerotinia libertiana, Sclerotinia minor, Sclerotinia ricini, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia spermophila, Sclerotinia trifoliorum, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia quinivorans, Serratia rubidaea, Serratia symbiotica, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Streptomyces achromogenes, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces carcinostaticus, Streptomyces cervinus, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces coeruleorubidus, Streptomyces davawensis, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lavendulae, Streptomyces lincolnensis, Streptomyces natalensis, Streptomyces nodosus, Streptomyces noursei, Streptomyces peuceticus, Streptomyces platensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces spectabilis, Streptomyces toxytricini, Streptomyces venezuelae, Streptomyces violaceoniger, Streptomyces violaceoruber, Thermomyces lanuginosa, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichophyton concentricum, Trichophyton eboreum, Trichophyton equinum, Trichophyton gourvilii, Trichophyton kanei, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton phaseoliforme, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton simii, Trichophyton soudanense, Trichophyton terrestre, Trichophyton tonsurans, Trichophyton vanbreuseghemii, Trichophyton verrucosum, Trichophyton violaceum, Trichophyton yaoundei, Whetzelinia schlerotiorum, Yersinia aldovae, Yersinia aleksiciae, Yersinia bercovieri, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia massiliensis, Yersinia mollaretii, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia rohdei, Yersinia ruckeri, Yersinia similis.
Особенно предпочтительны фосфолипаза А1, фосфолипаза А2, фосфолипаза С, фосфолипаза В, фосфолипаза D, ацилтрансфераза и их смеси из следующих организмов: ,
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Edwardsiella tarda, Erwinia herbicola, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Dictyostelium discoideum, Fusarium oxysporium, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mucor javanicus, Mucor mucedo, Mucor subtilissimus, Naja mossambica, Neurospora crassa, Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Pseudomonas species, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Rhizomucor pusillus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus, Rhizopus stolonifer, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Serratia liquefaciens, Sclerotinia libertiana, Shigella flexneri, Streptomyces violaceoruber, Trichophyton rubrum, Thermomyces lanuginosus, Trichoderma reesei, Whetzelinia sclerotiorum, Yersinia enterocolitica,
В одном из особенно предпочтительных воплощений изобретения используются фосфолипаза А1, фосфолипаза А2, фосфолипаза В, фосфолипаза С и/или фосфолипаза D, происходящие из следующих источников: микроорганизмов  поджелудочной железы свиньи, поджелудочной железы  быка, змеиного яда или пчелиного яда.
Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium oxysporium, Naja mossambica, Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Streptomyces violaceoruber, Thermomyces lanuginosus, Trichoderma reesei
По меньшей мере один фермент в первом ферментном компоненте композиции по изобретению может происходить как из одинаковых, так и из разных источников, предпочтительно одного или нескольких из указанных выше организмов/источников, причем особенно предпочтительны , поджелудочная железа свиньи или поджелудочная железа быка.
В контексте изобретения термин «протеаза» означает один или более ферментов или ферментных композиций из ферментов класса 3.4 (пептидгидролазы). Этот термин включает пептидазы и/или протеиназы. Протеазы катализируют гидролиз пептидных связей. Ферменты в составе композиции по изобретению могут быть животного происхождения, например из слизистой желудка, растительного или микроорганизменного происхождения, например из дрожжей или других грибов, из водорослей или бактерий. В частности, протеазы в контексте изобретения - это предпочтительно один или более ферментов из следующих групп протеаз: аминопептидазы, аспартатэндопептидазы, дипептидазы, дипептидилпептидазы, трипептидилпептидазы, пептидилдипептидазы, сериновые карбоксипептидазы металлокарбоксипептидазы, цистеиновые карбоксипептидазы, омегапептидазы, сериновые эндопептидазы, цистеиновые эндопептидазы, аспарагиновые эндопептидазы, металлоэндопептидазы, треониновые эндопептидазы, эндопептидазы, причем предпочтение отдается использованию аспартатных эндопептидаз, сериновых эндопептидаз или металлоэндопептидаз.
В контексте изобретения отдается предпочтение использованию указанных протеаз из следующих источников: слизистая желудка млекопитающих, поджелудочная железа свиньи, поджелудочная железа быка, Aspergillus, Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Dictyostelium, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia, Erwinia, Fusarium, Klebsiella, Listeria, Mucor, Naja, Neurospora, Pichia, Proteus, Pseudomonas, Providencia, Rhizomucor, Rhizopus, Salmonella, Sclerotinia, Serratia, Shigella, Streptomyces, Thermomyces, Trichoderma, Trichophyton, Whetzelinia, Yersinia.
Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Bacillus alvei, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus larvae, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus natto, Bacillus pasteurii, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus sporothermodurans, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseudoanthracis, Bacillus polymyxa, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter braakii, Citrobacter farmeri, Citrobacter freundii, Citrobacter gillenii, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sedlakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter youngae, Clostridium perfringens, Dictyostelium discoideum, Dictyostelium mucoroides, Dictyostelium polycephalum, Edwardsiella hoshinae, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda, Enterobacter amnigenus, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter gergoviae, Enterobacter intermedius, Enterobacter pyrinus, Escherichia albertii, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia senegalensis, Escherichia vulneris, Erwinia amylovora, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia cleae, Erwinia mallotivora, Erwinia papayae, Erwinia persicina, Erwinia piriflorinigrans, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia rhapontici, Erwinia tasmaniensis, Erwinia toletana, Erwinia tracheiphila, Fusarium avenaceum, Fusarium avenaceum, Fusarium chlamydosporum, Fusarium coeruleum, Fusarium culmorum, Fusarium dimerum, Fusarium incarnatum, Fusarium heterosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium napiforme, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium sporotrichiella, Fusarium tricinctum, Fusarium proliferatum, Fusarium sacchari, Fusarium solani, Fusarium sporotrichioides, Fusarium subglutinans, Fusarium tabacinum, Fusarium verticillioides, Klebsiella oxytoca, Klebsiella mobilis, Klebsiella singaporensis, Klebsiella granulomatis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, Listeria monocytogenes, Mucor amphibiorum, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor indicus, Mucor javanicus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor subtilissimus, Mucor racemosus, Naja mossambica, Neurospora Africana, Neurospora crassa, Neurospora discrete, Neurospora dodgei, Neurospora galapagosensis, Neurospora intermedia, Neurospora lineolata, Neurospora pannonica, Neurospora sitophila, Neurospora sublineolata, Neurospora terricola, Neurospora tetrasperma, Pichia barkeri, Pichia cactophila, Pichia cecembensis, Pichia cephalocereana, Pichia deserticola, Pichia eremophilia, Pichia exigua, Pichia fermentans, Pichia heedii, Pichia kluyveri, Pichia kudriavzevii, Pichia manshurica, Pichia membranifaciens, Pichia nakasei, Pichia norvegensis, Pichia orientalis, Pichia pastoris, Pichia pseudocactophila, Pichia scutulata, Pichia sporocuriosa, Pichia terricola, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus myxofaciens, Proteus penneri, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Rhizomucor endophyticus, Rhizomucor miehei, Rhizomucor pakistanicus, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor tauricus, Rhizomucor variabilis, Rhizopus arrhizus, Rhizopus azygosporus, Rhizopus circinans, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae, Rhizopus schipperae, Rhizopus sexualis, Rhizopus stonolifer, Rhizopus artocarpi, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Sclerotinia borealis, Sclerotinia homoeocarpa, Sclerotinia libertiana, Sclerotinia minor, Sclerotinia ricini, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia spermophila, Sclerotinia trifoliorum, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia quinivorans, Serratia rubidaea, Serratia symbiotica, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Streptomyces achromogenes, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces avermitilis, Streptomyces carcinostaticus, Streptomyces cervinus, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces coeruleorubidus, Streptomyces davawensis, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lavendulae, Streptomyces lincolnensis, Streptomyces natalensis, Streptomyces nodosus, Streptomyces noursei, Streptomyces peuceticus, Streptomyces platensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces spectabilis, Streptomyces toxytricini, Streptomyces venezuelae, Streptomyces violaceoniger, Streptomyces violaceoruber, Thermomyces lanuginosa, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichophyton concentricum, Trichophyton eboreum, Trichophyton equinum, Trichophyton gourvilii, Trichophyton kanei, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton phaseoliforme, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton simii, Trichophyton soudanense, Trichophyton terrestre, Trichophyton tonsurans, Trichophyton vanbreuseghemii, Trichophyton verrucosum, Trichophyton violaceum, Trichophyton yaoundei, Whetzelinia schlerotiorum, Yersinia aldovae, Yersinia aleksiciae, Yersinia bercovieri, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia massiliensis, Yersinia mollaretii, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia rohdei, Yersinia ruckeri, Yersinia similis
Особенно предпочтительно использовать протеазы и их смеси из .
В контексте изобретения предпочтительно использовать протеазы из следующих источников: слизистая желудка млекопитающих, поджелудочная железа свиньи, поджелудочная железа быка, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus saitoi, Aspergillus sojae, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Clostridium perfringens, Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Pseudomonas species, Rhizomucor pusillus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus, Rhizopus stolonifer, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Serratia liquefaciens, Streptomyces griseus, Streptomyces violaceoruber, Thermomyces lanuginosus, Trichoderma reesei, Yersinia enterocolitica.
По меньшей мере одна протеаза второго ферментного компонента композиции по изобретению может происходить из одинаковых или разных источников, предпочтительно из одного или нескольких указанных выше организмов.
В одном из предпочтительных воплощений изобретения количество фермента (ферментов) первого ферментного компонента композиции по изобретению выбирают в диапазоне от 1 части на миллион (ppm) до 1000 ppm, более предпочтительно от 1 ppm (частей/млн.) до 250 ppm, особенно предпочтительно в диапазоне от 5 ppm до 200 ppm, исходя из количества масла. В другом предпочтительном воплощении изобретения ферментативную активность второго ферментного компонента предлагаемой композиции выбирают в диапазоне от 1 ppm дo 1000 ppm, более предпочтительно от 1 ppm до 250 ppm, особенно предпочтительно в диапазоне от 5 ppm до 200 ppm, исходя из количества масла.
В одном из предпочтительных воплощений изобретения активность фермента (ферментов) первого ферментного компонента предлагаемой композиции выбирают в диапазоне от 0,01 единицы на 1 г масла (Е/г) до 10 Е/г, более предпочтительно – в диапазоне от 0,1 Е/г до 5 Е/г, особенно предпочтительно в диапазоне от 0,2 Е/г до 3 Е/г и наиболее предпочтительно в диапазоне от 0,3 до 2 Е/г. В другом предпочтительном воплощении изобретения ферментативная активность фермента второго ферментного компонента предлагаемой композиции выбирают в диапазоне от 0,01 единицы на 1 г масла (Е/г) до 10 Е/г, предпочтительно в диапазоне от 0,1 Е/г до 5 Е/г, особенно предпочтительно в диапазоне от 0,2 Е/г до 3 Е/г и наиболее предпочтительно в диапазоне от 0,3 Е/г до 2 Е/г. (Одна международная единица ферментативной активности, 1 Е – количество микромолей субстрата, превращенных под действием данного фермента за 1 минуту, 1 мкмоль/мин).
В контексте изобретения особенно предпочтительны композиции, в которых отношение ферментативных активностей первого и второго ферментных компонентов предлагаемой композиции составляет от 0,001 : 20 до 20 : 0,001, предпочтительно от 0,1 : 10 дo 10 : 0,1, более предпочтительно от 0,25 : 7,5 дo 7,5 : 0,25, еще более предпочтительно от 0,5 : 5 дo 5 : 0,5 наиболее предпочтительно от 1 : 1 дo 1 : 5.
Соблюдая предпочтительное по изобретению соотношение первого и второго ферментных компонентов предлагаемой композиции, возможно еще более сократить объем фосфолипидной фазы. А это означает повышение выхода продукта – масла.
Для первого и/или второго ферментных компонентов композиции по изобретению можно использовать, например, лиофилизованные препараты ферментов, растворенные в соответствующем для данного фермента буферном растворе (стандартные буферные растворы, подходящие для конкретных ферментов, описаны в опубликованных работах), например цитратный буферный раствор (0,1 М; рН 5) или ацетатный буферный раствор (0,1 м; рН 5). В одном из предпочтительных воплощений изобретения ферменты, растворенные в подходящем буферном растворе, добавляют в неочищенное масло. Чтобы добиться лучшей растворимости используемых по изобретению ферментов, в частности в композициях, содержащих фосфолипазы, можно добавлять также органические растворители. Органические растворители используются, например, при отделении фосфолипидов; они описаны в опубликованных работах. По изобретению предпочтительно использовать неполярные органические растворители, например гексан или ацетон, или их смеси, предпочтительно в количестве от 1% (масса/масса) до 30% (масса/масса); примеры возможных растворителей описаны в Европейском патенте № 1531182 A2.
В другом предпочтительном воплощении изобретения первый и/или второй ферментные компоненты предлагаемой композиции используются на подложке. В качестве подложки по изобретению предпочтительны такие неорганические материалы, как силикагель, осажденный кремнезем, силикаты или алюмосиликаты, и такие органические материалы, как метакрилаты или ионообменные смолы. Материалы, используемые в качестве подложки, способствуют повторному использованию ферментов из эмульсии масло/вода на последующих этапах очистки и экономической осуществимости этого способа рафинирования.
В еще одном из предпочтительных воплощений изобретения предлагаемая композиция содержит один или более других компонентов, причем в их числе особенно предпочтительны выбираемые из группы, состоящей из цитратного и ацетатного буферных растворов.
Авторы изобретения обнаружили, что сочетание ферментных компонентов, указанных выше (первого и второго ферментных компонентов предлагаемой композиции) особенно эффективно снижает эмульгируемость триглицеридов в водной фазе. Поэтому композицию по изобретению особенно предпочтительно использовать для дегуммирования составов, включающих триглицериды, как, например, неочищенное растительное масло или фосфолипидная фаза растительного масла.
Таким образом, в другом своем аспекте изобретение относится к способу дегуммирования составов, содержащих триглицериды, который включает этапы
а) контактирования состава, содержащего триглицериды, с композицией по изобретению, описанной выше;
b) отделение фосфолипидов и сопутствующих примесей от состава, содержащего триглицериды.
В этой связи было обнаружено, что, применяя способ по изобретению, возможно еще более снизить содержание фосфолипидов в составах, содержащих триглицериды, по сравнению с использованием только фермента, расщепляющего фосфолипиды; также он позволяет увеличить выход масла, повысить скорость реакции в ходе ферментативного дегуммирования, уменьшить объем фосфолипидов с сопутствующими примесями и/или улучшить отделяемость образующейся фосфолипидной фазы. При этом содержание фосфора становится ниже 20 ppm, особенно предпочтительно ниже 10 ppm, еще более предпочтительно ниже 4 ppm.
Также с помощью способа по изобретению возможно снизить содержание кальция и магния в составах, включающих триглицериды, в частности в неочищенном растительном масле, так что оно становится менее 20 ppm, особенно предпочтительно ниже 15 ppm, еще более предпочтительно ниже 10 ppm, сверх того предпочтительно менее 8 ppm и наиболее предпочтительно мене 4 ppm. В еще одном предпочтительном воплощении изобретения содержание кальция и магния становится менее 3 ppm.
Способ по изобретению отличается особыми преимуществами, так как благодаря использованию протеазы усиливается эффект фермента, расщепляющего фосфолипиды. В результате использования протеазы снижается вязкость фосфолипидной фазы масла, а кроме того возрастает подвижность фосфолипидов. Также увеличивается доступность молекул фосфолипидов, находящихся на границе раздела фосфолипидной фазы и масла, для фермента, расщепляющего фосфолипиды.
Благодаря тому, что по изобретению по меньшей мере один фермент, расщепляющий фосфолипиды, сочетается с по меньшей мере одной протеазой, можно сократить добавление ферментов, расщепляющих фосфолипиды, например фосфолипазы А1 или А2, при необходимости комбинируемой с фосфолипазой С; тем самым снижается стоимость очистки, что тоже является преимуществом способа по изобретению.
В контексте изобретения термин «триглицериды» означает триэфиры глицерина с жирными кислотами, которые служат основными составляющими природных жиров и масел как растительного, так и животного происхождения. В контексте изобретения составы, содержащие триглицериды, включают растительные или животные жиры и масла и смеси этих жиров и масел как друг с другом, так и с синтетическими или модифицированными жирами и маслами. Приведенные здесь термины определяются более подробно ниже.
В контексте изобретения термин «растительное масло» означает любое масло растительного происхождения. Из числа масел, которые можно использовать по изобретению, особенно предпочтительны следующие: соевое, рапсовое, улучшенное рапсовое, подсолнечное, оливковое, пальмовое, ятрофное, рыжиковое, хлопковое масла  и их смеси. Особенно подходят для использования по изобретению необработанные/неочищенные растительные масла. В настоящем документе термин «необработанное/неочищенное» применительно к маслу означает, что этот продукт еще не подвергался дегуммированию, нейтрализации, обесцвечиванию и/или дезодорированию. В контексте способа по изобретению также можно использовать смеси двух или более необработанных масел или подвергать обработке ферментами предварительно дегуммированное и/или предварительно кондиционированное масло.
В контексте изобретения термины «фосфолипидная фаза», «фосфолипиды и сопутствующие примеси/фосфолипиды с сопутствующими примесями», «фосфолипиды и сопутствующие примеси/фосфолипидная фаза растительного масла» означают все вещества, которые в результате обработки состава, содержащего триглицериды, кислыми и/или водными растворами осаждаются как более тяжелая фаза (Michael Bokisch: Fats and Oils Handbook, AOCS Press, Champaign, Illinois, 1998, pages 428-444). В настоящем документе термины «фосфолипидная фаза», «фосфолипиды и сопутствующие примеси/фосфолипиды с сопутствующими примесями», «фосфолипиды и сопутствующие примеси/фосфолипидная фаза растительного масла»  употребляются как синонимы. Использование фосфолипидной фазы растительного масла в качестве исходного материала важно, в частности, для получения лецитина, являющегося существенным компонентом фосфолипидной фазы растительного масла.
В контексте изобретения термин «предварительное дегуммирование» или «дегуммирование водной средой» означает обработку неочищенного масла водой или водным раствором кислоты для удаления, насколько это возможно, водорастворимых фосфолипидов. В контексте изобретения термины «предварительное дегуммирование» и «дегуммирование водной средой» употребляются как синонимы. Также в ходе предварительного дегуммирования, или дегуммирования водной средой после добавления к маслу кислоты возможно добавление щелочи, чтобы нейтрализовать эту кислоту. Перед добавлением фермента водную фазу отделяют. После предварительного дегуммирования содержание фосфора в неочищенном масле снижается с примерно 500-1500 ppm (например, в соевом и в рапсовом маслах) до менее 200 ppm. В результате предварительного дегуммирования из полученной фосфолипидной фазы можно выделить лецитин и/или эту фазу можно подвергнуть дальнейшей переработке для использования в пищевых целях. Однако отделение водной фазы или снижение содержания фосфора имеет тот недостаток, что снижается выход конечного продукта – очищенного масла. Переходящие в водную фазу фосфатиды (фосфолипиды) обладают эмульгирующим эффектом, из-за чего некоторое количество масла оказывается в эмульгированном виде в водной фазе и отделяется вместе с ней. Дальнейшая обработка масла может осуществляться ферментативным путем.
В контексте изобретения термин «предварительное кондиционирование» применительно к маслу означает добавление воды и/или водного раствора кислоты к необработанному маслу. Затем путем добавления щелочи, например раствора гидроксида натрия, рН устанавливается таким, чтобы могла протекать следующая далее ферментативная реакция. Лучше всего, если устанавливается рН, оптимальный для этого фермента в интервале от 3,5 до 7. После этого водную фазу не отделяют, а прямо добавляют ферменты. На данный момент присутствующие фосфолипиды и сопутствующие примеси остаются в масле или в эмульсии. Водную фазу и соответственно ферменты отделяют только после того, как ферменты подействуют на неочищенное (при необходимости предварительно кондиционированное) масло.
В одном из предпочтительных воплощений изобретения в порядке предварительного кондиционирования к неочищенному маслу может быть добавлена вода или водный раствор кислоты и при необходимости щелочь для нейтрализации кислоты, но отделения водной фазы перед добавлением ферментов не делается. Отсутствие этапа отделения водной фазы перед добавлением ферментов увеличивает выход масла. Повышение выхода продукта (масла) на 1% имеет большое экономическое значение, поскольку, например, в производстве соевого масла этот один процент соответствует приблизительно 400 000 т масла в год. Таким образом способ по изобретению в этом своем предпочтительном воплощении позволяет впрямую использовать неочищенные масла из соевых бобов или семян рапса с содержанием фосфора от 100 ppm до 1500 ppm. Кроме того, исключение этапа отделения водной фазы перед добавлением ферментов упрощает способ очистки.
2
В другом предпочтительном воплощении изобретения на этапе а) предлагаемого способа не добавляется никаких дополнительных эмульгирующих агентов, например додецилсульфата натрия (SDS), помимо уже присутствующих эмульгирующих- агентов, например лецитина. Аналогично, в способе по изобретению предпочтительно отсутствует добавление солей, например, хлорида кальция (CaCl).
Thermomyces lanuginosus
Fusarium oxysporium
Trichoderma reesei,
Streptomyces violaceoruber,
Aspergillus niger
Pichia pastoris
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus subtilis
Bacillus licheniformis
Aspergillus niger
Aspergillus oryzae
Для дегуммирования соевого или рапсового, или подсолнечного масла особенно предпочтительно использовать комбинацию фосфолипазы А1 из  или  и/или фосфолипазы А2 из поджелудочной железы свиньи или быка или  или  или и/или фосфолипазы C из  с протеазой из желудка или из , или из , или из , или из , или из .
В контексте изобретения контактирование состава, содержащего триглицериды, с композицией по изобретению на этапе а) предлагаемого способа может происходить любым известным специалистам в данной области техники образом, подходящим для задач изобретения. Предпочтительно контактирование состава, содержащего триглицериды, с композицией по изобретению на этапе а) предлагаемого способа достигается путем смешивания указанных состава и композиции.
После контактирования состава, содержащего триглицериды, с композицией по изобретению на этапе а) предлагаемого способа смесь указанных состава и композиции предпочтительно перемешивается, в частности предпочтительно перемешивается лопастной мешалкой со скоростью от 200 об/мин до 800 об/мин, предпочтительно от 250 об/мин до 600 об/мин, наиболее предпочтительно от 300 об/мин до 500 об/мин.
Температура смеси в ходе контактирования состава, содержащего триглицериды, с композицией по изобретению на этапе а) предлагаемого способа составляет предпочтительно от 15°C до 99°C, более предпочтительно от 20°C до 95°C, еще более предпочтительно от 22°C до 75°C, также предпочтительно от 25°C до 65°C, еще более предпочтительно от 30°C до 60°C и наиболее предпочтительно от 32°C до 55°C. При этом температуру указанной смеси следует выбирать так, чтобы она не превышала температуры денатурации используемых ферментов; предпочтительно, чтобы температура указанной смеси была по меньшей мере на 5°C ниже температуры, при которой эти ферменты денатурируют.
Продолжительность контактирования состава, содержащего триглицериды, с композицией по изобретению на этапе а) предлагаемого способа составляет предпочтительно от 1 минуты до 12 часов, более предпочтительно от 5 минут до 10 часов, также предпочтительно от 10 минут до 6 часов, еще более предпочтительно от 10 минут до 3 часов.
В ходе контактирования состава, содержащего триглицериды, с композицией по изобретению на этапе а) предлагаемого способа рН смеси составляет предпочтительно от 3 до 7,5, более предпочтительно от 4 до 6 и особенно предпочтительно от 4,0 до 5,5.
Контактирование состава, содержащего триглицериды, с первым и со вторым ферментными компонентами композиции по изобретению на этапе а) предлагаемого способа может происходить одновременно или последовательно. Если указанное контактирование осуществляется последовательно, то в контексте изобретения предпочтительно, чтобы состав, содержащий триглицериды, сначала контактировал со вторым ферментным компонентом. Если состав, содержащий триглицериды, сначала контактирует со вторым ферментным компонентом композиции по изобретению, а затем с первым ее ферментным компонентом, то особенно предпочтительно, чтобы после добавления одного из указанных компонентов и до добавления другого из них смесь перемешивалась в течение от 30 минут до 300 минут, предпочтительно от 60 минут до 240 минут, также предпочтительно от 70 минут до 120 минут.
Отделение фосфолипидов и сопутствующих примесей на этапе b) способа по изобретению может происходить любым известным специалистам в данной области техники образом, подходящим для задач изобретения. Предпочтительно, однако, чтобы указанное отделение осуществлялось с помощью какого-либо устройства, обеспечивающего разделение составляющих смесей, например путем центрифугирования или фильтрации. По изобретению предпочтительно использовать следующие разделяющие устройства: сопловые сепараторы, винтовые прессы, камерные сепараторы, дисковые триерные сепараторы, тарельчатые сепараторы с закрытым барабаном, двухфазовые декантеры, трехфазовые декантеры, трехопорные центрифуги, однобуферные центрифуги, вибрационные центрифуги с колеблющейся направляющей, вибрационные центрифуги, скоростные центрифуги с непроницаемой стенкой, винтовые центрифуги с непроницаемой стенкой, трубчатые центрифуги\, корзиночные центрифуги с ножевым съемом осадка, двухступенчатые подающие центрифуги, центрифуги-грохот со шнековой выгрузкой, центрифуги для стружки, центрифуги с выворачиваемым фильтром и универсальные центрифуги. В процессе центрифугирования происходит разделение фаз состава, содержащего триглицериды. Например в одном из предпочтительных воплощений изобретения, в котором составом, содержащим триглицериды, является неочищенное растительное масло, обработанное растительное масло, фосфолипиды с сопутствующими примесями и ферментная композиция оказываются в разных фазах, которые легко отделить одна от другой.
В одном из предпочтительных воплощений изобретения фазу, содержащую фосфолипиды с сопутствующими примесями, и фазу, содержащую композицию по изобретению, отделяют от обработанного масла. В этой связи особенно предпочтительно, чтобы первый и/или второй ферментный компоненты композиции по изобретению отделялись одновременно с фосфолипидами и сопутствующими примесями.
После указанного отделения ферменты, содержавшиеся в композиции по изобретению, можно регенерировать и/или очистить и использовать, например, вновь для дегуммирования. При необходимости для регенерации ферментов можно использовать адсорбент или подходящий вариант колоночной хроматографии. Потом можно использовать некоторое количество отделенной тяжелой фазы в дальнейшем дегуммировании масла способом по изобретению.
В другом своем предпочтительном воплощении изобретение относится к способу, описанному выше и включающему также этап
с) состав, содержащий триглицериды, который получен на этапе b), вновь контактирует с первым и/или вторым ферментными компонентами композиции по изобретению.
Контактирование на этапе с) способа по изобретению предпочтительно происходит в тех же условиях, которые описаны выше для этапа а) способа по изобретению. А именно, в одном из особенно предпочтительных воплощений изобретения  первый и/или второй ферментный компоненты композиции по изобретению перед новым контактированием подвергаются регенерации.
В одном из особенно предпочтительных воплощений изобретения состав, содержащий триглицериды, перед контактированием на этапе с) способа по изобретению подвергается предварительному кондиционированию, как описано выше.
В одном из особенно предпочтительных воплощений изобретения контактирование на этапе с) происходит, как уже говорилось выше, соответственно контактированию на этапе а) способа по изобретению.
В другом своем аспекте изобретение относится к применению композиции по изобретению, как описано подробнее выше, для дегуммирования составов, содержащих триглицериды.
Особенно предпочтительные воплощения изобретения описаны ниже, но эти описания никоим образом не ограничивают объем изобретения, а служат просто для лучшего объяснения.
Предпочтительное воплощение A)
a) контактирование состава, содержащего триглицериды, который выбирают из неочищенного соевого, рапсового и/или подсолнечного масла, с композицией. содержащей первый ферментный компонент, представляющий собой по меньшей мере один фермент, выбираемый из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2 и фосфолипазы С, и второй ферментный компонент, представляющий собой по меньшей мере один фермент, выбираемый из группы эндопротеаз;
b) отделение фосфолипидов и сопутствующих примесей от состава, содержащего триглицериды, путем центрифугирования.
В одном из особенно предпочтительных воплощений способа по изобретению в его предпочтительном воплощении А) перед этапом а) указанного способа осуществляется так называемое предварительное кондиционирование, при котором неочищенное масло на отдельном этапе способа смешивают с органической кислотой, предпочтительно с лимонной кислотой, взятой в количестве от 1,5 мл на 1 литр масла до 3 мл/л. При этом температура смеси доводится до предпочтительно 35-60°C, особенно предпочтительно до 48°C. По истечении времени реакции, составляющего от 30 минут до 2 часов, предпочтительно 1 час, рН смеси доводят до 5, прибавляя в стехиометрическом количестве раствор щелочи, предпочтительно раствор гидроксида натрия, взятого в количестве предпочтительно 0,5-2 моль на 1 литр смеси, особенно предпочтительно 1 моль/л. И только после того продолжают процедуру способа по данному изобретения, осуществляя этап а).
Предпочтительное воплощение В)
a) контактирование состава, содержащего триглицериды, который выбирают из неочищенного соевого и/или рапсового масла, с композицией, содержащей первый ферментный компонент, представляющий собой по меньшей мере один фермент, выбираемый из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2 и фосфолипазы С, и второй ферментный компонент, представляющий собой по меньшей мере один фермент, выбираемый из группы эндопротеаз, причем особенно предпочтительно, чтобы по меньшей мере один фермент первого ферментного компонента композиции по изобретению был иммобилизован на подложке;
b) отделение фосфолипидов и сопутствующих примесей от состава, содержащего триглицериды, путем центрифугирования.
В одном из особенно предпочтительных воплощений способа по изобретению в его предпочтительном воплощении В) особенно предпочтительно, чтобы ферменты первого и/или второго ферментных компонентов композиции по изобретению использовались в водной фазе (буферном растворе с рН предпочтительно в интервале от 4 до 5,5, особенно предпочтительно рН 4,0-5,0) в концентрации 0,05-5% (масса/объем). Контактирование на этапе а) осуществляется предпочтительно при температуре от 22°C до 70°C, более предпочтительно от 25°C дo 65°C.
Кроме того, в предпочтительном воплощении В) способа по изобретению осуществляется постдегуммирование путем прибавления раствора органической кислоты и/или раствора щелочи (после этапа b)). При этом температура смеси доводится предпочтительно до 35-60°C, особенно предпочтительно до 48°C. По истечении времени реакции, составляющего от 30 минут до 2 часов, предпочтительно 1 час, рН смеси доводят до 5, прибавляя раствор щелочи, предпочтительно раствор гидроксида натрия, в концентрации предпочтительно 0,5-2 мол/л, особенно предпочтительно 1 моль/л.
Предпочтительное воплощение С)
a) контактирование состава, содержащего триглицериды, который выбирают из фосфолипидов с сопутствующими примесями растительного масла, с композицией, содержащей первый ферментный компонент, представляющий собой по меньшей мере один фермент, выбираемый из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2 и фосфолипазы С, и второй ферментный компонент, представляющий собой по меньшей мере один фермент, выбираемый из группы протеаз, предпочтительно эндопротеаз, причем особенно предпочтительно, чтобы по меньшей мере один фермент первого ферментного компонента композиции по изобретению был иммобилизован на подложке;
b) отделение фосфолипидов и сопутствующих примесей от состава, содержащего триглицериды, путем центрифугирования.
Предпочтительное воплощение D)
a) контактирование состава, содержащего триглицериды, который выбирают из неочищенного соевого и/или неочищенного рапсового масла, с композицией, содержащей первый ферментный компонент, представляющий собой по меньшей мере один фермент, выбираемый из группы, состоящей из фосфолипазы А1, фосфолипазы А2 и фосфолипазы С, и второй ферментный компонент, представляющий собой по меньшей мере один фермент, выбираемый из группы протеаз, предпочтительно эндопротеаз, причем особенно предпочтительно, чтобы по меньшей мере один фермент первого ферментного компонента композиции по изобретению был иммобилизован на подложке;
b) отделение фосфолипидов и сопутствующих примесей от состава, содержащего триглицериды, путем центрифугирования.
В одном из особенно предпочтительных воплощений способа по изобретению в его предпочтительном воплощении D) особенно предпочтительно, чтобы перед этапом а) указанного способа осуществлялось предварительное кондиционирование, при котором неочищенное масло на отдельном этапе способа смешивают с органической кислотой, взятой в количестве 50-1500 ppm, предпочтительно с лимонной кислотой, взятой в количестве 100-1200 ppm. При этом температура смеси доводится предпочтительно до 40-90°C, особенно предпочтительно до 45-85°C. По истечении времени реакции, составляющего от 5 минут до 2 часов, предпочтительно 10-30 минут, смесь кондиционируют, прибавляя раствор щелочи, предпочтительно раствор гидроксида натрия, взятого в количестве предпочтительно 0,5-5 моль на 1 литр смеси, особенно предпочтительно 1 моль/л. И только после того продолжают процедуру способа по данному изобретения, осуществляя этап а).
Кроме того, можно снизить содержание фосфатидных кислот, оставшихся растворенными в составе, содержащем триглицериды, и не расщепленных фосфолипазами, путем снижения содержания кальция и/или магния в масле, обработанном способом по изобретению. Следовательно, описанные выше предпочтительные воплощения А)-D) способа по изобретению предпочтительно также дополнять последующим этапом, на котором снижается содержание двухвалентных ионов и, соответственно, содержание фосфора в масле путем повторного добавления комплексообразующих агентов, например лимонной или фосфорной, или щавелевой, или молочной, или яблочной кислоты.
Методы
В настоящей работе применялись следующие аналитические методы.
Определение содержания фосфора в растительных маслах
Фосфор определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой согласно стандарту DEV E-22.
Определение содержания кальция и магния в растительных маслах
Кальций и магний определяли методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой согласно стандарту DEV E-22.
Определение содержания свободных жирных кислот (FFA)
Содержание свободных жирных кислот определяли по поглощению гидроксида натрия или гидроксида калия в реакции омыления. Получали величину содержания (в процентах) свободных жирных кислот в исследовавшихся маслах. Определение проводили согласно стандарту DIN 53402 (метод DGF C-V 2).
Определение объема фосфолипидной фазы
Объем фосфолипидной фазы ферментативно не обработанных и ферментативно обработанных фосфолипидов и сопутствующих примесей, присутствующих в масле, определяли следующим образом. Нагревали 10-миллилитровую стеклянную центрифужную пробирку до рабочей температуры реакционной смеси, помещали образцы (2х2 мл) и центрифугировали со скоростью 3000 об/мин при контролируемой температуре в течение по меньшей мере 4 минут; в результате фосфолипидная фаза отделялась от масла. Для анализа брали пробы из верхних фаз масла. Для дополнительного документирования результатов образование фаз фотографировали.
Вариант 1
о
Подлежащее обработке неочищенное масло в количестве 400-600 г загружается в 1000-миллилитровый реактор Duran DN120 и отбираются пробы для анализирования. Масло в реакторе с помощью греющей пластины нагревается до температуры 40-85°С, в частности 48-80°С. После того, как нужная температура достигнута, начинают предварительное кондиционирование. Для этого к маслу добавляют определенное, зависящее от количества масла количество раствора лимонной кислоты (например, 1000 ppm). Затем смесь перемешивают с помощью диспергатора Ultraturrax в течение 1 минуты. Или же смесь инкубируют в течение 15 минут при перемешивании со скоростью 600 об/мин, чтобы произошла реакция с кислотой. Затем добавляют определенное количество раствора гидроксида натрия [1 моль/л, остаточное количество до 2% (объем/объем) или 3% (объем/объем) за вычетом воды от добавленных раствора кислоты и препарата фермента] до тех пор, пока рН не станет около 4; затем смесь инкубируют при перемешивании в течение еще 10 минут. Когда смесь остынет до температуры 48С, прибавляют фермент, смесь ферментов или иммобилизованный фермент, предпочтительно растворенные в воде или в буферном растворе. Добавленный ферментный препарат размешивают в смеси – для этого скорость перемешивания на время увеличивают (1 минута при 900 об/мин), после чего продолжают перемешивать при меньшей скорости.
Пробы отбирают через определенные промежутки времени с помощью пипетки. Каждую пробу помещают в стеклянную центрифужную пробирку, нагретую до температуры реакционной смеси) и центрифугируют со скоростью 3000 об/мин при контролируемой температуре по меньшей мере в течение 4 минут, чтобы отделить фосфолипидную фазу от масла. Для дополнительного документирования результатов образование фаз фотографировали; в образцах супернатанта определяли содержание фосфора, кальция и магния.
Вариант 2
К неочищенному маслу прибавляли фосфолипазы и дополнительные ферменты в подходящей комбинации в свободном или иммобилизованном виде вместе с водной фазой (буферный раствор для ферментов, рН 4-5) в количестве от 0,05% (масса/объем) до 5% (масса/объем). Эту эмульсию, состоящую из воды, ферментов (в случае иммобилизованных ферментов с подложкой) и масла тщательно перемешивают. Реакцию следует проводить при контролируемой температуре от 20°С до 70°С, лучше от 40°С до 65°С. Когда произойдет разделение фаз и сформируются твердые компоненты, их удаляют каким-либо стандартным методом, известным специалистам в данной области техники, например путем центрифугирования или фильтрации. В качестве дополнительной обработки масло дегуммируют разбавленной кислотой (например, лимонной кислотой) или раствором щелочи известным специалистам в данной области техники образом.
Вариант 3
Фосфолипидную фазу обрабатывают ферментами. В результате дегуммирования, проведенного известным специалистам в данной области техники образом, получается фосфолипидная фаза, и к ней прибавляют ферменты, причем не только фосфолипазы. Добавляемые ферменты могут быть в растворенном виде в водной фазе или суспендированными в органическом растворителе. Смесь следует нагреть до температуры 20-70°С, лучше до температуры 35-60°С. Смесь тщательно перемешивают до тех, пока процесс не закончится, что можно контролировать путем измерения вязкости или визуально - по растворению плотной до того фосфолипидной фазы. Путем центрифугирования достигается разделение фаз, так что каждую фазу можно отделить. Как правило, верхняя фаза состоит из полученного масла, средняя фаза - из фосфолипидов, а нижняя фаза является водной и содержит ферменты. Путем соответствующей обработки водной фазы можно выделить из нее ферменты и использовать их повторно. Перед дальнейшим использованием масла или содержащей ферменты водной фазы в зависимости от содержания в них двухвалентных ионов можно удалить эти ионы путем добавления комплексообразующих агентов.
Примеры и иллюстрации
Ниже изобретение разъясняется более подробно с помощью фигур и примеров. Отметим, что примеры и фигуры, приведенные в настоящем документе, носят сугубо иллюстративный характер, демонстрируя особенно предпочтительные воплощения изобретения. Ни примеры, ни фигуры не ограничивают объем изобретения.
Иллюстрации
Фиг. 1 изображает неочищенное рапсовое масло; предварительное кондиционирование; воды суммарно 3%.
Фиг. 2 изображает неочищенное рапсовое масло; предварительное кондиционирование с добавлением фермента PLA1 (0,3 Е на 1 г масла); воды суммарно 3%.
Фиг. 3 изображает неочищенное рапсовое масло; предварительное кондиционирование с добавлением ферментов PLA1 (0,3 Е на 1 г масла) и пепсина (1 Е на 1 г масла); воды суммарно 3%.
Пример 1
Для реакции по варианту 1 использовали неочищенное рапсовое масло со следующими исходными характеристиками: содержание фосфора 1200 ppm, кальция 365 ppm, магния 155 ppm, свободных жирных кислот 1,99%. Это масло подвергали предварительному кондиционированию с помощью водных растворов лимонной кислоты (1000 ppm) и гидроксида натрия (1 моль/л). Через определенные промежутки времени отбирали пробы (см. фиг. 1 и таблицу 1). По завершении реакции отделяли фосфолипидную фазу путем центрифугирования и определяли характеристики оставшегося масла методом Сокслета.
Thermomyces lanuginosus
Thermomyces lanuginosus
Для сравнения указанное предварительное кондиционирование проводили с добавлением фермента – фосфолипазы А1 из гриба  (Sigma-Aldrich) (см. фиг. 2, таблицу 2). На фиг. 3 и в таблице 3 представлены результаты предварительного кондиционирования с добавлением ферментов PLA1 из  и пепсина из слизистой желудка свиньи (Sigma-Aldrich).
Таблица 1. Содержание фосфора, кальция, магния и свободных жирных кислот (FFA) после предварительного кондиционирования; воды суммарно 3%.
Время [мин]
10
60
120
180
240
Ca [ppm]
76
11
9,5
9,4
9,5
Mg [ppm]
31
2,8
1,7
1,6
1,7
P [ppm]
247
20
14
13
14
FFA [%]
1,73
1,68
1,72
Фосфолипидыи сопутствующие примеси [%] 3 мин
5,8
6,5
6,0
6,0
6,0
Содержание фосфора, кальция, магния и свободных жирных кислот (FFA) после предварительного кондиционирования с добавлением PLA1 из Thermomyces lanuginosus (0,3 Е на 1 г масла;  воды суммарно 3%.
Таблица 2.
Время [мин]
10
60
120
180
240
Ca [ppm]
26
9,7
8,7
7,9
7,9
Mg [ppm]
9,7
2,1
1,8
1,4
1,5
P [ppm]
82
17
15
12
12
FFA [%]
1,76
2,35
2,14
Примеси [%] 3 мин
6,5
5,6
5,0
4,5
5,5
Содержание фосфора, кальция, магния и свободных жирных кислот (FFA) после предварительного кондиционирования с добавлением PLA1 из Thermomyces lanuginosus (0,3 Е на 1 г масла) и  пепсина (1 Е на 1 г масла);  воды суммарно 3%.
Таблица 3.
Время[мин]
10
60
120
180
240
Ca [ppm]
55
10
9,3
6,4
5,7
Mg [ppm]
23
3,1
3
1,9
1,6
P [ppm]
199
26
25
16
14
FFA [%]
1,86
2,14
2,17
Фосфолипидыи сопутствующие примеси [%] 3 мин
4,3
5,0
4,2
4,0
4,0
Как видно на фиг. 1, при использовании для предварительного кондиционирования неочищенного масла кислоты и щелочи объем фосфолипидной фазы  немалый и существенно не уменьшается, несмотря на перемешивание со скоростью 600 об/мин. Единственная фотография соответствует одному образцу. Отбор проб проводили в определенные моменты времени, а именно через 10, 60, 120, 180 и 240 минут (слева направо). В таблице 1 представлены соответствующие аналитические данные: содержание фосфора снижается через 240 минут с 247 ppm дo 14 ppm; концентрация двухвалентных ионов кальция и магния уменьшается, кальция – с 76 ppm дo 9,5 ppm; концентрация магния за все время протекания реакции снижается с 31 ppm дo 1,7 ppm. Содержание свободных жирных кислот остается практически неизменным. Предварительное кондиционирование служит подготовительным процессом для дегуммирования масла и в то же время играет роль сравнительной обработки.
Thermomyces lanuginosus
При использовании фосфолипазы А1 из гриба  (Sigma-Aldrich), как показано на фиг. 2, заметно уменьшение объема фосфолипидной фазы  за все время протекания реакции (одна фотография на каждое измерение/пробу) В таблице 2 представлены соответствующие аналитические данные и моменты времени отбора проб. Из таблицы 2 видно, что за 240 минут протекания реакции концентрация кальция снижается с 26 ppm дo 7,9 ppm, концентрация магния снижается с 9,7 ppm дo 1.5 ppm и содержание фосфора снижается с 82 ppm дo 12 ppm; содержание свободных жирных кислот возрастает с 1,76% дo 2,14%. Возрастание содержания свободных жирных кислот и снижение содержания фосфора свидетельствуют, что белок PLA1 проявляет свою ферментативную активность, и, следовательно, дегуммирование масла проходит успешно. Возрастание уровня свободных жирных кислот отражает активность фермента PLA1, который отщепляет от молекул фосфолипидов остатки жирных кислот; также объем фосфолипидной фазы  постепенно снижается. На фиг. 3 можно видеть объем фосфолипидной фазы  в масле, предварительно кондиционированном с добавлением фермента PLA1 и дополнительно пепсина. Из соответствующих аналитических данных, представленных в таблице 3 ясно, что уже через 120 минут достигается снижение объема фосфолипидной фазы до 4,2%, тогда как при использовании только PLA1 объем примесей составляет 5,0% (см. таблицу 2). Кроме того, содержание ионов (см. таблицу 3) сравнимо с таковым в случае использования только фермента PLA1 (см. таблицу 2). Содержание свободных жирных кислот возрастает с 1,86% дo 2,17%, что указывает на фосфолипазную активность. Полученные результаты показывают, что использование всего лишь одного дополнительного фермента -  пепсина - приводит к гораздо большему сокращению фосфолипидной фазы  и, следовательно, к увеличению выхода продукта реакции – масла.