КОРИНЕФОРМНАЯ БАКТЕРИЯ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ

1. Коринеформная бактерия, обладающая способностью продуцировать гетерологичный гибридный белок с помощью секреции, которая модифицирована таким образом, чтобы экспрессировать генетическую конструкцию для секреторного получения гетерологичного гибридного белка, кодирующую, по меньшей мере, гетерологичный гибридный белок, отличающаяся тем, что указанный гетерологичный гибридный белок содержит экстеин и интеин, имеющий активность ацильной перегруппировки.
2. Коринеформная бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный экстеин содержит целевой белок.
3. Коринеформная бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанный экстеин также содержит линкер, который связан с С-концом целевого белка в экстеине и расположен между целевым белком и интеином.
4. Коринеформная бактерия по п.3, отличающаяся тем, что указанный линкер есть последовательность из одного или более аминокислотных остатков.
5. Коринеформная бактерия по п.4, отличающаяся тем, что указанный линкер имеет мотив -NH-CH(R1)-CO-NH-CH(R2)-CO- при С-конце, где R1 и R2 есть боковые группы любой протеиногенной L-аминокислоты одного или различных типов, если линкер имеет длину два или более аминокислотных остатка.
6. Коринеформная бактерия по п.5, отличающаяся тем, что указанные R1 есть боковая группа любой протеиногенной L-аминокислоты и R2 есть боковая группа L-цистеина, или R1 есть водород и R2 есть боковая группа L-цистеина.
7. Коринеформная бактерия по любому из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что указанный целевой белок есть гетерологичный белок для коринеформной бактерии.
8. Коринеформная бактерия по п.7, отличающаяся тем, что указанный целевой белок выбран из группы, состоящей из биоактивного белка, рецепторного белка, антигенного белка и фермента.
9. Коринеформная бактерия по п.8, отличающаяся тем, что указанный биоактивный белок выбран из группы, состоящей из фактора роста, гормона, цитокина и родственной антителу молекулы.
10. Коринеформная бактерия по любому из пп.8 или 9, отличающаяся тем, что указанный биоактивный белок есть эксенатид как определено в следующих (А) или (В):
(A) белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34,
(B) вариант белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, но который содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и имеет активность, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34.
2
11. Коринеформная бактерия по п.9, отличающаяся тем, что указанная родственная антителу молекула состоит из одного или более белков, выбранных из Fab, F(ab′), Fc-гибридного белка и scFv.
12. Коринеформная бактерия по п.11, отличающаяся тем, что указанный Fab есть Fab трастузумаба, состоящий из тяжелой цепи как определено в следующих (С) или (D), и Fab трастузумаба, состоящий из легкой цепи как определено в следующих (Е) или (F):
(C) белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35,
(D) вариант белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, но который содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и имеет активность, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35.
(E) белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36,
(F) вариант белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, но который содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и имеет активность, соответствующую аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36.
13. Коринеформная бактерия по п.10, отличающаяся тем, что указанный интеин определен в следующих (G) или (H):
(G) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 37,
(H) вариант аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, но который содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и имеет активность ацильной перегруппировки.
14. Коринеформная бактерия по п.12, отличающаяся тем, что указанный интеин определен в следующих (I) или (J), если Fab есть Fab трастузумаба, состоящего из тяжелой цепи как определено в предшествующих (C) или (D):
(I) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 38, 40, 41 или 42,
(J) вариант аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38, 40, 41 или 42, но который содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и имеет активность ацильной перегруппировки.
15. Коринеформная бактерия по п.12, отличающаяся тем, что указанный интеин определен в следующих (К) или (L), если Fab есть Fab трастузумаба, состоящего из легкой цепи как определено в предшествующих (Е) или (F):
(K) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 37, (L) вариант аминокислотной последовательность SEQ ID NO: 37, но который содержит замену, делецию, вставку или добавлению одного или несколько аминокислотных остатков и имеет активность ацильной перегруппировки.
16. Коринеформная бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована далее таким образом, что активность пенициллинсвязывающего белка уменьшена.
17. Коринеформная бактерия по п.16, отличающаяся тем, что активность пенициллинсвязывающего белка уменьшена посредством ослабления экспрессии гена, кодирующего пенициллинсвязывающий белок, или нарушения такого гена.
18. Коринеформная бактерия по п.17, отличающаяся тем, что указанный пенициллинсвязывающий белок есть PBP1a или PBP1b.
19. Коринеформная бактерия по п.18, отличающаяся тем, что указанный пенициллинсвязывающий белок определен в следующих (M) или (N):
(М) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 44 или 46,
(N) вариант белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44 или 46, но который содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и имеет активность такую, что если его активность уменьшена в коринеформной бактерии, то количество гетерологичного гибридного белка, получаемого с помощью секреции, увеличено по сравнению с его количеством, наблюдаемым для немодифицированного штамма.
20. Коринеформная бактерия по любому из пп.16-19, отличающаяся тем, что указанная бактерия модифицирована далее таким образом, что активность белка поверхностного слоя клетки уменьшена.
21. Коринеформная бактерия по п.20, отличающаяся тем, что указанная активность белка поверхностного слоя клетки уменьшена посредством ослабления экспрессии гена, кодирующего белок поверхностного слоя клетки, или нарушения такого гена.
22. Коринеформная бактерия по п.21, отличающаяся тем, что указанный белок поверхностного слоя клетки есть PS1, CspB или CspA.
23. Коринеформная бактерия по п.22, отличающаяся тем, что указанный белок поверхностного слоя клетки определен в следующих (О) или (Р):
(О) аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 56, 57 или 58,
(Р) вариант белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, 57 или 58, но который содержит замену, делецию, вставку или добавление одного или нескольких аминокислотных остатков и имеет активность, такую, что если его активность уменьшена в коринеформной бактерии, то количество гетерологичного гибридного белка, получаемого с помощью секреции, увеличено по сравнению с его количеством, наблюдаемым для немодифицированного штамма.
24. Коринеформная бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная генетическая конструкция для секреторного получения гетерологичного гибридного белка также кодирует промотор, который функционирует в коринеформной бактерии.
25. Коринеформная бактерия по любому из пп.1-24, отличающаяся тем, что указанная генетическая конструкция для секреторного получения гетерологичного гибридного белка также кодирует сигнальный пептид, который функционирует в коринеформной бактерии.
26. Коринеформная бактерия по п.1, отличающаяся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Corynebacterium или Brevibacterium.
27. Коринеформная бактерия по п.26, отличающаяся тем, что указанная бактерия есть Corynebacterium glutamicum.
28. Способ получения гетерологичного гибридного белка с помощью секреции, включающий:
- выращивание бактерии по любому из пп.1-27 в питательной среде; и
- выделение гетерологичного гибридного белка, полученного с помощью секреции.