РАСТВОР ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА ДЛЯ КОНСЕРВАЦИИ КЛЕТОК
SOLUTION FOR CELL PRESERVATION, ITS APPLICATION AND METHOD FOR PRODUCING A SOLUTION FOR PRESERVATION OF CELLS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001]
Настоящее изобретение относится к раствору для консервации клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу консервации клеток, способу получения фиксированных клеток и способу анализа клеток с применением раствора для консервации клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения раствора для консервации клеток.
Уровень техники
[0002]
При анализе клеток клетки хранят до того как подвергнуть анализу. Например, при анализе клеток, выделенных из живого организма, необходимо надлежащим образом сохранить клетки на время периода с момента изъятия клеток до момента анализа клеток, поскольку клетки, выделенные из живого организма, начинают подвергаться автолизу.
[0003]
В Патентном источнике 1 описано, что клетки хранятся в растворе для консервации клеток перед анализом. В Примере 5 Патентного источника 1 раскрыто, что раствор для консервации клеток содержит 1 мМ ацетата магния, 2 мМ ацетата кальция, 10 мМ хлорида калия, 0,1% хлорида натрия и 20% метанола.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
ПАТЕНТНАЯ ЛИТЕРАТУРА
[0004]
Патентный источник 1: патент США 5,256,571
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКИЕ ЗАДАЧИ
[0005]
in vitro
Авторы изобретения обнаружили, что при хранении клеток в стандартном растворе для консервации клеток в течение заданного периода нуклеиновые кислоты в клетках могут становиться нестабильными и разрушаться. Поэтому существует потребность в разработке раствора для консервации клеток, в котором клетки могут с большей стабильность сохраняться  в течение заданного периода.
РЕШЕНИЯ ЗАДАЧ
[0006]
В настоящем изобретении предложен раствор для консервации клеток, содержащий низший спирт, включающий 1-6 атомов углерода, и ион двухвалентного металла в водном растворителе, где концентрация иона двухвалентного металла составляет от приблизительно 6 ммоль/л до приблизительно 82 ммоль/л.
[0007]
in vitro
В настоящем изобретении предложен способ консервации клеток, включающий погружение клеток в раствор для консервации клеток .
[0008]
В настоящем изобретении предложен способ получения раствора для консервации клеток, включающий смешивание низшего спирта, включающего 1-6 атомов углерода, и иона двухвалентного металла в водном растворителе, где концентрация иона двухвалентного металла в растворе для консервации клеток составляет от приблизительно 6 ммоль/л до приблизительно 82 ммоль/л.
[0009]
in vitro
В настоящем изобретении предложен способ получения фиксированных клеток, включающий контакт клеток с раствором для консервации клеток, в результате чего клетки становятся фиксированными.
[0010]
in vitro
В настоящем изобретении предложен способ анализа клеток, включающий следующие этапы: контакт клеток с раствором для консервации клеток , в результате чего клетки становятся фиксированными; и анализ нуклеиновых кислот в фиксированных клетках, которые получены в предыдущем этапе.
ПРЕИМУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0011]
in vitro
Согласно настоящему изобретению анализируемые клетки могут сохраняться в стабильном состоянии  в течение заданного периода, прежде чем быть подвергнутыми анализу.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0012]
Фиг. 1 является фотографией электрофореза в агарозном геле ДНК, выделенной из клеток HeLa, хранившихся в растворе для консервации клеток согласно варианту осуществления настоящего изобретения или в коммерчески доступном растворе для консервации клеток при заданных условиях.
Фиг. 2A является графиком, на котором показаны измеренные значения, полученные при хранении цервикальных клеток, выделенных у субъектов, в коммерчески доступном растворе для консервации клеток при заданных условиях и обнаружении нуклеиновых кислот, происходящих из вируса папилломы человека (ВПЧ), в ДНК клеток с помощью метода гибридного захвата (HC).
Фиг. 2B является графиком, на котором показаны измеренные значения, полученные при хранении цервикальных клеток, выделенных у субъектов, в коммерчески доступном растворе для консервации клеток при заданных условиях и обнаружении нуклеиновых кислот, происходящих из ВПЧ, в ДНК клеток с помощью метода HC.
Фиг. 3A является графиком, на котором показаны измеренные значения, полученные при хранении цервикальных клеток, выделенных у субъектов, в растворе для консервации клеток согласно варианту осуществления при заданных условиях и обнаружении нуклеиновых кислот, происходящих из ВПЧ, в ДНК клеток с помощью метода HC.
Фиг. 3B является графиком, на котором показаны измеренные значения, полученные при хранении цервикальных клеток, выделенных у субъектов, в растворе для консервации клеток согласно варианту осуществления при заданных условиях и обнаружении нуклеиновых кислот, происходящих из ВПЧ, в ДНК клеток с помощью метода HC.
Фиг. 4 является фотографией, сделанной при хранении цервикальных клеток, выделенных у субъектов, в растворе для консервации клеток согласно варианту осуществления или в коммерчески доступном растворе для консервации клеток в течение 2 дней при комнатной температуре и подвергнутых окраске по Папаниколау.
На Фиг. 5 показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации иона магния, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
Фиг. 6 является диаграммой, на которой показана видимая область диплоидных клеток в гистограмме площади флуоресценции, полученной при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворе для консервации клеток согласно варианту осуществления при 25°C в течение 4 часов, с помощью проточного цитометра.
Фиг. 7A является графиком, на котором показаны коэффициенты вариации (CV) площади флуоресценции в видимой области диплоидных клеток в отношении клеток HeLa, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации иона магния, при 25°C в течение 4 часов или при 30°C в течение 24 часов.
Фиг. 7B является графиком, на котором показаны коэффициенты вариации (CV) площади флуоресценции в видимой области диплоидных клеток в отношении клеток HeLa, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации иона магния, при 30°C в течение 24 часов.
На Фиг. 8A показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации метанола, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
На Фиг. 8B показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации метанола, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
На Фиг. 8C показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации метанола, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
На Фиг. 9 показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворе для консервации клеток при pH 6,4 или 7,0 при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
На Фиг. 10 показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации иона кальция, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
Фиг. 11 является гистограммами площади флуоресценции, полученными при анализе клеток HeLa, хранившихся в коммерчески доступном растворе для консервации клеток при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
Фиг. 12 является схематическим изображением, на котором показан пример раствора для консервации клеток, помещенного в контейнер.
На Фиг. 13 показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации иона кальция, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
На Фиг. 14 показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворе для консервации клеток, содержащем ион магния и ион кальция, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
Фиг. 15 является гистограммой площади флуоресценции, полученной при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворе для консервации клеток, содержащем этанол, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
На Фиг. 16 показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HeLa, хранившихся в растворе для консервации клеток Примера 1 или в растворе для консервации клеток, раскрытом в патенте США 5,256,571, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
На Фиг. 17 показаны гистограммы площади флуоресценции, полученные при анализе клеток HUVEC, хранившихся в растворах для консервации клеток, содержащих различные концентрации иона магния, при заданных условиях, с помощью проточного цитометра.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0013]
[1. Раствор для консервации клеток]
Раствор для консервации клеток согласно данному варианту осуществления содержит низший спирт, включающий 1-6 атомов углерода, и ион двухвалентного металла в водном растворителе, где концентрация иона двухвалентного металла составляет от приблизительно 6 ммоль/л до приблизительно 82 ммоль/л.
[0014]
Низший спирт, включающий 1-6 атомов углерода (в дальнейшем просто называемый "низшим спиртом"), отдельно не ограничен при условии, что он может смешиваться с водой в произвольном отношении при обычной температуре (25°C). Соответствующие примеры включают метанол, этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, изобутанол, втор-бутанол, трет-бутанол, н-амиловый спирт, изоамиловый спирт, втор-амиловый спирт, трет-амиловый спирт, 1-этил-1-пропанол, 2-метил-1-бутанол, н-гексанол и циклогексанол. Из них предпочтительными являются метанол или этанол, при этом метанол является наиболее предпочтительным с точки зрения действия, нужного при хранении и фиксации клеток (обезвоживание и коагуляция белка).
[0015]
В данном варианте осуществления может применяться только один тип низшего спирта или два или более типов низшего спирта. Два или более типов спирта могут быть смешаны в произвольном отношении. Например, смешанный спирт, полученный при смешивании метанола и этанола в произвольном отношении, может применяться в качестве раствора для консервации клеток.
[0016]
Концентрация низшего спирта в растворе для консервации клеток может быть надлежащим образом установлена в соответствии с периодом хранения клеток, способом анализа клеток и т.п. Слишком низкая концентрация (например, в случае, когда концентрация ниже, чем приблизительно 20% по объему) делает стабильное хранение клеток сложным. Слишком высокая концентрация (например, в случае, когда концентрация выше, чем приблизительно 60% по объему) может вызывать чрезмерную фиксацию клеток. В варианте осуществления концентрация низшего спирта обычно составляет от приблизительно 20% по объему до приблизительно 60% по объему, предпочтительно от приблизительно 30% по объему до приблизительно 50% по объему и наиболее предпочтительно от приблизительно 40% по объему до приблизительно 45% по объему. В другом варианте осуществления концентрация низшего спирта составляет от 20% по объему до 60% по объему, предпочтительно от 30% по объему до 50% по объему и наиболее предпочтительно от 40% по объему до 45% по объему. Низший спирт содержится в вышеуказанной концентрации, чтобы клетки можно было хранить в стабильном состоянии. Кроме того, также можно ожидать бактериостатическое действие или бактерицидное действие. В данном случае следует отметить, что "% по объему" также обозначают "об./об.%" или "об.%".
[0017]
Ион двухвалентного металла отдельно не ограничен при условии, что он не влияет на сохранение формы и содержимое клеток, и может быть выбран, например, из ионов металлов, которые добавляют в среду для культивирования клеток. В варианте осуществления примеры иона двухвалентного металла включают ион магния, ион кальция, ион цинка, ион железа (II), ион меди, ион стронция и ион молибдена. Из них предпочтительными являются ионы металлов II группы периодической системы химических элементов. В качестве иона металла II группы периодической системы химических элементов наиболее предпочтительны ион магния и ион кальция. В варианте осуществления может применяться только один тип иона двухвалентного металла или два или более типов ионов двухвалентных металлов.
[0018]
В варианте осуществления ион двухвалентного металла в растворе для консервации клеток предпочтительно образуется из соединения двухвалентного металла, растворимого в водном растворителе. Примеры соединения включают соли неорганических или органических кислот с двухвалентными металлами. Примеры солей неорганических кислот с двухвалентными металлами включают соли неорганических кислот (таких как соляная кислота, серная кислота, азотная кислота, хлорная кислота, бромоводородная кислота и иодоводородная кислота) с двухвалентными металлами. Примеры солей органических кислот с двухвалентными металлами включают соли органических кислот (таких как уксусная кислота, лимонная кислота, аскорбиновая кислота и щавелевая кислота) с двухвалентными металлами. Из них предпочтительными являются соли неорганических кислот с двухвалентными металлами. Соответствующие примеры включают хлорид магния, сульфат магния и хлорид кальция. В варианте осуществления соединение двухвалентного металла может быть ангидридом или гидратом.
[0019]
in vitro
В отношении концентрации иона двухвалентного металла авторы настоящего изобретения обнаружили, что в растворе для консервации клеток, содержащем низший спирт в качестве основного компонента, концентрация иона двухвалентного металла установлена в пределах от приблизительно 6 ммоль/л до приблизительно 82 ммоль/л, в результате чего клетки и нуклеиновые кислоты в клетках могут стабильно сохраняться  в течение заданного периода. В варианте осуществления концентрация иона двухвалентного металла предпочтительно составляет от приблизительно 6 ммоль/л до приблизительно 80 ммоль/л и более предпочтительно от приблизительно 10 ммоль/л до приблизительно 60 ммоль/л. В другом варианте осуществления концентрация иона двухвалентного металла составляет от 6 ммоль/л до 82 ммоль/л, предпочтительно от 6 ммоль/л до 80 ммоль/л и более предпочтительно от 10 ммоль/л до 60 ммоль/л. В данном случае следует отметить, что "ммоль/л" также обозначают "мМ". В варианте осуществления, в том случае, когда соединение двухвалентного металла, растворимое в водном растворителе, в особенности соль неорганической кислоты с двухвалентным металлом, растворяют в растворе для консервации клеток, концентрация иона двухвалентного металла в растворе для консервации клеток может быть выражена концентрацией соединения.
[0020]
Водный растворитель может быть смешан с низшим спиртом в необязательном отношении при обычной температуре (25°C) и отдельно не ограничен при условии, что он не влияет на сохранение формы и содержимое клеток. Примеры водного растворителя включают воду, физиологический солевой раствор, буферный раствор, раствор альбумина, раствор декстрана, раствор нормальной сыворотки человека или млекопитающего и их любую комбинацию.
[0021]
В качестве водного растворителя предпочтительно используется буферный раствор. Буферный раствор отдельно не ограничен при условии, что он является буферным раствором, имеющим буферное действие при pH от 6 до 8. Соответствующие примеры включают хороший буферный раствор, фосфатный буферный раствор (PBS), имидазольный буферный раствор и триэтаноламин гидрохлоридный буферный раствор (ТЭА). Примеры хорошего буферного раствора включают водные растворы буферных веществ, таких как PIPES, MES, бис-Трис, ADA, бис-Трис-пропан, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, HEPES, HEPPS, Трицин, Трис, Бицин и TAPS. В случае применения водных растворителей помимо буферного раствора любые буферные вещества, применяемые в вышеуказанных буферных растворах, могут быть добавлены в раствор для консервации клеток.
[0022]
В варианте осуществления показатель pH раствора для консервации клеток может находиться в диапазоне, подходящем для хранения клеток, и обычно находится в диапазоне от приблизительно 6 до приблизительно 8 и предпочтительно в диапазоне от приблизительно 6,4 до приблизительно 7. В другом варианте осуществления pH раствора для консервации клеток находится в диапазоне от 6 до 8 и предпочтительно в диапазоне от 6,4 до 7. Осмотическое давление раствора для консервации клеток отдельно не ограничено при условии, что оно не препятствует хранению клеток, при этом оно может быть физиологически изотоническим.
[0023]
В случае необходимости раствор для консервации клеток данного варианта осуществления может содержать добавку в водном растворителе, в дополнение к низшему спирту и иону двухвалентного металла. Добавка отдельно не ограничена при условии, что она не препятствует фиксации, хранению и анализу клеток. Соответствующие примеры включают известные вещества, такие как неорганические соли (например, хлорид натрия, хлорид калия), сахариды (например, глюкозу, трегалозу), консерванты (например, азид натрия, фенилметансульфонилфторид), белковые стабилизаторы (например, бычий сывороточный альбумин), противопенные вещества (например, этиленгликоль), антибиотики (например, пенициллин, стрептомицин) и противогрибковые средства (например, амфотерицин B).
[0024]
Trichomonas
Candida
in vitro
Клетки, которые предполагается хранить в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, отдельно не ограничены и могут быть, например, клетками многоклеточных организмов, клетками одноклеточных организмов или линий культивируемых клеток. Клетки многоклеточных организмов могут быть клетками, выделенными из живого организма, или могут быть клетками, выделенными из трупа. Примеры клеток многоклеточных организмов включают клетки, выделенные из млекопитающих, таких как человек. Конкретные соответствующие примеры включают цервикальные клетки, клетки в теле матки, клетки ротовой полости, клетки молочной железы, клетки щитовидной железы, клетки в моче, клетки в мокроте, клетки в бронхиальном браш-биоптате, клетки в перитонеальных смывах и клетки в целомической жидкости. Кроме того, клетки могут быть клетками, содержащимися в тканях, выделенных у млекопитающих, таких как человек. Выделенные ткани могут быть нормальными тканями или тканями, содержащими пораженные участки. Примеры клеток, содержащихся в выделенных тканях, включают первичные культивируемые клетки, эндотелиальные клетки пупочной вены в пупочном канатике и опухолевые клетки, содержащиеся в тканях опухоли, выделенных при операции или биопсии. Клетки могут быть простейшими, такими как , или грибами, такими как . Клетки могут быть клетками, полученными искусственно , такими как стволовые клетки или иПС клетки. Свойства клеток отдельно не ограничены, при этом клетки могут быть нормальными клетками, бессмертными клетками, раковыми клетками и т.п.
[0025]
коробка
На Фиг. 12 показан пример внешнего вида раствора для консервации клеток согласно данному варианту осуществления. На фигуре цифра 11 обозначает контейнер, содержащий раствор для консервации клеток. Контейнер, содержащий раствор для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, может быть помещен в коробку и затем предоставлен пользователю. Эта коробка может содержать вкладыш в упаковку, в котором описан способ применения раствора для консервации клеток. Кроме того, когда раствор для консервации клеток данного варианта осуществления предоставлен для хранения цервикальных клеток,  может содержать приспособление для отбора клеток для выделения клеток из шейки матки (например, тампон, щетку).
[0026]
[2. Способ получения раствора для консервации клеток]
Далее будет описан способ получения раствора для консервации клеток согласно данному варианту осуществления (в дальнейшем также просто называемый "способом получения"). Способ получения согласно данному варианту осуществления является способом получения раствора для консервации клеток, включающим смешивание низшего спирта, включающего 1-6 атомов углерода, и иона двухвалентного металла в водном растворителе так, чтобы концентрация иона двухвалентного металла составила от приблизительно 6 ммоль/л до приблизительно 82 ммоль/л. Следует отметить, что концентрации и типы низшего спирта, включающего 1-6 атомов углерода, и иона двухвалентного металла являются такими же, как описанные в отношении раствора для консервации клеток.
[0027]
В варианте осуществления соединение двухвалентного металла, растворимое в водном растворителе (в дальнейшем также просто называемое "соединением металла"), предпочтительно используется в качестве иона двухвалентного металла. Следует отметить, что это соединение является таким же, как соединение, описанное в отношении раствора для консервации клеток. Соединение металла, применяемое в способе получения согласно данному варианту осуществления, может находиться в форме раствора или может иметь твердую форму (например, порошка или кристалла).
[0028]
Низший спирт, применяемый в способе получения согласно данному варианту осуществления, может быть абсолютным спиртом. В альтернативе, при условии, что можно регулировать вышеуказанную концентрацию низшего спирта, он может быть гидратированным спиртом.
[0029]
В данном варианте осуществления нет никакого конкретного ограничения в отношении порядка добавления низшего спирта и соединения металла в качестве иона двухвалентного металла в водный растворитель. Например, соединение металла может быть смешано после смешивания низшего спирта и водного растворителя, или низший спирт может быть добавлен после смешивания соединения металла и водного растворителя. Кроме того, низший спирт и ион двухвалентного металла могут быть смешаны в водном растворителе по существу в одно и то же время. Условия смешивания отдельно не ограничены, причем смешивание может быть выполнено, например, при обычной температуре и нормальном давлении (например, при 25°C и давлении 1 атм).
[0030]
В варианте осуществления pH смеси, полученной, как описано выше, предпочтительно регулируют в диапазоне от приблизительно 6 до приблизительно 8, в особенности в диапазоне от приблизительно 6,4 до приблизительно 7, при использовании щелочи, такой как гидроксид натрия, или кислоты, такой как соляная кислота. В другом варианте осуществления предпочтительно, что pH смеси регулируют в диапазоне от 6 до 8, в особенности в диапазоне от 6,4 до 7.
[0031]
В варианте осуществления, в дополнение к низшему спирту и иону двухвалентного металла, может быть добавлена добавка, при необходимости. Следует отметить, что добавка является такой же, как описанная в отношении раствора для консервации клеток.
[0032]
[3. Способ консервации клеток с применением раствора для консервации клеток]
in vitro
Способ консервации клеток (в дальнейшем просто называемый "способом консервации") согласно данному варианту осуществления будет описан ниже. Способ консервации согласно данному варианту осуществления включает погружение клеток  в раствор для консервации клеток согласно данному варианту осуществления.
[0033]
Клетки, применяемые в способе консервации согласно данному варианту осуществления, являются такими же, как описанные выше.
[0034]
in vitro
В варианте осуществления клетки погружают  в достаточное количество (например, количество, которое в 100-1000 раз превышает объем клеток) раствора для консервации клеток, обеспечивая, таким образом, фиксацию клеток. После этого клетки можно хранить в течение заданного периода. В случае необходимости клетки, после погружения в раствор для консервации клеток, можно перемешать до такой степени, чтобы не повредить клетки, с получением суспензии. Перед погружением в раствор для консервации клеток клетки можно промыть PBS и т.п. В случае, когда клетки выделены из живого организма, клетки сразу начинают подвергаться автолизу, что приводит к деформации клеток и ядерных структур, а также деградации и модификации компонентов клетки, таких как нуклеиновая кислота и белок. Таким образом, клетки предпочтительно погружают в раствор для консервации клеток в течение не более 1 минуты после выделения. Контейнер для консервации отдельно не ограничен при условии, что это - контейнер, который может быть герметично закрыт крышкой, пробкой и т.п. Соответствующие примеры включают флакон, пробирку, микропробирку, микропланшет, чашку и бутылку.
[0035]
Температура при погружении клеток в раствор для консервации клеток (температура при контакте клеток с раствором для консервации клеток) предпочтительно составляет 35°C или ниже, более предпочтительно 32°C или ниже и еще более предпочтительно 30°C или ниже. Нижний предел температуры при погружении клеток в раствор для консервации клеток отдельно не ограничен при условии, что на последующий анализ не влияет замораживание раствора для консервации клеток и клеток. Например, нижний предел температуры может составлять 1°C или выше или 2°C или выше. Способ консервации согласно данному варианту осуществления может включать этап контакта клеток с раствором для консервации клеток при вышеуказанной температуре, предназначенный для фиксации клеток.
[0036]
Температура хранения клеток предпочтительно составляет 35°C или ниже, более предпочтительно 32°C или ниже и еще более предпочтительно 30°C или ниже. В случае, когда клетки хранятся в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, нуклеиновые кислоты клеток могут стабильно сохраняться не только в случаях хранения в охлажденном состоянии, но также и в случаях хранения при комнатной температуре. Нижний предел температуры хранения отдельно не ограничен при условии, что на последующий анализ не влияет замораживание раствора для консервации клеток и клеток. Например, нижний предел температуры хранения может составлять 1°C или выше или 2°C или выше. Способ консервации согласно данному варианту осуществления может включать этап хранения клеток в растворе для консервации клеток при вышеуказанной температуре в течение заданного периода. Следует отметить, что температура в момент контакта клеток с раствором для консервации клеток и температура хранения клеток могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.
[0037]
Раствор для консервации клеток может быть заменен в течение периода хранения. Хотя частота замены раствора для консервации клеток отдельно не ограничена, раствор для консервации клеток можно заменять, например, один раз в 90 дней.
[0038]
[4. Способ изготовления фиксированных клеток с применением раствора для консервации клеток]
in vitro
Способ изготовления фиксированных клеток согласно данному варианту осуществления (в дальнейшем также просто называемый "способом изготовления") будет описан ниже. Способ изготовления согласно данному варианту осуществления включает контакт клеток  с раствором для консервации клеток согласно данному варианту осуществления с получением фиксированных клеток. Следует отметить, что клетки, применяемые в способе изготовления согласно данному варианту осуществления, являются такими же, как описанные в способе консервации клеток согласно данному варианту осуществления.
[0039]
В варианте осуществления контакт клеток с раствором для консервации клеток может быть выполнен путем погружения клеток в достаточное количество (например, количество, которое в 100-1000 раз превышает объем клеток) раствора для консервации клеток. В альтернативе контакт клеток с раствором для консервации клеток может быть выполнен путем помещения клеток в пустую емкость и добавления достаточного количества раствора для консервации клеток к ним. Перед контактом с раствором для консервации клеток клетки могут быть промыты PBS и т.п. Клетки начинают немедленно подвергаться автолизу, который приводит к деформации клеток и ядерных структур и деградации и модификации компонентов клетки, таких как нуклеиновая кислота и белок. Таким образом, клетки предпочтительно подвергают контакту с раствором для консервации клеток в течение не более 1 минуты после выделения. Емкость, используемая для контакта, отдельно не ограничена, и соответствующие примеры включают флакон, пробирку, микропробирку, микропланшет, чашку и бутылку. В случае необходимости емкость может быть герметично закрыта крышкой, пробкой и т.п.
[0040]
В способе изготовления согласно данному варианту осуществления клетки, которые подвергают контакту с раствором для консервации клеток, подвергаются фиксации под действием низшего спирта, содержащегося в растворе для консервации клеток (обезвоживание и коагуляция белка). В варианте осуществления время контакта клеток с раствором для консервации клеток отдельно не ограничено при условии, что клетки фиксируются в достаточной степени. Температурные условия в момент контакта совпадают с условиями, описанными в способе консервации согласно данному варианту осуществления.
[0041]
В варианте осуществления полученные фиксированные клетки могут использоваться сразу или после промывки PBS и т.п., в качестве образцов для необходимого анализа. В альтернативе клетки и раствор для консервации клеток можно хранить в состоянии контакта друг с другом перед анализом. Условия хранения клеток совпадают с условиями, описанными в отношении способа консервации согласно данному варианту осуществления.
[0042]
[5. Способ анализа клеток с применением раствора для консервации клеток]
in vitro
Способ анализа клеток (в дальнейшем просто называемый "аналитическим способом") согласно данному варианту осуществления будет описан ниже. В аналитическом способе согласно данному варианту осуществления клетки сначала подвергают контакту  с раствором для консервации клеток согласно данному варианту осуществления с целью фиксации клеток. Клетки, раствор для консервации клеток и фиксация клеток являются такими же, как описанные выше.
[0043]
Затем нуклеиновые кислоты в полученных фиксированных клетках подвергают анализу. В данном варианте осуществления в анализе нуклеиновых кислот предпочтительно получить информацию, указывающую количество нуклеиновых кислот. Форма информации, указывающей количество нуклеиновых кислот, отдельно не ограничена и может быть определена надлежащим образом согласно способу получения информации. Информация, указывающая количество нуклеиновых кислот, может быть числовой информацией (например, измеренным значением), может быть диаграммой (например, графиком, полученным на основе числовой информации) или может быть визуальной информацией (например, окрашенным изображением, фотографией электрофорезного геля).
[0044]
Нуклеиновые кислоты в фиксированных клетках могут быть нуклеиновыми кислотами, изначально существующими в клетках, или нуклеиновыми кислотами, введенными извне при введении гена, в результате вирусной инфекции и т.п. Типом нуклеиновых кислот может быть либо ДНК, либо РНК. В варианте осуществления нуклеиновые кислоты в фиксированных клетках могут быть кДНК или кРНК, синтезированными с нуклеиновых кислот, выделенных из фиксированных клеток.
[0045]
В варианте осуществления способ анализа нуклеиновых кислот в фиксированных клетках может быть выбран из способов, известных в уровне техники. Примеры способа включают микроскопическое исследование, проточную цитометрию, амплификационные анализы нуклеиновых кислот (например, ПЦР анализ, ОТ-ПЦР анализ, ПЦР анализ в реальном времени), гибридизационные анализы (например, Саузерн-блот анализ, Нозерн-блот анализ), микроматричный метод и метод гибридного захвата (HC) (см. Clavel C. et al., J. Clin. Pathol, vol. 51, p. 737-740 (1998)) (Clavel C. et al., J. Clin. Pathol, vol. 51, p. 737-740 (1998), который включен в настоящую заявку посредством отсылки).
[0046]
В варианте осуществления предпочтительно, чтобы измеряемый образец был подготовлен из фиксированных клеток, и затем образец подвергают анализу. Измеряемый образец может быть подготовлен при разрушении фиксированных клеток или без разрушения фиксированных клеток. Методика подготовки для разрушения фиксированных клеток является, например, методикой выделения нуклеиновых кислот из фиксированных клеток. Методика подготовки без разрушения фиксированных клеток является, например, методикой окрашивания нуклеиновых кислот в состоянии, в котором сохраняется форма фиксированных клеток.
[0047]
Способ выделения нуклеиновых кислот из клеток как таковых известен в уровне техники. При выделении ДНК, например, фиксированные клетки смешивают с лизатом, содержащим поверхностно-активное вещество (например, холат натрия, додецилсульфат натрия). При выделении РНК, например, фиксированные клетки смешивают с лизатом, содержащим гуанидин тиоцианат и поверхностно-активное вещество. Затем полученную смесь подвергают физическому процессу (например, перемешиванию, гомогенизации, ультразвуковой фрагментации) для высвобождения нуклеиновых кислот, содержащихся в биологическом образце, из клеток, с осуществлением, таким образом, выделения нуклеиновых кислот. В этом случае предпочтительно подвергнуть смесь центрифугированию с целью осаждения клеточного дебриса, после чего супернатант, содержащий свободные нуклеиновые кислоты, используется для анализа. В альтернативе полученный супернатант может быть очищен любым способом, известным в уровне техники. Выделение и очистка нуклеиновых кислот из клеток также могут быть выполнены при использовании коммерчески доступного набора.
[0048]
Способ окрашивания нуклеиновых кислот с сохранением формы клетки без изменения известен в уровне техники. Например, фиксированные клетки сначала подвергают контакту с раствором для обработки, содержащим поверхностно-активное вещество (например, Нонидет (зарегистрированная торговая марка) P-40), Тритон (зарегистрированная торговая марка) X-100), при этом клеточная мембрана подвергается некоторому уровню повреждения, при котором краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты может проникать в клетку. Затем фиксированные клетки после обработки подвергают контакту с раствором красителя, в результате чего нуклеиновые кислоты могут окрашиваться, при этом сохраняется форма фиксированных клеток.
[0049]
Краситель для окрашивания нуклеиновой кислоты может быть подходящим образом выбран из известных красителей для окрашивания нуклеиновых кислот в соответствии со способом анализа нуклеиновых кислот. Например, в сучае использования оптического микроскопа для получения информации, примеры красителя для окрашивания нуклеиновых кислот включают гематоксилин, пиронин Y (пиронин G) и метиловый зеленый. Кроме того, при использовании флуоресцентного микроскопа, проточного цитометра и т.п. для получения информации, в качестве красителя для окрашивания нуклеиновых кислот предпочтительно использовать флуоресцентный краситель, способный окрашивать нуклеиновую кислоту. Примеры флуоресцентного красителя включают иодистый пропидий, бромистый этидий, гетеродимер этидий-акридина, диазидоэтидий, гомодимер-1 этидия, гомодимер-2 этидия, моноазид этидия, Hoechst33342, Hoechst33258, 4',6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI), тетраиодид триметилен-бис[[3-[[4-[[(3-метилбензотиазол-3-ий)-2-ил]метилен]-1,4-дигидрохинолин]-1-ил]пропил]диметиламиния] (TOTO-1), дииодид 4-[(3-метилбензотиазол-2(3H)-илиден)метил]-1-[3-(триметиламино)пропил]хинолиния (TO-PRO-1), тетраиодид N,N,N',N'-тетраметил-N,N'-бис[3-[4-[3-[(3-метилбензотиазол-3-ий)-2-ил]-2-пропенилиден]-1,4-дигидрохинолин-1-ил]пропил]-1,3-пропандиаминия (TOTO-3) и дииодид 2-[3-[[1-[3-(триметиламино)пропил]-1,4-дигидрохинолин]-4-илиден]-1-пропенил]-3-метилбензотиазол-3-ия (TO-PRO-3).
[0050]
Измеряемый образец, содержащий нуклеиновые кислоты, выделенные из фиксированных клеток, подходит для аналитического способа обнаружения заданной нуклеиновой кислоты в фиксированных клетках (например, способа амплификации нуклеиновых кислот, способа гибридизации, микроматричного способа, способа HC). Измеряемый образец, содержащий фиксированные клетки, нуклеиновые кислоты которых окрашены, и при этом сохранена форма фиксированных клеток, подходит для аналитического способа получения информации о нуклеиновых кислотах в соответствующих клетках (например, микроскопического исследования, проточной цитометрии). В варианте осуществления подходящий измеряемый образец подготавливают из фиксированных клеток в соответствии с целью анализа, и анализ может быть выполнен.
[0051]
В случае анализа нуклеиновых кислот в фиксированных клетках с помощью проточной цитометрии, предпочтительно выполнить этап окрашивания нуклеиновых кислот в фиксированных клетках между этапом фиксации клеток и этапом получения информации. Окрашивание нуклеиновых кислот в фиксированных клетках осуществляют, как описано выше. Нуклеиновые кислоты в окрашенных и фиксированных клетках анализируют предпочтительно при использовании микроскопа, проточной цитометрии и т.п. Интенсивность окрашивания клеток красителем для окрашивания нуклеиновых кислот главным образом зависит от количества внутриклеточных нуклеиновых кислот. Следует отметить, что структура хроматина связана с интенсивностью окрашивания (легкостью окрашивания), причем интенсивность окрашивания, как предполагается, более всего зависит от количества нуклеиновых кислот. Поэтому интенсивность окрашивания клеток измеряют с помощью микроскопа, проточной цитометрии и т.п., чтобы имелась возможность получения информации, указывающей количество нуклеиновых кислот. В частности, при использовании проточной цитометрии окрашенные и фиксированные клетки поступают в проточный цитометр, при этом регистрируют флуоресцентные сигналы от клеток. На основе флуоресцентных сигналов может быть получена информация, указывающая количество нуклеиновых кислот.
[0052]
В данном варианте осуществления в качестве аналитического способа на основе проточной цитометрии может использоваться, например, анализатор клеток или способ анализа клеток, описанные, например, в публикации заявки на патент США 2009/0091746 (публикация заявки на патент США 2009/0091746 включена в настоящую заявку посредством отсылки). В частности, множество клеток, включающих "измеряемую клетку-мишень" в публикации заявки на патент США 2009/0091746, фиксируют в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, при этом фиксированные клетки можно анализировать с помощью анализатора клеток или анализировать с применением способа анализа клеток.
[0053]
При измерении с помощью проточного цитометра измеряемый образец, содержащий окрашенные и фиксированные клетки, вводят в проточную кювету проточного цитометра, при этом клетки, проходящие через проточную кювету, облучаются светом, с получением в результате оптической информации, испускаемой соответствующими клетками (флуоресцентная информация и информация светового рассеяния).
[0054]
В данном варианте осуществления флуоресцентная информация является информацией (например, формой волны, интенсивностью флуоресценции), получаемой при испускании света возбуждения, имеющего подходящую длину волны для соответствующих клеток, окрашенных флуоресцентным красителем, и измерении флуоресценции возбуждения. Флуоресценцию испускают нуклеиновые кислоты в клетках, окрашенных флуоресцентным красителем. Соответственно, флуоресцентная информация отражает количество нуклеиновых кислот в фиксированных клетках. Следует отметить, что длина волны поглощаемого света может быть соответственно выбрана в зависимости от используемого флуоресцентного красителя.
[0055]
В данном варианте осуществления информация рассеянного света отдельно не ограничена при условии, что свет является рассеянным светом, который может быть измерен с помощью коммерчески доступного проточного цитометра. Например, ширина импульса рассеянного света и интенсивность рассеянного света, такого как прямой рассеянный свет (например, угол падения света составляет от приблизительно 0 до 20 градусов) и боковой рассеянный свет (угол падения света составляет приблизительно 90 градусов), могут использоваться в качестве информации светового рассеяния. В уровне техники известно, что боковой рассеянный свет отражает внутреннюю информацию, такую как ядра или гранулы клеток, а прямой рассеянный свет отражает информацию о размере клетки.
[0056]
В данном варианте осуществления источник света проточного цитометра отдельно не ограничен, при этом выбирают источник света, имеющий длину волны, подходящую для возбуждения флуоресцентного красителя. Например, используют красный полупроводниковый лазер, синий полупроводниковый лазер, аргоновый лазер, He-Ne лазер или ртутную дуговую лампу. В частности, так как полупроводниковый лазер дешев по сравнению с газовым лазером, он является, таким образом, предпочтительным.
[0057]
В данном варианте осуществления, в отношении вышеуказанной оптической информации, характеристические параметры, отражающие количество ДНК, содержащейся в клетках, размер ядер, размер клеток и т.п., получают, например, при анализе волновых форм сигнала. Раковые и атипичные клетки могут быть определены при использовании таких характеристических параметров.
[0058]
В аналитическом способе согласно данному варианту осуществления этап анализа нуклеиновых кислот в фиксированных клетках может включать этап обнаружения заданной нуклеиновой кислоты в фиксированных клетках. В этом случае предпочтительно использовать образец, содержащий нуклеиновые кислоты, выделенные из фиксированных клеток, в качестве измеряемого образца.
[0059]
В данном варианте осуществления заданная нуклеиновая кислота отдельно не ограничена, при этом может быть обнаружена произвольная нуклеиновая кислота, представляющая интерес. Способ обнаружения отдельно не ограничен и предпочтительно является гибридизационным методом с использованием полинуклеотида, который может быть специфично гибридизован с заданной нуклеиновой кислотой (зонд или праймер), микроматричным методом, методом HC, методом амплификации нуклеиновых кислот и т.п. Такой полинуклеотид может быть ДНК или РНК. Кроме того, специалисты в данной области техники могут надлежащим образом создать полинуклеотид, соответствующий последовательности оснований заданной нуклеиновой кислоты.
[0060]
Термин "может быть специфично гибридизован с", используемый в настоящем описании, означает, что полинуклеотид в качестве зонда или праймера может быть гибридизован с заданной нуклеиновой кислотой при строгих условиях. В данном случае строгие условия являются условиями, при которых полинуклеотид может быть гибридизован с заданной нуклеиновой кислотой с высоким уровнем обнаружения по сравнению с нуклеиновыми кислотами, отличными от заданной нуклеиновой кислоты (например, с более чем по меньшей мере двухкратным превышением фона). Следует отметить, что строгие условия обычно зависят от последовательности и отличаются в различных средах. Обычно строгие условия подбирают таким образом, чтобы температура плавления (Тп) была приблизительно на 5°C ниже, чем температура плавления определенной последовательности при указанной ионной силе и pH. Тп является температурой, при которой 50% полинуклеотида, комплементарного последовательности оснований заданной нуклеиновой кислоты, гибридизуется в равновесии (в зависимости от указанной ионной силы, pH и состава нуклеиновых кислот).
[0061]
32
35
3
125
В данном варианте осуществления зонд может быть помечен любым маркерным веществом, известным в уровне техники. Примеры маркерного вещества включают радиоактивные вещества, такие как P, S, H и I; флуоресцентные вещества, такие как флуоресцеин и Alexa Fluor (зарегистрированная торговая марка); ферменты, такие как щелочная фосфатаза и пероксидаза хрена; гаптен, такой как 2,4-динитрофенильная группа, биотин и авидин. При обнаружении нуклеиновых кислот с помощью метода HC, антитела против гибрида ДНК/РНК предпочтительно помечают указанными маркерными веществами. Кроме того, при обнаружении нуклеиновых кислот с помощью микроматриц, нуклеиновые кислоты в измеряемом образце предпочтительно помечают вышеуказанными маркерными веществами.
[0062]
В данном варианте осуществления нуклеиновые кислоты могут быть обнаружены следующим образом. В методе гибридизации заданная нуклеиновая кислота может быть обнаружена при детектировании сигнала от меченого зонда, специфично гибридизованного с заданной нуклеиновой кислотой. В микроматричном методе, в случае присутствия меченой нуклеиновой кислоты, специфично гибридизованной с зондом, расположенным на микрочипе, заданная нуклеиновая кислота может быть обнаружена при детектировании сигнала от меченой нуклеиновой кислоты. Следует отметить, что термин "детектирование сигнала", используемый в настоящем описании, включает качественное обнаружение присутствия или отсутствия сигнала, количественное определение интенсивности сигнала и полукачественное детектирование интенсивности сигнала с множеством уровней, таких как "отсутствие сигнала", "слабый сигнал" или "мощный сигнал".
[0063]
В методе амплификации нуклеиновых кислот реакционный раствор после амплификации с использованием праймера, комплементарного последовательности оснований заданной нуклеиновой кислоты, подвергают гель-электрофорезу и подтверждают присутствие или отсутствие амплифицированного продукта. В случае присутствия амплифицированного продукта заданная нуклеиновая кислота может быть обнаружена. В альтернативе, в анализе методом ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного вещества, которое интеркалирует в ДНК (например, SYBR (зарегистрированная торговая марка) Green I), или TaqMan (торговая марка) зонда заданная нуклеиновая кислота может быть обнаружена при детектировании сигнала от флуоресцентного вещества или зонда в реакционном растворе после или во время амплификации.
[0064]
В методе HC гибрид заданной нуклеиновой кислоты (ДНК) и РНК зонда, специфично гибридизованного с нуклеиновой кислотой, захватывают антителом в твердой фазе и меченым антителом, при этом детектируют сигнал от меченого антитела, в результате чего заданная нуклеиновая кислота может быть обнаружена.
[0065]
В данном варианте осуществления клетки, выделенные из шейки матки, фиксируют в растворе для консервации клеток. В качестве заданной нуклеиновой кислоты в клетках может быть обнаружена нуклеиновая кислота, происходящая из вируса папилломы человека (ВПЧ). Инфекция ВПЧ приводит к встраиванию ДНК ВПЧ в геномную ДНК клеток-хозяев. Таким образом, при обнаружении нуклеиновой кислоты из ВПЧ в клетках, выделенных из шейки матки субъекта, можно определить, что субъект инфицирован ВПЧ.
[0066]
ВПЧ включает 100 или более субтипов. В данном варианте осуществления обнаружение целевого ВПЧ отдельно не ограничено и может быть необязательно выбрано из известных субтипов. Например, может быть обнаружена нуклеиновая кислота, происходящая из ВПЧ высокого (онкогенного) риска, который, как считают, характеризуется высокой вероятностью развития рака шейки матки. Примеры ВПЧ высокого риска включают ВПЧ-16, ВПЧ-18, ВПЧ-31, ВПЧ-33, ВПЧ-35, ВПЧ-39, ВПЧ-45, ВПЧ-51, ВПЧ-52, ВПЧ-56, ВПЧ-58, ВПЧ-59, ВПЧ-68, ВПЧ-73 и ВПЧ-82.
[0067]
Способ обнаружения ВПЧ-производной нуклеиновой кислоты может быть соответственно выбран из известных методов обнаружения. Например, ВПЧ-производная нуклеиновая кислота может быть обнаружена с помощью метода амплификации нуклеиновой кислоты при использовании праймера, способного к амплификации геномной ДНК обнаруживаемого целевого ВПЧ. Кроме того, ВПЧ-производная нуклеиновая кислота может быть обнаружена с помощью метода гибридизации или метода HC при использовании зонда, который может быть специфично гибридизован с геномной ДНК ВПЧ. Следует отметить, что специалисты в данной области техники могут надлежащим образом создать праймер и зонд, соответствующие последовательности оснований геномной ДНК ВПЧ. Для обнаружения ВПЧ-производной нуклеиновой кислоты может использоваться коммерчески доступный набор для обнаружения ВПЧ.
[0068]
Клетки, фиксированные в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, могут быть подвергнуты не только способу анализа нуклеиновых кислот, но также и способу анализа размера и формы клеток, ядер и т.п. При анализе размера и формы клеток, ядер и т.п., например, могут использоваться проточный цитометр и микроскоп.
[0069]
При использовании проточного цитометра, информацию светового рассеяния и флуоресцентную информацию получают, пропуская клетки с флуоресцентно-окрашенными ядрами через проточную кювету и облучая соответствующие клетки светом. На основе каждой информации могут быть обнаружены аномальные клетки. В качестве проточного цитометра может использоваться, например, устройство, описанное в публикации заявки на патент США 2015/0104786 (публикация заявки на патент США 2015/0104786 включена в настоящую заявку посредством отсылки). Кроме того, может использоваться коммерчески доступный анализатор клеток для эксфолиатовной цитологии: LC-1000 (Sysmex Corporation).
[0070]
Кроме того, может использоваться проточный цитометр, имеющий функцию вывода изображения. Соответствующие клетки, проходящие через проточную кювету, отображаются, при этом патолог и т.п. наблюдает отображаемые клетки, что позволяет обнаруживать аномальные клетки.
[0071]
При использовании микроскопа, например, клетки анализируют таким образом, что клетки, фиксированные в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, окрашивают, наносят клетки на предметное стекло и затем исследуют клетки под микроскопом. При микроскопическом исследовании патолог и т.п. может наблюдать клетки под микроскопом. Фотоснимок окрашенного изображения получают с помощью микроскопа, имеющего функцию снятия изображения, и патолог и т.п. может наблюдать сфотографированное изображение. Процесс нанесения клеток на предметное стекло может быть выполнен патологом вручную и т.п. или может быть выполнен автоматически при использовании устройства для подготовки образцов. В качестве устройства для подготовки образцов может использоваться устройство, описанное в патенте США 5240606, (патент США 5240606 включен в настоящую заявку посредством отсылки). Кроме того, может использоваться коммерчески доступное устройство для подготовки образцов, такое как процессор ThinPrep (зарегистрированная торговая марка).
[0072]
Настоящее изобретение дополнительно включает применение раствора для консервации клеток для хранения клеток. Кроме того, настоящее изобретение также включает применение раствора для консервации клеток для изготовления фиксированных клеток. Кроме того, настоящее изобретение также включает применение раствора для консервации клеток для анализа клеток. Клетки, которые будут фиксировать, хранить или анализировать, являются такими же, как описанные выше. Состав раствора для консервации клеток является таким же, как описано выше.
[0073]
Далее настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на примеры, однако настоящее изобретение не ограничено примерами.
ПРИМЕРЫ
[0074]
Пример 1
Клетки хранили в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, и затем исследовали стабильность ДНК в клетках при хранении. Для сравнения такое же исследование выполняли при использовании коммерчески доступного раствора для консервации клеток.
[0075]
1. Материалы
(1-1) Раствор для консервации клеток
Раствор для консервации клеток приготавливали путем смешивания метанола (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорида магния (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 1 ниже (в дальнейшем также называемый "раствором для консервации клеток Примера 1"). При приготовлении раствора для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Раствор для консервации клеток имел pH 6,7. В качестве коммерчески доступного раствора для консервации клеток использовали PreservCyt (зарегистрированная торговая марка) (Hologic, Inc.). Хотя подробный состав PreservCyt (зарегистрированная торговая марка) не находится в открытом доступе, как известно, он представляет собой водный буфер, содержащий метанол в качестве основного компонента. Согласно анализу состава при использовании ИСП эмиссионного спектрофотометра (SII Nanotechnology Inc.), ионы двухвалентного металла в PreservCyt (зарегистрированная торговая марка) не были обнаружены.
[0076]
[Таблица 1]
Раствор для консервации клеток Примера 1
Метанол
43 об./об.%
MgCl<sub>2</sub>
20 ммоль/л
[0077]
(1-2) Клетки
2
В качестве клеток для хранения в растворе для консервации клеток, использовали линии человеческих клеток рака шейки матки HeLa (полученные из Американской коллекции типовых культур (ATCC)). Клетки HeLa культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM: Sigma-Aldrich Co. LLC.), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS: HyClone Laboratories, Inc.) при 37°C в атмосфере 5% CO.
[0078]
2. Исследование стабильности ДНК при хранении
(2-1) Хранение клеток
6
Культивируемые клетки HeLa собирали стандартным методом и подсчитывали. Клетки HeLa (1×10 клеток) добавляли в 12 мл раствора для консервации клеток Примера 1 или в 12 мл коммерчески доступного раствора для консервации клеток, который вносили в пластиковую пробирку объемом 15 мл (Labcon), погружая, таким образом, клетки в раствор для консервации клеток. Эти клетки хранили при температурных условиях 1°C или 31°C в течение 2 недель, 1 месяца или 2 месяцев. Следует отметить, что в клинической практике клетки обычно хранят в холодильной камере (приблизительно при 4°C). Температура "1°C" (т.е. температурные условия, установленные в данном примере) ниже, чем температура в холодильной камере. В данном примере эксперимент также приводили при температуре выше комнатной температуры (31°C), чтобы исследовать, можно ли применять раствор для консервации клеток при комнатной температуре в клинической практике.
[0079]
(2-2) Выделение ДНК
Образец, содержащий клетки HeLa и раствор для консервации, центрифугировали при 10000 об./мин в течение 1 минуты и удаляли супернатант. ДНК выделяли из собранных клеток при использовании набора QIAamp DNA Mini Kit (получения QIAGEN). Определенную операцию выполняли согласно руководству, прилагаемому к набору. В качестве контроля ДНК выделяли так же, как описано выше, из клеток HeLa, которые погружали в раствор для консервации клеток Примера 1 или коммерчески доступный раствор для консервации клеток на 3 часа (в дальнейшем также называемые "клетками непосредственно после фиксации").
[0080]
(2-3) Электрофорез
Оптическую плотность каждого из растворов ДНК измеряли при использовании спектрофотометра (Nanodrop2000 получения Thermo Fisher Scientific) и получали концентрации ДНК. Образцы для электрофореза в агарозном геле подготавливали из растворов ДНК так, чтобы количество ДНК, содержащейся в каждом образце, составляло 500 нг/дорожка. Полученные образцы подвергали электрофорезу в 0,5% агарозном геле.
[0081]
3. Результаты
На Фиг. 1 показаны результаты электрофореза. Как показано на Фиг. 1, при использовании коммерчески доступного раствора для консервации клеток длина нуклеотидной последовательности в ДНК, полученной из клеток, хранившихся в течение некоторого периода, была более короткой, чем в ДНК, полученной из клеток непосредственно после фиксации. Это указывает на то, что ДНК разрушалась. Это свидетельствует о том, что в случае коммерчески доступного раствора для консервации клеток ДНК не сохранялась надлежащим образом при хранении. Таким образом, это указывает, что в случае применения коммерчески доступного раствора для консервации клеток анализ ДНК хранившихся клеток нельзя было выполнить надлежащим образом. В то же время, в случае применения раствора для консервации клеток Примера 1 длина нуклеотидной последовательности в ДНК, полученной из клеток, хранившихся при любых температурных условиях, в течение любых периодов хранения, была почти такой же, как длина нуклеотидной последовательности в ДНК, полученной из клеток непосредственно после фиксации. Таким образом, это дает основания предположить, что в случае применения раствора для консервации клеток Примера 1 анализ ДНК может быть выполнен надлежащим образом даже после хранения клеток в течение некоторого периода.
[0082]
Пример 2
Стабильность ДНК в клетках при хранении исследовали путем хранения клеток в растворе для консервации клеток Примера 1 и последующего обнаружения заданной нуклеиновой кислоты в ДНК клеток (ВПЧ-производной нуклеиновой кислоты). Для сравнения PreservCyt (зарегистрированная торговая марка, Hologic, Inc.), т.е. коммерчески доступный раствор для консервации клеток, использовали для проведения такого же исследования.
[0083]
1. Исследование стабильности ДНК при хранении в коммерчески доступном растворе для консервации клеток
(1-1) Хранение клеток
Цервикальные клетки (восемь образцов) были выделены из шейки матки восьми субъектов. Данные восемь образцов соответственно добавляли в 12 мл PreservCyt (зарегистрированная торговая марка) и погружали клетки в раствор для консервации клеток. Образцы делили на три равных части с получением аликвот 1-3. Аликвоту 1 подвергали обнаружению нуклеиновой кислоты, описанному ниже, непосредственно после добавления в раствор для консервации клеток (непосредственно после фиксации). Аликвоту 2 подвергали обнаружению нуклеиновой кислоты, описанному ниже, после хранения при 1°C в течение 1 месяца или 2 месяцев. Аликвоту 3 подвергали обнаружению нуклеиновой кислоты, описанному ниже, после хранения при 31°C в течение 1 месяца или 2 месяцев. Номер каждого из образцов и условия хранения показаны в Таблице 2.
[0084]
[Таблица 2]
Номер образца
Условия хранения
Аликвота 1
Аликвота 2
Аликвота 3
A4015
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4016
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4017
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 1 месяца
при 31°C в течение 1 месяца
A4019
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4020
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 1 месяца
при 31°C в течение 1 месяца
A4038
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4039
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4040
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
[0085]
(1-2) Обнаружение нуклеиновой кислоты
В Примере 2 нуклеиновую кислоту, происходящую из ВПЧ, который инфицировал цервикальные клетки, обнаруживали с помощью метода гибридного захвата (HC). В качестве предварительной обработки в методе HC ДНК клеток, содержащуюся в каждой аликвоте, выделяли при использовании набора HC2 Sample Conversion Kit (продукт номер 5127-1220, QIAGEN). Определенную операцию выполняли согласно руководству, прилагаемому к набору. Набор для обнаружения ДНК ВПЧ (HPV DNA "QIAGEN" HCII (продукт номер 618915, QIAGEN)) использовали для обнаружения ВПЧ-производной нуклеиновой кислоты в ДНК, полученной из каждой аликвоты. Определенную операцию выполняли согласно руководству, прилагаемому к набору.
[0086]
(1-3) Результаты
Результаты показаны на Фиг. 2А и 2B. На фигурах по оси Y указан логарифм интенсивности хемилюминесценции, измеренной методом HC (значение показателя HC2), "день 0" по оси X указывает, что период хранения составляет ноль дней (непосредственно после фиксации), и "1м/2м" указывает, что период хранения составляет 1 месяц или 2 месяца. Как показано на Фиг. 2A, значение показателя HC2 аликвоты 2 имело тенденцию к снижению по сравнению со значением показателя HC2 аликвоты 1. Как показано на Фиг. 2B, значение показателя HC2 аликвоты 3 было снижено по сравнению со значением показателя HC2 аликвоты 1. Эти результаты показывают, что цервикальные клетки, выделенные у субъектов, хранились в коммерчески доступном растворе для консервации клеток при 1°C или 31°C в течение 1 месяца или в течение 2 месяцев, в результате чего нуклеиновые кислоты в клетках разрушились.
[0087]
2. Исследование стабильности ДНК при хранении в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления
(2-1) Хранение клеток
Цервикальные клетки (двенадцать образцов) выделяли из шейки матки двенадцати субъектов, отличных от восьми субъектов. Двенадцать образцов соответственно добавляли в 12 мл раствора для консервации клеток Примера 1, и, таким образом, клетки были погружены в раствор для консервации клеток. Образцы делили на три равных части, получив аликвоты 1-3. Клетки собирали из аликвоты 1 непосредственно после добавления в раствор для консервации клеток (непосредственно после фиксации) и хранили собранные клетки при -60°C. Через 2 месяца обнаружение нуклеиновой кислоты, описанное ниже, проводили на клетках, собранных из аликвоты 1, а также клетках из аликвот 2 и 3. Аликвоту 2 подвергали обнаружению нуклеиновой кислоты, описанному ниже, после хранения при 1°C в течение 2 месяцев. Аликвоту 3 подвергали обнаружению нуклеиновой кислоты, описанному ниже, после хранения при 31°C в течение 2 месяцев. Номер каждого образца и условия хранения показаны в Таблице 3.
[0088]
[Таблица 3]
Номер образца
Условия хранения
Аликвота 1
Аликвота 2
Аликвота 3
A4339
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4340
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4343
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4351
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4352
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4365
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
A4366
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
H-0072
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
H-0073
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
C-0113
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
C-0127
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
C-0131
день 0 (непосредственно после фиксации)
при 1°C в течение 2 месяцев
при 31°C в течение 2 месяцев
[0089]
(2-2) Обнаружение нуклеиновой кислоты
Таким же образом, как описано выше, нуклеиновую кислоту, происходящую из ВПЧ, который инфицировал цервикальные клетки, обнаруживали с помощью метода гибридного захвата (HC). Предварительную обработку в методе HC и обнаружение нуклеиновой кислоты методом HC выполняли при использовании набора HC2 Sample Conversion Kit (QIAGEN) и ДНК ВПЧ "QIAGEN" HCII (QIAGEN), соответственно. Определенную операцию выполняли согласно руководству, прилагаемому к каждому набору.
[0090]
(2-3) Результаты
Результаты показаны на Фиг. 3А и 3B. На фигурах по оси Y указана интенсивность хемилюминесценции, измеренная с помощью метода HC (значение показателя HC2), "день 0" по оси X указывает, что период хранения составляет ноль дней (непосредственно после фиксации), и "2м" указывает, что период хранения составляет 2 месяца. Как показано на Фиг. 3A, значение показателя HC2 аликвоты 2 было почти эквивалентно значению показателя HC2 аликвоты 1. Как показано на Фиг. 3B, значение показателя HC2 аликвоты 3 было снижено по сравнению со значением показателя HC2 аликвоты 1. Эти результаты показывают, что даже если цервикальные клетки, выделенные у субъекта, хранили в растворе для консервации клеток Примера 1 при 1°C или 31°C в течение 2 месяцев, нуклеиновые кислоты в клетках могли сохраняться в надлежащем состоянии.
[0091]
Пример 3
Проводили исследование, подходили ли клетки, хранившиеся в растворе для консервации клеток Примера 1, для окрашивания клеточных образцов. Для сравнения использовали клетки, хранившиеся в PreservCyt (зарегистрированная торговая марка, Hologic, Inc.), т.е. в коммерчески доступном растворе для консервации клеток.
[0092]
1. Окрашивание клеток, хранившихся в коммерчески доступном растворе для консервации клеток
Клетки, выделенные из шейки матки субъектов, суспендировали в 20 мл PreservCyt (зарегистрированная торговая марка) и оставляли при комнатной температуре на 2 дня. Систему изготовления препаратов ThinPrep2000 (Hologic, Inc.) использовали для получения препарата с клетками из суспензии клеток, прикрепленными на стекло. Определенную операцию выполняли согласно руководству по эксплуатации прибора. Полученный препарат окрашивали по Папаниколау в соответствии с методикой, показанной в Таблице 4 ниже.
[0093]
[Таблица 4]
Методика
Емкость для окрашивания
Время
1
70% этанол
2 мин
2
50% этанол
2 мин
3
Промывка водой
2 мин
4
1,5-кратное разбавление, гематоксилин Джилла
4 мин
5
Промывка проточной водой
5 мин
6
0,2% спиртовой р-р хлороводородной кислоты
1 мин
7
Промывка проточной водой
2 мин
8
70% этанол
2 мин
9
95% этанол
2 мин ×4 емкости
10
OG6 (оранжевый G6)
2 мин
11
95% этанол
2 мин ×4 емкости
12
EA (эозин)
2 мин
13
100% этанол
2 мин ×4 емкости
14
Ксилол
5 мин ×4 емкости
[0094]
2. Окрашивание клеток, хранившихся в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления
Клетки, выделенные из шейки матки субъектов, суспендировали в 20 мл раствора для консервации клеток Примера 1 и оставляли при комнатной температуре на 2 дня. Затем суспензию клеток центрифугировали при 800 g в течение 10 минут и удаляли супернатант. К осадку добавляли 200 мкл деионизированной воды с получением суспензии. Затем все количество полученной суспензии добавляли в осадочную камеру (BD Settling Chamber, Becton, Dickinson and Company), установленную на предметное стекло (BD SurePath PreCoat Slide, Becton, Dickinson and Company) и оставляли на 10 минут. После этого клетки на стекле фиксировали 95% этанолом. Полученный препарат окрашивали по Папаниколау в соответствии с методикой, показанной в Таблице 4 выше.
[0095]
3. Результаты
Результаты показаны на Фиг. 4. Как показано на Фиг. 4, клетки, хранившиеся в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, окрашивались по Папаниколау, в результате чего получили окрашенное изображение, эквивалентное изображению клеток, хранившихся в коммерчески доступном растворе для консервации клеток.
[0096]
Пример 4
Отношение между концентрацией иона магния в растворе для консервации клеток и стабильностью ДНК в клетках исследовали с помощью проточной цитометрии.
[0097]
1. Материалы
(1-1) Раствор для консервации клеток
В Примере 4 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая метанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорид магния (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 5 ниже. При приготовлении растворов для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Каждый раствор для консервации клеток имел pH 6,6.
[0098]
[Таблица 5]
Метанол(об./об.%)
MgCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 1
43
0
Раствор для консервации клеток 2
43
1,0
Раствор для консервации клеток 3
43
2,0
Раствор для консервации клеток 4
43
20
[0099]
(1-2) Клетки
В качестве клеток, хранившихся в растворе для консервации клеток, использовали линии человеческих клеток рака шейки матки HeLa (полученных от ATCC). Клетки HeLa культивировали так же, как в Примере 1.
[0100]
(1-3) Реактив и проточный цитометр
Набор GC-SEARCH KIT (SYSMEX CORPORATION) использовали в качестве раствора для окраски или удаления РНК. В качестве разбавителя использовали GC-PACK (SYSMEX CORPORATION). Анализатор клеток для эксфолиатовной цитологии: LC-1000 (SYSMEX CORPORATION) использовали в качестве проточного цитометра.
[0101]
2. Хранение клеток и проточный цитометрический (FCM) анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворах для консервации клеток 1-4, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 1°C или 31°C на 24 часа. Каждую суспензию клеток центрифугировали при 10000 об./мин в течение 1 минуты и удаляли супернатант. К 30 мкл оставшегося раствора, содержащего клетки, добавляли 1 мл разбавителя. Полученную смесь центрифугировали при 10000 об./мин в течение 1 минуты и удаляли супернатант. Раствор для окраски, удаления РНК и разбавитель добавляли к 30 мкл оставшегося раствора, содержащего клетки, получив измеряемый образец. Полученный измеряемый образец вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем были созданы распределения частот (гистограммы), в которых площадь флуоресценции, детектируемую от каждой из клеток, откладывали на оси X, и количество клеток откладывали на оси Y. Следует отметить, что площадь флуоресценции является показателем, отражающим количество ДНК в клетках.
[0102]
3. Результаты
На Фиг. 5 показаны полученные гистограммы площади флуоресценции. Далее будут описаны гистограммы площади флуоресценции. Известно, что на гистограммах площади флуоресценции обычно наблюдают два пика. В частности, пики включают пик, сформированный из популяции диплоидных клеток, и пик, сформированный из популяции клеток, которые превращаются в тетраплоидные клетки. Количество ДНК в клетках, которые превращаются в тетраплоидные клетки, выше, чем в диплоидных клетках. Обычно известно, что количество ДНК в диплоидных клетках постоянное. Поэтому когда ДНК стабильна, площади флуоресценции в диплоидных клетках становятся постоянными, и, таким образом, пик диплоидных клеток выглядит резким на гистограммах площади флуоресценции. В то же время, площадь флуоресценции является показателем, отражающим количество ДНК. Таким образом, когда дестабилизация ДНК приводит к ее разрушению или фрагментации, количество ДНК в диплоидных клетках становится менее постоянным, что вызывает изменение площади флуоресценции. В результате пик диплоидных клеток на гистограммах становится менее резким.
[0103]
Как показано на Фиг. 5, даже если клетки хранили в каком-либо из растворов для консервации клеток 1-4 при температурных условиях 1°C, формы гистограмм площади флуоресценции были нормальными. Однако при хранении клеток в растворах для консервации клеток 1, 2 и 3, имеющих низкую концентрацию иона двухвалентного металла, при 31°C, формы гистограмм были ломаными. В то же время, в случае использования раствора для консервации клеток 4, имеющего концентрацию иона двухвалентного металла 20 ммоль/л, наличия гистограммы ломаной формы не подтверждали даже при температурных условиях 31°C. Соответственно, показано, что концентрация иона двухвалентного металла установлена надлежащим образом, вследствие чего ДНК сохраняется в стабильном состоянии даже в случае хранения при высокой температуре, а также в случае хранения при низкой температуре, и в результате можно предотвратить появление ломаной гистограммы.
[0104]
Пример 5
Отношение между концентрацией иона магния в растворе для консервации клеток и стабильностью ДНК в клетках исследовали с помощью проточной цитометрии.
[0105]
1. Материалы
В Примере 5 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая метанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорид магния (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 6 ниже. При приготовлении растворов для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и PIPES (DOJINDO LABORATORIES) добавляли в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Каждый раствор для консервации клеток имел pH 6,6. Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0106]
[Таблица 6]
Метанол(об./об.%)
MgCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 5
43
0
Раствор для консервации клеток 6
43
1,0
Раствор для консервации клеток 7
43
2,0
Раствор для консервации клеток 8
43
3,0
Раствор для консервации клеток 9
43
4,0
Раствор для консервации клеток 10
43
5,0
Раствор для консервации клеток 11
43
6,0
Раствор для консервации клеток 12
43
8,0
Раствор для консервации клеток 13
43
10
Раствор для консервации клеток 14
43
20
Раствор для консервации клеток 15
43
30
Раствор для консервации клеток 16
43
40
Раствор для консервации клеток 17
43
60
Раствор для консервации клеток 18
43
80
Раствор для консервации клеток 19
43
82
Раствор для консервации клеток 20
43
85
Раствор для консервации клеток 21
43
90
Раствор для консервации клеток 22
43
92
Раствор для консервации клеток 23
43
95
Раствор для консервации клеток 24
43
100
Раствор для консервации клеток 25
43
120
Раствор для консервации клеток 26
43
200
[0107]
2. Хранение клеток и FCM анализ
2
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворах для консервации клеток 5-26, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 25°C на 4 часа или при 30°C на 24 часа. Измеряемые образцы получали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем были созданы гистограммы площади флуоресценции так же, как в Примере 4. Показатель стабильности формы гистограмм вычисляли следующим образом. Следует отметить, что вычисление будет описано со ссылкой на Фиг. 6. На основе гистограммы клеток, хранившихся в растворе для консервации клеток 14 (с концентрацией MgCl 20 ммоль/л) при 25°C в течение 4 часов, вычисляли изменения площади флуоресценции в области диплоидной клетки. Изменения соответствуют пику, обозначенному стрелкой на Фиг. 6. Видимую область диплоидной клетки определяли следующим образом: изменения площади флуоресценции в области диплоидной клетки имеют нижний предел 75%, и изменения площади флуоресценции в области диплоидной клетки имеют верхний предел 125%. На Фиг. 6 эта область соответствует области, расположенной между двумя линиями. Коэффициент вариации (CV) площади флуоресценции в видимой области диплоидной клетки вычисляли и использовали в качестве показателя стабильности формы гистограммы. Больший коэффициент вариации (CV) площади флуоресценции в области указывает, что форма гистограммы в диплоидных клетках ломаная.
[0108]
3. Результаты
Результаты показаны на Фиг. 7А и 7B. Как показано на Фиг. 7A, в случае хранения при 25°C в течение 4 часов, даже если использовали какой-либо из растворов для консервации клеток, имеющих концентрацию хлорида магния в диапазоне от 0 ммоль/л до 200 ммоль/л, значение CV в видимой области диплоидной клетки было низким. Кроме того, изменение значения CV из-за концентраций хлорида магния почти не наблюдалось. В то же время, как показано на Фиг. 7А и 7B, в случае хранения при 30°C в течение 24 часов, значение CV в видимой области диплоидных клеток было увеличено при использовании раствора для консервации клеток, имеющего высокую или низкую концентрацию хлорида магния. На основе этих результатов было подтверждено, что в случае использования растворов для консервации клеток 11-19, а именно когда концентрация иона двухвалентного металла в растворе для консервации клеток составляла от 6 ммоль/л до 82 ммоль/л, присутствовал эффект предотвращения ломаной формы гистограммы. Как описано выше, площадь флуоресценции является показателем, отражающим количество ДНК в клетках. Таким образом, когда дестабилизация ДНК приводит к ее разрушению или фрагментации, количество ДНК в диплоидных клетках становится менее постоянным, что вызывает изменение площади флуоресценции. В результате форма гистограммы в диплоидных клетках ломаная. Поэтому предполагается, что установление концентрации иона двухвалентного металла в растворе для консервации клеток в пределах от 6 ммоль/л до 82 ммоль/л способствовало стабилизации ДНК в клетках.
[0109]
Пример 6
Отношение между концентрацией низшего спирта в растворе для консервации клеток и стабильностью ДНК в клетках исследовали с помощью проточной цитометрии.
[0110]
1. Материалы
В Примере 6 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая метанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорид магния (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 7 ниже. При приготовлении раствора для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Каждый раствор для консервации клеток имел pH 6,7. Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0111]
[Таблица 7]
Метанол(об./об.%)
MgCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 27
40
10
Раствор для консервации клеток 28
40
20
Раствор для консервации клеток 29
40
40
Раствор для консервации клеток 30
45
10
Раствор для консервации клеток 31
45
20
Раствор для консервации клеток 32
45
40
Раствор для консервации клеток 33
38
10
Раствор для консервации клеток 34
38
20
Раствор для консервации клеток 35
38
40
Раствор для консервации клеток 36
38
60
Раствор для консервации клеток 37
48
10
Раствор для консервации клеток 38
48
20
Раствор для консервации клеток 39
48
40
Раствор для консервации клеток 40
48
60
Раствор для консервации клеток 41
35
20
Раствор для консервации клеток 42
35
40
Раствор для консервации клеток 43
43
20
Раствор для консервации клеток 44
43
40
Раствор для консервации клеток 45
50
20
Раствор для консервации клеток 46
50
40
[0112]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворах для консервации клеток 27-46, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 30°C на 24 часа. Измеряемые образцы подготавливали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограммы площади флуоресценции были созданы так же, как в Примере 4.
[0113]
3. Результаты
На Фиг. 8А, 8B и 8C показаны созданные гистограммы площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 8А и 8B, если концентрация иона двухвалентного металла в растворе для консервации клеток составляла от 10 ммоль/л до 60 ммоль/л, то даже если концентрация метанола (MeOH) составляла от 38 об./об.% до 48 об./об.%, формы гистограмм площади флуоресценции хорошо сохранялись. Как показано на Фиг. 8C, когда концентрация иона двухвалентного металла в растворе для консервации клеток составляла 20 ммоль/л или 40 ммоль/л, даже если концентрация метанола составляла 35 об./об.% или 50 об./об.%, формы гистограмм площади флуоресценции хорошо сохранялись.
[0114]
Пример 7
Отношение между pH раствора для консервации клеток и стабильностью ДНК в клетках исследовали с помощью проточной цитометрии.
[0115]
1. Материалы
В Примере 7 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая метанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорид магния (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 8 ниже. При приготовлении раствора для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Каждый раствор для консервации клеток 47-50 имел pH 6,4, и каждый раствор для консервации клеток 51-54 имел pH 7,0. Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0116]
[Таблица 8]
Метанол(об./об.%)
MgCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 47
43
10
Раствор для консервации клеток 48
43
20
Раствор для консервации клеток 49
43
40
Раствор для консервации клеток 50
43
60
Раствор для консервации клеток 51
43
10
Раствор для консервации клеток 52
43
20
Раствор для консервации клеток 53
43
40
Раствор для консервации клеток 54
43
60
[0117]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворах для консервации клеток 47-54, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 30°C на 24 часа. Измеряемые образцы подготавливали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограммы площади флуоресценции были созданы так же, как в Примере 4.
[0118]
3. Результаты
На Фиг. 9 показаны созданные гистограммы площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 9, если концентрация иона двухвалентного металла в растворе для консервации клеток составляла от 10 ммоль/л до 60 ммоль/л, то даже если pH составлял 6,4 или 7,0, формы гистограмм площади флуоресценции хорошо сохранялись.
[0119]
Пример 8
Отношение между концентрацией иона кальция в растворе для консервации клеток и стабильностью ДНК в клетках исследовали с помощью проточной цитометрии при использовании иона кальция в качестве иона двухвалентного металла.
[0120]
1. Материалы
В Примере 8 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая метанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорид кальция (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 9 ниже. При приготовлении раствора для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Каждый раствор для консервации клеток имел pH 6,7. Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0121]
[Таблица 9]
Метанол(об./об.%)
CaCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 55
43
0
Раствор для консервации клеток 56
43
1,0
Раствор для консервации клеток 57
43
20
[0122]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворах для консервации клеток 55-57, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 1°C или 31°C на 24 часа. Измеряемые образцы подготавливали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограммы площади флуоресценции были созданы так же, как в Примере 4.
[0123]
3. Результаты
На Фиг. 10 показаны созданные гистограммы площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 10, даже если клетки хранились в каком-либо из растворов для консервации клеток 55-57 при температурных условиях 1°C, формы гистограмм площади флуоресценции были нормальными. Однако если клетки хранились в растворах для консервации клеток 55 и 56, имеющих низкую концентрацию иона двухвалентного металла, при 31°C, формы гистограмм были ломаными. В то же время, при использовании раствора для консервации клеток 57 с концентрацией иона двухвалентного металла 20 ммоль/л, наличие ломаной формы гистограммы не подтверждалось, даже если температурные условия составляли 31°C. Соответственно, было показано, что при установлении концентрации иона двухвалентного металла надлежащим образом, ДНК стабильно сохранялась даже в случае хранения при высокой температуре, а также в случае хранения при низкой температуре, и в результате можно предтвратить ломаные гистограммы.
[0124]
Сравнительный пример 1
В случае клеток, хранившихся в коммерчески доступном растворе для консервации клеток, стабильность ДНК исследовали с помощью проточной цитометрии.
[0125]
1. Материалы
В Сравнительном Примере 1 в качестве коммерчески доступного раствора для консервации клеток использовали PreservCyt (зарегистрированная торговая марка, Hologic, Inc.). Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0126]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в PreservCyt (зарегистрированная торговая марка). Полученную суспензию клеток оставляли при комнатной температуре на 30 минут, при 31°C на 24 часа или при 31°C на 7 дней. Измеряемые образцы подготавливали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограммы площади флуоресценции были созданы так же, как в Примере 4.
[0127]
3. Результаты
На Фиг. 11 показаны созданные гистограммы площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 11, в случае хранения при комнатной температуре в течение 30 минут, форма гистограммы площади флуоресценции была нормальной. Однако в случае хранения при 31°C в течение 24 часов или 7 дней формы гистограмм были ломаными. Поэтому было установлено, что коммерчески доступный раствор для консервации клеток отличается от раствора для консервации клеток согласно данному варианту осуществления и не подходит для хранения при температурных условиях 31°C.
[0128]
Пример 9
Отношение между концентрацией иона кальция в растворе для консервации клеток и стабильностью ДНК в клетках исследовали с помощью проточной цитометрии.
[0129]
1. Материалы
(1-1) Раствор для консервации клеток
В Примере 9 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая метанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорид кальция (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 10 ниже. При приготовлении раствора для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Каждый раствор для консервации клеток имел pH 6,6. Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0130]
[Таблица 10]
Метанол(об./об.%)
CaCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 58
43
0
Раствор для консервации клеток 59
43
1,0
Раствор для консервации клеток 60
43
6,0
Раствор для консервации клеток 61
43
20
Раствор для консервации клеток 62
43
82
Раствор для консервации клеток 63
43
100
Раствор для консервации клеток 64
43
200
[0131]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворах для консервации клеток 58-64, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 30°C на 24 часа. Измеряемые образцы подготавливали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограммы площади флуоресценции были созданы так же, как в Примере 4.
[0132]
3. Результаты
На Фиг. 13 показаны созданные гистограммы площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 13, при хранении клеток в растворах для консервации клеток 60, 61 и 62, имеющих концентрации иона кальция 6, 20, и 82 ммоль/л, соответственно, при 30°C, формы гистограммы были хорошими. Как описано выше, площадь флуоресценции является показателем, отражающим количество ДНК в клетках. Следовательно, то, что формы гистограммы площади флуоресценции хорошие, означает, что ДНК в клетках стабильно сохранялась во время хранения. Поэтому было показано, что при установлении концентрации иона кальция надлежащим образом, ДНК в клетках могла стабильно сохраняться даже в случае хранения при температурных условиях 30°C.
[0133]
Пример 10
Клетки фиксировали и хранили в растворе для консервации клеток, содержащем ионы магния и кальция в качестве ионов двухвалентных металлов. Стабильность ДНК в хранившихся клетках исследовали с помощью проточной цитометрии. Для сравнения также использовали раствор для консервации клеток, не содержащий ионов двухвалентного металла.
[0134]
1. Материалы
(1-1) Раствор для консервации клеток
В Примере 10 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая метанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), хлорид магния (Kishida Chemical Co., Ltd.) и хлорид кальция (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 11 ниже. При приготовлении раствора для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Каждый раствор для консервации клеток имел pH 6,7. Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0135]
[Таблица 11]
Метанол(об./об.%)
MgCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
CaCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 65
43
0
0
Раствор для консервации клеток 66
43
10
10
[0136]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворах для консервации клеток 65 и 66, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 30°C на 24 часа. Измеряемые образцы подготавливали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограммы площади флуоресценции были созданы так же, как в Примере 4.
[0137]
3. Результаты
На Фиг. 14 показаны созданные гистограммы площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 14, когда клетки хранились в растворе для консервации клеток 65, содержащем ион двухвалентного металла, при 30°C, форма гистограммы была ломаной. В то же время, при использовании раствора для консервации клеток 66, имеющего общую концентрацию ионов двухвалентных металлов 20 ммоль/л, форма гистограммы была хорошей. Таким образом, было показано, что при использовании раствора для консервации клеток, содержащего два типа ионов двухвалентных металлов в подходящей концентрации, ДНК в клетках могла стабильно сохраняться даже в случае хранения при температурных условиях 30°C.
[0138]
Пример 11
Клетки фиксировали и хранили в растворе для консервации клеток, содержащем этанол в качестве низшего спирта. Стабильность ДНК в сохраненных клетках исследовали с помощью проточной цитометрии.
[0139]
1. Материалы
(1-1) Раствор для консервации клеток
В Примере 11 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая этанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорид магния (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 12 ниже. При приготовлении раствора для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Раствор для консервации клеток имел pH 6,7. Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0140]
[Таблица 12]
Метанол(об./об.%)
MgCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 67
30
20
[0141]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворе для консервации клеток 67. Полученную суспензию клеток оставляли при 30°C на 7 дней. Измеряемый образец подготавливали из суспензии клеток так же, как в Примере 4. Полученный измеряемый образец вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограмма площади флуоресценции была создана так же, как в Примере 4.
[0142]
3. Результаты
На Фиг. 15 показана созданная гистограмма площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 15, когда клетки хранились в растворе для консервации клеток 67, содержащем этанол в качестве низшего спирта, форма гистограммы была хорошей. Поэтому предположили, что при использовании раствора для консервации клеток, содержащего этанол и ион двухвалентного металла в подходящей концентрации, ДНК в клетках могла стабильно сохраняться даже в случае хранения при температурных условиях 30°C.
[0143]
Сравнительный пример 2
Стабильность ДНК в клетках, хранившихся в растворе для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, сравнивали со стабильностью ДНК в клетках, хранившихся в растворе для консервации клеток, описанном в Примере 5 Патентного источника 1 (патента США 5,256,571).
[0144]
1. Материалы
(1-1) Раствор для консервации клеток
В качестве раствора для консервации клеток согласно данному варианту осуществления использовали раствор для консервации клеток Примера 1. Кроме того, в качестве раствора для консервации клеток, описанного в Примере 5 Патентного источника 1 (в дальнейшем также называемого "раствором для консервации клеток Сравнительного примера 2"), приготавливали раствор для консервации клеток, имеющий следующий состав. Клетки, реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0145]
<Раствор для консервации клеток Сравнительного примера 2>
1 мМ гексагидрата ацетата магния
2 мМ моногидрата ацетата кальция
10 мМ хлорида калия
0,1% хлорида натрия
20% метанола
[0146]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HeLa добавляли и суспендировали в растворе для консервации клеток Примера 1 и растворе для консервации клеток Сравнительного примера 2, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 30°C на 7 дней. Измеряемые образцы подготавливали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограммы площади флуоресценции были созданы так же, как в Примере 4.
[0147]
3. Результаты
На Фиг. 16 показаны созданные гистограммы площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 16, когда клетки хранились в растворе для консервации клеток Примера 1 при 30°C в течение 7 дней, форма гистограммы площади флуоресценции была нормальной. В то же время, при хранении клеток в растворе для консервации клеток Сравнительного примера 2 форма гистограммы была ломаной. Таким образом, было установлено, что раствор для консервации клеток, описанный в Примере 5 патента США 5,256,571, отличается от раствора для консервации клеток согласно данному варианту осуществления и не подходит для хранения при температурных условиях 30°C.
[0148]
Пример 12
Полученные из нормальной ткани клетки фиксировали и хранили в растворе для консервации клеток, содержащем ион магния. Стабильность ДНК в хранившихся клетках исследовали с помощью проточной цитометрии.
[0149]
1. Материалы
(1.1) Раствор для консервации клеток
В Примере 12 растворы для консервации клеток приготавливали, смешивая метанол (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и хлорид магния (Kishida Chemical Co., Ltd.), с получением состава, показанного в Таблице 13 ниже. При приготовлении раствора для консервации клеток использовали воду в качестве растворителя и добавляли PIPES (DOJINDO LABORATORIES) в качестве буфера с получением концентрации 20 мМ. Водный раствор NaOH использовали для доведения pH. Каждый раствор для консервации клеток имел pH 6,7.
[0150]
[Таблица 13]
Метанол(об./об.%)
MgCl<sub>2</sub>(ммоль/л)
Раствор для консервации клеток 68
43
0
Раствор для консервации клеток 69
43
6
Раствор для консервации клеток 70
43
20
Раствор для консервации клеток 71
43
82
[0151]
(1-2) Клетки, реактив и проточный цитометр
В качестве полученных из нормальной ткани клеток, которые предполагали хранить в растворе для консервации клеток, использовали линии человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены, HUVEC (полученные из ATCC). Клетки HUVEC культивировали так же, как культивировали клетки HeLa в Примере 1. Реактив и проточный цитометр являются такими же, как используемые в Примере 4.
[0152]
2. Хранение клеток и FCM анализ
Клетки HUVEC добавляли и суспендировали в растворах для консервации клеток 68-71, соответственно. Полученные суспензии клеток оставляли при 30°C на 24 часа. Измеряемые образцы подготавливали из суспензий клеток так же, как в Примере 4. Каждый из полученных измеряемых образцов вводили в проточный цитометр и получали оптические сигналы (флуоресцентный сигнал и сигнал прямого светового рассеяния). Затем гистограммы площади флуоресценции были созданы так же, как в Примере 4.
[0153]
3. Результаты
На Фиг. 17 показаны созданные гистограммы площади флуоресценции. Как показано на Фиг. 17, когда клетки HUVEC хранились в растворе для консервации клеток 68, содержащем ион магния, при 30°C, форма гистограммы была ломаной. В то же время, при хранении клеток в растворах для консервации клеток 69, 70 и 71 с концентрацией иона магния 6, 20 и 82 ммоль/л, соответственно, при 30°C, формы гистограммы были хорошими. Следовательно, было показано, что при использовании раствора для консервации клеток согласно данному варианту осуществления, даже в случае хранения полученных из нормальной ткани клеток при температурных условиях 30°C, ДНК в клетках могла стабильно сохраняться.
СПИСОК НОМЕРОВ ПОЗИЦИЙ
[0154]
11: Емкость с раствором для консервации клеток