ДРОЖЖИ Saccharomyces cerevisiae, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В КАЧЕСТВЕ ПРОБИОТИКА, И КОМПОЗИЦИЯ НА ИХ ОСНОВЕ
Saccharomyces cerevisiae YEAST USED AS PROBIOTIC AND COMPOSITION BASED THEREON

Настоящее изобретение относится к области питания и здоровья человека и/или животного.
Изобретение более предпочтительно относится к новым штаммам дрожжей и новым дрожжам, получаемым исходя из новых штаммов. Такие дрожжи являются особенно полезными для комфортного состояния пищеварительного тракта и/или для предупреждения и/или лечения нарушений пищеварительного тракта человека или животного.
В литературе описано множество микроорганизмов для полезного применения у человека в пищеварительном тракте и в целях питания, см., например, WO 2006/021965.
Такие микроорганизмы традиционно обозначают термином "пробиотик", относящимся к активным микроорганизмам, способным приносить организму-хозяину пользу в отношении здоровья в том случае, когда их введение осуществляется в достаточном количестве (Joint FAO/WHO Expert Consultation Probiotics in food, FAO Food and nutrition paper Nr 85, ISBN 92-5-105513-0).
Полезный результат при пероральном введении микроорганизмов в большой степени зависит не только от штамма используемого микроорганизма, но также и от формы введения. Даже среди одного вида, в зависимости от используемых штаммов, наблюдаемые эффекты на практике очень сильно варьируют и являются иногда положительными, иногда отрицательными или нейтральными, как, например, для вида Escherichia coli, в котором можно найти как патогенные штаммы (например, типа энтеротоксиногенных или энтерогеморрагических), так и полезные штаммы, как, например, штамм Nissle 1917 (M. de Vrese; P.R. Marteau. Probiotics and Prebiotics: Effects on Diarrhea. 2007, J. Nutr., 137 (3 Suppl. 2), 803S-811S). Таким образом, в настоящее время в отношении заданного штамма невозможно предсказать, что при введении такого штамма можно рассчитывать на полезный эффект в отношении здоровья человека, и даже предусмотреть природу его возможного полезного эффекта или его интенсивность.
Некоторые штаммы микроорганизмов, в частности среди дрожжей и молочных бактерий, уже были идентифицированы в отношении некоторых случаев полезного действия на желудочно-кишечный тракт. Тем не менее, получение комплексного полезного действия на желудочно-кишечный тракт часто требует сопутствующего введения нескольких штаммов различной природы (I. Goktepe; V.K. Juneja; M. Ahmedna (eds). Probiotics in Food Safety and Human Health. 2006, CRC Taylor & Francis, ISBN 1-57444-514-6).
Кроме того, было замечено, что достаточно многие микроорганизмы, в частности молочные бактерии, обладают провоспалительным действием. Такой провоспалительный эффект может оказаться особенно вредным и нежелательным, например, в случае аутоиммунных заболеваний или иммуннодефицита.
Описаны некоторые фракции дрожжей и/или производные продукты дрожжей в отношении их полезного действия на пищеварительный тракт.
Так, например, маннопротеины, являющиеся производными продуктами дрожжей, описаны в отношении их ингибирующего действия на адгезию патогенов. Описаны также продукты клеточных стенок дрожжей в отношении их действия подобно волокнам. Однако, существует множество штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которые совсем не оказывают полезное действие или такие же эффекты.
Кроме того, в зависимости от используемых штаммов и форм вводимых дрожжей эффекты также могут очень сильно варьировать.
Таким образом, существует потребность в возможности располагать новыми штаммами микроорганизмов, которые могут оказывать полезное действие в отношении здоровья профилактически и/или терапевтически на известные или предполагаемые патологии или нарушения или на общее состояние как физического, так и психического здоровья.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является новый штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и новый штамм Saccharomyces cerevisiae var. boulardii, депонированный в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799.
Объектом настоящего изобретения являются также дрожжи Saccharomyces cerevisiae, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и дрожжи Saccharomyces var. boulardii, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799.
Другим объектом настоящего изобретения является композиция, содержащая дрожжи Saccharomyces cerevisiae, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3856, и/или дрожжи Saccharomyces var. boulardii, полученные исходя из штамма, депонированного в Национальной коллекции культур микроорганизмов под № CNCM I-3799, и/или по меньшей мере один производный продукт дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранный из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК).
Композиция по настоящему изобретению имеет следующие преимущества:
- способность, в частности, в сухих формах сопротивляться и выживать при переходе желудочного барьера, что позволяет оптимизировать ее действие на желудочно-кишечный тракт;
- противовоспалительное действие;
- отсутствие провоспалительного действия или очень слабое такое действие;
- способность уменьшать боли в кишечнике;
- способность затруднять и уменьшать адгезию и заселение бактериями, являющимися патогенными и/или имеющими инвазивный характер, желудочно-кишечного тракта, в частности тонкого кишечника и толстой кишки.
Такая новая композиция, обладающая такой комбинацией характеристик, до настоящего времени еще не была описана или идентифицирована.
Таким образом, данная композиция представляет собой исключительный интерес.
Другим объектом настоящего изобретения является применение упомянутой композиции для получения пищевой добавки и/или пробиотика, и/или продукта для лечебно-профилактического питания, и/или биологически активной добавки, и/или функциональных ингредиентов, и/или лечебно-косметического средства, и/или фармацевтически активного вещества, предназначенных для человека и/или животного.
В то же время настоящее изобретение относится к применению композиции, такой, как определено ранее, для получения пищевых композиций, предназначенных для улучшения комфортного состояния желудочно-кишечного тракта и/или улучшения кишечной микрофлоры.
Объектом настоящего изобретения является также применение композиции, такой, как определено ранее, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики расстройств кишечника, функциональных нарушений кишечника или заболеваний желудочно-кишечного тракта.
Объектом настоящего изобретения является также применение композиции, такой, как определено ранее, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или профилактики патологий или расстройств кишечника, характеризующихся состоянием гипералгезии.
Последним объектом настоящего изобретения является набор, содержащий по меньшей мере один вид дрожжей и/или по меньшей мере один производный продукт дрожжей, таких, как определено ранее, в форме, приемлемой для перорального введения.
Штамм, депонированный заявителем в соответствии с Будапештским договором в Национальной коллекции культур микроорганизмов (институт Пастера, Париж) под № CNCM I-3856, в дальнейшем описании для краткости обозначается "ScPro1".
Штамм, также депонированный заявителем в соответствии с Будапештским договором в Национальной коллекции культур микроорганизмов (институт Пастера, Париж) под № CNCM I-3799, в дальнейшем описании для краткости обозначается "SCB1".
Также для краткости производный продукт дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранный из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК) и их смесей, в дальнейшем описании упоминается как "производное".
Под пробиотиком понимают активные микроорганизмы, которые, в случае их введения в достаточном количестве, оказывают положительное действие на здоровье, комфортное состояние и хорошее самочувствие помимо традиционных питательных эффектов.
Под продуктом для лечебно-профилактического питания или биологически активной добавкой, или функциональным пищевым продуктом, или лечебно-косметическим средством понимают пищевой продукт, который содержит ингредиенты, оказывающие полезное действие на здоровье или способные улучшить физиологические функции.
Под пищевой добавкой понимают пищевой продукт, предназначением которого является дополнение нормального пищевого режима. Пищевая добавка представляет собой концентрированный источник питательных веществ или других веществ, обладающих питательным или физиологическим действием, в том случае, когда их используют индивидуально или в комбинации в малых количествах.
Под пищевыми продуктами, предназначенными для специального питания (DDAP), понимают пищевые продукты, целью которых является особое питание, предназначенное для четко определенной группы населения, такой, как грудные дети, дети младшего возраста, спортсмены.
Пищевая композиция, такая, как упомянуто в настоящем изобретении, может представлять собой пищевую добавку или DDAP.
Штаммы по настоящему изобретению были выявлены заявителем благодаря их многочисленным преимуществам и, в частности, благодаря их способности индуцировать полезное действие на пищеварительный тракт человека и, в частности, на тонкий кишечник и толстую кишку, а также на организм в целом.
На практике было замечено, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные неожиданным образом способны индуцировать противовоспалительное действие в противоположность достаточно большому числу штаммов дрожжей и при этом без провоспалительного действия.
На практике дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные вызывают увеличение секреции интерлейкина IL-10, вовлеченного в противовоспалительные сигналы. Кроме того, в отличие от действия пробиотических бактерий типа лактобактерий дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные не индуцируют синтез провоспалительного цитокина IL-12. Продуцирование провоспалительных цитокинов TNFα и IFNγ также заметно меньше по сравнению с бактериальными пробиотиками. В то же время испытания позволили доказать противовоспалительный эффект in vivo дрожжей ScPro1 и, в частности, уменьшение вдвое степени воспаления толстой кишки и уменьшение на треть кишечного некроза.
Кроме того, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные в их сухих формах способны преодолевать желудочный барьер без каких-либо отрицательных последствий на их выживаемость или их целостность, при этом данные дрожжи не внедряются во внутреннюю среду толстой кишки.
Заявителем впервые и неожиданно доказано, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные способны увеличивать сопротивляемость к боли, в частности, на модели с крысой in vivo.
В дополнение к данному полезному действию дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные способны ингибировать заселение и/или инвазию на уровне кишечника микроорганизмов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер. Введение данных дрожжей вызывает уменьшение численности энтеробактерий на уровне толстой кишки и кишечной микрофлоры, устойчивой к антибиотикам.
В частности, заявителем была показана профилактическая и терапевтическая активность против заселения кишечника дрожжами Candida albicans и воспалений, провоцируемых и поддерживаемых данным патогеном. В то же время, данные дрожжи проявляют ингибирующее действие на способность к адгезии и инвазии штаммов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер, патотипов Escherichia coli, выделенных из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона.
По настоящему изобретению дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть введены в активной или реактивируемой форме предпочтительно пероральным путем.
Под терминами "активная форма" или "активные" по настоящему изобретению понимают то обстоятельство, что дрожжи обладают активным или реактивируемым метаболизмом или способны к размножению. Речь идет, в частности, о дрожжах в сухом или свежем виде.
Как правило, дрожжи в свежем виде находятся в форме прессованных или крупитчатых дрожжей. Они могут находиться также в форме дрожжей в виде суспензии на водной основе, называемых также жидкими дрожжами. В данном случае дрожжи предпочтительно являются инкапсулированными. Способы инкапсулирования и различные типы капсул хорошо известны специалистам в данной области техники.
Среди сухих форм дрожжей можно упомянуть дрожжи, которые могут находиться в сухой быстрорастворимой или сухой активной форме. Под сухими дрожжами понимают любые дрожжи, имеющие содержание сухого вещества больше 90% и предпочтительно в интервале приблизительно от 92 до 96%.
Среди сухих дрожжей также можно упомянуть быстрозамороженные или незамороженные дрожжи со средней влажностью.
Быстрорастворимые сухие дрожжи предназначены главным образом для крупных и мелких хлебопекарных предприятий. Другие варианты применения и сбыта возможны на основе пищевого назначения (технология лекарственных форм, спиртовое брожение). Особенность данных сухих дрожжей состоит в том, что они не требуют увлажнения перед прибавлением к муке.
Данные дрожжи получают обезвоживанием дрожжей под действием градиента горячего воздуха, позволяющего превращать пастообразный продукт (прессованные или жидкие дрожжи) в продукт в виде тонкой сухой вермишели, который при этом остается активным. Затем продукт с целью обеспечения стабильности должен быть расфасован в отсутствии кислорода.
Сухие активные дрожжи представляют собой активные дрожжи, высушенные при низкой температуре с целью сохранения их ферментирующей способности и обеспечения достаточно длительного хранения. Дрожжи находятся в форме сферических частиц.
Данные дрожжи получают обезвоживанием дрожжей при совместном действии тепла и механического воздействия, которые позволяют превращать дрожжи в пастообразной форме в сухой продукт, сохраняя их жизнеспособность.
2
Выбранные сухие активные дрожжи получают экструзией и высушиванием в псевдоожиженном слое биомассы (активные клетки дрожжей). Такие сухие активные дрожжи, то есть сухие дрожжи, имеющие высокое содержание активных клеток дрожжей, находятся в форме гранул в общем случае с диаметром от 0,1 мкм до 2,5 мм и содержанием HO от 4 до 8% масс.
Такие сухие формы обладают преимуществом, состоящим в том, что они обеспечивают более хорошую гастрорезистентность по сравнению с формой свежих дрожжей и оптимизируют полезное действие дрожжей по настоящему изобретению. Дрожжи по настоящему изобретению предпочтительно находятся в форме сухих активных дрожжей.
В общем случае известно, что провоспалительные цитокины стимулируют воспалительные механизмы, которые при этом могут быть ответственными за достаточно многие клинические проблемы, в частности, в случаях аутоиммунных заболеваний или иммуннодефицита.
Так, например, дрожжи по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики и/или лечения как хронических, так и острых заболеваний или воспалительных расстройств кишечника, необязательно связанных с диареей или запорами.
В первом варианте осуществления настоящего изобретения расстройства и заболевания необязательно связаны с диареей.
Во втором варианте осуществления настоящего изобретения расстройства и заболевания не связаны с диареей. В частности, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть полезными для профилактики или лечения колитов, которые характеризуются в основном воспалением толстой кишки.
В частности, данные дрожжи являются в хорошей степени приемлемыми для профилактики и/или лечения хронических воспалительных заболеваний кишечника (MICI), в частности, язвенного колита, геморрагического ректоколита, целиакии или болезни Крона.
Данные заболевания характеризуются, в частности, обостренным иммунным ответом, в который вовлечены многие воспалительные каскады. Так, например, в рамках профилактики или лечения данных заболеваний пробиотиком и/или продуктом для лечебно-профилактического питания, и/или функциональным пищевым продуктом, и/или биологически активной добавкой, и/или лечебно-косметическим средством, является важным, чтобы провоспалительные эффекты были как можно более слабыми.
Таким образом, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные по настоящему изобретению являются наиболее предпочтительно приемлемыми для такого применения. Данные дрожжи обладают несколькими дополнительными преимуществами.
Первым преимуществом является то, что они обладают способностью увеличивать сопротивляемость к боли. Второе преимущество, в частности в случае болезни Крона, состоит в том, что данные дрожжи способны, в частности, ингибировать способность к адгезии и инвазии штаммов, являющихся патогенными и/или имеющих инвазивный характер E. coli, происходящих от больных, страдающих данным заболеванием.
Воспалительный ответ может быть, в частности, обусловлен инвазией любых патогенных микроорганизмов.
Так, например, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные по настоящему изобретению проявляют хорошую эффективность при профилактике или лечении желудочно-кишечных нарушений или заболеваний, обусловленных заселением кишечника микроорганизмами, являющимися патогенными и/или имеющими инвазивный характер прокариотов, таких, как бактерии, или эукариотов, таких, как грибы.
Желудочно-кишечные нарушения или заболевания могут представлять собой хронические воспалительные кишечные заболевания, такие, как язвенный колит, целиакия, болезнь Крона, геморрагический ректоколит.
Помимо того, что дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные позволяют увеличивать сопротивляемость к боли, они представляют собой также интерес для профилактики или лечения патологий или расстройств кишечника, сопровождаемых состоянием гипералгезии. Такие патологии или расстройства могут представлять собой предпочтительно функциональные кишечные расстройства, хронические воспалительные заболевания кишечника (MICI) или пищевую непереносимость (аллергии, выработка условных рефлексов и т.д.), характеризующиеся хронической висцеральной болью.
Данные дрожжи предпочтительно приемлемы для профилактики или лечения гипералгезии, в частности, синдрома раздражения кишечника (SII) любой формы (запор, диарея или их комбинация), а также хронических висцеральных болей, не относящихся к SII, таких, как функциональные абдоминальные боли без затруднений дефекации (FAPS: Functional Abdominal Pain) и боли, связанные с пищевой непереносимостью и целиакией.
Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные, или любые композиции, содержащие их, могут быть также приемлемыми в качестве профилактики у пациентов, имеющих предрасположенность или повышенную чувствительность к нарушениям или заболеваниям такого типа, или в качестве лечения, например, в случае кризисов или в течение более длительных периодов. Композиции и способы по настоящему изобретению могут уменьшать страдания больных, ослаблять симптомы или причину таких нарушений.
Объединение действия данных дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению на боль, воспаление и микроорганизмы, являющиеся патогенными и/или имеющие инвазивный характер, вызывает некоторым образом улучшение самочувствия, здоровья и/или комфортного состояния желудочно-кишечного тракта человека или животного.
7
10
8
10
Композиция по настоящему изобретению может содержать дрожжи ScPro1 и/или дрожжи SCB1, и/или по меньшей мере одно производное дрожжей Saccharomyces cerevisiae, выбранное из экстрактов дрожжей, производных продуктов клеточных стенок, париетальных глюканов, париетальных маннопротеинов, липидных фракций дрожжей, фракций нуклеиновых кислот дрожжей (РНК, ДНК), в количестве в интервале приблизительно от 10 до 6·10КОЕ и предпочтительно в интервале от 10 до 2·10 КОЕ или в интервале от 1 мг до 10 г и предпочтительно в интервале от 1 мг до 1 г. Такое количество может представлять собой суточное количество, принимаемое в один или несколько приемов в течение суток.
7
10
8
10
Предпочтительно дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные применяют при терапевтическом или нетерапевтическом назначении в суточной дозе в интервале от 10 до 6·10 КОЕ (колониеобразующих единиц) и предпочтительно в интервале от 10 до 2·10 КОЕ.
В случае, когда дрожжи и/или их производные находятся в активной, а не в реактивируемой форме, суточная доза, приемлемая при терапевтическом или нетерапевтическом назначении, находится предпочтительно в интервале от 1 мг до 10 г и более предпочтительно в интервале от 1 мг до 1 г. Эффективная суточная доза может быть введена в один, два, три или четыре приема.
Дрожжи и/или их производные по настоящему изобретению или композиции, содержащие их, предпочтительно вводят пероральным путем. Их количество может составлять терапевтически эффективную дозу, что означает, что по меньшей мере один из симптомов уменьшается или подавляется.
Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть включены в пищевую композицию, предназначенную для человека или животного, и/или введены с эксципиентами или наполнителями, приемлемыми для перорального введения.
Композиция, предназначенная для питания человека, может представлять собой жидкость, пасту или твердое вещество. В частности, композиция может представлять собой молочный продукт, такой, как сыр, масло, йогурт или сливки, продукт на основе фруктов, такой, как фруктовый сок, компот или фруктовая паста, напиток или твердый пищевой продукт, например, легкие закуски, галеты, или другой продукт. Таким образом, композиция содержит дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные и компоненты пищевого продукта или напитка.
Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные также могут быть включены в фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция является приемлемой для перорального введения. Таким образом, она содержит дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные, а также соответствующую традиционную основу, выбранную из эксципиентов, разрешенных для применения в фармацевтических композициях. Композиция может быть изготовлена в виде жидкости, такой, как сироп или ампулы для питья, или в виде таблеток, желатиновых капсул, пакетиков, капсул или порошков и других приемлемых галеновых препаратов.
Кроме того, дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные могут быть введены с другими пробиотиками и/или другими функциональными ингредиентами, в частности, с пробиотическими бактериями, в частности, для наиболее полного профилактического действия.
В качестве примера можно упомянуть молочные бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium, Pediococcus, Propionibacterium или Leuconostoc.
Дрожжи ScPro1 и/или SCB1 и/или их производные также могут быть введены с другими активными веществами, такими как антибиотики, аналгетические средства, противодиарейные средства, слабительные средства и их смеси.
Далее настоящее изобретение поясняется примерами и фигурами, приведенными в порядке пояснения и неограничительным образом:
- на фиг.1 показано изменение выживаемости дрожжей ScPro1 в пищеварительной системе, моделирующей толстую кишку человека, соответственно примеру 2;
- на фиг.2 показано действие дрожжей ScPro1 на микрофлору толстой кишки соответственно примеру 2;
- на фиг.3 и 4 показано изменение численности клеток Candida albicans в испражнениях мышей в опытах 1 и 2 примера 5, соответствующих модели профилактики (фиг.3) и лечения (фиг.4);
- на фиг.5 показана процентная доля остаточной адгезии клеток Escherichia coli AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника человека в зависимости от количества дрожжей ScPro1 при предварительной инкубации; клетки дрожжей инкубировали с эпителиальными клетками кишечника в течение часа. Инфицирование клеток штаммом AIEC LF82 осуществляли в присутствии дрожжей ScPro1 соответственно примеру 6;
- на фиг.6 показана процентная доля остаточной адгезии клеток Escherichia coli AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника человека в зависимости от количества дрожжей ScPro1 при совместной инкубации; клетки дрожжей и клетки Escherichia coli инкубировали одновременно с эпителиальными клетками кишечника в течение часа соответственно примеру 6;
- на фиг.7 показана оценка интенсивности воспаления кишечника мышей согласно макроскопической шкале Wallace после введения дрожжей ScPro1 и SCB1 соответственно примеру 4;
- на фиг.8 показана оценка интенсивности воспаления интестинального эпителия кишечника мышей согласно гистологической шкале Ameho после введения дрожжей ScPro1 и SCB1 соответственно примеру 4;
- на фиг.9 показана оценка интенсивности воспаления кишечника мышей согласно макроскопической шкале Wallace после введения дрожжей ScPro1 и SCB1, введенных по отдельности или в комбинации, соответственно примеру 4;
- на фиг.10 показана оценка интенсивности воспаления интестинального эпителия мышей согласно гистологической шкале Ameho после введения дрожжей ScPro1 и SCB1, введенных по отдельности или в комбинации, соответственно примеру 4;
- на фиг.11 показан уровень экспрессии иРНК гена, кодирующего белок IL-10, через один и три часа после приведения в контакт дрожжей или их производных по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;
- на фиг.12 показан уровень экспрессии иРНК гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα, через один и три часа после приведения в контакт дрожжей или их производных по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;
- на фиг.13 показано модулирование экспрессии иРНК гена, кодирующего белок IL-10, через один и три часа после приведения в контакт производных дрожжей по настоящему изобретению с эпителиальными клетками кишечника человека соответственно примеру 7;
- на фиг.14 показана экспрессия гена, кодирующего белок IL-10, в эпителиальных клетках кишечника мышей после введения дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению (пример 4);
- на фиг.15 показана экспрессия гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα, в эпителиальных клетках кишечника мышей после введения дрожжей и/или их производных по настоящему изобретению (пример 4);
- на фиг.16 показано количество цитокина IL-10 в пг/мл, секретированного интестинальными клетками биопсийных материалов больных, не обязательно страдающих болезнью Крона, после приведения их в контакт с дрожжами и/или их производными по настоящему изобретению (пример 8);
- на фиг.17 показано количество цитокина TNF-α в пг/мл, секретированного интестинальными клетками биопсийных материалов больных, не обязательно страдающих болезнью Крона, после приведения их в контакт с дрожжами и/или их производными по настоящему изобретению (пример 8);
- на фиг.18 показаны результаты испытаний по определению способности связывания пили типа 1 с маннопротеиновыми фракциями (EL05 и EL06) дрожжей ScPro1;
- на фиг.19A и 19B показана соответственно средняя процентная доля остаточной адгезии и остаточной инвазии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам T84 в случае совместной инкубации с возрастающими концентрациями дрожжей (пример 6) - *p < 0,05, **p < 0,01;
- на фиг.20A и 20B показана соответственно средняя процентная доля адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам T84 в случае совместной инкубации с возрастающими концентрациями маннопротеинов дрожжей EL05 (пример 6);
- на фиг.21A и 21B показана соответственно средняя процентная доля остаточной адгезии и остаточной инвазии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам T84 в случае предварительной инкубации с возрастающими концентрациями дрожжей (пример 6) - *p < 0,05, **p < 0,01;
- на фиг.22A и 22B показана соответственно средняя процентная доля адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам T84 в случае предварительной инкубации с возрастающими концентрациями маннопротеинов дрожжей EL05 (пример 6) - *p < 0,05, **p < 0,01;
- на фиг.23 показана процентная доля остаточной адгезии штамма AIEC LF82 по отношению к клеткам CHO-K1 и CHO-K1/CEACAM6 в случае предварительной инкубации с возрастающими концентрациями дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (пример 6) - *p < 0,05, **p < 0,01;
- на фиг.24 показана адгезия штамма AIEC LF82 или не имеющего пили мутанта LF82-δfimH на щеточной каемке энтероцитов 3 образцов клеток больных, страдающих болезнью Крона (пример 6);
- на фиг.25 показаны результаты измерений порога восприятия боли (в мм рт. ст.) здоровыми крысами в случае различных дрожжей (пример 9);
- на фиг.26 показаны результаты измерений порога восприятия боли (в мм рт. ст.) крысами с висцеральной повышенной чувствительностью в случае различных дрожжей (пример 9).
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1. Выживаемость дрожжей ScPro1 и/или SCB1 в искусственной пищеварительной среде, моделирующей кишечник человека
Исследование изменения дрожжей ScPro1 и/или SCB1 в процессе прохождения желудочно-кишечного тракта
Дрожжи ScPro1 и SCB1 были испытаны и исследованы in vivo в искусственной пищеварительной среде, моделирующей пищеварение человека, и, в частности, путем исследования выживаемости испытуемых жизнеспособных дрожжей в процессе прохождения желудочно-кишечного тракта.
Были испытаны два образца сухих активных дрожжей ScPro1 и два образца сухих активных дрожжей SCB1.
Два образца отличались временем хранения при комнатной температуре в вакууме: продолжительность хранения до 6 месяцев и до 2 лет.
Экспериментальные условия
Процессы пищеварения осуществляли в системе, называемой TIM1 (желудок + тонкий кишечник), в соответствии с экспериментальными условиями, установленными исходя из данных, полученных из литературных источников, и воспроизводя переваривание жидкого пищевого продукта (воды) взрослым здоровым человеком натощак с удалением продуктов пищеварения диализом и абсорбцией. Каждый цикл пищеварения осуществляли в течение 5 часов. Все эксперименты с пищеварением осуществляли в одних и тех же общих опытных условиях, описанных далее.
Температура: температуру поддерживали равной 37°C.
Параметры опорожнения желудка: Опорожнение желудка осуществляли соответственно зависимости, определенной Elashoff и соавт. (1982) и выраженной соответственно формуле:
<mrow />
<mrow><mi>F</mi><mo>=</mo><mn>1</mn><mo>−</mo><msup><mn>2</mn><mrow><mo>−</mo><msup><mrow><mo stretchy="false">(</mo><mi>t</mi><mo>/</mo><mi>T</mi><mo stretchy="false">)</mo></mrow><mi>b</mi></msup></mrow></msup></mrow>
где F означает порцию удаляемой пищи, t означает время, T означает время полувыведения пищевого продукта, а b означает параметр, описывающий форму кривой. Принятые параметры: T = 15 мин; b = 1.
m
3
-7
Параметры опорожнения тонкого кишечника: опорожнение тонкого кишечника осуществляли соответственно модифицированной зависимости Elashoff (при этом введение параметра d обеспечивает замедление опорожнения в конце пищеварения, F = F + d·t). Принятые параметры: T = 150 мин; b = 2,4; d = -10 (ср. фиг.2).
Заданные значения pH:
желудок (мин/ед. pH): 0/6,0; 10/3,2; 20/2,4; 40/1,8; 60/1,6; 90/1,5; 300/1,5;
двенадцатиперстная кишка: 6,4;
тощая кишка: 6,9;
подвздошная кишка: 7,2.
Желудочная секреция:
HCl;
пепсин;
липаза.
Кишечная секреция:
3
NaHCO в трех участках тонкого кишечника;
экстракт желчи в двенадцатиперстную кишку;
экстракт поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку;
Диализ/абсорбция
Удаление "малых" порций кишечного химуса осуществляли на двух уровнях TIM1 (тощая кишка и подвздошная кишка) посредством гемодиализаторов. Диализ кишечного химуса осуществляли непрерывно с солевым раствором, состав которого был близок к составу плазмы крови. Диализаты собирали в диализные мешки.
Отбор проб осуществляли в процессе пищеварения на разных уровнях тракта с целью контроля выживаемости испытуемых дрожжей.
Подсчеты численности дрожжей осуществляли соответственно традиционным микробиологическим методикам и принятому отбору проб: в желудке через 10, 20, 30 и 45 мин, на выходе из тонкого кишечника с накоплением в течение часа и в конечном остатке.
Методика подсчета изложена далее.
Для каждой отобранной пробы быстро осуществляли последовательное десятикратное разведение стерильным физиологическим раствором (NaCl, 8,5 г/л). Затем 0,1 мл каждого разведения наносили и затем распределяли по поверхности агаровой среды, разлитой в чашки Петри (две чашки на одно разведение). Чашки инкубировали в течение 48 ч при 35°C перед подсчетом "колониеобразующих единиц" (КОЕ).
Результаты подсчета выражали в КОЕ/мл (необработанные данные) и в процентном отношении клеток активных дрожжей по сравнению с числом клеток изначально введенных дрожжей для определения уровня выживаемости дрожжей в желудке и на выходе из тонкого кишечника.
В приведенной далее таблице обобщены теоретические уровни выживаемости (при 100%-й жизнеспособности) и реальные значения, полученные для каждого штамма на уровне желудка, в накопленной пробе на выходе из тонкого кишечника после 5 ч пищеварения и в накопленной пробе системы после 5 ч пищеварения.
Результаты
Продукты пищеварения
Введенные дрожжи, КОЕ
На выходе из желудка черезT = 45 мин
На выходе из тонкого кишечника черезT = 5 ч
Общая выживаемость черезT = 5 ч
ScPro1, образец 1
3,5·10<sup>10</sup>
89%
100%
106%
ScPro1, образец 2
2,0·10<sup>10</sup>
88%
95%
106%
SCB1 1
1,5·10<sup>10</sup>
83%
76%
81%
SCB1 2
1,5·10<sup>10</sup>
85%
69%
76%
Заключение
Данные результаты хорошо демонстрируют превосходную выживаемость в желудочно-кишечном тракте дрожжей ScPro1 и SCB1.
ПРИМЕР 2. Выживаемость дрожжей ScPro1 в искусственной пищеварительной среде, моделирующей кишечник человека
Исследование выживаемости дрожжей ScPro1 во время ферментации в толстой кишке и влияние дрожжей на кишечную микрофлору
Дрожжи ScPro1 в сухой активной форме были испытаны и исследованы in vitro в искусственной пищеварительной среде, моделирующей пищеварение человека, и, в частности, путем исследования изменения и воздействия жизнеспособных испытуемых дрожжей на среду во время ферментации в толстой кишке.
Ферментация в толстой кишке является непрерывной ферментацией с последовательным поступлением среды для сохранения микрофлоры. Данная среда содержит главным образом сложные углеводные соединения, не переваренные в верхней части пищеварительного тракта (крахмал, пектин, целлюлоза т.п.), в большей или меньшей степени гидролизованные белковые соединения и муцин.
Ферментированные соединения извлекаются из среды толстой кишки также последовательно. Среда проходит через систему диализа, обеспечивающую непрерывное удаление растворимых продуктов ферментации.
Диализат собирают для анализа жирных кислот с короткими цепями (AGCC). Среду выдерживают в анаэробных условиях, создаваемых за счет собственных газов ферментации, при этом среда имеет окислительно-восстановительный потенциал меньше -300 мВ. В заключение pH доводят до заданного значения, равного 6.
Каждый цикл пищеварения включал в себя: период стабилизации микрофлоры в течение 2-3 дней после засева толстой кишки, период обработки (по меньшей мере в течение 3 дней) по меньшей мере с одной ежедневной добавкой продукта и период прекращения обработки в течение 3 дней. В каждом опыте контролировали и/или регистрировали следующие параметры:
- жизнеспособность дрожжей;
- изменение различных аэробных и анаэробных бактериальных популяций;
- изменение основных продуктов ферментации (AGCC и газы);
- детектирование стандартной ферментативной активности;
- температура, pH и окислительно-восстановительный потенциал.
Ферментацию осуществляли в пенициллиновом флаконе вместимостью 60 мл, закрытом герметизируемой пробкой с септой и заполненном на 30 мл средой толстой кишки (культуральная среда со свежей фекальной микрофлорой). Образец дрожжей прибавляли к 30 мл среды.
Среда толстой кишки состояла, с одной стороны, из микробной суспензии, полученной из свежих испражнений, в буферном фосфатном растворе, а с другой стороны, из типичного пищевого продукта, используемого также для культивирования микрофлоры толстой кишки в искусственной толстой кишке.
После смешивания среды толстой кишки с испытуемым продуктом флакон закупоривали и герметизировали.
Все данные манипуляции производили в вытяжном анаэробном шкафу (в атмосфере смеси газов, не содержащей кислород). Флакон помещали в роторный инкубатор (37°C - 200 об/мин) на 24 ч.
Для каждого продукта испытание осуществляли в двух пробах. При этом в тех же самых условиях готовили также 4 флакона с контрольными пробами (без испытуемого продукта). При этом два флакона обрабатывали немедленно (начальное время), а два флакона инкубировали так же, как и испытуемые флаконы.
Ферментацию останавливали через 24 ч, а затем флаконы обрабатывали.
2
2
4
2
Продуцирование ферментационных газов. Объем газов, образующихся при ферментации, определяли посредством системы Мариотта (принцип измерения объема воды, вытесняемой давлением газов, содержащихся в пенициллиновом флаконе). При этом анализ газов, содержащихся во флаконе, осуществляли способом CPG (H, CO, CH, O).
Продуцирование жирных кислот с короткими цепями. Осуществляли отбор первой пробы содержимого толстой кишки. Пробу или замораживали или сразу обрабатывали для определения концентрации AGCC (летучие жирные кислоты с короткими цепями) в надосадочной культуральной жидкости. Данный анализ осуществляли способом CPG. Исследованные метаболиты представляли собой уксусную, пропионовую, масляную, изомасляную, валериановую, изовалериановую, капроновую, изокапроновую и гептановую кислоты.
Микробиологический анализ. Осуществляли отбор второй пробы содержимого толстой кишки и сразу обрабатывали (последовательное десятикратное разведение восстановительной разбавляющей средой) для подсчета численности общей анаэробной, факультативной аэробно-анаэробной и грибковой микрофлоры.
Результаты по выживаемости дрожжей ScPro1 представлены на фиг.1. На данной фигуре каждая вертикальная стрелка указывает на введение дрожжей ScPro1.
Было отмечено, что дрожжи ScPro1 проявляют хорошую выживаемость до 3-го дня после введения и значительную гибель между 4-м и 7-м днями периода введения. Данное обстоятельство показывает, что дрожжи не внедряются во внутреннюю среду толстой кишки.
Результаты микробиологического анализа представлены на фиг.2. Они показывают уменьшение численности энтеробактерий в присутствии дрожжей ScPro1 с повышением после прекращения введения дрожжей. Во время введения дрожжей ScPro1 также было отмечено, что значительно уменьшилась микрофлора, устойчивая к антибиотикам (хлорамфеникол, гентамицин).
Результаты по действию дрожжей ScPro1 на продуцирование летучих жирных кислот с короткими цепями (AGCC) обобщены в приведенной далее таблице (в мМ в среде толстой кишки).
Перед обработкой
Во время обработки
После обработки
Ацетат
71,4 ± 2,3
57,6 ± 4,2
60,6 ± 0,7
Пропионат
22,8 ± 0,6
26,5 ± 4,2
35,7 ± 1,1
Бутират
35,0 ± 1,6
36,5 ± 2,2
26,6 ± 4,2
Изобутират
3,2 ± 0,3
3,3 ± 0,2
3,4 ± 0,1
Изовалерат
5,6 ± 0,5
5,2 ± 0,2
5,3 ± 0,0
Валерат
8,0 ± 0,6
7,8 ± 1,4
9,1 ± 0,9
Изокапронат
0,1 ± 0,1
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
Капронат
9,0 ± 1,1
7,3 ± 0,3
5,7 ± 0,7
Гептаноат
0,2 ± 0,2
0,0 ± 0,1
0,0 ± 0,0
Итого
155,3 ± 2,7
144,1 ± 6,8
146,4 ± 3,4
Во время обработки было отмечено уменьшение содержания ацетатов, частично в пользу пропионатов, что предполагает уменьшение активности ацетогенной микрофлоры.
Среди других контролируемых параметров не было замечено явное действие обработки на:
- продуцирование газов (по количеству и содержанию);
- общую и простую (стабильную во времени) концентрацию сахаров;
- ферментативную активность.
ПРИМЕР 3. Исследование влияния дрожжей ScPro1 и SCB1 на индуцирование продуцирования цитокинов
Было исследовано влияние активных дрожжей ScPro1 и SCB1 на индуцирование продуцирования цитокинов в периферических мононуклеарных клетках крови человека (PBMC).
Дрожжи ScPro1 и SCB1 были испытаны в сухой быстрорастворимой форме и сухой активной форме в отношении их способности индуцировать продуцирование цитокинов IL-10, IL-12, TNFα, TNFγ в PBMC человека.
Получение периферических мононуклеарных клеток крови человека
6
Свежую человеческую кровь, полученную от доноров с хорошим здоровьем в Центре гемотрансфузии, разбавляли в 2 раза PBS-Ca (GIBCO) и очищали с градиентом фиколла (GIBCO). После центрифугирования при 400 g в течение 30 минут при 20°C периферические мононуклеарные клетки крови (PBMC) образуют в сыворотке слой в форме круга. PBMC тщательно собирали аспирацией, суспендировали в 50 мл конечного объема с использованием PBS-Ca и промывали 3 раза таким же буферным раствором с центрифугированием в течение 10 минут при 20°C и 350 g. Затем PBMC снова суспендировали, используя полную среду RPMI (GIBCO), обогащенную 10% масс./об. эмбриональной телячьей сыворотки (инактивированной при 56°C в течение 30 минут), 1% масс./об. L-глутамина (GIBCO) и гентамицином (150 мкг/мл) (GIBCO). Количество PBMC подсчитывали под микроскопом, отрегулированным на концентрацию 2·10 клетка/мл, и распределяли (в 1 мл аликвоты раствора) по 24-луночным чашкам для культивирования клеток (Corning, Inc.).
Микробиологические препараты
9
После культивирования, осуществленного в течение ночи, Lactobacillus, Lactococcus и Escherichia coli (контрольные штаммы) промывали 2 раза буферным раствором PBS, pH = 7,2, перед последующим суспендированием в PBS с концентрацией 2·10 КОЕ/мл.
8
7
8
9
Концентрация дрожжей, использованная в первой серии опытов, составляла 2·10 КОЕ/мл. Для исследования сравнения исходной дозы можно было осуществить последовательные разведения 10 на 10 для сравнения действия при концентрациях 2·10, 2·10 и 2·10 КОЕ/мл.
Инкубация периферических мононуклеарных клеток крови человека
2
10 мкл рабочей суспензии помещали в лунки чашек, содержащие PBMC, и инкубировали при 37°C в атмосфере смеси 5% CO и 95% атмосферного воздуха. После инкубации в течение 24 часов надосадочную жидкость отсасывали, центрифугировали при 2000 об/мин (модель Эппендорфа), извлекали осадок и хранили при -20°C.
Контрольный образец состоял из грамположительных бактерий (Lactobacillus и Lactococcus), грамотрицательных бактерий (Escherichia coli) и буферного раствора при отсутствии дрожжей.
Количественное определение цитокинов
Уровни экспрессии цитокинов определяли способом ELISA. Планшеты для анализа ELISA покрывали антителом (в течение ночи), а антитело насыщали 1%-м раствором PBS/BSA (бычьего сывороточного альбумина). Градуировочную кривую получали с известными концентрациями цитокинов с пределами обнаружения от 15,62 до 2000 пг/мл (инкубация в течение ночи). Исследование и количественное определение антицитокина производили измерением активности стрептавидина с субстратом TMB (тетраметилбензидин, Pharmingen2). Были использованы коммерческие наборы Pharmingen в соответствии с описанием изготовителя. Были выбраны четыре цитокина: 3 провоспалительных (TNFα, IFNγ, IL-12) и один противовоспалительный (IL-10).
Результаты
Ответы 4 цитокинов на 5 различных доноров оценивали при соотношении "дрожжи/PBMC", равном 1/1.
Результаты количественного определения 4 цитокинов, секретированных в надосадочную культуральную жидкость, обобщены в приведенной далее таблице A. Данные представлены как среднее значение (Moy) количественного определения по 5 донорам. В таблице приведены также значения стандартной ошибки среднего значения (Sem).
Таблица A
IL-10 (пг/мл)
IFNγ (пг/мл)
TNFα (пг/мл)
IL-12 (пг/мл)
Moy
Sem
Moy
Sem
Moy
Sem
Moy
Sem
Негативная контрольная проба
0
0
50
0
50
0
0
0
E. coli
2474
839
57376
29591
11185
3875
15
15
Lactococcus lactis
111
43
136103
62706
25362
9818
1101
543
Bifidobacterium longum
1072
355
33780
27164
14517
5601
22
20
Lactobacilus acidophilus
435
259
85543
46838
18369
6857
529
343
SCB1
569
291
27807
19231
6492
2698
14
10
ScPro1
442
292
15218
9304
3643
1847
8
5
Было замечено:
1) продуцирование в случае дрожжей ScPro1 и SCB1 очень малого, в некоторых случаях не обнаруживаемого количества IL-12, индуцированного PBMC, в отличие от сравнительных бактерий;
2) существенные уровни IL-10 в обоих случаях активных дрожжей, позволившие выявить, что SCB1 имеет более хороший результат, чем ScPro1;
3) явно меньшие по сравнению с различными испытуемыми пробиотическими бактериями количества IFNγ и TNFα, секретированные под действием дрожжей ScPro1 и SCB1.
Выводы:
- очевидно, что дрожжи ScPro1 и SCB1 в присутствии PBMC не индуцируют экспрессию провоспалительного цитокина IL-12 в противоположность тому, что традиционно наблюдают в случае пробиотических лактобактерий;
- дрожжи ScPro1 и SCB1 в присутствии PBMC индуцируют существенные уровни IL-10 (противовоспалительного);
- количества IFN-γ и TNF-α, секретированных PBMC в присутствии дрожжей ScPro1 или SCB1, явно меньше, чем в случае пробиотических бактерий.
Пример 4. Оценка защитного действия дрожжей ScPro1 и SCB1 в случае химически индуцированного колита (TNBS) в модели с мышью
Традиционно используемая предложенная модель с животным была адаптирована для измерения противовоспалительного действия дрожжей.
В данном опыте были использованы мыши линии Balb/c в возрасте 6 недель. Мыши были акклиматизированы в условиях лаборатории в течение недели перед опытом со свободным доступом к воде и пище. Каждый образец испытывали на группе из 10 мышей. Колит индуцировали в цикле со свободным доступом к питьевой воде, содержавшей 5% (масс./об.) TNBS, в течение 7 дней. Дрожжи вводили перорально один раз в день через желудочный зонд за 3 дня до начала индуцирования колита посредством TNBS и в течение периода обработки TNBS (7 дней).
Кроме двух испытуемых групп использовали контрольную группу (негативный контроль), в которой применяли только физиологический раствор.
Параметры испытаний, полученные по результатам обработки, приведены далее.
- Макроскопическое оценивание воспаления кишечника (шкала Wallace). Толстая кишка каждой мыши была осмотрена под препаровальной лупы (5-кратное увеличение) для оценки макроскопических повреждений по шкале Wallace от 0 до 10 в зависимости от критериев оценки, характеризующих степень воспаления, таких, как гиперемия, толщина стенки толстой кишки и площадь изъязвления.
- Гистологическое оценивание воспаления (шкала Ameho). Для осуществления гистологического оценивания по шкале Ameho от 0 до 6 в зависимости от степени инфильтрации воспаления, наличия эрозии, изъязвлений или некрозов и глубины, а также распространения повреждений по поверхности использовали участок толстой кишки, отбираемый точно в 2 см от анального канала. Количественное определение деградации и повреждений кишечника осуществляли 2 независимых эксперта.
- Количественное определение экспрессии генов, кодирующих IL-10 и PPARα. С этой целью из тканей толстой кишки выделяли общую РНК посредством набора RNeasy (Macherey Nagel, Хердт, Франция) согласно инструкции изготовителя. Количественное определение информационной РНК осуществляли, используя спектрофотометр. После обработки при 37°C в течение 30 минут с 20-50 единицами препарата DNase I RNase-free (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана, США) были использованы праймеры олиго-DT (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана, США) для синтеза простых одноцепочечных кольцевых ДНК. Информационные РНК количественно определяли с помощью набора SYBR green Master Mix (Applera, Куртабеф, Франция) и олигонуклеотидов человека, предназначенных для исследований in vitro (см. табл. B, приведенную далее), посредством прибора GeneAmp Abiprism 700 (Applera, Куртабеф, Франция). В каждом опыте использовали эталонные и неэталонные контрольные образцы. Для каждого образца осуществляли три измерения. Интенсивность окраски препарата SYBR vert определяли с использованием программы Abiprism 7000 SDS (Applera, Куртабеф, Франция). Все результаты нормализованы по сравнению с геном, кодирующим β-актин.
Таблица B
Гены
Последовательности нуклеотидных затравок
β-актин
F: 5'-AAgTCCCTCACCCTCCCAAAAg-3'R: 5'-AAgCAATgCTgTCACCTTCCC-3'
PPARα
F: 5'-ACgATgCTgTCCTCCTTgATg-3'R: 5'-gTgTgATAAAgCCATTGCCgT-3'
IL-10
F: 5'-CAgTCAgCCAgACCCACAT-3'R: 5'-gCTCCACTgCCTTgCTTT-3'
Дрожжи ScPro1 и SCB1 были испытаны в описанной ранее стандартной модели профилактики. Контроль массы тела животных перед индуцированием колита показал, что композиции дрожжей, вводимые мышам, очень хорошо переносились.
Воспаление кишечника, оцененное по шкале Wallace, в случае дрожжей ScPro1 (сухая активная форма, 1 мг/сутки) и SCB1 уменьшилось на 60% по сравнению с позитивным контролем. Дрожжи SCB1 также вызывали уменьшение воспаления. Некроз кишечника, оцененный по шкале Ameho, в случае дрожжей ScPro1 (сухая быстрорастворимая форма, от 1 мг до 100 мкг/сутки) уменьшился на треть по сравнению с позитивным контролем.
Дрожжи ScPro1 и SCB1, введенные по отдельности или совместно, повысили уровень экспрессии генов, кодирующих противовоспалительный интерлейкин IL-10 и нуклеарный рецептор PPARα
На фиг.7-10 хорошо видны превосходные значения макроскопических показателей по шкалам Wallace и Ameho для дрожжей ScPro1 и SCB1 с различными суточными дозами.
На фиг.7 и 8 представлены соответственно макроскопический показатель по шкале Wallace и гистологический показатель по шкале Ameho для дрожжей для ScPro1 и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме, вводимых ежедневно в количестве от 10 мкг до 1 мг.
Цифрами при каждом столбце графиков, показанных на фиг.7 и 8, обозначены следующие варианты:
1 означает TNBS, взятый отдельно;
2 означает TNBS + ScPro1 (1 мг);
3 означает TNBS + ScPro1 (100 мкг);
4 означает TNBS + SCB1 (1 мг);
5 означает TNBS + SCB1 (100 мкг).
Можно заметить, что дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме, вводимые с дозой 100 мкг/сутки, в значительной степени уменьшают повреждения на макроскопическом и гистологическом уровнях.
На фиг.9 и 10 представлены соответственно макроскопический показатель по шкале Wallace и гистологический показатель по шкале Ameho для дрожжей ScPro1 и SCB1, взятых по отдельности или в комбинации в сухой быстрорастворимой форме или в сухой активной форме и вводимых ежедневно в количестве от 100 мкг до 1 мг.
На фиг.14 и 15 показаны соответственно уровни экспрессии генов, кодирующих противовоспалительный интерлейкин и нуклеарный рецептор PPARα, на уровне интестинальных клеток.
Цифрами при каждом столбце графиков, показанных на фиг.9, 10, 14 и 15, обозначены следующие варианты:
1 означает TNBS, взятый отдельно;
2 означает TNBS + ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (100 мкг);
3 означает TNBS + ScPro1 в сухой активной форме (100 мкг);
4 означает TNBS + SCB1 в сухой активной форме (100 мкг);
5 означает TNBS + ScPro1 в сухой активной форме (1 мг);
6 означает TNBS + ScPro1 в сухой активной форме (100 мкг);
7 означает TNBS + ScPro1 в сухой активной форме (100 мкг) + SCB1 (100 мкг).
Выводы
Можно отметить, что дрожжи ScPro1 в сухой активной форме в значительной степени вызывают повреждения на макроскопическом уровне и существует синергический противовоспалительный эффект комбинации ScPro1 и SCB1 как на макроскопическом уровне, так и на гистологическом уровне.
Дрожжи ScPro1 и SCB1 повысили соответственно в 2,9 и 3,1 раза уровень экспрессии гена, кодирующего противовоспалительный интерлейкин IL-10, при дозах 100 мкг. Комбинация ScPro1 + SCB1 (столбец № 7) повысила в 2,7 раза данный уровень экспрессии (фиг.14).
Дрожжи ScPro1 и SCB1 повысили соответственно в 1,5 и 1,6 раза уровень экспрессии гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα, при дозах 100 мкг. Комбинация ScPro1 + SCB1 (столбец № 7) повысила в 1,7 раза данный уровень экспрессии (фиг.15).
ПРИМЕР 5. Исследование влияния дрожжей ScPro1 и SCB1 на заселение дрожжами Candida albicans на уровне кишечника в случае химически индуцированного воспаления в модели с мышью
Целью исследования является определение эффектов введения дрожжей ScPro1 и SCB1 пробиотического типа на заселение кишечника патогенными дрожжами Candida albicans и его эффект потенцирования воспаления в случае химически индуцированного колита в модели с мышью.
Испытуемые дрожжи приняты в сухой быстрорастворимой форме.
Экспериментальные условия
Мыши-самки линии Balb/C имели возраст от 4 до 6 недель. Со дня J0 до дня J14 животные получали DSS (Dextran Sodium Sulfate (сульфат декстраннатрия) с концентрацией 1,5% в питьевой воде для химического индуцирования воспаления.
Было осуществлено три опыта.
7
7
В первом опыте со дня J5 мышам через канюлю вводили 5·10 клеток дрожжей ScPro1 в 200 мкл PBS (буферный фосфатный раствор). Данную процедуру повторяли ежедневно в течение 19 дней. В день J0 мышам через канюлю вводили 5·10 клеток дрожжей штамма C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS.
7
7
Во втором опыте в день J0 мышам через канюлю вводили 5·10 дрожжевых клеток штамма C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS. Через 4 дня части мышей через желудочный зонд вводили по 5·10 клеток дрожжей ScPro1 в 200 мкл PBS. Данную процедуру повторяли ежедневно в течение 14 дней.
7
7
В третьем опыте в день J0 мышам через канюлю вводили 5·10 клеток дрожжей штамма C. albicans SC5314 в 200 мкл PBS. Через час части мышей через желудочный зонд вводили по 5·10 клеток дрожжей ScPro1 в 200 мкл PBS. Данную процедуру повторяли ежедневно в течение 14 дней.
Животных (участвовавших в опытах 1, 2 и 3) ежедневно контролировали по следующим показателям:
- консистенция испражнений, анальное кровотечение, масса тела (клинический показатель);
- ретрокультивирование 1 мг испражнений, гомогенизированных в 1 мл PBS, 10 мкл которого засевали на среду Candi-select; после культивирования в течение 24 ч при 37°C подсчитывали КОЕ C. albicans (окрашенных в синий цвет) и S. cerevisiae (окрашенных в зеленый цвет);
- животных забивали по окончании испытания. Сразу отбирали кровь пункцией в сердце, декантировали при комнатной температуре, сыворотку отделяли центрифугированием и хранили при -80°C. Отбирали толстую кишку и делили на 4 части, из которых 3 замораживали, а 1 помещали в фиксатор (PFA, 4%) для гистологического исследования.
Результаты
Как можно видеть на фиг.3, в первом опыте (испытание на профилактическое действие) в данной модели химически индуцированного колита наблюдается, что введение DSS в значительной степени увеличивает заселение слизистых оболочек кишечника дрожжами C. albicans, начиная с дня J4 (DSS + Ca). Представляет большой интерес, что введение пробиотических дрожжей ScPro1 в течение 19 дней в значительной степени уменьшает заселение дрожжами C. albicans, индуцированное посредством DSS.
Как видно из фиг.4, во втором опыте (испытание на терапевтическое действие) наблюдается, что введение пробиотических дрожжей ScPro1 или SCB1 уменьшает заселение, индуцированное посредством DSS. Кроме того, действие дрожжей ScPro1 заметно даже после прекращения обработки посредством DSS в день J14.
Выводы
Из изложенного следует, что введение дрожжей ScPro1 или дрожжей SCB1 в значительной степени уменьшает заселение дрожжами C. albicans, причем как в условиях профилактики, так и в условиях терапии. Следует заметить, что такое защитное действие продолжается даже после прекращения терапии.
ПРИМЕР 6. Исследование ингибирующего действия дрожжей ScPro1 или SCB1 или их производных на способность к адгезии и инвазии патогенных штаммов E. coli, выделенных из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона
Влияние активных дрожжей ScPro1, SCB1 и их производных было исследовано в отношении их ингибирующего действия на способность к адгезии и инвазии патогенных штаммов E. coli, выделенных из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона.
Штаммы E. coli, сокращенно называемые AIEC от Adherent-Invasive E. coli и выделенные из биопсийных материалов тонкого кишечника больных, страдающих болезнью Крона (MC), способны прикрепляться и захватывать эпителиальные клетки кишечника.
Штамм E. coli LF82, выделенный из хронически поврежденного участка тонкого кишечника у больного, страдающего болезнью Крона, обладает всеми характеристиками инвазивного бактериального патогена. Характеристика фенотипа "адгезия-инвазия" штамма LF82 и отсутствие генетических определителей инвазии, уже описанных у E. coli, Shigella и Salmonella, привело к детерминированию существования новой патогенной группы E. coli, которая может быть связана с болезнью Крона и обозначена AIEC. После фагоцитоза макрофагами мыши или человека штамм AIEC LF82 выживает и размножается в широкой вакуоли, при этом сохраняя целостность клетки-хозяина. В ответ на инфекцию макрофаги секретируют значительное количество TNFα. Степень распространения штаммов AIEC на уровне повреждений тонкого кишечника больных, страдающих MC, равна 36,4%.
Процесс адгезии бактерии на клетках эукариотов является результатом специфического взаимодействия между лигандом, присутствующим на поверхности бактерии и называемым адгезином, и рецептором протеиновой, гликопротеиновой или гликолипидной природы, экспрессируемым на поверхности эпителиальной клетки-хозяина. Касательно бактерий было доказано, что адгезин FimH пили типа 1 вовлечен в адгезию бактерий AIEC на эпителиальных клетках кишечника. Бактериальный адгезин FimH распознает энтероцитарный рецептор CEACAM6 (называемый также CD66c или NCA), представляющий собой гликопротеин, богатый остатками маннозы и аномально сверхэкспрессируемый на уровне тонкого кишечника у 90% больных, страдающих MC.
Экспериментальные условия
В качестве штамма-прототипа был использован штамм AIEC LF82, отличающийся своей способностью к адгезии и инвазии на эпителиальных клетках кишечника в культуре.
Данное исследование было проведено также с 10 штаммами AIEC, выделенными у больных, страдающих MC, для подтверждения результатов, полученных со штаммом AIEC LF82.
Штамм E. coli DAEC (Diffuse Adherent Escherichia Coli) C1845, который прикрепляется к эпителиальным клеткам по механизму, не зависящему от маннозы (адгезины Afa/Dr), был использован в качестве негативной контрольной пробы.
Испытания на агглютинацию
С активными дрожжами ScPro1 и SCB1 были осуществлены испытания на количественную агглютинацию как в присутствии бактерий AIEC, так и в присутствии экстрактов очищенных пили типа 1, полученных исходя из штамма AIEC LF82 согласно методике, описанной Boudeau и соавт. (2001, Mol. Microbiol. 39:1272-84). Индекс агглютинации определяли по фиксированной концентрации дрожжей и переменной концентрации бактерий или очищенных пили типа 1.
В случае фракций дрожжей маннопротеинового типа, для которых не наблюдается агглютинация, определение способности связывания пили типа 1 осуществляли способом ELISA.
2
2
Такие испытания традиционно осуществляют в микропланшетах. Фракции дрожжей фиксируют на микропланшете. Различные разведения очищенных пили типа 1 приводят в контакт с фракциями дрожжей. После промывок пили типа 1 открывают посредством антител анти-пили типа 1, полученных от кролика (Boudeau и соавт., 2001). После промывки используют вторичные антитела, связанные с пероксидазой. Количественное определение осуществляют с помощью субстрата пероксидазы (HO) и хромогена (тетраметилбензидина) путем измерения оптической плотности на микропланшетном фотометре при 450 нм.
Испытания на ингибирование взаимодействия бактерий AIEC с рецептором CEACAM6, экспрессируемым на поверхности эпителиальных клеток кишечника, дрожжами ScPro1 или SCB1
Использованные клетки
2
2
620
620
2
5
Для испытания на ингибирование in vitro (предварительная и совместная инкубация) были взяты недифференцированные эпителиальные клетки кишечника T84, в значительной степени экспрессирующие рецептор CEACAM6. Клетки T84 культивировали в атмосфере с 5% CO при 37°C в щелочной среде DMEM (среда Игла в модификации Дульбекко), дополненной 50% Ham-F12 (Life Technology) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, декомплементированной при нагревании. К данной среде прибавляли 1% аминокислот, не являющихся незаменимыми (Life Technology), 1% глутамина (Life Technology), 200 ед./л пенициллина, 50 мг/л стрептомицина, 0,25 мг/л амфотерицина B и 1% смеси витамин X-100 для среды MEM (Minimum Essential Medium) (Life Technology). Клетки засевали из расчета 4·10 клеток на лунку в 1 мл и инкубировали в течение 48 ч при 37°C в атмосфере с 5% CO. Затем слой клеток T84 промывали раствором PBS и далее в каждую из лунок прибавляли 1 мл инфицируемой среды (DMEM/F12 + 10% SVF). Бактериальную суспензию в PBS с оптической плотностью DO, равной 0,1, готовили исходя из штамма AIEC LF82, культивированного в течение ночи при 37°C в бульоне Луриа-Бертани (LB). Клетки T84 инфицировали мультиплетным источником инфекции (MOI) из расчета 10 бактерий на 1 клетку, прибавляя 25 мкл бактериальной суспензии с оптической плотностью DO, равной 0,1, к инфицируемой среде. Планшет на 24 лунки инкубировали в течение 3 ч при 37°C в атмосфере, обогащенной CO. Определение остаточной адгезии и остаточной инвазии бактерий осуществляли соответственно описанному далее.
5
Осуществляли опыт с клетками CHO-K1, не экспрессирующими CEACAM6, и такими же генетически модифицированными клетками, стабильно экспрессирующими CEACAM6 (CHO-K1/CEACAM6). Клетки CHO-K1 культивировали в среде DMEM/F12, содержавшей 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% L-глутамина, 200 ед./л пенициллина, 50 мг/л стрептомицина и 0,25 мг/л амфотерицина B. Клетки CHO-K1 культивировали в среде DMEM/F12, содержавшей 5% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% L-глутамина и 600 мкг/л гигромицина. Клетки засевали в 24-луночный планшет из расчета 2·10 клеток на лунку. После инкубации в течение 7-8 ч при 37°C среду заменяли новой культуральной средой, дополненной 5 мкМ бутирата натрия, для индуцирования экспрессии CEACAM6. Для контролирования экспрессии белка CEACAM6 трансфицированными клетками осуществляли вестерн-блоттинг.
6
После инкубации в течение 20-24 ч при 37°C клетки инкубировали с возрастающими концентрациями штамма дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме в течение 1 ч (опыт предварительной инкубации), затем их инфицировали посредством MOI 20 (4·10 бактерий на лунку) для соблюдения соотношения "бактерии/дрожжи", использованного ранее при проведении испытаний с клетками T84. После инкубации в течение 3 ч при 37°C прикрепленные бактерии подсчитывали в отсутствии или в присутствии дрожжей соответственно описанному далее.
В другом опыте использовали операционный материал, полученный от больных. Энтероциты, полученные из биопсийных материалов тонкого кишечника 3 больных, страдающих болезнью Крона, промывали раствором PBS и затем предварительно инкубировали в пробирке Эппендорфа вместимостью 2 мл в 1 мл среды DMEM, содержавшей 20% эмбриональной телячьей сыворотки, в присутствии 0, 1,25, 2,5 или 5 мг/мл штамма дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме. Содержимое пробирки перемешивали вращением в течение 15 мин при 37°C, затем энтероциты инфицировали в присутствии дрожжей 50 мкл культуры в среде LB в течение ночи штаммом AIEC LF82. Далее осуществляли инкубацию в течение 3 ч при перемешивании. Энтероциты промывали 2 раза раствором PBS, затем наносили между предметной пластиной и покровным стеклом и наблюдали с помощью фазоконтрастной микроскопии. Подсчеты бактерий, прикрепленных к щеточной каемке энтероцитов, осуществляли в отсутствии или в присутствии дрожжей. Опыт осуществляли также с не имеющим пили мутантом LF82-delta fimH для определения базального уровня адгезии бактерий AIEC, не распознающих пили типа 1 рецепторами CEACAM6. Испытания на ингибирование адгезии были проведены также в присутствии антитела анти-CEACAM6.
Методика анализа для определения остаточной адгезии и остаточной инвазии бактерий на эпителиальных клетках кишечника T84
Клеточный слой промывали раствором PBS 4 раза по 1 мл, затем клетки подвергали лизису путем инкубации в течение 5 мин при комнатной температуре с 500 мкл 1%-го раствора Triton X-100 в дистиллированной воде. Лизаты разбавляли и затем наносили на агар LB-Agar для определения числа КОЕ, соответствующего числу прикрепленных бактерий.
Для подсчета инвазивных бактерий клеточный слой промывали раствором PBS через 3 ч после инфицирования, затем в течение 1 ч инкубировали 1 мл инфицированной среды, содержавшей 100 мкг/мл гентамицина для уничтожения внеклеточных бактерий. Инвазивные бактерии подсчитывали после лизиса клеток, последовательных разведений и нанесения на агар LB-agar.
Уровни адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 анализировали по сравнению с клетками, инфицированными штаммом AIEC LF82 и не подвергавшимися какой-либо обработке дрожжами или производными дрожжей.
Все результаты выражены соответственно соотношению R:
R = число прикрепленных или инвазивных бактерий в присутствии дрожжей ScPro1/число прикрепленных или инвазивных бактерий в отсутствии обработки.
Методика 1. Модель совместной инкубации
Клетки T84 и суспензию бактерий получали соответственно методике, описанной ранее в испытании на адгезию и инвазию. Дрожжи или производные дрожжей суспендировали в PBS с определенной концентрацией и 25 мкл такой суспензии прибавляли к инфицируемой среде клеток T84 (1 мл). Затем клетки сразу инфицировали бактериальным штаммом MOI 10. Смесь "суспензия бактерий/дрожжи, инкубированные в присутствии клеток" гомогенизировали, а затем 24-луночный планшет инкубировали в течение 3 ч при 37°C. Уровни адгезии и инвазии бактериального штамма определяли соответственно описанному ранее и при этом в отсутствии и в присутствии дрожжей или экстрактов дрожжей при инфицировании. Соотношение между уровнем бактериальной адгезии или инвазии в отсутствии дрожжей (100%) и уровнем бактериальной адгезии или инвазии в присутствии дрожжей представляет собой уровень остаточной адгезии или остаточной инвазии бактерий.
Методика 2. Модель преварительной инкубации
Клетки T84 и суспензия бактерий получали соответственно методике, описанной ранее в испытании на адгезию и инвазию. Суспензию дрожжей или производных дрожжей прибавляли к инфицируемой среде (1 мл) клеток T84 в объеме 25 мкл. Суспензию дрожжей гомогенизировали, а затем инкубировали в течение 1 ч при 37°C в 24-луночном планшете для культивирования клеток. После данной инкубации клетки T84 инфицировали бактериальным штаммом MOI 10 в присутствии дрожжей в течение 3 ч при 37°C. Подсчет прикрепленных и инвазивных бактерий осуществляли соответственно описанному ранее в присутствии или в отсутствии дрожжей для определения процентной доли остаточной адгезии или остаточной инвазии, при этом 100% означает адгезию или инвазию в отсутствии дрожжей.
- Верификация экспрессии CEACAM6
Иммуноцитохимическую маркировку осуществляли для каждой партии культивированных клеток для проверки наличия и оценивания количества экспрессированного CEACAM6. Клетки культивировали на стерильных стеклянных пластинах. Клеточный слой промывали раствором PBS, затем фиксировали 3%-м параформальдегидом при pH = 7,4 в течение 10 минут при комнатной температуре. Клетки инкубировали с моноклональным антителом анти-CEACAM6 (клон 9A7, Genovac), разбавленным в соотношении 1/100 смесью "PBS-5% лошадиной сыворотки", во влажной атмосфере в течение часа. После промывки раствором PBS клетки приводили в контакт с вторичным антителом, связанным с флуорохромом (анти-мышиный FITC, Zymed) и разбавленным в соотношении 1/500 смесью "PBS-5% лошадиной сыворотки", в течение 1 часа во влажной атмосфере. Стеклянные пластины фиксировали на предметном стекле Moewiol и затем визуализировали с помощью флюоресцентного микроскопа.
- Проверка отсутствия клеточной цитотоксичности
Отсутствие клеточной цитотоксичности, индуцированной различными дозами дрожжей, проверяли количественным анализом лактатдегидрогеназы (LDH) в инкубационной среде "дрожжи/клетки" или "FDL/клетки" (Glasser и соавт., 2001).
Результаты
Испытания на агглютинацию с LF82
Титры агглютинации, полученные с LF82 в присутствии дрожжей ScPro1 или SCB1 в культуре (= свежем виде) или в сухом виде (высушивание до сухой быстрорастворимой или лиофилизованной формы), обобщены в приведенной далее таблице, в которой представлены результаты от 3 до 5 независимых опытов.
Титр агглютинации
Дрожжи
Форма
Среднее значение
Минимальное значение титра
Максимальное значение титра
ScPro1
Свежая культура
1/7
1/3
1/12
ScPro1
Сухая быстрорастворимая форма
1/58
1/20
1/96
ScPro1
Сухая лиофилизованная форма
1/43
1/24
1/64
SCB1
Свежая культура
1/28
1/12
1/40
SCB1
Сухая быстрорастворимая форма
1/16
1/12
1/20
SCB1
Сухая лиофилизованная форма
1/19
1/16
1/24
Были получены достоверно хорошие результаты агглютинации с LF82 в случае сухих дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме.
Для данных дрожжей была доказана значимость благоприятного воздействия способа и, в частности, способа сушки на их потенциал агглютинации.
Испытания на агглютинацию с очищенными пили
Титры агглютинации, полученные с очищенными пили в присутствии дрожжей ScPro1 в культуре (= свежем виде) или в сухой быстрорастворимой форме и дрожжей SCB1 (в сухой форме) обобщены в приведенной далее таблице.
Титр агглютинации
Дрожжи
Форма
Опыт 1
Опыт 2
Опыт 3
ScPro1
Свежие прессованные дрожжи
1/300
1/300
1/400
ScPro1
Сухая быстрорастворимая форма
1/600
1/600
1/300
SCB1
Сухая лиофилизованная форма
1/300
1/300
1/200
Данное испытание подтверждает, что для агглютинации в значительной степени необходимо взаимодействие "пили-дрожжи". Учитывая, что пили необходимы для распознавания маннозных структур, именно последние распознаются у дрожжей и принимают участие в наблюдаемом феномене агглютинации. Лучшие результаты получены в случае дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме.
Результаты испытаний по определению способности связывания пили типа 1 с маннопротеиновыми фракциями дрожжей ScPro1
На фиг.18 ясно показано, что очищенные пили типа 1, полученные из штамма AIEC LF82, специфически фиксируются на маннопротеинах дрожжей. Следует заметить, что способ получения (термический или ферментативный) таких маннопротеинов (EL05 и EL06) оказывает незначительное влияние на константу сродства к пили.
Результаты по ингибированию взаимодействия бактерий AIEC с рецептором CEACAM6, экспрессируемым на поверхности эпителиальных клеток кишечника
1/ Распределение образцов дрожжей или производных дрожжей по способности ингибирования адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника T84 в модели совместной инкубации.
7
7
7
Были исследованы дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (3,09·10 клетка/мг), ScPro1 в сухой форме (1,86·10 клетка/мг) и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме (5,83·10 клетка/мг), а также маннопротеины дрожжей EL05 (в сухой форме).

7
В качестве сравнительного образца прибавляли дрожжи Ultra-levure (Biocodex, 2,054·10 клетка/мг).
Сравнение ингибирующей способности дрожжей с одинаковым количеством дрожжей в модели совместной инкубации
8
После промывки раствором PBS и центрифугирования в течение 15 мин при 7500 об/мин образцы дрожжей снова суспендировали в PBS с концентрацией 4·10 клетка/мл. Разведение дрожжей в PBS осуществляли с соотношением 1/2, 1/10, 1/20 и 1/100.
Было осуществлено три независимых опыта согласно методике 1. Результаты на фиг.19A и 19B (остаточная адгезия и остаточная инвазия) представлены в виде средних значений уровней остаточной адгезии и остаточной инвазии и интервалов ошибки, соответствующей стандартной ошибке среднего значения.
На фиг.19A и 19B показаны следующие полученные результаты:
адгезия:
5
6
- дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме и ScPro1 в сухой форме сильно ингибируют адгезию штамма LF82 на клетках T84 в зависимости от дозы. Ингибирование дрожжами ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме в количестве 5·10 клетка/мл является более значительным по сравнению с дрожжами ScPro1 в сухой форме в количестве 5·10 клетка/мл;
7
- дрожжи SCB1 в сухой быстрорастворимой форме ингибируют адгезию менее сильно, чем 2 других образца дрожжей: остаточная адгезия при дозе 1·10 клетка/мл составляет 45,7% по сравнению с 18,7 и 8% остаточной адгезии для штаммов ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме и ScPro1 в сухой форме соответственно;
инвазия:
5
7
- дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме значительно ингибируют инвазию клеток T84 штаммом AIEC LF82 при дозе 1·10 клетка/мл. При дозе 1·10 клетка/мл уровень остаточной инвазии составляет 16,3%;
6
6
- для дрожжей ScPro1 в сухой форме и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме ингибирующее действие является более медленным при дозе 1·10 и 5·10 клетка/мл соответственно.
Испытания на ингибирование маннопротеинами EL05 в модели совместной инкубации
Маннопротеины дрожжей EL05 суспендировали в PBS с концентрацией 160 мг/мл. Осуществляли последовательные разведения в PBS с соотношением 1/2, 1/4, 1/8 и 1/40 и прибавляли 25 мкл каждой суспензии маннопротеинов к инфицируемой среде согласно методике 1.
Было осуществлено три независимых опыта. Результаты, показанные на фиг.20A и 20B (остаточная адгезия и остаточная инвазия), представлены в виде средних значений уровней остаточной адгезии и интервалов ошибки, соответствующей стандартной ошибке среднего значения.
На данных фигурах показано, что маннопротеины дрожжей EL05 обладают способностью ингибирования адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 на клетках T84 в зависимости от дозы в модели совместной инкубации.
2/ Распределение образцов дрожжей или производных дрожжей по способности ингибирования адгезии и инвазии штамма AIEC LF82 на эпителиальных клетках кишечника T84 в модели предварительной инкубации.
В модели предварительной инкубации были использованы такие же образцы дрожжей и фракций, что и в модели совместной инкубации.
Сравнение ингибирующей способности дрожжей с одинаковым количеством дрожжей в модели предварительной инкубации
8
После промывки раствором PBS и центрифугирования в течение 15 мин при 7500 об/мин образцы дрожжей снова суспендировали в PBS с концентрацией 4·10 клетка/мл. Разведение дрожжей в PBS осуществляли с соотношением 1/2, 1/10, 1/20 и 1/100. Было осуществлено три независимых опыта согласно методике 2.
Результаты, показанные на фиг.21A и 21B (остаточная адгезия и остаточная инвазия), представлены в виде средних значений уровней остаточной адгезии и остаточной инвазии и интервалов ошибки, соответствующей стандартной ошибке среднего значения.
6
Предварительная обработка клеток T84 дрожжами обеспечивает значительное ингибирование адгезии штамма LF82 при дозе 5·10 клетка/мл штамма ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме и ScPro1 в сухой форме. Тем не менее, в случае дрожжей SCB1 в сухой быстрорастворимой форме с такой дозой какого-либо значительного ингибирования не было замечено.
5
Предварительная обработка клеток T84 дрожжами обеспечивает ингибирование инвазии штамма LF82 при дозе 1·10 клетка/мл штамма дрожжей ScPro1 в сухой форме.
5
При дозе 5·10 клетка/мл 3 образца дрожжей индуцируют значительное уменьшение инвазии штамма LF82.
Испытания на ингибирование маннопротеинами EL05 в модели предварительной инкубации
Маннопротеины дрожжей EL05 суспендировали в PBS с концентрацией 160 мг/мл. Осуществляли последовательные разведения в PBS с соотношением 1/2, 1/4, 1/8 и 1/40 и прибавляли 25 мкл каждой суспензии маннопротеинов к инфицируемой среде согласно методике 2. Было осуществлено три независимых опыта. Результаты, показанные на фиг.22A и 22B (остаточная адгезия и остаточная инвазия), представлены в виде средних значений уровней остаточной адгезии и интервалов ошибки, соответствующей стандартной ошибке среднего значения.
Таким образом, маннопротеины EL05 позволяют ингибировать в зависимости от дозы адгезию и инвазию штамма LF82 при концентрации 2 мг/мл.
Результаты испытаний на ингибирование дрожжами адгезии штамма AIEC LF82 в случае CHO-K1, экспрессирующих или не экспрессирующих рецептор CEACAM6, в модели предварительной инкубации
Было осуществлено пять независимых опытов согласно упомянутой ранее методике 2.
На фиг.23 показано, что наблюдается значительное ингибирование адгезии штамма AIEC LF82 на клетках CHO/CEACAM6 при предварительной инкубации с 25 мкг/мл дрожжей. В случае таких клеток замечено ингибирующее действие в зависимости от дозы.
Адгезия штамма AIEC LF82 также наблюдается на клетках CHO-K1, что несомненно обусловлено экспрессией маннозосодержащих белков, экспрессируемых на поверхности таких клеток. Однако, предварительная инкубация штамма LF82 с дрожжами ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме не обеспечивает ингибирование в значительной степени адгезии на нетрансфицированных клетках.
Таким образом, данное обстоятельство свидетельствует, что дрожжи воздействуют на адгезию штамма LF82 с рецепторами CEACAM6, экспрессируемыми клетками.
Результаты ингибирования адгезии штамма AIEC LF82 на уровне щеточной каемки энтероцитов больных, страдающих болезнью Крона, в модели предварительной инкубации
На фиг.24 показаны средние индексы адгезии, полученные в ходе эксперимента и рассчитанные в присутствии или в отсутствии возрастающих концентраций дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (мг/мл) или в присутствии антитела анти-CEACAM6. По результатам, представленным на данной фигуре, можно констатировать зависящее от дозы значительное уменьшение адгезии штамма AIEC LF82 к щеточной каемке энтероцитов больных в случае присутствия штамма дрожжей ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме. При дозе дрожжей 5 мг/мл остаточная адгезия штамма AIEC LF82 подобна адгезии, наблюдаемой в присутствии антитела анти-CEACAM6, или адгезии, наблюдаемой в случае мутанта, лишенного пили типа 1.
Выводы
Из данного исследования вытекает, что:
- дрожжи ScPro1 и SCB1, в частности, в сухой быстрорастворимой форме проявляют большую способность агглютинации штамма LF82;
- дрожжи ScPro1 и SCB1 способны ингибировать in vitro адгезию и инвазию эпителиальных клеток человека (T84, энтероциты из биопсийных материалов тонкого кишечника) и клеток CHO, экспрессирующих рецептор CEACAM6 человека, в случае бактерий E. coli в зависимости от дозы;
- маннопротеины способны ингибировать in vitro адгезию и инвазию эпителиальных клеток человека (T84, энтероциты из биопсийных материалов тонкого кишечника) и клеток CHO, экспрессирующих рецептор CEACAM6 человека, в случае бактерий E. coli в зависимости от дозы;
- in vitro дрожжи ScPro1 способны в больших концентрациях частично защищать приблизительно 80% клеток, инфицированных бактериями.
ПРИМЕР 7. Исследование регуляторной роли дрожжей ScPro1, SCB1 и производных дрожжей в экспрессии генов, кодирующих IL-10 и PPARα, в эпителиальных клетках кишечника человека, культивируемых in vitro
Был исследован пробиотический характер дрожжей ScPro1 и SCB1, вводимых по отдельности или в комбинации, и/или фракций дрожжей и их способность ингибировать возникновение воспаления за счет взаимодействия с некоторыми кишечными рецепторами.
Испытания in vitro
В частности, было исследовано действие дрожжей и производных дрожжей по настоящему изобретению на различные рецепторы эпителиальных клетках кишечника путем анализа in vitro двух линий клеток рака толстой кишки CaCo-2 (ATCC HTB-37) и HT-29 (ATCC HTB-38).
С этой целью осуществляли транскрипционный анализ путем экстракции РНК по приведенной далее методике.
Клетки подвергали лизису в тризоле. Затем с растворимой фракцией осуществляли стадию с дезоксирибонуклеазой, прибавляя 200 мкл раствора, содержавшего 10 единиц ингибитора рибонуклеазы и 10 единиц дезоксирибонуклеазы.
10 мкг РНК были ретротранскрибированы в присутствии 200 единиц инверсной транскриптазы, дитиотреитола, олиго-dT15 и дезоксирибонуклеотидов.
Амплифицировали кДНК по известной методике конкурентной полимеразной цепной реакции (по-английски PCR, Polymerase Chain Reaction), используя специфические смысловые и антисмысловые затравки, в частности, гены, такие, как IL-10 и PPARα.
После 40 циклов амплификации, осуществленных в присутствии 1,25 единицы Ampli Taq Gold 5000, и разделения различных образцов на 3%-м геле агарозы интенсивность полос определяли с помощью диссектора.
5
Результаты выражены как число молекул иРНК на 10 молекул β-актина в качестве внутреннего стандарта.
Результаты, приведенные на фиг.11, представляют собой значения экспрессии иРНК через час (индекс A) и через 3 часа (индекс B) после приведения в контакт дрожжей или их производных с эпителиальными клетками кишечника, экспрессирующими ген, кодирующий противовоспалительный белок IL-10.
На фиг.11 цифрами обозначены испытанные дрожжи/производные дрожжей, которые показали уровень быстрой экспрессии, превышающий 4-кратный сравнительный сигнал:
3 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae;
5 означает дрожжи ScPro1 по настоящему изобретению;
6 означает экстракт дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
12 означает фракцию РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Данные результаты хорошо демонстрируют, что дрожжи и производные дрожжей Saccharomyces cerevisiae по настоящему изобретению индуцируют быструю экспрессию, уже через час, гена, кодирующего противовоспалительный цитокин IL-10.
Действительно, по сравнению с необработанным контрольным образцом экспрессия иРНК в случае дрожжей и их производных по настоящему изобретению превышает 4-кратное значение по оси ординат, которое уже соответствует превосходному уровню быстрой экспрессии.
Другие результаты представлены на фиг.13. На данной фигуре показано изменение в зависимости от количества внесенных производных дрожжей экспрессии иРНК гена, кодирующего белок IL-10.
Показанные на фиг.13 значения экспрессии были измерены через час (1 ч) и через три часа (3 ч). Варианты экспрессии в случае дрожжей и экстрактов дрожжей Saccharomyces cerevisiae по настоящему изобретению обозначены цифрами:
5 означает дрожжи ScPro1 по настоящему изобретению;
6 означает экстракт дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
8 означает париетальный β-глюкан Saccharomyces cerevisiae;
9 означает париетальный маннопротеин дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
11 означает фракцию ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
12 означает фракцию РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Экспрессию измеряли при различных концентрациях дрожжей и/или их производных.
Чем темнее цвет столбца на фиг.13, тем больше концентрация дрожжей/производного.
Результаты, представленные на фиг.13, показывают, что экстракты дрожжей Saccharomyces cerevisiae по настоящему изобретению индуцируют быструю экспрессию иРНК противовоспалительного цитокина (IL-10).
Результаты, приведенные на фиг.12, представляют собой значения экспрессии иРНК через час (индекс A) и через 3 часа (индекс B) после приведения в контакт дрожжей или их производных с эпителиальными клетками кишечника, экспрессирующими ген, кодирующий нуклеарный рецептор PPARα.
На фиг.12 цифрами обозначены испытанные дрожжи/производные дрожжей, которые показали уровень медленной экспрессии, превышающий 3-кратный сравнительный сигнал:
1 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae ScPro1 по настоящему изобретению в сухой активной форме;
4 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae;
5 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae ScPro1 по настоящему изобретению в сухой активной форме;
8 означает фракцию клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
9 означает фракцию париетальных β-глюканов дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
10 означает фракцию париетальных маннопротеинов дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
11 означает фракцию ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
12 означает фракцию РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Данные результаты хорошо демонстрируют, что дрожжи и производные дрожжей Saccharomyces cerevisiae по настоящему изобретению индуцируют медленную экспрессию, через три часа, гена, кодирующего нуклеарный рецептор PPARα.
Действительно, экспрессия иРНК в случае дрожжей и их производных по настоящему изобретению превышает 3-кратное значение по оси ординат, которое уже соответствует превосходному уровню медленной экспрессии.
ПРИМЕР 8. Исследование ex vivo регуляторной роли дрожжей и производных дрожжей в экспрессии генов, кодирующих IL-10 и TNF-α, в эпителиальных клетках кишечника человека выделенных из биопсийных материалов больных, страдающих болезнью Крона
Влияние дрожжей и/или производных дрожжей на секрецию цитокинов IL-10 (противовоспалительного) и TNF-α (провоспалительного) было исследовано ex vivo на биопсийных материалах больных, страдающих или не страдающих болезнью Крона.
2
Биопсийные материалы кишечника отбирали у больных, страдавших или не страдавших болезнью Крона, затем помещали на 24 ч в среду HBSS-CMF, дополненную пенициллином и стрептомицином, при 37°C в атмосфере, содержавшей 5% CO. После промывки биопсийные материалы приводили в контакт с дрожжами или производными дрожжей в течение 4 часов в среде RPMI 1640. Надосадочную жидкость отделяли для анализа способом ELISA. Затем биопсийные материалы подвергали лизису с целью экстракции как иРНК, так и общего белка.
Подтверждение секреции цитокинов осуществляли иммунологическим анализом надосадочных жидкостей культур клеток и белковых экстрактов способом ELISA. Белки денатурировали в течение 5 минут при 95°C в осадительном буферном растворе (об./об.; 75 мМ Tris, pH = 6,8; 5% глицерина; 0,25% бромфенолового синего; 2% SDS, 5% β-меркаптоэтанола), наносили (50 мкг) и разделяли на 10%-м геле полиакриламида. После разделения белки переносили на мембрану PVDF (Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech, Орсе, Франция) способом полусухого электропереноса (Hoefer TE77, Amersham Pharmacia Biotech, Орсе, Франция) в течение 1 часа при 16 В. PPARα и IL-10 выделяли с использованием поликлональных антисывороток кролика, анти-PPARα человека и анти-IL-10 человека, разбавленных в соотношении 1/500, и количественно определяли по хемилюминесценции (E.C.L. Amersham Pharmacia Biotech, Орсе, Франция) на пленке Biomax-MR (Kodak) посредством программы Gel Analyst (CLARA VISION, Париж, Франция).
На фиг.16 и 17 показаны результаты, полученные для IL-10 и TNF-α соответственно. По оси ординат отложено количество цитокинов, измеренное в пг/мл. Каждая точка соответствует результату измерения, полученному с биопсийным материалом больного, страдающего болезнью Крона в стадии обострения (кружок черного цвета), больного, страдающего болезнью Крона в стадии ремиссии (кружок серого цвета), и здоровых людей (кружок белого цвета). Прямоугольник соответствует среднему значению измерений.
На данных фигурах:
- 1 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae ScPro1 по настоящему изобретению в сухой активной форме;
- 3 означает дрожжи Saccharomyces cerevisiae;
- 8 означает фракцию клеточных стенок дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
- 11 означает фракцию ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae;
- 12 означает фракцию РНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
На фиг.16 показано, что дрожжи ScPro1 по настоящему изобретению увеличивают в 2 раза секрецию противовоспалительного цитокина IL-10 эпителиальными клетками больных, страдающих болезнью Крона или находящихся в стадии ремиссии, по сравнению со здоровыми людьми и негативной контрольной пробой (-), соответствующей измерениям, выполненным в присутствии только физиологического раствора.
На фиг.17 показано, что дрожжи ScPro1 по настоящему изобретению не вызывают увеличение секреции провоспалительного цитокина TNF-α кишечными клетками, выделенными из биопсийных материалов больных, страдающих болезнью Крона или находящихся в стадии ремиссии. Ни дрожжи ScPro1, ни какие-либо другие испытуемые дрожжи или производные дрожжей не индуцируют какую-либо секрецию TNF-α.
ПРИМЕР 9. Исследование аналгетических свойств дрожжей и производных дрожжей в модели с крысами при колоректальном расширении
Опыт со здоровыми крысами
1/ Материалы и методы
В данном исследовании были использованы крысы-самцы линии Sprague Dawley (Charles River, Арбресль, Франция) с массой тела в интервале от 175 до 200 г. Крысы проходили акклиматизацию в условиях питомника в течение недели перед экспериментом. Животных содержали по пять особей в клетке со свободным доступом к воде и пище. Все испытания проводили согласно рекомендациям Committee for Research and Ethical Issues, входящего в International Association for the Study of Pain [6]. Для избежания или минимизации дискомфорта животных были предприняты меры предосторожности.
2/ Оценивание чувствительности толстой кишки
Болевую рецепцию животных оценивали, измеряя давление внутри толстой кишки, необходимое для вызывания поведенческого ответа. Такое давление создавали колоректальным расширением посредством раздувания баллона, введенного в толстую кишку. Поведенческий ответ характеризуется поднятием задней части тела животного и ясно наблюдаемым абдоминальным сокращением, соответствующим сильным сокращениям [7-9]. Крыс анестезировали летучим обезболивающим средством (2%-й изофлюран) и интраректально вводили баллон (методика согласно процедуре, описанной Bourdu [8]) как можно менее травматично на глубину 7 см от ануса. Катетер прикрепляли к основанию хвоста липкой лентой. Через 5 минут крыс помещали в середине коробки из плексигласа, и катетер присоединяли к электронному баростату (Distender Series IIRTM, G & J Electronics). Давление повышали непрерывно до отключения по болевому рефлексу или до достижения предельного значения давления, равного 80 мм рт. ст.
3/ Вводимые соединения
Дрожжи вводили через желудочный зонд один раз в день в течение 15 дней.
Для позитивного контроля за 30 мин до колоректального расширения внутрибрюшинно вводили морфий с дозой 1 мг/кг.
В исследовании использовали 8 групп крыс:
- 10 контрольных крыс, получавших PBS;
- 10 крыс, получавших ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (100 мкг/день), (группа 1);
- 10 крыс, получавших ScPro1 в сухой форме (100 мкг/день), (группа 2);
- 10 крыс, получавших штамм SCB1 (100 мкг/день), (группа 3);
- 10 крыс, получавших штаммы ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (50 мкг/день) + SCB1 в сухой быстрорастворимой форме (50 мкг/день), (группа 4);
- 10 крыс, получавших 1 инъекцию морфия (1 мг/кг, за 30 мин до расширения) (группа 5).
4/ Результаты
На фиг.26 показано, что дрожжи ScPro1, с одной стороны, введенные в сухой быстрорастворимой форме отдельно (группа 1) или в комбинации со штаммом SCB1 (группа 4), а с другой стороны, введенные в сухой активной форме (группа 2), увеличивают порог восприятия боли, значительно уменьшая, таким образом, восприятие висцеральной боли по сравнению с крысами, которым ничего не вводили.
Приведенные далее результаты даны в мм рт. ст. по сравнению с контрольной группой:
- 74,5 ± 3,07 против 53,6 ± 3,9, p = 0,07 для штамма ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме - (группа 1);
- 66,5 ± 3,36 против 53,6 ± 3,9, p = 0,04 для комбинации штаммов ScPro1 и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме - (группа 4);
- 72 ± 2,59 против 53,6 ± 3,9, p < 0,01 для штамма ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме - (группа 2).
С другой стороны, такой эффект сравним с эффектом, вызываемым в группе 5 морфием, использованным с дозой 1 мг/кг, с болевым порогом 72 ± 2,59 мм рт. ст.
Штамм SCB1 в сухой быстрорастворимой форме также индуцирует аналгетический эффект у здоровых крыс - 70 ± 3,16 мм рт. ст., p = 0,026.
Опыт с крысами с повышенной висцеральной чувствительностью
1/ Материалы и методы
Были использованы крысы-самки линии Sprague Dawley (Charles River, Арбресль, Франция) с массой тела в интервале от 175 до 200 г. Крысы проходили акклиматизацию в условиях лаборатории в течение недели перед экспериментом. Животных содержали по пять особей в клетке со свободным доступом к воде и пище. Все испытания проводили согласно рекомендациям Committee for Research and Ethical Issues, входящего в International Association for the Study of Pain [6]. Были предприняты существенные меры предосторожности в отношении условий жизни для избежания или минимизации дискомфорта животных.
2/ Индуцирование повышенной чувствительности толстой кишки промыванием бутиратом
Для каждого промывания катетер (катетер Фогарти диаметром 2 мм) вводили в толстую кишку на глубину 7 см от ануса и вводили животным по 2 раза ежедневно в течение 3 дней по 1 мл раствора 200 мМ бутирата натрия с нейтральным значением pH (pH = 6,9). "Здоровым" животным вводили солевой раствор.
3/ Обработка животных дрожжами по настоящему изобретению
Было использовано 10 групп животных, обладавших повышенной висцеральной чувствительностью (n = 10 особей в группе). Подопытным животным вводили через желудочный зонд по 100 мкг дрожжей один раз в день в течение 15 дней. Контрольным животным вводили PBS согласно той же методике, что и ранее. Дрожжи суспендировали в растворе PBS. Инстилляции бутирата или солевых растворов начинали через 7 дней после первого введения через желудочный зонд в течение 3 дней. Повышенную чувствительность толстой кишки измеряли через 14 дней после начала обработки пероральным путем или через 7 дней после инстилляций в толстую кишку.
4/ Группы подопытных животных
В исследовании использовали семь групп крыс. Номера групп соответствуют фиг.26:
10 крыс, получавших PBS (контрольная группа);
10 крыс, получавших сухие дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (100 мкг/день) - (группа 1);
10 крыс, получавших сухие дрожжи ScPro1 в сухой активной форме (100 мкг/день) - (группа 2);
10 крыс, получавших дрожжи SCB1 в сухой быстрорастворимой форме (100 мкг/день) - (группа 3);
10 крыс, получавших ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме (50 мкг/день) и SCB1 в сухой быстрорастворимой форме (50 мкг/день) - (группа 4);
10 крыс, получавших морфий - (группа 5);
10 крыс, получавших фибраты - (группа 6).
5/ Результаты
Прежде всего можно отметить, что у контрольных крыс болевой порог в опытах с крысами с повышенной чувствительностью меньше болевого порога у здоровых крыс.
Дрожжи ScPro1 в сухой быстрорастворимой форме, вводимые по отдельности или в комбинации с дрожжами SCB1, оказывают в данной модели перспективное аналгетическое действие.
Получены следующие результаты:
Группы
мм рт. ст.
1
56,5 +/- 4,27; p = 0,03
4
59 +/- 4,33; p = 0,02
Дрожжи по настоящему изобретению позволяют восстанавливать уровень восприятия боли, сопоставимый с уровнем, наблюдаемым у здоровых крыс. Аналгетический эффект, индуцированный дрожжами, эквивалентен эффекту, вызываемому морфием.
На фиг.26 также показан значительный аналгетический эффект фенофибрата, который увеличивает в 2 раза порог восприятия боли у крыс с висцеральной повышенной чувствительностью (70 +/- 4,48, p = 0,001).
Данный результат подтверждает роль рецептора PPARα в модулировании висцеральной боли.