Влияние замены остатков Met на остаток Leu на каталитические свойства, окислительную и температурную стабильности оксидазы D-аминокислот дрожжей

УДК 577.15.1

ВЛИЯНИЕ ЗАМЕНЫ ОСТАТКОВ Met НА ОСТАТОК Leu НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ОКИСЛИТЕЛЬНУЮ И ТЕМПЕРАТУРНУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ ДРОЖЖЕЙ

Д.Л. Атрошенко1,2, И.В. Голубев1,2, С.С. Савин1,2, В.И. Тишков1,2,3*

Окислительная стабильность ферментов определяется в первую очередь остатками Cys и Met. В случае оксидазы D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO) методом направленного мутагенеза получены три мутеина с точечными заменами остатка Met на остаток Leu. Выбор положений для введения замены сделан на основе множественного выравнивания аминокислотных последовательностей DAAO из разных источников, а также анализа трехмерной структуры TvDAAO. Для полученных мутантов изучены каталитические свойства, а также температурная и окислительная стабильность. Во всех случаях замена привела к изменению у мутантных ферментов профиля субстратной специфичности. Наблюдается заметное увеличение констант Михаэлиса для небольших субстратов и уменьшению КМ для D-аминокислот с объемным боковым радикалом. Показано, что в результате одной из замен происходит повышение температурной стабильности TvDAAO в 2-3 раза по сравнению с ферментом дикого типа. Разработана методика определения стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода. Изучена окислительная стабильность фермента дикого типа и полученных мутантных TvDAAO. Установлено, что во всех случаях замена остатка Met на остаток Leu незначительно повлияла на окислительную стабильность фермента.

Ключевые слова: оксидаза D-аминокилот, Trigonopsis variabilis, направленный мутагенез, окислительная стабильность, каталитические свойства, температурная стабильность.

Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) относится к классу FAD-содержащих оксидоре-дуктаз и катализирует окислительное дезами-нирование D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты [1-4]. Этот фермент выполняет важные функции в живых организмах. Например, в микроорганизмах DAAO участвует в катаболизме экзогенных D-аминокислот [5]. В случае высших эукариот роль DAAO заключается в поддержании в клетке определенного уровня D-аминокислот, которые участвуют в регуляции самых разнообразных процессов (старение, функционирование нервной системы, секреция гормонов и т.д.) [6, 7]. Кроме того, фермент используется для решения различных задач биотехнологии. Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике нашли два фермента из дрожжей - Rhodotorula gracilis (RgDAAO) и Trigonopsis variabilis (TvDAAO). Второй фермент

используется чаще, поскольку среди известных оксидаз Э-аминокислот он обладает наилучшей температурной стабильностью и наиболее высокой активностью с цефалоспорином С (СРС) [1]. ТуЭААО используется в процессе получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК) -исходного соединения для производства полусинтетических цефалоспоринов разных поколений. Кроме того, ЭААО активно применяется в аналитической биотехнологии, хиральном синтезе, получении а-кетокислот [8-9] и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических и онкологических заболеваний [10-12].

Одним из главных ограничений при использовании ферментов в промышленности является их низкая операционная стабильность. Для ЭААО одним из процессов, определяющих ее операционную стабильность, является окисление амино-

кислотных остатков ферментов под действием пероксида водорода, который образуется в результате реакции, катализируемой этим ферментом [13-15].

Цель данной работы - изучение стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода и исследование влияния замен Met/Leu в положениях 104, 156 и 209 на каталитические свойства, а также температурную и химическую стабильность фермента.

Экспериментальная часть

Направленный мутагенез гена tvdaao. Для

проведения направленного мутагенеза в гене tvdaao применяли ПЦР, как описано ранее [16, 17]. В качестве матрицы использовали плазмиду pTvDAAO2.

Для введения мутации в ген tvdaao проводили ПЦР с использованием прямого праймера на начало (T7_For) и обратного праймера (T7_Rev) на конец гена, а также прямого (Mut_for) и обратного (Mut_rev) праймеров, несущих требуемые мутации в гене tvdaao (табл. 1).

Условия проведения ПЦР, обработка и клонирование полученных фрагментов аналогичны таковым, описанным в работах [16, 17]. Для каждого мутанта с чашек Петри были отобраны по три колонии и выделены плазмиды. Секвенирование показало, что все выделенные плазмиды содержат только требуемые нуклеотидные замены.

Культивирование штаммов-продуцентов E. coli и получение препаратов мутантных TvDAAO. Получение штаммов E. coli - продуцентов мутантных TvDAAO и фермента дикого типа, и их культивирование проводили, как описано в [16, 17]. Полученную биомассу собирали центрифугированием на центрифуге «Eppendorf 5804R» (6000 об/мин, 5 мин, +4°С). Полученный осадок клеток ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl (рН 8,0) в соотношении 1:4 (по массе) и хранили при -20°С.

Выделение и очистку мутантных TvDAAO и фермента дикого типа проводили согласно ранее разработанной методике [16, 17]. Чистоту полученных препаратов анализировали с помощью аналитического электрофореза в полиакриламид-ном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

Определение концентрации белков. Концентрацию активной TvDAAO определяли по концентрации окисленного FAD, измеряя поглощение при длине волны 455 нм на спектрофотометре «UV-1601PC» или «UV-1800PC» («Shimadzu»), используя коэффициент молярного поглощения 10 800 М-1 см- 1 [18].

Определение активности DAAO и определение кинетических параметров. Для определения активности TvDAAO использовали реакцию с участием второго фермента - перок-сидазы из корней хрена [19]. В качестве субстрата для TvDAAO использовали D-метионин, для пероксидазы из корней хрена - АБТС. Определение активности проводили по накоплению продукта окисления АБТС при длине волны 414 нм (е414 = 36 000 М-1см-1) на спектрофотометре «UV-1800PC» фирмы «Shimadzu».

Для определения величин максимальной скорости ферментативной реакции (^макс) и константы Михаэлиса (Км) концентрацию соответствующей D-аминокислоты варьировали в диапазоне от 0,3 до 7,0 Км, ориентируясь на значения Км для TvDAAO дикого типа. Активность TvDAAO при каждом значении концентрации D-аминокислоты измеряли не менее трех раз. Кинетические параметры ^макс и Км рассчитывали методом нелинейной регрессии с помощью программы OriginPro 8.5 SR1 («OriginLab Coroporation», США). Каталитическую константу ккат рассчитывали из значения V .

макс

Изучение температурной стабильности DAAO. Температурную стабильность мутантных TvDAAO и фермента дикого типа изучали

Т а б л и ц а 1

T7_For 5' -TAATACGACTCACTATAGGG-3'

T7_Rev 5 -GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'

M104L_for 5 -TG GAA GGT GCC TTG TCG GCC ATC TGT CAA CGC-3'

M104L_rev 5 '-ACA GAT GGC CGA CAA GGC ACC TTC CAG TTT AGG AAG AT-3'

M156L_for 5 -GTC TAC TTG AAC TGG CTG TTG TCC CAA TGC TTA TCG CTC G-3'

M156L_rev 5 '-AG CGA TAA GCA TTG GGA CAA CAG CCA GTT CAA GTA GAC TCC-3'

M209L_for 5 '-C GTC GAG GAC AAG AAG TTG TAC CCT ATT CGA GGA CAA GTC-3'

M209L rev 5 -TCG AAT AGG GTA CAA CTT CTT GTC CTC GAC GCC TC-3'

в 0,1 М КФБ (рН 8,0) при разных значениях температуры с шагом 2°С. В тонкостенные пластиковые пробирки объемом 0,5 мл помещали по 100-110 мкл раствора фермента заданной концентрации. Пробирки инкубировали в водном термостате при необходимой температуре (точность термостатирования ±0,1 °С). Через определенные промежутки времени пробирки вынимали, охлаждали в течение 1-2 мин во льду и измеряли активность. Эксперимент останавливали после уменьшения активности фермента до 5-10% от исходной величины. Для расчета кинетических параметров процесса инактивации мутантных ТуЭААО строили зависимости остаточной активности от времени и анализировали с помощью программы Оп^пРго 8.5 8Я1 («Оп^пЬаЬ», США) методом нелинейной регрессии.

Математический аппарат теории диссоциативной термоинактивации. Термоинактивация мутантных ТуЭААО и фермента дикого типа проходила в соответствии с диссоциативным механизмом. Для определения констант скорости термоинактивации использовали математический аппарат, подробно описанный в работах О.М. Пол-торака [20-21].

Изучение окислительной стабильности БЛЛО. Инактивацию мутантных ТуЭААО и фермента дикого типа в присутствии пероксида водорода изучали в 0,05 М КФБ (рН 8,0) при 30°С и разных концентрациях Н2О2 (0,01; 0,05 и 0,1 М). Концентрация фермента составляла 10 мкг/мл. Через определенные промежутки времени отбирали пробы по 100 мкл, добавляли к пробе 5 мкл раствора каталазы 10 000 Ед/мл (всего 50 Ед), перемешивали и измеряли остаточную активность ТуЭААО. Отбор проб прекращали после умень-

шения активности фермента до 5-10% от исходной величины. Для расчета кинетических параметров процесса инактивации мутантных TvDAAO строили зависимости остаточной активности от времени и анализировали с помощью программы OriginPro 8.5 SR1 («OriginLab Coroporation», США) методом нелинейной регрессии.

Результаты и их обсуждение

Выбор положений для введения аминокислотных замен. Анализ структуры TvDAAO показал, что на каждую субъединицу фермента приходится по 6 остатков метионина: Met104, Met156, Met209, Met226, Met245 и Met339. (рис. 1). Для каждого остатка метионина была рассчитана площадь поверхности, доступная растворителю (табл. 2). Наиболее доступным растворителю является остаток Met104 (доступная площадь поверхности 157,5 А2), в то время как для остатка Met226 доступность растворителю равна нулю. Остатки Met226 и Met245 находятся в активном центре фермента, поэтому мы исключили их из рассмотрения, так как аминокислотные замены в районе активного центра могут приводить к дестабилизации и потере активности фермента. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей DAAO из разных источников показало, что остатки Met226 и Met245 являются высококонсервативными, а в 339-м положении наиболее часто встречаются остатки метионина и цистеина, что свидетельствует о функциональной значимости указанных остатков в структуре фермента.

Таким образом, в результате анализа для последующего мутагенеза выбраны остатки Met в положениях 104, 156 и 209. Наиболее структур-

Рис. 1. Трехмерная структура TvDAAO (молекула FAD и остатки метионина показаны в CPK); А и Б - положения

остатков Met с поворотом 90°

Т а б л и ц а 2

Результаты множественного выравнивания и анализа расположения остатков метионина в

структуре фермента ТуБАЛО

Остаток Расположение Другие остатки в этом положении Площадь поверхности, доступной растворителю, Ä2

Met104 на поверхности у входа в активный центр Phe 157,5

Met156 место контакта субъединиц Val, Leu 2,72

Met209 рядом с поверхностью Val, Leu 4,43

Met226 в активном центре Met 0

Met245 в активном центре Met 5,53

Met339 рядом с поверхностью Cys, Met 8,35

П р и м е ч а н и е. Полужирным шрифтом выделены функционально важные консервативные остатки, которые не были подвергнуты мутагенезу.

но близким к остатку метионина и устойчивым к действию окислителей является остаток лейцина. На основании вышесказанного мы решили выполнить следующие замены: Met104Leu, Met156Leu и Met209Leu.

Получение мутантных TvDAAO с заменами Met104Leu, Met156Leu и Met209Leu. После проведения реакции направленного мутагенеза полученный фрагмент клонировали в исходную плазмиду, из которой предварительно удалили аналогичный фрагмент без мутации. Продуктом реакции лигирования трансформировали клетки E. coli DH5a и высевали на чашки Петри. С каждой чашки брали по 3 колонии, из которых выделили плазмидную ДНК.

После трансформации клеток E. coli BL21 (DE3)CodonPlus/pLysS полученными плазми-дами, содержащими в гене tvdaao мутации, кодирующие замены Met104Leu, Met156Leu, Met209Leu, было проведено культивирование штаммов-продуцентов. Выходы мутантных ферментов и TvDAAO дикого типа незначительно различались и находились в диапазоне от 9200 до 11800 Ед/л, т.е. экспрессия мутантных ферментов и фермента дикого типа происходит с примерно одинаковыми выходами активного растворимого белка. В случае удельной активности фермента, составляющей 580-860 Ед на 1 г биомассы, отличия также были несущественны. Таким образом, замены Met104Leu, Met156Leu, Met209Leu не влияют на уровень экспрессии TvDAAO.

Очистку мутантных TvDAAO и фермента дикого типа проводили с помощью анионообменной хроматографии на колонке MonoQ с последующим обессоливанием на колонке G25. Для полученных

препаратов ферментов были определены концентрации активного растворимого белка.

Аналитический SDS-электрофорез в полиакри-ламидном геле показал, что все препараты ферментов были получены в высокоочищенном виде и имели чистоту не менее 95% (на рисунке не показано).

Определение кинетических параметров мутантных TvDAAO. Значения КМ и максимальной скорости реакции, а также каталитической эффективности (отношение величины ккат к КМ) для каждого фермента с рядом D-аминокислот представлены в табл. 3. Полужирным шрифтом выделены случаи улучшения соответствующих кинетических параметров по сравнению с ферментом дикого типа. Как видно из табл. 3, для всех мутантных ферментов наблюдается уменьшение значений констант Михаэлиса в случае объемных D-аминокислот и увеличение КМ в случае остатков с небольшим боковым радикалом. Из табл. 3 также видно, что все мутантные ферменты имеют схожие профили каталитической эффективности. С небольшими субстратами (D-Ala, D-Val и D-Ser) для всех мутантных TvDAAO наблюдается уменьшение каталитической эффективности, а в случае объемных ароматических субстратов (D-Phe и D-Tyr) величины каталитической эффективности схожи с соответствующими значениями для фермента дикого типа.

Для мутанта TvDAAO Met156Leu наблюдается существенное уменьшение константы Миха-элиса с субстратами D-Leu, D-Tyr и D-Thr. Значения каталитических констант в большинстве случаев похожи на соответствующие значения для фермента дикого типа. В случае таких субстратов

со и о н

X

о

о я

Таблица 3

Каталитические параметры мутантных TvDAAO с заменами Metl04Leu, Metl56Leu, Met209Leu и фермента дикого типа

Субстрат wt-TvDAAO TvDAAO Metl04Leu TvDAAO Metl56Leu TvDAAO Met209Leu

KM, MM UKu,mM с KM, MM UKu, м1УГ с Км, мМ UKu, mNTV1 Км, мМ икц, мМ~ с

D-Met 0,46±0,03 80,5±0,8 175±7 1,02±0,03 118Д±1,1 116±3 0,96±0,02 86,4±0,8 90±2 0,95±0,06 60,9±0,9 64±4

D-Ala 16,7±0,7 109±2 6,5±0,3 80±5 169±7 2,10±0,16 27,3±1,5 135±3 5,0±0,3 25,0±1,5 89±2 3,6±0,2

D-Val I4,4±l,2 85±3 5,9±0,5 35,2±1,0 158±3 4,49±0,14 19,3±0,7 93,4±1,4 4,8±0,2 17,9±1,4 59,5±1,8 3,3±0,3

D-Leu 0,78±0,02 29,1±0,3 37±3 0,228±0,09 34,9±0,4 153±6 0Д60±0,015 20,3±0,4 127±12 0,193±0,011 14,12±0,17 73±4

D-Ser 37±3 20,5±0,9 0,56±0,06 48±5 6,3±0,4 0,13±0,02 47±4 18,2±0,7 0,39±0,03 39±4 13,0±0,6 0,34±0,04

D-Phe 0,37±0,04 27,2 ±0,8 74±8 0,33±0,03 36,6±0,7 111±9 0,57±0,04 29,9±0,5 52±3 0,251±0,006 16,4±0,4 65±2

D-Tyr 0,45±0,06 22,5±1,9 50±8 0,27±0,02 19,2 ±0,8 71±7 0,27±0,02 13,4±0,5 49±4 0Д4±0,02 6,3±0,3 45±6

D-Trp 0,49±0,04 42,4±1,4 87±8 0,29±0,03 50±2 170±20 0,67±0,04 37,2±1,2 55±4 0,60±0,05 26,5±1,2 44±4

D-Asn 22,6±1,5 62±2 2,8±0,2 15,5±0,6 45,1±0,8 2,90±0,13 19,6±1,4 50,0±1,7 2,6±0,2 15±2 25,1±1,3 1,6±0,2

D-Thr 11,1±0,8 1,75±0,04 0,158±0,012 нет активности 5,2±0,5 1,49±0,05 0,29±0,03 5,7±1,2 0,89±0,06 0,16±0,03

D-Lys 29±3 3,5±0,2 0,12±0,02 нет активности 28±9 8,0±1,3 0,28±0Д1 30±9 6,2±0,9 0,21±0,07

О

и

.ТЗ

Примечание. Полужирным шрифтом выделены случаи улучшения каталитических параметров мутантных TvDAAO по сравнению с таковыми для фермента дикого типа.

к»

(Л

как D-Ala, D-Val и D-Lys наблюдается увеличение значений каталитических констант. Значения каталитической эффективности увеличились с субстратами D-Leu, D-Thr и D-Lys.

В случае TvDAAO Met209Leu значения констант Михаэлиса уменьшились с субстратами D-Leu, D-Phe, D-Tyr, D-Asn и D-Thr. Значения каталитических констант уменьшились для большинства субстратов, однако с D-Lys произошло увеличение значения каталитической константы почти в два раза по сравнению с ферментом дикого типа. Увеличение значений каталитической эффективности наблюдается только с D-Leu и D-Lys.

Таким образом, введение замен Met156Leu и Met209Leu привело к изменению профиля субстратной специфичности TvDAAO. Замены привели к заметному увеличению константы Михаэлиса для небольших субстратов и ее уменьшению для объемных D-аминокислот.

Изучение температурной стабильности мутантных TvDAAO (Met156Leu и Met209Leu). Температурную стабильность мутантных TvDAAO изучали по кинетике термоинактивации при разных температуре и концентрации ферментов. На рис. 2 представлены зависимости остаточной активности полученных мутантов и фермента дикого типа от времени при одинаковой концентрации ферментов (10 мкг/мл) и температуре 56°С. Как видно из рис. 2, замены Met104Leu и Met209Leu привели к незначительному изменению стабильности TvDAAO, а замена Met156Leu привела к увеличению стабильности по сравнению с TvDAAO дикого типа.

В наших предыдущих работах неоднократно показано, что TvDAAO дикого типа и ее различ-

Время, мин

Рис. 2. Зависимость остаточной активности от времени мутантных ТуБААО с заменами МеИ04Ьеи (1), МеИ56Ьеи (2), МеШ9Ьеи (3), и ТуБААО дикого типа (4). Концентрация ферментов 10 мкг/мл; 0,1 М К-фосфатный буфер; рН 8,0; температура инкубации 56°С

ные мутантные формы при повышенной температуре инактивируются в соответствии с диссоциативным механизмом термоинактивации, который был подробно описан в работах О.М. Полторака для некоторых других олигомерных белков [20, 21]. Согласно этому механизму, на первой стадии происходит обратимая диссоциация активного ди-мера на неактивные мономеры, а на второй стадии субъединицы необратимо денатурируют. Экспериментальные зависимости остаточной активности фермента от времени корректно описываются суммой двух экспоненциальных функций, а скорость инактивации фермента зависит от его концентрации [17, 22-23].

Для диссоциативной термоинактивации олигомерных ферментов характерны следующие признаки [20,21]:

1) наличие изломов (т.е. двух линейных участков) на зависимостях остаточной активности от времени в полулогарифмических координатах;

2) при фиксированной температуре тангенс угла наклона первого линейного участка не зависит от концентрации фермента, а для второго линейного участка происходит увеличение тангенса угла наклона при уменьшении начальной концентрации фермента;

В качестве примера на рис. 3 (А, Б) представлены типичные зависимости остаточной активности от времени для мутантной ТуБААО МеИ56Ьеи в полулогарифмических координатах при разных значениях температуры (52-60°С) и начальной концентрации фермента (10, 20 и 40 мкг/мл). Действительно, данные зависимости представляют собой прямые с изломом. Кроме того, из рис. 3, А видно, что наклоны начальных линейных участков до точки излома совпадают, а после точки излома наклон увеличивается с уменьшением начальной концентрации фермента.

Такого рода зависимости были получены для всех мутантных форм ТуЭААО. Полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что термоинактивация мутантных ТуЭААО при повышенных значениях температуры, как и для фермента дикого типа, протекает по диссоциативному механизму. Для всех мутантных форм двустадийный характер термоинактивации наблюдается во всех исследованных интервалах температуры (которые зависят от стабильности мутантов) и при разной концентрации ферментов.

С использованием математического аппарата теории диссоциативной термоинактивации [20, 21] рассчитаны константы скорости инактивации обеих стадий процесса для мутантных ТуЭААО.

Результаты расчетов приведены в табл. 4 в сравнении с аналогичными параметрами для ТуБААО МеП04Ьеи и ТуБААО дикого типа. Для ТуБААО МеИ56Ьеи наблюдается уменьшение значений констант скорости инактивации первой и второй стадий в среднем в 2-3 раза по сравнению с ТуЭААО дикого типа, т.е. замена МеИ56Ьеи привела к увеличению температурной стабильности ТуЭААО во всем исследуемом диапазоне. В случае ТуБААО Ме1209Ьеи значения констант скорости первой стадии инактивации схожи с таковыми для ТуЭААО дикого типа, но константы диссоциации существенно увеличились. Значения констант скорости второй стадии уменьшились. Это может свидетельствовать о том, что введение данной замены привело к ухудшению межсубъединич-

-1-1-1-1-1—

0,00300 0,00305 0,00310

1/Т, К"1

1п

V 1 О 2 АЗ »4 О 5

0 25 50 75 100 125 150 Время, мин

0 20 40 60 80 100 120

Время, мин

Рис. 3. А. Зависимости остаточной активности от времени для мутантной ТуЭААО МеИ56Ьеи в полулогарифмических координатах при разной температуре. Концентрация фермента 10 мкг/мл; 0,1 М КФБ; рН 8,0; температура, °С: 52 (1), 54 (2), 56 (3), 58 (4) и 60 (5). Б. Зависимости остаточной активности от времени мутант-ной ТуБААО МеН56Ьеи в полулогарифмических координатах при разных значениях начальной концентрации фермента, мкг/мл: 10 (1 ), 20 (2) и 40 (3). Температура 58°С; 0,1 М К-фосфатный буфер; рН 8,0

1/Т, К"1

Рис. 4. Температурные зависимости констант скорости первой (к1) (А) и второй (к2) (Б) стадий термоинактивации в координатах 1п(к) - 1/Т для мутантных ТуЭААО с заменами МеШ4Ьеи (1), МеН56Ьеи (2), Мег209Ьеи (3) и ТуЭААО дикого типа (4). Концентрация ферментов 10 мкг/мл; 0,1 М К-фосфатный буфер; рН 8,0

ного связывания и к увеличению стабильности каждой отдельной субъединицы.

На основании зависимостей остаточной активности от времени были рассчитаны периоды полуинактивации для всех мутантных ТуЭААО при всех изученных значениях температуры. Полученные результаты согласуются со значениями констант скорости термоинактивации. Для ТуБААО МеИ56Ьеи наблюдается увеличение времени полуинактивации в 2-3 раза по сравнению с ферментом дикого типа во всем исследуемом диапазоне (рис. 2). Для ТуБААО М209Ьеи наблюдается незначительное уменьшение периодов полуинактивации, несмотря на улучшение значений констант скорости второй стадии инактивации. Это связано с тем, что на начальных

Т а б л и ц а 4

Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации мутантных TvDAAO и фермента дикого типа

Форма ТУБЛЛО Параметр Температура, °С

48 50 52 54 56 58 60

Дикий тип К 107, М дис • ' - 0,19 1,27 1,34 6,0 9,3 14,6

к1 -104, с-1 - 2,86 3,67 9,2 11,6 21,5 41

к2 -104, с-1 - 2,28 3,13 5,6 7,1 10,8 19,4

МеШ4Ьеи Кдис 107, М - 1,35 1,60 1,61 2,57 3,16 5,7

к1 -104, с-1 - 3,00 3,80 5,9 11,7 19,2 38

к2 -104, с-1 - 1,22 1,49 4,01 6,2 14,4 29

МеН56Ьеи К,. 107, М шэ • > - - 0,88 1,39 2,23 3,75 15,0

к1 -104, с-1 - - 1,37 2,62 4,40 9,78 27,0

к2 -104, с-1 - - 1,48 2,36 2,84 4,96 8,52

МеШ9Ьеи К48Д07, М 1,47 1,82 3,16 5,52 8,56 - -

к1 -104, с-1 1,85 2,90 4,82 7,32 13,6 - -

к2 -104, с-1 1,36 1,75 2,68 4,26 7,10 - -

П р и м е ч а н и е. Ошибка эксперимента составляла не более 15%; прочерк (-) в ячейках таблицы означает, что параметр не определяли из-за очень малого или очень большого значения констант; уменьшение параметров термоинактивации мутантных ТуБЛЛО по сравнению с ферментом дикого типа выделено полужирным шрифтом.

этапах термоинативации скорость инактивации в большей степени зависит от значения константы скорости первой стадии инактивации и константы диссоциации.

На рис. 4 (А, Б) приведены зависимости натурального логарифма констант скорости первой и второй стадий инактивации от обратной температуры (1/7). Видно, что в случае ТуБЛЛО МеИ56Ьеи значения констант скорости первой стадии инактивации уменьшились и при увеличении температуры приближаются к соответствующим значениям для ТуБЛЛО дикого типа. Для второй стадии инактивации зависимость аналогична таковой для фермента дикого типа и во всем исследуемом диапазоне значения констант скорости ниже соответствующих значений ТуБЛЛО дикого типа. Как было сказано выше, значения констант скорости инактивации в случае ТуБЛЛО Ме1209Ьеи схожи с таковыми для первой стадии ТуБЛЛО дикого типа и меньше соответствующих значений для второй стадии.

Таким образом, введение МеИ56Ьеи приводит к увеличению температурной стабильности и смещению температурного диапазона, в ко -тором реализуется диссоциативный механизм термоинактивации, примерно на 2°С в область более высоких температур. Введение замены

Ме1209Ьеи привело к увеличению значений констант диссоциации и в целом к незначительному уменьшению температурной стабильности фермента. Температурная стабильность мутанта ТуБЛЛО МеИ04Ьеи близка к таковой для фермента дикого типа.

Изучение окислительной стабильности мутантных TvDAAO с заменами Met104Leu, Met156Leu, Met209Leu и фермента дикого типа. На заключительном этапе работы мы изучили окислительную стабильность мутантных ТуБЛЛО и фермента дикого типа по кинетике инактивации при инкубации в растворе перок-сида водорода. Пероксид водорода был выбран в качестве окислителя, потому что происходит его выделение в процессе реакции, катализируемой БЛЛО. Кроме того, при получении 7-АЦК (наиболее крупномасштабном производстве с использованием ТуБЛЛО), в реакционную систему вносят дополнительные количества пе-роксида водорода для количественного протекания реакции [13].

В случае применения реакции с использованием ПХ для измерения активности ТуБЛЛО пероксид водорода, добавляемый при инкубации фермента, необходимо удалить. В этих целях использовали каталазу из печени быка. Каталаза может мешать определению активности ТуБЛЛО с помощью

ПХ, так как она катализирует разложение перок-сида водорода. Поэтому было решено инактиви-ровать каталазу кратковременным нагреванием таким образом, чтобы не изменялась активность ТуЭЛЛО. Оказалось, что каталаза из печени быка обладает высокой температурной стабильностью и в концентрации, необходимой для проведения эксперимента, не теряет каталитическую активности в течение 10 мин при 45°С.

В связи с вышесказанным мы исследовали влияние добавления каталазы на активность ТуЭЛЛО. Для этого была изучена зависимость наблюдаемой остаточной активности ТуЭЛЛО дикого типа и ее мутантных форм при добавлении разного количества каталазы в кювету при измерении активности ТуЭЛЛО (рис. 5). Оказалось, что присутствие каталазы в концентрации до 100 ед. активности в реакционной смеси не влияет на активность ТуЭЛЛО. Таким образом, нами предложена методика для изучения окислительной стабильности ТуЭЛЛО. Для устранения экзогенного пероксида водорода из реакционной смеси добавляли каталазу из печени быка в концентрации, при которой конечная концентрация каталазы в кювете для измерения активности ТуЭЛЛО составляет порядка 15 ед. активности. В данном случае влиянием каталазы на наблюдаемую активность ТуЭЛЛО при изучении окислительной стабильности можно пренебречь.

На рис. 6, А представлена зависимость остаточной активности ТуЭЛЛО МеИ56Ьеи от времени при инкубации с пероксидом водорода в разной концентрации (подобные зависимости получены для всех мутантных ферментов и фермента ди-

Рис. 5. Влияние количества каталазы в реакционной смеси на скорость реакции при измерении активности ТуБЛЛО дикого типа

кого типа). Видно, что фермент в значительной степени подвержен действию пероксида водорода и при увеличении концентрации быстрее теряет свою активность. Поскольку концентрация перок-сида водорода намного больше, чем концентрация фермента, то концентрация окислителя во время измерения практически не изменяется, и зависимость потери активности от времени должна соответствовать кинетике реакции первого порядка. Из рис. 6, А хорошо видно, что наблюдаемые зависимости действительно хорошо описываются моноэкспоненциальной функцией Л*ехр(-£хх), что свидетельствует о первом порядке процесса инактивации.

На рис. 6, Б представлены зависимости остаточной активности от времени инкубации для всех мутантных ферментов и фермента дикого типа при концентрации пероксида водорода, равной 0,01 моль/л. Видно, что стабильность

Рис. 6. А. Зависимости остаточной активности от времени мутантной ТуБЛЛО МеИ56Ьеи при разных значениях концентрации пероксида водорода: 10

Т а б л и ц а 5

Константы скорости инактивации мутантных TvDAAO и фермента дикого типа под действием пероксида водорода

Форма TvDAAO k -104, c-1 ин

H2O2

Дикий тип 4,9 17,9 27,7

Met104Leu 4,4 14,0 25,3

Met156Leu 5,2 19,3 29,3

Met209Leu 5,9 24,3 38,6

П р и м е ч а н и е. Ошибка эксперимента составляла не более 15%.

ферментов к действию пероксида водорода практически не изменилась при введении аминокислотных замен. В табл. 5 представлены рассчитанные значения констант скорости инактивации пероксидом водорода.

Значения константы скорости инактивации для TvDAAO Met104Leu и TvDAAO Met156Leu практически не изменились, а в случае TvDAAO Met209Leu увеличились по сравнению с таковыми для фермента дикого типа. Причиной этого, вероятно, является менее стабильная структура димерного мутантного фермента, что обсуждалось в главе, посвященной изучению температурной стабильности му-тантных ферментов.

Оксидаза D-аминокислот является важным ферментом для биотехнологии. Практическое применение DAAO обусловлено стабильностью Работа выполнена при поддержке Россий

фермента к действию пероксида водорода. В данной работе получены мутантные ферменты с заменами Met104Leu, Met156Leu и Met209Leu и изучена их окислительная стабильность. Введенные замены незначительно повлияли на окислительную стабильность. Изучение температурной стабильности для мутантных TvDAAO Met156Leu и TvDAAO Met209Leu показало, что в случае замены Met156Leu происходит увеличение температурной стабильности, что может быть использовано при объединении мутаций в целях повышения температурной стабильности TvDAAO. Несмотря на то, что замены Met156Leu и Met209Leu выполнены вдали от активного центра, они привели к изменению профиля субстратной специфичности, что может указывать на изменение трехмерной структуры фермента в результате проведения мутагенеза указанных остатков. ого научного фонда (проект № 16-14-00043).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Тишков В.И., Хороненкова С.В. // Биохимия. 2005. Т. 70. № 1. C. 51.

2. Pollegioni L., Sacchi S., Caldinelli L., Boselli A., Pilone M.S., Piubelli L., Molla G. // Curr. Protein Pept. Sci. 2007. Vol. 8. N 6. P. 600.

3. Pollegioni L., Molla G., Sacchi S., Rosini E., Verga R., Pilone M.S. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. Vol. 78. N 1. P. 1.

4. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. // Biochemistry (Moscow). 2008. Vol. 73. № 13. P. 1511.

5. Pollegioni L., Piubelli L., Sacchi S., Pilone M.S., Molla G. // Cell. Mol. Life Sci. 2007. Vol. 64. N 11. P. 1373.

6. Fisher G., Lopez S., Peterson K., Goff T., Philip I., Gaviria R., Lorenzo N., TsesarskaiaM. // Amino Acids. 2007. Vol. 32. N 1. P. 27.

7. Helfman P.M., Bada J.L. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1975. Vol. 72. N 8. P. 2891.

8. Hanson R.L., Schwinden M.D., Banerjee A., Brzo-zowski D.B., Chen B.C., Patel B.P., McNamee C.G., Kodersha G.A., Kronenthal D.R., Patel R.N., Szarka L.J. // Bioorg. Med. Chem. 1999. Vol. 7. N 10. P. 2247.

9. Roff G.J., LloydR.C., Turner N.J. // J. Am. Chem. Soc. 2004. Vol. 126. N 13. P. 4098.

10. Nishikawa T. // Biol. Pharm. Bull. 2005. Vol. 28. P. 1561.

11. Jönsson E.G., Saetre P., Vares M., Andreou D., Lars-son K., Timm S., Rasmussen H.B., Djurovic S., Melle I., Andreassen O. a., AgartzI., Werge T., Hall H., Terenius L. // Neuropsychobiology. 2009. Vol. 59. N 3. P. 142.

12. Ohi K., Hashimoto R., Yasuda Y., Yoshida T., Taka-hashi H., Iike N., Fukumoto M., Takamura H., Iwase M., Kamino K., Ishii R., Kazui H., Sekiyama R., Kitamura Y., Azechi M., Ikezawa K., Kurimoto R., Kamagata E., Tanimukai H., Tagami S., Morihara T., Ogasawara M., Okochi M., Tokunaga H., Numata S.,

Ikeda M., Ohnuma T., Ueno S.I., Fukunaga T., Tanaka T., Kudo T., Arai H., Ohmori T., Iwata N., Ozaki N., Takeda M. // Schizophr. Res., 2009. Vol. 109. N 1-3. P. 80.

13. Dey E.S., Flygare S., Mosbach K. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1991. Vol. 27. N 3. P. 239.

14. Betancor L., Hidalgo A., Fernández-Lorente G., Mateo C., Rodríguez V., Fuentes M., López-Gallego F., Fernán-dez-Lafuente R., Guisan J.M. // Biotechnol. Prog. 2003. Vol. 19. N 3. P. 784.

15. Fernández-LafuenteR., Rodríguez V., Mateo C., Fernán-dez-Lorente G., Arminsen P., Sabuquillo P., Guisán J.M. // J. Mol. Catal. - B Enzym. 1999. Vol. 7. N 1-4. P. 173.

16. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Чубарь Т.А., Тишков В.И. // Биохимия. 2012. 77. № 10. С. 1423.

17. Golubeff I.V., Komarova N.V., Ryzhenkova K.V., Chu-

bar Т.А., Savin S.S., Tshkov V.I. // Acta Naturae. 2014. Vol. 6. N 3(22). C. 76.

18. Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G., Sacchi S., Pilone M.S. // Biotechnol. Prog. 2004. Vol. 20. N 2. P. 467.

19. Савин C.C., Чернышев И.В., Тишков В.И., Хороненкова С.В. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2006. T. 47. № 1. C. 25.

20. Полторак, О.М., Чухрай Е.С. // Итоги науки и техники. Биотехнология. 1986. T. 5. C. 50.

21. Полторак О.М., Торшин И.Ю., Чухрай Е.С. // Биохимия. 1998. T. 63. № 3. C. 360.

22. Черскова Н., Хороненкова С., Тишков В. // Изв. АН. Сер. хим. 2010. T. 59. № 1. C. 262.

23. Комарова Н.В., Голубев И.В., Хороненкова С.В., Тишков В.И. // Изв. АН. Сер. хим. 2012. T. 61. № 7. C. 1489.

Поступила в редакцию 15.03.16

INFLUENCE OF Met/Leu AMINO ACID CHANGES ON CATALYTIC PROPERTIES AND OXIDATIVE AND THERMAL STABILITY OF YEAST D-AMINO ACID OXIDASE

D.L. Atroshenko1,2, I.V. Golubev1,2, S.S. Savin1,2, V.I. Tishkov1,2,3*

Oxidative stability of enzymes is mostly dependent on stability of Cys and Met residues. Three single point mutants with changes Met/Leu of D-amino acid oxidase (DAAO, EC 1.4.3.3) from the yeast Trigonopsis variabilis (TvDAAO) were prepared and characterized. Selection of position for amino acid residue substitution was made based on multiple alignment of different DAAO amino acid sequences and analysis of the TvDAAO structure. It was shown that substrate specificity profile changed for all mutans. KM values for small and bulky D-amino acids increased and decreased, respectively. In one case change Met/Leu resulted in 2-3-fold increase of thermal stability. Method to determine stability of TvDAAO in presence of hydrogen peroxide was developed and oxidative stability of wild-type and mutant TvDAAOs was studied. It was shown that all three mutations did not change of the enzyme oxidative stability.

Key words: D-amino acid oxidase, Trigonopsis variabilis, site-directed mutagenesis, oxidative stability, thermal stability, catalytic properties.

Сведения об авторах: Атрошенко Денис Леонидович - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (atrdenis@gmail.com); Голубев Игорь Владимирович - науч. сотр. химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук (golubeff.msu@gmail.com); Савин Святослав Сергеевич - науч. сотр. химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. биол. наук (savinslava@gmail.com); Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», докт. хим. наук (vitishkov@gmail.com).