РЕГИОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ 42-ЭФИРА РАПАМИЦИНА
REGIOSPECIFIC SYNTHESIS OF RAPAMYCIN 42-ESTER DERIVATIVES

Рапамицин (препарат Rapamune) является иммуносупрессантом естественного происхождения, который обладает новым механизмом действия. CCI-779 (42-эфир рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой) является эфиром рапамицина, который демонстрирует значительное ингибирующее воздействие на рост опухоли в моделях in vitro и in vivo.
Модификация рапамицина главным образом направлена на получение производных его 42-гидроксиэфира. Эти производные 42-гидроксиэфира рапамицина используются для стимуляции иммуносупрессии и в лечении отторжений после трансплантации, аутоиммунных заболеваний, воспалений, зрелой Т-клеточной лейкемии/лимфомы, твердых опухолей, грибковых инфекций и др. Этерификацию рапамицина в 42 положении выполняли непосредственно с помощью реакции рапамицина с ацилирующими агентами. Однако, так как рапамицин содержит две вторичных гидроксильных группы в положениях 31 и 42, попытки различить эти две гидроксильные группы для выполнения региоселективного синтеза 42-моноацилированных продуктов представляют сложную задачу.
Был издан ряд патентов, касающихся синтеза 42-ацилированных производных, таких как алкильный эфир (патент США No. 4316885), аминоалкильные эфиры (патент США No. 4650803), фторированные эфиры (патент США №4650803), амидные эфиры (патент США №5118677), эфиры мочевины (патент США No. 5118678), алкоксиэфиры (патент США No. 5233036), углекислые эфиры (патент США No. 5260300), гидроксиэфиры (патенты США №5362718 и №6277983). Однако ни в одном из патентов не описаны способы синтеза, которые являлись бы стереоспецифическими. Более того, выходы 42-моноэфиров рапамицина, получаемых этими способами, обычно низкие из-за недостаточной региоселективности и нестабильности молекулы рапамицина в основном или кислотном состояниях. Для получения чистого продукта обычно требуется разделение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Одним из вариантов улучшения региоселективности является использование в качестве интермедиата 31-силилзащищенного рапамицина. Однако в этот способ включено несколько дополнительных этапов.
Таким образом, необходим эффективный способ синтеза эфиров рапамицина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение предоставляет катализируемый липазой синтез производных 42-эфира рапамицина. Отличительными особенностями этого несложного процесса являются региоспецифичность и высокий выход продукта в мягких условиях.
Другие стороны и преимущества данного изобретения будут очевидны для специалиста в данной области.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение предоставляет способ получения 42-эфира рапамицина с общей формулой (I) в региоспецифичной форме с использованием липазы в присутствии рапамицина и ацильного донора.
где R является линейным или циклическим, алифатическим или ароматическим, насыщенным или ненасыщенным углеводородом, который по выбору содержит гидроксил, галоген и/или серосодержащий заместитель (серосодержащие заместители). В одном примере осуществления галогеном является Cl, Br, I или F.
Рапамицин может быть получен в соответствии с ранее описанными способами. См., например, патент США №3929992, изданный 30 декабря 1975 г. В качестве альтернативы рапамицин может быть приобретен коммерчески [например Rapamune, Wyeth] или получен с использованием альтернативных способов. Способы приготовления, очистки и/или получения исходного материала рапамицина данным изобретением не ограничиваются.
2
4
В одном опыте изобретение предоставляет региоспецифичный способ производства кеталь-защищенных 42-эфиров рапамицина, используемых для производства 42-эфира рапамицина. В одном опыте изобретение предусматривает производство изопропилиденкеталь-защищенного 42-эфира рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой, предшественника CCI-779 (пример 7). CCI-779 является эфиром рапамицина, который демонстрирует значительное ингибирующее воздействие на рост опухоли в моделях in vitro и in vivo. Использование этих и других гидроксиэфиров рапамицина описано в патентах США №5362718 и №6277983 и патентной публикации США No. US 2005-0033046 А1 (патентная заявка США No. 10/903062). Удаление кетальной защищающей группы может быть проведено в умеренно кислых условиях. В общем, можно следовать методике, опубликованной в патенте США №. 6277983 и цитируемых документах. В одном опыте депротекцию выполняют в однофазной системе водная кислота/органический растворитель, например в растворенной в тетрагидрофуране (ТГФ) серной кислоте, такой как 2 н. HSO/ТГФ при температуре примерно от 0 до 5°С. Однако для завершения этой реакции может потребоваться около трех или более дней, кроме того, необходима экстракция растворителем для выделения продукта из водной среды после завершения реакции. Другие способы удаления кетальной защищающей группы, такие как описанные в международной патентной заявке, названной Proline CCI-779, Production and Uses Therefor, and Two Step Enzymatic Synthesis of Proline CCI-779 and CCI-779 (Шу и др., (Chew et al.), обоснованной в предварительных заявках на патент США №60/562069 (зарегистрированной 14 апреля 2004 г.) и №60/623594 (зарегистрированной 29 октября 2004 г.)), должны быть известны специалистам в данной области.
Используемое здесь выражение "микробные липазы" включает ферменты, катализирующие гидролиз и образование эфирных связей, которые были первоначально выделены из неэукариотических источников, таких как Aspergillus niger, Candida antarctica, Candida rugosa, Mucor miehei, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens, Rhizopus delemar и т.д. Однако необходимо, чтобы выбранный для использования в изобретении фермент не требовал выделения и очистки непосредственно из первоисточника, а мог быть приготовлен синтетически, рекомбинантно или с помощью других соответствующих методик. Ряд этих ферментов доступен от некоторых коммерческих источников, более того, эти ферментные препараты могут быть использованы в грубой, частично очищенной, очищенной или иммобилизованной форме, они могут быть различного микробного происхождения, под различными торговыми названиями и от различных поставщиков.
Обнаружено, что для осуществления данного изобретения особенно подходит липаза В типа из Candida antarctica. Из всех изученных липаз липаза этого типа обеспечивает наибольшие скорости преобразования и наибольший выход выделяемого продукта. Липаза С. antarctica является коммерчески доступным ферментом с торговым названием, например, NOVO SP435 или NOVOZYME 435 от Novo Nordisk, или CHIRAZYME  L-2 от Roche Molecular Biochemicals and BioCatalytics.
2
2
3
Липаза PS от Pseudomonas cepacia, особенно ее иммобилизованная форма - липаза PS-C [например, доступная как липаза "Amano" II от Amano], может проводить реакцию с той же эффективностью, что и липаза NOVOZYM 435 с точки зрения синтеза, хотя и с более низкой скоростью реакции. В данном изобретении микробную липазу (например, С. antarctica (В типа)) объединяют с соответствующим растворителем для катализа реакции между ацильным донором и рапамицином. Специалист в данной области может легко выбрать соответствующий растворитель из, например, толуола, трет-бутилметилового эфира (ТБМЭ), этилового эфира, THF, MeCN, CHCl, CHCl, гексана, диоксана или смесей, включающих эти растворители. В одном опыте используют ТБМЭ (трет-бутилметиловый эфир). Ацильный донор, используемый в способе данного изобретения, выбирают из активированных эфиров, таких как виниловые эфиры, изопропениловые эфиры и ангидриды.
2
1
1
В одном опыте виниловые эфиры выбирают из эфиров с формулой CH=CH-O-COR, где R является алкилом, алкенилом, арилом, бензилом, незамещенным или замещенным гидроксилом, галогеном (F, Cl, Br, I) и серой. К применимым виниловым эфирам относят винилацетат, винилпропионат, винилхлорацетат, винилкротонат, винилбензоат и винилдеканоат. Однако специалист в данной области может подобрать для применения и другие виниловые эфиры.
2
3
2
2
В одном опыте изопропениловый эфир выбирают из эфиров с формулой СН=С(СН)-OCOR, где R является алкилом, алкенилом, арилом, бензилом, незамещенным или замещенным гидроксилом, галогеном (F, Cl, Br, I) и серой. В другом опыте ацильным донором является изопропенилацетат.
Используемый здесь термин "алкил", относится как к прямым, так и к разветвленным цепям замещенных углеводородных алифатических групп, содержащих от одного до десяти углеродных атомов, предпочтительнее от одного до восьми углеродных атомов и еще более предпочтительно от одного до шести углеродных атомов.
Предполагается, что термин "алкенил" включает в себя алкильные группы с прямыми и разветвленными цепями, содержащие, по крайней мере, одну двойную связь углерод-углерод и от двух до восьми углеродных атомов, предпочтительнее от двух до шести углеродных атомов.
Используемый здесь термин "арил" относится к карбоциклической ароматической системе, которая может состоять из одного кольца или множества ароматических колец, конденсированных или соединенных вместе таким образом, что по крайней мере одна часть конденсированных или соединенных кольцевых форм образует сопряженную ароматическую систему, например, из 6-14 углеродных атомов. Арильные группы включают фенил, нафтил, бифенил, антрил, тетрагидронафтил, фенантрил, индан и др., но ими не ограничиваются.
6
5
2
Используемый здесь термин "бензил" относится к группе с формулой СНСН.
1
2
3
4
5
6
7
8
Соответствующие ангидриды легко выбирают среди алкановых ангидридов (т.е. C, C, С, С, C, С, C и C ангидридов), которые могут быть разветвленными или с прямой цепью, а также замещенными галогеном, гидроксилом.
2
В одном опыте ферментативный процесс данного изобретения может выполняться при температурах от примерно 20°С до примерно 75°С или от примерно 25°С, 27°С, 30°С, 40°С до примерно 70°С, или от примерно 32°С или примерно 37°С до примерно 65°С. В другом опыте температура составляет от примерно 30°С до примерно 55°С. В еще одном опыте температура составляет от примерно комнатной до примерно 45°С. Обычно реакцию проводят в присутствии N до тех пор, пока все исходные материалы не будут израсходованы. Реакцию можно контролировать различными способами, такими как тонкослойная хроматография (ТСХ) и ВЭЖХ. Кроме того, специалистом в данной области могут быть использованы другие способы контроля реакции.
В реакции, использующей виниловый эфир или изопропениловый эфир в качестве ацильного донора, фермент (липазу) отфильтровывают и промывают соответствующим растворителем Может быть использован тот же растворитель, что и в реакции, или отличный от него. В случае, если растворители отличаются, может быть выбран любой из указанных выше растворителей или других обычно используемых растворителей, таких как ацетон, этилацетат, метанол, этанол, изопропанол и др. Комбинированный органический растворитель может быть затем выпарен при соответствующих условиях, например при пониженном давлении. Остаток затем очищают по соответствующим методикам, например с помощью хроматографической силикагелевой колонки, с помощью элюирования соответствующим растворителем или перекристаллизацией с соответствующим растворителем (например, с гексан-ацетоном, гексан-этилацетатом, этиловым эфиром и другими растворителями). В данной области известны и другие соответствующие методики очищения. Более того, другие соответствующие смеси растворителей и их соотношения могут быть легко определены специалистом в данной области.
2
В другом опыте в качестве ацильных доноров в катализируемом ферментом получении производных 42-эфира используют ангидриды. Выходы продукта обычно высокие и составляют около 95% (пример 9-11). В таком опыте ангидрид и соответствующее количество фермента смешивают в соответствующем растворителе с рапамицином и перемешивают в течение 16-96 часов, более желательно в течение 24-48 часов в присутствии N без доступа света. Соответствующим образом реакцию выполняют при температуре в пределах от комнатной до примерно 50°С. Отношение массы фермента к массе рапамицина может меняться в зависимости от вида ангидрида и продолжительности реакции, например, от приблизительно эквивалентных количеств (весовых отношений) рапамицина и фермента (в/в) до избыточного количества фермента для более быстрого проведения реакции. Если реакция не окончена после определенного периода времени, как указано выше, то по выбору либо добавляют дополнительный фермент, либо смесь перемешивают в течение дополнительного периода времени до завершения реакции, оцениваемого по ТСХ или ВЭЖХ. После отделения фермента с помощью фильтрации отделяют растворитель при пониженном давлении. Остаток очищают с использованием соответствующих способов, например на хроматографической силикагелевой колонке или перекристаллизацией.
Региоспецифические 42-производные рапамицина данного изобретения используют в фармацевтических составах. Таким образом, могут быть приготовлены рецептуры с 42-производными рапамицина данного изобретения любым соответствующим способом, описанным в литературе, посвященной рапамицину или его производным.
Рецептуры для орального применения, содержащие активные соединения данного изобретения, могут выполняться в виде любых традиционно используемых форм для орального введения, включая таблетки, капсулы, защечные формы, пастилки, леденцы и жидкости для полости рта, суспензии или растворы. Капсулы могут содержать смеси активного соединения (активных соединений) с инергными наполнителями и/или такими растворителями, как фармацевтически приемлемые крахмалы (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал или крахмал тапиоки), сахара, искусственные подсластители, порошковые целлюлозы, такие как кристаллическая и микрокристаллическая целлюлоза, пудры, желатины, загустители и так далее. Приемлемые таблеточные рецептуры могут быть приготовлены способами обычного продавливания, сырой или сухой грануляции с использованием фармацевтически приемлемых растворителей, связывающих агентов, лубрикантов, дезинтегрантов, поверхностно-модифицирующих агентов (включая поверхностно-активные вещества), включая без ограничения суспендирующие или стабилизирующие агенты, например стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, лаурилсульфат натрия, микрокристаллическую целлюлозу, кальцийкарбоксиметилцеллюлозы, поливинилпирролидон, желатин, альгиновую кислоту, акациевый загуститель, ксантановый загуститель, цитрат натрия, комплексные силикаты, карбонат кальция, глицин, декстрин, сахарозу, сорбитол, двукальциевый фосфат, сульфат кальция, лактозу, каолин, маннитол, хлорид натрия, талька, сухие крахмалы, порошковый сахар. К предпочтительным агентам, модифицирующим поверхность, относятся неионогенные и анионные вещества. Примерами агентов, модифицирующих поверхность, являются без ограничения полоксамер 188, хлорид бензалкония, стеарат кальция, кетостеариловый спирт, кетомакрогольный (cetomacrogol) эмульсионный воск, сорбитановые эфиры, двуокись кремния в коллоидной форме, фосфаты, додецилсульфат натрия, магний-алюмосиликат и триэтаноламин. Рецептуры данного изобретения для орального применения могут использовать стандартную задержку или постепенное высвобождение для изменения абсорбции активного соединения/соединений. Рецептура для орального введения может также состоять из раствора вводимого активного ингредиента в воде или фруктовом соке, включая при необходимости подходящие солюбилизаторы или эмульгаторы.
В одном опыте рецептуры для орального введения 42-эфира рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой описаны в патентной публикации США No. US 2004-0077677 А1 (также в патентной публикации США No. 10/663506). Такие рецептуры для орального применения включают грануляцию с использованием технологии влажной грануляции.
В некоторых случаях может быть желательным введение соединения непосредственно через дыхательные пути в форме аэрозоля.
Соединения могут также вводиться парентерально или внутрибрюшинно. Растворы или суспензии этих активных соединений в виде свободного основания или фармацевтически приемлемой соли могут быть приготовлены в воде, соответственно смешанной с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропилцеллюлоза. Дисперсии могут быть также приготовлены в глицероле, жидких полиэтиленгликолях, в их смесях в маслах. Эти препараты содержат консерванты для предотвращения роста микроорганизмов в обычных условиях хранения и использования
Фармацевтические формы для инъекций включают стерильные водные растворы или дисперсии, а также стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой в степени, приемлемой для введения через шприц. Она должна быть стабильной в условиях приготовления и хранения и устойчивой к контаминирующему действию таких микроорганизмов, как бактерии и грибы. Носителем может быть растворитель или дисперсная среда, содержащая, например, воду, этанол, высокоатомные спирты (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), а также их соответствующие смеси и растительные масла.
В одном опыте инъекционные рецептуры для 42-эфира рапамицина с 3-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метилпропионовой кислотой описаны в патентной публикации США No. US 2004-0167152 А1 (также в патентной публикации США No. 10/626943).
Парентеральные рецептуры, применяемые в данном изобретении, могут быть использованы для получения формы дозирования, которая приемлема или для введения препарата прямой инъекцией, или добавления препарата к стерильным инфузионным жидкостям для внутривенного введения.
Подразумевают, что трансдермальное введение включает все способы введения препарата через поверхность тела и внутренние оболочки проводящих путей, включая эпителиальную ткань и ткани слизистых оболочек. Такие введения препарата могут проводиться с использованием данных соединений или их фармацевтически приемлемых солей в форме примочек, кремов, пен, пластырей, суспензий, растворов и суппозиториев (ректальных и вагинальных).
Трансдермальное введение может быть осуществлено с помощью трансдермальных пластырей, содержащих активное соединение и носитель, который инертен для активного компонента, является нетоксичным для кожи и позволяет доставлять агент для соматической абсорбции в кровяное русло через кожу. Носитель может быть, например, в форме кремов и мазей, паст, гелей и окклюзионных приспособлений. Кремы и мази могут быть вязкими жидкостями или полутвердыми эмульсиями типа «масло в воде» или «вода в масле». Также могут применяться пасты, содержащие абсорбирующие порошки, диспергированные в петролеуме или гидрофильные петролеумсодержащие активные ингредиенты. Для высвобождения активного ингредиента в кровяное русло могут быть использованы разнообразные окклюзионные приспособления, такие как полупроницаемая мембрана, закрывающая резервуар, содержащий активный ингредиент с носителем или без него, или матрицу, содержащую активный ингредиент. Другие известные окклюзионные приспособления описаны в литературе.
Суппозиторные рецептуры могут быть получены из традиционных веществ, включающих масло какао с добавлением или без добавления восков для изменения точки плавления суппозиториев, а также глицерин. Также могут быть использованы водорастворимые основы суппозиториев, такие как полиэтиленгликоли различной молекулярной массы.
Более того, данное изобретение представляет упаковку и комлекты, содержащие региоспецифические 42-производные рапамицина, полученные в соответствии с данным изобретением и изготовленные по рецептуре для введения соответствующим способом. В одном опыте региоспецифические 42-производные рапамицина предоставлены для применения в одноразовой дозированной форме. Различные соответствующие емкости, включая бутылки, пузырьки, прозрачные упаковки и им подобные упаковки, известны в данной области. Такие упаковка и комплекты могут содержать и другие комплектующие, включая, например, инструкции для использования, шприцы, инструменты для введения в полость лечебного средства и т.п.
Перечисленные ниже примеры поясняют способы данного изобретения региоспецифического производства производных 42-эфира рапамицина. Как показано в нижеследующих примерах, липаза Candida antarctica особенно хорошо подходит по своей способности катализировать трансэтерификацию рапамицина в его 42-ацилпроизводные, используя винилацетат в качестве ацильного донора. Однако, как установлено выше, изобретение не ограничивается только этим типом липаз, поэтому могут быть использованы и другие соответствующие липазы микробного происхождения. Например, при использовании липазы PS Pseudomonas cepacia и ее иммобилизованной формы - липазы PS-C "Amano" II, Липазы PS-D - условия реакции могут включать более высокую температуру с большим количеством фермента. Например, в одном опыте, где используется иммобилизованная липаза PS-C, требуется удвоенное количество липазы (т.е. для достижения скорости преобразования липазы Novozym 435 при комнатной температуре требуется взять 200% липазы от веса рапамицина; в качестве альтернативы температура может быть увеличена до 45°С, при этом используется меньшее количество фермента (100% от веса рапамицина)).
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры иллюстрируют способ данного изобретения, используя виниловый эфир (примеры 1-8), изопропениловый эфир (пример 9) или ангидрид (примеры 10-12).
2
В одном опыте смесь рапамицина (20 мг, 0,022 ммоль), винилового эфира (50 мкл) и липазы NOVOZYM 435 (20 мг) в ТБМЭ (0,5 мл) перемешивали при комнатной температуре (кг) или при 45°С в присутствии N до тех пор, пока все исходные вещества не были израсходованы, что контролировалось с помощью ТСХ. Фермент отфильтровывали и промывали ТБМЭ. Смешанный органический растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью хроматографической силикагелевой колонки, элюируя смесью гексан-ацетон (в объемном соотношении 2:1) или перекристаллизовывали из гексан-ацетона. Дополнительные примеры проиллюстрированы в нижепредстаиленных схемах.
Пример 1
Пример 2
Пример 3
Пример 4
Пример 5
Пример 6
Пример 7
Пример 8
Пример 9
Согласно данному изобретению производные 42-эфира рапамицина получали, используя ангидриды в качестве ацильного донора, следующим образом.
2
2
Смесь рапамицина (20 мг, 0,022 ммоль), ангидрида (30 мг) и липазы NOVOZYM 435 (20 мг) в ТБМЭ (0,5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч (в присутствии N, без доступа света. [В случае уксусного ангидрида или пропионового ангидрида после 48 ч добавляли другую порцию липазы NOVOZYM 435 (20 мг) и ТБМЭ (0,1 мл), и смесь перемешивали дополнительные 48 ч до завершения реакции]. Растворитель затем удаляли, промывая газообразным азотом (N). Остаток очищали с помощью хроматографической силикагелевой колонки, элюируя смесью гексен-ацетон (в объемном соотношении 2:1) или перекристаллизовывали из гексан-ацетона. Продукт выделяли как белое твердое вещество.
Пример 10
Пример 11
Пример 12
Данное изобретение не ограничивается рамками описанных здесь специфических реакций. Несомненно, различные модификации изобретения, помимо описанных здесь, станут очевидными для специалиста в данной области из вышеупомянутого описания, сопровождаемого рисунками. Подразумевается, что такие модификации должны выполняться в рамках прилагаемых формул изобретения.
Кроме того, понятно, что значения являются приблизительными и представлены для описания.
Патенты, патентные публикации, статьи, методики и другие подобные им документы, приведенные в данном документе, описания которых представлены здесь, имеют ссылки на их полные версии. Учитывая, что в представленном здесь открытии могут возникать противоречия между техническим условием и представленным здесь документом, языковой стиль этого изобретения подлежал проверке.