Использование ВЭЖХ-масс-спектрометрии в анализе биологически активных веществ из морских источников

2001

Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра

Том 129

В.И.Высоцкий*, В.Г.Рыбин, О.Ю.Слабко*, Г.А.Вербицкий*, Д.В.Куклев

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ВЭЖХ-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ В АНАЛИЗЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ МОРСКИХ ИСТОЧНИКОВ

Одним из наиболее активно развивающихся методов анализа биологически активных веществ является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (Matissek, Wittkowski, 1990; Katz, 1996). Основное преимущество метода ВЭЖХ - возможность анализа широкого класса соединений без их предварительной модификации, что является необходимым шагом, например, при газовой хроматографии. В течение последних 20 лет метод ВЭЖХ стал применяться во многих областях химии, а для биохимиков ВЭЖХ - один из основных методов исследований. К настоящему времени жидкостные хроматографы оснащаются широким спектром детекторов, среди которых наибольшее распространение получили ультрафиолетовый, рефрактометрический и флюориметрический

(Christie, 1992).

В последнее время в практику химических и биохимических исследований все активнее вовлекается ВЭЖХ-масс-спектрометрия (ВЭЖХ-MC) (Энгельгардт, 1980). Приборное оформление этого метода может быть различным. Основной проблемой в течение длительного времени было непосредственное соединение жидкостного хроматографа высокого давления с масс-спектрометром (масс-селективным детектором). Это объясняется тем, что количество элюента при ВЭЖХ так велико, что с ним не может справиться обычная вакуумная система. При скорости расхода элюента 1 мл/мин образуется (при нормальных условиях) 4501200 мл/мин пара, в то время как для современных масс-спектрометрических вакуумных систем допустимые количества (при нормальных условиях) составляют 1-20 мл/мин. Указанная проблема удовлетворительно решалась различными способами, например щелевой сепарацией паров, послеколоночным делением потока либо обогатительными системами (транспортный детектор) (Энгельгардт, 1980).

В настоящее время эта проблема успешно решается в приборно-реализованных инструментах, например Agilent 1100 MSD ("Hewllet Packard", США). Принцип действия механизма отделения элюата от растворителя состоит в его распылении и обдуве азотом при высокой температуре (250-300 оС). Прибор комплектуется двумя типами ионизационных камер: для химической ионизации при атмосферном давлении

52

(ХИАД) и для электроспрея (ЭС). В первом случае (ХИАД) распыленный элюат в горячей азотной атмосфере попадает в зону коронного разряда, где ионизированные молекулы азота ионизируют молекулы растворителя элюата в газовой фазе, которые в свою очередь ионизируют молекулы анализируемого вещества (Wachs et al., 1991). Во втором случае (ЭС) распыленный элюат в горячей азотной атмосфере попадает в зону высокого потенциала, где происходят интенсивное дробление капелек при превышении релеевского радиуса плотности заряда и ионизация при столкновении молекул растворителя с анализируемым веществом (Gaskell, 1997). Образовавшиеся в обоих случаях ионы подаются на ионную оптику масс-спектрометра через капилляр с приложенным на него потенциалом (ионный сепаратор) и далее на квадруполь, где и происходит масс-детекция.

Применимость описанных методов мягкой ионизации в настоящее время активно изучается, однако, как правило, авторы статей и обзоров в научной литературе ограничиваются каким-либо одним классом соединений, например флавоноидами (Justesen et al., 1998) или экдистеро-идами (Bathori, 1998).

Целью настоящей работы было исследование применимости ВЭЖХ-МС к анализу широкого круга низкомолекулярных биорегуляторов, полученных из различных природных (в основном морских) объектов и из их производных. Основная часть аналитической работы выполнена в Научно-образовательном центре Института химии и прикладной экологии Дальневосточного государственного университета и Тихоокеанском научно-исследовательском рыбохозяйственном центре (г. Владивосток).

Описание метода

Все эксперименты проводили на ВЭЖХ-МС системе Agilent MSD 1100 ("Hewlett Packard", США) в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (ХИАД).

Ток азота (газ-осушитель) составлял 6 л/мин при работе в режиме регистрации положительных ионов (ХИАД+) и 3 л/мин при работе в режиме регистрации отрицательных ионов (ХИАД-), температура азота 300 oC (в обоих случаях). Напряжение на капилляре в режиме регистрации положительных ионов 4000 В и 2500 В - при работе в режиме регистрации отрицательных ионов. Напряжение на фрагменторе 100 В (другое указывается в конкретном случае). Напряжение коронного разряда 2500 В. Диапазон регистрируемых m/z составлял от 180 до 1000, в зависимости от природы используемого растворителя, например, для метанола - от 105, для ацетонитрила - от 140, для пропанола-2 - от 180.

Детектор на диодной матрице работал в режиме регистрации поглощения при длинах волн от 200 до 700 нм с разрешением 2-4 нм.

В работе использовалась колонка Shim-Pack FLC-ODS (4,6 x 5,0 мм, 3 мкм, 5600 тт; "Shimadzu", Япония) и водно-метанольные, водно-ацето-нитрильные и водно-изопропанольные смеси как подвижные фазы, при скорости потока 0,3-0,5 мл/мин и температуре колонки 55 oC.

Результаты ВЭЖХ-масс-спектрометрического исследования

Каротиноиды

Исследовались растительные каротиноиды и каротиноиды морского ежа Strongylocentrotus nudus.

а- и p-каротины из 100 г корней Daucus carota экстрагировали 500 мл гексана, как описано ранее (Khachik et al., 1988). Г ексановый экстракт сушили над безводным Na2SO4, упаривали в вакууме и очищали сухой остаток хроматографией на 10 г силикагеля (элюэнт - я-гексан). Фракции, содержащие каротиноиды, объединяли, концентрировали до объёма 5 мл в вакууме и аликвоту анализировали ВЭЖХ-МС.

Каротиноиды морского ежа Strongylocentrotus nudus извлекали по следующей методике. 980 мг липидов гонад морских ежей смешивали с 0,5 мл 10 % -ного водного раствора KOH и 10 мл этилового спирта. Смесь кипятили с обратным холодильником до полного растворения липидов (если полного растворения не происходило, то добавляли еще 10 мл спирта и продолжали нагревание). После этого к раствору добавляли 10 мл спирта, 20 мл воды и 25 мл диэтилового эфира, тщательно перемешивали, после чего эфирный слой отделяли. Процедуру экстракции повторяли 3 раза, эфирные фракции объединяли, сушили над безводным Na2SO4 и упаривали в вакууме. Получали 28 мг неомыляемой фракции, перерастворяли в 5 мл ацетонитрила и аликвоту анализировали ВЭЖХ-МС.

Длинная цепь сопряженных двойных связей способствует увеличению устойчивости ионизированной молекулы каротиноида, что можно наблюдать на масс-спектре эхиненона (рис. 1). Данный каротиноид, благодаря наличию кето-группы, легко образует устойчивый квазимолеку-лярный ион состава [M+H]+. Масс-спектр p-каротина отличался от спектра эхиненона не только значительно низкой относительной интенсивностью (50 %) квазимолекулярного иона состава [M+H]+, но и значительно более слабым сигналом полного ионного тока (10 мА, по сравнению с эхиненоном - 250 мА), при том что площадь хроматографического пика p-каротина при детекции в УФ-диапазоне при длине волны 455 нм (область максимума поглощения p-каротина и эхиненона) была немного меньше (не более чем на 5 %), чем у эхиненона. Этот факт свидетельствует о гораздо более слабой степени ионизации углеводородов по сравнению с их монокислородсодержащими аналогами. Мы полагаем, что при анализе природных смесей, содержащих широкий спектр каро-тиноидов, в том числе и углеводороды, необходимо учитывать факт слабой ионизации последних и для их точной идентификации в сложных смесях проводить дополнительную пробоподготовку, направленную на концентрирование именно углеводородных представителей каротиноидов.

551.4 [М + Н] +

100

Рис. 1. Масс-спектр эхиненона

F ig. 1. Mass-

spectrum of echinenone

U

O

X

o

**

400

**--------

700 mh

200

300

600

Масс-спектр эхиненона (рис. 1) регистрировался в режиме ХИАД(+) и характеризовался наличием основного сигнала иона [ M+H]+ (m/z 551), интенсивность которого составляла 100 %, и сигналов ионов неизвестного происхождения с величиной m/z, большей, чем 551 с интенсивностью (5-10 %). Масс-спектры а- и в-каротинов отличались от масс-спектра эхиненона сравнительно небольшой интенсивностью (около 50 %) сигнала протонированного молекулярного иона m/z 537.

Жирные кислоты и их производные

Высокочистые препараты свободных жирных кислот (табл. 1), а также их метиловых эфиров и этаноламидов, полученные, как описано ранее (Модифицированные жирные кислоты, 1997), анализировались ВЭЖХ-МС с использованием подвижной фазы ацетонитрил-вода (80: 20) в режиме регистрации отрицательных ионов (свободные жирные кислоты) и положительных ионов (метиловые эфиры и этаноламиды).

Таблица 1

Основные ионы, наблюдаемые в масс-спектрах жирных кислот и их производных

Table 1

The primary ions observed in the mass-spectra of fatty acids and their derivatives

Полиненасыщенная жирная кислота Ионы с относительной интенсивностью Свободная кислота Метиловый эфир [m-h]- [m+h]+ 100 % Этаноламид [m+h]+

18:3ю3 277 293 322

18:4ю6 275 291 320

18:5ю3 273 289 318

20:4ю6 303 319 348

20:5w3 301 317 346

22:5ю6 329 345 374

22:6ю3 327 343 372

Примечание. 18:3ю3 - а-линоленовая кислота. 18:4ю6 - 32,62,92,122-октадекатетраеновая кислота (ОДТК). 18:5ю3 - 32,62,92,122,152-октадека-пентаеновая кислота (ОДПК). 20:4ю6 - 52,82,112,142-эйкозатетраеновая кислота, арахидоновая кислота (АК). 20:5ю3 - 52,82,112,142,172-эйкозапентае-новая кислота (ЭПК). 22:5ю6 - 42,72,102,132,162-докозапентаеновая кислота (ю6-ДПК). 22:6ю3 - 42,72,102,132,162,192-докозагексаеновая кислота (ДГК).

Жирные кислоты и их производные имеют в своих структурах как электронно-донорные, так и электронно-акцепторные группы, что обусловливает образование не только положительных, но и отрицательных ионов в режиме ХИАД. Результаты проведенных исследований показали, что в случае наличия свободной карбоксильной группы акцепторный фактор превалирует над донорным, поэтому анализ данного класса соединений (карбоновые кислоты) предпочтительнее проводить в режиме регистрации отрицательных ионов. В случае ХИАД жирных кислот, модифицированных по карбоксильной группе (иод-лактоны, сложные эфиры, этаноламиды), происходит преимущественное образование положительных ионов состава [М+Н]+, что обусловливается доминированием донорного фактора над акцепторным. Это обстоятельство предопределяет проведение анализа указанных классов соединений в режиме регистрации положительных ионов.

Масс-спектры свободных жирных кислот характеризовались наличием основного сигнала иона [m-h]- , интенсивность которого во всех исследованных нами образцах составляла 100 %, и сигнала иона [M-H-H2O]-, интенсивность которого составляла 10-20 %. Масс-спектры метиловых эфиров жирных кислот характеризовались наличием основного сигнала иона [m+h]+, интенсивность которого составляла 100 %, и сигнала с незначительной интенсивностью (5-10 %) иона [M+H-MeOH]+. Масс-спектры этаноламидов жирных кислот характеризовались наличием основного сигнала иона [M+H-H2O]+, интенсивность которого составляла 100 %, и сигнала иона [m+h]+ интенсивностью 80-100 %.

Масс-спектры иод-лактонов ЭПК и ДГК (см. примечание к табл. 1) регистрировались в режиме ХИАД(+) и характеризовались наличием основного сигнала иона [M+H]+ и иона [M+H-HI]+. Причем в масс-спектре иод-лактона ЭПК (5-лактон) основной сигнал (интенсивность 100 %) давал ион [M+H-HI]+, а интенсивность протонированного молекулярного иона составляла 40 % (рис. 2); в случае же иод-лактона ДГК (у-лактон) основным был сигнал протонированного молекулярного иона (интенсивность 100 %), а интенсивность сигнала протонированного иона, образующегося в результате потери HI, составляла 45-50 %.

Оксилипины

Исследовалась применимость метода ВЭЖХ-МС к анализу простаг-ландинов F2a, B, E полученных биосинтетически, как описано ранее (Бергельсон, Дятловицкая, 1982), и A2, выделенного из общего липидного экстракта коралла Plexaura homomalla (Brash et al., 1987), а также синтетически полученных смесей всех изомеров моногидрокси производных арахидоновой кислоты (а именно, 5-гидрокси-6Е,82,112,142-эйкозатет-раеновой кислоты, 8-гидрокси-52,9Е,112,142-эйкозатетраеновой кислоты, 9-гидрокси-52,7Е,112,142-эйкозатетраеновой кислоты, 11-гидрокси-52,82,12Е,142-эйкозатетраеновой кислоты, 12-гидрокси-52,82,10Е,142-эйкозатетраеновой кислоты и 15-гидрокси-52,82,112,13Е-эйкозатетрае-новой кислоты, полученных из арахидоновой кислоты, как описано ранее) (Модифицированные жирные кислоты, 1997) и 15^)-гидроперокси-52,82,112,13Е-эйкозатетраеновой кислоты, полученной в результате ферментативного окисления арахидоновой кислоты соевой 15-липокси-геназой согласно описанной ранее методике (Куклев и др., 1995).

Оксилипины - оксигенированные производные полиненасыщенных жирных кислот. Наличие свободной карбоксильной группы, как и в случае с жирными кислотами, предопределяет преимущественное образование отрицательных ионов, поэтому масс-спектры всех оксилипинов регистрировались в режиме ХИАД(-) и характеризовались наличием основного сигнала иона [m-h]- и сигналов ионов общей формулы [M-n(H2O)-H]-, обусловленных дегидратацией квазимолекулярного иона [M-h]-, причем количество этих ионов (n) определялось количеством гидроксильных групп в молекуле. Интенсивность этих фрагментов обычно была выше 20 %. В некоторых случаях мы наблюдали дополнительную потерю формульного элемента H2O (моногидрокси производные арахидоновой кислоты), которую мы связываем с возможностью дегидратации карбоксильной группы с образованием кетена. Интенсивность «ке-тенного» иона невелика и составляла обычно менее 10 %. Масс-спектр простагландина A2 является хорошей иллюстрацией для представителей данного класса соединений и характеризуется наличием основного сигнала

56

иона [М-Н] т/z 333, интенсивность которого составляет 100 %, а также сигнала иона [М-Н-Н20]- т/ъ 315, интенсивность которого - 35 % (рис. 3).

Рис. 2. Масс-спектр иод-лактона эйкозапентаеновой кислоты Fig. 2. Mass-spectrum of eicosapentaenoic acid iodlactone

333.2 [M-H]'

COOH

OH

320

Рис. 3. Масс-спектр простаг-лангдина A2

F ig. 3. Mass-sp ectrum o f prostaglandin A2

340

380

400

Альдегиды и их 2,4-динитрофенилгидразоны Нами исследовалась применимость метода ВЭЖХ-МС к анализу ряда 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов, образующихся в процессе автоокисления водно-жировых эмульсий, а именно: формальдегида, ацетальдегида, пропаналя, (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля и (2£,^)-4-гидро-кси-2,6-нонадиеналя. Эти альдегиды были выделены из сложной смеси продуктов автоокисления жира сардины Sardinops melanosticta, как было описано ранее (Рыбин и др., 1999а, б).

57

Необходимость перевода альдегидов в 2,4-динитрофенилгидразо-ны при их анализе связана с трудностью и относительно низкой точностью определения альдегидов в сложных смесях оксигенированных углеводородов даже при использовании хроматографических методов (Рыбин и др., наст. сб., а). Большое разнообразие таких соединений, например, в сложных смесях продуктов автоокисления липидов обусловливает применение дериватизационных методов предварительного фракционирования. В случае 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов было показано (Svetlova et al., 1986; G oldring et al., 1993; Р ыбин и др., наст. сб., а), что компоненты исходной смеси продуктов окисления липидов обладают ВЭЖХ-подвижностью, значительно меньшей (для обращенно-фаз-ной хроматографии), чем 2,4-динитрофенилгидразоны альдегидов, присутствующих в такой смеси. Иными словами, проведение предварительного фракционирования в данном случае не является необходимым фактором. Следовательно, при использовании такого дериватизационно-го метода существенно возрастает точность анализа альдегидов, многочисленные представители которых являются высоколабильными соединениями.

Масс-спектры 2,4-динитрофенилгидразонов всех альдегидов (табл. 2) регистрировались в режиме ХИАД(-) и характеризовались наличием основного сигнала иона [M-H]- и, в случае наличия в структуре гидразона свободной гидроксильной группы, сигналом иона [M-H-H2O]-, обусловленного дегидратацией (интенсивность около 20 %). Так, например, в масс-спектре 2,4-динитрофенилгидразона (2£)-4-гидрокси-2-нонена-ля присутствует как сигнал иона [ M-H]- (m/z 335, интенсивность 100 %), так и сигнал иона [M-H2O-H]- (m/z 317, интенсивность 15 %) (рис. 4).

Таблица 2

Основные ионы, наблюдаемые в масс-спектрах 2,4-динитрофенилгидразонов

некоторых альдегидов

Table 2

The preliminary ions observed on mass-spectra of 2,4-dinitrophenylhydrazone derivative of some aldehydes

Ион Формаль- Ацеталь- Пропа- (2Е)-4-гидрокси- (2E,6Z)-4-гидрокси-дегид дегид наль 2-ноненаль 2,6-нонадиеналь

[M-H]- 209 223 235 335 333

[M-H-H0O]~ Нет Нет Нет___________317_______________315_______

юо -

80

О

X

ш

о 60

40

"Ыу4

CWN

ОН

1-Н]- 335.1

[М-Н-Н20]-

150

200

250

300

Р ис. 4. М асс-спектр 2,4-динитрофенилгидразона (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля Fig. 4. Mass-spec-trum of 2,4-dinitrophenylhydrazone derivative o f (2E )-4-hy droxy-2-nonenal

350

400

Стероиды

Исследовалась применимость метода ВЭЖХ-МС к анализу стероидов, а именно: тестостерону, андростерону, 17в-эстрадиолу и 20-гидрокси-экдизону. Тестостерон, андростерон, эстрадиол были приобретены у фирмы «Sigma» (США), 20-гидроксиэкдизон выделен самостоятельно (Рыбин и др., наст. сб., б).

При использовании метода ВЭЖХ для анализа соединений стероидной природы необходимо учитывать, что они могут значительно отличаться друг от друга по количеству гидроксильных групп (например, холестерин содержит одну гидроксильную группу, а 20-гидроксиэкдизон -шесть). Отмеченное обстоятельство делает практически невозможным проведение анализа биологических объектов на предмет содержания различных стероидов без проведения предварительного фракционирования компонентов исследуемых смесей, например, по их относительной полярности.

Масс-спектры стероидов регистрировались в режиме ХИАД(+) и характеризовались наличием основного сигнала иона [M+H]+ и сигналами ионов [ M+H-n(H2O)]+, обусловленных дегидратацией (интенсивность около 40 %). Причем в масс-спектре 17в-эстрадиола мы не наблюдали дегидратации, связанной с потерей фенольной гидроксильной группы, в масс-спектре 20-гидроксиэкдизона, содержащем 6 гидроксильных групп, мы не наблюдали сигнала иона с m/z 375, что, по-видимому, связано с трудностью дегидратации при С-14 атоме (третичная спиртовая группа). Наиболее интересным, с нашей точки зрения, является масс-спектр 20-гидроксиэкдизона (рис. 5), в котором мы наблюдали сигналы протони-рованного молекулярного иона [M+H]+ m/z 481 и ионов, образующихся при последовательной дегидратации: m/z 463 [M-(H2O)+H]+, m/z 445 [M-2(H2O)+H]+, m/z 427 [M-3(H2O)+H]+, m/z 409 [ M 4(H2O)+H]+ и m/z 391 [M-5(HO)+H]+.

Рис. 5. Масс-спектр 20-гидроксиэкдизона Fig. 5. Mass-spectrum of 20-hydroxyecdysone

Заключение

Оптимальные условия, предлагаемые нами для проведения анализа

методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селек-

тивной детекцией пяти классов биологически активных соединений

59

липидной природы, выделенных из морских источников или полученных синтетически из субстратов морского происхождения, представлены в табл. 3.

Таблица 3

Условия ВЭЖХ-МС для анализа некоторых классов биологически активных веществ

Table 3

Conditions of HPLC-MS for analysis of the some classes of biologically active compounds

Условия МС-детекции

Условия ВЭЖХ

Класс Темпе- Заряд Напря-

соедине- Скорость ратура Режим реги- жение

ний Колонка Элюент потока, колон- иони- стри- фраг-

мл/мин ки, оС зации руемых менто-

ионов ра, В

Каротино- иды Shim-Pack FLC ODS (4,6х50,0 мм 3 мкм) Ацетонитрил 0,5 55 ХИАД + 100

Жирные кислоты и их производные То же Ацетонитрил- " вода (80: 20) " " +, - 100

Оксили- пины Ацетонитрил- " вода (80: 20) " " - 100

Альдегиды и их 2,4-динитро-фенилгид-разоны Ацетонитрил- " вода (60: 40) 75

Стероиды Ацетонитрил- " вода (20: 80) " " + 100

Эти условия применительно к данному методу анализа можно подразделить на хроматографические и масс-спектрометрические. Условия проведения ВЭЖХ при использовании одной колонки, температуры и одинакового расхода элюента различаются для разных классов соединений выбором подвижной фазы. Выбор условий проведения масс-спектрометрической детекции в режиме ХИАД зависит от преобладающего типа (заряда) ионов, образующихся при ионизации анализируемых соединений (режим регистрации, табл. 3), а также от степени устойчивости квазимолекулярных ионов (фрагментор, табл. 3).

Таким образом, нами продемонстрирована эффективность применения высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектромет-рии - при анализе разнообразных биологически активных веществ липидной природы и родственных соединений, а именно: каротиноидов, жирных кислот и их производных, оксилипинов, альдегидов и их 2,4-динит-рофенилгидразонов, стероидов.

Литература

Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В.

дов. - М.: Наука, 1982.

Препаративная биохимия липи-

Куклев Д.В., Когтева Г.С., Латышев Н.А., Безуглов В.В. Окисление октадекапентаеновой (18:5n-3) кислоты соевой 15-липоксигеназой // Биоорган. химия. - 1995. - Т. 21, № 8. - С. 651-653.

Модифицированные жирные кислоты / Ред. Д.В.Куклев, В.В.Безуглов. - Владивосток, 1997. - 114 с.

Рыбин В.Г., Куклев Д.В., Машкин Д.С., Блинов Ю.Г. Определение (2£)-4-гидрокси-2-ноненаля в смесях продуктов окисления рыбных жиров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Наст. сб., а.

Рыбин В.Г., Зарембо Е.В., Куклев Д.В., Горовой П.Г. Идентификация 20-гидроксиэкдизона в гемолимфе Paralithodes camtschatica (Lithodidae) и соцветиях Serratula coronata var. Manshurica (Asteraceae) // Наст. сб., б.

Рыбин В.Г., Куклев Д.В., Бывальцева Т.М. и др. (2£)-4-гидрокси-2-ноненаль - активный компонент нового природного антимикробного препарата // Биоорган. химия. - 1999а. - Т. 25, № 9. - С. 716-720.

Рыбин В.Г., Куклев Д.В., Бывальцева Т.М. и др. (2£,62)-4-гидро-кси-2,6-нонадиеналь - активный компонент антимикробного препарата // Изв. ТИНРО. - 1999б. - Т. 125. - С. 238-243.

Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. -М.: Наука, 1980. - 245 с.

Bathori M. Purification and characterisation of plant ecdysteroids of Silene species // Trends Anal. Chem. - 1998. - Vol. 17, № 6. - P. 372-383.

Brash A.R., Baertschi S.W., Ingram C.D., Harris T.M. On non-cy-clooxygenase prostaglandin synthesis in see whi p coral Plexaura homomalla // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262, № 33. - P. 15829-15839.

Christie W.W. Detectors for HPLC of lipids with special reference to evaporate light-scattering detection // Advances in Li pid Methodology (1) / Ed. W.W.Christie. - Ayr: The Oily Press, 1992. - P. 239-272.

Gaskell S.J. Electrospray: Princi ples & Practice // J. Mass Spectrom. -1997. - Vol. 32. - P. 677-688.

Goldring C., Casini A.F., Maellaro E. et al. Determination of 4-hydrox-ynonenal by high-performance liq uid chromatography with electrochemical detection // Li pids. - 1993. - Vol. 28 , № 2. - P. 141-145.

Justesen U., Knuthsen P., Leth T. Quantative analysis of flavonoids, flavones and flavonones in fruits, vegetables and beverages by HPLC with photodiode array and mass spectrometric detection // J. Chromatography. - 1998. -Vol. 799. - P. 101-110.

Katz E.D. High Performance Liq uid Chromatography / Eds J.Willey, S.Chichester. - England, 1996. - 522 p.

Khachik F., Beecher G.R., Lusby W.R. Separation and identification of carotenoids and carotenol fatty acids esters in some sq uash products by liq uid-chromatography. Isolation and characterization of carotenoida and related esters // J. Agricul. Food. Chem. - 1988. - Vol. 36, № 5. - P. 938-946.

Matissek R., Wittkowski R. HPLC in food control and research. - Tech-nomic Pbs. Basel, 1990. - 385 p.

Svetlova N.I., Sokolova L.I., Grigoryeva D.N., Golovnya R.V. Application of the universal eq uation for liq uid chromatography to the calculation of the retention parameters for 2,4-dinitrophenylhydrazone derivatives of carbonyl compounds // J. Chromatography. - 1986. - Vol. 364. - P. 203-207.

Wachs T., Conboy J.C., Garicia F., Henion J.D. Liq uid Chromatography-Mass Spectrometry and Related Techniq ues via Atmospheric Pressure Ionization // J. Chromatogr. Sci. - 1991. - Vol. 29. - P. 357-366.

Поступила в редакцию 18.05.2001 г.