СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ ИММУНОГЛОБУЛИНА
METHOD OF VIRUS INACTIVATION FOR IMMUNOGLOBULIN PRODUCTION

Изобретение относится к медицине, а именно к инактивации вирусов в производстве глобулинов, которые относятся к белкам плазмы крови, принимающим участие в иммунных реакциях, и может быть использовано при производстве лекарственных препаратов, которые содержат иммуноглобулин фракции G.
Существенной проблемой при использовании лекарственных препаратов, полученных из биологического материала, является опасность контаминации вирусами. Известные методы инактивации вирусов, в частности тепловая обработка, неприемлемы к такому биологическому сырью, как глобулярные белки плазмы крови, поскольку приводят к их разрушению и потере биологической активности.
Наиболее близким является способ инактивации вирусов при получении иммуноглобулина, включающий очистку раствора иммуноглобулина, выделенного спиртовым фракционированием (RU, патент №2261112, кл. А61К 39/395, опубл. 27.09.2005). Очистка по известному способу предусматривает обработку раствора, который содержит разбавленный 12-ю объемами воды для инъекций экстракт спиртового осадка Б (III фракция Кона) и хлорид натрия, хлороформом, который добавляют к 3 мас.%, при рН 4,0…5,0. Смесь выдерживают в течение 14 часов при 0…3°С, центрифугируют, осадок удаляют и проводят осветляющую фильтрацию.
Недостатком известного способа является низкий уровень удаления/инактивации вирусов при проведении указанной обработки, что оставляет его вирусоопасным. В связи с этим известный способ предусматривает проведение дополнительной инактивации вирусов при комнатной температуре путем выдержки в течение 20…25 дней.
Задачей изобретения является усовершенствование способа инактивации вирусов при получении иммуноглобулина, в котором за счет предложенной обработки и условий ее проведения повышается эффективность удаления/инактивации вирусов, что обеспечивает вирусобезопасность иммуноглобулина для лекарственных препаратов. Предложенный способ является технологичным и легко контролируется.
Поставленная задача решается предложенным способом инактивации вирусов при получении иммуноглобулина, который включает очистку раствора иммуноглобулина, выделенного спиртовым фракционированием, в котором при очистке раствор иммуноглобулина предварительно обрабатывают сольвент-детергентной смесью, обработанный иммуноглобулин иммобилизуют на сульфопропилкатионитном сорбенте и осуществляют в две стадии промывание с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией. На первой стадии промывания используют ацетатный буферный раствор, который содержит октаноат натрия, хлорид натрия и пропиленгликоль, например 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, и промывание ведут объемом, соответствующим пяти объемам сорбента. На второй стадии промывания используют ацетатный буферный раствор, например 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, и промывание ведут объемом, соответствующим трем объемам сорбента. Лучше на первой и второй стадиях промывание проводить со скоростью 3 см/мин.
В качестве сольвент-детергентной смеси используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Обработку ведут путем перемешивания сольвент-детергентной смеси и раствора иммуноглобулина в течение 12…16 часов с последующим разбавлением 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л.
3
Для иммобилизации иммуноглобулина используют сульфопропилкатионитный сорбент, который имеет размер зерен 50 мкм, и сорбционную емкость 55 мг/см. Элюцию обработанного и промытого иммуноглобулина осуществляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия.
Экспериментально было установлено, что предварительная сольвент-детергентная обработка раствора иммуноглобулина, выделенного спиртовым фракционированием, с последующей его иммобилизацией на сульфопропилкатионитном сорбенте и промывкой определенным ацетатным буферным раствором приводят к повышению эффективности удаления/инактивации вирусов, что обеспечивает вирусобезопасность препаратов иммуноглобулина.
Способ осуществляется таким образом.
3
Иммуноглобулин, выделенный спиртовым фракционированием по методу Кона (раствор осадка «В»), растворяют в ацетатном буферном растворе. 3%-ный раствор иммуноглобулина обрабатывают сольвент-детергентной смесью. Эта стадия технологического процесса включает экспозицию иммуноглобулина раствором, который содержит сольвент и детергент. Как сольвент используют, например, три-н-бутилфосфат, как детергент - октоксинол 10, полисорбат 80, β-пропиоллактон и другие поверхностно-активные вещества. Смешивание проводят в реакторе. Например, 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80, смешивают с раствором иммуноглобулина. Смесь перемешивают в течение 12…16 часов при температуре 25°С. Далее смесь разбавляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Обработанный таким образом иммуноглобулин с помощью колоночной хроматографии при линейной скорости элюента 1 см/мин иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте, который имеет сорбционную емкость 55 мг/см и зерна размером 50 мкм.
После завершения сорбции осуществляют в две стадии промывание предварительно обработанного иммуноглобулина, иммобилизированного на сульфопропилкатионитном сорбенте, при линейной скорости элюента 3 см/мин. На первой стадии промывания используют ацетатный буферный раствор того же состава, что и для разбавления смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Промывание ведут объемом, соответствующим пяти объемам сорбента.
На второй стадии промывания используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5. Промывание ведут объемом, соответствующим трем объемам сорбента.
Элюцию иммуноглобулина осуществляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия.
Элюат содержит иммуноглобулин G в концентрации 3,5…4%.
Ниже приведены примеры, демонстрирующие эффективность способа инактивации вирусов при получении иммуноглобулина, но не ограничивающие его. Согласно требованиям GMP, преднамеренное внесение любого вируса в производственные помещения не допускается. Поэтому валидация проводилась в отдельной лаборатории, оборудованной соответствующим образом, с использованием модели производственного процесса (примеры 1-6).
Пример 1.
Для демонстрации эффективности удаления/инактивации вирусов предложенным способом использовали модельные вирусы вирусной диареи ВРХ (BVDV).
3 г осадка «В» иммуноглобулина человека, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, растворили в 15 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С.
10
50
3
3
В 3%-ный раствор иммуноглобулина вносили 6,45 log ТЦЛД/см вируса BVDV. В емкость, содержащую 15 мл 3%-ного раствора иммуноглобулина с вирусом BVDV, прибавили 15 мл сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 12 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Далее в емкость добавляют 90 мл раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонку диаметром 15 мм, содержащую 23 см сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1,7 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 70 мин. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонку пропускают 110 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержащего 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 5 мл/мин (отвечает линейной скорости - 3 см/мин) в течение 20 минут. Потом промывают 70 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 15 минут.
Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 50 минут. Элюат в количестве 34 мл собирали в стерильную посуду и проводили ультрафильтрацию.
10
50
3
Титр инфекционности вируса BVDV после инактивации - <1,0 log ТЦЛД/см.
Пример 2.
Для демонстрации эффективности удаления/инактивации вирусов предложенным способом использовали модельные вирусы псевдобешенства (PRV).
3 г осадка «В» иммуноглобулина человека, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, растворили в 15 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С.
10
50
3
3
В 3%-ный раствор иммуноглобулина вносили ≥7,33 log ТЦЛД/см вируса PRV. В емкость, содержащую 15 мл 3%-ного раствор иммуноглобулина с вирусом PRV, добавили 15 мл сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 14 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Далее в емкость добавляют 90 мл раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонку диаметром 15 мм, содержащую 23 см сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1,7 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 70 мин. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонку пропускают 110 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержащего 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 5 мл/мин (соответствует линейной скорости - 3 см/мин) в течение 20 минут. Потом промывают 70 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 15 минут.
Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 50 минут. Элюат в количестве 34 мл собирали в стерильную посуду и проводили ультрафильтрацию.
10
50
3
Титр инфекционности вируса PRV после инактивации составлял <1,0 log ТЦЛД/см.
Пример 3.
Для демонстрации эффективности удаления/инактивации вирусов предложенным способом использовали модельные энтеровирусы свиней (PTV-1).
3 г осадка «В» иммуноглобулина человека, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, растворили в 15 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С.
10
50
3
3
В 3%-ный раствор иммуноглобулина вносили ≥ 7,9 log ТЦЛД/см вируса PTV-1. В емкость, содержащую 15 мл 3%-ного раствора иммуноглобулина с вирусом PTV-1, добавили 15 мл сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 16 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Далее в емкость добавляют 90 мл раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонку диаметром 15 мм, содержащую 23 см сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1,7 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 70 мин. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонну пропускают 110 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержащего 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 5 мл/мин (соответствует линейной скорости - 3 см/мин) в течение 20 минут. Потом промывают 70 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 15 минут.
Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 50 минут. Элюат в количестве 34 мл собирали в стерильную посуду и проводили ультрафильтрацию.
10
50
3
Титр инфекционности вируса PTV-1 после инактивации составлял 3,3 log ТЦЛД/см.
Пример 4.
Для демонстрации эффективности удаления/инактивации вирусов предложенным способом использовали модельный штамм аденовирусов типа 4 (Ad4).
3 г осадка «В» иммуноглобулина человека, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, растворили в 15 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С.
10
50
3
В 3%-ный раствор иммуноглобулина вносили ≥7,0 log ТЦЛД/см вируса Ad4.
3
В емкость, содержащую 15 мл 3%-ного раствора иммуноглобулина с вирусом Ad4, добавили 15 мл сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 12 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Далее в емкость добавляют 90 мл раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1% мас. октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонку диаметром 15 мм, содержащую 23 см сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1,7 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 70 мин. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонку пропускают 110 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержащего 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 5 мл/мин (соответствует линейной скорости - 3 см/мин) в течение 20 минут. Потом промывают 70 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 15 минут.
Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 50 минут. Элюат в количестве 34 мл собирали в стерильную посуду и проводили ультрафильтрацию.
10
50
3
Титр инфекционности вируса Ad4 после инактивации составлял ≤ 5,77 log ТЦЛД/см.
Пример 5.
Для демонстрации эффективности удаления/инактивации вирусов предложенным способом использовали модельные вирусы гепатита утят (DHV-1).
3 г осадка «В» иммуноглобулина человека, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, растворили в 15 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С.
6
3
50
В 3%-ный раствор иммуноглобулина вносили 3,0×10 ЕЛД/см вируса DHV-1.
3
В емкость, содержащую 15 мл 3%-ного раствора иммуноглобулина с вирусом DHV-1 добавили 15 мл сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 12 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Далее в емкость добавляют 90 мл раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонку диаметром 15 мм, содержащую 23 см сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1,7 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 70 мин. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонку пропускают 110 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержащего 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 5 мл/мин (соответствует линейной скорости - 3 см/мин) в течение 20 минут. Потом промывают 70 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 15 минут.
Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 50 минут. Элюат в количестве 34 мл собирали в стерильную посуду и проводили ультрафильтрацию.
3
3
50
Титр инфекционности вируса DHV-1 после инактивации составлял ≤1,0×10 ЕЛД/см.
Пример 6.
Для демонстрации эффективности удаления/инактивации вирусов предложенным способом использовали модельные вирусы ВИЧ 1.
3 г осадка «В» иммуноглобулина человека, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, растворили в 15 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С.
10
50
3
В 3%-ный раствор иммуноглобулина вносили 5,5 log ТЦЛД/см вируса ВИЧ 1.
3
В емкость, содержащую 15 мл 3%-ного раствора иммуноглобулина с вирусом ВИЧ 1, добавили 15 мл сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 12 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Далее в емкость добавляют 90 мл раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонку диаметром 15 мм, содержащую 23 см сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1,7 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 70 мин. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонку пропускают 110 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержащего 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 5 мл/мин (соответствует линейной скорости - 3 см/мин) в течение 20 минут. Потом промывают 70 мл 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 15 минут.
Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 50 минут. Элюат в количестве 34 мл собирали в стерильную посуду и проводили ультрафильтрацию.
10
50
3
Титр инфекционности ВИЧ 1 после инактивации - <1,0 log ТЦЛД/см вируса.
Пример 7.
3 кг осадка «В» иммуноглобулина человека, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, растворили в 15 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 и температуре 4°С.
В реактор, содержащий 15 л 3%-ного раствора иммуноглобулина, с помощью вакуума подают 15 л сольвент-детергентной смеси: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80. Смесь перемешивают при температуре 25°С в течение 12 часов при скорости вращения мешалки 80 об/мин. Далее в реактор с помощью вакуума подают 90 л раствора, который содержит: 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Смесь перемешивают и пропускают через предварительно уравновешенную хроматографическую колонну диаметром 400 мм, содержащую 23 л сульфопропилкатионитного сорбента, при объемной скорости потока 1200 мл/мин (линейная скорость элюента - 1 см/мин). Сорбцию проводят около 10 часов. Иммобилизированный на сульфопропилкатионитном сорбенте предварительно обработанный иммуноглобулин подвергают промыванию в две стадии. Для этого через колонну пропускают 110 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5, содержащего 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л. Раствор пропускают при объемной скорости 3600 мл/мин (соответствует линейной скорости - 3 см/мин) в течение 37 минут. Потом промывают 70 л 0,05 М ацетатного буферного раствора при рН 5,5 в течение 23 минут.
Элюцию иммуноглобулина осуществляли 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 0,2 М хлорида натрия. Процесс элюции длился около 60 минут. Элюат в количестве 34 л собирали в стерильные 20-ти л стеклянные баллоны и проводили ультрафильтрацию.
Титр вирусов после инактивации - отсутствие вирусов. Таким образом, предложенный способ обеспечивает высокую эффективность в удалении вирусов, что повышает вирусобезопасность иммуноглобулиновых лекарственных препаратов, является технологичным и может использоваться в производственном масштабе.