СПОСОБЫ, ОТНОСЯЩИЕСЯ К ПЛЮРИПОТЕНТНЫМ КЛЕТКАМ

1. Способ создания плюрипотентной клетки, предусматривающий:
a. Выделение исходной клетки из раствора;
b. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии а, в сбалансированном солевом растворе Хенкса (HBSS);
c. Суспендирование клеточной суспензии, полученной на стадии b;
d. Добавление от приблизительно 2 до приблизительно 20 объемов HBSS к клеточной суспензии;
e. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии d;
f. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии е, в HBSS, характеризующемся рН, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0;
g. Инкубацию клеток при приблизительно их естественной in vivo температуре;
h. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии g; и
i. Ресуспендирование клеточного осадка, полученного на стадии h, в среде.
2. Способ по п. 1, при котором выделение предусматривает центрифугирование.
3. Способ по любому из пп. 1-2, дополнительно предусматривающий приведение исходной клетки в контакт с трипсином в течение от приблизительно 1 минуты до приблизительно 10 минут перед стадией а.
4. Способ по п. 3, дополнительно предусматривающий приведение исходной клетки в контакт с трипсином в течение от приблизительно 3 минут до приблизительно 5 минут перед стадией а.
5. Способ по любому из пп. 3-4, при котором трипсин дезактивируют путем приведения клеточного осадка в контакт с минимальной эссенциальной средой Игла в модификации Дюльбекко (DMEM)/F-12, содержащей 10% термически инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS).
6. Способ по любому из пп. 1-5, при котором суспендирование на стадии с предусматривает суспендирование клеток через серию щелей или просветов постепенно уменьшающихся диаметров.
7. Способ по п. 6, при котором серия содержит по меньшей мере 3 щели или просвета.
8. Способ по любому из пп. 6-7, при котором по меньшей мере первую щель или просвет предварительно покрывают HBSS или водой.
9. Способ по любому из пп. 6-8, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 2,0 мм.
10. Способ по п. 9, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим от приблизительно 0,7 мм до приблизительно 1,5 мм.
11. Способ по п. 10, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим приблизительно 1,1 мм.
12. Способ по любому из пп. 6-11, при котором суспендирование через первую щель или просвет проводят в течение от приблизительно 1 минуты до приблизительно 10 минут.
13. Способ по п. 12, при котором суспендирование через первую щель или просвет проводят в течение приблизительно 5 минут.
14. Способ по любому из пп. 6-13, при котором последние две щели или просвета в серии характеризуются внутренними диаметрами, составляющими от приблизительно 90 до приблизительно 200 мкм и от приблизительно 25 мкм до приблизительно 90 мкм.
15. Способ по п. 14, при котором последние две щели или просвета в серии характеризуются внутренними диаметрами, составляющими от приблизительно 100 до приблизительно 150 мкм и от приблизительно 50 мкм до приблизительно 70 мкм.
16. Способ по любому из пп. 1-15, при котором суспендирование предусматривает от приблизительно 5 до приблизительно 20 минут суспендирования через от второй до последней щели или просвета и от приблизительно 5 до приблизительно 20 минут суспендирования в последней щели или просвете.
17. Способ по п. 16, при котором суспендирование предусматривает приблизительно 10 минут суспендирования через от второй до последней щели или просвета и приблизительно 15 минут суспендирования в последней щели или просвете.
18. Способ по любому из пп. 6-17, при котором суспендирование в последней щели или просвете продолжают, пока суспензия не будет легко проходить через щель или просвет.
19. Способ по любому из пп. 6-18, при котором суспендирование в каждой щели или просвете продолжают, пока суспензия не будет легко проходить через такую щель или просвет.
20. Способ по любому из пп. 1-19, при котором общее время суспендирования составляет приблизительно 30 минут.
21. Способ по любому из пп. 1-20, при котором приблизительно 5 до приблизительно 15 объемов HBSS добавляют на стадии d.
22. Способ по любому из пп. 1-21, при котором приблизительно 10 объемов HBSS добавляют на стадии d.
23. Способ по любому из пп. 1-22, при котором рН HBSS на стадии f составляет от приблизительно 5,1 до приблизительно 5,7.
24. Способ по любому из пп. 1-23, при котором рН HBSS на стадии f составляет приблизительно 5,4.
25. Способ по любому из пп. 1-24, при котором рН клеточной суспензии в HBSS, полученной на стадии f, составляет от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0.
26. Способ по любому из пп. 1-25, при котором рН клеточной суспензии в HBSS, полученной на стадии f, составляет от приблизительно 5,6 до приблизительно 5,7.
27. Способ по любому из пп. 1-26, при котором стадия f предусматривает ресуспендирование клеток до концентрации, составляющей от приблизительно 0,5 миллиона клеток/мл до приблизительно 4 миллиона клеток/мл.
28. Способ по любому из пп. 1-27, при котором стадия f предусматривает ресуспендирование клеток до концентрации, составляющей приблизительно 2 миллиона клеток/мл.
29. Способ по любому из пп. 1-28, при котором стадия g предусматривает инкубацию клеток приблизительно при 37°С в течение приблизительно 25 минут.
30. Способ по любому из пп. 1-29, при котором объединенные стадии g и h продолжаются от приблизительно 10 минут до приблизительно 1 часа.
31. Способ по любому из пп. 1-30, при котором объединенные стадии g и h продолжаются в течение приблизительно 30 минут.
32. Способ по любому из пп. 1-31, при котором среда на стадии i представляет собой среду для образования клеточных сфер, содержащую DMEM/F12, приблизительно 1% антибиотика, приблизительно 2% В27 и необязательно один или несколько факторов роста.
33. Способ по п. 32, при котором факторы роста содержат bFGF, EGF и гепарин.
34. Способ создания плюрипотентной клетки, при котором исходная клетка присутствует в ткани, содержащей эритроциты, причем способ предусматривает:
а. Механическое разрезание ткани на тонкие срезы в присутствии одного или нескольких расщепляющих ЕСМ ферментов;
b. Инкубацию образца, полученного на стадии а, при приблизительно естественной для ткани in vivo температуре при перемешивании ткани;
c. Разбавление клеточной суспензии, полученной на стадии b, в HBSS;
d. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии с;
e. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии d, в HBSS;
f. Суспендирование клеточной суспензии, полученной на стадии е;
g. Добавление от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 объемов раствора для выделения эритроцитов к клеточной суспензии, полученной на стадии f, для создания бислоя;
h. Отделение слоя HBSS, полученного на стадии g, от слоя раствора для выделения эритроцитов;
i. Выделение клетки из суспензии HBSS, полученной на стадии h;
j. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии i, в HBSS с рН, составляющим приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0;
k. Инкубацию клеток при приблизительно естественной для ткани in vivo температуре;
l. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии k; и
m. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии 1, в среде.
35. Способ по п. 34, при котором ткань, содержащую эритроциты, выбирают из группы, состоящей из:
легкого, селезенки и печени.
36. Способ по любому из пп. 34-35, при котором ткань представляет собой легкое, и расщепляющий ЕСМ фермент представляет собой коллагеназу Р.
37. Способ по любому из пп. 34-36, при котором разрезание на тонкие срезы на стадии а продолжают в течение приблизительно 10 минут.
38. Способ по любому из пп. 34-37, при котором суспендирование на стадии f предусматривает суспендирование клеток через серию щелей или просветов постепенно уменьшающихся диаметров.
39. Способ по п. 38, при котором серия содержит по меньшей мере 3 щели или просвета.
40. Способ по любому из пп. 38-39, при котором по меньшей мере первую щель или просвет предварительно покрывают HBSS или водой.
41. Способ по любому из пп. 38-40, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 2,0 мм.
42. Способ по п. 41, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим от приблизительно 0,7 мм до приблизительно 1,5 мм.
43. Способ по п. 42, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим приблизительно 1,1 мм.
44. Способ по любому из пп. 38-43, при котором суспендирование через первую щель или просвет проводят в течение от приблизительно 1 минуты до приблизительно 10 минут.
45. Способ по п. 44, при котором суспендирование через первую щель или просвет проводят в течение приблизительно 5 минут.
46. Способ по любому из пп. 38-45, при котором последние две щели или просвета в серии характеризуются внутренними диаметрами, составляющими от приблизительно 90 до приблизительно 200 мкм и от приблизительно 25 мкм до приблизительно 90 мкм.
47. Способ по п. 46, при котором последние две щели или просвета в серии характеризуются внутренними диаметрами, составляющими от приблизительно 100 до приблизительно 150 мкм и от приблизительно 50 мкм до приблизительно 70 мкм.
48. Способ по любому из пп. 38-47, при котором суспендирование предусматривает от приблизительно 5 до приблизительно 20 минут суспендирования через от второй до последней щели или просвета и от приблизительно 5 до приблизительно 20 минут суспендирования в последней щели или просвете.
49. Способ по п. 48, при котором суспендирование предусматривает приблизительно 10 минут суспендирования через от второй до последней щели или просвета и приблизительно 15 минут суспендирования в последней щели или просвете.
50. Способ по любому из пп. 34-49, при котором суспендирование в последней щели или просвете продолжают, пока суспензия не будет легко проходить через щель или просвет.
51. Способ по любому из пп. 34-50, при котором суспендирование в каждой щели или просвете продолжают, пока суспензия не будет легко проходить через такую щель или просвет.
52. Способ по любому из пп. 34-51, при котором общее время суспендирования составляет приблизительно 30 минут.
53. Способ по любому из пп. 34-52, при котором рН HBSS на стадии j составляет от приблизительно 5,1 до приблизительно 5,7.
54. Способ по п. 53, при котором рН HBSS на стадии j составляет приблизительно 5,4.
55. Способ по любому из пп. 34-54, при котором рН клеточной суспензии в HBSS, полученной на стадии j, составляет от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0.
56. Способ по п. 55, при котором рН клеточной суспензии в HBSS, полученной на стадии j, составляет от приблизительно 5,6 до приблизительно 5,7.
57. Способ по любому из пп. 34-56, при котором стадия k предусматривает инкубацию клеток приблизительно при 37°С в течение приблизительно 25 минут.
58. Способ по любому из пп. 34-57, при котором объединенные стадии k и l продолжаются от приблизительно 10 минут до приблизительно 1 часа.
59. Способ по любому из пп. 34-58, при котором среда на стадии m представляет собой среду для образования клеточных сфер, содержащую DMEM/F12, 1% антибиотика, 1% В27 и необязательно один или несколько факторов роста.
60. Способ по п. 59, при котором факторы роста содержат bFGF, EGF и гепарин.
61. Способ создания плюрипотентной клетки, предусматривающий:
a. Выделение исходной клетки из раствора;
b. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии а, в растворе сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) и АТР, характеризующемся рН, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5;
c. Суспендирование клеточной суспензии, полученной на стадии b;
d. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии с, в HBSS;
e. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии d; и
f. Ресуспендирование клеточного осадка, полученного на стадии g, в среде.
62. Способ создания плюрипотентной клетки, предусматривающий следующее:
a. Выделение исходной клетки из раствора;
b. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии а, в растворе сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) и АТР, характеризующем рН, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5;
c. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии b;
d. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии с, в растворе HBSS и АТР, характеризующемся рН, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5, до клеточной суспензии;
e. Суспендирование клеточной суспензии, полученной на стадии d;
f. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии е, в HBSS;
g. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии f; и
h. Ресуспендирование клеточного осадка, полученного на стадии g, в среде.
3
63. Способ по любому из пп. 61-62, при котором АТР присутствует в растворе HBSS и АТР в концентрации, составляющей от приблизительно 1,5 до приблизительно 5 мг/см.
64. Способ по п. 63, при котором АТР присутствует в растворе HBSS и АТР в концентрации, составляющей от приблизительно 2,7 мМ до приблизительно 9 мМ.
65. Способ по любому из пп. 61-64, при котором раствор HBSS и АТР, характеризующийся рН, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5, получают путем титрования раствора HBSS с раствором АТР до достижения требуемого рН.
66. Способ по п. 65, при котором раствор АТР характеризуется концентрацией, составляющей от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мМ.
67. Способ по п. 66, при котором раствор АТР характеризуется концентрацией, составляющей приблизительно 200 мМ.
68. Способ по любому из пп. 61-67, при котором раствор HBSS и АТР характеризуется рН, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,7.
69. Способ по любому из пп. 61-68, при котором раствор HBSS и АТР характеризуется рН, составляющим приблизительно 5,0.
70. Способ по любому из пп. 61-69, при котором HBSS на стадии f по п. 62 и стадии d по п. 61 не содержит АТР.
71. Способ по любому из пп. 61-70, при котором выделение предусматривает центрифугирование.
72. Способ по любому из пп. 61-71, дополнительно предусматривающий приведение исходной клетки в контакт с трипсином в течение от приблизительно 1 минуты до приблизительно 10 минут перед стадией а.
73. Способ по п. 72, дополнительно предусматривающий приведение исходной клетки в контакт с трипсином в течение от приблизительно 3 минут до приблизительно 5 минут перед стадией а.
74. Способ по любому из пп. 72-73, при котором трипсин дезактивируют путем приведения клеточного осадка в контакт с минимальной эссенциальной средой Игла в модификации Дюльбекко (DMEM)/F-12, содержащей 10% термически инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS).
75. Способ по любому из пп. 61-74, при котором суспендирование предусматривает суспендирование клеток через серию щелей или просветов постепенно уменьшающихся диаметров.
76. Способ по п. 75, при котором серия содержит по меньшей мере 3 щели или просвета.
77. Способ по любому из пп. 75-76, при котором по меньшей мере первую щель или просвет предварительно покрывают HBSS или водой.
78. Способ по любому из пп. 75-77, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 2,0 мм.
79. Способ по п. 78, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим от приблизительно 0,7 мм до приблизительно 1,5 мм.
80. Способ по п. 79, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим приблизительно 1,1 мм.
81. Способ по любому из пп. 75-80, при котором суспендирование через первую щель или просвет проводят в течение от приблизительно 1 минуты до приблизительно 10 минут.
82. Способ по п. 81, при котором суспендирование через первую щель или просвет проводят в течение приблизительно 5 минут.
83. Способ по любому из пп. 75-82, при котором последние две щели или просвета в серии характеризуются внутренними диаметрами, составляющими от приблизительно 90 до приблизительно 200 мкм и от приблизительно 25 мкм до приблизительно 90 мкм.
84. Способ по п. 83, при котором последние две щели или просвета в серии характеризуются внутренними диаметрами, составляющими от приблизительно 100 до приблизительно 150 мкм и от приблизительно 50 мкм до приблизительно 70 мкм.
85. Способ по любому из пп. 61-84, при котором суспендирование предусматривает от приблизительно 5 до приблизительно 20 минут суспендирования через от второй до последней щели или просвета и от приблизительно 5 до приблизительно 20 минут суспендирования в последней щели или просвете.
86. Способ по п. 85, при котором суспендирование предусматривает приблизительно 10 минут суспендирования через от второй до последней щели или просвета и приблизительно 15 минут суспендирования в последней щели или просвете.
87. Способ по любому из пп. 75-86, при котором суспендирование в последней щели или просвете продолжают, пока суспензия не будет легко проходить через щель или просвет.
88. Способ по любому из пп. 75-87, при котором суспендирование в каждой щели или просвете продолжают, пока суспензия не будет легко проходить через такую щель или просвет.
89. Способ по любому из пп. 61-88, при котором общее время суспендирования составляет приблизительно 30 минут.
90. Способ по любому из пп. 61-89, при котором приблизительно 5 до приблизительно 15 объемов HBSS добавляют после суспендирования.
91. Способ по любому из пп. 61-90, при котором приблизительно 10 объемов HBSS добавляют после суспендирования.
92. Способ по любому из пп. 61-91, при котором рН HBSS, добавленного после суспендирования, составляет от приблизительно 5,1 до приблизительно 5,7.
93. Способ по любому из пп. 61-92, при котором рН HBSS, добавленного после суспендирования, составляет приблизительно 5,4.
94. Способ по любому из пп. 61-93, при котором рН клеточной суспензии в HBSS, полученной на стадии f по п. 62 или стадии d по п. 61, составляет от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0.
95. Способ по любому из пп. 61-93, при котором рН клеточной суспензии в HBSS, полученной на стадии f по п. 62 или стадии d по п. 61, составляет от приблизительно 5,6 до приблизительно 5,7.
96. Способ по любому из пп. 61-94, при котором после добавления HBSS после суспендирования клетки присутствуют в концентрации, составляющей от приблизительно 0,5 миллиона клеток/мл до приблизительно 4 миллиона клеток/мл.
97. Способ по любому из пп. 61-96, при котором после добавления HBSS после суспендирования клетки присутствуют в концентрации, составляющей приблизительно 2 миллиона клеток/мл.
98. Способ по любому из пп. 61-97, при котором среда представляет собой среду для образования клеточных сфер, содержащую DMEM/F12, приблизительно 1% антибиотика, приблизительно 2% В27 и необязательно один или несколько факторов роста.
99. Способ по п. 98, при котором факторы роста содержат bFGF, EGF и гепарин.
100. Способ создания плюрипотентной клетки, при котором исходная клетка присутствует в ткани, содержащей эритроциты, причем способ предусматривает:
a. Механическое разрезание ткани на тонкие срезы в присутствии одного или нескольких расщепляющих ЕСМ ферментов;
b. Инкубацию образца, полученного на стадии а, при приблизительно естественной для ткани in vivo температуре при перемешивании ткани;
c. Разбавление клеточной суспензии, полученной на стадии b, в растворе сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) и АТР, характеризующемся рН, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5;
d. Суспендирование клеточной суспензии, полученной на стадии с;
e. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии d, в HBSS;
f. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии е; и
g. Ресуспендирование клеточного осадка, полученного на стадии g, в среде.
101. Способ создания плюрипотентной клетки, при котором исходная клетка присутствует в ткани, содержащей эритроциты, причем способ предусматривает:
a. Механическое разрезание ткани на тонкие срезы в присутствии одного или нескольких расщепляющих ЕСМ ферментов;
b. Инкубацию образца, полученного на стадии а, при приблизительно естественной для ткани in vivo температуре при перемешивании ткани;
c. Разбавление клеточной суспензии, полученной на стадии b, в растворе сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS) и АТР, характеризующемся рН, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5;
d. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии b;
e. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии с, в растворе HBSS и АТР, характеризующемся рН, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5, до клеточной суспензии;
f. Суспендирование клеточной суспензии, полученной на стадии d;
g. Ресуспендирование клетки, полученной на стадии е, в HBSS;
h. Выделение клетки из суспензии, полученной на стадии f; и
i. Ресуспендирование клеточного осадка, полученного на стадии g, в среде.
102. Способ по любому из пп. 100-101, при котором ткань, содержащую эритроциты, выбирают из группы, состоящей из:
легкого, селезенки и печени.
103. Способ по любому из пп. 100-102, при котором ткань представляет собой легкое, и расщепляющий ЕСМ фермент представляет собой коллагеназу Р.
104. Способ по любому из пп. 100-103, при котором разрезание на тонкие срезы на стадии а продолжают в течение приблизительно 10 минут.
3
105. Способ по любому из пп. 100-104, при котором АТР присутствует в растворе HBSS и АТР в концентрации, составляющей от приблизительно 1,5 до приблизительно 5 мг/см.
106. Способ по п. 105, при котором АТР присутствует в растворе HBSS и АТР в концентрации, составляющей от приблизительно 2,7 мМ до приблизительно 9 мМ.
107. Способ по любому из пп. 100-106, при котором раствор HBSS и АТР, характеризующийся рН, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,5, получают путем титрования раствора HBSS с раствором АТР до достижения требуемого рН.
108. Способ по п. 107, при котором раствор АТР характеризуется концентрацией, составляющей от приблизительно 50 мМ до приблизительно 500 мМ.
109. Способ по п. 108, при котором раствор АТР характеризуется концентрацией, составляющей приблизительно 200 мМ.
110. Способ по любому из пп. 100-109, при котором раствор HBSS и АТР характеризуется рН, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,7.
111. Способ по любому из пп. 100-110, при котором раствор HBSS и АТР характеризуется рН, составляющим приблизительно 5,0.
112. Способ по любому из пп. 100-110, при котором HBSS на стадии g по п. 101 и стадии е по п. 100 не содержит АТР.
113. Способ по любому из пп. 100-110, при котором выделение предусматривает центрифугирование.
114. Способ по любому из пп. 100-113, дополнительно предусматривающий приведение исходной клетки в контакт с трипсином в течение от приблизительно 1 минуты до приблизительно 10 минут перед стадией с.
115. Способ по п. 114, дополнительно предусматривающий приведение исходной клетки в контакт с трипсином в течение от приблизительно 3 минут до приблизительно 5 минут перед стадией с.
116. Способ по любому из пп. 114-115, при котором трипсин дезактивируют путем приведения клеточного осадка в контакт с минимальной эссенциальной средой Игла в модификации Дюльбекко (DMEM)/F-12, содержащей 10% термически инактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS).
117. Способ по любому из пп. 100-116, при котором суспендирование предусматривает суспендирование клеток через серию щелей или просветов постепенно уменьшающихся диаметров.
118. Способ по п. 117, при котором серия содержит по меньшей мере 3 щели или просвета.
119. Способ по любому из пп. 100-118, при котором по меньшей мере первую щель или просвет предварительно покрывают HBSS или водой.
120. Способ по любому из пп. 100-119, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 2,0 мм.
121. Способ по п. 120, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим от приблизительно 0,7 мм до приблизительно 1,5 мм.
122. Способ по п. 121, при котором первая щель или просвет характеризуются внутренним диаметром, составляющим приблизительно 1,1 мм.
123. Способ по любому из пп. 100-122, при котором суспендирование через первую щель или просвет проводят в течение от приблизительно 1 минуты до приблизительно 10 минут.
124. Способ по п. 100-123, при котором суспендирование через первую щель или просвет проводят в течение приблизительно 5 минут.
125. Способ по любому из пп. 100-124, при котором последние две щели или просвета в серии характеризуются внутренними диаметрами, составляющими от приблизительно 90 до приблизительно 200 мкм и от приблизительно 25 мкм до приблизительно 90 мкм.
126. Способ по п. 125, при котором последние две щели или просвета в серии характеризуются внутренними диаметрами, составляющими от приблизительно 100 до приблизительно 150 мкм и от приблизительно 50 мкм до приблизительно 70 мкм.
127. Способ по любому из пп. 100-126, при котором суспендирование предусматривает от приблизительно 5 до приблизительно 20 минут суспендирования через от второй до последней щели или просвета и от приблизительно 5 до приблизительно 20 минут суспендирования в последней щели или просвете.
128. Способ по п. 127, при котором суспендирование предусматривает приблизительно 10 минут суспендирования через от второй до последней щели или просвета и приблизительно 15 минут суспендирования в последней щели или просвете.
129. Способ по любому из пп. 100-128, при котором суспендирование в последней щели или просвете продолжают, пока суспензия не будет легко проходить через щель или просвет.
130. Способ по любому из пп. 100-129, при котором суспендирование в каждой щели или просвете продолжают, пока суспензия не будет легко проходить через такую щель или просвет.
131. Способ по любому из пп. 100-130, при котором общее время суспендирования составляет приблизительно 30 минут.
132. Способ по любому из пп. 100-131, при котором приблизительно 5 до приблизительно 15 объемов HBSS добавляют после суспендирования.
133. Способ по любому из пп. 100-132, при котором приблизительно 10 объемов HBSS добавляют после суспендирования.
134. Способ по любому из пп. 100-133, при котором рН HBSS, добавленного после суспендирования, составляет от приблизительно 5,1 до приблизительно 5,7.
135. Способ по любому из пп. 100-134, при котором рН HBSS, добавленного после суспендирования, составляет приблизительно 5,4.
136. Способ по любому из пп. 100-135, при котором рН клеточной суспензии в HBSS, полученной на стадии g по п. 101 или стадии е по п. 100, составляет от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0.
137. Способ по любому из пп. 100-136, при котором рН клеточной суспензии в HBSS, полученной на стадии g по п. 101 или стадии е по п. 100, составляет от приблизительно 5,6 до приблизительно 5,7.
138. Способ по любому из пп. 100-137, при котором после добавления HBSS после суспендирования клетки присутствуют в концентрации, составляющей от приблизительно 0,5 миллиона клеток/мл до приблизительно 4 миллиона клеток/мл.
139. Способ по любому из пп. 100-138, при котором после добавления HBSS после суспендирования клетки присутствуют в концентрации, составляющей приблизительно 2 миллиона клеток/мл.
140. Способ по любому из пп. 100-139, при котором среда представляет собой среду для образования клеточных сфер, содержащую DMEM/F12, приблизительно 1% антибиотика, приблизительно 2% В27 и необязательно один или несколько факторов роста.
141. Способ по п. 140, при котором факторы роста содержат bFGF, EGF и гепарин.
142. Способ по любому из пп. 1-141, при котором исходная клетка представляет собой мышиную клетку, и среда для образования клеточных сфер содержит LIF.
143. Способ по любому из пп. 1-141, дополнительно предусматривающий стадию культивирования полученных клеток в течение по меньшей мере одной недели, причем культивирование предусматривает:
a. Добавление среды для образования клеточных сфер, необязательно содержащей факторы роста;
b. Перемешивание клеток для препятствия прикрепления ко дну чашки.
144. Способ по п. 143, при котором среду для образования клеточных сфер добавляют каждые 1-4 дня.
145. Способ по п. 143, при котором среду для образования клеточных сфер добавляют каждые 2 дня.
146. Способ по любому из пп. 142-145, при котором перемешивание предусматривает пипетирование клеток с помощью пипетки.
147. Способ по п. 146, при котором пипетка содержит отверстие, составляющее приблизительно 1,1 мм в диаметре.
148. Способ по любому из пп. 146-147, при котором пипетирование проводят по меньшей мере один раз в день.
149. Способ по п. 148, при котором пипетирование проводят по меньшей мере два раза в день.
150. Способ по любому из пп. 1-149, дополнительно предусматривающий выбор клетки с плюрипотентностью, при котором выбор предусматривает способ, выбранный из группы, состоящей из следующего:
выбор клеток с низким прилипанием; выбор клеток, которые представляют собой компонент сферы; и выбор клеток с маленьким относительным размером.
151. Способ по любому из пп. 1-150, дополнительно предусматривающий конечную стадию выбора клетки, проявляющей плюрипотентность.
152. Способ по любому из пп. 1-151, при котором исходная клетка не присутствует как часть ткани.
153. Способ по любому из пп. 1-152, при котором исходная клетка представляет собой соматическую клетку, стволовую клетку, клетку-предшественник или эмбриональную клетку.
154. Способ по любому из пп. 1-153, при котором исходная клетка представляет собой выделенную клетку.
155. Способ по любому из пп. 1-154, при котором исходная клетка присутствует в гетерогенной популяции клеток.
156. Способ по любому из пп. 1-155, при котором исходная клетка присутствует в гомогенной популяции клеток.
157. Способ по любому из пп. 1-156, при котором выбор клетки, проявляющей плюрипотентность, предусматривает выбор клетки, экспрессирующей маркер стволовой клетки.
158. Способ по п. 157, при котором маркер стволовой клетки выбирают из группы, состоящей из: Oct4; Nanog; Е-кадгерина и SSEA4.
159. Способ по любому из пп. 1-158, при котором выбор клетки, проявляющей плюрипотентность, предусматривает выбор клетки, которая не является адгерентной.
160. Способ по любому из пп. 1-159, дополнительно предусматривающий культивирование плюрипотентной клетки для обеспечения размножения плюрипотентной клетки.
161. Способ по любому из пп. 1-160, при котором плюрипотентная клетка экспрессирует маркер стволовой клетки.
162. Способ по п. 161, при котором маркер стволовой клетки выбирают из группы, состоящей из: Oct4; Nanog; Е-кадгерина и SSEA4.
163. Способ по любому из пп. 1-162, при котором исходная клетка представляет собой клетку млекопитающего.
164. Способ по любому из пп. 1-163, при котором исходная клетка представляет собой клетку человека.
165. Способ по любому из пп. 1-164, при котором исходная клетка представляет собой взрослую клетку, неонатальную клетку, фетальную клетку, амниотическую клетку или клетку пуповинной крови.
166. Способ по любому из пп. 1-165, дополнительно предусматривающий содержание плюрипотентной клетки in vitro.
167. Анализ, предусматривающий:
приведение в контакт плюрипотентной клетки, полученной с помощью способа по любому из пп. 1-166, с кандидатным средством.
168. Анализ по п. 167 для применения в идентификации средств, которые влияют на одно или несколько из жизнеспособности, дифференцировки, пролиферации плюрипотентной клетки.
169. Применение плюрипотентной клетки, полученной с помощью способа по любому из пп. 1-166, в способе клеточной терапии для субъекта.
170. Способ получения клетки или ткани, которые являются совместимыми с клеточной терапией, подлежащей введению субъекту, предусматривающий:
создание плюрипотентной клетки из клетки по любому из пп. 1-166;
причем клетка представляет собой аутологичную клетку или совпадающую по HLA аллогенную клетку.
171. Способ по п. 170, дополнительно предусматривающий дифференцировку плюрипотентной клетки по заданной линии дифференцировки перед введением клетки или ткани субъекту.
172. Композиция, содержащая плюрипотентную клетку, причем плюрипотентная клетка создана из клетки с помощью способов по любому из пп. 1-166.
173. Способ аутологичной клеточной терапии у субъекта, нуждающегося в клеточной терапии, предусматривающий:
a. создание плюрипотентной клетки из клетки по любому из пп. 1-166, причем клетку получают от субъекта, и
b. введение композиции, содержащей плюрипотентную клетку или ее дифференцированное потомство, субъекту.
174. Способ по п. 173, дополнительно предусматривающий дифференцировку плюрипотентной клетки по заданной линии дифференцировки перед введением композиции субъекту.