ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИДОВ И БИОТИПОВ БАКТЕРИЙ РОДА Yersinia
TEST-SYSTEM FOR DIFFERENTIATING SPECIES AND BIOTYPES OF BACTERIA OF GENUS Yersinia

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано при бактериологических исследованиях для внутриродовой и внутривидовой дифференциации бактерий рода Yersinia, а также для определения биотипа некоторых видов иерсиний.
Род Yersinia включает обширную группу грамотрицательных факультативно анаэробных микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae. Среди 17 видов, входящих в род Yersinia, только три отнесены к патогенным для человека и животных - возбудитель чумы Y.pestis, возбудитель псевдотуберкулеза Y.pseudotuberculosis и отдельные представители Y.enterocolitica, являющиеся возбудителями кишечного иерсиниоза. Заболеваемость кишечным иерсиниозом регистрируется в России практически повсеместно, но наблюдается неравномерное распространение инфекции по отдельным территориям.
Вид Y. enterocolitica широко распространен в природе. Представители вида встречаются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) различных животных, в воде, почве, могут контаминировать сырые овощи, молоко и другие продукты, хранящиеся в условиях холодильника [Bottone E.J. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates / J.Microb. Infect. - 1999. - №1. - P.323-333]. В соответствии с результатами биохимических реакций известно шесть биотипов Y.enterocolitica: 1А, 1В, 2, 3, 4, 5. Представители биотипов 1В, 2-5 являются патогенными и содержат хромосомные и плазмидные гены, детерминирующие адгезивность, инвазивность, термостабильные токсины и другие вирулентные свойства микроба [Thoerner P., Bin Kingombe С.I., Bogli-Stuber К., et al. PCR detection of virulence genes in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis and investigation of virulence gene distribution / J. Appl. Env. Microb. - 2003. - Vol.69, №3. - P.1810-1816]. Представители биотипа 1А отнесены к непатогенным, как неимеющие хромосомных и плазмидных генов вирулентности [Grant Т., Bennet-Wood V., Robbins-Brown R.M. Identification of virulence-associated characteristics in clinical isolates of Yersinia enterocolitica lacking classical virulence markers / Infection and Immunity. - 1998. - Vol 66. - №3. - P.1113-1120]. Однако в последние годы появились данные о наличии внутри этого биотипа патогенных вариантов, способных вызывать заболевания ЖКТ, сопровождающиеся диареей [Tennant S.M., Grant Т.Н., Robins-Browne R.M. Pathogenicity of Yersinia enterocolitica biotype 1A / FEMS Immun. Med. Microb. - 2003. - №38. - P.127-137].
Остальные представители рода отнесены к непатогенным, но могут быть возбудителями оппортунистических инфекций. До недавнего времени по биохимическим свойствам их подразделяли на восемь видов: Y.aldovae, Y.bercovieri, Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.kristensenii, Y.mollaretii, Y.rohdei, Y.ruckeri. Развитие молекулярно-генетических методов позволило в последние годы (2006-2011 гг.) дополнить род Yersinia еще шестью представителями - Y.aleksiciae [Spraguet L.D., Neubauer Н. Yersinia aleksiciae sp.nov. / Int. J. of Syst. and Evol. Microb., 2005. - Vol.55. - P.831-835], Y. similis [Spraguet L.D., Scholz H.C., Amman S., et al. Yersinia similis sp.nov. / Int. J. of Syst. and Evol. Microb., 2008. - Vol.58. - P.952-958], Y.massiliensis [Merhej V., Adekambi Т., Pargnier I., et al. Yersinia massiliensis sp.nov., isolated from fresh water / Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 2008. - Vol.58. - P.779-784], Y. nurmii [Murros-Kontiainen A., Fredriksson-Ahomaa M., Korkeala H., et al. Yersinia nurmii sp.nov. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2011. - Vol.61. - 2368-2372], Y.pekkanenii [Murros-Kontiainen A., Johansson P., Niskanen Т., et al. Y.pekkanenii sp.nov. / Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2011. - Vol.61. - P.2363-2367], Y. entomophaga [Hurst M.R.H., Becher S.A., Young S.D., et al. Yersinia entomophaga sp.nov., isolated from the New Zealand grass grub Costelytra zealandica I Int. J. Syst. Evol. Microbiol, 2011 - Vol.61. - P.844-849], а вид Y. intermedia - двумя биотипами (на данный момент насчитывается 10 биотипов Y.intermedia) [Martin L., Leclercq A., Savin C, and Carniel E. Characterization of atypical isolates of Yersinia intermedia and definition of two new biotypes / J. Clin. Microbiol., 2009. - Vol.47, №8. - P.2376-2380]. Разнообразие представителей рода и гетерогенность отдельных видов осложняет идентификацию иерсиний. Существующие коммерческие тест-системы по составу биохимических тестов ориентированы на выявление более часто встречающихся патогенных представителей семейства Enterobacteriaceae таких родов, как Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Shigella. У клинических микробиологов, использующих такие тест-системы, часто возникают проблемы при идентификации и дифференциации некоторых видов иерсиний, особенно Y.enterocolitica биотипа 1А, Y.intermedia, Y.frederiksenii, Y.bercovieri, Y.mollaretii, вследствие недостаточного количества необходимых тестов [Hallanvuo S., Peltola J., Heiskkanen Т., Siitonen A. Simlified phenotypic scheme evaluated by 16S rRNA sequencing for differentiation between Yersinia enterocolitica and Y.enterocolitica-like species / J.Clin. Microbiol., 2006. - Vol.44, №3. - P.1077-1080]. В целом отсутствует общедоступная система внутриродовой дифференциации бактерий рода Yersinia. Все это приводит к возникновению ошибок и получению некорректных результатов, особенно при исследовании материала из окружающей среды, смывов с овощей и других продуктов питания - основных источников выделения представителей Y.enterocolitica биотипа 1А и близкородственных видов.
Известны способы родовой и видовой фенотипической идентификации бактерий рода Yersinia и дифференциации представителей Y.enterocolitica на биотипы, в том числе по совокупности многих биохимических признаков - по ферментации некоторых углеводов, утилизации некоторых аминокислот, образованию метаболитов.
В определителе бактерий Берджи [Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоут [и др.], 9-е издание, Т.1. - М.: Мир, 1997 г. - 432 с., ил.] фенотипическая идентификация иерсиний производится по 56 признакам (таблицы 5.2 стр.227-229; 5.40, 5.41, 5.42, 5.43 стр.254-258), в т.ч. 22 теста для дифференциации 11 видов (подвижность, продукция индола, продукция ацетоина в реакции Фогеса-Проскауэра; утилизация цитрата; наличие уреазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, желатиназы, пиразинамидазы, β-ксилозидазы, τ-глутамилтрансферазы; образование кислоты из целлобиозы, мелибиозы, α-метил-D-глюкозида, раффинозы, L-рамнозы D-сорбитола, сахарозы, муцината, L-фукозы, L-сорбозы) и 7 тестов для определения биотипов Y.enterocolitica (продукция индола; наличие дезоксирибонуклеазы, наличие липазы, восстановление нитрата, образование кислоты из сахарозы, трегалозы, D-ксилозы). Недостатками видовой дифференциации по определителю бактерий Берджи является неточность дифференциации между видами Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.enterocolitica 1 биотипа, а также отсутствие дифференциации биотипа 1 Y.enterocolitica на биотип 1А, представители которого считаются непатогенными, и биотип 1В, представители которого являются патогенными. Межвидовая дифференциация Y.frederiksenii и Y.intermedia осложнена гетерогенностью представителей Y.intermedia, количество биотипов которых насчитывает 10.
th
В руководстве по клинической микробиологии [Wagner A. Yersinia. Manual of Clinical Microbiology, editor Patrick R. Murray, 9 edition, vol. 1. - Washington, D.C.: ASM Press, 2007. - P.688-697] предложена идентификация 11 видов иерсиний по 14 фенотипическим признакам (подвижность, наличие уреазы, продукция ацетоина в реакции Фогеса-Проскауэра, наличие орнитиндекарбоксилазы, утилизация цитрата, продукция индола, ферментация углеводов: рамнозы, сахарозы, целлобиозы, сорбозы, сорбитола, мелибиозы, раффинозы, фукозы) и дифференциация биотипов Y.enterocolitica по девяти биохимическим свойствам (наличие липазы, гидролиз эскулина, продукция индола, восстановление нитрата, тест на ДНКазу, наличие пиразинамидазы, ферментация салицина, ксилозы, трегалозы). Дифференциация по указанному набору фенотипических признаков имеет аналогичные с предыдущим способом недостатки вследствие отсутствия необходимых тестов и более полных данных биохимических свойств иерсиний.
В МУ 3.1.1.2438-09 [Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза. МУ 3.1.1.2438-09. М.: ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава», 2009] представлены биохимические свойства 10 видов иерсиний (вид Y.pestis не включен в таблицу) согласно определителю Берджи. Соответственно, данная таблица, также как и дифференциация видов и биотипов иерсиний по определителю Берджи, имеет ряд недостатков и не позволяет полноценно дифференцировать некоторые виды бактерий рода Yersinia.
В основе реализации существующих коммерческих тест-систем лежит определение совокупности фенотипических признаков бактерий, приведенных в определителе Берджи и других общепринятых руководствах.
Тест-система биохимическая для идентификации и дифференциации энтеробактерий «ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-24» (НПО Диагностические Системы, Н. Новгород) предназначена для фенотипической идентификации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae в течение 24 часов по 24-м биохимическим признакам. В состав набора «ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-24» входят: планшеты полистироловые 96-луночные разборные с нанесенными на дно лунок субстратно-индикаторные питательными средами, стабилизированными поливиниловым спиртом; раствор физиологический стерильный для приготовления суспензии культур микроорганизмов; масло вазелиновое стерильное для создания анаэробных условий протекания биохимической реакции; реактив для теста «индол» (3,5% раствор парадиметиламинобензальдегида); реактив для теста «фенилаланин» (10% раствор железа хлорида (III) гексагидрата); реактив 1 для теста «АМК» (12% раствор α-нафтола), реактив 2 для теста «АМК» (40% раствор калия гидроксида). Тест-система позволяет определить следующие биохимические свойства энтеробактерий: утилизацию цитрата натрия, малоната натрия, инозита, сорбита, маннита, адонита, дульцита, глюкозы, лактозы, сахарозы, арабинозы, мальтозы, рамнозы, трегалозы, гидролиз эскулина; образование индола, сероводорода, ацетилметилкарбинола (реакция Фогеса-Проскауэра); наличие уреазы, β-галактозидазы, декарбоксилаз орнитина и лизина, дезаминазы фенилаланина, дигидролазы аргинина. Тест-система идентифицирует такие виды иерсиний, как Y.enterocolitica, Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.kristensenii, Y.pseudotuberculosis, но не позволяет идентифицировать другие виды иерсиний, установить биотипы Y.enterocolitica и Y.intermedia и произвести дифференциацию между представителями вида Y.frederiksenii и некоторыми биотипами Y.intermedia.
Тест-система «ЭНТЕРОтест24» (и ее модификация «Энтеротест24Н») (ЭрбаЛахема, Чехия). Набор «ЭНТЕРОтест24» содержит: микротитровальные пластинки (каждая для идентификации 4 штаммов); рамку пластинки с крышкой для инкубации; полиэтиленовые пакеты для инкубации; бланки для регистрации результатов. Также необходимы реактивы, поставляемые отдельно: реактив для теста ИНДОЛ, реактив для теста ФЕНИЛАЛАНИН, реактив для теста АЦЕТОИН, парафиновое масло стерильное. Тест-система применяется для идентификации энтеробактерий по 24 признакам и включает панель из 24 биохимических субстратов. Тест-система «ЭНТЕРОтест24» включает 24 теста для определения таких биохимических свойств, как образование индола, образование сероводорода, наличие лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, аргинидигидролазы, утилизация цитрата, утилизация малоната, наличие фенилаланиндезаминазы, β-галактозидазы, гидролиз эскулина, образование ацетоина (реакция Фогеса-Проскауэра), ферментация инозитола, адонитола, целлобиозы, сахарозы, трегалозы, маннита, сорбитола, рамнозы, мелибиозы, раффинозы, дульцита, глюкозы. Тест система «ЭНТЕРОтест24 Н» состоит из 24 тестов, в том числе 5 тестов, отличающих ее от «ЭНТЕРОтест24»: вместо определения образования индола, наличия фенилаланиндезаминазы, образования ацетоина, ферментации рамнозы и глюкозы введены тесты для определения β-глюкуронидазы, β-ксилоксидазы, ферментации салицина, лактозы, артрата. Она может быть дополнена выпускаемыми отдельно тестами на образование индола и ацетоина, которые являются необходимыми для дифференциации иерсиний. С помощью тест-системы «ЭНТЕРОтест24» («Энтеротест24Н») возможно идентифицировать такие виды иерсиний, как Y.enterocolitica, Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.kristensenii, Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, но она не позволяет идентифицировать иерсиний других видов, произвести дифференциацию между Y.frederiksenii, некоторыми биотипами Y.intermedia и Y.enterocolitica биотипа 1А, а также установить биотипы Y.enterocolitica и Y.intermedia.
Микротестсистема для биохимической идентификации энтеробактерий («МТС-М-12Е») производства НПО «Питательные среды» (г.Махачкала). Набор «МТС-М-12Е» представляет собой контейнер, изготовленный из нейтрального прозрачного полистирола, с ячейками, на дне которых находятся субстратно-индикаторные питательные среды, стабилизированные поливиниловым спиртом. Тест-система позволяет определить следующие биохимические свойства энтеробактерий: утилизацию цитрата натрия, малоната натрия, глюкозы, лактозы, маннита, мальтозы, образование индола, сероводорода, наличие уреазы (3-галактозидазы, декарбоксилазы лизина, дезаминазы фенилаланина. Данная тест-система позволяет идентифицировать род Yersinia, но предлагаемых 12 тестов недостаточно для определения видов иерсиний и тем более биотипов.
За прототип выбрана тест-система «АР1 20Е» (bioMerieux, Франция). Набор «АР1 20Е» предназначен для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae и других нетребовательных к питательным веществам грамотрицательных палочек по 20 признакам. Состав набора «АР1 20Е»: стрипы API 20Е, контейнеры для инкубации, бланки для учета результатов, инструкция. Необходимы реактивы и материалы, не включенные в набор: минеральное масло; физиологический раствор API NaCl 0,85%; реактив к стрипу API 20Е TDA для определения триптофандезаминазы; реактив к стрипу API 20Е JAMES для определения индолообразования; реактив к стрипу API 20Е VP 1 и VP 2 для определения продукции ацетоина. Стрип API 20Е состоит из 20 микролунок, содержащих дегидрированные субстраты для определения β-галактозидазы, аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, утилизации цитратов, продукции сероводорода, уреазы, триптофандезаминазы, продукции индола, продукции ацетоина в реакции Фогеса-Проскауэра, желатиназы, ферментации D-глюкозы, D-маннита, инозита, D-сорбита, L-рамнозы, D-сахарозы, D-мелибиозы, амигдалина, L-арабинозы. С помощью тест-системы возможно идентифицировать такие виды иерсиний, как Y.enterocolitica, Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.kristensenii, Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, но данная тест-система не позволяет выявить иерсиний других видов, а также произвести дифференциацию между видами Y.frederiksenii и Y.intermedia и установить биотипы Y.enterocolitica и Y.intermedia.
Из уровня техники следует, что ни одна из существующих коммерческих тест-систем не позволяет произвести полноценное определение видов и биотипов бактерий рода Yersinia. Некоторые виды иерсиний часто не внесены в спектр определяемых тест-системами микроорганизмов. Такие виды, как Y.aldovae, Y.bercovieri, Y.mollaretii, Y.rohdei и Y.aleksiciae часто определяются как Y.enterocolitica из-за отсутствия у аналогов как некоторых тестов для их идентификации, так и данных по биохимическим свойствам этих видов. В свою очередь, представителей Y.frederiksenii, Y.intermedia дифференцируют неверно или не дифференцируют вообще. Нередко возникают ошибки определения вида, особенно при необходимости дифференцировать представителей биотипа 1А Y.enterocolitica, которые широко распространены в окружающей среде и часто выделяются из смывов с овощей и других продуктов питания.
Внутриродовая дифференциация иерсиний осложнена не только большим числом видов бактерий этого рода, но и высокой внутривидовой гетерогенностью. Имеющиеся схемы и коммерческие тест-системы для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae не способны корректно и полноценно осуществить внутриродовую и внутривидовую дифференциацию иерсиний.
Изобретение направлено на создание комплекса биохимических тестов, позволяющего корректно и полноценно осуществить внутриродовую и внутривидовую дифференциацию бактерий рода Yersinia.
Технический результат от использования изобретения - повышение специфической активности при дифференциации бактерий рода Yersinia за счет расширения диапазона определяемых видов и биотипов иерсиний.
В результате решения поставленной задачи авторы получили комплекс необходимых тестов для внутриродовой и внутривидовой дифференциации бактерий рода Yersinia.
Предложенная авторами тест-система состоит из набора питательных сред, содержащих субстраты, и реактивы для определения лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, триптофандезаминазы, уреазы, продукции ацетоина, продукции индола, ферментации мелибиозы, ферментации рамнозы, ферментации сахарозы, ферментации сорбита. Дополнительно в состав введены среды с субстратами для определения липазы, ферментации ксилозы, ферментации мальтозы, ферментации α-метил-D-глюкопиранозида, ферментации салицина, ферментации сорбозы, ферментации раффинозы при следующем количественном содержании компонентов тест-системы для одного определения, мл:
питательная среда для определения лизиндекарбоксилазы - 0,15
питательная среда для определения орнитиндекарбоксилазы - 0,15
питательная среда для определения триптофандезаминазы - 0,15
реактив для определения триптофандезаминазы - 0,025…0,050
питательная среда для определения уреазы - 0,15
питательная среда для определения продукции ацетоина - 0,15
реактив для определения продукции ацетоина - 0,025…0,050
питательная среда для определения продукции индола - 0,15
реактив для определения продукции индола - 0,025…0,050
питательная среда для определения ферментации мелибиозы - 0,15
питательная среда для определения ферментации рамнозы - 0,15
питательная среда для определения ферментации сахарозы - 0,15
питательная среда для определения ферментации сорбита - 0,15
питательная среда для определения - 5,00
питательная среда для определения ферментации ксилозы - 0,15
питательная среда для определения ферментации мальтозы - 0,15
питательная среда для определения ферментации
α-метил-D-глюкопиранозида - 0,15
питательная среда для определения ферментации салицина - 0,15
питательная среда для определения ферментации сорбозы - 0,15
питательная среда для определения ферментации раффинозы - 0,15.
Биохимические свойства бактерий рода Yersinia в отношении субстратов, используемых для определения перечисленных признаков, представлены в таблице 1.
Выделение и изучение чистой культуры возбудителя чумы Y.pestis могут проводиться только в специализированных лабораториях противочумных учреждений Роспотребнадзора при строгом соблюдении режима работы с микроорганизмами I-II групп патогенности. Поэтому приведем биохимические свойства Y.pestis только для сравнения с остальными представителями рода Yersinia.
Определение наличия фермента уреазы, осуществляющего гидролиз мочевины. Данный признак является основополагающим почти для всего рода Yersinia. Уреазой обладают такие виды, как Y.aldovae, Y.aleksiciae, Y.bercovieri, Y.enterocolitica, Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.kristensenii, Y.massiliensis, Y.mollaretii, Y.pseudotuberculosis, Y.rohdei и Y.similis. He обладают способностью гидролизовать мочевину Y.pestis и Y.ruckeri. Некоторые представители Y.mollaretii могут быть уреазонегативными, в этом случае их можно дифференцировать от Y.ruckeri (и Y.pestis) по результатам ферментации сахарозы.
Сахарозу ферментируют с образованием кислоты представители Y.bercovieri, Y.enterocolitica, Y.frederiksenii, Y.intermedia, Y.massiliensis, Y.mollaretii, Y.rohdei, не ферментируют представители Y.aldovae, Y.aleksiciae, Y.kristensenii, Y.pseudotuberculosis, Y.ruckeri, Y.similis, Y.pestis.
Определение наличия фермента орнитиндекарбоксилазы. Тест позволяет провести дифференциацию между видами Y.kristensenii и Y.pseudotuberculosis.
Определение наличия фермента лизиндекарбоксилазы. Обычно не используется для дифференциации видов иерсиний. Однако только этот тест позволяет дифференцировать Y.kristensenii от Y.aleksiciae. Лизиндекарбоксилаза также определяется у Y.massiliensis и у некоторых представителей Y.ruckeri.
Определение наличия фермента триптофандезаминазы. У всех иерсиний, за исключением представителей Y.massiliensis, данный фермент отсутствует.
Ферментация мальтозы с образованием кислоты наблюдается у всех иерсиний, кроме представителей Y.aldovae и Y.rohdei, дифференциацию между которыми, в свою очередь, можно провести по ферментации сахарозы (приведено выше).
Важную роль при видовой дифференциации иерсиний внутри рода играет такое биохимическое свойство бактерий, как способность образования ацетилметилкарбинола (ацетоина) в реакции Фогеса-Проскауэра. При (37±1)°С у всех иерсиний ацетоин не образуется. Однако при (26±2)°С наблюдаются результаты, отличающиеся для разных видов. Так, способностью образовывать ацетоин обладают представители видов Y.aldovae, Y.enterocolitica, Y.frederiksenii, Y.intermedia; не образуют ацетоин Y.bercovieri, Y.kristensenii, Y.mollaretii, Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, Y.rohdei. Этот тест важен для дифференциации Y.mollaretii и Y.bercovieri от Y.enterocolitica. Между собой Y.mollaretii и Y.bercovieri могут быть разделены при определении ферментации L-сорбозы.
Способность разложения рамнозы с образованием кислоты используется для дифференциации Y.frederiksenii от Y.enterocolitica, неспособных ферментировать рамнозу. Рамнозу также утилизируют представители отдельных биотипов Y.intermedia, а также Y.aldovae, Y.pseudotuberculosis и Y.similis.
По отсутствию у представителей всех биотипов Y.enterocolitica способности ферментировать с образованием кислоты рамнозу, раффинозу и мелибиозу, их дифференцируют от Y.intermedia. Вид Y.intermedia биохимически гетерогенный и включает, по данным референс-центра Парижского института Пастера [Martin L., Leclercq A., Savin С, and Carniel Е. Characterization of atypical isolates of Yersinia intermedia and definition of two new biotypes / J.Clin. Microbiol., 2009. - Vol.47, №8. - P.2376-2380], 10 биотипов. Несмотря на то что в отличие от биотипов Y.enterocolitica биотипы Y.intermedia не имеют важного клинического значения, высокая гетерогенность биохимических свойств этого вида требует внутривидовой дифференциации для корректного определения других видов иерсиний в ходе исследования. Деление на биотипы производят по способности ферментировать мелибиозу, рамнозу, α-метил-D-глюкопиранозид (α-метилглюкозид), раффинозу и способности утилизировать цитрат натрия. Распределение по биотипам отражено в таблице 1. Видно, что представители биотипов 1-7 Y.intermedia ферментируют мелибиозу в отличие от Y.frederiksenii. Определение способности ферментировать α-метил-D-глюкопиранозид является необходимым для дифференциации «рамнозоположительных» штаммов Y.frederiksenii от представителей Y.intermedia 8-10 биотипов.
Вид Y.enterocolitica по биохимическим свойствам разделен на шесть биотипов [Bottone E.J. Yersinia enterocolitica: overview and epidemiologic correlates / J.Microb. Infect, 1999. - №1. - P.323-333]. Установление биотипа имеет важное эпидемиологическое значение. Так, представители биотипа 1А считаются непатогенными, тогда как Y.enterocolitica биотипов 1В и 2-5 обладают набором генов вирулентности и способны вызывать заболевания человека и животных. Распределение по биотипам отражено в таблице 1. Внутривидовую дифференциацию следует проводить с использованием следующих тестов. Определение способности ферментации салицина, которая есть у представителей биотипа 1А. Определение наличия фермента липазы, который есть у представителей биотипа 1А и 1В, но отсутствует у биотипов 2-5. Этот тест позволяет дифференцировать патогенных представителей «американского» биотипа 1В от остальных патогенных Y.enterocolitica. Определение способности индолообразования позволяет дифференцировать между собой 2-й и 3-й биотипы Y.enterocolitica, индол способны образовывать представители биотипов 1А, 1В и 2, тогда как остальные индол не образуют. Дифференцировать между собой 3-й и 4-й биотипы Y.enterocolitica позволяет определение ферментации ксилозы. Представители 3-го биотипа в отличие от 4-го способны ферментировать ксилозу с образованием кислоты. По способности к ферментации сорбитола можно дифференцировать 4-й биотип от 5-го. Сорбитол ферментируют представители 4-го биотипа, тогда как штаммы Y.enterocolitica 5-го биотипа этой способностью не обладают, редкие представители этого биотипа могут не обладать орнитиндекарбоксилазой и не ферментировать сахарозу.
Изобретение реализуется следующим образом.
Все биохимические реакции проводят по общепринятым методикам. Исследуемые суточные агаровые культуры иерсиний засевают по одной петле (диаметр 2 мм) в среды, содержащие различные субстраты.
Углеводные субстраты. Тест основан на способности исследуемого микроорганизма утилизировать углевод, введенный в количественном соотношении 1% в жидкую питательную среду, содержащую пептон (1%), натрия хлорид (0,5%), бромтимоловый синий или феноловый красный (0,002%), с образованием кислоты, определяемым по изменению цвета индикатора среды [Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга I /Колл. Авторов // Под ред. Лабинской А.С., Волиной Е.Г. - М.: Издательство БИНОМ, 2008. - 1080 с.: ил.]. Ферментация углеводов сопровождается изменением синего (индикатор бромтимоловый синий) или красного (индикатор феноловый красный) цвета среды на желтый.
Мочевина. Микроорганизмы, обладающие ферментом уреаза, способны гидролизовать мочевину, образуя в виде конечных продуктов аммиак и диоксид углерода, тем самым изменяя рН среды в щелочную сторону. Изменение визуализируется с помощью индикатора. Среда для определения уреазы содержит 100 мл 0,067 М фосфатного буфе, рН 7,0 (40 мл калия дигидрофосфата в концентрации 9,078 г/л, 60 мл двуводного натрия гидрофосфата в концентрации 11,876 г/л); 2,5 г натрия хлорида; 2,5 мл 0,4% водно-щелочного раствора фенолового красного; 10 мл 50% мочевины; конечный объем доводят до 500 мл дистиллированной водой [Методические рекомендации по микробиологической диагностике раневых инфекций в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота / Добрынин В.М. [и др.] // утв. Нач. Главного военно-медицинского управления министерства обороны Российской Федерации. - СПб.: Савож, 1999. - 75 с]. Реакцию учитывают через один, два и 24 ч инкубации исследуемой культуры при (26±2)°С.
Аминокислоты лизин и орнитин. Тесты направлены на выявление ферментов, способных катализировать декарбоксилирование аминокислот с образованием щелочных продуктов, которое выявляется по изменению индикатора среды. Состав среды: пептон (0,5%), глюкоза (0,1%), бромтимоловый синий (0,003%), L-аминокислота (лизин, орнитин) (1%), вода дистиллированная; рН среды (6,5±5) [Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская микробиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II /Колл. Авторов // Под ред. Лабинской А.С., Костюковой Н.Н., Ивановой С.М. - М.: Издательство БИНОМ, 2010. - 1152 с.: ил.]. При разложении субстрата желтовато-зеленый цвет среды изменяется на синий.
3
Триптофан. Тест основан на способности микроорганизмов при росте на питательных средах, содержащих L-триптофан (α-амино-3-индолилпропионовая кислота), вырабатывать специфические дезаминазы в отношении L-триптофана, которые подвергают его окислительному дезаминированию с образованием индол-3-пировиноградной кислоты, что может быть выявлено качественной реакцией при добавлении хлорида железа (III). Жидкая среда для определения дезаминазы содержит пептон сухой ферментативный (1%), натрия хлорид (0,5%), L-триптофан (0,5%), воду дистиллированную. Для определения в среде индол-3-пирувата используют реактив, содержащий 50 мл 10% водный раствор хлорида железа (III) (FeCl) и 50 мл 10% раствора соляной кислоты [Методические рекомендации по микробиологической диагностике раневых инфекций в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота / Добрынин В.М. [и др.] // утв. Нач. Главного военно-медицинского управления министерства обороны Российской Федерации. - СПб.: Савож, 1999. - 75 с]. Наличие триптофандезаминазы выявляется по появлению темно-коричневого или красно-бурого окрашивания среды через 1-2 мин после внесения 1-2 капель реактива с хлорным железом.
Образование индола. Тест основан на том, что в процессе размножения в среде, содержащей триптофан, микроорганизмы образуют фермент триптофаназу, который расщепляет гетероциклическую аминокислоту L-триптофан с образованием индола и других веществ. Среда для индолообразования безуглеводная, содержит L-триптофан (0,25%) (или его источник), натрия хлорид (0,5%), калия дигидрофосфат (0,25%), воду дистиллированную; рН среды (7,3±1) [Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга I /Колл. Авторов // Под ред. Лабинской А.С., Волиной Е.Г. - М.: Издательство БИНОМ, 2008. - 1080 с.: ил.]. Содержание индола определяют добавлением бензойного альдегида (реактив Ковача или Эрлиха), реакция с которым ведет к образованию соединений розового или красного цвета. Для приготовления реактива Ковача 5 г параметиламинобензальдегида растворяют в 75 мл амилового спирта, затем добавляют 25 мл концентрированной соляной кислоты [Методические рекомендации по микробиологической диагностике раневых инфекций в лечебно-диагностических учреждениях армии и флота / Добрынин В.М. [и др.] // утв. Нач. Главного военно-медицинского управления министерства обороны Российской Федерации. - СПб.: Савож, 1999. - 75 с]. Наличие индола в среде после инкубации оценивают по появлению красного кольца на поверхности среды через 1-2 мин после внесения 1-2 капель реактива Ковача.
Образование ацетоина. Анаэробное сбраживание глюкозы идет с преобразованием метаболита пировиноградной кислоты в ацетоин (ацетилметилкарбинол). Среда для реакции Фогеса-Проскауэра содержит пептон (0,5%), калия гидрофосфат (0,5%), глюкозу (0,5%), воду дистиллированную; рН среды (6,9±1). После инкубации при (26±2)°С образование ацетоина выявляют по окрашиванию среды за счет окисления ацетоина в присутствии α-нафтола (добавляют 1-3 капли 6% спиртового раствора α-нафтола) в щелочной среде (добавляют 1-3 капли 40%-го водного раствора калия гидроксида) до диацетила, который образует комплексы вишнево-красного цвета, вступая в реакцию с азотистыми основаниями пептона [Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга I /Колл. Авторов // Под ред. Лабинской А.С., Волиной Е.Г. - М.: Издательство БИНОМ, 2008. - 1080 с.: ил.].
Среды с соответствующими субстратами могут помещаться как в стандартные бактериологические пробирки с пробками в объеме 0,5-1,0 мл, так и в лунки стерильного 96-луночного полимерного планшета в объеме 100-200 мкл (микрообъемная технология исследования). Микрообъемная технология исследования биохимических свойств бактерий наиболее экономична, проста, пригодна для автоматизации и стандартизации исследований. Могут быть использованы как круглодонные, так и плоскодонные полистироловые планшеты. Первые удобны при засеве исследуемого микроорганизма в среду. В свою очередь, плоскодонные планшеты выпускаются в виде разборных на отдельные стрипы. Стриппированные планшеты позволяют проводить исследования от одной культуры. Для создания анаэробных условий и для предотвращения выхода летучих метаболитов, например, аммиака, способных изменять рН среды в соседних лунках, после инокуляции культуры на среду в лунке наносят 2-3 капли стерильного минерального масла. Перед инкубацией планшет (или стрипы) заклеивают пленкой или убирают в плотный полиэтиленовый пакет для предотвращения контаминации и высыхания среды.
Твин 80 (эфир олеиновой кислоты) используется в качестве субстрата для определения наличия у микроорганизма фермента липазы. Для выявления липаз микроорганизмы культивируют на средах с липосодержащими субстратами, гидролитическое расщепление которых сопровождается визуально определяемым изменением внешнего вида среды. Использовали агаровую среду с добавлением 0,01% одноводного кальция хлорида и 1% твина 80 [Методы общей бактериологии: Пер. с англ. /Под ред. Ф.Герхардта [и др.], в трех томах, Т.3. - М.: Мир, 1984. - 264 с.: ил.]. В качестве агаровой основы использовали агар Хоттингера. Инкубация на данной среде производится в течение 24-48 часов при (26±2)°С. Положительный результат - появление мутного ореола вокруг колоний, состоящего из кристаллов кальциевого мыла. Среда для определения липазы является плотной и при приготовлении разливается в чашки Петри.
Важными условиями использования изобретения являются также возраст культуры бактерий, температурный и временной режимы. Оптимальный режим проведения исследования - инкубация суточной агаровой при (26±2)°С в течение 24 часов. Это объясняется психрофильными свойствами представителей рода Yersinia, у которых метаболизм некоторых веществ может различаться при (37±1)°С и (26±2)°С.
Отличительная особенность тест-системы - комплексное использование в одном наборе различных субстратов в питательной среде, позволяющих определять 17 биохимических свойств для полноценной дифференциации видов и биотипов бактерий рода Yersinia.
Специфическая активность тест-системы была установлена в ходе исследования 27 референс-штаммов иерсиний (26 получены из коллекции референс-центра по иерсиниям Парижского института Пастера, одна культура Y.enterocolitica КМ 174 - из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора): два штамма Y.pseudotuberculosis; 14 штаммов Y.enterocolitica, в том числе четыре штамма биотипа 1В, четыре штамма биотипа 1А, два штамма биотипа 2, один штамм биотипа 3, два штамма биотипа 4 и один штамм биотипа 5; три штамма Y.frederiksenii; три штамма различных биотипов Y.intermedia; три штамма Y.kristensenii; два штамма Y.bercovieri. Результаты представлены в таблице 2.
Специфичность тест-системы оценивали при идентификации некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae. Было исследовано восемь культур: две культуры Escherichia coli, одна культура Klebsiella oxytoca, одна культура Klebsiella pneumonia, одна культура Proteus mirabilis, одна культура Enterobacter amnigenes, одна культура Shigella sp., одна культура Salmonella enteritidis. Родовая и видовая принадлежность исследуемых культур определялась с помощью коммерческих тест-систем API 20Е (BioMerieux, Франция), ЭНТЕРОтест24 Н (Эрба Лахема, Чехия), ДС-ДИФ-Энтеро-24 (Диагностические Системы, Н. Новгород). Ни одна из исследуемых восьми культур не была идентифицирована как иерсиния тест-системой для внутриродовой и внутривидовой дифференциации бактерий рода Yersinia.
Результат от использования изобретения - повышение эффективности внутриродовой и внутривидовой дифференциации бактерий рода Yersinia за счет использования предлагаемых тестов, увеличение диапазона определяемых видов и биотипов, повышение стандартности исследования за счет устранения субъективного выбора различных тестов и методик их приготовления.
Приводим примеры использования тест-системы. Исследуемый материал - культуры бактерий, выделенные из смывов с овощей и из материала от человека и животных и идентифицированные как Yersinia sp. Для установления вида и биотипа использовали тест-системы для внутриродовой и внутривидовой дифференциации бактерий рода Yersinia. В лунки стерильного полистиролового планшета предварительно были разлиты 16 жидких сред с субстратами по 0,15 мл. Суточную агаровую культуру поместили петлей (диаметр 2 мм) в каждую лунку с субстратно-индикаторной средой. В лунки с мочевиной и аминокислотами внесли стерильное минеральное масло. На плотную среду в чашке Петри, содержащую твин 80, культуру засеяли штрихом. После инкубации при (26±2)°С в течение 24 часов в одну лунку с триптофаном (среда для определения индолообразования) внесли 1-2 капли реактива Ковача, в лунку со средой для определения образования ацетоина внесли поочередно 1 каплю 40% водного раствора калия гидроксида и 1 каплю 6% спиртового раствора α-нафтола. После инкубации при (26±2)°С в течение 30 минут в другую лунку с триптофаном (среда для определения триптофандезаминазы) внесли 1-2 капли реактива с хлорным железа (III) и произвели учет реакций. Для сравнения результатов использовали прототип - коммерческую тест-систему API 20Е (BioMerieux, Франция), у которой был наибольший процент верной идентификации референс-штаммов иерсиний различных видов.
Пример 1.
Из лаборатории практического здравоохранения была получена культура №1574, выделенная от мышевидного грызуна (рыжая полевка), и по результатам фенотипической идентификации была отнесена к роду Yersinia. В ходе исследования с использованием разработанной тест-системы данную культуру отнесли к виду Y.frederiksenii. А именно, было определено наличие уреазы, орнитиндекарбоксилазы; образования индола, ацетоина; ферментации сахарозы, сорбита, ксилозы, салицина, сорбозы, рамнозы, мальтозы. Остальные тесты дали отрицательный результат. Также биохимические свойства данной культуры исследовали коммерческой тест-системой API 20Е (BioMerieux, Франция). Такие тесты, как определение наличия β-галактозидазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, продукции индола, продукции ацетоина, ферментации D-глюкозы, D-маннита, D-сорбита, инозита, L-рамнозы, D-сахарозы, амигдалина, L-арабинозы были положительные, остальные - отрицательные. По результатам определения биохимических свойств культуры определили вид иерсиний. Согласно тест-системе API 20Е культура относилась либо к виду Y.frederiksenii, либо к виду Y.intermedia. Установить вид точно было возможно с использованием разработанной тест-системы. Результаты представлены в таблице 3.
Пример 2.
Из лаборатории практического здравоохранения была получена культура №1246, выделенная от мышевидного грызуна (бурозубка), и по результатам фенотипической идентификации была отнесена к роду Yersinia и видам Y.mollaretii или Y.bercovieri. В ходе исследования с использованием разработанной тест-системы данную культуру отнесли к виду Y.kristensenii. А именно, было определено наличие уреазы, орнитин декарбоксилазы; образование индола; ферментация сорбита, ксилозы, сорбозы, мальтозы. Остальные тесты дали отрицательный результат, в том числе культура не ферментировала сахарозу и не продуцировала ацетоин в реакции Фогеса-Проскауэра. Также биохимические свойства данной культуры исследовали коммерческой тест-системой API 20Е (BioMerieux, Франция). Такие тесты, как определение наличия β-галактозидазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы, ферментации D-глюкозы, D-маннита, D-сорбита, инозита, амигдалина, L-арабинозы были положительные, остальные - отрицательные. По полученным биохимическим свойствам культуры определили ее вид. Согласно результатам исследования как с использованием разработанной тест-системы, так и тест-системы API 20Е, исследуемый штамм относился к виду Y.kristensenii. Результаты представлены в таблице 3.
Пример 3.
Из лаборатории практического здравоохранения была получена культура №663, выделенная из материала от человека, и по результатам фенотипической идентификации была отнесена к роду Yersinia виду Y.enterocolitica. В ходе исследования с использованием разработанной тест-системы, был подтвержден вид, а также выявлен биотип данного штамма. Культура обладала уреазой, орнитиндекарбоксилазой; продуцировала ацетоин в реакции Фогеса-Проскауэра; ферментировала сахарозу, сорбит, сорбозу, мальтозу. Остальные тесты дали отрицательный результат, а именно, культура не образовывала индол; не обладала лизиндекарбоксилазой, триптофандезаминазой, липазой; не ферментировала ксилозу, салицин, мелибиозу, α-метил-D-глюкозид, рамнозу, раффинозу. При исследовании биохимических свойств коммерческой тест-системой API 20Е (BioMerieux, Франция), было выявлено наличие β-галактозидазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы; продукции ацетоина; способности ферментировать D-глюкозу, D-маннит, D-сорбит, инозит, сахарозу, амигдалин, L-арабинозу. Остальные тесты - отрицательные. Согласно тест-системе API 20Е был определен только вид исследуемого штамма - Y.enterocolitica. Результаты представлены в таблице 3.
Пример 4.
Из лаборатории практического здравоохранения была получена культура №1303, выделенная из смыва с картофеля, и по результатам фенотипической идентификации была отнесенная к роду Yersinia виду Y.mollaretii. В ходе исследования с использованием разработанной тест-системы данную культуру отнесли к виду Y.enterocolitica и биотипу 1А. По результатам биохимических тестов культура обладала уреазой, орнитиндекарбоксилазой, липазой, не обладала лизиндекарбоксилазой, триптофандезаминазой; продуцировала индол и ацетоин; ферментировала сахарозу, мальтозу, сорбит, сорбозу, ксилозу и салицин; не ферментировала мелибиозу, рамнозу, раффинозу и α-метил-D-глюкозид. Также биохимические свойства данной культуры исследовали коммерческой тест-системой API 20Е (BioMerieux, Франция), с помощью которой определили наличие β-галактозидазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы; продукцию индола и ацетоина; ферментацию D-глюкозы, D-маннита, D-сорбита, сахарозы, инозита, амигдалина, L-арабинозы; отсутствовала ферментация рамнозы и мелибиозы; культура не обладала лизиндекарбоксилазой, триптофандезаминазой, аргининдигидролазой, желатиназой, не продуцировала сероводород, не обладала способностью утилизировать цитрат натрия. По результатам определения биохимических свойств культуры с помощью API 20Е, установили вид Y.enterocolitica, но биотип не определили. Результаты представлены в таблице 3.
Пример 5.
Из лаборатории практического здравоохранения была получена культура №1482, выделенная из смыва с картофеля и по результатам фенотипической идентификации отнесенная к роду Yersinia виду Y.frederiksenii. В ходе исследования с использованием разработанной тест-системы было определено наличие уреазы, орнитиндекарбоксилазы; образование индола, ацетоина; ферментации сахарозы, сорбита, ксилозы, салицина, сорбозы, мальтозы, мелибиозы, рамнозы, α-метил-D-глюкозида, раффинозы. Остальные тесты дали отрицательный результат. По результатам определения биохимических свойств исследуемый штамм относился к виду Y.intermedia. Также биохимические свойства данной культуры исследовали коммерческой тест-системой API 20Е (BioMerieux, Франция). Было выявлено: наличие β-галактозидазы, орнитиндекарбоксилазы, уреазы; продукция индола, ацетоина; ферментация D-глюкозы, D-маннита, D-сорбита, L-рамнозы, D-сахарозы, амигдалина, L-арабинозы. Остальные тесты - отрицательные. Однако согласно полученным при использовании тест-системы API 20Е результатам культура относилась либо к виду Y.frederiksenii, либо к виду Y.intermedia. Установить вид точно можно было с использованием разработанной тест-системы. Результаты представлены в таблице 3.
Таким образом, применение разработанной тест-системы позволяет повысить специфическую активность при дифференциации бактерий рода Yersinia за счет расширения диапазона определяемых видов и биотипов иерсиний.