КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА, СОДЕРЖАЩАЯ ЯИЧНЫЙ БЕЛОК С ХАЛЬКАНТИТОМ
COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING CANCER CONTAINING AGG ALBUMEN WITH COPPER VITRIOL

Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции, включающей яичный белок с халькантитом, для профилактики или лечения рака, в частности к композиции для профилактики или лечения рака, которая включает только яичный белок с халькантитом, приготовленные смешиванием халькантита с яичным белком для детоксикации халькантита, или включает смесь яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли, а также к способу приготовления такой композиции.
Предшествующий уровень техники
Рак относится к классу заболеваний, которые начинаются с неконтролируемой пролиферации клеток, затем происходит инвазирование и разрушение соседних нормальных тканей и органов, что далее может вызвать возникновение новых локализаций для раковых клеток и, наконец, привести к смерти человека. За последнее десятилетие, для того чтобы победить рак, были сделаны значительные разработки по модулированию клеточного цикла и апоптоза, а также по нахождению новых мишеней типа онкогенов или генов-супрессоров, подавляющих опухолевый рост. Несмотря на достижения в этой области, уровень заболеваемости раком продолжает возрастать.
В настоящее время лечение рака основано на хирургических операциях, радиотерапии и химиотерапии с назначением множества разновидностей противораковых препаратов, обладающих сильной цитотоксичностью. Однако большая часть этих терапевтических мероприятий ограничивается использованием только для пациентов с ранними стадиями рака и для ограниченного числа раковых заболеваний, поэтому уровень смертности от рака постоянно возрастает.
Кроме того, поскольку большинство противораковых препаратов являются высокотоксичными химическими соединениями, постоянно предпринимаются попытки разработки противораковых препаратов с низкой токсичностью, в частности противораковых препаратов, производимых из натуральных компонентов.
4
2
Халькантит, который является разновидностью сульфатных минералов, состоит в основном из голубого пентагидрата CuSO·5HO. Халькантит является натуральным минералом с очень небольшой долей примесей других минералов в виде голубых кристаллов. Халькантит относится к кристаллам с триклинной системой и стекловатой структурой, которые имеют полупрозрачный голубой блестящий цвет. Известно, что халькантит, включая его искусственную разновидность медный купорос, используется в рвотных средствах, инсектицидах, красителях, фиксажах, электролитах и т.п. Имеется опасение отравления при применении из-за токсичности халькантита, являющегося лекарственным сырьем минерального происхождения. По этой причине имеется ограничение по клиническому применению халькантита, а факт использования халькантита в качестве противоракового препарата не известен из уровня техники.
Бамбуковая соль была изобретена Ил-хум Кимом (годы жизни 1909-1992, псевдоним - Ин-сан). Бамбуковая соль готовится путем синтезирования бамбука и соли с использованием процесса прокаливания. Здесь бамбук может действовать как средство восстановления клеток с генерацией новых клеток, а соль может действовать как стерилизатор и антисептик. В частности, соль с бамбуком прокаливается несколько раз в печи при высокой температуре, за счет чего происходит удаление из соли токсичных веществ с увеличением фармацевтического эффекта при ее применении.
Бамбуковая соль имеет несколько преимуществ, таких как наличие фармакологического эффекта при лечения воспалительных заболеваний за счет укрепления желудка, который считается одним из основных органов тела человека, эффекта очищения крови, эффекта детоксикации и очистки от шлаков и выделений, накопленных в организме, а также эффекта преобразования соматического типа из кислотного в слабощелочной. Дополнительно, известно, что бамбуковая соль в три-четыре раза эффективнее обычной соли в отношении противовоспалительных действия против бактерий и по стерилизационной способности, поэтому такая высокая стерилизационная способность ведет к ослаблению лихорадочного состояния организма.
Изобретателем было обнаружено, что композиция яичного белка с халькантитом, где токсичность халькантита нейтрализуется яичным белком, вызывает апоптоз раковых клеток и подавляет их рост, за счет чего может применяться в качестве натурального противоракового препарата. Более того, изобретатель обнаружил, что в качестве противораковой композиции может использоваться яичный белок с халькантитом самостоятельно или смесь яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли, что послужило основой настоящего изобретения.
Раскрытие изобретения
Техническая проблема
Варианты настоящего изобретения направлены на создание композиции для профилактики или лечения рака, которая включает яичный белок с халькантитом в качестве активного начала.
Варианты настоящего изобретения также направлены на создание функционального оздоровительного пищевого продукта для профилактики рака или улучшения состояния при раке, который включает яичный белок с халькантитом в качестве активного начала.
Варианты настоящего изобретения также направлены на создание способа приготовления композиции белка с халькантитом, который включает операции: (a) нагрев и дегидратация халькантита, являющегося лекарственным сырьем минерального происхождения, до тех пор пока весь халькантит не приобретет серый цвет; (b) охлаждение дегидратированного халькантита и его порошкование; и (c) смешивание халькантита, полученного в операции (b), с яичным белком.
Техническое решение
В одном аспекте по настоящему изобретению предлагается композиция для профилактики или лечения рака, включающая яичный белок с халькантитом в качестве активного начала.
4
2
В настоящем изобретении термин «яичный белок с халькантитом» означает смесь яичного белка и халькантита, который может быть приготовлен путем обжига халькантита (натуральный минерал, главным образом, состоящий из CuSO·5HO) для его дегидратации, порошкования дегидратированного халькантита и последующего смешивания порошка халькантита с яичным белком для проведения реакции между ними. В яичном белке с халькантитом, приготовленным таким образом, токсичность халькантита нейтрализуется яичным белком, за счет чего токсичность снижается или снимается, а фармацевтические свойства улучшаются.
Композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать бамбуковую соль.
Бамбуковая соль, используемая в настоящем изобретении, может быть продуктом, имеющимся на рынке, или приготовляться специально. Здесь бамбуковая соль может быть приготовлена ортодоксальным девятикратным методом, который описан в ряде книжных изданий, таких как «Универсальное и удивительное лекарстов» (1980) и «Удивительное лекарстов» (1986) автора Ил-хум Ким (псевдоним - Ин-сан), который известен как изобретатель бамбуковой соли, однако бамбуковая соль в настоящем изобретении не ограничивается таким способом ее получения. Например, способ производства бамбуковой соли может включать следующие операции: помещение морской соли, производимой на западном побережье Республики Корея, в ствол бамбука и закрытие открытых концов ствола пробками из желтой охры; плотная укладка стволов бамбука, заполненных внутри морской солью, в чугунный короб; обжиг стволов бамбука с использованием в качестве дров, за счет чего происходит сгорание стволов бамбука; размалывание остающегося после обжига столбика соли, а затем повторное помещение размолотой соли в новый ствол бамбука; повторение вышеописанного процесса восемь раз и во время девятого процесса расплавление соли за счет увеличения степени нагрева с помощью добавления сосновой смолы.
Яичный белок и халькантит, содержащиеся в композиции по настоящему изобретению, могут быть порошком. Также, когда композиция включает в себя как яичный белок с халькантитом, так и бамбуковую соль, порошок яичного белка с халькантитом и бамбуковая соль могут смешиваться при различных массовых соотношениях от 1:99 до 99:1, предпочтительно при массовом соотношении от 1:5 до 1:50 и более предпочтительно при массовом соотношении 1:5; 1:10, 1:15, 1:25 и 1:30.
Когда композиция по настоящему изобретению используется как препарат для орального приема, массовое количество молотой бамбуковой соли может быть равным или большим, чем массовое количество порошка яичного белка с халькантитом. В случае применения композиции детьми, ослабленными пациентами, старыми или больными людьми, доля бамбуковой соли может быть увеличена. Однако, если пациент имеет крепкий организм, может быть существенно увеличена доля порошка яичного белка с халькантитом и такая композиция может быть назначена в качестве лекарственного средства при массовом отношении яичного белка с халькантитом к бамбуковой соли вплоть до соотношения от 1:10 до 1:5.
Далее, когда композиция по настоящему изобретению используется как препарат для наружного применения, который наносится на кожу, используется для обработки протиранием или распылением или используется для клизмы, доля порошка яичного белка с халькантитом может быть увеличена, а также яичный белок с халькантитом может назначаться в качестве самостоятельного препарата.
Композиция яичного белка с халькантитом по настоящему изобретению может обладать способностью супрессии раковых клеток за счет повышения активности каспазы-3.
В ряде вариантов осуществления настоящего изобретения, в случае воздействия на клетки рака печени (HepG2), клетки рака толстой кишки (SW480), клетки рака молочной железы (MCF-7), клетки рака легких (NCI-H460) с помощью яичного белка с халькантитом может наблюдаться, что супрессия пролиферации клеток является зависимой от концентрации. Более того, в случае воздействия на клетки рака печени и клетки рака легких с помощью яичного белка с халькантитом, может наблюдаться ядерная фрагментация и конденсация хроматина, вызываемые апоптозом. Дополнительно, способность супрессии рака с помощью композиции яичного белка с халькантитом наблюдается на уровне белка и в результате может быть подтверждено, что активация белка каспазой-3 вызывает апоптоз, т.е. подтверждается, что композиция, включающая яичный белок с халькантитом, подавляет рост раковых клеток.
Композиция яичного белка с халькантитом по настоящему изобретению может использоваться для профилактики или лечения рака. В настоящем описании термин «профилактика» означает каждый случай, который предотвращает возникновение и развитие заболеваний за счет назначения композиции, а термин «лечение» означает каждый случай, который нормализует состояние при заболевании или изменяет состояние при заболевании в благоприятную сторону за счет назначения композиции.
Композиция по настоящему изобретению может применяться для большинства разновидностей рака, например, таких как печени, рак молочной железы, рак легких, рак толстой кишки, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак матки, рак предстательной железы, рак костей, глиома, лейкоз и т.д. Предпочтительно, когда композиция по настоящему изобретению назначается при раке печени, толстой кишки, молочной железы и легких, что не является ограничением.
Композиция, включающая яичный белок с халькантитом по настоящему изобретению в качестве активного начала, может использоваться в качестве фармацевтической композиции за счет включения в ее состав фармацевтически приемлемых носителей. В этом случае композиция может быть приготовлена вместе с такими носителями. Также композиция по настоящему изобретению может использоваться как отдельный агент, так и в качестве агента комплексной композиции с другими эффективными ингредиентами, повышающими эффект такого комплексного препарата.
В настоящем изобретении термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к носителям или разбавителям, которые не ингибируют биологическую активность и характеристики назначаемого химического препарата и не стимулируют живые организмы. Фармацевтически приемлемый носитель в композиции, приготовленной в виде жидкого раствора, может включать носители, приемлемые для живого организма, например, солевой раствор, стерилизованная вода, замедлитель, забуференный физиологический раствор, инъекционный раствор альбумина, раствор декстрозы, раствор солодового декстрина, глицерин, этанол, а также смесь, включающая хотя бы один из этих носителей. В случае необходимости в носитель могут быть добавлены целевые добавки типа антиоксидантов, буферных агентов и бактериостатических агентов. Также возможно готовить препарат для применения в виде инъекций (например, водный раствор, суспензия, эмульсия и т.п.), пилюль, капсул, гранул или таблеток за счет дополнительного добавления разбавителей, диспергентов, поверхностно-активных агентов, связующих агентов и лубрикантов.
Композиции по настоящему изобретению может применяться в любых лекарственных формах, включающих ее в качестве активного начала, и приготовляться в формах для перорального или парентерального введения. Препарат по настоящему изобретению может иметь любую лекарственную форму, подходящую для введения перорально, ректально, назально, для наружного применения, подкожно, вагинально, парентерально, в форме для ингаляции или инсуфляции. Здесь парентеральное введение может включать внутримышечное, подкожное или внутривенное введение.
Лекарственная форма для перорального приема, включающая композицию по настоящему изобретению, может быть приготовлена в форме, например, таблеток, пастилок, таблеток для рассасывания, водного раствора или липофильной суспензии, порошков или гранул, эмульсии, твердых или мягких капсул, сиропа, эликсира и т.п. Для приготовления композиции в форме таблеток или капсул композиция может включать связующие вещества (например, лактоза, сахароза, сорбитол, манитол, крахмал, амилопектин, целлюлоза или желатин), наполнители (например, дикальцийфосфат), разрыхлители (например, кукурузный крахмал или крахмал батата) и лубриканты (например, стеарат магния, стеарат кальция, натрия стеарил фумарат или парафинированный полиэтиленгликоль). В случае использования капсульных лекарственных форм жидкие носители типа жирного масла также могут быть добавлены в дополнение к вышеперечисленным веществам.
Лекарственная форма для парентерального введения, включающая композицию по настоящему изобретению, может быть приготовлена в форме для инъекций, типа подкожной, внутривенной или внутримышечной инъекции, в форме суппозитория или в форме спрея типа аэрозоли, который может вдыхаться через дыхательные пути. Для приготовления лекарственной формы для инъекций композиция по настоящему изобретению может смешиваться со стабилизатором или буферным агентом в воде для приготовления за счет этого раствора или суспензии, при этом приготовленный раствор или суспензия могут быть подготовлены в форме однократных доз в ампулах или флаконах. Такая форма, как суппозиторий, может быть приготовлена в форме композиции для ректального введения типа клизмы или свечей, включая обычную основу для свечей, например, масло какао или другие глицериды. В случае использования формы в виде спрея типа аэрозоли могут добавляться пропелленты с целевыми добавками, такие как водно-дисперсные вещества в конденсированном состоянии или диспергированный увлажненный порошок.
В другом аспекте по настоящему изобретению предлагается способ профилактики или лечения рака путем применения композиции, включающей яичный белок с халькантитом.
В настоящем изобретении лечение заболеваний может включать применение фармацевтической композиции, включающей яичный белок с халькантитом. В настоящем изобретении термин «применение» означает введение фармацевтической композиции по настоящему изобретению пациенту с помощью подходящих способов.
Композиция по настоящему изобретению может быть применена с помощью различных способов введения, например, с помощью только перорального способа введения или только парарентального способа введения, если в этом случае композиция может достичь орган-мишень. В частности, композиция может применяться с помощью обычных способов введения, например, с помощью перороального, ректального, наружного, внутривенного, внутритазового, внутримышечного, внутриартериального, подкожного, интраназального, ингаляционного, интраокулярного или интрадермального способа введения. Желательно, когда композиция применяется пероральным введением или накожно.
Способ лечения по настоящему изобретению включает применение композиции по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемых дозах. Для специалиста, обладающего обычными знаниями в этой области, очевидно, что общая дневная доза может быть назначена врачом в рамках надлежащей медицинской оценки. Терапевтически эффективная доза для определенного пациента может быть определена в зависимости от различных факторов или псевдофакторов, хорошо известных в области медицины, например, вид и длительность действия, которые должны быть достигнуты, возможность использования конкретной лекарственной формы и специфических композиций от частного случая, возраста пациента, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диетических ограничений, способа введения и коэффициента распределения композиции, продолжительности лечения, лекарственных средств, принимаемых совместно или последовательно с композицией и т.д. Поэтому эффективная дневная доза фармацевтической композиции, подходящая для объекта, может быть определена, принимая во внимание вышеуказанное. Предпочтительно, когда эффективная дневная доза фармацевтической композиции назначается в количестве от 0,1 г до 30 г, базируясь на массе порошка яичного белка с халькантитом. Однако такая доза не является ограничением, когда композиция назначается для наружного применения, например, для клизмы, наружного нанесения и т.п.
Далее, способ лечения по настоящему изобретению может использоваться для любых животных, которые могут болеть раком. Здесь под животными могут пониматься не только люди и приматы, но также домашние животные, такие как коровы, свиньи, овцы, лошади, собаки или кошки.
В частности, при пероральном приеме композиции по настоящему изобретению возможно глотать композицию вместе с водой, с водой, в которой смешаны и настояны имбирь и корень солодки, с водой, содержащей экстракт коры корня вяза, или со слюной. В качестве способа приема может использоваться прием капсул, содержащих композицию, с помощью вышеописанных способов, равно как и с помощью непосредственного приема композиции. В этом случае прием капсул, содержащих композицию, заглатыванием вместе со слюной более предпочтителен, чем прием капсул с водой или напитком. Композиция может быть назначена так, что ее можно смешать с пищей или напитком в небольшом количестве. Например, микстура с композицией может быть добавлена в рисовую лапшу или обжаренный чеснок, или порошок яичного белка с халькантитом может быть добавлен в сою с бамбуковой солью.
В частных вариантах осуществления настоящего изобретения яичный белок с халькантитом по настоящему изобретению назначается пациентам, страдающим от рака, вместе с бамбуковой солью, при этом также может наблюдаться противораковый эффект. В результате наблюдается, что применение яичного белка с халькантитом является эффективным для лечения рака молочной железы, лейкемии, рака желудка, рака толстой кишки, рака легких, рака костей, дисплазии шейки матки, рака щитовидной железы и т.д.
В другом аспекте по настоящему изобретению предлагается функциональный оздоровительный пищевой продукт для профилактики рака или улучшения состояния при раке, включающий яичный белок с халькантитом в качестве активного начала.
Функциональный оздоровительный пищевой продукт по настоящему изобретению может включать бамбуковую соль в дополнение к яичному белку с халькантитом.
Композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена с добавлением пищевых добавок, которые являются ситологически приемлемыми, и может использоваться в качестве функционального оздоровительного пищевого продукта для профилактики рака или улучшения состояния при раке. Такой функциональный оздоровительный пищевой продукт по настоящему изобретению может быть осуществлен в таких формах, как таблетки, капсулы, пилюли и жидкость.
Пища, в которую может быть добавлена композиция по настоящему изобретению, может включать, например, различные виды бакалейных товаров, напитков, желейные продукты, чай, витаминные комплексы, биологически активные пищевые добавки.
Термин «функциональный оздоровительный пищевой продукт» означает в настоящем описании пищевой продукту, который произведен или готовится с использованием сырья, обладающего полезными функциями для организма человека. Здесь термин «функциональный» означает, что потребление такой пищи направлено на управление с помощью питательных веществ структурой и функциями организма человека или достижения полезного эффекта с целью сохранения здоровья, например, физиологической активности.
Композиция по настоящему изобретению может быть добавлена в пищу или напитки для целей предотвращения рака или улучшения состояния при раке. Здесь количество композиции, добавляемой в пищу или напиток, может находиться в пределах от 0,01% мас. до 10% мас. по отношению к общей массе пищи. Например, общий объем напитка составляет 100 мл, композиция может быть добавлена в напиток в количестве от 0,01 г до 5 г, более предпочтительно от 0,5 г до 1 г.
В другом аспекте по настоящему изобретению предлагается способ приготовления композиции белка с халькантитом, включающий операции: (a) нагрев и дегидратация халькантита, являющегося лекарственным сырьем минерального происхождения, до тех пор, пока весь халькантит не приобретет серый цвет; (b) охлаждение дегидратированного халькантита и его порошкование; и (c) смешивание халькантита, полученного в операции (b), с яичным белком.
Здесь, ниже, способ приготовления белка с халькантитом по настоящему изобретению будет описан для каждой операции.
4
2
В операции (а) халькантит (в частности, натуральный минерал, содержащий CuSO·5HO) нагревают и затем подвергают дегидратации. Нагрев халькантита может выполняться с использованием обычных способов, которые известны из уровня техники. Предпочтительно, когда халькантит помещают в котел, а затем обжигают с помощью газового пламени, пламени древесины или древесного угля. В процессе нагревания халькантит можно переворачивать для равномерного нагрева при внимательном наблюдении изменения цвета каждые 3-5 часов. Хотя надлежащее время нагрева может варьироваться для разного обжигаемого количества, все же обычным является время обжига 10-24 час. Халькантит нагревают до тех пор, пока все его кристаллы не приобретут серый цвет, т.е. перейдут в состояние дегидратированного халькантита.
В операции (b) халькантит, нагретый и дегидратированный в операции (a), охлаждают, а затем порошкуют. Дегидратированный халькантит должен быть охлажден полностью. Здесь содержание влаги в дегидратированном халькантите может составлять 0-5%. После того как дегидратированный халькантит охлажден полностью, его измельчают в порошок. После этого порошок халькантита может быть уложен в пластиковый пакет или герметичный контейнер, чтобы предотвратить абсорбцию им влаги, а затем его хранят в сухом месте.
В операции (c) порошок халькантита, полученный в операции (b), смешивают с яичным белком, чтобы вызвать реакцию между халькантитом и яичным белком, которая снижает или снимает токсичность халькантита и улучшает фармацевтические свойства.
Здесь яйцо должно быть разделено на яичный желток и яичный белок, а затем в настоящем изобретении используется только яичный белок. Яйцо может быть домашним, предпочтительно яйцом курицы корейский огол. Порошок дегидратированного халькантита, приготовленный в операции (b), смешивают с яичным белком. При этом соотношение при смешивании может быть 600 г порошка халькантита на 140-400 г яичного белка, который обычно получают из 7-20 яиц. При наблюдении за процессом смешивания количество яичного белка может регулироваться, при этом халькантит и яичный белок могут быть смешаны равномерно с использованием подходящего устройства, например, деревянной лопатки, которая редко оказывает влияние на реакцию. Дополнительно, смешивание может выполняться в сосуде, который является неактивным в химической реакции, например, в глиняном сосуде, керамическом изделии или кварцевом сосуде. Во время смешивания следует уделять особое внимание этому процессу, т.к. при нем выделяется значительная теплота реакции.
Далее, если количество яичного белка слишком мало при смешивании, то достаточно трудно нейтрализовать токсичность порошка дегидратированного халькантита. И, наоборот, если количества яичного белка явно слишком много, теплота реакции слишком мала или практически не генерируется, что делает трудным достижение необходимого эффекта при смешивании. Таким образом, количество яичного белка должно быть тщательно отрегулировано. После того как халькантит и яичный белок смешаны надлежащим образом, эта смесь охлаждается до полного прекращения выделения теплоты реакции.
Более того, способ приготовления композиции по настоящему изобретению, после выполнения операции (c), может включать операцию (d) охлаждения смеси, полученной в операции (c), и порошкование охлажденной смеси, полученной в операции (c).
В операции (d) смесь, полученная в операции (c), охлаждают до полного выхода теплоты из смеси, после чего смесь халькантита и яичного белка измельчают в порошок, чтобы получить порошок яичного белка с халькантитом. Здесь за счет порошкования яичного белка с халькантитом он может эффективно использоваться в фармацевтических или ситологических препаратах или диетических продуктах, а также увеличивается площадь реакции, за счет чего максимально увеличивается терапевтическая активность.
В яичном белке с халькантитом, приготовленным с помощью вышеописанного способа, токсичность халькантита снята, а его фармацевтические свойства улучшены, поэтому он может использоваться в фармацевтической или диетической композиции для лечения или профилактики рака.
Преимущества
Композиция, включающая яичный белок с халькантитом по настоящему изобретению, приготовлена в такой форме, в которой токсичность халькантита снята, а фармацевтическая активность приготовленной композиции повышена до максимума, за счет чего композиция обладает ярко выраженной противораковой активностью. Поэтому такая композиция может использоваться для целей профилактики и лечения рака.
Краткое описание фигур чертежей
Фиг.1 иллюстрирует методику проведения теста обратной мутации микроорганизмов.
Фиг.2-4 и 5 иллюстрируют результаты МТТ-теста для каждой из клеток после обработки клеток рака печени (HepG2), клеток рака легких (NCI-H460), клеток рака толстой кишки (SW480) и клеток рака молочной железы (MCF-7) с помощью обожженного халькантита (IS3), яичного белка с халькантитом (IS4) и исходного халькантита (IS5) соответственно.
Фиг.6 и 7 иллюстрируют результаты окрашивания клеток DAPI после обработки NCI-H460 и HepG2 с помощью обожженного халькантита (IS3) и яичного белка с халькантитом (IS4), имеющих концентрацию 50 мкг/мл соответственно.
Фиг.8 иллюстрирует результаты вестерн-блоттинга для наблюдения степени экспрессии белка клеток после обработки клеток NCI-H460 с помощью яичного белка с халькантитом (IS4) с различной концентрацией.
Фиг.9, 10 и 11 иллюстрируют графики изменения веса тела, количества потребляемой пищи и количества потребляемой жидкости в зависимости от времени у мышей контрольной группы и опытных групп, которые были заражены клетками NCI-H460, соответственно.
Фиг.12 иллюстрирует график изменения объема опухоли в зависимости от времени у мышей контрольной группы и опытных групп, которые были заражены клетками NCI-H460.
Фиг.13 иллюстрирует сроки выживаемости у мышей контрольной группы и опытных групп, которые были заражены клетками NCI-H460.
Фиг.14 иллюстрирует часть гистопатологического исследования, а именно результаты оптической микроскопии печени мышей контрольной группы и опытных групп, которые были заражены клетками NCI-H460.
Примеры
Далее, композиция, включающая яичный белок с халькантитом для профилактики и лечения рака по настоящему изобретению, будет описана более подробно со ссылками на сопровождающие чертежи. Однако нижеприведенные примеры предназначены только для целей иллюстрации настоящего изобретения, не ограничивая настоящее изобретение.
Пример 1. Подготовка исследуемого материала (исходный халькантит, обожженный халькантит и яичный белок с халькантитом).
Обожженный халькантит получали обжигом и дегидратацией исходного халькантита, а яичный белок с халькантитом получали обработкой обожженного халькантита с яичным белком. В тесте использовали как исходный халькантит, так и обожженный халькантит и яичный белок с халькантитом.
Сначала готовили обожженный халькантит за счет нагрева и обжига исходного халькантита. В частности, когда исходный халькантит нагревали в течение 24 час, исходный халькантит стал серым за счет его дегидратации. Такой дегидратированный халькантит далее упоминается как «обожженный халькантит». После полного охлаждения обожженного халькантита его измельчали в порошок.
Яичный белок с халькантитом готовили за счет смешивания с последующей реакцией порошка обожженного халькантита с яичным белком. В частности, 600 г порошка обожженного халькантита смешивали с 260 г яичного белка, отделенного от 13 свежих яиц домашних куриц, и проведения реакции с использованием влаги, содержащейся в яичных белках, с выделением большого количества теплоты (теплота реакции). В результате халькантит приобрел зеленый цвет и его порошок агломерировался, такая композиция далее упоминается как «яичный белок с халькантитом».
Для целей дальнейшего использования обожженный халькантит (IS3), яичный белок с халькантитом (IS4) и исходный халькантит (IS5) были развешены по 100 мг с помощью весов, а затем были разведены каждый в бидистилляте воды для приготовления смеси в количестве 1 мл. После полного растворения материалов супернатант отфильтровали с помощью шприцевого фильтра (0,8 мкм) центрифугированием смеси при частоте вращения 6000 об/мин.
Таблица 1
Материал
Полный объем
Особенности
Размер фильтра
Примечание
Раствор вдистиллированнойводе
IS3
Обожженный халькантит
100 мг/мл
Растворимость 97% (около 30 мкг выпало в осадок)
фильтр 0,8 мкм
Супернатант отделен на центрифуге при 6000об/мин в течение 10 мин
IS4
Яичный белок с халькантитом
100 мг/мл
Крайне малый садок в виде белого порошка
фильтр 0,8 мкм
IS5
Исходный халькантит
100 мг/мл
Растворен
фильтр 0,8 мкм
Пример 2. Тест обратной мутации микроорганизмов для исследования генетической токсичности.
Для оценки степени генетической токсичности обожженного халькантита и яичного белка с халькантитом был выполнен тест обратной мутации микроорганизмов, с помощью которого можно обнаружить клеточный мутаген.
Сущностью этого теста является использование измененных штаммов, неспособных к биосинтезу гистидина, которые не растут в среде, не содержащей гистидин. Этот тест выполняется для обнаружения репарации гистидина, что является свойством исходного штамма и происходит под влиянием мутагенов в тесте обратной мутации. В этом тесте, если количество колоний штаммов, по крайней мере, в два раза превосходит их количество в необработанной группе (негативная контрольная группа) или возрастает в зависимости от концентрации исследуемого материал, то результат теста расценивается как положительный, и исследуемый материал считается мутагеном.
Для выполнения теста обратной мутации микроорганизмов в качестве предкультуры использовали стандартные штаммы Salmonella typhimurium TA98, ТА100, ТА1535 и ТА1537. Сначала провели пробу на толерантность, после чего два штамма, а именно ТА100 и ТА102, были отобраны в качестве штаммов для теста, как продемонстрировавшие толерантность по отношению к халькантиту. Штамм Salmonella typhimurium ТА100 является штаммом для теста на обратную мутацию в гене гуанина и цитозина, а штамм ТА102 является штаммом для теста на обратную мутацию аденина и тимина.
Когда антибактериальный тест выполнялся на клетках с использованием яичного белка с халькантитом (5000 мкг/чашка) и обожженного халькантита (2500 мкг/чашка), наблюдалось, что рост штаммов супрессировался. Поэтому тест на генетическую токсичность (обратной мутации) выполнялся при нижеприведенных концентрациях, когда рост штаммов не супрессировался (см. фиг.1).
Яичный белок с халькантитом, имеющий концентрацию 1250, 625, 313, 156 и 78 мкг/чашка, использовался в качестве опытной группы с максимальной концентрацией 2500 мкг/чашка. Также в качестве опытной группы использовался обожженный халькантит, имеющий концентрацию 625, 313, 156 и 78 мкг/чашка с максимальной концентрацией 1250 мкг/чашка.
В качестве позитивной контрольной группы использовались азид натрия с концентрацией 1 мкг/чашка (для штамма Salmonella typhimurium ТА100) и митомицин С (для штамма Salmonella typhimurium ТА102). В качестве негативной контрольной группы использовалась дистиллированная вода.
Соответствующие материалы для исследования, химические соединения позитивных контрольных групп, дистиллированная вода обрабатывались на чашках, после чего подсчитывалось количество колоний штамма с обратной мутацией. Результаты представлены ниже.
Таблица 2
Яичный белок с халькантитом, Штамм: ТА 100
Позитивная контрольная группа
Негативная контрольная группа
Опытная контрольная группа
Концентрация (мкг/чашка)
1
0
2500
1250
625
313
156
78
Количество
1136
194
241
195
157
142
159
186
1421
211
205
221
184
173
162
162
Среднее количество
1279
202
223
208
171
158
161
174
Таблица 3
Отожженный халькантит, Штамм: ТА 100
Позитивная контрольная группа
Негативная контрольная группа
Опытная контрольная группа
Концентрация (мкг/чашка)
1
0
1250
625
313
156
78
Количество
1662
237
192
186
193
192
173
1456
201
235
179
182
193
169
Среднее количество
1559
219
214
183
188
193
171
Таблица 4
Яичный белок с халькантитом, Штамм: ТА102
Позитивная контрольная группа
Негативная контрольная группа
Опытная контрольная группа
Концентрация (мкг/чашка)
1
0
2500
1250
625
313
156
78
Количество
>1000
5
3
4
2
1
0
2
>1000
3
5
3
2
0
3
1
Таблица 5
Отожженный халькантит, Штамм: ТА102
Позитивная контрольная группа
Негативная контрольная группа
Опытная контрольная группа
Концентрация (мкг/чашка)
1
0
1250
625
313
156
78
Количество
>1000
2
2
4
1
3
0
>1000
3
1
0
3
4
2
В случае штамма Salmonella typhimurium ТА100 количество колоний штамма в группах, обработанных яичным белком с халькантитом и обожженным халькантитом, было значительно меньше, чем в позитивной контрольной группе, и даже подобным количеству колоний в негативной контрольной группе при максимальной концентрации, не вызывающей супрессию роста микроорганизмов. Более того, количество колоний не возрастало в зависимости от концентрации. Поэтому было определено, что яичный белок с халькантитом и обожженный халькантит не являются мутагенами.
Также в случае штамма Salmonella typhimurium ТА102 колонии редко возникали в группах, обработанных яичным белком с халькантитом и обожженным халькантитом при максимальной концентрации, не вызывающей супрессию роста микроорганизмов. При этом количество колоний штамма в группах, обработанных яичным белком с халькантитом и обожженным халькантитом, было значительно меньше, чем в позитивной контрольной группе, и даже подобным количеству колоний в негативной контрольной группе. Также количество колоний не возрастало в зависимости от концентрации. Соответственно, было определено, что яичный белок с халькантитом и обожженный халькантит не являются мутагенами.
Пример 3. Культивирование раковых клеток.
2
10% FBS (фетальная бычья сыворотка), 100 U/мл пенициллина и 100 U/мл стрептомицина помещали в среду RPMI 1640 (содержащую L-глютамин) и культивировали клетки рака легких (NCI-H460) в инкубаторе при содержании CO 5%.
Клетки рака толстой кишки (SW480) и клетки рака молочной железы (MCF-7) культивировали в тех же условиях, что и клетки рака легких (NCI-H460).
2
10% FBS, 100 U/мл пенициллина и 100 U/мл стрептомицина помещали в среду DMEM (содержащую L-глютамин) и культивировали клетки рака печени (HepG2) в инкубаторе при содержании CO 5%.
Клетки NCI-H460, MCF-7, SW480 и HepG2 были получены для культивирования в Корейском банке линий клеток (KLCB).
Пример 4. Определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста.
Для исследования эффекта действия обожженного халькантита (IS3), яичного белка с халькантитом (IS4) и исходного халькантита (IS5) на рост раковых клеток этими материалами обрабатывали раковые клетки при различных концентрациях с определением жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста (анализ на основе 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида), оценивая за счет этого супрессию роста раковых клеток.
5
2
МТТ-тест проводился для раковых клеток четырех типов, а именно для клеток рака печени (HepG2), клеток рака толстой кишки (SW480), клеток рака молочной железы (MCF-7) и клеток рака легких (NCI-H460). Сначала каждая из линий клеток высеивалась в 96-луночной плашке с концентрацией 1×10 клеток на лунку по 100 мкл, после проводили культивирование 24 часа в инкубаторе при содержании CO 5% и температуре 37°C. После этого по 100 мкл каждого опытного материала (IS3, IS4 и IS5) помещали в лунки при концентрации 0; 3,125; 6,25; 12,5; 25 и 50 мкг/л соответственно и оставляли после обработки клеток опытным материалом на 24 часа.
Подготовили МТТ (тиазолил синий, SIGMA Со.) с концентрацией 2 мг/мл и добавили его в лунки по 15 мкл для проведения реакции с опытным материалом в течение 3-4 часов. 115 мкл опытного материала извлекали из каждой лунки так, чтобы в ней осталось 30 мкл материала фиолетового цвета, а затем добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (DMSO). После этого полученную смесь тщательно перемешивали с помощью микропланшетной мешалки для растворения осадка, после чего измеряли оптическую плотность раствора на микроридере при поглощении 540 нм. Все результаты теста были откорректированы с учетом замеренного поглощения в лунке, в которой клетки не культивировались.
Для всех образцов проявился эффект увеличения супрессии при увеличении концентрации. Также отмечалось, что рост раковых клеток наиболее эффективно подавлялся, когда раковые клетки взаимодействовали с яичным белком с халькантитом (IS4) (см. фиг.2-5).
Пример 5. Анализ апоптоза клеток с использованием окрашивания DAPI
Для определения того, как обожженный халькантит (IS3), яичный белок с халькантитом (IS4) и исходный халькантит (IS5) подавляют рост раковых клеток, индуцируя апоптоз раковых клеток (NCI-H460 и HepG2), раковые клетки обрабатывали каждым из опытных материалов. Затем раковые клетки окрашивали DAPI, а типы клеток наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Методика проведения эксперимента приведена ниже.
5
По 400 мкл каждой из клеток (1×10 клеток/мл) помещали в 8-луночное предметное стекло и культивировали 24 часа. После этого культивируемые клетки обработали опытным материалом с концентрацией 50 мкг/мл и проводили реакцию 24 часа. После проведения реакции питательная среда была удалена и была проведена реакция клеток с 500 мкл раствора 75 мМ KCl. Это позволило увеличить клетки так, чтобы было легко наблюдать их ядра. После охлаждения до состояния льда за счет смешивания с уксусной кислотой и метанолом при соотношении 1:3 в объеме 500 мкл при времени реакции 5 мин для иммобилизации клеток. Эту процедуру повторяли дважды. После иммобилизации результирующие клетки сушили на воздухе, а затем добавили по каплям 100 мкл раствора красителя DAPI и оставили на 10 мин, после чего промыли с помощью PBS. Верхнее стекло покрыли глицерином и наблюдали результирующие клетки с помощью флуоресцентного микроскопа (×100 или ×200). Среди трехсот подсчитанных клеток выявлялась и наблюдалась ядерная фрагментация и конденсация хроматина в соответствии с морфологическими признаками апоптоза.
Как было упомянуто выше, апоптоз, который является запрограммированной смертью клеток, сопровождается уменьшением клеток, фрагментацией ДНК, дисфункцией митохондрии, активацией протеолитического фермента каспазы. DAPI является синим флуоресцентным красителем и обладает свойством увеличения флуоресценции при связывании с малыми бороздками, в которых находятся АТ-кластеры ДНК. Благодаря этому свойству возможно визуально наблюдать степень фрагментации ДНК за счет простой проверки наличия фрагментированных и конденсированных апоптотических телец с помощью наблюдения в микроскоп.
Окрашивание DAPI выполнялось для клеток Н460 и HepG2, которые были обработаны обожженным халькантитом (IS3) и яичным белком с халькантитом (IS4), имеющих концентрации 50 мкг/мл. В отличие от контрольной группы (группа клеток, не обработанных халькантитом) ядерная фрагментация и конденсация хроматина наблюдалась для всех клеток. В частности, наблюдалось значительное количество апоптотических телец в клетках, обработанных яичным белком с халькантитом (IS4) (см. фиг.6 и 7).
Пример 6. Анализ экспрессии белков, сопровождающих апоптоз, вестерн-блоттингом.
Степень экспрессии белков, сопровождающих апоптоз, таких как каспаза-3, bax и bcl-2, оценивали для определения эффекта яичного белка с халькантитом по отношению к раковым клеткам на уровне белка.
Функцией белка bax является вызывание апоптоза за счет стимуляции секреции цитохрома С при движении из цитозоли в митохондрию. В противоположность этому известно, что белок bcl-2 действует в качестве системы передачи сигналов, которая передает сигналы в клетки или получает сигналы из клеток и ингибирует движение белка bax в митохондрию для супрессии апоптоза (Nomura et al., 1999; Murphy et al., 2000).
Каспаза-3 наиболее непосредственно ассоциируется с апоптозом и действует на стадии инициации апоптоза. Далее, каспаза-3 имеет активную форму гетеродимера 17 кДа и 19 кДа, получаемую отделением из профермента 35 кДа (Femandes-Alnemri et al., 1994), и служит для усиления начальных сигналов каспазы-8 и каспазы-9.
Апоптоз классифицируется на апоптоз с внутренним путем передачи сигнала и апоптоз с внешним путем передачи сигнала, который вызывает апоптоз за счет активности каспазы-3. Для того чтобы наблюдать каспазу-3 в активной форме, степень экспрессии прокаспазы-3 в неактивной форме 35 кДа должна быть снижена соответственно, или должен быть обнаружен белок, имеющий молекулярный вес 17 кДа и 19 кДа, который находится в активной форме (Kang et al., 2002; Ahn et al., 2004).
Вестерн-блоттинг выполнялся для определения, действительно ли яичный белок с халькантитом (IS4) контролирует экспрессию белков (т.е. каспазы-3, bax и bcl-2), которые вызывают апоптоз. С помощью такого анализа, возможно определить путь, которым яичный белок с халькантитом вызывает апоптоз в клетках. Методика проведения эксперимента приведена ниже.
Клетки рака легких (NCI-H460) были обработаны яичным белком с халькантитом (IS4) с концентрацией 0, 25, 50 и 100 мкг/мл соответственно, а затем культивировались 24 час при 37°C. После этого клетки собирали с помощью скрепера и центрифугировали вместе со средой при 1000 об/мин, супернатант отделяли, после чего клетки промывали дважды с 2 мл холодного PBS. От 50 мкл до 100 мкл лизирующего буфера добавляли в результирующие клетки и тщательно перемешивали, после чего оставляли на 2 часа при 4°C. Здесь лизирующий буфер состоял из 50 мМ Tris pH 8,0; 150 мМ NaCl; 0,02% азида натрия; 0,2% SDS; 100 мкг/мл PMSF (фенилметилсульфонил фторид); 50 мкл/мл апротинина; 1% Igepal-630 (или NP-40); 100 мМ NaF; 0,5% натрий дезоксихолата; 0,5 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота - Sigma Е-4884) и 0,1 мМ EGTA (этиленгликоль-бис(β-аминоэтилэфир) N,N,N',N'-тетрауксусная кислота - Sigma E-4378). После проведения реакции опытный материал помещали в пробирку 1,5 мл, затем перемешивали в течение 30 сек и центрифугировали при 23000 об/мин в течение 1 часа при температуре 4°C. Отделили только очищенный центрифугированием супернатант. Количество белка в результирующем опытном материале измерялось при помощи набора для выделения клеточных белков Total Protein Kit фирмы Bio-Rad. Лизирующий буфер и буфер для образцов 5Х смешивали с белком известной массы, чтобы определить белковый эквивалент, а затем результирующую смесь кипятили 5 мин при температуре в термоблоке 100°C. После этого опытный материал собрали центрифугированием результата в течение необходимого времени. После приготовления разделяющего геля (12,5%) и концентрирующего геля (5%) производили электрофорез, а затем переместили гель. Перемещенный гель погружали в красящий раствор (синий окрашивающий раствор Кумасси) на 10 мин и переносили в обесцвечивающий раствор для наблюдения оставшихся белков. Мембрану переноса промывали раствором TBS-T, а затем удаляли из нее влагу. После этого мембрану блокировали нежирным молоком, разведенным с раствором TBS-T, и промывали раствором TBS-T несколько раз. После проведения реакции с первичным антителом (bax, bcl-2, расщепленная каспаза-3; сигнальная система клетки) и вторичным антителом (антитела кролика) с последующей реакцией с раствором ECL в течение 1 мин, фотографическую пленку помещали на кассету и проводили наблюдение фотографированием с последующим проявлением.
В результате обработки клеток Н460 яичным белком с халькантитом (IS4) экспрессия расщепленной каспазы-3 имела тенденцию к увеличению при концентрациях 25 мкг/мл и 50 мкг/мл, однако эта тенденция незначительно снижалась при концентрации 100 мкг/мл. Предполагается, что это происходит потому, что исследуемый материал с более высокой концентрацией проявляет токсичность. Экспрессия blc-2 повышалась незначительно, а экспрессия bax снижалась в группе, обработанной яичным белком с халькантитом (IS4) (см. фиг.4).
Исходя из этих результатов может быть подтверждено, что яичный белок с халькантитом, являющийся активным началом предлагаемой композиции, активирует белок каспазы-3 в раковых клетках путем, отличным от пути для белков bax и bcl-2.
Пример 7. Определение противоракового эффекта
3
Клетки рака легких человека (NCI-H460) были подкожно трансплантированы в переднюю лапу «голой» мыши для формирования солидной опухоли до определенного размера. Яичный белок с халькантитом (IS4), демонстрирующий хорошую способность вызывать апоптоз клеток рака легких человека, в эксперименте in vivo вводился подкожно в течение четырех недель, и проводилось исследование противоракового эффекта яичного белка с халькантитом. При этом эксперимент на определение противоракового эффекта осуществлялся путем измерения размера солидной опухоли с использованием штангенциркуля с цифровой индикацией дважды в неделю с определением тенденции изменения по отношению к весу тела. Степень подавления роста солидной опухоли подсчитывали и сравнивали в день последнего измерения. В этот день завершения эксперимента вес и объем удаленной солидной опухоли измеряли с помощью плетизмометра. Во время эксперимента также идентифицировались особи с центральным некрозом за счет ежедневного осмотра в течение времени проведения эксперимента, а также особи, у которых в результате измерений объем солидной опухоли был больше, чем 1500 мм. Особь, соответствующая одному из вышеуказанных условий, считалась погибшей. Для каждой экспериментальной группы подсчитывался средний срок выживаемости. После завершения эксперимента подсчитывалось процентное увеличение срока жизни по сравнению с контрольной группой. Патологию внутренних органов идентифицировали визуально после аутопсии по окончании измерений. Также брали пробы крови для проведения анализа крови на ALP, CRE, BUN, TG, ALT, AST, уровень Ca, GLU и общий холестерин. Также извлекали органы (сердце, селезенка, яичко) для измерения их веса.
7-1. Материалы и методы.
1. Приготовление раковых клеток для трансплантации.
2
Клетки карциномы легких человека (NCI-H460) для трансплантации культивировали 95% при CO и 37°C в инкубаторе (MCO-20AIC, Sanyo), при этом в колбы для культур объемом 260 мл добавляли 100 U/мл пенициллина, 100 г/мл стрептомицина, 10% подогретую эмбриональную телячью сыворотку, содержащую RPMI-1640 (Gibco BRL). После адгезии клеток их промывали дважды сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) (Gibco BRL), а также промывали с 0,2% трипсином в HBSS, после чего использовали.
2. Ветеринарный осмотр и акклимация.
После получения лабораторных животных провели их ветеринарный осмотр на общее состояние здоровья. Для эксперимента были отобраны подходящие особи здоровых животных, после чего провели недельную акклимацию для их приспособления к окружающим условиям.
3. Классификация по группам.
3
После акклимации трансплантировали культивированные раковые клетки в виде опухоли экспериментальной группе здоровых животных для проведения эксперимента. Удалили кровеносные сосуды и подкожный жировой слой, расположенные на поверхности опухоли. Для трансплантации выбирали только свежие клетки, которые трансплантировали животным подкожно. Когда объем трансплантируемой опухоли достигал 100 мм, измеряли вес тела и размер опухоли, а классификацию по группам произвели методом случайной выборки.
4. Индивидуальная идентификация.
Карточку индивидуальной идентификации, на которой приводили информацию о типе опыта, номер опыта, опытный материал, номер группы, индивидуальный номер, пол, назначенную дозу, срок эксперимента и сведения об ответственном за эксперимент прикрепляли к клетке. Индивидуальную идентификацию выполняли с помощью маркировки на хвосте. Типы обработки групп и назначенные дозы приведены ниже в таблице 6.
Таблица 6
Группа
Назначенная доза
Число в группе, N
G1
Только NCI-460
только клетки опухоли NCI-H460
7
G2
IS4
45 мг/кг + NCI-H460 клетки опухоли
7
G3
IS4
90 мг/кг + NCI-H460 клетки опухоли
7
5. Способ введения
Опытный материал разводили в физиологическом растворе и вводили перорально с помощью зонда один раз в день в течение 4 недель.
6. Методика оценки.
1) Измерение веса тела.
Для оценки изменения веса тела в течение срока эксперимента вес тела измеряли один раз в 7 дней после начала эксперимента.
2) Приготовление образцовой опухоли.
7
1×10 клеток / «голая» мышь / 100 мкл вводили для получения штамма опухоли, которую затем субкультивировали в экспериментальной группе. Субкультивирование повторяли три раза для получения солидной опухоли, обладающей свойствами естественно раковой опухоли. Опухоль была трансплантирована животным пяти экспериментальных групп.
3
Животное, опухоль которого демонстрировала стадию быстрого роста при достаточном кровоснабжении, выводили из эксперимента до образования центрального некроза опухоли. Часть быстрорастущего участка материала опухоли отрезали по контуру до определенного размера (3×3×3 мм) для получения фрагмента опухоли. Фрагмент опухоли помещали в конец троакара, иссекали переднюю сторону левой задней лапы мыши примерно на 4 мм и вставляли в иссеченный участок приготовленный троакар так, чтобы его конец был размещен у части тела позади левой передней лапы. Троакар извлекали, быстро поворачивая на 360°. Фрагмент опухоли размещали в желательном положении. Иссеченный участок дезинфицировали. Положение опухоли контролировали ощупыванием через кожу. Рост опухоли наблюдали не менее двух раз в неделю. После проведения трансплантации животных классифицировали по группам, когда объем опухоли достиг 100 мм, после чего начинали вводить опытный материал.
3) Проведение противораковых испытаний (по среднему объему опухоли). Длинную ось и короткую ось опухоли измеряли штангенциркулем дважды в неделю, после чего измеряли вес тела. Если проходило 28 дней после начала введения опытного материала, эксперимент завершали, а опытные ткани проверяли для определения эффекта подавления раковой опухоли опытным материалом. Объем раковой опухоли и степень ингибирования роста опухоли после прошествия вышеуказанного периода времени подсчитывали с помощью следующих уравнений:
2
V=(А×В)/2,
где V - средний объем опухоли, А - длина длинной оси, В - длина короткой оси;
IR=[(CV-TV)/TV]×100,
где IR - степень ингибировании, CV - средний объем опухоли в контрольной группе, TV - средний объем опухоли в экспериментальной группе.
4) Средний срок выживаемости и процентное увеличение срока жизни (%ILS).
3
Выявляли особи, у которых проявлялся центральный некроз солидной опухоли по результатам ежедневных наблюдений во время эксперимента, а также особи, размер солидной опухоли которых становился более 1500 мм в результате измерения размера опухоли. Особь, соответствующую одному из вышеуказанных признаков, считали погибшей. Процентное увеличение срока жизни подсчитывали по следующей формуле:
%ILS=[(Т-С)/С]×100,
где Т и С - количество дней до смерти мыши в контрольной группе и экспериментальной группе соответственно.
7. Исследование уровня липидов в крови и общий анализ крови. Кровь отбирали из аорты на брюхе после аутопсии для получения сыворотки крови. Исследование на щелочную фосфотазу (ALP), креатинин (CRE), кальций, глюкозу (GLU), аланинаминотрансферазу (ALT), аспарагиновую трансаминазу (AST), мочевину (BUN) проводили с помощью автоматического биохимического анализатора крови (HITACHI, Токио, Япония).
8. Гистопатологическое исследование.
По завершению эксперимента у животных брали кровь и умерщвляли, чтобы извлечь печень, почки и селезенку, которые взвешивали и проводили визуальный осмотр. Ткани помещали в 10% нейтральный раствор формалина. Срезы тканей толщиной 4 мкм получали с помощью промежуточной лиофилизации парафином с окраской гематоксилином и эозином и проводили их исследование с помощью оптического микроскопа.
9. Статистический анализ.
Проводили тест Левене для сравнения однородности дисперсии для каждого из результатов эксперимента. В случае, когда дисперсия была однородной, выполняли однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Если исследовалась достоверность, выполняли тест Дуннетта для нахождения экспериментальной группы, имеющей значимые различия по сравнению с контрольной группой (при p<0,05 или p<0,01).
7-2. Результаты и обсуждение.
1. Изменение веса тела.
В отношении изменения веса тела и изменения количества потребляемой пищи и жидкости во время эксперимента отмечалось, что вес в начале эксперимента и количество потребляемой пищи в экспериментальной группе, которой вводили IS4, снижался по сравнению с контрольной группой, которая была только заражена клетками NCI-H460, однако эти показатели восстановились до нормальных по истечении одной недели (см. фиг.9, 10 и 11). Во время проведения эксперимента, в этой части не было того, что следовало бы еще отметить при сравнении групп.
2. Изменение объема опухоли (солидной опухоли).
3
3
3
Объем солидной опухоли измерялся во время эксперимента дважды в неделю с помощью штангенциркуля. В результате в экспериментальной группе, в которой вводилось 45 мг/кг или 90 мг/кг IS4, супрессия зависела от большей концентрации и от группы, которая была только заражена клетками NCI-H460 (см. фиг.12). При сравнении промежутков времени для групп рост клеток NCI-H460 подавлялся через 12 дней после начала введения IS4 и через 15 дней после начала такого введения, как показала тенденция ингибирования солидной опухоли по сравнению с группой, которая была только заражена клетками NCI-H460. В цифровом выражении тенденция ингибирования солидной опухоли показала, что на 22 день второй половины эксперимента в группе, в которой вводилось 45 мг/кг IS4, объем опухоли составлял 2221,74 мм, а при введении 90 мг/кг IS4, объем опухоли составлял 1517,07 мм, при этом в группе, которая была только заражена клетками NCI-H460, объем опухоли составлял 2806,47 мм.
3. Степень ингибирования роста опухоли (солидной опухоли).
В результате анализа степени ингибирования роста опухоли с базой 100% для группы, которая была только заражена клетками NCI-H460, экспериментальная группа продемонстрировала зависимость тенденции ингибирования от концентрации с 8 дня по 25 день (на 22 день: IR 82,47% при IS4 45 мг/кг < IR 59,99% при IS4 90 мг/кг). Группа, в которой вводилось 90 мг/кг IS4, продемонстрировала снижение ингибирования солидной опухоли с 22 дня (см. табл.7).
Таблица 7
Группа
День
0
4
8
12
15
19
22
26
29
только NCI-H460
100
100
100
100
100
100
100
100
100
IS4 45 мг/кг
99.99
76.19
72.11
79.55
75.44
85.92
82.47
79.32
73.73
IS4 90 мг/кг
92.76
75.26
78.71
75.41
68.23
68.97
59.99
69.37
66.06
4. Вес и объем опухоли (солидной опухоли).
3
3
3
В результате определения веса солидной опухоли, извлеченной в день завершения эксперимента, а также измерения ее объема с помощью плетизмометра, вес и объем солидной опухоли в группе, которая была только заражена клетками NCI-H460, составили 2,52±0,75 г и 4,67±1,18 см, те же показатели для группы, в которой вводилось 45 мг/кг IS4, были ниже и составили 2,24±0,78 г и 4,03±1,28 см, а для группы, в которой вводилось 90 мг/кг IS4, они составили 2,17±0,60 г и 3,79±0,85 см, показывая значительное снижение (при p<0,05) (см. табл.8).
Таблица 8
только NCI-H460
IS4 45 мг/кг
IS4 90 мг/кг
Вес опухоли (г)
2,52±0,75
2,24±0,78
2,17±0,60
Объем опухоли (см<sup>3</sup>)
4,67±1,18
4,03±1,28
3,79±0,85
5. Срок выживаемости и процентное увеличение срока жизни.
3
Выявляли особи, у которых проявлялся центральный некроз солидной опухоли по результатам ежедневных наблюдений во время эксперимента, а также особи, размер солидной опухоли которых становился более 1500 мм в результате измерения размера опухоли. Особь, соответствующую одному из вышеуказанных признаков, считали погибшей особью и соответственно подсчитывали срока выживаемости и процентное увеличение срока жизни. Срок выживаемости в группе, которая была только заражена клетками NCI-H460, составил 18,29±3,59 дней, в группе, в которой вводилось 45 мг/кг IS4 - 20,71±2,61 дней, т.о. увеличение срока жизни составило до 10,68%. Также и в группе, в которой вводилось 90 мг/кг IS4, срок выживаемости составил 22,33±2,44 дня, т.о. увеличение срока жизни составило до 22,08% (см. табл.9 и фиг.13).
Таблица 9
Терапия
Средний срок выживаемости (дни)
%ILS
только NCI-H460
18,29±3,59
0
IS4 45 мг/кг
20,71±2,61
10,68
IS4 90 мг/кг
22,33±2,44<sup>*</sup>
22,08
<sup>*</sup> Значимые различия от контрольной группы (только NCI-H460) при p<0,05
6. Гистопатологическое исследование (оптическая микроскопия) и измерение веса органов.
При определении различий в весе органов после аутопсии не было выявлено значительных отличий за исключением того, что вес печени в экспериментальной группе, в которой вводилось 45 мг/кг IS4, был значительно меньше (при p<0,01) по сравнению с группой, которая была только заражена клетками NCI-H460. При этом вес этого органа, измеренный после аутопсии, составлял 1,76±0,07 г в группе, которая была только заражена клетками NCI-H460, и 1,54±0,07 г в группе, в которой вводилось 45 мг/кг IS4, что доказывает значительное уменьшение (при p<0,01). Однако в группе, в которой вводилось 90 мг/кг IS4, вес этого органа составил 1,69±0,10 г, т.е. здесь не было отмечено значительного снижения (см. табл.10). Значительных различий между группами также не было обнаружено при гистопатологическом исследовании (см. фиг.14).
Таблица 10
Терапия
Абсолютный вес органа
Вес тела (г)
Печень (г)
(Селезенка (г)
Сердце (г)
только NCI-H460
26,64±1,61
1,76±0,07
0,33±0,04
0,15±0,01
IS4 45 мг/кг
25,37±0,88
1,54±0,07*
0,31±0,04
0,15±0,01
IS4 90 мг/кг
26,13±0,90
1,69±0,10
0,31±0,08
0,15±0,01
Терапия
Абсолютный вес органа
Почка (г)
Яичко (г)
левая
правая
левое
правое
только NCI-H460
0,22±0,06
0,21±0,05
0,11±0,06
0.11±0,06
IS4 45 мг/кг
0,22±0,03
0,22±0,02
0,09±0,01
0,09±0,01
IS4 90 мг/кг
0,23±0,01
0,23±0,01
0,09±0,01
0,09±0,01
Терапия
Относительный вес органа
Вес тела (г)
Печень (г)
Селезенка (г)
Сердце (г)
только NCI-H460
26,64±1,61
6,61±0,22
1,27±0,22
0,58±0,03
IS4 45 мг/кг
25,37±0,88
6,07±0,13*
1,24±0,19
0,58±0,05
IS4 90 мг/кг
26,13±0,90 6,47±0,24
1,18±0,28
0,59±0,03
Терапия
Относительный вес органа
Почка (г)]
Яичко (г)
левая
правая
левое
правое
только NCI-H460
0,82±0,22
0,80±0,19
0,42±0,21
0,42±0,20
IS4 45 мг/кг
0,86±0,10
0,87±0,08
0,35±0,04
0,36±0,04,
IS4 90 мг/кг
0,89±0,04
0,90±0,06
0,34±0,03
0,35±0,03
* Значимые различия от контрольной группы (только NCI-H460) при р<0,05
7. Биохимическое исследование крови.
Анализ результатов биохимического исследования крови, взятой после аутопсии, не выявил существенных различий крови по уровням ALP, CA, CRE, ALT, AST при введении опытного материала.
С другой стороны, уровни UN в крови продемонстрировали значительное снижение во всех экспериментальных группах, в которых вводили опытный материал (IS4 45 мг/кг, IS4 90 мг/кг, p<0,01). Также уровень PHOS в крови экспериментальной группы, в которой вводилось 45 мг/кг IS4, составил 7,79±0,82 мг/дл, продемонстрировав значимое различие по сравнению с уровнем 9,27±0,99 мг/дл в группе, которая была только заражена клетками NCI-H460 (группа IS4 45 мг/кг, p<0,05).
Таблица 11
Группа
ALP
CA
CRE
ALT
AST
PHOS
UN
МЕ/л
мг/дл
мг/дл
МЕ/л
МЕ/л
мг/дл
мг/дл
только клетки NCI-H460
67,62±7,27
10,18±0,44
0,35±0,06
184,08±43,85
25,75±4,62
9,27±0,99
29,38±0,68
IS4 45 мг/кг
70,57±13,61
10,10±0,79
0,30±0,06
175,19±53,17
24,10±3,51
7,79±0,82*
21,23±2,29**
IS4 90 мг/кг
67,93±4,45
10,40±0,43
0,35±0,06
160,50±36,66
30,25±11,91
8,35±0,75
21,58±1,63*
Результаты выражены как «значение» ± «среднеквадратичное отклонение»
* Значимые различия от контрольной группы (только NCI-H460) при p<0,05.
** Значимые различия от контрольной группы (только NCI-H460) при p<0,01.
Пример 8. Примеры лечения заболеваний
Композицию из яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли готовили смешиванием порошка яичного белка с халькантитом и порошка бамбуковой соли при массовом соотношении 1:20, после чего порошок смеси яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли помещали в желатиновые капсулы, которыми обеспечивали пациентов. Назначали от 10 до 20 капсул в день для приема проглатыванием одну за одной вместе со слюной или питьевой водой (дневная доза 5-10 г для взрослого или 1-3 капсулы на 10 кг веса тела). Пациенты принимали капсулы от двух до десяти раз в день с интервалом 1-2 часа. В случае необходимости для восстановления энергии также назначали лечебный травяной отвар и корейский соевый соус Sari-Jang для приема вместе с композицией из яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли.
8-1. История болезни 1. Лечение дисплазии шейки матки.
Информация о пациенте (фамилия - Ко, возраст - 35 лет, пол - женский): страдает дисплазией шейки матки, принимала противотуберкулезные препараты в течение 2 лет, являлась носителем вируса гепатита В. В этом состоянии принимала композицию из яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли с травяным отваром и Sari-Jang в течение 3 месяцев, а также композицию из яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли с водой вводили парентерально в матку. После этого при проведении обследования диагностировали, что большинство клеток стали нормальными, и только ядра были несколько увеличенными. После этого наступил рецидив из-за прерывания курса терапии. Однако после возобновления терапии (т.е. приема композиции из яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли и парентерального введения этой композиции) была в результате вылечена через один месяц.
8-2. История болезни 2. Лечение рака толстой кишки, рака легких и рака костей.
Информация о пациенте (фамилия - Чун, возраст - 57 лет, пол - мужской): диагноз - рак толстой кишки, рак легких и рак костей (рак шейного позвонка). После операции по удалению рака толстой кишки и рака легких (когда было проведено обследование из-за проблем с мочеиспусканием, мочевой пузырь был в норме, но часть мочевого пузыря была удалена, т.к. оказывала давление на нерв), рак метастазировался на позвоночник. Позвоночник был поражен за счет роста раковых клеток, из-за чего нервы вокруг ребра сдавливались так, что пациент страдал от сильной боли. Несмотря на проведение 6 курсов химиотерапии, состояние пациента не улучшилось в целом, и раковые клетки остались в неизменном виде. Более не оставалось терапевтических возможностей, а болеутоляющие практически не помогали переносить боль, и пациент был слишком ослаблен для проведения курса химиотерапии. В этой ситуации пациенту была назначена композиция из яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли с травяным отваром и Sari-Jang, которые принимались в течение 5 месяцев. После этого пациент прошел медицинское обследование, результаты которого показали, что пациент был излечен.
8-3. История болезни 3. Лечение рака щитовидной железы.
Информация о пациенте (фамилия - Ким, возраст - 46 лет, пол - мужской): 12 лет назад проходил курс лечения от острого гепатита, на настоящее время выявлено, что печень кальцинировалась. Диагностировался рака щитовидной железы, после чего назначен прием композиции из яичного белка с халькантитом и бамбуковой соли с травяным отваром и Sari-Jang без использования химиотерапии. Спустя один месяц по результатам компьютерной томографии было установлено, что размер опухоли уменьшился с 5,1 мм до 4,6 мм. После дополнительного курса приема композиции в течение 6 месяцев болезнь была вылечена.
Промышленная применимость
В соответствии с настоящим изобретением благодаря тому, что халькантит подвергнут детоксикации, а его фармацевтическая активность доведена до максимума в композиции, включающей яичный белок с халькантитом, то эта композиция яичного белка с халькантитом демонстрирует высокую противораковую активность. Также композиция по настоящему изобретению может эффективно использоваться в фармацевтических композициях для профилактики и лечения рака, а также применяться в функциональной оздоровительной пище.