Масс-спектрометрия для видовой расшифровки Candida spp. У пациентов с диарейным синдромом и клиническими проявлениями дисбиоза кишечника

2014, Т. 4, № 1

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕПРЕССИИ OmpT МАЛОЙ РНК VrrA У РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE

А.В. Керманов12, Т.В. Шамова3, А.Б. Мазрухо1, Р.В. Писанов1

1 Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

2Южный федеральный университет, г. Ростов-на-Дону 3Волгоградский государственный аграрный университет

У V. cholerae лабораторными методами обнаружены десятки типов молекул, относящихся к группе малых РНК-регуляторов. Неоднократно показано их участие в эффективном управлении экспрессией генов. Для малой РНК VrrA получены убедительные молекулярно-генетические доказательства подавления синтеза мембранных белков OmpA и OmpT.

Целью нашего исследования было выявление особенностей взаимодействия малой РНК VrrA и мишени — матричной РНК ompT штаммов V. cholerae с доступной геномной информацией. Эксперимент проводили in silico на 210 штаммах (N16961 рассматривали в качестве референтного), при этом оценивали свободную энергию гибридизации мишени с последовательностью малой РНК и участвующие в связывании позиции в последовательностях. Степень репрессии белка OmpT малой РНК VrrA принималась пропорциональной увеличению энергии гибридизации.

Результаты демонстрируют ожидаемое преобладании «референтной» или крайне близкой к ней энергии гибридизации VrrA с ompT. Тем не менее, у некоторых штаммов подавление ompT малой РНК VrrA усилено (штаммы RC385, CP1035 (8), LMA3984-4) или же ослаблено (штамм 1587). Усиление репрессии ompT при экспрессированной VrrA обеспечивается увеличением (по модулю) энергии образования дуплекса «малая РНК—мРНК» на 27%, а общей свободной энергии связывания — на 11%. Для штамма 1587 наблюдается уменьшение энергии связывания на 8%, причем участок связывания на мРНК расширен по направлению к 5'-концу, что, вероятно, еще более ослабляет удельную гибридизационную энергию для стандартного региона связывания. Недостаток сопроводительной информации затрудняет выявление функциональной связи между полученными результатами и другими биологическими особенностями штаммов. Дополнительные сведения о молекулярных механизмах, вовлеченных в регуляцию экспрессии мембранных белков, могут пролить свет на значение полученных отличий в гибриди-зационных энергиях ompT и VrrA для адаптивности штаммов холерного вибриона.

ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ, ПРИГОТОВЛЕННЫХ НА ОСНОВЕ МКА К АНТИГЕНУ 200 kDa B. PSEUDOMALLEI 100 Е.Э. Ким, Т.В. Замарина ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

На основе высокоактивных моноклональных иммуноглобулинов различной эпитопной направленности, взаимодействующих с гликопротеином капсулы возбудителя мелиоидоза с м.м. 200 kDa, были

получены экспериментальные образцы высокоактивных и специфичных диагностических препаратов для метода флуоресцирующих антител (МФА).

Для оценки спектра их специфической активности использовали мазки-препараты из взвесей 31 музейного штамма B. pseudomallei.

Установлено, что наибольшей активностью в отношении возбудителя мелиоидоза, сопоставимой с активностью моноклонального препарата сравнения, обладают иммуноглобулины флуоресцирующие моноклональные 5H11.

Специфичность всех экспериментальных образцов иммуноглобулинов флуоресцирующих моно-клональных оценивали по результатам окрашивания мазков-препаратов, приготовленных из взвесей гетерологичных микроорганизмов III—IV групп патогенности: B. thailandensis (5 штаммов), B. cepacia (5 штаммов), B. allicola, B. gladioli, B. marginata, P. putida (по одному штамму). Специфичность образцов была различной.

Оба препарата сравнения, приготовленные на основе поли- и моноклональных иммуноглобулинов, «узнавали» все штаммы B. thailandensis. В то время, как три из четырех вновь приготовленных препаратов (3C6, 5H11 и 6A11) проявили себя как специфичные диагностические средства, не взаимодействующие ни с одним из штаммов взятых в работу видов гетерологичных микроорганизмов. Только конъюгат 5C2 обладал перекрестной активностью в отношении одного штамма B. thailandensis и одного штамма B. cepacia. Наибольший интерес представляют данные об отсутствии кросс-реактивности МКА 3C6, 5H11, 6A11 в отношении B. thailandensis — буркхоль-дерии, наиболее близкой в антигеном отношении B. pseudomallei. Этот факт заслуживает внимания, так как по данным литературы подавляющее большинство экспериментальных препаратов и тест-систем, предназначенных для обнаружения возбудителя ме-лиоидоза, не позволяют дифференцировать эти два вида буркхольдерий.

Таким образом, получены доказательства того, что экспериментальные образцы конъюгатов мели-оидозных моноклональных 3C6, 5H11 и 6A11 по параметру специфичности превосходят применявшиеся в работе аналоги.

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ДЛЯ ВИДОВОЙ РАСШИФРОВКИ CANDIDA SPP. У ПАЦИЕНТОВ С ДИАРЕЙНЫМ СИНДРОМОМ И КЛИНИЧЕСКИМИ ПРОЯВЛЕНИЯМИ ДИСБИОЗА КИШЕЧНИКА

Н.С. Климович1, Е.А. Оришак2

1 ЗАО «Ситилаб», Санкт-Петербург

2 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург

Известно, что грибы рода Candida могут транс-лоцироваться из кишечника и вследствие гематогенной диссеминации поражать различные органы, без специфической симптоматики, а иногда и без явной клинической картины, что приводит к несвоевременной постановке диагноза «кандидоз». Возрастает число случаев кандидозов, вызываемых не С. albicans. Многие виды не С. albicans обладают устойчивостью к антифунгальным препаратам или имеют тенденцию к быстрому формированию таковой в ходе лечения. Доказано, что данные виды способны вызывать инвазивный кандидоз у лиц,

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

Инфекция и иммунитет

перенесших абдоминальные операции, особенно повторные, у лиц с предрасполагающей патологией (сахарный диабет, ВИЧ, хронический гепатит В, онкологические заболевания), у пациентов, имеющих в анамнезе длительную антибиотикотерапию или терапию глюкокортикостероидами. Показано, что некоторые виды Candida могут вызывать диарею новорожденных и антибиотикоассоциированную диарею у взрослых. Однако факт выявления Candida в фекалиях пациента зачастую является лишь свидетельством кандидоносительства, но не кандидо-за. Наиболее популярная трактовка находок Candida в фекалиях — дисбиоз кишечника с избыточным ростом Candida spp. При этом, как правило, не приводится видовая характеристика изолятов, что может повлечь за собой неудачные попытки элиминации не С. albicans. Нами обследовано 630 пациентов с диарейным синдромом и явлениями дисбиоза. У 99 пациентов выявлены грибы рода Candida. Видовое разнообразие изучали с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии. Полученные штаммы Candida spp. распределились по видам следующим образом: С. albicans — 66 изолятов (65% от числа изоля-тов Candida), С. lusitaniae — 9 (9%), С. krusei — 7 (7%), С. parapsilosis — 4 (4%), С. guilliermondii — 3 (3%), С. lambica — 2 (2%), С. tropicalis — 2 (2%), С. glabrata — 2 (2%), С. kefyr — 2 (2%), С. inconspicua — 2 (2%), С. dubliniensis — 1 (1%), С. intermedia — 1 (1%). Данные находки не позволяют дифференцировать кандио-носительство от кандидоза, однако установление вида Candida spp. с помощью масс-спектрометрии в ходе исследования на дисбиоз кишечника может послужить отправной точкой для дальнейшего обследования таких пациентов с целью своевременной терапии.

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА У ДЕТЕЙ С ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

Н.В. Корнева, А.А. Старшинова, Ю.Э. Овчинникова, О.А. Якунова, И.Ф. Довгалюк

ФГБУ Санкт-Петербургский НИИфтизиопульмонологии МЗ РФ

Введение. Широко применяемый в мире иммунологический тест для определения активности туберкулезной инфекции — QuantiFERON-TB Gold (КФ) — основан на количественном определении in vitro интерферона гамма (IFNy) методом иммуно-ферментного анализа в ответ на стимуляцию лимфоцитов антигенами ESAT-6, CFP-10 и TB7.7, специфичными для M. tuberculosis.

Цель: выявление особенностей иммунного ответа у детей с различными результатами КФ теста.

Материалы и методы. Группа включения: дети 3—14 лет, обследованные в отделении детской фтизиатрии в 2011—2013 гг. Всем был выполнен КФ, на основании результатов которого пациенты разделены на 2 группы: I группа (85) — с отрицательным результатом, II группа (155) — с положительным. Диагностический комплекс: клинические, иммунологические, бактериологические и лучевые методы (мультисрезовая компьютерная томография). Иммунологические методы: ДИАСКИНТЕСТ (ДСТ), оценка субпопуляционного состава лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD4+/CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD95+, HLAII), продукции индуцированных цитокинов (IL-2, IL-4, IFNy, TNFa), фагоцитарной активности нейтрофилов (фагоцитарный индекс

(ФИ), фагоцитарное число Райта (ФЧ) и индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ). Обработка материала проводилась с использованием программ Microsoft Office Word Excel 2010 и GraphPad Prism 6. Применялся критерий хи-квадрат (%2). Количественные данные представлены в виде M±SD. Различия считались значимыми при р < 0,05.

Результаты. Результаты ДСТ и КФ были сопоставимы: отрицательные результаты ДСТ достоверно преобладали в I группе (76,8% (I) против 3,1% (II), р < 0,001), положительные — во II (96,9% (II) против 23,2%

(I), р < 0,001). Специфические изменения во внутри-грудных лимфатических узлах (ВГЛУ) по данным МСКТ достоверно чаще выявлялись во II группе (83,3% (II) против 40,2% (I), р = 0,001). Уровни цитокинов TNFa (686,71+70,75 (I) против 962,37+91,88 (II), р = 0,05), IL-2 (173,58+24,23 (I) против 280,45+26,61

(II), р = 0,05) и IFNy (18 749,94+1566,68 (I) против 20 729,58+1396,93 (II), р = 0,05) были достоверно выше во II группе. Также во II группе отмечено достоверное повышение CD3+ (р = 0,04), CD4+ (р = 0,04) и CD95+ (р = 0,04), в I — достоверно повышены CD25+ (р = 0,03). Повышение ФЧ выявлено во II группе (42,3% (I) против 65% (II) (р < 0,01), ИЗФ выше в I группе (1,05+0,07 (I) против 0,94+0,06 (II).

Выводы. Положительные результаты КФ и ДСТ сопоставимы и ассоциированы со специфическими изменениями во ВГЛУ, активацией нейтрофилов, ростом уровня цитокинов TNFa, IL-2, IFNy и субпопуляций лимфоцитов CD3+, CD4+ и CD95+.

КОРРЕЛЯЦИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА (BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI) ДЛЯ КЛЕТОК TETRAHYMENA PYRIFORMIS С ИХ ВИРУЛЕНТНОСТЬЮ

Е.В. Король, Р.О. Абдрахманова, С.Н. Тихонов, Е.В. Шубникова

ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

Инфузории вида T pyriformis известны как модель для изучения вирулентности различных видов бактерий. Показано, что вирулентные микроорганизмы могут эффективно размножаться в клетках тетра-химен и вызывать их инцистирование, являющееся результатом цитотоксического действия бактерий на клетки инфузорий.

Цель настоящей работы состояла в сравнении цитотоксичности штаммов B. pseudomallei для клеток тетрахимен и установлении ее корреляции с показателями вирулентности для экспериментальных животных.

Использовали штаммы (B. pseudomallei 107, 99, 56770, С-141, 110), отличающиеся по вирулентности для моделей золотистых хомячков и белых мышей. Аксеническая культура Т. pyriformis получена из Института цитологии РАМН (Санкт-Петербург). Тетрахимены выращивали в L-бульоне «ХайМеди» при температуре 25°С. Изменения морфологии клеток наблюдали при световой и электронной микроскопии (увеличение 10x90 и х5000 соответственно). Культуры простейших и микроорганизмов соединяли в количественном соотношении 1:100 в L-бульоне и инкубировали при температуре 28 °С в течение 72 ч в климатической камере «Sanyo». Количество трофо-зоитов и цист подсчитывали в камере Горяева после обеззараживания сокультур 10% формалином.