СПОСОБ МОДИФИКАЦИИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ
METHOD FOR MODIFYING PHOTODYNAMIC THERAPY

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лечения злокачественных новообразований с использованием лазерного излучения, и может быть использовано для повышения эффективности фотодинамической терапии (ФДТ).
ФДТ основана на повреждении ткани-мишени действием свободных радикалов, которые образуются при взаимодействии света определенной длины волны и соединения-фотосенсибилизатора (ФС), локализующегося в ткани-мишени.
Преимущества ФДТ по сравнению с другими методами лечения, традиционно используемыми в онкологии, заключаются в возможности высокой избирательности поражения, прекрасном косметическом эффекте, исключении риска серьезных осложнений, связанных с хирургическим вмешательством, возможности сочетания в одной процедуре флуоресцентной диагностики и лечебного воздействия, а также возможности многократного повторения сеансов терапии.
Nowis D
По современным представлениям, механизм противоопухолевого действия фотодинамического воздействия складывается из непосредственного повреждения опухолевых клеток, клеток стромы и эндотелия кровеносных сосудов (Abels С. et al., 2004; Gillitzer R. et al., 2001; Gomer C.J. et al., 2006; . et al., 2005). Фотоиндуцированное повреждение микрососудистого русла в зоне светового воздействия является одним из ключевых механизмов реализации противоопухолевого терапевтического действия ФДТ, которое приводит к дистрофии и гибели опухолевых клеток.
Однако известно, что продукты неспецифического воспаления (цитокины, медиаторы, протеолитические ферменты и продукты деградации клеток) являются мощными индукторами неоангиогенеза. Активное кровоснабжение регенерирующей ткани может создавать условия для выживания оставшихся неповрежденных опухолевых клеток и прогрессирования опухолевого процесса.
Кроме того, побочными эффектами использования ФДТ являются кожная фототоксичность и болевой эффект, возникающий в результате лазерного воздействия.
В связи с этим возникает необходимость модификации фотодинамического лечения с целью устранения или минимизации указанных отрицательных последствий при сохранении противоопухолевого эффекта ФДТ.
Известен способ ФДТ опухолей (RU 2358779), в котором ФС предварительно активируют оптическим излучением. Раствор активированного ФС вводят в микродозах в акупунктурные точки, выбранные с учетом пораженного опухолью органа, или лимфотропным путем и проводят облучение светом соответствующей длины волны. Этим достигается значительное снижение дозы ФС, снижение кратности проведения сеансов, а также минимизируются потенциальные эффекты, обусловленные кожной фототоксичностью. Однако введение ФС на глубину, требуемую техникой метода, для достижения активных акупунктурных зон может сделать его недоступным для светового воздействия. Рекомендуемое для лимфотропной терапии введение в одну и ту же точку трех различных препаратов (анестетика, химотрипсина и ФС) может привести к непредсказуемым местным тканевым реакциям. Кроме того, данный подход не исключает реактивного интенсивного новообразования сосудов в зоне воздействия.
Наиболее близким к заявляемому изобретению способом того же назначения является способ повышения эффективности лечения неоваскуляризации путем сочетания фотодинамического лечения и воздействия антиангиогенного агента в качестве вспомогательного лекарственного средства (RU 2271222). Способ заключается во введении пациенту антиангиогенного лекарственного средства до или после проведения сеанса ФДТ. В качестве антиангиогенного лекарственного средства используют ингибиторы протеинкиназы С, ингибиторы гормонов роста и инсулиноподобного фактора роста-1, ингибиторы фактора роста эндотелия сосудов, ингибиторы циклооксигеназы, инигибиторы ангиотензина II, ингибиторы транскрипционного фактора NF-kB, антагонисты фосфолипазы А2. Выбран в качестве прототипа.
Применение способа-прототипа позволяет уменьшить количество лечебных сеансов, однако способ предлагается для лечения только неопухолевых заболеваний, в частности избыточной хороидальной неоваскуляризации.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи повышения эффективности ФДТ злокачественных опухолей.
Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических (лечебных) и экономических результатов:
Использование заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических (лечебных) и экономических результатов:
- потенцирование терапевтического эффекта ФДТ за счет ингибирования роста новообразованных сосудов в регенерирующей ткани, увеличения продолжительности ишемии поврежденной ткани и предотвращения роста остаточных опухолей;
- снижение проявлений фотоиндуцированного неспецифического воспаления и обусловленных им явлений: отека, кожной фототоксичности и болевого эффекта;
- снижение дозы ФС при сохранении противоопухолевого эффекта ФДТ.
Указанные лечебные результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что также как в известном способе осуществляют модификацию фотодинамического лечения.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что сеанс ФДТ дополняют курсом противовоспалительной терапии, который осуществляют путем сочетанного введения производного пропионовой кислоты и ингибитора фибринолиза непосредственно после окончания светового воздействия и продолжают до полного купирования симптомов острых воспалительных реакций. В качестве ингибитора фибринолиза используют препарат «Контрикал» или «Гордокс».
Сущность изобретения заключается в следующем.
В настоящее время принято считать, что воспалительный компонент является одним из составляющих в механизме реализации терапевтического эффекта ФДТ. Воспалительные реакции, индуцированные фотодинамическим воздействием, активируют систему неспецифической защиты и привлекают в зону повреждения нейтрофилы, макрофаги, тучные клетки, иммунокомпетентные клетки. Цитокины, которые высвобождаются в зоне воздействия, активируют лимфоциты и антиген-презентирующие клетки. Таким образом, фотоиндуцированная стимуляция иммунной системы может играть определенную роль в элиминации опухолевых клеток, сдерживании роста остаточной опухоли и реализации радикального эффекта ФДТ.
Одним из побочных эффектов ФДТ является отек, который развивается в зоне светового облучения как реакция на фотодинамическое воздействие. В большинстве случаев отек купируется самостоятельно в течение нескольких дней после сеанса ФДТ и не требует специального лечения. Однако при лечении опухолей полых органов - мочевого пузыря, пищевода, желудка, прямой кишки, бронхов, при фотодинамическом воздействии на метастазы, локализующиеся на слизистой оболочке плевры или брюшины, отек, вызванный фотоиндуцированной воспалительной реакцией, может привести к выраженному болевому синдрому и создавать угрозу перекрытия полости органа, сдавления соседних органов. Это может повлечь тяжелые клинические осложнения: нарушения прохождения пищи, жидкости, воздуха, оттока мочи.
Кроме того, кожная фототоксичность, которая развивается после лечения, как результат накопления световой дозы препаратом, удерживающимся в коже, при длительном облучении рассеянным дневным светом, может приводить к рубцовым изменениям ткани.
Все сказанное выше свидетельствует о целесообразности модификации известного способа ФДТ путем применения противовоспалительных средств, способных снизить проявления фотоиндуцированного неспецифического воспаления и обусловленных им явлений, фототоксичности и болевой эффект при сохранении противоопухолевого эффекта ФДТ.
Авторами заявляемого изобретения было установлено, что применение противовоспалительных лекарственных средств на начальных этапах развития фотоиндуцированных местных реакций не только способствует более раннему купированию отека, но также ингибирует рост новообразованных сосудов в регенерирующей ткани, приводит к более длительной ишемии поврежденной ткани и препятствует возобновлению активного роста опухоли.
Авторами разработана схема противовоспалительной и обезболивающей терапии, включающая введение нестероидного противовоспалительного средства, обладающего ингибиторной активностью в отношении циклооксигеназ (производных пропионовой кислоты (ППК), в форме препарата «Кетонал», и ингибитора фибринолиза (ИФ) в форме препарата «Контрикал» и препарата «Гордокс».
Кетопрофен - нестероидное противовоспалительное средство, производное пропионовой кислоты, применяется для купирования болевых синдромов различного генеза, а также обладает противовоспалительным действием. Он ингибирует циклооксигеназу и угнетает синтез простагландинов, стабилизирует лизосомальные мембраны и задерживает высвобождение из них ферментов, способствующих разрушению тканей при хроническом воспалении, а также снижает выделение цитокинов и тормозит активность нейтрофилов.
Ингибитор фибринолиза - препарат «Контрикал» является поливалентным ингибитором протеиназ. Он ингибирует протеолитические ферменты, регулирует активность калликреин-кининовой системы, системы свертывания и фибринолиза в крови и тканях, что, в конечном итоге, ингибирует вазодилятацию, одну из начальных фаз развития воспалительных реакций.
На модели подкожно трансплантированной саркомы S-37 у мышей авторами показано, что системное введение ППК или ИФ в терапевтических дозах в виде индивидуальных средств после сеанса ФДТ (через 1 и 5 часов, 1 и 2 суток после ФДТ, а также до начала ФДТ) слабо влияет на фотоиндуцированные местные реакции тканей в зоне воздействия и не оказывает влияния на рост остаточной опухоли.
Применение сочетания ППК и ИФ на фоне развившейся фотоиндупированной воспалительной реакции (через 1 и 2 суток после ФДТ) также не влияет на противоопухолевый эффект лечения.
У мышей, получавших дополнительное к ФДТ воздействие в виде сочетания ППК и ИФ, по сравнению с животными, которым проводили только ФДТ, увеличивается длительность латентного периода выхода остаточных опухолей, замедляется рост остаточных опухолей, снижается суммарный размер пораженных метастазами лимфатических узлов. Установлено, что при применении сочетания ППК и ИФ непосредственно после сеанса фотодинамического воздействия (двукратно, через 1 и 5 часов после ФДТ) полное купирование фотоиндуцированного отека у животных наблюдается раньше, чем у животных, получавших только ФДТ.
Таким образом, применение сочетания ППК и ИФ в качестве дополнительного воздействия приводит к потенциированию терапевтического эффекта ФДТ.
Возможность и целесообразность модификации фотодинамического лечения подтверждается результатами следующих экспериментальных исследований.
Эксперименты были проведены на модели саркомы S37 у мышей (линия BDF1, самки). Опухолевый штамм поддерживали in vivo в асцитном варианте. Для экспериментов асцитическую жидкость в разведении 1:3 изотоническим раствором хлористого натрия в количестве 0,05 мл прививали подкожно на наружную поверхность бедра животных. Лечение методом ФДТ начинали на 6 день роста опухоли. Размер опухолей на день начала лечения составлял 4-5×4-5 мм.
2
2
ФДТ осуществляли с применением препарата «Фотосенс» (пр-во ФГУ ГНЦ НИОПиК, г.Москва, Россия). Фотосенс (0,2% раствор во флаконах по 50 мл, действующее вещество: смесь натриевых солей ди-, три- и тетрасульфофталоцианина гидроксиалюминия со средней степенью сульфирования 3,0) вводили внутривенно в дозе, равной 5 мг/кг. Световое воздействие проводили через 24 часа после введения фотосенса. В качестве источника оптического излучения использовали светодиодный излучатель с длинной волны излучения 670±15 нм. Параметры облучения: плотность мощность - 80 мВт/см, плотность энергии - 90 Дж/см.
Противовоспалительную терапию (ПВТ) осуществляли путем сочетанного введения кетонала и контрикала. Кетонал (5% раствор в ампулах по 2 мл) вводили внутрибрюшинно в разовой дозе, равной 50 мг/кг, контрикал (лиофилизат, растворяли в 0,9% хлорида натрия) вводили внутривенно в разовой дозе, равной 5000 АТрЕ/кг. Введение кетонала и контрикала осуществляли через 1 час и через 5 часов после ФДТ.
Степень выраженности фотоиндуцированного отека оценивали по объему бедренной части лапы животного, которая подвергалась фотодинамическому воздействию. Бедро измеряли кронциркулем в трех взаимно перпендикулярных диаметрах. Полученные величины перемножали.
3
Объем опухоли рассчитывали по формуле V=a×b×c×0,52, где V - объем опухоли (мм); a, b и с - величины взаимно перпендикулярных измерений опухолевого узла.
к
опыт
к
к
опыт
Оценку противоопухолевого эффекта осуществляли по торможению роста опухоли (ТРО, %), которое вычисляли по формуле ТРО=[(V-V)/V]×100%, где V и V - средний объем опухоли в контрольной и опытных группах, соответственно.
Размеры метастазов у животных-опухоленосителей, получавших ФДТ, оценивали на 20-й день после начала лечения. Животных умерщвляли дислокацией шейных позвонков, вскрывали, увеличенные лимфатические узлы в подмышечной и паховой области измеряли кронциркулем в двух поперечных диаметрах. Полученные величины перемножали.
ФДТ с фотосенсом приводила к развитию типичных фотоиндуцированных реакций: отеку конечности и образованию некротического струпа в зоне облучения.
В течение первой недели после опадения отека и отторжения некротизированных тканей регистрировали значительное ТРО, по сравнению с животными, не получавшими лечения. Величина ТРО сохранялась на относительно высоком уровне - от 71 до 97% - до 14-15 дня после воздействия. При использованных условиях ФДТ с фотосенсом не приводила к полному излечению: у всех животных наблюдался продолженный рост опухоли. Длительность латентного периода выхода остаточных опухолей после ФДТ с фотосенсом в дозе 5 мг/кг варьировала от 1 до 4 дней (медиана 3,2 дня).
Наблюдалось, что снижение дозы фотосенса до 2,5 мг/кг приводит к существенному уменьшению противоопухолевого эффекта ФДТ: длительность латентного периода снижается до 0-2 дней, регистрируется активный продолженный рост остаточных опухолей, средний размер которых на 15-й день после воздействия в 1,7-2 раза превышает средний размер остаточных опухолей на тот же срок у животных, получавших ФДТ с фотосенсом в дозе 5 мг/кг. Величина ТРО едва достигает биологически значимой величины 43-50%.
В таблице 1 приведены результаты, демонстрирующие влияние применения ПВТ (сочетания кетонала и контрикала) на эффективность фотодинамического воздействия. Как видно из представленных данных, купирование фотоиндуцированного отека у животных наблюдалось на сутки раньше, чем у животных, получавших только ФДТ.
При снижении дозы фотосенса до 2,5 мг/кг местные тканевые реакции также выражены в меньшей степени, чем при его использовании в дозе 5 мг/кг. Полное исчезновение признаков отека регистрируется уже на 6 день после лечения. Применение ПВТ в этом режиме ФДТ купирует отек на 4 день после воздействия.
Медиана длительности латентного периода выхода остаточных опухолей после ФДТ с фотосенсом в дозе 5 мг/кг у животных, получавших ПВТ, значительно превышает таковую величину в группе животных, которым проводили только ФДТ. Рост остаточных опухолей у животных, которым вводили кетонал и контрикал после ФДТ, замедлен в 2,5 раза, по сравнению с опухолями у животных, которые не получали ПВТ. Суммарный размер пораженных метастазами лимфатических узлов у животных, получавших ПВТ после ФДТ, в 1,5 раз меньше, чем у животных, леченных только ФДТ.
Применение ПВТ приводит к тому, что в группах животных, получавших ФДТ с фотосенсом в дозе 2,5 мг/кг в сочетании с ПВТ, величина ТРО на 15-й день после воздействия составляет от 65% до 80%, т.е. становится сравнимой с таковой при ФДТ с фотосенсом в дозе 5 мг/кг.
Авторами было также выполнено сравнительное исследование эффективности модифицирующего действия противовоспалительной терапии (ПВТ), включающей препарат на основе кетопрофена (кетонал) и ингибитор фибринолиза в форме препарата «Контрикал» (ПВТ1), и включающей кетонал и ингибитор фибринолиза в форме препарата «Гордокс» (ПВТ2) на модели ФДТ в отношении подкожно трансплантированной саркомы S-37 у мышей. Кетонал (5% раствор в ампулах по 2 мл) вводили внутрибрюшинно в разовой дозе, равной 50 мг/кг, гордокс (раствор для инъекций 100000 КИЕ в ампулах по 10 мл) вводили внутривенно в разовой дозе, равной 5000 АТрЕ/кг. ФДТ проводили с использованием фотосенса в дозе 5 мг/кг. Введение противовоспалительных препаратов по схемам ПВТ-1 и ПВТ-2 осуществляли двукратно через 1 час и 5 часов после ФДТ.
В таблице 2 приведены результаты сравнительного исследования, демонстрирующие, что использование в качестве ингибитора фибринолиза апротинина в форме препарата «Гордокс» оказывает тот же эффект, что и ПВТ, включающая в качестве ингибитора фибринолиза апротинин в форме препарата «Контрикал». Различия между группами животных, получавших после ФДТ ПВТ1 и ПВТ2, статистически недостоверны.
Методом иммуногистохимии исследовали ткани животных, которые получали до начала лечения на 6 день роста опухоли, а также на 1, 3, 5, 9 и 13 день после лечения. В соответствующие сроки 2-3 животных в каждой экспериментальной группе умерщвляли дислокацией шейных позвонков, иссекали ткани лапки в области воздействия вместе с прилежащей кожей и мышцей. Ткани фиксировали в цинковом фиксаторе, после стандартной проводки и заключения в парафин готовили серийные срезы.
Для выявления микрососудов использовали моноклональное антитело к антигену эндотелия CD31 (анти-CD31) (BD Pharmingen, клон МЕС13.3). Рабочие растворы иммунохимических реагентов готовили на забуференном физиологическом растворе, содержащем бычий сывороточный альбумин в 1% концентрации. Срезы инкубировали с анти-CD31, разведенными в соотношении 1:30, 24 часа при +4°С. Связавшиеся антитела выявляли последовательной инкубацией с анти-крысиными биотинилированными поликлональными антителами (BD Pharmingen, кат. №559286), стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (DakoCytomation, Р0397) и хромогенным субстратом (DakoCytomation, K3467). После завершения иммуногистохимического окрашивания срезы докрашивали гематоксилином, обезвоживали и заключали в канадский бальзам. Окрашенные препараты анализировали на световом микроскопе Axioplan (Opton).
До начала воздействия, на 6 день после трансплантации опухоли, по периферии опухолевого образования имела место зона активной васкуляризации, в которой располагались пролиферирующие опухолевые клетки. Через сутки в поле ФДТ в окружении трансплантата (зона отека) наблюдали бесструктурную ткань, лишенную жизнеспособных клеток и микрососудов. На границе мышечной ткани, прилежащей к трансплантату, зоне наиболее выраженной васкуляризации в случае интактных опухолей, отмечены кровоизлияния.
В образцах ткани, полученных на 3 день после ФДТ, уже наблюдалось восстановление роста микрососудов в зоне воздействия, в подкожной клетчатке на границе некротизированной ткани. Жизнеспособные опухолевые клетки обнаруживались в участках активной пролиферации микрососудов.
В отличие от животных, получавших только ФДТ, у животных, получавших после ФДТ противовоспалительные препараты, до 13 дня наблюдения количество визуализируемых капилляров в зоне воздействия была значительно ниже. Сопоставление данных прижизненной оценки состояния трансплантатов на протяжении времени наблюдения после лечения, результатов гистологического исследования и картины иммунохимического окрашивания тканей, иссеченных на 3, 5, 9 и 13 день после воздействия, свидетельствовало, что сроки формирования остаточных опухолевых образований, доступных для пальпации и измерения, коррелируют с восстановлением кровоснабжения ткани.
Иммуногистохимическое исследование тканей животных в зоне фотодинамического воздействия показывает, что у животных, получавших кетонал и контрикал, в области фотоиндуцированного повреждения на протяжении до 13 дня после лечения регистрируется значительно меньшее количество капилляров, чем у животных, которым не проводили ПВТ после ФДТ. Это подтверждает механизм потенциирующего действия производного пропионовой кислоты и ингибитора фибринолиза в отношении фотодинамического лечения.
На Фиг.1 представлены фотографии микрососудов в зоне роста подкожного трансплантата саркомы S37 у мышей: А - до ФДТ (6 день роста опухоли); Б - 1 сутки после ФДТ. В - 13 сутки после ФДТ; Г - 13 сутки после ФДТ и совместного введения кетонала и контрикала. Справа - окрашивание гематоксилином и эозином; слева - непрямое иммунопероксидазное окрашивание с моноклональным антителом к CD31 (ув. ×50). Звездочкой обозначена зона пролиферации опухолевых клеток; стрелками - окрашенные микрососуды; тонкая стрелка - капилляры со стороны подкожной клетчатки; более толстая стрелка - со стороны мышечного слоя.
Таким образом, экспериментальные данные подтверждают, что двукратное введение кетопрофена в сочетании с препаратами «Контрикал» или «Гордокс» через 1 час и 5 часов после ФДТ у животных с подкожно привитой опухолью S37 эффективно купирует местные фотоиндуцированные побочные реакции и потенциирует противоопухолевое действие ФДТ как в отношении роста остаточной опухоли, так и в отношении образования метастазов.
Заявляемый способ обладает значительными преимуществами и отвечает критериям патентоспособности.
Таблица 1
Параметр эксперимента
Схема воздействия
ФДТ
ФДТ+ПВТ
ФДТ
ФДТ+ПВТ
Доза фотосенса
5 мг/кг
2,5 мг/кг
Длительность полного купирования фотоиндуцированного отека, сутки
6,8±0,5
5,3±0,4
6,2±0,6
4,0±0,4
Медиана длительности латентного периода выхода остаточных опухолей, сутки
3,2
9,0
1,5
4,2
Торможение роста опухолей на 15-й день после воздействия, %
84±13
90±10
45±6
73±8
Средний размер остаточных опухолей на 20-й день после лечения, мм<sup>3</sup>
790±164
313±142
998±112
716±165
Суммарный размер пораженных метастазами лимфатических узлов, мм<sup>2</sup>
192±14
128±13
н/о
н/о
Примечание: н/о - не определяли
Таблица 2
Параметр эксперимента
Схема воздействия
ФДТ
ФДТ+ПВТ1
ФДТ+ПВТ2
Длительность полного купирования фотоиндуцированного отека, сутки
6,9±0,6
5,0±0,5
5,5±0,4
Медиана длительности латентного периода выхода остаточных опухолей, сутки
3,1
9,4
9,7
Торможение роста опухолей на 15-й день после воздействия, %
83±13
90±8
93±5
Средний размер остаточных опухолей на 20-й день после лечения, мм<sup>3</sup>
820±181
356±121
402±161