Улучшенный способ получения комплекса физиологически активного полипептида

1. Способ получения комплекса физиологически активного полипептида с непептидильным полимером и константной областью иммуноглобулина, включающий:
1) взаимодействие непептидильного полимера, имеющего две или более альдегидных групп в качестве функциональных групп, с одним из физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина в присутствии восстановителя в концентрации 1-20 мМ; и
2) взаимодействие реакционной смеси со стадии (1) с другим из физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина в присутствии восстановителя в концентрации 1-100 мМ.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий выделение конъюгата физиологически активного полипептида с непептидильным полимером или конъюгата константной области иммуноглобулина с непептидильным полимером из реакционной смеси после стадии (1).
3. Способ по п. 1, где восстановитель действует для восстановления обратимой иминной двойной связи, полученной в результате связывания между альдегидной группой непептидильного полимера и аминогруппой физиологически активного полипептида или константной областью иммуноглобулина, с образованием ковалентной связи.
4. Способ по п. 1, где восстановитель выбран из группы, состоящей из цианоборгидрида натрия, комплекса боран-пиридин, борогидрида натрия, комплекса боран-диметиламин, комплекса боран-триметиламин и триацетоксиборогидрида натрия.
5. Способ по п. 1, где восстановитель используют в концентрации от 1 до 40 мМ на стадии (2).
6. Способ по п. 1, где взаимодействие на стадии (1) выполняют в течение от 1 до 16 ч.
7. Способ по п. 1, где взаимодействие на стадии (2) выполняют в течение от 1 до 48 ч.
8. Способ по п. 1, где взаимодействие на стадии (1) выполняют при температуре от 0 до 25°С.
9. Способ по п. 1, где взаимодействие на стадии (1) выполняют в течение от 1 до 16 ч при температуре от 0 до 25°С в присутствии восстановителя в концентрации от 1 до 20 мМ, и взаимодействие на стадии (2) выполняют в течение от 1 до 48 ч в присутствии восстановителя в концентрации от 1 до 40 мМ.
10. Способ по п. 1, где непептидильный полимер ковалентно связан с каждым из физиологически активного полипептида и константной области иммуноглобулина посредством их двух или более альдегидных функциональных групп.
11. Способ по п. 1, где функциональные группы непептидильного полимера связаны с каждой из аминогруппы физиологически активного полипептида и константной области иммуноглобулина, где аминогруппа присутствует на N-конце или на боковой цепи остатка Lys.
12. Способ по п. 1, где непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликолей, полипропиленгликолей, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливиниловых спиртов, полисахаридов, декстранов, поливинилэтиловых эфиров, полимолочной кислоты (PLA), полимолочной-гликолевой кислоты (PLGA), полимеров липидов, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.
13. Способ по п. 1, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоли.
14. Способ по п. 1, где молекулярная масса непептидильного полимера находится в диапазоне от 1 до 100 кДа.
15. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина является агликозилированной.
H1
H2
H3
H4
16. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина состоит из 1-4 доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов C, C, C и C.
17. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина дополнительно содержит шарнирную область.
18. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из константных областей, полученных из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, или их комбинаций или гибридов.
19. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, их комбинации и их гибрида.
20. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина представляет собой Fc-фрагмент IgG4.
21. Способ по п. 20, где константная область иммуноглобулина представляет собой агликозилированный Fc-фрагмент IgG4 человека.
22. Способ по п. 1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, гормонов, высвобождающих гормон роста, пептидов, высвобождающих гормон роста, интерферона, рецепторов к интерферону, колониестимулирующих факторов, глюкагоноподобных пептидов (GLP-1 и так далее), оксинтомодулина, сопряженных с белком-G рецепторов, интерлейкинов, рецепторов к интерлейкинам, ферментов, интерлейкин-связывающих белков, цитокин-связывающих белков, факторов, активирующих макрофаги, пептидов макрофагов, факторов В-клеток, факторов Т-клеток, белка А, ингибиторов аллергии, гликопротеинов некроза клеток, иммунотоксинов, лимфотоксинов, фактора некроза опухоли, супрессоров опухоли, трансформирующего фактора роста, альфа-1 антитрипсина, альбумина, α-лактальбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, гликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтинов, гемоглобина, тромбина, пептидов, активирующих рецепторы тромбина, тромбомодулина, фактора крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, активаторов плазминогена, фибрин-связывающих пептидов, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, белка С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, тромбоцитарного фактора роста, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, фактора роста кости, костестимулирующего белка, кальцитонина, инсулина, атриопептина, хрящевого индуцирующего фактора импульсного ответа, элкатонина, активирующего фактора соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, гормона высвобождения лютеинизирующего гормона, факторов роста нерва, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулиноподобного фактора роста, гормона коры надпочечников, глюкагона, холецистокинина, панкреатического полипептида, гастрин-высвобождающего пептида, кортикотропинвысвобождающего фактора, тиреостимулирующего гормона, аутотоксина, лактоферрина, миостатина, антигенов клеточных поверхностей, происходящих из вируса вакцинных антигенов, моноклональных антител, поликлональных антител и фрагментов антител.
23. Способ по п. 1, где физиологически активный полипептид представляет собой инсулин.