СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АБЛЮМИНАЛЬНОМУ МЕМБРАННОМУ АНТИГЕНУ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ЭНДОТЕЛИОЦИТОВ
METHOD OF OBTAINING MONOCLONAL ANTIBODIES TO ABLUMINAL MEMBRANE ANTIGEN OF CEREBRAL ENDOTHELIOCYTES

Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к проблеме получения биологически активных антител, связывающихся с живой клеткой.
Известны работы по получению поликлональных антител и моноклональных антител, визуализирующих капилляры головного мозга [Lin J.H. et al. 2002]. Наиболее селективный маркер церебральных эндотелиоцитов - ЕВА визуализируется антителами SMI-71 только на срезах мозга крысы (Sternberger L.A. et al. 1992). Подобным образом, антитела ОХ-26 окрашивают трансферриновый рецептор CD-71 только в микрососудах крысы (Pardridge at al. 2002). Получены моноклональные антитела, специфичные к инсулиновому рецептору церебральных микрососудов человека и различных видов животных. Известны также коммерческие препараты моноклональных антител к VEGF, FV для визуализации сосудов головного мозга [Zymed, USA]. Известно, что не все моноклональные антитела, полученные с целью визуализации церебральных эндотелиоцитов, могут применяться для визуализации живых клеток. Кроме того, в открытой печати приводятся противоречивые данные о кинетике аллогенных антител, вводимых в кровоток здоровым животным. Некоторые исследователи высказывают предположение о том, что аллогенные антитела при попадании в системный кровоток очень быстро теряют иммунохимическую активность вследствие взаимодействия с белками плазмы крови и элиминируются в результате захвата клетками печени и селезенки. При этом объективная оценка иммунохимической активности аллогенных антител в сосудистом русле подчас значительно ограничена вследствие методологических затруднений.
Задачей изобретения является получение биологически активных моноклональных антител к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов с высокой иммунохимической активностью, позволяющих визуализировать церебральные эндотелиоциты как ex vivo, так в условиях in vitro и in vivo.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения биологически активных моноклональных антител к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов, связывающихся с живой клеткой.
Авторами установлено, что аблюминальный антиген церебральных эндотелиоцитов доступен для циркулирующей в крови наносистемы на основе специфичных моноклональных антител при развитии опухолевого процесса в головном мозге крыс (глиома С6). Полученная наносистема способна проникать через патологический гемато-энцефалический барьер из кровеносного русла в область глиомы, что позволяет визуализировать сосудистую систему глиомы С6.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Препаратом мембранных белков церебральных эндотелиоцитов иммунизируют мышь линии Balb/C. Выделяют В-лимфоциты селезенки этой мыши и сливают с клетками миеломы мыши линии Sp2/0-Ag14, получают гибридомы, тестируют супернатанты полученных гибридом иммунохимически и отбирают гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов. Из них выбирают гибридому, характеризующуюся наибольшим количеством антитело-продуцирующих гибридных клеток, синтезирующих антитела, относящиеся к классу иммуноглобулинов G, сохраняющие биологическую активность в сыворотке крови не менее 24 часов, выделяют моноклональные антитела из супернатанта выбранной гибридомы.
В частности, выделение моноклональных антител из супернатанта выбранной гибридомы проводят методом аффинной хроматографии на протеин-G-агарозе.
Изобретение поясняется следующими фигурами.
На Фигуре 1 представлен диск-электрофорез солюбилизированного препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов крысы. А. - Маркеры молекулярной массы. Б. - Препарат мембранных белков (окрашивание кумасси G-250).
Фигура 2. Конфокальная лазерная микроскопия церебральных эндотелиоцитов на срезах головного мозга крысы с помощью анти-ВЕМР-1 антител.
Фигура 3. Накопление Анти-ВЕМР-1 в микрососудах мозга и печени (%) in vitro в зависимости от введенного количества меченых антител.
Фигура 4. Иммуногистохимическое окрашивание пиальных микрососудов Анти-ВЕМР-1. Увеличение 1×100.
Фигура 5. Иммунопероксидазное окрашивание микрососудов мозжечка с помощью анти-ВЕМР антител exvivo, увеличение 1×100.
125
Фигура 6. Распределение меченных I Анти-ВЕМР-1 в микрососудах мозга, печени и бессосудистой фракции мозга (in vitro).
Фигура 7. Распределение IgG в микрососудах мозга и печени (%) in vitro при различном количестве введенных меченых антител.
Фигура 8. Результаты лазерной конфокальной микроскопии визуализации церебральных эндотелиоцитов с помощью анти-ВЕМР-1 антител. По расположению ядра, окрашенного DAPI (синий цвет), антиген, к которому получены антитела, локализуется на аблюминальной поверхности церебральных эндотелиоцитов.
Фигура 9. Иммуногистохимический анализ срезов печени (А), легкого (Б, В) и почек (Г) с помощью анти-ВЕМР-1.
Способ осуществляется следующим образом.
В основу модификаций приготовления препаратов аблюминального антигена церебральных эндотелиоцитов, использованных в данной работе, положена методика Lidinsky et al. для мембранных белков микрососудов головного мозга. Основным требованием к модифицированным способам получения является максимальное сохранение антигенного спектра препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов с наибольшей экстракцией интегральных мембранных белков.
Используемая авторами методика получения препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов включает в себя следующие этапы.
1. Гомогенизация. К 50 г ткани головного мозга крысы добавляют 500 мл PBS, содержащего 5,5 mM глюкозу, 2 mM ЭДТА, 4 mM фенилметилсульфонилфлуорид и апротинин в дозе 0,5 Ед/мл и измельчают в гомогенизаторе ЕТА 0010 в течение 30 секунд на максимальной скорости.
2. Фильтрация. Полученный гомогенат однократно пропускают через сито с диаметром пор 360 µm, а затем полученный фильтрат - двукратно через сито с диаметром пор 160 µm. Полученный фильтрат центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин.
3. Градиентное центрифугирование в декстране. Осадок суспендируют в растворе декстрана Т-70 до конечной концентрации 15% (масса/об.), наслаивают по 10 мл на 25% раствор декстрана в пробирках по 50 мл и центрифугируют при 25000 g в течение 10 мин в бакетном роторе. Фракцию микрососудов, формировавших линию на интерфазе растворов декстрана различных плотностей, отбирают и повторно центрифугируют при 25000 g в течение 10 мин.
4. Осмотический лизис клеток. Препарат микрососудов суспендируют в 50 мл дистиллированной воды, перемешивают в течение 2 часов при 4°С и центрифугируют 15000 g в течение 10 мин. Процедуру повторяют дважды, отбирая осадок.
2
5. Сонификация. Осадок лизированных клеток растворяют в минимальном объеме HO и озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе «G112SP1T» (Laboratory Supplies Co. Inc.) при частоте 80 кГц в течение 20 мин (3 раза) в охлажденной дистиллированной воде с детергентом Triton-Х100. Препарат центрифугируют при 25000 g в течение 10 мин и отбирают надосадок.
Полученной в результате градиентного центрифугирования в декстране и последующего осмотического лизиса очищенной фракцией мембран эндотелиоцитов проводят иммунизацию мыши Balb/c в количестве 20 мкг по общему белку. Подкожно в три точки вводят препарат мембранных белков церебральных эндотелиоцитов (20 мкг) с равным объемом полного адъюванта Фрейнда с интервалом 1 раз в 10 дней, с последующим 2-месячным перерывом. Затем повторяют цикл иммунизации и на 5-6-й день после второго цикла иммунизации вводят внутрибрюшинно 50 мкг препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов в смеси с неполным адъювантом Фрейнда. Эффективность иммунизации оценивают методом иммунодиффузии с тест-системой (экстракт мозга).
2
Гибридизацию проводят на 3-4-й день после последней инъекции препарата мембранных белков церебральных эндотелиоцитов в соотношении клеток миеломы и В-лимфоцитов 1:10. Гибридные клоны отбирают на селективной среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Скрининг гибридом на продукцию специфичных антител проводят методами иммуногистохимии и иммуноцитохимии in vitro и in vivo. А именно, клетки гибридомы проводятся через серию реклонирований под контролем высокочувствительного иммуногистохимического метода на основе авидин-биотинового пероксидазного кита «ABC-Vectastain» (Vector Lab., USA) с усилением окрашивания DAB с помощью CoCl и лазерной конфокальной микроскопии с использованием вторичных флюоресцентных антител (Invitrogen, USA).
Из большого количества положительно реагирующих гибридом выбирают те, супернатанты которых содержали аффинные моноклональные антитела к мембранным антигенам эндотелиоцитов церебральных микрососудов, после чего проводятся последовательные серии реклонирования и анализа супернатантов для каждой из этих гибридом.
Отбирается одна гибридома, продуцирующая моноклональные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов, характеризующаяся наибольшим процентом антитело-продуцирующих гибридных клеток с продукцией моноклональных антител, относящихся к классу G, сохраняющих биологическую активность в сыворотке крови лабораторного животного не менее 24 часов.
Отбор гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов, проводится по результатам конфокальной микроскопии. Определение класса иммуноглобулинов осуществляется по результатам изотипирования с помощью коммерческих сывороток (Sigma, USA). Изучение биологической активности антител в сыворотке крови лабораторного животного проводится по результатам иммунохимического тестирования на срезах головного мозга крысы после 24-часовой циркуляции моноклональных антител, введенных в кровеносное русло крысы.
Для выполнения последующих экспериментов гибридные клетки выбранной гибридомы вводятся внутрибрюшинно мышам Balb/c для получения асцита. Асцит также проверяется методами иммуногистохимии и иммунофлюоресценции, положительные пробы объединяются и хранятся в холодильнике глубокого холода (-80°). Гибридные клетки из асцита отделяют центрифугированием и либо снова вводятся в мышь, либо стерильно замораживаются в жидком азоте в среде с ДМСО и нормальной сывороткой лошади.
Данная технология позволяет в любое время провести размораживание гибридных клеток и, после процедуры реклонирования, снова ввести их в мышь и получить асцит в неограниченном количестве (не менее 300 мл асцита со средней концентрацией MAb 4 мг/мл). Полученные антитела к аблюминальному мембранному антигену церебральных эндотелиоцитов названы авторами, как анти-ВЕМР-1 антитела.
Для проведения иммуногистохимического анализа на специфичность и/или последующего создания векторных иммунолипосом анти-ВЕМР-1 антитела выделяются из полученного асцита с помощью аффинной хроматографии на протеин-G агарозе. Фракцию IgG отбирают под контролем фотометра, концентрируют методом ультрафильтрации и хранят при -20° в растворе 50% глицерина. Иммунохимическая целостность антител контролируется иммуногистохимически на каждом этапе очистки и концентрирования. Чистота полученных анти-ВЕМР-1 антител оценивается в диск-электрофорезе в ПААГ с SDS.
На тканевую и видовую специфичность анти-ВЕМР-1 антитела проверяются методом иммуногистохимического анализа на срезах других органов крысы и срезах головного мозга других животных.
125
125
125
Для оценки специфичности взаимодействия анти-ВЕМР-1 антител с эндотелиальными антигенами церебральных микрососудов проводят радиоиммунное исследование накопления меченых анти-ВЕМР-1 антител в микрососудах печени и мозга in vitro. Анти-ВЕМР-1 антитела и неспецифические IgG мыши (контроль) конъюгируют с радиоактивным I Т-хлораминовым методом (Fraker P.J. и Speck J.C.Jr). Препараты меченных I антител отделяют от свободного йода и инкубируют с препаратом нативных микрососудов из свежеприготовленного гомогената мозга крысы. В качестве контроля используют меченые неспецифические иммуноглобулины G мыши (IgG-I). Расчет вводимой дозы проводят по удельной радиоактивности белковых препаратов (СРМ/мкг), точность расчетов проверяют по определению радиоактивности в образцах (СРМ/мл) с известной концентрацией белка. После инкубации с мечеными антителами препараты трехкратно отмывают 50-кратным объемом PBS методом центрифугирования по 10 мин при 50000 g. После отмывки препараты помещают в γ-счетчик и определяют общую и удельную радиоактивность сырого вещества микрососудов.
Для доказательств возможности осуществления предложенного способа с достижением заявленного назначения и указанного технического результата приводим следующие данные.
ПРИМЕР 1
2
Для получения препарата мембранных белков головного мозга к 50 г ткани головного мозга крысы добавляли 500 мл PBS, содержащего 5,5 mM глюкозу, 2 mМ ЭДТА, 4 mM фенилметилсульфонилфлуорид и апротинин в дозе 0,5 Ед/мл и измельчали в гомогенизаторе ЕТА 0010 в течение 30 секунд на максимальной скорости. Полученный гомогенат однократно пропускали через сито с диаметром пор 360 µm, а затем полученный фильтрат - двукратно через сито с диаметром пор 160 µm. Фильтрат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин. Осадок суспендировали в растворе декстрана Т-70 до конечной концентрации 15% (масса/об.), наслаивали по 10 мл на 25% раствор декстрана в пробирках по 50 мл и центрифугировали при 25000 g в течение 10 мин в бакетном роторе. Фракцию микрососудов, формировавших линию на интерфазе растворов декстрана различных плотностей, отбирали и повторно центрифугировали при 25000 g в течение 10 мин. Препарат микрососудов суспендировали в 50 мл дистиллированной воды, перемешивали в течение 2 часов при 4°С и центрифугировали 15000 g в течение 10 мин. Процедуру повторяли дважды, отбирая осадок. Осадок лизированных клеток растворяли в минимальном объеме HO и озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе «G112SP1T» (Laboratory Supplies Co. Inc.) при частоте 80 кГц в течение 20 мин (3 раза) в охлажденной дистиллированной воде с детергентом Triton-Х100. Препарат центрифугировали при 25000 g в течение 10 мин, отбирая надосадок. Полученный гетерогенный препарат мембранных белков микрососудов мозга был охарактеризован методом диск-электрофореза (Фигура 1).
Полученная в результате градиентного центрифугирования в декстране и последующего осмотического лизиса очищенная фракция мембран эндотелиоцитов была использована для иммунизации и последующего слияния, в результате которого были получены несколько гибридом, продуцирующих антитела, визуализирующие на срезах головного мозга крысы микрососуды. Под контролем иммунофлюоресцентного анализа с использованием конфокальной микроскопии анализа была отобрана гибридома, продуцирующая моноклональные антитела (анти-ВЕМР-1 антитела), специфичные к аблюминальному мембранному антигену эндотелиоцитов церебральных микрососудов.
2
Первоначально клетки выбранной гибридомы были проведены через серию реклонирований под контролем высокочувствительного иммуногистохимического метода в авторской модификации на основе авидин-биотинового пероксидазного кита «ABC-Vectastain» (Vector Lab., USA) с усилением окрашивания DAB с помощью СоСl. После проведения седьмой процедуры реклонирования супернатанты из 97% лунок окрашивали эндотелиоциты микрососудов мозга с одинаковой интенсивностью, что свидетельствовало об устойчивой секреции гибридными клетками моноклональных антител. Таким образом, было получено более 50 положительно реагирующих субклонов, из которых отобрали один, продуцирующий максимальное количество высококачественных анти-ВЕМР-1-антител к аблюминальному мембранному антигену микрососудов головного мозга под контролем иммунофлюоресцентного анализа с применением лазерной конфокальной микроскопии (Фигура 8, Г).
6
Для получения асцита гибридные клетки выбранной гибридомы в количестве 2×10 ввели внутрибрюшинно мышам Balb/c. He менее чем 7 дней после внутрибрюшинного введения гибридных клеток у мышей отбирали асцит. По ходу сбора асцит также проверялся методами иммуногистохимии и иммунофлюоресценции, положительные пробы объединяли и хранили в холодильнике глубокого холода (-80°).
С целью проведения иммуногистохимического анализа на специфичность и в последующем для создания векторных иммунолипосом для работ in vivo анти-ВЕМР-1 антитела были выделены из асцита мышей, иммунизированных препаратом мембранных белков церебральных эндотелиоцитов методом аффинной хроматографии на протеин-G-агарозе. Выход анти-ВЕМР-1 антител в аффинной хроматографии составлял не менее 50%.
Фракцию IgG (анти-ВЕМР-1 антител) отбирали под контролем фотометра, концентрировали методом ультрафильтрации и хранили при -20° в растворе 50% глицерина. Иммунохимическая функциональность антител контролировалась иммуногистохимически на каждом этапе очистки и концентрирования. Чистота полученных анти-ВЕМР-1 антител была оценена в диск-электрофорезе в ПААГ с SDS и составляла не менее 90%.
В дальнейшем, получив очищенный препарат антител анти-ВЕМР-1, авторы показали наличие большого количества антигена в препарате мембранных белков микрососудов мозга методом вестерн-иммуноблота.
Иммуногистохимический и иммунофлюоресцентный анализ очищенного препарата анти-ВЕМР-1 показал, что они прекрасно связываются с аблюминальным мембранным антигеном эндотелиоцитов церебральных микрососудов на срезах головного мозга крысы. Окрашивание микрососудов хорошо визуализировалось на срезах головного мозга крысы при использовании разведений от 1:1000 до 1:100000. При больших разведениях (1:200000, 1:300000) также микрососуды визуализировались при иммуногистохимии на срезах головного мозга крысы, но интенсивность окрашивания микрососудов значительно падала. При разведениях менее 1:1000 резко увеличивалось тонирование фона вследствие неспецифической сорбции антител. Рекомендуемый рабочий диапазон разведений полученного препарата анти-ВЕМР-1 антител для иммуногистохимии и иммунофлюоресценции на срезах головного мозга составляет 1:5000-1:10000.
Наиболее выраженная иммуногистохимическая реакция наблюдалось в ростральных отделах неокортекса, в гипоталамусе, в области коры мозжечка и в продолговатом мозге. Визуализировались как мелкие микрососуды (8-10 мкм), так и довольно крупные элементы сосудистого русла (100 и более мкм).
Абсорбция первичных антител сухой плазмой крови и экстрактами органов и тканей не влияла на интенсивность окрашивания. В то же время абсорбция гомогенатом ткани головного мозга приводила к резкому снижению интенсивности окрашивания, вплоть до его исчезновения. Наряду с окрашиванием микрососудов паренхимы мозга наблюдалось интенсивное окрашивание сосудистой системы оболочек мозга (пиальных микрососудов) и микрососудов хориоидального сплетения (Фигура 4).
В дальнейшем анти-ВЕМР-1 антитела проверялись на тканевую специфичность с помощью иммуногистохимического анализа на срезах других органов. Согласно выбранной схеме все супернатанты и асциты от субклонов выбранной гибридомы, а затем и очищенные анти-ВЕМР-1 антитела из асцита проверяли на срезах печени, сердца, легких, почки и селезенки (Фигура 5).
Таким образом, проведенное исследование показало, что анти-ВЕМР-1 визуализируют аблюминальный мембранный антиген, экспрессирующийся на аблюминальной поверхности эндотелиоцитов микрососудов мозга и в значительно меньшей степени - в микрососудах, локализующихся в слизистой и мышечной оболочках крупных бронхов. Это позволяет говорить о высокой тканевой специфичности анти-ВЕМР-1 антител.
Видовую специфичность анти-ВЕМР-1 антител характеризовали с помощью иммунопероксидазного и иммунофлюоресцентного анализа на срезах мозга крысы, мыши, кролика, быка и человека. На срезах мозга мыши определялось окрашивание микрососудов как с помощью иммунопероксидазной, так и иммунофлюоресцентной методик визуализации. При этом интенсивность окрашивания была несколько ниже, чем аналогичная на срезах мозга крысы. Это свидетельствовало о перекрестной иммунохимической реакции анти-ВЕМР-1 антител с гомологичными эпитопами мыши и крысы. На срезах мозга кролика, быка и человека положительной иммуногистохимической реакции на какие-либо структуры не наблюдалось. Таким образом, было сделано заключение об ограниченной видовой специфичности анти-ВЕМР-1 антител.
125
125
Для оценки специфичности взаимодействия анти-ВЕМР-1 антител с эндотелиальными антигенами церебральных микрососудов было проведено радиоиммунное исследование накопления меченых Анти-ВЕМР-1 в микрососудах печени и мозга in vitro. С этой целью выделенные из асцита анти-ВЕМР-1 антитела и неспецифические IgG мыши (контроль) конъюгировали с радиоактивным I. Йодирование проводили Т-хлораминовым методом в соответствии с процедурой, описанной Fraker P.J. и Speck J.C.Jr. Препараты меченных I антител отделяли от свободного йода на микроколонках с Sephadex G-50. Содержание общего белка в препаратах определяли при помощи бицинхониновой кислоты (ВСА Protein Assay reagent, «Pierce», США).
Препарат нативных микрососудов получали из свежеприготовленного гомогената мозга крысы путем ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте декстрана Т-70.
125
125
125
125
5
Взвесь микрососудов разделили на равные аликвоты и проинкубировали в течение 12 часов с мечеными анти-ВЕМР-1 антителами (анти-ВЕМР-1-I). В качестве контроля использовались меченые неспецифические иммуноглобулины G мыши (IgG-I). Расчет вводимой дозы проводили по удельной радиоактивности белковых препаратов (СРМ/мкг), точность расчета проверяли путем непосредственного определения радиоактивности в образцах (СРМ/мл) с известной концентрацией белка. Удельная радиоактивность белковых препаратов существенно не отличалась: в различных сериях эксперимента колебания удельной радиоактивности для анти-ВЕМР-1-I и для IgG-I не выходили за пределы 3-5·10СРМ/мкг. В этой связи стандартизацию вводимой дозы в опыте и в контроле проводили по общему белку. Оценивались следующие концентрации меченых антител: 50, 10, 5 и 1 мкг на аликвоту микрососудов. Все пробы исследовали в дублях.
После инкубации с мечеными антителами препараты трехкратно отмывали не менее чем 50-кратным объемом PBS с центрифугированием по 10 мин при 50000 g на каждом этапе отмывки. Полученный осадок помещали в γ-счетчик и определяли общую и удельную радиоактивность сырого вещества микрососудов. Результаты исследования представлены на гистограммах (Фигура 6, Фигура 7).
Было обнаружено достоверное накопление меченых анти-ВЕМР-1 антител в микрососудах мозга крысы. При этом наблюдался обратный дозозависимый эффект. При исходной концентрации анти-ВЕМР-1 антител 50 мкг/пробу соотношение радиоактивности мозг/печень составляло примерно 3:1. При уменьшении количества введенных антител степень специфического взаимодействия значительно возрастала и при концентрации 1 мкг/пробу в исходном препарате соотношение мозг/печень было около 20:1.
125
В контроле с мечеными неспецифическими IgG мыши эффекта захвата антител микрососудами мозга не наблюдалось. Независимо от введенного количества белка накопление метки в мозге колебалось от 2,12 до 4,1% от введенной дозы (Фигура 3). Накопление IgG-I в печеночных и церебральных микрососудах существенно не отличалось.
125
125
125
При сравнении захвата микрососудами мозга анти-ВЕМР-1-Iантител и IgG-I также был выявлен эффект достоверно большего накопления первых, максимально выраженный при исходной концентрации антител 1 мкг/пробу. При дальнейшем повышении концентрации анти-ВЕМР-1-I происходило насыщение микрососудов антителами и доля захваченных антител от введенной дозы снижалась.
Полученные данные были воспроизведены в экспериментах in vitro на препаратах выделенных церебральных микрососудов несколько раз. В качестве второго контроля, кроме микрососудов печени, использовался препарат бессосудистой фракции мозга крысы. Суммарные данные всех экспериментов представлены на гистограмме (Фигура 6).
Накопление меченых анти-ВЕМР-1 антител в пересчете на вес сырого вещества церебральных микрососудов составило 19,79%/100 мг, что в 27 раз превышает их накопление в микрососудах печени и в 11,5 раз в бессосудистой фракции мозга. Накопление неспецифических IgG в церебральных микрососудах при этом составило 1,03%/100 мг.
Следующий эксперимент с использованием полученных авторами и очищенных анти-ВЕМР-1 антител проводился с оценкой иммунохимической активности и кинетики антител после введения в кровеносное русло лабораторного животного. Здоровым крысам (8) под кетаминовым наркозом в бедренную вену вводили по 1 мг анти-ВЕМР-1 антител (3 крысы), анти-GFAP-антител (3 крысы) и неспецифических IgG мыши (2 крысы). Через 10 и 30 минут, 1, 2, 3 и 12 часов из противоположной бедренной вены забирали 0,3 мл крови, центрифугировали и инкубировали полученную сыворотку крови со срезами головного мозга крысы (в качестве первичных антител) в разведениях 1:100, 1:500 и 1:1000. Результаты исследования представлены на Фигуре 5.
Инкубация с крысиной сывороткой, содержащей неспецифические IgG крысы, ни в одном из 3-х случаев не привела к окрашиванию срезов мозга крысы. В отличие от IgG, инкубация с образцами сыворотки, содержащей специфические моноклональные антитела, приводила к окрашиванию срезов мозга крысы. Последнее свидетельствует о способности длительно циркулировать в крови без потери иммунохимической активности.
Следующий эксперимент был проведен для оценки иммунохимической активности анти-ВЕМР-1 антител после введения в кровеносное русло крыс с экспериментальной глиомой С6. Трем крысам в бедренную вену было введено по 1 мг анти-ВЕМР-1 антител, ковалентно связанных с липосомальными наноконтейнерами, содержащими гадолиний DTPA, после чего через 24 часа циркуляции иммунолипосом в кровотоке проводили МРТ исследование головного мозга. Результаты МРТ сканирования по накоплению диагностической метки в местах экспресии ВЕМР-1 свидетельствует о способности анти-ВЕМР-1 антител длительно циркулировать в крови (не менее 24 часов) без потери иммунохимической активности и достигать антигена мишени живой клетки (аблюминальной поверхности церебральных эндотелиоцитов).
Таким образом, полученные авторами моноклональные анти-ВЕМР-1 антитела, вводимые в кровоток живой крысы, сохраняют иммунохимическую активность в плазме крови по крайней мере в течение не менее 24 часов после инъекции и способны достигнуть антигена мишени.
Предложенный способ может быть использован для получения аналогов у человека. Иммуногистохимический анализ эндотелиальных антигенов с помощью моноклональных антител, полученных предложенным авторами способом, может применяться в экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo для характеристики сосудистой системы глиом.