Способ получения природного биополимера апизана и его применение для активации культур клеток животных in vitro при репродукции вирусов
METHOD OF OBTAINING THE NATURAL BIOPOLIMER OF APIZANE AND ITS APPLICATION FOR ACTIVATION OF CULTURES OF ANIMAL CELLS IN VITRO DURING VIRUS REPRODUCTION

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования линий клеток животных тканей и репродукции на них вирусов.
Из практики культивирования клеток известно, что для повышения ростстимулирующей активности клеток in vitro в качестве активатора используют сыворотку крови, белковые гидролизаты животного происхождения (Л.П. Дьяконов. Животная клетка в культуре /Под ред. Л.П. Дьяконова) М.: Изд. Спутник+, 2009. - 656 с.) и растительного (Трошкова Г.П. и др. Совершенствование технологии питательных сред на основе ферментативных гидролизатов рисовой и соевой муки. - Биотехнология. - 2006. №4. - С. 74-78).
Известен также способ активации культур клеток путем использования биодобавки - фито-зооэкстракта из щуки и кабачков (Хазиев Л.Р. Влияние фито-зооэкстрактов на вируспродуцирующие свойства культивируемых клеток: Автореферат дисс… канд. биол. наук. - Казань, 2013. - 16 с.).
Общим недостатком этих способов является использование дорогостоящего животного и растительного сырья, сложность технологии их получения, а также возможность контаминации питательных сред микроорганизмами и прионами, содержащимися в сыворотке крови, гидролизатах тканей и органов животных.
Вместе с тем известно, что одним из важнейших достижений мирового научно-технического прогресса в области изыскания новых биологически активных веществ (БАВ) за последние тридцать лет стало изучение, создание и внедрение в биотехнологию, клеточную и генную инженерию высокомолекулярных соединений (ВМС) - биополимеров (белков и нуклеиновых кислот). Высокомолекулярные соединения - это полимеры и биополимеры, молекулы которых состоят из большого числа повторяющихся групп атомов или звеньев одинакового или различного химического строения (Осари С. Биополимеры / Пер. с японского М.К. Овечкиной и Е.И. Пичужкиной. - М.: Мир, 1988. - С. 353-383).
Наиболее высокой биологической активностью обладают природные биополимеры - хитин и хитозан, полученные от ракообразных (хитозан) и насекомых (апизан), которые, проникая в клетки макроорганизма и взаимодействуя с рибосомами, стимулируют РНК-синтезирующие белки и ферменты, усиливая, тем самым, рост и развитие клеток (Сорокин А.Я. и др. Йод-высокополимеры и биологические возможности организма. - Л.: Наука, 1979. - 259 с.).
Ценнейший биополимер - хитозан, обладающий уникальными свойствами (биосовместимость, легкоусвояемость, нетоксичность, метаболизмстимуляция, бактерицидность, содержание в составе белков, углеводов, аминокислот, макро- и микроэлементов и т.д.) обусловливает возрастающий интерес к нему не только фармакологов, терапевтов, геронтологов, физиологов, но и биотехнологов (Албулов А.И., Белоусов В.И. Промышленная технология получения биополимеров // Матер. 7-й Междунар. конф. - М.: Изд. ВНИРО, 2003. С. 215-217).
Хитозан обладает многими свойствами, которые делают его привлекательным для широкого применения: в качестве корма для животных, питания, продуктов биомедицины, сельского хозяйства и окружающей среды, и обладает способностью к стимулированию роста Bifidobacteria - полезной кишечной бактерии. Антибактериальные, противогрибковые и антивирусные свойства делают хитозан особенно полезным для биомедицинского применения.
В результате многочисленных исследований к настоящему времени обнаружен ряд биологических эффектов хитозана: антиоксидантный, антибактериальный, противовирусный, регенирующий, иммуностимулирующий, антитоксичный и другие.
Хитозан показал себя как эффективный радиопротектор, сорбент токсинов и тяжелых металлов в организме, иммуномодулятор в ветеринарии, а также других областях. На сегодняшний день известно более 70 направлений применения хитозана. Японские специалисты назвали хитозан веществом XXI века (Хитин и хитозан / Под. ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Наука, 2002. - 368 с.).
Известно, что панцири ракообразных - достаточно дорогостоящее сырье и, несмотря на то, что разработано более 15 методов получения из них хитина, одомашненные и поддающиеся разведению насекомые, в силу своего воспроизводства, могут обеспечить большую биомассу, содержащую хитин. К таковым относятся тутовый шелкопряд, медоносная пчела и комнатная муха (Быкова В.М., Немцев С.В., Сырьевые источники и способы получения хитина и хитозана // Хитин и хитозан. - М.: Наука, 2002. - С. 7-23).
Потенциальным источником пчелиного хитозана служит кутикула, содержащая хитин. Сырьем для получения хитина и хитозана из пчелиных может служить подмор пчел, погибших, главным образом, в период зимовки и осыпавшихся на дно улья. Летом их гибель гораздо значительнее, чем зимой, но менее заметна, поскольку пчелы погибают вне улья. Пчелы осеннего вывода, не выполняющие интенсивную работу, хорошо переносят зимовку и живут 8-9 месяцев.
За счет широкого распространения пчеловодства в нашей стране существует возможность получать хитиновое сырье в значительных масштабах. Ежегодная сырьевая база подмора пчел является новым перспективным источником хитозана насекомых наряду с традиционными видами сырья.
Известен способ получения хитозана (пчелозана) из сухового подмора пчел путем одностадийной обработки 10% раствором щелочи NaOH, удаления щелочного гидролизата, промывания оставшуюся массы-хитина большим количеством воды до рН 7,0 при температуре 55±5°С, с последующей обработкой - дезацетилирования хитина пчел 50% раствором NaOH при температуре 125±5°С. После обработки хитина раствор сливают, а оставшиеся часть промывают до рН 7,0 проточных вод. Полученной остаток является хитозаном («пчелозаном») (Немцев С.В., Зуева О.Ю., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Варламова В.П. Пчела как потенциальный источник хитозана // Матер. VI Междун. конф. (Щелково, Московская обл., 22-24 окт. 2001 г)., Центр «Биоинженерия» РАН, 308 с.).
2
Известен также способ получения хитозана из пчел - апизана из сухого подмора пчел путем СO-экстракции (см. Немцов С.В., Хисматуллин Р.Г., Хисматуллин М.Р., Лариков В.В., Варламова В.П. // интернет-сайт: http:// o beewellms.ru/ru/tentorium-shop-apizan).
Недостатком обоих способов является то, что обработке подвергается подмор пчел без их предварительного измельчения, необходимого для разрушения частей пчел и увеличения активной поверхности контакта частиц с реагентами. В результате отсутствия измельчения на всех стадиях обработки сохраняются части пчелы, а это свидетельствует о неглубокой обработке сырья и о неполном отделения белка, хитина других веществ.
Известен способ получения хитозана из кутикулярных оболочек насекомых, которые измельчают до частиц размером 0,2-0,3 мм, обрабатывают 40% раствором щелочи при температуре 100-110°С, жидкостном модуле 1:20 в течение 3-3,5 ч при одновременном воздействии ультразвуком с частотой 15-35 кГц (Патент RU №2067588, опубл. 10.10.1996 г.).
Недостатком данного способа является то, что измельчение исходного сырья, в том числе кутикул насекомых без предварительной сушки до величины частиц 0,2-0,3 мм, практически не выполнено из-за высокой влажности сырья (8-10%), кроме того, измельченная масса из-за своей вязкости слабо реагирует на ультразвук и не разрушается.
Наиболее близким к предлагаемому является способ получения хитозан - меланинового комплекса из подмора пчел, включающий сушку сырья до влажности 3-4% и его растирание до порошкообразного состояния, депротеирование 10%-ным раствором щелочи NaOH, в соотношении 1:10 по массе, при температуре 78-82°С в течение 1,5-2 часов, добавление в реакционную смесь 50%-ного раствора NaOH и доведение таким образом концентрации до 30% от исходной, дезацетилирование полученного хитозана в закрытом сосуде без доступа воздуха при температуре 90-95°С в течение 1,5-2,0 часов при постоянном перемешивании, фильтрацию, промывку массы дистиллированной водой до нейтрального значения рН, а из фильтрата - осаждение меланина воздействием концентрированной соленой кислотой до изменения рН в кислую область и выпавший осадок, представляющий собой меланин и раздельную сушку хитозана и меланина до влажности 8-10% и их смешивание (Патент RU №2382051, МПК С08В 37/00, опубл. 20.02.10 г., БН №5).
Недостатком способа является сложность технологии получения хитозан-меланинового комплекса, его многостадийность - 7 стадий, а главное - способ предназначен для использования его на животных (in vivo).
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в повышении эффективности культивирования клеток животных in vitro за счет активации их роста и пролиферации с использованием предлагаемого биополимера апизана, обеспечивающего высокую репродукцию вирусов, используемых для изготовления вирус-вакцин и упрощении технологии получения хитозана.
-5
Для достижения названного технического результата в способе получения природного биополимера апизана для активации культур клеток in vitro при репродукции вирусов, предусматривающем предварительную сушку до 4-6%, измельчение хитинсодержащего сырья, депротеирование измельченного порошка подмора пчел с использованием 30%-ного раствора гидроокиси натрия, фильтрацию, промывку дистиллированной водой до нейтрального значения рН, депротеирование измельченного порошка подмора пчел с использованием гидроокиси натрия берут в соотношении 1:3 и проводят в течение 6 часов при температуре 75°С, а перед фильтрацией дополнительно осуществляют активацию хитина путем радиолиза продукта, в присутствии хлорной кислоты в соотношении 4:1 на гамма-установке «Пума» в дозе 10,0 Гр при мощности экспозиционной дозы 3,13×10 Кл/кг⋅с, а после промывки дистиллированной водой продукт подвергают лиофилизации и получают биополимер апизан - порошок светло-коричневого цвета, растворимый в воде и содержащий 40-43% белка, 20-22% хитина, 2-3% минеральных веществ, 10-20% меланина, 8-10% влаги, 1-2% золы, вязкость 5-10 с ПЭ и степенью дэацетиллирования 80-85%.
Для достижения этого же технического результата в способе активации культур клеток in vitro при репродукции вирусов, включающем внесение в питательную среду биодобавки, в качестве которой используют природный биополимер - апизан для стимуляции роста клеток из расчета 50-70 мг/мл, засевают питательную среду культурами клеток и выращивают клетки стандартным способом при одновременной деконтаминации питательной среды без использования антибиотиков.
-5
Существенными отличиями способа получения природного биополимера апизана является то, что депротеирование измельченного порошка подмора пчел с использованием гидроокиси натрия берут в соотношении 1:3 и проводят в течение 6 часов при температуре 75°С, перед фильтрацией дополнительно осуществляют активацию хитина путем радиолиза продукта в присутствии хлорной кислоты в соотношении 4:1 на гамма-установке «Пума» в дозе 10,0 Гр при мощности экспозиционной дозы 3,13×10 Кл/кг⋅с, после промывки дистиллированной водой продукт подвергают лиофилизации и получают биополимер апизан - порошок светло- коричневого цвета, растворимый в воде и содержащий 40-43% белка, 20-22% хитина, 2-3% минеральных веществ, 12-20% меланина, 8-10% влаги, 1-2% золы, вязкость 5-10 с ПЭ и степенью дэацетиллирования 80-85%, оказывающий ростстимулирующее действие на клетки при одновременном антибактерицидном действии на микробные контаминанты, которые всегда присутствуют в сыворотках крови и тканевых экстрактах животных.
Существенными отличиями способа активации культур клеток in vitro при репродукции вирусов является внесение в питательную среду полученного природного биополимера - апизана для стимуляции роста клеток из расчета 50-70 мг/мл, выращивание клеток стандартным способом при одновременной деконтаминации питательной среды без использования антибиотиков, что приводит к существенному повышению пролиферации и чувствительности культур клеток к вирусам и выхода вирусной биомассы.
Таким образом, использование в качестве активатора метаболизма культур клеток апизана позволяет исключить из состава питательной среды дорогостоящую компоненту-сыворотку крови сельскохозяйственных животных и осуществить одновременно деконтаминацию питательных сред без применения антибиотиков. Ростстимулирующий эффект апизана на культуры клеток животных, а также растений и пищевых грибов связан, во-первых, с высокой сорбционной активностью биополимера, который способен сорбировать не только тяжелые металлы и радионуклиды, но и токсические радикалы и метаболиты, которые образуются при культивировании клеток и ингибируют дальнейший рост клеток; во-вторых, усиление роста, пролиферации клеток благодаря наличию в составе апизана меланинов, содержащих цитостимулирующий фактор (цитостимулирующие гормоны), в-третьих, меланин, содержащийся в хитине, хитозане и апизане, обладает выраженными антиоксидантными (антирадикальными) свойствами, нейтрализуя путем захвата и перевода их в неокисленные соединения, т.е. выполняет роль «щита», защищающего клетки от губительных активных форм кислорода, образующихся при метаболизме клеток в процессе культивирования; в-четвертых, антибактериальная активность хитозана по отношению к микроорганизмам (вероятных контаминантов питательных сред) путем нейтрализации протеиназы - основного - химического оружия патогенов.
8
3
-1.
-1
Использование физического метода (ионизирующих излучений) для активации хитина и хитозана облегчает процесс их деацетилирования и снижения молекулярной массы, что придает биополимеру важнейшее свойство - водорастворимость, направленно влияя на их молекулярные и структурные параметры. В основе активации хитина и хитозана лежит радиолиз полисахаридов, который сопровождается взаимодействием молекул биополимера с радиоиндуцированными реакционно-активными радикалами ОН*, Н*, как основных реагентов, обусловливающих активацию субстрата. При этом активные радикалы реагируют с моно- и полисахаридами хитина с отрывом водорода от С-Н-связей. В результате образуются вторичные углеродные радикалы по полимерной цепи (постоянной константной радиолиза К=6,4⋅10дм. М С (Хитин и хитозан / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Наука, 2002. - 318 с.). Образовавшиеся углеродные радикалы быстро преобразовываются в устойчивые продукты с отщеплением молекул воды и образованием карбоксильных групп. Последний процесс и обусловливает деструкцию цепей полисахаридов, уменьшение молекулярной массы, что придает хитозану растворимость и повышает его биологической активности.
Способ активации культур клеток для репродукции вирусов осуществляется следующим образом.
На первом этапе получают потенциальный активатор метаболизма клеток - биополимер - (апизан). В качестве хитинсодержащего технологического сырья используют пчелиный подмор. Для подготовки технологического сырья собирают свежие погибшие пчелы без признаков плесени и разложения. Сырье просевают через сито с крупными ячейками, чтобы отделить от мелкого мусора. Затем подмор подсушивают в сушильном шкафу, или печи при температуре +45-45°С, или над батареей центрального отопления. Сухой материал подвергают гомогенизации на шаровой мельнице или электрокофемолке. Степень дисперсности контролируют микроскопически, которая должна составлять в пределах 60-90 мкм. Полученный порошок упаковывают в бумажные пакеты и подвергают стерилизации путем автоклавирования при 100°С и давлении 1,0-1,5 атмосфер.
На втором этапе получают хитин путем депротеинирования измельченного подмора пчел в 30%-ном растворе гидроокиси натрия (NaOH), взятом в соотношении 1:3, и проводят в течение 6 часов в сушильном шкафу при температуре 75°С, промывают полученный материал дистиллированной водой, подсушивают.
-5
4
На третьем этапе получают апизан путем облучения хитин-содержащего материала на гамма-установке «Пума» в дозе 10 Гр при мощности экспозиционной дозы 3,13⋅10 Кл/кг⋅с. Гидролиз хитина (радиолиз) проводят в присутствии 30%-ного раствора хлорной кислоты (HClO) при соотношении компонентов 4:1. Полученный продукт радиоактивации (радиолиза) промывают дистиллированной водой до нейтрального значения рН, после анализа химического состава определяют концентрацию сухого вещества в гидролизате, которая колеблется в пределах 12-15 мг/мл, разливают в ампулы по 2,0 мл и подвергают лиофилизации. Содержание апизана в ампуле составляет 30±0,5 мг.
Физико-химическая характеристика апизана представлена в таблице 1.
Способ активации культур клеток в присутствии апизане иллюстрируется следующими примерами
Пример 1. Определение концентрации апизана в ростовой среде, обеспечивающей оптимальный рост культур клеток.
Перед испытаниями препарат, расфасованный в ампулы по 30±0,5 мг лиофильно высушенного порошка, вскрывали и вносили в питательные среды из расчета 6,28; 12,25, 25,0, 50,0, 70,0, 90, 100,0, 110, 120, 130 мг/мл. В качестве ростовой среды использовали среду Игла MEM, которую разливали во флаконы и вносили в них апизан из расчета 6,25-130,0 мг/л. Среды с биодобавкой апизаном засевали культурой клеток линии МДВК при посевной концентрации 40 тыс. кл/мл. В качестве контрольной среды опытах использовали среду Игла MEM, содержащую в качестве стимулятора роста клеток 20% сыворотки крови коров (СКК). В качестве критерия оценки ростстимуляции (активации) испытуемого активатора (апизана) использовали индекс пролиферации (ИП), которой рассчитывали общепринятым методом.
Результаты исследования по изучению влияния на метаболизм клеток МДВК природного биополимера апизана в зависимости от его содержания в питательной среде приведены в таблице 2.
Из материалов таблицы видно, что питательная среда, содержащая апизан в диапазоне концентраций 50,0-70,0 мг/л, обеспечивала максимальный рост и развитие клеток тест-культуры (МДВК), при котором концентрация клеток в культуральной среде через 48 ч (логарифмическая фаза) составляла 8,8±0,35 и 9,1±0,35 кл/мл соответственно при индексе пролиферации 2,7-2,9 соответственно.
Дальнейшее увеличение концентрации биополимера (90, 100, 120, 150 мг/мл) не приводило к увеличению концентрации клеток в культуральной жидкости и индекса пролиферации.
Пример 2. Определение оптимальной дозы облучения хитин содержащего материала для активации апизана.
Для оптимизации условий облучения с целью получения водорастворимого и низкомолекулярного апизана, хитин - содержащий деацетилированный материал подвергали гамма-облучению в дозах 1,3, 5, 7, 12, 14, 16 Гр, последующим испытанием облученных образцов апизана на степень ростстимулирующей активности клеток. Оптимальную дозу гамма-облучения с целью радиоактивации апизана определяли путем внесения полученных вариантов гидролизатов в питательную среду Игла MEM, которую засевали культурой клеток МДВК и через 48-часового культивирования клеток определяли индекс пролиферации.
Результаты определения оптимальных доз гамма-облучения апизана для его активации представлены в таблице 3.
4
Пример 3. Определение оптимальной концентрации HClO для осуществления радиолиза (гидролиза) хитина с целью получения апизана.
4
Для этого готовят различные концентрации реагента (НСlO):10, 15, 20, 25, 30, 35, 40%, в которые вносят гидролизуемый (депротеинированный гидроокисью натрия (NaOH) хитинсодержащий материал) и проводят радиолиз путем облучения на гамма-установке в дозе 10,0 Гр. По завершению облучения гидролизат промывают дистиллированной водой до нейтрального значения рН и испытывают ростстимулирующую активность полученных вариантов апизана путем внесения их в питательные среды с последующим засевом в них клетки тест-культуры (МДВК). Дальнейшие исследования проводят как в примере 2.
4
Результаты испытаний ростстимулирующей активности вариантов апизана, полученного путем радиолиза в присутствии различных концентраций реагента (HClO) представлены в таблице 4.
4
Пример 4. Определение оптимального соотношения реагента HClO и гидролизуемого материала (хитина) при радиолизе субстрата.
4
Для этого готовят 30%-ный раствор HClO и вносят его в гидролизуемый субстрат-хитинсодержащий материал в соотношениях 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 3:2, 4:1, 5:1? затем смесь материал облучают гамма-лучами в дозе 10,0 Гр и полученные варианты гидролизат вносят в питательные среды, засевают тест-культурой клеток (МДВК) и дальнейшие исследования проводят согласно примеру 2.
Результаты исследования представлены в таблице 5.
4
Из данных таблиц 3, 4, 5 видно, что оптимальной дозой облучения хитинсодержащего материала является доза 10,0 Гр (табл. 3), оптимальная концентрация реагента HClO для гидролиза (радиолиза) хитина – 30% (табл. 4) при оптимальном соотношении хитина и реагента - 4:1 (табл. 5). Любые изменения указанных параметров гидролиза апизана ведут к снижению индекса пролиферации клеток культуры клеток МДВК.
Пример 5. Сравнительная оценка эффективности известного препарата-апизана, полученного по патенту RU №2382051 и апизана содержащего, полученного путем радиолиза.
2
Для сравнительной оценки ростстимулирующей активности известного (СО-экстрагированного - апизана) и радиоэкстрагированного апизана (предлагаемого) препараты вносят в питательные среды из расчета 50-70 мг/мл, засевают среды клетками тест-культур (МДВК) плотностью 40 тыс. кл/мл, выращивают в течение 72 ч и определяют индекс пролиферации согласно примеру 2.
Результаты сравнительных опытов по оценке ростстимулирующей активности известного и предлагаемого препаратов представлены в таблице 6.
Из данных таблицы видно, что апизан, полученный по известной методике (Патент №2382051), не обладает ростстимулирующим действием поскольку индекс пролиферации значительно (в 2,06 раза) предлагаемому.
Пример 6. Определения чувствительности первичной культуры клеток МДВК, выращенных на среде, содержащей апизан.
Для определения чувствительности культур клеток МДВК к вирусам, ростовую среду Игла MEM, содержащую апизан, заражали вирусами ИРТ и ПГ-3. В опыт брали культуры после образования полного монослоя.
В ходе эксперимента было проведено 5 последовательных пассажей каждого вируса. Уровень накопления вируса в культуре клеток определяли методом титрования по общепринятой в вирусологии методике.
Результаты проведенных исследований по репродукции вирусов ИРТ и ПГ-3 клетками линии МДВК в апизансодержащей и контрольной (сывороточной) средах представлены в таблице 7.
Из представленных в таблице материалов видно, что наибольшее количество вирусной массы ИРТ и ПГ-3 было получено при использовании апизана в качестве ростстимулирующей добавки в ростовую среду Игла MEM, содержащую при выращивании линии клеток МДВК. При этом вирус ИРТ размножается значительно лучше по сравнению с вирусом ПГ-3 и его титр превышал контрольные значения в 1,19 раза, титр ПГ-3 – в 1,20 раза.
Пример 7. Оценка возможности деконтаминации питательных сред путем использования апизана.
Учитывая, что использование антибиотиков для контаминации питательных сред имеет существенные недостатки: цитотоксическое действие на клетки в культуре и индукция антибиотикорезистентности у микроорганизмов-контаминантов, проводили исследования на оценке деконтаминации активности апизана, включенного в ростовые среды для культивирования выращивания культур клеток. При этом исходили из того, что одним из важнейших свойств биополимеров (хитозана, апизана) является их разнонаправленное действие на биологические объекты: ростстимуляция полезной микрофлоры (бифидобактерии, лактобактерии) и клеток органов и тканей организма и подавление развитие патогенной и условно-патогенной микрофлоры.
3
Для проведения опытов в питательную среду Игла MEM с апизаном, выделенным из экстракта, контаминировали мезофильные аэробными и факультативно (МАФАиМ), мышечной ткани коров, используемых в биотехнологии в качестве добавки (активатора) в питательные среды. Плотность контаминации питательных сред составляла 1,5⋅10 КОЕ/мл.
Опыты сопровождали соответствующим контролем – питательную среду Игла MEM, содержащую 20% сыворотки КРС, по 100ЕД пенициллина, стрептомицина и канамицина, заражали указанными микроорганизмами в тех же дозах и условиях контаминации. Опытные и контрольные среды выдерживали в течение 48 ч, производя посевы через 1, 2, 4, 12, 24 и 48 ч на МПА и МПБ для подсчета количества выживших микроорганизмов.
Результаты бактериологических исследований по изучению влияния апизана и антибиотиков на мезофильных аэробные и факультативные анаэробные микроорганизмы (КМАФА и М) представлены в таблице 8.
3
3
Из данных таблицы видно, что внесения в питательную среду Игла MEM, содержащую 1,5⋅10 КОЕ/мл мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов апизана в количестве 50-70 мг/мл среды, оказывали бактерицидное действие на микроорганизмы. При этом наиболее интенсивная гибель микроорганизмов наблюдалась при 12-24-часовом контакте их с испытуемыми агентами, когда в питательных средах обнаруживалось 0,05-0,09⋅10 КОЕ/мл, что составляет 50-90 микробных клеток на 1 мл среды. Полная гибель микробной популяции в питательной среде Игла MEM с апизаном наступала через 48 ч после выяснения препарата. В контрольной питательной среде MEM, содержащей по 100 /мл пенициллина, стрептомицина и канамицина, полной гибели микроорганизмов не наступала, при 48-часовой экспозиции в посевах из контрольной среды обнаруживались единичные колонии микроорганизмов, что свидетельствует о неполной деконтаминации питательной среды.
Таким образом, полученный природный биополимер апизан и способ активации культур клеток in vitro для репродукции вирусов с помощью полученного биополимера апизана приводит к существенному (3-кратному) повышению пролиферативной активности клеток и позволяет исключить из состава питательной среды дефицитный компонент-сыворотку крови животных и упростить технологию получения хитозана.