Молекулярные маркеры рака шейки матки

УДК 616-006:616-018

Е. Г. Сидоренко, И. И. Антонеева, Т. П. Генинг, Д. Р. Арсланова, Т. В. Абакумова

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ РАКА ШЕЙКИ МАТКИ1

Аннотация. В операционно-биопсийных препаратах 45 больных раком шейки матки на различных клинических стадиях заболевания при иммуногистохими-ческом исследовании определяли уровень экспрессии таких биомолекулярных маркеров, как р53, Bcl-2, и эпидермальный фактор роста. Выявлено, что экспрессия эпидермального фактора роста встречается редко, а также четко прослеживается усиление экспрессии p53 в эпителии и его снижение в строме при прогрессировании рака шейки матки. Экспрессия Bcl-2 в строме и эпителии повышается на стадии Ib-IIa. Определение уровня экспрессии данных маркеров имеет несомненное практическое значение для оценки биологического портрета опухоли при раке шейки матки в динамике опухолевой прогрессии.

Ключевые слова: биомолекулярные маркеры, рак шейки матки, прогрессирование опухоли.

Abstract. In the course of immunohistochemical research the authors have determined the level of expression of р53 and Bcl-2 biomolecular markers and the epidermal factor of growth in operational-biopsy preparations for 45 patients with cervical cancer at various clinical stages of the disease. It is revealed that the expression of the epidermal factor of growth is uncommon, the expression of p53 intensifies in epithelia and decreases in a stroma subject to cervical cancer progression.

The expression of Bcl-2 rises in a stroma and an epithelium at the stage Ib-IIa. Definition of the expression level of the given markers has an undoubtable practical value for estimation of a biological portrait of a tumor at cervical cancer in dynamics of tumoral progression.

Key words: biomolecular markers, cervical cancer, tumor progression.

Злокачественные опухоли рака шейки матки (РШМ) - одна из актуальных проблем клинической онкологии. По данным Международного агентства по изучению рака, каждый год регистрируется около 490 тыс. новых случаев РШМ, при этом свыше 55 % женщин умирает от этого заболевания [1]. Природа РШМ рассматривается как последовательный многоступенчатый процесс: от неизменного эпителия шейки матки до интраэпителиальной неопла-зии и до инвазивного рака [2].

Патологоанатомы всегда стремились связать с морфологией опухоли степень ее клинической агрессивности. Так, гистологические классификации опухолей разрабатывались с учетом уровня злокачественности составляющих их нозологических форм. Сегодня одним из наиболее перспективных направлений в диагностике злокачественных опухолей является определение опухолевых маркеров, что может давать дополнительную информацию о биологической особенности опухоли. Большое внимание уделяется изучению маркеров, характеризующих апоптоз, пролиферацию клетки, - это белки р53, Bcl-2, Ki-67 и EGFR, ЭФР [3].

Ген-супрессор р53 кодирует ядерный белок, модулирующий экспрессию генов, ответственный за репарацию ДНК, деление клеток и апоптоз [4, 5].

1 Работа поддержана грантом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России».

Почти в половине случаев злокачественных опухолей обнаруживаются мутации в хромосоме 17 в области локализации гена-супрессора р53 [6]. На сегодня в литературе нет единого мнения относительно динамики экспрессии р53 при прогрессировании РШМ. Согласно данным ряда авторов, он может как повышаться, так и снижаться при РШМ [7, 8]. Антиген Ki-67 - это ядерный белок, экспрессия которого отмечается в активную фазу клеточного цикла, включая митоз. Согласно данным литературы, экспрессия Ki-67 повышается при поражении шейки матки [9, 10].

Белку Bcl-2 принадлежит важная роль в регуляции апоптоза. Показано, что высокая степень экспрессии опухолевой клетки Bid (белка из семейства Bcl, играющего важную роль в регуляции апоптоза и интегрирующего сигналы для митохондрий) коррелирует с неблагоприятным прогнозом РШМ [11].

Эпидермальный фактор роста (ЭФР) - низкомолекулярный полипептид, который связывается с рецепторами эпидермального фактора роста как в нормальной, так и патологической клетке. На сегодня идентифицированы по меньшей мере три сигнальные системы, которые активируются ЭФР, стимулируя опухолевую прогрессию. Нарушения функциональной активности ЭФР и его рецептора обусловливают более 70 % всех злокачественных опухолей. Активация рецепторов ЭФР во всех тканях вызывает изменения в физиологии клетки: повышение проводимости Na-каналов, увеличение притока Са2+, экспрессия ряда онкогенов, синтез ДНК, что приводит к изменению дифференцировки, апоптоза, пролиферации, а также ангиогенезу. Наличие рецепторов к ЭФР, как правило, неблагоприятно коррелирует с клинико-морфологическими факторами и является признаком плохого прогноза заболевания [12].

В соответствии с вышеизложенным целью исследования была оценка уровня экспрессии молекулярно-биологических маркеров p53, Bcl-2 и ЭФР в ткани шейки матки на различных стадиях РШМ.

Материал и методы исследования

Материалом для исследования послужили гистологические препараты операционно-биопсийного материала первичной опухоли 45 больных РШМ, полученные до начала исследования. По стадиям заболевания больные распределились следующим образом: начальный процесс (TIa1-Ia2) - 15 человек; местно-ограниченный процесс (TIb-IIa) - 15 человек; распространенный процесс (TIIb-IV) - 15 человек.

Образцы опухолевой ткани фиксировали в нейтральном забуференном формалине с обычной стандартной проводкой и заливкой в парафин. Гистологические препараты окрашивали обычными способами и проводили имму-ногистохимические исследования. В иммуногистохимической оценке экспрессии mt p53 использовали мышиные моноклональные антитела p53, клон DO-7, Ig G2b (M7001 DakoCytomation) в разведении 1:100 при времени экспозиции 60 мин. Критерием положительной реакции считалась окраска 10 % и более ядер опухолевых клеток. Bcl-2 обнаруживался с помощью моноклональных антител к Bcl-2, клон Bcl-2/100/D5, IgGi (NCL-Bcl-2 Novocastra) в разведении 1:80 при инкубации 60 мин. Положительной считалась реакция при цитоплазматической и мембранной окраске более 10 % опухолевых клеток. Для выявления ЭФР использовали поликлональные антитела (фирма

«Бако»), Полученные в ходе исследования результаты подвергнуты обработке с использованием непараметрических статистических методов (81а1а 6,0),

Результаты исследования и обсуждение

В результате проведенных исследований установлено увеличение количества атипичных эпителиальных клеток опухоли, экспрессирующих р53 в динамике опухолевой прогрессии, При этом уровень экспрессии р53 в клетках стромы статистически значимо снижается (рис, 1, 2),

эпителий ф строма

Рис, 1, Экспрессия р53 в эпителии и строме шейки матки в динамике опухолевой прогрессии

О

• ^ ♦

Рис, 2, Экспрессия р53+ в клетках рака шейки матки

Так, в группе пациенток с начальным процессом положительная реакция с антителами к р53 была выявлена в 46,06 % случаях, У пациенток с местнораспространенным процессом положительная реакция была выявлена в 53,33 % случаях и в группе с распространенным процессом - в 88,88 % случаях, Наряду с р53, наиболее последовательно в канцерогенезе солидных опухолей изучается роль гена Вс1-2, Известно, что продукт этого гена, белок Вс1-2, ингибирует р53-зависимый и независимый апоптозные метаболические пути, В свою очередь белок р53 снижает активность Вс1-2, что, возможно, запускает апоптоз в клетках с поврежденной ДНК, Показано, что Вс1-2 подавляет Ба8-зависимый апоптоз [13], Изучен механизм, благодаря которому Вс1-2

реализует свою функцию при апоптозе [14, 15], Данные относительно уровня экспрессии белка Вс1-2 и возможностей использования его в качестве прогностического фактора у больных с солидными опухолями достаточно противоречивы [5],

Результаты проведенного нами исследования по оценке экспрессии Вс1-2 атипическими эпителиальными клетками представлены на рис, 3, 4,

іууууч эпителий — . - строма

Рис, 3, Экспрессия Вс1-2 в эпителии и строме шейки матки в динамике опухолевой прогрессии

" ♦ Л

4 V- •

' > . 1^9 I

^ МЧ I 11Вс.'- \ * т. м*

.} (

Рис, 4, Содержание Вс1-2+ в клетках рака шейки матки

Показано резкое и значимое усиление экспрессии при местноограниченном процессе по сравнению с начальным процессом (66,67 % против 33,33 %) и последующее снижение экспрессии при распространенном процессе до 33,33 %, Динамика экспрессии Вс1-2 в строме аналогичная (рис, 3),

Анализ ИГХ исследований показал, что положительная реакция с антителами к ЭФР была выявлена в группе пациентов на начальной стадии процесса в эпителиальных клетках только у одной больной (6,6 %) (рис, 5),

В строме положительная реакция на ЭФР была выявлена в пяти случаях (3,3 %), У пациентов с местнораспространенным процессом положительная реакция на ЭФР не была выявлена и в строме была выявлена в двух (33,3 %) случаях (рис, 6), Также не была выявлена положительная реакция с антитела-

ми к ЭФР в эпителиальных клетках у пациенток с распространенным процессом, В строме у пациенток этой группы положительная реакция была выявлена в трех (13,3 %) случаях, Согласно данным литературы, экспрессия ЭФР наблюдается примерно в 40 % злокачественных опухолей ЖКТ, легкого, яичников, матки [16], При этом можно считать достоверным, что гиперэкспрессия ЭФР играет важную роль в канцерогенезе, является маркером, характеризующим биологическое поведение опухоли и позволяющим индивидуализировать подходы при назначении терапии,

40 -т

!а стадия !Ь-!!а стадия !!Ь-!У стадия

строма — —эпителий

Рис, 5, Экспрессия ЭФР в эпителии и строме шейки матки в динамике опухолевой прогрессии

Рис, 6, Экспрессия ЭФР в раковых клетках шейки матки

Вывод

Таким образом, определение уровня экспрессии таких биомолекуляр-ных маркеров, как р53, Вс1-2 и ЭФР, имеет несомненное практическое значение для оценки биологического портрета опухоли при РШМ в динамике опухолевой прогрессии, В то же время сверхэкспрессия ЭФР у больных РШМ встречается редко, что, возможно, свидетельствует о его незначительной роли в патогенезе РШМ,

Список литературы

1. Кезик, В. Скрининг рака шейки матки / Весна Кезик // Практическая онкология. - 2009. - Т. 10, № 2. - С. 59-61.

2. Parkin, D. M. Global Cancer Statistics, 2002 / D. M. Parkin, F. Bray, J. Ferlay, P. Pissini // CA Cancer J. Clin. - 2005. - V. 55. - P. 74-108.

3. Барышников, А. Ю. Программированная клеточная смерть (апоптоз) / А. Ю. Барышников, Ю. В. Шишкин // Российский онкологический журнал. -1996. - № 1. - С. 58-61.

4. Копнин, Б. П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза (обзор) / Б. П. Копнин // Биохимия. - 2000. - Т. 65, № 1. - С. 5-33.

5. Абрамов, И. В. Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии / И. В. Абрамов, А. А. Фильченков // Вопросы онкологии. - 2003. - Т. 49. - С. 21-30.

6. Soussi, T. p53 website and analysis of p53 gene mutations in human cancer: forging a link between epidemiology and carcinogenesis / T. Soussi, K. Dehouche, C. Beroud // Hum Mutat. - 2000. - V. 15. - P. 105-113.

7. Петров, С. В. Экспрессия клеточных онкогенов в нормальном, метапластиче-ском, диспластическом эпителии и плоскоклеточном раке шейки матки / С. В. Петров, Н. Н. Мазуренко, Н. М. Сухова и др. // Архив патологии. - 1994. -№ 4. - С. 22-31.

8. Самойлова, Э. В. Молекулярные маркеры рака шейки матки : автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.14 / Самойлова Э. В. - М., 1997. - 27 с.

9. Кондриков, Н. И. Значение иммуногистохимического определения биомаркеров плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки / Н. И. Кондриков, М. В. Шамаракова, Ю. В. Горбачева // Акушерство и гинекология. - 2010. - № 6. - С. 44-48.

10. Кузнецова, М. Е. Иммуногистохимическая оценка пролиферативной активности и репаративных способностей плоскоклеточного рака шейки матки как показателей эффективности лучевой терапии : автореф. дис. . канд. мед. наук: 14.00.14 / Кузнецова М. Е. - СПб., 2008. - 25 с.

11. Stoenescu, T. M. Assessment tumor markers by immunohistochemistry (Ki67, p53 and Bcl-2) on a cohort of patients with cervical cancer in various stages of evolution / T. M. Stoenescu, L. D. Ivan, N. Stoenescu, D. Azoicai // Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. Iasi. - 2011. - Apr.-Jun. - V. 115, № 2. - Р. 485-492.

12. Leung, B. S. Evidence of an EGF/TGF-alpha-independendent pathway for estrogen-regulated cell proliferation / B. S. Leung, L. Stout, L. Zhou // J. Cellular Biochemy. -1991. - V. 46. - P. 125-133.

13. Акимов, А. А. Апоптоз и лучевая терапия злокачественных новообразований / А. А. Акимов, С. Д. Иванов, К. П. Хансон // Вопросы онкологии. - 2003. - Т. 49, № 3. - С. 261-269.

14. Korsmeyer, S. J. BCL-2 gene family and the regulation of programmed cell death / S. J. Korsmeyer // Cancer Res. - 1999. - № 59 (7 Suppl). - Apr. 1. - Р. 1693-1700.

15. Herrmann, J. L. Cell death signal transduction and Bcl-2 function / J. L. Herrmann, E. Bruckheimer, T. J. McDonnell // Biochem. Soc. Trans. - 1996. -Nov. - V. 24, № 4. - Р. 1059-1065.

16. Шаназаров, Н. А. Роль эпидермального фактора роста и его рецептора в кан-церогнезе: молекулярные механизмы их действия / Н. А. Шаназаров, А. Х. Сабиров, С. М. Сироткина // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. - Т. 8, № 4. - С. 85-90.

Сидоренко Екатерина Геннадьевна

аспирант, Институт медицины, экологии и физической культуры, Ульяновский государственный университет

E-mail: nikolaenkova73@mail.ru

Антонеева Инна Ивановна

доктор медицинских наук, доцент, кафедра онкологии и лучевой диагностики, Институт медицины, экологии и физической культуры, Ульяновский государственный университет

E-mail: aii72@mail.ru

Генинг Татьяна Петровна

доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой физиологии и патофизиологии, Ульяновский государственный университет

E-mail: Naum-53@yandex.ru

Арсланова Динара Ришатовна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Ульяновский государственный университет

E-mail: monika_rainbow@mail.ru

Абакумова Татьяна Владимировна

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Ульяновский государственный университет

E-mail: taty-abakumova@yandex.ru

Sidorenko Ekaterina Gennadyevna Postgraduate student, Institute of medicine, ecology and physical culture, Ulyanovsk State University

Antoneeva Inna Ivanovna Doctor of medical sciences, associate professor, sub-department of oncology and radiodiagnostics, Institute of medicine, ecology and physical culture,

Ulyanovsk State University

Gening Tatyana Petrovna Doctor of biological sciences, professor, head of sub-department of physiology and pathophysiology, Ulyanovsk State University

Arslanova Dinara Rishatovna Candidate of biological sciences, senior staff scientist, Ulyanovsk State University

Abakumova Tatyana Vladimirovna Candidate of biological sciences, senior staff scientist, Ulyanovsk State University

УДК 616-006:616-018

Молекулярные маркеры рака шейки матки / Е. Г. Сидоренко, И. И. Антонеева, Т. П. Генинг, Д. Р. Арсланова, Т. В. Абакумова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. -2012. - № 1 (21). - С. 18-24.