АНТИТЕЛО ПРОТИВ Fn14 ЧЕЛОВЕКА
ANTIBODY AGAINST HUMAN FN14

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001]
Настоящее изобретение относится к антителу против Fn14 человека.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002]
Кахексия представляет собой комплексный метаболический синдром, ассоциированный с лежащим в его основе заболеванием и характеризующийся потерей мышц с или без потери жировой массы. Выраженным клиническим признаком кахексии является снижение массы тела у взрослых или недостаточный рост у детей (непатентный документ 1). Приблизительно 80% пациентов с развернутой злокачественной опухолью имеют кахексию, которую называют кахексией онкологических больных. Кахексия ухудшает прогноз у пациента или качество жизни (QOL) вследствие резистентности к лечению, и она связана с повышением смертности. Однако, не существует эффективных способов лечения кахексии. Хотя механизм возникновения кахексии неясен, в последние годы кахексию считают воспалительным состоянием всего организма, обусловленным различными цитокинами (непатентный документ 2).
[0003]
Индуцируемый фибробластным фактором роста белок 14 (Fn14) (также обозначаемый как TNFRSF12A) является представителем семейства рецептора фактора некроза опухоли. Fn14 также известен как рецептор Tweak, который связывается с TNF-подобным слабым индуктором апоптоза (Tweak). Известно, что Tweak-зависимая или независимая активация Fn14 активирует каскад передачи сигнала NFkB и контролирует пролиферацию, миграцию, дифференцировку и апоптоз клеток, а также воспаление, вовлеченное в ангиогенез, повреждение тканей и регенерацию (непатентный документ 3).
[0004]
Что касается взаимосвязи со злокачественными опухолями, было описано, что Fn14 сверхэкспрессируется в различных солидных злокачественных опухолях (непатентный документ 4) и что Fn14 вовлечен в прогрессирование и метастазирование опухоли (непатентный документ 5). Кроме того, было описано, что в модели на мышах кахексии онкологических больных антитело против Fn14 является эффективным в отношении улучшения симптомов кахексии, и его действие является результатом ингибирования Fn14 в опухоли (непатентный документ 6).
[0005]
Между тем, активация Fn14 может вызывать продуцирование воспалительного цитокина и ухудшать воспалительное состояние. Энаватузумаб (патентный документ 1), который находится на стадии клинической разработки, был описан в качестве антитела-агониста Fn14 человека. В фазе I клинического испытания энаватузумаба была описана гепатотоксичность (непатентный документ 7), и было предположено, что лечение энаватузумабом может вызывать воспаление (непатентный документ 8).
[0006]
Моноклональное антитело мыши CRCBT-06-002 было описано в качестве антитела, которое в определенных условиях связывается с Fn14 человека и обладает активностью обладает активностью антагониста, но не обладает активностью агониста (патентный документ 2). Было описано, что CRCBT-06-002 обладает активностью антагониста, которая ингибирует продуцирование IL-8, индуцируемое стимуляцией посредством Tweak в клетках происходящей из злокачественной меланомы человека клеточной линии A375, и обладает эффективностью в модели кахексии онкологических больных на мышах. Однако активность агониста, которая индуцирует продуцирование IL-8 из клеток A375 в отсутствии Tweak, сохраняется (патентный документ 2).
[0007]
Антитело-антагонист Fn14, которое не обладает активностью агониста и может быть лишено нежелательных побочных эффектов, неизвестно.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
[0008]
[Патентный документ 1] WO 2009/020933
[Патентный документ 2] WO 2013/026099
Непатентный документ
[0009]
[Непатентный документ 1] Evans WJ et al., Clin Nutr. 2008, Vol. 27, p. 793-799
[Непатентный документ 2] Baracos VE et al., Nat Rev Dis Primers. 2018, Vol. 4 Article number 17105, p. 1-18
[Непатентный документ 3] Winkles JA, Nat Rev Drug Discov. 2008, Vol. 7, p. 411-425
[Непатентный документ 4] Culp PA et al., Clin Cancer Res. 2010, Vol. 16, p. 497-508
[Непатентный документ 5] HU G et al., Tumor Biol. 2017, Vol. 39 June, p. 1-9
[Непатентный документ 6] Johnston AJ et al., Cell. 2015, Vol. 162, p. 1365-1378
[Непатентный документ 7] Lam ET et al., Mol Cancer Ther. 2018, Vol. 17, p. 215-221
[Непатентный документ 8] Choi D et al., Am J Pharmacol Toxicol. 2017, Vol. 12, p. 18-38.
Описание изобретения
Проблемы, решаемые изобретением
[0010]
Задачей настоящего изобретения является предоставление антитела против Fn14 человека, обладающего превосходной безопасностью, которое сохраняет высокую активность антагониста активность и имеет сниженную активность агониста по сравнению с общепринятыми антителами.
Способы решения проблем
[0011]
Авторы изобретения провели тщательные исследования для получения антитела против Fn14 человека и в результате получили антитело против Fn14 человека, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательность в положениях аминокислот 31-35 SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 50-65 SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 98-114 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 24-40 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 56-62 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 95-103 SEQ ID NO: 4 (примеры 2-4). Авторы изобретения обнаружили, что антитело связывается с Fn14 человека (пример 6), ингибирует активацию NFkB и продуцирование IL-8, индуцируемое стимуляцией Tweak (примеры 7 и 8), и не индуцирует продуцирование IL-8 в отсутствии Tweak (пример 8). В результате было предоставлено антитело против Fn14 человека, обладающее активностью антагониста, но не активностью агониста, и было осуществлено настоящее изобретение. Более того, авторы изобретения обнаружили, что описанное выше антитело, которое является муринизированным (пример 4), подавляет снижение массы тела и мышечной массы в модели кахексии онкологических больных на мышах (пример 9), и что период выживания увеличивается в случае, когда антитело и гемцитабин используют в комбинации по сравнению с введением антитела отдельно или гемцитабина отдельно (пример 10).
[0012]
В соответствии с настоящим изобретением, например, предусматривается следующее изобретение.
[1]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 31-35 SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 50-65 SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 98-114 SEQ ID NO: 2; и
вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 24-40 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 56-62 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 95-103 SEQ ID NO: 4.
[2]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно [1], выбранные из следующих (1) и (2):
(1) антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4; и
(2) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, образованные посредством посттрансляционной модификации антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно (1).
[3]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно [2], содержащие:
вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2; и
вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4.
[4]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно [2], где посттрансляционная модификация представляет собой пироглутамилирование на N-конце вариабельной области тяжелой цепи и/или делецию лизина на C-конце тяжелой цепи.
[5]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно [2], содержащие:
вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2, в которой глутамин в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 модифицирован на пироглутаминовую кислоту; и
вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4.
[6]
Антитело против Fn14 человека согласно [2], выбранное из следующих (3) и (4):
(3) антитело против Fn14 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4; и
(4) антитело против Fn14 человека, образованное посредством посттрансляционной модификации антитела согласно (3).
[7]
Антитело против Fn14 человека согласно [6], содержащее:
тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2; и
легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4
[8]
Антитело против Fn14 человека согласно [6], где посттрансляционная модификация представляет собой пироглутамилирование на N-конце тяжелой цепи и/или делецию лизина на C-конце тяжелой цепи.
[9]
Антитело против Fn14 человека согласно [8], содержащее:
тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-454 SEQ ID NO: 2, в которой глутамин в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 модифицирован на пироглутаминовую кислоту; и
легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
[10]
2
Антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из [1]-[5], который представляет собой одноцепочечный фрагмент вариабельной области, Fab, Fab’ или F(ab’).
[11]
Полинуклеотид, содержащий:
последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3].
[12]
Полинуклеотид, содержащий:
последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3].
[13]
Экспрессирующий вектор, содержащий:
полинуклеотид согласно [11] и/или [12].
[14]
Клетка-хозяин, выбранная из группы, состоящей из следующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3], и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3], и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента;
(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3]; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3].
[15]
Клетка-хозяин, выбранная из группы, состоящей из следующих (e)-(h):
(e) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека согласно [7], и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;
(f) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека согласно [7], и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;
(g) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека согласно [7]; и
(h) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Fn14 человека согласно [7].
[16]
Способ получения антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента, причем способ включает:
стадию культивирования клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из следующих (A)-(C), для экспрессии антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента:
(A) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3], и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента;
(B) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3], и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; и
(C) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно [3], и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
[17]
Способ получения антитела против Fn14 человека, включающий:
стадию культивирования клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из следующих (D)-(F), для экспрессии антитела против Fn14 человека:
(D) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека согласно [7], и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;
(E) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека согласно [7], и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела; и
(F) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека согласно [7], и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Fn14 человека.
[18]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, продуцированные способом согласно [16].
[19]
Антитело против Fn14 человека, продуцированное способом согласно [17].
[20]
Фармацевтическая композиция, содержащая:
антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из [1]-[10], [18] и [19]; и
фармацевтически приемлемый эксципиент.
[21]
Фармацевтическая композиция, содержащая:
антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно [3];
антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно [5]; и
фармацевтически приемлемый эксципиент.
[22]
Фармацевтическая композиция, содержащая:
антитело против Fn14 человека согласно [7];
антитело против Fn14 человека согласно [9]; и
фармацевтически приемлемый эксципиент.
[23]
Фармацевтическая композиция согласно любому из [20]-[22], которая представляет собой фармацевтическую композицию для предупреждения или лечения кахексии онкологических больных.
[24]
Способ предупреждения или лечения кахексии онкологических больных, причем способ включает:
стадию введения терапевтически эффективного количества антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из [1]-[10], [18] и [19].
[25]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из [1]-[10], [18] и [19], которые предназначены для предупреждения или лечения кахексии онкологических больных.
[26]
Применение антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента согласно любому из [1]-[10], [18] и [19] для производства фармацевтической композиции для предупреждения или лечения кахексии онкологических больных.
[27]
Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных, содержащая:
антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из [1]-[10], [18] и [19] в качестве активного ингредиента,
где фармацевтическую композицию используют в комбинации со средством против злокачественной опухоли.
[28]
Фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных, содержащая:
средство против злокачественной опухоли,
где фармацевтическую композицию используют в комбинации с антителом против Fn14 человека или его антигенсвязывающим фрагментом согласно любому из [1]-[10], [18] и [19].
Эффекты изобретения
[0013]
Антитело против Fn14 человека по настоящему изобретению действует, подавляя воспаление посредством ингибирования активации Fn14 человека, индуцируемой стимуляцией посредством Tweak, без проявления активности агониста в отношении Fn14 человека, и его можно использовать в качестве средства для предупреждения или лечения кахексии онкологических больных.
Краткое описание чертежей
[0014]
[Фиг.1] На фиг.1 представлен ингибиторный эффект антитела против Fn14 человека на продуцирование воспалительного цитокина IL-8, индуцируемое стимуляцией посредством Tweak, в клетках A375. По вертикальной оси представлен уровень ингибирования (%), и по горизонтальной оси представлена концентрация антитела (нг/мл).
[Фиг.2] На фиг.2 представлена секреция IL-8, индуцируемая стимуляцией антителом против Fn14 человека в клетках A375. По вертикальной оси представлена концентрация IL-8 (пг/мл), и по горизонтальной оси представлена концентрация антитела (нг/мл).
[Фиг.3] На фиг.3 представлен ингибиторный эффект муринизированного антитела против Fn14 человека 4-1m на снижение массы тела, индуцируемое трансплантацией мышам клеток клеточной линии рака толстого кишечника мыши C26. По вертикальной оси представлена масса тела (г), и по горизонтальной оси представлено количество дней, прошедшее после инъекции злокачественных клеток.
[Фиг.4] На фиг.4 представлен ингибиторный эффект муринизированного антитела против Fn14 человека 4-1m на снижение мышечной массы, индуцируемое трансплантацией мышам клеток клеточной линии рака толстого кишечника мыши C26. По вертикальной оси представлена масса (мг) передней большеберцовой мышцы.
[Фиг.5] На фиг.5 представлен ингибиторный эффект муринизированного антитела антитело против Fn14 человека 4-1m на снижение мышечной функции, индуцируемое трансплантацией мышам клеток клеточной линии рака толстого кишечника мыши C26. По вертикальной оси представлена сила сжатия (g).
[Фиг.6] На фиг.6 представлен эффект муринизированного антитела против Fn14 человека 4-1m в комбинации с гемцитабином на период выживания мышей, которым трансплантировали клетки клеточной линии рака толстого кишечника мыши C26. По вертикальной оси представлена выживаемость (%), и по горизонтальной оси представлено количество дней, прошедшее после инъекции злокачественных клеток.
3
[Фиг.7] На фиг.7 представлен эффект комбинированного применения муринизированного антитела против Fn14 человека 4-1m с гемцитабином на объем опухоли, образовавшейся после трансплантации мышам клеток клеточной линии рака толстого кишечника мыши C26. По вертикальной оси представлен объем опухоли (мм), и по горизонтальной оси представлено количество дней, прошедшее после инъекции злокачественных клеток.
Варианты осуществления изобретения
[0015]
Далее настоящее изобретение описано подробно.
[0016]
Существует пять классов антител: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Основная структура молекулы антитела организована тяжелыми цепями, имеющими молекулярную массу от 50000 до 70000, и легкими цепями, имеющими молекулярную массу от 20000 до 30000, в каждом из классов в общем. Тяжелая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей приблизительно 440 аминокислот, имеет отчетливую структуру для каждого из классов и обозначается Igγ, Igμ, Igα, Igδ и Igε, которые соответствуют IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Кроме того, в IgG присутствует четыре подкласса IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и тяжелые цепи, соответственно, соответствующие им, обозначают как Igγ1, Igγ2, Igγ3 и Igγ4. Легкая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, содержащей 220 аминокислот, для которой известно два типа, тип L и тип K, и их обозначают как Igλ и Igκ. В пептидной конфигурации основной структуры молекулы антитела две гомологичных тяжелых цепи и две гомологичных легких цепи связаны дисульфидными связями (связь S-S) и нековалентными связями, и их молекулярная масса составляет от 150000 до 190000. Два типа легких цепей могут образовывать пару с любой тяжелой цепью. Соответствующие молекулы антител, как правило, состоят из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.
[0017]
Что касается межцепочечных связей S-S, в тяжелой цепи присутствует четыре связи S-S (пять в цепях Igμ и Igε) и в легкой цепи присутствует две таких связи; на 100-110 аминокислотных остатков образуется одна петля, и эта пространственная структура является сходной среди петель, и их называют структурным элементом или доменом. Домен, находящийся с N-концевой стороны как тяжелой цепи, так и легкой цепи, чья аминокислотная последовательность не является постоянной даже в случае образца из одного класса (подкласса) одной разновидности животных, называют вариабельной областью, и соответствующие домены называют вариабельной областью тяжелой цепи (VH) и вариабельной областью легкой цепи (VL). Аминокислотная последовательность C-концевой стороны вариабельной области является практически постоянной в каждом классе или подклассе, и ее называют константной областью (соответствующие домены обозначают как CH1, CH2, CH3 или CL, соответственно).
[0018]
Антигенный связывающий центр антитела организован из VH и VL, и специфичность связывания зависит от аминокислотной последовательности этого участка. С другой стороны, виды биологической активности, такие как связывание с комплементом и различными экспрессирующими Fc-рецептор клетками, отражают различия в структурах константных областей среди классов Ig. Понятно, что вариабельность вариабельных областей легких цепей и тяжелых цепей ограничена по большей части тремя небольшими гипервариабельными областями, присутствующими в обеих цепях, и эти области называют определяющими комплементарность областями (CDR: CDR1, CDR2 и CDR3 с N-концевой стороны). Оставшуюся часть вариабельной области называют каркасной областью (FR), и она является относительно постоянной.
[0019]
2
2
Различные антигенсвязывающие фрагменты, содержащие VH и VL антитела, также обладают активностью связывания антигена, и репрезентативные примеры такого антигенсвязывающего фрагмента включают одноцепочечный фрагмент вариабельной области (scFv), Fab, Fab и F(ab’). scFv представляет собой одновалентный фрагмент антитела, который состоит из VH и VL, соединенных друг с другом через линкер. Fab представляет собой одновалентный фрагмент антитела, который состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего VH, домен CH1 и часть шарнирной области. Fab’ представляет собой одновалентный фрагмент антитела, который состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, содержащего VH, домен CH1 и часть шарнирной области, и часть шарнирной области включает остатки цистеина, которые формируют связь S-S между тяжелыми цепями. Фрагмент F(ab’) представляет собой двухвалентный фрагмент антитела, в котором два Fab’-фрагмента связаны связью S-S между тяжелыми цепями в шарнирной области.
[0020]
<Антитело против Fn14 человека по настоящему изобретению>
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению включает антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющие следующие характеристики.
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 31-35 SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 50-65 SEQ ID NO: 2, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 98-114 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 24-40 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 56-62 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 95-103 SEQ ID NO: 4.
[0021]
В одном варианте осуществления антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4.
[0022]
В одном варианте осуществления антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению обладает описанными выше характеристиками и дополнительно содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи. В качестве константной области может быть выбрана константная область любого подкласса (например, Igγ1, Igγ2, Igγ3 или Igγ4 в качестве константной области тяжелой цепи, и Igλ или Igκ в качестве константной области легкой цепи). В одном варианте осуществления антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит константную область Igγ1 человека в качестве константной области тяжелой цепи и константную область Igκ человека в качестве константной области легкой цепи.
[0023]
Номер остатка, связанный с внесением мутаций аминокислот в константной области используемого антитела, может быть определен в соответствии с индексом EU (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda). L234A и L235A представляют собой замены лейцина в положении аминокислоты 234 и в положении аминокислоты 235 на аланин в константной области Igγ1 человека в соответствии с индексом EU, описанным Kabat et al., соответственно. Примеры константной области Igγ1 человека, имеющей мутации аминокислот L234A и L235A, включают константную область Igγ1 человека, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 126-455 SEQ ID NO: 2.
[0024]
В одном варианте осуществления антитело против Fn14 человека по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
[0025]
Известно, что, когда антитело экспрессируется в клетках, антитело модифицируется после трансляции. Примеры посттрансляционной модификации включают делецию лизина на C-конце тяжелой цепи посредством карбоксипептидазы, модификацию глутамина или глутаминовой кислоты на N-конце тяжелой цепи и легкой цепи на пироглутаминовую кислоту посредством пироглутамилирования, гликозилирования, окисления, дезамидации и гликирования, и известно, что такие посттрансляционные модификации встречаются в различных антителах (Liu H et al., J Phar Sci. 2008, Vol. 97 No. 7, p. 2426-2447).
[0026]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению также включает антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, модифицированные после трансляции. Примеры антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, модифицированных после трансляции, включают антитела против Fn14 человека, которые претерпели пироглутамилирование на N-конце вариабельной области тяжелой цепи и/или делецию лизина на C-конце тяжелой цепи, или их антигенсвязывающие фрагменты. В данной области известно, что такая посттрансляционная модификация вследствие пироглутамилирования на N-конце или делеции лизина на C-конце не оказывает никакого влияния на активность антитела (Lyubarskaya Y et al., Anal Biochem. 2006, Vol. 348, p. 24-39).
[0027]
В одном варианте осуществления антитело против Fn14 человека по настоящему изобретению включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, образованные посредством посттрансляционной модификации антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления посттрансляционная модификация представляет собой пироглутамилирование на N-конце вариабельной области тяжелой цепи и/или делецию лизина на C-конце тяжелой цепи.
[0028]
В одном варианте осуществления антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2, в которой глутамин в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 модифицирован на пироглутаминовую кислоту, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4.
[0029]
В одном варианте осуществления антитело против Fn14 человека по настоящему изобретению образовано посредством посттрансляционной модификации антитела против Fn14 человека, содержащего тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4, и посттрансляционная модификация представляет собой пироглутамилирование на N-конце тяжелой цепи и/или делецию лизина на C-конце тяжелой цепи.
[0030]
В одном варианте осуществления антитело против Fn14 человека по настоящему изобретению содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-454 SEQ ID NO: 2, в которой глутамин в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 модифицирован на пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
[0031]
2
В одном варианте осуществления антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению представляет собой scFv, Fab, Fab’ или F(ab’).
[0032]
Любой специалист в данной области может получить слитую форму, в которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент слиты с другим пептидом или белком, или также может получить модифицированную форму, с которой связан модифицирующий агент, на основе настоящего изобретения, и антитело по настоящему изобретению также включает эти формы антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Другие пептиды или белки, используемые для слияния, конкретно не ограничены при условии, что слитая форма связывается с Fn14, и их примеры включают сывороточный альбумин человека, различные пептиды меток, пептид искусственного мотива спирали, мальтоза-связывающие белки, глутатион-S-трансферазу, различные токсины и другие пептиды или белки, способные способствовать мультимеризации. Модифицирующий агент, используемый для модификации, конкретно не ограничен при условии, что модифицированная форма связывается с Fn14, и его примеры включают полиэтиленгликоль, цепи сахаров, фосфолипиды, липосомы и низкомолекулярные соединения.
[0033]
В одном варианте осуществления модифицирующий агент, используемый для модификации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, представляет собой полиэтиленгликоль.
[0034]
"Антитело против Fn14 человека" в настоящем описании означает антитело, связывающееся с Fn14 человека. Наличие связывания антитела против Fn14 с Fn14 человека можно подтверждать с использованием известного способа измерения активности связывания. Примеры способа измерения активности связывания включают твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). В случае использования ELISA, например, белок Fn14 человека иммобилизуют на планшете для ELISA и в него добавляют тестируемое антитело, подлежащее реагированию. После реакции проводят реакцию вторичного антитела, такого как антитело против IgG, меченное ферментом, таким как пероксидаза хрена (HRP). После реакции проводят промывание, а затем можно проводить подтверждение того, связывается ли тестируемое антитело с Fn14 человека, посредством идентификации связывания вторичного антитела путем измерения активности с использованием реагента, выявляющего активность (например, в случае мечения посредством HRP, субстрат пероксидазы TMB Microwell (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., 50-76-03)). В качестве конкретного способа измерения можно использовать способ, описанный в примере 6 ниже.
[0035]
Антитело против Fn14 человека по настоящему изобретению включает, в дополнение к связыванию с Fn14 человека, антитело, связывающееся с Fn14, происходящим из других животных (например, Fn14 мыши), при условии, что антитело связывается с Fn14 человека.
[0036]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть без труда получены специалистом в данной области с использованием известного в данной области способа на основе информации о последовательности тяжелой цепи и легкой цепи антитела по настоящему изобретению, которая раскрыта в настоящем описании. Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению конкретно не ограничены и могут быть получены способом, описанным в разделе <Способ получения антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и антитело против Fn14 человека, полученное этим способом>, описанном ниже.
[0037]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению далее очищают при необходимости, составляют в соответствии с общепринятым способом, и оно может быть использовано для предупреждения или лечения воспалительных заболеваний, таких как избыточный ангиогенез или изнуряющие заболевания, такие как снижение массы тела, мышечное истощение и кахексия.
[0038]
<Полинуклеотид по настоящему изобретению>
Полинуклеотид по настоящему изобретению включает полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.
[0039]
В одном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2.
[0040]
Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, показанную аминокислотной последовательностью из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований из положений оснований 1-375 SEQ ID NO: 1.
[0041]
В одном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, содержит последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2.
[0042]
Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, соответствующую SEQ ID NO: 1.
[0043]
В одном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, содержит последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4.
[0044]
Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований из положений оснований 1-342 SEQ ID NO: 3.
[0045]
В одном варианте осуществления полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, содержит последовательность оснований, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
[0046]
Примеры полинуклеотида, содержащего последовательность оснований, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, соответствующую SEQ ID NO: 3.
[0047]
Полинуклеотид по настоящему изобретению может быть без труда получен специалистом в данной области с использованием известного в данной области способа на основе последовательности оснований. Например, полинуклеотид по настоящему изобретению можно синтезировать с использованием известного в данной области способа синтеза генов. В качестве способа синтеза генов могут использоваться различные способы, такие как способ синтеза генов антител, описанный в WO90/07861, известный специалисту в данной области.
[0048]
<Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению>
Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению включает экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и/или полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.
[0049]
В одном варианте осуществления примеры экспрессирующего вектора по настоящему изобретению включают экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела.
[0050]
Escherichia coli
Экспрессирующие векторы, используемые для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению, конкретно не ограничены при условии, что полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и/или полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, может быть экспрессирован в различных эукариотических клетках-хозяевах (например, клетки животных, клетки насекомых, клетки растений и клетки дрожжей) и/или прокариотических клетках-хозяевах (например, ), и можно получать полипептиды, кодируемые ими. Примеры экспрессирующего вектора включают плазмидные векторы и вирусные векторы (например, аденовирус или ретровирус). Например, можно использовать pEE6.4 или pEE12.4. Ген антитела также может быть экспрессирован путем внесения сегмента гена вариабельной области в экспрессирующий вектор, уже имеющий ген константной области Ig человека, такой как AG-γ1 и AG-κ (например, см. WO94/20632).
[0051]
Escherichia
Экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать промотор, который функционально связан с полинуклеотидом по настоящему изобретению. Примеры промотора для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению в клетке животных включают происходящий из вируса промотор, такой как CMV, RSV или SV40, промотор актина, промотор 1α EF (фактор элонгации) и промотор белка теплового шока. Примеры промотора для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению бактериями (например, ) включают промотор trp, промотор lac, промотор λPL и промотор tac. Кроме того, примеры промотора для экспрессии полинуклеотида по настоящему изобретению дрожжами включают промотор GAL1, промотор GAL10, промотор PH05, промотор PGK, промотор GAP и промотор ADH.
[0052]
Escherichia coli
В случае использования клетки животных, клетки насекомых или клетки дрожжей в качестве клетки-хозяина, экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать кодон инициации и кодон терминации. В этом случае экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать энхансерную последовательность, нетранслируемую область с 5’-стороны и с 3’-стороны генов, кодирующих антитело по настоящему изобретению или его вариабельную область тяжелой цепи или вариабельную область легкой цепи, сигнальную последовательность секреции, точку сплайсинга, участок полиаденилирования или реплицирующийся элемент. В случае когда в качестве клетки-хозяина используют , экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать кодон инициации, кодон терминации, область терминатора и реплицирующийся элемент. В этом случае экспрессирующий вектор по настоящему изобретению может содержать селективный маркер (например, гены устойчивости к тетрациклину, гены устойчивости к ампициллину, гены устойчивости к канамицину, гены устойчивости к неомицину или гены дигидрофолатредуктазы), которые обычно используют в зависимости от назначения.
[0053]
<Трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению>
Примеры трансформированной клетки по настоящему изобретению включают клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела, и клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела.
[0054]
В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению включает клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, которая выбрана из группы, состоящей из следующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента;
(b) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента;
(c) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.
[0055]
В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин по настоящему изобретению включает клетку-хозяина, трансформированную экспрессирующим вектором по настоящему изобретению, которая выбрана из группы, состоящей из следующих (e)-(h):
(e) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;
(f) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;
(g) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению; и
(h) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению.
[0056]
Escherichia
Saccharomyces
Pichia
Трансформированная клетка-хозяин конкретно не ограничена при условии, что клетка-хозяин является пригодной для используемого экспрессирующего вектора, которым трансформируют клетку, и может экспрессировать антитело. Примеры трансформированной клетки-хозяина включают различные клетки, такие как натуральные клетки или искусственно полученные клетки, которые обычно используются в области настоящего изобретения (например, клетки животных (например, клетки CHO-K1SV), клетки насекомых (например, Sf9), бактерии (например, ), дрожжи (например,  или ) и т.п.). Например, можно использовать культивируемые клетки, такие как клетки CHO (клетки CHO-K1SV и клетки CHO-DG44), клетки 293 и клетки NS0.
[0057]
Способ трансформации клетки-хозяина конкретно не ограничен и, например, можно использовать способ с фосфатом кальция или способ электропорации.
[0058]
<Способ получения антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и антитело против Fn14 человека, полученное этим способом>
Способ получения антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению включает способ получения антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из следующих (A)-(C), для экспрессии антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента:
(A) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента;
(B) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; и
(C) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
[0059]
В одном варианте осуществления способ получения антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению включает способ получения антитела против Fn14 человека, включающий стадию культивирования клетки-хозяина, выбранной из группы, состоящей из следующих (D)-(F), для экспрессии антитела против Fn14 человека:
(D) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела;
(E) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела; и
(F) клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую тяжелую цепь антитела против Fn14 человека по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, содержащий последовательность оснований, кодирующую легкую цепь антитела.
[0060]
Способ получения антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению конкретно не ограничен при условии, что способ включает стадию культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента. В одном варианте осуществления примеры клетки-хозяина, используемой в способе, включают клетки-хозяева согласно (A)-(D), описанным выше.
[0061]
Escherichia coli
Escherichia coli
Трансформированную клетку-хозяина можно культивировать известным способом. Условия культивирования, например, температура, pH культуральной среды и время культивирования выбирают соответствующим образом. В случае когда клетка-хозяин представляет собой клетку животного, примеры культуральной среды включают культуральную среду MEM, дополненную приблизительно 5%-20% эмбриональной телячьей сывороткой (Eagle H, Science. 1959, Vol. 130, No. 3373, p. 432-437), культуральную среду DMEM (Dulbecco R and Freeman G, Virology. 1959, Vol. 8, p. 396-397), культуральную среду RPMI1640 (Moore GE et al., J Am Med Assoc. 1967, Vol. 199, p. 519) и культуральную среду 199 (Morgan JF et al., Proc Soc Exp Biol Med. 1950, Vol. 73, p. 1-8). Предпочтительно pH культуральной среды составляет приблизительно 6-8, и культивирование обычно проводят при приблизительно от 30°C до 40°C в течение приблизительно 15-336 часов при оптимальной вентиляции и перемешивании. В случае когда клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого, в качестве культуральной среды можно использовать культуральную среду Грейса (Smith GE et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1985, Vol. 82, p. 8404), дополненную эмбриональной телячьей сывороткой. Предпочтительно pH культуральной среды составляет приблизительно 5-8, и культивирование обычно проводят при приблизительно 20°C - 40°C в течение приблизительно от 15 часов до 100 часов при необязательной вентиляции и перемешивании. В случае когда клетка-хозяин представляет собой  или дрожжи, в качестве культуральной среды является пригодной, например, жидкая культуральная среда, дополненная источником питательных веществ. Питательная культуральная среда предпочтительно включает источник углерода, неорганический источник азота или органический источник азота, необходимый для роста трансформированной клетки-хозяина. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал и сахарозу, и примеры неорганического источника азота включают соли аммония, нитраты, аминокислоты, жидкий кукурузный экстракт, пептон, казеин, мясной экстракт, соевую муку и картофельный экстракт. При желании могут быть включены другие питательные вещества (например, неорганические соли (например, хлорид кальция, дигидрофосфат натрия и хлорид магния), витамины), и антибиотики (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин и канамицин). Предпочтительно pH культуральной среды составляет приблизительно 5-8. В случае когда клетка-хозяин представляет собой , например, в качестве культуральной среды предпочтительно можно использовать культуральную среду LB или культуральную среду M9 (Mol. Clo., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001, Vol. 3, A2.2). Культивирование обычно проводят при приблизительно от 14°C до 39°C в течение приблизительно от 3 до 24 часов при необязательной вентиляции и перемешивании. В случае когда клетка-хозяин представляет собой клетку дрожжей, в качестве культуральной среды можно использовать, например, минимальную среду Burkholder (Bostian KA et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1980, Vol. 77, p. 4504-4508). Культивирование обычно проводят при приблизительно от 20°C до 35°C в течение приблизительно от 14 до 144 часов при необязательной вентиляции или перемешивании. Посредством проведения культивирования описанным выше образом является возможной экспрессия антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.
[0062]
Способ получения антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, кроме того, может включать, в дополнение к стадии культивирования трансформированной клетки-хозяина по настоящему изобретению для экспрессии антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента, стадию извлечения, например, выделения или очистки антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента из трансформированной клетки-хозяина и/или культурального супернатанта. Примеры способа выделения или очистки включают способы с использованием растворимости, такие как высаливание и способ преципитации в растворителе, способы с использованием различий в молекулярной массе, такие как диализ, ультрафильтрация и гель-фильтрация, способы с использованием электрического заряда, такие как ионообменная хроматография и хроматография с гидроксилапатитом, способы с использованием специфической аффинности, такие как аффинная хроматография, способы с использованием различий гидрофобности, такие как обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография, и способы с использованием различий изоэлектрической точки, такие как электрофорез с изоэлектрическим фокусированием. Например, антитело, накопленное в культуральном супернатанте, можно очищать различными способами хроматографии, например, колоночной хроматографией с использованием колонки с белком A или колонки с белком G.
[0063]
Антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению также включает антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные способом получения антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.
[0064]
<Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению>
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый эксципиент. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно получать способом, обычно используемым с эксципиентами, т.е. эксципиентами для медицины или носителями для медицины, обычно используемыми в данной области. Примеры дозированных форм фармацевтических композиций включают парентеральное лекарственное средство, такое как инъекционное лекарственное средство и лекарственное средство для капельного вливания, и их можно вводить посредством внутривенного введения, подкожного введения, внутримышечного введения и т.п. При получении лекарственного средства эксципиенты, носители и добавки в соответствии с дозированными формами можно использовать в фармацевтически приемлемом диапазоне.
[0065]
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать множество типов антител против Fn14 человека или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению. Например, настоящее изобретение также включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые не являются модифицированными после трансляции, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, образованные посредством посттрансляционной модификации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
[0066]
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, также включает указанную ниже фармацевтическую композицию.
Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4, и антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, образованные посредством посттрансляционной модификации антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
[0067]
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также включает фармацевтическую композицию, содержащую антитело, в котором лизин на C-конце тяжелой цепи удален, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, модифицированные после трансляции на N-конце, антитело, в котором лизин на C-конце тяжелой цепи удален и которое модифицировано после трансляции на N-конце, и/или антитело, которое имеет лизин на C-конце тяжелой цепи и не модифицировано после трансляции на N-конце.
[0068]
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Fn14 человека, также включает фармацевтическую композицию, содержащую два или более типов антител против Fn14 человека, среди следующих (5)-(8):
(5) антитело против Fn14 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-454 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
(6) антитело против Fn14 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, в которой глутамин в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 модифицирован на пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
(7) антитело против Fn14 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-454 SEQ ID NO: 2, в которой глутамин в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 модифицирован на пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
(8) антитело против Fn14 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4.
[0069]
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция по настоящему изобретению, содержащая антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, также включает представленную ниже фармацевтическую композицию. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело против Fn14 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4, антитело против Fn14 человека, содержащее тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-454 SEQ ID NO: 2, в которой глутамин в положении аминокислоты 1 SEQ ID NO: 2 модифицирован на пироглутаминовую кислоту, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 4, и фармацевтически приемлемый эксципиент.
[0070]
Количество антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, подлежащее добавлению в состав, варьируется в зависимости от степени симптомов пациента, возраста пациента, используемой дозированной формы лекарственного средства, титра связывания антитела и т.п., и, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент можно использовать в количестве приблизительно от 0,001 мг/кг до 100 мг/кг в ходе введения.
[0071]
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно использовать в качестве средства для предупреждения или лечения заболеваний, таких как кахексия онкологических больных, при которых активный Fn14 человека вовлечен в патогенез.
[0072]
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения кахексии онкологических больных, содержащей антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения или предупреждения кахексии онкологических больных, включающему стадию введения терапевтически эффективного количества антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к антителу против Fn14 человека или его антигенсвязывающему фрагменту по настоящему изобретению для применения для предупреждения или лечения кахексии онкологических больных. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции для предупреждения или лечения кахексии онкологических больных.
[0073]
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных, которая содержит антитело против Fn14 человека или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению и используется в комбинации со средством против злокачественной опухоли. Настоящее изобретение относится к способу предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных, который включает стадию введения эффективных количеств антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению и средства против злокачественной опухоли. Настоящее изобретение относится к антителу против Fn14 человека или его антигенсвязывающему фрагменту по настоящему изобретению, которые используют в комбинации со средством против злокачественной опухоли, для применения для предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных. Настоящее изобретение относится к применению антитела против Fn14 человека или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению для производства фармацевтической композиции для предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных, и к применению фармацевтической композиции в комбинации со средством против злокачественной опухоли.
[0074]
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных, которая содержит средство против злокачественной опухоли и используется в комбинации с антителом против Fn14 человека или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к средству против злокачественной опухоли которое используется в комбинации с антителом против Fn14 человека или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению для применения для предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных. Настоящее изобретение относится к применению средства против злокачественной опухоли для производства фармацевтической композиции для предупреждения или лечения злокачественной опухоли или кахексии онкологических больных, и к применению фармацевтической композиции в комбинации с антителом против Fn14 человека или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению.
[0075]
В одном варианте осуществления средство против злокачественной опухоли, используемое в рамках настоящего изобретения, представляет собой гемцитабин.
[0076]
Для лучшего понимания настоящего изобретения предоставлены конкретные примеры, на которые приводится отсылка, однако они являются только примерами и настоящее изобретение не ограничивается ими.
Примеры
[0077]
Что касается частей, в которых используются коммерчески доступные наборы или реагенты, эксперименты проводили в соответствии с прилагаемым протоколом, если нет иных указаний.
[0078]
(Пример 1: Получение слитых белков Fn14-Fc человека и мыши)
Авторы изобретения получили слитый белок Fn14 человека-Fc человека и слитый белок Fn14 мыши-Fc мыши для применения в качестве антигена для получения антитела против Fn14 и материала для применения в скрининговом тесте. Слитый белок Fn14 человека-Fc человека представляет собой слитый белок, в котором C-конец внеклеточной частичной последовательности Fn14 человека (с 1-й по 79-ю аминокислоты последовательности под номером доступа NCBI: NP_057223.1) и N-конец Fc-области человека (с 106-й по 330-ю аминокислоты последовательности под номером доступа NCBI: P01857.1) связаны пептидным линкером (SEQ ID NO: 9). Слитый белок Fn14 мыши-Fc мыши представляет собой слитый белок, в котором C-конец внеклеточной частичной последовательности Fn14 мыши (с 1-й по 75-ю аминокислоты последовательности NCBI под номером доступа: AAF07882.1) и N-конец Fc-области мыши связаны, и, в частности, слитый белок, в котором гены, кодирующие внеклеточную частичную последовательность Fn14 мыши, включены в участок множественного клонирования между промоторной областью hEF1-HTLV и областью mIgG2B-Fc pFUSE-mIgG2B-Fc1 (InvivoGen, pfuse-mg2bfc1) с использованием ферментов рестрикции EcoRI и EcoRV, и экспрессируются. Получали экспрессирующие векторы, в которых гены, кодирующие описанные выше слитые белки, были включены в вектор GS pEE12.4 (Lonza), и их вводили в клетки CHO-K1SV (Lonza), соответственно. Каждый из слитого белка Fn14 человека-Fc человека и слитого белка Fn14 мыши-Fc мыши очищали из культурального супернатанта клеток CHO-K1SV в соответствии с общепринятым способом.
[0079]
(Пример 2: Получение антитела против Fn14 человека)
Антитело получали с использованием технологии разработки моноклональных антител человека с мышами "VelocImmune" (технология антител VelocImmune: Regeneron Pharmaceuticals, Inc. (патент США № 6596541)). Антитело, полученное посредством технологии VelocImmune, представляет собой антитело (также называемое химерным антителом), имеющее вариабельную область антитела человека и константную область антитела мыши. Мышей VelocImmune иммунизировали адъювантом для обеспечения иммунной реакции вместе с белком Fn14 человека, в котором область Fc человека вырезана и удалена из слитого белка Fn14 человека-Fc человека, полученного согласно примеру 1, с использованием FabRICATOR (Sigma, 77661). Лимфоциты, полученные из лимфатического узла иммунизированной мыши, подвергали слиянию с происходящими из мыши миеломными клетками SP2/0-Ag14 (ATCC: CRL-1581) в соответствии с общепринятым способом с получением гибридом, и гибридомы подвергали моноклонированию. Проводили селекцию гибридом, продуцирующих антитело, которые связываются с Fn14 человека и подавляют активацию NFkB, индуцируемую посредством стимуляции Tweak (далее называемую "Tweak-индуцированной активацией NFkB" в примерах ниже) и антитело очищали.
[0080]
(Пример 3: Анализ активации NFkB)
Для оценки действия антитела согласно примеру 2 в качестве агониста на Fn14 человека проводили оценку действия антитела на активацию NFkB в отсутствии Tweak посредством репортерного анализа. В частности, получали клетки HEK293 (ATCC, CRL-1573), которые были стабильно трансдуцированы люциферазным репотрерным вектором pGL4.32 (Promega K.K., E8491), имеющим транскрипционный отвечающий на NFkB элемент, включенный в него (далее называемые клетками NFkB/HEK293), и использовали для оценки.
[0081]
5
2
2
2
Клетки NFkB/HEK293 суспендировали в DMEM, содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку (Sigma, D6429) в количестве 1,25×10 клеток/мл, и высевали в количестве 80 мкл/лунка в белый 96-луночный планшет с прозрачным дном (Corning Incorporated, 3610). После культивирования в течение 2 часов в CO-инкубаторе, установленном на 37°C с атмосферой с 5% CO, получали серию разведений из 12 шагов для очищенного антитела, полученного согласно примеру 2, в описанной выше культуральной среде с приблизительно 3-кратным знаменателем прогрессии от конечной концентрации 1 нг/мл до 300 мкг /мл, а затем добавляли в количестве 20 мкл/лунка. После культивирования в течение ночи при 37°C в 5% CO, проводили измерение экспрессии люциферазы с использованием реагента для измерения люциферазы ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega Corporation) для количественного определения активации NFkB.
[0082]
В результате было отобрано антитело против Fn14 человека, которое не индуцировало активацию NFkB, т.е. не демонстрировало активность агониста, и было названо 4-1.
[0083]
(Пример 4: Получение полностью гуманизированного антитела и муринизированного антитела)
Гены, кодирующие тяжелую цепь и легкую цепь антитела, клонировали из гибридом, продуцирующих антитело, отобранное в примере 3, и определяли последовательность. После определения последовательности антитела гены, кодирующие сигнальные последовательности (Wittle N et al., Protein Engineering. 1987, Vol. 1, No. 6, p. 499-505) и гены константной области Igγ1 человека (состоящие из последовательности оснований в положениях оснований 376-1365 SEQ ID NO: 1), имеющие аминокислотные мутации L234A и L235A, соответственно, лигировали с 5’-стороны и 3’-стороны генов вариабельной области тяжелой цепи, и гены тяжелой цепи встраивали в вектор GS pEE6.4 (Lonza). Кроме того, гены, кодирующие сигнальные последовательности (Wittle N et al., Protein Engineering. 1987, Vol. 1, No. 6, p. 499-505), и гены константной области (состоящие из последовательности оснований в положениях оснований с 343 по 660 SEQ ID NO: 3) κ-цепи человека, соответственно лигировали с 5’-стороной и 3’-стороной генов вариабельной области легкой цепи, и гены легкой цепи встраивали в вектор GS pEE12.4. Эти векторы GS подвергали фрагментации ферментом рестрикции NotI-HF и PvuI-HF, и лигировали с использованием набора для лигирования ДНК <Mighty Mix> (Takara Bio Inc., 6023) с получением вектора GS, в который были встроены как гены тяжелой цепи, так и гены легкой цепи. Антитело очищали общепринятым способом из культурального супернатанта клеток CHO-K1SV, полученных посредством трансфекции вектора, и, таким образом, получали полностью гуманизированное антитело 4-1, и оно было названо 4-1h.
[0084]
Последовательность оснований полученной тяжелой цепи 4-1h соответствует SEQ ID NO: 1, аминокислотная последовательность, кодируемая ей, соответствует SEQ ID NO: 2, последовательность оснований легкой цепи соответствует SEQ ID NO: 3, и аминокислотная последовательность, кодируемая ей, соответствует SEQ ID NO: 4. Вариабельная область тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO: 2, состоит из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 2, и вариабельная область легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO: 4, состоит из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 4. CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи 4-1h состоят из аминокислотных последовательностей положений аминокислот 31-35, 50-65 и 98-114 SEQ ID NO: 2, соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи 4-1h состоит из аминокислотных последовательностей в положениях аминокислот 24-40, 56-62 и 95-103 SEQ ID NO: 4, соответственно.
[0085]
in vivo
Муринизированное антитело 4-1h (далее обозначаемое как 4-1m) получали для уменьшения иммуногенного риска при оценке антитела против Fn14 человека посредством теста  на мышах. Последовательность оснований, кодирующую вариабельную область 4-1m, получали путем частичной замены каркасной области (FR) легкой цепи и тяжелой цепи 4-1h на FR других антител мыши.
[0086]
4-1m получали с использованием того же способа, что и способ получения вектора, экспрессии антитела и очистки для 4-1h, описанный выше. Для константной области тяжелой цепи использовали гены, кодирующие константную область Igγ2a мыши (состоящие из последовательности оснований в положениях оснований 376-1365 SEQ ID NO: 5), имеющую мутацию аминокислоты D265A, и для константной области легкой цепи использовали гены константной области (состоящие из последовательности оснований в положениях оснований 343-660 SEQ ID NO: 7) κ-цепи мыши.
[0087]
Последовательность оснований полученной тяжелой цепи 4-1m соответствует SEQ ID NO: 5, аминокислотная последовательность, кодируемая ей, соответствует SEQ ID NO: 6, последовательность легкой цепи соответствует SEQ ID NO: 7, и аминокислотная последовательность, кодируемая ей, соответствует SEQ ID NO: 8. Вариабельная область тяжелой цепи, соответствующей SEQ ID NO: 6, состоит из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-125 SEQ ID NO: 6, и вариабельная область легкой цепи, соответствующей SEQ ID NO: 8, состоит из аминокислотной последовательности из положений аминокислот 1-114 SEQ ID NO: 8. CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи 4-1m состоит из аминокислотных последовательностей в положениях аминокислот 31-35, 50-65 и 98-114 SEQ ID NO: 6, соответственно. CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи 4-1m состоит из аминокислотных последовательностей в положениях аминокислот 24-40, 56-62 и 95-103 SEQ ID NO: 8, соответственно.
[0088]
(Пример 5: Анализ модификации аминокислот полностью гуманизированного антитела)
Очищенное 4-1h подвергали анализу модификации аминокислот и в результате большинство очищенных антител имели пироглутамилирование на N-конце тяжелой цепи и делецию лизина на C-конце.
[0089]
(Пример 6: ELISA связывания Fn14 человека и мыши для полностью гуманизированного антитела и муринизированного антитела)
50
Проводили оценку активности связывания 4-1h и 4-1m, полученных согласно примеру 4, с белком Fn14. Слитый белок Fn14 человека-Fc человека и слитый белок Fn14 мыши-Fc мыши, полученные согласно примеру 1, разбавляли фосфатно-солевым буфером (PBS) в дозе 1 мкг/мл и добавляли в 384-луночный прозрачный планшет MaxiSorp (Nunc, 464718) в количестве 15 мкл/лунка. Инкубацию проводили в течение ночи при 4°C для иммобилизации. На следующий день жидкость твердой фазы удаляли и проводили промывание содержащим 0,05% Tween-20 Tris-забуференным солевым раствором (TBS-T). К ней добавляли PBS, содержавший 20% Blocking One (Nacalai tesque, Inc., 03953-95), в количестве 50 мкл/лунка. Полученный материал оставляли стоять при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем промывали TBS-T. Получали серию разведений 4-1h или 4-1m, полученного согласно примеру 4, посредством разведения из 12 шагов с 4-кратным знаменателем прогрессии от максимальной концентрации 30 мкг/мл с использованием TBS-T, содержавшего 5% Blocking One (далее называемый разбавителем), и добавляли в количестве 20 мкл/лунка. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре проводили промывание TBS-T. Добавляли меченное пероксидазой хрена антитело против легкой цепи каппа человека (SouthernBiotech, 2060-05) в качестве вторичного антитела, разбавленное в 5000 раз разбавителем, в количестве 20 мкл/лунка для детекции 4-1h, и меченное пероксидазой хрена антитело против легкой цепи каппа мыши (SouthernBiotech, 1050-05) в качестве вторичного антитела, разбавленное в 4000 раз разбавителем в количестве 20 мкл/лунка для детекции 4-1m. После инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре проводили промывание TBS-T. Добавляли субстрат пероксидазы TMB Microwell (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., 50-76-03) и полученную смесь оставляли стоять в течение 3 минут для оценки 4-1h или в течение 5 минут для оценки 4-1m. Затем реакцию останавливали добавлением 2 M серной кислоты и проводили измерение поглощения при 450 нм с использованием SpectraMax Paradigm (Molecular Devices, LLC). Тест проводили в двух повторениях и величины EC вычисляли посредством 4-параметрической логистической аппроксимации кривой.
[0090]
В результате было подтверждено, что 4-1h и 4-1m, полученные согласно примеру 4, обладают активностью связывания с Fn14 человека и Fn14 мыши (таблица 1).
Таблица 1: Активность связывания 4-1h и 4-1m с Fn14 человека и Fn14 мыши
[Таблица 1]
Название антитела
EC<sub>50 </sub>(нг/мл)
Человек
Мышь
4-1h
30,4
23,2
4-1m
18,2
16,5
[0091]
(Пример 7: Анализ ингибирования индуцируемой Tweak активации NFkB для полностью гуманизированного антитела)
Для оценки активности 4-1h, полученного согласно примеру 4, в качестве антагониста Fn14, проводили оценку индуцируемого Tweak ингибиторного действия на активацию NFkB посредством репортерного анализа.
[0092]
5
2
2
2
50
50
Клетки NFkB/HEK293, полученные согласно примеру 3, суспендировали в DMEM, содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку, в количестве 1,25×10 клеток/мл, и высевали в количестве 80 мкл/лунка в белый 96-луночный планшет с прозрачным дном. После культивирования в течение ночи при 37°C с 5% CO получали серию разведений из 11 шагов для 4-1h, полученного согласно примеру 4, в указанной выше культуральной среде с приблизительно 3-кратным знаменателем прогрессии от конечной концентрации 0,1 нг/мл до 10 мкг/мл, а затем добавляли в количестве 10 мкл/лунка. После культивирования в течение 30 минут при 37°C с 5% CO добавляли 10 мкл Tweak (PeproTech, Inc., 310-06) до конечной концентрации 100 нг/мл. После культивирования в течение 5 часов при 37°C с 5% CO проводили количественное определение активации NFkB в соответствии со способом примера 3. В качестве контрольной группы была выбрана группа, в которой добавляли только свободную от антител культуральную среду, группу с добавлением Tweak определяли как ингибирование 0%, и группу без добавления Tweak определяли как 100% ингибирование для вычисления концентрации 50% ингибирования (величина IC) антитела посредством 4-параметриеской логистической аппроксимации кривой. Антитела тестировали в двух экземплярах и величины IC в трех испытаниях геометрически усредняли для вычисления 95% доверительного интервала (таблица 2). В этом тесте в качестве антитела для сравнения использовали антитело мыши против Fn14 человека CRCBT-06-002 (патентный документ 2).
[0093]
В результате было обнаружено, что 4-1h обладает более высокой активностью агониста, чем CRCBT-06-002.
Таблица 2: Активность ингибирования 4-1h относительно индуцируемой Tweak активации NFkB
[Таблица 2]
Название антитела
IC<sub>50</sub> (нг/мл)(95% доверительный интервал)
4-1h
41,5(27,2-63,4)
CRCBT-06-002
115(72,7-183)
[0094]
(Пример 8: Анализ продуцирования IL-8 для полностью гуманизированного антитела)
in vitro
4
2
2
Функциональную активность 4-1h, полученного согласно примеру 4, оценивали посредством анализа продуцирования IL-8 . Клетки A375 (ATCC, CRL-1619) суспендировали в DMEM, содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку, в количестве 5×10 клеток/мл, и высевали в количестве 100 мкл/лунка в 96-луночный планшет с плоским дном (IWAKI CO., LTD., 3860-096). После культивирования в течение ночи при 37°C с 5% CO проводили промывание PBS. Получали серию 10-кратных разведений 4-1h, полученного согласно примеру 4, в конечной концентрации от 1 нг/мл до 100 мкг/мл в описанной выше культуральной среде и добавляли к клеткам. После культивирования в течение ночи при 37°C с 5% CO в присутствии Tweak в конечной концентрации 5 нг/мл (оценка активности антагониста) или в отсутствии Tweak (оценка активности агониста), культуральный супернатант собирали и проводили измерение концентрации IL-8 в культуральном супернатанте с использованием набора ELISA Quantikine для IL-8/CXCL8 человека (R&D Systems, D8000C). Конечные объемы при оценке активности антагониста и оценке активности агониста в экспериментах составляли 65 мкл/лунка и 100 мкл/лунка, соответственно. В этом тесте антитела тестировали в двух повторениях с использованием CRCBT-06-002 в качестве антитела для сравнения.
[0095]
При оценке активности антагониста группа, в которой добавляли только свободную от антитела культуральную среду, была выбрана в качестве контрольной группы, группа с добавлением Tweak была определена как ингибирование 0% и группа без добавления Tweak была определена как 100% ингибирование для вычисления уровня ингибирования. Арифметическое среднее значение максимальных уровней ингибирования ± стандартная ошибка в каждом из четырех экспериментов представлены в таблице 3 (таблица 3). График активности антагониста представлен на фиг.1, и график активности агониста представлен на фиг.2.
[0096]
Как показано в таблице 3 и на фиг.1, было обнаружено, что 4-1h демонстрирует практически полную ингибиторную активность в отношении продуцирования IL-8, индуцируемого стимуляцией Tweak, в то время как CRCBT-06-002 демонстрирует только частичную ингибиторную активность. Кроме того, как показано на фиг.2, CRCBT-06-002 индуцировало продуцирование IL-8 само по себе в отсутствии Tweak, в то время как 4-1h по настоящему изобретению практически не индуцировало продуцирование IL-8.
[0097]
Из вышеуказанного было обнаружено, что CRCBT-06-002 является антителом-частичным антагонистом, обладающим действием агониста, в то время как 4-1h представляет собой антитело-полный антагонист, обладающее малым действием агониста в отношении Fn14 человека.
Таблица 3: Ингибиторная активность 4-1h и CRCBT-06-002 в отношении продуцирования IL-8, индуцированного стимуляцией Tweak
[Таблица 3]
Название антитела
Максимальный уровень ингибирования (%)Среднее значение±стандартная ошибка
4-1h
96,4±0,4
GRCBT-06-002
53,0±6,8
[0098]
(Пример 9: Действие в модели кахексии онкологических больных на мышах)
Мыши, имеющие клетки клеточной линии рака толстого кишечника мыши C26 (COLON 26), являются одним из репрезентативных примеров моделей кахексии онкологических больных, которые демонстрируют снижение массы тела и уменьшение мышечной массы, которые являются характеристиками кахексии (Aulino P et al., BCM Cancer. 2010, Vol. 10 363, p. 1-15) (Bonetto A et al., J Vis Exp. 2016, Nov. 30 117, p. 1-21).
[0099]
6
Клетки C26 (National Cancer Institute), суспендированные в количестве 10 клеток/100 мкл с использованием свободной от фенолового красного базальной мембраны BD на основе матрикса из матригеля (BD, 356237) подкожно инъецировали в количестве 100 мкл самцам мышей CD2F1 (Charles River Laboratories Japan Inc.) с получением мыши, которая имела опухоль C26. После подтверждения того, что масса тела имеющих опухолей C26 мышей начинала снижаться, начинали введение антитела. В частности, 4-1m, разбавленное PBS, подкожно вводили мышам, имеющим опухоль C26, в дозе 3 мг/кг (дозировка: 10 мл/кг) на 25-е, 28-е, 30-е, 32-е и 35-е сутки после инъекции клеток. В контрольной группе вводили изотипическое контрольное антитело аналогичным образом. Антитело IgG2a мыши против гемоцианина лимфы улитки (KLH), который представляет собой антиген, который не существует в биологическом организме, приобретали и использовали в соответствии с общепринятым способом в качестве изотипического контрольного антитела. Введение начинали с 15 мышей в каждой группе. Две мыши в группе введения 4-1m и семь мышей в контрольной группе умерли к 37-м суткам, которые были днем окончания эксперимента.
[0100]
За сутки до окончания эксперимента (36-е сутки), проводили измерение силы сжатия с использованием небольшого устройства для измерения силы сжатия у животных (MELQUEST Co., Ltd., GPM-100B). Массу тела измеряли на 37-сутки и массу изолированной передней большеберцовой мышцы измеряли в качестве мышечной массы. Что касается показателей, определенных на 36-е сутки и 37-е сутки, было определено значимое различие между группой введения 4-1m и контрольной группой с использованием t-критерия Стьюдента. Во всех случаях значение p<0,05 считалось значимым и в случае, когда существовало значимое отличие, на графике присутствует символ (*) (символ ** на графике указывает на то, что существовало значимое отличие с p <0,01).
[0101]
Изменение массы тела, последовательно измеряемое вплоть до 37-х суток, представлено на фиг.3. Уменьшение массы тела прогрессировало даже после начала введения в контрольной группе. Однако снижение массы тела подавлялось в группе введения 4-1m и на 37-е сутки наблюдали значительное увеличение массы тела в группе введения 4-1m по сравнению с контрольной группой (P=0,0019). Кроме того, наблюдали увеличение мышечной массы в группе введения 4-1m (фиг.4, p=0,0009). Более того, сила сжатия также была значительно увеличена (фиг.5, p=0,0003) в группе введения 4-1m, и было показано не только увеличение мышечной массы, а также улучшение мышечной функции.
[0102]
Описанные выше результаты показали, что 4-1m является эффективным против кахексии и может быть эффективным даже при терапевтическом введении после наблюдения снижения массы тела.
[0103]
(Пример 10: Действие на период выживания в модели кахексии онкологических больных на мышах)
Имеющих опухоль C26 мышей получали аналогично тому, как в примере 9. Введение начинали 5 мышам в каждой группе в момент времени, когда масса тела имеющих опухоль C26 мышей начинала снижаться. В частности, 4-1m, разбавленное PBS, подкожно вводили в дозе 0,3 мг/кг (дозировка: 10 мл/кг) три раза в неделю с 22-х по 70-е сутки после инъекции клеток, а затем на 71-е, 76-е, 78-е, 83-и и 85-е сутки. В контрольной группе вводили то же изотипическое контрольное антитело, что и в примере 9, аналогично тому, как 4-1m. Гемцитабин (торговое название: GEMZAR, Eli Lilly and Company), разбавленный PBS, подкожно вводили в группе введения гемцитабина в дозе 10 мг/кг (дозировка: 10 мл/кг). Как 4-1m, так и гемцитабин вводили в группе комбинированного введения гемцитабин-4-1m в один и тот же день. Длинный диаметр и короткий диаметр последовательно измеряли с использованием толщиномера (ASONE, VC01-150), и объем опухоли вычисляли по следующей формуле.
Объем опухоли=длинный диаметр (мм) × короткий диаметр (мм) × короткий диаметр (мм)/2
Выживаемость мышей представлена в качестве кривых выживаемости Каплана-Мейера на фиг.6. В случае, когда сравнивались различия кривых выживаемости между группами, проводили тестирование с помощью логарифмического рангового критерия и значимым считали p<0,05. Срединные периоды выживания в контрольной группе, группе введения 4-1m и группе введения гемцитабина составляли 41 дня, 57 дней и 55 дней, соответственно. Срединный период выживания в группе комбинированного введения гемцитабин-4-1m составлял 83 дня, и значимое отличие наблюдали по сравнению с кривой выживания для группы введения 4-1m отдельно или гемцитабина отдельно.
Как в случае, когда антитело вводили отдельно, так и в случае, когда антитело вводили в комбинации с гемцитабином, отсутствовало влияние введения 4-1m на объем опухоли (фиг.7).
Описанные выше результаты показали, что 4-1m может продлевать период выживания без влияния на размер опухоли и может быть более эффективным в отношении повышения выживаемости с использованием в комбинации со средствами против злокачественной опухоли, такими как гемцитабин.
Промышленная применимость
[0104]
Антитело против Fn14 человека по настоящему изобретению является пригодным для предупреждения или лечения различных заболеваний, в патогенез которых вовлечен Fn14 человека. Кроме того, ожидается, что способ получения полинуклеотида, экспрессирующего вектора, трансформированной клетки-хозяина или антитела по настоящему изобретению будет пригодным для продуцирования антитела против Fn14 человека.
Свободный текст списка последовательностей
[0105]
В числовом заголовке <223> приведенного ниже списка последовательностей приводится описание "искусственной последовательности". В частности, последовательности оснований, соответствующие SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7 списка последовательностей, представляют собой, соответственно, последовательности оснований тяжелой цепи и легкой цепи антитела против Fn14 человека, и аминокислотные последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 2, 4, 6 и 8, представляют собой соответственно, аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, кодируемых SEQ ID NO: 1, 3, 5 и 7. Аминокислотная последовательность, соответствующая SEQ ID NO: 9, представляет собой последовательность пептидного линкера, связывающую белок Fn14 человека и белок Fc-области человека.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Астеллас Фарма Инк.
<120>  АНТИТЕЛО ПРОТИВ FN14 ЧЕЛОВЕКА
<130>  A19011A00
<150>  JP 2018-205995
<151>  2018-10-31
<160>  9
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  1365
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  H-цепь антитела 4-1h
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1365)
<400>  1
cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag         48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt ggt tac         96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20                  25                  30
tac tgg agc tgg atc cgc cag ccc cca ggg aag ggg ctg gag tgg att        144
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
ggg gaa atc aat cat cgt gga agc acc aac tcc aac ccg tcc ctc aag        192
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
agt cga gac acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg        240
Ser Arg Asp Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
agg ctg agg tct gtg acc gcc gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg        288
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
cgc gag ggt ata agt gga agt atg ggg atc tac gac tac agc gga atg        336
Arg Glu Gly Ile Ser Gly Ser Met Gly Ile Tyr Asp Tyr Ser Gly Met
100                 105                 110
gac gtc tgg ggc caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca gcc tcc acc        384
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct        432
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130                 135                 140
ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa        480
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac        528
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc        576
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc        624
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195                 200                 205
aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag        672
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210                 215                 220
ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct        720
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
gaa gcc gct ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag        768
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245                 250                 255
gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg        816
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260                 265                 270
gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac        864
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275                 280                 285
ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac        912
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290                 295                 300
aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac        960
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305                 310                 315                 320
tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc       1008
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325                 330                 335
cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga       1056
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340                 345                 350
gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag       1104
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355                 360                 365
aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac       1152
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370                 375                 380
atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag       1200
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc       1248
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405                 410                 415
aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca       1296
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420                 425                 430
tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc       1344
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435                 440                 445
ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa                                           1365
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210>  2
<211>  455
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Asp Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Arg Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Glu Gly Ile Ser Gly Ser Met Gly Ile Tyr Asp Tyr Ser Gly Met
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
130                 135                 140
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
195                 200                 205
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
210                 215                 220
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245                 250                 255
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260                 265                 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275                 280                 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
290                 295                 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
305                 310                 315                 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325                 330                 335
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
340                 345                 350
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355                 360                 365
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370                 375                 380
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405                 410                 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
420                 425                 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
435                 440                 445
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450                 455
<210>  3
<211>  660
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  L-цепь антитела 4-1h
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(660)
<400>  3
gac atc gtg atg acc cag tct cca gac tcc ctg gct gtg tct ctg ggc         48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
gag agg gcc acc atc aac tgc aag tcc agg cag agt att tta tat agt         96
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Arg Gln Ser Ile Leu Tyr Ser
20                  25                  30
tcc aac aat aag aac tac tta act tgg tac cag cag aaa cca gga cag        144
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
cct cct aag ttg ctc att tac tgg gca tct acc cgg gaa tcc ggg gtc        192
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
cct gac cga ttc agt ggc agc ggg tct ggg aca gat ttc act ctc acc        240
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
atc agc agc ctg cag gct gaa gat gtg gca gtt tat tac tgt cag caa        288
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
tat tat agt act cct tac act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc        336
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
aaa cgg act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat        384
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115                 120                 125
gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac        432
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130                 135                 140
ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc        480
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac        528
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac        576
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180                 185                 190
gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc        624
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195                 200                 205
tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt                        660
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215                 220
<210>  4
<211>  220
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Arg Gln Ser Ile Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215                 220
<210>  5
<211>  1368
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  H-цепь антитела 4-1m
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1368)
<400>  5
gat gtt cag ctg caa gag tct ggc cct ggc ctg gtc aag cct tct cag         48
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
tct ctg tct ctg acc tgc gct gtg tac ggc ggc tct ttc tct ggc tac         96
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20                  25                  30
tac tgg tcc tgg atc cgg cag ttc cct ggc aac aag ctg gaa tgg atg        144
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
ggc gag atc aac cac cgg ggc tcc acc aac tct aac ccc agc ctg aag        192
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
tcc cgg atc tcc atc acc gtg gac acc tcc aag aac cag ttc ttt ctg        240
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
65                  70                  75                  80
cag ctc aac tcc gtg aca acc gag gac acc gcc acc tac tac tgt gcc        288
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
aga gag ggc atc tct ggc tcc atg ggc atc tac gac tac tcc ggc atg        336
Arg Glu Gly Ile Ser Gly Ser Met Gly Ile Tyr Asp Tyr Ser Gly Met
100                 105                 110
gat gtg tgg ggc cag ggc aca ctg gtt acc gtg tct gcc gct aag acc        384
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr
115                 120                 125
acc gct cct tcc gtg tat cct ctg gca cct gtg tgt ggc gac acc acc        432
Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr
130                 135                 140
gga agt tct gtg acc ctg gga tgt ctg gtc aag ggc tac ttc ccc gag        480
Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
cct gtg aca ctg acc tgg aac tct ggc tct ctg tcc tct ggc gtg cac        528
Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His
165                 170                 175
acc ttt cca gcc gtg ctg cag tct gac ctg tac acc ctg tct agc tcc        576
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser
180                 185                 190
gtg acc gtg acc tcc tct acc tgg cct agc cag tcc atc acc tgt aac        624
Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn
195                 200                 205
gtg gcc cat cct gcc tcc agc acc aag gtg gac aag aag atc gag cct        672
Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro
210                 215                 220
cgg ggc cct acc atc aag cct tgt cct cca tgc aag tgc ccc gct cct        720
Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
aat ctg ctc gga ggc ccc tcc gtg ttc atc ttc cca cct aag atc aag        768
Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys
245                 250                 255
gac gtg ctg atg atc tcc ctg tct cct atc gtg acc tgc gtg gtg gtg        816
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val
260                 265                 270
gcc gtg tcc gag gat gat cct gac gtg cag atc agt tgg ttc gtg aac        864
Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
275                 280                 285
aac gtg gaa gtg cac acc gct cag acc cag aca cac aga gag gac tac        912
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
290                 295                 300
aac agc acc ctg aga gtg gtg tct gcc ctg cct atc cag cat cag gat        960
Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
305                 310                 315                 320
tgg atg tcc ggc aaa gag ttc aag tgc aaa gtg aac aac aag gac ctg       1008
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
325                 330                 335
cct gct cca atc gag cgg acc atc tct aag cct aag ggc tct gtc agg       1056
Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg
340                 345                 350
gcc cct cag gtg tac gtt ttg cct cca cct gag gaa gag atg acc aag       1104
Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys
355                 360                 365
aaa caa gtg acc ctg aca tgc atg gtc acc gac ttc atg ccc gag gac       1152
Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp
370                 375                 380
atc tac gtg gaa tgg acc aac aac ggc aag acc gag ctg aac tac aag       1200
Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
aac acc gag cca gtg ctg gac tcc gac ggc tcc tac ttc atg tac tcc       1248
Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser
405                 410                 415
aag ctg cgc gtc gag aag aag aac tgg gtc gag aga aac tcc tac tcc       1296
Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser
420                 425                 430
tgc tcc gtg gtg cac gag ggc ctg cac aat cac cac acc acc aag tcc       1344
Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser
435                 440                 445
ttc tct cgg acc cct ggc aag tga                                       1368
Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
450                 455
<210>  6
<211>  455
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  6
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Ile Ser Ile Thr Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu
65                  70                  75                  80
Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Glu Gly Ile Ser Gly Ser Met Gly Ile Tyr Asp Tyr Ser Gly Met
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr
115                 120                 125
Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr
130                 135                 140
Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser
180                 185                 190
Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn
195                 200                 205
Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro
210                 215                 220
Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys
245                 250                 255
Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val
260                 265                 270
Ala Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn
275                 280                 285
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr
290                 295                 300
Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
305                 310                 315                 320
Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu
325                 330                 335
Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg
340                 345                 350
Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys
355                 360                 365
Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp
370                 375                 380
Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser
405                 410                 415
Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser
420                 425                 430
Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser
435                 440                 445
Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
450                 455
<210>  7
<211>  663
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  L-цепь антитела 4-1m
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(663)
<400>  7
gac atc gtg atg tct cag agc cct tcc tct ctg gcc gtg tcc gtg gga         48
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1               5                   10                  15
gag aaa gtg acc atg tcc tgc aag tcc cgg cag tcc atc ctg tac tcc         96
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Arg Gln Ser Ile Leu Tyr Ser
20                  25                  30
tcc aac aac aag aac tac ctg acc tgg tat cag cag aag ccc ggc cag        144
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
tct cct aag ctg ctg atc tac tgg gcc tcc acc aga gaa tct ggc gtg        192
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
ccc gat aga ttc acc ggc tct ggc tct ggc acc gac ttt acc ctg acc        240
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
atc tcc tcc gtg aag gcc gag gat ctg gct gtg tac tac tgc cag cag        288
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
tac tac agc acc cct tac acc ttt ggc tcc ggc acc aag ctg gaa atc        336
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
aag aga gct gac gcc gct cct acc gtg tct atc ttc cca cct agc tcc        384
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
115                 120                 125
gag cag ctg acc tct ggc gga gct tct gtc gtg tgc ttc ctg aac aac        432
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
130                 135                 140
ttc tac ccc aag gac atc aac gtg aag tgg aag atc gac ggc tcc gag        480
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
145                 150                 155                 160
aga cag aac ggc gtg ctg aac tct tgg acc gac cag gac tcc aag gac        528
Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
agc acc tac tcc atg tcc tcc aca ctg acc ctg aca aag gac gag tac        576
Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
180                 185                 190
gag cgg cac aac tcc tat acc tgc gag gct acc cac aag acc tcc acc        624
Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr
195                 200                 205
tct cca atc gtg aag tcc ttc aac cgg aac gag tgc tga                    663
Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215                 220
<210>  8
<211>  220
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  8
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Arg Gln Ser Ile Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
115                 120                 125
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
145                 150                 155                 160
Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
180                 185                 190
Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr
195                 200                 205
Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215                 220
<210>  9
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  9
Ile Glu Gly Arg Met Asp Gly Gly Gly
1               5
<---