СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ГЛАУКОНИТА ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЖИВЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
MEANS BASED ON GLAUCONITE FOR IMMOBILIZATION OF LIVING BACTERIAL CELLS

Изобретение относится к области охраны окружающей среды, в частности к биотехнологии и экологии, а именно к технологии получения биопрепарата пролонгированного действия для биоремедиации почв, грунтов, загрязненных в результате производственной деятельности, а также в сельском хозяйстве в качестве удобрений, стимуляторов роста растений.
12
9
8
Известен способ получения биогеосорбента для очистки нефтезагрязненных водных объектов (см. патент РФ № 2715036 по кл. МПК C12N1/20, опуб. 21.02.2020), состоящего из носителя - глауконитсодержащей породы с иммобилизованной на нем смесью штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D с титром клеток 10, дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D с титром клеток 10, микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024 с титром клеток 10. Биогеосорбент получают путем разбрызгивания смеси культуральных жидкостей микроорганизмов на носитель насыпной плотностью не толще 1 см.
Недостатком способа является невысокая эффективность биогеосорбента, обусловленная низким содержанием глауконита (от 30 до 70%), остальное - мехпримеси (опока, щебень и т.д.) и кварцевый песок, что является инертной средой, на которой не иммобилизуются смеси штаммов бактерий, предложенные выше. На инертной среде отсутствуют условия жизнедеятельности смеси штаммов бактерий, из-за этого эффективность биогеосорбента значительно снижается.
11
12
9
Известен также способ получения препарата для биодеградации нефтепродуктов (см. патент РФ № 2571219 по кл. МПК C12N 11/14, опуб. 20.12.2015), включающий в себя раздельное культивирование штаммов Bacillus megaterium ВКМ В-396, Bacillus subtilis ВКПМ В-5328, Pseudomonas putida BKM В-1301, Pseudomonas putida ВКПМ В-5624, Rhodococcus erythropolis ВКПМ AC-1269 до содержания 10-10 мкл/мл, приготовление микробной ассоциации смешиванием в одной емкости культуральных жидкостей штаммов с последующим напылением смеси в виде аэрозоля на глауконитсодержащий сорбент, в котором содержание глауконита составляет не менее 60%, осуществляют дальнейшее обезвоживание смеси путем подачи подогретого до 40°C воздуха со скоростью 3-5 м/с до достижения влажности в конечном биопрепарате 5% и содержания клеток 10 мкл/мл препарата.
Недостатком способа является также, как и предыдущего аналога, низкое содержание глауконита в глауконитсодержащем сорбенте, что значительно снижает его эффективность из-за более низкого содержания иммобилизированных микроорганизмов.
9
Наиболее близким к заявляемому является способ получения биопрепарата на основе глауконита с иммобилизованными на нем микроорганизмами (см. Хапцев З.Ю. Биотехнология получения иммобилизированных форм бактериальных препаратов// Автореферат магистерской работы. - Саратов. - 2017 /http://elibrary.sgu.ru› VKR), заключающийся в культивировании микроорганизмов Agrobacterium spp. или Pseudomonas spp., или Rhizobium spp. или Flaviobacterium spp, получении инокулята, иммобилизации его на глауконите при содержании живых бактериальных клеток 10мкл/г. и соотношении инокулята микроорганизмов к глаукониту 1:4, высушивании полученной массы или в естественных условиях в течение 24 часов при 22-24°С или путем выпаривания на роторно-вакуумном испарителе в течение 40 минут при 40°С.
Недостатком способа является ограниченное количество микроорганизмов, используемых для иммобилизации на глауконите и использование глауконита фиксированного размера.
Технической проблемой является расширение арсенала биопрепаратов на основе глауконита с иммобилизованными на нем микроорганизмами для улучшения плодородия почв.
Техническим результатом является возможность использования биопрепарата с длительным сроком хранения (до 3 лет) в широком диапазоне температур (от -40°С до +50°С).
9
Для достижения технического результата в способе получения биопрепарата на основе глауконита с иммобилизованными на нем микроорганизмами, заключающемся в культивировании микроорганизмов Agrobacterium spp. или Pseudomonas spp., или Rhizobium spp. или Flaviobacterium spp, получении инокулята, иммобилизации его на глауконите при содержании живых бактериальных клеток 10мкл/г. и соотношении инокулята микроорганизмов к глаукониту 1:4, высушивании полученной массы, согласно изобретнию, в качестве микроорганизмов выбирают также культуры или Azospirillum spp., или Bacillus spp., или Bradyrhizobium spp., или Rhodococcus spp., или Paenibacillus spp., а в качестве глауконита используют мелкодисперсный обогащенный глауконит с содержанием глауконита не менее 98% и с размером частиц от 1 нм до 100 мкм.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм.
Поверхность глауконита (сорбента) создает защитные условия для анаэробных и аэробных микроорганизмов, в которых они могут находится в иммобилизированном состоянии без дополнительных питательных веществ в достаточно широком температурном диапазоне -40 до +50°С, в течении 3 лет, что позволяет стабилизировать популяцию иммобилизированных микроорганизмов без применения дорогостоящих способ сушки и специальных условий хранения. Микроорганизмы культивируются на жидкой питательной среде в течение 18-24 часов, затем проводится их иммобилизация на сорбенте путем смешивания биомассы с сорбентом в соотношении 1 часть биомассы и 4 части сорбента. Находясь в иммобилизированном состоянии у микрорганизмов замедляются физиологические процессы. Кроме того, они защищены матрицей от неблагоприятных условий внешней среды (воздействия физических и химических факторов), т.е. получают конкурентные преимущества перед свободноживущими микроорганизмами.
Изобретение поясняется иллюстрациями, где представлен:
- на фиг. 1 - биопрепарат в виде порошка,
- на фиг. 2 - биопрепарат в виде гранул.
Способ осуществляется следующим образом.
8
9
Культуры Agrobacterium spp., Azospirillum spp., Bacillus spp., Bradyrhizobium spp., Pseudomonas spp., Rhizobium spp., Rhodococcus spp., Paenibacillus spp, Flaviobacterium spp выращивают на соответствующих жидких питательных средах при оптимальной температуре 24 часа при постоянном перемешивании в биореакторе, на качалке или шуттель-аппарате. При выращивании на соответствующих плотных питательных средах (на матрасах) культуру смывают с поверхности питательного агара стерильным физиологическим раствором. Затем концентрацию микроорганизмов в инокуляте доводят стерильным физиологическим раствором до 1×10-10 КОЕ\мл при помощи стандарта мутности. При необходимости инокулят концентрируют центрифугированием и разбавляют стерильным физиологическим раствором до соответствующей концентрации. Полученный инокулят культуры используют для иммобилизации на частицах мелкодисперсного обогащенного глауконита с содержанием глауконита не менее 98% и с размером частиц от 1 нм до 100 мкм. Соотношение инокулята микроорганизмов к глаукониту выбирают 1:4.
Препарат может быть изготовлен в виде порошка или гранул.
Получение препарата в виде порошка осуществляют путем высушивания полученной массы в естественных условиях в течение 24 часов при 22-24°С или путем выпаривания на роторно-вакуумном испарителе в течение 40 мин при 40°С.
Для изготовления препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8%. Подсушенные гранулы подают в дробилку, где они превращаются в гранулы неправильной формы, имеющие размер в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм. Затем гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу. Отсортированные гранулы фасуют во влагозащитную потребительскую тару.
Препарат хранят при температуре 22-24°С.
Сущность изобретения поясняется примерами, обосновывающими соотношение инокулята к глаукониту и операцию высушивания.
Пример 1.
9
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Rhizobium spp., из которой получали 3 инокулята, которые использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости 1,8×10 КОЕ\мл; 1,9×10 КОЕ\мл; 2,0×10КОЕ/мл; 2,1×10 КОЕ\мл; 2,4×10 КОЕ\мл; 2,5×10 КОЕ\мл. Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм. при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 1 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Изменение титра Rhizobium spp. при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителе при 40°С
0
3 года
0
3 года
1:1
2,1×10<sup>9</sup>
1,2×10<sup>9</sup>
1,8×10<sup>9</sup>
9,9×10<sup>8</sup>
1:2
2,5×10<sup>9</sup>
1,4×10<sup>9</sup>
2,0×10<sup>9</sup>
1,2×10<sup>9</sup>
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
1,9×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
Пример 2.
9
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Agrobacterium spp, из которой получали 3 инокулята, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 1,4×10 КОЕ\мл; 1,6×10 КОЕ\мл; 1,8×10КОЕ\мл; 2,0×10 КОЕ\мл; 2,1×10 КОЕ\мл; 2,3 ×10 КОЕ\мл. Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 2 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 2.Изменение титра Agrobacterium spp. при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителе при 40°С
0
3 года.
0
3 года
1:1
2,0×10<sup>9</sup>
1,2×10<sup>9</sup>
1,4×10<sup>9</sup>
9,0×10<sup>8</sup>
1:2
2,3×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
1,8×10<sup>9</sup>
1,0×10<sup>9</sup>
1:4
2,1×10<sup>9</sup>
1,4×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
9,8×10<sup>8</sup>
Пример 3
9
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Pseudomonas spp., из которой получали 3 инокулята, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 1,7×10 КОЕ\мл; 1,8×10 КОЕ\мл; 1,9×10КОЕ\мл; 2,4×10 КОЕ\мл; 2,6×10 КОЕ\млг; 2,7 ×10 КОЕ\мл. Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 3 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 3.Изменение титра Pseudomonas spp. . при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита) (Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителепри 40°С
0
3 года
0
3 года
1:1
2,4×10<sup>9</sup>
1,0×10<sup>9</sup>
1,9×10<sup>9</sup>
8,3×10<sup>8</sup>
1:2
2,7×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
1,7×10<sup>9</sup>
9,7×10<sup>8</sup>
1:4
2,6×10<sup>9</sup>
1,3×10<sup>9</sup>
1,8×10<sup>9</sup>
9,6×10<sup>8</sup>
Пример 4
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Flaviobacterium spp., из которой получали 3 инокулята, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 1,3×10 КОЕ\мл; 1,5×10 КОЕ\мл; 1,9×10КОЕ\мл; 2,0×10 КОЕ\мл; 2,4×10 КОЕ\мл. Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 3 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 4.Изменение титра Flaviobacterium spp., при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителепри 40°С
0
3 года
0
3 года
1:1
1,9×10<sup>9</sup>
9,9×10<sup>8</sup>
1,3×10<sup>9</sup>
8,9×10<sup>8</sup>
1:2
2,0×10<sup>9</sup>
1,0×10<sup>9</sup>
1,5×10<sup>9</sup>
9,3×10<sup>8</sup>
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
1,3×10<sup>9</sup>
9,9×10<sup>8</sup>
Пример 5
9
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Bacillus spp., из которой получали 3 инокулята, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 1,8×10 КОЕ\мл; 2,0×10 КОЕ\мл; 1,9×10 КОЕ\мл; 2,1×10 КОЕ\мл; 2,5×10 КОЕ\мл 2,4×10 КОЕ\мл. Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 5 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 5.Изменение титра Bacillus spp., при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителепри 40°С
0
3 года
0
3 года
1:1
2,1×10<sup>9</sup>
1,2×10<sup>9</sup>
1,8×10<sup>9</sup>
9,9×10<sup>8</sup>
1:2
2,5×10<sup>9</sup>
1,4×10<sup>9</sup>
2,0×10<sup>9</sup>
1,2×10<sup>9</sup>
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
1,9×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
Пример 6
9
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Bradyrhizobium spp., из которой получали 3 инокулята, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 1,4×10 КОЕ\мл; 1,8×10 КОЕ\мл; 1,6×10КОЕ\мл; 2,0×10 КОЕ\мл; 2,3×10 КОЕ\мл. 2,1×10 КОЕ\мл Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 6 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 6.Изменение титра Bradyrhizobium spp.. при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителепри 40°С
0
3 года
0
3 года
1:1
2,0×10<sup>9</sup>
1,2×10<sup>9</sup>
1,4×10<sup>9</sup>
9,0×10<sup>8</sup>
1:2
2,3×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
1,8×10<sup>9</sup>
1,0×10<sup>9</sup>
1:4
2,1×10<sup>9</sup>
1,4×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
9,8×10<sup>8</sup>
Пример 7
9
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Azospirillum spp, из которой получали 3 инокулята, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 1,3×10 КОЕ\мл; 1,5×10 КОЕ\мл; 1,3×10КОЕ\мл; 1,9×10 КОЕ\мл 2,0×10 КОЕ\мл; 2,4×10 КОЕ\мл. Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 7 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 7.Изменение титра Azospirillum spp. при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителепри 40°С
0
3 года
0
3 года
1:1
1,9×10<sup>9</sup>
9,9×10<sup>8</sup>
1,3×10<sup>9</sup>
8,9×10<sup>8</sup>
1:2
2,0×10<sup>9</sup>
1,0×10<sup>9</sup>
1,5×10<sup>9</sup>
9,3×10<sup>8</sup>
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
1,3×10<sup>9</sup>
9,9×10<sup>8</sup>
Пример 8
9
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Rhodococcus spp, из которой получали 3 инокулята, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 1,9×10 КОЕ\мл; 1,7×10 КОЕ\мл; 1,8×10КОЕ\мл; 2,4×10 КОЕ\мл. 2,7×10 КОЕ\мл; 2,6×10 КОЕ\мл; Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 8 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 8.Изменение титра Rhodococcus spp. при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителепри 40°С
0
3 года
0
3 года
1:1
2,4×10<sup>9</sup>
1,0×10<sup>9</sup>
1,9×10<sup>9</sup>
8,3×10<sup>8</sup>
1:2
2,7×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
1,7×10<sup>9</sup>
9,7×10<sup>8</sup>
1:4
2,6×10<sup>9</sup>
1,3×10<sup>9</sup>
1,8×10<sup>9</sup>
9,6×10<sup>8</sup>
Пример 9
9
9
9
9
9
9
В качестве культуры использовали Paenibacillus spp, из которой получали 3 инокулята, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости 1,4х0КОЕ\мл; 1,8×10 КОЕ\мл; 1,6×10 КОЕ\мл; 2,0×10КОЕ\мл; 2,3×10 КОЕ\мл; 2,1×10 КОЕ\мл. Инокуляты иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:1, 1:2, 1:4.
В таблице 9 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконите при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 9.Изменение титра Paenibacillus spp. при хранении порошковой формы препарата (КОЕ\г глауконита) (Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Порошковая форма биопрепарата, полученная высушиванием при22-24°С
Порошковая форма биопрепарата, полученная выпариванием на роторно-ваккумном испарителепри 40°С
0
3 года.
0
3 года
1:1
2,0×10<sup>9</sup>
1,2×10<sup>9</sup>
1,4×10<sup>9</sup>
9,0×10<sup>8</sup>
1:2
2,3×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
1,8×10<sup>9</sup>
1,0×10<sup>9</sup>
1:4
2,1×10<sup>9</sup>
1,4×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
9,8×10<sup>8</sup>
Пример 10
9
В качестве культуры использовали Azospirillum spp, из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,4×10 КОЕ\мл.
Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 10 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 10.Изменение титра Azospirillum spp. при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
Пример 11
9
В качестве культуры использовали Agrobacterium spp, из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,4×10 КОЕ\мл. Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 11. представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 11.Изменение титра Agrobacterium spp. при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
Пример 12
9
В качестве культуры использовали Pseudomonas spp, из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,6×10 КОЕ\мл. Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 12 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 12.Изменение титра Pseudomonas spp. при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года
1:4
2,6×10<sup>9</sup>
1,3×10<sup>9</sup>
Пример 13
9
В качестве культуры использовали Flaviobacterium spp, из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,4×10 КОЕ\мл. Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 13 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 13.Изменение титра Flaviobacterium spp. при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
Пример 14
9
В качестве культуры использовали Bacillus spp., из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,4×10 КОЕ\мл. Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 14 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 14.Изменение титра Bacillus spp., при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
Пример 15
9
В качестве культуры использовали Bradyrhizobium spp., из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,4×10 КОЕ\мл. Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 15 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 15.Изменение титра Bradyrhizobium spp., при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года.
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
Пример 16
9
В качестве культуры использовали Rhodococcus spp, из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,4×10 КОЕ\мл. Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 16 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 16.Изменение титра Rhodococcus spp при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
Пример 17
9
В качестве культуры использовали Paenibacillus spp, из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,4×10 КОЕ\мл. Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 17 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 17.Изменение титра Paenibacillus spp, при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,1×10<sup>9</sup>
Пример 18
9
В качестве культуры использовали Rhizobium spp. из которой получали инокулят, который использовали для иммобилизации при содержании живых бактериальных клеток в исходной культуральной жидкости: 2,4×10 КОЕ\мл. Инокулят иммобилизировали на мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм при соотношении инокулята к глаукониту 1:4.
Для получения препарата в виде гранул полученную массу направляют в гранулятор, на выходе из которого получают гранулы диаметром от 2 до 70 мм, длиной от 30 до 110 мм, которые затем подсушивают горячим воздухом при температуре 30-40°С до влажности не более 8% и подают в дробилку для получения гранул размером в поперечнике и в длину от 2 до 7 мм, после чего гранулы просеивают через сита, имеющие размер от 2 до 7 мм. Просеянные гранулы сортируют по гранулометрическому составу.
В таблице 18 представлено изменение титра культуры микроорганизма на глауконитовом препарате в виде гранул при хранении препарата в течение 3-х лет.
Таблица 18.Изменение титра Rhizobium spp. при хранении препарата в виде гранул(КОЕ\г глауконита)(Ро, 95)
Биомасса:глауконит
Препарат в виде гранул, полученный высушиванием при22-24°С
0
3 года
1:4
2,4×10<sup>9</sup>
1,6×10<sup>9</sup>
Таким образом, по результатам проведенных экспериментов было установлено, что наиболее оптимальными соотношениями в системе “биомасса:носитель(глауконит)” являются 1:2 и 1:4. Кроме того, оказалось, что порошковая форма биопрепаратов, полученная при высушивании в течении 24 часов при 22-24°С содержала больше живых микроорганизмов, чем порошок, полученный путем выпаривания на роторно-вакуумном испарителе в течение 40 мин при 40°С.
9
9
Из полученных данных также видно, что через 3 года хранения при температуре 22-24°С титр микроорганизмов в большинстве образцов, полученных при высушивании в течении 24 часов при 22-24°С, превышал 1×10 КОЕ\г, а в образцах, полученных путем выпаривания на роторно-вакуумном испарителе в течение 40 мин при 40°С титр микроорганизмов был ниже 1×10 КОЕ\г.
Учитывая тот факт, что одним из оптимальных соотношений в системе “биомасса:носитель (мелкодисперсный обогащенный глауконит не менее 98% с размером частиц от 1 нм до 100 мкм )” являются 1:4, нами были изготовлены глауконитовые гранулы на грануляторе. Процесс изготовления происходил в течение 10-15 мин., температура при изготовлении не более 40°С. Высушивание гранул проводили в течение 24 часов при 22-24°С.
Долгосрочное хранение препаратов в виде порошка или гранул осущетвляли при температурах хранения -40 до +50°С.