НАБОР И СПОСОБ СКРИНИНГА
KIT AND METHOD OF SCREENING

Уровень техники
С расширением знаний, связанных с геномикой, в медицине все сильнее ощущается потребность в переходе от терапии, применимой в общем к данному заболеванию к терапии, специально подобранной для конкретного человека, страдающего таким заболеванием. Преимущества специально подобранного терапевтического подхода очевидны, тогда как ненадлежащий выбор пациентов для лечения приводит к расходам на медицинское обслуживание и здравоохранение, которые могут быть ограничены не только за увеличения способности прогнозировать и, таким образом, не допускать части дорогостоящей и неэффективной терапии для конкретного пациента, но также за счет избежания пагубного воздействия на конкретного пациента.
При терапии опухолей эта потребность ощущается особенно остро, поскольку эффективность терапии обычно низкая: даже лекарственные препараты, нацеленные на конкретные мутации генов, могут быть неэффективны в 80-90% случаев в отсутствие адекватного выбора пациентов (B Majumder et al., Predicting clinical response to anticancer drags using an ex vivo platform which captures tumour heterogeneity Nat. Commun. 2015, 6:6169).
С целью обеспечения анализов, которые позволят эффективно внедрить персонализированную медицину, были успешно разработаны тесты, которые основаны на генетическом профиле и на экспрессии белков (Staunton JE et al., Chemosensitivity predicition by transcriptional profiling. PNAS 2001, 98:10787-10792; van’t Veerand LJ, Bernarnds R, Enabling personalised cancer medicine through analysis of gene-expression patterns.Nature 2008, 452:564-570). Однако, особенно в случаях опухолей, для эффективности терапии в значительной степени важно микроокружения опухоли в сочетании с другими характеристиками пациента. Чтобы также учесть эти факторы, остро необходим функциональный анализ ex vivo (Tian C. et al., Evaluation of a chemoresponse assay as a predictive marker for the treatment of recurrent ovarian cancer: further analysis of a prospective study. British J. Cancer 2014, 111:843-850).
В настоящее время существуют функциональные тесты ex-vivo, которые будучи осуществленными непосредственно после отбора биологических образцов и сохранения образца в контролируемых условиях, как можно более схожих с репрезентативными для микроокружения опухоли in-vivo, обнаружили высокую способность прогнозировать эффективность лекарственной терапии. В качестве примера способ предложен в публикации WO2010/135468. Однако имеющиеся в настоящее время функциональные тесты ex-vivo обнаруживают серьезные ограничения.
В частности, тесты, разработанные для анализа ex-vivo для фармакологической активности в гематологии и онкологии основаны главным образом на использовании проточной цитометрии (FACS) и/или флуорометрических или колориметрических тестах с использованием наборов, предназначенных для измерения жизнеспособности клеток и/или пролиферации на всех популяциях клеток, таких как метаболические анализы MTT, ATP, анализ MiCK (Kravtsov VD & Fabian’s Automated monitoring of apoptosis in cell suspension cultures. Lab. Invest. 1996, 74:557–570) и метод дисков DiSC (Weisenthal LM et al., A novel dye exclusion method for testing in vitro chemosensitivity of human tumors. Cancer Res. 1983, 43:749-757) для измерения гибели клеток и апоптоза. Такие тесты неизбежно обладают несколькими ограничениями. Проточная цитометрия, например, обнаруживает неспособность обеспечивать многопараметрический скрининг (High contant analysis) с периодическим мониторингом и неспособность работать с агрегатами клеток, поскольку разрушение клеток является фундаментальным предварительным условием для проведения теста, тем самым, не допускается оценка ответа клетки в этом контексте. Способы, которые обеспечивают измерение на всей популяции, в основном отличаются сложностями выполнении анализа, ограниченного субпопуляцией опухоли и, следовательно, ограниченной точностью. Кроме того, во всех описанных способах требуемые объемы образцов обычно значительны и не всегда совместимы с клинической практикой. Например, для снижения инвазивности процедур отбора проб или при наличии опухолей ограниченного размера, таких как метастазы, образец доступен в малых количествах, например, до нескольких тысяч клеток или нескольких десятков клеток, если образец взят из биопсии жидкости, т.е. путем выделения циркулирующих опухолевых клеток, и эти количества для анализа по описанным способам недостаточны. При наличии биологического образца, который содержит от нескольких тысяч клеток до нескольких десятков клеток, проведение клеточного анализа на таком образце затруднено из-за ограничений существующих в настоящее время измерительных приборов и, когда его можно выполнить, этот анализ все еще ограничен одним или более условиями эксперимента для этого образца. В более сложных случаях, в которых имеется только несколько клеток, например, 10-20 клеток, нельзя получить значимые данные с помощью имеющихся в настоящее время функциональных тестов. Кроме того, в настоящее время для выполнения функциональных тестов необходимы исполнители с опытом работы и специализированные лаборатории с оборудованием, которые не являются легкодоступными. Платформы для анализа, основанные на проточной цитометрии, если они обеспечивают полную автоматизацию, представлены сложным и громоздким оборудованием, поэтому едва ли приемлемы в клиническом контексте и, более конкретно, в диагностических лабораториях. Аналогично этому, другие описанные способы требуют выполнения операций вручную и наличия полной лаборатории для выполнения диагностического тестирования. Таким образом тесты проводятся в лаборатории вдали от места отбора образцов, тем самым, замедляя начало тестов на несколько дней, часто делая их несовместимыми со сроками клинической практики, для которой результаты могут потребоваться в течение 24-48 часов.
В публикации WO2012/072822 предлагается система с микролунками, открытыми сверху и снизу, в которой каналы обеспечивают сообщение микролунок по потоку текучей среды, а геометрия микролунок обеспечивает формирование в них мениска, где находятся клетки и/или частицы вводимые в них. Необязательно микролунки содержат электроды, которые позволяют управлять движением клеток и/или частиц в соответствующих микролунках.
US2016/161392
Остро ощущается потребность в функциональных тестах на основе клеточного анализа, позволяющего дать ответ за короткое время с момента получения биологического образца, например, в пределах 24-48 часов, и обеспечивающего получение высокоинформативных данных по проанализированным клеткам, т.е. учитывать морфологические данные, даже при периодическом мониторинге, обеспечивая динамический анализ информации, полученной от клеток в образце. Кроме того, указанный способ не должен зависеть от оператора, насколько это возможно, и требовать малых объемов биологического образца, чтобы также ограничивать объемы используемых реагентов и лекарственных средств при их проведении, таким образом, ограничивая расходы, сохраняя способность обеспечивать надежные результаты даже с очень малыми биологическими образцами с точки зрения количества, такими как содержащие всего 20 клеток.
Перемещение текучих сред в микрофлюидных устройствах обычно осуществляется с помощью вакуумных или нагнетающих насосов и/или клапанов. Комбинация насосов и клапанов обеспечивает точное управление перемещением текучих сред в контуре.
Например, Byun et al. (Pumps for Microfluidic Cell Cultures (Насосы для микрофлюидных клеточных культур), Electrophoresis 2014, 35:245-257) предлагают микрофлюидные устройства для клеточных культур и подходящие для них системы насосов. Также Au et al. (Microvalves and micropumps for BioMEMS, Micromachines 2011, 2:179-220) предлагают широкий ряд клапанов и насосов для использования в особых комбинациях, каждая с уникальными особенностями, которые позволяют применить ее в некоторых контекстах и не позволяют в других.
В имеющейся литературе показано, что нет стандартных параметров, на которых должен быть основан выбор микронасосов и микроклапанов, таким образом, требуется особое исследование для каждой конкретной системы.
Остро ощущаемая проблема состоит в эффективном управлении движением текучих сред по двум направлениям с микроконтуре, без необходимости полагаться на насосы и клапаны, которые являются громоздкими и требующими затрат с точки зрения покупки и управления.
Другой проблемой, связанной с микрофлюидными устройствами на основе клапанов является то, что если введение клапанов с микросистему предполагается для достижения высокой степени параллельности и/или уменьшенных общих размеров, то требуемая технологическая сложность очень велика, например, за счет необходимости введения эластомеров, а также жестких материалов.
В настоящем изобретении предлагается простое и эффективное решение проблемы за счет обеспечения возможности использовать одно устройство для обращения с жидкостью и для загрузки, и для перекачивания и необязательно для выпуска текучих сред в микрофлюидном устройстве.
Краткое описание фигур
На фиг. 1: показан пример схемы системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, используемой в способе по настоящему изобретению, на виде в перспективе (a), в вертикальном разрезе (b) и на виде сверху (c).
На фиг. 2: показана схема системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, используемой в другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению, на виде в перспективе (a), в вертикальном разрезе (b) и на виде сверху (c).
На фиг. 3: показана схема системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, используемой в предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению, на виде в перспективе (a), в вертикальном разрезе (b) и на виде сверху (c).
На фиг. 4: показана схема системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, используемой в другом предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению, на виде в перспективе (a), в вертикальном разрезе (b) и на виде сверху (c).
На фиг. 5: показан вид в разрезе участка системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, используемой в способе по настоящему изобретению.
На фиг. 6: показан пример изображений, полученных в канале видимого света (A), в канале флуоресценции DAPI (B), в канале флуоресценции FITC (C) и в канале флуоресценции CY5 (D). (E) – это результат суперпозиции изображений, полученных в канале FITC и CY5.
На фиг. 7: приведена классификация клеточной популяции по фиг. 6 в соответствии с разными оцененными параметрами.
На фиг. 8: приведена классификация раковых клеток в образце костного мозга, полученном у пациента, страдающего острой миелоидной лейкемией (AML). На (A) и (B) - результаты, полученные при FACS, на (C) и (D) – результаты, полученные по способу, предложенному в настоящей заявке. На (A) и (C) показан отсчет исходного уровня, выполненный на немеченных клетках контроля, который позволяет определить пороговое значение, указанное стрелкой; на (B) и (D) – счет серопозитивных клеток анти-CD34 или событий выше определенного порогового значения.
На фиг. 9: показаны данные, полученные на смеси клеток, выделенных у здорового донора и клеточной линии лимфомы Беркитта (Raji) по способу, описанному в настоящей заявке. Приведена классификация клеток опухоли в смеси, выделенной у здорового донора и клеток опухоли (A), анализ гибели клеток в популяции опухоли и в здоровой популяции (B) и кривая дозы/ответа после воздействия лекарственного препарата (C).
Фиг. 10: схематично показана в разрезе система открытых микролунок с возможностью переворачивания, используемая в альтернативном варианте осуществления способа по настоящему изобретению, которая также включает электроды в микролунке и на нижней поверхности канала.
На фиг. 11: тест на SU-DHL-4 (RTX) обработанных и необработанных клеток опухоли (CTRL) моноклональным антителом ритуксимабом. (A) – данные исследования живых клеток (светло-серый) и мертвых клеток (указаны стрелкой) в начальный момент времени (T0) и через 30 (T1) и 60 (T2) минут обработки с помощью способа по настоящему изобретению; (B) число живых клеток в момент времени T0, T1 и T2, полученное посредством проточной цитометрии; (C) сравнение между данными числа клеток, полученными через 60 минут обработки посредством проточной цитометрии, или с помощью способа по настоящему изобретению.
На фиг. 12: показано число клеток, указанное в процентах от клеток опухоли SU-DHL-4, выживших после обработки, полученное по FACS (квадратики) и с помощью способа по настоящему изобретению (кружки) в клетках контроля (светло-серый) и обработанных ритуксимабом (темно-серый).
На фиг. 13: приведена классификация клеток Raji опухоли в смеси клеток, выделенных у здорового донора и клеток Raji опухоли с помощью способа по настоящему изобретению. (A) данные исследования фазового контраста и флуоресценции; (B) специфические для клетки морфологические данные; (C) классификация клеток с учетом морфологических (диаметр) и функциональных (экспрессия CD38) параметров; (D) статистический анализ морфологических (диаметр) и функциональных (экспрессия CD38) данных популяции здоровых клеток (мононуклеары периферической крови, PBMC) и клетки Raji опухоли.
На фиг. 14: показаны изменения сигнала флуоресценции со временем. Данные, полученные с периодическим мониторингом в специфичном для клеток режиме (A) или в виде общего наблюдения популяции клеток (B). На фиг. (A) высвечены столбцы гистограммы, соответствующие субпопуляции, которая подверглась наименьшему повреждению клеток, что является самым малым относительным изменением сигнала флуоресценции. На фиг. (B) показаны столбцы, соответствующие субпопуляциям, которые содержат те же самые клетки, идентифицированные на графике (A).
На фиг. 15: показан автоматический способ мечения. На фиг. (A) показан сигнал фона, а на фиг. (B) показано изменение сигнала со временем, измеренного в микролунке при скорости потока 16 мкл/мин. Штриховая линия на фиг. (A) представляет собой фоновый сигнал, который измеряется без периодического мониторинга, но с чередованием измерений и промывки. На фиг. (C) показано отношение сигнал/шум, выраженное, как средний сигнал, измеренный на клетках, деленный на средний сигнал фона. На фиг. (D) приведены репрезентативные изображения, полученные с периодическим мониторингом во время промывки.
На фиг. 16: Временной анализ посредством проточной цитометрии изменения сигнала при длине волны 480 нм (FITC) с помощью клеток Jurkat, меченых Fluo-4 в результате моделирования (a) иономицином и (b) очищенным антителом OKT3.
На фиг. 17: Временной анализ в системы открытых микролунок изменения сигнала при длине волны 480 нм (FITC) с клетками Jurkat, меченными Fluo-4 в результате стимулирования (a) иономицином и (b) очищенным антителом OKT3. Штриховые линии представляют последовательность сигналов, полученную для отдельных клеток в микролунках. Непрерывные кривые представляют среднее значение сигнала.
На фиг. 18: схема набора по настоящему изобретению, который включает наконечник и микрофлюидное устройство.
На фиг. 19: схематически представлен вариант осуществления набора по настоящему изобретению. (A) наконечник, (B) впускная область, (C) наконечник введен во впускную область.
На фиг. 20: схематически представлен вариант осуществления набора по настоящему изобретению, наконечник введен во впускную область.
На фиг. 21: схематически представлен другой вариант осуществления набора по настоящему изобретению. (A) наконечник, (B) впускная область, (C) наконечник введен во впускную область.
На фиг. 22: схематически представлен другой вариант осуществления набора по настоящему изобретению, наконечник введен во впускную область, содержащую вертикальный канал и соединитель.
На фиг. 23: схематически представлен другой вариант осуществления набора по настоящему изобретению. (A) наконечник, (B) впускная область, (C) наконечник введен во впускную область, (D) наконечник введен во впускную область в альтернативном варианте осуществления.
На фиг. 24: схематически представлен другой вариант осуществления набора по настоящему изобретению. (A) наконечник, (B) впускная область, (C) наконечник введен во впускную область, (D) наконечник введен во впускную область в альтернативном варианте осуществления.
На фиг. 25: система открытых микролунок с возможностью переворачивания по настоящему изобретению, вид сверху.
На фиг. 26: система открытых микролунок с возможностью переворачивания по другому варианту осуществления, вид сверху.
На фиг. 27: три варианта осуществления, в полях A, B и C, области (70) выпуска микрофлюидного устройства (1).
На фиг. 28: схематически представлена автоматическая система обработки, в которую введено микрофлюидное устройство (1).
Подробное описание
Далее описаны микрофлюидное устройство (1), набор, содержащий наконечник (20) и впускную область (18) микрофлюидного устройства (1), область (70) выпуска микрофлюидного устройства (1). Настоящее изобретение также относится к способу введения и/или выпуска одной или более текучих сред из микрофлюидного устройства (1) и способу высокоинформативного анализа в микрофлюидном устройстве (1).
Определения
Под термином «совмещение поверхностей» в настоящем документе понимается взаимодействие между двумя элементами, так что эти два элемента могут рассматриваться, как соединенные. Когда происходит совмещение поверхностей этих двух элементов, в данном случае наконечника и вертикального канала, текучая среда, загруженная в наконечник и выбрасываемая в вертикальный канал, принудительно перемещается внутри канала, при этом совмещение поверхностей таково, чтобы предотвратить прохождение текучей среды мимо, т.е. указанное взаимное соединение таково, чтобы запечатать вместе два элемента.
Под термином «соединитель» в настоящем документе понимается любой трубковидный, цилиндрический, более или менее конический, сужающийся или расширяющийся элемент, предназначенный для обеспечения сообщения по текучей среде между двумя отделениями.
Под термином «угол полураствора усеченного конуса» понимается угол, сформированный прямой линией, создающий усеченный конус с прямой линией, которая образует ось его вращения.
Текучие среды: любое вещество в жидком или газообразном состоянии.
Биологический образец: образец, содержащий клетки, полученные от микроорганизма, животного и/или человека, предпочтительно человека, причем образец предпочтительно выбран из группы, содержащий биологические текучие среды или биопсию. Образец содержит клетки в суспензии или ткань. В предпочтительном варианте осуществления это образец крови или материал, полученный аспирацией костного мозга. В альтернативном варианте биологический образец состоит из культуры клеток, таких как клеточная линия, или из состава, содержащего культуру клеток и клетки пациента.
Высокоинформативный тест: фенотипический тест, проводимый на клетках.
Периодический мониторинг: способ получения изображений, включающий серию снимков одного и того же поля, полученных в определенной временной последовательности.
Режим Ex-vivo: тест, проводимый на ткани, полученной от организма в окружающей среде вне самого организма с минимальным изменением естественных условий.
Набор и способ введения одной или более текучих сред в микрофлюидное устройство
Настоящее изобретение относится к набору, который содержит наконечник (20), и к микрофлюидному устройству (1), которое содержит по меньшей мере один микроканал (3) и впускную область (8), которая содержит по меньшей мере один вертикальный канал (18), указанный наконечник (20), и размер вертикального канала (18) позволяет установить между ними совмещение поверхностей.
Наконечник выбран из имеющихся в продаже наконечников, которые обладают по меньшей мере одним проксимальным участком, предназначенным для взаимодействия с системой распределения текучей среды, и открытым коническим дистальным участком.
Как показано на фиг. 18, указанный наконечник (20) обладает проксимальным участком (22), предназначенным для взаимодействия с системой распределения текучей среды, и дистальным участком (21), проксимальный участок (22) в основном обладает трубчатой конфигурацией, а дистальный участок (21) является открытым коническим, концевое основание (25) дистального участка (21) обладает наружным диаметром d3, и верхнее основание (24) дистального участка (21) обладает наружным диаметром d4, причем впускная область (8) содержит вертикальный канал (18), который необязательно проходит через один или более соединителей по меньшей мере в один микроканал (3), верхнее отверстие вертикального канала (18) обладает диаметром d2, где d3<d2, наконечник (20) и вертикальный канал (18) обладают размером, позволяющим создавать совмещение поверхностей между ними.
Указанное совмещение поверхностей обычно формируется в соответствии с одним из режимов, показанных на фиг. 19 и 20. Как показано на фиг. 19, наконечник (20) и канал (18) имеют область уплотненного контакта в верхнем основании (9) вертикального канала (18). Как показано на фиг. 20, область уплотненного контакта расположена в пределах вертикального канала (18), в этом варианте она там, где концевое основание (25) дистального участка (21) наконечника (20) находится в контакте с внутренней стенкой вертикального канала (18). В обоих случаях имеет место уплотненный контакт. Предпочтительно указанный контактный участок (21) наконечника (20) и вертикальный канал (18) изготовлены из пластика, что делает систему достаточно упругой для обеспечения уплотнения без использования прокладок. В особенно предпочтительном варианте осуществления описанная далее геометрия системы обеспечивает, чтобы контакт между вертикальным каналом (18) и наконечником (20) возникал не в одной точке, а был распределен на участке поверхности, дополнительно обеспечивая эффективное уплотнение. В частности, это условие преимущественно обеспечивается, когда угол полураствора дистального участка (21) наконечника и вертикального канала (18) немного отличаются друг от друга, предпочтительно отличаются менее, чем на 10°. Даже более предпочтительно вертикальный канал (18) представляет собой цилиндр, необязательно несколько сужающийся книзу.
Как показано на фиг. 19A, длина дистального участка (21) наконечника (20) равна h2, угол полураствора усеченного конуса, сформированного дистальным участком (21) составляет (90°- β), и длина проксимального участка (22) равна h3. На фиг. 19A наконечник показан более детально, где указаны угол (26), имеющий измерение β, и продольная ось x, которые определяют угол полураствора усеченного конуса.
На фиг. 20-24 и в последующем описании представлены несколько особенно предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, но они не ограничивают защищаемый объем изобретения, который определяется пунктом 1 формулы изобретения.
В предпочтительном варианте осуществления, показанном на фиг. 19, в котором вертикальный канал (18) является каналом, сужающимся книзу, и обладает верхним основанием (9) и нижним основанием (12), нижнее основание (12) обладает диаметром d1, и верхнее основание (9) обладает диаметром d2, вертикальный канал (18) имеет высоту h1, и угол полураствора усеченного конуса, сформированный рупором конического канала равен (90° - α1). В предпочтительном варианте осуществления угол α1 равен 90°, и вертикальный канал (18) является цилиндром.
Предпочтительно углы β и α1 отличаются друг от друга на величину в пределах 15°, предпочтительно на 10°, даже более предпочтительно на величину от 4 до 5°.
В предпочтительном варианте осуществления, как показано на фиг. 19A, 19C, дистальный участок (21) наконечника (20) обладает в разрезе диаметром d2 в точке (28), расположенной вдоль дистального участка (21) на высоте h_x относительно контактного основания (25) дистального участка, высота h_x меньше, чем расстояние между верхним основанием (9) вертикального канала (18) и точкой впуска микроканала (3), где указанное расстояние равно h1, когда нет никакого соединителя, и d3<d2<d4 и (90° - α1) < (90° - β), предпочтительно угол α1 составляет от 80° до 90°, даже более предпочтительно он равен 90°. В частности, наконечник (20) входит во впускную область (8), которая является вертикальным каналом (18), за счет участка (27) длиной h_x, т.е. наконечник входит во впускную область (8), достигая точки совмещения поверхностей до достижения микроканала (3), т.е. наконечник и вертикальный канал (18), находящиеся во впускной области (8), достигают положения уплотнения, когда участок наконечника, введенный в вертикальный канал (18), такой что наконечник не достигает ом микроканала (3). В этом варианте осуществления (90° - α1) < (90° - β) и h_x = ((d2-d3)/2)*tgβ, предпочтительно угол α1 составляет от 80° до 90°, даже более предпочтительно он равен 90°.
В альтернативном варианте, как показано на фиг. 22, наконечник (20) входит в вертикальный канал (18), находящийся во впускной области (8), посредством участка (27) длиной h_x, где d1<d3<d2, (90° - α1) > (90° - β). Как показано на фиг. 22, необязательно впускная область (8) содержит соединитель (60), обладающий верхним основанием (12), которое совпадает с нижним основанием (12) вертикального канала (18).
В альтернативном варианте осуществления, как показано на фиг. 21, впускная область (8) дополнительно содержит расширяющийся участок (30) в форме полого усеченного конуса, высотой h4 и с верхним основанием (33) и нижним основанием (9), которое совпадает с верхним основанием (9) вертикального канала (18), верхнее основание (33) имеет диаметр d5 больше диаметра d2 нижнего основания (9), где угол полураствора усеченного конуса, образующего расширяющийся участок (30), составляет (90° - α2) и (90° - α2) > (90° - β).
Предпочтительно, как показано на фиг. 23, впускная область (8) также содержит, над расширяющимся участком (30), область (40) хранения, которая содержит по меньшей мере два участка: верхний участок (42) и нижний участок (41), причем верхний участок (42) обладает в основном трубчатой формой с верхним основанием (43) и нижним основанием (44) диаметром d6, и нижний участок (41) сужается книзу и обладает верхним основанием (44), которое совпадает с нижним основанием (44) верхнего участка (42) и нижним основанием (45) диаметром d5, область (40) хранения обладает высотой h5, и угол полураствора усеченного конуса, который образует нижний участок (41), равен (90° - α3), где угол α3 меньше или равен 90°, предпочтительно угол α3 равен 0°.
Когда впускная область также содержит область (40) хранения, наконечник (20) входит во впускную область (8) на длину, которая больше чем длина дистального участка (21) наконечника (20), расстояние между концевым основанием (25) дистального участка (21) наконечника (20) и верхним основанием (43) области (40) хранения составляет h_tot, (h_tot > h2), и расстояние между верхним основанием (24) дистального участка (21) наконечника (20) и нижним основанием (45) области (40) хранения равно h_y, 2*h_y*cotα3 + d5 > d4.
В альтернативном варианте и как показано на фиг. 23D, наконечник (20) входит во впускную область (8) на длину меньше, чем длина дистального участка (21) наконечника (20), расстояние между концевым основанием (25) дистального участка (21) наконечника (20) и верхним основанием (43) области (40) хранения равно h_tot, и расстояние между концевым основанием (25) дистального участка (21) наконечника (20) и верхним основанием (9) вертикального канала (18) равно h_x, h_tot = h_x + h4 + h5, и расстояние между верхним основанием (24) дистального участка (21) наконечника (20) и нижним основанием (45) области (40) хранения равно h_y, h_y = h2 – h_x –h4.
В другом варианте осуществления, как показано на фиг. 24, впускная область (8) дополнительно содержит участок (50) хранения, который содержит по меньшей мере два участка: верхний участок (52) и нижний участок (51), причем верхний участок (52) обладает в основном трубчатой формой с верхним основанием (53) и нижним основанием (54) диаметром d6, и нижний участок (51) сужается книзу и обладает верхним основанием (54), которое совпадает с нижним основанием (54) верхнего участка (52), и нижним основанием (55) диаметром d2, область (50) хранения имеет высоту h5, и угол полураствора усеченного конуса, который образует участок (50) хранения, равен (90° - α3), where (90° - α3) > (90° - β).
Когда впускная область содержит область (50) хранения, наконечник (20) входит во впускную область (8) на длину меньше общей длины наконечника (20), расстояние между концевым основанием (25) дистального участка (21) наконечника (20) и верхним основанием (53) области (50) хранения, равное h_tot, h_tot, меньше или равно h2 и (2*h_tot*cotβ + d3) < d6.
В альтернативном варианте, как показано на фиг. 24D, наконечник (20) входит во впускную область (8) на длину меньше общей длины наконечника (20), расстояние между концевым основанием (25) дистального участка (21) наконечника (20) и верхним основанием (53) области (50) хранения равно h_tot, и расстояние между концевым основанием (25) дистального участка (21) наконечника (20) и верхним основанием (9) вертикального канала (18) равно h_x, где h_tot > h2 и h_tot = h_x +h5.
Для специалистов в этой области очевидно, что возможны другие варианты осуществления.
Вариант осуществления, который включает присутствие емкости для хранения во впускной области (8), предпочтительно используется, когда необходимо контролировать испарение в микрофлюидном устройстве. В принципе, область хранения предпочтительно может оставаться заполненной текучей средой, загруженной в микрофлюидное устройство, чтобы когда требуется длительное время инкубации, не возникало нежелательных эффектов испарения.
Необязательное присутствие области хранения позволяет создать вертикальный канал (18) и, необязательно, соединители (60), объем которых снижен до минимума, чтобы не допустить потерь текучих сред, используя одну или более емкости для хранения только при необходимости.
Возможность иметь расширяющийся участок (30) дает преимущество обеспечения достаточно широкого отверстия, чтобы наконечник (20) мог входить во впускную область (8) также в нецентрированном состоянии вдоль вертикальной центральной оси впускного канала (18) для попадания в расширяющийся участок (30), а затем во время движения вниз наконечника (20), во впускной канал (18) за счет проскальзывания наконечника вдоль внутренних стенок расширяющегося участка и впускного канала, даже с возможным изгибанием/искривлением наконечника (20).
Необязательно микрофлюидное устройство (1) также содержит калибровочную пластину измерителя полного сопротивления, и наконечник (20) присоединен к распределительной системе, предусмотренной с системой регистрации полного сопротивления.
Необязательно микрофлюидное устройство содержит закрывающий элемент впускной области (8), например закрывающим элементом является колпачок или защитная пленка. В одном варианте осуществления защитная пленка состоит из эластомерного материала, например, силикона.
Неожиданное решение по настоящему изобретению, описанное в п. 1 формулы изобретения, позволяет, с использованием указанного далее способа, управлять введением одной или более текучих сред в микрофлюидное устройство только за счет использования совмещения поверхностей, которое имеет место между наконечником и вертикальным каналом, без использования насосов или клапанов.
В частности, способ загрузки/выпуска текучих сред в микрофлюидное устройство (1), входящее в описанный набор и заявленное в формуле изобретения, включает:
a) обеспечение набора по одному из п.п. 1-8;
b) необязательную загрузку текучей среды в наконечник (20);
c) позиционирование наконечника (20) над впускной областью (8) и его введение для достижения положения совмещения поверхностей между дистальной областью (21) наконечника (20) и вертикальным каналом (18) во впускной области (8);
d) выброс текучей среды, содержащейся в наконечнике (20), в микрофлюидное устройство (1) через впускную область (8) или, в альтернативном варианте, с тем же самым наконечником (20), отсасывание текучей среды, уже содержащейся в микрофлюидном устройстве.
Когда способ применяется для отсасывания, а не для выброса, и текучей средой является жидкость, удобно, если вертикальный канал (18) и необязательные соединители (60) также содержат эту жидкость, или жидкость содержится не только в микрофлюидном устройстве. Присутствие жидкости в контакте с наконечником (20) за счет уменьшения поверхностного натяжения облегчает всасывание, которое было бы затруднено, если бы наконечник всасывал воздух до всасывания текучей среды, содержащейся в микрофлюидном устройстве.
Микрофлюидное устройство
2
Также предлагается микрофлюидное устройство, которое представляет собой систему открытых микролунок с возможностью переворачивания, которая содержит упорядоченную последовательность открытых микролунок 2, по меньшей мере один микроканал 3, по меньшей мере один впускной порт 8 для реагентов и/или для одного или более биологических образцов и по меньшей мере один выпускной порт 10 для них, указанные впускной и выпускной порты сообщаются по микропотоку текучей среды с одним или более из микроканалов 3, причем микроканал 3 обладает площадью в сечении, размеры которой составляют порядка нескольких микрон, и обеспечивает текучую среду для микролунок 2, причем в одном варианте осуществления система открытых микролунок с возможностью переворачивания введена в автоматическую систему обработки, которая имеет следующие признаки: инкубатор с регулируемой температурой, влажностью и CO, систему распределения текучей среды, систему сбора данных фазово-контрастных и флуоресцентных изображений.
2
Автоматическая система обработки получена путем сборки элементов, которые известны специалистам в этой области, таких как инкубатор с управлением температурой, влажностью и CO, система пипеток для микропланшетов, объективы флуоресцентного и фазово-контрастного микроскопа, присоединенные к камере для получения изображений, такой как CMOS или CCD камера, управление элементами в целом или частично осуществляется с помощью программы, известной специалистам в этой области посредством присоединенного к ней аппаратного обеспечения.
В особенно предпочтительном варианте осуществления каждый микроканал 3 связан с впускным портом 8 и выпускным портом 10.
В предпочтительном варианте осуществления микрофлюидное устройство (1) также содержит емкости 6, 7, емкостями являются по меньшей мере одна емкость 6 для реагентов и по меньшей мере одна емкость 7 для одного или более биологических образцов. Емкости выбраны из группы, включающей: пластинки, одна или более пластинок с микролунками, такая как пластинка с 96 лунками, пробирки Эппендорфа. Емкостей 6 и 7 может быть 2 или 4, 8, 16, 24, 48, 96, 384.
В предпочтительном варианте осуществления, показанном на фиг. 3, 26, емкости 6, 7 встроены в систему 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания.
В другом варианте осуществления, показанном на фиг. 4, по меньшей мере один впускной порт 8 для реагентов также содержит область 11 хранения. В этом варианте осуществления реагенты и/или биологический образец расположены в области хранения до прохождения через впускной порт 8. Также выпускной порт 10 необязательно может содержать область 11 хранения. Область хранения предпочтительно расположена над впускным портом и в предпочтительном варианте осуществления предпочтительно состоит из двух участков: верхний участок 13 и нижний участок 14. Верхний участок 13 обладает цилиндрической формой, и нижний участок 14 имеет форму воронки, причем верхний участок 13 представляет собой цилиндр с основанием, диаметр которого больше диаметра впускного порта 8, и нижний участок 14 представляет собой воронку, которая соединяет верхний участок с впускным портом.
Область выпуска
В другом варианте осуществления, как показано на фиг. 27, область (70) выпуска, предназначенная для выпуска текучих сред из микрофлюидного устройства (1), которое содержит по меньшей мере одну впускную область (8), содержит емкость (12) для выпуска, соединенную по потоку текучей среды с микрофлюидным устройством (1) посредством по меньшей мере одного канала (22) выпуска и выпускного порта (10). В одном варианте осуществления текучая среды, проталкиваемая под давлением, приложенным к впускной области (8) в микрофлюидном устройстве (1), однонаправленно достигает емкости (12) для выпуска, причем объем V текучей среды меньше или равен объему емкости (12) для выпуска. Предпочтительно, как показано на фиг. 27A, канал (22) выпуска выходит по меньшей мере из одного микроканала (3), содержащегося в микрофлюидном устройстве (1), и представляет собой сифон.
Предпочтительно диаметр канала (22) выпуска такой, чтобы сифон оказывал капиллярное воздействие на текучую среду, содержащуюся в микроканале (3).
В другом варианте осуществления, показанном на фиг. 27C, канал (22) выпуска расположен на дне по меньшей мере одного микроканала (3), почти перпендикулярен ему и обеспечивает сообщение по меньшей мере одного микроканала (3) по потоку текучей среды с емкостью (12) для выпуска, которая расположена ниже этого микроканала (3).
В другом варианте осуществления, как показано на фиг. 27B, выпускной порт (10) расположен на дне по меньшей мере одного микроканала (3) и ведет в первую емкость (12a) для выпуска, расположенную ниже этого микроканала (3), и канал (22) выпуска, ведущий к емкости (12) для выпуска, выступает из первой емкости (12a) для выпуска. Предпочтительно, как показано на фиг. 27B, канал (22) для выпуска представляет собой сифон.
Канал (22) выпуска предпочтительно обладает площадью сечения с размерами несколько микрометров, например, от 100 мкм до 5 мм, предпочтительно от 500 мкм до 2 мм.
В особенно предпочтительном варианте осуществления набор по настоящему изобретению содержит микрофлюидное устройство, описанное выше.
Даже более предпочтительно набор по настоящему изобретению содержит микрофлюидное устройство, описанное выше, также отличающееся областью выпуска текучей среды, описанной выше.
В предпочтительном варианте осуществления, показанном на фиг. 25, микрофлюидное устройство (1) содержит впускную область (8), предназначенную для включения в набор по одному из п.п. 1-8 и область (70) выпуска по п. 10.
Следовательно, настоящее изобретение относится к способу загрузки/выпуска текучих сред из микрофлюидного устройства, способ включает:
a) обеспечение микрофлюидного устройства (1), содержащего впускную область (8) и область (70) выпуска по одному из п.п. 1-6, причем микрофлюидное устройство (1) загружено по меньшей мере первой текучей средой;
b) необязательно приложение давления по меньшей мере к первой текучей среде, попадающей в микрофлюидное устройство (1);
c) в альтернативном варианте размещение области (70) выпуска, в которой канал (22) выпуска обладает таким диаметром, чтобы текучая среда проходила из микрофлюидного устройства в канал выпуска за счет капиллярности;
способ отличается тем, что объем V по меньшей мере первой текучей среды меньше или равен объему емкости (12) для выпуска, по меньшей мере одна текучая среда однонаправленно достигает емкости (12) для выпуска.
В другом варианте осуществления способ дополнительно включает:
- введение второй или другой текучей среды через впускную область (8) в микрофлюидное устройство (1), причем первая, вторая и/или другая текучие среды независимо одинаковы или отличаются друг от друга и выбраны из группы, содержащей жидкости и газы;
- необязательно вторая и/или другая текучая среда полностью заменяет в микроканале (3) или в микроканале (3) и в открытых микролунках (2) с возможностью переворачивания, когда она присутствует в микрофлюидном устройстве (1), текучую среду, введенную ранее;
Способ отличается тем, что первая, вторая и/или другая текучие среды не смешиваются друг с другом.
В другом варианте осуществления, показанном на фиг. 26, микрофлюидное устройство (1) является микрофлюидным устройством (2) с открытыми микролунками с возможностью переворачивания и дополнительно содержит емкости (6) для реагентов и емкости (7) для одного или более биологических образцов.
В особенно предпочтительном варианте осуществления устройство содержит 16 микроканалов (3), каждый содержит впускную область (8) и выпускную область (10), причем каждый из микроканалов (3) обращен к 1200 открытым микролункам с возможностью переворачивания.
Помимо указанных выше преимуществ, следует отметить, что микрофлюидное устройство (1), которое содержит впускную область (8) по настоящему изобретению, особенно предпочтительно, поскольку оно:
- обеспечивает прямое сопряжение, т.е. без помощи затворов, микрофлюидного устройства с системами, обычно используемыми в этой области для управления и переноса жидкостей и газов;
- позволяет брать текучие среды с планшетов или из емкостей посредством введения их под давлением в микроканалы микрофлюидного устройства, причем объемы, применяемые в таких планшетах или емкостях больше или намного больше (например, 50 мкл или больше, 300 мкл, 1 мл или больше), чем объемы, типичные для микроканала (40 мкл или меньше), и перенос выполняется с помощью стандартных средств, уже широко используемых в сочетании с указанными выше планшетами или емкостями,
- позволяет последовательно вводить текучие средства в микрофлюидное устройство даже разного типа, без использования дополнительного оборудования, такого как насосы или клапаны.
Способ загрузки/выпуска текучей среды из микрофлюидного устройства
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается способ управления микрофлюидным устройством (1) с открытыми микролунками (2) с возможностью переворачивания, содержащим по меньшей мере одну впускную область (8), по меньшей мере одну выпускную область (10) и по меньшей мере один микроканал (3), способ включает:
- введение по меньшей мере первой текучей среды через впускную область (8) в микрофлюидное устройство (1);
- необязательно введение второй или другой текучей среды через впускную область (8) в микрофлюидное устройство (1), причем первая, вторая и другие текучие среды независимо друг от друга могут быть как одинаковы, так и отличаться ,и выбраны из группы, включающей жидкости и газы;
- необязательно вторая или другая текучая среда полностью заменяет в микроканале (3) или в микроканале (3) и в открытых микролунках (2) с возможностью переворачивания, текучую среду, введенную ранее;
- необязательно при отсасывании из впускной области (8) объема текучей среды, содержащейся в микроканале (3), текучая среда остается в микролунках (2).
В одном варианте осуществления способ осуществлен в микрофлюидном устройстве (1), содержащем впускную область (8) по одному из п.п. 1-8 и область (70) выпуска по п. 10, и отличается тем, что если полный объем первой и необязательно второй и другой текучих сред, введённый в микрофлюидное устройство (1), меньше, чем объем емкости (12) для выпуска, текучие среды не смешиваются друг с другом.
Способ высокоинформативного анализа биологических образцов
Неожиданно описанный в настоящем документе способ обеспечивает не только анализ с периодическим мониторингом, но также обработку при анализе с периодическим мониторингом. То есть при способе по настоящему изобретению можно не только отслеживать один и тот же образец в разные моменты времени (типичный анализ с периодическим мониторингом), но также манипулировать с одним и тем же образцом в разные моменты времени, при этом варьируя окружающие условия со временем автоматизированным образом. В качестве примера, в настоящем документе предлагается способ, позволяющий оценить для каждой отдельной клетки изменение морфологических и функциональных параметров после контролируемого воздействия фармакологического препарата, причем препарат добавляется во время такого отслеживания. В альтернативном варианте по тому же самому способу возможен динамический анализ образца, причем термин «динамический анализ» означает анализ образца, выполненный в разное время после воздействия интересующей терапии. Кроме того, при динамическом анализе, выполненном по настоящему изобретению, можно идентифицировать образец клетки, нечувствительный к терапии, чтобы воздействовать на него другим видом терапии. Заявленный в настоящем документе способ позволяет осуществить широкомасштабный высокоинформативный тест с обработкой с периодическим мониторингом независимо от оператора, при наличии оборудования, которое может быть установлено в любой аналитической лаборатории.
Способ по настоящему изобретению осуществлен в системе открытых микролунок с возможностью переворачивания, структура которых показана в качестве примера на фиг. 1. Система 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания содержит серию микролунок 2, открытых на обоих концах, расположенных в виде упорядоченной последовательности. Система 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания дополнительно содержит по меньшей мере один микроканал 3, причем по меньшей мере один микроканал 3 обладает площадью в сечении с размерами порядка нескольких микрон и обеспечивает текучую среду для микролунок 2. Система дополнительно содержит по меньшей мере один впускной порт 8 для реагентов и/или одного или более биологических образцов и по меньшей мере один выпускной порт 10, впускной и выпускной порты сообщаются по микропотоку текучей среды с одним или более микроканалами 3.
В особенно предпочтительном варианте осуществления, каждый микроканал 3 связан с впускным портом 8 и выпускным портом 10.
В предпочтительном варианте осуществления реагенты содержатся в емкостях 6, 7, причем этими емкостями являются по меньшей мере одна емкость 6 для реагентов и по меньшей мере одна емкость 7 для одного или более биологических образцов. Емкости выбраны из группы, включающей: пластинки, одну или более планшетов с микролунками, такую как планшет с 96 лунками, пробирки Эппендорфа. Емкостей 6 и 7 может быть 2 или 4, 8, 16, 24, 48, 96, 384.
В одном варианте осуществления, показанном на фиг. 2, емкости 6, 7 являются внешними по отношению к системе 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания. В предпочтительном варианте осуществления, показанном на фиг. 3, емкости 6, 7 встроены в систему 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания.
В другом варианте осуществления, показанном на фиг. 4, по меньшей мере один впускной порт 8 для реагентов также содержит область 11 хранения. В этом варианте осуществления реагенты и/или биологический образец расположены в области хранения до прохождения через впускной порт 8. Также выпускной порт 10 необязательно может содержать область 11 хранения. Область хранения предпочтительно расположена выше впускного порта и в предпочтительном варианте осуществления предпочтительно состоит из двух участков: верхний участок 13 и нижний участок 14. Верхний участок 13 обладает цилиндрической формой, и нижний участок 14 имеет форму воронки, причем верхний участок 13 представляет собой цилиндр с основанием, диаметр которого больше диаметра впускного порта 8, и нижний участок 14 представляет собой воронку, которая соединяет верхний участок с впускным портом.
Настоящее изобретение также относится к способу широкомасштабного высокоинформативного анализа биологических образцов, причем биологические образцы определены выше, способ включает, необязательно в указанном порядке:
a) обеспечение системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, которая содержит набор открытых микролунок 2, по меньшей мере один микроканал 3, по меньшей мере один впускной порт 8 для реагентов и/или одного или более биологических образцов и по меньшей мере один выпускной порт 10 для них, впускной и выпускной порты сообщаются по микропотоку текучей среды с одним или более микроканалами 3, причем микроканал 3 обладает площадью в сечении, размеры которого составляют несколько микрометров, и которое обеспечивает текучую среду для микролунок 2;
2
b) обеспечение системы автоматического управления системой открытых микролунок с возможностью переворачивания, которая содержит следующие особенности: инкубатор с регулируемой температурой, влажностью и CO, систему распределения текучей среды, систему сбора данных фазово-контрастных и флуоресцентных изображений;
c) размещение системы 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания в указанной автоматической системе;
d) загрузка реагентов через один или более впускных портов 8 для реагентов, причем реагенты включают: заполняющий буферный раствор и/или промывочный раствор и/или один или более лекарственных препаратов и/или один или более красителей, и/или один или более меченных антител и/или один или более маркеров жизнеспособности клеток;
e) загрузка одного или более биологических образцов через один или более впускных портов 8;
i) необязательно окрашивание клеток одним или более красителями и/или одним или более мечеными антителами и/или одним или более маркерами жизнеспособности клеток;
j) получение изображений от одной или более микролунок 2, причем изображениями являются полученные изображения в момент времени T0;
p) классификация показанных клеток, причем классификация проводится с морфологическими и/или функциональными параметрами, зарегистрированными по изображениям в момент времени T0.
В одном варианте осуществления система открытых микролунок с возможностью переворачивания представляет собой микрофлюидное устройство по п. 9; в другом варианте осуществления она является микрофлюидным устройством по п. 11, или микрофлюидным устройством 19, которое также содержит набор по одному из п.п. 1-8.
В одном варианте осуществления, когда реагенты и биологический образец содержаться в емкостях 6, 7, емкости 6, 7 являются внешними по отношению к системе 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания, как показано на фиг. 2, и загрузка реагентов и по меньшей мере одного биологического образца выполняется вручную, т.е. посредством автоматических систем распределения текучих сред, взятых из емкостей и загруженных во впускные порты 8. Предпочтительно емкости 6, 7 введены в автоматическую систему с открытыми микролунками с возможностью переворачивания.
В даже более предпочтительном варианте осуществления, показанном на фиг. 3, емкости 6, 7 встроены в систему 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания, и загрузка реагентов и по меньшей мере одного биологического образца выполняется вручную, т.е. посредством автоматических систем распределения текучих сред, взятых из емкостей и загруженных во впускные порты 8. В альтернативном варианте емкости 6, 7, встроенные в систему 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания, сообщаются по потоку текучей среды по меньшей мере с одним впускным портом 8.
Также, когда впускной порт 8 содержит область 11 хранения, емкости 6, 7 расположены, как указано выше, т.е. они являются внешними или встроенными в систему открытых микролунок с возможностью переворачивания.
В предпочтительном варианте осуществления некоторые из емкостей 6 предварительно загружены реагентами перед осуществлением способа, даже за несколько суток или месяцев до его осуществления, чтобы иметь особые готовые для использования емкости 6. В этом варианте осуществления единственным ручным этапом, требуемым от оператора, является предварительная загрузка биологического образца в одну или более емкостей 7.
В другом предпочтительном варианте осуществления, помимо указанного этапа загрузки биологического образца, другим ручным этапом, выполняемым оператором, является загрузка одного или более лекарственных препаратов в одну или более емкостей 6.
В предпочтительном варианте осуществления емкости 6, 7, встроенные или внешние по отношению к системе открытых микролунок с возможностью переворачивания, заранее загруженные реагентами и биологическим образцом, вводятся в автоматическую систему. В этом варианте осуществления этапы загрузки d) и e) через впускные порты также упоминаемые, как впускные области (8), происходят после этапа c) введения в автоматическую систему системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, в которую встроены емкости 6, 7, или систему открытых микролунок с возможностью переворачивания и емкостей 6, 7, внешних по отношению к ней, предпочтительно посредством автоматического забора биологического образца из емкости (7) и последующего расположения клеток, содержащихся в нем, в одну или более микролунок (2) и необязательно последующего введения лекарственных препаратов в одну или более микролунок и/или красителей, и/или одного или более меченых антител, и/или одного или более маркеров жизнеспособности клеток, причем красители и/или одно или более из меченых антител и/или маркеров жизнеспособности клеток подаются на впускные порты (8) из емкости (6).
Указанная морфологическая/функциональная классификация происходит по анализу флуоресценции с разрешением в одну клетку, одно клеточное скопление или всю клеточную популяцию, которая содержится в одной микролунке.
Указанные параметры получают и анализируют автоматически, посредством использования систем, известных специалистам в этой области.
Под термином «морфологические параметры» подразумеваются меры, относящиеся к размеру и форме клетки. Под «функциональными параметрами» подразумеваются особенности, наблюдаемые за счет маркеров, такие как экспрессия специфических антител.
В предпочтительном варианте осуществления способ также включает, после введения системы открытых микролунок с возможностью переворачивания в автоматическую систему:
f) заполнение по меньшей мере одного микроканала 3 заполняющим буферным раствором;
g) получение изображений от одной или более микролунок (2), либо по отдельности, либо подгруппами, причем изображения представляют собой определенные изображения исходного уровня (исходный уровень по времени T);
и, на этапе классификации p), классификацию выполняют с морфологическими и/или функциональными параметрами, зарегистрированными путем сравнения изображений в момент времени T0 с изображениями исходного уровня.
Даже более предпочтительно способ дополнительно включает:
k) распределение одного или более лекарственных препаратов, по отдельности или в комбинации, причем указанные лекарственные препараты предпочтительно забираются автоматическим способом из емкости 6 и распределяются в одну или более микролунок 2;
l) Инкубирование.
В этом варианте осуществления способ позволяет, например, анализ в условиях ex-vivo активности лекарственного препарата, причем классификация клеток, присутствующих в биологическом образце, выполненная на этапе p), обеспечивает непосредственное сравнение между, например, восприимчивостью к терапии здоровых клеток и раковых клеток, присутствующих в одном и том же биологическом образце, или сравнение ответа одного и того же типа клеток на разную терапию.
В даже более предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает, после этапа 1):
m) получение по меньшей мере двух изображений от одной или более микролунок 2, в разное время в течение инкубации, причем изображения обозначены T1, T2, Tn, где n – любое число равное или больше 2, предпочтительно 1000 или 100, даже более предпочтительно 25, в предпочтительном варианте осуществления - 9;
n) необязательно между получением изображений T1, T2, Tn, дополнительное окрашивание клеток одним или более красителями и/или одним или более мечеными антителами и/или одним или более маркерами жизнеспособности клеток;
o) необязательно между получением изображений T1, T2, Tn, дополнительное распределение одного или более лекарственных средств в микролунке 2 или в одной или более подгруппах микролунок 2, по отдельности или в комбинации;
и классификация по этапу p) включает сравнение морфологических и/или функциональных параметров, зарегистрированных по изображениям T0, T1, Tn и необязательно исходного уровня T.
Даже более предпочтительно способ дополнительно включает, после этапа классификации p):
q) анализ жизнеспособности клеток, анализ является специфичным для клетки, или выполняется на уровне скоплений клеток или с учетом всей популяции клеток, содержащихся в одной из микролунок 2.
В предпочтительном варианте осуществления на этапе k) лекарственные препараты распределяются по меньшей мере в двух разных концентрациях, и анализ жизнеспособности клеток, когда он проводится, приводит к получению кривой специфической для клетки дозы/ответа для одного или более проверенных лекарственных препаратов.
Необязательно разбавление каждого лекарственного препарата подготовлено системой распределения жидкости путем смешивания лекарственного препарата с разбавителем.
В другом варианте осуществления способ включает, после получения изображений на этапе j), подсчет среднего числа клеток в каждой микролунке 2 и последующее разбавление образца через систему распределения текучей среды, чтобы получить целевую концентрацию, т.е. концентрацию, которая обеспечивает нужное число клеток для каждой микролунки, и последующую загрузку разбавленного таким образом образца в один или более микроканалов системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, причем микроканалы отличаются от одного или более каналов, используемых на указанном выше этапе d).
На этапе k), если требуется комбинированное назначение по меньшей мере двух лекарственных препаратов, два или более лекарственных препаратов необязательно скомбинированы системой распределения жидкости путем смешивания перед загрузкой содержимого по меньшей мере двух емкостей 6, содержащих указанные лекарственные препараты.
Способ отличается тем, что в нем используется биологический образец, объем которого составляет в диапазоне от 1 мкл до 1 мл, предпочтительно от 10 до 100 мкл, с концентрацией от 5000 до 5000000 клеток/мл.
В предпочтительном варианте осуществления заполняющий буферный раствор содержит среду RPMI, дополненную 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и предпочтительно маркером гибели клеток, обычно 5 мкмоль пропидиум иодида (PI).
Система 1 открытых микролунок с возможностью переворачивания, которая показана на фиг. 1 в перспективе (a), вертикальном разрезе (b) и на виде сверху (c), и на фиг. 5 на виде в перспективе в разрезе, в предпочтительном варианте осуществления содержит 1200 микролунок 2 на каждый микроканал 3 и 16 микроканалов 3; в другом варианте осуществления она содержит 500 микролунок 2 и 5 микроканалов 3.
В предпочтительном варианте осуществления способ позволяет анализировать биологический образец, который содержит только примерно 10-20 клеток, и используется система открытых микролунок с возможностью переворачивания описанного в публикации WO2012/072822 типа.
В предпочтительном варианте осуществления биологический образец получен у животного и/или человека, больного раком, и указанный биологический образец содержит здоровые клетки и раковые клетки.
Все клетки будут высвечены на изображениях, полученных при фазовом контрасте и/или, если эти клетки окрашены красителем, в канале флуоресценции, таком как DAPI, если красителем является CMAC (7-амино-4-хлорметилкумарин). Другие красители, которые могут быть использованы в этом способе, могут быть выбраны из группы, содержащей: кальцеин-AM, карбоцианин, такой как DiD, DiO, DAPI (4’, 6-диамидино-2-фенилиндол). Другими красителями, которые могут быть использованы для целей настоящего способа, являются маркеры гибели клеток, такие как PI (пропидиум иодид), кальцеин-AM, JC1, каспаза 3/7, аннексин V. В другом варианте осуществления, в качестве красителей используются меченые антитела.
В особенно предпочтительном варианте осуществления способ включает повторение терапии, когда клетки, которые выживают при первом воздействии одного или более лекарственных препаратов, перечисленных на этапе k), подвергаются повторному воздействию терапии с другим лекарственным препаратом, причем дополнительная терапия включает воздействие одного или более уже использованных на этапе k) лекарственных препаратов при более высокой концентрации, или же на дополнительном этапе используется одно или более лекарственных препаратов, отличающихся от использованных на предыдущем этапе.
Повторение способа происходит в одном варианте осуществления на клетках, которые остаются живыми в одной или более микролунках 2, при этом дополнительная особая терапия может быть возможна, поскольку в системе открытых микролунок с возможностью переворачивания микроканал 3 освобождается от текучей среды, содержащей один или более лекарственных препаратов, и впоследствии заполняется второй текучей средой, содержащей другой один или более лекарственных препаратов. Оставшиеся клетки расположены на мениске на границе раздела воздух/текучая среда, и не подвергаются воздействию изменения текучей среды в микроканале. Клетки, расположенные на мениске, даже если они не являются клетками, растущими в состоянии адгезии, с жидкостной точки зрения ведут себя, как клетки, растущие в состоянии адгезии на дне закрытой лунки, где обычно можно заменить культурную среду без воздействия на эти адгезировавшие клетки. Преимущество настоящего варианта осуществления состоит и в том, что его можно использовать с клетками, которые растут в суспензии, когда мениск позволяет имитировать дно лунки без наложения принудительной адгезии на указанные клетки, например, за счет подложек, которые моделируют адгезию клеток, известное специалистам в этой области. Это особенно предпочтительно, поскольку обеспечивает наименьшее воздействие на биологический образец, предотвращая наложение внешних условий, отличающихся от физиологического контекста.
В предпочтительном варианте осуществления способ включает в указанном порядке:
a) обеспечение системы (1) открытых микролунок с возможностью переворачивания, которая содержит множество открытых микролунок (2), по меньшей мере один микроканал (3), по меньшей мере один впускной порт (8) для реагентов и/или одного или более биологических образцов и по меньшей мере один выпускной порт (10) для них, впускные и выпускные порты сообщаются по микропотоку текучей среды с одним или более микроканалами (3), причем микроканал (3) обладает площадью в сечении с размерами несколько микрометров и обеспечивает текучую среду в микролунки (2);
2
b) обеспечение системы автоматического управления для системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, которая содержит следующие особенности: инкубатор с регулируемой температурой, влажностью и CO, систему распределения текучей среды, систему сбора данных фазово-контрастных и флуоресцентных изображений;
c) размещение системы (1) открытых микролунок с возможностью переворачивания в автоматической системе;
f) необязательно заполнение по меньшей мере одного микроканала (3) заполняющим буферным раствором;
g) необязательно получение изображений от одной или более микролунок (2), по отдельности или подгруппами, причем указанные изображения определяются, как изображения исходного уровня;
d) загрузка реагентов через один или более из впускных портов (8), реагенты включают: заполняющий буферный раствор и/или промывочный раствор и/или один или более лекарственных препаратов и/или один или более красителей, и/или один или более меченых антител и/или один или более маркеров жизнеспособности клеток, и реагенты содержаться в емкостях (6) для реагентов;
e) загрузка одного или более биологических образцов через один или более указанных впускных портов (8), причем один или более биологических образцов содержаться в емкостях (7) для биологических образцов;
i) необязательно окрашивание клеток одним или более красителями и/или одним или более мечеными антителами и/или одним или более маркерами жизнеспособности клеток;
j) получение изображений от одной или более микролунок (2), изображения обозначаемы с T0;
k) распределение одного или более лекарственных препаратов через порты (8) в одну или более микролунок (2);
l) Инкубирование;
m) получение по меньшей мере двух изображений от одной или более микролунок (2) в разное время в течение инкубации, причем изображения обозначены, как изображения T1, T2, Tn, где n – любое число, равное или больше 2, предпочтительно 1000 или 100, даже более предпочтительно 25, в предпочтительном варианте осуществления - 9;
n) необязательно между получением изображений T1, T2, Tn дополнительное окрашивание клеток одним или более красителями и/или одним или более мечеными антителами и/или одним или более маркерами жизнеспособности клеток;
o) необязательно между получением изображений T1, T2, Tn дополнительное распределение одного или более лекарственных препаратов в микролунку (2) или в одну или более подгрупп микролунок (2), по отдельности или в комбинации;
p) классификация показанных клеток, классификация выполняется с морфологическими и/или функциональными параметрами, зарегистрированными по изображениям T0, T1, Tn и, необязательно, исходного уровня T.
Раковые клетки идентифицируются по параметрам размера и формы, таким как неровность мембраны, и посредством связывания меченого антитела, специфического для антигенов опухоли, когда наличие или отсутствие определенного сигнала, испускаемого одним или более специфическими мечеными антителами, определяет идентификацию типа клетки. Например, если исследуемой опухолью является лимфома, используется антитело анти-CD38 для дифференциального анализа клеток опухоли; если исследуемой опухолью является острая миелоидная лейкемия (AML), используется антитело анти-CD34, или анти-CD117, или анти-HLA-DR, или анти-CD33/CD14.
В предпочтительном варианте осуществления тестируемые лекарственные препараты выбирают из моноклональных антител, включая, например, алемтузумаб, бевацизумаб, цетуксимаб, ибритутомаб, офатумумаб, панитумумаб, ритуксимаб, тоситумомаб, трастузумаб, лекарственных препаратов для химиотерапии, такие как цитарабин, идарубицин, флударабин, децитабин, 5-азацитидин и малых молекул, таких как ибрутиниб, идасанутлин, венетоклакс, причем в способе по настоящему изобретению измеряется комплемент-опосредованная цитолитическая активность в случае моноклональных антител, или прямая цитотоксическая активность в случае лекарственных препаратов для химиотерапии и малых молекул.
Автоматический анализ изображений, полученных с помощью способа по настоящему изобретению, позволяет получить информацию, относящуюся к каждой отдельной клетке или кластеру клеток, отснятых на полученных изображениях.
В конце способа клетки, содержащиеся в микролунках, могут быть собраны и использованы для последующего анализа. В частности, описанный в настоящем документе способ позволяет выбрать одну или более лунок, в которых содержаться особенно интересующие клетки, такие как резистентные к воздействию лекарственных препаратов клетки, введенные в конкретный микроканал, перенести эти клетки в емкость (7) системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, развести их путем большего разбавления, чтобы получить микролунки, содержащие одну клетку. Когда нужная клетка идентифицирована, ее можно выделить. Тесты проводятся на одной или более выделенных клетках, как известно специалистам в этой области, например, RT-PCR.
Биологический образец может быть загружен или получен/извлечен, или он может быть обработан заранее, чтобы он был доступен для способа по настоящему изобретению. В частности, когда это образец крови или костного мозга, обработка предпочтительно включает этап сепарации эритроцитов по способам, известным специалистам в этой области, предпочтительно по градиенту плотности или путем использования буфера для лизиса. Когда образец содержит суспензию клеток, клетки подсчитываются и разбавляются до достижения концентрации для распределения. В альтернативном варианте этап счета и разбавления выполняется системой автоматически. Если образец получен биопсией, обработка обычно включает выделение фрагмента размером от 10 до 1000 мкм, который совместим с используемым микрофлюидом.
В альтернативном варианте осуществления используемый биологический образец выделен из животного и/или человека.
На фиг. 6 показан пример серии изображений, полученных в момент времени T1, биологического образца, содержащего лейкозные клетки из клеточной линии, смешанной с кровью, полученной у здорового донора. Следовательно, биологический образец содержит здоровые PBMC (мононуклеарные клетки периферической крови) и раковые клетки. Изображение получают в канале видимого света (A), в флуоресцентном канале DAPI с красителем (B), в флуоресцентном канале FITC для сигнала меченого анти-CD45 антитела (C) и в флуоресцентном канале CY5 для меченого анти-CD34 антитела (D). Наконец, на (E) показано наложение изображений (C) и (D). Продемонстрировано, что способ обладает высокой чувствительностью и высокой специфичностью будучи примененным для классификации клеток, как показано на изображении (E), на котором обнаружены все клетки, присутствующие в образце, а именно клетки с изображения (B), причем всеми клетками являются только CD45 положительные (C), и только их часть является также Cd34 положительной (D). Путем анализа клеток по морфологическим (диаметр клетки) и функциональным параметрам (экспрессия CD45, CD34) получена правильная классификация почти для всех клеток опухоли, как показано на фиг. 7, на котором четко видно, что маркер CD34 является параметром, который позволяет идентифицировать клетки опухоли с высокой чувствительностью и специфичностью, что очевидно по кривой ROC, для которой площадь под кривой получена равной 99,8% клеток, которые существуют фактически (кривая CD34 ROC). При использовании параметра CD45 получена кривая равная 85,2%, что показывает более низкую чувствительность и специфичность. В этом эксперименте показано, что для исследуемого типа опухоли CD34 является предпочтительным маркером и обеспечивает чрезвычайно точный анализ популяции клеток.
На фиг. 8 приведены кривые анализа полученных данных, относящихся к классификации раковых клеток. На (C) показано распределение клеток, окрашенных красителем CMAC и не окрашенных антителами анти-CD34/CD45. Это распределение позволяет определить максимальный сигнал, идентифицированный в таком отрицательном контроле, и в результате установить минимальный порог для классификации. Далее, на (D) подсчет выполнен после введения метки анти-CD34/CD45, с учетом порога, идентифицированного на (C) и классифицируя клетки, характеризующиеся сигналом, испускаемым антителом выше порога, в качестве раковых клеток. В частности, раковые клетки могут быть классифицированы, как таковые, поскольку они положительны к антителу анти-CD34 (CD34+), и поскольку они положительны и к антителам анти-CD34 и анти-CD45 (CD34+/CD45+). В качестве контроля способа на полях (A) и (B) показаны результаты, полученные посредством проточной цитометрии на тех же самых образцах. Эти результаты показывают, что данные, полученные по способу настоящего изобретения, полностью совместимы с полученными для того же образца посредством проточной цитометрии, которая является предпочтительным способом для этого типа анализа и счета клеток.
Для целей мониторинга жизнеспособности клеток на этапе i) клетки окрашивали маркерами жизнеспособности клеток. В качестве примера, пропидиум иодид (PI) или аннексин V являются часто используемыми для подобного маркерами: если мембрана повреждена, PI попадает в клетки и испускает флуоресцентное излучение после связывания нуклеиновых кислот. Следовательно, меченые клетки – это клетки с поврежденной или разрушенной мембраной, и их следует рассматривать, как мертвые. Другим широко используемым маркером жизнеспособности клеток является кальцеин-ацетоксиметил (кальцеин-AM) (Lichtenfels R et al., CARE-LASS calcein-release-assay, an improved fluorescence-based test system to measure cytotoxic T lymphocyte activity. J Immunol. Methods 1994, 172:227–239). Кальцеин ацетоксиметиловый эфир пассивно проходит через клеточную мембрану, и когда он внутри, преобразуется внутриклеточной эстеразой в кальцеин, который является полярным флуоресцентным продуктом, удерживаемым в жизнеспособных клетках, но выбрасывается клетками, мембрана которых повреждена, и которые, следовательно, считаются мертвыми.
На фиг. 9A-9B показан пример анализа, выполненного на биологическом образце, который включает клеточную линию лимфомы, клетки Raji и лейкоциты. В исследованных образцах обработку красителем, особенно ритуксимабом, выполняли по способу настоящего изобретения. В поле (A) показана способность способа по настоящему изобретению дифференцировать раковые клетки (кружки) и здоровые клетки (квадратики), используя морфологические параметры и CD38 маркер одновременно. В поле (B) показаны данные жизнеспособности клеток, полученные при количественной оценке присутствия кальцеина-AM в клетке, в частности, путем сравнения сигнала, испущенного после терапии с лекарственным препаратом, с сигналом, испущенным первоначально, причем снижение сигнала было связано с потерей жизнеспособности. В этом случае референтный порог определяется с помощью контроля, которым является канал, в котором образец не подвергается воздействию лекарственного препарата. В альтернативном варианте, в литературе в отношении физиологической потери сигнала приведены следующие ссылки (Neri S et al., Calcein-Acetyoxymethyl Cytotoxicity Assay: Standardization of a Method Allowing Additional Analyses on Recovered Effector Cells и Supernatants. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001, 8:1131–1135).
На фиг. 9C приведены кривые дозы/ответа, полученные для другой модели, состоящей из лейкозных клеточных линий (KG-1, Kasumi-1 и HL-60), для которых выполняли анализ ответа для лекарственного препарата для химиотерапии идарубицином. Результаты показывают 3 различных уровня ответа, наблюдаемые, например, посредством различных измеряемых величин IC50, указанных штриховыми вертикальными линиями: чувствительный (IC50 = 0,0049 мкмоль), чувствительный в среднем (IC50 = 0,0218 мкмоль) и резистентный (IC50 = 0,2127 мкмоль).
В качестве примера биологический образец, полученный при извлечении при раке печени, может быть использован в настоящем способе после частичного неферментативного расщепления. В биологический образец затем вводится метка, и он загружается в емкости. За время менее часа после извлечения система открытых микролунок с возможностью переворачивания готова для анализа и содержит клеточные кластеры и изолированные клетки. Эта возможность оценки влияния лекарственных препаратов также на клеточные кластеры очень предпочтительна, поскольку она также обеспечивает оценку любых изменений объема этого кластера, помимо меченых по разному областей в этом кластере. Также можно получить изображения на других фокальных плоскостях, что позволяет реконструировать 3D изображение кластера.
На фиг. 10 показана схема системы открытых микролунок с возможностью переворачивания, которая также содержит электроды 5, расположенные вокруг микролунок 2 и на основании микроканала 3. Электроды 5 обладают функцией перевода клеток 4, присутствующих в микроканале 3, в микролунку 2 в нужное время и в нужном режиме. Таким образом, электроды способствуют формированию клеточных кластеров внутри микролунок, следовательно, обеспечивая анализ, в котором также учитываются специфические клетки: клеточные взаимодействия.
Преимущества
Описанный в настоящем документе способ облегчает подход персонализированной медицины, который остро необходим, особенно при вмешательстве при опухолевых заболеваниях. Действительно, описанный в настоящем документе способ неожиданно обеспечивает тестирование на биологическом образце ex-vivo, даже на содержащем всего несколько клеток, например, всего около 10-20 клеток, если система открытых микролунок с возможностью переворачивания, используемая в указанном способе, относится к типу, описанному в публикации WO2012/072822, влияние различных лекарственных препаратов обеспечивать выбор наиболее эффективного лекарственного препарата для конкретного пациента и/или оптимальную дозу для конкретного пациента и/или определение резистентности образца пациента к одному или более типам лекарственной терапии. Анализ выполняется сразу же после получения биологического образца и завершается за период примерно 24 часа. Короткий срок не позволяет клеткам в биологическом образце претерпеть значительных изменений их функциональности, жизнеспособности и экспрессии генов, со ссылкой на их особенности в условиях ex-vivo. Скорость, с которой можно получить данные, позволяет использовать тот же самый способ в клинических ситуациях, для которых необходимо быстро принимать решения, например, при острой лейкемии.
Кроме того, с учетом того, что требуется небольшой биологический образец, указанный способ применим без значительного влияния на процедуру операции, поскольку при нем не требуется специального извлечения. Например, если используется кровь, обычно достаточен объем менее 1 мл. В случае костного мозга объемы, равные 1 мл, обычно достаточны для проведения нескольких тестов, т.е. 0,1 мл или менее для проведения одного теста. Образец при аспирации иглой может обеспечивать достаточно материала.
Разработанный в настоящем документе способ позволяет использовать сложные образцы, включая клеточные образцы и образцы сыворотки, с большим преимуществом с точки зрения условий, как можно более близких к физиологическим, чтобы улучшить прогностическую ценность теста.
Описанный в настоящем документе способ обеспечивает высокоинформативный анализ с разрешением до одной клетки, выполнение и динамического анализа (периодический мониторинг), и динамической обработки образца (с использованием программируемого изменения текучих сред, окружающих образец с течением времени), что является весьма предпочтительными особенностями, поскольку они обеспечивают мониторинг и сравнение изменения со временем данной клетки со специфическими свойствами, автоматическую подготовку образца и назначение лекарственных препаратов, и осуществление сложных протоколов, включающих, например, введение последовательностей лекарственных препаратов или введение меток со специфическими реагентами, такими как аннексин V, в конце периода инкубирования лекарственного препарата для определения исхода эксперимента с точки зрения жизнеспособности, вызывания апоптоза или оценки активации специфических путей, связанных с активностью лекарственного препарата.
Среди многих приложений, для которых описанный в настоящем документе способ является особенно функциональным, можно упомянуть возможность сравнения, быстро и автоматически, ответа раковых клеток пациента на специфическую терапию и средний ответ раковых клеток популяции пациентов, страдающих от одного и того же типа опухоли. Кроме того, существует возможность сравнения ответа раковых клеток пациента на специфическую терапию со средним ответом клеточных линий, относящихся к одному и тому же типу опухоли и/или к разным типам опухолей, таким как упомянутые в литературе.
Способ полностью автоматический, вмешательство оператора минимально, т.е. только при загрузке биологических образцов и реагентов и лекарственных препаратов в емкости. В некоторых вариантах осуществления вмешательство ограничено только загрузкой биологического образца, когда система открытых микролунок с возможностью переворачивания содержит емкость, уже загруженную реагентами и лекарственными препаратами, минимизируя, таким образом, ошибки, снижая риск перекрестного загрязнения и значительно повышая воспроизводимость результатов. Также можно загрузить биологический образец таким, какой он есть, без подготовки: система сама может зарегистрировать число содержащихся в нем клеток, разбавить их до оптимального разбавления и распределить их в интересующие микролунки.
В варианте осуществления, содержащем электроды в микролунках, можно получить особые группы клеток в отдельных микролунках, чтобы оценить связанные с клетками механизмы действия.
В качестве другого преимущества следует отметить, что при работе в микрометрическом масштабе потребление реагентов и лекарственных препаратов также ограничено, например, лекарственные препараты разбавляются в объемы всего лишь 20-50 мкл со значительной экономией по отношению к требованиям при работе на больших объемах, преимущество особенно очевидно, когда используются очень дорогие лекарственные препараты или на этапе разработки лекарственного препарата, когда его наличие может быть ограничено, особенно в случае биологических лекарственных препаратов.
В особенно предпочтительном варианте осуществления предлагается способ широкомасштабного высокоинформативного анализа биологических образцов, включающий, необязательно в указанном порядке:
a) обеспечение набора по п. 9 или 10;
2,
b) обеспечение автоматической системы управления системой открытых микролунок с возможностью переворачивания, которая содержит следующие особенности: инкубатор с регулируемой температурой, влажностью и CO систему распределения текучей среды, систему сбора данных фазово-контрастных и флуоресцентных изображений;
c) размещение системы (1) открытых микролунок с возможностью переворачивания в автоматической системе;
d) загрузку реагентов через один или более впускных портов (8), причем реагенты содержат: заполняющий буферный раствор и/или промывочный раствор и/или один или более лекарственных препаратов и/или один или более красителей, и/или одно или более меченых антител и/или один или более маркеров жизнеспособности клеток;
d) загрузку одного или более биологических образцов через один или более впускных портов (8);
e) необязательно окрашивание клеток одним или более красителями и/или одним или более мечеными антителами и/или одним или более маркерами жизнеспособности клеток;
f) получение изображений от одной или более микролунок (2), причем эти изображения обозначаемы с T0;
g) классификацию показанных клеток, классификация выполняется с морфологическими и/или функциональными параметрами, зарегистрированными по изображениям T0.
Пример 1. Оценка эффективности ритуксимаба на клетках неходжкинской лимфомы
5
2
Клетки: использовали клетки лимфомы SU-DHL-4 и клетки Raji (ATCC CCL-86). 3•10 клеток/мл инкубировали в среде RPMI с добавлением 10% FBS, 1% пуромицина/стрептомицина при температуре 37°C, относительной влажности 95%, 5% CO. Число клеток увеличивали, разделив их при достижении конфлюентности. PBMC выделяли из крови центрифугированием с градиентом. Цельная кровь здоровых доноров была получена в пробирках, обработанных антикоагулянтами в соответствии с постановлением «Этические принципы и указания по защите исследуемых людей». Выделенные PBMC промывали дважды 10 мл холодного HBSS после лизиса эритроцитов. Концентрация клеток и их жизнеспособность определяли с трипановым синим на счетной камере. Концентрацию регулировали до 1 миллиона клеток/мл.
Различные партии SU-DHL-4 или клетки Raji брали для исследования на пике их роста, промывали с PBS и считали в гемоцитометре с использованием трипанового синего. Концентрацию клеток регулировали до 1 миллиона клеток/мл, и их помечали кальцеином AM (CAM) 5 нмоль для проточной цитометрии и 250 нмоль для тестов по настоящему изобретению. Меченые клетки промывали один раз в PBS и повторно суспендировали с RPMI. Использовали тот же протокол для введения меток со свежевыделенными CAM PBMC. Жизнеспособность клеток была в заключение оценена по PI и проточной цитометрии.
Проточная цитометрия (сравнительная)
5
10 меченых CAM клеток для каждой партии высевали в двух экземплярах на пластинке с 96 лунками. Контрольную группу (CTRL) обрабатывали RPMI с добавлением PI до окончательной концентрации 1,5 мкмоль. Обрабатываемую группу обрабатывали ритуксимабом (RTX) до заключительной концентрации 10 мкг/мл в RPMI с добавлением PI до заключительной концентрации 1,5 мкмоль и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Сразу после этого сыворотку человека (hS) добавляли до заключительной концентрации 1%. Окончательный объем каждой лунки составил 200 мкл. 50 мкл образцы собирали в моменты времени 0, 30 и 60 мин после добавления hS и анализировали на FACS (FACSAria BD, USA).
Тесты на открытых лунках
6
Различные партии меченых CAM клеток повторно суспендировали в RPMI до заключительной концентрации 2·10/мл. Аналогично процедуре, за которой следует проточная цитометрия, группу RTX обрабатывали ритуксимабом до заключительной концентрации 10 мкг/мл без крошки и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Клетки CTRL и RTX высевали в систему открытых микролунок с возможностью переворачивания, как указано выше, получая оптимальное число равное или меньшее 7 клеток на лунку. Каналы промывали PBS на 20% FBS. Первый набор изображений получали для установления начальных условий (исходный уровень T). После загрузки канал CTRL обрабатывали RPMI, объединенным с hS, до заключительной концентрации 1% и PI при концентрации 5 мкмоль. Канал RTX обрабатывали RPMI с добавленным ритуксимабом 10 мкг/мл, HS 1% и PI 5 мкмоль. Изображения T1, T2, T3, T4 с периодическим мониторингом получали каждые 15 мин и до одного часа после обработки.
Микроскопия
2
Изображения получали в ярком поле (BF) для оценки морфологических характеристик, а затем при флуоресценции для оценки сигнала в полосах DAPI (ex: 360/40 нм, em: 460/50 нм), FITC (ex: 480/30 нм, em: 535 / 40 нм), TRITC (ex: 540/25 нм, em: 605/55 нм). Все изображения получали с 10x объективом камеры Nikon. При получении изображений микроскоп использовался в контролируемой атмосфере при температуре 37°C, влажности 95%, 5% CO.
Дисплей
Раковые клетки SU-DHL-4 были помечены CAM, а затем загружены в системы открытых микролунок, обработанных лекарственным препаратом в случае группы RTX, затем проводили наблюдения.
Результаты показаны на фиг. 11. В поле A показана последовательность изображений периодического мониторинга обработанных CTRL и RTX образцов в моменты времени T0 5-10 мин, T1 30 мин и T3 60 мин. Клетки, указанные стрелками, относятся к цвету, полученному в канале TRITC (PI), и представляют мертвые клетки. Они присутствуют только в моменты времени T2 и T3 в группе RTX. С большим контрастом видны клетки, полученные в канале FITC, т.е. живые клетки, меченые кальцеином-AM. В поле B показаны данные, полученные с FACS. В поле C показаны гистограммы анализа FACS и по способу настоящего изобретения в момент времени T2 60 минут. Процентное соотношение относится к популяции клеток, положительных по отношению к кальцеину-AM, т.е. живых клеток. Как показано, данные, полученные двумя способами, полностью сравнимы. В качестве подтверждения данные представлены линейным образом на фиг. 12, что приводит к выводу, что система по настоящему изобретению может быть использована для количественной оценки живых и мертвых клеток с течением времени, обеспечивая данные, эквивалентные выбранному в настоящее время способу, т.е. проточной цитометрии, со всеми преимуществами возможностей высокоинформативного анализа, не присущими проточной цитометрии.
Способ по настоящему изобретению дополнительно позволяет получить важные результаты, недостижимые при проточной цитометрии. Во-первых, наблюдалось, что в смеси раковых клеток Raji и PMBC благодаря введению метки CD38 возможно окрашивание и селективное наблюдение раковых клеток. Для этого раковые клетки Raji и PBMC помечали CAM и антителом анти-CD38 алекса-флюор Alexa Fluor 488 1:10, по отдельности. Часть клеток затем была смешана в соотношении 1:1. Клетки Raji, PMBC и смесь затем размещали на пластинках в трех разных каналах системы открытых микролунок с возможностью переворачивания и наблюдали. Как показано на фиг. 13, раковые клетки, высвеченные в поле A селективного окрашивания антителом анти-CD38 по сравнению ко всеми клетками, окрашенными CAM, легко выделяются по способу настоящего изобретения не только при использовании флуоресценции, связанной со специфическим маркером (поле C), но также по морфологическим параметрам (поле B и D).
Получение изображений с периодическим мониторингом обладает преимуществом обеспечения точного анализа каждого клеточного ответа на представленный стимул, например, посредством обработки лекарственными препаратами, причем точный анализ достигается путем оценки относительного изменения флуоресценции, которая в случае окрашивания красителем для прижизненной окраски, обеспечивает средство для определения клеточного ответа. Даже когда исходное окрашивание неравномерно, сигнал от каждой клетки затем нормализуется относительно его исходной величины. При сравнении абсолютный анализ флуоресценции после применения терапии, как обычно, обеспечивается посредством проточной цитометрии, в этом случае обеспечивает менее точный результат.
Например, на фиг. 14 сравнивается распределение, полученное путем динамического анализа, т.е. изменения флуоресценции в поле A, относительно распределения данных, полученных в абсолютных значениях, в поле B. Первое распределение на фиг. 14A получено по описанному в настоящем документе способу на клетках Raji после воздействия ритуксимаба. Клетки, обнаруживающие сниженное изменение интенсивности сигнала, представляют субпопуляцию возможно резистентных клеток, или клеток, которые претерпели наименьшее повреждение. Путем использования этого распределения были выбраны клетки, для которых изменение было меньше 45% уменьшения, они обозначены звездочкой (*) на чертеже и проанализированы в рамках анализа, показывающего изменение в абсолютных значениях (фиг. 14B). В частности, на этом чертеже столбцы, помеченные звездочкой, указывают на присутствие по меньшей мере одной клетки, идентифицированной, как резистентная по предыдущему анализу. Как показано на фиг. 14B, абсолютный анализ не предусматривает средства идентификации клеток с малым повреждением с той же точностью, что и способ, показанный на фиг. 14A, на что указывает тот факт, что имеется столбец слева на гистограмме, который показывает поднабор клеток с минимальной абсолютной интенсивностью, но которые не классифицируются, как резистентные в соответствии с относительным анализом, действительно, столбец не помечен звездочкой. Аналогичным образом, на правой стороне графика показаны клетки, которые, несмотря на высокую интенсивность сигнала, обнаружили значительную потерю сигнала и, следовательно, должны рассматриваться, как чувствительные к терапии в соответствии с относительным анализом.
Пример 2. Автоматический способ введения меток, анализ с периодическим мониторингом
Клетки загружаются в микролунки 2 открытой системы микролунок с возможностью переворачивания. Среда, в которой содержались такие клетки, затем удаляется путем серии повторяющихся промываний, причем такие промывания происходят путем пропускания через микроканалы 3 промывочной текучей среды, такой как HBSS. Изображения получают в последовательные моменты времени в течение операций промывки, и в поле D на фиг. 15 показаны изображения, полученные в момент времени 0 и через 3, 5, 7, 8, 10 и 12 минут от начала промывки. На графиках, показанных в полях B и C на фиг. 15 кривые указывают снижение фонового шума, которое достигается за счет использования промываний. В поле A процедура по описанному в настоящем документе способу сравнена со стандартным способом, который требует последующего центрифугирования. В частности, сплошная линия, помеченная ромбами, указывает результат с течением времени по способу по настоящему изобретению, где снижение 79,1% фонового шума наблюдается через 5 минут непрерывной инфузии промывочного раствора со скоростью 16 мкл/мин. Штриховая линия представляет результат, полученный путем стандартного способа центрифугирования, результат получен после 4 циклов промывания, разделенных 5 минутами центрифугирования при 1000 RCF. Сплошная линия, помеченная треугольником, показывает результат, полученный после 2 циклов, разделенных 5 минутами центрифугирования при 1000 RCF. Способ по настоящему изобретению позволяет получить сравнимые результаты, с очевидным преимуществом исключения длительного центрифугирования, которое неизбежно ведет к потере биологического материала, потеря которого в некоторых ситуациях может быть значительной до степени, ощутимой, чтобы поставить под угрозу сам анализ, а также к воздействию на биологический образец дополнительной нагрузки.
Пример 3. Оценка эффективности OKT3 для лимфобластов T
2
2
Клетки клеточной линии Jurkat (лейкозные T клетки человека) получали от ATCC и культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10%, инактивированной FBS среды, 10 ммоль Hepes (ГЭПЭС), 2 ммоль ультраглутамина и 1 ммоль пирувата натрия, 1% пеницилина/стрептомицина в колбах 25 см при температуре 37°C и 5% CO.
OKT3 гибридомы культивировали в биореакторах (CellLine, компания Integra Biosciences) в полной RPMI 1640 среде, содержащей 3% FBS, и 2 раза в неделю собирали супернатант. Очищение моноклональных антител выполняли с помощью двойного осаждения насыщенного аммоний сульфата при 30% и 50%, с последующим диализом в PBS. Чистоту OKT3 оценивали по гелю SDS-PAGE, и количество антител определяли посредством устройства NanoDrop (компании Thermo Scientific). Затем антитела замораживали при температуре -80°C перед использованием.
6
Для сравнения величину сигнала кальция на всей популяции клеток Jurkat выполняли в соответствии с протоколом Fluo-4 (компания Life Technologies). 1x10 клеток Jurkat промывали один раз в HBSS и инкубировали с Fluo-4 (4 нг/мкл) в течение 30 минут при температуре 37°C. После промывания и повторного суспендирования в HBSS, клетки обрабатывали очищенным антителом OKT3 при концентрациях 1, 5 и 10 мкг/мл или, в альтернативном варианте с использованием 50 мкл надосадочной жидкости от культуры гибридомов. В качестве положительного контроля потока кальция добавляли 2 мкг/мл иономицина (компании Sigma-Aldrich). Клетки обрабатывали указанным образом, а затем анализировали на проточном цитометре.
6
Для теста в открытых микролунках по настоящему изобретению клетки Jurkat помечали Fluo-4 20 мкмоль в HBSS, центрифугировали и повторно суспендировали в несодержащей сыворотку среде (RPMI 1640 с 25 ммоль Hepes или HBSS) при концентрации 1,6 x 10 клеток/мл в 1,5 мл пробирках Эппендрфа, используемых в качестве впускных емкостей для системы открытых микролунок с возможностью перевертывания. После осаждения клеток Jurkat в микролунках (приблизительно 1-10 клеток на микролунку) и промывания каналов с HBSS, растворы, содержащие иономицин (2 мкг/мл) или OKT3 (10 мкг/мл) принудительно пропускали через особые микроканалы системы открытых микролунок за счет перистальтического насоса. Изображения получали с помощью камеры, присоединенной к микроскопу на некотором расстоянии в течение 1 минуты и обрабатывали с помощью программы, разработанной компанией LabView, количественно оценивающей динамические характеристики одного и того же сигнала на каждой клетке образца.
Цитофлюориметрические результаты: развитие средней флуоресценции образцов после введения иономицина (a) или OKT3 (b) в образец количественно оценивали на проточном цитометре, получив результаты, показанные на фиг. 16. На графиках показано среднее изменение интенсивности флуоресценции, и подтверждается действенность используемой модели.
Изменение фонового сигнала в открытых микролунках: изменение сигнала, испускаемого одиночной клеткой, меченой Fluo-4 в отсутствие стимулов, оценивали количественно после загрузки клеток в системы открытых микролунок. Анализ показал увеличение сигнала до 38%.
Стимуляция иономиицином в открытых микролунках: стимуляция с иономицином показала среднее увеличение сигнала по отношению к исходному уровню от 193% до +/-139% в серии из 10 экспериментов. Типичный наблюдаемый паттерн показан на фиг. 17 (a). Как наблюдалось также по проточному цитометру, в случае стимуляции иономицином после исходного увеличения флуоресценции сигнал устанавливался на стабильно высоких значениях.
Стимуляция с OKT3 показала увеличение пика сигнала по сравнению со значением исходного уровня, равное в среднем от 178% до +/-90% в серии из 3 экспериментов. Типичный наблюдаемый паттерн показан на фиг. 17(b). Как также наблюдалось по проточному цитометру, в случае стимуляции OKT3, после исходного увеличения флуоресценции сигнал достигал пикового значения за несколько минут.
Сравнительный эксперимент показал, что способ по настоящему изобретению позволяет получить данные, сравнимые с полученными по выбранному способу, т.е. с проточной цитометрией.