Влияние наноцинка на активность протеолитических ферментов

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

ТЕМА НОМЕРА

УДК 57.042

Влияние наноцинка на активность протеолитических ферментов

Д. В. Карпенко,

д-р техн. наук, доцент;

У. В. Вартанова,

студентка;

Н. О. Борисова,

студентка;

М. А. Широкова,

студенка

Московский государственный университет пищевых производств

Нынешний этап развития человеческой цивилизации характеризуется повышенным интересом к внедрению в промышленном масштабе широкого спектра прогрессивных технологий, среди которых одно из первых мест занимают нанотехнологии. Применения наночастиц и нанопрепаратов позволяет эффективно решать многие задачи, например, изготовление защитных и светопоглощающих покрытий, спортивного оборудования, транзисторов, светоиспускающих диодов, топливных элементов, лекарств, медицинской аппаратуры, продуктов питания и материалов для их упаковки, косметики,одежды и многих других. Некоторые из этих задач могут быть решены только за счет применения наночастиц или наноматериалов, по крайней мере,сегодня.

В то же время, необходимо учитывать, что наночастицы различных веществ в силу своих малых размеров имеют высочайшую проникающую способность. Следствие этого — их проникновение в окружающую среду на этапах производства / получения частиц, использования в технологии той или иной продукции, а также на всем протяжении применения такой продукции. Результатом этого может быть накопление наночастиц в окружающей среде в целом, а также в сырье различных, в том числе, пищевых производств. Таким образом, эти частицы могут попадать в технологические процессы различных отраслей пищевой промышленности. При этом в литературе имеется ин-

формация об отрицательном воздействии наночастиц на объекты, прежде всего, биологические [1, 2]. Аналогичные выводы были сделаны на основании результатов исследований, проводившихся в последние годы на кафедре «Конструирование продуктов питания» ФГБОУ ВПО «МГУПП» [3, 4] с наночастицами серебра. Было установлено, что их присутствие в средах даже в невысоких концентрациях вызывает снижение активности целевых ферментов амилолитических ферментных препаратов, уменьшение числа проросших зерен ячменя, замедление процессов, происходящих при затирании в пивоваренном производстве, и ухудшение их результатов, а также существенно угнетает развитие дрожжевых популяций на стадии главного брожения.

Таким образом, актуальна задача установления влияния наночастиц и нанопрепаратов на различные объекты и процессы в пищевых, в частности, в бродильных производствах.

Для ее решения проводятся исследования, в качестве объекта которых был выбран нанопрепа-рат оксида цинка. Причин такого выбора было несколько. С одной стороны, наночастицы цинка в настоящее время применяются в промышленном масштабе: «они могут использоваться как компоненты средств для защиты против УФ-лучей (солнцезащитных кремов, мазей и других препаратов, так как они, по мнению ряда специалистов, безопасны для человека и не раздражают кожу), придавать новые

16 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2015

ТГЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

функции стеклам, пластмассам, краскам, синтетическим волокнам и т. д. Способность наночастиц оксида цинка к рассеянию электромагнитных волн может использоваться в тканях одежды для придания ей свойств невидимости в инфракрасном диапазоне за счет поглощения излучаемого человеческим телом тепла. Это позволяет производить камуфляжи, невидимые в широком диапазоне частот — от радио до ультрафиолета» [5]. При этом имеются данные и об отрицательном воздействии наночастиц цинка, по крайней мере, на микроорганизмы [6]. С другой стороны, в практике пивоварения препараты цинка (в виде солей) используют на многих предприятиях с целью активации развития дрожжевых популяций и интенсификации за счет этого стадии главного брожения. Следует учитывать разные гипотезы о положительном или отрицательном воздействии цинка как в составе тех или иных молекул, так и в виде на-ночастиц. Одна из них базируется на влиянии цинка на белки, в том числе, и биологически активные, а значит, и на ферменты.

В силу этого нами было решено исследовать влияние наночастиц оксида цинка на активность целевых ферментов препарата протеоли-тического типа действия Нейтраза 1,5 МГ. Этот ферментный препарат может применяться на различных

стадиях пищевых производств, а также во многих других отраслях промышленности, причем от его активности в значительной степени зависит эффективность процесса, для интенсификации которого данный препарат используется.

Для решения поставленной задачи были проведены несколько серий экспериментов, в которых в качестве субстрата использовали 5 %-ный раствор желатина. За основу определения протеолити-ческой активности (ПС) препарата был взят метод Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации [7], за исключением того, что продолжительность ферментативной реакции равнялась 60 мин, а не 3 ч, как в упомянутом методе. Таким образом, активность ферментного препарата в различных вариантах оценивали по приросту концентрации аминного азота по сравнению с его исходной концентрацией в реакционной смеси, в момент внесения в нее ферментного препарата. Опытные варианты каждой серии содержали определенные концентрации нанопрепарата оксида цинка, который вносили еще на этапе приготовления раствора субстрата, до добавления ферментного препарата. Контрольные варианты, не содержавшие наночастиц цинка, обрабатывали в тех же условиях. Во всех экспериментах концентрация ферментного препарата Ней-

100 -

80 -

60 -

40 -

0,02 0,4 1 2

Концентрация 7п0, мг/см3

Ц Контроль

Рис. 1. Влияние концентрации нанопрепарата оксида цинка (0,02-2,00 мг/см3) на увеличение концентрации аминного азота через 60 мин гидролиза желатина под действием ферментного препарата Нейтраза 1,5 МГ

траза 1,5 МГ в реакционной среде равнялась 1 мг /см3. По формуле, предложенной используемым методом определения ПС, рассчитывали концентрацию аминного азота в каждом из вариантов в момент внесения ферментного препарата и через 60 мин проведения ферментативной реакции, после чего находили разность между первой и второй. Таким образом определяли увеличение концентрации аминного азота в результате проявления про-теолитической активности целевых ферментов препарата Нейтраза 1,5 МГ. Для удобства сопоставления результатов отдельных экспериментов и их серий прирост концентрации аминного азота в контрольном варианте каждого эксперимента принимали за 100 %, аналогичные показатели опытных вариантов выражали в процентах по отношению к контролю. В первой серии экспериментов концентрацию нанопре-парата оксида цинка варьировали в диапазоне 0,02-2 мг / см3 раствора субстрата (желатина) (рис. 1).

Из представленных на рисунке данных следует, что присутствие наночастиц оксида цинка в концентрации 0,02 мг / см3 приводит к повышению протеолитической активности ферментов препарата Нейтраза 1,5 МГ более, чем на 20 % по сравнению с контролем. Концентрация исследуемого на-нопрепарата, равная 0,4 мг /см3, вызывает полную инактивацию целевых ферментов, тогда как ее увеличение до 1-2 мг/ см3 вновь оказывает слабый положительный эффект. Складывается впечатление, что никакой зависимости между концентрацией нанопрепарата оксида цинка в субстрате и протео-литической активностью ферментного препарата не существует или ее не удалось выявить. Для прояснения ситуации была проведена следующая серия экспериментов, в которой концентрацию наночастиц оксида цинка варьировали в диапазоне 0,1-0,5 мг /см3. Остальные условия были такими же, как в предыдущей. Полученные результаты представлены на рис. 2.

Видно, что характер зависимости ПС от концентрации нанопре-парата оксида цинка нелинеен, но схож с тем, который наблюдали в предыдущей серии экспериментов: при низком содержании нано-

0

1 <

§

ш I-

140 -г

120 -

20 -

0

5^ 2015

ПИВО и НАПИТКИ 17

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

Ш

250

200

150

100

Концентрация 7п0, мг/см3 Контроль

300

50

0

Рис. 2. Влияние концентрации нанопрепарата оксида цинка (0,1-0,5 мг/см3) на увеличение концентрации аминного азота через 60 мин гидролиза желатина под действием ферментного препарата Нейтраза 1,5 МГ

200

2

I 180

он

* 160

£ 140 зот

0 120-ог

ин 100

ам

ции 80 ра

ент 60 ц

1 40 ст о

ир 20 р

П

0

1 2 3 4 5

Концентрация 7п0, мг/см3

Ц Контроль

Рис. 3. Влияние концентрации нанопрепарата оксида цинка (1,0-5,0 мг/см3) на увеличение концентрации аминного азота через 60 мин гидролиза желатина под действием ферментного препарата Нейтраза 1,5 МГ

частиц оксида цинка активность протеаз ферментного препарата существенно превышает контрольное значение — до 300 % при 0,2 мг / см3; дальнейшее увеличение концентрации нанопрепарата оказывает ингибирующее влияние, вплоть до полной инактивации про-теаз при 0,4 мг / см3; однако, при концентрации наночастиц оксида цинка равной 1,0 мг /см3 вновь наблюдается превышение ПС в опытном варианте по сравнению с

контролем. С нашей точки зрения, совпадение характера зависимости протеолитической способности в двух сериях экспериментов свидетельствует о справедливости ранее высказанного предположения. Тем не менее, было решено изучить влияние более высоких концентраций нанопрепарата на ПС.

Для этого была проведена серия экспериментов, в которых на-нопрепарат цинка вносили в раствор субстрата в концентрациях из

диапазона 1,0-5,0 мг/см3, а далее поддерживали те же условия, что и в предыдущих сериях. Полученные результаты представлены на рис. 3.

Приведенные на рисунке данные свидетельствуют, что концентрации наночастиц оксида цинка, превышающие 0,5-3,0 мг/см3, приводят к активации протеаз ферментного препарата — при 3,0 мг / см3 под их действием было накоплено вдвое больше аминного азота, чем в контрольном варианте. Дальнейшее увеличение содержания нанопре-парата вызывает ингибирующий эффект — при 5,0 мг / см3 отмечено почти 40%-ное снижение контролируемой ферментативной активности.

Суммируя результаты всех трех рассмотренных серий экспериментов, можно заключить, что нано-частицы оксида цинка оказывают существенное влияние на активность протеолитических ферментов препарата Нейтраза 1,5 МГ, по крайней мере в условиях, сходных с теми, в которых проводились эксперименты. Это влияние имеет сложный характер: при определенных концентрациях наблюдается выраженный активирующий эффект (два «пика»), при других — ингибирующий, вплоть до полной инактивации при 0,4 мг / см3.

Безусловно, интересен вопрос о втором «пике» активирующих концентраций нанопрепарата оксида цинка. По нашему мнению, можно предположить, что при содержании нанопрепарата, превышающем 0,4 мг / см3, в отсутствии стабилизатора наночастицы оксида цинка образуют агрегаты или кластеры, которые утрачивают свойства, присущие наночастицам, или вообще выводятся из реакционной среды вследствие осаждения. В определенном диапазоне вносимых в раствор субстрата количеств наноча-стиц оксида цинка в реакционной среде находится очень небольшое количество наночастиц, аналогичное тому, которое обеспечивает внесение препарата в количестве примерно 0,2 мг / см3. Однако, дальнейшее увеличение количества добавляемого к субстрату наноок-сида цинка приводит к приближению концентрации в реакционной среде собственно наночастиц к значениям около 0,4 мг / см3. Как

18 ПИВО и НАПИТКИ 5 • 2015

I

ТГЕХНОЛОГИЧЕСКИЕИННОВАЦИИ в ОТРАСЛИ

следствие, начинает превалировать ингибирующий / инактивирующий эффект нанопрепарата.

В целом, можно заключить, что результаты проведенных исследований подтверждают высказанную гипотезу о том, что повышение содержания наночастиц оксида цинка в сырье, а значит, и в технологических средах пищевых / бродильных производств может привести к затрудненному протеканию технологических процессов, в частности, за счет подавления активности важных ферментов. Исследования в обсуждаемом направлении будут продолжены, об их результатах будет сообщено.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дугин, Г. С. Нанотехнология и ее возможное негативное влияние на окружающую среду/Г. С. Дугин // Проблемы безопасности и чрезвычайных ситуаций. — 2009. — № 5. — С. 33-37.

2. Подкопаев, Д. О. Сравнительная оценка антимикробной активности наноча-стиц серебра/Д. О. Подкопаев [и др.] // Российские нанотехнологии. — 2013. — Т. 8. — № 11-12. — С. 123-126.

3. Карпенко, Д. В. Влияние наночастиц серебра на прорастание ячменя и качество свежепроросшего солода /Д. В. Карпенко, Ю. А. Уваров // Пиво и напитки. — 2012. — № 3. — С. 32-33.

4. Карпенко, Д. В. Влияние наночастиц металлов на сбраживание пивного сус-

ла/Д. В. Карпенко [и др.] // Пиво и напитки. — 2012. — № 1. — С. 16-17.

5. Шаляпина, А. Я. Реакционная способность наночастиц оксида цинка [Электронный ресурс]/ А. Я. Шаляпина [и др.]. — Режим доступа: docs/konftez / shalyapina_a.ya.gubin.pdf.

6. Li- Hua Li. Preparation, characterization and antimicrobial activities of chitosan/Ag/ZnO blend films/Li- Hua Li, Jian- Cheng Deng, Hui-Ren Deng, Zi-Ling Liu, Xiao-Li Li // Chemical Engineering Journal. — 2010. — № 160. — P. 378-382.

7. Грачева, И. М. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов.: учебное пособие для вузов/И. М. Грачева [и др.]. — М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. — 240 с. (Si

0

1 <

§

ш I-

Влияние наноцинка на активность протеолитических ферментов

Ключевые слова

нанопрепарат оксида цинка; наночастицы; протеазы; ферментные препараты.

Реферат

Одно из самых интенсивно развивающихся в последние годы направлений науки и технологий — нанотехнологии. Их применение позволяет решать широкий круг проблем. Однако высказываются опасения относительно потенциального негативного влияния наночастиц и нанопрепаратов на объекты и процессы различных, в частности пищевых производств. В силу этого представляется целесообразным изучение воздействия нанопрепаратов, применяемых в промышленном масштабе, на сырье и процессы бродильных производств. Были проведены исследования влияния нанопрепа-рата оксида цинка на активность целевых ферментов препарата Нейтраза 1,5 МГ. После этого колориметрическим методом определяли протеолитическую способность опытного образца и сравнивали ее с аналогичным показателем контрольного варианта, не подвергавшегося воздействию звука. Было установлено, что различные концентрации нанооксида цинка оказывают разнонаправленное и сложное влияние на протеолитическую способность данного ферментного препарата. Показано, что при концентрациях нанопрепарата 0,2 и 3,0 мг / см3 реакционной среды под действием ферментов Нейтразы 1,5 МГ накапливается на 215 и 100 %, соответственно, больше аминного азота, чем в контроле. В то же время, наночастицы оксида цинка в концентрации 0,4 мг / см3 полностью инактивировали протеазы использованного ферментного препарата. На основании приведенных результатов авторы заключают, что повышение содержания наночастиц оксида цинка в сырье и, как следствие, в технологических средах пищевых / бродильных производств может привести к затрудненному протеканию технологических процессов, в частности, за счет подавления активности важных ферментов.

Авторы

Карпенко Дмитрий Валерьевич, д-р техн. наук, доцент;

Вартанова Ульяна Вадимовна, студентка;

Борисова Наталья Олеговна, студентка;

Широкова Мария Александровна, студентка

Московский государственный университет пищевых производств,

125080, Москва, Волоколамское шоссе, д. 11, DoKa.65@mail.ru

The Influense of Nanopreparation of Zinc Oxide at the Activity of Proteases

Key words

zinc oxide nanopreparation; nanoparticles; proteases; enzyme preparations.

Abstract

One of the most rapidly developing areas of science and technology in recent years is nanotechnology. Their use allows to solve a wide range of problems, but some concerns about the potential adverse effects of nanoparticles and nanopreparations on various objects and processes, in particular food production are expressed. Thereby, it is advisable to study the effects of nanopreparations used in the industrial scale on the raw materials and processes of fermentative industries. Studies of the effect of zinc oxide nanopreparation on the activity of enzyme preparation Neutrase 1.5 MG were conducted. After that test variant's proteolytic activity was determined by the colorimetric method and compared to the similar indicator of the control specimen which wasn't affected by the nanopreparations. It has been found that different concentrations of nanozinc provide complex and multidirectional impact on the activity of proteolytic enzymes of the preparation. It is shown that at nanopreparation concentrations 0.2 and 3.0 mg/ cm3 in the reaction medium, the action of enzymes of Neutrase 1.5 MG allow to accumulate 100 and 215%, respectively, more of FAN in comparison to the control. At the same time, the nanozinc concentration of 0.4 mg/ cm3 totally inactivates protease of Neutrase 1.5 MG. Based on these results the authors conclude that increasing of zinc oxide nanoparticles content in the raw materials and, as a consequence, in the technological media of food/ fermentative productions can lead to difficulties in technological processes, in particular by inhibiting of the key enzymes activities.

Authors

Karpenko Dmitrij Valer'evich, Doctor of Technical Sciences, Associate Professor;

Vartanova Uljana Vadimovna, Student;

Borisova Natalja Olegovna, Student;

Shirokova Marija Aleksandrovna, Student

Moscow State University of Food Production,

11 Volokolamskoe shosse, Moscow, 125080, Russia, DoKa.65@mail.ru

5 • 2015 ПИВО и НАПИТКИ 19