Способ оценки загрязнения территорий пестицидами путем биоиндикации
METHOD OF ASSESSING TERRITORIES CONTAMINATION WITH PESTICIDES BY BIOINDICATION

Изобретение относится к исследованиям в области охраны окружающей среды и рационального природопользования, а именно к способам оценки экологического состояния окружающей среды с помощью биотестирования. Способ может быть использован для экологического картирования, выявления неблагоприятных участков, исследуемых регионов и дифференцированной оценки пестицидного загрязнения региона.
Современный уровень техники характеризуется следующими аналогами предлагаемого способа.
Известны способы экологического мониторинга регионов, путем создания системы слежения за экологическим состоянием населенных пунктов и целых регионов, осуществляющих мониторинг всех сред в широком диапазоне их параметров независимо от источников загрязнения. В систему сбора информации входят: группы датчиков экологического контроля состояния среды, контрольные и диспетчерские пункты промышленных стоков предприятий, центральный диспетчерский пункт, станция космической связи с сетью спутников космической экологической разведки, а также автомобильные комплексы оперативного действия с соответствующими группами датчиков, связанные с диспетчерским пунктом (см. патент RU № 2145120, МПК G 08 C 19/00, 2000).
Указанные экологические системы сбора информации позволяют оценить экологическое состояние целого региона, однако являются трудоемкими, многостадийными, продолжительными по времени и чрезвычайно дорогостоящими.
Известен способ определения токсичности окружающей среды, взятый за прототип, основанный на выборе группы живых организмов в качестве биологических индикаторов качества окружающей среды (см. патент RU № 2057337, МПК G 01 N 33/18, 1996).
Способ осуществляют с помощью развивающихся эмбрионов и личинок морских ежей, которые для своей среды обитания служат естественным индикатором уровня техногенного загрязнения и являются высокочувствительными к токсическому действию радионуклидов, пестицидов, тяжелых металлов и других токсикантов.
Недостатками указанного метода является низкая репрезентативность, а также отсутствие селективности в биоиндикации пестицидного загрязнения среды обитания.
Известен также способ оценки загрязнения территорий пестицидами путем биоиндикации, включающий отбор представителей фауны, обитающих на этой территории, пробоотбор внутренних органов животных по которым выявляют признаки, характеризующие уровень зараженности территории пестицидами (см. RU № 226778, МПК G01N 33/02, G01N 33/18, G01N 33/24, 2006). При этом в качестве биоиндикаторов используют диких копытных животных, производят в заданный период времени пробоотбор внутренних органов животных, определяют содержание в них пестицидов, сравнивают полученные результаты с максимально допустимыми уровнями в пищевых продуктах, по значениям которых судят о загрязненности окружающей среды.
Недостатками указанного метода является ограниченная область применения (для территорий, прилегающих к лесным угодьям, где могут обитать дикие копытные животные), кроме того, высокая мобильность животных усложняет их «привязку» к территориям, где проводится оценка загрязнения. Кроме того, реальная оценка уровня заражения и динамики его изменения затруднена, ибо потребует отстрела большого количества животных. Все это снижает достоверность результатов оценки загрязнения территории пестицидами.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является повышение достоверности результатов оценки загрязнения территории пестицидами.
Технический результат, проявляющийся при решении задачи изобретения, выражается в повышении достоверности результатов оценки загрязнения территории пестицидами при упрощении ее процедуры и при отсутствии необходимости отстрела большого количества копытных животных. Обеспечивается возможность выяснения отдаленных последствий на нескольких поколениях насекомых и прогнозирования отдаленных последствий.
Поставленная задача решается тем, что способ оценки загрязнения территорий пестицидами путем биоиндикации, включающий отбор представителей фауны, обитающих на этой территории, пробоотбор их внутренних органов, по которым выявляют признаки, характеризующие уровень зараженности территории пестицидами, отличается тем, что в качестве биоиндикаторов используют членистоногих насекомых из отряда прямокрылых, которых отлавливают на территории, загрязненность которой пестицидами оценивают, при этом предварительно проводят отбор насекомых таких же видов на участке, где пестициды не применялись, которых используют как контрольную группу, далее насекомых обеих групп препарируют, выделяя из их тел желудочно-кишечный тракт, который исследуют на наличие морфологических изменений, затем результаты, полученные в контрольной группе, используют в опытной группе как минимальную степень морфологических изменений, причем всех насекомых опытной группы разделяют на три разряда, соответственно, или как с минимальной степенью морфологических изменений или со средней степенью морфологических изменений или с максимальной степенью морфологических изменений, затем определяют долю насекомых в разрядах от их общего количества, далее, по прошествии времени, повторяют отлов насекомых на контролируемой территории и повторяют морфологические исследования и определение доли насекомых в разрядах от их общего количества, причем при уменьшении суммарной доли насекомых с поражениями желудочно-кишечного тракта делают вывод о снижении степени загрязненности территории пестицидами и наоборот.
Кроме того, используют насекомых из отряда прямокрылых, саранчевых или кузнечиков, кроме занесенных в Красную книгу и в список 1-3 степени редких и готовящихся к исчезновению насекомых.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
При этом признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.
Признаки «…в качестве биоиндикаторов используют членистоногих насекомых из отряда прямокрылых, которых отлавливают на территории, загрязненность которой пестицидами оценивают…» обеспечивают возможность расширения числа одновременно исследуемых объектов фауны. При этом пестициды дают характерные изменения уже в 1-м поколении особей, попадающих в загрязненную среду (изменяется морфология эпителия ЖКТ, выше индекс апоптоза, ниже скорость пролиферации эпителиоцитов, деструкция эпителия и базальной мембраны в слизистых ЖКТ исследуемых особей).
Признаки «…предварительно проводят отбор насекомых таких же видов на участке, где пестициды не применялись, которых используют как контрольную группу…» обеспечивают формирование контрольной группы насекомых для условий отсутствия воздействия пестицидов.
Признаки «…насекомых обеих групп препарируют, выделяя из их тел желудочно-кишечный тракт, который исследуют на наличие морфологических изменений…» позволяют выявить изменения морфологии эпителия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) - оценивают индекс апоптоза, скорость пролиферации эпителиоцитов, деструкцию эпителия и базальной мембраны в слизистых ЖКТ.
Признак «…результаты, полученные в контрольной группе, используют в опытной группе как минимальную степень морфологических изменений…» позволяет установить нулевой (нижний) уровень загрязненности территории пестицидами.
Признаки «…всех насекомых опытной группы разделяют на три разряда, соответственно, или как с минимальной степенью морфологических изменений или со средней степенью морфологических изменений или с максимальной степенью морфологических изменений…» позволяют количественно оценить количество насекомых в каждом разряде.
Признак «…определяют долю насекомых в разрядах от их общего количества…» позволяет количественно оценить уровень загрязнения территорий пестицидами.
Признаки, указывающие, что «по прошествии времени повторяют отлов насекомых на контролируемой территории и повторяют морфологические исследования и определение доли насекомых в разрядах от их общего количества» позволяют оценить динамику изменения уровня загрязнения пестицидами.
Признаки, указывающие, что «при уменьшении суммарной доли насекомых с поражениями ЖКТ делают вывод о снижении степени загрязненности территории пестицидами и наоборот» позволяют сделать заключение о динамике уровня загрязнения.
Признаки, указывающие, что «используют насекомых из отряда прямокрылых, саранчевых или кузнечиков, кроме занесенных в Красную книгу и в список 1-3 степени редких и готовящихся к исчезновению насекомых» позволяет исключить отлов редких видов.
На фиг.1-фиг.4 показана градация степени загрязнения земель пестицидами на основе оценки состояния эпителиальной пластинки кишечника препарированной особи с прилежащей собственной пластинкой, при этом на фиг.1 показан вид эпителиальной пластинки кишечника при отсутствии загрязнения пестицидами; на фиг.2 показан вид пластинки, соответствующий 1 уровню загрязнения (нижний уровень); на фиг.3 показан вид пластинки, соответствующий 2 уровню загрязнения; на фиг.4 показан вид пластинки, соответствующий 3 уровню загрязнения (максимальный уровень); на фиг.5-фиг.8 показана градация степени загрязнения земель пестицидами на основе характеристики клеток мигрантов, при этом на фиг.5 показан вид клеток мигрантов при отсутствии загрязнения пестицидами; на фиг.6 показан вид клеток мигрантов, соответствующий 1 уровню загрязнения (нижний уровень); на фиг.7 показан вид клеток мигрантов, соответствующий 2 уровню загрязнения; на фиг.8 показан вид препарата, соответствующий 3 уровню загрязнения (максимальный уровень).
Пестициды, пыль всех видов (угольная в т.ч.), химические вещества (загрязнения нефтью) и физические факторы (в т.ч. радиация) дают характерные изменения уже в 1-м поколении особей, попадающих в загрязненную среду. Изменяется морфология эпителия ЖКТ, становится выше индекс апоптоза, ниже скорость пролиферации эпителиоцитов, деструкция эпителия и базальной мембраны в слизистых ЖКТ исследуемых особей.
Саранча (отряд прямокрылых) относится к семейству саранчовых, подотряду короткоусых, а кузнечик (отряд прямокрылых) – к семейству кузнечиков, подотряд длинноусых.
Различают около 7000 тысяч видов кузнечиков. Это очень выносливые насекомые, которые обитают почти по всей территории нашей земли.
На Дальнем Востоке России известно 25 видов из семейства кузнечики. С условием использования видов не занесенных в Красную книгу, или в список 1-3 степени редких и готовящихся к исчезновению насекомых (чтобы не наказали за отлов редких видов) можно использовать вид Уссурийский зеленый кузнечик - Tettigonia ussuriana Uv. (T. cantans auct.) - насекомое остепненных лугов.
Саранчовые (лат. Acridoidea) - надсемейство насекомых отряда прямокрылых, являются наиболее многочисленной группой данного отряда.
Предпочтительно из саранчовых использовать фитофилов - живущих на растениях, относящихся к травоядным хортобионтам, которые питаются травянистыми растениями.
На местности размещают модельную площадку: предпочтительно прямоугольную, длиной 10×20 или 15×30 м. Угловые точки площадки «закрепляют» вбитыми колышками. С учетом того, что саранча ведет дневной образ жизни, а кузнечик – ночной, назначают соответствующее время суток для отлова.
Методика отлова насекомых включает перемещение с сачком по прямой линии и выполнение 20-25 восьмиобразных движений – взмахов сачком по поверхности травы. Затем захватить сачок снизу, открыть и рассмотреть, что удалось отловить и выбрать особей отлавливаемого вида. Процедуру повторяют несколько раз за день или ночь (примерно через два-три часа).
В зависимости от времени отлова соотношение отловленных кузнечиков и саранчовых меняется (см. табл.1).
Таблица 1
Численность насекомых, отловленных на модельной площадке
Время отлова
Семейство саранчовых
Семейство кузнечиков
7<sup>00</sup>-7<sup>30</sup>
35
4
10<sup>30</sup> - 11<sup>00</sup>
53
4
14<sup>00</sup> - 14<sup>30</sup>
108
6
21<sup>00</sup> - 21<sup>30</sup>
65
7
23<sup>30</sup> - 24<sup>00</sup>
49
12
2<sup>00</sup> - 2<sup>30</sup>
31
21
Препарирование насекомых осуществляют известным образом с применением классического морфологического метода приготовления постоянных гистологических препаратов. Отловленные особи фиксируются в формалине в течение суток, затем промываются в проточной воде и помещаются на 5 секунд в дистиллированную воду. Затем материал помещают в спирты возрастающей на 10º концентрации от 50ºдо абсолютного спирта с выдержкой не менее 2 часов в каждой порции спирта. После этого проводят заливку в парафин через выдержку материала в ксилоле, а затем в смеси парафина и ксилола, с возрастанием в смеси парафина от 30% до чистого парафина с выдерживанием в термостате при температуре 65º. Последние две порции чистого парафина выдерживают до суток или двух. После этого на микротоме готовят срезы толщиной не более 5 мкм. Депарафинирование срезов производят в нескольких порциях ксилола при горизонтальном расположении стекол (для сохранения срезов на них). После депарафинирования срезов проводят окрашивание гематоксилином в течение 15 минут, эозином на 1 минуту. Смывают краситель водой для исключения артефактов, просветляют в ксилоле с контролем просветления в микроскопе и фиксируют окрашивание нанесением абсолютного спирта на срез. После этого наносят на срез каплю полиэстерола и накрывают срез покровным стеклом. Срезы изучают на микроскопе Olympus Bx51, анализируют срезы и готовят иллюстративный материал с использованием цифровой фотокамеры DPx25 c приложением фирменных компьютерных программ для морфометрического анализа данных.
Градация степени загрязнения земель пестицидами основывается на оценке состояния эпителиальной пластинки кишечника препарированной особи с прилежащей собственной пластинкой и на характеристике клеток мигрантов.
Градация степени загрязнения земель пестицидами на основе оценки состояния эпителиальной пластинки кишечника:
- При нулевом уровне загрязнения (см.фиг.1) эпителиальная пластинка кишечника кузнечика в экологически чистой среде, никогда не загрязняющейся пестицидами, характеризуется наличем нескольких типов эпителиоцитов: высокими столбчатыми, с центральным расположением ядра в цитоплазме, и цилиндрическими, в 2 раза превышающими по ширине столбчатые клетки, с низкими ядерно-цитоплазматическими отношениями, ядром в базальной части эпителиоцита. У основания столбчатых клеток идентифицируются мелкие пирамидные клетки. Также в составе эпителиального пласта идентифицируются клетки с фигурами митозов. Собственная пластинка содержит большое кодичество клеток;
- При первом уровне экологического загрязнения пестицидами (см.фиг.2) эпителиальная пластинка ЖКТ кузнечиков содержит клетки одного типа, что связано или с адаптацией к вредному воздействию и метаплазией всех типов клеток, либо апоптозом столбчатых эпителиоцитов, как наиболее чувствительных. Собственная пластинка вследствие снижения барьерной функции пителия становится менее плотной, рыхлой, сетевидной. Клетки эпителия приобретают ярко выраженную полярность, ядра идентифицируются в базальной части, выявляется извитая базальная мембрана. Также в поле зрения отмечаются единичные клетки с признаками кариопикноза;
- Второй уровень загрязнения характеризуется тем, что в клетках эпителиальной пластинки базальная часть становится резко базофильной, ядра практически не идентифицируются, в собственной пластинке появляются лимфоидноподобные клетки, что может быть связано с защитной реакцией на токсическое воздействие пестицидов и инфильтрацию иммуно-фагоцитарного звена в зону развивающейся гибели части эпителиоцитов. В собственной пластинке слизистой оболочки ЖКТ кузнечиков полностью утрачивается структура, субэпителиальное пространство полностью заполняется клетками-мигрантами, представляющими инфильтрат;
- Третьему уровню загрязнения соответствует некроз эпителиальной и собственной пластинки слизистой оболочки ЖКТ кузнечиков. Наблюдается полная деструкция эпителиального пласта. Барьерная функция осуществляется за счет клеток-мигрантов из глубже располагающихся структур. Идентифицируются макрофаги, мигрирующие за пределы эпителиальной пластинки. В собственной пластинке отмечаются очаги некроза.
Градация степени загрязнения земель пестицидами на основе характеристики клеток мигрантов:
- При нулевом уровне загрязнения (см.фиг.5) клетки мигранты представлены исключительно специализированными клетками, о чем свидетельствуют многочисленные гранулы. Это подтверждает их высокую фагоцитарную активность;
- При первом уровне экологического загрязнения пестицидами (см. фиг.6) количество специализированных клеток уменьшается, но увеличивается число молодых слабодифференцированных клеток, не обладающих специализированными защитными свойствами;
- При втором уровне экологического загрязнения пестицидами (см. фиг.7) количество неспециализированных клеток достигает 50%, что свидетельствует о снижении диффенцировки и о стадии декомпенсации защитных сил организма. Клетки инфильтрата характеизуются крупными ядрами и высокими ядерно-цитоплазматическими отношениями. В некоторых клетках наблюдается эксцентричное расположение ядер;
- При третьем уровне экологического загрязнения пестицидами (см. фиг.8) наблюдается декомпенсация защитных сил организма насекомого, апоптоз клеток инфильтрата, отсутствие дифференцировки на фоне гибели эпителиоцитов.
Примеры:
1. Морфологическая характеристика образцов отобранных в августе, обитающих на лесных полянах заповедника «Заповедник Кедровая Падь» (образцы брали у подножия сопок и по берегам рек Барабашевки и Кедровой), который расположен на западном берегу Амурского залива в Хасанском районе Приморского края, к западу от Владивостока, характеризовалась тем, что эпителиальная пластинка кишечника кузнечика в экологически чистой среде, никогда не загрязняющейся пестицидами, характеризуется наличем нескольких типов эпителиоцитов: высокими столбчатыми, с центральным расположением ядра в цитоплазме, и цилиндрическими в 2 раза превышающими по ширине столбчатые клетки, с низкими ядерно-цитоплазматическими отношениями, ядром, располагающимся в базальной части эпителиоцита. У основания столбчатых клеток идентифицируются мелкие пирамидные клетки, обеспечивающие регенераторный потенциал стенки ЖКТ. Также в составе эпителиального пласта идентифицируются клетки с фигурами митозов. Собственная пластинка содержит большое кодичество клеток; клетки-мигранты представлены исключительно специализированными клетками, о чем свидетельствуют многочисленные гранулы в их цитоплазме. Это подтверждает их высокую фагоцитарную активность.
2. Особи, отобранные в то же время, постоянно живущие на полях СХПК Искра в Октябрьском районе Приморского края, имели эпителиальные пластинки ЖКТ с содержанием клеток одного типа, что связано или с адаптацией к вредному воздействию и метаплазией всех типов клеток, либо апоптозом столбчатых эпителиоцитов, как наиболее чувствительных к повреждающим воздействиям токсических факторов. Собственная пластинка вследствие снижения барьерной функции пителия становится менее плотной, рыхлой, сетевидной. Клетки эпителия приобретают ярко выраженную полярность, ядра идентифцируются в базальной части, выявляется извитая базальная мембрана. Также в поле зрения отмечаются единичные клетки с признаками кариопикноза. Количество специализированных клеток уменьшается, но увеличивается число молодых слабодифференцированных клеток, не обладающих специализированными защитными свойствами.
3. Особи, обитающие на территории административного района «Агропромышленная группа «Армада» – это инновационный российско-китайский агропромышленный комплекс, один из крупнейших сельскохозяйственных производителей, Октябрьский район Приморского края характеризуются тем, что в клетках эпителиальной пластинки базальная часть становится резко базофильной, ядра практически не идентифицируются, в собственной пластинке появляются лимфоидноподобные клетки, что может быть связано с защитной реакцией на токсическое воздействие пестицидов и инфильтрацию иммуно-фагоцитарного звена в зону развивающейся гибели части эпителиоцитов. В собственной пластинке слизистой оболочки ЖКТ кузнечиков полностью утрачивается структура, субэпителиальное пространство полностью заполняется клетками-мигрантами, представляющими инфильтрат; количество неспециализированных клеток мигрантов достигает 50% в поле зрения, что свидетельствует о снижении диффенцировки эпителия и о стадии декомпенсации защитных сил организма. Клетки инфильтрата характеризуются крупными ядрами и высокими ядерно-цитоплазматическими отношениями, что свидетельствует о низкой специализации. В некоторых клетках наблюдается эксцентричное расположение ядер.
4. Для особей, отловленных на Территории Хорольского района, на сельхозугодьях, используемых под кукурузу, был характерен некроз эпителиальной и собственной пластинки слизистой оболочки ЖКТ. Наблюдалась полная деструкция эпителиального пласта. Барьерная функция осуществляется за счет клеток-мигрантов из глубже располагающихся структур. Идентифицируются макрофаги, мигрирующие за пределы эпителиальной пластинки. В собственной пластинке отмечаются очаги некроза. Это соответствует декомпенсации защитных сил организма насекомого, апоптоз клеток инфильтрата, отсутствие дифференцировки на фоне гибели эпителиоцитов.
На основании полученных результатов с использованием данных морфологического исследования можно сделать следующие выводы:
1. Территория Заповедника «Кедровая Падь» не загрязнена пестицидами.
2. Территория сельских угодий, используемых под зерновые культуры в районе Уссурийска Агропромышленной группы «Армада» загрязнена пестицидами. 1 уровень загрязнения.
3. Территория полей, используемых под овощные культуры СХПК Искра в Октябрьском районе Приморского края, загрязнена пестицидами. 2 уровень загрязнения.
4. Территория Хорольского района, сельхозугодья, используемые под кукурузу, имеют 3 уровень загрязнения.
Достоинства заявленного способа оценки загрязнения окружающей среды:
1. можно использовать большое количество живых объектов, существующих в реальных условиях;
2. исследования не являются дорогостоящими и трудоемкими, требующими специального оборудования, дают быстрый результат;
3. дают широкий спектр диагностических данных: мониторинг радиоактивного, химического загрязнения, в том числе и загрязнения пестицидами, промышленными отходами и т.д.;
4. возможность использовать метод в качестве прогнозирования отдаленных последствий загрязнений путем оценки изменений в нескольких поколениях.
Способ позволяет выяснить и прогнозировать отдаленные последствия на нескольких поколениях. Также подобный мониторинг позволит выявить необходимость повторной очистки - обработки территории, послужить платформой для разработки стратегии очистных, дезактивирующих работ и т. д.