Маркеры первичной химиорезистентности эпителиальных клеток асцита у больных раком яичников

DOI: 10.24411/0235-2990-2019-10026

Маркеры первичной химиорезистентности эпителиальных клеток асцита у больных раком яичников

Д. Р. ДОЛГОВА, *Т. П. ГЕНИНГ, Т. В. АБАКУМОВА, С. О. ГЕНИНГ, И. И. АНТОНЕЕВА, А. Б. ПЕСКОВ, А. Ю. ФЕДОТОВА

Ульяновский государственный университет, Ульяновск

Markers of Primary Chemoresistance of Epithelial Ascites Cells in Patients with Ovarian Cancer

D. R. DOLGOVA, *T. P. GENING, T. V. ABAKUMOVA, S. O. GENING, I. I. ANTONEEVA, A. B. PESCOV, A. YU. FEDOTOVA

Ulyanovsk State University, Ulyanovsk

Определяли маркеры первичной химиорезистентности (экспрессия генов ERCC1, TOP2a и ABCB1) в эпителиальних клетках асцита 32 первичных больных с верифицированным раком яичников с использованием ОТ-ПЦР. После стандартной химиотерапии по схеме АР (цисплатин+доксорубицин) оценивали безрецидивную выживаемость пациенток по Ка-план—Майеру. Были выделены больные с ранним (до 6 мес.) и поздним (более 6 мес.) рецидивом. В результате проведённых исследований установлено, что ранний рецидив имел место у 67% обследованных (безрецидивный период составил 88,7+13,3 дня). При этом в группах с повышенной экспрессией безрецидивный период значимо не различался, имели место ранние рецидивы. Использование Cochrane Q-test позволило установить, что при сниженных уровнях ERCC1 и ABCB1 доля выживших составляет 72,7% (р<0,157); снижение ERCC1 и повышение TOP2a повышает вероятность выживания до 75%; снижение ERCC1 и снижение TOP2a определяет вероятность выживания у 69,2% пациентов (р<0,157). Следовательно, для прогнозирования возможного ответа на стандартную химиотерапию по схеме АР при асцитном раке яичников целесообразно оценивать в эпителиальных клетках асцита экспрессию 2 показателей — ERCC1 и ABCB1.

Ключевые слова: рак яичников, асцит, гены лекарственной устойчивости, безрецидивная выживаемость.

Determined the primary chemoresistance markers (expression of genes ERCC1, TOP2a and ABCB1) in epithelial cells of ascites 32 primary patients with verified ovarian cancer using RT-PCR. After standard chemotherapy by the AR scheme (cisplatin+doxoru-bicin), the relapse-free survival of patients was assessed by Kaplan—Mayer. Patients with early (up to 6 months) and late (more than 6 months) relapse were isolated. As a result of the conducted studies it was established that early relapse occurred in 67% of the examined patients (the relapse-free period was 88.7+13.3 days). At the same time, in the groups with increased expression, the relapse-free period did not differ significantly, there were early relapses. The use of the Cochrane Q-test has allowed to establish that the reduced levels of ERCC1 and ABCB1, the proportion of survivors is to 72.7% (p<0.157 inch); decrease in ERCC1 and increased TOP2a increases the probability of survival to 75%; reduction of ERCC1 and reduced TOP2a determines the probability of survival of 69.2% (p<0.157 inch). Therefore, to predict the possible response to standard chemotherapy by the AR scheme in ascitic ovarian cancer, it is advisable in the epithelial cells of ascites to evaluate the expression of 2 parameters — ERCC1 and ABCB1.

Keywords: ovarian cancer, ascites, drug resistance genes, relapse-free survival.

Введение

Проблема химиорезистентности возникла на заре химиотерапии (XT), когда на фоне введения химиопрепаратов возникал интенсивный рост опухоли, расцениваемый как прогрессирование заболевания [1]. Однако существующие стандарты не предусматривают при назначении XT учёта молекулярно-генетических особенностей опухоли. Эпителиальный рак яичников — самый смертоносный гинекологический рак во всем мире. Химиорезистентность является одной из основ-

© Коллектив авторов, 2019

*Адрес для корреспонденции: 432017, г. Ульяновск, ул. Архитектора Ливчака, д. 2, УГУ. E-mail: Naum-53@yandex.ru

ных причин неудачи лечения [2]. Персонифицированное лечение больныгх раком яичников (РЯ) сегодня, видимо, должно учитывать тот факт, что клетки солидной и рецидивной асцитной форм могут существенно отличаться по набору и количеству экспрессируемых молекулярных маркеров [3]. Асцит может образовываться с момента возникновения заболевания и включать опухолевые клетки, устойчивые к препаратам I линии химиотерапии, используемым при терапии солидного РЯ. Препараты платины сегодня широко применяются при лечении РЯ. При этом полностью или частично на платиносодержащую терапию I линии отвечают только порядка 80% пациенток [4, 5]. Следовательно, каждая 5-я пациентка получает

токсичное и неэффективное лечение. На сегодняшний день показана роль системы репарации повреждений ДНК и, в частности, эндонуклеазы ERCC1-XPF в механизмах развития резистентности РЯ к препаратам платины. Рядом исследователей показано, что уровень транскрипции ERCC1, белка, участвующего в вырезании повреждённого участка ДНК, коррелирует с чувствительностью клеточных линий РЯ к препаратам платины [6]. Система АТФ-связанных кассетных транспортёров является одним из основных механизмов лекарственной устойчивости. Это белки семейства АБС, которые осуществляют АТФ-за-висимый транспорт в том числе и цито-статиков. Регуляция экспрессии генов АБС-транспортёров возможна на уровне опухолевых клеток и организма в целом. При этом под влиянием химиопре-паратов экспрессия АБС-транспортёров повышается [7]. Роль различных представителей семейства АБС-транспортёров в развитии первичной и приобретённой химиорезистентности изучается. Показано, в частности, что длительная цисплатиновая терапия сопровождалась повышенной экспрессией ABCB1 [8]. Также показано, что повышение экспрессии ABCB1 при РЯ коррелирует с укорочением безрецидивного периода [9]. Топоизомераза 2А — продукт гена TOP2A — участвует в изменении структуры хроматина в процессе репликации ДНК. Доксорубицин связывается с комплексом ДНК-топо-изомераза 2А и блокирует митоз, т.е. экспрессия белка TOP2A определяет чувствительность опухолевых клеток к доксорубицину. Однако данные относительно связи экспрессии TOP2A с эффективностью доксорубициносодержа-щей терапии достаточно противоречивы. Показано, что увеличение экспрессии TOP2A коррелирует с большей эффективностью антрациклиносодержа-щих схем и лучшей общей выживаемостью [10—12]. Однако, по данным других авторов [13], повышение экспрессии TOP2 в опухолевой ткани при карциноме яичников коррелировало с более коротким средним временем жизни.

Исходя из вышеизложенного целью исследования была оценка маркеров первичной химиорезистентности в эпителиальных клетках асцита больных РЯ.

Рис. 1. Безрецидивная выживаемость по Каплан-Майеру в зависимости от уровня транскрипта генов химиорезистентности.

а - экспрессия БРСС1 в клетках асцита; б - экспрессия ТОР2а в клетках асцита; в - экспрессия АВСВ1 в клетках асцита.

Материал и методы

Обследованы 32 больных с морфологически верифицированным асцитным РЯ в возрасте 36—80 лет (медиана 61,5 года) на III—IV клинических стадиях по FIGO. У всех обследованных наличие опухолевых клеток в асцитической жидкости подтверждено цитологически. По гистотипу большинство злокачественных опухолей представляли собой серозную аде-нокарциному (68,8%), эндометриоидную аденокарциному (в 31,2% случаев). Пациентки обследованы стандартно, они получали стандартную химиотерапию по схеме АР (циспла-тин+доксорубицин). В зависимости от времени возникновения рецидива после последнего курса XT все пациентки были разделены на 2 группы: с ранним рецидивом (до 6 мес.) и с рецидивом после 6 мес. Исследование проведено согласно требованиям комиссии по этике ИМЭиФК ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет» (протокол № 3 от 15.03.2015 г.).

Для выделения эпителиальных клеток из асцитической жидкости биоматериал центрифугировали при 1500 об/мин в течение 15 мин, осадок промывали в фосфатном солевом буфере (рН 7,4) и сохраняли в растворе, стабилизирующем РНК, при -80°С. Экстракция и очистка тотальной РНК проходила согласно протоколам производителя (ExtractRNA и CleanRNA Standard, ООО «Евроген», г. Москва) с последующей ОТ-ПЦР. В работе были использованы зонды TaqMan производства ThermoScientific: ERCC1 (Hs01012155_g1), TOP2a (Hs01032155_g1), ABCB1 (Hs01070648_m1). В качестве гена-рефери была использована 18S (Hs99999901_s1). Нормализованная экспрессия изученных генов, определяемая на амплифика-торе CFX96 (BioRad), высчитывалась относительно образцов морфологического неизменённого интактного яичника. ПЦР ставили в триплетах в конечном объёме 12,5 мкл, содержащем 2,5 мкл qPCRmix-HS (ООО «Евроген»), 6,5 мкл деионизован-ной воды, 1 мкл смеси прямого и обратного праймеров и флуоресцентной метки FAM (зонда) (ThermoScientific), 2,5 мкл кДНК матрицы. Программа амплификации была следующей: 1 цикл 95°С — 5 мин; 45 циклов 95°С — 15 с, 62°С — 30 с, 72°C — 20 с. Снятие флуоресцентного сигнала производилось на зелёном светофильтре (канал FAM) при 62°С.

Анализ безрецидивной и общей выживаемости по Каплан—Майеру проводился с использованием Statisttea 10.0. Достоверность различий между группами оценивали с использованием критерия Cochrane Q-test.

Результаты исследования

В результате проведённых исследований установлено, что у 67% пациентов с асцитной формой РЯ отмечены ранние рецидивы (в течение 6 мес. после прохождения последнего курса XT), и средний безрецидивный период составил 88,7±13,3 дня. У 33% обследованных не наблюдался рецидив в течение года после последнего курса XT. Причём в группе с повышенной экспрессией ERCC1 в эпителиальных клетках асцита больных РЯ среднее значение безрецидивного периода составило 86,5±14,9 дня (рис. 1, а), с повышенной экспрессией TOP2a — 92,8+21,7 (рис. 1, б), с повышенной экспрессией ABCB1 — 85,6+33,3 дня (рис. 1, в).

40% пациентов умерли в течение 1 года наблюдения, период общей выживаемости составил 241,07+48,8 дня.

Установлено, что в группе пациентов с ранним рецидивом уровень транскрипта ERCC1 повышен у 71,4% наблюдаемых, TOP2A — у 50%, ABCB1 — у 33% больных. В группе с поздним рецидивом число пациентов с повышенной экспрессией изученных генов практически не различаются (рис. 2).

Анализ выживемости пациентов с асцитной формой РЯ в зависимости от первичного моле-кулярно-генетического профилирования эпителиальных клеток асцита показал, что при сниженном уровне транскриптов генов ERCC1, ABCB1 (вероятность такой комбинации 28,9%) доля выживших составляет 72,7% (Cochrane Q-test, ^<0,157). При анализе 2 показателей, ответственных за чувствительность к препаратам стандартной XT, показано, что снижение транскрипта ERCC1 и повышение транскрипта TOP2a в клетках асцита первичных больных РЯ повышает вероятность выживания в течение 1 года до 75% (встречаемость такой комбинации в выборке — 10,5%). Однако при совместной комбинации (снижение ERCC1 и снижение TOP2a, встречаемость в выборке — 34,2%) доля выживших также достаточна высока и составляет 69,2% (р<0,157). Ситуация, когда снижен ERCC1, а остальные параметры не учиты-

Рис. 2. Число пациентов с повышенным уровнем нормализованной экспрессии генов химиорезистентности в группах с ранним и поздним рецидивом.

ваются, встречается в 44,7% случаев и даёт вероятность выживания 70,5%.

Исследования, посвящённые оценке молекулярной характеристики асцитных форм РЯ немногочисленны. По данным литературы, эпителиальные клетки асцита при РЯ происходят из первичной опухоли, включают субпопуляции стволовых клеток РЯ, чрезмерно экспрессируют основной антиген гистосовместимости I класса, что позволяет им избегать иммунного надзора, повышенно инвазивны и резистентны к лекарственным средствам [14, 15]. Клетки асцита при этом изучались в качестве мишени при разработке лекарств для рецидивной асцитной формы РЯ. Определённый интерес представляет работа по профилированию экспрессии miRNAs" в асците в

ЛИТЕРАТУРА

1. Чу Э., Де Вита В. Химиотерапия злокачественных новообразований. М.: Практика; 2008./ Chu E., De Vita V. Khimioterapiya zlokachestvennykh novoobrazovanij. M.: Praktika; 2008. [in Russian]

2. Liu S.C., Lin H, Huang C.C., Chang Chien C.C., Tsai C.C. et al. Prognostic role of excision repair cross complementing-1 and topoiso-merase-1 expression in epithelial ovarian cancer. Taiwan J Obstet Gynecol. 2016, 55 (2): 213—219.

3. Богуш T.A., Калюжный C.A., Дудко E.A., Кирсанов В.Ю., Тюляндина А.С., Богуш E.A. и др. Молекулярные особенности асцитных клеток рака яичников, выявляемых при иммунофлуориесцентном анализе с привлечением проточной цитофлуориметрии. Вестн. Моск. университета. Сер. 2. Химия. — 2016. — T. 57. — № 5. — С. 330— 335. / Bogush T.A., Kaljyuzhnyj S.A., Dudko E.A., Kirsanov V.Jyu, Tjyulyandina A.S., Bogush E.A. i dr. Molekulyarnye osobennosti ascit-nykh kletok raka yaichnikov, vyyavlyaemykh pri immunofluoriescent-nom analize s privlecheniem protochnoj citofluorimetrii. Vestn Mosk universiteta. Ser. 2. Khimiya 2016; 57: 5: 330—335. [in Russian]

4. Deloia J.A., BhagwatN.R., Darcy K.M., Strange M, Tian C, NuttallK. et al. Comparison of ERCC1/XPF genetic variation, mRNA and protein levels in women with advanced stage ovarian cancer treated with intraperitoneal platinum. Gynecol Oncol 2012; 126 (3): 448—454.

5. Cepeda V., Fuertes M.A., Castilla J., Alonso C. Quevedo C, Perez J.M. Biochemical mechanisms of cisplatin cytotoxicity. Anticancer Agents Med Chem 2007; 7 (1): 3—18.

6. Arora S, Kothandapani A., Tillison K, Kalman-Maltese V., Patrick S.M. Downregulation of XPF-ERCC1 enhances cisplatin efficacy in cancer cells. DNA Repair (Amst) 2010; 9 (7): 745—753.

7. Goler-Baron V., Assaraf Y.G. Overcoming multidrug resistance via photodestruction of ABCG2-rich extracellular vesicles sequestering photosensitive chemotherapeutics. PLoS One 2012; 7 (4): e35487.

8. Sun Y, Guan Z, Liang L, Cheng Y, Zhou J., Li J., Xu Y. NF-kB signaling plays irreplaceable roles in cisplatin-induced bladder cancer chemoresis-tance and tumor progression. Int J Oncol 2016; 48 (1): 225—234.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Долгова Динара Ришатовна — к. б. н., доцент кафедры физиологии и патофизиологии медицинского факультета, ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет», Ульяновск

Генинг Татьяна Петровна — д. б. н., профессор зав.каф. физиологии и патофизиологии медицинского факультета, ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет», Ульяновск

Абакумова Татьяна Владимировна — к. б. н., доцент кафедры физиологии и патофизиологии медицинского факультета, ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет», Ульяновск

Генинг Снежанна Олеговна — аспирант каф. онкологии и лучевой диагностики медицинского факультета, ФГБОУ

плане корреляции с общей выживаемостью [16]. Полученные нами данные о корреляции уровней генов-маркеров химиорезистентности в клетках асцита с безрецидивной выживаемостью позволяют с высокой степенью вероятности прогнозировать ответ на стандартную XT РЯ по схеме АР.

Заключение

Таким образом, для прогнозирования возможного ответа на стандартную XT по схеме АР при асцитном РЯ целесообразно оценивать в эпителиальных клетках асцита экспрессию 2 показателей — ERCC1 и ABCB1.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ

9. Sedlakova I., Laco J., Caltova K, Cervinka M,. Tosner J., Rezac A., SpaSek J. Clinical significance of the resistance proteins LRP, Pgp, MRP1, MRP3, and MRP5 in epithelial ovarian cancer. Int J Gynecol Cancer 2015; 25 (2): 236—243.

10. Erriquez J., Becco P., Olivero M., Ponzone R., Maggiorotto F., Ferrero A. et al. TOP2A gene copy gain predicts response of epithelial ovarian cancers to pegylated liposomal doxorubicin: TOP2A as marker of response to PLD in ovarian cancer. Gynecol Oncol 2015; 138 (3): 627—633.

11. Liu S.C., Lin H., Huang C.C, Chang Chien C.C., Tsai C.C., Ou Y.C. et al. Prognostic role of excision repair cross complementing-1 and topoi-somerase-1 expression in epithelial ovarian cancer. Taiwan J Obstet Gynecol 2016; 55 (2): 213—219.

12. Казанцева П.В., Цыганов M.M., Слонимская E.M., Литвяков Н.В., Чердынцева Н.В., Ибрагимова М.К. и др. Молекулярно-генетичес-кие маркеры эффективности неоадъювантной химиотерапии с применением антрациклинов у больных раком молочной железы. Сибирский онкологический журнал. — 2016. — Т. 15. — № 2. — С. 29—35. / Kazanceva P.V., Cyganov M.M., Slonimskaya E.M., Litvyakov N.V., Cherdynceva N.V., Ibragimova M.K. i dr. Molekulyarno-genetich-eskie markery effektivnosti neoad#jyuvantnoj khimioterapii s primene-niem antraciklinov u bol'nykh rakom molochnoj zhelezy. Sibirskij onko-logicheskij zhurnal 2016; 15: 2: 29—35. [in Russian]

13. Lu D., Shi H.C., WangZ.X., Gu X.W., Zeng ZJ.Multidrug resistance-associated biomarkers PGP, GST-pi, Topo-II and LRP as prognostic factors in primary ovarian carcinoma. Br J Biomed Sci 2011; 68 (2): 69—74.

14. Sarkar S., Malekshah O.M., Nomani A., Patel N., Hatefi A. A novel chemotherapeutic protocol for peritoneal metastasis and inhibition of relapse in drug resistant ovarian cancer. Cancer Med 2018 Jun 21.

15. Akhter M.Z., Sharawat S.K., Kumar V., Kochat V., Equbal Z., Ramakrishnan M. et al. Aggressive serous epithelial ovarian cancer is potentially propagated by EpCAM+CD45+ phenotype. Oncogene 2018; 37 (16): 2089-2103.

16. Zaveska L., Jandakova E., Weinberger V., Minar L., Hanzikova V., Duskova D. et al. Extracellular microRNAs as Potential Biomarkers for Ovarian Cancer. Reprod Sci. 2018 Jan 1; 1933719118776808.

ВО «Ульяновский государственный университет», Ульяновск

Антонеева Инна Ивановна — д. м. н., профессор каф. онкологии и лучевой диагностики медицинского факультета, ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет», Ульяновск

Песков Андрей Борисович — д. м. н., профессор каф. последипломного образования и семейной медицины, ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет», Ульяновск

Федотова Антонина Юрьевна — инженер-исследователь Научно-исследовательского медико-биологического центра, ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный университет», Ульяновск