Возможность получения сперматозоидов у мужчин с немозаичной формой синдрома Клайнфельтера в программах экстракорпорального оплодотворения. Обзор литературы и описание случая

Возможность получения сперматозоидов у мужчин с немозаичной формой синдрома Клайнфельтера в программах экстракорпорального оплодотворения. Обзор литературы

и описание случая

И.И. Витязева1, С.В. Боголюбов1, Е.Е. Брагина2, Е.А. Арифулин2

ФГБУ«Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва; 2отдел электронной микроскопии Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского ФГОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»

Контакты: Ирина Ивановна Витязева vitiazeva@yandex.ru

Описаны современные методы обследования, предоперационной подготовки и хирургического лечения бесплодия у мужчин с немозаичной формой синдрома Клайнфельтера (СК) путем извлечения тестикулярных сперматозоидов методом микродиссекции. Мужчины с СК, реагирующие на гормональную терапию ингибиторами ароматазы и хорионическим гонадотропином человека (ХГЧ), имеют больше шансов на благоприятный исход лечения бесплодия. Объем яичек, уровень тестостерона и результаты теста с ХГЧ являются важными прогностическими факторами у данной группы пациентов. Приведен клинический случай попытки лечения бесплодия у мужчины с СК методом микрохирургической экстракции сперматозоидов из ткани яичка (микроТЕСЕ).

Ключевые слова: мужское бесплодие, вспомогательные репродуктивные технологии, экстракорпоральное оплодотворение, ин-трацитоплазматическая инъекция единичного сперматозоида в ооцит, необструктивная азооспермия, синдром Клайнфельтера, микроТЕСЕ, AZF-делеции, извлечение сперматозоидов

Microdissection testicular sperm extraction in patients with non-mosaic Klinefelter syndrome in programme in vitro

fertilization: literature review and cases report

I.I. Vityazeva1, S.V. Bogolyubov1, Ye.Ye. Bragina2, Ye.A. Arifulin2

Endocrinology Research Center, Ministry of Health of Russia, Moscow; Department of Electron Microscopy, A.N. Belozersky Research Institute of PhysicochemicalBiology, M.V. Lomonosov Moscow State University

The article describes modern methods of examination, preoperative preparation and surgical treatment of infertility in men with non-mosaic form of Klinefelter syndrome (SK) by microdissection method of testicular sperm retrieval. Men with SK responsive to hormonal therapy with aromatase inhibitors and human chorionic gonadotropin (HCG), have a greater chance of a favourable outcome of infertility treatment. Testicular volume, testosterone levels and test results with HCG are important prognostic factors in this group of patients. We present a clinical case of treatment of infertility in men with SK by microTESE (microdissection testicular sperm extraction).

Key words: male infertility, assisted reproductive technologies, in vitro fertilization, intracytoplasmatic sperm injection, nonobstructive azoospermia, Klinefelter syndrome, microTESE, AZF-deletions, sperm retrieval rate

E

W

E

При ряде генетических заболеваний понимание их патофизиологии в сочетании с последними достижениями в области репродуктивной медицины могут значительно изменять перспективу биологического отцовства. Одним из таких генетических заболеваний является синдром Клайнфельтера (СК) — самая частая и тяжелая форма первичного мужского гипергонадотропного гипо-гонадизма, сопровождающаяся необструктивной азооспермией (НОА). По распространенности среди эндокринных патологий СК занимает третье место после сахарного диабета и заболеваний щитовидной железы [1].

В 1942 г. H.F. Jr. Klinefelter, будучи ассистентом профессора F. Albright в Массачусетской клинике общих заболеваний, совместно с ним описал 9 случаев с первичным гипогонадизмом, характеризующимся гинекомастией, уменьшенным объемом яичек, отсутствием сперматогенеза при сохранности клеток Лей-дига и с повышенной экскрецией фолликулостимули-рующего гормона (ФСГ) [2]. Через 30 лет R.G. Bunge и J.T. Bradbury провели цитогенетическое исследование пациента с аналогичной клинической картиной и определили кариотип мужчины как 47,XXY. В даль-

нейшем это генетическое заболевание получило название «синдром Клайнфельтера» [3].

Подобный синдром диагностируется у 10—12 % мужчин с азооспермией. В общей популяции мужского населения распространенность СК колеблется от 1/500 до 1/1000 и достигает 3—4 % среди мужчин с бесплодием. По данным австралийских авторов, вы-являемость СК составляет 223 на 100 000 мужчин, причем около 50 % случаев остаются без верификации. При пренатальном скрининге СК идентифицируется у 1 из 500 мальчиков [4, 5].

Согласно данным Бюро переписи населения США, в 2008 г. насчитывалось от 35 000 до 50 000 детей и подростков и приблизительно 550 000 мужчин всех возрастов с СК. Несмотря на то что в США и Европе в диагностике генетической патологии во время беременности существует и успешно используется самый дешевый и быстрый метод количественного определения основных анеуплоидий (флуоресцентная полиме-разная цепная реакция (ПЦР)) и тандемного повтора (STR — short tandem repeat) маркеров, для скрининга новорожденных на СК этот метод не применяют [6].

СК является более распространенным заболеванием, чем 3 другие формы патологии (врожденный гипотиреоз, фенилкетонурия, галактоземия), для которых сейчас в России существуют обязательные скрининго-вые программы. Только у 10 % мальчиков СК диагностируется до пубертатного возраста, у 25 % — в юности или раннем репродуктивном возрасте, а остальные случаи остаются не выявленными [6].

Главные симптомы СК — тестикулярная недостаточность и когнитивные проблемы — результат присутствия дополнительной Х-хромосомы. Спектр фенотипов взрослых пациентов с СК очень широк и колеблется от явного гипогонадизма до нормально вирилизированных мужчин. Поэтому диагноз часто устанавливается поздно. Нередко такие мужчины являются пациентами врачей других специальностей: эндокринологов (алиментарное ожирение, гинекомастия, сахарный диабет, нарушение функции щитовидной железы); терапевтов и невропатологов (боли в спине и костях); психологов и психотерапевтов (отставание интеллектуального развития и нарушение конгнитивных функций); и, к сожалению, лишь в последнюю очередь — урологов-андрологов (эректильная дисфункция и бесплодие) [1, 6, 7].

Заболевание связано с нерасхождением хромосом на ранних стадиях мейотического деления оогенеза (в 2/3 случаев) или сперматогенеза (в 1/3 случаев). Генотип 47,XXY имеют большинство пациентов с СК. Однако от 3 до 20 % мужчин с этим синдромом являются мозаиками (46,XY/47,XXY). Если при таком варианте заболевания репродуктивная функция сохранена, то частота сперматозоидов с дисомией половых хромосом (XX и YY) на порядок превышает долю анеуплоидных

по половым хромосомам сперматозоидов в эякуляте пациентов с нормальным кариотипом (46,XY). При FISH-анализе сперматид и сперматозоидов частота дисомных гамет при СК существенно выше, чем в контрольной группе (8,09 % против 0,11 %) [8-11].

N. Rives et al. сравнили анеуплоидию половых хромосом в сперматозоидах пациентов с кариотипом 47,XXY и 46,XY/47,XXY с таковой у мужчин 2 контрольных групп. В 1-ю контрольную группу вошли пациенты с доказанной фертильностью, во 2-ю — мужчины с нормальным кариотипом и бесплодием. Частота XX- и YY-дисомии, XY-гипергаплоидных и диплоидных сперматозоидов у мужчин с 47,XXY была значительно выше, чем у пациентов обеих контрольных групп (р < 0,0001). Аналогичные данные получены и в отношении мужчин с кариотипом 46,XY/47, XXY, за тем лишь исключением, что у них частота YY-дисомии сперматозоидов существенно не отличалась от наблюдавшейся у пациентов с бесплодием. Частота анеуплоидии половых хромосом у мужчин с кариоти-пом 47,XXY и 46,XY/47,XXY была практически одинаковой, однако частота XX-дисомии ядер сперматозоидов у пациентов с 47,XXY была выше, чем у мужчин с 46,XY/47,XXY. Частота дисомии хромосомы 12 была увеличена у 2 пациентов с XXY (0,42 и 0,49 %, р < 0,0001). Мейотические отклонения, наблюдаемые у 2 пациентов с XXY, были обусловлены нарушением сегрегации XY-половых клеток. Увеличение числа нерасхождений хромосом во время митоза половых клеток мужчин с бесплодием — характерная особенность как олиго-, так и азооспермии. У потомства пациентов с СК и олигозооспермией повышен риск анеуплоидии как половых хромосом, так и аутосом. Таким пациентам рекомендована преимплантационная генетическая диагностика по программе экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) /интрацитоплазматической инъекции единичного сперматозоида (ИКСИ), хотя она и сопряжена с некоторым риском потери эмбриона или некорректной диагностики [11, 12].

Дополнительная Х-хромосома при СК в 60 % случаев оказывается отцовской и в 40 % — материнской. Полисомия материнской половой хромосомы в 70 % случаев возникает из-за отклонений во время мейоза I. Обычно, если нерасхождение хромосом не является результатом постзиготного митотического нарушения у эмбриона, оно никак не связано с возрастом матери. В большинстве случаев, когда Х-хромосома является отцовской, Х и Y хромосомы не рекомбинируются друг с другом в мейозе I, и в результате получаются 2 парные хромосомы в одной дочерней клетке. Влияние возраста отца на возникновение СК остается недоказанным [13, 14].

Обычно СК клинически проявляется лишь после полового созревания. Из-за гетерогенности фенотипа (степень вирилизации резко варьирует), а также пото-

Е га Е

Е га Е

му что основные симптомы (андрогенная недостаточность, бесплодие) выявляются лишь в репродуктивном возрасте, СК, как уже отмечалось, диагностируется относительно поздно, зачастую только при обращении супружеской пары по поводу отсутствия беременности. Почти постоянными признаками СК при немозаичной (полной) форме являются уменьшенные плотные яички и азооспермия, и лишь в некоторых случаях — криптозооспермия (обнаружение единичных сперматозоидов в осадке после отмывания и центрифугирования эякулята) и/или андрогенная недостаточность. Полагают, что при низком или нормальном уровне тестостерона и высоких уровнях лю-теинизирующего гормона (ЛГ) и ФСГ все пациенты с СК нуждаются в компенсации гипогонадизма — медикаментозной заместительной терапии с перипубер-татного возраста [15, 16].

Тестикулярная дегенерация (гиалинизация и фиброз) со временем прогрессирует, и большинство юношей теряют зародышевые половые клетки уже до 14 лет. M.G. Bastida et al. обследовали 29 пациентов с СК (16 из них были препубертатного возраста, а 13 вступили в период полового созревания). Перед половым созреванием уровни ЛГ, ФСГ, тестостерона, антимюллерова гормона (АМГ) и ингибина B практически во всех случаях оставались в пределах нормы. В период полового созревания уровень ФСГ нарастал раньше и более заметно, чем уровень ЛГ. Ингибин В и АМГ в пубертатном периоде практически не определялись [16].

Раньше мужчин с немозаичной формой СК (47,XXY) считали абсолютно бесплодными. При гистологическом исследовании ткани яичек у них определяются обширные поля клеток Лейдига и гиалинизиро-ванные, а в некоторых случаях и склерозированные семенные канальцы с редкими очагами незавершенного сперматогенеза. Мягкая дисфункция клеток Лейди-га в большинстве случаев присутствует с самого раннего детства и сохраняется в период половой зрелости. Функция клеток Сертоли чаще всего снижена, а с середины периода полового созревания наблюдается резкое ее ухудшение. К сожалению, менее чем у 10 % мужчин синдром выявляется до пубертата. Иными словами, возможности терапевтического вмешательства до полной утраты зародышевых половых клеток очень ограничены. Кроме того, во многих случаях СК до пубертатного периода имеет место крипторхизм.

С совершенствованием вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), в том числе ИКСИ, появилась теоретическая возможность лечения бесплодия у пациентов с СК [15, 16]. В 1998 г. G. Palermo et al. впервые сообщили о нескольких случаях успешного лечения бесплодия у мужчин с немозаичной формой СК. За последние 15 лет зарегистрировано более 100 детей с нормальным кариотипом, рожденных от мужчин с СК [17-22].

J. Schiff et al. описали результаты 54 процедур извлечения тестикулярных сперматозоидов из семенных канальцев методом микрохирургической экстракции сперматозоидов из ткани яичка (microdissection testicular sperm extraction, микроТЕСЕ) при 25-кратном оптическом увеличении у 42 мужчин с СК [20]. Средний возраст пациентов на момент операции составлял 32,8 года. Средний возраст женщин — 33,2 года. Средний объем яичек у мужчин с СК — 2,5 см3 с каждой стороны. Уровни ФСГ и тестостерона составляли в среднем 33,2 МЕ/л (норма: 1,0-8,0 МЕ/л) и 9,8 нмоль/л (норма: 8,2-27,2 нмоль/л). Все пациенты с уровнем тестостерона в сыворотке крови < 15,6 нмоль/л первоначально получали гормональное лечение: только тестолактон (50-100 мг внутрь 2 раза в день) принимали 19 пациентов, в сочетании с инъекциями хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) (1500 МЕ внутримышечно 2 раза в неделю) — 13 больных; ингибитор аро-матазы (ИА) (анастрозол 1 мг/сут) был назначен 5 мужчинам, а в сочетании с ХГЧ — 1 пациенту; кло-мифен цитрат (25 мг/сут) получали 3 пациента; ре-комбинантный ФСГ (в течение 6 мес до процедуры микроТЕСЕ) - 1. У всех мужчин, получавших анастрозол и кломифен цитрат, удалось извлечь пригодные для дальнейшей работы сперматозоиды. У пациентов, принимавших только тестолактон или те-столактон в сочетании с ХГЧ, сперматозоиды были получены в 74 и 54 % случаев соответственно. Следует отметить, что из 6 мужчин с нормальным уровнем тестостерона гаметы были получены только у 4. После лечения уровень тестостерона составил 17,0 нмоль/л (р < 0,001). Сперматозоиды, пригодные для ИКСИ, были получены во время 39 из 54 процедур микроТЕСЕ (72,2 %) в день пункции фолликулов у партнерши или на день раньше. В 33 из 39 циклов ЭКО-ИКСИ-микроТЕСЕ были осуществлены переносы эмбрионов. Наступило 18 клинических беременностей и родился 21 живой ребенок с нормальным кариотипом. К сожалению, ни одной беременности не было достигнуто в последующих программах ЭКО-ИКСИ с применением размороженных тестикулярных сперматозоидов. По оценкам авторов, по меньшей мере 60 % мужчин с СК имеют жизнеспособные сперматозоиды, которые можно обнаружить с помощью техники микроТЕСЕ и использовать для ЭКО-ИКСИ.

В настоящее время не установлены оптимальные для извлечения сперматозоидов ни возраст, ни сроки медикаментозной терапии. Введение экзогенного тестостерона может снижать вероятность извлечения сперматозоидов. Не исключено, что это связано с исходно более тяжелой андрогенной недостаточностью у пациентов, которым назначают инъекции тестостерона. Генетический риск для потомства пациентов

с СК не превышает таковой для потомства мужчин с НОА и нормальным кариотипом [19].

К 2009 г. та же группа исследователей провела в общей сложности 91 процедуру микроТЕСЕ у 68 мужчин с немозаичной формой СК, получавших различные виды предоперационной гормональной подготовки. Удалось получить сперматозоиды у 45 (66,0 %) пациентов. Авторы предположили, что больший возраст и отсутствие эффекта предоперационной терапии являются плохими прогностическими факторами в отношении получения качественных сперматозоидов. После проведенной терапии у мужчин с уровнем тестостерона > 8,7 нмоль/л вероятность получения сперматозоидов, частота оплодотворения (FR — fertility rate) и частота наступления клинической беременности (PR — pregnancy rate) были выше, чем у мужчин с более низким уровнем тестостерона [23].

S. Friedler et al. провели ряд исследований, в которых использовали и свежие, и размороженные сперматозоиды от мужчин 23—36 лет с немозаичной формой СК. Исходные уровни ФСГ у пациентов были повышены, составляя в среднем 38,3 ± 11,4 мМЕ/мл (22—58 мМЕ/мл). Объем яичек колебался от 2 до 4 мл. Зрелые сперматозоиды при микроТЕСЕ удалось извлечь у 5 (42 %) из 12 пациентов. При использовании свежих и криоконсервированных сперматозоидов статистически значимых различий в FR (66,0 % против 58,0 % соответственно), частоте дробления эмбрионов (CR — cleavage rate; 98,0 % против 90,0 % соответственно) и частоте имплантации (IR — implantation rate; 33,3 % против 21,4 % соответственно) выявлено не было. После оплодотворения свежими сперматозоидами наступило 2 одноплодные беременности и 1 беременность тройней; после оплодотворения размороженными сперматозоидами было зарегистрировано 2 беременности. Все рожденные дети были генетически здоровы [21].

Обследовав 21 пациента с немозаичной формой СК, I. Madgar et al. установили прогностическое значение клинических и лабораторных показателей у мужчин, участвующих в программах ВРТ: сперматозоиды при микроТЕСЕ были обнаружены у 45 % пациентов, средний объем яичек, из которых удавалось получить сперматозоиды, составил 7,8 ± 2,5 мл (что представляется большим объемом для СК), а тех, из которых сперматозоиды извлечь не удалось, — 5,6 ± 1,2 мл. Уровни тестостерона в соответствующих случаях составляли 12,2 ± 4,2 и 5,9 ± 2,8 нмоль/л; уровни ФСГ и ЛГ в сыворотке между группами существенно не различались. После пробы с ХГЧ у мужчин с положительным результатом средний уровень тестостерона составил 55,6 ± 21,8 нмоль/л, а у тех, у кого сперматозоиды получены не были, — 23,7 ± 19,4 нмоль/л [24].

M.C. Maiburg et al., проводя анкетирование голландских мужчин с СК и их партнерш, выяснили,

что большинство из них (90 %) хотят иметь детей и позитивно относятся к проведению микроТЕСЕ по программе ИКСИ. Аргументами против микроТЕСЕ являлись возможный риск врожденных пороков или задержка развития ребенка [25].

В литературе имеются противоречивые данные о взаимосвязи между азооспермией пациентов с СК и полиморфизмом факторов азооспермии (AZF — azoospermia factor). Микроделеции AZF на длинном плече Y-хромосомы — наиболее часто встречающиеся генетические изменения при азооспермии и тяжелой форме олигозооспермии. Они являются одной из главных причин мужского бесплодия. Частота встречаемости микроделеций AZF-региона у мужчин с бесплодием варьирует от 1,0 до 35,0 %. При НОА такие микроделеции выявляются у 15—25 % мужчин, при па-тозооспермии тяжелой степени — у 7—10 %. Возможными причинами столь сильного расхождения могут быть разные критерии отбора пациентов, а также различное количество используемых маркеров для анализа ДНК. Наиболее часто микроделеции обнаруживаются в субрегионе AZFc (до 72 %), в субрегионе AZFb (15—16 %) и в субрегионе AZFa (5—6 %). Комбинация микроделеций во всех субрегионах встречается почти у 14—17 % пациентов. У подавляющего числа мужчин с микроделециями AZF-локуса верифицируется первичное бесплодие и в 80—85 % случаев — азооспермия [26, 27].

L. Hadjkasem-Loukil et al. обследовали 29 пациентов с азооспермией и 13 фертильных мужчин. Классические микроделеции были обнаружены у 6 из 9 пациентов с СК. Делеции gr/gr и b2/b3 являются частичными делециями AZFc-региона. Один пациент с СК без классических микроделеций имел gr/gr-делецию. Такие делеции были выявлены и у 4 из 18 пациентов с азооспермией без хромосомных аномалий. Кроме того, в этой группе были определены две b2/b3- и одна AZFc-делеция. Все пациенты с СК имели повышенный уровень ФСГ и ЛГ в плазме, но нормальную концентрацию тестостерона. При биопсии яичек пациентов с микроделецией Y-хромосомы был выявлен Сертоли-клеточный синдром. В группе фертиль-ных мужчин не были обнаружены ни микроделеции, ни частичные делеции региона AZFc. Сделан вывод, что популяция пациентов с СК может включать пациентов с Y-микроделециями, и скрининг на данные делеции должен быть частью диагностики, особенно при планировании лечения бесплодия методом ЭКО-ИКСИ [28].

По мнению J.H. Choe et al., рутинный скрининг классических AZF-делеций у пациентов с СК не является необходимым. Авторы нашли, что классическая AZF-делеция у пациентов с кариотипом 47,XXY может и не играть роли в генетической предрасположенности к СК. Они обследовали 95 мужчин с СК и азоосперми-

Е га Е

Е га Е

ей, среди которых 91 пациент имел чистую форму СК (47,XXY), а 4 были мозаиками (47,XXY/46,XY). Для определения наличия микроделеций Y-хромосомы (sY84, sY129, sY134, sY254, sY255) использовали метод ПЦР. Микроделеции Y-хромосомы не были обнаружены ни у одного пациента с СК и ни у одного фертильного мужчины. Уровень ФСГ у пациентов с СК был выше, чем у фертильных мужчин (38,2 ± 10,3 мМЕ/мл против 5,4 ± 2,9 мМЕ/мл соответственно,р < 0,001), а уровень тестостерона — ниже (1,7 ± 0,3 нг/мл против 4,3 ± 1,3 нг/мл соответственно, р < 0,001). Для уточнения механизма, лежащего в основе тяжелых нарушений сперматогенеза у пациентов с СК, необходимы дальнейшие исследования, включающие анализ частичных деле-ций региона AZFc (например, gr/gr или b2/b3) [29].

Различия в частоте получения сперматозоидов (SRR — sperm retrieval rate) могут быть связаны с гетерогенностью морфологии тестикулярной ткани. Наибольшая SRR имела место, если пациенты в предоперационном периоде принимали ИА, а само извлечение сперматозоидов проводилось методом микроТЕСЕ. Заместительная терапия тестостероном у мужчин с СК ассоциировалась с наименьшей SRR. Следовательно, необходимо постоянно следить за уровнем гонадотропинов, чтобы снизить риск подавления функции яичек, если в будущем потребуется лечение бесплодия [19].

Необходимы дальнейшие исследования и для установления оптимального срока заместительного лечения тестостероном у мужчин с СК. J.D. Raman и P.N. Schlegel прекращали введение препаратов тестостерона за 6—12 мес до начала лечения бесплодия. ИА (аримидекс (AsrtraZeneka)) назначали в предоперационном периоде всем пациентам (минимально в течение 6 мес), чтобы снизить уровень эстрадиола и повысить выработку тестостерона. ИА увеличивал уровень эндогенного тестостерона, и его использование связано не только с повышением SRR, но и с изменением качества тестикулярных сперматозоидов [30].

У некоторых пациентов с СК в эякуляте могут появляться единичные сперматозоиды. Поэтому существует дилемма: провести оплодотворение в программе ЭКО-ИКСИ эякуляторными сперматозоидами или использовать тестикулярные, извлеченные при микроТЕСЕ. I. Ben-Ami et al. провели в общей сложности 116 циклов ЭКО-ИКСИ у 17 пациентов с криптозооспермией. Первоначально было проведено несколько циклов ИКСИ с использованием эякуляторных сперматозоидов (n = 68), а при безуспешности лечения — тестикулярных (n = 48). Не было выявлено существенных различий в FR между 2 подгруппами, но при дальнейшем сравнении результаты лечения оказались значительно более высокими (IR — 20,7 % против 5,7 %, PR — 42,5 % против 15,1 % и частота живорожденных детей — 27,5 % против 9,4 %) при оплодотворении сперматозоидами, получен-

ными при микроТЕСЕ. Было определено 3 значимых предиктора наступления и вынашивания беременности, а именно: а) использование тестикулярных сперматозоидов; б) использование подвижных сперматозоидов; в) возраст женщины на момент проведения программы ЭКО-ИКСИ [31].

В последние годы для сохранения перспективы фертильности у пациентов препубертатного и ранне-пубертатного возраста с СК или у тех, которым предстоит лечение гонадотоксичными препаратами (поскольку эти пациенты еще не производят сперматозоиды и, соответственно, криоконсервация биологического материала невозможна), предложен забор сперматогониальных стволовых клеток (ССК), их криоконсервация и последующая аутотранспланта-ция. В клинике разработаны и уже используются протоколы криоконсервации ткани яичка. Метод витри-фикации - недорогую и технически несложную процедуру - можно рассматривать как альтернативу криоконсервации ткани яичка у пациентов препубер-татного возраста. Однако эффективность и безопасность трансплантации ССК показаны пока только на мышах. В настоящее время проводится адаптация методов аутотрансплантации ткани яичек человека.

Ткань яичка больных раком может содержать злокачественные клетки. Поэтому огромное значение приобретает процедура отделения злокачественных клеток из клеточной суспензии перед трансплантацией. Поскольку объем биопсийного материала, полученного от молодых мальчиков, мал и содержит небольшое количество ССК, размножение их в культуральной среде in vitro очень актуально. По мнению ряда исследователей, для пациентов с СК единственным вариантом может быть индукция сперматогенеза in vitro. Тем не менее в настоящее время восстановление фер-тильности у пациентов с СК и онкологических больных вышеописанными методами пока не представляется возможным [32, 33].

Таким образом, процедура микроТЕСЕ, совмещенная с ЭКО-ИКСИ, остается пока единственным эффективным методом получения сперматозоидов у мужчин с СК. Мужчины с гипергонадотропным ги-погонадизмом, которые реагируют на гормональную терапию, по-видимому, имеют больше шансов на благоприятный исход лечения бесплодия. Объем яичек, уровень тестостерона и результаты теста с ХГЧ являются важными прогностическими факторами у данной группы пациентов. У пациентов, участвующих в программе ЭКО-ИКСИ-микроТЕСЕ, повышается уровень самооценки, что благоприятно влияет на психологический комфорт супружеской пары.

Клинический случай

Пациент П., 30 лет, обратился в отдел ВРТ ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава Рос-

сии в июле 2013 г. с жалобами на отсутствие беременности в первом браке в течение 2 лет. Супруге 25 лет. Причин ненаступления беременности со стороны женщины не выявлено (менархе с 12 лет, установлено сразу; менструации регулярные, через 28—29 дней, умеренные, безболезненные; гинекологические заболевания и вмешательства отрицает; беременностей не было).

Впервые диагноз СК у пациента был заподозрен в 15-летнем возрасте после аппендэктомии, когда было обращено внимание на распределение жировой клетчатки по женскому типу. Медико-генетическое исследование выявило кариотип 47,ХХУ.

Из анамнеза пациента известно, что родился от матери 30лет, отца 31 года, вес при рождении 4160 г, рост 53 см. Яички при рождении находились в мошонке. Ходить начал в 1,5 года. Задержка речи до 3,5 года. В дальнейшем развитие соответствовало возрасту. Школу закончил отлично, получил высшее образование. В подростковом возрасте активно занимался спортом и имел дефицит веса (рост 180см, вес 50кг, индекс массы тела 15,4кг/м2). После прекращения активных физических нагрузок к 14—15 годам стал набирать вес за счет жировой ткани; в этом возрасте впервые диагностировано ожирение. Аппендэктомия в 15 лет, без осложнений. Эпидемическим паротитом не болел. Тяжелые травмы и сотрясения головного мозга отрицает. Профессиональных вредностей не имеет, контакт с радиацией и химическими веществами отрицает. Сексуальный дебют в 17 лет.

При первичном обращении к эндокринологу в 15 лет уровень ФСГ в сыворотке — 35,2 мМЕ/л, ЛГ — 13,1 мМЕ/л, тестостерона — 9,2 нмоль/л, тиреотропного гормона — 0,667мМЕ/л, тироксина (Т) — 13,6 пмоль/л. При однодневной пробе с ХГЧ отмечался подъем тестостерона до 14,3 нмоль/л через 24 ч и до 17,2 нмоль/л через 48 ч с последующим снижением до 15,6 нмоль/л через 72 ч. Рекомендовано наблюдение без заместительной терапии андрогенами. Через полгода другим специалистом пациенту был назначен омнадрен 250 в дозе 1,0 мл 1 раз в месяц, который он получал вплоть до марта 2013 г. Наблюдение специалиста было эпизодическим. О репродуктивных перспективах не информирован.

Семейный анамнез: отец страдает сахарным диабетом 2-го типа, мать перенесла операцию на щитовидной железе по поводу диффузного токсического зоба (субтотальная резекция), а в 2012 г. (в возрасте 66 лет) — мастэктомию по поводу рака молочной железы. В качестве терапии получает ИА — анастрозол.

Препараты тестостерона пациенту были отменены за 6мес до первичной консультации в отделе ВРТФГБУ «Эндокринологический научный центр».

Объективно: рост 191 см, вес 93кг, индекс массы тела 25,5кг/м2. Телосложение по женскому типу. Оволосение по мужскому типу, по Таннеру 4 балла. По боковым поверхностям бедер и на ягодицах отмечаются стрии

бледно-розового цвета. Кожа влажная. Половое развитие правильное. Оба яичка определяются в мошонке, по ~ 2,0см3. Придатки яичка не увеличены с обеих сторон. Варикозного расширения вен семенного канатика не выявлено.

При ультразвуковом исследовании органов мошонки с доплерографическим исследованием: левое яичко размерами 2,1 х 1,3 х 1,0см, объем 1,4см3. Структура неоднородная, с единичными кальцинатами. Экстратестику-лярная венозная сеть в проекции семенного канатика не расширена. При пробе Вальсальвы вены семенного канатика не дилатируют, в режиме цветного доплеровско-го картирования (ЦДК) рефлюкс крови не определяется. Головка придатка не увеличена (0,7 х 0,7см), контуры четкие, ровные. В оболочках яичка свободная жидкость не определяется. Кровоток в тестикулярной артерии Уша = 4,7 см/с, УшП = 2,0 см/с, индекс резистентности (ИР) — 0,57. Правое яичко размерами 2,1 х 1,2 х 1,0см, объем 1,3 см3. Структура неоднородная, с единичными кальци-натами. Экстратестикулярная венозная сеть в проекции семенного канатика не расширена. При пробе Вальсальвы вены семенного канатика не дилатируют, в режиме ЦДК и доплерографии рефлюкс крови не определяется. Головка придатка не увеличена (0,9 х 0,8см), контуры четкие, ровные. В оболочках яичка свободная жидкость не определяется. Кровоток в тестикулярной артерии Ушшх = 9,0см/с, Ут.п = 1,9см/с, ИР — 0,79.

При трансректальном ультразвуковом исследовании предстательная железа размерами 4,2 х 2,3 х 2,2 см, V = 12,0см3. Семенные пузырьки умеренно уменьшенных размеров 3,4 х 0,7см справа и 3,6 х 0,8см слева. При неоднократном семиологическом исследовании эякулята выявлена азооспермия.

Уровень гормонов в сыворотке: ФСГ — 34,4 мМЕ/мл (норма: 0,7—11,1); ЛГ — 22,9 мМЕ/мл (норма: 0,8—7,6 мМЕ/мл); индекс ЛГ/ФСГ — 0,67; пролактин — 14,5 нг/мл (норма: 2,5—17,0 нг/мл); тиреотропный гормон — 1,5 мкМЕ/мл (норма: 0,4—4,0мкМЕ/мл), Т4в — 1,4нг/дл (норма: 0,8—1,9 мМЕ/мл), тестостерон общий —1,8 нмоль/л (норма: 12,0—35,0 нмоль/л); эстрадиол (Е) — 18,8 пг/мл (норма: 0—206 пг/мл); индекс тестостерон (нг/дл)/Е2 (нг/дл) — 0,27; глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ) — 34,1 нмоль/л (норма: 13—71,0 нмоль/л); инсулин — 5,1 мкМЕ/мл (норма: 6—27,0 мкМЕ/мл); ингибин В — 4,23 пг/мл (норма для возраста 30—44лет: 80—220пг/мл, при СК — < 14,0пг/мл).

При биохимическом анализе крови (глюкоза, мочевина, мочевая кислота, аланинаминотрансфераза, аспар-татаминотрансфераза, холестерин, триглицериды, липопротеины низкой плотности, липопротеины высокой плотности, индекс атерогенности) отклонений не выявлено.

Верифицированный диагноз: бесплодие первичное. СК (кариотип 47,ХХУ). Гипергонадотропный гипогонадизм. Азооспермия.

Е га Е

Е га Е

Рис. 1. Правое яичко и его придаток, освобожденные от оболочек, 4-кратное увеличение: 1 — яичко; 2 — придаток яичка

По согласованию с пациентом, решено начать стимуляцию сперматогенеза препаратами ХГЧ (прегнил 1500 МЕ 2 раза в неделю внутримышечно и ИА — анастрозол 1 мг — по 1 таблетке 1 раз в сутки на 6мес). Назначена метаболическая и антиоксидантная терапия (карнитон 1000мг 2 раза в день, селцинк по 1 таблетке 2 раза в день, мексидол 5,0 мл внутримышечно 1 раз в день первые 10 дней каждого месяца вплоть до оперативного извлечения сперматозоидов). После 4 инъекций ХГЧ повторно определены уровни ФСГ (34,78 мМЕ/мл) и тестостерона (3,43 нмоль/л) для коррекции дозы препаратов. Однако, учитывая сложное психологическое состояние пациента и его нежелание продолжить прием анастрозола, решено было начать лечение по программе ЭКО-ИКСИ-микроТЕСЕ.

Для получения сперматозоидов планировалось выполнить микроТЕСЕ. В случае нахождения морфологически неизмененных сперматозоидов в семенных канальцах планировалось использование их для инсеминации; при их отсутствии предполагалось использование донорской спермы. Противопоказания для оперативного вмешательства не выявлены, согласие пациента на операцию получено, объем инвазивного вмешательства разъяснен. Согласие на использование спермы анонимного донора из банка спермы отдела ВРТ ФГБУ «Эндокринологический научный центр» также получено.

Проведена открытая билатеральная микроТЕСЕ. Время операции — 2 ч. Операция выполнялась под спинномозговой анестезией: в субарахноидальное пространство введен Sol. Marcaini-spinal 20мг; в целях стабилизации гемодинамики введены Sol. Atropini 1,0мг, Propofol 600мг. После обработки операционного поля в бессосудистой зоне мошонки (область raphe scrotum) произведен разрез кожи и оболочек длиной около 3,0см, тупым и острым путем освобождено и выведено в рану правое яичко размером около 1,5см3 (рис. 1). Под операционным микро-

Рис. 2. Правое яичко после рассечения белочной оболочки: 1 — однородные семенные канальцы при 10-кратном увеличении; 2 — продольно рассеченная белочная оболочка; 3 — головка придатка яичка

Рис. 3. Правое яичко после наложения швов (7/0) на белочную оболочку при 10-кратном увеличении: 1 — яичко; 2 — придаток яичка

скопом (10-кратное увеличение) продольно рассечена белочная оболочка в бессосудистой зоне яичка до 2,0см. Паренхима яичка гомогенная и при 30-кратном увеличении представляется однородной массой белесо-голубого цвета без структуризации отдельных канальцев (рис. 2). У нижнего полюса яичка визуализируются единичные семенные канальцы, сильно истонченные, местами присутствует только фиброзированная ткань. Отмечается повышенная кровоточивость из подоболочечньх сосудов. Гемостаз коагуляцией. Произведен забор семенных канальцев с поверхности (максимально атравматично в бессосудистой зоне), а также из глубины яичка. Получено около 30 фрагментов размерами 1,0 х 1,5мм. Отмечается их повышенная ломкость при тракции. Все фрагменты семенных канальцев переданы эмбриологу для поиска сперматозоидов. Сперматозоиды при исследовании обнаружены не были. Наложены швы на белоч-

ную оболочку (рис. 3). Гемостаз стабильный. Яичко помещено в правую половину мошонки, в рану погружен дренаж, произведено ушивание оболочек.

Из того же разреза тупым и острым путем освобождено и выведено в рану левое яичко размером менее 1,5см3. Белочная оболочка рассечена в бессосудистой зоне яичка, его паренхима представлена однородной массой белесо-голубого цвета без структуризации семенньх канальцев. Отмечается кровоточивость из подоболочечных сосудов. Коагуляционный гемостаз. При 30-кратном увеличении визуализирована поверхность яичка, семенные канальцы четко не просматриваются. Произведен забор семенных канальцев с поверхности (максимально атрав-матично в бессосудистой зоне), а также из глубины яичка, получено около 10 фрагментов размерами 1,0 х 1,0мм. Материал также передан эмбриологу для поиска сперматозоидов. Сперматозоиды при исследовании не обнаружены. Гемостаз стабильный. В рану введен дренаж. Произведено послойное ушивание раны. Наложена тугая повязка, холод на мошонку на 30мин. Ткань яичка и придатка отправлена на гистологическое и электронно-микроскопическое исследования (ЭМИ). Общий вес удаленной тестикулярной ткани — 12,2мг.

В послеоперационном периоде пациент получал антибактериальную терапию и обезболивающие препараты. Швы сняты на 7-е сутки. Заживление первичным натяжением.

Результаты гистологического исследования: ткань яичек с отечной полнокровной соединительной тканью, в которой имеется небольшое количество семенных канальцев, покрытых соединительнотканной оболочкой, выстилка семенных канальцев представлена спермато-генным эпителием в виде сперматогоний и сперматоци-тов 1-го порядка, в просвете канальцев имеется секрет, между клетками — сустентоциты. В присланной ткани яичек сперматозоиды отсутствуют (рис. 4).

В просвете семенного канальца определяются незрелые половые клетки и клетки Сертоли (рис. 5, 6). Характерная структура хроматина незрелой половой клетки позволяет определить ее как сперматоцит в профазе мейоза I. Зрелые сперматозоиды при ЭМИ тестикулярной ткани (рис. 7) обоих яичек не обнаружены.

11 'Яду. ' ' Зик^ Базальная

Рис. 5. Ультратонкий срез через стенку семенного канальца. Клетка Сертоли с характерным ядрышком

Рис. 6. Ультратонкий срез семенного канальца. В просвете канальца незрелая половая клетка

Через 1,5 мес после билатеральной микрохирургической биопсии яичек выполнено контрольное ультразвуковое исследование и ЦДК органов мошонки. Отмечается уменьшение объема левого яичка до 0,7см3 (исходный объем 1,4 см3, Д 50 %), снижение скоростных показателей кровотока в тестикулярных артериях, увеличение ИР (V = 3,9см/с, УтП = 0см/с, ИР — 1,0), а также уменьшение объема правого яичка до 0,9 см3 (исходный объем 1,3 см3, Д 44 %) и снижение скоростных показателей кровотока в тестикулярных артериях (Утах = 7,9см/с, V . = 2,9 см/с, ИР — 0,63). Структура паренхимы яичек

Е га Е

Рис. 4. Ткань яичек: 1 — семенные канальцы; 2 — фиброзированная ткань

Е га Е

Рис. 7. ЭМИтестикулярной ткани. Ультратонкий срез сосуда с гиалинизированными стенками

однородная, интратестикулярных и внутримошоночных гематом не выявлено. Пациенту предложено возобновить прием анастрозола по 1 таблетке в сутки, от которого он отказался. Назначен небидо 1000мг 1 раз в 12-14 нед.

Заключение

СК широко распространен в общей популяции мужчин, однако своевременно диагностируется редко. Не исключено, что в период раннего пубертата, когда начинается сперматогенез, в эякуляте могут присутствовать сперматозоиды. Сохранение эякуляторных сперматозоидов дает надежду на возможность реализации репродуктивной функции при диагнозе, который исторически приравнивался к абсолютному бесплодию. Наличие сперматозоидов в эякуляте упрощает процедуру ЭКО и позволяет избежать наркоза и операции.

По самым консервативным оценкам, не менее чем у 60 % мужчин с СК существует вероятность получения сперматозоидов с помощью техники микроТЕСЕ и возможность использовать их в программе ЭКО-ИКСИ. Однако на сегодняшний день не выявлено оптимального возраста для извлечения сперматозоидов, так же как и для оптимального времени назначения заместительной терапии. Недавно выявлен повышенный уровень тестостерона в тестикулярной ткани пациентов с СК, несмотря на его снижение в кровотоке. Это, вероятно, связано с недостаточной васкуляризацией гипоплазированных яичек при СК, что препятствует высвобождению тестостерона в кровь. При введении экзогенного тестостерона происходит его конвертация в эстрадиол, высокий уровень которого снижает уровень ФСГ. Таким образом, введение экзогенного тестостерона и нормализация его уровня в плазме крови не повышает уровень интра-тестикулярного тестостерона, а лишь приводит к снижению уровня ФСГ в периферической крови [34].

Экзогенное введение тестостерона может значительно снижать БЯЯ при СК. Данный эффект может быть

связан с тем, что при пиковом повышении уровня тестостерона в крови по механизму обратной связи снижается гипофизарная секреция ФСГ и ЛГ, что и приводит к остановке сперматогенеза. Позднее назначение препаратов тестостерона мужчинам с СК с заместительной целью зачастую усугубляет клиническую картину гипо-гонадизма. На сегодняшний день эта дилемма до конца не разрешена, так как имеется противоречие между отсутствием репродуктивной задачи у подростка в период оптимальной фертилизации (ранний пубертатный период) и ухудшением репродуктивного прогноза у зрелого мужчины, которому требуется заместительная терапия препаратами тестостерона, ухудшающая БЯК Недавние исследования показали, что использование местных (трансдермальных) андрогенов в сочетании с препаратами ИА у юношей в возрасте 14—22 лет с СК за 1—5 лет до хирургического извлечения сперматозоидов не приводит в будущем к снижению [35]. Раннее вмешательство и мультидисциплинарный подход к лечению бесплодия у пациентов с СК должны способствовать улучшению результатов, и ни одному молодому человеку не должно быть сказано, что у него бесплодие.

Для приведенного клинического случая характерно относительно позднее назначение заместительной тестостероновой терапии, эпизодическое посещение специалиста в последующие 15 лет, неинформированность о репродуктивных перспективах заболевания вплоть до принятия решения о методе лечения азооспермии, психологическая неготовность как самого пациента, так и его партнерши к длительному приему ИА. Все это и определило, очевидно, безуспешность попытки получения сперматозоидов в описанном случае. Сперматоциты 1-го порядка, выявленные при гистологическом исследовании и ЭМИ, являются тетра-плоидными половыми клетками и должны пройти еще 2 мейотических деления до образования гаплоидных клеток — сперматид, сначала круглых, а затем удлиненных; оплодотворение последними уже возможно при ЭКО-ИКСИ [12, 36—38]. Вопрос о возможности завершения спермиогенеза у данного пациента остался открытым.

Таким образом, несмотря на то что во время микроТЕСЕ яичек нами не были получены сперматозоиды, только данный вид хирургического вмешательства у пациентов с СК позволяет выделять семенные канальцы из фиброзированной ткани яичка. Поскольку в некоторых случаях хромосомные ошибки могут быть переданы потомству мужчин с СК, в случае получения у них сперматозоидов и, соответственно, эмбрионов в предтрансферном периоде необходима пре-имплантационная генетическая диагностика.

Необходимы также дальнейшие клинические рандомизированные многоцентровые исследования для оптимизации и стандартизации лечения пациентов с СК.

ЛИТЕРАТУРА

1. Калинченко С.Ю., Мельниченко Г.А., Гусакова Д.А. Синдром Клайнфельтера. М.: Практическая медицина, 2007.

2. Klinefelter H.F. Jr., Reifenstein E.C. Jr., Albright F. Syndrome characterized

by gynaecomastia, aspermatogenesis without A-Leydigism and increased excretion of follicle-stimulating hormone. J Clin Endocrinol 1942;2:615-27.

3. Bunge R.G., Bradbury J.T. A 10-year-old boy with a positive sex chromatin test. J Urol 1957;78(6):775-9.

4. Козлова С.И., Демикова Н.С., Семанова Е., Блинникова О.Е. Наследственные синдромы и медико-генетическое консультирование. М., 1996. С. 305.

5. Herlihy A.S., Halliday J.L., Cock M.L., McLachlan R.I. The prevalence and diagnosis rates of Klinefelter syndrome: an Australian comparison. Med J Aust 2011;194(1):24-8.

6. Cirigliano V., Lewin P., Szpiro-Tapies S.

et а!. Assessment of new markers for the rapid detection of aneuploidies by quantitative fluorescent PCR (QF-PCR). Ann Hum Genet 2001;65(Pt 5):421-7.

7. Lanfranco F., Kamischke A., Zitzmann M., Nieschlag E. Klinefelter's syndrome. Lancet 2004;364(9430):273-83.

8. Forti G., Corona G., Vignozzi L. et а! Klinefelter's syndrome: a clinical and therapeutical update. Sex Dev 2010;4(4-5): 249-58.

9. Abdelmoula N.B., Amouri A., Portnoi M.F. еt al. Cytogenetics and fluorescence in situ hybridization assessment of sex-chromosome mosaicism in Klinefelter's syndrome. Ann Genet 2004;47(2):163-75.

10. Андрология. Мужское здоровье и дисфункция репродуктивной системы. Под ред. Э. Нишлага, Г.М. Бере. М.: МИА, 2005. С. 185-7.

11. Баранов В.С., Кузнецова Т.В. Цитогене-тика эмбрионального развития человека. М.: Издательство Н-Л, 2007.

12. Rives N., Joly G., Machy A. et 8l. Assessment of sex chromosome aneuploidy in sperm nuclei from 47,XXY and 46,XY/47,XXY males: comparison with fertile and infertile males with normal karyotype. Mol Hum Reprod 2000;6(2):107-12.

13. Kuliev A., Verlinsky Y. Preimplantation genetic diagnosis in assisted reproduction. Expert Rev Mol Diagn 2005;5(4):499-505.

14. Jacobs P.A., Bacino C., Hassold T. et аТ

A cytogenetic study of 47,XXY males of known origin and their parents. Ann Hum Genet 1988;52(Pt 4):319-25.

15. Harvey J., Jacobs P.A., Hassold T., Pettay D. The parental origin of 47,XXY males. Birth Defects Orig Artic Ser 1990;26(4):289-96.

16. Джонс К. Наследственные синдромы по Дэвиду Смиту: атлас-справочник. Пер. с англ. А.Г. Азова, И.А. Ивановой,

А.В. Мишарина и др. М.: Изд-во Практика, 2011. С. 70-2.

17. Bastida M.G., Rey R.A., Bergada I. et al. Establishment of testicular endocrine function impairment during childhood and puberty

in boys with Klinefelter syndrome. Clin Endocrinol (Oxf) 2007;67(6):863-70.

18. Palermo G.D., Schlegel P.N., Sills E.S. et al. Births after intracytoplasmic injection

of sperm obtained by testicular extraction from men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. Engl J Med 1998;338(9):588-90.

19. Nodar F., De Vincentiis S., Olmedo S.B. et al. Birth of twin males with normal karyotype after intracytoplasmic sperm injection with use of testicular spermatozoa for a nonmosaic patient with Klinefelter's syndrome. Fertil Steril 1999;71(6):1149-52.

20. Schiff J.D., Palermo G.D., Veeck L.L. et al. Success of testicular sperm extraction [corrected] and intracytoplasmic sperm injection in men with Klinefelter syndrome.

J Clin Endocrinol Metab 2005;90(11):6263-7.

21. Poulakis V., Witzsch U., Diehl W. et al. Birth of two infants with normal karyotype after intracytoplasmic injection of sperm obtained by testicular extraction from two men with nonmosaic Klinefelter's syndrome. Fertil Steril 2001;76(5):1060-2.

22. Friedler S., Raziel A., Strassburger D. et al. Outcome of ICSI using fresh and cryopreserved-thawed testicular spermatozoa in patients with non-mosaic Klinefelter's syndrome. Hum Reprod 2001;16: 2616-20.

23. Виноградов И.В. Современные методы лечения генетически обусловленного секреторного бесплодия. Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 2011.

24. Ramasamy R., Ricci JA., Palermo G.D. et al. Successful fertility treatment for Klinefelter's syndrome. J Urol 2009;182(3):1108-13.

25. Madgar I., Dor J., Weissenberg R. et al. Prognostic value of the clinical and laboratory evaluation in patients with nonmosaic Klinefelter syndrome who are receiving assisted reproductive therapy. Fertil Steril 2002;77(6):1167-9.

26. Maiburg M.C., Hoppenbrouwers A.C., van Stel H.F., Giltay J.C. Attitudes

of Klinefelter men and their relatives towards

TESE-ICSI. J Assist Reprod Genet 2011;28(9):809-14.

27. Черных В.Б. Микроделеционный анализ AZF-локуса в рамках комплексного клинико-генетического обследования мужчин с азооспермией и олигоспермией. Автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2002.

28. Fu L., Ding Х.Р., Shen M.J. et al. Screening and clinical phenotype analysis

of microdeletions of azoospermia factor region on Y chromosome in 1011 infertile men. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi 2012; 29(2):184-7.

29. Hadjkacem-Loukil L., Ghorbel M., Bahloul A. et al. Genetic association between AZF region polymorphism and Klinefelter syndrome. Reprod Biomed Online 2009;19(4):547-51.

30. Choe J.H., Kim J.W., Lee J.S., Seo J.T. Routine screening for classical azoospermia factor deletions of the Y chromosome

in azoospermic patients with Klinefelter syndrome. Asian J Androl 2007;9(6):815-20.

31. Raman J.D., Schligel P.N. Aromatase ingibitors for male infertility. J Urol 2002; 167(2 Pt 1):624-9.

32. Ben-Ami I., Raziel A., Strassburger D. еt а! Intracytoplasmic sperm injection outcome of ejaculated versus extracted testicular spermatozoa in cryptozoospermic men. Fertil Steril 2013;99(7):1867-71.

33. Goossens E., Van Saen D., Tournaye H. Spermatogonial stem cell preservation and transplantation: from research to clinic. Hum Reprod 2013;28(4):897-907.

34. Tttttelmann F., Damm O.S., Luetjens C.M. et al. Intratesticular testosterone is increased in men with Klinefelter syndrome and may not be released into the bloodstream owing

to altered testicular vascularization — a preliminary report. Andrology 2014.

35. Mehta A., Bolyakov A., Roosma J. et al. Successful testicular sperm retrieval in adolescents with Klinefelter syndrome treated with at least

1 year of topical testosterone and aromatase inhibitor. Fertil Steril 2013;100(4):970—4.

36. Гоголевский П.А. Использование спер-матид в процедуре ЭКО/ ИКСИ. Проблемы репродукции 1998;2:5-11.

37. Vloeberghs V., Verheyen G., Tournaye H. Intracytoplasmic spermatid injection and

in vitro maturation: fact or fiction? Clinics (Sao Paulo) 2013;68 Suppl 1:151—6.

38. Mansour R.T., Fahmy I.M., Taha A.K. et al. Intracytoplasmic spermatid injection can result in the delivery of normal offspring. J Androl 2003;24(5):757—64.

E

W

E