СПОСОБ ОБРАБОТКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ТКАНИ ДЛЯ ИМПЛАНТИРУЕМОГО БИОПРОТЕЗА
METHOD OF BIOLOGICAL TISSUE TREATMENT FOR IMPLANTABLE BIOPROSTHESIS

Область техники
[001] Настоящие изобретение относится к области медицины, в частности к способам обработки биологической ткани для создания биопротезов с целью повышения биосовместимости и подавления кальцификации биопротезов после имплантации в организм пациента.
Уровень техники
[002] Различные типы имплантируемых биопротезов, используемых в медицине, могут быть полностью или частично сформированы из биологической ткани. Примеры биологических тканей, которые используются для формирования имплантируемых биопротезов, включают сердечные клапаны, кровеносные сосуды, кожу, твердую мозговую оболочку, перикард, связки и сухожилия. Эти биологические ткани обычно содержат такие структурные белки, как коллаген и эластин. Эластичность и жесткость биологической ткани в значительной степени определяется относительными количествами коллагена и эластина, присутствующими в ткани. Биологическая ткань для изготовления биопротезов подвергается химической обработке с целью придания ткани иммунологической инертности, механической прочности и устойчивости к биоразложению. Такая химическая обработка называется фиксацией биологической ткани. Для фиксации чаще всего используются химические вещества, называемые кросслинкирующими агентами. Молекулы кросслинкирующих агентов имеют относительно небольшие размеры и легко проникают в биологическую ткань, где образуют ковалентные поперечные связи между полипептидными цепями в пределах одной молекулы структурного белка (то есть, внутримолекулярные поперечные связи) или между соседними молекулами структурных белков (то есть межмолекулярными поперечными связями).
[003] В результате воздействия кросслинкирующего агента повышается устойчивость биологической ткани к механическому, термическому и ферментативному разрушению. При этом биологическая ткань становиться более прочной, но при этом частично теряет свою эластичность. Баланс между эластичностью и жесткостью определяется концентрацией и временем воздействия кросслинкирующего агента, а также температурой и кислотностью среды, в которой проводится процедура фиксации биологической ткани. При этом форма, которую биологическая ткань принимает во время фиксации, необратима и сохраняется на всех последующих этапах работы с биологической ткани.
[004] Примеры кросслинкирующих агентов, которые используют для обработки биологической ткани, включают: альдегиды, например, формальдегид, глутаровый альдегид (глутаральдегид), диальдегидный крахмал, параформальдегид, глицероальдегид, глиоксаль, ацетальдегид, акролеин; диизоцианаты, например, гексаметилендиизоцианат, карбодиимиды и некоторые полиэпоксидные соединения, например, Denacol-810, ЕХ-512, диглицидиловый эфир этиленгликоля. В некоторых случаях вместо химических веществ применяют фотоокисление.
[005] Известен способ обработки материала яремной вены крупного рогатого скота (КРС) для последующего изготовления содержащего клапан кондуита, который включает фиксацию биологической ткани с помощью эпоксидного кросслинкирующим агента - диглицидилового эфира этиленгликоля (патент № RU 2633544 C1, опубликован: 13.10.2017 г., МПК A61F 2/00). Недостатком указанного способа фиксации является недостаточно высокая частота поперечных сшивок, которые обеспечивает диглицидиловый эфир этиленгликоля, что приводит к сниженной механической прочности фиксированной биологической ткани.
[006] Наиболее популярным кросслинкирующим агентом, применяемым для обработки биологических тканей при создании биопротезов, является глутаральдегид. Глутаральдегид имеет небольшие молекулы, каждая из которых содержит две альдегидные группы, разделенные гибкой цепью из трех метиленовых групп. В образовании связей между полипептидными цепями одного или разных белков задействованы именно альдегидные группы глутаральдегида. В водных растворах глутаральдегид присутствует в виде мономеров и полимеров переменного размера, и в образовании поперечных связей участвуют, как правило, не отдельные мономеры, а полимеры глутаральдегида. Из полимерной цепи глутаральдегида выступают свободные альдегидные группы, которые наряду с концевыми альдегидными группами взаимодействуют с аминогруппами белков, что обеспечивает большую плотность поперечных связей между полипептидными цепями структурных белков и, соответственно, прочность биологической ткани.
[007] Основными проблемами, связанными с применением биопротезов, выполненных из фиксированных биологических тканей, является их отторжение и кальцификация после имплантации в организм пациента. Эти ограничения являются основными причинами реопераций у взрослых пациентов и высокой смертности у детей из-за высокой скорости кальцификации биопротезов в раннем детском возрасте. Отторжение является результатом иммунного ответа организма пациента на клеточный аппарат биологической ткани, в первую очередь на белки, заякоренные в цитоплазматической мембране и расположенные на поверхности клеток. Фиксация глутаральдегидом частично позволяет снизить иммуногенность биологической ткани за счет изменения третичной и четвертичной структуры белков и частичной маскировки эпитопов, которые могут опознаваться антителами в организме пациента и вызывать иммунный ответ. Однако любая фиксация биологической ткани, в том числе и фиксация глутаральдегидом, вызывает разрушение клеток и высвобождение большого количества антигенов. Кроме того, остатки клеток (клеточный дебрис), и в особенности фосфолипиды, входящие в состав клеточных мембран, провоцируют раннюю кальцификацию биологической ткани (Schoen and Levy, 2005). При этом установлена прямая связь между специфическим иммунным ответом в организме пациента посредством антител и кальцификацией биопротеза (Human and Zilla, 2001, Characterization of the immune response to valve bioprostheses and its role in primary tissue failure. Ann Thorac Surg.). В связи с этим для уменьшения иммунного ответа на биопротез и для предотвращения его кальцификации предлагаются методы обработки фиксированной биологической ткани, обеспечивающие удаление клеточного дебриса. Для этого используют различные подходы, включая обработку гипотоническим шоком, протеолитическими ферментами, нуклеазами и детергентами.
[008] Альтернативной стратегией по снижению уровня кальцификации биопротеза является обработка фиксированной биологической ткани аминоолиевой кислотой (AOA, amino oleic acid). Эта стратегия направлена на устранение одной из специфических причин кальцификации биопротезов, связанных с фиксацией биологической ткани глутаральдегидом. Дело в том, что в полимерных цепях глутаральдегида, участвующик в кросслинкировании белков, остаются ни с чем не связанные боковые альдегидные группы, которые невозможно вымыть из ткани. Эти свободные альдегидные группы, а также непрореагировавшие молекулы глутаральдегида, не вымытые из ткани, являются центрами нуклеации фосфатов кальция из плазмы крови, с последующим ростом кристаллов гидроксиапатита. Аминоолиевая кислота соединяется с остатками альдегида, предотвращая отложения кальция. Однако Шиффовы основания, образуемые при взаимодействии остатков альдегида с аминоолиевой кислотой, являются обратимыми и соответственно ингибирование кальцификации не может считаться надежным в долгосрочной перспективе (Дроздовский и Линник, 2016).
[009] Еще один способ обработки фиксированной биологической ткани предполагает инкубацию биологической ткани со 100%-ным глицерином для удаления липидов с поверхности биологической ткани, что снижает интенсивность иммунологического ответа и кальцификацию (заявка № WO 2011109433 A2, опубликована: 09.09.2011 г., МПК C12N 5/071, A61L 27/38, A61K 35/12, A61F 2/02). Однако использование растворов глицерина с концентрацией выше 60% приводит к ухудшению механической прочности биологической ткани.
[0010] Еще один вариант антикальциевой обработки фиксированной биологической ткани включает нанесение хитозанового покрытия (патент № RU 2519219 C1, опубликован: 10.06.2014 г., МПК A61L 27/36, A61F 2/24, A61L 27/28, A61L 27/20). Хитозан является одним из компонентов хитина и представляет собой длинную молекулу, по физическим параметрам напоминающую коллаген и способную образовывать связи с другими белками фиксированной биологической ткани. При этом хитозановое покрытие исключает возможность образования кальциевого осадка на поверхности фиксированной глутаральдегидом биологической ткани. Недостатком описанного способа обработки является сложность получения и нанесения покрытия. Кроме того, остается неясной долговечность хитозанового покрытия в условиях реальной работы биопротеза после имплантации. Так, в экспериментах, проведенных на крысах, было показано, что через четыре месяца после имплантации, в биологической ткани, обработанной хитозаном, накапливается значительное количество кальция с образованием кристаллов гидроксиапатита (Baucia et al., 2006). Таким образом использование хитозана в качестве средства против кальцификации биологической ткани, фиксированной глутаральдегидом, пока остается неэффективным.
[0011] Известен способ, описанный в патенте № US 6214054 (опубликован: 10.04.2001 г., МПК A61L 27/00, A61L 27/36, A61L 33/00, A61L 33/12). Указанный способ подразумевает фиксацию биологической ткани глутаральдегидом с последующей инкубацией фиксированной биологической ткани в растворе, содержащем детергент, спирт и формальдегид. Указанный раствор избавляет фиксированную биологическую ткань от остаточного альдегида и удаляет сайты инициации кальцификации, связанные с клеточным дебрисом. В указанном способе обработка биологической ткани завершается стерилизацией в растворе глутаральдегида. Описанный способ обработки биологической ткани усовершенствован в настоящем изобретении за счет контроля формы биологической ткани во время процедуры фиксации, за счет способа раскроя биологической ткани, а также за счет модификации процедуры стерилизации.
[0012] В настоящее время остается потребность в разработке новых сравнительно простых и воспроизводимых способов обработки биологических тканей, позволяющих получать качественный материал для создания биопротезов со сниженной вероятностью отторжения и кальцификации после имплантации в тело пациента.
Сущность изобретения
[0013] Задачей настоящего изобретения является является разработка надежного, воспроизводимого способа контролируемой обработки биологической ткани для создания имплантируемых биопротезов со сниженной способностью к отторжению и кальцификации после имплантации в тело пациента.
[0014] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата, как получение качественного материала для создания имплантируемых биопротезов, представляющего собой прочную, эластичную, пригодную для длительного хранения биологическую ткань определенной формы со сниженной вероятностью отторжения и кальцификации после имплантации в тело пациента.
[0015] Заявленный технический результат достигается за счет того, что способ обработки биологической ткани включает следующие этапы. После извлечения биологической ткани из тела животного ее механически очищают от остатков жировой ткани и слизи. Остатки жира и слизи могут приводить к неравномерности последующей химической обработке биологической ткани, а также способствовать кальцификации или отторжению биопротеза после имплантации. Механическую обработку проводят с помощью ткани, смоченной в изотоническом растворе, который позволяет избежать дегидратации или избыточной гидратации биологической ткани.
[0016] После механической обработки проводят визуальный контроль биологической ткани на предмет наличия кровоизлияний и механических повреждений, локальных точечных истончений и утолщений. Отбирают биологическую ткань с равномерной поверхностью, что позволяет в дальнейшем избежать неконтролируемых повреждений деталей биопротеза после его имплантации в организм пациента.
[0017] Затем биологическую ткань фиксируют в растворе глутаральдегида. Использование глутаральдегида в качестве кросслинкирующего агента позволяет получать оптимальное количество поперечных связей между полипептидными цепями коллагена, что стабилизирует коллагеновую структуру и сохраняет эластичность биологической ткани. Для того чтобы фиксированная биологическая ткань имела плоскую форму, оптимальную для создания деталей биопротеза, фиксацию биологической ткани проводят на плоских пластинах.
[0018] Из фиксированной биологической ткани с помощью лазерной резки вырезают детали биопротеза. Лазерную резку фиксированной биологической ткани производят в жидкости, что позволяет уменьшить краевое повреждение биологической ткани, возникающее при воздействии лазерного излучения. Во время лазерной резки биологическая ткань может быть полностью погружена в жидкость или может орошаться жидкостью. Жидкость может быть очищенной водой или изотоническим раствором. Изотонический раствор является более предпочтительным вариантом, так как позволяет избежать набухания и деформации ткани.
[0019] Фиксированную биологическую ткань, с целью снижения возможности последующих кальцификации и отторжения, обрабатывают раствором, содержащим детергент, этанол, формальдегид и буферный раствор. Детергент и этанол служат для удаления клеточного дебриса из биологической ткани. Кроме того, этанол вызывает изменения структуры коллагена, что снижает вероятность его кальцификации. Формальдегид в растворе используют в качестве стерилизующего агента. Буферный раствор поддерживает кислотность раствора, оптимальную для эффективности и стабильности остальных компонентов раствора.
[0020] В одном варианте реализации настоящего изобретения антикальциевую обработку биологической ткани проводят после фиксации, но до раскроя биологической ткани. В другом варианте реализации антикальциевую обработку биологической ткани проводят после раскроя фиксированной биологической ткани, но до сборки биопротеза. Еще в одном варианте реализации антикальциевую обработку биологической ткани проводят после сборки биопротеза.
[0021] Стерилизацию биологической ткани проводят в растворе, содержащем стерилизующий агент и буферный раствор, обеспечивающий pH = 5.0-7.4. В предпочтительном варианте изобретения в качестве стерилизующего агента выступает глутаральдегид. Указанное значение рН обеспечивает стабильность глутаральдегида в растворе, что позволяет хранить стерилизованную биологическую ткань в течение длительного времени.
Описание чертежей
[0022] На фиг. 1А представлен пример биопротеза согласно настоящему изобретению, вид сбоку.
[0023] На фиг. 1Б представлен пример биопротеза согласно настоящему изобретению, вид сверху.
Подробное описания изобретения
[0024] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.
[0025] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.
[0026] Способ согласно настоящему изобретению может применяться для обработки различных коллагенсодержащих тканей свиньи, КРС, лошади или других млекопитающих.
[0027] Обработку биологической ткани начинают не более чем через 8 ч от момента начала извлечения биологической ткани из тела животного.
[0028] Биологическую ткань помещают в чистый контейнер и промывают изотоническим раствором, например, раствором 0,9% масс. хлорида натрия. Изотонический раствор позволяет избежать гипогидратации или гипергидратации биологической ткани. Это исключает механическую деформацию биологической ткани за счет набухания или сморщивания, а также предотвращает преждевременное разрушение клеток биологической ткани. Разрушение клеток опасно тем, что при этом высвобождается содержимое лизосом, что может приводить к деградации структурных белков биологической ткани. Содержание 0.9% масс. хлорида натрия в растворе обеспечивает осмоляльность ~ 300 мОсм/л, что соответствует осмолярности крови и мягких тканей млекопитающих (Кудрявцева с соавт., 2013). Биологическую ткань разделяют на лоскуты, которые подвергают механической обработке. С помощью марлевой салфетки, смоченной в изотоническом растворе, например, 0.9% масс. хлорида натрия, очищают поверхность лоскутов биологической ткани, удаляя остатки жировой ткани и слизи. Затем тщательно обследуют лоскуты биологической ткани на отсутствие кровоизлияний и механических повреждений, локальных точечных истончений и утолщений. Отбирают лоскуты биологической ткани с равномерной поверхностью. Неравномерность толщины или повреждения биологической ткани могут приводить к механической непрочности деталей биопротеза, к неконтролируемому искажению нагрузок на детали биопротеза после его имплантации и преждевременной деградации биопротеза.
[0029] Лоскуты биологической ткани раскладывают на очищенной гладкой поверхности плоской пластины. Коррозионная активность водных растворов глутаральдегида сопоставима с коррозионной активностью воды при том же рН. Соответственно, во избежание разрушения пластины и попадания материала пластины на биологическую ткань, можно использовать только те пластины, которые выполнены из материала, не подверженного коррозии в воде. В одном варианте исполнения пластина может быть выполнена из нержавеющей стали, никеля, никель-хром-молибденового сплава, титана. В другом варианте исполнения пластина может быть выполнена из стекла, полиэтилена или полипропилена. В предпочтительном варианте исполнения пластина выполнена из пластика, например, из поливинилхлорида (ПВХ) или полиметилметакрилата (оргстекло). В этом случае поверхность пластины предварительно очищают раствором изопропилового спирта. Лоскуты биологической ткани равномерно распределяют по поверхности пластин и закрепляют любым подходящим способом, например, с помощью кнопок или клипс, выполненных из нержавеющей стали, пластика или другого материала, не оказывающего химического воздействия на биологическую ткань и не подверженного разрушению на последующих этапах обработки биологической ткани. Фиксация на пластинах необходима, так как форма, которую лоскуты биологической ткани принимают во время фиксации, необратима и сохраняется на всех последующих этапах обработки биологической ткани. Неправильная форма лоскута фиксированной биологической ткани может приводить к дефекту биопротеза. Например, при изготовлении протеза клапана сердца неконтролируемое искривление лоскута биологической ткани, из которого выполнены створки клапана, может приводить к неполной кооптации и перивальвулярным утечкам после имплантации протеза. Натяжение биологической ткани после закрепления на пластинах составляет 0.2-3.0 Н. Натяжение на нижней границе указанного диапазона позволяет сохранить естественную извитость волокон коллагена. Расправление извитых волокон коллагена обеспечивает эластичность фиксированной биологической ткани. В то же время извитость волокон коллагена увеличивает толщину фиксированной биологической ткани. Натяжение на верхней границе указанного диапазона приводит к полному и необратимому распрямлению волокон коллагена. При этом наблюдается повышение механической прочности фиксированной биологической ткани и снижение эластичности. Превышение указанной верхней границы приводит к разрыву волокон коллагена внутри биологической ткани (Овчаренко, 2016; Яблонский, 2016). Опасность таких разрывов в том, что они не видны без специальных гистологических исследований, и при этом отрицательно сказываются на долговечности биологической ткани, а также на ее способности гасить ударную нагрузку, например, при открытии/закрытии створчатого аппарата биопротеза клапана сердца, выполненного из фиксированной биологической ткани. Кроме того, механическое повреждение волокон коллагена способствует последующей кальцификации биологической ткани (Vyavahare and Tam, 2018). Конкретное натяжение биологической ткани во время фиксации зависит от требований к толщине и соотношению прочности/эластичности биологической ткани, определяемому специфическими функциями биопротеза, который будет изготовлен с применением данной фиксированной биологической ткани.
[0030] Пластины с закрепленными на них лоскутами биологической ткани перемещают в чистую емкость, заполненную фиксирующим раствором. Фиксирующий раствор содержит глутаральдегид в любом подходящем буферном растворе, например, фосфатном буфере PBS. Буферный раствор необходим, чтобы стабилизировать нейтральное значение рН раствора. Когда клетки биологической ткани погибают во время процесса фиксации, содержимое лизосом высвобождается, и pH становится кислым, что негативно сказывается на структуре коллагена (Zanaboni et al., 2000; Hayashi and Nagai, 1973). Буферный раствор обеспечивает pH 7.2-7.4. При таком значении рН глутаральдегид достаточно активен как кросслинкирующий агент, и при этом биологическая ткань находится в среде, кислотность которой близка к физиологической (Eltoum et al., 2001; Rasmussen and Albrechtsen, 1974). Было показано, что стабильность молекул коллагена выше при приблизительно нейтральном рН, чем при кислом или щелочном рН (Hayashi and Nagai, 1973). Поэтому для сохранения максимально нативной структуры волокон коллагена важна близкая к нейтральной кислотность раствора во время всего процесса фиксации, вплоть до его окончания. После фиксации структура коллагена стабилизируется за счет поперечных связей, и при дальнейших манипуляциях с биологической тканью уже нет необходимости выдерживать рН в столь узком диапазоне.
[0031] Применение глутаральдегида в качестве фиксирующего агента позволяет добиться высокой плотности поперечных связей между полипептидными цепями структурных белков, прежде всего, коллагена. При этом глутаральдегид также выступает в роли стерилизующего агента. Содержание глутаральдегида в фиксирующем растворе составляет 0.6±0.3% масс. и является оптимальным для фиксации биологической ткани при создании биопротезов. Слишком низкое содержание глутаральдегида в фиксирующем растворе приводит к неоправданному увеличению времени фиксации биологической ткани и, соответственно, производства биопротезов. Слишком высокое содержание глутаральдегида в фиксирующем растворе придает биологической ткани чрезмерную жесткость, затрудняет очищение биологической ткани от не прореагировавших молекул глутаральдегида после окончания фиксации, а также приводит к повышению уровня кальцификации фиксированной биологической ткани. Так, было показано, что увеличение концентрации глутаральдегида до 1.2% масс. приводит к повышению содержания кальция в фиксированной биологической ткани в 2 раза и более, в зависимости от используемого типа биологической ткани. В то же время снижение концентрации глутаральдегида до 0,3% масс. не оказывает существенного влияния на уровень кальцификации (Sinha et al., 2012). Масса фиксирующего раствора превышает массу лоскутов биологической ткани на пластинах не менее чем в 10 раз. Это обусловлено тем, что молекулы глутаральдегида расходуются при образовании связей между полипептидными цепями структурных белков, соответственно, количество молекул глутаральдегида должно заведомо превышать количество потенциальных сайтов кросслинкирования. При этом фиксирующий раствор полностью покрывает пластины с лоскутами биологической ткани. Контейнер герметично закрывают крышкой. Фиксацию лоскутов биологической ткани проводят при температуре от 20°С до не более 37°С. Температура влияет на скорость фиксации, а также на сохранность биологической ткани. Чем ниже температура фиксации, тем лучше сохраняется структура коллагеновых волокон, однако это сильно увеличивает время фиксации. С другой стороны, фиксация при 37°C способствует экстракции жидких компонентов цитоплазмы (Park et al., 2016), что может быть полезно для уменьшения антигенности биологической ткани. Однако, при температуре 37°C и выше возникает риск необратимой денатурации структурных белков биологической ткани (Xu, 2009; Leikina et al 2002). В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения температура фиксации биологической ткани составляет 18-25°C, что соответствует комнатной температуре. Это позволяет избежать использования дополнительного оборудования, такого как объемные термостаты, вмещающие большие емкости с биологической тканью. Через 24-72 часов с момента начала фиксации проводят замену фиксирующего раствора на свежий фиксирующий раствор в том же соотношении к массе лоскутов биологической ткани. Замена раствора обусловлена тем, что непрореагировавшие молекулы глутаральдегида в растворе со временем образуют олигомеры, которые медленнее проникают вглубь биологической ткани. Поэтому необходимо использовать новую порцию фиксирующего раствора, не содержащего длинных олигомеров. Фиксацию проводят в течение 3-14 суток. Такое время фиксации обеспечивает наиболее полное кросслинкирование структурных белков. Кроме того, на примере тканей перикарда свиньи было показано, что увеличение времени фиксации биологической ткани приводит к снижению уровня кальцификации фиксированной биологической ткани после имплантации (Sinha et al., 2012). Вероятно, это связано с тем, что по мере увеличения времени фиксации, увеличивается и количество альдегидных групп в моно- и полимерах глутаральдегида.
[0032] Были проведены исследования механической прочности аортальных клапанов, выполненных из перикарда свиньи, фиксированного либо глутаральдегидом согласно заявленному способу, либо с помощью эпоксисоединения - диглицидилового эфира этиленгликоля (ДЭЭ). При этом в одном случае перикард свиньи, фиксированный глутаральдегидом подвергался последующей антикальциевой обработке, описанной ниже. В другом случае перикард свиньи, фиксированный глутаральдегидом не подвергался последующей антикальциевой обработке. И в случае фиксации ДЭЭ фиксированный перикард также подвергался последующей антикальциевой обработке, описанной ниже. Исследования на усталостном тестере, представленные в Таблице 1, показывают, что фиксация глутаральдегидом обеспечивает большую механическую прочность биопротеза аортального клапана, чем фиксация перикарда ДЭЭ.
[0033] После окончания процесса фиксации лоскуты биологической ткани снимают с пластин и могут хранить в непрозрачном пластиковом контейнере, заполненном раствором для хранения. Раствор для хранения содержит 0.05-0.3% масс. глутаральдегида в качестве стерилизующего агента, а также изотонический или буферный раствор, например, раствор 0.9% масс. хлорида натрия или фосфатный буфер PBS. При этом раствор для хранения полностью покрывает лоскуты фиксированной биологической ткани.
2
2
2
2
[0034] Для создания биопротеза раскрой фиксированной биологической ткани производят в слое жидкости с помощью лазерной резки. При этом используют газовый углекислотный лазер (СО лазер). Было показано, что СО лазер является оптимальным для раскроя биологической ткани при изготовлении биопротезов для сердечно-сосудистой хирургии (Барбараш с соавт., 2010). Кроме того, СО лазер является недорогим по сравнению с другими лазерами, и его использование снижает стоимость производства биопротезов. Однако при рассечении биологической ткани с помощью СО лазера по всей толщине наблюдались деструктивные изменения биологической ткани за зоной разреза. При взаимодействии биологической ткани с лазерным излучением доминирует поглощение. Поглощенная энергия излучения преобразуется в тепло, достигающее температуры более 200°С, вследствие чего происходит выпаривание биологической ткани - как жидкой, так и твердой ее фазы - что и приводит к рассечению (Пушкарева, 2008). В то же время участки биологической ткани, прилегающие к зоне воздействия лазерного излучения, также подвергаются нагреву, за счет чего формируется зона термонекроза шириной до 1.2 мм. В этой зоне наблюдается слипание волокон коллагена (Барбараш с соавт., 2010). Лазерная резка в слое жидкости позволяет уменьшить ширину зоны термонекроза до не более, чем 0.2 мм, и кроме того край вырезанной детали биопротеза получается более ровным. Во время лазерной резки биологическая ткань может быть полностью погружена в жидкость. При этом слой жидкости составляет не более 1,5 мм. Дальнейшее увеличение количества жидкости не приводит к дальнейшему уменьшению ширины зоны термонекроза, при этом большая толщина слоя жидкости затрудняет манипуляции с биологической тканью. В другом варианте реализации настоящего изобретения рассекаемая лазерным излучением поверхность биологической ткани может быть смочена жидкостью путем орошения. Жидкость, которую используют при лазерной резке, представляет собой очищенную воду или изотонический раствор, например, раствор 0,9% масс. хлорида натрия. Изотонический раствор является более предпочтительным вариантом, так как позволяет избежать набухания и деформации ткани.
[0035] Вырезанную деталь биопротеза визуально осматривают под увеличением на предмет наличия таких дефектов, как порезы, разрывы, неоднородности, посторонние включения. Каждую раскроенную деталь биопротеза по всей поверхности измеряют высокоточным толщинометром. Для дальнейшей работы используют только те детали биопротеза, которые не имеют видимых дефектов или отклонений толщины биологической ткани от необходимой.
[0036] Раскроенные детали биопротеза помещают в контейнер, заполненный раствором для хранения. Условия хранения деталей биопротеза совпадают с условиями хранения фиксированной биологической ткани.
[0037] Для антикальциевой обработки биологическую ткань помещают в чистый контейнер с плотной крышкой, содержащий раствор для антикальциевой обработки, и инкубируют 15-50 часов при 18-37°С. Раствор для антикальциевой обработки содержит 0.1 до 4.0% масс. детергнета, 10-40% масс. этанола, 0.1-8.0% масс. формальдегида и до 100% буферного раствора, например, фосфатного буфера (PBS).
[0038] Буферный раствор обеспечивает приближенный к физиологическому рН 7.4±0.3, оптимальный для функционирования остальных компонентов раствора, в частности формальдегида, о чем будет сказано ниже.
[0039] Детергент в растворе служит для удаления клеточного дебриса из фиксированной биологической ткани. В предпочтительном варианте изобретения используется Triton Х-100 (октилфенилполиоксиэтилен), который является неионным детергентом и обладает способностью мягко растворять мембраны клеток без денатурирующей активности за счет взаимодействия с фосфолипидами клеточных мембран (Курапеев с соавт., 2012). Удаление остатков клеточных мембран крайне важно для снижения последующей кальцификации фиксированной глутаральдегидом биологической ткани. Дело в том, что глутаральдегид, воздействуя на клетки биологической ткани, вызывает увеличение притока кальция в цитоплазму. Возросшее количество внутриклеточного кальция, вместе с фосфором из фрагментов фосфолипидной мембраны и клеточного дебриса, запускает образование фосфата кальция. После этого происходит кальцификация коллагена, ведущая к прогрессирующему разрушению биопротезов в теле пациента (Kim et al., 1999). Соответственно, удаление клеточного дебриса, и особенно фосфолипидов клеточных мембран, снижает кальцификацию фиксированной биологической ткани в составе биопротеза в теле пациента. Кроме того, удаление клеточного дебриса с помощью Triton Х-100 снижает иммуногенность фиксированной биологической ткани (Meyer et al., 2006).
[0040] Обработка этанолом фиксированной глутаральдегидом биологической ткани также способствует удалению фосфолипидов клеточной мембраны и клеточного дебриса. Кроме того, этанол, будучи денатурирующим агентом, вызывает конформационные изменения в коллагене, что препятствует кристаллизации солей кальция на фиксированном коллагене и, соответственно, снижает вероятность кальцификации биопротеза (Schoen et al., 2005; Vyavahare and Tam, 2018).
[0041] Формальдегид в растворе для антикальциевой обработки выполняет функцию стерилизующего агента. Формальдегид инактивирует микроорганизмы путем алкилирования амино- и сульфгидрильных групп белков и кольцевых атомов азота пуриновых оснований (Rutala et al., 2008). Формальдегид при использовании в надлежащих концентрациях и при достаточном времени контакта эффективно убивает многие микроорганизмы, включая бактерии, грибы, споры, и вирусы. Показано, что уже при концентрации 0.04% масс. формальдегид останавливает рост таких сложных для инактивации микроорганизмов, как Bacillus anthracis, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, Yersina pestis и др. (Chua et al., 2019). Однако при малой концентрации формальдегида требуется длительное время обработки биологической ткани (14-21 день). При использовании формальдегида в качестве стерилизующего агента его концентрация в растворе обычно не превышает 8%, что обусловлено раздражающим действием формальдегида на ткани человека (Дульнева с соавт., 2005). Предпочтительной является концентрация формальдегида около 4.0% масс. Этой концентрации достаточно для уничтожения даже устойчивых микроорганизмов, в то же время такая концентрация позволяет в дальнейшем легко отмыть обработанную биологическую ткань от непрореагировавших молекул формальдегида, чтобы избежать раздражающего действия. На эффективность действия формальдегида влияют температура и кислотности среды. Причем температура играет двойную роль: повышение температуры, с одной стороны, усиливает проникающую способность формальдегида, но с другой стороны, увеличивает диссоциацию формальдегида и субстрата. Оптимальной являются температура 18-37°С и слабо щелочная среда с рН 7.0-8.0 (Fox et al., 1985 ; Thavarajah et al., 2012). Комбинация формальдегида с этиловым спиртом дополнительно повышает его стерилизующие свойства.
[0042] Формальдегид в качестве стерилизующего агента был выбран еще и потому, что дополнительно усиливает антикальцификационную эффективность указанного раствора. Способность формальдегида снижать кальцификацию фиксированной биологической ткани была обнаружена в экспериментах с фиксированными глутаральдегидом тканями перикарда свиньи и КРС. После фиксации глутаральдегидом ткани перикарда хранили в 4.0% масс. растворе формальдегида для предотвращения размножения микроорганизмов. В экспериментах с различными вариантами антикальциевой обработки фиксированную ткань перикарда, хранящуюся в 4.0% масс. растворе формальдегида, использовали как один из контролей. Оказалось, что хранение фиксированной глутаральдегидом ткани перикарда в 4.0% масс. растворе формальдегида приводит к снижению уровня кальцификации указанных тканей перикарда (Gong et al., 1991; Baucia et al., 2006).
[0043] В патенте US 6214054, формальдегид используется в качестве кросслинкирующего агента, однако данные, представленные в Таблице 1, показывают, что дополнительное кросслинкирование биологической ткани после фиксации глутаральдегидом не требуется. Так, аортальный клапан, выполненный из биологической ткани, фиксированной глутаральдегидом без последующей антикальциевой обработки, выдержал 17189 тыс. циклов на усталостном тестере. В то же время аортальный клапан, выполненный из биологической ткани, фиксированной глутаральдегидом с последующей антикальциевой обработкой, в среднем выдержал 16750 тыс. циклов на усталостном тестере. Таким образом, кросслинкирующие свойства формальдегида в растворе для антикальциевой обработки никак не увеличивают механическую прочность обработанной биологической ткани.
[0044] Как указано выше, заявленная антикальциевая обработка фиксированной биологической ткани приводит к некоторому снижению прочности обработанной биологической ткани. Однако исследование кальцификации фиксированной глутаральдегидом биологической ткани показало, что указанная заявленная обработка приводит к значительному снижению относительного содержания кальция в образце фиксированной глутаральдегидом биологической ткани, по сравнению с образцом фиксированной глутаральдегидом биологической ткани без антикальциевой обработки (Таблица 2). Дополнительно были проведены исследования уровня кальцификации створок биопротеза аортального клапана CoreValve (Medtronic), изготовленного из перикарда свиньи, фиксированного глутаральдегидом и дополнительно обработанного аминоолиевой кислотой (АОА). Данные, представленные в Таблице 2, говорят о том, что антикальциевая обработка согласно настоящему изобретению как минимум в 3 раза эффективнее снижает относительное содержание кальция в фиксированной глутаральдегидом биологической ткани, чем обработка АОА.
[0045] Исходя из результатов проведенных исследований, можно сделать вывод о том, что фиксация биологической ткани глутаральдегидом с последующей инкубацией фиксированной биологической ткани в заявленном растворе для антикальциевой обработки обеспечивает оптимальное сочетание механической прочности и низкого уровня кальцификации обработанной биологической ткани.
[0046] По окончании инкубации биологическую ткань отмывают от детергента, этанола и формальдегида в изотоническом растворе, например, растворе 0.9% масс. хлорида натрия в течение 2-20 минут. Обработанную биологическую ткань помещают в контейнер со стерилизующим раствором, описанным ниже.
[0047] В одном варианте реализации настоящего изобретения антикальциевую обработку биологической ткани проводят после фиксации, но до раскроя биологической ткани. В другом варианте реализации антикальциевую обработку биологической ткани проводят после раскроя фиксированной биологической ткани, но до сборки биопротеза. Еще в одном варианте реализации антикальциевую обработку биологической ткани проводят после сборки биопротеза.
[0048] Для стерилизации биологической ткани в чистый закрытый контейнер наливают стерилизующий раствор, в который при комнатной температуре помещают биологическую ткань. Затем контейнер герметично запечатывают и нагревают контейнер и его содержимое до 30-37°С. Указанную температуру контейнера и его содержимого поддерживают в течение 2-7 суток. Затем контейнер и его содержимое охлаждают до комнатной температуры и, не распечатывая контейнер, хранят при комнатной температуре. Стерилизующий раствор содержит стерилизующий агент и буферный раствор, например, PBS, обеспечивающий pH 5.0-7.4. В качестве стерилизующего агента могут применяться формальдегид, этиловый спирт с формальдегидом, этиловый спирт с глутаральдегидом. Однако в предпочтительном варианте изобретения в качестве стерилизующего агента используется только глутаральдегид в концентрации 0.025-1.0% масс. Присутствие этанола в стерилизующем растворе нежелательно, так как при длительном воздействии этанол, в силу своих денатурирующих свойств, может необратимо повреждать структуру коллагена, ухудшая механические свойства биологической ткани. Использование глутаральдегида обусловлено широким спектром его биоцидной активности при сравнительно низкой концентрации. В указанном диапазоне концентраций глутаральдегид эффективно убивает такие различные микроорганизмы, как грамположительные бактерии - Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus; грамотрицательные бактерии - Legionella pneumophila, Klebsiella aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens; дрожжевые грибки - Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae; плесневые грибки - Stachybotrys atra, Penicillium funiculosum, Aspergillus niger, Trichoderma viridae; водоросли - Scenedesmus obliquus, Euglena gracillis, Chlorella pyrenoidosa; и вирусы - гепатита А, гепатита В, гепатита С, иммунодефицита человека и другие (Gorman and Scott, 1980; Passagot et al., 1987; Payan et al., 2001; Ciesek et al., 2010; Druce et al., 1995). Предпочтительной является концентрация глутаральдегида 0.2% масс. Такая концентрация, с одной стороны, надежно убивает микроорганизмы при обработке в течение указанного времени, а с другой стороны, позволяет легко очистить биологическую ткань от молекул глутаральдегида перед имплантацией путем промывания в физиологическом растворе. Сравнительно низкое значение рН обеспечивает длительную функциональность стерилизующего раствора. Было показано, что растворы глутарового альдегида более устойчивы в кислой среде. Когда pH раствора превышает 5.0, мономер глутаральдегида демонстрирует тенденцию к полимеризации. Причем чем выше становится рН, тем быстрее растет полимеризации глутаральдегида, достигая существенного уровня при рН 7.5 (Rasmussen and Albrechtsen, 1974).
[0049] Эффективность глутаральдегида как стерилизующего агента напрямую связана с его высокой проникающей способностью. Поэтому эффективен раствор глутаральдегида, состоящий из мономеров и олигомеров, т.е. молекул, достаточно маленьких для быстрого и глубокого проникновения в биологическую ткань и инактивации микроорганизмов. Исходя из этого, логично, что рН раствора для стерилизации должен быть смещен в кислую сторону. Однако биоцидная активность глутаральдегида, обусловленная взаимодействием его карбонильных групп с сульфгидрильными, гидроксильными, карбоксильными и аминогруппами белков микроорганизмов, максимально проявляется в слабо щелочной среде (McKeen 2012). В предпочтительном варианте настоящего изобретения стерилизующий раствор имеет рН 6.0±0.5. Такая кислотность раствора для стерилизации является оптимальной с точки зрения биоцидной эффективности глутаральдегида и стабильности стерилизующего раствора. При этом не максимальная биоцидная эффективность глутаральдегида компенсируется продолжительным временем стерилизации, которое оказывается возможным благодаря стабильности стерилизующего раствора. Стерилизацию указанным способом проводят один раз за все время обработки биологической ткани после сборки биопротеза. Стабильность глутаральдегида в стерилизующем растворе позволяет хранить стерилизованную биологическую ткань в закрытом контейнере до двух лет перед имплантацией биопротеза.
[0050] В результате заявленной обработки биологической ткани получаются прочные, эластичные детали для биопротеза. Детали имеют плоскую форму и ровные края с минимальной шириной термонекроза, что позволяет минимизировать количество биологической ткани, используемой в биопротезе и не участвующей в выполнении специфических функций биопротеза.
[0051] Биопротезы, выполненные с использованием биологической ткани, обработанной согласно настоящему изобретению, могут содержать дополнительные элементы, выполненные из других материалов. В этом случае биологическая ткань прикрепляется к дополнительному элементу с помощью шитья, клея, сплавления или иным подходящим способом.
[0052] Биопротезы, выполненные с использованием биологической ткани, обработанной согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются, протезы артерий и сосудов нижних конечностей, перикардиальные лоскуты, аллографты и биопротезы клапанов сердца. На Фиг. 1А и 1Б в качестве примера показана принципиальная схема каркасного биопротеза аортального клапана. Данный биопротез содержит металлический сетчатый каркас 1, функцией которого является позиционирование и удержание биопротеза клапана в теле пациента после имплантации. К каркасу присоединено тело клапана 2, выполненное из биологической ткани, обработанной согласно настоящему изобретению. Тело клапана включает створчатый аппарат 3. При этом тело клапана может быть пришито, приклеено, приварено или присоединятся к каркасу любым другим подходящим способом.
Описание реализации изобретения
[0053] Пример 1. Фиксация биологической ткани на плоских пластинах.
[0054] Механически обработанный лоскут перикарда свиньи разложили на плоской поверхности пластины, выполненной из оргстекла. Поверхность пластины была предварительно очищена раствором изопропилового спирта. Лоскут перикарда равномерно распределили по поверхности пластины так, чтобы максимально плотно прижать перикард к поверхности пластины. Затем края лоскута перикарда прикрепили к краям пластины при помощи кнопок, выполненных из нержавеющей стали. При этом натяжение закрепленного перикарда было несколько неравномерным и составляло от 0.5 Н до 1 Н зависимости от участка перикарда. Указанное натяжение позволило в сильной степени сохранить естественную извитость волокон коллагена в фиксированном перикарде, что обеспечило эластичность фиксированного перикарда, необходимую для правильной работы створчатого аппарата биопротеза аортального клапана, который был впоследствии изготовлен из данного перикарда. Кроме того, толщина фиксированного перикарда составила от 180 до 360 мкм, что позволило изготовить из него биопротез аортального клапана, доставляемый к месту имплантации через катетер. Пластину с закрепленным на ней лоскутом перикарда переместили в чистую емкость, заполненную фиксирующим раствором. Фиксирующий раствор содержал 0.6% масс. глутаральдегида в фосфатном буфере PBS, рН 7.4. Масса фиксирующего раствора превышала массу лоскута перикарда на пластине приблизительно в 10 раз и полностью покрывал пластину с прикрепленным лоскутом перикарда. Контейнер герметично закрыли крышкой и инкубировали при комнатной температуре в течение 48 часов. Затем контейнер открыли и произвели полную замену фиксирующего раствора в контейнере. При этом новая порция фиксирующего раствора превышала массу лоскута перикарда на пластине приблизительно в 10 раз и полностью покрывала пластину с прикрепленным лоскутом перикарда. Далее контейнер герметично закрыли крышкой и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 суток. После окончания процесса фиксации контейнер открыли, открепили кнопки, удерживающие лоскут перикарда на пластине. Затем лоскут перикарда сняли с пластины и переместили в непрозрачный пластиковый контейнер, заполненный раствором для хранения.
[0055] Полученный фиксированный перикард использовали для изготовления биопротеза аортального клапана, аналогичного представленному на Фиг. 1. Исследование механической прочности и уровня кальцификации проводили по стандартной методике после стерилизации биопротеза. Биопротез помещали в усталостный тестер Heart Valve Durability Tester, Model MDV (Blockwise Engineering LLC, USA) и запускали циклы открытия/закрытия створчатого аппарата в растворе, содержащем кальций в концентрации 1,3 г/л. Испытание биопротеза проводились при 15 Гц и перепаде давления 100 мм.рт.ст., длительность испытания составила 13 дней. При этом створчатый аппарат биопротеза выдержал 17189 тыс. циклов открытия/закрытия. После окончания испытания биопротез извлекли из усталостного тестера и отрезали от него створчатый аппарат, который затем отдали в лабораторию НИОХ СО РАН для определения абсолютной и относительной массы Са в сухом образце фиксированного перикарда. По результатам исследования створчатый аппарат биопротеза содержал 1,5% масс. Са.
[0056] Пример 2. Антикальциевая обработка биологической ткани.
[0057] Биопротез аортального клапана, аналогичный тому, который описан в Примере 1, подвергли антикальциевой обработке. Для этого биопротез поместили в чистый контейнер, содержащий раствор для антикальциевой обработки. Раствор для антикальциевой обработки содержал 1.2% масс. Triton Х-100, 22% масс. этанола, 4% масс. формальдегида и 72.8% масс. фосфатного буфера PBS. Контейнер герметично закрыли и поместили в термостат, где инкубировали 24 часа при 37°С. По окончании инкубации контейнер открыли и переместили обработанный биопротез в раствор 0.9% масс. хлорида натрия, где инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. За время инкубации дважды меняли порцию раствора хлорида натрия.
[0058] Исследование уровня кальцификации проводили после стерилизации биопротеза тем же способом, который описан в Примере 1. По результатам исследования створчатый аппарат обработанного биопротеза содержал 0.12% масс. Са.
[0059] Пример 3. Лазерная резка фиксированной биологической ткани в слое жидкости.
2
[0060] Из лоскута фиксированного перикарда свиньи, полученного в Примере 1, вырезали детали биопротеза путем лазерной резки с использованием СО лазера. Для этого лоскут фиксированного перикарда из емкости для хранения выложили на манипуляционный стол автоматизированного лазерного комплекса. Далее выбрали визуально равномерный участок лоскута фиксированного перикарда и запустили процесс лазерной резки по программе, загруженной в лазерный комплекс.
[0061] В одном случае лоскут фиксированного перикарда во время лазерной резки был полностью покрыт слоем раствора 0.9% масс. хлорида натрия, толщина которого составляла 1,5 мм. В другом случае лоскут фиксированного перикарда орошали раствором 0.9% масс. Хлорида натрия во время лазерной резки. В третьем случае перикард никак не увлажняли во время лазерной резки.
[0062] Вырезанные детали осмотрели под увеличением на предмет наличия видимых порезов, разрывов, неоднородностей и посторонних включений, и измерили ширину зоны термонекроза в нескольких местах каждой детали. В первых двух случаях, когда лоскут фиксированного перикарда был полностью покрыт или орошался раствором хлорида натрия во время лазерной резки, зона термонекроза на краю вырезанных деталей составляла в среднем 0.2±0.01 мм. Детали, вырезанные из лоскута фиксированного перикарда без покрытия раствором хлорида натрия, имели зону термонекроза шириной в среднем 1±0.01 мм. Кроме того, детали, вырезанные из лоскута фиксированного перикарда без покрытия раствором хлорида натрия, имели более неровный и бугристый край, чем детали, вырезанные с применением раствора хлорида натрия.
[0063] Для дальнейшего создания биопротеза аортального клапана использовали детали, вырезанные с применением раствора хлорида натрия.
[0064] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.
[0065] Таблица 1. Механическая прочность биопротезов аортального клапана, выполненных из перикарда свиньи, обработанного различными способами.
Образец
Количество циклов на усталостном тестере
Биопротез аортального клапана, выполненный из перикарда свиньи, фиксированного глутаральдегидом c последующей антикальциевой обработкой
16745
Биопротез аортального клапана, выполненный из перикарда свиньи, фиксированного диглицидиловым эфиром этиленгликоля c последующей антикальциевой обработкой
16654
Биопротез аортального клапана, выполненный из перикарда свиньи, фиксированного глутаральдегидом без последующей антикальциевой обработки
17189
[0066] Таблица 2. Уровень кальцификации перикарда свиньи, обработанного различными способами.
Образец
Относительное содержание Ca, % масс.
Перикард свиньи, фиксированный глутаральдегидом без последующей антикальциевой обработки
1.5
Перикард свиньи, фиксированный глутаральдегидом с последующей антикальциевой обработкой
0.12
Corevalve 1 створка
0.75
Corevalve 2 створка
1.0
Corevalve 3 створка
0.36