УГНЕТЕНИЕ ОПУХОЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ПЛАЦЕНТАРНОГО ПЕРФУЗАТА ЧЕЛОВЕКА И ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ НАТУРАЛЬНЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ
SUPPRESSION OF TUMORS USING HUMAN PLACENTAL PERFUSATE AND AUXILIARY NATURAL KILLER CELLS ISOLATED FROM HUMAN PLACENTA

В настоящей заявке заявляется приоритет по предварительной заявке на патент США № 60/995763, поданной 28 сентября 2008 г., и предварительной заявке на патент США № 61/090555, поданной 21 августа 2008 г., описание которых целиком включено в настоящее изобретение посредством ссылки.
1. Область техники, к которой относится изобретение
В настоящем описании приведены способы подавления роста или пролиферации опухолевых клеток путем контактирования опухолевых клеток с плацентарным перфузатом, с клетками, выделенными из плацентарного перфузата, с натуральными клетками-киллерами из плаценты, в частности из плацентарного перфузата, и/или с комбинированными натуральными клетками-киллерами, включающими натуральные клетки-киллеры из плаценты, в частности, из плацентарного перфузата, и натуральные клетки-киллеры из пуповинной крови. Кроме того, в настоящем изобретении приведены способы продуцирования уникальной популяции натуральных клеток-киллеров из плаценты, например, из плацентарного перфузата, в частности, из плацентарного перфузата человека. Кроме того, в настоящем изобретении приведены способы применения плацентарного перфузата и выделенных из него натуральных клеток-киллеров для подавления пролиферации опухолевых клеток.
2. Уровень техники
+
Плацентарный перфузат содержит скопление клеток плаценты, полученных при прохождении раствора для перфузии через сосудистую сеть плаценты и извлечении раствора для перфузии из сосудистой сети, из материнской поверхности плаценты или из них обеих. Способы перфузии плаценты млекопитающих приведены, в частности, в патенте США № 7045146 и в патенте США № 7255879. Популяция клеток плаценты, выделенных с помощью перфузии, неоднородна и включает кроветворные (CD34) клетки, ядросодержащие клетки, такие как гранулоциты, моноциты и макрофаги, небольшой процент (меньше чем 1%) стволовых клеток плаценты, связанных с субстратом тканевой культуры, и натуральные клетки-киллеры. До настоящего момента никто еще не описывал применение плацентарного перфузата или популяции клеток плаценты из перфузата для подавления пролиферации опухолевых клеток.
Натуральные клетки-киллеры (NK) представляют собой цитотоксические лимфоциты, которые являются основным компонентом врожденной иммунной системы человека. NK клетки не экспрессируют рецепторы Т-клеточных антигенов (TCR), CD3 или рецептор поверхностных иммуноглобулинов В-клеток, однако обычно экспрессируют у людей поверхностные маркеры CD16 (FcγRIII) и CD56. NK клетки оказывают цитотоксическое действие; маленькие гранулы в их цитоплазме содержат специальные белки, такие как перфорин, и протеазы, известные как гранзимы. При высвобождении в непосредственной близости от клетки, которая намечена к уничтожению, перфорин образует поры в клеточной мембране клетки-мишени, через которые могут проникнуть гранзимы и связанные с ними молекулы, которые вызывают апоптоз. Один из гранзимов, гранзим В (известный также как гранзим 2 и цитотоксическая Т-лимфоцит-ассоциированная серинэстераза 1), является серинэстеразой, которая играет решающую роль в быстром индуцировании апоптоза клетки-мишени в опосредованном клетками иммунном ответе.
NK клетки активируются в ответ на интерфероны или цитокины, продуцируемые макрофагами. Активированные NK клетки называют активированными лимфокином клетками-киллерами (LAK). NK клетки имеют два типа рецепторов на поверхности, обозначенные как “активирующие рецепторы” и “ингибирующие рецепторы”, которые регулируют цитотоксическую активность клеток.
Среди других обладающих активностью веществ, NK клетки играют определенную роль при отторжении опухолей хозяином. Поскольку раковые клетки обладают пониженной экспрессией или совсем не обладают экспрессией молекул MHC класса I, то они могут стать мишенями для NK клеток. Собранные клинические данные свидетельствуют о том, что идентичная по гаплотипу трансплантация NK клеток человека, выделенных из PBMC или костного мозга, опосредует мощное антилейкемическое действие, не проявляя при этом заметной реакции “трансплантат против хозяина” (GVHD). См. Ruggeri et al, Science 295:2097-2100 (2002)). Натуральные клетки-киллеры могут активироваться клетками, у которых отсутствуют или у которых снижены уровни белков главного комплекса гистосовместимости (MHC). Активированные и размножившиеся NK клетки и LAK клетки использовали как в ex vivo терапии, так и при in vivo лечении пациентов с раком на поздней стадии, при этом достигнут определенный успех при лечении заболеваний, связанных с костным мозгом, таких как лейкоз; рак груди; и некоторые типы лимфомы. Лечение с использованием LAK клеток требует, чтобы пациент вначале получал IL-2, а затем проходил лейкоферез с последующей ex vivo инкубацией и выращиванием собранных аутогенных клеток крови в питательной среде в течение нескольких дней в присутствии IL-2. Для завершения лечения LAK клетки должны быть подвергнуты реинфузии вместе с относительно большими дозами IL-2. Указанная очищающая обработка является дорогостоящей и может вызвать серьезные побочные эффекты. Они включают задержку жидкости, отек легких, падение кровяного давления и высокую температуру.
Несмотря на благоприятные свойства NK клеток для уничтожения опухолевых клеток и инфицированных вирусами клеток, с ними по-прежнему трудно работать и трудно использовать их в иммунотерапии, в основном благодаря трудности поддерживать способность NK клеток нацеливаться на мишень и уничтожать опухолевые клетки в процессе выращивания и размножения. Таким образом, в данной области техники ощущается потребность в легко доступном источнике натуральных клеток-киллеров.
3. Сущность изобретения
В настоящем изобретении предлагается применение плацентарного перфузата; клеток из плацентарного перфузата, в частности, совокупности ядросодержащих клеток из плацентарного перфузата; комбинаций клеток плацентарного перфузата и клеток пуповинной крови; и/или натуральных клеток-киллеров из плаценты, в частности, натуральных клеток-киллеров из плацентарного перфузата и натуральных клеток-киллеров, полученных при ферментации тканей плаценты, с целью подавления пролиферации опухолевых клеток.
В соответствии с одним аспектом, в настоящем изобретении предлагается способ подавления пролиферации опухолевой клетки или популяции опухолевых клеток, который включает контактирование опухолевой клетки или популяции опухолевых клеток с плацентарным перфузатом человека. В конкретном варианте осуществления указанного способа опухолевой клеткой является клетка рака крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения опухолевыми клетками являются клетки рака крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения опухолевой клеткой является клетка солидной опухоли. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения опухолевыми клетками являются клетки солидной опухоли. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения опухолевой клеткой является клетка первичной карциномы из эпителия протоков, клетка лейкоза, клетка острого Т-клеточного лейкоза, клетка хронической миелоидной лимфомы (CML), клетка острого миелогенного лейкоза, клетка хронического миелогенного лейкоза (CML), клетка легочной карциномы, клетка аденокарциномы ободочной кишки, клетка гистиоцитарной лимфомы, клетка множественной миеломы, клетка ретинобластомы, клетка колоректальной карциномы или клетка колоректальной аденокарциномы. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование происходит в условиях in vitro. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование происходит в условиях in vivo. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное in vivo контактирование происходит в человеке.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный плацентарный перфузат представляет собой перфузат, который пропущен через сосудистую сеть плаценты, в частности, лишь через сосудистую сеть плаценты. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный плацентарный перфузат пропущен через сосудистую сеть плаценты и собран с материнской поверхности плаценты. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения все или практически все (в частности, больше чем 90%, 95%, 98% или 99%) клеток в указанном плацентарном перфузате являются клетками плода. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат содержит клетки плода и материнские клетки. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки плода в указанном плацентарном перфузате составляют меньше, чем приблизительно 90%, 80%, 70%, 60% или 50% клеток в указанном перфузате. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный перфузат получают, пропуская 0,9%-ый раствор NaCl через сосудистую сеть плаценты. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный перфузат включает культуральную среду. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный перфузат подвергают обработке, с целью удаления множества эритроцитов.
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
В соответствии с другим аспектом, в настоящем изобретении предлагается способ подавления пролиферации опухолевой клетки или множества опухолевых клеток, который включает контактирование опухолевой клетки или множества опухолевых клеток с множеством клеток плацентарного перфузата. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество клеток плацентарного перфузата представляет собой или включает совокупность ядросодержащих клеток из плацентарного перфузата. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный плацентарный перфузат или клетки плацентарного перфузата, в частности, совокупность ядросодержащих клеток из плацентарного перфузата, подвергают обработке для удаления, по меньшей мере, одного типа клеток. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование происходит в условиях in vitro. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование происходит в условиях in vivo. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное in vivo контактирование происходит в млекопитающем, в частности, в человеке. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки плацентарного перфузата подвергают обработке с тем, чтобы обогатить, по меньшей мере, одним типом клеток, в частности, клетками CD56. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки CD56 представляют собой натуральные клетки-киллеры CD56CD16 в частности, вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты (PINK), которые, например, выделяют из клеток плацентарного перфузата и клеток плаценты, полученных путем механической или ферментативной деструкции тканей плаценты. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные CD56 клетки отбирают с помощью CD56-связанных микрошариков. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные CD56 клетки представляют собой клетки, которые показывают заметно меньшую экспрессию NKG2D, NKp46 или CD94, чем эквивалентное число CD56CD16 натуральных клеток-киллеров. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения PINK клетки представляют собой CD3. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, по крайней мере, 50% клеток в указанных клетках плацентарного перфузата составляют указанные CD56 клетки. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, когда CD56 клетки составляют, по крайней мере, 50% от указанных клеток плацентарного перфузата, опухолевая клетка представляет собой клетку первичной карциномы из эпителия протоков, клетку лейкоза, клетку острого Т-клеточного лейкоза, клетку хронической миелоидной лимфомы (CML), клетку острого миелогенного лейкоза, клетку хронического миелогенного лейкоза (CML), клетку легочной карциномы, клетку аденокарциномы ободочной кишки, клетку гистиоцитарной лимфомы, клетку множественной миеломы, клетку ретинобластомы, клетку колоректальной карциномы или клетку колоректальной аденокарциномы. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения указанное контактирование происходит в условиях in vitro. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование представляет собой контактирование in vivo, в частности, в млекопитающем, например, в человеке.
+
-
-
in vivo
В соответствии с другим аспектом, в настоящем изобретении предлагается способ подавления пролиферации опухолевой клетки или множества опухолевых клеток, который включает контактирование опухолевой клетки или множества опухолевых клеток с множеством натуральных клеток-киллеров из плаценты, в частности, PINK клеток. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры из плаценты представляют собой натуральные клетки-киллеры, полученные из плацентарного перфузата. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры являются натуральными клетками-киллерами, которые получают физической деструкцией и/или ферментативным расщеплением тканей плаценты. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры являются натуральными клетками-киллерами CD56CD16, в частности, PINK клетками. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры выбирают, в частности, из клеток плацентарного перфузата или клеток, полученных путем физической деструкции и/или ферментативного расщепления тканей плаценты, с помощью CD56-конъюгированных микрошариков. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры представляют собой CD3. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения множество натуральных клеток-киллеров составляет, по крайней мере, 80% клеток в популяции клеток, которая содержит натуральные клетки-киллеры. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование происходит в условиях in vitro. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование в условиях  происходит в млекопитающем, в частности, в человеке.
+
+
В другом конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению указанное множество натуральных клеток-киллеров представляет собой клетки, которые показывают заметно меньшую экспрессию NKG2D, NKp46 или CD94, чем эквивалентное число CD56CD16 натуральных клеток-киллеров. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество натуральных клеток-киллеров, в частности, PINK клетки, экспрессирует одну или несколько молекул микроРНК hsa-miR-100, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-miR-302c, hsa-miR-326, hsa-miR-337, hsa-miR-497, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsa-miR-519d, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-618 и/или hsa-miR-99a с детектируемым более высоким уровнем, чем натуральные клетки-киллеры периферической крови.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество натуральных клеток-киллеров, в частности, PINK клетки, контактируют с количеством иммуномодулирующего соединения и в течение времени, которые достаточны для того, чтобы указанное множество натуральных клеток-киллеров могло экспрессировать детектируемое большее количество гранзима В, чем эквивалентное число указанных натуральных клеток-киллеров, которые не контактировали с указанным иммуномодулирующим соединением. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой леналидомид или помалидомид. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество натуральных клеток-киллеров, в частности, PINK клетки, контактирует с количеством иммуномодулирующего соединения и в течение времени, которые достаточны для того, чтобы указанные натуральные клетки-киллеры могли проявить детектируемую большую цитотоксичность по отношению к указанным опухолевым клеткам, чем эквивалентное число указанных натуральных клеток-киллеров, которые не контактировали с указанным иммуномодулирующим соединением, в частности, леналидомидом или помалидомидом. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество натуральных клеток-киллеров, в частности, PINK клетки, экспрессирует один или несколько из BAX, CCL5, CCR5, CSF2, FAS, GUSB, IL2RA или TNFRSF18 с более высоким уровнем, чем эквивалентное число указанных натуральных клеток-киллеров, которые не контактировали с указанным иммуномодулирующим соединением. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество натуральных клеток-киллеров, в частности, PINK клетки, экспрессирует одно или несколько из ACTB, BAX, CCL2, CCL3, CCL5, CCR5, CSF1, CSF2, ECE1, FAS, GNLY, GUSB, GZMB, IL1A, IL2RA, IL8, IL10, LTA, PRF1, PTGS2, SKI и TBX21 с более высоким уровнем, чем эквивалентное число указанных натуральных клеток-киллеров, которые не контактировали с указанным иммуномодулирующим соединением.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры из плаценты комбинируют с натуральными клетками-киллерами из другого источника, в частности, из крови плаценты и/или пуповинной крови, например, для получения комбинированных натуральных клеток-киллеров. В настоящем описании выражение “натуральные клетки-киллеры из плаценты” не включает натуральные клетки-киллеры из пуповинной крови или кровь плаценты. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры из плаценты комбинируют с натуральными клетками-киллерами из другого источника в соотношении приблизительно 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100 и т.п.
-
+
-
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры не выращивают в питательной среде, и они включают: детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56CD16, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56CD16, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56KIR2DL2/L3, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp46, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp30, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD562B4, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; или детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56CD94, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В других конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры выращивают в питательной среде, и они включают: детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56KIR2DL2/L3, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp46, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp44, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови; детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp30, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови.
В конкретном варианте осуществления любого из вышеуказанных способов опухолевая клетка является клеткой солидной опухоли. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения опухолевая клетка является клеткой жидкой опухоли, в частности, клеткой кровяной опухоли. В более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения опухолевая клетка является клеткой первичной карциномы из эпителия протоков, клеткой лейкоза, клеткой острого Т-клеточного лейкоза, клеткой хронической миелоидной лимфомы (CML), клеткой острого миелогенного лейкоза, клеткой хронического миелогенного лейкоза (CML), клеткой легочной карциномы, клеткой аденокарциномы ободочной кишки, клеткой гистиоцитарной лимфомы, клеткой множественной миеломы, клеткой ретинобластомы, клеткой колоректальной карциномы или клеткой колоректальной аденокарциномы.
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
В соответствии с другим аспектом, в настоящем изобретении предлагается композиция, включающая выделенные из плаценты натуральные клетки-киллеры CD56, CD16, в частности, PINK клетки. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры плаценты выделяют из плацентарного перфузата. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры плаценты выделяют из плаценты путем физической деструкции и/или ферментативного расщепления ткани плаценты. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры составляют, по меньшей мере, 50% клеток в композиции. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры составляют, по меньшей мере, 80% клеток в композиции. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция включает выделенные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16 получены от другого индивида, нежели указанные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выделенные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16 получены от одного индивида. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выделенные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16 представляют собой натуральные клетки-киллеры, по крайней мере, от двух различных индивидов. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры плаценты, в частности, PINK клетки, размножают.
В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает натуральные клетки-киллеры плаценты и натуральные клетки-киллеры из другого источника. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанным другим источником являются клетки пуповинная кровь и/или кровь из пуповины. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанным другим источником является периферическая кровь. В более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры из плаценты комбинируют с натуральными клетками-киллерами из другого источника в соотношении приблизительно 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45: 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95, 1:100 и т.п.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция представляет собой выделенный плацентарный перфузат. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный плацентарный перфузат получен от того же индивида, что и указанные натуральные клетки-киллеры. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный плацентарный перфузат представляет собой плацентарный перфузат от другого индивида, нежели указанные натуральные клетки-киллеры. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения все или практически все (в частности, больше, чем 90%, 95%, 98% или 99%) клетки в указанном плацентарном перфузате являются клетками плода. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат включает клетки плода и материнские клетки. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки плода в указанном плацентарном перфузате составляют меньше, чем приблизительно 90%, 80%, 70%, 60% или 50% клеток в указанном перфузате. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные перфузат получают при прохождении 0,9%-го раствора NaCl через сосудистую сеть плаценты. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный перфузат включает культуральную среду. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный перфузат подвергают обработке, с целью удаления множества эритроцитов.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция включает клетки плацентарного перфузата. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки плацентарного перфузата получены от того же индивида, что и указанные натуральные клетки-киллеры. В другом более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки плацентарного перфузата получены от другого индивида, нежели указанные натуральные клетки-киллеры. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция включает выделенный плацентарный перфузат и выделенные клетки плацентарного перфузата, при этом указанный выделенный плацентарный перфузат и указанные выделенные клетки плацентарного перфузата получены от различных индивидов. В другом более конкретном варианте воплощения любого из вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения, включающих плацентарный перфузат, указанный плацентарный перфузат представляет собой плацентарный перфузат, по меньшей мере, от двух индивидов. В другом более конкретном варианте воплощения любого из вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения, включающих клетки плацентарного перфузата, указанные выделенные клетки плацентарного перфузата взяты, по меньшей мере, от двух индивидов. Указанная композиция может дополнительно включать выделенные PINK клетки, при этом PINK клетки получены от другого индивида, нежели указанный плацентарный перфузат или указанные клетки перфузата.
+
-
+
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
-
В соответствии с другим аспектом, в настоящем изобретении предлагается способ выделения натуральных клеток-киллеров плаценты, который включает получение множества клеток плаценты и выделение натуральных клеток-киллеров из указанного множества клеток плаценты. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки плаценты представляют собой или включают клетки плацентарного перфузата, в частности, общее количество ядросодержащих клеток из плацентарного перфузата. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество клеток плаценты представляет собой или включает клетки плаценты, полученные путем механической и/или ферментативной деструкции ткани плаценты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное выделение проводят с использованием одного или нескольких антител. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные одно или несколько антител представляют собой одно или несколько антител к CD3, CD16 или CD56. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное выделение включает отделение клеток CD56 от клеток CD56 в указанном множестве клеток плаценты. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное выделение включает отделение клеток плаценты CD56, CD16 от клеток плаценты, которыми являются CD56 или CD16. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное выделение включает отделение клеток плаценты CD56, CD16, CD3 от клеток плаценты, которыми являются CD56, CD16 или CD3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ выделения натуральных клеток-киллеров плаценты приводит к популяции клеток плаценты, которая, по крайней мере, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или, по крайней мере, на 99% состоит из натуральных клеток-киллеров CD56, CD16.
В некоторых вариантах осуществления вышеуказанных способов клетки плацентарного перфузата размножают в культуре. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения указанные клетки размножают, по крайней мере, приблизительно или не более чем в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 дней. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки плацентарного перфузата размножают в присутствии фидера и/или в присутствии, по меньшей мере, одного цитокина. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный фидер включает клетки К562 или одноядерные клетки периферической крови. В другом более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный, по меньшей мере, один цитокин представляет собой интерлейкин-2.
3.1. Определения
В контексте настоящего описания “комбинированными натуральными клетками-киллерами” являются натуральные клетки-киллеры, в частности из совместимых друг с другом пуповины и плацентарного перфузата человека, при этом плацентарный перфузат получают из той же самой плаценты, что и пуповинную кровь. Натуральные клетки-киллеры из обоих источников выделяют раздельно или в одно и то же время и объединяют.
+
-
В данном описании “PINK” и “PINK клетки” относятся к вспомогательным натуральным клеткам-киллерам плаценты, которые получают из плаценты человека, в частности, из плацентарного перфузата человека, или тканей плаценты, которые подвергнуты механической и/или ферментативной деструкции. Указанные клетки представляют собой CD56 и CD16, которые, например, определяют методом проточной цитометрии, в частности, определяют методом флуоресцентно-активированного клеточного сортинга с использованием антител к CD56 и CD16. PINK клетки не получают из пуповинной крови или периферической крови.
В настоящем описании выражение “плацентарный перфузат” означает раствор для перфузий, который пропущен, по крайней мере, через часть плаценты, например, плаценты человека, в частности, через сосудистую сеть плаценты, включая множество клеток, собранных раствором для перфузий при прохождении через плаценту.
В настоящем описании выражение “клетки плацентарного перфузата” означает ядросодержащие клетки, в частности, все ядросодержащие клетки, которые выделены или которые могут быть выделены из плацентарного перфузата.
В настоящем описании выражение “угнетение опухолевой клетки”, “подавление пролиферации опухолевой клетки” и т.п. включает замедление роста популяции опухолевых клеток, в частности, путем уничтожения одной или нескольких опухолевых клеток в указанной популяции опухолевых клеток, например, за счет контактирования указанной популяции опухолевых клеток с PINK клетками, с популяцией клеток, включающей PINK клетки, с комбинированными натуральными клетками-киллерами, с популяцией клеток, включающей комбинированные натуральные клетки-киллеры, с плацентарным перфузатом человека и т.п.
4. Краткое описание чертежей
+
-
На фиг. 1 приведены результаты проточной цитометрии с использованием антител против CD3 и антител против CD56 для клеток, отобранных с помощью микрошариков CD56 из плацентарного перфузата человека (HPP). Большинство выделенных клеток представляют собой CD56CD3.
На фиг. 2 показана продукция цитокинов PINK клетками и/или опухолевыми клетками во время выращивания в питательной среде в течение 24 час. Фиг. 2А показывает секрецию интерферона гамма (IFNγ) вспомогательными натуральными клетками-киллерами (PINK), выделенными из плацентарного перфузата, индивидуально или в присутствии опухолевых клеток KG-1a. PINK клетки и клетки KG-1a выращивают в питательной среде индивидуально или в комбинации в соотношении 1:1. Ось Y: пикограммы IFNγ, продуцируемого культурами. Фиг. 2B показывает секрецию гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) PINK клетками индивидуально или в присутствии опухолевых клеток KG-1a. PINK клетки и клетки KG-1a выращивают в питательной среде индивидуально или в комбинации в соотношении 1:1. Ось Y: пикограммы GM-CSF, продуцируемого культурами.
На фиг. 3 показана цитотоксичность PINK клеток по отношению к опухолевым клеткам KG-1a при совместном выращивании в течение 24 час в питательной среде в соотношении 1:1, 5:1, 10:1 или 20:1 PINK клеток к опухолевым клеткам. Ось X: отношение PINK клеток к опухолевым клеткам. Ось Y: процент мертвых опухолевых клеток по сравнению с опухолевыми клетками без PINK клеток.
На фиг. 4 показана цитотоксичность натуральных клеток-киллеров (NK) плаценты и натуральных клеток-киллеров периферической крови (PB), которые выращивают в питательной среде в течение 21 дня, по отношению к клеткам К562. Величины ошибки обозначают стандартное отклонение 4 единиц выращенных NK клеток плаценты или 3 единиц выращенных NK клеток периферической крови.
На фиг. 5 показана цитотоксичность цельного плацентарного перфузата (HPP) человека, в том виде, как он получен из плаценты, по отношению к опухолевым клеткам KG-1a при совместном выращивании в течение 24 час в питательной среде в соотношении 1:1, 5:1, 10:1, 20:1 или 100:1 клеток HPP к опухолевым клеткам. Ось X: отношение клеток HPP к опухолевым клеткам. Ось Y: процент мертвых опухолевых клеток, по сравнению с опухолевыми клетками без клеток HPP.
На фиг. 6 показана цитотоксичность цельного плацентарного перфузата человека, в том виде, как он получен из плаценты и пуповинной крови (UCB), по отношению к опухолевым клеткам KG-1a при совместном выращивании в питательной среде в течение 48 час для серии разбавлений 100:1, 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1, 3,12:1, 1,56:1 или 0,78:1 клеток HPP или клеток UCB к опухолевым клеткам. Ось X: отношение клеток HPP или клеток пуповины к опухолевым клеткам. Ось Y: процент мертвых опухолевых клеток после совместного выращивания в течение 48 час в питательной среде, по сравнению с опухолевыми клетками без клеток HPP или клеток пуповины.
На фиг. 7 показана цитотоксичность цельного плацентарного перфузата человека, в том виде, как он получен из плаценты, по отношению к опухолевым клеткам KG-1a при совместном выращивании в питательной среде в течение 48 час для серии разбавлений 100:1, 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25:1, 3,12:1, 1,56:1 или 0,78:1 клеток HPP к опухолевым клеткам. Перфузат либо используют в том виде, как он получен, либо активируют в течение 24 час с помощью 100 ед./мл или 1000 ед./мл интерлейкина-2 (IL-2). Ось X: отношение клеток HPP к опухолевым клеткам. Ось Y: процент мертвых опухолевых клеток после совместного выращивания в питательной среде в течение 48 час, по сравнению с опухолевыми клетками без клеток HPP.
На фиг. 8 показано цитотоксическое действие плацентарного перфузата человека по отношению к перечисленным линиям опухолевых клеток после выращивания в питательной среде с клетками HPP или клетками UCB в отношении 50:1 к опухолевым клеткам. Фиг. 8А: совместное выращивание в питательной среде в течение 24 час. Фиг. 8В: совместное выращивание в питательной среде в течение 48 час. Ось X: протестированные клеточные линии. Ось Y: процент мертвых опухолевых клеток после совместного выращивания в питательной среде, по сравнению с количеством опухолевых клеток в отсутствие опухолевых клеток.
На фиг. 9 показана продукция IFNγ клетками HPP, которые выращивают в питательной среде совместно с клетками KG-1a с различными отношениями клеток HPP к опухолевым клеткам. Ось X: условия проведения эксперимента, включая отношение клеток HPP к опухолевым клеткам. Ось Y: уровни IFNγ на миллилитр после совместного выращивания в питательной среде в течение 24 час.
На фиг. 10 показана продукция IFNγ клетками HPP или клетками UCB при совместном выращивании в питательной среде с рядом опухолевых клеток. Клетки HPP или клетки UCB совместно выращивают в питательной среде в отношении 50:1 вместе с опухолевыми клеткам в течение 24 час (фиг. 10А) или 48 час (фиг. 10В). Уровни IFNγ определяют флуоресцентным анализом по методу Luminex (HCYTO-60K-03, Millipore). Ось X: протестированные клеточные линии. Ось Y: пикограммы IFNγ, продуцированного клетками HPP или клетками UCB, по сравнению с пикограммы IFNγ, продуцированного в отсутствие опухолевых клеток.
7
3
3
Фиг. 11 показывает уменьшение размера опухоли после введения 2×10 клеток плацентарного перфузата человека (HPP) мышам, имеющим опухоли клеток KG-1, объем которых составляет приблизительно 332 мм. Интратуморально - инъекции клеток HPP вводят подкожно непосредственно в область опухоли. Внутривенно - клетки HPP вводят внутривенно. Контроль - введения одного лишь носителя. Объем опухоли указан в мм.
5. Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении предлагается применение плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата и/или выделенных из перфузата натуральных клеток-киллеров (“PINK”), которые получают из плаценты, с целью подавления роста или пролиферации опухолевой клетки или множества опухолевых клеток. В частности, в настоящем изобретении предлагаются натуральные клетки-киллеры (NK) и популяции NK клеток, выделенных из плацентарного перфузата, в частности, плацентарного перфузата человека, или выделенных из ткани плаценты, которая повергнута механической и/или ферментативной деструкции, предлагаются способы получения NK клеток, а также способы применения указанных клеток. В настоящем изобретении предлагаются также популяции клеток, в частности, популяции клеток плаценты, которые включают натуральные клетки-киллеры. Способы получения плацентарного перфузата и способы получения клеток из плацентарного перфузата приведены ниже в разделе 5.1. Натуральные клетки-киллеры, выделенные из плацентарного перфузата, и способы получения указанных клеток приведены ниже в разделе 5.2. Способы применения плацентарного перфузата, клеток, выделенных из плацентарного перфузата, или натуральных клеток-киллеров, выделенных из плацентарного перфузата, в частности, вспомогательных натуральные клеток-киллеров, с целью подавления пролиферации опухолевых клеток, приведены ниже в разделе 5.3.
5.1. Плацентарный перфузат
5.1.1. Композиции для сбора клеток
Предлагаемые в настоящем изобретении плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата и натуральные клетки-киллеры, выделенные из плацентарного перфузата, могут быть собраны путем перфузии млекопитающего, в частности, путем перфузии послеродовой плаценты человека, с использованием композиции для сбора клеток плаценты. Перфузат может быть собран из плаценты путем перфузии плаценты любым физиологически приемлемым раствором, в частности, физиологическим раствором, культуральной средой или более сложной композицией для сбора клеток. Композиции для сбора клеток, пригодная для проведения перфузии плаценты и для сбора и сохранения клеток перфузата, в частности, общего количества ядросодержащих клеток плацентарного перфузата, или PINK клеток, подробно описаны в заявке на патент США № 2007/0190042, которая целиком включена в данное описание посредством ссылки.
Композиция для сбора клеток может представлять собой любой физиологически приемлемый раствор, который пригоден для сбора и/или выращивания в питательной среде стволовых клеток, например, физиологический раствор (в частности, забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Креба, модифицированный раствор Креба, раствор Игла, 0,9%-ый раствор NaCl и т.п.), культуральную среду (в частности, DMEM, H.DMEM и т.д.) и т.п.
Композиция для сбора клеток может включать один или несколько компонентов, которые проявляют тенденцию сохранять клетки плаценты, т.е. способны предотвратить отмирание клеток плаценты или отсрочить отмирание клеток плаценты, сокращать число клеток плаценты в популяции клеток, которые отмирают, или оказывать аналогичное действие, с момента сбора до момента выращивания в питательной среде. Подобными компонентами могут быть, например, ингибиторы апоптоза (в частности, ингибитор каспазы или ингибитор JNK); сосудорасширяющий агент (в частности, сульфат магния, антигипертензивное средство, предсердный натриуретический пептид (ANP), адренокортикотропин, кортикотропин-высвобождающий гормон, нитропруссид натрия, гидралазин, трифосфат аденозина, аденозин, индометацин или сульфат магния, ингибитор фосфодиэстеразы и т.д.); ингибитор некроза (в частности, 2-(1H-индол-3-ил)-3-пентиламиномалеимид, дитиокарбамат пирролидина или клоназепам); ингибитор TNF-α; и/или перфторуглерод, способный переносить кислород (в частности, перфтороктилбромид, перфтордодецилбромид и т.п.).
Композиция для сбора клеток может включать один или несколько ферментов, способных деструктурировать ткани, в частности, металлопротеазу, серинпротеазу, нейтральную протеазу, гиалуронидазу, РНКазу или ДНКазу и т.п. Подобные ферменты включают, однако этим не ограничиваясь, коллагеназу (в частности, коллагеназу I, II, III или IV, или коллагеназу из Clostridium histolyticum и т.п.); диспазу, термолизин, аластазу, трипсин, LIBERASE, гиалуронидазу и т.п.
Композиция для сбора клеток может включать бактерицидно или бактериостатически эффективное количество антибиотика. В некоторых не ограничивающих настоящее изобретение вариантах его осуществления антибиотиком является макролид (в частности, тобрамицин), цефалоспорин (в частности, цефалексин, цефуроксим, цефрозил, цефаклор, цефиксим или цефадроксил), кларитромицин, эритромицин, пенициллин (в частности, пенициллин V) или хинолон (в частности, офлоксацин, ципрофлоксацин или норфлоксацин), тетрациклин, стрептомицин и т.д. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антибиотик активен против грам(+) и/или грам(-) бактерий, в частности, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, и т.п.
Композиция для сбора клеток может также включать одно или несколько следующих соединений: аденозин (от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ); D-глюкоза (от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ); ионы магния (от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ); в одном варианте осуществления настоящего изобретения макромолекула с молекулярной массой больше чем 20000 дальтон присутствует в количестве, достаточном для поддержания целостности эндотелия и жизнеспособности клеток (в частности, синтетический или встречающийся в природе коллоид, полисахарид, такой как декстран или полиэтиленгликоль, который присутствует в количестве от приблизительно 25 г/л до приблизительно 100 г/л, или от приблизительно 40 г/л до приблизительно 60 г/л); антиоксидант (в частности, бутилзамещенный гидроксианизол, бутилзамещенный гидрокситолуол, глутатион, витамин С или витамин Е, который присутствует в количестве от приблизительно 25 мкМ до приблизительно 100 мкМ); восстановитель (в частности, N-ацетилцистеин, который присутствует в количестве от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 5 мМ); агент, препятствующий попаданию кальция в клетки (в частности, верапамил, который присутствует в количестве от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 25 мкМ); нитроглицерин (например, от приблизительно 0,05 г/л до приблизительно 0,2 г/л); в одном варианте осуществления настоящего изобретения антикоагулянт присутствует в количестве, достаточном для предотвращения свертывания остаточной крови (в частности, гепарин или гирудин, который присутствует с концентрацией от приблизительно 1000 единиц/л до приблизительно 100000 единиц/л); или амилоридсодержащее соединение (в частности, амилорид, этилизопропиламилорид, гексаметиленамилорид, диметиламилорид или изобутиламилорид, который присутствует в количестве от приблизительно 1,0 мкМ до приблизительно 5 мкМ).
5.1.2. Сбор плаценты и манипуляции с ней
В общем случае плаценту человека извлекают сразу же после ее удаления по окончании родов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения плаценту извлекают у пациента после информированного согласия и после того, как полностью изучены данные медицинской карты пациента, связанные с плацентой. Медицинскую карту продолжают заполнять и после родов. Подобную медицинскую карту можно использовать для координирования последующего использования плаценты или собранных из нее клеток. Например, клетки плаценты человека можно использовать, в соответствии с медицинской картой, для связанного с плацентой персонализованного лечения младенца, или для родителей, или родных братьев и сестер, или других родственников младенца.
Перед извлечением перфузата удаляют пуповинную кровь и кровь плаценты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения после родов удаляют пуповинную кровь плаценты. Пуповинную кровь из плаценты удаляют обычным способом. Для освобождения плаценты от крови самотеком, как правило, используют иглу или канюлю (см., в частности, Anderson, патент США № 5372581; Hessel et al., патент США № 5415665). Иглу или канюлю обычно размещают в пуповинной вене и плаценту можно осторожно массировать, чтобы облегчить дренаж пуповинной крови из плаценты. Подобное извлечение пуповинной крови можно осуществить на коммерческой основе, например, в LifeBank Inc., Cedar Knolls, N. J., ViaCord, Cord Blood Registry и CryoCell. Предпочтительно, проводят дренаж плаценты самотеком, не осуществляя дальнейшие манипуляции с тем, чтобы минимизировать деструкцию тканей в процессе извлечения пуповинной крови.
Как правило, плаценту транспортируют после родов или из родильной палаты в другое место, в частности, в лабораторию для извлечения пуповинной крови и сбора перфузата. Плаценту, предпочтительно, транспортируют в стерильном, термоизолированном транспортном устройстве (температуру плаценты поддерживают в интервале температур 20-28°С), например, помещают плаценту с зажатым проксимальным концом пуповины в стерильный пакет, снабженный застежкой-молнией, который затем помещают в изолированный контейнер. В другом варианте осуществления настоящего изобретения плаценту транспортируют с помощью набора для сбора пуповинной крови, как описано в патенте США № 7147626. Плаценту, предпочтительно, доставляют в лабораторию в течение от четырех до двадцати четырех часов после родов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения перед извлечением пуповинной крови проксимальный конец пуповины пережимают, предпочтительно, в пределах 4-5 см от места выхода пуповины из плацентарного кольца. В других вариантах осуществления настоящего изобретения проксимальный конец пуповины пережимают после извлечения пуповинной крови, но перед проведением дальнейшей обработки плаценты.
Перед сбором перфузата плаценту можно хранить в стерильных условиях либо при комнатной температуре, либо при температуре от 5 до 25°С. Перед проведением перфузии, с целью удаления любой остаточной пуповинной крови, плаценту можно хранить в течение более сорока восьми часов и, предпочтительно, в течение от четырех до двадцати четырех часов. Плаценту, преимущественно, хранят в растворе антикоагулянта при температуре в диапазоне от 5 до 25°С. Подходящие растворы антикоагулянта хорошо известны из области техники. Например, можно использовать гепарин или натриевое производное варфарина. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения раствор антикоагулянта представляет собой раствор гепарина (в частности, 1% масс./масс. в растворе 1:1000). Перед сбором плацентарного перфузата освобожденную от крови плаценту, предпочтительно, хранят в течение не более чем 36 час.
5.1.3. Перфузия плаценты
Способы перфузии плаценты млекопитающих раскрыты, в частности, Hariri, в патентах США № 7045148 и 7255879, и в патентной заявке США № 2007/0190042 под названием “Улучшенная композиция для сбора и сохранения органов”, описания которых целиком включено в настоящее изобретение посредством ссылки.
Перфузат можно получить, пропуская раствор для перфузии, в частности, физиологический раствор, культуральную среду или вышеуказанные композиции для сбора клеток, через сосудистую сеть плаценты. В одном варианте осуществления настоящего изобретения плаценту млекопитающего перфузируют, пропуская раствор для перфузии либо через пупочную артерию или пупочную вену, либо и через пупочную артерию, и пупочную вену. Поток раствора для перфузии через плаценту можно осуществить, например, самотеком через плаценту. Раствор для перфузии, предпочтительно, принудительно прокачивают через плаценту с помощью насоса, в частности, перистальтического насоса. Пупочную вену можно, в частности, катетеризовать с помощью канюли, например, канюли из тефлона или пластика, которая присоединена к стерильному присоединительному устройству, такому как стерильные трубки. Стерильное присоединительное устройство подсоединено к коллектору для перфузии.
В процессе подготовки к проведению перфузии плаценту, предпочтительно, ориентируют таким образом, чтобы пупочная артерия или пупочная вена располагались в самой верхней точке плаценты. Плаценту можно перфузировать, пропуская раствор для перфузии через сосудистую сеть плаценты или через сосудистую сеть плаценты и окружающую ткань. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пупочную артерию и пупочную вену одновременно присоединяют к пипетке, которая с помощью гибкого соединительного устройства подсоединена к емкости с раствором для перфузии. Раствор для перфузии пропускают через пупочную вену и артерию. Раствор для перфузии выделяется из кровеносных сосудов и/или проходит через стенки кровеносных сосудов в окружающие ткани плаценты и собирается в подходящем открытом сосуде с поверхности плаценты, которая соединена с маткой матери во время беременности. Раствор для перфузии можно также ввести через отверстие в пуповине и дать ему стекать и просачиваться из отверстий в стенке плаценты, которая состыковывалась со стенкой матки матери. В другом варианте осуществления настоящего изобретения раствор для перфузии проходит через пупочные вены и собирается из пупочной артерии, или проходит через пупочную артерию и собирается из пупочных вен, т.е. проходит лишь через сосудистую сеть плаценты (ткань плода).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, например, пупочную артерию и пупочную вену одновременно присоединяют, в частности, к пипетке, которая с помощью гибкого соединительного устройства подсоединена к емкости с раствором для перфузии. Раствор для перфузии пропускают через пупочную вену и артерию. Раствор для перфузии выделяется из кровеносных сосудов и/или проходит через стенки кровеносных сосудов в окружающие ткани плаценты и собирается в подходящем открытом сосуде с поверхности плаценты, которая соединена с маткой матери во время беременности. Раствор для перфузии можно также ввести через отверстие в пуповине и дать ему стекать и просачиваться из отверстий в стенке плаценты, которая состыковывалась со стенкой матки матери. Клетки плаценты, собираемые указанным способом, который можно назвать способом “поддона”, как правило, представляют собой смесь клеток плода и клеток матери.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения раствор для перфузии проходит через пупочные вены и собирается из пупочной артерии, или проходит через пупочную артерию и собирается из пупочных вен. Клетки плаценты, собираемые указанным способом, который можно назвать как способ “замкнутой цепи”, как правило, практически исключительно представляют собой клетки плода.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения перфузию по способу замкнутой цепи можно провести следующим образом. Послеродовую плаценту получают в течение 48 час после родов. Пуповину пережимают и отрезают выше зажима. Пуповину можно отбросить или же подвергнуть обработке, с целью извлечения, например, стволовых клеток пуповины, и/или же переработать мембрану пуповины для получения биоматериала. Амниотическую мембрану можно сохранять во время перфузии или же отделить от хориона, например, отслаивая ее с помощью пальцев. Если амниотическая мембрана отделена от хориона перед проведением перфузии, то ее можно, например, отбросить или подвергнуть переработке, в частности, с целью получения стволовых клеток путем ферментативного расщепления или с целью получения, например, биоматериала амниотической мембраны, в частности, биоматериала, который описан в патентной заявке США № 2004/0048796. После того как плацента очищена от визуально наблюдаемых сгустков крови и остаточной крови, например, с помощью стерильной марли, сосуды пуповины вскрывают, например, путем частичного разрезания мембраны пуповины, чтобы вскрыть разрез пупочного канатика. Сосуды идентифицируют и открывают, например, продвигая закрытый зажим типа “крокодил” через отрезанный конец каждого сосуда. Затем в каждую из артерий плаценты вставляют устройство, например, пластиковые трубки, присоединенные к устройству для проведения перфузии или перистальтическому насосу. Насос может быть любым насосом, пригодным для данного назначения, например, перистальтическим насосом. Затем в вену плаценты вставляют пластиковые трубки, подсоединенные к стерильному сборнику, в частности, пакету для хранения крови, такому как пакет для сбора крови емкостью 250 мл. В качестве альтернативы, трубки, подсоединенные к насосу, вставляют в вену плаценты, а трубки, подсоединенные к сборнику(ам), вставляют в одну или обе артерии плаценты. Затем плаценту перфузируют определенным объемом раствора для перфузии, например, используя приблизительно 750 мл раствора для перфузии. После этого собирают клетки перфузата, например, центрифугированием.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения проксимальный конец пуповины пережимают в процессе проведения перфузии и, более предпочтительно, пережимают в пределах 4-5 см от места соединения пуповины с плацентарным кольцом.
Первый сбор жидкости для перфузии из плаценты млекопитающего в процессе освобождения от крови обычно окрашен остаточными эритроцитами пуповинной крови и/или крови плаценты. Жидкость для перфузии становится более бесцветной по мере проведения перфузии и по мере того, как остаточные клетки пуповинной крови вымываются из плаценты. Как правило, от 30 до 100 мл раствора для перфузии достаточно для первичного вымывания крови из плаценты, однако в зависимости от наблюдаемых результатов может использоваться больше или меньше жидкости для перфузии.
Объем жидкости для перфузии, который используют для перфузии плаценты, может варьировать в зависимости от количества клеток плаценты, которые необходимо собрать, размера плаценты, количества сборов, которые необходимо осуществить для одной плаценты, и т.д. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения объем жидкости для перфузии может составлять от 50 мл до 5000 мл, от 50 мл до 4000 мл, от 50 мл до 3000 мл, от 100 мл до 2000 мл, от 250 мл до 2000 мл, от 500 мл до 2000 мл или от 750 мл до 2000 мл. Как правило, вслед за освобождением от крови плаценту перфузируют, используя 700-800 мл жидкости для перфузии.
Плаценту можно перфузировать множество раз в течение нескольких часов или нескольких дней. В том случае, когда плаценту предполагается перфузировать множество раз, ее можно поддерживать или выращивать в питательной среде в асептических условиях в подходящем сосуде и перфузировать композицией для сбора клеток или стандартным раствором для перфузий (в частности, нормальным физиологическим раствором, таким как забуференный фосфатом физиологический раствор (“PBS”), который содержит или не содержит антикоагулянт (например, гепарин натриевое производное варфарина, кумарин, бисгидроксикумарин) и/или который содержит или не содержит антимикробный агент (например, β-меркаптоэтанол (0,1 мМ); антибиотики, такие как стрептомицин (в частности, с концентрацией 40-100 мкг/мл), пенициллин (например, в количестве 40 ед./мл), амфотерицин В (в частности, с концентрацией 0,5 мкг/мл). В одном варианте осуществления настоящего изобретения изолированную плаценту поддерживают или выращивают в питательной среде в течение некоторого времени, не проводя сбор перфузата, таким образом, что плацента поддерживается или выращивается в питательной среде в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 час, или же в течение 2 или 3 дней до проведения перфузии и сбора перфузата. Плаценту после перфузии можно поддерживать в течение более или менее длительного времени, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или больше часов и перфузировать второй раз, используя, например, 700-800 мл жидкости для перфузии. Плаценту можно перфузировать 1, 2, 3, 4, 5 или большее количество раз, например, один раз в каждые 1, 2, 3, 4, 5 или 6 час. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения перфузию плаценты и сбор раствора для перфузии, например, композиции для сбора клеток плаценты, повторяют до тех пор, пока число извлеченных ядросодержащих клеток не упадет ниже 100 клеток/мл. Перфузаты, полученные в разные моменты времени, можно дополнительно обработать индивидуально, с целью извлечения зависимых от времени популяций клеток, в частности, совокупности ядросодержащих клеток. Кроме того, можно объединять в общий фонд перфузаты, полученные в разные моменты времени.
5.1.4. Плацентарный перфузат и клетки плацентарного перфузата
Плацентарный перфузат представляет собой гетерогенный набор клеток. Как правило, перед использование плацентарный перфузат освобождают от эритроцитов. Подобное освобождение можно провести, используя известные способы отделения красных кровяных клеток крови от ядросодержащих клеток крови. В одном варианте осуществления настоящего изобретения перфузат или клетки перфузата хранят при криогенной температуре. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат содержит, или клетки плацентарного перфузата представляют собой, лишь клетки плода или же комбинацию клеток плода и клеток матери.
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
Как правило, плацентарный перфузат, полученный после проведения одной перфузии, содержит от приблизительно 100 миллионов до приблизительно 500 миллионов ядросодержащих клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат или клетки плацентарного перфузата включают клетки CD34, в частности, кроветворные стволовые клетки или клетки-предшественники. Подобные клетки могут, в более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, включать CD34CD45 стволовые клетки или клетки-предшественники, CD34CD45 стволовые клетки или клетки-предшественники, миелоидные предшественники, лимфоидные предшественники и/или эритроидные предшественники. В других вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат или клетки плацентарного перфузата включают прилипающие стволовые клетки плаценты, в частности, стволовые клетки CD34. В другом варианте осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат или клетки плацентарного перфузата включают, например, эндотелиальные клетки-предшественники, остеопрогениторные клетки и натуральные клетки-киллеры. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат, после того, как он выделен из плаценты и освобожден от эритроцитов, или клетки перфузата, выделенные из подобного перфузата, включают приблизительно 6-7% натуральных клеток-киллеров (CD3, CD56); приблизительно 21-22% Т-клеток (CD3); приблизительно 6-7% В-клеток (CD19); приблизительно 1-2% эндотелиальных клеток-предшественников (CD34, CD31); приблизительно 2-3% нейтральных клеток-предшественников (nestin); приблизительно 2-5% кроветворных клеток-предшественников (CD34); и приблизительно 0,5-1,5% прилипающих стволовых клеток плаценты (в частности, CD34, CD117, CD105 и CD44), что определяют, например, методом проточной цитометрии, в частности, анализом по методу FACS.
5.2. Деструкция и расщепление ткани плаценты для получения PINK клеток
Натуральные клетки-киллеры плаценты, в частности, PINK клетки, могут быть получены из ткани плаценты, которая подвергнута механической и/или ферментативной деструкции.
Ткани плаценты можно деструктурировать, используя один или несколько ферментов, способных деструктурировать ткани, в частности, металлопротеазу, серинпротеазу, нейтральную протеазу, РНКазу или ДНКазу и т.п. Подобные ферменты включают, однако этим не ограничиваясь, коллагеназу (в частности, коллагеназу I, II, III или IV, коллагеназу из Clostridium histolyticum и т.п.); диспазу, термолизин, аластазу, трипсин, LIBERASE, гиалуронидазу и т.п. Как правило, после ферментации подвергнутую ферментации ткань пропускают через перколятор или фильтр, чтобы удалить частично ферментированные скопления клеток, при этом получают практически одноклеточную суспензию.
+
+
+
+
-
+
-
+
-
-
После получения суспензии клеток плаценты натуральные клетки-киллеры можно изолировать, используя, например, антитела к CD3 и CD56. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры плаценты отделяют, выбирая клетки, которые представляют собой CD56, и получают первую популяцию клеток; проводят контактирование указанной первой популяции клеток с антителами, специфичными для CD3 и/или CD16; и извлекают клетки из указанной первой популяции, которые представляют собой CD3 или CD56, при этом получают вторую популяцию клеток, которые в значительной степени представляют собой клетки CD56 и CD3, CD56 и CD16 или CD56, CD3 и CD16.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения для выделения натуральных клеток-киллеров плаценты из суспензии клеток плаценты используют магнитные шарики. Клетки можно выделить, например, с помощью методики магнито-активированного клеточного сортинга (MACS), способа разделения частиц, который основан на их способности связываться с магнитными шариками (в частности, имеющих диаметр 0,5-100 мкм), которые включают одно или несколько специфических антител, в частности, антител против CD56. Магнитные микросферы можно различным приемлемым способом модифицировать, включая ковалентное добавление антител, которые специфично распознают конкретную молекулу или гаптен на поверхности молекулы. Шарики затем смешивают с клетками, чтобы дать им провзаимодействовать. Затем клетки пропускают через магнитное поле, с целью выделения клеток, которые имеют специфический маркер клеточной поверхности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки могут быть выделены и вновь смешаны с магнитными шариками, связанными с антителами против дополнительных маркеров клеточной поверхности. Указанные клетки вновь пропускают через магнитное поле и изолируют клетки, которые связывают оба антитела. Подобные клетки затем можно разбавить на отдельных планшетах, таких как планшеты для микротитрования, чтобы выделить клоны.
5.3. Натуральные клетки-киллеры плаценты
+
-
+
-
+
+
+
+
+
+
В соответствии с одним аспектом, в настоящем изобретении предлагается выделение, изучение характеристик и применение натуральных клеток-киллеров из плаценты, в частности, из плацентарного перфузата и/или из подвергнутой механической и/или ферментативной деструкции ткани плаценты, а также композиции, включающие подобные натуральные клетки-киллеры. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения натуральными клетками-киллерами плаценты являются “вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты”, или “PINK” клетки, которые характеризуют как клетки CD56CD16, т.е. обладающие клеточным маркером CD56 и не имеющие клеточный маркер CD16, что определяют проточной цитометрией, например, методом флуоресцентно-активированного клеточного сортинга с использованием антител против CD16 и CD56, как описано выше. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются выделенные PINK клетки и выделенные множества PINK клеток. Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются выделенные множества клеток, включающие PINK клетки CD56CD16 в сочетании с натуральными клетками-киллерами CD56CD16. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры CD56CD16 могут быть выделены из плаценты или из другого источника, например, из периферической крови, пуповинной крови, костного мозга и т.п. Так, в различных других вариантах осуществления настоящего изобретения PINK клетки могут объединяться с натуральными клетками-киллерами CD56CD16, в частности, в соотношениях, например, приблизительно равных 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6: 1, 7:1, 8:1 или приблизительно 9:1. В настоящем описании термин “выделенный” означает, что клетки удалены из окружающей их среды, в частности, из плаценты.
-
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения PINK клетками являются CD3.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения PINK клетки не показывают один или несколько клеточных маркеров, которые имеют полностью зрелые натуральные клетки-киллеры (в частности, CD16), или показывают подобные один или несколько маркеров с заметно сниженным уровнем, по сравнению с полностью зрелыми натуральными клетками-киллерами, или показывают один или несколько клеточных маркеров, ассоциированных с предшественниками натуральными клетками-киллерами, но не с полностью зрелыми натуральными клетками-киллерами. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаемые в настоящем изобретении PINK клетки экспрессируют NKG2D, CD94 и/или NKp46 на заметно меньшем уровне, чем полностью зрелые PINK клетки. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаемое в настоящем изобретении множество PINK клеток экспрессирует, в целом, NKG2D, CD94 и/или NKp46 на заметно меньшем уровне, чем эквивалентное число полностью зрелых NK клеток.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения PINK клетки экспрессируют одну или несколько молекул микроРНК hsa-miR-100, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-miR-302c, hsa-miR-326, hsa-miR-337, hsa-miR-497, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsa-miR-519d, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-618 и/или hsa-miR-99a с заметно более высоким уровнем, чем натуральные клетки-киллеры периферической крови.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры плаценты, в частности, PINK клетки, размножают в питательной среде. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения в питательной среде размножают клетки плацентарного перфузата. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки плацентарного перфузата размножают в присутствии фидера и/или в присутствии, по крайней мере, одного цитокина. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный фидер включает клетки К562 или одноядерные клетки периферической крови. В другом более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный, по меньшей мере, один цитокин представляет собой интерлейкин-2.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается выделенное множество (например, популяция) PINK клеток. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения выделенную популяцию клеток получают изоляцией клеток из плацентарного перфузата с помощью CD56-микрошариков. В различных конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения указанная популяция включает, по крайней мере, приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или, по крайней мере, приблизительно 99% PINK клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения множество PINK клеток включает, или состоит из, PINK клетки, которые не размножали; в частности, оно представляет собой множество PINK клеток в том виде, в каком они выделены из плацентарного перфузата. В другом варианте осуществления настоящего изобретения множество PINK клеток включает, или состоит из, PINK клетки, которые размножали. Способы размножения PINK клеток описаны, в частности, Ohno et al., в заявке на патент США № 2003/0157713; см. также Yssel et al, J. Immunol. Methods 72(1):219-227 (1984) и Litwin et al., J. Exp. Med. 178(4):1321-1326 (1993), а также в методике размножения натуральных клеток-киллеров, приведенной ниже в примере 1.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения выделенное множество PINK клеток не показывает один или несколько клеточных маркеров, которые показывают полностью зрелые натуральные клетки-киллеры (в частности, CD16), или показывает один подобный или несколько подобных клеточных маркеров на заметно меньшем уровне, по сравнению с полностью зрелыми натуральными клетками-киллерами, или показывает один или несколько клеточных маркеров, ассоциированных с предшественниками натуральных клеток-киллеров, но не ассоциированных с полностью зрелыми натуральными клетками-киллерами. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаемые в настоящем изобретении PINK клетки экспрессируют NKG2D, CD94 и/или NKp46 на заметно меньшем уровне, чем полностью зрелые NK клетки. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаемое в настоящем изобретении множество PINK клеток экспрессирует, в целом, NKG2D, CD94 и/или NKp46 на заметно меньшем уровне, чем эквивалентное число полностью зрелых NK клеток.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения популяция PINK клеток экспрессирует одну или несколько молекул микроРНК hsa-miR-100, hsa-miR-127, hsa-miR-211, hsa-miR-302c, hsa-miR-326, hsa-miR-337, hsa-miR-497, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-515-5p, hsa-miR-517b, hsa-miR-517c, hsa-miR-518a, hsa-miR-518e, hsa-miR-519d, hsa-miR-520g, hsa-miR-520h, hsa-miR-564, hsa-miR-566, hsa-miR-618 и/или hsa-miR-99a с заметно более высоким уровнем, чем натуральные клетки-киллеры периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения популяция PINK клеток экспрессирует заметно более высокое количество гранзима В, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров периферической крови.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения предлагаемые в настоящем изобретении PINK клетки размножают в питательной среде. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения PINK клетки выращивают в питательной среде, в частности, размножают в питательной среде в течение, по крайней мере или не более чем, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения PINK клетки размножают в питательной среде в течение приблизительно 21 дня.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, предлагается выделенная популяция клеток, в частности, клеток плаценты, включающих PINK клетки. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения выделенная популяция клеток представляет совокупность ядросодержащих клеток из плацентарного перфузата, в частности, общее количество клеток плацентарного перфузата, включающих аутологические выделенные PINK клетки. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения популяция клеток представляет собой выделенную популяцию клеток, полученную выделением клеток из плацентарного перфузата с помощью CD56-микрошариков. В различных конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения указанная популяция включает, по меньшей мере, приблизительно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или, по меньшей мере, приблизительно 99% PINK клеток.
Поскольку послеродовая плацента включает ткани и клетки плода и клетки матери, то в зависимости от способа сбора плацентарный перфузат может включать лишь клетки плода или подавляющее большинство клеток плода (в частности, больше, чем приблизительно 90%, 95%, 98% или 99%) или может включать смесь клеток плода и матери (в частности, клетки плода составляют меньше, чем приблизительно 90%, 80%, 70%, 60% или 50% от общего количества ядросодержащих клеток перфузата). В одном варианте осуществления настоящего изобретения PINK клетки выделяют лишь из клеток плаценты плода, в частности, клеток, полученных перфузией плаценты по методу замкнутой цепи (см. выше), при этом перфузия дает перфузат, включающий подавляющее большинство клеток плаценты плода или состоящий лишь из клеток плаценты плода. В другом варианте осуществления настоящего изобретения PINK клетки выделяют из клеток плода и матери, в частности, клеток, полученных перфузией по методу поддона (см. выше), при этом перфузия дает перфузат, включающий смесь клеток плаценты плода и матери. Таким образом, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается популяция выделенных из плаценты вспомогательных натуральных клеток-киллеров, подавляющее большинство которых имеет фенотип плода. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения предлагается популяция выделенных из плаценты вспомогательных натуральных клеток-киллеров, которая включает натуральные клетки-киллеры, имеющие фенотип плода, и натуральные клетки-киллеры, имеющие фенотип матери.
В настоящем изобретении предлагаются также популяции выделенных из плаценты вспомогательных натуральных клеток-киллеров, которые включают натуральные клетки-киллеры из отличного от плаценты источника. Например, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается популяция PINK клеток, которая также включает натуральные клетки-киллеры из пуповинной крови, периферической крови, костного мозга, или из комбинации двух или большего количества указанных источников. Популяции натуральных клеток-киллеров, включающие PINK клетки и натуральные клетки-киллеры из отличного от плаценты источника, могут содержать клетки, например, в соотношении приблизительно 1:10, 2:9, 3:8, 4:7, 5:6, 6:5, 7:4, 8:3, 9:2, 10:1, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 100:1, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95, 100:1, 95:1, 90:1, 85:1, 80:1, 75:1, 70:1, 65:1, 60:1, 55:1, 50:1, 45:1, 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1: 15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45, 1:50, 1:55, 1:60, 1:65, 1:70, 1:75, 1:80, 1:85, 1:90, 1:95 или приблизительно 1:100, или т.п.
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются комбинации пуповинной крови и выделенных PINK клеток. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения пуповинная кровь комбинируется с PINK клетками в количестве приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или 5×10 или больше PINK клеток на миллилитр пуповинной крови.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
В настоящем изобретении предлагаются также способы выделения PINK клеток. В одном варианте осуществления настоящего изобретения PINK клетки собирают путем получения плацентарного перфузата, контактирования плацентарного перфузата с композицией, которая специфично связывает клетки CD56, в частности, с антителом против CD56, с последующим выделением клеток CD56, которое основано на указанном связывании, при этом получают популяцию клеток CD56. Популяция клеток CD56 представляет собой выделенную популяцию натуральных клеток-киллеров. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки CD56 контактируют с композицией, которая специфично связывается с клетками CD16, в частности, с антителом против CD16, и клетками CD16 из популяции клеток CD56. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетки CD3 также исключаются из популяции клеток CD56.
+
-
+
-
В одном варианте осуществления настоящего изобретения PINK клетки получают из плацентарного перфузата следующими образом. Плаценту человека после родов освобождают от крови и перфузируют, в частности, используя приблизительно 200-800 мл раствора для перфузии, лишь через сосудистую сеть плаценты. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения дают пуповинной крови стечь и промывают сосудистую сеть плаценты, в частности, с помощью раствора для перфузии, для удаления любых остаточных эритроцитов. Перфузат собирают и подвергают обработке, с целью удаления любых остаточных эритроцитов. Натуральные клетки-киллеры из общего количества ядросодержащих клеток перфузата можно выделить, основываясь на экспрессии CD56 и CD16. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения выделение PINK клеток включает выделение с использованием антитела против CD56, при этом выделенными клетками являются CD56. В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделение PINK клеток включает выделение с использованием антитела против CD16, при этом выделенными клетками являются CD16. В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделение PINK клеток включает выделение с использованием антитела против CD56 и исключение множества клеток, отличных от PINK клеток, с использованием антитела против CD16, при этом выделенные клетки включают клетки CD56, CD16.
Клетки можно выделить любым способом, известным из области техники, в частности методом флуоресцентно-активированного клеточного сортинга (FACS) или, предпочтительно, методом магнитного клеточного сортинга с использованием микрошариков, связанных со специфическими антителами. Магнитное разделение клеток можно провести в автоматическом режиме, используя, например, сепаратор AUTOMACS™ Separator (Miltenyi).
+
-
+
-
-
+
+
-
-
-
+
+
+
-
В соответствии с другим аспектом, в настоящем изобретении предлагается способ выделения натуральных клеток-киллеров плаценты, который включает получение множества клеток плаценты и отделение натуральных клеток-киллеров от указанного множества клеток плаценты. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетками плаценты являются или клетки плаценты представляют собой клетки плацентарного перфузата, в частности, совокупность ядросодержащих клеток из плацентарного перфузата. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения клетками плаценты являются или клетки плаценты представляют собой клетки плаценты, полученные механической и/или ферментативной деструкцией ткани плаценты. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанное выделение проводят с использованием одного или нескольких антител. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные одно антитело или несколько антител представляют собой одно или несколько антител против CD3, CD16 или CD56. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное выделение включает отделение клеток CD56 от клеток CD56 в указанном множестве клеток плаценты. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное выделение включает отделение клеток плаценты CD56, CD16, например, натуральных клеток-киллеров плаценты, в частности, PINK клеток, от клеток плаценты, которыми являются CD56 или CD16. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное выделение включает отделение клеток плаценты CD56, CD16, CD3 от клеток плаценты, которыми являются CD56, CD16 или CD3. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ выделения натуральных клеток-киллеров плаценты приводит к популяции клеток плаценты, которая, по крайней мере, на 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или, по крайней мере, на 99% состоит из натуральных клеток-киллеров CD56, CD16.
5.4. Натуральные клетки-киллеры плаценты из совместимых друг с другом перфузата и пуповинной крови
Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются натуральные клетки-киллеры, которые выделяют или которые могут быть выделены из комбинации совместимых образцов плацентарного перфузата и пуповинной крови, которые в настоящем описании обозначают как комбинированные натуральные клетки-киллеры. Термин “совместимые образцы” в данном описании означает, что натуральные клетки-киллеры получают из клеток плацентарного перфузата, клеток пуповинной крови, при этом клетки пуповинной крови получают из пуповинной крови плаценты, из которой получают плацентарный перфузат, т.е. из клеток плацентарного перфузата и клеток пуповинной крови, и, таким образом, натуральные клетки-киллеры из каждого источника принадлежат одному и тому же индивиду.
+
-
+
-
+
+
+
-
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры плаценты представляют собой лишь натуральные клетки-киллеры или практически представляют собой лишь натуральные клетки-киллеры, которые являются клетками CD56 и CD16. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры плаценты представляют собой натуральные клетки-киллеры, которые являются клетками CD56 и CD16, и натуральные клетки-киллеры, которые являются клетками CD56 и CD16. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры плаценты, по крайней мере, на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5% представляют собой натуральные клетки-киллеры CD56CD16 (PINK клетки).
-
+
-
-
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
В одном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры плаценты не выращивают в питательной среде. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56CD16, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56CD16, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD56KIR2DL2/L3, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp46, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp30, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD562B4, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56CD94, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови.
-
+
+
-
+
+
-
+
+
В другом варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры плаценты выращивают в питательной среде, например, в течение 21 дня. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое меньшее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56KIR2DL2/L3, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры плаценты не выращивают в питательной среде. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp44, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры включают детектируемое большее число натуральных клеток-киллеров CD3CD56NKp30, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения комбинированные натуральные клетки-киллеры экспрессируют детектируемое большее количество гранзима В, чем эквивалентное число натуральных клеток-киллеров из периферической крови.
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются комбинации пуповинной крови и комбинированных натуральных клеток-киллеров. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения пуповинную кровь объединяют с комбинированными натуральными клетками-киллерами в количестве приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 комбинированных натуральных клеток-киллеров на миллилитр пуповинной крови.
5.5. Комбинации перфузат/клетки
Помимо плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата, комбинированных натуральных клеток-киллеров, в частности, вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты, в настоящем изобретении предлагаются композиции, включающие перфузат или клетки, для использования с целью подавления пролиферации опухолевой клетки или множества опухолевых клеток.
5.5.1. Комбинации плацентарного перфузата, клеток перфузата и выделенных из плаценты вспомогательных натуральных клеток-киллеров
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
В настоящем изобретении предлагаются также композиции, включающие комбинации плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата, вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты и/или комбинированных натуральных клеток-киллеров, приведенных выше в разделах 5.1, 5.3 или 5.4. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предлагается, например, некоторый объем плацентарного перфузата, дополненный множеством клеток плацентарного перфузата и/или множеством натуральных клеток-киллеров плаценты, в частности, вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты, например, полученных из клеток плацентарного перфузата или ткани плаценты, подвергнутой механической и/или ферментативной деструкции. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, например, каждый миллилитр плацентарного перфузата дополняют, добавив приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клеток плацентарного перфузата, вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты и/или комбинированных натуральных клеток-киллеров. В другом варианте осуществления настоящего изобретения множество клеток плацентарного перфузата дополняют плацентарным перфузатом, вспомогательными натуральными клетками-киллерами плаценты и/или комбинированными натуральными клетками-киллерами. В другом варианте осуществления настоящего изобретения множество вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты дополняют плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата и/или комбинированными натуральными клетками-киллерами. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, когда для дополнения используют перфузат, объем перфузата составляет приблизительно, приблизительно больше, чем или приблизительно меньше, чем 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% от общего количества клеток (в растворе) плюс перфузат. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения, когда клетки плацентарного перфузата объединяют с множеством PINK клеток и/или комбинированных натуральных клеток-киллеров, клетки плацентарного перфузата обычно составляют приблизительно, приблизительно больше, чем или приблизительно меньше, чем 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% от общего числа клеток. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения, когда PINK клетки объединяют с множеством клеток плацентарного перфузата и/или комбинированных натуральных клеток-киллеров, PINK клетки обычно составляют приблизительно, приблизительно больше, чем или приблизительно меньше, чем 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% от общего числа клеток. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения, когда комбинированные натуральные клетки-киллеры объединяют с PINK клетками и/или клетками плацентарного перфузата, комбинированные натуральные клетки-киллеры обычно составляют приблизительно, приблизительно больше, чем или приблизительно меньше, чем 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% от общего числа клеток. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения, когда PINK клетки, комбинированные натуральные клетки-киллеры или клетки плацентарного перфузата используют для дополнения плацентарного перфузата, объем раствора (в частности, физиологического раствора, культуральной среды и т.п.), в котором суспендируют клетки, составляет приблизительно, приблизительно больше, чем или приблизительно меньше, чем 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% или 1% от общего объема перфузата плюс клетки, где PINK клетки перед дополнением суспендируют приблизительно в количестве 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клеток на миллилитр.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения любые вышеуказанные комбинации, в свою очередь, объединяют с пуповинной кровью или ядросодержащими клетками из пуповинной крови.
Кроме того, в настоящем изобретении предлагается объединенный плацентарный перфузат, который получают из двух или большего количества источников, в частности, из двух или большего количества плацент, и объединяют, т.е. получают общий фонд. Подобный объединенный перфузат может включать приблизительно равные объемы перфузата от каждого источника или может включать различные объемы от каждого источника. Относительные объемы от каждого источника можно выбрать случайно или же выбрать на основании, например, концентрации или количества одного или нескольких клеточных факторов, в частности, цитокинов, факторов роста, гормонов и т.п.; количества клеток плаценты в перфузате от каждого источника; или других характеристик перфузата от каждого источника. Аналогичным образом в общий фонд могут быть объединены перфузаты нескольких перфузий одной и той же плаценты.
+
+
Аналогично, в настоящем изобретении предлагаются клетки плацентарного перфузата и выделенные из плаценты вспомогательные натуральные клетки-киллеры, которые получают из двух или большего количества источников, в частности, из двух или нескольких плацент, и объединяют в общий фонд. Подобные объединенные клетки могут включать приблизительно равное число клеток от двух или большего количества источников или же различное число клеток от двух или большего количества объединенных в общий фонд источников. Относительное число клеток от каждого источника можно выбрать на основании, например, числа одного или нескольких специфических типов клеток в клетках, из которых предполагается сформировать общий фонд, например, числа клеток CD34, числа клеток CD56 и т.д.
Объединенные фонды могут включать, в частности, плацентарный перфузат, дополненный клетками плацентарного перфузата; плацентарный перфузат, дополненный выделенными из плаценты вспомогательными натуральными клетками-киллерами (PINK); плацентарный перфузат, дополненный как клетками плацентарного перфузата, так и PINK клетками; клетки плацентарного перфузата, дополненные плацентарным перфузатом; клетки плацентарного перфузата, дополненные PINK клетками; клетки плацентарного перфузата, дополненные как плацентарным перфузатом, так и PINK клетками; PINK клетки, дополненные плацентарным перфузатом; PINK клетки, дополненные клетками плацентарного перфузата; или PINK клетки, дополненные как клетками плацентарного перфузата, так и плацентарным перфузатом.
Кроме того, в настоящем изобретении предлагается плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата и вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты, а также их объединенные фонды или их комбинации, которые проанализированы, с целью определения степени или количества угнетения опухоли (т.е. действенности), которое можно ожидать, в частности, от заданного количества плацентарного перфузата или PINK клеток, или заданного объема перфузата. Например, аликвоту или образец с определенным количеством клеток вводят в контакт с известным количеством опухолевых клеток в условиях, в которых в ином случае опухолевые клетки могли пролиферировать, и скорость пролиферации опухолевых клеток в присутствии плацентарного перфузата, клеток перфузата, натуральных клеток-киллеров плаценты или их комбинаций в определенные периоды времени (в частности, по прошествии 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 недель или дольше) сравнивают с пролиферацией эквивалентного количества опухолевых клеток в отсутствие перфузата, клеток перфузата, натуральных клеток-киллеров плаценты или их комбинаций. Действенность плацентарного перфузата, клеток перфузата, и/или PINK клеток, или их комбинаций, или их объединенных фондов можно выразить, например, в виде количества клеток или объема раствора, требуемого для угнетения роста опухолевой клетки, в частности, приблизительно, на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% и т.п.
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата и PINK клетки предлагаются в качестве единиц фармацевтического качества, которые могут назначаться людям. Подобные единицы могут быть предложены в виде конкретного объема, например, 100 мл, 150 мл, 200 мл, 250 мл, 300 мл, 350 мл, 400 мл, 450 мл, 500 мл или т.п. Подобные единицы могут быть предложены в таком виде, чтобы они содержали конкретное число, например, клеток плацентарного перфузата, вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты или и тех и других, в частности, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клеток на миллилитр или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше клеток на единицу. Подобные единицы могут быть предложены в таком виде, чтобы они содержали конкретное количество одного из двух, или одного из трех компонентов, включающих плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата и/или PINK клеток.
В вышеуказанной комбинации плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата и/или PINK клеток любой из указанных, любые два из указанных или все три из указанных плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата и/или PINK клеток могут быть аутогенными по отношению к реципиенту (т.е. получены от самого реципиента) или могут быть гомологическими по отношению к реципиенту (т.е. получены, по крайней мере, от одного другого индивида, отличного от реципиента).
+
+
4
4
5
5
6
6
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
+
+
+
+
Любая из вышеуказанных комбинаций или любой из вышеуказанных фондов PINK клеток, клеток плацентарного перфузата и/или плацентарного перфузата могут включать натуральные клетки-киллеры CD56CD16, например, из плацентарного перфузата, периферической крови, пуповинной крови, костного мозга и т.п. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения комбинации включают приблизительно, по крайней мере приблизительно или не более чем приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше подобных натуральных клеток-киллеров на миллилитр, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше клеток на единицу. Натуральные клетки-киллеры CD56CD16 могут быть использованы в том виде, в каком они выделены из природного источника, или же могут быть выращены перед включением в одну из вышеуказанных комбинаций или объединенных фондов. Клетки CD56CD16 могут быть аутогенными по отношению к реципиенту (т.е. получены от того же индивида, что и плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата и/или PINK клетки; или же получены от самого индивида) или могут быть гомологическими по отношению к реципиенту (т.е. получены от индивида, отличного от источника плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата и/или PINK клеток; или от индивида, который не является реципиентом).
Предпочтительно, каждую единицу маркируют с указанием конкретного объема, количества клеток, типа клеток, а также того, были ли указанные единицы обогащены конкретными типами клеток, и/или действенности данного числа клеток в единице, или с указанием того, какое число миллилитров единицы вызывает подавление пролиферации конкретного типа или типов опухолевых клеток, которое можно измерить.
+
-
+
+
+
+
+
-
В настоящем изобретении предлагаются также композиции, включающие вспомогательные натуральные клетки-киллеры, самостоятельно или в комбинации с клетками плацентарного перфузата и/или с плацентарным перфузатом. Так, в соответствии с другим аспектом, в настоящем изобретении предлагаются композиции, включающие выделенные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16, при этом указанные натуральные клетки-киллеры выделены из плацентарного перфузата и при этом указанные натуральные клетки-киллеры составляют, по меньшей мере, 50% клеток в композиции. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры составляют, по меньшей мере, 80% клеток в композиции. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная композиция включает выделенные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16 получены от другого индивида, нежели указанные натуральные клетки-киллеры CD56, CD16. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные натуральные клетки-киллеры получены от одного и того же индивида. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные выделенные натуральные клетки-киллеры представляют собой натуральные клетки-киллеры, полученные, по крайней мере, от двух различных индивидов. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает выделенный плацентарный перфузат. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный плацентарный перфузат получен от того же самого индивида, что и указанные натуральные клетки-киллеры. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный плацентарный перфузат представляет собой плацентарный перфузат, полученный от другого индивида, нежели указанные натуральные клетки-киллеры. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает клетки плацентарного перфузата. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки плацентарного перфузата получены от того же самого индивида, что и указанные натуральные клетки-киллеры. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки плацентарного перфузата получены от другого индивида, нежели указанные натуральные клетки-киллеры. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно включает выделенный плацентарный перфузат и выделенные клетки плацентарного перфузата, при этом указанный выделенный плацентарный перфузат и указанные выделенные клетки плацентарного перфузата получены от разных индивидов. В другом более конкретном варианте воплощения любого из вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения, включающих плацентарный перфузат, указанный плацентарный перфузат представляет собой плацентарный перфузат, полученный, по меньшей мере, от двух индивидов. В другом более конкретном варианте воплощения любого из вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения, включающих клетки плацентарного перфузата, указанные выделенные клетки плацентарного перфузата получены, по меньшей мере, от двух индивидов.
5.2.2. Композиции, включающие прилипающие стволовые клетки плаценты
В других вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат, множество клеток плацентарного перфузата и/или множество PINK клеток, или комбинации или объединенные фонды любых из указанных веществ, дополняют прилипающими стволовыми клетками плаценты. Подобные стволовые клетки описаны, например, в выданных на имя Hariri патентах США №№ 7045148 и 7255879. Прилипающие стволовые клетки плаценты не являются трофобластами.
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
Плацентарный перфузат, множество клеток плацентарного перфузата и/или множество PINK клеток, или комбинации или объединенные фонды любых из указанных веществ могут быть дополнены, например, с помощью 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клеток на миллилитр или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше прилипающих клеток плаценты. Прилипающие стволовые клетки плаценты в комбинациях могут быть, например, прилипающими стволовыми клетками плаценты, которые выращивают в питательной среде, например, для 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 или 40 удвоений популяций или больше.
Прилипающие стволовые клетки плаценты, когда их культивируют в первичных культурах или в клеточной культуре, прилипают к субстрату тканевой культуры, в частности, к поверхности контейнера с тканевой культурой (например, к пластику с тканевой культурой). Прилипающие стволовые клетки плаценты в культуре обычно принимают фибробластоидную, звездообразную форму, при этом от главной клетки отходит ряд цитоплазменных придатков. Тем не менее, прилипающие стволовые клетки плаценты морфологически различимы от фибробластов, культивированных в тех же условиях, поскольку стволовые клетки плаценты дают большее количество подобных придатков, чем фибробласты. Морфологически стволовые клетки плаценты различимы также от кроветворных стволовых клеток, которые обычно принимают более сглаженную, или булыжникообразную, морфологию в культуре.
Прилипающие стволовые клетки плаценты и популяции стволовых клеток плаценты, пригодные для использования в композициях и способах по настоящему изобретению, экспрессируют множество маркеров, которые могут быть использованы для идентификации и/или выделения стволовых клеток или популяций клеток, которые включают стволовые клетки. Прилипающие стволовые клетки плаценты и популяции прилипающих стволовых клеток, пригодные для использования в композициях и способах по настоящему изобретению, включают стволовые клетки и популяции, содержащие стволовые клетки, которые получают непосредственно из плаценты или из любой ее части (например, из амниотической оболочки, хориона, амнион-хориальной пластинки, котиледонов плаценты, пуповинного канатика и т.п.). В одном варианте осуществления настоящего изобретения популяция прилипающих стволовых клеток плаценты является популяцией (т.е. представляет собой две или больше) прилипающих стволовых клеток плаценты в культуре, например, популяцию в контейнере, в частности, в пакете.
Прилипающие стволовые клетки плаценты обычно экспрессируют маркеры CD73, CD105, CD200, HLA-G и/или OCT-4 и не экспрессируют CD34, CD38 или CD45. Прилипающие стволовые клетки плаценты могут также экспрессировать HLA-ABC (MHC-1) и HLA-DR. Указанные маркеры могут использоваться для идентификации прилипающих стволовых клеток плаценты и для отделения стволовых клеток плаценты от других типов стволовых клеток. Поскольку стволовые клетки плаценты могут экспрессировать CD73 и CD105, то они могут обладать свойствами, подобными свойствам стволовых клеток мезенхимы. Однако поскольку прилипающие стволовые клетки плаценты могут экспрессировать CD200 и HLA-G, специфичный для плода маркер, то их можно отделить от стволовых клеток мезенхимы, в частности, полученных из костного мозга стволовых клеток мезенхимы, которые не экспрессируют ни CD200, ни HLA-G. Аналогично, отсутствие экспрессии CD34, CD38 и/или CD45 идентифицирует прилипающие стволовые клетки плаценты как не кроветворные стволовые клетки.
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
В одном варианте осуществления настоящего изобретения прилипающими стволовыми клетками плаценты являются клетки CD200, HLA-G, при этом стволовые клетки заметно подавляют пролиферацию раковых клеток или рост опухоли. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD73 и CD105. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD34, CD38 или CD45. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD34, CD38 и CD45, CD73 и CD105. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные прилипающие стволовые клетки продуцируют одно или несколько эмбриоидоподобных телец, если их выращивают в питательной среде в условиях, которые позволяют формироваться эмбриоидоподобным тельцам.
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
В другом варианте осуществления настоящего изобретения прилипающими стволовыми клетками плаценты являются клетки CD73, CD105, CD200, при этом указанные стволовые клетки заметно подавляют пролиферацию раковых клеток или рост опухоли. В конкретном варианте указанных популяций указанными прилипающими стволовыми клетками являются HLA-G. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются CD34 CD38 или CD45. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются CD34, CD38 и CD45. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются CD34, CD38, CD45 и HLA-G. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные прилипающие стволовые клетки плаценты продуцируют одно или несколько эмбриоидоподобных телец, если их выращивают в питательной среде в условиях, которые позволяют формироваться эмбриоидоподобным тельцам.
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
В другом варианте осуществления настоящего изобретения прилипающими стволовыми клетками плаценты являются CD200, OCT-4, при этом указанные стволовые клетки заметно подавляют пролиферацию раковых клеток или рост опухоли. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются CD73 и CD105. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются HLA-G. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются CD34, CD38 и CD45. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются CD34, CD38, CD45, CD73, CD105 и HLA-G. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения прилипающие стволовые клетки продуцируют одно или несколько эмбриоидоподобных телец, если их выращивают в питательной среде в условиях, которые позволяют формироваться эмбриоидоподобным тельцам.
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
+
+
В другом варианте осуществления настоящего изобретения прилипающими стволовыми клетками плаценты являются CD73, CD105 и HLA-G, при этом указанные прилипающие стволовые клетки заметно подавляют пролиферацию раковых клеток или рост опухоли. В конкретном варианте воплощения вышеуказанного множества клеток указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD34, CD38 или CD45. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD34, CD38 и CD45. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также OCT-4. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD200. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD34, CD38, CD45, OCT-4 и CD200.
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
В другом варианте осуществления настоящего изобретения прилипающими стволовыми клетками плаценты являются стволовые клетки CD73, CD105, при этом указанные стволовые клетки продуцируют одно или несколько эмбриоидоподобных телец в условиях, которые позволяют формироваться эмбриоидоподобным тельцам, и при этом указанные прилипающие стволовые клетки заметно подавляют пролиферацию раковых клеток или рост опухолей. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD34, CD38 или CD45. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также CD34, CD38 и CD45. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также OCT-4. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными прилипающими стволовыми клетками являются также OCT-4, CD34, CD38 и CD45.
+
В другом варианте осуществления настоящего изобретения прилипающими стволовыми клетками плаценты являются стволовые клетки OCT-4, при этом указанные стволовые клетки плаценты продуцируют одно или несколько эмбриоидоподобных телец, когда их выращивают в питательной среде в условиях, которые позволяют образовываться эмбриоидоподобным тельцам, и при этом указанные стволовые клетки идентифицированы как клетки, заметно подавляющие пролиферацию раковых клеток или рост опухолей.
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
-
-
-
В различных вариантах осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, 10%, по меньшей мере, 20%, по меньшей мере, 30%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% указанных выделенных стволовых клеток плаценты представляют собой стволовые клетки OCT4. В конкретном варианте воплощения вышеуказанных популяций указанными стволовыми клетками являются CD73 и CD105. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными стволовыми клетками являются CD34, CD38 или CD45. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными стволовыми клетками являются CD200. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанными стволовыми клетками являются CD73, CD105, CD200, CD34, CD38 и CD45. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанную популяцию размножают, например, пересевают культуры клетки на среде, по крайней мере, один раз, по крайней мере, три раза, по крайней мере, пять раз, по крайней мере, 10 раз, по крайней мере, 15 раз или, по крайней мере, 20 раз.
В более конкретном воплощении любого из вышеприведенных вариантов осуществления настоящего изобретения прилипающие стволовые клетки плаценты экспрессируют ABC-p (специфический плацентарный транспортный белок ABC; см., в частности, Allikmets et al, Cancer Res. 58(23):5337-9 (1998)).
+
+
+
+
+
+
-
-
В другом варианте осуществления настоящего изобретения прилипающими стволовыми клетками плаценты являются CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD200, CD34 и CD133. В другом варианте осуществления настоящего изобретения прилипающие стволовые клетки плаценты, стволовые клетки плаценты нерегулируемо секретируют IL-6, IL-8 и моноцитарный хемоатрактантный белок (MCP-1).
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
Каждая из вышеуказанных стволовых клеток плаценты может включать стволовые клетки плаценты, полученные и выделенные непосредственно из плаценты млекопитающего, или стволовые клетки плаценты, которые выращивают в питательной среде и которые пересевают на среде, по меньшей мере, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 или более раз, а также их комбинации. Вышеуказанные множества прилипающих стволовых клеток плаценты, угнетающие опухолевые клетки, могут включать приблизительно, по крайней мере или не более чем 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше прилипающих стволовых клеток плаценты.
5.5.3. Композиции, включающие среду, кондиционированную стволовыми клетками плаценты
В настоящем изобретении предлагается также применение угнетающих опухоли композиций, которые содержат PINK клетки, плацентарный перфузат и/или плацентарный перфузат и дополнительно кондиционированную среду. Прилипающие стволовые клетки плаценты, клетки плацентарного перфузата и/или вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты могут использоваться для получения кондиционированной среды, которая способна угнетать опухолевые клетки, т.е. среды, которая включает одну или несколько биомолекул, секретируемых или экскретируемых стволовыми клетками, которые оказывают детектируемое супрессивное действие на опухолевые клетки, во множестве иммунных клеток одного или различных типов. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения кондиционированная среда представляет собой среду, в которой клетки плаценты (в частности, стволовые клетки, клетки плацентарного перфузата, PINK клетки) выращены, по крайней мере, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или больше дней. В других вариантах осуществления настоящего изобретения кондиционированная среда представляет собой среду, в которой клетки плаценты выращены, по крайней мере, до степени слияния 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или вплоть до степени слияния 100%. Подобную кондиционированную среду можно использовать для поддержания культуры отдельной популяции клеток плаценты или клеток другого вида. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагаемая в настоящем изобретении кондиционированная среда представляет собой среду, в которой выращены прилипающие стволовые клетки плаценты и клетки, отличные от стволовых клеток плаценты.
Подобную кондиционированную среду можно объединять с любыми из комбинаций или с любой комбинацией плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата и/или вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты с образованием композиции, угнетающей опухолевые клетки. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения композиция включает меньше, чем половину кондиционированной среды по объему, в частности, приблизительно или меньше, чем приблизительно 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% по объему.
+
Так, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая культуральную среду из культуры стволовых клеток плаценты, где указанные стволовые клетки (a) прилипают к субстрату; (b) экспрессируют CD200 и HLA-G, или экспрессируют CD73, CD105 и CD200, или экспрессируют CD200 и OCT-4, или экспрессируют CD73, CD105 и HLA-G, или экспрессируют CD73 и CD105 и способствуют формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции клеток плаценты, которые включают стволовые клетки плаценты, когда указанную популяцию выращивают в питательной среде в условиях, которые позволяют образовываться эмбриоидоподобным тельцам, или экспрессируют OCT-4 и способствуют формированию одного или нескольких эмбриоидоподобных телец в популяции клеток плаценты, которые включают стволовые клетки плаценты, когда указанную популяцию выращивают в питательной среде в условиях, которые позволяют образовываться эмбриоидоподобным тельцам; и (c) заметно подавляют рост или пролиферацию опухолевой клетки или популяции опухолевых клеток. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция также содержит множество указанных стволовых клеток плаценты. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция содержит множество клеток, отличных от стволовых клеток плаценты. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки, отличные от стволовых клеток плаценты, включают клетки CD34, в частности, клетки-предшественники кроветворных клеток, такие как клетки-предшественники кроветворных клеток периферической крови, или клетки-предшественники кроветворных клеток плацентарной крови. Клетки, отличные от стволовых клеток плаценты, включают также другие стволовые клетки, такие как стволовые клетки мезенхимы, в частности, выделенные из костного мозга стволовые клетки мезенхимы. Клетки, отличные от стволовых клеток плаценты, могут также представлять собой один или несколько типов зрелых клеток или клеточных линий. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения композиция включает антипролиферативное средство, в частности, антитело против MIP-1α или против MIP-1β.
5
6
7
8
5
5
5
6
6
6
7
7
7
8
8
8
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения культуральная среда, кондиционированная клетками плаценты, или супернатант получают из множества стволовых клеток плаценты, которые выращивают в питательной среде совместно с множеством опухолевых клеток в соотношении приблизительно 1:1, приблизительно 2:1, приблизительно 3:1, приблизительно 4:1 или приблизительно 5:1 стволовых клеток плаценты к опухолевым клеткам. Например, кондиционированную культуральную среду или супернатант можно получить из культуры, содержащей приблизительно 1×10 стволовых клеток плаценты, приблизительно 1×10 стволовых клеток плаценты, приблизительно 1×10 стволовых клеток плаценты или приблизительно 1×10 стволовых клеток плаценты или больше. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения кондиционированную культуральную среду или супернатант получают из культуры, содержащей от приблизительно 1×10 до приблизительно 5×10 стволовых клеток плаценты и от приблизительно 1×10 опухолевых клеток; от приблизительно 1×10 до приблизительно 5×10 стволовых клеток плаценты и приблизительно 1×10 опухолевых клеток; от приблизительно 1×10 до приблизительно 5×10 стволовых клеток плаценты и приблизительно 1×10 опухолевых клеток; или от приблизительно 1×10 до приблизительно 5×10 стволовых клеток плаценты и приблизительно 1×10 опухолевых клеток.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения кондиционированная среда, пригодная для введения индивиду массой 70 кг, представляет собой надосадочную жидкость, кондиционированную приблизительно 70 миллионами стволовых клеток плаценты, приблизительно в 200 мл культуральной среды.
Кондиционированную среду можно концентрировать, с целью получить пригодный для введения фармацевтический продукт. Например, кондиционированную среду можно концентрировать приблизительно на 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% или более путем удаления воды, в частности, испарением, лиофилизацией и т.п. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, например, 200 мл кондиционированной среды от приблизительно 70 миллионов стволовых клеток плаценты можно концентрировать до объема приблизительно 180 мл, 160 мл, 140 мл, 120 мл, 100 мл, 80 мл, 60 мл, 40 мл, 20 мл или меньше. Кондиционированную среду можно практически высушить, например, превратить в порошок, в частности, путем испарения, лиофилизации и т.п.
5.6. Сохранение перфузата и клеток плаценты
Плацентарный перфузат или клетки плаценты, в частности, клетки перфузата, комбинированные натуральные клетки-киллеры и PINK клетки, можно сохранить, т.е. поместить в условия, которые позволяют осуществить их длительное хранение, или в условия, в которых ингибируется смерть клеток, в частности, за счет апоптоза или некроза.
Плацентарный перфузат можно получить прохождением композиции для сбора клеток плаценты, по крайней мере, через часть плаценты, в частности, через сосудистую сеть плаценты. Композиция для сбора клеток плаценты включает одно или несколько соединений, которые оказывают консервирующее действие на содержащиеся в перфузате клетки. Подобная композиция для сбора клеток плаценты описана выше в разделе 5.1, в частности, она может представлять собой композицию, которая включает ингибитор апоптоза, ингибитор некроза и/или перфторуглерод, способный переносить кислород, как описано в родственной заявке на патент США № 11/648812, озаглавленной “Улучшенная композиция для сбора и сохранения стволовых клеток плаценты и способ применения указанной композиции”, которая подана 28 декабря 2006. В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция для сбора клеток плаценты, прошедшая через плаценту или ткань плаценты, представляет собой перфузат, пригодный для использования в способах, описанных ниже в разделе 5.4.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат и/или клетки плаценты собирают из послеродовой плаценты млекопитающего, в частности, человека, путем контактирования клеток с композицией для сбора клеток плаценты, которая включает ингибитор апоптоза и перфторуглерод, способный переносить кислород, при этом указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение времени, достаточных для того, чтобы снизить или предотвратить апоптоз в популяции стволовых клеток, по сравнению с популяцией стволовых клеток, которая не контактировала с ингибитором апоптоза. Например, плаценту можно перфузировать композицией для сбора клеток плаценты и выделить из нее клетки плаценты, например, совокупность ядросодержащих клеток плаценты. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитором апоптоза является ингибитор каспазы. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения ингибитором апоптоза является JNK ингибитор. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный JNK ингибитор не регулирует дифференцировку или пролиферацию указанных стволовых клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция для сбора клеток плаценты содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод, способный переносить кислород, в разных фазах. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция для сбора клеток плаценты содержит указанный ингибитор апоптоза и указанный перфторуглерод, способный переносить кислород, в эмульсии. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция для сбора клеток плаценты дополнительно включает эмульгатор, в частности, лецитин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения во время контактирования с клетками плаценты температура указанного ингибитора апоптоза и указанного перфторуглерода составляет от приблизительно 0°С до приблизительно 25°С. В другом более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения во время контактирования с клетками плаценты температура указанного ингибитора апоптоза и указанного перфторуглерода составляет от приблизительно 2°С до приблизительно 10°С или от приблизительно 2°С до приблизительно 5°С. В другом более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование проводят в процессе транспортировки указанной популяции стволовых клеток. В другом более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное контактирование проводят в процессе замораживания и оттаивания указанной популяции стволовых клеток.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат и/или клетки плацентарного перфузата можно собирать и сохранять путем контактирования перфузата и/или клеток с ингибитором апоптоза и органосохраняющим соединением, при этом указанный ингибитор апоптоза присутствует в количестве и в течение времени, достаточных для того, чтобы снизить или предотвратить апоптоз клеток, по сравнению с перфузатом или клетками плаценты, которые не контактировали с ингибитором апоптоза.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения органосохраняющим соединением является раствор UW (описан в патенте США № 4798824; известен также как VIASPAN™; см. также Southard et al., Transplantation 49(2):251-257 (1990) или раствор, описанный в выданном на имя Stern et al. патенте США № 5552267. В другом варианте осуществления настоящего изобретения органосохраняющая композиция представляет собой гидроксиэтилкрахмал, лактобионовую кислоту, раффинозу или их комбинации. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиция для сбора клеток плаценты дополнительно включает перфторуглерод, способный переносить кислород, как в виде двухфазной системы, так и в виде эмульсии.
В другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению плацентарный перфузат или клетки плаценты контактируют с композицией для сбора клеток плаценты, которая в процессе перфузии включает ингибитор апоптоза и перфторуглерод, способный переносить кислород, органосохраняющее соединение или их комбинацию. В другом варианте осуществления настоящего изобретения клетки плаценты контактируют с указанным соединением для сбора стволовых клеток после проведения сбора путем перфузии.
Как правило, в процессе сбора, обогащения и выделения клеток плаценты, предпочтительно, минимизируют или устраняют стресс, вызванный гипоксией, и механический стресс. Поэтому в другом варианте осуществления способа по настоящему изобретению плацентарный перфузат, клетки плаценты или популяцию клеток плаценты при сборе, обогащении или выделении подвергают условиям гипоксии в течение меньше, чем шесть часов в течение указанного срока сохранения, при этом условие гипоксии заключается в том, что концентрация кислорода меньше, чем нормальная концентрация кислорода в крови. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанную популяцию клеток плаценты подвергают указанным условиям гипоксии в течение меньше, чем двух часов в течение указанного срока сохранения. В другом более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанную популяцию клеток плаценты в процессе сбора, обогащения или выделения подвергают указанным условиям гипоксии в течение меньше, чем одного часа, или меньше, чем тридцати минут или не подвергают условиям гипоксии. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанную популяцию клеток плаценты не подвергают касательному напряжению в процессе сбора, обогащения или выделения.
Предлагаемые в настоящем изобретении клетки плаценты можно сохранять в условиях криотемператур, например, в среде для хранения в условиях криотемператур в небольших контейнерах, в частности, ампулах. Пригодная среда для хранения в условиях криотемператур включает, однако этим не ограничиваясь, культуральную среду, которая содержит, в частности, среду для выращивания или среду для замораживания, например, коммерчески доступную среду для замораживания, в частности, C2695, C2639 или C6039 (Sigma). Среда для хранения в условиях криотемператур, предпочтительно, включает ДМСО (диметилсульфоксид) с концентрацией, в частности, приблизительно 10% (об./об.). Среда для хранения в условиях криотемператур может содержать дополнительные агенты, например, метилцеллюлозу и/или гликоль. В процессе сохранения в условиях криотемператур клетки плаценты, предпочтительно, охлаждают со скоростью приблизительно 1°С/мин. Преимущественная криотемпература составляет приблизительно от -80°С до приблизительно -180°С, предпочтительно, приблизительно от -125°С до приблизительно -140°С. Охлажденные до криотемператур клетки плаценты можно перенести в жидкий азот и хранить до оттаивания перед использованием. В некоторых варианта осуществления настоящего изобретения, например, как только ампулы достигли температуры приблизительно -90°С, их переносят в хранилище для сохранения в жидком азоте. Сохраняемые клетки, преимущественно, оттаивают при температуре от приблизительно 25°С до приблизительно 40°С, преимущественно, при температуре приблизительно 37°С.
5.7. Применение плацентарного перфузата, PINK клеток и комбинированных натуральных клеток-киллеров плаценты для угнетения роста опухолевой клетки
В настоящем изобретении предлагаются также способы угнетения роста, в частности, пролиферации, опухолевой клетки с использованием плацентарного перфузата, клеток, выделенных из плацентарного перфузата, выделенных комбинированных натуральных клеток-киллеров или выделенных натуральных клеток-киллеров плаценты, в частности, выделенных из плаценты вспомогательных натуральных клеток-киллеров.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, предлагается способ подавления пролиферации опухолевой клетки или множества опухолевых клеток, который включает контактирование опухолевой клетки или множества опухолевых клеток с плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата, выделенными комбинированными натуральными клетками-киллерами и/или PINK клетками таким образом, что пролиферация опухолевой клетки или множества опухолевых клеток заметно снижается, по сравнению с опухолевой клеткой или множеством опухолевых клеток того же самого типа, которые не контактировали с плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата, выделенными комбинированными натуральными клетками-киллерами и/или PINK клетками.
В настоящем описании “контактирование” в одном варианте осуществления настоящего изобретения охватывает прямой физический, например, клеточно-клеточный, контакт между плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата, натуральными клетками-киллерами плаценты, в частности, вспомогательными натуральными клетками-киллерами плаценты, и/или выделенными комбинированными натуральными клетками-киллерами; и опухолевой клеткой или множеством опухолевых клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения “контактирование” охватывает наличие того же физического окружения, в частности, плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата, натуральные клетки-киллеры плаценты, в частности, вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты и/или выделенные комбинированные натуральные клетки-киллеры помещают в тот же самый контейнер (в частности, в чашку с культурой, многолуночный планшет), что и опухолевую клетку или множество опухолевых клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения “контактирование” плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата, комбинированных натуральных клеток-киллеров или вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты и опухолевой опухоли или множества опухолевых клеток осуществляют, в частности, путем инъекции или вливания плацентарного перфузата или клеток, в частности, клеток плацентарного перфузата, комбинированных натуральных клеток-киллеров или вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты, индивиду, например, человеку, у которого имеется опухолевая клетка или множество опухолевых клеток, например, больному раком.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат используют в любом количестве, которое приводит к обнаруживаемому терапевтическому эффекту для индивида, у которого имеется опухолевая клетка или множество опухолевых клеток, например, для больного раком. В некоторых других вариантах осуществления настоящего изобретения клетки плацентарного перфузата, вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты и/или комбинированные натуральные клетки-киллеры используют в любом количестве, которое приводит к обнаруживаемому терапевтическому эффекту для индивида, у которого имеется опухолевая клетка или множество опухолевых клеток. Так, в другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ подавления пролиферации опухолевой клетки или множества опухолевых клеток, который включает контактирование опухолевой клетки или множества опухолевых клеток с плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата и/или выделенными из плаценты вспомогательными натуральными клетками-киллерами, и/или множеством PINK клеток внутри индивида таким образом, что указанное контактирование приносит терапевтический эффект указанному индивиду, что можно обнаружить или подтвердить.
В настоящем описании “терапевтический эффект” включает, однако этим не ограничиваясь, уменьшение размера опухоли; уменьшение или прекращение развития опухоли; уменьшение числа раковых клеток в образце ткани, в частности, в образце крови, на единицу объема; клиническое улучшение любого симптома конкретного типа рака, который имеется у индивида; уменьшение или прекращение ухудшения любого симптома конкретного типа рака, который имеется у индивида, и т.д. Контактирование плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата и/или PINK клеток, которое приводит к одному или нескольким подобным терапевтическим эффектам, считается терапевтически эффективным.
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетки плацентарного перфузата, в частности, ядросодержащие клетки из плацентарного перфузата, комбинированные натуральные клетки-киллеры и/или вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты используют в любом количестве или числе, которое приводит к обнаруживаемому терапевтическому эффекту для индивида, у которого имеется опухолевая клетка или множество опухолевых клеток, в частности, больному раком. Клетки плацентарного перфузата, комбинированные натуральные клетки-киллеры и/или натуральные клетки-киллеры плаценты, в частности, вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты, можно вводить указанному индивиду в виде количества клеток, в частности, указанному индивиду можно назначать приблизительно, по крайней мере приблизительно или не более чем приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или 5×10 клеток плацентарного перфузата, комбинированных натуральных клеток-киллеров и/или натуральных клеток-киллеров плаценты. В других вариантах осуществления настоящего изобретения клетки плацентарного перфузата, комбинированные натуральные клетки-киллеры и/или выделенные из плаценты вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты можно вводить подобному индивиду в виде определенного количества клеток, в частности, указанному индивиду можно назначать приблизительно, по крайней мере приблизительно или не более чем приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или 5×10 клеток плацентарного перфузата, комбинированных натуральных клеток-киллеров и/или натуральных клеток-киллеров на килограмм массы индивида. Клетки плацентарного перфузата и/или выделенные из плаценты вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты можно вводить подобному индивиду в соответствии с приблизительным отношением между клетками плацентарного перфузата и/или натуральными клетками-киллерами плаценты, в частности, вспомогательными натуральными клетками-киллерами плаценты и опухолевыми клетками указанного индивида. Например, клетки плацентарного перфузата и/или натуральные клетки-киллеры плаценты, в частности, вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты можно вводить указанному индивиду в отношении приблизительно, по крайней мере приблизительно или не более чем приблизительно 1:1, 1:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1 к количеству опухолевых клеток указанного индивида. Число опухолевых клеток у подобного индивида можно оценить, в частности, путем подсчета числа опухолевых клеток во взятом у индивида образце ткани, например, крови, биопсии и т.п. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения, в частности, для солидных опухолей, указанный подсчет проводят в сочетании с визуализацией опухоли или опухолей с тем, чтобы определить приблизительный объем опухоли.
Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ подавления пролиферации опухолевой клетки или множества опухолевых клеток с использованием комбинаций плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата, комбинированных натуральных клеток-киллеров и/или вспомогательных натуральных клеток-киллеров, выделенных из плаценты. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения предлагается способ подавления пролиферации опухолевой клетки или множества опухолевых клеток, который включает контактирование указанной опухолевой клетки или указанных опухолевых клеток с плацентарным перфузатом, дополненным множеством клеток плацентарного перфузата или PINK клеток; с клетками плацентарного перфузата, дополненными плацентарным перфузатом или множеством PINK клеток; с PINK клетками, дополненными плацентарным перфузатом и клетками плацентарного перфузата, множеством PINK клеток и множеством комбинированных натуральных клеток-киллеров; с множеством комбинированных натуральных клеток-киллеров и множеством клеток плацентарного перфузата; с плацентарным перфузатом, дополненным комбинированными натуральными клетками-киллерами; или с комбинацией всех из указанных плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата, комбинированных натуральных клеток-киллеров и PINK клеток.
4
4
5
5
6
6
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
Например, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения пролиферация опухолевой клетки или множества опухолевых клеток подавляется плацентарным перфузатом, дополненным множеством клеток плацентарного перфузата, комбинированными натуральными клетками-киллерами и/или множеством вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты. Например, в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения каждый миллилитр плацентарного перфузата дополнен приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клетками плацентарного перфузата или вспомогательными натуральными клетками-киллерами плаценты. В других конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат, в частности, одну единицу (т.е. сбор от одной плаценты) или приблизительно 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мл перфузата дополняют приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше PINK клетками, комбинированными клетками-киллерами и/или клетками плацентарного перфузата на миллилитр, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше PINK клетками, комбинированными клетками-киллерами и/или клетками плацентарного перфузата.
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
11
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения пролиферация опухолевой клетки или множества опухолевых клеток подавляется множеством клеток плацентарного перфузата, дополненных плацентарным перфузатом, комбинированными натуральными клетками-киллерами и/или вспомогательными натуральными клетками-киллерами плаценты. В более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клеток плацентарного перфузата на миллилитр, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше клеток плацентарного перфузата дополняют приблизительно или, по меньшей мере, приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше PINK клетками и/или комбинированными натуральными клетками-киллерами на миллилитр, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше PINK клетками. В других более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клеток плацентарного перфузата, PINK клеток и/или комбинированных натуральных клеток-киллеров на миллилитр, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше клеток плацентарного перфузата дополняют с помощью приблизительно или, по крайней мере, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мл перфузата или приблизительно 1 единицей перфузата.
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
11
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения пролиферация опухолевой клетки или множества опухолевых клеток подавляется множеством вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты, дополненных плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата и/или комбинированными натуральными клетками-киллерами. В более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше PINK клеток дополняют приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клетками плацентарного перфузата и/или комбинированными натуральными клетками-киллерами на миллилитр, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше клетками плацентарного перфузата и/или комбинированными природными клетками-киллерами. В других более конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше клеток плацентарного перфузата и/или комбинированных натуральных клеток-киллеров на миллилитр, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше клеток вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты и/или комбинированных натуральных клеток-киллеров дополняют с помощью приблизительно или, по крайней мере, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мл перфузата или приблизительно 1 единицей перфузата.
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
4
4
5
5
6
6
7
7
8
8
9
9
10
10
11
В другом варианте осуществления настоящего изобретения пролиферация опухолевой клетки или множества опухолевых клеток подавляется путем контактирования опухолевой клетки или опухолевых клеток с плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата, PINK клетками и/или комбинированными природными клетками-киллерами, дополненными прилипающими стволовыми клетками плаценты. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата или PINK клетки дополняют приблизительно 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10 или больше прилипающими стволовыми клетками плаценты на миллилитр, или 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10, 5×10, 1×10 или больше прилипающими стволовыми клетками плаценты.
4
5
6
7
8
9
10
В другом варианте осуществления настоящего изобретения пролиферация опухолевой клетки или множества опухолевых клеток подавляется путем контактирования опухолевой клетки или опухолевых клеток с плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата, комбинированными природными клетками-киллерами и/или PINK клетками, дополненными средой, которая кондиционирована прилипающими стволовыми клетками плаценты, в частности, дополнена 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,1; 0,8; 0,9; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мл культуральной среды, которая кондиционирована прилипающими стволовыми клетками плаценты, на единицу перфузата, клеток перфузата, комбинированных природных клеток-киллеров и/или PINK клеток, или на 10, 10, 10, 10, 10, 10 или 10 клеток.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата, природные клетки-киллеры плаценты, в частности, PINK клетки, комбинированные природные клетки-киллеры или их комбинации и объединенные фонды используют в том виде, в каком они изначально получены, т.е. перфузат в том виде, в каком он получен в процессе перфузии, клетки плацентарного перфузата в том виде, в каком они выделены из подобного перфузата, комбинированные природные клетки-киллеры из подобного перфузата и совместимой пуповинной крови, или PINK клетки, выделенные из подобного перфузата или подобных клеток плацентарного перфузата. В других вариантах осуществления настоящего изобретения плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата, PINK клетки и их комбинации и объединенные фонды подвергают обработке перед использованием. Например, плацентарный перфузат может быть использован в своей сырой, не подвергавшейся обработке форме, в какой он выделен из плаценты. Плацентарный перфузат может быть также перед использованием подвергнут обработке, например, путем негативного отбора одного или нескольких типов клеток; путем уменьшения объема с помощью дегидратации; путем лиофилизации или повторной гидратации и т.д. Аналогично, популяции клеток перфузата могут использоваться в изначально выделенной из плацентарного перфузата форме, в частности, в виде совокупности ядросодержащих клеток из плацентарного перфузата, или же могут быть подвергнуты обработке, например, с целью удаления одного или нескольких типов клеток (в частности, эритроцитов). PINK клетки могут использоваться в изначально выделенной из плацентарного перфузата форме, в частности, при использовании микрошариков CD56, или могут быть подвергнуты обработке, например, с целью удаления одного или нескольких типов клеток, отличных от клеток-киллеров.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ подавления пролиферации опухолевой клетки или опухолевых клеток, который заключается в контактировании опухолевой клетки или опухолевых клеток с плацентарным перфузатом, клетками плацентарного перфузата, PINK клетками, комбинированными природными клетками-киллерами и их объединенными фондами или комбинациями, при этом указанный плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата, PINK клетки, комбинированные природные клетки-киллеры или их объединенные фонды или комбинации имели контакт с интерлейкином-2 (IL-2) в течение определенного периода времени перед указанным контактированием. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный период времени составляет приблизительно, составляет по крайней мере приблизительно или составляет не больше, чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 или 48 перед указанным контактированием.
Перфузат, клетки плацентарного перфузата, PINK клетки, комбинированные природные клетки-киллеры или их объединенные фонды и/или комбинации можно назначать индивиду, у которого обнаружен рак, один раз, или назначать их индивиду, у которого обнаружен рак, в процессе антираковой терапии, или же назначаться несколько раз, в частности, один раз в каждый 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23 час или один раз в каждый 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 день, или один раз в каждую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше неделю в процессе лечения. Перфузат, клетки плацентарного перфузата, PINK клетки, их объединенные фонды и/или комбинации можно вводить без учета того, назначали ли человеку, который болен раком, или человеку, имеющему опухолевые клетки, перфузат, клетки плацентарного перфузата, PINK клетки, их объединенные фонды и/или комбинации в прошлом. Так, способы, предлагаемые в настоящем изобретении, охватывают введение человеку, который болен раком, или человеку, имеющему опухолевые клетки, любой комбинации плацентарного перфузата, клеток плацентарного перфузата, PINK клеток, их объединенных фондов и/или комбинаций.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения опухолевыми клетками являются клетки кровяной опухоли. В различных конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения опухолевыми клетками являются клетки первичной карциномы из эпителия протоков, клетки лейкоза, клетки острого Т-клеточного лейкоза, клетки хронической миелоидной лимфомы (CML), клетки острого миелогенного лейкоза, клетки хронического миелогенного лейкоза (CML), клетки легочной карциномы, клетки аденокарциномы ободочной кишки, клетки гистиоцитарной лимфомы, клетки множественной миеломы, клетки ретинобластомы, клетки колоректальной карциномы или клетки колоректальной аденокарциномы.
Плацентарный перфузат, клетки плацентарного перфузата, PINK клетки, комбинированные природные клетки-киллеры, их объединенные фонды и/или комбинации могут быть частью схемы лечения рака, которая включает один или несколько других антираковых средств. Подобные антираковые средства хорошо известны из области техники. Конкретными антираковыми средствами, которые могут назначаться индивиду, имеющему рак, в дополнение к перфузату, клеткам перфузата, PINK клеткам, их объединенным фондам и/или комбинациям, являются, однако этим не ограничиваясь: ацивицин; акларубицин; акодазол гидрохлорид; акронин; адозелезин; алдеслейкин; алтретамин; амбомицин; аметантрон ацетат; амсакрин; анастрозол; антрамицин; аспарагиназа; асперлин; азацитидин; азетепа; азотомицин; батимастат; бензодепа; бикалутамид; бисантрен гидрохлорид; биснафид димезилат; бизелезин; блеомицин сульфат; брекинар натрий; бропиримин; бусулфан; кантиномицин; калустерон; карацемид; карбетимер; карбоплатин; кармустин; карубицин гидрохлорид; карзелезин; цедефингол; целекоксиб (ингибитор COX-2); хлорамбуцил; циролемицин; цисплатин; кладрибин; криснатол мезилат; циклофосфамид; цитарабин; дакарбазин; дактиномицин; даунорубицин гидрохлорид; децитабин; дексормаплатин; дезагуанин; дезагуанин мезилат; диазихон; доцетаксел; доксорубицин; доксорубицин гидрохлорид; дролоксифен; дролоксифен цитрат; дромостанолон пропионат; дуазомицин; эдатрексат; эфломитин гидрохлорид; элсамитруцин; энлоплатин; энпромат; эпипропидин; эпирубицин гидрохлорид; эрбулозол; эзорубицин гидрохлорид; эстрамустин; эстрамустин натрий фосфат; этанидазол; этопозид; этопозид фосфат; этоприн; фадрозол гидрохлорид; фазарабин; фенретинид; флоксуридин; флударабин фосфат; фторурацил; фторцитабин; фосхидон; фотриецин натрий; гемцитабин; гемцитабин гидрохлорид; гидроксимочевина; идарубицин гидрохлорид; ифосфамид; илмофозин; ипроплатин; иринотекан; иринотекан гидрохлорид; ланреотид ацетат; летрозол; лейпролид ацетат; лиарозол гидрохлорид; лометрексол натрий; ломустин; лозоксантрон гидрохлорид; мазопрокол; мейтанзин; меклоретамин гидрохлорид; мегестрол ацетат; меленгестрол ацетат; мелфалан; меногарил; меркаптопурин; метотрексат; метотрексат натрий; метаприн; метурепеда; метиндомид; миторцин; митокромин; митогиллин; митомалцин; митомицин; митоспер; митотан; митоксантрон гидрохлорид; микофеноловая кислота; нокодазол; ногаламицин; ормаплатин; оксисуран; паклитаксел; пегаспрагаза; пелиомицин; пентамустин; пепломицин сульфат; перфосфамид; пипоброман; пипосулфан; пироксантрон гидрохлорид; пликамицин; пломестан; порфимер натрий; порфиромицин; преднимустин; прокарбазин гидрохлорид; пуромицин; пуромицин гидрохлорид; пиразофурин; рибоприн; сафингол; сафингол гидрохлорид; семустин; симтразен; спарфосат натрий; спарсомицин; спирогерманий гидрохлорид; спиромустин; спироплатин; стрептонигрин; стрептозоцин; сулофенур; тализомицин; текогалан натрий; таксотер; тегафур; телоксантрон гидрохлорид; темопорфин; тенипозид; тероксирон; тестолактон; тиамиприн; тиогуанин; тиотепа; тиазофурин; тирапазамин; торемифен цитрат; трестолон ацетат; трицирибин фосфат; триметрексат; триметрексат глюкуронат; трипторелин; тубулозол гидрохлорид; горчичный урацил; уредепа; вапреотид; вертепорфин; винбластин сульфат; винкристин сульфат; виндезин; виндезин сульфат; винепидин сульфат; винглицинат сульфат; винлеурозин сульфат; винорелбин тартрат; винрозидин сульфат; винзолидин сульфат; ворозол; зениплатин; зиностатин; и зорубицин гидрохлорид.

6
Другими антираковыми средствами являются, однако ими не ограничиваясь: 20-эпи-1,25-гидроксивитамин D3; 5-этинилурацил; абиратерон; акларубицин; ацилфульвен; адециперол; адозелезин; алдеслейкин; антагонисты ALL-TK; алтретамин; амбамустин; амидокс; амифостин; аминолевулиновая кислота; амрубицин; амсакрин; анагрелид; анастрозол; андрографолид; ингибиторы ангиогенеза; антагонист D; антагонист G; антареликс; антидорсально экспрессирующийся морфогенетический белок-1; антиандроген, карцинома простаты; антиэстроген; антинеопластон; антисмысловые олигонуклеотиды; афидиколин глицинат; модуляторы гена апоптоза; регуляторы апоптоза; апуриновая кислота; ara-CDP-DL-PTBA; аргининдеаминаза; азулакрин; атаместан; атримустин; аксинастатин 1; аксинастатин 2; аксинастатин 3; азасетрон; азатоксин; азатирозин; производные баккатина III; баланол; батимастат; антагонисты BCR/ABL; бензохлорины; бензоилстауроспорин; производные бета-лактама; бета-алетин; бетакламицин B; бетулиновая кислота; ингибитор bFGF; бикалутамид; бисантрен; бисазиридинилспермин; биснафид; бистратен A; бизелезин; брефлат; бропиримин; будотитан; бутионин сулфоксимин; калципотриол; калфостин C; производные камптотецина; капецитабин; карбоксамид-аминотриазол; карбоксиамидотриазол; CaRest M3; CARN 700; ингибитор из хрящевой ткани; карзелезин; ингибиторы казеинкиназы (ICOS); кастаноспермин; цекропин B; цетрореликс; хлорины; хлорохиноксалин сульфонамид; цикапрост; цис-порфирин; кладрибин; аналоги кломифена; клотримазол; коллисмицин A; коллисмицин B; комбретастатин A4; аналоги комбретастатина; конагенин; крамбесцидин 816; криснатол; криптофицин 8; производные криптофицина; курацин A; циклопентантрахиноны; циклоплатам; ципемицин; цитарабин окфосфат; цитолитический фактор; цитостатин; дакликсимаб; децитабин; дегидродиденмин B; деслорелин; дексаметазон; дексифосфамид; дексразоксан; дексверапамил; диазихон; диденмин B; дидокс; диэтилнорспермин; дигидро-5-азацитидин; 9-дигидротаксол; диоксамицин; дифенилспиромустин; доцетаксель; доконазол; долазетрон; доксифлуридин; доксорубицин; дролоксифен; дронабинол; дуокармицин SA; эбселен; экомустин; эделфосин; эдреколомаб; эфлорнитин; элемен; эмитефур; эпирубицин; эпристерид; аналоги эстрамустина; агонисты эстрогена; антагонисты эстрогена; этанидозол; этопозид фосфат; эксеместан; фадрозол; фазарабин; фенретинид; филграстим; финастерид; флавопиридол; флезеластин; флуастерон; флударабин; фтордауноруницин гидрохлорид; форфенимекс; форместан; фостриецин; фотемустин; тексафирин гадолиния; нитрат галлия; галоцитабин; ганиреликс; ингибиторы гелатиназы; гемцитабин; ингибиторы глутатиона; гепсулфам; герегулин; гескаметилен бисацетамид; гиперицин; ибандроновая кислота; идарубицин; идоксифен; идрамантон; илмофозин; иломастат; иматиниб (в частности, GLEEVEC), имихимод; пептиды, обладающие иммуностимулирующей активностью; ингибитор рецептора инсулиноподобного фактора роста-1; агонисты интерферона; интерфероны; интерлейкины; иобенгуан; иододоксорубицин; ипомеанол-4; ироплакт; ирсогладин; изобенгазол; изогомохаликондрин B; итазетрон; жасплакинолид; кахалалид F; ламелларин-N триацетат; ланреотид; лейнамицин; ленограстим; лентинан сульфат; лептолстатин; летрозол; ингибирующий фактор лейкоза; альфа-интерферон из лейкоцитов; лейпролид + эстроген + прогестерон; лейпрорелин; левамизол; лиарозол; аналог линейного полиамина; липофильный дисахаридный пептид; липофильные соединения платины; лиссоклинамид 7; лобаплатин; ломбрицин; лометрексол; лонидамин; лозоксантрон; локсорибин; луртотекан; тексафирин лютеция; лизофиллин; литические пептиды; маитансин; манностатин A; маримастат; мазопрокол; маспин; ингибиторы малтрилизина; ингибиторы матричной металлопротеиназы; меногарил; мербарон; метерелин; метиониназа; метоклопрамид; ингибитор MIF; мифепристон; милтефозин; миримостим; митогуазон; митолактол; аналоги митомицина; митонафид; митотоксин-фактор роста фибробластов-сапорин; митоксантрон; мофаротин; молграмостим; эрбитукс, хорионический гонадотропин человека; монофосфориллипид A + стрептокиназа клеточной стенки микобактерий; мопидамол; антираковый агент горчицы; микапероксид B; экстракт клеточной стенки микобактерии; мириапорон; N-ацетилдиналин; N-замещенные бензамиды; нафарелин; нагрестип; налоксон + пентазоцин; напавин; нафтерпин; нартограстим; недаплатин; неморубицин; неридроновая кислота; нилутамид; низамицин; модуляторы окиси азота; нитроксидный антиоксидант; нитруллин; облимерсен (GENASENSE); O-бензилгуанин; октреотид; окиценон; олигонуклеотиды; онапристон; ондансетрон; орацин; пероральный индуцирующий фактор цитокинов; ормаплатин; озатерон; оксалиплатин; оксауномицин; паклитаксел; аналоги паклитакселя; производные паклитакселя; палауамин; пальмитоилризоксин; памидроновая кислота; панакситрол; паномифен; парабактин; пацеллиптин; пегаспаргаза; пелдезин; пентозанполисульфат натрия; пентостатин; пентрозол; перфлуброн; перфосфамид; пириллиловый спирт; феназиномицин; фенилацетат; ингибиторы фосфатазы; пицибанил; пилокарпин гидрохлорид; пирарубицин; пиритрексим; плацетин A; плацетин B; ингибитор активатора плазминогена; комплекс платины; платиновые соединения; платина-триаминовый комплекс; порфимер натрий; порфиромицин; преднизон; пропил-бис-акридон; простагландин J2; ингибиторы протеасом; иммуномодулятор на основе белка А; ингибитор протеинкиназы C; ингибитор протеинкиназы C, микроводоросли; ингибиторы протеин-тирозин фосфатазы; ингибиторы пурин-нуклеозид фосфорилазы; пурпурины; пиразолоакридин; конъюгат пиридоксилированного гемоглобина и полиоксиэтилена; антагонисты raf; ралтитрексед; рамосетрон; ингибиторы ras фарнезил-протеин трансферазы; ингибиторы ras; ингибитор ras-GAP; деметилированный ретеллиптин; этидронат рения Re 186; ризоксин; рибозимы; RII ретинамид; рохитукин; ромуртид; рокинимекс; рубигинон B1; рубоксил; сафингорл; саинтопин; SarCNU; саркофитол A; саграмостим; миметики Sdi 1; семустин; ингибитор клеточного старения 1; смысловые олигонуклеотиды; ингибиторы передачи сигнала; сизофиран; собузоксан; борокаптат натрия; фенилацетат натрия; солверол; соматомедин-связывающий белок; сонермин; спарфосовая кислота; спикамицин D; спиромустин; спленопентин; спонгистатин 1; кваламин; стипиамид; ингибиторы стромелизина; сульфинозин; антагонист суперактивного вазоактивного интестинального пептида; сурадиста; сурамин; свенсонин; таллимустин; тамоксифен метиодид; тауромустин; тазаротен; текогалан натрий; гегафур; теллурапирилий; ингибиторы теломеразы; темопорфин; тенипозид; тетрахлордекаоксид; тетразомин; талибластин; тиокоралин; тромбопоэтин; миметик тромбопоэтина; тималфазин; агонист рецептора тимопоэтина; тимотринан; тироидстимулирующий гормон; олова этил-этиопурпурин; тирапазамин; титаноцена бихлорид; топсентин; торемифен; ингибиторы трансляции; третиноин; триацетилуридин; трицирибин; триметрексат; трипторелин; трописетрон; туростерид; ингибиторы тирозинкиназы; тирфостины; ингибиторы UBC; убенимекс; ингибирующий рост фактор из мочеполового синуса; антагонисты рецептора урокиназы; вапреотид; вариолин B; веларесол; верамин; вердины; вертепорфин; винорелбин; винксантин; витаксин; ворозол; занотерон; зениплатин; зиласкорб; и зиностатин стималамер.
5.8. Обработка натуральных клеток-киллеров иммуномодулирующими соединениями
Выделенные натуральные клетки-киллеры, в частности, PINK клетки или комбинированные натуральные клетки-киллеры, рассматриваемые в настоящем описании, можно подвергать обработке иммуномодулирующим соединением, например, вводить в контакт с иммуномодулирующим соединением, с целью усиления антиопухолевой активности указанных клеток. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ повышения цитотоксичности натуральных клеток-киллеров по отношению к опухолевой клетке, который включает контактирование натуральной клетки-киллера с иммуномодулирующим соединением в течение времени и с концентрацией, достаточных для того, чтобы натуральная клетка-киллер демонстрировала повышенную цитотоксичность по отношению к опухолевой клетке, по сравнению с натуральной клеткой-киллером, которая не контактировала с иммуномодулирующим соединением. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, предлагается способ усиления экспрессии гранзима В в натуральных клетках-киллерах, который включает контактирование натуральной клетки-киллера с иммуномодулирующим соединением в течение времени и с концентрацией, достаточных для того, чтобы натуральная клетка-киллер демонстрировала повышенную экспрессию гранзима В, по сравнению с натуральной клеткой-киллером, которая не контактировала с иммуномодулирующим соединением. Иммуномодулирующим соединением может быть любое приведенное ниже соединение, в частности, леналидомид или помалидомид.
В настоящем изобретении предлагается также способ повышения цитотоксичности популяции натуральных клеток-киллеров, в частности, PINK клеток или комбинированных натуральных клеток-киллеров, по отношению к множеству опухолевых клеток, который включает контактирование популяции натуральных клеток-киллеров с иммуномодулирующим соединением в течение времени и с концентрацией, достаточных для того, чтобы популяция натуральных клеток-киллеров демонстрировала детектируемую повышенную цитотоксичность по отношению к указанному множеству опухолевых клеток, по сравнению с эквивалентным числом натуральных клеток-киллеров, которые не контактировали с иммуномодулирующим соединением. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, предлагается способ усиления экспрессии гранзима В в популяции натуральных клеток-киллеров, который включает контактирование популяции натуральных клеток-киллеров с иммуномодулирующим соединением в течение времени и с концентрацией, достаточных для того, чтобы популяция натуральных клеток-киллеров экспрессировала детектируемое повышенное количество гранзима В, по сравнению с эквивалентным числом натуральных клеток-киллеров, которые не контактировали с иммуномодулирующим соединением. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанная популяция натуральных клеток-киллеров содержится вместе с клетками плацентарного перфузата, в частности, с общим количеством ядросодержащих клеток, выделенных из плацентарного перфузата.
+
-
В конкретных вариантах воплощения вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения натуральными клетками-киллерами являются CD56, CD16, вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты (PINK клетки). В другом конкретном варианте воплощения вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения натуральные клетки-киллеры представляют собой комбинированные натуральные клетки-киллеры, т.е. натуральные клетки-киллеры от совместимых друг с другом плацентарного перфузата и пуповинной крови.
В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество натуральных клеток-киллеров, в частности, PINK клетки или комбинированные натуральные клетки-киллеры, которые контактировали с указанным иммуномодулирующим соединением, экспрессирует один или несколько из BAX, CCL5, CCR5, CSF2, FAS, GUSB, IL2RA или TNFRSF18 на более высоком уровне, чем эквивалентное число указанных натуральных клеток-киллеров, которые не контактировали с указанным иммуномодулирующим соединением. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное множество натуральных клеток-киллеров, в частности, PINK клетки, которые контактировали с указанным иммуномодулирующим соединением, экспрессируют один или несколько из ACTB, BAX, CCL2, CCL3, CCL5, CCR5, CSF1, CSF2, ECE1, FAS, GNLY, GUSB, GZMB, IL1A, IL2RA, IL8, IL10, LTA, PRF1, PTGS2, SKI и TBX21 на более высоком уровне, чем эквивалентное число указанных натуральных клеток-киллеров, которые не контактировали с указанным иммуномодулирующим соединением.
В настоящем изобретении предлагается также способ повышения цитотоксичности популяции клеток плацентарного перфузата человека, в частности, совокупности ядросодержащих клеток из плацентарного перфузата, по отношению к множеству опухолевых клеток, который включает контактирование клеток плацентарного перфузата с иммуномодулирующим соединением в течение времени и с концентрацией, достаточных для того, чтобы клетки плацентарного перфузата демонстрировали детектируемую повышенную цитотоксичность по отношению к указанному множеству опухолевых клеток, по сравнению с эквивалентным числом клеток плацентарного перфузата, которые не контактировали с иммуномодулирующим соединением. В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, предлагается способ усиления экспрессии гранзима В в популяции клеток плацентарного перфузата, который включает контактирование популяции клеток плацентарного перфузата с иммуномодулирующим соединением в течение времени и с концентрацией, достаточных для того, чтобы популяция клеток плацентарного перфузата экспрессировала детектируемое повышенное количество гранзима В, по сравнению с эквивалентным числом клеток плацентарного перфузата, которые не контактировали с иммуномодулирующим соединением.
Иммуномодулирующие соединения либо могут быть приобретены на коммерческой основе, либо могут быть получены в соответствии со способами, приведенными в патентах или патентных публикациях, на которые делаются ссылки в настоящем описании и которые все включены в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, оптически чистые композиции могут быть получены асимметрическим синтезом или расщеплением с помощью известных расщепляющих агентов или хиральных колонок, а также другими стандартными методами синтетической органической химии. Иммуномодулирующие соединения могут быть рацемическими, стереохимически обогащенными или стереохимически чистыми и могут охватывать их фармацевтически приемлемые соли, сольваты и пролекарства.
В контексте настоящего описания, если не указано иное, термины “иммуномодулирующие соединения” охватывает органические молекулы небольшого размера, которые заметно ингибируют TNF-α, LPS-индуцированные моноциты IL-1β и IL-12 и частично ингибируют продукцию IL-6. В конкретных примерах иммуномодулирующими соединениями являются леналидомид, помалидомид или талидомид.
Конкретные примеры иммуномодулирующих соединений включают, однако этим не ограничиваясь, циано- или карбоксисодержащие производные замещенных стиролов, таких как раскрытые в патенте США № 5929117; 1-оксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины, такие как раскрытые в патентах США №№ 5874448 и 5955476; тетразамещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолины, описанные в патенте США № 5798368; 1-оксо и 1,3-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины (в частности, 4-метилзамещенное производные талидомида), включая, однако этим не ограничиваясь, такие производные, как раскрытые в патентах США №№ 5635517, 6476052, 6555554, и 6403613; 1-оксо и 1,3-диоксоизоиндолины, замешенные в 4- или 5-позиции индолинового цикла (в частности, 4-(4-амино-1,3-диоксоизоиндолин-2-ил)-4-карбамоил-бутановая кислота), описанные в патенте США № 6380239; изоиндолин-1-он и изоиндолин-1,3-дион, замещенные в 2-позиции 2,6-диоксо-3-гидроксипиперидин-5-илом (в частности, 2-(2,6-диоксо-3-гидрокси-5-фторпиперидин-5-ил)-4-аминоизоиндолин-1-он), приведенные в патенте США № 6458810; класс не полипептидных циклических амидов, раскрытых в патентах США №№ 5698579 и 5877200; аминоталидомид, а также аналоги, продукты гидролиза, метаболиты, производные и предшественники аминоталидомида и замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)фталимиды и замещенные 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолы, такие как раскрытые в патентах США №№ 6281230 и 6316471; и изоиндолимидные соединение, такие как описанные в патентной публикации США № 2003/0045552 А1, патенте США № 7091353 и международной заявке WO 02/059106. Содержание каждого из указанных в настоящем описании патентов и патентных публикаций включено в данное описание посредством ссылки. Иммуномодулирующие соединения не включают талидомид.
В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующими соединениями являются 1-оксо и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, замещенные аминогруппой в бензольном цикле, как описано в патенте США № 5635517, который целиком включен в настоящее описание посредством ссылки. Указанные соединения имеют структуру I:
2
2
где один из X и Y обозначает C=O, а другой из X и Y обозначает C=O или CH, а R обозначает атом водорода или низший алкил, в частности, метил. Конкретные иммуномодулирующие соединения включают, однако этим не ограничиваясь:
1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин;
1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-5-аминоизоиндолин;
1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-6-аминоизоиндолин;
1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-7-аминоизоиндолин;
1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-аминоизоиндолин; и
1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-5-аминоизоиндолин.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения относятся к классу замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)фталимидов и замещенных 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолов, таких как описанные в патентах США №№ 6281230; 6316471; 6335349; и 6476052 и международной заявке WO 98/03502, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Отдельные примеры соединений имеют формулу:
где:
2
один из X и Y обозначает C=O, а другой из X и Y обозначает C=O или CH;
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R и R независимо от других обозначает атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или (ii) один из R, R, R и R обозначает -NHR, а остальные из R, R, R и R обозначают атом водорода;
5
R обозначает атом водорода или алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода;
6
6
1
2
3
4
1
2
3
4
R обозначает атом водорода или алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, бензил или атом галогена; при условии, что R отличен от атома водорода, если X и Y обозначают C=O и (i) каждый из R, R, R и R обозначает атом фтора или (ii) один из R, R, R или R обозначает амино.
Отдельные представители этого класса имеют формулы:
1
где R обозначает атом водорода или метил. Отдельный вариант осуществления настоящего изобретения охватывает использование энантиомерно чистых форм (в частности, оптически чистого (R)- или (S)-энантиомера) указанных соединений.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения относятся к классу изоиндолимидов, раскрытых в опубликованных заявках на патент США № 2003/0096841 и № 2003/0045552, а также в WO 02/059106, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Отдельные представители имеют формулу II:
и их фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты, клатраты, энантиомеры, диастереомеры, рацематы и смеси стереоизомеров, где:
2
один из X и Y обозначает C=O, а другой обозначает CH или C=O;
1
3
3
4
6
5
5
3
3
3
3'
3
3'
5
1
8
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
1
8
2
1
8
1
8
1
8
R обозначает H, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)алкил-(С-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, C(O)R, C(S)R, C(O)OR, (C-C)алкил-N(R), (C-C)алкил-OR, (C-C)алкил-C(O)OR, C(O)NHR, C(S)NHR, C(O)NRR, C(S)NRR или (C-C)алкил-O(CO)R;
2
1
8
2
8
2
8
R обозначает H, F, бензил, (C-C)алкил, (C-C)алкенил или (C-C)алкинил;
3
3'
6
5
5
5
5
1
8
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
0
8
2
1
8
1
8
8
R и R независимо обозначают (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, (C-C)алкил-N(R), (C-C)алкил-OR, (C-C)алкил-C(O)OR, (C,-C)алкил-O(CO)R или C(O)OR;
4
5
1
8
2
8
2
8
1
4
0
4
1
6
0
4
2
5
R обозначает (С-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, (C-C)алкил-OR, бензил, арил, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил или (C-C)алкил-(C-C)гетероарил;
5
1
8
2
8
2
8
2
5
R обозначает (C-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил или (C-C)гетероарил;
6
5
6
1
8
2
8
2
8
2
5
0
8
в каждом случае R независимо обозначает H, (С-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)гетероарил или (C-C)алкил-C(O)O-R или группы R могут быть объединены с образованием гетероалкильной группы;
n обозначает 0 или 1; и
* обозначает атом углерода при хиральном центре.
1
3
4
6
5
5
3
5
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
1
8
2
1
8
1
8
1
8
В конкретных соединениях формулы II, если n равно 0, то R обозначает (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, C(O)R, C(O)OR, (C-C)алкил-N(R), (С-C)алкил-OR, (С-C)алкил-C(O)OR, C(S)NHR или (С-C)алкил-O(CO)R;
2
1
8
R обозначает H или (С-C)алкил; и
3
6
5
5
5
5
5
1
8
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
5
8
2
0
8
1
8
1
8
1
8
R обозначает (С-C)алкил, (C-C)циклоаклил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, (C-C)алкил-(С-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, (C-C)алкил-N(R); (C-C)алкил-NH-C(O)O-R; (С-C)алкил-OR, (С-C)алкил-C(O)OR, (С-C)алкил-O(CO)R или C(O)OR; а другие переменные имеют те же самые значения.
2
1
В других конкретных соединениях формулы II, R обозначает H или (C-C4)алкил.
1
1
8
В других конкретных соединениях формулы II, R обозначает (C-C)алкил или бензил.
1
1
8
2
3
2
2
3
В других конкретных соединениях формулы II, R обозначает H, (C-C)алкил, бензил, CHOCH, CHCHOCH или группу
1
В другом варианте воплощения соединений формулы II, R обозначает группу
7
6
5
5
5
5
7
1
8
3
7
2
8
2
8
0
4
1
6
0
4
2
5
0
8
2
1
8
1
8
1
8
где Q обозначает O или S, а в каждом случае R независимо обозначает H, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, бензил, арил, атом галогена, (C-C)алкил-(C-C)гетероциклоалкил, (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, (C-C)алкил-N(R), (C-C)алкил-OR, (C-C)алкил-C(O)OR, (C-C)алкил-O(CO)R или C(O)OR, или же соседние группы R могут быть объединены с образованием замещенного бициклического алкила или арильного цикла.
1
3
В других конкретных соединениях формулы II, R обозначает C(O)R.
3
5
0
4
2
5
1
8
0
4
В других конкретных соединениях формулы II, R обозначает (C-C)алкил-(C-C)гетероарил, (C-C)алкил, арил или (C-C)алкил-OR.
В других конкретных соединениях формулы II гетероарилом является пиридил, фурил или тиенил.
1
4
В других конкретных соединениях формулы II, R обозначает C(O)OR.
1
4
В других конкретных соединениях формулы II, атом водорода в группе C(O)NHC(O) может быть замещен (C-C)алкилом, арилом или бензилом.
Дальнейшие примеры соединений, входящих в данный класс соединений, включают, однако этим не ограничиваясь: [2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил]амид; (2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил)карбаминовой кислоты трет-бутиловый эфир; 4-(аминометил)-2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион; N-(2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1,3-диоксо-2,3-дигидро-1H-изоиндол-4-илметил)ацетамид; N-{(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил)-1,3-диоксоизо-индолин-4-ил)метил}циклопропилкарбоксамид; 2-хлор-N-{(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}ацетамид; N-(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)-3-пиридилкарбоксамид; 3-{1-оксо-4-(бензиламино)изоиндолин-2-ил}пиперидин-2,6-дион; 2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-4-(бензиламино)изоиндолин-1,3-дион; N-{(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}пропанамид; N-{(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-3-пиридилкарбоксамид; N-{(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}гептанамид; N-{(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}-2-фурилкарбоксамид; {Ν-(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)карбамоил}метилацетат; N-(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)пентанамид; N-(2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)-2-тиенилкарбоксамид; N-{[2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}(бутиламино)карбоксамид; N-{[2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}(октиламино)карбоксамид; и N-{[2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))-1,3-диоксоизоиндолин-4-ил)метил}(бензиламино)карбоксамид.
Наконец, другие конкретные иммуномодулирующие соединения принадлежат к классу изоиндолимидов, раскрытых в опубликованной заявке на патент США № 2002/0045643, международной заявке WO 98/54170 и патенте США № 6395754, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Отдельными представителями являются соединения формулы III:
и их фармацевтически приемлемые соли, гидраты, сольваты, клатраты, энантиомеры, диастереомеры, рацематы и смеси стереоизомеров, где:
2
один из X и Y обозначает C=O, а другой обозначает CH или C=O;
2
R обозначает H или CHOCOR';
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R или R независимо от других обозначает атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или (ii) один из R, R, R или R обозначает нитро или группу -NHR, а остальные из R, R, R или R обозначают атом водорода;
5
R обозначает атом водорода или алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода;
6
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, бензо, атом хлора или атом фтора;
7
10
8
9
R' обозначает R-CHR-N(RR);
7
n
2n
R обозначает м-фенилен или п-фенилен или -(CH)-, где n имеет значение от 0 до 4;
8
9
8
9
2
2
1
2
2
1
каждый из R и R независимо от другого обозначает атом водорода или алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или же R и R вместе образуют тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен или -CHCHXCHCH-, где X обозначает -O-, -S- или -NH-;
10
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или фенил; и
* обозначает атом углерода при хиральном центре.
Другими примерными соединениями являются соединения формулы:
где:
2
один из X и Y обозначает C=O, а другой из X и Y обозначает C=O или CH;
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R или R независимо от других обозначает атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или (ii) один из R, R, R или R обозначает группу -NHR, а остальные из R, R, R или R обозначают атом водорода;
5
R обозначает атом водорода или алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода;
6
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, бензо, атом хлора или атом фтора;
7
n
2n
R обозначает м-фенилен или п-фенилен или -(CH)-, где n имеет значение от 0 до 4;
8
9
8
9
1
1
2
2
2
2
каждый из R и R независимо от другого обозначает атом водорода или алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или же R и R вместе образуют тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен или -CHCHXCHCH-, где X обозначает -O-, -S- или -NH-; и
10
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или фенил.
Другими примерными соединениями являются соединения формулы:
где:
2
один из X и Y обозначает C=O, а другой из X и Y обозначает C=O или CH;
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R или R независимо от других обозначает атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или (ii) один из R, R, R или R обозначает нитро- или замещенную аминогруппу, а остальные из R, R, R или R обозначают атом водорода; и
6
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, бензо, атом хлора или атом фтора.
Другими примерными соединениями являются соединения формулы:
где:
2
один из X и Y обозначает C=O, а другой из X и Y обозначает C=O или CH;
1
2
3
4
1
2
3
4
5
1
2
3
4
(i) каждый из R, R, R или R независимо от других обозначает атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или (ii) один из R, R, R или R обозначает группу -NHR, а остальные из R, R, R или R обозначают атом водорода;
5
7
10
8
9
7
8
9
10
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или CO-R-CH(R)NRR, где значение каждого из R, R, R и R уже определено в настоящем описании; и
6
R обозначает алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, бензо, атом хлора или атом фтора.
Конкретными примерами указанных соединений является формула:
где:
2
один из X и Y обозначает C=O, а другой из X и Y обозначает C=O или CH;
6
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, бензо, атом хлора или атом фтора.
7
n
2n
R обозначает м-фенилен, п-фенилен или -(CH)-, где n имеет значение от 0 до 4;
8
9
8
9
1
1
2
2
2
2
каждый из R и R независимо от другого обозначает атом водорода или алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или же R и R вместе образуют тетраметилен, пентаметилен, гексаметилен или -CHCHXCHCH-, где X обозначает -O-, -S- или -NH-; и
10
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или фенил.
Наиболее предпочтительными иммуномодулирующими соединениями являются 4-(амино)-2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион и 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион. Указанные соединения могут быть получены с помощью стандартных синтетических методов (см., в частности, патент США № 5635517, который включен в настоящее описание посредством ссылки). Указанные соединения могут быть получены от компании Celgene Corporation, Warren, NJ. 4-(Амино)-2-(2,6-диоксо-(3-пиперидил))изоиндолин-1,3-дион имеет следующую химическую структуру:
Соединение 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион имеет следующую химическую структуру:
В другом варианте осуществления настоящего изобретения конкретные иммуномодулирующие соединения охватывают полиморфные формы 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, такие как форма A, B, C, D, E, F, G и H, раскрытые в патентной публикации США № 2005/0096351 A1, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Например, форма A 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой несольватированное кристаллическое вещество, которое можно получить из систем неводных растворителей. Дебаеграмма формы A содержит значительные по величине пики приблизительно при углах 2θ, равных 8; 14,5; 16; 17,5; 20,5; 24 и 26, а максимум его температуры плавления, определяемой методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), составляет приблизительно 270°С. Форма A слабо гигроскопична или не гигроскопична и, видимо, является наиболее термодинамически стабильным безводным полиморфом 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион, обнаруженным к настоящему времени.
Форма B 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой полугидратированное кристаллическое вещество, которое можно получить из различных систем растворителей, включая, однако этим не ограничиваясь, гексан, толуол и воду. Дебаеграмма формы B содержит значительные по величине пики при углах 2θ, приблизительно равных 16, 18, 22 и 27, и имеет эндотермы на кривой DSC приблизительно при 146 и 268°С, которые идентифицируют как дегидратацию и плавление при исследовании на горячем столике микроскопа. Изучение взаимопревращений показывают, что форма B превращается в форму E в водных системах растворителей и превращается в другие формы в ацетоне и других безводных системах.
Форма C 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой полусольватированное кристаллическое вещество, которое можно получить из растворителей, таких, однако этим не ограничиваясь, как ацетон. Дебаеграмма формы C содержит значительные по величине пики при углах 2θ, приблизительно равных 15,5 и 25, и имеет максимум температуры плавления, определяемой методом дифференциальной сканирующей калориметрии, приблизительно при 269°С. Форма C не гигроскопична при относительной влажности меньше приблизительно 85%, однако может превращаться в форму B при более высоких значениях относительной влажности.
Форма D 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой сольватированный кристаллический полиморф, получаемый из смеси ацетонитрила и воды. Дебаеграмма формы D содержит значительные по величине пики при углах 2θ, приблизительно равных 27 и 28, и имеет максимум температуры плавления, определяемой методом дифференциальной сканирующей калориметрии, приблизительно при 270°С. Форма D либо слабо гигроскопична, либо негигроскопична, однако обычно превращается в форму B, когда ее подвергают стрессу при больших величинах относительной влажности.
Форма E 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой дважды гидратированное кристаллическое вещество, которое можно получить при суспендировании 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в воде и при медленном выпаривании 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в водной системе с соотношением приблизительно 9:1 ацетон : вода. Дебаеграмма формы E содержит значительные по величине пики при углах 2θ, приблизительно равных 20, 24,5 и 29, и имеет максимум температуры плавления, определяемой методом дифференциальной сканирующей калориметрии, приблизительно при 269°С. Форма E может превращаться в форму C в системе растворителей на основе ацетона и в форму G в системе растворителей на основе ТГФ. В водных растворах форма E, видимо, является наиболее стабильной формой. Исследование десольватации формы E показывает, что при нагревании приблизительно до 125°С приблизительно в течение пяти минут форма E может превращаться в форму F.
Форма F 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой несольватированное кристаллическое вещество, которое можно получить дегидратацией формы E. Дебаеграмма формы F содержит значительные по величине пики при углах 2θ, приблизительно равных 19, 19,5 и 25, и имеет максимум температуры плавления, определяемой методом дифференциальной сканирующей калориметрии, приблизительно при 269°С.
Форма G 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой несольватированное кристаллическое вещество, которое можно получить при суспендировании формы B и формы E в растворителе, таком как, однако этим не ограничиваясь, тетрагидрофуран (ТГФ). Дебаеграмма формы G содержит значительные по величине пики при углах 2θ, приблизительно равных 21, 23 и 24,5, и имеет максимум температуры плавления, определяемой методом дифференциальной сканирующей калориметрии, приблизительно при 267°С.
Форма H 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона представляет собой частично гидратированное (приблизительно 0,25 мол) кристаллическое вещество, которое можно получить при выдерживании формы E при относительной влажности 0%. Дебаеграмма формы H содержит значительные по величине пики при углах 2θ, приблизительно равных 15, 26 и 31, и имеет максимум температуры плавления, определяемой методом дифференциальной сканирующей калориметрии, приблизительно при 269°С.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения, которые можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, однако этим не ограничиваясь, 1-оксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины и 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксо-3-фторпиперидин-3-ил)изоиндолины, такие как описываемые в патентах США №№ 5874448 и 5955476, каждый из которых включен в настоящее описание посредством ссылки. Отдельными представителями являются соединения формулы:
где
2
Y обозначает атом кислорода или H, и
1
2
3
4
каждый из R, R, R или R независимо от других обозначает атом водорода, атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или амино.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения, пригодные для использования в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, однако этим не ограничиваясь, 2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолины, приведенные в патенте США № 5798368, который включен в настоящее описание посредством ссылки. Отдельными представителями являются соединения формулы:
1
2
3
4
где каждый из R, R, R или R независимо от других обозначает атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода.
Другие конкретные иммуномодулирующие соединения, которые можно использовать в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, однако этим не ограничиваясь, 1-оксо- или 1,3-диоксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)изоиндолины, раскрытые в патенте США № 6403613, который включен в настоящее описание посредством ссылки. Отдельными представителями являются соединения формулы:
где
2
Y обозначает атом кислорода или H,
1
2
1
2
первый из R и R обозначает атом галогена, алкил, алкокси, алкиламино, диалкиламино, циано или карбамоил, а второй из R и R независимо от первого обозначает атом водорода, атом галогена, алкил, алкокси, алкиламино, диалкиламино, циано или карбамоил, и
3
R обозначает атом водорода, алкил или бензил.
Конкретные примеры соединений представлены формулой:
где
1
2
первый из R и R обозначает атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, диалкиламино, в котором каждый алкил содержит от 1 до 4 атомов углерода, циано или карбамоил,
1
2
второй из R и R независимо от первого обозначает атом водорода, атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, алкиламино, в котором алкил содержит от 1 до 4 атомов углерода, диалкиламино, в котором каждый алкил содержит от 1 до 4 атомов углерода, циано или карбамоил, и
3
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или бензил. Конкретные примеры включают, однако этим не ограничиваясь, 1-оксо-2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-4-метилизоиндолин.
Другие соединения, которые могут использоваться в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, имеют формулу:
где
1
2
первый из R и R обозначает атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, диалкиламино, в котором каждый алкил содержит от 1 до 4 атомов углерода, циано или карбамоил,
1
2
второй из R и R независимо от первого обозначает атом водорода, атом галогена, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, алкокси, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, алкиламино, в котором алкил содержит от 1 до 4 атомов углерода, диалкиламино, в котором каждый алкил содержит от 1 до 4 атомов углерода, циано или карбамоил, и
3
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или бензил.
Другие конкретные примеры иммуномодулирующих соединений, которые могут использоваться в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, однако этим не ограничиваясь, 1-оксо- и 1,3-диоксоизоиндолины, замещенные в 4- или 5-позиции индолинового цикла, которые описаны в патенте США № 6380239 или опубликованной заявке на патент США № 2006/0084815, которые включены в настоящее описание посредством ссылки. Отдельными представителями являются соединения формулы:
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
1
2
где атом углерода, помеченный как С*, указывает на хиральный центр (когда n отличен от нуля, а значение R отличается от значения R); один из X и X обозначает амино, нитро, алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, или NH-Z, а другой из X и X обозначает атом водорода; каждый из R и R независимо от другого обозначает гидрокси или NH-Z; R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, атом галогена или галогеналкил; Z обозначает атом водорода, арил, алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, формил или ацил, содержащий от одного до шести атомов углерода; а n имеет значение 0, 1 или 2; при условии, что если X обозначает амино, а n равен 1 или 2, то R и R оба не обозначают гидрокси; и их соли.
Другие соединения, которые могут использоваться в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, имеют формулу:
1
2
1
2
1
2
1
2
3
где атом углерода, помеченный как С*, указывает на хиральный центр, когда n отличен от нуля, а значение R отличается от значения R; один из X и X обозначает амино, нитро, алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, или NH-Z, а другой из X и X обозначает атом водорода; каждый из R и R независимо от другого обозначает гидрокси или NH-Z; R обозначает алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, атом галогена или атом водорода; Z обозначает атом водорода, арил или алкил или ацил, содержащий от одного до шести атомов углерода; n имеет значение 0, 1 или 2.
Конкретные примеры соединений, которые могут использоваться в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, включают, однако этим не ограничиваясь, 2-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-4-карбамоилмасляную кислоту и 4-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-4-карбамоилмасляную кислоту, которые имеют следующие структуры, соответственно, и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и стереоизомеры:
Другие примерные соединения имеют формулу:
1
2
1
2
1
2
1
2
3
где атом углерода, помеченный как С*, указывает на хиральный центр, когда n отличен от нуля, а значение R отличается от значения R; один из X и X обозначает амино, нитро, алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, или NH-Z, а другой из X и X обозначает атом водорода; каждый из R и R независимо от другого обозначает гидрокси или NH-Z; R обозначает алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, атом галогена или атом водорода; Z обозначает атом водорода, арил или алкил или ацил, содержащий от одного до шести атомов углерода; а n имеет значение 0, 1 или 2; и их соли.
Конкретные примеры включают, однако этим не ограничиваясь, 4-карбамоил-4-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}масляную кислоту, 4-карбамоил-2-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}масляную кислоту, 2-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}-4-фенилкарбамоилмасляную кислоту и 2-{4-[(фуран-2-илметил)амино]-1,3-диоксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил}пентандионовую кислоту, которые имеют следующие структуры, соответственно, и их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, пролекарства и стереоизомеры:
Другие конкретные примеры соединения имеют формулу:
где
1
2
1
2
один из X и X обозначает нитро или NH-Z, а другой из X и X обозначает атом водорода;
1
2
каждый из R и R независимо от другого обозначает гидрокси или NH-Z;
3
R обозначает алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, атом галогена или атом водорода;
Z обозначает атом водорода, фенил, ацил, содержащий от одного до шести атомов углерода, или алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода; и
n имеет значение 0, 1 или 2;
1
2
1
2
при условии, что если один из X и X обозначает нитро, а n равен 1 или 2, то R и R оба не обозначают гидрокси; и
2
1
2
n
если -COR и -(CH)COR различны, то атом углерода, обозначенный как С*, представляет собой хиральный центр. Другие примерные соединения имеют формулу:
где
1
2
один из X и X обозначает алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода;
1
2
каждый из R и R независимо от другого обозначает гидрокси или NH-Z;
3
R обозначает алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода, атом галогена или атом водорода;
Z обозначает атом водорода, фенил, ацил, содержащий от одного до шести атомов углерода, или алкил, содержащий от одного до шести атомов углерода; и
n имеет значение 0, 1 или 2; и
2
1
2
n
если -COR и -(CH)COR различны, то атом углерода, обозначенный как С*, представляет собой хиральный центр.
Наконец, другие конкретные иммуномодулирующие соединения включают, однако этим не ограничиваясь, изоиндолин-1-он и изоиндолин-1,3-дион, замещенные в 2-позиции 2,6-диоксо-3-гидроксипиперидин-5-илом, которые описаны в патенте США № 6458810, включенном в настоящее описание посредством ссылки. Примерные соединения имеют формулу:
где
атом углерода, помеченный как С*, обозначает хиральный центр;
2
X обозначает -C(O)- или -CH-;
1
3
R обозначает алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или -NHR;
2
R обозначает атом водорода, алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, или атом галогена; и
3
R обозначает атом водорода,
алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, который замещен или незамещен с помощью алкокси, содержащего от 1 до 8 атомов углерода, атомом галогена, амино или алкиламино, содержащим от 1 до 4 атомов углерода,
циклоалкил, содержащий от 3 до 8 атомов углерода,
фенил, замещенный или незамещенный алкилом, содержащим от 1 до 8 атомов углерода, с помощью алкокси, содержащего от 1 до 8 атомов углерода, атомом галогена, амино или алкиламино, содержащим от 1 до 4 атомов углерода,
4
бензил, замещенный или незамещенный алкилом, содержащим от 1 до 8 атомов углерода, с помощью алкокси, содержащего от 1 до 8 атомов углерода, атомом галогена, амино или алкиламино, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или группой COR, в которой
4
R обозначает атом водорода,
алкил, содержащий от 1 до 8 атомов углерода, который замещен или незамещен с помощью алкокси, содержащего от 1 до 8 атомов углерода, атомом галогена, амино или алкиламино, содержащим от 1 до 4 атомов углерода,
циклоалкил, содержащий от 3 до 8 атомов углерода,
фенил, замещенный или незамещенный алкилом, содержащим от 1 до 8 атомов углерода, с помощью алкокси, содержащего от 1 до 8 атомов углерода, атомом галогена, амино или алкиламино, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или
бензил, замещенный или незамещенный алкилом, содержащим от 1 до 8 атомов углерода, с помощью алкокси, содержащего от 1 до 8 атомов углерода, атомом галогена, амино или алкиламино, содержащим от 1 до 4 атомов углерода.
Приведенные здесь соединения либо можно купить на коммерческой основе, либо получить в соответствии со способами, описанными в патентах или патентных публикациях, приведенных в настоящем описании. Кроме того, оптически чистые соединения могут быть получены асимметрическим синтезом или получены путем расщепления с помощью известных расщепляющих агентов или хиральных колонок, а также другими стандартными методами синтетической органической химии.
Различные иммуномодулирующие соединения содержат один или несколько хиральных центров и могут существовать в виде рацемических смесей энантиомеров или смесей диастереомеров. Применение охватывает чистые формы указанных соединений, а также использование смесей подобных форм. Например, смеси, включающие равные или неравные количества энантиомеров конкретного иммуномодулирующего соединения могут использоваться в способах и композициях, которые предлагаются в настоящем изобретении. Указанные изомеры могут быть получены асимметрическим синтезом или путем расщепления с помощью стандартных методов, таких как хиральные колонки или хиральные расщепляющие агенты. См., в частности, Jacques, J., et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981); Wilen, S.H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); и Wilen, S.H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p.268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972).
Следует отметить, что если возникает противоречие между изображенной структурой и названием, приведенным для указанной структуры, то изображенная структура имеет приоритет. Кроме того, если стереохимия структуры или части структуры не обозначена, например, жирными или пунктирными линиями, то следует считать, что структура или часть структуры охватывает все возможные для нее стереоизомеры.
5.9. Введение PINK клеток, плацентарного перфузата человека или комбинированных натуральных клеток-киллеров
Указанные PINK клетки, клетки плацентарного перфузата человека, комбинированные натуральные клетки-киллеры, популяции клеток, содержащие указанные клетки, или их комбинации могут вводиться индивиду, например, индивиду, имеющему опухолевые клетки, в частности, больному раком, любым известным из области техники медицински приемлемым способом, который пригоден для осуществления введения живых клеток. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут быть хирургически имплантированы, введены посредством инъекции, вливания, например, с помощью катетера или шприца, или же введены непосредственно или опосредованно в то место, которое требуется восстановить или нарастить. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки вводят индивиду внутривенно. В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные клетки вводят индивиду по месту расположения опухоли, например, солидной опухоли. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, когда индивид имеет опухоли более чем в одном месте, указанные клетки вводят, по крайней мере, в два места или во все места расположения опухолей. В других конкретных вариантах осуществления изобретения клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, или композиции, содержащие указанные клетки, вводят перорально, интраназально, внутриартериально, парентерально, офтальмологически, внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, интрацеребрально, интравентрикулярно, интрацеребровентрикулярно, внутриоболочечно, интрацистернально, интраспинально или периспинально. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения указанные клетки доставляют с помощью внутричерепных или внутрипозвоночных игл и/или катетеров, снабженных или не снабженных насосным устройством.
Указанные PINK клетки, клетки плацентарного перфузата человека, комбинированные натуральные клетки-киллеры или их комбинации или популяции клеток, содержащие подобные клетки, могут вводиться индивиду в виде композиции, например, в виде матрицы, гидрогеля, клеточного каркаса и т.п., которые включают клетки.
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаемые в настоящем изобретении клетки высевают на природной матрице, в частности, биоматериале плаценты, таком как вещество амниотической мембраны. Подобным веществом амниотической мембраны может быть, например, амниотическая мембрана, непосредственно отделенная от плаценты млекопитающего; зафиксированная или подвергнутая термообработке амниотическая мембрана, практически высушенная (т.е. содержащая <20% НО) амниотическая мембрана, мембрана хориона, практически высушенная мембрана хориона, практически высушенная амниотическая мембрана и мембрана хориона и т.п. Предпочтительные биоматериалы плаценты, на которые могут высеваться стволовые клетки плаценты, описаны Hariri в опубликованной заявке на патент США № 2004/0048796, содержание которой целиком включено в настоящее описание посредством ссылки.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения указанные PINK клетки, клетки плацентарного перфузата человека, комбинированные натуральные клетки-киллеры или их комбинации или популяции клеток, содержащие подобные клетки, суспендируют в растворе гидрогеля, пригодного, например, для инъекции. Подходящие гидрогели для подобных композиций включают самоорганизующиеся пептиды, такие как RAD16. В одном варианте осуществления настоящего изобретения раствору гидрогеля, содержащего указанные клетки, дают отвердеть, например, в форме, при этом образуется матрица, в которой диспергированы предназначенные для имплантации клетки. Клетки в подобной матрице можно также культивировать таким образом, что перед имплантацией клетки митотически размножаются. Гидрогель может быть, например, органическим полимером (натуральным или синтетическим), который перекрестно сшит посредством ковалентных, ионных или водородных связей с образованием трехмерной структуры с открытой решеткой, которая удерживает молекулы воды, образуя гель. Образующие гель вещества включают полисахариды, такие как альгинат или его соли, пептиды, полифосфазины и полиакрилаты, которые сшиты ионными связями, или блочные сополимеры, такие как блочные сополимеры полиэтиленоксида и пропиленгликоля, которые сшиваются под действием температуры или pH, соответственно. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гидрогель или матрица по настоящему изобретению является биоразлагаемой.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения получение представляет собой in situ полимеризацию (см., в частности, опубликованную заявку на патент США № 2002/0022676; Anseth et al., J. Control Release, 78(1-3):199-209 (2002); Wang et al., Biomaterials, 24(22):3969-80 (2003)).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полимеры, по крайней мере, частично растворимы в водных растворах, таких как вода, забуференные солевые растворы или водно-спиртовые растворы, и содержат несущие заряд боковые группы или их одновалентные ионные соли. Примерами полимеров, имеющих кислотные боковые группы, которые могут взаимодействовать с катионами, являются поли(фосфазены), поли(акриловые кислоты), поли(метакриловые кислоты), сополимеры акриловой кислоты и метакриловой кислоты, поли(винилацетат) и сульфонированные полимеры, такие как сульфонированный полистирол. Могут также использоваться сополимеры, имеющие боковые кислотные группы, которые образованы взаимодействием акриловой или метакриловой кислоты и мономерами или полимерами виниловых эфиров. Примерами кислотных групп являются группы карбоновых кислот, группы сульфоновой кислоты, галогенсодержащие (предпочтительно, фторсодержащие) спиртовые группы, ОН группы фенолов и кислые ОН группы.
Стволовые клетки плаценты по настоящему изобретению или их совместные культуры можно высевать на трехмерную структуру или каркасное соединение и имплантировать in vivo. Подобную структуру можно имплантировать в комбинации с любым одним или несколькими факторами роста, клетками, лекарствами и другими компонентами, которые стимулируют образование тканей или каким-либо другим образом усиливают или улучшают осуществление настоящего изобретения.
Примеры каркасных соединений, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают нетканые каркасные структуры, пористые пенопласты или самоорганизующиеся пептиды. Нетканые каркасные структуры можно получить с использованием волокон, которые содержат синтетический поглощающий сополимер гликолевой кислоты и молочной кислоты (например, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). В качестве каркасной структуры могут также использоваться пенопласты, приготовленные, например, из сополимера поли(ε-капролактон)/поли(гликолевая кислота) (PCL/PGA), который получают с помощью таких способов, как сублимационная сушка или лиофилизация (см., в частности, патент США № 6355699).

Стволовые клетки плаценты по настоящему изобретению можно также высевать на или вводить во взаимодействие с физиологически приемлемыми керамическими веществами, включая, однако этим не ограничиваясь, моно-, ди-, три-, альфа-три-, бета-три- и тетракальцийфосфат, гидроксиапатит, фторапатиты, сульфаты кальция, фториды кальция, оксиды кальция, карбонаты кальция, магнийкальцийфосфаты, биологически активные стекла, такие как BIOGLASS, и их смеси. Пористые биосовместимые керамические вещества, которые в настоящее время коммерчески доступны, включают SURGIBONE (CanMedica Corp., Канада), ENDOBON (Merck Biomaterial France, Франция), CEROS (Mathys, AG, Bettlach, Швейцария) и минерализованные коллагены, применяемые для имплантации костей, такие как HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) и VITOSS, RHAKOSS™ и CORTOSS (Orthovita, Malvern, Pa.). Трехмерная структура может представлять собой смесь, композицию или композит натуральных и/или синтетических веществ.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, стволовые клетки плаценты можно высевать на войлок или вводить во взаимодействие с войлоком, который может быть, например, быть образован многожильной нитью, которую приготавливают из биопоглощающего вещества, такого как сополимеры или смеси PGA, PLA, PCL или гиалуроновой кислоты.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, стволовые клетки плаценты по настоящему изобретению можно высевать на каркасные пенопласты, которые могут представлять собой композитную структуру. Подобным каркасным пенопластам можно с помощью пресс-формы придать необходимую форму, например, в виде части конкретной структуры в теле человека, которую необходимо восстановить, заменить или нарастить. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения каркасную структуру перед инокуляцией клеток по настоящему изобретению обрабатывают, например, 0,1М раствором уксусной кислоты с последующим инкубированием в полилизине, PBS и/или коллагене, чтобы усилить прикрепление. Внешние поверхности матрицы можно модифицировать с тем, чтобы улучшить присоединение или усилить рост клеток и дифференцировку ткани, например, путем плазменного осаждения на матрицу или добавления одного или нескольких белков (в частности, коллагенов, эластичных волокон, сетчатых волокон), гликопротеинов, гликозаминогликанов (в частности, сульфата гепарина, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, сульфата дерматана, сульфата кератина и т.д.), клеточного матрикса и/или других веществ, таких как, однако этим не ограничиваясь, желатин, альгинаты, агар, агароза, смолистые вещества растительного происхождения и т.п.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения каркасное соединение не является тромбогенным или его обрабатывают с помощью веществ, которые придают ему нетромбогенные свойства. Подобные обработки и вещества также могут способствовать росту или поддерживать рост эндотелия, миграцию и осаждение внеклеточного матрикса. Примеры подобных веществ и обработок включают, однако этим не ограничиваясь, натуральные вещества, такие как белки базальной мембраны, например, ламинин и коллаген IV типа, синтетические вещества, такие как EPTFE, и сегментированные полиуретаномочевиновые кремнийорганические соединения, такие как PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Калифорния). Каркасное соединение может также представлять собой антитромботические средства, такие как гепарин; каркасные соединения перед высеванием стволовых клеток плаценты можно также обработать, с целью изменить заряд на поверхности (в частности, нанести покрытие в плазме).
6. ПРИМЕРЫ
6.1. Пример 1. Изучение свойств вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты, выделенных из плацентарного перфузата и пуповинной крови
В данном примере показано выделение и культивирование натуральных клеток-киллеров из плацентарного перфузата человека.
7
7
8
-
-
+
-
+
-
+
-
+
+
Выделение натуральных клеток-киллеров плаценты. Натуральные клетки-киллеры выделяют из 8 единиц плацентарного перфузата человека (HPP) и из 4 единиц пуповинной крови (UCB) с помощью CD56-связанных микрошариков. Выделение PINK клеток проводят путем селекции с использованием магнитных микрошариков (Miltenyi Biotec). Плаценту после родов освобождают от крови и перфузируют с помощью раствора для перфузии (0,9% NaCl раствор для инъекций, качество которого соответствует Фармакопее США (номер по каталогу 68200-804, VWR) в количестве от приблизительно 200 до приблизительно 750 мл. Перфузат, не проходивший какую-либо обработку, собирают и удаляют из него эритроциты. Одноядерные клетки из HPP или UCB промывают один раз буферным раствором (RPMI 1640 без фенолового красного плюс 5% FBS) для проведения флуоресцентно-активированного клеточного сортинга (FACS), а затем центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 6 мин. Подсчитывают число клеток и сгусток клеток вновь суспендируют в 80 мкл буфера на 10 всех частиц с 20 мкл CD3 микрошариков (номер по каталогу 130-050-101, Miltenyi). Систему хорошо перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при температуре 4-8°С. Добавляют 1-2 мл буферного раствора на 10 всех частиц, а затем смесь центрифугируют с ускорением 300×g в течение 10 мин. Жидкость над осадком полностью удаляют с помощью пипетки. Сгусток клеток вновь суспендируют в количестве до 10 клеток на 500 мкл буфера и подготавливают для проведения магнитного разделения. Колонку LS (Miltenyi Biotec) помещают в магнитное поле клеточного сепаратора MIDIMACS™ (Miltenyi Biotec), промывают колонку с помощью 3 мл буферного раствора и помещают в колонку суспензию из клеток и микрошариков. Собирают не содержащие метку клетки CD3, которые прошли через колонку и которые включают натуральные клетки-киллеры, вместе с 2×3 мл используемого для промывки буфера. Клетки CD3 подсчитывают, промывают один раз, а затем окрашивают с помощью микрошариков CD56 MicroBeads (номер по каталогу 130-050-401, Miltenyi) и выделяют/отделяют по той же самой методике, которую использовали для вышеописанного отделения с помощью микрошариков CD3. Так собирают популяцию CD56CD3, которая готова для проведения дальнейшего анализа. Диапазон процентного содержания натуральных клеток-киллеров составляет от 3,52 до 11,6 (медиана: 6,04, среднее значение: 5,22) для HPP и от 1,06 до 8,44 для UCB (медиана: 3,42, среднее значение: 4,2). Выделение натуральных клеток-киллеров из HPP с использованием микрошариков CD56 дает популяцию, которая имеет чистоту приблизительно 80%. См. фиг. 1. Среди всей популяции натуральных клеток-киллеров CD56, CD3, диапазон процентного содержания натуральных клеток-киллеров CD56, CD16 (т.е. PINK клеток) составляет от 56,6 до 87,2 (медиана: 74,2, среднее значение: 65,5) для HPP и 53,7 до 96,6 (медиана: 72,8) для UCB. Диапазон процентного содержания натуральных клеток-киллеров CD56, CD16 составляет от 12,8 до 43,3 (медиана: 25,8, среднее значение: 34,5) для HPP и от 3,4 до 46,3 (медиана: 27,3, среднее значение: 33,4) для UCB.
7
+
-
В других экспериментах натуральные клетки-киллеры выделяют, используя набор реагентов для проведения негативного отбора с помощью магнита, который нацеливается на антигены, располагающиеся на поверхности клеток крови человека (CD3, CD4, CD14, CD19, CD20, CD36, CD66b, CD123, HLA-DR, гликофорин A). Хранящиеся при криогенной температуре единицы HPP и UCB оттаивают и разбавляют в соотношении 1:1 средой для оттаивания (RPMI Media 1640 (номер по каталогу 22400, Gibco) плюс 20% сыворотки плода коровы, деактивированной термообработкой (номер по каталогу SH30070.03, Hyclone)) и центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 8 мин. Жидкость над осадком отделяют и обрабатывают хлоридом аммония, с целью дальнейшего освобождения от эритроцитов; каждую единицу вновь суспендируют приблизительно в 30 мл охлажденного льдом буфера для FACS (RPMI 1640, без фенолового красного, плюс 5% FBS), а затем добавляют 60 мл охлажденного льдом хлорида аммония (номер по каталогу 07850, Stem Cell), раствор энергично перемешивают и затем инкубируют на льду в течение 5 мин. Затем одноядерные клетки 3 раза промывают буфером для FACS и центрифугируют со скоростью 1500 об/мин в течение 8 мин. Посчитывают количество клеток и сгусток клеток вновь суспендируют в количестве 5×10 живых клеток на миллилитр буфера RoboSep Buffer (номер по каталогу 20104, Stem Cell), а также добавляют к суспензии клеток 0,1 мг/мл раствора ДНКазы I (номер по каталогу 07900, Stem Cell), осторожно перемешивают с помощью пипетки и перед проведением выделения инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Перед выделением из суспензии клеток с помощью фильтрации на нейлоновом перколяторе с размером ячеек 40 мкм (номер по каталогу 352340, BD Falcon) удаляют скопления клеток. Выделение проводят в автоматическом режиме в устройстве RoboSep (номер по каталогу 20000, Stem Cell) по программе “Human NK Negative Selection 19055 and high recovery” (добавляют 50 мкл/мл коктейля, добавляют 100 мкл/мл микрочастиц, инкубируют в течение 10 и 5 мин, разделяют в течение 1×2,5 мин) с использованием набора реагентов для обогащения натуральных клеток-киллеров человека Human NK Cell Enrichment Kit (номер по каталогу 19055, Stem Cell), включая коктейль для негативного отбора EasySep Negative Selection Human NK Cell Enrichment Cocktail и магнитные частицы EasySep Magnetic Microparticles. Указанным образом получают популяцию CD56CD3, которая готова для проведения дальнейшего анализа.
-5
+
-
5
6
2
Размножение натуральных клеток-киллеров. В общем случае, натуральные клетки-киллеры (NK) размножают следующим образом. Готовят исходную среду для культуры натуральных клеток-киллеров, используя модифицированную методику, которая описана в Yssel et al., J. Immunol. Methods 72(1):219-227 (1984) и Litwin et al., J. Exp. Med. 178(4):1321-1326 (1993). Если коротко, то исходная среда включает IMDM (Invitrogen) с 10% FCS (Hyclone) и содержит следующие конечные концентрации реагентов: 35 мкг/мл трансферина (Sigma-Aldrich), 5 мкг/мл инсулина (Sigma-Aldrich), 2×10 M этаноламина (Sigma-Aldrich), 1 мкг/мл олеиновой кислоты (Sigma-Aldrich), 1 мкг/мл линолевой кислоты (Sigma-Aldrich), 0,2 мкг/мл пальмитиновой кислоты (Sigma-Aldrich), 2,5 мкг/мл BSA (Sigma-Aldrich) и 0,1 мкг/мл фитогемаглютинина (PHA-P, Sigma-Aldrich). Натуральные клетки-киллеры CD56CD3 вновь суспендируют с концентрацией 2,5×10 живых клеток на миллилитр исходной среды плюс 200 ед./мл IL-2 (R&D Systems) в клеточной культуре, помещенной на 24-луночный планшет или в Т-колбу. В исходную среду в качестве фидера совместно добавляют обработанные митомицином С аллогенные клетки PBMC и К562 (клеточная линия хронического миелогенного лейкоза) до конечной концентрации 1×10 на миллилитр. NK клетки выращивают в питательной среде в течение 5-6 дней при температуре 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО. Через 5-6 дней, а затем через каждый 3-4 дня в культуру добавляют равный объем поддерживающей среды (IMDM с 10% FCS, 2% сыворотки AB человека, антибиотики, L-глутамин и 400 единиц IL-2 на миллилитр). NK клетки собирают на 21 день.

-
+
+
+
5
Изучение свойств вспомогательных натуральных клеток-киллеров, выделенных из плаценты. Имеющие общего донора образцы HPP и CB оттаивают и промывают с помощью буфера для FACS (RPMI-1640 с 5% FBS). Затем, в соответствии с инструкцией изготовителя, натуральные клетки-киллеры обогащают с помощью микрошариков CD56, использую магнитную разделительную систему ROBOSEP (StemCell Technologies). Обогащенную с помощью CD56 популяцию натуральных клеток-киллеров окрашивают следующими антителами (если специально не оговорено, то поставляются компанией BD Bioscience) для определения иммунофенотипа: против CD56, конъюгированные с PE-Cy-7, против CD3 APC Cy7, против CD16 FITC, против NKG2D APC, против NKp46 APC, против CD94 PE(R&D), против NKB1 PE и против KIR-NKAT2 PE. CD94, NKG2D и NKp46 не содержат маркеров, или показывают пониженную экспрессию в предшественниках NK клеток, но присутствуют в полностью дифференцированных NK клетках. См. Freud et al., “Evidence for Discrete States of Human Natural Killer Cell Differentiation In Vivo” J. Exp. Med. 203(4):1033-1043 (2006); Eagle & Trowsdale, “Promiscuity and the Single Receptor: NKG2” Nature Reviews Immunology, опубликовано на веб-узле в Сети 3 августа 2007 г.; Walzer et al., “Natural Killer Cells: From CD3NKp46 to Post-Genomics Meta-Analyses” Curr. Opinion Immunol. 19:365-372 (2007). Как указано в таблице 1, экспрессия KIR3DL1, KIR2DL2/L3, NKG2D, NKp46 и CD94 незначительно различается между обогащенной популяцией клеток CD56 из HPP и HLA-совместимой популяцией клеток CD56 из пуповинной крови (CB).
6.2. Пример 2: Исследование вспомогательных натуральных клеток-киллеров плаценты, выделенных из объединенных плацентарного перфузата и пуповинной крови
Одноядерные клетки пуповинной крови и плацентарного перфузата (combo) от одного донора смешивают и промывают один раз буфером FACS (RPMI-1640 с 5% FBS) и проводят определение иммунофенотипа с помощью антител, приведенных в таблице 2 на BD FACSCanto (BD Biosciences). Полученные данные анализируют с использованием программного обеспечения FlowJo software (Tree Star).
Таблица 2Перечень антител, которые применяют для исследования иммунофенотипа
Название
Производитель
Номер по каталогу
FITC против hu CD3
BD Bioscience
555332
FITC против hu CD3
Miltenyi
130-080-401
APC-Cy7 против hu CD3
BD Bioscience
557832
FITC против hu CD16
BD Bioscience
555406
PE-Cy5 против hu CD16
BD Bioscience
555408
PE против hu CD56
BD Bioscience
555516
PE против hu CD56
Miltenyi
130-090-755
PE-CY5 против hu CD56
BD Bioscience
555517
PE-Cy7 против hu CD56
BD Bioscience
557747
PE против hu CD94
R&D
FAB-1058P
PE против hu KIR-NKAT2 (2DL2/L3)
BD Bioscience
556071
PE против hu NKB1 (3DL1)
BD Bioscience
555967
APC против hu NKG2D
BD Bioscience
558071
APC против hu NKp46
BD Bioscience
558051
PE против hu CD226
BD Bioscience
559789
PE против hu NKp44
BD Bioscience
558563
PE против hu NKp30
BD Bioscience
558407
PE против hu 2B4
BD Bioscience
550816
изотип FITC IgG1 мыши
BD Bioscience
340755
изотип FITC IgG2b мыши
BD Bioscience
556577
изотип PE IgG1 мыши
BD Bioscience
340761
изотип PE IgG2b мыши
BD Bioscience
555743
изотип PerCP IgG1 мыши
BD Bioscience
340762
изотип PE-Cy5 IgG2b мыши
BD Bioscience
555744
изотип APC IgG1 мыши
BD Bioscience
340754
изотип APC IgG2a мыши
BD Bioscience
555576
изотип APC-Cy7 IgG1 мыши
BD Bioscience
348802
изотип PE-Cy5 IgG1 мыши
BD Bioscience
348798
+
+
+
-
+
+
+
-
Исследование иммунофенотипа NK клеток плаценты и NK клеток периферической крови (PB). Натуральные клетки-киллеры можно разделить на две основные группы: NK клетки CD56CD16 и клетки CD56CD16. NK клетки CD56CD16 имеют множество цитолитических гранул и показывают высокую экспрессию CD16, а потому способны вызывать опосредованную антителами клеточную цитотоксичность (ADCC). Напротив, NK клетки CD56CD16 имеют очень мало цитолитических гранул, показывают низкую экспрессию или совсем не экспрессируют CD16, однако при активации способны продуцировать цитокины и хемокины. Индивидуальные натуральные клетки-киллеры демонстрируют разнообразный набор комбинаций активирующих и ингибирующих рецепторов, включая иммуноглобулиноподобные рецепторы клеток-киллеров (KIRs, в частности, KIR3DL1 и KIR2DL2/3), естественные рецепторы цитотоксичности NCRs (в частности, NKp30, NKp44 и NKp46), лектиноподобные рецепторы клеток-киллеров (KLRs; в частности, CD94, NKG2D), 2B4 и CD226.
-
+
-
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
FACS анализ проводят для натуральных клеток-киллеров плаценты и натуральных клеток-киллеров периферической крови с помощью флуоресцентно-связанных моноклональных антител против специфических рецепторов натуральных клеток-киллеров. Среди исследованных 11 подгрупп натуральных клеток-киллеров полученные значения для количества клеток в семи из 11 подгрупп натуральных клеток-киллеров (CD3CD56CD16, CD3CD56CD16, CD3CD56KIR2DL2/3, CD3CD56NKp46, CD3CD56NKp30, CD3CD562B4 и CD3CD56CD94) показывают значимое различие (p<0,05) между натуральными клетками-киллерами плаценты и натуральными клетками-киллерами периферической крови (отвечают за 64% различий) (таблица 3А; см. также таблицы 3В и 3С).
-
+
-
-
+
+
Таблицы 3В и 3С показывают исследование фенотипа NK клеток CD3CD56CD16 и NK клеток CD3CD56CD16 в 16 единицах объединенной пуповинной крови и плаценты человека от одного донора (combo) и в 13 единицах периферической крови (PB) в отдельном эксперименте.
+
-
+
-
-
+
+
-
+
+
-
+
+
-
+
+
60,9% натуральных клеток-киллеров плаценты представляют собой клетки CD56CD16 (вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты, PINK клетки) в то время как лишь 21,4% натуральных клеток-киллеров периферической крови являются клетками CD56CD16. После выращивания в питательной среде в течение 21 дня процент в четырех из 11 подгрупп натуральных клеток-киллеров (CD3CD56KIR2DL2/3, CD3CD56NKp46, CD3CD56NKp44 и CD3CD56NKp30) показывает значимое различие (p<0,05) между натуральными клетками-киллерами плаценты и периферической крови (таблица 4).
Кроме того, в отдельном эксперименте показывают, что после выращивания в питательной среде в течение 21 дня NK клетки плацентарной и периферической крови демонстрируют уникальные профили цитокинов, в частности, для IL-8, что определяют с помощью флуоресцентного анализа Luminex (таблица 5).
6
Определение профиля микроРНК натуральных клеток-киллеров плаценты и натуральных клеток-киллеров периферической крови. Выделенные или размноженные натуральные клетки-киллеры используют для приготовления микроРНК (miRNA) с помощью набора реагентов для выделения микроРНК MIRVANA™ miRNA Isolation Kit (Ambion, номер по каталогу 1560). Натуральные клетки-киллеры (от 0,5 до 1,5×10 клеток) деструктурируют в денатурирующем буфере для лизиса. Затем образцы экстрагируют смесью кислота–фенол + хлороформ, чтобы выделить РНК, в значительной степени обогащенные образцами небольших РНК. Добавляют 100%-ый этанол таким образом, чтобы концентрация этанола в образце составила 25%. Когда полученную смесь лизат/этанол пропускают через воронку со стеклянным фильтрующим дном, то большие РНК иммобилизуются, а небольшие РНК собирают в фильтрате. Затем концентрацию этанола в фильтрате повышают до 55% и смесь пропускают через стеклянный фильтр, на котором иммобилизуются небольшие РНК. Указанные РНК несколько раз промывают и элюируют раствором с малой ионной силой. Концентрацию и чистоту извлеченных небольших РНК определяют, измеряя их поглощение на длине волны 260 и 280 нм.
miRNAs, которые, как показано, уникальны для PINK клеток, приведены в таблице 6. Было установлено, что одна miRNA, обозначенная как has-miR-199b, уникальная для NK клеток периферической крови.
Определение иммунофенотипа выращенных в питательной среде NK клеток плаценты и некультивированных NK клеток. Полный спектр свойств выращенных в питательной среде PINK клеток определяют путем проведения обширных исследований иммунофенотипа и изучения цитотоксичности. Для определения фенотипа размноженных NK клеток проводят анализ экспрессии рецепторов натуральных клеток-киллеров (NKRs), таких как KIRs, NKG2D, NKp46, NKp44 и 2B4. Изучение цитотоксичности проводят, помечая опухолевые клетки (клетки К562) с помощью РКН26, а затем в течение 4 час культивируют совместно с PINK клетками. Начиная со дня 0 по 21 день экспрессия NKG2D возрастает с 60,9%±4,8% до 86%±17,4% (значение p 0,024); экспрессия NKp46 возрастает с 10,5%±5,4% до 82,8%±9,0% (значение p 0,00002); экспрессия NKp44 возрастает с 9,6%±6,5% до 51,6%±27,5% (значение p 0,022); а экспрессия 2B4 снижается с 13,0%±7,1% до 0,65%±0,5% (значение p 0,009) (таблица 7). В указанных условиях культивирования ингибиторные KIRs, включая KIR3DL1 (иммуноглобулиноподобный рецептор клеток-киллеров, три домена, длинный цитоплазматический хвост 1, ингибиторный рецептор) и KIR2DL2/L3 (иммуноглобулиноподобный рецептор клеток-киллеров, два домена, длинный цитоплазматический хвост 2 и длинный цитоплазматический хвост 3; ингибиторные рецепторы) остаются без изменения при размножении в течение 21 дня. Кроме того, изменения в экспрессии NKRs коррелируют с заметным увеличением цитолитической активности на 21-й день, по сравнению с 14-м днем, по отношению к клеткам К562 (63%±15% против 45%±4%, значение p 0,0004). Полученные данные позволили идентифицировать предполагаемые маркеры NK клеток, которые хорошо коррелируют с цитотоксической активностью натуральных клеток-киллеров.
Определение мембранного протеомического профиля выращенных в питательной среде NK клеток плаценты и выращенных в питательной среде NK клеток периферической крови с использованием методики иммобилизации с помощью липидов и методом ЖХ/МС с линейной ионной ловушкой. Очистка мембранного белка:Натуральные клетки-киллеры плаценты из комбинированного плацентарного перфузата и клеток пуповинной крови, а также натуральные клетки-киллеры PB, которые выращивают в питательной среде в течение 21 дня, инкубируют в течение 15 мин с раствором коктейля ингибиторов протеазы (P8340, Sigma Aldrich, St. Louis, MO; содержит 4-(2-аминоэтил)бензол-сульфонилфторид (AEBSF), пепстатин А, Е-64, бестаин, лейпептин и апротинин без комплексонов металлов) перед проведением лизиса клеток. Затем клетки подвергают лизису, добавив 10 мМ раствор HCl, который не содержит детергентов, и центрифугируют в течение 10 мин с ускорением 400×g с тем, чтобы получить сгусток клеток и удалить ядра. Супернатант после удаления ядер переносят в пробирку ультрацентрифуги и центрифугируют на ультрацентрифуге WX80 с ротором Т-1270 (Thermo Fisher Scientific, Asheville, NC) с ускорением 100000×g в течение 150 мин, при этом получают сгусток мембранного белка.
Получение, иммобилизация и ферментация протеолипосом: Сгусток мембранного белка промывают несколько раз буфером NANOXIS (10 мМ Tris, 300 мМ NaCl, pH 8). Сгусток мембранного белка суспендируют в 1,5 мл буфера NANOXIS, а затем при охлаждении льдом подвергают ультразвуковой обработке на ультразвуковой установке с насадкой VIBRA-CELL™ VC505 (Sonics & Materials, Inc., Newtown, CT) в течение 20 мин. Размер протеолипосом определяют окрашиванием с помощью красителя FM1-43 (Invitrogen, Carlsbad, CA) и получают визуальное изображение с помощью флуоресцентного микроскопа. Концентрацию белка в суспензии протеолипосом определяют анализом BCA (Thermo Scientific). Протеолипосомы затем инжектируют в LPI™Flow Cell (Nanoxis AB, Gothenburg, Швеция) с помощью стандартной пипетки с наконечником и оставляют для иммобилизации на 1 час. После иммобилизации проводят серию операций отмывки и непосредственно в LPI™Flow Cell инжектируют 5 мкг/мл трипсина (Princeton Separations, Adelphi, NJ). Гранулят инкубируют в течение ночи при температуре 37°С. Затем триптические пептиды элюируют из гранулята и обессоливают с помощью картриджа Sep-Pak cartridge (Waters Corporation, Milford, MA).
Фракционирование на колонке с сильным катионным обменом: Триптические пептиды восстанавливают в растворе 0,1% муравьиная кислота/вода и помещают в колонку с сильным катионным обменом (SCX) TOP-TIP™ (PoIyLC, Columbia, MD), наконечник пипетки заполняют 30 мкм насадкой из полисульфоэтиласпартамида. Пептиды элюируют из SCX TOP-TIP™ в ступенчатом градиенте буфера на основе формиата аммония, pH 2,8 (10 мМ–500 мМ). Каждую SCX фракцию сушат с помощью системы speed-vac и вновь восстанавливают в 5%-ом ацетонитриле, 0,1%-ой муравьиной кислоте, подготавливая к последующему анализу ЖХ/МС.
LTO ЖХ/МС анализ с линейной ионной ловушкой: Каждую SCX фракцию отделяют на колонке 0,2 мм × 150 мм 3 мкм 200 Å MAGIC C18 (Michrom Bioresources, Inc., Auburn, CA), непосредственно сопряженной с аксиальным источником для электрораспылительной ионизации в нанопотоке с десольватацией в вакууме (ADVANCE) (Michrom Bioresources, Inc.), используя градиентное элюирование в течение 180 мин (буфер А: вода, 0,1% муравьиная кислота; Буфер В: ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота). Источник ADVANCE позволяет добиться чувствительности, которая сопоставима с традиционной ионной ловушкой высокой емкости nanoESI, но при этом работать при значительно большей объемной скорости потока, составляющей 3 мкл/мин. Элюированные пептиды анализируют на масс-спектрометре с LTO линейной ионной ловушкой (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA), для которого применяют десять зависимых от данных МС/МС сканирований после полной развертки каждого масс-спектра.
Биоинформатика: Шесть файлов RAW, соответствующих 6 солевым фракциям, которые собирают для каждой клеточной линии опухолевых клеток (AML, CML), изучают путем однократного поиска относительно базы данных IPI Human Database, применяя алгоритм SEQUEST, с помощью автоматизированного рабочего места SORCERER™ SOLO™ (Sage-N Research, San Jose, CA). Задают 1,2 ат. ед. массы для допустимого отклонения массы пептида, окисление метионина принимают за дифференциальную модификацию, а карбамидометилирование принимают за статическую модификацию. Для сортировки и анализа протеомических данных для мембраны используют вариант Scaffold программного обеспечения Trans-Proteomic Pipeline (TPP). Белки допускают для проведения анализа, если их идентифицируют с пептидной вероятностью 95%, белковой вероятностью 95% и 1 уникальный пептид. Сравнение наборов протеомических данных для мембраны проводят с помощью метода Perl scripts, специально разработанного в компании, которую представляют авторы изобретения.
Анализ показывает, что идентифицированы 8 мембранных белков из выращенных в питательной среде NK клеток, которые уникальны по отношению к мембранным белкам, идентифицированным из NK клеток периферической крови. См. таблицу 8. Кроме того, 8 мембранных белков идентифицированы из NK клеток периферической крови, которые уникальны по отношению к выращенным в питательной среде NK клеткам плаценты. См. таблицу 8. Было установлено, что лишь 10 идентифицированных мембранных белков распределяются как среди культивированных NK клеток плаценты, так и среди NK клеток периферической крови.
Таблица 8
Белки, специфичные для NK клеток плаценты
Белки, специфичные для NK клеток периферической крови
Аминопетидаза N
Предшественник рецептора 4 фактора роста фибробластов
Аполипопротеин Е
Нуклеотид-4-подобный иммуноассоциированный белок 1
Белок 1, взаимодействующий с атропином-1
Предшественник интегрина альфа-L
Иннексин inx-3
Предшественник интегрина бета-2
Предшественник интегрина альфа-2
Предшественник интегрина бета-4
Предшественник интегрина бета-5
Предшественник мембранной литической муреинтрансгликозилазы D
Предшественник гликопротеина GP49B поверхности тучной клетки
Связывающий оксистерин протеин-связанный белок 8
Рецептор 1 рианодина
Предшественник перфорина 1
6.3. Пример 3: Цитотоксичность натуральных клеток-киллеров по отношению к опухолевым клеткам
Данный пример показывает, что вспомогательные натуральные клетки-киллеры плаценты обладают цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам. PINK клетки из HPP цитотоксичны по отношению к клеткам острого миелогенного лейкоза, что подтверждает анализ цитотоксичности и анализ Luminex секреции цитокинов NK клетками.
В анализе секреции цитокинов обогащенные микрошариками CD56 натуральные клетки-киллеры из HPP смешивают с клетками KG-1a острого миелогенного лейкоза в соотношении 1:1. После инкубирования в течение 24 час собирают надосадочную жидкость и проводят анализ Luminex секреции IFN-γ и GM-CSF. Повышенные уровни IFN-γ и GM-CSF наблюдаются после 24-часового инкубирования CD56-обогащенных клеток HPP с клетками KG-1a, как показано на фиг. 2.
Цитотоксичность PINK клеток
+
-
образец
контроль
При проведении анализа цитотоксичности с использованием PINK клеток опухолевые клетки-мишени помечают сукцинимидильным эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE). CFSE представляет собой витальный краситель, который нетоксичен по отношению к клеткам и перераспределяется между дочерними клетками в процессе деления клеток. Затем клетки помещают на 96-луночные планшеты с U-образным дном для тканевых культур и инкубируют со свежевыделенными PINK клетками CD56CD16 с соотношениями эффектор-мишень (E:T), равными 20:1, 10:1, 5:1 и 1:1, в среде RPMI 1640, дополненной 10% FBS. После 4 час инкубирования клетки собирают и исследуют методом проточной цитометрии на присутствие CFSE. Количество клеток-мишеней, выделенных из культуры без NK клеток, используют в качестве эталона. Цитотоксичность определяют как: (1-CFSE/CFSE)*100%. Значительная цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам наблюдается при соотношении 20:1. См. фиг. 3.
Чувствительность опухолевых клеток к выращенным в питательной среде PINK клеткам

+
-
+
+
2
Анализ по высвобождению лактатдегидрогеназы (LDH). Анализ по высвобождению LDH проводят с помощью набора реагентов для колориметрического определения цитотоксичности CYTOTOX 96 (Promega, номер по каталогу G1780). В этом анализе выращенные в питательной среде NK клетки, которые представляют собой комбинацию клеток CD56CD16 и клеток CD56CD16, выделенных из совместимых друг с другом HPP/UCB, являются клетками-эффекторами, а опухолевые клетки являются клетками-мишенями. Клетки-эффекторы и клетки-мишени помещают на 96-луночные планшеты с U-образным дном для тканевых культур и инкубируют при различных соотношениях эффектор-мишень (E:T) в 100 мкл среды RPMI 1640 без фенолового красного (Invitrogen, номер по каталогу 11835-030), дополненной 2% сыворотки AB человека (Gemini, номер по каталогу 100-512). Культуры инкубируют в течение 4 час при 37°C в 5% CO. После инкубирования 50 мкл надосадочной жидкости переносят на планшет для проведения ферментативного анализа, и активность LDH определяют в соответствии с рекомендациями изготовителя, а поглощение измеряют на длине волны 490 нм в ридере для ELISA (Synergy HT, Biotek). Степень цитотоксичности рассчитывают в соответствии со следующим уравнением: % Цитотоксичности = (Значение для образца - Произвольное значение для эффектора - Произвольное значение для мишени)/(Максимальное значение для мишени - Произвольное значение для мишени)*100%.
Некоторые опухолевые клетки могут легче взаимодействовать с NK клетками, чем другие. Для исследования чувствительности опухолевых клеток к выращенным в питательной среде PINK клеткам проводят исследование с использованием анализа по высвобождению LDH для двенадцати различных линий опухолевых клеток, которые совместно выращивают с PINK клетками. 12 линий опухолевых клеток включают хронический миелогенный лейкоз человека (CML), лимфому, ретинобластому (RB) и множественную миелому (ММ) (таблица 9). Цитотоксичность NK клеток определяют с помощью анализа по высвобождению LDH после 4-часового совместного выращивания в питательной среде.
Таблица 9Данные из ATCC для клеточных линий
Название
Описание
CCRF-CEM
Лейкоз человека
KG-1
Острый миелоидный лейкоз человека
KG-1A
Острый миелоидный лейкоз человека
K562
Хронический миелоидный лейкоз человека
KU812
Хронический миелоидный лейкоз человека
U-937
Гистиоцитная лимфома человека
WERI-RB-1
Ретинобластома человека
HCC2218
Рак груди человека
RPMI8226
Множественная миелома человека
HCT116
Колоректальная карцинома человека
HT29
Колоректальная аденокарцинома человека
U266
Множественная миелома человека
При отношении эффектора к мишени (E:T), равном 10:1, значительная цитотоксичность выращенных в питательной среде PINK клеток наблюдается по отношению к клеткам K562 (CML) с величиной 88,6%±5,6%, к клеткам U937 (лимфома) с величиной 89,2%±9,8%, к клеткам WERI-RB-1 (RB) с величиной 73,3%±11,8%, к клеткам RPMI8226 (MM) с величиной 61,3%±1,3% и к клеткам U266 (MM) с величиной 57,4%±4,7% (таблица 10).
Усиление цитотоксичности PINK клеток путем обработки леналидомидом и помалидомидом

6
Выделение и очистка РНК. Из выделенных или размноженных NK клеток с помощью набора реагентов RNAQUEOUS-4PCR (Ambion, номер по каталогу AM1914) получают РНК. Если коротко, то NK клетки (от 0,5 до 1,5×10 клеток) подвергают лизису в предназначенном для проведения лизиса растворе гуанидиния. Образец лизата затем смешивают с раствором этанола и наносят на фильтр из оксида кремния, который селективно и количественно связывает мРНК и более крупные РНК рибосом; очень маленькие РНК, такие как тРНК и рибосомная РНК 5S не связываются количественно. Затем фильтр промывают, чтобы удалить остаточные ДНК, белок и другие загрязнения, а РНК элюируют свободной от нуклеазы водой, которая содержит следы ЭДТК для хелатирования тяжелых металлов. Фильтр из оксида кремния устанавливают в небольшой картридж, который помещается в не содержащие РНКазу пробирки микроцентрифуги, которые поставляются вместе с набором реагентов. Образец лизата, промывные растворы и растворы после элюирования пропускают через фильтр с помощью центрифуги или применяя вакуумметрическое давление. После элюирования фильтра РНК обрабатывают сверхчистой ДНКазой 1, которая поставляется вместе с набором реагентов, чтобы удалить следовые количества ДНК. Наконец, ДНКазу и двухвалентные катионы удаляют с помощью реагента, также поставляемого вместе с набором реагентов. Концентрацию и чистоту выделенных РНК, определяют, измеряя поглощение на длине волны 260 нм и 280 нм.

Анализ методом количественной ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR). Выделенные РНК затем можно использовать для синтеза кДНК с помощью набора реагентов для обратной транскрипции TAQMAN (Applied Biosystems, номер по каталогу N8080234) с последующим анализом методом количественной ПЦР в режиме реального времени с использованием системы 7900HT Fast Real-Time PCR и иммунной матрицы человека (Applied Biosystems, номер по каталогу 4370573) и матрицы микроРНК человека (Applied Biosystems, номер по каталогу 4384792).
ex vivo
Леналидомид и помалидомид являются химическими аналогами талидомида с усиленной антираковой и противоспалительной активностями. Чтобы установить, способны ли леналидомид и помалидомид усиливать цитотоксичность PINK клеток,  культивированные PINK клетки (день 19) предварительно обрабатывают леналидомидом или помалидомидом в течение 24 час с последующим совместным выращиванием в питательной среде с клетками-мишенями клеточной линии колоректальной карциномы HCT-116. Обработанные леналидомидом NK клетки демонстрируют цитотоксичность 42,1%, а обработанные помалидомидом PINK клетки демонстрируют цитотоксичность 47,4%, в то время как контрольные NK клетки, не подвергавшиеся обработке, демонстрируют лишь цитотоксичность 24,3%.
Анализ методом количественной ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR) и методом проточной цитометрии показывает, что вызываемое помалидомидом усиление цитотоксичности NK клеток коррелирует с повышенной экспрессией гена (увеличение 60%±1,7%) гранзима В (GZMB) (таблица 11) и с повышенным процентом GZMB-позитивных NK клеток (увеличение 25%). Кроме того, экспрессия GM-CSF усиливается в обработанных леналидомидом (увеличение 232%±1,6%) и помалидомидом (увеличение 396%±0,3%) PINK клетках (таблица 11А, 11В).
Таблица 11А, 11В. Анализ qRT-PCR, обработанных леналидомидом и помалидомидом, выращенных в питательной среде PINK клеток, по сравнению с необработанными клетками. 11А: Кратное изменение экспрессии гена между обработанными леналидомидом и не обработанными леналидомидом образцами для поименованных генов. Для определения, равны ли кратные изменения в обработанных леналидомидом и не обработанных леналидомидом образцах, используют парный t-тест. 11В: Кратное изменение экспрессии гена между обработанными помалидомидом и не обработанными помалидомидом образцами для 25 поименованных генов. Для определения, равны ли кратные изменения в обработанных и не обработанных образцах, используют парный t-тест.
BAX – BCL2-ассоциированный белок ХCCL5 – лиганд 5 хемокина (мотив С-С)CCR5 – рецептор 5 хемокина (мотив С-С)CSF2 – колониестимулирующий фактор 2 (гранулоцит-макрофаг)FAS – суперсемейство генов рецептора TNF, член 6GUSB – глюкозидаза-βIL2RA – рецептор-α интерлейкина 2TNFSF18 – суперсемейство генов рецептора фактора некроза опухолей, член 18
ACTB – β-актинBAX – BCL2-ассоциированный белок ХCCL2 – лиганд 2 хемокина (мотив С-С)CCL3 – лиганд 3 хемокина (мотив С-С)CCL5 – лиганд 5 хемокина (мотив С-С)CCR5 – рецептор 5 хемокина (мотив С-С)CSF1 – колониестимулирующий фактор 1 (макрофаг)CSF2 – колониестимулирующий фактор 2 (гранулоцит-макрофаг)ECE1 – эндотелин-конвертирующий фермент 1FAS – суперсемейство генов рецептора TNF, член 6GNLY – гранулизинGUSB – глюкуронидаза-β
GZMB – гранзим В (гранзим 2, цитотоксическая Т-лимфоцит-ассоциированная серинэстераза 1)IL1A – α интерлейкин 1IL2RA – рецептор-α интерлейкина 2IL8 – интерлейкин 8IL10 – интерлейкин 10LTA – лимфотоксин α (суперсемейство TNF, член 1)PRF1 – перфорин 1 (образующий поры белок)PTGS2 – простагландин-эндопероксид-синтаза 2 (простагландин G/H синтаза и циклооксигеназа)SKI – гомолог вирусного онкогена v-ski саркомы (птичий)NBX21 – T-box 21
Цитотоксичность комбинированных натуральных клеток-киллеров
2
+
+
+
В отдельном анализе на цитотоксичность выращенные в питательной среде NK клетки, которые получают из взятых от одного донора образцов пуповинной крови и плацентарного перфузата, являются клетками-эффекторами, а опухолевые клетки являются клетками-мишенями. Опухолевые клетки помечают с помощью PKH26 (Sigma-Aldrich, номер по каталогу PKH26-GL) (см., в частности, Lee-MacAry et al., J. Immunol. Meth. 252(1-2):83-92 (2001)), который встраивается в цитоплазматическую мембрану клетки благодаря своему липофильному алифатическому остатку, а затем помещают на 96-луночные планшеты с U-образным дном для тканевых культур и инкубируют с выращенными в питательной среде NK клетками при различных соотношениях эффектор-мишень (E:T) в 200 мкл среды RPMI 1640, дополненной 10% FBS. Культуры инкубируют при 37°C в атмосфере 5% CO в течение 4 час. После инкубирования клетки собирают и в культуры добавляют TO-PRO-3 (Invitrogen, номер по каталогу T3605), не способный проникать сквозь мембрану краситель ДНК, до конечной концентрации 1 мкМ, а затем проводят анализ FACS с помощью BD FACSCanto. Цитотоксичность выражают в процентах отмерших клеток (PKH26TO-PRO-3) среди всех опухолевых клеток-мишеней PKH26.
+
+
+
В данном анализе на цитотоксичность клетки K562 хронической миелоидной лимфомы (CML) человека помечают с помощью PKH26, который встраивается в цитоплазматическую мембрану клетки, и помещают на 96-луночные планшеты с U-образным дном для тканевых культур. NK клетки плаценты (комбинированные) или NK клетки периферической крови, которые выращивают в питательной среде в течение 21 дня, смешивают с клетками K562 в соотношениях эффектор к мишени (E:T), равных 10:1, 5:1, 2,5:1 и 1,25:1, в среде RPMI 1640, дополненной 10% об./об. FBS. После инкубирования в течение 4 час клетки собирают и в клеточные культуры добавляют TO-PRO-3, а затем исследуют методом проточной цитометрии на присутствие PKH26 и TO-PRO-3. Цитотоксичность выражают в виде процента отмерших клеток PKH26TO-PRO-3 среди всех опухолевых клеток-мишеней PKH26. Как NK клетки плаценты, так и NK клетки периферической крови демонстрируют значительную токсичность по отношению к клеткам К562 для всех исследованных отношений E:T (фиг. 4). Значительно большая токсичность NK клетки плаценты, чем NK клеток периферической крови, по отношению к клеткам К562 наблюдается при двух соотношениях E:T, равных 10:1 и 5:1 (фиг. 4).
6.4. Пример 4: Цитотоксичность плацентарного перфузата человека по отношению к опухолевым клеткам.
образец
контроль
Данный пример показывает, что клетки плацентарного перфузата человека обладают цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам и что цитотоксичность совокупности ядросодержащих клеток из HPP (TNC-HPP) по отношению к KG-1a выше, чем цитотоксичность TNC, выделенных из совместимой UCB. Совокупность ядросодержащих клеток из HPP или пуповинной крови (UCB) смешивают с клетками KG-1a в соотношениях 1:1, 5:1, 10:1, 20:1 или 100: 1. После инкубирования в течение 24 час или 48 час клетки собирают и исследуют в присутствии CFSE с помощью анализа FACS (BD FACSCanto, BD Bioscience). В качестве контроля используют отдельно выращенные в питательной среде опухолевые клетки. Цитотоксичность определяют как: (1 - CFSE/CFSE)*100%. Значительная цитотоксичность была показана при соотношении 100:1. См. фиг. 5.
В отдельном эксперименте цитотоксичность совокупности ядросодержащих клеток из HPP сравнивают с цитотоксичностью совокупности ядросодержащих клеток из пуповинной крови. Совместимые TNC-HPP или UCB смешивают с клетками KG-1a в соотношениях 0,78:1, 1,56:1, 3,12:1, 6,25:1, 12,5:1, 25:1, 50:1 или 100:1. TNC-HPP показывают устойчиво более высокую цитотоксичность для всех сравниваемых соотношений, по сравнению с цитотоксичностью UCB. См. фиг. 6.
В другом эксперименте за 24 час до инкубирования с клетками KG-1a клетки TNC-HPP стимулируют с помощью 100 ед./мл или 1000 ед./мл IL-2, в то время как HPP, выращенные в среде RPMI, используют в качестве контроля. При отношении NK клеток к клеткам KG-1a, равном 6,25 или больше, IL-2 усиливает цитотоксичность TNC-HPP. См. фиг. 7.
5
4
Эксперименты продолжают, применяя более широкий спектр опухолевых клеток, как указано в таблице 12, при этом используют 5×10 клеток HPP и 1×10 опухолевых клеток.
Таблица 12Типы опухолевых клеток, исследованные на цитотоксическое действие плацентарного перфузата
HCC2218
Первичная карцинома из эпителия протоков человека
CCRF-CEM
Лейкоз человека
J.RT3-T3.5
Острый Т-клеточный лейкоз человека
K562
Хронический миелоидный лейкоз человека (CML)
KG-1
Острый миелоидный лейкоз человека
KG-1A
Острый миелоидный лейкоз человека (AML)
KU812
Лейкоз человека (CML)
NCI-H1417
Легочная карцинома человека
SNU-CI
Аденокарцинома ободочной кишки человека
U-937
Гистиоцитная лимфома человека
WERI-RB-1
Ретинобластома человека
HCT116
Колоректальная карцинома человека
HT29
Колоректальная аденокарцинома человека
U266
Миелома человека
Когда клетки HPP и опухолевые клетки совместно выращивают в питательной среде в течение 24 час или 48 час с соотношением 50:1, то клетки HPP показывают значительную токсичность по отношению к опухолевым клеткам. Для обоих указанных периодов времени совместное выращивание в питательной среде приводит к отмиранию более 50% опухолевых клеток. См. фиг. 8А и 8В.
6.5. Пример 5: Продукция цитокинов клетками плацентарного перфузата человека при воздействии опухолевых клеток
Для определения первичного механизма действия, который отвечает за опосредование действенных антилейкемических эффектов клетками HPP, анализируют профиль высвобождения цитокинов клетками HPP, которые выращивают в питательной среде совместно с клеточными линиями, и сравнивают с профилем высвобождения цитокинов клетками UCB в различные моменты времени, используя многократно повторяемые анализы по методу Luminex.
2005
Надосадочные жидкости, которые собирают после инкубирования, подвергают анализу по методу Luminex, с целью определения концентрации IFN-γ, TNF-α и GM-CSF (номер по каталогу HCYTO-60K-03, Millipore). Указанные три цитокина связаны с цитоксичностью NK клеток. (См., в частности, Imai et al., Blood , 106(1):376-83). Проводят также количественный RT-PCR, с целью исследования экспрессии IFN-γ, TNF-α и GM-CSF, используя прибор Applied Biosystems FAST 7900HT и праймеры. Условия выращивания те же самые, что и для совместного выращивания при проведении анализа на цитотоксичность, которые описаны выше. Концентрации цитокинов определяют с помощью анализа по методу Luminex.
Было установлено, что секреция IFN-γ, TNF-α и GM-CSF из клеток HPP, которые выращивают в питательной среде совместно с опухолевыми клетками, значительно выше, чем секреция IFN-γ, TNF-α и GM-CSF из клеток UCB. В одном эксперименте клетки HPP смешивают с клетками KG-1a с отношениями, равными 0,78:1, 1,56:1, 3,12:1, 6,25:1, 12,5:1, 25:1, 50:1 или 100:1, как в присутствии, так и в отсутствие 100 ед. IL-2. TNC-HPP показывают устойчивую повышенную продукцию IFN-γ в присутствии IL-2, по сравнению с отсутствием IL-2. Было показано, что за 24 час уровни IFN-γ увеличиваются приблизительно в 5-26 раз (медиана: в 16 раз); за 48 час приблизительно в 3-65 раз (медиана: в 27 раз), что согласуется с результатами, полученными при исследовании цитотоксичности. См. фиг. 9.
В другом эксперимента за 24 час до инкубирования с клетками KG-1a клетки TNC-HPP стимулируют с помощью 100 ед./мл или 1000 ед./мл IL-2, в то время как HPP, выращенные в среде RPMI, используют в качестве контроля. Клетки HPP или совместимые клетки UCB инкубируют в течение 24 час вместе или без IL-2, прежде чем выращивать совместно с клетками KG-1a. Секреция IFN-γ наиболее усиливается в клетках HPP, которые выращивают совместно с К562 и KG-1a. Когда клетки HPP обрабатывают с помощью 100 ед./мл IL-2, то цитотоксичность клеток HPP по отношению к KG-1a увеличивается после 24 час и 48 час. После обработки с помощью IL-2 уровень секреции IFN-γ в клетках HPP выше, чем уровень секреции IFN-γ в совместимых клетках UCB. Более высокая экспрессия IFN-γ подтверждается анализом RT-PCR клеток из совместимых HPP и UCB. Полученные результаты показывают, что клетки HPP проявляют большую антилейкемическую активность, по сравнению с клетками UCB, и указанная большая активность связана со значительным увеличением продукции IFN-γ.
4
5
Продукцию IFN-γ в клетках HPP и в клетках пуповинной крови при совместном выращивании в питательной среде с перечисленными линиями опухолевых клеток анализируют, используя линии опухолевых клеток, приведенные выше в таблице 1. Клетки HPP и опухолевые клетки выращивают совместно в течение 24 час или 48 час с соотношением 50:1, используя 10 опухолевых клеток и 5×10 клеток HPP. Для клеточных линий CCRF-CEM, J.RT3-T3.5, K562, KG1, KG-1a, KU812, NC1-H1417, U-937 и WER1-RB-1 увеличение продукции IFN-γ в клетках HPP через 24 час совместного выращивания в питательной среде превосходит продукцию IFN-γ клетками пуповинной крови, которые совместно выращивают с указанными клеточными линиями в течение того же периода времени. См. фиг. 10А. Через 48 час совместного выращивания в питательной среде увеличение продукции IFN-γ в клетках HPP превосходит продукцию IFN-γ в клетках пуповинной крови для всех линий опухолевых клеток. См. фиг. 10В. Из всех линий опухолевых клеток клетки К562 индуцируют наибольшее увеличение продукции IFN-γ в клетках HPP как через 24 час, так и через 48 час. Аналогичные результаты наблюдаются для TNF-α и GM-CSF.
+
Анализ клеточного цикла показывает, что процент KG-1a в S-фазе уменьшается на 30%, когда их совместно выращивают в питательной среде с HPP, по сравнению с отдельно выращенными клетками KG-1a. Дальнейшие эксперименты по совместному выращиванию, которые проводят с использованием различных обогащенных фракций HPP, показывают, что антилейкемическая активность HPP в значительной степени обусловлена высокой концентрацией уникальных незрелых натуральных клеток-киллеров, которые характеризуются высоким уровнем экспрессии CD56 и отсутствием экспрессии CD16.
6.6. Пример 6: Подавление пролиферации опухолевых клеток in vivo клетками плацентарного перфузата человека
6.6.1. Вещества и методы
Данный пример показывает эффективность действия плацентарного перфузата человека в условиях in vivo против опухолевых клеток при использовании модели ксенотрансплантата опухоли для мышей NOD/SCID.
2

Выращивание клеток KG-1 в питательной среде. Клетки KG-1 выдерживают в среде Дульбекко в модификации Искова, дополненной 20% сывороткой плода коровы (питательная среда), при температуре 37°C в газовой смеси 95% воздух/5% CO и относительной влажности 100%. Среду в культуре сменяют раз в два дня, а клетки еженедельно пересевают. Клетки KG-1 вырастают в виде суспензий. Поэтому для смены среды или пересева клеток собирают суспензии клеток в пробирках для центрифуги и центрифугируют со скоростью 2000 об/мин в течение 10 мин на роторе SORVALL HERAEUS (часть № 75006434). Надосадочную жидкость отбрасывают, а соответствующее количество сгустка клеток вновь суспендируют в питательной среде для продолжения выращивания.
Приготовление клеток KG-1 для имплантации. Для имплантации клеток мышам клетки собирают центрифугированием, как описано выше. Собирают сгустки клеток и вновь суспендируют их в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Для определения числа клеток, которые будут имплантированы мышам, проводят расчет аликвоты суспензии клеток с помощью гемацитометра. Для исключения нежизнеспособных клеток в суспензии используют краситель трипановый синий.
Приготовление клеток HPP для имплантации. Для хранения и оттаивания HPP образцы получают в замороженном виде в сухом транспортном контейнере в исправном состоянии. Образцы хранят в сухом транспортном контейнере до 7 февраля 2007 г., когда их оттаивают. В день, когда проводят оттаивание, образцы HPP извлекают из криохолодильника (по очереди) и помещают в пластиковые пакеты с открываемым верхом. Пакеты затем помещают на водяную баню с температурой 37°C и при осторожном перемешивании выдерживают до практически полного оттаивания (в пакете остается небольшой замерзший кусочек). Затем пакеты удаляют из бани, извлекают образцы из пакетов с открываемым верхом и осторожно переворачивают до тех пор, пока образцы окончательно не оттают. Образцы затем помещают в вытяжной шкаф с ламинарным потоком и внешнюю поверхность пакетика с кровью стерилизуют, разбрызгивая 70%-ый раствор этанола. Пакетики с кровью вскрывают с помощью стерильных ножниц, клетки переносят в стерильные конические пробирки емкостью 50 мл (1 пробирка для каждого образца HPP; 2 пробирки для каждого образца UCB) с помощью стерильной пипетки. Затем в каждую пробирку медленно добавляют 10 мл буферного раствора для оттаивания (2,5% альбумина человека, 5% декстрана 40) и содержимое каждой пробирки осторожно перемешивают (в течение 2,2-2,9 мин). Каждый пакетик с кровью затем споласкивают 10 мл буферного раствора для оттаивания, который затем медленно добавляют в конические пробирки емкостью 50 мл (в течение 0,7-1,3 мин).
После оттаивания каждый образец перед центрифугированием хранят на тающем льду. Все пробирки центрифугируют в течение 10 мин (440×g при 10°C), надосадочную жидкость удаляют с помощью стерильной пипетки, а сгустки крови осторожно разбивают, встряхивая пробирку. Аликвоту 1 мл носителя (PBS + 1% сыворотки плода коровы) добавляют в одну из пробирок и содержимое пробирки перемешивают, осторожно вращая пробирки круговыми движениями. С помощью пипетки емкостью 2 мл содержимое переносят во вторую пробирку, затем в третью пробирку и затем в четвертую пробирку. Опорожненные пробирки промывают с помощью 0,2 мл буферного раствора для разбавления.
Для подсчета клеток аликвоту 25 мкл переносят в коническую пробирку емкостью 15 мл, которая содержит 975 мкл носителя, помещенную в лед. Эритроциты затем подвергают лизису, добавив 4 мл холодного реагента для лизиса, содержащего хлорид аммония, и инкубируют на льду в течение 10 мин. После инкубирования в каждую пробирку добавляют 5 мл холодного PBS, а затем пробирки центрифугируют (10 мин, 400×g, 10°C). После лизиса эритроцитов проводят подсчет клеток с помощью гемацитометра, используя краситель трипановый синий для установления жизнеспособности клеток. Результаты подсчетов корректируют для проведения разбавления, а затем делят на коэффициент лизиса (0,46), чтобы оценить число клеток, присутствовавших до проведения лизиса эритроцитов.
8
Для того чтобы приготовить дозировки HPP, после проведения подсчета клетки HPP разбавляют до концентрации 1×10 клеток/мл, добавляя носитель. Затем до заправления шприцев клетки HPP хранят на льду. Время, прошедшее между оттаиванием первого образца и завершением приготовления дозы, составляет менее 3 час.
Перед заправкой шприцев аликвоту 50 мкл дозировочного вещества откладывают в сторону для проверки после введения дозы путем проведения подсчета, как указано выше. После введения дозы оставшееся вещество для дозирования исследуют для подтверждения дозы.
3
3
3
7
3
План эксперимента. В День 1 двадцати четырем самцам мышей NOD/SCID (Jackson Laboratories) подкожно имплантируют в боковую область 5 миллионов жизнеспособных клеток KG-1. Мышей разделяют таким образом, чтобы четыре-пять мышей оказались в микроизоляции в системе клеток с подстилкой из древесных опилок. Им в достатке предоставляют стерилизованную пищу для грызунов и воду. Мышей дважды в неделю тщательно осматривают для контролирования роста опухоли. Первая опухоль, которую можно измерить, обнаруживается в День 25. Затем раз в неделю регистрируют вес, а размеры опухоли измеряют дважды в неделю с помощью штангенциркуля. В День 52 после имплантации животных произвольно распределяют в три отдельные группы, при этом средний объем опухолей составляет приблизительно 300-350 мм. См. ниже в таблице 13. Первую группу составляют четыре контрольные мыши, средний объем опухоли у которых равен 312 мм. Двум из указанных мышей имплантируют внутривенно (IV), а двум другим имплантируют интратуморально (IT) 200 мкл и 50 мкл раствора носителя, соответственно. Вторую группу, средний размер опухоли в которой равен 345 мм, составляют четыре мыши, которым внутривенно имплантируют 200 мкл клеток HPP на одну мышь (2×10 клеток). Последняя группа, которой имплантируют интратуморально 50 мкл клеток HPP на одну мышь, также состоит из четырех мышей, средний объем опухоли у которых составляет 332 мм.
Таблица 13Экспериментальные группы для проведения <i>in vivo </i>экспериментов по угнетению
Номер животного
Группа, прошедшая обработку с помощью HPP
Объем опухоли в день имплантации HPP
Группа 1 (контрольная)
IV 1
457
IT 2
429
IT 3
214
IV 4
147
Среднее значение:
312
Группа 2 (IV имплантация клеток)
1
466
2
209
3
217
4
487
Среднее значение:
345
Группа 3 (IT имплантация клеток)
1
491
2
256
3
296
4
285
Среднее значение:
332
IV – имплантация 200 мкл; IT – имплантация 50 мкл
На День 66, через 14 дней после имплантации клеток HPP, исследования прекращают вследствие того, что опухоли достигают слишком больших размеров.
6.6.2. Результаты
3
3
3
Объем опухолей (TV) измеряют вплоть до Дня 66 (14 дней после имплантации клеток HPP), когда TV контрольной группы достигает в среднем 2921 мм. Группа, которой введение проводили внутривенно, по окончании исследования имела величину TV, равную в среднем 2076 мм, а группа, которой введение проводили интратуморально, имела величину TV, равную в среднем 2705 мм. Что касается % увеличения TV после проведения обработки, то группа IT показывает умеренное 20%-ое ингибирование, в то время как группа IV показывает более чем 35%-ое угнетение роста опухолей, по сравнению с контрольной группой. Ингибирование в группе IT можно продемонстрировать. См. фиг. 11.
Эквиваленты:
Объем настоящего изобретения не следует ограничивать приведенными в данном описании конкретными вариантами осуществления изобретения. В самом деле, различные модификации настоящего изобретения, в дополнение к приведенным в настоящем описании, станут очевидными для специалистов из предшествующего описания и сопутствующих фигур. Следует понимать, что подобные модификации входят в объем прилагаемой формулы настоящего изобретения.
Все приведенные в данном описании ссылки целиком и для всех целей включены в настоящую заявку посредством ссылки так, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент или заявка на патент специально и индивидуально были указаны для включения в настоящую заявку ссылкой во всей ее полноте для всех целей. Цитирование любой публикации приведено для его раскрытия до даты регистрации и его не следует рассматривать как признание того, что настоящее изобретение не может предвосхитить подобную публикацию благодаря более раннему изобретению.