Сравнительное исследование репаративной регенерации костной ткани при использовании тканеинженерной матрицы на основе материала «ТИОПРОСТ» и материала «КоллапАн-М»

Сравнительное исследование репаративной регенерации костной ткани при использовании тканеинженерной матрицы на основе материала «ТИОПРОСТ» и материала «КоллапАн-М»

А.В. Сахаров 1, А.А. Гпотова 1, А.А. Макеев 1, А.Е. Просенко 1, Е.И. Рябчикова 2

1 Новосибирский государственный педагогический университет, Новосибирск

2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Comparative investigation of reparative bone tissue regeneration while using a tissue-engineered matrix based on «TIOPROST» and «KollapAn-M» materials

A.V. Sakharov1, A.A. Glotova 1, A.A. Makeev1, A.E. Prosenko 1, E.I. Ryabchikova 2

1 Novosibirsk State Pedagogical University, Novosibirsk

2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, SB RAS

Регенерация костной ткани нижней челюсти у крыс при использовании нового остеопластического материала «ТИОПРОСТ» по сравнению с материалом «КоллапАн-М» изучена методами световой микроскопии. Полученные результаты показали, что скорость восполнения объема костного дефекта при использовании «ТИОПРОСТа» более чем на 1 мес. опережает регенерацию костной ткани при использовании материала «КоллапАн-М». Установлено, что после заполнения дефекта костной ткани «ТИОПРОСТом» он образует пористую трехмерную конструкцию, которая выполняет поддерживающую функцию, являясь тканеинженерной матрицей, не обладает провоспалительными свойствами и. «ТИОПРОСТ» ограничивает продолжительность стадий альтерации и экссудации воспаления в ране. В процессе биодеградации «ТИОПРОСТ» индуцирует активный рост кровеносных сосудов из ложа костного дефекта в каналы тканеинженерной матрицы. Полученные данные развивают существующие представления о роли свободнорадикальных процессов в механизмах посттравматической регенерации костной ткани и обосновывают целесообразность использования антиоксидантных соединений для оптимизации остеогенеза при повреждении костной ткани.

Ключевые слова: дефект костной ткани, тканеинженерная матрица, антиоксидант, имплантация, биодеградация, репаративная регенерация.

Regeneration of the rat mandible bone tissue when using a novel osteoplastic material TIOPROST in comparison with the material «KollapAn-M» is studied by methods of light microscopy. The results obtained have shown that the inflammation rate of a bone defect volume applying TIOPROST surpasses bone tissue regeneration by the material «KollapAn-M» for more than one month. Having filled the bone tissue defect TIOPROST is determined to form a porous 3D construction which has a supportive function being a tissue-engineering matrix, have no pro-inflammatory properties. TIOPROST restrains the duration of the inflammation alteration and exudation stages in a wound. During biodegradation TIOPROST induces an active growth of blood vessels from a bone defect bed into tissue engineered matrix canals. The data obtained evolve the current knowledge on the role of free-radical processes in post-traumatic bone tissue regeneration mechanisms and substantiate the rationale for application of antioxidant compounds to optimize osteogenesis in bone tissue injury.

Key words: bone tissue defect, tissue engineered matrix, antioxidant, implantation, biodegradation, reparative regeneration.

Разработка технологий управления репаративной регенерацией костной ткани и восполнения дефектов костей является одной из актуальных задач хирургической стоматологии. Пристальное внимание исследователей к этой проблеме обусловлено широким распространением воспалительных и онкологических заболеваний костей, высокой частотой послеоперационных осложнений [1—5]. Для восстановления объема утраченной костной ткани успешно используются биоматериалы и их синтетические аналоги [6-9]. Несмотря на широкий выбор современных материалов для костной пластики, многие из них имеют ряд существенных недостатков, что негативно отражается на сроках формирования и качестве регенерата и, соответственно, ограничивает их широкое применение в медицинской практике. Одним из перспективных направлений клеточных технологий в области репаративной регенерации костной ткани является разработка и применение тканеинженер-

е-таП: asakharov142@rambler.ru

ных конструкций на основе пористых материалов, являющихся матрицей для доставки клеток, либо конструкцией для её активного заселения клетками реципиента [1, 2, 4, 10—12]. Сокращение сроков формирования в области костного дефекта гисто-типического регенерата осуществляется введением в состав остеопластических композиций различных биологически активных веществ [1, 2]. Влияние антиоксидантов на формирование гистотипическо-го регенерата костной ткани изучено недостаточно. Исследование влияния полифункционального антиоксиданта нового поколения «Тиофан», являющегося основой материала «ТИОПРОСТ», на регенерацию кожного дефекта у крыс показали, что данный материал сокращает продолжительность стадий альтерации и экссудации в ране, а поры материала заселяются малодифференцированными клетками с их последующей тканеспецифической дифферен-цировкой. Пористая структура материала обеспечи-

вает поддерживающую функцию и в процессе биодеградации индуцирует активный рост кровеносных сосудов в каналах материала [13]. Целью данного исследования явилось сравнение эффективности восстановления дефекта костной ткани нижней челюсти крыс при использовании тканеинженерных матриц на основе материала «ТИОПРОСТ» и материала «КоллапАн-М», широко использующегося в клинической практике для восполнения костных дефектов.

Материал и методы

Материал «ТИОПРОСТ» получен в Новосибирском НИИ химии антиоксидантов на основе поли-функционального серосодержащего антиоксиданта нового поколения «Тиофан» (бис-[3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]сульфид). Высокая антиоксидантная активность «Тиофана» обусловлена наличием в его структуре двух фрагментов с анти-окислительной активностью, фенольного и серосодержащего, а также синергическими взаимоотношениями между ними [14].

Средство (материал) для заполнения костных полостей «КоллапАн-М», состоит из гидроксиапатита и коллагена, содержит метронидазол (другие варианты «КоллапАна» характеризуются наличием линкомици-на гидрохлорида, гентамицина сульфата, диоксидина, клафорана, рифампицина или изониазида), характеризуется длительным сроком биодеградации [6].

Эксперимент проведен на самцах крыс линии Ви-стар весом 250—300 г, которых разделили на контрольную и две целевые группы по 50 животных в каждой. Животным всех групп стоматологическим бором диаметром 3,5 мм производили дефект нижней челюсти на глубину 2 мм. У крыс контрольной группы костный дефект оставляли свободным; крысам первой целевой группы дефект костной ткани заполняли материалом «ТИОПРОСТ», который после введения in vivo изменяет свои физико-химические свойства и переходит из гелеобразного состояния в твердое кристаллическое, что позволяет полностью заполнить объем костного дефекта различной конфигурации и в течение 15—18 мин придать костному органу требуемую анатомическую форму. У крыс второй опытной группы дефект костной ткани нижней челюсти заполняли материалом «КоллапАн-М». Животным всех групп в течение 7 сут. послеоперационного периода внутримышечно вводили антибиотик линкомицин в дозе 5 мг/кг массы тела один раз в сутки. Крыс по 10 особей из каждой группы выводили из эксперимента на 3, 14, 30, 60 и 90-е сут. Все манипуляции на животных осуществляли под хлороформным наркозом с соблюдением правил асептики и антисептики, а также в соответствии с международными принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным и решением биоэти-ческого комитета НГПУ (протокол заседания № 1 от 25.01.2010 г.). Для проведения морфологического анализа у животных всех групп после их выведения из эксперимента в течение 5 мин эксплантировали фрагмент костной ткани нижней челюсти, включающий интактные участки и область регенерата. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 12 сут., промывали в проточной воде и помещали в декальцинирующий раствор. Декальцинацию костной ткани проводили в течение 14 сут. в 10% растворе этилендиаминтетраацетата

на боратном буфере с рН 7,2. После дегидратации и просветления в ксилоле материал заливали в гистомикс. Срезы толщиной 10—15 мкм монтировали на предметные стекла, окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Локализацию фибрина в ткани определяли по Касону.

Результаты и обсуждение

У крыс всех групп через 3 сут. послеоперационного периода на светооптическом уровне отчетливо определялась область сформированного дефекта (рис. 1). В образцах костной ткани животных контрольной группы дефект заполнен фибрином и тканевым детритом, среди которых локализовались многочисленные эритроциты, многие из которых имели признаки гемолиза, полиморфноядерные лейкоциты и лимфоциты (рис. 1). По всему периметру раны фибрин отграничивал торцы опилов нижней челюсти от некротических масс и лейкоцитов.

В образцах костной ткани животных первой целевой группы на 3-и сут. послеоперационного периода весь объем костного дефекта заполнен материалом «ТИОПРОСТ» (рис. 1). На гистологических препаратах материал определялся в виде оптически прозрачных полостей неправильной формы, что обусловлено его растворением в абсолютном этаноле при проведении необходимой для морфологического анализа пробоподготовки. Поры материала сообщаются между собой и формируют узкие каналы, содержимое которых имеет умеренно базофильную окраску (рис. 1). Каналы образуют сетчатую структуру, пронизывающую весь объем тканеинженерной матрицы. На препаратах видно, что материал плотно прилегает к опилам кости (рис. 1). В данный период наблюдения поверхность костной раны покрыта реактивной рыхлой волокнистой соединительной тканью, в которой заметно формирование кровеносных сосудов. Среди компонентов межклеточного вещества соединительной ткани идентифицируются многочисленные малодифференцированные клетки, макрофаги, единичные нейтрофилы и лимфоциты.

В образцах костной ткани животных второй целевой группы, через 3 сут. после повреждения и заполнения раны материалом «КоллапАн-М», края опилов костного органа ровные и по периметру отграничены от препарата лейкоцитарным валом (рис. 1). Между лейкоцитами заметны отложения фибрина и мелкие частицы «КоллапАн-М» (рис. 1). Поверхность дефекта покрыта слоем фибрина, среди которого заметны полиморфноядерные лейкоциты и некротические массы.

Морфологические характеристики острой фазы воспаления в костной ране у крыс всех групп через 3 сут. послеоперационного периода имеют ярко выраженные различия. Высокое содержание в раневом дефекте крыс контрольной группы полиморфноядерных лейкоцитов, генерирующих активные кислородные метаболиты (АКМ) [15], а также вовлечение в свободнорадикальный процесс ионов железа при гемолизе эритроцитов [15, 16] способствуют деструкции клеток и межклеточного вещества костной ткани в области реципиального ложа и развитию ярко выраженного воспаления. Интенсивность воспалительной реакции в ткани при введении материала «КоллапАн-М» ниже, чем у животных контрольной группы, что связано с наличием антимикробных средств в его составе.

Г

д

н

Рис. 1.

Дефект нижней челюсти крысы через 3 сут. наблюдения:

А - контрольная группа;

Б, Г - первая целевая группа, дефект заполнен материалом «ТИОПРОСТ»; В, Д - вторая целевая группа, дефект заполнен препаратом «КоллапАн-М».

1 - опил кости;

2 - воспалительный инфильтрат;

3 - участок локализации материала «ТИОПРОСТ»;

4 - участок локализации материала «КоллапАн-М»;

5 - фибрин;

А-Г - окраска гематоксилин и эозин.

Д - реакция на фибрин по Касону.

Ув.: А, Б х100; В, Д х200; Г х400

Наименьший уровень воспалительной реакции отмечен при использовании материала «ТИОПРОСТ». Очевидно, данный феномен обусловлен различными механизмами действия входящих в состав материалов «КоллапАн-М» и «ТИОПРОСТ» веществ и показывает отчетливый противовоспалительный эффект последнего.

Анализ препаратов костной ткани крыс контрольной группы, полученных через 14 сут. после нанесения дефекта, показал, что весь его объем заполнен регенератом, который на 2/3 выполнен обильно васкуляризированной реактивной волокнистой соединительной тканью (рис. 2). Признаки активного остеогенеза наблюдаются лишь в области ложа дефекта.

В образцах костной ткани животных первой целевой группы через 14 сут. послеоперационного периода дефект с поверхности покрыт сформированным периостом, в котором видны наружный (фиброзный) и внутренний (камбиальный) слои (рис. 2). Полость дефекта полностью выполнена регенератом, представленным грубоволокнистой костной тканью, среди которой идентифицируются остатки материала «ТИОПРОСТ». Полученные результаты позволяют полагать, что формирование регенерата происходит за счет последовательных процессов биодеграции материала «ТИОПРОСТ» и заполнения полости каналов формирующейся примитивной костной тканью. Анализ препаратов показывает, что рост кровеносных сосудов происходит по внутренней

поверхности каналов (рис. 2), мелкие клетки вытянутой или овальной формы локализованы на периферии кровеносных сосудов. Дифференцированные клетки имеют овальную форму, и между ними идентифицируются прослойки межклеточного вещества (рис. 2). Наиболее дифференцированные клетки занимают центральную часть канала. Их морфология соответствует таковой «типичных» высокоактивных остеобластов. Строго определенное пространственное расположение в каналах материала остеогенных клеток различного уровня дифференцировки указывает на гематогенный путь миграции малодифференцированных клеток.

В образцах костной ткани крыс второй целевой группы через 14 сут. послеоперационного периода полость дефекта выполнена грубоволокнистой костной тканью с низким содержанием межклеточного вещества. Среди межклеточного вещества соединительной ткани выявляются частицы материала «КоллапАн-М», окруженные лейкоцитами и клеточный детрит (рис. 2).

Таким образом, морфология регенерата на 14 сут. наблюдения имеет выраженные различия у животных целевых групп. В образцах, полученных от крыс первой целевой группы, деградация «ТИОПРОСТа» сопряжена с его замещением интенсивно васкуля-ризированной грубоволокнистой костной тканью. У крыс второй целевой группы в тканях регенерата сохраняются признаки воспаления, а остеобласты имеют признаки низкой функциональной активности.

Рис. 2.

Дефект нижней челюсти крысы через 14 сут. наблюдения: А, Б - контрольная группа; В - первая целевая группа;

Г, Д - вторая целевая группа группа;

1 - новообразованная костная ткань;

2 - участок локализации материала «ТИОПРОСТ»;

3 - периост;

4 - опил кости;

5 - участки локализации материала «КоллапАн-М»;

', 6 - ретикулофиброзная костная ткань регенерата.

' Окраска гематоксилин и эозин.

Ув.: А, В, Д х200; Б, Г х100

-1 I*’ * 1 € I

£ * > .

. 6 .. -

9\'

Д Д

\,,л

Через 30 сут. в образцах костной ткани крыс контрольной группы дефект полностью заполнен регенератом и с поверхности покрыт утолщенным периостом. В области ложа костного дефекта регенерат представлен молодой костной тканью, объем которой составляет около 1/3 объема всего регенерата. На поверхности формирующихся костных трабекул идентифицируются функционально активные остеобласты. В области торцов опилов регенерат выполнен волокнистой тканью с признаками интенсивной ва-скуляризации.

На гистологических препаратах костной ткани животных первой целевой группы к 30-м сут. наблюдения дефект более чем на 2/3 представлен формирующейся пластинчатой костной тканью (рис. 3А). На поверхности между периостом и регенератом локализованы небольшие участки, заполненные материалом «ТИОПРОСТ», который имеет признаки резорбции и замещения костной тканью. Следует отметить, что по всему периметру дефекта регенерат интегрирован с костной тканью нижней челюсти (рис. 3Б).

В аналогичных образцах костной ткани крыс второй целевой группы дефект по всему периметру краев опилов нижней челюсти и ложа выполнен формирующейся грубоволокнистой костной тканью. Кроме остеогенных клеток в составе регенерата определяются нейтрофилы и макрофаги, идентифицируются частицы материала «КоллапАн-М» (рис. 3В). Именно в этот период наблюдения наиболее отчетливы различия по срокам и качеству регенерации между животными целевых групп, очевидно, обусловленные

морфогенетическими особенностями регенерации. У крыс первой целевой группы выселение остеогенных клеток происходит из гаверсовых каналов тканевого ложа дефекта, периоста и сосудов регенерата с их последующей дифференцировкой. У животных второй целевой группы основным источником остеогенных клеток является периост.

У животных контрольной группы на 60-е сут. после повреждения кости дефект полностью заполнен регенератом, представленным грубоволокнистой костной тканью (рис. 3Г). У крыс первой целевой группы дефект полностью выполнен молодой пластинчатой костной тканью, которая отчетливо консолидирована с костной тканью опилов нижней челюсти (рис. 3Д). Структурно регенерат представлен растущими остео-нами первого типа с хорошо выраженным центральным каналом и узким ободком остеоида, под слоем которого видны многочисленные активные остеобласты.

В образцах костной ткани животных второй целевой группы к 60 суткам наблюдения новообразованная костная ткань определяется на поверхности раневого дефекта между краями опилов и в центре регенерата (рис. 3Е).

Морфологическое исследование костной ткани крыс контрольной и второй целевой групп через 90 сут. показало, что регенерат выполнен созревающей костной тканью, в структуре которой преобладают растущие остеоны первого типа. Следует отметить, что в межклеточном веществе регенерата крыс второй опытной группы присутствовали крупные частицы препарата «КоллапАн-М».

‘ «

. *  ж Ш *

Рис. 3.

Дефект нижней челюсти крысы через 30 и 60 сут. наблюдения:

А, Б - первая целевая группа, 30 сут. наблюдения;

В - вторая целевая группа, 30 сут.;

Г - контрольная группа, 60 сут.;

Д - первая целевая группа, 60 сут.;

Е - вторая целевая группа, 60 сут.; черными стрелками обозначена граница между регенератом и опилом кости;

1 - участок локализации материала «ТИОПРОСТ»;

2 - новообразованная костная ткань;

3 - опил кости;

4 - «реактивная» волокнистая соединительная ткань с воспалительным инфильтратом;

5 - сосуды регенерата.

Окраска гематоксилин и эозин.

Ув.: А, В х200; Б, Д х400; Г, Е х100

Регенерат крыс первой целевой группы на 90-е сут. наблюдения по морфологии и тинкториальным свойствам не имеет заметных отличий от интакт-ных участков костной ткани нижней челюсти, и в его структуре преобладали зрелые остеоны второго типа. Остеоны второго типа характеризуются узким просветом центрального канала и слабо выраженным слоем уплощенных остеобластов.

Проведенное морфологическое исследование показало, что регенерация костной ткани с использованием материала «ТИОПРОСТ» более чем на 1 мес. опережает таковую при применении материала «КоллапАн-М». Положительное влияние на формирование гистотипического регенерата обусловлено антирадикальными и противопероксидны-ми свойствами антиоксиданта «Тиофана», входящего в состав «ТИОПРОСТа». Полученные данные свидетельствуют о целесообразности использования антиоксидантных соединений для оптимизации остеогенеза при повреждении костной ткани, когда вследствие повреждения кровеносных сосудов и гемолиза эритроцитов в свободнорадикальный процесс активно вовлекаются металлы переменной валентности. Кроме того, генерация клетками воспаления АКМ и тканевая гипоксия опосредуют интенсивное течение

свободнорадикальных процессов, оказывающих негативное влияние на клетки остеогенного дифферо-на в пределах поврежденного компартмента. Обладая выраженными антиоксидантными свойствами, «ТИОПРОСТ» опосредованно оказывает влияние на развитие воспаления в ране, а именно, ограничивает продолжительность стадий альтерации и экссудации, стимулирует пролиферацию остеогенных клеток. Данное исследование показало, что синтетический материал «ТИОПРОСТ» при заполнении им дефекта костной ткани образует пористую трехмерную структуру, которая выполняет поддерживающую функцию, не обладает провоспалительными свойствами и активно биодеградирует в течение первого месяца, полностью исчезая в период между 60-ми и 90-ми сут. послеоперационного периода. Несомненным преимуществом использования данного синтетического материала для замещения дефектов костной ткани является отсутствие риска инфицирования реципиента, поскольку в его составе отсутствуют компоненты животного происхождения. Полученные результаты позволяют заключить, что «ТИОПРОСТ» является перспективным материалом для разработки тканеинженерных конструкций как самостоятельно, так и в качестве носителя клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Григорьянц Л.А., Сирак С.В., Слётов А.А. и др. Эффективность использования композиционных остеопластических материалов для пластики костных дефектов челюстей. Стоматология 2007; Спецвыпуск: ВО-4.

2. Десятниченко К.С., Курдюмов С.Г., Леонтьев В.К. Пути повышения активности, стимулирующей репаративный остеогенез, у материалов, имплантируемых в костный дефект. Мед. Бизнес. 200В; 5: 143-45.

3. Федоровская Л.Н., Григорьян А.С., Кулаков А.А. и др. Сравнительный анализ процесса заживления костных дефектов челюсти под воздействием различных пластических материалов [экспериментально-морфологическое исследование). Стоматология 2001; В: 4-7.

4. Хенч Л., Джонс Д. Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей. М.: Техносфера; 2007.

5. Штейнле А.В. Посттравматическая регенерация костной ткани. Сибирский медицинский журнал 2009; 4(1): 101-8.

В. Дунаев М.В., Туманова А.С., Китаев В.А. и др. Применение разновидностей «Коллапана» в амбулаторной практике. Новое в стоматологии 2005; 2:82-5.

7. Иванов С.Ю., Панасюк А.Ф., Панин А.М. и др. Опыт применения биокомпозиционных остеопластических материалов. Нижегородский медицинский журнал 2003; 244-50.

8. Панин А.М. Биокомпозиционные остеопластические мате-

риалы. Применение и перспективы развития. Сб. статей. Стоматология XXI века. Н. Новгород; 2003. С. 146—48.

9. Xin R., Leng J., Chen J. A comparative study of calcium phosphate formation on bioceramics in vitro and in vivo. Biomaterials 2005; 26(33):6477-86.

10. Burg K.J.L., Porter S., Kellam J.F. Biomaterials development for bone tissue engineering. Biomaterials 2000; 21:2347—59.

11. Деев Р.В., Исаев А.А., Кочиш А.Ю. и др. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии: пути развития. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 2(4): 18—30.

12. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Бозо И.Я. и др. Тканеинженерный эквивалент кости: методологические основы создания и биологические свойства. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI(1): 62-7.

13. Руднева А.А., Сахаров А.В., Макеев А.А. и др. Реакция тканей кожи на синтетический материал «ТИОПРОСТ», разработанный для использования в тканевой инженерии. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2010; 5(1): 53-7.

14. Просенко А.Е., Терах Е.И., Кандалинцева Н.В. и др. Серосодержащий фенольный антиоксидант тио-фан как перспективный лекарственный препарат. Материалы Всероссийской конф. Новосибирск, Сибвузиздат; 2004. С. 391-92.

15. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс при воспалении. Успехи соврем. биологии 1997; 117:155-71.

16. Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. М.: «Слово»; 2006.

Поступила 19.05.2011