СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО АНТИГЕННЕЗАВИСИМУЮ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ В-ЛИМФОЦИТОВ
METHOD OF OBTAINING SUBSTANCE, STIMULATING ANTIGEN-INDEPENDENT DIFFERENTIATION OF B-LYMPHOCYTES

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и касается получения биологически активных средств из сырья животного происхождения, стимулирующих антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.
5
Известен способ получения гемолимфопоэтических ростковых факторов из супернатанта культуры клеток костного мозга (см. патент США №5264418, МКИ C07K 3/20, 1993), включающий ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе, Con-A аффинную хроматографию, гель-фильтрацию на Sephacryl S-300, ионообменную хроматографию на mono-Q колонке, гель-фильтрацию на Superose 12. Получаемое вещество (HLGF-1) обладает способностью стимулировать дифференцировку пре-B клеток. Однако данный способ является сложным многостадийным процессом, требующим большого количества реактивов и специального оборудования, процесс требует длительного времени, а препарат активен лишь в концентрации от 5 до 10 мг/мл. Конечный продукт имеет белковую природу с ММ 110-140 кД, что придает веществу дополнительные аллергенные свойства.
Известен способ получения вещества, стимулирующего созревание В-лимфоцитов, из ткани сумки Фабрициуса птиц (см. а.с. СССР №1438044, МПК A61K 39/00, 1985, опуб. 10.04.1999), который по технической сущности и достигаемому результату является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом. Способ включает гомогенизацию предварительно замороженного при -40°C сырья с последующей экстракцией в 3%-ном растворе уксусной кислоты при соотношении 1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты и добавление хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3%-ной уксусной кислоты при pH 3,5-4,0, полученный экстракт отфильтровывают, центрифугируют, надосадочную жидкость приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5, формируют осадок, осаждают ацетоном, с последующей фильтрацией и лиофилизацией.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение ассортимента высокоэффективных лекарственных средств, стимулирующих антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.
Результат достигается тем, что способ получения средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, из сырья животного происхождения, включающий гомогенизацию предварительно замороженного при -40°C сырья с последующей экстракцией в 3%-ном растворе уксусной кислоты при соотношении 1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты и добавление хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3%-ной уксусной кислоты при pH 3,5-4,0, в котором полученный экстракт отфильтровывают, центрифугируют, надосадочную жидкость приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5, формируют осадок, осаждают ацетоном, с последующей фильтрацией и лиофилизацией, отличается тем, что в качестве сырья используют ткань эндометрия свиней, экстракцию проводят в течение 36 часов, экстракт центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, а формирование осадка продолжается 12 часов при -4°C, целевой продукт дополнительно очищают ультрафильтрацией с пределом молекулярного удержания 5 кД.
В предлагаемом способе используют матки свиней в возрасте от 2 до 5 лет, отделяют эндометрий, который после промывки в холодной проточной воде замораживают при -40°C, гомогенизируют и загружают в реактор с охлаждением и мешалкой в 3%-ный раствор уксусной кислоты (1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты) и добавляют хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3%-ной уксусной кислоты (pH 3,5-4,0). Экстракцию проводят в течение 36 ч при 4°C. Экстракт отфильтровывают, центрифугируют (3000 об/мин в течение 20 мин) и надосадочную жидкость приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5 (1 часть экстракта к 5 частям ацетона). Формирование осадка продолжается 12 ч при -4°C. Осадок отфильтровывают под вакуумом, отмывают чистым ацетоном и высушивают на воронке Бюхнера с использованием фильтровальной бумаги. Полученный порошок далее высушивают при 18-20°C и растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1 г/10 мл и подвергают ультрафильтрации через фильтр с пределом молекулярного удержания 5000 Д. Полученный фильтрат стерилизуют фильтрацией, разливают в стерильные флаконы по 1 мл и лиофилизируют.
Данный способ позволяет получить средство, обладающее высокой биологической активностью. Так, средство, полученное этим способом, стимулировало созревание T- и B-лимфоцитов в культуре клеток в концентрации 1 мг/мл. Молекулярная масса данного средства колеблется от 600 до 5000 Д.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
ПРИМЕР 1. Брали 500 г свежезамороженной ткани эндометрия свиней, гомогенизировали в гомогенизаторе. Гомогенат заливали 5 объемами (2,5 литра) 3%-ной уксусной кислоты с хлоридом цинка в концентрации 1 г/литр раствора кислоты. Экстракцию проводили в течение 36 часов при температуре +4°C при постоянном перемешивании. Затем экстракт фильтровали через бязевую ткань, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут. К полученному экстракту добавляли охлажденный до -4…-5°C ацетон в соотношении 1:5 (1 часть экстракта и 5 частей ацетона), осадок формировали в течение 12 часов при температуре -4°C. Полученный осадок отфильтровывали под вакуумом, тщательно промывали чистым ацетоном и высушивали. Порошок растворяли в 10 объемах дистиллированной воды, перемешивая в течение 1 часа, и подвергали ультрафильтрации на мембране Millipore (США) с пределом молекулярного удержания 5 кД. Выход активного вещества составил 5,8 г. При инкубации с лимфоцитами полученное вещество в концентрации 1 мг/мл повышало количество B-лимфоцитов с Ig-рецепторами до 32,5±1,5% (контроль 22,7±1,1%).
Полученное вещество представляет собой комплекс пептидов с молекулярной массой до 5000 Д. Пептидная природа средства, полученного по предлагаемому способу, подтверждается следующими данными:
1) дает цветную реакцию с биуретовым реактивом;
2) молекулярная масса компонентов, определенная с помощью гель-хроматографии, составляет 600-5000 Д;
3) основной спектр (пик) поглощения в ультрафиолетовом свете колеблется в пределах 220-230 нм (спектрофотометрически).
Все вышеуказанное позволяет достаточно точно провести идентификацию полученного средства.
При сопоставительном анализе заявляемого способа и способа-прототипа выявлены следующие сходные признаки:
1) оба способа предназначены для получения средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов;
2) в качестве исходного сырья используют ткани животного происхождения;
3) сырье предварительно замораживают;
4) сырье гомогенизируют;
5) гомогенат подвергают экстракции;
6) экстракт фильтруют и центрифугируют;
7) осадок отфильтровывают под вакуумом;
8) полученное вещество лиофильно высушивают.
Однако известный способ-прототип и предлагаемый способ имеют следующие отличия:
1) в прототипе экстракцию проводят из сумки Фабрициуса птиц, а в предлагаемом способе экстракцию осуществляют из ткани эндометрия свиней, что более доступно;
2) в способе-прототипе время экстракции составляет 48-72 часа, а в предлагаемом способе экстракцию осуществляют в течение 36 часов;
3) в предлагаемом способе с целью дополнительной очистки целевого продукта осадок подвергают ультрафильтрации с пределом молекулярного удержания 5 кД;
4) в способе-прототипе целевой продукт представлен щелочными полипептидами с молекулярной массой от 2000 до 12000 Д, а в предлагаемом способе выделяют пептиды преимущественно с ММ от 600 до 5000 Д.
Таблица 1
Сравнение различных способов получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-клеток
№
Отличительный признак
Способ-прототип
Предлагаемый способ
1
Субстрат
Сумка Фабрициуса птиц
Ткань эндометрия свиней
2
Длительность экстракции
48-72 ч
36 ч
4
Дополнительная фильтрация
Ультрафильтрация с порогом 5 кД
5
Характеристика целевого продукта
Щелочные полипептиды с ММ 2-12 кД
Щелочные пептиды с ММ 0,6-5 кД
6
Активная концентрация препарата
5-10 мг/мл
1 мг/мл
Доказательство правильности выбранных в предлагаемом способе параметров экстракции и ультрафильтрации приведены в таблицах 2-5. Количество B-лимфоцитов, несущих Ig-рецепторы, определяли методом прямой антиглобулиновой розеточной реакции с антисыворотками к иммуноглобулинам человека (Кудрявцева Е.Р., 1983). Концентрация пептидов в опыте составляла 1 мг/мл.
Таблица 2
Влияние pH среды экстракции на биологическую активность получаемого средства
pH среды экстракции
Количество B-лимфоцитов (%), имеющих Ig-рецепторы (n=20)
Контроль
21,3±1,2
7,0
22,3±1,4
6,5
23,2±1,3
6,0
23,4±1,2
5,5
24,1±1,4
5,0
31,2±1,3*
4,5
31,4±1,4*
4,0
32,5±1,5*
3,5
31,8±1,6*
3,0
25,1±1,2
2,5
22,4±1,5
* показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,01
Из таблицы 2 видно, что для получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, необходимо проводить экстракцию при pH 4,0-3,5. Более высокие или более низкие значения pH приводят к снижению специфической активности получаемого вещества.
Таблица 3
Влияние времени экстракции на биологическую активность получаемого вещества
Время экстракции, ч
Количество B-лимфоцитов (%), имеющих Ig-рецепторы (n=18)
Контроль
21,3±1,2
6
22,3±1,7
12
23,7±1,9
24
29,7±1,6*
36
32,1±1,5*
48
31,8±1,9*
72
30,9±2,1*
* показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,01
Из таблицы 3 видно, что оптимальное время экстракции составляет 36 часов. Уменьшение или увеличение времени экстракции приводит к снижению активности целевого продукта.
Таблица 4
Влияние порога ультрафильтрации на биологическую активность получаемого вещества
Молекулярная масса вещества, кД
Количество B-лимфоцитов (%), имеющих Ig-рецепторы (n=17)
Контроль
21,3±1,2
До 3
27,3±2,3
До 5
32,1±1,5*
До 10
27,7±1,9
* показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,01
Из таблицы 4 видно, что максимальной специфической активностью обладает фракция с молекулярной массой около 5000 Д.
Биологическую активность полученного вещества, как и в способе-прототипе, изучали методом прямой антиглобулиновой розеточной реакции с антисыворотками к иммуноглобулинам человека (Кудрявцева Е.Р., 1983). Известно, что Ig-рецепторы являются маркером дифференцировки В-клеток и экспрессируются на зрелых B-лимфоцитах. Лимфоциты периферической крови больных с ожогами IIIб-IV степени 15-30% поверхности тела инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°C в полной питательной среде с полученными пептидами в концентрации от 0,1 до 1 мг/мл. Исследование проводили на лимфоцитах ожоговых больных, поскольку известно, что при ожоговой болезни нарушается антигеннезависимая дифференцировка B-лимфоцитов и в периферической крови появляется большое количество незрелых или «нулевых» клеток (Эберт Л.Я., 1980). В качестве контроля использовали лимфоциты, инкубированные с добавлением аналогичного объема физиологического раствора.
Таблица 5
Влияние полученного вещества на экспрессию иммуноглобулиновых рецепторов B-лимфоцитов
Концентрация вещества, мкг/мл
Количество лимфоцитов (%), имеющих Ig-рецепторы (n=19)
Контроль
21,3±1,2
0,1
22,1±1,3
0,5
27,1±1,1*
1,0
32,6±1,4**
10,0
31,8±1,6**
20,0
30,5±1,3*
100,0
30,7±1,1*
* показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,05
** показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,01
Таким образом, по предлагаемому способу получают средство, обладающее стимулирующим действием на антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов. По сравнению со способом-прототипом предлагаемый способ позволяет достигнуть повышения активности целевого продукта, что выражается в снижении активной концентрации препарата. Так, средство, полученное по предлагаемому способу, обладает специфической активностью в концентрации от 1,0 до 10 мг/мл, в то время как по способу-прототипу - 5-10 мг/мл.
Средство, стимулирующее антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, может найти применение в медицине для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний различной этиологии с преимущественным поражением гуморального звена иммунитета, в том числе и возникающего при развитии послеродового эндометрита.