Использование multiple locus variable tandem repeats analysis в систематике возбудителя бруцеллеза

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.841.93:579.253].083.1:577.21.08

Ю. К. Кулаков1, Д. А. Ковалев2, Е. Н. Мисетова2, С. И. Головнева2, Л. В. Ляпустина2,

М. М. Желудков1

использование multiple locus variable number tandem repeats analysis в систематике возбудителя бруцеллеза

1ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва 2ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора

В современной системе мероприятий по борьбе с бруцеллезом возрастающее значение приобретают методы, позволяющие проводить молекулярно-генетическую дифференциацию штаммов одного вида. Метод MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis) был выбран для молекулярно-генетической дифференциации до штаммового уровня и одновременного установления генетического родства изучаемых штаммов. Цель работы состояла в типировании методом MLVA штаммов трех патогенных для человека видов бруцелл с анализом стабильности выбранных локусов, в выявлении различий между ними и соответствия данных, полученных этим методом и фено-типическим методом дифференциации бруцелл, для использования метода MLVA в систематике возбудителя бруцеллеза. Материалы и методы. Двадцать шесть штаммов бруцелл, представляющих референтные (n = 15), вакцинные (n = 2), полевые штаммы трех патогенных видов бруцелл - B. melitensis (n = 3), B. abortus (n = 2), B. suis (n = 2) - и изоляты (n = 2) с неясным таксономическим положением были типированы методом MLVA с 9 парами праймеров на известные вариабельные локусы генома бруцелл. Проведен анализ стабильности выбранных локусов, их отличий по Hunter-Gaston discrimination index (HGDI) и соответствия получаемых данных фенотипическим методам идентификации. Результаты. Метод MLVA подтверждает результаты фенотипи-ческих методов идентификации, стабильность выбранных локу-сов у большинства референтных и вакцинных штаммов с высоким индексом вариабельности HGDI 0.9969 для всех локусов. Дендрограмма на основе данных MLVA-типирования позволила распределить штаммы бруцелл в родственные кластеры в соответствии с их таксономическим видовым и биоварным положением и формированием 25 генотипов. Штаммы B. melitensis сформировали кластер, родственный референтному штамму B. melitensis 63/9 биовар 2. Австралийские изоляты Brucella 83-4 и Brucella 83-6, выделенные от мышевидных грызунов, сформировали удаленный от других штаммов бруцелл кластер. Заключение. MLVA - перспективный метод штаммовой дифференциации бруцелл с известным и неопределенным таксономическим статусом для их систематики и создания каталога MLVA-генотипов, который будет способствовать качественному усовершенствованию системы эпидемиологического надзора за этой инфекцией в России.

Ключевые слова: бруцеллез, Brucella, ПЦР, MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis), систематика, эпидемиологический надзор

Бруцеллез - особо опасная зоонозная инфекция животных и человека, которая характеризуется тяжелым, часто хроническим течением с инвалидизацией больных людей и потерей поголовья сельскохозяйственных животных [1, 2, 28]. Природным резервуаром для бруцелл служат сельскохозяйственные и дикие животные, поэтому эпидемиология бруцеллеза целиком определяется его эпизоотологией [1, 2, 6].

Бруцеллы - грамотрицательные, факультативные, внутриклеточные бактериальные патогены. По адаптации к определенному хозяину, степени патоген-ности для людей, фенотипическим и генетическим характеристикам род Brucella включает 10 видов [10, 28]. В России основными патогенными видами бруцелл являются B. melitensis (мелкий рогатый скот), вызывающий у людей наиболее тяжелые формы эпидемической заболеваемости, B. abortus (крупный ро-

гатый скот) и B. suis (свиньи, зайцы, олени, мышевидные грызуны), характеризующиеся тем, что у людей вызывают спорадическую заболеваемость [1, 2, 4].

Традиционная система идентификации и систематизации выделяемых полевых штаммов бруцелл несовершенна. В связи с тем что используемые фе-нотипические методы позволяют дифференцировать возбудителя бруцеллеза до видобиоварного уровня, но характеризуются трудоемкостью, длительностью и неспецифичностью анализа [6, 17, 27, 28], они не отвечают современным требованиям типирования.

В настоящее время система противоэпидемических мероприятий по контролю и борьбе с бруцеллезом наряду со своевременным выявлением источника инфекции, быстрым выделением, проведением видовой идентификации возбудителя включает и его штаммовую дифференциацию.

Благодаря данным о нуклеотидных последовательностях полных геномов трех патогенных видов бруцелл [11] стали появляться новые методы для изучения генетического полиморфизма, претендующие на роль молекулярных методов дифференциации до штаммо-вого уровня: MLST (Multiple Loci Sequence Typing), SNP (Single Nucleotide Polymorphism) и MLVA (multiple-locus variable-number tandem-repeats analysis). Метод MLVA позволяет дифференцировать изоляты одного вида и одновременно подтверждать их родственные связи [9, 17, 27]. Он основан на сравнительном анализе локусных вариабельных тандемных повторов I и II хромосом бруцелл. Геномы патогенных видов бруцелл содержат много локусов, содержащих тандемные повторы различной длины - от 8 н. п. (нуклеотидных пар) и больше, с разным числом копий повторов в ло-кусах у штаммов возбудителя бруцеллеза одного вида. Штаммовый генетический полиморфизм определяют прямым секвенированием локусов и по размеру ПЦР-продуктов в агарозном гель-электрофорезе.

В настоящее время используют несколько схем типирования методом MLVA с разными локусами бруцелл [5, 9, 17, 22, 27]. Наиболее часто используют комбинацию локусов, предложенную P. Le Fleche и соавт. [17] для молекулярного типирования изолятов бруцелл в странах Европы [5, 17, 19, 25, 27], Северной [9, 18, 22, 23] и Южной Америки [18, 21] и Азии [12, 13, 15, 24].

Метод MLVA начинают использовать в систематике и молекулярной эпидемиологии штаммов возбудителя бруцеллеза, циркулирующих в России и прилегающих территориях [3, 4], и для идентификации вакцинных штаммов B. abortus 82 и 75/79-AB [16].

Цель работы заключалась в типировании методом MLVA штаммов трех патогенных для человека видов бруцелл с анализом стабильности выбранных

локусов, в выявлении различии между ними и соответствия данных, получаемых этим методом и фено-типическим методом дифференциации бруцелл, для использования такового в систематике возбудителя бруцеллеза.

Материалы и методы

Штаммы бруцелл. В работе использовали 2б штаммов возбудителя бруцеллеза, включающих референтные, вакцинные и полевые штаммы разных видов (табл. 1), из коллекции ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора и ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоц-развития России, Москва. Фенотипические свойства изолятов изучали общепринятыми фенотипическими методами и фаготипированием с использованием ви-доспецифических вирулентных бруцеллезных бактериофагов Tb, Wb, Bk, Fi [б].

Выделение ДНК. Отдельную колонию каждого штамма собирали на кончик петли и выделяли ДНК по методике R. Boom и соавт. [8] с использованием сорбентно-го набора на основе диоксида кремния.

MLVA. Праймеры, фланкирующие 9 известных вариабельных локусов BRU1543

- (Bruce 04), BRU1322 - (Bruce Об), BRU1134 - (Bruce 08), BRU588 - (Bruce 09), BRU211 - (Bruce 11), BRU548 -(Bruce 1б), BRU339 - (Bruce 18), BRU329

- (Bruce 21) и BRU424 - (Bruce 42) [ll], были синтезированы в ЗАО «Синтол», Россия.

Реакционная смесь содержала 25 мкл следующего состава: 1xPCR буфер "Ин-терЛабСервис" Россия, 1,76 мМ каждого из дНТФ, по 10 пмоль каждого праймера. 1,0 ед. Taq-полимеразы и 5-30 нг ДНК каждого штамма. Для амплификации использовали термоциклеры GeneAmp PCR System 9l00 и Veriti 96-well Thermal Cycler в следующем режиме: 96°C - 5 мин

- 1 цикл; 96°C - 30 с, 60°C - 30 с, l0°C -б0 с - 30 циклов и заключительный этап l0°C - 5 мин.

Гель-электрофорез. 3-5 мкл продукта амплификации вносили в ячейку 3% ага-розного геля на трис-ацетатном буфере и проводили электрофорез при напряжении 8 В/см в течение 2 ч. Для визуализации продуктов ПЦР гель окрашивали раствором этидия бромида (0,5 мкг/мл), отмывали дистиллированной водой и фотографировали. Размеры ампликонов сравнивали с ДНК-маркером O'Gene Ruler 100 н. п. фирмы "Fermentas" (Литва).

Секвенирование продуктов амплификации. Использовали генетический анализатор ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems), набор реактивов - BigDye Termina-torv3.l всоответствиисметодическимире-комендациями. ДНК-последовательности продуктов амплификации анализировали в программе Sequencing Analysis v5.4. При

сопоставлении последовательностей были использованы программы FinchTV 1.4.0. и BLAST (NCBI).

Кластерный анализ. Результаты секвенсного анализа переводили в числовой формат тандемных повторов для каждого локуса у всех штаммов. Для построения дендрограммы использовали программное обеспечение SAS JMP 8 версии.

Анализ MLVA-генотипов. MLVA-генотипы 26 штаммов в числовом формате сравнивали с базами данных генотипов бруцелл "Brucella 2009" и другими на сайте Microorganisms Tandem Repeats Database (http://minisatellites.u-psud.fr) с использованием on line инструментов для анализа [20].

Генетическое разнообразие оценивали индексом разнообразия - HGDI [14], который рассчитывали для каждого из 9 локусов в отдельности и для всех вариабельных локусов с использованием on line калькулято-

Таблица 1

характеристика штаммов бруцелл, использованных в работе

Штамм Биовар Хозяин Страна, регион первичного выделения Год

Референтные штаммы

B. melitensis 16-M 1 Коза США 1952

B. melitensis 63/9 2 " Индия 19б3

B. melitensis 706 (Ether) З " Италия 19б1

B. abortus 544 1 Корова Англия 195б

B. abortus Tulya З Человек Уганда 1967

B. abortus 292 4 Корова Англия 1967

B. abortus B-3196 5 " " 1967

B. abortus 870 б " Африка 1967

B. abortus 63/75 l " Англия 1967

B. abortus C-68 9 " " 1967

B. suis 1330 1 Свинья США 195б

B. suis Thomsen 2 " Дания 19бб

B. suis 686 З " США 19бб

B. suis 40 4 Олень СССР, Тюменская обл. 19б2

B. suis 513 5 Мышь СССР, Чечня 19l5

Вакцинные штаммы

B. melitensis Rev1 1 Коза Мексика 1953

B. abortus 19 BA 1 Корова СССР 1949

Полевые штаммы

B. melitensis 565 2 Овца СССР, Кисловодск 1953

B. melitensis C-457 2 Человек Россия, Ставропольский краИ 1999

B. melitensis 548 1 Овца СССР, Ставропольский край 1948

B. abortus A-422 1 Человек Португалия 19б5

B. abortus 1552 1 " СССР, Ростовская обл. 19б2

B. suis 6 1 Человек Канада 1952

B. suis 3-4 5 " СССР, Северная Осетия 1981

Brucella 83/4 б МышевидныИ грызун Австралия 19бб

Brucella 83/6 б То же " 19бб

ра (http://insilico.ehu.es/mini_tools/discriminatory_pow-er) [7]. HGDI указывает на вероятность того, что произвольно взятые из анализируемой выборки 2 изолята будут различаться по генотипу. Чем больше значения HGDI (определяется от 0 до 1), тем выше разрешающая способность метода.

Воспроизводимость и стабильность типирования оценивали по рекомендациям Study Group on Epidemiological Markers (ESGEM) [26].

Результаты и обсуждение

Молекулярное типирование штаммов бруцелл методом MLVA. Девять вариабельных локусов, содержащих тандемные повторы от 8 до 134 н. п., были амплифицированы в ПЦР на ДНК 26 референтных, вакцинных и полевых штаммов бруцелл. Вариации в размерах ПЦР-продуктов были обусловлены разным количеством копий тандемных повторов от 0 до 13 у тестируемых штаммов.

Метод типирования MLVA показал высокую разрешающую способность с индексом вариабельности HGDI = 0,9969 для 9 локусов. В табл. 2 показаны параметры генетического разнообразия штаммов и HG-DI для каждого локуса, наибольшая вариабельность была связана с локусом BRU548 (HGDI = 0,8677), а наименьшая - с локусом BRU329 (HGDI = 0,5415).

Результаты секвенсного анализа всех амплифика-ционных продуктов были переведены в формат числа копий тандемных повторов для каждого локуса и использованы для построения дендрограммы кластерного анализа, представленной на рисунке. Двадцать шесть штаммов бруцелл формировали 25 MLVA-генотипов и группировались в генетически родственные кластеры в соответствии с их видовым таксономическим положением.

Генетически родственный кластер на дендрограм-ме составляли полевые штаммы B. melitensis C-457, 548 и 565, выделенные в разные годы в Ставропольском крае, вместе с референтным штаммом B. melitensis 63/9 биовар 2 и близко примыкающим вакцинным штаммом B. melitensis Rev-1. Этот кластер при сравнении с базой данных MLVA-генотипов показывал наибольшее родство со Средиземноморским восточным генотипом 45, что согласуется с полученными данными о циркуляции изолятов этого генотипа в России и в приграничных государствах [4]. Близкое генетическое родство всех штаммов B. melitensis из России выявлено с референтным штаммом B. melitensis 63/9 биовар 2 азиатского происхождения, который был выделен в 1963 г. в Индии. Российские штаммы имели различные MLVA-генотипы в сравнении с изолятами, представляющими Американский и Средиземноморский западный кластеры, и близкородственные MLVA-генотипы (за счет идентичных локусов BRU1322, BRU211, BRU339, BRU588), и с генотипом 42 из Средиземноморского восточного кластера, приведенным в работах [15, 23, 25]. Кроме того, полученные нами и европейскими исследователями [5, 17, 21, 28] данные подтвердили существование внутри вида B. melitensis

высокой степени генетического родства. Результаты MLVA-типирования B. melitensis не соответствовали традиционному таксономическому делению этого вида на 3 биовара по фенотипическому признаку агглютинации с монорецепторными антисыворотками M и A [4, 5, 17, 21, 28]. Это в большей степени связано со сложностями воспроизведения, стандартизации и как следствие с несовершенством этого фенотипического теста для дифференциации бруцелл.

Полевые штаммы B. abortus 1552, B. abortus A-422 группировались в родственный кластер вместе с большинством референтных штаммов B. abortus 544, B. abortus 63/75-M, B. abortus 870, B. abortus B/3196 и B. abortus C-98 и вакцинным штаммом B. abortus 19 BA. При этом полевые штаммы B. melitensis и B. abortus располагались на дендрограмме в соседних кластерах, подтверждая известное близкое таксономическое родство этих видов.

В соответствии с общепринятой систематикой био-вары 1-4 вида B. suis формировали отдельный кластер на дендрограмме, в который попали полевой штамм B. suis 6 биовар 1 вместе с референтными штаммами B. suis 1330, Thomsen, 686 и 40.

Известно, что изоляты бруцелл, выделенные от мышевидных грызунов из природного очага северных предгорий Большого Кавказа, решением подкомитета по таксономии бруцелл ФАО/ВОЗ (Бостон, 1982 г.) были отнесены к самостоятельному биовару 5 B. suis [6]. На дендрограмме кластерного анализа биовар 5 B. suis, представленный полевым (B. suis 3-4) и референтным (B. suis 513) штаммами, формировал удаленный от других биоваров этого вида кластер в соответствии с современной таксономией бруцелл [28]. В настоящее время изучение мышевидных изолятов представляет очевидный интерес для систематики видов бруцелл и требует проведения дальнейших исследований.

Австралийские штаммы Brucella 83-4, Brucella 83-6, выделенные от диких грызунов, харатеризова-лись отсутствием продуктов амплификации в локусах BRU588, BRU211 и BRU329 в связи с их полной де-лецией и частичной делецией в локусе BRU424. На дендрограмме эти штаммы сформировали кластер, удаленный от других штаммов бруцелл. Этот ре-

Таблица 2

Генетическое разнообразие изученных 26 штаммов бруцелл, по данным MLVA-9, включающее количество генотипов, число копий тандемных повторов и HGDI для каждого локуса

Локус Размер тандемных повторов, н. п. Количество генотипов для локуса Число копий тандемных повторов в локусе HGDI

BRU1543-(Bruce 04) 8 6 3, 4, 5, 6, 7, 13 0,8215

BRU1322-(Bruce 06) 134 4 1, 2, 3, 4 0,7538

BRU1134-(Bruce 08) 18 3 2, 3, 5 0,5569

BRU588-(Bruce 09) 8 8 0, 3, 5, 6, 7, 8, 10, 13 0,7323

BRU211-(Bruce 11) 63 5 0, 3, 4, 6, 9 0,7354

BRU548-(Bruce 16) 8 8 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 12 0,8677

BRU339-(Bruce 18) 8 5 4, 5, 6, 7, 9 0,7385

BRU329-(Bruce 21) 8 3 0, 8, 9 0,5415

BRU424-(Bruce 42) 125 5 0, 1, 2, 3, 4 0,7692

в В. melitensis 16-М " В. suis 3-4 " В. suis 513

В. melitensis 706 " В. abortus 292 " В. abortus Tulya " В. suis 1330

В. suis Thomsen

В. suis 40 1

В. suis 6 '

В. suis 686 В. melitensis 565 В. melitensis С-457 В. melitensis 63/9 В. melitensis 548 В. melitensis Rev1 В. abortus А-422 В. abortus 544 В. abortus 63/75-М В. abortus S19 В. abortus 870 В. abortus 1552 В. abortus В/3196 В. abortus С-68

+Brucella 83-4 +Brucella 83-6

0

Генетическое родство

100%

Кластерный анализ 26 штаммов, представляющих референтные (n = 15), вакцинные (n = 2), полевые штаммы трех патогенных видов бруцелл: B. melitensis (n = 3), B. abortus (n = 2), B. suis (n = 2) и австралийские изоляты (n = 2), на основе данных

MLVA-9.

Знаками плюс, крест и черный квадрат обозначены кластерно-родственные штаммы бруцелл.

зультат согласуется с данными MLVA-типирования

7 штаммов бруцелл, выделенных от австралийских грызунов, которые также находились в удалении от остальных видов бруцелл в кластерном анализе и были близкородственными новому виду B. inopinata [24]. Несомненно, австралийские штаммы заслуживают дальнейшего детального изучения с использованием как MLVA, так и других таксономических генетических маркеров.

СтабильностьMLVA-локусов и воспроизводимость схемы типирования MLVA-9 на референтных и вакцинных штаммах бруцелл. Референтные и вакцинные штаммы бруцелл с известными MLVA-генотипами использовали также для сравнительного изучения воспроизводимости MLVA-специфических штаммовых генотипов, стабильности тандемных повторов в 9 анализируемых локусах и соответствия этих данных результатам, полученным фенотипическим методом анализа. Для решения этой задачи полученные MLVA-генотипы на основе данных секвенсного анализа в 9 локусах лабораторных референтных (15) и вакцинных (2) штаммов сравнивали с одноименными штаммовы-ми генотипами, представленными в международных базах данных [20]. Для 13 штаммов результаты сравнения показали идентичность MLVA-генотипов и стабильное наследование тандемных повторов в анализируемых локусах. Результаты типирования MLVA-9 для этих штаммов воспроизводились после проведения 20 лабораторных пересевов на твердых питательных средах триптозного агара in vitro.

С другой стороны, результаты показали, что 3 референтных штамма B. melitensis 16M (по всем 9 локу-сам), B. suis Thomsen (по 7 локусам, кроме Bruce 06 и Bruce 21), B. abortus 292 (по 7 локусам, кроме Bruce 08 и Bruce 21) и вакцинный штамм B. melitensis Rev-1 (по

8 локусам, за исключением Bruce 16) не соответствова-

ли MLVA-генотипам международной базы данных. Результаты фенотипи-ческой идентификации этих штаммов также выявили несоответствия в тестах агглютинации с монорецеп-торными антисыворотками Ми A, чувствительности к фагам и краскам, связанные с контаминацией этих штаммов при пересевах.

Таким образом, MLVA-локусы проявляют стабильность в наследовании числа копий повторов, а схема MLVA-типирования воспроизводится на большинстве изученных штаммов бруцелл. Использование MLVA дает возможность типировать изоляты бруцелл до уровня штам-мовых различий и в то же время систематизирует штаммы бруцелл в соответствии с существующим таксономическим положением видов и биоваров бруцелл. Важным преимуществом MLVA-типирования является возможность проведения генетической идентификации как изо-лятов бруцелл, так и контрольных референтных и вакцинных штаммов бруцелл, что позволит заменить несовершенную систему их фенотипической идентификации, которая не отвечает требуемым критериям специфичности и быстроты анализа.

Таким образом, MLVA-типирование может служить эффективным инструментом для решения практических задач в эпидемиологии бруцеллеза, а широкое применение этого метода в России позволит качественно улучшить эпидемиологический надзор за этой инфекцией.

Сведения об авторах:

Кулаков Юрий Константинович - канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. бруцеллеза.

ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздрав-соцразвития России, Москва, e-mail: ykulakov@mail.ru

Ковалев Дмитрий Анатольевич - вед. науч. сотр. лаб. подготовки специалистов, канд. хим. наук

ФГУ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт». Роспотребнадзора, www. snipchi-rospotrebnadzor.ru E-mail: alcheem@mail.ru

Желудков Михаил Михайлович - руководитель лаб. бруцеллеза, д-р мед. наук, ФГБУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, Москва, e-mail: mmzhel.gamaleya@mail.ru

Ляпустина Лариса Вениаминовна - зам. дир. по научно-производственной работе, д-р мед. наук, ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. Роспотребнадзора, e-mail: larisavl@ mail.ru

Мисетова Елена Николаевна - ст. науч. сотр. лаб. подготовки специалистов, канд. мед. наук, ФГУЗ Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт, e-mail: snipchi@mail.stv.ru

Головнева Светлана Ивановна - науч. сотр. лаб. бруцеллеза, e-mail: snipchi@mail.stv.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Вершилова П. А. Бруцеллез. - М.: Медицина, 1972.

2. Желудков М. М., Цирельсон Л. Е., Кулаков Ю. К. и др. // Эпиде-миол. и вакцинопрофилактика. - 2009. - № 6. - С. 23-28.

3. Кулаков Ю. К., Erdenebaatar J., Цирельсон Л. Е. и др. // Журн. микробиол. - 2010. - № 3. - С. 17-22.

4. Кулаков Ю. К., Erdenebaatar J., Желудков М. М. и др. // Молекул. генетика. - 2011. - № 2. - С. 8-12.

5. AlDahoukS., Le FlecheP., NocklerK. et al. // J. Microbiol. Meth. -2007. - Vol. 69. - P. 137-145.

6. Alton G. G., Jones L. M., Angus R. D. et al. // Techniques for the brucellosis laboratory. - Paris, 1988. - P. 54-58.

7. Bikandi J., San Millan R., Rementeria A. et al. // Bioinformatics. -2004. - Vol. 20. - P. 798-799.

8. BoomR., SolC. J., SalimansM. M. et al. // J. Clin. Microbiol. - 1990.

- Vol. 28. - P. 495-503.

9. Bricker B. J., Ewalt D. R. // Bio. Med. Central Microbiol. - 2005. -Vol. 5. - P. 37.

10. Ficht T. // Future Microbiol. - 2010. - Vol. 6. - P. 859-866.

11. Halling S. M., Peterson-Burch B. D., Bricker B. J. et al. // J. Bacte-riol. - 2005. - Vol. 187. - P. 2715-2726.

12. HerM., Kang S. I., ChoD. H. et al. // Bio. Med. Centr. Microbiol. -

2009. - Vol. 29, N 9. - P. 230.

13. Her M., Kang S. I., Kim J. W. et al. // J. Microbiol. Biotechnol. -

2010. - Vol. 20. - P. 1750-1755.

14. Hunter P. R., Gaston M. A. // J. Clin. Microbiol. - 1988. - Vol. 26. -P. 2465-2466.

15. Jiang H., Mao L. L., Zhao H. Y. et al. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 2010. - Vol. 104, N 12. - P. 796-800.

16. Kulakov Y. K., ZheludkovM. M., Sclyarov O. D. // Vaccine. - 2010.

- Vol. 28 (suppl. 5). - P. 41-45.

17. Le Fleche P., Jacques I., Grayon M. et al. // Bio. Med. Centr. Microbiol. - 2006. - Vol. 6. - P. 9.

18. MaquartM., Le Fleche P., Foster G. et al. // Bio. Med. Central Microbiol. - 2009. - Vol. 20, N 9. - P. 145.

19. Marianelli C., Graziani C., Santangelo C. et al. // J. Clin. Microbiol.

- 2007. - Vol. 45. - P. 2923-2928.

20. Microorganisms Tandem Repeats Database. http://minisatellites.u-psud.fr

21. NocklerK., MavesR., CepedaD. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2009.

- Vol. 47, N 10. - P. 3147-3155.

22. ReesR. K., GravesM., CatonN. et al. // J. Microbiol. Meth. - 2009.

- Vol. 78, N 1. - P. 66-70.

23. TillerR. V., DeB. K., BoshraM. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2009. -Vol. 47, N 7. - P. 2226-2231.

24. Tiller R. V., Gee J. E., Frace M. A. et al. // Appl. Environ. Microbiol.

- 2010. - Vol. 76, N 17. - P. 5837-5845.

25. Valdezate S., Navarro A., Villalon P. et al. // J. Clin. Microbiol. -2010. - Vol. 48, N 8. - P. 2734-2740.

26. Van Belkum A., Tassios P. T., Dijkshoorn L. et al. // Clin. Microbiol. Infect. - 2007. - Vol. 13 (suppl. 3). - P. 1-46.

27. Whatmore A. M., Shankster S. J., Perrett L. L. et al. // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44. - P. 1982-1993.

28. Whatmore A. M. // Infect. Genet. Evol. - 2009. - Vol. 9. - P. 11681184.

Поступила 29.12.11

USE OF MULTIPLE LOCUS VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS ANALYSIS FOR THE BRUCELLA SYSTEMATIZATION

Y. K. Kulakov1, D. A. Kovalev2, E. N. Misetova2, S. I. Golovneva2, L. V. Lyapustina2, and M. M. Zheludkov1

1Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health and Social Development of the

Russian Federation, Moscow, Russia 2Stavropol Plague Control Research Institute of Federal Service for Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Stavropol, Russia

The methods of molecular-genetic differentiation to strain level acquire increasing significance in the current system of struggle with brucellosis. MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis) was selected for molecular-genetic differentiation to strain level and simultaneous establishment of the genetic relationship of investigated Brucella strains.

The goal of this work was MLVA typing of three pathogenic Brucella species strains with the analysis of stability of chosen loci, discrimination power and concordance to conventional phenotypic methods of the Brucella differentiation for use in systematization of brucellosis causing agents.

Materials and Methods. Twenty six Brucella strains representing reference (n = 15), vaccine (n = 2) and field strains of three pathogenic Brucella species were tested: B. melitensis (n = 3), B. abortus (n = 2), B. suis (n = 2), and isolates (n = 2) with unidentified taxonomic position using MLVA with 9 pairs primers on known variable loci of Brucella genome. The analysis of the stability of chosen loci, discrimination power on Hunter-Gaston discrimination index (HGDI) and consistency to phenotypic methods of identification was performed.

Results. MLVA was confirmed for the results of phenotypic methods of identification, stability of the chosen loci in majority reference, and vaccine strains with a high index of variability HGDI 0.9969 for all loci. A dendrogram was plotted on the basis of MLVA data on distributed Brucella strains in related clusters according to its taxonomic species and biovar positions and construction of 25 genotypes. B. melitensis strains formed cluster related to the reference strain of B. melitensis 63/9 biovar 2. Australian isolates of Brucella 83-4 and Brucella 83-6 isolated from rodents formed a cluster distant from other strains of Brucella.

Conclusion. MLVA is a promising method for differentiation of Brucella strains with known and unresolved taxonomic status for their systematization and creation of MLVA genotype catalogue that will promote qualitative improvement of brucellosis surveillance system in Russia.

Key words: brucellosis, Brucella, PCR, MLVA (multiple locus variable number tandem repeats analysis), differentiation, epidemiological inspection