ФЕРМЕНТАТИВНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ГЕКСОЗ

1. Способ получения гексозы из сахарида, включающий:
превращение фруктозо–6–фосфата (F6P) в гексозу, катализируемое одним или несколькими ферментами,
причем гексоза выбрана из группы, состоящей из аллозы, маннозы, галактозы, фруктозы, альтрозы, талозы, сорбозы, гулозы и идозы; и
причем указанные ферменты выбраны из группы, состоящей из изомеразы, эпимеразы и гексозо–специфической фосфатазы и их смесей.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой аллозу, и данный способ включает:
превращение F6P в псикозо–6–фосфат (P6P), катализируемое псикозо–6–фосфат–3–эпимеразой (P6PE);
превращение P6P в аллозо–6–фосфат (A6P), катализируемое аллозо–6–фосфат–изомеразой (A6PI); и
превращение A6P в аллозу, катализируемое аллозо–6–фосфат–фосфатазой (A6PP).
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой маннозу, и данный способ включает:
превращение F6P в маннозо–6–фосфат (M6P), катализируемое маннозо–6–фосфат–изомеразой (M6PI) или фосфоглюкоза/фосфоманнозаизомеразой (PGPMI); и
превращение M6P в маннозу, катализируемое маннозо–6–фосфат–фосфатазой (M6PP).
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой галактозу, и данный способ включает:
превращение F6P в тагатозо–6–фосфат (T6P), катализируемое фруктозо–6–фосфат–4–эпимеразой (F6PE);
превращение T6P в галактозо–6–фосфат (Gal6P), катализируемое галактозо–6–фосфат–изомеразой (Gal6PI); и
превращение Gal6P в галактозу, катализируемое галактозо–6–фосфат–фосфатазой (Gal6PP).
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой фруктозу, и данный способ включает:
превращение F6P в фруктозу, катализируемое фруктозо–6–фосфат–фосфатазой (F6PP).
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой альтрозу, и данный способ включает:
превращение F6P в псикозо–6–фосфат (P6P), катализируемое псикозо–6–фосфат–3–эпимеразой (P6PE);
превращение P6P в альтрозо–6–фосфат (Alt6P), катализируемое альтрозо–6–фосфат–изомеразой (Alt6PI); и
превращение полученного Alt6P в альтрозу, катализируемое альтрозо–6–фосфат–фосфатазой (Alt6PP).
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой талозу, и данный способ включает:
превращение F6P в тагатозо–6–фосфат (T6P), катализируемое фруктозо–6–фосфат–4–эпимеразой (F6PE);
превращение T6P в талозо–6–фосфат (Tal6P), катализируемое талозо–6–фосфат–изомеразой (Tal6PI); и
превращение Tal6P в талозу, катализируемое талозо–6–фосфат–фосфатазой (Tal6PP).
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой сорбозу, и данный способ включает:
превращение F6P в тагатозо–6–фосфат (T6P), катализируемое фруктозо–6–фосфат–4–эпимеразой (F6PE);
превращение T6P в сорбозо–6–фосфат (S6P), катализируемое сорбозо–6–фосфат–эпимеразой (S6PE); и
превращение S6P в сорбозу, катализируемое сорбозо–6–фосфат–фосфатазой (S6PP).
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой гулозу, и данный способ включает:
превращение F6P в тагатозо–6–фосфат (T6P), катализируемое фруктозо–6–фосфат–4–эпимеразой (F6PE);
превращение T6P в сорбозо–6–фосфат (S6P), катализируемое сорбозо–6–фосфат–эпимеразой (S6PE);
превращение S6P в гулозо–6–фосфат (Gul6P), катализируемое гулозо–6–фосфат–изомеразой (Gul6PI); и
превращение Gul6P в гулозу, катализируемое гулозо–6–фосфат–фосфатазой (Gul6PP).
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что гексоза представляет собой идозу, и данный способ включает:
превращение F6P в тагатозо–6–фосфат (T6P), катализируемое фруктозо–6–фосфат–4–эпимеразой (F6PE);
превращение T6P в сорбозо–6–фосфат (S6P), катализируемое сорбозо–6–фосфат–эпимеразой (S6PE);
превращение S6P в идозу–6–фосфат (I6P), катализируемое идозо–6–фосфат–изомеразой (I6PI); и
превращение I6P в идозу, катализируемое идозо–6–фосфат–фосфатазой (I6PP).
11. Способ по любому из пп. 1–10, дополнительно включающий стадию превращения глюкозо–6–фосфата (G6P) в F6P, где указанная стадия катализируется фосфоглюкоизомеразой (PGI).
12. Способ по п. 11, дополнительно включающий стадию превращения глюкозо–1–фосфата (G1P) в G6P, где указанная стадия катализируется фосфоглюкомутазой (PGM).
13. Способ по п. 12, дополнительно включающий стадию превращения сахарида в G1P, причем указанная стадия катализируется, по меньшей мере, одним ферментом, при этоме указанный сахарид выбран из группы, состоящей из крахмала или его производного и сахарозы.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что по меньшей мере один фермент на стадии превращения сахарида в G1P выбран из группы, состоящей из альфа–глюкан–фосфорилазы (αGP), мальтозо–фосфорилазы, сахарозо–фосфорилазы и их смесей.
15. Способ по п. 13 или 14, отличающийся тем, что сахаридом является крахмал или его производное, выбранное из группы, состоящей из амилозы, амилопектина, растворимого крахмала, амилодекстрина, мальтодекстрина, мальтозы, глюкозы и их смесей.
16. Способ по п. 15, дополнительно включающий стадию превращения крахмала в производное крахмала, где производное крахмала получают ферментативным гидролизом крахмала или кислотным гидролизом крахмала.
17. Способ по п. 15 или 16, отличающийся тем, что в способе добавляют 4–глюкантрансферазу (4GT).
18. Способ по любому из пп. 13–17, отличающийся тем, что производное крахмала получено ферментативным гидролизом крахмала, катализируемым изоамилазой, пуллуланазой, альфа–амилазой или их комбинацией.
19. Способ по п. 2, отличающийся тем, что A6PI содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 55% идентичность последовательности с SEQ ID No: 1 или 2, причем указанная A6PI катализирует превращение P6P в A6P.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что A6PI содержит укладку Россмана для катализа, с His на С–конце 1–й β–цепи укладки Россмана; Arg на С–конце α–спирали С–конца 5–й β–цепи укладки Россмана; His в активном сайте; Cys; Thr в активном сайте; GTG–гидрофобный–G мотив вблизи активного сайта и Asn вблизи активного сайта.
21. Способ по любому из пп. 2 и 19–20, отличающийся тем, что A6PP содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 30% идентичность последовательности с любой из SEQ ID No: 3–7, и где указанная A6PP катализирует превращение A6P в аллозу.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что A6PP содержит домен укладки Россмана для катализа, C1 кэпированный домен, сигнатуру DxD в 1–ой β–цепи укладки Россмана, Thr или Ser на конце 2–ой β–цепи укладки Россмана, Lys на N–конце α–спирали С–терминально относительно 3–ей β–цепи укладки Россмана, и сигнатуру ED на конце 4–ой β–цепи укладки Россмана.
23. Способ по п. 3, отличающийся тем, что M6PI содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 25% идентичность последовательности с любой из SEQ ID No: 8–11, причем указанная M6PI катализирует превращение F6P в M6P.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что M6PI содержит два домена с ядром из антипараллельных β–цепей, напоминающих укладку купина, и третий домен, состоящий только из α–спиралей, и двухвалентный катион металла.
25. Способ по любому из пп. 3, 23 или 24, отличающийся тем, что PGPMI содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 25% идентичность последовательности с любой из SEQ ID No: 15–17, и где указанная PGPMI катализирует превращение F6P в M6P.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что PGPMI содержит две укладки Россмана, GGS–мотив, SYSG–X–T–X–ET–гидрофобный мотив, EN–сигнатуру, где Glu присутствует для переноса основного протона в активном сайте, и HN–сигнатуру, где His присутствует для раскрытия/закрытия кольца субстрата во время катализа.
27. Способ по любому из пп. 3 и 23–26, отличающийся тем, что M6PP содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 30% идентичность последовательности с любой из SEQ ID No: 12–14, причем указанная M6PP катализирует превращение M6P в маннозу.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что M6PP содержит домен укладки Россмана для катализа, C1 кэпированный домен, сигнатуру DxD в 1–ой β–цепи укладки Россмана, Thr или Ser в конце 2–ой β–цепи укладки Россмана, Lys на N–конце α–спирали С–терминально относительно 3–ей β–цепи укладки Россмана, и сигнатуру GDxxxD на конце 4–ой β–цепи укладки Россмана.
29. Способ по п. 5, отличающийся тем, что F6PP содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 25% идентичность последовательности с SEQ ID No: 21, причем указанная F6PP катализирует превращение F6P во фруктозу.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что F6PP содержит домен укладки Россмана для катализа, C1 кэпированный домен, сигнатуру DxD в 1–ой β–цепи укладки Россмана, Thr или Ser в конце 2–ой β–цепи укладки Россмана, Lys на N–конце α–спирали С–терминально относительно 3–ей β–цепи укладки Россмана, и сигнатуру ED на конце 4–ой β–цепи укладки Россмана.
31. Способ по п. 4, отличающийся тем, что Gal6PI представляет собой мультимер из двух субъединиц Lac A и Lac B,
причем указанная Lac A содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 25% идентичность последовательности с SEQ ID No: 18;
причем указанная Lac B содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 25% идентичность последовательности с SEQ ID No: 19,
причем указанная Gal6PI катализирует превращение T6P в Gal6P.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что Gal6PI содержит гетеродимер (‘A’ и ‘B’), состоящий из субъединиц с Россман–подобными αβα сэндвич–укладками, Arg130 и Arg134 в ‘A’ и His9 и Arg39 в ‘B’ для связывания фосфатной группы субстрата, His96 в ‘A’ для раскрытия кольца субстрата, Asn97 в ‘A’ для стабилизации высокоэнергетических промежуточных продуктов и Cys65 и Thr67 в ‘B’ для участия в переносе протона.
33. Способ по любому из пп. 4, 31 и 32, отличающийся тем, что Gal6PP содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 25% идентичность последовательности с SEQ ID No: 20, причем указанная Gal6PP катализирует превращение Gal6P в галактозу.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что Gal6PP содержит домен укладки Россмана для катализа, C2 кэпированный домен, сигнатуру DxD в 1–ой β–цепи укладки Россмана, Thr или Ser на конце 2–ой β–цепи укладки Россмана, и сигнатуру GDxxxD на конце 4–ой β–цепи укладки Россмана.
35. Способ по п. 14, отличающийся тем, что гексозой является фруктоза, сахарид представляет собой сахарозу, и где по меньшей мере один фермент представляет собой сахарозо–фосфорилазу.
36. Способ по любому из пп. 3 и 23–28, дополнительно включающий превращение G6P в F6P катализируемое PGPMI, причем F6P превращается в М6Р с помощью PGPMI.
37. Способ по любому из пп. 1–36, отличающийся тем, что стадии указанного способа проводят при температуре в диапазоне от около 40°C до около 70°С, при рН в диапазоне от около 5,0 до около 8,0, и/или в течение от около 8 часов до около 48 часов.
38. Способ по любому из пп. 1–37, отличающийся тем, что стадии указанного способа проводят в одном биореакторе или в множестве биореакторов, расположенных последовательно.
39. Способ по любому из пп. 1–38, отличающийся тем, что стадии указанного способа проводят без АТФ, без NAD(P)(H), при концентрации фосфата от около 0,1 мМ до около 150 мМ, фосфат перерабатывают, и/или, по меньшей мере, одна стадия указанного способа включает энергетически выгодную химическую реакцию.
40. Гексоза, полученная способом по любому из пп. 1–39, выбранная из группы, состоящей из аллозы, маннозы, галактозы, фруктозы, альтрозы, талозы, сорбозы, гулозы и идозы.