СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМОЙ КОМПОЗИЦИИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА
METHOD OF PRODUCING WATER-SOLUBLE COMPOSITION OF SILVER NANOPARTICLES

Изобретение относится к способам получения высокодисперсных коллоидных частиц или наночастиц металлического серебра, которые могут быть использованы в производстве катализаторов химических процессов, а также в биотехнологии, медицине и ветеринарии в составе препаратов с антибактериальным действием.
Известен способ получения наночастиц серебра в обратных мицеллах (Крутяков Ю.А., Кудринский А.А., Оленин А.Ю., Лисичкин Г.В. - Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы. // Успехи химии, 77(3), 2008, стр. 242-269; RU 2147487 С2, МПК 7 B22F 9/24, опубл. 20.04.2000). Способ заключается в формировании обратно-мицелярного раствора (дисперсии) и контролируемом восстановлении ионов серебра в мицеллах. В качестве ионного серебра используют водорастворимые соли серебра (нитрат, ацетат), в качестве восстанавливающих агентов используют различные восстановители - формальдегид, гидразин, борогидрид, гипофосфит, гидрохинон, тартрат, цитрат и другие.
Недостатками этого способа являются низкая технологичность, использование органических растворителей и поверхностно-активных веществ, от которых в последующем сложно избавиться и примеси которых повышают токсичность получаемых наночастиц серебра.
Известен способ получения наночастиц серебра восстановлением из раствора его солей в гелевой катионообменной матрице (RU 2385293 С2, МПК (2006.01) C01G 5/00, В82В 3/00, опубл. 27.03.2010). Получаемые по данному способу наночастицы серебра иммобилизованы в объеме матрицы.
Недостатком способа является низкая биодоступность наночастиц серебра.
Известен способ получения наноразмерных частиц серебра из массива металла серебра. Способ включает в себя дробление, диспергирование массива металла различными методами: газодинамическое распыление расплава, испарение и конденсация, распыление взрывом, электродуговой и электроискровой разряды (RU 2403317 С2, МПК (2006.01) С23С 16/44, В82В 3/00, опубл. 10.11.2010; Каплуненко В.Г., Косинов Н.В., Поляков Д.В. - Получение новых биогенных и биоцидных наноматериалов с помощью эрозионно-взрывного диспергирования металлов. / Физический вакуум и природа. Киев, 2008. Вып. 1 - С. 18-22).
Недостатками данного способа являются высокая энергоемкость, использование сложного оборудования и специальных условий (вакуум, инертный газ). Полученные таким способом наночастицы серебра используются преимущественно в технических целях. Невысокая стабильность водных растворов получаемых данным способом наночастиц серебра и их неудовлетворительные фармакологические показатели (по токсикологии, специфической антибактериальной активности) затрудняют использование таких наночастиц в биотехнологии, медицине и ветеринарии.
Известен способ получения наночастиц серебра в водной среде путем электрохимического анодного растворения металлического серебра (RU 2390344 С2, МПК (2006.01) A61K 33/38, C01G5/00, В82В 3/00, опубл. 27.05.2010). Способ включает в себя растворение стабилизаторов в дистиллированной воде, помещение в полученный раствор анода, выполненного в виде серебряной пластины, и катода, выполненного в виде пластины из нержавеющей стали, электрохимическое растворение анода при пропускании через раствор постоянного электрического тока. Процесс растворения стабилизаторов проходит в две стадии: сначала в дистиллированной воде при нагревании до 45-55°С и перемешивании растворяют стабилизатор, выбранный из полигликолей, поливинилпирролидона, желатина или полиакрилата натрия или калия, а затем после охлаждения в полученный раствор добавляют при перемешивании стабилизатор, выбранный из цитратов аммония, калия или натрия.
В этом способе используется сложный стабилизатор, включающий в свой состав полимер без уточнения его медицинского предназначения, и низкомолекулярный компонент, выбранный из цитратов аммония, калия или натрия. Это означает, что часть серебра в получаемом растворе присутствует в виде цитрата, то есть в виде соли, и в растворе обязательно присутствуют продукты окисления цитрат-аниона (в частности ацетондикарбоновая и итаконовая кислоты) (Крутяков Ю.А., Кудринский А.А., Оленин А.Ю., Лисичкин Г.В. - Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы. // Успехи химии, 77(3), 2008. - С. 242-269). Это может негативно сказаться на фармакологических показателях получаемого наносеребра, в частности по токсичности. Токсикологические и бактерицидные характеристики получаемых данным способом водных растворов наночастиц серебра не приводятся. Подтверждаемые возможные перспективы применения таких препаратов для медицинских целей неизвестны.
Известен коммерческий бактерицидный водорастворимый лекарственный препарат колларгол (Благитко Е.М., Бурмистров В.А., Колесников А.П., Михайлов Ю.И., Родионов П.П. - Серебро в медицине /Новосибирск, Наука-Центр, 2004). Колларгол представляет собой коллоидную композицию, содержащую металлическое серебро, стабилизированное защитными высокомолекулярными соединениями белковой природы - гидролизатами казеина и/или альбумина. Способ получения колларгола включает в себя следующие основные операции.
1. Приготовление восстановительной смеси гидролизатов белка путем щелочного гидролиза казеина и альбумина (обработка раствором едкого натра при нагревании).
2. Приготовление окиси серебра путем ее количественного осаждения из водного раствор нитрата серебра раствором едкого натра.
3. Восстановление окиси серебра путем обработки восстановительной смесью в водном растворе при нагревании и перемешивании.
4. Переосаждение полученного продукта коллоидного серебра серной или уксусной кислотой с промывкой осадка дистиллированной водой с целью удаления посторонних веществ. Затем осадок переводят в раствор добавлением раствора едкого натра, концентрируют раствор путем упаривания, снова осаждают и отделяют осадок, который подвергают сушке.
По внешнему виду фармакопейный колларгол представляет собой зеленовато- или синевато-черные пластинки с металлическим блеском. Содержит 70% серебра. Растворяется в воде с образованием коллоидного раствора.
Недостатками известного способа получения коллоидного металлического серебра является низкая технологичность и сложность получения целевого продукта с воспроизводимыми свойствами из-за непостоянства состава и неоднородности исходного белкового сырья и продуктов его гидролиза. Кроме того, водные растворы колларгола нестабильны, что не позволяет выпускать колларгол в виде готовых к применению лекарственных форм с длительными сроками хранения. Колларгол выпускается в виде субстанции (порошка), из которой в рецептурных отделах аптек или клиник готовят экстемпоральные формы в виде 1-2% водного раствора, срок годности которого не более 30 дней. Это затрудняет широкое использование колларгола в медицинской и ветеринарной практике.
Известен способ получения электролитическим методом коллоидных наночастиц серебра (CN 101225533 А, МПК С25С 1/20; С25С 5/02, опубл. 23.07.2008), выбранный в качестве прототипа, включающий электролиз раствора поливинилового спирта и нитрата серебра с использованием серебряных катода и анода. В этом способе в качестве полимера-стабилизатора используют поливиниловый спирт, в электролит добавляют нитрат серебра в концентрации 20-60 мг на 1000 мл (0,002-0,006 мас.%). Для электролиза используют электроды из серебряного прута диаметром 4-6 мм и длиной от 90 до 110 мм. Время электролиза составляет 50-60 минут.
Недостатком такого способа является невысокий выход коллоидного серебра. Токсикологические и бактерицидные характеристики получаемых этим способом коллоидных наночастиц серебра не известны.
Задача изобретения - разработка способа получения водорастворимой композиции наночастиц серебра с улучшенными показателями по антимикробной активности и токсикологии.
Предложенный способ получения водорастворимой композиции наночастиц серебра так же как в прототипе заключается в электролизе раствора детоксикационного полимера-стабилизатора и нитрата серебра с использованием серебряных катода и анода.
Согласно изобретению в качестве полимера-стабилизатора используют поливинилпирролидон медицинского назначения. Отдельно в воде готовят раствор поливинилпирролидона с концентрацией 5-40 мас.% и раствор нитрата серебра, которые после растворения компонентов объединяют из расчета конечной концентрации нитрата серебра в пересчете на серебро 0,1-2,5 мас.%, и весовом соотношении серебро/полимер от 1:10 до 1:20. Затем ведут электролиз при перемешивании и нагреве при 90-95°С до полного перехода ионного серебра в коллоидное.
Концентрации поливинилпирролидона меньше 5 мас.% приводят к агрегативной нестабильности получаемого раствора коллоидного серебра, а концентрации больше 40 мас.% плохо растворимы. Концентрации нитрата серебра в перерасчете на серебро в электролите меньше 0,1 мас.% малопродуктивны и экономически малоцелесообразны с учетом выхода коллоидного серебра. Концентрации серебра больше 2,5 мас.% вызывают агрегативную нестабильность получаемого раствора коллоидного серебра. Рекомендуемое соотношение серебро/полимер составляет от 1:10 до 1:20 (на 1 весовую часть серебра 10-20 весовых частей полимера). При соотношениях серебро/полимер меньше 1:10 повышается агрегативная неустойчивость получаемого коллоидного серебра в процессе длительного хранения. При соотношениях серебро/полимер больше 1:20 возникают проблемы с неполной растворимостью больших количеств поливинилпирролидона при больших концентрациях серебра.
Перемешивание и нагрев при 90-95°С используют для интенсификации процесса перехода ионного серебра в коллоидное серебро и для создания условий, способствующих образованию высокодисперсных частиц серебра с узким распределением частиц по размерам и с хорошей агрегационной стабильностью. Если раствор не перемешивать и не греть при указанной температуре, образуется агрегативно нестабильный раствор, содержащий крупные частицы серебра, которые при хранении выпадают в осадок.
Технический результат заключается в повышении специфической антимикробной активности и снижении токсичности, а также в повышении выхода коллоидного серебра.
В таблице 1 представлены результаты сравнительных анализов антибактериальной (бактерицидной и бактериостатической) активности препарата, полученного предложенным способом, и колларгола.
В таблице 2 представлены результаты сравнительной оценки острой токсичности при внутрибрюшинном введении препарата, полученного предложенным способом и колларгола.
В таблице 3 представлены результаты сравнения антибактериальной (бактерицидной и бактериостатической) активности препарата, полученного с помощью способа-прототипа, и препарата, полученного предложенным способом.
В отдельных емкостях в дистиллированной воде по отдельности готовили раствор полимера-стабилизатора и раствор нитрата серебра. В качестве полимера-стабилизатора использовали полимер с детоксикационным действием поливинилпирролидон медицинский низкомолекулярный (ФСП 42-0345-4368-03). Непосредственно перед процедурой электролиза (получение коллоидного серебра) растворы смешивали в необходимой концентрации и пропорции. Концентрация поливинилпирролидона составляла 5-40 мас.%. Концентрация нитрата серебра в пересчете на серебро в электролите составляла 0,1-2,5 мас.%. Соотношение серебро/полимер составляло от 1:10 до 1:20 (на 1 весовую часть серебра 10-20 весовых частей полимера). Для получения выбранных концентраций в качестве растворителя использовали дистиллированную воду в необходимом для соответствующего разбавления количестве.
При растворении поливинилпирролидона объем раствора увеличивался, незначительно увеличивалась плотность получаемого раствора, которая составляла 1,02-1,05 г/мл в зависимости от концентрации полимера. Так как растворы с полимером, особенно концентрированные, вязкие, плохо дозируются по объему, и существенная часть раствора остается на стенках, то для большей точности при приготовлении растворов, их смешивании, для удобства расчета концентрации в мас.%, количество компонентов, включая воду, отмеряли по весу, в граммах. Пробы также отбирали по весу.
2
Полученный раствор перемешивали и помещали в электродную ячейку, выполненную из инертного материала (стекло). В ней же размещали электроды. Во избежание загрязнения раствора примесями других металлов, анодом и катодом служили пластины из чистого серебра (ГОСТ Р ИСО 9001-2001). При перемешивании и нагреве раствора на электроды подавали постоянный ток напряжением 9-12 В и плотностью 5-15 А/м. Нагревали раствор до температуры 90-95°С, выдерживали при этой температуре в течении времени, достаточного для полного перехода ионного серебра в коллоидное серебро. Полноту перехода ионного серебра в коллоидное проверяли качественной капельной пробой на ионное серебро с насыщенным раствором NaCl (Государственная фармакопея СССР, X издание, стр. 746). Ионное серебро при добавлении хлорид-ионов образует характерный белый осадок хлорида серебра, нерастворимый в азотной кислоте, но растворимый в избытке раствора аммиака. Время электролиза определяется концентрацией серебра и составляет 1-15 минут в зависимости от концентрации серебра. Раствор меняет цвет в зависимости от концентрации серебра от темно-коричневого цвета различной интенсивности при небольших концентрациях серебра до темно-серо-коричневого цвета при больших количествах серебра из-за образования коллоидного серебра. При отрицательной пробе на ионное серебро раствор выдерживали при температуре 90-95°С еще дополнительно 2-3 минуты для полноты перехода ионного серебра в коллоидное. Затем процесс прекращали, раствор охлаждали, переливали в мерную емкость, доводили дистиллированной водой или раствором полимера до необходимой концентрации по серебру. Готовый раствор переливали в емкость из непрозрачного материала. Хранили раствор в герметично закрытом виде в защищенном от света месте.
Пример 1.
В химическом стакане емкостью 500-600 мл взвесили 80 г поливинилпирролидона, добавили 250 г дистиллированной воды и растворили при перемешивании до полного растворения. Таким образом, получили раствор с концентрацией поливинилпирролидона 24,2 мас.%.
В другом стакане емкостью 100-150 мл взвесили 7,9 г нитрата серебра (в пересчете на чистое серебро это составляет 5 г), добавили 50 г дистиллированной воды и растворили. После полного растворения раствор нитрата серебра прилили к раствору поливинилпирролидона, перемешали, довели массу раствора до 400 г дистиллированной водой. Таким образом, получили раствор с конечной концентрацией серебра 1,25 мас.% (0,0125 г/г раствора) и весовом соотношении серебро/полимер 1:16. Полученный раствор перелили в электролитическую ячейку, нагревали при перемешивании до температуры 93°С и пропускали постоянный электрический ток в течение 8 минут, что достаточно для полного перехода ионного серебра в коллоидное. Полноту перехода ионного серебра в коллоидное серебро контролировали качественной капельной пробой на ионное серебро. После отрицательной пробы на ионное серебро раствор дополнительно еще выдерживали 2 минуты в режиме нагревания и электролиза, затем процесс прекращали, раствор охлаждали и переливали в герметично закрывающуюся емкость из непрозрачного материала. По данным химического анализа концентрация коллоидного серебра в данном образце составила 1,26 мас.%, или соответственно выход коллоидного серебра составил 0,0126 г/г раствора.
Пример 2.
Взвесили 8 г поливинилпирролидона, растворили его в 152 г дистиллированной воды, таким образом, получили раствор с концентрацией поливинилпирролидона 5 мас.%. В другой емкости взвесили 0,64 г нитрата серебра (0,40 г в пересчете на чистое серебро), растворили его в 50 г дистиллированной воды, затем растворы объединили, довели до 400 г дистиллированной водой. Получили 400 г раствора с конечной концентрацией серебра 0,1 мас.% и весовом соотношении серебро/полимер 1:20. Полученный раствор перелили в электролитическую ячейку, нагревали при перемешивании до температуры 90°С, и пропускали постоянный электрический ток в течение 3 минут, что достаточно для полного перехода ионного серебра в коллоидное. После отрицательной пробы на ионное серебро раствор дополнительно еще выдерживали 2 минуты в режиме нагревания и электролиза, затем процесс прекращали, раствор охлаждали и переливали в герметично закрывающуюся емкость из непрозрачного материала. По данным химического анализа концентрация коллоидного серебра в данном образце составила 0,102 мас.%, или соответственно выход коллоидного серебра составил 0,00102 г/г раствора.
Пример 3.
Взвесили 100 г поливинилпирролидона, растворили его в 150 г дистиллированной воды, получили раствор поливинилпирролидона 40 мас.%. В другой емкости взвесили 15,8 г нитрата серебра (10 г в пересчете на чистое серебро), растворили его в 134,2 г дистиллированной воды, затем растворы объединили. Таким образом, получили 400 г раствора с конечной концентрацией серебра 2,5 мас.% и весовом соотношении серебро/полимер 1:10. Полученный раствор перелили в электролитическую ячейку, нагревали при перемешивании до температуры 95°С и пропускали постоянный электрический ток в течение 15 минут, что достаточно для полного перехода ионного серебра в коллоидное, что контролировали качественной пробой на ионное серебро. После отрицательной пробы на ионное серебро раствор дополнительно еще выдерживали 2 минуты в режиме нагревания и электролиза, затем процесс прекращали, раствор охлаждали и переливали в герметично закрывающуюся емкость из непрозрачного материала. По данным химического анализа концентрация коллоидного серебра в данном образце составила 2,52 мас.%, или соответственно выход коллоидного серебра 0,0252 г/г раствора.
Пример 4.
Было проведено сравнительное изучение антибактериальной (бактерицидной и бактериостатической) активности препарата, полученного по примеру 1, и колларгола - коммерчески доступного препарата, разрешенного для применения в медицине и ветеринарии. Водные растворы препаратов перед исследованием были стандартизованы по содержанию серебра, которое составляло 1 мас.% (0,01 г/г раствора).
В качестве тест-штаммов использовали следующие бактериальные культуры:
- Escherichia coli - грамотрицательная неспороносная бактерия;
- Staphylococcus aureus - грамположительная неспороносная бактерия;
- Candida albicans - дрожжи, эукариотический тип строения клеток.
Методика исследования
Материалы и реактивы:
- Физиологический раствор 0,9%;
- L-бульон - стандартизованная питательная среда (состав среды: триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, хлорид натрия - 10 г/л, 0.6% глюкозы, рН - 7,2);
- Рыбный питательный агар, РПА.
Антимикробную активность препаратов определяли путем подсчета количества жизнеспособных бактерий в колониеобразующих единицах (КОЕ/мл) при культивировании тест-штамма на жидкой питательной среде в присутствии разведений исследуемых препаратов. В качестве контроля была питательная среда с добавлением тест-штамма, но без добавления препарата.
Для определения антимикробной активности препаратов использовали суспензии бактериальных тест-культур с концентрацией 10-10 КОЕ/мл, которые получали разведением свежеприготовленной суточной культуры в L-бульоне. В пробирки с 10 мл суспензии бактерий добавляли расчетное количество разведения препарата и инкубировали в термостате на качалке (180 оборотов в минуту) при температуре 37°С. Через 24 часа отбирали пробы суспензии, которые раститровывали с целью определения жизнеспособных бактерий. Для подсчета концентрации жизнеспособных бактерий (колониеобразующие единицы, КОЕ) делали десятикратные разведения образцов на физиологическом растворе и высевали на чашки с РПА, которые инкубировали в термостате при 37°С, и через 20 часов учитывали результаты - подсчитывали число выросших колоний и рассчитывали концентрацию жизнеспособных бактерий в КОЕ/мл суспензии.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, препарат, полученный предложенным способом, обладает более высокой антимикробной активностью. Образцы препаратов в разведении 10" оказывали бактерицидное действие (0, отсутствие роста бактерий тест-штамма), поэтому в таблице 1 не приведены.
Пример 5.
Сравнительная оценка острой токсичности при внутрибрюшинном введении колларгола и препарата, полученного согласно примеру 3.
50
100
Исследование проводили на белых взрослых мышах весом 20-22 г. Водные 25% растворы колларгола и препарата, полученного согласно примеру 3, в возрастающих дозах вводили внутрибрюшинно мышам до появления летального исхода. Расчет летальных доз делали в пересчете на сухое вещество препаратов в мг на кг массы животного. LD вызывала гибель 50% мышей, LD вызывала 100% гибель мышей.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, препарат, полученный заявляемым способом, менее токсичен.
Пример 6.
Сравнение выхода коллоидного серебра у препарата сравнения, полученного с помощью способа-прототипа, и препаратов, полученных заявленным способом.
Для получения препарата сравнения в качестве электролита использовали 5% раствор поливинилового спирта 400 г, в который был добавлен нитрат серебра в количестве 0,024 г, то есть в концентрации 0,060 г на 1000 г. Время электролиза 50 минут. По данным химического анализа содержание серебра или выход коллоидного серебра в препарате сравнения составил 0,00015 г/г раствора. В препаратах по заявленному способу, полученных в примерах 1, 2, 3, выход коллоидного серебра соответственно составлял 0,0126 г/г раствора, 0,00102 г/г раствора, 0,0252 г/г раствора, то есть гораздо больше.
Таким образом, положительным результатом предложенного способа по сравнению с известным способом получения с дополнительным введением нитрата серебра в наибольшей концентрации (0,06 г на 1000 г) в раствор электролита является повышение выхода коллоидного серебра. Это происходит за счет перехода ионного серебра, представленного в виде нитрата серебра, в коллоидное серебро.
Пример 7.
Сравнительное изучение антибактериальной (бактерицидной и бактериостатической) активности препарата сравнения, полученного с помощью способа-прототипа и препарата, полученным заявленным способом.
В качестве препарата сравнения использовали препарат, полученный в примере 6, то есть препарат с максимальным содержанием нитрата серебра в растворе 0,06 г на 1000 г в соответствии со способом-прототипом. В качестве препарата по заявленному способу использовали препарат, полученный в примере 2, то есть с минимальным значением добавляемого в электролит нитрата серебра. Перед тестированием для корректного сравнения в препарате по заявленному способу концентрация серебра была уменьшена путем соответствующего разбавления водой до значения концентрации препарата сравнения (0,00015 г/г раствора).
В качестве тест-штаммов использовали следующие бактериальные культуры:
- Escherichia coli - грамотрицательная неспороносная бактерия;
- Staphylococcus aureus - грамположительная неспороносная бактерия;
Методика исследования приведена в примере 4.
Как видно из результатов, представленных в таблице 3, препарат по заявленному способу обладает большей антимикробной активностью.