Протекторное действие биологически активных веществ на жизнеспособность эпидермальных клеток Allium cepa L. при кратковременном металлическом стрессе

ДМИТРИЕВА О. О., БАШМАКОВ Д. И.

ПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ALLIUM CEPA L.

ПРИ КРАТКОВРЕМЕННОМ МЕТАЛЛИЧЕСКОМ СТРЕССЕ Аннотация. В работе исследованы эффекты регуляторов роста (РР) на жизнеспособность эпидермальных клеток лука при кратковременных экспозициях высоких (1 и 10 мМ) концентраций ионов тяжелых металлов (ТМ). Спустя 2 ч. экспозиции воздействие металлов достигало сублетального (на фоне 1 мМ Ni2+ и Cu2+, также 10 мМ Co2+, Zn2+ и Ni2+) и летального (на фоне 10 мМ Cu2+) уровня. В ряде случаев РР частично или полностью нивелировали возникающие под действием ионов ТМ негативные эффекты.

Ключевые слова: Allium cepa L., тяжелые металлы, жизнеспособность, регуляторы роста растений, эпидермальные клетки, кратковременный стресс.

DMITRIEVA O. O., BASHMAKOV D. I.

PROTECTIVE EFFECTS OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES ON VIABILITY OF ONION (ALLIUM CEPA L.) EPIDERMAL CELLS UNDER SHORT-TERM METAL STRESS Abstract. We studied the effect of growth regulators (PGRs) on the viability of onion epidermal cells exposed to short-term metal stress (1 and 10 mM of heavy metal ions). After 2 h. the metal exposure has reached sub-lethal (at 1 mM Ni2+ or Cu2+ and 10 mM of Co2+, Zn2+ or Ni2+) and lethal (at 10 mM of Cu 2+) levels. In some cases, the PGR neutralized (partially or completely) the negative HM effects.

Keywords: Allium cepa L., heavy metals, viability, onion epidermal cells, plant growth regulators, short-term stress.

В связи с проблемой загрязнения окружающей среды продуктами техногенеза тяжелые металлы (ТМ) стали объектом пристального внимания экологического мониторинга [2; 6]. Как и многие факторы среды, ТМ действуют на организм дозировано - их действие определяется не только концентрацией ионов, поступивших в клетку, но и продолжительностью экспозиции [2; 5; 13; 17]. Однако до сих пор чрезвычайно мало сведений о том, насколько быстро в клетках может развиться окислительный стресс и последующие за ним окислительные повреждения мембран и органелл. К тому же, в естественных условиях ТМ на своем пути минуют многочисленные барьеры, препятствующие их продвижению по растению [13].

В современной агрономической практике используется большое количество искусственных и натуральных биологически активных веществ (БАВ), способных защитить

растения от холода, жары, засухи и других неблагоприятных факторов, повысить количество и качество урожая [1; 7; 8; 13-16; 19; 20]. Цель нашей работы - изучить влияние природных и синтетических БАВ на жизнеспособность растительных клеток на фоне непосредственного (на тканевом уровне) действия ТМ.

Постановка эксперимента. Клетки эпидермальной ткани луковицы лука (Allium cepa L.) сорта «Каба» помещали в чашки Петри на растворы, содержащие 1 мМ или 10 мМ ионов ТМ (Cu2+, Zn2+, Ni2+ или Co2+). Контролем была дистиллированная вода. Половина чашек Петри из каждого варианта опыта содержала тот или иной синтетический или природный регулятор роста (РР): 10 нМ тидиазурона (TDZ); 0,1 мкМ цитодефа (CTD); 25 ppm 6-бензиламинопурина (6-БАП); 0,1% гумат+7 (HUM) или иммуноцитофита (ICP - 10 мкМ этилового эфира арахидоновой кислоты). По истечении 2 ч. эпидермальную ткань лука погружали в гипертоничный раствор NaCl и через световой микроскоп Биолам ЛОМО С1 (увеличение 150), по наличию или отсутствию плазмолиза, подсчитывали количество живых и погибших клеток в 4-5 полях зрения в каждом варианте опыта. Опыт повторяли трижды. Результаты обрабатывали статистически по общепринятым биометрическим формулам. Значения в таблицах и на рисунке представлены в виде «среднее арифметическое ± стандартная ошибка среднего арифметического».

Из полученных в ходе экспериментов данных следует, что количество живых клеток в контроле на протяжении опыта оставалось на уровне около 85%. Ионы ТМ по-разному влияли на жизнеспособность эпидермальных клеток. Количество живых клеток в растворах, содержащих 1 мМ ионов Ni2+, Co2+ и Zn2+ после двухчасовой экспозиции оставалось на уровне контроля, в то время как та же концентрация Cu2+ вызывала снижение числа жизнеспособных клеток на 13%. Имела место тенденция к уменьшению количества живых клеток с увеличением концентрации ТМ. Однако в среде, содержащей ионы Cu2+ и Ni2+, наблюдали резкое существенное снижение жизнеспособности клеток. Как показали полученные результаты, Co и Zn лучше других металлов поддерживали жизнедеятельность растительных клеток, в то время как спустя 2 ч. экспозиции растворы, содержащие ионы Ni и Cu убивали от 5-12 до 11-30% клеток эпидермальной ткани лука (по сравнению с водным контролем).

Согласно методике, предложенной М. Н. Прозиной [4], если количество жизнеспособных клеток в той или иной токсичной среде меньше контрольной на 20% и более, то эта доза токсиканта считается летальной. Соответственно, если процент живых клеток в среде выше или на уровне контроля, то данная доза поддерживает жизнеспособность клеток и может считаться витальной (оптимальной). Сублетальные дозы, снижающие жизнеспособность клеток, лежат между этими экологическими зонами.

Можно заключить, что при кратковременном воздействии ионов Zn2+ и Co летальная

зона находилась вне исследованных концентраций. Сублетальными были обе исследованные концентрации Ni2+. Летальным для клеток лука оказалось 2 ч. действие 10 мМ ионов Cu2+.

Из таблицы видно, что синтетические и природные регуляторы роста оказывали неодинаковое влияние на жизнеспособность клеток по сравнению водным контролем. Так, в среде, содержащей синтетические регуляторы роста тидиазурон и цитодеф, количество живых клеток достоверно снижалось относительно водного контроля на 6% и 9% соответственно. Природные регуляторы роста сами по себе не влияли на жизнеспособность эпидермальных клеток. Однако, на фоне ТМ, положительный эффект синтетических регуляторов роста был более заметен по сравнению с таковым у природных. Так, в растворах, содержащих 1 мМ ионов ТМ, синтетические регуляторы роста поддерживали жизнеспособность клеток лука в оптимальной и субоптимальной зонах в 92% случаев, против 75% - у природных регуляторов. При увеличении концентрации до 10 мМ эффективность синтетических и природных регуляторов роста значительно падала (они поддерживали количество живых клеток на уровне водного контроля в 42% и 38% соответственно).

Таблица

Жизнеспособность эпителиальных клеток луковицы Allium cepa L. при действии тяжелых

металлов и регуляторов роста растений, % к водному контролю

Вариант опыта Без РР Регуляторы роста растений

синтетические природные

CTD TDZ 6-БАП HUM ICP

Вода 100 ± 0,7 81,3 ± 6,7 93,7 ± 1,4 100,3 ± 1,7 99,6 ± 1,7 97,9 ± 2

Co 1 мМ 98,7 ± 1,2 109,8 ± 1,5 99,5 ± 2,6 104,2 ± 7,4 107 ± 1,4 97,6 ± 1,7

10 мМ 96,9 ± 1,4 107,9 ± 1,2 95,9 ± 2,9 94,6 ± 6,9 103,6 ± 2,8 97,2 ± 2,5

Zn 1 мМ 100 ± 0,9 94,6 ± 3,2 100 ± 4,9 99,9 ± 2 99,1 ± 2,4 91,3 ± 1,1

10 мМ 96,5 ± 0,9 94,5 ± 2,2 103,5 ± 5,5 101 ± 3 98,6 ± 1,5 89,2 ± 2,2

Ni 1 мМ 94 ± 1,1 96,5 ± 4,6 100,1 ± 4,2 99,5 ± 2 92,2 ± 0,8 101,5 ± 2,4

10 мМ 85,8 ± 1,9 94,2 ± 3,1 94,6 ± 3,1 100,4 ± 2,9 87,8 ± 5,3 82,4 ± 4,6

Cu 1 мМ 85,4 ± 8,6 92,1 ± 1,3 106,3 ± 2,5 100 ± 1,8 102,5 ± 2,7 97,4 ± 1,8

10 мМ 64,2 ± 8,1 24,8 ± 1,6 23,3 ± 1,6 49,2 ± 3,5 88,6 ± 2,4 78,8 ± 2,4

— витальная (оптимальная) зона

— субоптимальная зона

— сублетальная (пессимальная) зона

— летальная зона

Кроме того, можно оценить относительную эффективность регуляторов роста, сравнивая жизнеспособность эпидермальных клеток в обработанных и необработанных РР вариантах. Можно констатировать, что реакция клеток на регуляторы роста металлоспецифична. Так, на фоне 1 мМ исследованных ТМ наиболее эффективны следующие регуляторы роста: на фоне N1 - иммуноцитофит и тидиазурон, на фоне Со - цитодеф и гумат+7, на фоне Си - тидиазурон и гумат, на фоне 2п - ни один из исследованных РР существенно не повышал жизнеспособности клеток (рисунок 1, А). При увеличении концентрации ТМ до 10 мМ наибольший эффект оказывали: при повышенном содержании № - 6-БАП, Со - цитодеф и гумат+7, Си - гумат+7 и иммуноцитофит, 2п - тидиазурон (рисунок 1, Б).

150 130 110 90 70 50 30

Б

т.т! 1.«

Ш.т

т ±

1ЧП Со

N1

к

"и 2п

Варианты обработки

ЯСТВ итог Иб-БАП и ним 11СР

Рис. 1. Сравнительная эффективность регуляторов роста на фоне А - 1 мМ и Б - 10 мМ ТМ.

Таким образом, при кратковременном сильном Zn-стрессе тидиазурон оказывал слабый протекторный эффект на клетки лука. В присутствии ионов Со2+ слабоэффетивны: тидиазурон, 6-БАП и иммуноцитофит; на фоне ионов Си2+ - синтетические РР, а на фоне ионов №2+ -природные РР.

Мы предполагаем, что в условиях проведенного эксперимента в вариантах без РР наблюдались прямые последствия развития окислительного стресса [3; 5; 9; 11; 12; 17; 18], который уже в течение нескольких часов убивал значительное число эпидермальных клеток. В ряде вариантов с РР, очевидно, уже успевали активироваться механизмы устойчивости [7; 8; 10; 13-16; 19; 20], ущерб от окислительных повреждений был частично или полностью нивелирован. Однако влияние высоких (10 мМ) концентраций металлов все же приводило к летальным уровням АФК и гибели клеток.

Выводы.

1. Токсичность всех изученных ТМ возрастала с повышением их концентраций, однако этот эффект проявлялся в большей степени на фоне ионов Ni2+ и Cu2+.

2. Спустя 2 ч. экспозиции эпидермальных клеток на растворах, содержащих регуляторы роста, успевали включаться протекторные механизмы, которые в ряде случаев частично или полностью нивелировали возникающие под действием ионов металлов окислительные повреждения.

3. Степень эффективности регуляторов роста металлоспецифична. При сильном загрязнении среды металлами наибольший эффект оказывали: при повышенном содержании Zn - тидиазурон, Co - цитодеф и гумат+7, Ni - синтетические препараты цитокининового типа действия, Cu - природные регуляторы роста.

ЛИТЕРАТУРА

1. Башмаков Д. И., Лукаткин А. С., Духовскис П. В., Станис В. А. Влияние синтетических регуляторов роста на ростовые реакции огурца и кукурузы при действии тяжелых металлов // Доклады российской академии сельскохозяйственных наук. - 2007. - № 5. - С. 20-21.

2. Башмаков Д. И., Лукаткин А. С. Эколого-физиологические аспекты аккумуляции и распределения тяжелых металлов у высших растений / под ред. А. С. Лукаткина. -Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2009. - 236 с.

3. Колупаев Ю. Е. Активные формы кислорода в растениях при действии стрессоров: образование и возможные функции // Вестн. Харьковского нац. аграрн. ун-та. Сер. Биология. - 2007. - № 3. - С. 6-26.

4. Прозина М. Н. Микроскопическая техника. - М.: Высшая школа, 1960. - 198 с.

5. Сазанова К. А., Башмаков Д. И., Лукаткин А. С. Генерация супероксидного анион-радикала в листьях растений при хроническом действии тяжелых металлов // Тр. КарНЦ РАН. Сер. Экспериментальная биология. - 2012. - № 2. - С. 119-124.

6. Титов А. Ф., Таланова В. В., Казнина Н. М., Лайдинен Г. Ф. Устойчивость растений к тяжелым металлам // Институт биологии Кар. НЦ РАН. - Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2007. - 172 с.

7. Яхин О. И., Лубянов А. А., Серегин И. В., Яхин И. А. Влияние регуляторов роста на накопление тяжелых металлов и проявление их токсического действия у высших растений // Агрохимия. - 2014. - № 12. - С. 61-78.

8. Argueso C. T., Raines T., Kieber J. J. Cytokinin signaling and transcriptional networks. Curr. Opin // Plant Biol. - 2010. - Vol. 13. - pp. 533-539.

9. Barconi D., Bernardini G., Santucci A. Linking protein oxidation to environmental

pollutants: redox proteome approaches // J. Proteomics. - 2011. - Vol. 74, No 11. -pp. 2324-2337.

10. Bartoli C. G., Casalongue C. A., Simontacchi M. Marquez-Garcia B. Interaction between hormone and redox signalling pathways in the control of growth and cross tolerance to stress // Environ. Exp. Bot. - 2013. - Vol. 94. - pp. 73-88.

11. Dietz K. J., Baier M., Kramer U. Free radicals and reactive oxygen species as mediators of heavy metal toxicity in plants // Heavy metal stress in plants: from molecules to ecosystems / Eds. M. N. V. Prasad, J. Hagemeyer. - Berlin, Germany: Springer-Verlag, 1999. - pp. 73-97.

12. Finkel T., Holbrook N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing // Nature. - 2000. - Vol. 408, No 9. - pp. 239-247.

13. Gangwar S., Singh V. P., Tripathi D. K., Chauhan D. K., Prasad Sh. M. and Maurya J. N. Plant Responses to Metal Stress: The Emerging Role of Plant Growth Hormones in Toxicity Alleviation // Emerging Technologies and Management of Crop Stress Tolerance, Volume 2: A Sustainable Approach / Ed. by P. Ahmad and S. Rasool. - Chapter 10. -Elsevier Inc., 2014. - pp. 215-248.

14. Ha S., Vankova R., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K., Phan Tran L. S. Cytokinins: metabolism and function in plant adaptation to environmental stresses // Trends Plant Sci. - 2012. - Vol. 17. - pp. 172-179.

15. Hamayun M., Khan S. A., Khan A. L., Shin J. H., Ahmad B., Shin D. H. et al. Exogenous gibberellic acid reprograms soybean to higher growth and salt stress tolerance // J. Agric. Food Chem. - 2010. - Vol. 58. - pp. 7226-7232.

16. Iqbal M., Ashraf M. Gibberellic acid mediated induction of salt tolerance in wheat plants: growth, ionic partitioning, photosynthesis, yield and hormonal homeostasis // Environ. Exp. Bot. - 2013. - Vol. 86. - pp. 76-85.

17. Maksymiec W. Signaling responses in plants to heavy metal stress // Acta Physiol. Plant. - 2007. - Vol. 29. - pp. 177-187.

18. Sytar O., Kumar A., Latowski D., Kuczynska P., Strzalka K., Prasad M. N. V. Heavy metal-induced oxidative damage, defence reactions, and detoxification mechanisms in plants // Acta Physiol. Plant. - 2013. - Vol. 35. - pp. 985-999.

19. Thomas J. C., Perron M., LaRosa P. C., Smigocki A. C. Cytokinin and the regulation of a tobacco metallothionein-like gene during copper stress // Physiol. Plant. - 2005. -Vol. 123. - pp. 262-271.

20. Wilkinson S., Kudoyarova G. R., Veselov D. S., Arkhipova T. N., Davies W. J. Plant hormone interactions: innovative targets for crop breeding and management // J. Exp. Bot. -2012. - Vol. 63. - pp. 3499-3509.