Содержание возбуждающих и тормозных аминокислот в мозге крыс при литий-пилокарпиновых судорогах и на фоне предварительного введения леветирацетама и нового производного рацетама ГИЖ-290

ШШЩШММ ШИМ 4№ЮШ

Содержание возбуждающих и тормозных аминокислот в мозге крыс при литий-пилокарпиновых судорогах и на фоне предварительного введения леветирацетама и нового производного рацетама

ГИЖ-290

Ковалёв И.Г., Боков Р.О., Кудрин В.С., Воронина Т.А., Ковалёв Г.И.

ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», г. Москва

Резюме. С помощью метода ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией изучено влияние нового производного рацетама с противо-судорожной активностью (2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты; ГИЖ-290) и вещества сравнения леветирацетама на содержание нейроактивных аминокислот аспартата, глутамата, таурина, глицина и ГАМК в гомогенатах гиппокампа и префрон-тальной коры (ПФК) мозга крыс. В гиппокампах интактных крыс ГИЖ-290 (5 мг/кг, в/б) повышал уровни глутамата, глицина и ГАМК на 22, 42 и 28%, а леветирацетам (600 мг/кг), напротив, приводил к снижению этих показателей на 18, 26 и 26 %. На максимуме литий-пилокарпиновых судорог обнаруживалось уменьшение концентрации аспартата (-19 %) и увеличение глицина в ПФК (+24 %). Предварительное введение ГИЖ-290 и леветирацетама не влияло на эти показатели, но вызывало возрастание концентраций таурина в гомогенатах ПФК. Таким образом, изученные показатели не являются маркерами противосудорожного действия леветирацетама и ГИЖ-290, но указывают на различия в механизмах формирования их противосудорожного эффекта.

Ключевые слова: нейроактивные аминокислоты, «литий-пилокарпиновая» модель судорог, леветирацетам, производное 4-фе-нил-пирролидона, гиппокамп, префронтальная кора, крысы

The brain excitatory and inhibitory amino acids content in rats with lithium-pilocarpine-evoked seizures and after the preliminary administration of levetiracetam and novel racetam derivative GIZH-290

KovaLev I.G., Bokov R.O., Kudrin V.S., Voronina T.A., KovaLev G.I.

FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow

Resume. The effects of a new racetam derivative with anticonvulsant activity GIZh-290 (2-oxo-4-phenyLpyrroLidin-1-yL) acetic acid and Levetiracetam for the content of neuroactive amino acids aspartate, gLutamate, taurine, gLycine and GABA in homogenates of the hippocampus and prefrontaL cortex (PFC) of rat brain using the HPLC method with fLuorescent detection were studied. In the hippocampi of intact rats HIZh-290 (5 mg/kg, ip) increased the LeveLs of gLutamate, gLycine and GABA by 22, 42 and 28 %, and Levetiracetam (600 mg/kg), on the contrary, reduced them by 18, 26 and 26 %. At the maximum of Lithium-piLocarpine seizures, a decrease in the content of aspartate (-19 %) and an increase in gLycine in the PFC (+24 %) were detected. PreLiminary administration of GIZh-290 and Levetiracetam did not affect these parameters, but caused an increase in taurine concentrations in the PFC homogenates. Thus, the indicators studied are not markers of anticonvuLsant action of Levetiracetam and GIZH-290, but indicate differences in the mechanisms of the drugs anticonvuLsant effect formation.

Keywords: neuroactive amino acids, "Lithium-piLocarpine" modeL of seizures, Levetiracetam, 4-phenyL-pyrroLidone derivative, hippocampus, prefrontaL cortex, rats

Автор, ответственный за переписку:

Ковалёв Иван Георгиевич - аспирант ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова»; 125315, г. Москва, ул. Балтийская, 8; тел.: +7 (966) 121-23-31; e-mail: vanneit@yandex.ru

Введение

Леветирацетам обладает не только уникальным противоэпилептическим эффектом [1], но и специфическим профилем действия на животных моделях [2]. Одной из моделей является т. н. «литий-пило-карпиновая», адекватная для тестирования ПЭП, эффективных по отношению к парциальным и вторично-генерализованным судорогам, блокирующих эпилептогенез, а также проявляющих активность при индуцированном судорогами поведенческом дефиците [3].

В 2016—2017 гг. нами было обнаружено и фармакологически охарактеризовано новое производное рацетама, 2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил) уксусной кислоты (ГИЖ-290), значительно превосходящее леветирацетам не только по специфической противосудорожной активности [4], но и по спектру поведенческой активности [5].

Целью настоящей работы стало сравнение влияний ГИЖ-290 и леветирацетама на содержание тормозных (ГАМК, таурина, глицина) и возбуждающих (глутамата, аспартата) аминокислот в префронтальной коре (ПФК) и гиппокампе мозга у нативных крыс,

ЖШЩММШ ШШИМ 4ИЮШ

а также при литий-пилокарпиновых судорогах на фоне предварительного введения обоих веществ.

Материалы и методы

Животные: самцы белых аутбредных крыс (200—250 г) были поставлены из питомника «Столбовая» (Московская обл., РФ) и помещены в условия с контролируемой постоянной температурой и влажностью (40—60 %) воздуха, регулярно сменяемым циклом день—ночь (12 ч—12 ч), доступом к воде и еде ad libitum. Организация экспериментов соответствовала этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123 от 18 марта 1986 г., Страсбург; Об утверждении правил лабораторной практики: приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19 июня 2003 г. М., 2003).

Вещества: пилокарпин, хлорид лития (оба Sigma, St. Louis, МО); леветирацетам (Некст Фарма САС 17, Франция); производное 4-фенил-пирролидона-2 (ГИЖ-290) синтезировано в Отделе химии ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова».

Литий-хлорид-пилокарпиновая модель судорог. Эксперименты проводили на аутбредных крысах-самцах массой 220—240 г. Согласно принятому протоколу [1, 6], животным вводили водный раствор хлорида лития — 127 мг/кг (в/б), а через 16 ч — пилокарпин (в/б) в дозе 40 мг/кг. В результате у 97—100 % животных развивается эпилептический статус и гибель. Леветирацетам и ГИЖ-290 вводили внутрибрюшинно за 40 мин до введения пилокарпина.

Животные были случайным образом разделены на 6 групп по 7 особей в каждой. Группа I: контроль (физраствор); группа II: леветирацетам (600 мг/кг, в/б); группа III: ГИЖ-290 (5 мг/кг, в/б); группа IV: LiCl+пилокарпин и физраствор; группа V: LiCl+пилокарпин и леветирацетам; группа VI: LiCl+пилокарпин и ГИЖ-290. Декапитацию крыс проводили через 40 мин после последних инъекций, фронтальную кору и гиппокампы извлекали на льду, быстро замораживали в жидком азоте и сохраняли в криопробирках при —80 °С для проведения хроматографического анализа.

Хроматография. Определение содержания тормозных (ГАМК, глицин, таурин) и возбуждающих (аспартат, глутамат) нейромедиаторных аминокислот в экстрактах ткани мозга проводили методом ВЭЖХ с флуоресцентной детекцией, согласно модифицированной методике [7]. Поскольку исследуемые аминокислоты в нативной форме являются очень слабыми хромофорами (не флюоресцируют и не поглощаются в UV области), для устойчивой детекции они были предварительно дериватизированы ортофталевым диальдегидом (ОФА), который обладает флуоресцентными свойствами и, вступая в реакцию с аминокислотой, образует флуоресцирующий комплекс. Для деривации аминокислот к

25 мкл супернатанта добавляли 25 мкл 0,1 М боратного буфера и 10 мкл о-фталальдегид-сульфитного реактива в 0,1 М боратном буфере (рН 9,5). ГАМК, аспартат, глутамат, таурин, глицин в начальной концентрации 0,1 мкМ/мл в 0,1 н НС1О4 использовали в качестве стандартной смеси для калибровки.

Через 20 мин после инкубации при комнатной температуре, 20 мкл реакционной смеси наносили на колонку Hypersil ODS 5 mkM, 4,6 х 250. Регистрацию продуктов разделения проводили на флюоресцентном детекторе Agilent 1100, США, при длине волны возбуждения 230 нм и длине волны эмиссии 392 нм. Подвижная фаза для определения нейромедиаторных аминокислот состояла из 0,06 M NaH2PO4 х H2O, 0,0032 M Na2HPO4, 0,025 тМ ЭДТА, и 1,24 mM CH3OH, pH 5,6. Скорость подвижной фазы составляла 1,5 мл/мин.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Statisti-са 6.0 с привлечением методов параметрической и непараметрической статистики (i-тест Стьюдента, тест Манна—Уитни). Тканевое содержание аминокислот выражали в мкмоль/мг сырой ткани. В таблицах представлены средние значения с учётом стандартной ошибки среднего (теап ± S.E.M).

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования изучали влияние леветирацетама (ЛВТ, 600 мг/кг, в/б) и ГИЖ-290 (5 мг/кг, в/б) на содержание возбуждающих (глутамата и аспартата) и тормозных (ГАМК, таурина, глицина) в префронтальной коре (ПФК) и гиппокампе нативных крыс (группы II и III). Было показано (табл. 1), что под воздействием ЛВТ в гиппокампе происходит увеличение концентрации глутамата до 9,17 ± 0,66 мкмоль/мг сырой ткани (контроль — 7,5 ± 0,44 мкмоль/мг), глицина до 2,01 ± 0,21 (контроль — 1,42 ± 0,13 мкмоль/мг), а также ГАМК — до 6,57 ± 0,42 мкмоль/мг по сравнению с 5,14 ± ± 0,36 в контроле (для всехр < 0,05).

Напротив, в аналогичных условиях ГИЖ-290 проявлял выраженную тенденцию к снижению уровней этих аминокислот в гиппокампе: 6,14 ± 0,51 мкмоль/мг для глутамата, 1,05 ± 0,07 мкмоль/мг (обар < 0,1) для глицина и 3,79 ± 0,30 мкмоль/мг для ГАМК (р < 0,05). В образцах ПФК никаких значимых изменений аминокислот не наблюдалось, равно как и в гиппокампах для аспартата и таурина (табл. 1).

Таким образом, значимые изменения в мозге нативных крыс наблюдаются только в гиппокампах, причём под воздействием ЛВТ содержание глутамата, глицина и ГАМК возрастают, соответственно, на 22, 42 и 28 % по сравнению с контролем (p < 0,05), тогда как после введения ГИЖ-290, напротив, происходит уменьшение уровней ГАМК (—26 %; p < 0,05), а также в некоторой степени глутамата и глицина (0,05 < p < 0,10).

На следующем этапе тканевые уровни нейроактив-ных аминокислот измеряли на пике судорог, вызванных

ШМЩШМШ ШИМ 4№ЮШ

Таблица 1

Влияние леветирацетама (ЛВТ) и ГИЖ-290 на содержание (мкмоль/мг ткани) нейроактивных аминокислот

в мозге интактных крыс

Аминокислоты Структура мозга Контроль

Аспартат ПФК 2,30 ± 0,07 2,36 ± 0,12 2,22 ± 0,14

Гиппокамп 1,66 ± 0,09 1,88 ± 0,15 1,42 ± 0,08

Глутамат ПФК 7,28 ± 0,20 6,95 ± 0,21 7,52 ± 0,39

Гиппокамп 7,5 ± 0,44 9,17 ± 0,66* 6,14 ± 0,51#

Глицин ПФК 3,74 ± 0,12 3,93 ± 0,19 3,57 ± 0,24

Гиппокамп 1,42 ± 0,13 2,01 ± 0,21* 1,05 ± 0,07#

Таурин ПФК 12,30 ± 0,47 11,2 ± 0,30 13,0 ± 0,94

Гиппокамп 14,0 ± 1,24 16,50 ± 2,37 11,2 ± 0,84

ГАМК ПФК 3,57 ± 0,16 3,23 ± 0,21 3,86 ± 0,28

Гиппокамп 5,14 ± 0,36 6,57 ± 0,42* 3,79 ± 0,30*

Примечание'. #/* — достоверность отличия от Контроля при р < 0,1/0,05 (критерий Манна-Уитни).

комбинацией литий+пилокарпин. Результаты свидетельствуют, что в фазе, соответствующей максимуму судорожной активности, в группе IV происходит некоторое снижение концентрации аспартата в ПФК (0,05 < р < 0,10) и гиппокампе (-20 %; р < 0,05), а также возрастание уровней глутамата (0,05 <р < 0,10) и глицина (+24 %; р > 0,05) в ПФК (табл. 2).

Предварительное введение ни ЛВТ (группа V), ни ГИЖ-290 (группа VI) не изменяло описанных выше эффектов просудорожной комбинации литий + + пилокарпин. Кроме того, под влиянием обоих веществ обнаруживалось увеличение уровней таурина в ПФК, более выраженное для ГИЖ-290: +21 % по сравнению с группой IV (табл. 2). Таурин относится к нейроактивным аминокислотам тормозного действия, вызывающим гиперполяризацию и ингибицию разряда нейронов. Существует предположение, что таурин защищает нейроны от глутаматной токсичности, снижая

внутриклеточное содержание кальция и последующие события для обзора см. [8].

Принято считать, что системное введение пилокарпина вызывает судороги, которые избирательно подавляются с помощью ПЭП, модулирующих ГАМКерги-ческую нейропередачу [9]. Хотя убедительные данные о прямом воздействии ЛВТ на ГАМК-систему пока отсутствуют, но у крыс после введения 375 мг/кг пилокарпина было описано снижение уровня аспартата, возрастание глутамина и ГАМК при неизменности концентрации глицина. Защитное действие леветирацетама (34 мг/кг) выражалось в увеличении аспартата и уменьшении глутамина, ГАМК, а также глицина [10].

В наших экспериментах изменений концентраций этих аминокислот не отмечено ни под воздействием комбинации литий + пилокарпин, ни при предварительном введении обоих веществ, что не позволяет счи-

Таблица 2

Влияние профилактического введения леветирацетама

Аминокислоты Структура мозга Контроль

Аспартат ПФК 2,30 ± 0,07 2,00 ± 0,13# 2,10 ± 0,18# 1,83 ± 0,05*

Гиппокамп 1,66 ± 0,09 1,34 ± 0,10* 1,38 ± 0,07# 1,30 ± 0,06*

Глутамат ПФК 7,28 ± 0,20 7,99 ± 0,20# 8,00 ± 0,37# 7,27 ± 0,48

Гиппокамп 7,50 ± 0,44 7,64 ± 0,38 6,93 ± 0,47 7,46 ± 0,41

Глицин ПФК 3,74 ± 0,12 4,63 ± 0,13* 4,72 ± 0,22* 4,59 ± 0,28*

Гиппокамп 1,42 ± 0,13 1,17 ± 0,05 1,18 ± 0,12 1,28 ± 0,09

Таурин ПФК 12,30 ± 0,47 13,30 ± 0,72 14,60 ± 1,44# 16,10 ± 1,0V

Гиппокамп 14,0 ± 1,24 15,3 ± 1,83 12,9 ± 0,98 14,6 ± 0,44

ГАМК ПФК 3,57 ± 0,16 4,02 ± 0,24 3,78 ± 0,13 4,05 ± 0,12#

Гиппокамп 5,14 ± 0,36 4,92 ± 0,12 4,80 ± 0,27 5,94 ± 0,60

Примечание: #/* — достоверность отличия от Контроля прир < 0,1/0,05; А — достоверность отличия от группы IV (критерий Манна-Уитни).

ЖШЩММШ ШШИМ 4ИЮШ

тать изученные показатели нейрохимическими маркерами противосудорожного эффекта ЛВТ и ГИЖ-290. Вместе с тем, разнонаправленность влияний обоих веществ с рацетамовой структурой на уровни глутамата, глицина и ГАМК в гиппокампах нативных крыс (увеличение под влиянием ЛВТ и уменьшение после ГИЖ-290) допускает предположение о различиях механизмов их противосудорожных эффектов.

Выводы

1. Новое производное рацетама, 2-оксо-4-фенилпирролидин-1-ил)уксусной кислоты (ГИЖ-290) в дозе 5,0 мг/кг через 80 мин после в/б введения вызывает в гиппокампах интактных крыс увеличение содержания глутамата, глицина и ГАМК на 22, 42 и 28 %, соответственно. Вещество сравнения леветирацетам (600 мг/кг), напротив, приводит к снижению этих показателей на 18, 26 и 26 %, соответственно.

2. В условиях моделирования судорожного состояния у крыс, вызываемого комбинацией литий + пилокарпин, обнаруживается уменьшение концентрации аспартата в гиппокампе на 19 % и повышение уровня глицина в префронтальной коре мозга на 24 % относительно контроля.

3. Предварительное введение ГИЖ-290 и леветира-цетама практически не влияет на указанные показатели, но вызывает рост концентрации аминокислоты таурина в гомогенатах префронтальной коры мозга крыс, более выраженное у ГИЖ-290.

4. Полученные результаты не позволяют рассматривать изученные показатели маркерами противосудорожного действия леветирацетама и ГИЖ-290, но указывают на различия в механизмах формирования их противосудорожного эффекта.

Литература

1. Kitgaard H., Pitkanen A. Antiepileptogenesis, neuroprotection, and disease modification in the treatment of epilepsy: focus on levetiracetam. Epileptic Disord 2003; 5: Suppl. 1: S9—16.

2. Kitgaard H., Matagne A., Gobert J., Wulfer E. Evidence for a unique profile of levetiracetam in rodent models of seizures and epilepsy, Eur J Pharmacol 1998; 353: 191-206.

3. Leite J.P., Garcia-Cairasco N., Cavalheiro E.A. New insights from the use of pilocarpine and kainate models. Epilepsy Res 2002, 50 (1-2): 93-103.

4. Ковалёв И.Г., Воронина Т.А., Литвинова С.А., Жмуренко Л.А., Мокрое Г.В. Изучение эффектов леветирацетама и нового производного 4-фенилпирролидона ГИЖ-290 в закрытом крестообразном лабиринте у мышей линий BALB/c и C57BL/6. Эксперим. и клин. фармакол. 2017; 80 (6): 13-18.

5. Ковалёв И.Г., Васильева Е.В., Боков Р.О., Салимое Р.М. Ковалёв Г.И. Изучение эффектов леветирацетама и нового производного 4-фенил-пирролидона ГИЖ-290 в закрытом крестообразном лабиринте у

MBimen BALB/c h C57BL/6. OapMaKOKHHeTHKa h ^apMaKOflHHaMHKa 2017; 2: 18-21.

6. Jope R.S., Morrisett R.A., Snead O.C. Characterization of lithium potentiation of pilocarpine-induced status epilepticus in rats. Exp Neurol 1986; 91: 471-480.

7. Pearson S.J., Czudek C., Mercer K., Reynolds G.P. Electrochemical detection of human brain transmitter amino acids by high-performance liquid chromatography of stable o-phtalaldehyde-sulphite derivatives. J Neuronal Transm. 1991; 86: 151-157.

8. Oya S.S., Saransaari P. Taurine and epilepsy. Epilepsy Res. 2013; 104: 187-194.

9. Turski W.A., Andrews, J.S., Loschmann P., BresslerK., Bortolotto Z.A., Calderazzo-Filho L.S. et al. Substantia nigra regulates action of antiepileptic drugs. Brain Res. 1990; 520: 232-239.

10. Kitgaard H., Matagne A., Grimee R., Vanneste-Goemaere J., Marginea-nu D.-G. Electrophysiological, neurochemical and regional effects of levetiracetam in the rat pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Seizure. 2003; 12: 92-100.