Действие этилметилгидроксипиридина сукцината и тиотриазолина на протеолиз в эксперименте in vitro

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2011

ДЕЙСТВИЕ ЭТИЛМЕТИЛГИДРОКСИПИРИДИНА СУКЦИНАТА И ТИОТРИАЗОЛИНА НА ПРОТЕОЛИЗ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Ш VITRO

ХОДОС О.А.*, ГИДРАНОВИЧ Л.Г.*, САЧЕК М.М.**

У О «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»,

кафедра органической химии,

ГУ «Республиканский научно-практический центр медицинских технологий, информатизации, управления и экономики здравоохранения», г.Минск**

Резюме. Исследовано влияние препаратов этилметилгидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин на интенсивность протеолиза в экстракте ткани головного мозга и сыворотке крови крыс in vitro. Показано, что этилметилгидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин не оказывают влияния на общую протеолитическую активность, активность а1-протеиназного ингибитора, а2-макроглобулина и активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ в сыворотке крови крыс в эксперименте in vitro. Было также установлено, что этилметилгидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин не влияют на активность трипсиноподобных, цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга крыс in vitro.

Ключевые слова: протеиназы, ингибиторы, этилметилгидроксипиридина сукцинат, тиотриазолин.

Abstract. The influence of ethylmethylhydroxypyridine succinate and thiotriazolin on proteolysis in brain tissue extract and blood serum of rats was studied «in vitro». Ethylmethylhydroxypyridine succinate and thiotriazolin were shown to have no effect on general proteinase activity, activity of ^-proteinase inhibitor, a2-macroglobulin and activity of endogenous inhibitors of cysteinic proteinases in blood serum of rats in experiment «in vitro». Ethylmethylhydroxypyridine succinate and thiotriazolin had no effect on activity of trypsin-like and cysteinic proteinases and their endogenous inhibitors in brain tissue extract of rats in experiment «in vitro» as well.

В последние годы достаточно активно изучаются лекарственные средства этилметилгидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин. Этилметилгидроксипиридина сукцинат ингибирует свободно-радикальные процессы окисления липидов, оказывает модулирующее влияние на активность мембраносвязанных ферментов и ионных каналов [1, 2, 3, 4].

Адрес для корреспонденции: г.Витебск, ул.Нижненабережная, д. 19, кв. 28. Тел. +375 (33) 329-27-20 -Ходос О.А.

Тиотриазолин способен оказывать мощное антиоксидантное действие, блокировать окислительный стресс [5]. Он может становиться акцептором электронов от активных форм кислорода и других нестойких соединений и принимать участие в ключевых реакциях реализации энергетического метаболизма благодаря наличию тиогруппы [5, 6]. Данный препарат предотвращает гибель клеток путем предупреждения обратимой и необратимой модификации белковых молекул, конкурируя за супероксидный анион с цистеи-новыми и метиониновыми фрагментами про-

теинов биологических мембран [5, 6, 7]. Однако способность этилметилгидроксипириди-на сукцината и тиотриазолина оказывать влияние на активность протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов в ткани головного мозга и сыворотке крови изучена недостаточно.

Целью исследования было изучение влияния препаратов этилметилгидроксипириди-на сукцинат и тиотриазолин на интенсивность протеолиза в экстракте ткани головного мозга и сыворотке крови крыс in vitro.

Методы

В качестве источника ферментативной активности использовали экстракт ткани головного мозга и сыворотку крови самцов крыс линии Wistar. В экстракте ткани головного мозга исследовали активность трипсиноподобных и цистеиновых протеиназ, а также их эндогенных ингибиторов. В сыворотке крови определяли общую протеолитическую активность, активность aj-протеиназного ингибитора, a2-макроглобyлина, ингибиторов цисте-иновых протеиназ. Активность протеолити-ческих ферментов и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга и сыворотке крови крыс определяли спектрофотометрически по интенсивности расщепления высокостабильного в растворе, низкомолекулярного хромогенного субстрата N-a-бензо-ил-О^-аргинин-пара-нитроанилида (БАП-НА).

Для определения активности трипсиноподобных протеиназ и их эндогенных ингибиторов в качестве базовых методик использовались методы, описанные Erlanger B. и др. [8], а также методики, предложенные Хвато-вым Т. А. с соавт. и Карягиной И.Ю. с соавт. [9, 10]. Изучение активности цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов осуществляли с помощью метода Lenney J.F. [11]. Данные методики разрабатывались авторами для исследования протеолиза в сыворотке крови, поэтому они были модифицированы нами для изучения активности протеиназ и их эндогенных ингибиторов в экстрактах ткани головного мозга крыс. В инкубационную смесь

вносили этилметилгидроксипиридина сукци-ната: 10 мкл (0,5 мг), 50 мкл (2,5 мг) и 100 мкл (5,0 мг) и тиотриазолина: 10 мкл (0,25 мг), 50 мкл (1,25 мг) и 100 мкл (2,5 мг). При исследовании влияния лекарственных средств на интенсивность протеолиза in vitro вводили 2 контроля - на источник ферментативной активности (сыворотка, экстракт) и на реактивы. Исследование каждого показателя (а также всех контрольных проб) проводили в пяти параллелях. Измерения оптической плотности контрольных и опытных проб осуществляли против дистиллированной воды на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 410 нм, а также вносили поправку на мутность при 550 нм.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета прикладных компьютерных программ. Для обработки результатов применяли методы непараметрической статистики (ANOVA по Краскелу-Уоллису) [12, 13, 14]. Для описания данных приводили медианы, доверительные интервалы для каждой из групп и точное значение р [12, 14].

Результаты и обсуждение

Внесение в инкубационную смесь 0,5 мг,

2.5 мг и 5,0 мг этилметилгидроксипиридина сукцината (табл. 1), а также 0,25 мг, 1,25 мг и

2.5 мг тиотриазолина (табл. 2) не влияло на общую протеолитическую активность (р=0,1087), активность aj-протеиназного ингибитора (р=0,1709) и a2-макроглобyлина (р=0,2122) в сыворотке крови in vitro. Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ также не подвергалась изменению под влиянием данных препаратов (р=0,1367).

При внесении в инкубационную среду этилметилгидроксипиридина сукцината и ти-отриазолина не происходило изменения активности трипсиноподобных протеолитичес-ких ферментов (р=0,6274) и цистеиновых протеиназ (р=0,1085) в экстракте ткани головного мозга крыс in vitro. Под воздействием указанных препаратов in vitro активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных (р=0,6509) и цистеиновых протеиназ

Таблица 1

Влияние этилметилгидроксипиридина сукцината на интенсивность протеолиза в экстракте ткани головного мозга и сыворотке крови крыс in vitro

Показатель Контроль Количество этилметилгидроксипиридина сукцината в пробе

0,5 мг 2,5 мг 5,0 мг

Экстракт ткани головного мозга

Активность трипсиноподобных протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 63,11 74,80 67,79 79,48

Активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ, нмоль/с-мг белка. 0,49 0,51 0,51 0,50

Активность цистеиновых протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 49,09 39,74 53,76 58,44

Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 32,73 35,06 35,06 44,41

Сыворотка крови

Общая протеолити-ческая активность сыворотки крови, нмоль/с-л. 27,01 30,65 20,78 21,30

Активность а1-протеиназного ингибитора сыворотки крови, мкмоль/с-л. 4,73 4,92 4,85 4,84

Активность а2- макроглобулина, мкмоль/с-л 0,20 0,19 0,19 0,21

Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ, отн. ед. 2370,37 2518,52 2518,52 3629,63

Примечания: данные представлены в виде медианы, (-95% - +95%) - доверительный интервал.

(р=0,0677) в экстракте ткани головного мозга также не претерпевала изменений.

Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что, видимо, этилметил-гидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин не обладают прямым эффектом на интенсивность протеолиза in vitro, что не исключает

возможности регуляции активности протео-литических ферментов и их эндогенных ингибиторов in vivo опосредованным путем через улучшение микроциркуляции, метаболизма головного мозга, реологических свойств крови, а также благодаря антиоксидантному действию.

Таблица 2

Влияние препарата тиотриазолин на интенсивность протеолиза в экстракте ткани головного мозга и сыворотке крови крыс in vitro

Показатель Контроль Количество препарата тиотриазолин в пробе

0,25 мг 1,25 мг 2,5 мг

Экстракт ткани головного мозга

Активность трипсиноподобных протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 63,11 79,47 77,13 72,46

Активность эндогенных ингибиторов трипсиноподобных протеиназ, нмоль/с-мг белка. 0,49 0,49 0,49 0,50

Активность цистеиновых протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 49,09 51,42 60,77 51,42

Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ, нмоль/ч-мг белка. 32,73 32,73 32,73 35,06

Сыворотка крови

Общая протеолитическая активность сыворотки крови, нмоль/с-л. 27,01 25,97 21,82 23,38

Активность а1-протеиназного ингибитора сыворотки крови, мкмоль/с-л. 4,73 4,85 4,91 4,87

Активность а2- макроглобулина, мкмоль/с-л 0,20 0,18 0,20 0,20

Активность эндогенных ингибиторов цистеиновых протеиназ, отн. ед. 2370,37 2074,07 2444,44 2370,37

Примечания: данные представлены в виде медианы, (-95% - +95%) - доверительный интервал.

Заключение

1. Этилметилгидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин не оказывают влияния на общую протеолитическую актив-

ность, активность al-протеиназного ингибитора, a2-макроглобyлина, а также активность эндогенных ингибиторов цистеино-вых протеиназ в сыворотке крови крыс в эксперименте in vitro.

2. Этилметилгидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин не влияют на активность трипсиноподобных, цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов в экстракте ткани головного мозга крыс in vitro.

Литература

1. Яковлев, В.А. Мексидол в комплексной терапии ал-

когольной зависимости: пособие для врачей / В.А. Яковлев. - М., 2005. - 21 с.

2. Воронина, Т. А. Отечественный препарат нового поколения мексидол: основные эффекты, механизм действия, применение / Т.А. Воронина. - М., 2004. -21 с.

3. Андреева, Н.Н. Коррекция мексидолом постреани-мационных изменений липидного обмена мозга / Н.Н. Андреева, И.В. Мухина // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2005. - Т. 68, № 3. -С 37 - 41.

4. Павлов, И.С. Мексидол в клинике пограничной тера-

пии / И.С. Павлов, Л.А. Медведева. - М., 2005. - 20 с.

5. Метаболические кардиопротекторы: фармакологические свойства и применение в клинической практике / В.А. Визир [и др.]. - Запорожье, 2006. -36 с.

6. Влияние тиотриазолина на гистоморфологические изменения нейронов коры и гиппокампа в постин-сультный период / И.Ф. Беленичев [и др.] // Медицина сегодня. [Электронный ресурс]. - 2007. - №5. -Режим доступа: http://novosti.mif-ua.com/archive/ issue-3094/article-3189/ - Дата доступа: 16.07.2010.

7. Результаты клинического применения антиоксиданта тиотриазолина в комплексном лечении больных с тяжелой черепно-мозговой травмой / Л. А. Дзяк [и др.] // [Электронный ресурс]. - 2003. - №7S. -Режим доступа: http://www.health-ua.com/articles/ 324.html - Дата доступа: 16.07.2010.

S. Erlanger, B.F. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin / B.F Erlanger, N. Kokowsky, M. Cohen // Arch Biochem. Biophys. -1961. - Vol. 95, № 2. - Р. 271-27S.

9. Ускоренный метод определения основных ингибиторов протеиназ в плазме крови человека: Метод. Рекомендации. / Хватов В.Б., Белова Т.А. - М., 19S1.

- 27 с.

10. Карягина, И.Ю. Использование метода комплексного определения активности трипсиноподобных про-теиназ, a1-антитрипсина и a2-макроглобyлина в гастроэнтерологической клинике / И.Ю. Карягина, Р.А. Зарембский, М.Д. Балябина // Лабораторное дело.

- 1990. - №2. - С. 10 - 13.

11. Thermostable endogenous inhibitors of cathepsins B and H / JF. Lenney [et al.] // Eur J Biochem. - 1979. -Vol. 101, № 1. - Р. 153 - 161.

12. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA / О.Ю. Реброва. - М.: МедиаСфера, 2003. - 312 с.

13. Гланц, С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. / С. Гланц. - М.: Практика, 1999. - 459с.

14. Фадеев, В.В. Представление данных в оригинальных работах и их статистическая обработка / В.В. Фадеев // Проблемы эндокринологии. - 2002. - Т. 4S, N 3.

- С. 47 - 4S.

Поступила 24.11.2011 г. Принята в печать 02.12.2011 г.