Молекулярно-генетическая система детекции делеции экзона 7 гена SMN1, пригодная для проведения неонатального скрининга
MOLECULAR GENETIC SYSTEM FOR DETECTION OF DELETION SMN1 EXON 7 SUITABLE FOR NEONATAL SCREENING

Область техники
Изобретение относится к области медицины и биотехнологии, конкретно к медицинской генетике и молекулярной биологии и может быть использовано для неонатального скрининга 5q спинальной мышечной атрофии.
Предшествующий уровень техники
Наследственные спинальные мышечные атрофии (СМА) - большая, генетически гетерогенная группа заболеваний, характеризующихся прогрессирующей дегенерацией и гибелью двигательных нейронов передних рогов спинного мозга, а в ряде случаев и ядер ствола головного мозга [1]. Самой распространенной группой СМА являются проксимальные спинальные мышечные атрофии 0-IV типа, связанные с геном SMN1 (5q СМА), на долю которых приходится 85% всех форм заболеваний этой группы [2]. 5q СМА является одним из самых частых аутосомно-рецессивных заболеваний в мире и самой частой причиной генетически-обусловленной детской смертности. [3]. В России частота носительства составляет 1/36, а расчетная частота встречаемости -1/5184 [4].
Причина 5q СМА - мутации гена SMN1 в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии. Ген SMN1 находится в зоне инвертированного повтора на хромосоме 5q, в состав повтора входит также ген SMN2, имеющий минимальные отличия от гена SMN1 - кодирующая последовательность SMN2 отличается от последовательности SMN1 одним нуклеотидом (с.840С>Т) и приводит к альтернативному сплайсингу экзона 7, поэтому с него считывается лишь 10% нормального белка SMN [5, 6, 7]. У 95-97% больных с 5q СМА причиной болезни является делеция экзона 7 гена SMN1 в гомозиготном состоянии.
В России зарегистрировано два препарата для патогенетической терапии 5q СМА. Препарат на основе антисмыслового олигонуклеотида Нусинерсен был зарегистрирован в Российской Федерации для лечения всех типов СМА с 2019 года.
Препарат - малая молекула Рисдиплам был зарегистрирован в России в декабре 2020 года. Другие препараты проходят в настоящее время разные фазы клинических испытаний [8]. Наибольшая эффективность применения данных препаратов с точки зрения снижения смертности и степени инвалидизации достигается при досимптоматическом применении. Учитывая возраст манифестации болезни, наиболее целесообразно выявление больных в рамках неонатального скрининга. На сегодняшний день успешные проекты неонатального скрининга 5q СМА проводятся в Тайване (Chien, 2017), 18 штатах США (Kraszewski J., 2018, upd. 2019), Германии (Mueller-Felber W, 2019), Австралии (Kariyawasam DST, 2019) и других странах.
Для 5q СМА отсутствует биохимический маркер, поэтому единственный возможный способ проведения скрининговых исследований - молекулярно-генетическая диагностика, направленная на поиск делеции экзона 7 гена SMN1 в гомозиготном состоянии.
С 2023 года в РФ скрининг новорожденных расширяется до 36 нозологий: 29 болезней, имеющих биохимические маркеры, будут исследоваться методом тандемной масс-спектрометрии, дефицит биотинидазы, врожденный гипотиреоз, адреногенитальный синдром, муковисцидоз, галактоземия - стандартными биохимическими методами и первичные иммунодефициты и 5q СМА - молекулярно-генетическими методами.
Основными критериями, необходимыми для включения болезни в программу скрининга, названы следующие: «болезнь должна быть четко очерчена клинически и биохимически; болезнь должна представлять собой значимую проблему (высокую степень инвалидизации и смертности); болезнь должна быть распространенной (встречаться с частотой не менее 1:10 000-1:15 000 новорожденных); процедура скрининга должна быть приемлемой и корректной для пациента и общества; процедура скрининга должна иметь адекватную стоимость; болезнь должна иметь готовое, апробированное лечение, эффективное на доклиническом этапе» [9].
Система, которой проводится неонатальный скрининг, должна отвечать следующим требованиям: 1) в качестве биологического материала используется пятно крови из пятки новорожденного, взятое для скрининга, 2) короткий срок выдачи результатов, 3) чувствительность и специфичность более 99%, 4) низкая себестоимость, 5) универсальность, простота исполнения, масштабируемость [10].
На сегодняшний день для детекции делеций гена SMN1 у больных применяются следующие методы:
1) Метод количественной мультиплексной лигазной реакции [11, 12, 13]. Для этого существуют коммерческие системы, например, SALSA MLPA Probemix Р021 SMA (MRCHOLLAND, Нидерланды) и отечественные разработки [14]. Достоинствами данного метода является его высокая точность, возможность детектировать делеции в гетерозиготном состоянии. Основными недостатками данного метода являются трудоемкость анализа, высокая стоимость исследования, необходимость наличия дорогостоящего оборудования (генетического анализатора - секвенатора) для проведения исследования, высокие требования к качеству биологического материала для анализа. Таким образом, данный метод невозможно использовать для массового скрининга новорожденных.
2) Метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) [15]. Достоинствами данного метода является возможность детектировать делеции с использованием простых приборов и реагентов. Основными недостатками данного метода являются трудоемкость анализа, многоэтапность анализа, необходимость наличия оборудования (амплификатор, камера для электрофореза в полиакриламидном геле) и реактивов, требующих специальных условий хранения (ферментов рестрикции) для проведения исследования, высокие требования к качеству биологического материала для анализа. Таким образом, данный метод невозможно использовать для массового скрининга новорожденных.
3) ПЦР в реальном времени [16]. Достоинством данного метода является возможность детекции числа копий гена SMN1, а также возможность выявления делеции в гетерозиготном состоянии, отсутствие этапа электрофоретической детекции результата. К недостаткам относится низкая точность исследования, относительно высокая стоимость и трудоемкость анализа, необходимость наличия дорогостоящей аппаратуры. Таким образом, данный метод невозможно использовать для массового скрининга новорожденных.
4) Мультиплексный ПЦР-анализ в режиме реального времени с использованием мишень-специфических последовательностей праймеров и зондов TaqMan™ для амплификации и обнаружения четырех мишеней: TREC, KREC, Экзон 7 SMN1 и RPP30 в ДНК, извлеченной из пятна высушенной крови новорожденного. Каждый зонд TaqMan™ имеет уникальный краситель, связанный с их 5'-концевой областью, что позволяет одновременно обнаруживать четыре мишени, если они присутствуют. Количество каждой мишени, присутствующей в ДНК, определяется интенсивностью флуоресценции, испускаемой каждым красителем, высвобождаемым из распадающегося зонда во время амплификации, которая обнаруживается прибором для ПЦР в реальном времени (DBS). Прибор измеряет сигналы флуоресценции и преобразует их в сравнительные количественные показания, которые выражаются в виде функции пороговых значений цикла (Ct) [17]. Преимуществами данной системы является: возможность исследований одновременно СМА и иммунодефицитов, работа с пятном крови, масштабируемость под потребности лаборатории, высокая точность и быстрота исследования. Недостатками данной системы для неонатального скрининга является наличие этапа выделения ДНК, дороговизна.
5) Полимеразная цепная реакция и анализ кривой плавления. Метод основан на том, что разные генетические последовательности имеют разные температуры плавления ДНК. Используя подход, основанный на усилении разницы температур плавления зонда, генерируются пики, специфичные для SMN1 и SMN2 [18]. Преимуществами данной методики является отсутствие этапа выделения ДНК, адаптация сразу под несколько детектирующих амплификаторов, быстрота и простота исполнения. К недостаткам относится дороговизна.
Технический результат и технические задачи
Отличием предлагаемого изобретения от существующих аналогов является способ достижения разницы температур плавления с использованием коротких олигонуклеотидных проб, комплиментарных последовательности экзона 7 генов SMN (SMN1 и SMN2), позволяющих надежно различать форму кривой плавления, соответствующие последовательностям этих генов, и специфично детектировать молекулярно-генетическими методами делецию SMN1 в гомозиготном состоянии и отличать ее от делеции SMN2, из материала пятно крови на фильтровальной бумаге без этапа выделения ДНК.
Задачей заявляемого изобретения является создание, подбор условий и валидация оптимальной молекулярно-генетической системы детекции гомозиготной делеции экзона 7 генов SMN1 и SMN2 методом асимметричной ПЦР с последующим анализом кривой плавления, пригодной для проведения неонатального скрининга на 5q спинальную мышечную атрофию.
Задача решается путем создания оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции делеций экзона 7 генов SMN1 (NM_000344.4) и SMN2 (NM_017411.4), побора оптимальных условий амплификации и детекции, а также валидацией системы на оптимальном числе образцов с известными генотипами.
Техническим результатом заявленного изобретения является система для детекции гомозиготной делеции экзона 7 генов SMN1 и SMN2 методом асимметричной ПЦР с последующим анализом кривой плавления, пригодная для проведения неонатального скрининга.
Технический результат достигается подбором оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для полимеразной цепной реакции, комплементарных последовательностям экзонов 7 генов SMN1 (NM_000344.4) и SMN2 (NM_017411.4), имеющих нуклеотидный состав: SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2; подбором последовательностей гибридизационных проб, имеющих нуклеотидный состав: SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4; подбором оптимальных условий проведения асимметричной полимеразной цепной реакции с пятен крови на фильтровальной бумаге и подбора оптимальных условий детекции результатов методом анализа кривой плавления на детектирующих амлификаторах (приборах для проведения ПЦР в реальном времени). Полученные результаты оценивают путем исследования 819 образцов сухих пятен крови на фильтровальной бумаге с известными генотипами по наличию/отсутствию экзона 7 в генах SMN, из них 10 образцов с делецией экзона 7 гена SMN1 в гомозиготном состоянии, 53 образца с делецией экзона 7 гена SMN2 в гомозиготном состоянии, 756 образцов с наличием экзона 7 в генах SMN. (Данные по генотипам образцов получены при исследовании с использованием набора Salsa МС002 SMA Newborn Screen (MRC Holland, Нидерланды), делеции валидированы методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.
Разница в температурах плавления дуплексов, образованных гибридизационными пробами и последовательностями экзонов 7 гена и псевдогена достигается за счет использования олигонуклеотидов, коплементарных последовательности генов SMN таким образом, чтобы один из нуклеотидов в своем составе имел вариант С.840ОТ экзона 7, различающий два этих гена. Гибридизационные пробы представляют собой линейный олигонуклеотид, имеющий на 3' конце гаситель флуоресценции BHQ2 и линейный олигонуклеотид с флуорофором SY5 на 5' конце и блокирующий фосфор на 3'.
Данные олигонуклеотиды комплементарны обратным цепям генов SMN1 (NM_000344.4) и SMN2 (NM_017411.4). Для обогащения продукта полимеразной цепной реакции обратными цепями, являющимися мишенями для отжига детектирующих олигонуклеотидов, на первом этапе проводится асимметричная полимеразная цепная реакция с избытком обратного праймера SEQ ID NO: 1 по отношению к прямому SEQ ID NO: 2 4:1. На втором этапе после полимеразной цепной реакции проводится снижение температуры до 30°С для эффективного отжига детектирующих проб с флуорофором и с гасителем флуоресценции. Затем температуру реакционной смеси постепенно повышают до 80°С, что сопровождается диссоциацией гибридизированных проб, при этом флуоресцентная метка отдаляется от гасителя и нарастает детектируемый сигнал флуоресценции. Нарастание сигнала флуоресценции детектируется на длине волны 520+/-15 нм при температурах от 30°С до 80°С. Так как последовательность пробы SEQ ID NO: 3 подобрана комплементарно участку генов SMN, содержащему вариант с. 840 ОТ, разница в температурах плавления дуплексов, образованных гибридизационными пробами и последовательностями 7 экзонов гена и псевдогена, составляет 10°С: SMN2 52±2°С, SMN1 62±2°С, что позволяет надежно различать пики, соответствующие генам SMN1 и SMN2. При наличии делеции в гомозиготном состоянии отжига специфической пробы не происходит, соответственно пик плавления отсутствует.
Изобретение поясняется фигурами. На фигурах 1-3 представлены кривые плавления, полученные в результате диссоциации в раствор детектирующей пробы, комплементарной обратной цепи генов SMN, включающей в свой состав гаситель флуоресценции BHQ2 на 3' конце олигонуклеотида SEQ ID NO: 3, и пробы, имеющей в своем составе флуорофор Су5 на 5' конце одигонуклеотида SEQ ID NO: 4 и блокирующий фосфор на 3'. На фигуре 1 цветом визуализирована кривая плавления, соотвествующая наличию экзона 7 генов SMN1 и SMN2, на фигуре 2 цветом визуализирована кривая плавления образца с делецией экзона 7 гена SMN1, на фигуре 3 цветом визуализирована кривая плавления образца с делецией экзона 7 гена SMN2.
Осуществление изобретения
Образцы для генотипирования представляют собой пятна крови на фильтровальной бумаге, полученные из пяточной капиллярной крови новорожденных для проведения массового скрининга. Образец крови берут из пятки новорожденного ребенка через 3 часа после кормления на 4-й день жизни у доношенного и на 7-й день - у недоношенного ребенка. Забор образцов крови осуществляется на специальные фильтровальные бумажные тест-бланки (далее -тест-бланк), которые выдаются медико-генетической консультацией (центром) государственным и муниципальным учреждениям здравоохранения, оказывающим медицинскую помощь женщинам в период родов, по количеству ежегодного числа родов и, при необходимости, государственным и муниципальным учреждениям здравоохранения, оказывающим медицинскую помощь детям. Перед забором образца крови пятку новорожденного ребенка необходимо вымыть, протереть стерильной салфеткой, смоченной 70-градусным спиртом. Во избежание гемолиза крови обработанное место следует промокнуть сухой стерильной салфеткой. Прокол пятки новорожденного ребенка осуществляется одноразовым скарификатором, первая капля крови снимается стерильным сухим тампоном. Мягкое надавливание на пятку новорожденного ребенка способствует накоплению второй капли крови, к которой перпендикулярно прикладывается тест-бланк, пропитываемый кровью полностью и насквозь в соответствии с указанными на тест-бланке размерами. Вид пятен крови должен быть одинаковым с обеих сторон тест-бланка. Тест-бланк высушивается в горизонтальном положении на чистой обезжиренной поверхности не менее 2 часов без применения дополнительной тепловой обработки и попадания прямых солнечных лучей [19].
На первом этапе исследования проводится вырезание пятен крови диаметром 1,2 мм с использованием панчера (Harris UNI-CORETM QIAGEN, Германия), которые затем помещают в соответствующие лунки одноразового 96 х 0.1 мл планшета (BlOplastics BV, Нидерланды). Предварительно в лунки раскапывается по 3 мкл деионизованной воды для уменьшения электростатического заряда. Затем в отдельной 1,5 мл пробирке готовится реакционная смесь и раскапывается по 22 мкл в лунки, содержащие пятна. Планшет закрывается крышками Masterclear cap strips (Eppendorf, Германия).
4
2
4
2
Состав реакционной смеси: 3 пмоль олигонуклеотида SEQ ID NO: 2, 20 пмоль олигонуклеотида SEQ ID NO: 1; по 3 пмоль олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3 И SEQ ID NO: 4; по 200 мкмоль каждого нуклеозидтрифосфата (dATP, dTTP, dGTP, dCTF); буфер для ПЦР (67 ммоль Tris-HCl; 16.6 ммоль (NH)SO; 0.01% Twin-20; рН 8.8); 4,0 ммоль MgCl; 5,0 единиц активности ДНК-полимеразы Biotaq («БиоМастер», Россия). Олигонуклеотиды синтезированы НПО «Синтол», Россия и ЗАО «Евроген», Россия.
Амплификацию фрагментов ДНК проводили методом ПЦР с последующим анализом кривой плавления/диссоциации на приборе QuantStudio5 (ThermoFisher, США).
Параметры ПЦР были следующие: денатурация двухцепочечной ДНК при t=95°C в течении 1 минуты, далее 45 циклов полимеразной цепной реакции t=95°C - 10 секунд, t=60°C - 30 секунд, t=68°C - 40 секунд. Затем проводился этап анализа кривой плавления/диссоциации. Смесь медленно охлаждали до t=30°C, инкубировали 2 минуты и медленно нагревали до t=80°C (на последнем этапе регистрировали флуоресценцию).
Полученные результаты анализировали с помощью программного обеспечения QuantStudioTM Design @ Analysis Software v1.5.1 (ThermoFisher, США).
Для оценки чувствительности и специфичности системы прогенотипированы 819 образцов сухих пятен крови на фильтровальной бумаге с известными генотипами по наличию/отсутствию экзона 7 в генах SMN, из них 10 образцов с делецией экзона 7 гена SMN1 в гомозиготном состоянии, 53 образца с делецией экзона 7 гена SMN2 в гомозиготном состоянии, 756 образцов с наличием 7 экзона в генах SMN. (Данные по генотипам образцов получены при исследовании с использованием набора Salsa МС002 SMA Newborn Screen (MRC Holland, Нидерланды). Генотипы и число образцов приведены в Таблице 1.
Все образцы с делецией экзона 7 SMN1 не дали сигнала в диапазоне температур от 60°С до 64°С, все образцы с делецией экзона 7 SMN2 не дали сигнала в диапазоне температур от 50°С до 54°С. Таким образом, чувствительность системы для выявления гомозиготной делеции экзона 7 генов SMN составляет 100%. Температуры диссоциации проб для генов SMN1 и SMN2 не перекрывались у всех 819 исследованных образцов. Таким образом, специфичность системы для выявления гомозиготной делеции экзона 7 гена SMN1 составляет 100%.
В 4 образцах наблюдался выраженный дисбаланс интенсивности пиков: пик на температуре плавления 52±2°С, соответствующий гену SMN2, был в 5-8 раз выше пика на температуре 62±2°С, соответствующего гену SMN1. При последующем изучении данных образцов методом количественной мультиплексной лигазной реакции были установлены гетерозиготные по делеции экзона 7 гена SMN1 (число копий = 1) генотипы с большим числом копий гена SMN2 (более 4), что и объясняет выявленный артефакт.
Преимущество заявленного способа заключается в следующем: Применение данного изобретения позволяет оптимизировать неонатальный скрининг 5q СМА, позволяет проводить высокоинформативное исследование на образцах сухих пятен крови, минуя этап выделения ДНК. Низкая себестоимость и простота исследования позволяют применять данный способ детекции практически в любой ПЦР-лаборатории с минимальным набором оборудования и реактивов.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Приведены результаты визуализации анализа кривой плавления с использованием программного обеспечения QuantStudioTM Design @ Analysis Software v1.5.1 (ThermoFisher, США). По оси ординат отсчитывается величина, обратная интенсивности флуоресценции, по оси абсцисс - температура плавления. Tm - температура полной диссоциации проб в раствор (максимум флуоресценции). Синим цветом визуализирована одна из кривых плавления, соответствующих норме (присутствует пик, соответствующий SMN2, на температуре 52°С, и пик, соответствующий SMN1 - на 62°С).
Фиг. 2. Приведены результаты визуализации анализа кривой плавления с использованием программного обеспечения QuantStudioTM Design @ Analysis Software v1.5.1 (ThermoFisher, США). По оси ординат отсчитывается величина, обратная интенсивности флуоресценции, по оси абсцисс - температура плавления. Tm - температура полной диссоциации проб в раствор (максимум флуоресценции). Красным цветом визуализирована одна из кривых плавления, соответствующих делеции гена SMN1 (присутствует пик, соответствующий SMN2, на температуре 52°С, отсутствует пик, соответствующий гену SMN1, на температуре 62°С).
Фиг. 3. Приведены результаты визуализации анализа кривой плавления с использованием программного обеспечения QuantStudioTM Design @ Analysis Software v1.5.1 (ThermoFisher, США). По оси ординат отсчитывается величина, обратная интенсивности флуоресценции, по оси абсцисс - температура плавления. Tm - температура полной диссоциации проб в раствор (максимум флуоресценции). Зеленым цветом визуализирована одна из кривых плавления, соответствующих делеции гена SMN2 (отсутствует пик, соответствующий SMN2, на температуре 52°С, присутствует пик, соответствующий гену SMN1, на температуре 62°С).
Список литературы
1. Prior TW, Russman BS. Spinal muscular atrophy. Gene Review. 2003.
2. Brzustowicz L.M., Lehner Т., Castilla et al. Genetic mapping of chronic childhood-onset spinal muscular atrophy to chromosome 5q11.2 - q13.3. // Nature. 1990. V. 344. P. 540-541.
3. Crawford TO. Neuromuscular Disorders of Infancy, Childhood, and Adolescence. 2003. Chpt. 8. P. 145-166.
4. Zabnenkova W et al. Spinal muscular atrophy carrier frequency in Russian Federation. ASHG. 2016. P. 2476W.
5. McLean MD et al. Hum Mol Genet. 1994; 3: 1951-1956, Burglen L et al. Genomics. 1996; 32: 479-482.
6. Rochette CF et al. Hum Genet. 2001; 108: 255-266.
7. Lorson CL et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96: 6307-6311.
8. https://www.curesma.org.
9. Захарова Е.Ю. Программы массового скрининга: технические, социальные и этические вопросы. Медицинская генетика. 2006;3:21-23.
10. Newborn screening act sheets and confirmatory algorithms. American College of Medical Genetics, 2011, http://www.acmg.net/StaticContent/ACT/SCID.pdf.
11. KP593 - «Клинические рекомендации Проксимальная спинальная мышечная атрофия 5q», Москва.
12 Prior TW, Leach ME, Finanger E. Spinal Muscular Atrophy. 2000 Feb 24 [Updated 2020 Dec 3].
13. Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., editors. GeneReviews [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2021. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1352/.
14. Забненкова В.В., Щагина O.A, Поляков А.В. Результаты анализа носительства спинальной мышечной атрофии с использованием новой медицинской технологии «Количественный метод детекции числа копий генов локуса СМА». Медицинская генетика. 2016;15(2):18-23. https://doi.org/10.1234/XXXX-XXXX-2016-2-18-23.
15. Shagina I, Dadali HL, Sitnikov VP, Pugachev W, Malygina NA, Evgrafov OV. Prenatal diagnosis of spinal muscular atrophy in Russia. Prenat Diagn. 1995;15(1):27-34. doi:10.1002/pd.l970150107.
16. Определение количества копий гена SMN1 у больных спинальной мышечной атрофией Северо-Западного региона России / М.А. Маретина, А.В. Киселев, Г.Ю. Железнякова [и др.] // Медицинская генетика. - 2012. - Т. 11. - №4(118). - С. 25-28.
17. https://rh.perkinelmer.com/products/eonis-system/, Gutierrez-Mateo С, Timonen A, Vaahtera K, et al. Development of a Multiplex Real-Time PCR Assay for the Newborn Screening of SCID, SMA, and XLA. Int J Neonatal Screen. 2019; 5(4):39. Published 2019 Nov 2. doi:10.3390/ijns5040039.
18. Strunk A, Abbes A, Stuitje AR, et al. Validation of a Fast, Robust, Inexpensive, Two-Tiered Neonatal Screening Test algorithm on Dried Blood Spots for Spinal Muscular Atrophy. Int J Neonatal Screen. 2019; 5(2):21. Published 2019 May 15. doi:10.3390/ijns5020021.
19. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 22 марта 2006 г. N 185 "О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания".
--->
Перечень последовательностей нуклеотидов
<110> Федеральное государственное бюджетное научное учреждение “Медико-
генетический научный центр имени академика Н.П.Бочкова”
Federal'noe gosudarstvennoe nauchnoe byudzhetnoe uchrezhdenie “Mediko-
geneticheskiy nauchnyy tsentr imeni akademika N.P.Bochkova”
<120> МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЕТЕКЦИИ ДЕЛЕЦИИ ЭКЗОНА 7 ГЕНА SMN1,
ПРИГОДНАЯ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ НЕОНАТАЛЬНОГО СКРИНИНГА
<140> 2021137289/20(078412)
<141> 2021 12 16
<160> 4
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ccataaagtt ttacaaaagt aagattcac 29
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gtgaaacaaa atgcttttta acatcc 26
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cagggtttca gacaaaatc 19
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
aaaagaagga aggtgctcac attcc 25
<---