Конструируем рибонуклеазы. Ножницы-ферменты

Преодоление клеточной мембраны также представляет проблему для любых заряженных молекул, в том числе и олигорибонуклеотидов. Здесь на помощь может прийти использование в качестве средств доставки препаратов катионных липидов и полимеров, которые образуют с интерферирующими РНК комплексы определенного размера. Такие комплексы способны проникать в клетки благодаря природным механизмам транспорта веществ. Другим перспективным подходом является присоединение к siPHK молекул, заведомо обладающих способностью проникать в клетки, таких как холестерин, фолат и других природных молекул, необходимых для функционирования клетки.

Проблема доставки интерферирующих РНК в некоторые типы клеток и тканей уже успешно решена, и эффективность подавления экспрессии генов-мишеней подтверждена на экспериментальных животных. Однако, как отмечают специалисты, текущее состояние дел в этой области следует считать обнадеживающим, но скромным результатом. Именно от разработки адекватных средств и схем доставки лекарственных молекул РНК в самые разные типы клеток при различных заболеваниях зависит то, как скоро всю мощь этого нового подхода в лечении удастся почувствовать на практике.

Литература

Логашенко Е.Б., Владимирова А. В., Зенков А.Н., Репкова М.Н., Вепьяминова А. Г., Черноловская Е.Л., Власов В.В. (2005) Обращение фенотипа множественной лекарственной устойчивости с помощью малых интерферирующих РНК. // Известия АН, серия химическая, 2, 41—44.

Агоп'т N. (2006) Target selectivity in mRNA silencing. Gene Therapy, 13, 509—516.

Corey D. (2007) Chemical modification: the key to clinical application of RNA interference? // The Journal of Clinical Investigation, 117, 3615—3622.

Grimm D. and Kay M. (2007) Therapeutic application of RNAi: is mRNA targeting finally ready for prime time ? The Journal of Clinical Investigation, 117, 3633—3641.

Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., DriverS. E., and Mello C.C. (1998). Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans//Nature, 391, 806-811.

Kabilova Т. O., Chemolovskaya E.L., Vladimirova A. V., Vlassov V. V. (2006) Inhibition of Human Carcinoma and Neuroblastoma Cell Proliferation by anti c-Myc siRNA // Oligonucleotides, 16, 15—25.

в.н.сильников

В клетках нашего организма — сложно устроенных «химических фабриках» — постоянно происходит бесчисленное множество самых разнообразных биохимических реакций. Причем процессы деструкции, разрушения ненужных или чужеродных для клетки веществ не менее значимы для нее, чем процессы синтеза. Осуществляются они, как правило, с помощью ферментов — природных катализаторов белковой природы

Рибонуклеиновые кислоты, которые служат матрицами для синтеза белков, являются важнейшим компонентом клеточного биохимического «производства». Однако в некоторых случаях, при инфекциях или других патологических состояних организма, необходимо остановить процессы синтеза того или иного белка. И один из способов сделать это — разрушить соответствующую РНК с помощью специальных ферментов.

Неудивительно, что ученые начали задумываться о возможности создания на их основе принципиально новых лекарственных препаратов, способных избирательно уничтожать, например, вирусные РНК, не затрагивая при этом жизненно важные рибонуклеиновые кислоты клеток организма.

Все гениальное — просто

Рибонуклеазы — ферменты класса гидролаз, расщепляющие РНК, — широко распространены в клетках всех организмов. Самый известный из них — панкреатическая рибонуклеаза (или РНКаза А), выделенная из поджелудочной железы быка.

Говоря об этом ферменте, постоянно приходится добавлять слово «впервые». РНКаза А — первый ферментный белок, для которого в начале 60-х гг. прошлого века была полностью определена последовательность входящих в его состав аминокислот. А когда в 1969 г. был осуществлен первый химический синтез фермента, им оказалась все та же панкреатическая рибонуклеаза. Более того, она же стала и первым ферментом, вошед-

сильников

Владимир Николаевич — доктор химических наук, заведующий лабораторией органического синтеза Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск). Автор и соавтор более 80 научных публикаций. Лауреат премии Ленинского комсомола в области науки и техники (1989).

Имеет 4 патента на изобретения

КОНСТРУИРУЕМ РИБОНУКЛЕАЗЫ

Природные рибонуклеазы — ферменты, разрушающие ненужную или чужеродную (вирусную) РНК — присутствуют в клетках всех живых организмов

61

Рибонуклеазы были первыми ферментами, для которых были созданы искусственные аналоги — низкомолекулярные соединения, действующие подобно белкам-катализаторам

шим в медицинскую практику (его попользуют в качестве противовирусного средства). В качестве отступления заметим что фермент онконаза — аналог РНКазы А, выделенный из ооцитов лягушки Ranapipiens, сегодня является абсолютно новым противораковым препаратом, явный успех клинических испытаний которого позволяет говорить о зарождении нового класса противоопухолевых препаратов — серьезной альтернативе классической химиотерапии.

Следугцей вехой на пути превращения рибонуклеаз в лекарства можно считать 1980-е гг., когда американский биохимик Р. Бреслоу обнаружил, что небольшие молекулы гетероциклического вещества имидазола способны расщеплять РНК подобно природной панкреатической рибонуклеазе. Ему пришла мысль, что можно создать искусственные аналоги ферментов — низкомолекулярные соединения с функциями

природных катализаторов. Эта идея была гениальна в своей простоте: для достижения результата достаточно взять каталитически активные группы, встречающиеся в активных центрах природных ферментов, зафиксировать их определенным образом в пространстве — и синтетический аналог фермента готов!

Через несколько лет Р. Бреслоу удалось реализовать высказанную им идею на практике. И хотя полученные им «искусственные» рибонуклеазы были способны расщеплять фосфодиэфирные связи лишь в специально синтезированном для этих целей субстрате, а не в природных РНК, начало было положено.

Появление первых работ по искусственным рибонук-леазам совпало с пиком исследований по другой очень интересной тематике — так называемым антисмыс-ловым олигонуклеотидам, работы по которым велись велись в отделе биохимии Института общей химии СО РАН (Новосибирск), возглавляемого академиком Д.Г. Кнорре*. Здесь следует пояснить, что более менее протяженные последовательности нуклеиновых кислот являются уникальными по своей структуре. Поэтому на них можно направленно воздействовать комплементарными (антисмысловыми) олигонуклеотидами, которые

62

• N^/HN

0 ОН''

hn4^NH......."0-Р=0

\

активным центр РНКазы А

В активный центр РНКазы А

\

0-Р=0 ™ И/

i молекула РНК

часть молекулы, имитирующие активный центр РНКазы А

0--Н" j* V=

/

Расщепляемая ^р^

связь РНК Cj, - °

о--..... *г=

\

о' —N

\ р / 0-' ^0

0 I

0-Р=0

I

о

Механизм действия природной панкреатической рибонуклеазы (А) и искусственной рибонуклеазы (Б) схожи: они расщепляют фосфодиэфирные связи в молекуле РНК

A Aq

G С U С А

G G '

G АС CU

G U U U U GAAGGCCUU

yGCGAAA CUUCCGGAA с А С с с

G U

С g фрагмент мРНК

q | Leishmania amazonensis

L I

А U

: У

,А U 31

Место

расщепления РНК -

И и

к

G С

U А

А U

С G

А U

антисмысловые олигонуклеотиды, несущие группу, расщепляющую РНК

Аналоги природных ферментов — удобный инструмент для молекулярной биологии и

генной инженерии

Коньюгат антисмысловых олигонуклеотидов с синтетическими аналогами рибонуклеазы — каталитически активными группами, расщепляющими РНК по определенным нуклеотидным последовательностям — эффективно разрушает регуляторную часть мРНК инфекционного агента лейшмании

могут специфично «узнавать» и присоединяться лишь к определенным участкам конкретной нуклеиновой кислоты.

Объединение этих двух технологий — «антисмысло-вой» и низкомолекулярных искусственных рибонук-леаз — сулило прорыв в производстве синтетических ферментов для медицинских целей. А поскольку хорошие идеи зачастую приходят в голову многим людям одновременно, неудивительно, что работы в этом направлении в 90-х гг. прошлого века начались практически одновременно по всему миру — в Японии, Европе, Соединенных Штатах и России.

Не хуже природных

К сожалению, в ходе реализации антисмысловой технологии в ее первоначальном варианте обнаружился ряд проблем, в результате чего создание реальных лекарственных препаратов на основе таких соединений отодвинулось на неопределенное время. Эти проблемы касались в первую очередь проникновения синтетических олигонуклеотидных производных сквозь клеточные мембраны, а также их стабильности в живых системах.

Кроме того, на свертывание работ в этом направлении повлияла причина «нетехнологического» характера. Антисмысловая технология на начальном этапе своего становления казалась настолько легко реализуемой,

* Подробнее читайте в журнале «НАУКА из первых рук», №2(14), 2007

что во всем мире как грибы стали появляться коммерческие фирмы, обещающие создать «панацею» уже в ближайшие годы. В эту область были инвестированы огромные средства; когда же обещанной быстрой отдачи не последовало, компании стали быстро разоряться, произошло и значительное сокращение финансирование фундаментальных исследований. Для российских ученых этот период совпал с общим развалом российской экономики, значительным сокращением финансирования науки в целом.

Когда новосибирские ученые из Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН начинали свою работу в области конструирования искусственных рибонуклеаз на основе олигонуклеотидных конъюгатов, они знали о всех трудностях, хотя, как и многие в то время, считали их временными. К сожалению, идеальные носители для наших рибонуклеаз — синтетические аналоги нуклеиновых кислот, легко проникающие внутрь клеток и не разрушающиеся под действием природных ферментов, — не созданы до сих пор.

Однако, несмотря на все трудности, работу по созданию искусственных рибонуклеаз ученые не прекратили, начав с моделирования той самой РНКазы А. В лаборатории органического синтеза были синтезированы десятки потенциальных искусственных ферментов. Все они в той или иной степени расщепляли фосфодиэфир-ные связи в различных молекулах природной РНК, при этом совершенно не затрагивая ДНК. Каждая молекула этих синтетических ферментов была способна катализировать разрушение десятков и сотен связей в РНК.

Искусственные рибонуклеазы могут стать высокоизбирательными малотоксичными лекарственными препаратами для лечения вирусных, онкологических и наследственных заболеваний

Окончательно сказать, что структурно-функциональ-ные аналоги РНКазы А созданы, ученые смогли после того, как детально исследовали особенности разрушения РНК в присутствии как природного, так и синтетических ферментов. Дело в том, что помимо высокой эффективности природным ферментам свойственна еще и высокая избирательность действия. Например, РНКаза А наиболее эффективно расщепляет связи в цепочке РНК между нуклеотидами аденином (А) и цитозином (С) и несколько хуже — между аденином и уридином (и). Так вот, оказалось, что искусственные ферменты работали практически также, как и природный.

Конечно, даже самые активные из созданных рибо-нуклеаз уступают по активности природному ферменту в сотни и даже тысячи раз. Однако если учесть, что РНКаза А ускоряет разрушение РНК в 1014 раз, то и полученные результаты выглядят впечатляюще. В то же время искусственные рибонуклеазы обладают рядом преимуществ: в первую очередь, они очень дешевы по сравнению с природными ферментами. Кроме того, эти соединения очень стабильны и могут работать в широком диапазоне условий.

Универсальные «солдаты

»

Где могут найти применение искусственные рибонуклеазы? В первую очередь там, где сейчас используют природные ферменты. Например, в современной биотехнологии — при выделении геномной ДНК, при подготовке ее для ПЦР-анализа, который широко используется в самых различных областях, от медицинской диагностики до криминалистики.

Искусственные рибонуклеазы совершенно инертны по отношению к другим биомолекулам, в частности, белкам. Это их свойство оказалось незаменимым при создании вакцин. Ведь чтобы получить безопасные противовирусные вакцины, вирусные частицы надо «обезоружить», т.е. разрушить их генетический материал. Наиболее часто для этой цели в настоящее время используется формальдегид, сочетающий высокую активность с низкой стоимостью. Однако формальдегид также частично разрушает вирусные белки, а именно: на них в организме при вакцинации вырабатывается иммунный ответ. В результате эффективность вакцинации снижается. Искусственные рибонуклеазы лишены этого недостатка, что подтвердили предварительные эксперименты, проведенные на лабораторных мышах, зараженных вирусом гриппа. Выживаемость животных, получавших подобную вакцину, оказалась существенно выше по сравнению с контрольной группой, вакцинированной стандартным образом.

И наконец, искусственные ферменты могут с успехом заменить природные в исследованиях различных РНК-белковых комплексов. Например, при решении вопроса о том, чем на заре становления жизни определялась специфичность протоферментов — их РНК-связывающим центром, «узнающим» определенные связи в цепочке РНК (как это наблюдается у современных рибонук-леаз) или эту функцию первоначально исполняли их каталитически активные центры? Подобные работы напрямую связаны с одой из важнейших фундаментальных эволюционных проблем — проблемой становления белковой жизни.

Выстрел в десятку

Исследования расщепления протяженных фрагментов РНК (в частности фрагментов генома вируса гриппа) привели к важному открытию: оказалось, что некоторые искусственные рибонуклеазы расщепляют

Основатель направления создания синтетических ферментов профессор Р. Бреслоу

не все принципиально доступные им фосфодиэфир-ные связи, но лишь те, что находятся в определенных пространственных элементах РНК. Это означало возможность вновь вернуться к идее создания избирательных противовирусных препаратов, но уже на основе низкомолекулярных соединений, без привлечения «антисмысловой» технологии: ферменты сами, без помощников, могли теперь «распознавать» и уничтожать «нужную» РНК!

К сожалению, в успех этого мероприятия мало кто верил, да и сами полномасштабные испытания проти-вирусной активности — дорогое удовольствие. Помог случай: на одной из научных конференций новосибирские ученые встретились с вирусологами из Одесского противочумного института, которые согласились провести испытания пятнадцати новых соединений. И это был, что называется, выстрел в десятку: десять из испытанных соединений показали четко выраженную противогриппозную активность. Более того, эффективность четырех из них была сопоставима или даже превышала эффективность таких известных лекарственных препаратов, как ремантадин и дейтефорин в 50—100 раз! Это был безусловный успех, учитывая низкую токсичность испытанных рибонуклеаз.

Эти работы вызвали живой интерес со стороны не только украинских, но и белорусских, и итальянских коллег, а также некоторых фармацевтических компаний. Заинтересованность проявили и региональные власти. Но самой высокой оценкой своей работы сами ученые считают слова легендарного «отца-основателя» искусственных ферментов Р. Бреслоу, высказанные им на недавнем международном симпозиуме: «Я восхищен новосибирскими химиками, сумевшими получить такие результаты!»

Литература

Зенков М.А., Сильников В.Н., Власов В. В. Химические рибонуклеазы // Молекулярная биология. — 1998. — Т. 32. - № 1. С. 62-70.

Гарипова И.Ю., Сильников В.Н. Сайт-специфичные синтетические рибонуклеазы на основе конъюгатов олигонук-леотидов сметаллонезависимыми органическими катализаторами гидролиза фосфодиэфирных связей//Известия АН. Серия химическая. — 2002. — № 7. С. 1025—1030

Сил ьников В.Н., Власов В. В. Конструирование реагентов для направленного расщеплен ия рибонуклеиновых кислот // Успехи химии. - 2001. -Т.70 - № 6. С. 562-580.

Kuznetsova I.L., Silnikov V.N. Small ribonuclea.se mimics. Ed. Malina A.Zenkova «Artificial Nucleases» in Nucleic Acids and Molecular Biology — 2004. — V. 13. P. 111—128, Springer Verlag Berlin.

Глоссарий

Антигены — высокомолекулярные коллоидные вещества, которые при введении в организм животных или человека вызывают образование специфических, реагирующих с ними антител.

Антисмысловой олигонуклеотид молекула РНК или ДНК, полученная в лаборатории и комплементарная по последовательности своей мРНК-мишени. Антисмысловой подход использует такие олигонуклеотиды для подавления экспрессии специфических генов.

Аутоиммунные заболевания — заболевания, при которых иммунная система организма начинает атаковать клетки своего организма.

Вектор — в современной биологии так называют средство доставки чужеродного генетического материала в клетку-мишень. Также вектором называют организм — переносчик болезни.

Гликопротеин — белок, содержащий олигосахаридные цепи, ковалентно присоединенные к полипептидной цепи.

Интерфероны и цитокины это белки, продуцируемые клетками иммунной системы для регуляции иммунного ответа. Интерфероны принадлежат к классу цитокинов.

Множественная лекарственная устойчивость состояние, позволяющее болезнетворному организму сопротивляться лечению широким спектром лекарственных препаратов. Такими организмами, проявляющими множественную лекарственную устойчивость могут быть патологические клетки, в том числе бактериальные или раковые.

Моноклональные антитела — это моноспецифические антитела, идентичные между собой в силу того, что они производятся иммунными клетками, являющимися клонами одной родительской клетки. Создание технологии моноклональных антител позволило, в частности, начать применение терапевтических методик на их основе в клинике. Это стало революцией в ряде областей медицины, включая онкологию.

Нокаут гена/сайленсинг — совокупность экспериментальных подходов, позволяющих подавить экспрессию специфического гена-мишени.

Онкоген — ген, участвующий в злокачественной трансформации клетки.