СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА К ВОЗДЕЙСТВИЮ РАДОНА
METHOD FOR DETERMINING INDIVIDUAL SENSITIVITY OF HUMAN GENOME TO RADON EXPOSURE

Изобретение относится к области медицины, генетики человека и может быть использовано для оценки индивидуальной радиочувствительности генома человека (в случаях проживания или работы в условиях воздействия повышенных доз радона).
2
Известен способ определения генотоксической чувствительности к комплексу химических мутагенов, проявляющейся в виде определенного уровня хромосомных аберраций (ХА), применимый для оценки профессиональной пригодности лиц для работы в условиях с повышенной вредностью по генетическим маркерам (а.с. SU 1621718 A1, кл. G01N 33/48, опубл. 22.04.1988). Суть метода заключается в том, что у испытуемого забирают кровь из локтевой вены, культивируют ее 48 часов в присутствии фитогемагглютинина, для накопления хромосом в стадии метафазы используют обработку колхицином. Затем проводят гипотоническую обработку и фиксацию клеток. Полученную суспензию раскапывают на охлажденные предметные стекла и высушивают на воздухе. С помощью С-метода дифференциальной окраски хромосом выявляют экстремальные варианты С-полиморфизма. Для этого препараты окрашивают красителем Гимза после предварительной денатурации в насыщенном растворе Ba(OH) и инкубации в стандартном солевом растворе 2×SSC при 60°C. Оценку С-сегментов проводят полуколичественным методом по 5-балльной системе. За экстремальные варианты принимают варианты: 1 или 5 баллов, перицентрические инверсии. Наличие в генотипе таких вариантов сопряжено с высокой частотой хромосомных нарушений. Таким образом, при наличии в генотипе экстремальных вариантов гетерохроматина судят о непригодности лиц для работы на предприятиях с повышенной токсической вредностью.
Известен также способ определения индивидуальной чувствительности и профессиональной пригодности лиц для работы в условиях повышенного содержания угольной пыли (патент RU 2316764 С1, кл. G01N 33/48, опубл. 10.02.2008). Суть метода заключается в том, что у испытуемых для исследования берут 0,5-1,0 мл крови из локтевой вены. Проводят культивирование лимфоцитов и получают препараты хромосом по стандартной методике. Препараты «состаривают» в термостате при 37°С в течение 24 часов. Окрашивание выполняют нанесением на препарат азотнокислого серебра и определяют следующие цитогенетические показатели: суммарная активность AgЯOP (Ag-положительных ядрышкообразующих районов хромосом), количество AgЯOP, аргентофильность D-хромосом, аргентофильность G-хромосом, ассоциативный индекс, число ассоциаций на клетку с ассоциациями, число ассоциирующих акроцентриков на клетку с ассоциациями. На основании совокупности полученных показателей рассчитывают уровень вероятности высокого уровня ХА и при его значении 50% и менее определяют профессиональную пригодность испытуемого для работы в условиях повышенного содержания угольной пыли.
Необходимо отметить, что данные способы подразумевают различные подходы к прогнозированию уровня ХА при воздействии химических соединений. Известны способы биологической индикации радиационных воздействий, позволяющие подтверждать факт облученности и степень ее тяжести, основанные на определении в лимфоцитах периферической крови обследуемого ХА дицентрического типа и Е-37-розетко-образующих лимфоцитов (патент RU 2126156 C1, кл. G01N 33/53, опубл. 10.02.1999).
Наиболее близким способом определения индивидуальной радиочувствительности может служить способ экспресс-выявления облученных пациентов с повышенными частотами ХА (патент RU 2141 658 C1, Кл. G01N 33/48, опубл. 20.11.1999). В качестве маркера для выявления пациентов с повышенными частотами ХА после радиационных воздействий используют аномалии ядер интерфазных лимфоцитов типа «хвостов» в мазках крови. По повышенной частоте встречаемости таких лимфоцитов (0,8% и выше) выявляют пациентов с повышенной частотой ХА. К недостаткам данного способа следует отнести отсутствие прогностической значимости, т.к. в данном способе речь идет не о риске накопления хромосомных нарушений, не об определении индивидуальной чувствительности генома до радиационного воздействия, а только об индикации - выявлении лиц с повышенными уровнями хромосомных мутаций после радиационного воздействия. Это существенно сужает область применения и информативность способа.
В связи с успехами молекулярной медицины и разработкой адекватных молекулярно-генетических методов в последние годы стало возможным выявление связи генетических полиморфизмов ферментов репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков с ответом на воздействие факторов окружающей среды. В настоящее время найдены потенциальные гены-кандидаты, которые могут влиять на частоту спонтанных и индуцированных хромосомных повреждений у человека. Установлено, что нулевые генотипы по глутатион-S-трансферазе (GSTM1 и GSTT1) ассоциированы с более высоким уровнем ХА, индуцированных митомицином C (Григорьева С.А. Изучение генетически обусловленной чувствительности к действию мутагенов окружающей среды в индуцированном мутагенезе у человека. Автореф. дисс. М., 2007). Показано увеличение частоты кольцевых и дицентрических хромосом у носителей XRCC1 280 His/His в условиях воздействия радона внутри помещений (Kiuru A., Lindholm С., Heilimo I. et al., 2005. Inflluence of DNA repair gene polymorphisms on the yield of chromosomal aberrations // Enviromental and molecular mutagenesis. V.46 1.3. P.198-205). В экспериментах in vitro показано, что индивидуумы с диким типом XRCC1 194 Arg/Arg демонстрируют большее число хромосомных разрывов на клетку при обработке культур клеток блеомицином и диоловыми эпоксидами бензо[а]пирена (Wang Y., Spitz M.R., Zhu Y. et al., 2003. From genotype to phenotype: correlating XRCC1 polymorphisms with mutagen sensitivity // DNA Repair (Amst). 2 (8). P.901-908). Однако данные исследования лишь отмечают вклад отдельных генотипов в формировании хромосомных аберраций, не предлагается конкретных способов использования полученных результатов для определения индивидуальной чувствительности человека к действию мутагенов.
Основными задачами предложенного изобретения являются: создание способа определения индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию природной радиации (радона) и повышение прогностической значимости путем привлечения в систему прогноза молекулярно-генетических маркеров (генов ферментов репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков).
Это достигается за счет того, что в предложенном способе определения индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию радона, включающем исследование крови человека и определение индивидуального уровня ХА, определяют предрасполагающие и протективные генотипы генов-кандидатов: маркер Arg280His гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Arg, протективный генотип Arg/His; маркер Arg194Trp гена XRCC1 - предрасполагающий генотип Arg/Arg, протективный генотип Arg/Trp; маркер Asn148Glu гена АРЕ1 - предрасполагающий генотип Glu/Glu, протективные генотипы Asn/Asn, Asn/Glu; маркер A2455G гена CYP1A1 - предрасполагающий генотип A/G, протективные генотипы А/А и G/G; маркер делеция в гене GSTM1 - предрасполагающий генотип о/о, протективный +, и делают заключение о высокой индивидуальной чувствительности к действию повышенных доз радона при количественном преобладании предрасполагающих генотипов или равном количестве предрасполагающих и протективных генотипов, а о высокой индивидуальной устойчивости к воздействию радона - при количественном преобладании протективных генотипов.
3
Новизна данного подхода заключается в разработке комплекса молекулярно-генетических характеристик, оценка совокупности которых необходима и достаточна для определения индивидуальной чувствительности генома человека к воздействию радона (в дозах выше 200 Бк/м).
Впервые установлена роль полиморфизма отдельных генов биотрансформации ксенобиотиков (GSTM1 и CYP1A1) в формировании хромосомных нарушений в условиях хронического воздействия высоких доз радона. Среди широкого спектра известных полиморфных генов репарации выделены маркеры, связанные с повышенным риском хромосомных нарушений в условиях действия природной радиации - Arg280His и Arg194Trp гена XRCC1, Asn148Glu гена АРЕ1.
Оценка совокупности полиморфизмов генов ферментов репарации ДНК и биотрансформации ксенобиотиков, использованная в предложенном способе, позволила с высокой эффективностью и точностью определять потенциальный риск формирования хромосомных аберраций у лиц, подвергающихся воздействию природной радиации. Это может быть использовано как для оценки индивидуальной чувствительности к действию радона внутри жилых помещений, так и в промышленных условиях, например у шахтеров, работающих в условиях воздействия очень высоких доз радона.
Способ выполняют в следующей последовательности:
1. Формируют группы наблюдений.
3
3
3
Для этого формируют две группы доноров с высоким (выше среднего) и низким уровнем ХА, формирующимся в условиях хронического высокого воздействия радона. В нашем исследовании были обследованы дети-подростки (211 человек), проживающие в школе-интернате. Было экспериментально установлено, что концентрация радона в воздухе помещений школы-интерната превышает допустимый уровень для эксплуатируемых зданий (до 200 Бк/м) и достигает 583 Бк/м в зимний период и 334 Бк/м в весенний период.
Выбор детей-подростков обоснован тем, что в этом случае минимизируется воздействие таких факторов, как вредные привычки, хронические болезни и влияние профессионального контакта с производственными вредностями. Помимо этого, компактное нахождение всех членов выборки (совместное проживание в школе-интернате не менее 3 месяцев до начала исследования) обеспечивает максимальную унификацию по параметрам питания и условиям проживания. Все доноры не имели хронических заболеваний, были некурящие. В обследование не включали детей, получающих медикаментозное лечение, а также проходивших рентгенологическое обследование в течение 3 мес. до сбора материала. На каждого обследуемого был оформлен протокол информированного согласия, подписанный родителями либо лицами, осуществляющими опеку несовершеннолетних. Половозрастная характеристика групп представлена в таблице 1.
Подготовку препаратов метафазных хромосом осуществляли с использованием стандартного полумикрометода культивирования лимфоцитов [Hungerford Р.А., 1965. Leukocytes cultured from small inocula of whole blood and the preparation of metaphase chromosomes by treatment with hypotonic KC1 // Stain Techn. Vol.40. P.333-338]. Культивировали цельную венозную кровь, которую брали из локтевой вены. В культуральный флакон помещали 0,5 мл крови, 0,1 мл фитогемагглютинина (ПанЭко), 6 мл среды RPMI 1640 (ПанЭко), 1,5 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Длительность культивирования составляла 48 ч. За 2 ч до фиксации в культуры добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. По окончании культивирования клетки обрабатывали гипотоническим раствором 0,55% KCl в течение 10-15 мин при 37°C. Фиксацию материала проводили в 3 сменах охлажденного этанол-уксусного фиксатора (3:1). Клеточную суспензию раскапывали на чистые охлажденные, смоченные водой предметные стекла. Препараты шифровали и окрашивали 2%-ным раствором красителя Гимза (Merk). Учет ХА проводили без кариотипирования. Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям [Бочков Н.П., Кулешов Н.П., Журков B.C., 1972. Анализ спонтанных хромосомных аберраций в культуре лейкоцитов человека // Цитология. Т.14. №10. С.1267-1273]. Просматривали 100-300 метафаз. Оценивали частоту клеток с ХА.
В среднем частота ХА у обследованных доноров всей выборки составила 5,30±0,16%. Это достоверно значимо превышает значения базового фонового уровня для региона (2,86%), что подтверждает факт генотоксического воздействия радона. Примечательным является то, что, несмотря на сходство воздействующих факторов: интенсивность воздействия радона, возраст, питание, состояние здоровья, 43% детей демонстрируют особенно высокие показатели уровня хромосомных аберраций. У 91 человека частота клеток с ХА была выше среднего и составила 7,42±0,18%. Очевидно, что причины подобной повышенной чувствительности генетически детерминированы. Из этих доноров и была сформирована опытная группа. В группу сравнения вошли 120 человек. Средняя частота клеток с ХА в данной группе была ниже среднего и составила 3,48±0,12%. Разница между этими группами была статистически достоверна (p<0,01).
2. Формируют таблицу относительного риска.
2
Проводят сравнение частот аллелей, генотипов и сочетаний генотипов полиморфных маркеров генов-кандидатов в опытной и контрольной группах. Сравнение частот проводят по критерию χ с поправкой Йетса с помощью ППП Statistica 6.0. Относительный риск и доверительный интервал рассчитывают по формулам:
a
где +0,5 - количество доноров с высоким уровнем ХА носителей данного гена/генотипа; b+0,5 - количество носителей данного гена/генотипа с невысоким уровнем ХА; c+0,5 - количество доноров с высоким уровнем ХА без данного гена/генотипа; d+0,5 - количество доноров с низким уровнем ХА без данного гена/генотипа (с поправкой на малое число наблюдений).
Для построения доверительного интервала берут величину L=lnOP, которую приближенно можно считать нормально распределенной со средним значением:
или
и стандартным отклонением:
Нижней и верхней доверительными границами показателя, между которыми его показатели находятся с вероятностью 1-а, соответственно составляют величины:
где  - значение критерия Стьюдента, соответствующее вероятности ошибки α; в частности, при построении 95% доверительного интервала α=0,05 и ; при 99% доверительного интервала α=0,01 и ; а при 99,9% доверительного интервала α=0,001 и .
В качестве нижней и верхней доверительных границ берут антилогарифмы от величин  и :
где e=2,718.
Если доверительный интервал не включает значения 1,0, то связь воздействие-заболевание считают статистически значимой.
Значения относительного риска для всех причинных генотипов приведены в таблице 2. При относительном риске более 1,5 делают заключение о предрасположенности, при относительном риске менее 0,7 - о генетической устойчивости от формирования высокого уровня хромосомных нарушений.
3. Формируют таблицу протективных и предрасполагающих генотипов (табл.3).
4. Детальное описание способа.
Пример 1.
У обследуемой Т. 15 лет в стерильную пробирку типа «вакутейнер» (с ЭДТА) была взята венозная кровь в объеме 1,5 мл. ДНК выделяли с использованием фенол-хлороформной экстракции. Для генотипирования нуклеотидных замен A2455G гена CYP1A1, Arg280His и Arg194Trp гена XRCC1, Asn148Glu гена АРЕ1 использовали метод ПЦР и набор реактивов, разработанный НПФ «Литех» (г.Москва). Детекцию мутаций в генах CYP1A1 (Т3801С), GSTM1 (делеция) проводили в соответствии с инструкциями к наборам реактивов фирмы-производителя (ООО «СибДНК», г.Новосибирск). Амплификацию проводили с использованием амплификатора «Терцик». Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов проводили в 3% агарозе с последующей окраской бромистым этидием. Полученные значения генотипов и аллелей представлены в таблице 4. Установлено наличие 6 предрасполагающих генотипов. Исходя из полученных результатов сделано заключение о существовании высокого риска генетически детерминированных хромосомных нарушений при воздействии радона. Это заключение подтвердилось тем, что при патогенетическом анализе обследуемой Т. уровень ХА аберраций составил 6,5%.
Пример 2.
У обследуемого Т. 11 лет типирование полиморфных маркеров проводили так же, как описано в примере 1. Полученные результаты представлены в таблице 5. Выявлено преобладание протективных генотипов (4 протективных и 2 предрасполагающих генотипа). Сделано заключение о генетически детерминированной устойчивости к формированию хромосомных аберраций в условиях воздействия радона. Это заключение подтвердилось тем, что при цитогенетическом анализе обследованного Т. реальный уровень ХА составил 3,5%.
5. Эффективность способа.
Определяли полиморфные гены-кандидаты в группе сравнения у подростков, подвергающихся хроническому воздействию радона. Обнаружили, что из 120 человек с относительно небольшой частотой ХА (3,48±0,12%)) у 22 подростков имело место преобладание предрасполагающих генотипов или равное количество предрасполагающих и протективных генотипов. Это свидетельствует о том, что их индивидуальная чувствительность к воздействию радона повышена. Средняя частота ХА у них (3,84%±0,35%) оказалась выше, чем у других 98 из 120 подростков с преобладанием протективных генотипов и обладающих индивидуальной устойчивостью к действию радона (3,38±0,78%). Очевидно, что с увеличением времени воздействия радона частота ХА у 98 подростков с генетически детерминированной индивидуальной устойчивостью будет возрастать в меньшей степени, чем у 22 подростков с генетически детерминированной индивидуальной чувствительностью. Таким образом, группа с повышенной чувствительностью к действию радона (91 человек), сформированная с помощью известного метода анализа ХА, увеличилась на 22 человека за счет применения предлагаемого способа, включающего в себя определение полиморфных генов-кандидатов. То есть эффективность способа повысилась на 24,2%.
6. Вывод.
Предложенный способ обладает большей прогностической значимостью, т.к. позволяет проводить оценку генетически детерминированной предрасположенности к формированию повышенного уровня хромосомных аберраций еще до воздействия радиационного фактора.
Таблица 1
Половозрастная характеристика групп
Показатель
Опытная группа (доноры с высоким уровнем хромосомных аберраций)
Группа сравнения (доноры с низким уровнем хромосомных аберраций)
Возраст, лет
13,30
13,24
Мальчики/девочки
52,7%/47,3%
51,6%/48,3%
Всего человек
91
120
Таблица 2
Риск высокого уровня хромосомных аберраций, ассоциированный с генотипами основных генов-кандидатов
Полиморфный маркер
Генотип
Относительный риск (RR и 95% CI)
Arg/Arg
11,26 [6,92-18,31]
Arg280His гена XRCC1
Arg/His
0, 09 [0,05-0,15]
His/His
Arg/Arg
3,75 [2,24-6,28]
Arg194Trp гена XRCC1
Arg/Trp
0,27 [0,16-0,45]
Trp/Trp
Asn/Asn
0,43 [0,17-1,14]
Asn148Glu гена АРЕ1
Asn/Glu
0,37 [0,14-0,94]
Glu/Glu
2,30 [0,88-6,06]
A/A
0,32 [0,12-0,86]
A2455G гена CYP1A1
A/G
3,11 [1,16-8,30]
G/G
0,41 [0,21-0,82]
T/T
1,76 [0,67-4,62]
Т3801С гена CYP1A1
T/C
0,57 [0,22-1,49]
С/С
2,29 [1,51-3,49]
делеция в гене GSTM1
0/0 (делеция)
3,00 [1,56-5,73]
0/+ и +/+
0,33 [0,17-0,64]
Таблица 3
Протективные и предрасполагающие генотипы высокого риска хромосомных нарушений у доноров, подвергающихся воздействию радона внутри помещений
Полиморфные маркеры
Предрасполагающие генотипы
Протективные генотипы
Arg280His гена XRCC1
Arg/Arg
Arg/His
Arg194Trp гена XRCC1
Arg/Arg
Arg/Trp
Asn148Glu гена APE1
Glu/Glu
Asn/Asn, Asn/Glu
A2455G гена CYP1A1
A/G
A/A, G/G
Т3801С гена CYP1A1
T/T, C/C
T/C
делеция в гене GSTM1
0/0 (делеция)
+
Таблица 4
Результаты генотипирования 1
Маркер
Генотип
RR
Полиморфный маркер Arg280His гена XRCC1
Arg/Arg
<b>11,26</b>
Полиморфный маркер Arg194Trp гена XRCC1
Arg/Arg
<b>3,75</b>
Полиморфный маркер Asn148Glu гена АРЕ1
Glu/Glu
<b>2,30</b>
Полиморфный маркер A2455G гена CYP1A1
A/G
<b>3,11</b>
Полиморфный маркер Т3801С гена CYP1A1
T/T
<b>1,76</b>
Полиморфный маркер - делеция в гене GSTM1
0/0
<b>3,00</b>
Таблица 5
Результаты генотипирования 2
Маркер
Генотип
RR
Полиморфный маркер Arg280His гена XRCC1
Arg/Arg
<b>11,26</b>
Полиморфный маркер Arg194Trp гена XRCC1
Arg/Arg
<b>3,75</b>
Полиморфный маркер Asn148Glu гена АРЕ1
Asn /Glu
0,37
Полиморфный маркер A2455G гена CYP1A1
A/A
0,32
Полиморфный маркер Т3801С гена CYP1A1
T/C
0,57
Полиморфный маркер - делеция в гене GSTM1
+
0,33