АНТИОКСИДАНТНОЕ, СТРЕСС-И НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО-КОМЕНАТ КАЛИЯ
ANTIOXIDANT, STRESS- AND NEUROPROTECTIVE PHARMACOLOGICAL AGENT POTASSIUM COMENATE

Изобретение относится к экспериментальной медицине и фармакологии, а именно средствам для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением мозга.
Многие патологии ЦНС, при которых наблюдаются деструктивные процессы нейронов головного мозга, связаны с активацией перекисного окисления липидов (ПОЛ). Окислительный стресс, ведущий к гиперпродукции свободных радикалов (СР) и деструкции мембран, связанной с активацией фосфолипазного гидролиза, играет главную роль в патогенетических механизмах ишемии мозга. Ишемия головного мозга инициирует каскад биохимических реакций, лежащих в основе тканевого повреждения. Основные механизмы нейронального повреждения включают истощение энергетических ресурсов в условиях ацидоза ткани мозга, нарушение ионного гомеостаза, деполяризацию клеточных мембран, накопление возбуждающих аминокислот и гиперпродукцию активных форм кислорода (АФК). Хронический окислительный стресс приводит к повреждению всех классов биомолекул, включая липиды, белки и нуклеиновые кислоты. Избыток свободных радикалов, отрицательно воздействующий на ДНК нейронов мозга, может вызвать изменение в генетическом коде и гибель клетки [Попова М.С., Степаничев М.Ю. Индукция клеточного цикла, амилоид-бета и свободные радикалы в механизме развития нейродегенеративных процессов в мозге // Нейрохимия. 2008. Т.25. №3. С.170-178; Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. М.: Знание. 2000. С.226-221; Смирнова И.Н., Федорова Т.Н., Танашян М.М., Суслина З.А. Клиническая эффективность и антиоксидантная активность мексидола при хронических цереброваскулярных заболеваниях // Нервные болезни. 2006. №1. С.33-36; Федорова Т.Н. Окислительный стресс и защита головного мозга от ишемического повреждения: Дисс. д-ра биол. наук: 03.00.04: Москва. 2004. 298 с. РГБ ОД. 71:05-3/6; Calabrese V., Bates Т.Е., Stella A.M. NO synthase and NO-dependet signal pathways in brain aging and neuredegenerative disorders: the role of oxidant / antioxidant balance // Neurochem. 2000. V.25. P.1315-1341].
2+
Другим важнейшим фактором, вызывающим гибель нейронов, является продолжительная стимуляция нейронов ЦНС нейромедиатором глутаматом. Являясь возбуждающим нейромедиатором, глутамат содержится в большинстве нейронов мозга. В условиях ишемии глутамат высвобождается из окончаний ишемизированных нейронов в межклеточное пространство. В нормальных условиях нейроны и клетки глии поглощают избыточный глутамат из межклеточного пространства. Однако ишемические клетки лишены необходимой для этого энергии. В результате накопления большого количества глутамата происходит насыщение рецепторов соседних нейронов и зона повреждения расширяется. Перевозбуждение глутаматных рецепторов, сопровождающее гипоксию, ишемию, оказывает поражающее действие на нейроны, приводит к нарушениям кальциевого гомеостаза. Отсроченная кальциевая дизрегуляция является одним из ключевых сигналов, приводящих к усилению генерации АФК и ПОЛ после токсического действия глутамата, снижению уровня эндогенных антиоксидантов, повреждению и гибели клеток мозга при ишемических состояниях [Суслина ЗА., Максимова М.Ю. Концепция нейропротекции: новые возможности ургентной терапии ишемического инсульта. Симпозиум НИИ неврологии РАМН «Лечение ОНМК: состояние проблемы» // Нервные болезни. 2004. №3. С.4-7; Vergun О., Keelan J., Khodorov B.I., Duchen M.R. Glutamate-induced mitochondrial depolarisation and perturbation of calcium homeostasis in cultured rat hippocampal neurons // J. Physiol. 1999. Vol.519. P.451-466; Пинелис В.Г., Быкова Л.П., Богачев А.П., Исаев Н.К., Викторов И.В., Ходоров Б.И. Токсическое действие глутамата на культивируемые зернистые клетки мозжечка снижает внутриклеточное содержание АТФ. Роль ионов Са // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1997. Т.123. №2. С.162-164; Nishizawa Y. Glutamate release and neuronal damage in ischemia // Life Sciences. 2001. Vol.69. P.369-381].
Антиоксидантная защита организма при оксидативном стрессе неспособна полностью нейтрализовать образующийся избыток АФК. В этих условиях очевидна целесообразность использования антиоксидантных препаратов, способных защитить мозговую ткань от повреждения [Nonaka Sh., Katsube N. and Chuang D.-M. Lithium Protects Rat Cerebellar Granule Cells against Apoptosis Induced by Anticonvulsants, Phenytoin and Carbamazepine // JPET. 1998. V.286. P.539-547].
В настоящее время для профилактики и лечения дегенеративных заболеваний с ишемическим повреждением применяют антиоксиданты, которые по своему происхождению подразделяют на две основные группы: природные и синтетические.
Природные антиоксиданты: ферменты, белки, низкомолекулярные соединения (витамины Е и С, каротиноиды, убихинон и др.).
Группу синтетических антиоксидантов представляют синтетические аналоги витамина Е, ароматические фенолы и полифенолы (ионол, пробукол), эмоксипин и мексидол, некоторые производные барбитуровой кислоты и фенотиазина, препараты железа и цинка, органические кислоты и их производные, некоторые аминокислоты и производные аминостероидов [Карнеев А.Н., Соловьева Э.Ю. и др. Использование препаратов альфа-липоевой кислоты в качестве нейропротективной терапии хронической ишемии мозга. Справочник поликлинического врача. http://old.consilium-medicum.com/media/refer/06_08/76.shtml]. При этом интоксикация некоторыми лекарственными препаратами, в том числе барбитуратами может вызвать обратимые когнитивные расстройства - дисметаболические деменции [Чухловина М.Л. Деменция. Диагностика и лечение. Санкт-Петербург: 2010. С.60].
Известно применение в качестве лекарственных средств различных соединений калия. Это главным образом органические соли калия (калия оротат, калия аспарагинат, калия ацетат) и неорганические соли калия (калия хлорид) [Крю Ж. Биохимия, Медицинские и биологические аспекты, пер. с франц. М., 1979. с.46; Лабораторные методы исследования в клинике, под ред. В.В. Меньшикова. М., 1987. С.261, 263; http://dic.academic.ru/]
Калий - основной катион внутриклеточной жидкости, важен для самых различных биологических процессов. Он важен для нервной и мышечной деятельности, поскольку образует электролитическую среду, необходим для поддержания осмотического давления и кислотно-щелочного равновесия, для нормальной работы нервных окончаний и мышечных клеток в проведении нервных импульсов в нервной и мышечной ткани. Главной функцией калия является формирование трансмембранного потенциала и распространение изменения потенциала по клеточной мембране путем обмена с ионами натрия по градиенту концентраций. Калий участвует в поддержании электрической активности мозга, функционировании нервной ткани, сокращении скелетных и сердечных мышц, замедляет ритм сердечных сокращений и, действуя аналогично блуждающему нерву, участвует в регулировании деятельности сердца, участвует в нормализации артериального давления. Известно, что снижение соотношения натрий/калий путем добавки в пищу калия снижает давление у гипертоников. Добавки калия могут снизить риск заболеваний сосудов мозга, а также почек и сердца [Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. М.: 2004. 272 с. http://www.adlshop.ru/node/121].
Известно применение калия хлорида (Kalii chloridum). Калий участвует в процессе проведения нервных импульсов и передачи их на иннервируемые органы. Введение в организм калия сопровождается повышением содержания ацетилхолина и возбуждением симпатического отдела нервной системы. При внутривенном введении отмечается увеличение выделения надпочечниками адреналина.
Противопоказания: при неосторожном внутривенном введении препарат может вызвать интоксикацию (парестезии). В редких случаях может наблюдаться парадоксальная реакция - увеличение числа экстрасистол. При приеме внутрь могут появиться тошнота, рвота, диарея. Применение калия хлорида противопоказано при нарушениях атриовентрикулярной проводимости, при полной блокаде сердца, выделительной функции почек. В этих случаях калий накапливается в плазме крови, что может привести к интоксикации. Имеются данные о тяжелых осложнениях, имевших место после приема плохо растворимых лекарственных форм калия хлорида. Во избежание возможных осложнений, не рекомендуется применять калия хлорид в виде обычных таблеток
Известно применение лекарственного средства аспаркам, содержащего калия аспарагинат и др. Этот препарат обладает свойствами, аналогичными свойствам калия хлорида. Однако в отличие от него оказывает значительно менее выраженное местное раздражающее действие на пищеварительный тракт и лучше переносится больными. Это объясняется тем, что в таблетках «Аспаркам» калий содержится в виде органической соли, которая по сравнению с калия хлоридом диссоциирует в меньшей степени [http://www.mordovnik.ru/solkalia. Соли калия; Малая медицинская энциклопедия. М.: Медицинская энциклопедия. 1991-1996 гг.; Первая медицинская помощь. М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г.; Энциклопедический словарь медицинских терминов. М.: Советская энциклопедия. 1982-1984 гг. http://dic.academic.ru].
Наиболее близким к заявляемому антиоксидантному нейропротекторному средству является коменовая кислота (5-гидрокси-γ-пирон-2-карбоновая).
Коменовая кислота обладает антиоксидантным и нейротропным свойствами [Шурыгин А.Я., Колендо С.В., Югай Г.А. Антиоксидантное действие коменовой кислоты. Известия ВУЗов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2000. №1. С.100-101, Гусарук Л.Р. Влияние перенесенного стресса на морфофункциональные особенности культивируемых нейронов крыс. Автореф. дисс. канд. биол. наук. М. 1998; Шурыгин А.Я. Препарат бализ. 2002. 416 с].
Установлен ее выраженный ростстимулирующий эффект на культуры нейронов коры головного мозга пренатально стрессированных животных (Шурыгин А.Я. Препарат бализ, 2002, 416 с.). Коменовая кислота обладает мягким седативным действием, не вызывающим привыкания [патент РФ на изобретение №2209062, МПК (7) A61K 31/351, A61P 25/20], является высокоэффективным ненаркотическим анальгетическим средством, не имеющим негативных побочных эффектов, не вызывающих зависимости и привыкания, приводящий к долговременному снятию болевого синдрома [патент РФ №2322977 A61K 31/351 (2006.01), A61P 29/02 (2006.01)]. Обладает антиабстинентным, анксиолитическим и антидепрессантными свойствами [Панова Т.И. Механизмы влияния коменовой кислоты на интегративную деятельность мозга / Теоретическая и экспериментальная медицина. Медицина сегодня и завтра. 2005. №1. С.28-33].
Техническим результатом является создание лекарственного средства, способствующего снижению гибели нейронов в условиях оксидативного стресса при нейрогенеративных заболеваниях мозга.
Для достижения технического результата предлагается использовать в качестве фармакологического средства для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением мозга, калиевую соль коменовой кислоты (коменат калия), полученную при смешении раствора коменовой кислоты, подогретого до температуры 70-80°C, с раствором гидроксида калия при объемах, взятых из расчета, произведенного стехиометрически, до значения рН, равного 4,6. Коменат калия применяют в количестве от 2 до 8 мг на 1 кг массы тела в качестве антиоксидантного, стресс- и нейропротекторного средства один раз ежедневно, натощак, в течение 3-х суток.
Для получения калиевой соли коменовой кислоты берем 50 мл 3 мМ горячего раствора коменовой кислоты (70-80°C) и добавляем, помешивая, 15 мл 3 мМ раствора гидроксида калия. Реакция протекает быстро, раствор окрашивается в желтый цвет. Калиевую соль коменовой кислоты выделяют из раствора отгонкой воды под вакуумом или выпариванием воды из раствора соли на водяной бане. Выход комената калия составляет около 90%.
Антиоксидантные стресс- и нейропротекторные свойства калиевой соли коменовой кислоты изучали с использованием модельной системы, генерирующей свободные радикалы (система ЦФЛ), культуры нейронов головного мозга, а также модели стресса на экспериментальных животных.
Антиокислительные свойства калиевой соли коменовой кислоты
2
4
Действие комената калия на генерацию активных форм кислорода (АФК) в модельной системе изучали в среде ЦФЛ (цитратно-фосфатный буфер с добавлением люминола) следующего состава: 4 мл цитратно- фосфатного буфера (105 мМ KCl, 20 мМ KHPO, 4 мМ цитрата натрия; рН 7,45) с добавлением люминола (10 мМ). Образование АФК инициировали введением при постоянном перемешивании 30 мкл 35 мМ раствора сернокислого железа. В данной модели окисление ионов железа в присутствии ортофосфата и цитрата сопровождается образованием АФК и при этом возникает хемилюминесценция (ХЛ), избирательно усиливающаяся люминолом, которая подавляется в присутствии антиоксидантов. Регистрацию ХЛ осуществляли прибором SmartLum 5773 в течение 5 минут. Оценивали светосумму хемилюминесценции.
Антиокислительную активность калиевой соли коменовой кислоты оценивали по угнетению ХЛ модельной системы при добавлении водных растворов препарата в сравнении с раствором коменовой кислоты. Конечная концентрация вещества в кювете составляла 0,1 мг/мл и 0,01 мг/мл. Хемилюминесценция свободных радикалов модельной системы ЦФЛ (контроль) принимается за 100%. Результаты экспериментов определяли по интенсивности хемилюминесценции (в у.е.) и рассчитывали в процентах от контроля [Фархутдинов P.P., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободнорадикального окисления в биологии и медицине. 1995, Уфа, 90 с.]. Обработку полученных данных осуществляли с помощью программного обеспечения PowerGraph версия 3.3. Достоверность отличий оценивали с помощью критерия Стьюдента. Результаты исследования представлены в таблице 1.
Таблица 1
Уровень снижения свободных радикалов в модельной системе ЦФЛ в присутствии коменовой кислоты и ее калиевой соли (% от контроля)
№ п/п
Препарат
Концентрация, мг/мл
0,01
0.1
1
коменат калия
34,24±1,22<sup>*</sup>
64,6±0,95<sup>*</sup>**
2
коменовая кислота
33,29±1,36<sup>*</sup>
69,39±1,16<sup>*</sup>**
Примечание:1 <sup>*</sup> р<0,001 в сравнении с контролем;2 <sup>**</sup> р<0,001 в сравнении с 0,01 мг/кг.
Анализ данных, представленных в таблице 1, показывает, что калиевая соль коменовой кислоты значительно снижает содержание свободных радикалов в сравнении с контролем в модельной системе ЦФЛ. При этом уровень снижения свободных радикалов коменатом калия практически не отличается от уровня гашения свободных радикалов коменовой кислотой. Антиокислительные свойства комената калия и коменовой кислоты зависят от концентрации вещества. Так, увеличение их концентрации в испытуемом растворе с 0,01 мг/мл до 0,1 мг/мл способствует значительному (более чем на 30%) повышению уровня гашения свободных радикалов.
Таким образом, калиевая соль коменовой кислоты обладает выраженным антиоксидантным действием, при этом ее антиокислительные свойства практически не отличаются от таковых коменовой кислоты.
Для оценки состояния оксидативных механизмов в мозге наиболее часто используют определение продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), промежуточным продуктом которого является малоновый диальдегид (МДА), а также исследование хемилюминесценции биологических сред.
Влияние комената калия на интенсивность свободнорадикального окисления и содержание МДА в мозге стрессированных животных.
Уровень свободнорадикального окисления в мозге определяли хемилюминесцентным методом [Фархутдинов У.Р., Фархутдинов P.P. // Бюл. экспер. биол. и мед. 2000, Т.129. №3, С.260-264] на приборе SmartLum 5773. Результаты экспериментов оценивали по интенсивности хемилюминесценции (светосумма хемилюминесценции в у.е.) и рассчитывали в процентах от контроля. Статистический анализ результатов проводили с использованием критерия Стьюдента [Лакин Г.Ф. Биометрия. М. 1990. 352 с.]. Содержание МДА определяли по методу Гаврилова Б.В. и соавт. [Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль Л.М. Определение содержания продуктов перекисного окисления липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой // Вопросы медицинской химии. 1987. №1. С.19-21]. Статистический анализ результатов проводили с использованием критерия Стьюдента [Лакин Г.Ф. Биометрия. М. 1990. 352 с] в МО Excel 2003.
Коменат калия вводили мышам per os, в течение 3-х суток, один раз в сутки натощак, в концентрациях 1, 2, 4 и 8 мг на 1 кг массы тела до стрессирования мышей. Стресс у мышей вызывали путем подвешивания за шейную складку в течение пяти часов. Через 5 часов мышей декапитировали, головной мозг помещали в жидкий азот и затем в мозге определяли уровень свободнорадикального окисления (СРО) и МДА.
Расчет интервала количеств комената калия 1-8 мг/кг массы тела производился с учетом его эффективности и отсутствия вредного влияния на организм.
+
Известно, что токсическая доза калия для человека составляет 6 г [Скальный А.В., Рудаков И.А. Биоэлементы в медицине. М. 2004. 272 с.]. Максимальная разовая доза калия, содержащегося в коменате калия, в расчете на человека в наших экспериментах составляет 0,11 г. Кроме этого мы сопоставили содержание K в нашем препарате и в лекарственных препаратах KCl и калия аспарагинат. Так разовая доза калия для человека в KCl составляет 0,21 г, а в лекарственном препарате калий аспарагинат разовая доза 0,04 г, а дневная - 0,12 г. В этой связи применение комената калия в количествах более 8 мг/кг массы тела считают нецелесообразным.
Были сформированы следующие группы самцов белых беспородных мышей:
1) интактные;
2) интактные + коменат калия 1 мг/кг;
3) интактные + коменат калия 2 мг/кг массы тела;
4) интактные + коменат калия 4 мг/кг;
5) интактные + коменат калия 8 мг/кг массы тела;
6) стрессированные;
7) стрессированные + коменат калия 1 мг/кг;
8) стрессированные + коменат калия 2 мг/кг массы тела;
9) стрессированные + коменат калия 4 мг/кг;
10) стрессированные + коменат калия 8 мг/кг массы тела.      Эксперимент проводился на 54 белых беспородных мышах-самцах, массой 23-25 г, по 9 мышей в каждой группе. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние комената калия на СРО и содержание МДА в головном мозге (дрессированных мышей (M±m)
№ п/п
Группы животных
СРО (светосумма, у.е.)
МДА (нМ/1 г белка)
1
интактные
208,23±4,31
3,17±0,14
2
интактные + коменат калия 1 мг/кг
214,32±2,17
3,37±0,52
3
интактные + коменат калия 2 мг/кг
215,89±1,25
3,69±0,48
4
интактные + коменат калия 4 мг/кг
221,12±4,91
3,32±2,17
5
интактные + коменат калия 8 мг/кг
218,01±4,26
3,49±1,23
6
стрессированные
247,08±7,71<sup>**</sup>
4,46±0,20<sup>***</sup>
7
стрессированные + коменат калия 1 мг/кг
234,03±6,52
3,42±1,07
8
стрессированные + коменат калия 2 мг/кг
228,13±5,12▪
3,31±0,31▪
9
стрессированные + коменат калия 4 мг/кг
218,00±3,62▪▪
3,28±0,28▪
10
стрессированные + коменат калия 8 мг/кг
204,99±2,27▪▪
3,21±0,15▪▪▪
Примечание: <sup>*</sup> р≤0,05; <sup>**</sup> р≤0,01; <sup>***</sup> р≤0,001 - достоверность статистически значимых различий по сравнению с интактным контролем▪ р≤0,05; ▪▪ р≤0,01; ▪▪▪ р≤0,001 - достоверность по сравнению со стрессированными животными (стресс-контроль).
Анализ данных, представленных в таблице 2, показывает, что при применении комената калия в количествах 1-8 мг/кг массы тела у интактных животных (2, 3, 4 5 группы) уровень свободнорадикального окисления в мозге практически не отличается от интактного контроля (1 группа). Резкое повышение уровня свободных радикалов (р≤0,01) наблюдается после стрессового воздействия (6 группа) на организм животных. При применении комената калия в количествах 1-8 мг/кг массы тела интенсивность СРО в мозге стрессированных животных снижается. При этом в группе 7 (1 мг/кг массы тела) отмечается довольно слабое снижение уровня СРО. Наиболее выраженную антиокислительную активность калиевая соль коменовой кислоты проявляет в количестве 8 мг/кг массы тела (группа 10).
Исследование влияния комената калия на содержание МДА в мозге вышеназванных групп животных показало, что коменат калия в количествах 1-8 мг/кг массы тела практически не оказывает влияния на содержание МДА в мозге интактных животных (группы 2, 3, 4, 5). Значительное и достоверное, в сравнении с интактными животными, повышение уровня МДА отмечается после стрессового воздействия на организм (группа 6). В то время как у мышей стрессированных и получавших коменат калия в количествах 1, 2, 4 и 8 мг/кг массы тела отмечается снижение содержания МДА, в сравнении с группой 6 (стресс-контроль). При этом наиболее выраженное и практически одинаковое снижение уровня МДА отмечается в группах мышей 8, 9 и 10 (2, 4 и 8 мг/кг массы тела).
Таким образом, установлено, что коменат калия в количествах 2, 4 и 8 мг/кг массы тела оказывает выраженное антиоксидантное стресспротекторное действие, проявляющееся в интенсивном снижении гиперпродукции свободных радикалов и содержания продуктов перекисного окисления липидов в мозге стрессированных животных. При этом наиболее выраженное антиоксидантное, стресспротекторное действие калиевая соль коменовой кислоты оказывает в количестве 8 мг/кг массы тела. В этой связи для дальнейших исследований нами применялась калиевая соль коменовой кислоты в количестве 8 мг/кг массы тела.
Влияние калиевой соли коменовой кислоты на антиоксидантную глутатионовую систему в мозге стрессированных животных
Известно, что в состав антиоксидантной системы, необходимой для контроля за продукцией активных форм кислорода и предотвращения свободнорадикальных реакций, входят как ферменты, так и многочисленные низкомолекулярные антиоксиданты или соединения, препятствующие образованию свободных радикалов. Различные антиоксиданты играют в тканях разную роль.
Важным звеном защиты клеток от токсического действия первичных продуктов ПОЛ является антиоксидантная глутатионовая система [Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и патологии / Под. ред. акад. АМН Украины Ю.А. Зозули. К., 1997, 413 с.]. Влияние калиевой соли коменовой кислоты на антиоксидантную глутатионовую систему оценивали по активности ферментов глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и содержанию восстановленного глутатиона в мозге стрессированных животных.
Глутатион выполняет функцию донора водорода и кофактора ряда антиоксидантных ферментных систем. Снижение внутриклеточного содержания восстановленного глутатиона существенно снижает устойчивость клеток и организма к интоксикации. Определение свободных сульфгидрильных групп (восстановленного глутатиона (GSH)) в кислоторастворимом надосадке определяли по методу [Sedlak J., Lindsay R.H. Estimation of total, proteinbound and nonprotein sulthydryl groups in tissue with Ellman′s reagent // Anal. Biochem. 1968. Vol.25. P.192-205].
Фермент глутатионпероксидаза (ГП) является одним из основных ферментов антиокислительной защиты организма от эндогенно или экзогенно индуцированного образования перекисей, в том числе перекисей липидов. С помощью глутатиона ГП восстанавливает основной продукт перекисного окисления липидов - гидроперекиси липидов, обезвреживает их токсическое действие на мембраны и предотвращает инициацию вторичных реакций окисления липидов [Гаврилова А.Р., Хмара Н.Ф. Определение активности гутатионпероксидазы эритроцитов при насыщающих концентрациях субстрата // Лабораторное дело. 1986. №12. С.721-724].
Глутатионпероксидазу определяли по скорости окисления глутатиона восстановленного в присутствии гидроперекиси третичного бутила [Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Лабораторное дело. 1986. №12. С.724-727]. Сущность метода заключается в том, что во время инкубации пробы глутатионпероксидаза из супернатанта окисляет насыщающие концентрации глутатиона восстановленного - субстрата. По количеству оставшегося неокисленным глутатиона восстановленного судят об активности глутатионпероксидазы.
Функциональная роль высокоспецифичной цитоплазматической глутатионредуктазы заключается в генерации восстановленного глутатиона из его дисульфидной формы.
Активность глутатионредуктазы (ГР) определяется по методу [Юсупов Л.Б. О повышении точности определения активности глутатионпероксидазы эритроцитов // Лабораторное дело. 1989. №4. С.100-101].
Эксперимент проводили на белых беспородных мышах - самцах, массой 18-20 г. Были сформированы следующие группы животных:
1) интактные;
2) стрессированные;
3) интактные + коменат калия 8 мг/кг массы тела;
4) стрессированные + коменат калия 8 мг/кг массы тела.
Коменат калия вводили мышам в концентрации 8 мг/кг массы тела в течение 3-х суток до стрессирования животных, один раз в сутки натощак. Стресс вызывали методом иммобилизации, путем подвешивания мышей за шейную складку в течение пяти часов. Через 5 часов мышей декапитировали, головной мозг помещали в жидкий азот и затем определяли содержание восстановленного глутатиона, активность ферментов глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы.
Результаты исследования представлены в таблице 3.
Таблица 3
Влияние комената калия на антиоксидантную глутатионовую систему головного мозга стрессированных животных
№ п/п
Группы животных
GSH мкмоль / 1г вл. тк
ГП мкмоль / 1 мин 1 г белка
ГР мкмоль / 1 сек 1 г белка
1
интактные
2,00±0,05
664,00±12,00
1,28±0,06
2
стрессированные
1,82±0,04<sup>*</sup>
745,00±30,00<sup>*</sup>
1,47±0,05<sup>*</sup>
3
интактные + коменат калия 8 мг/кг массы тела
2,07±0,06▪▪
612±24,00▪▪
1,18±0,16
4
стрессированные + коменат калия 8 мг/кг массы тела
2,04±0,08▪
619,00±22,00▪▪
1,24,±0,10▪
Примечание:
<sup>*</sup> p≤0,05; <sup>**</sup> р≤0,01 - достоверность статистически значимых различий по сравнению с интактным контролем;▪ р≤0,05; ▪▪ р≤0,01 - по сравнению со стрессированными животными (стресс-контроль).
Анализ данных, представленных в таблице 3, показал, что после стрессового воздействия (группа 2) в головном мозге животных значительно увеличивается активность глутатионпероксидазы (р≤0,001), повышается активность глутатионредуктазы (р≤0,05), отмечается значительное снижение концентрации восстановленного глутатиона (р≤0,05).
Применение комената калия в количестве 8 мг/кг массы тела за 3 дня до стрессового воздействия способствует нормализации антиокислительных процессов в головном мозге экспериментальных животных (гр. 4). Практически не изменились показатели глутатионового обмена после введения комената калия интактным животным. То есть, коменат калия в количестве 8 мг/кг массы тела не оказывает отрицательного влияния на глутатионовый обмен интактных животных. Таким образом, установлено, что иммобилизационное стрессовое воздействие на организм мышей приводит к интенсификации ПОЛ (повышенное содержание СРО и МДА) в головном мозге и мобилизации глутатионовой АОС (статистически значимое повышение активности ферментов глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы). Применение калиевой соли коменовой кислоты в количестве 8 мг/кг массы тела в течение трех дней до стрессирования животных способствует нормализации оксидативных механизмов ПОЛ и, соответственно, восстановлению антиоксидантной защиты мозга,  что проявляется в снижении активности ферментов глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы, повышении концентрации восстановленного глутатиона. При этом уровень антиоксидантной защиты при применении комената калия практически не отличается от такового в мозге интактных животных (группа интактная-контроль).
Влияние калиевой соли коменовой кислоты на глутаматную цитотоксичность в культуре зернистых клеток мозжечка крысят
Разработка методов профилактики и лечения базируется на предположении о том, что значительное число клеток мозга можно спасти, блокируя инициацию или ход внутринейрональных патохимических деструктивных процессов, имеющих определенные временные и пространственные характеристики.
Влияние калиевой соли коменовой кислоты на глутаматную цитотоксичность в культуре нейронов мозжечка крысят изучали в сравнении с коменовой кислотой.
Исследования выполнены на крысятах линии Wistar. Культуры зернистых клеток мозжечка получали из мозга 7-9-дневных крысят методом ферментно-механической диссоциации [Викторов И.В., Хаспеков Л.Г., Шашкова Н.А. // Руководство по культивированию нервной ткани: Методы, техника, проблемы. 1986. М. 266 с.]. Культуры клеток после 7 дней культивирования подвергали действию глутамата и/или калиевой соли коменовой кислоты, коменовой кислоты.
2
-2
-3
-4
-5
-6
-3
-4
Коменат калия и коменовую кислоту вносили в группы культур нейронов без воздействия глутамата и после 10-минутного воздействия (100 мкМ) глутамата в сбалансированном солевом растворе (ССР), предварительно поместив их в исходную питательную среду. После чего культуры инкубировали в CO-инкубаторе еще 4,5-5 часов. Исследовано влияние комената калия в концентрациях 10 М, 10 М, 10 М, 10 М, 10 М и коменовой кислоты в концентрациях 10 М, 10 М. Контролем служили культуры, помещенные на 10 мин в ССР, а также культуры, обработанные глутаматом в ССР. После фиксации культур учитывали число живых и погибших нейронов на инвертированном микроскопе Invertoscopes ID 03. Достоверность отличий оценивали с помощью критерия Стьюдента в МО Excel 2003.
Культуры нейронов мозжечка, полученные от интактных крысят, делили на следующие группы соответственно:
1.1 контроль ССР;
-2
1.2 ССР + коменат калия 10 M;
-3
1.3 ССР + коменат калия 10 M;
-4
1.4 ССР + коменат калия 10 M;
-5
1.5 ССР + коменат калия 10 M;
-6
1.6 ССР + коменат калия 10 М;
-3
1.7 ССР + коменовая кислота 10 М;
-4
1.8 ССР + коменовая кислота 10 M;
2.1 контроль ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ;
-2
2.2 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат калия 10 M;
-3
2.3 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат калия 10 M;
-4
2.4 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат калия 10 M;
-5
2.5 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат калия 10 М.
-6
2.6 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменат калия 10 M;
-3
2.7 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменовая кислота 10 M;
-4
2.8 ССР с глутаматом (Glu) 100 мкМ + коменовая кислота 10 M. Результаты исследования представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Влияние комената калия и коменовой кислоты на цитотоксический эффект глутамата в культуре нейронов мозжечка
№ п/п
Группы культур
Число живых нейронов (%)
Контроль
Коменат калия (М)
Коменовая кислота (М)
10<sup>-2</sup>
10<sup>-3</sup>
10<sup>-4</sup>
10<sup>-5</sup>
10<sup>-6</sup>
10<sup>-3</sup>
10<sup>-4</sup>
1
2
3
4
5
6
7
8
1
ССР
95,12±0,62
94,82±1,05
95,13±0,97
96,14±0,76
95,92±0,71
95,60±1,11
85,8±3,3
85,2±6.0
2
глутамат
29,04±1,56<sub>#</sub> <sup>**</sup>
48,28±2,14<sub>#</sub> <sup>**</sup>
46,88±1,35<sub>#</sub> <sup>**</sup>
64,97±3,27<sub>#</sub> <sup>**</sup>
54,65±3,51<sub>#</sub> <sup>**</sup>
50,37±2,37<sub>#</sub> <sup>**</sup>
46,7±3,1<sub>#</sub> <sup>**</sup>
35,9±2,9<sub>#</sub> <sup>*</sup>
Примечание:1 <sub>#</sub> р<0,001 - в сравнении с контролем ССР;2 <sup>*</sup> р<0,05 - в сравнении с группой контроль глутамат;3 <sup>**</sup> р<0,001 - в сравнении с группой контроль глутамат.
-2
-6
-4
Анализ результатов исследований показал (табл.4), что число выживших нейронов после воздействия комената калия (группы 1.2-1.6) и коменовой кислоты (группы 1.7, 1.8) на интактные зернистые клетки мозжечка, независимо от концентрации вещества, практически не отличается от контроля (группа 1.1). После воздействия глутамата выживаемость зернистых клеток мозжечка значительно (на 66,08%) снижается (группа 2.1), р<0,001. Внесение в культуры нейронов мозжечка, обработанные глутаматом комената калия (10 М - 10 М), способствовало достоверному повышению устойчивости нейронов к глутаматной цитотоксичности во всех группах культур (группы 2.2-2.6). При этом максимальная выживаемость нейронов отмечалась в группе культур 2.4 с внесением комената калия в концентрации 10 М. При применении коменовой кислоты выживаемость нейронов в группах культур, обработанных глутаматом (2.7 и 2.8), была достоверно выше, чем в группе контроль-глутамат, однако ее максимум был значительно ниже, чем при добавлении в культуры калиевой соли коменовой кислоты.
Таким образом, установлено, что применение калиевой соли коменовой кислоты на фоне глутаматной цитотоксичности способствует значительному увеличению выживаемости нейронов мозжечка в культуре. При этом устойчивость нейронов к токсическому воздействию глутамата в культурах с добавлением соли коменовой кислоты превышает таковую при применении коменовой кислоты, взятой за прототип по наибольшему количеству совпадений.
Токсичность калиевой соли коменовой кислоты мы оценивали по показателям свободнорадикального окисления и перекисного окисления липидов в мозге экспериментальных животных (табл.2), а также по контрольным культурам нейронов мозжечка с добавлением исследуемых доз вышеназванных солей. Результаты исследований показали, что калиевая соль коменовой кислоты в изучаемых нами дозах не токсична.
Известно, что основой для проведения клинических испытаний антиоксидантов при лечении заболеваний с дегенеративными расстройствами служат исследования, проведенные на культивируемых клетках и модельных животных [Andersen Julie K. Oxidative stress in neurodegene ration: cause or consequence? // Nature Reviews Neuroscience 2004. Vol.5. S 18-S25].
Нами исследовано влияние различных доз калиевой соли коменовой кислоты на уровень свободных радикалов в модельной системе ЦФЛ и в головном мозге стрессированных животных, на антиоксидантную глутатионовую систему в головном мозге (дрессированных животных (табл.1, 2, 3), а также на устойчивость культивируемых нейронов мозжечка к глутаматной цитотоксичности (табл.4).
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что стрессовое воздействие на организм экспериментальных животных сопровождается усилением окислительных процессов в головном мозге, проявляющемся в повышении уровня свободных радикалов и увеличением содержания в мозге одного из продуктов перекисного окисления липидов - МДА, снижением уровня глутатионовой защиты.
Установлено, что применение калиевой соли коменовой кислоты в количествах 2-8 мг/кг массы тела до стрессового воздействия на организм значительно снижает уровень свободных радикалов, стимулирует антиоксидантную глутатионовую систему в мозге стрессированных животных. В этих дозах калиевая соль коменовой кислоты при пероральном введении оказывает выраженное антиоксидантное, стресспротекторное действие.
Изучено влияние калиевой соли коменовой кислоты на устойчивость культивируемых нейронов мозжечка к глутаматной цитотоксичности.
-2
-6
-4
Установлено, что применение комената калия в концентрациях 10 М - 10 М в культуре нервных клеток мозжечка на фоне глутаматной цитотоксичности значительно повышает выживаемость нейронов. Максимальная выживаемость нейронов отмечается в группе культур после воздействии комената калия в концентрации 10 М (группа 2.9, р<0,001).
Получение комената калия и изучение авторами элементов тонкого механизма его воздействия на активированные окислительные процессы в головном мозге стрессированных животных и развитие глутаматной эксайтотоксичности позволяет сделать вывод о перспективности его использования в качестве антиоксидантного, стресс- и нейропротекторного лекарственного средства при ишемическом повреждении мозга, в том числе, с нарушением ионного гомеостаза и на фоне сердечно-сосудистой патологии. Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемыми, что подтверждает новизну полученного соединения как антиоксидантных, стресс- и нейропротекторных средств. Тем самым расширяется спектр высокоэффективных лекарственных средств с антиоксидантными, стресс- и нейропротекторными свойствами для профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний, вызываемых оксидативным повреждением головного мозга.
Следовательно, заявляемое техническое решение удовлетворяет также критериям: новизна, изобретательский уровень и промышленная применимость.