ШТАММ А 2045/КИРГИЗИЯ/2007 ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА А ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРОТИВОЯЩУРНЫХ ВАКЦИН И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА А
A 2045/KYRGYZSTAN/ 2007 STRAIN OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS Aphtae epizooticae TYPE A FOR ANTIGENIC AND IMMUNOGENIC PERFORMANCE CONTROL OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE VACCINES AND FOR PRODUCTION OF BIOPREPARATIONS FOR DIAGNOSIS AND SPECIFIC PREVENTION OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE TYPE A

Штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса ящура Aphtae epizooticae, и может быть использовано для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин, а также при разработке и изготовлении средств диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
Ящур - это острое, контагиозное, вирусное заболевание парнокопытных животных, проявляющееся лихорадкой, везикулярными (афтозными) поражениями слизистой оболочки ротовой полости, бесшерстных участков кожи головы, вымени, венчика, межкопытной щели и сопровождающееся нарушением движения. Для этого возбудителя характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Многолетний опыт показывает, что при эндемичном ящуре снижаются доходы в молочном и мясном животноводстве на (%): 30÷40.
Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus. Он имеет 7 антигенных типов, большое количество подтипов и множество штаммов.
Возбудитель ящура обладает значительной антигенной вариабельностью штаммов в пределах одного серотипа, которая выявляется в различные временные промежутки и на разных территориях и зависит от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других различных факторов. Антигенная изменчивость вируса ящура обусловлена заменами аминокислот в полипептидных фрагментах (антигенных эпитопах), экспонированных на поверхности капсидных белков.
Сдвиги антигенного спектра, соответствующие обновлению структуры нового полевого штамма, могут варьировать от незначительных, улавливаемых моноклональными антителами, до существенных, регистрируемых с помощью традиционных поликлональных иммуноглобулинов. Существенные изменения антигенных характеристик природного штамма с большой вероятностью вызывают ослабление специфического иммунитета, индуцированного негомологичным антигеном. Они вызывают также затруднения штаммоспецифической диагностики.
В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики.
Известны штаммы вируса ящура типа А, использовавшиеся в качестве производственных на территории СССР и РФ в течение последних 50 лет.
7
7
К ним относятся следующие штаммы: А №103, выделенный в 1962 году в Куйбышевской области; А №2, выделенный в 1965 году в Таджикской ССР; А №717/73, выделенный в 1973 году в Ставропольском крае.
Указанные штаммы использовались для получения диагностикумов и противоящурных вакцин, применявшихся в различных регионах страны.
Однако после ликвидации ящура, вызываемого близкими им в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в коллекции штаммов микроорганизмов ФГУ «ВНИИЗЖ» (1÷7).
22
Известен штамм №550 вируса ящура А, выделенный в 1964 году в Азербайджане и используемый в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики и диагностики, применяемых на всей территории России и в странах постсоветского пространства (8, 9).
Недостатки данного штамма состоят в его недостаточной антигенной и иммуногенной активности относительно эпизоотических изолятов вируса ящура типа А, циркулирующих в настоящее время в странах Закавказья, Центральной Азии и Ближнего Востока (Турция, Иран и т.д.) ввиду имеющихся существенных антигенных отличий.
Известен штамм №1707 «Армения-98» вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (10).
Известен также штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (11).
В последние годы в Центральной Азии и на Ближнем Востоке доминировали две генетические линии вируса ящура типа А: линия А/Иран/96 (к этой генетической группе относится российский производственный штамм №1707 «Армения-98») и А/Иран/2005. Генетическая линия А/Иран/99 не получила такого широкого распространения, как эти две упомянутые, и возможно поэтому штаммы из группы А/Иран/99 не входят в первоочередной перечень рекомендуемых МЭБ/ФАО вакцинных штаммов.
1
22
22
Выделение в 1998 г. в хозяйстве Охчик Амассийского района Республики Армения от КРС вируса ящура типа А и изучение его филогенетического родства показало, что при сравнительном исследовании первичной структуры гена VP штамма №1707 «Армения-98» вируса ящура типа А с производственными штаммами и полевыми изолятами установлено, что изоляты Армения/98 идентичны между собой и родственны штаммам типа А Турция/97, Турция/98 и Иран/96. Также установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от вируса подтипа A (18% различий), куда относится и используемый для производства средств диагностики и специфической профилактики штамм A №550. К этой же линии относится выделенный в 1999 г. от больных коров в частном секторе села Уде Адигенского района Республики Грузия штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А. Штаммы А №1707 «Армения-98» и А (Грузия) 1999/№1721 депонированы 12.11.1998 г. и 19.08.2003 г. соответственно во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ».
Производственный штамм А №1707 «Армения-98» вируса ящура типа А применялся в составе противоящурных вакцин в буферной зоне Закавказья.
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм А (Грузия) 1999/№1721 вируса ящура типа А для изготовления диагностических и вакцинных препаратов (11).
Недостатки известных штаммов, в том числе и штамма-прототипа, состоят в антигенных отличиях от изолятов вируса ящура типа А, выделенных в различные временные промежутки, а приговленные на их основе вакцины обеспечивают эффективную защиту животных только против заражения гомологичным вирусом.
22
В 2003 году на территории Ирана был выделен новый изолят вируса ящура типа А, значительно отличающийся от ранее изученных штаммов этого типа. В течение 2005÷2006 гг. ящур типа А получил широкое распространение в странах Западной Азии - Иране, Турции, Саудовской Аравии и Пакистане. В феврале 2006 года ящур типа А линии Иран/05 попал во Фракию - европейскую часть Турции, которая граничит с Болгарией и Грецией. Проведение 100% вакцинации всех жвачных с применением штамма A во Фракии в феврале-марте 2006 г. предотвратило распространение ящура в соседние Грецию и Болгарию, однако через 3÷4 месяца появились свежие случаи заболевания (12).
В связи с этим возникла необходимость получить новый производственный штамм из эпизоотического вируса ящура серотипа А для обеспечения безопасности территории России и сопредельных государств от этого возбудителя.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала производственных штаммов вируса ящура серотипа А, обладающих высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и сохраняющих антигенную и иммуногенную активность после инактивации, пригодных для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов и высокоиммуногенных вакцинных препаратов, гомологичных эпизоотическому вирусу, появившемуся на территории Республики Киргизия.
Указанная задача решена получением штамма А №2045/Киргизия/2007 (авторское наименование) вируса ящура типа А, используемого для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2045/Киргизия/2007, был выделен из проб афтозного материала от больной телки, поступивших в ФГУ «ВНИИЗЖ» в декабре 2007 года из Республики Киргизия (экспертиза №2045 «Киргизия/07»). Производственный штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А получен путем последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток.
Штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А депонирован 7 июля 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой): производственный штамм А №2045/Киргизия/2007-ДЕП вируса ящура типа А.
По сравнению со штаммом-прототипом штамм А №2045/Киргизия/2007 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации.
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А.
1
Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором представлена дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура серотипа А с другими эпизоотическими и вакцинными штаммами вируса ящура серотипа А. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VP.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в
котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP1 штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP1 штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А.
Штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А характеризуется следующими признаками и свойствами.
Морфологические признаки
Штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23÷25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности (ГА-активности). У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН). При иммунизации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РМН.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007 индуцирует образование вирусспецифических и вируснейтрализующих антител, выявляемых в РСК в разведениях 1:80÷1:160 и в ИФА в разведениях 1:10000÷1:12000.
1
1
22
22
Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура гена VP вируса ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007 и выведена первичная структура белка VP. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А имеет близкое филогенетическое родство со штаммами А/Иран/05 и А/Турция/06 (процент нуклеотидных различий 3,82÷4,3 и 4,46÷5,57 соответственно) и значительно отличается от вакцинного штамма А №550. Кроме того, он отличается от штаммов вируса этого типа, выделенных в 1998 г. в Армении и Турции, а также в Грузии и Иране в 1999 г. (см. дендрограмму). Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А со штаммами вируса ящура серологического типа А составила: со штаммом А №550 - 18,15%, со штаммом А №1707 «Армения-98» - 17,68%, со штаммом А/Турция/98 - 17,2%, со штаммом А (Грузия) 1999/№1721 - 18,79%, со штаммом А/Иран/99 - 17,68%.
Таким образом, филогенетический анализ показал, что штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А принадлежит к новой генетической линии вируса ящура серологического типа А.
22
Антигенное родство штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А с производственным штаммом вируса ящура А №550 и штаммами, ранее выделенными на Азиатском континенте, изучено в РСК, ИФА и РМН.
22
22
Результаты исследований в РСК представлены в таблице 1. Антигенное родство (R) штамма А №2045/Киргизия/2007 с другими вирусами ящура серологического типа А составило для А/Иран/ - 8%, А/Ирак 24/64 - 28%, А/Иран/05 - 68%, А/Турция/06 - 66%, А №550 - 14%.
1
22
22
1
1
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r) составило для А/Иран/97 - 0,125, А №550 - 0,17, А/Ирак 24/64 - 0,6, А/Турция/06 - 0,5. При значении r≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близко родственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического вируса, при значении r<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического вируса (13).
1
22
22
1
1
1
Результаты исследований в ИФА представлены в таблице 3. Антигенное соответствие (r) составило для А №550 - 0,24. А/Ирак 24/64 - 0,24, А/Иран/97 - 0,19, А/Турция/06 - 0,5. При значении r, равном 0,4÷1,0, полевой изолят и производственный штамм находятся в близком антигенном родстве; при значении r 0,2÷0,39 полевой изолят антигенно родственен производственному штамму, вакцина из производственного штамма может быть использована, если не будет найдено более родственного штамма и при условии, что животные будут иммунизированы более 1 раза; при значении r<0,2 полевой изолят отличается от производственного штамма, вакцина из которого не приемлема для защиты от заражения полевым вирусом (14).
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм А №2045/Киргизия/2007 репродуцируется в монослойной культуре клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), ВНК-21 и IB-RS-2 и в течение 18÷24 часов инкубирования урожай вируса в указанных культурах клеток достигает значений от 6,0 до 7,5 Ig ТЦД/см. При высокой множественности заражения (1÷10 ТЦД/клетка) вызывает ЦПД через 5 часов. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточных культурах на протяжении 10 пассажей (срок наблюдения).
Генотаксономическая характеристика
6
Штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10 Д.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10 Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP, VP, VP и VP. Липопротеидная оболочка отсутствует.
1
66a
Основным антигенным белком является VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства
-18
3
Масса вириона составляет 8,4×10 г. Коэффициент седиментации 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,45 г/см.
Устойчивость к внешним факторам
Штамм А №2045/Киргизия/2007 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей (срок наблюдения).
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма А №2045/Киргизия/2007, был выделен в ФГУ «ВНИИЗЖ» из проб афтозного материала, полученных в декабре 2007 года от подозреваемого в заболевании ящуром КРС из Республики Киргизия (экспертиза №2045 «Киргизия/07»). Пробы афтозного материала поступили в ФГУ «ВНИИЗЖ» 28 декабря 2007 года.
При выделении вируса с целью получения его однородной популяции, обладающей оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали комплекс биологических, вирусологических и биохимических методов, предусмотренных методическими указаниями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура (15).
Биологические и вирусологические методы включали:
3
3
50
выделение вируса на культуре первично-трипсинизированных клеток СП с последующей адаптацией на культурах перевиваемых линий клеток ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 и КРС (2 пассажа). Для постановки биопроб на первичных и перевиваемых культурах клеток их выращивали на соответствующих питательных средах в стационарных условиях во флаконах емкостью 50÷100 см, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией афтозного материала (множественность заражения составляла 1÷10 ТЦД на клетку), приготовленной в растворе Хенкса с 0,5% гидролизата лактальбумина (ГЛА) и антибиотиками по стандартной рецептуре. Для удаления микрофлоры и балластных клеточных компонентов суспензию обрабатывали 10% хлороформом. После 30-минутного контакта при 37°С во флаконы вносили по 5÷10 см поддерживающей среды и инкубировали при 37°С до появления ЦПД вируса. При наличии ЦПД (округление клеток, повышение их оптической плотности, дегенерация и отделение клеток от стекла) флаконы подвергали замораживанию-оттаиванию, очистке клеточной взвеси хлороформом и центрифугированию при 3000 g в течение 15 мин. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследования в РСК на наличие вирусного антигена, при этом использовали набор коммерческих типоспецифических сывороток, хранящихся в музее штаммов ФГУ «ВНИИЗЖ». Вирус считался адаптированным к культурам клеток, если в течение 18÷24 часов проявлялось (%): 90÷100 ЦПД в монослое.
Адаптация эпизоотического изолята №2045 «Киргизия/07» к различным клеточным линиям наступала на уровне 3÷5 пассажа. Вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30, был использован для заражения суспензии клеток ВНК-21 с целью получения антигена для изготовления экспериментальной серии вакцины, а также для получения антигена для гипериммуннизации морских свинок.
Вирус, адаптированный к культуре клеток IB-RS-2, использовали для получения антигена для РСК и ИФА.
Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 4.
Данные, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о хорошей адаптационной способности штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А к использованным клеточным культурам.
Изолированный с помощью перечисленных методов вирусный препарат был исследован в РСК и ИФА с целью идентификации его типовой принадлежности (таблицы 5 и 6). Проведена проверка штамма на стерильность, отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и микоплазмами, а также посторонними вирусами в ПЦР и ОТ-ПЦР.
Приведенные в таблицах 5 и 6 результаты свидетельствуют о том, что в афтозном материале экспертизы №2045 «Киргизия/07» выявлен антиген вируса ящура типа А в разведении 1:4 в РСК и 1:32 в ИФА. Контаминации бактериальной и грибной микрофлорой, микоплазмами и посторонними вирусами не обнаружено.
Полученному штамму вируса ящура типа А присвоено авторское наименование: штамм А №2045/Киргизия/2007.
Штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А депонирован 7 июля 2009 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой): производственный штамм А №2045/Киргизия/2007-ДЕП вируса ящура типа А.
Пример 2
Для гипериммунизации морских свинок используют антиген из штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А, репродуцированного в монослойной культуре клеток ПСГК-30. Вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей добавлением 0,05% полигексаметиленгуанидина (ПГМГ). Очищенный вирус концентрируют в 100 раз добавлением 10% полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.м. 6000 и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,025÷0,05% при значении рН 8,0÷8,3.
3
Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда вводят морским свинкам в объеме 1,0 см внутримышечно. Через 21 и 7 дней иммунизацию повторяют и через 10 дней после последнего введения антигена животных обескровливают. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК в соответствии с методическими рекомендациями по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура (15).
После этого готовят серию путем смешивания типоспецифичных индивидуальных проб сыворотки одинаковой активности. Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двусторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами.
3
После консервирования азидом натрия (1:5000) и выдерживания при 4°С в течение 30 дней полученную сыворотку фасуют в ампулы по 0,5÷1,0 см и высушивают методом сублимации под вакуумом.
Способом, описанным в примере 2, была приготовлена 1 серия гипериммунной сыворотки, характеристика которой представлена в таблице 7.
Данные, приведенные в таблице 7, свидетельствуют о том, что получена диагностическая сыворотка, по специфической активности отвечающая требованиям ГОСТа 25384-82.
Пример 3
Для получения антигена для иммунохимических реакций используют вирус ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007, адаптированный к культуре клеток перевиваемых линий ВНК-21, ПСГК-30 и IB-RS-2. Для адаптации используют вируссодержащий материал в виде 10% суспензии афт КРС. Пассирование проводят в течение 3÷5 последовательных пассажей. Полученный вирус используют для наработки вирусного сырья. Заражение клеточных культур и сбор вирусного материала проводят по общепринятой методике.
Полученную вируссодержащую суспензию концентрируют в 100 раз добавлением (%): 8÷10 ПЭГ. Полученный концентрат инактивируют АЭЭИ, фасуют во флаконы и высушивают методом сублимации под вакуумом.
Антиген, полученный на культуре клеток ВНК-21, используется для получения диагностических компонентов для ИФА.
Указанным способом было приготовлено 3 серии диагностического антигена, характеристики которых приведены в таблице 8.
Результаты исследований, приведенные в таблице 8, свидетельствуют, что получены диагностические антигены, специфическая активность которых соответствует требованиям ГОСТа 25384-82.
Пример 4.
50
Для изготовления вакцины инактивированной сорбированной вирус ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007 репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2÷7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,001÷0,05 ТЦД на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре (36°С)÷(37°С). Через 8÷10 часов культивирования проводят подсчет живых и мертвых клеток путем окраски трипановым синим. Если количество живых клеток составляет (%): 15÷20, то культивирование продолжают еще 2÷3 часа. При достижении количества мертвых клеток (%): 90÷95 культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S и 75S компонентов.
3
Количество 146S и 75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/см. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15÷20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленной ледяной уксусной кислотой до рН 8,0÷8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной (%): 0,025÷0,05. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12÷24 часов при (36°С)÷(37°С) и рН 7,2÷7,6 с перемешиванием через 5÷6 часов в течение 3÷5 минут. По окончании инактивации суспензию антигена охлаждают до (4°С)÷(8°С). В охлажденную суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации (%): 0,005÷0,007 для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем гидрата окиси алюминия (ГОА).
3
3
Расчетный объем геля ГОА 3%-ной концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 мг/см Р<0,01 n=10, а концентрация 146S и 75S компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/см. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10%-ный раствор сапонина до конечной концентрации не менее 0,075%.
Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и проводят контроль стерильности по ГОСТу 28085-89.
3
3
Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2 см, затем подкожно в дозе 10 см. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут в течение 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.
Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.
Пример 5
Проведены испытания на КРС противоящурной вакцины инактивированной сорбированной из штамма А №2045/Киргизия/2007, изготовленной так, как описано в примере 4.
3
3
3
2
2
50
50
КРС массой 200÷250 кг иммунизировали подкожно, вводя по 2 см цельной вакцины и в разведениях 1:4 и 1:16. Вакцина в цельном виде уже на 10 день после вакцинации (ДПВ) индуцировала достаточный уровень вируснейтрализующих антител (4,50±0,52 log), а к 20ДПВ количество вируснейтрализующих антител (ВНА) увеличилось в 2 раза до 5,55±0,20 log. Протективная (защитная) доза вакцины для 50% животных (ПД) была равной 0,25 см, т.е. в прививной дозе 2 см содержалось 8 ПД, что свидетельствует о высокой иммуногенной активности сорбированной вакцины.
Пример 6
22
Проведены сравнительные испытания на морских свинках иммуногенной активности вакцины инактивированной сорбированной против ящура типа А из штамма А №2045/Киргизия/2007 и вакцины инактивированной сорбированной против ящура из штамма А №550, изготовленных так, как описано в примере 4.
Для определения иммуногенной активности каждого препарата использовали по 128 морских свинок и дополнительно для контроля 4 группы морских свинок по 6 животных в каждой. Вакцины вводили в цельном виде и разбавленные фосфатным буфером в соотношении 1:3, 1:9 и 1:27. На каждое разведение вакцин брали по 8 морских свинок. Каждую группу из 8 свинок содержали в отдельном вольере, на котором закрепляли этикетку с указанием серии вакцины, ее разведения, даты начала испытаний и количества животных, привитых данным разведением.
3
3
Каждую вакцину вводили 6 группам морских свинок внутримышечно в объеме 2 см в область правого и левого бедра по 1 см. Невакцинированные группы морских свинок использовали для проверки активности контрольных серотипов вируса ящура.
22
22
22
50
22
50
4
3
За вакцинированными морскими свинками вели наблюдение в течение 21 суток. После этого всех привитых и контрольных свинок заражали адаптированным к морским свинкам вирусом ящура штаммов А №550 и А №2045/Киргизия/2007. Вирусную суспензию вводили морским свинкам интрадермально в плантарную поверхность одной из задних лапок в дозе 10 ГД/0,1 см. Учет результатов заражения проводили через 3, 5 и 7 суток и оценивали по генерализации ящурного процесса на передних и одной из задних лапок. Генерализацией считали образование вторичных афт хотя бы на одной лапке, в которую не вводили вирус. Контроль вакцины считали действительным, если из 6 невакцинированных свинок генерализованной формой ящура заболевали 6 животных. В таблице 9 представлены результаты изучения на морских свинках иммуногенной активности моновалентных противоящурных вакцин инактивированных сорбированных из штаммов А №2045/Киргизия/2007 и А №550 при контрольном заражении гомологичным и гетерологичным штаммами вируса ящура А №2045/Киргизия/2007 и А №550. Вакцина, приготовленная из штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А, при проверке на морских свинках оказалась высокоиммуногенным препаратом против гомологичного вируса (ИмД составляет 0,050) и менее иммуногенна против вируса ящура штамма А №550 (ИмД=0,25).
Пример 7
Для изготовления вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа А вирус штамма А №2045/Киргизия/2007 репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют, очищают от балластных примесей, контролируют полученный антиген на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S и 75S компонентов вируса и стерильность так, как описано в примере 4.
Необходимую концентрацию 146S и 75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией. Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Полученный концентрат антигена хранят при 4÷6°С до момента использования в вакцине.
Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7÷1:1 соответственно. Из масляных адъювантов можно использовать масляный адъювант ВНИИЗЖ (16), а также масляный адъювант марки Montanide ISA-70 или Montanide ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция, стандарт ИСО 9001).
3
В результате получают вакцину инактивированную эмульсионную против вируса ящура типа А, которая представляет собой молокоподобную жидкость, нерастворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается в месте введения, не вызывает образования абсцессов, общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней и КРС в дозе 2 см через 28 ДПВ. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S и 75S компонентов.
Пример 8
50
50
2
3
3
Проведены испытания иммуногенной активности противоящурной вакцины инактивированной эмульсионной из штамма А №2045/Киргизия/2007, изготовленной так, как описано в примере 7. Иммуногенная активность данной вакцины проверена на подсвинках массой 40÷50 кг. Результаты исследований представлены в таблице 10. ИмД вакцины составила 0,05 см, т.е. в прививном объеме 2 смсодержалось 40 ПД для свиней. Подсвинки, привитые цельной вакциной, на 21 ДПВ имели титр ВНА, равный 6,50±0,20 log. После контрольного заражения заболели с генерализацией процесса 2 контрольных подсвинка и 1 подсвинок, вакцинированный разведением вакцины 1:25.
50
3
Испытанная эмульсионная вакцина имела высокую иммуногенную активность на свиньях (40 ПД/2,0 см).
Пример 9
50
3
3
Вирус ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на КРС, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на КРС, заражая 1÷2 животных массой 250÷300 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение последних 2-х лет не проводили вакцинацию животных против ящура. Количество пассажей вируса не должно превышать 20, начиная от исходного вируса. Суспензию вируса, содержащую 10000÷10000000 ИД/см с антибиотиками, вводят по 0,2÷0,3 см в 20÷40 каналов интрадермолингвально по всей поверхности языка. Зараженных животных не кормят до снятия вируса. Через 20÷30 часов после заражения афты снимают по мере их созревания. Лимфу собирают шприцом. На основе собранного афтозного материала готовят 20%-ную суспензию вируса, которую очищают от балластных примесей вышеописанным способом с последующим добавлением в нее антибиотиков и глицерина. Полученную суспензию вируса оценивают в РСК и методом ОТ-ПЦР с последующим проведением нуклеотидного секвенирования на типо- и штаммоспецифичность. Активность вируса в РСК должна быть не меньше 1:4.
4,0
3
50
Инфекционную активность вируса определяют на КРС. Контрольный вирус должен иметь титр инфекционности не менее 10 ИД/0,2 см. Флаконы с суспензией вируса в присутствии глицерина хранят в холодильнике при минус (40°С)÷(70°С).
Пример 10
Вирус ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007, предназначенный для контроля иммуногенной активности противоящурных вакцин на свиньях, готовят следующим образом. Полученный вирус предварительно освежают на свиньях, заражая 1÷2 животных массой 30÷50 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны, где в течение 2 лет не проводили вакцинацию скота против ящура. Вируссодержащую суспензию вводят под слизистую оболочку языка или в кожу венчика конечностей. Созревшие афты снимают через 24÷72 ч после заражения. Приготовление суспензии вируса и контроль его активности осуществляют так, как описано в примере 9. Титрование инфекционной активности вируса ящура проводят на свиньях и в культуре клеток СП.
Пример 11
Контроль иммуногенной и антигенной активности вакцины инактивированной сорбированной из вируса ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007, изготовленной так, как описано в примере 4, осуществляли следующим образом. Для проверки иммуногенной активности препарата использовали 17 голов КРС массой 200÷250 кг, доставленных из благополучных по ящуру зон страны. Первой группе животных из 5 голов КРС ввели вакцину подкожно в цельном виде. Второй группе животных из 5 голов КРС ввели подкожно разведение вакцины на фосфатно-буферном растворе в соотношении 1:4 и третьей группе из 5 голов в разведении 1:16.
3
4,0
3
50
Объем прививной дозы составил 2,0 см. На 20 ДПВ у 15 вакцинированных и 2 контрольных голов КРС взяли пробы крови и провели контрольное заражение животных введением под слизистую языка суспензии вируса ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007 третьего пассажа на КРС в дозе 10 ИД/0,2 см.
2
50
50
3
Антигенную активность вакцины контролировали по уровню ВНА в сыворотке крови в РН на монослое первично-трипсинизированной культуры клеток СП. На 20 ДПВ уровень ВНА у КРС, привитых цельной вакциной, составил 5,50±0,20 log p<0,001. Через 8 дней после заражения провели патологоанатомическое исследование КРС. Заболели 2 контрольных животных, 1 животное, привитое разведением вакцины 1:4, и 4 животных, привитых разведением вакцины 1:16. ПД вакцины составила 0,25 см. Прививная доза вакцины содержала 8 ПД, что свидетельствовало об эффективности препарата. Такая вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.
Пример 12
Контроль иммуногенной и антигенной активности вакцины инактивированной эмульсионной из вируса ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007, изготовленной так, как описано в примере 7, осуществили следующим образом.
3
4
3
3
50
2
50
50
Для проверки иммуногенной активности препарата использовали 17 голов свиней массой 30÷50 кг. Свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Двух животных использовали в качестве контрольных. Первую группу животных иммунизировали внутримышечно цельной дозой вакцины объемом 2,0 см, содержащей 6,0 мкг иммуногенных компонентов вируса ящура типа А штамма А №2045/Киргизия/2007. Вторую группу животных иммунизировали разведением вакцины 1:5, а третью - разведением 1:25. На 21 ДПВ 15 вакцинированным и 2 контрольным свиньям под слизистую языка ввели суспензию афтозного вируса ящура А штамма А №2045/Киргизия/2007, адаптированного к свиньям, в дозе 10ИД/0,2 см. Количество ВНА у свиней, привитых цельной дозой вакцины, было равным 6,50±0,20 log p<0,001. На 8 день после заражения провели патологоанатомическое исследование животных. Заболели генерализованной формой ящура 2 контрольных и 1 животное, привитое разведением вакцины 1:25. ИмД вакцины составила 0,05 см. Прививная доза вакцины содержала 40 ПД для свиней.
Таким образом, вакцина считается иммуногенной и пригодной для практического применения.
Таблица 1
Антигенный спектр штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура серологического типа А по данным РСК
Сравниваемые штаммы
Показатели
r<sub>1</sub>
r<sub>2</sub>
R%
А/Иран/97
0,05
0,11
8
А<sub>22</sub>/Ирак 24/64
0,08
1,0
28
А/Иран/05
0,46
1,0
68
А/Турция/06
0,59
0,76
66
А<sub>22</sub> №550/64
0,02
1,0
14
Примечание: R≥40% - штаммы вируса ящура относятся к одному подтипу
R=(%): 25÷40 - к разным подтипам.
Таблица 2
Антигенное соответствие (r<sub>1</sub>) в РМН изолята А №2045/Киргизия/2007 штаммам вируса ящура типа А
Штаммы
Показатель r<sub>1</sub>
А/Иран/97
0,125
А<sub>22</sub> №550
0,17
А<sub>22</sub> Ирак 24/64
0,6
А Турция/06
0,5
Таблица 3
Антигенное соответствие (r<sub>1</sub>) в ИФА штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А штаммам вируса ящура типа А
Штаммы
Показатель r<sub>1</sub>
А<sub>22</sub> №550
0,24
А<sub>22</sub> Ирак 24/64
0,24
А Иран/97
0,19
А Турция/06
0,5
Таблица 4
Биологические свойства вируса эпизоотического штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура типа А
Система репродукции вируса
Время проявления биологической активности (часы)
Количество адаптационных пассажей
Характеристика адаптированного материала
Активностьв РСК
Титр инфекционной активности (lgТЦД<sub>50</sub>/см<sup>3</sup>)
СП
20
3
1:2
6,5
ПСГК-30
20
3
1:6
7
IB-RS-2
24
4
1:4
6,33
ВНК-21
24
5
1:12
7,5÷8,25
Таблица 5
Определение типа вируса в 33%-ной суспензии афтозного материала в РСК (экспертиза №2045 «Киргизия/07»)
г/и сыворотки в рабочем разведении
Экспертиза №2045
Контроль
цельный
1:2
1:4
1:8
к/а
А<sub>/</sub>Турция/06
О/Приморский/2000
Азия-1 Амурский/2005
Сат-1
Сат-2
Сат-3
б/а
А/Турция/06
4
4
3
-
4
-
-
-
-
-
-
О/Приморский/2000
-
-
-
-
-
4
-
-
-
-
-
Азия-1 Амурский/2005
-
-
-
-
-
-
4
-
-
-
-
Сат-1
-
-
-
-
-
-
-
4
-
-
-
Сат-2
-
-
-
-
-
-
-
-
4
-
-
Сат-3
-
-
-
-
-
-
-
-
-
4
-
б/с
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
б/к
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Примечание: 4-100% задержка гемолиза;
«-» - полный гемолиз
б/с - без сыворотки
б/а - без антигена
б/к - без комплемента
Таблица 6
Определение типа вируса в 10%-ной суспензии афтозного материала в ИФА (экспертиза №2045 «Киргизия/07»)
Антиген
Активность в диагностической системе
А<sub>22</sub>
O<sub>1</sub>
Азия-1
А Киргизия/07
1:32
-
-
Контроль А<sub>22</sub>
1:128
-
-
Контроль O<sub>1</sub>
-
1:128
-
Контроль Азия-1
-
-
1:256
Таблица 7
Характеристика диагностической сыворотки, полученной на антиген из штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура серологического типа А
Наименование препарата
Серия
Объем (см<sup>3</sup>)
Активность в РСК
с гомологичным диагностикумом
с гетерологичными диагностикумами А
А<sub>22</sub> №550
А Турция/06
А<sub>22</sub> Ирак 24/64
А Иран/97
Гипериммунная сыворотка
1
200
1:80
<1:4,9
1:152
1:20
1:14
Таблица 8
Характеристика диагностических антигенов из штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура серологического типа А, выращенного на различных культурах клеток
Наименование препарата
Серия
Объем (см<sup>3</sup>)
Активность в РСК
с гомологичным диагностикумом А №2045/Киргизия/ 2007
с гетерологичным диагностикумом А<sub>22</sub> №550
Культуральный антиген ПСГК-30
1
40
1:16
<1:2
Культуральный антиген IB-RS-2
1
60
1:12
<1:2
Культуральный антиген ВНК-21
1
100
1:16
<1:2
Таблица 9
Перекрестное испытание на морских свинках иммуногенной активности вакцин из штамма A<sub>22</sub> №550 вируса ящура и штамма А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура
Штаммы вируса ящура для контрольного заражения
Вакцина из штамма А<sub>22</sub> №550 вируса ящура типа А
Вакцина из штамма вируса ящура А №2045/Киргизия/2007
ИмД<sub>50</sub>МС
ПД<sub>50</sub>МС
ИмД<sub>50</sub>МС
ПД<sub>50</sub>МС
А<sub>22</sub> №550
0,07
28,5
0,25
8,0
А №2045/Киргизия/2007
0,21
9,5
0,05
40,0
Примечание: ИмД<sub>50</sub> - 50% иммунизирующая доза;
ПД<sub>50</sub> - 50% протективная доза в прививном объеме
Таблица 10
Результаты испытания вакцины инактивированной эмульсионной против ящура типа А из штамма А №2045/Киргизия/2007 на свиньях
Прививная доза, см<sup>3</sup>
Разведения вакцины
Количество 146S + 75S компонентов в прививной дозе (мкг)
Количество ВНА (log <sub>2</sub>) в сыворотке крови на 21 ДПВ
Количество подсвинков, защищенных от контрольного заражения
ПД<sub>50</sub> (см<sup>3</sup>)
2
Ц
6,0
6,50±0,20
5/5
40
p<0,001
2
1:5
1,2
3.67±0.45
5/5
p<0,001
2
1:25
0,24
2.43±0.61
4/5
p<0,025
Контроль
0/2
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Штамм А №2045/Киргизия/2007 вируса ящура Aphtae epizooticae типа А для контроля антигенной и иммуногенной активности противоящурных вакцин и для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа А».
1. Bojko A.A. Déclaration sur I'apparition en URSS d'un type virus aphteus différent des souches de type A antérieurement étudiés dans Ie Pays. BOIE, 1965, 64, 2, 1075-1077.
22
4
2. Дарда П.И. и соавт. Антигенные свойства вируса ящура штамма А (А). Ветеринария. - 1966, 1, 20-22.
3. Рëрер X. Ящур / Пер. с нем. Г.А.Сурковой; под ред. и с предисл. канд. вет. наук. П.В.Малярца. - М.: Колос, 1971. - 432 с.
4. Ящур / А.Н.Бурдов, А.И.Дудников, П.В.Малярец [и др.]; под ред. А.Н.Бурдова. - М., Агропромиздат, 1990. - 320 с.
5. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М., ВНИТИБП, 1998, 928 с.
6. Инфекционная патология животных: в 2 т. / под ред. А.Я.Самуйленко, Б.В.Соловьева, Е.А.Непоклонова, Е.С.Воронова. - М.: «Академкнига», 2006. - Т.1. - 911 с.
7. Vincent R. Racaniello. Picornaviridae The Viruses and Their Replication // Virology. Vol.1. [Viruses] ed. B.N. Fields [et al.]. 5 th. ed. - Philadelphia, 2007. - P.795-838.
8. Промышленный регламент на производство вакцины против ящура типов А, О, С, Азия-1, Сат-1, Сат-2 и Сат-3 инактивированной сорбированной моно- и поливалентной (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21): утв. директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.09.2009. - Владимир, 2009. - 216 с.
9. Промышленный регламент на производство вакцины против ящура инактивированной эмульсионной моно- и поливалентной для профилактики ящура свиней (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21): утв. директором ФГУ «ВНИИЗЖ» 11.09.2009. - Владимир, 2009. - 240 с.
10. Пат. РФ №2140452; С12N 7/00, А61К 39/135, G01N 33/569, A61К 39/42, С07К 16/08; 27.10.1999 г.
11. Пат. РФ №2242513; С12N 7/00, А61К 39/135; 20.12.2004 г. (прототип).
12. Foot-and-mouth Disease. Sitiation worldwide and major epidemiological events in 2005÷2006 / K. Sumption, J. Lubroth, T. Murrai, S. De la Rocque // Empress / Focus on. - 2007. - №1.
13. OIE. Manual of diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial animals (Mammals, Birds and Beers). - 6 th ed. - Paris, 2008. - Vol.1. - P 203÷207.
14. Selection of foot and mouth disease vaccine strains - a review / D.J. Paton, J.F. Valacher, J. Bregman [et al.] // Rev. Sci. Techn. OIE. - 2005. - Vol.24, №3. - P.981÷993.
15. Гусев А.А., Захаров В.М., Шажко Ж.А. и соавт. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура. - Владимир, 2002. - 31 с.
16. Пат. РФ №2108111; А61К 39/39, 39/00, 39/102, 39/12. 39/135; 10.04.1998 г.