Микробная трансформация грибного мицелия как возможного предшественника гуминовых кислот

ЭКОЛОГИЯ

УДК 631.46

МИКРОБНАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ГРИБНОГО МИЦЕЛИЯ

КАК ВОЗМОЖНОГО ПРЕДШЕСТВЕННИКА ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ

Е.Н. Цыганова, Д.Г. Звягинцев, Л.В. Лысак, А.Л. Степанов

Проведено исследование микробной трансформации грибного мицелия чистыми и смешанными культурами бактерий. О разложении грибной биомассы судили по скорости эмиссии СО2 с помощью газовой хроматографии и по изменению численности бактериальных клеток (люминесцентная микроскопия). Обнаружена относительная устойчивость меланинов грибов к микробной деструкции. Показано, что на ее ранних этапах грибной мицелий в большей степени разлагается нативным комплексом микроорганизмов, а на более поздних — грамположительными бактериями. За два месяца лабораторного эксперимента грибная биомасса разложилась на 25—37%. Результаты исследования подтверждают возможность включения меланинов с состав гуминовых кислот.

Ключевые слова: грибной меланин, разложение, почвенный комплекс микроорганизмов, чистые бактериальные культуры.

Введение

Одно из направлений изучения формирования гуминовых кислот составляют так называемые микробиологические теории, согласно которым образование гумусовых веществ происходит при непременном участии микроорганизмов, что выражается в процессах разложения и преобразования составных частей растительных остатков, взаимодействия их с микробными протеинами и другими продуктами микробного синтеза. В частности, большое внимание уделялось возможности образования гуминовых кислот из темноокрашенных пигментов грибов — меланинов [2, 4, 5, 7—10]. Одна из характерных особенностей гуминовых кислот — их устойчивость к микробной трансформации.

Цель работы — изучение деструкции грибного мицелия как источника возможных предшественников гуминовых кислот различными культурами бактерий.

Объекты и методы исследования

В работе использовали мицелий гриба С1айо-яропит сЫйоярогтйея. Культуру в течение месяца выращивали на среде Фриза [1] следующего состава: ^Н4)2С4Н406 — 5 г, N^N03 — 1 г, К2НР04 — 0,5 г, №С1 — 0,1 г, сахароза — 30 г, вода — 1 л.

Полученную биомассу отфильтровывали от куль-туральной среды и разрушали тремя способами: ав-токлавированием, растиранием с песком, замораживанием жидким азотом с последующим растиранием с песком.

Степень микробной трансформации грибной биомассы оценивали на основе измерения интенсивности дыхания бактерий методом газовой хро-

матографии. Для этих целей использовали чистые культуры грамположительных бактерий (Bacillus ce-reus, Arthrobacter globiformis, Rhodococcus sp, Promic-romonospora sp., Cellulomonas sp.), грамотрицательных бактерий (Myxococcus sp., Polyangium sp., Cytophaga azolla), их смесь, а также нативный комплекс микроорганизмов, выделенный из перегнойно-глеевой почвы. В опытах применяли среду следующего состава: NH4NO3 — 1 г, K2HPO4 — 0,5 г, NaCl — 0,1 г, вода — 1 л, в качестве единственного источника углерода добавляли мицелий гриба из расчета 30 мг его сухой биомассы на 1 мл среды. Интенсивность дыхания измеряли по эмиссии СО2 на хроматографе московского опытного завода Хроматограф, модель 3700. Длина колонки — 3,2 м, наполнитель — Полисорб 1, температура — 40°, сила тока катарометра — 150 мА, газ-носитель — гелий, скорость расхода — 30 мл/мин.

Содержание углерода в мицелии определяли методом Тюрина: окисление образца осуществляли 0,4 н. раствором К2СГ2О7 в разбавленной серной кислоте (1:1) с последующим титрованием его избытка 0,2 н. солью Мора в присутствии фенилантранило-вой кислоты [6].

Также оценивали изменение численности бактерий при разложении мицелия с помощью метода люминесцентной микроскопии [3]. В качестве красителя использовали акридин оранжевый.

Результаты и обсуждение

При обработке мицелия по стандартной методике после автоклавирования [4] эмиссия СО2 по сравнению с эндогенным дыханием была велика и сохранялась на протяжении 35 сут. (рис. 1, а). Это указывает на возможный гидролиз органического ве-

9 ВМУ, почвоведение, № 1

Рис. 1. Динамика микробного разложения грибного мицелия: а — автоклавирование, б — растирание с песком, в — замораживание; 1 — грибной мицелий, 2 — контроль

щества в условиях автоклавирования и содержание большого количества легко доступного для микробного разложения органического вещества. Интенсивность эмиссии СО2 при растирании мицелия с песком также свидетельствует о высокой интенсивности дыхания в течение 3-х нед., что может объясняться примесями клеточных компонентов (рис. 1, б). Наименьшая интенсивность эмиссии СО2 наблюдалась при разложении мицелия с помощью замораживания. Разница между эндогенным дыханием

и при внесении мицелия была минимальной, что говорит о наименьшей степени загрязненности полученного препарата легко гидролизуемыми веществами (рис. 1, в).

На основе полученных результатов была продолжена работа по изучению микробной трансформации мицелия темноокрашенных грибов в двух вариантах: после его обработки жидким азотом с последующим растиранием и при минимальном разрушении мицелия простым растиранием с песком.

В итоге было установлено, что мицелий гриба разлагается разными организмами неодинаково. Так, на первых этапах (до 24 сут.) он наиболее интенсивно разлагался при использовании нативного комплекса микроорганизмов, выделенного из перегной-но-глеевой почвы (рис. 2, а). На поздних стадиях эксперимента разложение мицелия значительно интенсивнее протекало в вариантах с использованием смесей бактериальных культур, особенно смеси грам-положительных бактерий.

Аналогичный результат был получен и при разложении мицелия бактериальными культурами после его простого растирания с песком. В этом опыте в течение первых 5-ти сут. скорость разложения мицелия смесью чистых культур бактерий мало отличалась от таковой нативным комплексом. Однако уже на 12-е сут. наблюдалось более активное разложение мицелия смесью чистых культур бактерий (рис. 2, б). Данный факт подтверждается и чисто визуальными наблюдениями. В процессе разложения среда над добавленным субстратом мутнела, а сам препарат постепенно менял окраску с черного на коричневый. Больше всего обесцветились образцы, разлагаемые смесью грамположитель-ных и грамотрицательных бактерий, что согласовывается с интенсивностью эмиссии СО2 в тех же образцах. В наименьшей степени поменяли окраску образцы, разлагаемые нативным комплексом.

Содержание углерода в грибном мицелии, определенное методом Тюрина, составило 15,67 ± 0,13%. Это означает, что во флаконы было внесено по 4,7 мг С в составе грибной биомассы. Расчет интенсивности разложения мицелия показал, что за время опыта выделилось от 0,1 до 0,15 ммоль СО2, что соответствует 1,2—1,7 мг С и составляет 25—37%

Рис. 2. Интенсивность разложения грибного мицелия: а — обработанного жидким азотом, б — растертого с песком; 1 — смесь бактерий, 2 — грамположительные бактерии, 3 — грамотрицательные бактерии, 4 — почвенный комплекс микроорганизмов

от изначально внесенного углерода мицелия. Таким образом, за 58 дней разложилось от 25 до 37% биомассы грибов в зависимости от внесенных микроорганизмов (таблица).

Измерение численности бактерий показало, что число клеток за период проведения опыта увеличилось на порядок (от п • 108 до п • 109 кл/мл), что может свидетельствовать об активности внесенных организмов.

Заключение

Результаты наших экспериментов свидетельствуют об относительной устойчивости меланинов грибов к микробной деструкции. Показано, что на ранних этапах грибной мицелий в большей степени разлагается нативным комплексом микроорганизмов, а на более поздних — грамположительными бактериями. За два месяца лабораторного эксперимента грибная биомасса разложилась на 25—37%. Проведенное исследование подтверждает возможность включения меланинов в состав гуминовых кислот.

Степень разложения грибного мицелия

Микроорганизмы Интенсивность дыхания Выделившийся углерод, %

ммоль С мг С

Смесь бактериальных культур 0,145 1,74 37,1

Грамположительные бактерии 0,130 1,56 33,1

Грамотрицательные бактерии 0,098 1,18 25,1

Почвенный комплекс микроорганизмов 0,099 1,19 25,2

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Запрометова K.M., Мирчинк Т.Г., Орлов Д.С., Юх-нин A.A. Характеристика черных пигментов темноокра-шенных почвенных грибов // Почвоведение. 1971. N° 7.

2. Запрометова K.M., Мирчинк Т.Г. Пигменты темно-окрашенных грибов и их экологическая роль // Микробные метаболиты. М., 1979.

3. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. М., 1991.

4. Лях С.П. Микробный меланогенез и его функции. М., 1981.

5. Орлов Д. С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М., 1990.

6. Орлов Д. С., Гришина Л.А. Практикум по химии гумуса. М., 1981.

7. Reisinger О., Kilbertus G. Biodegradation et humifica-tion. I. Biologie de la formation des granules noire par Aureo-basidium pullulans Arnaud (De Baiy) // Bull. Acad. Soc. Lorraines Sei. 1972. Vol. 11, N 4.

8. Reisinger О., Kilbertus G. Biodegradation et humifi-cation. III. Liberation des granules. Modele experimental en presence de bacteries et conclusion generals // Soil Biol. Bio-chem. 1973. Vol. 5, N 2.

9. Reisinger О., Kilbertus G. Biodegradation et humifica-tion. IV. Microorganismes intervenant dans la decomposition des cellules d'Aureobasidium pullulans Arnaud (De Baiy) // Canad. J. Microbiol. 1974. Vol. 20, N 10.

10. Schnitzer M., Ortiz de Serra M.I., Ivcirson К The chemistry of fungal hiirnic acid-like polymère and of soil hu-mic acids // Soil Sei. Soc. Amer. Proc. 1973. Vol. 37, N 2.

Поступила в редакцию 13.08.2010

THE MICROBIAL TRANSFORMATION OF FUNGAL MYCELIUM

AS THE PREDECESSOR OF HUMIC ACIDS

E.N. Tsyganova, D.G. Zvyagintsev, L.V. Lysak, A.L. Stepanov

This work includes investigation of microbial decomposition of fungal mycelium by pure and mixed bacteria cultures. The decomposition of mycelium was estimated according to CO 2 emission activity by gas chromatography method and change of bacterial cells quantity by method of luminescence microscopy. A comparative stability of fungal melanin to microbial destruction was found. It was shown that at first fungal mycelium was decomposed mainly by native complex of microorganisms and latter by gram-positive bacteria. For two months of work the fungal biomass has been decomposed for 25—37%. The results of our research verify the possibility of melanin to be included in humic acids.

Key words: melanin, decomposition, soil microbial complex, pure bacteria cultures.

Сведения об авторах. Цыганова Елена Николаевна, студентка каф. биологии почв. Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв. Тел.: (495)939-34-05; e-mail: Stepanov_aleksey@maii.ru. Лысак Людмила Вячеславовна, канд. биол. наук, доцент каф. биологии почв. Звягинцев Дмитрий Григорьевич, докт. биол. наук, профессор, каф. биологии почв.

10 ВМУ, почвоведение. № 1