СОДЕРЖАЩИЕ ГАЛАКТОЗА-АЛЬФА-1,3-ГАЛАКТОЗУ N-ГЛИКАНЫ В ГЛИКОПРОТЕИНОВЫХ ПРОДУКТАХ, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ КЛЕТОК СНО
N-GLYCANES CONTAINING GALACTOSE-ALPHA-1,3-GALACTOSE IN GLYCOPROTEIN PRODUCTS PRODUCED FROM CHO CELLS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Данное изобретение относится к способам и материалам для обнаружения особых гликановых структур в белках, экспрессированных из клеточных систем экспрессии млекопитающих.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Многие рекомбинантные терапевтические биофармацевтические продукты получают в культурах клеток млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО). Культуры клеток млекопитающих являются предпочтительными по сравнению с другими системами экспрессии, такими как дрожжевые и прокариотические системы, для продуцирования рекомбинантных гликопротеинов, главным образом, из-за того, что культуры клеток млекопитающих продуцируют гликопротеины с паттернами гликозилирования, которые, в основном, распознаются и переносятся людьми.
[0003] Известны потенциально неблагоприятные эффекты терминальных связей альфа-связанной галактозы (gal-α-1,3-gal), Chung et al., N Engi J Med, 358: 11 (2008). Ранее сообщалось, что такие терминальные связи альфа-галактозы не присутствуют в рекомбинантных гликопротеинах, продуцируемых клетками яичника китайского хомячка (СНО). Например, в то время, как анти-CDw52 антитело, кэмпас, продуцируемое в NSO, клеточной линии миеломы, развивающейся у мышиных, включает потенциально иммуногенные гликоформы, имеющие нередуцирующие терминальные остатки альфа-связанной галактозы, кэмпас (Campath), продуцируемый из клеток СНО, содержал, главным образом, три гликоформы, которые соответствуют нормальному IgG человека. Sheeley et al., Analytical Biochemistry 247: 102-110 (1997).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Данное изобретение основано, частично, на открытии того, что гликопротеины, полученные из рекомбинантных клеток СНО, содержат гликановые структуры с терминальными связями галактоза-α-1,3-галактозы, которые могут иметь вредные эффекты при применении таких гликопротеинов для терапевтических целей. Например, введение гликопротеинов с терминальными альфа-gal связями людям для терапевтических целей может привести к образованию моноклональных антител к рекомбинантному гликопротеину у пациентов так, что последующие введения будут менее эффективными или даже будут вызывать неблагоприятные реакции гиперчувствительности у пациента.
[0005] В отличие от такой предыдущей идеи, Заявители неожиданно обнаружили, что существенная фракция рекомбинантных гликопротеинов, продуцированных в культурах клеток СНО, может проявлять присутствие терминальных gal-α-1,3-gal связей, представляя потенциал для неблагоприятных реакций на белковые и пептидильные продукты, введенные пациентам.
[0006] Данное изобретение обеспечивает соединения и способы, которые являются пригодными для продукции и анализа рекомбинантных гликопротеинов из клеток СНО, и композиции, содержащие такие гликопротеины, где гликопротеины включают модулированные (например, сниженные или, в некоторых случаях, увеличенные) уровни терминальных gal-α-1,3-gal связей.
[0007] Таким образом, в первом аспекте данное изобретение включает способы для оценки популяции клеток яичника китайского хомячка (СНО). В определенных вариантах осуществления способ испытания включает:
(a) обеспечение одной или более клеток СНО из популяции; и
(b) измерение гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, продуцированные указанными клетками, где клетки СНО не были генетически сконструированы, чтобы экспрессировать последовательность, кодирующую альфа-галактозилтрансферазу.
[0008] Этап измерения может включать любое из следующих: (а) выделение гликопротеинов, продуцированных клетками, и измерение гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы на гликопротеинах, (b) выделение специфической гликопротеиновой композиции, продуцированной клетками, и измерение гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, в выделенной гликопротеиновой композиции, (с) выделение гликанов из гликопротеинов, продуцированных клетками, и измерение гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы из выделенных гликанов, (d) отщепление моносахаридов от гликанов, присутствующих на гликопротеине или одной или более клеток СНО, и выявление терминальных высвобожденных альфа-галактозных остатков из отщепленных моносахаридов, (е) обеспечение, по меньшей мере, одного пептида из гликопротеина, продуцированного клетками, и измерение гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы на, по меньшей мере, одном пептиде, (f) измерение относительного уровня гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, на гликопротеине путем измерения гликанов на клеточной поверхности одной или более клеток СНО. Методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, может включать один или более из следующих способов и комбинации любых из этих способов: хроматографические способы, способы масс-спектрометрии (MS), электрофоретические способы (такие как капиллярный электрофорез), способы ядерного магнитного резонанса (NMR), моносахаридный анализ, флюоресцентные способы, поглощение в УФ и видимой областях спектра, ферментные способы и применение детекторной молекулы (такой как антитело или лектин).
[0009] Источник гликанов для измерения этапа 2 может быть выбран из группы, включающей следующее: популяция клеток СНО; гликопротеины или гликаны, экспрессированные на поверхности клеток СНО; пептиды, полученные от отщепления белков, присутствующих на поверхности клеток популяции клеток СНО; гликаны, присутствующие на поверхности популяции клеток СНО; гликопротеины, секретированные или экспрессированные популяцией клеток СНО, выделенный из гликопротеинового продукта экспрессии, экспрессированного из клетки СНО или популяции клеток СНО; пептиды, полученные из выделенного белкового продукта экспрессии, экспрессированного из клетки СНО или популяции клеток СНО; или гликаны, полученные из выделенного белкового продукта экспрессии, экспрессированного из клетки СНО или непосредственно из популяции клеток СНО. В некоторых вариантах осуществления способ включает обработку источника гликанов или гликопептидов одной или более экзогликозидаз, включая фермент альфа-галактозидазу, с последующим анализом гликановой популяции.
[0010] В некоторых вариантах осуществления используемый способ обеспечивает количественное измерение гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы. В некоторых вариантах осуществления используемый способ обеспечивает качественное измерение.
[0011] В некоторых вариантах осуществления способ также включает получение гликопротеинового препарата из культуры клеток СНО, отщепление одного или более гликанов из гликопротеинового препарата (например, с помощью одной или более гликозидаз, таких как α-1,3-галактозидазы; α-1,4-галактозидазы или α-1,6-галактозидазы), и измерение гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы.
[0012] В определенных вариантах осуществления способ проводят в ходе производственного цикла для терапевтического гликопротеина путем получения образца из культуры клеток СНО производственной линии, например, чтобы контролировать гликановую структуру в ходе производства. В определенных вариантах осуществления этап измерения повторяют, по меньшей мере, один раз, с течением времени, например, этап измерения повторяют, по меньшей мере, один, два, три раза или более, в течение периода времени культивирования клеток СНО. В других вариантах осуществления способ проводят на гликопротеиновом продукте, продуцированном из клеток СНО, например, как часть испытания качества или высвобождения гликопротеинового продукта.
[0013] В некоторых вариантах осуществления этап измерения включает сравнение уровня гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, в первом препарате гликопротеина, продуцируемого из первой популяции клеток СНО, с уровнем гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, во втором препарате гликопротеина, продуцированной из второй популяции клеток СНО. В некоторых таких вариантах осуществления определяют и сравнивают гликаны гликопротеинового препарата из популяций клеток СНО, культивируемых при различных условиях культивирования.
[0014] В некоторых вариантах осуществления способ может дополнительно включать этап сравнения уровня гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, с эталонным уровнем (например, контрольным уровнем или диапазоном, или значением в спецификации продукта).
[0015] В определенных вариантах осуществления способа этап измерения включает применение детекторной молекулы, которая способна обнаружить присутствие или отсутствие терминальных альфа-галактозильных остатков. В определенных вариантах осуществления детекторная молекула включает антитело, которое способно связываться с терминальными альфа-галактозильными эпитопами. В других вариантах осуществления изобретения детекторная молекула включает лектин. В некоторых вариантах осуществления детекторная молекула может содержать флюоресцентную часть или радиоизотопную часть.
[0016] Популяция клеток СНО может включать клональную клеточную популяцию. Популяция клеток СНО может быть в культуре, например, или образцом из клеточной культуры в биореакторе для производства терапевтического гликопротеина. В определенных вариантах осуществления популяция клеток СНО будет трансформирована, по меньшей мере, с одним вектором, кодирующим терапевтический гликопротеин. Терапевтический гликопротеин может быть человеческого, нечеловеческого или синтетического происхождения. Терапевтический гликопротеин может быть предназначен для лечения людей или ветеринарных назначений.
[0017] В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает этап оценки биологической активности гликопротеина, продуцированного клеткой, например, оценка присутствия или уровня иммуногенного потенциала гликопротеина, например, in vitro или in vivo, например, на животной модели.
[0018] Во втором аспекте данное изобретение включает способы скрининга одной или более клеток яичника китайского хомячка (СНО) на способность продуцировать гликаны, содержащие терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы на гликопротеине, причем способ включает:
(a) обеспечение множества популяций клеток СНО, где ни одна из множества не была генетически сконструированной, чтобы продуцировать терминальные остатки альфа-галактозила на гликанах (например, не была генетически сконструированной, чтобы экспрессировать последовательность, кодирующую альфа-галактозилтрансферазу);
(b) культивирование каждого из множества клеток СНО при условиях, пригодных для экспрессии гликопротеинового продукта экспрессии;
(c) измерение гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, продуцируемые каждой из множества клеток СНО, и
(d) выбор одного или более из множества препаратов клеток СНО на основе присутствия целевого уровня терминальных остатков галактоза-альфа-1-3-галактозы, продуцированных выбранным препаратом клеток СНО.
[0019] Гликаны, содержащие терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, могут быть получены и измерены из гликопротеинов, продуцированных препаратами клеток СНО, из выделенного гликопротеинового продукта экспрессии препаратов клеток СНО, из пептидов, полученных из гликопротеинового продукта экспрессии препаратов клеток СНО, из гликанов клеточной поверхности препаратов клеток СНО или из препаратов гликанов, полученных из препаратов клеток СНО или из их гликопротеинового продукта экспрессии. В определенных вариантах осуществления способ скрининга дополнительно включает этап выделения гликопротеинового продукта экспрессии из клеточной культуры и измерения терминальных остатков галактоза-альфа-1-3-галактозы на гликопротеине, продуцированном клетками на этапе (с). В определенных вариантах осуществления способ скрининга клеток дополнительно включает этап количественной оценки количества остатков альфа-галактозила, присутствующих на гликопротеиновом продукте экспрессии. В определенных вариантах осуществления этап (b) способа скрининга клеток имеет место в биореакторе.
[0020] Каждое из множества популяций клеток СНО может содержать различную популяцию СНО штаммов, различную клональную клеточную популяцию или различные образцы (например, образцы, взятые с течением времени) из клеточной культуры в производственной линии для терапевтического гликопротеина. В определенных вариантах осуществления популяция клеток СНО будет трансформирована с, по меньшей мере, одним вектором, кодирующим терапевтический гликопротеин, например терапевтический гликопротеин человека. В определенных вариантах осуществления способа скрининга клеток гликопротеиновый продукт экспрессии представляет собой секретированный гликопротеин, экспрессированный из клеток СНО.
[0021] Этап измерения способа скрининга может включать любую методику, раскрытую в данном описании для определения и/или количественной оценки терминальных остатков альфа-галактозила на гликопротеине.
[0022] В третьем аспекте изобретение включает способ оценки гликопротеиновой композиции, продуцированной в клетке-хозяине СНО. Способ включает измерение количества терминальной галактоза-альфа-1-3-галактозы, присутствующей в гликопротеиновой композиции, где гликопротеиновая композиция была продуцирована в клетках-хозяевах СНО, где клетки-хозяева СНО не были генетически сконструированные, чтобы экспрессировать последовательность, кодирующую альфа-галактозилтрансферазу.
[0023] В одном варианте осуществления способ включает запись уровня терминальной галактоза-альфа-1-3-галактозы, присутствующей в гликопротеиновой композиции, в печатном виде или на машиночитаемом носителе.
[0024] В некоторых вариантах осуществления способ также включает сравнение измеренного уровня терминальной галактоза-альфа-1-3-галактозы, присутствующей в гликопротеиновой композиции, с эталонным уровнем, таким как контроль или эталонная спецификация. Эталонный уровень может быть спецификацией (например, инструкция FDA или вкладыш для врача) или качественным критерием для фармацевтического препарата, содержащего гликопротеиновую композицию.
[0025] В одном варианте осуществления эталонный уровень или качественный критерий составляет не более чем 5% терминальной галактоза-альфа-1-3-галактозы, присутствующей в гликопротеиновой композиции, например, не более чем 4,5%, 4%, 3,5%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5%, 1%, 0,5%, 0,25%, 0,2%, 0,1% или меньше. Уровень галактоза-альфа-1-3-галактозы, присутствующей в гликопротеиновой композиции может быть измерен как уровень гликанов, содержащих галактоза-альфа-1-3-галактозу, относительно общего количества гликанов в образце, таком как гликопротеиновый препарат.
[0026] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает хроматографический способ.
[0027] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает способы масс-спектрометрии (MS).
[0028] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает электрофоретические способы (такие как капиллярный электрофорез).
[0029] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает способы ядерного магнитного резонанса (NMR).
[0030] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает моносахаридный анализ.
[0031] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает флюоресцентные способы.
[0032] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает поглощение в УФ и видимой областях спектра.
[0033] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает ферментные способы.
[0034] В одном варианте осуществления методика, используемая для измерения терминальных gal-α-1,3-gal связей, включает и использование детекторной молекулы (такой как антитело или лектин).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[0035] Фигура 1 представляет собой изображение корового пентасахарида, общего для N-гликановых структур.
[0036] Фигура 2 представляет собой изображение нередуцирующей концевой N-гликановой структуры, имеющей терминальную gal-α-1,3-gal связь.
4
6
1
[0037] Фигура 3 представляет собой флюоресцентную хроматограмму фракции гликанов, полученных из абатацепта, показывающую выявление гликановых видов с композицией HexNAcHexFuc, которая могла бы соответствовать структуре, содержащей галактоза-α-1-3 связанную галактозу.
4
6
1
[0038] Фигура 4 иллюстрирует MS спектры гликановых видов, полученных из абатацепта с композицией HexNAcHexFuc. Спектры коррелируют с гликановой структурой, содержащей нередуцирующую концевую галактоза-α1-3-галактозу.
4
6
1
[0039] Фигура 5 представляет собой флюоресцентную хроматограмму фракции гликанов, полученных из абатацепта и контрольного белка (также содержащего гликан с композицией HexNAcHexFuc) до и после обработки α-галактозидазой.
2
4
5
1
[0040] Фигура 6 представляет собой MS спектры видов с композицией HexNAcHexFuc, образованных от обработки гликановой фракции, полученной из абатацепта, альфа-галактозидазой.
[0041] Фигура 7 иллюстрирует MALDI-MS спектры фракции гликанов, полученных из абатацепта, обработанного различными экзогликозидазами.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0042] Если ниже не определено иное, все выражения, применяемые в данном описании, используются в их обычном значении, что будет понятно специалисту в данной области техники.
[0043] Приблизительно, около, примерно: Как используется в данном описании, выражения "приблизительно", "около" или "примерно", как применяется к одному или более значениям интереса, относятся к значению, которое подобно установленному эталонному значению. В определенных вариантах осуществления выражения "приблизительно", "около" или "примерно", относятся к диапазону значений, которые попадают в пределы 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньше установленного эталонного значения.
[0044] Обнаружение, выявление: Как используется в данном описании, выражения "выявление", "обнаружение" и "средство выявления" используются взаимозаменяемо для обозначения определения того, присутствует или отсутствует определенная химическая часть, такая как терминальный остаток альфа-1,3-галактозила, в или на соединении, композиции, клетке или клеточной популяции. Средство выявления может включать селектируемый маркер, или идентифицируемый признак, такой как флюоресцентная или радиоактивная часть, и может включать мечение реагента, соединения, клетки или клеточной популяции. Выявление может также относится к анализу соединения, композиции, клетки или клеточной популяции с использованием таких методик, как масс-спектрометрия или связанные способы, электрофоретические способы, ядерный магнитный резонанс, хроматографические способы или комбинации перечисленных выше, для определения присутствия или отсутствия химической части в или на соединении, композиции, клетке или клеточной популяции. Выявление также может включать количественную оценку абсолютных или относительных уровней химической части, которая подлежит выявлению.
[0045] Гликан: Как известно из уровня техники и используется в данном описании, "гликаны" представляют собой сахара. Гликаны могут быть мономерами или полимерами остатков сахара, но типично содержат, по меньшей мере, три сахара, и могут быть линейными или разветвленными. Гликан может включать остатки натуральных сахаров (например, глюкозы, N-ацетилглюкозамина, N-ацетилнейраминовой кислоты, галактозы, маннозы, фукозы, гексозы, арабинозы, рибозы, ксилозы и т.д.) и/или модифицированных сахаров (например, 2'-фторрибозы, 2'-дезоксирибозы, фосфоманнозы, 6'сульфо-N-ацетилглюкозамина и т.д.). Выражение "гликан" включает гомо- и гетерополимеры остатков сахаров. Выражение "гликан" также охватывает гликановый компонент гликопротеина (например, гликопротеина, гликолипида, протеогликана и т.д.). Выражение также охватывает свободные гликаны, включая гликаны, которые были отщеплены или высвобождены иным образом из гликопротеина.
[0046] Гликановый препарат: Выражение "гликановый препарат", как используется в данном описании, относится к набору гликанов, полученных согласно определенному способу получения. В некоторых вариантах осуществления "гликановый препарат" относится к набору гликанов, полученных из гликопротеинового препарата (смотри определение гликопротеинового препарата ниже). В некоторых вариантах осуществления гликановый препарат включает гликопротеины. В некоторых вариантах осуществления гликановый препарат включает высвобожденные гликаны.
[0047] Гликопротеин: Как используется в данном описании, выражение "гликопротеин" относится к "белку" (как определенно в данном описании), который содержит пептидный скелет, ковалентно связанный с одной или более частями сахара (т.е., гликанами). Как понятно специалистам в данной области техники, пептидный скелет типично содержит линейную цепь аминокислотных остатков. Часть(части) сахара может быть в форме моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов и/или полисахаридов. Часть(части) сахара может содержать одну неразветвленную цепь остатков сахара или может содержать одну или более разветвленных цепей. В определенных вариантах осуществления части сахара могут включать сульфатные и/или фосфатные группы. Альтернативно или дополнительно, части сахара могут включать ацетил-, гликолил-, пропил- или другие алкил-модификации. В определенных вариантах осуществления гликопротеины содержат О-связанные части сахара; в определенных вариантах осуществления гликопротеины содержат N-связанные части сахара.
[0048] Гликопротеиновый препарат: "Гликопротеиновый препарат", как это выражение используется в данном описании, относится к набору отдельных молекул гликопротеина, каждая из которых содержит полипептид, имеющий определенную аминокислотную последовательность (где аминокислотная последовательность включает, по меньшей мере, один сайт гликозилирования) и, по меньшей мере, один гликан, ковалентно присоединенный, по меньшей мере, к одному сайту гликозилирования. Отдельные молекулы определенного гликопротеина в гликопротеиновом препарате типично имеют идентичные аминокислотные последовательности, но могут отличаться по занятости, по меньшей мере, одного из сайтов гликозилирования и/или по идентичности гликанов, связанных, по меньшей мере, с одним из сайтов гликозилирования. То есть, гликопротеиновый препарат может содержать только одну гликоформу определенного гликопротеина, но более типично содержит множество гликоформ. Различные препараты одного и того же гликопротеина могут отличаться по идентичности присутствующих гликоформ (например, гликоформа, которая присутствует в одном препарате, может отсутствовать в другом) и/или по относительным количествам различных гликоформ.
[0049] Гликозидаза: Выражение "гликозидаза", как используется в данном описании, относится к средству, которое расщепляет ковалентную связь между последовательными сахарами в гликане или между сахаром и частью скелета (например, между сахаром и пептидным скелетом гликопротеина). В некоторых вариантах осуществления гликозидаза является ферментом. В определенных вариантах осуществления гликозидаза является белком (например, белковый фермент), содержащий одну или более полипептидных цепей. В определенных вариантах осуществления гликозидаза представляет собой химическое средство отщепления, например, гидразин.
[0050] N-гликан: Выражение N-гликан", как используется в данном описании, относится к полимеру сахаров, который был высвобожден из гликопротеина, но ранее был связан с гликопротеином посредством азотного мостика (смотри определение N-связанного гликана ниже),
3
[0051] N-связанные гликаны: TV-связанные гликаны представляют собой гликаны, которые связаны с гликопротеином посредством азотного мостика. Существует разновидный набор N-связанных гликанов, но типично основан на общем коровом пентасахариде (Man)(GlcNAc)(GlcNAc).
[0052] О-гликан: Выражение "О-гликан", как используется в данном описании, относится к полимеру сахаров, который был высвобожден из гликоконъюгата, но ранее был связан с гликоконъюгатом посредством кислородного мостика (смотри определение О-связанного гликана ниже).
[0053] О-связанные гликаны: О-связанные гликаны представляют собой гликаны, которые связаны с гликоконъюгатом посредством кислородного мостика. О-связанные гликаны типично присоединены к гликопротеинам посредством N-ацетил-D-галактозамина (GalNAc) или посредством N-ацетил-D-глюкозамина (GlcNAc) к гидроксильной группе серина (Ser) или L-треонина (Thr). Некоторые О-связанные гликаны также имеют модификации, такие как ацетилирование и сульфатация.
[0054] Модулировать: Выражение "модулировать", как используется в данном описании, относится к способности объекта контроль, в заданных пределах, величины параметра, такого как уровень остатков альфа-галактозы, присутствующих в гликопротеиновой композиции. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления уровень остатков альфа-галактозы может быть смодулирован так, чтобы он оставался в заданных пределах. В некоторых вариантах осуществления уровень остатков альфа-галактозы может быть смодулирован так, чтобы он не превышал более чем 5,0%, 1,0%, 0,5%, 0,1%, 0,05% или 0,01% общих TV-гликанов, присутствующих в гликопротеиновой композиции. В других вариантах осуществления уровень остатков альфа-галактозы может быть смодулирован так, чтобы он не изменялся на более чем 10,0%, 5,0%, 1,0%, 0,5% или 0,1% заданного или желаемого уровня.
[0055] Протеаза: Выражение "протеаза", как используется в данном описании, относится к средству, которое расщепляет пептидную связь между последовательными аминокислотами в полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления протеаза представляет собой фермент (т.е. протеолитический фермент). В определенных вариантах осуществления протеаза представляет собой белок (например, белковый фермент), содержащий одну или более полипептидных цепей. В определенных вариантах осуществления протеаза представляет собой химическое средство отщепления.
[0056] Обеспечение: Выражение "обеспечение", как используется в данном описании, относится к субъекту, получающему рассматриваемый объект, такой как СНО клетка, препарат клеток СНО или гликопротеиновый препарат, из любого источника, включая, но без ограничения, получением с помощью собственного производства субъекта или с помощью получения субъекта от другой стороны. Например, препарат клеток СНО обеспечивается, если он произведен или получен с помощью любой машины, человека или юридического лица. В некоторых вариантах осуществления препарат клеток СНО может быть получен с помощью машины, которая может затем проводить одно или более испытаний, процессов или доработок гликопротеинового препарата. В некоторых вариантах осуществления препарат клеток СНО может быть получен человеком. В некоторых вариантах осуществления препарат клеток СНО может быть получен из посторонним юридическим лицом. В некоторых вариантах осуществления препарат клеток СНО может быть получен человеком или фирмой, выполняющих услуги определения характеристик для второго лица или компании.
[0057] Терминальный остаток α-1,2-галактозы; терминальная gal-α-1,3-gal связь: Выражения "терминальный остаток α-1,3-галактозы", "терминальные gal-α-1,3-gal связи" и "нередуцирующий концевой остаток α-1,3 связанной галактозы", как используется в данном описании, взаимозаменяемо описывают гликановую структуру, проиллюстрированную на Фигуре 2, в которой гликановая структура, которая может быть присоединена к пептиду или белку, заканчивается двумя остатками галактозы, которые связаны друг с другом на остатках, обозначены как 1 и 3 остатки, соответственно, на молекулах галактозы.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0058] Хотя клетки-хозяева, используемые для синтеза рекомбинантных гликопротеинов, обладают внутриклеточным аппаратом, чтобы производить сложное гликозилирование, эти клетки не всегда обладают таким же набором ферментов, как клетки, в которых гликопротеин экспрессирован естественным образом. Клональная селекция клеточных линий и изменения в условиях производства могут также производить гетерогенность в гликопротеинах, экспрессированных в культивированных клетках. Функциональная роль гликозилирования в активности гликопротеина делает необходимым точное определение характеристик терапевтических продуктов, продуцированных в клеточных линиях.
[0059] Ранее сообщалось, что терминальные gal-α-1,3-gal связи не присутствуют в рекомбинантных гликопротеинах, продуцируемых клетками яичника китайского хомячка (СНО). Chung et al., N Engi J Med, 358: 11 (2008). Данное раскрытие основано, по меньшей мере, частично, на неожиданном открытии того, что терминальные остатки а-1,3-галактозы могут быть обнаружены на гликопротеинах, продуцированных СНО клетками, и таким образом, важно определить, отследить и контролировать этот аспект гликановой структуры при использовании клеток СНО для продуцирования терапевтических продуктов.
[0060] Данное раскрытие обеспечивает способы анализа композиции гликанов на гликопротеинах, продуцируемых СНО клетками. Согласно данному раскрытию гликаны из гликопротеиновых препаратов, продуцированных в клетках СНО, могут быть проанализированы для определения того, включают ли они терминальные остатки α-1,3-галактозы. Данное раскрытие обеспечивает способы выявления таких модификаций и способы продуцирования гликопротеинов, которые включают или не включают такие модификации.
Гликановые препараты
[0061] Данное раскрытие обеспечивает способы анализа структуры и/или композиции отдельных гликанов в гликановом препарате, например, оценки гликанов, содержащих терминальные остатки галактоза-альфа-1-3-галактозы, продуцированные клетками СНО, например, оценки терминальных остатков альфа-галактозила на гликопротеинах, продуцированных клетками СНО, Гликановый препарат может быть получен из клеточного препарата или из гликопротеина с помощью любого способа, доступного в области техники. В общем, получение гликанового препарата включает этапы (1) получения клетки или гликопротеинового препарата; и (2) необязательно высвобождение гликанов из клетки или гликопротеинового препарата. В некоторых вариантах осуществления получение гликанового препарата необязательно включает мечение гликанового препарата обнаруживаемой меткой.
Гликопротеиновые препараты
[0062] Описаны способы рекомбинантного продуцирования гликопротеинов. Гликопротеины, секретированные культивируемыми клетками, могут быть выделены и очищены любыми доступными способами, такими как анионообменная хроматография, обращенно-фазовая хроматография, гель-фильтрация, иммуноаффинная хроматография и их комбинации.
N-связанный гликановый препарат
[0063] В некоторых вариантах осуществления TV-гликановый препарат получают путем обеспечения популяции гликопротеина и удаления N-связанных гликанов из гликопротеинов в популяции.
[0064] В некоторых вариантах осуществления TV-связанные гликаны удаляют из гликопротеинов (например, гликопротеины) ферментативным гидролизом. В целом, гликаназы, пригодные для использования согласно данному раскрытию, расщепляют между GlcNAc-Asn, GlcNAc-GlcNAc или Man-GlcNAc остатками кора. Иллюстративные ферменты, которые могут быть использованы для удаления TV-связанных гликанов из гликопротеинов, включают, но не ограничиваются, TV-гликаназу F и/или TV-гликаназу-А, О-гликаназу и/или Endo Н.
[0065] В некоторых вариантах осуществления TV-связанные гликаны удаляют из гликопротеинов химическим расщеплением. В качестве нескольких примеров, гидразин, боргидрид натрия и/или трифторметансульфоновая кислота (TFMS) могут быть использованы для удаления гликанов из гликопротеина.
О-связанный гликановый препарат
[0066] В некоторых вариантах осуществления О-связанный гликановый препарат получают путем обеспечения популяции гликопротеина (например, гликопротеин) и удаления О-связанных гликанов из гликопротеинов в популяции.
[0067] В некоторых вариантах осуществления О-связанные гликаны удаляют из гликопротеинов (например, гликопротеины) путем b-элиминанирования. В некоторых вариантах осуществления O-связанные гликаны удаляют из гликопротеинов (например, гликопротеины) путем восстановительного b-элиминирования. В некоторых вариантах осуществления O-гликаны удаляют из гликопротеинов (например, гликопротеины) путем невосстановительного b-элиминирования.
4
[0068] В некоторых вариантах осуществления О-связанные гликаны удаляют из гликопротеинового препарата (например, гликопротеина) путем инкубации препарата в растворе, который включает щелочной тетрагидроборат. В некоторых вариантах осуществления тетрадейтериоборат используется, например, чтобы встроить дейтериевую метку, чтобы облегчить выявление О-связанных гликанов. В различных иллюстративных способах препарат гликопротеина инкубируют в растворе, содержащем 0,8-1,0 М NaBH и 0,05-0,1 М NaOH при 42-45°С в течение 2-24 часов. Реакция для удаления О-связанных гликанов может быть прекращена путем добавления кислоты (например, 1,0 М HCl).
[0069] В некоторых вариантах осуществления О-связанные гликаны удаляют из гликопротеинового препарата путем инкубирования препарата в растворе, который включает NaOH. В различных иллюстративных способах гликопротеин инкубируют в растворе, содержащем 50-200 мМ NaOH при 27-45°С в течение 2-48 часов. Реакция может быть прекращена путем добавления кислоты.
4
4
4
4
[0070] В некоторых вариантах осуществления О-связанные гликаны удаляют из гликопротеинового препарата путем инкубирования препарата в растворе, который включает NHOH. В различных иллюстративных способах гликопротеин инкубируют в растворе, содержащем 25-28% NHOH при 45-60°С в течение 2-40 часов. Реакция может быть прекращена путем удаления NHOH в вакууме. В некоторых вариантах осуществления раствор включает карбонат аммония (например, в насыщающей концентрации). В некоторых вариантах осуществления обработанный NHOH препарат обрабатывают кислотой (например, борной кислотой).
[0071] В некоторых вариантах осуществления О-связанные гликаны удаляют из гликопротеинового препарата путем инкубирования препарата в водном растворе, который включает этиламин (например, этиламин в концентрации около 70%) или метиламин (например, метиламин в концентрации около 40%), в течение около 4-24 часов.
[0072] В некоторых вариантах осуществления О-связанный гликановый препарат получают из гликопротеиновой популяции, из которой N-связанные гликаны были удалены.
Маркирующие гликаны
[0073] В некоторых вариантах осуществления метки могут быть связаны с гликанами до или после высвобождения из гликопротеина. TV-связанные гликаны или О-связанные гликаны (например, TV-гликаны, которые были выделены из популяции гликопротеина) могут быть связаны с одной или более выявляемыми метками. Выявляемые метки типично связаны с редуцирующими концами гликанов. В некоторых вариантах осуществления выявляемые метки представляют собой флюоресцентные части. Иллюстративные флюорофоры, которые могут быть использованы согласно данному раскрытию, включают, но не ограничиваются, 2-аминобензойную кислоту (2АА), 2-аминобензамид (2АВ) и/или 2-аминопурин (2АР). В общем, флюорофоры для использования согласно данному раскрытию характеризуются тем, что способны реагировать с редуцирующим концом олигосахарида и/или моносахарида при условиях, которые не повреждают и/или не разрушают гликан. В некоторых вариантах осуществления флюоресцентные части присоединены непосредственно к редуцирующим концам. Например, прямое присоединение может быть осуществлено путем прямой конъюгации восстановительным аминированием. В некоторых вариантах осуществления флюоресцентные части присоединены к редуцирующим концам опосредованно. Например, опосредованное присоединение может быть осуществлено реакционной сшивающей "ножкой".
3
2
35
[0074] В некоторых вариантах осуществления выявляемые метки включают радиоактивные части или изотопно-меченные молекулы. Иллюстративные радиоактивные части, которые могут быть использованы согласно данному раскрытию, включают, но не ограничиваются, тритий (Н), дейтерий (Н) и/или S. Типично, такие части непосредственно присоединяются или иным образом связываются с флюорофором. В качестве одного примера радиоактивного флюорофора, 2АР может быть модифицирован так, чтобы все водороды были дейтерированы.
Высвобождение гликанов
[0075] Данное раскрытие обеспечивает улучшенные способы определения паттернов гликозилирования гликопротеинов. Такие способы могут включать воздействие на гликановую популяцию одной или более экзогликозидаз и анализ структуры и/или композиции продуктов обработки ферментами. В некоторых вариантах осуществления экзогликозидазы, используемые согласно данному раскрытию, распознают и расщепляют только один определенный тип гликозидной связи. В некоторых вариантах осуществления экзогликозидазы, используемые согласно данному раскрытию, распознают и расщепляют более чем один определенный тип гликозидной связи. Среди экзогликозидаз, которые могут быть пригодны для данного изобретения, находятся α-галактозидазы, β-галактозидазы; гексозаминидазы, маннозидазы и их комбинации, как описано в Таблице 1.
Экзогликозидазы
[0076] Экзогликозидазы представляют сбой ферменты, которые отщепляют терминальные гликозидные связи от нередуцирующего конца гликанов. Они типично являются высоко специфическими к определенным моносахаридным связям и аномерности (α/β). В некоторых вариантах осуществления соседние паттерны разветвления могут влиять на экзогликозидазную специфичность. Обработка экзогликозидазой обычно дает в результате гликаны стандартных антенных цепей, связи которых являются расщепленными у пентасахаридного кора (M3N2), содержащего 3 маннозных и 2 GlcNAc остатка. Тем не менее, необычно модифицированные виды (например, фукозилированные виды на антенных цепях или коре, с высоким содержанием маннозы и гибридные гликаны, гликаны с вытянутым лактозамином, сульфатированные гликаны, фосфорилированные гликаны и т.д.) являются устойчивыми к экзогликозидазной обработке и могут быть хроматографически растворены и количественно оценены относительно M3N2 пентасахарида.
[0077] Иллюстративные экзогликозидазы, которые могут быть использованы согласно данному раскрытию, включают, но не ограничиваются, сиалидазу, галактозидазу, гексозаминидазу, фукозидазу и маннозидазу. Экзогликозидазы могут быть получены из любого источника, включая коммерческие источники или путем выделения и/или очистки из клеточного источника {например, бактерии, дрожжи, растения и т.д.).
[0078] В некоторых вариантах осуществления экзогликозидазы (например, сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы, фукозидазы и маннозидазы) могут быть разделены на множество категорий или "подклассов". В некоторых вариантах осуществления различные подклассы проявляют различные способности к расщеплению различных типов связей. Таблица 1 представляет некоторые иллюстративные экзогликозидазы, их специфичности по отношению к связям и организм, из которого каждая из них получена. Специалисту в данной области техники будет понятно, что это является иллюстративным, не исчерпывающим перечнем экзогликозидаз, и что любая экзогликозидаза, имеющая специфичность к любой связи, может быть использована согласно данному раскрытию.
Таблица 1.
Экзогликозидазы
Класс фермента
ЕС#*
Активность
Организм
α-Сиалидаза
3.2.1.18
α-2/3,6,8 (обычно не специфическая к связи)
Arthrobacter ureafaciens
Vibrio cholerae
Clostridium perfringens
α-2,3 (NeuAc из олигосахаридов)
Salmonella typhimurium Streptococcus pneumonia
α-2/3,6 (NeuAc из комплекса)
Clostridium perfringens
β-Галактозидаза
3.2.1.23
связи β-1/3,4,6 Gal
Бычий семенник виды Xanthamonas виды Streptococcus E.coli
связи β-1/4,6 Gal
Канавалия мечевидная
связь β-1,4 Gal
Streptococcus pneumonia
связь β-1,3-Gal
E.coli
виды Xanthomonas
связи β-1/3,6-Gal
виды Xanthomonas E.coli
β-Гексозаминидаза
3.2.1.52
гексозамины β-1/2,3,4,6
Streptococcus plicatus
3.2.1.30
Streptococcus pneumonia
Бактероиды
Канавалия мечевидная
α-Фукозидаза
3.2.1.51
α-1-3,4-Fuc (обычно дегликозилированная структура Льюиса)
Xanthomonas
3.2.1.111
Миндальная мука
α-1/2,3,4,6-Fuc (обычно имеет широкую специфичность)
Бычья почка
С.meningosepticum
α-1,6-Fuc
E.coli
α-1,2-Fuc
Xanthomonas
α-Маннозидаза
3.2.1.24
α-1/2,3,6-Man
Канавалия мечевидная
α-1/2,3-Man
Xanthomonas manihotis
α-1,6-Man (типично коровая маннозидаза)
виды Xanthomonas
α-1,2-Man
Aspergillus saitoi
β-Маннозидаза
3.2.1.25
α-1,4-Man
Helix pomatia
* "EC#" означает регистрационный номер Комиссии по ферментам
[0079] Согласно данному раскрытию популяция гликана может быть обработана любой экзогликозидазой или любым набором экзогликозидаз. В общем, реакции экзогликозидазы имеют место при условиях, которые соответствуют ферментной активности. Например, рН, температура, компоненты реакционного раствора и концентрация (например, соль, детергент и т.д.), и продолжительность времени реакции могут быть оптимизированы для того, чтобы достичь желаемого уровня экзогликозидазной активности. См., например, WO 2008/130926, содержание которой включено в данное описание посредством ссылки.
Анализ структуры и активности гликана
[0080] В общем, способы согласно раскрытию включают этап, на котором гликановый препарат подвергают анализу, чтобы определить, включает ли гликан определенный тип модификации (например, терминальные остатки α-1,3-галактозы). В некоторых вариантах осуществления анализ включает сравнение структуры и/или функции гликанов в одном препарате гликопротеина из одного источника со структурой и/или функцией гликанов в, по меньшей мере, одном другом гликопротеиновом препарате из другого источника. В некоторых вариантах осуществления анализ включает сравнение структуры и/или функции гликанов в одном или более из образцов со структурой и/или функцией гликанов в эталонном образце.
[0081] Структура и композиция гликанов может быть проанализирована любым доступным способом. В некоторых вариантах осуществления структуру и композицию гликана анализируют с помощью хроматографических способов, способов масс-спектрометрии (MS), хроматографических способов с последующей MS, электрофоретических способов, электрофоретических способов с последующей MS, способов ядерного магнитного резонанса (NMR) и их комбинаций.
[0082] В некоторых вариантах осуществления структура и композиция гликана может быть проанализирована хроматографическими способами, включая, но без ограничения, жидкостную хроматографию (LC), высокоэффективную жидкостную хроматографию (HPLC), сверхэффективную жидкостную хроматографию (UPLC), тонкослойную хроматографию (TLC), хроматографию на амидной колонке и их комбинации.
[0083] В некоторых вариантах осуществления структура и композиция гликана может быть проанализирована с помощью масс-спектрометрии (MS) и связанных способов, включая, но без ограничения, тандемную MS, LC-MS, LC-MS/MS, масс-спектрометрию с использованием лазерной десорбции и ионизации в присутствии матрицы (MALDI-MS), масс-спектрометрию с Фурье-преобразованием (FTMS), разделение ионной подвижности с масс-спектрометрией (IMS-MS), диссоциацию с переносом электрона (ETD-MS) и их комбинации.
[0084] В некоторых вариантах осуществления структура и композиция гликана может быть проанализирована с помощью электрофоретических способов, включая, но без ограничения, капиллярный электрофорез (СЕ), CE-MS, электрофорез в геле, электрофорез в агарозном геле, электрофорез в акриламидном геле, электрофорез в SDS-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим вестерн-блоттингом с использованием антител, которые распознают специфические гликановые структуры, и их комбинации.
[0085] В некоторых вариантах осуществления структура и композиция гликана может быть проанализирована с помощью ядерного магнитного резонанса (NMR) и связанных способов, включая, но без ограничения, одномерный NMR (1D-NMR), двумерный NMR (2D-NMR), NMR при вращении под магнитным углом с корреляционной спектроскопией (COSY-NMR), NMR с полной корреляционной спектроскопией (TOCSY-NMR), NMR с гетероядерной одноквантовой корреляцией (HSQC-NMR), NMR с гетероядерной многоквантовой корреляцией (HMQC-NMR), NMR с вращательной спектроскопией ядерного эффекта Оверхаузера (ROESY-NMR), NMR со спектроскопией ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY-NMR) и их комбинации.
[0086] В некоторых вариантах осуществления методики, описанные в данном документе, могут быть скомбинированы с одной или более другими техниками для выявления, анализа и/или выделения гликанов или гликопротеинов. Например, в определенных вариантах осуществления гликаны анализируют согласно данному раскрытию с использованием одного или более доступных способов (в качестве нескольких примеров, смотри Anumula, Anal. Biochem. 350(1): 1, 2006; Klein et al., Anal. Biochem., 179: 162, 1989; и/или Townsend, R.R.Carbohydrate Analysis" High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis., Ed. Z. El Rassi, c.181-209, 1995, каждый из которых включен в данное описание посредством ссылки в их полноте). Например, в некоторых вариантах осуществления гликаны характеризуют, используя один или более из хроматографических способов, электрофоретических способов, способов ядерного магнитного резонанса и их комбинаций. Такие иллюстративные способы включают, например, NMR, масс-спектрометрию, жидкостную хроматографию, 2-мерную хроматографию, SDS-PAGE, окрашивание антителом, окрашивание пектином, количественный анализ моносахаридов, капиллярный электрофорез, электрофорез углеводородов с помощью флюорофора (FACE), мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЕКС), обработки экзогликозидазой и/или эндогликозидазой и их комбинации. Специалистам в данной области техники будут известны другие методики, которые могут быть использованы, чтобы охарактеризовать гликаны, вместе со способами, описанными в данном описании.
[0087] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, позволяют выявить виды гликана (такие как терминальные остатки альфа-галактозила), которые присутствуют в низких уровнях в популяции гликанов. Например, данные способы позволяют выявить виды гликана, которые присутствуют на уровнях менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1,5%, менее 1%, менее 0,75%, менее 0,5%, менее 0,25%, менее 0,1%, менее 0,075%, менее 0,05%, менее 0,025% или менее 0,01% в популяции гликанов.
[0088] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, позволяют выявить определенные структуры {например, терминальные остатки альфа-галактозила), которые присутствуют в низких уровнях в популяции гликанов. Например, данные способы позволяют выявить определенные структуры, которые присутствуют на уровнях, менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1,5%, менее 1%, менее 0,75%, менее 0,5%, менее 0,25%, менее 0,1%, менее 0,075%, менее 0,05%, менее 0,025% или менее 0,01% в популяции гликанов.
[0089] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, позволяют выявить относительные уровни отдельных видов гликана в популяции гликанов. Например, может быть измерена площадь под каждым пиков жидкостного хроматографа и выражена как процент от общего. Такой анализ обеспечивает относительное процентное количество каждых гликановых видов в популяции гликанов. В другом примере относительные уровни отдельных гликановых видов определяют из площадей пиков в эксперименте 1D-NMR, или из значений пересекающихся пиков из спектра 1H-15HSQC (например, с коррекцией на основе ответов от стандартов), или с помощью относительной количественной оценки путем сравнения одного пика во всех образцах.
[0090] В некоторых вариантах осуществления оценивают биологическую активность гликопротеинового препарата (например, гликопротеиновый препарат). Биологическая активность гликопротеиновых препаратов может быть проанализирована любым доступным способом. В некоторых вариантах осуществления оценивают связывающую активность гликопротеина (например, связывание с рецептором). В некоторых вариантах осуществления оценивают терапевтическую активность гликопротеина (например, активность гликопротеина в уменьшении тяжести или симптома заболевания или состояния, или в замедлении возникновения симптома заболевания или состояния). В некоторых вариантах осуществления оценивают фармакологическую активность гликопротеина (например, биодоступность, фармакокинетика, фармакодинамика). Для способов анализа биодоступности, фармакокинетики и фармакодинамики гликопротеиновых терапевтических средств смотри, например, Weiner et al., J Pharm Biomed Anal. 15(5): 571-9, 1997; Srinivas et al., J. Pharm. Sci. 85(1): 1-4, 1996; и Srinivas et al., Pharm. Res. 14(7): 911-6, 1997.
[0091] Как будет понятно специалисту в данной области техники, определенная биологическая активность или терапевтическая активность, которая может быть испытана, будет варьировать в зависимости от определенного гликопротеина.
[0092] Потенциальная неблагоприятная активность или токсичность (например, предрасположенность вызывать гипертензию, аллергические реакции, тромботические события, пароксизмы или другие неблагоприятные явления) гликопротеиновых препаратов могут быть проанализированы с помощью любого доступного способа. В некоторых вариантах осуществления иммуногенность гликопротеинового препарата оценивают, например, определением того, вызывает ли препарат ответ антител у субъекта.
[0093] В различных вариантах осуществления биологическую активность, терапевтическую активность и т.д., гликопротеинового препарата, имеющего терминальные остатки альфа-галактозила, сравнивают с гликопротеиновым препаратом, который не имеет терминальных остатков альфа-галактозила. В различных вариантах осуществления биологическую активность, терапевтическую активность и т.д., гликопротеинового препарата, имеющего терминальные остатки альфа-галактозила, сравнивают с препаратом гликопротеина, который имеет другой уровень терминальных остатков альфа-галактозила.
Применения
[0094] Способы данного раскрытия могут быть использованы для анализа гликанов из гликопротеинов в любом из ряда состояний, включая, например, свободные гликаны, гликопротеины (например, гликопептиды, гликолипиды, протеогликаны и т.д.), связанные с клеткой гликаны (например, гликаны, связанные с ядром, цитоплазмой, клеточной мембраной, т.д.); гликаны, связанные с клеточными, внеклеточными, внутриклеточными и/или субклеточными компонентами (например, белками); гликаны во внеклеточном пространстве {например, среда клеточной культуры) и т.д.
[0095] Способы данного раскрытия могут быть использованы в одной или более стадиях разработки процесса для получения терапевтического или другого коммерчески значимого гликопротеина. Неограничивающие примеры таких стадий разработки процесса, которые могут использовать способы данного раскрытия, включают клеточную селекцию, клональную селекцию, оптимизацию сред, условия культивирования, условия процесса и/или процедуру очистки. Специалистам в данной области техники будут известны другие стадии разработки процесса.
[0096] Данное раскрытие может быть использовано, чтобы контролировать степень и/или тип гликозилирования, имеющего место в определенной клеточной культуре (например, степень терминальных остатков альфа-галактозила гликопротеинового препарата, продуцированного в клеточной культуре), что, тем самым, позволяет регулировать или возможно завершить культивирование для того, чтобы, например, достичь определенного желаемого паттерна гликозилирования, или чтобы избежать развития определенного нежелательного паттерна гликозилирования.
[0097] Данное раскрытие может также быть использовано для оценки характеристик гликозилирования клеток или клеточных линий (например, линии клеток СНО), которые предусматриваются для получения определенного желаемого гликопротеина (например, даже до того, как клетки или клеточные линии были сконструированы для получения гликопротеина, или для получения гликопротеина на коммерчески значимом уровне).
[0098] Например, если целевой гликопротеин представляет собой терапевтический гликопротеин, например, подвергающийся регуляционному тестированию в одной или более странах, зачастую будет желательным контроль культур для оценки вероятности того, что они будут образовывать продукт с паттерном гликозилирования, настолько близким к установленному паттерну гликозилирования фармацевтического продукта, насколько это возможно (например, имеющий степень терминальных остатков альфа-галактозила, которая близка к таковой фармацевтического продукта), вне зависимости от того, производится ли он точно таким же путем. Как используется в данном описании, "близкий" означает паттерн гликозилирования, имеющий, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% и 99% корреляцию с установленным паттерном гликозилирования фармацевтического продукта. В таких вариантах осуществления образцы продуктивной культуры типично берут в несколько точек времени и сравнивают с установленным стандартом или с контрольной культурой для того, чтобы оценить относительное гликозилирование.
[0099] Например, в некоторых вариантах осуществления способы для контроля получения гликопротеина может включать этапы, на которых (i) в ходе получения гликопротеина, удаляют, по меньшей мере, первый и второй образцы, содержащие гликаны, из продукционной системы; (ii) подвергают каждый из первого и второго образцов, содержащих гликаны, анализу для определения того, присутствует ли определенная модификация (например, терминальные остатки альфа-галактозила); и (in) сравнивают продукты, полученные из первого образца, содержащего гликан, с теми, что получены из второго образца, содержащего гликан, так, что определяют различия и, тем самым, контролируют ход получения гликопротеина. В некоторых вариантах осуществления гликопротеин представляет собой абатацепт. В некоторых вариантах осуществления продукционная система включает клетки СНО.
[0100] Вне зависимости от контроля получения определенного целевого белка с целями контроля качества данное раскрытие может быть использовано, например, для контроля гликозилирования на определенных стадиях развития или при определенных ростовых условиях.
[0101] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, могут быть использованы, чтобы охарактеризовать, модулировать и/или контролировать, или сравнивать качество терапевтических продуктов. В качестве одного примера, данные методики могут быть использованы для оценки гликозилирования в клетках, продуцирующих терапевтический белковый продукт. Особенно если учесть, что гликозилирование может зачастую влиять на активность, биодоступность или другие характеристики терапевтического белкового продукта, способы для оценки клеточного гликозилирования в ходе получения такого терапевтического белкового продукта являются особенно желаемыми. Среди прочего, данное раскрытие может облегчать анализ гликозилирования в реальном времени в продукционных системах для терапевтических белков, и, следовательно, может быть достигнута модуляция гликозилирования.
[0102] Типичные терапевтические гликопротеиновые продукты, чье получение и/или качество может контролироваться согласно данному раскрытию, включают, например, любой из множества гематологических средств (включая, например, эритропоэтин, факторы свертываемости крови и т.д.), интерферонов, колониестимулирующих факторов, антител, ферментов и гормонов.
[0103] Типичные коммерчески доступные гликопротеиновые продукты включают, например, те, что представлены в Таблице 2, если продуцируются в клетках СНО.
Таблица 2
Иллюстративные коммерчески доступные гликопротеиновые продукты
Белковый продукт
Эталонный препарат
интерферон гамма-1b
Actimmune<sup></sup>
альтеплаза; тканевой активатор плазминогена
Activase<sup></sup>/Cathflo<sup></sup>
рекомбинантный антигемофильный фактор
Advate
альбумин человека
Albutein<sup></sup>
ларонидаза
Aldurazyme<sup></sup>
интерферон альфа-N3, полученный из лейкоцитов человека
Alferon N<sup></sup>
антигемофильный фактор человека
Alphanate<sup></sup>
отфильтрованный от вирусов фактор коагуляции IX человека
AlphaNine<sup></sup> SD
алефацепт; рекомбинантный, димерный слитый белок LFA3-Ig
Amevive<sup></sup>
бивалирудин
Angiomax<sup></sup>
дарбепоэтин альфа
Aranesp<sup>™</sup>
бевацизумаб
Avastin<sup>™</sup>
Белковый продукт
Эталонный препарат
интерферон бета-1а; рекомбинантный
Avonex<sup></sup>
фактор коагуляции IX
BeneFix<sup>™</sup>
интерферон бета-1b
Betaseron<sup></sup>
тозитумомаб
Bexxar<sup></sup>
антигемофильный фактор
Bioclate<sup>™</sup>
гормон роста человека
BioTropin<sup>™</sup>
ботулинический токсин типа А
Botox<sup></sup>
алемтузумаб
Campath<sup></sup>
акритумомаб; меченный технецием-99
CEA-Scan<sup></sup>
алглюцераза; модифицированная из бета-глюкоцереброзидазы
Ceredase<sup></sup>
имиглюцераза; рекомбинантная из бета-глюкоцереброзидазы
Cerezyme<sup></sup>
Crotalidae поливалентый иммунный Fab, овечий
CroFab<sup>™</sup>
дитоксин иммунный Fab, овечий
DigiFab<sup>™</sup>
расбуриказа
Elitek<sup></sup>
этанерцепт
Enbrel<sup></sup>
эпоэтин альфа
Epogen<sup></sup>
цетуксимаб
Erbitux<sup>™</sup>
альгазидаза бета
Fabrazyme<sup></sup>
урофоллитропин
Fertinex<sup>™</sup>
фоллитропин бета
Follistim<sup>™</sup>
терипаратид
Forteo<sup></sup>
соматропин человека
GenoTropin<sup></sup>
глюкагон
GlucaGen<sup></sup>
фоллитропин альфа
Gonal-F<sup></sup>
антигемофильный фактор
Helixate<sup></sup>
антигемофильный фактор; Фактор XIII
Hemofil<sup></sup>
трастузумаб
Herceptin<sup></sup>
инсулин
Humalog<sup></sup>
комплекс антигемофильный фактор/фактор фон Виллебранда человека
Humate-P<sup></sup>
соматотропин
Humatrope<sup></sup>
инсулин человека
Humulin
адалимумаб
HUMIRA<sup>™</sup>
рекомбинантная гиалуронидаза человека
Hylenex<sup>™</sup>
Белковый продукт
Эталонный препарат
интерферон альфакон-1
Infergen<sup></sup>
эптифибатид
Integrilin<sup>™</sup>
альфа-интерферон
Intron A<sup></sup>
палифермин
Kepivance
анакинра
Kineret<sup>™</sup>
антигемофильный фактор
Kogenate<sup></sup>FS
инсулин гларгин
Lantus
гранулоцитомакрофагоколониестимулирующий фактор
Leukine<sup></sup>/Leukine<sup></sup> жидкий
лютропин альфа, для инъекции
Люверис
OspA липопротеин
LYMErix<sup>™</sup>
ранибизумаб
Lucentis<sup></sup>
гемтузумаб озогамицин
Mylotarg<sup>™</sup>
галсульфаза
Naglazyme<sup>™</sup>
несиритид
Natrecor<sup></sup>
пегфилграстим
Neulasta<sup>™</sup>
опрелвекин
Neumega<sup></sup>
филграстим
Neupogen<sup></sup>
фанолесомаб
NeutroSpec<sup>™</sup> (ранее LeuTech<sup></sup>)
сом атропин [рДНК]
Norditropin<sup></sup>/Нордитропин Nordiflex<sup></sup>
инсулин; суспензия цинка;
Novolin L
инсулин; суспензия изофана
Novolin N
инсулин, регулярный;
Novolin R
инсулин
Novolin
фактор коагуляции Vila
NovoSeven<sup></sup>
соматропин
Nutropin<sup></sup>
иммуноглобулин внутривенный
Octagam<sup></sup>
PEG-L-аспарагиназа
Oncaspar<sup></sup>
абатацепт, полностью растворимый белок слияния человека
Orencia<sup>™</sup>
муромомаб-CD3
Orthoclone OKT3<sup></sup>
хорионический гонадотропин человека
Ovidrel<sup></sup>
пегинтерферон альфа-2а
Pegasys<sup></sup>
пегилированный вариант интерферона альфа-2b
PEG-Intron<sup>™</sup>
абареликс (суспензия для инъекции); антагонист высвобождающего гонадотропин гормона
Plenaxis<sup>™</sup>
Белковый продукт
Эталонный препарат
эпоэтин альфа
Procrit<sup></sup>
альдеслейкин
Proleukin, IL-2<sup></sup>
соматрем
Protropin<sup></sup>
дорназа альфа
Pulmozyme<sup></sup>
эфализумаб; селективный, обратимый Т-клеточный блокатор
Raptiva<sup>™</sup>
комбинация рибавирина и альфа интерферона
Rebetron<sup>™</sup>
интерферон бета 1а
Rebif<sup></sup>
антигемофильный фактор
Recombinate<sup></sup>
rAHF/антигемофильный фактор
ReFacto<sup></sup>
лепирудин
Refludan<sup></sup>
инфликсимаб
Remicade<sup></sup>
абциксимаб
ReoPro<sup>™</sup>
ретеплаза
Retavase<sup>™</sup>
ритуксимаб
Rituxan<sup>™</sup>
интерферон альфа-2а
Roferon-A<sup></sup>
соматропин
Saizen<sup></sup>
синтетический свиной секретин
SecreFlo<sup>™</sup>
базиликсимаб
Simulect<sup></sup>
экулизумаб
Soliris<sup></sup>
пегвисомант
Somavert<sup></sup>
паливизумаб; рекомбинантно продуцируемое, гуманизированное mAb
Synagis<sup>™</sup>
тиротропин альфа
Thyrogen<sup></sup>
тенектеплаза
TNKase<sup>™</sup>
натализумаб
Tysabri<sup></sup>
внутривенные 5% и 10% растворы иммуноглобулина человека
Venoglobulm-S<sup></sup>
интерферон альфа-n1, лимфобластоидный
Wellferon<sup></sup>
дротрекогин альфа
Xigris<sup>™</sup>
омализумаб; гуманизированное моноклональное антитело, полученное на основе рекомбинантной ДНК, нацеленное на иммуноглобулин-Е
Xolair<sup></sup>
даклизумаб
Zenapax<sup></sup>
ибритумомаб тиуксетан
Zevalm<sup>™</sup>
соматотропин
Zorbtive<sup>™</sup> (Serostim<sup></sup>)
[0104] В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способы, в которых гликаны из различных источников или образцов сравнивают друг с другом. В некоторых таких примерах несколько образцов из одного источника (например, из одного и того же источника клеток СНО) получают с течением времени так, чтобы контролировать изменения в паттернах гликозилирования (и особенно в паттернах гликозилирования клеточной поверхности) (например, изменения в присутствии или степени терминальных остатков альфа-галактозила). В некоторых вариантах осуществления один из образцов представляет собой предыдущий образец или запись предыдущего образца. В некоторых вариантах осуществления один из образцов представляет собой эталонный образец.
[0105] В некоторых вариантах осуществления раскрытие обеспечивает способы, в которых гликаны из гликопротеинов, экспрессированных различными клеточными источниками, сравнивают друг с другом. В некоторых вариантах осуществления один или более из сравниваемых клеточных источников представляют собой клетки СНО.
[0106] В некоторых вариантах осуществления гликаны из различных образцов клеточных культур, приготовленных при условиях, которые отличаются по одному или более выбранным параметрам (например, тип клеток, тип культуры [например, непрерывное питание в отличие от периодического питания и т.д.], условия культивирования [например, тип сред, присутствие или концентрация определенного компонента определенной среды(сред), осмолярность, рН, температура, регулирование по времени или степень сдвига по одному или более компонентам, таким как осмолярность, рН, температура и т.д.], время культивирования, этапы выделения и т.д.), но в остальном идентичные, сравнивают так, чтобы определить эффекты выбранного параметра на гликозилирование. В определенных вариантах осуществления гликаны из различных образцов клеточных культур, полученных при условиях, которые отличаются по одному выбранному параметру, сравнивают так, чтобы определить эффект одного выбранного параметра на паттерны гликозилирования {например, присутствие или отсутствие терминальных остатков альфа-галактозила). Среди прочих применений, следовательно, применение методик, как описано в данном документе, могут способствовать определению эффектов определенных параметров на паттерны гликозилирования в клетках.
[0107] В некоторых вариантах осуществления сравнивают гликаны из различных партий гликопротеина, вне зависимости от того, получены ли они одним и тем же способом или различивши способами, и получены ли они одновременно или раздельно. В таких вариантах осуществления данное раскрытие способствует контролю качества гликопротеинового препарата. Альтернативно или дополнительно некоторые такие варианты осуществления способствуют контролю за развитием конкретной культуры, продуцирующей гликопротеин (например, когда образцы удаляют из культуры в различные точки времени, анализируют и сравнивают друг с другом). В некоторых примерах множественные образцы из одного источника получают с течением времени так, чтобы контролировать изменения в паттернах гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления образцы, содержащие гликаны, удаляют с интервалами около 30 секунд, около 1 минуты, около 2 минуты, около 5 минут, около 10 минут, около 30 минут, около 1 часа, около 2 часов, около 3 часов, около 4 часов, около 5 часов, около 10 часов, около 12 часов или около 18 часов, или даже с большими интервалами. В некоторых вариантах осуществления образцы, содержащие гликаны, удаляют с неравномерными интервалами. В некоторых вариантах осуществления образцы, содержащие гликаны, удаляют в интервалами 5 часов.
[0108] В некоторых вариантах осуществления способы согласно раскрытию могут быть использованы для контроля паттерна гликозилирования гликопротеинов в ходе их продуцирования клетками. Например, получение гликопротеина (например, коммерческое получение) может включать этапы (1) культивирования клеток, которые продуцируют гликопротеин, (2) получения образцов с регулярными или нерегулярными интервалами при культивировании и (3) анализа паттерна гликозилирования полученного гликопротеина(гликопротеинов) в полученном образце(образцах). В некоторых вариантах осуществления такие способы могут включать этап сравнения паттернов гликозилирования полученного гликопротеина(гликопротеинов) в полученных образцах с другим. В некоторых вариантах осуществления такие способы могут включать этап сравнения паттернов гликозилирования полученного гликопротеина(гликопротеинов) в полученном образце(образцах) с паттерном гликозилирования эталонного образца.
[0109] В любом из этих вариантов осуществления показатели анализа гликана могут быть записаны, например, в протокол контроля качества. Как отмечено выше, в некоторых вариантах осуществления сравнение осуществляется с предыдущей записью предыдущей или стандартной партии и/или с эталонным образцом гликопротеина. [ОНО] В некоторых вариантах осуществления гликаны из различных партий определенного гликопротеина, вне зависимости от того, получены ли они одним и тем же способом или различными способами, и получены ли они одновременно или раздельно, сравнивают друг с другом и/или с эталонным образцом. В некоторых вариантах осуществления сравнение партии с партией может включать этапы (i) обеспечения первого гликанового препарата из первой партии гликопротеина; (ii) обеспечения второго гликанового препарата из второй партии гликопротеина; (iii) проведения процедуры анализа каждому из первого и второго гликановых препаратов; и (iv) сравнения результатов анализа, полученных от первого гликанового препарата с продуктами расщепления, полученными из второго препарата, так, чтобы оценить согласованность двух партий. В некоторых вариантах осуществления гликановые препараты могут обеспечиваться путем удаления, по меньшей мере, одного гликана, по меньшей мере, из одного гликопротеина из партии и, необязательно, выделения удаленных гликанов. В некоторых вариантах осуществления гликановые препараты могут быть помечены, как описано в данном документе (например, флюоресцентно и/или радиоактивно; например, до и/или после выделения).
[0111] В некоторых вариантах осуществления данное раскрытие способствует контролю качества гликопротеинового препарата. Показатели анализа гликана могут быть записаны, например, в протокол контроля качества. Как отмечено выше, в некоторых вариантах осуществления сравнение проводят с предыдущей записью предыдущей или стандартной партии гликопротеина. В некоторых вариантах осуществления сравнение проводят с эталонным образцом гликопротеина.
[0112] В определенных вариантах осуществления данное раскрытие может быть использовано в исследованиях для модификации характеристик гликозилирования клетки, например, для установления условий клеточной линии и/или культуры с одной или более желаемьми характеристиками гликозилирования, например, клеточной линии, которая продуцирует гликопротеины, имеющие или не имеющие терминальные остатки альфа-галактозила. Такие условия клеточной линии и/или культуры могут затем быть использованы, при необходимости, для получения определенного целевого гликопротеина, для которого такая характеристика(характеристики) гликозилирования, как предполагается, является благоприятной. В определенных вариантах осуществления клетка представляет собой клетку СНО.
[0113] Согласно данному раскрытию методики, описанные в данном документе, могут быть использованы для выявления желательных или нежелательных гликанов, например, для выявления или количественной оценки присутствия одной или более примесей в продукте, или для выявления или количественной оценки присутствия одного или более активных или желаемых видов.
[0114] В определенных вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, способствуют выявлению гликанов, которые присутствуют в очень низких уровнях в источнике {например, биологический образец, гликановый препарат и т.д.). В таких вариантах осуществления можно выявить и/или необязательно количественно оценить уровни гликанов, которые присутствуют на уровнях, менее около 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,075%, 0,05%, 0,025% или 0,01% в популяции гликанов. В некоторых вариантах осуществления можно выявить и/или необязательно количественно оценить уровни гликанов, включающие от 0,1% до 5%, например, от 0,1% до 2%, например, от 0,1% до 1%, гликанового препарата.
[0115] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, позволяют выявить определенные связи, которые присутствуют на низких уровнях в популяции гликанов. Например, данные способы позволяют выявить определенные связи (например, терминальные gal-α-1,3-gal связи), которые присутствуют на уровнях, меньше чем 10%, меньше чем 5%, меньше чем 4%, меньше чем 3%, меньше чем 2%, меньше чем 1,5%, меньше чем 1%, меньше чем 0,75%, меньше чем 0,5%, меньше чем 0,25%, меньше чем 0,1%, меньше чем 0,075%, меньше чем 0,05%, меньше чем 0,025% или меньше чем 0,01% в популяции гликанов.
[0116] В некоторых вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, позволяют выявить относительные уровни отдельных видов гликанов в популяции гликанов. Например, площадь под пиком жидкостного хроматографа может быть измерена и выражена как процент от общего. Такой анализ обеспечивает относительное процентное количество каждого из видов гликанов в популяции гликанов.
[0117] Данное раскрытие будет более специфично проиллюстрировано со ссылкой на следующие примеры. Тем не менее, следует понимать, что данное раскрытие не ограничивается этими примерами каким-либо образом.
[0118] Специалист в данной области техники может без труда предусмотреть различные другие комбинации в пределах объема данного изобретения, рассматривая пример со ссылкой на описание изобретения, приведенное в данном документе.
ПРИМЕРЫ Пример 1
[0119] Orencia™ (абатацепт) представляет собой растворимый слитый белок, который состоит из внеклеточного домена антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов человека (CTLA-4), связанного с модифицированной Рс (шарнир, СН2 и СН3 домены) частью иммуноглобулина G1 человека (IgGI). Абатацепт продуцируется методикой рекомбинантной ДНК в клеточной системе экспрессии млекопитающего. Очевидный молекулярный вес абатацепта составляет 92 килодальтон. Абатацепт используют для лечения симптомов ревматоидного артрита, для замедления развития повреждения сустава и для улучшения физической функции. Большая сложность этого биотерапевтического средства, возникающая из-за его трудного гликозилирования (3 N-связанных и два О-связанных сайта гликозилирования), требует аккуратного получения и характеристики. Поскольку различные модификации белковой химической композиции (модификации белкового скелета, гликозилирование и т.д.) могут воздействовать на биологическую функцию гликопротеина, важно обеспечить хороший контроль за химическими и физическими свойствами этого биотерапевтического средства в ходе производства.
[0120] Эпитоп Gal-al-3Gal ("альфа-gal") типично не обнаруживается в белках человека и не предполагается в продуктах, полученных из СНО. Этот эпитоп типично наблюдается в белках, выделенных из свиней и мышей. У людей есть циркулирующие антитела против Galal-3Gal концов, и, таким образом, важно контролировать эти виды в гликопротеиновых терапевтических средствах и понимать, как это относится к разработке процесса. Данное раскрытие определяет присутствие альфа-gal структуры в абатацепте (который экспрессирован в клетках СНО).
Процедура, используемая для анализа видов гликана
[0121] N-гликаны были выделены из лекарственного вещества путем обработки с PNGASE-F с последующей очисткой твердофазной экстракцией. Затем гликаны метили 2АВ, а выбранные фракции затем анализировали с помощью LC-MS-MS. Гликановые структуры далее подтверждали с помощью комбинации экзогликозидаз, MALDI-MS и LC-MS/MS.
4
6
1
[0122] Эти данные иллюстрируют присутствие терминальной альфа-связанной галактозы в N-гликанах абатацепт-СТLА4 гликопротеина. Образцы N-связанного гликана Orencia (абатацепт), растворимого слитого белка, который состоит из внеклеточного домена антигена 4 цитиотоксических Т-лимфоцитов человека (CTLA-4), связанного с модифицированной Fc (шарнир, СН2 и СН3 домены) частью иммуноглобулина G1 человека (IgGI), анализировали посредством LC-MS/MS. Фигура 3 показывает флюоресцентную хроматограмму фракции гликанов, полученной из абатацепта, показывая выявление видов гликана с композицией HexNAcHexFuc, что может соответствовать структуре, содержащей галактоза-α-1-3 галактозу.
2
4
6
1
[0123] Спектр MS от видов гликана, полученных из Orencia™ с композицией HexNAcHexFuc подтверждают присутствие нередуцирующей концевой галактоза-α-1-3 связанной галактозы (Фигура 4), хотя это не устраняет возможности других потенциальных структур, таких как гликан гибридного типа.
[0124] Дополнительное подтверждение этой структуры было получено с использованием комбинации различных обработок экзогликозидазой с последующей LC-ESI-MS/MS и MALDI-MS. N-гликановые фракции, полученные как из Orencia™, так и контрольного белка, подвергались ферментным обработкам экзогликозидазой. Оба образца обрабатывали с (i) α-галактозидазой и (ii) смесью β-галактозидазы, β-N-ацетилгексозаминодазы и маннозидазы для расщепления потенциальной структуры нередуцирующей концевой галактоза-α-1-3 связанной галактозы. Сравнение флюоресцентных хроматограмм для продуктов двух реакций показано на Фигуре 5.
4
6
1
4
5
1
4
6
1
2
[0125] Не наблюдалось больших различий в гликанах из контрольного белка до и после обработки α-галактозидазой. С другой стороны явное уменьшение видов с композицией HexNAcHexFuc и увеличение примесей в видах композиции HexNAcHexFuc наблюдалось в Orencia™. MS для видов с композицией HexNAcHexFuc из абатацепта как результат ферментной обработки также показана на Фигуре 6.
[0126] Дополнительное подтверждение было получено из результатов обработки другим набором экзогликозидаз (бета-галактозидаза, гексозаминидаза и маннозидаза), что анализировали с помощью MALDI-TOF-MS (Фигура 7).
4
6
1
[0127] Данные позволяют предположить, что виды с композицией HexNAcHexFuc в Orencia™ содержат, в основном, нередуцирующую концевую галактоза-α1-3 связанную галактозу.
Уточнения и альтернативы
[0128] В то время как способы были конкретно показаны и описаны со ссылкой на специфические иллюстративные варианты осуществления, следует понимать, что различные изменения в форме и детали могут быть осуществлены без отступления от сущности и объема данного раскрытия. Тем самым, все варианты осуществления, которые попадают в объем и сущность способов, и их эквиваленты, подразумеваются, как заявленные. Формула изобретения, описания и диаграммы способов, систем и испытаний данного раскрытия не должны читаться как ограниченные описанным порядком элементов, если только это не указано.
[0129] Вся литература и подобный материал, цитированные в этой заявке, включая, но без ограничения, патенты, патентные заявки, статьи, книги, монографии и веб-страницы, вне зависимости от формата такой литературы и подобных материалов, однозначно включены посредством ссылки в их полноте. В случае, когда один или более из включенных литературных источников и подобных материалов отличаются от или противоречат данной заявке, включая, но без ограничения, определяемые выражения, применение выражений, описанные методики или подобное, данная заявка это контролирует. Заглавия разделов, используемые в данном описании, приводятся лишь в организационных целях и не должны толковаться как ограничивающие описанный объект изобретения каким-либо способом. В то время как способы были описаны во взаимосвязи с различными вариантами осуществления или примерами, не подразумевается, что способы являются ограниченными такими вариантами осуществления или примерами. Наоборот, способы включают различные альтернативы, модификации и эквиваленты, что будет понятно специалистам в данной области техники.