СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR RHEUMATOID ARTHRITIS

Изобретение относится к области медицины, в частности к ревматологии.
Ревматоидный артрит (РА) является одним из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний. Социальная значимость данного заболевания не вызывает сомнений. Диагностические критерии РА, используемые в настоящее время, были предложены Американской коллегией ревматологов (АКР) в 2010 г. (Aletaha D. et al. 2010. "2010 rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League Against Rheumatism collaborative initiative". Ann. Rheum. Dis. 69 (9): 1580-8. doi:10.1136/ard. 2010.138461. PMID 20699241). Согласно данным рекомендациям, лабораторными критериями для диагностики РА являются ревматоидный фактор (РФ) и антитела к циклическому цитруллинсодержащему пептиду (АЦЦП).
Известен способ лабораторного обследования при подозрении на РА, включающий определение скорости оседания эритроцитов, содержания в сыворотке крови С-реактивного белка, электролитов, РФ и АЦЦП (последние - только по мере необходимости); общий анализ мочи; биохимические исследования (печеночные ферменты, креатинин, общий белок), описанный в монографии под ред. Насонова Е.Л., 2008. Ревматология. Клинические рекомендации. - М.: ГЭОТАР-Медиа. Понятно, что большинство вышеуказанных лабораторных показателей не являются специфичными для РА.
Наиболее распространен метод дифференциальной диагностики ревматоидного артрита путем определения в сыворотке крови РФ. Он достаточно прост в исполнении и широко внедрен в практику. Ревматоидный фактор выявляется у 70-90% больных РА. Однако главным недостатком определения данного показателя в сыворотке крови является низкая чувствительность и специфичность на ранней стадии РА. К тому же частота выявления РФ, значения которого превышают пороговое, у здоровых людей среднего возраста составляет около 3%, а у пожилых - 15%. Диагностические уровни РФ часто встречаются при синдроме Шегрена, гранулематозе Вегенера, аутоиммунных поражениях печени, системной красной волчанке (СКВ), криоглобулинемии и реже при многих других аутоиммунных заболеваниях, а также хронических инфекциях, в частности подостром септическом эндокардите, туберкулезе, вирусном гепатите С. Кроме того, существует так называемая серонегативная форма РА, при котором уровень ревматоидного фактора не превышает нормальные значения вне зависимости от длительности заболевания (Conrad К., Roggenbuck D., Reinhold D., Dörner T. Profiling of rheumatoid arthritis associated autoantibodies. Autoimmun. Rev. 2010 9 (6):431-435).
Известен способ диагностики PA с помощью относительно новых маркеров заболевания - АЦЦП и антикератиновых антител (АКА), которые обладают более высокой специфичностью (Kamali et al. Anti-CCP and antikeratin antibodies in rheumatoid arthritis, primary Sjogren′s syndrome, and Wegener′s granulomatosis. Clin Rheumatol. 2005. 24 (6): 673-6; Маслянский А.Л., Лапин СВ., Мазинг А.В., Булгакова Т.В., Лазарева Н.М., Чешуина М.Д., Олейник П.А., Иливанова Е.П., Тотолян А.А., Мазуров В.И. Диагностическая значимость серологических маркеров ревматоидного артрита. Научно-практическая ревматология, 2012, №5 (54). С. 20-24). АЦЦП и АКА определяются в сыворотке при помощи иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлуоресценции. Чувствительность и специфичность при РА - 77% и 95% для АЦЦП и 42% и 91% для АКА соответственно. Данный способ позволяет выявить РА, серонегативный по РФ. Однако остается некоторая вероятность обнаружения АЦЦП и АКА при других воспалительных поражениях суставов (2-3%) и при других типах аутоиммунных заболеваний. Кроме того, данный способ является достаточно трудоемким, длительным и дорогим в постановке и используется достаточно ограничено, в отличие, например, от определения РФ.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является способ диагностики РА с использованием синовиальной жидкости (Авторское свидетельство SU 1810829, 1993). Сущность метода состоит в том, что в синовиальной жидкости методом электронного парамагнитного резонанса определяют содержание двухвалентной меди, входящей в состав церулоплазмина, и трехвалентного железа, связанного с трансферрином, и при концентрации Cu+2 - церулоплазмина 1,73×10-5 M и более и уровня Fe3+-трансферрина 7,19 мкмоль/л и менее диагностируют ревматоидный артрит, а при уровне Cu+2 - церулоплазмина 1,64×10-5 M и менее и концентрации Fe3+-трансферрина 11,49 мкмоль/л и более диагностируют деформирующий остеоартроз. Однако в настоящее время данный метод не используется на практике, т.к. требует специализированного оборудования (ЭПР-спектрометр).
Изобретение направлено на разработку способа дифференциальной диагностики РА с остеоартрозом (OA), обладающего достаточной чувствительностью и специфичностью, с использованием синовиальной жидкости в качестве исследуемого биоматериала. Поставленная задача достигается тем, что производится взятие синовиальной жидкости пациента, центрифугирование пробы с отделением супернатанта, с последующим установлением диагноза по содержанию белковых продуктов в супернатанте. Авторами предложено в качестве определяемых белковых продуктов использовать хемокины класса СХС, а именно CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10 и CXCL11/ITAC. Для диагностики ревматоидного артрита необходимо определить значения содержания хемокинов в супернатанте. В результате проведенных исследований были установлены пороговые значения для данных хемокинов, которые составляют, соответственно, 2625,8 пг/мл для CXCL9/MIG, 3108,2 пг/мл для CXCL9/MIG и 32,4 пг/мл для CXCL11/ITAC. При превышении порогового значения хотя бы одним из хемокинов диагностируется РА. Если значения содержания хемокинов в супернатанте ниже пороговых для трех хемокинов одновременно констатируют отсутствие РА и возможное наличие OA. Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с традиционными методами являются то, что определение специфичных маркеров проводится в синовиальной жидкости, полученной непосредственно в месте локализации процесса (внутри сустава), а не в сыворотке крови. Для проведения анализа необходимо очень небольшое количество биоматериала (достаточно 100 мкл синовиальной жидкости), при этом достигается высокая диагностическая значимость в дифференциации между лицами с РА и лицами с OA. Риск для пациента от применения данного способа сведен к минимуму, данный способ не влияет на здоровье пациентов и позволяет ускорить, стандартизировать и автоматизировать процесс получения окончательного результата диагностики.
Изобретение реализуется следующим образом.
Пример 1. Выбор порогового значения содержания хемокинов.
Для расчетов пороговых значений использовали значения содержания исследуемых хемокинов в группах с РА и OA. Образцы синовиальной жидкости (не менее 100 мкл) от лиц с подозрением на РА или OA отбираются в стерильный шприц при проведении артроскопических манипуляций (диагностическая или ревизионная артроскопия, артроскопическая синовэктомия), далее переносятся в стерильные пробирки и центрифугируются при 1000 g при +4°С в течение 15 минут. Супернатант отбирается в промаркированную сухую пробирку и может храниться при -80°С до постановки эксперимента. Для определения содержания хемокинов в супернатанте используют технологию мультиплексного иммуноферментного анализа по стандартным методикам согласно инструкциям производителя (Millipore, США). Статистическую обработку проводили в программах GRAPH Pad Prism 6.02 и GMP 11.0. Использовали непараметрические тесты (тест Манна-Уитни), данные были представлены в виде медианы с указанием первого и третьего квартилей (Me [Q25;Q75]. Для оценки диагностической ценности анализируемых биомаркеров был проведен анализ характеристической кривой (receiver-operating-characteristic curve-ROC) при фиксированном значении специфичности (87,5%). Были рассмотрены графические изображения характеристических кривых и определены значения площади под кривой - AUC (Area Under the Curve), а также отношение правдоподобия положительного результата (ОПП), которые определяют значимость теста для диагностики. Результаты анализа показали, что все три биомаркера в отдельности обладают достаточно высокой чувствительностью (78,5-94,7%), что позволяет их использование с диагностической целью. Значения AUC для всех трех хемокинов были более 0,8, что говорит об очень хорошем качестве выбранной модели. Для всех трех хемокинов ОПП было более 6, а это говорит о хорошей диагностической информативности. В результате анализа были получены следующие пороговые значения: для CXCL9/MIG - 4461 пг/мл, для CXCL10/IP-10 - 3893 пг/мл, для CXCL11/ITAC - 31,92 пг/мл.
Пример 2. Диагностика заболевания на основе предлагаемого метода.
Больной З., 51 год.
Диагноз: серонегативный (РФ-, АЦЦП-) ревматоидный артрит, с системными проявлениями, поздняя стадия, активность 3. При поступлении высокая клинико-лабораторная активность течения РА определила показания к интенсификации терапии. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: для CXCL9/MIG - 18503,822 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 9845,156 пг/мл, CXCL11/ITAC - 69,181 пг/мл. Сравниваем полученные значения с пороговыми: по всем трем показателям наблюдается превышение пороговых значений. Заключение: РА, что подтверждает клинический диагноз.
Больная Α., 78 лет.
Диагноз: деформирующий артроз тазобедренных и коленных суставов, 2-3 стадии. Поступила для проведения санационной артроскопии левого коленного сустава. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: для CXCL9/MIG - 955,375 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 1183,208 пг/мл, CXCL11/ITAC - 5,84 пг/мл. Сравниваем полученные значения с пороговыми: ни по одному показателю не наблюдается превышения пороговых значений. Заключение: отсутствие РА, наличие OA, что подтверждает клинический диагноз.
Больной Д., 27 лет.
Диагноз: ревматоидный артрит, серонегативный (РФ-, АЦЦП-), неэрозивный (2 рентгенологическая стадия), с системными проявлениями (ревматоидный васкулит, тромбоцитоз, лихорадка, снижение веса), активность III. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: для CXCL9/MIG - 15652,58 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 508,127 пг/мл, CXCL11/ITAC - 388,352 пг/мл. Сравниваем полученные значения с пороговыми: по двум показателям (CXCL9/MIG и CXCL11/ITAC) наблюдается превышение пороговых значений. Заключение: наличие РА, что подтверждает клинический диагноз.
Больная С, 28 лет.
Диагноз: ревматоидный артрит, серопозитивный (РФ+, АЦЦП+), эрозивный (4 рентгенологическая стадия), ФК1, с системными проявлениями (лихорадка, лимфоаденопатия, снижение веса, анемия), активность 2. В ходе проведения исследований были получены следующие концентрации биомаркеров: для CXCL9/MIG - 6171,923 пг/мл, CXCL10/IP-10 - 6407,466 пг/мл, CXCL11/ITAC - 14,869 пг/мл. Сравниваем полученные значения с пороговыми: по двум показателям (CXCL9/MIG и CXCL10/IP-10) наблюдается превышение пороговых значений. Заключение: наличие РА, что подтверждает клинический диагноз.