ТЕТРАПЕПТИДЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ С-Х-С-ХЕМОКИНОВ ЧЕЛОВЕКА, ПОДХОДЯЩИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЙ КОЖИ
TETRAPEPTIDES OBTAINED FROM HUMAN SYNTHETIC CHEMICALS SUITABLE FOR TREATING DIFFERENT SKIN CONDITIONS

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/835424, поданной 14 июня 2013 года, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение относится к тетрапептидам, обладающим биологической, косметической и терапевтической активностью. В частности, настоящее изобретение относится к тетрапептидам, полученным из консервативной области нескольких С-Х-С-хемокинов. Эти пептиды демонстрировали активность, включающую стимулирование миграции клеток, ангиогенеза, нейтрализацию компонентов бактериальных клеток, таких как индуцируемые липотейхоевой кислотой (ЛТК) провоспалительные сигналы, и стимулирование нормальной замены эпидермиса кожи. Настоящее изобретение также относится к способам применения этих пептидов для стимулирования заживления ран и лечения различных повреждений, поражающих кожу и другие связанные поверхности тела, такие как полость рта.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Кератиноциты и эндотелиальные клетки кожи представляют собой основные источники растворимых факторов, регулирующих заживление кожных ран и язв. Все аномалии, связанные со снижением активности, включая выработку факторов роста, ангиогенный ответ, функционирование макрофагов, накопление коллагена, функционирование эпидермального барьера и миграцию и пролиферацию кератиноцитов и фибробластов, являются одной из причин нарушенного заживления ран. Факторы роста и цитокины применялись в условиях клиники для лечения ран. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленными, ТФР (тромбоцитарный фактор роста) (Rees et al, 1999) и ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), которые, как было показано, оказывали благоприятное действие на заживление ран у пациентов, страдающих от различных ран и хронических кожных язв различной этиологии, включая язвы ног, связанные с лечением гидроксимочевиной (Stagno et al, 1999), венозные язвы ног (Da Costa et al, 1999), язвы, связанные с гемоглобинопатиями (Voskaridou et al, 1999), и раны вследствие ампутации (Gaches et al, 1998). Также внутрикожное введение ГМ-КСФ пациентам с поражениями кожи, страдающим от лепры, приводило к улучшению заживления ран и увеличению числа и слоев кератиноцитов (Kaplan et al, 1992; Braunstein et al, 1994).
[0004] Оба фактора роста и цитокины представляют собой белки. Сложности применения белковых препаратов для лечения ран эпидермиса часто связаны с большим размером используемых белков. Сложная структура и стоимость получения природных белков препятствуют их широкому клиническому применению. Стабильность и совместимость таких природных белков в составе также представляют серьезную проблему. Плохая проницаемость из-за большого размера природных белков с точки зрения достижения целевого слоя кожи часто снижает эффективность и является причиной отсутствия полезных эффектов белковых препаратов. Для устранения этих проблем короткие пептиды, несущие активность больших белков, должны удовлетворить потребность в менее дорогом, экономически эффективном получении и простой обработке и применении. Кроме того, короткие биологически активные пептиды лучше поглощаются и удерживаются тканью раны благодаря меньшей подверженности воздействию протеаз. Предпочтительные характеристики поглощения коротких биологически активных пептидов также делают их приемлемым решением для применений помимо лечения острых и хронических ран, таких как лечение проблем кожи, ассоциированных со старением и солнечным облучением.
[0005] Хемокины являются структурно родственными и представляют собой большое суперсемейство белков с молекулярной массой от 8 до 150 кДа, которые обладают разнообразной биологической активностью. Они обычно секретируются при стимулировании клеток для регуляции миграции лейкоцитов в процессе гомеостаза, а также во время воспаления, и необходимы для осуществления связи между врожденным и адаптивным иммунитетом. Наряду с молекулами адгезии, такими как интегрины и селектины, хемокины и их рецепторы действуют прежде всего как часть сложной молекулярной сети, которая облегчает избирательное перемещение конкретных типов клеток в микроокружение ткани-мишени и из него (Key et al., 2003; Ono et al., 2003). Хемокины избирательно опосредуют региоспецифичное рекрутирование нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов. В дополнение к тому, что хемокины являются хемотаксическими факторами, они также играют важную роль в поддержании гомеостаза, ангиогенеза/ангиостаза, дифференцировке и активации клеток, заживлении ран, росте и метастазировании опухолей, хоминге лимфоцитов и развитии лимфоидной ткани и влиянии на общий баланс иммунного ответа 1 типа/2 типа (Behm et al., 2012; Gillitzer et al., 2001; Raman et al., 2011; Romagnani et al., 2004; Rossi et al., 2000).
[0006] Определяемые наличием тетрацистеинового мотива, хемокины подразделяются на четыре отдельных семейства в соответствии с конфигурациями остатков цистеина на их N-конце. Существуют два больших подсемейства, подсемейство CCL (CCL1-CCL28) и подсемейство CXCL (CXCL1-CXCL16), а также два небольших подсемейства, подсемейство XCL (XCL1-XCL2) и подсемейство CX3CL1 (Bacon et al. 2003). Подсемейство хемокинов СХС играет важную роль в различных процессах, включая воспаление, заживление ран, регуляцию роста, ангиогенез и онкогенез (Keeley et al., 2008; 2011). Многие хемокины взаимодействуют с гликозаминогликановыми (ГАГ) фрагментами протеогликанов эндотелиальных клеток и внеклеточного матрикса (Handel et al., 2005). Гепарин, который служит в качестве модельного соединения для гепаринсульфата, является наиболее распространенным классом ГАГ, который экспрессируется фактически на каждой клетке организма. Все хемокины взаимодействуют с гепариновыми ГАГ.
ом
[0007] В своих исследованиях авторы настоящего изобретения отмечали, что С-Х-С-хемокины показывают некоторые сходства последовательности в их первичных аминокислотных последовательностях, хотя и являются высококонсервативными по вторичным структурам. Анализ первичных аминокислотных последовательностей девяти С-Х-С-хемокинов человека позволяет обнаружить высококонсервативную область, расположенную в С-концевом фрагменте, которая участвует в связывании ГАГ, с использованием номера доступа в базе данных NCBI для каждого хемокина, приведенного ниже в 1 абзаце раздела "Подробное описание изобретения". Авторы настоящего изобретения получили тетрапептиды из ГАГ-связывающей области и проверили их биологическую активность. Неожиданно, данные тетрапептиды демонстрировали различные виды биологической активности, включая стимулирование миграции кератиноцитов, индукцию ангиогенеза в эндотелиальных клетках пупочной вены человека, нейтрализацию ЛТК-индуцируемых провоспалительных цитокинов и модулирование роста клеток и выработки факторов роста. Указанные тетрапептиды подходят и в качестве фармацевтических, и в качестве косметических продуктов для улучшения различных состояний кожи.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Настоящее изобретение относится к коротким биологически активным пептидам, которые подходят для стимулирования заживления ран у млекопитающих. Раны, являющиеся предпочтительными мишенями для выделенных пептидов, представляют собой раны, поражающие кожу и связанные поверхности слизистых. Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом, пептиды согласно настоящему изобретению обладают способностью влиять на заживление ран путем стимулирования миграции клеток и ангиогенеза. Пептиды согласно настоящему изобретению подходят для применения как in vitro, так и in vivo и способны индуцировать вышеупомянутые виды активности в кератиноцитах.
1
2
[0009] Один из вариантов реализации настоящего изобретения относится к выделенным тетрапептидам формулы (I или V)-X-K-X, где X1 может быть выбран из Е, Q и K и Х2 может быть выбран из М, F, I, W, V и L. Выделенные пептиды могут содержать либо L-, либо D-энантиомерные формы аминокислот или их комбинацию. В соответствии с еще одним вариантом реализации настоящего изобретения выделенные пептиды могут быть конъюгированы с белком-носителем или модифицированы посредством С-концевого амидирования или N-концевого ацилирования жирными кислотами (т.е. липидирования). Эти добавки увеличивают биологическую активность пептидов при нанесении их на кожу и раны.
[00010] В соответствии с некоторыми предпочтительными вариантами реализации настоящего изобретения все выделенные пептиды содержат лизин в положении 3. Конкретные варианты реализации выделенных пептидов включают последовательности, соответствующие SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7, все из которых демонстрируют стимулирующую активность по отношению к миграции клеток и влияют на заживление ран.
1
2
[00011] Полученные тетрапептиды, показанные ниже, соответствуют формуле (I или V)-X-K-X, где X1 может быть выбран из Е, Q и K и Х2 может быть выбран из М, F, I, W, V и L.
[00012] Другой вариант реализации настоящего изобретения относится к терапевтическим или косметическим композициям, которые содержат фармацевтически или косметически приемлемый носитель и один или более из вышеупомянутых пептидов. Вышеупомянутые композиции подходят для получения лекарственного средства или косметических композиций для применения в лечении ран кожи млекопитающих. Концентрация пептида в таких композициях предпочтительно находится в диапазоне от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 500 мкг/мл или от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 20 мг/мл. Предпочтительные формы состава представляют собой аэрозоли, эмульсии, жидкости, растворы, лосьоны, кремы, пасты, мази, порошки, гели и пены.
[00013] Кроме того, пептиды согласно настоящему изобретению и содержащие их композиции могут обеспечивать полезные свойства для включения в составы для общего ухода за кожей и косметические составы, такие как различные косметические средства для кожи, кремы для кожи, лосьоны, солнцезащитные средства и лечебные лосьоны или кремы, такие как противоугревые составы для ухода за кожей после лазерных процедур.
[00014] Настоящее изобретение также относится к способам применения вышеупомянутых композиций для заживления ран у млекопитающих. Как правило, способ лечения включает введение эффективного количества композиций, содержащих пептид, в область ран и/или воспалительных состояний, в частности, кожи (эпидермиса) и связанных слизистых тканей в течение эффективного количества времени. Такие раны включают хирургические раны, ссадины, волдыри, ожоги, рваные раны, язвы, гематомы, высыпания, рубцы, растяжки и повреждения кожи, обусловленные внутренним и внешним влиянием старения и воздействия окружающей среды, включая образование морщин, обвисание кожи и фотоповреждение. Воспалительные заболевания кожи включают псориаз, атопический дерматит и розацеа и воспаление, возникающее в результате эпиляции.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[00015] Хемокины модулируют заживление ран, воспалительную/противовоспалительную и ангиогенную/ангиостатическую активности. Они выполняют свои функции путем связывания с рецепторами класса рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR, англ.: G-protein coupled receptor) на лейкоцитах и гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клеток в тканях-мишенях. Связывание хемокинов с ГАГ опосредовано ионными силами, возникающими в результате взаимодействий отрицательно заряженных цепей на молекулах ГАГ с кластерами основных остатков в молекулах хемокинов (Handel et al., 2005). In vivo ситуация является более сложной, и было сделано предположение о том, что хемокины работают путем создания фиксированного или гаптотактического (haptotactic) градиентов, которые направляют миграцию клеток к местам воспаления (Proudfoot, 2006). Взаимодействия ГАГ-хемокин могут играть ключевую роль в установлении градиентов вдоль внеклеточного матрикса и могут способствовать связыванию хемокинов с их рецепторами, сопряженными с G-белком. ГАГ или протеогликаны, содержащие гепаринсульфат (ГС), также могут выступать в качестве функциональных ко-рецепторов хемокинов для передачи сигнала, что приводит к образованию тройного комплекса ГАГ/хемокина и рецептора хемокина (Handel et al. 2005). Исследования конкретных хемокинов позволили картировать сайты связывания ГАГ с хемокинами. При внимательном рассмотрении первичной аминокислотной последовательности консервативного ГАГ-связывающего сайта девяти белков-предшественников С-Х-С-хемокинов человека, включая предшественник GRO-альфа (CXCL-1), предшественник хемокина 2 (CXCL-2), предшественник хемокина 3 (CXCL-3), предшественник хемокина 4 (CXCL-4), предшественник хемокина 5 (CXCL-5), предшественник хемокина 6 (CXCL-6), предшественник ИЛ-8 (CXCL8), предшественник хемокина 9 (CXCL-9), предшественник хемокина 11 (CXCL-11), мы обнаружили консервативный тетрапептидный участок, представляющий особый интерес. Консервативный тетрапептидный фрагмент, определенный в данном исследовании, расположен внутри части ГАГ-связывающего участка. Ниже представлено схематическое изображение выравнивания С-концевых последовательностей выбранных предшественников С-Х-С-хемокинов человека и выделен консервативный короткий тетрапептид. Выравнивание осуществляли с применением программы COBALT для множественного выравнивания белковых последовательностей на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации США (NCBI, англ.: National Center for Biotechnology Information) (ncbi.nlm.nih.gov). В выравнивании показана только С-концевая часть каждого хемокина, и числа обозначают начало и конец остатков в последовательностях. А. предшественник GRO-альфа (номер доступа в базе данных NCBI Р09341.1); В. предшественник хемокина 2 (номер доступа в базе данных NCBI NP_002080.1); С.предшественник хемокина 3 (номер доступа в базе данных NCBI NP_002081.2); D. предшественник хемокина 4 (номер доступа в базе данных NCBI Р80162.4); Е. предшественник хемокина 5 (номер доступа в базе данных NCBI NP_002985.1); F. предшественник хемокина 6 (номер доступа в базе данных NCBI NP_002984.1); G. предшественник ИЛ-8 (номер доступа в базе данных NCBI); Н. предшественник хемокина 9 (номер доступа в базе данных NCBI NP_002407.1); I. предшественник хемокина 11 (номер доступа в базе данных NCBI ЕАХ05774.1).
1
2
[00016] В выравнивании показан короткий тетрапептидный мотив, который является высококонсервативным среди СХС-хемокинов. * обозначает части ГАГ-связывающего сайта хемокинов. Тетрапептиды обнаруживают консервативный остов, представляющий собой I-K-. За исключением ИЛ-8, который содержит валин (V), все другие последовательности содержат изолейцин (I) в положении 1 и лизин (K) в положении 3 тетрапептидного мотива. Таким образом, формулу (I или V)-X-K-X можно использовать для представления полученных тетрапептидов, приведенных в таблице 1. Следует отметить, что ГАГ-связывающий участок хемокинов также вовлечен в образование димеров, поскольку большинство СХС-хемокинов обратимо существуют в виде мономеров и димеров, следовательно, на профиль рекрутинга будет влиять не только константа равновесия мономер-димер, но также и связывающие взаимодействия мономера и димера с рецепторами на нейтрофилах и с ГАГ на поверхности клеток и межклеточном пространстве в ткани-мишени (Gangavarapu et al., 2012).
1
2
[00017] Полученные тетрапептиды, показанные ниже, соответствуют формуле I(V)-Х-K-Х, где X1 может быть выбран из Е, Q и K и Х2 может быть выбран из М, F, I, W, V и L.
С-Х-С-хемокины хорошо известны своей хемотактической активностью в отношении многих типов клеток. Для оценки того, обладают ли вновь полученные тетрапептиды активностью стимулирования миграции кератиноцитов, пептиды, соответствующие SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8, были подвергнуты анализу методом зарастания царапины на кератиноцитах, анализу, хорошо зарекомендовавшему себя для оценки способности активного соединения индуцировать миграцию клеток и закрытие раны in vitro. Эксперимент проводили в бессывороточной среде для выращивания кератиноцитов при отсутствии добавок для того, чтобы ограничить пролиферацию клеток. Область раны исследовали с помощью фазово-контрастной микроскопии в указанные моменты времени. Как показано в таблице 1, тетрапептиды значительно индуцировали закрытие царапаной раны. При концентрации 20 мкг/мл процент закрытия раны, индуцированного SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7, составлял от 165% до 240% по сравнению с процентом в случае обработки фосфатно-солевым буфером (ФСБ), который принимали за 100% (таблица 1). Пептид, соответствующий SEQ ID NO 8, генерированный случайным образом, не вызывал миграцию клеток и закрытие царапаной раны. Для подтверждения того, что пептиды не были токсичными для кератиноцитов в концентрациях, исследованных в анализе закрытия царапаной раны, все пептиды подвергали МТТ-тесту на цитотоксичность. Ни один из пептидов не был цитотоксичным по отношению к кератиноцитам нормальной кожи in vitro после инкубации в течение 24 ч в концентрации до 500 мкг/мл. В заключение, лечение тетрапептидами, соответствующими SEQ ID NOs 1-7, значительно индуцировало миграцию нормальных эпидермальных кератиноцитов человека в область царапины, на что указывает процент закрытия раненой области через 7 ч обработки по сравнению с процентом для контрольных клеток, обработанных ФСБ.
[00018] Ангиогенез, образование новых капилляров из уже существующей сосудистой сети, представляет собой важную стадию заживления ран. Пептиды, полученные согласно настоящему изобретению, SEQ ID NOs 1-7, также стимулируют образование капилляров. Для анализа ангиогенеза in vitro используют эндотелиальные клетки пупочной вены человека (ЭКПВЧ) с целью измерения ряда явлений, приводящих к формированию новых капилляров. При индукции ЭКПВЧ подвергаются миграции с выстраиванием в линию, затем прорастанием из отдельных клеток. Явление прорастания приводит к образованию новых капилляров, которые далее развиваются, формируя закрытые многогранники. В конечном счете развивается сложная сетчатая структура. Пептид кателицидин человека, LL-37, представляет собой хорошо изученный пример стимулятора ангиогенеза. Он применяется в качестве положительного контроля в оценке. Прорастание новых капилляров становится видимым сразу после обработки LL-37 в течение 3 ч (таблица 2). После обработки LL-37 в течение 5 ч формируются закрытые многогранники. По сравнению с LL-37 пептиды, соответствующие SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7, вызывали сходные изменения в ЭКПВЧ, приводящие к образованию новых капилляров и сложных многогранных структур при обработке в течении 3 и 5 ч (таблица 2). В противоположность этому пептид, генерированный случайным образом, соответствующий SEQ ID NO 8 (KMG), и ФСБ не вызывали такого изменения в тот момент времени, когда ангиогенную активность наблюдали для LL-37 и пептидов согласно настоящему изобретению (таблица 2).
[00019] Хорошо известно, что пептидогликановый (ПГН) компонент клеточной стенки грамположительных бактерий стимулирует экспрессию провоспалительных цитокинов. Липотейхоевая кислота (ЛТК) является ключевой молекулой в составе ПГН, которая вызывает зависимое от концентрации и времени увеличение уровня провоспалительных сигналов, включая усиление экспрессии синтазы оксида азота (iNOS), циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2), ИЛ-1 бета, ФНО-альфа и ИЛ-6 (Lin et al., 2010). Таким образом, авторы предварительно обрабатывали ЛТК пептидами согласно настоящему изобретению и затем оценивали стимулирующее действие на ИЛ-6 при контакте с кератиноцитами кожи человека. Как показано в таблице 3, предварительная обработка ЛТК пептидами, соответствующими SEQ ID №1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7, значительно снизжала уровень ЛТК-стимулированной экспресии ИЛ-6 в культуре кератиноцитов кожи человека, что указывает на то, что пептиды могут нейтрализовать токсический эффект свободных ЛТК. Весьма вероятно, что положительно заряженные остатки тетрапептидов связываются с отрицательно заряженными ЛТК, таким образом блокируя взаимодействие ЛТК с ее рецепторами. Это имеет большое значение, поскольку компоненты клеточной стенки бактерий вовлечены в воспалительные состояния кожи, такие как угревая сыпь, розацеа, атопический дерматит и т.д.
[00020] Модуляция пролиферации клеток представляет собой еще одну важную стадию заживления ран. Авторы настоящего изобретения исследовали пролиферативную активность пептида согласно изобретению на кератиноцитах кожи человека. По сравнению с хемотаксической активностью, измеренной в анализе методом зарастания царапины, стимулирования ангиогенеза и блокирования ЛТК-индуцированной экспрессии ИЛ-6, пептиды согласно настощему изобретению показали различную, хотя и умеренную, активность по модулированию пролиферации кератиноцитов. SEQ ID NO: 1 (НВ2233) показывал ингибиторную активность в отношении пролиферации кератиноцитов, такую ингибиторную активность также наблюдали для SEQ ID NO 3 (НВ2270). SEQ ID NO 6, по-видимому, стимулировал пролиферацию кератиноцитов, но такая активность была лишь незначительной. Ингибиторная активность в отношении пролиферации кератиноцитов подтолкнула авторов настоящего изобретения проверить экспрессию ТРФ-β1, как как этот ростовой фактор хорошо известен способностью ингибировать пролиферацию клеток. Как показано в таблице 4, оба пептида, соответствующие SEQ ID NO 1 и 3, индуцировали умеренный уровень экспрессии ТРФ-β1 в культуре кератиноцитов.
[00021] SOR-300-FT, разработанная компанией MatTek Corporation (Ashland MA), представляет собой высокодифференцированную in vitro псориатическую ткань, состоящую из нормальных кератиноцитов человека и псориатических фибробластов. Морфологически ткань имеет равномерную толщину, и она экспрессирует повышенные уровни гиперпролиферированных клеток, а также провоспалительных маркеров, таких как псориасин, элафин, бета-дефенсин-2 человека и LL-37 и т.д. (Ayehunie et al., 2012). Провоспалительное состояние ткани подтолкнуло авторов настоящего изобретения проверить пептиды согласно изобретению, чтобы увидеть, модулируют ли они воспалительную реакцию. Из-за высокой стоимости модели ткани репрезентативный пептид, соответствующий SEQ ID NO 1, НВ2233, был выбран в качестве объекта исследования для подтверждения концепции с применением модели ткани SOR-300-FT. Ткани SOR-300-FT обрабатывали НВ2233 в двух повторностях в концентрации 200 мкг/мл. Всего изучали 12 маркерных генов, ассоциированных с состоянием псориаза. Исследование проводили параллельно с кальципотриолом. Анализ посредством количественной ПЦР (КПЦР) показал, что после обработки в течение 72 ч SEQ ID NO 1 (НВ2233) значительно снижал уровень экспрессии LL-37 (3,7 раза), который избыточно экспрессируется в воспаленной пораженной псориазом коже (таблица 5). Препарат для лечения псориаза кальципотриол значительно уменьшал экспрессию бета-дефенсина-2 человека (9,0 раз) и псориасина (2,3 раза). И НВ2233, и кальципотриол уменьшали экспрессию Ki67, который отвечает за гиперпролиферацию и раннее созревание кератиноцитов в пораженной псориазом коже. Кроме того, SEQ ID NO: 1 (НВ2233) также снижает уровень CXCL1 (GRO альфа) и CXCL5 (ENA-78), экспрессия каждого из которых значительно повышена в пораженной псориазом коже по сравнению с нормальной здоровой кожей (Ayehunie S., 2012), однако кальципотриол, по-видимому, не влияет на уровень экспрессии обоих генов. Это ясно указывает на то, что НВ2233 может являться новым лекарственным средством, которое функционирует посредством механизма, отличного от механизма действия существующего препарата кальципотриола, для лечения воспалительных состояний кожи, таких как псориаз.
[00022] Для лучшего понимания того, как тот же пептид влияет на нормальные ткани здоровой кожи, авторы настоящего изобретения взяли SEQ ID NO: 1, НВ2233, для анализа уровня экспрессии генов, выполняемого компанией Sunny Biodiscovery (Santa Paula, CA), с применением заменителей нормальной кожи человека EPIDERM™, приобретенных в компании MatTek Corporation (Ashland, MA). Заменители кожи приводили в состояние равновесия в течение ночи перед обработкой пептидом или водным контролем в двух повторностях в течение 24 ч. В конце обработки РНК экстрагировали и подвергали анализу ПЦР-массивов. Как показано в таблице 6, SEQ ID NO 1, НВ2233, стимулировал экспрессию генов, участвующих в синтезе внеклеточного матрикса (ВКМ) (коллагена и интегринов). Как и ожидалось, он модулировал экспрессию хемокинов (CXCL11 и MAPK3 и т.д.) и факторов роста (ТРФ-β1 и фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС) и т.д.). Анализ уровня экспрессии генов подтвердил наличие активности, наблюдаемой in vitro, состоящей в том, что пептиды согласно настощему изобретению модулировали пролиферацию клеток, ангиогенез и заживление ран.
[00023] Все пептиды, включенные в рамки настоящего изобретения, были синтезированы с помощью стандартных твердофазных химических методов с применением 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc)-стратегии. Пептиды могут быть получены в виде либо амидированных последовательностей, либо последовательностей со свободной С-концевой кислотой с использованием стандартных аминокислот. Амидирование С-концевой карбоксильной группы может сделать пептиды согласно настоящему изобретению менее подверженными деградации под действием протеаз и увеличить их растворимость по сравнению с формой свободной кислоты, обеспечивая тем самым повышенную терапевтическую эффективность. Пептиды могут содержать L- или D-энантиомеры аминокислот, включая либо остатки в одной энантиомерной форме, либо комбинацию обеих форм. Пептиды могут быть модифицированы как по N-концу, так и по С-концу. Например, обсуждается, что липидирование или ацетилирование N-конца может улучшить проникновение пептида через кожу без изменения биологически активной функции пептида (Samah, 2011). Поэтому пептиды также могут быть липидированы, что может обеспечить повышенное проникновение через кожу. Примеры насыщенных или ненасыщенных жирных кислот, которые могут применяться для обеспечения С12-18 липидного компонента соединений согласно настоящему изобретению включают лауриновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, миристолеиновую кислоту, пальмитолеиновую кислоту, олеиновую кислоту и линолевую кислоту. С-конец пептидов может быть модифицирован кислотной группой (-СООН) или амидирован (например, -CONH2, -CONHR или -CONR2). Амидирование С-концевой карбоксильной группы может сделать пептиды согласно настоящему изобретению менее подверженными деградации под действием протеаз и увеличить их полярность по сравнению с формами свободных кислот, обеспечивая тем самым повышенную терапевтическую эффективность. Также функциональные группы пептидов, которые могут быть модифицированы, как правило, включают гидроксил, амино, гуанидино, карбоксил, амид, фенольные, имидазольные кольца или сульфгидрил.
[00024] Пептиды также могут быть конъюгированы с растворимыми или нерастворимыми молекулами-носителями для модификации их свойств растворимости при необходимости и для увеличения локальных концентраций пептидов в тканях-мишенях. Примеры растворимых молекул-носителей включают, но не ограничиваются перечисленными, полимеры полиэтиленгликоля (ПЭГ) и поливинилпирролидон; примеры нерастворимых полимеров включают, но не ограничиваются перечисленными, силикаты, полистирол и целлюлозу. Пептиды могут быть микроинкапсулированы с применением липосомных технологий или с помощью нанотехнологий для повышения их стабильности и для контролируемого высвобождения. Обобщая вышеприведенный протокол, пептиды могут быть получены с применением любого способа, известного специалистам в данной области техники, такого как описанные в публикациях Merrifield (J Am Chem Soc. 85: 2149, 1963); Carpino et al. (J Org Chem. 51: 3732, 1986); Merrifield et al. (Anal Chem. 38: 1905, 1966) или Kent et al. [High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, IN: PEPTIDES 1984 (Ragnarsson, ed.) Almqvist and Wiksell Int., Stockholm (Sweden), pp. 185-188], полное содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
[00025] Настоящее изобретение относится к способам применения описанных выше пептидов, таких как применение в составах или в качестве терапевтических агентов. Эти способы могут включать применение единственного пептида или нескольких пептидов в комбинации. В некоторых случаях композиция согласно настоящему изобретению может находиться внутри устройств, помещаемых на, в или под кожу. Такие устройства включают трансдермальные пластыри, имплантаты и инъекционные устройства, которые высвобождают вещества таким образом, что они вступают в контакт с кожей или волосяными фолликулами посредством либо пассивных, либо активных механизмов высвобождения. Композиции, применяемые для доставки пептидов в соответствии со способами, описанными в настоящей заявке, могут находиться в форме аэрозоля, эмульсии, жидкости, лосьона, раствора, геля, микроинкапсуляции, крема, пасты, мази, порошка, пены или другого фармацевтически приемлемого состава. Кроме того, пептиды могут быть доставлены с применением менее вовлекаемых составов, таких как деионизированная/дистиллированная вода, ФСБ или стандартные медицинские физиологические растворы.
[00026] Состав может необязательно иметь косметическую привлекательность и/или содержать другие агенты, такие как ретиноиды, витамин С и другие пептиды, которые могут выступать в качестве вспомогательного средства для терапевтического действия пептидов согласно настоящему изобретению. В состав также могут быть добавлены антибиотики для предотвращения инфекции, что обеспечивает максимально эффективное протекание процессов заживления.
[00027] Состав может содержать ингибиторы протеаз. Ингибитор протеаз может быть выбран для конкретных протеаз-мишеней, которые, как предполагают, разрушают выбранный биологически активный пептид; такой выбор будет определяться исходя из длины и/или последовательности биологически активного пептида. Однако ингибиторы протеаз не должны быть обязательно выбраны каким-либо конкретным образом; например, согласно настоящему изобретению может применяться коктейль ингибиторов протеаз, который содержит два или более ингибиторов. Настоящее изобретение может включать следующие виды ингибиторов протеаз: ингибиторы сериновых протеаз, ингибиторы цистеиновых протеаз, ингибиторы аспартатных протеаз, ингибиторы металлопротеиназ, ингибиторы тиоловых протеаз и ингибиторы треониновых протеаз. Ингибитор протеазы, используемый в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой пептид или белок или химическое вещество. Неограничивающими примерами таких ингибиторов являются серпины, которые включают альфа-1-антитрипсин, ингибитор комплемента 1, антитромбин, альфа-1-антихимотрипсин, ингибитор активатора плазминогена 1 и нейросерпин или химические вещества, включающие, но не ограничивающиеся перечисленными, урсоловую кислоту и транексамовую кислоту, которые могут выступать в качестве вспомогательного средства для терапевтического действия пептидов согласно настоящему изобретению.
[00028] В целом, фармацевтически приемлемый состав будет содержать любой носитель, подходящий для применения на коже человека. Такие фармацевтически и косметически приемлемые носители включают этанол, диметилсульфоксид, глицерин, диоксид кремния, оксид алюминия, крахмал и эквивалентные носители и разбавители. Состав может необязательно иметь косметическую привлекательность и/или содержать другие агенты, такие как ретиноиды или другие пептиды, могут выступать в качестве вспомогательных средств для терапевтического действия пептидов согласно настоящему изобретению. В состав также могут быть добавлены антибиотики для предотвращения инфекции, что обеспечивает максимально эффективное протекание процессов заживления. Концентрация пептида в композиции может составлять от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 500 мкг/мл или от примерно 0,1 мкг/мл до примерно 10%; однако конечная используемая концентрация может варьировать за пределами этих диапазонов в зависимости от природы раны/состояния ткани, биологической активности пептида согласно настоящему изобретению и применения какого-либо вспомогательного средства или способа для достижения повышенного поглощения композиции. Во втором издании Справочника косметических ингредиентов (1992) Ассоциации по парфюмерно-косметическим товарам и душистым веществам (CTFA, англ.: Cosmetic Toiletries and Fragrance Association) описывает широкий спектр неограничивающих косметических и фармацевтических ингредиентов, обычно используемых в производстве средств по уходу за кожей, которые подходят для применения в композициях согласно настоящему изобретению. Примеры таких классов ингредиентов включают: абразивные вещества, абсорбенты, компоненты для обеспечения эстетических свойств, такие как отдушки, пигменты, окрашивающие вещества/красители, эфирные масла, средства для обеспечения ощущений кожи, вяжущие вещества и т.п. (например, гвоздичное масло, ментол, камфора, эвкалиптовое масло, эвгенол, ментиллактат, продукт перегонки гамамелиса), агенты против угревой сыпи, агенты, предотвращающие слипание, пеногасители, противомикробные агенты (например, йодпропилбутилкарбамат), антиоксиданты, связующие, биологические добавки, буферные агенты, объемообразующие агенты, хелатирующие агенты, химические добавки, косметические биоциды, денатураты, вяжущие средства, наружные анальгетики, пленкообразователи или пленочные материалы, замутняющие агенты, регуляторы рН, пропелленты, восстанавливающие агенты, усилители экскреции, агенты для отбеливания и осветления кожи (например, гидрохинон, койевая кислота, аскорбиновая кислота, аскорбилфосфат магния, аскорбилглюкозамин), кондиционирующие агенты для кожи (например, увлажнители), успокаивающие и/или заживляющие агенты для кожи (например, пантенол и его производные, алоэ вера, пантотеновая кислота и ее производные, аллантоин, бисаболол и глицирризинат дикалия), агенты для обработки кожи, загустители, витамины и их производные.
[00029] Введение пептидов согласно настощему изобретению и связанных с ними композиций может быть проведено для людей и животных, включая всех млекопитающих. Применение также может быть осуществлено в сочетании с типичными и/или экспериментальными материалами, такими как тканевые трансплантаты, заменители кожи, продукты культивирования тканей и покрытия. Примеры включают, но не ограничиваются перечисленными, марли (тканые и нетканые, пропитанные, неприлипающие, тампонирующие, удаляющие омертвевшие части); давящие повязки и системы; заполнители и очистители раны; контактные слои; коллагены; амниотические мембраны; бесклеточную дерму человека; бесклеточные матрицы и комбинированные продукты и различные широко используемые перевязочные материалы.
[00030] Список широко используемых перевязочных материалов
[00031] В общем, композиция может быть введена местно, перорально, трансдермально, системно или любым другим способом, известным специалистам в данной области техники, который подходит для доставки пептидов согласно настоящему изобретению в ткань-мишень. Композиции также могут применяться in vitro или ex vivo, либо на растущих в культуре клетках или трансплантатах пациента, например.
[00032] Композиции согласно настоящему изобретению могут содержать один или более дополнительных агентов, которые оказывают эффект ухода за кожей. Помимо компонента биологически активного пептида, настоящее изобретение может включать другие активные агенты, такие как гиалуроновая кислота, ниацинамид, фитантриол, фарнезол, бисаболол, салициловая кислота, ретинол, ретиноевая кислота, альфа-гидроксикислоты, аскорбиновая кислота и алгуроновая кислота. Ожидается, что некоторые дополнительные активные агенты будут действовать синергетически с компонентом биологически активного пептида или увеличат срок хранения состава.
[00033] Кроме того, сокращения для аминокислот соответствуют обычно используемым:
[00034] Подробную информацию о способах получения и введения лекарственных средств можно найти в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Несмотря на то, что желательна локальная местная доставка, существуют другие способы доставки, например: пероральное, парентеральное введение, введение с помощью аэрозоля, внутримышечное, подкожное, чрескожное, интрамедуллярное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутривенное, внутрибрюшинное или интраназальное введение. Пептиды согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в ряде переносящих сред, например, в спрее; аэрозоле; эмульсии типа вода и масло; эмульсии типа масло и вода; креме для лица или креме для тела; лосьоне для загара или лосьоне после загара или другой переносящей среде для местного введения. Кроме того, пептиды согласно настоящему изобретению и содержащие их композиции могут обеспечивать полезные свойства для включения в составы для общего ухода за кожей и косметические составы, такие как различные косметические средства для кожи, кремы для кожи, лосьоны, солнцезащитные средства и лечебные лосьоны или кремы, такие как противоугревые составы.
Области применения
[00035] Пептиды согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения ран кожи. Повреждение кожи и слизистой ткани происходит при нарушении целостности слоя эпидермиса, например, в результате разрыва, ожога или образования волдыря. Травма также может включать сдавливание или ушиб, которые включают повреждение тканей без сопутствующего разрыва эпидермиса. Кожные инфекции, а также некоторые хронические заболевания, такие как рак и аутоиммунные заболевания, также могут вызывать повреждения на поверхностях эпидермиса. Язвы, такие как язвы, связанные с диабетом или язвы, ассоциированные с пролежнями, являются еще одной формой повреждения кожи; эти раны довольно трудноизлечимы и являются воспаленными, подверженными инфекции и требуют длительного процесса заживления. Устойчивость язвы или другого типа хронических ран обусловлена сбоем клеточных процессов, участвующих в заживлении и образовании новых кровеносных сосудов, вследствие нарушения способности к ангиогенезу. Ангиогенез представляет собой процесс формирования новой капиллярной сети (микрососудов) в ответ на гипоксию или другие стимулы (Folkman et al., 1992). Процесс включает местную секрецию факторов ангиогенеза как из эндотелия в состоянии гипоксии, так и поддерживающих перицитов, которые вызывают пролиферацию эндотелия и прорастание новых сосудов. Недостаточный ангиогенез является одной из причин нарушения заживления ран и кожи (Galiano et al., 2004). Сбой в заживлении ран также может быть результатом неспособности к эпителизации поражения отчасти из-за того, что кератиноциты на границе раны не мигрируют, чтобы закрыть или покрыть больное место (Enoch and Price, 2004). Заживление ран кожи и слизистых управляется, в частности, посредством активации базальных кератиноцитов. При активации кератиноциты, расположенные по периметру раны, мигрируют с образованием единого слоя поверх раны в процессе, называемом эпителизацией. Было показано, что кератиноциты на незаживающем краю хронических ран являются гиперпролиферативными, но немигрирующими, и отсутствие миграции приводит к неспособности к эпителизации и играет важную роль в патогенезе хронических язв (Harsha et al., 2008). Настоящее изобретение также может применяться для лечения повреждений, связанных с кератиноцитами в коже и слизистых тканях. Термин "связанные слизистые ткани" относится к любой ткани, устроенной подобно коже и содержащей эпителиальные клетки/кератиноциты, включающей, но не ограничивающейся перечисленными, внутренние выстилающие поверхности, связанных с полостью рта, носом, горлом, ухом, анусом, гениталиями и конъюнктивой века глаза. Примерами ран или поражений/травм, которые могут затрагивать эти ткани и поддаются лечению с применением пептидов согласно настощему изобретению, являюся ссадины, волдыри, ожоги, рваные раны, уколы, язвы, гематомы, высыпания и рубцы. Постхирургическая травма также может подлежать лечению с помощью пептидов.
[00036] Другая форма повреждения эпидермиса является малозаметной и приводит к последствиям в течение длительного периода времени, нарушая в конечном итоге функции кожи, так называемая стареющая кожа. Существуют два основных процесса, которые вызывают старение кожи: внутренний (хронологическое старение) в случае защищенной от солнца кожи и внешний (фотостарение) в случае подвергнутых воздействию солнца участков. Внутреннее старение отражает генетический фон и зависит от времени. В любом случае, стареющая кожа имеет один или более из следующих признаков: морщины, тонкие линии, гиперпигментация, эритема, потеря блеска, гладкости, прочности, чистоты и равномерности тона кожи и изменения во внешнем виде пор. В основе этих видимых признаков лежат различные гистологические и цитологические изменения, вызванные острым или хроническим воздействием внешних стимулов, таких как ультрафиолетовое (УФ) излучение и загрязнения в дополнение к генетической предрасположенности. Косметические проблемы, такие как морщинистость, сухость, истончение, провисание и большая восприимчивости к ушибам, представляют собой обычные внешние признаки повреждения эпидермиса, которые, в дополнение к старению, также могут возникнуть преждевременно из-за длительного воздействия повреждающих агентов, таких как ультрафиолетовые лучи и загрязнения. Соответственно, пептиды, предложенные согласно настоящему изобретению, могут применяться для решения проблем, связанных со старением кожи, вызванным как внутренними, так и внешними стимулами, с целью предотвращения и репарации повреждения для регенерации таким образом здоровой ткани кожи, чтобы обратить эффекты старения. Аналогично, пептиды могут применяться для ткани, которая была повреждена в результате воздействия различных внешних агентов, таких как солнечный свет. Настоящее изобретение также может применяться в косметических целях для придания коже более молодого внешнего вида и текстуры. Можно заставить короткие пептиды, сами по себе неизмененные, или с помощью химической модификации и/или специализированной системы доставки, проникать через эпидермис, чтобы воздействовать на процессы, обратные тем, которые вызывают истончение кожи, морщины, хрупкость и огрубение/отвердение. Поскольку кератиноциты являются основным компонентом поверхностей эпидермиса и их количество снижено в старой и поврежденной коже, их пополнение посредством стимуляции пептидами, как ожидается, изменит вышеупомянутую проблему.
[00037] Кожа является относительно эластичной, но есть пределы ее способности к растяжению. Растяжки, или стрии, представляют собой форму рубцевания на коже, имеющую нездоровый оттенок. Они вызваны разрывом дермы, который с течением времени может уменьшиться, но не исчезнет полностью. Они впервые появляются в красноватых или пурпурных линий, но, как правило, постепенно выцветают до более светлого диапазона. Растяжки часто являются результатом быстрого растяжения кожи, ассоциированного с быстрым ростом или быстрой потерей веса. Растяжки могут появиться в любом месте на участках тела, которые вообще не подвергаются заметному или чрезмерному растяжению или увеличению размеров. Наиболее распространенные места представляют собой живот, грудь, плечи, подмышки, спину, бедра, бока и ягодицы. Растяжки часто вызваны гормональными изменениями на некоторых основных этапах жизни, таких как половое созревание и беременность, но лечение кортикостероидами, ожирение, эстетическая хирургия и интенсивные занятия бодибилдингом могут привести к появлению растяжек. Под действием кортикостероидов рост как кератиноцитов, так и фибробластов может быть серьезно нарушен, и, следовательно, синтез коллагенов I и III, а также синтез фибронектина также значительно снижен до более чем на 90% по сравнению с нормальной кожей (Rogalski et al., 2002). Было показано, что сочетание высоких доз кортикостероидов и терапии с применением анти-ФРЭС (антиангиогенеза) может ухудшить состояние стрий, и его следует избегать (Wheeler et al., 2012). Репарация и восстановление функции кератиноцитов в дермальном/эпидермальном слое может быть ключом к коррекции растяжек. Пептиды согласно настоящему изобретению, которые способствуют закрытию царапаной раны и стимулируют ангиогенез, необходимый для заживления ран, таким образом, являются оптимальными для лечения растяжек.
[00038] Кератиноциты производят и выделяют антимикробные пептиды (АМП), которые действуют в качестве эндогенных антибиотиков и в качестве сигнальных молекул в пределах врожденной иммунной системы кожи. АМП являются ключевым компонентом врожденной иммунной защитной системы организма-хозяина и обеспечивают первую линию защиты и уничтожение патогенных микроорганизмов. Кроме того, они также модулируют и модифицируют воспалительные реакции организма-хозяина посредством различных механизмов. Однако аномальная экспрессия этих пептидов была ассоциирована с патогенезом воспалительных заболеваний кожи. Недавние исследования предполагают, что LL-37 может играть важную роль в патогенезе псориаза и розацеа.
[00039] Псориаз представляет собой хроническое воспалительное заболевание кожи, которое поражает приблизительно 2% от общей численности населения (Lowes et al, 2007). Псориаз характеризуется накоплением Т-клеток типа Th1 и нейтрофилов, гиперпролиферацией и дифференцировкой кератиноцитов и усиленной выработкой эпидермальных АМП. При псориатических пораженях наблюдается высокий уровень экспрессии многих АМП, таких как кателицидин (LL-37), β-дефенсины, белки S100, хемокины, РНКаза 7, лизоцим, элафин, липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов, и т.д. В частности, кателицидин LL-37 избыточно экспрессируется в воспаленной коже при псориазе, связывается с внеклеточной собственной ДНК, высвобождающейся из погибающих клеток, и преобразует собственную ДНК в мощный стимул для плазмоцитоидных дендритных клеток (Dombrowski et al., 2012). Несмотря на то, что мнения о роли LL-37 при псориазе расходятся, очевидно, что этот пептид индуцирует пролиферацию кератиноцитов и выработку провоспалительных цитокинов в культуре кератиноцитов. В дополнение к псориазу, недавно была показана вовлеченность LL-37 в развитие системной красной волчанки и ревматоидного артрита (PA). LL-37 имеет высокий уровень экспрессии в коже пациентов, страдающих системной красной волчанкой (Sun et al., 2011). При РА нейтрофильные гранулоциты активизируют воспаление и повреждение тканей в суставе за счет выделения цитотоксических агентов, АМП, протеаз и других медиаторов воспаления. В модели на животных было показано, что уровень экспрессии LL-37 сильно повышен в синовиальных мембранах при РА и в суставах крыс с артритом по сравнению со здоровыми суставами (Hoffmann et al., 2012). Наблюдение того факта, что НВ2233 значительно снижал уровень экспрессии LL-37, а также нескольких других факторов, тесно связанных с воспалением, позволяет предполжить, что пептиды согласно настощему изобретению могут являться потенциальными лекарственными средствами для лечения воспалительных состояний, включающих, но не ограничивающихся перечисленными, псориаз, системную красную волчанку и ревматоидный артрит.
[00040] Розацеа является одним из наиболее распространенных дерматозов у взрослых. Современные концепции предполагают, что известные клинические инициирующие факторы, такие как УФ-излучение, тепло, холод, стресс, острая пища и микроорганизмы модулируют передачу сигналов Toll-подобных рецепторов (TLR, англ.: Toll-like receptor), индуцируют активные формы кислорода, а также усиливают выработку АМП и нейропептидов (Kenshi et al., 2009; Yamasaki et al., 2009). Сообщалось об избытке кателицидина в форме LL-37 при розацеа, который, по-видимому, является результатом аномальной функции распознавания TLR врожденного иммунологического рисунка и действия протеаз, которые превращают hCAP18 (Yamasaki et al., 2007; 2011). По аналогии с псориазом и системной красной волчанкой, присутствие избытка LL-37 при розацеа, как предполагается, допускает распознавание собственных нуклеиновых кислот как плазмоцитоидными дендритными клетками, так и кератиноцитами, которые могут усугубить воспаление, что способствует развитию заболевания за счет возможности передачи сигналов аутовоспаления (Gilliet et al., 2008; Ganguly et al., 2009). Снижение экспрессии LL-37 в тканях кожи SOR-300-FT с помощью пептидов согласно настоящему изобретению обосновывает перспективное и потенциально полезное лечение для улучшения LL-37-ассоциированного воспалительного состояния при розацеа.
[00041] В дополнение к воспалительным состояниям кожи, повышенные уровни LL-37 также ассоциированы с несколькими агрессивными типами твердых опухолей. Было показано, что LL-37 постепенно избыточно экспрессируется при опухолях предстательной железы человека по мере увеличения индекса Глисона и при костных метастазах (Jonathan et al., 2011). Похожие клинические наблюдения были сделаны при карциномах рака яичника (Coffelt et al., 2008), молочной железы (Heilborn et al., 2005) и разновидносях рака легкого (von Haussen et al., 2008). Несмотря на то, что LL-37, как правило, нормально отщепляется от своего предшественника, антимикробного белка-18 кателицидина человека (hCAP-18, англ.: human cathelicidin antimicrobial protein-18), под действием протеазы 3 нейтрофилов, становясь активированным, данные указывают на то, что раковые клетки также вырабатывают фермент, осуществляющий протеолитическое расщепление секретируемого ими hCAP-18 независимо от нейтрофилов (Sorensen et al., 2001). Это может объяснять повышенные уровни LL-37 в случаях рака. Несмотря на то, что участие LL-37 при раке еще остается выяснить, все свойства LL-37 по усилению пролиферации, ангиогенеза, защиты от апоптоза и эпителиально-мезенхимального перехода, могли бы служить в качестве отличительных признаков рака и могут использоваться трансформированными/злокачественными клетками для стимулирования роста опухоли и метастазирования. Снижение уровня экспрессии LL-37 с помощью пептида согласно настощему изобретению, такого как НВ2233, может обеспечить эффективный способ уменьшения уровня LL-37 с предотвращением таким образом распространения раковых клеток. Потенциальный благоприятный эффект может дополнительно быть усилен в комбинации с противораковыми препаратами.
[00042] Заражение бактериями может вызывать сепсис и приводить к септическому шоку, характеризующемуся стойкой гипотензией и в конечном итоге полиорганной недостаточностью и смертью (Ulevitvh et al., 1995). Сепсис, вызываемый грамположительными бактериями, был признан как важное клиническое состояние (Ulevitvh et al., 1995). Его этиологическими факторами являются компоненты клеточной стенки грамположительных бактерий, такие как пептидогликан (ПГН) и липотейхоевая кислота (ЛТК). В дополнение к септическому шоку ЛТК также является этиологическим фактором других воспалительных состояний. Атопический дерматит (АД) представляет собой распространенное хроническое воспалительное заболевание кожи. Патогенез АД полностью не изучен, и уровень экспрессии кателицидина (LL-37) и его связь с тяжестью заболевания экземы был неоднозначным. Пациенты с АД особенно восприимчивы к стафилококковым инфекциям кожи, которые связаны с ухудшением состояний их кожи. Несмотря на то, что механизмы, с помощью которых стафилококковые бактерии могут усугублять АД, еще не ясны, выработка цитокинов кератиноцитами или иммунными клетками, сопровождающая прямую инфекцию или взаимодействие с компонентами или продуктами распада бактерий, по-видимому, играет важную роль (Bieber et al., 2008). Инфекции S. aureus являются известными инициирующими факторами воспаления кожи и могут модулировать иммунный ответ, обусловленный либо прямым заражением бактериями, либо бактериальными продуктами. Результаты исследований указывают на высокие уровни ЛТК S. aureus на поражениях кожи при АД (Travers et al., 2010). Промывная жидкость, полученная из поражений при АД, как было обнаружено, индуцировала выработку ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10 и фактора некроза опухолей альфа дендритными клетками (ДК), полученными из костного мозга мышей (Travers JB et al., 2010). Пептиды согласно настощему изобретению демонстрировали высокие уровни связывания с ЛТК стафилококков in vitro, и такая активность может обеспечить перспективное лечение для нейтрализации токсического действия ЛТК или ЛПС из грамотрицательных бактерий, выделяющихся при инфекции или лечении антибиотиками, с целью улучшения состояний, ассциированных с септическим шоком и АД кожи.
[00043] Потенциал пептидов согласно настощему изобретению с точки зрения модулирования экспрессии ТРФ-β (трансформирующего фактора роста бета) на кератиноцитах представляет особый интерес. ТРФ-β представляет собой плейотропный цитокин/фактор роста, который регулирует пролиферацию, дифференцировку, апоптоз, ремоделирование матрикса, адгезию, инвазию и миграцию клеток. В общем, ТРФ-β1 может вырабатываться многими различными типами клеток. Было обнаружено, что все изоформы ТРФ-β стимулируют синтез и обмен белков внеклеточного матрикса фибробластами.
[00044] Волосяной фолликул является интегральным компонентом кожи, и каждый волос представляет собой ороговевший продукт фолликула. Все без исключения волосяные фолликулы проходят цикл активности: волос растет до максимальной длины, затем рост прекращается и волосы выпадает и заменяется. Фазы цикла роста волос были описаны как анаген, длительный период роста; катаген, переходный период от роста до покоя продолжительностью от 2 до 4 недель; телоген, период покоя продолжительностью 2-4 месяца. Несмотря на то, что прямые доказательства для человека отсутствуют, исследования на мышах показывают, что ингибирование пролиферации кератиноцитов и индукция выработки ТРФ-β1 непосредственно связаны с регрессией катагена (Foitzik et al., 2000). Наблюдение in vitro того факта, что рост изолированных, культивированных в органах волосяных фолликулов крысы и человека в стадии анагена ингибируется ТРФ-β1 напоминает в некоторых аспектах ранние этапы катаген-подобной трансформации. Активность SEQ ID NO 1, НВ2233, по ингибированию роста кератиноцитов и модулированию экспрессии ТРФ-β1 может указывать на то, что пептиды согласно настоящему изобретению потенциально могут быть терапевтически полезными для удаления нежелательных волос. Кроме того, увеличение уровня экспрессии ТРФ-β также было связано с незрелостью меланоцитов вследствие снижения уровня экспрессии ассоциированного с микрофтальмией транскрипционного фактора (MITF, англ.: microphthalmia-associated transcription factor), а также меланогенных генов, приводящей к седым волосам (Nishimura et al., 2010). Соответственн, пептиды согласно настощему изобретению имеют большой потенциал для таких применений как депигментация темных пятен или осветление кожи.
[00045] Кожные теги (ST, англ: skin tags), мягкие фибромы, фиброэпителиальные полипы или акрохордоны представляют собой альтернативные термины для описания распространенного доброкачественного состояния кожи, которое состоит из кусочка кожи, выступающего от окружающей кожи. Гистологически ST являются полипоидным поражением с налегающим умеренно акантозным эпидермисом, свободным отечным сосудисто-волокнистым ядром, характеризующимся умеренным хроническим воспалением и безжилковой дермой. Кожные теги считаются наиболее распространенными фиброзными поражениями кожи. Несмотря на то, что точная этиология полностью не изучена, была описана связь с ожирением, сахарным диабетом, трением, акромегалией, трансплантацией органов, вирусом папилломы человека и другими состояниями (Zaher et al., 2007). Факторы роста и гормоны, а также их рецепторы играют значительную роль в формировании кожных тегов (Safoury et al., 2010ab). Тот факт, что кожные теги вызваны факторами, стимулирующими пролиферацию эпидермальных кератиноцитов и дермальных фибробластов, соединения, такие как пептиды согласно настоящему изобретению, которые подавляют пролиферацию клеток, потенциально могут быть полезными для замедления прогрессирование и предотвращения образования кожных тегов.
[00046] Следующие примеры включены для демонстрации некоторых предпочтительных вариантов реализации настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Идентификация пептидов, стимулирующих миграцию клеток и закрытие царапаной раны
2
[00047] Кератиноциты кожи человека (АТСС CRL-2404) культивировали в бессывороточной среде для выращивания кератиноцитов с добавлением 5 нг/мл рекомбинантного человеческого эпителиального фактора роста (ЭФР) (Life Technologies, Grand Island, N.Y.). Клетки высевали на 12-луночные планшеты и позволяли достичь 100% слияния. Клеточный монослой выдерживали в условиях недостатка питательных веществ в течение 24 ч, затем получали царапаную рану при помощи наконечника Р200 (200 мкл) пипетки. Царапаные раны промывали и фотографировали в момент времени 0. Пептид добавляли до конечной концентрации 20 мкг/мл. Клетки выдерживали в инкубаторе при 37°С, 5% СО в инкубаторе при влажности >90%, за исключением короткого периода времени при комнатной температуре, когда получали изображения. Закрытие царапаной раны происходило в течение 7-8 ч после обработки и полученные результаты представлены в таблице 1.
Пример 2: Цитотоксичность на нормальных кератиноцитах кожи человека
2
2
[00048] Для того, чтобы убедиться, что пептиды нецитотоксичны для клеток, нормальные кератиноциты эпидермиса человека высевали в 96-луночный планшет.Планшет инкубировали при 37°С в присутствии 5% СО, и клетки оставляли для роста до слияния >95%. Пептиды разбавляли в стоковые растворы с концентрациями 50, 100, 200 и 500 мкг/мл. Культуральную среду для клеток заменяли свежей питательной средой, содержащей пептиды в различных концентрациях, и затем инкубировали при 37°С и 5% СО в течение 24 ч. По окончании обработки измеряли жизнеспособность клеток с использованием набора для МТТ-теста, приобретенного в компании АТСС (Manassas, VA). Результаты представлены в таблице 1. В концентрациях от 50 до 500 мкг/мл пептиды не влияли на жизнеспособность клеток при измерении с применением МТТ-анализа.
Пример 3: Идентификация пептидов, стимулирующих ангиогенез
3
4
2
[00049] Анализ ангиогенеза проводили с применением набора In Vitra Angiogenesis Assay, приобретенного в компании Millipore. Вкратце, матриксный слой готовили с применением раствора ECMATRIX™ в соответствии с инструкциями производителя. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (ЭКПВЧ) (АТСС, Manassas, VA) культивировали в полной среде F12K (АТСС, Manassas, VA) с добавлением 0,1 мг/мл гепарина (Sigma-Aldrich), 30 мкг/мл добавки для роста эндотелиальных клеток (ECGS) (Sigma-Aldrich) и 10% фетальной бычьей сыворотки (АТСС, Manassas, VA). Клетки собирали и ресуспендировали в полной среде. Пептид смешивали с клетками в количестве примерно 5×10-1×10 клеток на лунку в 96-луночном планшете перед посевом клеток на поверхность полимеризованного раствора ECMATRIX™. Планшет инкубировали при 30°С, 5% СО до 9-12 часов. Образование капилляров периодически проверяли с помощью инвертированного светового микроскопа и делали фотографии через 3- и 5-часовые интервалы и присваивали числовые значения каждому типовому признаку, как показано ниже.
[00050] Как показано в таблице 2, SEQ ID №1-7 значимо стимулировали образование капилляров в эндотелиальных клетках пупочной вены человека. Как и было запланировано, LL-37 применяли в качестве положительного контроля, и он также стимулировал ангиогенез. ФСБ применяли в качестве отрицательного контроля, и клетки начинали мигрировать и выстраиваться в линию, но не происходило прорастания или формирования замкнутых многогранников через 5 ч.
Пример 4: Иденификация пептидов, блокирующих ЛТК-индуцируемую экспрессию IL-6
[00051] ЛТК S. aureus индуцировала стимуляцию ИЛ-6 в кератиноцитах эпидермиса человека. Кератиноциты человека выращивали до слияния >80% в бессывороточной среде для выращивания кератиноцитов. ЛТК S. aureus в концентрации 10 мкг/мл предварительно инкубировали с каждым пептидом (50 мкг/мл) при комнатной температуре в течение 30 мин, после этого смесь переносили в культуру кератиноцитов. Обработку проводили в течение 24 ч. Супернатант удаляли. После кратковременного центрифугирования для удаления возможных остатков клеток супернатант подвергали анализу на ИЛ-6 с помощью набора для ИФА, приобретении) в компании CellSciences (Canton, MA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Как показано в таблице 3, SEQ ID №1-7 четко нейтрализовывали или имели антагонистическое воздействие на стимуляцию ЛТК экспрессии ИЛ-6 в кератиноцитах кожи человека.
Пример 5: Идентификация пептидов, модулирующих клеточную пролиферацию и экспрессию ТРФ-β в кератиноцитах кожи человека.
2
[00052] Нормальные кератиноциты кожи человека (АТСС CRL-2404) культивировали в бессывороточной среде для выращивания кератиноцитов с добавлением 5 нг/мл рекомбинантного человеческого эпителиального фактора роста (ЭФР) (Life Technologies, Grand Island, N.Y.). Клетки ежедневно исследовали под микроскопом. При достижении культурой слияния 50-75% из планшета отсасывали среду и добавляли 0,25% трипсина/ЭДТА. Когда клетки становились округлыми и отсоединялись, то нейтрализовали трипсин добавлением свежей культуральной среды. Затем клетки центрифугировали и осадок ресуспендировали в свежей культуральной среде. Для подсчета клеточной суспензии применяли гематоцитометр и общее количество клеток доводили примерно до 500-1000 клеток на лунку путем добавления 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку. Как правило, использовали центральные 60 лунок, а внешние лунки заполняли свежей средой для минимизации испарения. Когда клетки прикреплялись в каждой лунке после инкубации 6-8 ч, в трех повторах добавляли 100 мкл свежей среды, содержащей ФСБ или 2х требуемой концентрации пептида. Микропланшеты инкубировали при 37 градусах Цельсия и 5% СО в течение 48-72 ч.
[00053] В конце инкубации клетки подвергали анализу клеточной цитотоксичности CYTOSCAN™ SRB (GBiosciences, Сент-Луис, штат Миссури) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, клетки фиксировали перед окрашиванием сульфородамином В (SRB). После тщательного промывания краситель растворяли с помощью солюбилизирующего буфера. Поглощение измеряли при 565 нм с применением микропланшетного ридера. Результаты, представленные в таблице 5, представляют собой среднее значение трех обработок, и значения выхоящие за пределы ±10% от контроля, считались значимыми.
[00054] Стимуляцию ТРФ-β проводили в лаборатории Sunny Biodiscovery Lab (Santa Paula, CA). Вкратце, нормальные неонатальные эпидермальные кератиноциты человека выращивали в питательной среде cellnTec для выращивания кератиноцитов (Швейцария). Среда не содержала ТРФ-β в соответствии с информацией от поставщика сред. В день эксперимента питательную среду обновляли и клетки обрабатывали 50 мкг/мл пептида в трех повторах в течение 72 часов. В конце обработки супернатант удаляли, активировали и оценивали количественно, используя набор для ИФА LEGEND МАХТМ total TGF-β1 для определения общего ТРФ-β1 (Biolegend, Sam Diego, CA).
Пример 6: Влияние репрезентативного пептида на структуру псориатической ткани SOR-300-FT человека.
2
[00055] Ткани SOR-300-FT™ переносили в 6-луночные планшеты, содержащие 0,9 мл предварительно подогретой среды для анализа, и уравновешивали в стандартных условиях культивирования (37°С, 5% СО) в течение 1 ч. После уравновешивания в течение 1 ч ткани повторно подкармливали свежей питательной средой, как описано далее: 1) в момент времени 24 ч ткани подкармливали 0,9 мл культуральной среды и 2) для моментов времени >24 ч ткани подкармливали 5 мл культуральной среды путем размещения вставок с клеточной культурой в верхней части устройств для промывки (Part # EPI-WSHR, MatTek Corporation). Затем 50 мкл исследуемых образцов наносили местно на псориатические ткани (n=3), и исследуемые образцы добавляли к культуральной среде в 3-х концентрациях, выбранных заказчиком. В моменты времени 24 и 48 часов: а) ткани местно промывали 3 раза 300-400 мкл ФСБ, Ь) вставки, содержащие ткани, плотно захватывали с стерильным пинцетом и исследуемые образцы аккуратно промывали путем погружения вставки в ФСБ и декантирования среды со вставки, и с) свежие исследуемые образцы повторно наносили на ткань сразу после промывки и декантации (50 мкл местно). Анализ проводили в течение t=72 ч (3Х повторных нанесений). кДНК получали с использованием набора Qiagen RT2 First Strand Kit (cat# 330401). Относительную экспрессию гена измеряли с помощью Qiagen RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (cat# 330502) и праймеров Qiagen RT2. Анализ проводили с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX.
Пример 7: Анализ уровня экспрессии генов на заменителях нормальной кожи человека.
[00056] 84 гена, кодирующих внеклеточные матричные и адгезионные молекулы, анализировали с применением ПЦР-массивов, которые выполняли в компании Sunny Biodiscovery, Inc (Santa Paula, CA). Вкратце, заменители кожи EPIDERM™ (Cat. #EPI-212) получали от MatTek (Ashland, MA) и обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя. После уравновешивания в течение ночи среду заменяли и наносили НВ2233 (330 мкг/мл) или воды в качестве контроля на поверхность ткани кожи в двух повторах и оставляли для обработки в течение 24 часов. После окончания обработки ткани собрали и консервировали в растворе RNAlater (Ambion, Austin, ТХ). РНК экстрагировали и очищали при помощи набора с Illustra mini RNAspin (Cat. #95017-489, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Очищенную общую РНК оценивали при 260 нм и 280 нм на спектрофотометре с диодной матрицей Agilent НР-8452А. Концентрацию РНК выравнивали по образцам и экспрессию генов, представляющих интерес, измеряли посредством количественной ПЦР в режиме реального времени с помощью системы BioRad iCycler iQ Detection System с применением ПЦР-массивов PAHS-121A с набором для синтеза первой цепи. Мастер-микс SYBR Green и условия проведения ПЦР от Qiagen. Эффективность ΔΔCt метода использовали для количественного определения результатов, после нормализации экспрессии генов к 5 генам домашнего хозяйства, выполненные посредством программного обеспечения анализа данных ПЦР-массивов RT2 РrоfilerПЦРArray Data analysis version 3.5. Гены рассматривали как дифференциально экспрессируемые, если уровень экспрессии был достаточно высоким (менее 30 циклов для обнаружения) и модуляция составляла 1,5 или более в каждой серии дублей.
[00057] Все композиции или способы, описанные и заявленные в настоящем документе, могут быть получены и осуществлены без излишних экспериментов в свете настоящего описания. Несмотря на то, что композиции и способы согласно настоящему изобретению были описаны в терминах предпочтительных вариантов реализации, специалистам в данной области техники будет очевидно, что изменения могут быть применены к композициям и/или способам и стадиям или последовательности стадий способов, описанных в настоящей заявке, без отступления от концепции, сущности и объема настоящего изобретения. Конкретнее, будет очевидно, что определенные агенты, которые являются как химически, так и физиологически связанными, могут быть заменены на агенты, описанные в настоящем документе, если будут достигнуты такие же или аналогичные результаты. Все такие подобные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются входящими в объем настоящего изобретения.
[00058] Полное содержание всех патентов и публикаций, указанных в настоящей заявке, включено в настоящее описание посредством ссылки.
Ссылки
[00059] Ayehunie S., Hedin С., et al., (2012) development and characterization of 3D psoriatic tissue model. TR#702. pl-5. Society of investigative dermatology Meeting 2012.
[00060] Bacon K, Baggiolini M, et al., (2003) Chemokine/chemokine receptor, nomenclature. Cytokine; 21: 48-9.
[00061] Behm B, Babilas P, et al., (2012) Cytokines, chemokines and growth factors in wound healing. J Eur Acad Dermatol Venereol. 26(7): 812-20.
[00062] Bieber T. Atopic dermatitis. (2008) New Engl J Med. 358(14): 1483-1494.
[00063] Braunstein, S, Kaplan, G, Gottlieb, AB, et al: ГМ-КСФ activates regenerative epidermal growth and stimulates keratinocyte proliferation in human skin in vivo. J Invest Dermatol 1994, 103: 601-604.
[00064] Coffelt SB, Waterman RS, et al., (2008). Ovarian cancers overexpress the antimicrobial protein hCAP-18 and its derivative LL-37 increases ovarian cancer cell proliferation and invasion. Int J Cancer. 2008; 122(5): 1030-1039.
[00065] Dombrowski Y, Schauber J, (2012). Cathelicidin LL-37: a defense molecule with a potential role in psoriasis pathogenesis. Exp Dermatol. 21(5): 327-30.
[00066] Enoch S, and Price P (2004). Cellular, molecular and biochemical differences in the pathophysiology of healing between acute wounds, chronic wounds and wounds in the aged. World Wide Wounds. (worldwidewounds.com/2004/august/Enoch/Pathophysiology-Of-Healing.html).
[00067] Foitzik K, Lindner G, et al., (2000). Control of murine hair follicle regression (catagen) by TGF-β1 in vivo. FASEB J. 14: 752-760.
[00068] Folkman J, Shing Y (1992). Review Angiogenesis. J Biol Chem. 1992 Jun 5; 267(16): 10931-4.
[00069] Galiano RD, Tepper OM, Pelo CR, et al., (2004). Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. Am J Pathol. Jun; 164(6): 1935-47.
[00070] Ganguly D, Chamilos G, Lande R, et al, (2009). Self-RNA-antimicrobial peptide complexes activate human dendritic cells through TLR7 and TLR8. J Exp Med. Aug 31; 206(9): 1983-94.
[00071] Gangavarapu P, Rajagopalan L, Kolli D, et al., (2012). The monomer-dimer equilibrium and glycosaminoglycan interactions of chemokine CXCL8 regulate tissue-specific neutrophil recruitment. J Leukoc Biol. 91(2): 259-65.
[00072] Gilliet M and Lande R (2008). Antimicrobial peptides and self-DNA in autoimmune skin inflammation. Curr Opin Immunol. 20(4): 401-7.
[00073] Gillitzer R and Goebeler M (2001). Review Chemokines in cutaneous wound healing. J Leukoc Biol. 69(4): 513-21.
[00074] Handel TM, Johnson Z, Crown SE, et al., (2005). Review Regulation of protein function by glycosaminoglycans--as exemplified by chemokines. Annu Rev Biochem.; 74: 385-410.
[00075] Harsha A, Stojadinovic O, Brem H, et al., (2008). ADAM 12: a potential target for the treatment of chronic wounds. J Mol Med (Berl). 86(8): 961-9.
[00076] Heilbora JD, Nilsson MF, et al., (2005). Antimicrobial protein hCAP18/LL-37 is highly expressed in breast cancer and is a putative growth factor for epithelial cells. Int J Cancer. 114(5): 713-719.
[00077] Hoffmann MH, Brans H, et al., (2012). The cathelicidins LL-37 and rCRAMP are associated with pathogenic events of arthritis in humans and rats. Ann Rheum Dis. 2012 Nov 29. [Epub ahead of print]
[00078] Kaplan, G, Walsh, G, Guido, LS, et al: Novel responses of human skin to intradermal recombinant granulocyte/macrophage-colony-stimulating factor: Langerhans cell recruitment, keratinocyte growth, and enhanced wound healing. J Exp Med 1992, 175: 1717-1728.
[00079] Keeley EC, Mehrad B, and Strieter RM (2008). Chemokines as mediators of neovascularization. Arterioscler Thromb Vase Biol. 28(11): 1928-36.
[00080] Keeley EC, Mehrad B, Strieter RM (2011). Chemokines as mediators of tumor angiogenesis and neovascularization. Exp Cell Res. 317(5): 685-90.
[00081] Key K (2003). Arrest chemokines. Microcirculation; 10: 289-95.
[00082] Mann A, Breuhahn K, Schirmacher P, Blessing M. Keratinocyte-derived granulocyte-macrophage colony stimulating factor accelerates wound healing: Stimulation of keratinocyte proliferation, granulation tissue formation, and vascularization. J Invest Dermatol. 2001 Dec; 117(6): 1382-90.
[00083] Lin HY, Tang CH, et al., (2010). Peptidoglycan enhances proinflammatory cytokine expression through the TLR2 receptor, MyD88, phosphatidylinositol 3-kinase/AKT and NF-kappaB pathways in BV-2 microglia. Int Immunopharmacol. 10(8): 883-91.
[00084] Lowes MA, Bowcock AM, Krueger JG (2007). Review Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature. 445(7130): 866-73.
[00085] Nishimura EK, Suzuki M, et al., (2010). Key roles for transforming growth factor beta in melanocyte stem cell maintenance. Cell Stem Cell. 6(2): 130-40.
[00086] Ono SJ, Nakamura T et al., (2003). Chemokines: roles in leukocyte development, trafficking, and effector function. J Allergy Clin Immunol. 111: 1185-99.
[00087] Proudfoot AE (2006). The biological relevance of chemokine-proteoglycan interactions. Biochem Soc Trans. 34(Pt 3): 422-6.
[00088] Raman D, Sobolik-Delmaire T, Richmond A (2011). Chemokines in health and disease. Exp Cell Res. 317(5): 575-89.
[00089] Rees, RS, Robson, MC, Smiell, JM, Perry, BH: Becaplermin gel in the treatment of pressure ulcers: a phase II randomized, double-blind, placebo-controlled study. Wound Repair Regen 1999, 7: 141-147.
[00090] Rogalski С et al., (2002). Extensive striae distensae as a result of topical corticosteroid therapy. Acta Derm Venereol, 83: 54-55.
[00091] Romagnani P, Lasagni L, Annunziato F, et al., (2004). Review CXC chemokines: the regulatory link between inflammation and angiogenesis. Trends Immunol. 25(4): 201-9.
[00092] Rossi D, and Zlotnik A (2000). The biology of chemokines and their receptors. Annu Rev Immunol. 18: 217-42.
[00093] Safoury О El, M Fawzi, et al, (2010a). Increased tissue leptin hormone level and mast cell count in skin tags: A possible role of adipoimmune in the growth of benign skin growths. Indian J Dermatol Venereol Leprol. 76 (5): 538-542.
[00094] Safoury О El, Rashid L, and Ibrahim M, (2010b). A study of androgen and estrogen receptors α, β in skin tags. Indian J Dermatol. 2010 55(1): 20-24.
[00095] Stagno, F, Guglielmo, P, Consoli, U, Fiumara, P, Russo, M, Giustolisi, R: Successful healing of hydroxyurea-related leg ulcers with topical granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 1999, 94: 1479-1480.
[00096]  OE, Follin P, Johnsen et al., (2001). Human cathelicidin, hCAP-18 is processed to the antimicrobial peptide LL-37 by extracellular cleavage with proteinase 3. Blood. 97(12): 3951-3959.
[00097] Sun CL., Zhang FZ et al., (2011). LL-37 expression in the skin in systemic lupus erythematosus. Lupus. 20(9): 904-11.
[00098] Travers JB, Kozman A, Mousdicas N, et al., (2010). Infected atopic dermatitis lesions contain pharmacologic amounts of lipoteichoic acid. J Allergy Clin Immunol. 125(1): 146-52.
[00099] Ulevitch RJ, Tobias PS, (1995). Receptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immunol. 1995; 13: 437-57.
[000100] von Haussen J, Koczulla R, et al., (2008). The host defence peptide LL-37/hCAP-18 is a growth factor for lung cancer cells. Lung Cancer. 59(1): 12-23.
[000101] Voskaridou, E, Kyrtsonis, MC, Loutradi-Anagnostou, A: Healing of chronic leg ulcers in the hemoglobinopathies with perilesional injections of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood 1999, 93: 3568-3569.
[000102] Wheeler H, Black J, Webb S, Shen H, (2012). Dehiscence of corticosteroid-induced abdominal striae in a 14-year-old boy treated with bevacizumab for recurrent glioblastoma. J Child Neurol. 27(7): 927-9.
[000103] Kenshi Yamasaki, Richard L. Gallo, (2009). The molecular pathology of rosacea. Published in final edited form as: J Dermatol Sci. 55(2): 77-81.
[000104] Yamasaki K, Gallo RL (2011). Rosacea as a disease of cathelicidins and skin innate immunity. J Investig Dermatol Symp Proc. Dec; 15(1): 12-5.
[000105] Yamasaki K, Di Nardo A, Bardan A, et al., (2007). Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea. Nat Med. 13(8): 975-80.
[000106] Zaher H, El Safoury OS, El Komy MM, et al., (2007). Mahmoud SB, Abd El Hamid H. Study of mast cell count in skin tags. Indian J Dermatol. 52: 184-7.