СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНЫХ АНТИГЕНОВ В ПОЧВЕ
METHOD FOR EVALUATING BACTERIAL LIPOPOLYSACCHARIDE ANTIGENS IN SOIL

Изобретение относится к способам исследования материалов при помощи иммунологического анализа.
Известен способ твердофазного иммуноферментного анализа для специфической идентификации и подсчета Azospirillum brasilense Cd на корнях злаковых растений, который может быть использован и для определения бактериальных антигенов в почве. Способ заключается в выявлении бактерий с помощью кроличьих антител (Ат) на интактные клетки в бактериальных суспензиях или гомогенатах корней с применением анти-кроличьих Ат, коньюгированных со щелочной фосфатазой (Levanony H., Bashan Y., Kahana Z.E. Enzyme-linked immunosorbent assay for specific identification and enumeration of Azospirillum brasilense Cd in cereal roots // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V.53. P.358-364).
Однако антитела, используемые для реализации известного метода, характеризуются весьма широкой специфичностью и ограниченно пригодны для выявления штаммов азоспирилл, относящихся к определенным серологическим группам. Кроме того, для получения регистрируемых результатов с помощью этого способа требуется долговременная инкубация реагентов с козьими анти-кроличьими антителами, конъюгированными со щелочной фосфатазой (в течение ночи), а время развития ферментативной реакции составляет от 2-х до 24-х часов. При этом используют не стандартные планшеты для иммуноферментного анализа (ИФА), а планшеты для культуры тканей, специально предназначенных для адсорбции клеток.
Известен способ иммуноферментного определения в почве фитопатогенного вируса, заключающийся в иммуноферментном исследовании (сэндвич-методом) вирусных частиц, извлеченных из почвенных образцов с помощью вымывающего буфера, отфильтрованных под вакуумом от частиц почвы через специальный фильтр и переведенных в осадок с помощью ультрацентрифугирования. Сэндвич-метод иммуноферментного определения при этом подразумевает использование специальных дополнительных антител для адсорбции определяемых частиц в лунках планшетов для ИФА (ToMV (Fillhart R.C., Bachand G.D., Castello J.D. Detection of infectious tobamoviruses in forest soils // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V.64. P.1430-1435)).
Однако известный способ не позволяет выявлять вирусы непосредственно в почвенных образцах и требует выполнения дополнительных процедур (фильтрование, ультрацентрифугирование) для выделения и концентрирования вирусных частиц.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является оптимизация условий проведения твердофазного ИФА с использованием Ат на липополисахариды (ЛПС).
Технический результат, достигаемый при использовании заявляемого изобретения, заключается в выявлении антигена, специфичного для почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum, непосредственно в почвенных суспензиях.
Почвенные азотфиксирующие бактерии рода Azospirillum представляют собой признанный модельный объект в исследовании феномена растительно-микробной ассоциативности. Прогресс в их исследовании в качестве потенциальных стимуляторов роста растений в значительной степени зависит от развития быстрых и надежных способов качественного и количественного определения данных микроорганизмов в почве. Выявляющие системы на основе антител являются весьма удобным средством мониторинга разнообразных микроорганизмов, и одним из наиболее эффективных серологических подходов является иммуноферментный анализ - метод выявления антигенов (или антител), основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки.
Поставленная задача решается тем, что способ определения бактериальных липополисахаридных антигенов в почве согласно техническому решению включает получение специфических антител на липополисахариды, приготовление почвенной суспензии с последующей сорбцией бактериальных клеток и липополисахаридов в составе микроосадка из полученной суспензии, проведение иммунноферментного анализа сформированного микроосадка с антителами на липополисахариды с измерением оптической плотности продуктов иммуноферментной реакции, сравнение измеренных значений оптической плотности с контрольными значениями, при этом о наличии бактериальных липополисахаридных антигенов судят по величине отклонения измеренных значений от контрольных на величину не менее 10-15%. Для получения специфических антител на липополисахариды приготавливают суспензию грамотрицательных бактерий в 2%-ном растворе глутарового альдегида, после чего проводят иммунизацию кроликов обработанной суспензией с последующим забором крови и выделением из нее антител в виде фракции иммуноглобулинов класса G. При приготовлении почвенной суспензии образцы почвы ресуспендируют в 0.05-молярном натрий-карбонатном буферном растворе из расчета на 1 часть почвы - 35-45 частей буферного раствора, после чего полученную суспензию титруют последовательными двойными разведениями с использованием вышеупомянутого буферного раствора в лунках планшета для проведения иммуноферментного анализа. При проведении иммуноферментного анализа в лунки с почвенной суспензией вносят по 100 мкл 0.05% раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 15000-25000 в качестве балластного блокирующего соединения, затем удаляют блокирующий раствор, после чего вносят в лунки по 50 мкл специфических антител на липополисахариды, растворенных в забуференном фосфатами физиологическом растворе, содержащем 0.02% Твин-20 и 0.005% полиэтиленгликоля, после многократной промывки лунок, достаточной для избавления от неспецифически связанных антител, вносят по 50 мкл раствора, содержащего 0.02% Твин-20 и 0.005% полиэтиленгликоля, в который были добавлены меченые пероксидазой козьи анти-кроличьи антитела в количестве 1-5 мкг/мл, затем планшеты дважды промывают забуференным фосфатами физиологическим раствором, содержащим 0.02% Твин-20, и в лунки вносят по 50 мкл субстрата для оценки пероксидазной активности, представляющего собой 0.03% орто-фенилендиамина и 0.02% перекиси водорода в 0.1 М натрий-цитратном буфере (рН 4.5). Иммунизацию кроликов проводят внутривенно, при этом животным вводят 6 раз ежедневно суспензию клеток объемом от 0.4 до 1.6 мл, спустя неделю инъекции повторяют 4 раза (ежедневно), используя по 2 мл суспензии, или проводят внутрикожно или подкожно рассредоточенными подкожными инъекциями в область спины, при этом животным вводят 1 мл бактериальной суспензии, предварительно смешанной с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, еженедельно в течение 4 недель или проводят 3 раза с интервалом 2 недели, вводя в подколенные лимфатические узлы, 0.5, 1 и 1.5 мл суспензии клеток, предварительно смешанной с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1; при этом отбор крови проводят через 6 суток после последней иммунизации, антитела получают фракционированием антисыворотки 40% сульфатом аммония с последующим диализом против забуференного фосфатами физиологического раствора. При ресуспендировании образцов почвы сначала проводят разведение образцов почвы из расчета на 1 г почвы - 10 мл 0.05-молярного натрий-карбонатного буфера (рН 9.6), после чего взвесь встряхивают в течение 25-35 сек, затем отбирают 250 мкл взвеси и разводят ее тем же буфером, доводя объем до 1 мл. Для проведения сорбции антигена из полученной почвенной суспензии планшеты с нанесенными образцами почвенной суспензии выдерживают в течение 30-60 мин на виброшейкере при температуре 18-22°, затем выдерживают в течение 18 часов при температуре 4°, после чего производят декантирование суспензии. Изобретение поясняется следующими изображениями.
490
На фиг.1 представлен график значений D опытных и контрольных образцов почвы через 60 мин после внесения в почву бактерий A. brasilense Sp245 (вертикальными стрелками отмечены области значений, использованные при учете результатов).
490
На фиг.2 представлен график значений D опытных и контрольных образцов почвы через 7 суток после внесения в почву бактерий A. brasilense Sp245 (вертикальными стрелками отмечены области значений, использованные при учете результатов).
Sp245
На фиг.3 представлены результаты ИФА образцов почвы (чернозем южный) с использованием Ат на ЛПС после внесения суспензии клеток A.brasilense Sp245.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
В модельных почвенных экспериментах использовали образец почвы чернозема южного, отобранный в Саратовской области.
2
4
2
4
4
4
2
2
4
2
4
660
9
При осуществлении способа использованы антитела, полученные иммунизацией кроликов целыми клетками азоспирилл, поверхность которых предварительно обрабатывали глутаровым альдегидом. При таком способе иммунизации в крови подопытных животных синтезируются антитела, специфичные к O-антигенам бактерий. Культуры клеток выращивали в течение 18 часов на жидкой синтетической малатной среде, содержащей в 1 л: малат Na - 5 г, KHPO - 0.4 г, KHPO - 0.4 г, NaCl - 0.1 г, MgSO - 0.2 г, FeSO·7HO - 0.02 г, NaMoO·2HO - 0.002 г, NHCl - 1 г (рН 6.8-7.0). По окончании культивирования клетки отделяли центрифугированием, отмывали дважды в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР) и переносили в раствор, содержащий 2% глутарового альдегида. Полученную суспензию клеток хранили при температуре +4°С. Непосредственно перед иммунизацией клетки дважды отмывали в ЗФР. Использовали суспензию клеток с оптической плотностью D=0.5 при длине волны света 660 нм в кювете толщиной 1=1 см, чему соответствует их концентрация примерно 10 кл/мл. Иммунизацию животных производят различными способами, например, внутривенным введением суспензии клеток объемом от 0.4 до 1.6 мл. При этом животных иммунизировали 6 раз ежедневно. Через неделю инъекции повторяли 4 раза (ежедневно), используя по 2 мл суспензии. Отбор крови проводили через 6 суток после последней иммунизации. Фракции иммуноглобулинов (IgG) получали из антисывороток осаждением сульфатом аммония. Иммунизация может быть произведена и внутрикожно/подкожно и внутрь лимфатических узлов, однако наиболее оптимальной с точки зрения эффективности дальнейшей реализации способа является иммунизация внутрь лимфатических узлов, заключающаяся в трехкратном введении кроликам с интервалом 2 недели в подколенные лимфатические узлы 0.5, 1 и 1.5 мл суспензии клеток, предварительно смешанной с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Преимущество этой методики определяется меньшими трудозатратами при неизменно высоком титре получаемых специфических антител.
490
Для дальнейшей реализации способа подготавливали почвенную суспензию. Образцы почвы в количестве 1 г тщательно ресуспендировали в 10 мл 0.05-молярного натрий-карбонатного буфера (рН 9.6), после чего полученную суспензию активно встряхивали вручную в течение 30 сек, отбирали 250 мкл взвеси и разводили ее тем же буфером, доводя объем до 1 мл. По 50 мкл последовательных двойных разведении образцов вносили в лунки планшета для иммуноферментного анализа. Анализ всех проб проводили в дупликатах. «Нулевым» контролем, определяющим значение оптической плотности, вычитаемое из всех значений, полученных для индивидуального образца, являлись лунки с натрий-карбонатным буфером, не содержащие антигена. Планшеты с нанесенными образцами выдерживали в течение 30 мин на виброшейкере при комнатной температуре для обеспечения равномерной сорбции антигена из раствора; в половине планшетов иммобилизацию антигена на этом завершали, удалив из них исследуемые суспензии декантированием, а в оставшихся планшетах иммобилизацию проводили в течение ночи (18 ч) при +4°С без перемешивания. На следующем этапе в лунки планшетов вносили по 100 мкл 0.05% раствора полиэтилегликоля-20000 (ПЭГ) в качестве балластного соединения для блокирования свободных связей на полистироле. После удаления блокирующего раствора в лунки вносили по 50 мкл кроличьих анти-ЛПС антител («первых» Ат), растворенных в ЗФР, содержащем 0.02% Твин-20 и 0.005% ПЭГ (для предотвращения неспецифической сорбции антител) (раствор 1). После трехкратной промывки лунок 100 мкл ЗФР, содержащим 0.02% Твин-20 (раствор 2), в них вносили по 50 мкл раствора 1, в который были добавлены меченые пероксидазой козьи анти-кроличьи антитела («Sigma», США) (2 мкг/мл). Планшеты дважды промывали раствором 2 и в лунки вносили по 50 мкл субстрата для оценки пероксидазной активности, представляющего собой 0.03% ОФДА и 0.02% перекиси водорода в 0.1 М натрий-цитратном буфере (рН 4.5). Реакцию останавливали внесением в лунки планшетов по 100 мкл 1-нормального раствора серной кислоты. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны 490 нм (D).
Для выявления специфического бактериального антигена использовали непрямой иммуноферментный анализ - при котором окрашенный продукт появляется в результате взаимодействия комплекса антиген-антитело с анти-иммуноглобулиновыми Ат, конъюгированными с ферментом.
490
490
490
490
Установлено, что даже кратковременная иммобилизация образцов на твердой фазе позволяет получать достоверный результат по выявлению бактерий. Тем не менее, время иммобилизации антигена сказывалось на результатах эксперимента, т.к. разница в итогах 30-минутной и 18-часовой адсорбции составляла примерно 10%. Зависимость величины регистрируемого сигнала от концентрации анализируемого соединения при проведении ИФА практически всегда имеет в той или иной степени нелинейный характер. При этом анализ такого сложного матрикса, как почва, осложняется наличием различных интерферирующих факторов, влияющих на протекание ферментной реакции в каждом конкретном случае. Поэтому отмечают не абсолютные значения D, а разницу значений D опытных и контрольных образцов в областях примерной линейной зависимости значений оптической плотности от степени разведения проб. На фиг.1 и 2 приведены графики, отражающие различия значений D опытных и контрольных образцов почвы через 60 мин (а) и через 7 суток (б) после внесения бактерий A.brasilense Sp245. Математическая обработка результатов состоит в определении выраженной в процентах разницы значений D опытных и контрольных образцов. Разницу значений находят для каждого разведения, конечный результат (фиг.3) представляет собой среднюю величину (среднее арифметическое).
Результаты ИФА почвенных суспензий позволили оценить динамику численности азоспирилл в почве, инокулированной штаммом A. brasilense Sp245.
Пример конкретного выполнения.
9
Заявляемый способ реализован для образцов почвы чернозема южного, отобранного в Саратовской области. В экспериментах по интродукции бактерий в почву использовали штамм A.brasilense Sp245. Бактерии выращивали при 30°С до поздней логарифмической фазы роста в жидкой синтететической малатной среде и отмывали в ЗФР. Поликлональные Ат на ЛПС штамма A. brasilense Sp245 получали иммунизацией кроликов. Образцы почв отбирали в середине августа. Для внесения штамма A. brasilense Sp245 в почву 18-часовую бульонную культуру дважды отмывали в ЗФР и осаждали центрифугированием. Ресуспендированные в ЗФР клетки вносили в лабораторные пластиковые сосуды с почвой (1×10 кл/г почвы). Результаты ИФА почвенных суспензий получены при адсорбции образцов в лунках планшетов в течение ночи, концентрации выявляющих кроличьих антител 50 мкг/мл, концентрации конъюгированных с пероксидазой козьих анти-кроличьих антител 2 мкг/мл и развитии хромофорной реакции в течение 4 мин. Для проведения иммуноферментного анализа в качестве твердой фазы использовали полистироловые 96-луночные планшеты (ООО «Медполимер», г.Санкт-Петербург, Россия). Тестируемые образцы иммобилизовали за счет простой адсорбции. В качестве ферментной метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с козьими анти-кроличьими антителами («Sigma», США). В качестве субстратного реагента использовали орто-фенилендиамин (ОФДА) с перекисью водорода. Интенсивность окрашивания раствора измеряли на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С (ЗАО «ИЛИП», г.Санкт-Петербург, Россия). Изменение численности интродуцированных бактерий оценивали в сравнении с контрольной почвой. Отбор проб проводили через 60 мин, 24 часа (1 сутки), а также через 7, 14, 21 и 28 суток после внесения бактериальной суспензии в почву. Полученные результаты подвергали статистической обработке. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.
Таким образом, заявляемый способ может быть использован как для контроля поведения интродуцированных в почву бактерий и оценки эффективности применения бактериальных удобрений и биокомплексов, так и для исследования воздействия различных факторов на почвенный микробиоценоз.