АНТИТЕЛО ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ С РЕЦЕПТОРОМ ИНТЕРЛЕЙКИНА 4
ANTIBODY FOR SPECIFIC BINDING WITH INTERLEUKIN 4 RECEPTOR

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области биофармацевтики. Конкретнее, настоящее изобретение относится к антителу, которое способно связываться с рецептором интерлейкина 4 (IL-4) (IL-4R), и путям его применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Интерлейкин-4 (IL-4) представляет собой цитокин, вырабатываемый преимущественно активированными T-клетками, моноцитами, базофилами, тучными клетками и эозинофилами. IL-4 вовлечен во множество биологических процессов, и его биологические эффекты, известные в уровне техники, включают в себя стимуляцию пролиферации активированных B-клеток и T-клеток и дифференцировку CD4+ T-клеток в T-хелперные клетки II типа. Более того, исследования показали, что IL-4 обладает множественными эффектами в опосредовании иммунных ответов на заболевания, такие как аллергические заболевания, аутоиммунные заболевания, инфекционные заболевания и опухоли, и обладает терапевтическими эффектами в отношении опухолей, аутоиммунных заболеваний и инфекционных заболеваний и т.п. При этом IL-4 также может регулировать иммунный ответ на введение вакцины. Следовательно IL-4 всегда представлял собой интересный объект для исследования, привлекая обширное внимание.
IL-13 также представляет собой цитокин, вырабатываемый активированными T-клетками, который обладает разными функциями в разных типах клеток, таких как моноциты, B-клетки, тучные клетки и кератиноциты. IL-13 может подавлять высвобождение воспалительных цитокинов и хемокинов из моноцитов, индуцировать пролиферацию и дифференцировку B-клеток и способствовать синтезу IgE. IL-13 и IL-4 имеют много общих свойств относительно биологических функций, включая подавление высвобождения медиаторов воспаления из моноцитов, индуцирование дендритообразного развития макрофагов, содействие экспрессии CD23 на поверхности моноцитов и стимуляцию синтеза иммуноглобулинов B-клетками. В то же время IL-13 также обладает собственными биологическими особенностями, которые в основном включают: содействие дифференцировке моноцитов человека и изменение антигенов на поверхности клетки; индуцирование пролиферации и дифференцировки B-клеток и содействие секреции антител из B-клеток; регуляцию синтеза IgE, таким образом обладая связью с аллергическими реакциями в организме; подавление роста опухолевых клеток; ингибирование репликации HIV; и т.п.
Биологическая активность IL-4 опосредуется специфическим рецептором IL-4 на поверхности клетки (IL-4R, который у человека называют «hIL-4R»). IL-4R человека представляет собой гетеродимер, образованный двумя полипептидными цепями, в которых альфа-цепь (hIL-4Rα, UniProtKB: P24394) характеризуется высокой аффинностью к IL-4. Исследования показали, что альфа-цепь рецептора клеточной поверхности IL-13 (IL-13Rα-цепь) также образует другую форму комплекса IL-4R с IL-4Rα-цепью. Так как IL-4Rα-цепь в комплексе IL-4R играет главную роль в связывании с IL-4 и другими вовлеченными цитокинами, IL-4Rα-цепь в настоящее время изучается в качестве основного объекта. Более того, было клинически доказано, что моноклональные антитела человека к IL-4Rα-цепи являются эффективными в облегчении тяжести и лечении патологических состояний, таких как астма, экзема, атопический дерматит и т.п.
Рецептор интерлейкина 4 человека, как известно, образуется в виде растворимой формы белка (shIL-4Rα, SEQ ID NO: 94), который подавляет пролиферацию клеток, опосредованную IL-4, и повышающую регуляцию IL-5, опосредованную T-клетками. Две формы рецептора являются ассоциированными с аллергической реакцией, которая проявляется в виде заболеваний, таких как аллергический ринит, синусит, астма, экзема и т.д. Следовательно, блокирующие антитела, которые нацеливаются на белок, могут помочь в лечении и облегчении тяжести указанных заболеваний.
Астма представляет собой хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, при котором вовлечено много воспалительных клеток, таких как эозинофилы, тучные клетки и лимфоциты, а ее конкретный патогенез все еще неясен. Так как цитокины, такие как IL-4, играют важную роль в возникновении и развитии бронхиальной астмы, разработка антител, специфичных в отношении IL-4, является одним из эффективных путей лечения астмы. Ингибирование IL-4/IL-4Rα может иметь эффективный иммуномодулирующий эффект в отношении астмы.
Аллергический ринит (AR) характеризуется патогенезом, во многом общем с патогенезом астмы и, как и астма, принадлежит к аллергии I типа. При этом в ходе исследований было обнаружено, что IL-4, IL-17 и IgE играют важную роль в патогенезе аллергического ринита. На текущий момент лекарственная терапия имеет приоритет в отношении лечения AR, в котором интраназальные кортикостероиды и антигистаминные средства занимают центральную позицию.
Атопический дерматит (AD), также известный как гетеротопный дерматит, или наследственный аллергический дерматит, представляет собой общеизвестное дерматологическое заболевание, которое наиболее часто встречается у детей и подростков и часто усложняется определенными наследственными аллергическими заболеваниями, такими как аллергический ринит, астма и т.п. Вовлечение иммунологических факторов, таких как IL-4 и IL-13, является одним из основных причин патогенеза.
Эозинофильный эзофагит (EoE) представляет собой хроническое иммуновоспалительное заболевание, характеризующееся инфильтрацией эозинофилов (EOS) во всех слоях пищевода. Проявление EoE связано с дисфункцией Th2-клеток. В настоящее время протоколы с высокой специфичностью, такие как новое биологическое средство, направленное на IL-5 (такое как меполизумаб), начали пользоваться большой популярностью в исследованиях. Несмотря на то, что посредством иммуномодулирующей терапии были достигнуты результаты в животных моделях, остается необходимость в исследованиях с клиническими испытаниями с участием людей. Лекарственные препараты, такие как ингибиторы PGD2, антитела к TNF-α и антитела к IL-13, в настоящее время находятся на этапе исследования.
Лекарственные препараты на основе моноклональных антител, нацеливающиеся на hIL-4R, на данный момент вошли в этап клинических испытаний, например, дупилумаб, который показал хорошую эффективность в фазе II клинического испытания в отношении атопического дерматита. В дополнение к дупилумабу другие моноклональные антитела к hIL-4R были заявлены в патентных заявках компаниями, например, патент US 7186809 и патент US 7638606.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предусматривает антитело, специфичное к IL-4R, которое получено с помощью скрининга и оптимизации, и при этом антитело может служить в качестве блокирующего связывание IL-4 с IL-4R средства и может применяться для лечения воспалительных или аллергических заболеваний посредством связывания с IL-4R.
Со ссылкой на нумерацию аминокислотных остатков последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 58, антитело по настоящему изобретению содержит серин в положении 31 (31Ser) вариабельной области легкой цепи, содержащейся в нем, и со ссылкой на нумерацию аминокислотных остатков последовательности, изложенной под SEQ ID NO: 93, антитело содержит аспарагиновую кислоту в положении 103 (103Asp) и тирозин в положении 104 (104Tyr) вариабельной области тяжелой цепи, содержащейся в нем. При этом 31Ser расположен в CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела по настоящему изобретению соответственно, а 103Asp и 104Tyr расположены в CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению соответственно.
Предпочтительно вариабельная область легкой цепи антитела по настоящему изобретению содержит CDR1, изложенную под SEQ ID NO: 2, и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит CDR3, изложенную под SEQ ID NO: 19.
Предпочтительно вариабельная область легкой цепи антитела по настоящему изобретению содержит комбинацию CDR1, CDR2 и CDR3, выбранных из группы, состоящей из:
(1) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 5;
(2) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 5;
(3) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 6;
(4) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 7;
(5) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 8;
(6) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 6;
(7) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 7; и
(8) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 8; и
вариабельная область тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению содержит комбинацию CDR1, CDR2 и CDR3, выбранных из группы, состоящей из:
(1) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 14, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 17, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19;
(2) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 14, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 18, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19;
(3) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 15, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 17, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19;
(4) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 15, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 18, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19;
(5) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 16, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 18, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19; и
(6) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 16, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 17, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19.
Более предпочтительно антитело по настоящему изобретению содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в виде следующих последовательностей: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 57, и антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в виде следующих последовательностей: SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 91 и SEQ ID NO: 92.
Более предпочтительно антитело по настоящему изобретению содержит комбинацию вариабельной области легкой цепи, и вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из:
(1) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(2) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 63;
(3) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 59;
(4) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 60;
(5) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 61;
(6) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 67;
(7) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 65;
(8) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 66;
(9) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 64;
(10) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(11) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 74;
(12) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 75;
(13) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 76;
(14) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 77;
(15) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 78;
(16) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 80;
(17) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 40, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(18) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 41, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(19) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(20) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(21) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(22) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 49, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(23) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 50, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(24) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 45, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(25) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 46, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(26) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 47, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(27) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(28) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(29) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(30) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(31) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(32) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91; и
(33) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 51, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело, которое может связываться с рецептором интерлейкина 4 (IL-4) (IL-4R). Антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL), а вариабельная область легкой цепи содержит комбинацию CDR1, CDR2 и CDR3, выбранную из группы, состоящей из:
(1) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 1, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 5;
(2) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 5;
(3) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 5;
(4) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 1, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 5;
(5) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 6;
(6) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 7;
(7) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 8;
(8) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 1, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 6;
(9) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 6;
(10) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 2, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 8;
(11) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 1, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 4, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 8 и
(12) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 1, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 3, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 8;
и/или
антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), и вариабельная область тяжелой цепи содержит комбинацию CDR1, CDR2 и CDR3, выбранную из группы, состоящей из:
(1) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 14, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 17, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19;
(2) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 14, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 18, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19;
(3) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 14, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 17, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 20;
(4) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 14, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 18, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 20;
(5) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 15, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 17, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19;
(6) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 16, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 17, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19; и
(7) CDR1, изложенной под SEQ ID NO: 14, CDR2, изложенной под SEQ ID NO: 18, и CDR3, изложенной под SEQ ID NO: 19.
Далее, что касается каркасных областей антитела по настоящему изобретению, описанного выше, вариабельная область легкой цепи антитела по настоящему изобретению предпочтительно содержит комбинацию FR1, FR2, FR3 и FR4, выбранную из группы, состоящей из:
(1) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 9, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 10, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 12, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 13; и
(2) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 9, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 11, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 12, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 13.
Предпочтительно вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит комбинацию FR1, FR2, FR3 и FR4, выбранную из группы, состоящей из:
(1) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 21, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(2) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 22, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(3) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 23, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(4) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 24, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(5) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 24, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 35, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(6) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 25, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(7) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 26, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(8) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 27, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(9) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 29, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(10) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 30, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(11) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 24, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 33, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(12) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 24, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 36, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(13) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 24, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 37, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(14) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 31, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(15) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 27, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 35, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(16) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 26, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 35, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(17) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 25, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 35, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(18) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 28, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 35, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(19) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 28, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 34, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(20) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 23, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 35, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38;
(21) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 22, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 35, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38; и
(22) FR1, изложенной под SEQ ID NO: 21, FR2, изложенной под SEQ ID NO: 32, FR3, изложенной под SEQ ID NO: 35, и FR4, изложенной под SEQ ID NO: 38.
В соответствии с составом домена вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи антитела, известного из уровня техники, вариабельная область легкой цепи или вариабельная область тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению содержит вышеуказанные компоненты домена в порядке FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 или содержит вышеуказанные компоненты домена в порядке (X)n-FR1-(X)n-CDR1-(X)n-FR2-(X)n-CDR2-(X)n-FR3-(X)n-CDR3-(X)n-FR4-(X)n, в котором X представляет собой любой аминокислотный остаток, и n представляет собой ноль или целое число, которое больше чем ноль.
Предпочтительно антитело, предусмотренное настоящим изобретением, содержит вариабельную область легкой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в виде следующих последовательностей:
SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58;
и/или
антитело, предусмотренное настоящим изобретением, содержит вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из аминокислотных последовательностей, представленных в виде следующих последовательностей:
SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 и SEQ ID NO: 93.
В соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения антитело, предусмотренное настоящим изобретением, содержит комбинацию вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из:
(1) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(2) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 63;
(3) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 59;
(4) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 60;
(5) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 61;
(6) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 67;
(7) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 65;
(8) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 66;
(9) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 64;
(10) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 68;
(11) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 69;
(12) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 70;
(13) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 71;
(14) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 72;
(15) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 73;
(16) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 89;
(17) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 88;
(18) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 87;
(19) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 86;
(20) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 83;
(21) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 82;
(22) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 81;
(23) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 85;
(24) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 84;
(25) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(26) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 90;
(27) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 74;
(28) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 75;
(29) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 76;
(30) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 77;
(31) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 78;
(32) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 80;
(33) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 39, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(34) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 40, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(35) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 41, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(36) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 42, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(37) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 43, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(38) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(39) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(40) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 68;
(41) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 72;
(42) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 82;
(43) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 85;
(44) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(45) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 48, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(46) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 49, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(47) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 50, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(48) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 45, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(49) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 46, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(50) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 47, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(51) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 56, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(52) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(53) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(54) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 68;
(55) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 72;
(56) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 82;
(57) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 85;
(58) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(59) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(60) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(61) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 68;
(62) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 72;
(63) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 82;
(64) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 85;
(65) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 54, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(66) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 53, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(67) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 51, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(68) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 52, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(69) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 52, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 62;
(70) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 52, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(71) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 58, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 92;
(72) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 57, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 93;
(73) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 44, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 93;
(74) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 58, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 91;
(75) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 55, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 93; и
(76) вариабельной области легкой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 51, и вариабельной области тяжелой цепи, изложенной под SEQ ID NO: 93.
Антитело, предусмотренное настоящим изобретением, способно связываться с IL-4R и функционирует как антагонист IL-4R. Предпочтительно антитело способно связываться с IL-4Rα, предпочтительно с IL-4Rα млекопитающих, более предпочтительно с IL-4Rα человека, еще более предпочтительно с растворимым IL-4Rα человека.
аффинность связывания антитела, предусмотренного настоящим изобретением, с IL-4Rα можно определить с помощью способа Biacore или ELISA. Было определено, что антитело связывает IL-4Rα с аффинностью, которая составляет менее 100 нМ, менее 10 нМ, менее 1 нМ, менее 0,5 нМ и даже менее 0,1 нМ.
В одинаковых условиях отношение уровня экспрессии антитела, предусмотренного настоящим изобретением, к уровню экспрессии эталонного антитела составляет 0,1-3:1, предпочтительно 0,3-3:1, более предпочтительно 0,4-3:1, более предпочтительно 0,5-3:1, еще более предпочтительно 0,6-3:1, более предпочтительно 0,7-3:1, еще более предпочтительно 1-3:1.
В отношении типа антитела, антитело, предусмотренное настоящим изобретением, может представлять собой моноклональное антитело, полностью или частично гуманизированное антитело или химерное антитело.
Или предпочтительно антитело представляет собой иммуноглобулин, предпочтительно IgA, IgD, IgE, IgG или IgM, более предпочтительно подтипа IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, еще более предпочтительно подтипа IgG2 или IgG4.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает слитый белок или конъюгат, содержащий антитело по настоящему изобретению. Слитый белок или конъюгат могут дополнительно содержать рецептор клеточной поверхности, активный белок или активный полипептид, низкомолекулярное соединение, такое как аминокислота и сахарид, низкомолекулярный полимер или другие части, химически модифицирующие антитело и т.д., связанные с антителом по настоящему изобретению с помощью химических или физических способов.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает последовательность нуклеиновой кислоты, которая может кодировать вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела, предусмотренного настоящим изобретением.
Предпочтительно последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать тяжелую цепь и/или легкую цепь антитела, предусмотренного настоящим изобретением.
В еще одном аспекте настоящее изобретение также предусматривает вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, предусмотренную настоящим изобретением. Вектор может представлять собой эукариотический вектор экспрессии, прокариотический вектор экспрессии, искусственную хромосому, фаговый вектор или т.п.
Вектор или последовательность нуклеиновой кислоты, описанные выше, можно применять для трансформации или трансфекции клеток-хозяев в целях сохранения или экспрессии антитела и т.п. Соответственно, настоящее изобретение также предусматривает клетку-хозяина, трансформированную или трансфицированную с помощью последовательности нуклеиновой кислоты или вектора. Клетка-хозяин может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку, например, бактериальную клетку или клетку насекомого, гриба, растения или животного.
Антитело, предусмотренное настоящим изобретением, может быть получено с помощью любого способа, известного из уровня техники. Например, сначала вариабельная область тяжелой цепи и/или вариабельная область легкой цепи антитела или тяжелая и/или легкая цепь антитела могут быть получены из последовательности нуклеиновой кислоты, предусмотренной настоящим изобретением, а затем собраны в антитело с любым другим доменом антитела; или клетку-хозяина, предусмотренную настоящим изобретением, культивируют в условиях, при которых клетка-хозяин может экспрессировать вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи антитела или тяжелую и/или легкую цепь антитела для сборки в антитело.
Необязательно способ дополнительно включает стадию выделения полученного антитела.
Антитело, слитый белок или конъюгат, последовательность нуклеиновой кислоты, вектор или клетка-хозяин, предусмотренные настоящим изобретением, или антитело, полученное с помощью способа, описанного выше, могут содержаться в фармацевтической композиции и, более конкретно, в фармацевтическом препарате для различных целей, согласно фактической необходимости. Следовательно, в дополнительном аспекте настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело, слитый белок или конъюгат, последовательность нуклеиновой кислоты, вектор, клетку-хозяина по настоящему изобретению и/или антитело, полученное с помощью способа, описанного выше.
Необязательно фармацевтическая композиция может представлять собой фармацевтический препарат. Фармацевтический препарат представляет собой, например, инъекционный раствор.
Фармацевтическая композиция или фармацевтический препарат могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество, в зависимости от конкретной лекарственной формы.
Фармацевтическая композиция или фармацевтический препарат также могут содержать по меньшей мере один из следующих лекарственных препаратов: антиастматические средства, такие как альбутерол и т.д., антигистаминные средства, такие как лоратадин и т.д., иммуносупрессивные средства, такие как такролимус и пимекролимус и т.д., блокаторы М-рецептора, такие как ипратропия бромид и т.д., блокаторы рецептора лейкотриена, такие как монтелукаст и т.д., ингибиторы фосфодиэстеразы, такие как теофилин и т.д., нестероидные противовоспалительные лекарственные средства, такие как 5-аминосалициловая кислота и т.д., гормоны, такие как беклометазон и будесонид и т.д., другими словами, антитело, слитый белок или конъюгат, последовательность нуклеиновой кислоты, вектор, клетка-хозяин, предусмотренные настоящим изобретением, или антитело, полученное с помощью способа по настоящему изобретению, описанного выше, можно применять в комбинации с другими лекарственными препаратами при необходимости.
В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение также предусматривает применение антитела, слитого белка или конъюгата, последовательности нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина или антитела, полученного с помощью способа изготовления лекарственного препарата для предупреждения, лечения или облегчения тяжести воспалительного или аллергического заболевания.
Предпочтительно воспалительное или аллергическое заболевание предусматривает аутоиммунное заболевание, такое как аллергический дерматит, астма, эозинофильный эзофагит, экзема, аллергический ринит, носовой полип, ревматоидный артрит и т.п.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ предупреждения, лечения или облегчения тяжести воспалительного или аллергического заболевания, и при этом способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела, слитого белка или конъюгата, последовательности нуклеиновой кислоты, вектора, клетки-хозяина, предусмотренных настоящим изобретением и/или антитела, полученного с помощью способа по настоящему изобретению.
Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее, более предпочтительно субъект представляет собой человека.
Предпочтительно воспалительное или аллергическое заболевание предусматривает аутоиммунное заболевание, такое как аллергический дерматит, астма, эозинофильный эзофагит, экзема, аллергический ринит, носовой полип, ревматоидный артрит и т.п.
Другие лекарственные препараты можно применять в комбинации для предупреждения, лечения или облегчения тяжести воспалительного или аллергического заболевания, например, способ дополнительно включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, по меньшей мере одного лекарственного препарата, выбранного из группы, состоящей из: антиастматических средств, таких как альбутерол и т.д., антигистаминных средств, таких как лоратадин и т.д., иммуносупрессивных средств, таких как такролимус и пимекролимус и т.д., блокаторов М-рецепторов, таких как ипратропия бромид и т.д., блокаторов рецепторов лейкотриенов, таких как монтелукаст и т.д., ингибиторов фосфодиэстеразы, таких как теофилин и т.д., нестероидных противовоспалительных леакрственных средств, таких как 5-аминосалициловая кислота и т.д., гормонов, таких как беклометазон и будесонид и т.д.
Предпочтительно лекарственный препарат вводят одновременно или последовательно с антителом, слитым белком или конъюгатом, последовательностью нуклеиновой кислоты, вектором, клеткой-хозяином, предусмотренными настоящим изобретением, и/или антителом, полученным с помощью способа по настоящему изобретению.
В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение также предусматривает набор, и при этом набор содержит антитело, слитый белок или конъюгат, последовательность нуклеиновой кислоты, вектор, клетку-хозяина, предусмотренные настоящим изобретением, и/или антитело, полученное с помощью способа по настоящему изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Настоящее изобретение может быть более простым для понимания в комбинации с неограничивающими вариантами осуществления по настоящему изобретению и прилагаемыми графическими материалами, в которых представлено следующее.
На фигуре 1 показаны фармакокинетические кривые, полученные с применением антител по настоящему изобретению, у мыши.
На фигуре 2 показаны фармакокинетические кривые, полученные с применением антител по настоящему изобретению, у макака-крабоеда.
На фигуре 3 представлены панели 3A-3C, на которых показано специфическое связывание антител по настоящему изобретению с клетками TF-1, экспрессирующими IL-4Rα, определенное с помощью FACS, где на панели 3A показан сигнал флуоресценции без добавления антитела L1012H1031 по настоящему изобретению; на панели 3B показан сигнал флуоресценции с добавлением антитела L1012H1031 по настоящему изобретению; на панели 3C показано наложение сигналов панелей 3A и 3B для сравнения.
На фигуре 4 представлены панели 4A-4D, на которых показано, что специфическое связывание антител по настоящему изобретению с клетками TF-1, экспрессирующими IL-4Rα, блокировано sIL-4Rα, что присутствует в системе, как определено с помощью FACS, где на панели 4A показан сигнал флуоресценции без добавления антитела L1012H1031 по настоящему изобретению; на панели 4B показан сигнал флуоресценции с добавлением антитела L1012H1031 по настоящему изобретению; на панели 4C показан сигнал флуоресценции с добавлением антитела L1012H1031 по настоящему изобретению и sIL-4Rα; и на панели 4D показано наложение сигналов панелей 4A-4C для сравнения.
На фигуре 5 представлены панели 5A-5B, на которых показан эффект антител по настоящему изобретению в отношении подавления высвобождения TARC и MDC, определенный с помощью ELISA, где на панели 5A показан результат, заключающийся в том, антитело L1020H1031 по настоящему изобретению подавляет высвобождение TARC, и на панели 5B показан результат, заключающийся в том, что антитело L1020H1031 по настоящему изобретению подавляет высвобождение MDC.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Настоящее изобретение будет дополнительно детально описано в комбинации с конкретными вариантами осуществления в дальнейшем. Специалистам в данной области техники следует принимать во внимание, что предусмотренные варианты осуществления применяются только для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Все экспериментальные способы в следующих примерах являются традиционными способами если не указано иное. Исходные материалы, применяемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными, полученными из обычных запасов биохимических реагентов, если не указано иное.
В следующих примерах антитела, показанные в таблице 1, и их эффекты представлены в качестве примера и являются проверенными.
Таблица 1. Антитела, приводимые в качестве примера, предусмотренные настоящим изобретением
Пример 1. Получение антител по настоящему изобретению и определение уровней экспрессии с помощью электрофореза в SDS-PAGE-геле в невосстанавливающих условиях
Последовательность, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, вставляли в вектор pFUSE2ss-CLIg-hK (Invivogen, номер по каталогу: pfuse2ss-hclk) с применением сайтов рестрикции EcoRI и BsiWI с конструированием вектора экспрессии легкой цепи. Последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи антитела, вставляли в вектор pFUSEss-CHIg-hG2 (Invivogen, номер по каталогу: pfusess-hchg2) или вектор pFUSEss-CHIg-hG4 (Invivogen, номер по каталогу: pfusess-hchg4) с применением сайтов рестрикции EcoRI и NheI с конструированием вектора экспрессии тяжелой цепи.
6
Культивирование и трансфекцию клеток Expi293 проводили в соответствии с руководством набора системы экспрессии Expi293™ от Invitrogen (номер по каталогу: A14635). Плотность клеток доводили до 2×10 клеток/мл для трансфекции и добавляли на каждый мл культуры клеток 0,6 мкг вектора экспрессии легкой цепи, описанного выше, и 0,4 мкг вектора экспрессии тяжелой цепи, описанного выше, а надосадочную жидкость из культуры собирали через четыре дня.
Культуральную надосадочную жидкость подвергали электрофорезу в SDS-PAGE-геле в невосстанавливающих условиях в соответствии с протоколом, описанным в Appendix 8, the Third edition of the "Molecular Cloning: A Laboratory Manual".
Изображения получали с помощью сканирующей системы для получения изображений геля от BEIJING JUNYI Electrophoresis Co., LTD и количественную оценку для определения уровней экспрессии антител после временной трансфекции проводили в геле с применением программного обеспечения Gel-PRO ANALYZER . Результаты выражали относительно уровня экспрессии контрольного антитела 1 (контрольное антитело 1 конструировали в соответствии с патентом US 7186809, которое содержит вариабельную область легкой цепи, изложенную под SEQ ID NO: 10 из патента US 7186809, и вариабельную область тяжелой цепи, изложенную под SEQ ID NO: 12 из патента US 7186809, то же самое ниже) (контрольное антитело 2 конструировали в соответствии с патентом US 7638606, которое содержит вариабельную область легкой цепи, изложенную под SEQ ID NO: 6 из патента US 7638606, и вариабельную область тяжелой цепи, изложенную под SEQ ID NO: 42 из патента US 7638606, то же самое ниже). Что касается результатов, см. таблицы 2a-2c ниже.
Таблица 2a. Уровни экспрессии антител по настоящему изобретению после временной трансфекции (антител, уровни экспрессии которых значительно выше, чем уровни экспрессии контрольного антитела 1)
Таблица 2b. Уровни экспрессии антител по настоящему изобретению после временной трансфекции (антител, уровни экспрессии которых немного ниже, чем уровень экспрессии контрольного антитела 1)
Таблица 2c. Уровни экспрессии антител по настоящему изобретению после временной трансфекции (антител, уровни экспрессии которых значительно ниже, чем уровень экспрессии контрольного антитела 1)
Пример 2. Выявление подавляющего эффекта антител по настоящему изобретению в отношении пролиферации клеток TF-1 с помощью hIL-4 или hIL-13
1. Получение реагентов
Раствор hIL-4 (Invivogen, номер по каталогу: rhil-4): hIL-4 растворяли в 100 мкл PBS, содержащего 0,1% BSA (Beyotime, номер по каталогу: ST023), с получением раствора с концентрацией 100 мкг/мл, а растворенный hIL-4 распределяли в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл (Nunc) в объеме 5 мкл на пробирку и затем пробирки хранили в холодильнике при -20°C.
Раствор WST-1 (Beyotime, номер по каталогу: C0036): электроноакцепторное средство объемом 5 мл (C0036-2) добавляли к порошку WST-1 (C0036-1) и получали раствор WST-1, когда порошок WST-1 полностью растворялся, затем его распределяли в центрифужные пробирки объемом 1,5 мл (Nunc) в объеме 620 мкл на пробирку и потом пробирки хранили в холодильнике при -20°C.
2. Культура клеток TF-1
5
6
6
2
Замороженные в жидком азоте клетки TF-1 (ATCC: CRL-2003™) извлекали, взбалтывали на водяной бане при 37°C для быстрого растворения. Растворенную суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку объемом 15 мл, а затем в нее добавляли среду 1640 до 10 мл. Пробирку центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость из нее удаляли и клеточные осадки сохраняли и промывали еще раз. 10 мл среды 1640, содержащей 10% FBS и 2 нг/мл GM-CSF (Sino Biological, номер по каталогу: 10015-H01H), добавляли в пробирку и получали плотность клеток, составляющую 1×10-1×10 клеток/мл. Суспензию переносили в колбу для клеточной культуры T75 (Nunc) и клетки статически культивировали в инкубаторе (Thermo) при 37°C, 5% CO. Каждые 2-3 дня суспензию клеток извлекали, центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и клетки ресуспендировали в среде объемом 10 мл. Затем подсчитывали 1×10 клеток и переносили в новую колбу для клеточной культуры T75, и в нее добавляли среду до объема 10 мл. Клетки непрерывно пассировали 2-3 раза для достижения хорошего состояния (клетки были яркими и имели немного неправильную форму при суспендировании по отдельности) для эксперимента по блокированию пролиферации.
3. Получение и очистка антител
a) Образцы культуральной надосадочной жидкости антител по настоящему изобретению:
клетки Expi293 трансфицировали с помощью плазмид, несущих разные группы генов антител, и 200 мкл культуральной надосадочной жидкости извлекали через 4 дня после трансфекции, а затем центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и использовали для эксперимента по блокированию пролиферации.
b) Образцы очищенных антител по настоящему изобретению: для каждого антитела по настоящему изобретению культуральную надосадочную жидкость, клетки которой экспрессируют антитело, пропускали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и затем очищали с помощью колонки для аффинной хроматографии с белком А GE MabSelect Sure (номер по каталогу: 11003494) в системе очистки GE AKTA purifier 10. Очищенное антитело собирали и концентрировали с применением концентратора с ультрафильтрацией Amicon (номер по каталогу: UFC903096) и затем проводили количественную оценку. Антитело разбавляли с помощью PBS до концентрации от 0 до 1 мкг/мл для эксперимента по блокированию пролиферации.
4. Эксперимент по блокированию пролиферации
5
5
2
Выращенные до достаточного состояния клетки в колбе для клеточной культуры T75 извлекали и переносили в центрифужную пробирку объемом 15 мл, которую затем центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли и клеточные осадки ресуспендировали с помощью 10 мл PBS, центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли и клеточные осадки ресуспендировали в 10 мл среды 1640 (без GM-CSF), содержащей 10% FBS, центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость удаляли и клеточные осадки ресуспендировали в 5 мл среды 1640 (без GM-CSF), содержащей 10% FBS. Клетки подсчитывали и плотность клеток доводили до 5×10 клеток/мл с помощью добавления среды. Суспензию клеток добавляли в 96-луночный планшет в объеме 80 мкл на лунку (лунки по внешнему кругу оставляли без клеток для предотвращения испарения). Для каждого антитела по настоящему изобретению 10 мкл очищенного антитела с разными концентрациями или 10 мкл соответствующей культуральной надосадочной жидкости добавляли к клеткам в 96-луночный планшет (в 3 лунки повторности). Затем hIL-4 разбавляли до 50 нг/мл с помощью среды 1640, содержащей 10% FBS, и добавляли в соответствующие лунки в 96-луночном планшете в объеме 10 мкл на лунку так, чтобы конечная плотность клеток составляла 4×10 клеток/мл, концентрация hIL-4 составляла 5 нг/мл и объем в каждой лунке 96-луночного планшета составлял 100 мкл. Вводили группу отрицательного контроля (в 3 лунках повторности), в которой не добавляли hIL-4 или антитело и добавляли только такое же количество клеток и такой же объем среды для культивирования. При этом вводили группу положительного контроля (в 3 лунках повторности) с добавлением hIL-4 в такой же концентрации и такого же объема среды, и в данной группе не добавляли антитело. 200 мкл PBS добавляли в каждую лунку по внешнему кругу 96-луночного планшета для клеточной культуры для предотвращения испарения жидкости во внутреннем круге. 96-луночный планшет для клеточной культуры помещали в инкубатор с 5% CO при 37°C для статического культивирования.
Вышеописанный эксперимент повторяли с помощью такой же процедуры с применением 500 нг/мл hIL-13 (его конечная концентрация составляла 50 нг/мл после добавления в клетки).
5. Статистическая обработка данных
2
После статического культивирования клеток в 96-луночном планшете для клеточной культуры в течение 72 часов в инкубаторе с 5% CO к клеткам в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора WST-1. 96-луночный планшет для клеточной культуры помещали в инкубатор с 5% CO2 при 37°C для дополнительного статического культивирования. 24 ч спустя 96-луночный планшет помещали в Flexstation 3 (Molecular Devices) и считывали значения OD450-OD650.
Для культуральных надосадочных жидкостей антител по настоящему изобретению их значения OD450-OD650 (значение OD) и значения группы положительного контроля и группы отрицательного контроля применяли для расчета степени подавления следующим образом: степень подавления = (значение OD надосадочной жидкости трансфицированных клеток - значение OD группы положительного контроля) / (значение OD группы отрицательного контроля - значение OD группы положительного контроля) × 100%. Результаты блокирующего эффекта антител по настоящему изобретению в отношении пролиферации клеток TF-1 с помощью hIL-4 или hIL-13 показаны в таблицах 3a-3b ниже.
Для очищенных антител по настоящему изобретению с разными концентрациями измеренные данные OD450-OD650 вводили в программное обеспечение prism5, в котором значение группы отрицательного контроля было установлено как самое низкое, значение группы положительного контроля было установлено как самое высокое, и использовали логарифм концентрации антитела. Кривую логарифма концентрации антитела и значения OD450-OD650 аппроксимировали с помощью программного обеспечения prism5. Рассчитанные значения IC50 показаны в таблице 4 ниже.
Таблица 3a. Результаты скрининга подавляющих эффектов антител по настоящему изобретению в отношении активности пролиферации клеток TF-1 (антител с увеличенными уровнями подавления по сравнению с контрольным антителом 1).
Таблица 3b. Результаты скрининга подавляющих эффектов антител по настоящему изобретению в отношении активности пролиферации клеток TF-1 (антител с такими же или сниженными уровнями подавления по сравнению с контрольным антителом 1).
Таблица 4. Данные по активности очищенных антител (600-900 мл) после временной трансфекции
Пример 3. Выявление показателей способности антител по настоящему изобретению к связыванию с sIL-4Rα с применением ELISA
1. Получение реагентов
Раствор sIL-4Rα (PEPRO TECH, номер по каталогу: 200-04R): брали sIL-4Rα и к нему добавляли 1 мл ddH2O, размешивали путем переворачивания и затем получали раствор с концентрацией 100 мкг/мл. Раствор хранили в холодильнике при -20°C после разделения на порции.
Образец для тестирования: для каждого антитела по настоящему изобретению 10 мкл и 2 мкл надосадочной жидкости клеточной культуры клеток Expi293, экспрессирующих антитело после временной трансфекции (среда представляла собой среду экспрессии Expi293, Invitrogen, номер по каталогу: A1435102; суспендирование клеточной культуры проводили в течение 4 дней при 100 об./мин в инкубаторе с 8% CO2) соответственно добавляли к 990 мкл и 998 мкл PBS с получением образцов антител для тестирования при разбавлениях 1:100 и 1:500.
Контрольный образец: в качестве образцов отрицательного контроля культуральную надосадочную жидкость нормальных клеток (нетрансфицированные клетки Expi293; среда представляла собой среду экспрессии Expi293, Invitrogen, номер по каталогу: A1435102; суспендирование клеточной культуры проводили в течение 4 дней при 100 об./мин в инкубаторе с 8% CO2) также разбавляли при 1:100 и 1:500.
2. Выявление с применением ELISA
100 мкл раствора sIL-4Rα с концентрацией 100 мкг/мл добавляли к 9,90 мл PBS, размешивали путем переворачивания и затем получали буфер для иммобилизации антигенов с концентрацией 1,0 мкг/мл. Полученный буфер для иммобилизации антигенов добавляли в 96-луночный планшет ELISA (Corning) в объеме 100 мкл на лунку. 96-луночный планшет ELISA инкубировали в течение ночи в холодильнике при 4°C. На следующий день раствор из него удаляли и PBS, содержащий 2% BSA, добавляли в 96-луночный планшет ELISA ряд за рядом в объеме 300 мкл на лунку. 96-луночный планшет ELISA инкубировали в течение 2 часов в холодильнике при 4°C. Затем PBS, содержащий 2% BSA, удаляли и планшет промывали 3 раза с помощью PBST. Разбавленные антитела для тестирования последовательно добавляли в соответствующие лунки, при этом также добавляли нормальные культуральные надосадочные жидкости в качестве образцов отрицательного контроля. Для каждого образца применяли три дублированные лунки в объеме 100 мкл каждая. Планшет ELISA заворачивали в предохраняющую пленку (или покрывали) и инкубировали в течение 1 ч при 10°C в инкубаторе с постоянной температурой. Затем 96-луночный планшет ELISA извлекали и раствор из него удаляли. После промывания с помощью PBST 3 раза добавляли раствор TMB (Solarbio, номер по каталогу: PR1200) в 96-луночный планшет ELISA ряд за рядом в объеме 100 мкл на лунку. 96-луночный планшет ELISA выдерживали при комнатной температуре в течение 5 минут и сразу же добавляли 2 M раствор H2SO4 для прекращения реакции. 96-луночный планшет ELISA помещали в Flexstation 3 (Molecular Devices), считывали значения OD450 и собирали, рассчитывали и анализировали данные. Результаты выражали относительно аффинности контрольного антитела 1. Что касается результатов, см. таблицы 5a-5c ниже.
Таблица 5a. Значения аффинности антител по настоящему изобретению к sIL-4Rα (антител, значения аффинности которых значительно больше, чем значения аффинности контрольного антитела 1)
Таблица 5b. Значения аффинности антител по настоящему изобретению к sIL-4Rα (антител, значения аффинности которых такие же или немного ниже, чем значения аффинности контрольного антитела 1)
Таблица 5c. Значения аффинности антител по настоящему изобретению к sIL-4Rα (антител, значения аффинности которых значительно ниже чем значения аффинности контрольного антитела 1)
Пример 4. Фармакокинетика антител по настоящему изобретению у мыши
Серии фармакокинетических экспериментов осуществляли на мышах для дополнительного скрининга антител.
Отбирали мышей SPF Balb/c в возрасте 6-8 недель и осуществляли подкожную инъекцию антител (антител по настоящему изобретению или контрольного антитела 2) в дозе 5 мг/кг (массы мыши). Образцы крови собирали в моменты времени перед введением (0 ч) и через 2, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 216, 264, 336 ч после введения. Для забора крови животных анестезировали посредством ингаляции изофлурана, образцы крови брали из глазничного венозного сплетения, и объем образца от каждого животного составлял приблизительно 0,1 мл; через 336 ч после введения животных анестезировали посредством ингаляции изофлурана и затем умерщвляли после забора крови из полой нижней вены.
К образцам крови не добавляли антикоагулянта, а сыворотку выделяли из каждого образца посредством центрифугирования при 1500 g в течение 10 мин при комнатной температуре в течение 2 ч после забора крови. Собранные надосадочные жидкости сразу же переносили в новые маркированные центрифужные пробирки и затем обеспечивали временное хранение при -70°C. Концентрации антител у мышей определяли с помощью ELISA.
1. Получение реагентов
Раствор sIL-4Rα (PEPRO TECH, номер по каталогу: 200-04R): брали sIL-4Rα и к нему добавляли 1 мл ddH2O, размешивали путем переворачивания и затем получали раствор с концентрацией 100 мкг/мл. Раствор хранили в холодильнике при -20°C после разделения на порции.
Образец для тестирования: 1 мкл сыворотки, собранной в разные моменты времени, добавляли к 999 мкл PBS, содержащего 1% BSA, с получением образца сыворотки для тестирования в разбавлении 1:1000.
Стандартный образец: антитело для тестирования разбавляли до концентрации 0,1 мкг/мл с помощью PBS, содержащего 1% BSA и 0,1% нормальной сыворотки животного (Beyotime, номер по каталогу: ST023). После этого 200, 400, 600, 800, 900, 950, 990 и 1000 мкл PBS, содержащего 1% BSA и 0,1% нормальной сыворотки животного, соответственно добавляли к 800, 600, 400, 200, 100, 50, 10 и 0 мкл антител для тестирования с концентрацией 0,1 мкг/мл, и стандартные образцы антител по настоящему изобретению, таким образом, получали с конечной концентрацией 80, 60, 40, 20, 10, 5, 1 или 0 нг/мл соответственно.
2. Выявление с применением ELISA
250 мкл раствора sIL-4Rα с концентрацией 100 мкг/мл добавляли к 9,75 мл PBS, размешивали путем переворачивания и затем получали буфер для иммобилизации антигенов с концентрацией 2,5 мкг/мл. Полученный буфер для иммобилизации антигенов добавляли в 96-луночный планшет ELISA (Corning) в объеме 100 мкл на лунку. 96-луночный планшет ELISA инкубировали в течение ночи в холодильнике при 4°C после заворачивания в предохраняющую пленку (или покрытия). На следующий день 96-луночный планшет ELISA извлекали и раствор из него удаляли, а PBS, содержащий 2% BSA, добавляли в него в объеме 300 мкл на лунку. 96-луночный планшет ELISA инкубировали в течение 2 часов в холодильнике при 4°C после заворачивания в предохраняющую пленку (или покрытия). Затем 96-луночный планшет ELISA извлекали и раствор из него удаляли, а планшет промывали 3 раза с помощью PBST. Разбавленные стандартные антитела и сыворотку для выявления последовательно добавляли в соответствующие лунки и для каждого образца делали три дублированных лунки в объеме 100 мкл каждая. Планшет ELISA заворачивали в предохраняющую пленку (или покрывали) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем раствор из 96-луночного планшета ELISA удаляли и планшет промывали с помощью PBST 3 раза. Далее раствор TMB (Solarbio, номер по каталогу: PR1200) добавляли в 96-луночный планшет ELISA ряд за рядом в объеме 100 мкл на лунку. 96-луночный планшет ELISA выдерживали при комнатной температуре в течение 5 минут и сразу же добавляли 2 M раствор H2SO4 для прекращения реакции. 96-луночный планшет ELISA затем помещали в Flexstation 3 (Molecular Devices), считывали значения OD450, собирали данные и результаты рассчитывали с помощью программного обеспечения Winnonlin. Результаты фармакокинетических исследований показаны на фигуре 1 и в таблице 6 ниже.
Таблица 6. Результаты фармакокинетических исследований антител по настоящему изобретению у мыши
Пример 5. Фармакокинетика антител по настоящему изобретению у макака-крабоеда
Серии фармакокинетических экспериментов осуществляли на макаках-крабоедах для дополнительного скрининга антител.
Отбирали макаков-крабоедов в возрасте 3-5 лет весом 2-5 кг каждый и осуществляли подкожную инъекцию антител (антител по настоящему изобретению или контрольного антитела 2) в дозе 5 мг/кг (вес макака-крабоеда). Антитело или контрольное антитело 2 для введения тщательно экстрагировали с помощью одноразового обеззараженного шприца и осуществляли многоточечные инъекции подкожно на внутренней стороне бедра животного, и вводимый объем на каждую точку составлял не более 2 мл. Образцы цельной крови собирали из подкожной вены задней конечности животного в моменты времени перед введением (0 h) и через 0,5, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336 ч, 432 ч, 504 ч, 600 ч, 672 ч после введения. Объем крови, собранной от каждого животного, составлял приблизительно 0,1 мл каждый раз.
К образцам крови не добавляли антикоагулянта, а сыворотку выделяли из каждого образца посредством центрифугирования при 1500 g в течение 10 мин при комнатной температуре в течение 2 ч после забора крови. Собранные надосадочные жидкости сразу же переносили в новые маркированные центрифужные пробирки и затем обеспечивали временное хранение при -70°C. Концентрацию антител у макаков-крабоедов определяли согласно способу, описанному в примере 4. Результаты фармакокинетических исследований показаны на фигуре 2 и в таблице 7 ниже.
Таблица 7. Результаты фармакокинетических исследований антител по настоящему изобретению у макака-крабоеда
Пример 6. Выявление связывания антител по настоящему изобретению с клетками TF-1 с применением FACS
1. Клеточная культура
5
6
6
2
Клетки TF-1 (ATCC: CRL-2003™), замороженные в жидком азоте, извлекали, осторожно взбалтывали на водяной бане при 37°C для быстрого растворения. Растворенную суспензию клеток переносили в центрифужную пробирку объемом 15 мл, а затем в нее добавляли среду 1640 (Hyclone, номер по каталогу: SH30809.01B) до 10 мл. Пробирку центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость из нее удаляли и клеточные осадки сохраняли и промывали еще раз. Плотность клеток доводили до 1×10-1×10 клеток/мл с помощью среды 1640, содержащей 10% FBS (Hyclone, номер по каталогу: SV30184.02) и 2 нг/мл GM-CSF (Sino Biological, номер по каталогу: 10015-H01H). Суспензию переносили в колбу для клеточной культуры T75 (Nunc) и клетки статически культивировали в инкубаторе (Thermo) при 37°C, 5% CO. Каждые 2-3 дня суспензию клеток извлекали, центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и клетки ресуспендировали в 10 мл среды. Затем подсчитывали 1×10 клеток и переносили в новую колбу для клеточной культуры T75, и в нее добавляли среду до объема 10 мл. Клетки непрерывно пассировали 2-3 раза для достижения хорошего состояния (клетки были яркими и имели немного неправильную форму при суспендировании по отдельности) для эксперимента.
2. Обработка клеток
6
Брали клетки Tf-1 и подсчитывали их под микроскопом. Клетки делили на три группы и помещали в три центрифужные пробирки объемом 1,5 мл соответственно. Число клеток для каждой группы составляло 1×10. Клетки центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и затем ресуспендировали в 1 мл холодного PBS, содержащего 1% BSA, для повторного промывания. Затем клетки центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и добавляли 45 мкл холодного PBS, содержащего 1% BSA, в каждую центрифужную пробирку для ресуспендирования клеток, а затем 5 мкл (500 мкг/мл) антитела L1021H1031, L1020H1031 или L1012H1031 по настоящему изобретению добавляли в первую центрифужную пробирку, а 5 мкл PBS добавляли во вторую центрифужную пробирку в качестве отрицательного контроля. Клетки оставляли на льду в течение 45 мин и затем центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин. После этого клетки ресуспендировали в 1 мл холодного PBS, содержащего 1% BSA, для повторного промывания и центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин 499 мкл холодного PBS, содержащего 1% BSA, добавляли в каждую центрифужную пробирку для ресуспендирования клеток и затем в нее добавляли 1 мкл FITC-маркированного антитела козы к IgG человека (H+L) (Beyotime, номер по каталогу: A0556). После нахождения на льду в течение 45 мин клетки центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и ресуспендировали в 1 мл холодного PBS, содержащего 1% BSA, для повторного промывания. Таким образом получали клетки для выявления.
3. Выявление с помощью FACS
Прибор FACS и его операционная система работали в соответствии с правильным протоколом. После установки правильных параметров клетки добавляли в трубку для детектирования для выявления сигнала флуоресценции канала FL1. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6, и они показаны на фигуре 3, панели 3A-3C. Можно видеть, что антитела по настоящему изобретению способны специфически связывать клетки TF-1, экспрессирующие IL-4Rα.
Пример 7. Выявление блокирующего эффекта растворимого hIL-4 Rα (sIL-4Rα) в отношении связывания антител с клетками TF-1 с помощью FACS
1. Получение реагентов
Раствор hIL-4 (Invivogen, номер по каталогу: rhil-4) получали, как описано в примере 2.
2. Клеточная культура
Клетки TF-1 (ATCC: CRL-2003™) культивировали, как описано в примере 6.
3. Смешивание sIL-4Rα с антителами по настоящему изобретению
10 мкл (100 мкг/мл) sIL-4Rα и 5 мкл (500 мкг/мл) антитела L1021H1031, L1020H1031 или L1012H1031 по настоящему изобретению смешивали до однородности в центрифужной пробирке объемом 1,5 мл при молярном соотношении 2:1. Смесь 10 мкл PBS и 5 мкл антитела L1021H1031, L1020H1031 или L1012H1031 по настоящему изобретению служила в качестве положительного контроля, и 15 мкл PBS служили в качестве отрицательного контроля. Центрифужные пробирки помещали в инкубатор при 37°C в течение 1 ч.
4. Обработка клеток
6
Брали клетки TF-1 и затем подсчитывали их под микроскопом. Клетки делили на четыре группы и помещали в четыре центрифужные пробирки объемом 1,5 мл соответственно. Число клеток для каждой группы составляло 1×10. Клетки центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и затем ресуспендировали в 1 мл холодного PBS, содержащего 1% BSA, для повторного промывания. Затем клетки центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и добавляли 35 мкл холодного PBS, содержащего 1% BSA, в каждую центрифужную пробирку для ресуспендирования клеток, а затем 15 мкл каждой из разных смесей антител и контроль, полученные на стадии 3, добавляли в пробирки соответственно. После нахождения на льду в течение 45 мин клетки центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и ресуспендировали в 1 мл холодного PBS, содержащего 1% BSA, для повторного промывания, и центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин 499 мкл холодного PBS, содержащего 1% BSA, добавляли в каждую центрифужную пробирку для ресуспендирования клеток, а затем в нее добавляли 1 мкл FITC-маркированного антитела козы к IgG человека (H+L) (Beyotime, номер по каталогу: A0556). После нахождения на льду в течение 45 мин клетки центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин и ресуспендировали в 1 мл холодного PBS, содержащего 1% BSA, для повторного промывания. Таким образом получали клетки для выявления.
5. Выявление с помощью FACS
Прибор FACS и его операционная система работали в соответствии с правильным протоколом. После установки правильных параметров клетки добавляли в трубку для детектирования для выявления сигнала флуоресценции канала FL1. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo 7.6, и они показаны на фигуре 4, панели 4A-4D. Можно увидеть, что sIL-4Rα может специфически и эффективно блокировать специфическое связывание антител по настоящему изобретению с клетками TF-1.
Пример 8. Определение аффинности антитела с помощью Bicore
Антитело к Fc (AHC) человека (GE Healthcare) связывали с чипом CM5, а затем антитело по настоящему изобретению захватывали с помощью AHC. Затем sIL-4Rα человека при разных концентрациях пропускали по поверхности чипа, на которой захватывалось антитело по настоящему изобретению. Для захвата и связывания антитело по настоящему изобретению разбавляли до 2 мкг/мл и антиген sIL-4Rα разбавляли до 0,39, 0,78, 1,56, 3,13, 6,25, 12,5, 25,0, 50,0 и 100,0 нМ. Затем экспериментальный способ устанавливали в программе управления Biacore T200, после чего экспериментальная программа работала с целью выявления. Результаты показаны в таблице 8 ниже.
Таблица 8. Результаты выявления аффинности антитела
Пример 9. Исследование подавляющего эффекта антител по настоящему изобретению в отношении высвобождения TARC и MDC с применением ELISA
6
10 мл свежей крови (от донора) с добавлением гепарина для предотвращения свертывания смешивали с PBS при комнатной температуре в соотношении 1:1 и затем смесь осторожно добавляли к 20 мл раствора для разделения лимфоцитов человека (Solarbio, номер по каталогу: P8610), приготовленного заранее. После центрифугирования при 1500 об./мин в течение 30 мин при комнатной температуре слой PBMC осторожно удаляли и дважды промывали с помощью PBS. Клетки окончательно разбавляли с помощью среды 1640, содержащей 10% FBS и 200 МЕ/мл IL-2 и затем добавляли в 24-луночный планшет в количестве 1×10 клеток на лунку. После этого антитело L1020H1031 с конечной концентрацией 1000, 300, 100, 30 или 10 нг/мл добавляли в каждую лунку с последующим добавлением в них IL-4 с конечной концентрацией 10 нг/мл (или IL-13 с конечной концентрацией 100 нг/мл). Выявление осуществляли в соответствии со способом, предусмотренным набором Human TARC ELISA (Abcam, номер по каталогу: ab183366) или набором Human MDC ELISA (Abcam, номер по каталогу: ab179885), после 72 часов культивирования.
Результаты показаны на фигуре 5, панели 5A-5B, и согласно им антитела по настоящему изобретению могут эффективно подавлять высвобождение TARC и MDC, и подавляющий эффект на высвобождение увеличивается с увеличением концентрации антитела.
Пример 10. Эффект конкретных аминокислот на фармакокинетику и уровни экспрессии антител по настоящему изобретению
Фармакокинетические свойства in vivo антител про настоящему изобретению дополнительно определяли и сравнивали в данном примере с целью исследовать возможные эффекты конкретных аминокислот в конкретных положениях на фармакокинетические свойства антител у животных. Конкретный экспериментальный способ был аналогичен описанному в примере 4, и результаты показаны в таблице 9 ниже.
Таблица 9. Результаты определения фармакокинетических свойств in vivo антител по настоящему изобретению
Что касается конкретной последовательности, аминокислота в положении 103 в последовательности тяжелой цепи H1031 (SEQ ID NO. 91) антитела (в CDR3) представляет собой Asp (103Asp), и аминокислота в положении 104 представляет собой Tyr (104Tyr). По сравнению с антителами, которые не содержат 103Asp и 104Tyr в тяжелой цепи, антитела по настоящему изобретению, которые содержат 103Asp и 104Tyr, характеризуются в 2-4 раза большей площадью под кривой лекарственный препарат-время и на приблизительно 70% сниженной скоростью выведения.
Уровни экспрессии антител по настоящему изобретению также определяли и сравнивали с целью исследовать возможные эффекты конкретных аминокислот в конкретных положениях на экспрессию антител. Культивирование и трансфекцию клеток Expi293 осуществляли в соответствии с примером 1, а собранную культуральную надосадочную жидкость затем пропускали через фильтр с размером пор 0,22 мкм и потом очищали с помощью колонки для аффинной хроматографии с белком А GE MabSelect Sure (номер по каталогу: 11003494) в системе очистки GE AKTA purifier 10. Очищенное антитело собирали и концентрировали с применением трубки концентратора с ультрафильтрацией Amicon (номер по каталогу: UFC903096) и затем проводили количественную оценку. Результаты количественной оценки показаны в таблице 10 ниже.
Таблица 10. Результаты определения уровней экспрессии антител по настоящему изобретению
Что касается конкретной последовательности, аминокислота в положении 31 в последовательности легкой цепи L1012 (SEQ ID NO. 44), L1020 (SEQ ID NO. 55) или L1023 (SEQ ID NO. 51) антитела (в CDR1) представляет собой Ser (31Ser). По сравнению с антителами, которые не содержат 31Ser в легкой цепи, антитела по настоящему изобретению, которые содержат 31Ser, характеризуются в 2-5 раза большим уровнем экспрессии.
Вышеизложенное описание вариантов осуществления настоящего изобретения не предназначено ограничивать настоящее изобретение, и специалисты в данной области техники могут осуществлять различные изменения и вариации в соответствии с настоящим изобретением, которые находятся в пределах объема правовой охраны настоящего изобретения без отступления от его сущности и объема.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  СУЧЖОУ КОННЕКТ БИОФАРМАСЬЮТИКАЛС, ЛТД
<120>  АНТИТЕЛО ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ С РЕЦЕПТОРОМ ИНТЕРЛЕЙКИНА 4
<130>  LC16210014P
<150>  CN2016103992544
<151>  08-06-2016
<160>  94
<170>  PatentIn версия 3.3
<210>  1
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR1-1
<400>  1
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  2
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR1-2
<400>  2
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala
1               5                   10
<210>  3
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR2-1
<400>  3
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr
1               5
<210>  4
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR2-2
<400>  4
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro
1               5
<210>  5
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR3-1
<400>  5
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>  6
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR3-2
<400>  6
Gln Gln Tyr Asp His Ser Pro Pro Trp Thr
1               5                   10
<210>  7
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR3-3
<400>  7
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Ala Gly Trp Thr
1               5                   10
<210>  8
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR3-4
<400>  8
Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala Gly Trp Thr
1               5                   10
<210>  9
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR1-1
<400>  9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210>  10
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR2-1
<400>  10
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Phe
1               5                   10                  15
<210>  11
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR2-2
<400>  11
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  12
<211>  32
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR3-1
<400>  12
Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  13
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR4-1
<400>  13
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  14
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR1-1
<400>  14
Arg Asn Ala Met Phe
1               5
<210>  15
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR1-2
<400>  15
Arg Asn Ala Met His
1               5
<210>  16
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR1-3
<400>  16
Asp Tyr Ala Met Phe
1               5
<210>  17
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR2-1
<400>  17
Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
Arg
<210>  18
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR2-2
<400>  18
Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1               5                   10                  15
Arg
<210>  19
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR3-1
<400>  19
Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>  20
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR3-2
<400>  20
Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp
1               5
<210>  21
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-1
<400>  21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  22
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-2
<400>  22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  23
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-3
<400>  23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  24
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-4
<400>  24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  25
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-5
<400>  25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  26
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-6
<400>  26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  27
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-7
<400>  27
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  28
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-8
<400>  28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  29
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-9
<400>  29
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  30
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-10
<400>  30
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20                  25                  30
<210>  31
<211>  30
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1-11
<400>  31
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Asp
20                  25                  30
<210>  32
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR2-1
<400>  32
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1               5                   10
<210>  33
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR2-2
<400>  33
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val Ser
1               5                   10
<210>  34
<211>  31
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3-1
<400>  34
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
1               5                   10                  15
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  35
<211>  31
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3-2
<400>  35
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
1               5                   10                  15
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  36
<211>  31
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3-3
<400>  36
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
1               5                   10                  15
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  37
<211>  31
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3-4
<400>  37
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met
1               5                   10                  15
Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210>  38
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR4-1
<400>  38
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  39
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1007)
<400>  39
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  40
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1008)
<400>  40
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  41
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1009)
<400>  41
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  42
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1010)
<400>  42
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  43
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1011)
<400>  43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  44
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1012)
<400>  44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  45
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1016)
<400>  45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  46
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1017)
<400>  46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  47
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1018)
<400>  47
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  48
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1013)
<400>  48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  49
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1014)
<400>  49
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  50
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1015)
<400>  50
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  51
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1023)
<400>  51
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  52
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1024)
<400>  52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  53
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1022)
<400>  53
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  54
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1021)
<400>  54
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  55
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1020)
<400>  55
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  56
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1019)
<400>  56
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  57
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1000)
<400>  57
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  58
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL(L1001)
<400>  58
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala
85                  90                  95
Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  59
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1009)
<400>  59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  60
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1010)
<400>  60
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  61
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1011)
<400>  61
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  62
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1007)
<400>  62
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  63
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1008)
<400>  63
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  64
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1015)
<400>  64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  65
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1013)
<400>  65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  66
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1014)
<400>  66
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  67
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1012)
<400>  67
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  68
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1016)
<400>  68
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  69
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1017)
<400>  69
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  70
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1018)
<400>  70
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  71
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1019)
<400>  71
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  72
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1020)
<400>  72
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  73
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1021)
<400>  73
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  74
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1033)
<400>  74
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  75
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1034)
<400>  75
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  76
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1035)
<400>  76
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  77
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1036)
<400>  77
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  78
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1037)
<400>  78
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Glu Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  79
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1039)
<400>  79
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  80
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1038)
<400>  80
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  81
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1028)
<400>  81
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  82
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1027)
<400>  82
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  83
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1026)
<400>  83
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  84
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1030)
<400>  84
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  85
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1029)
<400>  85
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  86
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1025)
<400>  86
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  87
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1024)
<400>  87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  88
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1023)
<400>  88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  89
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1022)
<400>  89
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  90
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1032)
<400>  90
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  91
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1031)
<400>  91
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  92
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1000)
<400>  92
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  93
<211>  115
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH(H1001)
<400>  93
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn
20                  25                  30
Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  94
<211>  209
<212>  БЕЛОК
<213>  человек
<220>
<223>  sIL4R?
<400>  94
Gly Asn Met Lys Val Leu Gln Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met
1               5                   10                  15
Ser Ile Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser
20                  25                  30
Thr Glu Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala
35                  40                  45
His Thr Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly Gly Ala Gly Cys Val Cys His
50                  55                  60
Leu Leu Met Asp Asp Val Val Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu
65                  70                  75                  80
Trp Ala Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu
85                  90                  95
His Val Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val
100                 105                 110
Ser Asp Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn
115                 120                 125
Tyr Leu Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn
130                 135                 140
Asp Pro Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala
165                 170                 175
Arg Val Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp
180                 185                 190
Ser Pro Ser Thr Lys Trp His Asn Ser Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln
195                 200                 205
His
<---