СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНЫХ СРЕД
METHOD OF DETERMINING TOXICITY OF AQUEOUS MEDIA

Изооретение относится к анализу воды особыми способами и может быть использовано в биологии и экологии для токсикологической оценки качества водных сред, в том числе и водных вытяжек отходов в области охраны окружающей среды, а также при экологическом контроле с диагностическими или исследовательскими целями.
Проблемы загрязнения окружающей среды требуют разработки и реализации эффективных методов контроля токсичности водных сред.
Известен способ определения токсичности водных сред с использованием в контролируемых условиях биологических объектов (тест-организмов) (Филенко О.Ф. Некоторые принципы биотестирования токсичности загрязняемых природных вод // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. - Л.: Гидрометеоиздат. - 1989. - С.185-193). Органами Госстандарта РФ утверждено использование цериодафний для проведения экспериментов по оценке класса опасности водных отходов (ФР. 1.39.2001.00282. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости цериодафний. М.: Акварос. - 2001. - 52 с; ФР. 1.39.2001.00283., Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний. М.: Акварос. - 2001. - 48 с).
2
3
Известный способ заключается в том, что отбирают жидкие осадки, фильтруют, измеряют pH, температуру и содержание O в полученном экстракте (водная вытяжка из осадков сточных вод или отходов должна иметь pH=7,0-8,2, температуру 20±2°C, концентрацию растворенного кислорода не ниже 6 мг/дм) и анализируют в 100, 30, 9, 3 и 1%-ной концентрациях. В процессе приготовления разбавлений пробы тщательно перемешивают. Разбавления в трех параллельных сериях. В качестве контроля используется три параллельные серии с культивированной водой.
Учет смертности дафний в опыте и контроле проводят через каждый час до конца первого дня опыта, а затем 2 раза в сутки ежедневно до истечения 96 часов.
Для определения токсичности исследуемых вод, водной вытяжки рассчитывается процент погибших в тестируемой воде дафний (A, %) по сравнению с контролем:
,
k
t
где X - количество выживших дафний в контроле; X - количество выживших дафний в тестируемой воде.
При A<10% тестируемая вода или водная вытяжка не оказывает токсического действия (безвредная кратность разбавления). При A>50% тестируемая вода, водная вытяжка оказывает токсическое действие (средняя летальная кратность разбавления).
Однако известный способ имеет ряд недостатков. Прежде всего, дафнии нельзя отнести к легко культивируемым в лабораторных условиях тест-организмам, поскольку они реагируют на присутствие в помещении паров различных химических веществ и их сложно культивировать в тех лабораториях, где выполняются химические анализы (Жмур Н.С. Государственный и производственный контроль токсичности вод методами биотестирования в России. М.: Международный Дом Сотрудничества, 1997. - 117 с). При наличии в воде, используемой в качестве культивационной, какого-либо фонового загрязнения (например, железа), возникают трудности при содержании тест-культуры. Кроме того, для оценки функционального состояния тест-объекта под влиянием изучаемого фактора обычно используют несколько параметров, относящихся к разным уровням интегральности (Филенко О.Ф. Некоторые принципы биотестирования токсичности загрязняемых природных вод // Методы биоиндикации и биотестирования природных вод. - Л.: Гидрометеоиздат.- 1989. - С.185-193). При этом для каждого уровня могут быть выделены частные и интегральные тест-функции. Попытка судить о состоянии интегральных параметров по динамике частных всегда подвержена риску существенной количественной ошибки. И, самое главное, оценка токсичности водных сред при таком способе исследования осуществляется по прошествии достаточно длительного времени.
Известен способ определения токсичности водных сред с использованием лейкоформы красителя трифенилметанового ряда (Способ определения токсичности водной среды. Авторы: Эрнестова Л.С., Власова Г.В. Номер публикации 2007713, Дата публикации 1994.02.15, Заявка 4952638/04. Дата подачи заявки 1991.06.28. Опубликовано 1994.02.15. Номер редакции МПК5. Основной индекс МПК G01N 33/18).
Известный способ заключается в том, что отбирают пробу водной среды, фильтруют, добавляют тестирующую смесь, состоящую из лейкоформы красителя трифенилметанового ряда и гликолевого реактива при соотношении, равном (0,5-1):(0,0005-0,0015). Вода считается токсичной при величине адсорбции выше 0,3 мкг·экв/л.
Однако известный способ имеет невысокую чувствительность и для его осуществления требуется наличие дорогостоящего оборудования.
2+
2+
За прототип предлагаемого способа выбран известный способ определения токсичности водных сред, включающий исследование активности Mg-ATФазы плазматических мембран мозга животных, активированной ионами хлора и/или бикарбоната (Способ определения токсичности водной среды (варианты), реагент для определения токсичности водной среды, применение Mg-ATФазы плазматических мембран мозга животных. Авторы: Попов А.А., Мензиков С.А., Мензикова О.В. № публикации 2266539, дата публикации 2005.12.20, заявка №2004129244/15, дата подачи заявки 2004.10.05. Номер редакции МПК7. Основной индекс МПК G01N 33/18, G01N 33/48, C02F 1/68).
2+
Известный способ осуществляют следующим образом. Пробу водной среды фильтруют, доводят до физиологических значений pH не содержащим фосфор буфером, добавляют плазматические мембраны мозга животных, перемешивают. Затем добавляют раствор, содержащий трис-АТФ и источник ионов магния, а также источник/источники ионов хлора и/или бикарбоната и инкубируют. По снижению активности Mg-ATФазы, определяемой по концентрации неорганического фосфора, определяют токсичность водной среды.
Однако известный способ имеет ряд недостатков: он весьма дорог в осуществлении, трудоемок, требует наличия значительного количества реактивов и биологического материала, полученного при забое животных.
Задачей предлагаемого изобретения является обеспечение возможности быстрого и достоверного определения токсичности водных сред при минимальном количестве исследуемого материала и необходимых реактивов.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе определения токсичности водных сред, включающем забор пробы водной среды, ее фильтрацию и коррекцию pH до физиологических значений, к одной объемной части исследуемой пробы водной среды добавляют две объемные части 10% раствора бычьего сывороточного альбумина, перемешивают, высушивают каплю материала на горизонтально расположенном стекле при комнатной температуре в течение 18-24 часов, анализируют структурный макропортрет дегидратированной капли с помощью светового микроскопа и при наличии характерных особенностей в виде штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин, трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда определяют токсичность водных сред.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию «новизна», так как в процессе проведенных патентно-информационных исследований по патентной и научно-технической литературе не выявлено источников информации, которые бы порочили новизну изобретения.
Предлагаемое изобретение отвечает критерию «изобретательский уровень», так как не выявлено технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.
Известен способ клиновидной дегидратации, при котором каплю биологического материала помещали горизонтально на предметное стекло, высушивали при комнатной температуре в течение 18-24 часов и получали структурный макропортрет дегидратированой капли, который в дальнейшем анализировали (Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. // Морфология биологических жидкостей человека. 2001 г. - М.: Хризостом. - С.118-123). Способ применяется в медицине, например, для оценки интоксикации организма или диагностики определенных заболеваний. При повышенном содержании в крови белково-пептидных и белково-аминокислотных агрегаций в структурном макропортрете наблюдают «морщины» - особые концентрационные волны. При воспалительных процессах любого характера выявляют структуры типа языков Арнольда и ковров Серпинского. При нарушениях липидного обмена наблюдают эффект смазанности.
Авторы предлагаемого способа не обнаружили в научно-технической литературе сведений о возможности применения метода клиновидной дегидратации для оценки токсичности в водных средах.
По мнению авторов предлагаемого изобретения при определении токсичности водных сред методически более верно в качестве тест-объекта использовать не биологический субстрат, а стандартизированный раствор какого-либо белка. Наиболее подходящим белком для данной цели является альбумин - один из основных белков плазмы крови. Одна из важнейших функций альбуминов - транспортная. Эти белки участвуют в переносе свободных жирных кислот, холестерина, билирубина, кальция, многих биологически активных веществ. Альбумины способны связывать любые гидрофобные и амфифильные лиганды малой молекулярной массы (до 1000 Д) (Добрецов Г.Е., Миллер Ю.И. Биохимия и физико-химия сывороточного альбумина. // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. М: Ириус, 1994. - С.13-26). По изменению конформации сывороточного человеческого альбумина, определяемой соотношением его общей и эффективной концентрации, диагностируют эндогенную интоксикацию организма (Гаврилов В.Б., Бидула М.М., Фурманчук Д.А. Снижение эффективной концентрации альбумина как индикатор дисбаланса между накоплением и связыванием токсинов в плазме крови при эндогенной интоксикации. // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. М: Ириус, 1998. - С.132-139). Патологическое изменение структурной конформации белков плазмы крови при эндогенной интоксикации сопровождается появлением характерных особенностей в ее структурном макропортрете (Обухова Л.М., Ведунова М.В., Конторщикова К.Н., Добротина Н.А. Морфофизиологический анализ плазмы крови при эндогенной интоксикации // Вестник Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского. - 2007. - № 6. - С.104-108).
Предварительно была проведена исследовательская работа по определению наиболее подходящей концентрации альбумина в анализируемой пробе. В ходе экспериментальной разработки способа были изучены объемные соотношения 1:1, 1:2; 1:3; 1:5; 1:10; 1:50; 1:100; 2:1; 3:1; 5:1; 10:1.
Наиболее информативными были результаты, полученные с применением 10% раствора бычьего сывороточного альбумина в объемном соотношении 2:1 к исследуемой жидкости.
В ходе разработки предлагаемого способа экспериментальным путем была доказана необходимость и достаточность для определения токсичности водных сред наличия в высохшей капле смеси, состоящей из одной объемной части исследуемой пробы водной среды и двух объемных частей 10% раствора бычьего сывороточного альбумина, характерных особенностей в виде штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин, трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда.
Были исследованы и проанализированы 15 образцов водных сред и водных извлечений, доставленных в лабораторию промышленной и экологической токсикологии НИИ химии Нижегородского государственного университета для проведения биологического тестирования с целью определения их токсических свойств. Из них 1 проба отличалась высокой токсичностью (гибель 100% организмов в неразбавленной пробе), 3 - средней степенью токсичности (гибель организмов в диапазоне от 50 до 100%), 6 - слабой степенью токсичности (гибель организмов в диапазоне от 10 до 50%). Также были исследованы заведомо нетоксичные образцы культивационной воды, использовавшиеся в качестве контроля при проведении биологического тестирования (5 образцов).
На фиг.1 показано изображение высохшей капли смеси, содержащей 1 объемную часть нетоксичной артезианской воды ТЗ «Королевская вода» и 2 части
10% раствора сывороточного бычьего альбумина (ув.×15).
На фиг.2 показано изображение высохшей капли смеси, содержащей 1 объемную часть водных хозяйственно-бытовых стоков после очистных сооружений и 2 части 10% раствора сывороточного бычьего альбумина (ув.×15). Цифрой 1 показаны штриховые трещины, 2 - круглые трещины, 3 - параллельные трещины.
Предложенным способом исследовали 15 проб водных сред. Параллельно проводили биологическое тестирование с использованием дафний Ceriodaphnia affinis. При помощи программного пакета «Statistics» была проведена обработка результатов двух методов. Коэффициент корреляции по Пирсону между результатами (процент гибели) биотестирования и количеством особенностей в структурном макропортрете водных сред с добавлением альбумина составил 0,33 при вероятности р=0,048, что свидетельствует о достоверной связи между двумя этими показателями.
Предлагаемый способ при использовании дает следующий положительный эффект. Способ позволяет определить наличие токсичности водных сред и предварительно оценить ее величину.
В качестве основного преимущества метода клиновидной дегидратации перед методом биотестирования является отсутствие в необходимости культивирования тест-организмов, что значительно снижает расходы на заработную плату персонала и себестоимость анализа. Способ прост в исполнении, занимает меньше времени, чем биотестирование, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, большого количества исследуемого материала, что позволяет в дальнейшем проводить другие виды исследований. Способ может быть использован в токсикологической оценке качества водных сред при экологическом контроле.
Предполагаемый способ осуществляется следующим образом.
Производят забор водной среды, фильтруют ее и доводят pH до физиологических значений. К одной объемной части исследуемой жидкости добавляют две объемные части 10% раствора бычьего сывороточного альбумина, перемешивают. Затем на предметное стекло, специальным образом обработанное, расположенное строго горизонтально, наносят каплю приготовленной смеси объемом 0,01 мл (10 мкл). При этом диаметр капли составляет около 5 мм. Делают 6 повторов для проверки достоверности и взаимной идентичности высохшей капли. Высушивание проводят при температуре 20-25°C и относительной влажности 65-70% вдали от нагревательных приборов и прямых солнечных лучей при минимальной подвижности окружающего воздуха. В процессе высыхания капля должна быть неподвижной. Продолжительность периода высыхания составляет 18-24 часа. Вид и структуру дегидратированной капли оценивают с помощью микроскопа в отраженном свете при увеличении 10×8. При наличии в исследуемой жидкости токсических веществ, наблюдаем в высохшей капле смеси характерные особенности в виде штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, закругленных и круглых трещин, трещин в виде черной сети, в виде рыбьей чешуи, морщин, линий Валнера и языков Арнольда.
Примеры использования предлагаемого способа при установлении локализации белков в биологических жидкостях.
Пример 1. Для выявления токсичности к одной объемной части артезианской воды ТЗ «Королевская вода» добавляли 2 части 10% раствора альбумина. В высохшей капле смеси выявлено практически полное отсутствие особенностей (фиг.1). По результатам биологического тестирования по показателю безвредной кратности разбавления вод вода «Королевская» не токсична (Бкр 10=1,00).
Пример 2. Водные хозяйственно-бытовые стоки после очистных сооружений тестировали предложенным способом. В высохшей капле смеси выявлено значительное количество особенностей: штриховые, круглые и параллельные трещины (фиг.2). По результатам биологического тестирования по показателю безвредной кратности разбавления вод водные хозяйственно-бытовые стоки после очистных сооружений высокотоксичны (Бкр 10=92,00).
На фиг.3 представлено изображение таблицы аномальных особенностей структурного макропортрета смеси, содержащей 1 объемную часть водных отходов и 2 части 10% раствора сывороточного бычьего альбумина: штриховых, параллельных, концентрических, многолучевых, круглых трещин, трещин типа черная сеть и рыбья чешуя; морщин, линий Валнера, языков Арнольда.
Таким образом, с помощью вышеуказанного способа можно объективно установить наличие токсичности в водных средах. Данный способ при достаточно высокой чувствительности не требует каких-либо специальных условий и предназначен для проведения массовых анализов.