СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РИСКА РАЗВИТИЯ ДЕМЕНЦИЙ АЛЬЦГЕЙМЕРОВСКОГО ТИПА НА ОСНОВЕ ГИДРОГЕЛЕВОГО МАТРИЧНОГО БИОЧИПА
METHOD FOR DETECTING GENETIC RISK FACTORS FOR DEVELOPMENT OF ALZHEIMER TYPE DEMENTIA ON THE BASIS OF HYDROGEL MATRIX BIOCHIP

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии, генетике и персонализированной медицине и представляет собой способ определения генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа с использованием биочипа с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами.
Существование семейных форм болезни Альцгеймера (БА) свидетельствует о том, что важную роль в патогенезе этого заболевания играют генетические факторы. В настоящее время выявлен ряд локусов, вовлеченных в развитие деменций. Эти знания внесли существенный вклад в понимание патогенеза и полигенной природы БА, создали задел для дальнейшего изучения молекулярных процессов, лежащих в основе развития заболевания, и разработки новых стратегий диагностики и терапии. Отдельные однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) в выявленных локусах, как правило, оказывают небольшой эффект на риск развития заболевания, и не могут использоваться в качестве самостоятельных прогностических маркеров, в связи с чем необходимо использовать именно полигенную модель. Лица, генетически предрасположенные к развитию когнитивных нарушений, могут получить пользу от терапевтического вмешательства на ранних стадиях заболевания, на которых нейродегенерация не прогрессирует. Настоящее изобретение направлено на установление генетических маркеров, которые могут использоваться для оценки полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа.
Уровень техники
Из всех психических патологий нейродегенеративные заболевания в наибольшей степени характеризуются снижением когнитивных функций пациентов. Распространенность деменций экспоненциально возрастает с возрастом и удваивается каждые пять лет после 65 лет. В странах с более высокими доходами распространенность составляет 5-10% среди лиц в возрасте 65 лет и старше (Hugo J, Ganguli М. Dementia and cognitive impairment: epidemiology, diagnosis, and treatment. Clinics in Geriatric Medicine. 2014. 30(3): 421-442). Ожидаемая продолжительность жизни увеличивается по всей планете, поэтому ожидается рост распространенности деменций (Prince М, Prina М, Guerchet. Alzheimer's Disease International. World Alzheimer Report (2013) Journey of Caring: An analysis of long term care for dementia. Available at: http://www.alz.co.uk/research/world-report-2013.). В настоящее время выделяют пациентов с небольшим снижением когнитивных функций (mild cognitive impairment - MCI). Такая патология характеризуется снижением уровня функционирования и не влияет существенным образом на качество жизни (Sanford AM. Mild Cognitive Impairment. Clinics in Geriatric Medicine. 2017. 33(3): 325-337). В то же время, болезнь Альцгеймера признана ВОЗ в качестве одного из глобальных приоритетов общественного здравоохранения. Процент людей, страдающих этой болезнью, в возрасте от 65 до 74 лет составляет 3%, а в возрасте от 75 до 84 лет уже 17%. БА является прогрессирующим расстройством, характеризующимся нарушением памяти, познания и поведенческих функций (деменция). Несмотря на большие успехи в понимании патогенеза БА, до сих пор нет эффективных методов лечения пациентов с прогрессирующей деменцией (Lane СА, Hardy JM. Schott.Alzheimer's disease. European Journal of Neurology. 2018. 25(1): 59-70).
Существование семейных форм болезни Альцгеймера (БА) свидетельствует о том, что важную роль в патогенезе этого заболевания играют генетические факторы. Наследуемость БА с поздней манифестацией составляет 58-79%, с ранней манифестацией - более 90% (Sims R, Hill М, & Williams J. The multiplex model of the genetics of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 2020: 1-12. doi: 10.1038/s41593-020-0599-5).
Наиболее изученным, но не исчерпывающим, генетическим фактором риска БА является наличие у индивидуума аллеля s4 гена АРОЕ, кодирующего аполипопротеин Е. Данный аллель встречается у 20-25% пациентов с БА и увеличивает риск развития заболевания в 3 раза у гетерозиготных носителей и в 15 раз у гомозиготных (Karch СМ, Cruchaga С & Goate AM. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 2014. 83(1): 11-26). Усилия многих научных групп были направлены на детальное изучение генетической природы БА. Проведение масштабных полногеномных ассоциативных исследований (genome-wide association studies, GWAS), выполненных с использованием образцов десятков тысяч больных БА и здоровых доноров, потребовало создания международных консорциумов, таких как Международный проект геномики болезни Альцгеймера (International Genomics of Alzheimer's Project, IGAP, https://directorsblog.nih.gov/tag/international-genomics-of-alzheimers-project/), Консорциум no генетике болезни Альцгеймера (Alzheimer's Disease Genetics Consortium, ADGC, http://www.adgenetics.org/), Инициатива по нейровизуализации болезни Альцгеймера (Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative, ADNI, http://adni.loni.usc.edu/) и др. В проектах участвовали исследовательские группы из США, Англии, Франции, Голландии, Исландии и других стран. В результате совместных исследований накоплен большой объем данных по генетике БА (Kunkle BW et al. Genetic meta-analysis of diagnosed Alzheimer's disease identifies new risk loci and implicates Aβ, tau, immunity and lipid processing. Nature Genetics. 2019. 51(3): 414-430; Ridge PG et al. Assessment of the genetic variance of late-onset Alzheimer's disease. Neurobiology of Aging. 2016. 41: 200-e13.) и выявлено более 40 локусов, связанных с заболеванием (Andrews SJ, Fulton-Howard В & Goate A. Interpretation of risk loci from genome-wide association studies of Alzheimer's disease. The Lancet Neurology. 2020. 19(4): 326-335). Эти знания внесли существенный вклад в понимание патогенеза и полигенной природы БА, создали задел для дальнейшего изучения молекулярных процессов, лежащих в основе развития заболевания, и разработки новых стратегий диагностики и терапии. Тем не менее, отдельные ОНП в выявленных локусах, как правило, оказывают небольшой эффект на риск развития заболевания, и не могут использоваться в качестве самостоятельных прогностических маркеров.
На основе данных GWAS разными научными коллективами были предложены полигенные модели риска развития БА, которые основаны на оценке суммарного (мультипликативного) влияния нескольких SNP. Эти модели включают от 19 до 31 SNP (Chouraki V et al. Evaluation of a genetic risk score to improve risk prediction for Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 2016. 53(3): 921-932; Zhang Q et al. Risk prediction of late-onset Alzheimer's disease implies an oligogenic architecture. Nature Communications. 2020. 11(1): 1-11), каждому из которых присваивается свой коэффициент, и значение полигенного риска (ПГР) рассчитывается как сумма числа рисковых аллелей умноженных на соответствующие коэффициенты. В качестве дополнительных факторов могут учитываться аллели гена APOE, пол, возраст и прочие социальные и физиологические характеристики. Исследования моделей ПГР показали связь как с риском и возрастом развития БА и деменций (Leonenko G et al. Polygenic risk and hazard scores for Alzheimer's disease prediction. Annals of Clinical and Translational neurology. 2019. 6(3): 456-465; Zhang Q et al. Risk prediction of late-onset Alzheimer's disease implies an oligogenic architecture. Nature Communications. 2020. 11(1): 1-11), так и с функциональными изменениями: нейродегенерацией в отдельных областях мозга (Harrison ТМ et al. An Alzheimer's disease genetic risk score predicts longitudinal thinning of hippocampal complex subregions in healthy older adults. Eneuro. 2016. 3(3): ENEURO.0098-16.2016.; Kauppi K et al. Combining polygenic hazard score with volumetric MRI and cognitive measures improves prediction of progression from mild cognitive impairment to Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 2018. 12: 260) и отложением амилоида во всем мозге (Mormino ЕС et al. Polygenic risk of Alzheimer disease is associated with early-and late-life processes. Neurology. 2016. 87(5): 481-488; Voyle N et al. Genetic risk as a marker of amyloid-β and tau burden in cerebrospinal fluid. Journal of Alzheimer's Disease. 2017. 55(4): 1417-1427; Ge T et al. Dissociable influences of APOE s4 and polygenic risk of AD dementia on amyloid and cognition. Neurology. 2018. 90(18): e1605-e1612; Tan С et al. Polygenic hazard score: an enrichment marker for Alzheimer's associated amyloid and tau deposition. Acta Neuropathologica. 2018. 135(1): 85-93).
Таким образом, полигенные модели представляют собой перспективный инструмент персонализированной медицины для выявления людей с высоким риском БА. Лица, генетически предрасположенные к развитию когнитивных нарушений, могут получить пользу от терапевтического вмешательства на ранних стадиях заболевания, на которых нейродегенерация не прогрессирует. Однако для использования ПГР в реальной клинической практике с целью индивидуального подбора профилактических мер необходимы дальнейшие исследования, в том числе по валидации разработанных моделей ПГР на других популяциях.
В зарубежных исследованиях для определения ПГР используют дорогостоящие и трудоемкие методы на основе микрочипов высокой плотности или высокопроизводительного секвенирования (Illumina Infinium Neuro Consortium Array https://www.illumina.com/science/consortia/human-consortia/neuro-consortium.html; Allen M et al. Human whole genome genotype and transcriptome data for Alzheimer's and other neurodegenerative diseases. Scientific Data. 2016. 3: 160089; Hong S et al. Genome-wide association study of Alzheimer's disease CSF biomarkers in the EMIF-AD Multimodal Biomarker Discovery dataset. Translational Psychiatry. 2020. 10(1):403; Prokopenko D et al. Whole-genome sequencing reveals new Alzheimer's disease-associated rare variants in loci related to synaptic function and neuronal development. Alzheimers & Dementia. 2021. doi: 10.1002/alz.12319). Актуальной является задача разработки доступного и простого в применении инструмента, который позволит осуществить мостовые исследования модели ПГР БА в российской популяции, а также будет применим для разработки стратегии скрининга населения.
Из анализа уровня техники можно сделать вывод, что в настоящее время существует необходимость разработки способа определения генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа, который выгодно отличался бы от известных способов простотой и быстротой проведения анализа.
Раскрытие сущности изобретения
В настоящем изобретении предложен способ определения генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа, который выгодно отличается от известных из уровня техники способов возможностью одновременной идентификации 23 генетических маркеров риска развития деменций альцгеймеровского типа, включая rs6656401 в гене CR1, rs6733839 в гене BIN1, rs35349669 в гене INPP5D, rs190982 в гене MEF2C, rs9271192 в гене HLA-DRB5/1, rs10948363 в гене CD2AP, rs2718058 в гене NME8, rs1476679 в гене ZCWPW1, rs11771145 в гене EPHA1, rs28834970 в гене PTK2B, rs9331896 в гене CLU, rs10838725 в гене CELF1, rs7274581 в гене CASS4, rs983392 в гене MS4A6A, rs10792832 в гене PICALM, rs11218343 в гене SORL1, rs17125944 в гене FERMT2, rs10498633 в гене RIN-SLC24A, rs8093731 в гене DSG2, rs4147929 в гене АВСА7, rs3865444 в гене CD33, rs429358 и rs7412 в гене АРОЕ (Таблица 1).
Способ выявления генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа на основе биочипа с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами может быть использован для получения информации о генотипе пациента, что позволит применять лекарственные средства, обеспечивающие предотвращение и замедление когнитивных нарушений у пациентов с БА и людей со снижением когнитивных функций. Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала.
Предлагаемый способ выявления генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа основан на проведении мультиплексной ПЦР с получением одноцепочечных флуоресцентно-меченных фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE с последующей гибридизацией полученных фрагментов на биочипе, регистрацией гибридизационной картины (флуоресцентного изображения) и анализа флуоресцентных сигналов. Интерпретация результатов с установлением генотипа осуществляется в зависимости от того, в каком элементе биочипа зарегистрированы гибридизационные комплексы, образованные иммобилизованным олигонуклеотидным зондом и фрагментом соответствующего гена.
Способ включает следующие стадии:
а) обеспечение биочипа, представляющего собой матрицу элементов, в каждом из которых иммобилизован олигонуклеотидный зонд, имеющий последовательность, выбранную из группы, включающей (а) соответствующие последовательности фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE дикого типа, (б) соответствующие последовательности фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE с однонуклеотидными заменами, характеризующими минорный аллель;
б) мультиплексную амплификацию фрагментов гена CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE при использовании геномной ДНК человека в качестве матрицы и набора праймеров, с получением преимущественно флуоресцентно-меченных фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE;
в) гибридизацию амплифицированных флуоресцентно-меченных продуктов, полученных на стадии (б), на биочипе, полученном на стадии (а);
г) регистрацию и интерпретацию результатов гибридизации.
В одном из воплощений способ характеризуется тем, что биочип представляет собой подложку с матрицей гидрогелевых элементов, полученных способом химической или фотоиндуцируемой сополимеризации и содержащими иммобилизованные олигонуклеотидные зонды, последовательности которых представлены SEQ ID NO: 1-46. Перечень последовательностей олигонуклеотидных зондов, используемых для изготовления биочипа, и их SEQ ID приведены в Таблице 2.
В другом воплощении способ характеризуется тем, что стадию мультиплексной амплификации фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE проводят, используя геномную ДНК, выделенную из крови человека.
В следующем воплощении способ характеризуется тем, что при проведении стадии мультиплексной амплификации фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE используют набор специфичных праймеров, последовательности которых представлены SEQ ID: 47-93. Перечень последовательностей праймеров, используемых при мультиплексной амплификации фрагментов вышеперечисленных генов и их SEQ ID приведены в Таблице 3.
В еще одном из воплощений способ характеризуется тем, что на стадии регистрации и интерпретации результатов гибридизации определяют генотипы по выбранным локусам, ассоциированные с риском развития деменций альцгеймеровского типа.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура 1. Схема расположения зондов в ячейках биочипа для определения генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа, (а) расположение ячеек на биочипе; (б) расшифровка условных обозначений.
Фигура 2. Гибридизационная картина (флуоресцентное изображение) биочипа при анализе ДНК пациента с выявленной деменцией.
Фигура 3. Гибридизационная картина (флуоресцентное изображение) биочипа при анализе ДНК пациента без зарегистрированных когнитивных нарушений.
Таблица 1. Перечень ОНП в генах-мишенях, используемых в способе определения генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа с использованием биочипа с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами.
Таблица 2. Перечень олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных в элементах биочипа, используемого в способе в способе определения генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа, соответствующих Фигуре 1.
Таблица 3. Перечень последовательностей праймеров, используемых на стадии мультиплексной амплификации фрагментов фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE.
Осуществление изобретения
Целью изобретения являлось создание способа определения генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа. Определение таких маркеров с использованием гидрогелевого матричного биочипа включает идентификацию 23 однонуклеотидных полиморфизмов в генах CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE с установлением генотипов, ассоциированных с риском развития деменций альцгеймеровского типа. Перечень ОНП в генах-мишенях, анализируемых с использованием заявляемого способа, представлен в Таблице 1.
Одновременный анализ множества ОНП достигается при использовании биологических микрочипов (биочипов). Биочип представляет собой матрицу (массив) элементов, в каждом из которых иммобилизован специфичный олигонуклеотидный зонд. Заявленный в данном изобретении способ заключается в обеспечении биочипа с соответствующими иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, проведении мультиплексной амплификации с использованием праймеров, комплементарных фрагментам генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE, с получением преимущественно одноцепочечных флуоресцентно-меченных фрагментов ДНК, гибридизацию флуоресцентно-меченных продуктов на биочипе, регистрацию флуоресцентных сигналов с получением гибридизационной картины и интерпретацию результатов гибридизации в зависимости от того, в каком элементе биочипа зарегистрированы гибридизационные комплексы, образованные иммобилизованным олигонуклеотидным зондом и фрагментами генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE.
Биочип для осуществления заявляемого способа представляет собой матрицу элементов на подложке из стекла или пластика, которые могут быть сформированы разными способами. Растворы олигонуклеотидных зондов могут быть нанесены непосредственно на подложку с получением так называемого «планарного» биочипа, как описано в книге Matson R.S. Microarray Methods and Protocols. 2009. CRC Press. 216 pages, ISBN 9781420046656. Биочип также может представлять собой матрицу, состоящую из гидрогелевых элементов полусферической формы («трехмерный» биочип), содержащих ковалентно иммобилизованные олигонуклеотиды, изготовленный, например, методом сополимеризационной иммобилизации, разработанной и запатентованный Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН) (Грядунов с соавт.Acta Naturae. 2018. 10(4): 4-18, doi: 10.32607/20758251-2018-10-4-4-18; Shaskoskiy et al. Polymers. 2021. 13, 22, 3889. doi: 10.3390/polyml3223889). При изготовлении гидрогелевого биочипа формируют композиции, содержащие гелеобразующие мономеры и олигонуклеотидные зонды, подлежащие иммобилизации. Композиции наносят на подложки из стекла или пластика в виде массива микрокапель с помощью автоматического микродозатора (робота). Под действием УФ-излучения происходит полимеризация геля с одновременной ковалентной иммобилизацией зондов в элементах (микрокаплях). Изготовление биочипа на основе гидрогелей для идентификации 23 ОНП в генах CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE описано в Примере 1.
Выбор дискриминирующих олигонуклеотидных зондов проводят с учетом длины и сложности анализируемой последовательности, в частности, наличие повторов и протяженных гомополимерных последовательностей для обеспечения специфичности зондов в отношении анализируемой последовательности. Для каждого ОНП подбирают набор специфичных олигонуклеотидов, способный выявлять известные варианты замен. С использованием программного обеспечения Oligo v. 6.3 (Molecular Biology Insights Inc., США), рассчитывают температуры плавления олигонуклеотидов и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур плавления составлял не более 2-3°С. Избегают олигонуклеотидов, которые способны формировать вторичные структуры типа «шпильки» с высокими температурами плавления. Положение определяемых вариабельных нуклеотидов выбирают по возможности не далее 1-4 нуклеотида от середины соответствующего дискриминирующего олигонуклеотида. Последовательности олигонуклеотидных зондов, иммобилизованных в элементах биочипа, используемого в заявляемом способе, приведены в Таблице 2.
Схема расположения зондов в ячейках биочипа для определения генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа представлена на Фигуре 1. Биочип содержит элементы с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, специфичными к исследуемым фрагментам генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE, и элементы с иммобилизованным флуоресцентным маркером. Элементы с маркером используются для правильного позиционирования биочипа при регистрации флуоресцентного изображения и его обработки программным обеспечением биочип-анализатора (сканера) при получении результатов.
Мультиплексную амплификацию фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE для анализа с использованием биочипа проводят, используя геномную ДНК, выделенную из крови человека. Выделение ДНК проводят с использованием стандартных наборов для выделения нуклеиновых кислот, например, набором «LumiMAG» для выделения геномной ДНК из цельной крови и буккального эпителия (ООО «Биотех-Индустрия», Россия), набором для выделения и очистки суммарной ДНК из цельной крови и культур клеток «ExtractDNA Blood & Cells» (ЗАО «Евроген) и др.
Мультиплексную ПЦР-амплификацию выполняют любым способом, позволяющим получить флуоресцентно-меченные фрагменты ДНК, соответствующие анализируемым последовательностям, например, с использованием процедур, описанных в статьях: Грядунов Д. А. с соавт. Молекулярная биология. 2011. 45 (6): 973-983, doi: 10.1134/S0026893311050062; Зименков Д.В. с соавт. Молекулярная биология, 2014, т. 48(2): 251-264, doi: 10.7868/S0026898414020189; Zimenkov D et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2016. 71(6): 1520-1531, doi: 10.1093/jac/dkw015; Ikonnikova et al. Drug Metabolism and Personalized Therapy, 2021. 36(1): 33-40, doi: 10.1515/dmpt-2020-0155. Последовательности праймеров, используемых на стадии мультиплексной амплификации фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE, приведены в Таблице 3.
На следующей стадии выполняют гибридизацию амплифицированных флуоресцентно-меченных продуктов-фрагментов перечисленных генов на биологическом микрочипе. Гибридизацию проводят в растворе, содержащем буферный компонент для поддержания рН, соль для создания ионной силы и хаотропный (дестабилизирующий водородные связи) агент, при температуре, зависящей от температуры плавления иммобилизованных на микрочипе олигонуклеотидов, например, как описано в работе Mikhailovich V.M. et al. Journal of Clinical Microbiology. 2001. 131(1): 94-98, doi: 10.1023/a:1017555318388.
По окончании процедуры гибридизации регистрируют флуоресцентные сигналы элементов биочипа, обусловленные формированием гибридизационных комплексов между иммобилизованными олигонуклеотидными зондами и флуоресцентно-меченными фрагментами генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE. Регистрацию флуоресцентной картины гибридизации биочипа осуществляют с помощью любой детектирующей системы, способной возбуждать флуоресценцию и регистрировать флуоресцентный сигнал (например, анализатор биочипов, снабженный ПЗС-камерой и специальным программным обеспечением производства ООО «БИОЧИП-ИМБ» (Москва, Россия).
Интерпретацию результатов гибридизации выполняют посредством сравнения интенсивностей флуоресцентного сигнала элементов, в которых образовались совершенные и несовершенные гибридизационные комплексы. Сравнивают флуоресцентные сигналы в элементах, содержащих зонды, соответствующие аллелям генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE дикого типа, и флуоресцентные сигналы в элементах, содержащих зонды, соответствующие аллелям с однонуклеотидной заменой (минорным аллелем). Вычисляют значения дискриминационных отношений, как отношения средних сигналов от ячеек аллеля дикого типа к средним сигналам ячеек минорного аллеля. С использованием методов статистической обработки определяют диапазон дискриминационных отношений, характеризующих гомозиготное состояние ОНП по дикому типу или минорному аллелю, либо гетерозиготное состояние.
Полученные результаты позволяют установить генотипы ОНП rs6656401 в гене CR1, rs6733839 в гене BIN1, rs35349669 в гене INPP5D, rs190982 в гене MEF2C, rs9271192 в гене HLA-DRB5/1, rs10948363 в гене CD2AP, rs2718058 в гене NME8, rs1476679 в гене ZCWPW1, rs11771145 в гене EPHA1, rs28834970 в гене PTK2B, rs9331896 в гене CLU, rs10838725 в гене CELF1, rs7274581 в гене CASS4, rs983392 в гене MS4A6A, rs10792832 в гене PICALM, rs11218343 в гене SORL1, rs17125944 в гене FERMT2, rs10498633 в гене RIN-SLC24A, rs8093731 в гене DSG2, rs4147929 в гене АВСА7, rs3865444 в гене CD33, rs429358 и rs7412 в гене АРОЕ, и сделать вывод о риске развития деменций альцгеймеровского типа.
С использованием схемы расположения дискриминирующих олигонуклеотидов на биочипе, приведенной на Фигуре 1, проводят сравнение сигналов внутри групп элементов SEQ ID 1-2 (группа rs6656401), SEQ ID 3-4 (группа rs6733839), SEQ ID 5-6 (группа rs35349669), SEQ ID 7-8 (группа rs190982), SEQ ID 9-10 (группа rs9271192), SEQ ID 11-12 (группа rs10948363), SEQ ID 13-14 (группа rs2718058), SEQ ID 15-16 (группа rs1476679), SEQ ID 17-18 (группа rs11771145), SEQ ID 19-20 (группа rs28834970), SEQ ID 21-22 (группа rs9331896), SEQ ID 23-24 (группа rs10838725), SEQ ID 25-26 (группа rs983392), SEQ ID 27-28 (группа rs10792832), SEQ ID 29-30 (группа rs11218343), SEQ ID 31-32 (группа rs17125944), SEQ ID 33-34 (группа rs10498633), SEQ ID 35-36 (группа rs8093731), SEQ ID 37-38 (группа rs4147929), SEQ ID 39-40 (группа rs3865444), SEQ ID 41-42 (группа rs7274581), SEQ ID 43-44 (группа rs429358), SEQ ID 45-46 (группа rs7412) (Таблица 2), получают значения дискриминационных отношений внутри каждой группы. Зная значения дискриминационных отношений, характеризующих гомозиготное состояние дикого типа или минорного аллеля, либо гетерозиготное состояние, делают вывод о генотипе образца. Диапазон значений для разных генотипов определяется для каждого ОНП на стадии разработки и может быть внесен в программное обеспечение ImageWare (ООО «БИОЧИП-ИМБ») для автоматизированной интерпретации результатов анализа на биочипе. Полученные данные по генотипам характеризуют полигенный риск развития деменций альцгеймеровского типа.
Фигура 2 иллюстрирует гибридизационную картину (флуоресцентное изображение) биочипа при анализе ДНК пациента с выявленной деменцией. Фигура 3 иллюстрирует гибридизационную картину, полученную при анализе ДНК пациента без зарегистрированных когнитивных нарушений.
Описанный алгоритм интерпретации результатов гибридизации может быть реализован в программном обеспечении, позволяющем проводить автоматическую обработку результатов при регистрации флуоресцентного изображения биочипа, определения интенсивности флуоресцентного сигнала в каждом элементе, сравнения сигналов внутри групп и выдачи отчета о генотипах анализируемых ОНП, как полигенном риске развития деменций альцгеймеровского типа.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.
Пример 1. Изготовление гидрогелевого биочипа для идентификации генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа.
Олигонуклеотидные зонды с последовательностями SEQ ID NO: 1-46 (Таблица 2) синтезировали на автоматическом синтезаторе MerMade 48Х automatic synthesizer (Biosearch Technologies, США) с использованием стандартного фосфорамидитного метода. Зонды содержали спейсер со свободной аминогруппой для ковалентной иммобилизации в гидрогеле, которая вводилась в процессе синтеза с использованием 5'-Amino-Modifier С6 («Glen Research», США). Проводили очистку зондов обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе «Gilson», Франция.
Биочипы на основе гидрогеля изготавливали методом сополимеризационной иммобилизации по ранее разработанной методике, описанной в статье Shaskoskiy et al. Polymers. 2021. 13, 22, 3889. doi: 10.3390/polym13223889.
Композиция для приготовления сополимеризационных микрочипов включала растворы 4,75% метакриламида, 0,25% N,N'-метиленбисакриламида, 50% глицерина, 5% N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамина (TEMED), водные растворы олигонуклеотидов в концентрации 500-2000 пмоль/мкл, содержащих аминогруппу на 5'-конце, и 0,1 пмоль красителя Texas Red (Thermo Fischer Scientific, США). Композиции переносили в колодцы 384-луночного микротитровального планшета (Genetix, Великобритания), перемешивали и наносили на полимеризационные пластины в виде массива капель объемом ~0,1 нл с помощью роботизированного автоматического микродозатора - модифицированной установки «QArray 2 high-throughput microarray spotter» (Genetix, Великобритания) с четырьмя пинами диаметром 150 мкм каждый. Микродозатор обеспечивал перенос капель композиций последовательно и в строго определенном порядке в заданное место пластины с точностью 10 мкм. Полимеризацию гелевых элементов индуцировали УФ-облучением с длиной волны 312 нм и интенсивностью 0,06 мкВ/см2 в течение 45 минут при 45°С в токе азота. По окончании полимеризации пластины промывали 0,1 М PBS-буфером, содержащим 0,1% Tween 20 в течение 15 минут при 22°С, затем деионизованной водой в течение 15 минут при 65°С, затем деионизованной водой и высушивали. Разрезание полимеризационных пластин на индивидуальные подложки микрочипов выполняли с использованием лазера, фиксированного на двухкоординатном позиционере, после чего подложки вкладывали в пластиковые держатели формата предметного стекла и проводили технологический контроль качества. Диаметр гидрогелевых элементов составлял (100±5) мкм, а расстояние между элементами (200±10) мкм. Технологический контроль качества включал проверку каждого микрочипа с использованием портативного флуоресцентного микроскопа, оснащенного CCD-камерой и программным обеспечением, распознающим элементы биочипа и обсчитывающим основные параметры (диаметр, объем, отклонения от заданных геометрических параметров матрицы) с последующей статистической обработкой и выдачей информации о пригодности микрочипа для дальнейшего использования. В случае положительного заключения проводили окончательную сборку биочипа посредством монтажа составной гибридизациоиной камеры объемом 30 мкл (ООО «РИ-СК», Россия).
Схема размещения элементов изготовленного биочипа для идентификации генетических маркеров полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа, приведена на Фигуре 1. Биочип состоит из 94 элементов, 92 из которых содержат иммобилизованные олигонуклеотидные зонды с SEQ ID NO: 1-46, и два элемента с иммобилизованным флуоресцентным маркером (М, флуоресцентно-меченный гексануклеотид 5'-NH2-AAATAT-NH-Cy5-3'). Ячейки с маркером используются для правильного позиционирования биочипа при регистрации флуоресцентного изображения после проведения гибридизации и его обработки программным обеспечением анализатора биочипов (сканера) при автоматическом получении результатов. Ячейки с иммобилизованными зондами продублированы с целью повышения надежности анализа. Биочип обеспечивает идентификацию ОНП в генах CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE с получением генотипов, характеризующих полигенный риск развития деменций альцгеймеровского типа.
Назначение каждого олигонуклеотидного зонда, присутствующего на биочипе, приведено в Таблице 2.
Пример 2. Процедура идентификации геномных маркеров, характеризующих полигенный риск развития деменций альцгеймеровского типа с использованием гидрогелевого матричного биочипа.
Проведение анализа включало стадии мультиплексной амплификации фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE с получением одноцепочечных флуоресцентно-меченных фрагментов ДНК, гибридизации полученных ПЦР-продуктов на биочипе, полученном, как описано в Примере 1, регистрации и интерпретации результатов гибридизации.
Для анализа использовали образцы крови пациентов с болезнью Альцгеймера и здоровых доноров, полученные в ПКБ №1 ДЗМ. Выделение геномной ДНК проводили с использованием набора «LumiMAG» для выделения геномной ДНК из цельной крови и буккального эпителия (ООО «Биотех-Индустрия», Россия).
Проведение мультиплексной ПЦР. Для каждого образца амплификацию фрагментов генов CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE проводили в двух реакционных смесях, различающихся составом праймеров: реакционная смесь I включала праймеры SEQ ID NO: 47-50, 55-58, 61-68, 71-74, 79-92, 93; реакционная смесь II - праймеры SEQ ID NO: 51-54, 59-60, 69-70, 75-78, 93. Готовили реакционные смеси объемом 25 мкл, внося в пробирку следующие реагенты:
А) Реакционная смесь I
Б) Реакционная смесь II
С целью флуоресцентного маркирования ПЦР-продуктов - фрагментов амплифицируемых генов использовали флуоресцентный краситель - аналог Су5, обладающим максимумом поглощения при 645 нм, максимумом флуоресценции при 670 нм (Kuznetsova V.E., Spitsyn М.А. et al. Mendeleev Communications, 2016, v. 26(2), p. 95-98), который коньюгировали на 5'-конце праймера с последовательностью SEQ ID NO:93.
В пробирки, соответствующие отрицательному контрольному образцу, вместо раствора геномной ДНК добавляли 2 мкл деионизованной воды.
Мультиплексную ПЦР проводили на амплификаторе S1000 (Bio-Rad, США) с использованием следующей последовательности стадий: денатурация 3 мин при 95°С, 50 циклов по схеме 95°С - 30 с, 65°С - 30 с, 67°С - 30 с, 69°С - 30 с, 72°С - 20 с и далее 50 циклов по схеме 95°С - 20 с, 56°С - 10 с, 72°С - 30 с. Полученные растворы использовали для проведения гибридизации на биочипах.
Гибридизацию на биочипах выполняли по следующей процедуре. В пробирку добавляли 10 мкл 20×SSPE (Panreac, Испания), 10 мкл формамида (Panreac, Испания) и по 10 мкл реакционных смесей I и II после проведения ПЦР. Растворы перемешивали и 30 мкл полученной гибридизационной смеси вносили в реакционную камеру биочипа.
Гибридизацию флуоресцентно-меченнных ПЦР-продуктов и иммобилизованных в ячейках биочипа олигонуклеотидных зондов проводили в термостате при 37°С в течение 6-12 час. По окончании гибридизации биочипы трижды промывали дистиллированной водой и высушивали в потоке воздуха до полного исчезновения капель на поверхности подложки.
Регистрацию результатов гибридизации флуоресцентных гибридизационных картин проводили с использованием Универсального аппаратно-программный комплекс для анализа биологических микрочипов (УАПК) (ООО «БИОЧИП-ИМБ», Россия), оснащенный специализированным программным обеспечением «ImageWare» (ООО «БИОЧИП-ИМБ»).
Полученные после проведения анализа гибридизационные картины приведены на Фигурах 2 и 3. Проводили обработку сигналов ячеек микрочипа с вычислением значений дискриминационных отношений в программном обеспечении «ImageWare» (ООО «БИОЧИП-ИМБ»), сравнением полученных значений с диапазоном, соответствующим гомозиготному состоянию дикого типу или минорного аллеля, либо гетерозиготному состоянию, по результатам которого генотипы, характеризующие полигенный риск развития деменций альцгеймеровского типа.
При анализе образца геномной ДНК от пациента с болезнью Альцгеймера (гибридизационная картина на Фигуре 2) получен генотип, соответствующий высокому риску развития деменций альцгеймеровского типа:
При анализе образца геномной ДНК от пациента без зарегистрированных когнитивных нарушений (гибридизационная картина на Фигуре 3) получен генотип, соответствующий низкому риску развития деменций альцгеймеровского типа:
Корректность идентификации ОНП в генах CR1, BIN1, INPP5D, MEF2C, HLA-DRB5/1, CD2AP, NME8, ZCWPW1, EPHA1, PTK2B, CLU, CELF1, CASS4, MS4A6A, PICALM, SORL1, FERMT2, RIN-SLC24A, DSG2, ABCA7, CD33, APOE с использованием предлагаемого способа проверяли методом мультилокусного секвенирования по Сэнгеру на автоматическом анализаторе 3500xL Applied Biosystems (США). Результаты, полученные с использованием способа, предлагаемого в данном изобретении, и полученные методом секвенирования, совпали для всех анализируемых образцов.
Способ с использованием биочипа, предлагаемый в данном изобретении, позволяет быстро и точно одновременно идентифицировать геномные маркеры полигенного риска развития деменций альцгеймеровского типа. Метод не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Способ может применяться в клинической лабораторной диагностике, медицине, включая психиатрию и геронтологию для выявления лиц, генетически предрасположенных к развитию когнитивных нарушений, связанных с развитием деменций альцгеймеровского типа. Такие пациенты могут получить пользу от терапевтического вмешательства на ранних стадиях заболевания, на которых нейродегенерация не прогрессирует.
--->
SEQUENCE LISTING (перечень последовательностей олигонуклеотидов и праймеров)
<110> Государственное бюджетное учреждение здравоохранения
города Москвы "Психиатрическая клиническая больница № 1
им. Н.А. Алексеева Департамента здравоохранения города Москвы"
<120> СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ РИСКА
РАЗВИТИЯ ДЕМЕНЦИЙ АЛЬЦГЕЙМЕРОВСКОГО ТИПА НА ОСНОВЕ
ГИДРОГЕЛЕВОГО МАТРИЧНОГО БИОЧИПА
<130> 1111111111111111
<160> 93
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Збонд для идентификации ОНП гбб56401 в гене CR1, дикий тип
<400> 1
atcttctcgt cgccttc  17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs6656401 в гене CR1, замена G на А
<400> 2
atcttctcat cgccttct  18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs6733839 в гене BIN1, дикий тип
<400> 3
ttcttaaaaa cacccttttc с    21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs6733839 в гене BIN1, замена С на Т
<400> 4
ttcttaaaaa tacccttttc с
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs35349669 в гене INPP5D, дикий тип
<400> 5
tgatagcttc ccactgag
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs35349669 в гене INPP5D, замена С на Т
<400> 6
tgatagcttt ccactgagt
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl90982 в гене MEF2C, дикий тип
<400> 7
ctcaaagata aaccaggaca
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl90982 в гене MEF2C, замена А на G
<400> 8
ctcaaagatg aaccaggac
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs9271192 в гене HLA-DRB5/1, дикий тип
<400> 9
cccctctcat aaaaagtcat а
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs9271192 в гене HLA-DRB5/1, замена А на С
<400> 10
ccctctcata caaagtcata
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl0948363 в гене CD2AP, дикий тип
<400> 11
gggcaaaaca aattttgtta
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl0948363 в гене CD2AP, замена А на G
<400> 12
gggcaaaacg aattttgtt 19
<210> I3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs2718058 в гене NME8, дикий тип
<400> 13
tttttcctgt taatttccta tct
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs2718058 в гене NME8, замена А на G
<400> 14
tttttcctgt tgatttccta tc
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl476679 в гене ZCWPW1, дикий тип
<400> 15
gatcctgtta tggactcct
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl476679 в гене ZCWPW1, замена Т на
<400> 16
atcctgttac ggactcct
<210>
17
<211>
21
<212>
DNA
<213>
Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП nsll771145 в гене ЕРНА1, дикий тип
<400> 17
taaactttat gaaacggaat с
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsll771145 в гене ЕРНА1, замена G на А
<400> 18
taaactttat aaaacggaat са
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs28834970 в гене РТК2В, дикий тип
<400> 19
gtggaattgt acaacactg
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs28834970 в гене РТК2В, замена Т на С
<400> 20
tggaattgca caacactg
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs9331896 в гене CLU, дикий тип
<400> 21
acagctttgt ggagga
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs9331896 в гене CLU, замена Т на С
<400> 22
acagcttcgt ggagga
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl0838725 в гене CELF1, дикий тип
<400> 23
gccaacattg сассас
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl0838725 в гене CELF1, замена Т на
<400> 24
agccaacact gcacca
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs983392 в гене MS4A6A, дикий тип
<400> 25
ctaaaattcc acatgcaatt tt
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<400> 26
ctaaaattcc acgtgcaatt tt   22
<210>27
<211>20
<212> DNA
213> Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rsl0792832 в гене PICALM, дикий тип
<400> 27
aaaaatgtag gagcaaaaca  20
<210>28
<211>21
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rsl0792832 в гене PICALM, замена G на А
<400> 28
gaaaaatgta gaagcaaaac a
<210>29
<211>20
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rsll218343 в гене S0RL1, дикий тип
<400> 29
agccggtaat agagtatttt 20
<210>30
<211>19
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rsll218343 в гене S0RL1, замена Т на С
<400> 30
agccggtaac agagtattt 19
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl7125944 в гене FERMT2, дикий тип
<400> 31
gtttcagatc tccttgatag 20
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl7125944 в гене FERMT2, замена Т на С
<400> 32
tttcagatcc ccttgatag 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl0498633 в гене RIN-SLC24A, дикий тип
<400> 33
ctctcagtca gtaaacagtt 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rsl0498633 в гене RIN-SLC24A, замена G на Т
<400> 34
ctctcagtca ttaaacagtt а 21
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<21В> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs8093731 в гене DSG2, дикий тип
<400> 35
tctaatgcca ctcaagct 18
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs8093731 в гене DSG2, замена С на Т
<400> 36
ttctaatgct actcaagct 19
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs4147929 в гене АВСА7, дикий тип
<400> 37
gcccattgtg cccct 15
<210> 38
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs4147929 в гене АВСА7, замена G на А
<400> 38
tgcccattat gcccct 16
<210>39
<211>18
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rs3865444 в гене CD33, дикий тип
<400> 39
taaacacccc atggatct 18
<210>40
<211>19
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rs3865444 в гене CD33, замена С на А
<400> 40
taaacaccca atggatcta 19
<210>41
<211>14
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rs7274581 в гене CASS4, дикий тип
<400> 41
tctggcctgg cgcg
<210>42
<211>13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rs7274581 в гене CASS4, замена Т на С
<400> 42
tctggcccgg cgc 13
<210>43
<211>14
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Зонд для идентификации ОНП rs429358 в гене АРОЕ, дикий тип
<400> 43
aggacgtgtg cggc 14
<210> 44
<211> 13
<212> DNA
<21В> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs429358 в гене АРОЕ, замена Т на С
<400> 44
ggacgtgcgc ggc
<210> 45
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs7412 в гене АРОЕ, дикий тип
<400> 45
tgcagaagcg cctgg
<210> 46
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Зонд для идентификации ОНП rs7412 в гене АРОЕ, замена С на Т
<400> 46
gcagaagtgc ctggc
<210> 47
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для амплификации фрагмента гена CR1
<400> 47
atcatttcct tctctgtctc catcttctc
<210> 48
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента гена CR1 13
<400> 48
tcattggatc tcattagaag agcaaaggac acacacagag 40
<210>49
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена BIN1
<400>49
aaaaggaaag aaatctctgt tctgcttc
<210>50
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена BIN1
<400>50
tcattggatc tcattactag tcttctctgg ttccttcttc tg
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена INPP5D
<400> 51
ggtgcaggcc cacagtgata
<210>52
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена INPP5D
<400>52
tcattggatc tcattacagc ccacccctga tgcttt
<210> 53
<211> 32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена MEF2C
<400>53
cttttaagtg tagttttcta tgtgctcttc ас
<210>54
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена MEF2C
<400>54
tcattggatc tcattattaa aaagacttta ataattcctg tcctgg
<210>55
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена HLA-DRB5/1
<400>55
ggtatctaaa gtaaaattcc aatacccctc tca
<210>56
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена HLA-DRB5/1
<400>56
tcattggatc tcattagaac cccaaggagc tctgataaag ta
<210>57
<211>32
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для амплификации фрагмента гена CD2AP
<400> 57
ggatttgagt ataagttcta acttcttagg gc 32
<210>58
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена CD2AP
<400>58
tcattggatc tcattaggtc atttttctaa acacaacact ttagttcca
<210>59
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена NME8
<400>59
ctaggtcttt tcagagaacg agcattgg
<210>60
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена NME8
<400>60
tcattggatc tcattaaaat tacaacataa atcaacacag ttgaagatag g
<210> 61
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для амплификации фрагмента гена ZCWPW1
<400> 61
caaaaaacgt cacatggtac ttagactg 28
<210> 62
<211> 39
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена ZCWPW1
<400>62
tcattggatc tcattaccat tctcccgatc tgttctggc
<210>63
<211>24
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена ЕРНА1
<400>63
cctgacttaa aacaccacgg agtg
<210>64
<211>47
<212>
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена ЕРНА1
<400>64
tcattggatc tcattagaca ccaaagaatg catatcagat gattccg
<210>65
<211>28
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена РТК2В
<400>65
ttatggatct gccttttctg gtcattcc
<210>66
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента гена РТК2В
<400> 66
tcattggatc tcattagcta agtgaaagca gccgtcgc 38
<210>67
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена CLU
<400>67
ctccggtggt ccagacacag
<210>68
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена CLU
<400>68
tcattggatc tcattacatt cagctcttcc cctcccagg
<210>69
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена CELF1
<400>69
cttctggaga ctgaggcacg agaatta
<210>70
<211>37
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена CELF1
<400>70
tcattggatc tcattacttg tcgcccacga tggagta
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<21В> Artificial Sequence
<220>
<22B> Прямой праймер для амплификации фрагмента гена MS4A6A <400> 71
aggaacaaca atttgaacaa caggtgtttc
<210> 72
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence <220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента гена MS4A6A
<400> 72
tcattggatc tcattagttt tagacaacta agcttgtggt aagtttctac
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для амплификации фрагмента гена PICALM
<400> 73
gaggccactt aaaggaagtg gga
<210> 74
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента гена PICALM
<400> 74
tcattggatc tcattaggcc atcctttctc acacttacag с
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для амплификации фрагмента гена S0RL1
<400> 75
cactgcaccc agccggtaa 19
<210>76
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена SORL1
<400>76
tcattggatc tcattaactc aaacaaggat gtgggaacat gtg
<210>77
<211>25
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена FERMT2
<400>77
gcttttgttc tggcctagtt tgtgg
<210>78
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента  гена FERMT2
<400>78
tcattggatc tcattactgg tactggtgca tgattttgcc
<210>79
<211>27
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена RIN-SLC24A
<400>79
cttcaggcac ttagcagaca agatgat
<210> 80
<211> 40
<212> DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента гена RIN-SLC24A
<400> 80
tcattggatc tcattaccat ggctgtcctg ttcctacctg
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для амплификации фрагмента гена DSG2
<400> 81
gacactctaa ggcgggactc agtaatc
<210> 82 <211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента гена DSG2
<400> 82
tcattggatc tcattattct aattgggatg ttaacagtgg ttttcaagc
<210> 83
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для амплификации фрагмента гена АВСА7
<400> 83
tgtcccattc tcacatttgc сс
<210> 84
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента гена АВСА7
<400> 84
tcattggatc tcattagcca gcattgagtg tggagca 37
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена CD33
<400>85
cccagacact cacacggacc
<210>86
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена CD33
<400>86
tcattggatc tcattaacac cagggctgat cactgc
<210>87
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Прямой праймер для амплификации фрагмента гена CASS4
<400>87
gtcagaccgg gtaagcagct tg
<210>88
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>Обратный праймер для амплификации фрагмента гена CASS4
<400>88
tcattggatc tcattagcct cagcctccca aagtggaag
<210> 89
<211> 17
<212> DNA
<21В> Artificial Sequence
<220>
<22B> Прямой праймер для амплификации фрагмента 1 гена АРОЕ
<400> 89
tgggcgcgga catggag
<210> 90
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента 1 гена АРОЕ
<400> 90
tcattggatc tcattacagc tcctcggtgc tctgg
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Прямой праймер для амплификации фрагмента 2 гена АРОЕ
<400> 91
gcgatgccga tgacctgc
<210> 92
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Обратный праймер для амплификации фрагмента 2 гена АРОЕ
<400> 92
tcattggatc tcattaaggc gctcgcggat gg
<210> 93
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223>Универсальный адаптерный праймер
<400> 93
taatgagatc caatga
<---