Метод ИК-спектроскопии в исследовании взаимодействия хлоргексидина с липидными мембранами

О. С. Дружинина, Н. Ф. Кашапов, А. И. Скоринкин,

Д. А. Файзуллин

МЕТОД ИК-СПЕКТРОСКОПИИ В ИССЛЕДОВАНИИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХЛОРГЕКСИДИНА С ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ

Ключевые слова: ИК-спектроскопия, хлоргексидин, липидные мембраны.

Метод ИК-спектроскопии был применен для исследования суспензий искусственных мембран с хлоргексидином. Было показано, что хлоргексидин, в зависимости от концентрации, по-разному влияет на липидные мембраны. Анализ ИК-спектров суспензий искусственных мембран с хлоргексидином показал, что при концентрациях ниже 10'4 Моль/л хлоргексидин встраивается в липидный бислой, что приводит к перестройке структуры поверхностного слоя липидов и более плотной упаковке головок. При более высоких концентрациях происходит механическое разбавление молекул липида молекулами хлор-гексидина, приводящее к менее плотной упаковке полярных головок липидов и их более сильной гидратации.

Key words: IR-spectroscopy, сhlorhexidine, lipid membranes.

The IR-spectroscopy method has been applied to research of suspensions of artificial membranes with сhlorhexidine. It has been shown that сhlorhexidine, depending on concentration, differently influences on lipid membranes. The analysis of IR-spectra of suspensions of artificial membranes with сhlorhexidine has shown that at concentration below 10'4 Mol/l сhlorhexidine is built in lipid bilayer that leads to reorganisation of structure of a blanket of lipids and more dense packing of heads. At higher concentration there is a mechanical diluting of molecules of a lipid by сhlorhexidines molecules, leading to less dense packing of polar heads of lipids and their stronger hydration.

Метод ИК-спектроскопии, может использоваться для исследования биологических объектов в различном физическом состоянии - жидком, твердом, в виде суспензий. Достоинствами его являются быстрота и высокая чувствительность к изменениям структуры объекта, которые могут иметь место при его функционировании или внешних воздействиях.

В процессе выполнения данной работы решалась задача установления методом ИК-спектроскопии проникновения и связывания молекул хлоргексидина биглюконата (являющегося биологически активным веществом, которое используется при гнойновоспалительных процессах для местного лечения) с искусственной липидной мембраной.

Экспериментальная часть

В работе использовали яичный фосфатидилхолин (лецитин, ФХ) («Биолек» Харьков), поскольку именно он наиболее весомо представлен в мембранах нервной ткани (до 60-80 вес. % по отношению к другим фосфолипидам), около 80% которого локализовано на внешней стороне мем-

Рис. 1 - Молекула яичного ФХ: 1 - полярная головка, 2 -жирнокислотный хвост

браны. На рисунке 1 приведена молекула ФХ. Молекула хлоргексидина биглюконата (ХБ) (рис. 2) содержит ароматическую, аминную, карбонильную СН2- и ОН - группы.

Неозвученные водные липидные дисперсии (мультислойные липосо-

мы) получали следующим образом: растворы, содержащие приблизительно 500 мг фосфолипида в этаноле, упаривали, затем помещали в вакуумный шкаф на 2 часа при температуре 70 Со, добавляли 0,7 мл буферного раствора трис -НС1 (25 мМоль/л, рН 7,42) и механически встряхивали. Образцы представляли из себя 140 мкл полученного раствора лецитина с добавлением 60 мкл трисо-

вого буфера (контроль) или того же объема раствора хлоргексидина биглюконата (получали из препарата “Дезин”, 20% водный раствор, pH 6.09) в трисовом буфере различных концентраций (в опытных образцах использовались следующие концентрации ХБ: 6,7-10-7, 6,7-10-6, 6,7-10-5, 6,7-10-4, 6,7-10- , 6,7-10" Моль/л). Данный предел по концентрациям выбран в связи с тем, что в опытах, установивших каналоблокирующую способность ХБ, концентрация последнего была порядка 10-4. Кроме того интерес представляла область низких (10-7) и высоких (10-2) концентраций. При максимальной концентрации ХБ соотношение препарат: фосфатидилхолин составило примерно 1:1. Далее образцы подвергали по крайней мере 3-кратному циклу замораживания - оттаивания для обеспечения максимального смешения компонентов.

Рис. 2 - Молекула хлоргексидина биглюконата

Снимали и анализировали ИК-спектры 3G% водных (Н2О) суспензий ФХ в контроле и с добавлением ХБ в опыте. Спектры регистрировали в диапазоне 4GGG^95G см-1 на Фурье-ИК спектрофотометре Vector 22 (Bruker) с разрешением 4 см-1 в кюветах из CaF2 с толщиной слоя 1G микрон. Количество сканов 128. Кюветы термостатировали при 250С. Спектры ХБ в воде и буфера при той же концентрации записывали отдельно и затем вычитали из спектров опыта, добиваясь компенсации поглощения воды и поглощения полос ХБ.

Результаты и их обсуждение

При анализе спектров липидных дисперсий мы учитывали, что имеет место перекрывание полос колебаний связи N-H гидразидных фрагментов хлоргексидина с поглощением воды. Также поглощение СН-групп ароматического фрагмента хлоргексидина перекрывается в области деформационных колебаний C-H связей с поглощением метиленовых фрагментов и фосфорной группы липида.

Отметим сразу, что при вычитании спектра водного раствора хлоргексидина из спектров его смеси с лецитиновой дисперсией не удавалось добиться компенсации поглощения хлоргексидина в области N-H колебаний, что свидетельствует о взаимодействии хлоргексидина с молекулами лецитина, в частности, с заряженной NH2+ -группой гидра-зидного фрагмента. Те области, в которых наблюдались перекрывания, исключались из анализа. Число CH2 групп в молекуле хлоргексидина намного меньше по сравнению с лецитином и их поглощением можно пренебречь. Изменения наблюдались в спектрах в области поглощения химических групп, относящихся как к полярной, так и к неполярной части липида, что свидетельствует о комплексном воздействии хлоргексидина на структуру липидного бислоя. Также наблюдалась концентрационная зависимость воздействия хлоргексидина на фосфотидилхолин. Более подробную картину взаимодействия можно получить из анализа спектральных полос отдельных групп в составе липида.

Влияние хлоргексидина на частоту и интенсивность полосы поглощения C-N связи

Полярный характер головки фосфатидилхолина обусловлен наличием двух противоположно заряженных групп - отрицательно заряженного остатка фосфорной кислоты PO4-3

и положительно заряженного атома азота в составе концевой метиламмонийной группы N+(CH3)3 холинового остатка. В спектре фосфатидилхолина с добавлением хлор-гексидина наблюдаются выраженные изменения по сравнению с контролем. Свидетельства о характере этого взаимодействия можно получить из анализа полосы 97G см-1 , относящейся к валентному колебанию vasC-N связи этого фрагмента. При концентрации хлор-5 -1

гексидина б^Ш- Моль/л наблюдается уменьшение частоты с 971,б до 971 см- (рис. 3).

-2

При дальнейшем увеличении концентрации хлоргексидина до б^Ш максимум этой полосы сдвигается относительно контроля в высокочастотном направлении до 972,5 см-1. Рост частоты указывает на упрочение связи C-N вследствие ослабления электростатического взаимодействия групп N+ (CH3)3 и PO2-3 соседних молекул ФХ, что может быть вызвано внедрением молекул хлоргексидина в полярную часть бислоя. Уменьшение частоты при малой концентрации хлоргексидина, в свою очередь, может быть следствием усиления электростатических взаимодействий. Взаимодействие лецитина с молекулами хлор-5

гексидина при концентрации б^Ш М приводит к перестройке структуры поверхностного слоя липидов и более плотной упаковке головок. Заметим, что мольное отношение хлоргексидина к ФХ составляет при этой концентрации всего 1:1GGG.

Концентрация

Рис. 3 - Зависимость максимума полосы поглощения О-М-групп от концентрации хлоргексидина

Влияние хлоргексидина на частоту и интенсивность полосы поглощения 0=0 связи

Информацию об изменениях в жирнокислотном хвосте липида можно получить из анализа полосы валентных колебаний C=O связи эфирной группы. В контроле полоса поглощения С=О групп состоит из двух компонент приблизительно равной интенсивности - 1740 и 1724 см-1. Сложная структура этой полосы обусловлена резонансным расщеплением основного валентного колебания С=О связи за счет сильного взаимодействия соседних макромолекул, упакованных в орторомбическую решетку. Нарушение этого взаимодействия при изменении конформации бислоя или в силу других причин должно приводить к уменьшению расщепления. Таким образом, наблюдаемое нами в опыте перераспределение интенсивностей компонент поглощения С=О связи эфирных групп дает основание утверждать, что связывание молекул ХБ с бислоем сопровождается уменьшением взаимодействия между полярными группами соседних липидных головок за счет изменения структуры бислоя при внедрении молекул препарата в его полярную часть. Перераспределение интенсивностей компонент приводит к смещению видимого максимума полосы. Мы видим, что вновь при концентрации 6,7-10- Моль/л на зависимости наблюдается экстремум (рис. 4), обусловленный относительным усилением низкочастотной компоненты, что можно объяснить только изменением структуры бислоя. При дальнейшем увеличении концентрации хлоргексидина форма полосы возвращается к прежнему виду. При концентрациях выше 6,7-10- Моль/л преобладает другой процесс - чисто механическое разбавление молекул липида молекулами хлоргексидина, приводящее к менее плотной упаковке полярных головок липидов и их более сильной гидратации.

—— ширина полосы

36

34

32

Концентрация хлоргексидина

Рис. 4 - Зависимости максимума поглощения и ширины полосы С=О-групп от концентрации хлоргексидина

Выводы

1. При концентрациях ниже 10-4 Моль/л хлоргексидин встраивается в липидный бислой, что приводит к перестройке структуры поверхностного слоя липидов и более плотной упаковке головок.

2. При более высоких концентрациях происходит механическое разбавление молекул липида молекулами хлоргексидина, приводящее к менее плотной упаковке полярных головок липидов и их более сильной гидратации.

Литература

1. Верболович, В.П. Инфракрасная спектроскопия биологических мембран/ В.П. Верболович. -М.: Наука, 1977. - 128 с.

2. Жижина, Г.Н. Инфракрасная спектроскопия высокого разрешения: Сб. статей. - М.: Мир, 1972.

3. Марголис, Л.Б. Липосомы и их взаимодействие с клетками./ Л.Б. Марголис, Л.Д. Бергельсон. -М.: Наука, 1986. - 240 с.

4. Смит, А. Прикладная ИК-спектроскопия./ А. Смит. - М.: Мир, 1982. - 328 с.

5. Чиргадзе, Ю.Н. Инфракрасные спектры и структура полипептидов и белков./ Ю.Н. Чиргадзе. -М.: Наука, 1965. - 135 с.

6. Шайхутдинова, А.Р. Механизмы модуляции работы рецепторно-канального комплекса хлор-гексидином / А.Р.Шайхутдинова, Е.Е. Никольский, Р.А. Гиниатуллин, А.И. Скоринкин // Доклады академии наук. - 2005. - Т.402. - С. 1-3.

7. Борисоглебская, Е.И. Водородные связи по верхнему и нижнему ободу молекулы в ка-ликс[п]аренах (п = 4, 6) по данным ИК-спектроскопии и квантово-химических расчетов/ Е.И. Борисоглебская [и др.] // Вестник Казан. технол. ун-та. - 2008. - № 3. - С.23-29.

© О. С. Дружинина - асс. каф. ТОМЛП КГТУ, solnyshek@list.ru; Н. Ф. Кашапов - д-р техн. наук, проф. каф. ТОМЛП КГТУ, kashnail@mail.ru; А. И. Скоринкин - канд. биол. наук, доц. КГТУ, askorink@yandex.ru; Д. А. Файзуллин - канд. биол. наук, науч. сотр. КИББ КазНЦ РАН, dfaizullin@mail.ru.