СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ ПРИ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ ТИПА 2 У ЯКУТОК
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING DAIBETIC RETINOPATHY ACCOMPANYING TYPE 2 DIABETES MELLITUS IN YAKUT FEMALES

Предлагаемое изобретение относится к медицине и может быть использовано в офтальмологии, а также в эндокринологии, медицинской генетике, общественном здоровье и здравоохранении, медико-социальной экспертизе, генной инженерии, генотерапии для прогнозирования развития и профилактики диабетической ретинопатии (ДР) при сахарном диабете типа 2 (СД типа 2) у якуток.
Известен способ прогнозирования возникновения и развития диабетической ретинопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом (заявка 2003122404/15, G01N 33/68, БИПМ №6, 27.02.2005 г.), который позволяет прогнозировать возникновение и прогрессирование диабетической ретинопатии у больных инсулинзависимым сахарным диабетом при проведении иммунологического исследования сыворотки крови путем определения содержания интерлейкина - 1β при наличии его в концентрации 50 пкг/мл и выше. Возникновение диабетической ретинопатии при отсутствии клинических явных изменений на глазном дне прогнозируют при концентрации интерлейкина - 1β 700 пкг/мл и более.
Известен способ прогнозирования клинической манифестации диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом 2 типа (патент 2292549, G01N 33/487, БИПМ №3, 27.01.2007 г.), который позволяет исследовать индуцированную хемолюминесценцию слезной жидкости и световую чувствительность макулы с помощью фотостресс-теста. При значениях индуцированной хемолюминесценции слезной жидкости от 0,031-0,043 отн. ед. и показателях световой чувствительности макулы от 56 до 75 секунд прогнозируют высокий риск клинической манифестации диабетической ретинопатии на ранней стадии.
Известен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (заявка 2005112169/15, G01N 33/48, БИПМ №30, 27.10.2006 г.), который включает определение нитритов в крови, а в слезной жидкости - холестерин, СОД и каталазу, по этим показателям составляют карту, по которой определяют стадии развития ДР.
Известен способ диагностики диабетической ретинопатии (патент 2071059, G01N 33/68, БИ №36, 27.12.1996 г.), который позволяет диагностировать диабетическую ретинопатию при определении в сыворотке крови повышенного уровня тироксинсвязывающего гормона в 1,5 и более раз.
Известен способ прогнозирования развития диабетической ретинопатии (патент 2124727, G01N 33/53, A61F 9/00, БИ №1, 10.01.1999 г.), который обеспечивает возможность прогнозирования перехода непролиферативной стадии диабетической ретинопатии в пролиферативную путем иммунологического исследования слезной жидкости и определения концентрации иммуноглобулина А при его значениях не менее 0,20 г/л.
Однако все перечисленные выше способы не позволяют в полном объеме определять специфические и генетические признаки диабетической ретинопатии непосредственно у больных сахарным диабетом типа 2, в частности, в зависимости от этнической принадлежности обследуемых пациентов, а именно у якутов.
Известен способ диагностики риска развития у субъекта атеросклероза или диабетической ретинопатии (заявка 2001130755/14, C12Q 1/68, БИПМ №24, 27.08.2003 г.), включающий определение у диабетика наличия полиморфизма на участке сигнального пептида препро- NPY человека. Полиморфизм заключается в замене лейцина на пролин в 7-ом положении на участке сигнального пептида препро- NPY человека и является индикатором повышенного риска развития диабетической ретинопатии и атеросклероза.
Данный способ диагностики разработан на основе изучения генетической предрасположенности к ДР при сахарном диабете независимо от его типа в гетерогенной популяционной среде и поэтому не приемлем для медико-генетического консультирования по ДР при СД типа 2 в других регионах, в частности в Республике Саха (Якутия). Это обусловлено тем, что генетическая предрасположенность к ДР при СД типа 2, как и к другим многофакторным заболеваниям, формируется в зависимости от особенностей популяционно-генетической структуры этноса, к которому относится этническая группа якутов.
Задача предлагаемого способа - прогнозирование риска развития ДР при СД типа 2 у якуток.
Поставленную задачу решают за счет того, что амплификацию специфичности гена адипонектина - ADIPOQ определяют методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и при выявлении генотипа *T/*T и аллеля *T полиморфного варианта 45 G/T - ADIPOQ прогнозируют риск развития диабетической ретинопатии.
Способ осуществляют следующим образом
Кровь для выделения ДНК собирают из локтевой вены пациента в специальный вакутейнер с консервантом EDTA. Собранную кровь замораживают в специальном контейнере при температуре - 20°С и ниже.
ДНК экстрагируют из лейкоцитов с помощью системы очистки (Promega, Madison, WI). В работе использовали полиморфный маркер гена адипонектина, участвующий в метаболизме липидов и углеводов: ADPIQ (вариант 45G/T). Гаплотип rs2241766 гена ADIPOQ анализирован с помощью аллельной дифференциации Tagman универсальной средой ПЦР (по AmpErase UNG). Все реакции проводились на системе ABI7300 с использованием программы SDS 1.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Фрагменты ПНР денатурировали при температуре 95°С в течение 5 минут с последующей ренатурацией понижением температуры до 25°С на протяжении 45 минут. Идентификация аллелей выполнена с использованием системы Wave Nuclear Acid Fragment Analysis System (Transgenomic, Omaha, NE). Результаты соответствовали прямым данным секвенирования.
2
Статистическая обработка материалов. Статистический анализ данных проведен с использованием пакета Statistica 8.0 и SAS 7.0. При сравнении качественных данных использован критерий Пирсона χ и точный критерий Фишера. Критическое значение уровня значимости принималось равным 5%. Относительный риск заболевания по каждому аллелю вычисляли как соотношение шансов (odds ratio - OR) с расчетом доверительных интервалов (OR'). При OR=1 ассоциации нет, OR>1 - положительная ассоциация заболевания с аллелем и генотипом и OR<1 - отрицательная ассоциация.
Офтальмологическое обследование пациентов включало стандартные методы определения визометрии, офтальмотонуса, биомикроскопии, офтальмоскопии с применением универсальной линзы Гольдмана в условиях медикаментозного мидриаза при отсутствии противопоказаний.
Учитывая особые этические моменты, связанные с охраной права личности, осмотры и забор биологического материала проводились с заполнением специальных медицинских карт при добровольном согласии на участие в клиническом исследовании взрослого пациента или родителя несовершеннолетнего больного. Форма указанной медицинской карты одобрена Комитетом по этике при Якутском научном центре СО РАН РФ (Протокол №5 от 21.06.2006 г.).
Нами обследованы коренные жители, принадлежащие к этнической группе якутов, проживающие в 5 районах (Амгинский, Усть-Алданский, Таттинский, Чурапчинский, Мегино-Кангаласский) Республики Саха (Якутия).
В ходе работы исследованы 238 образцов ДНК этнических якутов обеих гендерных групп. Группу исследования составили 78 больных ДР (Классификация E.Kohner, M.Porta, 1990) при СД типа 2, в возрасте свыше 40 лет. Контрольная группа состояла из 160 добровольных доноров, той же этнической группы, без клинических и лабораторных признаков сахарного диабета, не родственных между собой и не имеющих отягощенный семейный анамнез по сахарному диабету. Сравнительная клинико-социальная характеристика исследуемых пациентов в обеих группах представлена в таблице 1.
Таблица 1
Сравнительная социально-клиническая характеристика исследуемых пациентов в этнической группе якутов
Характеристика исследуемых пациентов в этнической группе якутов
Группа больных ДР при СД 2 типа
Контрольная группа
1
2
3
Возраст
54.7±10.9
57.0±14.7
Пол (М/Ж в %)
31.5/68.5
42.6/57.4
Индекс массы тела
27.5±3.76
25.2±2.87
Гликемия (ммоль/л)
11.7±4.81
4.8±0.75
Артериальное давление (систолическое) (ммHg)
151±24
140±14
Артериальное давление (диастолическое) (ммHg)
92±11
88±8
Из таблицы 1 видно, что пациенты обеих групп не имели особых статистических различий по полу и возрасту. Основной составляющей обеих групп были женщины в возрасте старше 50 лет. Среди пациентов исследуемой группы отмечается повышенный индекс массы тела, уровня гликемии артериального давления.
В результате офтальмологического исследования пациентов установлено, что длительность развития ДР варьировала в диапазоне от 1 года до 20 лет. ДР развилась в 62.8% случаев после установления СД типа 2 в течение первых 5 лет. Впервые выявленная ДР, преимущественно 1 и 2 стадии, установлена нами при сроке СД типа 2 на момент исследования и продолжительности основного заболевания до 1 года в 30% случаев.
2
Данный факт подтверждает тяжесть диабетических микроангиопатий органа зрения, обусловливающих раннюю слепоту и слабовидение пациентов в первые годы заболевания. В результате молекулярно-генетического исследования отмечено, что эмпирическое распределение частот генотипов полиморфного варианта 45 G/T гена адипонектина в популяции якутов соответствует теоретически ожидаемому равновесию Харди-Вайнберга (χ=0.066, P=0.999).
Среди мужчин с ДР и здоровых лиц достоверные статистические различия по полиморфному варианту 45 G/T гена адипонектина (ADIPOQ) не выявлены. Оценка распределения частот генотипов и аллелей полиморфного варианта 45 G/T гена адипонектина (ADIPOQ) обнаружила статистически значимые различия между женщинами, больными ДР, и женщинами контрольной группы (табл.2).
OR
OR
Из табл.2 видно, что с наибольшей частотой в группе женщин, больных ДР, чем у женщин в контрольной группе, встречаются генотип *T/*T (82.35% против 64.15%, Р=0.047) и аллель *T (90.2% против 79.25%, Р=0.617). Относительный риск (OR) генотипа *T*T составил 2.61 (CI=1.05-5.38) и аллеля *T составил 2.41 (CI=1.05-5.38). Частоты других генотипов и аллелей достоверно не различаются.
Предлагаемый способ позволяет при выявлении генотипа *T/*T и аллеля *T полиморфного варианта 45 G/T (ADIPOQ) гена адипонектина у якуток прогнозировать риск развития диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2.
Выявленные генотип *T/*Т и аллель *T полиморфного варианта 45 G/T (ADIPOQ) гена адипонектина являются маркерами повышенного риска диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 для женщин данного этноса. Полученные результаты будут способствовать своевременному прогнозированию и/или выявлению группы риска по диабетической ретинопатии среди якуток и помогут определить тактику ведения пациента с предрасположенностью к диабетической ретинопатии с использованием индивидуального комплекса профилактических и лечебных мероприятий.