УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КЛЕТОК

Полезная модель относится к области медицины, цитологии, биофизики и касается современного метода регуляции адгезии, дифференцировки, пролиферации и апоптоза клеток посредством воздействия на них электрическим сигналом. Устройство предназначено для электрической стимуляции клеток с целью регуляции клеточной адгезии и пролиферации за счет восприимчивости клеток к электрическим сигналам. Устройство найдет применение в области тканевой инженерии с целью повышения функциональности биосовместимых матриксов и ускорения образования полноценной живой ткани из адгезированных на биосовместимом матриксе клеток, а также в исследованиях, посвященных изучению ответных реакций клеток на электрическое поле.
2
Известно устройство для стимуляции нейрональных возбудимых клеток, представленное в патенте РФ 2621841 С1 [1]. Устройство для стимуляции предполагает размещение клеток на чаше микроэлектродной матрицы, которая представляет собой массив металлических микроэлектродов. Микроэлектроды сформированы на подложке, имеющей контактные площадки по периметру, которые соединены с микроэлектродами за счет токопроводящих дорожек. Принципиальным отличием является то, что микроэлектродную матрицу предварительно размещают в коннекторе, расположенном в СО инкубаторе. В коннекторе над микроэлектродной матрицей устанавливают плату таким образом, чтобы чаша с культурой клеток выступала сквозь отверстие платы, и контакты платы были расположены соосно контактным площадкам матрицы с возможностью взаимодействия с ними.
2
2
2
2
Недостатком данного устройства является размещение стимулятора вне камеры СO инкубатора и соединение коннектора и микроэлектродной матрицы со стимулятором посредством проводных соединений, что предполагает нарушение постоянства температуры и влажности в камере СOинкубатора в силу невозможности герметичного закрытия СO инкубатора. Данный фактор может оказывать существенное влияние на поведение клеток при проведении долгосрочных исследований по стимуляции, поэтому компактность устройства и, как следствие, возможность размещения устройства полностью в СO инкубаторе является актуальной задачей при разработке устройств для электрической стимуляции клеток in vitro.
2
Близким по технической сущности является устройство для электрической стимуляции клеток фибробластов на слоях из полипиррола (Guixin S., Mahmoud R., Shiyun M., Zhang Z. Electrical stimulation enhances viability of human cutaneous fibroblasts on conductive biodegradable substrates // Biomedical Materials Research. - 2007. - Vol. 84. - N. 4. - P. 1027-1036.) [2]. Для проведения электрической стимуляции были изготовлены восьмилуночные планшеты из полиметилметакрилата, площадь основания каждой лунки которого имела размеры 2,6×2,0 см. В лунке размещалось по два платиновых электрода толщиной 0,1 мм, направленных параллельно стенкам лунок и перпендикулярно основанию. Для изоляции электродов от культуральной среды и их фиксации были изготовлены полиметилметакрилатовые блоки соответствующих размеров, которые размещались попарно в лунках планшета и закрывали основную часть электродов.
Недостатком данного устройства является необходимость в закреплении и фиксировании полиметилметакрилатовых блоков внутри лунок планшета, что усложняет техническую реализацию устройства, особенно при необходимости проведения регулярных экспериментов с применением данного устройства. Также изготовление нестандартных восьмилуночных планшетов с лунками прямоугольной формы ограничивает универсальность устройства в случае использования данного технического решения для стандартных 6-луночных или 12-луночных культуральных планшетов.
Прототипом устройства для электрической стимуляции роста клеток является устройство, описанное в патенте РФ 2488629 С1 [3]. Устройство состоит из культурального планшета с лунками и крышкой, на крышке планшета расположена макетная плата с электрическими шинами и цилиндрическими электродами, которые погружаются в культуральную среду до контакта с электропроводящим основанием на дне лунки. В каждой лунке размещается по два электрода. Электроды проведены через отверстия, выполненные в крышке планшета. Диаметр отверстий не превышает полутора диаметров электрода с целью обеспечения свободного подведения электродов и защиты от попадания внешних веществ в лунки планшета. Каждый электрод прикреплен к макетной плате посредством плеча, выведенным под прямым углом.
Особенностью прототипа является локальное подведение электрического сигнала к клеткам. Подобное решение позволяет минимизировать потребляемую устройством мощность. Тем не менее данная конструктивная особенность подразумевает маленькую площадь контакта между электродами и проводящим основанием, на котором высажены клетки, что увеличивает сопротивление контакта, локализует электрическое поле в небольшом объеме и снижает эффективность стимуляции в случае, когда размеры электропроводящего основания во много раз превышают диаметр электродов.
Задача предлагаемой полезной модели - оптимизировать устройство для электрической стимуляции роста клеток за счет упрощения конструкции и снизить токсическое воздействие на клетки со стороны устройства.
Основным элементом устройства для электрической стимуляции роста клеток является культуральный планшет с закрываемой крышкой. На фиг. 1 представлен вид одной из лунок культурального планшета в разрезе, где
1 - лунка культурального планшета,
2 - крышка культурального планшета,
3 - печатная плата,
4 - электропроводящее основание,
5 - электрод,
6 - отверстие для вывода электродов и паяное соединение электрода с метализированным отверстием печатной платы.
В крышке культурального планшета 2 формируют отверстия для электродов 5 таким образом, что над каждой лункой находится два отверстия 6. Предпочтительным является расположение отверстий на линии диаметра лунки, симметрично относительно ее центра.
Поверх крышки культурального планшета располагается печатная плата 3, предназначенная для соединения соответствующих электродов в разных лунках и подачи на них напряжения, а также для закрепления электродов. Печатная плата имеет отверстия 6 для электродов, расположение которых соответствует отверстиям в крышке культурального планшета.
Печатная плата приклеивается или иным образом соединяется с крышкой планшета. На печатной плате могут быть расположены элементы схемы формирования импульсов или какой-либо другой электронной схемы, что позволяет сделать всю систему для электрической стимуляции более компактной.
В отверстия печатной платы впаяны электроды, служащие для передачи потенциала от платы к электропроводящему основанию 4. В целях быстрой замены электродов возможно установить на плате гнезда или зажимы. Электродам придают форму, как показано на фиг. 1. Горизонтальная часть электрода имеет плотный пружинистый контакт с электропроводящим основанием за счет наличия угловой и вертикальной частей, которые покрываются изолирующим нетоксичным диэлектрическим покрытием с целью уменьшения тока внутри электролитной культуральной среды. Выведенный через отверстия конец электрода припаивается к металлизированному отверстию печатной платы, которая закрепляется на крышке культурального планшета.
На дне лунки культурального планшета располагается электропроводящее основание, на которое высаживается культуры клеток для адгезии, роста, дифференцировки. расположена подложка для выращивания клеточной культуры.
2
Устройство размещается в СО инкубаторе, в камере которого создаются оптимальные условия для жизнедеятельности клеток. В таком случае компактность предлагаемого устройства является преимуществом, поскольку позволяет разместить устройство целиком в камере инкубатора с минимальной тратой свободного пространства и не требует вывода конструктивных элементов (в частности, проводов для подключения к генератору) вне камеры инкубатора, что сохраняет постоянство параметров внутри камеры.
Таким образом, конструкция устройства для электрической стимуляции роста клеток создана таким образом, что электроды имеют плотный контакт с электропроводящим основанием и электрические сигналы проходят между двумя разнополюсными электродами и непосредственно через электропроводящее основание, которые выполняют роль платформы для передачи электрических импульсов к клеткам.
2
Устройство оптимизировано за счет увеличения площади контакта между электродами и электропроводящим основанием, повышения надежности контакта, уменьшения контактного сопротивления и вероятного повреждения электропроводящего основания при соприкосновении с электродами, увеличения области стимуляции и повышения однородности электрического поля. Предлагаемые в полезной модели решения упрощают конструкцию устройства, по сравнению с устройствами-аналогами. В частности, отсутствие подвижных элементов вне культурального планшета способствует меньшей повреждаемости устройства при его транспортировке и возможности размещения нескольких устройств друг на друге в целях проведения многочисленных единовременных экспериментов с минимальными затратами пространства в СО инкубаторе. Так же задачей полезной модели является снижение токсического воздействия на клетки со стороны устройства за счет использования изолирующего покрытия для электродов и герметизации отверстий, через которые осуществляется вывод электродов из лунки планшета. Ключевой задачей, для реализации которой используются предлагаемые решения, является усиление эффекта влияния электрической стимуляции на рост и дифференцировку клеток.
В рамках реализации данного устройства в качестве электродов были выбраны акупунктурные стерильные иглы диаметром 0,3 мм из хирургической стали с золотым напылением. Использованы стерильные культуральные планшеты с 6 лунками. Спроектированный и изготовленный генератор электрических импульсов предусматривает функцию переключения между конденсаторами и резисторами различных емкостей и сопротивлений с целью изменения параметров электрического сигнала, стабилизации амплитуды выходных импульсов при изменении напряжения питания генератора, снижения влияния сопротивления нагрузки генератора на выходное напряжение. Питание генератора осуществлялось от батареи типа «Крона» напряжением 9 В.
С целью проверки работы устройства проведены эксперименты по электрической стимуляции клеток соединительной ткани человека (фибробластов). В качестве электропроводящего основания были использованы массивы углеродных нанотрубок, которые синтезировали методом каталитического плазменно-химического осаждения из газовой фазы, а затем осуществлялось структурирование массивов (выпрямление углеродных нанотрубок) на лазерном аппарате «LaserScan» посредством импульсного лазерного излучения иттербиевого волоконного лазера с длиной волны 1064 нм. Такие структурированные массивы имеют высокую электропроводность (порядка 0,01-0,1 См/м), являются хорошей подложкой для адгезии и роста клеток. На основе данного материала могут быть сформированы адгезивные элементы для клеток в биомедицинских устройствах. Непосредственно перед экспериментами сформированные массивы углеродных нанотрубок дезинфицировали в бактерицидной камере под воздействием ультрафиолетового излучения, а затем размещали в стерильном устройстве для электрической стимуляции клеток.
5
Серии экспериментов выполнялись при следующих условиях: время непрерывной стимуляции составляло 48 ч при предварительной инкубации клеток без подачи электрических сигналов в течение 24 ч. Амплитуда электрического импульса в каждом независимом эксперименте варьировалась от 60 мВ до 200 мВ, длительность импульса составляла 1 мс, длительность паузы - 400 мс. Для получения суспензии клеток в посадочной дозе 10 клеток/мл и проведения исследований по электрической стимуляции клетки культивировали в культуральной среде «Среда 199» с солями Хенкса и с глутамином, а также с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
Изображения клеток на массивах углеродных нанотрубок после электрической стимуляции, полученные на сканирующем электронном микроскопе, представлены на фиг. 2. Результаты фотоколориметрического МТТ-теста представлены на фиг. 3.
Сравнение клеток на массивах углеродных нанотрубок, которые не подвергались воздействию электрической стимуляции, показало, что в результате электрической стимуляции клетки наблюдалась более плотная локализация клеток и более активное образование клеточных конгломератов. Электрическая стимуляция не привела к патологическим нарушениями в морфологии клеток. Результаты МТТ-теста подтвердили, что с повышением амплитуды электрического сигнала наблюдалось увеличение процента погибших клеток. Наилучший результат от электрической стимуляции был получен при амплитуде сигнала 80-120 мВ для фибробластов, при данных значениях увеличение коэффициента пролиферативной активности по сравнению с контролем составило 13-16%.
Источники информации:
1. Патент РФ 2621841 С1.
2. Статья Guixin S., Mahmoud R., Shiyun M., Zhang Z. Electrical stimulation enhances viability of human cutaneous fibroblasts on conductive biodegradable substrates // Biomedical Materials Research. - 2007. - Vol. 84. - N. 4. - P. 1027-1036.
3. Патент РФ 2488629 C1 (прототип).