Проблемы соответствия антибиотикочувствительности in vitro и эффективности химиотерапии инфекций, вызванных патогенными буркхольдериями

Є

Проблемы соответствия антибиотикочувствительности in vitro и эффективности химиотерапии инфекций, вызванных патогенными буркхольдериями

В. И. ИЛЮХИН, Т. В. СЕНИНА, М. Н. ТРУШКИНА, Е. В. ШУБНИКОВА, Ю. В. АНТОНОВ, Н. В. АНДРОПОВА

ФГУЗ научно-исследовательский противочумный институт, Волгоград

Problems of in vitro Antibiotic Susceptibility Compliance with Efficacy of Chemotherapy in Infections Due to Pathogenic Burkholderias

V. I. ILYUKHIN, T. V. SENINA, M. N. TRUSHKINA, E. V. SHUBNIKOVA, YU. V. ANTONOV, N. V. ANDROPOVA Research Antiplague Institute, Volgograd

Из всех известных видов микробов рода Burkholderia только 2 являются облигатными патогенами: B.mallei и B.pseudoma-llei, вызывающие сап и мелиоидоз соответственно. Остальные виды относятся к сапрофитам, являясь естественными обитателями водоёмов и почвы, однако в определённых условиях способны вызывать оппортунистические инфекции у человека и животных. Для всех видов буркхольдерий характерна высокая устойчивость к антибактериальным средствам, включая антибиотики. По значениям МПК наиболее эффективными химиопрепаратами против патогенных буркхольдерий являются тетрациклины, фторхинолоны, пенемы и комбинированные сульфаниламиды. При лечении в эксперименте сапа и мелиоидоза набор эффективных препаратов варьировал в обратной зависимости от тяжести и скорости протекания инфекции. Наилучшие результаты получены при использовании ко-тримоксазола, далее в порядке убывания эффекта — доксицикли-на, ципрофлоксацина и цефтазидима. Показано, что определённое значение при оценке перспектив использования химиопрепаратов для лечения буркхольдериальных инфекций может представлять модификация метода определения антибиотикочувствительности, состоящая в добавлении к среде нативной крови и подращивании в атмосфере 5% СО2.

Ключевые слова: Burkholderia, сап, мелиоидоз, хuмuomeрanuя, aнmuбuomuкoчyвcmвumeльнocmь.

Among the known species of Burkholderia only two are obligate pathogens, i. e. B.mallei and B.pseudomallei, causative agents of glanders and melioidosis respectively. The other species are saprophytes as natural inhabitants of water reservoirs and soil, still capable of causing opportunistic infections in humans and animals under definite conditions. All the species of Burkholderia are characterized by high resistance to antibacterials, including antibiotics. By the MICs, the most efficient chemotherapeutics against pathogenic burkholderias are tetracyclines, fluoroquinolones, penems and combined sulfanilamides. In the treatment of experimental glanders and melioidosis the set of the effective drugs had the inverse variation dependence on the infection severity and the desease process rate. Co-trimoxasole showed the best results, then followed doxicycline, ciprofloxacin and ceftazidime in the diminishing succession. The modification of the method for determination of antibiotic susceptibility with addition of native blood to the medium and the subculture under the atmosphere of 5% CO2 was shown useful in estimation of the prospects of the use of chemotherapeutics for the treatment of Burkholderia infections.

Key words: Burkholderia, glanders, melioidosis, chemotherapy, antibiotic susceptibility.

Введение

В род ВыгкНоШепа входит более 30 видов, из них В.та1Ш и В^еыйоша11е1 являются возбудителями особо опасных инфекций — сапа и мелиоидоза [1,2], остальные представители этого рода относятся к сапрофитам, из которых в медицинской практике наиболее известны В^кайаЫепт

— почвенный микроб, филогенетически близкий B.pseыdomallei, и В.еераЫа, вызывающая оппортунистические или нозокомиальные инфекции у больных с иммунодефицитом, притом наиболее

© Коллектив авторов, 2009

Адрес для корреспонденции: 400131 Волгоград, ул. Голубинская, 7. НИПЧИ

тяжёлая форма — это cepacia-синдром, возникающий у больных муковисцидозом [3—5].

Заболевания, вызванные патогенными буркхольдериями, требуют длительной интенсивной химиотерапии, так как эти микробы устойчивы к широкому набору антибиотиков, а в процессе многодневного введения препаратов часто наблюдается селекция устойчивых форм возбудителей, поэтому рекомендуется в процессе лечения поэтапная смена препаратов и комбинированная химиотерапия [1, 2, 5].

Известно, что использование препаратов, достаточно активных in vitro в отношении патогенных микроорганизмов, в том числе и буркхольде-

-е-

Є

Таблица 1. Чувствительность буркхольдерий к химиотерапевтическим препаратам

Препараты МДК, мкг/мл B.mallei B.pseudomallei B.cepacia B.thailandensis

Амоксиклав 40 3,1

Ампициллин 25 50

Гентамицин 4 1,5

Доксициклин 4 0,7

Ко-тримоксазол 100 1,5

Меропенем 10 0,7

Офлоксацин 10 1,5

Пиперациллин 40 3,0

Полимиксин В 15 >100 >100 >100 >100

Рифампицин 20 3,1

Хлорамфеникол 20 3,1

Цефтазидим 70 3,1

Ципрофлоксацин 4 1,5

Примечание. МДК - максимально достижимая концентрация препарата в крови; диапазон МПК, мкг/мл; МПК50 -препарата (медиана), мкг/мл.

рий (B.mallei, B.pseudomallei), в ряде случаев оказывается неэффективным при лечении вызываемых ими заболеваний [1, 5, 6]. Этот феномен связыша-ют с различными факторами, проявляющимися в процессе взаимодействия микроорганизма с антибиотиками в условиях in vivo: с постантибиотичес-ким эффектом, повышением антибиотикоустой-чивости бактерий при формировании биоплёнки, наконец, с прямым воздействием физико-химических факторов внутренней среды макроорганизма, существенно влияющих на характер взаимодействия антибиотиков с патогенным микроорганизмом [7—9].

Целью нашей работы явилось изучение эффективности различных химиопрепаратов при лечении инфекций, вызванных патогенными буркхольдериями. При этом мы пытались установить влияние на МПК условий постановки опытов, моделирующих характер взаимодействия препаратов с микробами in vivo, а именно добавление в среду крови экспериментальных животных в атмосфере с 5% С02.

Материал и методы

Штаммы буркхольдерий получены из коллекционного центра Волгоградского противочумного института. Принадлежность культур Burkholderia к виду подтверждена стандартными микробиологическими и генетическими методиками [3,4]. Количество исследованных штаммов: B.mallei — 14, B.pseudomallei — 20, B.cepacia — 18 и B.thailandensis — 5.

Чувствительность культур к химиопрепаратам определяли 2 методами на среде Mueller-Hinton («Himedia»): диско-диф-фузионным методом со стандартными бумажными дисками диаметром 6 мм («Himedia») и методом серийныгх разведений на плотной среде, содержащей убывающие концентрации препаратов от 100 мкг/мл до 0,7 мкг/мл. Постановка опытов и учёт результатов соответствовали общепринятым стандартам [10]. Параллельно чувствительность буркхольдерий к химиопрепаратам определяли на среде Mueller-Hinton с добавлением свежей гепаринизированной («Richter», 5 МЕ/мл) крови в атмосфере 5% СО2 (СО2 инкубатор Forma scientific).

Для определения вирулентности (ЛД50) культур буркхольдерий золотистыгх хомячков и белыгх крыс подкожно заражали суспензией суточной агаровой культуры с интервалом в

1 lg. При моделировании инфекции животных заражали бактериальной суспензией в дозе 103 ЛД50.

Лечение начинали через 24 ч после инфицирования. Дозы препаратов определяли в соответствии с рекомендациями по лечению острых форм мелиоидоза и сапа: для ципрофлок-сацина 40 мг/кг, для хлорамфеникола — 40 мг/кг, цефтазиди-ма — 120 мг/кг, меропенема — 50 мг/кг, рифампицина — 20 мг/кг, ко-тримоксазола — б0 мг/кг и для доксициклина — 40 мг/кг [1, б, 11]. За исключением меропенема, препараты давали per os в суспензии подсолнечного масла, меропенем вводили подкожно в объёме 0,5 мл. Длительность лечения — 10 сут, окончательный учёт результатов — через 30 сут после прекращения лечения.

Статистическая обработка результатов проведена с использованием непараметрических критериев анализа: достоверность различий выживаемости животных в опытной и контрольной группах при лечении рассчитана по критерию Уайта, сравнение показателей чувствительности к антибиотикам в разных условиях постановки опытов оценивали по критерию знаков, в качестве средних величин использовали медиану, а ЛД50 рассчитывали по Керберу [12].

Результаты и обсуждение

Данные по определению МПК методом серийных разведений на среде Mueller Hinton представлены в табл. 1. Установлено, что подавляющее большинство штаммов буркхольдерий всех 4 видов являются резистентными к пенициллинам, аминогликозидам, полимиксину В, умеренно чувствительными к рифампицину, тетрацикли-нам, хлорамфениколу. Высокая чувствительность проявляется к пенемам, фторхинолонам и отдельным комбинированным препаратам сульфаниламидов и беталактамов. Принципиально эти данные не отличаются от ранних наблюдений по этой проблеме [1, 13—15], за исключением появления в списке антибиотиков ранее неизвестных препаратов.

При сопоставлении видовой чувствительности буркхольдерий к химиопрепаратам можно констатировать, что наибольшей резистентностью обладают штаммы сапрофитных видов (B.cepacia и B.thailandensis), а максимальная чувствительность проявляется у штаммов единст-

О

Є

Таблица 2. Эффективность химиотерапии экспериментального сапа и мелиоидоза у золотистых хомячков

Инфицирующий агент (заражающая доза) Препараты Доза, мг/кг/сут Л Т, сутки

B.mallei 10230 (104 м. к.) Цефтазидим 120 10/10 7,5

Mеропенем 50 10/10 б,5

Ципрофлоксацин 50 4/10* 14,2*

Доксициклин 50 5/10* 1б,5*

Рифампицин 50 10/10 15,5*

Хлорамфеникол 80 10/10 б,2

Ко-тримоксазол 100 2/10* 8,5

Контроль — 10/10 5,2

B.pseudomallei С-141 (104 м. к.) Цефтазидим 120 10/10 7,0

Mеропенем 50 10/10 б,2

Ципрофлоксацин 50 8/10 15,5*

Доксициклин 50 10/10 18*

Рифампицин 50 10/10 5

Хлорамфеникол 80 10/10 5

Ко-тримоксазол 100 7/10 30*

Контроль — 10/10 4,0

Примечание. Л - летальность среди заражённых животных, где числитель - количество павших, знаменатель - общее число заражённых; Т - средняя продолжительность жизни павших животных, * - достоверность различия показателя с контролем превышают 95% (р<0,05).

венного среди буркхольдерий патогена завершенного типа B.mallei [3].

Для лечения экспериментальных инфекций у животных быши отобраны штаммы с характеристиками чувствительности соответствующими средним показателям МПК для данного вида: B.mallei 10230 и B.pseudomallei С-141.

Перед проведением опытов по лечению животных быши определены ЛД50 штаммов для двух видов лабораторных животных. Так как наибольшей чувствительностью к патогенным буркхольдериям обладают золотистые хомячки [3, 6, 11], культуры всех изученных видов буркхольдерий быши проверены на вирулентность на этом виде животных. Для типовыгх штаммов ЛД50 имели следующие показатели: для B.mallei 10230 — 1,4х101 м. к., B.pseudomallei С-141 — 0,8х101 м. к., B.cepacia 25416

— > 5х108, B.thailandensis 264 — 2х106 м. к. При заражении белых крыс вымвлено, что этот вид резистентен к инфицированию B.mallei, B.cepacia и B.thailandensis и среди животных, получавших максимальную дозу 109 м. к., гибель не отмечена. Вирулентность штаммов B.pseudomallei для белых крыс варьирует в широких пределах, так же как и форма заболевания — от локальных абсцессов до сепсиса. Максимальная вирулентность отмечена у штамма B.pseudomallei 100, у которого ЛД50 составила

0,8х103м. к.

Для заражения животныгх была избрана равноэффективная доза, соответствующая 103 ЛД50. Лечение химиопрепаратами начинали через 24 ч после инфицирования. Лечебные дозы, учитышая более интенсивный уровень метаболизма и высокий коэффициент соотношения площади поверхности тела к массе тела у лабораторных животных, по сравнению с человеком, были несколько выше рекомендуемых для лечения людей [1, 6, 16]. Из отобранныгх препаратов для ле-

чения высокочувствительных к сапу и мелиоидозу золотистых хомячков наиболее эффективным оказался ко-тримоксазол, достоверно снизивший уровень летальности при заражении B.mallei 10230 и существенно увеличивший продолжительность жизни павших животных при обеих инфекциях (табл. 2). Вполне перспективными препаратами при лечении сапа оказались ципрофлоксацин и доксициклин, которые, однако, при мелиоидозной инфекции не предотвращали летальность животных, лишь достоверно увеличив продолжительность их жизни.

Определённый интерес представляло испытание этих препаратов на белых крысах в опытах с мелиоидозной инфекцией. При 100% летальности в контроле эффективными оказались, за исключением хлорамфеникола, все перечисленные в табл. 2 препараты (после 10-дневной терапии количество выживших животных составляло 50—100%).

Таким образом, уровень защиты при химиотерапии сапа и мелиоидоза коррелировал не только с уровнем МПК препаратов, но и зависел от характера протекания инфекции. При заражении равноэффективной дозой 103 ЛД50 скорость протекания инфекции распределялась в следующем порядке: мелиоидоз (золотистые хомячки ), сап (золотистые хомячки) — мелиоидоз (белые крысы). Эффективность препаратов соответствовала той же тенденции. Отсюда можно было предположить, что in vitro для оценки эффективности химиопрепаратов против буркхольдерий желательно воспроизвести условия, моделирующие характер взаимоотношений in vivo, а именно добавив к среде нативную кровь животных в атмосфере, содержащей 5% СО2.

В наших опытах (табл. 3) вымвлено, что практически во всех случаях резистентность к препаратам в модифицированный условиях повышалась, особен-

О

Є

Таблица 3. Чувствительность к антибиотикам буркхольдерий на среде Mueller-Hinton с добавлением крови лабораторных животных в атмосфере 5%

Антибиотики с ю А Д V Штаммы

B.mallei 1G23G B.pseudomallei C-141 B.cepacia 25416 B.thailandensis 264

к з. x. б. к. к з. x. б. к. к з. x. б. к. к з. x. б. к.

Ципрофлоксацин 5 16—24 3G 22* 28 3G 25* 28 3G 3G 25* 33 3G 29

Меропенем 1G 13—16 33 22* 32 3G 2G* 28 25 1G* 1G* 25 2G* 17*

Цефтазидим 3G 14—18 27 2G* 29 25 2G* 2G* 22 8* 15* 25 2G* 23

Хлорамфеникол 3G 12—18 3G 3G 3G 28 25 22* 25 11* 15* 25 25 22

Доксициклин 1G 12—16 3G 25 3G 25 2G* 2G* 2G 15* 18 25 25 22

Рифампицин 3G 14—19 2G 8* 15* 12 8* 11 12 8* 11 12 1G 11

Ко-тримоксазол 25 1G—16 35 33 32 3G 28 28 3G 25 24 28 26 27

Примечание. С - содержание препарата в диске (мкг); <К->Б - зона оценки резистентности (К) и чувствительности (Б), мм; К - контроль; з. х. и б. к. - зоны задержки роста на среде с добавлением крови золотистых хомячков или белых крыс в атмосфере 5% С02; цифры - медиана 5 опытов; * - достоверность различия показателя с контролем превышает 95% (р<0,05).

но заметное снижение чувствительности буркхольдерий в этих условиях отмечается в опытах с рифам-пицином и меропенемом. В то же время размер зоны задержки роста штаммов ко-тримаксазолом и при модификации постановки опыта существенно превышал стандарт показателя чувствительности к данному препарату. Причём достоверное уменьшение зон задержки роста вокруг дисков с химиопрепаратами отмечено в 25 случаях, в 19 из которых в большинстве своём этот феномен отмечен в опытах с кровью наиболее чувствительных к буркхольдери-ям — золотистых хомячков.

Объяснение этому явлению двоякое — с одной стороны, в условиях повышенного содержания СО2 снижается эффективность действия некоторых групп антибиотиков [7, 10], с другой — добавление крови к среде МиеПег-НЩоп повышает ее ростовые свойства. В наших опытах показано, что при высеве на модифицированную среду взвеси 103 м.к. буркхольдерий в среднем на 20% повысилось количество колоний и их размер при учёте на третьи сутки после высева.

Таким образом, на основании полученных нами данных следует сделать предположение, что оценка чувствительности патогенных культур к набору антибиотиков в стандартных условиях не может служить единственным определяющим фактором при назначении набора препаратов для лечения инфекций, вызванных патогенными бурк-

хольдериями. Во многом на эффективность терапии влияет характер инфекционного процесса у конкретного макроорганизма, скорость и форма сформировавшегося патологического процесса. Для прогнозирования результатов лечения различными химиотерапевтическими препаратами необходима дальнейшая разработка методов оценки взаимодействия в системе микроб — антибиотик в условиях, максимально приближенных к процессу, происходящему в конкретном макроорганизме.

Выводы

1. Наиболее активными препаратами в отношении патогенных буркхольдерий являются комбинированные сульфаниламиды, тетрацик-лины и фторхинолоны.

2. При лечении экспериментальных инфекций, вызванных патогенными буркхольдериями, эффективность монотерапии определяется не только уровнем МПК препаратов, но и характером и скоростью протекания инфекционного процесса в макроорганизме. Наиболее эффективными препаратами для лечения экспериментального сапа и мелиоидоза являются ко-тримокса-зол, ципрофлоксацин и доксициклин.

3. Определение МПК химиопрепаратов с добавлением крови и в атмосфере с 5% СО2 повышает ценность прогноза эффективности рекомендуемых терапевтических антибактериальных средств.

ЛИТЕРАТУРА

1. Cheng A. C, Currie B. J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology and management. Clin Microbiol Rev 2005; 18: 383—416.

2. Waag D. M, Deshazer D. Glanders. New insights into an old disease. In: Infectious Disease: Ed. by L. E. Lindler, F. J. Lebeda, G. W. Korch, N.

J. 2004; 209—237.

3. Илюхин В. И., Сенина Т. В., Плеханова Н. Г. и др. Burkholderia thai-landensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2002; 1: 7—11.

4. Антонов В. А., Илюхин В. И., Сенина Т. В. и др. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia Журн микробиол эпидемиол иммунол 2008; 4: 78—82.

Gibson R. L., Burns J. L., Ramsey B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Resp Crit Care Med.2003; 168: 918—951.

Илюхин В. И., Алексеев В. В., Антонов Ю. В. и др. Эффективность лечения экспериментального сапа при аэрогенном заражении. Антибиотики и химиотер 1994; 9—10: 45—48.

Corkill J. E., Deveney J., Pratt J. Effect of pH and CO2 on in vitro susceptibility of Pseudomonas cepacia to beta-lactams. Pediatr Res 1994;

35: 3: 299—302.

Walsh A. L., Smith M. D., Wuthiekanum V., White N. J. Postantibiotic effect and Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei: an evaluation of current treatment. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 2356—2358.

Є

9. Илюхин В. И., Батманов В. П. Влияние температуры и рН среды

по чувствительности патогенньш псевдомонад к xимиoпрeпaрa-там. Антибиотики и xимиoтeр1997; 4: 21—23,

ДО. Ericsson H. M., Sherris J. C. Antibiotic sensitivity testing. Acta Pathol et Microbiol Scand 1971; 217: 1—9G.

11. Russell P., Eley S. M., Ellis J. et al. Comparison of efficacy of ciprofloxacin and doxycycline against experimental melioidosis and glanders. J Antimicrob Chemother 2GGG; 45: 813—818.

12. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологически исслeдoвaнияx. М.: 1962;18G,

13. Антонов Ю. В., Илюхин В. И., Поповцева Л. Д. и др. Чувствительность псевдомонад к современным антибактериальным препаратам. Антибиотики 1991; 1: 14—16,

14. Kenny D. L., Russell P., Rogers D. et al. In vitro susceptibilities of Burkholderia mallei in comparison to those of other pathogenic Burkholderia spp. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43: 11: 2773—2775.

15. Thibault F. M., Hernande Z. E., Vidal D. R. et al. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents. Ibod 2004; 54: 1134—1138.

16. Навашин С. М., Фомина И. П., Архангельский А. М. и др. Инструкция по единой методике экспериментального изучения и клинических испытаний новых антибиотиков и химиопрепаратов для экстренной профилактики и лечения опасных инфекционных заболеваний. М.: 1980; 15.