Способ дооперационной дифференциальной диагностики анапластического рака щитовидной железы
METHOD FOR PREOPERATIVE DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF ANAPLASTIC THYROID CANCER

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для дооперационной дифференциальной диагностики анапластического рака щитовидной железы.
Анапластический рак (АР) щитовидной железы человека встречается всего в 0,8-2% случаев среди всех тиреоидных карцином, однако в структуре смертности его доля составляет уже 15-40%. АР щитовидной железы является одной из самых быстрорастущих опухолей человека, в результате чего у 80% больных при ее обнаружении уже имеются отдаленные метастазы. Плохой прогноз также связан с тем, что анапластическая карцинома щитовидной железы часто выявляется уже на поздних стадиях. Таким образом, ранняя и точная диагностика имеет ключевое значение для быстрого начала терапии анапластического рака щитовидной железы. Тонкоигольная аспирационная пункционная биопсия (ТАПБ) узлов щитовидной железы под УЗИ-контролем является наиболее широко используемым способом получения цитологического материала для первоначальной оценки риска злокачественности этих образований. ТАПБ является малоинвазивным, но не всегда окончательным методом диагностики АР щитовидной железы. Наличие обширного некроза, воспаления и атипичных ядер, схожих с другими неопластическими состояниями, может значительно снизить диагностический потенциал ТАПБ у больных АР щитовидной железы и требует дополнительного проведения открытой биопсии опухоли.
Сложность и неоднозначность первичной диагностики АР щитовидной железы отражена в клинических рекомендациях ATА, в которых рекомендуется начинать лечение, не дожидаясь результатов биопсии (1). Все это диктует необходимость поиска новых маркеров, которые способны ускорить дооперационную диагностику АР.
В последнее время особое внимание уделяется роли микроРНК в диагностике АР щитовидной железы. МикроРНК относятся к классу малых некодирующих РНК, которые регулируют посттранскрипционную экспрессию генов. Использование различных микроРНК в качестве диагностических маркеров дифференцированных форм рака щитовидной железы в настоящее время уже успешно реализовано в различных генетических панелях, таких как ThyGenX/ThyraMIR, Rosetta Reveal (2), mir-THYpe (3), ТироидИНФО (4). Подобные исследования в отношении АР щитовидной железы остаются единичными и с низкой выборкой, прежде всего в силу редкой встречаемости этой опухоли.
Известен способ определения доброкачественных и злокачественных новообразований щитовидной железы (ЩЖ) человека, включающий взятие образца ткани опухоли ЩЖ и прилежащей неизмененной ткани железы в качестве контроля, выделение микроРНК из образцов, проведение реакции обратной транскрипции, измерение уровня экспрессии микроРНК-21, -221, -222, -155, -205 методом ПЦР в реальном времени с последующим сравнительным анализом изменения уровня экспрессии микроРНК в норме и при опухолевых образованиях ЩЖ и составлением заключения о наличии и типе новообразования. В случае изменения уровня экспрессии вышеуказанных микроРНК не более чем в 4 раза, как в сторону повышения, так и в сторону понижения экспрессии, по отношению к контрольному образцу, делают заключение о доброкачественном новообразовании. В случае изменения уровня экспрессии микроРНК более чем в 4 раза, делают заключение о злокачественном новообразовании (5).
Недостатками известного способа являются трудоемкость, связанная с необходимостью измерения уровня экспрессии большого количества микроРНК, а также непригодность для диагностики анапластического рака щитовидной железы.
Наиболее близким к заявляемому способу-прототипом, является способ дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы человека, где при неопределенных цитологических заключениях выполняют молекулярно-генетическое исследование, производя методом ОТ-ПЦР в реальном времени количественную оценку матричной РНК (мРНК) и микроРНК и при условии показателей HMG А2 более0.09, микроРНК-221 более0,0105 имикроРНК-375 более -12,1213, определяют фолликулярную опухоль с признаками злокачественности, при условии показателей микроРНК-146b более 0.1721, определяют папиллярный рак, при показателях миРНК-375 более 5.25 14, определяют медуллярный рак, а показатель соотношения митохондриальной ДНК/ядерной ДНК более 5716,3013 - В-клеточный рак, наличие мутации V600 в гене BRAF - папиллярный рак (6)
Недостатками известного способа являются трудоемкость, связанная с необходимостью измерения уровня экспрессии большого количества микроРНК, а также ограниченные функциональные возможности, в связи с тем, что способ не предназначен для диагностики анапластического рака щитовидной железы.
Задачей изобретения является создание точного и быстрого способа дооперационной диагностики АР щитовидной железы с целью как можно более раннего начала лечения данной группы пациентов.
Технический результат: обеспечение высокой точности диагностики, а также ее упрощение.
Предлагаемый способ заключается в следующем.
Цитологический окрашенный препарат, полученный путем ТАПБ из опухоли щитовидной железы пациента, смывают с цитологических стекол лизирующим буфером, далее из него проводят выделение суммарного пула РНК и микроРНК любым из известных способов, с помощью коммерческих наборов для выделения, затем производят детекцию и количественную оценку уровня экспрессии микроРНК-21 и микроРНК-145, методом ОТ-ПЦР в реальном времени.
Используют стандартную концентрацию прямых и обратных праймеров - 0,5 мкМ, концентрация флуоресцентно меченого зонда - 0,25 мкМ. Реакцию обратной транскрипции проводят в течение 15 мин. при 16°С, 15 мин. при 42°С, затем обратную транскриптазу инактивируют 2 мин. при 95°С и отбирают 3 мкл полученной смеси для ПЦР в реальном времени. Протокол ПЦР: предварительный прогрев при 95°С - 2 мин, 50 циклов: денатурация при 94°С -10 сек, отжиг праймеров и элонгация: 60°С - 20 сек.
Анализ полученных данных проводят 2(-ΔCt) методом (7).
При условии показателей уровня экспрессиимикроРНК-21 более 15 и соотношения микроРНК-21/микроРНК-145 более 120 делают заключение о наличии у пациента АР щитовидной железы.
Предварительно, для определения и обоснования диагностических значений микроРНК, был проведен сравнительный анализ уровней экспрессии человеческих микроРНК в 60 гистологических образцах, полученных у пациентов с АР щитовидной железы. Контрольные группы составили 25 пациентов с доброкачественными узлами (ДУ), 36 с фолликулярными аденомами (ФА), 32 с фолликулярным раком (ФР) и 152 больных папиллярным раком щитовидной железы (ПР). Для оценки возможности диагностики АР щитовидной железы по окрашенным цитологическим стеклам, у 7 из 60 больных дополнительно проведен анализ уровней экспрессии диагностически значимых микроРНК в гистологических и цитологических препаратах. Были оценены уровни экспрессии 14 наиболее информативных микроРНК(миР) при раке щитовидной железы (миР-144, миР-145, миР-146b, миР-155, миР-183, миР-199b, миР-221, миР-31, миР-375, миР-451а, миР-551b, миР-7, миР-21, миР -125b). Статистически значимые различия, отличающие АР щитовидной железы одновременно от всех контрольных групп, были выявлены для 4-х микроРНК. Наиболее повышенная экспрессия микроРНК при анапластическом раке наблюдалась у микроРНК-21 и микроРНК-155, а снижена у микроРНК-145 и микроРНК-125b. Относительные уровни экспрессии микроРНК, информативных в качестве маркера АР (р<0,00089) представлены на фиг. 1, из которой видно, что наиболее значимыми микроРНК для дифференциальной диагностики АР являются микроРНК-21имикроРНК-145.
Для определения диагностической ценности данных микроРНК в качестве маркера АР, был проведен ROC-анализ каждой из них, а также различных их комбинаций. Наибольшее значение площади под ROC кривой (AUC) были получены для миР-21 (AUC=0,95), и у комбинации миР-21 /миР-145, AUC=0,96.
ROC-анализ специфичных микроРНК для анапластического рака щитовидной железы представлен на фиг.2. Из фиг.2 видно, что диагностические маркеры миР-21 и миР-21/миР-145 обладают высокой чувствительностью и специфичностью. В частности, при отсечке экспрессии миР-21 в 15, чувствительность составила 0,96, специфичность 0,83; для отсечки соотношения миР-21/миР-145 в 120, чувствительность 0,95, специфичность 0,94. Проведено сопоставление уровней экспрессии микроРНК в гистологических и окрашенных цитологических препаратах у 7 больных АР. Использование миР-21 и соотношения миР-21/миР-145 в качестве маркера АР щитовидной железы в цитологических препаратах оказалось точным во всех 7 случаях (100%).
Предлагаемый способ дооперационной диагностики АР щитовидной железы отличается от известных тем, что дает возможность с высокой точностью применять его уже на окрашенных цитологических препаратах.
Ниже приведены конкретные примеры, иллюстрирующие эффективность заявленного способа дооперационной диагностики анапластического рака щитовидной железы
Пример 1.
У пациентки В., 59 лет, которая предъявляла жалобы на быстрый рост опухоли на шее, был установлен диагноз: многоузловой нетоксический зоб 2 ст. по ВОЗ. Ей была выполнена ТАПБ щитовидной железы под УЗИ контролем, по результатам цитологического исследования подозрение на фолликулярную опухоль (Bethesda IV), что соответствует «неопределенному» цитологическому заключению и операция носит диагностический характер.
Был проведен молекулярно-генетический анализ первичного цитологического материала с окрашенного стекла этой пациентки заявляемым способом.
Выделение суммарного пула РНК, содержащего также и микроРНК, проводили с помощью набора «РеалБест экстракция 100» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Материал, нанесенный на цитологические стекла, смыли 600 мкл лизирующего буфера, входящего в используемый набор для выделения, в пробирку объемом 1,5 мл.
Измерение уровня экспрессии микроРНК проводили методом ОТ-ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США).
Использовали стандартную концентрацию прямых и обратных праймеров - 0,5 мкМ, концентрация флуоресцентно меченого зонда - 0,25 мкМ. Реакцию обратной транскрипции проводили в течение 15 мин. при 16°С, 15 мин. при 42°С, затем обратную транскриптазу инактивир овал и 2 мин. при 95°С и отбирали 3 мкл полученной смеси для ПЦР в реальном времени. Протокол ПЦР: предварительный прогрев при 95°С-2 мин, 50 циклов: денатурация при 94°С - 10 сек, отжиг праймеров и элонгация: 60°С - 20 сек.
Анализ полученных данных пороговых циклов ПЦР в реальном времени проводился 2(-ΔCt) методом (7).
При проведении молекулярно-генетического анализа получены следующие значения исследуемых биомаркеров: значение уровня экспрессии микроРНК-21 составило 37, соотношение микроРНК-21/микроРНК-145 составило 1739, на основании чего было сделано заключение о наличии у пациентки АР щитовидной железы (более 99%).
Пациентке в короткие сроки была выполнена диагностическая операция - открытая биопсия опухоли щитовидной железы. Гистологическое заключение - подозрение на низкодифференцированный рак щитовидной железы. Выполнено уточняющее иммуногистохимическое исследование, в результате которого подтвержден диагноз: анапластический рак щитовидной железы.
Таким образом, проведение молекулярно-генетического анализа позволило сократить время между ТАПБ и непосредственным удалением опухоли, что, безусловно, позволило избежать дальнейшего увеличения опухоли в размерах и повысило вероятность положительного прогностического характера заболевания.
Пример 2.
Пациентка Е. 78 лет, 10 лет назад выявлен многоузловой зоб, наблюдалась у эндокринолога. Последний год отмечает появление удушья, дискомфорт в области шеи. При контрольном УЗИ отмечен рост узлов и увеличение объема щитовидной железы на 26% по сравнению с предыдущими данными. Выполнена ТАПБ щитовидной железы под УЗИ контролем, по результатам цитологического исследования: злокачественное поражение (Bethesda VI), подозрение на анапластическую карциному. В соответствии с клиническими рекомендациями, цитологическое заключение Bethesda VI является показанием к оперативному лечению, в то время как подозрение на анапластический рак требует проведения уточняющей открытой биопсии с последующим гистологическим исследованием. Пациентке был проведен молекулярно-генетический анализ первичного цитологического материала.
Выделение суммарного пула РНК и измерение уровня экспрессии микроРНК-21 и микро РНК-145 проводили аналогично примеру 1.
Значение уровня экспрессии микроРНК-21 составило 1,2, соотношение микро РНК-21/микроРНК-145 составило 12, что указывало на отсутствие АР щитовидной железы у пациентки (менее 1%). Учитывая данные молекулярно-генетического исследования, в целях сокращения сроков обследования, больной было решено выполнить оперативное лечение в объеме тиреоидэктомии без проведения уточняющей открытой биопсии. Послеоперационное гистологическое исследование позволило установить диагноз: высокодифференцированный папиллярный рак щитовидной железы, таким образом, подтвердив верность принятого лечебно-диагностического алгоритма, сократив время между диагностическими мероприятиями и операцией.
Использование предлагаемого способа позволит на дооперационной стадии с высокой точностью осуществлять диагностику анапластического рака щитовидной железы, тем самым сократив время между диагностическими мероприятиями и операцией, для как можно более раннего начала лечения данной группы пациентов.
Источники информации
1. Smallridge R.C., Ain K.B., Asa S.L., et al. American Thyroid Association Anaplastic Thyroid Cancer Guidelines Taskforce. American Thyroid Association Guidelines for Management of Patients with Anaplastic Thyroid Cancer. Thyroid. 2012; 22:1104-1139.
2. Vargas-Salas, S., Martínez, J. R., Urra, S., et al. Genetic testing for indeterminate thyroid cytology: review and meta-analysis. Endocrine-related cancer, 2018, 25(3), R163-R177.
3. Santos, M., Buzolin, A. L., Gama, R. R., et al. Molecular Classification of Thyroid Nodules with Indeterminate Cytology: Development and Validation of a Highly Sensitive and Specific New miRNA-Based Classifier Test Using Fine-Needle Aspiration Smear Slides. Thyroid: official journal of the American Thyroid Association, 2018, 28(12), 1618-1626.
4. Titov S, Demenkov PS, Lukyanov SA, et al. Preoperative detection of malignancy in fine-needle aspiration cytology (FNAC) smears with indeterminate cytology (Bethesda III, IV) by a combined molecular classifier [published online ahead of print, 2020 Mar 25]. J Clin Pathol. 2020; jclinpath-2020-206445.
5. Патент RU 2548773 C1, опубл. 20.04.2015. Способ дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы человека.
6. Патент RU 2705110 С1, опубл. 06.11.2018. Способ дифференциальной диагностики новообразований щитовидной железы.
7. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001 Dec; 25(4):402.