Исследование молекулярной структуры лекарственных растений одуванчика ( Taraxacum officinale Wigg. ) и цикория обыкновенного ( Cichorium intybus L. ) методом спиновой метки

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2012, том 55, №11_

ФИЗИКА

УДК 541.64.543.422.23

И.Х.Юсупов, А.Д.Бахдавлатов, академик АН Республики Таджикистан Р.Марупов

ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ СТРУКТУРЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОДУВАНЧИКА (TARAXACUM OFFICINALE WIGG.) И ЦИКОРИЯ ОБЫКНОВЕННОГО (CICHORIUMINTYBUS L.) МЕТОДОМ СПИНОВОЙ

МЕТКИ

Физико-технический институт им.С.У.Умарова АН Республики Таджикистан

Разработана методика химической модификации дикорастущих лекарственных растений одуванчика и цикория методом спиновой метки. Изучена стабильность и молекулярная подвижность нитроксильного радикала, введённого в матрицу одуванчика и цикория. Установлено, что при комнатной температуре в спектрах ЭПР наблюдается заторможенность вращательной подвижности спиновой метки с временем корреляции rc<10-7e, которая свидетельствует об изменении системы меж- и внутримолекулярных водородных связей в области присоединения метки.

Ключевые слова: спиновая метка - одуванчик - цикорий - спектры ЭПР.

При изучении структуры жидкостей, полимеров и биологических структур используют различные физико-химические методы. Однако многие методы не дают более подробной информации о динамической структуре молекул, изменении конформационных переходов, содержании различных дефектов и микропустот. Для получения информации о динамической структуре молекул широкое применение нашёл метод спиновых меток на основе стабильных нитроксильных радикалов [1-6]. Спиновые метки играют роль молекулярных датчиков и дают уникальную информацию о различных динамических изменениях исследуемой системы.

В данной работе разработана методика химической модификации дикорастущих лекарственных растений одуванчика и цикория по спиновой метке, также методом ЭПР изучена подвижность спиновой метки модифицированных исследуемых объектов.

Образцы одуванчика были собраны во время цветения из местностей произрастания: вблизи и вдали от автомагистрали (г. Душанбе), а также на разных высотах над уровнем моря и в различных условиях постоянного воздействия природно-техногенного радиационного фона у бассейна реки Сиёма (Варзобское ущелье), в местах слияния с притоком Малый Игизак, Большой Игизак и Игизак. Образцы цикория были собраны из различных мест - с Памира (Хорогский, Дарвазский, Шугнанский районы). Образцы тщательно очищали от сопутствующих веществ, промывали обычной и дистиллированной водой, экстрагированным эфиром, спиртом и высушивали при комнатной температуре. В качестве спиновой метки использовали стабильный нитроксильный радикал (I), имеющий следующую структурную формулу:

Адрес для корреспонденции: Юсупов Изатулло Ходжаевич. 734063, Республика Таджикистан, г. Душанбе, ул. Айни, 299/1, Физико-технический институт АН РТ. E-mail: usupizat@yandex.ru

нсГ\/\0А/Ч>

Исследуемые образцы химически модифицировали по гидроксильным группам спиновой меткой (I) следующим образом: навески образца по 25 мг помещали в 0.9 мл раствора в фосфатный буфер (pH=9-10) с добавлением 0.1 мл этанолового раствора спиновой метки (I) с концентрацией (102 м/л), после чего концентрация радикала (I) в инкубационной среде достигала 4^10"3 м/л. Смесь выдерживали в течение пяти суток при комнатной температуре, затем нагревали два часа при 333-343 К. Модифицированные образцы отмывали от непрореагировавшего радикала в следующей последовательности: вода - этанол, вода - этанол и вода до получения неизменного сигнала ЭПР. После многократного промывания образцы сушили при комнатной температуре [3]. Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре РЭ-1306 в стандартных молибденовых ампулах с внутренним диаметром 3.0 мм, в которые помещали по 25 мг спин-меченого образца. Спектры ЭПР записывали при следующих условиях: затухание СВЧ мощности - 5 Дб, амплитуда развертки магнитного поля - 200 Э, скорость развёртки магнитного поля - 40 Э/мин, постоянное время развёртки - 0.3 с и амплитуда ВЧ модуляции 100 кГц при комнатной температуре. Спектры приведены на рис.1, а характеристики образцов спин-меченых одуванчика и цикория даны в таблице. По форме спектра регистрируемого сигнала поглощения можно оценить время корреляции вращательных движений ^ с радикала в диапазоне 5-10_11-10"7с [1,4,6].

Для определения времени корреляции вращения спиновой метки радикала (I) в этаноловом растворе (рис.1а) использовали формулу [1]:

1 1,2 • 1010 1

у = — = ^ , =\-сек ,

.V

И-1 У

АН о

где АН0 - ширина центрального компонента в гауссах; Н0, Н+1 и Ъ_1 - интенсивность компонентов спектра с М=0, +1 и -1, V = 1/т - величина, условно называемая "частотой вращения" радикала.

Согласно литературным данным [7], цикорий содержит инулин от 11 до 65% и его молекулярная структура состоит из (С6Н1205)п, содержащих большое количество ОН-групп.

Рис.1. ЭПР -спектры нитроксильного свободного радикала (I) в этаноловом растворе с концентрацией 4^10-3 М/л - (а) и спин-меченого листа одуванчика при комнатной температуре - (б).

Поэтому можно предположить, что радикал (I) ковалентно взаимодействует с гидроксильной группой структуры лекарственных растений.

Об этом свидетельствует вид спектра ЭПР (рис.1б), соответствующий заторможенному вращению радикала (с частотой вращения V ~ 108 с-1), а также практическая независимость спектра ЭПР от многократных промывок. В таблице приведены следующие параметры спектров ЭПР спин-меченых изученных образцов при комнатной температуре: 2А^ - расстояние между внешними экстремумами; А! - полуширина линий в низком поле; АН - полуширина линий в высоком поле; Н/Н -отношение амплитуд низкопольных линий слабо и сильно иммобилизованных меток и - ширина линии центрального компонента спектра ЭПР.

Как видно из рис. 1 (а), в спектрах ЭПР наблюдается свободная вращательная подвижность спиновой метки с временем корреляции тс < 10-7с . Спектры ЭПР спин-меченых образцов (рис.2 и рис.3) при комнатной температуре представляют собой суперпозиции двух сигналов и сильную заторможенность вращательной подвижности спиновой метки с временем корреляции тс < 10-7с, что характеризует неоднородность аморфных областей в исследуемых образцах, в которые проникает метка, а также свидетельствует о изменении системы меж- и внутримолекулярных однородных связей в области присоединения метки.

Как видно из таблицы, параметры А! и АН в спектрах ЭПР (рис.2 и 3), характеризующие медленно вращающийся радикал, изменяются незначительно, а параметр Н'/Н является очень чувствительным, изменяется интенсивно и говорит о появлении нового компонента сигнала ЭПР, относящегося к быстро вращающемуся радикалу, что свидетельствует о появлении сверхтонкой структуры в спектрах исследуемых образцов.

Таблица

Параметры спектров ЭПР спин-меченых образцов одуванчика и цикория в зависимости от высоты

над уровнем моря и места произрастания

Название образцов Место произрастания, высота над ур.м. (м) Название составных частей М Гс МН Гс МН0 Гс 2АЪ Гс Ь'/Ь

Одуванчик Вблизи от автомагистрали (Душанбе), 780 листья 12 9.6 16.8 120 12

лепестки цветков 15.6 18 18 120 24

Вдали от автомагистрали (Душанбе), 780 листья 10.8 10.8 19.2 126 20.4

лепестки цветков 12 15.6 19.2 122.4 26.4

Игизак, 2130 листья 12 13.2 15.6 120 21.6

Большой Игизак, 2180 листья 9.6 9.6 14.6 124.8 12

Малый Игизак, 2477 листья 9.6 9.6 15.6 123.6 2.4

Цикорий Дарваз, 2160 листья 10.8 9.6 19.2 168 18

стебли 24 12 43.2 273.6 34.8

Хорог, 2200 листья 7.2 8.4 15.6 120 31.2

стебли 15.6 15.6 24 166.8 39.6

корни 15.6 14.2 30 222 14.4

Шугнан, 2800 листья 12 12 30 216 9.6

стебли 21.6 25.2 31.2 213.6 51.6

корни 16.8 19.2 31.2 213.6 56.4

0.37 МТ

Рис.2. ЭПР-спектры спин-меченых образцов одуванчика в зависимости от места произрастания и высоты над уровнем моря: 1 - вблизи от автомагистрали (Душанбе), 780 м над ур. м.: листья (сплошная линия), лепестки цветков (пунктирная линия); 2 - вдали от автомагистрали (Душанбе): листья (сплошная линия), лепестки цветков (пунктирная линия); 3 - Игизак, 2130 м над ур. м. листья; 4 - Большой Игизак, 2180 м над ур. м. листья и 5 - Малый Игизак, 2477 м над ур. м. - листья при комнатной температуре.

Рис.3 ЭПР-спектры спин-меченых образцов цикория в зависимости от места произрастания и высоты над уровнем моря: 1 - Дарваз, 2160 м. над ур.м.: а - листья, б - стебли; 2 - Хорог, 2200м. над ур.м.: а - листья, б - стебли, в - корни; 3 - Шугнан, 2800 м. над ур.м.: а - листья, б - стебли, в - корни.

Параметры АИ0 и 2А^ для образцов одуванчика практически не изменяются, а если изменяются, то очень незначительно (см. табл.и рис.2); для цикория в зависимости от составных частей эти же параметры изменяются намного больше (рис.3). Например, для стебля цикория из Дарваза они составляют 43.2 и 273.6 Гс, соответственно, то есть происходит уширение линий спектров ЭПР, которое свидетельствует о значительном изменении вращательной подвижности спиновых меток, введённых в структурную матрицу цикория. Эти изменения хорошо видны на рис. 3 в спектрах ЭПР.

Таким образом, на основании полученных экспериментальных данных можно заключить, что:

- разработана методика химической модификации дикорастущих лекарственных растений одуванчика и цикория методом спиновой метки;

- радикал (I) ковалентно взаимодействует с гидроксильной группой структуры лекарственных растений;

- методом спиновой метки изучена стабильность и молекулярная подвижность нитроксильной спиновой метки, введённой в матрицу одуванчика и цикория;

- установлено, что при комнатной температуре в спектрах ЭПР наблюдается заторможенность вращательной подвижности спиновой метки с временем корреляции тс < 10-7с, которая свидетельствует об изменении системы меж- и внутримолекулярных водородных связей в области присоединения метки;

- изменение параметров спектров ЭПР и вращательной подвижности спиновых меток при комнатной температуре зависит от высоты над уровнем моря и экологических условий места произрастания образцов.

Поступило 10.08.2012 г.

ЛИТЕРАТУРА

1. Лихтенштейн Г.И. Метод спиновых меток в молекулярной биологии. - М.: Наука, 1974, 256 с.

2. Бободжанов П.Х., Лихтенштейн Г.И. - ДАН ТаджССР, 1974, т.17, № 10, с. 34-37.

3. Марупов Р., Юсупов И.Х., Бободжанов П.Х., Фролов Е.Н., Лихтенштейн Г.И. - Биофизика, 1979, т.24, №3, с. 519-523.

4. Юсупов И.Х., Бободжанов П.Х., Марупов Р., Анциферова Л.И., Кальтовер В.К., Лихтенштейн Г.И. - Высоком. соед. Сер. А, 1984, т.26, № 2, с. 369-374.

5. Бободжанов П.Х., Юсупов И.Х., Марупов Р. - ЖПС, 1992, т.56, №3, с.424-428.

6. Кальтовер В.К. - Итоги науки и техники. - Биофизика. - М.: ВИНИТИ, 1979, т.11, 10 с.

7. Каррер П. - Курс органической химии. - Л.: Госнаучтеххимиздат, 1960, с. 457-458.

И.Х.Юсупов, А.Д.Бахдавлатов, Р.Марупов

ТАДЦИЦИ СОХТИ МОЛЕКУЛАВИИ РАСТАНИ^ОИ ЦОЦУ ВА СИКОРИИ ДОРУВОРЙ БО УСУЛИ НИШОНА^ОИ СПИНЙ

Институти физикаю-техникаи ба номи С.У.Умарови Академияи илмх;ои Цум^урии Тоцикистон

Методикаи дар таркиби растаних,ои дорувории худруй коку ва сикорй шинонидани нишонах,ои спинй бо рох,и химиявй, нишон дода шудааст. Муайян карда шудааст, ки дар х,ароратх,ои хонагй, дар хатх,ои спектралии резонанси электронию парамагнетикй (ЭПР), полати хдракати сусти даврзании нишонах,ои спинй бо вакти коррелятсионии тс < 10'7е мушохдда карда мешаванд, ки ин дар бораи тагирёбии системах,ои байни ва дохилии молекулавии алоках,ои гидрогенй малумот медихдд.

Калима^ои калиди: нишонауои спинй - цоцу - сикорий - спектруои резонанси электронию парамагнетикй.

I.Kh.Yusupov, A.D.Bahdavlatov, R.Marupov

RESEARCH OF MOLECULAR STRUCTURE OF HERBS OF THE DANDELION (TARAXACUM OFFICINALE WIGG.) AND CHICORY ORDINARY (CICHORIUM INTYBUS L.) THE METHOD OF THE SPIN LABEL

S.U. Umarov Physical-Technical Institute, Arndemy of Sciences of the Republic of Tajikistan There had been showed a technique of chemical updating wild herbs of a dandelion and chicory from a spin label. The method of a spin label studies stability and molecular mobility nitrocsil-ny the spin label, the dandelion entered into a matrix and chicory. It has been arranged, that at a room temperature in spectra EPR block of rotary mobility of a spin label with time of correlation Tc < 10' c which label joining testifies about system change between intra-molecular hydrogen communications in area is observed.

Key words: a spin label - a chicory - dandelion - spectra EPR.