СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО БЕЛКОВОГО ПРОДУКТА ДЛЯ БОЛЬНЫХ ГИСТИДИНЕМИЕЙ
METHOD FOR MANUFACTURE OF FUNCTIONAL PROTEIN PRODUCT FOR PATIENTS WITH HISTIDINEMIA

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к производству специализированных продуктов, предназначенных для детей и взрослых, больных гистидинемией, с низким содержанием гистидина.
Наиболее близким аналогом является способ получения функционального белкового продукта для больных гистидинемией, включающий подготовку белоксодержащей биологической системы (казеин), проведение гидролиза, обработку гидролизата ферментом L-гистидин-аммоний-лиазой, инактивацию фермента нагреванием (см. Борисова Г.В., Бессонова О.В., Крупин А.В., «Разработка технологии удаления продуктов биотрансформации гистидина из гидролизатов казеина», Техника и технология пищевых производств, №4, 2011 г., КемТИПП, с. 23-27).
Заявленное изобретение отличается от аналога тем, что способ включает подготовку белоксодержащей смеси (концентрат сывороточных белков), ферментативный или кислотный гидролиз, обработку полученного гидролизата ферментом L-гистидин-аммоний-лиазой (количество вносимого фермента составляет 0,000016-0,8% от массы белка) с целью биотрансформации гистидина до аммиака и транс-уроканиновой кислоты, удаление побочных продуктов и инактивацию фермента путем кратковременного нагрева до 85°C в течение 10-15 с, сгущения белоксодержащей системы до содержания сухих веществ 40-45%, сушки при 165°C до содержания влаги 14%. Удаление из полученных гидролизатов сывороточных белков побочных продуктов биотрансфорации гистидина (аммиака и транс-уроканиновой кислоты) позволили привести разработанную технологию в соответствие с требованиями, предъявляемыми к продуктам без гистидина или с низким его содержанием. Также основным отличием является использование концентрата сывороточных белков (альбуминов и глобулинов) в качестве биологической системы (субстрата) вместо казеина, которые имеют более высокую биологическую ценность по аминокислотному составу по сравнению с казеином.
Данное техническое решение является наиболее близким к заявляемому по совокупности существенных признаков, т.к. предполагается получение готового промежуточного продукта с заданным аминокислотным составом (прототип).
Другим аналогом является способ получения белкового продукта для детей, больных фенилкетонурией (см. Просеков А.Ю., Бабич О.О., Остроумов Л.A. RU 2376893 С1 от 27.12.2009 г. - реферат), где основным отличием является использование в качестве биологической системы концентрата сывороточных белков вместо казеина, как биологически полноценного источника молочного белка, а также ферментных препаратов, применяемых для ферментативного гидролиза белка. В заявленном изобретении применяется ферментативный гидролиз, как наиболее рациональный способ извлечения аминокислоты гистидин из полипептидной цепи белковой молекулы, эндопепти-дазами (термолизин) и экзопептидазами (карбоксипептидаза А и лейцинами-нопептидаза) в равных соотношенях. Термолизин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных аминокислотными остатками гистидина, карбоксипептидаза А расщепляет С-концевые связи, а лейцинаминопептидаза расщепляет аминные связи в полипептидной цепи. Процесс ферментативного гидролиза проводят при подобранных параметрах в рабочих диапазонах данных ферментных препаратов: при температуре 50±1°C, активной кислотности 7,6±0,01 при фермент-субстратном соотношении 1:50, продолжительностью 8±0,05 ч. Полученный гидролизат подвергали дополнительному ферментативному гидролизу специфическим ферментом по отношению к гистидину, L-гистидин-аммоний-лиазой, в количестве, подобранным опытным путем, 0,000016-0,8% от массы белка, с целью максимального удаления гистидина из полипептидной цепи.
Наиболее близким аналогом является способ получения функционального белкового продукта для больных гистидинемией, включающий подготовку белоксодержащей биологической системы (казеин), проведение гидролиза, обработку гидролизата ферментом L-гистидин-аммоний-лиазой, инактивацию фермента нагреванием (см. Борисова Г.В., Бессонова О.В., Крупин А.В., «Разработка технологии удаления продуктов биотрансформации гистидина из гидролизатов казеина», Техника и технология пищевых производств, №4, 2011 г., КемТИПП, с.23-27).
Заявленное изобретение отличается от аналога тем, что способ получения белкового продукта для больных гистидинемией включает стадии адсорбции, сгущения смеси до содержания сухих веществ 40-45%, сушки при 165°C до содержания влаги 14%), количество вносимого фермента составляет 0,000016-0,8%) от массы белка, инактивацию фермента проводят путем кратковременного нагрева до 85°C в течение 10-15 с. Также основным отличием является использование концентрата сывороточных белков (альбуминов и глобулинов) в качестве биологической системы, которые имеют более высокую биологическую ценность по аминокислотному составу.
В заявленном изобретении применяется ферментативный гидролиз, термолизином (эндопептидазой) и карбоксипептидазой А и лейцинаминопептидазой (экзопептидазами) в равных соотношениях. Термолизин используется для разрыва полипептидных связей, образованных аминокислотными остатками гистидина, карбоксипептидаза А расщепляет С-концевые связи, а лейцинаминопептидаза расщепляет N-концевые связи в полипептидной цепи. Процесс ферментативного гидролиза проводят при температуре 50±1°C, активной кислотности 7,6±0,01 при фермент-субстратном соотношении 1:50, продолжительностью 8±0,05 ч, что позволяет расщепить белок до 98%. Далее гидролизат подвергают дополнительному ферментативному гидролизу для расщепления гистидина до уроканиновой кислоты и аммиака ферментом L-гистидин-аммоний-лиазой. Температура сушки (165°C) подобрана технологическим методом проб с учетом максимального сохранения при нагревании всех незаменимых и заменимых аминокислот в белковых гидролизатах с целью получения полноценного продукта для специализированных продуктов питания, предназначенных для больных гистидинемией.
Задачей технического решения является способ получения функционального белкового продукта с низким содержанием гистидина массовой долей до 0 мг, предназначенный для специализированных продуктов питания с целью создания эффективной диетотерапии для больных гистидинемией детей и взрослых.
Технический результат достигается за счет использования в качестве белоксодержащей биологической системы концентрата сывороточных белков, подвергаемого ферментативному или кислотному гидролизу, обеспечивающему полное расщепление полипептидной цепи белковой молекулы на свободные аминокислоты. В процессе гидролиза глубина расщепления белков при определенных условиях должна быть не менее 85-98%. Полученный гид-ролизат, практически представленный смесью аминокислот, обрабатывают ферментом, осуществляющим превращение гистидина в уроканиновую кислоту и аммиак, затем проводят инактивацию фермента методом кратковременного нагревания до 85°C в течение 10-15 с. В результате дальнейшей обработки гидролизаты белка полностью свободны от гистидина.
Способ получения функционального белкового продукта для больных гистидинемией реализуют следующим образом:
1) биологическую систему (в качестве белоксодержащей биологической системы используют КБС) подвергают ферментативному или кислотному гидролизу, с целью расщепления полипептидной цепи белковой молекулы на свободные аминокислоты;
2) полученный гидролизат обрабатывают ферментом, осуществляющим превращение гистидина в уроканиновую кислоту, в количестве 0,000016-0,8% от массы белка, затем проводят инактивацию фермента методом кратковременного нагревания до 85°C в течение 10-15 с;
3) гидролизат белка, полностью свободный от гистидина, сгущают до содержания сухих веществ 40-45% и сушат при 165°C до содержания влаги 14%.
Температура сушки (165°C) подобрана технологическим методом проб с учетом максимального сохранения при нагревании всех незаменимых и заменимых аминокислот в белковых гидролизатах с целью получения полноценного продукта для специализированных продуктов питания, предназначенных для больных гистидинемией.
Пример 1
Подготавливают белоксодержащую биологическую систему, в качестве которой используют концентрат сывороточных белков (массовая доля белка 95,0%). Для этого сухой концентрат сывороточных белков в количестве 15 кг на 100 л растворяют в 45-65 л воды температурой 35-40°C в течение 30 мин, фильтруют, доводят водой до заданного объема. Далее полученную смесь пастеризуют при 74±2°C и охлаждают до температуры 37±1°C. Затем проводят ферментативный гидролиз. Для этого подготавливают ферментативную систему, состоящую из эндопептидаз (термолизин) и экзопептидаз (карбоксипептидаза А и лейцинаминопептидаза) в равных соотношениях в количестве 0,075 кг, что соответствует 0,5% от массы белка. После подготовки обеих систем приступают к проведению ферментативного гидролиза. Для этого в подготовленную белоксодержащую биологическую систему вносят ферментативную систему при температуре 50±1°C, выдерживают 8±0,05 при фермент-субстратном соотношении 1:50, затем проводят инактивацию ферментов методом кратковременного нагревания до 85°C в течение 10-15 с.
Ферментативный гидролиз белков, при данных условиях, обеспечивает достаточно полное (96,8%) расщепление полипептидной цепи белковой молекулы в биологической системе на свободные аминокислоты. Полученные данные приведены в таблице 1.
Полученный гидролизат обрабатывают ферментом, осуществляющим превращение гистидина в уроканиновую кислоту, а именно L-гистидин-аммоний-лиазой (ГАЛ) в количестве 0,000016 кг, что соответствует 0,00016% от массы белка (табл. 2), затем проводят инактивацию фермента методом кратковременного нагревания до 85°C в течение 10-15 с.
После окончания гидролиза полученный гидролизат, освобожденный от гистидина в количестве 70±0,2 кг, подвергают сгущению до содержания сухих веществ 40-45% и сушке при 165°C до содержания влаги 14%. После проведения технологического процесса получают 7,0±0,1 кг порошка с влажностью 14%.
Пример 2
Подготавливают белоксодержащую биологическую систему, в качестве которой используют сухой концентрат сывороточных белков в количестве 15 кг на 100 л растворяют в 45-65 л воды температурой 35-40°C в течение 30 мин, фильтруют, добавляют воды до необходимого объема. После чего полученную смесь пастеризуют и охлаждают до температуры 37±1°C. В качестве гидролиза используют солянокислый способ. Для этого подготавливают соляную кислоту путем трехкратной перегонки до получения 5,7 н. раствора. После подготовки обеих систем приступают к проведению кислотного гидролиза. Для этого в подготовленную биологическую систему вносят 18,7 л 5,7 н. раствор соляной кислоты. Гидролиз ведут при температуре 120°C, продолжительности 5 часов, давлении 1,3 атм.
Проведение кислотного гидролиза белков при данных условиях обеспечивает достаточно полное (86,7%) расщепление полипептидной цепи молекулы белка в белоксодержащей биологической системе на свободные аминокислоты. Данные опыта представлены в таблице 3.
Далее прогидролизованную смесь направляют на деминерализацию, с целью освобождения от соляной кислоты. Колонку загружают ионообменной смолой - анионитом марки АВ-17-8, при этом высота слоя загрузки фильтра - 0,4 м, диаметр фильтра - 0,2 м, скорость фильтрации - 5-8 м/ч. Деминерализацию проводят при рН 7±0,5, продолжительность процесса 120±5 мин при нормальном атмосферном давлении.
Полученный гидролизат обрабатывают ферментом, осуществляющим превращение гистидина в уроканиновую кислоту, а именно L-гистидин-аммоний-лиазой в количестве 0,8 кг, что соответствует 5% от массы белка (табл. 4), затем проводят инактивацию фермента методом кратковременного нагревания до 85°C в течение 10-15 с.
После этого гидролизат, освобожденный от гистидина в количестве 70±0,2 кг, подвергают сгущению до содержания сухих веществ 40-45% и сушке при 165°C до содержания влаги 14%. После проведения технологического процесса получают 7,0±0,1 кг порошка с влажностью 14%.
Таким образом, в процессе ферментативного или кислотного гидролиза обеспечивается достаточно полное расщепление полипептидной цепи белковой молекулы в биологической системе на свободные аминокислоты, а за счет специфического фермента - L-гистидин-аммоний-лиазы, осуществляется превращение гистидина в уроканиновую кислоту, в результате чего достигается полное удаление гистидина из биологической системы, улучшение эффективности диетотерапии за счет снижения содержания гистидина в функциональном белковом продукте.