СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМИДЫ, КОДИРУЮЩЕЙ АКТИВАТОР ПЛАЗМИНОГЕНА
METHOD OF PREPARING PLASMID ENCODING PLASMINOGEN ACTIVATOR

При терапии, обусловленной фибрином закупорки сосудов, например, инфаркта сердца, эмболии легких, артериальных сосудистых заболеваний конечностей и др. активаторы плазминогена играют существенную роль. С начала 50-х годов известно, что превращение плазминогена обусловлено его преобразованием в плазмин, т.е. в энзим, который обусловливает расщепление фибрина в растворимые полипептиды и, таким образом, растворение обусловленных фибрином тромбов. Этот активатор плазминогена был назван урокиназой, и оказалось, что в действительности существуют различные формы урокиназы. Все эти формы получаютс , однако, непосредственно из одной молекулы-предшественника известного приблизительно с середины 70-ых годов цимогена проурокиназы. Тогда было установлено, что эта проурокиназа обладает одноцепочечной структурой, и она была названа "scu-PA" (single chain urinary plasminogen aktivator). Scu-PA cостоит из 411 аминокислот и гликолизирован в природной предшествующей форме до аминокислоты 302.
Из различных работ известно генотехнологическое получение негликозилированной части протеина scu-PA, который назван "rscu-PA" (рекомбинированный sсu-PA) или имеет также тривиальное название "саруплаза". При терапевтическом использовании rscu-PA оказалось, что его наблюдаемое действие и совместимость превосход т употребительные фибринолитики (см. Ланцет, 1989, с. 863-868).
Дл  получени  негликозилированного активатора плазминогена rscu-PA использовали прокариоты, о чем уже существовали некоторые данные в литературе. Известные до насто щего времени способы получени  scu-PA основаны на экспрессии структурного гена scu-PA, выделенного из человеческих тканей. К сожалению, при этом достигаетс  лишь незначительна  степень экспрессии, котора  не обеспечивает экономичного получени  целевого продукта в больших количествах. Так, например, описанное Hibino и др. в "Agric. Biol. Chem.", 52, 329-336 (1988) получение rscu-PA в E.coli дает степень экспрессии лишь 2% измеренную в общем количестве белка бактерий. С другой стороны, в европейской за вке на патент N 92182 А2, а также Holmos и др. достигаемую степень экспрессии точно не указывают. Однако при проверке этих данных в различных штаммах было получено менее 2% протеина бактерий rscu-PA.
Следует указать на то, что в большинстве случаев экспрессии эукариотного протеина в бактери х получаетс  также rscu-PA в клетке в качестве денатурированного включенного тела, которое далее называетс  протеином предварительной стадии, который после промежуточного выделени  должен быть протеинохимически возвращен к правильной четвертичной структуре rscu-PA. Полученный таким образом продукт можно затем перевести дл  определени  образовавшегос  количества rscu-PA, например добавлением плазмина, в двухцепочечную негликозилированную урокиназу (rtcu-PA), энзимна  активность которой определена и может служить мерой образовавшегос  количества rscu-PA. Естественно, можно определ ть выход протеина предварительной стадии или rscu-PA и, таким образом, степень экспрессии, например, с помощью денситометрической оценки гелевого электрофореза всего протеина.
Неожиданно было обнаружено, что бактерии, трансформированные плазмидами, полученными в соответствии с изобретением, дают во много раз большую степень экспрессии, чем штамм-хоз ин, идентично трансформированный плазмидами, известными из способа уровн  техники. Полученные в соответствии с изобретением плазмиды в соответствии с этим более пригодны, чем все известные до насто щего времени плазмиды, дл  получени  rscu-PA или его протеина предшествующей стадии. Следует еще упом нуть, что известным образом может быть получен также с помощью уже упом нутого выше дл  аналитических целей расщеплени  rscu-PA, например плазмином, также и rscu-PA в технических масштабах, после чего благодар  предложенному изобретению очень доступен rscu-PA.
Плазмиды, получаемые в соответствии с изобретением, отличаютс , кроме того, тем, что их оперон имеет регулируемый в соответствующем случае синтетический промотор, активную в качестве места св зи рибосом последовательность Шино-Дальгарно, стартовый кодон, синтетический структурный ген дл  scu-PA и противоположный расположению структурного гена по крайней мере один терминатор. Предпочтительно имеют место один за другим следующие терминаторы, в случае которых речь идет в частности о trpA терминаторе и/или о tetA/orfl терминаторе из Tn 10 (см. Schollmeier и др.).
В случае регулируемого промотора речь идет, в частности, о промоторе или trp-промоторе.
В контрольном регионе полученные в соответствии с изобретением плазмиды имеют рассто ние между последовательностью Шино-Дальгарно и стартовым кодоном 6-12, предпочтительно 8-10 нуклеотидов.
При конструировании использованного в новых плазмидах структурного гена предпочтительно встраивают закодированные дл  соответствующих аминокислот приведенные ниже базовые последовательности. При этом в структурном гене не должны быть выполнены одновременно все эти отличительные признаки.
Аминокислота Триплет Аргинин CGT Лейцин CTG Валин GTT Пролин CCG Глицин GGT С другой стороны, при построении структурного гена целесообразно, по возможности, избегать применени  следующего кодона дл  соответствующих названных аминокислот (причем снова не должны выполн тьс  одновременно эти отличительные признаки дл  всех аминокислот).
Кодон, которого следует избегать Аминокислота АТА Изолейцин GTC Валин ССС Пролин AAG Лизин AGG, AGA, CGG, CGA Аргинин GGA, GGG Глицин Путем выбора кодона в соответствии с изобретением дл  отдельных аминокислот в структурном гене, а также вышеназванных отличительных признаков контрольного гена, полностью преп тствуют образованию стабильных вторичных структур между структурным геном и контрольным регионов.
Дл  получени  синтетического структурного гена сначала синтезируют олигонуклеотиды в отрезке 40-80 оснований в одну цепочку. Целесообразно получать их в масштабе 1 мкм/моль по методу твердых фаз по Адамсу и др. с помощью ДНК-синтезатора модели "Biosearch 8600" фирмы "New Brunswick Scient". В качестве мономерного синтона примен етс  при этом имеющийс  в продаже β-цианоэтилзамещенные диизопропиламино-фосфорамидиты соответствующих необходимых дезоксирибонуклеозидов. После отщеплени  относител  наход щиес  на концах еще тритилзамещенные нити обессоливаютс  в стерильных услови х путем гельфильтрации и предварительно очищаютс , и затем в две стадии подвергаютс  первому разделению с помощью "возвратной фазы" HPLC. Соответствующий основной продукт детритилируют, и после двух дополнительных стадий очистки "возвратной фазы" HPLC получают целевой олигонуклеотид высокой чистоты, как показал гельэлектрофорезный анализ (PAGE).
Из группы 4-9 этих отдельных нитей получали затем длиной около 200 нуклеотидов фрагменты двойных цепей, чтобы неконцевые, отдельные олигонуклеотиды у 5'-конца фосфорилировать и соответствующие комплементарные нити вместе с концевыми олигонуклеотидами ренатурировать и лигировать. После лигации образовавшиес  способные к клонированию двойные цепные фрагменты используют затем в подход щих линеаризированных векторах. Дополнительные меры можно узнать из нижеприведенных примеров.
Используемые сокращени  имеют следующие значени : бп основные пары; ДЕ 52 анионообменник фирмы Ватман; ЕДТК этилендиаминтетраукасусна  кислота; ИПТГ изопропил-b-D-тиогалактопиранозид; ПАГЕ полиакриламидгельэлектрофорез; PU Ploug untis; НДС натрийдодецилсульфат; Ш.Д.-последовательность: Шине-Дальгарно последовательность; Трис-HCl гидрохлорид трисгидроксиметиламинометана; Твин-80 полиэтиленоксид (20) сорбитанмоноолеат.
Дл  конструировани  в соответствии с изобретением новых плазмидов предпочтительно исход т от имеющейс  в продаже плазмиды pBR (4363 бп). Предпочтительно из него элиминируют nic/bom область и/или тетрациклиновый резистентный ген. При этом нет необходимости полностью удал ть ген резистентности к тетрациклину, чаще всего достаточно, чтобы плазмида не передала трансформированному таким образом штамму бактерии устойчивости к тетрациклину. С помощью этих мер (удаление nic/bom области и, к тому же, части гена резистентности к тетрациклину) получают так называемую "высоконадежную плазмиду".
Предпочтительной стратегией дл  конструировани  новой плазмиды в соответствии с изобретением, исход  из модифицированной, как упоминалось выше, плазмиды pBR 322 (или другой названной известной ранее плазмиды),  вл етс  в качестве последующей стадии встраивание синтетического "сайта мультиклонировани " между местом разреза Eco RI и Hind III. Этот сайт мультиклонировани  (см. фиг. 3) имеет установленную последовательность мест разреза, лежащие между ними основани   вл ютс  произвольно выбранными, за исключением последовательности между Hba I и Nde I, которые содержат места св зи рибосом (Шине-Дальгарно-последовательность) из Hyl-оперона-5'-AAGGAG-3'(4) B.subtilis, а также установленного рассто ни  между Ш.Д.-последовательностью и стартовым кодоном ATG. Следующие за Ш.Д.-последовательностью основани  GAAAT перенесены из (4) и св заны с CATATG, местом разреза Nde I. Таким образом, рассто ние между Ш.Д.-последовательностью и ATG составл ет 8 основных пар. Рассто ни  между отдельными местами разреза сайта мультиклонировани  должны быть из соображений технологии клонировани  по меньшей мере около 20 нуклеотидов, в результате чего облегчаетс  удаление промежуточных фрагментов.
С помощью этого сайта мультиклонировани  в плазмиду ввод т места разреза, которые (целесообразно после встраивани  терминатора транскрипции) делают возможным следующее друг за другом успешное встраивание частичной последовательности scu-PA структурного гена, предпочтительно начинающегос  от С-конца целевого протеина, т. е. от 3'-конца нити ДНК получающегос  структурного гена, а также встраивани , например, синтетического или также выделенного из другой плазмиды или имеющегос  в продаже trp-промотора. Полна  нуклеотидна  последовательность полученного таким образом scu-PA структурного гена представлена с указанием аминокислот, соответствующих отдельному кодону, на фиг. 26 и 27.
Другие новые плазмиды могут быть получены в соответствии с изобретением из сконструированной, как описано выше, плазмиды. Например, путем разреза с помощью Eco RI и Hind III получают синтетический scu-PA структурный ген со всеми единицами регулировани  и затем встраивают в другой, в энтеробактерийную, в частности E.coli, автономно множащуюс  плазмиду, который, к тому же, линеаризируют или укорачивают с помощью разреза с помощью Eco RI и Hind III. Таким же в принципе способом, но при использовании места разреза Eco RI и Xba I можно заменить также, например, trp-промотор taс-промотором (и наоборот) в полученной в соответствии с изобретением плазмиде.
Аналогично можно исходить также из других известных плазмид, которые обладают единственным местом разреза Eco RI и Hind III, например рис. 9, 12, 13, 18, 19 и др.
Новые плазмиды с увеличенным рассто нием между Шино-Дальгарно-последовательностью и стартовым кодоном ATG можно получить в соответствии с изобретением тем, что сконструированна , как описано выше, плазмида, в которой упом нутое рассто ние составл ет например, 8 нуклеотидов, разрезают Nde I, которое заполн ет полученное место разреза, и непосредственно после этого полученные концы лигируют, в результате чего образуетс  желаема  нова  плазмида, в которой рассто ние между Ш.Д.-последовательностью и стартовым кодоном составл ет, например, 10 нуклеотидов.
Как уже было сказано, с бактери ми, трансформированными плазмидами, полученными в соответствии с изобретением, может быть достигнута во много раз больша  степень экспрессии, чем в случае известных из уровн  техники плазмид. Трансформацию подход щих компетентных организмов-хоз ев осуществл ют известным образом. Дл  экспрессии полученных в соответствии с изобретением плазмид особенно пригодны организмы-хоз ева штамма типа E.coli и примен емые энтеробактерии, например штамм Pseudomonas, salmonella, Enterobacter, Klebsiella или Serratia.
Предпочтительными организмами-хоз евами  вл ютс  штаммы типа E.coli, например E.coli GRT-1 и, в частности, штаммы E.coli подгруппы К12 как, например, E. coli K12 IM101 /ATCC 33876/, E.coli K12 IM103 /ATCC 39403/, E.coli K12 IM105 /DSM 4162/, E.coli K12 ATCC 31446 или также E.coli K12 DHI /ATCC 33849/.
Введение экспрессии в экспрессионную систему E.coli, котора  содержит taс-промотор, можно осуществл ть, например, путем добавлени  лактозы или отбора глюкозы, но предпочтительно путем добавлени  изопропил-b-D-тиогалактопиранозида. Однако если в плазмиде имеетс  trp-промотор, то индукцию осуществл ют предпочтительно с помощью индолакрилуксусной или индолакрилпропионовой кислоты. Другие известные индукторы, само собой разумеетс , могут быть также использованы.
После индукции и достижени  определенной вышеуказанной плотности клетки, клетки отдел ют центрифугированием, и остаток после центрифугировани  после суспендировани  в водном солевом растворе перевод т, например, в гомогенизатор, в котором клетки в результате разницы давлений подвод т к месту. После нового центрифугировани  получают в остатке протеин предварительной стадии rscu-PA нар ду с водонерастворимыми обломками клеток и пр. В результате обработки раствором гидрохлорида гуанидина протеин предварительной стадии переходит в раствор, и после нового центрифугировани  отсто вшийс  раствор обрабатывают редокс-системой (например содержащей восстановленный или окисленный глутатион), в результате чего осуществл етс  образование естественной конформации, т. е. образование целевой rscu PA. Она находитс  затем в реакционной смеси в растворенной форме и может быть выделена в чистом виде в результате обычных стадий очистки (например, хроматографии и последующего высушивани  замораживанием).
o
o
Дл  аналитических целей целесообразно ферментировать трансформированные подлежащим исследованию плазмидой штамм Е.coli и после достижени  вышеуказанной оптимальной плотности суспензии клетки индуцировать подход щим индуктором экспрессию rscu-PA-протеина предварительной стадии. После соответствующей продолжительности ферментации отбирают аликвотные части, и отцентрифугированные из них клетки раствор ют затем лизоцимом (1 мг лизоцима на мл 50 ммоль буфера трисгидролорида с рН 8,0, 50 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислотой и 15% сахарозы). Гомогенат лизированных клеток солюбилизируют в 4-5 моль растворе гуанидингидрохлорида и после разбавлени  до 1,2 моль гуанидин-гидрохлорида при добавлении восстановительного средства (глутатиона, меркаптоэтанола или гистеина) за 2-5 часов подвергают реакции обратной (см. также, например, Винклер и др.). Полученную таким образом одноцепную rscu-PA при добавлении плазмиды превращают в двухнитевую rscu-PA, активность которой определ етс  с помощью субстрата S 2444 (пироГлю-Гли-Арг-п-нитроанилид); Каби диагностика Швеци , который отщепл етс  только от двухнитевой активной урокиназы. Это активирование rscu-PA плазмином осуществл ют в 50 ммоль трис-буфере, 12 ммоль хлористого натри , 0,02% твина-80 при рН 7,4 и 37C. Соотношение rscu-PA к плазмину должно составл ть приблизительно (100-1500):1, счита  на мол рность, или приблизительно (8000-36000):1, счита  на энзимную единицу. Тестовую инкубацию провод т в 500 ммоль трис-буфера, 38 ммоль хлористого натри  при рН 8,8 в присутствии 0,36 мкммоль апротинина (дл  торможени  плазмина) и 0,27 ммоль S 2444 при 37C. В зависимости от содержани  пробы rscu-PA реакцию после 5-60-минутной инкубации останавливают путем добавлени  90%-ной уксусной кислоты и измер ют экспрессию при 405 нм. По указанию изготовител  субстрата S 2444 в случае этой предварительной стадии изменение экстинкции означает 0,05 в минуту при 405 нм активности 25 PU/мл тестового раствора.
Выходы rseu-PA, полученные из протеина предварительной стадии, полученные при применении различных изготовленных в соответствии с изобретением плазмид в различных бактери х, приведены на фиг. 10, 12 и 14.
Как видно из фиг. 11, а также из данных нижеприведенных примеров, в частности таблицы 1 примера 2, плазмиды, получаемые в соответствии с изобретением, осуществл ют предпочтительно в штаммах E.coli образование rscu-PA протеина предварительной стадии со степенью экспрессии от 10 до 25 мас. в частности 14-20 мас. образовавшегос  общего протеина. Степень экспрессии, следовательно, при применении новых плазмид может быть достигнута, по крайней мере, в 10-15 раз выше, чем в случае известных плазмид, например pUK 54 trp 207-1.
На фиг. 1 и 2: показан конструкци  плазмиды pBF 158 из имеющейс  в продаже плазмиды pBR 322. При этом удал лись последовательно nic/bom-область и больша  часть гена резистентности к тетрациклину.
На фиг. 3 нуклеотидна  последовательность синтетического "сайта мультиклонировани ".
На фиг. 4 конструкци  плазмиды pBF 158-01. Изображено введение синтетического сайти мультиклонировани  в плазмиду pBF 158 между местами разреза Eco RI и Hind III.
На фиг. 5 конструкци  плазмида pBF 158-01 T. Фрагмент Cla I x Hind III замен ют соответствующим фрагментом "Т" из плазмиды pRT 61, на котором находитс  tet A/orfL терминатор из Tn 10.
На фиг. 6-12 нуклеотидные последовательности синтетических фрагментов гена, кодированного дл  человеческой scu-PA, их введение при образовании структурного гена дл  scu-PA в плазмиду в соответствии с изобретением, исход  из плазмиды pBF 158-01 Т, описанной в примерах 1г-1е и изображенной на фиг. 13-18 и 20.
На фиг. 13-15 конструкци  плазмиды pBF 158-02 T-pBF 158-06 Т с помощью введени  олигонуклеотидного фрагмента М4-М8, исход  из С-конца целевого протеина (соответственно 3'-конца нити ДНК), начина  с плазмиды pBF 158-01 Т.
На Ффг. 16-18 конструкци  плазмиды pBF 158-08 Т через вспомогательную конструкцию в плазмиде рис. 19 (см. пример 1b).
На фиг. 19 нуклеотидна  последовательность синтетического типа trp-промотора.
На фиг. 20 конструкци  экспрессионной плазмиды дл  протеина предварительной стадии человеческого rscu-PA, pBF 160. Структурный ген дл  scu-PA изображен с помощью черной толстой линии между местами разреза Nde I и Cla I.
На фиг. 21 степень экспрессии протеина предварительной стадии человеческого rscu-PA (определена в виде активности rtcu-PA по обратной реакции и активированию) в различных трансформированных плазмидой pBF 160 (○-----○) или плазмидой pUK 54 trp-207-1 (10)  штаммов E.coli при контроле trp-промотора в зависимости от времени после индукции с индолакриловой кислотой к моменту времени 0. Указаны определенные с помощью субстрата S 2444 rtcu-PA-активности в PU на мл ферментационной среды с оптической плотностью, равной 1 при 578 нм.
На фиг. 22 денситограмма SDS-RAGE протеинов из трансформированного с помощью pBF 161 E.coli K12 IM103-клеток после ферментации пред (А) и 6 часов после (В) добавлени  индолакриловой кислоты в качестве индуктора.
На фиг. 23 степень экспрессии протеина предварительной стадии человеческого rscu-PA (определенного в виде rtcu-PA-активности после обратной реакции и активировани ) в E.coli K12 IM103, трансформированного с помощью pBF 171, т.е. при контроле tac-промотора. Индукцию осуществл ли к моменту времени 0 с изопропил-β-D-тиогалактопиранозидом. Указаны определенные rtcu-PA-активность по отношению к субстрату S 2444 в PU на мл ферментативной среды с оптической плотностью, равной 1 при 578 нм.
На фиг. 24 увеличение рассто ни  между Ш.Д.-последовательностью и стартовым кодоном ATG от 8 до 10 баз с помощью наполнени  Nde I местом разреза и последующей лигацией соответствующих тупых концов.
На фиг. 25 степень экспрессии протеина предварительной стадии человеческого rseu-PA (определенной в виде rtcu-PA-активности после обратной реакции и активировани ) при контроле trp-промотора в E.coli GRT-I, трансформированном плазмидой pBF 161 (○-----○) или pBF 163 (Δ-----Δ). Индукцию осуществл ют с андолактиловой кислотой непосредственно после момента времени 0. Указаны определенные с субстратом S 2444 rtcu-активности в PU на мл ферментативной среды с оптической плотностью, равной 1 при 578 нм.
На фиг. 26 и 27 полна  нуклеотидна  последовательность scu-PA-структурного гена с указанием аминокислот, соответствующих отдельному кодону.
Реакционные системы, примен емые в примерах на осуществление способа,  вл ютс  употребительными, имеющимис  в продаже (см. например: Nachr. Chem. Techn. Lab. 35, 939, 1987).
Используема  в примерах дл  селекции клонов культурна  среда содержит на литр: 7,8 г пептона из рыбы, 7,8 г пептона из казеина, 10 г дрожжевого экстракта, 5,6 г хлористого натри , 10 г глюкозы. Эту среду смешивают с 10 г агара на литр в тепле и выливают на пластины.
Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды pBF 160 дл  протеина предварительной стадии rscu-PA с синтетическим scu-PA-геном при контроле trp-промотора.
а) Конструирование плазмиды pBF 158.
i) Из плазмиды pBF 322 (Фармаце , N 27-4902, 4363 бп) вырезают nic/bom-область, котора  находитс  между основани ми и 2263, удал ют (см. также рис. 1), как следует ниже: pBR 322 у основани  2298 с Nde I, и таким образом линеаризируют. Выступающие концы наполн ют путем реакции "заполнени ", и таким образом получают тупые концы. После этого у основани  2068 разрезают с помощью Pvu II, и оба тупых конца оставшейс  части pBR 322 с помощью обычной техники снова лигируют с помощью Т4-лигазы. Непосредственно после этого лигационна  вставка в соответствующих E.coli K12 IM103 клетках (АТСС 39403) трансформируетс . Трансформированные клетки культивируют на среде при добавлении 150 μг ампициллина/мл. Из полученных клонов выбирают такие, которые содержат плазмиду pBF 157, котора  отличаетс  от исходной плазмиды pBF 322 на 228 нуклеотидов а) Pst I x BspM II, б/Pst I x Bal I-, в/Pst I x Ava I-фрагменты. Оба единственных места разреза Pvu II и Nde I pBR 322 более не содержатс  в плазмиде pBF 157.
ii) Из pBF 157 удал ют большую часть тетрациклиновой последовательности путем разреза с помощью Eco RV x Nru I и последующей лигации по вившихс  тупых концов. После трансформации E.coli K12 IM103 и культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл получают клоны, из которых выбирают те, которые содержат плазмиду pBF 158. Она на 787 ануклеотидов короче, чем pBF 157, и отличаетс , кроме того, отсутствием места разреза Bam HI. Трансформаци  штаммов бактерий с помощью pBF 158 не придает им резистентности к тетрациклину.
b) Конструирование pBF 158-01, введение синтетического мультиклонирующего сайта.
Из pBF 158 путем разреза с помощью Ero RI x Hind III удал ют фрагмент, величиной 31 нуклеотид и в люк лигируют синтетический сайт мультиклонировани , последовательность которого изображена на фиг. 3. После трансформации лигационной вставки в E.coli K12 IM103 и культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат плазмиду pBF 158-01. Она отличаетс  от pBF 158 дополнительными единственными местами разреза Xba I, Nde I, Sae I, Eag I, Kpn I, Spe I, а также вторым местом разреза Pst I (фиг. 4).
с) Конструирование pBF 158-01 T, введение транскрипционного терминатора.
Из pBF 158-01 удал ют фрагмент Cla I x Hind III сайта мультиклонировани  и замен ют Cla I x Hind III фрагментом из pRT 61, на котором находитс  tlt A/ort L терминатор из Tn 10.
После трансформации в штамме E.coli K12 IM103 и культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирали те клоны, которые содержали плазмиду pBF 158-01 T. Она отличаетс  от pBF 158-01 фрагментом Cla I x Hind III, большим на 297а нуклеотидов (фиг. 5).
d) Введение синтетического фрагмента М4-М8 дл  scu-PA-гена, конструкци  плазмидов pBF 158-02 T-pBF 158-06 Т.
Все синтетические фрагменты описаны на фиг. 5а-5g. Они ввод тс  в соответствующие векторы в качестве приблизительно двойных жгутовых фрагментов длиной 200 нуклеотидов. Дл  этого векторы разрезают остаточными энзимами, соответствующими названным местам разреза, и с помощью электрофореза на агарозном геле, электроэлюировани  и очистки отдел ют через ДЕ 52 от подлежащего удалению фрагмента. После этого осуществл ют лигирование относ щимс  к нему синтетическим фрагментом двойной цепи с помощью Т4-лигазы, трансформации в E. coli K12 IM103 (фиг. 13-15) и селекции на среде, содержащей ампициллин.
i) Лигирование фрагмента М 8 между Bam HI и Gla I в плазмиду pBF 158-01 T.
По вл етс  плазмида pBF 158-02 T.
Одигонуклеотид 019 кодирует дл  С-терминальной последовательности scu-PA. За стоп-кодоном ТАА находитс  место разреза Nhe I, распростран ющеес  от дополнительной последовательности транскрипционной trpa-терминатора до Cla I.
ii) Лигирование фрагмента М 7 между Spe I и Bam HI в плазмиду pBF 158-02 Т.
Получаетс  плазмида pBF 158-03 Т.
iii) Лигирование фрагмента М6 между Kpn I и Spe I в плазмиду pBF 158-03 T.
Получаетс  плазмида pBF 158-04 T.
iv) Лигирование фрагмента М 5 между Eag I и Kpn I в плазмиду pBF 158-04 Т.
Получаетс  плазмида pBF 158-05 T.
v) Лигаци  фрагмента М4 между Sac I и Eag I в плазмиду pBF 158-05 Т.
Получаетс  плазмида pBF 158-06 Т.
Из полученных клонов i-v выбирают соответственно те, которые отличаютс  от соответствующего предшественника наличием введенного нового фрагмента в дополнительно проверенной правильной последовательности.
е) Введение синтетических фрагментов М 2 и М 3 дл  seu-PA-гена. Конструирование pBR 158-08 Т.
Так как дл  введени  фрагментов М 2 и М 3 необходим Pst-I-разрез и на используемой дл  этого плазмиде pBF 158 находитс  еще Pst-I место разреза (в ампициллиновой последовательности), которое мешало бы при последующем клонировании, поступают следующим образом (фиг. 16-18).
i) Из имеющейс  в продаже (например, "Pharmacia") плазмиды (рис. 19) удал ют сайт мультиклонировани  и дополнительно 212 нуклеотидов вверх от Nde I x Hind III фрагмента. В полученном пропуске затем лигируют синтетический сайт мультиклонировани  из плазмиды pBF 158-04-3 Т в виде Nde-I x Hind III-фрагмента. Эту плазмиду pBF 158-04-3 Т получают из плазмиды pBF 158-02 Т (см. пример 1 di) путем введени  олигонуклеотидного фрагмента М 6 и соответствующей плазмиды pBF 158-04 Т без фрагмента М 7. После трансформации в E. coli K12 IM103 клеток и культивировани  на среде со 150 μг ампициллин/мл выбирают те клоны, которые содержат плазмиду рис. 19-04-3. Она отличаетс  от рис. 19 наличием фрагмента Nde I x Hind III длиной 712 нуклеотидов.
ii) Из рис. 19-04-3 удал ют фрагмент Pst I x Sae I, выдел ют линеаризированный вектор, и лигируют олигонуклеотидный фрагмент М 3. После трансформации в E.coli K12 IM103 и культивировани  на среде с 150 μг ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат плазмиду рис. 19-07. Она отличаетс  от рис. 19-04-3 фрагментом Pst I x Sae I длиной 189 нуклеотидов, который содержит фрагмент М 3 с правильной последовательностью.
iii) Из вышеописанной плазмиды рис. 19-07 удал ют фрагмент Nde I x Ast I и в пропуск лигируют фрагмент М 2. После трансформации в E.coli K12 IM103 и культивировани  на среде с 150 μг ампициллина/мл, выбирают те клоны, которые содержат плазмиду рис. 19-08. Она отличаетс  от рис. 19-07 наличием фрагмента Nde I x Pst I длиной 246 бп (М2) с правильно дополнительно проверенной последовательностью.
iv) Из плазмиды фиг. 19-08 удал ют фрагменты М 2 и М 3 в виде Nde I x Sae I фрагмента и лигируют в полученную после разрезов с помощью Nde I x Sae I большую часть pBF 158-06 T. После трансформации в E.coli K12 IM103 и культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат плазмиду pBF 158-08-T. Она отличаетс  от pBF 158-06 Т наличием фрагмента Nde I x Sae I длиной 435 нуклеотидов.
I) Конструирование плазмиды pBF 160, введение синтетического trp-промотора.
Уже известна  последовательность trp-промотора распростран етс  до Xba I места разреза и удлин етс  у 5'-конца с помощью последовательности 5'ААТТЦТГАААТ-3'. В результате этого конструируют Eco RI место разреза (фиг. 19, фрагмент М1). Отдельные нити 021 и 021 А ренатурируют и лигируют в плазмиду pBF 158-08 T, разрезанную Eco RI x Xba I (фиг. 20). После трансформации в E. coli K12 IM103 и культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат pBF 160. Плазмида pBF 160 отличаетс  от всех вышеописанных предшественников тем, что штаммы бактерий, таким образом трансформированные E.coli, на добавление индолакриловой кислоты экспримируют протеин предварительной стадии rscu-PA.
g) Экспрессионный тест i) Ферментаци  Различные штаммы, E.coli, трансформированные с помощью плазмиды pBF 160, например E.coli GRT-I, E.coli K12 IM103, а также E.coli K12 ATCC 31446, при соответствующих одинаковых услови х ферментируют в среде, состо щей из 38 ммоль сульфата аммони , 56 ммоль фосфатного буфера рН 7,0, 1 ммоль сульфата магни , 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, содержащей 150 мг ампициллина на литр, и индуцируют с помощью 62 мг индолакриловой кислоты/л экспрессию протеина предварительной стадии rseu-PA. Дл  сравнени  вышеназванные штаммы трансформируют с помощью вышеописанного плазмида, который содержит ген человеческой проурокиназы из банка кДНК, полученного из МРНК клеток Детройт 562 и имеющий обозначение pUK 54 trp 207-1, и затем при одинаковых услови х ферментируют и подвергают индукции.
Перед индукцией и каждый час после индукции, всего 6 часов, соответственно центрифугируют 1 мл клеточной суспензии с оптической плотностью (ОП) 1 при 578 нм и используют дл  тестировани  степени экспрессии.
II) Обратна  реакци  протеина предварительной стадии до rscu-PA, его расщепление до rtcu-PA и измерение активности.
Отделенные центрифугированием клетки, как описано выше, соедин ют с лизоцимом и затем используют гомогенат лизированных клеток дл  определени  активности, как описано выше.
Степени экспрессии, определенные таким образом после измерени  активности rtcu-PA, образованной из rscu-PA, получены из протеина предварительной стадии, представлены на фиг. 21. Отсюда видно, что штаммы E.coli, которые были трансформированы с помощью плазмиды pBF 160, дают 10-15-кратный выход эксперссии по сравнению с известными из литературы такими же штаммами E.coli, трансформированными с помощью плазмиды pUK 54 trp 207-1. Кроме того, оказалось, что выходы экспрессии во всех штаммах в зависимости от используемой дл  трансформации плазмиды лежат приблизительно при одинаковых значени х, т. е. что в частности штаммы (независимо от отдельных E.coli штаммов), трансформированные с помощью плазмиды pBF 160, всегда дают во много раз большую степень экспрессии, чем идентичные штаммы, трансформированные известной плазмидой pUK 54 trp 207-1.
Пример 2.
а) Конструирование экспрессионной плазмиды pBF-161 дл  протеина предварительной стадии rseu-PA с синтетическим scu-PA-геном при контроле trp-промотора.
Плазмид pBF 322 разрезали с помощью Eco RI и Hind III. Полученный фрагмент длиной 31 нуклеотид отдел ли с помощью подготовительного электрофореза на агарозном геле. Оставшуюс  часть pBF 322 элюировали с помощью электроэлюировани  из гел  и очищали с помощью хроматографии с помощью ДЕ 52.
Плазмиду pBF 160 (пример 11) также разрезают с помощью Еco RI и Hind III и фрагмент Eco RI x Hind III длиной 1684 нуклеотида, который содержит синтетический scu-PA-ген со всеми единицами регулировани  (trp-промотор), отдел ют с помощью электротрофореза на агарозном геле, элюируют, как описано выше, и очищают.
Полученные таким образом фрагменты лигируют обычным способом с помощью Т4-лигазы и затем трансформируют в E.coli K12 M103. После культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат фрагмент Eco RI x Hind III длиной 1684 нуклеотида и продуцируют протеин rscu-PA предварительной стадии после добавлени  индолакриловой кислоты. Эти клоны содержат плазмид pBF 161.
b) Экспрессионный тест.
E.coli GRT-I, E.coli K12 IM103 и E.coli K12 ATCC 31 446 трансформируют с помощью pBF 161 и затем ферментируют, как описано в примере 1g, и испытывают результат экспрессии. Выходы rscu-PA протеина предварительной стадии определ ют как rtcu-PA активность через 1-6 часов после индукции, и они сравнимы со значени ми выходов, представленных на фиг. 21 дл  применени  плазмида pBF 160 дл  трансформации.
Полученный по аналоги с примером 1 gi центрифугированием клеточный осадок может быть также включен путем кип чени  в 0,25 моль трис-HCl-буфере, рН 8,0 с 4% натрийдодецилсульфата, 1% меркаптоэтанола и 20% глицерина. Растворенные таким образом протеины отдел ют с помощью SDS-PAGG и делают видимыми с помощью окрашивани  Кумассиблю. Окрашенные гели оценивают денсимметрически и интегрируют п тна среди пиков. Количество образовавшегос  после индукции индолакриловой кислоты rseu-PA протеина предварительной стадии определ ют с помощью субстракции п тен, идентифицированных в качестве протеина предварительной стадии полос перед индукцией, от полос, полученных после индукции. На фиг. 22 представлена диаграмма протеина, полученного из E.coli K12 M103 клеток. В вышеописанном примере количество rscu-PA протеина предварительной стадии после индукции составл ет 17,9 мас. бактериального общего протеина. Другие примеры указаны в таблице.
Пример 3. Конструирование экспрессионной плазмиды дл  протеина предварительной стадии rscu-PA с синтетическим scu-PA-геном при контроле trp-промотора в pBR 322 с делецией в генрезистентности к тетрациклину.
а) Конструирование плазмиды pBR 322 del.
Плазмиду pBR 322 разрезают с помощью Eco RV и Nru I. Полученный фрагмент величиной 787 нуклеотидов удал ют с помощью агарозегельэлектрофореза, остаточное количество pBR 322 из гел  элюируют с помощью электроэлюировани , очищают через ДЕ 52 тупые концы pBR 322 Eco RV x Nru I остаточной части, и обычным образом лигируют с помощью Т4-лигазы. После трансформации в E.coli K12 IM103 и культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирают те клоны, из которых аликвотна  часть после перенесени  на среду с 25 μг тетрациклина/мл на ней не вырастает, т.е. не обладает тетрациклиновой резистенцией. Клоны содержат плазмид pBR 322 del, который отличаетс  от pBR 322 тем, что он на 787 нуклеотидов меньше и не может быть разрезан более с помощью Eco RV и Nru I.
b) Конструирование плазмиды pBF 162.
pBR 322 del разрезают с помощью Ero RV и Hind III. Полученный таким образом фрагмент длиной 31 нуклеотид отдел ют с помощью препаративной агарозегельэлектрофореза, остаточную часть pBR 322 del элюируют с помощью электроэлюировани  из гел  и очищают ДЕ 52.
Таким образом, из pBF 160 получают фрагмент Eco RI x Hind III длиной 1684 нуклеотида, который содержит синтетический seu-PA-ген со всеми единицами регулировани  (trp-промотор).
Оба фрагмента обычным образом лигируют Т4-лигазой и затем трансформируют в E.coli K12 IM103 клетки. После культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирают клоны, которые содержат фрагмент Eco RI x Hind III длиной 1684 бп и продуцируют после добавлени  62 μг индолакриловой кислоты/мл rscu-PA протеин промежуточной стадии. Эти клоны содержат плазмиду pBF 162.
с) Экспрессионный тест.
E. coli GRT-I трансформируют с помощью pBF 162 и затем ферментируют, как описано в примере 1g, и испытывают результат экспрессии. Выходы rseu-PA-протеина предварительной стадии определ ют как rtcu-PA-активность 6 часов после индукции, котора  составл ет 1300 pU/мл клеточной суспензии с оптической плотностью 1 и сравнима со значени ми выходов, представленных на рис. 10 дл  экспрессии после трансформации E.coli GRT-I с помощью плазмиды pBF 160.
Пример 4.
а) Конструирование экспрессионной плазмиды pBF 171 дл  протеина предварительной стадии rscu-PA с синтетическим scuPA-геном при контроле taс-промотора.
Плазмиду pBF 161 разрезают с помощью Eco RI и Xba I. Полученный фрагмент длиной 74 нуклеотида отдел ют с помощью препаративного агарозегельэлектрофореза, остаточную часть плазмида элюируют с помощью электроэлюировани  и затем очищают с помощью ДЕ 52.
o
Из плазмиды ptac SDT (DSM 5018) выдел ют фрагмент Eco RI x Xba I, который содержит taс-промотор. Дл  этого разрезают ptaс SDT с помощью Eco RI x Xba I и фрагмент отдел ют с помощью препаративного полиакриламидгелевого электрофореза. Фрагмент элюируют с помощью нагрева до 65C в аммонийацетат/SDS-буфере, рН 8,0 из механически измельченного полиакриламида и очищают многократной экстракцией фенола, который насыщен 1 моль трис-буфера, рН 8,0.
Оба полученных таким образом фрагмента обычным образом лигируют Т4-лигазой и затем трансформируют в E.coli K12 IM103. После культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирают те клоны, которые после добавлени  ИПТГ продуцируют rscu-PA-протеин предварительной стадии. Эти клоны содержат плазмид pBF 171.
б) Экспрессионный тест.
E. coli K12 IM103 трансформируют с помощью pBF 171 и затем ферментируют, как описано в примере 1g, и исследуют результат экспрессии. Индукцию осуществл ют, однако, с помощью полиакриламидгелевого электрофореза (конечна  концентраци  0,5 ммоль).
Выходы rscu-PA-протеина предварительной стадии, определенные в виде rtcu-PA активности через 1 6 часов после индукции, представлены на рис. 12. Они сравнимы со значени ми выходов, представленных на рис. 10 дл  применени  плазмиды pBF 160 в одинаковых штаммах E.coli.
Пример 5.
а) Конструкци  экспрессионного плазмида pBF 172 дл  rscu-PA-протеина прдварительной стадии с синтетическим scu-геном при контроле taс-промотора в pBR 322 с делецией в гене резистентности к тетрациклину.
Плазмиду pBR 322 del (см. пример 3а) разрезают с помощью Eco RI x Hind III. Полученный фрагмент длиной 31 нуклеотид отдел ют с помощью препаративного агарозогелевого электрофореза, остаточную часть pBR 322 del элюируют с помощью электроэлюировани  из гел  и затем очищают ДЕ 52.
Таким же образом получают из pBF 171 (пример 4а) фрагмент Eco RI x Hind III, который содержит синтетический scu-PA-ген со всеми единицами регул рности (tac-промотор).
Оба полученных таким образом фрагмента лигируют обычным образом Т4 лигазой и затем трансформируют в E.coli K12 IM103 клетки. После культивировани  на среде со 150 μг ампициллина/мл выбирают клоны, которые продуцируют в присутствии 0,5 ммоль ИПТГ rscu- PA-протеин предварительной стадии. Эти клоны содержат плазмиду pBF 172.
б) Экспрессионный тест.
E. coli K12 IM103 трансформируют с помощью pBF 172 и затем ферментируют, как описано в примере 1d, и исследуют результат экспрессии. Индукцию осуществл ют, однако, с помощью ИПТГ (конечна  концентраци  0,5 ммоль). Выходы rscu-протеина предварительной стадии определ ют как rtcu-PA-активность 1-6 часов после индукции, и она составл ет приблизительно 1100 pU/мл клеточной суспензии оптической плотности 1 и сравнимы со значени ми выходов, представленными на фиг. 21 дл  применени  плазмиды pBF 160 с тем же E.coli штаммом.
Пример 6.
Изменение рассто ни  между Ш.Д.-последовательностью и стартовым кодоном в экспрессионной плазмиде дл  rscu-PA-протеина предварительной стадии.
Стартовый кодон, ATG, описанный во всех конструкци х примеров 1-5,  вл етс  составной частью Nde-I-места разреза-CATATG-Nde-I разрезает за первым А гексануклеотидную последовательность и дает 5'-концы, которые перекрывают два основани . Заполн ют 3'-концы, т.е. конструируют тупые концы, и после этого снова лигируют так, что соответствующа  последовательность удлин етс  на основные пары. Одновременно удал ют Nde I-место. Как видно из фиг. 24, в представленном там примере рассто ние от Ш.Д.-последовательности до стартового кодона удлин етс  от 8 до 10 основных пар. В дальнейшем экспериментальное проведение по сн етс  в примере: а) Конструкци  плазмида pBF 163.
Плазмид pBF 161 разрезают с помощью Nde I, затем выступающие концы заполн ют фрагментом Кленова полимеразы 1 ДНК (2). После этого ДНК лигируют обычным образом Т4-лигазой и затем трансформируют в E.coli K12 IM103. После культивировани  на ампициллинсодержащей среде выбирают клоны, которые содержат плазмиду pBF 163. Она отличаетс  от pBF 161 отсутствием I места Nde и дополнительным основанием -ТА- в области прежнего Nde-I-места (см. фиг. 24).
б) Экспрессионный тест.
E.coli GRT-I трансформируют с помощью плазмиды pBF 163 и затем ферментируют, как описано в примере 1g, и испытывают результат экспрессии. Выходы rseu-PA-протеина предварительной стадии, определенные после обратной реакции и активировани  в виде rtcu-PA-активности на мл клеточной суспензии с оптической плотностью 1 через 1-7 часов после индукции 62 мл индолакриловой кислоты/л приведены на фиг. 25. Они сравнимы со значени ми выходов, представленных на фиг. 21 дл  применени  плазмиды pBF 160 в том же штамме E.coli.