ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ БАЗИГИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST BASIGIN AND THEIR APPLICATION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Данное описание в целом относится к гуманизированным антителам против базигина и их применению.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Базигин (также известный как EMMPRIN, нейротелин и антиген М6) представляет собой высокогликозилированный трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой от 50 до 60 кДа и является представителем суперсемейства иммуноглобулинов (IgSF). Человеческий базигин имеет 269 аминокислот, которые можно отнести к внеклеточной, трансмембранной и внутриклеточной областям, из которых первые 21 аминокислотных остатков, начиная от N-концевой точки начала трансляции, составляют сигнальный пептид, остатки 22-205 составляют внеклеточный домен, остатки 206-229 составляют трансмембранную область с характерной структурой лейциновой застежки, остатки 230-269 на С-конце составляют внутриклеточный домен.
[0003] Было продемонстрировано, что базигин сверхэкспрессируется во многих типах солидных опухолей человека, таких как рак легкого, рак печени, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак пищевода или рак желудка. Предыдущие исследования показали, что молекулы базигина являются важными функциональными мембранными белками при прогрессировании опухоли и задействованы в различных связанных с раком феноменах, таких как:
[0004] i. Базигин опосредует адгезию и метастазирование опухолевых клеток. Базигин, который экспрессируется на поверхности опухолевых клеток, взаимодействует с винклином, способствуя образованию псевдоподий, распластыванию и адгезии опухолевых клеток; взаимодействует с аннексином II, способствуя секреции ММР-2 в опухолевых клетках; ускоряет деградацию окружающего матрикса и способствует метастазированию опухоли за счет стимуляции опухолевых клеток и фибробластов вокруг опухолевых клеток к секретированию различных внеклеточных матриксных металлопротеиназ (ММР), например, ММР-1, ММР-2, ММР-3, ММР-11, МТ1-ММР и МТ2-ММР и так далее.
[0005] ii. Базигин задействован в анаэробном метаболизме опухолевых клеток. Базигин является важным молекулярным шапероном переносчика монокарбоксилатов МСТ-1 и МСТ-4. Базигин может взаимодействовать с МСТ-1 и МСТ-4, способствуя их правильному расположению на клеточной мембране, и продолжать регулировать перенос ими метаболитов лактата. Поскольку опухолевые клетки в основном используют анаэробный метаболизм для получения энергии, базигин регулирует энергетический метаболизм и функцию опухолевых клеток опосредованно через экспрессию МСТ.
[0006] iii. Базигин способствует устойчивости опухолевых клеток к лекарственным средствам. Базигин влияет на транскрипцию гена множественной лекарственной устойчивости (MDR) и способствует экспрессии P-g за счет механизма регуляции коэкспрессии, таким образом индуцируя множественную лекарственную устойчивость опухоли. Kanekura et al. представили доказательства, что базигин вызывает множественную лекарственную устойчивость посредством P-g, что указывает на то, что базигин может быть потенциально эффективной мишенью для ингибирования MDR. Кроме того, базигин способствует ядерной локализации p-TFII-I и повышает экспрессию Bip, ключевого фактора реакции несвернутых белков (UPR), приводящей к стрессу эндоплазматического ретикулума и UPR в опухолевых клетках, тем самым ингибируя апоптоз, что приводит к нечувствительности к лекарственным средствам. Ингибирование базигина может способствовать апоптозу клеток гепатоцеллюлярной карциномы и усиливать чувствительность опухолевых клеток к существующим противоопухолевым лекарственным средствам.
[0007] iv. Базигин повышает экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), способствуя ангиогенезу в опухоли. Таким образом, ингибирование экспрессии базигина может существенно подавлять секрецию VEGF и тем самым ингибировать ангиогенез в опухоли.
[0008] v. Базигин взаимодействует со множеством молекул. В трансмембранной области белка базигин расположен высококонсервативный отрицательно заряженный глутамат, который является структурной основой для взаимодействия с различными белками клеточной мембраны, и это также позволяет предположить, что базигин может влиять на различные физиологические активности клеток посредством взаимодействий с различными белками. Базигин взаимодействует с CD98, интегрином, кавеолином-1, циклофилинами (СуР) и другими белками, влияя на рост и метастазирование опухолевых клеток путем изменения клеточных функций, таких как энергетический метаболизм, взаимодействие клеток с матриксом, передача сигнала и так далее.
[0009] Кроме того, ряд ретроспективных исследований показали тесную взаимосвязь между уровнем экспрессии базигина в опухолевой ткани и прогнозом раковых пациентов. У пациентов с немелкоклеточным раком легкого уровни экспрессии базигина и прогноз пациента тесно связаны.
[0010] Таким образом, базигин стал новой мишенью для противоопухолевой терапии, и успешная разработка лекарственного средства на основе антитела "Ликартин" стала доказательством безопасности и эффективности лекарственных средств, мишенью которых является базигин.
[0011] Кроме того, взаимодействие между базигином, экспрессируемым на эритроцитах, и белком роптрий PfRh5 Plasmodium falciparum по типу лиганд-рецептор опосредует дистальное распознавание эритроцитов Plasmodium falciparum, что является ключевым элементом в инвазии Plasmodium falciparum. Взаимодействие между PfRh5 и базигином на эритроцитах происходит у различных малярийных штаммов, что позволяет предположить, что базигин на эритроцитах, как ожидается, является важной мишенью для противомалярийных лекарственных средств. Для преодоления резистентности к химиотерапевтическим лекарственным средствам новые противомалярийные лекарственные средства против человеческого базигина, расположенного на эритроцитах, используют в комбинации с традиционными противомалярийными лекарственными средствами.
[0012] В диагностике и лечении заболеваний широко используют моноклональное антитело (McAb). Однако многократные инъекции мышиного McAb в организм человека могут вызвать у пациента реакцию человеческого организма против мышиных антител (НАМА), системные аллергические реакции могут препятствовать эффективности антитела. Поэтому ведутся научно-исследовательские работы по изучению человеческих антител и гуманизированных антител для выяснения их потенциальных преимуществ.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0013] В данном описании предложены гуманизированные антитела против базигина с высокой аффинностью связывания, биологическая активность которых экспериментально подтверждена.
H
[0014] В данном описании предложено гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (V).
H
Hi
H5
H23
H49
H79
H80
H89
Н94
[0015] В некоторых воплощениях V имеет аминокислотную последовательность  где X в положении i (i=5, 23, 49, 79, 80, 89, 94) SEQ ID NO: 1 обозначен X, каждый из X, X, X, X, X, X, Х может представлять собой любую аминокислоту.
H5
H23
H49
H79
H80
H89
H94
[0016] В некоторых воплощениях X представляет собой V или L. В некоторых воплощениях X представляет собой А или S. В некоторых воплощениях X представляет собой S, А или G. В некоторых воплощениях X представляет собой N или S. В некоторых воплощениях X представляет собой Т или I. В некоторых воплощениях X представляет собой K или R. В некоторых воплощениях X представляет собой А или Т.
H5
H23
H49
H79
H80
H89
H94
[0017] В некоторых воплощениях (а) X представляет собой V, X представляет собой А; и/или (b) X представляет собой S или А; и/или (с) X представляет собой N, X представляет собой Т, X представляет собой K или R, X представляет собой А.
H
[0018] В некоторых воплощениях V содержит три гипервариабельных участка (CDR) тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 9-11.
H
[0019] В некоторых воплощениях V содержит каркасные области (FR), как показано в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15.
H
[0020] В некоторых воплощениях V имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7.
L
[0021] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит вариабельную область легкой цепи (V).
L
Lj
L9
L10
L13
L21
L22
L42
L43
L60,
L65
L80
L81
L83
[0022] В некоторых воплощениях Vимеет аминокислотную последовательность  где X в положении j (j=9, 10, 13, 21, 22, 42, 43, 60, 65, 80, 81, 83) SEQ ID NO: 2 обозначен X, каждый из X, X, X, X, X, X, X, X X, X, X, X может представлять собой любую аминокислоту.
L9
L10
L13
L21
L22
L42
L43
L60
L65
L80
L81
L83
[0023] В некоторых воплощениях X представляет собой S, Р или А. В некоторых воплощениях X представляет собой Т или S. В некоторых воплощениях X представляет собой A, L или V. В некоторых воплощениях X представляет собой L или I. В некоторых воплощениях X представляет собой S или Т. В некоторых воплощениях X представляет собой K или Q. В некоторых воплощениях X представляет собой А, Т или S. В некоторых воплощениях X представляет собой S или А. В некоторых воплощениях X представляет собой S или Т. В некоторых воплощениях X представляет собой Р или S. В некоторых воплощениях X представляет собой Е или D. В некоторых воплощениях X представляет собой F или I.
L9
L10
L13
L21
L22
L42
L43
L60
L65
L80
L81
L83
[0024] В некоторых воплощениях (a) X представляет собой S или А, X представляет собой Т или S, X представляет собой A, X представляет собой L или I, X представляет собой S или Т; (b) X представляет собой K или Q, X представляет собой А или Т; и/или (с) X представляет собой S, X представляет собой S или Т, X представляет собой Р, X представляет собой Е или D, X представляет собой F.
L
[0025] В некоторых воплощениях V содержит три CDR легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 22-24.
L
[0026] В некоторых воплощениях V содержит FR как показано в SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
L
[0027] В некоторых воплощениях V имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO:20.
2
[0028] В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент антитела, выбранный из F(ab'), Fab', Fab, Fv, scFv, dsFv, dAb и одноцепочечного связывающего полипептида.
[0029] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент содержат константную область тяжелой цепи IgG человека. В некоторых воплощениях IgG человека представляет собой IgG2 человека. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент содержат константную область человеческой κ-цепи.
D
-11
-10
-11
-10
[0030] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с K от приблизительно 1×10 М до приблизительно 5×10М или от приблизительно 5×10М до приблизительно 1,1×10М.
[0031] В одном аспекте данного описания также предложена последовательность выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе.
[0032] В некоторых воплощениях последовательность выделенной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21.
[0033] В другом аспекте данного описания также предложен вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе.
[0034] В другом аспекте данного описания предложена клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в данном документе. В некоторых воплощениях клетка-хозяин представляет собой клетку СНО.
[0035] В еще одном аспекте данного описания предложена композиция, содержащая гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
[0036] В другом аспекте данного описания предложен способ лечения у субъекта состояния, связанного с базигином, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, предложенной в данном описании.
[0037] В некоторых воплощениях связанное с базигином состояние представляет собой рак или малярию. В некоторых воплощениях рак представляет собой рак легкого, рак печени, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак пищевода или рак желудка. В некоторых воплощениях субъектом является человек.
[0038] В другом аспекте данного описания предложено применение гуманизированного антитела против базигина или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе, в изготовлении лекарственного средства для лечения у субъекта состояния, связанного с базигином.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0039] Фиг. 1 является графической иллюстрацией, показывающей некоторые приведенные в качестве примера вариации в определенных аминокислотных сайтах FR тяжелой цепи гуманизированных антител против базигина.
[0040] Фиг. 2 является графической иллюстрацией, показывающей некоторые приведенные в качестве примера вариации в определенных аминокислотных сайтах FR легкой цепи гуманизированных антител против базигина.
[0041] На Фиг. 3 показано дозозависимое связывание антител против базигина, в том числе мышиного 6Н8 (сплошная линия, ромбы), химерного 6Н8 (сплошная линия, треугольники вершиной вниз), гуманизированного НР6Н8-1 (сплошная линия, круги), гуманизированного НР6Н8-2 (сплошная линия, треугольники вершиной вверх), гуманизированного НР6Н8-3 (сплошная линия, квадраты), с человеческим базигином, которое определяли методом ELISA.
[0042] На Фиг. 4 схематично изображена структура экспрессирующего вектора pcDNA3.3-LC-N-229-205, несущего ген легкой цепи антитела против базигина, последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи, встроена между сайтами Xba I и Bsi WI плазмиды pcDNA3.3, за ней расположена последовательность, кодирующая константную область человеческой каппа-цепи.
[0043] На Фиг. 5 схематично изображена структура экспрессирующего вектора pOptivec-HC-D-229-205, несущего ген тяжелой цепи антитела против базигина, последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, встроена между сайтами Xba I и Nhe I плазмиды pOptivec, за ней расположена последовательность, кодирующая константную область тяжелой цепи человеческого IgG2.
[0044] На Фиг. 6 показаны результаты экспрессии антитела НР6Н8-1 в линии клеток яичников китайского хомячка (СНО).
[0045] На Фиг. 7 показаны результаты иммуногистохимического окрашивания НР6Н8-1 злокачественных тканей при раке толстой кишки, печени и легкого.
[0046] На Фиг. 8 представлены результаты ингибирования in vitro инвазии эритроцитов Plasmodium falciparum под воздействием гуманизированного антитела НР6Н8-1, результаты представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0047] Приведенное ниже описание данного изобретения служит для иллюстрации различных воплощений данного изобретения. Таким образом, обсуждаемые конкретные модификации не следует считать ограничивающими объем данного изобретения. Специалисту в области техники будет очевидно, что могут быть произведены различные эквиваленты, изменения и модификации, не выходящие за пределы данного изобретения и следует понимать, что такие эквивалентные воплощения входят в объем данного изобретения. Все процитированные документы, включая публикации, патенты и заявки на патенты, включены во всей полноте путем ссылки.
Гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент
[0048] В одном аспекте данного описания представлено гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент.
H
H1
H2
H3
L
L
H
L
[0049] В данном описании термин «антитело» охватывает любой иммуноглобулин, моноклональное антитело, мультивалентное антитело, мультиспецифическое антитело или биспецифическое (двухвалентное) антитело. Нативное интактное антитело содержит две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), соединенные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь антитела состоит из вариабельной области (V) и первой, второй и третьей константной области (C, C, C, соответственно), тогда как каждая легкая цепь антитела состоит из вариабельной области (V) и константной области (C). Вариабельные области легкой и тяжелой цепей отвечают за связывание антигена. Вариабельные области в обеих цепях обычно подразделяются на три гипервариабельные области, обозначаемые областями, определяющими комплементарность (CDR) (где выделяют CDR легкой (L) цепи, включающие LCDR1, LCDR2 и LCDR3, и CDR тяжелой (Н) цепи, включающие HCDR1, HCDR2, HCDR3). Границы CDR для антител и антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, могут быть определены или идентифицированы согласно Kabat, Chothia или Al-Lazikani (Al-Lazikani, В., Chothia, С., Lesk, А. М., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, С. et al, J Mol Biol. Dec 5; 186(3):651-63 (1985); Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196,901 (1987); Chothia, C. et al., Nature. Dec 21-28; 31(6252):877-83 (1989); Kabat E.A. et al., National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). В некоторых воплощениях границы CDR антитела определяют согласно базе данных Kabat. Три CDR расположены между фланкирующими участками, известными под названием каркасных областей (FR, среди которых выделяют FR тяжелой (Н) цепи, включая HFR1, HFR2, HFR3 и HFR4, и FR легкой (L) цепи, включая LFR1, LFR2, LFR3 и LFR4), которые более консервативны по сравнению с CDR и образуют каркас, поддерживающий гипервариабельные петли. Таким образом, каждая V и V содержит три CDR и четыре FR, расположенные в следующем порядке (аминокислотные остатки от N конца к С концу): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Константные области тяжелой и легкой цепей не задействованы в связывании антигена, но демонстрируют различные эффекторные функции.
[0050] У млекопитающих тяжелые цепи классифицируют как α, δ, ε, γ и μ, и легкие цепи классифицируют как λ или κ. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелой цепи антитела подразделяют на пять основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, которые характеризуются наличием тяжелых цепей α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Существуют такие подклассы нескольких основных классов антител, как IgG1 (тяжелая цепь γ1), IgG2 (тяжелая цепь γ2), IgG3 (тяжелая цепь γ3), IgG4 (тяжелая цепь γ4), IgA1 (тяжелая цепь α1) или IgA2 (тяжелая цепь α2).
[0051] Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который имеет часть тяжелой и/или легкой цепи, происходящую от одного биологического вида, и остальную часть тяжелой и/или легкой цепи, происходящую от другого биологического вида, обозначают химерным. В качестве примера, химерное антитело может содержать константную область человеческого происхождения и вариабельную область, происходящую из рода, не являющегося человеком, например, мыши.
[0052] Гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту, который содержит CDR, происходящие из антител, не являющихся человеческими (например, антител грызунов, кролика, собаки, козы, лошади или цыпленка), и FR вариабельных областей и константные области (если такие имеются) полностью или существенно происходящие из иммуноглобулинов человека.
[0053] «Существенно» в данном описании относится к высокой степени сходства между двумя сравниваемыми объектами (например, последовательностями, численными значениями), и специалист в области техники не будет считать существующие различия между двумя объектами значимыми и/или будет ожидать, что между двумя сравниваемыми объектами существует небольшое различие в свойствах (например, физических свойствах или биологической активности).
[0054] В некоторых воплощениях последовательность гуманизированного антитела или антигенсвязывающего фрагмента изменена (например, имеет замену, вставку или делецию) для улучшения одного или более свойств антитела, таких как аффинность связывания, стабильность, иммуногенность, фармакокинетическое время полужизни, чувствительность к pH, возможность конъюгации и т.д. В некоторых воплощениях изменяют один или более чем один аминокислотный остаток в одном или более CDR, не являющихся человеческими, и/или FR, являющихся человеческими, для улучшения одного или более вышеуказанных свойств антитела при сохранении или улучшении аффинности связывания антитела, где измененные аминокислотные остатки либо являются несущественными для специфического связывания, либо изменения являются консервативными, не влияющие существенным образом на связывание гуманизированного антитела с базигином.
[0055] В некоторых воплощениях CDR, происходящие из антител, не являющихся человеческими, могут содержать такую же аминокислотную последовательность, как и CDR, не являющиеся человеческими, производными которых они являются, или могут содержать не более 3, не более 2 или не более 1 измененной аминокислоты. В некоторых воплощениях изменения представляют собой консервативные замены.
[0056] «Консервативная замена» в отношении аминокислотной последовательности относится к замене аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь со схожими физико-химическими свойствами, или к замене тех аминокислот, которые не являются критически важными для активности полипептида. Например, консервативные замены могут быть произведены среди аминокислотных остатков с неполярными боковыми цепями (например, Met, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe и Trp), среди остатков с незаряженными полярными боковыми цепями (например, Cys, Ser, Thr, Asn, Gly и Gln), среди остатков с отрицательно заряженными боковыми цепями (например, Asp и Glu), среди аминокислот с положительно заряженными боковыми цепями (например, His, Lys и Arg), среди аминокислот с бета-разветвленными боковыми цепями (например, Thr, Val и Ile), среди аминокислот с серосодержащими боковыми цепями (например, Cys и Met) или среди остатков с ароматическими боковыми цепями (например, Trp, Tyr, His и Phe). В некоторых воплощениях замены, делеции или вставки могут также считаться «консервативными заменами», при условии, что такие замены, делеции или вставки не приводят к значимому изменению конформационной структуры белка и поэтому могут сохранять биологическую активность белка. Количество аминокислот, которые встраивают или удаляют при консервативной замене, может варьировать в диапазоне от приблизительно 1 до 3.
H
H
L
L
[0057] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (V). В некоторых воплощениях V содержит CDR, приведенные в SEQ ID NO: 9-11. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи (V). В некоторых воплощениях V содержит CDR, приведенные в SEQ ID NO: 22-24.
[0058] В некоторых воплощениях для виртуальной симуляции связывания антител или антигенсвязывающих фрагментов с человеческим базигином можно применять компьютерные программы и таким образом идентифицировать аминокислотные сайты антител/фрагментов (например, FR), которые являются несущественными для связывания. В ходе симуляции в таких сайтах можно тестировать различные аминокислоты для идентификации тех аминокислот, которые не приводят к изменению структуры/конформации связывающей части антигена или антигенсвязывающего фрагмента, или возможно, улучшают одно или более свойств антител или антигенсвязывающих фрагментов, таких как связывание или аффинность связывания, стабильность, иммуногенность, фармакокинетическое время полужизни, чувствительность к pH, возможность конъюгации и т.д. Примеры таких компьютерных программ включают SYBYL, Discovery Studio, МОЕ, AMBER, GROMACS, NAMD, CONCOORD, DynDom, Autodock, MODELER, MolMol и т.д., без ограничения.
[0059] В некоторых воплощениях FR области гуманизированного антитела против базигина или его антигенсвязывающего фрагмента могут содержать некоторые аминокислотные вариации, например, не более чем в 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотном сайте. В некоторых воплощениях FR области гуманизированного антитела против базигина или его антигенсвязывающего фрагмента гомологичны FR, которые не являются человеческими.
[0060] В данном описании термины «гомолог» и «гомологичный» используются взаимозаменяемо и относятся к аминокислотным последовательностям или нуклеотидным последовательностям (или их комплементарным цепям), которые при оптимальном выравнивании идентичны другим последовательностям по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%).
[0061] Процент (%) «идентичности последовательности» применительно к аминокислотной последовательности (или нуклеотидной последовательности) определяют как процент аминокислотных остатков (или нуклеотидов) в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам (или нуклеотидам) в референтной последовательности после выравнивания последовательностей и расстановки пропусков (гэпов), если это необходимо для достижения максимального соответствия. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной (или нуклеотидной) последовательности может выполняться, например, с помощью общедоступных программных инструментов, таких как BLAST, BLASTp, ALIGN или Megalign (DNASTAR).
H
Hi
H5
H23
H49
H79
H80
H89
H94
H
Hi
H5
H23
H49
H79
H80
H89
H94
[0062] В некоторых воплощениях V имеет аминокислотную последовательность  где X в положении i (i=5, 23, 49, 79, 80, 89, 94) SEQ ID NO: 1 обозначен X, каждый из X, X, X, X, X, X, X может представлять собой любую аминокислоту. В некоторых воплощениях V состоит из аминокислотной последовательности  где X в положении i (i=5, 23, 49, 79, 80, 89, 94) SEQ ID NO: 1 обозначен X, каждый из X, X, X, X, X, X, X может представлять собой любую аминокислоту.
H5
H23
H49
H79
H80
H89
H94
[0063] В некоторых воплощениях X представляет собой V или L. В некоторых воплощениях X представляет собой А или S. В некоторых воплощениях X представляет собой S, А или G. В некоторых воплощениях X представляет собой N или S. В некоторых воплощениях Xпредставляет собой Т или I. В некоторых воплощениях X представляет собой K или R. В некоторых воплощениях X представляет собой А или Т.
H5
H23
H49
H79
H80
H89
H94
[0064] В некоторых воплощениях (а) X представляет собой V, Xv представляет собой А; и/или (b) Xv представляет собой S или А; и/или (с) Xv представляет собой N, X представляет собой Т, Xv представляет собой K или R, Xv представляет собой А.
H5
H23
H49
H49
H49
H79
H80
H89
H94
H79
H80
H9
H94
[0065] В некоторых воплощениях X представляет собой V, Xv представляет собой А. В некоторых воплощениях X представляет собой S или А. В некоторых воплощениях X представляет собой S. В некоторых воплощениях X представляет собой А. В некоторых воплощениях X представляет собой N, X представляет собой Т, X представляет собой K, X представляет собой А. В некоторых воплощениях X представляет собой N, X представляет собой Т, X представляет собой R, X представляет собой А.
H
H
H
[0066] В некоторых воплощениях V содержит одну или более чем одну FR область тяжелой цепи, выбранную из SEQ ID NO: 12-15. В некоторых воплощениях V содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO: 7. В некоторых воплощениях V состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 7.
L
L
[0067] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи V. В некоторых воплощениях V содержит CDR, приведенные в SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24.
L
L9
L10
L13
L21
L22
L42
L43
L60
L65
L80
L81
L83
L
L
L9
L10
L13
L21
L22
L42
L43
L60
L65
L80
L81
L83
[0068] В некоторых воплощениях Vl имеет аминокислотную последовательность  где X в положении j (j=9, 10, 13, 21, 22, 42, 43, 60, 65, 80, 81, 83) SEQ ID NO: 43 обозначен Xj, каждый из X, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X может представлять собой любую аминокислоту. В некоторых воплощениях V состоит из аминокислотной последовательности  где X в положении j (j=9, 10, 13, 21, 22, 42, 43, 60, 65, 80, 81, 83) SEQ ID NO: 43 обозначен Xj, каждый из X, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X, X может представлять собой любую аминокислоту.
L9
L10
L13
L21
L22
L42
L43
L60
L65
L80
L81
L83
[0069] В некоторых воплощениях X представляет собой S, Р или А. В некоторых воплощениях X представляет собой Т или S. В некоторых воплощениях X представляет собой A, L или V. В некоторых воплощениях X представляет собой L или I. В некоторых воплощениях X представляет собой S или Т. В некоторых воплощениях X представляет собой K или Q. В некоторых воплощениях X представляет собой А, Т или S. В некоторых воплощениях X представляет собой S или А. В некоторых воплощениях X представляет собой S или Т. В некоторых воплощениях X представляет собой Р или S. В некоторых воплощениях X представляет собой Е или D. В некоторых воплощениях X представляет собой F или I.
L9
L10
L13
L21
L22
L42
L43
L60
L65
L80
L81
L83
[0070] В некоторых воплощениях (a) X представляет собой S или A, X представляет собой Т или S, X представляет собой A, X представляет собой L или I, X представляет собой S или Т; (b) X представляет собой K или Q, X представляет собой А или Т; и/или (с) X представляет собой S, X представляет собой S или Т, X представляет собой Р, X представляет собой Е или D, X представляет собой F.
L9
L10
L13
L21
L22
L9
L10
L13
L21
L22
L9
L10
L13
L21
L22
[0071] В некоторых воплощениях X представляет собой S, X представляет собой Т, X представляет собой A, X представляет собой L, X представляет собой S. В некоторых воплощениях X представляет собой А, X представляет собой S, Xv представляет собой A, X представляет собой I, X представляет собой S. В некоторых воплощениях X представляет собой S, X представляет собой S, X представляет собой A, X представляет собой L, X представляет собой Т.
L42
L43
L42
L43
L42
L43
[0072] В некоторых воплощениях X представляет собой K, X представляет собой А. В некоторых воплощениях X представляет собой Q, X представляет собой Т. В некоторых воплощениях X представляет собой Q, X представляет собой А.
L60
L65
L80
L81
L83
L60
L65
L80
L81
L83
[0073] В некоторых воплощениях X представляет собой S, X представляет собой S, X представляет собой Р, X представляет собой Е, X представляет собой F. В некоторых воплощениях X представляет собой S, X представляет собой S, X представляет собой Р, X представляет собой D, X представляет собой F.
L
[0074] В некоторых воплощениях V содержит одну или более чем одну FR область, выбранную из SEQ ID NO: 25-28.
L
L
[0075] В некоторых воплощениях V содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20. В некоторых воплощениях V состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20.
[0076] В некоторых воплощениях гуманизированные антитела или их антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую цепь, содержащую константную область тяжелой цепи IgA, IgD, IgE, IgG или IgM человека. В некоторых воплощениях тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи IgG человека. В некоторых воплощениях IgG человека представляет собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. В некоторых воплощениях IgG человека представляет собой IgG2 человека. В некоторых воплощениях гуманизированные антитела или их фрагмент содержат легкую цепь, содержащую константную область человеческой λ, или κ цепи. В некоторых воплощениях легкая цепь содержит константную область человеческой к цепи.
[0077] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина, описанное в данном документе, содержит: три CDR тяжелой цепи, приведенные в SEQ ID NO: 9-11, каркасные последовательности тяжелой цепи HFR1, HFR2, HFR3 и HFR4, приведенные в SEQ ID NO: 12-15, CDR легкой цепи, приведенные в SEQ ID NO: 22-24 и каркасные последовательности легкой цепи LFR1, LFR2, LFR3 и LFR4, приведенные в SEQ ID NO: 25-28, где последовательности вариабельной области тяжелой цепи соответствуют формуле: HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4, и последовательности вариабельной области легкой цепи соответствуют формуле: LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4.
[0078] Гуманизированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент могут найти применение в качестве лекарственных средств для человека. В некоторых воплощениях, поскольку оно обладает сниженной иммуногенностью или с меньшей вероятностью индуцирует иммунный ответ у человека по сравнению с антителами биологических видов, не являющихся человеком. В некоторых воплощениях животное, не являющееся человеком, представляет собой млекопитающее, например, мышь, крысу, кролика, козу, овцу, морскую свинку, хомяка или примата, не являющегося человеком (например, макака (например, яванского макака или макака-резус) или человекообразную обезьяну (например, шимпанзе, гориллу, высших обезьян (simian or affen))).
D
off
on
off
on
D
[0079] Термин «специфическое связывание» или «специфически связывается» в данном описании относится к неслучайной реакции связывания между двумя молекулами, например, между антителом и антигеном. Аффинность связывания может быть представлена значением K, которое рассчитывают как отношение между скоростью диссоциации (k) и скорости ассоциации (k), т.е. k/k, когда связывание между антигеном и антителом достигает равновесия. Значение K можно определять подходящими способами, известными в области техники, включая, например, исследование связывания методом плазменного резонанса (SPR) с применением таких инструментов, как Biacore (см., например, Murphy, М. et al., Current protocols in protein science, Chapter 19, unit 19.14, 2006).
D
D
D
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-11
-7
-11
-8
-11
-9
-11
-9
-11
-9
-11
-10
-11
-11
-11
-10
-11
-10
[0080] В некоторых воплощениях антитела против базигина и их антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в данном описании, способны специфически связывать базигин человека с аффинностью связывания (K) приблизительно 10 М или менее (например, 10 М, 10 М, 10 М, 10 М, 10 М), что определяют в исследовании связывания методом плазмонного резонанса. В некоторых воплощениях антитела или антигенсвязывающие фрагменты, предложенные в данном описании, специфически связываются с базигином, являющимся или не являющимся человеческим, с аффинностью связывания (K) от приблизительно 1×10 М до приблизительно 1×10 М, от приблизительно 1×10 М до приблизительно 1×10 М, от приблизительно 1×10 М до приблизительно 5×10 М, от приблизительно 1×10 М до приблизительно 1×10 М, от приблизительно 1×10 М до приблизительно 1×10 М, от приблизительно 5×10 М до приблизительно 5×10 М или от приблизительно 5×10 М до приблизительно 1,1×10М. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с базигином с K от приблизительно 1×10 М до приблизительно 5×10 M или от приблизительно 5×10 М до приблизительно 1,1×10 М.
[0081] В некоторых воплощениях антитела против базигина и их антигенсвязывающие фрагменты специфически связываются с базигином человека, но не с базигином мыши, например, аффинность связывания с базигином мыши составляет менее 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от таковой с человеческим базигином.
2
2
[0082] В данном описании термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к фрагменту антитела, образованному из фрагмента антитела, содержащего один или более чем один CDR, или к любой другой части антитела, которая связывается с антигеном, но не содержит интактной структуры нативного антитела. Примеры антигенсвязывающего фрагмента включают, без ограничения, фрагменты Fab, Fab', F(ab'), Fv, стабилизированный дисульфидными связями Fv фрагмент (dsFv), (dsFv), диатело (dAb), биспецифическое стабилизированное дисульфидными связями диатело (биспецифическое ds-dAb), одноцепочечный Fv (scFv), димер scFv, одноцепочечный связывающийся полипептид, выделенный CDR и мультиспецифическое антитело. Антигенсвязывающий фрагмент способен связываться с тем же антигеном, с которым связывается родительское антитело.
[0083] «Fab» относится к моновалентному антигенсвязывающему фрагменту антитела, состоящему из единственной легкой цепи (как вариабельных, так и константных областей), присоединенной к вариабельной области и первой константной области единственной тяжелой цепи посредством дисульфидной связи.
[0084] «Fab» относится к моновалентному антигенсвязывающему фрагменту, который соответствует Fab-фрагменту, дополнительно включающему часть шарнирного участка.
2
[0085] «F(ab')» относится к димеру двух Fab' фрагментов, которые связаны между собой посредством дисульфидных связей.
[0086] «Fv» состоит из вариабельной области единственной легкой цепи, присоединенной к вариабельной области единственной тяжелой цепи.
2
H
L
[0087] «dsFv» относится к стабилизированному дисульфидными связями фрагменту Fv, где связь между вариабельной областью единственной легкой цепи и вариабельной областью единственной тяжелой цепи представляет собой дисульфидную связь. В некоторых воплощениях «(dsFv)» содержит три пептидные цепи: две группировки V, соединенные посредством пептидного линкера и связанные дисульфидными мостиками с двумя группировками V. В некоторых воплощениях dsFv является биспецифическим, где каждая тяжелая и легкая цепь, связанная дисульфидной связью, имеет различную антигенную специфичность.
H
L
H
L
L
H
[0088] «Диатело» или «dAb» относится к небольшим фрагментам с двумя антигенсвязывающими сайтами, где фрагменты содержат домен V соединенный с доменом V в составе единой полипептидной цепи (V-V или V-V) (см., например, Holliger P. et al., Proc Natl Acad Sci USA.; 90(14):6444-8 (1993); EP 404097; WO 93/11161) при помощи линкера, длина которого недостаточна для спаривания двух доменов единой цепи, домены принудительно спариваются с комплементарными доменами другой цепи и образуют два антигенсвязывающих сайта.
H1
L2
L1
H2
H1
L1
[0089] В некоторых воплощениях «биспецифическое стабилизированное дисульфидными связями диатело» содержит V-V (соединенные посредством пептидного линкера), связанные с V-V (также соединенными пептидным линкером) посредством дисульфидного мостика между V и V.
H
L
[0090] «Одноцепочечное Fv» или «scFv» или «одноцепочечное антитело» относится к фрагментам антитела, полученным генно-инженерными способами, содержащим единственный домен V и единственный домен V антитела, где указанные домены соединены друг с другом непосредственно или через последовательность пептидного линкера с образованием единой полипептидной цепи (Huston JS et al., Proc Natl Acad Sci USA, 85:5879(1988)).
[0091] «Димер scFv» относится к димеру двух scFv.
[0092] «Одноцепочечный связывающий полипептид» относится к любому одноцепочечному полипептиду, который способен связываться с антигеном или эпитопом.
[0093] В данном описании термин «антиген» относится к молекуле или части молекулы, способной связываться антителом или антигенсвязывающим фрагментом и кроме того, способной применяться у животного для продуцирования антител, способных связываться с указанным антигеном. Антиген может иметь один или более чем один эпитоп. Термин «эпитоп» в данном описании относится к определенной группе атомов (например, углеводным боковым цепям, фосфорильным группам, сульфонильным группам) или аминокислотам антигена, которые способны взаимодействовать с антителами или антигенсвязывающими фрагментами.
2
[0094] В некоторых воплощениях антигенсвязывающий фрагмент представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab, Fab', F(ab'), Fv, dsFv, dAb, scFv и одноцепочечного связывающего полипептида.
[0095] В некоторых воплощениях данного описания предложено приведенное в качестве примера мышиное моноклональное антитело HAb18GC2 (также обозначаемое 6Н8), его химерное антитело (т.е., с6Н8) и гуманизированные антитела НР6Н8-1, НР6Н8-2, НР6Н8-3.
[0096] Мышиное моноклональное антитело HAb18GC2 имеет вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 31, вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 29. Химерное антитело с6Н8 содержит константную область человеческого происхождения изотипа IgG1, слитую с вышеуказанной вариабельной областью мышиного происхождения.
[0097] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина выбрано из группы, состоящей из НР6Н8-1, НР6Н8-2 и НР6Н8-3, имеющих вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 3, 5 и 7, соответственно (соответствующую кодирующим последовательностям ДНК SEQ ID NO: 4, 6 и 8, соответственно), и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 16, 18 и 20, соответственно (соответствующую кодирующим последовательностям ДНК SEQ ID NO: 17, 19 и 21, соответственно).
[0098] Способы получения гуманизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента
[0099] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающие фрагменты получают рекомбинантными способами. Рекомбинантный метод получения гуманизированного антитела против базигина или его антигенсвязывающих фрагментов включает:
[00100] 1) иммунизацию подходящего животного, не являющегося человеком, человеческим белком базигин или клетками, продуцирующими человеческий базигин. Животное может представлять собой мышь, крысу, овцу, козу, кролика или морскую свинку. Создание антитело-продуцирующей гибридомы, с использованием селезенки или лимфатических узлов животного, не являющегося человеком, или сбор В клеток иммунизированного животного, не являющегося человеком, и определение титра моноклональных антител против базигина, не являющихся человеческими. Выделение и секвенирование ДНК, кодирующей моноклональное антитело при помощи стандартных методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).
[00101] 2) Клонирование полинуклеотидов, кодирующих моноклональные антитела против базигина, не являющиеся человеческими, имеющие подходящий титр, из созданной гибридомы или собранных клонов В клеток. Анализ последовательности полипептидов, кодируемых полинуклеотидами, для определения границ CDR моноклональных антител, не являющихся человеческими.
[00102] 3) Получение рекомбинантного гена гуманизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента путем пересадки генов CDR, не являющихся человеческими, на ген иммуноглобулина человека, так что каркасные участки вариабельного домена и константные области, если таковые присутствуют, полностью или существенно происходят из последовательности иммуноглобулина человека.
[00103] 4) Возможно, включение рекомбинантного гена в подходящий вектор и внедрение вектора или рекомбинантного гена в клетку-хозяина для продуцирования гуманизированного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе.
[00104] Антитело и его антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, могут быть получены в по существу чистой и гомогенной форме путем культивирования клеток-хозяев, с последующим разделением и очисткой клеток-хозяев или культуральной жидкости (например, супернатанта). Для разделения и очистки антитела и его антигенсвязывающих фрагментов можно применять любой подходящий способ очистки полипептида.
[00105] Последовательность выделенной нуклеиновой кислоты
[00106] В одном аспекте данного описания предложена последовательность выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе.
[00107] «Выделенное» вещество представляет собой вещество, которое изменено руками человека по сравнению с исходным состоянием, например, вещество естественного происхождения, которое отделено от его исходного окружения, может обозначаться выделенным веществом. «Выделенная» нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая по существу свободна от других молекул нуклеиновой кислоты и не ассоциирована с компонентами природного происхождения, сопровождающими нуклеиновую кислоту в нативном состоянии. «Последовательность выделенной нуклеиновой кислоты» относится к последовательности молекулы выделенной нуклеиновой кислоты.
[00108] В некоторых воплощениях последовательности выделенной нуклеиновой кислоты содержат одну или более чем одну нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательности CDR, предложенные в данном описании. В некоторых воплощениях последовательность выделенной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8 или гомологичную ей последовательность. В некоторых воплощениях последовательность выделенной нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 или SEQ ID NO: 21 или гомологичную ей последовательность.
[00109] В данном описании термины «гомолог» и «гомологичный» используются взаимозаменяемо и относятся к нуклеотидным последовательностям (или их комплементарным цепям) или к аминокислотным последовательностям, которые при оптимальном выравнивании идентичны по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) другим последовательностям.
[00110] Процент (%) «идентичности последовательности» применительно к нуклеотидной последовательности (или к аминокислотной последовательности) определяют как процент нуклеотидов (или аминокислотных остатков) в кандидатной последовательности, которые идентичны нуклеотидам (или аминокислотным остаткам) в референтной последовательности после выравнивания последовательностей и расстановки пропусков (гэпов), если это необходимо для достижения максимального соответствия. Выравнивание в целях определения процента идентичности нуклеотидной (или аминокислотной) последовательности может выполняться, например, с помощью общедоступных программных инструментов, таких как BLASTN, BLASTp (доступ на вебсайте Национального центра биотехнологической информации США (NCBI), см. также Altschul S.F. et al, J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990); Stephen F. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)), ClustalW2 (доступ на веб-сайте Европейского института биоинформатики см. также Higgins D.G. et al, Methods in Enzymology, 266:383-402 (1996); Larkin M.A. et al, Bioinformatics (Oxford, England), 23(21): 2947-8 (2007)) и программ ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут использовать параметры по умолчанию, предлагаемые программным инструментом, или могут настроить необходимые параметры выравнивания, например, выбрав подходящий алгоритм.
[00111] Вектор
[00112] В другом аспекте данного описания также предложен вектор, содержащий последовательность выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент.
[00113] Термин «вектор», используемый в данном документе, относится к нуклеиновой кислоте-носителю, способной трансформировать или трансфицировать клетки, обеспечивая экспрессию гена в клетках. Вектор может представлять собой экспрессирующий вектор или клонирующий вектор. В данном описании предложены векторы (например, экспрессирующие векторы), содержащие последовательность нуклеиновой кислоты, предложенной в данном описании, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, по меньшей мере один промотор (например, SV40, CMV, EF-1α), функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, и по меньшей мере один селективный маркер. Экспрессирующие векторы по данному описанию могут быть векторами на основе вируса, плазмиды, фага и космиды. Примеры включают ретровирус (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус (например, вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, папилломавирус, паповавирус (например, SV40), фаг лямбда и фаг М13, плазмиду pcDNA3.3, pOptivec, pCMV, pEGFP, pIRES, pQD-Hyg-GSeu, pALTER, pBAD, pcDNA, pCal, pL, pET, pGEMEX, pGEX, pCI, pEGFT, pSV2, pFUSE, pVITRO, pVIVO, pMAL, pMONO, pSELECT, pUNO, pDUO, Psg5L, pBABE, pWPXL, pBI, p15TV-L, pPro18, pTD, pRS10, pLexA, pACT2.2, pCMV-SCRIPT.RTM., pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, PCR 2.1, pEF-1, pFB, pSG5, pXT1, pCDEF3, pSVSPORT, pEF-Bos и т.д., без ограничения.
[00114] Клетка-хозяин
[00115] В другом аспекте данного описания предложена клетка-хозяин, содержащая вектор, описанный в данном документе.
[00116] «Клетка-хозяин» в данном описании относится к клетке, в которую внедрены экзогенная нуклеиновая кислота и/или вектор для экспрессии одного или более чем одного экзогенного белка. Термин «клетка-хозяин» обозначает как конкретную клетку-объект, так и ее потомков. Клетка-хозяин может быть прокариотической, эукариотической, растительной клеткой, животной клеткой или гибридомой. Различные клетки-хозяева могут обладать различными характеристиками и механизмами посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов, таким образом, в качестве клеток-хозяев можно выбрать подходящие клеточные линии для обеспечения надлежащей модификации и процессинга (например, первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования) экспрессируемого гуманизированного антитела против базигина или антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых воплощениях клетки-хозяева представляют собой клетки млекопитающего.
[00117] Примерами подходящих линий клеток млекопитающих, используемых в качестве хозяев, являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированных SV40 (например, COS-7); линия человеческих эмбриональных клеток почки (например, клетки 293 или 293Т, субклонированные для роста в суспензионной культуре); клетки почки детеныша хомяка (ВНК, АТСС CCL 10); клетки яичника китайского хомячка (например, CHO/-DHFR, CHO/-GS, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:116 (1980)); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 АТСС CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, АТСС CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, АТСС CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, АТСС CCL 34); клетки печени крысы Буффало (BRL 3А, АТСС CRL 141); клетки легких человека (W138, АТСС CCL 75); клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (Hep G2, НВ 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562, АТСС CCL51); клетки TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); клетки MRC 5; клетки FS4; PC 12; клеточная линия фибробластов эмбриона мыши (3Т3); клетки миеломы NSO (линия клеток миеломы мыши, которые не продуцируют цепи функциональных эндогенных иммуноглобулинов). В некоторых воплощениях клетки-хозяева представляют собой клетки СНО.
[00118] Клетки-хозяева, трансформированные указанными выше векторами или рекомбинантными генами, можно культивировать в стандартной питательной среде или в стандартной питательной среде, соответствующим образом модифицированной для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности. В некоторых воплощениях клетки-хозяева могут быть совместно трансформированы вторым полинуклеотидом, кодирующим другой фрагмент антитела. В некоторых воплощениях клетки-хозяева могут содержать экзогенную нуклеиновую кислоту, но не экспрессируют белок, кодируемый экзогенной нуклеиновой кислотой, на желаемом уровне пока в клетки не будет внедрен регуляторный агент или не будет внедрена регуляторная последовательность таким образом, чтобы она оказалась функционально связана с нуклеиновой кислотой. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, трансформированные векторами, могут транзиторно экспрессировать антитело против базигина.
[00119] Фармацевтическая композиция
[00120] В одном аспекте данного описания предложена фармацевтическая композиция, содержащая одно или более чем одно гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе.
[00121] Предложенная фармацевтическая композиция может находиться в любой стандартной форме, известной в области техники, включая, жидкий раствор, суспензию, эмульсию, пилюли, капсулы, таблетки, композицию с пролонгированным высвобождением или порошок, без ограничения. В некоторых воплощениях фармацевтические композиции составлены в виде композиции для инъекций. Примеры композиций для инъекций включают стерильные растворы готовые для инъекций; стерильные суспензии готовые для инъекций; стерильные эмульсии готовые для инъекций; стерильные сухие растворимые продукты, такие как лиофилизированные порошки, готовые для растворения в растворителе непосредственно перед применением и т.п. Лиофилизированный порошок может храниться в соответствующих условиях, например, при температуре от приблизительно 4°С до комнатной. Растворы, которые могут применяться для растворения, могут быть либо водными, либо неводными. В некоторых воплощениях однодозовые композиции для инъекций запакованы в ампулу, флакон или шприц с иглой. В некоторых воплощениях многодозовые композиции для инъекций запакованы в ампулу или флакон.
[00122] В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
[00123] Термин «фармацевтически приемлемый», используемый в данном описании, означает, что указанный носитель в целом является химически и/или физически совместимым с другими ингредиентами, входящими в состав фармацевтической композиции, и с медицинской точки зрения подходит для применения in vivo у субъекта, являющегося реципиентом (например, у людей и животных) без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции или иной проблемы или осложнения, соразмерно разумному соотношению польза/риск.
[00124] «Фармацевтически приемлемые носители» могут включать, например, фармацевтически приемлемые водные, неводные или твердые носители, антимикробные агенты, изотонические агенты, буферы, регуляторы pH, суспендирующие/диспергирующие агенты, секвестрирующие или хелатирующие агенты, разбавители, адъюванты, эксципиенты или нетоксические дополнительные вещества, другие компоненты, известные в области техники, или любые их комбинации, которые могут облегчать хранение и введение субъекту активных ингредиентов. Фармацевтически приемлемые носители, которые могут применяться в данном описании, включают известные в области техники, например, описанные в документе «Remington Pharmaceutical Sciences» Mack Pub. Co., New Jersey (1991), включенном здесь путем ссылки.
[00125] В качестве дополнительной иллюстрации, фармацевтически приемлемые носители могут включать, например, стерильную воду, хлорид натрия, декстрозу, лактозу, фруктозу, глюкозу, трегалозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, этиловый спирт, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль, фенол, крезол, бензиловый спирт, хлорбутанол, глицерин, пролин, гистидин, аргинин, соляную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, молочную кислоту, янтарную кислоту, аскорбиновую кислоту, ацетат, цитраты, янтарную кислоту, цитрат, фосфат, сорбитат, фосфаты сахарозы, сукцинат натрия, цитрат натрия, этанол, ацетат натрия, гидроксид натрия, метиловый и пропиловый эфиры п-гидроксибензойной кислоты, тимеросал, хлорид бензалкония, хлорид бензетония, сорбитан монолаурат, триэтаноламин олеат, циклодекстрин, Твин-20, Твин-80, кукурузный сироп, глицерин, бисульфат натрия, прокаина гидрохлорид, полоксам, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, поливинилпирролидон, ЭДТА, ЭГТА или другой подходящий агент.
[00126] В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция содержит гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, и один или несколько других терапевтических агентов. В некоторых воплощениях другой терапевтический агент представляет собой агент, применяемый в лучевой терапии, химиотерапии, таргетной терапии, генной терапии, иммунотерапии, гормональной терапии, ингибировании ангиогенеза, паллиативной терапии, хирургии, противомалярийный препарат или их комбинацию.
[00127] Наборы
[00128] В данном описании предложены наборы, содержащие антитела против базигина или его антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе. В некоторых воплощениях наборы могут найти применение для детекции наличия или уровня базигина в биологическом образце. Биологическим образцом могут быть клетки или ткани.
[00129] В некоторых воплощениях антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент, входящий в состав набора, конъюгирован с детектируемой меткой (например, флуоресцентной, радиоактивной или ферментной меткой). В некоторых других воплощениях набор содержит немеченое антитело против базигина или его антигенсвязывающие фрагменты и дополнительно содержит вторичное меченное антитело, которое способно связываться с немеченым антителом против базигина. Набор может дополнительно включать средства для детекции метки. Набор может содержать дополнительные реагенты и буферы, применяемые для осуществления конкретного способа. Набор может дополнительно содержать инструкцию по применению и упаковку, которая разделяет все компоненты набора. В некоторых воплощениях набор включает иммунологический тест для определения антитела против базигина.
[00130] В некоторых воплощениях предложен набор для определения уровня белка базигина. В некоторых воплощениях набор применяют для прогнозирования, диагностики, предупреждения или лечения состояний, связанных с базигином.
[00131] Способ лечения
[00132] В одном аспекте данного описания предложен способ лечения у субъекта состояния, связанного с базигином, включающий введение субъекту эффективного количества фармацевтической композиции, предложенной в данном описании.
[00133] В другом аспекте данного описания предложено применение гуманизированного антитела против базигина или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе, в изготовлении лекарственного средства для лечения у субъекта состояния, связанного с базигином.
[00134] В другом аспекте данного описания предложено гуманизированное антитело против базигина или его антигенсвязывающий фрагмент по данному описанию, используемые для лечения у субъекта состояния, связанного с базигином.
[00135] Термин «субъект», используемый в данном описании, относится к животному. Обычно животное является млекопитающим, частные примеры включают приматов (например, человека), собак, кошек, лошадей, коров, свиней и овец. В некоторых воплощениях субъектом является человек.
[00136] «Состояние, связанное с базигином» в данном описании относится к любому состоянию, которое вызвано, обострено или иным образом связано с повышенной или пониженной экспрессией или активностями базигина (например, человеческого базигина). В некоторых воплощениях состояние, связанное с базигином, представляет собой рак, воспалительное заболевание или инфекционное заболевание.
[00137] «Рак» в данном описании относится к любому состоянию здоровья, характеризующемуся ростом злокачественных клеток или неоплазией, аномальной пролиферацией, инфильтрацией или метастазированием, и охватывает как солидные опухоли, так и несолидные злокачественные новообразования (гемобластозы), такие как лейкоз. В данном описании «солидная опухоль» относится к плотной массе неопластических и/или злокачественных клеток. Примеры рака включают немелкоклеточный рак легкого (плоскоклеточный/неплоскоклеточный), мелкоклеточный рак легкого, почечноклеточный рак, колоректальный рак, рак толстой кишки, рак яичника, рак молочной железы (включая базальную карциному молочной железы, протоковую карциному и дольковую карциному молочной железы), рак поджелудочной железы, карциному желудка, рак мочевого пузыря, рак пищевода, мезотелиому, меланому, рак головы и шеи, рак щитовидной железы, саркому, рак предстательной железы, глиобластому, рак шейки матки, карциному вилочковой железы, меланому, миеломы, грибковые заболевания, рак из клеток Меркеля, гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК), фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому и другие саркомы, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, злокачественные новообразования лимфоидной ткани, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовых желез, медуллярную карциному щитовидной железы, папиллярную карциному щитовидной железы, феохромоцитомы, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярные аденокарциномы, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, гепатому, карциному желчевыводящих путей, хориокарциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, семиному, классическую лимфому Ходжкина (ЛХ), первичную медиастинальную крупноклеточную В-клеточную лимфому, Т-клеточную/богатую гистиоцитами В-клеточную лимфому, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, острый миелогенный лейкоз, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, истинную полицитемию, опухоли, происходящие из тучных клеток, посттрансплантационные лимфопролиферативные расстройства положительные и отрицательные по вирусу Эпштейна-Барр, и диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (ДККЛ), плазмобластную лимфому, экстранодальную NK/T-клеточную лимфому, назофарингеальную карциному, HHV8-ассоциированную первичную выпотную лимфому, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, миелодиспластический синдром, волосатоклеточный лейкоз и миелодисплазию, первичную лимфому ЦНС, опухоли позвоночного столба, глиому ствола головного мозга, астроцитому, медуллобластому, краниофарингиому, эпендимому, пинеалому, гемангиобластому, невриному слухового нерва, олигодендроглиому, менингиому, меланому, нейробластому и ретинобластому, без ограничения. В некоторых воплощениях рак представляет собой метастатический рак, в частности, метастатический рак, экспрессирующий базигин.
[00138] В некоторых воплощениях состояния, связанные с базигином, представляют собой воспалительные заболевания, такие как системная красная волчанка (СКВ), воспаление слизистой кишечника, вызывающая истощение болезнь, связанная с колитом, рассеянный склероз, вирусные инфекции, ревматоидный артрит, остеоартрит, болезнь Крона и воспалительные заболевания кишечника, псориаз, системная склеродермия, аутоиммунный диабет и тому подобные.
[00139] В некоторых воплощениях состояния, связанные с базигином, представляют собой инфекционные заболевания, такие как грибковая инфекция, паразитарная/протозойная инфекция или хроническая вирусная инфекция, например, малярия, кокцидиоидомикоз (coccidioiodmycosis immitis), гистоплазмоз, онихомикоз, аспергиллез, бластомикоз, кандидоз (candidiasis albicans), паракокцидиомикоз, микроспоридиоз, акантамебный кератит, амебиаз, аскаридиоз, бабезиоз, балантидиаз, байлисаскаридоз, болезнь Шагаса, хлонорхоз, кохлиомиаз, криптоспоридиоз, дифиллоботриоз, дракункулез, эхинококкоз, элефантиаз, энтеробиоз, фасциолез, фасциолопсидоз, филяриоз, лямблиоз, гнатостомоз, гименолипедоз, изоспороз, болезнь Катаямы, лейшманиоз, болезнь Лайма, метагонимоз, миаз, онхоцеркоз, педикулез, чесотка, шистосомоз, сонная болезнь, стронгилоидоз, тениоз, токсокароз, токсоплазмоз, трихиниллез, трихуроз, трипанозомоз, гельминтная инфекция, гепатит В (HBV), гепатит С (HCV), инфекция, вызванная вирусом герпеса, вирусом Эпштейна-Барр, ВИЧ, цитомегаловирусная инфекция, инфекция, вызванная вирусом простого герпеса I типа, инфекция, вызванная вирусом простого герпеса II типа, инфекция, вызванная вирусом папилломы человека, аденовирусная инфекция, инфекция, вызванная вирусом иммунодефицита человека I типа, вирусом иммунодефицита человека II типа, герпесвирусная инфекция, ассоциированная с саркомой Капоши, инфекция, вызванная вирусом Торке Тено, инфекция, вызванная Т-лимфотропным вирусом человека I типа, Т-лимфотропным вирусом человека II типа, инфекция, вызванная вирусами Varicella zoster, вирусом Джона Каннингхэма или полиомавирусом 1. В некоторых воплощениях состояние представляет собой малярию.
[00140] Термины «осуществление лечения», «лечение» или «терапия» состояния в данном описании могут использоваться взаимозаменяемо и охватывают терапевтическое лечение, профилактические или превентивные меры, такие как предупреждение или облегчение состояния, замедление начала или скорости развития состояния, снижение риска развития состояния, предупреждение или замедление развития симптомов, ассоциированных с состоянием, уменьшение или прекращение симптомов, ассоциированных с состоянием, достижение полной или частичной регрессии состояния, излечение состояния или некоторые их комбинации.
[00141] Термин «терапевтически эффективное количество» в данном описании относится к дозировке или концентрации лекарственного средства, эффективной для лечения заболевания или состояния, связанного с человеческим базигином. Например, касательно применения гуманизированного антитела против базигина или его антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, для лечения рака, терапевтически эффективное количество представляет собой дозировку или концентрацию антитела или антигенсвязывающего фрагмента, способных сокращать объем опухоли, ингибировать рост или пролиферацию раковых клеток, ингибировать или замедлять рост опухоли или инфильтрацию раковыми клетками других органов, ингибировать или замедлять метастазирование раковых клеток, облегчать любой симптом, ассоциированный с раком, предупреждать или замедлять развитие рака или их некоторую комбинацию. Либо, касательно применения гуманизированного антитела против базигина или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, для лечения малярии, терапевтически эффективное количество представляет собой дозировку или концентрацию антитела или антигенсвязывающего фрагмента, способных ингибировать инфекцию или пролиферацию плазмодия, облегчать любой симптом, ассоциированный с малярией, предупреждать или замедлять развитие малярии или их некоторую комбинацию.
[00142] Терапевтически эффективное количество (при применении в виде монотерапии или в комбинации с другими агентами, такими как химиотерапевтические агенты) гуманизированного антитела против базигина или антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе, будет зависеть от различных факторов, известных в области техники, например, характера заболевания, которое следует лечить, типа антитела, массы тела, возраста, клинического анамнеза, принимаемых препаратов, состояния здоровья субъекта, иммунного статуса и возможных перекрестных реакций, аллергии, чувствительности и нежелательных побочных эффектов, а также способа и пути введения, тяжести и развития заболевания и суждения лечащего врача или ветеринара. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в данном документе, можно вводить в терапевтически эффективной дозировке, составляющей от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг один или несколько раз в сутки (например, приблизительно 0,01 мг/кг, приблизительно 0,3 мг/кг, приблизительно 0,5 мг/кг, приблизительно 1 мг/кг, приблизительно 3 мг/кг, приблизительно 5 мг/кг, приблизительно 10 мг/кг, приблизительно 15 мг/кг, приблизительно 20 мг/кг, приблизительно 25 мг/кг, приблизительно 30 мг/кг, приблизительно 35 мг/кг, приблизительно 40 мг/кг, приблизительно 45 мг/кг, приблизительно 50 мг/кг, приблизительно 55 мг/кг, приблизительно 60 мг/кг, приблизительно 65 мг/кг, приблизительно 70 мг/кг, приблизительно 75 мг/кг, приблизительно 80 мг/кг, приблизительно 85 мг/кг, приблизительно 90 мг/кг, приблизительно 95 мг/кг или приблизительно 100 мг/кг один или несколько раз в сутки). В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или антигенсвязывающий фрагмент вводят в дозировке приблизительно 50 мг/кг или менее, а в некоторых воплощениях дозировка составляет 20 мг/кг или менее, 10 мг/кг или менее, 3 мг/кг или менее, 1 мг/кг или менее, 0,3 мг/кг или менее, или 0,1 мг/кг или менее. В некоторых воплощениях вводимая дозировка может изменяться в ходе курса лечения. Например, в некоторых воплощениях изначально вводимая дозировка может быть выше, чем дозировки, вводимые в последующем. В некоторых воплощениях вводимая дозировка может изменяться в ходе курса лечения в зависимости от реакции субъекта.
[00143] Режим дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического ответа). В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в данном документе, вводят субъекту однократно или в ходе серии процедур. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в данном документе, вводят субъекту посредством одного или более отдельных введений или путем непрерывной инфузии, в зависимости от характера и тяжести заболевания. Рекомендации можно найти, например, в патентах US 4657760; 5206344; 5225212.
[00144] Гуманизированные антитела против базигина и антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, можно вводить любым способом, известным в области техники, например, таким как парентеральный (например, подкожные, внутрибрюшинные, внутривенные инъекции, в том числе внутривенные инфузии, внутримышечные или внутрикожные инъекции) или непарентеральный (например, пероральное, интраназальное, внутриглазное, подъязычное, ректальное или местное) способ введения.
[00145] В некоторых воплощениях гуманизированное антитело против базигина или антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, можно вводить с контролируемым высвобождением. Препараты для парентерального введения с контролируемым высвобождением могут быть изготовлены в виде имплантов, масляных инъекций или корпускулярных систем (например, микросфер, микрочастиц, микрокапсул, нанокапсул, наносфер и наночастиц) (см. Banga, A.J., Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, Pa., (1995); Kreuter, J., Colloidal Drug Delivery Systems, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., pp. 219-31 (1994); Tice & Tabibi, Treatise on Controlled Drug Delivery, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc. New York, N.Y., pp. 315-339, (1992)). В некоторых воплощениях гуманизированные антитела против базигина или его антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, можно вводить в деградируемых или недеградируемых полимерных матрицах (см. Langer, Accounts Chem. Res. 26:537-51, 1993).
[00146] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют обычное значение, известное специалистам в области, к которой относится данное изобретение.
[00147] В данном описании все термины в единственном числе охватывают термины во множественном числе, за исключением случаев, когда из контекста не следует противоположное. Следует понимать, что термины «содержит», «содержащий», «включает», «включающий», «имеет» и/или «имеющий», используемые в данном описании, обозначают существование указанных признаков, стадий, операций, элементов и/или компонентов, но не исключают существования или добавления одного или более других признаков, стадий, операций, элементов, компонентов и/или их групп. В данном описании термин «приблизительно» при использовании с конкретным указанным численным значением означает, что значение может отклоняться от указанного значения не более чем на 10%.
[00148] Все процитированные документы, включая любые перекрестные ссылки или родственные патенты или заявки на патенты, включены во всей полноте путем ссылки, если они явным образом не исключены или не ограничены иным образом. Цитирование любого документа не означает, что его признают прототипом какого-либо изобретения, изложенного или заявленного в данном документе, или что этот документ сам по себе или в какой-либо комбинации с любым другим документом или документами излагает, позволяет предположить или прийти к любому такому изобретению. Кроме того, в случае, если какое-либо значение или определение термина в данном документе противоречит какому-либо значению или определению этого же термина в документе, включенном путем ссылки, приоритетным является значение или определение, приписываемое такому термину в данном документе.
ПРИМЕРЫ
[00149] Приведенные ниже примеры служат для лучшей иллюстрации заявленного изобретения и их не следует считать ограничивающими объем изобретения. Все конкретные композиции, материалы и способы, описанные ниже, целиком или частично, входят в объем данного изобретения. Эти конкретные композиции, материалы и способы не предназначены для ограничения изобретения, но всего лишь иллюстрируют конкретные воплощения, входящие в объем изобретения. Специалист в области техники может создать эквивалентные композиции, материалы и методы, без изобретательской деятельности и не выходя за рамки изобретения. Следует понимать, что возможны различные вариации описанных процедур, которые при этом остаются в рамках данного изобретения. Такие вариации входят в объем изобретения.
ПРИМЕР 1. Конструирование вектора для фагового дисплея
[00150] Получили клеточную линию гибридомы HAb18GC2 и депонировали ее в Китайском центре для коллекции типовых в 2006 г. под номером доступа ССТСС-С200636. Подробная информация о клеточной линии, антителе, продуцируемом клеточной линией, и способе получения описана в патенте Китая ZL200710007452.2, включенном во всей полноте путем ссылки.
[00151] Общую РНК выделяли из клеток гибридомы HAb18GC2 с использованием набора для выделения общей РНК (Omega bio-tek) согласно инструкциям, прилагающимся к набору. Целостность выделенной общей РНК анализировали путем электрофореза в агарозном геле.
[00152] Из 1 мкг общей РНК получали кДНК путем синтеза первой цепи кДНК согласно инструкциям к набору реагентов для обратной транскрипции PrimeScript RT (TaKaRa) и хранили при -20°С для последующих экспериментов.
[00153] Фрагменты гена VH и фрагменты гена VL амплифицировали в реакции ПЦР с матрицы кДНК с использованием набора праймеров специфических для гена VH и VL, соответственно. В ПЦР применяли ДНК полимеразу Phusion High-Fidelity (NEB), и реакционную смесь готовили согласно инструкциям NEB. Условия проведения ПЦР были следующими: 94°С, 5 мин; (94°С, 15 с, 54°С, 30 с, 72°С, 1 мин) × 35 циклов; 72°С, 10 мин. Размер амплифицированных фрагментов определяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле.
[00154] Последовательность линкера и обратнокомплементарную ей последовательность добавляли на 3' конец фрагмента гена VH и 5' конец фрагмента гена VL, соответственно, при помощи праймеров (VH обратный линкер-R1:  VL линкер-F1:  в следующей реакции ПЦР.
[00155] Фрагмент гена VH и фрагмент гена VL с линкерной последовательностью или последовательностью, обратнокомплементарной последовательности линкера, смешивали 1:1 (моль/моль) и ген scFv амплифицировали при помощи метода ПЦР с перекрывающимися праймерами. Реакционную смесь готовили следующим образом: 1 пмоль фрагмента гена VH, 1 пмоль фрагмента гена VL, 100 пмоль праймера pFL-6H8-F1  100 пмоль праймера pFL-6H8-R2  10 мкл 10х буфера ПЦР. Условия проведения ПЦР были следующими: 95°С, 5 мин; (95°С, 15 с, 56°С, 30 с, 72°С, 1 мин) × 35 циклов; 72°С, 10 мин. Размер амплифицированных фрагментов определяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле.
[00156] Полосы, соответствующие ожидаемому размеру, вырезали и выделяли при помощи набора для выделения фрагментов ДНК (Omega bio-tek) для получения фрагмента гена scFv, содержащего сайты рестрикции Nco I и Not I.
[00157] Фрагмент гена scFv, содержащий сайт расщепления Nco I и Not I, и плазмидный вектор pGEM-T (Promega) определяли при помощи УФ спектрофотометра и затем подвергали расщеплению рестрикционными ферментами.
[00158] Реакцию проводили следующим образом: смешивали 3 мкг выделенного фрагмента гена scFv или 3 мкг вектора pGEM-T, 1 мкл Nco I-HF, 1 мкл Not I-HF рестрикционных эндонуклеаз (NEB), 5 мкл 10х буфера CutSmart и добавляли воду до 50 мкл. Рестриктазную реакционную смесь инкубировали при температуре 37°С в течение 1 часа. Размер полученных продуктов определяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле и полосы, соответствующие ожидаемому размеру, вырезали и выделяли при помощи набора для выделения фрагментов ДНК (Omega bio-tek) для получения расщепленного фрагмента гена scFv и вектора pGEM-T.
[00159] После расщепления выделенный фрагмент гена scFv и вектор pGEM-T лигировали. Условия проведения лигазной реакции были следующими: 0,7 мкг расщепленного фрагмента гена scFv, 1,4 мкг расщепленного вектора pGEM-T, 40 Ед лигазы Т4, 40 мкл 5х лигазного буфера. Реакционную смесь для лигазной реакции инкубировали при температуре 16°С в течение ночи. Компетентные клетки TG1 трансформировали продуктом лигазной реакции, затем распределяли по поверхности чашек с LB агаром и инкубировали при 37°С в течение ночи. Отбирали отдельные колонии и проводили скрининг положительных клонов с помощью универсального праймера для вектора. Затем положительные клоны секвенировали для верификации правильности вставки и те из них, которые содержали правильную вставку (обозначенную рекомбинантной плазмидой pFL-6H8), хранили при -40°С для последующего применения. Рекомбинантная плазмида pFL-6H8 содержала ген scFv с последовательностями полных вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи.
ПРИМЕР 2. Определение CDR и FR мышиного моноклонального антитела 6Н8
[00160] CDR вариабельной области легкой цепи и тяжелой цепи мышиного моноклонального антитела 6Н8 против человеческого базигина (также известного как HAb18GC2, см. патент Китая: ZL200710007452.2) определяли согласно базе данных Kabat. Аминокислотные последовательности трех CDR легкой цепи приведены в SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24 в перечне последовательностей, соответственно. Аминокислотные последовательности трех CDR тяжелой цепи приведены в SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 в перечне последовательностей, соответственно.
ПРИМЕР 3. Отбор соответствующих каркасных последовательностей иммуноглобулина человека
[00161] Для гуманизации антитела последовательности FR человеческого происхождения, полученные из базы данных Kabat, пересаживали на указанные CDR и проводили скрининг пересаженных вариабельных областей антитела на предмет гомологии и структур. Для анализа молекулярной структуры антитела до и после гуманизации при помощи молекулярного моделирования, моделирования на основе гомологии и механической оптимизации, а также для проверки возможных изменений в человеческих FR с целью удостовериться, что замена FR не приводит к изменению общей структуры скелета VH and VL, в частности, не разрушает вторичную структуру мышиного моноклонального антитела в виде β-слоя, благодаря чему сохраняется или улучшается аффинность исходного мышиного антитела, использовали компьютерную программу под названием Discovery Vision (VIOVIA, версия 3.5) Отобранные последовательности FR вариабельных областей тяжелой/легкой цепи человеческого происхождения с возможными вариациями в определенных сайтах приведены наряду с последовательностями FR мышиного происхождения на Фиг. 1 и Фиг. 2 данного описания.
ПРИМЕР 4. Конструирование и скрининг библиотеки фагового дисплея гуманизированного антитела против человеческого базигина
[00162] На основании последовательностей CDR, определенных в Примере 2, и последовательностей FR, верифицированных в Примере 3, получали соответствующие нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагмент ScFv гуманизированного антитела с использованием кодонов, предпочтительных для клеток млекопитающих. Кодирующий ген получали методом ПЦР с перекрывающимися праймерами, затем клонировали в клонирующий вектор и амплифицировали, а положительные клоны подвергали секвенированию. Гуманизацию FR проводили путем внедрения изменений и вариаций в определенные аминокислотные сайты кодирующей последовательности FR тяжелой/легкой цепи с помощью праймеров. Ниже приведен подробный протокол.
[00163] Материалы
[00164] В качестве матрицы использовали фрагмент scFv мышиного происхождения из Примера 1. Для амплификации вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи (hVH) и гуманизированной области легкой цепи (hVL) использовали следующие праймеры:
[00165] Прямые праймеры hVH включали:
[00166] 1) 6H8-L1-F1: SEQ ID NO: 37
[00167]
[00168] 2) 6H8-L1-F2: SEQ ID NO: 38 (6H8-L1-F2 обозначает смесь праймеров, где R=G или A, S=G или С)
[00169]
[00170] 3) 6H8-L1-F3: SEQ ID NO: 39 (6H8-L1-F3 обозначает смесь праймеров, где R=G или A)
[00171]
[00172] Обратные праймеры hVH включали:
[00173] 1) 6H8-L1-R1: SEQ ID NO: 40 (6H8-L1-R1 обозначает смесь праймеров, где М=А или С, Y=Т или С)
[00174]
[00175] 2) 6H8-L1_R2: SEQ ID NO: 41
[00176]
AG
[00177] 3) 6H8-L1-R3: SEQ ID NO: 42 (6H8-L1-R3 обозначает смесь праймеров, где R=G или А, K=G или T)
[00178]
[00179] 4) 6H8-L1-R4: SEQ ID NO: 43
[00180]
[00181] 5) 6H8-L1_R5: SEQ ID NO: 44 (6H8-L1_R5 обозначает смесь праймеров, где R=G или A, S=G или С, W=А или T, V=G или С или A)
[00182]
[00183] Прямые праймеры hVL включали:
[00184] 1) 6H8-L1_F4: SEQ ID NO: 45 (6H8-L1_F4 обозначает смесь праймеров, где М=А или С, W=А или Т)
[00185]
[00186] 2) 6H8-L1_F6: SEQ ID NO: 46 (6H8-L1_F6 обозначает смесь праймеров, где Y=Т или С, S=G или С, W=А или Т)
[00187]
[00188] 3)6H8-L1_F5: SEQ ID NO: 47
[00189]
[00190] Обратные праймеры hVL включали:
[00191] 1) 6H8-L1_R6: SEQ ID NO: 48 (6H8-L1_R6 обозначает смесь праймеров, где Н=А или С или Т, K=G или Т)
[00192]
[00193] 2) 6H8-L1_R8: SEQ ID NO: 49
[00194]
[00195] 3) 6H8-L1_R7: SEQ ID NO: 50 (праймер 6H8-L1_R7 обозначает смесь праймеров, где W=А или Т, М=А или С)
[00196]
[00197] Способ и результаты
[00198] Целевые фрагменты амплифицировали по следующей схеме амплификации:
[00199] 1 стадия амплификации: для амплификации пяти фрагментов 1 стадии из вектора pFL-6H8, полученного в Примере 1, использовали пять пар праймеров (6H8-L1-F1+6H8-L1-R1, 6H8-L1-F2+6H8-L1-R3, 6H8-L1-F3+6H8-L1-R4, 6H8-L1_F4+6H8-L1_R6, 6Н8-L1_F6+6H8-L1_R8). Условия проведения ПЦР были следующими: 95°С, 3 мин; (95°С, 30 с, 55°С, 30 с, 72°С, 40 мин) × 40 циклов; 72°С, 10 мин. После ПЦР размер амплифицированных фрагментов определяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле и затем лигировали в вектор pMD18-T (TaKaRa). Продуктами лигазной реакции трансформировали компетентные клетки, отбирали клоны и проводили скрининг для верификации правильности вставки. На основании результатов секвенирования фрагменты с правильными последовательностями обозначали 6H8-L1-1, 6H8-L1-2, 6Н8-L1-3, 6H8-L1-4 и 6H8-L1-5, соответственно.
[00200] 2 стадия амплификации: для амплификации фрагментов 2 стадии в качестве матриц использовали пять фрагментов стадии 1, полученных выше (6H8-L1-1, 6H8-L1-2, 6H8-L1-3, 6H8-L1-4 и 6H8-L1-5), и четыре пары праймеров (6H8-L1-F1+6Н8-L1_R2, 6H8-L1-F2+6H8-L1_R5, 6H8-L1_F4+6H8-L1_R7, 6H8-L1_F5+6H8-L1_R8). Условия проведения ПЦР были такими же, как и на 1 стадии амплификации. После ПЦР продукты ПЦР очищали путем электрофореза в 1% агарозном геле и лигировали в вектор pMD18-T (TaKaRa) и трансформировали им компетентные клетки. Отбирали положительные клоны и проводили скрининг для верификации правильности вставки. Фрагменты с правильными последовательностями по результатам секвенирования обозначали 6H8-L1-6, 6H8-L1-9, 6H8-L1-7 и 6H8-L1-8, соответственно.
[00201] 3 стадия амплификации: следуя тем же процедурам, как и на 1 стадии амплификации, для получения фрагментов 3 стадии (6H8-L1-10) в качестве матриц использовали два фрагмента 2 стадии, полученные выше (6H8-L1-6 и 6H8-L1-9), и пару праймеров (6H8-L1-F1+6H8-L1_R5); для получения фрагмента 3 стадии (6H8-L1-11) в качестве матриц использовали два фрагмента 2 стадии, полученные выше (6H8-L1-7 и 6H8-L1-8), и пару праймеров (6H8-L1_F4+6H8-L1_R8).
[00202] 4 стадия амплификации: следуя тем же процедурам, как и на 1 стадии амплификации, для получения фрагментов 4 стадии (6H8-L1-12) в качестве матриц использовали фрагменты 3 стадии, полученные выше (6H8-L1-10 и 6H8-L1-11) и пару праймеров (6H8-L1-F1+6H8-L1_R8).
[00203] Фрагмент 6H8-L1-12 расщепляли рестрикционными ферментами NcoI-HF и NotIl-HF (NEB) с последующим разделением путем электрофореза в 1% агарозном геле и затем расщепленный фрагмент очищали с использованием набора для выделения из геля (Omega bio-tek). Очищенный расщепленный фрагмент лигировали с фаговым вектором pComb3Xss (включающим слитый с с-myc белок, предварительно встроенный в остов фагового вектора), который расщепляли тем же набором рестрикционных ферментов (т.е., NcoI-HF и NotI-HF) при помощи ДНК лигазы Т4 (TaKaRa). Продукт лигазной реакции деионизировали и затем трансформировали им компетентные клетки TG1 методом электропорации. Трансформированные клетки TG1 инокулировали в чашки с LB для скрининга клонов. Регистрировали емкость фаговой библиотеки антитела 6H8-L1 и хранили библиотеку при -80°С для дальнейшего использования.
[00204] Отбор антител 6H8-L1 из фаговой библиотеки по специфичности к антигену проводили методом твердофазного отбора со следующими стадиями:
[00205] Фаговую библиотеку антитела 6H8-L1 оживляли в 60 мл среды 2YT и инкубировали в шейкер-инкубаторе при 37°С до достижения культурой OD600 0,3-0,4. Добавляли фаг-хелпер M13KO7 (Invitrogen) и инкубировали культуру в течение 30 мин в неподвижном инкубаторе и в течение 60 мин в шейкер-инкубаторе при 37°С. Центрифугировали культуру при 1500 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость отбрасывали, а клетки ресуспендировали в 60 мл среды 2YT (без глюкозы), содержащей 50 мкг/мл канамицина. Ресуспендированную культуру инкубировали в течение ночи в шейкер-инкубаторе при 30°С, центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин для преципитации бактерий, содержащих библиотеку фагового дисплея. Надосадочную жидкость переносили в чистую центрифужную пробирку, аликвотировали по 30 мл/пробирку, в каждую пробирку для центрифугирования добавляли 7,5 мл PEG/NaCl, хорошо перемешивали, помещали на лед на 1 ч и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость отбрасывали и ресуспендировали фаги в 2,2 мл раствора, содержащего PBS-5% BSA. Ресуспендированные фаги вновь центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин для удаления клеточного дебриса.
[00206] Для проведения отбора по аффинности в ходе 5 раундов сортировки (связывание-отмывка-амплификация) использовали планшеты с иммобилизованным человеческим базигином, в каждом цикле отбора концентрацию иммобилизованного антигена постепенно снижали (1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,01 мкг/мл, 0,001 мкг/мл, 0,0001 мкг/мл). Эксперимент с отбором останавливали, когда отношение сигнал-шум (S/N) составляло ниже 10. Отбирали 768 клонов и культивировали отобранные клоны и индуцировали для экспрессии антител scFv, которые использовали в анализе ELISA.
ПРИМЕР 5. ELISA и секвенирование
2
3
3
[00207] Человеческий базигин разводили до 1 мкг/мл буфером для иммобилизации (200 мМ NaCO/NaHCO, pH 9,2), 50 мкл которого добавляли в каждую лунку 96-луночных планшетов и инкубировали в течение ночи при 4°С. Раствор для иммобилизации в каждой лунке удаляли и трехкратно промывали планшеты 1х буфером PBS, блокировали 200 мкл блокирующего буфера (2% BSA/1x буфер PBS) на лунку при комнатной температуре в течение 1 ч, а затем промывали 200 мкл 1х буфера PBS на лунку. В отдельные лунки планшетов добавляли культуральную надосадочную жидкость, содержащую антитела ScFv и отрицательный контроль, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем планшеты трехкратно промывали 200 мкл 1х буфера PBS. В отдельные лунки планшетов в качестве вторичного антитела добавляли антитело против с-Мус (HRP) (Abeam Cat# ab19312, 50 мкл/лунку), которое разводили блокирующим буфером (1:2500), и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем планшеты 6 раз промывали 200 мкл 1х буфера PBS. В каждую лунку добавляли раствор субстрата ТМВ (50 мкл/лунку) и давали прореагировать в течение 10 мин, для остановки реакции добавляли останавливающий раствор (2 М HCl, 50 мкл/лунку). Измеряли поглощение при 450 нм с использованием считывающего устройства для планшетов ELISA. На основании результатов ELISA для секвенирования отбирали 123 клона с А450> 2,0.
[00208] Оценивали степень гуманизации отсеквенированных последовательностей ДНК, руководствуясь базой данных первичных иммуноглобулинов человека и веб-сайтом http://www.bioinf.org.uk/abs/shab/. Для сортировки по аффинности отбирали 26 молекул scFV с наибольшей степенью гуманизации.
ПРИМЕР 6. Определение аффинности связывания scFv методом SPR
[00209] Аффинность антитела определяли при помощи ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Чип GLC (Bio-Rad, 1765011) активировали 0,04 М EDC + 0,01 М сульфо-NHS (Bio-Rad). Человеческий базигин разводили до 10 мМ при помощи 10 мМ NaAc (рН 4,5) и затем пропускали по поверхности чипа со скоростью 30 мкл/мин для связывания антигена с активированным чипом через аминогруппы. Наконец, чип инактивировали 1 М раствором этаноламин-HCl (Bio-Rad) и после поворота чипа на 90 градусов промывали буфером (PBS/0,005% Tween 20) до стабилизации базовой линии. В шесть горизонтальных каналов инжектировали пять супернатантов клеточных культур антитела scFv и один отрицательный контроль, соответственно, при скорости 30 мкл/мин. Время связывания составляло 60 с, и время диссоциации составляло 900 с. Анализировали данные, используя кинетическую модель Лэнгмюра.
on
D
off
off
[00210] Для исследования связывания человеческого базигина с супернатантом TG1, содержащим антитела scFv, в реальном времени использовали SPR. Константы скорости ассоциации (K) всех прошедших скрининг антител были сопоставимыми, поэтому для определения аффинности связывания антител вместо K использовали константы скорости диссоциации (K). Аффинность связывания человеческого базигина с гуманизированными антителами scFv предварительно оценивали по K, результаты приведены в Таблице 1.
[00211]
off
[00212] С учетом других характеристик, среди антител с относительно низкими значениями K для конструирования интактных антител отбирали пять гуманизированных scFv (т.е., 11188, 11214, 11242, 11245 и 11305), соответственно.
ПРИМЕР 7. Конструирование интактного гуманизированного антитела
[00213] Пять клонов с отобранными на основании результатов предшествующего сортировки по аффинности scFv инокулировали на ночь. Из каждой ночной культуры выделяли плазмиды и подтверждали их последовательности путем секвенирования.
[00214] Для амплификации гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи (VH) и гуманизированной вариабельной области легкой цепи (VL) для создания интактного гуманизированного антитела использовали следующие праймеры:
[00215] Прямой праймер VL: PCI-wbp229_F1, SEQ ID NO: 51
[00216]
[00217] Обратный праймер VL: pCI-6H8_R8, SEQ ID NO: 52
[00218]
[00219] Прямые праймеры VH включали:
[00220] 1) PCI-wbp229_F2: SEQ ID NO: 53
[00221]
[00222] 2) PCI-wbp229_F3: SEQ ID NO: 54
[00223]
[00224] 3) 6H8-L1_R2: SEQ ID NO: 55
[00225]
[00226] 4) 6H8-L1R5: SEQ ID NO: 56
[00227]
[00228] Обратный праймер VH: PCI-wbp229_R1, см. SEQ ID NO: 57
[00229]
[00230] Целевые фрагменты амплифицировали по следующей схеме амплификации:
[00231] Для амплификации областей VL и VH для интактного гуманизированного антитела WBP229-201 в качестве матрицы использовали плазмиду из 11188, пару праймеров (PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 и PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1).
[00232] Для амплификации областей VL и VH для интактного гуманизированного антитела WBP229-202 в качестве матрицы использовали плазмиду из 11214, пару праймеров (PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 и PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1).
[00233] Для амплификации областей VL и VH для интактного гуманизированного антитела WBP229-203 в качестве матрицы использовали плазмиду из 11242, пару праймеров (PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 и PCI-wbp229_F3+PCI-wbp229_R1).
[00234] Для амплификации областей VL и VH для интактного гуманизированного антитела WBP229-204 в качестве матрицы использовали плазмиду из 11245, пару праймеров (PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 и PCI-wbp229_F2+PCI-wbp229_R1).
[00235] Для амплификации областей VL и VH для интактного гуманизированного антитела WBP229-205 в качестве матрицы использовали плазмиду из 11305, пару праймеров (PCI-wbp229_F1+pCI-6H8_R8 и PCI-wbp229_F3+PCI-wbp229_R1).
[00236] После ПЦР амплифицированные фрагменты разделяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле и полосы, соответствующие ожидаемому размеру, выделяли и подвергали очистке.
[00237] Очищенные фрагменты VL/VH расщепляли NgoMIV и SnaBI и расщепленные фрагменты очищали с помощью набора для очистки ДНК, а затем лигировали с экспрессирующим вектором для млекопитающих pCI, который включал ген (константной области тяжелой цепи hIgG2 или константной области человеческой к цепи), который расщепляли теми же ферментами. Продуктами лигирования трансформировали клетки Е. coli ТОР10 (Invitrogen), и трансформированные клетки распределяли по поверхности чашек с LB агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Положительные клоны затем инокулировали в жидкую среду LB, содержащую 100 мкг/мл ампициллина, и после верификации клонов путем секвенирования выделяли из клонов плазмиды с использованием набора для выделения плазмид Midi-Prep (QIAGEN). Полученные плазмиды обозначали pCI-WBP229-201L и pCI-WBP229-201H, pCI-WBP229-202L и pCI-WBP229-202H, pCI-WBP229-203L и pCI-WBP229-203H, pCI-WBP229-204L и pCI-WBP229-204H, pCI-WBP229-205L и pCI-WBP229-205H, соответственно, каждая из них содержала ген полной легкой цепи или ген полной тяжелой цепи для продуцирования интактного гуманизированного антитела.
ПРИМЕР 8. Транзиторная трансфекция клеток и очистка антител
6
2
[00238] Клетки HEK293 (1,0×10 клеток/мл) совместно трансфицировали парой плазмид, содержащих один ген легкой цепи и один ген соответствующей тяжелой цепи (например, pCI-WBP229-201L/H~205L/H) при помощи реагента для трансфекции Freestyle Мах производства Invitrogen. Трансфицированные клетки инокулировали в шейкер-инкубаторе при 37°С и 5% CO при вращении со скоростью 120 об/мин. Через 7 дней после трансфекции собирали культуральную надосадочную жидкость путем центрифугирования и использовали колонки для аффинной хроматографии с белком А для выделения и очистки целевых антител из надосадочной жидкости. Отбирали три культуры, с наибольшей продукцией гуманизированного антитела, а именно:
[00239] 1) НР6Н8-1 (соответствует pCI-WBP229-205L/H) с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 3 и аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 16.
[00240] 2) НР6Н8-2 (соответствует pCI-WBP229-204L/H) с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 5 и аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 18.
[00241] 3) НР6Н8-3 (соответствует pCI-WBP229-203L/H) с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 7 и аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 20.
ПРИМЕР 9. Определение аффинности связывания гуманизированных антител против человеческого базигина
[00242] 200 нг рекомбинантного человеческого белка базигин наносили на планшет ELISA и оставляли в течение ночи при 4°С. Покрытый планшет блокировали 0,1% BSA при комнатной температуре в течение 1 часа. Готовили 5 растворов каждого из трех антител, полученных в Примере 8, а также родительского мышиного моноклонального антитела 6Н8 и химерного антитела с6Н8 с увеличением концентраций 10, 100, 1000, 10000 и 100000 нг/мл. 100 мкл каждого из растворов добавляли в отдельные лунки и оставляли планшет при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли 100 мкл разведенного 1:4000 вторичного антитела, представляющего собой антитело козы против константной области человеческой легкой цепи, конъюгированное с пероксидазой хрена (Millipore), и оставляли при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем планшеты трехкратно промывали 200 мкл 1х буфера PBS, в каждую лунку добавляли раствор субстрата ТМВ (50 мкл/лунку) и давали прореагировать в течение 10 мин, для остановки реакции добавляли останавливающий раствор (2 М HCl, 50 мкл/лунку). Измеряли поглощение при 450 нм с использованием считывающего устройства для планшетов ELISA.
[00243] Согласно результатам, три гуманизированных антитела и химерное антитело с6Н8 демонстрировали существенно более высокую аффинность к человеческому базигину по сравнению с родительским мышиным антителом 6Н8 (Фиг. 3).
[00244] Аффинность связывания трех гуманизированных антител, мышиного антитела 6Н8 и химерного антитела с6Н8 также определяли методом SPR (подробное описание этапов приведено в Примере 6), данные приведены в Таблице 2.
[00245]
[00246] Как показано на Фиг. 3 и в Таблице 2, аффинность связывания гуманизированных антител была выше по сравнению с родительским мышиным антителом 6Н8. Иммуногенность гуманизированных антител для человека ниже по сравнению с таковой родительского мышиного антитела 6Н8, и стабильность гуманизированных антител выше, чем у родительского мышиного антитела 6Н8.
ПРИМЕР 10. Конструирование высокоэффективного вектора, экспрессирующего антитело против базигина человека, и скрининг стабильно экспрессирующих клеточных линий
[00247] В соответствии с результатами, приведенными в Примере 9, для конструирования высокоэффективного вектора, экспрессирующего антитело против базигина человека, использовали последовательность гена НР6Н8-1.
[00248] 1. Конструирование вектора, экспрессирующего ген легкой цепи
[00249] Синтезировали последовательность гена, кодирующего VL область НР6Н8-1, и добавляли сайты распознавания рестрикционных ферментов XbaI и BsiWI на 5' и 3' конце последовательности, соответственно. Синтезированную молекулу и плазмиду pcDNA3.3-LC-104new-M с геном константной области легкой цепи разрезали рестрикционными ферментами XbaI и BsiWI. Разрезанные продукты разделяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле и выделяли полосы, соответствующие ожидаемому размеру, и очищали. Очищенные фрагменты (фрагмент 416 пн, происходящий из синтетической молекулы, и фрагмент 5712 пн, происходящий из плазмиды pcDNA3.3-LC-104new-M) лигировали при помощи лигазы Т4 и реакционную смесь инкубировали при 16°С в течение 20 мин. Для трансформации компетентных клеток Е. coli ТОР10 (Invitrogen) использовали 10 мкл из 20 мкл раствора для лигирования. После того, как трансформацию колоний подтверждали при помощи ПЦР, анализа ферментного расщепления и секвенирования, один моноклон, не имеющий ошибок, инокулировали в течение ночи в 200 мл среды LB при 37°С в шейкер-инкубаторе при 220 об/мин. Плазмиду выделяли и обозначали pcDNA3.3-LC-N-229-205 (показана на Фиг. 4).
[00250] 2. Конструирование вектора, экспрессирующего ген тяжелой цепи
[00251] Аналогично, синтезировали последовательность гена, кодирующего VH область НР6Н8-1, и добавляли сайты распознавания рестрикционных ферментов XbaI и NheI на 5' и 3' конце последовательности, соответственно. Синтезированную молекулу и плазмиду pOptivec-HC-208-M с геном константной области тяжелой цепи расщепляли рестрикционными ферментами XbaI и NheI. Расщепленные продукты разделяли при помощи электрофореза в 1% агарозном геле и выделяли полосы, соответствующие ожидаемому размеру, и очищали. Очищенные фрагменты (фрагмент 434 пн, происходящий из синтетической молекулы, и фрагмент 5364 пн, происходящий из плазмиды pOptivec-HC-208-M) лигировали при помощи лигазы Т4 и реакционную смесь инкубировали при 16°С в течение 20 мин. Для трансформации компетентных клеток Е. coli ТОР10 (Invitrogen) использовали 10 мкл из 20 мкл раствора после проведения лигазной реакции. После того, как трансформацию колоний подтверждали при помощи ПЦР, анализа ферментного расщепления и секвенирования, один моноклон, не имеющий ошибок, инокулировали в течение ночи в 200 мл среды LB при 37°С в шейкер-инкубаторе при 220 об/мин. Плазмиду выделяли и обозначали pOptivec-HC-D-229-205 (показана на Фиг. 5).
[00252] 3. Конструирование и скрининг клеточных линий СНО со стабильной экспрессией
[00253] Клетки CHO/DHFR трансфицировали при помощи реагента Freestyle Мах (Invitrogen) экспрессирующим вектором cDNA3.3-LC-N-229-205, кодирующим легкую цепь гуманизированного антитела, и экспрессирующим вектором pOptivec-HC-D-229-205, кодирующим тяжелую цепь гуманизированного антитела. Через 48 часов после трансфекции делали первый пассаж клеток и проводили скрининг с использованием среды Opti СНО с добавлением 500 мкг/мл G418 до восстановления жизнеспособности клеток выше 85%. Второй раунд скрининга проводили в среде для скрининга, содержащей 500 нМ МТХ. Отбирали одиночные клоны при помощи ClonePix FL. Через 7-10 дней культивирования моноклональной культуры уровень экспрессии НР6Н8-1 в культуральной надосадочной жидкости составлял 2,23±0,18 г/л при определении методом HTRF (показано на Фиг. 6).
ПРИМЕР 11. Определение специфичности гуманизированных антител против базигину
2
2
[00254] Для определения специфического связывания антитела НР6Н8-1 с опухолевыми тканями использовали иммуногистохимический метод и исследовали перекрестную реактивность антитела. Для блокирования и инактивации эндогенной пероксидазы использовали 3% НО, для блокирования использовали рабочий раствор нормальной овечьей сыворотки, в качестве первичного антитела использовали НР6Н8-1, в качестве вторичного антитела использовали меченное биотином антитело кролика к человеческому Fc, в качестве метки использовали раствор конъюгата стрептомицина и альбумина, меченного пероксидазой хрена, для развития окрашивания использовали DAB и для докрашивания использовали гематоксилин. После дегидратации образцов подготавливали предметные стекла с указанными образцами для микроскопического исследования.
[00255] Результаты показаны на Фиг. 7, специфическое окрашивание антителом НР6Н8-1 наблюдалось в тканях рака легкого, рака печени, рака толстой кишки и других злокачественных опухолей, но редко в нормальных тканях, различные степени окрашивания обозначали «++» или «+++».
[00256] Приведенные выше результаты показывают, что гуманизированное антитело, созданное согласно данному описанию путем пересадки CDR, способно специфически распознавать человеческий базигин.
Пример 12. Антималярийный тест in vitro с антителом НР6Н8-1
[00257] Эритроциты человека (О-тип) инфицировали штаммами Plasmodium falciparum Dd2, 3D7, FCC1 и Nf54, соответственно. Когда степень зараженности достигала ≥1%, а частота розеткообразования ≥80%, проводили антималярийный тест. Культуру разводили моноклональным антителом, чтобы исходный уровень паразитемии составлял 0,5%, добавляли свежие эритроциты, чтобы гематокрит исходно составлял 2%, добавляли моноклональное антитело НР6Н8-1 в концентрациях 100, 10, 1, 0,1, 0,01 мкг/мл, соответственно, каждую концентрацию исследовали в трипликатах. После культивирования в течение 72 ч при 37°С готовили тонкий мазок крови и исследовали при увеличении 100х в иммерсионный микроскоп для подсчета паразитарного индекса. Эксперимент повторяли независимо три раза, результаты усредняли и производили статистический анализ с использованием SPSS.
[00258] Результаты исследования фармакодинамики гуманизированного моноклонального антитела НР6Н8-1 in vitro на штаммах Plasmodium falciparum Dd2, 3D7, FCC1 и Nf54 приведены на Фиг. 8. Через 72 ч после введения антитела гуманизированное моноклональное антитело НР6Н8-1 демонстрировало выраженный противомалярийный эффект в отношении всех штаммов Plasmodium falciparum, при этом значения IC50 составляли 0,04, 0,02, 0,04 и 0,05 мг/мл, соответственно.
--->
SEQUENCE LISTING
<110>  Fourth Military Medical University
<120>  HUMANIZED ANTI-BASIGIN ANTIBODIES AND THE USE THEREOF
<130>  022079-8006WO01
<160>  57
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  116
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированной вариабельной
области тяжелой цепи гуманизированного антитела против базигина
или антигенсвязывающего фрагмента с вариациями
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (23)..(23)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (49)..(49)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (79)..(80)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (89)..(89)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (94)..(94)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<400>  1
Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Xaa Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Xaa Xaa
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Thr Glu Asp Thr Xaa Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>  2
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированной вариабельной
области легкой цепи гуманизированного антитела против базигина
или антигенсвязывающего фрагмента с вариациями
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9)..(10)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (21)..(22)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (42)..(43)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (60)..(60)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (65)..(65)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (80)..(81)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (83)..(83)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<400>  2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr
20                  25                  30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Xaa Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Xaa
65                  70                  75                  80
Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  3
<211>  116
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой
цепи (VH) гуманизированного антитела HP6H8-1
<400>  3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>  4
<211>  348
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области
тяжелой цепи (VH) гуманизированного антитела HP6H8-1
<400>  4
gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgaggctc       60
tcctgtgccg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggcttgagtg ggtttccgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca      180
cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc      240
ctgtacctgc agatgaactc cttaaagact gaagacactg ccgtgtatta ctgtaccagc      300
tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca                   348
<210>  5
<211>  116
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой
цепи (VH) гуманизированного антитела HP6H8-2
<400>  5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>  6
<211>  348
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области
тяжелой цепи (VH) гуманизированного антитела HP6H8-2
<400>  6
gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgaagctc       60
tcctgtgccg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggcttgagtg ggttgccgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca      180
cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc      240
ctgtacctgc aaatgaactc cttaaggact gaagacactg ccgtgtatta ctgtaccagc      300
tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca                   348
<210>  7
<211>  116
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой
цепи (VH) гуманизированного антитела HP6H8-3
<400>  7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>  8
<211>  348
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области
тяжелой цепи (VH) гуманизированного антитела HP6H8-3
<400>  8
gaagtgcagc ttgtggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc cctgaagctc       60
tcctgtgccg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccaggct      120
ccagggaagg ggcttgagtg ggttgccgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca      180
cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaaacacc      240
ctgtacctgc agatgaactc cttaaagact gaagacactg ccgtgtatta ctgtaccagc      300
tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca                   348
<210>  9
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  HCDR1
<222>  (1)..(10)
<400>  9
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Trp Met Asn
1               5                   10
<210>  10
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  HCDR2
<222>  (1)..(19)
<400>  10
Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210>  11
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  HCDR3
<222>  (1)..(5)
<400>  11
Tyr Asp Tyr Glu Tyr
1               5
<210>  12
<211>  25
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  VARIANT
<222>  (5)..(5)
<223>  X= any amino acid
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (23)..(23)
<223>  Xaa может быть любой природной аминокислотой
<400>  12
Glu Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Ala Ser
20                  25
<210>  13
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  Human heavy chain FR2
<222>  (1)..(14)
<400>  13
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Xaa
1               5                   10
<210>  14
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  Human heavy chain FR3
<222>  (1)..(32)
<400>  14
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Xaa Xaa Leu Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Met Asn Ser Leu Xaa Thr Glu Asp Thr Xaa Val Tyr Tyr Cys Thr Ser
20                  25                  30
<210>  15
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  Human heavy chain FR4
<222>  (1)..(11)
<400>  15
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1               5                   10
<210>  16
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой
цепи (VL) гуманизированного антитела HP6H8-1
<400>  16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr
20                  25                  30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  17
<211>  321
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой
цепи (VL) гуманизированного антитела HP6H8-1
<400>  17
gacattcaga tgacccaatc tccctccacc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc       60
ctctcctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca      120
ggcaaggccc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtcccctcc      180
cgcttcaccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc      240
gaggacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg      300
gggacaaagt tggaaataaa a                                                321
<210>  18
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой
цепи (VL) гуманизированного антитела HP6H8-2
<400>  18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr
20                  25                  30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Thr Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  19
<211>  321
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области легкой
цепи (VL) гуманизированного антитела HP6H8-2
<400>  19
gacattcaga tgacccaatc tcccgcctcc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc       60
atctcctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca      120
ggccagaccc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtcccctcc      180
cgcttctccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc      240
gacgacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg      300
gggacaaagt tggaaataaa a                                                321
<210>  20
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой
цепи (VL) гуманизированного антитела HP6H8-3
<400>  20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr
20                  25                  30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  21
<211>  321
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  Последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области
легкой цепи (VL) гуманизированного антитела HP6H8-3
<400>  21
gacattcaga tgacccaatc tccctcctcc ctgtccgcct cagtgggcga cagggtcacc       60
ctcacctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca      120
ggccaggccc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtcccctcc      180
cgcttcaccg gcagtggatc tggcacagat ttcactctga ccatcagcag tctgcagccc      240
gacgacttcg caacctatta ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg      300
gggacaaagt tggaaataaa a                                                321
<210>  22
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  LCDR1
<222>  (1)..(11)
<400>  22
Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser
1               5                   10
<210>  23
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  LCDR2
<222>  (1)..(7)
<400>  23
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1               5
<210>  24
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  LCDR3
<222>  (1)..(9)
<400>  24
Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1               5
<210>  25
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  Human light chain FR1
<222>  (1)..(23)
<400>  25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Ser Xaa Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Xaa Xaa Cys
20
<210>  26
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  Human light chain FR2
<222>  (1)..(15)
<400>  26
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Xaa Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210>  27
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  Human light chain FR3
<222>  (1)..(32)
<400>  27
Gly Val Pro Xaa Arg Phe Thr Gly Xaa Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Xaa Xaa Asp Xaa Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210>  28
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  Human light chain FR4
<222>  (1)..(10)
<400>  28
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  29
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  Amino acid sequence of the light chain variable region of 6H8
<222>  (1)..(107)
<400>  29
Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr
20                  25                  30
Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  30
<211>  321
<212>  DNA
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  Nucleic acid sequence of the light chain variable region of 6H8
<222>  (1)..(321)
<400>  30
aacattgtaa tgacccaatc tcccaaatcc atgtccatgt cagtgggcga gagggtcacc       60
ttgagctgca aggccagtga gaatgtgggt acttatgtat cctggtatca acagaaacca      120
gagcagtctc ctaaactgct gatatacggg gcatccaacc ggtacactgg ggtccccgat      180
cgcttcacag gcagtggatc tgcaacagat ttcactctga ccatcagcag tgtgcaggct      240
gaagaccttg cagattatca ctgtggacag agttacagct atccattcac gttcggctcg      300
gggacaaagt tggaaataaa a                                                321
<210>  31
<211>  116
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  Amino acid sequence of heavy chain variable region of 6H8
<222>  (1)..(116)
<400>  31
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65                  70                  75                  80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
115
<210>  32
<211>  348
<212>  DNA
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  Nucleic acid sequence of the heavy chain variable region of 6H8
<222>  (1)..(348)
<400>  32
gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc       60
tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt aacttctgga tgaactgggt ccgccagtct      120
ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgcaaca      180
cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt      240
gtctacctgc agatgaacaa cttaagaact gaagacactg gcatttatta ctgtaccagc      300
tatgattacg aatactgggg ccaagggact ctggtcaccg tctctgca                   348
<210>  33
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  pFL-6H8-F1
<400>  33
cccagccggc catggccgaa gtgaagcttg aggagtct                               38
<210>  34
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  линкер-R1
<400>  34
caaagttgga aataaaagcg gccgcagaac aaaa                                   34
<210>  35
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  линкер-F1
<400>  35
ttttgttctg cggccgcttt tatttccaac tttg                                   34
<210>  36
<211>  34
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  pFL-6H8-R2
<400>  36
ttttgttctg cggccgcttt tatttccaac tttg                                   34
<210>  37
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1-F1
<400>  37
cagccggcca tggccgaagt gcagcttgtg gagtctg                                37
<210>  38
<211>  53
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1-F2
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (34)..(35)
<223>  R = G или A, S = G или C
<400>  38
cgccaggctc cagggaaggg gcttgagtgg gttrscgaaa ttagattgaa atc              53
<210>  39
<211>  50
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1-F3
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (17)..(17)
<223>  R = G или A
<400>  39
cagatgaact ccttaargac tgaagacact gccgtgtatt actgtaccag                  50
<210>  40
<211>  48
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1-R1
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (21)..(21)
<223>  M = A или C
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (32)..(32)
<223>  Y = T или C
<400>  40
gaaagtgaat ccagaggcgg macaggagag cytcagggat cctccagg                    48
<210>  41
<211>  53
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_R2
<400>  41
ccctggagcc tggcggaccc agttcatcca gaagttactg aaagtgaatc cag              53
<210>  42
<211>  47
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1-R3
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (36)..(36)
<223>  R = G или A
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (39)..(39)
<223>  K = G или T
<400>  42
taaggagttc atctgcaggt acaggrtgkt tttggaatca tctcttg                     47
<210>  43
<211>  38
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1-R
<400>  43
gggagattgg gtcatctgaa tgtcgctagc accgccac                               38
<210>  44
<211>  49
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_R5
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (23)..(24)
<223>  R = G или A, S = G или C
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (33)..(33)
<223>  W = A или T
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (36)..(36)
<223>  V = G или C или A
<400>  44
ggtgaccctg tcgcccactg agrsggacag ggwggvggga gattgggtc                   49
<210>  45
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_F4
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19)..(19)
<223>  M = A или C
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (22)..(22)
<223>  W = A или T
<400>  45
gtgggcgaca gggtcaccmt cwcctgcaag gccagtgag                              39
<210>  46
<211>  53
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_F6
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (15)..(15)
<223>  Y = T или C
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (20)..(20)
<223>  S = G или C
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (24)..(24)
<223>  W = A или T
<400>  46
tcagcagtct gcagyccgas gacwtcgcaa cctattactg tggacagagt tac              53
<210>  47
<211>  50
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_F5
<400>  47
ccggcagtgg atctggcaca gatttcactc tgaccatcag cagtctgcag                  50
<210>  48
<211>  51
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_R6
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (33)..(33)
<223>  H = A или C или T
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (36)..(36)
<223>  K = G или T
<400>  48
gttggatgcc ccgtatatca gcagtttagg gghctkgcct ggtttctgtt g                51
<210>  49
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_R8
<400>  49
tttgttctgc ggccgctttt atttccaact ttgtccc                                37
<210>  50
<211>  54
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_R7
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (15)..(15)
<223>  W = A или T
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (24)..(24)
<223>  M = A или C
<400>  50
agatccactg ccggwgaagc gggmggggac cccagtgtac cggttggatg cccc             54
<210>  51
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PCI-wbp229_F1
<400>  51
gctccccggg gcgcgctgtg acattcagat gacccaatc                              39
<210>  52
<211>  42
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  pCI-6H8_R8
<400>  52
ggtgcagcca ccgtacgttt tatttccaac tttgtccccg ag                          42
<210>  53
<211>  41
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PCI-wbp229_F2
<400>  53
ctctccacag gtgtacactc cgaagtgcag cttctggagt c                           41
<210>  54
<211>  41
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  PCI-wbp229_F3
<400>  54
ctctccacag gtgtacactc cgaagtgcag cttgtggagt c                           41
<210>  55
<211>  53
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_R2
<400>  55
ccctggagcc tggcggaccc agttcatcca gaagttactg aaagtgaatc cag              53
<210>  56
<211>  49
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  6H8-L1_R5
<400>  56
ggtgaccctg tcgcccactg agrsggacag ggwggvggga gattgggtc                   49
<210>  57
<211>  39
<212>  DNA
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>   PCI-wbp229_R1
<400>  57
gggcccttgg tcgacgctgc agagacagtg accagagtc                              39
<---