БИОСЕНСОР С ПОВЫШЕННЫМ КОЭФФИЦИЕНТОМ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
BIOSENSOR WITH HIGH SENSITIVITY FACTOR

Область техники
Изобретение относится к электроаналитическим системам анализа и может быть использовано в медицинских диагностических центрах или машинах скорой помощи для определения концентрации глюкозы в разбавленной крови, а также сыворотке и плазме крови.
Уровень техники
Из уровня техники известны технические решения, обеспечивающие электрохимическое ферментативное определение глюкозы. В частности, первым подходом к такому анализу было решение [L.C.J. Clark, С. Lyons. Annals of the New York Academy of Sciences 102 (1962) 29], заключающееся в помещении фермента глюкозооксидазы, катализирующей окисление глюкозы кислородом, вблизи мембраны амперометрического кислородного платинового датчика, фиксирующего локальное уменьшение концентрации кислорода. Впоследствии была предложена модификация данного решения [S.J. Updike, G.P. Hicks. Nature 214 (1967) 986], заключающаяся в иммобилизации фермента на поверхности мембраны кислородного сенсора.
Однако такое решение имеет следующие недостатки:
i) в равновесии с воздухом концентрация кислорода в водных растворах довольно высока (0.2 мМ), что затрудняет анализ низких концентраций анализируемого вещества;
ii) в реальных объектах равновесная концентрация кислорода может изменяться; и
iii) образующийся в ходе ферментативной реакции пероксид водорода способен электрохимически восстанавливаться в тех же условиях, что приводит к ошибкам в анализе.
Также известно решение [G.G. Guilbault, G.J. Lubrano. Anal. Chim. Acta 64(3) (1973) 439], в котором для анализа глюкозы используют определение выделяющегося в процессе ферментативного окисления глюкозы пероксида водорода.
Данный способ также имеет ряд недостатков. Использование реакции окисления пероксида водорода при 0.6 В приводит к появлению систематической погрешности при анализе крови за счет присутствия ряда восстановителей (урат, аскорбат, парацетамол и другие), также окисляющихся при этом потенциале. Кроме того, используется неоптимальный способ иммобилизации фермента - ковалентное связывание с поверхностью электрода - что может приводить к частичной потере активности фермента из-за нарушения его структуры.
Известно также решение [Карякин А.А., Карякина Е.Е., Мокрушина А.В., Андреев Е.А. СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ МИКРОБИОСЕНСОРА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ ИЛИ ЛАКТАТА, RU 2580288], направленное на создание микробиосенсора с использованием двухэлектродной микросистемы, берлинской лазури (БЛ) и иммобилизованных ферментов глюкозооксидазы и лактатоксидазы.
Однако, в данном источнике информации для иммобилизации глюкозооксидазы используется нафион, а γ-аминопропилтриэтоксисилан используется только для иммобилизации лактатаоксидазы. В то же время, несмотря на похожее название и принадлежность к классу оксидоредуктаз, глюкозооксидаза и лактатоксидаза являются принципиально разными ферментами по структуре белковой последовательности (от первичной до четвертичной), структуре активного центра и размеру (лактатоксидаза (ЛОД) в несколько раз больше глюкозооксидазы (ГОД)), кроме того, каждый фермент требует отдельного подбора матрицы для иммобилизации и условий иммобилизации.
-9
-12
Например, иммобилизация лактатоксидазы в матрицу нафиона не приводит к получению сколько-либо чувствительных биосенсоров. Кроме того, субстраты этих ферментов относятся к разным классам соединений - глюкоза (для глюкозооксидазы) - сахара и лактат (для лактатоксидазы) - гидроксикислоты. Двухэлектродные микросенсоры, упомянутые в источнике, могут быть использованы для имплантации и определения глюкозы или лактата непосредственно в крови, но не в лабораторных проточно-инжекционных установках для анализа большого количества образцов разбавленной крови, в которых легко применимы заявляемые биосенсоры. Кроме того, массовое производство микробиосенсоров затруднительно, а их использование требует специальных, более чувствительных приборов для измерения малых токов и специальной изоляции от внешних электромагнитных шумов, так как, в связи с малой площадью электродов (<2 мм вся система, включая внешнюю изоляцию) требуется измерение очень малых (10 - 10 А) токов.
2
Наиболее близким к заявляемому является решение, представленное в статье [А. Karyakin, Е.A. Kotel'nikova et. al. Anal. Chem. 74 (2002) 1597], позволяющее с высокой чувствительностью и точностью определять концентрацию глюкозы в различных объектах. Для создания биосенсоров на глюкозу используются стеклоуглеродные электроды, модифицированные электрохимическим способом пленкой берлинской лазури (БЛ), поверх которой нанесена ферментсодержащая мембрана на основе нафиона. Проточно-инжекционная система на основе биосенсора обладает следующими характеристиками: коэффициент чувствительности 50 мА/Мсм, нижний предел определяемых концентраций 0.1 мкМ. Система позволяет проводить определение глюкозы в разбавленной крови с минимальной пробоподготовкой. Однако использование стеклоуглеродных электродов не подходит для промышленного производства биосенсоров в связи с большими затратами на производство электрода и высокой стоимостью материалов. Кроме того, каждый электрод производится мастером индивидуально, что непригодно для создания сменных блоков для прибора - анализатора глюкозы, в качестве которых в основном используются биосенсоры. Электрохимический способ синтеза БЛ также неудобен для массового производства биосенсоров по причине высоких затрат времени на производство и невозможности автоматизации этого процесса, т.к. каждый сенсор производится индивидуально, в несколько этапов, включая использование прибора, что исключает параллельное производство нескольких сенсоров.
Раскрытие изобретения
Технической проблемой заявленного изобретения является необходимость создания экспрессного, точного, высокочувствительного и селективного биосенсора, обеспечивающего возможность проведения анализа крови (определения концентрации глюкозы) в лабораторных условиях.
Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, заключается в повышении чувствительности заявляемого биосенсора.
К преимуществом заявляемого биосенсора также можно отнести обеспечение возможности мелкосерийного производства биосенсоров на глюкозу за счет использования технологии печати электродов на листе полиэтилентерефталата (около 350-400 электродов на одну партию, цикл производства 6 часов) и технологии химического осаждения БЛ (до 60 сенсоров за одну партию, цикл производства 2,5 ч.).
Технический результат достигается за счет использования геля полиалкоксисилана в качестве мембранообразующего компонента, что обеспечивает улучшение аналитических характеристик биосенсора. Технический результат также достигается за счет увеличения содержания фермента в ферментсодержащей мембране, которое стало возможным вследствие замены мембранообразующего компонента на гель полиалкоксисилана.
об.
об.
Поставленная задача решается тем, что планарный биосенсор для определения глюкозы в жидкой пробе, включает размещенные на подложке хлоридсеребряный электрод сравнения, рабочий и вспомогательный электроды, при этом на рабочий электрод нанесена пленка берлинской лазури и мембрана, выполненная из полиалкоксисилана, включающая в качестве фермента глюкозооксидазу, иммобилизованную внутри слоя мембраны, при этом электрод сравнения расположен на расстоянии 3-5 мм от рабочего электрода с обеспечением возможности задания постоянного нулевого потенциала на рабочем электроде. Площадь вспомогательного электрода заявляемого биосенсора больше площади рабочего электрода, при этом все электроды биосенсора выполнены с возможностью подключения к потенциостату. Мембрана, содержащая фермент, может быть получена методом гидролиза с последующей поликонденсацией из мономера, выбранного из метилтриметоксисилана, винилтриметоксисилана, γ-меркаптопропилметилтриметоксисилана, фенилтриметоксисилана, бензилтриэтоксисилана, толилтриэтоксисилана, γ-глицидилоксипропилтриэтоксисилана, γ-аминопропилтриэтоксисилана. Мембрана также может быть получена посредством включения фермента в гель полиалкоксисилана непосредственно при его образовании из мономера. Такая мембрана содержит - 2-12 мкг глюкозооксидазы и получена из 0,5-2,5 % раствора γ-аминопропилтриэтоксисилана в изопропиловом спирте с содержанием воды 15 %. Рабочий электрод может быть выполнен радиусом 0,8-1 мм и расположен на расстоянии от электрода сравнения не более 5 мм. Биосенсор может быть изготовлен методом трафаретной печати и может иметь толщину 0,22-0,35 мм.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется чертежами, где
на фиг. 1 представлена схема планарного электрода - основы для изготовления биосенсора на глюкозу,
на фиг. 2 представлена схема действия сенсорного материала,
об.
на фиг. 3 - представлена диаграмма чувствительности определения глюкозы для рабочего электрода с пленкой, содержащей ГОД, и различными мембранообразующими компонентами (концентрация 0,5 % в мембранообразующей смеси),
на фиг. 4 - представлена диаграмма чувствительности определения глюкозы для рабочего электрода с пленкой, содержащей ГОД, и различными концентрациями γ-аминопропилтриэтоксисилана и ГОД в мембранообразующей смеси (3D),
на фиг. 5 - представлена диаграмма чувствительности определения глюкозы для рабочего электрода с пленкой, содержащей ГОД, и различными концентрациями γ-аминопропилтриэтоксисилана и ГОД в мембранообразующей смеси (2D),
на фиг. 6 - представлен пример градуировочной зависимости для заявляемого биосенсора,
и на фиг. 7 - представлен график проверки правильности показаний биосенсора путем сравнения с аккредитованным прибором (анализатор глюкозы Eco-Basic).
Позициями на фигурах обозначены:
1 - подложка,
2 - вспомогательный электрод,
3 - рабочий электрод,
4 - электрод сравнения,
5 - фотоотверждаемый изолятор, разделяющий электроды,
6 - контакты,
7 - мембрана на основе геля полиалкоксисилана, содержащая фермент ГОД,
8 - пленка берлинской лазури (БЛ),
9 - поверхность рабочего электрода,
10 - Метилтриметоксисилан,
11 - Винилтриметоксисилан,
12 - Фенилтриметоксисилан,
13 - (γ-меркаптопропил) триметоксисилан,
14 - Бензилтриэтоксисилан,
15 - Толилтриэтоксисилан,
16 - (γ-аминопропил) триэтоксисилан,
17 - (γ-глицидилоксипропил) триэтоксисилан
18 - нафион.
Осуществление изобретения
Заявляемый биосенсор включает электрод сравнения, вспомогательный электрод и рабочий электрод, модифицированный сенсорным покрытием, позволяющим селективно определять целевой аналит - глюкозу (схема трехэлектродной печатной структуры, на основе которой создан биосенсор, изображена на фиг. 1). Сенсорное покрытие включает пленку электрокатализатора восстановления пероксида водорода (БЛ) и биораспознающий элемент (мембрану геля полиалкоксисиланов, содержащую фермент - ГОД) (схема сенсорного покрытия и принцип его действия изображены на фиг. 2).
об.
об.
об.
На рабочий электрод последовательно нанесены пленка БЛ и мембрана на основе геля полиалкоксисилана, содержащая фермент - ГОД для получения сенсорного покрытия для определения глюкозы. Сплошная однородная пленка БЛ толщиной 60-80 нм нанесена по методике [Borisova A.V., Karyakina Е.Е., Cosnier S., Karyakin A.A. // Electroanalysis. 2009. Vol. 21 P. 409]. Мембрана, содержащая фермент - ГОД, получена из мембранообразующей смеси с концентрацией γ-аминопропилтриэтоксисилана 0,5-2,5 % (фиг. 5, 6), или ряда других алкоксисиланов (метилтриметоксисилана, винилтриметоксисилана, γ-меркаптопропилметилтриметоксисилана, фенилтриметоксисилана, бензилтриэтоксисилана, толилтриэтоксисилана, γ-глицидилоксипропилтриэтоксисилана) с концентрацией 0,5 % (фиг. 3) ГОД - 1-6 мг/мл и воды - 15 % в изопропиловом спирте (фиг. 5, 6), по методике, которая заключается в смешивании раствора мономера алкоксисилана в изопропиловом спирте и водного раствора фермента с последующим нанесением на поверхность электрода и высушиванием при температуре 4°С в течение 12 ч. При этом происходит катализируемая ферментом реакция гидролиза и поликонденсации мономера алкоксисилана и образуется гель полиалкоксисилана с включенными внутрь него молекулами фермента, удерживаемыми в пленке. Эффект повышения чувствительности биосенсора при использовании геля полиалкоксисилана может достигаться за счет создания более благоприятной среды для фермента в такой матрице, благодаря чему он демонстрирует большую активность.
Электрод сравнения расположен на расстоянии не более 5 мм от рабочего электрода с обеспечением возможности задания постоянного нулевого потенциала на рабочем электроде.
Вспомогательный электрод имеет площадь, превышающую площадь рабочего электрода, для уменьшения влияния процессов, протекающих на вспомогательном электроде, на измеряемый сигнал.
Все электроды выполнены с возможностью подключения к потенциостату.
Толщина биосенсора составляет 0,22-0,35 мм. Такая толщина обеспечивает достаточную механическую прочность полученных сенсоров, не приводя к их излишней громоздкости; при этом материал подложки не является хрупким и его невозможно расколоть (в отличие от используемой в некоторых аналогах керамики).
об.
об.
Для определения глюкозы используется биосенсор на основе трехэлектродной печатной системы (ТПС) (фиг. 1). ТПС изготавливается методом трафаретной печати на пластиковой подложке из полиэтилентерефталата (ПЭТФ). Изготовление печатной системы включает несколько этапов: на пластиковую подложку наносят слой серебросодержащей пасты, служащей в качестве токопроводящих контактов, а также материала электрода сравнения; далее наносят слой углеродной пасты, служащей материалом вспомогательного и рабочего электродов, затем наносят слой фотоотверждаемого изолятора, отделяющего рабочий электрод от электрода сравнения и вспомогательного электрода и закрывающего токопроводящие контакты от соприкосновения с раствором в ячейке. Способ изготовления сенсорного покрытия биосенсора включает химическую модификацию поверхности рабочего электрода пленкой БЛ с последующей иммобилизацией фермента ГОД в мембрану на поверхности модифицированного электрода. Мембрана состоит из геля полиалкоксисилана с включенным в него ферментом - ГОД. Принцип действия сенсорного покрытия основан на селективном электрокаталитическом восстановлении пероксида водорода, выделяющегося в процессе катализируемой ферментом реакции, на поверхности электрода с нанесенной пленкой БЛ (фиг. 2). Мембрана, содержащая фермент - ГОД, получена путем нанесения капли мембранообразующей смеси, содержащей алкоксисилан с концентрацией 0,5-2,5 %, ГОД - 1-6 мг/мл и воду - 15 % в изопропиловом спирте (фиг. 4), на поверхность рабочего электрода с последующим высушиванием при температуре 4°С в течение 1 часа.
Аналитический сигнал биосенсора регистрируется методом амперометрии при приложении потенциала 0 В (относительно хлорид-серебряного электрода сравнения, в дальнейшем - ХСЭ) по увеличению тока в присутствии аналита - глюкозы.
Определение концентраций глюкозы заявляемым биосенсором осуществляется следующим образом:
2
4
2
4
• На первом этапе через электроаналитическую систему, включающую заявляемый биосенсор, пропускают фоновый буферный раствор (50 мМ КНРО/КНРО, 0,1 М KCl, рН 6.0), одновременно измеряя ток на рабочем электроде при потенциале 0 мВ относительно внутреннего хлорид-серебряного электрода сравнения. Данный этап заканчивается установлением постоянного фонового тока на рабочем электроде.
• На втором этапе в петлю инжектора (в закрытом положении) вводят анализируемый раствор (объем петли инжектора 50 мкл, объем образца - 300 мкл, избыток образца выливается через слив петли). После этого инжектор устанавливают в открытое положение и часть введенного образца из петли (50 мкл) по системе шлангов поступает в проточно-инжекционную ячейку. При этом потенциостат измеряет изменение катодного тока на рабочем электроде, выражающееся в появлении пиков на экспериментальной кривой зависимости тока от времени. Высота пиков пропорциональна концентрации аналита в исследуемом растворе. После измерения образец вымывается из ячейки фоновым буферным раствором через слив ячейки.
• Этапы 1 и 2 повторяют для ряда модельных растворов с концентрациями аналитов 1 мкМ - 1 мМ. Каждую концентрацию необходимо определить, по меньшей мере, три раза. По результатам измерений строится градуировочная зависимость. Далее в качестве анализируемого раствора используют образцы крови (разбавленные фоновым буферным раствором в 100 раз). Концентрацию глюкозы в образцах крови находят по построенной ранее градуировочной зависимости.
-1
-2
Сенсорные материалы и биосенсор на их основе позволяют селективно различать сигнал, обусловленный присутствием глюкозы в образце крови на фоне всех прочих компонентов образца. Коэффициент чувствительности биосенсора составляет более 200 мА⋅М⋅см (фиг. 6) при определении глюкозы; диапазон определяемых содержаний (ДОС) - от 5 до 1000 мкМ. Биосенсор обладает высокой воспроизводимостью (систематическая погрешность не превышает 3%), операционной стабильностью (свыше 50 измерений без необходимости перекалибровки при определении концентрации глюкозы). ДОС биосенсора полностью перекрывает диапазон физиологических концентраций глюкозы в крови как в норме, так и в патологии. Объем пробы крови, необходимый для измерений, составляет всего 10 мкл, что в 2 раза меньше, чем для аналогов. Время анализа для биосенсора не превышает одной минуты.
об.
об.
-2
-1
-2
-1
-2
Пример 1. Создание ферментсодержащих мембран на основе различных полиалкоксисиланов проводили путем смешения раствора полиалкоксисилана в изопропиловом спирте (0,5 % в конечной смеси) и водного раствора ГОД (1,5 мг/мл в конечной смеси), содержание воды в конечной смеси составляло 15 %, так как такое содержание воды в водно-органических смесях обеспечивает наилучшее сохранение активности ГОД. О качестве полученных мембран судили по величине коэффициента чувствительности биосенсоров на основе таких мембран, измеренного как тангенс угла наклона зависимости отклика биосенсора (в мА⋅см) от концентрации модельного раствора глюкозы, на которую получен данный отклик (в М). Данные эксперимента для биосенсоров с мембранами на основе полиметилтриметоксисилана, поливинилтриметоксисилана, поли-γ-меркаптопропилметилтриметоксисилана, поли-γ-глицидилоксипропилтриэтоксисилана, полифенилтриметоксисилана, полибензилтриэтоксисилана, и политолилтриэтоксисилана представлены на фиг. 3, для сравнения приведены данные, полученные для биосенсора с мембраной на основе нафион (прототип) в аналогичных условиях. Наилучшей чувствительностью обладали биосенсоры с мембраной на основе поли-γ-аминопропилтриэтоксисилана, для которого был проведен дополнительный подбор содержания различных компонентов мембраны (фиг. 4, 5) и показана возможность дальнейшего увеличения чувствительности при увеличении количества ГОД в мембране, возможное за счет большей емкости мембраны на основе полиалкоксисилана по сравнению с нафионом (для которого увеличение количества фермента в мембране невозможно). Пример зависимости отклика биосенсора с мембраной на основе поли-γ-аминопропилтриэтоксисилана от концентрации модельных растворов глюкозы (градуировочного графика) приведен на фиг. 6. Чувствительность такого биосенсора превышает 200 мА⋅М⋅см, что значительно выше прототипа (40-50 мА⋅М⋅см).
Пример 2. Проведена проверка правильности работы биосенсора на основе мембраны, содержавшей 1,5 об.% γ-аминопропилтриэтоксисилана и 4 мг/мл ГОД в мембранообразующей смеси, путем анализа стандартизованных образцов сыворотки крови с известной концентрацией глюкозы с нормальным (Spintpol Н Normal) и патологическим (Spintrol Н Pathologic) содержанием, произведенными компанией Spinreact (Испания).
После измерения серии откликов на образцы проводили измерение отклика на модельные растворы аналита, при этом изменения откликов на модельные растворы после измерения образцов замечено не было. Данные по определенным концентрациям глюкозы и лактата представлены в табл. 1. Они не отличались от данных, представленных в паспорте образцов. Таким образом, разработанный биосенсор может быть использован для анализа образцов разбавленной крови.
Данные, полученные при использовании заявляемого биосенсора (представленные во втором столбце), совпадают как с данными, полученными при помощи анализатора глюкозы Eco-Basic (Care Diagnostica, Германия), широко используемом в клинических лабораториях для анализа крови (представленных во втором столбце), так и с данными по содержанию определяемого компонента, приведенными в паспорте стандартных образцов.
Пример 3. При помощи биосенсора определена концентрация глюкозы в разбавленных образцах крови доноров (фиг. 7). Процедура пробоподготовки сводилась к разбавлению образцов крови в 100 раз фоновым буферным раствором.
Полученные результаты хорошо согласуются с результатами, полученными методом сравнения (анализатор глюкозы Eco-Basic), коэффициент корреляции Пирсона составил 0,95.
Таким образом, заявленный технический результат изобретения, заключающийся в обеспечении повышения чувствительности биосенсора достигается (в частности, коэффициент чувствительности увеличен относительно прототипа в 4,5 раза), а также, как следствие, достигается повышение точности анализа крови с использованием заявляемого биосенсора в составе электроаналитической системы, за счет исключения систематической погрешности, которая, как правило, присутствует при измерении известными анализаторами. Кроме того, становится возможным использование мелкосерийного производства биосенсоров на глюкозу.