METHOD TO DETERMINE FOOD VALUE OF WORM-INFESTED FISHES
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ ЦЕННОСТИ РЫБ, ЗАРАЖЕННЫХ ГЕЛЬМИНТАМИ

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к ветеринарно-санитарной экспертизе.
Известно определение белка в сыворотке крови методом электрофореза [см. Лабораторные исследования в ветеринарии под ред. В.Я.Антонова и П.Н.Блинова. М.: «Колос», 1971. С.423-427], где путем электрофореза осуществляют разделение белка на четыре группы: альбумины, альфа-, бета- и гамма-глобулины. При pH 8,6 белки в электрическом поле движутся к аноду, т.к. они в этих условиях заряжены отрицательно. Наиболее быстро движутся альбумины, затем альфа-глобулины, бета-глобулины и наконец гамма-глобулины. Используют прибор для электрофореза на бумаге; фотоэлектроколориметр для определения количества элюированного из электрофореграмм красителя, денситометр, хроматографическую фильтровальную бумагу. Электрофорез проводят на полосках бумаги, затем проводят колориметрическое определение соотношения отдельных фракций белка путем извлечения краски из бумаги. После окраски на электрофореграмме выявляются четыре пятна, соответствующие альбумину, альфа-, бета- и гамма-глобулинам.
При электрофорезе на бумаге определяется лишь соотношение между отдельными фракциями сывороточных белков. Поэтому необходимо определить общее количество белка и вычислить абсолютное количество отдельных белковых фракций.
Наиболее близким по технической сущности является способ анализа аминов в рыбе посредством системы капиллярного электрофореза «Капель» (см. Практическое руководство по использованию систем капиллярного электрофореза «Капель», Н.В.Комарова, Я.С.Каменцев. С-П, 2008 г., с.102), включающий дериватизацию биопробы, воздействие на нее капиллярным зонным электрофорезом с использованием рабочего буфера, обнаружение аминокислот и их качественный и количественный анализ.
Недостатками известных методов являются ограниченные возможности, сложность исследования, длительный процесс определения, отсутствие возможности и количественного состава связанных аминокислот в вытяжке мышц различных видов рыб в зависимости от степени инвазии личинками Anisakis simplex.
Техническим решением задачи является расширение функциональных и технологических возможностей с использованием капиллярного электрофореза прибора «Капель-103Р», сокращение сроков выполнения и повышение точности определения связанных аминокислот при установлении качества и безопасности рыбной продукции, инвазированной личинками Anisakis simplex.
3
3
3
3
3
Поставленная задача достигается тем, что в способе определения питательной ценности рыб, зараженных гельминтами, включающем дериватизацию биопробы, воздействие на нее капиллярным зонным электрофорезом с использованием рабочего буфера, обнаружение аминокислот и их качественный и количественный анализ, согласно изобретению в качестве биопробы используют водную вытяжку мышечной ткани рыб, зараженных анизакидозом, предварительно проводят гидролиз биопробы, для этого берут навеску 0,1-0,2 г мышечной ткани рыб и заливают до 10 см 20%-ной соляной кислотой в сосуды для гидролиза, затем их закрывают пробками и помещают в термостат на 14 ч при температуре не более 105°C, далее охлаждают, отбирают пипеткой в микрососуд не более 0,05 см гидролизата и высушивают досуха, добавляют до 0,1 см 0,1 M раствора карбоната натрия, перемешивают, затем добавляют не более 0,3 см раствора фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте и оставляют для прохождения реакции на 40 минут, после высушивания содержимого в естественных условиях в него добавляют не более 0,5 см дистиллированной воды, перемешивают, переносят в пробирку Эппендорфа и центрифугируют для удаления газов и взвесей, затем полученные данные в результате качественного и количественного анализов сравнивают с контрольным результатом концентрации связанных аминокислот клинически здоровых рыб и определяют качество рыбы, если концентрация связанных аминокислот у зараженных рыб по сравнению с контролем уменьшается, то рыбу относят к недоброкачественной.
Новизна заявленного предложения обусловлена тем, что экспресс-анализом установлены параметры изменения концентрации связанных аминокислот мышечной ткани рыб в зависимости от степени инвазии спиралевидными личинками вида Anisakis, рода Anisakis simplex, кроме того, установлен порядок и время выхода связанных аминокислот в вытяжке мышечной ткани рыб.
Преимущество данного метода состоит в следующем: высокая эффективность разделения компонентов, недоступная при других методах исследованиях; низкий расход реактивов и растворителей; простота аппаратуры; высокая скорость анализа и высокая воспроизводимость условий реакции; хорошая растворимость производных в водной среде; коммерческая доступность; широкие возможности капиллярного электрофореза при анализе связанных аминокислот. Кроме того, заявляемое предложение является более экономичным, т.к. не требует применения дорогостоящих химических реактивов.
Сущность изобретения поясняется чертежом, где представлен график концентрации связанных аминокислот в вытяжке мышечной ткани на примере хамсы.
Пример конкретного осуществления способа определения питательной ценности рыб, зараженных гельминтами.
Предварительно проводят паразитологические исследования рыб, при которых были выявлены спиралевидные личинки вида Anisakis, рода Anisakis simplex у рыб: из семейства тресковые - путассу северная (Micromesistius poutassou) и минтая (Theragra); из семейства сельдевые - сельди атлантической (Clupca barengus), из семейства анчоусовые (Engraulidae), отряда сельдеобразные - хамсы черноморской (Engraulis encrasicholus ponticus); семейства корюшковые (Osmeridae) - мойвы (Mallotus villosus). Затем в зависимости от степени инвазии личинками Anisakis пробы рыб разделяют на группы. Пробы путассу разделяют на четыре группы: первая - при инвазии от одной до двух личинок Anisakis., вторая - от 9 до 13, третья - от 20 до 36, четвертая - от 44 до 63. Пробы минтая - на две группы: первая - при обнаружении личинок Anisakis от одной до двух, вторая - от 7 до 8. Пробы сельди - на три группы: первая - при обнаружении личинок Anisakis от 10 до 14, вторая - от 15 до 20 и третья - от 31 до 42. Пробы хамсы - на четыре группы: первая - неинвазированная, вторая - инвазированная от 1 до 4 личинок Anisakis, третья - от 15 до 20 и четвертая - от 21 до 27. Пробы мойвы - на две группы: первая - не инвазированная личинками Anisakis, вторая - от 4 до 8.
3
3
3
3
3
3
3
Концентрацию связанных аминокислот определяют в вытяжке мышечной ткани выше указанных рыб неинвазированных и инвазированных личинками вида Anisakis, рода Anisakis simplex. С этой целью у отобранных средних проб мышечной ткани предварительно подвергают гидролизу. Для этого берут навеску 0,1-0,2 г мышечной ткани рыб и заливают 10 см 20%-ной соляной кислоты в специальных сосудах для гидролиза. Сосуды закрывают пробками и помещают в термостат на 14 ч при температуре 105°C. Затем охлаждают, отбирают пипеткой в микрососуд (стаканчик или бюкс) 0,05 см гидролизата и высушивают досуха. После добавляют 0,1 см 0,1 M раствора карбоната натрия, перемешивают, затем добавляют 0,3 см раствора фенилизотиоцианата (ФИТЦ) в изопропиловом спирте (0,2 см ФИТЦ в 12 см изопропилового спирта) и оставляют для прохождения реакции на 40 минут. После высыхания содержимого в естественных условиях добавляют 0,5 см дистиллированную воду, перемешивают, переносят в пробирку Эппендорфа и центрифугируют для удаления газов и взвесей. Для анализа используют прибор капиллярного электрофореза «Капель-103 Р», который оборудован ультрафиолетовым детектором, с длиной волны детектора 254 нм (см. чертеж).
-6
3
Условия анализа: кварцевый капилляр, длиной 0,5 м до детектора, внутренним диаметром 75×10 м; регулируемый источник высокого напряжения положительной полярности 3-25 кВ; гидростатический ввод пробы под давлением 30 мБар в течение 5 сек; буферный рабочий раствор на основе β-циклодекстрина (54 мг в 12,5 см буферного раствора дигидрофосфата и гидрофосфата натрия); напряжение «плюс 10 кВ»; время анализа проходит в течение 40 мин; принудительное воздушное охлаждение капилляра до комнатной температуры; вывод и обработка результатов на компьютере. Метод капиллярного электрофореза для определения массовой концентрации аминокислот основан на разделении анионных форм N-фенилтиокарбамилпроизводных аминокислот под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности. Для идентификации и количественного определения анализируемых компонентов регистрируют ультрафиолетовое поглощение при длине волны 254 нм.
Альфа-аминокислоты при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде дают N-фенилтиокарбамильные (ФТК) производные, которые представляют собой кислоты, в щелочных условиях существующие в форме анионов. Благодаря наличию в структуре полученных соединений бензольного кольца, фенилкарбамильные производные имеют полосу поглощения при 254 нм. Содержание связанных аминокислот определяют через его производные с фенилизотиоцианатом методом капиллярного электрофореза.
В процессе проведения анализа установлен порядок и время выхода связанных аминокислот в вытяжке проб рыб (табл.1).
Таблица 1
Порядок и время выхода связанных аминокислот в вытяжке проб рыб
№
Компонент
Время выхода, мин
№
Компонент
Время выхода, мин
1
2
3
4
5
6
1
Аргинин
15,53
8
Валин
28,38
2
Лизин
21,37
9
Пролин
29,13
3
Тирозин
22,00
10
Треонин
30,19
4
β-фенилаланин
23,28
11
Триптофан
30,71
5
Гистидин
23,49
12
Серии
32,03
6
Лейцин
27,00
13
α-аланин
32,26
7
Метионин
28,00
14
Глицин
35,31
В результате проведения эксперимента установлены следующие отличительные критерии концентрации связанных аминокислот в мышечной ткани рыб в зависимости от степени инвазии их личинками вида Anisakis, рода Anisakis simplex. Общая концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц путассу, пораженной от одной до двух личинок, составила 143332,32 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 9 до 13 личинок Anisakis - 117059,46 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 20 до 36 - 98655,25 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 44 до 63 - 83363,16 мг/кг фарша рыбы (табл.2).
Таблица 2
Концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц путассу (M±m; n=10)
Связанные аминокислоты, мг/кг фарша рыбы
Количество личинок Anisakis на висцеро путассу
1-2
9-13
20-36
44-63
Аргинин
6929,11±122,19
6272,34±86,45***
5334,22±96,11***
4471,07±114,29***
Лизин
326,01±3,13
264,89±2,88***
240,66±2,81***
217,88±1,01***
Тирозин
56465,39±1053,05
44808,64±1254,56***
35817,88±1192,96***
29602,44±713,63***
β-фенилаланин
171,18±1,61
154,01±1,60***
130,85±1,10
111,37±2,07***
Гистидин
5384,37±86,68
5685,16±110,64*
4432,04±136,88***
3296,78±98,66***
Лейцин
11009,17±193,01
9189,60±118,81***
7699,76±126,38***
6855,51±180,65***
Метионин
11576,88±266,24
9878,88±172,74***
8355,79±231,71***
6479,28±92,79***
Валин
4702,09±92,60
3670,68±106,77***
3331,93±115,76***
3760,93±75,16***
Пролин
4982,38±88,07
4067,99±69,49***
3464,57±95,41***
2951,27±57,30***
Треонин
14178,04±141,13
12086,00±236,66***
8780,16±115,58***
7490,64±92,28***
Триптофан
221,17±1,34
189,21±4,44***
180,22±1,34***
110,91±1,66***
Серии
3435,89±82,36
2358,72±61,71***
1710,41±22,53***
1400,67±23,01***
α-аланин
18217,92±166,08
15155,83+237,69***
16040,46±115,17***
13302,55±280,80***
Глицин
5732,06±83,73
3277,51±85,40***
3136,30±68,77***
3311,86±92,31***
*P<0,05;*** P>0,001
Среди всех связанных аминокислот в экстракте мышц путассу максимальная процентная концентрация приходилась на тирозин (39-43%), α-аланин (10-12%), треонин (9-11%), гистидин (4-5%), и, напротив, минимальная - на лизин (0,20-0,30%), триптофан (015,-0,20%).
Таблица 3
Концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц минтая (M±m; n=10)
Связанные аминокислоты, мг/кг фарша рыбы
Количество личинок Anisakis висцеро минтая
1-2
7-8
Аргинин
7527,86±92,42
6558,58±112,31***
Лизин
334,60±1,47
277,27±1,74***
Тирозин
66746,94±1298,05
39857,92±1004,76***
β-фенилаланин
2573,52±69,12
1820,23±28,76***
Гистидин
8022,69±196,54
6464,98±243,66***
Лейцин
12158,98±115,03
10292,96±155,47***
Метионин
13931,84±309,86
11013,63±156,98***
Валин
6074,15±236,78
4482,47±140,58***
Пролин
7089,47±267,35
5194,37±90,36***
Треонин
17547,65±193,97
14281,48±267,81***
Триптофан
445,82±8,06
280,11±4,87***
Серии
4606,82±112,62
3331,17±118,67***
α-аланин
22248,38±456,89
18236,08±185,04***
Глицин
9039,85±172,49
7157,06±120,95***
***P>0,001
Общая концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц минтая, пораженного от одной до двух личинок, составила 178348,57 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 7 до 8 личинок Anisakis - 129248,31 мг/кг фарша рыбы (табл.3).
Среди всех связанных аминокислот в экстракте мышц минтая, пораженного от одной до двух личинок, максимальная процентная концентрация приходилась на тирозин (30-37%), α-аланин (12-14%), треонин (9-11%), метионин (7-8%), лейцин (6-8%), гистидин (4-5%), и, напротив, минимальная - на триптофан (0,22-0,25%), лизин (0,19-0,21%).
Общая концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц сельди, пораженной от 10 до 14 личинок, составила 152103,64 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 15 до 20 личинок Anisakis - 93538,3 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 31 до 42 - 99027,89 мг/кг фарша рыбы (табл.4).
Таблица 4
Концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц сел (M±m; n=10)
Связанные аминокислоты, мг/кг фарша рыбы
Количество личинок Anisakis висцеро сельди
10-14
15-20
31-42
Аргинин
12442,33±285,79
5949,16+83,09***
5596,551200,15***
Лизин
886,18±23,77
402,77111,48***
253,8916,31***
Тирозин
1487,61±36,59
903,47116,28***
1057,36124,98***
β-фенилаланин
3832,01±84,88
1257,82147,39***
1374,94149,05***
Гистидин
33547,64±873,54
21331,3711355,39***
21241,981988,47***
Лейцин
12200,29±450,32
7870,011361,15***
8377,381398,58***
Метионин
11615,87±354,68
9813,681474,35**
11307,551407,14
Валин
5224,57±138,37
3419,431136,78***
3582,461103,76***
Пролин
6177,73±53,23
4711,791245,90***
4943,271202,47***
Треонин
28369,53±529,26
13593,471589,83***
15254,361559,75***
Триптофан
1063,28±31,73
860,68110,27***
868,97135,08***
Серии
4742,13±122,50
3086,771107,02***
3503,14189,99***
α-аланин
21878,12±1052,04
14518,181619,35***
16059,961703,78***
Глицин
8636,35±451,99
5819,701404,80***
5606,081416,01***
**P>0,01;***P>0,001
Среди всех связанных аминокислот в экстракте мышц сельди максимальная процентная концентрация приходилась на гистидин (21-23%), треонин (14-19%), α-аланин (14-16%) и, напротив, минимальная - на лизин (0,30-0,43%), триптофан (0,69-0,92%) и тирозин (0,97-1,07%).
Общая концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц хамсы, не пораженной личинками Anisakis, составила 214630,99 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 1 до 4 личинок Anisakis - 193158,58 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 15 до 20 - 173418,87 мг/кг фарша рыбы, при инвазии от 21 до 27 - 151973,78 мг/кг фарша рыбы (табл.5).
Таблица 5
Концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц хамсы (M±m; n=10)
Связанные аминокислоты, мг/кг фарша рыбы
Количество личинок Anisakis а висцеро хамсы
0
15-20
21-27
Аргинин
10456,73±137,59
8993,56±86,01***
7457,80±128,67***
6174,55±83,84
Лизин
306,38±2,81
287,52±3,12
268,35±8,39 ***
243,87±7,61 ***
Тирозин
641,28±6,05
604,65±5,18***
624,36±3,53*
511,62±8,70 ***
β-фенилаланин
758,23±11,91
610,49±10,10
682,85±7,48 ***
481,89±9,76 ***
Гистидин
50302,33±380,35
46303,65±632,82***
44805,24±1167,30***
34289,18±1085,20***
Лейцин
16349,40±491,70
15159,42+114,75*
13194,15±307,56***
10853,28±158,50 ***
Метионин
22205,60±399,37
20011,14±197,66***
18151,36±261,61***
14858,64±205,31***
Валии
8889,71±116,9 8
8156,38±112,72***
6334,96±95,07***
6199,31±193,33***
Пролин
11965,10±181,61
10915,16+118,22***
9926,86±141,20***
8471,13±120,44
Треонин
28622,76±388,58
26779,71±335,43***
22066,42±531,49***
20180,24±19,14***
Триптофан
799,60±26,82
611,23±9,02 ***
570,94±15,30***
374,49±8,57 ***
Серии
6481,59±122,76
6146,50±40,34*
5500,81±109,41***
3631,23±113,64
α-аланин
39140,30±573,68
33484,70±500,40***
30740,11±650,65***
25174,18±927,81***
Глицин
17711,98±555,87
15094,47±109,44***
13094,66±240,39***
10947,58±151,24***
*Р<0,05 ***Р>0,001
Из всех связанных аминокислот в экстракте мышц хамсы максимальная процентная концентрация приходилась на гистидин (22,5-23,4), α-аланин (16,56-18,24%), треонин (13,2-13,3%), метионин (9,8-10,4%), глицин (7,2-8,25%), лейцин (7,1-7,61%), пролин (5,57%), аргинин (4,06-4,9%), и, напротив, минимальная приходилась на лизин (0,14-0,16%), тирозин (0,30-0,33%), триптофан (0,25-0,37%).
Общая концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц мойвы, не пораженной личинками Anisakis, составила 137828,58 мг/кг фарша рыбы, при инвазии мойвы от 4 до 8 личинками Anisakis - 102580,22 мг/кг фарша рыбы (табл.6).
Максимальная процентная концентрация из всех связанных аминокислот в экстракте мышц мойвы приходилась на тирозин (34-36%), а-аланин (12-13%), треонин (11-12%), метионин (6-8%), лейцин (7-8%), гистидин (3-4%), и, напротив, минимальная - на триптофан (0,17-0,18%), лизин (0,14-0,20%).
Таблица 6
Концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц мойвы (M±m; n=10)
Связанные аминокислоты, мг/кг фарша рыбы
Количество личинок Anisakis на висцеро мойвы
0
4-8
Аргинин
6660,09±146,83
4714,88±96,87***
Лизин
275,07±1,67
149,18±1,14***
Тирозин
47697,34±716,51
37158,45±959,38***
β-фенилаланин
1453,13±30,32
1124,90±39,52***
Гистидин
5262,00±71,35
3799,70±125,54***
Лейцин
10173,79±159,68
8004,11±173,42***
Метионин
11203,33±218,77
6962,93±156,61***
Валии
4547,34±94,88
3674,13±107,44***
Пролин
5661,71±118,98
4304,36±84,73***
Треонин
16100,05±221,43
11941,06±225,03***
Триптофан
241,37±1,32
181,18±1,85***
Серии
3598,49±145,34
1986,97±38,90***
α-аланин
17612,16±362,75
12986,79±216,30***
Глицин
7342,71±204,70
5591,58±117,06***
***P>0,001
При инвазии рыб личинками Anisakis происходило снижение связанных аминокислот в зависимости, как от степени инвазии, так и от вида рыбы. При инвазии сельди личинками Anisakis наблюдалось снижение концентрации связанных аминокислот, что, по всей видимости, обусловлено продуктами жизнедеятельности гельминтов. Однако при инвазии от 15 до 20 личинок Anisakis происходило снижение тирозина, β-фенилаланин, лейцина, метионина, треонина, серина, α-аланина и, напротив, повышение лизина относительно пораженной сельди от 31 до 42 личинок. В результате исследований нами установлено, что в экстракте мышц сельди, инвазированной от 10 до 14 личинок Anisakis, общая концентрация связанных аминокислот была выше в 1,6 раза и в 1,5 раза, чем при инвазии от 15 до 20 и от 31 до 42 личинок соответственно.
В экстракте мышц путассу, инвазированной от одной до двух личинок Anisakis, общая концентрация связанных аминокислот была выше в 1,4 раза, в 1,7 раза и в 2 раза, чем при инвазии от 9 до 13, от 20 до 36 и от 44 до 63 личинок соответственно. В экстракте мышц минтая, инвазированного от одной до двух личинок Anisakis, общая концентрация связанных аминокислот была выше в 1,4 раза, чем при инвазии от 7 до 8 личинок. В экстракте мышц мойвы, не инвазированной личинками Anisakis, общая концентрация связанных аминокислот была выше в 1,3 раза, чем при инвазии от 4 до 8 личинок.
В результате исследований авторами установлено, что у пораженных личинками Anisakis рыб, концентрация связанных аминокислот в экстракте мышц хамсы была выше, чем у сельди и мойвы в 1,5 раза, путассу - в 1,8 раза, минтая - в 1,2 раза. Снижение концентрации связанных аминокислот происходило за счет разрыва полипептидных связей между аминокислотами и образования свободных аминокислот, что свидетельствовало о процессе распада белка. Данный процесс, обусловлен влиянием продуктов жизнедеятельности личинок нематод рода Anisakis. Низкая концентрация связанных аминокислот в мышечной ткани минтая обусловлена не только наличием личинок Anisakis, но и структурой ткани, в отличие от других изучаемых видов рыб. На основании этого нами установлено, что рыба при интенсивной инвазии (путассу, сельдь и хамса - более 20; минтай и мойва - более 7) не может быть использована для пищевых целей.