Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения
METHOD OF PRODUCING AND CONCENTRATING microRNA-CONTAINING EXOSOMES OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS FOR USE IN COSMETIC AND MEDICINAL AGENTS FOR STIMULATING REGENERATIVE PROCESSES AND SLOWING DOWN AGING PROCESSES

Способ получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения.
Предлагаемое изобретение относится к биотехнологиям, а более конкретно к способам получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения.
Регуляторные микроРНК вырабатываются практически всеми клетками организма и выделяются во внеклеточное пространство в виде экзосом. Экзосомы образуются из эндосомальных мультивезикулярных телец и состоят из двухслойного липидного слоя, включая керамиды, холестерол, сфинголипиды, фосфоглицериды и белки-рецепторы (Tkach, Mercedes et al. Communication by Extracellular Vesicles: Where We Are and Where We Need to Go. Cell, Volume 164, Issue 6, 1226-1232. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.01.043). Экзосомы являются универсальным транспортом микроРНК, обеспечивая их защиту и проникновение в клетки. В большинстве случаев высокоспециализированные клетки, такие как гепатоциты, альвеоциты, кардиомиоцты синтезируют свой, уникальный спектр микроРНК, свойственный для своего микроокружения (Chen-Rong Tsao et al. Mesenchymal Stem Cell Derived Exosomes: A New Hope for the Treatment of Cardiovascular Disease? Acta Cardiol Sin 2014; 30:395-400). Например, гепатоциты вырабатывают те микроРНК, действие которых приводит к пролиферации гепатоцитов, регкрутингу их предшественников, повышению синтетической активности (Herrera Sanchez et al. Extracellular vesicles from human liver stem cells restore argininosuccinate synthase deficiency. Stem Cell Research & Therapy (2017) 8:176, DOI 10.1186/s 13287-017-0628-9).
Таким образом, использование микроРНК в практике ограничивается их составом и происхождением.
Согласно данным литературы, стволовые клетки участвуют в стимуляции регенеративных процессов практически при любой патологии. Согласно современным данным, это отчасти зависит и от их синтетической активности (Lu et al. Exosomes as potential alternatives to stem cell therapy for intervertebral disc degeneration: in-vitro study on exosomes in interaction of nucleus pulposus cells and bone marrow mesenchymal stem cells Stem Cell Research & Therapy (2017) 8:108, DOI 10.1186/s 13287-017-0563-9).
Основной регенеративный эффект стволовых клеток обусловлен за счет экспрессии специфических микроРНК, активирующих пролиферативные и другие необходимые для регенерации процессы. Поэтому особенно важно разработать способ, позволяющий эффективно выделять из культуры стволовых клеток экзосомы, обогащать их и использовать для разработки лекарственных и косметических средств.
Известен способ получения экзосом (Processes for producing stable exosome formulations US 20160158291 A1 Номер заявки US 14/958,804, Дата публикации 9 июня 2016): в котором экзосомы получают из другого типа клеток (кардиосфер). Выделение экзосом проводится с помощью фильтрации и ультрафильтрации.
Недостатком известного способа является сложность и длительность процесса обогащения экзосом в культуральной жидкости.
Известен также способ получения экзосом (Method of purifying exosomes WO 2012087241 A1 (Номер заявки PCT/SG2011/000441, Дата публикации 28 июня 2012): в котором используются мезенхимально-стромальные клетки, а для получения экзосом использованы ионнообменные колонны.
Недостатком способа является его сложность.
Известен также способ получения экзосом (Methods and compositions for exosome isolation US 20130273544 A1 Номер заявки US 13/765,677,
Дата публикации 17 окт 2013): данный способ использует полимеры для разделения экзосом.
Недостатком метода является невысокая эффективность.
Известен метод получения экзосом из клеток плаценты и жира, (Exosome compositions and methods for preparation and use thereof for regulating and conditioning skin and hair WO 2017023690 A1 Номер заявки PCT/US2016/044458 Дата публикации 9 фев 2017): Данный патент описывает получение экзосом из клеток плаценты и жира, для выделения экзосом используется ультрацентрифугирование, а для получения экзосом с повышенным содержанием белка используют «тепловой шок».
Известен способ производства крема (Skin cream WO 2015009325 A1 (Номер заявки PCT/US2013/051394, Дата публикации 22 янв 2015), содержащего экзосомы и цитокины. В качестве клеток - продуцентов экзосом используются трансформированные и обычные фибробласты, а для выделения экзосом использована химическая преципитация и ультрацентрифугирование.
Известна кондиционная среда, предназначенная для лечения повреждений нормальных тканей (коржи и слизистых), вызванных ожогом. Она содержит минеральные соли, антибиотики и питательные вещества, достаточные для поддержания жизнеспособности и роста мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга человека, включая продукты их жизнедеятельности. Кондиционную среду получают на стадии стационарного роста культуры стабильной клеточной линии мезенхимальных стволовых клеток, находящихся в Go периоде клеточного цикла, а затем среду собирают, (патент RU 2292212 (Заявка: 2005116811/15, 02.06.2005, Опубликовано: 27.01.2007):
Недостатком известной кондиционной среды является ее использование только для лечения ожогов.
Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является метод получения экзосом из клеток плаценты и жира, (Exosome compositions
and methods for preparation and use thereof for regulating and conditioning skin and hair WO 2017023690 Al Номер заявки PCT/US2016/044458 Дата публикации 9 фев 2017), в котором получают экзосомы из клеток плаценты и жира, для выделения экзосом используется ультрацентрифугирование, а для получения экзосом с повышенным содержанием белка используют «тепловой шок».
Недостатком известного способа является то, что экзосомы получают только из клеток плаценты и жира, из-за чего количество получаемых экзосом ограничено и не позволяет получать экзосомы в необходимых количествах.
Задачей изобретения является создание эффективного и производительного способа получения и концентрирования микроРНК содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток для применения в косметических и лекарственных средствах для стимуляции регенеративных процессов и замедления процессов старения.
Поставленная задача решается предлагаемым способом получения и концентрирования микроРНК-содержащих экзосом мультипотентных мезенхимально-стромальных клеток, содержащий выработку мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующее культивирование и сбор культуральной жидкости, обогащенной экзосомами, концентрацию экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсибилизации, заморозку или высушивание полученного концентрата для долгосрочного хранения, в котором в качестве источника экзосом используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки (ММСК) от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в среде альфаМЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмой пуповинной крови (UCPRP), культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляют до 80-100%
монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным, или проточным: при статичном культивировании клетки помещают в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри, и при достижении 80-100% монослоя культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры, при достижении клетками монослоя, культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7-и дней, при получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100 кДа, за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100 кДа или 500 кДа, в результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируются в диафильтрате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит экзосомы, которые измеряют с помощью проточной цитометрии и измерения уровня РНК или другими доступными методами, далее полученные экзосомы могут быть использованы в течении 2-х недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, могут быть заморожены при -20°С, -40°С, -60°С и -80°С и храниться на протяжении 6-ти месяцев, или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2-х лет при отрицательных температурах или +4°C.
Способ основан на выработке мезенхимально-стромальных клеток пуповины, жировой ткани и пульпы зуба, последующим культивированием и сбором культуральной жидкости, обогащенной экзосомами. В дальнейшем, производится концентрация экзосом и обеднение крупномолекулярными белками с целью снижения сенсибилизации. Полученный концентрат замораживается или высушивается для долгосрочного хранения.
Преимущества способа заключаются в источнике экзосом, их особенности получения, концентрировании и хранении.
Способ осуществляется следующим образом.
В качестве источника экзосом используют мультипотентные мезенхимально-стромальные клетки (ММСК) от 1 до 4 пассажа, полученные от тестированных доноров, при этом источниками клеток являются пульпа зуба, жировая ткань, костный мозг, пуповина, для накопления экзосом ММСК культивируют в среде альфаМЕМ или ДМЕМ с низким содержанием глюкозы, 5 мМ Л-аланил-глютамина и активированной тромбоцитарной плазмой пуповинной крови (UCPRP), культивирование клеток в вышеописанной среде осуществляют до 80-100% монослоя культуры, причем культивирование может быть статичным, или проточным: при статичном культивировании клетки помещают в культуральную посуду типа флакон, чашка Петри, и при достижении 80-100% монослоя культуральную жидкость меняют каждые 24 часа, собранную культуральную среду сохраняют для выделения экзосом, при этом с одной культуры производят 5-7 съемов обогащенной среды, а при проточном культивировании клетки помещают в инкубатор проточного типа на клеточные носители, в качестве которых используют микрочастицы, половолоконные структуры, при достижении клетками монослоя, культуральную среду полностью меняют на новую, после чего производят стандартное культивирование в течение 7-и дней, при получении обогащенной экзосомами среды производится ее концентрирование с удалением белковой фракции свыше 100 кДа, за счет использования системы тангенциальной фильтрации для удаления крупных
частиц и концентрирования: сначала культуральную среду центрифугируют 30 минут при 2000g или фильтруют фильтром на 1-10 мкм для удаления крупных остатков клеток, далее надосадочную жидкость фильтруют тангенциальным фильтром с порами 100 кДа или 500 кДа, в результате фильтрации объем жидкости уменьшают, а экзосомы концентрируются в диафильтрате, последний далее фильтруют ультрафильтрацией для удаления микровезкул и других крупных частиц с использованием фильтров с размерами 0.22 мкм и 0.1 мкм, полученный фильтрат содержит экзосомы, которые измеряют с помощью проточной цитометрии и измерения уровня РНК или другими доступными методами, далее полученные экзосомы могут быть использованы в течении 2-х недель в неизменном виде для производства косметических или лекарственных форм, могут быть заморожены при -20°С, -40°С, -60°С и -80°С и храниться на протяжении 6-ти месяцев, или подвергнуты лиофилизации для долгосрочного хранения: до 1 года при комнатной температуре и более 2-х лет при отрицательных температурах или +4°С.
Процесс лиофилизации проводится в лиофильной сушке в два этапа. Предварительно экзосомальный концентрат замораживают в соответствующей посуде для сушки до -70°С в морозильной камере, затем проводится сушка в лиофильной камере по схеме:
Первичная сушка
Шаг 1 - охлаждение до -40°С и выдержка 90 минут, давление 100 mT
Шаг 2 - охлаждение до -30°С и выдержка 600 минут, давление 100 mT
Шаг 3 - охлаждение до -10°С и выдержка 300 минут, давление 100 mT
Шаг 4 - охлаждение до 0°С и выдержка 120 минут, давление 100 mT
Шаг 5 - нагрев до +10°С и выдержка 120 минут, давление 100 mT
Вторичная сушка проводится при +20°С минимум 120 минут при 100 mT
Концентрат экзосом, полученный предлагаемым способом, может быть использован для добавления в косметическую продукцию с целью замедления процессов старения кожи, стимуляции синтеза внеклеточного матрикса и улучшения состояния кожи. Так же, экзосомы могут быть использованы для создания кремов и гелей для стимуляции регенерации поверхностных и глубоких повреждений или для создания инъекционных препаратов, стимулирующих восстановление утраченных функций. Предлагаемый способ эффективен и имеет высокую производительность