СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНОГО АНГИОГЕНЕЗА, РЕТИНАЛЬНОГО ОТЕКА, РЕТИНАЛЬНОЙ ИШЕМИИ И ДИАБЕТИЧЕСКОЙ РЕТИНОПАТИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗБИРАТЕЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ RTK
METHOD OF TREATING OPHTHALMIC ANGIOGENESIS, RETINAL OEDEMA, RETINAL ISCHEMIA AND DIABETIC RETINOPATHY WITH USING SELECTIVE RTK INHIBITORS

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки, патентной заявки США, серийный номер 60/655676, поданной 23 февраля 2005 г.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область изобретения
Настоящее изобретение относится к предупреждению и лечению глазной неоваскуляризации, ангиогенеза, ретинального отека, диабетической ретинопатии и осложнения, связанного с ретинальной ишемией. В частности, настоящее изобретение относится к применению избирательных ингибиторов рецепторной тирозинкиназы (RTKi) для лечения таких расстройств.
2. Описание связанной области
Экссудативная возрастная макулярная дегенерация (AMD) и пролиферативная диабетическая ретинопатия (PDR) являются основными причинами приобретенной слепоты в развитых странах и характеризуются патологической неоваскуляризацией заднего сегмента. Патологическую неоваскуляризацию заднего сегмента (PSNV), обнаруженную при экссудативной AMD, характеризуют как патологическую хориоидальную NV, тогда как при PDR обнаруживают преретинальную NV. Патологический глазной ангиогенез, включающий в себя PSNV, происходит как каскад событий, прогрессирующий от начального стимула до формирования аномальных новых капилляров. Побуждающая причина как для экссудативной AMD, так и для PDR пока неизвестна, однако продукция различных проангиогенных факторов роста, по-видимому, является общим стимулом. Растворимые факторы роста, такие как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF или FGF-2), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-I), ангиопоэтины, и т.д., обнаружены в тканях и жидкостях, полученных от пациентов с патологическим глазным ангиогенезом. После запуска ангиогенного каскада базальная мембрана и внеклеточный матрикс капилляров деградируют, и происходит пролиферация и миграция эндотелиальных клеток капилляров. Эндотелиальные выросты анастомозируют с формированием трубок с последующим формированием проходимого просвета. Новые капилляры обычно обладают увеличенной проницаемостью сосудов или негерметичностью из-за несформированной барьерной функции, что может приводить к отеку ткани. Дифференцировку в зрелый капилляр показывают по присутствию непрерывной базальной мембраны и нормальных эндотелиальных соединений между другими эндотелиальными клетками и перицитами; однако, этот процесс дифференцировки часто нарушен во время патологических состояний.

Хотя PSNV представляет собой угрожающую зрению патологию, ответственную за две наиболее распространенных причины приобретенной слепоты, способы лечения являются немногочисленными и в лучшем случае паллиативными. Принятые способы лечения для PSNV при экссудативной AMD включают в себя лазерную фотокоагуляцию и фотодинамическую терапию Visudyne; оба способа лечения включают в себя индуцированную лазером окклюзию пораженной сосудистой сети и связаны с локализованным разрушением сетчатки, индуцированным лазером. Для пациентов с PDR решетчатая или панретинальная лазерная фотокоагуляция и хирургические вмешательства, такие как витреоэктомия и удаление преретинальных мембран, являются единственными доступными в настоящее время возможностями. Несколько различных соединений клинически оценивали для фармакологического лечения PSNV, включая RETAANE (Alcon Research, Ltd.), Lucentis (Genentech), adPEDF (GenVec), скваламин (Genaera), CA4P (OxiGENE), VEGF-ловушку (Regeneron), анти-VEGF или VEGFR RNAi (Acuity и SIRNA, соответственно) и LY333531 (Lilly). Недавно для такого использования одобрили Macugen (Eyetech/Pfizer), аптамер анти-VEGF, инъецируемый в стекловидное тело.
Макулярный отек является основной причиной потери зрения у пациентов с диабетом, в то время как преретинальная неоваскуляризация (PDR) является основной причиной практической слепоты. Сахарный диабет характеризуют постоянной гипергликемией, которая вызывает обратимые и необратимые патологические изменения в микроциркуляторном русле различных органов. Диабетическая ретинопатия (DR), таким образом, представляет собой заболевание капилляров сетчатки, которое проявляется как каскад стадий с увеличивающимися уровнями тяжести и ухудшением прогнозов для зрения. Основные факторы риска, опубликованные для диабетической ретинопатии, включают в себя длительность сахарного диабета, качество гликемического контроля и присутствие системной гипертензии. DR широко классифицируют по 2 основным клиническим стадиям: непролиферативной диабетической ретинопатии (NPDR) и пролиферативной диабетической ретинопатии (PDR), где термин «пролиферативный» относится к присутствию преретинальной неоваскуляризации, как указано ранее.
2
Непролиферативная диабетическая ретинопатия (NPDR) и последующий макулярный отек связаны, частично, с ретинальной ишемией в результате ретинальной микроваскулопатии, вызванной постоянной гипергликемией. NPDR включает в себя ряд клинических подкатегорий, которые включают в себя начальную «фоновую» DR, где наблюдают от небольших многоочаговых изменений в сетчатке (например, микроаневризмы, «точечно-пятнистые» кровоизлияния и инфаркты в слое нервных волокон) до препролиферативной DR, непосредственно предшествующей развитию PNV. Гистопатологическими отличительными признаками NPDR являются ретинальные микроаневризмы, утолщение базальной мембраны капилляров, потеря эндотелиальных клеток и перицитов и возможная окклюзия капилляров, приводящая к местной ишемии. Данные, накопленные по моделям на животных и эмпирическим исследованиям на людях, показывают, что ретинальная ишемия часто связана с увеличенными местными уровнями провоспалительных и/или проангиогенных факторов роста и цитокинов, таких как простагландин E, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-I), ангиопоэтин 2, и т.д. Диабетический макулярный отек можно наблюдать либо во время NPDR, либо во время PDR, однако, часто его наблюдают на более поздних стадиях NPDR, и он является прогностическим признаком прогрессирования по направлению к наиболее тяжелой стадии, PDR.
В настоящее время не одобрено фармакологической терапии для лечения NPDR и/или макулярного отека. Современным стандартом лечения является лазерная фотокоагуляция, которую используют для стабилизации или устранения макулярного отека и замедления прогрессирования по направлению к PDR. Лазерной фотокоагуляцией можно уменьшать ретинальную ишемию посредством разрушения здоровой ткани и таким образом, уменьшения метаболических потребностей; она также может модулировать экспрессию и продукцию различных цитокинов и трофических факторов. Подобно способам лечения экссудативной AMD, лазерная фотокоагуляция у пациентов с диабетом является разрушающей клетки процедурой, и поле зрения глаза после лечения подвержено необратимой угрозе. Ретинальный отек, отличный от макулярного отека, можно наблюдать при различных заболеваниях заднего сегмента, таких как задний увеит, окклюзия ветви ретинальной вены, вызванное хирургическим вмешательством воспаление, эндофтальмит (стерильный и нестерильный), склерит и эписклерит, и т.д.
Эффективная фармакологическая терапия патологического глазного ангиогенеза, ретинального отека, DR и ретинальной ишемии будет предоставлять значительную пользу пациенту, таким образом предотвращая инвазивные хирургические или разрушающие лазерные процедуры. Эффективное лечение этих патологий будет улучшать качество жизни пациента и производительность в обществе. Кроме того, издержки для общества, связанные с предоставлением помощи и медицинского обеспечения слабовидящим, можно намного уменьшить.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
50
50
50
Настоящее изобретение преодолевает эти и другие недостатки предшествующего уровня техники посредством предоставления сильнодействующего и эффективного предупреждения патологического глазного ангиогенеза, ретинального отека, диабетической ретинопатии и осложнения, связанного с ретинальной ишемией, так же как посредством вызывания регрессии неоваскуляризации и/или ангиогенеза заднего сегмента. В одном из аспектов способы по изобретению включают в себя лечение таких расстройств посредством введения нуждающемуся в этом пациенту композиции, содержащей терапевтически эффективное количество ингибитора рецепторной тирозинкиназы, блокирующего аутофосфорилирование по тирозину рецептора 1 VEGF (FIt-I), рецептора 2 VEGF (KDR), рецептора 3 VEGF (Flt-4), Tie-2, PDGFR, c-KIT, Flt-3 и CSF-IR. Предпочтительно, соединение, применяемое в способах по изобретению, обладает значением IC от 0,1 нМ до 250 нМ для каждого из этих рецепторов. Более предпочтительно, соединение обладает значением IC от 0,1 нМ до 100 нМ, по меньшей мере для шести из этих рецепторов. Наиболее предпочтительно, соединение обладает значением IC менее чем 10 нМ, по меньшей мере для четырех из этих рецепторов.
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
Как применяют здесь, фразы «каждый из этих рецепторов», «каждый рецептор, перечисленный в пункте формулы изобретения n», «по меньшей мере шесть (или четыре) из этих рецепторов» и «по меньшей мере шесть (или четыре) рецептора, перечисленных в пункте формулы изобретения n», описывают значение IC для каждого отдельного рецептора в обозначенном списке. Например, в абзаце выше фраза «от 0,1 нМ до 250 нМ для каждого из этих рецепторов» требует, чтобы рецептор 1 VEGF (FIt-I) обладал значением IC между 0,1 нМ и 250 нМ, чтобы рецептор 2 VEGF (KDR) обладал значением IC между 0,1 нМ и 250 нМ, чтобы рецептор 3 VEGF (Flt-4) обладал значением IC между 0,1 нМ и 250 нМ, чтобы Tie-2 обладал значением IC между 0,1 нМ и 250 нМ, чтобы PDGFR обладал значением IC между 0,1 нМ и 250 нМ, чтобы c-KIT обладал значением IC между 0,1 нМ и 250 нМ, чтобы FIt-I обладал значением IC между 0,1 нМ и 250 нМ, и чтобы CSF-IR обладал значением IC между 0,1 нМ и 250 нМ. Подобным образом, фраза «от 0,1 нМ до 100 нМ по меньшей мере для шести из этих рецепторов» требует, чтобы шесть из восьми рецепторов в обозначенном списке все обладали IC от 0,1 нМ до 100 нМ.
Иногда в этом документе фразу «одновременно блокирует аутофосфорилирование по тирозину» используют по отношению к активности связывания рецептора предпочтительными соединениями для применения в способах по изобретению. Использование этой фразы относится к тому факту, что предпочтительные соединения обладают активностью антагониста для многих подтипов рецепторной тирозинкиназы. То есть, они не являются избирательными для одного рецептора, но являются высокоэффективными антагонистами двух или более рецепторных тирозинкиназ.
Важно, что соединения для применения в способах по изобретению обладают профилем связывания рецептора, где одно соединение блокирует множество рецепторов семейства RTK. Одна предпочтительная группа рецепторов, аутофосфорилирование которых по тирозину блокируют, перечислена выше. Дополнительные предпочтительные профили связывания включают в себя следующие: a) Tie-2, PDGFR и рецептор 2 VEGF (KDR); b) рецептор 2 VEGF (KDR), рецептор 1 VEGF (FIt-I), PDGFR и Tie-2; c) рецептор 2 VEGF (KDR), рецептор 1 VEGF (FIt-I) и Tie-2; d) рецептор 2 VEGF (KDR), рецептор 1 VEGF (FIt-I) и PDGFR; e) рецептор 2 VEGF (KDR) и Tie-2; f) рецептор 2 VEGF (KDR) и PDGFR; и g) рецептор 2 VEGF (KDR), Tie-2 и PDGFR.
50
50
50
50
В одном предпочтительном аспекте для каждого распределения рецепторов по группам, перечисленным в a)-f) выше, значение IC для каждого рецептора в каждой группе составляет от 0,1 нМ до 200 нМ. В другом предпочтительном аспекте значение IC для каждого рецептора в каждой группе составляет от 0,1 нМ до 100 нМ. В другом предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один рецептор в каждой из предпочтительных групп рецепторов, перечисленных в a)-f) выше, обладает значением IC менее чем 10 нМ. В другом предпочтительном варианте осуществления, два или более рецепторов в каждой предпочтительной группе рецепторов, перечисленных в a)-f) выше, обладают значением IC менее чем 10 нМ.
Предпочтительные ингибиторы рецепторной тирозинкиназы для применения в способах по изобретению включают в себя в качестве неограничивающих примеров следующие соединения:
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[2-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[2-фтор-5-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[2-фтор-5-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-хлорфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(4-морфолинилметил)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-[2-фтор-5-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(4-морфолинилметил)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-[3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(4-морфолинилметил)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(3-хлорфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(4-морфолинилметил)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(3-метилфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(4-морфолинилметил)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(4-морфолинилметил)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(3,5-диметилфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(4-морфолинилметил)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(3-феноксифенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(4-морфолинилметил)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(3-бромфенил)мочевина;
N-(4-{3-амино-7-[2-(4-морфолинил)этокси]-1,2-бензизоксазол-4-ил}фенил)-N'-[3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-(4-{3-амино-7-[2-(4-морфолинил)этокси]-1,2-бензизоксазол-4-ил}фенил)-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина;
N-(4-{3-амино-7-[2-(4-морфолинил)этокси]-1,2-бензизоксазол-4-ил}фенил)-N'-[2-фтор-5-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-(4-{3-амино-7-[2-(4-морфолинил)этокси]-1,2-бензизоксазол-4-ил}фенил)-N'-(3-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3,5-диметилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-фенилмочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(4-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-цианофенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-фтор-3- (трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-бромфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-хлорфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-этилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-фтор-4-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-фторфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3,5-дифторфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-метоксифенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(4-метоксифенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-нитрофенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(4-фторфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(2-фторфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-хлор-4-фторфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-хлор-4-метоксифенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-(диметиламино)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-(трифторметокси)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[2-(трифторметокси)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[3,5-бис(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-хлор-4-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[3,5-бис(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-(трифторметокси)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-фторфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-метоксифенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3,5-дифторфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(4-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-бромфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3,5-диметилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-(диметиламино)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-хлорфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[2-фтор-5-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3,5-диметилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-этилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(4-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-(трифторметокси)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-фтор-4-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-метоксифенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-фенилмочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[3,5-бис(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-бромфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метил-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-фторфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-метокси-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(4-фтор-3-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-фтор-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[3- (трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-фтор-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-хлорфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-фтор-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-фтор-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(3-метилфенил)мочевина;
N-[4-(3-амино-7-фтор-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-[2-фтор-5-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-(3-амино-7-фтор-1,2-бензизоксазол-4-ил)фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(трифторметокси)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-[2-фтор-5-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(трифторметокси)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-[3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(трифторметокси)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(трифторметокси)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(3-хлорфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(трифторметокси)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(3-бромфенил)мочевина;
N-{4-[3-амино-7-(трифторметокси)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-[4-фтор-3-(трифторметил)фенил]мочевина;
N-[4-[3-амино-1H-индазол-4-ил]фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина; и
N-{4-[3-амино-7-(трифторметокси)-1,2-бензизоксазол-4-ил]фенил}-N'-(4-фтор-3-метилфенил)мочевина.
Наиболее предпочтительным соединением для применения в способах по изобретению является N-[4-[3-амино-1H-индазол-4-ил]фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина.
Другие предпочтительные соединения для применения в описанных здесь способах можно идентифицировать с использованием описанных здесь анализов, выполнение которых является общепринятым для специалиста в данной области.
RTKi можно вводить посредством любого целесообразного способа или пути введения, однако, местное введение является предпочтительным. Предполагают, что можно использовать все местные доступы к глазу, включая местное, субконъюнктивальное, окологлазное, ретробульбарное введение, введение в субтеноново пространство, внутрикамерное введение, введение в стекловидное тело, внутриглазное, субретинальное и супрахориоидальное введение. Возможно системное или парентеральное введение, включая в качестве неограничивающих примеров внутривенное, подкожное и пероральное введение. Наиболее предпочтительным способом введения является инъекция раствора или суспензии в стекловидное тело или в субтеноново пространство; введение в стекловидное тело или помещение в субтеноново пространство биоразлагаемого или не биоразлагаемого устройства (имплантата); или местное глазное введение раствора или суспензии. В одном из предпочтительных вариантов осуществления соединение вводят посредством заднего околосклерального введения раствора, суспензии или геля. В другом предпочтительном варианте осуществления соединение вводят посредством введения в стекловидное тело биоразлагаемого имплантата. В конкретных предпочтительных аспектах биоразлагаемый имплантат вводят в стекловидное тело посредством устройства, такого как описанное в патентной заявке США серийный no 60/710046, поданной 22 августа 2005 г.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Следующие рисунки составляют часть настоящего описания и включены сюда для дополнительной иллюстрации конкретных аспектов настоящего изобретения. Изобретение можно лучше понять, исходя из этих рисунков в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных здесь.
ФИГ.1 Избирательный RTKi, AL-39324, ингибирует преретинальную неоваскуляризацию (NV) после однократной инъекции в стекловидное тело в модели индуцированной кислородом ретинопатии (OIR) на крысах.
ФИГ.2 Избирательный RTKi, AL-39324, предотвращает преретинальную неоваскуляризацию (NV) после перорального введения через желудочный зонд в модели на крысах индуцированной кислородом ретинопатии (OIR).
ФИГ.3 Избирательный RTKi, AL-39324, ингибирует индуцированную лазером хориоидальную неоваскуляризацию (CNV) после однократной инъекции в стекловидное тело у мыши.
ФИГ.4 Избирательный RTKi, AL-39324, вызывает регрессию существующей индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации (CNV) после однократной инъекции в стекловидное тело у мыши.
ФИГ.5 Сравнение очагов CNV между группами мышей после лечения AL-39324.
ФИГ.6 Избирательный RTKi, AL-39324, ингибирует индуцированную лазером хориоидальную неоваскуляризацию (CNV) после перорального введения через желудочный зонд у мыши.
ФИГ.7 Избирательный RTKi, AL-39324, ингибирует вызванную диабетом проницаемость сосудов сетчатки после однократной инъекции в стекловидное тело у крысы.
ФИГ.8 Избирательный RTKi, AL-39324, ингибирует индуцированную VEGF проницаемость сосудов сетчатки после однократной инъекции в стекловидное тело у крысы.
ФИГ.9 Избирательный RTKi, AL-39324, полностью предотвращает вызванную диабетом проницаемость сосудов сетчатки после перорального введения через желудочный зонд в модели на крысах с STZ.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Согласно способам по настоящему изобретению, композицию, содержащую ингибитор рецепторной тирозинкиназы (RTKi), обладающий профилем ингибирования киназы, подобным показанному в таблице 1, вводят пациенту, страдающему от глазной неоваскуляризации, ангиогенеза, ретинального отека, диабетической ретинопатии и/или ретинальной ишемии, чтобы предотвратить потерю остроты зрения, связанную с такими состояниями. Более конкретно, является предпочтительным, чтобы ингибитор рецепторной тирозинкиназы для применения в способах по изобретению блокировал аутофосфорилирование по тирозину рецептора 1 VEGF (FIt-I), рецептора 2 VEGF (KDR), рецептора 3 VEGF (Flt-4), Tie-2, PDGFR, c-KIT, Flt-3 и CSF-IR. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что соединения с таким уникальным профилем связывания ингибируют или предотвращают глазную неоваскуляризацию, ретинальный отек, диабетическую ретинопатию, и/или ретинальную ишемию значительно более активно и эффективно, чем известные в настоящее время соединения для такого применения. Более неожиданно, соединения для применения в способах по изобретению, обладающие предпочтительными профилями связывания, описанными здесь, вызывают регрессию неоваскуляризации.
Таблица 1Профиль ингибирования киназ AL-39324
Родственные RTK
Неродственные TK<sup>a</sup>
Ser/Thr-киназы<sup>b</sup>
Киназа
IC<sub>50</sub> (нМ)
Киназа
IC<sub>50</sub> (нМ)
Киназа
IC<sub>50</sub> (нМ)
KDR
4
SRC
> 50000
AKT
> 50000
FLT1
3
IGFR
> 50000
SGK
940
FLT4
190
TNSS
> 50000
CDC2
9800
PDGFR β
66
LCK
38000
PKA
5900
CSP-IR
3
EGFR
> 50000
KIT
14
HCK
> 50000
FLT3
4
CMBT
> 50000
TIE2
170
LYN
> 20000
RBT
1900
FYN
> 50000
FGFR
> 12500
FGR
> 50000
a) Значения IC<sub>50</sub>, определяемые при концентрации АТФ 1 нМ;b) Значения IC<sub>50</sub>, определяемые при концентрации АТФ 5-10 мкМ.
Обратимое фосфорилирование белков является одним из важнейших биохимических механизмов, опосредующих передачу сигналов в эукариотической клетке. Эту реакцию катализируют протеинкиназы, которые переносят фосфатную группу γ из АТФ на гидроксильные группы белков-мишеней (Hunter, 2000). В геноме человека закодировано 518 таких ферментов, из которых приблизительно 90 избирательно катализируют фосфорилирование гидроксильных групп тирозина (Manning, 2002; Robinson, 2000). Эти тирозинкиназы человека организовали в формате дендрограммы на основе гомологии последовательности их каталитических доменов (http://www.cellsignal.com/retail/). Цитозольные тирозинкиназы остаются внутри клетки, в то время как рецепторные тирозинкиназы (RTK) обладают как внеклеточным, так и внутриклеточным доменами и функционируют как связанные с мембраной рецепторы поверхности клеток. Как таковые, RTK опосредуют клеточные ответы на сигналы внешней среды и облегчают широкий диапазон клеточных процессов, включая пролиферацию, миграцию и выживание.
Поскольку RTK являются одними из принципиальных компонентов сигнальной сети, которые передают внеклеточные сигналы в клетках, дисрегуляция путей передачи сигнала RTK связана с рядом расстройств человека, включая рак и заболевание глаз. Следовательно, является хорошо обоснованной применимость ингибиторов RTK (RTKi), особенно антагонистов семейства рецепторов VEGF, для ингибирования ангиогенеза во множестве тканей, включая глаз. Однако, авторы настоящего изобретения являются первыми, кто показал, что одновременное блокирование аутофосфорилирования по тирозину по меньшей мере одного рецептора VEGF вместе с другим типом рецепторных тирозинкиназ не только значительно ингибирует ангиогенез (т.е. в большей степени, чем обнаружено ранее), но также вызывает регрессию ангиогенеза.
Семейство рецепторов VEGF
Семейство рецепторов VEGF состоит из трех RTK, KDR (рецептор с доменом, содержащим киназную вставку; известный также как VEGFR2), FLT1 (Fms-подобная тирозинкиназа; известный также как VEGFR1) и FLT4 (VEGFR3) (Ferrara 2003). Эти рецепторы опосредуют биологическую функцию факторов роста эндотелия сосудов (VEGF-A, -B, -C, -D, -E и фактора роста плаценты (PlGF)), семейства гомодимерных гликобелков, которые связывают рецепторы VEGF с различными аффинностями (Wiesmann 1997; Ferrara 1997). KDR, FLT1 и FLT4 обладают тремя структурными областями: внеклеточным доменом, содержащим семь иммуноглобулинподобных мотивов, которые содержат участки связывания фактора роста, одним трансмембранным доменом, и внутриклеточным расщепляющим киназу доменом, опосредующим тирозинкиназную активность, необходимую для передачи сигнала (de Vries 1992; Terman 1992). Эти мотивы сравнивали с мотивами структурно-родственных RTK из семейств PDGF, FGF, RET и TIE в дендрограмме, показанной на http://www.cellsignal.com/retail/. Для всех обсуждаемых ниже RTK связывание лиганда с внеклеточным доменом вызывает димеризацию рецептора и аутофосфорилирование специфических внутриклеточных остатков тирозина. Эти фосфорилированные группы тирозина служат участками стыковки для других белков и в конечном счете приводят к передаче сигналов в нисходящем направлении (Schlessinger 2000).
VEGF, VEGFR-1 и -2: Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) связывает с высокой аффинностью связанные с мембраной рецепторные тирозинкиназы VEGFR-2 (KDR, FIk-I) и VEGFR-I (FIt-I). Эксперименты с культурой клеток и нокаутом гена показывают, что каждый рецептор вносит вклад в разные аспекты ангиогенеза.
KDR: KDR является основным медиатором митогенных, ангиогенных и увеличивающих проницаемость эффектов VEGF-A, далее в этом документе обозначенного VEGF. Множество различных типов клеток способны продуцировать VEGF, однако его биологическая активность преимущественно ограничена сосудистой сетью из-за избирательной для эндотелиальных клеток экспрессии KDR (Ferrara 2003; Terman 1992; Millauer 1993; Quinn 1993). Неудивительно, что ось VEGF/KDR является первичным медиатором ангиогенеза, пути, посредством которого новые кровеносные сосуды формируются из предсуществующих сосудов (Ferrara 2003; Griffioen 2000; Rak 1995). Роль этого пути передачи сигнала в развитии ангиогенеза соответствует летальности эмбриона и аномальному формированию кровеносных сосудов, которые наблюдают у VEGF- и KDR-нулевых мышей (Shalaby 1995; Carmeliet 1996).
in vivo
FLT1: Несмотря на их структурное сходство, KDR и FLT1 выполняют несколько различные функции  (Shalaby 1995; Fong 1995). FLT1 связывает VEGF с высокой аффинностью, однако увеличение киназной активности не является настолько сильным, как у KDR (Waltenberger 1994). FLT1 также связывает VEGF-B и фактор роста плаценты, два лиганда, которые KDR не связывает. Помимо эндотелиальных клеток, FLT1 экспрессирован на поверхности клеток гладких мышц, моноцитов и гематопоэтических стволовых клеток (Rafii 2002). Активация передачи сигнала FLT1 приводит к мобилизации происходящих из костного мозга эндотелиальных клеток-предшественников, которые рекрутируются в опухоли, и, возможно, в пораженные заболеванием сетчатку/хориоид, где вносят вклад в формирование новых кровеносных сосудов (Erikson, 2002; Lyden 2001; Grant 2002; Csaky 2004).
FLT4: Несмотря на его структурное сходство с KDR и FLT1, FLT4 опосредует передачу сигнала VEGF-C и VEGF-D, но не VEGF-A. Существенно, что активация FLT4 в отсутствие передачи сигнала KDR способна вызывать лимфангиогенез и метастазирование в моделях опухолей на животных (Krishnan 2003).
165
VEGF и его RTK вносят вклад в морфогенез сосудов и прогрессию заболевания благодаря их способности опосредовать два преобладающих механизма: рост новых сосудов (васкулогенез и/или ангиогенез) и проницаемость сосудов (Lueng 1989; Keck 1989; Hanahan 1997; Yancopoulos 2000). Что касается глаза, VEGF является критическим фактором развития во время развития сосудов в заднем сегменте (Stone 1995). Более того, ткани глаза человека отвечают на множество стимулов, таких как гипоксия, посредством индукции VEGF, что приводит к неоваскуляризации заднего сегмента и нарушению гематоретинального барьера (т.е., увеличенной проницаемости капилляров) (Shima 1995; Hartnett 2003). VEGF и VEGFR локализованы в неоваскулярных тканях, полученных от пациентов с диабетической ретинопатией и экссудативной AMD, и связаны с увеличенной тяжестью заболевания (Lutty 1996; Chen 1997; Witmer 2002; Kvanta 1996). Недавние свидетельства позволяют предполагать, что изоформа VEGF может являться первичным медиатором заболевания глаз, однако остается четко определить роль других изоформ (Ishida 2003; Ishida 2003).
in vivo
Модели на животных для глазного ангиогенеза и диабетической ретинопатии использовали, чтобы показать критическую роль передачи сигнала VEGF в заболевании заднего сегмента. Результаты исследований фармакологической эффективности, проведенных в этих системах , использовали для подтверждения применимости различных способов лечения для человека. Более раннее определение ключевой роли, которую VEGF играет в патологическом ангиогенезе глаза, показали на модели ретинальной ишемии на не относящихся к человеку приматах, где VEGF в пространственном и временном отношении коррелировал с NV (Miller 1994; Tolentino 1996). Более того, инъекция VEGF в стекловидное тело приводит к ретинальной ишемии и микроангиопатии у тех же видов приматов (Tolentino 1996). Примечательно, что инъекция в стекловидное тело нейтрализующего моноклонального антитела анти-VEGF ингибирует NV, обнаруженную в этой модели, и предоставляет предварительное доказательство, что лечение анти-VEGF может являться многообещающим для заболевания человека (Adamis 1996). В моделях индуцированной кислородом ретинопатии (OIR) получают преретинальную NV, подобную NV, обнаруженной для заболеваний человека, ретинопатии недоношенных и PDR, и широко используют модели в анализах скрининга для антиангиогенных способов. В моделях OIR на грызунах уровни VEGF в сетчатке коррелируют с частотой возникновения и тяжестью патологии, а инъекция в стекловидное тело ингибитора RTK, блокирующего VEGFR, обеспечивает значительное снижение ретинальной NV (Werdich 2004; Unsoeld 2004). Модели индуцированной лазером хориоидальной NV на грызунах и приматах являются общепринятыми для экспериментальной имитации экссудативной AMD и, как показано, являются зависимыми от VEGF (Shen 1998; Kwak 2000; Krzystolik 2002). Результаты клинических офтальмологических исследований с макугеном (анти-VEGF аптамер, Eyetech/Pfizer) и луцентисом (rhFab против VEGF, Genentech) подтвердили, что ингибирование передачи сигнала VEGF является привлекательной офтальмологической мишенью (Eyetech Study Group 2002; Sorbera 2003; Saishin 2003).
Рецепторы ангиопоэтина
Ангиопоэтины (Ang1-4) являются лигандами для рецепторов Tie, Tie-1 и Tie-2, семейства RTK, которые избирательно экспрессированы на эндотелиальных клетках сосудов и некоторых гематопоэтических клетках (Yancopoulos 2000). Tie-2-/- мыши умирают во время эмбриогенеза на сутки 9,5-10,5, при этом сосуды являются несформированными с отсутствием организации (Asahara 1998). Ang1 и Ang2 полностью вовлечены в васкулогенез и ангиогенез, действуя через рецептор Tie-2. Регуляция Ang2 повышена в эндотелиальных клетках сетчатки посредством воздействия VEGF и гипоксии, и его экспрессия индуцирована во время физиологического и патологического ангиогенеза глаза (Oh 1999; Hackett 2000). Передача сигнала через Tie-2 может регулировать ангиогенез сетчатки согласованно с передачей сигнала VEGF и может являться критическим путем передачи сигнала при непролиферативной диабетической ретинопатии (Sarlos 2003; Hammes 2004; Ohashi 2004; Takagi 2003). Во множестве типов клеток, в хориоидальных неоваскулярных мембранах, полученных от пациентов с экссудативной AMD, регуляция Ang2 и VEGF согласованно повышена, и Tie-2 является экспрессированным (Otani 1999).
Семейство рецепторов PDGF
PDGFR-α и -β: Изоформы α и β рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGF) существуют в форме гомодимеров или α/β гетеродимеров и наиболее часто их обнаруживают на поверхности фибробластов, клеток гладких мышц и клеток эндотелия сосудов (Ostman 2001; Benjamin 1998). Ремоделирование кровеносных сосудов, по-видимому, определено покрытием эндотелия перицитами, которое регулируют PDGF-B и VEGF (Benjamin 1998). Связанные с опухолью фибробласты являются источником факторов роста, включая VEGF, следовательно, считают, что паракринная передача сигнала PDGF вносит вклад в прогрессирование заболевания для этих опухолей (Ponten 1994; Skobe 1998; Fukumura 1998). PDGFR-β вносит вклад в ангиогенез опухолей через пролиферацию и миграцию перицитов, периэндотелиальных клеток, которые связаны с несформированными кровеносными сосудами и стабилизируют их (Lindahl 1997; Hellstrom 1999; Reinmuth 2001; George 2001; Wang 1999). Показано, что ингибирование передачи сигнала рецептором PDGF в фибробластах и перицитах усиливает противоопухолевые эффекты химиотерапии посредством регуляции интерстициального давления жидкости в опухоли (Pietras 2002). Подобным образом, PDGF и PDGFR могут являться важными для ретинальных нейронов и микроциркуляторного русла и модулировать ангиогенез в глазах (Mudhar 1993; Wilkinson 2004).
RTK, экспрессированные гематопоэтическими клетками-предшественниками
Несколько RTK, включая VEGFR, CSF-IR, KIT и FLT3, являются экспрессированными гематопоэтическими клетками-предшественниками (HPC) и могут быть вовлечены в патологический ангиогенез глаза. Например, показано, что HPC проникают к участкам хориоидальной неоваскуляризации (Espinosa 2003; Cousins 2004). Однако, большинство данных, связанных с этими RTKi, получено на онкологических моделях. CSF-IR кодирован клеточным гомологом ретровирусного онкогена v-fms и является основным регулятором развития макрофагов (Sherr 1985). KIT экспрессируют гематопоэтические клетки-предшественники, тучные клетки, гаметы и пейсмекерные клетки кишечника (интерстициоциты Кахаля) (Natali 1992; Turner 1992). Он вносит вклад в прогрессию опухоли по двум основным механизмам: а именно, аутокринной стимуляции его лигандом, фактором стволовых клеток (SCF), и посредством мутаций, приводящих к независимой от лиганда киназной активности (Heinrich 2002; Tian 1999). FLT3 в норме экспрессирован на гематопоэтических стволовых клетках, где его взаимодействие с лигандом FLT3 (FL) стимулирует выживание, пролиферацию и дифференцировку стволовых клеток (Rosnet 1993; Rosnet 1996). Кроме сверхэкспрессии в различных лейкозных клетках (Dehmel 1996; Kiyoi 2002), FLT3 часто мутирован в гематологических злокачественных новообразованиях у приблизительно одной трети пациентов с острым миелоидным лейкозом (AML), несущих активирующие мутации (Stirewalt 2003; Armstrong 2003; Nakao 1996; Sawyers 2002; Kottaridis 2003).
Обоснование для многонаправленных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ
5
На основании вышеприведенной информации, протеинкиназы и RTK наметили для разработки новых фармакологических способов для множества состояний человека, таких как рак и заболевание заднего сегмента (Lawrence 1998; Gschwind 2004). Соответственно, многие фармацевтические компании развивают усилия в области медицинской химии для разработки как избирательных, так и многонаправленных ингибиторов RTK (Traxler 2001; Murakata 2002). Разработали высокоспецифические ингибиторы VEGFR-2 или KDR и показали для них сильное и эффективное ингибирование индуцированного опухолью ангиогенеза (Shaheen 2001; Boyer 2002, Bilodeau 2002; Manley 2002; и Curtin 2004). Соединение RTKi, SU1 1248, в настоящее время находится на клинических испытаниях для лечения опухолей. Это соединение выбрано на основании эффективности ингибиторов с избирательностью для различных киназ на модели онкогенеза клеток панкреатических островков у трансгенных мышей (Inoue 2002; McMahon 2002). В этой модели сочетание избирательного ингибитора KDR (SU5416) плюс гливек, ингибитор PDGFR и KIT, приводит к ответам, более сильным, чем для каждого средства в отдельности (Bergers 2003). Эти ответы включают в себя регрессию развившихся опухолей, что приписывают одновременному ингибированию передачи сигнала VEGF в эндотелиальных клетках и передачи сигнала PDGF в перицитах, поскольку наблюдают разрушение связывания эндотелиальная клетка-перицит. Существенно, что такого разрушения контактов эндотелиальная клетка-перицит не наблюдали в сосудистой сети этих животных вне опухолей.
Что касается офтальмологических признаков, Campochiaro et al. показали, что пероральное введение RTKi, избирательных для VEGFR, PDGFR и PKC (т.е., PKC-412), ингибирует как преретинальную, так и хориоидальную NV у мышей (Seo 1999). С использованием перорального введения RTKi с различными профилями избирательности, Campochiaro показал, что блокирования VEGFR-2 достаточно для полного предотвращения ретинальной NV, однако, оно не действует на развитые, покоящиеся ретинальные капилляры (Ozaki 2000). После этих доклинических результатов PKC-412 оценивали для пациентов - людей с диабетическим макулярным отеком (Campochiaro 2004). Хотя пилотные результаты позволяют предполагать уменьшение макулярного отека и улучшение остроты зрения, опасения относительно токсичности для печени замедляют клинические испытания. Позднее инъекцией в стекловидное тело RTKi, блокирующих VEGFR-2, IGF-IR, FGFR-I и EGFR, обеспечивали умеренное уменьшение (25%) среднего показателя ретинопатии в модели мышей OIR (Unsoeld 2004). Ни одно из соединений, тестированных в вышеупомянутых исследованиях, не обладало конкретным профилем связывания рецепторов, как у соединений, применимых в способах по настоящему изобретению. Авторы настоящего изобретения впервые показали, что для соединений, обладающих описанным здесь профилем связывания рецептора, наблюдают уникальные и неожиданные результаты по отношению к ингибированию неоваскуляризации и/или ангиогенеза.
Авторы настоящего изобретения впервые обнаружили, что для эффективного ингибирования неоваскуляризации является важным, чтобы терапевтическое соединение обладало активностью для многих рецепторов, как описано здесь. RTKi, заявляемые здесь, обеспечивают воспроизводимую эффективность против патологического глазного ангиогенеза и проницаемости сосудов после местной или системной терапии. Более того, описанные здесь RTKi для применения в способах по изобретению вызывают регрессию образования новых сосудов в глазах и/или ангиогенеза. Неожиданно, заявляемые здесь RTKi предоставили несколько новых преимуществ по отношению к офтальмологическому применению по сравнению с другими публично описанными соединениями.
Идентификация и избирательность для киназ предпочтительных соединений
Высокая гомология вторичной структуры каталитических доменов конкретных RTK, таких как рецепторы VEGF и PDGF, позволяет предполагать возможность идентификации соединений, ингибирующих множество членов семейства. Предпочтительные соединения для применения в способах по настоящему изобретению обладают таким профилем. Анализы для определения активности тестируемых соединений по связыванию рецептора, хорошо известные специалисту в данной области, можно использовать для идентификации дополнительных потенциальных соединений для применения в способах по настоящему изобретению.
Модели, описанные в примерах ниже, можно использовать для идентификации дополнительных эффективных соединений для потенциального применения в способах по изобретению или для выбора предпочтительного соединения из соединений, идентифицированных посредством анализов связывания рецептора, хорошо известных специалисту в данной области. Например, тестируемое соединение можно оценивать в модели OIR на крысах, описанной в примере 1, полученной с помощью лазера модели на мышах, описанной в примере 3, модели на крысах с применением VEGF, описанной в примере 6, и модели на крысах с диабетом, описанной в примере 7. Потенциальные RTKi (тестируемые соединения) для применения в способах по изобретению предпочтительно обеспечивают:
- >75% ингибирование преретинальной NV в модели OBR на крысах после однократной инъекции в стекловидное тело ≤3% раствора или суспензии, или перорального введения через желудочный зонд раствора или суспензии <30 мг/кг/сутки.
- >70% ингибирование хориоидальной NV в полученной с помощью лазера модели на мышах после однократной инъекции в стекловидное тело ≤3% раствора или суспензии, или перорального введения через желудочный зонд раствора или суспензии <30 мг/кг/сутки.
- >50% ингибирование проницаемости сосудов сетчатки в модели на крысах с применением VEGF после однократной инъекции в стекловидное тело ≤3% раствора или суспензии, или перорального введения через желудочный зонд раствора или суспензии <30 мг/кг/сутки.
- >75% ингибирование проницаемости сосудов сетчатки в модели индуцированного STZ диабета у крыс после однократной инъекции в стекловидное тело ≤3% раствора или суспензии, или перорального введения через желудочный зонд раствора или суспензии <30 мг/кг/сутки.
Соединения, способные достигать активности в описанных выше категориях, будут являться предпочтительными средствами с потенциальной клинической применимостью. Для более предпочтительных средств будут также показывать >25% регрессию хориоидальной NV в полученной с помощью лазера модели на мышах после однократной инъекции в стекловидное тело ≤3% раствора или суспензии, или 50% регрессию при пероральном введении через желудочный зонд раствора или суспензии <30 мг/кг/сутки.
Наиболее предпочтительное соединение для применения по настоящему изобретению, AL-39324 (N-[4-[3-амино-1H-индазол-4-ил]фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина), является сильным, конкурирующим с АТФ ингибитором для всех членов рецепторных тирозинкиназ VEGF и PDGF с отсутствием существенного ингибирования других тирозин- и серин/треонинкиназ. Его профиль ингибирования киназ показан в таблице 1. Его идентифицировали на основании его активности в первичных ферментативных анализах рецептора VEGF/PDGF, в анализах на клетках, стимулированных факторами роста, и в модели индуцированного эстрадиолом отека матки у мышей, все эти анализы хорошо известны специалисту в данной области. С использованием этого способа тестирования идентифицировали несколько серий новых, конкурирующих с АТФ многонаправленных ингибиторов RTK, включая замещенные мочевиной аминоиндазолы, членом которых является AL-39324.
50
50
50
Предпочтительные соединения RTKi для применения в способах по настоящему изобретению являются сильными конкурентными ингибиторами участка связывания АТФ для выбранной группы RTK. То есть, предпочтительные средства одновременно блокируют аутофосфорилирование по тирозину рецептора 1 VEGF (FIt-I), рецептора 2 VEGF (KDR), рецептора 3 VEGF (Flt-4), TIE-2, PDGFR, c-KIT, FLT-3 и активность CSF-IR в низких нМ концентрациях. Предпочтительно, соединения для применения в способах по изобретению обладают IC в диапазоне между 0,1 нМ и 250 нМ для каждого из этих рецепторов. Более предпочтительные соединения обладают IC в диапазоне между 0,1 нМ и 100 нМ по меньшей мере для шести из этих рецепторов. Наиболее предпочтительные соединения обладают IC в диапазоне между 0,1 нМ и 10 нМ по меньшей мере для четырех из этих рецепторов.
В других вариантах осуществления RTKi для применения в способах по изобретению одновременно блокируют аутофосфорилирование по тирозину (a) KDR, FIt-I, PDGFR и Tie-2; (b) KDR, FIt-I и Tie-2; (c) KDR, FIt-I и PDGFR; (d) KDR, Tie-2 и PDGFR; (e) KDR и Tie-2; и (f) KDR и PDGFR. Следует понимать, что описанные выше предпочтительные профили связывания представлены не в конкретном порядке предпочтения, а просто представляют дополнительные предпочтительные профили связывания для соединений, применимых в способах по изобретению.
Авторы настоящего изобретения показали, что RTKi с описанным здесь профилем связывания воспроизводимо вызывают ингибирование и регрессию ретинальной (примеры 1-2) и хориоидальной неоваскуляризации (примеры 3-5), а также блокируют усиленную VEGF (пример 6) и индуцированную диабетом (пример 7) проницаемость сосудов сетчатки. Ни для одного из известных ранее соединений RTKi не показали предпочтительного профиля связывания или не показали полного ингибирования плюс регрессии ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации, и блокирования усиленной VEGF и диабетом проницаемости сосудов сетчатки настолько сильно или эффективно.
Наиболее предпочтительным соединением для применения в способах по настоящему изобретению является N-[4-[3-амино-1H-индазол-4-ил)фенил]-N'-(2-фтор-5-метилфенил)мочевина (обозначенное здесь также AL-39324), обладающее следующей структурой:
Как показано выше, RTKi, заявленные в настоящем изобретении, при использовании для глаз предоставляют несколько отдельных и новых преимуществ относительно других опубликованных ингибиторов тирозинкиназы: 1) высоко активное и эффективное ингибирование ретинальной и хориоидальной неоваскуляризации, 2) регрессию существующей CNV, 3) выраженное ингибирование индуцированной VEGF и диабетом проницаемости сосудов сетчатки, и 4) интраокулярную переносимость (пример 8). Новый профиль избирательности RTK, обеспечиваемый предпочтительными RTKi для применения в способах по изобретению, вероятно, отвечает за их отличительную активность по сравнению с описанными ранее RTKi и другими классами соединений. Профиль избирательности этих соединений, в сочетании с их физико-химическими свойствами, делает их кандидатами для новой доставки посредством местного введения. В общем, эти характеристики обеспечивают предпочтительные соединения с особенными преимуществами как для эффективности, так и для безопасности во время лечения наиболее распространенных причин приобретенной слепоты.
Конкретные RTKi известны как обладающие антиангиогенной активностью и заявлены для офтальмологических и не офтальмологических показаний. Например, в ряде патентов/патентных заявок США и международных патентов/патентных заявок заявлено применение ингибиторов протеинтирозинкиназ в качестве антиангиогенных средств: патенты США No 6177401 B1; 5773459; 6448277 B2; 6765012 B2; патентная заявка США No 2004/0002501 A1; патенты PCT No WO 01/85691 A1; патентные заявки PCT No WO 00/67738; 03/22852 A2; 03/068228; 03013439/JP; 03/080625; и европейская патентная заявка No EP 02787595 2002. Ни в одной из данных ссылок не предполагают, что является предпочтительным лечить по офтальмологическим показаниям с использованием RTKi, обладающих конкретными предпочтительными профилями связывания соединений, описанными здесь.
Предпочтительными RTKi для применения в способах по настоящему изобретению являются соединения, описанные в заявке США 20050020603, поданной 10 мая 2004 г., и в заявке PCT № PCT/US 04/16166, поданной 21 мая 2004 г., обе основаны на предварительной заявке №60/472810, поданной 22 мая 2003 г.
RTKi для применения в способах по изобретению можно вводить посредством любого целесообразного способа или пути введения, однако, местное введение является предпочтительным. Предполагают, что можно использовать все местные доступы к глазу, включая местное, субконъюнктивальное, окологлазное, ретробульбарное введение, введение в субтеноново пространство, внутрикамерное введение, введение в стекловидное тело, внутриглазное, субретинальное и супрахориоидальное введение. Возможно системное или парентеральное введение, включая в качестве неограничивающих примеров внутривенное, подкожное и пероральное введение. Наиболее предпочтительным способом введения является инъекция раствора или суспензии в стекловидное тело или в субтеноново пространство, или размещение биоразлагаемых или не биоразлагаемых устройств в стекловидном теле или субтеноновом пространстве, или местное глазное введение раствора или суспензии, или заднее околосклеральное введение гелевого состава. Другим предпочтительным способом введения является введение в стекловидное тело биоразлагаемого имплантата, вводимого посредством устройства, такого как описанное в патентной заявке США серийный номер 60/710046, поданной 22 августа 2005 г.
Как правило, дозы, применяемые для описанных выше целей, будут меняться, однако будут представлять собой эффективное количество для ингибирования или вызывания регрессии неоваскуляризации или ангиогенеза. В других аспектах дозы будут представлять собой эффективное количество для предупреждения или лечения AMD, DR, осложнения, связанного с ретинальной ишемией и макулярного и/или ретинального отека. Как применяют здесь, термин «фармацевтически эффективное количество» означает количество одного или нескольких RTKi, которое эффективно лечит AMD, DR и/или ретинальный отек, или ингибирует неоваскуляризацию или ангиогенез, или вызывает регрессию неоваскуляризации или ангиогенеза у пациента-человека. Дозы, применяемые для любой из описанных выше целей, как правило, составляют от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 миллиграмм на килограмм массы тела (мг/кг), вводимые от одного до четырех раз в сутки. При местном введении композиций дозы, как правило, лежат в диапазоне концентраций от 0,001 до приблизительно 5% масс./об., с введением 1-2 капель 1-4 раза в сутки. Для введения в стекловидное тело, заднего околосклерального введения, введения в субтеноново пространство или другого типа местного введения, соединения, как правило, присутствуют в диапазоне концентраций от 0,001 до приблизительно 10% масс./об. При введении посредством имплантата соединения, как правило, присутствуют в диапазоне концентраций от 0,001 до приблизительно 40% масс./об.
Следующие примеры приведены, чтобы продемонстрировать предпочтительные варианты осуществления по изобретению. Специалистам в данной области следует принимать во внимание, что описанные в следующих примерах способы представляют собой способы, которые, как обнаружили авторы настоящего изобретения, хорошо действуют при осуществлении изобретения на практике и которые, таким образом, можно рассматривать как предпочтительные способы для его осуществления на практике. Однако специалистам в данной области в свете настоящего описания следует принимать во внимание, что можно внести множество изменений в описанные конкретные варианты осуществления и все еще получать подобный или одинаковый результат без отклонения от сущности и объема изобретения.
Пример 1
Предупреждение преретинальной неоваскуляризации после введения в стекловидное тело ингибитора рецепторной тирозинкиназы (RTKi), AL-39324, в модели индуцированной кислородом ретинопатии на крысах
:
МЕТОДЫБеременные крысы Sprague-Dawley получены на 14 сутки беременности и затем рожали на 22 ± 1 сутки беременности. Немедленно после рождения крысят пулировали и случайно распределяли по отдельным пометам (n=17 крысят/помет), помещенным в отдельные переносные клетки внутри камеры для подачи кислорода и подвергали профилю воздействия кислорода от 0-14 постнатальных суток. Затем пометы помещали в комнатный воздух от суток 14/0 до суток 14/6 (14-20 постнатальные сутки). Кроме того, на сутки 14/0, каждого крысенка случайно записывали в качестве контроля с воздействием кислорода или в различные группы обработки. Для случайно распределенных в группу обработки инъекцией: в один глаз инъекцией в стекловидное тело вводили 5 мкл 0,1%, 0,3%, 0,6% или 1% AL-39324, а в контралатеральный глаз инъекцией в стекловидное тело вводили 5 мкл носителя. На сутки 14/6 (20 постнатальных суток), всех животных в обоих исследованиях подвергали эвтаназии.
P
Сразу после эвтаназии, сетчатки от всех крысят собирали, фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов, подвергали окрашиванию АДФазой и фиксировали на стеклах как тотальные препараты. Для каждого удовлетворительно подготовленного плоского препарата получали цифровые изображения. Компьютеризованный анализ изображений применяли для получения оценки NV в баллах по часовым меридианам для каждого поддающегося прочтению образца. Каждый часовой меридиан из всего 12 для сетчатки оценивали по присутствию или отсутствию преретинальной NV. Статистические сравнения с использованием средних баллов NV для часовых меридианов для каждой из групп лечения использовали в непараметрических анализах. Для каждого крысенка без инъекции представляли один показатель NV, принимая среднее значение для обоих глаз, и использовали для сравнения с каждой группой дозирования. Поскольку крысят распределяли случайно и не обнаружили разницы для контрольных крысят из всех пометов после воздействия кислорода, показатели NV объединяли для всех групп обработки. ≤ 0,05 считали статистически значимым.
:
РЕЗУЛЬТАТЫ Местное введение AL-39324 обеспечивает сильную антиангиогенную эффективность против преретинальной неоваскуляризации, где наблюдали 100% ингибирование преретинальной NV суспензиями между 0,3%-1%. Показали общие статистические различия между группами обработки (тест Крускала-Уоллиса в однофакторном ANOVA: P<0,001) (ФИГ.1). Для глаз после обработки 0,3-1% AL-39324 показали значительное ингибирование преретинальной NV по сравнению с глазами после инъекции носителя и контрольными глазами без инъекции (таблица 2). Эффективности не наблюдали для 0,1% глаз после обработки.
Таблица 2
Обработка
% ингибирования (по сравнению с глазом после инъекции носителя)
значение <i>p</i>
Медианная NV
Диапазон NV
Медианная NV (носитель)
Диапазон NV (носитель)
Контроль без обработки
7,8
3,2-10,9
0,1% AL-39324
37
0,161
2,835
1,1-5,3
4,5
1,1-8,4
0,3% AL-39324
100
0,002
0
0-5
7
2-8,72
0,6% AL-39324
100
<0,001
0
0-1,1
5,45
2-10,9
1% AL-39324
100
<0,001
0
0-2
4
1-8
Пример 2
Системное введение AL-39324 (RTKi) активно предупреждает преретинальную неоваскуляризацию в модели на крысах OIR.
:
МЕТОДЫБеременные крысы Sprague-Dawley получены на 14 сутки беременности и затем рожали на 22±1 сутки беременности. Немедленно после рождения крысят пулировали и случайно распределяли по отдельным пометам (n=17 крысят/помет), помещенным в отдельные переносные клетки внутри камеры для подачи кислорода и подвергали профилю воздействия кислорода от 0 до 14 постнатальных суток. Затем пометы помещали в комнатный воздух от суток 14/0 до суток 14/6 (14-20 постнатальные сутки). Кроме того, на сутки 14/0 каждого крысенка случайно записывали в качестве контроля с воздействием кислорода для обработки носителем или для обработки лекарственным средством при 1,5, 5, 10 мг/кг p.o., BID. На сутки 14/6 (20 постнатальных суток) всех животных в обоих исследованиях подвергали эвтаназии и получали тотальные препараты сетчатки, как описано в примере 1 выше.
:
РЕЗУЛЬТАТЫ Системное введение RTKi, AL-39324, обеспечивает сильную эффективность в модели на крысах OIR, где 20 мг/кг/сутки p.o. обеспечивает полное ингибирование преретинальной NV. Показали общие статистические различия между группами обработки и необработанными контролями (тест Крускала-Уоллиса в однофакторном ANOVA: P<0,001) (фиг. 2, таблица 3). Для крысят после введения 10 и 20 мг/кг/сутки p.o. показали значительное ингибирование преретинальной NV по сравнению с обработанными носителем крысятами, где наивысшая доза обеспечивает полное ингибирование (тест ранговых сумм Манна-Уитни: P= 0,005 и P< 0,001). Крысята после введения 3 мг/кг/сутки p.o. не обладали значительным снижением NV.
Таблица 3
Обработка
% ингибирования (по сравнению с глазом после инъекции носителя)
значение <i>p</i>
Медианная NV
Диапазон NV
Контроль без обработки
0,427
5,885
2,5-10,5
PEG 400 (носитель)
7,4
3,5-9,5
3 мг/кг AL-39324 в PEG 400
-1,4
0,91
7,5
3,8-9,8
10 мг/кг AL-39324 в PEG 400
86,4
0,001
1,105
0-8
20 мг/кг AL-39324 в PEG 400
100
<0,001
0
0
Пример 3
Предупреждение индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации (CNV) у мыши после введения в стекловидное тело ингибитора рецепторной тирозинкиназы (RTKi), AL-39324.
МЕТОДЫ. CNV вызывали посредством индуцированного лазером разрыва оболочки Бруха. Коротко, мышей C57BL/6J в возрасте от 4 до 5 недель подвергали анестезии с использованием внутрибрюшинного введения гидрохлорида кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг), и зрачки обоих глаз расширяли местным введением 1% тропикамида и 2,5% Mydfm. Одну каплю целлюлозы (Gonioscopic) местно применяли для смазывания роговицы. Переносное покровное стекло накладывали на роговицу и использовали как контактную линзу для облегчения визуализации дна. От трех до четырех ожогов сетчатки наносили в случайно назначенный глаз (правый или левый глаз для каждой мыши) с использованием лазера Alcon 532 нм EyeLite с системой введения щелевой лампой. Лазерные ожоги использовали для получения разрыва в оболочке Бруха, который показывали офтальмологически по формированию пузырька под сетчаткой. Только мышей с лазерными ожогами, для которых получали три пузырька на глаз, включали в исследование. Ожоги, как правило, помещали в положениях 3, 6, 9 или 12 часа в заднем полюсе сетчатки, избегая ответвлений ретинальных артерий и вен.
2
Каждую мышь случайным образом назначали в одну из следующих групп обработки: контроли без инъекции, контроли с ложной инъекцией, мыши с инъекцией носителя или одна из трех групп с инъекцией одного из трех RTKi. Контрольных мышей подвергали лазерной фотокоагуляции в обоих глазах, где в один глаз вводили ложную инъекцию, т.е. пункцию иглой в плоскую часть реснитчатого тела. Для животных с инъекцией в стекловидное тело, в один обработанный лазером глаз вводили инъекцию в стекловидное тело 5 мкл 0%, 0,3%, 1% или 3% AL-39324. Инъекцию в стекловидное тело выполняли сразу после лазерной фотокоагуляции. На 14 сутки после воздействия лазера всех мышей подвергали анестезии и системной перфузии меченного флуоресцеином декстрана. Глаза собирали и получали в виде хориоидальных плоских препаратов со стороной RPE, обращенной к наблюдателю. Все хориоидальные плоские препараты обследовали с использованием флуоресцентного микроскопа. Фиксировали цифровые изображения CNV, где CNV идентифицировали как области гиперфлуоресценции на окрашенном фоне. Компьютеризованный анализ изображений использовали для определения границ и измерения двумерных областей гиперфлуоресцентной CNV на очаг (мкм) для измерения исхода. Медианную площадь CNV/ожог для мыши из группы обработки или среднюю площадь CNV/ожог для группы обработки использовали для статистического анализа в зависимости от нормальности распределения данных; P ≤ 0,05 считали значимым.
Результаты. Местное введение RTKi, AL-39324, обеспечивает сильную антиангиогенную эффективность на модели индуцированной лазером CNV у мышей. Показали общие статистические различия между группами обработки с помощью однофакторного ANOVA по Крускалу-Уоллису (P = 0,015) (ФИГ.3). Более того, для глаз после инъекции 1% AL-39234 (↓84,1%) и 3% AL-39234 (↓83,0%) показали значительное ингибирование CNV по сравнению с глазами после инъекции носителя (тест ранговых сумм Манна-Уитни; P=0,004 и P=0,017, соответственно). Разницу с пограничной достоверностью обнаружили между глазами после инъекции 0,3% AL-39234 и глазами после инъекции носителя (P=0,082).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Медианное и среднее ± s.d. площади CNV/ожог на мышь в контрольной группе без инъекции составляло 21721 мкм и 32612 ± 23131 мкм (n=4 мыши) и для ложной инъекции составляло 87854 мкм и 83524 ± 45144 мкм (n=4 мыши). Медианное и среднее ± s.d. площади CNV/ожог на мышь в группе мышей с обработкой носителем составляло 133014 мкм и 167330 ± 143201 мкм (n=6 мышей). Медианное/среднее ± s.d. в группах после обработки 0,3%, 1% и 3% AL-39324 составляли 38891 мкм и 44283 ± 28886 мкм (n=5 мышей); 21122 мкм и 21036 ± 3100 мкм (n=5 мышей); 22665 мкм и 27288 ± 12109 мкм (n=5 мышей) соответственно.
Пример 4
Введение в стекловидное тело RTKi, AL-39324, вызывает регрессию существующей индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации (CNV) у мыши
МЕТОДЫ: CNV получали посредством индуцированного лазером разрыва оболочки Бруха, как описано выше в примере 3. Каждую мышь случайным образом распределяли в одну из следующих групп обработки: контроли без инъекции, контроли с ложной инъекцией, мыши с инъекцией носителя, группа с инъекцией AL-39324. Контрольных мышей подвергали лазерной фотокоагуляции обоих глаз, где в один глаз вводили ложную инъекцию, т.е. пункцию иглой в плоскую часть реснитчатого тела. Для животных с инъекцией в стекловидное тело в один обработанный лазером глаз вводили инъекцию в стекловидное тело 5 мкл 0%, 1% или 3% AL-39324 или 2 мкл 1% AL-39324. Всем мышам проводили лазерную фотокоагуляцию на сутки 0. Для мышей, случайно распределенных в группу инъекции, проводили однократную инъекцию в стекловидное тело на 7 сутки после воздействия лазера. Также на 7 сутки после воздействия лазера нескольких мышей без инъекции подвергали эвтаназии и использовали их глаза в качестве контролей. На 14 сутки после воздействия лазера всех оставшихся мышей подвергали эвтаназии и системной перфузии меченного флуоресцеином декстрана. Затем глаза собирали и получали в виде хориоидальных плоских препаратов со стороной RPE, обращенной к наблюдателю. Хориоидальные плоские препараты анализировали, как описано выше в примере 3.
P
РЕЗУЛЬТАТЫ: Местное введение RTKi, AL-39324, вызывало регрессию существующей индуцированной лазером CNV у взрослой мыши. Показали общие статистические различия между группами обработки с помощью однофакторного ANOVA по Крускалу-Уоллису ( = 0,002) (ФИГ.4). К 14 суткам после лазерного разрыва в оболочке Бруха, медианная площадь CNV в глазах после инъекции 2 мкл 1% AL-39324 (↓45,4%), 5 мкл 1% AL-39324 (↓29,7%) и 5 мкл 3% AL-39324 (↓41,0%) являлась значительно сниженной по сравнению с величиной CNV, присутствующей на 7 сутки после воздействия лазера (тесты ранговых сумм Манна-Уитни; P=0,025, P=0,039 и P=0,012, соответственно). Для глаз после инъекции 2 мкл 1% AL-39234 (↓55,9%), 5 мкл 1% AL-39234 (↓43,7%) и 3%-39234 (↓52,3%) показали значительное ингибирование CNV по сравнению с глазами после инъекции носителя на 14 сутки после воздействия лазера (тесты ранговых сумм Манна-Уитни; P=0,009, P=0,006, и 0,001, соответственно). Макроскопическе уменьшение развития CNV наблюдали как уменьшение гиперфлуоресцентной области в участке лазерной фотокоагуляции в глазах после инъекции 1% или 3% AL-39324 по сравнению с 1) контрольными глазами на 7 сутки после воздействия лазера и 2) глазами после инъекции носителя на 14 сутки после воздействия лазера (ФИГ.5).
Таблица 4
Медианная CNV (мкм)
Средняя CNV (мкм)
SE
N (мышей)
Контроль на сутки 7
51808
54452
5385
12
Контроль без инъекции на сутки 14
32881
34589
8413
4
Контроль с ложной инъекцией на сутки 14
54078
48594
8614
4
Носитель
64067
65932
5833
12
1% AL-39324 (2 мкл)
28268
30959
7287
4
1% AL-39324 (5 мкл)
36429
39178
5861
11
3% AL-39324 (5 мкл)
30560
35174
4110
8
Пример 5
Системное введение RTKi, AL-39324, обеспечивает зависимое от дозы ингибирование и регрессию индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации (CNV) у мыши.
МЕТОДЫ. CNV получали посредством индуцированного лазером разрыва оболочки Бруха, как описано в примере 3 выше. Мышей случайным образом распределяли в группы для перорального введения через желудочный зонд 0, 3, 10 и 20 мг/кг/сутки AL-39324. Мышам перорально вводили через желудочный зонд 0, 1,5, 5 или 10 мг/кг дважды в сутки и в течение 14 суток после воздействия лазера. Для модели регрессии или вмешательства мышей случайным образом распределяли по группам для введения 0, 1,5, 5 или 10 мг/кг AL-39324 p.o. BID, (0, 3, 10 или 20 мг/кг/сутки) на 7 сутки после лазерной фотокоагуляции. Пероральное введение через желудочный зонд продолжали дважды в сутки в течение 14 суток после воздействия лазера. Нескольких мышей подвергали эвтаназии на 7 сутки после воздействия лазера и использовали для контроля. На 14 сутки после воздействия лазера всех мышей подвергали анестезии и системной перфузии меченного флуоресцеином декстрана. Затем глаза собирали и получали в виде хориоидальных плоских препаратов, как описано в примере 3 выше.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Системное введение ведущего RTKi, AL-39324, обеспечивает сильное и высоко эффективное ингибирование индуцированной лазером CNV, где для мышей, обработанных 20 мг/кг/сутки, показали полное ингибирование развития CNV и значительную регрессию развившейся CNV. В модели предупреждения показали общие статистические различия между группами обработки с помощью однофакторного ANOVA по Крускалу-Уоллису (P 0,001) (ФИГ.6, Таблица 5a). Более того, системное введение 20 мг/кг/сутки AL-39324 обеспечивает полное ингибирование CNV (P<0,009), и для мышей, обработанных 10 мг/кг/сутки, показали 84,3% ингибирование CNV (P<0,002). Для мышей, обработанных 3 мг/кг/сутки, не показали значительного ингибирования (P<0,589) по сравнению с глазами после инъекции носителя (тесты ранговых сумм Манна-Уитни).
В модели регрессии показали общие статистические различия между группами обработки с помощью однофакторного ANOVA по Крускалу-Уоллису (P 0,001) (фигура 7 и таблица 5b). Для мышей, обработанных 20 мг/кг/сутки и 10 мг/кг/сутки, показали значительную регрессию существующей CNV до 68,0% и 41,8%, соответственно, по сравнению с необработанными контролями (тест ранговых сумм Манна-Уитни, P 0,002 и P 0,011, соответственно). Для мышей, обработанных 3 мг/кг/сутки, не показали значительной регрессии существующей CNV (тест ранговых сумм Манна-Уитни, P> 0,065). Не обнаружили значительной разницы между контрольной и обработанной носителем группами (тест ранговых сумм Манна-Уитни, P=0,792).
Таблица 5a
Медианная CNV (мкм<sup>2</sup>)
Средняя CNV (мкм<sup>2</sup>)
SD
Число мышей
Носитель
26417
25316
11196
6
3 мг/кг/день AL-39324
22317
21670
7012
6
10 мг/кг/день AL-39324
4137
4046
3625
6
20 мг/кг/день AL-39324
0
3266
5079
6
Таблица 5b
Обработка
Медианная CNV (мкм<sup>2</sup>)
Средняя CNV (мкм<sup>2</sup>)
SD
Число мышей
Контроль
47055
49665
11183
5
Носитель
41362
52974
33403
6
3 мг/кг/день AL-39324
33967
35442
11807
8
10 мг/кг/день AL-39324
27389
29773
9514
8
20 мг/кг/день AL-39324
15036
15706
8301
8
Пример 6
Введение в стекловидное тело RTKi, AL-39324, ингибирует индуцированную VEGF проницаемость сосудов сетчатки у крысы
:
МЕТОДЫ Взрослых крыс Sprague-Dawley подвергали внутримышечной анестезии кетамина/ксилазина и их зрачки расширяли местным введением мидриатических средств. Крыс случайным образом распределяли в группы для инъекции в стекловидное тело 0%, 0,3%, 1,0% и 3,0% AL-39324 и в группу положительного контроля. Десять мкл каждого соединения инъецировали в стекловидное тело в каждый обрабатываемый глаз (n=6 глаз на группу). Через трое суток после первой инъекции в стекловидное тело всем животным в оба глаза вводили инъекцию в стекловидное тело 10 мкл 400 нг hr VEGF. Через двадцать четыре часа после инъекции VEGF для всех животных выполняли внутривенное вливание 3% синего красителя Эванса, где 50 мг/кг синего красителя Эванса вводили инъекцией в боковую хвостовую вену во время общей анестезии. После циркуляции красителя в течение 90 минут крыс подвергали эвтаназии. Затем крыс подвергали системной перфузии сбалансированным солевым раствором, затем оба глаза каждой крысы немедленно удаляли, и сетчатки собирали с использованием хирургического микроскопа. После измерения массы сетчатки во влажном состоянии синий краситель Эванса экстрагировали посредством помещения сетчатки в 0,2 мл формамида (Sigma) с последующими гомогенизацией и ультрацентрифугированием. Образцы крови центрифугировали и плазму разводили в 100 раз формамидом. Для образцов как сетчатки, так и плазмы, 60 мкл супернатанта использовали для измерения поглощения синего красителя Эванса (ABS) при 620/740 нм. Нарушение гематоретинального барьера и, в результате, проницаемость сосудов сетчатки измеряли по поглощению красителя как среднее +/- s.e.m. от массы нетто ABS/массу во влажном состоянии/ABS в плазме. Двусторонний t-тест Стьюдента использовали для попарных сравнений между глазами OS и OD в каждой группе. Однофакторный ANOVA использовали для определения общей разницы между способами обработки, где P < 0,05 считали значимым.
.
РЕЗУЛЬТАТЫОднократная инъекция в стекловидное тело AL-39324 обеспечивает сильное и эффективное ингибирование индуцированной VEGF проницаемости сосудов сетчатки у крыс (ФИГ.8). Показали общую статистическую разницу между группами обработки и контролями с носителем (тест Стьюдента-Ньюмана-Коулса в однофакторном AVOVA: P<0,001). Проницаемость сосудов сетчатки являлось значительно сниженной в глазах, обработанных AL-39324, по сравнению с обработанными носителем глазами: 0,3% AL-39324 (↓50%), 1,0% AL-39324 (↓61%), 3% AL-39324 (↓53%) и положительным контролем (↓69%), соответственно.
Среднее ABS ± s.e.m. в группе контроля с носителем составляло 9,93±1,82. В группе с обработкой лекарственным средством 0,3% AL-39324 составляло 4,84±0,64; в группе 1,0% AL-39324 составляло 3,87±0,62; в группе 3,0% AL-39324 составляло 4,75±0,40 и в группе положительного контроля составляло 3,11±0,46. Значительной разницы между группами, обработанными лекарственным средством, обнаружено не было.
Пример 7
Введение в стекловидное тело RTKi, AL-39324, ингибирует индуцированную VEGF проницаемость сосудов сетчатки у крысы
МЕТОДЫ: У самцов крыс Long-Evans индуцировали диабет с помощью 65 мг/кг стрептозотоцина (STZ) после голодания в течение ночи. После подтверждения диабета (глюкозы в крови > 250 мг/дл) начинали обработку посредством перорального введения через желудочный зонд. Крысам без диабета (NDM) и с диабетом (DM) перорально вводили через желудочный зонд либо носитель, либо AL-39324 при 1,5 или 5 мг/кг/сутки BID. Спустя 2 недели имплантировали катетеры в яремную вену за 1 сутки до вливания индикаторного красителя. Проницаемость сосудов сетчатки, RVP, измеряли с использованием проникновения альбумина с синим Эванса (45 мг/кг) после 2-часового периода циркуляции.
:
РЕЗУЛЬТАТЫ Обе группы, NDM и DM, хорошо переносили пероральную обработку RTKi без наблюдаемых системных или побочных эффектов ERG. Уровни глюкозы в крови и массы тела не отличались между контролем DM и группами обработки DM. Диабет увеличивал RVP (38,1+33,4 мкл/г/час, n=9) по сравнению с контролем NDM (7,3+2,5 мкл/г/час, n=5, p<0,001). RVP являлась значительно сниженной у животных DM после обработки AL-39324 при 1,5 мг/кг/сутки (11,4±4,1 мкл/г/час, n=6, p<0,05) и при 5 мг/кг/сутки (8,9±3,1 мкл/г/час, n=7, p<0,01), по сравнению с контролем DM (Фиг.9). RVP не менялась у NDM, обработанных при 5 мг/кг/сутки.
Пример 8
Предварительное исследование интраокулярной безопасности с использованием однократной инъекции в стекловидное тело AL-39324 у взрослой крысы
Пилотное исследование интраокулярной безопасности (не-GLP) выполняли с использованием однократной инъекции в стекловидное тело взрослых крыс 0, 0,1 и 1,0% AL-39324. Измерения исходов продолжали вплоть до 1 месяца после инъекции, и они включали в себя клинические (фотографирование дна и обратная офтальмоскопия), функциональные (электроретинография) и морфологические (гистопатология) способы. У животных, обработанных AL-39324, по сравнению с контролями после инъекции носителя не обнаружили значительных неблагоприятных событий.
Все композиции и/или способы, описанные и заявленные здесь, можно получать и выполнять без излишних экспериментов в свете настоящего описания. В то время как композиции и способы по настоящему изобретению описаны в отношении предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области будет очевидно, что можно вводить изменения в композиции и/или способы и в стадии или в последовательность стадий описанного здесь способа без отклонения от идеи, сущности и объема изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что описанные здесь вещества можно заменить конкретными веществами, которые являются как химически, так и структурно родственными им, для достижения сходных результатов. Полагают, что все такие замены и модификации, очевидные специалистам в данной области, попадают в сущность, объем и идею изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
Список литературы
Следующие литературные источники в той степени, в которой в них приведены примеры способов или другие подробности, дополнительные к приведенным здесь, определенно приведены здесь в качестве ссылки.