ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗЫ АКТИВАЦИИ Т-КЛЕТОК, ОСНОВАННЫЕ НА ИЗМЕРЕНИИ РНК С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

1. Способ детекции копий по меньшей мере одной молекулы РНК, экспрессируемой в отдельных клетках, включающий:
(a) предоставление образца, содержащего популяцию клеток, которые экспрессируют специфические рецепторы, способные инициировать сигнальные каскады, приводящие к экспрессии генов при связывании с ними лигандов или стимулирующих молекул;
(b) индукцию экспрессии генов в клетках ex vivo либо сразу, либо после культивирования при инкубировании клеток по меньшей мере с одним соединением, которое связывается специфическими рецепторами и инициирует экспрессию генов;
(c) фиксацию и пермеабилизацию клеток;
(d) мечение копий по меньшей мере одной молекулы РНК, экспрессируемой клетками, с помощью набора флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов гибридизации и удаление несвязавшихся зондов при промывке; и
(e) детекцию клеток с событиями экспрессии с помощью проточной цитометрии (FC), где событие экспрессии является одним или более измерениями флуоресценции, которые группируют с помощью гейтирования интенсивности флуоресценции.
2. Способ по п. 1, где стадия индукции включает стимуляцию сигнализации T-клеточных рецепторов (TCR) и последующей экспрессии генов с помощью антигенпрезентирующих клеток (APC), которые присутствуют в популяции клеток, или с помощью искусственных APC (aAPC).
3. Способ по п. 2, где стимуляция с помощью APC или aAPC индукции происходит в течение периода, выбранного из группы, состоящей из от 30 мин до 6 ч, от 6 до 24 ч и от 24 до 72 ч.
4. Способ по п. 2, где стадия индукции включает костимуляцию с использованием по меньшей мере одного моноклонального антитела (mAb).
5. Способ по п. 2, где стадия индукции включает костимуляцию с использованием по меньшей мере одного моноклонального антитела (mAb), которое связывается с aAPC.
6. Способ по п. 1, где соединение получено из микроорганизма.
7. Способ по п. 1, где соединение включает пептид или смесь пептидов.
8. Способ по п. 2, где пептид или смесь пептидов, которые связываются с молекулами MHC класса I или MHC класса II, добавляют к APC или aAPC.
9. Способ по п. 8, где пептид или смесь пептидов присутствует в концентрации от 1 до 20 мкг/мл.
10. Способ по п. 1, где по меньшей мере одна молекула РНК кодируется геном цитокина.
11. Способ по п. 10, где ген кодирует IL-2, TNFα или IFNγ.
12. Способ по п. 1, где стимулирующие молекулы являются иммуногенными пептидами, полученными из M. tuberculosis.
13. Способ по п. 1, где набор зондов включает от 20 до 60 зондов, каждый из которых однократно помечен одной и той же флуоресцентной молекулой.
14. Способ по п. 1, где популяция клеток представляет собой T-клетки, полученные из PBMC человека, по меньшей мере одна молекула РНК кодируется геном цитокина, клетки в популяции клеток индуцируются aAPC с одной или более нагруженными пептидами молекулами MHC, которые взаимодействуют с TCR, и набор зондов включает от 20 до 60 зондов, каждый из которых однократно помечен одной и той же флуоресцентной молекулой.
15. Способ по п. 1, где по меньшей мере одну детектированную клетку с событием экспрессии отделяют от клеток, не имеющих событий экспрессии, с помощью сортировки флуоресцентно-активированных клеток.
16. Способ по п. 15, где экспрессию генов измеряют в отделенных клетках.
17. Способ по п. 16, где измерение экспрессии генов проводят с помощью ОТ-ПЦР или транскриптомного анализа РНК в клетках.
18. Способ по п. 1, где стадия индукции включает стимуляцию сигнализации toll-подобных рецепторов и последующей экспрессии генов с помощью микробного продукта или синтетического соединения, где микробный продукт является липидом, гликаном, гликолипидом, сульфолипидом, гликопротеином, белком, пептидом или нуклеиновой кислотой и где стимул присутствует в концентрации от 1 до 100 нг/мл, от 100 до 1000 нг/мл или от 1 до 20 мкг/мл.
19. Способ по п. 18, где стимуляцию проводят в течение периода, выбранного из группы, состоящей из от 30 мин до 6 ч, от 6 до 24 ч и от 24 до 72 ч.
20. Способ по п. 1, где соединение является цитокином.
21. Способ по п. 20, где цитокин является цитокином, выбранным из группы, состоящей из IFNγ, IL-2, IL-15 и TNFα.
22. Способ по п. 1 или 18, в котором присутствует больше одного соединения или стимула.
23. Способ по п. 22, где различные стимулы подают в разное время.
24. Способ детекции копий по меньшей мере одной молекулы РНК, экспрессируемой в отдельных клетках, включающий:
(a) предоставление образца, содержащего популяцию клеток, которые экспрессируют специфические рецепторы, способные инициировать сигнальные каскады, приводящие к экспрессии генов при связывании с ними лигандов или стимулирующих молекул;
(b) фиксацию и пермеабилизацию клеток;
(c) мечение копий по меньшей мере одной молекулы РНК, экспрессируемой клетками, с помощью набора флуоресцентно меченных олигонуклеотидных зондов гибридизации и удаление несвязавшихся зондов при промывке; и
(d) детекцию клеток с событиями экспрессии, с помощью проточной цитометрии, где событие экспрессии является одним или более измерениями флуоресценции, которые группируют с помощью гейтирования интенсивности флуоресценции.
25. Способ по п. 1 или 24, где рецепторы выбраны из группы, состоящей из toll-подобных рецепторов, NOD и NOD-подобных рецепторов, сопряженных с G-белком рецепторов, рецепторов полипептидных гормонов, рецепторов цитокинов, B-клеточных рецепторов и T-клеточных рецепторов.
+
+
+
+
+
+
26. Способ по п. 1 или 24, где популяция включает клетки, выбранные из группы, состоящей из PBMC, T-клеток, лимфоцитов, CD3CD4 T-клеток (T-хэлперов 1 или Th1 клеток), CD3CD4 T-клеток (T-хэлперов 2 или Th2 клеток), CD3CD8 T-клеток, Th17, Treg клеток, NK-клеток, NKT-клеток, макрофагов, дендритных клеток, клеток, формирующих эндотелий и эпителий различных органов тела, и клеток нервной системы.