СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДНОГО ОРГАНИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ
METHOD FOR PRODUCTION OF ORGANIC COMPOUND

Изобретение относится к ферментативному получению органических соединений с по меньшей мере 3 атомами углерода или с по меньшей мере 2 атомами углерода и по меньшей мере одним атомом азота при применении содержащей сахар среды, которая включает по меньшей мере одну часть не содержащих крахмал твердых составляющих источника крахмала, для культивирования микроорганизмов.
Содержащими сахар жидкими средами являются основные источники питательных веществ для многих способов ферментации; содержащиеся в средах части сахаров метаболизируют из применяемых микроорганизмов, при этом получают органические концентраты. Выбор такого рода полученных микробиологических продуктов метаболизма, то есть органических соединений, включает при этом, например, низкомолекулярные летучие соединения, такие как этанол, нелетучие продукты метаболизма, такие как аминокислоты, витамины и каротеноиды, а также множество других веществ.
Для таких в общем известных микробиологических способов ферментации необходимы различные источники углеводов в зависимости от различных условий способа. Их обогащают чистой сахарозой через свекольную и тростниково-сахарную мелассу, так называемые «higt test molasses» (инвертированная тростниково-сахарная меласса) до глюкозы из гидролизатов крахмала. Для биотехнологического получения L-лизина, кроме того, называют уксусную кислоту и этанол в качестве косубстратов, применяемых в промышленных масштабах (Pfefferle et al., Biotechnogical Manufacture of Lysine, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Vol.79 (2003), 59-112).
На основе названных источников углеводов основаны различные методы и способы действия для основывающемся на сахаре ферментативном получении микробиологических продуктов метаболизма. На примере L-лизина они описываются, например, Pfefferle et al. (в указанном месте), принимая во внимание исходную разработку, технологическую разработку и промышленное производство.
Важнейшим источником стимулированного микроорганизмами ферментативного получения микробиологических продуктов метаболизма является крахмал. В предлежащих стадиях реакции его вначале конденсируют и засахаривают, прежде чем его можно применять в качестве источников углеводов в ферментации. Для этого получают крахмалы из натуральных источников крахмала, таких как картофель, съедобный маниок, злаки, например пшеница, кукуруза, ячмень, рожь, тритикале или рис, обычно в предварительно очищенной форме и затем ферментативно конденсируют и засахаривают, чтобы затем применять в непосредственной ферментации для производства желаемых продуктов метаболизма.
Наряду с применением такого рода предварительно очищенных источников крахмала также описывают применение неочищенных источников крахмала для получения источников углеводов для ферментативного производства микробиологических продуктов метаболизма. При этом типично источники крахмала вначале измельчают путем помола. Затем размолотый материал подвергают конденсации и осахариванию. Так как данный размолотый материал естественно наряду с крахмалами содержит еще ряд не содержащих крахмал составляющих, которые могут отрицательно воздействовать на ферментацию, данные составляющие обычно отделяют перед ферментацией. Отделение может происходить или непосредственно путем помола (международная заявка на патент WO 02/077252; японские заявки на патент JP 2001-072701; JP 56-169594; китайская заявка на патент CN 1218111), путем конденсации (международная заявка на патент WO 02/077252; китайская заявка на патент CH 1173541), или ссылаясь на осахаривание (китайская заявка на патент CN 1266102; Beukema et al.: Production of fermentation syrups by enzymatic hydrolysis of potatoes; potatoe saccharification to give culture medium (Conference Abstract), Symp. Biotechnol. Res. Neth. (1983), 6; нидерландская заявка на патент NL 8302229). Однако во всех способах в ферментации применяют в основном чистый гидролизат крахмала.
Более новые способы ферментативного получения органических соединений включают, в частности, очищение источников крахмала перед ферментацией, например очищение конденсированных и осахаренных растворов крахмала (японская заявка на патент JP 57159500), или предоставляют методы, которые должны содействовать получению ферментационных сред из обновляемых ресурсов (европейская заявка на патент ЕР 1205557).
Неочищенные источники крахмалов, напротив, применяют в большом объеме при ферментативном получении биоэтанола. При этом источники крахмала, обычно цельные зерновые, вначале измельчают сухими и затем гидролизуют составляющую крахмала из источника крахмала при воздействии ферментов. Причем гидролиз можно проводить как периодически, например в котлах с мешалкой, так и непрерывно, например в струйных котлах. Соответствующие описания процессов находятся, например, в «The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries», Jaques et al. (производитель), Nottingham Univ. Press 1995, ISBN 1-8977676-735, глава 2, с.7-23, и в McAloon et al., «Determining the cost of producing ethanol from corn starch and lignocellulosic feedstocks», NREL/TP-58028893, National Renewable Energy Laboratory, октябрь 2000.
Так как при ферментативном получении биоэтанола концентрат получают путем дистилляции, применение источников крахмала из процесса сухого помола в предварительно не очищенной форме не представляет серьезной проблемы. Однако при применении способа сухого помола для получения других микробиологических продуктов метаболизма является проблематичным поток твердых веществ, вносимый в ферментацию через сахарный раствор, так как он может как отрицательно воздействовать на ферментацию, например, принимая во внимание скорость передачи кислорода или потребность в кислороде применяемых микроорганизмов (сравни для этого Mersmann, A. Et al.: Selection and Design of Aerobic Bioreactors, Chem. Eng. Technol. 13 (1990), 357-370), так и несущественно не может затруднить последующую переработку.
Кроме того, благодаря введению твердых веществ уже при получении суспензии, содержащей крахмал, вязкость суспензии может достигнуть критического значения, вследствие чего суспензия с более чем 30 мас.% кукурузной муки в воде больше не смешивается гомогенно (Industrial Enzymology, 2 издание, Т.Godfrey, S.West, 1996). Вследствие этого при обычном способе действия ограничена концентрация глюкозы. Принимая во внимание ферментативное получение, это в этом отношении не является далее значимым, так как более высокие концентрации на основании токсичности продукта для дрожжей, применяемых для ферментации, и без того не могли бы рационально превращаться.
При ферментативном получении других органических продуктов метаболизма в виде этанола недостатком в принципе является то, что в ферментацию необходимо добавлять содержащие сахар среды с незначительными концентрациями сахара, потому что это приводит к сверхпропорциональному разбавлению ферментационного раствора и, следовательно, досягаемая конечная концентрация концентратов уменьшается, что с одной стороны вызывает высокие затраты при получении из ферментационной среды и снижает выход пространство-время. Данные соображения являются важными, в частности, в том случае, если гидролизат крахмала, полученный для производства биоэтанола в больших объемах, который имеет обычно незначительные концентрации сахара и глюкозы до примерно 30 или 33 мас.%, необходимо добавлять частично к низкообъемной побочной ферментации для получения других химикалий.
На основании представленных трудностей и ограничений способы сухого помола, которые применяют для получения биоэтанола в широком объеме, при которых ферментативное получение других микробиологических продуктов метаболизма в виде этанола, до сих пор оставалось без существенного экономического значения.
Испытания для переноса плана сухого помола и связанных с данным способом принципиальных преимуществ на промышленное получение микробиологических продуктов метаболизма описывались до сих пор исключительно при применении съедобного маниока в качестве источника крахмала. Таким образом в японской заявке на патент JP 2001/275693 описывают способ ферментативного получения аминокислот, при котором в качестве источника крахмала применяют очищенные клубни съедобного маниока, которые измельчают сухими. Однако для проведения способа необходимо устанавливать размер частиц размолотого материала ≤150 мкм. При для этого примененной фильтрации части применяемого размолотого материала, включая не содержащие крахмал составляющие, отделяют перед конденсацией/осахариванием содержащихся крахмалов и последующей ферментации. При данном способе достигают незначительной концентрации сахара. Подобный способ описывают в японской заявке на патент JP 2001/309751 для получения добавок к кормам, содержащих аминокислоты.
Повышенные концентрации сахара в жидкой среде, используемой для ферментации, можно достигнуть при применении размолотого материала для осахаривания, который значительно содержит твердые, не содержащие крахмал составляющие источника крахмала, путем способа, описанного в международной заявке на патент WO 2005/116228 (РСТ/ЕР 2005/005728). При этом неожиданно не оказывается необходимым отделение содержащихся в источнике крахмала твердых, не содержащих крахмал составляющих, перед ферментацией. Подобный способ при применении источников крахмала, выбираемых из зерновых, описывают в заявке РСТ/ЕР 2006/066057 (более старая немецкая заявка на патент DE 102005042541.0). В отдельных случаях наблюдают торможение или замедление размножения микроорганизмов.
Поэтому задачей предложенного изобретения является предоставление следующего способа получения органических соединений путем ферментации, который способствует никакому или, по меньшей мере, никакому полному предыдущему отделению содержащихся в источнике крахмала, не содержащих крахмал твердых составляющих. Кроме того, он должен отличаться легкостью в применении используемых сред и их беспроблемным применением в ферментации. В частности способ должен позволять применение злаков в качестве источников крахмала.
Неожиданно найдено, что изображенные здесь проблемы уровня техники можно преодолеть посредством того, что вначале путем помола, конденсации и осахаривания источников крахмала без предыдущего отделения не содержащих крахмал твердых составляющих источника крахмала получают первую содержащую сахар жидкую среду (1) и ее вместе с метаболизируемыми моносахаридами, дисахаридами или олигосахаридами или составом, который содержит метаболизируемые моносахариды или олигосахариды в концентрации, по меньшей мере, 50 мас.% и который в основном свободен от твердых веществ, нерастворимых в воде, добавляют в ферментацию.
Таким образом, предметом изобретения является способ получения, по меньшей мере, одного органического соединения с по меньшей мере 3 атомами углерода или с по меньшей мере 2 атомами углерода и по меньшей мере 1 атомом азота путем ферментации, включающий следующие стадии:
а1) помол источника крахмала при получении размолотого материала, который содержит, по меньшей мере, одну часть не содержащих крахмал твердых составляющих источника крахмала;
а2) суспендирование размолотого материала в водной жидкости и гидролиз части крахмала в размолотом материале путем ферментативной конденсации и, при необходимости, последующего осахаривания, причем получают первую жидкость (1), содержащую моносахариды или олигосахариды; и
b) добавление жидкости (1), содержащей моносахариды или олигосахариды, вместе с метаболизируемыми моносахаридами, дисахаридами или олигосахаридами или составом, который содержит метаболизируемые моносахариды или олигосахариды в концентрации, по меньшей мере, 50 мас.% и который в основном свободен от твердых веществ, нерастворимых в воде, добавляют к ферментационной среде, которая содержит микроорганизм, который способен к перепроизводству органического соединения, при ферментационных условиях.
Применение жидкости (1), полученной путем ферментативного гидролиза, содержащей моносахариды или олигосахариды, приводит к очевидному снижению затрат при ферментативном получении органических соединений. На основе к тому же параллельного добавления метаболизируемых сахаров (то есть метаболизируемых моносахаридов, дисахаридов или олигосахаридов) в концентрированной форме, кроме того, избегают нежелательного разбавления ферментационного раствора. Кроме того, благодаря предложенному согласно изобретению способу можно избежать проблемы вязкости, которая может произойти при конденсации источников крахмала при более высоких концентрациях размолотого материала. Кроме того, таким образом можно избежать проблем при размножении микроорганизма.
Здесь и далее относительно жидкости (1), содержащей моносахариды или олигосахариды, применяют понятие «жидкость (1)» и синоним «жидкая среда (1)».
В качестве источника крахмала для предложенного согласно изобретению способа прежде всего применяют сухие зерновые культуры или семена, которые в высушенном состоянии демонстрируют, по крайней мере, 40 мас.% и предпочтительно, по меньшей мере, 50 мас.% части крахмала. Они находятся во многих зерновых культурах, культивируемых сегодня в большом масштабе, таких как кукуруза, пшеница, овес, ячмень, рожь, тритикале, рис, а также в сахарной свекле и картофеле и различных сортах проса, например сорго и мило. Предпочтительно источник крахмала выбирают из зерновых и специально из кукурузных зерен, зерен ржи, зерен тритикале и зерен пшеницы. В принципе предложенный согласно изобретению способ также можно проводить с аналогичными источниками крахмала, как, например, смесь различных содержащих крахмал зерновых культур или семян.
Для получения жидкой среды (1) на стадии а1) соответствующий источник крахмала измельчают с добавлением или без добавления жидкости, например воды, предпочтительно без добавления жидкости. Также можно комбинировать сухое измельчение с последующим влажным измельчением.
Для сухого измельчения типично применяют молотковые мельницы, роторные мельницы или вальцовые дробильные мельницы; для влажного измельчения подходят смесители с мешалкой, шаровые мельницы, циркуляционные мельницы, дисковые мельницы, мельницы с кольцевой камерой сгорания, вибрационные мельницы или планетарные мельницы. В принципе также применяют другие мельницы. Количество жидкости, необходимое для влажного измельчения, специалист в данной области может установить в лабораторных экспериментах. Обычно его устанавливают таким образом, что содержание сухого вещества находится в области от 10 до 20 мас.%.
Благодаря помолу устанавливают размер зерен, подходящий для заключительной стадии способа. При этом предпочтительно оказывается, если при измельчении размолотый материал, полученный, в частности, при сухом измельчении, на стадии а1), имеет частицы муки, то есть гранульные составляющие, с размером зерен в области от 100 до 630 мкм в части от 30 до 100 мас.% предпочтительно от 40 до 95 мас.% и особенно предпочтительно от 50 до 90 мас.%. Предпочтительно полученный размолотый материал содержит 50 мас.% частиц муки с размером зерен более чем 100 мкм. Как правило, по меньшей мере, 95 мас.% измельченных частиц муки имеет размер зерен менее чем 2 мм. При этом измерение размера зерен происходит с помощью ситового анализа при применении вибрационного анализатора. В принципе для достижения высокого выхода продукта предпочтителен незначительный размер зерен. Однако слишком незначительный размер зерен может приводить к проблемам, в частности вследствие комкования/агломерации, при процессе образования пульпы размолотого материала во время конденсации или при переработке, например, при сушке твердых веществ после стадии ферментации.
Обычно муку характеризуют через степень измельчения или через тип муки, причем их соотносят друг с другом таким образом, что с возрастающей степенью измельчения также увеличивается индекс типа муки. Степень измельчения соответствует массовому количеству полученной муки в расчете на 100 мас.% применяемого размолотого материала. В то время как при помоле получают вначале чистую, тонкую муку, например, из внутренней части хлебного зерна, при следующем измельчении, а именно с возрастающей степенью измельчения, возрастает часть содержания неочищенного волокна и оболочек в муке, причем становится незначительнее часть крахмала. Поэтому степень измельчения отражается также в так называемых типах муки, которые применяют в виде цифровых данных для классифицирования муки, в частности муки из злаковых культур, и которые основываются на зольности муки (так называемая шкала зольности). Тип муки или число типов при этом указывает количество золы (минеральных веществ) в мг, которые остаются при сгорании в 100 г сухого вещества муки. Для муки злаковых культур более высокое число типов означает более высокую степень измельчения, так как ядро зерен злаковых культур содержит примерно 0,4 мас.%, оболочки напротив примерно 5 мас.% золы. При низкой степени измельчения мука из зерен злаковых культур возникает таким образом преимущественно из измельченных мучнистых ядер, то есть составляющих крахмала злаковых культур; при высокой степени измельчения мука из зерен злаковых культур также содержит измельченный, содержащий белок слой алейрона злаковых культур, при шроте также составляющие содержащего белок и содержащего жир микроорганизма, а также оболочки семян, содержащие неочищенные волокна и золу. Для предложенных согласно изобретению целей в принципе является предпочтительной мука с высокой степенью измельчения или высоким числом типов. Если в качестве источника крахмала применяют зерновые культуры, то предпочтительно измельчают цельные не очищенные от шелухи зерна и перерабатывают далее, при необходимости, после предыдущего механического отделения от зародыша и оболочки зерна.
Согласно изобретению размолотый материал, применяемый для получения жидкой среды (1), содержит, по меньшей мере, одну часть, предпочтительно, по меньшей мере, 20 мас.%, в частности, по меньшей мере, 50 мас.%, специально, по меньшей мере, 90 мас.% и совсем специально, по меньшей мере, 99 мас.% не содержащих крахмал твердых составляющих, содержащихся в измельченных злаковых культурах, соответственно степени измельчения. В расчете на содержащие крахмал составляющие размолотого материала (и таким образом на количество моносахарида, дисахарида или олигосахариды в жидкой среде (1)) число не содержащих крахмал твердых составляющих в размолотом материале предпочтительно составляет, по меньшей мере, 10 мас.% и, в частности, по меньшей мере, 15 мас.%, например, от 15 до 75 мас.% и специально в области от 20 до 60 мас.%.
Ферментативный гидролиз размолотого продукта согласно стадии а2) может происходить обычными способами, известными специалисту в данной области, например, методами, описанными, цитированными в начале «The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries», глава 2, с.7-23.
Для этого вначале размолотый материал перемешивают с водной жидкостью, например свежей водой, возвращенной технической водой, например, из следующей ферментации, или со смесью данных жидкостей, причем получают водную суспензию. Данный процесс часто обозначают также как процесс получения пульпы.
Количество размолотого материала и водной жидкости, как правило, выбирают таким образом, что путем гидролиза получают водную жидкую среду (1), в которой общая концентрация моносахаридов, дисахаридов и/или олигосахаридов находится в области от 100 до 750 г/кг, предпочтительно в области от 150 до 700 г/кг и, в частности, в области от 200 до 650 г/кг. Соответственно этому размолотый материал применяют типично в количестве от 150 до 800 г/кг, часто в области от 200 до 750 г/кг и, в частности, в области от 250 до 700 г/кг, в расчете на общую массу суспензии (пульпы).
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения количество размолотого материала и водной жидкости выбирают таким образом, что путем гидролиза получают водную жидкую среду (1), в которой общая концентрация моносахаридов, дисахаридов и/или олигосахаридов находится в области от 100 до 400 г/кг, предпочтительно в области от 150 до 350 г/кг и, в частности, в области от 200 до 300 г/кг. Соответственно этому размолотый материал применяют типично в количестве от 150 до 550 г/кг, часто в области от 200 до 500 г/кг и, в частности, в области от 250 до 450 г/кг, в расчете на общую массу суспензии (пульпы). В принципе также можно применять большие количества размолотого материала, чтобы достигнуть высокой общей концентрации моносахаридов, дисахаридов и/или олигосахаридов, например, концентраций выше от 400 до 700 г/кг, в частности в области от 450 до 650 г/кг или от 500 до 650 г/кг.
Для ферментативного гидролиза части крахмала вначале, как правило, проводят конденсацию размолотого материала в присутствии фермента, конденсирующего крахмал, как правило, α-амилазы. Также применяют другие ферменты, конденсирующие активные и стабильные при реакционных условиях крахмалы.
Для конденсации части крахмала в размолотом материале можно применять в принципе все конденсирующие ферменты, в частности α-амилазы (класс ферментов ЕС 3.2.1.1), например, α-амилазы, которые получены из Bacillus lichenformis или Bacillus staerothermophilus и специально такие, которые применяют для конденсации материалов, полученных способом сухого помола в рамках получения биоэтанола. Пригодные для конденсации α-амилазы также коммерчески доступны, например, у фирмы Novozymes под названием Termamyl 120 L, тип L; или у фирмы Genencor под названием Spezyme. Также для конденсации можно применять комбинацию различных α-амилаз.
При этом получают водную среду, которая содержит конденсированные составляющие крахмала из размолотого материала, типично олигосахариды, имеющие, как правило, от 3 до 18, в частности от 6 до 12, элементов моносахаридов, в частности элементов глюкозы, а также не содержащие крахмал составляющие применяемого размолотого материала, в частности твердые, не содержащие крахмал составляющие размолотого материала, применяемого для конденсации.
-1
Предпочтительно количества конденсирующего крахмалы фермента и размолотого материала выбирают таким образом, что вязкость достаточно сокращается во время процесса гелеобразования, чтобы обеспечить эффективное перемешивание суспензии, например, с помощью мешалок. Предпочтительно вязкость реакционной смеси во время гелеобразования составляет максимально 20 Па·с, особенно предпочтительно максимально 15 Па·с и в высшей степени предпочтительно максимально 8 Па·с. Измерение вязкости, как правило, происходит с помощью вискозиметра Хааке типа Roto Visko RV20 с измерительной системой М5 и измерительным устройством MVDIN при температуре 50°С и скорости сдвига 200 с.
α-амилазы (или применяемый фермент, конденсирующий крахмалы) можно помещать в реакционный сосуд или добавлять в течение стадии а2). Предпочтительно добавляют частичное количество α-амилазы, необходимой на стадии а2), в начале стадии а2) или данное частичное количество помещают в реактор. Общее количество α-амилазы находится обычно в области от 0,002 до 3,0 мас.%, предпочтительно от 0,01 до 1,5 мас.% и особенно предпочтительно от 0,02 до 0,5 мас.%, в расчете на общее количество применяемого источника крахмала.
Конденсацию можно проводить выше или ниже температуры гелеобразования. Предпочтительно конденсация происходит на стадии а2), по меньшей мере, время от времени выше температуры гелеобразования или температуры клейстеризации применяемых крахмалов (так называемый процесс пропаривания). Температура, необходимая к тому же для соответствующих крахмалов, известна специалисту в данной области (см. цитированный вначале «The Alcohol Textbook - A reference for the beverage, fuel and industrial alcohol industries», глава 2, с.11) или может быть определена им в экспериментах. Как правило, температуру выбирают между 80 и 165°С, предпочтительно между 90 и 150°С и особенно предпочтительно в области от 100 до 140°С, причем температура находится, как правило, по меньшей мере, 5 К, в частности, по меньшей мере, 10 К и особенно предпочтительно, по меньшей мере, 20 К, например, от 10 до 100 К, в частности от 20 до 80 К выше температуры гелеобразования. При данных температурах гранульная структура крахмалов разрушается (гелеобразование), вследствие этого возможна их ферментативная деструкция.
2
4
3
4
Для оптимального действия α-амилазы (или применяемого фермент, конденсирующего крахмалы) на стадию а2) проводят предпочтительно, по меньшей мере, время от времени в оптимуме pH конденсирующего фермента, часто при значении pH в слабо кислой области, предпочтительно между 4,0 и 7,0, особенно предпочтительно между 5,0 и 6,5, причем обычно перед или в начале стадии а2) проводят установление pH; данное значение pH предпочтительно контролируют и, при необходимости, регулируют в течение конденсации. Установление значения pH происходит предпочтительно с помощью разбавленных минеральных кислот, таких как HSO или HPO, или разбавленных щелочей, таких как NaOH или KOH.
В предпочтительном варианте осуществления для конденсации частей крахмала в размолотом материале согласно стадии а2), по меньшей мере, частичное количество размолотого материала непрерывно или периодически подают к водной жидкости. При этом в реактор предпочтительно подают, по меньшей мере, 40 мас.%, в частности, по меньшей мере, 50 мас.% и в высшей степени предпочтительно, по меньшей мере, 55 мас.% в течение конденсации, однако перед возможным осахариванием. Часто добавляемое количество не превышает 90 мас.%, в частности 85 мас.% и особенно предпочтительно 80 мас.%. Предпочтительно добавляемое в течение частичное количество размолотого продукта подают в реактор при условиях, которые существуют при конденсации. Добавление может проходить периодически, то есть частями в нескольких частичных порциях, которые предпочтительно составляют соответственно не более чем 30 мас.%, особенно предпочтительно не более чем 20 мас.%, например, от 1 до 30 мас.% и, в частности, от 2 до 20 мас.%, общего количества конденсируемого размолотого материла, или непрерывно. Важным при данном варианте осуществления является то, что к началу конденсации только часть размолотого материала, предпочтительно не более чем 60 мас.%, в частности не более чем 50 мас.% и особенно предпочтительно не более чем 45 мас.% размолотого материала, находится в реакторе и остаточное количество размолотого продукта добавляют во время конденсации.
Конденсацию можно проводить также непрерывно, например, в многостадийном каскаде реакторов.
В предпочтительном варианте осуществления стадию а2) предложенного согласно изобретению способа проводят таким образом, что вначале частичное количество максимум 60 мас.%, предпочтительно максимум 50 мас.% и особенно предпочтительно максимум 45 мас.%, например, от 10 до 60 мас.%, в частности от 15 до 50 мас.% и особенно предпочтительно от 20 до 45 мас.%, в расчете на общее количество размолотого материала, в котором водную жидкость суспендируют и затем проводят конденсации.
В предпочтительном варианте осуществления происходит периодическое или непрерывное, в частности добавление частями частичного количества размолотого продукта на стадии а2) так, что вязкость водной среды составляет максимально 20 Па·с, предпочтительно максимально 15 Па·с и особенно предпочтительно максимально 8 Па·с. Для поддержания контроля вязкости оказывается предпочтительно, если добавляют, по меньшей мере, 25 мас.%, предпочтительно, по меньшей мере, 35 мас.% и особенно предпочтительно, по меньшей мере, 50 мас.% общего количества добавляемого размолотого материала при температуре выше температуры гелеобразования крахмалов, содержащихся в размолотом материале. На котроль вязкости можно далее влиять таким образом, что частями добавляют, по меньшей мере один крахмал конденсирующий фермент, предпочтительно α-амилазу, или/и, по меньшей мере, осахаривающий фермент, предпочтительно глюкоамилазу.
Для проведения предложенного согласно изобретению способа возможно предварительно термостатировать водную жидкость, применяемую для суспендирования твердого размолотого материала, при слегка повышенной температуре, например, в области от 40 до 60°С. Однако предпочтительно жидкости применяют при комнатной температуре.
К суспензии размолотого материала в таком случае добавляют фермент, конденсирующий, по меньшей мере, один крахмал, предпочтительно α-амилазу. Если частичное количество размолотого продукта предоставляют только в течение конденсации, то добавляют сначала предпочтительно только частичное количество α-амилазы, например, от 10 до 70 мас.% и, в частности, от 20 до 65 мас.%, в расчете на α-амилазу, используемую в целом на стадии а2). Добавляемое в данный момент времени количество α-амилазы в данном случае руководствуется активностью соответствующей α-амилазы в отношении применяемого источника крахмала при реакционных условиях и находится обычно в области от 0,0004 до 2,0 мас.%, предпочтительно от 0,001 до 1,0 мас.% и особенно предпочтительно от 0,02 до 0,3 мас.%, в расчете на общее количество используемого источника крахмала. При этом альтернативно можно перемешивать частичное количество α-амилазы с применяемой жидкостью перед приготовлением суспензии.
Предпочтительно к суспензии добавляют применяемое количество или частичное количество α-амилазы перед началом нагревания при температуре, применяемой для конденсации, в частности при комнатной температуре, или только слегка повышенной температуре, например, в области от 20 до 30°С.
Таким образом, приготовленную суспензию затем нагревают предпочтительно при температуре выше температуры гелеобразования применяемого крахмала. Как правило, температуру выбирают в области от 80 до 165°С, предпочтительно от 90 до 150°С и особенно предпочтительно в области от 100 до 140°С, причем температура находится выше температуры гелеобразования предпочтительно, по меньшей мере, 5 К, в частности 10 К и особенно предпочтительно, по меньшей мере, 20 К, например, от 10 до 100 К, в частности от 20 до 80 К (температура клейстеризации). При контроле вязкости, при необходимости, постепенно к содержащей крахмал суспензии добавляют частичные количества источника крахмала, например, соответственно от 1 до 30 мас.% и, в частности, от 2 до 20 мас.%, в расчете на общее применяемое количество размолотого продукта. В данном случае предпочтительно добавлять добавляемое в течение конденсации частичное количество размолотого материала в, по меньшей мере, 2, предпочтительно, по меньшей мере, 4 и особенно предпочтительно, по меньшей мере, 6 частичных порций реакционной смеси. В данном варианте осуществления альтернативно может происходить добавление не используемого при приготовлении суспензии частичного количества размолотого материала непрерывно во время конденсации. При добавлении температуру необходимо сохранять предпочтительно выше температуры гелеобразования крахмала.
После достижения желаемой температуры или, при необходимости, после полного добавления муки реакционную смесь обычно еще в течение времени, например, от 10 до 60 минут или дольше, если необходимо, сохраняют при температуре, установленной выше температуры гелеобразования крахмала, то есть уваривают. Затем реакционную смесь, как правило, охлаждают при немного пониженной температуре, однако предпочтительно выше температуры гелеобразования, например, от 70 до 90°С. затем добавляют, при необходимости, следующее частичное количество α-амилазы, предпочтительно основное количество. В данном случае количество α-амилазы, добавляемое в данный момент времени, в зависимости от активности применяемой α-амилазы при реакционных условиях составляет предпочтительно от 0,002 до 2,0 мас.%, особенно предпочтительно от 0,01 до 1,0 мас.% и в высшей степени предпочтительно от 0,02 до 0,4 мас.%, в расчете на общее количество используемого источника крахмала.
Для полного разложения крахмала до декстрина реакционную смесь так долго сохраняют при установленной температуре или, при необходимости, далее нагревают до тех пор, пока окажется отрицательным или, по меньшей мере, в основном отрицательным обнаружение крахмала с йодом или, при необходимости, другой тест для обнаружения крахмала. При этом к реакционной смеси при необходимости можно добавлять еще одну или несколько следующих частичных количеств α-амилазы, например, в области от 0,001 до 0,5 мас.% и предпочтительно от 0,002 до 0,2 мас.%, в расчете на общее количество используемого источника крахмала.
Альтернативно водную суспензию, содержащую размолотый материал, для конденсации части крахмала можно нагревать вначале путем введения водяного пара до температуры выше температуры клейстеризации крахмала, содержащегося в источнике крахмала или размолотом материале. Типично нагревают при такой температуре, которая находится выше соответствующей температуры клейстеризации, по меньшей мере, 10 К и в частности, по меньшей мере, 20 К, например, от 10 до 100 К, в частности от 20 до 80 К. В частности суспензию нагревают при температуре в области от 90 до 150°С и специально в области от 100 до 140°С.
При водяном паре, применяемом для нагревания, речь типично идет о перегретом водяном паре, который имеет температуру, по меньшей мере, 105°С, в частности, по меньшей мере, 110°С, например, от 110 до 210°С. Предпочтительно в суспензию водят водяной пар с избыточным давлением. Соответственно этому пар предпочтительно имеет давление, по меньшей мере, 1,5 бар, например, от 1,5 до 16 бар, в частности от 2 до 12 бар.
Введение водяного пара в суспензию происходит, как правило, таким образом, что пар вводят в суспензию с избыточным давлением, предпочтительно с избыточным давлением от 1 до 10 или 11 бар, в частности от 1,5 до 5 бар и предпочтительно с высокой скоростью. Благодаря введению пара суспензия мгновенно нагревается до температур выше 90°С, таким образом температур выше температуры клейстеризации.
Предпочтительно нагревание водяным паром происходит в непрерывно работающем устройстве, в которое суспензию подводят непрерывно с определенным давлением подачи, которое получают из вязкости суспензии, скорости передачи и геометрии устройства, и в которое в области подачи суспензии через регулируемую насадку подают горячий пар с избыточным давлением, в расчете на давление передачи. Благодаря подаче пара с избыточным давлением суспензия не только нагревается, а также в систему вносится механическая энергия, которая способствует следующему разделению частиц размолотого продукта, вызывает особенно равномерное внесение энергии, и таким образом влечет за собой последствием равномерную клейстеризацию гранульных частиц крахмала в размолотом материале. Типично данные устройства имеют геометрию в форме трубы. Предпочтительно введение пара происходит в направлении продольной оси устройства в форме трубы. Подача суспензии происходит, как правило, под углом, по меньшей мере, 45° или вертикально к этому. Регулируемая насадка типично имеет коническую геометрию, которая сужается в направлении течения пара. В данной насадке расположена игла или кегль, расположенный на передвигаемом в продольном направлении стержне. Игла или кегль с конусом насадки образуют зазор. Сдвигом иглы или стержня в продольном направлении можно простым способом установить размер зазора и вместе с тем поверхность поперечного разреза отверстия насадки, вследствие этого простым способом можно регулировать скорость ввода пара.
Кроме того, типично данные устройства имеют перемешивающую трубу, в которой суспензию после ввода пара транспортируют и выводят из устройства. Данная перемешивающая труба расположена обычно в направлении ввода пара и вертикально к загрузочному материалу. Перемешивающая труба образует типично с насадкой зазор, через который транспортируют суспензию. Благодаря данному зазору при транспортировке дополнительные силы сдвига воздействуют на суспензию и таким образом повышают механическое внесение энергии в суспензию. Перемешивающая труба может быть расположена подвижно в продольном направлении. Сдвигом перемешивающей трубы простым способом можно установить размер отверстия зазора и вместе с тем перепад давления в устройстве.
Такие устройства известны из уровня техники под названием струйный котел, например, устройство, представленное в «The Alcohol Textbook», глава 2, loc. Cit, фигура 13, и коммерчески доступны, например, под названием HYDROHEATER ФИРМЫ Hydro Thermal Corp. Waukesha WI, США.
При непрерывном проведении реакции суспензию, обработанную водяным паром, как правило, в связи с этим переводят в зону дополнительной реакции, чтобы продолжить гелеобразование составляющих крахмала. В зоне дополнительной реакции господствует избыточное давление, типично абсолютное давление в области от 2 до 8 бар. Температуры в зоне дополнительной реакции находятся типично в области от 90 до 150°С. Время обработки в данной зоне дополнительной реакции может составлять в зависимости от температуры суспензии в области от 1 мин до 4 ч. Зоны дополнительной реакции имеют типично геометрию в форме трубы или колонки. В одном варианте осуществления действует зона дополнительной реакции, имеющая геометрию вертикально расположенной колонны. При этом суспензию после покидания устройства для обработки паром достают в верхней области колонны и берут в нижней области. В другом варианте осуществления зона последующей реакции имеет геометрию в форме трубы.
После покидания зоны последующей реакции давление суспензии понижают, как правило, и затем проводят конденсацию. Предпочтительно понижение давления проводят в виде мгновенного испарения, чтобы охладить суспензию, предпочтительно до температуры ниже 100°С, в частности ниже 85°С. Затем, как правило, происходит конденсация таким образом выведенного крахмала в отдельный реакционный сосуд. Конденсацию можно проводить вышеописанным способом.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения, по меньшей мере, одну часть или общее количество, как правило, по меньшей мере, 50%, в частности, по меньшей мере, 80% общего количества или общее количество фермента, конденсирующего крахмал, перед нагреванием водяным паром добавляют к суспензии размолотого материала в водной жидкости. Таким образом, конденсация происходит уже во время нагревания до температуры выше температуры клейстеризации. Соответственно проводят нагревание водяным паром и фазу дополнительной реакции. Таким образом, может не состояться последующая конденсация в отдельном реакционном сосуде. Таким образом, предпочтительно такую конденсацию проводят для пополнения деструкции крахмала в декстрины.
2+
2+
2
Для стабилизации применяемых ферментов при необходимости можно устанавливать концентрацию ионов Са, например, с помощью CaCl, на специфическое для ферментов оптимальное значение. Подходящие значения концентраций специалист в данной области может определить в лабораторных экспериментах. Если применяют, например, термамил в качестве α-амилазы, то предпочтительно устанавливать концентрацию Ca, например, от 10 до 100 ppm, предпочтительно от 20 до 80 ppm и особенно предпочтительно примерно от 30 до 70 ppm в жидкой среде, причем данные ppm относятся к массе и означают г/1000 кг.
Для полной деструкции крахмала до декстринов реакционную смесь при установленной температуре сохраняют так долго до тех пор, пока окажется отрицательным или, по меньшей мере, в основном отрицательным обнаружение крахмала с йодом или, при необходимости, другой тест для обнаружения крахмала. При этом к реакционной смеси при необходимости можно добавлять еще одну или несколько следующих частичных количеств α-амилазы, например, в области от 0,001 до 0,5 мас.% и предпочтительно от 0,002 до 0,2 мас.%, в расчете на общее количество используемого источника крахмала.
Таким образом, получают водный гидролизат крахмала, который содержит конденсированную часть крахмала из размолотого материала, типично декстрина и, при необходимости, следующие олигосахариды и моносахариды или дисахариды, а также не содержащие крахмал составляющие размолотого материала, в частности твердые, не содержащие крахмал составляющие размолотого материала, применяемого для конденсации.
После заключительной конденсации крахмала можно проводить осахаривание декстринов, содержащихся в жидкой среде, то есть их разложение до глюкозы, непрерывно или периодически известным способом. Конденсированную среду можно полностью осахарить в специальном резервуаре для осахаривания, прежде чем ее добавляют, например, на следующую стадию ферментации.
В первом варианте осуществления данного изобретения перед последующей ферментацией осахаривание проводят только частично. Можно, например, подходить таким образом, что частичное количество декстринов, содержащихся в жидкой среде, например, в области от 10 до 90 мас.% и, в частности, в области от 20 до 80 мас.%, в расчете на общую массу декстринов (или первоначального крахмала), засахаривают и полученную содержащую сахар жидкую среду применяют в ферментации. Затем в ферментационной среде следующее осахаривание может происходить in situ. Далее осахаривание можно проводить при отсутствии отдельной емкости для осахаривания непосредственно в ферментере (in situ).
Преимуществами осахаривания in situ, то есть осахаривание, частично или полностью происходящее в ферментере, являются с одной стороны сокращенные инвестиционные затраты, с другой стороны благодаря замедленному высвобождению глюкозы при необходимости можно предоставлять высокую концентрацию в композиции (порции), без возникновения ингибирования или изменения метаболизма применяемых микроорганизмов. При Е, coli приводят к слишком высокой концентрации глюкозы, например, к образованию органических кислот (ацетат), в то время как Saccharomyces cerevisae в данном случае перестраивается, например, на сбраживание, несмотря на то, что в проветриваемых ферментерах присутствует в достаточном количестве кислород (эффект Crabtree). Замедленное высвобождение глюкозы устанавливают путем регулирования концентрации глюкоамилазы. Таким образом, вышеназванные эффекты можно подавить и можно представить больший субстрат, так что можно сократить разбавление, полученное из подаваемого потока.
Осахаривание декстринов (то есть олигосахаридов) в конденсированном растворе крахмала происходит ферментативным путем, то есть с помощью, по меньшей мере, одного фермента, засахаривающего декстрины. Для этого можно применять в принципе все глюкоамилазы (класс ферментов 3.2.1.3), в частности глюкоамилазы, которые получают из Aspergilus и специально такие, которые применяют для осахаривания материалов, полученных способом сухого помола в рамках получения биоэтанола. Глюкоамилазы, пригодные для осахаривания, также коммерчески доступны, например, у фирмы Novozymes под названием Dextrozyme GA; или у фирмы Genencor под названием Optidex. Также можно применять комбинацию различных глюкоамилаз.
По меньшей мере, один засахаривающий фермент, в частности, по меньшей мере, одну глюкоамилазу, добавляют к содержащей декстрины жидкой среде, полученной путем конденсации, обычно в количестве от 0,001 до 5,0 мас.%, предпочтительно от 0,005 до 3,0 мас.% и особенно предпочтительно от 0,01 до 1,0 мас.%, в расчете на общее количество применяемого источника крахмала.
Поскольку осахаривание проводят в ферментере, конденсированный раствор крахмала охлаждают, как правило, до температуры ферментации, то есть от 32 до 37°С, прежде чем подвести его в ферментер. Глюкоамилазу (или, по меньшей мере, один засахаривающий фермент) для осахаривания в данном случае добавляют непосредственно в ферментационный раствор. Осахаривание конденсированного крахмала согласно стадии а2) происходит при этом параллельно к метаболизму сахара через микроорганизмы.
В случае осахаривания в емкости для осахаривания конденсированный раствор крахмала охлаждают или термостатируют обычно при температурном оптимуме засахаривающего фермента или слегка ниже, например, от 50 до 70°С, предпочтительно от 60 до 65°С и затем перемешивают с глюкоамилазой.
2
Предпочтительно перед добавлением осахаривающего фермента, в частности глюкоамилазы, значение pH жидкой среды устанавливают на значение в оптимальной области действия применяемой глюкоамилазы, предпочтительно в области между 3,5 и 6,0; особенно предпочтительно между 4,0 и 5,5 и в высшей степени предпочтительно между 4,0 и 5,0. Однако также возможно, в частности при проведении осахаривания непосредственно в ферментере, значение pH устанавливают снаружи вышеназванных областей, например, в области от больше 6,0 до 8,0. Это может быть необходимо, например, при ферментативном получении лизина, пантотената и витамина B несмотря на ограниченную активность эталонных глюкоамилаз в данной области в целом предпочтительно или на основе устанавливаемых условий ферментации.
В предпочтительном варианте осуществления осахаривание происходит в специальной емкости для осахаривания. Для этого конденсированный раствор крахмала термостатируют при оптимальной для фермента температуре или слегка ниже и устанавливают значение pH вышеописанным способом на значение, оптимальное для фермента.
После добавления осахаривающего фермента содержащую декстрин суспензию сохраняют предпочтительно в течение времени, например, от 2 до 72 часов или дольше, поскольку необходимо, в частности от 5 до 48 часов при установленной температуре, причем декстрины засахариваются до моносахаридов. Развитие осахаривания может происходить с помощью способов, известных специалисту в данной области, например, ВЖХР, ферментативных испытаний или тест-полосок для определения уровня глюкозы. Осахаривание заканчивается, если концентрация моносахаридов больше существенно не поднимается или снова падает.
Так как для получения содержащей сахар жидкой среды (1), как правило, применяют размолотый материал, который содержит, по меньшей мере, одну часть или все составляющие источника крахмала (то есть не происходит или происходит не полностью отделение не содержащих крахмал твердых составляющих источника крахмала), полученная жидкая среда (1) включает также часть или все не содержащие крахмал твердые составляющие источника крахмала. Это часто обуславливает введение не пренебрегаемой части фитата, например, из зерновой культуры. Чтобы избежать полученного из этого ингибирующего действия, предпочтительно на стадии а2) к жидкой среде добавляют, по меньшей мере, одну фитазу, прежде чем содержащую сахар жидкую среду подводят на стадию ферментации.
Добавление фитазы может происходить перед, во время или после конденсации или осахаривания, поскольку она обладает соответственно необходимой стабильностью при нагревании.
Можно применять любые фитазы, в общем чья активность при реакционных условиях ограничена соответственно максимально несущественно. Предпочтительными являются фитазы с температурной стабильностью (Т50)>50°С и особенно предпочтительно >60°С.
Количество фитазы составляет обычно от 1 до 10000 единиц/кг источника крахмала и, в частности, от 10 до 4000 единиц/кг источника крахмала.
Для повышения выхода всего сахара или для получения свободных аминокислот к реакционной смеси во время получения содержащей сахар жидкой среды, кроме того, можно добавлять следующие ферменты: например пуллюланазы, целлюлазы, гемицеллюлазы, глюканазы, ксиланазы, гликозидазы или протеазы. Добавление данных ферментов может положительно воздействовать на вязкость, то есть снижать (например, путем отделения длинноцепных (также обозначаемых как с более отделения длинноцепных (также обозначаемых как с более длинными цепями) глюканов и/или от (арабино-)ксиланов), которые вызывают высвобождение метаболизируемых глюкозидов и высвобождение от (остаточного) крахмала. Применение протеаз имеет аналогичный положительный эффект, причем могут высвобождаться дополнительно аминокислоты в виде факторов роста для ферментации.
Благодаря описанному здесь применению стадии а1) и а2) получают, в зависимости от того проведено ли осахаривание или нет, жидкую среду, содержащую декстрин, или моносахарид, или дисахарид, с общей концентрацией моносахаридов, дисахаридов и/или олигосахаридов в вышеназванных областях.
При сахарах, содержащихся в жидкой среде (1) после осахаривания, в частности, речь идет о глюкозе, причем могут содержаться также следующие моносахариды, такие как отличающиеся от глюкозы гексозы и пентозы, например, фруктоза, манноза, галактоза, сорбоза, ксилоза, арабиноза и рибоза. Часть отличающихся от глюкозы моносахаридов можно варьировать в зависимости от применяемого источника крахмала и содержащихся в нем не содержащих крахмал составляющих и воздействовать путем проведения способа, например, путем растворения составляющих глюкозы путем добавления целлюлаз. Предпочтительно моносахариды содержащей сахар жидкой среды включают часть глюкозы, по меньшей мере, 60 мас.%, часто, по меньшей мере, 70 мас.%, в частности, по меньшей мере, 80 мас.% и специально, по меньшей мере, 85 мас.%, в расчете на общее количество сахара, содержащееся в содержащей сахар жидкой среде. Обычно часть глюкозы находится в области от 75 до 99,9 мас.%, в частности от 80 до 99 мас.% и специально от 85 до 97 мас.%, в расчете на общее количество сахара, содержещегося в содержащей сахар жидкой среде. Поскольку не проводят никакого осахаривания, часть декстринов в моносахаридах, дисахаридах и олигосахаридах, содержащихся в среде (1), соответствует в основном части глюкозы.
Поскольку не проводят никакого осахаривания, метаболизируемые эквиваленты глюкозы находятся в основном в форме олигосахаридов, в частности декстринов. Основной составляющей данных олигосахаридов или декстринов типично является глюкоза, причем среда также может содержать незначительные количества моносахаридов и/или олигосахаридов и элементы олигосахаридов, построенные из других элементов моносахаридов. В таком случае типично сахарсодержащие составляющие в жидкой среде (1), то есть моносахариды, дисахариды и олигосахариды, включают часть олигосахаридов, в частности декстрины, по меньшей мере, 60 мас.%, часто, по меньшей мере, 70 мас.%, в частности, по меньшей мере, 80 мас.%, специально, по меньшей мере, 90 мас.%, то есть часть моносахаридов и дисахаридов является меньше чем 40 мас.%, часто меньше чем 30 мас.%, в частности меньше чем 20 мас.% и специально меньше чем 10 мас.%. Обычно часть глюкозы, в свободной или связанной форме, находится среди эквивалентов глюкозы жидкой среды (1) в области от 50 до 99 мас.%, в частности от 75 до 97 мас.% и специально от 80 до 95 мас.%, в расчете на общее количество эквивалентов глюкозы.
Согласно изобретению следующая ферментация происходит как при применении жидкой среды (1), так и отличающегося от этого источника метаболизируемых моносахаридов, дисахаридов и/или олигосахаридов (далее также источники сахара). Применяемые для этого моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды можно применять как таковые или в форме состава, который содержит метаболизируемые моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды в концентрации, по меньшей мере, 50 мас.%, предпочтительно в концентрации, по меньшей мере, 60 мас.%, в расчете на общую массу среды и который в отличие от водной жидкой среды (1) в основном свободен от твердых веществ, нерастворимых в воде.
Содержащиеся в источнике сахара моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды предпочтительно выбирают из моносахаридов, как правило, гексаз и/или пентоз, например, глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, сорбозы, ксилозы, арабинозы и рибозы, специально среди глюкозы, фруктозы и галактозы, и дисахаридов, таких как сахароза, мальтоза, лактоза, специально сахароза. Пригодными также являются смеси моносахаридов и дисахаридов, а также олигосахариды с высокой частью встроенной глюкозы и их смеси с моносахаридами и/или дисахаридами. Примеры составов, которые содержат метаболизируемые моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды в концентрации, по меньшей мере, 50 мас.% и которые в основном свободны от твердых веществ, нерастворимых воде, включают сироп глюкозы, сироп сахарозы, сгущенные соки, сироп мальтозы, сироп декстрина, но также и продукты отходов производства сахара (мелассы), в частности мелассы из сахарной свеклы, а также мелассы из получения тростникового сахара.
Предпочтительными в частности являются вещества, которые содержат преимущественно моносахариды и/или дисахариды, в частности глюкозу и/или сахарозу, а также смеси, которые содержат глюкозы и/или сахарозу и олигосахариды с высокой частью встроенной глюкозы, например, глюкозу, сахарозу, сироп глюкозы, сироп сахарозы, сгущенные соки и мелассы.
Моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды или содержащие их составы можно также применять как жидкую среду (1) как для композиций ферментационной среды (периодическая фаза), так и для подкармливания во время ферментации, если ее проводят как в виде подпитки, или полунепрерывно.
Общее количество моносахаридов, дисахаридов и/или олигосахаридов, вводимых в ферментацию путем добавления жидкой среды (1), составляет предпочтительно, по меньшей мере, 40 мас.%, в частности, по меньшей мере, 50 мас.% особенно предпочтительно, по меньшей мере, 60 мас.%, например, от 40 до 95 мас.%, в частности от 50 до 90 мас.% и специально от 60 до 90 мас.% общего количества моносахаридов, дисахаридов и/или олигосахаридов, вводимых в ферментацию.
Жидкую среду (1) и моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды, или содержащие их составы можно подавать в ферментацию отдельно друг от друга или вместе.
Согласно предпочтительному варианту осуществления данного изобретения жидкую среду (1) и моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды или содержащий их состав перед добавлением к ферментации перемешивают друг с другом. Таким образом, при применении низкоконцентрированной жидкой среды, которая имеет, как правило, общую концентрацию моносахаридов, дисахаридов и олигосахаридов от 100 до 400 г/кг, повышают содержание всего сахара содержащей сахар жидкой среды (1), полученной согласно стадиям а1) и а2), и хотя предпочтительно около, по меньшей мере, 50 г/кг, в частности, по меньшей мере, 100 г/кг, специально, по меньшей мере, 150 г/кг, например, примерно от 50 до 300 г/кг, в частности около от 100 до 250 г/кг и специально около от 120 до 200 г/кг на более чем 40 мас.%, предпочтительно на, по меньшей мере, 45 мас.% в частности, на, по меньшей мере, 50 мас.% и особенно предпочтительно на, по меньшей мере, 55 мас.%, в расчете на общую массу.
После добавления данных источников сахара к жидкой среде (1) полученная жидкая среда имеет предпочтительно содержание сухой массы в области от 45 до 80 мас.% и особенно предпочтительно в области от 50 до 75 мас.% или от 55 до 75 мас.%, в расчете на общую массу. При этом является предпочтительно регулировать вязкость жидкой среды (1), например, с помощью регулирования температур таким образом, что значения не превышают максимально 20 Па·с, особенно предпочтительно максимально 15 Па·с и в высшей степени предпочтительно максимально 8 Па·с.
В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения содержащие моносахариды и/или дисахариды в форме глюкозы или сахарозы побочные продукты получения сахара добавляют к первой жидкой среде (1). Примерами для этого являются мелассы, возникающие при получении сахара из тростникового сахара или, в частности, свекловичного сахара.
Согласно изобретению жидкую среду (1), полученную на стадиях а1) и а2), и отличающиеся от нее источники сахара подают в ферментацию, где она служит для культивирования микроорганизмов. В ферментации производятся микробиологические продукты метаболизма микроорганизмов.
Проведение ферментации может происходить обычным способом, известным специалисту в данной области. Для этого в, как правило, соответственно желаемом микроорганизме культивируют жидкую среду, полученную здесь описанным способом.
Способ ферментации может происходить как периодически (периодический способ), так и полунепрерывно (способ подпитки, включая подпитку с промежуточными урожаями), причем предпочтительным является полунепрерывный способ действия.
Предпочтительно полученная согласно предложенному согласно изобретению способу жидкая среда (1) или условный источник сахара, то есть метаболизируемые моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды или состав, который содержит метаболизируемые моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды в концентрации, по меньшей мере, 50 мас.% и который типично в основном свободен от твердых веществ, нерастворимых в воде, или их смесь, при необходимости, после разбавления с водой и добавления обычных составляющих среды, таких как буфер, питательные соли, источники азота, такие как сульфат аммония, мочевина и т.д., комплексные составляющие питательных сред, содержащие аминокислоты, такие как экстракты дрожжей, пептоны, CSL и т.п., с которыми желаемый микроорганизм инокулируют, и его размножают при условиях ферментационной среды, до концентрации микроорганизмов может достигать постоянного состояния, желательного для ферментации. При этом сахар, полученный в жидкой среде (1), метаболизируется и образуется желаемый продукт метаболизма (так называемый периодический способ действия или периодическая фаза).
При способе действия подпитки затем путем подвода следующей, полученной согласно предложенному согласно изобретению способу жидкой среды (1) и отличающегося от нее источника сахара, в частности путем подвода жидкой среды, полученной путем перемешивания жидкой среды (1) с отличающимся от нее источником сахара, ферментационный процесс проводят далее и продукт метаболизма, перепроизведенный от микроорганизма, обогащается в ферментационном растворе, причем продукт метаболизма может находиться как в клетках микроорганизма, так и в водной фазе ферментационной среды.
Предпочтительно ферментацию проводят полунепрерывно, то есть как подпитку. При этом, таким образом, подойдет, что микроорганизм вначале размножают при применении содержащей сахар жидкой среды, например, при применении жидкой среды (1) или других источников сахара, до достижения желаемой концентрации микроорганизмов в ферментере. Затем в ферментер добавляют жидкую среду (1) вместе со следующим источником сахара, то есть метаболизируемыми моносахаридами, дисахаридами и/или олигосахаридами или средой, которая содержит метаболизируемые моносахариды, дисахариды и/или олигосахариды в концентрации, по меньшей мере, 50 мас.% и которая в основном свободна от твердых веществ, нерастворимых в воде. Вследствие этого ферментационный процесс поддерживают и продукт метаболизма, перепроизведенный от микроорганизма, обогащается в ферментационном растворе (см. выше). При этом объемное соотношение добавляемой содержащей сахар жидкой среды (1) и следующего источника сахара, к представленной и содержащей микроорганизм периодической среде, в общем, в области от примерно 1:10 до 10:1 и предпочтительно при примерно от 1:5 до 5:1 и специально в области от 1:1 до 5:1. В частности через скорость подачи содержащей сахар жидкой среды можно регулировать содержание сахара в ферментационном растворе. Как правило, скорость подачи установить таким образом, что содержание моносахаридов в ферментационном растворе находится в области >0 мас.% до примерно 5 мас.% и в частности не превышает значение 3 мас.%.
Полученную на стадии а2) содержащую сахар жидкую среду или ее смесь с другим источником сахара можно при необходимости стерилизовать перед ферментацией, причем микроорганизмы обычно убивают термическим или химическим способом. Для этого содержащую сахар жидкую среду обычно нагревают обычно до температуры выше 80°С. Подавление жизнедеятельности или лизирование клеток может происходить непосредственно перед ферментацией. Для этого общую содержащую сахар жидкую среду подают в лизирование или проводят подавление жизнедеятельности. Это может происходить термически, механически или химически.
Изобретение, в частности, относится к способу получения органических нелетучих соединений с по меньшей мере 3 атомами углерода или с по меньшей мере 2 атомами углерода и по меньшей мере 1 атомом азота. При этом под нелетучими органическими соединениями понимают такие соединения, которые нельзя получить дистилляционным путем не разложенные из ферментационного раствора. Данные соединения имеют, как правило, температуру кипения выше температуры кипения воды, часто выше 150°С, в частности выше 200°С при нормальном давлении. Как правило, речь идет соединениях, которые находятся при нормальных условиях (298 К, 101,3 кПа) в твердом состоянии.
Однако также возможно, что приложенную согласно изобретению содержащую сахар жидкую среду применяют в ферментации для получения нелетучих микробиологических продуктов метаболизма, которые при нормальном давлении имеют температуру плавления ниже температуры кипения воды или/и масляную консистенцию.
6
12
Понятие нелетучие микробиологические продукты метаболизма включает здесь, в частности, органические, при необходимости, 1 или несколько, например, 1, 2, 3 или 4 группы гидроксила несущие монокарбоновые, дикарбоновые кислоты и трикарбоновые карбоновые кислоты, имеющие предпочтительно от 3 до 10 атомов углерода, например винная кислота, итаконовая кислота, янтарная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, 3-гидроксипропионовая кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, 2,5-фурандикарбоновая кислота, глютаровая кислота, левулиновая кислота, глюконовая кислота, аконитовая кислота и диаминопимелиновая кислота, лимонная кислота; протеиногенные и неионогенные аминокислоты, например лизин, глютамат, метионин, фенилаланин, аспарагиновая кислота, триптофан и треонин; основания пурина и пиримидина; нуклеозиды и нуклеотиды, например никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и аденозин-5'-монофосфат (АМФ); липиды; насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, имеющие предпочтительно от 10 до 22 атомов углерода, например γ-линоленовая кислота, дигомо-γ-линоленовая кислота, арахидоновая кислота, эйкозапентановая кислота и докозагексановая кислота; диолы, имеющие предпочтительно от 3 до 8 атомов углерода, например, пропандиол и бутандиол; многоатомные (также обозначаются как высокоатомные) спирты, имеющие 3 или более, например 3, 4, 5 или 6 групп ОН, например глицерин, сорбитол, манитол, ксилитол и арабинитол; длинноцепные (также обозначаемые как с более длинными цепями) спирты, имеющие, по меньшей мере, 4 атома углерода, например, от 4 до 22 атомов углерода, например бутанол; гидраты углерода, например гиалуроновая кислота и трегалоза; ароматические соединения, например ароматические амины, ванилин и индиго; витамины и провитамины, например аскорбиновая кислота, витамин B, витамин B и рибофлавин, кофакторы и так называемые нутрацевтики; протеины, например ферменты, такие как амилазы, пектиназы, кислотные, гибридные или нейтральные целлюлазы, эстеразы, такие как липазы, панкреазы, протеазы, ксиназы и оксиредуктазы, такие как лакказы, каталазы и пероксидазы, глюканазы, фитазы; каротеноиды, например ликопин, β-каротин, астраксантин, зеаксантин и кантаксантин; кетоны, имеющие предпочтительно от 3 до 10 атомов углерода, и при необходимости, 1 или несколько групп гидроксила, например ацетон и ацетоин; лактоны, например, γ-бутиролактон, циклодекстрины, биополимеры, например полигидроксиацетат, сложный полиэфир, например полилактид, полисахариды, полиизопреноиды, полиамиды; а также первичные стадии и производные вышеназванных соединений, следующими, применяемыми в качестве нелетучих микробиологических продуктов метаболизма, описывает Gutcho в Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation (1973), ISBN: 0818805086.
Понятие «кофактор» включает не содержащие протеин соединения, которые необходимы для возникновения нормальной ферментативной активности. Данные соединения могут быть органическими или неорганическими; предложенные согласно изобретению кофактор-молекулы являются предпочтительно органическими. Примерами таких молекул являются НАД и никотинамидадениннуклеотидфосфат (НАДФ); первичной стадией кофакторов является ниацин.
Понятие «нутрацевтики» включает добавки питательных веществ, которые полезны для здоровья растений и животных, в частности людей. Примерами таких молекул являются витамины, антиоксиданты и определенные липиды, например многократно ненасыщенные жирные кислоты.
В частности полученные продукты матеболизма выбирают из ферментов, аминокислот, витаминов, дисахаридов, алифатических гидроксикарбоновых кислот, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, кетонов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, алканолов, имеющих от 4 до 10 атомов углерода и алкандиолов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода и, в частности, от 3 до 8 атомов углерода.
Для специалиста в данной области понятно, что такие полученные ферментативным путем соединения соответственно получают в энантиомерной форме, произведенной из применяемых микроорганизмов (поскольку существуют различные энантиомеры). Таким образом, например, из аминокислот получают, как правило, соответствующий L-энантиомер.
Микроорганизмы, применяемые в ферментации, известным образом зависят от соответствующих микробиологических продуктов метаболизации, как поясняют в частности ниже. Они могут быть природного происхождения или генетически модифицированными. Примеры подходящих микроорганизмов и способов ферментации указаны, например, в таблице А.
В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения полученное органическое соединение выбирают среди, при необходимости, несущих группы гидроксила монокарбоновых кислот, дикарбоновых кислот и трикарбоновых кислот, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, протеиногенных и непротеиногенных аминокислот, оснований пиридина, оснований пиримидина; нуклеозидов, нуклеотидов, липидов; насыщенных и ненасыщенных жирных кислот; диолов, имеющих от 4 до 10 атомов углерода, многоатомных спиртов, имеющих 3 или больше групп гидроксила, длинноцепных спиртов, имеющих, по меньшей мере, 4 атома углерода, гидратов углерода, ароматических соединений, витаминов, провитаминов, кофакторов, нутрацевтиков, протеинов, каротеноидов, кетонов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, лактонов, биополимеров и циклодекстринов.
Первый предпочтительный вариант осуществления данного изобретения относится к применению полученной согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном получении ферментов, таких как фитазы, ксиланазы или глюканазы.
Второй предпочтительный вариант осуществления данного изобретения относится к применению полученной согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном получении аминокислот, таких как лизин, метионин, треонин.
Следующий предпочтительный вариант осуществления данного изобретения относится к применению полученной согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном получении витаминов, таких как пантотеновая кислота и рибофлавин, предшественники и их побочные продукты.
Следующие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения относятся к применению полученной согласно изобретению содержащей сахар жидкой среды в ферментативном получении
- монокарбоновых кислот, дикарбоновых кислот и трикарбоновых кислот, в частности монокарбоновых кислот и дикарбоновых кислот, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, таких как пропионовая кислота, фумаровая кислота и янтарная кислота,
- алифатических гидроксикарбоновыхе кислот, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, таких как молочная кислота;
- длинноцепных алканолов, таких как названы выше, в частности алканолов, имеющих от 4 до 10 атомов углерода, таких как бутанол;
- диолов, таких как названы выше, в частности алкандиолов, имеющих от 3 до 10 и, в частности, от 3 до 8 атомов углерода, таких как пропандиол;
- кетонов, таких как названы выше, в частности кетонов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, таких как ацетон; и
- гидратов углерода, таких как названы выше, в частности дисахаридов, таких как трегалоза.
В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления при ферментации продукта метаболизма, полученных от микроорганизмов, речь идет о полигидроксиалканоатах, таких как поли-3-гидроксобутират, и сложном сополиэфире с другими органическими гидроксикарбоновыми кислотами, такими как 3-гидроксивалериановая кислота, 4-гидроксимасляная кислота и другие, которые описывают в указанном месте, например, также длинноцепные (также обозначаемые как с более длинными цепями) гидроксикарбоновые кислоты, такие как 3-гидроксиоктановая кислота, 3-гидроксидекановая кислота и 3-гидрокситетрадекановая кислота, а также их смеси. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в S.Y.Lee, Plastic Bacteria Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria, Tibtech, Bd. 14, (1996), с.431-438.
Поэтому в предпочтительном варианте осуществления микроорганизмы, применяемые в ферментации, выбирают из природных или рекомбинантных микроорганизмов, которые перепроизводят, по меньшей мере, один из следующих продуктов метаболизма:
- ферментов, такие как фитаза, ксиланаза или глюканаза;
- аминокислот, таких как лизин, треонин или метионин;
- витаминов, таких как пантотеновая кислота и рибофлавин; предшественник и/или их побочные продукты;
- дисахаридов, такие трегалоза;
- алифатических монокарбоновых кислот и дикарбоновых кислот, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, таких как пропионовая кислота, фумаровая кислота и янтарная кислота;
- алифатических гидроксикарбоновых кислот, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, таких как молочная кислота;
- полигидроксиалканоатов, таких как поли-3-гидроксибутират и сложные сополиэфиры 3-гидроксимасляной кислоты;
- кетонов, имеющих от 3 до 10 атомов углерода, таких как ацетон;
- алканолов, имеющих от 4 до 10 атомов углерода, таких как бутанол; и алкандиолов, имеющих от 3 до 8 атомов углерода, таких как пропандиол.
Подходящие микроорганизмы выбирают обычно из семейства Corynebacterium, Bacillus, Ashbya, Escherichia, Aspergillus, Alcaligenes, Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Lactobacillus, Propionibacterium, Rhizopus и Clostridium, в частности из штаммов Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Escherichia coli, Aspergillus niger или Alcaligenes latus, Anaerobiospirillum succiniproducens, Actinobacillus succinogenes, Lactobacillus delbrückii, Lactobacillus leichmanii, Propionibacterium arabinosum, Propionibacterium schermanii, Propionibacterium freudenreichii, Clostridium propionicum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium acetobutylicum, Rhizopus arrhizus и Rhizopus oryzae.
В предпочтительном варианте осуществления при микроорганизме, применяемом при ферментации, речь идет о штамме из семейства Corynebacterium, в частности о штамме Corynebacterium glutamicum. В частности речь идет о штамме семейства Corynebacterium, специально Corynebacterium glutamicum, который перепроизводит аминокислоту, специально лизине, метионине или глютамате.
В следующем предпочтительном варианте осуществления при микроорганизме, применяемом при ферментации, речь идет о штамме из семейства Escherichia, в частности о штамме Escherichia coli. В частности речь идет о семействе Escherichia, специально о штамме Escherichia coli, который перепроизводит аминокислоту, специально лизине, метионине или треонине.
В специальном предпочтительном варианте осуществления при продукте метаболизма, производимым от микроорганизмов в ферментации, речь идет о лизине. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в Pfefferle et al., в указанном месте, и патенте США 3708395. В принципе применяют как непрерывный, так и периодический (партия или подпитка) режим работы, предпочтительно режим работы подпитка.
В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления при продукте метаболизма, производимом от микроорганизмов в ферментации, речь идет о метионине. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в международной заявке WO 03/087386 и WO 03/100072.
В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления при продукте метаболизма, производимом от микроорганизмов в ферментации, речь идет о пантотеновой кислоте. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в международной заявке WO 01/021772.
2
В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления при продукте метаболизма, производимом от микроорганизмов в ферментации, речь идет о рибофлавине. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в международной заявке WO 01/011052, немецкой заявке на патент DE 19840709, международной заявке WO 98/29539, европейской заявке на патент 1186664 и Fujioka, К.: New biotechnology for riboflavin (витамин B) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления при продукте метаболизма, производимом от микроорганизмов в ферментации, речь идет о фумаровой кислоте. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в Rhodes et al, Production of Fumaric Acid in 20-L Fermentors, Applied Microbiology, 1962, 10 (1), 9-15.
В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления при продукте метаболизма, производимом от микроорганизмов в ферментации, речь идет о янтарной кислоте. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в Int. J. Syst. Bacteriol. 26, 498-504 (1976); европейская заявка на патент ЕР 249773 (1987), изобретатель: Lemme u. Datta; патент США 5504004 (1996), изобретатель: Guettler, Jain u. Soni; Arch. Microbiol. 167, 332-342 (1997); Guettler MV, Rumler D, Jain MK., Actinobacillus succinogenes sp.Nov., a novel succinic-acid-producing strain from the bovine rumen. Int J Syst Bacteriol. 1999 Jan; 49 Pt 1:207-16; патенты США 5723322, 5573931, 5521075, международная заявка на патент WO 99/06532, патенты США 5869301 или 5770435.
В следующем особенно предпочтительном варианте осуществления при продукте метаболизма, производимом от микроорганизмов в ферментации, речь идет о фитазе. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в международной заявке WO 98/55599.
При ферментации получают ферментационный раствор, который наряду с желаемым микробиологическим продуктом метаболизма в основном во время ферментации содержит полученную биомассу, которая содержит неметаболизированные составляющие засахаренного раствора крахмала и, в частности, не содержащие крахмал твердые составляющие источника крахмала, такие как, например, волокна и неутилизированный сахар, а также неутилизированные буферные и питательные соли. В предложенном изобретении данную жидкую среду также обозначают как ферментационный раствор, причем выражение ферментационный раствор также включает (содержащую сахар) жидкую среду, при которой происходит только частичное или неполное ферментативное превращение содержащегося в ней сахара, то есть частичное или неполный микробиологический метаболизм метаболизируемого сахара (например, моносахаридов и сахаридов).
Перед изолированием или обеднением микробиологического продукта метаболизма, или отделением летучих составляющих ферментационного раствора при необходимости проводят стадию стерилизации вышеописанным способом.
Специальный вариант осуществления данного изобретения относится к способу, при котором, по меньшей мере, один микробиологический продукт метаболизма обедняют или изолируют из ферментационного раствора. Летучие составляющие ферментационного раствора затем значительно удаляют, причем получают твердый или полутвердый протеиновый состав. Точное описание проведения такого способа и полученного при этом протеинового состава является предметом международной заявки на патент WO 2005/116228 (РСТ/ЕР 2005/005728), на которую относительно следующих деталей ссылка.
Выделение или обеднение продукта метаболизма из ферментационного раствора, то есть органического соединения с, по меньшей мере, 3 атомами углерода, или, по меньшей мере, 2 атомами углерода, и, по меньшей мере, один атом азота (далее также концентрат) происходит, как правило, таким образом, что, по меньшей мере, один продукт метаболизма обедняют или выделяют из ферментационного раствора таким образом, что содержание такого продукта метаболизма в оставшемся ферментационном растворе составляет максимум 20 мас.%, в частности максимум 10 мас.%, специально максимум 5 мас.% и в высшей степени предпочтительно максимум 2,5 мас.%, соответственно в расчете на общую массу оставшегося ферментационного раствора.
Изолирование или обеднение продукта метаболизма из ферментационного раствора может происходить на одной или нескольких стадиях. При этом основной стадией является отделение твердых составляющих из ферментационного раствора. Это можно проводить или перед, или после изолирования концентрата. Как для изолирования концентратов, так и для отделения твердых веществ, то есть твердо-жидкофазной сепарации, известны обычные в специальной области методы, которые также включают стадии для грубого и тонкого очищения концентратов, а также для расфасовки (например, описывают в Belter, P. A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), и Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5 издание на CD-ROM, издательство Wiley).
Для выделения концентрата можно поступить предпочтительно таким образом, что вначале удаляют твердые составляющие из ферментационного раствора, например, с помощью центрифугирования или фильтрации и затем концентрат изолируют из жидкой фазы, например, путем кристаллизации, осаждения, адсорбции или дистилляции. Альтернативно можно изолировать концентрат также непосредственно из ферментационного раствора, например, путем применения хроматографического способа или способов экстрагирования. В качестве хроматографического способа в частности называют ионообменную хроматографию, при которой концентрат можно селективно изолировать на хроматографической колонке. В данном случае происходит отделение твердых веществ из оставшегося ферментационного раствора предпочтительно, например, путем декантирования, выпаривания и/или сушки.
В случае летучих или масляных соединений, как правило, необходим контроль максимальных температур во время переработки, в частности во время сушки. Предпочтительно такие соединения также можно получить посредством того, что они составлены в, так сказать, твердой форме (псевдотвердой форме) на адсорбентах. Адсорбенты, пригодные для данной цели, указаны, например, в международной заявке на патент WO 2005/116228 (РСТ/ЕР 2005/005728). Примерами для соединений, которые можно предпочтительно получить таким способом, являются γ-линоленовая кислота, дигомо-γ-линоленовая кислота, арахидоновая кислота, эйкозапентаеновая кислота и докосагексановая кислота, кроме того, пропионовая кислота, молочная кислота, пропандиол, бутандиол и ацетон. Также согласно предложенному изобретению данные соединения в псевдотвердой композиции понимают в качестве нелетучих микробиологических продуктов метаболизма в твердой форме.
Следующий специальный вариант осуществления относится к способу, при котором летучие составляющие ферментационного раствора значительно или полностью отделяют без предыдущего изолирования или обеднения нелетучими микробиологическими продуктами метаболизма, и при необходимости, без предыдущего отделения твердых составляющих, причем получают твердую формулировку нелетучего микробиологического продукта метаболизма. Более точное описание проведения такого способа находится в РСТ/ЕР 2006/066057 (более старая немецкая заявка на патент DE 102005042541.0).
В значительной мере означает, что после удаления летучих составляющих остается твердый или, по меньшей мере, полутвердый остаток, который после добавления твердых веществ можно переводить в твердый продукт. Как правило, это означает, что летучие составляющие необходимо удалить до содержания остаточной влажности не более чем 30 мас.%, часто не более чем 20 мас.% и, в частности, не более чем 15 мас.%, как правило, летучие составляющие ферментационного раствора предпочтительно удаляют из ферментационного раствора до содержания остаточной влажности в области от 0,2 до 30 мас.%, предпочтительно от 1 до 20 мас.%, особенно предпочтительно от 2 до 15 мас.% и в высшей степени предпочтительно от 5 до 15 мас.%, в расчете на общую массу твердых веществ, установленную после сушки. Содержание остаточной влажности можно определить способом, известным специалисту в данной области, например, с помощью термогравиметрии (Hemminger et al., Методы термического анализа, издательство Springer, Берлин, Heidelberg, 1989).
Получение нелетучего (нелетучих) продукта (продуктов) метаболизма в твердой форме из ферментационного раствора может происходить на одной, двух или нескольких стадиях, в частности в одностадийном или двухстадийном способе действия. Как правило, включают, по меньшей мере, одну стадию сушки, в частности заключительную стадию для получения продукта метаболизма в твердой форме
При одностадийном способе действия летучие составляющие ферментационного раствора удаляют, при необходимости, после вышеназванного предварительного отделения, до достижения желаемого содержания остаточной влажности.
При двухстадийном или многостадийном способе действия вначале ферментационный раствор, например, с помощью (микрофильтрации, ультрафильтрации) фильтрации или термически путем выпаривания части летучих составляющих. Часть летучих составляющих, которые удаляют на данной стадии, составляет, как правило, от 10 до 80 мас.% и, в частности, от 20 до 70 мас.%, в расчете на общую массу летучих составляющих ферментационного раствора. На одной или нескольких заключительных стадиях остаточные летучие составляющие ферментационного раствора удаляют до достижения желаемого содержания остаточной влажности.
Удаление летучих составляющих жидкой среды происходит согласно данному варианту осуществления в основном без предшествующего обеднения или законченного изолирования концентрата. При удалении летучих составляющих ферментационного раствора, следовательно, нелетучий продукт метаболизма в основном удаляют не вместе с летучими составляющими жидкой среды, а оставляют с, по меньшей мере, одной частью, обычно с основным количеством и, в частности, с общим количеством прочих твердых составляющих из ферментационного раствора в полученном таким образом остатке. Соответственно этому также можно, предпочтительно незначительные, части желаемого нелетучего микробиологического продукта метаболизма, как правило, максимально 20 мас.%, например, от 0,1 до 20 мас.%, предпочтительно не более чем 10, в частности не более чем 5 мас.%, особенно предпочтительно максимально 2,5 мас.% и в высшей степени предпочтительно максимально 1 мас.%, в расчете на общую сухую массу продукта метаболизма, при удалении летучих составляющих ферментационного раствора вместе с этим. В высшей степени предпочтительном варианте осуществления остается желаемый нелетучий микробиологический продукт метаболизма до, по меньшей мере, 90 мас.%, в частности, по меньшей мере, 95 мас.%, специально 99 мас.% и совсем специально примерно 100 мас.%, соответственно в расчете на общую сухую массу продукта метаболизма, в качестве твердого вещества в смеси с частью, полученной после удаления летучих составляющих, или совокупность твердых составляющих ферментационной среды.
Поскольку желательно, перед удалением летучих составляющих часть, например, от 5 до 80 мас.% и, в частности, от 30 до 70 мас.%, не содержащих сахар твердых составляющих можно удалить из ферментационного раствора, например, с помощью центрифугирования или фильтрации. При необходимости проводят такое предварительное отделение, чтобы удалить грубые частицы твердого вещества, которые не содержат или только содержат только незначительные части нелетучего микробиологического продукта метаболизма. Для предварительной фильтрации можно применять обычные способы, известные специалисту в данной области, например, при применении крупноячеистых сит, сеток, перфорированных листов и т.п. При необходимости отделение грубых частиц твердого вещества также может происходить в центробежном сепараторе. Применяемые при этом устройства также известны специалисту в данной области, такие как декантаторы, центрифуги, седикантеры и сепараторы. Таким образом получают твердый или полутвердый, например пастообразный, остаток, который содержит нелетучий продукт метаболизма и нелетучие, как правило, твердые, не содержащие крахмал составляющие источника крахмала или, по меньшей мере, большую часть этого, часто, по меньшей мере, 90 мас.% или общее количество твердых не содержащих крахмал составляющих.
Благодаря добавлению вспомогательных средств формулирования, таких как носители и покрытия, связующие средства, а также другие присадки, можно получать свойства высушенных и вместе с твердыми составляющими в ферментации находящегося продукта метаболизма целенаправленно относительно различных параметров, таких как содержание активного вещества, размер зерен, форма частиц, склонность к пылимости, гигроскопичность, стабильность, в частности стабильность при хранении, цвет, запах, текучесть, склонность к агломерации, электростатический заряд, чувствительность к свету и температуре, механическая стабильность и способность к редиспергированию известным способом.
К обычно применяемым вспомогательным средствам формулирования относятся, например, связующие средства, носители, средства для опудривания, средства, улучшающие текучесть, кроме того, красящие пигменты, биоциды, диспергаторы, противовспениватели, средства для регулирования вязкости, кислоты, щелочные растворы, антиоксиданты, стабилизаторы ферментов, ингибиторы ферментов, адсорбаты, жиры, жирные кислоты, масла или их смеси. Такие вспомогательные средства формулирования предпочтительно применяют, в частности, при применении способов формулирования и сушки, таких как распылительная сушка, сушка в вихревом слое и сублимационная сушка, в качестве вспомогательных средств сушки. Относительно следующих деталей ссылка на РСТ/ЕР 2006/066057 (более старая немецкая заявка на патент DE 102005042541.0).
Часть вышеназванных добавляемых веществ и, при необходимости, следующие добавляемые вещества, такие как материалы покрытия, можно сильно варьировать в зависимости от специальных требований соответствующего продукта метаболизма, а также в зависимости от свойств применяемого добавляемого веществ, и находится, например, в области от 0,1 до 80 мас.% и, в частности, в области от 1 до 30 мас.%, соответственно в расчете на общую массу готового составленного продукта или смеси веществ.
Добавление вспомогательных средств формулирования может происходить перед, во время или после переработки ферментационного раствора (также обозначается как композиция продукта или структура твердого вещества) и, в частности, во время сушки. Добавление вспомогательных средств формулирования перед переработкой ферментационного раствора или продукта метаболизма может быть предпочтительно, чтобы улучшить способность к ведению процесса перерабатываемых веществ или продуктов. Вспомогательные средства формулирования можно добавлять как к продукту метаболизма, полученному в твердой форме, так и к содержащему его раствору или суспензии, например, после заключительной ферментации непосредственно к ферментационному раствору, или полученному в течение переработки раствору, или суспензии перед последующей стадией сушки.
Таким образом вспомогательные вещества можно подмешивать, например, в суспензию микробиологического продукта метаболизма; такую суспензию можно наносить на носитель, например, путем разбрызгивания или подмешивания. Добавление вспомогательных средств формулирования во время сушки может играть, например, роль, если разбрызгивают раствор или суспензию, содержащую продукт метаболизма. В частности добавление вспомогательных средств формулирования происходит после сушки, например, при нанесении покрытий или слоев покрытия на высушенные частицы. Следующие вспомогательные вещества можно добавлять к продукту как после сушки, так и после возможной стадии покрытия.
Удаление летучих составляющих из ферментационного раствора происходит известным образом обычными способами отделения твердых фаз от жидких фаз, включая способы фильтрации и способы выпаривания летучих составляющих жидких фаз. Такие способы, которые могут включать также стадии для грубой очистки концентратов, а также стадии для расфасовки, описывают, например, Belter, P.A, Bioseparations: Downstream Processing for Biotechnology, John Wiley & Sons (1988), и Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5 издание, на CD-ROM, издательство Wiley. В рамках композиции продукта или переработки после заключительной ферментации применяемые, известных специалисту в данной области способов, аппаратуры, вспомогательных веществ или общие и специальные варианты осуществления, кроме того, описывают в европейских заявках на патент ЕР 1038527, ЕР 0648076, ЕР 835613, ЕР 0219276, ЕР 0394022, ЕР 0547422, ЕР 1088486, международная заявка на патент WO 98/55599, европейская заявка на патент ЕР 0758018 и международная заявка на патент WO 92/12645.
В первом варианте данного осуществления нелетучий микробиологический продукт метаболизма, поскольку он находится в жидкой фазе растворенным, переводят из жидкой фазы в твердую фазу, например, путем кристаллизации или осаждения. Затем происходит отделение нелетучих твердых составляющих, включая продукт метаболизма, например, с помощью центрифугирования, декантирования или фильтрации. Подобным образом также можно отделить масляные продукты метаболизма, причем соответственно масляные продукты ферментации путем добавления адсорбентов, например кремниевую кислоту, силикагель, глину и активированный уголь, переводят в твердую форму.
Во втором варианте данного осуществления летучие составляющие удаляют путем выпаривания. Выпаривание может происходить известным способом. Примерами подходящих способов выпаривания летучих составляющих являются распылительная сушка, сушка в вихревом слое или агломерация в вихревом слое, сублимационная сушка, прямоточные пневматические сушилки и контактные сушилки, а также экструзионная сушка. Также можно проводить комбинацию вышеназванных задающих форму способов со способами, такими как экструзия, гранулирование или дробление. При данных последних названных способах предпочтительно применяют частично или значительно предварительно высушенные смеси веществ, содержащие продукт метаболизма.
В предпочтительном варианте осуществления удаление летучих целесообразно с помощью обычных передающих устройств для жидкостей, составляющих ферментационного раствора включает способ распылительной сушки или способ сушки в вихревом слое, включая гранулирование в вихревом слое. Для этого ферментационный раствор, при необходимости, после предварительного отделения для удаления грубых частиц твердого вещества, которые не содержат или содержат только незначительные части нелетучего микробиологического продукта метаболизма, подают в один или несколько аппаратов для распылительной сушки или сушки в вихревом слое. Транспорт или подача загруженного твердым веществом ферментационного раствора происходит содержащих твердые вещества, например насосов, таких как эксцентриковые шнековые насосы (например, фирмы Delasco PCM) или насосы высокого давления (например, фирмы LEWA Herbert Ott GmbH).
Проведение ферментации также может происходить таким образом, что
(i) из жидкой среды (1), полученной на стадии а2), со следующим источником сахара берут частичное количество не больше чем 50 мас.%, например, в области от 5 до 45 мас.%, в расчете на общую массу, и добавляют остаточное количество, при необходимости, вместе со следующим источником сахара, таким как определено выше, к ферментации для получения первого продукта метаболизма (А), например, нелетучего продукта метаболизма (А), в твердой форме или летучего продукта метаболизма (А); и
(ii) взятое частичное количество, при необходимости, после предыдущего полного или частичного отделения не содержащих крахмал твердых составляющих источника крахмала, при необходимости, вместе со следующим источником сахара, как определено выше, добавляют к ферментации для получения второго продукта метаболизма (В), который идентичен с продуктом метаболизма (А) или отличается от него.
В случае отделения не содержащих крахмал твердых составляющих согласно (ii) содержание твердого вещества оставшейся части жидкой среды составляет предпочтительно максимально 50 мас.%, в частности максимально 30 мас.%, особенно предпочтительно максимально 10 мас.% и в высшей степени предпочтительно максимально 5 мас.%. В частности в данном случае предпочтительно отделять общее количество твердых веществ перед ферментацией для получения второго продукта метаболизма (В).
Данный способ действия способствует тому, что в нем применяют отдельную ферментацию согласно (ii) микроорганизмов, для которых необходимо выполнить определенные минимальные требования, например, относительно скорости передачи кислорода. Для таких в отдельной ферментации согласно (ii) используемых микроорганизмов применяют, например, Bacillus species, предпочтительно Bacillus subtilis. Соединения, получаемые благодаря таким микроорганизмам в отдельной ферментации, выбирают из витаминов, кофакторов и нутрицевтиков, пуриновых оснований и пиримидина, нуклеозидов и нуклеотидов, липидов, насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, ароматических соединений, протеинов, каротеноидов, специально из витаминов, кофакторов и нутрицевтиков, протеинов и каротеноидов и совсем специально из рибофлавина и пантотената кальция.
Предпочтительная разработка данного способа действия относится к параллельно осуществляемому получению подобных продуктов метаболизма (А) и (В) в двух отдельных ферментациях. Это, в частности, предпочтительно в том случае, если для различных применений подобного продукта метаболизма устанавливают различные требования к чистоте. Таким образом, первый продукт метаболизма (А), например аминокислоту, применяемую в качестве добавки к кормам, например лизин, метионин, треонин или глютамат, получают при применении содержащего твердое вещество ферментационного раствора и подобный второй продукт метаболизации (В), например, аминокислоты, одинаково применяемые в качестве пищевых добавок, при применении согласно (ii) обедненного твердым веществом ферментационного раствора. Благодаря полному или частичному отделению не содержащих крахмал твердых составляющих можно сократить затраты на очищение при переработке продукта метаболизма, чья область применения требует высокую чистоту, например, в качестве пищевых добавок.
В следующем предпочтительном варианте осуществления данного способа действия можно провести, например, как указано ниже. Внедряют предпочтительно ферментацию больших объемов для получения продуктов метаболизма А, например, из аминокислот, таких как лизин, метионин, глютамат или треонин, из лимонной кислоты или из этанола, например, соответственно способам, описанным в международной заявке на патент WO 2005/116228 (РСТ/ЕР 2005/005728) или РСТ/ЕР 2006/066057 (более старая немецкая заявка на патент DE 102005042541.0) или соответственно уровню техники, известному для ферментативного получения биоэтанола (см. выше). Согласно (i) берут часть жидкой среды (1), полученной на стадии а2), или их смесь со следующим источником сахара. Согласно (i) взятую часть согласно (ii) обычным способом, например, центрифугированием или фильтрацией, полностью или частично можно освободить от твердых составляющих, в зависимости от требований ферментации для получения В. Таким образом полученную, при необходимости, полностью или частично освобожденную от твердых веществ жидкую среду (1) согласно (ii), при необходимости вместе со следующим источником сахара, таких как определено выше, подают к ферментации для производства продукта метаболизма В. Согласно (ii) отделенный поток твердых веществ предпочтительно возвращают к потоку содержащей сахар жидкой среды ферментации с большими объемами.
Если полученный в ферментации с большими объемами микробиологический продукт метаболизма (А) является этанолом, то происходит отбор из жидкой среды (1). В таком случае жидкая среда (1) должна иметь содержания сахара, такие как являются обычными при ферментативном производстве этанола (биоэтанола), например, в области от 20 до 30 мас.% обычно при данном действии остаточные количества содержащей сахар жидкой среды (1), полученные при стадии (i), приводят к ферментации для получения А (то есть здесь этанола). Вместе со следующим источником сахара взятое на стадии (i) частичное количество содержащей сахар жидкой среды (1), при необходимости, после отделения твердых веществ согласно стадии (ii) добавляют к ферментативному получению В.
2
В предпочтительном варианте осуществления вышеописанного способа действия при продукте метаболизма В, полученном в ферментации из микроорганизмов, речь идет о рибофлавине. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в международной заявке WO 01/011052, немецкой заявке на патент DE 19840709, международной заявке WO 98/29539, европейской заявке на патент 1186664 и Fujioka, К.: New biotechnology for riboflavin (витамин В) and character of this riboflavin. Fragrance Journal (2003), 31 (3), 44-48.
Для проведения данного варианта способа внедряют предпочтительно ферментацию с большими объемами для получения продуктов метаболизма А, например, аминокислот, таких как лизин, глютамат, треонин или метионин, из лимонной кислоты или этанола, как описано выше. Согласно (i) берут часть жидкой среды (1), полученной на стадии а2), или их смесь со следующим источником сахара. Согласно (i) взятую часть согласно (ii) обычным способом, например, центрифугированием или фильтрацией, полностью или частично можно освободить от твердых составляющих, в зависимости от требований ферментации для получения В. Таким образом полученную, при необходимости, полностью или частично освобожденную от твердых веществ жидкую среду (1) согласно (ii), при необходимости вместе со следующим источником сахара, таких как определено выше, подают к ферментации для производства продукта метаболизма В, здесь рибофлавина. Согласно (ii) отделенный поток твердых веществ предпочтительно возвращают к потоку содержащей сахар жидкой среды ферментации больших объемов.
Таким образом, согласно (ii) полученный содержащий рибофлавин ферментационный раствор можно перерабатывать согласно обычным условиям и способам действиям, таким как описывают для других источников углеводов, например, в немецкой заявке на патент DE 4037441, европейских заявках на патент ЕР 464582, ЕР 438767 и DE 3819745. После лизирования клеточной массы происходит отделение кристаллического рибофлавина предпочтительно путем декантирования. Другие виды отделения твердых веществ, например фильтрация, также являются возможными. Затем рибофлавин сушат предпочтительно с помощью распылительных сушилок и сушилок с вихревым слоем. Альтернативно к этому можно переработать согласно (ii) полученную содержащую рибофлавин ферментационную смесь согласно аналогичным условиям и способам действия, таким как, например, описывают в европейских заявках на патент ЕР 1086668 и ЕР 730034. После пастеризации ферментационный раствор здесь центрифугируют и остаточную содержащую твердое вещество фракцию обрабатывают минеральной кислотой. Образованный рибофлавин фильтруют из вводно-кислой среды, при необходимости, промывают и затем сушат.
В следующем предпочтительном варианте осуществления данного способа действия при продукте метаболизма В, полученном в ферментации из микроорганизмов, речь идет о пантотеновой кислоте. Для проведения ферментации здесь можно применять аналогичные условия и способы действия, такие как описывают для других источников углеродов, например, в международной заявке WO 01/021772.
Для проведения данного варианта способа можно поступать, например, как описывают выше для рибофлавина. Согласно (ii) предварительно очищенную, предпочтительно в основном освобожденную от твердых веществ, содержащую сахар жидкую среду (1) или ее смесь со следующим источником сахара подают в ферментацию согласно (ii) для производства пантотеновой кислоты. Причем особенно предпочтительной является вязкость, уменьшенная по сравнению с содержащей твердое вещество жидкой средой. Отделенный поток твердого вещества возвращают к потоку содержащей сахар жидкой среды ферментации с большими объемами.
Согласно (ii) полученную содержащий пантотеновую кислоту ферментационный раствор можно перерабатывать согласно аналогичным условиям и способам действия, таким как, например, описывают в европейской заявке на патент ЕР 1050219 и международной заявке на патент WO 01/83799. После пастеризации общего ферментационного раствора оставшиеся твердые вещества отделяют, например, путем центрифугирования или фильтрации. Фильтрат из отделения твердых веществ частично выпаривают, при необходимости перемешивают и сушат, в частности сушат распылением.
В рамках параллельно описанного способа фильтрации с большими объемами отделенные твердые вещества можно получить вместе с соответственно желаемым микробиологическим продуктом метаболизма (А).
После сушки и/или формулирования или расфасовки к композиции продукта или протеиновому составу можно добавлять целые или молотые злаковые культуры, предпочтительно кукурузу, пшеницу, ячмень, просо, тритикале и/или рожь.
Следующие примеры служат для иллюстрирования отдельных аспектов предложенного изобретения, однако никоим образом не ограничивают его объем.
Примеры
I. Измельчение источника крахмала
Применяемые далее размолотые материалы получают, как указано ниже. Цельные зерна кукурузы полностью измельчают при применении роторной мельницы. При применении различных бил, дробящих плит или элементов сит достигают три различные тонкости помола. Ситовый анализ размолотого продукта с помощью лабораторного вибрационного сита (вибрационного анализатора: Retsch Vibrotronic тип VE1; время просеивания 5 мин; амплитуда 1,5 мм) дает результаты, приведенные в таблице I.
Таблица I
Номер испытания
Т 70/03
Т 71/03
Т 72/03
<2 мм/%
99,4
100
10
<0,8 мм/%
66
100
99
<0,63 мм/%
58,6
98,5
91
<0,315 мм/%
48,8
89
65
<0,1 мм/%
25
9,6
<0,04 мм/%
8
3,2
Количество размолотого материала общее
20 кг
11,45 кг
13,75 кг
II. Ферментативная конденсация крахмала и осахаривание
II.1. Без фитазы на стадии осахаривания
II.1а) ферментативная конденсация крахмала
2
4
Из 320 г сухой измельченной кукурузной муки (Т71/03) при непрерывном перемешивании замешивают суспензию в 480 г воды и перемешивают с 310 мг хлорида кальция. Перемешивание продолжают во время всего проведения испытания. После установления значений pH с помощью HSO на 6,5 и нагревания до 35°С добавляют 2,4 г термамила 120 л типа L (Novozymes A/S). Реакционную смесь нагревают при температуре 86,5°С в течение 40 мин, причем значение pH при необходимости с помощью NaOH подстраивают на предварительно установленное значение. В течение 30 мин добавляют следующие 400 г сухой измельченной кукурузной муки (Т71/03), причем температуру повышают до 91°С. Реакционную смесь сохраняют при данной температуре в течение около 100 мин. Затем добавляют следующие 2,4 г термамила 120 L и температуру сохраняют в течение около 100 мин. Успех конденсации прослеживают во время продолжительности проведения с помощью реакции йод-крахмал. Затем температуру повышают до 100°С и реакционную смесь кипятят в течение следующих 20 мин. К данному моменту никакого крахмала больше не обнаруживают. Реактор охлаждают при температуре 35°С.
II.1b) осахаривание
2
4
Реакционную смесь, полученную из II.1а), нагревают при непрерывном перемешивании до 61°С. Перемешивание продолжают во время всего проведения испытания. После установления значений pH с помощью HSO на 4,3 добавляют 10,8 г (9,15 мл) декстрозима GA (Novozymes A/S). Температуру сохраняют в течение около 3 ч, причем успех реакции прослеживают с помощью тест-полосок для определения уровня глюкозы (S-глюкотест фирмы Boehringer). Результаты приводят в нижестоящей таблице II. Затем реакционную смесь нагревают при температуре 80°С и после этого охлаждают. Получают около 1180 г жидкого продукта с плотностью около 1,2 кг/л и определенным с помощью инфракрасной сушилки содержанием сухой массы около 53,7 мас.%. Содержание сухой массы около 53,7 мас.%. Содержание сухой массы (без водорастворимых составляющих) после промывки водой составляет примерно 14 мас.%. Полученная путем ЖХВР часть глюкозы в реакционной смеси составляет 380 г/л (ср. таблицу 2, проба №7).
Таблица II
Проба №
мин (с добавлением глюкоамилазы)
Конц. глюкозы в избытке [г/л]
1
5
135
2
45
303
3
115
331
4
135
334
5
165
340
6
195
359
7
225
380
II.2. С фитазой на стадии осахаривания
II.2а) конденсация крахмала
Сухую измельченную пробу размолотого материала конденсируют соответственно II.1а).
II.2b) осахаривание
2
4
Реакционную смесь, полученную из II.2а), нагревают при непрерывном перемешивании до 61°С. Перемешивание продолжают во время всего проведения испытания. После установления значений pH с помощью NSO на 4,3 добавляют 10,8 г (9,15 мл) декстрозима GA (Novozymes A/S) и 70 мкл фитазы (700 единиц фитазы, Natuphyt Liquid 1000L фирмы BASF акционерное общество). Температуру сохраняют в течение около 3 ч, причем успех реакции прослеживают с помощью тест-полосок для определения уровня глюкозы (S-глюкотест фирмы Boehringer). Затем реакционную смесь нагревают при температуре 80°С и после этого охлаждают. Полученный продукт сушат с помощью инфракрасной сушилки и промывают водой. Часть глюкозы в реакционной смеси определяют путем ЖХВР.
II.3. Следующие рабочие инструкции для ферментативной конденсации и осахаривания крахмала.
II.3а) кукурузная мука
2
2
2
2+
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. 1,54 мл CaCl маточного раствора (100 г CaCl×2HO/л) добавляют в пульпу до конечной концентрации примерно 70 ppm Са. При непрерывном перемешивании 240 г кукурузной муки медленно сыпят в воду. После установления pH на 6,5 с помощью 50 мас.% водного раствора NaOH добавляют 4,0 мл (= 2 мас.% фермента/сухой массы) термамила 120L тип L (Novozymes A/S). Затем пульпу быстро нагревают до температуры 85°С. При этом pH необходимо постоянно контролировать и, при необходимости, подрегулировать.
2
2
2
2+
После достижения окончательной температуры начинают с добавления следующей муки, вначале 50 г муки. Дополнительно к пульпе добавляют 0,13 мл CaCl маточного раствора, чтобы концентрацию Сасохранить при 70 ppm. Во время добавления температуру сохраняют постоянной при 85°С. Ждут, по меньшей мере, 10 мин, чтобы гарантировать полную реакцию, прежде чем добавляют следующую порцию (50 г муки и 0,13 мл CaCl маточного раствора). После добавления двух порций добавляют 1,67 мл термамила; затем добавляют две следующие порции (соответственно 50 г муки и 0,13 мл CaCl маточного раствора). Достигают содержания сухой массы 55 мас.%. После добавления температуру повышают до 100°С и пульпу кипятят в течение 10 мин.
Изымают пробу и охлаждают ее при комнатной температуре. После разбавления пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора люголя (смесь 5 г йода и 10 г йодида калия на литр). Темно-синяя окраска показывает содержание оставшегося крахмала; коричневая окраска возникает, если крахмал был полностью гидролизован. Если испытание показывает часть оставшегося крахмала, то температуру снова понижают до 85°С и сохраняют постоянной. Добавляют следующие 1,67 мл термамила, до тех пор пока не получат отрицательную реакцию йод-крахмал.
Смесь, испытанную отрицательно на содержание крахмала, затем для следующей реакции осахаривания доводят до 61°С. pH устанавливают путем добавления 50%-ной серной кислоты до 4,3. В течение реакции pH сохраняют при данном значении. Температуру сохраняют при 61°С. К смеси добавляют 5,74 мл (=1,5 мас.% фермента/сухой массы) декстрозима GA (Novozymes A/S), чтобы конденсированный крахмал превратить в глюкозу. Реакция происходит в течение одного часа. Для дезактивации фермента смесь нагревают при температуре 85°С. Горячую смесь разливают в стерильный сосуд и хранят ее после охлаждения при температуре 4°С. Конечная концентрация глюкозы достигает 420 г/л.
II.3b) ржаная мука (включая предварительную обработку целлюлазы/гемицеллюлазы)
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании 155 г ржаной муки медленно сыпят в воду. Температуру сохраняют постоянной при 50°С. После установления pH на 5,5 с помощью 50 мас.% водного раствора NaOH добавляют 3,21 мл (=2,5 мас.% фермента/сухой массы) вискозима L (Novozymes A/S). Через 30 мин начинают добавление следующей муки, вначале 55 г муки. Через следующие 30 мин снова добавляют 50 г муки; 30 мин спустя еще раз 40 г муки. Через 30 мин после последнего добавления можно начать с конденсации.
2
2
2
Добавляют 1,7 мл CaCl маточного раствора (100 г CaCl×2HO/л). После установления pH на 6,5 с помощью 50 мас.% водного раствора NaOH добавляют 5,0 мл (=2 мас.% фермента/сухой массы) термамила 120L тип L (Novozymes A/S). Затем пульпу быстро нагревают до температуры 85°С.
При этом pH необходимо постоянно контролировать и, при необходимости, подрегулировать.
2
2
2
2+
После достижения окончательной температуры начинают с добавления следующей муки, вначале 60 г муки. Дополнительно к пульпе добавляют 0,13 мл CaCl маточного раствора, чтобы концентрацию Сасохранить при 70 ppm. Во время добавления температуру сохраняют постоянной при 85°С. Ждут, по меньшей мере, 10 мин, чтобы гарантировать полную реакцию, прежде чем добавить следующую порцию (40 г муки и 0,1 мл CaCl маточного раствора). Добавляют 1,1 мл термамила; затем добавляют следующие порции (40 г муки и 0,1 мл CaCl маточного раствора). Достигают содержания сухой массы 55 мас.%. После добавления температуру повышают до 100°С и пульпу кипятят в течение 10 мин.
Изымают пробу и охлаждают ее при комнатной температуре. После разбавления пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора люголя (смесь 5 г йода и 10 г йодида калия на литр). Темно-синяя окраска показывает содержание оставшегося крахмала; коричневая окраска возникает, если крахмал был полностью гидролизован. Если испытание показывает часть оставшегося крахмала, то температуру снова понижают до 85°С и сохраняют постоянной. Добавляют следующие 1,1 мл термамила, до тех пор пока не получат отрицательную реакцию йод-крахмал.
Смесь, испытанную отрицательно на содержание крахмала, затем для следующей реакции осахаривания доводят до 61°С. pH устанавливают путем добавления 50%-ной серной кислоты до 4,3. В течение реакции pH сохраняют при данном значении. Температуру сохраняют при 61°С. К смеси добавляют 5,74 мл (=1,5 мас.% фермента/сухой массы) декстрозима GA (Novozymes A/S), чтобы конденсированный крахмал превратить в глюкозу. Реакция происходит в течение одного часа. Для дезактивации фермента смесь нагревают при температуре 85°С. Горячую смесь разливают в стерильный сосуд и хранят ее после охлаждения при температуре 4°С. Конечная концентрация глюкозы достигает 370 г/л.
II.3с) пшеничная мука (включая предварительную обработку ксиланазы)
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. Воду нагревают при температуре 55°С и значение pH устанавливают 6,0 с помощью 50 мас.% водного раствора NaOH. После установления температуры и pH добавляют 3,21 мл (=2,5 мас.% фермента/сухой массы) Shearzyme 500L (Novozymes A/S). При непрерывном перемешивании 155 г пшеничной муки медленно сыпят в воду. Температуру и pH сохраняют постоянными. Через 30 мин начинают добавление следующей муки, вначале 55 г муки. Через следующие 30 мин снова добавляют 50 г муки; 30 мин спустя еще раз 40 г муки. Через 30 мин после последнего добавления можно начать с конденсации.
Конденсацию и осахаривание проводят, как описывают под II.3b. Конечная концентрация глюкозы достигает 400 г/л.
III. Штамм АТСС13032 lysCfbr
В некоторых следующих примерах применяют модифицированный штамм Corynebacterium glutamicum, который описывают под названием АТСС13032 lysCfbr в международной заявке на патент WO 05/059144.
Пример 1
fbr
Получают по гидролизату кукурузной муки, пшеничной муки и ржаной муки, как описывают под 1). Содержание общего сахара в данной среде повышают с помощью добавления различных сахарных растворов (содержащих глюкозу, сахар-сырец, мелассу). Среду в качестве источника углерода применяют в испытаниях в вибрационной колбе при применении Corynebacterium glutamicum (АТСС13032 lysC) и Bacillus PA824 (точное описание в международной заявке на патент WO 02/061108).
1) получение гидролизата муки
а) гидролизат кукурузной муки
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании 155 г кукурузной муки медленно сыпят в воду.
Конденсация
После установления pH на 5,8 с помощью 50 мас.% водного раствора NaOH добавляют 2,6 мл (=2 мас.% фермента/сухой массы) Liquozyme SC (Novozymes A/S). Затем пульпу быстро нагревают до температуры 100°С и кипятят в течение 10 минут. При этом pH необходимо постоянно контролировать и, при необходимости, подрегулировать.
Изымают пробу и охлаждают ее при комнатной температуре. После разбавления пробы деионизированной водой (примерно 1:10) добавляют каплю концентрированного раствора люголя (смесь 5 г йода и 10 г йодида калия на литр). Темно-синяя окраска показывает содержание оставшегося крахмала; коричневая окраска возникает, если крахмал был полностью гидролизован.
Осахаривание
Смесь, испытанную отрицательно на содержание крахмала, затем для следующей реакции осахаривания доводят до 61°С. pH устанавливают путем добавления 50%-ной серной кислоты до 4,3. В течение реакции pH сохраняют при данном значении. Температуру сохраняют при 61°С. К смеси добавляют 2,0 мл (=1,5 мас.% фермента/сухой массы) декстрозима GA (Novozymes A/S), чтобы конденсированный крахмал превратить в глюкозу. Реакция происходит в течение одного часа. Для дезактивации фермента смесь нагревают при температуре 85°С. Горячую смесь разливают в стерильный сосуд и хранят ее после охлаждения при температуре 4°С.
b) гидролизат пшеничной муки
предварительная обработка ксиланазой
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. Воду нагревают при температуре 55°С и значение pH устанавливают 6,0 с помощью 50 мас.% водного раствора NaOH. После установления температуры и pH добавляют 3,21 мл (=2,5 мас.% фермента/сухой массы) Shearyme 500L (Novozymes A/S). При непрерывном перемешивании 155 г пшеничной муки медленно сыпят в воду. Температуру и pH сохраняют постоянными. Через 30 мин можно начинать с конденсации.
Конденсация и осахаривание проводят, как описывают под 1а)
c) гидролизат ржаной муки
предварительная обработка целлюлазой/гемицеллюлазой
360 г деионизированной воды помещают в реакционный сосуд. При непрерывном перемешивании 155 г ржаной муки медленно сыпят в воду. Температуру сохраняют постоянной при 50°С. После установления pH на 5,5 с помощью 50 мас.% водного раствора NaOH добавляют 3,21 мл (=2,5 мас.% фермента/сухой массы) вискозима L (Novozymes A/S). Через 30 мин после последнего добавления можно начать с конденсации.
Конденсацию и осахаривание проводят, как описывают под 1а)
2) получение Inokulum
а) для Corynebacterium glutamicum
После размазывания на стерильной СМ+СаАс-агаре (состав: см. таблицу 1; 20 мин при 121°С) клетки инкубируют в течение ночи при температуре 30°С. Затем клетки соскребают от плит и соль ресуспендируют. 25 мл среды (см. таблицу 4) в 250 мл колбе Эрленмейера с двумя дефлекторами затравливают соответственно с таким количеством полученной таким образом клеточной суспензии, что оптические плотности достигают значения OD610=0,5 при 610 нм.
Таблица 1: состав пластин из СМ+СаАс-агара
Концентрация
Составляющее
10,0 г/л
D-глюкоза
2,5 г/л
NaCl
2,0 г/л
Мочевина
50,0 г/л
Bacto Pepton (Difco)
50,0 г/л
Экстракт дрожжей (Difco)
50,0 г/л
Экстракт говядины (Difco)
20,0 г/л
Касаминокислота
20,0 г/л
Агар
b) для Bacillus
42 мл среды первичных культур (см. таблицу 2) в 250 мл колбе Эрленмейера с двумя дефлекторами затравливают соответственно с 0,4 мл замороженной культуры и инкубируют в течение 24 ч при температуре 43°С при колебании (250 об/мин) в увлажняющем вибрационном шкафу.
Таблица 2: состав среды первичных культур
Составляющее
Концентрация
Мальтоза
28,6 г/л
Соевая мука
19,0 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
7,6 г/л
Глютамат мононатрия
4,8 г/л
Цитрат натрия
0,95 г/л
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
9,5 мг/л
MnCl<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
1,9 мг/л
ZnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
1,4 мг/л
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
1,9 мг/л
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,2 мг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,7 мг/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>×3H<sub>2</sub>O
15,2 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
3,9 г/л
MgCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,9 г/л
CaCl<sub>2</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,09 г/л
MOPS
59,8 г/л
pH*
7,2
* Устанавливают с разбавленным водным раствором КОН.
42 мл среды основной культуры (смотри таблицу 6) в 250 мл колбе Эрленмейера с двумя дефлекторами затравливают соответственно с 1 мл первичной культуры.
3) получение ферментационного раствора
а) для Corynebacterium glutamicum
Состав среды в колбе приводят в таблице 4. Должна существовать концентрация исходного сахара 60 г/л. Причем половина сахара происходит из гидролизата (ферментационной среды (1)), другую половину добавляют в качестве сахарного раствора. К тому же получают смесь из гидролизата и сахарного раствора и добавляют к среде в колбе. В контрольной среде применяют соответствующее количество раствора глюкозы.
Применяют следующие растворы (см. таблицу 3):
После затравливания колбы инкубируют в течение 3 дней при температуре 30°С и при колебании (200 об/мин) в увлажняющем вибрационном шкафу. После прекращения ферментации содержание лизина определяют с помощью ЖХВР. Анализы ЖХВР проводят с приборами 1100 серии LC фирмы Agilent. Определение концентрации аминокислот происходит с помощью ЖХВР на Agilent 100 серии LC систем ЖХВР. Предколоночная дериватизация орто-фталальдегидом позволяет квантификацию образованных аминокислот, отделение смесей аминокислот происходит на колонке Hypersil AA (Agilent). Результаты составлены в таблице 5.
b) для bacillus
Состав среды в колбе приводят в таблице 6. Должна существовать концентрация исходной глюкозы 28,6 г/л. Причем половина сахара происходит из гидролизата, другую половину добавляют в качестве раствора глюкозы. В контрольной среде применяют соответствующее количество раствора глюкозы.
Таблица 6: среда в колбе
Кукуруза 250 г/л †
57 мл/л ‡
Пшеница 259 г/л †
55 мл/л ‡
Рожь 218 г/л †
67 мл/л ‡
Раствор глюкозы (с=626 г/л)
23 мл/л
Соевая мука
19,0 г/л
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
7,6 г/л
Глютамат мононатрия
4,8 г/л
Цитрат натрия
0,95 г/л
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
9,5 мг/л
MnCl<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
1,9 мг/л
ZnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
1,4 мг/л
CoCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
1,9 мг/л
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,2 мг/л
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,7 мг/л
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>×3H<sub>2</sub>O
15,2 г/л
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
3,9 г/л
MgCl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,9 г/л
CaCl<sub>2</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,09 г/л
MOPS
59,8 г/л
pH*
7,2
* Устанавливают с разбавленным водным раствором NaOH.
† Концентрация глюкозы в гидролизате.
‡ Требуемая навеска гидролизата на литр среды.
После затравливания колбы инкубируют в течение 24 ч при температуре 43°С и при колебании (250 об/мин) в увлажняющем вибрационном шкафу. После прекращения ферментации содержание глюкозы и пантотеновой кислоты определяют с помощью ВЖХР. Определение глюкозы происходит с помощью колонки Aminex HPX-87H фирмы Bio-Rad. Определение концентрации пантотеновой кислоты происходит через отделение на колонке Aqua C18 (Phenomenex).
Результаты составлены в таблице 7.
Таблица 7: средние значения через 24 ч
Гидролизат муки
Пантотеновая кислота, в=24 ч [г/л]
Выход [г пантотеновой кислоты / г глюкозы]
Кукуруза
2,7
0,09
Пшеница
2,4
0,08
Рожь
2,7
0,09
Контроль
2,7
0,09