КОМБИНАЦИЯ R,R-ГЛИКОПИРРОЛАТА И МОНТЕЛУКАСТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ЕЕ ОСНОВЕ
COMBINATION OF R,R-GLYCOPYRROLATE AND MONTELUKAST FOR TREATMENT OF RESPIRATORY DISEASES AND BASED ON IT PHARMACEUTICAL COMPOSITION

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к комбинации, включающей наружные (ингаляционные) антихолинергетики и ингаляционные или применяемые перорально антагонисты лейкотриеновых (LT) рецепторов (антагонисты BLT- и CysLT-рецепторов) для лечения респираторных заболеваний, включая аллергический ринит, бронхиальную астму и хронические обструктивные заболевания легких (COPD). Кроме того, оно включает представление этой комбинации в виде применяемого местно (ингаляционно) препарата и его применение посредством ингаляционного устройства, например Novolizer.
Уровень техники
Аллергический ринит поражает 20% взрослого населения и до 40% детей. Хотя сам ринит не угрожает жизни (если только он не сопровождается сильной астмой или анафилаксией), его протекание может быть весьма болезненным. Аллергический ринит часто сосуществует с другими заболеваниями, такими как астма, синусит, назальные полипы, аллергический конъюктивит и атопический дерматит. Ринит может также серьезно понизить качество жизни, производительность, обучаемость и т.д. К тому же, недостаточная терапия ринита может приводить к другим нарушениям, включая инфекцию пазух, ушей и нижних дыхательных путей. Эффективная терапия аллергического ринита требует понимания патофизиологии этого заболевания, а также роли различных воспалительных механизмов. По существу, в распоряжении врачей имеются различные классы лекарственных средств для лечения пациентов с аллергическим ринитом. Среди них антигистамины второго поколения и антихолинергические агенты, интраназальные кортикостероиды и стабилизаторы мастоцитов. Недавно к средствам терапии добавились антагонисты лейкотриеновых (LT) рецепторов.
1
По механизму аллергический ринит - это типичное аллергическое заболевание. В отношении патофизиологии имеются некоторые сходства между ринитом и астмой. Ринит определяется как воспаление носовых мембран и характеризуется комплексом симптомов, состоящим из любой комбинации следующих: чиханье, закупорка носового канала, зуд в носу и ринорея. В настоящий момент антагонисты Н-рецептора, противоотечные средства, хромогликат натрия, кортикостероиды, антагонисты cysLT- рецептора и антихолинергетики являются наиболее распространенными фармакологическими средствами для лечения ринита.
Бронхиальная астма, поражающая до 10% населения развитых стран, характеризуется бронхостенозом, хроническим воспалением дыхательных путей, гиперреактивностью дыхательных путей и отеком слизистой. Ремоделирование дыхательных путей и измененная нон-холинергическая, нонадренергическая нейропередача может способствовать развитию необратимой обструкции дыхательных путей и затруднению дыхательной функции. На протяжении последних 20 лет бронхиальная астма стала большой проблемой для здравоохранения во всем мире. Хотя данные свидетельствуют о том, что нынешняя терапия астмы привела к некоторому понижению уровня смертности, астма продолжает оставаться одной из основных проблем здравоохранения. Она no-прежнему является одной из главных причин предотвратимых госпитализаций во всем мире и служит причиной потери нескольких миллионов рабочих дней. Вместе с увеличением распространения астмы, расходы, связанные с этим заболеванием, также резко растут.
Патофизиология астмы включает сложную сеть молекулярных и клеточных взаимодействий, хотя вклад каждого индивидуального фактора надо полагать, различается от пациента к пациенту, в зависимости от условий и раздражителей. Основные участники в развитии фенотипа астмы включают запускающие стимулы, такие как сами аллергены, клетки, такие как Т-клетки, эпителиальные клетки и мастоциты, продуцирующие разнообразные цитокины, включая IL-5, GM-CSF, IL-3, IL-4 и IL-13, и хемокины, такие как эотаксин, адгезированные молекулы и т.д. Последние достижения в понимании воспалительных и иммунологических механизмов астмы обозначили много потенциальных терапевтических способов предотвращения или обращения аномалий, лежащих в основе астмы.
В настоящее время фармакотерапия является основой для лечения астмы. Доступны ингаляционные агонисты β2-рецептора кратковременного и длительного действия. Ингаляционные агонисты β2-рецептора кратковременного действия сейчас используются при необходимости для быстрого снятия симптомов. В последние годы ингаляционные агонисты β2-рецептора длительного действия играли все более важную роль в лечении астмы, особенно для пациентов с формой астмы от средней до тяжелой. Антимускариновые лекарства несколько менее эффективны в облегчении астматических приступов, чем агонисты β2-адренорецепторов (Rodrigo and Rodrigo, Chest 2002; 121:1977-87). Однако, с появлением нового антихолинергического препарата тиотропиум, значение антихолинергетиков в лечении респираторных заболеваний стало сильно возрастать. Ингаляционные кортикостероиды стали основой в терапии хронической астмы. Они являются наиболее эффективным из известных способов клинического лечения, но могут вызывать серьезные вторичные эффекты и, более того, могут быть неэффективными для невосприимчивых к кортикостероидам астматиков.
Хроническое обструктивное заболевание легких (COPD) тоже весьма распространено. Это заболевание характеризуется прогрессирующим ограничением дыхания, сопровождаемым воспалительными реакциями. Обзор источников информации со всего мира ясно показывает, что табак является не единственной причиной COPD. С увеличением продолжительности жизни населения во всем мире также увеличивается и риск заболеваемости COPD. Распространение COPD варьирует между 3% и 10% с постоянно возрастающей тенденцией. Хотя COPD является основной причиной заболевания и смерти, его признание как проблемы здоровья обществом происходило медленно, несмотря на растущий процент смертности от COPD и снижение процента смертности для большинства сердечно-сосудистых заболеваний (Hurd Chest 200; 117 (2 SuppI): 1S-4S). К тому же, COPD возлагает дополнительный экономический груз на отдельных граждан и общество.
В целом, про патогенез COPD известно гораздо меньше, чем про патогенез астмы. Недавние исследования серьезно расширили понимание патогенетических механизмов, лежащих в основе COPD. Так, существует мнение относительно того, что COPD также является воспалительным заболеванием. С современной патогенетической точки зрения, нейтрофильные гранулоциты, CD8+ лимфоциты и макрофаги с их медиаторами, скорее всего, играют решающие роли в патогенезе COPD.
3
Современное лечение сфокусировано на улучшении функционирования легких пациентов, страдающих от COPD. Первым шагом на этом пути является прекращение курения. Доказано, что уменьшение или прекращение курения может привести к улучшению некоторых респираторных показателей. Бронхолитики (агонисты β2-адренорецептора и антихолинергетики) являются сейчас основой симптоматической терапии. Агонисты β2-адренорецептора кратковременного и длительного действия, такие как сальбутамол, фенотерол, сальметерол, формотерол, представляют собой признанные терапевтические средства в лечении симптоматической COPD. Из антимускариновыхлекарств кратковременного действия широко применяется ипратропиум. Недавно во всем мире был введен в практику тиотропиум, антихолинергетик длительного действия с некоторым предпочтением к М-мускариновым рецепторам (Hansel and Barnes, Drugs Today (Bare) 2002; 38: 585-600). Также, антихолинергические агенты могут эффективно применяться для лечения COPD у лошадей. Ипраториум в дозировке 2400 мкг/лошадь является эффективным бронхолитиком для лошадей с COPD (Duvivier et al. Equine Vet J. 1999; 31: 20-4, Bayly et al. Equine Vet J. 2002 Jan; 34(1): 36-43). В настоящее время, противовоспалительная терапия COPD является нерешенной проблемой. Использование соматических и ингаляционных глюкокортикоидов для COPD заметно увеличилось за последние 20 лет. Они тестировались при допущении, что подавление воспаления в ходе COPD должно изменять течение заболевания. Хотя доказано преимущество ингаляционных кортикостероидов в лечении астмы, до недавних пор их эффективность в неастматических вызванных курением COPD не была очевидной (Bonay et al. Drug Saf 2002; 25: 57-71). Ингаляционные кортикостероиды оказывают сравнительно небольшое воздействие на воспалительные процессы, которые характеризуют COPD (Adcock and Chung, Curr Opin Investig Drugs 2002; 3: 58-60).
Затруднение дыхания и воспаление дыхательных путей являются признаками как аллергического ринита/астмы, так и COPD. Имеются веские доказательства того, что воспаление дыхательных путей является основной проблемой у пациентов с ринитом, астмой и COPD. Хотя воспаление дыхательных путей при рините/астме и COPD, соответственно, включает различные типы клеток, оба заболевания обладают хронической воспалительной природой, связанной с клеточным проникновением и активацией. В то время как аллергический ринит и бронхиальная астма предпочтительно характеризуются эозинофилами и CD4 лимфоцитами, в патогенезе COPD главную роль играют нейтрофильные гранулоциты, CD8 лимфоциты и магрофаги.
4
4
4
Астма- и COPD-подобные заболевания, соответственно, могут проявляться у животных, например у лошадей. Доказано, что LTB и LTD могут участвовать в патогенезе конского COPD (Marr et al. Res Vet Sci 1998; 64: 219-24). Судя по всему, у лошадей существует связь между генерацией LT и холинергической системой. Нейтрофильное воспаление дыхательных путей и бронхоспазм, опосредованный мускариновыми рецепторами, являются отличительными признаками COPD у лошадей. Сообщалось, что LT-ны участвуют в обострении COPD. Действительно, такие медиаторы как LT усиливают холинергический ответ в дыхательных путях лошадей (Olszewski et al. Am J Physiol 1999; 276: L522-9). Также имеются доказательства того, что холинергическая активация (ацетилхолин) стимулирует альвеолярные макрофаги к высвобождению продуктов, обладающих липоксигеназной активностью (LTB и CysLTs) (Sato et al. Am J Physiol 1998; 274: L970-9).
Риновирусы являются причиной более 50% инфекций дыхательных путей. Осложнения при инфекциях, вызванных риновирусом (например, обычная простуда), которые включают, например, проявление или обострение астмы, в определенных популяциях могут быть весьма значительными. Поэтому было бы очень полезно минимизировать потенциальные неблагоприятные последствия путем использования адекватной терапии. Недавно было показано, что риновирус, связанный с простудными заболеваниями, вызывает бронхиальное воспаление с отчетливо выраженной экспрессией протеинов 5-LO пути (Seymour et al. J Infect Dis 2002; 185: 540-4), что свидетельствует об усиленной выработке LT в этих дыхательных путях. Вследствие этого, по всей видимости LT-антагонисты способны уменьшать проявление легочных симптомов, являющихся результатом вирусной инфекции (Bisgaard et al. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167: 379-83). Более того, хорошо известно, что холинергетики типа ипраториума вызывают специфическое облегчение ринореи и чихания, связанных с обычной простудой (Hayden et al. Ann Intern Med 1996; 125: 89-97).
Лейкотриены (LT) являются важными медиаторами патофизиологии аллергических заболеваний дыхательных путей, таких как астма и ринит, и они также вовлечены в COPD. Главными эффектами, опосредованными LT, являются бронхостеноз, воспаление дыхательных путей, отеки гиперсекреция слизистой.
4
4
4
4
4
1
Метаболизм арахидоновой кислоты с участием 5-липоксигеназы приводит к получению группы биологически активных липидов, известных как лейкотриены (LT). LTB является сильным активатором хемотаксиса лейкоцитов. Цистеинильные LT (LTC, LTD, LTE) отвечают за спазмогенную активность, ранее описываемую как слабореактивную анафилаксию (SRS-A). Эти воспалительные медиаторы вырабатываются различными типами клеток, включая мастоциты, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, макрофаги и моноциты. Они проявляют свои биологические эффекты посредством связывания и активирования специфических рецепторов (LTB у BLT-рецептора, цистеинил-LT у cysLT-рецептора). Это происходит в последовательности событий, которые приводят к сокращению гладкой мускулатуры дыхательных путей человека, хемотаксису и повышенной проницаемости сосудов, гиперсекреции слизи, уменьшению моторики ресничек. Эти эффекты обуславливают их важную роль в таких заболеваниях как астма, аллергический ринит и COPD.
Антагонисты cysLT-рецептора (например, зафирлукаст, монтелукаст, пранлукаст) и производные антагонистов других LT-рецепторов, таких как L-648,051, МК-571, верлукаст (МК-0679), побилукаст (SK&F 104353), AS-35, ICI 204,219 и другие, представляют собой эффективное и хорошо переносимое средство против астмы и аллергического ринита для взрослых и детей, особенно в случаях астмы, индуцированной нагрузками и аспирином. Они также могут иметь клиническое применение в случае COPD. Недавно возникло предположение, что зафирлукаст, антагонист cysLT-рецептора, может увеличивать объем вдыхаемого воздуха, а также улучшать альвеолярную вентиляцию у пациентов, страдающих от COPD (Bu et al. Chin Med J 2003; 116(3): 459-461).
4
4
4
Даже если нет неоспоримых клинических данных в пользу дополнительного эффекта LTB при астме человека, при других респираторных состояниях, таких как COPD, которые характеризуются выраженной нейтрофильной инфильтрацией, может быть так, что хемотактические свойства LTB более важны (Daniele and O'Byrne, Am Rev Respir Dis 1991; 143: S3-5). У пациентов, страдающих от COPD, усиленный окислительный стресс коррелирует с повышенной способностью нейтрофилов синтезировать хемотактический фактор LTB и в конечном счете может вносить вклад в инфильтрацию/активацию нейтрофилов в дыхательные пути пациентов, страдающих от COPD (Montuschi et al. Thorax 2003; 58: 585-8).
Лечение антихолинергетиками признано как важный способ лечения заболеваний верхних и нижних дыхательных путей, ринита, астмы и COPD. Использованный в настоящем изобретении антагонист мускаринового рецептора служит веществом длительного действия. Любое соединение подобного типа может использоваться в данном подходе комбинационной терапии.
1
3
3
Гликопирролат, еще одно четвертичное аммониевое антихолинергическое соединение, состоит из четырех стереоизомеров. Гликопирролат принадлежит к так называемым антихолинергическим лекарствам и является антагонистом нейротрансмиттера ацетилхолина на его клеточном рецепторе. Этот эффект ведет к заметной бронходилятации и уменьшению секреции слизи. Это соединение слабо абсорбируется из слизистых мембран, таким образом уменьшая антихолинергические побочные эффекты (Ali-Melkkila et al. Acta Anaesthesiol Scand 1993; 37: 633-42). Гликопирролат неселективен в своем связывании с М-М-рецепторами. Однако, кинетические исследования показали, что гликопирролат медленно диссоциирует с М мускариновых рецепторов (Hadda et al. Br J Pharmacol 199; 127: 413-20). Подобно тиотропиуму, такое поведение объясняет относительную рецепторную селективность гликопирролата и его длительный период действия. Действительно, имеются доказательства, что рацемический гликопирролат оказывает заметные и длительные бронходилаторные эффекты и на пациентов-астматиков, и на пациентов с COPD (Walker et al. Chest 1987; 91: 49-51, Schroeckenstein et al. J Allergy Clin Immunol 1988; 82: 115-9, Gilman et al. Chest 1990; 98: 1095-8, Cyduka and Emerman Ann Emerg Med 1995; 25: 470-3). К тому же, использование наружного антихолинергического лечения (например, ипраториум или гликопирролат) при аллергическом рините является как безопасным, так и эффективным для подавления симптомов (Milford et al. J laryngol Otol 1990; 104: 123-5, Meltzer J Allergy Clin Immunol 1992; 90: 1055-64). Поскольку ринит, астма и COPD характеризуются повышенной секрецией слизи, антисекреторный эффектантихолинергетиков, таких как гликопирролат, является дополнительным преимуществом при их использовании в терапии данных заболеваний.
В настоящее время лечение астмы и COPD не является удовлетворительным. То же самое правомерно для ринита, когда относительно простое назальное заболевание, несмотря на казалось бы удовлетворительное лечение, развивается далее в бронхиальную астму. Учитывая широкое распространение этих заболеваний, задачей, поставленной в настоящем изобретении было предложение улучшенного, более эффективного и более подходящего терапевтического воздействия.
Эта задача может быть решена в соответствии с настоящим изобретением посредством комбинации наружних антихолинергетиков с по меньшей мере одним антагонистом лейкотриенового рецептора.
Антагонисты BLT- и CysLT-рецепторов подавляют воспалительные процессы в верхних и нижних дыхательных путях (например, ринит, астма и COPD). Таким образом, эти эффекты антагонистов LT-рецептора приводят к улучшенной слизистой и бронхиальной функции у пациентов, страдающих от заболеваний дыхательных путей, включая аллергический ринит, бронхиальную астму и COPD. Фармакодинамические свойства обоих лекарственных классов, антихолинергетиков (особенно R,R-гликопирролата) и антагонистов LT-рецептора, дополняют друг друга и приводят к более эффективному лечению указанных заболеваний, сводя к минимуму подверженность организма воздействию. Комбинация по настоящему изобретению, антагонист LT-рецептора и антихолинергетик, превосходит индивидуальные соединения по терапевтическому эффекту, безопасности применения и длительности действия, или побочным эффектам, а именно - неожиданно, синергетическим образом. К тому же, доверие пациентов тоже увеличивается.
Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение представляет комбинацию для лечения респираторных заболеваний, включая аллергический ринит, бронхиальную астму и хронические обструктивные заболевания легких (COPD), которая включает наружные (ингаляционные) антихолинергетики и ингаляционные или применяемые перорально антагонисты лейкотриеновых (LT) рецепторов (антагонисты BLT- и CysLT-рецепторов). Кроме того, настоящее изобретение предлагает эту комбинацию в виде применяемого местно (ингаляционно) препарата, а также его применение посредством ингаляционного устройства, например Novolizer.
В одном из вариантов осуществления комбинация антихолинергетика, который выбирается из группы, включающей рацемический гликопирролат, один из его энантиомеров, особенно R,R-гликопирролат, один из его диастеремеров и их физиологически приемлемые соли и смеси, и по меньшей мере один лейкотриеновый ингибитор для лечения респираторных заболеваний, выбранных из группы, включающей аллергический ринит, бронхиальную астму, хронические обструктивные заболевания легких (COPD) и обычную простуду.
В предпочтительном варианте осуществления антихолинергетик представляет собой R,R-гликопирролат или его физиологически приемлемые соли.
В другом предпочтительном варианте лейкотриеновый ингибитор выбирают из группы, включающей монтелукаст, зафирлукаст, пранлукаст, L-648,051, MK-571, верлукаст (MK-0679), побилукаст (SK&F 104353-Z2), AS-35, ICI 204,219, томелукаст (LY 171,883) или их физиологически приемлемые соли.
Комбинации, соответствующие настоящему изобретению, могут содержать дневную дозу лейкотриенового ингибитора, которая составляет от 1 до 100 мг, предпочтительно от 5 до 20 мг.
В другом варианте осуществления дневная доза R,R-гликопирролата может составлять от 1 до 500 мкг.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения дневная доза R,R-гликопирролата составляет от 5 до 100 мкг.
Фармацевтическая композиция, соответствующая настоящему изобретению, эффективна для лечения респираторных заболеваний, таких как аллергический ринит, бронхиальная астма, хронические обструктивные заболевания легких (COPD) или обычная простуда. Она может содержать антихолинергетик, который выбирается из группы, включающей рацемический гликопирролат, один из его энантиомеров, особенно R,R-гликопирролат и один из его диастеремеров и их физиологически приемлемые соли или их смеси, и по меньшей мере один лейкотриеновый ингибитор.
В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит R,R-гликопирролат или его физиологически приемлемые соли.
Активные компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде готовой к использованию смеси в фиксированной комбинации, с использованием обычных для таких случаев наполнителей и добавок, в пригодной для ингаляционного использования фармацевтической форме.
В одном варианте осуществления в фармацевтической композиции активные компоненты доступны в виде отдельных упаковок, причем оба компонента могут доставляться из отдельных упаковок таким образом, что их ингаляционное применение происходит одновременно.
В одном из вариантов осуществления активные компоненты могут использоваться независимо один от другого.
В одном из вариантов осуществления фармацевтическая композиция представляет собой ингаляционный аэрозоль с пропеллентом или без пропеллента.
В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой сухой порошок для ингаляций.
В другом варианте осущественииия фармацевтическая композиция представляет собой суспензию или раствор для ингаляций.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция представлена в ингаляторе.
Настоящее изобретение относится также к применению наружного антихолинергетика, который может выбирается из рацемического гликопирролата, одного из его энантиомеров, особенно R,R-гликопирролата или одного из его диастеремеров или их физиологически приемлемых солей или их смеси, и по меньшей мере лейкотриенового ингибитора или их физиологически приемлемых солей для приготовления фармацевтической композиции для лечения у млекопитающих респираторных заболеваний, включая аллергический ринит, бронхиальную астму, хронические обструктивные заболевания легких (COPD) или обычную простуду.
В предпочтительном варианте осуществления антихолинергетик представляет собой R,R-гликопирролат или его физиологически приемлемые соли.
В другом предпочтительном варианте млекопитающие представляют собой кошек, собак или лошадей.
В другом предпочтительном варианте осуществления респираторные заболевания характеризуются обструктивным компонентом или лежащим в его основе воспалением. К ним относятся астма и хронические обструктивные болезни легких (COPD).
Осуществление изобретения
Не только TNFα, но также и IL-2 играет важную роль в воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Известно, что при некоторых формах астмы (например, внутренней и профессиональной), определенные подвиды Т-клеток вырабатывают, среди прочих, IL-2 (Ricci et al.; J Investig Allergol Clin Immunol 1994; 4:214- 20). Более того, пациенты-аллергики имеют специализированные популяции Т-клеток, которые могут быть простимулированы к выработке IL-2 (McHugh et al.; Clin Exp Allergy 1993; 23:137-44). Также было показано, что антагонист cysLT-рецептора зафирлукаст проявлял способность подавлять, помимо прочего, экспрессию IL-2 у овальбумин-чувствительных крыс Брауна Норвэя (Lin et al.; Clin Exp Allergy 2002; 32:960-6). Поэтому было исследовано влияние R,R-гликопирролата в комбинации с антагонистами cysLT-рецептора на выброс TNF-alpha- и интерлейкин(IL)-2 с использованием периферических моноядерных клеток крови человека (РВМС). Исследования были одобрены Университетским Этическим Комитетом в соответствии с Хельсинкской и Токийской Международной Декларацией.
2
РВМС изолируют из гепаринизированных образцов крови здоровых доноров посредством центрифугирования по градиенту плотности. Добавляют эквивалентные объемы буфера Хэнкса (Life Technologies, Гейдельберг, Германия). Поверх 15 мл Histopaque-1077 (Sigma, Дейзенхофен, Германия) наливают не более 40 мл смеси крови с буфером Хэнкса и центрифугируют 30 минут при комнатной температуре (2000 об/мин). Различимую полоску, содержащую РВМС переносят в свежую пробирку и дважды промывают буфером Хэнкса. После этого клетки высевают в среду RPMI 1640 Medium (Life Technologies, Гейдельберг, Германия) с Glutamax I (Gibco BRL, Эггенштайн) и 10% PCS (Boehringer Mannheim, Пенцберг, Германия). После выделения РВМС культивируют в среде RPMI 1640 дополненной 10% сыворотки эмбриона теленка (FCS) при 37°С 5% CO в течение ночи. Моноциты отделяют от других клеток методом связывания, несвязывающиеся клетки удаляют сменой среды.
6
2
Клетки ресуспендируют в концентрации 10 клеток/мл и инкубируют в 500 мкл объемах в 24-ячейного планшета культур клеток (Falcon Becton Dickinson Labware) при 37°С, 5%СО. После пред-инкубации с тестируемым веществом (0,5 мкл/500 мкл среды) в течение 30 мин, клетки стимулируют липосахаридом (LPS) (100 нг/мл). Для стимулирования выделения IL-2 вместо LPS используют ТРА (форбол-12-миристат-13-ацетат) (25 нМ) и иономицин (1 мкг/мл). В указанные промежутки времени клетки седиментируют посредством центрифугирования. Собирают супернатанты и хранят их замороженными при -80°С до определения протеина; клетки лизируют RLT lysis буфером (Qiagen, Хилден, Германия) и держат при -80°С до анализа.
3
4
Определение цитокинов в супернатантах культур проводят сэндвичевым методом ELISA с использованием подходящих пар антител (Pharmingen, Гейдельберг, Германия). ELISA планшеты (Maxisorb, Nunc) покрывают на ночь анти-цитокиновыми моноклональными антителами (mAb) в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,5. После промывки планшеты блокируют посредством Assay Diluent (Pharmingen, Гейдельберг, Германия) на 1 час и промывают снова. Соответственно разбавленные образцы супернатанта и стандарты распределяют в двух экземплярах и инкубируют планшеты 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывают и инкубируют 1 ч с работающим детектором (биотинированные анти-цитокиновые антитела и конъюгат, содержащий авидин и пероксидазу хрена). После промывки добавляют субстрат (ТМВ и перекись водорода). Реакцию останавливают добавлением 1М HPO. Планшеты сканируют при 450 нм (стандарт 570 нм) в сканере микропланшетов (Dynatech). Результаты выражают в процентном отношении контрольного уровня выработки цитокинов клетками, стимулированными в отсутствие соединения.
При стимуляции LPS, выброс базального TNFα из моноцитов возрастает со 150 пг/мл до 3208 пг/мл. R,R-гликопирролат сам по себе не влияет на индуцированный LPS выброс TNFα при концентрациях до 10 мкмоль/л. ТРА/иономицин значительно стимулирует выброс IL-2 из РВМС (от 0 пг/мл [ниже предела определения] до 5300 пг/мл). Сходно с TNFα, R,R-гликопирролат сам по себе не влияет на стимулированный выброс IL-2 при концентрациях до 10 мкмоль/л.
50
50
Антагонист cysLT-рецептора монтелукаст ингибирует выброс TNF-(концентрационно-зависимым образом. Значение IC для монтелукаста составляет 2,45±0,85 нмоль/л. Одновременное добавление 10 мкмоль/л R,R-гликопирролата не влияет на IC монтелукаста (2,58 нмоль/л).
50
50
Монтелукаст значительно ингибирует выброс IL-2 со значением IC, равным 0,88±0,14 нмоль/л. Одновременное добавление 10 мкмоль/л R,R-гликопирролата неожиданно весьма значительно уменьшает IC до 0,26±0,07 нмоль/л (р=0,0023) синергетическим образом.
Суммируя вышесказанное, основываясь на настоящем экспериментальном исследовании, мы можем заключить, что R,R-гликопирролат может заметно увеличить противовоспалительную активность антагонистов cysLT-рецептора.
Примеры
Описанная в настоящем изобретении комбинационная терапия включает введение по меньшей мере одного антагониста cysLT- или BLT-рецептора с антихолинергическим соединением длительного действия для предотвращения приступа заболевания верхних или нижних дыхательных путей или для лечения существующего состояния и уменьшения воспаления дыхательных путей. Соединения могут вводиться вместе в составе одноразовой лекарственной формы. Также они могут вводиться в составе разных лекарственных форм. Они могут вводиться одновременно. Также они могут вводиться либо через небольшой промежуток времени, либо через достаточно большой интервал времени, как, например, когда одно лекарство вводится утром, а второе вводится вечером. Комбинация может применяться профилактически или после наступления симптомов. В некоторых случаях комбинации могут использоваться для предотвращения прогрессирования заболевания дыхательных путей или для замедления ухудшения функций, например функций легких.
1
Эти лекарства, антихолинергетики и антагонисты LT-рецептора, обычно применяются в виде аэрозоля или в виде порошков для ингаляций. Настоящее изобретение рассматривает либо введение одного вещества следом за другим, либо совместное введение обоих лекарств в составе одной лекарственной формы, например посредством ингалятора, который помещает оба лекарства в один или даже более ингаляционных контейнеров. Лекарственные формы выбираются из известных в настоящее время. В настоящее время, все известные антагонисты LT-рецептора являются биодоступными при пероральном введении и применяются в виде таблеток. Однако, имеются доказательства эфективности антагонистов LT-рецептора при наружном применении. Перспективной представляется потенциальная роль антагониста LT-рецептора L-648,051 для местной аэрозольной терапии астмы (Young Agents Actions 1988; 23(Suppl): 113-9). Антагонист LT-рецептора МК-571 полностью ингибирует in vivo хемотактический ответ слизистой оболочки глаз морских свинок, демонстрируя применимость не только в случае аллергического конъюнктивита, но и при аллергическом рините и астме (Chan Eur J Pharmacol 1990; 191:273-80). Ингаляционный антагонист LT-рецептора ICI 204,219 в заметной степени защищает астматиков от вызванного нагрузками бронхостеноза (Makker Am Rev Respir Dis 1993; 147:1413-8). Ингаляционный антагонист LT-рецептора верлукаст (МК-0679) вызывает у астматиков заметное улучшение среднего FEV (Lammers, Pulm Pharmacol 1992; 5:121-5). Ингаляционный антагонист LT-рецептора AS-35 подавляет в зависимости от дозировки антиген-индуцированный бронхостеноз у морских свинок (Bando, Arzneimittelforschung 1994; 44:754-7). Ингаляционный антагонист LT-рецептора побилукаст (SK&F 104353) значительно подавляет LT-индуцированный бронхостеноз у астматиков (Christie, J Allergy Clin Immunol 1991; 88:193-8). Таким образом, ингаляционные антагонисты LT-рецептора типа L-648,051 пригодны для ингаляционного применения (Evans, Br J Clin Pharmacol 1989; 28: 125-35).
В экспериментальной модели аллергического ринита у крыс наружно применяемый в глаза зафирлукаст эффективно ингибирует развитие симптомов и выброс медиаторов (Papathanassiou et al. Inflamm Res 2004; 53:373-6).
Для достаточного проявления желаемой активности активные ингредиенты могут даваться от 1 до 8 раз в день. Предпочтительно, активные ингредиенты вводятся примерно от одного до четырех раз в день, более предпочтительно один или два раза в день. Продолжительность действия делает возможным введение два раза в день. Если активные компоненты присутствуют в форме фиксированной комбинации, введение проще для пациента, так как оба активных ингредиента заключены в одном контейнере.
Антагонист LT-рецептора, например монтелукаст, может вводиться перорально в количестве между 1 и 100 мг/день на одного взрослого человека, предпочтительно от 5 до 20 мг/день, в зависимости от степени воспаления дыхательных путей. В назальных спреях или каплях концентрация антагониста LT-рецептора, например монтелукаста, в комбинации может варьировать от 0,01 до 5%. Предпочтительные концентрации антагониста LT-рецептора составляют от 0,1% до 2%. В ингаляторах с мерной дозировкой или в сухих порошках для ингаляций дозировка антагониста LT-рецептора, например монтелукаста, в комбинации может быть в пределах от 0,05 до 10 мг на дозу, предпочтительно от 0,2 до 5 мг на дозу.
Ингаляционное антихолинергическое лекарство, например рацемический гликопирролат, один из его энантиомеров или их смесь и их соли, сольваты и гидраты, могут вводиться с помощью ингалятора с мерной дозировкой или сухого порошка для ингаляций в количестве между 1 и 500 мкг/день на взрослого человека, предпочтительно от 5 до 100 мкг/день. В назальных спреях или каплях концентрация антихолинергического компонента, например гликопирролата, в соответствии с настоящим изобретением может варьировать от 0,0001 до 0,5%. Предпочтительны концентрации от 0,001 до 0,1% R,R-гликопирролата.
Предусматривается, что оба активных ингредиента вводятся одновременно или через очень небольшой промежуток времени. Альтернативно, одно лекарство можно принимать утром и одно - позже в течение дня. Или по другому сценарию, одно вещество может приниматься дважды в день, а другое один раз в день, либо в то же время что и один из двух приемов, либо отдельно. Предпочтительно оба лекарства принимаются вместе в одно и то же время.
При использовании в ветеринарии, антихолинергетик, например гликопирролат, можно давать лошадям в количестве от 1 до 32 мкг/кг/день, предпочтительно между 4 и 16 мкг/кг/день, индивидуально или в комбинации с ингаляционным или вводимым перорально антагонистом LT-рецептора. Антагонист cysLT-рецептора, например монтелукаст, может вводиться в количестве между 10 и 1000 мг/день, предпочтительно от 50 до 200 мг/день в зависимости от степени воспаления дыхательных путей. Желательная доза антагониста BLT-рецептора зависит от его сродства к рецептору и доступности у клеточного рецептора.
Лекарственные формы и способ их приготовления
Настоящее изобретение описывает комбинацию, в которой антихолинергетик, такой как R,R-гликопирролат, вводится индивидуально или в комбинации с антагонистом LT-рецептора, например монтелукастом, зафирлукастом и/или пранлукастом. Они вводятся одновременно, один за другим как индивидуальные вещества или как фиксированная комбинация описанным образом.
Активные вещества могут вводиться, в соответствии с настоящим изобретением, одновременно, последовательно или независимо одно от другого, наружно (интраназально или посредством ингаляции) в виде фиксированной комбинации или в виде индивидуальных соединений, или перорально в комбинации с наружным применением. Если присутствуют различные лекарственные формы, то они связаны друг с другом и содержат в единичной дозе соответствующие активные соединения в тех же количествах и соответствующих весовых соотношениях, в которых они могут присутствовать в комбинации.
Композиции для перорального или наружного применения могут вводиться в различных фармацевтически приемлемых формах введения, например назальные спреи или назальные капли, таблетки, покрытые пленкой таблетки, капсулы или гранулы. Лекарственные формы для наружного применения могут также включать эмульсию, пасту, крем и/или гель.
В дополнение к активным соединениям фармацевтические препараты по настоящему изобретению могут содержать другие компоненты, такие как консерванты, стабилизаторы, изотонические агенты, загустители, стабилизаторы суспензии, наполнители для регулировки рН, буферные системы, увлажнители и другие, например, красители.
Противомикробные консервирующие вещества включают, например: бензалкония хлорид, хлорбутанол, тиомерсаль, метилпарабен, пропилпарабен, сорбиновую кислоту и ее соли, эдетат натрия, фенилэтиловый спирт, хлоргексидина гидрохлорид и бромид, хлоргексидина ацетат, хлоргексидина диглюконат, хлоркрезол, фенилртутные соли, феноксиэтиловый спирт, цетилпиридиниум хлорид или бромид.
Комбинация эдетата натрия и бензалкония хлорида может быть подходящей для использования в качестве консерванта. Эдетат натрия используется в концентрациях от 0,05 до 0,1% и бензалкония бромид в концентрациях от 0,005 до 0,05 мас.%, из расчета на общий вес композиции.
Подходящими наполнителями для регулировки изотоничности или осмотического давления лекарственной формы являются, например: хлорид натрия, хлорид калия, маннитол, глюкоза, сорбитол, глицерин, пропиленгликоль. В целом, эти наполнители применяются в концентрациях от 0,1 до 10%.
Лекарственные формы по настоящему изобретению могут также включать подходящие буферные системы или другие наполнители для регулирования рН в целях установления и поддержания рН порядка от 4 до 8, предпочтительно от 5 до 7,5. Подходящими буферными системами являются, например, цитратный, фосфатный, трометамольный, глициновый, боратный, ацетатный. Эти буферные системы можно приготовить из таких веществ как лимонная кислота, мононатрия фосфат, динатрия фосфат, глицин, борная кислота, тетраборат натрия, уксусная кислота, ацетат натрия. Также могут быть использованы другие наполнители для регулирования рН, такие как соляная кислота или гидроксид натрия.
Кроме того, для приготовления устойчивой водной суспензии, содержащей нерастворимые в воде вещества, необходимы подходящие стабилизаторы суспензии и подходящие увлажнители в целях диспергирования и стабилизации суспензии лекарственного вещества приемлемым образом.

Подходящими стабилизаторами суспензии являются водорастворимые или частично водорастворимые полимеры: они включают, например, метилцеллюлозу (МС), натриевую карбоксиметилцеллюлозу (Na- CMC), гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), поливиниловый спирт (PVAL), поливинилпирролидон (PVP), полиакриловую кислоту, полиакриламид, геллановую камедь (Gelrite), гидратированный алюмогель (Unemul), декстрины, циклодекстрины, ацетат фталат целлюлозы и смеси микрокристаллической целлюлозы (различные типы Avicel) и натриевой карбоксиметилцеллюлозы. Эти соединения могут одновременно выступать в роли загустителей в целях увеличения вязкости и, таким образом, увеличения продолжительности контакта лекарственного вещества с тканями в месте нанесения.

Подходящими увлажнителями являются, например бензалкония хлорид, цетилпиридиния хлорид, тилоксапол, различные полисорбаты (Tween) и другие полиэтоксилированные вещества и полоксамеры.
Для назального введения растворов или суспензий по настоящему изобретению в настоящее время доступны различные приспособления для генерации капель и спреев. Например, лекарственные формы можно вводить в носовые каналы посредством капельницы (или пипетки), которая включает стеклянную, пластиковую или металлическую распределительную трубку. Мелкие капельки и спреи могут быть получены с помощью интраназальных распылителей или сдавливаемых пузырьков, также известными в настоящее время.
Настоящее изобретение также включает набор, содержащий по меньшей мере одну однократную дозу дегидратированного по меньшей мере одного лекарственного соединения, а также любые требуемые наполнители лекарственной формы, готовые для приготовления растворов или суспензий добавлением необходимого количества стерильной или нестерильной воды.
В соответствии с настоящим изобретением активные вещества могут вводиться одновременно, последовательно или независимо одно от другого, посредством ингаляций фиксированной комбинации или индивидуальных соединений, или перорально в сочетании с ингаляцией.
В качестве ингаляционных композиций можно рассматривать дозированные ингаляторы под давлением, сухие порошки или растворы для ингаляций без пропеллента. Среди последних находятся даже стерильные, готовые к употреблению или готовящиеся непосредственно перед употреблением растворы для ингаляций, суспензии или концентраты в виде распыляемой композиций в водной и/или органической среде. Эти формы дозировки являются частью настоящего изобретения.
Содержащие пропеллент дозированные ингаляторы под давлением могут содержать активный R,R-гликопирролат и по меньшей мере один антагонист LT-рецептора в растворе или в дисперсии в пропелленте. Пропелленты, которые могут использоваться для ингаляционных аэрозолей в настоящем изобретении, хорошо известны: в основном применяются галогенированные производные углеводородов TG134a и TG227 или их смеси. Кроме того, обычно добавляются детергенты (например, олеиновая кислота), стабилизаторы (например, эдетат натрия), сорастворители (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота), лубриканты (например, полиоксиэтиленглицеринтриолеат) или буферные системы или другие наполнители для регулирования рН (например, соляная кислота). Активные ингредиенты могут иметь средний диаметр частиц до 5 мкм.
Комбинация этилового спирта и полиоксиэтилен-25-глицерилтриолеата (торговая марка Tagat TO) в концентрации между 0,5 и 1,5% может быть использована в качестве комплекса детергент/стабилизатор/сорастворитель/ лубрикант.
Упомянутые выше пропеллентсодержащие аэрозоли, растворы или суспензии по настоящему изобретению вводятся посредством известных науке ингаляторов, так называемых дозированных ингаляторов поддавлением (=pMDI). Они могут укомплектовываться металлическими или пластиковыми носиками различного размера, отвечающими за дозировку и высвобождение содержимого.
Сухие порошки содержат действующий антихолинергетик и/или по меньшей мере один антагонист LT-рецептора либо без добавок, либо в смеси с фармацевтически приемлемым, физиологически безвредным носителем. Он может быть выбран из материалов, известных в качестве носителей для ингаляционных композиций в виде сухих порошков, например моносахаридов (например, глюкоза, арабиноза), дисахаридов (например, лактоза, сахароза, мальтоза), олиго- и полисахаридов (например, декстран) и сахароподобных спиртов (например, сорбит, маннит).
Наилучшей из известных технологий является использование, главным образом, лактозы или моногидрата лактозы. Используемые наполнители характеризуются распределением размеров частиц до примерно 500 мкм, при этом предпочтительный диаметр частиц составляет примерно от 110 до 290 мкм. Активный ингредиент может иметь средний размер частиц до 4 мкм.

Ингаляционные порошки по настоящему изобретению можно принимать с помощью современных приспособлений для ингаляции сухих порошков, например Novolizer. Ингаляционный порошок может быть предварительно дозирован в капсулы (например, желатиновые) или блистеры (алюминиевые пакетики) или может отмериваться из большой упаковки непосредственно перед использованием. Антихолинергетик и по меньшей мере один антагонист LT-рецептора могут присутствовать в виде фиксированной комбинации, или оба активных ингредиента находятся в отдельных упаковках, так что они могут приниматься независимо один от другого из одного приспособления или из одного и более различных приспособлений, или одновременно.
Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение, но не ограничивают его.
Пример 1
Назальный спрей или капли для носа, содержащие гликопирролат
R,R-гликопирролат
0,0070 г
Гидроксипропилметилцеллюлоза
0,1000 г
Эдетат натрия
0,0500 г
Безалкония хлорид
0,0125 г
Раствор сорбитола 70%
6,6000 г
Очищенная вода
до 100 мл
Приготовление раствора
Вносят 80% очищенной воды в подходящий контейнер, оборудованный мешалкой. Затем добавляют последовательно гликопирролат, гидроксипропилметилцеллюлозу, бензалкония хлорид, эдетат натрия и раствор сорбитола и растворяют при перемешивании. Доливают очищенную воду до конечного объема и перемешивают. Профильтровывают полученный раствор через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм и разливают в пузырьки.
Пример 2
Назальный спрей или суспензионные капли для носа, содержащие монтелукаст (1%)
Монтелукаст
1,0000 г
Avicel RC 591
1,1000 г
Полисорбат 80
0,1000 г
Эдетат натрия
0,0500 г
Безалкония хлорид
0,0200 г
Раствор сорбитола 70%
6,0000 г
Очищенная вода
до 100 мл
Приготовление суспензии:
Вносят 80% очищенной воды в подходящий перемешиваемый контейнер, оборудованный гомогенизирующим приспособлением и гомогенизируют там при высокой скорости Avicel RC 591. Затем при перемешивании растворяют Полисорбат 80, раствор сорбитола, эдетат натрия и бензалкония хлорид. Затем гомогенизируют там же активное соединение монтелукаст при высокой скорости до получения однородной суспензии. Затем доливают очищенную воду до конечного объема и снова гомогенизируют. Затем вакуумируют суспензию для удаления образующихся пузырьков воздуха. Образовавшуюся суспензию затем разливают по пузырькам.
Пример 3
Назальный спрей или капли для носа, содержащие R,R-гликопирролат и монтелукаст
R,R-гликопирролат
0,0070 г
Монтелукаст
1,0000 г
Avicel RC 591
1,1000 г
Полисорбат 80
0,1000 г
Эдетат натрия
0,0500 г
Безалкония хлорид
0,0200 г
Раствор сорбитола 70%
6,0000 г
Очищенная вода
до 100 мл
Приготовление:
Вносят 80% очищенной воды в подходящий перемешиваемый контейнер, оборудованный гомогенизирующим приспособлением и гомогенизируют там при высокой скорости Avicel RC 591. Затем при перемешивании растворяют R,R-гликопирролат и наполнители Полисорбат 80, раствор сорбитола, эдетат натрия и бензалкония хлорид. Затем гомогенизируют там же активное соединение монтелукаст при высокой скорости до получения однородной суспензии. Затем доливают очищенную воду до конечного объема и снова гомогенизируют. Затем вакуумируют суспензию для удаления образующихся пузырьков воздуха. Образовавшуюся суспензию затем разливают по пузырькам.
Пример 4
Сухой порошок для ингаляций с 20 мкг гликопирролата и 2,5 мг монтелукаста на однократную дозу
R,R-гликопирролат
20,000 г
Монтелукаст
2500,000 г
Лактоза
9480,000 г
Приготовление сухого порошка для ингаляций:
Микронизированный гликопирролат в количестве 20 г смешивают с 180 г моногидрата альфа-лактозы, смесь просеивают через сито с размером ячеек 0,5 мм и затем смешивают снова. Полученную смесь смешивают с 1800 г моногидрата альфа-лактозы (= смесь 2). Эту смесь разделяют на две части. Первую часть гликопирролат/лактозной смеси 2 смешивают с 2500 г микронизированного Монтелукаста, смесь просеивают на ситах с размером ячеек 0,8 мм и затем снова перемешивают (= смесь 3). Сначала смешивают смесь 3 и 7500 г лактозы; наконец, эту смесь смешивают со второй частью гликопирролат/лактозной смеси 2 (= смесь 4). Полученную смесь просеивают на ситах с размером ячеек 0,8 мм. Перемешивают ее снова и полученную порошковую смесь заправляют в порошковые ингаляторы с выпуском 12 мг порошка в одной дозе.
Из расчета на однократную дозу, порошковый ингалятор высвобождает и доставляет в дыхательные пути пациента 20 мкг гликопирролата и 2,5 мг Монтелукаста.
Пример 5
Дозированный ингалятор под давлением с 50 мкг гликопирролата и 2,5 мг Монтелукаста на однократную дозу
R,R-Гликопирролат
0,840 г
Монтелукаст
42,000 г
Сахарин натрия
1,800 г
Tagat TO
23,400 г
Абсолютный этиловый спирт
23,400 г
HFA 227
2340,000 г
Приготовление дозированного ингалятора под давлением:
1,1,1,2,3,3,3-Гептафторпропан (=HFA 227) в количестве 2000 г охлаждали до температуры -55°С и в процессе перемешивания добавляют раствор 23,4 г полиоксиэтилен-25-глицерилтриолеата (торговая марка: Tagat ТО) в 23,4 г абсолютного этилового спирта. Затем последовательно добавляют 0,840 г микронизированного гликопирролата, 42,000 г микронизированного Монтелукаста и 1,800 г микронизированного сахарина натрия, и полученную суспензию интенсивно гомогенизируют. При дальнейшем охлаждении и перемешивании суспензию наполняют охлажденным пропеллантом 227 до 2340 г и после дальнейшего перемешивания заправляют в металлические баллончики, которые закрывали дозирующими клапанами, выпускающими 100 мкл суспензии за один раз.
За один раз выбрасывается 50 мкг гликопирролата и 2,5 мг Монтелукаста.