Молекулярные и экологические аспекты формирования гетерогенной структуры OmpF поринов непатогенных иерсиний

Научная смена

Вестник ДВО РАН. 2009. № 6

Стенкова Анна Михайловна

В 2004 г. окончила очное отделение Академии экологии, морской биологии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета (АЭМББ ДВГУ). Студенткой 4-го курса Анна Михайловна пришла в ТИБОХ и начала осваивать методы молекулярного клонирования. Ее дипломная работа «Клонирование и секвенирование OmpF-подобного гена из Yersinia enterocolitica» под руководством к.м.н. М.П.Исаевой была посвящена исследованию организации гена неспецифического порообразую-щего белка. После окончания университета Анна Михайловна продолжила работу в лаборатории морской биохимии, разрабатывала новые методы исследований. Изучала молекулярно-генетические характеристики генов OmpF поринов всех видов рода Yersinia с одновременным молекулярным типи-рованием штаммов по некоторым генам «домашнего хозяйства». В настоящее время Анна Михайловна готовится к защите диссертационной работы по этой теме. Ею впервые установлены последовательности генов OmpF поринов для новых видов иерсиний, в том числе для штаммов, циркулирующих на территории Дальнего Востока. Анна Михайловна - автор 6 публикаций и патента «Разработка мультиплексного ПЦР анализа для детекции рода Yersinia с одновременной идентификацией патогенных для человека видов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica» (2008 г.). Результаты работы представлены ею на 5 научных конференциях, из них 3 международных. С 2006 г. Анна Михайловна принимает участие в проведении большого практикума по рекомбинантным ДНК у студентов 4-го курса кафедры биохимии и биотехнологии АЭМББ ДВГУ. Под ее руководством выполнены 3 дипломные и 7 курсовых работ.

УДК 579.25 А.М.СТЕНКОВА

Молекулярные и экологические аспекты формирования гетерогенной структуры OmpF поринов непатогенных иерсиний

На основании последовательностей генов «домашнего хозяйства» — 16S рДНК и gyrB, а также OmpF гена, кодирующего белок наружной мембраны бактерий и экспрессирующегося при недостатке питательных веществ, низких температурах и пониженном осмотическом давлении, было проведено генотипирование

СТЕНКОВА Анна Михайловна - младший научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток). E-mail: stenkova@gmail.com

Работа поддержана проектом ДВО РАН, тематика которого соответствует программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», грант 09-І-П22-05.

13 штаммов непатогенных видов иерсиний (Yersinia intermedia, Y. kristensenii, Y. frederiksenii), выделенных на территории Дальнего Востока. Выявлена высокая гетерогенность гена OmpF порина у иерсиний, возможно, обусловленная внутривидовой /межвидовой рекомбинацией или действием адаптивной эволюции. Впервые для российского Дальнего Востока обнаружены штаммы иерсиний, генетически близкие к недавно охарактеризованным видам: Y. aleksiciae и Y. massiliensis.

Ключевые слова: иерсинии, порин, OmpF ген, генотипирование, 16SрДНК, gyrB, филогения.

Molecular and ecological aspects of diversity of OmpF porins from nonpathogenic Yersinia. A.M.STENKOVA (Pacific Institute Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

Based on the sequences of housekeeping genes, such as 16S rDNA and gyrB, and OmpF gene, encoding the outer membrane protein of bacteria and expressed under the condition of limited nutrients, low temperatures and reduced osmotic pressure, genotyping of 13 isolated at the territory of the Russian Far East strains of non-pathogenic Yersinia (Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. frederiksenii) was carried out. A high heterogeneity of Yersinia OmpF gene might be caused by intraspecies/interspecies recombination or the adaptive evolution. It was the first time when the strains genetically closed to the recently described species Y. aleksiciae and Y. massiliensis were discovered in the Russian Far East.

Key words: Yersinia, porin, OmpF, genotyping, 16S rDNA, gyrB, phylogeny.

Род Yersinia представлен 14 видами. Три вида (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) являются патогенными для человека, поэтому наиболее полно изучены и охарактеризованы по своим биологическим, экологическим и эпидемиологическим свойствам. Еще восемь (Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. bercovieri, Y. mol-larettii, Y rohdei, Y ruckeri и Y. aldovae) долгое время рассматривались как непатогенные и относились к Y. enterocolitica-подобным бактериям. Поскольку практически все виды рода Yersinia выделялись от больных и здоровых людей по всему миру, их клиническое значение остается неясным [16]. В последнее время появляется все больше данных о том, что некоторые из них способны вызывать заболевания у людей [4]. Недавно род Yersinia пополнился тремя новыми видами. На основании сравнения гена 16S рДНК и ряда биохимических тестов был охарактеризован новый вид - Y. aleksiciae, представляющий штаммы, ранее определенные как Y. kristensenii [14]. В 2008 г. на основании молекулярных и фенотипических данных из Y pseudotuberculosis был выделен новый вид Y. similis [15]. В этом же году французскими учеными был предложен еще один новый вид Y. massiliensis, включающий всего два штамма, изолированные из резервуаров для воды [13]. При сравнении «генов домашнего хозяйства» оказалось, что штаммы Y. massiliensis разделяют высокую степень гомологии нуклеотидных последовательностей со штаммами геномови-да 2 Y. frederiksenii.

Бактерии рода Yersinia широко распространены в природе, занимая как наземные, так и водные экосистемы. Способность существовать в широком диапазоне температур (4-45°С) - психрофильность - обусловливает их циркуляцию в основном в регионах умеренного и холодного климата. Иерсинии обнаружены у насекомых, ракообразных, птиц, рыб, целого ряда млекопитающих, в том числе крупного рогатого скота, свиней, мелких грызунов. Резервуаром же данных микроорганизмов служат почвенные и водные сообщества животных, где, по-видимому, реализуется сапрофитический способ существования [2]. Патогенные иерсинии способны реализовывать свои паразитические свойства при попадании в организм теплокровного животного и снова возвращаться к сапрофитизму при переходе в окружающую среду [3].

Следовательно, повсеместная распространенность, психрофильность, варьирующая патогенность и широкий спектр хозяев создают предпосылки для использования бактерии рода Yersinia в качестве модельного рода для проведения молекулярно-генетических, экологических и эволюционных исследований.

Механизмы адаптации иерсиний к различным хозяевам и различным условиям окружающей среды изучены недостаточно. Мембранные, поверхностные молекулы в этом контексте представляют особый интерес, так как первыми отвечают на изменения условий окружающей среды, а также участвуют в процессе взаимодействия микроорганизма и хозяина. Одними из таких молекул являются неспецифические порины - доминирующие белки

наружной мембраны бактерий, которые обладают уникальными структурными свойствами и функционируют как поры, регулируя проницаемость мембраны [5, 8]. OmpF порин играет огромную роль в адаптации бактерий к условиям окружающей среды, становясь при определенных условиях одним из доминантных белков наружной мембраны, например при недостатке питательных веществ, низких температурах и пониженном осмотическом давлении [6]. OmpF порины участвуют в формировании устойчивости к некоторым антибиотикам, отвечая снижением уровня экспрессии белка или числа функционирующих пор. Некоторые порины могут рассматриваться как факторы вирулентности при бактериальной инвазии на начальных этапах инфекции [17].

Данная работа направлена на решение вопросов, связанных с установлением филогенетических отношений некоторых дальневосточных штаммов Yersinia (Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii) на основе изучения генов «домашнего хозяйства» - 16S рДНК, gyrB и ompF гена, экспрессирующегося в условиях окружающей среды.

Бактериальные штаммы, использованные в работе, были любезно предоставлены д.м.н., проф. Ф.Н.Шубиным и д.м.н., проф. Н.Ф.Тимченко (Институт микробиологии и эпидемиологии CO РАМН, Владивосток). Всего было получено 13 штаммов Yersinia, из них 5 - Y. intermedia, 5 - Y. kristensenii, 3 - Y. frederiksenii (см. таблицу). Все праймеры, использованные в работе, были сконструированы с помощью программ Primer Premier5 и Vector NTI9 на основе нуклеотидных последовательностей 16S рДНК, gyrB и ompF генов Yersinia, опубликованных в базе данных GenBank (NCBI).

Участки последовательностей соответствующих генов иерсиний амплифицировали с помощью разработанных праймеров и секвенировали на ДНК-секвенаторе ABI PRISM 310. Полученные последовательности объединяли с имеющимися данными из GenBank и обрабатывали с помощью пакетов программ ClustalW2, DnaSP, MEGA4.1, ProSeq3.

В последнее время метод полимеразной цепной реакции с последующим анализом нуклеотидной последовательности (секвенированием) широко используется для точной идентификации бактерий и определения их родства в отношении других штаммов [7]. Ранее на основе 16S рДНК была показана возможность идентификации рода Yersinia [10] и описания новых видов или подвидов [15]. Тем не менее ввиду высокой консервативности 16S рДНК не позволяет различать близкородственные виды иерсиний [11, 13]. Недавно в качестве молекулярного маркера для классификации бактерий был предложен ген gyrB, кодирующий В-субъединицу ДНК-гиразы - фермента, участвующего в процессах репликации, транскрипции и рекомбинации ДНК. Этот ген удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к филогенетическим молекулярным маркерам. Он крайне редко передается горизонтально, присутствует во всех видах бактерий, является геном «домашнего хозяйства». Быстрые темпы эволюционных изменений его нуклеотидной последовательности наряду с высоким уровнем консерватизма аминокислотной последовательности позволяют

Характеристика штаммов Yersinia из Института микробиологии и эпидемиологии СО РАМН

Вид Штамм Источник, год изоляции штамма Вид после генотипирования

Y. intermedia 5З7З Вода, 1990 Y. intermedia

5З75 Вода, 1990 -//-

1215 Человек, 1979 Y. enterocolitica

1948 Вода, 1990 Y. intermedia

59З4 Кал суслика, 1980 -//-

Y. kristensenii б2бб Кал мыши, 1980 Y. aleksiciae

991 ? -//-

5З0б Кал бурозубки, 1980 Y. kristensenii

58б2 Внутренние органы полёвки, 1980 -//-

б572 Смыв с моркови, 1992 -//-

Y. frederiksenii 4б48 Человек, 1990 Y. frederiksenii

4849 ? -//-

204З ? Y. massiliensis

8б

использовать этот ген для исследования бактерий на уровне видов и отдельных штаммов [5, 6]. Ген gyrB был успешно использован для генотипирования Y frederiksenii [9] и проведения мультилокусного анализа одиннадцати видов иерсиний [11].

Для установления филогенетического родства и уточнения видовой идентификации исследуемых штаммов иерсиний был проведен анализ генов «домашнего хозяйства» -16S рДНК и gyrB. Мы генотипировали 13 штаммов иерсиний, по фенотипическим и биохимическим признакам охарактеризованных как Y. intermedia, Y. kristensenii и Y. frederiksenii (см. таблицу). Все последовательности (37 16S рДНК и 37 gyrB), полученные нами или взятые из банка данных, выравнены в программе ClustalW2; окончательный размер нуклеотидных последовательностей составил 750 н.п. для 16S рДНК и 430 н.п. для gyrB. Фрагменты 16S рДНК и gyrB генов были объединены и использованы для построения общего филогенетического дерева методом ближайших соседей (рис. 1). Все виды иерсиний формируют отдельные группы. Из исследуемых пяти штаммов Y. intermedia четыре (5373, 5375, 1948 и 5934) находятся в одной группе с типовыми штаммами этого вида, а пятый (1215) - в одной группе со штаммами Y. enterocolitica. Известно, что Y. enteroco-litica является наиболее гетерогенным по биохимическим и серологическим свойствам видом, включающим 6 биоваров и более 50 серотипов. По разным данным, корректная биохимическая идентификация этого вида составляет 50-80% [12]. Два штамма Y. kris-tensenii (991 и 6266) оказались генетически ближе к штаммам Y. aleksiciae, что может быть объяснено недавним выделением Y. aleksiciae из Y. kristensenii [14]. При этом интересно, что группа Y. aleksiciae генетически ближе к Y. bercovieri и Y. mollaretii, чем к Y. kristensenii. Штамм Y. frederiksenii 2043 расположен на одной ветви с типовыми, недавно охарактеризованными штаммами Y. massiliensis [13], тогда как остальные изоляты Y. frederiksenii (4648 и 4849) находятся в одной группе с Y. frederiksenii. Ряд исследований показывает, что Y. frederiksenii представляет собой генетически гетерогенную группу, состоящую, по меньшей мере, из трех геномовидов (1-3) [9]. В настоящее время штаммы геномовида 2 Y. frederiksenii выделены как отдельный вид - Y. massiliensis [13].

Рис. 1. Филогенетическое дерево иерсиний, построенное методом ближайших соседей на основании объединенных последовательностей 168 рДНК и §угВ генов. Здесь и на рис. 3 шкала отображает количество нуклеотидных замен на нуклеотидный сайт. Цифры в узлах дерева показывают величину поддержки бутстрепом в 1000 реплик

Рис. 2. Распределение нуклеотидного разнообразия вдоль OmpF гена иерсиний. Pi - средняя величина нуклеотидного разнообразия (окно = 20 н.п., шаг = 5 н.п.); н.п. - нуклеотидные пары. L1-L8 - участки, кодирующие наружные петли

Нам удалось выявить филогенетическое родство исследуемых штаммов иерсиний. В целом 16S рДНК-gyrB дерево соответствует ранее описанному дереву на основе MLST данных [11]. Установлено, что 4 из 13 исследуемых штаммов требуют переопределения. С учетом данных генотипирования, штамм Y frederiksenii 2043 отнесен нами к Y. massil-iensis, Y. intermedia 1215 - к Y enterocolitica, а Y kristensenii 991 и 6266 - к Y. aleksiciae.

ПЦР-амплификацию, секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей OmpF гена иерсиний проводили в соответствии с вышеописанными методами. Длина 23 OmpF генов варьировала от 1086 до 1146 н.п. При обработке данных обнаружено высокое разнообразие последовательностей OmpF гена по сравнению с объединенными

Рис. 3. Филогенетическое дерево иерсиний, построенное методом ближайших соседей на основании кодирующих последовательностей ОшрР генов

16S рДНК-gyrB генами иерсиний. Было найдено 425 вариабельных нуклеотидных сайта, что составило 35,6% от длины гена (1194 н.п.). В среднем эволюционная дивергенция всех нуклеотидных последовательностей ompF генов составила 0,125 ± 0,004 нуклеотидных замен на нуклеотидный сайт, что почти в три раза выше эволюционной дивергенции последовательностей 16S рДНК-gyrB генов (0,046 ± 0,003). Примечательно, что распределение нуклеотидного разнообразия вдоль исследованного фрагмента OmpF гена характеризовалось неоднородностью, формируя высоковариабельные и консервативные домены (рис. 2). Основываясь на ранее установленной топологической модели OmpF порина [1], мы определили, что вариабельные участки соответствуют наружным петлям белковой молекулы, а консервативные - трансмембранным р-стрендам.

На основе множественного выравнивания последовательностей было построено филогенетическое дерево (рис. 3). Наиболее гетерогенной группой по OmpF гену является Y. intermedia. Четыре исследуемых штамма Y. intermedia разделились на две далеко отстоящие филогенетические ветви; только штаммы 5934 и 5373 группировались с типовым штаммом ATCC 29909. Подобная картина наблюдалась также для штаммов Y. aleksiciae и Y. frederiksenii. В то же время достаточно однородную группу формировали штаммы Y. kristensenii, образуя один клад с типовым штаммом ATCC 33638. Полученные данные свидетельствуют о межвидовой и внутривидовой гетерогенности OmpF гена иерсиний, дивергенция которого может быть обусловлена мутационным процессом, адаптивной эволюцией и рекомбинационными событиями.

Таким образом, в результате генотипирования 13 штаммов иерсиний впервые на территории Дальнего Востока выявлены недавно охарактеризованные виды Y. aleksiciae и Y. massiliensis. Филогенетический анализ OmpF гена, кодирующего белок наружной мембраны иерсиний, показал его высокую гетерогенность по сравнению с генами «домашнего хозяйства», что может быть связано с экологическими аспектами существования исследуемой группы микроорганизмов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гузев К.В., Исаева М.П., Новикова О.Д. и др. Молекулярная характеристика OmpF-подобных поринов

патогенных Yersinia // Биохимия. 2005. Т. 70, № 10. С. 1338-1345.

2. Природная очаговость болезней: исследования института им. Н.Ф.Гамалеи РАМН / под ред. Э.И.Корен-берга. М.: Русаки, 2003. 256 с.

3. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 2001. 256 с.

4. Старостина Н.А. Эпидемиологические и экологические особенности заболеваний, вызываемых Yersinia frederiksenii, Yersinia kristensenii, Yersinia intermedia: автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2000. 12 с.

5. Buchanan S.K., Smith B.S., Venkatramani L. et al. Crystal structure of the outer membrane active transporter

FepA from Escherichia coli // Nature Struct. Biol. 1999. Vol. 6. P. 56-63.

6. Castillo-Keller M., Vuong P., Misra R. Novel mechanism of Escherichia coli Porin Regulation // J. Bacteriol. 2006. Vol. 188. P. 576-586.

7. Clarridge J.E. Impact of the 16S rDNA gene sequence analyses for identification of Bacteria on clinical microbiology and infectious diseases // Clin. Microbiol. Rev. 2004. Vol. 17. P. 840-862.

8. Cowan S.W., Schirmer T., Rummel G. et al. Crystal structures explain functional properties of two E. coli porins // Nature. 1992. Vol. 358. P 727-733.

9. Demarta A., De Respinis S., Dolina M., Peduzzi R. Molecular typing of Yersinia frederiksenii strains by means of 16S rDNA and gyrB genes sequence analyses // FEMS Microbiol. Lett. 2004. Vol. 238. P. 423-428.

10. Ibrahim A., Goebel B.M., Liesack W. et al. The phylogeny of the genus Yersinia based on 16S rDNA sequences // FEMS Microbiol. Lett. 1993. Vol. 114. P. 173-177.

11. Kotetishvili M., Kreger A., Wauters G. et al. Multilocus sequence typing for studying genetic relationships among Yersinia species // J. Clin. Microbiol. 2005. Vol. 43. P 2674-2684.

12. Linde H.J., Neubauer H., Meyer H. et al. Identification of Yersinia species by the Vitek GNI Card // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 37. P. 211-214.

13. Merhej V., Adekambi T., Pagnier I. et al. Yersinia massiliensis sp. nov., isolated from fresh water // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. Vol. 58. P. 779-784.

14. Sprague L.D., Neubauer H. Yersinia aleksicieae sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. Vol. 55. P. 831-835.

15. Sprague L.D., Scholz H.C., Amann S. et al. Yersinia similis sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. Vol. 58. P. 952-958.

16. Sulakvelidze A. Yersinia other than Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, and Y. pestis: the ignored species // Microbes Infect. 2000. Vol. 2. P 497-513.

17. Su H., Watkins N.G., Zhang Y.X., Caldwell H.D. Chlamydia trachomatis-host cell interactions: role of the chlamydial major outer membrane protein as an adhesin // Infect. and Immun. 1990. Vol. 58. P. 1017-1025.