Исследование миграции трансплантированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в организме опухоленосителя

Оригинальные исследования

55

Исследование миграции трансплантированных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в организме опухоленосителя

А.В.Мелешина 1, Е.И. Черкасова 1, Е.А. Сергеева 2, М.В. Ширманова 3, И.В Балалаева 12,

Е.В. Киселева 4, Е.В. Загайнова 13

1 Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород

2 Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород

3 Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород

4 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва

The study of migration of the multipotent mesenchymal stromal cells in the body of animal with a tumor

A.V. Meleshina 1, E.I. Cherkasov1, E.A. Sergeeva 2, M.V. Shirmanova 3, I.V. Balalaeva 1-2, E.V. Kiseleva 4, E.V. Zayganova 1-3

1 Nizhny Novgorod State University, Nizhny Novgorod

2 Institute of Applied Physics of Russian Academy of Science, Nizhny Novgorod

3 Nizhny Novgorod State Medical Academy, Nizhny Novgorod

4 N.K. Koltzov Institute of Developmental Biology of RAS, Moscow

Изучение роли различных видов стволовых и про-гениторных клеток в канцерогенезе является объектом интенсивных исследований. При этом все большее распространение получают флюоресцентные методы для исследования миграции клеток в организме реципиента и участия их в опухолевом патогенезе. В данной работе с применением методов проточной цитометрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии исследовано взаимодействие мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) костного мозга с аллогенной опухолью.

ММСК выделяли из костного мозга самцов GFP+-трансгенных мышей линии С57/В6. Опухоли были привиты самцам линии С57/Bl6 подкожной инъекцией опухолевых клеток карциномы легкого Льюис. За день до этого выполняли миелоабляцию облучением. GFP+-ММСК и клетки костного мозга мышей С57/В6 системно вводили животным той же линии на следующие сутки после облучения. Животные были разделены на две группы: 1 — облученные животные с прививанием опухоли и введением аллогенных костномозговых клеток, в том числе GFP+-ММСК; 2 (контрольная) — необлученные животные с прививанием опухоли, без введения клеток. Методом проточной цитометрии оценивали уровень флюоресценции свежевыделенных клеток костного мозга у животных 1 и контрольной групп на 7-е, 12-е и 15-е сут. после трансплантации GFP+-ММСК. В этих же группах животных методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии анализировали распределение меченых GFP+-клеток и их дериватов в органах и тканях опухоли также на 7-е, 12-е и 15-е сут. после трансплантации.

Установлено, что при системном введении донорские GFP+-ММСК отсутствуют в костном мозге и тканях индуцированной опухоли, но вместе с тем способны мигрировать в организме реципиента, накапливаясь в потенциальных нишах (селезенка, печень), и активно пролиферировать.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимные

стромальные клетки костного мозга, карцинома легкого Льюис, проточная цитометрия, конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, миграция, канцерогенез.

The study of stem and progenitor cells role in carcinogenesis is the subject of intense investigation. At the same time fluorescent methods become more common for the studying of the stem cells migration into recipient organism and their involvement in tumor pathogenesis. In this study the interaction between bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) and allogenic tumor (Lewis lung carcinoma) was investigated using the methods of the flow cytometry and a confocal laser scanning microscopy. MMSC were isolated from bone marrow of the males GFP+-transgenic mice C57/Bl6. The tumors were implanted in mice C57/Bl6 by subcutaneous injection of Lewis lung carcinoma tumor cells. The day before that myeloablation was performed by irradiation. GFP+-MMSC and bone marrow cells from the males C57/Bl6 were administrated into mice C57/Bl6 systemically on the following day after irradiation. The animals were divided into two groups: 1 — irradiated mice with tumor inoculation and injection of bone marrow cells including GFP+-MMSC; 2 (control) — unirradiated mice with tumor inoculation but without cells transplantation. The fluorescence level of freshly isolated bone marrow cells from animals of the first and control groups was evaluated by flow cytometry on the 7, 12 and 15 days after GFP+-MMSC transplantation. In these groups of animals we analyzed the distribution of the labeled GFP+-MMSC and their descendants in the organs and tumor tissues by laser scanning microscopy also on the 7, 12 and 15 days after transplantation. It was established that in systemic administration donor GFP+-MMSC were absent in the bone marrow and tissues of induced tumors, but at the same time they were able to migrate into recipients accumulating in the potential niches (spleen, liver) and proliferate actively.

Key words: bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells, Lewis lung carcinoma, flow cytometry, confocal laser scanning microscopy, migration, carcinogenesis.

e-mail: almele@ya.ru

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

56

Оригинальные исследования

Изучение роли различных видов стволовых клеток в канцерогенезе является объектом интенсивных исследований. Стволовые и прогенеторные клетки различного происхождения играют важную роль в развитии опухоли, но особенно интересны в этом отношении мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК). ММСК могут быть получены из костного мозга (КМ), жировой ткани, скелетной мускулатуры, периферической и пуповинной крови, синовиальной оболочки суставов и др. ММСК характеризуются фибробластоподобной морфологией, высоким пролиферативным потенциалом, способностью к симметричному и асимметричному делению, мультилинейностью дифференцировки, выраженными адгезивными свойствами, способностью к образованию колоний в культуре. Вместе с тем именно костномозговые ММСК наиболее изучены, применяются в клинической практике (главным образом, в рамках клинических исследований) и до сих пор остаются «золотым стандартом» в работах, посвященных изучению фенотипа, функций и роли ММСК в постнатальном развитии организма.

ММСК участвуют в формировании динамичной системы в КМ, состоящей из дифференцированных фибробластов, ретикулярных клеток, эндотелия, компонентов экстрацеллюлярного матрикса, цитокинов. При этом взаимодействие между собой и с другими клетками осуществляется через специфические рецепторы и молекулы адгезии [1].

Главными функциями ММСК КМ в организме являются: формирование гемопоэтического и стромального микроокружения, участие в морфогенезе, самоподдержание и восстановление пула ММСК, участие в гомеостатических реакциях организма, процессах регенерации, репарации и адаптации системы ММСК в норме и патологии [2]. Имеются также сведения об участии ММСК КМ в канцерогенезе. Считается, что ММСК способны мигрировать в опухоли подобно тому, как они мигрируют в поврежденные ткани, в том числе и в связи с тем, что опухолевый рост сопровождается воспалительным процессом. Привлечение ММСК в опухоль было продемонстрировано в ряде ксенотрансплантационных моделей меланомы [3], рака яичников [4], рака молочной железы [5], гепатоцеллюлярной карциномы [6].

Предполагается существование нескольких механизмов привлечения и участия ММСК в канцерогенезе. Наиболее вероятной считается мобилизация ММСК из системных ниш (в первую очередь костномозговых) и их последующий хоуминг в опухоль в ответ на действие хемотаксических агентов, продуцируемых опухолевыми клетками. При этом отмечается, что ингибирования действия одного из агентов недостаточно для нарушения аттракции ММСК, что говорит о нескольких согласованных механизмах в регулировании их тропизма к опухоли. Способность ММСК к преодолению барьера из эндотелиальных клеток сосудистой стенки является важнейшим условием реализации этого механизма миграции клеток к опухоли.

Привлеченные ММСК могут воздействовать на канцерогенез в нескольких направлениях. Во-первых, оказывать прямое действие через секрецию молекул паракринного действия, влияющих на фенотип опухолевых клеток. Во-вторых, за счет иммуносупрессивных свойств изменять состав «местных» иммунокомпетентных клеток, нарушая иммунные реакции,

направленные на подавление роста злокачественных клеток. В-третьих, способствовать васкуляризации опухоли, усиливая ангиогенез. В-четвертых, дифференцироваться в микросреде опухоли и выступать в качестве местных источников для развития опухолевых стромальных клеток [7].

Для изучения участия стволовых клеток в опухолевом патогенезе и наблюдения распределения их в организме реципиента традиционно используются иммуногистохимический анализ, проточная цитометрия, ПЦР и др. Одновременно с этим флюоресцентные методы исследования получают все большее распространение как при ex vivo, так и при исследованиях in vivo. В качестве генетических меток (маркеров) используют системы люциферин-люци-феразы и флюоресцентных (GFP-подобных) белков различных групп, генами которых трансфицируют исследуемые клетки. Это позволяет отслеживать местоположение маркированных клеток и их продуктов, а также происходящие с ними изменения, что крайне важно при исследованиях in vivo.

При оценке субклеточного распределения флюоресцирующих веществ эндогенного и экзогенного происхождения in vitro стандартом является метод конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ) [8, 9]. Пространственное разрешение КЛСМ позволяет строить полноценные трехмерные изображения оптически прозрачных флюоресцирующих объектов, а также наблюдать структуру образцов биотканей на глубинах до 100 мкм. Методика КЛСМ демонстрирует высокую чувствительность при визуализации структур, меченных флюоресцирующими белками.

Целью работы было исследование методами проточной цитометрии и КЛСМ распределения аллогенных GFP + ^МСК в организме реципиента и их взаимодействия с привитой аллогенной опухолью (карцинома легкого Льюис). Исследование включало последовательное решение следующих задач:

1. Выделение ММСК из КМ трансгенных GFP+-мышей линии С57/В16 и характеристика их методами проточной цитометрии и КЛСМ;

2. Облучение животных-реципиентов, прививка им опухоли и трансплантация аллогенных костномозговых клеток, включая GFP+^МСК;

3. Исследование миграции меченных ММСК в организме животного с опухолью.

Материал и методы

Дизайн эксперимента

Животным экспериментальной группы была выполнена миелоабляция облучением с последующим (на следующие сутки) прививанием опухоли и системной трансплантацией аллогенных клеток КМ. При этом «клеточный препарат», подготовленный для введения, включал как GFP+^МСК, так и гемопоэтические GFP^-клетки, необходимые для репопуляция костного мозга реципиента, поддержки кроветворения. GFP + ^МСК в созданной модели выступали в качестве «сигнальных», поскольку именно по их флюоресценции оценивали присутствие ММСК или их потомков в органах реципиента (КМ, легкие, печень, селезенка, ткани опухоли). Общая схема эксперимента представлена на рис. 1.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Оригинальные исследования

57

Рис. 1.

Дизайн исследования:

I - экспериментальная группа;

II - контрольная группа. КМ - клетки костного мозга мышей линии С57/В16;

LLC - карцинома легкого Льюис;

ПЦ - проточная цитометрия;

КЛСМ - конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Клеточные культуры

В работе использовали ММСК КМ самцов линии С57/В16 и самцов GFP + -TpaHcreHHbix мышей той же линии. ММСК выделяли из бедренных костей и костей голени. КМ вымывали с помощью иглы раствором стерильного фосфатно-солевого буфера с гентамицином (200 ед/мл, ПанЭко, Россия), промывали средой DMEM (ПанЭко, Россия) с гентамицином (2 раза), центрифугировали (1200 об/мин, 10 мин), суспензию клеток фильтровали через нейлоновый фильтр (диаметр пор = 100 мкм). Клетки культивировали в среде DMEM с L-глутамином (280мг/л), содержащей 20% эмбриональной бычьей сыворотки (HyClone, США) и гентамицин (200 ед/мл) при 37°С в атмосфере с 5% СО2. Неадгезиро-вавшиеся клетки удаляли через 72—96 ч Затем культуры переводили на среду DMEM с 10% сыворотки. Смену среды проводили каждые 3—4 сут. В экспериментах использовали первичные культуры ММСК.

Клетки КМ выделяли из бедренных костей самцов линии С57/В16. КМ вымывали раствором стерильного фосфатно-солевого буфера с гентамицином (200 ед/мл, ПанЭко, Россия) с помощью иглы. Полученную суспензию клеток промывали фосфатно-солевым буфером 3 раза, центрифугировали (1200 об/мин, 5 мин) и фильтровали через нейлоновый фильтр (диаметр пор = 100 мкм). Клетки характеризовали с помощью проточной цитометрии, количество определяли в камере Горяева.

Опухолевые модели и облучение

При выборе режима облучения руководствовались литературными данными [10, 11], где было установлено, что доза облучения выше 5 Гр приводит к полной миелоабляции КМ, а восстановление его функций происходит в течение 4 нед. после облучения. Эффективным (сублетальным) режимом облучения для абляции только КМ мышей признано однократное облучение дозой 5 Гр [12]. Поэтому облучение лабораторных животных проводили в этом режиме с помощью излучателя РУМ17 с фильтром Cu05 + 1Al (210 kV, 15mA, F = 47см, доза 75 рад/мин), ИБР РАН, Москва.

Карциному легкого Льюис прививали самцам линии C57/BI6 в возрасте 3 мес. на следующий день

после облучения подкожной инъекцией в область левого бедра 100 мкл 10% взвеси опухолевой ткани (10 мкг).

Содержание и использование лабораторных животных соответствовало правилам, принятым в Российской Федерации, рекомендациям локального этического комитета и национальным законам [13].

Трансплантация клеток

GFP+^МСК (1х10в) и костномозговые клетки мышей С57/В16 (1х10в) системно вводили мышам той же линии на следующие сутки после облучения. Были сформированы следующие группы животных: 1 (экспериментальная) — облученные животные с прививанием опухоли и трансплантацией аллогенных костномозговых клеток, в том числе GFP+^МСК (n = 12); 2 (контрольная) — необлученные животные с прививанием опухоли, но без введения каких-либо клеток (n = 3).

Проточная цитометрия

С помощью проточной цитометрии оценивали уровень флюоресценции свежевыделенных костномозговых клеток на 7-е, 12-е и 15-е сут. после трансплантации.

Для оценки уровня флюоресценции с помощью проточной цитометрии использовали: первичные культуры ММСК КМ мышей линии С57/В16 и GFP+-трансгенных животных той же линии; костномозговые клетки животных контрольной и экспериментальной групп.

В работе использовали проточный цитометр FACS Calibur (BD, США) с возбуждением флюоресценции лазером с длиной волны 488 нм и регистрацией сигнала в диапазоне длин волн 515—545 нм. В случае клеточных культур анализировали не менее 40 000 событий, при исследовании клеток КМ — не менее 200 000 событий.

Конфокальная лазерная сканирующая

микроскопия

Методом КЛСМ анализировали распределение меченых GFP+^МСК и их дериватов в органах и тканях опухоли на 7-е, 12-е и 15-е сут. после трансплантации.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

58

Оригинальные исследования

Для анализа распределения меченых клеток в организме реципиента животных выводили из эксперимента дислокацией шейного позвонка. Далее осуществляли эксплантацию образцов органов для исследования на установке для лазерной сканирующей микроскопии (LSM 510 META 23, Carl Zeiss, Германия) на основе моторизированного инвертированного микроскопа (Axiovert 200M), оснащенного модулем для детектиции спектров эпифлюоресценции в видимом диапазоне с разрешением 10 нм. Конфокальные изображения были получены с помощью объектива х40 с числовой апертурой NA = 1.3. Регистрацию флюоресцентных изображений осуществляли при однофотонном возбуждении аргоновым лазером на длине волны 488 нм мощностью 1—2 мВт на образце. Для идентификации флюоресценции GFP (488/506) регистрировали спектры флюоресценции в интервале 490—600 нм. Изображения, полученные на конфокальном микроскопе,

обрабатывали в компьютерной программе Zeiss LSM Image browser (version 4.0.0.91).

Результаты

Из 12 облученных животных (экспериментальная группа) на второй день после облучения и трансплантации клеток количество выживших составило 50%, что, вероятно, связано с развитием острой лучевой болезни.

Характеристика

флюоресцентных свойств ММСК

GFP+-MMCK трансгенных животных были выделены и культивированы. Установлено, что при культивировании с увеличением числа пассажей происходит «угасание» первоначально ярко флюоресцирующих клеток, при этом ММСК к 3 пассажу теряют до 70% первоначальной флюоресценции (рис. 2).

В

Рис. 2.

Культуры GFP+-MMCK:

А - первичная культура;

Б - культура 3 пассажа;

В - спектры флюоресценции первичной культуры ММСК (фиолетовая кривая) и ММСК 3 пассажа (синяя кривая). Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, возбуждение при длине волны 488 нм, регистрация - 490-600 нм, размер кадра 320x320 мкм

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Оригинальные исследования

59

В связи с этим в данной работе использовали клетки первичной культуры, что, с одной стороны, могло привести к разнородности популяции вводимых клеток, но с другой стороны — позволило сохранить максимум флюоресцентных свойств.

Проточная цитометрия

В предварительных экспериментах был проведен анализ интенсивности флюоресценции первичных культур GFP+-MMCK и GFP--MMCK мышей линии С57/В16 (контроль). Установлено, что GFP+-MMCK обладают яркой флюоресценцией в диапазоне 515—545 нм, GFP-ММСК, закономерно, флюоресцентными свойствами не обладали (рис. 3А). Костномозговые клетки животных экспериментальной группы были выделены через 7, 12 и 15 сут. после трансплантации. В ходе анализа распределения клеток КМ животных экспериментальной и контрольной групп по уровню сигнала не было выявлено достоверных различий. Флюоресценция, характерная для GFP+-клеток, не была обнаружена ни в одном случае (рис. 3Б). Таким образом, GFP+-MMCK в КМ экспериментальных животных не были выявлены.

Конфокальная лазерная сканирующая

микроскопия

Для получения контрольного спектра белка GFP на установке КЛСМ анализировали спектральные характеристики культуры GFP+-MMCK. Данный спектр использовали для дальнейшего сравнения со спектрами тканей исследуемых органов (рис. 2В). Полученный спектр клеток имел ярко выраженный пик на длине волны 506 нм и полностью соответствовал спектру флуоресценции белка GFP [14].

У животных экспериментальной группы после введения GFP+-MMCK в тканях легких были обнаружены участки флюоресценции, соответствующей спектру белка GFP: яркие, достаточно часто встречающиеся в поле зрения на 7-е сут. после трансплантации и разрозненные к 12-м и 15-м сут. эксперимента (рис. 4А). Их спектральные характеристики представлены на рис. 5А, где экспрессия белка GFP характеризовалась пиком на длине волны 506 нм.

Участки флюоресценции GFP соответствовали размерам единичной клетки (10—20 мкм) и располагались диффузно (по 1—3 в поле зрения). Областей групповой локализации обнаружено не было.

В селезенке животных экспериментальной группы на 7-е сут. после трансплантации были обнаружены небольшие скопления клеток со спектральными характеристиками GFP белка. К 12-м сут. их количество увеличилось, были найдены яркие локальные скопления GFP+-клеток — от 20 до 50 клеток в группе, рассеянные по органу с определенной периодичностью. На 15-е сут. удалось зафиксировать лишь диффузно распределенные «точки», которые по размеру были меньше одной клетки (рис. 4). На всех сроках наблюдения отмечено полное соответствие спектральных характеристик обнаруженных клеток спектру флуоресценции белка GFP (рис. 5Б).

В тканях печени на 7-е сут. после трансплантации были определены зоны флюоресценции, имеющие спектры, отличные от спектра белка GFP (рис. 5В). Яркие флюоресцирующие локальные скопления GFP+-клеток, часто встречающиеся в поле зрения, обнаружены на 12-е сут. после трансплантации (рис. 4В). К 15-м сут. выявлено как уменьшение количества клеток в группах, так и сокращение числа подобных групп в тканях органа. Спектральные характеристики клеток полностью соответствовали спектру белка GFP (рис. 5В).

В опухолевых тканях участков с GFP-флюоресценцией на 7-е сут. после трансплантации обнаружено не было. Несколько подобных участков были найдены на 12-х и 15-х сут., однако они не соответствовали размерам клеток (были значительно меньше), в отличие от обнаруженных в печени и селезенке (рис. 4). Вместе с тем, спектральные характеристики найденных участков имели ярко выраженный пик на длине волны 506 нм (рис. 5Г).

Интенсивность собственной флюоресценции в тканях животных контрольной группы оценивали при тех же условиях и настройках, что и в случае экспериментальной группы. В тканях легких, селезенки, печени и опухоли была отмечена слабая флюоресценция (рис. 4), однако ее спектр кардинально отличался от спектра GFP+-клеток (рис. 5).

Рис. 3. Распределение популяций клеток по уровням флуоресценции в зеленой области спектра:

А - распределение первичных культур ММСК [черная кривая - GFP-негативных, зеленая кривая - GFP+-MMCK]; Б - распределение клеток костного мозга [черная кривая - животного контрольной группы; синяя, красная и зеленая кривые - животных 7, 12 и 15 сут. после трансплантации GFP+-MMCK, соответственно]. Проточная цитометрия

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

60

Оригинальные исследования

7 сутки 12 сутки 15 сутки Контроль

А

Б

В

Г

Рис. 4. Ткани легких (А), селезенки (Б), печени (В) и опухолей (Г) животных экспериментальной и контрольной групп через 7, 12 и 15 сут. после трансплантации GFP+-MMCK. Участки флюоресценции GFP - ярко-зеленые. Возбуждение - 488 нм, регистрация 490-600 нм, размер кадра 320x320 мкм. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

Оригинальные исследования

61

ч:

о;

0,8

х

О)

3

и

О)

а.

о

2

х

&

0,6

0,4

0,2

0  490

545

Длина волны флюоресценции, нм

600

Длина волны флюоресценции, нм

Г

490 545

Длина волны флюоресценции, нм

600

1

Рис. 5. Характеристики флюоресценции тканей животных экспериментальной и контрольной групп

после трансплантации GFP+-MMCK: А - легкого, Б - селезенки, В - печени, Г - опухоли. Синие, красные и зеленые кривые -7, 12 и 15 сут. после трансплантации GFP+-MMCK, соответственно; черные кривые - контроль

Обсуждение

Для изучения распределения донорских GFP+-ММСК в тканях и органах животного с опухолью были использованы методы проточной цитометрии и КЛСМ.

Ранее методом прижизненного биоимиджинга у животных с трансплантацией стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) человека мы выявили перераспределение меченых флюоресцентным белком TurboFP СКЖТ из зоны введения [15]. У животных-опухоленосителей с системным введением СКЖТ флюоресценция меченых клеток была зарегистрирована методом флюоресцентного биоимиджинга in vivo в области селезенки как на ранних стадиях канцерогенеза, так и при сформированной опухоли. Полученные результаты соответствовали литературным данным [16, 17]. В настоящей работе мы также использовали метод in vivo имиджинга для исследования миграции ММСК в опухоль и потенциальные

ниши организма, однако обнаружить органы накопления ММСК у животных экспериментальных групп нам не удалось. Это могло быть обусловлено следующими причинами: 1) малое количество трансплантированных меченых ММСК; 2) неадекватность выбранного типа клеток и линий лабораторных животных задачам исследования; 3) глубокая локализация ниш. Тем не менее, данный метод является достаточно эффективным при изучении in vivo моделей [18-20].

Проточная цитометрия была применена для анализа клеток КМ лабораторных животных, поскольку применение КЛСМ для данных исследований имеет ряд ограничений. Меченые клетки не были обнаружены в КМ ни одного из животных экспериментальных групп ни на одном из контрольных сроков после трансплантации GFP+^МСК (7, 12, 15 сут.). Тем не менее, в работе A. Saton с соавт. (2008) было показано, что GFP+-клетки могут составлять до 80% от

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013

62

Оригинальные исследования

клеток КМ мышей-реципиентов линии C57/BL6 при их летальном облучении (12 Гр) и введении 1 млн. аллогенных GFP+-костномозговых клеток уже через 4 нед. [10]. В работе D. Nolan с соавт. (2007) было показано, что гемопоэз у летально облученных (11 Грей) животных может быть восстановлен более чем на 95% через 4 нед. после трансплантации 10 млн. донорских GFP+-костномозговых клеток [11]. Вероятно, в используемой нами модели отсутствие GFP+-ММСК в КМ животных экспериментальной группы связано со слишком ранними сроками наблюдения, на которых репопуляция КМ уже началась, но активная пролиферация еще не наступила, или в связи с малым количеством трансплантированных клеток.

Проблема перераспределения стволовых клеток в организме животного-опухоленосителя активно изучается. Известны in vivo модели, на которых подтверждено присутствие донорских ММСК в зоне опухолевого роста. Например, в работе S. Kidd с соавт. (2009) методами биолюминесцентного имиджинга и иммуногистохимии показано, что в ксеногенной модели рака молочной железы системно введенные ММСК КМ человека, меченные люциферазой, способны мигрировать в опухолевые узлы [20]. В наших исследованиях методом КЛСМ участки с флюоресценцией GFP+-клеток были обнаружены в опухолевых тканях животных на 12-е и 15-е сут. после трансплантации. Но вследствие того, что эти участки были значительно меньше размеров единичной клетки, мы не можем с уверенностью говорить о присутствии GFP+-клеток на данных сроках в тканях опухоли.

Согласно литературным данным, легкие животных в экспериментальных моделях in vivo выступают в качестве пункта «премиграции», где системно введенные стволовые клетки накапливаются (3—4 сут.) и затем (к 7—9 сут.) перераспределяются в организме реципиента [20]. Это подтверждают полученные нами данные. На всех сроках после введения GFP+^МСК

ЛИТЕРАТУРА:

1. Cheng L., Hammond H., Ye Z. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture. Stem Cells 2003; 21(2):131-42.

2. Пыко И.В., Корень С.В., Квачева З.Б. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга: свойства, функции, возможность использования в регенеративной и восстановительной терапии. Мед. Журн. 2007; 4:18-22.

3. Ren C., Kumar S., Chanda D. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells producing interferon-alpha in a mouse melanoma lung metastasis model. Stem Cells 2008; 26:2332-8.

4. Komarova S., Kawakami Y., Stoff-Khalili M.A. Mesenchymal progenitor cells as cellular vehicles for delivery of oncolytic adenoviruses. Mol. Cancer Ther. 2006; 5:755-66.

5. Karnoub A.E., Dash A.B., Vo A.P. Mesenchymal stem cells within tumor stroma promote breast cancer metastasis. Nature 2007; 449:557-63.

6. Niess H., Bao Q., Conrad C. Selective targeting of genetically engineered mesenchymal stem cells to tumor stroma microenvironments using tissuespecific suicide gene expression suppresses growth of hepatocellular carcinoma. Ann. Surg. 2011; 254:767-74.

7. Cuiffo B.G., Karnoub A.E. Mesenchymal stem cells in tumor development. Emerging roles and concepts. Cell Adhes. Migrat. 2012; 6(3):220-30.

8. Furia L., Cicalese A., Rancati I. et al. Stem Cell Biology in Cancer Research. A New Challenge for Fluorescence Microscopy, http://www. leica-microsystems.com/science-lab/stem-cell-biology-in-cancer-research/.

9. Hogan C., Dupre-Crochet S., Norman M. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat. Cell Biol. 2009; 11(4):460-7.

10. Saton A., Saito T., Sato Y. et al. Traffic of infused bone marrow cells after genetically - labeled syngeneic bone marrow transplantation following lethal irradiation in mice. Fukushima J. Med. Sci. 2008; 54(1):11-24.

в тканях легких были зарегистрированы области с соответствующими спектрами флюоресценции. Максимум приходился на 7-е сут. после трансплантации, а затем их количество уменьшалось.

Нами также были обнаружены донорские GFP+-ММСК в печени и селезенке животных, что согласуется с результатами, полученными другими авторами [16]. Были выявлены особенности распределения клеток в тканях этих органов: обнаружены локальные скопления GFP+-клеток - от 20 до 50 в группе, рассеянные с определенной периодичностью и встречающиеся как на поверхности, так и в более глубоких слоях (до 60 нм) тканей печени и селезенки. Вероятно, нами были обнаружены места активной пролиферации донорских ММСК, о чем свидетельствуют как характер распределения клеток (пулами), так и число клеток в каждой группе. При этом эффективность накопления ММСК в этих органах разнесена во времени: в селезенке популяции донорских ММСК обнаруживаются раньше (7 сут. после трансплантации), чем в печени.

Таким образом, взаимодействие опухоли (карциномы легкого Льюис) с ММСК, выделенными из КМ трансгенных GFP+-мышей линии С57/В16, было изучено на сроке до 15 сут. туморогенеза с применением методов проточной цитометрии и КЛСМ. Установлено, что в пределах указанного срока при системном введении донорские GFP+^МСК отсутствуют в КМ и тканях индуцированной опухоли, но вместе с тем способны мигрировать в организме реципиента, накапливаясь в потенциальных «нишах» (селезенка, печень) и активно пролиферировать.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке проекта РФФИ №11-02-01 199 «Флуоресцентный биоимиджинг системы «опухоль — стволовая клетка»» и грантов Правительства РФ (договора № 11.G34.31.0017 и № 14.512.11.0015).

11. Nolan D.J., Ciarrocchi A., Mellick A. S. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are a major determinant of nascent tumor neovascularization. Gen. Dev. 2007; 21:1546-58.

12. Shen J., Tsai Y.-T., DiMarco N.M. Transplantation of mesenchymal stem cells from young donors delays aging in mice. Scientific reports 2011; 67 t1):1-7.

13. Генин А.М., Капланский А.С. Биоэтические правила проведения исследований на человеке и животных в авиационной, космической и морской медицине. Авиационная и экологическая медицина 2001; 4:14-20.

14. Evrogen Joint Stock Company. Basic fluorescent proteins, http://www.evrogen.ru/products/TagGFP2/TagGFP2.shtml.

15. Мелешина А.В., Черкасова Е.И., Сергеева Е.А. Исследование взаимодействия мезенхимных стволовых клеток и опухоли методами флюоресцентного биоимиджинга. Современные технологии в медицине 2012; 4:7-16.

16. Wolf D., Rumpold H., Koeck R. Mesenchymal stem cells: potential precursors for tumor stroma and targeted - delivery vehicles for anticancer agents. J. Nation. Cancer Inst. 2005; 97t7):540-2.

17. Bell E.L., Klimova T.A., Eisenbart J. Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia - inducible factor - dependent extension of the replicative life span during hypoxia. Mol. Cell Biol. 2007; 27:5737-45.

18. Wang H., Cao F., De A. Trafficking mesenchymal stem cell engraftment and differentiation in tumor-bearing mice by bioluminescence imaging. Stem cells 2009; 27:1548-58.

19. Spaeth E. L., Dembinski L., Sasser A.K. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. Plos One 2009; 4:1-11.

20. Kidd S., Spaeth E., Dembinski J. L. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells 2009; 27:2614-23

Поступила 1507.2013

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013