Получение моноклональных антител к экзотоксину а синегнойной палочки и оценка их протективных свойств

ЛИТЕРАТУРА

1. Маркушева Л.И. Метаболизм предшественников нуклеиновых кислот при псориазе: автореферат док. биол. наук. - М., 1998. - С. 8-12.

2. Маслякова Г.Н. // Хирургия. - 2002. - № 1. - С. 21-23.

3. Саватеева М.В., Савина М.И., Маркушева Л.И. Самсонов В.А. // Бюлл. экспер. биол. и медицины. -2002. - Т. 134, № 8. - С. 202-204.

4. Тополян А.А. // Лаборатория. - 1999. - № 1. -С. 20-22.

5. Fantuzzi G., Dinarello C.A. // Eur. Cytokine Netw. -1998. - Vol. 9, № 1. - Р. 85-92.

6. Gurlich R., Maruna P., Peskova M. // Immunology. - 2000. - Vol. 79, № 12. - Р. 585-588.

Fastova I.A., Yaroshenko I.F. Interlenkine-1 content in blood and tissues duving experimental perifont+TS in mice // Vestnik of Volgograd state medical University. - 2004. - № 12. - P. 12-14.

In the experiments carried out on 25 white mice after modeling of acute peritonitis the quantity of IL-la in the blood serum, the tissues of the liver, lungs, heart and small intestines of intact animals and within 1, 3, 6 and 24 hours of modeling was determined. At the beginning of peritonitis the strong activation of liver functions and transport of IL-la were observed whereas 24 h later the quantity of IL-la in the lung tissue increased.

УДК 616.98:576.8.097.29/3

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ЭКЗОТОКСИНУ А СИНЕГНОЙНОЙ ПАЛОЧКИ И ОЦЕНКА ИХ ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ

М.А. Ободова, Н.П. Храпова, М.В. Ломтатидзе, Л.В. Ломова, В.М. Самыгин, Л.К. Жога

Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Нозокомиальные инфекции остаются актуальной проблемой в стационарах во всех странах мира, несмотря на проведение регламентированных санитарно-эпидемиологических мероприятий и успехи в антимикробной терапии [6]. Одной из основных причин госпитальной инфекции с высоким уровнем летальности является синегнойная палочка. При этом антибактериальная терапия чаще всего недостаточно эффективна вследствие увеличения числа антибиоти-корезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa, что делает очевидной необходимость разработки новых средств профилактики и лечения синегнойной инфекции [5]. В связи с этим, обсуждается вопрос целесообразности возврата к идее применения специфических антител в качестве иммунопрофилактических и иммунотерапевтиче-ских средств. За рубежом исследования по оценке протективных свойств моноклональных антител (МКА) к различным антигенам P. aeruginosa проводят с середины 80-х годов. Протективная активность выявлена у ряда мышиных МКА к белку F наружной мембраны P. aeruginosa и человеческих МКА к липополисахариду (ЛПС) и экзотоксину А (ЭТА) P. aeruginosa [3]. Хотя экспериментальное моделирование может лишь частично воспроизвести клиническую ситуацию, настоящие эксперименты дают возможность уверенно говорить о целесообразности применения МКА в качестве дополнительного терапевтического средства при синегнойной инфекции [4].

В нашей стране подобные исследования не проводят ввиду отсутствия отечественных коллекций гибридом-продуцентов МКА против антигенов P.aeruginosa. В настоящее время в Волгоградском НИПЧИ создан набор гибридных клонов, продуцирующих мышиные МКА к водорас-

творимым антигенам клеток, ЛПС P.aeruginosa, проводится работа по получению МКА к ЭТА синегнойной палочки, изучению их свойств [1].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Получение моноклональных антител к экзотоксину А P.aeruginosa, оценке их протективных свойств на модели синегнойного сепсиса в эксперименте.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали типовой токсигенный штамм P.aeruginosa 103Р из коллекционного центра ВолгНИПЧИ, который выращивали методом глубинного культивирования в жидких питательных средах различного состава. Препарат экзотоксина А выделяли из жидкой среды культивирования методом осаждения белка ацетатом цинка и сульфатом аммония. В качестве источника иммунных спленоцитов, подкормочных клеток и резервуара для наращивания гибридомных клеток использовали мышей линии ВАЬВ/е. На этапе подготовки иммунных спленоцитов животных иммунизировали препаратами ЭТА. Схемы иммунизации инбредных мышей состояли из 3-4 инъекций антигена. При этом варьировали дозы, способы введения антигена и интервалы между инъекциями. Опыты по гибридизации иммунных спленоцитов и клеток мышиной миеломы осуществляли через 2-3 суток после бустирующей инъекции антигена.

Вторым партнером при гибридизации служили клетки мышиной миеломы P3-X63.Ag8.653 и Бр2/0 . Линии мышиных миеломных клеток P3-X63.Ag8.653 и Бр2/0 были получены из "Банка клеточных культур" института цитологии АН РФ (г. Санкт-Петербург).

Гибридизацию клеточных линий проводили, следуя общепринятому протоколу гибридомной технологии, внося ряд модификаций в этап подготовки иммунных спленоцитов. Результативность воспроизведения гибридомной технологии оценивали по показателю эффективности гибридизации (% лунок с растущими клонами от общего числа засеянных в стандартные 96-луночные пластины) и показателю эффективности получения антителопродуцентов (% лунок с антитело-продуцентами от числа лунок с растущими гиб-ридомами).

Антителопродукцию в лунках с растущими гибридомами определяли тестированием проб сред культивирования в ТИФМ каждые 3-4 дня. Трехкратное совпадение положительных результатов реакции с нарастанием титров мышиных иммуноглобулинов при тестировании культу-ральной жидкости (КЖ) служило основанием для продолжения работы с выявленными гибридо-мами-продуцентами антител (АТ).

Клонирование гибридом проводили методом предельных разведений в возможно ранние сроки. Часть неклонированной культуры сохраняли в жидком азоте. С целью стабилизации признака антителопродукции и интенсификации роста клеток моноклонов культуру клонировали не менее двух раз.

МКА накапливали in vivo и in vitro. Для накопления МКА in vitro осуществляли непрерывное культивирование гибридом в пластиковой посуде различного объема по общепринятой методике. Для накопления МКА in vivo гибридные клетки вводили внутрибрюшинно мышам линии BALB/c, предварительно праймированным пристаном или неполным адъювантом Фрейнда. Накопление ас-цитической жидкости (АЖ), содержащей МКА, отслеживали в течение месяца, выполняя тотальный забор при ее максимальном накоплении. МКА из КЖ и АЖ выделяли методом сульфатного осаждения белка, стерилизовали методом мембранной фильтрации, содержание белка в препаратах МКА определяли спектрофотометриче-ски при 280 нм, МКА стерильно ампулировали и хранили при -20 °С.

Специфическую активность МКА оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного метода (ТИФМ), в качестве антигенов использовали ЭТА и водно-солевой экстракт (ВСЭ) Н-3 P. aeruginosa 103Р в концентрациях, предварительно установленных для каждой конкретной серии антигенного препарата. Условия проведения анализа в части температурных режимов, экспозиции ингредиентов в лунках пластин, состава буферных растворов на различных этапах ТИФМ соответствовали стандартным требованиям.

Оценку протективных свойств полученных МКА проводили по общепринятой методике при парентеральном введении последних в организм инфицированных биопробных животных с после-

дующей оценкой сроков средней продолжительности жизни (СПЖ) и числа выживших особей в опытных группах. Протективную активность МКА оценивали на модели мышиного синегной-ного сепсиса. Срок наблюдения за экспериментальными животными - 30 суток с момента заражения. День постановки опыта считали нулевым. Продолжительность жизни индивидуального животного - число полных суток с момента заражения. По истечении 30 суток производили расчет показателя СПЖ для каждой группы, контролем антител считали нормальный мышиный иммуноглобулин (НМИг).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Данные протоколов гибридизации приведены в табл. 1.

Всего из первого слияния вынесен 21 клон, из них один стабильный антителопродуцент к ЭТА 3F5 (клонирован, заморожен), из второго слияния -также 21 клон, из них три стабильных антитело-продуцента к ЭТА P. aeruginosa 103P, 5F10, 5H9, 4D2 (клонированы, заморожены).

Результаты оценки протективных свойств полученных МКА к ЭТА синегнойной палочки представлены в табл. 2.

Описано два опыта по получению МКА к ЭТА синегнойной палочки. При этом оптимальная схема иммунизации мышей линии BALB/c состояла из четырехкратного введения антигена, суммарная доза на весь цикл иммунизации не превышала 130 нг ЭТА. По данным настоящего исследования результативными оказались опыты, в которых в качестве миеломного партнера участвовала линия Sp2/0. Несмотря на высокие показатели эффективности гибридизации и эффективности получения АТ-продуцентов, последние оказались нестабильными, и всего было отобрано четыре стабильных клона-продуцента МКА к ЭТА P. aeruginosa 103P. Во всех опытах, в результате которых удавалось отобрать стабильные антителопродуценты, бустирующую инъекцию антигена проводили внутриселезеноч-но, что говорит о целесообразности именно этого способа введения для получения эффективных результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные МКА к ЭТА P.aeruginosa 103Р обладают более выраженным протективным эффектом, нежели МКА к другим антигенам P.aeruginosa 103Р (к липополисахариду, полисахариду в составе ЛПС, белкам наружной мембраны), которые были получены ранее [2]. Процент увеличения СПЖ по сравнению с контролем для МКА к экзотоксину А составил от 33 до 65, для МКА к липополисахариду от 17 до 50, для МКА к полисахариду в составе ЛПС от 17 до 33, для МКА к белкам наружной мембраны от 0 до 17.

Таблица 1

Протокол гибридизации № 1

1 просмотр (18-й день)* 2 просмотр (20-й день) * 3 просмотр (33-й день) *

% клоно-образования % антитело-продуцентов % клоно-образования % антитело-продуцентов % клоно-образования % антитело-продуцентов

149/480 31 % 80/149 53,7 % 90/480 18,8 % 12/90 13,3 % 36/480 7,5 % 13/36 36,1 %

ВСЭ Н-3 ЭТА ВСЭ Н-3 + ЭТА 64/80 27/80 12/80 80 % 33,8 % 15 % 9/90 3/90 0/90 10 % 3,3 % 0 10/36 7/36 4/36 27,7 % 19,4 % 11,1 %

Протокол гибридизации № 2

1 просмотр (18-й день) * 2 просмотр (24-й день) * 3 просмотр (32-й день) *

133/480 27,7 % 28/133 21 % 235/480 49 % 18/235 7,7 % 144/480 30 % 31/144 21,5 %

ВСЭ Н-3 ЭТА ВСЭ Н-3 + ЭТА 19/28 13/28 4/28 67,8 % 46.2 % 14.3 % 8/18 11/18 1/18 44,4 % 61,1 % 5,6 % 19/144 14/144 2/ 144 13,2 % 9,7 % 1,4 %

Примечание. * - день после слияния.

Таблица 2

Препарат МКА Режим введения Доза МКА на 1 животное Путь введения СПЖ Соотношение выживших / павших животных % увеличения СПЖ по сравнению с контролем

3F5 За 24 ч до введения культуры (режим серопрофилактики) 2 мг по концентрации белка Внутри-брюшинный 29,3 5/6 65 %

4D2 15,8 3/6 33 %

5F10 20,6 4/6 51 %

Y-глобулин поли- клональный (5H9+3F5+5F10) 20,3 4/6 51 %

НМИг (контроль) 6,6 1/6 -

ЛИТЕРАТУРА

1. Разработка моноклональных диагностических средств для обнаружения синегнойной палочки: отчет о НИР (заключит.) / Волгогр. науч.-исслед. противочум. ин-т. - Волгоград, 2000. - № ГР 01.9.80 001810. - 53 с.

2. Серопрофилактика синегнойной инфекции в эксперименте: отчет о НИР (заключит.) / Волгогр. науч.-исслед. противочум. ин-т. - Волгоград, 2002. -№ ГР 01.2.00 1-4722. - 49 с.

3. Bruderer U, Deusinger M, Schurch U, Lang A.B. // Res. Immunol. - 1993. - Vol. 144, № 9. - P. 659-665.

4. Pseudomonas aeruginosa / Stanislavsky E. et al.,

1997.

5. VanDelden C., Iglewski B.H. // Emerg. Infect. Dis. -

1998. - Vol. 4, № 4, OCT. - DEC. - Р. 551-560.

6. Weinstein R. // Emerg. Infect. Dis. - 1998. - Vol. 4, № 3. - P. 416-420.

Obodova M.A., Khrapova N.P., Lomtatidze M.V., Lomova L.V., Samygin V.M., Zhoga L.K. Production & protective potential of murine monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa exotoxin a // Vestnik of Volgograd state medical University. - 2004. - № 12. - P. 14-16.

In the present study, four stable hybridomas producing murine monoclonal antibodies (MAbs) against Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (ETA) were obtained in two fusions. The protective effect of murine monoclonal antibodies against P. aeruginosa ETA was evaluated while administering MAbs parenterally using murine pseudomonas sepsis model. The protective effect was evaluated according to mice' average lifetime index. Anti-ETA MAbs possessed a more expressive protective potential than MAbs against other P. aeruginosa antigens. Anti-ETA MAbs as protective agents expanded average lifetime index of animal models to 33-65 per cent compared to the control groups.