ОЛИГОДЕНДРОЦИТ-СПЕЦИФИЧНЫЙ ПРОМОТОР, микроРНК, СПЕЦИФИЧНАЯ К ГЕНУ PLP1, ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЙ ПРОМОТОР И/ИЛИ УКАЗАННУЮ микроРНК, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННЫЙ ВЕКТОР
OLIGODENDROCYTE-SPECIFIC PROMOTOR, microRNA SPECIFIC TO PLP1 GENE, VECTOR CONTAINING SPECIFIED PROMOTOR AND/OR SPECIFIED microRNA, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SPECIFIED VECTOR

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к олигодендроцит-специфичному промотору, в частности, к олигодендроцит-специфичному промотору, содержащему нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 90% идентичную нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение также относится к микроРНК, специфичной к гену PLP1. Кроме того, настоящее изобретение относится к вектору, содержащему указанный промотор и/или указанную миРНК, и к фармацевтической композиции, содержащей такой вектор.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Гипомиелиновая лейкодистрофия представляет собой общий термин, обозначающий заболевания головного мозга у детей, вызванные слабым развитием белого вещества головного мозга, причем в настоящее время известно 11 заболеваний. Типичным заболеванием среди них является болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PMD). PMD характеризуется нарушением миелинизации центральной нервной системы и представляет собой редкое трудноизлечимое заболевание, которое вызывает серьезные нарушения моторного развития и неврологические симптомы сразу после рождения. По оценкам заболеваемость в Японии составляет 1,45 случаев на 100000 новорожденных мальчиков. В настоящее время необходимые средства лечения отсутствуют.
[0003] Миелин продуцируется олигодендроцитами (олигодендроглией), представляющими собой тип глиальных клеток, присутствующих в головном мозге, и имеет многослойную структуру изолирующих фосфолипидов, окружающих аксоны нейронов. Главным белком миелина является протеолипидный белок (PLP), в качестве других компонентов также известны основной белок миелина (MBP) и человеческая 2',3'-фосфодиэстераза циклических нуклеотидов (CNP). PMD вызывается аномалиями в гене протеолипидного белка (ген PLP1). Среди них наиболее частой мутацией является дупликация PLP1 (примерно 60%). Дупликация PLP1 приводит к сверхэкспрессии гена PLP1, поэтому можно ожидать, что нормализация уровня его экспрессии даст терапевтический эффект.
[0004] В непатентном документе 1 раскрыта опосредованная аденоассоциированным вирусом (AAV) экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP), управляемая промотором основного белка миелина (MBP) или промотором глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) в мозге мышей в процессе развития, и описано, что экспрессия GFP, управляемая промотором GFAP, является высокоспецифичной для астроцитов после введения вектора в мозг новорожденных и взрослых мышей. В непатентном документе 1 также указано, что селективность промотора MBP в отношении олигодендроцитов была низкой после введения AAV новорожденным мышам, но превосходной после введения вектора на 10-е сутки после рождения. В этом документе предполагается, что введение AAV, управляемого клеточно-специфичным промотором, непосредственно в развитый постнатальный мозг приводит к целевой долговременной экспрессии трансгена в глиальных клетках.
[0005] В непатентном документе 2 описывается разработка генной терапии, направленной на олигодендроциты, против Пелицеус-Мерцбахера-подобной болезни, где ген GJC2/Cx47 вставляют ниже промотора основного белка миелина и вводят мышам возрастом 10 дней путем однократной интрацеребральной инъекции во внутреннюю капсулу с использованием вектора на основе аденоассоциированного вируса (AAV.MBP.Cx47myc).
[0006] В непатентных документах 1 и 2 раскрыта генная терапия и соответствующий промотор с использованием вектора AAV, но не описывается какая-либо генная терапия, направленная на аномалии гена PLP1, и подходящие для нее промоторы или микроРНК.
Список литературы
Непатентная литература
[0007] Непатентный документ 1: von Jonquieres G et al., Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 2013 Jun 14; 8(6): e65646.
Непатентный документ 2: Georgiou E et al., Gene therapy targeting oligodendrocytes provides therapeutic benefit in a leukodystrophy model. Brain. 2017 Mar 1; 140(3): 599-616.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
[0008] Настоящее изобретение относится к вектору, способному олигодендроцит-специфически подавлять экспрессию гена PLP1 с целью лечения PMD, вызванной аномалией гена PLP1, соответствующему промотору и соответствующей микроРНК, а также к фармацевтической композиции, содержащей вектор.
Решение задачи
[0009] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что промотор человеческой фосфодиэстеразы 2',3'-циклических нуклеотидов (CNP), имеющий последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, может управлять экспрессией гена в олигодендроцит-специфичной и высокоэффективной манере, и что вектор AAV, содержащий данный промотор и микроРНК, специфичную для гена PLP1, находящуюся ниже промотора и функционально связанную с ним, может подавлять экспрессию гена PLP1, и тем самым завершили настоящее изобретение.
[0010] А именно, настоящее изобретение относится к нижеследующим аспектам.
[1] Олигодендроцит-специфичный промотор, содержащий нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 90% идентичную нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1.
[2] Промотор по п.[1], содержащий нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1.
[3] Олигодендроцит-специфичный вектор, содержащий промотор по п.[1] или [2].
[4] Вектор по п.[3], дополнительно содержащий последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, функционально связанную с промотором.
[5] МикроРНК, специфичная для гена PLP1, содержащая пару нуклеотидных последовательностей, состоящую из антисмысловой последовательности и смысловой последовательности, где пара нуклеотидных последовательностей выбрана из группы, состоящей из пар антисмысловых последовательностей, показанных в левом столбце таблицы 1, и смысловых последовательностей, показанных рядом с антисмысловыми последовательностями в правом столбце таблицы.
[6] МикроРНК по п.[5], содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-7 и 24-51.
[7] МикроРНК по п.[5], содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-5, 7, 24, 26, 29-32, 35, 36, 42 и 51.
[8] МикроРНК по п.[5], содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 29, 31 и 32.
[9] Вектор, содержащий последовательность микроРНК по любому из пп.[5]-[8].
[10] Вектор по п.[9], где последовательность микроРНК функционально связана с олигодендроцит-специфичным промотором.
[11] Вектор по п.[10], где олигодендроцит-специфичный промотор представляет собой промотор по п.[1] или [2].
[12] Вектор по любому из пунктов [3], [4] и [9]-[11], где вектор представляет собой вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV).
[13] Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по любому из пунктов [3], [4] и [9]-[12].
[14] Фармацевтическая композиция по п.[13], которая представляет собой фармацевтическую композицию для лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1.
[15] Фармацевтическая композиция по п.[14], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.
[16] Фармацевтическая композиция по п.[14], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.
[17] Фармацевтическая композиция по п.[13], которая представляет собой ингибитор экспрессии гена PLP1, подавляющий экспрессию гена PLP1.
[18] Способ лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, включающий введение эффективного количества вектора по любому из пп.[3], [4] и [9]-[12] пациенту, нуждающемуся в лечении.
[19] Способ по п.[18], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.
[20] Способ по п.[18], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.
[21] Способ подавления экспрессии гена PLP1, включающий введение эффективного количества вектора по любому из пп.[3], [4] и [9]-[12] пациенту, нуждающемуся в лечении.
[22] Вектор по любому из пп.[3], [4] и [9]-[12] для применения в способе лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1.
[23] Вектор по п.[22], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, спастическую параплегию типа 2 или рассеянный склероз.
[24] Вектор по п.[22], где заболевание представляет собой болезнь Пелицеуса-Мерцбахера.
Полезные эффекты изобретения
[0011] Вектор AAV, содержащий промотор по настоящему изобретению, способен обеспечивать экспрессию гена в олигодендроцит-специфичной и высокоэффективной манере и, кроме того, он успешно подавляет экспрессию гена PLP1 благодаря включению последовательности микроРНК, специфичной для человеческого гена PLP1, функционально связанной с промотором, и, следовательно, его можно использовать в качестве терапевтического средства против PMD, вызванной дупликацией PLP1 и др.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0012] [Фиг. 1] На фиг. 1 показана схематическая диаграмма вектора AAV, описанного в примере 1.
[Фиг. 2] На фиг. 2 показаны фотографии, представляющие результат анализа специфичности AAV-экспрессирующих клеток методом иммунофлуоресцентного окрашивания, описанного в примере 2.
[Фиг. 3] На фиг. 3 показан график, демонстрирующий результаты измерения по участкам подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 по интенсивности флуоресценции, генерируемой в процессе иммунофлуоресцентного окрашивания PLP1, как описано в примере 3.
[Фиг. 4] На фиг. 4 показаны графики, демонстрирующие результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 4. На (A) и (B) показаны относительные уровни экспрессии гена PLP1 и относительные уровни экспрессии гена Olig2 соответственно.
[Фиг. 5] На фиг. 5 показаны фотографии, представляющие результаты гистологического анализа методом иммуноокрашивания после введения мышам PLP1-Tg, как описано в примере 5.
[Фиг. 6] На фиг. 6 показаны фотографии, представляющие результаты микроморфологического анализа с помощью электронного микроскопа после введения мышам PLP1-Tg, как описано в примере 5.
[Фиг. 7] На фиг. 7 показан график, демонстрирующий увеличение продолжительности жизни после введения мышам PLP1-Tg, как описано в примере 5.
[Фиг. 8] На фиг. 8 показан график, демонстрирующий увеличение массы тела после введении мышам PLP1-Tg, как описано в примере 5.
[Фиг. 9] На фиг. 9 показан график, демонстрирующий результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 6.
[Фиг. 10] На фиг. 10 показан график, демонстрирующий результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 7.
[Фиг. 11] На фиг. 11 показан график, демонстрирующий результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 8.
[Фиг. 12] На фиг. 12 показан график, демонстрирующий результаты измерения подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, как описано в примере 9.
[Фиг. 13] На фиг. 13 показан график, демонстрирующий результаты измерения по участкам подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 по интенсивности флуоресценции, генерируемой в процессе иммунофлуоресцентного окрашивания PLP1, как описано в примере 10.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0013] [Промотор]
Промотор по настоящему варианту осуществления представляет собой олигодендроцит-специфичный промотор, содержащий нуклеиновую кислоту, последовательность которой по меньшей мере на 90%, предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 98% идентична нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, наиболее предпочтительно указанный промотор содержит нуклеиновую кислоту, имеющую нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1. Помимо нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90% идентичной нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, промотор может содержать на конце нуклеотидных последовательностей участки для клонирования в векторах, такие как участки распознавания рестрикционными ферментами, и последовательность att для шлюзового клонирования.
[0014] Нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, описанную в SEQ ID NO: 1, представляет собой человеческий промотор CNP, который можно получить из chr17:40118309-40120101 стандартной последовательности человеческого генома (GRCh37/hg19). Человеческий ген CNP представляет собой ген, специфически экспрессирующийся в олигодендроцитах головного мозга, причем его специфичность, как полагают, определяется последовательностью указанного промотора. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что последовательность человеческого промотора CNP, описанная в SEQ ID NO: 1, может обеспечивать олигодендроцит-специфическую экспрессию генов, отличных от гена CNP, расположенных ниже этого промотора.
[0015] Промотор согласно настоящему варианту осуществления представляет собой промотор, который специфически функционирует в олигодендроцитах, благодаря чему гены, функционально связанные с промотором и расположенные ниже его, специфически экспрессируются в олигодендроцитах. Промотор настоящего варианта осуществления можно получит с помощью методов генной инженерии. Например, ген человеческого промотора CNP получают из генома человека, а промотор, имеющий желаемую нуклеотидную последовательность, получают путем делеции, вставки или замены некоторых нуклеотидов. Альтернативно промотор, имеющий желаемую нуклеотидную последовательность, можно получить путем частичного или полного синтеза.
[0016] [микроРНК]
микроРНК обычно содержит антисмысловую последовательность и смысловую последовательность и может образовывать структуру шпильки, тем самым превращаясь в зрелую микроРНК. Антисмысловая цепь зрелой микроРНК связывается с мРНК-мишенью, вызывая разложение или подавление трансляции указанной мРНК и тем самым подавление экспрессии целевого гена. микроРНК по настоящему варианту осуществления представляет собой микроРНК, специфичную для гена PLP1, в частности человеческого гена PLP1, содержит антисмысловую последовательность и смысловую последовательность и может подавлять экспрессию гена PLP1.
[0017] Предпочтительно микроРНК по настоящему варианту осуществления содержит 5'-фланкирующую последовательность, антисмысловую последовательность, последовательность петли на стебле, смысловую последовательность и 3'-фланкирующую последовательность в указанном порядке, начиная с 5'-конца. Конфигурация требует, чтобы длина 5'-фланкирующей последовательности составляла 25-100 нуклеотидов, последовательности петли на стебле - 4-30 нуклеотидов, а 3'-фланкирующей последовательности - 25-100 нуклеотидов.
[0018] Фланкирующая последовательность может представлять собой любую последовательность, которая, как известно, обычно экспрессируется в олигодендроцитах, например, можно использовать 5'-фланкирующую последовательность и 3'-фланкирующую последовательность, полученные из miR155. Помимо 5'-фланкирующей последовательности и 3'-фланкирующей последовательности, полученных из miR155, можно использовать 5'-фланкирующую последовательность и 3'-фланкирующую последовательность miR-138, miR-219, miR-9, miR-23a, miR-388 и miR-297c, которые, как известно, экспрессируются в олигодендроцитах.
[0019] Последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, можно сконструировать с помощью программного обеспечения, такого как BLOCK-iT(TM) RNAi Designer (ThermoFisher Scientific, США), например, можно использовать описанные ниже кандидатные нуклеотидные последовательности микроРНК человеческого PLP1.
Кандидатная нуклеотидная последовательность 1 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 2):
5'-AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAGGTTTTTGGCCACTGACTGACCTGCCTCTCTTCTTCCTTT-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 2 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 3):
5'-AACACCAGGAGCCACACAACGGTTTTGGCCACTGACTGACCGTTGTGTCTCCTGGTGTT-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 3 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 4):
5'-TTCCATGGGAGAACACCATACGTTTTGGCCACTGACTGACGTATGGTGCTCCCATGGAA-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 4 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 5):
5'-TGAGCAGGGAAACCAGTGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACACTGTTCCCTGCTCA-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 5 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 6)
5'-AGGGCTTTCTGATTGACAGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCTGTCACAGAAAGCCCT-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 6 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 7):
5'-ACCCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACtggattgtttctttggggt-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 7 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 24)
5'-ACAAATGCAGCAATAAACAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTGTTTAGCTGCATTTGT-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 8 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 25):
5'-AATAGACTGGCAGGTGGTCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGACCACGCCAGTCTATT-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 9 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 26)
5'-AAAGAATGAGCTTGATGTTGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCAACATCGCTCATTCTTT-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 10 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 27):
5'-AGATACTCATAGTCTTGGTAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTACCAAGTATGAGTATCT-3'
Кандидатная нуклеотидная последовательность 11 микроРНК человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 28):
5'-AAGCCCATGTCTTTGGGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTCCCAGACATGGGCTT-3'
[0020] Альтернативно, чтобы сконструировать последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, конструируют искусственные миРНК, как описано в разделе Примеры, и выбирают оптимальную последовательность миРНК, которую затем используют для синтеза микроРНК.
[0021] микроРНК по настоящему варианту осуществления содержит пару нуклеотидных последовательностей, состоящую из антисмысловой последовательности и смысловой последовательности, где пара нуклеотидных последовательностей может быть выбрана из группы, состоящей из пар, содержащих антисмысловую последовательность, описанную в левом столбце таблицы 1, и смысловую последовательность, указанную справа от антисмысловой последовательности в правом столбце таблицы.
Таблица 1. Антисмысловые и смысловые последовательности микроРНК, сконструированные для человеческого гена PLP1
Антисмысловая последовательность
Смысловая последовательность
AAAGGAAGAAGAAAGAGGCAG（SEQ ID NO: 52）
CTGCCTCTCTTCTTCCTTT（SEQ ID NO: 53）
AACACCAGGAGCCACACAACG（SEQ ID NO: 54）
CGTTGTGTCTCCTGGTGTT（SEQ ID NO: 55）
TTCCATGGGAGAACACCATAC（SEQ ID NO: 56）
GTATGGTGCTCCCATGGAA（SEQ ID NO: 57）
TGAGCAGGGAAACCAGTGTAG（SEQ ID NO: 58）
CTACACTGTTCCCTGCTCA（SEQ ID NO: 59）
AGGGCTTTCTGATTGACAGCC（SEQ ID NO: 60）
GGCTGTCACAGAAAGCCCT（SEQ ID NO: 61）
ACCCCAAAGAAACACAATCCA（SEQ ID NO: 62）
TGGATTGTTTCTTTGGGGT（SEQ ID NO: 63）
ACAAATGCAGCAATAAACAGG（SEQ ID NO: 64）
CCTGTTTAGCTGCATTTGT（SEQ ID NO: 65）
AATAGACTGGCAGGTGGTCCA（SEQ ID NO: 66）
TGGACCACGCCAGTCTATT（SEQ ID NO: 67）
AAAGAATGAGCTTGATGTTGG（SEQ ID NO: 68）
CCAACATCGCTCATTCTTT（SEQ ID NO: 69）
AGATACTCATAGTCTTGGTAG（SEQ ID NO: 70）
CTACCAAGTATGAGTATCT（SEQ ID NO: 71）
AGAAACACAATCCAGTGGCCA（SEQ ID NO: 72）
TGGCCACTATTGTGTTTCT（SEQ ID NO: 73）
AAATAGGTCTCAATTAGCTTT（SEQ ID NO: 74）
AAAGCTAAGAGACCTATTT（SEQ ID NO: 75）
AAGAAACACAATCCAGTGGCC（SEQ ID NO: 76）
GGCCACTGTTGTGTTTCTT（SEQ ID NO: 77）
TAAACAGGTGGAAGGTCATTT（SEQ ID NO: 78）
AAATGACCCCACCTGTTTA（SEQ ID NO: 79）
TTGTAGTCGCCAAAGATCTGC（SEQ ID NO: 80）
GCAGATCTGGCGACTACAA（SEQ ID NO: 81）
AATTAGAGCCTCCATTCCTTT（SEQ ID NO: 82）
AAAGGAATAGGCTCTAATT（SEQ ID NO: 83）
TTAAGGACGGCAAAGTTGTAA（SEQ ID NO: 84）
TTACAACTGCCGTCCTTAA（SEQ ID NO: 85）
TTTAAGGACGGCAAAGTTGTA（SEQ ID NO: 86）
TACAACTTCCGTCCTTAAA（SEQ ID NO: 87）
ATGTCTTTGGGACTCTGACTC（SEQ ID NO: 88）
GAGTCAGACCCAAAGACAT（SEQ ID NO: 89）
TATCTATCCTGTGTCTACCAG（SEQ ID NO: 90）
CTGGTAGACAGGATAGATA（SEQ ID NO: 91）
AAATTACTTTCTGATCCTCAG（SEQ ID NO: 92）
CTGAGGATGAAAGTAATTT（SEQ ID NO: 93）
TCTAACAAGCCCATGTCTTTG（SEQ ID NO: 94）
CAAAGACAGGCTTGTTAGA（SEQ ID NO: 95）
AATTACTTTCTGATCCTCAGG（SEQ ID NO: 96）
CCTGAGGAAGAAAGTAATT（SEQ ID NO: 97）
AGTAAATGTACACAGGCACAG（SEQ ID NO: 98）
CTGTGCCTGTACATTTACT（SEQ ID NO: 99）
TAAGTAAGGTTGGCTGAGTTA（SEQ ID NO: 100）
TAACTCAGAACCTTACTTA（SEQ ID NO: 101）
TTCTGTGGGTGAAAGATCCTT（SEQ ID NO: 102）
AAGGATCTCACCCACAGAA（SEQ ID NO: 103）
AGAAGATGCTGACAACACCCT（SEQ ID NO: 104）
AGGGTGTTCAGCATCTTCT（SEQ ID NO: 105）
AATTGTAGCCGGCTGGCTAGT（SEQ ID NO: 106）
ACTAGCCACGGCTACAATT（SEQ ID NO: 107）
AGATTTGGGCAAACGCTCTTA（SEQ ID NO: 108）
TAAGAGCGTGCCCAAATCT（SEQ ID NO: 109）
ATTCTACGCTCCCTTATGCTG（SEQ ID NO: 110）
CAGCATAAGAGCGTAGAAT（SEQ ID NO: 111）
TGGTAATAGAGAGACCAGAAT（SEQ ID NO: 112）
ATTCTGGTCTCTATTACCA（SEQ ID NO: 113）
TATAGATGGCAAGAGGACCAA（SEQ ID NO: 114）
TTGGTCCTTGCCATCTATA（SEQ ID NO: 115）
AAACCAGTGTAGCTGCAGCCC（SEQ ID NO: 116）
GGGCTGCATACACTGGTTT（SEQ ID NO: 117）
[0022] микроРНК настоящего варианта осуществления предпочтительно содержит одну из приведенных ниже пар нуклеотидных последовательностей.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 52 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 53 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 54 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 55 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 56 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 57 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 58 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 59 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 62 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 63 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 64 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 65 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 68 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 69 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 72 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 73 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 76 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 77 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 78 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 79 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 84 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 85 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 86 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 87 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 98 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 99 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 116 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 117 в качестве смысловой последовательности.
[0023] Более предпочтительно микроРНК настоящего варианта осуществления содержит одну из нижеследующих пар нуклеотидных последовательностей.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 52 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 53 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 72 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 73 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 76 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 77 в качестве смысловой последовательности.
- Пара нуклеотидных последовательностей, состоящая из SEQ ID NO: 78 в качестве антисмысловой последовательности и SEQ ID NO: 79 в качестве смысловой последовательности.
[0024] Кроме того, последовательность микроРНК по настоящему варианту осуществления может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29-51, приведенных в таблице 2.
Таблица 2. Последовательности микроРНК, сконструированные для человеческого гена PLP1
SEQ ID NO:
pre-miRNA Sequence
29
AGAAACACAATCCAGTGGCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGGCCACTATTGTGTTTCT
30
AAATAGGTCTCAATTAGCTTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAAGCTAAGAGACCTATTT
31
AAGAAACACAATCCAGTGGCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGCCACTGTTGTGTTTCTT
32
TAAACAGGTGGAAGGTCATTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAATGACCCCACCTGTTTA
33
TTGTAGTCGCCAAAGATCTGCGTTTTGGCCACTGACTGACGCAGATCTGGCGACTACAA
34
AATTAGAGCCTCCATTCCTTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAAGGAATAGGCTCTAATT
35
TTAAGGACGGCAAAGTTGTAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTACAACTGCCGTCCTTAA
36
TTTAAGGACGGCAAAGTTGTAGTTTTGGCCACTGACTGACTACAACTTCCGTCCTTAAA
37
ATGTCTTTGGGACTCTGACTCGTTTTGGCCACTGACTGACGAGTCAGACCCAAAGACAT
38
TATCTATCCTGTGTCTACCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGGTAGACAGGATAGATA
39
AAATTACTTTCTGATCCTCAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGAGGATGAAAGTAATTT
40
TCTAACAAGCCCATGTCTTTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAAAGACAGGCTTGTTAGA
41
AATTACTTTCTGATCCTCAGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCTGAGGAAGAAAGTAATT
42
AGTAAATGTACACAGGCACAGGTTTTGGCCACTGACTGACCTGTGCCTGTACATTTACT
43
TAAGTAAGGTTGGCTGAGTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAACTCAGAACCTTACTTA
44
TTCTGTGGGTGAAAGATCCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGGATCTCACCCACAGAA
45
AGAAGATGCTGACAACACCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGGTGTTCAGCATCTTCT
46
AATTGTAGCCGGCTGGCTAGTGTTTTGGCCACTGACTGACACTAGCCACGGCTACAATT
47
AGATTTGGGCAAACGCTCTTAGTTTTGGCCACTGACTGACTAAGAGCGTGCCCAAATCT
48
ATTCTACGCTCCCTTATGCTGGTTTTGGCCACTGACTGACCAGCATAAGAGCGTAGAAT
49
TGGTAATAGAGAGACCAGAATGTTTTGGCCACTGACTGACATTCTGGTCTCTATTACCA
50
TATAGATGGCAAGAGGACCAAGTTTTGGCCACTGACTGACTTGGTCCTTGCCATCTATA
51
AAACCAGTGTAGCTGCAGCCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGGCTGCATACACTGGTTT
[0025] МикроРНК по настоящему варианту осуществления может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-7 и 24-51, предпочтительно она может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-5, 7, 24, 26, 29-32, 35, 36, 42 и 51, и более предпочтительно она может содержать нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 29, 31 и 32.
[0026] [Вектор]
Олигодендроцит-специфичный вектор по настоящему варианту осуществления содержит олигодендроцит-специфичный промотор и/или микроРНК, специфичную для гена PLP1. Вектор по настоящему варианту осуществления представляет собой вектор, который можно использовать для лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1 или с подавлением экспрессии гена PLP1.
[0027] Вектор может представлять собой плазмиду или вектор, способный инфицировать клетки человека и экспрессировать ген, примеры вектора включают аденоассоциированный вирус (AAV), лентивирус, ретровирус, аденовирус, вирус Сендай и плазмиды (включая комплексы с липосомами или полимерами), предпочтительно вектор представляет собой AAV. AAV представляет собой небольшой вирус, не содержащий хелпер-зависимой оболочки, который относят к роду Dependovirus семейства Parvoviridae, и который инфицирует таких животных, как люди, приматы и грызуны. AAV индуцирует очень слабый иммунный ответ, патогенность данного вируса не подтверждена. AAV может инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, причем после заражения клетки-хозяина AAV может выживать вне ядерных хромосом и экспрессировать ген при низкой частоте вставки в хромосомальный геном хозяина.
[0028] В качестве AAV предпочтительно используют, например, любой из серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 и AAV9, также предпочтительно могут использоваться гибридные мозаичные векторы AAV и химерные векторы AAV. Например, в гибридном мозаичном векторе AAV может присутствовать любое сочетание AAV1-AAV9, включая гибрид AAV1/2. Примеры химерных векторов AAV включают Olig001 (Powell SK et al., Gene Ther. 2016 Nov; 23 (11): 807-814), обладающий высоким тропизмом в отношении олигодендроцитов.
[0029] Олигодендроцит-специфичный промотор, входящий в состав вектора по настоящему варианту осуществления, не ограничивается конкретным промотором и может представлять собой любой промотор, способный специфически функционировать в олигодендроцитах, и предпочтительно промотор по настоящему варианту осуществления, то есть олигодендроцит-специфичный промотор, представляет собой олигодендроцит-специфический промотор, содержащий нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 90% идентичную нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1. микроРНК, специфичная для гена PLP1, входящая в состав вектора по настоящему варианту осуществления, не ограничивается конкретной микроРНК и может представлять собой любую микроРНК, способную подавлять экспрессию гена PLP1, и предпочтительно она представляет собой микроРНК по настоящему варианту осуществления, то есть микроРНК, содержащую пару нуклеотидных последовательностей, состоящую из антисмысловой последовательности и смысловой последовательности, где пара нуклеотидных последовательностей выбрана из группы, состоящей из пар, содержащих антисмысловую последовательность, указанную в левом столбце таблицы 1, и смысловую последовательность, указанную в правом столбце таблицы рядом с антисмысловой последовательностью.
[0030] Вектор по настоящему варианту осуществления может содержать олигодендроцит-специфичный промотор по настоящему варианту осуществления и трансген, функционально связанный с промотором. Трансген не ограничивается конкретным трансгеном, но предпочтительно используют, например, последовательность микроРНК, специфичную для гена PLP1, в частности последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1. Последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, можно сконструировать с использованием программного обеспечения, такого как BLOCK-iT(TM) RNAi Designer (ThermoFisher Scientific, USA). Альтернативно, чтобы сконструировать последовательность микроРНК, специфичную для человеческого гена PLP1, получают искусственные миРНК, как описано в разделе Примеры, и выбирают из них оптимальную последовательность, которую используют для конструирования микроРНК. В качестве такой микроРНК, специфичной к человеческому гену PLP1, предпочтительно используют, например, описанную выше микроРНК настоящего варианта осуществления.
[0031] Вектор настоящего варианта осуществления может содержать олигодендроцит-специфичный промотор и микроРНК настоящего варианта осуществления, функционально связанную с промотором. Олигодендроцит-специфичный промотор не ограничивается конкретным промотором, а его примеры включают промотор гена основного белка миелина и промотор гена PLP1. В качестве олигодендроцит-специфичного промотора предпочтительно используют описанный выше олигодендроцит-специфичный промотор по данному варианту осуществления. Вектор согласно настоящему варианту осуществления может предпочтительно содержать олигодендроцит-специфичный промотор согласно настоящему варианту осуществления и одну или несколько микроРНК согласно настоящему варианту осуществления, функционально связанные с промотором.
[0032] Вектор настоящего варианта осуществления также может содержать репортерный ген для подтверждения экспрессии гена. Примеры репортерного гена включают, без ограничения, GFP, Venus, и tdTomato.
[0033] Вектор настоящего варианта осуществления можно легко сконструировать методом генной инженерии. Например, гибридный вектор AAV1/2, содержащий промотор hCNP, описанный в SEQ ID NO: 1, и репортерный ген, можно получить следующим способом. Промотор hCNP, кодирующий участок репортерного гена, такого как Venus, 3'-нетранслируемый участок и сигнал поли-A SV40 располагают в указанном порядке между двумя участками распознавания NotI самокомплементарного вектора AAV, и затем в 3'-нетранслируемый участок вставляют нуклеотидную последовательность кассеты экспрессии микроРНК. Вектор можно хранить в замороженном виде при -20°C до использования, а при использовании вектора клетки AAV293 (Takara Bio Inc., Japan) трансфицируют вектором вместе с серотип-специфической хелперной плазмидой и аденовирусной хелперной плазмидой pHelper и культивируют в течение 72 часов, чтобы обеспечить амплификацию в клетках или в культуральной среде. В зависимости от масштаба очистку можно проводить методом колоночной хроматографии, ультрафильтрации, ультрацентрифугирования и т.п. Титр векторного генома полученного вектора AAV можно определить методом количественной ПЦР с использованием набора для титрования AAVpro (Takara Bio Inc., Japan).
[0034] [Фармацевтическая композиция]
Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления включает вышеописанный вектор по настоящему варианту осуществления. Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления предпочтительно представляет собой фармацевтическую композицию для лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1. Примеры заболевания, связанного с аномалиями гена PLP1, включают болезнь Пелицеуса-Мерцбахера (PMD) и спастическую параплегию типа 2, каждая из которых вызывается дупликацией гена PLP1, точечной мутацией гена PLP1, мутацией с делецией или вставкой в гене PLP1, или рассеянный склероз. Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления также может представлять собой ингибитор экспрессии гена PLP1, способный подавлять экспрессию гена PLP1.
10
14
11
13
[0035] Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления предпочтительно представляет собой водный раствор, содержащий вектор AAV, и может иметь титр от 5×10 до 5×10 вг/мл, предпочтительно от 5×10 до 5×10 вг/мл.
[0036] Фармацевтическая композиция по настоящему варианту осуществления может содержать фармацевтически приемлемый вспомогательный компонент, такой как фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), и, кроме того, она может содержать другое терапевтическое средство. Фармацевтическую композицию по настоящему варианту осуществления можно получить путем растворения в водном растворе, таком как вода, с добавлением при необходимости других компонентов.
[0037] При лечении болезни Пелицеуса-Мерцбахера фармацевтическую композицию по настоящему варианту воплощения можно вводить непосредственно в мозг, причем примеры такого введения включают введение в один или несколько участков паренхимы головного мозга (например, в белое вещество полушария головного мозга, внутреннюю капсулу, мозжечок) или спинного мозга кроме того, можно вводить интрацеребровентрикулярно/интратекально или внутрисосудисто/внутрибрюшинно. Введение можно проводить в любое время после рождения. Количество вводимого препарата может варьировать в зависимости от участка введения и возраста, но в случае введения в паренхиму головного мозга можно вводить от 0,1 до 2 мл/участок, предпочтительно примерно 0,5 мл/участок. В случае интрацеребровентрикулярного/интратекального введения можно вводить от 0,5 до 2 мл/кг массы тела, предпочтительно до 1 мл/кг массы тела. В случае внутрисосудистого или внутрибрюшинного введения можно вводить от 1 до 10 мл/кг массы тела, предпочтительно до 5 мл/кг массы тела.
[0038] [Способ лечения]
Способ лечения по настоящему варианту осуществления представляет собой способ лечения заболевания, связанного с аномалией гена PLP1, включающий введение эффективного количества описанного выше вектора настоящего варианта осуществления пациенту, нуждающемуся в лечении. Альтернативно способ лечения настоящего варианта осуществления представляет собой способ подавления экспрессии гена PLP1, включающий введение эффективного количества описанного выше вектора настоящего варианта осуществления пациенту, нуждающемуся в лечении.
ПРИМЕРЫ
[0039] Далее настоящее изобретение описывается более детально в разделе Примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается нижеследующими примерами.
[0040] <Пример 1. Конструирование кассеты экспрессии олигодендроцит-специфичного AAV и содержащего ее вектора AAV>
Последовательность пре-микроРНК (микроРНК PLP1, SEQ ID NO: 9), специфичную для мРНК мышиного гена PLP1 (NM_011123.3, SEQ ID NO: 8) и последовательность пре-микроРНК, используемой в качестве отрицательного контроля (miR-neg, SEQ ID NO: 10), конструируют с использованием BLOCK-iT(TM) RNAi Designer (ThermoFisher Scientific, USA). miR-neg представляет собой последовательность микроРНК, которая может образовывать структуру шпильки и таким образом процессировааться в зрелую микроРНК, однако предполагается, что она не является специфичной для известных генов позвоночных.
PLP1-микроРНК (SEQ ID NO: 9):
5'-ACTCCAAAGAAACACAATCCAGTTTTGGCCACTGACTGACTGACTGGATTGTTTCTTTGGAGT-3'
miR-neg (SEQ ID NO: 10):
5'-GTATGCATCGAATGAGATTCCGTTTTGGCCACTGACTGACGGAATCTCTCGATGCATAC-3'
[0041] Последовательность микроРНК PLP1 и последовательность miR-neg синтезируют в соответствии с конструированными последовательностями и клонируют в участке клонирования вектора pcDNA(TM) 6.2-GW/miR (ThermoFisher Scientific, USA), входящего в состав набора для получения вектора экспрессии BLOCK-iT(TM) Pol II miR RNAi. 5'-Фланкирующую последовательность (SEQ ID NO: 11) и 3'-фланкирующую последовательность (SEQ ID NO: 12), полученные из мышиной miR-155, располагают по обе стороны от последовательности микроРНК PLP1 или последовательности miR-neg, соответственно. 5'-Фланкирующая последовательность и 3'-фланкирующая последовательность, полученные из мышиной miR-155, представляют собой 5'-участок и 3'-участок мышиной miR-155, за исключением фрагмента шпилечной структуры, и последовательности пре-микроРНК или miR-neg помещают между 5'-фланкирующей последовательностью и 3'-фланкирующей последовательностью так, чтобы указанные последовательности микроРНК могли экспрессироваться.
5'-фланкирующая последовательность (SEQ ID NO: 11):
5'-CTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCT-3'
3-'фланкирующая последовательность (SEQ ID NO: 12):
5'-CAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATGGAACAAATGGCC-3'
[0042] С использованием полученного вектора pcDNA(TM) 6.2-GW/miR методом ПЦР амплифицируют фрагмент 5'-фланкирующая последовательность-последовательность микроРНК PLP1 (или последовательность miR-neg)-3'-фланкирующая последовательность, продукт амплификации расщепляют XhoI/BamHI и вставляют во фрагмент ДНК, полученный путем расщепления вектора pW-CAG-Venus-WPRE (SEQ ID NO: 13) с помощью XhoI/BamHI, проводят расщепление на обоих концах WPRE, расположенного на 3'-конце последовательности venus (SEQ ID NO: 14), чтобы удалить последовательность WPRE. Затем полученный вектор расщепляют SpeI/EcoRI для удаления промотора CAG, фрагмент ДНК вставляют в данный участок на 5’-конце последовательности Venus, где фрагмент ДНК получают путем ПЦР-амплификации человеческого промотора CNP (SEQ ID NO: 1) размером 1,8 т.о., и расщепляют на обоих концах SpeI/EcoRI, чтобы обеспечить олигодендроцит-специфичную экспрессию гена. Полученный вектор дополнительно расщепляют NotI, чтобы удалить каркас одноцепочечного AAV, полученного из pW-CAG-Venus-WPRE, соединяют с каркасом самокомплементарного аденоассоциированного вируса (scAAV), полученного путем расщепления pscW-PABPN1 (SEQ ID NO: 15) ферментом NotI, и получают конечные конструкции микроРНК Pscw-hCNP-Venus-PLP1 (SEQ ID NO: 16) и Pscw-hCNP-Venus-miR-neg (SEQ ID NO: 17) (Фиг. 1).
[0043] Гибридный вектор AAV1/2 (вектор scAAV-AAV1/2) получают по способу, описанному в непатентном документе 1. А именно, клетки AAV293 совместно трансфицируют, используя PEI, полученными ранее конструкциями scAAV, микроРНК Pscw-hCNP-Venus-PLP1 или Pscw-hCNP-Venus-miR-neg, серотип-специфичными хелперными плазмидами AAV p5E18RXC1 (Xiao W et al., J Virol (1999) 73: 3994-4003) и pAAV-RC (Agilent Technologies), кодирующими гены rep и cap AAV1 и AAV2, соответственно, и аденовирусной хелперной плазмидой pHelper (Agilent Technology). Клетки собирают через 72 часа после трансфекции и вектор scAAV-AAV1/2 очищают с использованием набора для очистки AAVpro (Takara Bio Inc., Japan). Титры векторных геномов определяют методом количественной ПЦР с использованием набора для титрования AAVpro (Takara Bio Inc., Japan).
[0044] Полученные векторы scAAV-AAV1/2 были сконструированы как вектор микроРНК AAV-hCNP-Venus-PLP1 (или вектор микроРНК PLP1) и вектор AAV-hCNP-Venus-miR-neg (или вектор miR-neg).
[0045] <Пример 2. Введение векторов AAV мышам дикого типа и экспрессия указанных векторов>
12
Один микролитр раствора вектора микроРНК PLP1 или вектора miR-neg, полученных в примере 1 (титр: 1,2×10 вг/мл), вводят в полосатое тело и внутреннюю капсулу каждой мыши Jcl:B6C3F1 дикого типа возрастом 10 дней (n=5/группу). Перед инъекцией мышей анестезируют раствором пентобарбитала. Введение вектора проводят с использованием шприца 33G со скоростью 150 нл/мин. После инъекции каждую мышь оставляют в покое на 1 минуту и затем иглу медленно вытаскивают из мозга. После этого мышей возвращают группой матери и выращивают до 17-го дня после рождения.
[0046] Экспрессию гена, обеспечиваемую каждым вектором, определяют путем детекции зеленого флуоресцентного белка на 17 день после рождения. Типы Venus-экспрессирующих клеток, идентифицируют путем двойного иммуноокрашивания клеточными маркерами, такими как Gst-π (маркер зрелых олигодендроцитов), NeuN (маркер нейронов), Iba1 (маркер микроглии) и GFAP (маркер астроцитов).
[0047] Чтобы провести иммуноокрашивание, мышей Jcl:B6C3F1 анестезируют раствором Форан для ингаляций, после чего их подвергают транскардиальной перфузии PBS и затем свежим 4% раствором параформальдегида. Мозги собирают, фиксируют в течение ночи при 4°C, затем среду заменяют 30% раствором сахарозы в PBS и хранят в замороженном состоянии в заключающей среде OCT Compound (TissueTech, Inc.). Получают коронарные срезы (20 мкм) и подвергают их иммуноокрашиванию для подтверждения специфичности инфицированных клеток, экспрессирующих Venus. Срезы инкубируют с блокирующим раствором (PBS, содержащий 0,05% Triton(TM) X-100 и 5% козьей сыворотки) в течение 3 часов при комнатной температуре, после чего инкубируют при 4°C в течение ночи с Gst-π (Cell Signaling Technology, Inc., 1:300), GFAP (Millipore Corporation, 1:400), NeuN (Chemicon, 1:400) или Iba1 (Biocare Medical, LLC., 1:500) в качестве первичных антител. Затем срезы промывают и инкубируют с соответствующим вторичным антителом (ThermoFisher Scientific, USA) в течение 1 часа при комнатной температуре. Ядра клеток визуализируют 40,60-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI, Sigma-Aldrich Co. LLC). Слайды заключают в гистологическую среду ProLong Diamond (Thermo Fisher Scientific, USA) и фотографируют с помощью флуоресцентного микроскопа KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japan).
[0048] Результаты показаны на фиг. 2. Из фиг. 2 видно, что Venus-положительные клетки соответствуют Gst-π-положительным олигодендроцитам, но не соответствуют NeuN-положительным нейронам, GFAP-положительным астроцитам и IbaI-положительной микроглии. Таким образом, фиг. 2 демонстрирует, что вектор miR-neg экспрессируется в олигодендроцит-специфической манере с высокой эффективностью.
[0049] <Пример 3. Оценка 1 эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 1>
12
Один микролитр раствора каждого из двух векторов scAAV-AAV1/2 (титр: 1,2×10 вг/мл), полученных в примере 1, вводят в полосатое тело, внутреннюю капсулу и мозжечок каждой мыши Jcl:B6C3F1 дикого типа возрастом 10 дней (n=3/группу). Используют такой же метод введения, как и в примере 2. Затем, чтобы оценить эффективность нокдауна микроРНК PLP1, определяют экспрессию белка PLP1 в Venus-положительных клетках методом иммуноокрашивания. Иммуноокрашивание проводят таким же способом, как и в примере 2, за исключением того, что в качестве первичного антитела используют кроличье поликлональное антитело против PLP1 (Numata Y et al., J Biol Chem. 2013 Mar 15; 288 (11): 7451-66), а в качестве вторичного антитела используют флуоресцентное антитело против кроличьих иммуноглобулинов (Thermo Fisher Scientific, USA). Каждый участок мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы фотографируют с помощью флуоресцентного микроскопа KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japan).
[0050] Среднюю интенсивность флуоресценции иммуноокрашенного PLP1 количественно определяют с помощью Image J 1.45s (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA), результаты количественного анализа интенсивности флуоресценции методом иммунофлуоресцентного окрашивания PLP1 показаны на фиг. 3. Из фиг. 3 можно видеть, что почти нет разницы в экспрессии белка PLP1 между стороной, в которую не вводят вектор miR-neg (неинфицированная сторона), и стороной, в которую вводят вектор (инфицированная сторона), тогда как в случае вектора микроРНК PLP1 эффект ингибирования экспрессии белка PLP1, наблюдаемый на инфицированной стороне по сравнению с неинфицированной стороной, составляет 40%. Отсутствие различия в количестве астроцитов и микроглии между неинфицированной стороной и инфицированной стороной указывает на отсутствие реактивной воспалительной реакции при введении AAV.
[0051] <Пример 4. Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 2>
12
Один микролитр раствора каждого из двух векторов scAAV-AAV1/2 (титр: 1,2×10 вг/мл), полученных в примере 1, вводят в полосатое тело и внутреннюю капсулу каждой мыши Jcl:B6C3F1 дикого типа возрастом 10 дней (n=4/группу). Используют такой же метод введения, как и в примере 2. Затем, чтобы оценить эффективность нокдауна микроРНК PLP1, определяют экспрессию мРНК PLP1 в Venus-положительных клетках методом количественной ПЦР.
[0052] Чтобы провести сортировку Venus-положительных клеток, мышей Jcl:B6C3F1 анестезируют раствором Форан для ингаляций и подвергают транскардиальной перфузии 20 мл PBS. Мозг удаляют и примерно нарезают микроножницами. К каждому мозгу добавляют 1 мл аккутазы (Millipore Corporation) и инкубируют при 37°C в течение 30 минут. К каждому образцу добавляют 2 мл сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS), содержащего 10% FBS, и ткань гомогенизируют с помощью микропипетки. Каждый образец фильтруют через клеточное сито 100 мкм и собранную суспензию клеток центрифугируют. Чтобы очистить клетки от остатков миелина, их ресуспендируют в HBSS, содержащем 40% перколла (Amersham plc), и центрифугируют при 700 g в течение 25 минут при комнатной температуре. Верхний слой миелина отсасывают, а моноциты ресуспендируют в 1 мл среды DMEM/F12. Клетки разделяют в проточном цитометре FACSCanto (BD Biosciences) и результаты анализируют с помощью программного обеспечения FlowJo (Tree Star Inc., OR, RRID: NIF-0000 to 30575). Результаты представляют в виде процента от общего числа клеток.
[0053] Для проведения количественной ПЦР выделяют общую РНК из Venus-положительных клеток с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen), а для синтеза кДНК используют набор с обратной транскриптазой SuperScript (Thermo Fisher Scientific, USA). Экспрессию генов анализируют методом количественной ОТ-ПЦР с помощью LightCycler 480 SYBR Green I Master и LightCycler 480 Instrument, используя нижеследующие специфические праймеры (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Switzerland). Результаты нормализуют по гену домашнего хозяйства β-актина и рассчитывают относительные уровни экспрессии PLP1 и Olig2. Значения CP (значения точек пересечения), полученные для каждого образца, преобразуют в логарифмические значения, чтобы нанести на график относительные уровни экспрессии±SD, и полученные графики приводят на фиг. 4.
Прямой праймер PLP1 (SEQ ID NO: 18): 5'-GTTCCAGAGGCCAACATCAAGCTC-3'
Обратный праймер PLP1 (SEQ ID NO: 19): 5'-AGCCATACAACAGTCAGGGCATAG-3'
Прямой праймер Olig2 (SEQ ID NO: 20): 5'-GGGAGGTCATGCCTTACGCGC-3'
Обратный праймер Olig2 (SEQ ID NO: 21): 5'-CTCCAGCGAGTTGGTGAGC-3'
Прямой праймер β-актина (SEQ ID NO: 22): 5'-CACAGCTTCTTTGCAGCTCCTT-3'
Обратный праймер β-актина (SEQ ID NO: 23): 5'-GACGACCAGCGCAGCGATA-3'
[0054] Из фиг. 4 можно видеть, что отсутствуют значительные различия в уровне экспрессии мРНК маркера олигодендроцитов Olig2 между вектором miR-neg и вектором микроРНК PLP1 (B), тогда как уровень экспрессии мРНК PLP1 после введения вектора микроРНК PLP1 свидетельствует о наличии эффекта подавления экспрессии гена PLP1, составляющего примерно 60% (A).
[0055] <Пример 5: Эффект введения PLP1-трансгенным мышам (PLP1-Tg)>
12
В полосатое тело и внутреннюю капсулу каждого потомка мышей PLP1-Tg/B6C3 возрастом 10 дней (масса тела 5-6 г) со сверхэкспрессией мышиного PLP1 вводят вектор микроРНК PLP1 (группа лечения, n=16) или вектор miR-neg (группа имитации лечения, n=16), чтобы провести тестирование лечения. PLP1-Tg/B6C3 получают путем обратного скрещивания PLP1-Tg/BDF1, подаренных доктором Tetsushi Kagawa из Национального института физиологических наук, со штаммом B6C3 (Kagawa T et al., Neuron. 1994 Aug; 13 (2): 427-42). В случае PLP1-Tg-гомозиготных индивидуумов 1 мкл раствора каждого из двух видов векторов scAAV-AAV1/2 (титр: 1,2×10 вг/мл), полученных в примере 1, вводят в полосатое тело и внутреннюю капсулу каждой мыши возрастом 10 дней таким же способом, как и в примере 2. В качестве положительного контроля используют однопометных мышат дикого типа (n=16), которым вводят вектор miR-neg. У некоторых из этих мышей удаляют ткань головного мозга на 25 день после рождения (15 дней после инъекции) и проводят гистологический анализ (иммуноокрашивание и морфометрический анализ) ткани мозга, у остальных мышей регистрируют массу и выживаемость.
[0056] Гистологический анализ методом иммуноокрашивания проводят следующим образом. У мышей дикого типа, мышей PLP1-Tg из группы лечения и мышей PLP1-Tg из группы имитации лечения, где n=5 в каждой группе, каждый из мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы подвергают иммуноокрашиванию по способу, описанному в примере 3, на 25 день после рождения (15 день после инъекции). У мышей дикого типа, которые составляют группу положительного контроля, после введения PLP1 наблюдаются фиброзные сильно окрашенные изображения, соответствующие миелиновым оболочкам мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы. При анализе мышей PLP1-Tg окрашенные изображения, соответствующие миелиновым оболочкам, практически отсутствуют у мышей, получающих имитацию лечения, хотя было получено окрашенное изображение, свидетельствующее об аномальном накоплении PLP1 в цитоплазме олигодендроцитов. С другой стороны, у мышей из группы лечения почти отсутствуют окрашенные изображения, свидетельствующие о накоплении PLP1 в цитоплазме, но наблюдается окрашивание фиброза, которое соответствует миелиновой оболочке, таким образом, было обнаружено, что введение вектора микроРНК PLP1 дает улучшенные окрашенные изображения PLP1 по сравнению с аномальными. На фиг. 5 показаны микрофотографии мозолистого тела.
[0057] Микроморфологический анализ с использованием электронного микроскопа проводят следующим образом. У мышей дикого типа и мышей PLP1-Tg из группы лечения и группы имитации лечения, где n=2/группу, фиксацию с рефлюксом проводят с использованием 0,1 М фосфатного буфера, содержащего 2% глутаральдегида и 2% параформальдегида, на 25 день после рождения (15 день после инъекции), и затем мозг собирают и дополнительно фиксируют путем пропитывания таким же буфером. Каждый из мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы проверяют на AAV-инфицированные участки под стереоскопическим флуоресцентным микроскопом, вырезают квадратный кусок ткани размером 600 мкм и фиксируют его 0,1 М фосфатным буфером, содержащим 1% осмия. После обезвоживания срез ткани погружают в эпоксидную смолу, получают ультратонкий срез размером 70 нм, который наблюдают с помощью электронного микроскопа (Tecnai Spirit, Thermo Fisher Scientific, USA) при увеличении в 7300 раз.
[0058] На фиг. 6 показаны фотографии, сделанные с помощью электронного микроскопа. Очевидно, что в мозолистом теле, полосатом теле и внутренней капсуле мышей дикого типа большинство аксонов являются миелинизированными. У мышей PLP1-Tg из группы имитации лечения доля миелинизированных аксонов была явно низкой, кроме того, аксоны были сужены. С другой стороны, у мышей PLP1-Tg из группы лечения доля миелинизированных аксонов увеличивается, а диаметр аксонов значительно превышает диаметр аксонов у мышей из группы имитации лечения. Из полученных результатов видно, что анализ ультратонкой морфологии свидетельствует о том, что введение вектора микроРНК PLP1 оказывает терапевтический эффект благодаря увеличению доли миелинизированных волокон.
[0059] Мышей из группы лечения и мышей из группы имитации лечения, где n=9/группу, наблюдают в возрасте от 25 дней до смерти, оценивая массу тела и выживаемость в каждой группе. Обнаружено, что введение мышам PLP1-Tg вызывает эффект значительного увеличения выживаемости (продолжительности жизни) (фиг. 7) и эффект увеличения массы тела (фиг. 8), что подтверждает эффективность данного метода лечения.
[0060] Описанные результаты демонстрируют, что олигодендроцит-специфичный промотор и вектор AAV, содержащий данный промотор, можно использовать в качестве фундаментального метода для разработки способа лечения PMD, и что вектор AAV, обеспечивающий экспрессию гена, содержащий PLP1-специфичную микроРНК и указанный промотор, является эффективным средством для лечения PMD.
[0061] <Пример 6: Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 3>
Чтобы оценить эффективность нокдауна под действием микроРНК человеческого PLP1, сконструированной с использованием BLOCK-iT(TM) RNAi Designer (Thermo Fisher Scientific, USA), плазмиду pcDNA(TM) 6.2-hPLP1, которая может обеспечивать сверхэкспрессию кодирующей последовательности человеческого гена PLP1, и плазмиду pscw.CAG.Venus.PLP1-miRNA, полученную путем клонирования последовательности в 3'-нетранслируемом участке ниже кДНК, кодирующей Venus, флуоресцентный белок, экспрессируемый под контролем промотора CAG, одновременно вводят в клетки HeLa методом трансфекции. Для трансфекции используют TransIt-LT1 (Takara Bio Inc.). Через 24 часа клетки собирают и экстрагируют общую РНК с помощью набора RNeasy Mini (Qiagen). Для проведения количественной ПЦР синтезируют кДНК с помощью набора с обратной транскриптазой SuperScript(R) (Thermo Fisher Scientific, USA). Экспрессию гена анализируют методом количественной ПЦР с помощью LightCycler (R) 480 SYBR Green I Master и LightCycler (R) 480 Instrument, используя нижеследующие специфические праймеры (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Switzerland). Праймеры, используемые для определения экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, описаны ниже.
Прямой праймер человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 280): 5′-GCTCCAACCTTCTGTCCATCT-3′
Обратный праймер человеческого PLP1 (SEQ ID NO: 281): 5′-ACGGCAAAGTTGTAAGTGGC-3′
Прямой праймер человеческого β-актина (SEQ ID NO: 282): 5'-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3'
Обратный праймер человеческого β-актина (SEQ ID NO: 283): 5'-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3'
[0062] На фиг. 9 показаны результаты нокдауна. Эффективность нокдауна рассчитывают, принимая уровень экспрессии PLP1 в клетках, экспрессирующих miR-neg, за 1. Результаты нормализуют по гену домашнего хозяйства β-актина и рассчитывают как относительный уровень экспрессии±SD. Идентифицируют семь последовательностей, которые снижают уровень экспрессии гена PLP1 (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 7, 24 и 26).
[0063] <Пример 7. Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 4>
Пару миРНК, состоящую из смысловой цепи и соответствующей антисмысловой цепи, показанных в таблице 3, и раствор для трансфекции (RNAi MAX, Invitrogen) смешивают, полученный раствор добавляют к клеткам U-251MG, после чего клетки культивируют в течение 48 часов.
[Таблица 3]
Таблица 3. Последовательности миРНК, сконструированные для человеческого гена PLP1
№
SEQ ID NO:
Смысловая/антисмысловая цепь
Последовательность миRNA
1
118
hPLP1-001
UGACCUUCCACCUGUUUAUdTdT
119
hPLP1-001anti
AUAAACAGGUGGAAGGUCAdTdT
2
120
hPLP1-002
GUGCCUGUGUACAUUUACUdTdT
121
hPLP1-002anti
AGUAAAUGUACACAGGCACdTdT
3
122
hPLP1-003
UUGCCCAAAUCUGCCUAUUdTdT
123
hPLP1-003anti
AAUAGGCAGAUUUGGGCAAdTdT
4
124
hPLP1-004
AGGAAUGGAGGCUCUAAUUdTdT
125
hPLP1-004anti
AAUUAGAGCCUCCAUUCCUdTdT
5
126
hPLP1-005
UGGCCACUGGAUUGUGUUUdTdT
127
hPLP1-005anti
AAACACAAUCCAGUGGCCAdTdT
6
128
hPLP1-006
GCGGGUGUGUCAUUGUUUGdTdT
129
hPLP1-006anti
CAAACAAUGACACACCCGCdTdT
7
130
hPLP1-007
GACCUUCCACCUGUUUAUUdTdT
131
hPLP1-007anti
AAUAAACAGGUGGAAGGUCdTdT
8
132
hPLP1-008
ACUCCCUUCUCCUUGAUAAdTdT
133
hPLP1-008anti
UUAUCAAGGAGAAGGGAGUdTdT
9
134
hPLP1-009
CUGCAAGUCACAAAGGAAUdTdT
135
hPLP1-009anti
AUUCCUUUGUGACUUGCAGdTdT
10
136
hPLP1-010
GGUCCUCUUGCCAUCUAUAdTdT
137
hPLP1-010anti
UAUAGAUGGCAAGAGGACCdTdT
11
138
hPLP1-011
CCUCGUUAGGGAAGAGAAAdTdT
139
hPLP1-011anti
UUUCUCUUCCCUAACGAGGdTdT
12
140
hPLP1-012
GGAGAAGAGGACAAAGAUAdTdT
141
hPLP1-012anti
UAUCUUUGUCCUCUUCUCCdTdT
13
142
hPLP1-013
GGCCAACAUCAAGCUCAUUdTdT
143
hPLP1-013anti
AAUGAGCUUGAUGUUGGCCdTdT
14
144
hPLP1-014
AGGCCAACAUCAAGCUCAUdTdT
145
hPLP1-014anti
AUGAGCUUGAUGUUGGCCUdTdT
15
146
hPLP1-015
CUCCCUUCUCCUUGAUAACdTdT
147
hPLP1-015anti
GUUAUCAAGGAGAAGGGAGdTdT
16
148
hPLP1-016
GCCUCUUUCUUCUUCCUUUdTdT
149
hPLP1-016anti
AAAGGAAGAAGAAAGAGGCdTdT
17
150
hPLP1-017
CUGUGCCUGUGUACAUUUAdTdT
151
hPLP1-017anti
UAAAUGUACACAGGCACAGdTdT
18
152
hPLP1-018
AAGGAAUGGAGGCUCUAAUdTdT
153
hPLP1-018anti
AUUAGAGCCUCCAUUCCUUdTdT
19
154
hPLP1-019
AGGGUGUUGUCAGCAUCUUdTdT
155
hPLP1-019anti
AAGAUGCUGACAACACCCUdTdT
20
156
hPLP1-020
ACAGCUGAGUUCCAAAUGAdTdT
157
hPLP1-020anti
UCAUUUGGAACUCAGCUGUdTdT
№
SEQ ID NO:
Смысловая/антисмысловая цепь
Последовательность миRNA
21
158
hPLP1-021
GCCACUGGAUUGUGUUUCUdTdT
159
hPLP1-021anti
AGAAACACAAUCCAGUGGCdTdT
22
160
hPLP1-022
ACAACUUUGCCGUCCUUAAdTdT
161
hPLP1-022anti
UUAAGGACGGCAAAGUUGUdTdT
23
162
hPLP1-023
GCUGAUGCCAGAAUGUAUGdTdT
163
hPLP1-023anti
CAUACAUUCUGGCAUCAGCdTdT
24
164
hPLP1-024
UUGCCGUCCUUAAACUCAUdTdT
165
hPLP1-024anti
AUGAGUUUAAGGACGGCAAdTdT
25
166
hPLP1-025
CUGCCUCUUUCUUCUUCCUdTdT
167
hPLP1-025anti
AGGAAGAAGAAAGAGGCAGdTdT
26
168
hPLP1-026
CCACUGGAUUGUGUUUCUUdTdT
169
hPLP1-026anti
AAGAAACACAAUCCAGUGGdTdT
27
170
hPLP1-027
GGAUCAGAAAGUAAUUUCUdTdT
171
hPLP1-027anti
AGAAAUUACUUUCUGAUCCdTdT
28
172
hPLP1-028
UAGCCAGCCGGCUACAAUUdTdT
173
hPLP1-028anti
AAUUGUAGCCGGCUGGCUAdTdT
29
174
hPLP1-029
AGCGUAGAAUCUGUGUAGAdTdT
175
hPLP1-029anti
UCUACACAGAUUCUACGCUdTdT
30
176
hPLP1-030
UCCCUUCUCCUUGAUAACAdTdT
177
hPLP1-030anti
UGUUAUCAAGGAGAAGGGAdTdT
31
178
hPLP1-031
UUCCAAGGAGCUGAGAAUAdTdT
179
hPLP1-031anti
UAUUCUCAGCUCCUUGGAAdTdT
32
180
hPLP1-032
UGCCAGAAUGUAUGGUGUUdTdT
181
hPLP1-032anti
AACACCAUACAUUCUGGCAdTdT
33
182
hPLP1-033
AUGCCUUCCAGUAUGUCAUdTdT
183
hPLP1-033anti
AUGACAUACUGGAAGGCAUdTdT
34
184
hPLP1-034
CAACUUUGCCGUCCUUAAAdTdT
185
hPLP1-034anti
UUUAAGGACGGCAAAGUUGdTdT
35
186
hPLP1-035
CCAACAUCAAGCUCAUUCUdTdT
187
hPLP1-035anti
AGAAUGAGCUUGAUGUUGGdTdT
36
188
hPLP1-036
UGGCCUUACACCUCGUUAGdTdT
189
hPLP1-036anti
CUAACGAGGUGUAAGGCCAdTdT
37
190
hPLP1-037
AGGACAUCCCGACAAGUUUdTdT
191
hPLP1-037anti
AAACUUGUCGGGAUGUCCUdTdT
38
192
hPLP1-038
GUCAGAGUCCCAAAGACAUdTdT
193
hPLP1-038anti
AUGUCUUUGGGACUCUGACdTdT
39
194
hPLP1-039
UUGCAGGAGAAGAGGACAAdTdT
195
hPLP1-039anti
UUGUCCUCUUCUCCUGCAAdTdT
40
196
hPLP1-040
GGUAGACACAGGAUAGAUAdTdT
197
hPLP1-040anti
UAUCUAUCCUGUGUCUACCdTdT
№
SEQ ID NO:
Смысловая/антисмысловая цепь
Последовательность миRNA
41
198
hPLP1-041
UCAGCCAACCUUACUUACAdTdT
199
hPLP1-041anti
UGUAAGUAAGGUUGGCUGAdTdT
42
200
hPLP1-042
AUGGAACUGCCUCUUUCUUdTdT
201
hPLP1-042anti
AAGAAAGAGGCAGUUCCAUdTdT
43
202
hPLP1-043
ACUCAGCCAACCUUACUUAdTdT
203
hPLP1-043anti
UAAGUAAGGUUGGCUGAGUdTdT
44
204
hPLP1-044
CUUCCACUGAUGGAAACAAdTdT
205
hPLP1-044anti
UUGUUUCCAUCAGUGGAAGdTdT
45
206
hPLP1-045
AUGACCUUCCACCUGUUUAdTdT
207
hPLP1-045anti
UAAACAGGUGGAAGGUCAUdTdT
46
208
hPLP1-046
UCUCCUGAGGAUCAGAAAGdTdT
209
hPLP1-046anti
CUUUCUGAUCCUCAGGAGAdTdT
47
210
hPLP1-047
GAGGAUCAGAAAGUAAUUUdTdT
211
hPLP1-047anti
AAAUUACUUUCUGAUCCUCdTdT
48
212
hPLP1-048
GGAUCUUUCACCCACAGAAdTdT
213
hPLP1-048anti
UUCUGUGGGUGAAAGAUCCdTdT
49
214
hPLP1-049
CUGAGGAUCAGAAAGUAAUdTdT
215
hPLP1-049anti
AUUACUUUCUGAUCCUCAGdTdT
50
216
hPLP1-050
CUGGUAGACACAGGAUAGAdTdT
217
hPLP1-050anti
UCUAUCCUGUGUCUACCAGdTdT
51
218
hPLP1-051
GCAGUUGCUGGUGGCUAAUdTdT
219
hPLP1-051anti
AUUAGCCACCAGCAACUGCdTdT
52
220
hPLP1-052
AAGACAUGGGCUUGUUAGAdTdT
221
hPLP1-052anti
UCUAACAAGCCCAUGUCUUdTdT
53
222
hPLP1-053
UUGCUGCCACUUACAACUUdTdT
223
hPLP1-053anti
AAGUUGUAAGUGGCAGCAAdTdT
54
224
hPLP1-054
UCGUUAGGGAAGAGAAACAdTdT
225
hPLP1-054anti
UGUUUCUCUUCCCUAACGAdTdT
55
226
hPLP1-055
UCCACUGAUGGAAACAAAGdTdT
227
hPLP1-055anti
CUUUGUUUCCAUCAGUGGAdTdT
56
228
hPLP1-056
AGAGCGUUUGCCCAAAUCUdTdT
229
hPLP1-056anti
AGAUUUGGGCAAACGCUCUdTdT
57
230
hPLP1-057
UGAUUGCUGCCACUUACAAdTdT
231
hPLP1-057anti
UUGUAAGUGGCAGCAAUCAdTdT
58
232
hPLP1-058
GGAGCGUAGAAUCUGUGUAdTdT
233
hPLP1-058anti
UACACAGAUUCUACGCUCCdTdT
59
234
hPLP1-059
UGAGGAUCAGAAAGUAAUUdTdT
235
hPLP1-059anti
AAUUACUUUCUGAUCCUCAdTdT
60
236
hPLP1-060
GGUGUUGUCAGCAUCUUCUdTdT
237
hPLP1-060anti
AGAAGAUGCUGACAACACCdTdT
№
SEQ ID NO:
Смысловая/антисмысловая цепь
Последовательность миRNA
61
238
hPLP1-061
GUCAAAGCAAGGAUCUUUCdTdT
239
hPLP1-061anti
GAAAGAUCCUUGCUUUGACdTdT
62
240
hPLP1-062
AGAUCUUUGGCGACUACAAdTdT
241
hPLP1-062anti
UUGUAGUCGCCAAAGAUCUdTdT
63
242
hPLP1-063
UGCAGGAGAAGAGGACAAAdTdT
243
hPLP1-063anti
UUUGUCCUCUUCUCCUGCAdTdT
64
244
hPLP1-064
UGGUGGCUAAUGGUGUAACdTdT
245
hPLP1-064anti
GUUACACCAUUAGCCACCAdTdT
65
246
hPLP1-065
AGCUAAUUGAGACCUAUUUdTdT
247
hPLP1-065anti
AAAUAGGUCUCAAUUAGCUdTdT
66
248
hPLP1-066
GUGCUGAUGCCAGAAUGUAdTdT
249
hPLP1-066anti
UACAUUCUGGCAUCAGCACdTdT
67
250
hPLP1-067
UUUCCAAGGAGCUGAGAAUdTdT
251
hPLP1-067anti
AUUCUCAGCUCCUUGGAAAdTdT
68
252
hPLP1-068
UGUGCCUGUGUACAUUUACdTdT
253
hPLP1-068anti
GUAAAUGUACACAGGCACAdTdT
69
254
hPLP1-069
CAGGUACAGAGAAGGAAUGdTdT
255
hPLP1-069anti
CAUUCCUUCUCUGUACCUGdTdT
70
256
hPLP1-070
GCAUAAGGGAGCGUAGAAUdTdT
257
hPLP1-070anti
AUUCUACGCUCCCUUAUGCdTdT
71
258
hPLP1-071
UCAGGUACAGAGAAGGAAUdTdT
259
hPLP1-071anti
AUUCCUUCUCUGUACCUGAdTdT
72
260
hPLP1-072
GCUGCAGCUACACUGGUUUdTdT
261
hPLP1-072anti
AAACCAGUGUAGCUGCAGCdTdT
73
262
hPLP1-073
UCUCCCAUGGAAUGCUUUCdTdT
263
hPLP1-073anti
GAAAGCAUUCCAUGGGAGAdTdT
74
264
hPLP1-074
UGCCUUCCAGUAUGUCAUCdTdT
265
hPLP1-074anti
GAUGACAUACUGGAAGGCAdTdT
75
266
hPLP1-075
GCUGCCACUUACAACUUUGdTdT
267
hPLP1-075anti
CAAAGUUGUAAGUGGCAGCdTdT
76
268
hPLP1-076
ACUUUGCCGUCCUUAAACUdTdT
269
hPLP1-076anti
AGUUUAAGGACGGCAAAGUdTdT
77
270
hPLP1-077
ACCUUACUUACAGCAUAAGdTdT
271
hPLP1-077anti
CUUAUGCUGUAAGUAAGGUdTdT
78
272
hPLP1-078
UGGACUACUGAAGCCCUAAdTdT
273
hPLP1-078anti
UUAGGGCUUCAGUAGUCCAdTdT
79
274
hPLP1-079
CUUCCAGUAUGUCAUCUAUdTdT
275
hPLP1-079anti
AUAGAUGACAUACUGGAAGdTdT
80
276
hPLP1-080
UCUGGUCUCUCUAUUACCAdTdT
277
hPLP1-080anti
UGGUAAUAGAGAGACCAGAdTdT
81
278
hPLP1-081
GUCCCAAAGACAUGGGCUUdTdT
279
hPLP1-081anti
AAGCCCAUGUCUUUGGGACdTdT
[0064] Затем из клеток экстрагируют РНК, и экспрессию гена PLP1 оценивают методом количественной ПЦР (n=3). Набор SuperPrep Cell Lysis RT для кПЦР (TOYOBO CO., LTD.) используют для получения РНК и синтеза кДНК. Для проведения количественной ПЦР используют зонд Taqman для гена PLP1 (Hs00166914_m1, Applied Biosystems) и гена S18 (Hs99999901_s1, Applied Biosystems). Результаты экспрессии генов нормализуют по гену домашнего хозяйства S18.
[0065] На фиг. 10 показаны результаты. На вертикальной оси фиг. 10 откладывают эффективность нокдауна для клеток U-251MG, к которым был добавлен только раствор для трансфекции. Эффективность нокдауна гена PLP1 рассчитывают как относительные уровни экспрессии, принимая уровень экспрессии в клетках U-251MG, к которым добавлен только раствор для трансфекции, за 1. Выбраны 24 пары последовательностей миРНК, которые снижают уровень экспрессии гена PLP1 до среднего значения 50% или менее в обоих испытаниях (№ 2, 4, 10, 16, 21, 22, 26, 28, 34 , 38). 40, 43, 45, 47, 48, 52, 56, 59, 60, 62, 65, 70, 72 и 80).
[0066] <Пример 8 Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 5
Последовательность микроРНК конструируют на основе 24 пар последовательностей миРНК, полученных в примере 7 (таблица 2). Среди них выбирают последовательности микроРНК, специфичные для последовательности, кодирующей последовательность человеческого гена PLP1 (SEQ ID NO: 2, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 42 и 51). Среди них SEQ ID NO: 2, 29, 31, 32 и 33 представляют собой последовательности, специфичные для последовательности, общей мышей и для приматов, таких как обыкновенная мартышка.
[0067] Чтобы оценить 10 последовательностей микроРНК, каждую плазмиду, полученную путем клонирования любой из последовательностей ниже промотора CAG, вводят методом трансфекции в клетки HeLa, в которых обеспечивается сверхэкспрессия кодирующих последовательностей человеческого гена PLP1. Экспериментальные детали праймеров, используемых для анализа экспрессии гена PLP1 методом количественной ПЦР, такие же, как в Примере 6. Результат нокдауна показан на фиг. 11. На вертикальной оси фиг. 11 откладывают уровень экспрессии±SD, по отношению к уровню экспрессии, когда добавлен вектор, содержащий miR-neg, где уровень экспрессии PLP1 принимают за 1. Согласно фиг. 11, микроРНК, имеющие любую из последовательностей SEQ ID NO: 2, 29, 30, 31, 32, 35, 36, 42 и 51, вызывают нокаут человеческого гена PLP1.
[0068] <Пример 9. Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 6>
Каждый из векторов, используемых в примерах 6 и 8, содержащих микроРНК, имеющую нуклеотидную последовательность, описанную в одном из SEQ ID NO: 2, 29, 31, 32 и 35, трансфицируют в клетки U-251MG, которые эндогенно экспрессируют человеческий ген PLP1, и оценивают эффективность подавления экспрессии гена PLP1. Плазмиду, полученную путем клонирования ниже промотора CAG, вводят в клетки методом трансфекции, и методом FACS отбирают только клетки, экспрессирующие GFP. После этого экспрессию гена PLP1 анализируют методом количественной ПЦР. В качестве праймеров используют нуклеотидные последовательности, описанные в SEQ ID NO: 280-283.
[0069] Результаты показаны на фиг. 12. На вертикальной оси фиг. 12 откладывают относительные уровни экспрессии, принимая за 1 уровень экспрессии PLP1, когда добавлен вектор, содержащий miR-neg. Согласно фиг. 12, векторы, содержащие микроРНК с SEQ ID NO: 2, 29, 31, 32 и 35, также оказывают подавляющий эффект на экспрессию эндогенного гена PLP1.
[0070] <Пример 10 Оценка эффективности подавления экспрессии (нокдауна) в пересчете на уровень экспрессии гена PLP1 - Часть 7>
12
Один микролитр раствора вектора scAAV-AAV1/2, содержащего микроРНК с SEQ ID NO: 2, полученного в примере 9 (титр: 1,2×10 вг/мл), вводят в полосатое тело, внутреннюю капсулу и мозжечок каждой из мышей Jcl:B6C3F1 дикого типа возрастом 10 дней (n=3/группу). Используют такой же метод введения, как и в примере 2. После этого, чтобы оценить эффективность нокдауна микроРНК PLP1, экспрессию белка PLP1 в Venus-положительных клетках определяют методом иммуноокрашивания. Метод иммуноокрашивания включает использование в качестве первичного антитела кроличьего поликлонального антитела против PLP1 (Numata Y et al., J Biol Chem. 2013 Mar 15; 288 (11): 7451-66), а в качестве вторичного антитела - флуоресцентное антитело против кроличьих иммуноглобулинов (Thermo Fisher Scientific, USA). Каждый участок мозолистого тела, полосатого тела и внутренней капсулы фотографируют с помощью флуоресцентного микроскопа KEYENCE (KEYENCE CORPORATION, Japan).
[0071] Среднюю интенсивность флуоресценции иммуноокрашенного PLP1 количественно определяют с использованием изображения J 1.45s (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA), а на фиг. 13 показаны результаты количественного анализа интенсивности флуоресценции методом иммуноокрашивания. На вертикальной оси фиг. 13 откладывают относительные уровни экспрессии PLP1 на инфицированной стороне по сравнению с неинфицированной стороной. Из фиг. 13 можно видеть, что почти нет различия в экспрессии белка PLP1 между стороной, в которую не вводят вектор miR-neg (неинфицированная сторона), и стороной, в которую вводят вектор (инфицированная сторона), тогда как в случае вектора микроРНК PLP1 наблюдается эффект ингибирования экспрессии белка PLP1 на инфицированной стороне, который по сравнению с неинфицированной стороной составляет 40%.
Применение в промышленности
[0072] Промотор по настоящему изобретению и вектор AAV по настоящему изобретению можно использовать в качестве терапевтических средств против PMD, вызванной дупликацией PLP1. Их также можно использовать в качестве терапевтических средств против PMD, вызванной точечной мутацией PLP1. Кроме того, поскольку PLP1 является одним из антигенов-мишеней при рассеянном склерозе, предположительно их можно использовать в качестве терапевтических средств против рассеянного склероза.