Выживаемость Burkholderia pseudomallei в клетках ресничной инфузории Tetrahymena pyriformis: влияние микроорганизма на инцистирующую активность тетрахимен

МИКРОБИОЛОГИЯ

Пробл. особо опасных инф. 2017; 3:49-52. DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-49-52

УДК 616.98:579.841.11

Е.В.король, л.к.меринова, Е.В.Шубникова, о.А.меринова, Т.В.сенина, н.Г.Плеханова

выживАЕМоСть BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI в клетках рЕСничной инфузории TETRAHYMENA PIRIFORMIS:

влияние микроорганизма на инциСтирующую активность тетрахимен

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт», Волгоград, Российская Федерация

цель исследования заключалась в моделировании взаимодействия Burkholderia pseudomallei с Tetrahymena pyriformis in vitro и изучении изменений в популяционном составе простейших при совместном культивировании с микроорганизмом. материалы и методы. В работе использовали штаммы B. pseudomallei 110, С141, 57576, 107, отличающиеся по вирулентности для мышей линии BALB/c. Аксеническую культуру T. pyriformis выращивали в LB-бульоне при температуре 28 °С. Буркхольдерии соединяли с тетрахименами в соотношении 100:1. Сокультуры инкубировали при температуре 28 °С в LB на протяжении срока наблюдения. Образцы сокультур просматривали при световой микроскопии, оценивая изменения в популяционном составе тетрахимен по количественному соотношению трофозоитов и цист. Для определения динамики размножения культур B. pseudomallei, ассоциированных с T. pyriformis, из сокультур ежедневно производили высев на плотную питательную среду для подсчета выросших колоний. результаты и выводы. В ассоциации с тетрахименами B. pseudomallei поглощается клетками простейших, размножается в них и индуцирует инцистирующую активность тетрахимен. При этом вирулентный штамм B. pseudomallei 110 осуществляет переход клеток T. pyriformis в состояние цист на 2-4-е сутки и их полное разрушение на 7-8-е сутки. Авирулентный штамм B. pseudomallei 107 вызывает полное инцистиро-вание простейших не ранее 7 суток, и значительная часть цист остается неразрушенной на 10-е сутки. Динамика роста B. pseudomallei в сокультуре с T. pyriformis характеризуется в первые сутки отчетливым снижением количества жизнеспособных клеток, которое через 24 ч возрастает и постепенно достигает показателей, близких к исходным. Кривые подъема концентрации микроорганизмов зависят от вирулентности штамма: максимальное размножение культуры B. pseudomallei 110 наблюдается спустя 48 ч, тогда как для штамма B. pseudomallei 107 это время составляет не менее 7-8 сут.

Ключевые слова: Burkholderia pseudomallei, Tetrahymena pyriformis, мелиоидоз, вирулентность, внутриклеточное выживание, инцистирование.

Корреспондирующий автор: Король Екатерина Васильевна, e-mail: vari2@sprint-v.com.ru.

E.V.Korol', L.K.Merinova, E.V.Shubnikova, O.A.Merinova, T.V.Senina, N.G.Plekhanova

survival of Burkholderia pseudomallei in cells of Tetrahymena pyriformis Ciliate Infuzorian; Effect on Tetrahymena encystment Activity

Volgograd Research Anti-Plague Institute, Volgograd, Russian Federation

Objective of the study was to model the interaction of Burkholderia pseudomallei with Tetrahymena pyriformis in vitro and investigate the changes in the population composition of the protozoa when co-cultured with a microorganism. Materials and methods. B. pseudomallei 110, C141, 57576, 107 strains differing in virulence for BALB/c mice were used. The axenic culture of T. pyriformis was incubated with microorganisms in 100 to 1 ratio, at 28 °C, in LB. Samples of co-cultures were examined using light microscopy, by counting the number of trophozoites and cysts in the population. Dynamics of multiplication of B. pseudomallei cultures associated with T. pyriformis was determined through seeding bacteria on a dense nutrient medium to count the grown colonies. Results and conclusions. B. pseudomallei in association with T. pyriformis is ingested by protozoan cells; it multiplies in them and stimulates protozoa encystment. Hereby virulent strain B. pseudomallei 110 induces encystment of T. pyriformis on days 2-4 and complete cell destruction within 7-8 days. Avirulent strain, B. pseudomallei 107, induces full encystment on day 7; significant part of the cysts remains intact on day10. Dynamics of B. pseudomallei growth, co-cultured with T. pyriformis is characterized on day 1 by distinct decrease in the number of viable bacterial cells and increase in it within following 24 hours. Bacteria concentration curves depend on the virulence of the strain: maximum level of B. pseudomallei 110 replication is observed after 48 hours, while that of B. pseudomallei 107 - not less than after 7-8 days.

Key words: Burkholderia pseudomallei, Tetrahymena pyriformis, melioidosis, virulence, intracellular survival, encystment.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Corresponding author: Ekaterina V. Korol', e-mail: vari2@sprint-v.com.ru.

Citation: Korol' E.V., Merinova L.K., Shubnikova E.V., Merinova O.A., Senina T.V., Plekhanova N.G. Survival of Burkholderia pseudomallei in cells of Tetrahymena pyriformis Ciliate Infuzorian: Effect on Tetrahymena Encystment Activity. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2017; 3:49-52. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2017-3-49-52

Burkholderia pseudomallei - возбудитель мелио-идоза - факультативный внутриклеточный патоген человека и многочисленных видов животных [3, 8]. Он может выживать и размножаться в фагоцитарных и нефагоцитарных клетках человека in vitro, что рассматривается в качестве главного фактора длитель-

ного персистирования возбудителя в макроорганизме, приводящего к формированию латентных и хронических форм инфекции [7].

В эндемичных регионах естественной средой обитания В. pseudomallei являются почвенные, водные экосистемы и ризосфера растений [2, 6].

В настоящее время сохранение B. pseudomallei во внешней среде связывают со способностью образовывать биопленки, а также инвазировать сво-бодноживущие в почве и воде амебы (Acantamoeba spp) и персистировать в них [5, 6]. В сокультуре с Acantamoeba spp. буркхольдерии, интернированные простейшими, остаются жизнеспособными в амебных вакуолях, размножаются в них, а после разрушения трофозоитов элиминируются в окружающее пространство [5].

Помимо амеб в процессах внутриклеточного выживания и распространения различных патогенных микроорганизмов принимают участие цилиарные инфузории вида Tetrahymena pyriformis. Отмечено, что бактерии разных видов (Legionella pneumophilla, Mycobacteria spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli) обладают способностью избегать переваривания фагоцитарными вакуолями тетрахимен, сохраняться и распространяться во внешней среде в экскретируе-мом остатке вакуолей или в цистах [1, 9, 10].

особенности взаимодействия B. pseudomallei с T. pyriformis не описаны. T. pyriformis является убик-витарным видом, обычным для среды обитания возбудителя мелиоидоза и может представлять интерес для изучения процессов его внутриклеточного выживания как в объектах внешней среды, так и в макроорганизме.

Цель данной работы заключалась в моделировании взаимодействия B. pseudomallei с T. pyriformis in vitro и изучении изменений в популяционном составе простейших при совместном культивировании с микроорганизмом.

Материалы и методы

Аксеническая культура T. pyriformis получена из Института цитологии РАМН (Санкт-Петербург). Тетрахимены выращивали в LB-бульоне (HiMedia) при температуре 28 °С.

В работе использовали дикие штаммы B. pseudo-mallei 110, С141, 57576, 107, отличающиеся по вирулентности для мышей линии BALB/c (LD50 - 1103, 2,5 104, 5104, 5108 м.к. соответственно), а также штамм B. pseudomallei 110 PAS, вирулентность которого была повышена путем пассирования на золотистых хомячках (LD50 для хомячков 5 м.к.).

Буркхольдерии, выращенные на агаре Luria-Bertani (LB) при 32 °С, 24 ч, суспендировали в стерилизованной автоклавированием речной воде и соединяли с тетрахименами в соотношении 100:1 (1106 м.к./мл бактерий и 1104 кл/мл тетрахимен) в LB-бульоне.

Сокультуры микроорганизма и тетрахимен инкубировали в климатической камере (Sanyo, Япония) при температуре 28 °С на протяжении срока наблюдения (от 24 ч до 10-15 сут). Образцы со-культур после предварительного обеззараживания в течение 1 ч 10 % формалином просматривали в камере Горяева при световой микроскопии (микроскоп Lomo Micmed 6, увеличение ><400), оценивая

изменения в популяционном составе тетрахимен по количественному соотношению трофозоитов и цист. Морфологические изменения клеток T. pyriformis визуализировали на экране компьютера с использованием программы Scope Photo.

Для определения динамики размножения культур B. pseudomallei, ассоциированных с T. pyriformis, из сокультур ежедневно производили высев на плотную питательную среду LB-агар для подсчета выросших колоний. Параллельно определяли динамику размножения культур B. pseudomallei в LB-бульоне.

для статистической обработки полученных данных использовали методы определения средних величин и доверительных границ к ним (p<0,05).

Результаты и обсуждение

для первоначальной характеристики морфологических изменений клеток тетрахимен в сокультуре с буркхольдериями использовали штамм B. pseudomallei 110. Как показано на рис. 1, при совместном инкубировании микроорганизма с тетрахименами в течение 24 ч в трофозоитах наблюдалось появление фагоцитарных вакуолей (рис. 1, Б). Через 48-72 ч выявлялись существенно увеличенные в размере клетки тетрахимен, содержащие множество вакуолей и расположенные в них, а также вне клеток трофозои-тов, микроорганизмы (рис. 1, В). На 2-е-3-и сутки в сокультуре с буркхольдериями тетрахимены начинали образовывать цисты (рис. 1, г), которые в течение последующих дней подвергались разрушению.

дальнейшее наблюдение за изменениями в по-пуляционном составе тетрахимен в сокультуре с B. pseudomallei показало, что присутствие микроорганизма ограничивает размножение трофозоитов и оказывает влияние на их инцистирующую активность. Динамика отмеченных изменений имеет различия, зависящие от штамма.

Так, в сокультуре с B. pseudomallei 110 в тече-

Рис. 1. Морфология клеток T. pyriformis, ассоциированных с B. pseudomallei 110:

А - интактный трофозоит T. pyriformis; Б - трофозоит в сокультуре с Б. pseudomallei 110 через 24 ч совместного культивирования в LB-буль-оне при 28 °С; В - трофозоит в сокультуре с Б. pseudomallei 110 через 48-72 ч, стрелками показаны вакуоли, а также внутри и внеклеточно расположенные бактерии; Г - циста Т. pyriformis. Световая микроскопия, увеличение х400

МИКРОБИОЛОГИЯ

Рис. 2. Динамика образования цист клетками тетрахимен в сокультуре со штаммами B. pseudomallei

200000

180000

160000

iE 140000 S

5 120000

пи i i i i i i i п i рч i н i I I I I I I I ИИ—— I

I I I I I I I I I I I I I I I I I I I N I

4 5 6

Время [сутки]

i_J Трофозоиты

Цисты

0

0

1

2

3

7

s

9

ние 24-48 ч наблюдается размножение трофозоитов, менее интенсивное, чем в контроле, но уже на вторые сутки часть из них (40 %) подвергается инци-стированию, на третьи - количество образовавшихся цист при взаимодействии с этим штаммом достигает максимума (рис. 2). Далее происходит постепенное исчезновение трофозоитов из сокультуры и снижение количества выявляемых цист, вызванное их разрушением. На 7-8-е сутки в образцах тетрахимен с B. pseudomallei 110 определяются только разрушающиеся цисты и их фрагменты.

Пассированный в организме золотистых хомячков штамм B. pseudomallei 110 PAS проявлял более выраженное действие на жизнедеятельность тетра-химен, индуцируя инцистирование основной массы клеток (более 70 %) уже на вторые сутки.

В отличие от них, штамм B. pseudomallei 107, имевший существенно сниженную вирулентность для экспериментальных животных, в ассоциации с тетрахименами вызывал полное инцистирование простейших не ранее 7 суток, значительная часть образовавшихся цист оставалась неразрушенной на 9-10-е сутки и сохранялась в последующие 5 сут (рис. 2).

Что касается влияния двух других штаммов B. pseudomallei С 141 и 57576, то в сравнении с B. pseudomallei 110, оно проявлялось в более замедленной динамике инцистирования T. pyriformis. На 4-5-е сутки в сокультуре с ними можно было наблюдать присутствующие в различном количестве тро-фозоиты и цисты, интенсивное разрушение которых отмечалось не ранее, чем через 8-10 сут.

при этом, как показано на рис. 2, в контрольных образцах T. pyriformis в LB-бульоне при 28 °С в течение 10 сут происходило активное размножение тро-фозоитов (от 10000 до 140000 кл/мл), которые постепенно подвергались спонтанному инцистированию. Однако и после 30 сут (срок наблюдения) общее количество клеток в культуре T. pyriformis составляло более 150000 кл/мл, из них около 60 % приходилось на долю цист.

Определение динамики роста культур B. pseudomallei в LB-бульоне обнаружило, что кривые размножения микроорганизма в сокультуре с T. pyriformis

характеризуются у всех исследованных штаммов отчетливым снижением количества жизнеспособных клеток (на два порядка и более), наблюдаюшимся в первые сутки. Но уже спустя 24 ч концентрация бактерий начинает возрастать и постепенно достигает показателей, близких к исходным (n106 м.к./мл). Кривые подъема концентрации имеют штаммовые различия: размножение B. pseudomallei 110 достигает максимума через 48 ч, тогда как для штамма B. pseudomallei 107 это время составляет не менее 6-7 сут (рис. 3). следует отметить, что проявление инцистирующей активности штамма в отношении тетрахимен находится в соответствии со временем его размножения в клетках простейших: штамм, который с наибольшей скоростью размножается внутри T. pyriformis (B. pseudomallei 110), вызывает их инцистирование в более короткий срок, чем штамм, характеризующийся меньшей скоростью размножения (B. pseudomallei 107).

Таким образом, как следует из приведенных данных, B. pseudomallei при взаимодействии с T. pyri-formis проявляет резистентность к фагоцитарной активности их вакуолей. После поглощения клетками тетрахимен происходит гибель значительной части микроорганизма, но оставшиеся бактерии, устойчивые к фагоцитозу, восстанавливают свою численность в различные промежутки времени в зависимости от штамма. Первоначальное переваривание части бактерий позволяет размножиться трофозоитам, однако начавшееся внутриклеточное размножение микроорганизма подавляет жизнеспособность тро-фозоитов и ускоряет их инцистирование по сравнению со спонтанным цистообразованием. Очевидно, что избегание фагоцитарной активности тетрахимен и ускорение их инцистирования в гораздо большей степени выражено у вирулентного штамма B. pseudo-mallei 110 по сравнению с менее вирулентными культурами, особенно с B. pseudomallei 107.

способность к выживанию возбудителя мелиои-доза в фагоцитарных вакуолях простейших, установленная нами в ассоциации с T. pyriformis, отмечена ранее в работе Inglis T.J. et al. при взаимодействии этого микроорганизма с Acantamoeba spp. [5]. В отличие от

Время

данных, представленных этими авторами, мы наблюдали другой характер фагоцитоза, связанный с особенностями физиологии самой модели, которая спонтанно поглощает бактерии, а не захватывает их путем coiling-фагоцитоза. Кроме того, в цитируемой работе не установлено влияние B. pseudomallei на цистообра-зование амеб. Результатом их взаимодействия, как показано Inglis T.J. et al., являлось наступающее после поглощения B. pseudomallei разрушение трофозоитов и выход бактерий во внешнюю среду.

Индуцирующее влияние на инцистирование тетрахимен описано Pushkareva V.I. et al. при взаимодействии с простейшими этого вида Listeria monocytogenes. Показано также, что устойчивые к фагоцитозу листерии оставались жизнеспособными в цистах на протяжении 14 сут, сохраняя в них основные биологические свойства [9]. Как следует из наших данных, продолжительность сохранения цист в сокультуре B. pseudomallei с тетрахименами зависела от вирулентности штамма, но, в конечном итоге, даже при взаимодействии со слабовирулентным штаммом, каким является B. pseudomallei 107, наступало их разрушение и выход микроорганизма во внешнюю среду.

В общем виде эффект влияния B. pseudomallei на инцистирование T. pyriformis может быть связан с цитотоксическим действием на клетки тетра-химен продуктов размножения бактерий. в работе Pushkareva V.I. et al. непосредственная роль в этом процессе отводится основному фактору вирулентности L. monocytogenes - листероиолизину (LLO), обладающему гемолитической активностью [9]. известно, что возбудитель мелиоидоза продуцирует различные токсические факторы (протеазы, гемолизины, фосфолипазы), значение которых в реализации патогенности до конца не изучено [4]. С этой точки зрения оценить их роль как факторов вирулентности и одновременно факторов, индуцирующих инцистирование тетрахимен, не представляется возможным. Тем не менее, вполне возможно, что быстро размножающиеся вирулентные штаммы B. pseudomallei, которые в короткий срок вызывали инцистирование тетрахимен, внутриклеточно продуцировали в большом количестве токсические вещества, способные оказывать подавляющее действие на жизнедеятельность простейших, тогда как эти же самые вещества

---в. pseudomallei 107 Рис. 3. Динамика размножения штаммов (культура) B. pseudomallei в контроле и в сокультуре с

— A. pseudomallei С 141 T pyriformis

— —— В. pseudomallei 110

В. pseudomallei 107

В. pseudomallei С 141

~— В. pseudomallei 110

в макроорганизме других хозяев могли не иметь решающего значения для вирулентности.

конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

References / СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Berk S.G., Faulkner G Garduno E., Joy M.C., Ortiz-Jimenez M.A., Garduno R.A. Packaging of live Legionella pneumophila into pellets expelled by Tetrahymena spp. does not require bacterial replication and depends on a dot/Icm-mediated survival mechanism. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74:2187-99. DOI: 10.1128/ AEM.01214-07.

2. Chen Y.S., Lin H.H., Mu J.J., Chiang C.S., Chen C.H., Buu L.M., Lin Y.E., Chen Y.L. Distribution of melioidosis cases and viable Burkholderia pseudomallei in soil: evidence for emerging melioidosis in Taiwan. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(4):1432-4. DOI: 10.1128/JCM.01720-09.

3. Cheng A.C Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18(2):383-416 DOI: 10.1128/CMR.18.2.383-416.2005.

4. Galyov E.E., Brett P. J., DeShazer D. Molecular insights into Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 2010; 64:495-517. DOI: 10.1146/annurev. micro.112408.134030.

5. Inglis T.J., Rigby P., Robertson T.A., Dutton N.S. Henderson M., Chang B.J. Interaction between Burkholderia pseudomallei and Acantamoeba spp. results in coiling phagocytosis, endamebic bacterial survival, and escape. Infect. Immun. 2000; 68(3):1681-6. DOI: 10.1128/IAI.68.3.1681-1686.2000.

6. Inglis T. J., Sagripanti J.L. Environtmental factors that affect the survival and persistance of Burkholderia pseudomallei. Appl. Environ. Microbiol. 2006; 72:6865-75. DOI: 10.1128/AEM.01036-06.

7. Jones A.L., Beveridge T.J Woods D.E. Intracellular survival of Burkholderia pseudomallei. Infect. Immun. 1996; 64:782-90.

8. Limmathurotsakul D., Thammasart S., Warrasuth N., Thapanagulsak P., Jatapai A., Pengreungrojanachai V., Anun S., Joraka W., Thongkamkoon P., Saiyen P., Wongratanacheewin S., Day N.P., Peacock S.J. Melioidosis in animals, Thailand, 2006-2010. Emerg. Infect. Dis. 2012; 18(2):325-7. DOI: 10.3201/eid1802.111347.

9. Pushkareva VI Ermolaeva S.A. Listeria monocytogenes virulence factor Listeriolysin O favors bacteria growth in co-culture with the ciliate Tetrahymena pyriformis, causes protozoan encyst-ment and promotes bacterial survival inside cysts. BMC Microbiol. 2010; 10:26. DOI: 10.1186/1471-2180-10-26.

10. Strahl E.D., Gillaspy G.E. Falkinham J.O. Fluorescent acid-fast microscopy for measuring phagocytosis of Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, and Mycobacterium scrofu-laceum by Tetrahymena pyriformis and their intracellular growth. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67:4432-9. DOI: 10.1128/ AEM.67.10.4432-4439.2001.

Authors:

Korol' E.V., Merinova L.K., Shubnikova E.V., Merinova O.A., Senina T.V., Plekhanova N.G. Volgograd Research Anti-Plague Institute. 7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131, Russian Federation. E-mail: vari2@ sprint-v.com.ru.

об авторах:

Король Е.В., Меринова Л.К., Шубникова Е.В., Меринова О.А., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru.

Поступила 16.06.17.