РАЗЖИЖЕННАЯ БИОМАССА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ И СПОСОБ ЕЕ СБРАЖИВАНИЯ
LIQUEFIED BIOMASS, METHOD OF ITS OBTAINING, ITS APPLICATION AND METHOD OF ITS FERMENTATION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к материалу разжиженной биомассы из сахарной свеклы и/или сахарного тростника, а также способам его получения и использования.
Уровень техники
Сахарная свекла (Beta vulgaris) и сахарный тростник (Saccharum sp.) представляют собой ценные источники рафинированного сахара, такого как жидкая или кристаллическая сахароза для промышленного и потребительского использования. Корнеплоды сахарной свеклы содержат сахарозу и жом сахарной свеклы, при этом последний содержит пектин, целлюлозу и гемицеллюлозу. Сахарный тростник содержит сахарозу и жом сахарного тростника, при этом последний содержит целлюлозу, гемицеллюлозу, пектины и лигнин. Способом рафинации сахара является способ экстракции сахарозы либо из сахарной свеклы, либо из сахарного тростника с последующими удалением примесей и кристаллизацией сахарозы. После удаления грязи, песка, сорняков и листьев сахарную свеклу подают на резальные машины и режут на длинные куски, называемые стружкой. Стружку выгружают в шпарильный чан, ведущий к диффузору. Здесь из стружки удаляют сахар в результате растворения в горячей воде по непрерывному противоточному способу. Продукты данного способа представляют собой сахарный раствор, называемый сырым соком (соком-сырцом), и так называемый свекловичный жом, при этом последний сушат в жомосушилке. Сырой сок проходит по различным стадиям очистки и фильтрования для удаления примесей и несахаристых веществ для получения сиропа (уровень содержания сухих веществ 65-70%) или после кристаллизации рафинированного сахара-песка. Помимо рафинации для получения кристаллического сахара сахароза в форме сахара-сырца или сиропа представляет собой ценный субстрат для сбраживания при биотехнологическом производстве химических агентов и биомолекул. Вследствие дороговизны технологического процесса на рафинадном заводе использование сахарозы и других сахаров в качестве исходного сырья для сбраживания при получении продуктов, таких как топлива или элементарные звенья полимеров, является относительно дорогостоящим. Поэтому желательными являются более дешевые субстраты для сбраживания.
Биомасса из сахарной свеклы без проведения дополнительной обработки для разжижения биомассы и гидролиза полимеров не может быть эффективно использована в типичных способах сбраживания, таких как в случае получения этанола, бутанола, молочной кислоты или пропионовой кислоты.
Были описаны способы химической обработки для высвобождения мономерных сахаров и сахарозы из биомассы, содержащей целлюлозу, пектин и гемицеллюлозу, такой как биомасса из сахарной свеклы. Для гидролиза биомассы из сахарной свеклы могут быть использованы неселективные способы, такие как сернокислотная обработка; однако такая обработка неэффективна при низких температурах. При повышенных температурах (например, предварительная паротепловая обработка с использованием разбавленной кислоты при 200-250°С) она приводит к получению ингибирующих компонентов, таких как гидроксиметилфурфураль (ГМФ) или фурфураль, которые делают последующий способ сбраживания проблематичным, (Jing et al., 2009).
В публикации US 4,886,672 (Baynast et al.) описывается способ разжижения биомассы из сахарной свеклы в результате проведения ферментативной обработки. Способ включает промывание и грубое измельчение биомассы из сахарной свеклы, перемешивание измельченного продукта с ферментной смесью, доведение значения рН до величины в диапазоне от 3 до 5,5, дополнительное тонкое измельчение субстрата и извлечение получающейся в результате жидкости. Ферментная смесь, использующаяся в данном способе, содержит, по меньшей мере, одну «SPS-азу» («SP 249» - ферментный препарат, полученный из культуры Aspergillus aculeatus), одну целлюлазу («Celluclast» - ферментный препарат, полученный из культуры Trichoderma reesei) и одну целлобиазу («Novo 188» - ферментный препарат, полученный из культуры Aspergillus niger). В данном способе могут быть добавлены бактериостатические агенты, такие как формалин. Несмотря на нежелательность добавления таких бактериостатических агентов для последующих способов сбраживания, использующих разжиженную биомассу, их добавление описывается как существенное во избежание роста микроорганизмов, например, при получении биомассы, стабильной при хранении.
Сущность изобретения
Таким образом, задача настоящего изобретения, заключается в предложении способа получения биомассы, которая может быть использована в последующем способе сбраживания даже после продолжительного хранения.
В первом аспекте, таким образом, изобретение предлагает способ получения разжиженной биомассы, включающий следующие стадии:
(а) получения твердой биомассы, произведенной из сахарной свеклы и/или сахарного тростника;
(b) разжижения упомянутой биомассы путем воздействия на нее ферментной смесью, включающей активность целлобиогидролазы, бета-глюкозидазы и полигалактуроназы, для получения разжиженной биомассы с содержанием остаточного нерастворимого сухого вещества менее 2 масс.%. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения для придания разжиженной биомассе стабильности при хранении добавляют химический агент или микроорганизм.
В одном в особенности предпочтительном варианте осуществления изобретения химический агент или микроорганизм добавляют до или во время стадии (b).
Химический агент предпочтительно представляет собой кислоту, которую добавляют в количестве, обеспечивающем доведение значения рН разжиженной биомассы до значения рН менее 3.
Изобретение также предлагает разжиженную биомассу, произведенную из сахарной свеклы и/или сахарного тростника, которая является устойчивой при хранении и поддающейся сбраживанию, в частности, ту, которая может быть получена способом настоящего изобретения. Данная разжиженная биомасса может быть использована для получения продукта, являющегося результатом сбраживания.
В еще одном аспекте, таким образом, изобретение предлагает способ получения разжиженной биомассы, включающий следующие стадии:
(a) получения твердой биомассы, произведенной из сахарной свеклы и/или сахарного тростника;
(b) разжижения упомянутой биомассы путем воздействия на нее ферментной смесью, включающей активность целлобиогидролазы, бета-глюкозидазы и полигалактуроназы, для получения разжиженной биомассы с содержанием остаточного нерастворимого сухого вещества менее 2 масс.%; и
(c) сбраживания сахаров, высвобожденных из разжиженной биомассы, для получения одного или нескольких продуктов сбраживания.
В одном предпочтительном варианте осуществления данного аспекта стадии (b) и (с) проводят одновременно. В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения для придания перерабатываемому сырью стабильности при хранении добавляют химический агент или микроорганизм.
Краткое описание фигур
Фигура 1 демонстрирует воздействие дозировки фермента на состав и выход сахаров.
2
4
Фигура 2 демонстрирует воздействие добавления HSО на выход сахарида и значение рН реакции.
Фигура 3 демонстрирует профили роста микроорганизмов и глюкозы для нестерилизованного гидролизата сахарной свеклы (ГСС) при добавлении (после силосования) и без добавления (без силосования) культуры Lactobacillus amylovorus.
Фигура 4 демонстрирует сопоставление одновременных/последовательных методик ферментативного разжижения и силосования.
Фигура 5 демонстрирует профиль значения рН и рост клеток для культуры Clostridium saccharobutylicum (DSMZ 13864) на разжиженной среде сахарной свеклы.
Фигура 6 демонстрирует получение АБЭ при использовании культуры Clostridium saccharobutylicum (DSMZ 13864) на разжиженной среде сахарной свеклы.
Фигура 7 демонстрирует спиртовое сбраживание для гидролизата сахарной свеклы при использовании культуры S. cerevisiae. Раскрытие изобретения
На стадии (а) способа настоящего изобретения получают биомассу из сахарной свеклы и/или биомассу из сахарного тростника.
Термин «биомасса из сахарной свеклы» означает полную и непереработанную ткань корнеплода Beta vulgaris, включая покровную ткань и внутренний жом. Сухая ткань Beta vulgaris содержит 80 масс.% растворимой сахарозы, в то время как свекловичный жом образован из приблизительно 90% полимерных сахаров, включая 7% пектина, 7% целлюлозы и 7% гемицеллюлозы в форме арабинана. Термин «биомасса из сахарного тростника» обозначает полные и непереработанные стебли Saccharum sp., включая покровную ткань и внутренний жом. Сухая ткань Saccharum sp. содержит 80 масс.% растворимой сахарозы, в то время как сухая тростниково-сахарная биомасса образована из приблизительно 70% полимерных Сахаров, включая 45% целлюлозы, 23% лигнина и 25% гемицеллюлозы, главным образом в форме ксилана.
Биомассу перед проведением для нее ферментативной обработки предпочтительно промывают, а промывные воды перед последующей переработкой удаляют. Кроме того, биомассу предпочитается получать в дисперсной форме, например, в результате резки биомассы перед стадией (b), предпочтительно в форме стружки. Размер частиц биомассы предпочтительно таков, чтобы 90 масс.% и более частиц имели бы максимальную длину, равную по меньшей мере 1 мм, более предпочтительно находящуюся в диапазоне от 10 до 200 мм. В случае дисковидных частиц диаметр предпочтительно составляет по меньшей мере 1 мм. Однако биомассу до или во время стадии (b) предпочтительно не измельчают.
Для стадии разжижения биомассу добавляют при уровне содержания сухого вещества в диапазоне предпочтительно от 5 до 30 масс.%, более предпочтительно от 15 до 25 масс.%. Термин «сухое вещество» или «сухие вещества» означает долю массы в биомассе, определенную при использовании ИК-весов после удаления воды из свежей ткани.
Перед проведением стадии (b) для твердой биомассы она может быть заморожена, хотя в общем случае это не является ни необходимым, ни желательным.
После этого на стадии (b) способа твердую биомассу, предпочтительно в дисперсной форме, разжижают вплоть до достижения уровня содержания остаточного нерастворимого сухого вещества менее 2 масс.% (предпочтительно менее 1 масс.%, еще более предпочтительно менее 0,5 масс.%), при использовании ферментных композиции или смеси, включающих активность целлобиогидролазы, бета-глюкозидазы и полигалактуроназы. Это фактическая стадия разжижения. Термин «разжижение» означает гидролитическую конверсию нерастворимых полимерных субстратов в растворимые мономерные или олигомерные продукты по химическим, физическим и/или ферментативным способам, таким как гидролиз. Термин «полимерный субстрат» означает вещества, образованные либо из определенного мономерного компонента, либо из ограниченного ассортимента определенных мономерных компонентов, ковалентно связанных друг с другом в виде линейной или частично разветвленной молекулярной структуры.
Термин «активность» фермента обозначает каталитическую активность фермента в надлежащих условиях, в которых фермент исполняет функцию белкового катализатора, который преобразует определенные полимерные или искусственные субстраты в определенные олигомерные или мономерные продукты.
Термин «целлобиогидролаза» означает фермент Е.С. класса 3.2.1.91, который катализирует гидролиз полимерной целлюлозы с образованием целлобиозы и других олигомеров бета-В-глюкозы. Активность целлобиогидролазы предпочтительно обеспечивается целлюлазным продуктом, который может демонстрировать, помимо активности целлобиогидролазы (СВН I и/или СВН II), одну или несколько активностей, выбираемых из активности эндо-глюканазы (EG I и/или EG II), активности экзо-бета-глюкозидазы и активности эндо-ксиланазы.
Термин «полигалактуроназа» означает фермент Е.С.класса 3.2.1.15, который катализирует распад полимерного пектина и полигалактуроновой кислоты с образованием олигомеров галактуроновой кислоты и мономерной галактуроновой кислоты. Активность полигалактуроназы предпочтительно обеспечивается пектиназным продуктом, который может демонстрировать, помимо активности полигалактуроназы, одну или несколько активностей, включающих активность пектин-лиазы, активность арабинофукозидазы, активность эндо-арабиназы, активность эндо-ксиланазы, активность пектат-лиазы, активность пектинметилэстеразы, активность полигалактуронидазы. В одном предпочтительном варианте осуществления активность полигалактуроназы демонстрирует оптимум в диапазоне значений рН от 2 до 7 и активность, равную по меньшей мере 50% от ее оптимальной активности, при значении рН, меньшем чем 3. В еще одном предпочтительном варианте осуществления активность полигалактуроназы демонстрирует оптимум в диапазоне значений рН от 2 до 3.
Термин «бета-глюкозидаза» означает фермент Е.С. класса 3.2.1.21, который катализирует гидролиз целлобиозы, целлотриозы, целлотетраозы и других олигомеров бета-В-глюкозы с образованием соответствующего мономера глюкозы.
Термин «пектинметилэстераза» означает фермент Е.С. класса 3.1.1.11, который катализирует гидролиз метальных заместителей на основной цепи модифицированного полигалактуронана. Термин «рамногалактуроназа» означает фермент Е.С. класса 3.2.1, который катализирует гидролиз рамнозных заместителей основной цепи полигалактуронана. Термин «1,3-/1,6-D-глюканаза» означает фермент Е.С. класса 3.2.1, который катализирует гидролиз гексозных заместителей полимеров 1,3-/1,6-модифицированных сахаров.
Термин «ферментная смесь» означает смесь белковых субстанций, которые способны каталитически преобразовывать полимерные или олигомерные субстраты в более мелкие олигомерные или мономерные компоненты (структурные элементы). В соответствии с настоящим изобретением ферментная смесь, использующаяся на стадии (b), предусматривает активность целлобиогидролазы, бета-глюкозидазы и полигалактуроназы.
Ферментная смесь предпочтительно содержит от 1 до 50 масс.%, предпочтительно от 1 до 10%, более предпочтительно от 1 до 4 масс.% целлобиогидролазы в расчете на общую массу ферментной смеси. Ферментная смесь предпочтительно содержит от 1 до 10 масс.%, более предпочтительно от 1 до 4 масс.%, бета-глюкозидазы в расчете на общую массу ферментной смеси. Ферментная смесь предпочтительно содержит от 25 до 75 масс.%, более предпочтительно от 35 до 45 масс.% полигалактуроназы в расчете на общую массу ферментной смеси. В особенности предпочтительными являются ферментные смеси, содержащие от 1 до 50 масс.% целлобиогидролазы, от 1 до 10 масс.% бета-глюкозидазы и от 1 до 75 масс.% полигалактуроназы, в частности от 30 до 40 масс.% целлобиогидролазы, от 1 до 4 масс.% бета-глюкозидазы и от 35 до 45 масс.% полигалактуроназы, в расчете на общую массу ферментной смеси.
Массовое соотношение целлобиогидролаза: бета-глюкозидаза: полигалактуроназа предпочтительно находится в диапазоне 1: (от 0,01 до 0,2): (от 0,5 до 10), более предпочтительно в диапазоне 1: (от 0,03 до 0,2): (от 1 до 2).
Ферментная смесь предпочтительно также демонстрирует одну или несколько дополнительных активностей гемицеллюлазы или петиназы, предпочтительно выбираемых из арабиназы, ксиланазы, пектинметилэстеразы, рамногалактуроназы и 1,3-/1,6-бета-D-глюканазы или комбинации из арабиназы и полигалактуроназы с рамногалактуронидазой и/или пектин-лиазой. Термин «гемицеллюлаза» означает набор активностей гидролазы, которые отвечают за удаление и деполимеризацию гемицеллюлозных остатков в биомассе (например, арабинана, арабиноксилана, галактана и ксилана). Данные ферментативные активности включают арабиназу, арабинофукозидазу, галактазу, галактозидазу, ксиланазу, ксилозидазу, арабиногалактазу и 1,3-/1,6-бета-D-глюканазу. Термин «пектиназа» означает набор активностей гидролазы, эстеразы и лиазы, которые отвечают за удаление и деполимеризацию пектиновых остатков в биомассе (например, полигалактуронана, рамногалактуронана, ксилогалактуронана). Данные ферментативные активности включают рамногалактуроназу, полигалактуроназу, глюкуронидазу, пектин-лиазу, пектинметилэстеразу, ацетилэстеразу, ацетилгалактуронэстеразу и пектат-лиазу.
Термин «ксиланаза» означает фермент Е.С. класса 3.2.1.8, который катализирует статистический гидролиз полимерного ксилана, полимерного пектина или гемицеллюлозы, содержащей ксилозные остатки, что в результате приводит к образованию олигомеров сахаров, включающих ксилозу, и/или мономерных ксилозных остатков. Термин «арабиназа» означает фермент Е.С. класса 3.2.1.99, который катализирует статистический гидролиз арабинановых и пектиновых веществ, содержащих арабинозные остатки, с образованием низших олигосахаридов, содержащих арабинозные звенья, и мономерных арабинозных остатков. Термин «ксилозидаза» означает фермент Е.С. класса 3.2.1.37, который катализирует гидролиз ксилобиозы, ксилотриозы, ксилотетраозы или олигомеров, включающих ксилозу, с образованием мономерных ксилозных остатков или низших олигомеров, включающих ксилозу. Термин «арабинофукозидаза» означает фермент Е.С. класс 3.2.1.55, который катализирует гидролиз арабинозы, арабинотриозы, арабинотетраозы или других олигомеров сахаров, включающих арабинозу, с образованием более коротких олигомеров или мономерной арабинозы.
В ферментной смеси предпочтительно отсутствует фермент инвертаза.
Термин «Ф/С» означает массовое соотношение между общим содержанием ферментов и содержанием сухого вещества определенной биомассы.
Ферментную смесь к биомассе предпочтительно добавляют в количестве в диапазоне от 0,025 до 4 масс.% от биомассы, более предпочтительно от 0,05 до 0,5 масс.% от биомассы, при этом в особенности предпочтительным является диапазон от 0,05 до 0,1 масс.% от биомассы.
В одном предпочтительном варианте осуществления стадию (b) проводят в течение от 2 до 100 часов, более предпочтительно от 2 до 80 часов, при этом в особенности предпочтительным является значение, находящееся в диапазоне от 2 до 20 часов, еще более предпочтительно меньшее чем 10 часов. Температура реакции предпочтительно находится в диапазоне от 35 до 60°С, более предпочтительно от 40 до 50°С. В еще одном предпочтительном варианте осуществления стадию (b) проводят в течение более чем 100 часов, а температура реакции находится в диапазоне от 10 до 30°С, более предпочтительно реакцию проводят при температуре окружающей среды без нагревания или охлаждения.
В соответствии с настоящим изобретением для придания разжиженной биомассе устойчивости/стабильности при хранении до или во время стадии (b) добавляют химический агент или микроорганизм. Добавление химического агента или микроорганизма предпочтительно доводит значение рН конечного разжиженного продукта до значения менее 3. В одном в особенности предпочтительном варианте осуществления химический агент и/или микроорганизм к твердой биомассе добавляют до или вместе с ферментной смесью.
2
4
2
3
2
4
2
3
3
2
2
2
Химический агент предпочтительно представляет собой кислоту, более предпочтительно неорганическую кислоту, такую как серная кислота. Кислоту предпочтительно добавляют в количестве, обеспечивающем доведение значения рН разжиженной биомассы до значения рН, меньшего чем 3, более предпочтительно меньшего чем 1,5. Химические агенты для консервации биомассы включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: минеральные кислоты, такие как HSO, HSO, HCl, HPO, НСО, HNO, HNO, и/или ангидриды кислот, такие как SO, CO, которые добавляют по истечении 0-4 часов после инициирования ферментативного разжижения, предпочтительно с концентрациями 0,01-0,1 об.%/масс.%, более предпочтительно 0,01-0,03 об.%/масс.%. Концентрацию и время добавления данных химических агентов оптимизируют таким образом, чтобы данные агенты не уменьшали бы эффективность способа ферментативного разжижения и не приводили бы к получению продуктов разложения сахаров. В одном в особенности предпочтительном варианте осуществления кислоту к биомассе добавляют до или совместно с ферментной смесью.
600
В еще одном варианте осуществления изобретения для придании разжиженной биомассе устойчивости при хранении до или во время стадии (b) добавляют микроорганизмы. Предпочтительные микроорганизмы включают одного или нескольких представителей, выбираемых из молочнокислых бактерий, включая Bacilli, Lactobacilli и Lactococci, дрожжей, включая Saccharomyces, и спиртообразующих бактерий, включая Clostridia, которые способны вырабатывать консервант. Биологические агенты, которые могут быть добавлены для консервации разжиженной биомассы, включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Lactobacillus sp., Leuconostoc sp., Bifidobacterium sp., Clostridium sp., Zymomonas sp., Escherichia sp. или Propionibacterium sp. Инокулирование суспензии биомассы из сахарной свеклы или сахарного тростника данными биологическими агентами после инициирования способа ферментативного разжижения в результате приводит к образованию продуктов сбраживания, которые включают любого представителя из нижеследующих, но не ограничиваются только этим: этанол, бутанол, ацетон, 1,3-пропандиол, пропанол, уксусная кислота, молочная кислота и пропионовая кислота, которые исполняют функцию консервантов, защищающих получающуюся в результате жидкость от порчи микроорганизмами. Размер микробного инокулята (и точный момент времени добавления инокулята в процессе ферментативного разжижения) оптимизируют для каждого биологического агента таким образом, чтобы не ухудшить эффективность способа ферментативного разжижения. В одном предпочтительном варианте осуществления микробный инокулят добавляют до достижения оптической плотности ОПнм=0,1. Предпочтительно микробный инокулят добавляют по истечении 0-4 часов после начала ферментативного разжижения. В одном в особенности предпочтительном варианте осуществления микроорганизм к биомассе добавляют до или совместно с ферментной смесью. В дополнение к этому, получающиеся в результате продукты сбраживания образуются в минимальных количествах в аэробных или анаэробных условиях и в отсутствие контроля значения рН, так что консервируется максимум сахара, высвобожденного из биомассы, и одновременно концентрация упомянутых продуктов сбраживания является достаточной для ингибирования роста всех микробных субстанций. Для описывающегося способа биологической консервации значение рН в общем случае является саморегулирующимся при конечном значении рН, меньшем чем 3, предпочтительно находящемся в диапазоне от 1,5 до 2,5, когда сбраживание является самопрекращающимся без ручного вмешательства. Получение консервирующих продуктов сбраживания в анаэробных условиях создает дополнительное преимущество, заключающееся в отсутствие потребности в разработке подачи кислорода в установку для хранения. Поэтому предполагаемая установка для хранения может представлять собой силосохранилище простого сельскохозяйственного типа для хранения биомассы.
Проблемы предшествующего уровня техники, связанные с использованием разжиженной биомассы из сахарной свеклы и сахарного тростника в качестве рентабельных сбраживаемых сред, преодолеваются, таким образом, в результате предложения комбинаций из последовательных и/или параллельных способов ферментативного разжижения и химической/биологической консервации, что делает возможным использование разжиженной биомассы в способах сбраживания, находящихся по ходу технологического потока дальше, в целях получения ферментов и ценных дополнительных химических агентов.
Одно дополнительное преимущество представленных методик заключается в возможности проведения ферментативного разжижения биомассы и консервации параллельно и в одном резервуаре, что обеспечивает наличие одного и рентабельного технологического устройства. Таким образом, сбор, хранение, разжижение биомассы и консервация получающейся в результате жидкости могут быть объединены на одной технологической стадии. Поэтому для полной реализации способа разжижения и консервации биомассы из сахарной свеклы/сахарного тростника можно просто перевести исходное сырье для биомассы с поля в установку для хранения, добавить ферменты разжижения, перемешать их с химическими или биологическими агентами для инициирования консервации и в заключение закрыть установку для установления анаэробной среды.
Еще одно другое преимущество способа заключается в консервации мягкими технологиями консервирования, описывающимися в настоящем документе, 90-100 масс.% от первоначального уровня содержания сахаров, высвобожденных в результате ферментативного разжижения биомассы из сахарной свеклы и сахарного тростника, что поэтому является доступным для способов сбраживания, находящихся по ходу технологического потока дальше. Еще одно другое преимущество настоящего способа заключается в том, что в противоположность предшествующему уровню техники разжиженная биомасса не содержит бактериостатических агентов, таких как формалин, или продуктов разложения сахаров, таких как гидроксиметилфурфураль (ГМФ), которые исполняют функцию ингибиторов сбраживания в способах, находящихся по ходу технологического потока дальше.
Изобретение, таким образом, также предлагает материал разжиженной биомассы из сахарной свеклы и/или сахарного тростника, который является устойчивым/стабильным при хранении и поддающимся сбраживанию. Данный материал биомассы предпочтительно может быть получен способом настоящего изобретения. Его предпочтительное значение рН является менее 3, предпочтительно находится в диапазоне от 1,5 до 2,5. Его уровень содержания сахаров предпочтительно является менее 65 масс.% в расчете на общую массу разжиженного продукта. Его уровень содержания сахарозы предпочтительно находится в диапазоне от 0 до 90 масс.%, более предпочтительно от 0 до 50 масс.%, его уровень содержания фруктозы предпочтительно находится в диапазоне от 0 до 45 масс.%, более предпочтительно от 20 до 45 масс.%, а его уровень содержания глюкозы в общем случае находится в диапазоне от 0 до 70 масс.%, предпочтительно от 50 до 70 масс.%, в каждом случае в расчете на совокупный уровень содержания сахаров. В одном предпочтительном варианте осуществления уровень содержания сахарозы является менее 10 масс.%, а уровень содержания глюкозы и фруктозы является более 45 масс.% и 40 масс.% соответственно от общего уровня содержания сахаров. Сумма содержания фруктозы и содержания глюкозы предпочтительно является более 90 масс.% от общего содержания сахаров. Устойчивость при хранении может быть достигнута без стерилизации под действием тепловой обработки или концентрирования получающейся в результате жидкости стадии (b) способа.
Материал разжиженной биомассы считается устойчивым при хранении в случае увеличения количества колониеобразующих единиц, которые обнаруживаются на чашке с твердой агаровой средой Лурия-Бертани после хранения в течение 6 месяцев при комнатной температуре менее 1000 КОЕ/мл. Материал разжиженной биомассы считается поддающимся сбраживанию в случае его, по меньшей мере, такой же эффективности при получении этанола с использованием культуры S. cerevisiae, что и у гидролизата кукурузного крахмала с тем же самым уровнем содержания гексоз.
В еще одном аспекте изобретения для предотвращения порчи разжиженной биомассы в течение более чем 4 месяцев, достаточными являются минимальная концентрация химических или биологических консервантов в 0,2-15 об.% и промышленные условия хранения. Как было продемонстрировано, концентрация химического или биологически произведенного консервантов, использующихся в описанных способах, при получении дополнительных ценных химических агентов не оказывает какого-либо значительного воздействия на технологии сбраживания, осуществляемые по ходу технологического потока дальше, при том условии, что значение рН и концентрация органического растворителя будут удовлетворять техническим требованиям к желательной методике сбраживания. Для регулирования данных параметров в соответствии с желательной методикой сбраживания консерванты в альтернативном варианте могут быть удалены при использовании энергоэффективных способов, таких как осаждение кислоты и оснований или удаление растворителя при использовании ректификации при переменном давлении.
Как было продемонстрировано в одном конкретном аспекте изобретения, разжиженная и консервированная биомасса из сахарной свеклы/сахарного тростника представляла собой превосходный компонент промышленных сбраживаемых сред для бактериальных, дрожжевых и грибковых организмов, производящих дополнительные ценные продукты, такие как ферменты, фармацевтические или химические продукты.
Примеры микроорганизмов для сбраживания разжиженной биомассы из сахарной свеклы/сахарного тростника после регулирования значения рН включают нижеследующее, но не ограничивается только этим: бактерии, дрожжи или мицелиальные грибки.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизмы выбирают из группы Bacillus sp., Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp., Clostridium sp., Escherichia sp., Propionibacterium sp., Acetobacter sp., Gluconobacter sp., Corynebacterium (Brevibacterium) sp., Cryptococcus sp., Achromobacter sp., Streptomyces sp., Streptococcus sp., Pseudomonas sp., Erwinia sp., Xanthomonas sp., Leuconostoc sp. или Ralstonia sp.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления изобретения микроорганизмы выбирают из группы Saccharomyces sp., Schizosaccharomyces sp., Candida utilis, Mucor sp., Torulopsis sp., Pichia sp., Hansenula sp.или Rhodotorula sp.
2
12
Дополнительные ценные продукты, являющиеся результатом бактериального сбраживания (Schmid, 2006) разжиженной биомассы из сахарной свеклы/сахарного тростника, включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: органические кислоты (например, уксусная кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, пропионовая кислота и глюкуроновая кислота), аминокислоты (например, глютаминовая кислота, лейцин, лизин, треонин, аспарагиновая кислота, фенилаланин, цистеин), капролактамы (например, альфа-аминокапролактам), антибиотики (например, блеомицин, вирджиниамицин, линкомицин, моненсин, бластицидин, тетрациклин), витамины (например, витамин В, B и С), ферменты, нуклеотиды/нуклеозиды (например, НАДН, АТФ, цАМФ, ФАД, кофермент А), биополимеры (например, полигидроксибутират, полиамиды/фиброины), полисахариды (например, ксантан, декстран), аминоглюканы (например, гиалуроновая кислота), а также органические растворители и биотополива (например, ацетон, этанол, бутанол, пропандиол).
Дополнительные ценные продукты (Schmid, 2006), являющиеся результатом дрожжевого сбраживания разжиженной биомассы из сахарной свеклы/сахарного тростника, включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: органические растворители (например, этанол, пропанол), нуклеотиды (например, РНК), биологические поверхностно-активные вещества (например, липиды софорозы), ферменты и биополимеры (например, спидроины).
Примеры грибкового сбраживания при использовании разжиженной и консервированной биомассы из сахарной свеклы/сахарного тростника в качестве среды после минимального регулирования значения рН включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: Aspergillus sp., Trichoderma sp., Penicillium sp., Acremonium sp., Rhizopus sp.и Talaromyces sp..
Дополнительные ценные продукты, являющиеся результатом грибкового сбраживания, (Schmid, 2006) в случае разжиженной биомассы из сахарной свеклы/сахарного тростника, включают нижеследующее, но не ограничиваются только этим: органические кислоты (лимонная кислота, фумаровая кислота), антибиотики (например, пенициллин, цефалоспорин), ферменты и полисахариды (например, хитин).
Предпочтительные способы сбраживания включают:
Способ сбраживания, в котором сжиженную биомассу подвергают сбраживанию при использовании культуры S. cerevisiae для получения этанола.
Способ сбраживания, в котором штамм относится к роду Clostridium и в котором продукт сбраживания представляет собой н-бутанол, ацетон или этанол.
Способ сбраживания, в котором штамм относится к роду Escherichia и в котором продукт сбраживания представляет собой рекомбинантный фермент или биохимический агент, такой как органическая кислота, аминокислоту или спирт.
Способ сбраживания, в котором штамм относится к роду Propionibacterium и в котором продукт сбраживания представляет собой пропионовую кислоту.
Способ сбраживания, в котором штамм относится к роду Corynebacterium и в котором продукт сбраживания представляет собой аминокислоту.
Способ сбраживания, в котором штамм относится к роду Aspergillus и в котором продукт сбраживания представляет собой органическую кислоту или фермент.
Способ сбраживания, в котором штамм относится к роду Lactobacillus и в котором продукт сбраживания представляет собой органическую кислоту.
В одном предпочтительном варианте осуществления твердую биомассу одновременно разжижают при использовании ферментной смеси и инокулируют микроорганизмом, таким как дрожжи (например, культура S. cerevisiae), что в результате приводит к получению одностадийного способа разжижения и сбраживания. Предпочтительно основной продукт сбраживания (например, этанол) будет присутствовать в концентрации, придающей совокупной жидкости способа устойчивость/стабильность при хранении.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления разжиженную биомассу подвергают сбраживанию при использовании штамма дрожжей, грибков или бактерий, способного производить спирт или органическую кислоту, и где спирт или органическую кислоту отделяют от ферментативного бульона в результате (1) отгонки спирта или органической кислоты из ферментативного бульона. В одном в особенности предпочтительном варианте осуществления разжиженную биомассу подвергают сбраживанию при использовании штамма дрожжей, грибков или бактерий, способного производить спирт, и где спирт отделяют от ферментативного бульона в результате (1) отгонки спирта из ферментативного бульона, предпочтительно при использовании диоксида углерода или воздуха или их смеси, (ii) адсорбирования спирта на материале адсорбера и (ill) последующего десорбирования спирта из материала адсорбера.
Примеры
Следующие далее примеры представлены только для целей иллюстрации и не должны восприниматься в качестве ограничения изобретения.
Пример 1: Ферментативное разжижение целой сахарной свеклы
Материал целой сахарной свеклы получали из свежих корнеплодов сахарной свеклы, отбираемых в качестве образцов в Зульцемоосе, Германия. Корнеплоды свеклы промывали для удаления остаточной почвы и разрезали на куски 10 мм х 10 мм (стружку) при использовании гомогенизатора Уоринга. Материал сахарной свеклы в среднем характеризовался уровнем содержания сухих веществ 24,7%.
Использовали следующие ферменты: арабиназа (E-EARAB, Megazymes Inc., Ирландия), арабинофукозидаза (E-AFASE, Megazymes Inc., Ирландия), ксиланаза (Е-XYTR1, Megazymes Inc., Ирландия), полигалактуронидаза (E-PGALUSP, Megazymes Inc., Ирландия), целлюлаза (Celluclast, Novozymes, Дания; включающая активности СВН I, СВН II, EG I, EG II, BGL, эндо-ксиланазы), целлюлаза В (Ecostone Cellulase, AB Enzymes GmbH, Дармштадт, Германия; ферментный препарат для культуры Т. reesei, включающий активности СВН I, СВН II, EG I, EG II, BGL, эндо-ксиланазы), бета-глюкозидаза (Novo 188, Novozymes, Дания) и пектиназа (Pectinex Ultra SP-L, Novozymes, Дания; включающая активности пектин-лиазы, арабинофукозидазы, эндо-арабиназы, эндо-ксиланазы, пектат-лиазы, пектинметилэстеразы и полигалактуронидазы). При необходимости ферменты обессоливали и концентрировали с 45 мл буфера ацетата натрия (50 ммоль/л, рН 5) при использовании ультрафильтрационных устройств Amicon на 50 мл (отсечка на 10 кДа; Millipore, Мэйдстоун, Великобритания).
Кроме того, использовали следующие ферменты: целлюлазный ферментный препарат, произведенный из культуры Trichoderma reese, (ATCC 56764, 60787); пектиназный ферментный препарат, произведенный из культуры Aspergillus niger (DSMZ: 737, DSM 7840); пектиназный ферментный препарат, произведенный из культуры Aspergillus aceulatus (CBS 589.94); бета-глюкозидазный ферментный препарат, произведенный из культуры Aspergillus niger (DSMZ 737).
Концентрации белка определяли по методу Бредфорда (Bradford, 1976). Активности эндо- и экзо-целлюлазы измеряли при использовании п-нитрофенил-бета-D-целлобиозида (Wood и Bhat, К., 1988). Активность арабинофуранозидазы определяли при использовании 4-нитрофенил-альфа-L-арабинофуранозида (pNP-Araf) (Taylor et al., 2006). Активность ксилозидазы определяли при использовании замещенного о-нитрофенолом бета-D-ксилопиранозида (Chen et al., 1986; Taguchi et al., 1996). Пример 1.1: Разжижение биомассы из сахарной свеклы в технических условиях
Получали следующую ферментную смесь:
0,8 мл Celluclast (0,5 масс.% сухих веществ), 0,13 мл Novo 188 (0,1 масс.% сухих веществ), 3,7 мл Pectinex Ultra SP-L (0,5 масс.% сухих веществ), 30,4 мл буфера NaAc с концентрацией 50 ммоль/л (рН 5).
Ферментную смесь перемешивали со свежим материалом сахарной свеклы (стружками) с различными массовыми соотношениями (0-0,1 масс.% фермент/субстрат, Ф/С). Конечная реакционная смесь содержала 15% сухих веществ материала сахарной свеклы. Смесь инкубировали без проведения какой-либо дополнительной механической обработки при 45°С в течение 6 часов. После инкубирования биомасса сахарной свеклы почти полностью разжижалась. Согласно определению при использовании измерений на ИК-весах в качестве нерастворимого сухого вещества оставалось только 0,35 масс.% от первоначальной биомассы из сахарной свеклы. Получающуюся в результате суспензию отфильтровывали через найлоновый фильтр на 0,2 мкм, а после этого 100 мкл использовали для анализа по методу ВЭЖХ. Получающуюся в результате гидролизную смесь анализировали по методу ВЭЖХ (Agilent, Германия) при использовании ионообменной колонки Aminex НРХ 87 (BioRad Labs, Геркулес, США) (элюент: 100% воды, Т: 85°С, скорость течения: 0,6 мл/мин, определение показателя преломления).
Получающийся в результате состав сахаридов в супернатанте в зависимости от различных соотношений дозировок ферментов продемонстрирован на Фигуре 1. Как показывают данные, способ разжижения завершался по истечении 6 часов, что отличает данный способ от предшествующего уровня техники, когда для разжижения требовалось, как минимум, 20 часов (de Baynast et al., 1989).
Результаты также свидетельствуют, до или во время стадии разжижения сахарной свеклы дополнительный подвод механической энергии не требуется. Для эффективного разжижения биомассы в способе не требуется измельчение биомассы. При экспериментальном полном разжижении достигается количественное высвобождение всех компонентов сахаров из биомассы из сахарной свеклы. К эффективному разжижению в результате приводит дозировка в 0,1% Ф/С.
Пример 2: Разжижение и консервация биомассы
Пример 2.1: Разжижение и химическая консервация биомассы
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Для химической консервации разжиженной сахарной свеклы и предотвращения роста микроорганизмов без оказания неблагоприятного воздействия на ферментативные разжижение и гидролиз биомассы использовали минеральную кислоту (HSO). Воздействие концентрации и времени добавления HSO на эксплуатационные характеристики при ферментативном разжижении: свежую биомассу из сахарной свеклы получали так, как это описывалось выше. Для инициирования разжижения биомассы из сахарной свеклы (20 г; конечные 20 масс.% сухих веществ) добавляли ферментный препарат (0,1% Ф/С), включающий следующие активности: 50 масс.% пектиназы, 50 масс.% целлюлазы, 4 ЦБЕ/мл бета-глюкозидазы. В дополнение к этому, в исходное сырье дозировали различные концентрации HSO (0,2 об.%/масс.%, 0,3 об.%/масс.%). После этого разжижение проводили в закрытой колбе Эрленмейера в течение 7 дней при 45°С без перемешивания. По истечении 7 дней инкубационного периода при использовании стандартных методик ВЭЖХ (см. выше) проводили определение для способа ферментативного разжижения в присутствии HSO. Данные продемонстрированы на Фигуре 2. В начале ферментативной реакции добавляли кислоту. Добавление 0,2 об.%/масс.% HSO (рН 2,5) приводит к полному разжижению биомассы из свеклы. Неожиданно, ферментативное разжижение могло быть проведено при значении рН 2,5.
Пример 2.2: Разжижение биомассы и ее биологическая консервацияпри использовании культуры Lactobacilli (силосование, индуцированное молочной кислотой)
600
600
Стабильное исходное сырье для сбраживания получили из биомассы сахарной свеклы в результате проведения одновременных разжижения и консервации, индуцированной молочной кислотой (силосования). Культуры Lactobacillus (Lactobacillus amylovorus DSMZ 16698) активировали на среде МРШ, содержащей дополнительно 5 масс.% глюкозы. Свежую биомассу из сахарной свеклы получали так, как это описывалось выше. Для индуцирования разжижения биомассы (20 масс.%) добавляли ферментный препарат, включающий следующие активности: 0,25% пектиназы, 0,25% целлюлазы, 4 ЦБЕ/мл бета-глюкозидазы (дозировка: 0,1% Ф/С). Биомассу из сахарной свеклы одновременно инокулировали культурами Lactobacillus (ОПнм=0,1) (гидролизат биомассы после силосования) или в альтернативном варианте не инокулировали (контрольный образец, без силосования). Одновременные разжижение биомассы/культивирование микроорганизмов проводили в анаэробных условиях в колбах Эрленмейера при 40°С в течение 350 часов. Как это ни удивительно, но добавление культуры микроорганизмов не оказывало какого-либо воздействия на способ ферментативного разжижения, который в экспериментальных условиях завершался в течение 72 часов. В течение всего времени инкубирования рост клеток микроорганизмов отслеживали спектрометрически при ОП ни, в то время как концентрацию глюкозы отслеживали по методу ВЭЖХ. Значение рН гидролизатов биомассы как после силосования, так и без силосования слегка уменьшалось от значения рН 4 до 3,5, что относится к высвобождению кислотных метаболитов, подобных молочной и уксусной кислоте. Как демонстрируют данные на Фигуре 3, в образце после силосования (после обработки культурой Lactobacillus) рост клеток происходит быстрее, чем в контрольном образце без силосования, но он прекращался по истечении 95 часов инкубационного периода. В противоположность этому, в контрольном образце без силосования рост клеток продолжается вплоть до окончания периода отбора образцов. Наиболее важно то, что в контрольном образце без силосования продолжающийся рост клеток по окончании времени отбора образцов в результате приводит к потере глюкозы в 50 масс.%/об.%. Как демонстрируют данные, одновременные ферментативное разжижение и биологическое силосование культурой Lactobacilli представляют собой возможный способ консервации ~90 масс.%/об.% сахаров в гидролизате сахарной свеклы (сбраживаемой среде).
Консервацию микроорганизмами рассматривали в еще одной последовательности экспериментов с инокулированием при использовании культуры Lactobacilli. Количество подвергнутой обработке биомассы и ферментная смесь, использовавшаяся для разжижения, эквивалентны экспериментам, описывавшимся выше. Экспериментальные условия:
1. Ферментная смесь (только ферментативное разжижение, без силосования; контрольный образец);
600
2. Ферментная смесь+силосование в результате добавления культуры Lactobacillus (ОПнм=0,1) по истечении 0 часов разжижения;
600
3. Ферментная смесь+силосование в результате добавления культуры Lactobacillus (ОПнм=0,1) по истечении 8 часов разжижения.
Методику проведения способа разжижения и консервации биомассы отслеживали по глюкозе и молочной кислоте по методу ВЭЖХ по истечении 8, 48 и 240 часов. Кумулятивные результаты продемонстрированы на Фигуре 4. Как демонстрируют данные, в отсутствие культур силосования Lactobacillus уровень содержания глюкозы быстро понижался. Непосредственное добавление культур силосования Lactobacillus приводит к быстрому образованию молочной кислоты и ограничивало потери глюкозы (~10 масс.%/об.%), подтверждая консервацию, индуцированную молочной кислотой. В противоположность этому, добавление культур силосования Lactobacillus по истечении 8 часов после инициирования ферментативного разжижения в результате приводило к меньшему образованию молочной кислоты и большей потере глюкозы.
Пример 2.3: Раздельные разжижение и химическая консервация биомассы
2
4
2
4
2
4
Для химической консервации разжиженной сахарной свеклы и предотвращения роста микроорганизмов после ферментативных разжижения и гидролиза биомассы использовали минеральную кислоту (HSO). Сахарную свеклу разжижали так, как это описывалось в Примере 1.1. К разжиженной биомассе добавляли HSO по истечении 4 часов и инкубировали при комнатной температуре в колбе Эрленмейера, которую снабжали бродильной трубкой для высвобождения любых образующихся газообразных веществ. Уровень содержания сахаров в разжиженной биомассе отслеживали в течение 190 дней. Образцы асептически отбирали по истечении 15, 46, 99 и 190 дней и при использовании методик ВЭЖХ, описывавшихся выше, измеряли концентрации сахаров. Как демонстрируют данные на фигуре 8, в течение периода отбора образцов нельзя было обнаружить какой-либо потери сахаров, что указывает на достижимость долговременной консервации разжиженной биомассы из сахарной свеклы в результате добавления серной кислоты до конечной концентрации 0,5 или 1 об.%. Значение рН консервированной биомассы определили равным 1,33 и 1 для образцов, содержащих 0,5 или 1 об.% HSO соответственно.
Пример 3: Разжиженная биомасса из сахарной свеклы в качестве сбраживаемой среды
Пример 3.1: Получение ацетона, бутанола и этанола
600
4
3
4
2
4
4
2
600
-
Гидролизат сахарной свеклы получали так, как это описывалось в примере 1.1. К сбраживаемой среде, содержащей 15 масс.%/об.% гидролизата сахарной свеклы в качестве единственного источника углерода, добавляли культуру Clostridium saccharobutylicum (DSMZ 13864, инокулят ОПнм=1). Состав среды: 15 масс.%/об.% гидролизата сахарной свеклы, 6 г/л триптона-пептона (BD), 2 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л NHCHCOO, 0,3 г/л MgSO, 0,5 г/л KHPO, 0,01 г/л FeSO×7HO, 0,2 г/л биотина, 1 г/л п-аминобензойной кислоты, 1 г/л гидрохлорида тиаминхлорида, 1 мг/л резазурина. Сбраживание проводили в течение 40 часов при 35°С и рН 6,5. Определение для биомассы проводили в результате измерений ОПнм и измеряли значение рН. После этого образцы центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин. Получающиеся в результате супернатанты анализировали при использовании анализа по методу ГХ, определяя в реакционной смеси концентрации ацетона, бутанола и этанола. Фигура 5 демонстрирует развитие профиля значений рН и плотности клеток во время методики сбраживания. Фигура 6 демонстрирует получение растворителей. Как демонстрируют данные, при росте надлежащих штаммов Clostridia на средах на основе гидролизата сахарной свеклы возможно получение растворителя.
Кроме того, бутанол очищали в результате адсорбции бутанола in situ («на месте») из паровой фазы в адсорбере. Адсорбцию проводили при температурах окружающей среды, что значительно уменьшает потребность в энергии для извлечения в сопоставлении с обычными способами. Бутанол удаляют из адсорбера в результате нагревания адсорбента и собирают в результате охлаждения бутанолсодержащих паров, выходящих из адсорбера в конденсатор. В сопоставлении со способом отгонки газом концентрация органической молекулы в случае данного способа является значительно большей вследствие селективности адсорбера по отношению к органической молекуле. Извлечения бутанола из сбраживаемой среды добивались при использовании способа адсорбирования/десорбирования бутанола с применением цеолитного материала. Для данного способа цеолит МИ получали в соответствии с документом US 7,244,409. Бутанол адсорбировали из отбираемой сверху паровой фазы ферментативного бульона АБЭ (в закрытой системе). Бутанол, адсорбированный на цеолите, десорбировали (извлекали) в результате нагревания адсорбента. Пары, исходящие из колбы, конденсировали в конденсаторе и собирали. Совокупный уровень содержания бутанола в конденсате составлял 67%.
Пример 3.2: Получение этанола при использовании культуры S. cerevisiae с применением «сырого» гидролизата свеклы в качестве источника углерода
Гидролизат сахарной свеклы получали так, как это описывалось выше, и использовали в качестве единственного компонента сбраживаемой среды для получения этанола с применением культуры S. cerevisiae (DSMZ 1333).
Неразбавленный и нестерилизованный гидролизат сахарной свеклы (30 мл) инокулировали при использовании 1 г/л клеток S. cerevisiae. Сбраживание проводили во встряхиваемых колбах на 100 мл, которые инкубировали при 28°С (200 об/мин) в течение 48 часов. При использовании неинокулированной среды гидролизата свеклы включали негативный контроль. Концентрации этанола определяли по истечении 24 и 48 часов при использовании анализа по методу ГХ (Sillers et al., 2008). В образце с негативным контролем по истечении 48 часов времени инкубирования нельзя было обнаружить образования этанола. Фигура 7 демонстрирует результаты для этанольного сбраживания. Сбраживание в результате приводило к получению выхода этанола 64 масс.%/об.% в расчете на количество глюкозы, содержащейся в «сыром» гидролизате свеклы (13-15 масс.%/об.%). Как свидетельствует данный результат, ферментативный гидролизат сахарной свеклы может быть непосредственно использован при этанольных сбраживаниях в отсутствие потребности в дополнительной обработке гидролизата.
Ссылки:
Bradford M. M. (1976) A rapid and Sensitive Method for Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
Chen W. P., Matsuo M., Yasui T. (1986) Agric. Biol. Che, 50, pp.1183-1194.
De Baynast, De Septfontaines R., Brouard F., Baret J.-L., Gicquiaux Y., Olsen H. (1988) Process for the liquefaction of beets and chicory roots by enzymatic hydrolysis and liquid hydrolysate. US 4,886,672.
Ezeji T. C., Qureshi N., Blaschek H. P. (2004) Butanol fermentation research: upstream and downstream manipulations. Chem. Rec., Vol.4, No. 5, pp.305-314. Jing X., Zhang X., Bao J. (2009) Inhibitor performance of lignocellulose degradation products on industrial cellulose enzymes during cellulose hydrolysis. Appl. Biochem. BiotechnoL, DOI 10.1007/sl2010-009-8525-z (ahead of print).
Oosterveld A., Beldmann G., Voragen A. G. J. (2002) Enzymatic modification of pectic polysaccharides obtained from sugar beet pulp.Carbohydrate Polymers 48, pp.73-81.
Sakamoto Т., Sakai T. (1995) Analysis and structure of sugar-beet pectins by enzymatic methods. Phytochemistry 39, pp.821-823.
Schmid R, D. (2006) Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engin. Wiley-VCH edts.
Sillers R., Chow A., Tracy В., Papoutskis E. T. (2008) Metabolic engineering of the nonsolvatogenic Clostridium acetobutyricum strain M5 to produce butanol without acetone demonstrate the robustness of the acid-formation pathways and the importance of electron balance. Metabol Engineer. 10, pp.321-332.
Spagnuolo M., Crecchio C., Pizigallo M. D. R., Ruggiero. (1997) Synergistic effects of cellolytic and pectolytic enzymes in degrading sugar beet pulp.Bioresour. Technol. 60, pp.215-222.
Taguchi H.; Hamasaki Т., Akamatsu Т., Okada H. (1996) A simple assay for xylanase using onitrophenyl-P-D-xylobioside. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 60, pp.983-985.
Woskow and Glatz (1991) Propionic acid production by a propionic acid-tolerant strain of Propionibacterium acidipropionici in Batch and semicontinuous fermentation. Appl. Envir.
Microbiol. 57, pp.2821-2828.
Wood T. M., Baht K. M. (1989) Methods for measuring cellulose activities. Methods in Enzymology. 160, pp.87-112.