БИОПОЛИМЕРНЫЙ МАТРИКС ДЛЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК И РЕГЕНЕРАЦИИ НЕРВНЫХ ТКАНЕЙ
BIOPOLYMERIC MATRIX FOR PROLIFERATION OF CELLS AND REGENERATION OF NERVOUS TISSUES

Область техники.
Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к биосовместимому матриксу для пролиферации клеток и регенерации нервных тканей и, предпочтительно, к биополимерному матриксу на основе коллагенсодержащей структуры.
Изобретение может быть использовано в нейрохирургии для стимуляции регенерации поврежденных нервных тканей.
Предшествующий уровень техники.
Нервные клетки в процессе своего развития и дифференциации со временем теряют способность к регенерации, но могут восстанавливать свои отростки и окончания. Восстановление морфологической структуры нервных клеток может происходить, если клетки сохраняют жизнеспособность и нет препятствий для прорастания регенерирующих аксонов через дефекты нервной ткани. Препятствием на пути регенерирующих нервных волокон может являться зона рубца между концами сшитого нерва. Рубцово-спаечный процесс приводит к возникновению неврологического дефицита вследствие адгезии нерва с рубцовой тканью. Для успешной регенерации нервов необходимым является прорастание нервных волокон с минимальной потерей аксонов на линии шва и эффективное восстановление иннервации тканей и проводимости нервных импульсов.
В последнее время исследуются различные материалы, клеточные линии, факторы роста, имплантируемые в зону повреждения нервов для стимуляции их регенерации. Одним из перспективных направлений является применение биополимерных матриксов, обладающих биосовместимостью и свойствами биостимуляции (см. - Christine E. Schmidt, Jennie Baier Leach. «Neural Tissue Engineering: Strategies for Repair and Regeneration», Annu. Rev. Biomed. Eng., 2003, 5, pp.293-347; см. - Yi-Cheng Huang, Yi-You Huang. «Tissue Engineering for Nerve Repair», Biomed. Eng. Appl., Basis&Comm., 2006 (June), 18, pp.100-110).
Имплантируемые матриксы (в зависимости от назначения) должны обладать: биосовместимостью; функциями каркаса и питательной среды для клеток; способностью стимулировать пролиферацию клеток; биодеградацией; пористой структурой, обеспечивающей процессы неоваскуляризации и пригодностью для хирургических манипуляций (см. - «Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей». Серия «Мир биологии и медицины, Москва, «Техносфера», 2007).
В качестве биополимерных матриксов находят применение: альгинаты, коллаген, хитозан, фиброины шелка. Широко используемым биоматериалом в косметологии и медицине, в т.ч. для создания имплантируемых матриц в нервные ткани, является коллаген (см. - «Biomedical applications of collagen», International Jornal of Pharmaceutics, 2001, 221, pp.1-22; см. - A.Alovskaya, T.Alekseeva, J.B.Phillips, V.King, R.Brown. «Fibronectin, Collagen, Fibrin - Components of Extracellular Matrix for Nerve regeneration», Topics in Tissue Engineering, Vol.3, 2007, Chapter 12, pp.1-26).
Коллаген - белок, являющийся основным компонентом внеклеточного матрикса и составной частью соединительной ткани. Коллаген при имплантации в ткани стимулирует репаративные процессы, является биодеградируемым материалом.
Так, например, в техническом решении (патент RU №2249462, публ. 10.04.2005) предлагается биополимерный матрикс для регенерации тканей организма.
Основой данного биополимерного матрикса является гетерогенная коллагенсодержащая структура, состоящая из фаз: твердой - в виде микрочастиц (микросфер) из коллагена ткани млекопитающих, и жидкой - из денатурированного коллагена ткани птиц при соотношении фаз (1-10):(1-10). Матрикс (при комнатной температуре) представляет собой упругоэластичную массу (гель) и имеет размер микрочастиц 100-300 мкм. Гетерогенная структура матрикса позволяет увеличивать и регулировать время биодеградации коллагена, что повышает эффективность восстановления тканей. Дополнительно матрикс может содержать добавки, способствующие росту клеток и тканей, в частности, клетки нервных тканей. Согласно изобретению преимуществами данного матрикса являются: биосовместимость; опорно-трофическая функция и способность стимулировать пролиферацию клеток.
На основе данного технического решения создан биополимерный матрикс для пролиферации и регенерации тканей на основе гетерогенной коллагенсодержащей структуры, состоящей из микрочастиц коллагена с размером 30-300 мкм, распределенных в гомогенном геле коллагена при соотношении фаз (1-10):(1-10), с набухаемостью не менее 87%, pH 4,8-7,2 (товарный продукт «СфероГЕЛЬ», ЗАО «Биомир-сервис», Россия).
Клинические исследования композиции «СфероГЕЛЬ» дали положительные результаты по стимуляции регенерации нервных тканей. При применении композиции «СфероГЕЛЬ» создаются предпосылки по формированию более рыхлой рубцовой ткани и улучшение прорастания аксонов через область анатомического повреждения нерва. (см. - Федяков А.Г. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук «Экспериментально-клиническое обоснование применения биополимерных материалов в хирургии периферических нервов». Москва, 2010 г.; «Биосовместимые материалы». Учебное пособие / Под ред. В.И.Севастьянова, М.П.Кирпичникова. Москва, «Медицинское информационное агентство», 2011, с.214-215, с.249-251).
Вместе с тем, исследования данной гетерогенной коллагенсодержащей структуры при использовании ее в качестве имплантируемой нейроэндопротезной системы в дефект нервной ткани показали не достаточно полную реализацию ее регенерирующего потенциала в отношении нервных тканей.
В техническом решении (патент RU №2394593, публ. 27.03.2010) предлагается биополимерный матрикс для пролиферации клеток и регенерации нервных тканей, на основе гетерогенного коллагенсодержащего матрикса, состоящего из микрочастиц коллагена с размером 30-300 мкм, распределенных в гомогенном геле коллагена при соотношении фаз (1-10):(1-10), с набухаемостью не менее 87%, pH 4,8-7,2, и нейральных стволовых клеток.
Данный биополимерный матрикс в виде упругоэластичной клеточно-биополимерной активной массы используется в качестве имплантируемой нейроэндопротезной системы для замещения дефектов головного и спинного мозга и вегетативной нервной системы.
Техническое решение по патенту RU №2394593 по совокупности используемых в его композиции компонентов выбрано в качестве ближайшего аналога заявляемого изобретения.
Вместе с тем, в композиции указанного биополимерного матрикса дополнительно содержатся другие клеточные культуры, факторы роста и стимуляторы клеточной регенерации, например, метилурацил, лейкоген, аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), пентоксил. Наличие в данном биополимерном матриксе синтезированных стимуляторов клеточной регенерации ухудшает биосовместимость матрикса с нервными тканями вследствие возможного проявления аллергических реакций.
Известны также технические решения (патенты US: №4955893, публ. 11.09.1990; №5019087, публ. 28.05.1991; №7892573, публ. 22.02.2011) для регенерации нервных тканей, в которых предлагаются биосовместимые матриксы на основе композиций гомогенных коллагенов с гликозаминогликаном или ламинином (адгезивным гликопротеином) или кератином (фибриллярным белком). Однако использование в данных биоматриксах гомогенных коллагенов способствует нежелательному повышению скорости их биодеградации, ухудшению опорно-трофических функций матриксов, что снижает эффективность пролиферации и регенерации нервных тканей.
Известно также техническое решение (см. заявка US №20100068240, публ. 18.03.2010), в соответствии с которым композиция биополимерного матрикса для регенерации нервных тканей имеет гомогенную структуру биополимера и наночастицы металлов, в частности золото, серебро. Авторы технического решения предполагают, что данная композиция способствует как улучшению опорно-трофической функции матрикса, так и повышению стимуляции регенерации нервных тканей. Однако использование указанных наночастиц металлов в матриксах не обеспечивает необходимую биодеградацию данных матриксов при их имплантации в дефекты нервной ткани и может вызвать цитотоксический эффект.
В технических решениях (заявка US №20110052713, публ. 03.03.2011; патент RU №2375080, публ. 27.03.2009) для стимуляции регенерации нервных тканей предлагаются композиции на основе коллоидных систем, соответственно на основе наночастиц диоксида кремния и кремния, наличие которых стимулирует регенерацию нервных тканей за счет использования электрических свойств (проводимости) этих наночастиц.
Однако получаемые по данным техническим решениям инъекционные суспензии наночастиц не обеспечивают необходимую адгезию и опорно-трофическую функцию при введении в область травмированного участка нервных тканей.
Используемые в техническом решении по патенту RU №2375080 кремниевые нанокластеры получают методом электрохимического травления пластин монокристаллического кремния в электролите на основе плавиковой кислоты и этанола. Получают слои пористого кремния с размером 2-5 нм, которые отделяют от подложки, высушивают и подвергают механическому измельчению до получения порошка. Метод электрохимического травления пластин кремния в электролите на основе кислоты и этанола для получения порошков кремния имеет негативные стороны, т.к. на поверхности частиц, кремниевых нанокластеров присутствуют продукты реакции и остатки кислот, что существенно снижает биосовместимость материала.
Таким образом, приведенный уровень техники свидетельствует, что использование для нервных тканей имплантируемых биополимерных матриксов со стимулирующими добавками способствует проявлению адгезионных, опорно-трофических функций и обеспечивает пролиферацию и регенерацию нервных клеток и тканей.
С позиций современной медицины важным является разработка и расширение спектра имплантируемых материалов на основе биополимерных матриксов, содержащих стимулирующие добавки, обладающих биосовместимыми, биодеградируемыми свойствами и способствующих пролиферации клеток и регенерации нервных тканей.
Сущность изобретения.
Технический результат настоящего изобретения состоит в разработке биополимерного матрикса, стимулирующего пролиферацию клеток и регенерацию нервных тканей и обладающего биосовместимыми свойствами.
-3
-2
Для достижения данного технического результата предложен биополимерный матрикс для пролиферации клеток и регенерации нервных тканей на основе гетерогенной коллагенсодержащей структуры, состоящей из микрочастиц коллагена с размером 30-300 мкм, распределенных в гомогенном геле коллагена при соотношении фаз (1-10):(1-10), с набухаемостью не менее 87%, pH 4,8-7,2, и нейральных стволовых клеток, при этом гетерогенная коллагенсодержащая структура содержит стимулирующую добавку в виде наночастиц кремния с размером 50-150 нм в количестве 1·10-1·10 мас.%.
4
Согласно изобретению, наночастицы кремния получают методом лазеро-индуцированного пиролиза моносилана SiH.
6
Согласно изобретению, используют нейральные стволовые клетки в 0,5-1 мл 0,9%-ного раствора NaCl из расчета на 1 мл гетерогенной коллагенсодержащей структуры в количестве 1·10 клеток.
При анализе известного уровня техники не выявлено технических решений с совокупностью признаков, соответствующих настоящему изобретению и обеспечивающих описанный выше результат.
Приведенный анализ известного уровня техники свидетельствует о соответствии заявляемого технического решения критериям изобретения «новизна», «изобретательский уровень».
Настоящее изобретение может быть реализовано при использовании известных методов, технологий, оборудования и материалов, используемых в медицине, биотехнологии, клеточно-регенеративной терапии.
Осуществление изобретения.
Изобретение поясняется рис.1 - Изображения наночастиц кремния (метод просвечивающей электронной микроскопии) и таблицей 1 - Оценка in vitro жизнеспособности и пролиферативной активности нейральных стволовых клеток (НСК) на биополимерном матриксе.
Для реализации изобретения используют.
1. Гетерогенная коллагенсодержащая структура.
Гетерогенную коллагенсодержащую структуру получают по способу, описанному в техническом решении (RU №2249462), на основании которого выпускается товарный продукт - композиция имплантируемого гетерогенного геля «СфероГЕЛЬ» (ТУ 9398-001-54969743-2006, производство ЗАО «Биомир-сервис», Россия).
Гетерогенная коллагенсодержащая структура названного продукта состоит из микрочастиц (микросфер) коллагена с размером 30-300 мкм, распределенных в гомогенном геле коллагена при соотношении фаз (1-10):(1-10), с набухаемостью не менее 87%, pH 4,8-7,2. Микрочастицы коллагена (твердая фаза) получают из ткани млекопитающих, а гель коллагена (жидкая фаза) - из денатурированного коллагена ткани птиц. Матрикс (при комнатной температуре) представляет собой упругоэластичную массу (гель).
2. Наночастицы кремния.
Кремний, частицы кремния используются в косметологии, медицине, ортопедии и являются биосовместимым материалом (см. - RU №2375080, публ. 27.03.2009; RU №2003137823, публ. 27.03.2005; US №7186287, публ. 06.03.2007; WO 2010/096733 A2, публ. 26.08.2010; Л.А.Осьминкина, Е.Н.Лукьянова и другие. Влияние наноструктурированного кремния на процессы пролиферации стволовых и раковых клеток - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Российская академия медицинских наук. Москва, 2011, том 151, №1, с.91-95).
4
Наночастицы кремния по изобретению получают на основе технологии лазеро-индуцированного пиролиза моносилана SiH, описанной в работах: А.Г.Владимиров, С.Б.Коровин, В.И.Пустовой. Люминесценция кремниевых наночастиц. Институт Общей Физики им. A.M.Прохорова РАН. Сборник тезисов докладов Третьего Международного форума по нанотехнологиям RUSNANOTECH. Москва, 2008 г., с.767-770; A.Vladimirov, S.Korovin, A.Surkov, E.Kelm, and V.Pustovoy. Prokhorov General Physics Institute, Russian Academy of Sciences. «Synthesis of Luminescent Si Nanoparticles Using the Laser-Induced Pyrolysis», Laser Physics, 2011, Vol.21, No.4, pp.830-835.
4
2
2
4
x
Процесс получения наночастиц кремния заключается в подаче в проточный реактор реакционной газовой смеси: моносилана (SiH) и добавочного газа - гелия (Не), в индуцировании реакции пиролиза газовой смеси непрерывным излучением CO-лазера при давлении газовой смеси в реакторе ниже атмосферного. В качестве буферного газа, для осуществления теплоотвода при экзотермической реакции пиролиза, используется аргон (Ar). Под воздействием излучения CO - лазера (выходная мощность 70 Вт, длина волны λ=10,6 µ) происходит разложение молекул SiH на активные преципитаты SiH с последующим образованием связей кремний-кремний (Si-Si), что приводит к синтезу наночастиц кремния в зоне реакции.
2
Характерными регулируемыми параметрами процесса (реакции) являются: расход и соотношение расходов газов: моносилан: гелий: аргон, как 1:1: (45-65); плотность мощности лазерного излучения 5000-8000 Вт/см; давление газовой смеси в реакторе 200-650 торр. Процесс обеспечивает возможность получения наночастиц кремния с размерами в диапазоне от 5 до 200 нм. Регулируемость процесса позволяет контролировать средние размеры наночастиц кремния и получать (при необходимости) наночастицы с узкой дисперсией по размерам.
На рис.1 приведены изображения (с просвечивающего электронного микроскопа) получаемых наночастиц кремния. Для исследования используется просвечивающий (трансмиссионный) электронный микроскоп ТЕМ «LEО912 АВ OMEGA».
4
Необходимо отметить, что лазеро-индуцированный пиролиз моносилана SiH позволяет получать «чистые поверхности» наночастиц кремния - без химических примесей, продуктов реакции и остатков кислот в отличие от метода электрохимического травления пластин кремния (см. указанный выше патент RU №2375080). Также, согласно исследованиям, наночастицы кремния обладают свойствами биодеградации (например, см. - Ji-Ho Park, Luo Gul and other. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications. Nature Materials, 2009, 8, pp.331-336).
3. Нейральные стволовые клетки.
Нейральные стволовые клетки (НСК) определяют как клетки с неограниченным пролиферативным потенциалом, способные к самовоспроизведению и генерации мультипотентных клеток-потомков, которые могут дифференцироваться в основные типы нервных клеток - глиальные и нейроны. НСК обладают свойствами патотропизма - способностью к миграции в патологический очаг. Благодаря способности генерировать все клеточные типы в нервной системе и миграционной способности, НСК перспективны для заместительной клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний, в т.ч. в качестве клеточных компонентов имплантатов и биополимерных матриксов для тканей организма. НСК в клеточно-регенеративной терапии используются, преимущественно, при устранении дефектов нервной ткани центральной нервной системы, но, также, могут (благодаря описанным выше свойствам и разным способам их получения) использоваться при терапии тканей периферической нервной системы.
Нейральные стволовые клетки (НСК) получают, например, из фрагмента (ткани) обонятельной выстилки носа пациента и культивируют по стандартному протоколу (см. методику, изложенную в RU №2394593, публ. 27.03.2010).
Нейральные стволовые клетки (НСК) по изобретению используются:
- в качестве стимулирующего агента в композиции имплантируемого гетерогенного геля «СфероГЕЛЬ»;
- для оценки in vitro жизнеспособности и пролиферативной активности культуры клеток на биополимерном матриксе по изобретению.
4. Биополимерный матрикс.
6
Для получения биополимерного матрикса по изобретению в композицию имплантируемого гетерогенного геля «СфероГЕЛЬ» (ТУ 9398-001-54969743-2006) вводят суспензию нейральных стволовых клеток (НСК). Полученная композиция центрифугируется, при этом суспензия НСК перфузируется в гетерогенный гель «СфероГЕЛЬ». Для приготовления данной композиции используют суспензию, содержащую НСК в 0,5-1 мл 0,9%-ного раствора NaCl из расчета на 1 мл «СфероГЕЛЬ» в количестве 1·10 клеток (см. патенты RU: №2394593).
Согласно исследованиям (см. выше) in vitro и in vivo гетерогенная коллагенсодержащая структура обладает биосовместимостью, опорно-трофической функцией и способностью стимулировать пролиферацию клеток.
После приготовления указанной композиции в нее вводят стимулирующую добавку в виде наночастиц кремния, которые диспергируются при интенсивном перемешивании.
-3
2
В качестве стимулирующей добавки по изобретению, используют, полученные по описанной выше технологии (п.2), наночастицы кремния с размером 50-150 нм в количестве 1·10-1·10 мас.%.
Наночастицы кремния при указанном диапазоне размеров и концентрации используют для структурирования коллагенсодержащего материала, для улучшения его опорно-трофической функции, поддержки пролиферации клеток и тканей, повышения биоактивных свойств материала, улучшения регенерации нервных тканей.
Уменьшение параметров используемых наночастиц и их количественного содержания в имплантируемом гетерогенном геле может привести к ухудшению структурирования коллагенсодержащего материала, его опорно-трофической функции. Увеличение размеров наночастиц значительно усложняет технологический процесс лазеро-индуцированного пиролиза моносилана SiH4.
2
5. Применяемые в биотехнологии приборы и оборудование: ламинарный шкаф (ВЛ22, Сампо, Россия); CO-инкубатор (Sanyo, Япония); световой фазово-контрастный инвертированный микроскоп Leica DM IL (Германия); флуоресцентный фазово-контрастный микроскоп Leica DM5000B (Германия), оснащенный ртутной лампой НВО 100АС, наборами фильтров для анализа флуоресценции UV (ВР 340-380, LP 425), UV/V (ВР 355-425, LP 470), FITC (ВР 450-490, LP 520), TRITC (ВР 510-560, LP 590), ВР 520-590, LP 620, камерой и системой анализа изображения DC420 (Leica, Германия); встряхиватель Вортекс (Elmi, Латвия); центрифуга Eppendorf 5204 R (Eppendorf, Германия); водяная баня (BioSan); проточный цитофлуориметр Coulter Epics XL (Beckman Coulter, США); автоматические пипетки (Eppendorf, Германия); гемоцитометр (Bright Line, США); холодильник (Indesit, Россия) и низкотемпературный холодильник (Sanyo, Япония),
6. Материалы и вещества;
- флуоресцентный краситель - флуоресцеин диацетат (fluorescein diacetate, FDA) [Invitrogen (Molecular Probes), США, Sigma-Aldrich, США];
- флуоресцентный краситель - пропидий-йодид (propidium iodide, PI) [Invitrogen (Molecular Probes), США, Sigma-Aldrich, США];
- реагент МТТ-теста-3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ Reagent) [ICN Pharmaceutical, США];
- флуоресцентный краситель - липофильный краситель DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate) [Invitrogen (Molecular Probes), США];
3
2
- апротонный растворитель - диметилсульфоксид (dimethylsulfoxide) (CH)SO (Компания «Биолот», Россия);
- фетальная телячья сыворотка (ФТС/FBS) [HyClone, США, PromoCell, Германия];
- ростовая (питательная) среда Игла MEM (Sigma-Aldrich, США);
- фосфатно-солевой буфер (ФСБ/PBS)) [Gibco, Великобритания];
- раствор: трипсин - ЭДТА (Trypsin -EDTA) [Gibco, Великобритания];
- коллагеназа IA [Sigma-Aldrich, США];
- деионизованная вода [Компания «Сигма Тек», Россия].
7. Методы и тесты, известные при цитологических исследованиях.
Для оценки жизнеспособности и пролиферативной активности НСК на биополимерном матриксе (по изобретению) используют показатели: соотношение живых и мертвых клеток (тест «live-dead»); жизнеспособность клеток (МТТ-тест); пролиферативная активность клеток (клеточный прирост) (метод видеомикроскопии). 7А. Оценка соотношения живых и мертвых клеток (тест «live-dead»).
Тест «live-dead» (выявление живых и мертвых клеток) (Протокол фирмы Invitrogen (Molecular Probes), США) основан на использовании флуорохрома - флуоресцеин диацетата (fluorescein diacetate, FDA, зеленая флюоресценция) и ядерного красителя пропидий-йодида (propidium iodide, PI, красная флюоресценция). Сама по себе молекула FDA не обладает флуоресценцией. При попадании в живую клетку FDA подвергается гидролизу под воздействием эстераз (ферментов), что приводит к появлению свободных молекул флуоресцеина, флуоресцирующих в зеленой области спектра, что позволяет детектировать живые клетки во флуоресцентном микроскопе с использованием набора фильтров (ВР 450-490, LP 520). Пропидий-йодид (propidium iodide, PI) может окрашивать ядра любых клеток, но в поврежденные и мертвые клетки краситель проникает гораздо быстрее, что позволяет выявить такие клетки сразу после проведения окрашивания. Внутри клетки краситель ковалентно связывается с нуклеиновыми кислотами, в частности, интеркалирует с молекулами ДНК, что позволяет визуализировать ядро с использованием набора фильтров для красной флюоресценции (ВР 520-590, LP 620). Окрашивание ядер свидетельствует о том, что клетка повреждена или погибла.
7Б. Оценка жизнеспособности клеток (МТТ-тест).
3
2
При тестировании оценивают количество живых клеток. Принцип метода МТТ-теста (Протокол фирмы Invitrogen (Molecular Probes), США) основан на способности фермента сукцинатдегидрогеназы митохондриальной мембраны клеток млекопитающих восстанавливать желтую соль 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана (азогидразоны) фиолетового цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток. По интенсивности накопления кристаллов формазана в цитоплазме судят об уровне митохондриального дыхания клетки, что является показателем ее жизнеспособности. Количество образуемого формазана в клеточном монослое пропорционально имеющемуся количеству живых клеток. Формазан экстрагируется из клеток апротонным растворителем ДМСО - диметилсульфоксидом ((СН)SO). Интенсивность окраски раствора пропорциональна количеству живых клеток и определяется колориметрически.
2
Непосредственно перед использованием готовят рабочий раствор МТТ (1,5 мг/мл 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид) на ростовой среде. Клетки инкубируют 2 часа в рабочем растворе МТТ в стандартных условиях (+37°C, 5% СО). Останавливают реакцию удалением раствора, добавляют ДМСО и помещают клетки на 15 минут на шейкер при 150 об/мин. Интенсивность окраски измеряют на спектрофотометре при Х=540 нм.
7С. Оценка пролиферативной активности клеток (метод видеомикроскопии).
Одним из наиболее точных показателей, характеризующих пролиферативную активность клеток, является клеточный прирост, определяемый с использованием метода видеомикроскопии (см. - С.Е.Дромашко, О.В.Квитко и др. Компьютерная видеомикроскопия живых клеток. Минск, ИПНК НАН Белоруссии, 2010, 37 с.). Сущность метода состоит в том, что в одних и тех же полях зрения фотографируются 10 полей зрения с помощью цифровой камеры, установленной на инвертированном микроскопе, оснащенном флуоресцентной насадкой с эпифлуоресценцией. Фотографирование клеток проводится последовательно в разные временные точки периода культивирования клеток на носителях (поверхностях), например, культуральных пластиках. Затем на полученных изображениях определяется количество клеток в каждом поле зрения с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, США), рассчитывается клеточный прирост в каждом поле зрения и определяется среднее значение клеточного прироста для данной временной точки.
Для визуализации клеток используют окраску клеток липофильным красителем (зондом) DiO - флуорохромом с флюоресценцией в зеленой области (ВР 450-490, LP 520), который неспецифически окрашивает мембраны клеток и может быть детектирован во флуоресцентном микроскопе. Клетки окрашиваются липофильным красителем DiO в суспензии (НСК + среда культивирования) перед посадкой на носитель - культуральный пластик.
8. Оценка in vitro жизнеспособности и пролиферативной активности НСК на биополимерном матриксе.
Исследования in vitro проводят с применением:
- биополимерного матрикса (по изобретению) - гетерогенный гель «СфероГЕЛЬ» с НСК и добавкой наночастиц кремния (см. п.4);
- гетерогенного геля «СфероГЕЛЬ» с НСК и без добавки наночастиц кремния (см, п.1);
- нейральные стволовые клетки (НСК) (см. п.3);
- среда культивирования НСК; ростовая среда Игла MEM (Sigma-Aldrich), глюкоза 0,8%, L-глютамин 2 мМ, фетальная телячья сыворотка (ФТС/FBS) 10%, добавки В27, HEPES (Sigma-Aldrich) 20 мМ.
- носителей (в виде поверхностей стандартных культуральных пластиков) для нанесения составов гетерогенного геля «СфероГЕЛЬ» и суспензий НСК;
- тестов для оценки in vitro жизнеспособности и пролиферативной активности НСК на биополимерном матриксе по выбранным показателям (см. п.7).
Тесты in vitro проводились на образцах в соответствии с примерами 1 и 2.
-3
Пример 1. На культуральный пластик наносится биополимерный матрикс (по изобретению) - гетерогенный гель «СфероГЕЛЬ» с НСК и добавкой наночастиц кремния в количестве 5·10 мас.% и затем наносится суспензия НСК (НСК + среда культивирования).
Пример 2 (контрольный). На культуральный пластик наносится гетерогенный гель «СфероГЕЛЬ» с НСК и без добавки наночастиц кремния и затем наносится суспензия НСК (НСК + среда культивирования).
2
Через 24 часа и через 5 дней культивирования (37°С, СО 5%) на образцах (по примерам 1 и 2) было сфотографировано по 10 рандомически выбранных полей зрения для определения клеточного прироста (см. пункт 7С).
Также, через 5 дней культивирования на образцах (по примерам 1 и 2) был проведен тест «live-dead» для определения соотношения живых и мертвых клеток и МТТ-тест для определения жизнеспособности клеток (см. пункты 7А, 7Б).
9. Результаты оценки in vitro жизнеспособности и пролиферативной активности НСК на биополимерном матриксе.
В таблице 1 приведены результаты оценки in vitro жизнеспособности и пролиферативной активности НСК на биополимерном матриксе.
Для оценки жизнеспособности и пролиферативной активности НСК на биополимерном матриксе (по изобретению) используют показатели (см. п.7): соотношение живых и мертвых клеток (качественная оценка, живые/мертвые клетки); жизнеспособность клеток (количество живых клеток, %); прирост клеток (кратность отличий, ед. и прирост клеток, %).
Согласно таблице 1, для исследованных по тесту «live-dead» образцов (примеры 1 и 2), практически все НСК были живыми (реакция FDA положительная), мертвые НСК (реакция PI положительная) выявлялись крайне редко.
Количество живых НСК согласно результатам МТТ-теста находилось в пределах допустимых значений 96-100%. Активность митохондрий клеток (уровень митохондриального дыхания клетки), детектируемая с помощью реагента ММТ (МТТ Reagent), находилась на высоком уровне.
Данные по приросту НСК представлены как кратность увеличения клеточной популяции и как процент по сравнению с приростом на образце по примеру 2.
Прирост НСК для образца (пример 1) превышал прирост НСК для образца (пример 2) на 22%, что характеризует способность стимулирующей добавки в виде наночастиц кремния в составе биополимерного матрикса (по изобретению) оказывать влияние на повышение пролиферативной активности НСК, при поддержании (сохранении) жизнеспособности культуры клеток в процессе роста.
Таким образом, разработан биополимерный матрикс для пролиферации клеток и регенерации нервных тканей со стимулирующей добавкой в виде наночастиц кремния, способствующей повышению пролиферации клеток и регенерации тканей.
Используемые при реализации изобретения коллагенсодержащие композиции и наночастицы кремния являются биосовместимыми материалами, применяемыми в косметологии, медицине, ортопедии, клеточно-тканевой инженерии.
Используемые при реализации изобретения нейральные стволовые клетки обладают пролиферативным потенциалом, миграционными свойствами, способностью дифференцироваться в основные типы нервных клеток - глиальные и нейроны. Эти клетки позволяют при биотехнологических и медицинских исследованиях in vitro имитировать элементы нервной ткани человека.
Таблица 1
Оценка in vitro жизнеспособности и пролиферативной активности НСК на биополимерном матриксе.
Образцы по примерам
Живые/Мертвые клетки Тест «live-dead»
Количество живых клеток, % МТТ-тест
Прирост клеток, кратность отличийМетод видеомикроскопии
Прирост клеток, %Метод видеомикроскопии
Пример 1
Живые клетки
96
2,64±0,17
122
Пример 2 (контрольный)
Живые клетки
100
2,16±0,11
100