ПРЕПАРАТ, СНИЖАЮЩИЙ ВРЕМЯ КАТАЛЕПТИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ, ТРЕВОЖНОСТЬ И УСИЛИВАЮЩИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКУЮ МОТИВАЦИЮ
PREPARATION REDUCING CATALEPSY RESPONSE TIME, ANXIETY AND ENHANCING EXPLORATORY MOTIVATION

Область техники
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в терапевтической практике во всех случаях применения препаратов глицина.
Уровень техники
Аминокислота глицин в настоящее время находит широкое применение в медицине. Препараты глицина способны уменьшать психоэмоциональное напряжение и агрессивность, повышать социальную адаптацию, нормализовать сон и повышать умственную работоспособность, уменьшать выраженность общемозговых расстройств при ишемическом инсульте и снижать токсическое действие алкоголя (Gusev E.I., Skvortsova V.I., Dambinovac S.A. et al. // Cerebrovasc. Diseases. 2000. V.10. №1. P.49-60) [1], (Gannon M.C., Nuttall J.A., Nuttall F.Q. // Amer. J.Clin. Nutr. 2002. V.76. P.1302-1307) [2], (Senthilkumar R., Sengottuvelan M., Nalini N. // Cell. Biochem. Funet. 2004. V.22. №2. P.123-128) [3]. В США препараты глицина одобрены для лечения негативной симптоматики у больных шизофренией (Javitt D.C., Zylberman I., Zukin S.R. et al. // Amer. J.Psychiatry. 1994. V.151. №8. P.1234-1236) [4].
Применение глицина для лечения ишемического инсульта также известно из патентов РФ №2082398 от 24.12.1992 «Способ лечения острого периода ишемического инсульта» [5], №2145895 от 24.12.1996 «Способ лечения церебрального ишемического инсульта» [6]. В то же время в современной фармации актуальной и важной проблемой остается разработка способов повышения биологической активности лекарственного препарата без изменения его молекулярного состава. Одним из приемов, которым это достигается, является изучение биологической активности полиморфных форм как уже известных, так и вновь синтезируемых препаратов.
(A.LLines, Z.Goodman. Polymorph Control: past, present and future. Drug. Discovery Today, V.13, №6, р.198-210, 2008) [7].
(Polymorphs and solvats of molecular solids in the pharmacevtical industy. In Reactivity of molecular solids. Ed. by E.Boldyreva, V.Boldyrev. John Wileyand Sons Ltd. Chichester. 1999, pp.241-270) [8].
(Polymorphism in Pharmaceutical Solids. Ed. by H.Brittain Marcel Dekker Inc. N.Y.Basel, 1999) [9].
Задачей настоящего изобретения является создание более биологически эффективных препаратов на базе глицина.
Раскрытие изобретения
Поставленная задача решена применением гамма-модификации глицина для получения биологически эффективного препарата, снижающего время каталептических реакций, тревожность и усиливающего исследовательскую мотивацию.
При использовании глицина в составе лекарственных форм его активность может зависеть от строения и свойств супрамолекулярных комплексов со вспомогательными компонентами (excipients). Несмотря на то что глицин может существовать в виде нескольких полиморфных модификаций (Boldyreva E.V. In: Models, Mysteries, and Magic of Molecules. В.: Springer_Verlag, 2007. P.169-194) [10], до сих пор влияние различий в его кристаллической структуры на биологическую активность не исследовалось. Ни в каталогах, ни на упаковке товарных реактивов и препаратов глицина (как чистого вещества, так и в составе многокомпонентных лекарственных форм) не указывается, какие полиморфные модификации глицина присутствуют в образце. Не указывается фазовый состав использованных препаратов глицина и в публикациях, посвященных их терапевтическому применению.
Нами проведено сопоставление биологической активности α- и γ-полиморфных модификаций глицина на примере их влияния на поведение крыс линии ГК с генетической предрасположенностью к каталепсии. В результате показано, что γ-полиморфная модификация глицина обладает более высокой активностью, чем α-форма. Эффект является весьма необычным, поскольку обе формы имеют практически одинаковую кинетику растворения и их молекулы имеют одинаковую конформацию. Объяснение различий в биологической активности двух полиморфных модификаций глицина предлагается искать в различном строении молекулярных ассоциатов, которые поступают в организм при пероральном приеме двух форм.
Изобретение подтверждается следующими экспериментами по лечению каталептического синдрома у крыс.
Глицин фирмы "Союзхимреактив", представлявший собой смесь α- и γ-модификаций, перекристаллизовывали для получения чистых в фазовом отношении α- и полиморфных модификаций. Образцы характеризовали при помощи рентгенофазового анализа (Bruker D8_GADDSdiffractometer, СuKα_излучение, λ=1.54184 Е, Hi_STAR двухкоординатный детектор), ИК-спектроскопии (спектральный диапазон 4000-600 см-1, разрешение 4 см-1, ИК Фурье_спектрометр Excal_ibur 3100 с приставкой НПВО ATR MIRacle, Рikе) и хроматографически (Миллихром АO_2). ИК-спектры снимали без какой-либо предварительной пробоподготовки и без разбавителя, чтобы исключить возможное влияние на фазовый состав в процессе приготовления образца к исследованию. Размер частиц в образцах α- и γ-глицина (конгломераты 50-70 мкм из частиц 1-20 мкм) контролировали при помощи оптической и сканирующей электронной микроскопии.
В опытах использовали линию крыс ГК (генетическая каталепсия), полученных в ИЦиГ СОРАН путем селекции из аутбредной популяции крыс Вистар (Барыкина Н.Н., Чепкасов И.Л., Алехина Т.А и др. // Генетика. 1983. Т.19. №5. С.2014-2021) [11], (Колпаков В.Г., Куликов А.В., Алехина Т.А. и др. // Генетика. 2004. Т.40. №6. С.672-678) [12]. Эксперименты выполнены на 30 самцах одинакового возраста (3-3.5 месяца) и веса (300 г), содержавшихся в одинаковых условиях вивария ИЦиГ СО РАН, соответствовавших требованиям международной конвенции (Experientia, 1995. V.51. Р.1-5). Все крысы были разделены на три равные группы по 10 животных в каждой, одна из которых получала α-глицин, другая - γ-глицин, а третья, контрольная, - плацебо. За 2 дня до начала эксперимента крыс рассаживали в одиночные клетки. Глицин ежедневно на протяжении всего эксперимента давали крысам в виде порошка (10 мг), закатанного в шарик плавленого сыра (1.5 г), и контролировали, чтобы шарик был съеден крысой в присутствии экспериментатора. Контрольные крысы получали сыр без глицина (плацебо). Каталептическую реакцию исследовали за день до начала приема глицина (или плацебо), а также на 15-й день после начала введения препарата. Тест открытого поля проводили на 17-й день, тест с приподнятым крестообразным лабиринтом - на 19-й и тест со светло-темной камерой - на 21-й день. Тест на каталептическую реакцию проводили, как описано в [11]. Подробные методики проведения других поведенческих тестов даны в (The Behavior of the Laboratory Rat. A Handbook with Tests. I.Q. Whishaw, B. Kolb Eds. Oxford: Oxford Univ. Press, 2005. 504 p.) [13]. Все поведенческие тесты начинали в 14:00, и продолжительность каждого теста составляла 5 мин. После каждого эксперимента аппараты для тестирования поведения тщательно отмывались. Поведение животных записывали на видеокамеру, при этом наблюдатель находился в соседнем помещении. Обработку результатов видеозаписи проводил экспериментатор, не знающий, какой именно препарат получали крысы каждой группы, используя специальную компьютерную программу.
Статистическую обработку результатов проводили с применением непараметрического критерия Mann-Whitney (Statistica 6.0). Статистически значимыми считали различия при p<0.05.
Влияние глицина на каталептическую готовность: из Фиг.1 следует, что ни α-глицин, ни тем более плацебо были не в состоянии достоверно уменьшить время каталептического застывания крыс ГК. Однако γ-глицин оказался в этом отношении весьма эффективным. Крысы, получавшие на протяжении двух недель γ-глицин, практически не проявляли каталептической реакции. Результаты испытаний крыс в тесте открытого поля (Табл. 1) также показали преимущественную активность γ-глицина. Хотя α-глицин действовал на поведение крыс в том же направлении, что и γ-глицин, сдвиги поведения под влиянием α-глицина не достигали уровня статистической достоверности. В то же время γ-глицин привел к достоверному увеличению двигательной активности в центре площадки в первую минуту теста. Количество вертикальных стоек (rearing), как и их продолжительность, также значительно возрастали, что указывает на усиление исследовательской мотивации у крыс, получавших γ-глицин. Поведенческие признаки снижения тревожности крыс, получавших γ-глицин, отмечены при испытании в приподнятом крестообразном лабиринте (Табл. 1). В 2.5 раза увеличилось время пребывания крыс на открытых рукавах и на открытой центральной площадке. Латентное время выхода крыс в открытый рукав под влиянием γ-глицина уменьшилось в 4 раза. Уменьшение мотивации страха и усиление исследовательской мотивации под влиянием глицина (главным образом γ-формы) отмечены в тесте с темно-светлой камерой (Табл. 1). Надо подчеркнуть, что ни одна из испытанных нами крыс линии ГК не осмелилась за время теста полностью покинуть темный отсек и выйти на светлую половину. Однако крысы, получавшие γ-глицин, достоверно чаще и на более длительное время высовывали голову из отверстия, соединяющего темную и светлую камеры. Они в 5 раз чаще становились передними лапами на пол светлой камеры (высовывались наполовину), чем крысы, получавшие α-глицин. Крысы из группы плацебо ни разу не демонстрировали такой "смелости".
Таким образом, можно заключить, что введение глицина, главным образом его γ-формы, оказало положительное действие на характеристики поведения крыс линии ГК, что выражалось в резком уменьшении времени каталептических реакций, в снижении реакции страха при попадании в новую обстановку и в усилении исследовательской мотивации.
Ранее для ряда веществ уже наблюдалась различная биологическая активность разных полиморфных кристаллических модификаций одного и того же соединения или же различия в активности кристаллических и аморфных препаратов (Shakhtshneider Т.Р., Boldyrev V.V. In: Reactivity of Molecular Solids, Molecular Solid State Series. Chichester: Wiley, 1999. P.271-311) [14], (Hilfiker R. Polymorphism in the Pharmaceutical Industry. Weinheim: Wiley_VCH, 2006. 414 p.) [15], однако, как правило, эти различия были обусловлены существенно разной скоростью растворения форм, вследствие чего в раствор (или в биологические жидкости при приеме препарата) за одно и то же время поступали различные дозы вещества. Были также описаны случаи, когда различия активности были обусловлены разными конформациями молекул (Леонидов Н.Б. // Рос. хим. журн. 1997. Т.41. №5. С.10-21) [16], или изомерией, связанной с миграцией протона и образованием изомеров [14].
Случай с глицином представляется значительно более сложным и интересным. Кинетика растворения α- и γ-полиморфных модификаций практически одинакова (Yang X., Wang X., Ching СВ. // J. Chem. Eng. Data. 2008. V.53. №5. P.1133-1137) [17], а конформации молекул глицина в обеих формах совпадают. Поэтому объяснение различий в биологической активности двух полиморфных модификаций следует, по-видимому, искать в различиях строения молекулярных ассоциатов, которые поступают в организм при пероральном приеме двух форм. В этой связи интересно отметить, что по данным атомносиловой микроскопии и малоуглового рентгеновского рассеяния (Carter P.W., Hillier А.С, Ward M.D. // J. Amer. Chem. Soc. 1994. V.116. №3. P.944-953) [18], (Chattopadhyay S., Erdemir D., Evans J.M.B. et al. // Cryst. Growth Design. 2005. V.5. №2. P.523-527) [19], при растворении полиморфных модификаций глицина в воде в раствор переходят не отдельные изолированные молекулы, но фрагменты исходных кристаллических структур: центросимметричные димеры при растворении α-формы и полярные цепочки при растворении гамма-формы. Существование таких супрамолекулярных ассоциатов может влиять на взаимодействие глицина с рецепторами либо прямо (если связывание с рецептором осуществляет не отдельная молекула, но ассоциат из нескольких молекул), либо косвенно (для разрушения ассоциата на отдельные молекулы, связывающиеся затем с рецептором, необходима различная энергия).
Применение гамма-глицина в препаратах глицина позволит значительно сократить количество используемого глицина при сохранении его терапевтических свойств.
Источники информации
1. Gusev E.I., Skvortsova V.I., Dambinovac S.A. et al. // Cerebrovasc. Diseases. 2000. V.10. №1. P.49-60.
2. Gannon M.C., Nuttall J.A., Nuttall F.Q. // Amer. J. Clin. Nutr. 2002. V.76. P.1302-1307.
3. Senthilkumar R., Sengottuvelan M., Nalini N. // Cell. Biochem. Funct. 2004. V.22. №2. P.123-128.
4. Javitt D.C., Zylberman I., Zukin S.R. et al. // Amer. J.Psychiatry. 1994. V.151. №8. P.1234-1236.
5. Патент РФ №2082398 от 24.12.1992.
6. Патент РФ №2145895 от 24.12.1996.
7. A.LLines, Z.Goodman. Polymorph Control: past, present and future. Drug. Discovery Today, v. 13, №6, p. 198-210, 2008.
8. Polymorphs and solvats of molecular solids in the pharmacevitical industy. In Reactivity of molecular solids. Ed. by E.Boldyreva, V. Boldyrev. John Wileyand Sons Ltd. Chichester. 1999, P.241-270.
9. Polymorphism in Pharmaceutical Solids. Ed by H.Brittain Marcel Dekker Inc N.Y. Basel, 1999.
10. Boldyreva E.V. In: Models, Mysteries, and Magic of Molecules. В.: Springer_Verlag, 2007. P.169-194.
11. Барыкина H.H., Чепкасов И.Л., Алехина Т.А и др. // Генетика. 1983. Т.19. №5. С.2014-2021.
12. Колпаков В.Г., Куликов А.В., Алехина Т.А. и др. // Генетика. 2004. Т.40. №6. С.672-678.
13. The Behavior of the Laboratory Rat. A Handbook with Tests. I.Q. Whishaw, B. Kolb Eds. Oxford: Oxford Univ.Press, 2005. 504 p.
14. Shakhtshneider T.P., Boldyrev V.V. In: Reactivity of Molecular Solids, Molecular Solid State Series. Chichester: Wiley, 1999. P.271-311.
15. Hilfiker R. Polymorphism in the Pharmaceutical Industry. Weinheim: Wiley_VCH, 2006. 414 p.
16. Леонидов Н.Б. // Рос. хим. журн. 1997. Т.41. №5. С.10-21.
17. Yang X., Wang X., Ching СВ. // J. Chem. Eng. Data. 2008. V.53. №5. P.1133-1137.
18. Carter P.W., Hillier A.C., Ward M.D. // J. Amer. Chem. Soc. 1994. V.116. №3. P.944-953.
19. Chattopadhyay S., Erdemir D., Evans J.M.B. et al. // Cryst. Growth Design. 2005. V.5. №2. P.523-527.
Табл. 1
Влияние α- и γ-глицина на основные характеристики поведения крыс линии ГК
Характеристики поведения
Контроль (плацебо)
Альфа-глицин
Гамма-глицин
Тест открытого поля
Латентный период начала локомоции, сек
35,0±19,8
18,7±6,4
11,2±2,6
Локомоция на периферии в 1-ю мин, кв. шт.
24,0±5,0
34,4±9,4
30,8±6,5
Локомоция в центре в 1-ю мин, кв. шт.
0,1±0,1
0,6±0,5
1,1±0,4*
Локомоция на периферии за 5 мин, кв. шт.
172,5±26,6
193,4±17,6
187,7±13,2
Локомоция в центре за 5 мин, кв. шт.
3,9±1,6
7,3±1,9
8,4±2,2
(Локомоция в центре / Общая локомоция) за 5 мин, %
1,7±0,6
3,8±0,9
3,9±0,9*
Эпизоды вертикальных стоек (rearing), шт.
14,4±2,4
20,0±3,6
23,3±1,8**
Общее время вертикальных стоек (rearing), сек
28,9±5,9
42,6±8,7
48,3±4,7*
Время пребывания в центре, сек
9,0±2,8
12,3±2,7
15,8±3,4
Число заходов в центр, шт.
2,3±0,7
2,9±0,6
3,4±0,8
Приподнятый крестообразный лабиринт
Время в закрытом рукаве, сек
223,5±17,5
239,1±16,1
137,8±30,9
Время в центре, сек
47,1±8,8
29,5±8,9
63,8±18,6
Время в открытом рукаве, сек
29,4±9,9
31,4±11,9
98,4±34,4
(Время в центре)+(время в открытом рукаве), сек
76,5±17,47
60,9±16,1
162,2±31,0*†
Латентное время выхода в открытый рукав, сек
139,1±44,8
125,4±41,1
32,1±17,4#
Темно-светлая камера
Высовывание головы из темного отсека, шт.
0,6±0,3
1,4±0,5
2,5±0,7*
Высовывание головы из темного отсека, сек
1,0±0,5
3,3±1,0
5,8±1,8*
Латентный период высовывания головы, сек
226,7±32,5
213,5±23,3
128,1±39,4
Выход наполовину (передние лапы в светлом отсеке), шт.
0±0
0,3±0,2
1,2±0,7*
Выход наполовину (передние лапы в светлом отсеке), сек
0±0
0,7±0,5
3,8±1,9*
Латентный период выхода наполовину, сек
300±0
289±8,6
214,8±40,9*
% крыс, выходивших наполовину
0%
20%
40%#
* - p<0.05, ** - p<0.01 - γ-глицин по сравнению с плацебо (Mann-Whitney U-критерий);
† - p<0.05 - γ-глицин по сравнению с α-глицином (Mann-Whitney U-критерий);
# - p<0.03 - γ-глицин по сравнению с плацебо (χ<sup>2</sup> критерий).