МИКРОБНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ РОСТА РАСТЕНИЙ И ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ
MICROBIAL COMPOSITIONS AND METHODS OF USING FOR IMPROVING PLANT GROWTH AND TREATING PLANT DISEASES

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США номер 62/097287, поданной 29 декабря 2014 года, раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки во всей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Раскрытый в настоящем изобретении предмет относится к композициям, содержащим выделенные микробные штаммы для нанесения на растения, семена растений и почву, окружающую растения, для улучшения роста растений и для лечения болезней растений. В некоторых случаях микробные штаммы доставляются в растения, семена растений и почву, окружающую растения, в комбинации с химическим активным агентом, обладающим противомикробными свойствами.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известно, что множество микроорганизмов, обладающих благотворным действием на рост и жизнеспособность растений, присутствуют в почве, живут в симбиозе с растениями в частности в корневой зоне (Способствующие росту растений Ризобактерии «PGPR»), или обитают в качестве эндофитов внутри растения. Их благотворные способствующий росту растений свойства включают фиксацию азота, желатирование железа, солюбилизацию фосфатов, ингибирование неполезных микроорганизмов, устойчивость к насекомым, Индуцированную системную устойчивость (ISR), системную приобретенную Устойчивость (SAR), разложение растительного материала в почве с увеличением полезного органического вещества почвы и синтез фитогормонов, таких как индол-уксусная кислота (IAA), ацетоин и 2,3-бутандиол, которые стимулируют рост растений, развитие и реакции на окружающие стрессы, такие как засуха. В дополнение, эти микроорганизмы могут влиять на стрессовую реакцию растения на этилен путем разрушения молекулы-предшественника, 1-аминоциклопропан-1-карбoксилата (ACC), стимулируя посредством этого рост растений и замедляя созревание плодов. Эти полезные микроорганизмы могут улучшать качество почвы, рост растений, урожай и качество сельскохозяйственных культур. Различные микроорганизмы демонстрируют такую биологическую активность, которая может быть полезна для борьбы с болезнями растений. Данные биопестициды (живые организмы и соединения естественно продуцируемые данными организмами) являются более безопасными и более биоразлагаемыми, чем синтетические удобрения и пестициды.
Патогенные грибы, включая, но без ограничения, Botrytis spp. (напр., Botrytis cinerea), Fusarium spp. (напр., F. Oxisporum и F. grаminearum), Rhizoctonia spp. (напр., R. solani), Magnaporthe spp. Mycosphaerella spp. Puccinia spp. (напр., P. recondita), Phytopthora spp. И Phakopsora spp. (напр., P. pachyrhizi), представляют собой один тип вредителей растений, которые могут вызывать тяжелые экономические потери в сельскохозяйственной и плодоовощной промышленности. Химические агенты могут применяться для борьбы с патогенными грибами, но применение химических агентов имеет недостатки, включая высокую стоимость, недостаток эффективности, появление устойчивых штаммов грибов и нежелательное влияние на окружающую среду. В дополнение, данные химические обработки имеют тенденцию к отсутствию селективности и в дополнение к патогенам растений, на которых нацелены обработки, могут пагубно влиять на благотворные бактерии, грибы и членистоногих. Вторым типом вредителей растений являются патогенные бактерии, включая, но без ограничения, Erwinia spp. (напр., Erwinia chrysanthemi), Pantoea spp. (напр., P. citrea), Xanthomonas (напр., Xanthomonas campestris), Pseudomonas spp. (напр., P. syringae) и Ralstonia spp. (напр., R. soleacearum), которые вызывают тяжелые экономические потери в сельскохозяйственной и плодоовощной промышленности. Подобно патогенным грибам, применение химических агентов для лечения этих патогенных бактерий имеет недостатки. Вирусы и вирусоподобные организмы составляют третий тип агентов, вызывающих болезни растений, с которыми трудно бороться, но к которым бактериальные микроорганизмы могут обеспечить устойчивость у растений через индуцированную системную устойчивость (ISR). Таким образом, микроорганизмы, которые могут применяться в качестве биоудобрения и/или биопестицида для борьбы с патогенными грибами, вирусами и бактериями, являются желательными и пользуются большим спросом для улучшения сельскохозяйственной экологичности. Заключительный тип патогенов растений включает патогенные нематоды растений и насекомых, которые могут вызывать тяжелое повреждение и потерю растений.
Сообщалось, что некоторые члены видов Bacillus являются биорегулирующими штаммами, и некоторые применяются в коммерческих продуктах (Joseph W. Kloepper, et al. 2004, Phytopathology Vol. 94, № 11, 1259-1266). Например, штаммы, применяемые в настоящее время в коммерческих биорегулирующих продуктах, включают: штамм QST2808 Bacillus pumilus, применяемый в качестве действующего вещества в Sonata и Ballad-plus, производимом Bayer Crop Science; штамм GB34 Bacillus pumilus, применяемый в качестве действующего вещества в YieldShield, производимом Bayer Crop Science; штамм QST713 Bacillus subtilis, применяемый в качестве действующего вещества в Serenade, производимом Bayer Crop Science; штамм GBO3 Bacillus subtilis, применяемый в качестве действующего вещества в Kodiak и System3, производимом Helena Chemical Company. Различных штаммы Bacillus thuringiensis и Bacillus firmus применяют в качестве биорегулирующих агентов против нематод и насекомых-переносчиков, и эти штаммы служат в качестве основы множества коммерчески доступных биорегулирующих продуктов, включая NORTICA и PONCHO-VOTIVO, производимых Bayer Crop Science. В дополнение, штаммы Bacillus, применяемые в настоящее время в коммерческих биостимулирующих продуктах, включают: штамм FZB42 Bacillus amyloliquefaciens, применяемый в качестве действующего вещества в RhizoVital 42, производимом ABiTEP GmbH, а также различные другие виды Bacillus subtilus, которые включены в виде целых клеток, включая их экстракт продукта ферментации, в биостимулирующие продукты, такие как FULZYME, производимые JHBiotech Inc.
Раскрытый в настоящем изобретении предмет предоставляет микробные композиции и способы их применения для улучшения роста растений и лечения болезней растений.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте осуществления предоставлена композиция для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит: биологически чистую культуру Bacillus velezensis RTI301, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и биологически чистую культуру Bacillus subtilis RTI477, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками, при этом нанесение композиции на семена растений, корни растений или почву, окружающую растение, способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает доставку в семена растения, корни растения или почву, окружающую растение, композиции, содержащей: биологически чистую культуру Bacillus velezensis RTI301, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и биологически чистую культуру Bacillus subtilis RTI477, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками, при этом доставка композиции способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает: доставку в семена растения, корни растения или почву, окружающую растение, комбинации: первой композиции, содержащей биологически чистую культуру Bacillus velezensis RTI301, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и второй композиции, содержащй биологически чистую культуру Bacillus subtilis RTI477, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками, при этом доставка комбинации способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлены семена растения, при этом семена растения покрыты композицией для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит: споры биологически чистой культуры Bacillus velezensis RTI301, депонированной как ATCC № PTA-121165, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; и споры биологически чистой культуры Bacillus subtilis RTI477, депонированной как ATCC № PTA-121167, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками.
В одном варианте осуществления предоставлены семена растения, при этом семена растения покрыты композицией для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит: споры биологически чистой культуры Bacillus velezensis RTI301, депонированной как ATCC № PTA-121165, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; споры биологически чистой культуры Bacillus subtilis RTI477, депонированной как ATCC № PTA-121167, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; и инсектицид бифентрин.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает посев семян растения в подходящую ростовую среду, при этом семена были покрыты композицией, содержащей: споры биологически чистой культуры Bacillus velezensis RTI301, депонированной как ATCC № PTA-121165, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; и споры биологически чистой культуры Bacillus subtilis RTI477, депонированной как ATCC № PTA-121167, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками, имеющейся в количестве, подходящем для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлена композиция для улучшения роста растений, при этом композиция содержит: биологически чистую культуру Bacillus velezensis RTI301, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; биологически чистую культуру Bacillus subtilis RTI477, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и инсектицид бифентрин.
В одном варианте осуществления предоставлена композиция для улучшения роста растений, при этом композиция содержит: биологически чистую культуру Bacillus velezensis RTI301, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; биологически чистую культуру Bacillus subtilis RTI477, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и инсектицид бифентрин, при этом композиция находится в готовой форме, совместимой с жидким удобрением.
В одном варианте осуществления предоставлена композиция для улучшения роста растений, при этом композиция содержит: биологически чистую культуру Bacillus velezensis RTI301, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; биологически чистую культуру Bacillus subtilis RTI477, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и фунгицид, содержащий одно или комбинацию экстракта из Lupinus albus doce, полипептида BLAD или фрагмента полипептида BLAD.
В одном варианте осуществления предоставлен продукт, при этом продукт содержит: первую композицию, содержащую биологически чистую культуру Bacillus velezensis RTI301, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками, и биологически чистую культуру Bacillus subtilis RTI477, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; вторую композицию, содержащую одно или комбинацию микробного, биологического или химического инсектицида, фунгицида, нематоцида, бактериоцида, гербицида, растительного экстракта, регулятора роста растений или удобрения, при этом первая и вторая композиции упакованы отдельно; и, необязательно, инструкции для доставки в количестве, подходящем для улучшения роста растений, комбинации первой и второй композиций в: листья растения, кору растения, плоды растения, цветки растения, семена растения, корни растений, черенок растения, привой растения, каллусную ткань растения; почву или ростовую среду, окружающую растение; почву или ростовую среду перед посевом семян растений в почву или ростовую среду; или почву или ростовую среду перед посадкой растения, черенка растения, привоя растения или каллусной ткани растения в почву или ростовую среду.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1 показывает схематичную диаграмму геномной организации, окружающей и содержащей уникальный оперон лантибиотического биосинтеза, обнаруженный в штамме RTI301 Bacillus velezensis, по сравнению с соответствующими областями двух референсных штаммов Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus amyloliquefaciens FZB42 и Bacillus amyloliquefaciens TrigoCor1448, в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
ФИГ. 2A представляет собой фотографию извлеченных растения пшеницы после 13 дней выращивания, показывающую контрольные растения. ФИГ. 2B представляет собой фотографию извлеченных растения пшеницы после 13 дней выращивания, показывающую растение, инокулированное штаммом RTI477. Эти фотографии показывают положительное действие штамма RTI477 Bacillus subtilis на ранний рост растения пшеницы в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
ФИГ. 3A представляет собой фотографию, показывающую штамм RTI301 Bacillus velezensis, покрывающий пятнами газон штамма RTI472 Bacillus amyloliquefaciens. ФИГ. 3B представляет собой фотографию, показывающую штамм RTI301 Bacillus velezensis, покрывающий пятнами газон штамма Bacillus subtilis RTI477. Эти фотографии показывают совместимость между штаммом RTI301 Bacillus velezensis и штаммом RTI477 Bacillus subtilis в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
ФИГ. 4A представляет собой фотографию, показывающую морфологию штамма Bacillus velezensis RTI301 в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения. ФИГ. 4B представляет собой фотографию, показывающую морфологию штамма Bacillus subtilis RTI477 в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
6
ФИГ. 5A показывает контрольные растения. ФИГ. 5B показывает растения, инокулированные RTI301 плюс RTI477 (отношение 3:1) при 10 КОЕ/мл. Фиг. 5A-5B представляют собой фотографии, показывающие положительное действие на ранний рост растений, полученное в результате инокуляции семян сои комбинацией RTI301 Bacillus velezensis плюс штамм RTI477 Bacillus subtilis и extracted после 8 дней роста в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
ФИГ. 6 представляет собой схематичную диаграмму, показывающую оба ранее зарегистрированных циклических липопептида типа фенгицина и типа дегидроксифенгицина, вырабатываемых видами микробов, включая Bacillus amyloliquefaciens и Bacillus subtilis, и вновь идентифицированные молекулы (показанные жирным шрифтом) тип фенгицина и дегидроксифенгицина, вырабатываемые одним или обоими изолятами RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilus в соответствии с одним или более вариантами осуществления настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Термины «a», «an» и «the» при использовании в данной заявке, включая формулу изобретения, относятся к «одному или более». Таким образом, например, ссылка на «растение» включает множество растений, если в контексте явно не указано обратное.
На протяжении данного описания и формулы изобретения термины «содержат», «содержит» и «содержащий» используются в неисключительном смысле, за исключением, когда контекст требует иного. Также, термин «включают» и его грамматические варианты предназначен для неограничивающего применения, так что перечисление пунктов в списке не предназначено для исключения других подобных пунктов, которые могут быть замещены или добавлены к перечисленным пунктам.
Для целей данного описания и формулы изобретения термин «приблизительно» при использовании в связи с одним или более числами или цифровыми диапазонами, следует понимать в отношении ко всем данным числам, включая все числа в диапазоне, и изменяет этот диапазон, расширяя границы выше и ниже установленных численных значений. Перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает в себя все числа, напр., целые числа, включая их фракции, включенные в этот диапазон (например, перечисление от 1 до 5 включает 1, 2, 3, 4, и 5, а также их фракции, напр., 1,5, 2,25, 3,75, 4,1 и тому подобное) и любой диапазон в пределах данного диапазона.
Для целей данного описания и формулы изобретения термины «метаболит» и «соединение» используются взаимозаменяемо, при использовании в связи с соединениями, обладающими противомикробной активностью, которые вырабатываются штаммом RTI301 или другими штаммами Bacillus amyloliquefaciens.
В одном или более вариантах осуществления настоящего изобретения предоставлены композиции и способы улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений. В одном варианте осуществления предоставлена композиция для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит два или более совместимых микроорганизма, причем первый микроорганизм с противомикробными свойствами используется для создания ниши путем ингибирования роста и появления эндогенных микроорганизмов, присутствующих в почве или живущих в симбиозе с растением. Второй микроорганизм имеет полезные свойства для роста растений и/или жизнеспособности растений и совместим с ростом первого микроорганизма. Второй микроорганизм присутствует в количестве, достаточном для становления и улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений. Нанесение композиции на семена растений, корни растений или почву, окружающую растение способствует росту растений и/или жизнеспособности растений. Свойства второго микроорганизма, которые являются благотворными для роста растений и/или жизнеспособности растений, включают одно из увеличенного урожая растений, улучшенной всхожести, улучшенного развития корней, улучшенного роста растений, улучшенной жизнеспособности растений, улучшенного внешнего вида, повышенной устойчивости к растительным патогенам, уменьшенной патогенной инфекции или их комбинацию. Растительный патоген может включать одно или комбинацию насекомых, нематод, патогенных грибов растений или патогенных бактерий растений.
В другом варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает доставку в семена растения, корни растения или почву, окружающую растение, композиции, которая включает два или более совместимых микроорганизмов. Композиция содержит по меньшей мере одну биологически чистую культуру первого микроорганизма, обладающую противомикробными свойствами и присутствующую в количестве, подходящем для ингибирования роста эндогенных микроорганизмов, имеющихся в почве, окружающих или живущих в симбиозе с растением. Она предназначена для создания ниши для становления второго микроорганизма. Композиция также содержит по меньшей мере одну биологически чистую культуру второго микроорганизма, обладающую свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом рост второго микроорганизма совместим с ростом первого микроорганизма, и при этом второй микроорганизм присутствует в количестве, подходящем для становления и улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений. Доставка композиции в семена растений, корни растений или почву, окружающую растение, способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
Для облегчения процесса становления второго микроорганизма, рост второго микроорганизма может происходить быстрее, чем рост первого микроорганизма, и второй микроорганизм может отличаться фенотипом с быстрым ростом и высокой подвижностью бактерий.
Композиции и способы включают применение с любым типом растений, включая, например, однодольные, двудольные, зерновые, кукурузу, сахарную кукурузу, воздушную кукурузу, семенную кукурузу, силосную кукурузу, полевую кукурузу, рис, пшеницу, ячмень, сорго, спаржу, плод кофейного дерева, голубику, ежевику, малину, логанову ягоду, чернику, клюкву, крыжовник, бузину, смородину, ежемалину, кустовые ягоды, капустные овощи, брокколи, капусту, цветную капусту, брюссельскую капусту, листовую капусту, кормовую капусту, листовую горчицу, кольраби, тыквенные овощи, огурец, дыню-канталупу, дыню обыкновенную, мускусную дыню, тыкву большую столовую, арбуз, тыкву обыкновенную, баклажан, луковые овощи, лук, чеснок, лук-шалот, цитрусовые, апельсин, грейпфрут, лемон, мандарин, танжело, помело, плодовые овощи, перец, томат, физалис, мексиканский томат, бамию, виноград, травы/специи, листовые овощи, салат, сельдерей, шпинат, петрушку, радиккио, бобовые овощи (сочные и сушеные бобы и горох), бобы, зеленую фасоль, лущильные сорта фасоли, фасоль обыкновенную, соевые бобы, зрелую фасоль, нут, фасоль Лима, горох, нут обыкновенный, колотый горох, чечевицу, масличные культуры, канолу, клещевину, кокос, хлопок, лен, масличную пальму, оливу, арахис, рапсовое семя, сафлор, кунжут, подсолнечник, соевые бобы, семечковый плод, яблоню, яблоню лесную, грушу, айву, боярышник, корнеклубневые и стеблевые овощи, морковь, картофель, батат, маниоку, свеклу, имбирь, хрен, редьку, женьшень, репу, косточковые, абрикос, вишню, нектарин, персик, сливу, чернослив, клубнику, лесной орех, миндаль, фисташки, пекан, грецких орех, лещину, каштан, кешью, буковый орех, орех серый, макадамию, киви, банан, голубую агаву, травы, газонную траву, декоративные растения, пуансеттию, черенки лиственных пород, каштановые, дуб, клен, сахарный тростник или сахарную свеклу.
Первым микроорганизмом, обладающим противомикробными свойствами, и вторым микроорганизмом, обладающим свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений, для применения в композициях и способах настоящего изобретения могут быть микроорганизмы Bacillus spp. Термины «антагонистичный» и «противомикробный» используются в данном описании взаимозаменяемо для целей описания и формулы изобретения. Первым микроорганизмом может быть штамм Bacillus spp. а штаммом Bacillus spp. Может быть Bacillus amyloliquefaciens. Вторым микроорганизмом, обладающим свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений, может быть Bacillus subtilis. Полезными свойствами для роста растений и/или жизнеспособности растений могут быть одно или оба из способствующих росту свойств и антагонистических свойств для обеспечения защиты против патогенных инфекций растений и/или для лечения или борьбы с патогенными инфекциями растений.
Примеры первого микроорганизма, обладающего противомикробными свойствами, и второго микроорганизма, обладающего свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений, для применения в композициях и способах настоящего изобретения описаны ниже. Например, взаимодействующие с растениями бактерии, идентифицированные, как относящиеся к видам Bacillus subtilis, были выделены из корней Moringa oleifera, растущего в Северной Калифорнии, и в последующем протестированы на способствующие росту растений и антагонистические растительным патогенам свойства. Более конкретно, выделенный бактериальный штамм был идентифицирован, как новый штамм Bacillus subtilis через анализ последовательности высококонсервативной рРНК 16S и генов rpoB (см. Пример 1). Определили, что последовательность РНК 16S нового бактериального изолята (обозначенного «RTI477 Bacillus subtilis») является идентичной генетической последовательности рРНК 16S трех других известных штаммов Bacillus subtilis, штамма NS6 (KF177175) Bacillus amyloliquefaciens и штамма DSM 10 (NR_027552) Bacillus subtilis подвид subtilis. В дополнение было определено, что последовательность rpoB RTI477 имеет самый высокий уровень сходства последовательности с известными штаммами PY79 (CP006881) Bacillus subtilis или 6051-HGW (CP003329) Bacillus subtilis подвид subtilis (т.е. 99% идентичность последовательности; отличие 9 пар оснований) или BAB-1a (CP004405) Bacillus subtilis подвид subtilis (т.е. 99% идентичность последовательности; отличие 10 пар оснований). Отличия в последовательности для гена rpoB на уровне ДНК показывают, что RTI477 является новым штаммом Bacillus subtilis. Штамм RTI477 Bacillus subtilis был депонирован 17 апреля 2014 года в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Американской коллекции типовых культур (ATCC) в Манассасе, Виргиния, США и имеет учетный номер PTA-121167.
В качестве примера первого микроорганизма, обладающего противомикробными свойствами, взаимодействующие с растениями бактерии, идентифицированные, как относящиеся к видам Bacillus amyloliquefaciens, были выделены из почвы ризосферы винного винограда, растущего на винограднике в Нью-Йорке, и в последующем тестированы на антагонистические свойства к растительным патогенам. Более конкретно, выделенный бактериальный штамм был идентифицирован, как новый штамм Bacillus amyloliquefaciens через анализ последовательности высококонсервативной рРНК 16S и генов rpoB (см. Пример 2). Определили, что последовательность РНК 16S нового бактериального изолята (обозначенного «RTI301 Bacillus velezensis») является идентичной генетической последовательности рРНК 16S трех других известных штаммов Bacillus amyloliquefaciens, штамма NS6 (KF177175) Bacillus amyloliquefaciens, штамма FZB42 (NR_075005) Bacillus amyloliquefaciens и штамма DSM 10 (NR_027552) Bacillus subtilis подвид subtilis. Также определили, что генетическая последовательность rpoB штамма RTI301 имеет сходство последовательности с таким же геном у TrigoCor1448 (CP007244) Bacillus amyloliquefaciens подвид plantarum (99% идентичность последовательности; отличие 3 пары оснований); Bacillus amyloliquefaciens подвид plantarum AS43.3 (CP003838) (99% идентичность последовательности; отличие 7 пар оснований); CC178 (CP006845) Bacillus amyloliquefaciens (99% идентичность последовательности; отличие 8 пар оснований), и FZB42 (CP000560) Bacillus amyloliquefaciens (99% идентичность последовательности; отличие 8 пар оснований). Штамм RTI301 был идентифицирован в качестве Bacillus velezensis. Отличия в последовательности для гена rpoB на уровне ДНК показывают, что RTI301 является новым штаммом Bacillus velezensis. Штамм RTI301 Bacillus velezensis был депонирован 17 апреля 2014 года в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Американской коллекции типовых культур (ATCC) в Манассасе, Виргиния, США и имеет учетный номер PTA-121165.
Дальнейший анализ последовательности генома штамма RTI301 Bacillus velezensis выявил, что штамм имеет гены, связанные с лантибиотическим биосинтезом, для которых отсутствуют гомологи в других близкородственных штаммах RTI301 Bacillus velezensis (см. Пример 3). Это проиллюстрировано на фиг. 1, которая показывает схематичную диаграмму геномной организации уникального лантибиотического биосинтетического кластера обнаруженного в RTI301 Bacillus velezensis, и соответствующую область для двух известных референсных штаммов Bacillus amyloliquefaciens, FZB42 (средний) и TrigoCor1448 (нижний), показанных под штаммом RTI301. На фиг. 1 можно видеть, что у штаммов FZB42 и TrigoCor1448 отсутствует множество генов, имеющихся в данном кластере, и имеется низкая степень идентичности последовательности внутри ряда генов, которые имеются. BLASTn анализ данного кластера против неизбыточной (nr) нуклеотидной базе данных в NCBI показал высокую гомологию с 5' и 3' фланкирующими областями (аналог высокому % сходству на фиг. 1) в штаммах B. amyloliquefaciens. Однако, лантипептидный биосинтетический кластер был уникальным в RTI301, и в NCBI nr базе данных не обнаружено никакой значительной гомологии с какой-либо предыдущей секвенированной ДНК. Данные показывают, что вновь идентифицированный RTI301 имеет уникальный путь лантибиотического биосинтеза.
В дополнение, дальнейший анализ последовательности генома штамма RTI301 Bacillus velezensis выявил, что данный штамм имеет гены, связанные с большим числом путей биосинтеза продуцирования молекул, обладающих противомикробными свойствами. Они включают пути биосинтеза субтилизина, сурфактина, итурина, фенгицинов, амилоциклицина, диффицидина, бацилизина, бацилломицина и бациллаэна. В отличие от штамма RTI301 с широким диапазоном противомикробных путей биосинтеза, дальнейший анализ последовательности штамма RTI477 выявил, что данный штамм имеет гены, связанные с путями биосинтеза более ограниченной группы молекул, обладающих противомикробными свойствами. Штамм RTI477 имеет пути биосинтеза субтилизина, фенгицинов, сурфактина, диффицидина, бациллаэна, бацилизина и бацилломицина, но полные пути биосинтеза итуринов, лантибиотиков и амилоциклицинов не были обнаружены.
7
Проводили эксперименты для определения способствующей росту и антагонистической активности штаммов RTI301 и RTI477. Эксперименты, проводимые для определения способствующей росту и антагонистической активности штамма RTI477 Bacillus subtilis на различных растениях и в изменяющихся условиях, описаны в данном описании в примерах 4-6. Пример 4 описывает антагонистическую активность изолята RTI477 Bacillus subtilis против основных растительных патогенов при измерении в опытах с чашками. Пример 5 описывает измерение различных фенотипических признаков изолята RTI477 Bacillus subtilis и показывает, что данный изолят имеет фенотип с быстрым и сильным ростом бактерий. Пример 6 описывает способствующую росту активность изолята RTI477 у пшеницы. Пророщенные семена пшеницы инокулировали в течение 2 дней в суспензии ~2×10 КОЕ/мл штамма RTI477 и после этого выращивали в горшках. Фотографии извлеченных растений после 13 дней роста показаны на фиг. 2. ФИГ. 2A показывает контрольные растения, а ФИГ. 2B показывает растения, инокулированные RTI477. Определяли сухой вес всходов пшеницы с получением в результате общего среднего веса сухих растений равного 35,41 мг для растений, инокулированных штаммом RTI477 Bacillus subtilis по сравнению с весом, равным 33,38 мг, для неинокулированного контроля, что составляет 6% увеличение сухого веса над неинокулированным контролем для обработанных RTI477 растений.
Аналогично штамму RTI477 проводили эксперименты для определения способствующей росту и антагонистической активности штамм RTI301 velezensis на различных растениях и в изменяющихся условиях. Эти эксперименты описаны в данном описании в примерах 4-5. Пример 4 описывает антагонистическую активность изолята RTI301 velezensis против основных растительных патогенов при измерении в опытах с чашками. Штамм RTI301 показал превосходные антагонистические свойства против широкого диапазона патогенных микроорганизмов растений по сравнению со штаммом RTI477. Пример 5 описывает измерение различных фенотипических признаков изолята RTI301 velezensis. Следует заметить, что по сравнению с RTI301, RTI477 растет быстрее и имеет фенотип с сильным ростом бактерий на твердой среде.
Совместимость штамма RTI301 Bacillus velezensis с другими изолятами Bacillus тестировали посредством выявления штамма RTI301 на газоне различных других штаммов. Эти данные описаны в примере 7. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 3A-3B. Фиг. 3A-3B представляют собой фотографии, показывающие совместимость выращивания между штаммами RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis и отсутствие совместимости между штаммом RTI301 и другим штаммом Bacillus amyloliquefaciens, RTI472 Bacillus amyloliquefaciens, депонированным как PTA-121166 американской коллекцией типовых культур (ATCC). Когда штамм RTI301 покрывал пятнами газон штамма RTI472 (ФИГ. 3A), для роста штамма RTI472 обнаружена четкая зона ингибирования. В отличие от этого, когда штамм RTI301 покрывал пятнами газон штамма RTI477 (ФИГ. 3B), для штамма RTI477 обнаружено только минимальное ингибирование и отсутствие расчистки клеточного газона. Следовательно, было сделано заключение, что рост RTI301 и RTI477 является совместимым.
Не ограничиваясь каким-либо конкретным механизмом действия, предложен один следующий режим действия для объяснения наблюдаемого отличия совместимости штаммов. На основании геномной последовательности трех протестированных штаммов (т.е. RTI301, RTI472 и RTI477), спрогнозировали, что все эти штаммы продуцируют антагонистичные соединения бацилизина, бациллаэна, диффицидина и бацилломицина. Однако, в то время, как как RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis имеют ген для синтеза субтилизина, данный ген отсутствует в геноме RTI472 Bacillus amyloliquefaciens. Субтилизин представляет собой бактериоцин, класс белковоподобных токсинов, продуцируемых бактериями для ингибирования роста аналогичных или близкородственных бактериального штамма (штаммов). Следовательно, было задекларировано, что субтилизин, синтезируемый RTI301 Bacillus velezensis, мог быть ингибитором роста RTI472 Bacillus amyloliquefaciens. В отличие от этого, штамм RTI477 Bacillus subtilis не ингибируется RTI301, потому что штамм RTI477 продуцирует свой собственный субтилизин и таким образом является устойчивым к соединению.
Также анализировали различия морфологии штаммов между штаммами RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis. Фотографии, показывающие морфологию каждого из этих штаммов, показаны на фиг. 4: RTI301 Bacillus velezensis (ФИГ. 4A) и RTI477 Bacillus subtilis (ФИГ. 4B). морфология колоний штаммов RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis, показанная на фиг. 4A-4B, показывает потенциальное отличие поведения штаммов, когда доходит до подвижности. Подвижность является ключевым признаком для колонизации ризосферы связанными с растениями бактериями. RTI301 Bacillus velezensis растет в виде четко ограниченных круглых колоний. В отличие от этого, RTI477 Bacillus subtilis растет в виде рыхлой колонии, морфология которой является показателем роста бактерий на твердой среде и подвижности. Рост бактерий на твердой среде и подвижность являются релевантными фенотипами для быстрой колонизации ризосферы и поверхности корня растения. Снова, не ограничваясь каким-либо конкретным механизмом действия, было задекларировано, что фенотип с сильным ростом бактерий на твердой среде, связанный с морфологией штамма RTI477 Bacillus subtilis, является причиной того, что данный штамм является более эффективным колонизатором ризосферы, чем RTI301 Bacillus velezensis.
6
7
8
6
6
В свете совместимости выращивания и наблюдаемого отличия в фенотипе, тестировали комбинацию штаммов RTI301 и RTI477 на ее способность способствовать росту и жизнеспособности растений. Проводили эксперименты для определения влияния применения штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis отдельно и в комбинации, на прорастание семян соевых бобов, развитие корней и ранний рост растений. Эксперименты проводили, как описано в примере 8, с использованием спор RTI301 и RTI477. Комбинации спор RTI301 и RTI477 добавили к семенам в соотношениях 1:3, 1:1 и 3:1. Данные показаны в таблице V. Инокуляция семян соевых бобов RTI301 Bacillus velezensis в концентрациях 1×10, 1×10 и 1×10 имела отсутствие эффекта на рост растений и развитие и архитектуру корней. Инокуляция семян соевых бобов RTI477 Bacillus subtilis в таких же концентрациях предоставило только незначительное улучшение при самой низкой концентрации на развитие и архитектуру корней. Однако инокуляция семян соевых бобов комбинацией обоих RTI301 и RTI477 (при соотношении 1:3) во всех тестируемых концентрациях привела к улучшению развития корней и раннего роста растений. Наилучшие результаты в развитии корней обнаружили при использовании RTI301 и RTI477 в сстотношении 3:1 в концентрации 1×10 КОЕ/мл. Фотографии положительного действия инокуляции семян спорами RTI301 плюс RTI477 в данном соотношении 3:1 показаны на фиг. 5A и 5B (A - Контрольные растения; B - растения, инокулированные RTI301 плюс RTI477 (отношение 3:1) при 10 КОЕ/мл). Влияние было особенно положительным в отношении формирования и архитектуры корней, как показано на фиг. 5A-5B. Мелкие корневые волоски являются важными для всасывания воды, питательных веществ и взаимодействия растения с другими микроорганизмами в ризосфере. Эти результаты показывают, что в то время, как нанесение отдельных штаммов не оказывало или мало влияло по сравнению с контрольными растениями, обработка семян нанесением комбинации штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis обеспечило более чем ожидаемую пользу для раннего роста и укоренения соевых бобов. Обнаружено синергетическое влияние комбинации штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis, которое обеспечивало неожиданную пользу для роста растений.
+5
+5
+5
Дополнительный эксперимент на сое провели для исследования влияния обработки семян комбинацией штаммов RTI301 и RTI477 на урожай. Эксперимент был поставлен следующим образом: 1) семена не обрабатывали; 2) семена обрабатывали комбинацией CruiserMaxx (тиаметоксам, флудиоксонил плюс металаксил-M; SYNGENTA CROP PROTECTION, INC) и тиофанатметилом, что представляет собой типичную обработку семян сои (комбинация CruiserMaxx и тиофанатметила называется «CHEM CONTROL»); 3) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс инокулировали 5,0×10 КОЕ/семя штамма RTI301; 4) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс инокулировали 5,0×10 КОЕ/семя штамма RTI477; 5) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс инокулировали комбинацией обоих штаммов с 5,0×10 КОЕ/семя. Провели десять испытаний на 10 независимых участках, и результаты урожая сои (бушелей на акр) представлены в таблице VI. Результаты в таблице VI показывают, что инокуляция либо RTI301 Bacillus velezensis, либо только RTI477 Bacillus subtilis имело отсутствие действия на общий урожай сои по сравнению с семенами, которые обрабатывали только CHEM CONTROL. Как обнаружили в предыдущем эксперименте, инокуляция комбинацией RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis обеспечивала синергетическое влияние и привела к 5% увеличению урожая сои (с 58,2 до 61,1 бушелей на акр). Комбинация штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis обеспечила неожиданную пользу для урожая сои.
+5
ПРИМЕР 9 описывает пользу обработки семян комбинацией штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis для кукурузы. Для эксперимента на кукурузе данные суммированы в таблице VII, а порядок был следующим: 1) семена не обрабатывали («UTC»); 2) семена обрабатывали комбинацией 3 наиболее часто применяемых химических активных агентов, называемых «CHEM CONTROL» или «CC»); и 3) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс комбинацией 5,0×10 КОЕ/семя каждого из штаммов RTI301 и RTI477 («CC+RTI 301/477 1:1»). Два испытания проводили в условиях естественного инфекционного фона или инокуляции почвы Rhizoctonia. Следует заметить, что увеличение урожая на 10,7 бушелей на акр и 59,8 бушелей на акр обнаружено для комбинации RTI301 и RTI477 1:1 плюс химический контроль по сравнению с одним химическим контролем для естественного инфекционного фона и полевых испытаний с инокуляцией Rhizoctonia, соответственно. Эти данные показывают, что обработка семян комбинацией этих штаммов может приводить к очень большому увеличению урожая кукурузы.
+5
ПРИМЕР 10 описывает эксперименты, показывающие влияние на появление всходов и урожай сои при обработке семян комбинацией штаммов RTI301 и RTI477 в дополнение к химическим активным агентам для борьбы с патогенами. В частности, эксперимент на сое был поставлен следующим образом: 1) семена не обрабатывали (UTC); 2) семена обрабатывали комбинацией 3 наиболее часто применяемых химических активных агентов, называемых «CHEM CONTROL»); 3) семена обрабатывали VIBRANCE (действующее вещество Sedaxane; SYNGENTA CROP PROTECTION, INC; и 4) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс 5,0×10 КОЕ/семя каждого из штаммов RTI301 и RTI477. Провели два испытания, в которых семена растений при посеве инокулировали Rhizoctonia solani. Результаты в таблице VIII показывают, что обработка комбинацией RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis в дополнение к CHEM CONTROL приводила к повышению урожая в среднем на 13,3 бушелей на акр больше, чем только CHEM CONTROL (с 59,4 до 72,7 бушелей на акр). Таким образом, обработка семян комбинацией RTI301 и RTI477 обеспечивает значительное улучшение урожая сои даже в условиях тяжелого инфекционного фона.
12
12
3
3
3
3
3
3
3
ПРИМЕР 11 описывает пользу капельного орошения комбинацией штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis для тыквы большой столовой, томата и перца. Влияние заболевания, вызванное почвенными грибами, не было зарегистрировано ни для одного из испытаний. В испытании с тыквой большой столовой споры вносили в норме 3,75×10КОЕ/гектар для RTI301 Bacillus velezensis и 0,625×10КОЕ/гектар для RTI477 Bacillus subtilis во время посева посредством проливания корневой зоны без дальнейшего нанесения посредством капельного орошения. ACCOMPLISH LM (LOVELAND PRODUCTS) использовали в качестве коммерческого контроля и наносили таким же образом, как описано для комбинации RTI301+RTI477 в норме 2340 мл/га. Данный продукт содержит смесь Acidovorax facilis (1×10КОЕ/мл), Bacillus licheniformis (1×10КОЕ/мл), Bacillus subtilis (1×10КОЕ/мл), Bacillus oleronius (1×10КОЕ/мл), Bacillus marinus (1×10КОЕ/мл), Bacillus megaterium (1×10КОЕ/мл) и Rhodococcus rhodochrous (1×10КОЕ/мл). Добавление спор RTI301 плюс RTI477 привело к увеличению как общего, так и товарного урожая для тыквы большой столовой по сравнению с необработанными контрольными растениями, у которых бактериальные споры не были включены в пропитку, а также по сравнению с растениями коммерческого контроля. В частности, у обработанных RTI301+RTI477 растений получили всего 873,4 кг/га тыквы большой столовой по сравнению с 838,3 кг/га и 836,1 кг/га для необработанных контрольных растений и растений, обработанных ACCOMPLISH, соответственно, обеспечив соответствующее увеличение массы всей тыквы большой столовой на 4,2% и 4,5%. Увеличение общей массы растений тыквы большой столовой, обработанных спорами RTI301 Bacillus velezensis плюс RTI477 Bacillus subtilis по отношению к необработанным контрольным растениям и растениям обработанным коммерческим стандартом, демонстрирует положительное действие на рост, обеспеченное данной обработкой.
12
12
В испытании на томатах споры наносили в норме 0,625×10КОЕ/гектар для RTI301 Bacillus velezensis и 3,75×10КОЕ/гектар для RTI477 Bacillus subtilis во время посева посредством проливания корневой зоны, с последующим двумя нанесениями в виде капельного орошения в такой же норме через 17 и через 35 дней после высадки. ACCOMPLISH LM использовали в качестве коммерческого контроля и вносили таким же образом, как описано для комбинации RTI301+RTI477 в норме 2340 мл/га. Добавление спор RTI301 плюс RTI477 приводило к увеличению как общего, так и товарного урожая для томатов по сравнению с необработанными контрольными растениями, у которых бактериальные споры не были включены в пропитку и орошение, а также по сравнению с коммерческими контрольными растениями. В частности, у растений, обработанных RTI301+RTI477, получили всего 21824 кг/га товарных томатов по сравнению с 16765 кг/га и 21420 кг/га для необработанных контрольных растений и растений, обработанных ACCOMPLISH, соответственно, обеспечив соответствующее увеличение массы товарных томатов на 30,2% и 1,9%. Существенное увеличение массы товарных томатов у растений, обработанных RTI301 Bacillus velezensis плюс RTI477 Bacillus subtilis споры, демонстрирует положительный эффект роста, обеспеченный данной обработкой, особенно по сравнению с необработанными контрольными растениями.
12
В испытании на перце (перец халапеньо) споры наносили в норме 1,25×10КОЕ/гектар на штамм обоих RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis во время посева посредством проливания корневой зоны, с последующим двумя нанесениями в виде капельного орошения в такой же норме через 17 и через 35 дней после высадки. ACCOMPLISH LM использовали в качестве коммерческого контроля и вносили таким же образом, как описано для комбинации RTI301+RTI477, в норме 2340 мл/га. Добавление спор RTI301 плюс RTI477 привело к повышению урожая для перца халапеньо по сравнению с необработанными контрольными растениями, у которых бактериальные споры не вносили, а также по сравнению с коммерческими контрольными растениями. В частности, у растений, обработанными RTI301+RTI477, получили всего 4154 кг/га товарного перца по сравнению с 3455 кг/га и 3930 кг/га для необработанных контрольных растений и растений, обработанных ACCOMPLISH, соответственно, обеспечив соответствующее увеличение массы товарного перца на 20% и 5,7%. Существенное увеличение массы товарного перца у растений, обработанных спорами RTI301 Bacillus velezensis плюс RTI477 Bacillus subtilis, по отношению к необработанным контрольным растениям и растениям, обработанным промышленным стандартом, демонстрирует положительное действие на рост, обеспеченное данной обработкой.
3
3
Противомикробные метаболиты, продуцируемые штаммами RTI301 и FTI477, идентифицированы в примере 12 и проиллюстрированы на фиг. 6. Пример 12 описывает исследование циклических липопептидов, фенгицинов и дегидроксифенгицинов, продуцируемых штаммами RTI301 и RTI477, и неожиданно, идентификацию некоторых ранее не зарегистрированных классов данных молекул. Было определено, что RTI301 Bacillus velezensis продуцирует ранее зарегистрированные соединения фенгицина A, B и C и соединения дегидроксифенгицина A, B и C. Неожиданно, в дополнение к этим известным соединениям, было определено, что штамм RTI301 также продуцирует ранее неидентифицированные производные данных соединений, причем L-изолейцин в положении 8 цепи циклического пептида (обозначено X на фиг. 6) замещен L-метионином. Новые классы фенгицина и дегидроксифенгицина обозначены в данном описании как MA, MB и MC, со ссылкой на производные классов A, B и C, в которых L-изолейцин в X на фиг. 6 замещен L-метионином. Вновь идентифицированные молекулы показаны на фиг. 6 и в таблице IX жирным шрифтом. Вновь идентифицированные соединения фенгицин MA, MB и MC также обнаружили для штамма RTI477, однако соответствующие соединения дегидроксифенгицин MA, MB и MC для штамма RTI477 не обнаружили (см. Таблица IX).
3
Дополнительно определили, что штамм RTI301 продуцирует дополнительный класс фенгицина и дегидроксифенгицина, которые не были ранее идентифицированы. В данном классе L-изолейцин фенгицина B и дегидроксифенгицина B (положение X на фиг. 6) замещен L-гомоцистеином (Hcy). Эти ранее неидентифицированные метаболиты фенгицина и дегидроксифенгицина обозначены в данном описании как фенгицин H и дегидроксифенгицин H и показаны на фиг. 6 и в таблице IX. Вновь идентифицированное соединение фенгицин H также обнаружили для штамма RTI477, однако соответствующее соединение дегидроксифенгицин H для штамма RTI477 не обнаружили (Таблица IX).
1
Дополнительно определили, что штамм RTI301 продуцирует дополнительный ранее неидентифицированный класс метаболитов фенгицина и дегидроксифенгицина. В данном классе аминокислота в положении 4 каркасной структуры циклического пептида (положение X на фиг. 6) замещена L-изолейцином. Эти ранее неиднтифицированные метаболиты обозначены в данном описании как фенгицин I и дегидроксифенгицин I и показаны на фиг. 6 и в таблице IX. Вновь идентифицированные соединения фенгицин I и дегидроксифенгицин I также обнаружили для штамма RTI477 (Таблица IX).
Таким образом, в композициях и способах настоящего изобретения Bacillus amyloliquefaciens, обладающая противомикробными свойствами, может представлять собой RTI301 Bacillus velezensis, депонированный как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками. Аналогично, Bacillus subtilis, обладающая полезными свойствами для роста и/или жизнеспособности растений, может представлять собой RTI477 Bacillus subtilis, депонированный как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками. В композициях и способах настоящего изобретения, растением может быть соя или кукуруза, и польза для роста растений может быть продемонстрирована посредством увеличенного урожая.
В одном варианте осуществления предоставлена композиция, имеющая два или более совместимых микроорганизмов для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит: по меньшей мере одну биологически чистую культуру первого микроорганизма, обладающего противомикробными свойствами и присутствующего в количестве, подходящем для ингибирования роста эндогенных микроорганизмов, имеющихся в почве, окружающих или живущих в симбиозе с растением; и по меньшей мере одну биологически чистую культуру второго микроорганизма, обладающего свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом рост второго микроорганизма совместим с ростом первого микроорганизма, и при этом второй микроорганизм присутствует в количестве, достаточном для становления и улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом нанесение композиции на семена растений, корни растений, или почву, окружающую растение, способствует росту растений и/или жизнеспособности растений. Свойства второго микроорганизма, которые являются благотворными для роста растений и/или жизнеспособности растений, включают одно из увеличенного урожая растений, улучшенной всхожести, улучшенного развития корней, улучшенного роста растений, улучшенной жизнеспособности растений, улучшенного внешнего вида, повышенной устойчивости к растительным патогенам, уменьшенной патогенной инфекции или их комбинацию. Растительный патоген может включать одно или комбинацию насекомых, нематод, патогенных грибов растений или патогенных бактерий растений.
В одном варианте осуществления предоставлена композиция для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит: биологически чистую культуру RTI301 Bacillus velezensis, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и биологически чистую культуру RTI477 Bacillus subtilis, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками, имеющейся в количестве, подходящем для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений. Нанесение композиции на семена растений, корни растений или почву, окружающую растение способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
Как используется в данном описании, фраза «биологически чистая культура бактериального штамма» относится к одному или комбинации: спор биологически чистой ферментационной культуры бактериального штамма, вегетативным клеткам биологически чистой ферментационной культуры бактериального штамма, одному или более продуктам биологически чистой ферментационной культуры бактериального штамма, сухим веществам биологически чистой ферментационной культуры бактериального штамма, супернатанту биологически чистой ферментационной культуры бактериального штамма, экстракту биологически чистой ферментационной культуры бактериального штамма и одному или более метаболитов биологически чистой ферментационной культуры бактериального штамма.
В одном варианте осуществления композиции представлены в виде посевной матрицы. Посевная матрица может быть в виде горшечной смеси.
В одном варианте осуществления композиции дополнительно содержат одно или комбинацию носителя, диспергатора или дрожжевого экстракта.
В одном варианте осуществления композиции дополнительно содержат один или комбинацию микробного, биологического или химического инсектицида, фунгицида, нематоцида, бактериоцида, гербицида, растительного экстракта, регулятора роста растений или удобрения, имеющихся в количестве, подходящем для улучшения роста растений и/или для обеспечения защиты против патогенной инфекции у растения.
В одном варианте осуществления композиция для улучшения роста растений содержит: биологически чистую культуру RTI301 Bacillus velezensis, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; биологически чистую культуру RTI477 Bacillus subtilis, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и инсектицид бифентрин.
В одном варианте осуществления композиция для улучшения роста растений содержит: биологически чистую культуру RTI301 Bacillus velezensis, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; биологически чистую культуру RTI477 Bacillus subtilis, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и инсектицид бифентрин, при этом композиция находится в готовой форме, совместимой с жидким удобрением. Готовая форма, совместимая с жидким удобрением, может содержать гидратированный силикат алюминия и магния и по меньшей мере один диспергатор. Инсектицид бифентрин может присутствовать в концентрации, варьирующей от 0,1 г/мл до 0,2 г/мл. Инсектицид бифентрин может присутствовать в концентрации приблизительно 0,1715 г/мл. Термин «в готовой форме, совместимой с жидким удобрением», как используется во всем описании и формуле изобретения, предназначен для обозначения, что готовая форма способна растворяться или диспергироваться или эмульгироваться в водном растворе, обеспечивая возможность смешивания с удобрением для доставки в растения в жидкой готовой форме.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает доставку в семена растения, корни растения или почву, окружающую растение, композиции, содержащей: по меньшей мере одну биологически чистую культуру первого микроорганизма, обладающего противомикробными свойствами и присутствующего в количестве, подходящем для ингибирования роста эндогенных микроорганизмов, имеющихся в почве, окружающих или живущих в симбиозе с растением; и по меньшей мере одну биологически чистую культуру второго микроорганизма, обладающего свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом рост второго микроорганизма совместим с ростом первого микроорганизма, и при этом второй микроорганизм присутствует в количестве, подходящем для становления и улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом доставка композиции способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает доставку в семена растения, корни растения или почву, окружающую растение, композиции, содержащей: биологически чистую культуру RTI301 Bacillus velezensis, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и биологически чистую культуру RTI477 Bacillus subtilis, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками, при этом доставка композиции способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает: доставку в семена растения, корни растения или почву, окружающую растение, комбинации: первой композиции, содержащей биологически чистую культуру RTI301 Bacillus velezensis, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и второй композиции, содержащй биологически чистую культуру RTI477 Bacillus subtilis, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками, при этом доставка комбинации способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
8
12
8
12
8
12
Композиции, содержащие микроорганизмы, могут быть в форме жидкости, масляной дисперсии, порошкообразного вещества, сухого смачивающегося порошка, сыпучих гранул или сухих смачивающихся гранул. Микроорганизмы могут присутствовать в виде спор или вегетативных клеток. Композиция может быть в форме жидкости, а каждый из RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis может присутствовать в концентрации от приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл до приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл. Композиция может быть в форме порошкообразного вещества, сухого смачивающегося порошка, сыпучих гранул или сухих смачивающихся гранул, а каждый из RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis может присутствовать в количестве от приблизительно 1,0×10 КОЕ/г до приблизительно 1,0×10 КОЕ/г. Композиция может быть в форме масляной дисперсии, а каждый из RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis может присутствовать в концентрации от приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл до приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл.
Композиции, содержащие микроорганизмы, могут дополнительно содержать один или комбинацию носителя, диспергатора или дрожжевого экстракта.
В одном варианте осуществления предоставлены семена растения, которые покрывают композицией, имеющей два или более совместимых микроорганизмов для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений. Композиция покрытия содержит споры по меньшей мере одной биологически частой культуры первого микроорганизма, обладающего противомикробными свойствами и присутствующего в количестве, подходящем для ингибирования роста эндогенных микроорганизмов, имеющихся в почве, окружающих или живущих в симбиозе с растением. Композиция также содержит споры по меньшей мере одной биологически частой культуры второго микроорганизма, обладающего свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом рост второго микроорганизма совместим с ростом первого микроорганизма, и при этом второй микроорганизм присутствует в количестве, достаточном для становления и улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлены семена растения, покрытые композицией для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит: споры биологически чистой культуры RTI301 Bacillus velezensis, депонированной как ATCC № PTA-121165, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; и споры биологически чистой культуры RTI477 Bacillus subtilis, депонированной как ATCC № PTA-121167, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками, имеющиеся в количестве, подходящем для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений.
2
9
В одном варианте осуществления каждый из RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis присутствует в количестве, варьирующем от приблизительно 1,0×10 КОЕ/семя до приблизительно 1,0×10 КОЕ/семя.
В одном варианте осуществления семена растения дополнительно содержат одно или комбинацию микробного, биологического или химического инсектицида, фунгицида, нематоцида, бактериоцида, гербицида, растительного экстракта, регулятора роста растений или удобрения, имеющихся в количестве, подходящем для улучшения роста растений и/или для обеспечения защиты против патогенной инфекции у растения. В одном варианте осуществления инсектицидом является бифентрин.
В одном варианте осуществления предоставлены семена растения, при этом семена растения покрыты композицией для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит: споры биологически чистой культуры RTI301 Bacillus velezensis, депонированной как ATCC № PTA-121165, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; споры биологически чистой культуры RTI477 Bacillus subtilis, депонированной как ATCC № PTA-121167, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; и инсектицид бифентрин.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает посев семян растения в подходящую ростовую среду, при этом семена были покрыты композицией, содержащей споры по меньшей мере одной биологически частой культуры первого микроорганизма, обладающего противомикробными свойствами и присутствующего в количестве, подходящем для ингибирования роста эндогенных микроорганизмов, имеющихся в почве, окружающих или живущих в симбиозе с растением; и споры по меньшей мере одной биологически частой культуры второго микроорганизма, обладающего свойствами улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом рост второго микроорганизма совместим с ростом первого микроорганизма, и при этом второй микроорганизм присутствует в количестве, подходящем для становления и улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает посев семян растения в подходящую ростовую среду, при этом семена были покрыты композицией, содержащей: споры биологически чистой культуры RTI301 Bacillus velezensis, депонированной как ATCC № PTA-121165, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; и споры биологически чистой культуры RTI477 Bacillus subtilis, депонированной как ATCC № PTA-121167, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками, при этом покрытие, содержащее споры RTI301 и RTI477, способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
Семенами с покрытием настоящего изобретения могут быть семена большого множества растений, включая, например, семена однодольных, двудольных, зерновых, кукурузы, сахарной кукурузы, воздушной кукурузы, семенной кукурузы, силосной кукурузы, полевой кукурузы, риса, пшеницы, ячменя, сорго, капустных овощей, брокколи, капусты, цветной капусты, брюссельской капусты, листовой капусты, кормовой капусты, листовой горчицы, кольраби, луковых овощей, лука, чеснока, лука-шалота, плодовых овощей, перца, томата, физалиса, мексиканского томата, бамии, винограда, трав/специй, тыквенных овощей, огурца, дыни-канталупы, дыни обыкновенной, мускусной дыни, тыквы большой столовой, арбуза, тыквы обыкновенную, баклажана, листовых овощей, салата, сельдерея, шпината, петрушки, радиккио, бобовых овощей (сочных и сушеных бобов и гороха), бобов, зеленой фасоли, лущильных сортов фасоли, фасоли обыкновенной, соевых бобов, зрелой фасоли, нута, фасоли Лима, гороха, нута обыкновенного, колотого гороха, чечевицы, масличных культур, канолы, клещевины, хлопка, льна, арахиса, рапса, сафлора, кунжута, подсолнечника, соевых бобов, корнеклубневых и стеблевых овощей, моркови, картофеля, батата, свеклы, имбиря, хрена, редьки, женьшеня, репы, сахарного тростника, сахарной свеклы, трав и газонной травы.
Cеменами растений с покрытием могут быть кукуруза или соевые бобы, а польза для роста растений может быть продемонстрирована в виде увеличенного урожая.
Для семян растений с покрытием свойства второго микроорганизма, полезные для роста растений и/или жизнеспособности растений, включают одно или более из увеличенного урожая, улучшенной всхожести, улучшенного развития корней, улучшенного роста растений, улучшенной жизнеспособности растений, улучшенного внешнего вида, повышенной устойчивости к растительным патогенам или уменьшенной патогенной инфекции или их комбинацию. Растительный патоген может включать одно или комбинацию насекомых, нематод, патогенных грибов растений или патогенных бактерий растений.
2
9
Первым и вторым микроорганизмами композиции покрытия семян растения могут быть микроорганизмы Bacillus spp. Рост второго микроорганизма может происходить быстрее, чем рост первого микроорганизма, и второй микроорганизм может отличаться фенотипом с быстрым ростом и высокой подвижностью бактерий. Вторым микроорганизмом может быть Bacillus subtilis. Первым микроорганизмом может быть Bacillus amyloliquefaciens, а вторым микроорганизмом может быть Bacillus subtilis. Bacillus amyloliquefaciens может представлять собой RTI301 Bacillus velezensis, депонированный как ATCC № PTA-121165, или его мутант, обладающий всеми определяющими его характеристиками. Bacillus subtilis может представлять собой RTI477 Bacillus subtilis, депонированный как ATCC № PTA-121167, или его мутант, обладающий всеми определяющими его характеристиками. Композиция, наносимая на семена растений, может содержать количество спор каждого из первого микроорганизма и второго микроорганизма от приблизительно 1,0×10 КОЕ/семя до приблизительно 1,0×10 КОЕ/семя.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает посев семян растения в подходящую ростовую среду, при этом семена были покрыты композицией, содержащей: споры биологически чистой культуры RTI301 Bacillus velezensis, депонированной как ATCC № PTA-121165, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками; и споры биологически чистой культуры RTI477 Bacillus subtilis, депонированной как ATCC № PTA-121167, или ее мутанта, обладающего всеми определяющими ее характеристиками, имеющиеся в количестве, подходящем для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлена композиция для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом композиция содержит: один или более химически активных агентов, обладающих одним или обоими антибактериальным или противогрибковым свойствами и присутствующих в количестве, подходящем для ингибирования роста эндогенных микроорганизмов, имеющихся в почве, окружающих или живущих в симбиозе с растением; и по меньшей мере одну биологически чистую культуру микроорганизма, обладающего свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений. Рост микроорганизма совместим с химически активным агентом, и микроорганизм присутствует в количестве, подходящем для становления и улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений. Нанесение композиции на семена растений, корни растений или почву, окружающую растение способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
В одном варианте осуществления предоставлен способ улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, при этом способ включает доставку в семена растения, корни растения или почву, окружающую растение, комбинации: одного или более химически активных агентов, обладающих одним или обоими антибактериальным или противогрибковым свойствами, имеющихся в количестве, подходящем для ингибирования роста эндогенных микроорганизмов, имеющихся в почве, окружающих или живущих в симбиозе с растением; и композиции, содержащей по меньшей мере одну биологически чистую культуру микроорганизма, обладающего свойствами, полезными для роста растений и/или жизнеспособности растений. Рост микроорганизма совместим с химически активным агентом или, в случае несовместимости, микроорганизм доставляется после доставки химически активного агента. Микроорганизм присутствует в количестве, подходящем для становления и улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, так что доставка комбинации химически активного агента и микроорганизма способствует росту растений и/или жизнеспособности растений. В случае, когда один или более химически активных агентов и микроорганизм совместимы, один или более химически активных агентов могут быть составлены вместе с композицией, которая содержит микроорганизм. Доставка комбинации химически активного агента и микроорганизма в семена растений, корни растений или почву, окружающую растение, способствует росту растений и/или жизнеспособности растений.
Для композиции и способа, включающих один или более химически активных агентов, свойства микроорганизма, полезные для роста растений и/или жизнеспособности растений, могут состоять из увеличенного урожая, улучшенной всхожести, улучшенного развития корней, улучшенного роста растений, улучшенной жизнеспособности растений, улучшенного внешнего вида, повышенной устойчивости к растительным патогенам, уменьшенной патогенной инфекции или их комбинации. Растительные патогены могут включать одно или комбинацию насекомых, нематод, патогенных грибов растений или патогенных бактерий растений.
Один или более химически активных агентов для создания ниши могут включать, например, но без ограничения, стробилурин, триазол, флутриафол, тебуконазол, протиаконазол, экспоксиконазол, фторпирам, хлорталонил, тиофанатметил, медьсодержащий фунгицид, фунгицид гидроксид меди, содержащий EDBC фунгицид, манкозеб, фунгицид сукцинат дегидрогеназа (SDHI), биксафен, ипродион, диметоморф или валифеналат. В другом примере один или более химически активных агентов могут включать фумигант, такую как, например, хлорпикрин, дазомет, 1,3-дихлорпроpен (Телон), диметил дисульфид, метам натрия/калия, метил бромид.
8
12
8
12
8
12
Композиция может быть в форме жидкости, масляной дисперсии, порошкообразного вещества, сухого смачивающегося порошка, сыпучих гранул или сухих смачивающихся гранул. Полезный микроорганизм может присутствовать в виде спор или вегетативных клеток. Полезным микроорганизмом может быть Bacillus spp. Полезным микроорганизмом может быть Bacillus subtilis. Микроорганизмом может быть Bacillus subtilis, отличающаяся фенотипом с быстрым ростом и высокой подвижностью бактерий. Микроорганизмом может быть RTI477 Bacillus subtilis, депонированный как ATCC № PTA-121167, или его мутант, обладающий всеми определяющими его характеристиками. Композиция может быть в форме жидкости, а полезным микроорганизмом может быть RTI477 Bacillus subtilis, присутствующий в концентрации от приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл до приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл. Композиция может быть в форме порошкообразного вещества, сухого смачивающегося порошка, сыпучих гранул или сухих смачивающихся гранул, а RTI477 Bacillus subtilis может присутствовать в количестве от приблизительно 1,0×10 КОЕ/г до приблизительно 1,0×10 КОЕ/г. Композиция может быть в форме масляной дисперсии, а RTI477 Bacillus subtilis может присутствовать в концентрации от приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл до приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл.
В композициях и способах, имеющих два или более совместимых микроорганизмов настоящего изобретения для улучшения роста растений и/или жизнеспособности растений, композиции могут дополнительно содержать один или комбинацию микробного, биологического или химического инсектицида, фунгицида, нематоцида, бактерицида, гербицида, растительного экстракта, регулятора роста растений или удобрения, имеющихся в количестве, подходящем для улучшения роста растений и/или для обеспечения защиты против патогенной инфекции у растения.
В одном варианте осуществления фунгицид может содержать экстракт из Lupinus albus doce. В одном варианте осуществления фунгицид может включать BLAD полипептид. BLAD полипептид может представлять собой фрагмент встречающегося в природе запасного белка семян из сладкого люпина (Lupinus albus doce), который воздействует на восприимчивые патогенные грибы, вызывая повреждение на клеточной стенке гриба и разрушая внутреннюю клеточную мембрану. Композиции могут включать приблизительно 20% BLAD полипептида.
В одном варианте осуществления инсектицидом может быть бифентрин. Нематоцидом может быть кадусафос. Композиция может быть в готовой форме в виде жидкости, порошка, смачиваемых растворимых гранул или в виде сыпучих гранул. Инсектицидом может быть бифентрин и клотианидин. Инсектицидом может быть бифентрин и клотианидин, а композиция может быть составлена совместимой с жидким удобрением. Инсектицидом может быть бифентрин или зета-циперметрин.
Нематоцидом может быть кадусафос. Инсектицидом может быть бифентрин и клотианидин. Композиция может быть в готовой форме в виде жидкости, а инсектицидом может быть бифентрин или зета-циперметрин.
В одном варианте осуществления способ может дополнительно включать внесение жидкого удобрения в: почву или ростовую среду, окружающую растение; почву или ростовую среду перед посевом семян растений в почву или ростовую среду; или почву или ростовую среду перед посадкой растений в почву или ростовую среду.
В варианте осуществления композиция бифентрина может содержать: бифентрин; гидратированный силикат алюминия и магния; и по меньшей мере один диспергатор, выбранный из сложного эфира сахарозы, лигносульфoната, алкилполигликозида, конденсата формальдегида нафталенсульфоновой кислоты и фосфатного эфира.
Бифентрин предпочтительно может иметься в концентрации от 1,0% по весу до 35% по весу, более конкретно от 15% по весу до 25% по весу на основании общего веса всех компонентов в композиции. Композиция инсектицида бифентрина может быть в жидкой готовой форме в концентрации, варьирующей от 0,1 г/мл до 0,2 г/мл. Инсектицид бифентрин может быть в жидкой готовой форме в концентрации приблизительно 0,1715 г/мл.
Диспергатор или диспергаторы предпочтительно могут иметься в общей концентрации от приблизительно 0,02% по весу до приблизительно 20% по весу на основании общего веса всех компонентов в композиции.
В некоторых вариантах осуществления гидратированный силикат алюминия и магния может быть выбран из группы, состоящей из монтмориллонита и аттапульгита.
В некоторых вариантах осуществления фосфатный эфир может быть выбран из фосфатного эфира нонилфенола и калийной соли этоксилированного фосфата тридецилового спирта.
Другие варианты осуществления могут дополнительно содержать по меньшей мере одно из противозамерзающего агента, противопенного агента и биоцида.
В одном варианте осуществления предоставлена композиция для улучшения роста растений, при этом композиция содержит: биологически чистую культуру RTI301 Bacillus velezensis, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; биологически чистую культуру RTI477 Bacillus subtilis, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; и инсектицид, при этом композиция находится в готовой форме, совместимой с жидким удобрением. Инсектицидом может быть одно или комбинация пиретроидов, бифентрина, тефлутрина, зета-циперметрина, фосфорорганических соединений, хлорэтоксифоса, хлорпирифоса, тебупиободфоса, цифлутрина, фипролов, фипронила, никотиноидов или клотианидина. Инсектицидом может быть бифентрин. Композиция может включать инсектицид бифентрин и гидратированный силикат алюминия и магния и по меньшей мере один диспергатор. Инсектицид бифентрин может присутствовать в концентрации, варьирующей от 0,1 г/мл до 0,2 г/мл. Инсектицид бифентрин может присутствовать в концентрации приблизительно 0,1715 г/мл.
В дополнение, пригодные инсектициды, гербициды, фунгициды, и нематоциды композиций и способов настоящего изобретения могут включать следующее:
Инсектициды: A0) различные инсектициды, в том числе агригата, фосфид алюминия, амблисейус, афелинус, афидиус, афидолетес, артемизинин, NPV калифорнийской совки, азоциклотин, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis-spp. aizawai, Bacillus thuringiensis spp. kurstaki, Bacillus thuringiensis, Beauveria, Beauveria bassiana, бета-цифлутрин, биопрепараты, бисультап, брофлутринат, бромофосэтил, бромопропилат, биотехнологическая кукуруза генно-модифицированная, биотехнологическая соя генно-модифицированная, капсаицин, картап, экстракт древогубца, хлорантранилипрол, хлорбензурон, хлорэтоксифос, хлорфлуазурон, хлорпирифосэтил, книдиадин, криолит, цианофос, циантранилипрол, цигалотрин, цигексатин, циперметрин, dacnusa, DCIP, дихлорпропен, дикофол, диглифус, диглифус+dacnusa, диметакарб, дитиоэфир, додецилацетат, эмамектин, энкарсия, EPN, эретмоцерус, этилен-дибромид, эвкалиптол, жирные кислоты, жирные кислоты/соли, феназахин, фенобукарб (BPMC), фенпироксимат, флуброцитринат, флуфензин, форметанат, формотион, фуратиокарб, гамма-цигалотрин, сок чеснока, вирус гранулеза, harmonia, NPV совки хлопковой, инактивированная бактерия, индол-3-илмасляная кислота, иодметан, железо, изокарбофос, изофенфос, изофенфосметил, изопрокарб, изотиоат, каолин, линдан, лиуянгмицин, матрин, мефосфолан, метальдегид, metarhizium anisopliae, метамидофос, метолкарб (MTMC), минеральное масло, мирекс, м-изотиоцианат, моносултап, myrothecium verrucaria, налед, neochrysocharis formosa, никотин, никотиноиды, масло, олеиновая кислота, оментоат, ориус, оксиматрин, пециломицес, парафиновое масло, паратионэтил, pasteuria, нефтяное масло, феромоны, фосфорная кислота, photorhabdus, фоксим, Фитосейулюс, пиримифосэтил, растительное масло, вирус гранулеза моли капустной, вирус полиэдроза, полифенольные экстракты, калия олеат, профенофос, просулер, протиофос, пираклофос, пиретрины, пиридафентион, пиримидифен, пирипроксифен, экстракт квиллайи, хинометионат, рапсовое масло, ротенон, сапонин, сапонозит, соединения натрия, фторсиликат натрия, крахмал, steinernema, стрептомицеты, сульфурамид, сера, тебупиримфос, тефлутрин, темефос, тетрадифон, тиофанокс, тиометрон, трансгены (напр., Cry3Bb1), триазамат, триходерма, трихограмма, трифлумурон, вертициллез, вератрин, изомерные инсектициды (напр., Каппа-бифентрин, каппа-тефлутрин), дихоромезотиаз, брофланилид, пиразифлумид; A1) класс карбаматов, в том числе адикарб, аланикарб, бенфуракарб, карбарил, карбофуран, карбосульфан, метиокарб, метомил, оксамил, пиримикарб, пропоксур и тиодикарб; A2) класс фосфорорганических соединений, в том числе ацефат, азинфосэтил, азинфосметил, хлорфенвинфос, хлорпирифос, хлорпирифосметил, деметон-Sметил, диазинон, дихлофос/DDVP, дикротофос, диметоат, дисульфотон, этион, фенитротион, фентион, изоксантион, малатион, метамидофос, метидатион, мевинфос, монокротофос, оксиметоат, оксидеметонметил, паратион, паратионметил, фентоат, форат, фозалон, фосмет, фосфамидон, пиримифосметил, хиналфос, тербуфос, тетрахлорвинфос, триазофос и трихлорфон; A3) класс циклодиеновых хлоррганических соединений, например, эндосульфан; A4) класс фипролов, в том числе этипрол, фипронил, пирафлупрол и пирипрол; A5) класс неоникотиноидов, в том числе ацетамиприд, клотианидин, динотефуран, имидаклоприд, нитенпирам, тиаклоприд и тиаметоксам; A6) класс спиносинов, в том числе спиносад и спинеторам; A7) активаторы хлоридных каналов из класса мектинов, в том числе абамектин, эмамектин бензоат, ивермектин, лепимектин и милбемектин; A8) имитаторы ювенильных гормонов, в том числе гидропрен, кинопрен, метопрен, феноксикарб и пирипроксифен; A9) селективные блокаторы питания равнокрылых, в том числе пиметрозин, флоникамид и пирифлухиназон; A10) ингибиторы роста клещей, в том числе клофентезин, гекситиазокс и этоксазол; A11) ингибиторы митохондриальной АТФ-синтазы, в том числе диафентиурон, фенбутатин оксид и пропаргит; разобщители окислительного фосфорилирования, в том числе хлорфенапир; A12) блокаторы каналов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, в том числе бенсултап, картап гидрохлорид, тиоциклам и тиосултап-натрий; A13) ингибиторы биосинтеза хитина типа 0 из класса бензоилмочевины, в том числе бистрифлурон, дифторбензурон, флуфеноксурон, гексафлумурон, луфенурон, новалурон и тефлубензурон; A14) ингибиторы биосинтеза хитина типа 1, в том числе бупрофезин; A15) соединения, нарушающие линьку, в том числе циромазин; A16) агонисты экдизоновых рецепторов, в том числе метоксифенозид, тебуфенозид, галофенозид и галхромафенозид; A17) агонисты октопаминовых рецепторов, в том числе амитраз; A18) ингибиторы переноса электронов митохондриального комплекса пиридабен, тебуфенпирад, толфенпирад, флуфенерим, циенопирафен, цифлуметофен, гидраметилнон, ацехиноцил или флуакрипирим;A19) потенциалзависимые блокаторы натриевых каналов, в том числе индоксакарб и метафлумизон; A20) ингибиторы синтеза липидов, в том числе спиродиклофен, спиромесифен и спиротетрамат; A21) модуляторы рецепторов рианодина из класса диамидов, в том числе флубендиамид, фталамидные соединения (R)-3-Хлор-N1-{2-метил-4-[1,2,2,2-тетрафтор-1-(трифторметил)этил]фенил}-N2-(1-метил-2-метилсульфонилэтил)фталамид и (S)-3-Хлор-N1-{2-метил-4-[1,2,2,2-тетрафтор-1-(трифторметил)этил]фенил}-N2-(1-метил-2-метилсульфонилэтил)фталамид, хлорантранилипрол и циантранилипрол; A22) соединения неизвестного или неопределенного механизма действия, в том числе азадирактин, амидофлумет, бифеназат, флуэнсульфон, пиперонила бутоксид, пиридалил, сульфоксафлор; или A23) модуляторы натриевых каналов из класса пиретроидов, в том числе акринатрин, аллетрин, бифентрин, цифлутрин, ламбда-цихалотрин, циперметрин, альфа-циперметрин, бета-циперметрин, зета-циперметрин, дельтаметрин, эсфенвалерат, этофенпрокс, фенпропатрин, фенвалерат, флуцитринат, тау-флувалинат, перметрин, силафлуофен и тралометрин.
Фунгициды: B0) бензовиндифлупир, антипероноспорик, аметоктрадин, амисулбром, солей меди (напр., гидроксид меди, оксихлорид меди, сульфат меди, персульфат меди), боскалид, тифлумазид, флутианил, фуралаксил, тиабендазол, беноданил, мепронил, изофетамид, фенфурам, биксафен, флуксапироксад, пенфлуфен, седаксан, кумоксистробин, эноксастробин, флуфеноксистробин, пираоскистробин, пираметоксистробин, триклопирикарб, фенамистробин, метоминостробин, пирибенкарб, мептилдинокап, фентина ацетат, фентина хлорид, фентина гидроксид, окситетрациклин, хлозолинат, хлорнеб, текнацен, этридиазол, йодокарб, протиокарб, Bacillus subtilis syn. Bacillus amyloliquefaciens (напр., штаммы QST 713, FZB24, MBI600, D747), экстракт Melaleuca alternifolia, пиризоксазол, окспоконазол, этаконазол, фенприразамин, нафтифин, тербинафин, валидамицин, пириморф, валифеналат, фталид, пробеназол, изотианил, ламинарин, экстракта Reynoutria sachalinensis, фосфористая кислота и соли, теклофталам, триазоксид, пириофенон, органические масла, калия бикарбонат, хлорталонил, фторимид; B1) азолы, в том числе битерталон, бромуконазол, ципроконазол, дифеноконазол, диниконазол, энилконазол, эпоксиконазол, флуквинконазол, фенбуконазол, флусилазол, флутриафол, гексаконазол, имибенконазол, ипконазол, метконазол, миклобутанил, пенконазол, пропиконазол, протиоконазол, симеконазол, триадимефон, триадименол, тебуконазол, тетраконазол, тритиконазол, прохлораз, пефуразоат, имазалил, трифлумизол, циазофамид, беномил, карбендазим, тиабендазол, фуберидазол, этабоксам, этридиазол и гимексазол, азаконазол, диниконазол-М, окспоконазол, паклобутразол, униконазол, 1-(4-хлор-фенил)-2-([1,2,4]триазол-1-ил)-циклогептанол и имазалилсульфат; B2) стробилурины, в том числе азоксистробин, димоксистробин, энестробурин, флуоксастробин, крезоксимметил, метоминостробин, оризастробин, пикоксистробин, пираклостробин, трифлоксистробин, энестробурин, метил (2-хлор-5-[1-(3-метилбензилоксиимино)этил]бензил)карбамат, метил (2-хлор-5-[1-(6метилпиридин-2-илметоксиимино)этил]бензил)карбамат и метил 2-(орто-(2,5-диметилфенилоксиметилен)-фенил)-3-метоксиакрилат, 2-(2-(6-(3-хлор-2-метил-фенокси)-5-фторо-пиримидин-4-илокси)-фенил)-2-метоксиимино-N-метил-ацетамид и 3-метокси-2-(2-(N-(4-метокси-фенил)-циклопропанкарбоксимидоилсульфанилметил)-фенил)-сложный метиловый эфир акриловой кислоты; B3) карбоксамид, в том числе карбоксин, беналаксил, беналаксил-M, фенгексамид, флутоланил, фураметпир, мепронил, металаксил, мефеноксам, офурац, оксадиксил, оксикарбоксин, пентиопирад, изопиразам, тифлузамид, тиадинил, 3,4-дихлор-N-(2-цианофенил)изотиазол-5-карбоксамид, диметоморф, флуморф, флуметовер, фторпиколид (пикобензамид), зоксамид, карпропамид, диклоцимет, мандипропамид, N-(2-(4-[3-(4-хлорфенил)проп-2-инилокси]-3-метоксифенил)этил)-2-метансульфонил-амино-3-метилбутирамид, N-(2-(4-[3-(4-хлор-фенил)проп-2-инилокси]-3-метокси-фенил)этил)-2-этансульфониламино-3-метилбутирамид, метил 3-(4-хлорфенил)-3-(2-изопроксикарбонил-амино-3-метил-бутириламино)пропионат, N-(4'-бромбифенил-2-ил)-4-дифторметил^метилтиазол-δ-карбоксамид, N-(4'-трифторoметил-бифенил-2-ил)-4-дифторметил-2-метилтиазол-5-карбоксамид, N-(4'-хлор-3'-фторобифенил-2-ил)-4-дифторметил-2-метил-тиазол-5-карбоксамид, N-(3\4'-дихлор-4-фторобифенил-2-ил)-3-дифторометил-1-метил-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-5-фторобифенил-2-ил)-3-дифторметил-1-метилпиразол-4-карбоксамид, N-(2-циано-фенил)-3,4-дихлоризотиазол-5-карбоксамид, 2-амино-4-метил-тиазол-5-карбоксанилид, 2-хлор-N-(1,1,3-триметил-индан-4-ил)-никотинамид, N-(2-(1,3-диметилбутил)-фенил)-1,3-диметил-5-фторо-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'-хлор-3',5-дифторо-бифенил-2-ил)-3-дифторметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'-хлор-3',5-дифторо-бифенил-2-ил)-3-трифторoметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-5-фторо-бифенил-2-ил)-3-трифторoметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',5-дифторо-4'метил-бифенил-2-ил)-3-дифторметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',5-дифторо-4'метил-бифенил-2-ил)-3-трифторoметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(цис-2-бициклопропил-2-ил-фенил)-3-дифторметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(транс-2-бициклопропил-2-ил-фенил)-3-дифторометил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, фторпирам, N-(3этил-3,5-5-триметил-циклогексил)-3-формиламино-2-гидрокси-бензамид, окситетрациклин, силтиофам, N-(6-метокси-пиридин-3-ил) циклопропанкарбоксамид, 2-йодо-N-фенил-бензамид, N-(2-бицикло-пропил-2-ил-фенил)-3-дифторметил-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-1,3-диметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-1,3-диметил-5-фторопиразол-4-ил-карбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-5-хлор-1,3-диметил-пиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-фторметил-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-(хлорфторметил)-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид,N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-дифторметил-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-дифторметил-5-фторо-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-5-хлор-3-дифторметил-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3', 4', 5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-(хлордифторметил)-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-5-фторо-1-метил-3-трифторoметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-5-хлор-1-метил-3-трифторoметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-1,3-диметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-1,3-диметил-5-фторопиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-5-хлор-1,3-диметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-фторметил-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-(хлорфторметил)-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид,N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-дифторметил-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-дифторметил-5-фторо-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-5-хлор-3-дифторметил-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-3-(хлордифторметил)-1-метилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-5-фторо-1-метил-3-трифторoметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(2',4',5'-трифторoбифенил-2-ил)-5-хлор-1-метил-3-трифторoметилпиразол-4-илкарбоксамид, N-(3',4'-дихлор-3-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-3-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дифторо-3-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дифторо-3-фторобифенил-2-ил)-1-метил-S-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3'-хлор-4'-фторо-3-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-4-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дифторо-4-фторобифенил-2-ил)-1-метил-S-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-4-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дифторо-4-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3'-хлор-4'-фторо-4-фторобифенил-2-ил)-1-метил-S-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-5-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дифторо-5-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-5-фторобифенил-2-ил)-1-метил-S-дифторметил-1H-пиразол-карбоксамид, N-(3',4'-дифторо-5-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3',4'-дихлор-5-фторобифенил-2-ил)-1,3-диметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(3'-хлор-4'-фторо-5-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-дифторметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'-фторо-4-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'-фторо-5-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид,N-(4'-хлор-5-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'метил-5-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'-фторо-5-фторобифенил-2-ил)-1,3-диметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'-хлор-5-фторобифенил-2-ил)-1,3-диметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'метил-5-фторобифенил-2-ил)-1,3-диметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'-фторо-6-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-(4'-хлор-6-фторобифенил-2-ил)-1-метил-3-трифторoметил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-[2-(1,1,2,3,3,3-гексафторопропокси)-фенил]-3-дифторметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид, N-[4'-(трифторoметилтио)-бифенил-2-ил]-3-дифторметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид и N-[4'-(трифторoметилтио)-бифенил-2-ил]-1-метил-3-трифторoметил-1-метил-1H-пиразол-4-карбоксамид; B4) гетероциклические соединения, в том числе флуазинам, пирифенокс, бупиримат, ципродинил, фенаримол, феримзон, мепанипирим, нуаримол. Пириметанил, трифорин, фенпиклонил, флудиоксонил, алдиморф, додеморф, фепропиморф, тридеморф, фепропидин, ипродион, процимидон, винклозолин, фамоксадон, фенамидон, октилинон, пробеназол, 5-хлор-7-(4-метил-пиперидин-1-ил)-6-(2,4,6-трифторoфенил)-[1,2,4]триазолo[1,5-a]пиримидин, анилазин, дикломезин, пирохилон, прохиназид, трициклазол, 2-бутокси-6-йодо-3-пропилхромен-4-он, ацибензолар-Sметил, каптафол, каптан, дазомет, фолмет, феноксанил, квиноксифен, N,N-диметил-3-(3-бромо-6-фторо-2-метилиндол-1-сульфонил)-[1,2,4]триазол-1-сульфонамид, 5этил-6-октил-[1,2,4]триазолo[1,5-a]пиримидин-2,7-диамин, 2,3,5,6-тетрахлор-4-метансульфонил-пиридин, 3,4,5-трихлор-пиридин-2,6-ди-карбонитрил, N-(1-(5-бромо-3-хлор-пиридин-2-ил)этил)-2,4-дихлор-никотинамид, N-((5-бромо-3-хлор пиридин-2-ил)метил)-2,4-дихлор-никотинамид, дифлуметорим, натрапирин, додеморфацетат, фтороимид, бластицидин-S, хинометионат, дебакарб, дифензокват, дифензокватметилсульфат, оксолиновая кислота и пипералин; B5) карбаматы, в том числе манкозеб, манеб, метам, метасульфокарб, метирам, фербам, пропинеб, тирам, зинеб, зирам, диэтофенкарб, ипроваликарб, бентиаваликарб, пропамокарб, пропамокарб гидрохлорид, 4-фторофенил N-(1-(1-(4-цианофенил)-этансульфонил)бут-2-ил)карбамат, метил 3-(4-хлор-фенил)-3-(2-изопроксикарбониламино-3-метил-бутириламино)пропаноат; или B6) другие фунгициды, в том числе гуанидин, додин, свободное основание додина, иминоктадин, гуазатин, антибиотики: касугамицин, окситетрациклин и его соли, стрептомицин, полиоксин, валидамицин A, производные нитрофенила: бинапакрил, динокап, динобутон, серосодержащие гетероциклические соединения: дитианон, изопротиолан, металлоорганические соединения: фентина соли, фосфорорганические соединения: эдифенфос, ипробенфос, фосетил, фосетил-алюминий, фосфористая кислота и ее соли, пиразофос, толклофос-метил, хлоррганические соединения: дихлофлуанид, флусульфамид, гексахлор-бензен, фталид, пенцикурон, хинтозин, тиофанат, тиофанатметил, толилфлуанид, другие: цифлуфенамид, цимоксанил, диметиримол, этиримол, фуралаксил, метрафенон и спироксамин, гуазатинацетат, иминоктадин-триацетат, иминоктадин-трис(албезилат), гидрат гидрохлорида касугамицина, дихлорфен, пентахлорфенол и его соли, N-(4-хлор-2-нитро-фенил)-N-этил-4-метил-бензенсульфонамид, диклоран, нитротал-изопропил, текназен, бифенил, бронофол, дифениламин, милдиомицин, оксинкоппер, прогексадион-кальций, N-(циклопропилметоксиимино-(6-дифторометокси-2,3-дифторо-фенил)-метил)-2-фенил ацетамид, N'-(4-(4-хлор-3-трифторoметил-фенокси)-2,5-диметил-фенил)-N-этил-N-метил формамидин, N'-(4-(4-фторо-3-трифторoметил-фенокси)-2,5-диметил-фенил)-N-этил-N-метил формамидин, N'-(2-метил-5-трифторметил-4-(3-триметилсульфанил-пропокси)-фенил)-N-этил-N-метилформамидин и N'-(5-дифторметил-2-метил-4-(3-триметилсульфанил-пропокси)-фенил)-N-этил-N-метил формамидин.
Гербициды: C1) ингибиторы ацетил-СоА-карбоксилазы (ACC), например, эфиры оксимов циклогексанона, в том числе алоксидим, клетодим, клопроксидим, циклоксидим, сетооксидим, тралкоксидим, бутроксидим, клефоксидим или тепралоксидим; феноксифеноксипропионовые сложные эфиры, в том числе клодинафоп-пропаргил, цигалофоп-бутил, диклофопметил, феноксапропэтил, феноксапроп-Pэтил, фентиапропэтил, флуазифоп-бутил, флуазифоп-P-бутил, галоксифоп-этоксиэтил, галоксифопметил, галоксифоп-Pметил, изоксапирифоп, пропаквизафоп, квизалофопэтил, квизалофоп-Pэтил или квизалофоп-тефурил; или ариламинопропионовые кислоты, в том числе флампропметил или флампроп-изопропил; C2 ингибиторы ацетолактатсинтазы (ALS), например, имидазолиноны, в том числе имазапир, имазаквин, имазаметабензметил (имазам), имазамокс, имазапик или имазетапир; пиримидиловые сложные эфиры, в том числе пиритиобак-кислота, пиритиобак-натрий, биспирибак-натрий. KIH-6127 или пирибензоксим; сульфонамиды, в том числе флорасулам, флуметсулам или метосулам; или препараты сульфонилмочевины, в том числе амидосульфурон, азимсульфурон, бенсульфуронметил, хлоримуронэтил, хлорсульфурон, циносульфурон, циклосульфамурон, этаметсульфуронметил, этоксисульфурон, флазасульфурон, галосульфуронметил, имазосульфурон, метсульфуронметил, никосульфурон, примисульфуронметил, просульфурон, пиразосульфуронэтил, римсульфурон, сульфометуронметил, тифенсульфуронметил, триасульфурон, трибенуронметил, трифлусульфуронметил, тритосульфурон, сульфосульфурон, форамсульфурон или йодосульфурон; C3) амиды, например, аллидохлор (CDAA), бензоилпропэтил, бромбутид, хлортиамид. Дифенамид, этобензанид(бензхломет)(этобензанидибензхломет)), флутиамид, фосамин или моналид; C4) ауксины-гербициды, например, пиридинкарбоновые кислоты, в том числе клопиралид или пиклорам; или 2,4-D или беназолин; C5) ингибиторы транспорта ауксина, например, напталам или дифлуфензопир; C6) ингибиторы биосинтеза каротиноидов, в том числе бензофенап, кломазон (диметазон), дифлуленикан, фторхлоридон, флуридон, пиразолинат, пиразоксифен, изоксафлутол, изоксахлортол, мезотрион, сулкотрион (хлормезулон), кетоспирадокс, флуртамон, норфлуразон или амитрол; C7) ингибиторы энолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазы (EPSPS), в том числе глифосат или сульфосат; C8) ингибиторы глутаминсинтетазы, в том числе биланафос (биалафос) или глуфосинат аммония; C9) ингибиторы биосинтеза липидов, в том числе аналиды, в том числе анилофос или мефенацет; хлорацетаналиды, в том числе диметенамид, S-диметенамид, ацетохлор, алахлор, бутахлор, бутенахлорхлор, диэтатилэтил, диметахлор, метазахлор, метолахлор, S-метолахлор, претилахлор, пропахлор, принахлор, тербухлор, тенилхлор или ксилахлор; тиомочевина, в том числе бутилат, циклоат, диаллат, димепиперат, ЭПТК, эспрокарб, молинат, пебулат, прозулфокарб, тиобенкарб (бентиокарб), триаллат или вемолат; или бенфуресата или перфлуидона; C10) ингибиторы митоза, например, карбаматов, в том числе асулам, карбетамид, хлорпрофам, орбенкарб, пронамид (пропизамид), профам или тиокарбазил; динитроанилины, в том числе бенефин, бутралин, динитрамин, эталфлуралин, флухлоралин, оризалин, пендиметалин, продиамин или трифторалин; пиридины, в том числе дитиопир или тиазопир; или бутамифос, хлортал-диметил (DCPA) или гидразид малеиновой кислоты; C11) ингибиторы фотопорфириноген IX оксидазы, в том числе дифениловые эфиры, в том числе ацифлуорфен, натрий ацифлуорфен, аклонифен, бифенокс, кломитрофен (CNP), этоксифен, фтордифен, фторгликофенэтил, фомезафен, фурилоксифен, лактофен, нитрофен, нитрофторфен или оксифторфен; оксадиазолы, в том числе оксадиаргил или оксадиазон; циклические имиды, в том числе азафенидин, бутафенацил, карфентразонэтил, цинидонэтил, флумиклоракпентил, флумиоксазин, флумипропин, флупропацил, флутиацетметил, сульфентразон или тидиазимин; или пиразолы, в том числе ET-751.JV 485 или нипираклофен; C12) ингибиторы фотосинтеза, в том числе пропанил, пиридат или пиридафол; бензотиадиазиноны, в том числе бентазон; динитрофенолы, в том числе бромфеноксим, динозеб, динозебацетат, динотерб или DNOC; дипиридилены, в том числе циперкватхлорид, дифензокватметилсульфат, дикват или паракватдихлорид; мочевина, в том числе хлорбромурон, хлортолурон, дифеноксурон, димефурон, диурон, этидимурон, фенурон, флуометурон, изопротурон, изоурон, линурон, метабензтиазурон, метазол, метобензурон, метоксурон, монолинурон, небурон, сидурон или тебутиурон; фенолы, в том числе бромоксинил или иоксинил; хлоридазона; триазинов, в том числе аметрин, атразин, цианазин, десмеин, диметаметрин, гексазинон, прометон, прометрин, пропазин, симазин, симетрин, тербуметон, тербутрин, тербутилазин или триетазин; триазиноны, в том числе метамитрон или метрибузин; урацилы, в том числе бромацил, ленацил или тербацил; или бискарбаматы, в том числе десмедифам или фенмедифам; C13) синергисты, в том числе оксираны, в том числе тридифан; C14) CIS ингибиторы синтеза клеточной стенки, в том числе изоксабен или дихлорбенил; C15) различные другие гербициды, например, дихлорпропионовые кислоты, в том числе далапон; дигидробензофураны, в том числе этофумезат; фенилуксусные кислоты, в том числе хлорфенак (фенак); или азипротрин, барабн, бенсулид, бензтиазурон, бензофтор, буминафос, бутидазол, бутирона, кафенстрола, хлорбуфама, хлорфенпропметила, хлороксурон, цинметилина кумилурон, циклурон, ципразин, ципразол, дибензилурон, дипропетрин, димрон, эглиназинэтил, эндотал, этиозин, флукабазон, фторбентранил, флупоксан, изокарбамид, изопропалин, карбутилат, мефлуидид, монирон, напропамид, напропанилид, нитралин, оксацидомефон, фенизофам, пиперофос, проциазин, профлуралин, пирибутикарб, секбуметон, сульфаллат (CDEC), тербукарб, триазифлам, триазофенамид или триметурон; или их экологически безопасные соли.
Нематоциды или бионематоциды: Беномил, клоэтокарб, алдоксикарб, тирпат, диамидафос, фенамифос, кадусафос, диклофентион, этопрофос, фенсульфотион, фостиазат, гетерофос, изамидофоф, исазофос, фосфокарб, тионазин, имикиафос, мекарфон, ацетопрол, бенклотиаз, хлорпикрин, дазомет, флуенсульфон, 1,3-дихлорпропен (телон), диметил дисульфид, метам натрия, метам калия, соль метам (все генераторы MITC), метилбромид, биологические вспомогательные вещества для почв (напр., семена горчицы, экстракты семян горчицы), паровую фумигацию почвы, аллил изотиоцианат (AITC), диметил сульфат, фурфуал (альдегид).
Пригодные регуляторы роста растений настоящего изобретения включают следующее: Регуляторы роста растений: D1) Антиауксины, в том числе клофибровую кислоту, 2,3,5-три-йодбензойную кислоту; D2) Ауксины, в том числе 4-CPA, 2,4-D, 2,4-DB, 2,4-DEP, дихлорпроp, фенопроp, IAA, IBA, нафталенацетамид, α-нафталенуксусные кислоты, 1-нафтол, нафтоксиуксусные кислоты, калия нафзатемат, натрий нафзатемат, 2,4,5-T; D3) цитокины, в том числе 2iP, бензиладенин, 4-гидроксиксифенэтиловый спирт, кинетин, зеатин; D4) дефолианты, в том числе цианамид кальция, диметипин, эндоталь, этефон, мерфос, метоксурон, пентахлорфенол, тидиазурон, трибуфос; D5) ингибиторы этилена, в том числе авиглицин, 1-метилциклопроpен; D6) высвободители этилена, в том числе ACC, этацелазил,этефон, глиоксим; D7) гаметоциды, в том числе фенридазон, гидразид малеиновой кислоты; D8) гиберреллины, в том числе гиберреллины, гибберелловую кислоту; D9) ингибиторы роста, в том числе абсцизовую кислоту, анцимидол, бутралин, карбарил, хлорфоний, хлорпрофам, дикегулак, флуметралин, фторидамид, фосамин, глифосин, изопиримол, жасмоновую кислоту, гидразид малеиновой кислоты, мепикват, пипроктанил, прогидрожасмон, профам, тиаожен, 2,3,5-три-йодбензойную кислоту; D10) морфактины, в том числе хлорфлурен, хлорфлуренол, дихлорфлуренол, флуренол; D11) замедлители роста, в том числе хлормекват, даминозид, флупримидол, мефлуидид, паклобутразол, тетциклацис, униконазол; D12) стимуляторы роста, в том числе брассинолид, брассинолидэтил, DCPTA, форхлорфенурон, химексазол, просулер, триаконтанол; D13) неклассифицированные регуляторы роста растений, в том числе бахмедеш, бензофтор, буминафос, карвон, холина хлорид, циобутид, клофенцет, цианамид, цикланилид, циклогексимид, ципросульфамид, эпохолеон, этиклозат, этилен, фуфентиомочевина, фуралан, гептопаргил, холосульф, инабенфид, каретазан, арсенат свинца, метасульфoкарб, прогексадион, пиданон, синтофен, триапензатемол, тринексapac.
Удобрением может быть жидкое удобрения. Термин «жидкое удобрение» относится к удобрению в текучей или жидкой форме, содержащему различные пропорции азота, фосфора и калия (например, но без ограничения, 10% азота, 34% фосфора и 0% калия) и микроудобрения, более известные как стартовые удобрения, которые содержат большое количество фосфора и способствуют быстрому и интенсивному росту корней.
Химические готовые формы настоящего изобретения могут иметь любой подходящий традиционный вид, например, концентрат эмульсии (EC), концентрат суспензии (SC), суспоэмульсия (SE), капсульная суспензия (CS), воднодиспергируемая гранула (WG), эмульгируемая гранула (EG), эмульсия вода в масле (EO), эмульсия масло в воде (EW), микроэмульсия (ME), масляная дисперсия (OD), смешивающееся с маслом текучее вещество (OF), смешивающаяся с маслом жидкость (OL), растворимый концентрат (SL), ультрамалообъемная суспензия (SU), ультрамалообъемная жидкость (UL), диспергируемый концентрат (DC), смачивающийся порошок (WP) или любая технически выполнимая готовая форма в комбинации с допустимыми в сельском хозяйстве адъювантами.
В одном варианте осуществления предоставлен продукт, содержащий: первую композицию, содержащую биологически чистую культуру RTI301 Bacillus velezensis, депонированную как ATCC № PTA-121165, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками, и биологически чистую культуру Bacillus amyloliquefaciens RTI477, депонированную как ATCC № PTA-121167, или ее мутант, обладающий всеми определяющими ее характеристиками; вторую композицию, содержащую одно или комбинацию микробного, биологического или химического инсектицида, фунгицида, нематоцида, бактериоцида, гербицида, растительного экстракта, регулятора роста растений или удобрения, при этом первая и вторая композиции упакованы отдельно; и, необязательно, инструкции для доставки в количестве, подходящем для улучшения роста растений, комбинации первой и второй композиций в: листья растения, кору растения, плоды растения, цветки растения, семена растения, корни растений, черенок растения, привой растения, каллусную ткань растения; почву или ростовую среду, окружающую растение; почву или ростовую среду перед посевом семян растений в почву или ростовую среду; или почву или ростовую среду перед посадкой растения, черенка растения, привоя растения или каллусной ткани растения в почву или ростовую среду.
В одном варианте осуществления первая композиция дополнительно содержит одно или комбинацию носителя, диспергатора или дрожжевого экстракта.
8
12
8
12
8
12
В одном варианте осуществления первая композиция находится в виде жидкости, порошкообразного вещества, сыпучих гранул, сухого смачивающегося порошка или сухих смачивающихся гранул. В одном варианте осуществления первая композиция находится в виде жидкости, а каждый из RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis имеется в концентрации от приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл до приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл. В одном варианте осуществления первая композиция находится в виде порошкообразного вещества, сухого смачивающегося порошка, сыпучих гранул или сухих смачивающихся гранул, а каждый из RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis имеется в количестве от приблизительно 1,0×10 КОЕ/г до приблизительно 1,0×10 КОЕ/г. В одном варианте осуществления первая композиция находится в виде масляной дисперсии, а каждый из RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis имеется в концентрации от приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл до приблизительно 1,0×10 КОЕ/мл.
В продукте инсектицидом может быть одно или комбинация пиретроидов, бифентрина, тефлутрина, зета-циперметрина, фосфорорганических соединений, хлорэтоксифоса, хлорпирифоса, тебупиободфоса, цифлутрина, фипролов, фипронила, никотиноидов или клотианидин. В одном варианте осуществления инсектицидом во второй композиции продукта является бифентрин. В одном варианте осуществления инсектицидом во второй композиции продукта является бифентрин, и он находится в готовой форме, совместимой с жидким удобрением.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры были включены для предоставления рядовому специалисту в данной области рекомендации по использованию на практике типичных вариантов осуществления раскрытого в настоящей заявке предмета изобретения. В свете настоящего изобретения и общего уровня квалификации в данной области, специалисты могут понять, что следующие примеры предназначены только для иллюстрации, и что могут быть использованы многочисленные изменения, модификации и изменения без выхода за рамки раскрытого в настоящей заявке предмета изобретения.
ПРИМЕР 1
Идентификация бактериального изолята в качестве Bacillus Subtilis через Анализ последовательности
Связанный с растением бактериальный штамм, обозначенный в данном документе RTI477, был выделен из корней Moringa oleifera, растущего в Северной Калифорнии. РРНК 16S и гены rpoB штамма RTI477 секвенировали, а после этого сравнивали с другими известными бактериальными штаммами в базах данных NCBI и RDP с использованием BLAST. Было определено, что частичная последовательность РНК 16S RTI477 (SEQ ID NO: 1) идентична частичной генетической последовательности рРНК 16S штамма BSn5 Bacillus subtilis (CP002468), штамма NS6 (KF177175) Bacillus amyloliquefaciens и штамма DSM 10 (NR_027552) Bacillus subtilis подвид subtilis. В дополнение, было определено, что последовательность rpoB RTI477 имеет 99% идентичность последовательности с известными штаммами PY79 (CP006881) Bacillus subtilis, 6051-HGW (CP003329) Bacillus subtilis подвид subtilis (т.е. 99% идентичность последовательности; отличие 9 пар оснований), и BAB-1a (CP004405) Bacillus subtilis подвид subtilis (т.е. 99% идентичность последовательности; отличие 10 пар оснований). Штамм RTI477 был идентифицирован в качестве штамма Bacillus subtilis. Отличия в последовательности для гена rpoB на уровне ДНК показывают, что RTI477 является новым штаммом Bacillus subtilis. Штамм RTI477 Bacillus subtilis был депонирован 17 апреля 2014 года в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Американской коллекции типовых культур (ATCC) в Манассасе, Виргиния, США и имеет учетный номер PTA-121167.
ПРИМЕР 2
Идентификация бактериального изолята в качестве Bacillus Amyloliquefaciens через Анализ последовательности
Связанный с растением бактериальный штамм, обозначенный в данном документе RTI301, был выделен из почвы ризосферы винного винограда, растущего на винограднике в Нью-Йорке. РРНК 16S и гены rpoB штамма RTI301 секвенировали, а после этого сравнивали с другими известными бактериальными штаммами в базах данных NCBI и RDP с использованием BLAST. Было определено, что частичная последовательность РНК 16S RTI301 (SEQ ID NO: 3) идентична генетической последовательности рРНК 16S штамма NS6 (KF177175) Bacillus amyloliquefaciens, штамма FZB42 (NR_075005) Bacillus amyloliquefaciens и штамма DSM 10 (NR_027552) Bacillus subtilis подвид subtilis. Также определили, что генетическая последовательность rpoB RTI301 (SEQ ID NO: 4) имеет сходство последовательности с таким же геном у TrigoCor1448 (CP007244) Bacillus amyloliquefaciens подвид plantarum (99% идентичность последовательности; отличие 3 пары оснований); Bacillus amyloliquefaciens подвид plantarum AS43.3 (CP003838) (99% идентичность последовательности; отличие 7 пар оснований); CC178 (CP006845) Bacillus amyloliquefaciens (99% идентичность последовательности; отличие 8 пар оснований) и FZB42 (CP000560) Bacillus amyloliquefaciens (99% идентичность последовательности; отличие 8 пар оснований). Штамм RTI301 был идентифицирован в качестве Bacillus velezensis. Отличия в последовательности для гена rpoB на уровне ДНК показывают, что RTI301 является новым штаммом Bacillus velezensis. Штамм RTI301 Bacillus velezensis был депонирован 17 апреля 2014 года в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры в Американской коллекции типовых культур (ATCC) в Манассасе, Виргиния, США и имеет учетный номер PTA-121165.
ПРИМЕР 3
Гены, связанные с биосинтезом Противомикробных Соединений в RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis
Дальнейший анализ последовательности генома штамма RTI301 Bacillus velezensis выявил, что данный штамм имеет гены, связанные с рядом путей биосинтеза продуцирования молекул, обладающих противомикробными свойствами. Они включают пути биосинтеза субтилизина, сурфактина, итурина, фенгицинов, амилоциклицина, диффицидина, бацилизина, бацилломицина и бациллаэна. В дополнение, гены, связанные с лантибиотическим биосинтезом, обсуждались в штамме RTI301, для которых нет гомологов в других близкородственных штаммах Bacillus amyloliquefaciens. Это проиллюстрировано на фиг. 1, которая показывает схематичную диаграмму геномной организации, окружающей и включающей оперон лантибиотического биосинтеза, обнаруженный в RTI301 Bacillus velezensis. На фиг. 1 верхний набор стрелок представляет кодирующие белки области для штамма RTI301 с указанным относительным направлением транскрипции. Для сравнения, соответствующие области для двух референсных штаммов Bacillus amyloliquefaciens, FZB42 и TrigoCor1448, показаны под штаммом RTI301. Гены в опероне лантибиотического синтез в штамме RTI301 первоначально идентифицировали с использованием RAST, а затем их идентичность уточнили с использованием BLASTp. Степень аминокислотной идентичности белков, кодируемых генами штамма RTI301 по сравнению с двумя референсными штаммами, обозначена как степень затенения соответствующих стрелок, а также процентная идентичность, указанной внутри стрелки. На фиг. 1 можно видеть, что имеется высокая степень идентичности последовательности генов у 3 различных штаммов в областях, окружающих оперон лантибиотического синтеза, но только низкая степень идентичности последовательности внутри оперон лантибиотического синтеза (т.е. Менее чем 40% внутри оперона лантибиотического синтеза, но более чем 99% в окружающих областях). BLASTn анализ данного кластера проводили против неизбыточной (nr) нуклеотидной базы данных в NCBI, и анализ показал высокую степень гомологии в 5' и 3' фланкирующих областях в штаммах B. amyloliquefaciens (аналог высокому % сходству на фиг. 1). Однако, лантипептидный биосинтетический кластер был уникальным в RTI301, и в NCBI nr базе данных не обнаружено никакой значительной гомологии с какой-либо предыдущей секвенированной ДНК. Таким образом, данный оперон лантибиотического синтеза является уникальным признаком для штамма RTI301 Bacillus velezensis.
В отличие от штамма RTI301 с широким диапазоном противомикробных путей биосинтеза, дальнейший анализ последовательности штамма RTI477 выявил, что данный штамм имеет гены, связанные с путями биосинтеза более ограниченной группы молекул, обладающих противомикробными свойствами. Штамм RTI477 имеет пути биосинтеза субтилизина, фенгицинов, сурфактина, диффицидина, бациллаэна, бацилизина и бацилломицина, но полные пути биосинтеза итуринов, лантибиотиков и амилоциклицинов не были обнаружены.
ПРИМЕР 4
Противомикробные Свойства изолятов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis
Антагонистическая способность изолятов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis к основным растительным патогенам измеряли в опытах с чашками. Опыт с чашками для оценки антагонизма к грибным растительным патогенама проводили путем выращивания бактериального изолята и патогенных грибов бок о бок в чашках с агаром 869 на расстоянии 4 см. Чашки инкубировали при комнатной температуре и регулярно проверяли до двух недель на характер роста, в том числе подавление роста, занятие местообитания или отсутствие эффекта. В случае скрининга на антагонистические свойства к патогенам бактерий, патоген сперва распространяли в качестве газона в чашках с агаром 869. После этого аликвоты 20 мкл культуры каждого изолята наносили на чашку. Чашки инкубировали при комнатной температуре и регулярно проверяли до двух недель на зону ингибирования на газоне вокруг мест, где были нанесены RTI477 и RTI301. Сущность антагонистической активности показан в таблицах I и II ниже для каждого штамма RTI477 и RTI301, соответственно. Штамм RTI301 показал превосходные антагонистические свойства против широкого диапазона патогенных микроорганизмов растений по сравнению со штаммом RTI477.
Таблица I. Антагонистические свойства изолята RTI477 Bacillus subtilis против основных растительных патогенов
Противомикробные Опыты
RTI477
Alternaria solani
+++
Aspergillus flavus
+
Aspergillus nomius
+-
Botrytis cinerea
++
Cercospora sojina
++/+++
Fusarium colmorum
+
Fusarium grаminearum
+++
Fusarium oxisporum f. sp. Lycopersici
+
Fusarium oxisporum f. sp. cubense
+
Fusarium virguliforme
++/+++
Glomerella cingulata
++
Magnaporthe grisea
+++
Monilina fructicola
++
Rhizoctonia solani
++
Sclerotinia homeocarpa
++
Sclerotinia sclerotiorum
+
Septoria tritici
++
Stagonospora nodorum
++/+++
Phytophthora capsici
++
Pythium sylvatium
+-/+
Pythium aphanidermatum
+
Erwinia amylovora
+
Erwinia carotovora
+
Pseudomonas syringae pv. tomato
-
Xanthomonas axonopodis
+
Xanthomonas euvesicatoria
+
+++ очень сильная активность, ++ сильная активность,+активность, +-слабая активность, -активность не обнаружена
Таблица II. Антагонистические свойства изолята RTI301 Bacillus velezensis против основных растительных патогенов.
Противомикробные Опыты
RTI301
Alternaria solani
++
Aspergillus flavus
++
Aspergillus nomius
+++
Botrytis cinerea
+++
Cercospora sojina
+++
Fusarium colmorum
+
Fusarium grаminearum
+++
Fusarium oxisporum f. sp. Lycopersici
++
Fusarium oxisporum f. sp. cubense
++
Fusarium virguliforme
++/+++
Glomerella cingulata
+++
Magnaporthe grisea
++/+++
Monilina fructicola
++/+++
Rhizoctonia solani
++
Sclerotinia homeocarpa
++/+++
Sclerotinia sclerotiorum
+++
Septoria tritici
++
Stagonospora nodorum
++/+++
Phytophthora capsici
++
Pythium sylvatium
+-/+
Pythium aphanidermatum
+
Erwinia amylovora
+
Erwinia carotovora
+
Pseudomonas syringae pv. tomato
-
Ralstonia solenacearum
++
Xanthomonas axonopodis
++
Xanthomonas euvesicatoria
++
+++ очень сильная активность, ++ сильная активность, + активность, + - слабая активность, - активность не обнаружена
ПРИМЕР 5
Фенотипические признаки изолятов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis
В дополнение к антагонистическим свойствам для штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis также измеряли различных фенотипические признаки, и данные показаны ниже в таблицах III и IV для каждого штамма, соответственно. Опыты проводили согласно методикам, описанным в тексте под таблицами. Следует заметить, что RTI477 растет быстрее и имеет фенотип с сильным ростом бактерий на твердой среде по сравнению с RTI301.
Таблица III. Фенотипические Опыты: выработка фитогормонов, ацетоина и индолилуксусной кислоты (IAA), и круговорот питательных веществ Изолята RTI477 Bacillus subtilis.
Характеристические Опыты
RTI477
Выработка кислоты (Метиловый красный)
-
Выработка ацетоина (MR-VP)
++
Активность хитиназы
-
Выработка Индол-3-уксусной кислоты
-
Активность протеазы
++
Солюбилизация фосфатов
+-
Фенотип
сухой крем, сильный рост, большое скопление
+++ очень сильная, ++ сильная,+некоторая, +-слабая, -не обнаружено
Таблица IV. Фенотипические Опыты: выработка фитогормонов, ацетоина и индолилуксусной кислоты (IAA), и круговорот питательных веществ изолята RTI301 Bacillus velezensis.
Характеристические Опыты
RTI301
Выработка кислоты (Метиловый красный)
-
Выработка ацетоина (MR-VP)
+++
Активность хитиназы
+-
Выработка Индол-3-уксусной кислоты
-
Активность протеазы
+++
Солюбилизация фосфатов
+-
Фенотип
осклизлый крем, четкие границы, круглые колонии
+++ очень сильная, ++ сильная,+некоторая, +-слабая, -не обнаружено
Тест на Ацетоин. 20 мкл стартовой культуры с высоким содержанием среды 869 перенесли в 1 мл среды Фогеса-Проскауера с метиловым красным (Sigma Aldrich 39484). Культуры инкубировали в течение 2 дней при 3°C 200 об/мин. Перенесли 0,5 мл культуры и добавили 50 мкл 0,2 г/л метилового красного. Красный цвет показывал выработку кислоты. Остальные 0,5 мл культуры перемешали с 0,3 мл 5% альфанафтола (Sigma Aldrich N1000) с последующим 0,1 мл 40% KOH. Образцы интерпретировали спустя 30 минут инкубации. Появление красного цвета показывало выработку ацетоина. Как для теста на кислоту, так и на ацетоин в качестве отрицательного контроля использовали неинокулированную среду (Sokol et al. 1979, Journal of Clinical Microbiology. 9: 538-540).
3
Индол-3-Уксусная Кислота. 20 мкл стартовой культуры с высоким содержанием среды 869 перенесли в 1 мл 1/10 среды 869, обогащенной 0,5 г/л триптофана (Sigma Aldrich T0254). Культуры инкубировали в течение 4-5 дней в темноте при 30°C, 200 об/мин. Образцы центрифугировали, и 0,1 мл супернатанта перемешивали с 0,2 мл реагента Salkowski (35% перхлорная кислота, 10 мМ FeCl). После инкубации в течение 30 минут в темноте, образцы, показавшие розовый цвет, регистрировали положительными для синтеза IAA. В качестве положительного сравнения использовали разведения IAA (Sigma Aldrich I5148); в качестве отрицательного контроля использовали неинокулированную среду (Taghavi, et al. 2009, Applied and Environmental Microbiology 75: 748-757).
Тест солюбизизации фосфатов. Бактерии помещали в чашки на агаровую среду Pikovskaya (PVK), состоящую из 10 г глюкозы, 5 г трифосфата кальция, 0,2 г калия хлорида, 0,5 г сульфата аммония, 0,2 г натрия хлорида, 0,1 г гептагидрата сульфата магния, 0,5 г дрожжевого экстракта, 2 мг сульфата марганца, 2 мг сульфата железа и 15 г агара на литр, pH7, автоклавированную. Чистые зоны были индикатором солюбилизирующих фосфаты бактерий (Sharma et al. 2011, Journal of Microbiology and Biotechnology Research 1: 90-95).
Активность хитиназы. 10% сырого веса коллоидного хитина добавляли в модифицированную PVK агаровую среду (10 г глюкозы, 0,2 г калия хлорида, 0,5 г сульфата аммония, 0,2 г натрия хлорида, 0,1 г гептагидрата сульфата магния, 0,5 г дрожжевого экстракта, 2 мг сульфата марганца, 2 мг сульфата железа и 15 г агара на литр, pH7, автоклавированную). В эти хитиновые чашки помещали бактерии; чистые зоны показывали активность хитиназы (N. K. S. Murthy & Bleakley. 2012. «Simplified Method of Preparing Colloidal Chitin Used for Screening of Chitinase Producing Microorganisms». Internet Journal of Microbiology. 10(2)).
Активность протеазы. Бактерии помещали в чашки на агаровую среду 869, обогащенную 10% молоком. Чистые зоны показывали способность разрушать белки, подтверждая активность протеазы (Sokol et al. 1979, Journal of Clinical Microbiology. 9: 538-540).
ПРИМЕР 6
Влияние на рост Изолята RTI477 Bacillus subtilis у пшеницы
7
Определяли влияние применения бактериального изолята RTI477 на ранний рост растений и силу пшеницы. Эксперимент проводили путем инокуляции поверхности стерилизованных пророщенных семян пшеницы в течение 2 дней в суспензии ~2×10 КОЕ/мл бактерий при комнатной температуре с проветриванием в темноте (контроль также проводили без бактерий). После этого инокулированные и контрольные семена высаживали в 6ʺ горшки, наполненные песком. 10 семян на горшок и 1 горшок на вариант обработки высаживали и поливали по необходимости, чередуя воду и модифицированный раствор Хогланда. Горшки инкубировали на лабораторном подоконнике приблизительно при 21°C, обеспечивая естественные циклы света/темноты в течение 13 дней, в этот момент растения извлекали, и измеряли параметры. Сухой вес определяли как общий вес на 9 растений, получив в результате общий средний вес сухих растений 35,41 мг для растений, инокулированных штаммом RTI477 Bacillus subtilis, по сравнению с весом 33,38 мг для неинокулированного контроля, что составляет 6% увеличение сухого веса над неинокулированным контролем. Фотографии извлеченных растения после 13 дней роста показаны на фиг. 2. ФИГ. 2A показывает контрольные растения, а ФИГ. 2B показывает растения, инокулированные RTI477.
ПРИМЕР 7
Совместимость выращивания RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis
Совместимость штамма RTI301 Bacillus velezensis с другими изолятами Bacillus тестировали посредством обнаружения штамма RTI301 на газоне различных других штаммов. Результаты данного эксперимента показаны на фиг. 3A-3B. Фиг. 3A-3B представляют собой фотографии, показывающие совместимость выращивания между штаммами RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis и отсутствие совместимости между штаммом RTI301 и другим штаммом Bacillus amyloliquefaciens, RTI472 Bacillus amyloliquefaciens, депонированным как PTA-121166 американской коллекцией типовых культур (ATCC). Когда штамм RTI301 покрывал пятнами газон штамма RTI472 (ФИГ. 3A), для роста штамма RTI472 наблюдалась четкая зона ингибирования. В отличие от этого, когда штамм RTI301 покрывал пятнами газон штамма RTI477 (ФИГ. 3B), для штамма RTI477 наблюдалась только минимальное ингибирование и отсутствие расчистки клеточного газона. Следовательно, было сделано заключение, что рост RTI301 и RTI477 является совместимым.
Не ограничваясь каким-либо конкретным механизмом действия, для объяснения наблюдаемого отличия совместимости штаммов предложен один следующий режим действия. На основании геномной последовательности трех протестированных штаммов (т.е. RTI301, RTI472 и RTI477) спрогнозировали, что все эти штаммы продуцируют антагонистичные соединения бацилизина, бациллаэна, диффицидина и бацилломицина. Однако, в то время, как RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis имеют ген синтеза субтилизина, данный ген отсутствует в геноме RTI472 Bacillus amyloliquefaciens. Субтилизин представляет собой бактериоцин, класс белковоподобных токсинов, продуцируемых бактериями для ингибирования роста аналогичного или близкородственного бактериального штамма (штаммов). Следовательно, было задекларировано, что субтилизин, синтезируемый RTI301 Bacillus velezensis, мог быть ингибитором роста RTI472 Bacillus amyloliquefaciens. В отличие от этого, штамм RTI477 Bacillus subtilis не ингибируется RTI301, потому что штамм RTI477 продуцирует свой собственный субтилизин и, таким образом, является устойчивым к соединению.
Также анализировали различия морфологии штаммов между штаммами RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis. Фотографии, показывающие морфологию каждого из этих штаммов, показаны на фиг. 4: RTI301 Bacillus velezensis (ФИГ. 4A) и RTI477 Bacillus subtilis (ФИГ. 4B). Морфология колоний штаммов RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis, показанная на фиг. 4A-4B, демонстрирует потенциальное отличие поведения штаммов, когда доходит до подвижности. Подвижность является ключевым признаком для колонизации ризосферы связанными с растениями бактериями. RTI301 Bacillus velezensis растет в виде четко ограниченных круглых колоний. В отличие от этого, RTI477 Bacillus subtilis растет в виде рыхлой колонии, морфология которой является показателем роста бактерий на твердой среде и подвижности. Рост бактерий на твердой среде и подвижность являются потенциально важным фенотипом для быстрой колонизации ризосферы и поверхности корня растения. Снова, не ограничваясь каким-либо конкретным механизмом действия, было задекларировано, что фенотип с сильным ростом бактерий на твердой среде, подтвержденный морфологией штамма RTI477 Bacillus subtilis, мог являться причиной более эффективной колонизацией данным штаммом ризосферы, чем RTI301 Bacillus velezensis.
В свете совместимости выращивания и наблюдаемого различия фенотипа, комбинацию штаммов RTI301 и RTI477 дополнительно тестировали на активность улучшения роста и жизнеспособности растений.
ПРИМЕР 8
Комбинация RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis Приводит к Свойствам Синергистического Улучшения Роста Растений
8
Положительное влияние на прорастание семян и развитие и архитектуру корней наблюдали для множества семян растений, инокулированных вегетативными клетками или покрытых спорами штамма RTI477 Bacillus subtilis. Это в данном описании выше в примере 6 описано, например, у пшеницы. В дополнение, проводили эксперименты для определения влияния применения штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis на семенах соевых бобов на прорастание, развитие и архитектуру корней, и ранний рост растений и/или жизнеспособность растений. Эксперименты проводили, как описано ниже, с использованием спор RTI301 и RTI477. Для экспериментов получали споры штаммов в 2XSG в 14 л биореакторе. Споры собирали, но впоследствии не промывали в концентрации 1,0×10 КОЕ/мл. В экспериментах концентрацию спор разбавляли в 10 раз или более. На дно отдельных стерильных пластмассовых ростовых камер помещали стерильную фильтровальную бумагу, и в каждый контейнер помещали по шесть семян. Три мл каждого разведения спор RTI301 или RTI477 добавляли в ростовые камеры, которые закрывали и инкубировали при 19°C в течение 8 дней, после чего всходы фотографировали. В дополнение, также тестировали комбинации спор RTI301 и RTI477, добавленных в соотношениях 1:3, 1:1 и 3:1. Данные показаны в таблице V ниже. Ни один из двух штаммов при нанесении отдельно не ингибировал прорастание семян по сравнению с неинокулированным контролем.
6
7
8
6
7
6
6
Инокуляция семян соевых бобов RTI301 Bacillus velezensis в концентрации 1 X 10, 1 X 10 и 1 X 10не оказывала влияние на развитие и архитектуру корней. Инокуляция семян соевых бобов RTI477 Bacillus subtilis в тех же самых концентрациях в самой низкой концентрации обеспечивала только небольшое улучшение развития и архитектуры корней. Неожиданно, инокуляция семян соевых бобов комбинацией и RTI301 и RTI477 (отношение 1:3) при всех протестированных концентрациях приводила к улучшению развития корней. Инокуляция семян соевых бобов комбинацией RTI301 и RTI477 (отношение 1:1) для концентрации 1 X 10 КОЕ/мл и 1 X 10 КОЕ/мл приводила к улучшению развития корней, при этом наиболее последовательные результаты наблюдались для концентрации 1 X 10 КОЕ/мл. Наилучшие результаты на развитие корней наблюдались, когда RTI301 и RTI477 наносили в соотношении 3:1 в концентрации 1 X 10 КОЕ/мл.
6
В дополнение, фотографии положительного действия инокуляции семян спорами RTI301 плюс RTI477 (отношение 3:1) показаны на фиг. 5A и 5B (A - Контрольные растения; B - растения, инокулированные RTI301 плюс RTI477 (отношение 3:1) при 10 КОЕ/мл). Влияние было особенно положительным в отношении формирования и архитектуры корней, как показано на фигурах 5A-5B. Мелкие корневые волоски являются важными для всасывания воды, питательных веществ и взаимодействия растения с другими микроорганизмами в ризосфере. Эти результаты показывают, что в то время, как нанесение отдельных штаммов не оказывало или оказывало небольшое влияние по сравнению с контрольными растениями, обработка семян с нанесением комбинации штаммов RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis может значительно улучшать ранний рост и укоренение соевых бобов.
Таблица V. Исследование Прорастания Семян Соевых бобов для обработки спорами RTI301 и RTI477
Штамм
ID
Влияние концентрации спор (КОЕ/мл) на прорастание и развитие корней соевых бобов
10<sup>8</sup>
10<sup>7</sup>
10<sup>6</sup>
RTI 301
B. amyloliquifaciens
=
=
=
RTI 477
B. subtilis
=
=
+
RTI301+RTI477
B. amyloliquifaciens+B. subtilis 1:3
+
++
+
RTI301+RTI477
B. amyloliquifaciens+B. subtilis 1:1
=
+
++
RTI301+RTI477
B. amyloliquifaciens+B. subtilis 3:1
=
=
+++
+++ очень выраженная польза для роста, ++ сильная польза для роста,+польза для роста, +-слабая польза для роста,=отсутствие наблюдаемого эффекта,-слабое ингибирование, --сильное ингибирование, n.d. не определяли
+5
+5
+5
Дополнительные эксперименты проводили для исследования влияния на рост и развитие растений после инокуляции семян растения комбинацией штаммов RTI301 и RTI477. В частности, эксперимент на соевых бобах планировали следующим образом: 1) семена не обрабатывали; 2) семена обрабатывали комбинацией CruiserMaxx (инсектицид плюс фунгицид, содержащий тиаметоксам, флудиоксонил плюс металаксил-M; SYNGENTA CROP PROTECTION, INC) и фунгицида тиофанат метила, что представляет собой обычную обработку семян соевых бобов (комбинация CruiserMaxx и тиофанат метила обозначается «CHEM CONTROL»); 3) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс инокулировали штаммом RTI301 5,0×10 КОЕ/семя; 4) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс инокулировали штаммом RTI477 5,0×10 КОЕ/семя; 5) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс инокулировали комбинацией обоих штаммов по 5,0×10 КОЕ/семя. Десять опытов проводили с 4 или 5 повторами на вариант обработки на опыт. Результаты среднего урожая сои (бушелей на акр) для десяти полевых опытов представлены в таблице VI ниже, причем участки полевых опытов расположены в Висконсине (2), Индиана (2), Иллинойс (3) и Айова (3). Четыре опыта инокулировали Rhizoctonia solani, три опыта инокулировали либо Fusarium graminearum, либо F. virguliforme, один опыт инокулировали Phytophthora sojae, а два опыта не инокулировали. Каждый патоген выращивали раздельно на влажных автоклавированных семенах зерновых, а затем сушили воздухов. Высушенный инокулюм, используемый в выбранном опыте, высевали в смеси с семенами с заданной нормой для обеспечения инфекции, когда семена начинали расти.
Результаты в таблице VI показывают, что инокуляция либо только RTI301 Bacillus velezensis, либо RTI477 Bacillus subtilis не оказывала действия на общий средний урожай сои по сравнению с семенами, которые обрабатывали только CHEM CONTROL. Как обнаружили в предыдущем эксперименте, инокуляция комбинацией RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis обеспечивала синергетическое влияние и в 10 полевых испытаниях привела в среднем к 5% увеличению урожая сои (с 58,2 до 61,1 бушелей на акр, см. Таблицу VI). Следует заметить, что обнаружили увеличение урожая в 3,7 бушелей на акр с комбинацией RTI 301 и RTI 477 плюс химический контроль по сравнению с химическим контролем для урожая в полевых испытаниях без инокуляции (N=2 опыта), увеличение на 4,3 бушелей на акр для двух штаммов плюс химический контроль по сравнению с химическим контролем для опытов с инокуляцией Rhizoctonia (N=4 опыта), увеличение на 1,5 бушеля на акр для двух штаммов плюс химический контроль по сравнению с химическим контролем для опытов с инокуляцией Fusarium (N=3 опыта), и увеличение на 1,0 бушель на акр для двух штаммов плюс химический контроль по сравнению с химическим контролем для опытов с инокуляцией Phytophthora (N=1 опыт), так что ответ в виде урожая возникал независимо от заражения болезнями и обработки семян химическими фунгицидами.
Таблица VI. Средние результаты инокуляции семян сои RTI301 Bacillus velezensis, RTI477 Bacillus subtilis и комбинацией обоих штаммов.
Обработка
Урожай(бушель/акр)n=10
Увеличение урожая по сравнению с CHEM CONTROL
Значение парного t-критерия Стьюдента
1
НЕОБРАБОТАННЫЕ СЕМЕНА
55,6
-2,6
0,011
2
CHEM CONTROL
58,2
~
~
3
CHEM CONTROL+RTI301
58,1
-0,1
0,468
4
CHEM CONTROL+RTI477
58,1
-0,1
0,460
5
CHEM CONTROL+RTI301+RTI477
61,1
2,9
0,007
Не ограничваясь каким-либо конкретным механизмом действия, одно объяснение наблюдаемого синергетического влияния комбинации двух штаммов на урожай сои заключается в следующем. RTI301 Bacillus velezensis продуцирует широкий диапазон антагонистичных метаболитов, в том числе субтилизин, которые могут ингибировать рост и появление конкурирующих штаммов как грибов, так и бактерий, в том числе близкородственных Bacillus видов. Таким образом, штамм RTI301 при отдельном нанесении на растение может открыть нишу/пространство для его становления в ризосфере. Однако, данные не поддерживают сильные способствующие росту растений свойства для RTI301 Bacillus velezensis. Таким образом, после того, как штамм RTI301 был введен и открыл нишу в ризосфере, он мог прижиться, но не мог значительно способствовать росту растений и/или жизнеспособности растений. Это подтверждается отсутствием наблюдаемого увеличения урожая сои после обработки семян только RTI301 Bacillus velezensis.
В отличие от этого, RTI477 Bacillus subtilis, вероятно, имеет более узкий диапазон антагонизма, чем RTI301 Bacillus velezensis и, таким образом, можно ожидать, является менее эффективным в открытии ниши, в которой приживается при наносении на семена растений его одного. В результате штамм мог бы легче не приживаться в ризосфере сои, что могло бы привести к отсутствию благотворного влияния на рост растений. Это подтверждается наблюдаемым отсутствием повышения урожая сои после обработки семян только RTI477 Bacillus subtilis.
Эксперименты показали, что рост штамма RTI477 Bacillus subtilis совместим с RTI301 Bacillus velezensis. В дополнение, фенотип RTI477 показывает, что данный штамм может представлять собой фенотип с сильным ростом бактерий на твердой среде и, таким образом, предположительно, может более эффективно колонизировать ризосферу, чем RTI301 Bacillus velezensis. Следовательно, можно ожидать, что комбинация обоих штаммов имеет благотворное влияние на сою. В частности, когда RTI301 Bacillus velezensis открывает нишу для приживания в ризосфере сои, штамм может вытесняться RTI477 Bacillus subtilis вследствие его фенотипа с быстрым ростом бактерий. Штамм RTI477 может затем прижиться в ризосфере сои, причем он может оказывать благотворное влияние на его растение-хозяин. Это было подтверждено наблюдаемым повышением урожая сои после инокуляции семян растений комбинацией обоих штаммов.
ПРИМЕР 9
Обработка семян комбинацией спор RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis увеличивает урожай кукурузы
Дополнительные эксперименты проводили для исследования влияния на рост, развитие и урожай растений после инокуляции семян растений комбинацией штаммов RTI301 и RTI477.
+5
В частности, эксперимент на кукурузе был поставлен следующим образом, а данные суммированы в таблице IX ниже: 1) семена не обрабатывали («UTC»); 2) семена обрабатывали комбинацией MAXIM (фунгицид широкого действия флудиоксонил для обработки семян в виде его действующего вещества с 0,0625 мг/семя; SYNGENTA CROP PROTECTION, INC), APRON XL (действующее вещество металаксил-M с 0,0625 мг/семя); SYNGENTA CROP PROTECTION, INC) и PONCHO (инсектицид клотианидин с 0,25 мг/семя; BAYER CROPSCIENCE, INC), что является обычной обработкой семян кукурузы (комбинация MAXIM, APRON XL и PONCHO обозначена «CHEM CONTROL» или «CC»); и 3) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс комбинация 5,0×10 КОЕ/семя каждого из штаммов RTI301 и RTI477 («CC+RTI 301/477 1:1»). Два опыта проводили с 5 повторами на вариант обработки на опыт, в условиях естественного инфекционного фона или инокуляции почвы Rhizoctonia, соответственно. Для опыта с инокуляцией Rhizoctonia выращивали раздельно на увлажненных автоклавированных семенах зерновых, а затем высушивали. Высушенный инокулят перемешивали с семенами при посеве в заданной норме для предоставления инфекции, когда семена начинали расти. Результаты среднего урожая кукурузы (бушелей на акр) в полевых опытах представлены в таблице IX ниже, причем оптыные полевые участки расположены в Shawneetown, Illinois.
Результаты в таблице VII показывают, что инокуляция с CHEM CONTROL плюс комбинация RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis 1 к 1 значительно увеличивали средний урожай кукурузы по сравнению с семенами, которые обрабатывали только CHEM CONTROL. Следует заметить, что увеличение урожая на 10,7 бушелей на акр и 59,8 бушелей на акр обнаружено с комбинацией RTI301 и RTI477 1:1 плюс химический контроль по сравнению с полевыми опытами только с химическим контролем для естественного инфекционного фона и инокулированием Rhizoctonia, соответственно. Эти данные показывают, что обработка семян комбинацией этих штаммов значительно повышает урожай кукурузы.
Таблица VII. Увеличение урожая для необработанных семян кукурузы (UTC), семян кукурузы, обработанных химическим контролем (CC), и семян кукурузы, обработанных CC плюс комбинацией RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis как на естественном инфекционном фоне, так и при искусственной инокуляции Rhizoctonia. Статистическая значимость (в виде букв) на основании P=0,1.
естественный
Rhizoctonia
Бушель/акр
Увеличение
Бушель/акр
Увеличение
1
UTC
170,7
e
-23,8
142
e
-22,0
2
CC
194,5
bcd
0,0
164
de
0,0
3
CC+RTI 301/477 1:1
205,2
a-d
10,7
223,8
ab
59,8
ПРИМЕР 10
Обработка семян комбинацией RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis повышала урожай соевых бобов, Искусственно Инокулированных Rhizoctonia solani
+5
Эксперименты проводили для исследования влияния на появление всходов и урожай соевых бобов, когда для борьбы с патогеном в дополнение к химически активным агентам семена обрабатывали комбинацией штаммов RTI301 и RTI477. В частности, эксперимент на соевых бобах был поставлен следующим образом: 1) семена не обрабатывали (UTC); 2) семена обрабатывали комбинацией CruiserMaxx (инсектицид плюс фунгицид, содержащий тиаметоксам, флудиоксонил плюс металаксил-M; SYNGENTA CROP PROTECTION, INC) и тиофанат метил фунгицид, что является обычной обработкой семян соевых бобов (комбинация CruiserMaxx и тиофанат метила обозначена «CHEM CONTROL»); 3) семена обрабатывали VIBRANCE (действующее вещество Sedaxane; SYNGENTA CROP PROTECTION, INC; и 4) семена обрабатывали CHEM CONTROL плюс 5,0×10 КОЕ/семя каждого из штамма RTI301 и RTI477. Два опыта проводили в Whitewater, WI с 4 повторами на вариант обработки на опыт. Опыты инокулировали Rhizoctonia solani, сперва отдельно выращивая патоген на увлажненных автоклавированных семенах зерновых, а после этого высушенный инокулюм перемешивали с семенами во время посева в заданной норме, обеспечивая инфекцию, когда семена начинали расти. результаты среднего появления всходов соевых бобов и урожая для опытов представлены в таблице VIII ниже. Результаты в таблице VIII показывают, что обработка комбинацией RTI301 Bacillus velezensis и RTI477 Bacillus subtilis в дополнение к CHEM CONTROL приводила к повышению урожая в среднем на 13,3 бушелей на акр по сравнению только с химически активным агентом (с 59,4 до 72,7 бушелей на акр). Таким образом, обработка семян комбинацией RTI301 и RTI477 может обеспечивать значительное улучшение урожая соевых бобов, даже в условиях тяжелого инфекционного фона.
Таблица VIII. Средние результаты появления всходов соевых бобов и урожая в полевых опытах с растениями, искусственно инокулированными Rhizoctonia solani с обработкой семян сои комбинацией B. velezensis RTI301 и B. subtilis RTI477 в дополнение к обработке семян соевых бобов химически активным агентом.
Обработка
%Появление всходов
Урожай(Бш/Акр)
Увеличение урожая по сравнению с CHEM CONTROL(Бш/Акр)
1
UTC
36
49,3
-10,1
2
CHEM CONTROL
49
59,4
-
3
VIBRANCE
56
60,8
1,4
4
CHEM CONTROL+RTI301+RTI477
65
72,7
13,3
ПРИМЕР 11
Влияние на Фрукты и Овощи Капельного орошения изолятом RTI301 Bacillus velezensis плюс изолятом RTI477 Bacillus subtilis
Эксперименты с полевыми испытаниями проводили для определения действия капельного орошения спорами RTI301 Bacillus velezensis плюс RTI477 Bacillus subtilis на тыкву большую столовую, томат и перец. Ни для одного из опытов не был зарегистрирован инфекционный фон, обусловленный почвенными грибами. Влияние на урожай растений определяли согласно экспериментам, описанным ниже.
12
3
3
3
3
3
3
3
Полевое испытание проводили для растений перца (перец халапеньо), причем споры во время посева наносили в норме 1,25 X 10КОЕ/гектар на штамм как RTI301 Bacillus velezensis, так и RTI477 Bacillus subtilis посредством проливания корневой зоны, с последующими двумя нанесениями в виде капельного орошения в такой же норме на 17 и 35 день после высадки. В качестве коммерческого контроля использовали ACCOMPLISH LM (LOVELAND PRODUCTS), который вносили таким же образом, как описано для комбинации RTI301+RTI477 в норме 2340 мл/га. Данный продукт содержит смесь Acidovorax facilis (1×10КОЕ/мл), Bacillus licheniformis (1×10КОЕ/мл), Bacillus subtilis (1×10КОЕ/мл), Bacillus oleronius (1×10КОЕ/мл), Bacillus marinus (1×10КОЕ/мл), Bacillus megaterium (1×10КОЕ/мл) и Rhodococcus rhodochrous(1×10КОЕ/мл).
Добавление спор RTI301 плюс RTI477 привело к повышению урожая для перцев халапеньо по сравнению с необработанными контрольными растениями, на которые бактериальные споры не наносили, а также по сравнению с растениями коммерческого контроля. В частности, результатом обработки растений RTI301+RTI477 было всего 4154 кг/га товарного перца по сравнению с 3455 кг/га и 3930 кг/га для необработанных контрольных растений и растений, обработанных ACCOMPLISH, соответственно, что составляет соответствующее увеличение массы товарного перца на 20% и 5,7%. Существенное увеличение веса товарного перца у растений, обработанных спорами RTI301 Bacillus velezensis плюс RTI477 Bacillus subtilis, по отношению к необработанным контрольным растениям и растениям, обработанным коммерческим стандартом, демонстрирует положительное влияние на рост, обеспечиваемое данной обработкой.
12
12
Аналогичное полевое испытание проводили для растений томатов, причем споры наносили во время посева в норме 0,625 X 10КОЕ/гектар для RTI301 Bacillus velezensis и в норме 3,75 X 10КОЕ/гектар для RTI477 Bacillus subtilis посредством проливания корневой зоны, с последующими двумя нанесениями в виде капельного орошения в такой же норме на 17 и 35 день после высадки. ACCOMPLISH LM использовали в качестве коммерческого контроля и наносили таким же образом, как описано для комбинации RTI301+RTI477 в норме 2340 мл/га.
Добавление спор RTI301 плюс RTI477 приводило к увеличению и общего и товарного урожая томатов по сравнению с необработанными контрольными растениями, на которых бактериальные споры не имелись в пропитке и орошении, а также по сравнению с растениями коммерческого контроля. В частности, результатом обработки растений RTI301+RTI477 было всего 21,824 кг/га товарных томатов, по сравнению с 16,765 кг/га и 21,420 кг/га для необработанных контрольных растений и растений, обработанных ACCOMPLISH, соответственно, что составляет соответствующее увеличение массы товарных томатов на 30,2% и 1,9%. Существенное увеличение in вес товарных томатов растений, обработанных спорами RTI301 Bacillus velezensis плюс RTI477 Bacillus subtilis, в частности по сравнению с необработанными контрольными растениями, демонстрирует положительное действие на рост, обеспеченное данной обработкой.
12
12
Аналогичное полевое испытание проводили для растений тыквы большой столовой, причем споры наносили во время посева в норме 3,75 X 10КОЕ/гектар для RTI301 Bacillus velezensis и в норме 0,625 X 10КОЕ/гектар для RTI477 Bacillus subtilis посредством проливания корневой зоны, без дополнительного нанесения посредством капельного орошения. ACCOMPLISH LM использовали в качестве коммерческого контроля и наносили таким же образом, как описано для комбинации RTI301+RTI477 в норме 2340 мл/га.
Добавление спор RTI301 плюс RTI477 приводило к увеличению и общего и товарного урожая для тыквы большой столовой по сравнению с необработанными контрольными растениями, у которых бактериальный споры не были включены в пропитку, а также по сравнению с коммерческими контрольными растениями. В частности, результатом обработки растений RTI301+RTI477 было всего 873,4 кг/га тыквы большой столовой по сравнению с 838,3 кг/га и 836,1 кг/га для необработанных контрольных растений и растений, обработанных ACCOMPLISH, соответственно, что составляет соответствующее увеличение массы всей тыквы большой столовой на 4,2% и 4,5%. Увеличение общего веса растений тыквы большой столовой, обработанных спорами RTI301 Bacillus velezensis плюс RTI477 Bacillus subtilis по отношению к необработанным контрольным растениям и растениям, обработанным промышленным стандартом, демонстрирует положительное действие на рост, обеспеченное данной обработкой.
ПРИМЕР 12
Идентификация новых Метаболитов, продуцируемых изолятами RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis
Ранее было зарегистрировано, что виды микробов, включая Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens (см., например, Li, Xing-Yu, et al., 2013, J. Microbiol. Biotechnol. 23(3), 313-321; Pecci Y, et al. 2010, Mass Spectrom., 45(7):772-77) вырабатывают пять классов метаболитов типа фенгицина и метаболитов типа дегидроксифенгицина. Эти метаболиты являются молекулами циклических пептидов, которые также содержат группу жирных кислот. Пять классов метаболитов типа фенгицина и типа дегидроксифенгицина обозначаются A, B, C, D и S. Каркасная структура этих метаболитов, а также специфическая аминокислотная последовательность для каждого из пяти классов показана на фиг. 6. У Bacillus subtilis соединения типа фенгицина называются плипастатины. Плипастатины A и B имеют молекулярную массу, аналогичную фенгицинам A и B, и отличаются только в том, что тирозиновый остаток в положении 3 пептидного кольца имеет форму D у фенгицинов и форму L у плипастатинов, а тирозиновый остаток в положении 9 пептидного кольца имеет L у фенгицинов и форму D у плипастатинов. (Marc Ongena and Philippe Jacques, 2007, Trends in Microbiology Vol.16, No.3: 115-125). Для целей данного описания и формулы изобретения термин «Фенгицин» будет использоваться в отношении и метаболитов плипастатина и метаболитов фенгицина. Аналогичным образом, для целей данного описания и формулы изобретения термин «дегидроксифенгицин» будет использоваться в отношении и метаболитов дегидроксиплипастатина и метаболитов дегидроксифенгицина.
Метаболиты типа фенгицина и дегидроксифенгицина, продуцируемые RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis, анализировали с использованием UHPLC-TOF MS. Молекулярные массы этих метаболитов, продуцируемых штаммами после 6 дней роста в среде 869 или среде 2x SG при 30°C, сравнивали с теоретическими молекулярными массами, ожидаемыми для метаболитов типа фенгицина и дегидроксифенгицина. В дополнение, для определения аминокислотного состава различных метаболитов типа фенгицина, продуцируемых штаммами, секвенирование пептидов с использованием LC-MS-MS проводили для каждого из метаболитов типа фенгицина, ранее идентифицированных посредством UHPLC-TOF MS. Таким образом, было определено, что штаммы вырабатывают фенгицин A, B, C, D и S и дегидроксифенгицин A, B, C, D и S. Неожиданно, в дополнение к этим известным соединениям, было определено, что штаммы также вырабатывают ранее неиднтифицированные производные этих соединений.
3
3
Например, было определено, что штамм RTI301 Bacillus velezensis продуцирует фенгициноподобные и дегидроксифенгицинподобные соединения, где L-изолейцин в положении 8 цепи циклического пептида (обозначено X на фиг. 6) замещен L-метионином. Новые классы фенгицина и дегидроксифенгицина в данном описании названы MA, MB и MC, со ссылкой на производные классов A, B и C, в которых L-изолейцин в X на фиг. 6 был замещен L-метионином. Вновь идентифицированные молекулы показаны на фиг. 6 и в таблице IX ниже. Вновь идентифицированные соединения фенгицина MA, MB и MC также были обнаружены для штамма RTI477, однако соответствующие соединения дегидроксифенгицина MA, MB и MC не были обнаружены для штамма RTI477 (Таблица IX).
3
Дополнительно определили, что штамм RTI301 продуцирует дополнительный класс фенгицина и дегидроксифенгицина, который не был ранее идентифицирован. В этом классе L-изолейцин фенгицина B и дегидроксифенгицина B (положение X на фиг. 6) замещен L-гомоцистеином (Hcy). Эти ранее неиднтифицированные метаболиты фенгицина и дегидроксифенгицина в данном описании называются фенгицин H и дегидроксифенгицин H и показаны на фиг. 6 и в таблице IX. Вновь идентифицированное соединение фенгицина H также было обнаружено для штамма RTI477, однако соответствующее соединение дегидроксифенгицина H не было обнаружено для штамма RTI477 (Таблица IX).
1
Дополнительно определили, что штамм RTI301 продуцирует дополнительный класс ранее неиднтифицированных метаболитов фенгицина и дегидроксифенгицина. В этом классе аминокислота в положении 4 каркасной структуре циклического пептида (положение X на фиг. 6) замещена L-изолейцином. Эти ранее неиднтифицированные метаболиты в данном описании называются фенгицин I и дегидроксифенгицин I и показаны на фиг. 6 и в таблице IX. И вновь идентифицированные соединения фенгицина I и дегидроксифенгицина I были также обнаружены для штамма RTI477 (Таблица IX).
Суть аминокислотных последовательностей для ранее зарегистрированных метаболитов типа фенгицина и дегидроксифенгицина и вновь идентифицированных метаболитов предоставлена в таблице IX ниже.
Таблица IX. Сущность MS/MS идентификации метаболитов типа фенгицин в изолятах RTI477 Bacillus subtilis и RTI301 Bacillus velezensis.
Гомолог
X<sub>1</sub>
X<sub>2</sub>
X<sub>3</sub>
R
Масса кольца
теоретический C16 молеулярная формула
теоретический C16 [M+H]<sup>+</sup>
Наблюдаемый
Наблюдаемый
RTI301
RTI477
Фенгицин A
Ala
Thr
Ile
OH
1080,6
C<sub>72</sub>H<sub>110</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>
1463,8
C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Фенгицин B
Val
Thr
Ile
OH
1108,7
C<sub>74</sub>H<sub>114</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>
1491,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Фенгицин C
Aba
Thr
Ile
OH
1094,6
C<sub>73</sub>H<sub>112</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>
1477,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Фенгицин D
Val
Thr
Val
OH
1094,6
C<sub>73</sub>H<sub>112</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>
1477,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Фенгицин S
Val
Ser
Ile
OH
1094,6
C<sub>73</sub>H<sub>112</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>
1477,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Фенгицин MA
Ala
Thr
Met
OH
1098,7
C<sub>71</sub>H<sub>108</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>S
1481,8
C15, C16, C17
C15, C16, C17
Фенгицин MB
Val
Thr
Met
OH
1126,8
C<sub>73</sub>H<sub>112</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>S
1509,8
C14, C15, C16
C14, C15, C16, C17
Фенгицин MC
Aba
Thr
Met
OH
1112,7
C<sub>72</sub>H<sub>110</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>S
1495,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Фенгицин H
Val
Thr
Hcy
OH
1112,7
C<sub>72</sub>H<sub>110</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>S
1495,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Фенгицин I
Ile
Thr
Ile
OH
1122,8
C<sub>75</sub>H<sub>116</sub>N<sub>12</sub>O<sub>20</sub>
1505,8
C16, C17
C16
Дегидроксифенгицин A
Ala
Thr
Ile
H
1080,6
C<sub>72</sub>H<sub>110</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>
1447,8
C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Дегидроксифенгицин B
Val
Thr
Ile
H
1108,7
C<sub>74</sub>H<sub>114</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>
1475,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Дегидроксифенгицин C
Aba
Thr
Ile
H
1094,6
C<sub>73</sub>H<sub>112</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>
1461,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Дегидроксифенгицин D
Val
Thr
Val
H
1094,6
C<sub>73</sub>H<sub>112</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>
1461,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Дегидроксифенгицин S
Val
Ser
Ile
H
1094,6
C<sub>73</sub>H<sub>112</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>
1461,8
C14, C15, C16, C17
C14, C15, C16, C17
Дегидроксифенгицин MA
Ala
Thr
Met
H
1098,7
C<sub>71</sub>H<sub>108</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>S
1465,7
C14
Not наблюдаемого
Дегидроксифенгицин MB
Val
Thr
Met
H
1126,8
C<sub>73</sub>H<sub>112</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>S
1493,8
C15
Not наблюдаемого
Дегидроксифенгицин MC
Aba
Thr
Met
H
1112,7
C<sub>72</sub>H<sub>110</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>S
1479,8
C15
Not наблюдаемого
Дегидроксифенгицин H
Val
Thr
Hcy
H
1112,7
C<sub>72</sub>H<sub>110</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>S
1479,8
C14, C15, C16
Not наблюдаемого
Дегидроксифенгицин I
Ile
Thr
Ile
H
1122,8
C<sub>75</sub>H<sub>116</sub>N<sub>12</sub>O<sub>19</sub>
1489,9
C14, C15, C16
C14, C15, C16
Ссылки
Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, перечисленные в данном документе, включены посредством ссылки во всей своей полноте.
Хотя вышеизложенный предмет был описан с некоторыми подробностями с помощью иллюстрации и примера с целью ясности объяснения, должно быть понятно специалистам в данной области, что некоторые изменения и модификации могут быть реализованы на практике в пределах объема правовых притязаний формулы изобретения.