АНТИТЕЛО, КОТОРОЕ ОБЛАДАЕТ СПОСОБНОСТЬЮ НЕЙТРАЛИЗОВАТЬ СУБСТАНЦИЮ, ОБЛАДАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬЮ, АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ФУНКЦИИ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ VIII (FVIII)
ANTIBODY WHICH IS CAPABLE OF NEUTRALIZING A SUBSTANCE HAVING AN ACTIVITY OF AN ALTERNATIVE COAGULATION FACTOR FUNCTION VIII (FVIII)

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам, предназначенным для применения в способах измерения реактивности FVIII в присутствии субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения фактора свертывания VIII (FVIII).
Предпосылки создания изобретения
Гемофилия представляет собой геморрагическое заболевание, вызываемое врожденным дефицитом или дисфункцией VIII (FVIII) или фактора свертывания IX (FIX). В первом случае ее называют гемофилией А, а во втором случае ее называют гемофилией В. Гены обоих факторов локализованы на хромосоме X, и, поскольку они обусловливают сцепленные с Х-хромосомой рецессивные генетические аномалии, то 99% или большее количество пациентов, у которых развивается заболевание, являются лицами мужского пола. Известно, что коэффициент частоты заболевания составляет примерно один на 10000 случаев рождения живых младенцев мужского пола, а соотношение между количеством заболеваний гемофилией А и гемофилией В составляет примерно 5:1.
Основными областями кровотечения у страдающих гемофилией пациентов являются внутрисуставные, внутримышечные, подкожные, внутриротовые, внутричерепные области, области, находящиеся в пищеварительном тракте, интраназальные области и т.п. Среди них повторные внутрисуставные кровотечения могут развиваться с превращением в гемофильную артропатию, сопровождающуюся суставными нарушениями и трудностями при ходьбе, которые в конечном итоге могут требовать замены суставов. Таким образом, они является основным фактором, снижающим качество жизни (QOL) страдающих гемофилией пациентов.
Серьезность гемофилии хорошо коррелирует с активностью FVIII или активностью FIX в крови. Заболевание у пациентов с активностью фактора свертывания менее 1% классифицируют как серьезное, у пациентов с активностью от 1% или более до менее 5% классифицируют как умеренное, а у пациентов с активностью от 5% или более до менее 40% классифицируют как слабое. Для пациентов с серьезными симптомами, на долю которых приходится примерно половина пациентов с гемофилией, характерны симптомы кровотечения, возникающие несколько раз в месяц, если их не подвергают описанной ниже профилактической заместительной терапии, и эта частота существенно выше, чем у пациентов с умеренными симптомами и у пациентов со слабыми симптомами.
Известно, что помимо гемофилии и приобретенной гемофилии болезнь фон Виллебранда, вызываемая функциональной аномалией или дефицитом фактора фон Вильдебранда (vWF), является патологией, связанной с кровотечением. vWF необходим не только для того, чтобы имела место нормальная адгезия тромбоцитов к субэндотелиальным тканям в областях повреждения стенок сосудов, но он необходим также и для формирования комплекса с FVIII и поддержания содержания FVIII в крови на нормальном уровне. У пациентов с болезнью фон Вильдебранда, эти функции снижены, что приводит к нарушению гемостаза.
Для предупреждения и/или лечения кровотечения у страдающих гемофилией пациентов применяют главным образом факторы свертывания крови, очищенные из плазмы и полученные методами генетической инженерии. Считается, что для пациентов с серьезной гемофилией поддержание активности FVIII или активности FIX в крови на уровне 1% или более с помощью заместительной терапии на основе FVIII или FIX должно быть эффективным в отношении предупреждения проявлений симптомов кровотечения (непатентные документы 1, 2). С другой стороны, у пациентов с гемофилией, прежде всего, у пациентов с серьезной гемофилией, могут вырабатываться антитела против FVIII или FIX, которые называют ингибиторами. Когда образуются такие ингибиторы, то ингибиторы блокируют воздействие содержащей фактор свертывания композиции. В результате осуществляют нейтрализующее лечение с использованием содержащей фактор свертывания композиции в больших количествах или лечения по типу «шунтирующего действия» с использованием комплексного концентрата или содержащей активированный фактор свертывания VII композиции (композиция FVIIa).
Измерение активности FVIII при гемофилии А осуществляют главным образом с помощью одностадийного анализа свертывания (крови), основанного на определении активированного частичного тромбопластинового времени (АРТТ) (непатентный документ 3), и хромогенного анализа на основе системы, реконструированной с использованием очищенного фактора свертывания (непатентный документ 4).
Измерение титра ингибитора FVIII при гемофилии А осуществляют главным образом с помощью анализа Бетезда или анализ Бетезда в модификации Неймеген (непатентные документы 5, 6).
В последние годы было выявлено биспецифическое антитело, которое связывается как с FIX и/или с активированным фактором свертывания IX (FIXa), так и с фактором свертывания X (FX) и/или активированным фактором свертывания крови X (FXa), и которое замещает кофакторную функцию FVIII или более конкретно функцию стимуляции активации FX посредством FIXa (непатентные документы 7, 8; патентные документы 1, 2, 3). Биспецифическое антитело функционально замещает FVIII, компенсируя снижение его функции в реакции свертывания, обусловленное дефицитом или функциональным нарушением FVIII. Например, касательно производства тромбина и АРТТ, которые являются индикаторами реакции свертывания, биспецифическое антитело приводит к укорочению АРТТ в плазме страдающего гемофилией пациента, вне зависимости от присутствия ингибитора FVIII и повышает производство тромбина. Воздействие биспецифического антитела, заключающееся в укорочении АРТТ, оказалось более выраженным по сравнению с воздействием FVIII. Это обусловлено тем, что FVIII проявляет кофакторную активность в плазме только после активации активированным фактором X (FXa) или тромбином, в то время как вышеуказанное биспецифическое антитело не нуждается в таком процессе активации и поэтому быстрее проявляет свою кофакторную функцию.
Кроме того, были получены антитела против Fab к FIXa и против Fab к FX биспецифического антитела и были определены концентрации биспецифического антитела в образцах плазмы, взятых в опытах на животных (непатентный документ 9).
Биспецифическое антитело замещает кофакторную функцию FVIII, воздействуя тем самым на систему анализа, предназначенную для измерения реактивности самого FVIII. Например, при измерении активности FVIII в плазме с помощью одностадийного анализа свертывания на основе АРТТ с целью диагностирования серьезности гемофилии А или с целью мониторинга фармакологической активности содержащей FVIII композиции в организме пациента, которому ввели содержащую FVIII композицию, воздействию, стимулирующему укорочение времени свертывания, сильно препятствует присутствие биспецифического антитела, что значительно ухудшает точность измерений. Кроме того, при определении титра ингибитора FVIII в плазме с помощью анализа Бетезда на основе АРТТ стимулирующему укорочение времени свертывания воздействию сильно препятствует присутствие биспецифического антитела, что значительно ухудшает точность измерений. Это означает, что в организме пациентов, которым ввели биспецифическое антитело, невозможно точно измерить активность FVIII и титр ингибитора FVIII. Таким образом, желательно иметь в распоряжении методы, которые позволяют осуществлять измерение активности FVIII и титр ингибитора FVIII даже в присутствии биспецифического антитела.
Список процитированной литературы
Непатентные документы
[непатентный документ 1] N. Engl. J. Med.; 357(6), 2007, сс. 535-544;
[непатентный документ 1] Thromb Res.; 127 (приложение 1), 2011, сс. 14-17;
[непатентный документ 3] Thromb Diath Haemorrh.; 7, 15 мая 1962, сс. 215-228;
[непатентный документ 4] Haemostasis. 19, 1989, сс. 196-204;
[непатентный документ 5] Thromb Diath Haemorrh.; 34(3), 1975, сс. 869-872;
[непатентный документ 6] Thromb Haemost.; 73(2), февраль 1995, сс. 247-251;
[непатентный документ 7] Nat Med.; 18(10), 2012, сс. 1570-1574;
[непатентный документ 8] PLoS One.; 8(2), 2013, е57479;
[непатентный документ 9] J Thromb Haemost.; 12(2), 2014, сс. 206-213,
вспомогательная информация
Патентные документы
[патентный документ 1] WO 2005/035756;
[патентный документ 2] WO 2006/109592;
[патентный документ 3] WO 2012/067176.
Краткое изложение сущности изобретения
Задачи, положенные в основу настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам, предназначенным для применения в способах измерения реактивности FVIII в присутствии субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII, например, в способах измерения активности FVIII или титра ингибитора FVIII. Кроме того, задача, положенная в основу настоящего изобретения, заключалась в том, чтобы разработать антитела, включенные в наборы или т.п., предназначенные для измерения реактивности FVIII, такой как активность FVIII и титр ингибитора FVIII, в присутствии субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII.
Средства решения указанных задач
Для решения вышеуказанных задач при создании настоящего изобретения были получены субстанции, позволяющие нейтрализовать активность биспецифического антитела, и путем целенаправленного изучения параметров тестирования, при которых измеряют реактивность FVIII, были найдены условия измерений, гарантирующие точность даже в присутствии биспецифического антитела. В результате при создании настоящего изобретения было установлено, что путем применения нейтрализующих антител к биспецифическому антителу в соответствующих концентрациях (например, в концентрациях, при которых биспецифическое антитело может быть в достаточной степени нейтрализовано), можно точно оценивать активность FVIII в плазме страдающих гемофилией А пациентов с помощью одностадийного анализа свертывания на основе АРТТ, а также было установлено, что можно точно оценивать титр ингибитора FVIII в плазме страдающего гемофилией А пациента, у которого присутствует ингибитор FVIII, с помощью анализа Бетезда на основе АРТТ. Кроме того, при создании настоящего изобретения были успешно созданы наборы, содержащие нейтрализующие антитела к биспецифическому антителу, которое обладает FVIII-замещающей активностью, предназначенные для применения при измерении. Настоящее изобретение основано на указанных результатах и в нем предложены:
[1] антитело, которое нейтрализует субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения фактора свертывания VIII;
[2] антитело по п. [1], где субстанция, обладающая активностью в отношении функционального замещения фактора свертывания VIII, представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с фактором свертывания IX и/или активированным фактором свертывания IX и с фактором свертывания X и/или активированным фактором свертывания X;
[3] антитело по п. [2], где биспецифическое антитело представляет собой любое из антител, указанных ниже, в котором первый полипептид ассоциирован с третьим полипептидом и второй полипептид ассоциирован с четвертым полипептидом, а именно:
биспецифическое антитело, в котором первый полипептид представляет собой Н-цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, второй полипептид представляет собой Н-цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и третий полипептид и четвертый полипептид представляют собой общие L-цепи, имеющие SEQ ID NO: 10 (Q499-z121/J327-z119/L404-k);
биспецифическое антитело, в котором первый полипептид представляет собой Н-цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36, второй полипептид представляет собой Н-цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, и третий полипептид и четвертый полипептид представляют собой общие L-цепи, имеющие SEQ ID NO: 38 (Q153-G4k/J142-G4h/L180-k);
[4] антитело по одному из п.п. [1]-[3], где нейтрализующее антитело представляет собой антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с фактором свертывания IX и/или активированным фактором свертывания IX, и которое содержит
а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, CDR2, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и CDR3, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; и
б) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, CDR2, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, и CDR3, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20;
[5] антитело по одному из п.п. [1]-[4], где нейтрализующее антитело представляет собой антитело, которое содержит
а) вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; и
б) вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
[6] антитело по одному из п.п. [1]-[3], где нейтрализующее антитело представляет собой антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с фактором свертывания X и/или активированным фактором свертывания X, и которое содержит
а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, CDR2, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, и CDR3, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26; и
б) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, CDR2, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и CDR3, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32;
[7] антитело по одному из п.п. [1]-[3] и [6], где нейтрализующее антитело представляет собой антитело, которое содержит
а) вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и
б) вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
[8] нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по одному из п.п. [1]-[7];
[9] вектор, в который интродуцирована нуклеиновая кислота по п. [8];
[10] клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п. [8] или вектор по п. [9];
[11] способ получения антитела, заключающийся в том, что культивируют клетку по п. [10];
[12] антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с фактором свертывания IX и/или активированным фактором свертывания IX, и которое содержит
а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, CDR2, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и CDR3, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; и
б) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, CDR2, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19, и CDR3, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20;
[13] антитело по п. [12], содержащее
а) вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; и
б) вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2;
[14] антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с фактором свертывания X и/или активированным фактором свертывания X, и которое содержит
а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, CDR2, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25, и CDR3, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26;
б) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, CDR2, состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и CDR3, который состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32;
[15] антитело по п. [14], которое содержит
а) вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; и
б) вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;
[16] нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по одному из п.п. [12]-[15];
[17] вектор, в который интродуцирована нуклеиновая кислота по п. [16];
[18] клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по п. [16] или вектор по п. [17]; и
[19] способ получения антитела, заключающийся в том, что культивируют клетку по п. [18].
Эффекты изобретения
В настоящем изобретении предложены антитела, которые применяют для измерения активности FVIII и титра ингибитора FVIII, избегая при этом влияния активности субстанции, обладающей FVIII-замещающей активностью. Субстанция, обладающая FVIII-замещающей активностью, включает биспецифическое антитело, которое связывается с FIX и/или FIXa и с FX и/или FXa.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - результаты одностадийного анализа свертывания, осуществленного в условиях нейтрализации биспецифического антитела к FIXa/FX с использованием rAQ8-mIgG2b и rAJ540-rbtIgG. Когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл или 100 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX, а именно АСЕ910, разводили буфером (№3 и №7), то было установлено, что активности FVIII находились выше диапазона калибровочной кривой. С другой стороны, когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл или 100 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX, а именно АСЕ910, разводили буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№4 и №8), то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностями в образцах, в которые не добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX (№1 и №5). Когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл или 100 ед./дл рекомбинантного FVIII, разводили буфером, содержащим только два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№2 и №6), то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностями в образцах, в которые не добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX (№1 и №5);
на фиг. 2 - результаты одностадийного анализа свертывания, осуществленного в условиях нейтрализации биспецифического антитела к FIXa/FX с использованием AQ1 и AJ541 или AQ1 и AJ522. Когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX, а именно АСЕ910, разводили буфером (№4), то было установлено, что активности FVIII находились выше диапазона калибровочной кривой. С другой стороны, когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим анти-FIXa/FX антителом, а именно АСЕ910, разводили буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX, а именно AQ1 и AJ541 (№5), или буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX, а именно AQ1 и AJ522 (№6), то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностями в образцах, в которые не добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX (№1). Когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, разводили буфером, содержащим только два типа антител к биспецифическому антителу к FIXa/FX, а именно AQ1 и AJ541 (№2), или буфером, содержащим только два типа антител, а именно AQ1 и AJ522 (№3), то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностями в образцах, в которые не добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX (№1).
на фиг. 3 - результаты одностадийного анализа свертывания, осуществленного в условиях нейтрализации биспецифического антитела к FIXa/FX с использованием AQ512 и AJ114 или AQ512 и AJ521. Когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX, а именно hBS23, разводили буфером (№4), то было установлено, что активности FVIII находились выше диапазона калибровочной кривой. С другой стороны, когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX, а именно hBS23, разводили буфером, содержащим два типа антител к биспецифическому анти-FIXa/FX антителу, AQ512 и AJ114 (№5), или буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX, а именно AQ512 и AJ521 (№6), то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностями в образцах, в которые не добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX (№1). Когда плазму с дефицитом FVIII, которая содержала 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, разводили буфером, содержащим только два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX, а именно AQ512 и AJ114 (№2), или буфером, содержащим только два типа антител, а именно AQ512 и AJ521 (№3), то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностями в образцах, в которые не добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX (№1);
на фиг. 4 - результаты анализа Бетезда, осуществленного в условиях нейтрализации биспецифического антитела к FIXa/FX с использованием rAQ8-mIgG2b и rAJ540-rbtIgG. Установлено, что активность ингибитора FVIII в плазме, содержащей только биспецифическое антитело к FIXa/FX АСЕ910 (#3) была эквивалентна 100% FVIII, установленной с помощью калибровочной кривой, или превышала ее. С другой стороны, установлено, что титр ингибитора FVIII в содержащей FVIII плазме, которая содержала биспецифическое антитело к FIXa/FX и два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№4), был сходным с титром в содержащей ингибитор плазме, которая не содержала добавок (№1). Для содержащей ингибитор FVIII плазмы, которая содержала только два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№2) были получены результаты, сходные с результатами для варианта №1.
Варианты осуществления изобретения
Способ измерения активности FVIII, предлагаемый в настоящем изобретении, включает стадию, на которой приводят в контакт описанные ниже субстанции (1) и (2). Альтернативно этому способ можно осуществлять с применением методов, обычно используемых для измерения активности FVIII. Более подробно способ описан также в разделе «Примеры».
(1) Полученный из крови образец, который содержит субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII;
(2) Субстанция, которая нейтрализует субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII.
Методы измерения активности FVIII
Можно использовать методы измерения активности FVIII, которые обычно применяют для этой цели и которые известны специалистам в данной области, например, можно применять одностадийный анализ свертывания (Casillas и др., Coagulation 4, 1971, сс. 107-111), в котором используют плазму с дефицитом фактора VIII (фирма Sysmex, Кобе, Япония), основанный на определении времени свертывания (измерения аРТТ). Одностадийный анализ свертывания осуществляют, например, следующим образом. Смешивают три раствора, а именно, 50 мкл десятикратно разведенной тестируемой плазмы, 50 мкл плазмы с дефицитом FVIII и 50 мкл реагента для определения АРТТ; и полученную смесь инкубируют при 37°С в течение 5 мин, после чего добавляют 50 мкл раствора кальция для инициации реакции свертывания и затем измеряют время до свертывания. Кроме того, осуществляют измерения с использованием вместо тестируемой плазмы серийно разведенных образцов нормальной плазмы (активность FVIII в десятикратно разведенной нормальной плазме принимают за 100%) и получают калибровочную кривую, откладывая на графике по горизонтальной оси активность FVIII, а по вертикальной оси время свертывания. Время свертывания для тестируемой плазмы преобразуют в активность FVIII с использованием калибровочной кривой и рассчитывают активность FVIII в тестируемой плазме. В контексте настоящего описания, если не указано иное, выражение «измерение активности FVIII» используют в качестве выражения, которое может включать «измерение активности активированного фактора свертывания VIII (FVIIIa)».
В качестве метода измерения активности FVIII можно применять помимо одностадийного анализа свертывания анализ образования тромбина (TGA), методы измерения с использованием ротационной тромбоэластометрии, хромогенный анализ FVIII, анализ формы сигнала свертывания, анализ производства тромбина и активированного фактора X и т.п. Способ измерения титра ингибитора FVIII, предлагаемый в настоящем изобретении, включает стадию, на которой приводят в контакт описанные ниже субстанции (1) и (2). Альтернативно этому способ можно осуществлять с применением методов, обычно используемых для измерения титра ингибитора FVIII. Более подробно способ описан также в разделе «Примеры».
(1) Полученный из крови образец, который содержит субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII;
(2) Субстанция, которая нейтрализует субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII.
Методы измерения титра ингибитора FVIII
Можно использовать методы измерения титра ингибитора FVIII, которые обычно применяют для этой цели и которые известны специалистам в данной области, например, можно применять анализ Бетезда (Kasper и др., Thrombos Diath Haemorrh 34, 1975, сс. 869-872), метод ELISA и анализ Бетезда в модификации Неймеген (Verbruggen и др., Thromb Haemost 73, 1995, сс. 247-251). Анализ Бетезда осуществляют, например, следующим образом. Раствор, полученный путем смешивания в равных количествах нормальной плазмы и тестируемой плазмы, инкубируют при 37°С в течение двух часов и затем измеряют остаточную активность фактора VIII в нормальной плазме с помощью одностадийного анализа свертывания на основе частичного активированного тромбопластинового времени (АРТТ). Действие, приводящее к ингибированию на 50% активности фактора VIII в нормальной плазме, принимают за 1 единицу согласно системе Бетезда (1BU) и поэтому титр ингибитора FVIII рассчитывают в единицах Бетезда. Если титр ингибитора FVIII в тестируемой плазме является высоким и остаточная активность FVIII не находится в пределах от 25% до 75%, то для пересчета единиц Бетезда используют тестируемую плазму, разведенную соответствующим образом буфером, и затем полученное значение умножают на коэффициент разведения для расчета титра ингибитора FVIII в тестируемой плазме.
FVIII
FVIII представляет собой одну из ряда молекул, участвующих в свертывании крови, которая проявляет кофакторную активность после активации тромбином или FXa, и стимулирует реакцию активации FX с помощью FIXa.
Ингибитор FVIII
Ингибитор FVIII представляет собой изоантитело против чужого FVIII и оно образуется у 20-30% страдающих гемофилией А пациентов. У индивидуума, который изначально является здоровым, впоследствии могут образовываться аутоантитела против FVIII. Как правило, большинство являющихся ингибиторами FVIII изоантител и аутоантител функционируют в качестве нейтрализующих антител к FVIII, и они снижают или элиминируют активность FVIII.
Активность в отношении замещения FVIII
В контексте настоящего изобретения выражение «субстанция, обладающая активностью в отношении функционального замещения FVIII» может быть перефразирована как «субстанция, обладающая FVIII-подобной активностью». В контексте настоящего изобретения выражение «функционально замещает/замещающий FVIII» означает, что имеет место стимулирование обусловленной FIXa активации FX (стимулируется образование FXa посредством FIXa). Более конкретно, в контексте настоящего изобретения выражение «функционально замещает/замещающий FVIII» означает распознавание FIX или FIXa и FX или FXa, и стимулирование активации фактора FX фактором FIXa (стимулирование образования FXa посредством FIXa). Стимулирующую образование FXa активность можно оценивать, например, с помощью измерительной системы, включающей FXIa, FX, синтетический субстрат S-2222 (синтетический субстрат FXa) и фосфолипиды. Такая измерительная система позволяет продемонстрировать корреляцию между серьезностью заболевания и клиническими симптомами в случаях гемофилии А (Rosen S., Andersson М., Blomback М. и др., Clinical applications of a chromogenic substrate method for determination of FVIII activity, Thromb Haemost; 54, 1985, cc. 811-823).
В контексте настоящего изобретения предпочтительным вариантом субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII, является, например, биспецифическое антитело, которое связывается с FIX и/или FIXa и с FX и/или FXa. Такое антитело можно получать с помощью методов, описанных, например, в WO 2005/035756, WO 2006/109592 и WO 2012/067176. Биспецифическое антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, включает антитела, описанные в указанных документах.
Предпочтительное биспецифическое антитело представляет собой, например, АСЕ910 (Q499-z121/J327-z119/L404-k), которое представляет собой биспецифическое антитело, описанное в запатентованном документе (WO 2012/067176) (биспецифическое антитело, в котором ассоциированы Н-цепь, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, и L-цепь, имеющая SEQ ID NO: 10, и ассоциированы Н-цепь, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и L-цепь, имеющая SEQ ID NO: 10), и hBS23 (Q153-G4k/J142-G4h/L180-k) (биспецифическое антитело, в котором ассоциированы Н-цепь, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36 и L-цепь, имеющая SEQ ID NO: 38, и ассоциированы Н-цепь, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, и L-цепь, имеющая SEQ ID NO: 38), которые представляют собой биспецифические антитела, описанные в патентном документе (WO 2012/067176).
Нейтрализация
В контексте настоящего изобретения понятие «нейтрализация» применительно к субстанции, которая нейтрализует субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII, относится, например, к полному или частичному ингибированию активности в отношении функционального замещения FVIII субстанции, которая обладает активностью в отношении функционального замещения FVIII. Например, если субстанция, обладающая активностью в отношении функционального замещения FVIII, представляет собой антитело, то полное или частичное ингибирование активности в отношении функционального замещения FVIII может осуществляться (но, не ограничиваясь только этим) посредством полного или частичного ингибирования связывания антитела с антигеном.
Нейтрализующие субстанции
В контексте настоящего изобретения понятие «субстанция» в выражении «нейтрализующая субстанция» применительно к субстанции, которая нейтрализует субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII, относится, например, к пептидам, полипептидам, органическим соединениям, аптамерам, антителам и т.п.п., которые связываются с субстанцией, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII.
В комбинации можно применять несколько нейтрализующих субстанций, например, в комбинации можно применять антитела и аптамеры.
Полипептиды
В контексте настоящего изобретения понятие «полипептиды», как правило, относится к белкам и пептидам длиной примерно десять аминокислот или более. Как правило, они представляют собой полученные из биологического источника полипептиды, но они не ограничены только указанными полипептидами и могут представлять собой, например, полипептиды, содержащие созданную искусственным путем последовательность. Кроме того, они могут представлять собой любые нативные полипептиды или синтетические полипептиды, рекомбинантные полипептиды или т.п. Кроме того, фрагменты вышеуказанных полипептидов также подпадают под понятие полипептиды, предлагаемые в настоящем изобретении.
Органические соединения
В контексте настоящего изобретения органические соединения представляют собой, например, низкомолекулярные соединения, предпочтительно имеющие молекулярную массу 1000 или менее.
Аптамеры
Понятие «аптамер» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая специфически связывается с молекулой-мишенью, такой как полипептид. Например, аптамеры, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой РНК-аптамеры, обладающие способностью специфически связываться с субстанциями, обладающими FVIII-замещающей активностью. Получение и терапевтическое применение аптамеров хорошо известно в данной области. Например, аптамеры можно получать с помощью метода SELEX (см. патенты США №№5475096, 5580737, 5567588, 5707796, 5763177, 6699843 и т.п.).
Антитела
Когда субстанция, обладающая активностью в отношении функционального замещения FVIII, представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с FIX и/или FIXa и с FX и/или FXa, то примерами антител, которые связываются с субстанцией, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII, включают антитела, выбранные из группы, состоящей из антител, которые связываются с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIX, антител, которые связываются с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIXa, антител, которые связываются с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FX, антител, которые связываются с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FXa, и биспецифические антитела, которые связываются с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIX и/или FIXa и с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FX и/или FXa. Вышеуказанные антитела можно применять по отдельности или в виде многокомпонентных комбинаций. Например, можно применять несколько антител, которые связываются с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с одним типом антигена, например, несколько типов антител, которые связываются с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIX. Например, когда субстанция, обладающая активностью в отношении функционального замещения FVIII, представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с FIX и/или FIXa и с FX и/или FXa, то можно применять следующие комбинации антител:
(а) антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIX, и антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FX;
(б) антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIXa, и антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FX;
(в) антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIX и антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIXa; и
(г) антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIX, антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FX, и антитело, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIXa.
Примерами антитела, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FIX и/или FIXa, являются антитела AQ8, AQ1 и AQ512. Нуклеотидные последовательности вариабельных областей и соответствующие им аминокислотные последовательности анализировали с помощью программы GENETYX, версия 9 (фирма GENETYX CORPORATION).
Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность вариабельной области Н-цепи AQ8 представлены в следующих SEQ ID NO:
аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 1; и
нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 5.
Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность вариабельной области L-цепи AQ8 представлены в следующих SEQ ID NO:
аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 2; и
нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 6.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CDR 1-3 Н-цепи AQ8 представлены в следующих SEQ ID NO:
аминокислотная последовательность CDR1: SEQ ID NO: 12;
аминокислотная последовательность CDR2: SEQ ID NO: 13;
аминокислотная последовательность CDR3: SEQ ID NO: 14;
нуклеотидная последовательность CDR1: SEQ ID NO: 15;
нуклеотидная последовательность CDR2: SEQ ID NO: 16; и
нуклеотидная последовательность CDR3: SEQ ID NO: 17.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CDR 1-3 L-цепи AQ8 представлены в следующих SEQ ID NO:
аминокислотная последовательность CDR1: SEQ ID NO: 18;
аминокислотная последовательность CDR2: SEQ ID NO: 19;
аминокислотная последовательность CDR3: SEQ ID NO: 20;
нуклеотидная последовательность CDR1: SEQ ID NO: 21;
нуклеотидная последовательность CDR2: SEQ ID NO: 22; и
нуклеотидная последовательность CDR3: SEQ ID NO: 23.
Примерами антитела, которое связывается с Fab, содержащим антигенсвязывающий сайт, который связывается с FX и/или FIXa, являются антитела AJ540, AJ541, AJ522, AJ114 и AJ521. Нуклеотидные последовательности вариабельных областей и соответствующие им аминокислотные последовательности анализировали с помощью программы GENETYX, версия 9 (фирма GENETYX CORPORATION).
Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность вариабельной области Н-цепи AJ540 представлены в следующих SEQ ID NO:
аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 3; и
нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 7.
Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность вариабельной области L-цепи AJ540 представлены в следующих SEQ ID NO:
аминокислотная последовательность: SEQ ID NO: 4; и
нуклеотидная последовательность: SEQ ID NO: 8.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CDR 1-3 Н-цепи AJ540 представлены в следующих SEQ ID NO:
аминокислотная последовательность CDR1: SEQ ID NO: 24;
аминокислотная последовательность CDR2: SEQ ID NO: 25;
аминокислотная последовательность CDR3: SEQ ID NO: 26;
нуклеотидная последовательность CDR1: SEQ ID NO: 27;
нуклеотидная последовательность CDR2: SEQ ID NO: 28; и
нуклеотидная последовательность CDR3: SEQ ID NO: 29.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CDR 1-3 L-цепи AJ540 представлены в следующих SEQ ID NO:
аминокислотная последовательность CDR1: SEQ ID NO: 30;
аминокислотная последовательность CDR2: SEQ ID NO: 31;
аминокислотная последовательность CDR3: SEQ ID NO: 32;
нуклеотидная последовательность CDR1: SEQ ID NO: 33;
нуклеотидная последовательность CDR2: SEQ ID NO: 34; и
нуклеотидная последовательность CDR3: SEQ ID NO: 35.
Понятие «антитело» используется в наиболее широком смысле и антитела могут представлять собой моноклональные антитела, поликлональные антитела, димеры, мультимеры, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), производные антител и продукты, представляющие собой модифицированные антитела (Miller K. и др., J Immunol., 170(9), 2003, сс. 4854-4861), если они обладают требуемой биологической активностью. Антитела могут представлять собой мышиные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела или антитела из других видов, или они могут представлять собой искусственные синтезированные антитела. Антитела, представленные в настоящем описании, могут представлять собой молекулы иммуноглобулина любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса. Иммуноглобулины могут происходить из животных любого вида (например, человека, мышей или кроликов). Понятия «антитело», «иммунный глобулин» и «иммуноглобулин» используют взаимозаменяемо в их наиболее широком смысле.
2
2
3
Понятие «производное антитела» включает часть антитела, предпочтительно вариабельную область антитела или по меньшей мере антигенсвязывающую область антитела. Производные антитела включают (но, не ограничиваясь только ими), например, Fab-, Fab'-, F(ab')-, Fv-фрагменты, линейные антитела и одноцепочечные антитела (scFv), sc(Fv), Fab, доменные антитела (dAb) (WO 2004/058821, WO 2003/002609), димерные антитела (диабоди), триабоди, тетрабоди, миниантитела (минибоди) и мультиспецифические антитела, образованные из производных антител. В контексте настоящего описания «Fab» состоит из одной легкой цепи и СН1-домена и вариабельной области одной тяжелой цепи. Кроме того, «Fv» представляет собой наименьшее производное антитела и включает полную антигенраспознающую область и антигенсвязывающую область. Производное антитела может представлять собой, например, слияние антитела в виде IgG и Fc. Например, оно описано в примере 2 описания патента U.S. №5641870; у Zapata G. и др., Protein Eng., 8(10), 1995, сс. 1057-1062; Olafsen Т. и др., Protein Eng. Design & Sel., 17(4), 2004, сс. 315-323; Holliger P. и др., Nat. Biotechnol., 23(9), 2005, сс. 1126-1136; Fischer N. и др., Pathobiology., 74(1), 2007, сс. 3-14; Shen J. и др., J Immunol Methods., 318, 2007, cc. 65-74; и Wu и др., Nat Biotechnol., 25(11), 2007, cc. 1290-1297.
Примерами продуктов, представляющих собой модифицированные антитела, могут служить антитела, сцепленные с различными молекулами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, включают такие продукты, представляющих собой модифицированные антитела. Не накладывается ограничений на предназначенные для сцепления субстанции, используемые в продуктах, представляющих собой модифицированные антитела, предлагаемых в настоящем изобретении. Для получения таких продуктов, представляющих собой модифицированные антитела, можно осуществлять химические модификации полученных антител. Такие методы уже являются общепринятыми в данной области.
Понятие «биспецифические антитела» относится к антителам, имеющим вариабельные области, которые распознают различные эпитопы, при этом указанные области находятся в одной и той же молекуле антитела. Биспецифические антитела могут представлять антитела, которые распознают два или большее количество различных антигенов, или антитела, которые распознают два или большее количество различных эпитопов одного и того же антигена. Биспецифические антитела могут представлять собой не только полные антитела, но и производные антител. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, включают также биспецифические антитела. В контексте настоящего изобретения понятия «биспецифическое антитело к FIXa/FX» и «биспецифическое антитело, которое связывается с FIXa и FX» используют как синонимы.
Методы получения генетически сконструированных антител
В качестве антител можно применять рекомбинантные антитела, полученные методами генетической инженерии. Рекомбинантные антитела можно получать путем клонирования ДНК, кодирующих антитела, с использованием гибридом или продуцирующих антитело клеток, таких как сенсибилизированные лимфоциты, которые продуцируют антитела, встраивания их в векторы и затем интродуцирования их в хозяев (клетки-хозяева) для производства антител.
Антитела включают человеческие антитела, мышиные антитела и крысиные антитела, но их происхождение не ограничено указанными видами. Они могут представлять собой также генетически модифицированные антитела, такие как химерные антитела и гуманизированные антитела.
Методы получения человеческих антител известны. Например, для получения представляющих интерес антител можно иммунизировать трансгенных животных, несущих весь спектр генов человеческих антител, представляющими интерес антигенами (см. публикации международных заявок на патент WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096 и WO 96/33735).
Генетически модифицированные антитела можно получать с помощью известных методов. Например, конкретно химерные антитела содержат вариабельные области Н-цепи и L-цепи антитела, происходящие из иммунизированного животного, и константные области Н-цепи и L-цепи из человеческого антитела. Химерные антитела можно получать путем связывания ДНК, кодирующих вариабельные области антитела, происходящего из иммунизированного животного, с ДНК, кодирующими константные области человеческого антитела, встраивания их в экспрессионный вектор и затем интродуцирования его в хозяина для производства антител.
Гуманизированные антитела представляют собой модифицированные антитела, которые называют также реконструированными человеческими антителами. Гуманизированное антитело конструируют путем переноса CDR антитела, полученного из иммунизированного животного, в гипервариабельные участки человеческого антитела. Для этих целей можно применять известные стандартные методы генетической рекомбинации (см. публикацию заявки на европейский патент ЕР 239400; публикацию международной заявки на патент WO 96/02576; Sato K. и др., Cancer Research, 53, 1993, сс. 851-856; публикацию международной заявки на патент WO 99/51743).
Биспецифические антитела представляют собой антитела, обладающие специфичностью в отношении двух различных антигенов.
Например, биспецифические антитела IgG-типа (хотя биспецифические антитела не ограничены антителами IgG-типа) могут секретироваться гибридной гибридомой (квадромой), полученной путем слияния двух типов гибридом, продуцирующих антитела IgG-типа (Milstein С. и др., Nature, 305, 1983, сс. 537-540). Их секрецию можно обеспечивать также путем интродукции генов L-цепи и Н-цепи, кодирующих два типа представляющих интерес IgG, т.е. в общей сложности четырех типов генов, в клетки для совместной экспрессии генов.
В этом случае посредством интродукции соответствующих аминокислотных замен в СН3-области Н-цепей можно обеспечивать условия для преимущественной экспрессии IgG, имеющих гетерогенную комбинацию Н-цепей (Ridgway J.В. и др., Protein Engineering, 9, 1996, сс. 617-621; Merchant A.M. и др., Nature Biotechnology, 16, 1998, сс. 677-681; WO 2006/106905; Davis J.H. и др., Protein Eng Des Sel., 4, 2010, cc. 195-202).
Касательно L-цепей, поскольку разнообразие вариабельных областей L-цепей меньше разнообразия вариабельных областей Н-цепей, то следует ожидать, что можно получать общую L-цепь, которая может обеспечивать связывающую способность для обеих Н-цепей. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой антитела, содержащие одинаковые (общие) L-цепи. Можно обеспечивать эффективную экспрессию биспецифических IgG путем интродукции генов общей L-цепи и обеих Н-цепей в клетки.
Эпитопы
Антитела, представляющие собой вариант субстанций, которые нейтрализуют субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII, предлагаемые в настоящем изобретении, включают антитела, которые связываются с эпитопом, перекрывающимся с эпитопом, связывающимся с описанными выше антителами, и предпочтительно антитела, которые связываются с тем же самым эпитопом.
Определение того, распознает ли антитело тот же самый эпитоп или эпитоп, перекрывающийся с эпитопом, который распознается другим антителом, можно осуществлять путем изучения конкуренции между двумя антителами за эпитоп. Конкуренцию между антителами можно оценивать с помощью анализов в условиях конкуренции с применением таких методов, как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), метод флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) и технология флуорометрического анализа в микрообъемах (FMAT (зарегистрированный товарный знак)). Количество антител, связанных с антигеном, косвенно коррелирует со связывающей способностью рассматриваемых в качестве возможных конкурентов антител (тестируемых антител), которые в условиях конкуренции связываются с одним и тем же или перекрывающимся эпитопом. Иными словами, когда количество тестируемых антител или их аффинность в отношении одного и того же или перекрывающегося эпитопа увеличивается, то количество антител, связанных с антигеном, снижается, а количество тестируемых антител, связанных с антигеном, возрастает.Конкретно процедура заключается в том, что меченные соответствующим образом антитела и тестируемые антитела одновременно добавляют к антигенам и затем с помощью метки выявляют связанные антитела. Количество антител, связанных с антигеном, можно легко определять, осуществляя заранее мечение антител. На такую метку не накладывается конкретных ограничений, и метод мечения выбирают так, чтобы он соответствовал применяемому методу анализа. Конкретные примеры метода мечения включают мечение с использованием флуоресцентной метки, радиоактивной метки и ферментной метки.
50
В контексте настоящего описания выражение «антитело, которое связывается с перекрывающимся эпитопом» или «антитело, которое связывается тем же самым эпитопом» относится к тестируемому антителу, которое может снижать уровень связывания меченого антитела по меньшей мере на 50%, взятого в концентрации, которая, как правило, в 100 раз выше, предпочтительно в 80 раз выше, более предпочтительно в 50 раз выше, еще более предпочтительно в 30 раз выше и еще более предпочтительно в 10 раз выше концентрации немеченого антитела, при которой связывание немеченого антитела снижает уровень связывания меченого антитела на 50% (IC). Эпитоп, распознаваемый антителом, можно анализировать методами, известными специалистам в данной области, например, это можно осуществлять с помощью вестерн-блоттинга и т.п.
Методы получения антител
Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать методами, известными специалистам в данной области. Более конкретно, ДНК, кодирующую представляющее интерес антитело, встраивают в экспрессионный вектор. Встраивание в экспрессионный вектор осуществляют таким образом, чтобы экспрессия происходила под контролем регулирующих экспрессию областей, таких как энхансеры и промоторы. Затем клетки-хозяева трансформируют этим экспрессионным вектором для экспрессии антител. На этой стадии можно применять соответствующие комбинации хозяина и экспрессионного вектора.
Примерами векторов являются векторы серии М13, векторы серии pUC, pBR322, pBluescript и pCR-Script. Помимо указанных векторов для цели субклонирования и вырезания кДНК можно применять, например, pGEM-T, pDIRECT или рТ7.
В частности, экспрессионные векторы можно применять в качестве векторов с целью получения антитела. Например, когда хозяин представляет собой штамм Е. coli, такой как JM109, DH5α, НВ101 или XLl-Blue, то экспрессионные векторы обязательно должны иметь промотор, позволяющий осуществлять эффективную экспрессию в Е. coli, например, промотор lacZ (Ward и др., Nature, 341, 1989, сс. 544-546; и FASEB J., 6, 1992, сс. 2422-2427), промотор araB (Better и др., Science, 240, 1988, сс. 1041-1043) или промотор Т7. Примерами таких векторов являются указанные выше векторы, а также pGEX-5Х-1 (производимый фирмой Pharmacia), «QIAexpress system» (производимый фирмой QIAGEN), pEGFP и рЕТ (в этом случае предпочтительным хозяином является штамм BL21, экспрессирующий РНК-полимеразу Т7).
Векторы могут содержать сигнальную последовательность для секреции полипептида. В том случае, когда производство имеет место в периплазме Е. coli, то в качестве сигнальной последовательности для секреции полипептида можно применять сигнальную последовательность pelB (Lei S. Р. и др., J. Bacterid., 169, 1987, с. 4397). Векторы можно переносить в клетки-хозяева с помощью методов на основе хлорида кальция или методов электропорации.
Помимо экспрессионных векторов для Е. coli примерами векторов для получения антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, являются экспрессионные векторы, происходящие из млекопитающих (например, pcDNA3 (производимый фирмой Invitrogen Corp.), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res., 18(17), 1990, c. 5322), pEF и pCDM8), экспрессионные векторы, происходящие из клеток насекомых (например, «бакуловирусная система экспрессии Bac-to-BAC» (производимая фирмой GIBCO BRL) и pBacPAK8), экспрессионные векторы, происходящие из растений (например, рМН1 и рМН2), экспрессионные векторы, происходящие из вирусов животных (например, pHSV, pMV и pAdexLcw), экспрессионные векторы, происходящие из ретровирусов (например, pZIPneo), экспрессионные векторы, происходящие из дрожжей (например, набор для экспрессии «Pichia Expression Kit» (производимый фирмой Invitrogen Corp.), pNV11 и SP-Q01) и экспрессионные векторы, происходящие из Bacillus subtilis (например, pPL608 и pKTH50).
Для осуществления экспрессии в клетках животных, таких как клетки СНО, клетки COS или клетки NIH3T3, векторы должны обязательно иметь промотор, необходимый для обеспечения внутриклеточной экспрессии, например, промотор SV40 (Mulligan и др., Nature, 277, 1979, с. 108), промотор MMTV-LTR, промотор EF1α (Mizushima и др., Nucleic Acids Res, 18, 1990, с. 5322), промотор CAG (Gene, 108, 1991, с. 193) или промотор CMV, и более предпочтительно иметь ген, пригодный для скрининга трансформированных клеток (например, ген, обусловливающий устойчивость к лекарственному средству, который может функционировать в качестве маркера при применении лекарственного средства (неомицин, G418 и т.д.)). Примеры векторов, обладающих такими свойствами, включают рМАМ, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.
Примером метода, предназначенного для обеспечения стабильной экспрессии гена и увеличения количества внутриклеточных копий гена, является метод, включающий трансфекцию СНО-клеток с дефицитом пути синтеза нуклеиновой кислоты векторами, несущими ген DHFR, служащий для его восполнения (например, pCHOI), и использование метотрексата (МТХ) при амплификации гена. Примером метода, предназначенного для обеспечения кратковременной экспрессии гена, является метод, включающий применение COS-клеток, несущих ген, обеспечивающий экспрессию антигена Т SV40, на их хромосомах, для трансформирования клеток векторами, несущими сайт инициации репликации SV40 (pcD и т.д.). Можно использовать также сайт инициации репликации, происходящий из вируса полиомы, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV) или т.п. Экспрессионные векторы, предназначенные для увеличения количества копий гена в системе клетки-хозяина, могут дополнительно содержать маркер для селекции, такой как ген аминогликозидтрансферазы (АРН), ген тимидинкиназы (ТК), ген ксантингуанин-фосфорибозилтрансферазы Е. coli (Ecogpt) или ген дигидрофолатредуктазы (dhfr).
Предлагаемые в настоящем изобретении антитела, полученные описанными выше методами, можно выделять из клеток-хозяев или из их окружения (среды или т.п.) и очищать с получением практически чистых и гомогенных антител. Антитела можно выделять и очищать стандартными методами, применяемыми для выделения и очистки антител, и на тип метода не накладывается ограничений. Например, антитела можно выделять и очищать, подбирая и объединяя соответствующим образом методы хроматографии на колонках, фильтрации, ультрафильтрации, обессоливания, осаждения растворителем, экстракции растворителем, дистилляции, иммунопреципитации, электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, изоэлектрического фокусирования, диализа, перекристаллизации и т.п.
Методы хроматографии включают, например, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенной фазой и адсорбционную хроматографию (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, под ред. Daniel R. Marshak., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). В качестве указанных выше хроматографических методов можно применять жидкостную хроматографию, например, ЖХВР и жидкостную экспресс-хроматографию белков (FPLC). Колонки, применяемые для аффинной хроматографии, включают колонки с белком А и колонки с белком G. Колонки с белком А включают, например, Hyper D, POROS и сефарозу FF (фирма GE Amersham Biosciences). Под объем настоящего изобретения подпадают антитела, высокоочищенные с использованием указанных методов очистки.
Полученные антитела можно очищать до гомогенности. Выделение и очистку антител можно осуществлять с использованием методов выделения и очистки, обычно применяемых для выделения и очистки белков. Например, антитела можно выделять и очищать, подбирая и объединяя соответствующим образом методы хроматографии на колонках, фильтрации, ультрафильтрации, обессоливания, диализа, электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, изоэлектрического фокусирования и т.п., но, не ограничиваясь только ими (Antibodies: A Laboratory Manual, под ред. Harlow и David Lane, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Колонки, применяемые для аффинной хроматографии, включают, например, колонки с белком А и колонки с белком G.
Методы получения образцов
Согласно настоящему изобретению полученные из крови образцы предпочтительно представляют собой образцы, полученные из крови, взятой из организма исследуемого индивидуума. Такие полученные из крови образцы можно получать из организма исследуемых индивидуумов, которым вводили субстанцию, обладающую FVIII-замещающей активностью. К исследуемым индивидуумам относится, например, пациент с геморрагическими симптомами в любой части организма (пациент с геморрагическим заболеванием). Основными областями кровотечения являются (но, не ограничиваясь только ими) внутрисуставные, внутримышечные, подкожные, внутриротовые, внутричерепные области, области, находящиеся в пищеварительном тракте, интраназальные области и т.п. Пациент с геморрагическим заболеванием предпочтительно представляет собой пациента с геморрагическим заболеванием, вызываемым снижением или дефицитом активности FVIII и/или активности FVIIIa. Пациент с геморрагическим заболеванием, вызываемым снижением или дефицитом активности FVIII и/или активности FVIIIa представляет собой пациента с геморрагическими симптомами, и примерами таких пациентов являются пациенты с уже имевшимся ранее или наступившим впоследствии (после возникновения симптомов) снижением или дефицитом активности FVIII и/или активности FVIIIa или их обеих. Снижение FVIII- и FVIIIa-активности означает, что указанные активности у пациента составляют предпочтительно (но, не ограничиваясь только указанными величинами) менее чем 40% (например, менее чем 40%, менее чем 30%, менее чем 20% или менее чем 10%), более предпочтительно менее чем 10% (например, менее чем 10%, менее чем 9%, менее чем 8%, менее чем 7% или менее чем 6%), еще более предпочтительно менее чем 5% (например, менее чем 5%, менее чем 4%, менее чем 3% или менее чем 2%) и наиболее предпочтительно менее чем 1% по сравнению с активностями, характерными для здоровых индивидуумов.
Более конкретно, примеры таких заболеваний включают (но, не ограничиваясь только ими) заболевания, выбранные из гемофилии (гемофилия А и гемофилия В), приобретенной гемофилии и болезни фон Виллебранда, вызываемой функциональной аномалией или дефицитом фактора фон Вильдебранда (vWF). Полученные из крови образцы включают сыворотку, плазму или цельную кровь. Согласно настоящему изобретению предпочтительно применяют образцы плазмы. Специалистам в данной области хорошо известны методы отбора полученных из крови образцов у исследуемых индивидуумов.
Наборы
Различные типы реагентов, таких как буферы, необходимые для метода измерения реактивности FVIII, в котором применяют антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, могут быть заранее упакованы и предоставлены в виде набора. Набор, предлагаемый в настоящем изобретении, может включать помимо буфера образцы плазмы, выделенные из организма человека с нормальной активностью FVIII и активностью FIX, субстанцию, обладающую FVIII-замещающей активностью и любую субстанцию, которую можно использовать при измерении активности FVIII или любую субстанцию, которую можно использовать при измерении титра ингибитора FVIII. Кроме того, различные типы реагентов, включенных в набор, могут находиться в форме порошка или жидкости в зависимости от метода их применения. Кроме того, их можно хранить в соответствующих контейнерах и применять в зависимости от потребности.
Серьезность заболевания у пациента, которому вводят субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII, можно диагностировать, например, с помощью метода, в котором применяют антитело, предлагаемое в настоящем изобретении. С помощью метода, в котором применяют антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, можно измерять реактивность FVIII и на основе результатов измерений можно диагностировать/оценивать серьезность заболевания и/или титр ингибитора у пациента. Установление диагноза и оценку можно осуществлять согласно методам, известным специалистам в данной области.
Мониторинг фармакологической активности препарата FVIII в организме пациентов, которым вводили препарат FVIII и субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII, можно осуществлять, например, с помощью методов, в которых применяют антитело, предлагаемое в настоящем изобретении. Мониторинг можно осуществлять с помощью методов, известных специалистам в данной области.
Набор, который включает антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять в качестве набора для диагностирования серьезности заболевания у пациента, которому вводили субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII. Реактивность FVIII можно измерять с помощью набора, который включает антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, и на основе результатов измерений можно диагностировать/оценивать у пациента серьезность заболевания и/или титр ингибитора. Установление диагноза и оценку можно осуществлять согласно методам, известным специалистам в данной области.
Набор, который включает антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять, например, в качестве набора для мониторинга фармакологической активности препарата FVIII в организме пациента, которому вводили препарат FVIII и субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII. Мониторинг можно осуществлять с помощью методов, известных специалистам в данной области.
Например, настоящее изобретение можно применять в способе лечения пациента, включающем стадии, на которых:
(а) вводят первую дозу субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII;
(б) осуществляют мониторинг реактивности FVIII в организме пациента;
(в) на основе выявленной реактивности FVIII определяют вторую дозу субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII; и
(г) вводят вторую дозу субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII.
Кроме того, настоящее изобретение можно применять, например, в способе лечения пациента, включающем стадии, на которых:
(а) вводят субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII, в соответствии с первым периодом введения;
(б) осуществляют мониторинг реактивности FVIII в организме пациента;
(в) на основе выявленной реактивности FVIII определяют второй период введения субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения FVIII; и
(г) вводят пациенту субстанцию, обладающую активностью в отношении функционального замещения FVIII, в соответствии со вторым периодом введения.
Можно применять, например, также способ лечения пациента, который включает осуществление мониторинга реактивности FVIII и изменение вводимой дозы и/или интервала введения субстанции, обладающей активностью в отношении функционального замещения фактора свертывания FVIII в зависимости от реактивности FVIII.
Субстанция, обладающая активностью в отношении функционального замещения FVIII, предпочтительно представляет собой биспецифическое антитело, которое связывается с FIX и/или FIXa и с FX и/или FXa. Более предпочтительно она представляет собой описанное ниже антитело, которое является биспецифическим антителом, в котором первый полипептид ассоциирован с третьим полипептидом, и второй полипептид ассоциирован с четвертым полипептидом, а именно:
Биспецифическое антитело, в котором первый полипептид представляет собой Н-цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, второй полипептид представляет собой Н-цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, и третий полипептид и четвертый полипептид представляют собой общие L-цепи, имеющие SEQ ID NO: 10 (Q499-z121/J327-z119/L404-k), или
биспецифическое антитело, в котором первый полипептид представляет собой Н-цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36, второй полипептид представляет собой Н-цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37, и третий полипептид и четвертый полипептид представляют собой общие L-цепи, имеющие SEQ ID NO: 38 (Q153-G4k/J142-G4h/L180-k).
Для указанного выше биспецифического антитела доза составляет, например, от 0,001 до 100 мг/кг. Предпочтительно она составляет примерно 0,001 мг/кг, примерно 0,003 мг/кг, примерно 0,005 мг/кг, примерно 0,01 мг/кг, примерно 0,03 мг/кг, примерно 0,05 мг/кг, примерно 0,1 мг/кг, примерно 0,3 мг/кг, примерно 0,5 мг/кг, примерно 1 мг/кг, примерно 3 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг, примерно 20 мг/кг, примерно 30 мг/кг, примерно мг/кг мг/кг, примерно 50 мг/кг, примерно 60 мг/кг, примерно 70 мг/кг, примерно 80 мг/кг, примерно 90 мг/кг и примерно 100 мг/кг. Для указанного выше биспецифического антитела период введения составляет, например, по меньшей мере 1 день или более. Период предпочтительно составляет 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель, 12 недель, 13 недель, 14 недель, 15 недель, 16 недель, 17 недель, 18 недель, 19 недель, 20 недель, 21 неделю, 22 недели, 23 недели, 24 недели, 25 недель, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 4 месяца, 5 месяцев, 6 месяцев, 7 месяцев, 8 месяцев, 9 месяцев, 10 месяцев, 11 месяцев или 1 год. Дозы до и после стадии мониторинга могут быть одинаковыми или различными. Периоды введения доз до и после стадии мониторинга могут быть одинаковыми или различными.
Целевыми пациентами для способов, в которых используют антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, или наборы, включающие антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, представляют собой, например, пациентов с гемофилией А, пациентов с приобретенной гемофилией А, пациентов с болезнью фон Вильдебранда и пациентов с гемофилией А, у которых присутствует ингибитор FVIII и/или FVIIIa.
В контексте настоящего описания варианты, в которых используются выражение «содержащий…», включают варианты, в которых используются выражение «практически состоящий из…» и варианты, в которых используется выражение «состоящий из…».
Все патенты и процитированные документы, специально процитированные в настоящей заявке, полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано на примерах, но их не следует рассматривать как ограничивающие его объем.
Примеры
Ниже настоящее изобретение проиллюстрировано на конкретных примерах, но их не следует рассматривать как ограничивающие его объем.
Пример 1.
Получение антител против биспецифического антитела к FIXa/FX и определение последовательности вариабельной области
При создании изобретения была сделана попытка создать антитела против АСЕ910 (Q499-z121/J327-z119/L404-k) (биспецифическое антитело, в котором Н-цепь, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, ассоциирована с L-цепью, имеющей SEQ ID NO: 10, и Н-цепь, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, ассоциирована с L-цепью, имеющей SEQ ID NO: 10), которое представляет собой биспецифическое антитело, описанное в патентном документе (WO 2012/067176). Для получения F(ab')2, состоящих из соответствующих Fab анти-FIXa-плеча и анти-FX-плеча, применяли методы генетической рекомбинации и расщепление пепсином.
Мышей и крыс иммунизировали конструкциями анти-FIXa-F(ab')2 или анти-FX-F(ab')2. Осуществляли клеточное слияние клеток, полученных из селезенки, которую изымали из мышей или крыс, или из крысиных лимфатических узлов, с клетками мышиной миеломы согласно общим методам, создавая гибридомы. Супернатанты культур гибридом анализировали с помощью ELISA, позволяющего обнаруживать связывание АСЕ910 с анти-FIXa-плечом или анти-FX-плечом, и в итоге отбирали мышиные антитела AQ8 и AQ1 и крысиное антитело AQ512, которые связывались только с анти-FIXa-плечом, но не с анти-FX-плечом АСЕ910, и крысиные антитела AJ540, AJ114, AJ521, AJ522 и AJ541, которые связывались только с анти-FX-плечом, но не с анти-FIXa-плечом АСЕ910. Кроме того, анализировали нуклеотидные последовательности вариабельных областей антитела AQ8 или антитела AJ540. Нуклеотидные последовательности вариабельных областей AQ8 и AJ540 и кодируемые ими аминокислотные последовательности анализировали с помощью программы GENETYX Ver. 9 (фирма GENETYX CORPORATION).
Пример 2. Получение экспрессионных векторов для рекомбинантного мышиного антитела AQ8 и рекомбинантного химерного крысиного-кроличьего антитела AJ540
Рекомбинантное мышиное антитело AQ8 создавали путем объединения последовательностей вариабельных областей антитела AQ8, полученного согласно методу, описанному в примере 1, с известными последовательностями константных областей мышиного IgG2b (тяжелая цепь: EMBL, регистрационный номер J00461; легкая цепь: EMBL, регистрационный номер V00807) с получением гена полноразмерного антитела и последующего его встраивания в экспрессионный вектор. Аналогично этому рекомбинантное химерное крысиное-кроличье антитело AJ540 создавали путем объединения известного кроличьего IgG (тяжелая цепь: EMBL, регистрационный номер L29172, легкая цепь: EMBL, регистрационный номер Х00231) с вариабельными областями антитела AJ540. Полученные экспрессионные клоны плазмид интродуцировали в клетки HEK293, осуществляли крупномасштабное культивирование и очистку с использованием белка А и гель-фильтрации, в результате чего получали рекомбинантное мышиное антитело AQ8 (rAQ8-mIgG2b) и рекомбинантное химерное крысиное-кроличье антитело AJ540 (rAJ540-rbtIgG).
Пример 3. Одностадийный анализ свертывания, осуществленный в условиях нейтрализации биспецифического антитела к FIXa/FX с использованием rAQ8-mIgG2b и rAJ540-rbtIgG
К плазме с дефицитом FVIII (фирма George King), содержащей 10 ед./дл или 100 ед./дл рекомбинантного FVIII (препарат Когенейт ФС (Kogenate FS), фирма Bayer Yakuhin, Ltd.), добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX АСЕ910 в концентрации 0 или 300 мкг/мл. Затем каждый из полученных образцов плазмы разделяли на две группы для приготовления предназначенных для измерений растворов образцов: группу, которую подвергали 10-кратному разведению с использованием имидазольного буфера (фирма Kyowa Medex); и группу, которую подвергали 10-кратному разведению с использованием имидазольного буфера, дополненного 300 мкг/мл каждого из rAQ8-mIgG2b и rAJ540-rbtIgG. rAQ8-mIgG2b и rAJ540-rbtIgG добавляли в количестве, достаточном для нейтрализации АСЕ910. Подробное описание комбинаций представлено ниже.
Кроме того, для получения калибровочной кривой, позволяющей преобразовывать время свертывания в активность FVIII, приготавливали растворы стандартной плазмы Coagtrol N (фирма Sysmex), осуществляя 10-кратные, 20-кратные, 40-кратные, 80-кратные и 160-кратные разведения с использованием имидазольного буфера (активности FVIII для соответствующих растворов, применявшихся для построения калибровочной кривой, составляли 93%, 46,5%, 23,3%, 11,6% и 5,81%). Смешивали 50 мкл раствора образца, предназначенного для измерений, или раствора для калибровочной кривой, 50 мкл человеческой плазмы с дефицитом фактора VIII (фирма Sysmex) и 50 мкл реагента Thrombocheck APTT-SLA (фирма Sysmex) и инкубировали при 37°С в течение 5 мин. После инкубации добавляли 50 мкл раствора хлорида кальция (0,02 моля/л, фирма Sysmex) для инициации свертывания и измеряли время свертывания с помощью автоматического анализатора свертывания крови KC4 Delta (фирма Stago).
Время свертывания для образца, предназначенного для измерений, превращали в активность FVIII на основе времени свертывания, соответствующего каждой величине FVIII-активности для раствора, применявшегося для построения калибровочной кривой.
Результаты
Результаты представлены на фиг. 1. Когда плазму с дефицитом FVIII, содержащую 10 ед./дл или 100 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX, разводили буфером (№3, №7), то было установлено, что активности FVIII находились выше диапазона калибровочной кривой и не могли быть точно измерены. С другой стороны, когда плазму с дефицитом FVIII, содержащую 10 ед./дл или 100 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX, разводили буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№4, №8), то было установлено, что FVIII-активности были сходными с активностями, измеренными для групп без добавления биспецифического антитела к FIXa/FX (№1, №5). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что антитела против биспецифического антитела к FIXa/FX полностью нейтрализуют активность биспецифического антитела, что позволяет осуществлять точное измерение активности FVIII в плазме даже в присутствии биспецифического антитела. Когда плазму с дефицитом FVIII, содержащую 10 ед./дл или 100 ед./дл рекомбинантного FVIII, разводили буфером, содержащим только два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№2, №6), то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностями, измеренными для групп без добавления биспецифического антитела к FIXa/FX (№1, №5); таким образом, было установлено, что антитела против биспецифического антитела к FIXa/FX нейтрализуют воздействия, специфические для биспецифического антитела.
Пример 4. Одностадийный анализ свертывания, осуществленный в условиях нейтрализации биспецифического антитела к FIXa/FX с использованием AQ1 и AJ541 или AQ1 и AJ522
К плазме с дефицитом FVIII (фирма George King), содержащей 10 ед./дл рекомбинантного FVIII (препарат Когенейт ФС, фирма Bayer Yakuhin, Ltd.), добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX АСЕ910 в концентрации 0 или 10 мкг/мл. Затем каждый из полученных образцов плазмы разделяли на три группы для приготовления предназначенных для измерений растворов образцов: группу, которую подвергали 10-кратному разведению с использованием имидазольного буфера (фирма Kyowa Medex); группу, которую подвергали 10-кратному разведению с использованием имидазольного буфера, дополненного 100 мкг/мл каждого из AQ1 и AJ541; и группу, которую подвергали 10-кратному разведению с использованием имидазольного буфера, дополненного 100 мкг/мл каждого из AQ1 и AJ522. AQ1, AJ541 и AJ522 добавляли в количестве, достаточном для нейтрализации АСЕ910. Подробное описание комбинаций представлено ниже.
Кроме того, для получения калибровочной кривой, позволяющей преобразовывать время свертывания в активность FVIII, приготавливали растворы стандартной плазмы Coagtrol N (фирма Sysmex), осуществляя 10-кратные, 20-кратные, 40-кратные, 80-кратные, 160-кратные, 320-кратные и 640-кратные разведения с использованием имидазольного буфера (активности FVIII для соответствующих растворов, применявшихся для построения калибровочной кривой составляли 102%, 51,0%, 25,5%, 12,8%, 6,38%, 3,19% и 1,59%). Смешивали 50 мкл раствора образца, предназначенного для измерений, или раствора для калибровочной кривой, 50 мкл человеческой плазмы с дефицитом фактора VIII (фирма Sysmex) и 50 мкл реагента Thrombocheck APTT-SLA (фирма Sysmex) и инкубировали при 37°С в течение 5 мин. После инкубации добавляли 50 мкл раствора хлорида кальция (0,02 моля/л, фирма Sysmex) для инициации свертывания и измеряли время свертывания с помощью автоматического анализатора свертывания крови KC4 Delta (фирма Stago).
Время свертывания для образца, предназначенного для измерений, превращали в активность FVIII на основе времени свертывания, соответствующего каждой величине активности FVIII для раствора, применявшегося для построения калибровочной кривой.
Результаты
Результаты представлены на фиг. 2. Когда плазму с дефицитом FVIII, содержащую 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX АСЕ910, разводили буфером (№4), то было установлено, что активность FVIII находилась выше диапазона калибровочной кривой и не могла быть точно измерена. С другой стороны, когда плазму с дефицитом FVIII, содержащую 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом FIXa/FX АСЕ910, разводили буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№5), а именно, AQ1 и AJ541, или буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела FIXa/FX (№5), а именно, AQ1 и AJ522, то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностью, измеренной для группы без добавления биспецифического антитела к FIXa/FX (№1). Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что не только rAQ8-mIgG2b и rAJ540-rbtIgG, но также и другие комбинации антител являются эффективными в качестве антител против биспецифического антитела к FIXa/FX, позволяющими полностью нейтрализовать активность биспецифического антитела АСЕ910.
Пример 5. Одностадийный анализ свертывания, осуществленный в условиях нейтрализации биспецифического антитела к FIXa/FX с использованием AQ512 и AJ114 или AQ512 и AJ521
К плазме с дефицитом FVIII (фирма George King), содержащей 10 ед./дл рекомбинантного FVIII (препарат Когенейт ФС (Kogenate FS), фирма Bayer Yakuhin, Ltd.), добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX hBS23 в концентрации 0 или 10 мкг/мл. Затем каждый из полученных образцов плазмы разделяли на три группы для приготовления предназначенных для измерений растворов образцов: группу, которую подвергали 10-кратному разведению с использованием имидазольного буфера (фирма Kyowa Medex); группу, которую подвергали 10-кратному разведению с использованием имидазольного буфера, дополненного 100 мкг/мл каждого из AQ512 и AJ114; и группу, которую подвергали 10-кратному разведению с использованием имидазольного буфера, дополненного 100 мкг/мл каждого из AQ512 и AJ521. AQ512, AJ114 и AJ521 добавляли в количестве, достаточном для нейтрализации hBS23. Подробное описание комбинаций представлено ниже.
Кроме того, для получения калибровочной кривой, позволяющей преобразовывать время свертывания в активность FVIII, приготавливали растворы стандартной плазмы Coagtrol N (фирма Sysmex), осуществляя 10-кратные, 20-кратные, 40-кратные, 80-кратные, 160-кратные, 320-кратные и 640-кратные разведения с использованием имидазольного буфера (FVIII-активности для соответствующих растворов для калибровочной кривой составляли 102%, 51,0%, 25,5%, 12,8%, 6,38%, 3,19% и 1,59%). Смешивали 50 мкл раствора образца, предназначенного для измерений, или раствора для калибровочной кривой, 50 мкл человеческой плазмы с дефицитом фактора VIII (фирма Sysmex) и 50 мкл реагента Thrombocheck APTT-SLA (фирма Sysmex) и инкубировали при 37°С в течение 5 мин. После инкубации добавляли 50 мкл раствора хлорида кальция (0,02 моля/л, фирма Sysmex) для инициации свертывания и измеряли время свертывания с помощью автоматического анализатора свертывания крови KC4 Delta (фирма Stago).
Время свертывания для образца, предназначенного для измерений, превращали в активность FVIII на основе времени свертывания, соответствующего каждой величине активности FVIII для раствора, применявшегося для построения калибровочной кривой.
Результаты
Результаты представлены на фиг. 3. Когда плазму с дефицитом FVIII, содержащую 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa FX hBS23, разводили буфером (№4), то было установлено, что активность FVIII находилась выше диапазона калибровочной кривой и не могла быть точно измерена. С другой стороны, когда плазму с дефицитом FVIII, содержащую 10 ед./дл рекомбинантного FVIII, дополненную биспецифическим антителом к FIXa/FX hBS23, разводили буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№5), а именно, AQ512 и AJ114, или буфером, содержащим два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№6), а именно, AQ512 и AJ521, то было установлено, что активности FVIII были сходными с активностью, измеренной для групп без добавления биспецифического антитела к FIXa/FX (№1). Это свидетельствует о том, что даже в присутствии hBS23, т.е. биспецифического антитела, отличного от АСЕ910, можно точно измерять активность FVIII несмотря на присутствие биспецифического антитела, осуществляя полную нейтрализацию его активности, и, следовательно, подход, предлагаемый в настоящем изобретении, эффективен для различных биспецифических антител, обладающих FVIII-замещающей активностью.
Пример 6. Анализ Бетезда, осуществленный в условиях нейтрализации биспецифического антитела к FIXa/FX с использованием rAQ8-mIgG2b и rAJ540-rbtIgG
К плазме с дефицитом фактора VIII (содержащей ингибиторы FVIII) (фирма George King Bio-Medical), добавляли биспецифическое антитело к FIXa/FX АСЕ910 в концентрации 0 или 300 мкг/мл. Кроме того, каждый из приготовленных образцов плазмы подвергали 25-кратному разведению или 30-кратному разведению с использованием имидазольного буфера (фирма Kyowa Medex), содержащего 0,25% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (фирма Sigma-Aldrich) (ниже в настоящем описании обозначен как БСА-имидазол). К Coagtrol N (фирма Sysmex), представляющей собой стандартную плазму, либо добавляли указанные антитела rAQ8-mIgG2b и rAJ540-rbtIgG в концентрации 300 мкг/мл каждое, либо их не добавляли.
Два типа приготовленных образцов плазмы смешивали в равных количествах, получая указанные ниже комбинации (в общей сложности 8 типов), а затем осуществляли их инкубацию при 37°С в течение 2 ч.
После инкубации осуществляли дополнительное десятикратное разведение смешанных растворов БСА-имидазолом с получением растворов для измерений. Кроме того, для получения калибровочной кривой, служащей для преобразования времени свертывания в величины активности FVIII, приготавливали растворы путем 20-кратного, 40-кратного, 80-кратного, 160-кратного и 320-кратного разведения Coagtrol N БСА-имидазолом (активности FVIII соответствующих растворов, применявшихся для построения калибровочной кривой, составляли 100%, 50%, 25%, 12,5% и 6,25%).
Смешивали 50 мкл раствора образца, предназначенного для измерений, или раствора для калибровочной кривой, 50 мкл человеческой плазмы с дефицитом фактора VIII (фирма Sysmex) и 50 мкл реагента Thrombocheck APTT-SLA (фирма Sysmex) и инкубировали при 37°С в течение 3 мин. После инкубации добавляли 50 мкл раствора хлорида кальция (0,02 моля/л, фирма Sysmex) для инициации свертывания и измеряли время свертывания с помощью автоматического анализатора свертывания крови KC4 Delta (фирма Stago).
Время свертывания для образца, предназначенного для измерений, превращали в активность FVIII на основе времени свертывания, соответствующего каждой величине активности FVIII для раствора, применявшегося для построения калибровочной кривой. Кроме того, когда остаточная активность FVIII составляла 50%, то ее принимали за 1 согласно шкале Бетезда, и после расчета величин по шкале Бетезда для измеряемого образца среднее значение, рассчитанное путем умножения величины на 25 или 30, принимали за титр ингибитора для каждого из исходных растворов образца.
Результаты
Результаты представлены на фиг. 4. Было установлено, что активность ингибитора FVIII в плазме, содержащей только биспецифическое антитело к FIXa/FX (№3), составляла 100% или превышала диапазон калибровочной кривой для FVIII; поэтому титр ингибитора FVIII нельзя было определить.
С другой стороны, было установлено, что титр ингибитора FVIII в содержащей ингибитор FVIII плазме, которая содержала биспецифическое антитело к FIXa/FX и два типа антитела против биспецифического антитела к FIXa/FX (№4), был сходным с титром в содержащей ингибитор плазме без добавок (№1). Таким образом, указанный результат свидетельствует о том, что антитела против биспецифического антитела к FIXa/FX полностью нейтрализовали активность биспецифического антитела, позволяя осуществлять точное измерение титра ингибитора FVIII в плазме даже в присутствии биспецифического антитела. Для плазмы, содержащей ингибитор FVIII, которая содержала только два типа антител против биспецифического антитела к FIXa/FX (№2), были получены результаты, сходные с результатами, полученными для варианта №1; таким образом, было установлено, что антитела против биспецифического антитела к FIXa/FX обладали нейтрализующими действиями, специфическими в отношении биспецифического антитела.
Промышленная применимость
В настоящем изобретении предложены антитела, применяемые в способах измерения реактивности FVIII в присутствии биспецифического антитела, обладающего активностью в отношении функционального замещения FVIII, например, в способах измерения активности FVIII или титра ингибитора FVIII. Способы, в которых применяют антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, позволяют осуществлять точное измерение реактивности FVIII у пациентов при лечении геморрагических заболеваний, таких как гемофилии, путем применения биспецифического антитела.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Чугаи Сейяку Кабусики Кайся
<120>  Антитело, которое обладает способностью нейтрализовать
субстанцию, обладающую активностью, альтернативной функции
фактор свертывания VIII (FVIII)
<130>  C1-A1407P
<150>  JP 2014-197207
<151>  2014-09-26
<160>  38
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  124
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  VH AQ8
<400>  1
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Ala Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Asp Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp
100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  2
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  VL AQ8
<400>  2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Glu Thr Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Phe Ser
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Thr Asp Ser Leu Lys Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Met Lys Ile Asn Ser Met Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Arg Gln Ser Tyr Asp Phe Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  3
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  VH AJ540
<400>  3
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Lys Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Asn
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Asn Val Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Pro
100                 105                 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  4
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  VL AJ540
<400>  4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Met Ser Ile Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ala Asn Gln Asn Val Asp Phe Asn
20                  25                  30
Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Met Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser Asn Ser Phe Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  5
<211>  372
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность VH AQ8
<400>  5
gaagtgaacc tggtggaaag cggcggaggc ctggtgcagc ccggaggcag catgtctctg     60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcacc gactactaca tgagctgggt ccgccagccc    120
cctggcaagg ctctggaatg gctggctctg atcagaaaca aggccaacgg ctacaccacc    180
gagtacagcg ccagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacaacag ccagagcatc    240
ctgtacctgc agatgaacgc cctgcgggcc gaggactccg ccacctacta ctgcgccaga    300
gacagctact acagctacga cggctacgcc atggactact ggggccaggg caccagcgtg    360
accgtgtcta gc                                                        372
<210>  6
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность VL AQ8
<400>  6
gacatccaga tgacccagag ccctgcctcc ctggccgcct ctgtgggcga gacaatcacc     60
atcacctgtc aggccagcga gaacatctac ttcagcctgg cctggtatca gcagaagcag    120
ggcaagagcc cccagctgct gatctacaac accgacagcc tgaaggacgg cgtgcccagc    180
agattcagcg gcagcggctc cggcacccag tacagcatga agatcaacag catgcagccc    240
gaggacaccg ctacctactt ttgccggcag agctacgact tcccctggac cttcggcgga    300
ggcaccaagc tggaaatcaa g                                              321
<210>  7
<211>  360
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность VH AJ540
<400>  7
cagatccagc tggtgcagag cggccctgag ctgaagaaac ccggcgagag cgtgaagatc     60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc gactacgcca tgcactgggt gaaacaggtg    120
cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacct acaccggcaa gcccacctac    180
gccgacgact tcaagggcag attcgtgttc agcctggaag ccagcgccag caccgccaac    240
ctgcagatca gcaacctgaa gaacgaggac accgccaacg tgttctgcgc cagagagggc    300
ggaggctact actggtactt cgacttctgg ggccctggca caatggtgac agtgtccagc    360
<210>  8
<211>  321
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность VL AJ540
<400>  8
gacatcgtga tgacccagag ccccaccagc atgagcatca gcgtgggcga cagagtgacc     60
atgaactgca aggccaacca gaacgtggac ttcaacgtgg actggtatca gcagaaaacc    120
ggccagtccc ccaagctgct gatctacaag gccagcaacc ggtacacagg cgtgcccgac    180
agattcacag gcagcggcag cggcaccgac ttcaccttca ccatcagcaa catgcaggcc    240
gaggacctgg ccgtgtacta ctgcatgcag agcaacagct tccccctgac cttcggctcc    300
ggcaccaacc tggaaatcaa g                                              321
<210>  9
<211>  448
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Glu Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Thr Gly Arg Glu Tyr Gly Gly Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195                 200                 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210                 215                 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440                 445
<210>  10
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Gln
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Gln Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asp Pro Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  11
<211>  444
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Искусственная последовательность
<400>  11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20                  25                  30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Ile Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr His Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Lys Ser Tyr Gly Tyr Tyr Leu Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Glu Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435                 440
<210>  12
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR1 тяжелой цепи AQ8
<400>  12
Asp Tyr Tyr Met Ser
1               5
<210>  13
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR2 тяжелой цепи AQ8
<400>  13
Leu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210>  14
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR3 тяжелой цепи AQ8
<400>  14
Asp Ser Tyr Tyr Ser Tyr Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  15
<211>  15
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR1 тяжелой цепи AQ8
<400>  15
gactactaca tgagc                                                      15
<210>  16
<211>  57
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR2 тяжелой цепи AQ8
<400>  16
ctgatcagaa acaaggccaa cggctacacc accgagtaca gcgccagcgt gaagggc        57
<210>  17
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR3 тяжелой цепи AQ8
<400>  17
gacagctact acagctacga cggctacgcc atggactac                            39
<210>  18
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  AQ8 CDR1 легкой цепи
<400>  18
Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Phe Ser Leu Ala
1               5                   10
<210>  19
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR2 легкой цепи AQ8
<400>  19
Asn Thr Asp Ser Leu Lys Asp
1               5
<210>  20
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR3 легкой цепи AQ8
<400>  20
Arg Gln Ser Tyr Asp Phe Pro Trp Thr
1               5
<210>  21
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR1 легкой цепи AQ8
<400>  21
caggccagcg agaacatcta cttcagcctg gcc                                  33
<210>  22
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR2 легкой цепи AQ8
<400>  22
aacaccgaca gcctgaagga c                                               21
<210>  23
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR3 легкой цепи AQ8
<400>  23
cggcagagct acgacttccc ctggacc                                         27
<210>  24
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR1 тяжелой цепи AJ540
<400>  24
Asp Tyr Ala Met His
1               5
<210>  25
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR2 тяжелой цепи AJ540
<400>  25
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  26
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR3 тяжелой цепи AJ540
<400>  26
Glu Gly Gly Gly Tyr Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
1               5                   10
<210>  27
<211>  15
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR1 тяжелой цепи AJ540
<400>  27
gactacgcca tgcac                                                      15
<210>  28
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR2 тяжелой цепи AJ540
<400>  28
tggatcaaca cctacaccgg caagcccacc tacgccgacg acttcaaggg c              51
<210>  29
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR3 тяжелой цепи AJ540
<400>  29
gagggcggag gctactactg gtacttcgac ttc                                  33
<210>  30
<211>  11
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR1 легкой цепи AJ540
<400>  30
Lys Ala Asn Gln Asn Val Asp Phe Asn Val Asp
1               5                   10
<210>  31
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR2 легкой цепи AJ540
<400>  31
Lys Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1               5
<210>  32
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  CDR3 легкой цепи AJ540
<400>  32
Met Gln Ser Asn Ser Phe Pro Leu Thr
1               5
<210>  33
<211>  33
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR1 легкой цепи AJ540
<400>  33
aaggccaacc agaacgtgga cttcaacgtg gac                                  33
<210>  34
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR2 легкой цепи AJ540
<400>  34
aaggccagca accggtacac a                                               21
<210>  35
<211>  27
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  нуклеотидная последовательность CDR3 легкой цепи AJ540
<400>  35
atgcagagca acagcttccc cctgacc                                         27
<210>  36
<211>  448
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  искусственная последовательность
<400>  36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Ser Ile Ser Pro Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Arg Arg Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Arg Ala Gly His Asn Tyr Gly Ala Gly Trp Tyr Phe Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195                 200                 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210                 215                 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355                 360                 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
<210>  37
<211>  444
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  искусственная последовательность
<400>  37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn
20                  25                  30
Asn Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Thr Arg Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Glu Glu Phe
50                  55                  60
Gln Asp Arg Val Thr Met Thr Ile Asp Lys Ser Thr Gly Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Tyr His Asp Glu Trp Gly Glu Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Gln Cys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435                 440
<210>  38
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  искусственная последовательность
<400>  38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Arg Asn Ile Glu Arg Asn
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Glu Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Arg Lys Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Pro Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<---