Способ получения биологически активного вещества, обладающего антибактериальной активностью, и вещество, полученное этим способом
METHOD FOR PRODUCING A BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE HAVING ANTIBACTERIAL ACTIVITY, AND A SUBSTANCE OBTAINED BY THIS METHOD

Изобретение относится к биологически активным веществам и может быть применено в медицине в качестве антибактериального лекарственного средства.
Известны способы получения как производных пенициллина [Патент 547176 Франция. Способ получения пенициллинов / Жан Бушодон, Пьер Ле Руа, Майер Наум Мессер (Франция). - №2000645/04; заявл. 15.02.1974; опубл. 15.02.1977, Бюл. № 6], так и ампициллина из группы полусинтетических антибиотиков, широко применяемого в медицинской практике [Патент 568369 Франция. Способ получения ампициллина / Жан Бушодон, Пьер Ле Руа, Майер Наум Мессер (Франция). - №2000645/2112821/04; заявл. 18.03.1975; опубл. 05.08.1977, Бюл. № 29; А.с. 490804 СССР. Способ получения безводного ампициллина / С.С. Смирнова, Т.А. Волошина, С.С. Шайхиев, Г.М. Миткох (СССР). - №1930391/23-4; заявл. 07.06.1973; опубл. 05.11.1975, Бюл. № 41; Патент 525431 Дания. Способ получения кристаллического пивалоилоксиметилового эфира ампициллина / Эрнст Торндал Биндеруп, Ганс Юрген Петерсен, Свен Лисберг (Дания). - №1963763/04; заявл. 05.10.1973; опубл. 15.08.1976, Бюл. № 30].
В литературе описан способ получения ампициллина из 6-аминопенициллановой кислоты путем химического или энзиматического ацилирования. В основе химических методов лежит ацилирование 6-аминопенициллановой кислоты с помощью производного фенилглицина, аминогруппа которого блокирована защитной группой, или с помощью производного фенилуксусной кислоты, содержащего способную превращаться в аминорадикал группу. По окончании ацилирования защитная группа должна быть удалена из боковой цепи промежуточного пенициллина в достаточно мягких условиях, чтобы не затронуть остальную часть молекулы [Патент 547176 Франция. Способ получения пенициллинов / Жан Бушодон, Пьер Ле Руа, Майер Наум Мессер (Франция). - №2000645/04; заявл. 15.02.1974; опубл. 15.02.1977, Бюл. № 6].
Однако известные в литературе способы синтеза производных 6-аминопенициллановой кислоты сложны, сопровождаются потерями целевого продукта. В случае получения ампициллина ацилированием 6-аминопенициллановой кислоты производным фенилглицина, аминогруппа которого блокирована защитной группой и активированным по карбоксильной группе, сопровождается разогревом реакционной массы, что снижает эффективность защиты аминогруппы фенилглицильного остатка, приводит к образованию смесей и необходимости разделения продуктов реакции, что уменьшает выход целевого продукта.
Технической задачей изобретения является упрощение способа получения производных пенициллина, в результате чего было синтезировано биологически активное вещество, обладающее высокой антибактериальной активностью.
Z
I
II
Для этого предлагается способ получения биологического вещества с антибактериальной активностью путем синтеза ()-6-(2-гидрокси-4-оксо-4-фенилбут-2-енамидо)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты (), осуществляющийся при взаимодействии 5-фенил-2,3-дигидро-2,3-фурандиона () с 6-аминопенициллановой кислотой в среде абсолютного ацетонитрила в течение 40 минут по схеме:
II
H
Синтез исходного 5-фенил-2,3-дигидро-2,3-фурандиона () осуществлен cогласно ранее описанных методик [5-Арил-2,3-фурандионы / Ю.С. Андрейчиков, Ю.А. Налимова, Г.Д. Плахина, Р.Ф. Сараева, С.П. Тендрякова // Химия гетероциклических соединений. - 1975. - №11. - С. 1468-1470; Reactions of 5-aryl-furan-2,3-diones with acylmethylenetriphenylphosphoranes: Synthesis and biological activity of 3(2)-furanone derivatives / V.O. Kozminykh, N.M. Igidov, E.N Kozminykh, Z.G. Aliev // Pharmazie. - 1993. - Bd. 48, H. 2. - S. 99-106].
Iа
Ближайшим аналогом по структуре и действию заявляемому соединению является 6-аминопенициллановая кислота () [Rolinson, G.N. 6-Aminopenicillanic Acid / G.N. Rolinson, Betchworth // Chemotherapia. - 1961. - Vol. 2, №1. - P. 52-59] формулы:
Iа
Структурный аналог () обладает низкой антибактериальной активностью (таблица 1).
I
В медицинской практике широко используется диоксидин в качестве антибактериального лекарственного средства, аналогичный по фармакологическому действию заявляемому соединению (), который взят нами в качестве эталона сравнения [Машковский, М.Д. Лекарственные средства: пособие для врачей / М.Д. Машковский. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна, 2012. - С. 848].
Z
I
Технической задачей изобретения является производное 6-аминопенициллановой кислоты - новая неописанная ранее ()-6-(2-гидрокси-4-оксо-4-фенилбут-2-енамидо)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота (), обладающая высоким антибактериальным действием.
Z
I
Для решения поставленной задачи предлагается биологически активное вещество, обладающее высокой антибактериальной активностью, производное 6-аминопенициллановой кислоты, а именно - ()-6-(2-гидрокси-4-оксо-4-фенилбут-2-енамидо)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота формулы ():
Сущность изобретения иллюстрируется примером 1.
Пример 1.
Получение заявляемого соединения (I).
II
о
-1
1
13
18
18
2
6
6
3
3
аром
6
d
J
d
Смесь 0.35 г (0.002 моль) соединения и 0.43 г (0.002 моль) 6-аминопенициллановой кислоты в 20 мл безводного ацетонитрила перемешивали на магнитной мешалке при 70°С в течение 40 минут. Полученный раствор охлаждали, выпавший при охлаждения осадок отфильтровывали и перекристаллизовывали из безводного ацетонитрила. Выход 0.55 г (70%). Т. пл. 165-166С. Найдено, %: C 55.50; Н 4.61; N 7.13; S 8.28. СHNOS. Вычислено, %: C 55.38; Н 4.65; N 7.18; S 8.21. ИК-спектр (ФСМ-1201, в вазелиновом масле, ν, см): 3360 (NH), 1751 (CO), 1692 (СО), 1674, 1597 (С=С, С=О). Спектр ЯМР Н (Bruker Avance III HD, рабочая частота 400 МГц, DMSО-, ТМS, д, м.д.): 1.51 с (3Н, CН), 1.62 с (3Н, CН), 4.38 с (1Н, СН), 5.54-5.64 м (2Н, 2СН), 7.11 с (1Н, СН), 7.57-8.78 (м, 5Н.), 8.78 д (1Н, NH, 7.7), 13.21 уш. с (1Н, ОН). Спектр ЯМР С (Bruker Avance III HD, рабочая частота 100 МГц, DMSО-, ТМS, д, м.д.): 26.51, 31.16, 58.58, 63.94, 67.02, 70.23, 94.72, 127.60, 128.79, 133.48, 133.90, 160.93, 168.71, 171.83, 176.94, 186.07.
I
Заявляемое соединение () представляет собой бесцветное кристаллическое вещество, растворимое в ДМФА, уксусной кислоте, при нагревании - в этиловом спирте и ацетонитриле.
I
Предлагаемый способ позволяет получать целевой продукт - производное 6-аминопенициллановой кислоты () с высоким выходом, а также более удобен и прост в применении, так как не требуется защиты карбоксильной группы и аминогруппы, как в случае синтеза ампициллина, и, следовательно, по окончании ацилирования нет необходимости в удалении защитных групп, а также не сопровождается образованием побочных продуктов.
Исследование антибактериальной активности и острой токсичности заявляемого соединения (I).
50
I
Острую токсичность (ЛД, мг/кг) соединения () изучали на белых мышах (самках) массой 16-18 г при однократном внутрибрюшинном введении [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильева, О.Л. Верстаковой, М.В. Журавлевой, В.К. Лепахина, Н.В. Коробова, В.А. Меркулова, С.Н. Орехова, И.В. Сакаевой, Д.Б. Утешева, А.Н. Яворского. - М.: Гриф и К, 2012. - Ч. 1. - 944 с.]. За животными вели наблюдение в течение 10 суток, фиксируя поведение, интенсивность и характер двигательной активности, наличие судорог, координацию движений, тонус скелетной мускулатуры, реакции на тактильные, звуковые и световые раздражители, частоту и глубину дыхательных движений, ритм сердечных сокращений, состояние волосяного и кожного покрова, окраску видимых слизистых оболочек, потребление воды и пищи, изменение массы тела.
Рассчитывали острую токсичность, соблюдая рекомендации государственного фармакологического комитета по изучению общетоксического действия биологически активных веществ [Методические рекомендации по изучению общетоксического действия фармакологических средств. Утв. 25. 12. 97 / Вестн. фармакоп. комитета. - 1998. - №1. - С. 27-32].
I
I
50
50
Установлено, что для соединения () ЛД составляет >1200 мг/кг. Следовательно, заявляемое соединение () менее токсично, чем эталон сравнения диоксидин, ЛД которого 750 мг/кг [U.S. National Library of Medicine [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://chem.nlm.nih.gov/chemidplus/name/dioxydine] в 1,6 раза (таблица 1).
I
Согласно классификации токсичности препаратов соединение () относится к классу практически нетоксичных веществ [Сидоров, К.К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения / К.К. Сидоров // Токсикология новых промышленных химических веществ. - 1973. - Вып. 13. - С. 47-51; Березовская, И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения / И.В. Березовская // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, № 3. - С. 32-34].
(I)
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
4
3
5
Антибактериальную активностьзаявляемого соединенияопределяли пробирочным методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / под ред. А.Н. Миронова, Н.Д. Бунятян, А.Н. Васильева, О.Л. Верстаковой, М.В. Журавлевой, В.К. Лепахина, Н.В. Коробова, В.А. Меркулова, С.Н. Орехова, И.В. Сакаевой, Д.Б. Утешева, А.Н. Яворского. - М.: Гриф и К, 2012. - Ч. 1. - 944 с.]. Скрининг антибактериальной активности осуществляли в отношении типовых штаммов ATCC 6538-P, ATCC 25922. Исследуемые соединения массой 0,05 г растворяли в 5 мл ДМСО, получая основной раствор вещества в концентрации 10мкг/мл. Данный раствор служил основой для рабочего раствора, имеющего концентрацию 2×10 мкг/мл, который последовательно разводили двукратно в жидкой питательной среде в ряду из 10 пробирок. Концентрация исследуемых соединений в первой пробирке ряда разведений в питательной среде составляла 1000,0 мкг/мл. Для определения антибактериальной активности использовали питательный бульон (ФБУН ГНЦ ПМБ, г. Оболенск) и типовые суточные культуры, выращенные на питательном агаре. Концентрация микробных клеток в опыте составила 2-5×10 КОЕ/мл. В качестве положительного контроля использовали питательную среду с внесенной исследуемой культурой. В качестве отрицательного контроля использовали интактную питательную среду. Посевы инкубировали в термостате при температуре 35±2°С. Оценку роста бактерий проводили визуально через 18-24 ч инкубирования. В качестве значения МПК (минимальной подавляющей концентрации) принимали наименьшую концентрацию соединения, при которой отсутствует видимый рост тест-организма.
(I)
Iа
Полученные результаты заявляемого соединенияпо антибактериальной активности сравнивали с экспериментальными данными диоксидина и аналогом по структуре () (таблица 1). Результаты испытаний антибактериальной активности и острой токсичности представлены в таблице 1.
Таблица 1Антибактериальная активность и острая токсичность соединения (<b>I</b>)
Cоединение
Острая токсичность соединенийЛД<sub>50</sub>, мг/кг,(в/б)
Антибактериальная активностьМПК, мкг/мл
<i>S. aureus</i>ATCC 6538-P
<i>E. coli</i>ATCC 25922
Заявляемое соединение (<b>I</b>)
<b>>1200</b>
<b>7,8</b>
<b>31,2</b>
Структурный аналог (<b>Iа</b>)
-
1000,0
1000,0
Диоксидин(1% раствор)
750*
62,5
31,2
*-данные литературы:*U.S. National Library of Medicine [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://chem.nlm.nih.gov/chemidplus/name/dioxydine.
Iа
Iа
I
Z
Как видно из таблицы 1, структурный аналог () обладает низкой антибактериальной активностью. Ацилирование 6-аминопенициллановой кислоты () остатком 5-фенил-2,3-дигидро-2,3-фурандиона с образованием ()-6-(2-гидрокси-4-оксо-4-фенилбут-2-енамидо)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновой кислоты () приводит к резкому усилению биологического действия в отношении изученных штаммов микроорганизмов.
(I)
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Кроме того, заявляемое соединениепо антибактериальной активности превосходит эффект эталона сравнения диоксидина в отношении  ATCC 6538-P ~ в 8 раз (МПК 62,5/7,8) и сравнимо с действием диоксидина в отношении ATCC 25922, а также менее токсично, чем диоксидин.
Z
I
Iа
I
Таким образом, ()-6-(2-гидрокси-4-оксо-4-фенилбут-2-енамидо)-3,3-диметил-7-оксо-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2-карбоновая кислота () синтезирована простым и удобным способом, проявляет более высокую антибактериальную активность по сравнению со структурным аналогом () и эталоном сравнения (раствор диоксидина 1%), а также является практически нетоксичной, что делает возможным использование соединения () для создания нового лекарственного средства, обладающего антибактериальной активностью.