Разработка и апробация дот-блот ИФА тест-cистемы для выявления антител к ВЛКРС

Хисамутдинов, И.А. Яппаров, Д.А. Яппаров. - №2012145905/10, заявл. 26.10.2012, опубл. 20.09.2014; 4. Патент №2536246 Российская Федерация, МПК d2N 1/20 (2006.01). Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (бентонит) / И.А. Дегтярева, А.Х. Яппаров, И.А. Яппаров, А.Я. Хидиятуллина, А.М. Ежкова, В.О. Ежков, Д.А. Яппаров, Н.Ш. Хисамутдинов, С.К. Зарипова. -№2012145904/10, заявл. 26.10.2012, опубл. 20.12.2014; 5. Microbiological methods for assessing soil quality / ed. By J. Dloem, D.W. Hopkins, A. Benedetti // CABI Publishing. - 2006. - 307 p.

ВЛИЯНИЕ КОМПЛЕКСНОГО УДОБРЕНИЯ НА МИКРОБИОЦЕНОЗ КУКУРУЗЫ И ЕЕ

УРОЖАЙНОСТЬ

Дегтярева И.А., Яппаров А.Х., Давлетшина А.Я., Мотина Т.Ю.

Резюме

Сформирована коллекция диазотрофных и фосфатмобилизующих микроорганизмов, найденных в естественных условиях Республики Татарстан. На основе наноструктурной водно-фосфоритной суспензии и консорциума штаммов (Azotobacter chroococcum, Pseudomonas brassicacearum, Sphingobacterium multivorum, Achromobacter xylosoxidans) создано комплексное удобрение, применение которого повышает урожайность кукурузы на 39,0% и улучшает состояние почвенного микробиоценоза.

INFLUENCE OF THE COMPLEX FERTILIZER ON MICROBIOCENOSIS OF THE CORN AND

HER PRODUCTIVITY

Degtyareva I.A., Yapparov A.Kh., Davletshina A.Ya., Motina T.Yu.

Summary

The formed collection nitrogen-fixing and phosphatemobilizing microorganism, found in natural condition of the Republic Tatarstan. On base nanostructural water- phosphorite suspension and consortium strains (Azotobacter chroococcum, Pseudomonas brassicacearum, Sphingobacterium multivorum, Achromobacter xylosoxidans) is created complex fertilizer, which using raises the productivity of the corn on 39,0% and perfects the condition of soil microbiocenosis.

УДК 619:616.98:579.873.21:636.22.28

РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ДОТ-БЛОТ ИФА ТЕСТ-CИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ

АНТИТЕЛ К ВЛКРС

Джакаит Д.А. - аспирант; Якупов Т.Р. - д.в.н, доцент

Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана

e-mail: jakait.akamuran@yahoo.com

Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, ВЛКРС, антитела, дот-блот иммуноанализ, ИФА, нитроцеллюлозная мембрана.

Key words: leucosis of cattle, BLV, antibodies, dot-immunoassay, ELISA, nitrocellulose membrane.

Для изучения эпизоотической ситуации по инфекционным болезням в регионах и для их диагностики в мировой практике широко используются и разрабатываются различные экспресс тест-системы. Наиболее значимыми в разработке экспресс-тестов для диагностики

инфекционных болезней являются методы иммунохимического анализа (1). При этом применяются различные технологии, среди которых немаловажную роль играют модифицированные методы ИФА, которые в представительном арсенале методов, используемых в вирусологии, занимают

особое место. Несмотря на то, что его история насчитывает уже несколько десятилетий, интерес к данной проблеме не убывает (2). Согласно современной статистике (США и Европа) на долю ИФА приходится 60 % всех проводимых иммуноанализов (3). Дальнейшее развитие данной технологии направлено на расширение спектра анализируемых серологически значимых антигенов и лигандов, а также на разработку экспресс тест-систем, позволяющих с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять наличие антител к данным антигенам в минимальном объеме без больших экономических затрат и за минимально короткий промежуток времени. В этой связи наиболее перспективными являются методы ИФА разной модификации в дот-блот варианте.

Дот-иммуноанализ основан на иммунохимической реакции антиген -антитело. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью антивидового конъюгата после добавления

нерастворимого субстрата, образующего окрашенные (коричневые) пятна различной интенсивности в местах связывания антигена и антитела.

Материалы и методы. В работе использовали сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ; положительные и отрицательные контрольные сыворотки коммерческих наборов по определению антител к ВЛКРС методом ИФА; буферные растворы и реактивы для постановки ИФА; иммуноферментный анализ ставили в непрямом варианте по методу, описанному Woller A. et al. (1976); использовали антиген, выделенный из крови больных лейкозом коров; набор для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота в сыворотке крови и молоке иммуноферментным методом»

производства ФКП «Курская биофабрика -фирма «БИОК».

Результаты исследований и обсуждение. Основой тест-системы является иммобилизованный на полоске нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ) антиген ВЛКРС (4). Специфичность и чувствительность иммунохимических тест-систем всецело зависит от качества антигена. В своих прежних исследованиях

нами установлено, что антиген ВЛКРС из набора для РИД исследований без дополнительной обработки не пригоден для дот-иммуноанализа. На полосках НЦМ проявлялись только едва заметные окрашенные пятна, по которым невозможно судить о характере иммунной реакции.

При выделении антигена ВЛКРС из сывороток крови больных лейкозом коров исходили из того, что вирусные частицы главным образом содержатся в составе ЦИК. Технологию разрабатывали с учетом необходимости диссоциации ЦИК и избавления от сывороточных антител и всех остальных белков. На разработанный способ подана заявка для патентования.

Антигенные свойства выделенных белковых фракций вирусных частиц изучали в ИФА с использованием сывороток крови инфицированных ВЛКРС и больных лейкозом коров из различных хозяйств районов Республики Татарстан. По результатам исследований установили, что вирусные частицы выделенные из сывороток крови больных лейкозом коров, обладают антигенными свойствами и не уступают по специфичности антигену gp51 применяемых в коммерческих наборах для ИФА.

Для постановки дот-иммуноанализа можно использовать различные

твердофазные пористые носители. Носители на основе нитроцеллюлозы считаются наиболее удобными за счет высоких сорбционных свойств для белков (иммобилон) и простоты обращения с ними

(5).

Полоски нитроцеллюлозной

мембраны маркировали карандашом на квадратики 3х3мм для удобства при проведении реакции (один квадратик - одна реакция). Антиген адсорбировали путем погружения полосок НЦМ в раствор антигена в карбонатном буфере.

Для блокировки свободных после сорбции антигена мест на НЦМ использовали альбумин

лиофилизированный (из человеческой сыворотки). Альбумин растворяли в дистиллированной воде и установили, что при использовании 0,5%-й концентрации отмечается полное отсутствие фона. Оптимальное время инкубации при комнатной температуре составило от двух часов и более. Полоски НЦМ промывали в

твинфосфатном буфере, известном в методике классического ИФА как промывочный раствор, а также в дистиллированной воде и высушивали при комнатной температуре. Иммобилоны как основа тест-системы готовы для дальнейшего использования. Процедура промывки иммобилонов описана многими исследователями (6), которые предлагают использовать дистиллированную воду, ЗФР (забуференный физиологический раствор), Т-ФСБ и др. Результаты исследований показали, что промывка НЦМ дистиллированной водой не влияет чувствительность тест-системы. Однако на следующих стадиях иммуноанализа (после нанесения исследуемой сыворотки, конъюгата и субстрата) при промывании НЦМ необходимо использовать только специальные промывочные буферные растворы.

На следующем этапе нашей работы оптимизировали условия связывания антител с иммобилизованным на НЦМ антигеном, а также время инкубации НЦМ с конъюгатом и время ферментативной реакции с субстратом. При этом основной

нашей задачей было определение минимального временного интервала инкубации во всех случаях, не вызывающего понижения чувствительности тест-системы.

В качестве конъюгата использовали антивидовые антитела меченые с пероксидазаой, субстрат - ТМБ. Таким образом, при разработке дот-блот тест-системы придерживались классических принципов твердофазной ИФА.

В качестве контрольных сывороток использовали положительные и

отрицательные контроли коммерческого набора для выявления антител к ВЛКРС методом ИФА. Исследуемые сыворотки наносили в объеме 2 мкл. Нанесение раствора конъюгата и субстратной смеси проводили в двух вариантах: 1) точечный, 2) погружением иммобилона в предварительно подготовленные растворы реактивов (флотация). Объемы нанесения и время инкубации определялись

экспериментально. Учет результатов производили визуально по наличию или отсутствию коричневых пятен на точках нанесения образцов (рис.1).

Рис.1 - Визуализация результатов дот-блот ИФА.

Тест-систему апробировали для выявления антител к ВЛКРС в пробах сывороток крови коров из неблагополучных по лейкозу хозяйств. Всего исследовали 22 пробы. В качестве сравнительного теста использовали ИФА в классическом исполнении с применением «набора для выявления антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке иммуноферментным методом» производства ФКП «Курская биофабрика - фирма «БИОК». Одна проба служила отрицательным контролем. Все остальные - положительные в иммуноферментном анализе.

Результаты ИФА и дот-иммуноанализа в целом совпали, кроме 1-й

пробы, которая в ИФА была

положительной, а в дот-блот анализе -отрицательной.

Заключение. Проведенные

исследования показали, что тест система дот-блот ИФА с использованием вирусных частиц выделенных из сыворотки крови больных лейкозом коров, вполне пригодна для скрининговых исследований на лейкоз крупного рогатого скота. Она обладает меньшей чувствительностью, чем ИФА, однако гораздо проще и дешевле при постановке, не требует специального оборудования. Постановка реакции требует гораздо меньшего времени по сравнению с классическим ИФА и не зависит от

количества проб. Если для постановки зарубежных исследователей (7,8). При

классического ИФА требуется не менее 3-х массовых исследованиях возможно

часов, то для ИФА в дот-варианте около нанесение раствора конъюгата и

одного часа. Аналогичные заключения субстратной смеси методом флотации, что

делают также ряд отечественных и не влияет на чувствительность метода.

ЛИТЕРАТУРА: 1. Бреус Ю.В. Разработка и конструирование экспресс-теста для диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Ю.В. Бреус, О.Д.Небещук, Я.В.Хоменко и др. // Вестник науки Казахского агротехнического университета им. С.Сейфуллина. - 2013. - №4 (79). - C. 15-21. 2. Иванов А.П. Разработка и применение экспериментальных и промышленных иммуноферментных тест-систем для лабораторной диагностики вирусных инфекций /А.П.Иванов // Автореферат дисс. д.мед.н., Москва - 1998 г. 3. S, S Deshpande. Enzyme immunoassays—From concept to product development: Chapman & Hall, London., p.464. 1996 ISBN 0-412-0560101. 4. Владыко А.С. Разработка и апробация диагностической тест-системы для выявления антител к ВИЧ методом дот-иммуноанализа / А.С.Владыко, Т.В.Школина, Л.Е.Сурикова и др.// Рубрики:76.03.41, 76.35.33. Сроки выполнения НИР:1996-1998; 5. Таранин А.В. Способ выявления антител к вирусу алеутской болезни норок / А.В.Таранин, С.М.Мирошниченко, ВВ. Перемыслов // Патент. № 2074393 от 27.02.1997; 6. Аронова Н.В. Использование препаратов липополисахарида Fracisella Tularensis в точечном твердофазном иммуноферментном анализе/ Н.В.Аронова, Н.В.Павлович, Н.Л.Пичурина и др.// Ростов-на-Дону. Патент 2362170 от 20.07.2009. 7. T. Anand, T.A. Narasa Raju, C. Vishnu, L.V. Venkateswar Rao, G. Sharma.Development of Dot-ELISA for the detection of human rotavirus antigen and comparison with RNA-PAGELett Appl Microbiol., 3 (2001), pp. 176-180. 8. Hemmatzadeh, F., F. Amini : Dot-blot enzyme immunoassay for the detection of bovine viral diarrhea virus antibodies. Vet. arhiv 79, 343-350, 2009.

РАЗРАБОТКА И АПРОБАЦИЯ ДОТ-БЛОТ ИФА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ

АНТИТЕЛ К ВЛКРС

Джакаит Д.А, Якупов Т.Р.

Резюме

Разработана тест-система дот-блот ИФА с использованием вирусных частиц, выделенных из сыворотки крови больных лейкозом коров. Оптимизированы условия проведения и доказана возможность использования метода для диагностики лейкоза у крупного рогатого скота.

DEVELOPMENT AND TESTING OF THE DOT BLOT ELISA TEST-SYSTEM TO DETECT

ANTIBODIES TO BLV

Jakait J.A, Yakupov T.R.

Summary

The developed test system of the dot-blot ELISA was based on the use of viral particles isolated from sera of cows infected with bovine leukemia virus. The conditions for conducting analysis were optimized and the possible use of the method for the diagnosis of leucosis in cattle was proved.

УДК 619:612.325:636.5

УЛЬТРАМИКРОСТРУКТУРА КЛЕТОК ПОВЕРХНОСТНОГО ЭПИТЕЛИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛЕЗИСТОЙ ЧАСТИ ЖЕЛУДКА КУР

Дышлюк Н.В. - к. вн., доцент Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины, г. Киев

e-mail: dushlyuk@ukr.net

Ключевые слова: куры, электронная микроскопия, железистая часть желудка, поверхностный эпителий, эпителиоциты, М-клетки.