СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ИММУНОПРОФИЛАКТИКИ КОКЛЮША
METHOD FOR PREPARING CELL-FREE VACCINE FOR PERTUSSIS IMMUNISATION

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при производстве высокоиммуногенных безвредных препаратов для профилактики коклюша.
Известен способ получения бесклеточных коклюшных вакцин на основе индивидуально очищенных антигенов Bordetella pertussis с последующим их объединением в готовом препарате, такие вакцины содержат в своем составе от 1 до 5 очищенных антигенов. Однако до настоящего времени остается не ясна роль отдельных антигенов Bordetella pertussis в отношении их вклада в обеспечение протективной функции иммунопрофилактического препарата. Вместе с тем в настоящий момент наблюдается тенденция повышения эффективности бесклеточных коклюшных вакцин за счет включения в их состав от 3 до 5 антигенных компонентов (Еженедельный эпидемиологический бюллетень, 2010, №40, 385-400). Таким образом, является целесообразным получение препаратов, содержащих природный комплекс антигенов Bordetella pertussis, обладающий наиболее оптимальным соотношением протективных антигенов.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению аналогом (прототип) является способ получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша (описание к патенту №2332231 на изобретение «Способ получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша» МПК А61К 39/10, опубликован 10.02.2008), включающий выращивание культуры Bordetella pertussis на питательной среде КУА (казеиново-угольный агар) при (36±1)°С в течение 48 часов с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды, при этом в микробной суспензии, содержащей 70±10 ME микробных клеток, устанавливают рН 8,4±0,1, после чего в суспензию добавляют водный раствор дезоксихолата натрия до конечной концентрации 0,5% и выдерживают при температуре (3±1)°С в течение 2 часов, затем полученный комплекс антигенов Bordetella pertussis отделяют от биомассы центрифугированием, подвергают диафильтрации, ультрафильтрации, обезвреживают 0,03% формалина при рН 7,6±0,2 и температуре (36±3)°С в течение 3 суток. Обезвреженный комплекс антигенов Bordetella pertussis осаждают соляной кислотой при рН 3,5±0,3 в присутствии 0,30±0,05% гексаметафосфата натрия. Полученный осадок растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 7,1±0,3 и проводят стерилизующую фильтрацию готового продукта. Однако препарат, получаемый данным способом, является пирогенным (содержит более 100 эндотоксических единиц (ЭЕ) в одной человеческой дозе), вследствие чего не соответствует международным требованиям, предъявляемым к бесклеточным коклюшным вакцинам (European pharmocopeia 6.0 01/2008:1595).
Признаки известного технического решения, совпадающие с признаками заявленного изобретения, заключаются в выращивании штаммов Bordetella pertussis на среде КУА с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды, установлении в суспензии концентрации микробных клеток 60-80 ME при рН 8,4±0,1, экстракции комплекса антигенов Bordetella pertussis 0,5% раствором дезоксихолата натрия, отделении его от клеток центрифугированием, очистке от низкомолекулярных балластных примесей диафильтрацией.
Задачей, решаемой изобретением, является повышение качества бесклеточной коклюшной вакцины.
Технический результат, обеспечивающий решение указанной задачи, заключается в снижении уровня содержания эндотоксинов Bordetella pertussis в препарате бесклеточной коклюшной вакцины.
Технический результат достигается тем, что в известном способе получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша, включающем выращивание культуры Bordetella pertussis на казеиново-угольном агаре с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды, установление в суспензии концентрации микробных клеток 60-80 ME и рН 8,4±0,1, экстракцию комплекса антигенов Bordetella pertussis 0,5% раствором дезоксихолата натрия, отделение его от микробных клеток центрифугированием и очистку диафильтрацией от низкомолекулярных балластных примесей, согласно изобретению комплекс антигенов Bordetella pertussis переводят в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09 М NaCl, а удаление эндотоксинов из комплекса антигенов Bordetella pertussis проводят с помощью хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005 М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl, после чего комплекс антигенов Bordetella pertussis обезвреживают 0,100±0,025% формалина при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток.
Перевод комплекса антигенов Bordetella pertussis в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09 М NaCl, осуществляется для обеспечения условий хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005 М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl, которую проводят для снижения уровня содержания эндотоксинов в комплексе антигенов Bordetella pertussis. Концентрация формалина 0,100±0,025% при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток обеспечивает полное обезвреживание токсических компонентов комплекса антигенов Bordetella pertussis.
Новыми признаками заявленного способа по отношению к прототипу являются: перевод комплекса антигенов в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09 М NaCl; удаление эндотоксинов из комплекса антигенов путем проведения хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005 М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl; обезвреживание комплекса антигенов Bordetella pertussis 0,100±0,025% формалина при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток.
Способ получения препарата осуществляется следующим образом. Для изготовления вакцины используют 3-5 штаммов возбудителя коклюша Bordetella pertussis 1 фазы. Микробы выращивают на КУА в матрацах при (36±1)°С в течение 48 часов. По истечении указанного времени выросшую культуру в каждом матраце контролируют на бактериологическую чистоту и типичность морфологии микробных клеток путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. С каждого матраца с культурой Bordetella pertussis, удовлетворяющей требованиям по морфологии и чистоте, производят смыв культуры стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2). Бактериальную суспензию сливают в стерильную бутыль. Производят стандартизацию суспензии по оптическому стандарту мутности, устанавливая концентрацию 60-80 ME микробных клеток в 1 мл суспензии. В стандартизованной суспензии устанавливают рН 8,4±0,1 с помощью 5% раствора натрия гидроксида. К охлажденной до (3±1)°С микробной суспензии, содержащей 60-80 ME, добавляют 10% раствор дезоксихолата натрия до конечной концентрации его в суспензии, равной 0,5%, и выдерживают при температуре (3±1)°С в течение двух часов при периодическом перемешивании. После этого комплекс антигенов Bordetella pertussis отделяют от биомассы посредством центрифугирования. Полученный раствор комплекса антигенов Bordetella pertussis подвергают осветляющей фильтрации через мембраны с диаметром пор 1-3 мкм. Затем проводят очистку целевого продукта на ультрафильтрационной установке с мембранными модулями. Вначале проводят диафильтрацию против 0,9% раствора натрия хлорида, затем переводят в 0,005 М сукцинатно-боратный буферный раствор с рН 7,3±0,2, содержащий 0,09М NaCl. По окончании диафильтрации целевой продукт концентрируют до исходного объема, устанавливают рН 7,3±0,2, подвергают микрофильтрации через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм. Далее проводят дополнительную очистку комплекса антигенов для снижения уровня содержания эндотоксина Bordetella pertussis с помощью хроматографии на колоннах с анионообменной смолой Whatman DE-52, уравновешенной 0,005М сукцинатно-боратным буферным раствором с рН 7,3±0,2, содержащим 0,09 М NaCl. При прохождении раствора через колонну происходит адсорбция эндотоксической составляющей на смолу, а целевой продукт выходит транзитом. Элюцию комплекса антигенов Bordetella pertussis контролируют спектрофотометрически, фракцию, содержащую комплекс антигенов Bordetella pertussis, собирают в емкость, добавляют формалин до концентрации 0,100±0,025%, устанавливают рН 7,6±0,2. Затем проводят стерилизующую фильтрацию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, полученный раствор выдерживают при температуре (33±2)°С в течение 12±2 суток до полного обезвреживания токсических компонентов препарата. Данная технология позволяет получить препарат коклюшного антигенного комплекса со сниженным содержанием эндотоксинов (табл.1) и с полноценной антигенной структурой, которая соответствует антигенной структуре широко применяемого в настоящее время цельноклеточного коклюшного компонента комбинированной АКДС-вакцины (табл.2).
Таблица 1
Содержание эндотоксинов Bordetella pertussis в препаратах бесклеточного коклюшного антигена по данным хромогенного ЛАЛ-теста по конечной точке
Содержание эндотоксинов в вакцинной дозе (0,5 мл)
препарат по патенту
препарат по изобретению
№ образца
ЭЕ
№ образца
ЭЕ
1
2531,00
1
4,99
2
2820,00
2
0,90
3
3060,00
3
0,63
Все результаты хромогенного ЛАЛ-теста подтверждены в испытаниях на пирогенность на кроликах.
Таблица 2
Антигенная структура коклюшных препаратов по данным ммуноферментного анализа
Препарат
КТ<sup>1</sup>
ФГА<sup>2</sup>
ПРН<sup>3</sup>
Агг2<sup>4</sup>
Агг3<sup>5</sup>
Цельноклеточный компонент АКДС-вакцины
+
+
+
+
+
Бесклеточный препарат по изобретению
+
+
+
+
+
1. КТ - коклюшный анатоксин; 2. ФГА - филаментозный гемагглютинин; 3. ПРН -пертактин; 4. Агг 2 - фимбриальный агглютиноген типа 2; 5. Агг 3 - фимбриальный агглютиноген типа 3