Штамм Bradyrhizobium ottawaense, высокоэффективный микросимбионт сои, и микробный препарат на его основе для повышения продуктивности растений
BRADYRHIZOBIUM OTTAWAENSE STRAIN, A HIGHLY EFFECTIVE SOYBEAN MICROSYMBIONT, AND A MICROBIAL PREPARATION BASED ON IT TO INCREASE PLANT PRODUCTIVITY

Группа изобретений относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, а именно к средствам улучшения азотного питания сои за счет формирования эффективного симбиоза, и может быть использована для повышения урожайности сои.
Соя (Glycine max (L.) Merr.) характеризуется высоким содержанием белка (до 40%), масла (до 18%) и других ценных питательных элементов в зерне (Скрипко О.В., Литвиненко О.В., Исайчева Н.Ю. Сравнительная характеристика биохимического состава семян сои новых сортов амурской селекции для использования в пищевой промышленности // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2015. - №8. - С. 34-39; Зотиков В.И. Роль зернобобовых культур в решении проблемы кормового белка и основные направления по увеличению их производства // Научное обеспечение производства зернобобовых и крупяных культур. - Орел. - 2004. - С. 256-260.), следовательно, наращивание производства зерна сои способствует решению задачи обеспечения растущего населения мира белком.
Наряду с гидротермическими условиями важным фактором продуктивности агроценозов является обеспечение растений элементами питания, в частности, азотом. Бобовые растения способны удовлетворять потребности в азоте за счет формирования симбиоза с клубеньковыми бактериями (ризобиями). В последнее время применение микробных препаратов на основе высокоэффективных штаммов специфических ризобий является важным и необходимым агротехнологическим приемом выращивания сои (Соя. Биология и технология возделывания / В.М. Лукомец, В.Ф. Баранов, У.Т. Корреа и др. - Краснодар: Советская Кубань, 2005.-433 с).
Известны штаммы клубеньковых бактерий и инокулянты, применяемые для повышения продуктивности растений сои, представленные в патентах РФ (SU 491695, 15.11.1975; SU 1039933, 07.09.1983; RU 2413762, 10.11.2010; RU 2413707, 10.10.2010; RU 2568067, 10.11.2015; RU 2586521, 10.06.2016; RU 2426778, 20.08.2011; RU 2487932, 20.07.2013; RU 2654580, 21.05.2018; RU 2728471, 29.07.2020) и других стран (UA 142683 U, 25.06.2020; KZ А4 24880, 15.11.2011; KZ А4 28715, 15.07.2014; KZ А 17761, 15.09.2006). При большинстве положительных свойств у приведенных выше известных штаммов и инокулянтов имеется ряд недостатков, таких как низкий уровень нодуляции и азотфиксирующей активности в определенных типах почвы, избирательность к сортам, слабый адаптационный потенциал к почвенно-климатическим условиям, высокая чувствительность к антибиотикам и другим агрохимическим факторам, требовательность к субстратам и условиям культивирования. К недостаткам следует отнести также отсутствие информации об эффективности запатентованных штаммов в разных регионах промышленного выращивания сои, в том числе в зонах рискованного земледелия.
Известен штамм клубеньковых бактерий сои Rhizobium japonicum 634б, используемый для изготовления бактериального препарата нитрагина под сою (А.с. SU 1034358, 07.04.1984) - активный симбиотрофный азотфиксатор для промышленного использования. Недостатком, препятствующим использование штамма Bradyrihobium japonicum 6346 в качестве бактериального препарата под сою, является невысокая конкурентноспособность в почвах с почвенной популяцией соевых ризобий, значительное варьирование эффективности симбиоза с различными сортами сои. А также высокая требовательностиь к условиям культивирования и хранения, что усложняет технологию получения высоких титров инокулюма.
В основу изобретения поставлена задача селекции высокоактивного, эффективного, устойчивого к агрохимикатам, повышенному содержанию аммония, высокотехнологичного штамма клубеньковых бактерий сои и получение микробного препарата на его основе, который может быть использован для повышения урожайности сои.
Поставленная задача решена путем выделения штамма клубеньковых бактерий Bradyrhizobium ottawaense М-8, микросимбионта сои с комплексом полезных свойств, и создания на его основе микробного препарата для повышения продуктивности растений.
Штамм Bradyrhizobium ottawaense М-8 выделен методом аналитической селекции. Первичная идентификация проведена по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам согласно определителю Берджи (Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. - 432 с.). Генетическая идентификация проведена с использованием высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 16S рРНК (таксономический анализ). Показано сходство с гомологичным штаммом Bradyrhizobium ottawaense 0099Т (Query cover - 100%, Identity - 99.89%>M8). Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM05210.
Клетки штамма имеют форму изогнутых палочек, подвижные благодаря жгутикам, монотрихи. Размер клеток в 5-10-суточной культуре составляет 0,3x1,2 мкм. Бактероидные формы имеют вид более крупных палочек. Культура медленного роста, грамотрицательная, спор не образует. Штрих на агаризованной гороховой среде блестящий, обильный, беловатый, плоский и слизистый. Колонии клеток однотипные, круглые с четким контуром, выпуклые, белые, блестящие, слизистые, появляются на 9-е сутки диаметром до 1,0 мм. Вокруг колоний на поверхности агара часто образуется радужный ореол. В качестве источника углерода используют различные формы углеводов. Интенсивный рост на средах с моносахаридами (глюкозой, арабинозой, ксилозой), дисахаридами (лактозой, мальтозой) и сахарными спиртами (сорбитом, маннитом, дульцитом). При росте на углеводах отмечается подщелачивание среды. В качестве единственного источника углерода органические кислоты, в частности цитрат, не использует.
В качестве источника азота ассимилирует некоторые минеральные формы: азотнокислый натрий, аммонийные соли. На мясо-пептонном агаре (ΜΠΑ) и глицерино-пептонном агаре рост отсутствует, но бактерии хорошо растут на бобовом (гороховом, люпиновом, нутовом, соевом) и капустном агаре. Штамм не гидролизует крахмал, казеин и агар, желатин не разжижает. Обладает денитрифицирующей способностью (восстанавливает нитраты до молекулярного азота), уреазной и каталазной активностью, молоко подщелачивает среду, флюоресцирующих и феназиновых пигментов не образует. Не патогенен.
По отношению к кислороду культура - аэроб. Температурный интервал роста штамма М-8 18-37°С, t оптимум - 25-28°С, рост бактерий наблюдается в диапазоне рН 4,5-8,5, оптимальной для развития клетки штамма является близкая к нейтральной реакция среды рН 6,5-7,5. В симбиозе с растением сои бактерии штамма фиксируют азот атмосферы 50,1-70,5 мгм азота на 1 растение за час.Азотфиксирующую активность определяли методом ацетиленредукции на газовом хромотографе «Хром-5» (Hardy, R.W.F.; Burns, R.C.; Herbert, R.R.; Holsten, R.D.; Jackson, E.K. Biological nitrogen fixation: a key to world protein // Plant and Soil / Special vol. - 1971. - P. 561-590.).
Заявленный штамм образует симбиоз с растениями сои, что подтверждено в вегетационных и полевых опытах.
Пример 1.
Исследование проводили в вегетационном опыте на безазотном субстрате - вермикулит, на котором выращивали сорт сои Сибирячка. Инокуляция семян сои заявленным штаммом Bradyrhizobium ottawaense М-8 обеспечила увеличение высоты растений на 9,4 и 12,2 см (40,1 и 59,8%) соответственно в сравнении с абсолютным контролем и вариантом с инокуляцией стандартным штаммом, надземной массы - на 0,43 и 0,53 г (39,4 и 53,5%) соответственно. Масса корней при инокуляции штаммом М-8 была на уровне контроля и в 3 раза превышала вариант с применением стандартного штамма (таблица 1).
Пример 2.
Влияние бактеризации семян суспензией штаммов Bradyrhizobium japonicum 634б (прототип) и Bradyrhizobium ottawaense М-8 на симбиотическую эффективность сортов сои Дуар, Славия, Лира, Славяночка, Казачка.
Исследование проводили в вегетационном опыте на субстрате -чернозем южный, на котором выращивали пять сортов сои. Бактеризацию проводили 3-суточных проростков. Во всех вариантах бактеризации на корнях растений сформировались азотфиксирующие клубеньки от 15 до 36 ед./растение. Эффективность бактеризации штаммом Bradyrhizobium ottawaense М-8 была на уровне референтного штамма Bradyrhizobium japonicum 634б, однако имела тенденцию к увеличению на четырех сортах Славия, Лира, Славяночка, Казачка, повысив фитомассу растений на 7,7-18,8% (фиг. 1).
Пример 3.
В полевых опытах на черноземе южном в условиях орошения установлено, что Br. ottawaense М-8 формировал эффективный симбиоз с растениями сои. Количество клубеньков на корнях, инокулированных заявленным штаммом и их масса в 4 и 2,6 раза соответственно были больше чем при бактеризации семян штаммом-прототипом (таблица 2). Обработка семян обеспечила прибавку урожая зерна сои на 0,37 т/га (30,3%) к контролю без инокуляции. При обработке семян штаммом-прототипом прибавка урожая зерна составляла 0,29 т/га.
Таким образом, заявленный штамм Bradyrhizobium ottawaense М-8 имеет преимущества перед штаммом-прототипом (Bradyrhizobium japonicum 634б):
1) более конкурентноспособен;
2) формирует эффективный симбиоз с современными сортами сои, что обеспечивает спрос потребителей на инокулюм нового селекционированного штамма.
Технологические свойства штамма Br. ottawaense М-8 определяли по способности расти в производственных средах (Хотянович А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и применения препаратов на их основе (методические рекомендации). - Л.: Б.и., 1991.-60 с). Бактерии культивировали в течении 4 суток, при скорости вращения качалки 180-200 об/мин. Установлено, что штамм Bradyrhizobium ottawaense М-8 технологичен. В условиях глубинного периодического культивирования в полусинтетических жидких питательных средах, штамм Br. ottawaense М-8 набирает титр 6,0-9,5 млрд колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл (пример 4, таблица 3). Пример 4.
4
2
4
2
4
2
4
4
3
Селекционный штамм Bradyrhizobium ottawaense М-8 менее требователен к условиям хранения, что также свидетельствует о технологичности штамма и возможности получить микробный препарат на основе заявленного штамма с длительным сроком сохранения жизнеспособности клеток. Штамм бактерий устойчив к повышенному (до 20 г/л) содержанию аммония. Через 96 часов культивирования (четверо суток) бактериальный штрих занимает до 50% поверхности скошенной минерально-растительной среды (гороховый отвар - 10; глюкоза - 10; сахар пищевой - 2,5; (NH)SO - 0,1; KHPO - 0,5; KHPO - 0,5; MgSO - 0,2; СаСО - 1,0; агар-агар - 20,0).
Предлагаемый штамм бактерий совместим с агрохимическими средствами защиты сои, что подтверждено примером 5.
Пример 5.
В лабораторных условиях на агаризованных средах изучали совместимость штаммов бактерий с химическими протравителями, используемыми в посевах бобовых и зерновых культур, зарегистрированных в РФ: Максим (1,5-2,0 л/т); ТМТД (4,0-5,0 л/т), Инстиво (0,5-1,0 л/т); Дивидент экстрим (0,5-1,0 л/т); Делит Про (0,5 л/т) (таблица 4).
На основе штамма Br. ottawaense М-8 разработана сыпучая форма препарата с использованием в качестве субстрата-носителя пылевидной фракции вермикулита (до 1-2 мм). Подготовленный субстрат инокулируют жидкой культурой, полученной в примере 4 (рабочая). Субстрат с культурой тщательно перемешивают и оставляют на доращивание в течение 14 дней при температуре 18-20°С. Титр готового препарата 5,8±0,21 - 6,8±0,81 млрд КОЕ в 1 грамме. рН водной вытяжки 7,7.
Обработку семян проводят следующим образом: препарат суспендируют в воде, количество которой соответствует 1,3% рабочего раствора от массы семян, наносят на семена и тщательно перемешивают. Вермикулит хорошо прилипает к семенам, но для лучшего эффекта рекомендовано использовать прилипатель (например, раствор гумата натрия, КМЦ, и т.д.). Для механизированной обработки в протравочной машине суспензию фильтруют, а фильтрат вносят с семенами.
Пример 6.
В полевых испытаниях на черноземе южном на фоне почвенной популяции ризобий исследовали эффективность микробного препарата на основе заявленного штамма Br. ottawaense М-8. Установлено, что такой агроприем, как предпосевная обработка семян, за счет формирования эффективного симбиоза ризобактерий с растением, обеспечил прибавку урожая зерна сои на 12,2% (2,3 ц/га).
Таким образом, методом аналитической селекции получен активный, эффективный, конкурентоспособный, технологичный штамм Br. ottawaense М-8, который является микросимбионтом растений сои современных сортов. В полусинтетических питательных средах заявленный штамм набирает высокий титр 6,0-9,5 млрд колониеобразующих единиц в мл культуры. Разработана сыпучая форма микробного препарата на основе штамма Br. ottawaense М-8. Показано, что инокуляция семян сои как штаммом, так и микробным препаратом на его основе повышает продуктивность растений на 30,3 и 12,2% соответственно.