Пролиферация и дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при культивировании в альгинатных микрокапсулах и широкопористых губках

глиального рубца клетки линии НЕК-293, трансфици-рованые конструкцией, содержащей ген gdnf, трансплантировали взрослым мышам линии СВА. Имму-ногистохимическая окраска срезов мозга мышей, проживших после трансплантации 18 сут., на белковые маркеры рубцовой ткани, показала, что присутствие трансгенного gdnf в трансплантированных клетках уменьшает глиальную посттравматическую реакцию окружающей трансплантат ткани мозга. Результаты подтверждают перспективность применения GDNF в качестве нейропротектора в тканевой терапии.

Для успешного применения перечисленных выше трансгенов в генной и клеточной терапии необходимо иметь конструкции с управляемой экспрессией трансгенного продукта. Полученная нами конструкция, содержащая промотор гена белка теплового шока дрозофилы Ihsp70) и репортерный ген синего флуоресцентного белка (СФБ) под тем же промотором, была введена в геном эмбриональных стволовых клеток ИСК) мышей. Трансформированные клетки обнаруживали выраженное голубое свечение только после предварительного температурного шока, полученного прогреванием культуры ЭСК при 39°С в течение 30 мин.

Таким образом, показана возможность использования промоторов дрозофилы для регуляции экспрессии в клетках млекопитающих чужеродных генов, полезных при лечении различных, в частности, нейродеге-неративных, заболеваний.

A.Ю. Петренко 1 а, Ю.А. Петренко 1 а, А.И. Правдюк \ С.П. Мазур 1 а, Р.В. Иванов 3, Ю.В. Степаненко 3,

B.И. Лозинский 3, В.И. Грищенко 1 а Пролиферация и дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при культивировании в альгинатных микрокапсулах и широкопористых губках

1 Институт проблем криобиологии и криомедицины НАНУ, Харьков, Украина

2 Межведомственный научный центр криобиологии и криомедицины, Харьков, Украина

3 Институт элементоорганических соединений им. АН, Несмеянова, РАН, Москва, Россия alexanderjetrenko@cryo.org.ua

A.Yu. Petrenko, Yu.A. Petrenko, A.I. Pravduk, S.P. Mazur,

R.V. Ivanov, Yu.V. Stepanenko, V.l. Lozinsky, V.l. Grischenko Proliferation and differentiation of multipotent mesenchymal stromal cells in culture within alginate microbeads and wide pore sponges

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) характеризуются мультилинейным дифференцировочным потенциалом, что определяет перспективу их применения в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Монослойное культивирование является классическим подходом для изучения клеток, в том числе и ММСК. Однако в этой системе клеткам доступно только двухмерное пространство, тогда как в естественных условиях они имеют трехмерную архитектонику.

Целью работы явилось изучение пролиферации и диф-ференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека при монослой-ном и объемном культивировании в составе альгинатных микрокапсул и широкопористых криогелевых губок.

ММСК выделяли из костного мозга взрослого человека в соответствии с этическими нормами. После экспансии в монослойной культуре иммунофенотип

клеток определяли методом проточной цитофлуори-метрии. Для инкапсуляции ММСК смешивали с раствором альгината натрия и распыляли в раствор, содержащий ионы кальция. После гелеобразования получали микрокапсулы размером 500^1000 мкм с иммобилизированными клетками. Широкопористые губки изготавливали из альгината методом криоструктурирования. Модификацию адгезивных свойств носителя проводили ковалентным присоединением к поверхности пор желатина типа А. Пролиферацию и метаболическую активность определяли Alamar Blue тестом. Дифференцировку осуществляли добавкой соответствующих индуцирующих факторов в среду культивирования, продукты дифференцировки определяли биохимическими и гистологическими методами.

Цитофлуориметрические исследования показали, что клетки, изолированные из костного мозга взрослого человека, после 4-го пассажа имели иммунофенотип, характерный для ММСК (CD29 + , CD44 + , CD73+, CD105+, CD34\ CD450. В ходе последующего монослойного культивирования в среде экспансии клетки активно пролиферировали, а в присутствии соответствующих индуцирующих факторов ММСК дифференцировались в остеогенном и адипогенном направлениях. После инкапсуляции в альгинатные микрокапсулы ММСК не распластывались, сохраняя сферическую форму, и практически не пролиферировали при последующем культивировании в среде экспансии. Вместе с тем, альгинат-инкапсулированные ММСК сохраняли жизнеспособность, метаболическую активность и способность к индуцированной дифферен-цировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлениях. Остановка пролиферации ММСК в альгинатных микрокапсулах может быть обусловлена потерей ориентации клеток в гомогенном полужидком окружении или низкими адгезивными свойствами альгината. Для выяснения этого вопроса ММСК культивировали в широкопористых губках на основе альгината. При заселении таких губок ММСК вели себя так же, как при инкапсуляции в микросферы — не адгезирова-лись к их поверхности, что сопровождалось потерей способности к пролиферации. Прямое введение желатина в концентрациях от 0,125% до 0,5% в альгинатный носитель не обеспечивал адгезию и пролиферацию ММСК. Модификация альгинатных губок путем ковалентной сшивки желатиновых наночастиц к поверхности пор увеличивала адгезивные свойства носителя. В ходе последующего культивирования в широкопористых альгинатных губках с модифицированной желатином поверхностью пор ММСК пролиферировали и мигрировали, занимая весь объем носителя. Изучение дифференцировочных возможностей показало, что ММСК в составе вышеуказанных губок способны дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях.

Выводы:

1. ММСК в составе альгинатных микрокапсул или широкопористых губок не способны к пролиферации в результате низких адгезивных свойств альгината.

2. Модификация альгинатного носителя путем химического присоединения якорных частиц желатина к поверхности пор сопровождается адгезией клеток и их пролиферацией.

3. Для индуцированной дифференцировки ММСК в адипогенном, хондрогенном и остеогенном направлениях не требуется столь прочный контакт с поверхностью как для пролиферации; дифференцировочный

потенциал клеток реализуется при культивировании в составе как адгезивных, так и неадгезивных носителей на основе альгината.

Работа выполнена при поддержке совместного гранта РФФИ и ГФФИ Украины (проект № 09-04-90403-Укр_ф_а).

А.Г. Попандопуло

Лечение рефрактерной стенокардии с использованием аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток

Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака АМН Украины, Донецк, Украина Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького, Донецк, Украина pag.lctc@male.ru

A.G. Popandopulo

Treatment of refractory angina pectoralis with the use of autologous multipotent mesenchymal stromal cells

Несмотря на использование медикаментозной терапии и методов прямой реваскуляризации миокарда при ишемической болезни сердца (ИБС), проблема рефрактерной стенокардии остается актуальной. У большого количества пациентов на фоне лечения сохраняются симптомы заболевания, высок процент инвалидизации.

Цель работы — изучить эффективность применения аутогенных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (аутоММСК) костного мозга с учетом путей доставки у больных с рефрактерной стенокардией.

Материал и методы. В исследование включено 48 пациентов с рефрактерной стенокардией (45 мужчин и 3 женщины) в возрасте от 46 до 68 лет (средний возраст 53,7+1,62) с функциональным классом стенокардии ii—IV. Всем выполнено катетерное электромеханическое картирование левого желудочка (ЛЖ) с помощью системы Noga ХР, при котором выявлены обширные зоны гибернированного миокарда и рубцовые поля после перенесенных инфарктов. Оценивалось количество приступов стенокардии в сутки, частота госпитализаций, развитие инфарктов миокарда, летальность, качество жизни с использованием Миннесотского опросника а также контрольные картирования ЛЖ в сроки 6 и 12 мес.

Пациенты разделены на 4 группы. Пациентам I группы сразу после завершения процесса картирования ЛЖ были выполнены инъекции аутоММСК с применением системы навигации NOGA ХР (8—10 инъекций) — 11 пациентов. Во II группе осуществлено в/в введение — 13 больных. В III группе — интракоронарное введение — 14 пациентов. Пациентам IV группы производилось интрамиокардиальное введение физиологического раствора при выполнении катетерной навигации NOGA ХР в количестве и по объему раствора аналогичного в группе I.

Результаты. Период наблюдения составил 6—18 мес. Госпитализаций с острым коронарным синдромом или нарастанием сердечной недостаточности не было. При контроле у 32 пациентов выявлена положительная динамика (66,8%). В группе I отмечено улучшение качества жизни по Миннесотскому опроснику на 13— 38 баллов, в группе II — на 24—45 баллов, в группе III — на 26—39, в группе IV — положительной динамики не отмечено. Количество приступов стенокардии умень-

шилось с 2—8 в сут. до 1—2 у пациентов первых трех групп. В четвертой группе у 20% пациентов отмечена отрицательная динамика. При ЗхоКГ увеличилась фракция выброса левого желудочка на 5—10% и уменьшилось КДО ЛЖ на 30—50 мл (до 10—12% от исходного объема) при интрамиокардиальном введении, на 3— 8% и 20^46 мл соответственно при внутривенном введении, на 6—9% и 25—50 мл при интракоронарном введении. В IV группе эти показатели улучшились только у 1 пациента, в 70% остались на прежнем уровне, а у 2 больных зарегистрировано уменьшение ФВ и КДО. При контрольном картировании ЛЖ в первой группе у 9 (91%), во второй группе — у 10 (76,9%), в третьей группе у 11 (78,6%) отмечена положительная динамика. При этом зона гибернированного миокарда значительно уменьшилась или исчезла. На вольтажной униполярной карте увеличилась амплитуда электрограммы, что является свидетельством увеличения массы живого миокарда, на механической карте увеличилась амплитуда движения сегмента. При интрамиокардиальном введении — более выраженная динамика — преимущественно исчезновение зон гибернации в зонах инъекций. В то же время отрицательная динамика в связи с основным заболеванием отмечена нами у 20% четвертой группы. Неудовлетворительный результат у пациентов второй и третьей групп зарегистрирован в 7,7 и 7,1% соответственно. Отрицательной электромеханической динамики у пациентов первой группы нами не выявлено.

Таким образом, введение аутоММСК является безопасным и может быть использовано в практической медицине. Введение аутоММСК путем интрамиокар-диальных инъекций более эффективно, чем внутрисо-судистое (системное и регионарное) введение. Внутривенный и интракоронарный пути введения сопоставимы по своей эффективности. Механическая травма при интрамиокардиальном введении не имеет существенного влияния на течение основного заболевания.

В.Е. Рябинин

Состояние, возможности и перспективы развития клеточных технологий: региональные аспекты*

Лаборатория «Искусственные органы и клетки» ЮУНЦ РАМН, Челябинск, Россия

ООО «Центр Клеточных Технологий при Областной Клинической Больнице», Челябинск, Россия veryabinin@mail.ru

V.E. Ryabinin

State, opportunities and perspectives of development of cell-based technologies: regional aspects

В докладе обсуждаются вопросы, касающиеся состояния и перспектив регионального развития клеточных технологий. Подчеркивается актуальность поддержки научных исследований в области биомедицинских технологий со стороны государственных структур, частных предприятий, инвесторов и венчурных фондов. Продемонстрированы конкретные примеры такого взаимодействия и проанализированы причины возможной их недостаточной эффективности. Приведена информация о развитии клеточных технологий в Уральском федеральном округе. Показана возможность продвижения новых биомедицинских технологий в регионах за счет бюджетных средств в рамках существующих

* Статья опубликована полностью в рубрике «Оригинальные исследования».