Способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК
METHOD FOR BACILLUS THURINGIENSIS STRAINS GENETIC CERTIFICATION BY MEANS OF MULTIPLEX EXPRESS ANALYSIS OF REFERENCE DNA SEQUENCES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и биотехнологии и обеспечивает способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК, применяемый для генетической паспортизации коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Bacillus thuringiensis представляет собой грамположительную спорообразующую почвенную бактерию, которая во время споруляции синтезирует большие количества кристаллического белкового эндотоксина, который может оказывать инсектицидное действие на некоторые виды насекомых.
Указанный белок в течение длительного времени использовали в качестве микробного пестицида, в связи с чем бактерия Bacillus thuringiensis являлась объектом многих исследований. В результате таких исследований были выделены новые штаммы, обладающие не только инсектицидной, но и противовирусной активностью. Так, например, в патенте RU2405035 описан новый штамм Bacillus thuringiensis (Bt), обладающий противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) и антикандидозной активностью, в частности, относительно Candida albicans 620.
Согласно патенту RU2551236 Государственным научным центром вирусологии и биотехнологии «Вектор» был обнаружен и депонирован новый штамм Bacillus thuringiensis (Bt), обладающий противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа человека A/H3N2 для получения препаратов, направленных на подавление указанного вируса.
В патенте RU2178798 описан выделенный и очищенный белок, происходящий из Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, имеющий молекулярную массу приблизительно 20 кДа, определенную с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ, и чувствительность к протеазам и кислым условиям, проявляющий цитотоксическое действие против опухолевых клеток.
В заявке RU2003109416 предложен инсектицидный препарат на основе бактерий Bacillus thuringiensis, содержащий в качестве действующего начала растворенный дельта-эндотоксин, а в составе целевых добавок растворитель, прилипатель-стабилизатор, наполнитель.
Инсектицидные белки, локализованные в указанных бактериях, разделяют по размерам на три класса: 133-145 кДа, 65-67 кДа и 27 кДа.
Различные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis могут экспрессировать один или более классов размеров.
Белок 133-145 кДа является пиротоксином, который при расщеплении протеазами средней части желудочно-кишечного тракта дает аминоконцевой фрагмент приблизительно 67 кДа, который содержит токсиновую часть молекулы. Токсин 67 кДа имеет значительную структурную гомологию с токсинами из различных других подвидов Bacillus thuringiensis. Однако токсин 27 кДа не обнаруживает гомологии с любым токсином из других классов токсинов, но является высокогомологичным в пределах этого подвида. Так, например, при клонировании гена для токсина 27 кДа из подвидов israeliensis (Bacillus thuringiensis israeliensis), kyushunsis (Bacillus thuringiensis kursataki) и morrisoni (Bacillus thuringiensis morrisoni) было обнаружено, что токсин Bacillus thuringiensis israeliensis отличается одним основанием от токсина Bacillus thuringiensis morrisoni; тогда как он только на 39% идентичен токсину Bacillus thuringiensis kursataki (Waalaijk et al., 1985; Ward and Ellar, 1986; Ward et al., 1986; Galjart et al., 1987; Koni and Ellar, 1993). Было также показано, что токсины из различных подвидов являются цитолитическими в отношении клеток насекомых в культуре.
Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения (ВКСМ) поддерживает 37 штаммов Bacillus thuringiensis, обладающих выраженной энтомоцидной активностью и используемых для производства препаратов фитозащитного действия (битоксибациллин, бактокулицид, бацикол). Эффективность производимых биопрепаратов зависит от качества микробного материала.
Исследования показывают, что контроль за чистотой и аутентичностью коммерческих штаммов может осуществляться с помощью их молекулярно-генетической паспортизации.
Идентификация штаммов различных бактерий широко применяется в области техники. Так, например, в патенте RU2486251 представлен способ идентификации и дифференциации прокариотического микроорганизма, содержащего hin-регион, предусматривающий выделение и/или концентрирование ДНК, присутствующей в образце, амплификацию межгенного региона, визуализацию и секвенирование амплифицированных продуктов, а также сравнение полученных продуктов амплификации и их нуклеотидных последовательностей с известными, причем в качестве межгенного региона в указанном способе используют нуклеотидную последовательность, расположенную между копиями генов тРНК-Глю, представляющую собой hin-регион, которую амплифицируют с помощью родоспецифичных праймеров и секвенируют, идентификацию и дифференциацию прокариотических микроорганизмов проводят при этом на основании количества, длины и нуклеотидной последовательности продуктов такой реакции, характеризующих hin-регион.
Согласно патенту RU2561469 описан способ определения геновариантов штаммов возбудителя чумы методом мультилокусного секвенирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, амплификацию ДНК мишеней в полимеразной цепной реакции с использованием сконструированных праймеров, секвенирование амплифицированных фрагментов, выявление в них замен единичных нуклеотидов, маркерных для отдельных геновариантов, и определение геновариантов.
Однако указанный способ также не может быть использован для генетической паспортизации коммерческих штаммов Bacillus thuringiensis.
Согласно патенту СА2086405 предложен способ применения праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) для определения штаммов бактерии Bacillus thuringiensis, а также набор и способ, основанные на применении указных праймеров.
Недостатком указанного способа можно считать невозможность определения конкретного штамма Bacillus thuringiensis, т.е. невозможность использования метода для паспортизации штаммов.
В патенте DE19904795 предложен способ, позволяющий разделить виды Bacillus cereus и Bacillus thuringiensis от других видов бацилл на основе полиморфизма определенных последовательностей ДНК. Однако указанный способ также не позволяет определить конкретный штамм Bacillus, т.е. его невозможно использовать для паспортизации штаммов.
Патент RU2415948 описывает способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов генов, анализ результатов, отличающийся тем, что при проведении ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры на гены rhaS, araC, metB, aspA и thiH, имеющие следующие последовательности:
в полученной нуклеотидной последовательности фрагментов генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, в позиции 773 гена araC, в 988 и 989 гена metB, в 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH, определяют генотип штамма, по аллелям генов rhaS, araC, metB, aspA и thiH устанавливают сиквенс-тип (ST) штамма Y.pestis с последующей дифференциацией штаммов путем сравнения установленного сиквенс-типа с сиквенс-типами основного и неосновных подвидов.
Однако указанный способ не позволяет разделить штаммы в пределах одного биовара.
В настоящее время наиболее эффективной технологией доскональной генетической характеристики штаммов микроорганизмов считается полногеномное секвенирование. При этом, несмотря на несомненную востребованность полногеномного секвенирования для паспортизации коммерческих штаммов, ее широкое применение ограничивается значительной трудозатратностью и себестоимостью. Поэтому для удешевления анализа и сокращения сроков его выполнения необходима разработка экспресс-методов высокопроизводительного секвенирования, позволяющих определять конкретные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В ходе экспериментов было неожиданно обнаружено, что одним из решений поставленной задачи может быть анализ не всего генома, а наиболее таксономически и функционально значимых генетических локусов (так называемого референт-комплекса). Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что указанный результат достигается с помощью стадии мультиплексного пиросеквенирования с использованием праймеров, содержащих определенные последовательности (SEQ ID NO: 1-60), представленные в настоящем изобретении.
Bacillus thuringiensis
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ генетической паспортизации штаммов  с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК, включающий:
а) выделение бактериальной ДНК;
б) проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК с использованием праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 1-60 и их комбинаций;
Bacillus thuringiensis
в) пиросеквенирование полученных референт-комплексов ДНК для получения уникальных генетических паспортов штаммов , достаточных для разделения штаммов в пределах одного биовара.
Bacillus thuringiensis
В частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 53.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Используемые в настоящей заявке термины и определения являются общеупотребительными и понятными для специалиста в данной области техники.
Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis
В настоящем изобретении предложен способ генетической паспортизации штаммов  с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК с использованием праймеров, позволяющий каждому штамму  создать свой генетический паспорт с уникальным набором фрагментов ДНК.
Bacillus thuringiensis
Таким образом, заявляемый способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает:
а) выделение бактериальной ДНК,
б) проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК с использованием праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 1-60 и их комбинаций,
Bacillus thuringiensis
в) пиросеквенирование полученных референт-комплексов ДНК для получения уникальных генетических паспортов штаммов , достаточных для разделения штаммов в пределах одного биовара.
Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis
Bacillus thuringiensis
При необходимости в дальнейшем проверить, например, для цели защиты прав, проверки качества продукта и т.д., не используется ли в каком-либо препарате исходный штамм , из этого препарата выделяют содержащийся в нем штамм и при помощи заявленного способа получают генетический паспорт выделенного штамма, после чего проводят аутентификацию исходного штамма в этом препарате путем сравнения генетических паспортов выделенного штамма и исходного штамма . При этом заявленный способ позволяет идентифицировать штамм  очень точно - в пределах одного биовара.
Описание предпочтительных вариантов реализации изобретения
Bacillus thuringiensis
В одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 53.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 55.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 57.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 31.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 35.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43.
thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов Bacillus  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 54.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 56.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 58.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 36.
Bacillus thuringiensis
В еще одном частном случае реализации настоящего изобретения способ проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК штаммов  включает использование конкретной комбинации праймеров, содержащих последовательности SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44.
Следующие ниже примеры представлены исключительно для целей иллюстрации реализации данного изобретения и никоим образом не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
1. Выделение бактериальной ДНК
Общую ДНК бактерий выделяли по следующей методике: 1,5±0,1 мл ночной культуры клеток центрифугировали при 14000 об/мин в течение 2 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 буфера ТЕ (10 ммоль Трис-HCl, 5 ммоль ЭДТА, рН-8,0). К суспензии добавляли лизоцим (1 мг/мл) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли SDS до концентрации 0,5% и протеиназу К до концентрации 0,05 мг/мл и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Окончательное разрушение клеток проводили методом встряхивания со стеклянными шариками в гомогенизаторе FastPrep24 при максимальной мощности в течение 1 мин.
Далее проводили экстракцию смесью фенола, хлороформа и изоамилового спирта (24:24:1). ДНК осаждали двумя объемами этанола 5±1 мин при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 2 мин при 14000 об/мин, удаляли супернатант, осадок промывали 70±2% этанолом, подсушивали и растворяли в 100 мкл дистиллированной воды.
2. Проведение мультилокусной ПЦР для получения референт-комплексов ДНК
Для проведения мультилокусной ПЦР использовали следующие праймеры:
Смеси праймеров готовили следующим образом.
Для приготовления смесей праймеров F отбирали по 3,5 мкл 10 0,5 рМ раствора каждого праймера F и перемешивали на вортексе. Аналогично готовили смеси праймеров R.
Комбинации праймеров, используемые для мультилокусного пиросеквенирования:
Для проведения мультилокусной ПЦР использовали следующие параметры.
Состав реакционной смеси:
Режим проведения ПЦР:
Амплифицированную ДНК визуализировали с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле с использованием маркера GeneRuler 100 bp DNA Ladder (Fermentas) для оценки наличия амплификатов нужного размера.
3. Проведение пиросеквенирования образцов ДНК
Нуклеотидную последовательность референт-комплекса определяли на пиросеквенаторе Junior GS (Roche Applied Science, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Работу по сборке ридов и анализу референт-комплексов проводили с помощью программы CLC Genomics Workbench 7.5.1. (http://www.clcbio.com/products/latest-improvements/).
Таким образом, заявляемый способ генетической паспортизации штаммов Bacillus thuringiensis с помощью проведения мультиплексного экспресс-анализа референтных последовательностей ДНК позволяет определять конкретные подвиды бактерии Bacillus thuringiensis в пределах одного биовара. При этом в отличие от способов, использующих полногеномное секвенирование, он является высокопроизводительным и характеризуется значительно меньшей трудозатратностью и себестоимостью, его применение приводит к сокращению сроков анализа и удешевлению его выполнения. Сравнение современных методов паспортизации штаммов, полученное опытным путем, приведено ниже в таблице.
Любые патенты или публикации, упомянутые в этой заявке, являются показательными в отношении уровней квалификации специалистов в данной области, к которым имеет отношение данное изобретение. Эти патенты и публикации включены в настоящую заявку в качестве ссылки в полном объеме.
Специалисту в данной области будет понятно, что представленные примеры вместе со способами, описанными в настоящей заявке, являются в настоящее время типичными предпочтительными вариантами, являются примерами и не предназначены для ограничения объема изобретения. Любые модификации, очевидные для специалиста в данной области техники, являются частью изобретательского замысла согласно настоящей заявке и должны быть также включены в объем настоящего изобретения.