Ограниченный туморогенный потенциал CD34+CD38+ трансформированных клеток при остром миелобластном лейкозе является артефактом

И I II II

тп

Новости клеточных технологий

ЛИТЕРАТУРА:

1. Basak О., Taylor V. Stem cells of the adult mammalian brain and their niche. Cell Mol. Life Sci. 2008 Nov 18. Epub ahead of print.

2. Beausejour C.M., Campisi J. Ageing: balancing regeneration and cancer. Nature 2006; 443(7110): 404—5.

3. Lessard J., Sauvageau G. Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells. Nature 2DD3; 423(6937): 255-60.

4. Molofsky A.V., PardalR., Iwashita Т., Park I.К., Clarke M.F., Morrison

S.J. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature 2DD3; 425(6961): 962—7.

5. Weedon M.N., Lettre G., Freathy R.M. et al. A common variant of HMGA2 is associated with adult and childhood height in the general population. Nature genetics 2DD7; 39(101: 1245—50.

6. Vescovi A.L., Galli R., Reynolds B.A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer 2006; 6(B): 425—36.

7. Fusco A., Fedele M. Roles of FIMGA proteins in cancer. Nature Reviews Cancer 2007; 7(121: 899—910.

8. Nishino J., Kim I., Chada K., Morrison S.J. Flmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16lnk4a and p19Arf expression. Cell 2008; 135(21: 227—39.

Порготовип П.В. Дмитриев

По материалам: Nishino J„ Kim I., Chada K.: Morrison S.J, Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16lnk4a and p19Arf expression. Cell 2008; 135(2): 227-39

Ограниченный туморогенный потенциал С034+С038+ трансформированных клеток при остром миелобластном лейкозе является артефактом

В исследованиях последних лет было обнаружено, что в составе общей массы трансформированных клеток при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) у человека существует малочисленная популяция лейкозных стволовых клеток (ЛСК). Серийная трансплантация именно этой популяции клеток приводит к возникновению ОМЛ у иммунодефицитных мышей-реципиентов, тогда как туморогенный потенциал других популяций опухолевых клеток ограничен [1]. ЛСК имеют фенотипическое и функциональное сходство со стволовыми кроветворными клетками (СКК) и, как было показано, обладают большой резистентностью к применяемой для лечения ОМЛ химиотерапии и, вероятно, являются источником рецидивов [2]. В связи с этим, ЛСК привлекли особое внимание ученых и клиницистов, так как разработка методов терапии, направленных на их уничтожение, может привести к революции в лечении ОМЛ, а также целого ряда других гематологических и солидных злокачественных новообразований.

Тщательное изучение биологии ЛСК сталкивается со значительными трудностями, что прежде всего обусловлено малочисленностью этой популяции клеток. Изоляция ЛСК стала возможна только при использовании высокоэффективной сортировки «клеток-кандидатов» на основании паттерна экспрессируемых на поверхности антигенов методом FACS [3]. В качестве реципиентов при последующих трансплантациях, как правило, используются мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD/SCID), которые характеризуются рядом выраженных дефектов в Т-, В-, NK-клетках и системе комплемента, что позволяет использовать их в качестве универсальных «биореакторов» [4]. Именно при использовании этой линии мышей было показано, что ЛСК при ОМЛ имеют иммунофенотип CD34+CD38~, тогда как CD34+CD38+ клетки характеризуются низкой туморогенной активностью [3].

Тем не менее, не все исследователи признают адекватность используемой экспериментальной модели. В частности группа D. Bonnet установила, что используемые для идентификации клеток и дальнейшей сортировки антитела могут значительно искажать результаты

по репопулирующей активности гемопоэтических предшественников и ЛСК в ЫОО/БСЮ мышах [7]. В настоящем исследовании они провели более детальный анализ вероятных артефактов, связанных с использованием антител при изучении туморогенного потенциала разных популяций злокачественных клеток ОМЛ при их трансплантации ЫОО/БСЮ мышам.

На первом этапе изучалось влияние инкубации мо-нонуклеарных клеток (пуповинной крови или ОМЛ) с антителами к одному из антигенов (С034, С045, С013, С0123, СйЗ, С020 и С038) или изотипическими контрольными антителами, проводимой непосредственно перед отмыванием и трансплантацией мышам. Инкубация с антителами к С034, С045, что было объяснимо, и С038, что было удивительно, приводила к значительному снижению приживления мононуклеарных клеток. При этом эффект анти-С038 антител проявлялся быстро; количество окрашенных РКН26 мононуклеарных клеток пуповинной крови стремительно снижалось уже через 16 час. после трансплантации. Кроме того, анти-С038 антитела снижали туморогенный потенциал мононуклеарных клеток ОМЛ в среднем более, чем в 500 раз.

С целью определения обусловлен ли эффект антител взаимодействием их Рс-фрагментов с рецепторами на клетках иммунной системы реципиентов, мононук-леарные клетки инкубировались как с целыми молекулами анти-С038 антител, так и с Р(аЬ)2-фрагментами этих же антител. Степень приживляемое™ была значительно выше у клеток, обработанных Р(аЬ)2-фрагмен-тами. Следовательно, ингибирующий эффект анти-С038 антител был в значительной степени обусловлен их взаимодействием с Рс-рецепторами на поверхности клеток реципиентов, несмотря на наличие у мышей многочисленных дефектов иммунной системы.

Ингибирующий эффект антител к С038 уменьшается при предварительном введении ЫОО/БСЮ мышам иммунносупрессивных антител. Обработка антителами к С0122 (С0122 — р-цепь рецептора к И-2), вызывающих истощение 1МК-клеток и частично моноцитов/макрофагов [5], не только предотвращала ингибирующий эффект инкубации с анти-С038 антителами, но и приводила

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 1, 2009

І І І І І І І 4- І   тп

Новости клеточных технологий

к значительном увеличению приживляемое™ мононукле-арных клеток как пуповинной крови, так и ОМЛ. Аналогичные, хотя и намного менее выраженные результаты были получены при использовании в качестве реципиентов МСЮ/БСЮ мышей с более выраженными врожденными дефектами иммунной системы — мыши МСЮ/БСЮ с нокаутированными генами р-микроглобулина ИМСЮ/БСЮ/ в2ггг;~) и мыши МСШ/БСЮ с нокаутированными генами гамма-цепи рецептора к И-2 (МСШ/БСЮ/ШЗгг^).

Обнаружив выраженный ингибирующий эффект предварительной инкубации с анта-С038 антителами на приживление мононуклеарных клеток ОМЛ, авторы пришли к выводу, что, несмотря на ранее полученные данные [3, 61, существуют экспрессирующие С038 популяции ЛСК. В противном случае ингибирующий эффект анти-С038 антител был труднообъясним. Чтобы доказать эту гипотезу, они использовали наиболее иммунодефицит-ные линии мышей, которые помимо этого были подвергнуты дополнительной иммунносупрессии анти-С0122 антителами, что позволило избежать ингибирующий эф-

фект анти-С038 антател. Путём внутрикостномозгового введения животным трансплантировались Сй34+С038+ и Сй34+С038 фракции клеток, полученных из 7 образцов костного мозга больных с ОМЛ. При анализе результатов через 8-11 недель было выявлено приживление клеток от всех 7 образцов и развитие ОМЛ у 19 из 21 мыши, которым производилось введение клеток с фенотипом С034+С038+. В параллельной группе с трансплантацией Сй34+С038 клеток для четырёх из семи образцов ОМЛ не удалось выявить приживление трансплантата, мышь с пятым образцом умерла до осуществления анализа, у мыши с шестым образцом развился ОМЛ, тогда как у мыши с 7 образцом был обнаружен химеризм клеток крови, но убедительных данных о наличии ОМЛ получено не было.

Таким образом, в данном исследовании было показано, что анти-С038 антитела оказывают выраженный ингибирующий эффект на репопулирующий потенциал СКК и туморогенную активность ЛСК при их трансплантации ЫОО/БСЮ мышам (см. рис.).

Использование анти-СЮ38 антител и БСЮ/ЫОО мышей является причиной ограниченного туморогенного потенциала С034’С038’ клеток ОМЛ. В предыдущих исследованиях с использованием ЭСЮ/Л/СЮ мышей в качестве реципиентов было показано, что С034’С038’ популяция клеток ОМЛ имеет ограниченный туморогенный потенциал [А], Однако в настоящей работе, где использовались мыши с более выраженным угнетением иммунной системы, трансплантация С034’С038’ опухолевых клеток приводила к возникновению лейкоза практически у все реципиентов. Авторы продемонстрировали, что основной причиной выявленного артефакта является взаимодействие Рс-фрагметов антител, в основном анти-СОЗВ, с Рс-рецепторами клеток иммунной системы ЭСЮ/ЫОО мышей [вероятно ЫК-клетками). Более глубокое угнетение иммунной системы мышей приводило к отмене этого взаимодействия, в результате чего проявлялся туморогенный потенциал С034’С038’ клеток ОМЛ [Б]

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009

ИМИ!

Новости клеточных технологий

h

Этот эффект, вероятно, обусловлен распознаванием Рс-фрагментов антител экспрессирующими Рс-рецептор иммунными клетками реципиента, что в конечном итоге является фатальным для трансплантированных клеток. Менее выраженное, хотя и значительное, влияние анти-С038 антител наблюдалось при трансплантации ЫСЮ/БСЮ мышам с более выраженными врожденными дефектами 1\1К-клеток, свидетельствуя об их роли в подавлении меченных антителами клеток.

Недооценка роли иммунной системы МСШ/БСЮ мышей в предыдущих исследованиях привела, по-видимому, к ошибочному мнению, что ЛСК при ОМЛ локализуются исключительно в популяции С034+С038 клеток. В настоящем исследовании было показано, что ЛСК гораздо более гетерогенны и популяция С034+Сй38+ может иметь более выраженную туморогенную активность. Тем не менее, для окончательного ответа на этот вопрос необходимо проведение после-

довательной серийной трансплантации CD34+CD38+ клеток, что позволит определить их ограниченный или неограниченный потенциал к пролиферации.

Основным достижением исследования является вывод, что метод сортировки клеток на основании паттерна выявляемых антителами структур методом FACS и последующей серийной трансплантации выделенных клеток NOD/SCID мышам не является оптимальным для изучения туморогенного потенциала разных популяций опухолевых клеток. Необходима разработка модификаций метода, в которых, например, использовались бы мыши-реципиенты с более выраженными дефектами иммунной системы или вместо целых антител применялись бы только Р(аЬ)2-фрагменты. В свете новой информации также необходим пересмотр многочисленных данных об опухолевых стволовых клетках при других новообразованиях, которые были получены с использованием аналогичной экспериментальной модели.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Bhatia М., Wang J.C., Карр U., Bonnet D., Dick J.E. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. PNAS 1997; 94: 5320—5.

2. Krause D., Van Etten R. Right on target: eradicating leukemic stem cells. TRENDS in Molecular Medicine 2007; 13C11 ]: 470—81.

3. LapidotT., Sirard C., Vormoor J. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature 1994; 367 [64641: 645-8.

4. Shultz L., Schweitzer P., Christianson S. et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol.

1995; 154: 180-91.

5. Tanaka T., Kitamura F., Nagasaka Y. Selective long-term elimination of natural killer cells in vivo by an anti-interleukin 2 receptor beta chain monoclonal antibody in mice. J. Exp. Med. 1993; 178: 1103—7.

6. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 1997; 3: 730-7.

7. Taussig D.C., Pearce D.J., Simpson C. et al. Hematopoietic stem cells express multiple myeloid markers: implications for the origin and targeted therapy of acute myeloid leukemia. Blood 2005; 106: 4086—92.

Подготовил ИЛ. Плакса

По материалам: Taussig D„ Miraki-Moud F„ Anjos-Afonso F. et ai. AnthCD38 antibody-mediated clearance of human repopulating cells masks the heterogeneity of leukemia-initiating cells. Blood 2008:112: 568-575

Новые данные о хромосомных аберрациях, возникающих в эмбриональных стволовых клетках человека в процессе культивирования

При культивировании эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) человека необходимо проводить постоянный мониторинг их кариотипа, поскольку в процессе культивирования in vitro в ЗСК нередко возникают хромосомные аберрации [1—3], такие как анеуплоидии — потери или, напротив, приобретения лишних хромосом в диплоидном хромосомном наборе. Логично предположить, что подобные изменения генома клетки могут влиять на ее пролиферацию как в сторону ее усиления, так и подавления, способность к спонтанной дифференциров-ке в том или ином направлении, а также приводить к злокачественной трансформации. По этой причине изменения кариотипа ЗСК снижают воспроизводимость и достоверность результатов научных экспериментов, приводя к многочисленным артефактам, а также являются серьезным препятствием для применения ЗСК в клинической практике [1]. К настоящему времени известно о возникновении таких хромосомных аномалий при культивировании ЗСК, как появление в геноме лишних 12, 17 и X хромосом [2—4].

В декабре 2008 года в журнале Nature Biotechnology появилось сразу две работы независимых групп исследователей, где было показано, что набор хромосомных аберраций, происходящих в ЗСК человека при культивировании, несколько шире уже известного. При этом исследователи не стали ограничиваться общепринятой окраской препаратов метафазных пластинок по Гимза, применяющейся для учета хромосомных аберраций, поскольку этот метод не обладает достаточной точностью. Помимо стандартного метода был использован анализ единичных нуклеотидных полиморфизмов (т.н. SNP-анализ от single nucleotide polymorphysm), основанный на микрочиповой технологии [3], и проведена сравнительная геномная гибридизация, также результаты были подтверждены флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) и оценено влияние хромосомных аберраций на экспрессию генома с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR).

Научная группа С. Spits охарактеризовала семнадцать линий ЗСК человека, полученных в собственной

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 1, 2009