СПОСОБ ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА β-1b
METHOD FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT INTERFERON β-1b

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения рекомбинантного интерферона бета-1b человека, в частности к способу его очистки.
Интерфероны (ИФН) - гетерогенные гликопротеины иммунной системы, обладающие противовирусными, противоопухолевыми и иммуномодулирующими эффектами и различающиеся между собой как источником клеточной продукции, так и проявлениями функциональной активности. ИФН бета с самых первых шагов внедрения его рекомбинантных препаратов был предназначен, главным образом, для противоопухолевой терапии [С. Angelucci et al. Recombinant human IFN-beta affects androgen receptor level, neuroendocrine differentiation, cell adhesion, and motility in prostate cancer cells. J. Interferon Cytokine Res., 2007, 27(8): 643-52; S. Kohashi et al. Interferon-beta inhibits liver metastases from murine colon 26 carcinoma and its highly metastatic variant. Surg. Today, 2007, 37(6): 474-481]. Помимо этого, препараты ИФН бета востребованы для лечения вирусных инфекций, в частности гепатита С, везикулярного стоматита и других [I.M. Pedersen et al. Interferon modulation of cellular microRNAs as an antiviral mechanism. Nature, 2007, 449 (7164): 919-22; J. Feher, G. Lengyel. Interferon in the treatment of viral hepatitis. The interferon was discovered 50 years ago. Orv. Hetil., 2007, 148(33): 1539-43; M.D. Trottier, D.S. Lyles, C.S. Reiss. Peripheral, but not central nervous system, type I interferon expression in mice in response to intranasal vesicular stomatitis virus infection. J. Neurovirol., 2007, 13(5): 433-445]. В последние годы основным направлением применения рИФН бета-1b стали неврологические заболевания, в первую очередь рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания нервной системы, болезнь Бехтерева [М. Kremenchutzky, S. Morrow, С. Rush. The safety and efficacy of IFN-beta products for the treatment of multiple sclerosis. Expert Opin. Drug Saf., 2007, 6(3): 279-88; S. Pay et al. Dendritic cell subsets and type I interferon system in Behçet's disease: does functional abnormality in plasmacytoid dendritic cells contribute to Th1 polarization? Clin. Exp. Rheumatol., 2007, 25 (4 Suppl 45): S34-40]. Отмечена клиническая эффективность рИФН бета-1b при терапии стероидоустойчивого язвенного колита, гломерулонефрита, хронического панкреатита [S.C. Satchell et al. Interferon-beta Reduces Proteinuria in Experimental Glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol., 2007, 18(11): 2875-84; R. Talukdar, R.K. Tandon. Pancreatic stellate cells: New target in the treatment of chronic pancreatitis. J. Gastroenterol. Hepatol., 2007].
Среди препаратов ИФН бета наибольшее признание на мировом фармацевтическом рынке заслужили рекомбинантный ИФН бета-1b, или Бетаферон (Schering AG, Germany), и в меньшей степени ИФН бета-1а, в частности Авонекс (Gedeon Richter, Hungary). Помимо особенностей фармакологического действия каждого из этих препаратов, имеющих свою фармакодинамику и свои показания для назначения пациентам, следует отметить, что у препарата ИФН бета-1b есть определенные преимущества, которые определили на него больший спрос. При оценке этих преимуществ исследователи отмечают, в частности, его неспособность, в отличие от ИФН бета-1а, к индукции нейтрализующих антител [Р. Barbero et al. Every-other-day interferon beta-1b versus once-weekly interferon beta-1a for multiple sclerosis (INCOMIN Trial) II: analysis of MRI responses to treatment and correlation with Nab. Mult. Scler., 2006, 12(1): 72-76], меньшую выраженность болевых ощущений и местной реакции на инъекционное введение ИФН бета-1b [К. Baum et al. Comparison of injection site pain and injection site reactions in relapsing-remitting multiple sclerosis patients treated with interferon beta-1a or 1b. Mult. Scler., 2007, 13(9): 1153-1160], а также различия в технологии получения этих препаратов: рекомбинантный ИФН бета-1а получают на клетках яичника китайских хомячков, то есть в эукариотической системе, а рекомбинантный ИФН бета-1b можно получать и в прокариотической системе с использованием штамма-продуцента E.coli [F.P. McCormick et al. Human interferon-.beta. (IFN-.beta.) produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells. United States Patent 5,795,779 August 18, 1998; A. Whitty et al. Interferon-beta fusion proteins and uses. United States Patent 6,800,735, October 5, 2004].
Технологии получения и очистки рИФНβ-1b посвящено много патентных исследований, в их числе: US Patent 5,795,779, August 18, 1998 (McCormick et al. Human interferon-.beta. (IFN-.beta.) produced in Chinese hamster ovary (CHO) cells); US Patent 6,323,006, November 27, 2001 (Peregrino Ferreira et al. Recombinant human beta-CIS interferon); US Patent 4,894,330, January 16, 1990 (Hershenson et al. Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC); US Patent 5,004,605, April 2, 1991 (Hershenson et al. Low pH pharmaceutical compositions of recombinant .beta.-interferon); US Patent 6,923,956, August 2, 2005 (Tschope et al. Liquid interferon-.beta. formulations); RU 2006 123 539 А (Парк Дзи-Соок и др. Способ очистки интерферона бета).
Известен способ получения рекомбинантного интерферона бета-1b (рИФН бета-1b) человека в нерастворимой форме - в виде тел включения (пат. РФ № 2261913, МПК C12N 15/22, опубл. 2005)
По сравнению с растворимой формой экспрессия белка в виде тел включения имеет ряд преимуществ - нерастворимые агрегаты белка не проявляют токсического действия, практически не атакуются протеазами, с высоким выходом выделяются центрифугированием. В то же время существуют проблемы низкого выхода активного корректно сложенного белка после проведения рефолдинга в процессе очистки рИФН бета-1b, что определяется пространственной структурой последнего [М. Karpusas et al. The crystal structure of human interferon b at 2.2-Å resolution. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1997. Vol.94. P.1 1813-11818].
Известен способ очистки рИФН бета-1b и использованием детергента додецилсульфат натрия при его получении в нерастворимой форме (Патент США 4,530,787, 1985).
Однако при относительно низкой токсичности этого препарата использование додецилсульфата натрия в технологическом процессе сопряжено с целым рядом препятствий: это соединение вызывает значительную денатурацию целевого белка, его не удается удалить из раствора, что в свою очередь делает невозможной последующую ионообменную хроматографию, необходимую для дальнейшего процесса очистки рИФН бета-1b.
Известен способ очистки рИФН бета-1b, позволяющий избежать указанных недостатков применением в качестве детергента цвиттергента 3-14, который не обладает денатурирующими свойствами, не образует ионных связей, является рН-независимым, может быть удален из раствора, делает возможной ионообменную хроматографию [Russell-Harde D., Knauf M., Croze E. The use of Zwittergent 3-14 in the purification of recombinant human interferon-beta Serl7 (Betaseron). // J. Interferon Cytokine Res. - 1995. - Vol.15(1). - P.31-37].
Известен наиболее близкий к заявленному способ очистки рИФН бета-1b из растворимого состояния с использованием аффинной хроматографии, катионно-обменной хроматографии и диафильтрации (Заявка РФ № 2006123543. «Способ очистки интерферона бета».
Однако в этом способе не учитывается возможность получения названного препарата из тел включения E.coli и не охарактеризованы связанные с этим особенности его очистки.
Изобретение решает задачу оптимизации условий очистки рИФН бета-1b на этапах отмывки и растворения тел включения E.coli, продуцирующей рекомбинантный интерферон бета-1b человека, в ходе технологического процесса рефолдинга целевого белка, а также при окислении последнего.
Заявляемый способ очистки рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli предусматривает следующие основные стадии: (1) отмывка тел включения; (2) растворение тел включения; (3) рефолдинг целевого белка; (4) прехроматографическая подготовка образца; (5) хроматография на Ceramic S; (6) хроматография на Source S30; (7) окисление; (8) гель-фильтрация на Superdex 75 Prep grade; (9) хроматография на Source Q30; (10) гель-фильтрация на Sephacril S200HR; (11) контроль эффективности очистки целевого белка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с последующим стандартным определением его противовирусной активности.
Отличительными особенностями заявляемого способа являются:
- в ходе отмывки тел включения навеску размороженных тел включения ресуспендировали в 10 мл 2% водного раствора цвиттергента 3-14;
- раствор для рефолдинга целевого белка содержит 20 мМ Трис-HCl, pH 9.0, 0,2% полиэтиленгликоль (PEG) 3550, 300 мМ NaCl, 2 мМ восстановленного глутатиона (GSH), 1 мМ окисленного глутатиона (GSSG), 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 0,05% цвиттергента 3-14;
- в ходе предхроматографической подготовки образца используют буфер Б следующего состава: 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ фенилметансульфонил-флуорида (PMSF);
- в процессе хроматографии используют буферы: (1) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; (2) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 50 мМ NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; (3) 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 1 М NaCl, 0,05% Цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF;
- для окисления целевого белка используют смесь цистеамин/цистамин в концентрации 1 мМ/0,1 мМ.
Контроль выхода и активности рекомбинантного интерферона бета-1b после очистки показал соответствие следующим критериям: выход 10%, мультимеры по гель-фильтрации <5%, родственные белки по обращенно-фазовой хроматографии <5%, родственные белки по электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) <5%, белки штамма-продуцента по иммуноферментному анализу (ИФА) <5 нг/мг, эндотоксины по LAL-тесту (тесту с применением "Limulus Amebocite Lisate" - лизата клеток краба-мечехвоста) <5 ЭЕ/мг (эквивалентных единиц на 1 миллиграмм), удельная активность интерферона бета-1b 32 млн МЕ/мг (Международных Единиц на 1 миллиграмм).
Изобретение иллюстрируют примеры.
Пример 1. Оптимизация рефолдинга и окисления рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli с использованием цвиттергента 3-14
Целесообразность использования цвиттергента 3-14 в процессе растворения и рефолдинга рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli потребовала оптимизации условий их выполнения. С этой целью были составлены полуэмпирические формулы, и на их основе осуществлен подбор оптимального соотношения ингредиентов в процессе рефолдинга целевого белка и его окисления из предполагаемого интервала значений, как это представлено в таблицах 1-2 и формулах 1-2.
Таблица 1
Определение общего соотношения параметров ингредиентов в процессе рефолдинга рИФН бета-1b
Переменная
Описание
Верхнее значение
Нижнее значение
A
pH
7,5
9,0
B
Полиэтиленгликоль 3550
0%
0,1%
C
Мочевина
0 M
D
NaCl
50 мМ
300 мМ
Е
Цистеамин/цистамин
1 мМ/0,3 мМ
1 мМ/0,1 мМ
F
Цвиттергент 3-14
25%
G
Температура
10°C
Формула 1. Общее соотношение параметров ингредиентов с обозначением их взаимозависимости:
Таблица 2
Определение соотношения параметров ингредиентов в процессе окисления ИФН бета-1b
Переменная
Описание
Верхнее значение
Нижнее значение
A
pH
7,5
9,0
B
Полиэтиленгликоль 3550
0%
0,1%
D
NaCl
50 Мм
300 Мм
E
Цистеамин/цистамин
1 Мм/0,3 Мм
1 Мм/0,1 Мм
Формула 2. Соотношение изолированной группы параметров с обозначением их взаимозависимости:
В конечном итоге были установлены следующие финальные параметры выполнения рефолдинга и окисления ИФН бета-1b:
- Цвиттергент 3-14: 0,05%;
- Трис-HCl, 10 мМ: рН 7,5;
- Температура: +10°С;
- Nacl: 50 мМ;
- ЭДТА-Na: 1 мМ;
- Цистеамин/цистамин: 1 мМ/0,1 мМ.
Соблюдение этих условий позволяло добиваться 70% выхода целевого белка после осуществления рефолдинга и 10% выхода после полного цикла очистки.
Пример 2. Очистка рекомбинантного интерферона бета-1b из тел включения E.coli
Отмывка, растворение и рефолдинг тел включения. В процессе растворения и рефолдинга тел включения использовался буфер А следующего состава: 7 М гуанидин хлорид, 20 мМ дитиотреитол (DTT), 0,5 мМ PMSF.
Навеску размороженных тел включения (500 мг) ресуспендировали в 10 мл 2% водного раствора цвиттергента 3-14, суспензию перемешивали в течение 10-15 мин при комнатной температуре и центрифугировали при ускорении 500g и температуре 4°С 15 минут. Супернатант удаляли и повторяли процедуру центрифугирования. Выход по белку на этой стадии ~50-60%.
250 мг отмытых телец включения ресуспендировали в 2,5 мл буфера А, суспензию инкубировали 2 часа при 60°С. Нерастворившийся материал удаляли центрифугированием с ускорением 12000g при температуре 4°С 10 мин.
Готовили раствор для рефолдинга (указаны конечные концентрации компонентов, конечный объем 50 мл) - 20 мМ Трис-HCl, pH 9.0, 0,2% PEG 3550, 300 мМ NaCl, 2 мМ восстановленного глутатиона (GSH), 1 мМ окисленного глутатиона (GSSG), 2 мМ ЭДТА, 0,05% цвиттергент 3-14 - и добавляли в него растворенные в буфере А тела включения. Полученный раствор перемешивали и инкубировали при 10°С в течение ночи.
Предхроматографическая подготовка образца. Использовался буфер Б следующего состава: 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF.
Полученный в растворе образец разбавляли буфером Б в 6 раз, выпавший осадок удаляли центрифугированием (14000g, 20 мин, 4°С). В супернатанте доводили pH и проводимость до соответствующих значений буфера Б, после чего его концентрировали до исходного объема на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10) и затем центрифугировали (14000g, 10 мин, 4°С).
Хроматографическая очистка рИФН бета-1b, его окисление и гелъ-филътрация. Для стабильности процесса очистки на данном этапе использовались буферы: Б - 25 мМ Трис-HCl, pH 8.0, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; В - 25 мМ Трис-HCl, pH 7,5, 50 мМ NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF; Г - 25 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 М NaCl, 0,05% цвиттергент 3-14, 0,5 мМ PMSF.
Подготовленный образец растворенных тел включения вводили (3 мл/мин) на колонку HyperD Ceramic S (Ciphergen, 10/100 мм, максимальное давление 30 атм), уравновешенную 10 объемами буфера Б. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Проскок в объеме нанесенного образца (50 мл) собирали и связавшиеся примесные вещества удаляли промывкой 3 объемами буфера Г. Колонку регенерировали 1 объемом 100 мМ NaOH и уравновешивали стартовым буфером (Б).
Порцию образца (10 мл) наносили на колонку Source S30 (10/100 мм, максимальное давление 30 атм, 2,5 мл/мин), уравновешенную 10 объемами буфера Б, собирая проскок. Колонку промывали 2-5 объемами буфера Б и элюировали связавшийся материал градиентом концентрации NaCl (0-500 мМ, 5 объемов колонки, 3 мл/мин). Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали фракцию, выходящую в 150-200 мМ NaCl. Перед нанесением следующей порции образца колонку регенерировали 1 объемом 100 мМ NaOH и уравновешивали стартовым буфером (Б). Процедуру повторяли для объединенного проскока с колонки Source S30.
Собранные фракции рИФН бета-1b объединяли и в полученный раствор добавляли цистеамин/цистамин до концентрации 1 мМ/0,1 мМ. Образец инкубировали в течение ночи при 4°С, центрифугировали (12000g, 4°С, 10 мин) и супернатант концентрировали до 1,5 мл на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10).
Образец окисленного рИФН бета-1b (1,5 мл) вводили на колонку Superdex 75 Prep grade (16/500 мм, 13000 т.т./м, максимальное давление 5 атм), уравновешенную буфером В Разделение вели в буфере В, на скорости 30 см/ч. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм (нанометров). Собирали основную фракцию (время удерживания 39,25 мин).
Образец рИФН бета-1b наносили на колонку Source Q30 (10/100 мм, максимальное давление 30 атм (атмосфер), 2,5 мл/мин), уравновешенную 10 объемами буфера В, собирая проскок. Колонку промывали 2-5 объемами буфера В и элюировали связавшийся материал градиентом концентрации NaCl (50-1000 мМ, 10 объемов колонки, 4 мл/мин). Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали фракцию, выходящую в 200-300 мМ NaCl. Колонку регенерировали промывкой 1 объемом 100 мМ HCl. Собранную фракцию концентрировали до 1 мл на ультрафильтрационной ячейке Amicon (мембрана РМ-10).
Образец рИФНβ-1b (1 мл) вводили на колонку Sephacryl S200HR (16/600 мм, >5000 т.т./м, максимальное давление 1,5 атм), уравновешенную буфером В. Разделение вели в буфере В на скорости 15 см/ч. Оптическую плотность элюата контролировали спектрофотометрически на длине волны 280 нм. Собирали основную фракцию (время удерживания 95,3 мин).
Пример 3. Контроль эффективности способа очистки рекомбинантного интерферона β-1b из тел включения E.coli
Эффективность предложенного способа очистки рИФНβ-1b контролировалась в процессе получения 11 партий опытных образцов препарата с последующим определением их противовирусной активности. Протоколы получения даух опытных партий представлены в таблицах 3 и 4.
При получении опытной партии S4/2401 количество тел включения E.coli до отмывки составляло 500 мг, после отмывки - 230 мг. Конечное содержание рИФН бета-1b составляло 1,88 мг (10%).
В процессе получения опытной партии S4/1301 количество тел включения E.coli до отмывки составляло 1000 мг, после отмывки - 460 мг. Конечное содержание рИФН бета-1b составляло 3,76 мг (10%).
50
Оценку биологической (антивирусной) активности 11 образцов рекомбинантного ИНФ бета-1b проводили в диплоидной культуре фибробластов человека М27 (НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН). В качестве тест-вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей (ЕМС) в количестве 100 ЦТД (цитотоксическая доза, вызывающая цитотоксический эффект у 50% образцов клеточных культур). За единицу активности ИФН принимали величину, обратную его разведению, при которой наблюдается 50% защита клеток от цитодеструктивного действия, вызванного репликацией тест-вируса. Контролем служил образец препарата «Бетаферон» (Schering AG, USA). Протокол титрования представлен в таблице 5.
Таблица 3
Протокол получения опытной партии S4/2401 рИФН бета-1b
№ п/п
Объем, мл
Стадия процесса
Чистота по ВЭЖХ, %
Кол-во по ВЭЖХ, мг
Выход стадии по ВЭЖХ, %
Общий выход, %
LAL, ЕЭ/мг
Белки E.coli, нг/мг
1
20
Исходные тела включения
-
18,8
-
100%
-
-
2
9
Отмытые тела включения
-
11,1
59%
59%
-
-
3
211
Солюбилизация в цвиттергенте 3-14
-
5,6
51%
30%
-
29472
4
40
Хроматография на Source S30
-
4,0
72%
22%
-
1705,1
5
40
Окисление
91%
3,9
96%
21%
-
897,63
6
15
Гель-фильтрация на Superdex 75
95,6%
2,4
62%
13%
-
1532,6
7
24
Хроматография на Source Q30
95,1%
2,4
97%
12%
-
1645,6
8
8
Гель-фильтрация на Sephacril S200HR
97,9%
2,1
88%
11%
-
1413,7
9
50
Хроматография на Source C4/G25
-
1,88
71%
10%
-
-
10
Готовая форма
3
3,4
Таблица 4
Протокол получения опытной партии S4/1301 рИФН бета-1b
№ п/п
Объем, мл
Стадия процесса
Чистота по ВЭЖХ, %
Кол-во по ВЭЖХ, мг
Выход стадии по ВЭЖХ, %
Общий выход, %
LAL, ЕЭ/мг
Белки E.coli, нг/мг
1
40
Исходные тела включения
-
37,6
-
100%
-
-
2
18
Отмытые тела включения
-
22,2
59%
59%
-
-
3
200
Рефолдинг
-
18,2
82%
48%
-
-
4
200
Обессоливание/ концентрирование
-
16,3
90%
43%
-
29472
5
20
Хроматография на Source S30
-
11,3
69%
30%
-
1705
6
5,5
Окисление/концентрирование
59,8
12,0
107%
32%
-
897,6
7
27
Гель-фильтрация на Superdex 75
90,7
8,4
70%
22%
-
1533
8
30
Хроматография на Source Q30
87,9
6,7
79%
18%
-
1646
9
7,5
Гель-фильтрация на Sephacril S200HR
97,0
4,7
71%
13%
-
1414
10
4,5
Хроматография на Source C4/G25
96,5
3,76
68%
10%
-
-
11
5
Готовая форма
3
3,4
Таблица 5
Результаты титрования образцов рИФHβ-1b
Образцы рИФНр-1b
Содержание ИФН
В объеме
Титр интерферона, Ед/0,2 мл
Средняя удельная активность
№1
0,023 мг
0,5 мл
6,4×10<sup>5</sup>
№2
0,023 мг
0,5 мл
7,56×10<sup>5</sup>
№3
0,023 мг
0,5 мл
6,4×10<sup>5</sup>
№4
0,023 мг
0,5 мл
7,56×10<sup>5</sup>
№5
0,023 мг
0,5 мл
8,2×10<sup>5</sup>
№6
0,023 мг
0,5 мл
7,56×10<sup>5</sup>
32×10<sup>6</sup> МЕ/мг
№9
0,023 мг
0,5 мл
7,56×10<sup>5</sup>
№10
0,023 мг
0,5 мл
7,56×10<sup>5</sup>
№11
0,023 мг
0,5 мл
6,4×10<sup>5</sup>
Контроль (Бетаферон)
0,023 мг
0,5 мл
6,4×10<sup>5</sup>
30×10<sup>6</sup> МЕ/мг
Как показывают протоколы исследований, предлагаемый оптимизированный способ очистки позволяет получить субстанцию рИФН бета-1b в полной мере отвечающей требованиям нормативных документов, при этом полученный рИФН бета-1b по удельной противовирусной активности не уступает зарубежному аналогу Бетаферону. В целом предлагаемый способ очистки тел включения E.coli позволяет получить субстанцию рИФН бета-1b со следующими показателями:
- выход целевого белка: 10%;
- мультимеры по гель-фильтрации: <5%;
- родственные белки по обращенно-фазовой хроматографии: <5%;
- родственные белки по ДСН-ПААГ: <5%;
- белки штамма-продуцента по ИФА: <5 нг/мг;
- эндотоксины по ЛАЛ-тесту: <5 ЭЕ/мг;
- удельная активность: 32 млн МЕ/мг.