(R,R)- И (S,S)-ДИАСТЕРЕОМЕРЫ 2,11-ДИМЕТИЛСПЕРМИНА И 3,10-ДИМЕТИЛСПЕРМИНА
(R,R)- AND (S,S)-DIASTEREOMERS OF 2,11-DIMETHYLSPERMINE AND 3,10-DIMETHYLSPERMINE

Изобретение относится к области органической химии и биоорганической химии, а именно, к получению новых производных биогенных полиаминов, конкретно к синтезу неизвестных ранее тетрагидрохлоридов (R,R)- и (S,S)-диастереомеров 2,11-диметилспермина (1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекан) и 3,10-диметилспермина (1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекан). Эти новые аналоги представляют собой оригинальные инструменты исследования ферментов метаболизма спермина, а также могут быть использованы in vitro и in vivo для изучения индивидуальных клеточных функций легко взаимопревращающихся и частично взаимозаменяемых спермина и спермидина.
Биогенные полиамины спермин (Spm) и спермидин (Spd) присутствуют в клетках всех типов в мкМ-мМ концентрациях, что a priori определяет множественность и разнообразие их клеточных функций. [Casero R.A., Marton L.J. "Targeting polyamine metabolism and function in cancer and other hyperproliferative diseases". http://Nat.Rev.Drug Discov., 6, 373-390 (2007)]. Повышенное содержание Spm и Spd (Чертеж 1) в опухолевых клетках [Wallace Н.М. "Targeting polyamine metabolism: a viable therapeutic/preventative solution for cancer?" Expert. Opin. Pharmacother., 8, 2109-2116 (2007)], жизненная необходимость полиаминов для развития возбудителей малярии, сонной болезни, лейшманиоза и других тропических заболеваний, вызываемых трипаносоматидами [Heby О., Persson L., Rentala М. "Targeting the polyamine biosynthetic enzymes: a promising approach to therapy of African sleeping sickness, Chagas′ disease and leishmaniasis". Amino Acids, 33, 359-366 (2007)] формируют прикладную составляющую исследований клеточных функций Spm и Spd. Правомерность подобного подхода подтверждается противоопухолевой активностью ингибиторов биосинтеза полиаминов [Seiler N. "Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. Part 1. Selective enzyme inhibitors". Curr. Drug Targets., 4, 537-564 (2003)] и индукторов ферментов катаболизма Spm и Spd [Casero R.A., Woster P.M. "Recent advances in the development of polyamine analogues as antitumor agents". J. Med. Chem., 52, 4551-4573 (2009)], а также успешным использованием α-дифторметилорнитина (DFMO, Eflornithine), являющегося эффективным ингибитором биосинтеза Spm и Spd, для лечения поздних стадий сонной болезни [Burri С.С., Brun R. "Eflornithine for the treatment of human african trypanosomiassis". Parasitol. Res. 90, 49-52 (2003)].
Аналоги Spm представляют собой ценный источник физиологически активных соединений, применяемых как для специфичского снижения содержания полиаминов в клетках, [Seiler N. ″Thirty years of polyamine-related approaches to cancer therapy. Retrospect and prospect. Part 2. Structural analogues and derivatives″. Curr. Drug Targets, 4, 565-585 (2003); Wallace H.M., Niiranen K. ″Polyamine analogues - an update″. Amino Acids, 33, 261-265 (2007)], так и для изучения индивидуальных клеточных функций Spm и Spd. Последнее осложнено частичной взаимозаменяемостью и легкостью взаимопревращений Spm и Spd. Относительно простым решением, хорошо дополняющим существующие подходы и позволяющим дискриминировать клеточные эффекты Spm и Spd, может быть истощение внутриклеточного пула полиаминов и использование для обращения эффекта функционально активных миметиков Spm и Spd, не способных к взаимопревращениям. Однако соединения с подобным комплексом свойств до настоящего времени не известны.
Недавно на примере рацемических С-монометилированных аналогов Spd было показано, что биохимические свойства этих производных, включая метаболическую устойчивость и способность выполнять клеточные функции полиаминов, удается регулировать перемещением метальной группы по углеродному скелету Spd [Hyvönen М.Т., Keinänen Т.А. Khomutov М., Simonian A., Weisell J., Kochetkov S.N., Vepsäläinen J., Alhonen L., Khomutov A.R. ″The use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolism″. J. Med. Chem, 54, 4611-4618 (2011); Хомутов M.A., Хивонен M.T., Симонян A.P., Вепсалайнен Й., Алхонен Л., Кочетков С.Н., Кейнанен Т.А. ″Новый метаболически устойчивый функционально-активный миметик спермидина.″ Биоорган. химия, 37(2), 253-258 (2011); Даидх С, Хомутов М.А., Симонян А.Р., Кочетков С.Н., Мадхубала P. ″Leishmania donovani: Структурные аспекты узнавания С-метилированных аналогов спермидина в качестве природного полиамина″. Молекулярная биология, 45(4), 673-678 (2011)]. Более того, биохимические свойства и клеточная активость (R)- и (S)-изомеров 1-метилспермидина и 1-метилспермина, а также (R,R)-, (R,S)- и (S,S)-диастереомеров 1,12-диметилспермина [Grigorenko N.A., Khomutov A.R., Keinänen Т.А., Järvinen A., Alhonen L., Jänne J., Vepsäläinen J. ″Synthesis of novel optical isomers of cc-methylpolyamines″. Tetrahedron, 63(10), 2257-2262 (2007)] определялась конфигурацией хирального центра [Keinanen Т.А., Jarvinen A., Uimari A., Vepsalainen J., Khomutov A.R., Grigorenko N.A., Hyvonen M.T., Cerrada-Gimenez M., Alhonen L., Janne J. ″α-Methylated polyamines as potential drugs and experimental tools in enzymology″ Mini Rev.Med.Chem., 7(8), 813-820 (2007); Хомутов A.P., Кейнанен ТА., Григоренко Н.А., Хивонен М.Т., Умари А., Пиетила М., Серрада-Хименес М., Симонян А.Р., Хомутов М.А., Вепсалайнен Й., Алхонен Л., Янне Ю. ″Метилированные аналоги биогенных полиаминов спермина и спремидина как инструмент исследования клеточных функций полиаминов и ферментов их метаболизма″. Молекулярная биология, 43(2), 274-285 (2009); Hyvonen М.Т., Howard М.Т., Anderson СВ., Grigorenko N., Khomutov A.R., Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J., Keinanen T.A. ″Divergent regulation of the key enzymes of polyamine metabolism by chiral alpha-methylated polyamine analogs". Biochem. J., 422(2), 321-328 (2009)]. Следует особо отметить, что как перемещение метильной группы по углеродному скелету Spd, так и изменение конфигурации хирального центра, сообщают аналогам новые биохимические свойства, которые не являются самоочевидными (не могут быть предсказаны на основании анализа свойств ближайших прототипов - гем-диметильных производных Spd).
Соответственно, и неизвестные ранее тетрагидрохлориды (R,R)- и (S,S)-диастереомеров 2,11-диметилспермина и 3,10-диметилспермина представляют собой новый инструмент исследования ферментов метаболизма Spm и клеточных функций полиаминов. Полученные при помощи этих соеднений данные будут служить основой для рационального создания новых регуляторов клеточного метаболизма на основе оригинальных физиологически-активных аналогов Spm.
Данным изобретением задача создания новых функционально активных метаболически-устойчивых миметиков Spm и оригинальных инструментов исследования ферментов метаболизма Spm решается путем синтеза неизвестных ранее тетрагидрохлориды (R,R)- и (S,S)-диастереомеров 2,11-диметилспермина (1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекан) и 3,10-диметилспермина (1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекан) формулы:
2
3
2
1
12
Неизвестые ранее тетрагидрохлориды (R,R)- и (S,S)-диастереомеров 2,11-диметилспермина были получены по схеме, представленной на Чертеже 2. Исходными соединениями в синтезах этих диастереомеров были коммерчески доступные (R)- и (S)-изомеры 3-бром-2-метилпропанола-1 (1) и (2), которые по описанной в литературе методике [Duranti А., Franchini С., Lentini G., Loiodice F., Tortorella V., De Luca A., Pierno S., Camerino D.C. "Homologation of mexiletine alkyl chain and stereoselective blockade of skeletal muscle sodium channels". Eur. J. Med. Chem., 35, 147-156 (2000)] были превращены в соответствующие фталильные производные (3) и (4). Удаление фталильной группы гидразинолизом позволило получить (R)- и (S)-аминоспирты (5) и (6), из которых были приготовлены соответствующие N-карбобензокси производные (7) и (8), являющиеся ключевыми интермедиатами в синтезе целевых диастереомеров. Спирты (7) и (8) были с высоким выходом превращены в соответствующие бромиды (9) и (10) без выделения промежуточных метансульфонатов. Алкилирование бис-нозилпутресцина бромидами (9) и (10) в DMF в присутствии KСО гладко приводило к соответствующим продуктам, которые без выделения обрабатывали тиофенолом для удаления защитных групп, а образовавшиеся N,N-бис-Cbz-спермины (11) и (12) очищали колоночной хроматографией на SiO. После удаления Cbz-групп каталитическим гидрированием над Pd-чернью были получены целевые тетрагидрохлориды (S,S)- и (R,R)- диастереомеров 2,11-диметилспермина (13) и (14) с суммарными выходами 34% и 32%, считая на (S)- и (R)-изомеры N-(фталоил)-3-амино-2-метилпропанола-1, соответственно.
4
2
3
1
3
1
1
1
12
3
Неизвестные ранее тетрагидрохлориды (RR)- и (S,S)-диастереомеров 3,10-диметилспермина были получены по схеме, представленной на Чертеже 3. Исходными соединениями в синтезах этих диастереомеров были коммерчески доступные (R)- и (S)-аланинолы, из которых через метансульфонаты N-(трет-бутилоксикарбонил)-2-аминопропанола-1 с высоким выходом были приготовлены нитрилы N-(трет-бутилоксикарбонил)-3-аминомасляной кислоты. Восстановление этих нитрилов LiAlH в эфире при 0°C гладко приводило к N-Вос-1,3-диаминобутанам в соответствии с ранее описанным в литературе [Grigorenko N.A., Khomutov A.R., Keinänen Т.А., Järvinen A., Alhonen L., Jänne J., Vepsäläinen J. ″Synthesis of novel optical isomers of α-methylpolyamines″. Tetrahedron, 63(10), 2257-2262 (2007)]. Последующее карбобензоксилирование свободной аминогруппы позволило получить ключевые N-Cbz-N-Вос-1,3-диаминобутаны (11) и (12), из которых в результате избирательным удалением Вос-группы при помощи HCl/EtOH были синтезированы N-Cbz-1,3-диаминобутаны (13) и (14). Из этих N-Cbz-диаминов были приготовлены соответствующие нозилаты (15) и (16), алкилирование которых 1,4-дийодбутаном в DMF и последующее удаление нозильной защиты, без выделения промежуточного нозилата, с высоким выходом привело к N,N-бис-Cbz-сперминам (17) и (18), которые очищали хроматографией на SiO. Последующее удаление Cbz-групп каталитическим гидрированием над Pd-чернью прозволило получить целевые тетрагидрохлориды (S,S)- и (R,R)-диастереомеров 3,10-диметилспермина (19) и (20) с суммарными выходами 31% и 35%, считая на (S)- и (R)-N-(трет-бутилоксикарбонил)-1,3-диаминобутаны, соответственно.
Исследование основных биохимических свойств тетрагидрохлоридов 2,11- и 3,10-диметилсперминов было начато с изучения способности аналогов восстанавливать рост клеток с истощенным пулом полиаминов (клетки выращивали в присутствии DFMO - ингибитора орнитиндекарбоксилазы, ключевого фермента биосинтеза полиаминов). Оказалось, что в этих условиях тетрагидрохлориды и 2,11-, и 3,10-диметилспермин восстанавливали рост клеток примерно на 80% (Чертеж 4). Соответственно, эти производные представляют собой новые функционально-активные миметики спермина.
Система активного транспорта полиаминов строго контролируется небольшим короткоживущим белком антизимом, биосинтез которого индуцируется в ответ на повышение внутриклеточного содержания спермина/спермидина [Kurain L., Palanimurugan R., Godderz D., Dohmen R.J. ″Polyamine sensingbynascentornithine decarboxylaseantizyme stimulates decoding of its mRNA″ Nature, 477, 490-494 (2011)]. Соответственно, ингибирование биосинтеза белка циклогексимидом (СИХ, Чертеж 5) приводит к увеличению накопления спермина/спермидина в клетке. Единственным исключением является 2-метилспермидин, транспорт которого не зависит от того, обработаны клетки СНХ, или нет [Hyvönen М.Т., KeinänenT.A., Khomutov М., Simonian А., Weisell J., Kochetkov S.N., Vepsäläinen J., Alhonen L., Khomutov A.R. ″The use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolism″. J. Med. Chem, 54(13), 4611-4618 (2011)]. Аналоги спермина с подобным комплексом свойств в литературе не описаны. Более того, как следует из Чертежа 5, транспорт, тетрагидрохлорида 2,11-диметилспермина, но не тетрагидрохлорида 3,10-диметилспермина, зависит от биосинтеза антизима в клетке. Эти данные являются оригинальными и никак не следуют из известных зависимостей действия от строения в ряду аналогов спермина.
Антизим не только блокирует проникновение полиаминов в клетку, а также, связываясь с орнитиндекарбоксилазой, осуществляет доставку субъединиц фермента в 26S протеосомы. Соответственно, обработка клеток спермином и его миметиками приводит к практически полному снижению активности фермента. Оказалось, что тетрагидрохлорид 3,10-диметилспермин представляет собой первый функционально-активный миметик спермидина мало влияющий на активность орнитиндекарбоксилазы в клетке, тогда как тетрагидрохлорид 2,11-диметилспермин действует подобно спермину и его известным аналогам (Чертеж 6). Таким образом, получено еще одно доказательство, что тетрагидрохлорид 3,10-диметилспермин не способен индуцировать биосинтез антизима в клетке, тогда как тетрагидрохлорид 2,11-диметилспермин обладает подобным свойством.
S-Аденизилметиониндекарбоксилаза, наряду с декарбоксилазой орнитина, является скорость-определяющим ферментом биосинтеза полиаминов. Исследование эффектов тетрагидрохлоридов 2,11- и 3,10-диметилсперминов на активность фермента в клетках DU145 показало, что аналоги действуют по-разному и выращивание клеток в присутствии тетрагидрохлорида 2,11-диметилспермина приводит к существенному понижению активности фермета в клетках (Чертеж 7).
1
1
Спермидин/спермин-N-ацетилтрансфераза является скорость-определяющим ферментом катаболизма полиаминов и повышение концентрации спермина в клетке вызывает продуктивный сплайсинг мРНК спермидин/спермин-N-ацетилтрансферазы, что, вместе с антизим-зависимыми механизмами регуляции, является одним из основных способов поддержания гомеостаза полиаминов в клетке. В этом случае эффекты тетрагидрохлоридов 2,11- и 3,10-диметилсперминов оказались сопоставимы (Чертеж 8).
Приведенные выше данные позволяют с уверенностью рассматривать предмет иобретения в качестве нового инструмента исследований ферментов метаболизма спермина и его клеточных функций.
Ниже приведены конкретные примеры, раскрывающие сущность изобретения.
Пример 1
Синтез тетрагидрохлоридов (R,R)- и (S,S)-диастереомеров 2,11-диметилспермина
2
2
5
f
4
2
2
2
2
2
2
3
3
1
Гидрохлорид (5)-3-амино-2-метил-пропанола-1 (1). К раствору 2.0 г (9.1 ммоль) (S)-N-(фталоил)-3-амино-2-метил-пропанола-1 в 75 мл EtOH прибавляют 11 мл 1 М раствора гидразингидрата в EtOH и кипятят 1.5 ч. Реакционную смесь охлаждают, к полученной суспензии прибавляют 50 мл 1 М HCl, спирт отгоняют в вакууме, оставшийся раствор кипятят 1 ч и затем упаривают в вакууме досуха. Остаток суспендируют в 20 мл НО, гидразид фталевой кислоты отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха и остаток соупаривают с абсолютным EtOH (3×20 мл). Нерастворимый в спирте хлоргидат гидразина отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме досуха и высушивают в вакууме над РО/КОН, что приводит к 0.99 г (87%) соединения (1) в виде частично закристаллизовавшегося масла, R 0.10 (диоксан-25% NHOH, 95:5). Н-ЯМР (DO) δ: 3.74 (1H, уш. с, CbzNHCH), 3.46-3.41 (1Н, м, NHCHCH), 3.05-2.98 (1H, м, NHCHCH), 1.74-1.68 (1Н, м, СНСН), 1.14 (3Н, д, J 6.5, СН).
Гидрохлорид (R)-3-амино-2-метил-пропанола-1 (2). Получают аналогично соединению (1), исходя из 2.19 г (10.0 ммоль) (R)-N-(фталоил)-3-амино-2-метил-пропанола-1 и 12.8 мл 1 М раствора гидразингидрата в EtOH, что приводит к 1.14 г (91%) соединения (2), физико-химические характеристики которого идентичны соединению (1).
3
2
3
3
3
2
4
2
3
2
4
2
5
3
ƒ
3
3
6
5
2
6
5
2
2
2
2
3
1
(S)-N-(Бензилоксикарбонил)-3-амино-2-метил-пропанол-1 (3). К охлажденному до 0°C раствору 0.94 г (7.5 ммоль) соединения (1) в смеси 15 мл THF, 7.5 мл 1 М NaHCO и 9 мл 2 М NaCO при эффективном перемешивании механической мешалкой прибавляют 1.12 мл (8 ммоль) CbzCl в 3 порций с интервалом в 20 мин. Реакционную смель перемешивают еще 1 ч при 0°C и 5 ч при комнатной температуре, водную фазу отделялют, экстрагируют CHCl (2×5 мл) и объединенные органические вытяжки упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 20 мл CHCl, промывают последовательно 0.5 М HSO (2×5 мл), НО (5 мл), 1 М NaHCO (3 мл), НО (3 мл), 5 М NaCl (5 мл), сушат над MgSO, растворитель отгоняют в вакууме и оставшееся масло подсушивают сначала в вакууме масляного насоса, а затем в вакууме над PO/КОН. Частично закристаллизовавшееся масло растирают со смесью эфир-гексан (1:2) (2×10 мл), осадок отфильтровывают и после высушивания на воздухе получают 1.51 г (90%) соединения (3), Rƒ 0.51 (CHCl-МеОН, 9:1), R 0.42 (CHCl-МеОН, 97:3). H-ЯМР (CDCl) δ:7.39-7.29 (5Н, м, СН); 5.08 (2Н, с, СНСН); 4.77 (1Н, с, NHCbz); 3.96-3.76 (2Н, м, NHCH); 3.70 (2Н, d, J6.4 Гц, CHOH); 2.78 (1Н, уш. с, ОН); 2.05-1.91 (1Н, м, СНСНСН); 1.03 (3Н, д, J 7.0 Гц, СН).
(R)-N-(Бензилоксикарбонил)-3-амино-2-метил-пропанол-1 (4). Получают аналогично соединению (3), исходя из 1.07 г (8.5 ммоль) соединения (2) и 1.27 мл (9.1 ммоль) CbzCl, что приводит к 1.69 г (89%) соединения (4), физико-химические характеристики которого идентичны соединению (3).
3
2
2
2
2
3
3
2
2
4
2
4
ƒ
3
3
3
2
3
2
4
2
5
ƒ
3
3
6
5
2
6
5
2
2
2
2
3
1
(S)-N-(Бензилоксикарбонил)-3-амино-2-метил-1-бромпропан (5). К охлажденному до 0°C раствору 1.505 г (6.75 ммоль) соединения (3) и 1.26 мл (9 ммоль) EtN в 20 мл абс. CHClпри перемешивании прибавляют в течение 15 мин раствор 0.58 мл (15 ммоль) MsCl в 5 мл абс. CHClи перемешивают 30 мин при 0°C и 1 ч при комнатной температуре. К реакционной смеси прибавляют 15 мл 1 М NaHCO, органический слой отделяют, промывают последовательно 1 М NaHCO (2×5 мл), HO (5 мл), 0.5 М HSO (3×8 мл), HO (5 мл), 5 М NaCl (10 мл), высушивают над MgSO, упаривают в вакууме досуха и получают (S)-N-(бензилоксикарбонил)-3-амино-2-метил-1-метансульфонилпропан R 0.62 (СНСl-МеОН, 97:3). Сырой (S)-N-(бензилоксикарбонил)-3-амино-2-метил-1-метансульфонилпропан растворяют в 5 мл a6c. THF и прибавляют раствор 1.75 г (20 ммоль) LiBr в 10 мл a6c. THF. Реакционную смесь перемешивают 12 ч при комнатной температуре, прибавляют 15 мл CHCl, осадок отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме досуха. К остатку прибавляют 25 мл CHCl, последовательно промывают HO (2×10 мл), 1 М NaHCO (2×8 мл), HO (5 мл), 5 М NaCl (10 мл) и высушивают над MgSO. Растворитель упаривают в вакууме и после высушивания остатка в вакууме над PO получают 1.89 г (95%) бромида (5) в виде густого масла, который используют далее без дополнительной очистки; R 0.61 (CHCl); Н-ЯМР (CDCl):δ: 7.37-7.26 (5Н, м, СН); 5.03 (2Н, с, CHCH); 4.87 (1Н, уш. с, NHCbz); 3.75-3.59 (2Н, м, NHCH); 3.42-3.28 (2Н, м, CHBr); 2.45-2.33 (1H, м, СНСНСН); 1.06 (3Н, д, J 6.8 Гц, СН).
(R)-N-(Бензилоксикарбонил)-3-амино-2-метил-1-бромпропан (6). Получают аналогично соединению (5), исходя из 1.56 г (7.0 ммоль) соединения (4), что приводит к 1.89 г (94%) соединения (6), физико-химические характеристики которого идентичны соединению (5).
1
4
l
4
1
3
2
2
2
2
3
2
5
ƒ
3
6
6
4
6
4
2
2
2
2
2
N,N-бис-(о-Нитрофенилсульфонил)-1,4-диаминобутан. К охлажденному до 0°C раствору 1.1 г (12.5 ммоль) 1,4-диаминобутана и 5.2 мл (37.5 ммоль) EtN в 50 мл абс. CHClпри интенсивном перемешивании прибавляют в течение 40 мин при 0°C раствор 6.05 г (27.3 ммоль) NsCl в 30 мл абс. CHCl. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 0°C и 3 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают МеОН (3×15 мл), CHCl (3×10 мл) и после высушивания в вакууме над РО получают 5.3 г (91%) N,N-бис-(o-нитрофенилсульфонил)-1,4-диаминобутана в виде желтоватых кристаллов; т. пл. 185-186°C; R 0.55 (CHCl-МеОН, 200:1). Н-ЯМР (DMSO-d)δ:7.98-7.91 (4Н, м, СН); 7.86-7.81 (4Н, м, СН); 2.87-2.82 (4Н, м, CHNHNs); 1.44-1.37 (4Н, м, CHCHCHCH).
1
12
1
4
1
2
3
2
3
3
3
2
4
2
4
2
5
ƒ
4
3
6
5
2
6
5
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
(S,S)-N,N-бис-(Бензил оксикарбонил)-1,12-диамино-2,11 -диметил-4,9-диазадодекан (7). Суспензию 1.89 г (6.6 ммоль) бромида (5), 1.08 г (2.35 ммоль) N,N-бис-(о-нитрофенил-сульфонил)-1,4-диаминобутана и 2.15 г (15.5 ммоль) KCO в 20 мл a6c.DMF перемешивают 64 ч при комнатной температуре, затем прибавляют 10 мл a6c.DMF, 1.85 г (13.5 ммоль) KCO, 0.83 мл (8.0 ммоль) Ph-SH и перемешивают еще 12 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривают в вакууме, к остатку прибавляют 30 мл CHCl, осадок отфильтровывают, промывают CHCl (3×7 мл), объединенные фильтраты промывают HO (2×10 мл), 5 М NaCl (10 мл) и высушивают над MgSO. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток растворяют в 10 мл диоксана и очищают на колонке с SiO (65 г), элюируя смесью диоксан-25% NHOH, 97:3, что после высушивания в вакууме над РО приводит к 1.15 г соединения (7) (70%, считая на (5)) в виде бесцветных кристаллов, R 0.41 (диоксан-25% NHOH, 97:3). Н-ЯМР (CDCl)δ:7.36-7.26 (10Н, м, СН); 5.51 (2Н, уш. с, NHCbz); 5.08 (4Н, с, два CHCH); 3.73-3.54 (4Н, м, CbzNHCH); 2.73-2.65 (2Н, м, CHCHNH); 2.64-2.54 (2Н, м, CHCHNH); 2.54-2.45 (4Н, м, CHNH); 2.35-2.23 (1H, м, СНСНСН);1.72-1.40 (4Н, м, CHCHCHCH); 1.04 (6Н, д, J 6.1, СН).
1
12
1
4
(R,R)-N,N-бис-(Бензилоксикарбонил)-1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекан (8). Получают аналогично соединению (7), исходя из 1.89 г (6.6 ммоль) бромида (6), 1.08 г (2.35 ммоль) N,N-бис-(о-нитрофенилсульфонил)-1,4-диаминобутана, что приводит к 1.06 г (65%) соединеия (8), физико-химические характеристики которого идентичны соединению (7).
2
2
5
ƒ
2
ƒ
2
2
4
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
12
31
4
12
34
4
4
1
13
+
Тетрагидрохлорид (S,S)-1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекан (9). К раствору 1.15 г (2.3 ммоль) соединения (7) в 15 мл смеси АсОН-МеОН, 1:1 прибавляют 0.4 мл суспензии Pd-черни в МеОН и гидрируют при атмосферном давлении до прекращения выделения CO. Pd-чернь отфильтровывают, промывают МеОН (5 мл) и объединенные фильтраты упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 10 мл МеОН, прибавляют 3 мл (15 ммоль) 5 М HCl и упаривают в вакууме досуха. Остаток несколько раз соупаривают с абс. EtOH и перекристаллизовывают из абс. МеОН. После высушивания в вакууме над PO/KOH получают 0.6 г (69%) соединения (9) в виде бесцветных кристаллов; R 0.15 (н-BuOH-АсОН-Ру-HO, 4:2:1:2). R 0.33 (CHCl-МеОН-25% NHOH, 1:2:1). Н-ЯМР (DO)δ:3.17-3.13 (8Н, м, два CHNHCH), 3.04-2,93 (4Н, м, два NHCH), 2.30-2.41 (2Н, м, два СНСН), 1.82 (4Н, м, CHCHCHNH), 1.16 (6Н, д, J 6.5 Гц, два СНСН). С-ЯМР (DO)δ:53.51, 50.53, 45.23, 32.28, 25.52,17.05. HRMS (ESI-MS): Вычислено для [М+Н] CHN 231.2549, Найдено 231.2551. Вычислено, %: С 38.31; Н 9.11; N 14.89. CHNCl. Найдено, %: С 37.91; Н 9.18; N 14.74.
+
12
31
4
12
34
4
4
Тетрагидрохлорид (R,R)-1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекан (10). Получают аналогично соединению (9), исходя из 1.06 г (2.13 ммоль) соединения (8), что приводит к 0.52 г (65%) соединеия (10). Вычислено для [М+Н] CHN 231.2549, Найдено 231.2552. Вычислено, %: С 38.31; Н 9.11; N 14.89. CHNCl. Найдено, %: С 37.74; Н 9.23; N 14.61. Остальные физико-химические характеристики идентичны соединению (9).
Пример 2
Синтез тетрагидрохлоридов (R,R)- и (S,S)-диастереомеров 3,10-диметилспермина
1
3
3
20
1
13
3
2
2
4
2
2
2
f
4
D
8
24
3
3
3
6
5
2
6
5
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
(S)-N-(Бензилоксикарбонил)-N-(трет-бутилоксикарбонил)-1,3-диаминобутан (11). К охлажденному до +4°C раствору 2.4 г (12.8 ммоль) (S)-N-(трет-бутилоксикарбонил)-1,3-диаминобутана и 2.6 г (26 ммоль) EtN в 35 мл a6c. THF при перемешивании прибавляют за 30 мин раствор 2.2 г (13 ммоль) CbzCl в 10 мл a6c. THF, перемешивают 1 ч при +4°C и 4 ч при 20°C. Осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме досуха, остаток растворяют в 50 мл бензола, промывают последовательно HO (2×5 мл), 10% лимонной кислотой (4×4 мл), НО (5 мл), 5 М NaCl (2×5 мл) и высушивают над MgSO. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток очищают колоночной хроматографией на SiO (60 г), элюируя смесью CHCl-МеОН, 98:2, что приводит к густому маслу, затвердевающему при высушивании в вакууме (25°C/1 мм Hg). После перекристаллизация из гексана получают 3.31 г (81.3%) соединения (11), т. пл.82.5-83°C, R 0.72 (диоксан-25% NHOH, 98:2), [α]  +48.9°. Вычислено, %: С 63.33; Н 8.13; N 8.69. CHClN. Найдено, %: С 63.41; Н 8.18; N 8.66. Н-ЯМР (CDCl): 7.39-7.27 (5Н, м, СН), 5.57 (1Н, уш. с, NHCbz), 5.12-5.02 (2Н, м, CHCH), 4.34 (1Н, уш. с, CbzNHCH), 3.74 (1Н, уш. с, CbzNHCH), 3.46-3.41 (1H, м, NHCHCH), 3.05-2.98 (1Н, м, NHCHCH), 1.74-1.68 (1H, м, СНСН), 1.48-1.42 (10Н, м, NHC(CH)), 1.14 (3Н, д, J 6.5, СН). С-ЯМР (CDCl) δ: 128.52, 128.13, 128.04, 77.41, 77.30, 77.09, 76.77, 66.54, 43.83, 37.98, 37.86, 37.17, 28.43, 21.64.
1
3
3
20
3
D
8
24
3
3
(R)-N-(Бензилоксикарбонил)-N-(трет-бутилоксикарбонил)-1,3-диаминобутан (12). Получают аналогично соединению (11), исходя из 1.84 г (9.79 ммоль) (R)-N-(трет-бутилоксикарбонил)-1,3-диаминобутана, 2.02 г (20 ммоль) EtN и 1.7 г (10 ммоль) CbzCl, что приводит к 2.71 г (86%) соединеия (12), [α]  -50.4°. Вычислено, %: С 63.33; Н 8.13; N 8.69. CHClN. Найдено, %: С 63.37; Н 8.11; N 8.68. Остальные физико-химические характеристики идентичны соединению (11).
1
2
2
2
2
2
(S)-N-(Бензилоксикарбонил)-1,3-диаминобутан (13). К раствору 1.0 г (3.1 ммоль) соединения (11) в 5 мл абс. EtOH прибавляют 2 мл 6.7 М HCl/EtOH и через 3 ч при 20°C реакционную смесь упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 10 мл абс. EtOH, выливают в 40 мл абс. EtO и оставляют на ночь при -20°C. Выделевшееся масло отделяют, промывают абс. EtOH (10 мл) декантацией и к остатку прибавляют 4 мл 2 М NaOH и 6 мл CHCl. Органическую фазу отделяют, а водную фазу экстрагируют CHCl (4×4 мл).
2
2
2
2
3
2
5
ƒ
4
3
6
5
2
6
5
2
3
2
2
2
2
2
3
3
1
13
Объединенные CHCl-вытяжки промывают НО (2 мл), 5 М NaCl (3×5 мл) и высушивают над KCO. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток высушивают в вакууме над РО и получают 0.515 г (75%) соединения (13) в виде густого масла, R 0.44 (диоксан-25% NHOH, 9:1), H-ЯМР (CDCl)δ:7.35-7.26 (5Н, м, СН), 5.48 (1Н, уш. с, NHCbz),5.09 (2Н, с, CHCH), 3.4-3.2 (2Н, м, CbzNHCH.), 3.01-2.92 (1H, м, СНСН), 1.62-1.55 (1H, м, NHCHCH), 1.47-1.38 (1Н, м, NHCHCH), 1.25-1.22 (2Н, м, NH), 1.20 (3Н, д, J 6.5, СН). С-ЯМР (CDCl)δ: 156.55, 136.85, 128.55,128.09, 77.40, 77.09, 76.77, 66.60, 45.56, 39.18, 29.75, 24.90.
1
(R)-N-(Бензилоксикарбонил)-1,3-диаминобутан (14). Получают аналогично соединению (13),исходя из 1.17 г (3.63 ммоль) соединения (12)и 2.5 мл 6.7 М HCl/EtOH в 5 мл абс. EtOH что приводит к 0.6 г (75%) соединения (14) в виде густого масла, физико-химические характеристики которого идентичны соединению (13).
1
3
(S)-N-(Бензилоксикарбонил)-N-(о-нитрофенилсульфонил)-1,3-диаминобутан (15).
3
2
2
2
2
2
2
2
2
4
2
5
ƒ
3
6
4
2
6
4
2
6
4
2
6
5
2
6
5
2
2
2
2
2
2
3
3
3
1
13
К охлажденному до +4°C раствору 0.515 г (2.32 ммоль) соединения (13) и 0.36 мл (8.8 ммоль) EtN в 4.5 мл абс. CHClприбавляют при перемешивании в течение 10 мин раствор 0.525 г (2.37 ммоль) NsCl в 2.5 мл абс. CHCl, перемешивают 1 ч при +4°C и еще 3 ч при 20°C. Осадок отфильтровывают, фильтрат разбавляют 10 мл CHClи последовательно промывают НО (2×5 мл), 10% лимонной кислотой (4×4 мл), НО (5 мл), 5 М NaCl (2×5 мл) и высушивают над MgSO. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток высушивают в вакууме над РО и получают 0.93 г (98.5%) соединения (15), в виде полузакристаллизовавшегося масла, R 0.22 (EtOAc-гексан, 2:3). H-ЯМР (CDCl)δ:8.22-8.05 (1Н, м, CHNO), 7.84-7.83 (1Н, м, CHNO), 7.73-7.69 (2Н, м, CHNO), 7.36-7.31 (5Н, м, СН), 5.09 (2Н, с, CHCH), 3.59-3.52 (1H, м, NHCbz), 3.44-3.36 (1H, м, NHCHCH), 3.26-3.18 (1Н, м, NHCHCH), 1.78-1.77 (1Н, уш. с, NHNs), 1.58-1.51 (2Н, м, NHCHCH), 1.26-1.24 (1H, м, СНСН), 104 (3Н, д, J 6.5, СН). С-ЯМР (CDCl)δ:156.53,147.96,136.71,133.65,133.00,130.78,128.60,128.18,125.52, 77.41, 77.10, 76.77, 66.74, 48.76, 37.64, 37.15, 21.67.
3
3
(R)-1-(Бензилоксикарбонил)-N-(о-нитрофенилсульфонил)-1,3-диаминобутан (16). Получают аналогично соединению (15), исходя из 0.6 г (2.7 ммоль) соединения (14), 0.41 мл (3.01 ммоль) EtN и 0.61 г (2.75 ммоль) NsCl, что приводит к 1.07 г (97.4%) соединения (16), в виде густого масла, физико-химические характеристики которого идентичны соединению (15).
1
12
1
2
3
2
3
2
4
2
5
ƒ
4
3
6
5
2
6
5
2
2
2
2
2
2
2
3
3
(S,S)-N,N-бис-(Бензилоксикарбонил)-1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадод екан (17). К раствору 0.92 г (2.26 ммоль) соединения (15) в 7.5 мл абс. DMF прибавляют 0.31 г (1.0 ммоль) 1,4-дийодбутана, 1.2 г (7.23 ммоль) безв. KCO и перемешивают 12 ч при 40°C. Затем к реакционной смеси прибавляют 0.6 г (3.6 ммоль) безв. KCO, 0.73 мл (7.2 ммоль) PhSH и перемешивают еще 16 ч при 20°C. Осадок отделяют центрифугированием, промывают DMF (2×5 мл), растворитель отгоняют в вакууме, остаток очищают колоночной хроматографией на SiO (60 г), элюируя смесью диоксан-25% NHOH, 97:3, что после высушивания в вакууме над РО приводит к 0.45 г соединения (17) (79%, считая на (15)) в виде бесцветных кристаллов, R 0.48 (диоксан-25% NHOH, 97:3). Н-ЯМР (CDCl)δ:7.36-7.26 (10Н, м, СН); 5.86 (2Н, уш. с, NHCbz); 5.08 (4Н, с, два СНСН);3.68-3.66 (4Н, м, CHNHCbz), 3.33-3.23 (4Н, м, CHNHCH), 2.59-2.50 (2Н, м, CHNHCH), 1.77-1.70 (4Н, м, CHCHNH), 1.66-1.41 (6Н, м, CHCHCH+СНСН), 107 (3Н, д, J 6.6 Гц, СН).
1
12
(R,R)-N,N-бис-(Бензилоксикарбонил)-1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекан (18). Получают аналогично соединению (17), исходя из 1.05 г (2.58 ммоль) соединения (16) и 0.34 г (1.1 ммоль) 1,4-дийодбутана, что после удаления нозильной защиты приводит к 0.430 г (78%) соединения (18) в виде густого масла, физико-химические характеристики которого идентичны соединению (17).
2
2
5
ƒ
2
ƒ
4
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
12
31
4
12
34
4
1
+
Тетрагидрохлорид (S,S)-1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана (19). К раствору 0.44 г (0.89 ммоль) соединения (17) в 8 мл смеси АсОН-МеОН, 1:1 прибавляют ~0.2 мл суспензии Pd-черни в МеОН и гидрируют при атмосферном давлении до прекращения выделения CO. Pd-чернь отфильтровывают, промывают МеОН, объединенные фильтраты упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в EtOH, прибавляют 2 мл 5.0 М HCl, упаривают в вакууме досуха и остаток перекристаллизовывают из смеси MeOH-EtOH, что после высушивания в вакууме над РО/KOH приводит к 0.22 г (66%) соединения (19) в виде смокающих на воздухе кристаллов; R 0.24 (n-бутанол-АсОН-пиридин-HO, 4:2:1:2). R 0.13 (диоксан-25% NHOH, 7:3). Н-ЯМР (DO): 3.52-3.38 (2Н, м, два СНСН), 3.22-3.04 (8Н, м, два CHNHCH), 2.25-2.14 (2Н, м, CHCH), 2.01-1.88 (2Н, м, CHCH), 1.84-1.73 (4Н, м, CHCHCHNH), 1.35 (6Н, д, J 3.3, 2 СНСН). HRMS (ESI-MS): Вычислено для [М+Н] CHN 231.2549. Найдено 231.2545. Вычислено, %: С 38.31; Н 9.11; N 14.89. CHN4Cl. Найдено, %: С 38.51; Н 9.13; N 14.69.
12
34
4
Тетрагидрохлорид (R,R)-1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана (20). Получают аналогично соединению (19), исходя из 0.42 г (0.83 ммоль) соединения (18), что приводит к 0.225 г (72%) соединения (20) в виде смокающих на воздухе кристаллов. Вычислено, %: С 38.31; Н 9.11; N 14.89. CHN4Cl. Найдено, %: С 38.57; Н 9.23; N 14.58. Остальные физико-химические характеристики идентичны соединению (19).
Пример 4
Восстановление роста клеток с истощенным пулом полиаминов при помощи терагидрохлоридов 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана и 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана.
2
6
Клетки карциномы простаты DU145 выращивают на модифицированной среде Игла, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 0.05 мг/мл гентамицина при 37°C в атмосфере, содержащей 10% CO, в целом, как описано ранее [Hyvonen М.Т., Keinanen Т.А., Cerrada-Gimenez М., Sinervirta R., Grigorenko N., Khomutov A.R., Vepsalainen J., Alhonen L., Janne J. ″Role of hypusinated eukaryotic translation initiation factor 5A in polyamine depletion-induced cytostasis″. J.BioLChem., 282(48), 34700-34706 (2007)]. Для определения рост-восстанавливающей способности клетки DU145 выращивают в 10 см чашках Петри до плотности 1×10 клеток / чашку, а затем продолжают выращивание в среде, содержащей 0.1 мМ терагидрохлоридов 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана или 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодеканаи 5 мМ α-дифторметилорнитина (DFMO) в течение 3 сут. Рост-восстанавливающую способность оценивают, сравнивая количество клеток в контроле (клетки DU145 выращенные без добавления DFMO или аналогов спермина) с количеством клеток, выращенных только в присутствии DFMO, или в присутствии DFMO и аналогов спермина. Результаты экспериментов представлены на Чертеже 4.
Пример 5
Транспорт терагидрохлоридов 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана и 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана в клетки.
2
Клетки DU145 выращивают аналогично описанному в Примере 4, затем клетки инкубируют 2 ч с циклогексимидом (СНХ, конечная концентрация 20 мкМ), и после этого в культуральную среду вносят терагидрохлорид 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана, или терагидрохлорид 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана (конечные концентрации 100 мкМ) и инкубируют еще 4 ч. Клетки DU145 разрушают (20 мин при 0°C в лизирующем натрий-фосфатном буфере, содержащем Na-EDTA, Triton Х-100 и дитиотреитол), к аликвоте прибавляют 50% раствор сульфосалициловой кислоты, содержащий 1,7-диаминогептан (внутренний стандарт) и после инкубации при 0°C в течение 2 ч центрифугируют. В супернатанте определяют количество 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана, или 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана, методом ВЭЖХ (хроматограф HP 1090, колонка Hypersil ODS 5 µМ, 100×2.1 мм), нормируя на 1,7-диаминогептан. Элюция градиентом концентраций, pH и содержания ацетонитрила аналогично описанному ранее [Hyvonen Т., Keinanen ТА., Khomutov A.R., Khomutov R.M., Eloranta Т.О. ″Monitoring of the uptake and metabolism of aminooxy analoques of polyamines in cultured cells by HPLC″. J.Chromatogr., 574(1), 17-21 (1992)]. Постколоночная модификация полиаминов при помощи о-фталевого альдегида позволяет детектировать полиамины по флуоресценции (детектор LKB 4460) - возбуждение при 340 нм, эмиссия при 425 нм. Результаты анализа представлены на Чертеже 5.
Пример 6
Активность орнитиндекарбоксилазы в клетках DU145, обработанных терагидрохлоридами 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадо декана, или 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана.
14
14
2
2
Метод основан на использовании радиоактивно-меченого по карбоксильной группе орнитина - [С]-Orn и улавливании, выделяющегося в ходе ферментативной реакции, [С]-COпри помощи пропитанных Ва(ОН) фильтров GFC.
2
14
Клетки DU145 выращивают аналогично описанному в Примере 4, затем в культуральную среду вносят терагидрохлорид 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана, или терагидрохлорид 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана (конечные концентрации 100 мкМ) и инкубируют еще 6 ч. Клетки DU145 лизируют и определяют активность орнитиндекарбоксилазы аналогично описанному ранее [Hyvonen М.Т., KeinanenT.A., Khomutov М., Simonian A., Weisell J., Kochetkov S.N., Vepsalainen J., Alhonen L., Khomutov A.R. ″The use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolism″. J.Med.Chem., 54(13), 4611-4618 (2011)]. Субстратная смесь в объеме 0.2 мл содержит 0.125 М Tris-HCl-буфер, pH 7.4; 5 мМ NaEDTA; 5 мМ дитиотреитол; 0.5 мМ орнитин; 1 микроКю [С]-Orn и 0.4 мМ пиридоксаль-5′-фосфата. Результаты экспериментов представлены на Чертеже 6.
Пример 7
Активность S-аденозилметиониндекарбоксилазы в клетках DU145. обработанных терагидрохлоридами 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана, или 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана.
14
14
14
2
2
Метод основан на использовании радиоактивно-меченого по карбоксильной группе S-аденозилметионина - [C]-AdoMet и улавливании выделяющегося в ходе ферментативной реакции [С]-CO при помощи пропитанных Ва(ОН) фильтров GFC фирмы Whatman. Клетки DU145 выращивают аналогично описанному в Примере 4, затем в культуральную среду вносят терагидрохлорид 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана, или терагидрохлорид 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана (конечные концентрации 100 мкМ) и инкубируют еще 6 ч. Клетки DU145 лизируют и определяют активность S-аденозилметиониндекарбоксилазы аналогично описанному ранее [Hyvonen М.Т., KeinanenT.A., Khomutov М., Simonian A., Weisell J., Kochetkov S.N., Vepsalainen J., Alhonen L., Khomutov A.R. ″The use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolism″. J.Med.Chem, 54(13), 4611-4618 (2011)]. Субстратная смесь в объеме 0.125 мл содержит 0.05 М натрий-фосфатный буфер pH 7.4; 2.5 мМ дитиотреитол; 1.5 мМ путресцина; 0.4 мМ S-аденозилметионина и 1 микроКю [С]-S-аденозилметионина. Результаты экспериментов представлены на Чертеже 7.
Пример 8
1
Активность спермилин/спермин-N-ацетилтрансферазы в клетках DU145, обработанных терагидрохлоридами 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана, или 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана.
14
14
14
1
14
1
14
Метод основан на использовании радиоактивно-меченого по ацетильной группе [С]-ацетилкоэнзима А([С]-АсСоА). [С]-Ацетильная группа переносится на субстрат (спермидин) и образовавшийся радиоактивно-меченый N-ацетилспермидин, в отличие от исходного [С]-АсСоА, сорбируется на катионообменных фильтрах СМ фирмы Whatman. Клетки DU145 выращивают аналогично описанному в Примере 4, затем в культуральную среду вносят терагидрохлорид 1,12-диамино-2,11-диметил-4,9-диазадодекана, или терагидрохлорид 1,12-диамино-3,10-диметил-4,9-диазадодекана (конечные концентрации 100 мкМ) и инкубируют еще 6 ч. Клетки DU145 лизируют и определяют активность спермидин/спермин-N-ацетилтрансферазы аналогично описанному ранее [Hyvönen М.Т., KeinänenT.A., Khomutov М., Simonian A., Weisell J., Kochetkov S.N., Vepsäläinen J., Alhonen L., Khomutov A.R. ″The use of novel C-methylated spermidine derivatives to investigate the regulation of polyamine metabolism″. J.Med.Chem, 54(13), 4611-4618 (2011)]. Субстратная смесь в объеме 0.2 мл содержит 0.1 М Tris-HCl-буфер, pH 7.8; 10 мМ спермидин; 10 мМ дитиотреитол; 0.1 микроКю [С]-АсСоА, удельная активность 60 мКю/ммоль. Результаты экспериментов представлены на Чертеже 8.