СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗГЛЮТЕНОВОЙ СПОРОВОЙ ИЛИ ПЛЕСНЕВОЙ КУЛЬТУРЫ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К ВИДУ РЕNICILLIUM ROQUEFORTI, И БЕЗГЛЮТЕНОВАЯ СПОРОВАЯ ИЛИ ПЛЕСНЕВАЯ КУЛЬТУРА PENICILLIUM ROQUEFORTI, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЫРА С ГОЛУБЫМИ ПРОЖИЛКАМИ, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ЛИЦ, СТРАДАЮЩИХ ЦЕЛИАКИЕЙ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОЛОЧНОГО ПРОДУКТА С ГОЛУБЫМИ ПРОЖИЛКАМИ
METHOD OF OBTAINING NON-GLUTEN SPORE OR MOLDY CULTURE BELONGING TO PENICILLIUM ROGUEFORTI GENUS AND NON-GLUTEN SPORE MOLDY CULTURE OF PENICILLIUM ROGUEFORTI, USED TO PRODUCE CHEESE WITH BLUE STREAKS MEANT FOR PERSONS SUFFERING FROM COELIAC DISEASE AND METHOD OF OBTAINING DIARY PRODUCT WITH BLUE STREAKS

Настоящее изобретение относится к безглютеновым споровым или плесневым культурам рода Penicillium, в частности к виду Penicillium roqueforti, для образования голубых прожилок у сыров, предназначенных для лиц, страдающих целиакией.
Целью настоящего изобретения является способ получения указанных безглютеновых культур, в котором используют безглютеновый неаллергенный культуральный субстрат, возможно в сочетании с последующей ферментативной обработкой, подходящей для полного удаления следовых количеств глютена, если они есть, являющихся следствием случайных и непреднамеренных загрязнений (перекрестных загрязнений).
Целиакия представляет собой энтеропатическое хроническое иммунозависимое воспалительное заболевание, возникающее из-за употребления в пищу глютена, запасающего белка, естественно содержащегося в некоторых злаках. Эта пищевая непереносимость затрагивает генетически предрасположенных лиц любого возраста, обладающих иммунной системой, которая аномальным образом реагирует на употребление в пищу белковых фракций, типичных для пшеничного глютена, спельты (вид пшеницы), камута и спела (spel) (вид пшеницы), ячменя, ржи, тритикале (гибрид пшеницы и ржи) и их производных. Некоторые индивидуумы также обнаруживают непереносимость белков овса. Технически, термин "глютен" применим к комбинации простых проламиновых (богатых пролином), называемых "глиадинами", и глютелиновых (богатых глутамином), называемых "глютенинами", белков злаков, упомянутых выше. В контексте целиакии термин "глютен" часто используют в отношении всех видов белков, содержащихся в злаках, хотя среди различных белковых фракций, которые образуют глютен, глиадин, по-видимому, причиняет наибольший вред.
Целиакия может встречаться в различных клинических формах, не всегда в явном виде; фактически, существуют латентные или скрытые, клинически невыраженные и без явных симптомов, моносимптомные формы или формы со всеми, кишечными и внекишечными, клиническими симптомами.
Хроническое воспаление приводит к повышению уровня внутриэпителиальных лимфоцитов кишечника, к гипертрофии крипт и прогрессирующему уплощению и исчезновению кишечных ворсинок тонкой кишки, в частности слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, с последующей потерей способности всасывания питательных веществ и возникновения симптомов, таких как хроническая диарея, вздутие живота, отсутствие аппетита, потеря веса, анемия и авитаминоз. В наиболее тяжелых случаях, отмеченных поздним диагнозом, может встречаться остеопороз, бесплодие, повторные выкидыши, низкий рост у подростков, сахарный диабет, аутоиммунный тиреоидит, алопеция, эпилепсия с церебральной кальцификацией и злокачественная лимфома кишечника. У лиц, страдающих целиакией, употребление в пищу глютена, даже в малых количествах, может вызвать аномальный ответ иммунной системы: фермент трансглутаминаза, присутствующий в ткани слизистой оболочки кишечника, связывается с глиадином и посредством дезамидирования превращает его в молекулу, способную активировать Т-клетки (клетки иммунной системы, способные опосредовать все иммунные ответы в отношении белковых антигенов), с последующей продукцией иммуноглобулинов IgG и IgA против трансглутаминазы и IgA против эндомизия. На первом этапе происходит увеличение активированных внутриэпителиальных Т-клеток кишечника, хотя при развитии заболевания данное увеличение затрагивает как лимфоциты, так и инфильтрующие плазматические клетки собственной ламины, с выработкой металлопротеиназ, отвечающих за укорочение ворсинок и, следовательно, за повреждение слизистой оболочки кишечника.
Возможности предотвращать развитие или лечения целиакии до сих пор не существует, поэтому безглютеновая диета, строго соблюдаемая на протяжении всей жизни, является единственной терапией, способной гарантировать настоящее здоровье лицам с целиакией. Лица, страдающие целиакией, должны избегать также малейших следовых количеств муки опасных злаков, поскольку употребление в пищу глютена, даже в минимальных количествах, может вызвать аутоиммунный ответ. Поскольку отношение количества потребляемого глютена к токсическому эффекту, индуцированному на кишечном уровне, все еще не определено, термин "следовые количества", с количественной точки зрения, имеет фундаментальное практическое значение в лечении целиакии и включении в проект пищевого законодательства, поскольку указанные "следовые количества" относятся к максимальному пределу "допустимого" глютена (порогового) в продуктах, подходящих в качестве диеты для лиц, страдающих целиакией. Все специалисты согласны, что доза глиадина 100 мг в сутки, равная 200 мг глютена, то есть около 3 г хлеба, является достаточной для того, чтобы вызвать у большинства лиц, страдающих целиакией, увеличение числа внутриэпителиальных лимфоцитов кишечника, ранний признак хронического воспаления кишечника.
Что касается минимального порога, то немногочисленные научные работы, проведенные к настоящему времени, вроде бы показали, что потребление вплоть до 10 миллиграмм в сутки глиадина (равное 20 миллионным долям глютена) не способно существенно повредить слизистую оболочку кишечника, но может привести, в меньшинстве случаев, к развитию желудочно-кишечных симптомов.
-1
-1
-1
На международном законодательном уровне старый стандарт "Кодекс стандарта для безглютеновых пищевых продуктов", все еще действующий, утверждает, в качестве максимального содержания глютена в диетических терапевтических продуктах, 0,05 азота на 100 г сухого продукта (в отношении пшеничного крахмала), что соответствует глютеновой фракции, равной примерно 500 млн. Однако происходит правомерный и уместный пересмотр вышеизложенной директивы, который, по-видимому, предполагает, что безглютеновые пищевые продукты, полученные из природных безглютеновых ингредиентов, не должны содержать более чем 20 млн глютена, тогда как безглютеновые пищевые продукты, полученные из злаков с глютеном, могут иметь максимальный предел 200 млн глютена.
Во Франции, Великобритании и Нидерландах, ожидающих пересмотра вышеизложенной директивы, в качестве максимального предела для безглютеновых продуктов рассматривают 200 миллионных долей. В Италии (законодательный декрет №109/1992) вступит в силу закон, который устанавливает, что если в составе пищевого продукта или в составе одного или более ингредиентов (ароматизатора, вспомогательного вещества или коадъюванта), которые его образуют, присутствуют злаки, содержащие глютен, или вещества, происходящие из него, и/или если в процессе производства в конечном продукте может быть получено аналитически определяемое количество глютена выше 20 долей на миллион, то такой продукт должен быть указан на этикетке в конце перечня ингредиентов и хорошо видимым образом, словами "глютен-содержащий продукт".
Поэтому, для обеспечения лиц, страдающих целиакией, точной информацией об отсутствии глютена в пищевых продуктах, следует обязательно, также в сырах, указывать на этикетке присутствие возможных следовых количеств глютена.
Для молочной промышленности, специализирующейся на производстве сыров с голубыми прожилками, этот новый регулирующий аспект влечет за собой серьезный коммерческий урон от уменьшения потенциального числа потребителей. Однако полное исключение глютена из диеты осуществить нелегко, учитывая, что явления перекрестного загрязнения природных безглютеновых злаков и производных (крахмалов, муки, крахмальной муки и других) могут происходить уже на уровне мукомольного производства.
-1
Такие продукты затем используют в пищевой промышленности для получения сложных пищевых продуктов на основе разнообразных технологических ингредиентов, вспомогательных веществ и коадъювантов различного происхождения и природы. Последние исследования показали, что до 6% "теоретически" безглютеновых продуктов на основе описанных ингредиентов действительно содержат более 30 мг глиадина на 100 г конечного продукта, что равно 600 млн глютена. Поэтому для исключения возможного глютенового загрязнения необходимо учитывать, для каждого производимого заводским путем пищевого продукта, не только все используемые ингредиенты и технологический процесс, но и всю производственную цепочку для каждого отдельного ингредиента.
В число "пищевых продуктов, представляющих риск", о чем также предупреждала Итальянская ассоциация больных целиакией, дополнительно включены "сыры с голубыми прожилками и с плесневой коркой", поскольку из экспериментальных исследований, также проводимых в Италии, следует, что некоторые "сыры с голубыми прожилками и с плесневой коркой" могут содержать глютен, происходящий из культуральных сред для выращивания шизомицетов (плесени и дрожжей), используемых в качестве заквасочных культур для получения характерных голубых прожилок голубого сыра (Penicillium roqueforti), белого пушка, покрывающего сыры, такие как Brie, камамбер (Camembert) и Саrrе de I′Est, Tomme blanche (Penicillium candidum) и/или рафинации многих других видов сыра (дрожжи родов Kluyveromices, Debaromyces).
Согласно правилу, вступающему в силу, которое направлено на то, чтобы удовлетворить потребность лиц, страдающих целиакией, в точной информации об отсутствии глютена в пищевых продуктах, если такие сыры содержат следовые количества глютена или все-таки производятся с технологическими глютенсодержащими ингредиентами или коадъювантами, следует обязательно указывать это на этикетке.
Поэтому сохраняется растущая потребность в способности обеспечивать безглютеновые молочные продукты с голубыми прожилками.
Кроме того, в случае, когда процесс производства пенициллиновых культур не предполагает применения какого-либо глютенсодержащего ингредиента или вещества, тем не менее возможно, что из-за непреднамеренных и случайных перекрестных загрязнений некоторые компоненты, используемые в производственном процессе, привносят следовые количества глютена.
Поэтому все операторы участков согласны, что до сих пор сохраняется сильно растущая потребность в обеспечении способа приготовления культуральных сред, подходящих для роста шизомицетов (плесени и дрожжей), используемых в качестве заквасочных культур для получения голубых прожилок сыров, допускающего применение субстрата не на основе хлеба и одновременно способного уменьшить перекрестные, непреднамеренные и случайные загрязнения, если они есть.
В частности, сохраняется потребность в обеспечении способа получения культуральных сред для выращивания шизомицетов (плесени и дрожжей), используемых в качестве заквасочных культур для получения голубых прожилок сыров, который предполагает двойной уровень безопасности, относящийся к отсутствию глютена.
Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить способ получения культуральных сред, который способен преодолеть ограничения, существующие в известной области техники, и может быть безопасным образом предназначен для лиц, страдающих целиакией.
Эти и другие цели, которые будут очевидны из следующего подробного описания, достигнуты заявителем, который усовершенствовал методологию, включающую двойной уровень безопасности, относящийся к отсутствию глютена в культуральных средах.
В частности, автор изобретения разработал методику, которая предполагает: первый способ получения споровых или плесневых культур, выращиваемых на селективном природном безглютеновом культуральном субстрате, способном полностью сохранять биологическую активность спор плесени и, следовательно, способность обеспечивать оптимальное образование голубых прожилок, и затем второй способ, который предполагает ферментативную обработку указанных культур.
Плесени, принадлежащие к виду Penicillium roqueforti, предпочтительно выбранные из группы, депонированной заявителем в коллекционном центре DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур GmbH; Брауншвейг, Германия) 21.12.2005, составляет объект настоящего изобретения, в котором указанная группа состоит из микроорганизмов, идентифицированных указанным центром, с инвентарными номерами, приведенными в следующей таблице 1:
Таблица 1
Название
Регистрирующая организация
Регистрационный номер
Дата регистрации
Владелец
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17815
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17816
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17817
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17818
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17819
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17820
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17821
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17822
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17823
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17824
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17825
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17826
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17827
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17828
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17829
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
Penicillium roqueforti
DSMZ
DSM 17830
21.12.2005
MOFIN S.R.L.
как представлено в прилагаемом независимом пункте формулы изобретения.
Способ получения безглютеновой споровой или плесневой культуры, выбранной из вышеуказанной группы, композиция, содержащая по меньшей мере одну из указанных культур, и применение по меньшей мере одной из указанных культур для получения молочного продукта с голубыми прожилками, предназначенного для людей с целиакией, составляют, следовательно, цель настоящего изобретения, имеющего признаки, изложенные в прилагаемой формуле изобретения.
Образование голубых прожилок, то есть прожилок с более или менее насыщенным зеленым цветом, типичным для сортов горгонзола (Gorgonzola) (Италия), рокфор (Roquefort), Bresse Blue, Blue d′Auvergne, Sas-senage и других (Франция), Stilton (Англия), Danablue (Дания), Cabrales (Испания) и Bluecheese (США), получают посредством выращивания плесени, принадлежащей к роду Penicillium (вид Penicillium roqueforti), которую специально добавляют в молоко во время обработки вместе с молочными ферментами и сычужным ферментом. Штаммы плесени, количество спор и методы обработки варьируются от сыра к сыру, но все типологии характеризуются видом молочнокислого-сычужного свертывания с преобладанием в конце молочнокислого типа, с влажным и особенно мягким и сопровождающимся растрескиванием свертыванием, с медленным и постепенным обезвоживанием. Ферментативное действие смешанной микрофлоры (молочнокислые бактерии, плесень и часто дрожжи) позволяет получить за относительно короткий период времени сильно протеолизированные пасты (с коэффициентом созревания около 65%), характеризующиеся присутствием различных ароматических веществ, для липолитического действия, оказываемого Penicillium на жировые вещества. Образование трещин, необходимых для роста плесени, является следствием как скисания, осуществляемого молочными ферментами, так и образования диоксида углерода, выделяемого гетероферментными дрожжами или бактериями.
Во время созревания образцы подвергают, на двух разных стадиях, прокалыванию с обеих сторон соответствующими иглами. Операция имеет целью обеспечение доступа воздуха и, следовательно, ввода кислорода в трещины, существующие в пасте.
Только в условиях аэрации споры Penicillium способны развиваться путем формирования сначала переплетения гиф (мицелия), которые внедряются в отверстия и трещины и затем образуют конидиофоры, которые несут споры с более или менее насыщенным зеленым/голубым цветом.
Именно цвет спор характеризует типичный внешний вид горгонзолы и всех других сыров с голубыми прожилками, тогда как протеолитическое и липолитическое действия плесени приводят к созреванию сыра и образованию специфических вкусовых признаков.
Споровые культуры различных штаммов Penicillium roqueforti, используемые в процессе обработки, получают в специализированных лабораториях в жидкой или лиофилизированной форме, в соответствии с методикой, известной специалистам в данной области техники.
На самом деле, осуществляют получение промежуточной культуры, которое предполагает посев спор штамма Penicillium (из пробирки из Рабочего банка клеток) на подходящую агаровую культуральную среду (например, картофельный агар, картофельно-декстрозный агар, агар с солодовым экстрактом) и последующее инкубирование при 22-28°С в течение 5-10 суток с целью увеличения их числа.
Когда рост и образование спор промежуточной культуры (обычно в течение недели) в одной из вышеописанных культуральных сред завершится, стерильной пипеткой споры отделяют и собирают с поверхности агаровой среды.
В особенно предпочтительном воплощении указанную промежуточную культуру получают посредством роста спор, принадлежащих к виду Penicillium roqueforti, выбранному из группы, описанной выше, и заявленной в прилагаемом независимом пункте формулы изобретения.
Указанные споры выделяли из естественной среды обитания, предпочтительно из кормовых субстратов.
Споры промежуточной культуры после суспендирования в подходящей стерильной жидкой среде (физиологическом растворе или самих культуральных бульонах, описанных выше, без агара в прописи) образуют инокулят для получения конечной культуры.
Автор изобретения обнаружил, что полезным является применение в качестве ростового субстрата по меньшей мере природного безглютенового субстрата растительного происхождения.
На практике автор изобретения обнаружил, что полезным является применение в качестве ростового субстрата одного или более чем одного субстрата, выбранного из группы, включающей: природный безглютеновый рис, кукурузу, картофель, маниоку, тапиоку, каштаны, горох, бобы и бобовые, в форме вспученных или взорванных зерен (таких как попкорн) или в форме муки как таковой и/или предварительно заваренной.
Что касается клубней (картофель, тапиока и маниока), их следует предварительно разрезать на мелкие кубики или полоски, в зависимости от возможности; однако можно также использовать их муку и как таковую, и предварительно заваренную. Бобовые (например, кормовые бобы, горох, бобы и турецкий горох), наоборот, используют как таковые или в высушенной форме. Однако можно использовать любую смесь сырьевых материалов, уже перечисленных. Преимущественно субстрат выбирают из риса и/или кукурузы; предпочтительно в форме вспученного или взорванного субстрата или в форме муки, используемой отдельно и/или во всех простых и/или сложных предполагаемых комбинациях.
Предпочтительный субстрат, состоящий из вспученного риса и/или взорванной кукурузы, помещают в колбы из пирексного стекла с широким горлом, которые затем закрывают бактериологической ватой и стерилизуют в автоклаве при 121°С в течение 20 минут.
Каждую колбу затем инокулируют суспензией спор культуры Penicillium и помещают для инкубации вместе со многими другими идентичными суспензиями, образующими единую производственную партию, в термостаты с контролируемой температурой, варьирующей от 20 до 28°С, в зависимости от используемых штаммов.
Природа культурального субстрата и условия инкубации делают возможным переход от покоящейся споровой формы к вегетативной форме; спора прорастает, и из каждой образуются клетки (гифы), которые продуцируют ферменты, способные превращать сложные вещества, находящиеся в вышеупомянутом субстрате, в более простые молекулы, которые поглощаются клетками и определяют их быстрый рост.
Каждая гифа удлиняется и сегментируется, приводя к образованию двух дочерних клеток, которые запускают механизм, приводящий через несколько суток к длинным нитям.
Из более или менее тесного переплетения гиф образуется нечто похожее на серовато-белый пушок (мицелий), который затем, когда он достигает вполне определенного уровня развития и когда условия окружающей среды благоприятны, продуцирует особые гифы в форме метелки (конидиофоры) с плодовыми телами, которые, в свою очередь, несут споры с более или менее насыщенным зеленым/голубым цветом.
Время, необходимое для поддержания спор, изменяется от штамма к штамму, но в основном, при использовании хлеба в качестве субстрата, цикл заканчивается через 12-21 сутки после инокуляции.
Когда рост завершается, один или более чем один субстрат, составляющий объект настоящего изобретения, полностью заселенный и покрытый мицелием и зелеными спорами, извлекают из колбы с помощью стерильного водного раствора соли и агара и подвергают измельчению, гомогенизации и фильтрации на подходящем оборудовании для выделения спор. В конце процесса получают жидкость зеленого/голубого цвета, в которой суспендированы споры продуцируемого штамма Penicillium.
За стадией выделения следует стадия нормализации титра спор, цель, которой добиваются путем добавления дополнительной фракции стерильного водного раствора соли и агара до тех пор, пока не будет достигнута такая же оптическая плотность, как в контрольном образце штамма, определяемая посредством нефелометрического сравнения.
Способ, описанный в настоящий момент, уже позволяет сертифицировать полученную таким образом культуру Penicillium как безглютеновую культуру, поскольку на любой стадии производственного процесса использовали природный, не содержащий глютена, ингредиент, эксципиент или вещество.
Тем не менее, для того чтобы обеспечить дополнительный уровень безопасности, автор изобретения преимущественно объединяет такую методику получения с обработкой протеолитическими ферментами, способными разрушать глютен, если таковой есть, появляющийся в результате случайного перекрестного загрязнения, которую осуществляют на суспензии спор, полученной с субстратов, описанных выше.
Поэтому в настоящем изобретении автор изобретения может предложить методику, которая предполагает двойной уровень безопасности, способный также исключить возможный риск вследствие присутствия следовых количеств глютена из-за перекрестных загрязнений, случающихся на всем протяжении производственной цепочки используемых сырьевых материалов.
Ферментативная обработка, являющаяся объектом настоящего изобретения, была определена после того, как оценили различные протеолитические ферменты, как протеазы, так и пептидазы, и их смеси, такие как трипсин, химотрипсин, панкреатин, пепсин, папаин и бромелаин.
Преимущественно используют пепсин и бромелаин или смесь этих двух ферментов в соотношении от 1:10 до 10:1; предпочтительно в массовом соотношении от 1:5 до 5:1.
Пепсин представляет собой фермент, содержащийся в желудочном соке, который способствует перевариванию пищи. Пепсин является протеазой, которая работает лучше всего в кислой среде и способна расщеплять белки во многих разных точках и случайным образом. Его гидролитическое действие обусловлено активным центром, который содержит два остатка аспарагиновой кислоты. Его выделяют, в частности, из слизистой оболочки желудка свиней, или из сычуга жвачных животных, в частности быков. Он имеется в продаже как в жидкой, так и в порошковой форме с разным титром, выраженным в ферментных единицах (Enzymatic Units), или для бычьего типа, используемого в молочной промышленности для свертывания молока и воздействия на созревание сыра, в MCU (единицы свертывания молока, от англ. Milk Clotting Units).
Бромелаин представляет собой сложную смесь протеиназ, обычно выделяемую из стебля ананаса, хотя похожие ферменты также присутствуют в его мякоти. Бромелаин доступен в виде порошка с ферментативной активностью, выраженной в GDU (единицы переваривания желатина, от англ. Gelatin Digesting Units) или MCU (единицы свертывания молока). 1 MCU эквивалентна приблизительно 2/3 GDU.
Гидролиз глютена происходит в довольно широком диапазоне температур, от 5 до 60°С; предпочтительно от 30 до 50°С. Величина рН находится в диапазоне от 1 до 7; предпочтительно от 4 до 5. В частности, рН для пепсина находится в диапазоне от 1,8 до 6,0, а для бромелаина рН находится в диапазоне от 3,5 до 6,5.
Преимущественно температура находится в диапазоне от 30 до 40°С; предпочтительно температура составляет 37°С для пепсина. Преимущественно температура находится в диапазоне от 40 до 50°С; предпочтительно температура составляет 45°С для бромелаина.
Время гидролиза составляет от 5 до 60 часов; предпочтительно от 15 до 50 часов.
-1
Для определения рабочих условий, при которых следует проводить ферментативную обработку, подходящую для исключения возможного присутствия глютена в плесневых культурах, полученных с помощью природных безглютеновых веществ, были проведены эксперименты, в которых к таким культурам произвольно добавляли известные количества глютена так, чтобы установить конечную концентрацию в интервале, варьирующем от 3 до 20 млн. Такие концентрации глютена способствуют более серьезной ситуации, чем та, которая могла бы наблюдаться после перекрестного загрязнения, случающегося в производственной цепочке природных безглютеновых пищевых продуктов и веществ, используемых в качестве ростовых веществ для плесени.
В экспериментах, проводимых с целью гидролиза произвольно добавленного глютена, использовали пепсин в виде жидкости с титром в диапазоне от 300 до 800 MCU, преимущественно с титром, равным 500 MCU, и порошковый бромелаин с титром в диапазоне от 1500 до 3000 GDU, преимущественно с титром, равным 2200 GDU.
Провели несколько тестов, варьируя время от времени конечную концентрацию ферментов, используемых отдельно или в смеси, или условия проведения гидролиза (температуру, рН плесени и время действия).
-1
Полное удаление максимального количества добавленного глютена, равного 20 млн, предпочтительно осуществляли с одновременным применением пепсина (с титром, равным 500 MCU) и бромелаина (с титром, равным 2200 MCU) с общей продолжительностью 20-28 часов, например 24 часа, с температурой в диапазоне от 24 до 30°С при контролируемом рН в диапазоне от 4 до 5. После ферментативной обработки и сертификации партии посредством контроля качества осуществляют расфасовку в стерильные колбы.
На основании Европейского правила, которое вступило в силу в конце 2005 года, только сыр с голубыми прожилками, произведенный с помощью плесени, полученной согласно технологии, которая является объектом настоящего изобретения, даст абсолютные гарантии отсутствия в нем глютена. Поэтому для этого сыра любое упоминание на этикетке, касающееся присутствия глютена, будет излишним.
Хотя о сырьевых материалах, используемых в качестве ростовых субстратов, уже имеется достаточное количество сведений, некоторые предпочтительные воплощения, относящиеся к ферментативной обработке, приведены ниже лишь в качестве примера, который не ограничивает значения настоящего изобретения.
В этих предпочтительных воплощениях рабочие условия являются такими, что биологическая активность спор плесени, и, следовательно, ее способность обеспечивать оптимальное образование голубых прожилок и созревание голубых сыров защищены.
Например, в предпочтительном воплощении используют:
а) концентрацию бромелаина: от 0,1 до 0,4 г/литр плесени (равно 220-880 GDU/л); рН гидролиза: 4,4-4,6; температуру гидролиза: 22-28°С (например, 24°С); продолжительность гидролиза: 24-48 часов.
Например, в другом предпочтительном воплощении используют:
б) концентрацию пепсина: от 0,2 до 0,4 г/литр плесени (равно 100-200 MCU/л); рН гидролиза: 4,4-4,6; температуру гидролиза: 22-28°С (например, 24°С); продолжительность гидролиза: 24-48 часов.
Например, в еще одном предпочтительном воплощении используют:
в) концентрацию бромелаина: от 0,05 до 0,2 г/литр плесени (равные 110-440 GDU/л); концентрацию пепсина: от 0,1 до 0,2 мл/литр плесени (равные 50-100 MCU/л); рН гидролиза: 4,4-4,6; температуру гидролиза: 22-28°С (например, 24°С); продолжительность гидролиза: 24-48 часов.
Преимущественно, при способе, являющемся объектом настоящего изобретения, конечное количество глютена, которое определяют с помощью более чувствительного теста, имеющегося в настоящее время в продаже, всегда получается неопределимым. В этом случае можно гарантировать отсутствие глютена в культурах, полученных согласно способу по настоящему изобретению. Аналитический контроль в отношении концентраций глютена осуществляли с помощью набора RIDASCREEN Gliadin для ELISA от компании R-Biopharm А (Дармштадт, Германия) для количественного анализа глиадина и соответствующих проламинов. Из бюллетеня "Подходы к установлению пороговых значений для основных пищевых аллергенов и для глютена в пищевых продуктах" - проекта отчета Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами Соединенных Штатов от июня 2005 г. можно заключить, что аналитический набор, используемый для определения концентрации глютена, является одним из немногих установленных, наиболее чувствительных, количественных и специфических для различных глиадинов.