СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ХЕМОКИН CCL2 (МСР-1) ЧЕЛОВЕКА И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1. Способ определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин CCL2 (МСР-1) человека, включающий: выделение РНК из образцов анализируемого материала (кровь, ткани, коскобы, пунктаты, клеточные культуры), синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции, амплификацию кДНК генов с помошью ПЦР в реальном времени, отличающийся тем, что:
а) нормирование полученных результатов выполняют при помощи нормировочного коэффициента, рассчитанного как среднее арифметическое количества в образце кДНК генов RPL32, АСТВ и PII кодирующих рибосомный белок L32, b-актин и полимеразу-II соответственно, при этом амплификацию кДНК генов RPL32, АСТВ и PII осуществляют при помощи одной triplex-ПЦР;
б) накопление продуктов амплификации детектируют в режиме реального времени при помощи одного из способов:
1б) при помощи интекалирующего с двухцепочечной ДНК флуоресцентного красителя с высоким индексом дискриминации флуоресценции у связанной и несвязанной форм, например, SYBR GreenI (Invitrogen);
2б) при помощи олигонуклеотидной пробы типа TaqMan комплементарной центральной части амплифицируемого фрагмента транскрипта; проба длиной 20-30 нуклеотидов, несет на 5'-конце флуорофор (FAM, R6G, ROX) и на 3'-конце не флуоресцентный тушитель (BHQ, FTQ и др.);
в) определение относительного количества кДНК гена МСР1 и нормировочных генов RPL32, АСТВ и PII осуществляют при помощи калибровочной кривой построенной при амплификации стандартных образцов ДНК взятых в 6-ти последовательно убывающих трехкратных разведений известных концентраций; стандарт представляет собой смесь фрагментов ДНК, несущих амплифицируемую последовательность кДНК генов RPL32, АСТВ, PII и МСР1 длиной по 500 пар нуклеотидов; относительное количество кДНК каждого гена определяют исходя из уравнения калибровочной кривой при этом учитывается эффективность амплификации каждой из реакций амплификации.
2. Набор для определения уровня транскрипции гена, кодирующего хемокин CCL2 (МСР-1) человека по п.1, включающий:
а) олигонуклеотидные праймеры и пробы для амплификации при помощи одной triplex-ПЦР кДНК генов RPL32, АСТВ и PII кодирующих рибосомный белок L32, b-актин и полимеразу-II соответственно
ACTB_F 5'-GTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3'
ACTB_R 5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'
ACTB_pr 5'-R6G-CGCCCTGGACTTCGAGCAAGAGA-BHQ-3'
RPL32_F 5'-CAACATTGGTTATGGAAGCAACA-3'
RPL32_R 5'-TGACGTTGTGGACCAGGAACT-3'
RPL32_pr 5'-FAM-ACATGCTGCCCAGTGGCTTCCG-BHQ-3'
POLR2A_F 5'-GCACCACGTCCAATGACAT-3'
POLR2A_R 5'-GTGCGGCTGCTTCCATAA-3'
POLR2A_pr 5'- ROX-TACCACGTCATCTCCTTTGATGGCTCCTAT-BHQ-3'
б) олигонуклеотидные праймеры и проба для амплификации при помощи - ПЦР кДНК гена, кодирующего CCL2 (МСР-1)
CCL2-F 5'-TCGCCTCCAGCATGAAAGTC-3'
CCL2-R 5'-TCTGCACTGAGATCTTCCTATTG-3'
CCL2-pr 5'-FAM-CCCTTCTGTGCCTGCTGCTCATAG-3'.