ТВЕРДОФАЗНЫЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ С ЗАЩИТНЫМИ ГРУППАМИ ВОС И FMOC

1. Способ приготовления пептида, содержащего три или более аминокислотных остатков, имеющего N-концевую аминокислоту, предпоследнюю аминокислоту, прилегающую к N-концевой аминокислоте, и С-концевую аминокислоту, причем указанный способ включает следующие этапы:
(а) прикрепление первой аминокислоты к твердому носителю-смоле эфирной связью с образованием «продукта первого присоединения», что включает (i) проведение реакции водного раствора карбоната цезия со спиртовым раствором первой аминокислоты с образованием цезиевой соли первой аминокислоты, (ii) получение свободной от растворителя цезиевой соли первой аминокислоты, (iii) проведение реакции твердого носителя-смолы с цезиевой солью первой аминокислоты в безводном полярном апротонном растворителе с образованием «продукта первого присоединения»,
где первая аминокислота соответствует С-концевой аминокислоте этого пептида, аминогруппа основной цепи первой аминокислоты блокирована Boc и первая аминокислота не имеет в боковой цепи функциональной группы, для которой требуется защита, а твердый носитель-смола представляет собой смолу из хлорметилированного полистирола;
(б) снятие защиты Boc с продукта первого присоединения кислотой с образованием «деблокированного продукта первого присоединения»;
(в) по усмотрению, присоединение к «деблокированному продукту первого присоединения» «следующей аминокислоты», что включает проведение реакции «следующей аминокислоты» с «деблокированным продуктом первого присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением «блокированного продукта следующего присоединения», причем «следующая аминокислота» имеет в основной цепи аминогруппу, блокированную Boc, и если эта «следующая аминокислота» имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или эти функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые стабильны к кислотным или щелочным реагентам, используемым для снятия защиты соответственно Boc и Fmoc;
(г) снятие защиты Boc с «блокированного продукта следующего присоединения», что включает проведение реакции этого «блокированного продукта следующего присоединения» с кислотой с получением «деблокированного продукта следующего присоединения»;
(д) по усмотрению, повторение этапов (в) и (г), причем в каждом цикле образуется «деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения», где Х обозначает число желаемых повторений циклов;
(е) присоединение «следующей аминокислоты» к «деблокированному продукту первого присоединения» из этапа (б) или, по усмотрению, к «деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения» из этапа (д), что включает проведение реакции «следующей аминокислоты» с указанным «деблокированным продуктом первого присоединения» или с указанным «деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением «блокированного продукта следующего присоединения», причем эта «следующая аминокислота» имеет блокированную Fmoc аминогруппу основной цепи, при условии, что если эта «следующая аминокислота» имеет одну или несколько функциональных групп в боковой цепи, тогда функциональные группы в боковой цепи не требуют защиты или функциональные группы в боковой цепи имеют защитные группы, которые устойчивы к щелочным реагентам, используемым для снятия защиты Fmoc;
(ж) снятие защиты Fmoc с «блокированного продукта следующего присоединения», что включает проведение реакции «блокированного продукта следующего присоединения» с первичным или вторичным амином, чтобы получить «деблокированный продукт следующего присоединения»;
(з) по усмотрению, повторение этапов (е) и (ж), причем в каждом цикле образуется «деблокированный продукт (Х+1)-го следующего присоединения», где Х - желаемое число повторений цикла, пока не будут включена в пептид и деблокирована предпоследняя аминокислота;
(и) присоединение N-концевой аминокислоты к «деблокированному продукту (Х+1)-го следующего присоединения», что включает проведение реакции N-концевой аминокислоты с «деблокированным продуктом (Х+1)-го следующего присоединения» в органическом растворителе, содержащем реагент для наращивания пептида, с получением «блокированного продукта завершенного присоединения», где «N-концевая аминокислота» имеет аминогруппу основной цепи, блокированную Boc или Fmoc;
(и) снятие защитных групп Boc или Fmoc с «блокированного продукта завершенного присоединения», включающее проведение реакции «блокированного продукта завершенного присоединения» с кислотой в случае Boc или с основанием в случае Fmoc с образованием завершенного пептидного продукта на смоле;
(к) если на «завершенном пептидном продукте на смоле» имеются функциональные группы боковых цепей, тогда, по усмотрению, снятие защиты функциональных групп боковых цепей «завершенного пептидного продукта на смоле», что включает проведение реакции «завершенного пептидного продукта на смоле» с подходящими снимающими защиту реагентами с получением «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой»; и
(л) отщепление пептида от твердого носителя смолы в составе «завершенного пептидного продукта на смоле» или «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой» с получением пептида, что включает проведение реакции «завершенного пептидного продукта на смоле» или «завершенного пептидного продукта на смоле со снятой защитой» с аммиаком, первичным амином или вторичным амином до практического завершения отщепления пептида от смолы;
при условии, что этапы (е) и (ж) в синтезе пептида должны быть осуществлены по меньшей мере один раз.
2. Способ по п.1, где аммиак, первичный амин или вторичный амин в этапе (л) находятся в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель.
3. Способ по п.1, где этап (л) дополнительно включает следующие стадии:
(i) осаждение отщепленного пептида из растворителя;
(ii) отделение фильтрованием твердого носителя-смолы и осажденного пептида и
(iii) экстрагирование пептида кислотным раствором для выделения пептида.
4. Способ по п.1, где первая аминокислота представляет собой Boc-L-Thr.
5. Способ по п.4, где первая аминокислота представляет собой цезиевую соль Boc-L-Thr, дающую в качестве продукта первого присоединения Boc-L-Thr-смолу, а «деблокированным продуктом первого присоединения» является H-L-Thr-смола.
6. Способ по п.5, где кислотой, используемой для удаления защитной группы Boc в этапе (и), является трифторуксусная кислота (ТФУ).
7. Способ по п.6, где органическим растворителем является метилен-хлорид, хлороформ или дитметилформамид, а реагентом для наращивания пептида является диизопропил-карбодиимид, дициклогексил-карбодиимид или N-этил-N'-(3-диметил-аминопропил)карбодиимид.
8. Способ по п.7, включающий проведение этапов (е) и (ж) шесть раз после образования «деблокированного продукта первого присоединения» формулы H-L-Thr-смола, где последующие аминокислоты присоединяются в порядке: Fmoc-L-Cys(Acm), Fmoc-L-Val, Fmoc-L-Lys(Boc), Fmoc-D-Trp, Fmoc-L-Tyr(O-t-Bu) и Fmoc-L-Cys(Acm) с образованием продукта Н-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.
9. Способ по п.8, включающий присоединение Boc-D-β-Nal к Н-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смоле согласно этапу (и) с получением Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смолы.
10. Способ по п.9, включающий одновременное снятие группы Boc, блокирующей D-β-Nal, группы O-t-Bu, защищающей Tyr, и группы Boc, защищающей Lys в Boc-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr(O-t-Bu)-D-Trp-Lys(Boc)-Val-Cys(Acm)-Thr-смоле согласно этапу (и) с получением завершенного пептидного продукта на смоле формулы H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смола.
2
11. Способ по п.10, включающий отщепление пептида H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr от твердой смолы путем проведения реакции H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-смолы с аммиаком в растворителе, содержащем спирт и, по усмотрению, апротонный полярный растворитель, до в основном полного отщепления с получением H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH.
12. Способ по п.11, где спиртом является метанол, а полярный апротонный растворитель - это диметилформамид.
2
2
2
13. Способ по п.12, включающий одновременное удаление групп Acm, защищающих Cys, и циклизацию получающихся остатков Cys со снятой защитой в «завершенном пептидном продукте на смоле» формулы H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH путем проведения реакции H-D-β-Nal-Cys(Acm)-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys(Acm)-Thr-NH с раствором йода в спирте до в основном полных снятия защиты и циклизации с получением H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH.
2
14. Способ по п.1, где пептид представляет собой H-D-β-Nal-[Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys]-Thr-NH.
15. Способ по п.1, где пептид является аналогом соматостатина.
16. Способ по п.1 для получения пептида, содержащего три или более аминокислотных остатков, имеющего N-концевую аминокислоту, предпоследнюю аминокислоту, прилегающую к N-концевой аминокислоте, и С-концевую аминокислоту, как он в основном здесь описан и проиллюстрирован примерами.