СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКОКОНЦЕНТРИРОВАННЫХ РАСТВОРОВ ГЛЮКОЗЫ ИЗ ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ
METHOD FOR OBTAINING HIGHLY CONCENTRATED GLUCOSE SOLUTIONS FROM CELLULOSE-CONTAINING RAW MATERIALS

Изобретение относится к микробиологической и пищевой промышленности, а именно к получению высококонцентрированных растворов глюкозы, и может быть использовано в качестве питательной среды для конверсии широкого круга продуктов микробного метаболизма (этанола, молочной кислоты, дрожжей, бактериальной целлюлозы).
На сегодняшний день ферментативные гидролизаты из целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) являются наиболее перспективными питательными средами для получения широкого круга продуктов микробиологического синтеза. Об этом говорит достаточно большое количество тематических обзоров, публикуемых в российской и зарубежной печати [Brodeur G., Yau Е., Badal K., Collier J., Ramachandran K.B., Ramakrishnan S. Chemical and physicochemical pretreatment of lignocellulosic biomass: a review // Enzyme Research. - 2011. - V. 2011. - P. 1-17; Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and lignocellulosic chemistry // Bioenergy Research. - 2012. - №5. - P. 1043-1066; Jordan D.B., Bowman M.J., Braker J.D., Dien B.S., Hector R.E., Lee C.C., Mertens J.A., Wagschal K. Plant cell walls to ethanol // Biochemical Journal. - 2012. - №442. - P. 241-252; Sun Y., Chehg J. Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol production: a review // Bioresourse Technology. - 2002. - №83. - P. 1-11], посвященных актуальной теме ферментативного гидролиза предварительно обработанного ЦСС, в особенности на моделях из недревесного сырья.
ЦСС состоит из трех основных групп полимеров: целлюлозы, гемицеллюлоз и лигнина. Предварительная обработка биомассы является ключевым этапом в процессе эффективного ферментативного гидролиза и дальнейшей успешной микробиологической переработки гидролизатов. Цель обработки заключается в разрушении физической структуры целлюлозосодержащей биомассы и удалении нецеллюлозных компонентов (лигнин и гемицеллюлозы) для увеличения содержания и доступности целлюлозной фракции. Гемицеллюлозы неустойчивы для химического воздействия и легко удаляются даже при мягких условиях. Однако лигнин устойчив к воздействию химических веществ, и его экстрагирование из биомассы требует более жестких условий обработки.
Самым распространенным компонентом растительного сырья для получения глюкозы является целлюлоза. Как правило, многие авторы стремятся к высокому выходу глюкозы из ЦСС, при этом намеренно снижают начальную концентрацию субстрата при ферментативном гидролизе (чем ниже начальная концентрация субстрата, тем выше выход глюкозы). Проведение ферментативного гидролиза ЦСС при повышенной начальной концентрации субстрата является ключевым этапом для масштабирования процесса до промышленного производства. При этом увеличивается концентрация глюкозы в гидролизатах, а соответственно и концентрация полученных биопродуктов, и снижается стоимость процесса из-за отсутствия необходимости проведения дополнительных технологических операций по концентрированию растворов сахаров [Ioelovich М., Morag Е. Study of enzymatic hydrolysis of pretreated biomass at increased solids loading // Bioresources. - 2012. - №7. - P. 4672-4682].
На сегодняшний день известны публикации, в которых ключевой задачей является исследование ферментативного гидролиза при повышенных начальных концентрациях (60-120 г/л) образцов целлюлозы мискантуса и плодовых оболочек овса, позволяющее получать глюкозные растворы с концентрацией 40-80 г/л. Известны работы [Макарова Е.И., Будаева В.В., Скиба Е.А. Ферментативный гидролиз целлюлоз из плодовых оболочек овса при различных концентрациях субстрата // Химия растительного сырья. - 2013. - №2. - С. 43-50; Макарова Е.И. Результаты ферментации целлюлозы мискантуса в ацетатном буфере и водной среде // Химия в интересах устойчивого развития. - 2013. - Т. 21, №2. - С. 219-225; Макарова Е.И. Биоконверсия непищевого целлюлозосодержащего сырья: энергетических растений и отходов АПК: дис. … канд. технич. наук: 03.01.06. Щелково, 2015, 161 с.]. Недостатком описанных работ является использование «чистых» субстратов - образцов целлюлозы, полученных химической обработкой в две стадии, а также недостаточно высокие начальные концентрации субстрата, которые, в свою очередь, не обеспечивают биосинтез ряда продуктов с высоким выходом.
Изучение уровня техники выявило сходное по своей сути известное техническое решение по патенту РФ №2533921 (дата публикации 27.11.2014 г.), предусматривающее обработку сырья (мискантуса или плодовых оболочек злаков) разбавленным раствором азотной кислоты. Однако в предлагаемом способе не рассмотрена стадия ферментативного гидролиза полученного субстрата и полностью не отражено проведение ферментативного гидролиза при высоких начальных концентрациях субстрата. Кроме того, использование представленных в патенте продуктов предварительной обработки целлюлозосодержащего сырья в качестве субстратов позволит получить глюкозо-пентозные гидролизаты, что нежелательно при их дальнейшей биотехнологической переработке.
Другим известным способом является техническое решение по патенту US №4525218, (дата публикации 1985 г.), включающее предварительную обработку целлюлозы концентрированными растворами цинка при +65-75°C и последующий ферментативный гидролиз целлюлозы.
Недостаток предложенного способа заключается в длительности процесса, неизбежной необходимости использования коррозионно-устойчивого оборудования и, вследствие этого, высокой стоимости производимого продукта.
Известен также способ получения глюкозы из ЦСС по патенту РФ №2223327 (дата публикации 10.02.2004 г.), включающий предварительную обработку ЦСС и ферментативный гидролиз полученного субстрата.
Недостатками способа являются: использование в качестве субстратов крахмалосодержащего сырья (ячменная и рисовая дробина), а также хлопкового линта, представляющего собой практически чистую целлюлозу, использование которой в качестве субстрата ферментативного гидролиза нецелесообразно ввиду его дороговизны, низкой реакционной способности волокна и широкой востребованности в различных других областях промышленности; использование ферментных препаратов с высокой стоимостью в большом избытке приводит к неоправданному увеличению стоимости продукта, использование в процессе специального оборудования (речь о стадии предварительной обработки, осуществляемой с помощью экструзии), а также необходимость проведения дополнительных технологических операций для дальнейшего использования гидролизатов в виде сиропов в кондитерской промышленности и при производстве этанола.
Наиболее близким и потому принятым за прототип является способ получения глюкозы из ЦСС по авторскому свидетельству №562573 (дата публикации 21.09.1977 г.), предусматривающий предварительную обработку сырья, нагревание и ферментативный гидролиз.
Недостатком описанного способа является сложность и длительность процесса, так как гидролиз проходит в две стадии, способ, приведенный в данном техническом решении, применен к чистой целлюлозе, что значительно ограничивает сырьевую базу производимого продукта. Кроме того, в описываемом способе не предусмотрена возможность утилизации или рационального использования целлюлозосодержащих отходов.
Задачей заявляемого технического решения является разработка доступного (дешевого) способа получения высококонцентрированных глюкозных гидролизатов с упрощенной стадией предварительной обработки ЦСС, возможностью утилизации или использования целлюлозосодержащих отходов и сырьевой базы быстровозобновляемого растительного сырья, произрастающего на большей части территории РФ.
Поставленная задача решается предлагаемым способом получения высококонцентрированных растворов глюкозы из целлюлозосодержащего сырья, который включает предварительную обработку сырья и последующий ферментативный гидролиз, при этом предварительную обработку сырья осуществляют обработкой разбавленного раствора гидроксида натрия концентрацией 0,5-6,0%, затем производят нагрев, осуществляют выдержку в течение 1-6 ч, а ферментативный гидролиз проводят при начальных концентрациях субстрата 250-300 г/л с внесением свежей порции субстрата каждые 2-8 ч и отводом глюкозы с помощью мембранного фильтра.
В качестве целлюлозосодержащего сырья может быть использован мискантус, или плодовые оболочки, или солома злаковых культур.
Заявляемое техническое решение отличается от прототипа тем, что стадия предварительно обработки осуществляется разбавленным раствором щелочи - дешевым и эффективным реагентом. Гидролиз проводится при высоких концентрациях субстрата с последовательным внесением свежих порций субстрата. Щелочная делигнификация проводится при пониженных значениях температуры и давления, при этом отсутствует необходимость использования реакторов из специальных материалов, а остаточный раствор щелочи используется многократно. Обработка ЦСС разбавленным раствором гидроксида натрия приводит к увеличению удельной площади поверхности полученного продукта, снижению степени полимеризации и кристалличности целлюлозы, разрушает структурные связи лигнина и углеводов, а также структуру лигнина, что приводит к значительному увеличению степени конверсии целлюлозных субстратов при их дальнейшем ферментативном гидролизе.
Продукт после щелочной обработки сырья подвергают ферментативному гидролизу в ферментере в водной среде при начальных концентрациях субстрата 250-300 г/л мультиэнзимной композицией из комплекса целлюлазных, ксиланазных и β-глюканазных ферментов при фермент-субстратном соотношении 1:70-1:90. Высокая концентрация глюкозы 220-250 г/л в гидролизате обеспечивается внесением свежей порции субстрата каждые 2-8 ч и отводом глюкозы с помощью мембранной фильтрации. Полная продолжительность ферментативного гидролиза составляет 20-32 ч.
В качестве ЦСС в предлагаемом способе используются мискантус или отходы переработки злаковых культур - плодовые оболочки или солома овса. Эти источники выбраны исходя из высокого содержания целлюлозы в сырье (40-52%), доступности, низкой стоимости и быстрой возобновляемости.
Численные значения концентраций раствора гидроксида натрия в пределах 0,5-6,0% и продолжительности обработки в пределах 1-6 ч выбраны исходя из того, что уменьшение концентрации гидроксида натрия в варочном растворе менее 0,5% и увеличение продолжительности обработки свыше 6 ч приводят к снижению м.д. α-целлюлозы в образце и не обеспечивают необходимого удаления нецеллюлозных компонентов из сырья (пентозанов и лигнина), в частности продукты щелочной делигнификации мискантуса характеризуются м.д. α-целлюлозы 80%, м.д. пентозанов 9%, лигнина 10%; плодовых оболочек овса м.д. α-целлюлозы 77%, м.д. пентозанов 10%, лигнина 11%; соломы м.д. α-целлюлозы 79%, м.д. пентозанов 9,5%, лигнина 10%. Увеличение концентрации раствора гидроксида натрия выше 6,0% и соответственно уменьшение продолжительности обработки менее 1 ч не требуется, так как при этом не происходит значительного улучшения характеристик продуктов (продукты из мискантуса характеризуются м.д. α-целлюлозы 88%, м.д. пентозанов 5%, лигнина 3%; плодовых оболочек овса м.д. α-целлюлозы 85%, м.д. пентозанов 7%, лигнина 4%; соломы м.д. α-целлюлозы 87%, м.д. пентозанов 6%, лигнина 3,5%), при этом увеличивается вязкость суспензии в реакторе.
Выбранный диапазон концентраций субстратов обеспечивает получение гидролизатов с высокими значениями концентрации глюкозы при одновременно высоких значениях ее выходов. Уменьшение концентрации субстрата менее 250 г/л не позволяет получить необходимо высокой концентрации глюкозы в растворе по окончанию процесса гидролиза. Увеличение концентрации субстрата выше 300 г/л приводит к значительному снижению выхода глюкозы (менее 50%), обусловленному трудностями перемешивания суспензии из-за ее высокой вязкости, в результате чего целлюлазы имеют ограниченную подвижность из-за адсорбции на пористой структуре субстрата, а также имеет место частичное ингибирование ферментов избытком субстрата.
Последовательное внесение свежих порций субстрата через 2-8 ч также способствует получению высококонцентрированных растворов глюкозы при одновременно высокой степени конверсии субстрата. Уменьшение интервала подачи субстрата менее 2 ч приводит к резкому снижению степени конверсии субстрата (выход глюкозы 25-40%), обусловленного субстратным ингибированием ферментов. При добавлении свежей порции субстрата реже, чем через 8 ч, не происходит увеличения выхода глюкозы в гидролизатах выше 85-90% при увеличении общей продолжительности процесса гидролиза.
Для пояснения предлагаемого способа приведены примеры конкретного выполнения
Пример 1
10 кг мискантуса с влажностью 7% загружают в аппарат объемом 250 л, заливают 180 л 3%-ного раствора гидроксида натрия, включают перемешивание и нагрев рубашки аппарата. Нагревают содержимое аппарата до 98°C, выдерживают в течение 3 ч при постоянном перемешивании, охлаждают содержимое аппарата до 40°C. Суспензию фильтруют на вакуум-воронке, отжимают, промывают водой до нейтральной реакции и во влажном состоянии (влажность 75%) направляют на ферментативный гидролиз. Характеристики продукта: м.д. α-целлюлозы 83%, м.д. лигнина 6%, м.д. пентозанов 6%.
Для обеспечения концентрации субстрата 260 г/л навеску влажного субстрата массой 7,5 кг делят на 3 равные части. Первую порцию субстрата загружают в ферментер объемом 10 л, заливают 1,5 л дистиллированной воды, включают перемешивание. pH в ферментере поддерживается на уровне 4,6 автоматическим подтитровыванием 25%-ным раствором аммиака. Включают нагрев ферментера и содержимое нагревают до температуры 45-47°C, вносят 21 г мультиэнзимной композиции, состоящей из комплекса целлюлазных, ксиланазных и β-глюканазных ферментов. Через 8 ч и 16 ч в ферментер загружают вторую и третью порции влажного субстрата. Гидролизат фильтруют через мембранный фильтр с концентрированием глюкозы в отдельной емкости. Через 24 ч процесс гидролиза заканчивается. Концентрация глюкозы в ферментативном гидролизате 248 г/л, выход глюкозы от массы субстрата в пересчете на абсолютно сухое сырье 86%.
Пример 2
10 кг плодовых оболочек овса с влажностью 7% загружают в аппарат объемом 250 л, заливают 180 л 5%-ного раствора гидроксида натрия, включают перемешивание и нагрев рубашки аппарата. Нагревают содержимое аппарата до 98°C, выдерживают в течение 1,5 ч при постоянном перемешивании, охлаждают содержимое аппарата до 40°C. Суспензию фильтруют на вакуум-воронке, отжимают, промывают водой до нейтральной реакции и во влажном состоянии (влажность 75%) направляют на ферментативный гидролиз. Характеристики продукта: м.д. α-целлюлозы 85%, м.д. лигнина 4%, м.д. пентозанов 7%.
Для обеспечения концентрации субстрата 280 г/л навеску влажного субстрата массой 9 кг делят на 5 равных частей. Первую порцию субстрата сгружают в ферментер объемом 10 л, заливают 1,25 л дистиллированной воды, включают перемешивание. pH в ферментере поддерживается на уровне 4,6 автоматическим подтитровыванием 25%-ным раствором аммиака. Включают нагрев ферментера и содержимое нагревают до температуры 45-47°C, вносят 23 г мультиэнзимной композиции, состоящей из комплекса целлюлазных, ксиланазных и β-глюканазных ферментов. Через 4 ч, 8 ч, 12 ч и 16 ч в ферментер загружают свежую порцию влажного субстрата массой 1,8 кг. Гидролизат фильтруется через мембранный фильтр с концентрированием глюкозы в отдельной емкости. pH в ферментере поддерживается автоматическим подтитровыванием гидролизата. Через 22 ч процесс гидролиза заканчивается. Концентрация глюкозы в ферментативном гидролизате 264 г/л, выход глюкозы от массы субстрата в пересчете на абсолютно сухое сырье 85%.
Пример 3
10 кг соломы овса с влажностью 6% загружают в аппарат объемом 250 л, заливают 180 л 6%-ного раствора гидроксида натрия, включают перемешивание и нагрев рубашки аппарата. Нагревают содержимое аппарата до 98°C, выдерживают в течение 1 ч при постоянном перемешивании, охлаждают содержимое аппарата до 40°C. Суспензию фильтруют на вакуум-воронке, отжимают, промывают водой до нейтральной реакции и во влажном состоянии (влажность 72%) направляют на ферментативный гидролиз. Выход абсолютно сухого продукта от абсолютно сухого сырья составляет 60%. Характеристики продукта: м.д. α-целлюлозы 86%, м.д. лигнина 4%, м.д. пентозанов 6%.
Для обеспечения концентрации субстрата 250 г/л навеску влажного субстрата массой 7,2 кг делят на 3 равные части. Первую порцию субстрата массой 2,4 кг сгружают в ферментер объемом 10 л, заливают 1,5 л дистиллированной воды, включают перемешивание. pH в ферментере поддерживается на уровне 4,6 автоматическим подтитровыванием 25%-ным раствором аммиака. Включают нагрев ферментера и содержимое нагревают до температуры 45-47°C, вносят 21 г мультиэнзимной композиции, состоящей из комплекса целлюлазных, ксиланазных и β-глюканазных ферментов. Через 6 ч и 12 ч в ферментер загружают вторую и третью порции влажного субстрата массой 2,4 кг. Гидролизат фильтруется через мембранный фильтр с концентрированием глюкозы в отдельной емкости. pH в ферментере поддерживается автоматическим подтитровыванием гидролизата. Через 20 ч процесс гидролиза заканчивается. Концентрация глюкозы в ферментативном гидролизате 231 г/л, выход глюкозы от массы субстрата в пересчете на абсолютно сухое сырье 83%.
Отработанный по завершению одного цикла раствор щелочи укрепляют гидроксидом натрия до необходимой концентрации раствора (0,5-6,0%) и многократно используют вновь, отработанный 50 циклов раствор используют для получения щелочного лигнина путем разбавления водой. Лигнин при этом выпадает в осадок, затем его фильтруют и используют в качестве компонента композитов в автомобильной промышленности (арболит) и сырья в производстве компонентов топлива.
Предлагаемый способ получения высококонцентрированных растворов глюкозы из целлюлозосодержащего сырья легко реализуется на имеющемся оборудовании, используемые реактивы не являются дефицитными, эффективность заявляемого способа подтверждена положительными экспериментальными результатами.