Тканеспецифический матрикс для тканевой инженерии паренхиматозного органа и способ его получения
TISSUE-SPECIFIC MATRIX FOR TISSUE ENGINEERING OF THE PARENCHYMAL ORGAN AND A METHOD FOR PREPARING IT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине и клеточной трансплантологии, точнее к тканеспецифическим матриксам и способам получения таких матриксов,
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фундаментальной проблемой современной клинической трансплантологии является повсеместная нехватка донорских органов, которая, согласно прогнозам на ближайшие годы, будет только увеличиваться. При поиске альтернативных способов компенсации или замены поврежденных жизненно важных органов и тканей основной акцент делается на использование технологий регенеративной клеточной медицины.
Одним из ведущих направлений последней является тканевая инженерия -создание имплантируемых клеточно-инженерных конструкций (КИК) и тканеинженерных конструкций (ТИК) для длительной компенсации функции поврежденного органа. Тканевая инженерия представляет собой область медицины, занимающуюся созданием новых тканей и органов для терапевтической реконструкции поврежденного органа посредством доставки в нужную область опорных структур (матриксов или каркасов) и клеток. Основная идея тканевой инженерии заключается в использовании биологических или синтетических матриц с формой и функциями требуемого органа для последующего замещения поврежденной ткани.
КИК паренхиматозных органов включают в себя следующие компоненты:
- аутологичные или аллогенные клетки паренхиматозных органов или тканей,
- подходящий носитель (матрикс, каркас) для иммобилизации на нем клеточного материала и трансплантации созданных КИК;
Ключевым вопросом создания эффективных биомедицинских клеточных продуктов является разработка матриксов (каркасов), позволяющих доставлять специфические клетки в орган, требующий коррекции и лечения, и обеспечивать их длительное функционирование в нем.
«Матрикс» представляет собой трехмерный носитель, который является подходящим для формирования колоний клеток. Матрикс может быть колонизирован клетками или тканью. Формирование колоний клеток может протекать в искусственных условиях вне организма либо в естественных условиях в организме человека либо животного. При трансплантации матрикс используют для локализации трансплантата, а также в качестве метки допустимых границ для ткани, которая будет образовываться в организме.
Матрикс - это основное вещество ткани или органа, которое содержит другие, более специализированные структуры. Искусственно созданные матриксы изготавливают из биоматериалов: синтетических и природного происхождения с соответствующими медико-техническими свойствами. Матриксы также могут быть получены из биологических тканей посредством удаления клеточных компонентов или децеллюляризации с сохранением трехмерной структуры.
Тканеспецифический матрикс - это матрикс со свойствами определенного органа или ткани.
Трехмерные матриксы рассматриваются в качестве базовых элементов в заместительной и регенеративной медицине, обеспечивающих успешную организацию и поддержание роста, пролиферацию и дифференцировку трансплантируемых клеток в процессе формирования определенных типов живых тканей.
Матриксы для КИК и ТИК должны обладать следующими принципиально важными свойствами:
- многофункциональностью (выполнять одновременно функции каркаса, подложки и питательной среды для клеточных культур);
- механической прочностью и эластичностью, достаточной для хирургических манипуляций;
- биосовместимостью на белковом и клеточном уровне;
- способностью стимулировать пролиферацию и дифференциацию клеток;
- пористой структурой, обеспечивающей процессы неоваскуляризации;
- возможностью стерилизации стандартными способами без изменения их физико- химических и биохимических характеристик.
Известны матриксы, изготавливаемые из материалов как синтетического (металлы и их сплавы, синтетические полимеры, керамика, биостекла) (WO 2004/108810, HUMANAUTOCELL GMBH, 16.12.2004; СН 102961782 (A), UNIV TIANJIN POLYTECHNIC, 13.03.2013; KR 20120032209 (A), SNU R& DB FOUNDATION, 05.04.2012; WO 2007081704 (А2) UNIV CHICAGO, 19.07.2007), так и природного происхождения (хитозан, коллаген, желатин, эластин, фибронектин (RU 2425645 С1, ФГБУ«ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России», 10.08.2011; RU 2425646 С1, ФГБУ ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России; 10.08.2011; RU 2425647 С1, ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России 10.08.2011; RU 2425648 С1, ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России, 10.08.2011; US 2014044948 (A1), TOKYO INST TECH, 13.02.2014) с соответствующими медико-техническими характеристиками.
Известен полимерный матрикс с бимодальной структурой односвязных пор, при получении которого готовят раствор полиоксибутират-полиоксивалерат в дихлорэтане и проводят его последующие замораживание и сублимационную сушку при определенных режимах (RU 2428172 С1, ФГБУ "Курчатовский институт", 10.09.2011).
Известен универсальный матрикс на основе коллагена для трансплантации и заместительной терапии различных тканей и органов (RU 2249462 С1, В.И. Севастьянов, 10.04.2005).
Наиболее интересны биодеградируемые матриксы, которые выполняют функцию временного каркаса, способствующего формированию зрелой ткани, и полностью распадаются при взаимодействии с биологическими системами (СН 101530631 (A), UNIV WUHAN TECH, 16.09.2009). Биорезорбция приводит со временем к исчезновению трансплантата без каких-либо побочных эффектов.
Известны инъекционный гетерогенный упругоэластичный биодеградируемый биополимерный гидрогель и способ его получения, предполагающий использование коллагенсодержащих тканей животного происхождения (RU 2433828 С1, ЗАО "БИОМИР сервис", 20.11.2011). Известный гидрогель обладает длительным биостимулирующим эффектом.
Широкое распространение получили биорезорбируемые матриксы на основе биополимерных материалов и синтетических резорбируемых полимеров.
Известны биоактивный резорбируемый пористый 3D-матрикс, представляющий собой композитный продукт, объединяющий резорбируемый синтетический частично-кристаллический полимер медицинского назначения в виде 3D-матрикса и биополимерный гетерогенный гель, который инкорпорирован в часть его пор и способ его получения (RU 2533457 С1, ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России, АНО «ИМБИИТ», 20.11.2014). Биосовместимый материал сочетает положительные свойства резорбируемых синтетических полимеров и биополимерных гетерогенных гелей.
Среди природных материалов наиболее востребован коллаген, обладающий слабыми антигенными, анафилактогенными и токсическими свойствами. Наряду с перечисленными преимуществами, серьезным недостатком коллагеновых матриксов является нерегулируемое время биодеградации и ограниченный срок функционирования коллагеновых изделий в условиях живого организма, что недостаточно для полного восстановления функции органа и приводит к формированию в нем рубцовой ткани.
Основным недостатком биополимерных гидрогелевых материалов является невозможность создания из них каркасов заданной конфигурации с необходимыми физико-механическими свойствами.
Существенным недостатком синтетических полимеров является их высокая гидрофобность, что отрицательно влияет на их взаимодействие с клеточными культурами. Кроме того, слабо выраженные биоактивные свойства относительно пролиферации клеток и регенерации тканей существенно ограничивают их применения в заместительной и регенеративной медицине.
Среди приведенных выше примеров био-синтетических или синтетических матриксов для иммобилизации клеточного материала и пролонгирования сроков выживания изолированных ассоциатов тканеспецифических клеток предпочтение отдается полимерам природного происхождения (биополимерам) и их производным.
Эти матриксы наряду с высокотехнологичными свойствами обладают в разной степени выраженности биосовместимостью, механической прочностью, эластичностью, способностью к биодеградации, отсутствием иммуногенности. Однако они не обладают тканеспецифической каркасностью по отношению к тем тканям и органам, функцию которых они призваны улучшать. Такие матриксы нуждаются в дополнительной обработке: декорировании, нанесении дополнительного покрытия или модифицировании их поверхности путем введения структур - сайтов для лучшей адгезии клеток.
Известны способы изготовления нативного (тканеспецифического) матрикса различных паренхиматозных органов, обеспечивающие изготовление тканеспецифического объемного матрикса - каркаса целого органа с сохранением архитектоники ткани и микроциркуляторного русла путем децеллюляризации органа.
В литературе представлены описания методик изготовления тканеспецифических матриксов: почек (Karina Н., Nakayama B.S., Batchelder С.А., Lee С.I., Tarantal A.F. Decellularized Rhesus Monkey Kidney as a Three-Dimensional Scaffold for Renal Tissue Engineering. //Tissue Engineering. -2010. -Part A. Vol. 16. - p. 2207-2216), сердца [Ott H.C., Matthiesen T.S., Goh S.K. et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. //Nat. Med. -2008. Vol. l4(2). - p. 213-221), легких ([Petersen Т.Н., Calle E.A., Colehour M.B., Niklason L.E. Matrix composition and mechanics of decellularized lung scaffolds. // Cells Tissues Organs. -2012. -Vol. l95(3). - p. 222-231), печени [Baptista P.M., Vyas D., Moran E., Wang Z., Soker S. Human Liver Bioengineering Using a Whole Liver Decellularized Bioscaffold. //Methods Mol. Biol. -2013. -Vol. 1001, -p. 289-298) и других органов (Arenas-Herrera J.E., Ко I.K., Atala A., Yoo J.J. Decellularization for whole organ bioengineering. //Biomed Mater. -2013. Vol. 8(l):014106. Park K.M., Woo H.M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. //Transplant. Proc. -2012. -Vol. 44(4). -p. l 151-1154).
Каркасные белки нативных матриксов интегративно содержат в своем составе остатки тканевых структур (гликопротеиды внеклеточного вещества, структурные белки межклеточных контактов и факторы прикрепления клеток), которые позволяют оптимизировать условия для пролонгированной жизнедеятельности прикрепившихся клеток.
Децеллюляризированные органные матриксы предназначены для их последующей рецеллюляризации (ревитализации) и изготовления рецеллюляризованных (ревитализированных) трансплантатов целых органов путем их реинженеринга.
Известен тканеспецифический матрикс легких и способ его получения (JP 2016013123 (1), UNIV YALE 28.01.2016), при котором осуществляют перфузию ткани под определенным давлением раствором, содержащим гипертонический раствор, с удалением иммуногенных маркеров.
Для повышения эффективности децеллюляризации известно добавление к перфузионному раствору щелочи (NaOH) (CH 105031731 (A), UNIV WENZHOU MEDICAL, 11.11.2015).
Для уменьшения повреждения таких органов как сердце, легкие, почки, печень при их децеллюляризации предлагается применять статическое давление к ткани в среде, содержащей поверхностно-активное вещество (JP 2015160039 (A), ADEKA CORP, 07.09.2015; JP 2015160040 (A), ADEKA CORP, 07.09.2015).
Путем перфузии сосудистого русла донорского органа специальными децеллюляризирующими составами получают изолированный цельный децеллюляризированный орган. Он состоит из внеклеточных белков, сохраняющих внутреннюю архитектонику органа, которая при засеве клеток позволяет прикрепляться к нему различным типам клеток, обеспечивающих специализированные функции органа.
Использование децеллюляризированного органного матрикса сопровождается высоким процентом неполной децеллюляризации трансплантатов из-за возникающих в нем нарушений микроциркуляции. Сложность полноценного заселения клетками всего объема органных децеллюляризированных матриксов, а также доставки кислорода и питательных веществ ко всем прикрепленным донорским клеткам, особенно в глубине органного матрикса, приводят к низкой эффективности рецеллюляризации.
Из-за больших размеров сложно произвести надежный контроль формирования межклеточных взаимоотношений, объема и глубины заселения матриксов клеточным материалом.
Возникают технические трудности при установлении индивидуальных режимов и стандартизированных сроков культивационного перфузирования при рецеллюляризации нативных органных матриксов для формирования адекватной биологической функции вновь созданного органа.
Известен способ получения тканеспецифического матрикса паренхиматозных органов, например печени, обеспечивающий изготовление тканеспецифического объемного матрикса - каркаса целого органа с сохранением архитектоники ткани путем децеллюляризации органа (KR 20150074672 (A), UNIV YONSEI IACF, 02.07. 2015).
Метод подразумевает децеллюляризацию целого органа с дальнейшим получением из него порошкообразного матрикса. Однако для этого используется целый орган.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является тканеспецифический матрикс паренхиматозного органа, представляющий собой измельченный децеллюляризированный нативный орган (RU 2539918, ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России 27.01.2015 - ближайший аналог). При получении такого матрикса проводят профилактику внутрисосудистой агрегации клеточных элементов крови и нарушений микроциркуляции за 60-120 минут до перфузионной отмывки донорского органа. После перфузионной отмывки и извлечения донорского органа проводят его децеллюляризацию, после чего измельчают. Порции измельченных фрагментов замораживают. Далее замороженные порции измельчают повторно, размораживают, лиофильно высушивают, стерилизуют и получают образцы искомого матрикса. Известный универсальный способ получения матрикса позволяет не только сохранить нативные свойства и тканеспецифичность, но и обеспечивает более эффективную рецеллюляризацию всего объема матрикса за счет увеличения площади адгезивных поверхностей матрикса для контакта с засеваемыми клетками.
При использовании предлагаемого матрикса можно визуально контролировать рецеллюляризацию, подбирать соотношение площади матрикса и количества засеваемых клеток для повышения эффективности пролиферации последних при создании и имплантации КИК. Матрикс характеризуется адекватными условиями для прорастания сосудов, на отдельных участках матрикс сам может представлять собой стенку сосуда, что создает условия для пролонгированной жизнедеятельности посаженных на него клеток. Матрикс не требует дополнительного покрытия (декорирования, модифицирования) поверхности внеклеточными тканевыми структурными белками для усиления клеточной адгезии тканеспецифических клеток. Достоинство известного матрикса заключается в возможности его длительного хранения перед применением с сохранением тканеспецифичности.
Однако децеллюляризация при изготовлении такого матрикса проводится путем перфузии растворов детергентов через цельный орган, поэтому она, как правило, является неполной.
Кроме того, нередко орган, используемый в качестве донорского, может быть доступен только в виде фрагментов. В этом случае указанный выше способ не может быть применен для получения тканеспецифического матрикса.
При выраженном жировом гепатозе с поражением от 35% объема печени и выше она не может быть использована для трансплантации человеку, поэтому такой ценный донорский материал оказывается невостребованным.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение направлено на усовершенствование способа получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа, позволяющее расширить арсенал сырьевых материалов, повысить полноту децеллюляризации донорского органа, обеспечить длительное хранение матрикса с сохранением его тканеспецифичности.
Патентуемый способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа млекопитающего включает последовательное выполнение следующих операций:
а) получение донорского материала в виде донорского органа или его части;
б) фрагментацию донорского материала;
в) замораживание фрагментов и их последующее оттаивание;
г) первоначальное измельчение фрагментов;
д) децеллюляризацию измельченных частиц;
е) лиофилизацию измельченных частиц;
ж) замораживание измельченных частиц;
з) последующее измельчение замороженных частиц до размера в диапазоне от 50 до 300 мкм с получением образцов искомого матрикса.
Важным обстоятельством является последовательность проведения указанных этапов: сначала выполняют фрагментацию донорского материала, затем последовательно замораживают и оттаивают полученные фрагменты, далее проводят их первоначальное измельчение, только после этого осуществляют децеллюляризацию измельченных частиц, затем выполняют их лиофилизацию и последующее измельчение в замороженном состоянии.
Способ может характеризоваться тем, что указанным млекопитающим является человек, а донорский орган может быть органом человека с диагностированной смертью мозга или биологической смертью, кроме того, он может быть выбран из следующего ряда: печень, почка, легкое, поджелудочная железа, селезенка.
Способ может характеризоваться тем, что при получении донорского материала сохраняют кровенаполнение его сосудов.
Способ может характеризоваться и тем, что донорский материал представляет собой печень или ее часть и, по меньшей мере, 35% объема донорского материала поражено жировым гепатозом. Причем, поражение жировым гепатозом может составлять от 35% до 75% объема донорского материала.
Способ может характеризоваться тем, что при фрагментации донорского материала формируют фрагменты размером от 10 мм до 15 мм.
Способ может характеризоваться тем, что замораживание фрагментов донорского материала проводят при температуре от - 30°С до - 80°С, хранение фрагментов проводят при температуре от - 30°С до - 80°С, а после замораживания перед оттаиванием фрагменты выдерживают для хранения предпочтительно от 1 до 40 суток, а оттаивание фрагментов проводят при температуре от 35°С до 40°С.
Способ может характеризоваться также тем, что этап в) замораживание фрагментов и их последующее оттаивание повторяют, по меньшей мере, однократно.
Способ может характеризоваться и тем, что при первоначальном измельчении фрагментов получают частицы с размером от 0,5 мм до 5 мм.
Способ может также характеризоваться тем, что децеллюляризацию измельченных частиц проводят путем последовательной инкубации в растворах детергентов с повышающейся концентрацией при перемешивании компонентов со скоростью 2-500 оборотов в минуту, а в качестве растворов детергентов последовательно используют:
а) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% натриевой соли додецилсульфата (SDS);
б) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;
в) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS.
Способ может характеризоваться тем, что после децеллюляризации проводят отмывку децеллюляризированных фрагментов от детергентов путем инкубации с 400-500 мл PBS при их перемешивании с трехкратной заменой раствора на свежий раствор того же состава с периодичностью один раз в сутки, сохраняя при перемешивании скорость перемешиваемых компонентов, которая применялась в процессе децеллюляризации.
Способ может характеризоваться тем, что при лиофилизации фрагментов их сначала замораживают в течение 4-8 часов при температуре от -40°С до -50°С, а затем выдерживают при давлении от 2 Па до 100 Па с повышением температуры до 30-35°С в течение 18-48 часов.
Способ может характеризоваться тем, что замораживание частиц перед их последующим измельчением до размера в диапазоне от 50 до 300 мкм проводят до температуры жидкого азота.
Способ может характеризоваться тем, что измельченный продукт до частиц размером в диапазоне от 50 до 300 мкм стерилизуют γ-облучением в дозе 15 кГр, а после стерилизации хранят при температуре от 4°С до 6°С.
Кроме того, изобретение относится и к тканеспецифическому матриксу для тканевой инженерии паренхиматозного органа, который может быть получен с помощью патентуемого способа.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в:
- расширении арсенала исходных сырьевых материалов для получения тканеспецифического матрикса путем использования не только цельных донорских органов, но и их частей, а также донорских органов, которые не могут быть использованы для трансплантации по медицинским показаниям;
- обеспечении возможности длительного хранения донорского материала, а именно донорского органа или его части, при получении тканеспецифического матрикса, а также длительного, удобного хранения, в том числе в условиях бытового холодильника, полученного тканеспецифического матрикса за счет оригинальной последовательности выполнения следующих процедур, проводимых в оригинальных режимах: механическое фрагментирование, замораживание с последующим оттаиванием, первичное измельчение донорского материала, децеллюляризация во вращательном режиме, лиофильное высушивание, замораживание и последующее измельчение;
- проведении полной децеллюляризации донорских органов или их частей за счет исключения этапа децеллюляризации целого органа путем перфузии растворов детергентов по его сосудистым структурам, а также предварительного повреждения клеток путем фрагментации, замораживания, измельчения перед проведением децеллюляризации;
- проведении адекватной децеллюляризации без отмывки донорского материала от элементов крови,
- одновременном сохранении тканеспецифичности матрикса за счет сохранения нативных свойств его структурных белков, межклеточных контактов и факторов прикрепления клеток, упрощении реинженеринга матрикса с увеличением плотности и равномерности последующей рецеллюляризации при длительном хранении донорского материала и матрикса, а также использовании в качестве донорского материала частей органа и/или органа, непригодного для трансплантации в качестве цельного органа.
Такой технический результат не обеспечивался ранее при получении тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа и заявителю не известен, что позволяет считать предлагаемое изобретение соответствующим критерию «изобретательский уровень».
В основе патентуемого способа лежат неизвестные ранее свойства паренхиматозного органа сохранять тканеспецифичность после предварительного замораживания и измельчения перед децеллюляризацией, что решает проблему хранения ценного донорского материала.
Нам удалось также разработать способ децеллюляризации, исключив традиционную перфузию растворами детергентов цельного паренхиматозного органа. В предлагаемом способе удаление клеток производят из ранее измельченных частиц органа. Это позволяет значительно повысить полноту децеллюляризации за счет увеличения поверхностей контакта между раствором детергента и матриксом, а также упростить последующий реинженеринг, предполагающий засевание его клетками. Причем, предварительные фрагментация, замораживание и измельчение донорского материла приводят к разрушению клеток и способствуют повышению полноты децеллюляризации.
Нами установлено, что адекватная децеллюляризация может быть достигнута без предварительной отмывки донорского материала от элементов крови. Это позволяет использовать часть органа для приготовления матрикса, расширив тем самым арсенал исходного донорского материала. Предложенная нами технология получения тканеспецифического матрикса позволяет в процессе децеллюляризации не только удалить клетки органа, но и элементы крови.
Важным обстоятельством, используемым в настоящем изобретении, является тот факт, что в заявляемом способе в качестве исходного сырья может быть не только часть паренхиматозного органа, а также орган, который не может быть использован в качестве донорского органа для трансплантации из-за поражения при некоторых заболеваниях, например, поражение печени при жировом гепатозе.
Предлагаемая технология позволяет создать тканеспецифические матриксы с длительным сроком хранения из любого солидного органа, что является ключевой задачей при разработках биоискусственных органов.
В предлагаемом изобретении не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека. Использован донорский материал только взрослых доноров.
Для получения матрикса органа в качестве исходного материала используют соответствующий донорский орган - донорскую печень; для матрикса почки -донорскую почку и т.д.
Эксплантацию паренхиматозного донорского органа, например печени человека, производят у человека с диагностированной смертью мозга или биологической смертью. Может быть произведена резекция донорского органа для получения его части, например при родственной трансплантации, или при поражении остального объема органа при заболевании, сопровождающемся нарушением его морфологии и функции.
При этом, в качестве донорского материала может быть выбрана донорская печень человека, не использованная для трансплантации в качестве цельного органа, например из-за жирового гепатоза, занимающего от 35 до 75% ее объема. Жировой гепатоз или неалкогольная жировая болезнь печени, или стеатоз, или жировая дистрофия печени представляет собой хроническое заболевание печени, при котором происходит необратимое перерождение гепатоцитов в жировую ткань.
После эксплантации органа или его части их погружают в стерильный физиологический раствор.
При фрагментировании донорского органа предпочтительно получение фрагментов размером от 10 мм до 15 мм. Для проведения фрагментирования могут быть использованы, например хирургический скальпель или медицинские ножницы.
Замораживание и хранение фрагментов органа производят при температуре от - 30°С до - 80°С с использованием хорошо известных специалистам замораживающих устройств. Если требуется хранение фрагментов, то оно может быть осуществлено в течение предпочтительно от 1 до 40 суток.
После оттаивания до температуры от 35°С до 40°С выполняют дальнейшее механическое измельчение на частицы предпочтительно размером от 0,5 до 5 мм. Для проведения этого механического измельчения могут быть также использованы хирургический скальпель или медицинские ножницы. Полученные фрагменты для удобства последующей обработки разделяют на порции массой 15-20 г.
Децеллюляризация полученных частиц может быть проведена с использованием растворов детергентов, известных специалистам. При этом может быть использована последовательная инкубация, например, в растворах детергентов с постепенно повышающейся концентрацией:
а) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% натриевой соли додецилсульфата (SDS);
б) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;
в) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS при постоянном или периодическом перемешивании интубируемых компонентов со скоростью их вращения 2-500 оборотов в минуту. Для перемешивания могут быть использованы различные известные специалистам ротационные системы, например, горизонтальная ротационная система для флаконов, магнитная мешалка.
2
4
2
4
PBS - известный специалистам реагент, имеющий рН 7,4, представляющий собой физиологический раствор, забуференный фосфатами, следующего состава: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ КС1, 1,47 мМ KHPO, 8,1 мМ NaHPO, дистиллированная вода до 1 л.
Отмывка децеллюляризированных частиц от детергентов может быть осуществлена путем инкубации фрагментов с 400-500 мл раствора PBS при их постоянном или периодическом перемешивании, сохраняя скорость перемешивания фрагментов и раствора PBS, которая применялась в процессе децеллюляризации, с трехкратной заменой раствора на свежий раствор PBS того же состава и количества с периодичностью один раз в сутки.
Лиофилизация порций децеллюляризированных частиц с суммарной массой до 10 г может быть проведена в сублимационной камере. Их сначала замораживают в течение 4-8 часов при температуре от -40°С до -50°С, затем выдерживают при давлении от 2 Па до 100 Па с повышением температуры до 30-35°С в течение 18-48 часов.
Лиофилизованные частицы повторно механически измельчают в замороженном виде, например с помощью криомельницы. Замораживание частиц перед их последующим измельчением до размера в диапазоне от 50 до 300 мкм проводят до температуры жидкого азота.
Для получения частиц с заданным размером может быть использован набор сит с соответствующим размером ячейки для удаления фрагментов с размерами, не удовлетворяющими вышеуказанному критерию. Например, может быть использован набор сит с квадратными ячейками, например с размером ячейки 200×200 мкм (40 mesh) для удаления крупных фрагментов и сито с размером ячеек 130×130 мкм (60 mesh) для удаления мелких фрагментов.
Полученный продукт - стерильный децеллюляризированный измельченный тканеспацифический матрикс может быть длительно сохранен при температуре 4-6°С до рецеллюляризации клетками, выделенными из идентичных донорских органов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 представлена эксплантированная донорская печень крысы.
На фиг. 2 представлена гистологическая картина децеллюляризированного нативного матрикса печени крысы.
На фиг. 3 представлены данные сканирующей электронной микроскопии децеллюляризированного нативного матрикса печени крысы.
На фиг. 4 представлен результат гистологического исследования матрикса печени, полученный по предлагаемому способу, после его реинженеринга.
На фиг. 5 представлено изображение децеллюляризированного нативного матрикса почки крысы, полученное с помощью электронной микроскопии.
На фиг. 6 приведены результаты гистологического исследования фрагмента печени человека после ее децеллюляризации с использованием при перемешивании горизонтальной ротационной системы для флаконов и скорости вращения 2 оборота в минуту.
На фиг. 7 представлены результаты гистологического исследования фрагмента печени человека, децеллюляризованного с применением магнитной мешалки и скорости вращения - 500 оборотов в минуту.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приводим примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Получение тканеспецифического матрикса из цельной печени крысы. После эксплантации органа, который представлен на фиг. 1, осуществили его фрагментацию, получив фрагменты размером 1×1,5×1 см. Полученные фрагменты замораживали и хранили до 39 суток в холодильнике при -40°С. Размораживали фрагменты печени и проводили их первичное измельчение до размеров 0,3×0,5×0,3 см и составляли из них порции массой 15-20 г.
Проводили децеллюляризацию полученных порций, содержащих частицы печени крысы путем последовательной инкубации их при постоянном перемешивании со скоростью вращения 2 оборота в минуту с применением горизонтальной ротационной системы для флаконов в растворах детергентов с постепенно повышающейся концентрацией с заменой раствора на следующий с периодичностью один раз в сутки:
а) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% натриевой соли додецилсульфата (SDS);
б) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;
с) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS.
Отмывку децеллюляризированных частиц от детергентов осуществляли путем
инкубации с 400-500 мл раствора PBS при постоянном перемешивании со скоростью их вращения 2 оборота в минуту с применением горизонтальной ротационной системы для флаконов, с трехкратной заменой раствора на свежий раствор того же состава с периодичностью один раз в сутки. Лиофилизовали децеллюляризованные частицы следующим образом. Их сначала замораживали в течение 4 часов при температуре -40°С, затем выдерживали при давлении от 2 Па с повышением температуры до 35°С в течение 20 часов.
Лиофилизованные фрагменты децеллюляризированного матрикса повторно механически измельчали в замороженном виде с применением криомельницы. Для получения частиц с заданным размером был использован набор сит с квадратными ячейками с размером ячейки 200×200 мкм (40 mesh) для удаления крупных фрагментов и сито с размером ячеек 130×130 мкм (60 mesh) для удаления мелких фрагментов. После стерилизации γ-облучением в дозе 15 кГр децеллюляризированный порошкообразный матрикс хранили при температуре 4°С до рецеллюляризации клетками, выделенными из идентичных донорских органов.
Из представленных на фиг. 2 материалов гистологического исследования полученного матрикса печени крысы (фазовый контраст, увеличение микроскопа х200) и данных сканирующей электронной микроскопии полученного матрикса (х 3μm) следует, что размеры его пор составляют не более 50 мкм, а суммарная пористость полученного матрикса не превышает 80%.
Приведенные характеристики полученного в соответствии с предлагаемым способом порошкообразного матрикса свидетельствуют о его пригодности для рецеллюляризации клетками.
Пример 2. Реинжиниринг печени крысы путем засевания клетками печени тканеспецифического матрикса печени крысы. На матрикс, полученный по способу, изложенному в примере 1, осуществляли посадку клеток печени.
Выделение клеток печени осуществляли по известной методике (Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Шмерко Н.П., Севастьянов В.И., Готье С.В. Выживание клеток печени, иммобилизированных на 3-D матриксах при моделировании печеночной недостаточности //Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2011. - 3. -Т.ХШ. - с. 59-66.). Заселение частиц полученного сухого порошкообразного децеллюляризированного матрикса клетками печени осуществляли по также по известной методике (Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Шмерко Н.П., Севастьянов В.И., Готье С.В. Выживание клеток печени, иммобилизированных на 3-D матриксах при моделировании печеночной недостаточности //Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2011. - 3. - Т.ХШ. - с. 59-66.).
12
6
250 мкл влажного децеллюляризированного матрикса, содержащего от 3,5 до 3,8×10 частиц матрикса, смешивали с 1 мл суспензии клеток (1×10 клеток/мл). Матриксы из печени с клетками печени, помещали в отдельные стерильные чашки Петри (d=90 мм) для инкубации in vitro в ростовой среде DMEM/Ham F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Vedium/Nutrient Mixture F-12 Ham или среде Игла, модефицированной Дульбеко, смешанной со средой Ham F-12), с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, дексаметазона, этаноламина, селенита натрия, инсулина в объеме 10 мл.
Полученные суспензии клеток печени с частицами децеллюляризованного матрикса инкубировали в течение 5 суток. Изучение результатов прикрепления и пролиферации клеток на матриксах осуществляли на 5 сутки без замены питательной среды.
Данные гистологического исследования (гематоксилин-эозин, увеличение микроскопа ×400), представленные на фиг. 4, демонстрируют наличие адгезированных клеток печени на децеллюляризованном матриксе печени крысы, где видны децеллюляризированный матрикс печени и адгезированные клетки печени. Данный пример свидетельствует о сохранении тканеспецифических свойств полученного с помощью предложенного способа матрикса. Сравнительный анализ адгезии клеток печени на этом матриксе соответствует таковой на матриксе, полученном с помощью способа-прототипа. Матрикс, полученный по предлагаемому способу, обладает адгезивными свойствами и пригоден для рецеллюляризации.
Пример 3. Получение тканеспецифического матрикса из почки крысы. После эксплантации органа осуществили его фрагментацию, получали при этом фрагменты размерами от 10 до 15 мм. Полученные фрагменты замораживали и хранили 35 суток в холодильнике при -40°С. Размораживали фрагменты печени и проводили их первичное измельчение до размеров от 0,5 до 5,0 мм, составляли из них порции массой 15-20 г.
Проводили децеллюляризацию полученных порций, содержащих частицы почки крысы путем последовательной инкубации их при постоянном перемешивании со скоростью вращения 3 оборота в минуту с применением горизонтальной ротационной системы для флаконов в растворах детергентов с постепенно повышающейся концентрацией с заменой раствора на следующий с периодичностью один раз в сутки:
а) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% натриевой соли додецилсульфата (SDS);
б) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;
с) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS.
Отмывку децеллюляризированных частиц от детергентов осуществляли путем инкубации с 400-500 мл раствора PBS при постоянном перемешивании со скоростью их вращения 3 оборота в минуту с применением горизонтальной ротационной системы для флаконов, с трехкратной заменой раствора на свежий раствор того же состава с периодичностью один раз в сутки. Лиофилизовали децеллюляризованные частицы, сначала замораживая их порции массой до 10 г матрикса в течение 8 часов при температуре -50°С, затем высушивали в вакууме при давлении 100 Па и повышении температуры до 35°С в течение 48 часов.
Лиофилизованные фрагменты децеллюляризированного матрикса повторно механически измельчали в замороженном виде с применением криомельницы. После стерилизации γ-облучением в дозе 15 кГр децеллюляризированный матрикс хранили при температуре 6°С до рецеллюляризации клетками, выделенными из идентичных донорских органов.
Из представленных на фиг. 5 материалов в виде электронной микроскопии децеллюляризированного нативного матрикса почки крысы (х 3μm), следует, что размеры его пор составляют не более 50 мкм, а суммарная пористость полученного матрикса не превышает 80%.
Приведенные характеристики полученного в соответствии с предлагаемым способом порошкообразного матрикса свидетельствуют о его пригодности для рецеллюляризации клетками почки.
Пример 4. Получение тканеспецифического матрикса из части печени человека. Крупный фрагмент донорской печени человека разделяли на фрагменты размером 10-15 мм, замораживали до температуры - 40°С и хранили при этой температуре в течение 8 суток. После оттаивания фрагментов донорской печени человека при 37°С их механически измельчали при помощи ножниц и скальпеля до частиц, размером в диапазоне от 0,5 до 5 мм. Из полученных частиц составляли порции массой 15-20 г. Затем осуществляли децеллюляризацию порций частиц печени, последовательно инкубируя их при постоянном перемешивании со скоростью вращения 2 оборота в минуту с применением горизонтальной ротационной системы для флаконов в растворах детергентов с постепенно повышающейся концентрацией с заменой раствора на следующий с периодичностью один раз в сутки:
а) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% натриевой соли додецилсульфата (SDS);
б) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;
с) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS.
Отмывку децеллюляризированных частиц от детергентов осуществляли путем инкубации при постоянном перемешивании со скоростью вращения 2 оборота в минуту с применением горизонтальной ротационной системы для флаконов с 400-500 мл раствора PBS, с трехкратной заменой раствора на свежий раствор того же состава с периодичностью один раз в сутки. Лиофилизовали децеллюляризованные частицы, при этом сначала замораживали их (порции массой до 10 г матрикса) в течение 6 часов при температуре -40°С, затем высушивали в вакууме при давлении 2 Па при повышении температуры до 32°С в течение 18 часов. Лиофилизованные фрагменты децеллюляризированного матрикса повторно механически измельчали в замороженном виде с применением криомельницы. Для получения частиц с заданным размером был использован набор сит с квадратными ячейками с размером ячейки 200×200 мкм (40 mesh) для удаления крупных фрагментов и сито с размером ячеек 130×130 мкм (60 mesh) для удаления мелких фрагментов. Образцы стерилизовали γ-облучением в дозе 15 кГр. Стерильный децеллюляризированный измельченный матрикс хранили при температуре 5°С до рецеллюляризации клетками, выделенными из донорской печени.
На фиг. 6 приведены данные гистологического исследования фрагмента печени человека, децеллюляризованного с применением ротационной системы, скорость вращения - 2 оборота в минуту. (Окрашивание гематоксилином и эозином, увеличение х100). Из представленных на фиг. 6 материалов следует, что большая часть образца имеет рыхлую структуру, соответствует морфологии внеклеточного матрикса нативной печени.
Пример 5. Получение тканеспецифического матрикса из печени человека, пораженной жировым гепатозом. Крупный фрагмент донорской печени человека со стеатозом 52% разделяли на фрагменты 10-15 мм, замораживали до температуры -80°С и хранили при этой температуре в течение 20 суток. Производили оттаивание фрагмента донорской печени человека при 40°С и механически измельчали при помощи ножниц и скальпеля до частиц, размером от 0,5 до 5 мм. Из полученных частиц составляли порции массой 15-20 г. После чего осуществляли децеллюляризацию порций частиц печени, последовательно инкубируя их при периодическом перемешивании со скоростью вращения 500 оборотов в минуту с применением магнитной мешалки в растворах детергентов с постепенно повышающейся концентрацией с заменой раствора на следующий с периодичностью один раз в сутки:
а) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% натриевой соли додецилсульфата (SDS);
б) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;
с) 400-500 мл раствора PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS.
Отмывку децеллюляризированных частиц от детергентов осуществляли путем инкубации с 400-500 мл раствора PBS при периодическом перемешивании со скоростью вращения 100 оборотов в минуту с применением магнитной мешалки, с трехкратной заменой раствора на свежий раствор того же состава с периодичностью один раз в сутки. Децеллюляризованные частицы лиофилизовали: сначала замораживали их (порции массой до 10 г матрикса) в течение 8 часов при температуре -40°С, затем высушивали в вакууме при давлении 3 Па с повышением температуры до 30°С в течение 40 часов. Лиофилизованные фрагменты децеллюляризированного матрикса повторно механически измельчали в замороженном виде с применением криомельницы. Образцы стерилизовали γ-облучением в дозе 15 кГр. Стерильный децеллюляризированный порошкообразный матрикс хранили при температуре 4-6°С до рецеллюляризации клетками, выделенными из донорской печени.
На фиг. 7 приведен пример гистологического исследования фрагмента печени человека, пораженной жировым гепатозом, децеллюляризация которого производилась с применением магнитной мешалки, скорость вращения - 500 оборотов в минуту. (Окрашивание гематоксилином и эозином, увеличение х100).
Из представленных на фиг.7 материалов следует, что децеллюляризованные образцы, полученные с применением высоких скоростей перемешивания, демонстрируют волокнисто-ячеистую структуру хорошо отмытой ткани с минимальным количеством клеточного детрита.
Для специалиста в области тканевой инженерии должно быть очевидно, что в настоящее изобретение могут быть внесены различные модификации и изменения, не отступая от сущности и объемы формулы изобретения, которые не нашли отражения в приведенных примерах осуществления изобретения
Патентуемое изобретение может быть использовано при изготовлении КИК и ТИК для их последующей трансплантации с целью коррекции или лечения недостаточной функции паренхиматозных органов, для получения имплантируемых тканевых эквивалентов паренхиматозных органов после иммобилизации на предлагаемом матриксе соответствующего ему тканеспецифического клеточного материала.