Способ синтеза флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH)
METHOD FOR SYNTHESISING A FLUORESCENTLY LABELLED DNA PROBE FOR A REACTION OF FLUORESCENT IN SITU HYBRIDISATION (FISH)

Изобретение относится к области молекулярной биологии, а именно к способам синтеза олигонуклеотидного зонда  с флуоресцентной меткой, предназначенного для выявления хромосомных перестроек, путем гибридизации ДНК-зонда с искомой последовательностью ДНК-мишени и дальнейшей визуализации результата с помощью люминесцентного микроскопа. Заявляемый способ реализован на примере выявления делеции короткого плеча 17 хромосомы (del 17p).
Существуют различные варианты хромосомных перестроек, которые включают в себя: обмен частями одной хромосомы с другой хромосомой (транслокации), делеция или вставка нового участка хромосомы, а также дупликации или потеря целых хромосом. Как правило, хромосомные перестройки вовлечены в патогенез различных онкологических заболеваний и их выявление используется в качестве диагностических и прогностических маркеров злокачественных процессов (Liehr T. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2017, 588 р.).
В частности, делеция короткого плеча хромосомы 17 (17р), содержащего ген, кодирующий белок ТР53, возникает у 10-15% пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), встречается при раке яичников, пищевода, прямой кишки, мозга. При ХЛЛ повреждение функции белка р53 вследствие делеции 17р коррелирует с неблагоприятным прогнозом при терапии алкилирующими агентами и определяет необходимость выбора альтернативной терапии (Olivier M, Hollstein M, Hainaut P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol., 2010; 2(1):a001008).
Хромосомные перестройки могут быть обнаружены цитогенетическими или молекулярно-генетическими методами: секвенированием ДНК или полимеразно-цепной реакцией (ПЦР). Цитогенетические методы и методы секвенирования отличаются трудоемкостью и повышенными требованиями к квалификации персонала. Аллель-специфическая ПЦР ограничена способностью выявлять только отдельные точечные молекулярные изменения ДНК и не позволяет в полной мере оценивать хромосомные перестройки. На данный момент одним из самых чувствительных методов обнаружения протяженных делеций является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), позволяющая с высокой точностью регистрировать количество клеток, имеющих данное нарушение.
Для выполнения данного исследования необходимо использовать специфические олигонуклеотидные зонды с различными флуоресцентными метками, комплементарные искомой хромосомной ДНК последовательности. Специфическое связывание зонда с анализируемой ДНК в ходе процесса гибридизации выявляется при дальнейшей люминесцентной микроскопии и свидетельствует о наличии или отсутствии хромосомных перестроек (Liehr T. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2017, 605 р.).
Для создания ДНК-зондов могут использоваться искусственные хромосомы дрожжей (YACs), бактериальные искусственные хромосомы (BACs) и P1- искусственные хромосомы (PACs). YAC получают из ДНК дрожжей, которые затем лигируют с необходимой нуклеотидной последовательностью и помещают в плазмиду, их отличает низкая стабильность и высокая вероятность химеризма. Для PAC используется бактериофаг P1, и получаемая таким образом искусственная хромосома более стабильна, однако, размер последовательности, которая с ее помощью может быть наработана, не должна превышать 100 kb. По сравнению с вышеперечисленными системами BAC имеет ряд преимуществ. К ним относят: легкую отчистку полученной ДНК, малую подверженность химеризму и большую стабильность. (Kumaran Narayanan Bacterial Artificial Chromosomes. Human Press, 2015. 345 р., DOI: 10.1007/978-1-4939-1652-8).
Процесс создания зонда, который может быть использован для FISH диагностики, включает в себя следующие этапы: (1) поиск интересующей последовательности путем скрининга библиотеки BAC для определения оптимальных BAC-клонов; (2) культивирование E. Coli, содержащих плазмиду в выбранных BAC-клонах; (3) выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток E. Coli; (4) встраивание флуоресцентной метки в олигонуклеотиды; (5) очистка меченных ампликонов от непрореагировавших компонентов реакционной смеси; (6) подбор оптимальных условий денатурации и гибридизации; (3) тестирование зондов на образцах фиксированных клеток для оценки их чувствительности и специфичности к искомой последовательности ДНК.
Для внесения метки в ДНК-зонд существуют различные методы, в частности, внесение радиоактивных меток, которые требуют соблюдения соответствующих особых мер радиационной безопасности, как при подготовке зонда, так и при последующей работе с ним. Использование гаптенов (биотин, флуоресцин, диоксигенин) позволяет обойти эти ограничения, однако добавляет дополнительный этап окрашивания препарата, что увеличивает трудоемкость и время подготовки анализируемого образца. Наиболее оптимальным с точки зрения, как подготовки самого зонда, так и проведения анализа является включение в зонд прямой молекулярной метки (Cy3, Cy5), флуоресценция которой обеспечивается за счет возбуждения молекулы красителя ультрафиолетовым излучением. Известен такой способ энзиматического внедрения метки путем Nick-трансляции. При этом встраивают нуклеотид с флуоресцентной меткой в двуцепочечную ДНК, путем создания разрывов в одной из цепей с помощью ДНКазы I. А для восстановления брешей используется ДНК-полимераза I, обладающая 5'-3'-экзонуклеазной активностью, что позволяет ей восстановить разрыв с использованием меченных нуклеотидов (Mathew CG (1985). "Radiolabeling of DNA by nick translation". Nucleic Acids. Methods Mol. Biol. 2. pp. 257-61). Основным недостатком данного метода является то, что внесение разрывов в зонд снижает его специфичность по отношению к таргетной последовательности ДНК, кроме того, для применения этого метода требуется достаточно большое количество исходной ДНК.
Наиболее близким техническим решением (прототипом) к заявленному способу является способ получения ДНК-зонда для FISH, изложенный в статье Kumar R. et al. (Kumar R., Baisvar V.S., Kushwaha B. et al. Improved protocols for BAC insert DNA isolation, BAC end sequencing and FISH for construction of BAC based physical map of genes on the chromosomes. Mol. Biol. Rep., 2020, 47, рр. 2405-2413).
Способ реализуют следующим образом:
1) BAC-клоны бактерий культивируют в в течение 12 часов в LB-среде при 37°C с хлорамфениколом (12 мкг/мл), затем бактериальные колонии культивируют на жидкой среде SOB в течение 10 часов и центрифугируют при 10000g в течение 10 мин. Осадок используют для выделения плазмидной ДНК бактерий.
2) Выделение плазмидной ДНК осуществляют с использованием набора реагентов Qiagen midi kit из 60 мл культуры бактерий.
3) Встраивание флуоресцентной метки осуществляют с помощью реакции Nick-трансляции, используя 1 мкг плазмидной ДНК BAC-клона.
Недостатки указанного способа (прототипа) - большое количество ДНК, требующееся для внедрения метки при использовании Nick-трансляции, а также низкая концентрация получаемых в реакции Nick-трансляции продуктов.
Задачей изобретения была разработка способа синтеза ДНК-зонда не имеющего недостатков, характерных для технологии Nick-трансляции, то есть получение достаточного количества зонда для выполнения реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с хорошей специфичностью. С этой целью предложено техническое решение, заключающееся в использовании BAC-клона и технологии DOP-ПЦР со специально подобранными вырожденными праймерами, позволяющие как наработать ампликоны определенной длины, так и встроить в них меченные нуклеотиды.
Технический результат заключается в изготовлении олигонуклеотидного продукта с достаточной концентрацией флуоресцентно-меченого фрагмента комплементарного к искомому фрагменту ДНК для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с высокой чувствительностью, специфичностью и яркостью получаемого флуоресцентного сигнала, что позволяет проводить визуальное обнаружение данной делеции.
Технический результат достигается тем, что синтез флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для реакции флуоресцентной in situ гибридизации (FISH), например, для выявления делеции короткого плеча хромосомы 17 человека проводят путем использования для накопления комплементарной к искомому фрагменту ДНК специально подобранного ВАС-клона содержащим специфическую плазмиду RP11-89D11, культивирование данного BAC- клона проводят в среде Luria-Bertani с антибиотиком хлорамфениколом в концентрации не менее 12 мкг/мл, выделение плазмидной ДНК проводят при помощи колонок с силикатным носителем, а последующее встраивание флуоресцентной метки цианин (Cy3) посредством реакции DOP-ПЦР в буфере содержащем: 3 мкл ПЦР-буфера 10Х, 4 мкл MgCl2 (25 мМ), по 2 мкл DOP праймеров (15 мкМ), по 1 мкл dATP, dTTP, dGTP (8 мМ), 2 мкл dCTP (2 мМ), 3,8 мкл Cy3-dCTP (2 мМ), 4,2 мкл воды, 0,5 мкл Taq ДНК полимеразы (5 ед/мкл) и 4 мкл ДНК BAC-клона в объеме реакционной смеси 30 мкл на амплификторе с получением ампликонов длиной 200-700 пар нуклеотидов
Сопоставительный анализ с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков заявляемого изобретения, изложенных в его формуле. Следовательно, изобретение соответствует критерию «новизна».
Из литературных данных неизвестно о способе синтеза ДНК-зонда из BAC-клона RP11-89D11 с последующим включением метки реакцией DOP-ПЦР, который был бы идентичен заявляемому, либо явно бы вытекал из известных ранее подходов, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».
Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов:
На фиг. 1 представлена электрофореграмма продуктов амплификации DOP-ПЦР;
На фиг. 2 А, Б представлены спектры поглощения ДНК со встроенной флуоресцентной меткой, на фиг. 2 А, Б цифрой 1 обозначен спектр поглощения TE-буфера, цифрой 2 обозначены спектры поглощения ДНК BAC-клона RP11-89D11, цифрой 3 обозначена световая эмиссия ДНК BAC-клона без метки, цифрой 4 обозначена световая эмиссия ДНК BAC-клона с меткой Cy3;
На фиг. 3 представлены изображения ядер клеток, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием разработанного ДНК-зонда для выявления del17p;
На фиг. 4 представлены изображения ядер клеток, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием коммерческого ДНК-зонда для выявления del17p «Р53 deletion probe» фирмы Cytocell.
Способ синтеза зонда осуществляется следующим образом.
Получение ДНК-зонда показано на примере синтеза ДНК-зонда для выявления делеции короткого плеча хромосомы 17 человека (17p) в реакции FISH. Используя информацию о последовательность нуклеотидов в ДНК короткого плеча 17 хромосомы, содержащей участок гена TP53 был выбран бактериальный BAC-клон RP11-89D11 содержащий специфическую комплементарную последовательность плазмидных олигонуклеотидов, который ранее не использовался в синтезе ДНК-зондов, в том числе для выявления делеции 17p. Бактерии E. coli с плазмидой RP11-89D11, культивируются в 10-12 часов в среде Luria-Bertani с агаром и антибиотиком хлорамфеникол в концентрации 12,5 мкг/мл и оптимальной температуре (37 град С). Затем колонии клеток собирают и выделяют плазмидную ДНК RP11-89D11 при помощи колонок с силикатным носителем, например с помощью набора «GeneJET Plasmid Miniprep Kit (50)» (Thermo Scientific, США). В дальнейшем проводят встраивание флуоресцентной метки цианин (Cy3) в выделенную плазмидную ДНК посредством реакции DOP-ПЦР с использованием из трех вырожденных праймеров: CCGACTCGAGNNNNNNNNNNCTAGAA, CCGACTCGAGNNNNNNNNNNTAGGAG, CCGACTCGAGNNNNNNNNNNTTCTAG. Причем DOP-ПЦР проводят в буфере содержащем: 3 мкл ПЦР-буфера 10Х, 4 мкл MgCl2 (25 мМ), по 2 мкл DOP праймеров (15 мкМ), по 1 мкл dATP, dTTP, dGTP (8 мМ), 2 мкл dCTP (2 мМ), 3,8 мкл Cy3-dCTP (2 мМ), 4,2 мкл воды, 0,5 мкл Taq ДНК полимеразы (5 ед/мкл) и 4 мкл ДНК BAC-клона в объеме реакционной смеси 30 мкл на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США).
Программа амплификации указана в таблице 1.
Таблица 1. Программа амплификации DOP-ПЦР
Кол-во циклов
Шаг
Время, сек
Температура
1
1
300
95°С
4
1
60
30°С
2
180
72°С
35
1
30
94°С
2
30
56°С
3
120
72°С
Визуализацию продуктов DOP-ПЦР проводят в 1,5 % геле агарозы с помощью электрофореза в течение 1 часа. Результат представлен на фиг.1.
На фиг. 1 рядом с образцом, соответствующим продукту DOP-ПЦР BAC-клона представлен маркер молекулярного веса, позволяющий определить длину синтезированного ДНК-зонда. Видно, что полученный ДНК-зонд представляет собой смесь фрагментов длиной 150-500 п.о., что соответствует длине, которая рекомендована для ДНК-зонда.
Очистку реакционной смеси после DOP-ПЦР проводят стандартными методами, например с использованием набора «QIAquick PCR Purification Kit» (Qiagen, Германия). Конечный продукт флуоресцентно-меченого зонда получают при растворении 5 мкл очищенных ампликонов с флуоресцентной меткой в гибридизационном буфере: 70% формамид, 10% декстран сульфат, 2Х SSC.
Оценка эффективности встраивания метки в синтезированный ДНК-зонд осуществляется спектральными методами. Перед проведением спектральных исследований в каждый образец (включая контрольный буфер), содержащий 30 мкл наработанного зонда, добавляют по 1 мл деионизованной воды. Запись спектров поглощения образцами в диапазоне 200 - 400 нм проводят с помощью UV/VIS-спектрофотометра, например- UVIKON 943 (Kontron Instruments, Италия), наличие ДНК в образцах оценивают по величине оптической плотности при 260 нм. Встраивание флуоресцентной метки в зонд оценивают с помощью спектрофлуориметра, например - Varian Cary Eclipse спектрофлуориметр (Agilent Technologies, США) по наличию световой эмиссии при 568 нм после возбуждения образца при длинах волн 540 - 550 нм. На фиг. 2А на кривых, обозначенных цифрой 2, показано, что поглощение света максимально при 260 нм, что соответствует пику поглощения ДНК. На фиг. 2Б на кривых, обозначенных цифрой 4 показано, что световая эмиссия имеет пик в области 565 нм, что соответствует эмиссии флуорофора Cy3. Таким образом, можно заключить, что полученные ампликоны представляют собой фрагменты ДНК-зонда с встроенной флуоресцентной меткой Cy3.
Пример использования зонда для выявления делеции 17р в клиническом материале:
Полученный ДНК-зонд наносят на предметное стекло с фиксированными ядрами лейкоцитов крови пациента с ХЛЛ в объеме не менее 2 мкл и сверху накрывают покровным стеклом. Препарат помещают во влажную камеру на 5 минут при 75° С и затем продолжают инкубировать препарат во влажной камере в течение 12 часов при 37° С. После инкубации убирают покровное стекло, осуществляют отмывку препарата от не связавшегося ДНК-зонда. Для этого прогревают раствор 0,4Х SSC до 73° С, затем опускают в этот раствор предметное стекло на 3 минуты при 73° С, после чего предметное стекло помещают в раствор 2Х SSC с 0,05% Твин 20 на 30 секунд при комнатной температуре, после чего промывают в дистиллированной воде и высушивают в темном месте. Затем наносят 5 мкл DAPI/Antifade для контроокрашивания ядер и накрывают покровным стеклом. Препарат анализируют с помощью флуоресцентного микроскопа.
Сравнительная оценка результатов, полученных с помощью заявляемого способа с результатами, полученными с использованием ДНК-зонда для FISH «Р53 deletion probe» фирмы Cytocell (Великобритания) представлена на фигуре 3 и 4. На фиг. 3 представлен результат FISH с использованием разработанного зонда. В ядрах лейкоцитов видны яркие точки, свидетельствующие о специфическом связывании зонда с участком ДНК, комплементарным гену TP53. На фиг. 4, на которой представлен результат FISH с использованием с использованием коммерческого ДНК-зонда видно, что в каждом ядре также есть по два сигнала, соответствующие гену ТР53 на хромосоме 17.
На препаратах, полученных с использованием представленного способа и коммерческого ДНК-зонда, выполнено FISH-исследование для 15 больных хроническим лимфолейкозом. Во всех случаях флуоресцентные сигналы гибридизированных участков ДНК контрастно визуализировались по отношению к фоновой флуоресценции, что позволило достоверно определять количество флуоресцентных сигналов. При этом, у двух пациентов была выявлена делеция 17p с использованием как разработанного ДНК-зонда, так и коммерческого ДНК-зонда, в то время как остальные 13 проб показали отрицательный результат как на разработанном ДНК-зонде, так и на коммерческом аналоге, что свидетельствует о сопоставимой диагностической эффективности использования полученного ДНК-зонда и его коммерческого аналога в наборе для флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Таким образом, плазмида RP11-89D11, полученная из бактериального штамма-продуцента E.coli, показала достаточную эффективность для наработки необходимого для реакции  FISH количества ДНК-зонда, так как многокопийна и хорошо амплифицируется в присутствии хлорамфеникола, а технология DOP-ПЦР с использованием оригинальных специфических вырожденных праймеров, позволяет, как наработать ампликоны определенной оптимальной длины, так и встроить в них нуклеотиды с меткой, что дает в итоге продукт длиной 150-500 н.п., обладающий хорошей чувствительностью и специфичностью связывания с искомой ДНК мишенью.