Способ закрытия перфорации барабанной перепонки
METHOD TO CLOSE TYMPANIC MEMBRANE PERFORATION

Уровень техники
При травматической перфорации барабанной перепонки в оториноларингологии имеется большой опыт использования различных способов закрытия перфорации (пластики) с применением различных материалов ([Семенов Ф.В. Отомикроскопическое обследование больных с патологией среднего уха. «Вестник оториноларингологии» 2001:4: 48-50.) Столь большое разнообразие методик пластики и многообразие применяемых для этого материалов указывает на нерешенность данной проблемы. При использовании как аутологичных, так и синтетических пластических материалов сохраняется достаточно высокая частота рецидивов перфорации перегородки и развития гнойных отитов (Onal К., Kazikdas K.С., Uquz M.Z., Gursoy S.T. A multivariate analysis of otological, surgical and patient-related factors in determining success in myringoplasty. Clin Otolaryngol.2005:30 (2): 115-20. doi: 10.1111/j. 1365-2273.2004.00947.x).
Существует способ закрытия перфорации барабанной перепонки при помощи нанесения на края перфорации геля из гиалуроната цинка на стерильном ватном зонде в течение 7-ми дней. Гель, содержащий гиалуронат цинка, при наружном применении обладает регенерирующим действием, за счет гиалуроновой кислоты, которая является основным компонентом соединительной ткани, и обладает противомикробным действием за счет цинка (RU2256434 Способ закрытия перфорации барабанной перепонки). Недостатком данного способа является дороговизна геля, необходимость ежедневного контроля пациентов, продолжительность и кратность процедур.
Другой способ представляет собой использование тромбоцитарного сгустка крови в качестве «опоры» для неотимпанальной мембраны состоящей из височной фасции. Тромбоцитарный сгусток помещают в барабанную полость, при нахождении в которой он способствует ускорению регенерации тканей, приживлению неотимпанальной мембраны (RU 2441632 Способ тимпанопластики). Недостатками данного способа являются дополнительная травматизация в месте забора материала для неотимпанальной мембраны (височная фасция), временное ограничение подвижности слуховых косточек с возможным последующим ухудшением слуха.
В качестве ближайшего аналога принят способ закрытия перфорации барабанной перепонки при помощи аллофибробластов, которые наносили на коллагеновую мембрану (синтетическая повязка) в области дефекта барабанной перепонки. Это ускоряло процесс регенерации тканей барабанной перепонки (RU №2165765 Способ устранения травматического дефекта барабанной перепонки). Недостатками способа являются: его дороговизна, необходимость дополнительной травматизации кожи при дермопластике, длительность процесса культивирования фибробластов в предоперационном периоде, возможность возникновения аллергических реакций на синтетический материал.
До настоящего времени плазма крови, обогащенная тромбоцитарными факторами роста, не использовалась для лечения перфорации барабанной перепонки.
Задачей изобретения является создание высокоэффективного и безопасного способа лечения травматической перфорации барабанной перепонки.
Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат. Способ является высокоэффективным. Он позволяет улучшить результаты лечения перфорации барабанной перепонки за счет ускорения регенерации тканей при отсутствии аллергических реакций на введение аутоплазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, сокращает продолжительности пред- и послеоперационного периода, уменьшает финансовые затраты на лечение больных с перфорациями барабанных перепонок.
Сущность изобретения состоит в том, что в способе закрытия перфорации барабанной перепонки 0.5 мл аутоплазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, аппликационно однократно вводят в область перфорации барабанной перепонки.
Технический результат достигается за счет того, что плазма крови, обогащенная факторами роста, обладает аутологичностью (биосовместимостью), безопасна с точки зрения переноса инфекционных возбудителей. Поскольку факторы роста взаимодействуют с мембранными рецепторами, а не с ядерными рецепторами клеток, применение плазмы крови обогащенной тромбоцитарными факторами роста не влияет на гиперплазию, канцерогенез и рост опухолей. Вторичные посредники факторов роста инициируют нормальную экспрессию генов в клетках. Факторы роста не блокируют механизмов обратной связи процессов регенерации и репарации тканей, и не являются мутагенами. При этом авторы исходят из того факта, что результатом воздействия плазмы крови обогащенной факторами роста является экспрессия белков, регулирующих процессы хемотаксиса, адгезии, пролиферацию клеток, ангиогенеза, синтеза компонентов внеклеточного матрикса, дифференцировку клеток участвующих в регенерации тканей. Тем самым, использование данного изобретения способствует улучшению результатов лечения перфорации барабанной перепонки, сокращению продолжительности послеоперационного периода. Применение данного изобретения возможно даже в условиях стационара дневного пребывания.
Способ осуществляется следующим образом.
Плазму крови, обогащенную тромбоцитарными факторами роста, получают непосредственно перед операцией из собственной крови пациента путем центрифугирования цельной венозной крови (2 мл) в стерильной пробирке с антикоагулянтом 3,8% цитратом натрия. Пробирку помещают в центрифугу, в режиме 23 rpm в течение 8 минут. Происходит отделение эритроцитов от плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов. Верхний слой содержит плазму с тромбоцитами, средний - слой с лейкоцитами и последний, нижний слой, - с эритроцитами. Плазму, обогащенную тромбоцитарными факторами роста, селективно отделяют от остальных компонентов крови. После активации тромбоцитов катализатором - 10% хлоридом кальция, происходит образование биологически совместимой матрицы, из тромбоцитов которой освобождается содержимое гранул в окружающую среду. Количество катализатора из расчета 4 капли раствора на 1 мл плазмы. Фибрин, содержащийся в плазме, после активации полимеризуется, выступая в качестве матрицы для направленной регенерации тканей, и в последующем оказывает стимулирующее действие на заживление ран, обеспечивая миграцию фибробластов. Активная секреция факторов роста начинается в первые 10 минут после свертывания крови. Затем они секретируются еще в течение 3-5 дней, но в меньшей концентрации. Плазма крови, обогащенная тромбоцитарными факторами роста, должна быть активирована непосредственно перед использованием. Полученный сгусток из плазмы крови, обогащенной тромбоцитарными факторами роста, однократно аппликационно вводят в наружный слуховой проход в область перфорации барабанной перепонки.
Эффективность нового способа закрытия перфорации барабанной перепонки была доказана экспериментально.
Эксперименты выполнили на крысах самцах, линии Wistar, возраст 3 мес., массой тела 230-250 гр, в количестве 36 голов (оценивали 72 барабанных перепонок). Все работы с животными провели в соответствии с законодательством Российской Федерации, положениями Директивы 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 года по охране животных, используемых в научных целях (статья 27), а также требованиями и рекомендациями «Руководства по содержанию и использованию лабораторных животных» («Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» National Academy Press, USA 2011). Выделили 2 группы: 1-ю (экспериментальную, 18 голов) и 2-ю (контрольную, 18 голов). Рандомизацию животных проводили методом «конвертов». Животные сравниваемых групп не различались по массе тела. Масса тела составила 239±6 г и 242±5 г в первой и второй группе, соответственно. До исследования провели отоскопию на наличие воспалительных процессов, перфораций барабанной перепонки, инородных тел в наружном слуховом проходе. Травматическую перфорацию барабанной перепонки выполняли в условиях общей анестезии стерильной иглой размерами (0,6 мм × 30 мм) 23 G (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия) в задне-нижнем квадранте барабанной перепонки. Общую анестезию провели препаратами «Золазепам» и «Ксилазин» из расчета 5 мг препарата /1 кг массы тела животного в/и стерильной иглой размером 25 G (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия). В экспериментальной группе у каждой особи произвели забор 1 мл аутокрови из хвостовой вены стерильной иглой 30 G U-40 Insulin 0,30 мм × 8 мм (СФМ Госпитал Продактс ГмбХ, Зегельфлигердамм, Берлин, Германия). Кровь помещали в стерильную вакуумную пробирку объемом 1,8 мл с цитратом натрия 3,8% (PUTH ООО «Вита Хели», Ижевск). Этап центрифугирования крови с 3,8% цитратом натрия проводили в режиме 230 rpm 8 мин (центрифуга СМ-12-0-6, фабрика «НК Групп», Россия). После центрифугирования происходило разделение крови на 3 части: плазма крови с тромбоцитами, лейкоцитами и эритроцитами. Часть плазмы крови с тромбоцитами отбирали с помощью стерильной пипетки Пастера, добавляли катализатор (1 капля 10% раствора CaCl), через 15 минут происходило образование сгустка, обогащенного тромбоцитарными факторами роста. Полученный тромбоцитарный сгусток однократно аппликационно вводили в наружный слуховой проход в область перфорации барабанной перепонки животных экспериментальной группы. Визуальную оценку регенерации барабанной перепонки произвели при помощи отоскопа Welch Allyn Surgitek, США ежедневно. Эвтаназию животных провели с помощью помещения их в камеру с насыщенным углекислым газом, затем произвели микроскопическую оценку.
Статистическую обработку данных проводили в программе Statistica 7.0 методом
ANOVA и критерия U Вилкоксона-Манна-Уитни. Анализируемые величины представили в цифровом виде и в виде: Me (25%; 75%). Различия между группами на этапах эксперимента считали достоверными при р≤0,05.
В экспериментальной группе на 5-е сутки после операции признаков острого отита не было, закрытие ПБП выявили в 4 случаях, «сухая» перфорация барабанной перепонки (без признаков воспаления) сохранилась в 8 случаях (табл.). В контрольной группе на 5-е сутки после операции признаки острого отита выявили в 9 случаях, закрытие перфорации барабанной перепонки не отметили, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 3 случаях. Частота развития острого среднего отита с ПБП в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (р<0,01).
Прим. * - достоверность различий в группах, (р<0,01).
На 10 сутки после операции в 1-й группе развитие острого отита выявили в 1 случае, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 1 случае, закрытие перфорации барабанной перепонки выявили в 10 случаях. На 10 сутки после операции во 2-й группе развитие острого отита выявили в 6 случаях, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 6 случаях, закрытия перфорации барабанной перепонки не было. Частота закрытия перфорации барабанной перепонки в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (р<0,01).
На 15 сутки после операции в 1-й группе не было признаков острого среднего отита, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 1 случае, закрытие перфорации барабанной перепонки выявили в 11 случаях. На 15 сутки после операции во 2-й группе наличие признаков острого среднего отита определили в 1 случае, «сухая» перфорация барабанной перепонки сохранилась в 10 случае, закрытий перфорации барабанной перепонки отметили в 1 случае. Частота закрытия перфорации барабанной перепонки в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (р<0,05). Частота сохранения перфорации барабанной перепонки без признаков воспаления («сухая» перфорация) в 1-й группе была достоверно меньше, чем во 2-й (р<0,05).
Медиана общего числа случаев закрытия ПБП на всех этапах эксперимента в 1-й группе составила 10 и была достоверно (р≤0,01) больше, чем во 2-й- единичный случай из 36 наблюдений.
Полученные результаты свидетельствуют о благоприятном влиянии плазмы крови обогащенной тромбоцитарными факторами роста на регенерацию барабанной перепонки в условиях ее травматической перфорации. Это проявляется в достоверном уменьшении частоты развития острого среднего отита на 5 день после перфорации и в увеличении сравнительной частоты закрытия перфорации барабанной перепонки как на 10 и 15 день, так и в общем в экспериментальной группе.