ПЕРОРАЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ С ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ ЭФФЕКТОМ В ОТНОШЕНИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ
ORAL COMPOSITIONS WITH IMMUNOMODULATING EFFECT RELATIVELY TO NATURAL KILLER CELLS

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к пероральным композициям для применения в способе лечения повторных спонтанных абортов (RSA) или повторных неудачных имплантаций (RIF) после искусственного оплодотворения (ЭКО (IVF)) у субфертильных женщин, имеющих повышенное количество и/или цитотоксичность NK клеток.
Предшествующий уровень техники изобретения
Естественные клетки-киллеры (NK) представляют собой специфическую группу крупных гранулярных лимфоцитов (LGL), которые играют важную роль во врожденных иммунных ответах, а также влияют на адаптивные иммунные ответы и иммунную регуляцию (Herberman RB. Role of human natural killer cell responses in health and disease. Clin Diagn Lab Immunol 1994; 1:125-33). Они образуют 1-2% лимфоидной ткани, обнаруживаемой главным образом в селезенке. В периферической крови NK клетки составляют 5-15% всех лимфоцитов и 70-95% LGL (Stites DP, Terr AI, Parslow TG. Basic and clinical immunology. 8th edition, Appleton and Lange, Norwalk, Conn, 1994).
NK клетки экспрессируют на поверхности ряд маркеров, наиболее характерными из которых являются молекулы CD16 и CD56 (Caligiuri M. Human natural killer cells. Blood. 2008;112:461-9). На основании относительной экспрессии CD16 и CD56 NK клетки могут быть поделены на различные субпопуляции. Две основных подгруппы представляют собой CD56dim CD16bright (низкая экспрессия CD56, высокая экспрессия CD16), и CD56bright CD16dim/- (высокая экспрессия CD56, низкая или отсутствие экспрессии CD16). Клетки CD56dim CD16bright, которые составляют по меньшей мере 90% всех NK клеток периферической крови, обладают цитотоксической функцией. При активации они высвобождают перфорин и гранзимы из гранул, когда они двигаются в область воспаления в ответ на хемокины, высвобождаемые при воспалении эндотелиальными и природными иммунными клетками (Moretta A, Marcenaro E, Parolini S, Ferlazzo G, Moretta L. NK cells at the interface between innate and adaptive immunity. Cell Death Differ 2008; 15:226-33). Клетки CD56bright CD16dim/- составляют большинство NK клеток во вторичных лимфоидных тканях, они являются только слабо цитотоксичными до активации, но, под воздействием цитокинов, они немедленно продуцируют большие количества INF-γ и могут приобретать иммунорегуляторные свойства (Poli A, Michel T, Theresine M, Andres E, Hentges F, Zimmer J, CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cell subset. Immunology 2009 Apr;126(4):458-65). Такие клетки составляют основную клеточную популяцию лейкоцитов эндометрия (CD56 eGL: гранулоциты эндометрия), вероятно после локальной дифференцировки (Hiby SE1, King A, Sharkey AM, Loke YW, Human uterine NK cells have a similar repertoire of killer inhibitory and activatory receptors to those found in blood, as demonstrated by RT-PCR and sequencing, Mol Immunol. 1997 Apr;34(5):419-30).
bright
dim/-
NK-подобные клетки (CD56 CD16) являются доминантной популяцией децидуальных клеток с первых стадий беременности на протяжении первого триместра. Существуют доказательства, что их пролиферация и дифференцировка синхронизированы с секреторной фазой менструального цикла, когда эстрогены и прогестерон готовят эндометрий к предполагаемой беременности. В течение этой фазы маточные стромальные лейкоциты сильно повышаются (25% с 5%) в результате притока NK клеток из крови или других тканей, или репрограммирования и дифференцировки стромальных клеток эндометрия в NK клетки (Gellersen B, Brosens IA, Brosens JJ. Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives. Semin Reprod Med 2007; 25:445-53.Santoni A, Carlino C, Gismondi A. Uterine NK cell development, migration and function. Reprod Biomed Online 2008; 16:202-10). Если беременность развивается, NK-подобные клетки быстро повышаются и распределяются по децидуальной оболочке, вблизи от вневорсинчатого трофобласта (King A. Uterine leukocytes and decidualization. Hum Reprod Update 2000; 6:28-36). Из-за увеличения их количества и прямого контакта с внедряющимся трофобластом они важны для развития нормальной беременности. Существуют доказательства, что одновременно с имплантацией и децидуализацией бластоцисты маточные NK клетки становятся активированными, они продуцируют IFN-γ, перфорин и другие молекулы, включая ангиогенные факторы, так что они могут контролировать инвазию трофобласта посредством их цитотоксической активности, и также инициировать нестабильность сосудов и ремоделированиие децидуальных артерий для увеличения кровотока в фетоплацентарной единице (Ashkar AA, Di Santo JP, Croy BA. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. J Exp Med 2000;192:259-70). Более того, децидуальные NK клетки могут быть вовлечены в цитокин-опосредованную иммунорегуляцию материнского иммунного ответа, продуцирующего цитокины Th2-типа и факторы роста, что приводит к росту плаценты и локальной иммуносупрессии и иммуномодуляции (Clark D, Arck PC, Jallili R, et al. Psycho-Neuro-Cytokine/Endocrine pathways in immunoregulation during pregnancy. Am J Reprod Immunol 1996; 35:330-7 Chaouat G, Tranchot Diallo J, Volumenie JL, et al. Immune suppression and Th1/Th2 balance in pregnancy revisited: A (very) personal tribute to Tom Wegmann. Am J Reprod Immunol 1997; 37:427-34).
dim
bright
Децидуальные NK клетки, вероятно, являются основной клеточной популяцией, вовлеченной в случаи так называемых аллоиммунных абортов, когда эмбрион распознается как чужеродный и ʺотторгаетсяʺ матерью (Labarrere CA. Allogeneic recognition and rejection reactions in the placenta. Am J Reprod Immunol 1989;21:94-9 Stern JJ, Coulam CB: Current status of immunologic recurrent pregnancy loss. Curr Opin Obstet Gynecol 1993;5:252-9). Под влиянием цитокинов Th1-типа они стимулируются и становятся классическими NK клетками, экспрессирующими CD16 (CD56 CD16), которые могут повреждать трофобласт или непосредственно путем высвобождения цитолитических веществ или опосредованно путем продукции воспалительных цитокинов (King A, Wheeler R, Carter NP, et al. The response of human decidual leukocytes to IL-2. Cell Immunol 1992; 141:409-42).
Клинические исследования продемонстрировали, что женщины, которые склонны к абортам, имеют повышенное количество NK клеток обычного CD3-CD56+CD16+ типа в матке (Vassiliadou N, Bulmer JN: Immunohistochemical evidence for increased numbers of 'classic' CD57+ natural killer cells in the endometrium of women suffering spontaneous early pregnancy loss. Hum Reprod 1996;11:1569-74 Kwak JY, Beer AE, Kim SH, et al. Immunopathology of the implantation site utilizing monoclonal antibodies to natural killer cells in women with recurrent pregnancy losses. Am J Reprod Immunol 1999;41:91-8), а также увеличение подгрупп NK в крови и активности NK клеток которые ассоциированы с абортом эмбрионов с нормальными хромосомами (Coulam CB, Goodman C, Roussev RG, et al. Systemic CD56+ cells can predict pregnancy outcome. Am J Reprod Immunol 1995;33:40-6 Aoki K, Kajiura S, Matsumoto Y, et al. Preconceptual natural killer cell activity as a predictor of miscarriage. Lancet 1995; 345:1340-2).
bright
dim/-
Из-за вышеуказанных данных повышенное количество и/или цитотоксичность NK клеток периферической крови (CD56 CD16) используют в практике для диагностики аллоиммунных абортов и в качестве маркеров для выбора женщин для иммунотерапии (Coulam CB, Goodman C, Roussev RG, et al. Systemic CD56+ cells can predict pregnancy outcome. Am J Reprod Immunol 1995;33:40-6 Aoki K, Kajiura S, Matsumoto Y, et al. Preconceptual natural killer cell activity as a predictor of miscarriage. Lancet 1995; 345:1340-2).
Классически основным лечением для уменьшения активности вредных NK клеток и предотвращения абортов и/или RIF была активная иммунизация женщин с использованием лимфоцитов отца или третьего лица (Gafter U, Sredni B, Segal J, Kalechman Y. Suppressed cell-mediated immunity and monocyte and natural killer cell activity following allogeneic immunization of women with spontaneous recurrent abortion. J Clin Immunol 1997; 17:408-19), и пассивная иммунизация в форме внутривенного введения иммуноглобулина G (IVIg) (Ruiz JE, Kwak JY, Baum L, et al. Intravenous immunoglobulin inhibits natural killer cell activity in vivo in women with recurrent spontaneous abortion. Am J Reprod Immunol 1996; 35:370-5). Некоторыми известными побочными эффектами или нежелательными явлениями внутривенного иммуноглобулина являются: асептический менингит, почечная недостаточность, тромбоэмболия, гемолитические реакции, анафилактические реакции, заболевания легких, энтерит, кожные расстройства и инфекционные заболевания (Stiehm, 2013). Альтернативным методом лечения, предложенным в течение последних лет для подавления функциональной цитотоксичности NK клеток, является внутривенное введение жировых эмульсий (например, Intralipid), включающих очищенное соевое масло, очищенный яичный фосфолипид, безводный глицерин и воду для инъекций, которые обычно используются в качестве источника энергии и незаменимых жирных кислот у пациентов с питательными или другими расстройствами, требующими парентерального питания (Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin, Intralipid and soluble human leukocyte antigen-G. Am J Reprod Immunol 2007;57:262-9, Meng L, Lin J, Chen L, Wang Z, Liu M, Liu Y, Chen X, Zhu L). Лечение Intralipid уменьшает цитотоксичность NK клеток периферической крови, но не снижает количество NK клеток периферической крови. Более того, внутривенная инфузия Intralipid может вызывать некоторые побочные эффекты, такие как боль в мочевом пузыре, кровь в моче или мутная моча, озноб, затрудненное, жгучее или болезненное мочеиспускание, лихорадку, частые позывы на мочеиспускание, боль в пояснице или в боку, сухость во рту и рвоту. Недавние исследования показали, что внутривенное введение Intralipid может вызывать гепатомегалию, желтуху, холестаз, спленомегалию, тромбоцитопению, лейкопению или синдром жировой нагрузки (<1% в клинических исследованиях) (FDA,2007).
И увеличение количества и повышенная цитотоксичность NK клеток периферической крови могут вызывать повторные спонтанные аборты (Am J Reprod Immunol. 2007 Nov;58(5):447-59. Decline in number of elevated blood CD3(+) CD56(+) NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy, van den Heuvel MJ1, Peralta CG, Hatta K, Han VK, Clark DA; An Increased NK-cell percentage 5 days after the pregnancy termination could be a marker of immune aetiology of miscarriage, as the probability of an aborter with NK >12% to have an immune-mediated abortion is almost 90%. Am J Reprod Immunol. 2008 Apr;59(4):306-15. doi: 10.1111/j.1600-0897.2007.00547.x. Epub 2008 Feb 21).
Было показано, что оценка NK клеток периферической крови в момент аборта является значимой и обусловлена важной ролью повышенного количества NK клеток. (Paparistidis N1, Papadopoulou C, Chioti A, Papaioannou D, Tsekoura C, Keramitsoglou T, Kontopoulou-Antonopoulou V, Agapitos E, Balafoutas C, Varla-Leftherioti M).
Ряд исследований показали, что снижение количества и активности периферических NK клеток приводит к существенному увеличению частоты живорождений, что возникает при очень высоких дозах (Am J Reprod Immunol. 2006 Mar;55(3):232-9; High levels of peripheral blood NK cells in women suffering from recurrent spontaneous abortion are reverted from high-dose intravenous immunoglobulins (Perricone R1, Di Muzio G, Perricone C, Giacomelli R, De Nardo D, Fontana L, De Carolis C. Am J Reprod Immunol. 2010 Mar 1;63(3):263-5. doi: 10.1111/j.1600-0897.2009.00790.x. Epub 2010 Jan 8; CD3-CD56+CD16+ natural killer cells and improvement of pregnancy outcome in IVF/ICSI failure after additional IVIG-treatment. Heilmann L1, Schorsch M, Hahn T. Am J Reprod Immunol. 2007 Apr;57(4):262-9; Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin, intralipid and soluble human leukocyte antigen-G.. Roussev RG1, Ng SC, Coulam CB.(Am J Reprod Immunol. 2007 Nov; 58(5):447-59; Decline in number of elevated blood CD3(+) CD56(+) NKT cells in response to intravenous immunoglobulin treatment correlates with successful pregnancy. Van den Heuvel MJ1, Peralta CG, Hatta K, Han VK, Clark DA).
Вышеупомянутые варианты лечения имеют ряд недостатков и неудобств. Например, они требуют повторной госпитализации пациентов, а также постоянного наблюдения врача. Более того, так как пациентов госпитализируют, они могут подвергнуться внутрибольничным инфекциям. Кроме того, такие методы ассоциированы с рисками и побочными эффектами интервенционного лечения (включая жизнеугрожающие, как сепсис из-за продуктов человеческого происхождения, гиперкоагуляцию из-за инфузий жировой эмульсии). Кроме того, такое лечение ассоциировано с серьезными побочными эффектами.
Настоящее изобретение решает указанные проблемы и обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с предшествующей областью техники.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение предоставляет пероральные композиции, включающие комбинацию жирных кислот или их сложных эфиров для применения женщинами, которые имели повторные спонтанные аборты (RSA) или повторные неудачные имплантации (IVF) и имеют повышенное количество и/или цитотоксичность NK клеток периферической крови.
Композиции по настоящему изобретению включают в качестве активных ингредиентов комбинацию жирных кислот или их сложных эфиров и их можно вводить в определенных количествах и в течение определенного периода времени.
Соответственно, настоящее изобретение имеет целью предотвратить иммуноопосредованную суб-фертильность в существенно большей когорте пар, имеющих связанные проблемы, которые вне зависимости от их семейного статуса лишают их возможности родить ребенка, что также может иметь существенное социальное, психологическое и экономическое влияние.
Подробное описание изобретения
В настоящее время неожиданно было обнаружено, что пероральная композиция, включающая смесь жирных кислот или их сложных эфиров, вводимая в определенных количествах и в течение определенного периода времени, снижает количество и цитотоксичность периферических NK клеток у женщин, имеющих повторные спонтанные аборты (RSA) или повторные неудачные имплантации (RIF), и имеющих повышенное количество NK клеток периферической крови и/или повышенную цитотоксичность NK клеток периферической крови.
Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает пероральную композицию, включающую в качестве активных ингредиентов комбинацию жирных кислот или их сложных эфиров, для применения в способе лечения повторных спонтанных абортов или повторных неудачных имплантаций у женщин, имеющих 12% или более NK клеток периферической крови среди общего количества клеток периферической крови и/или где цитотоксичность NK клеток периферической крови пациентки по меньшей мере на 10% выше, чем средняя цитотоксичность контрольной популяции здоровых женщин репродуктивного возраста без репродуктивных неудач и которые родили по меньшей мере одного ребенка, где композицию вводят перорально в течение 15-70 дней и где общее количество жирных кислот или их сложных эфиров, вводимое в сутки, составляет от 0,03 г/кг массы тела до 1 г/кг массы тела, рассчитанное в виде жирных кислот.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения повторных спонтанных абортов или повторных неудачных имплантаций у женщин, имеющих 12% или более NK клеток периферической крови в общем количестве клеток периферической крови и/или где цитотоксичность NK клеток периферической крови женщины по меньшей мере на 10% выше, чем средняя цитотоксичность контрольной популяции здоровых женщин репродуктивного возраста при отсутствии репродуктивных неудач и которые родили по меньшей мере одного ребенка, включающий введение женщине пероральной композиции, содержащей в качестве активных ингредиентов комбинацию жирных кислот или их сложных эфиров, где композицию вводят перорально в течение 15-70 дней и где общее количество жирных кислот или их сложных эфиров, вводимое в сутки, составляет от 0,03 г/кг массы тела до 1 г/кг массы тела, рассчитанного как жирные кислоты.
С целью оценки цитотоксичности NK клеток могут быть применены несколько методов. Хотя высвобождение 51Cr является классическим методом для определения цитотоксичности, альтернативные методы являются доступными и некоторые другие в стадии разработки. В лабораториях, где применение радиоактивных изотопов нежелательно или недопустимо, или когда используют опухолевые клетки-мишени, которые с трудом поглощают метку 51Cr, могут быть использованы тест-системы, которые используют ферменты и колориметрические или флуорометрические красители. В настоящее время наиболее частым методом для определения активности NK клеток является поточная цитометрия, способ, который может быть модифицирован относительно применения реагентов, тем не менее, результат остается прежним. (Determination of natural killer cell function by flow cytometry.Kimberly l.Kane et al, Clinical and diagnostic laboratory immunology, may 1996, p. 295-300; Evaluation of a Flow Cytometry-Based Assay for Natural Killer Cell Activity in Clinical Settings, R. Valiathan et al. 2011 The Authors. Scandinavian Journal of Immunology).
Специалист в области техники понимает, что цитотоксичность NK обычно может меняться у пациента из-за множества возможных иммунологических и эндокринных влияний на NK клетки. Следовательно, при повторном тестировании здоровых пациентов можно ожидать минимальные изменения активности NK. Различная контрольная популяция может обеспечить различные средние значения цитотоксичности NK. С целью получения статистически корректного результата чем больше контрольных образцов, тем лучше. Тем не менее, настоящее изобретение применимо к пациенткам, имеющим цитотоксичность NK клеток периферической крови по меньшей мере на 10% выше, чем средняя цитотоксичность контрольной популяции здоровых женщин репродуктивного возраста с отсутствием репродуктивных неудач, таких как выкидыш или неуспешные IVF, и у которых есть по меньшей мере один ребенок.
В соответствии с настоящим изобретением термин ʺповторные спонтанные аборты (RSA)ʺ определяют, как две или более спонтанных потери беременности до 20й недели беременности.
В соответствии с настоящим изобретением термин ʺповторные неудачные имплантации (RIF)ʺ определяют, как отсутствие имплантации после двух повторных неудачных циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), или интрацитоплазматической инъекции спермы (ИКСИ) или циклов внедрения замороженных эмбрионов.
В соответствии с настоящим изобретением повышенную цитотоксичность NK клеток периферической крови определяют, как любую уничтожающую активность, которая по меньшей мере на 10% выше, чем средняя цитотоксичность контрольной популяции здоровых женщин репродуктивного возраста при отсутствии репродуктивных неудач, таких как выкидыш или неуспешные IVF, и которые родили по меньшей мере одного ребенка.
Термин ʺлечение повторных спонтанных абортов или повторных неудачных имплантацийʺ обозначает снижение риска невынашивания у леченной пациентки по сравнению с риском, который у нее может быть при отсутствии лечения, а также улучшение исходов беременности.
В соответствии с настоящим изобретением термин ʺжирная кислотаʺ обозначает алифатическую одноосновную карбоновую кислоту, имеющую насыщенную или ненасыщенную цепочку, обычно включающую от 4 до 28 атомов углерода.
В соответствии с настоящим изобретением термин ʺдлинноцепочечная жирная кислотаʺ обозначает жирную кислоту, имеющую алифатическую цепь из 13 или более атомов углерода.
В соответствии с настоящим изобретением, термин ʺсреднецепочечная жирная кислотаʺ обозначает жирную кислоту, имеющую от 6 до 12 атомов углерода.
В соответствии с настоящим изобретением термин ʺкороткоцепочечная жирная кислотаʺ обозначает жирную кислоту, имеющую менее чем 6 атомов углерода.
Композиции по настоящему изобретению содержат комбинацию жирных кислот или их сложных эфиров. Жирные кислоты включают короткоцепочечные, среднецепочечные или длинноцепочечные, насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты. Предпочтительно композиции по настоящему изобретению включают длинноцепочечные жирные кислоты или длинноцепочечные и среднецепочечные жирные кислоты.
Примеры насыщенных длинноцепочечных жирных кислот включают пальмитиновую, стеариновую, миристиловую и арахиновую кислоту.
Примеры мононасыщенных длинноцепочечных жирных кислот включают олеиновую, докозагексаеновую (DHA), эйкозапентаеновую (EPA), пальмитоолеиновую, миристолеиловую и сапиеновую кислоту.
Примеры полинасыщенных длинноцепочечных жирных кислот включают линолевую, α-линоленовую и γ-линоленовую кислоту.
Примеры среднецепочечных жирных кислот включают лауриловую, каприновую и каприловую кислоту.
Примеры короткоцепочечных жирных кислот включают бутановую, 2-метилпропановую, пентановую и 3-метилбутановую кислоту.
1
6
Сложные эфиры жирных кислот композиции по настоящему изобретению представляют собой сложные эфиры жирных кислот с алифатическими спиртами, такими как C-C спирты, глицеридами, т.е. моноглицеридами, диглицеридами или триглицеридами, фосфолипидами, такими как фосфатидовые кислоты или фосфоглицериды, сфинголипидами, сахаролипидами, восками и их смесями. Предпочтительно сложные эфиры жирных кислот представляют собой глицериды, сфинголипиды или сахаролипиды и их смеси. Более предпочтительно сложными эфирами жирных кислот являются глицериды.
В соответствии с настоящим изобретением термин ʺрассчитанный, как жирные кислотыʺ обозначает, что, когда композиция включает сложные эфиры жирных кислот, их количество необходимо преобразовывать в таковое соответствующих жирных кислот с целью определения количества пероральной композиции для введения.
Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну насыщенную, по меньшей мере одну мононенасыщенную и по меньшей мере одну полиненасыщенную длинноцепочечную жирную кислоту или их сложный эфир.
Предпочтительно по меньшей мере 50 мас.% активных ингредиентов в композициях по настоящему изобретению, рассчитанные как жирные кислоты, представляют собой длинноцепочечные жирные кислоты или их сложные эфиры. Более предпочтительно по меньшей мере 65 мас.% активных ингредиентов в композициях по настоящему изобретению, рассчитанные как жирные кислоты, представляют собой длинноцепочечные жирные кислоты или их сложные эфиры. Еще более предпочтительно по меньшей мере 97 мас.% активных ингредиентов в композициях по настоящему изобретению, рассчитанных как жирные кислоты, представляют собой длинноцепочечные жирные кислоты или их сложные эфиры.
Жирные кислоты композиций по настоящему изобретению действуют как внутриклеточные и межклеточные медиаторы, имеющие различные эффекты на иммунный и воспалительный ответы, где вовлечены NK клетки. Жирные кислоты вовлечены через несколько механизмов в модуляцию иммунной системы, включающих (i) текучесть мембраны; (ii) продукцию липидных пероксидов; (iii) синтез эйкозаноидов; и (iv) влияние на регуляцию генов. Возможно, что иммуномодуляция жирными кислотами осуществляется не только отдельно, но также совместным действием таких факторов.
Композиции по настоящему изобретению могут включать дополнительные активные ингредиенты, такие как витамины, ионы металлов или аминокислоты. Когда такие активные ингредиенты присутствуют, их общее количество составляет предпочтительно менее чем 6% общего количества активных ингредиентов. Примеры витаминов включают витамины B1, B2, B3, B6, D, миоинозитол, инозитол и фолиевую кислоту. Ионы металлов могут включать, например, селен, магний, медь, цинк или марганец. Аминокислоты могут включать натуральные аминокислоты, такие как L-аргинин или L-глютамин. Витамины, ионы металлов или аминокислоты не влияют непосредственно на уменьшение количества и/или цитотоксической активности NK клеток, но влияют на иммунную защиту организма путем поддержки физических барьеров, клеточного иммунитета и продукции антител. Тем не менее существует мнение, что стероидный гормон 1,25-дигидроксивитамин D3 {1,25-(OH)2-D3) оказывает иммуносупрессивное действие.
Присутствие витаминов в композициях по настоящему изобретению вызывает модуляцию иммунного ответа и оказывает гомеостатический эффект на окружение, где находятся NK клетки. Целью является создание благоприятного окружения и участие в улучшении всего репродуктивного процесса, осуществляя модуляцию материнского ответа путем поддержания баланса иммунной системы. Однако, повышенный уровень витаминов может усиливать иммунную систему и увеличивать эффект NK клеток. По этой причине, когда витамины присутствуют в композициях по настоящему изобретению, их общее количество предпочтительно составляет менее чем 4% общего количества активных ингредиентов.
Композиции по настоящему изобретению могут иметь любую форму, подходящую для перорального введения. Такие формы хорошо известны в области техники и включают жидкие формы, такие как пероральные растворы, пероральные суспензии и пероральные эмульсии, пероральные гели или твердые формы, такие как таблетки, капсулы или саше. Композиции по настоящему изобретению можно вводить в виде пищевых добавок.
В добавление к активным ингредиентам композиции по настоящему изобретению могут включать одно или более фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, хорошо известных в области техники, таких как вяжущие вещества, разбавители, дезинтегрирующие вещества, суспендирующие средства, смазывающие вещества, растворители, эмульгаторы, загустители, буферы, консерванты, подсластители, красители, ароматизаторы и подобные.
Композиции могут быть получены способами, хорошо известными в области техники.
Композиции по настоящему изобретению вводят в течение от 15 до 70 дней. Предпочтительно композиции вводят в течение от 30 до 60 дней. Более предпочтительно, композиции вводят в течение от 40 до 50 дней.
Композиции по настоящему изобретению можно вводить один раз в сутки или более чем один раз в сутки, например, два раза в сутки. Тем не менее в соответствии с настоящим изобретением общее количество жирных кислот или их сложных эфиров, вводимое в сутки, составляет от 0,03 г/кг массы тела до 1 г/кг массы тела, рассчитанного как жирные кислоты. Предпочтительно общее количество жирных кислот или их сложных эфиров, вводимое в сутки, составляет от 0,10 г/кг массы тела до 0,70 г/кг массы тела, рассчитанного как жирные кислоты. Более предпочтительно общее количество жирных кислот или их сложных эфиров, вводимое в сутки, составляет от 0,20 г/кг массы тела до 0,50 г/кг массы тела, рассчитанное как жирные кислоты.
Композиции по настоящему изобретению специфически снижают количество и цитотоксичность NK клеток периферической крови без общего подавления иммунной системы.
С помощью настоящего изобретения и цитотоксичность NK клеток и процент NK клеток в общем количестве клеток периферической крови остается на низком уровне в течение 12-14 недель после прекращения лечения, достигая длительной протекции и предотвращения RSA или RIF у субфертильных женщин, имеющих повышенное количество NK клеток периферической крови и/или повышенную активность NK клеток периферической крови. Это представляет собой существенное улучшение по сравнению с внутривенным введением Intralipid, при котором эффект прекращается через 6-9 недель после прекращения лечения (Acacio B, Ng SC,Coulam CB., Am J Reprod Immunol. 2008 Sep;60(3):258-63. doi: 10.1111/j.1600-0897.2008.00621.x.Duration of intralipid's suppressive effect on NK cell's functional activity Roussev RG). Более того, лечение Intralipid уменьшает цитотоксичность NK клеток периферической крови, но неизвестно чтобы оно снижало количество NK клеток периферической крови. Наоборот, настоящее изобретение уменьшает и количество и цитотоксичность NK клеток периферической крови. Кроме того, внутривенная инфузия Intralipid может вызывать несколько побочных эффектов, таких как боль в мочевом пузыре, кровь или мутность в моче, затрудненное, жгучее или болезненное мочеиспускание, лихорадку, частые позывы на мочеиспускание, боль в пояснице или в боку, сухость во рту и рвоту, тогда как настоящее изобретение не проявляет таких побочных эффектов.
В противоположность вариантам лечения предшествующей области техники, в которых применяются внутривенные или подкожные инфузии (иммунизация лимфоцитами), в настоящем изобретении композиции вводят перорально и их компоненты потребляются через пищеварительный тракт и следуют нормальному процессу потребления и абсорбции пищи. Таким образом лечение RSA или RIF становится проще и безопаснее по сравнению с вариантами лечения в предшествующей области техники. Более того, с настоящим изобретением нет необходимости в госпитализации или постоянном наблюдении врача, что защищает женщин от внутрибольничных инфекций. Кроме того, настоящее изобретение не ассоциировано с рисками и побочными эффектами интервенционного лечения. Более того с настоящим изобретением уменьшение количества и цитотоксичности NK клеток периферической крови продолжается дольше после прекращения лечения и достигается длительная защита по сравнению с вариантами лечения в предшествующей области техники.
Примеры
Примеры 1-4 иллюстрируют эффект композиций по настоящему изобретению по уменьшению количества периферических NK клеток и их активности (цитотоксичность). Композиции вводили здоровым женщинам репродуктивного возраста (в возрасте от 25 до 46 лет), имеющим RSA или RIF, и имеющим повышенное количество и активность NK клеток периферической крови. Образцы крови от всех женщин тестировали в нулевой день до начала лечения, в день 45 и в день 70 в зависимости от случая. Все они проходили рутинное обследование через 12 недель после прекращения лечения.
Исследование образцов периферической крови на процент NK клеток среди всех лимфоидных клеток и активность NK клеток проводили поточной цитометрией с использованием ранее описанных методик. (Determination of natural killer cell function by flow cytometry.Kimberly l.Kane et al., Clinical and diagnostic laboratory immunology, may 1996, p. 295-300; Evaluation of a Flow Cytometry-Based Assay for Natural Killer Cell Activity in Clinical Settings, R. Valiathan et al. 2011 The Authors. Scandinavian Journal of Immunology). Указанный способ дает процент клеток-мишеней, уничтожаемых натуральными цитотоксическими клетками, присутствующими в PBL. Два флуоресцентных красителя использовали для отличия эффекторных и клеток мишеней и живых и мертвых клеток-мишеней. Одним является зеленый флуоресцентный краситель, 3,3'-диоктадецилоксакарбоцианин перхлорат (DiO), который используют для метки плазматических мембран K562, клеточной линии человеческих эритролейкемических опухолевых клеток, используемых в качестве популяции мишени. Второй краситель йодид пропидия (PI), непроникающий через мембраны, красный флуоресцентный краситель, который добавляют во время анализа, когда мембраны клеток мишеней разрушаются NK-подобными клетками. Интактные клетки мишени, непораженные эффекторами, были единственно позитивными (и демонстрировали только зеленую флуоресценцию), тогда как мишени, уничтожаемые эффекторами, несущие нарушенные мембраны, являются двойными позитивными (и демонстрируют и зеленую и красную флуоресценцию). Эффекторные клетки и клетки мишени добавляют в пробирки для создания различных соотношений эффектор-к-мишени (E:T) 1:50, 1:25 и 1:12,5. В следующих примерах результаты представлены в виде соотношений E:T 50:1.
(Natural killer cell functional activity suppression by intravenous immunoglobulin, intralipid and soluble human leukocyte antigen-G. Roussev RG1, Ng SC, Coulam CB. Am J Reprod Immunol. 2007 Apr; 57(4):262-9.).
Контрольными образцами были здоровые женщины репродуктивного возраста с отсутствием репродуктивных неудач, таких как выкидыши или неудачные IVF, и которые родили по меньшей мере одного ребенка. На основании здоровой контрольной популяции средняя цитотоксичность NK составила 19% в соотношении 50:1.
Изменения цитотоксичности и количества NK клеток от дня 0 до дня 70 измеряли вышеуказанным способом. Во время введения композиций по изобретению исходный средний процент активности и количество NK клеток достоверно снижались через 45 дней и затем снижались близко к исходному уровню после 70 дней. Повторное измерение после введения пероральной композиции показало достоверное снижение и количества и цитотоксичности NK клеток.
В примерах ниже используются следующие сокращения:
LCFA - длинноцепочечные жирные кислоты,
SFA - насыщенные жирные кислоты,
MUFA - мононенасыщенные жирные кислоты,
PUFA - полиненасыщенные жирные кислоты,
MCFA - среднецепочечные жирные кислоты.
Пример 1
Группу из 15 женщин лечили один раз в сутки пероральной композицией 1 в форме перорального раствора, включающего активные ингредиенты, показанного в таблице 1a. Жирные кислоты композиции находились в форме глицеридов. Количество вводимой композиции было таковым, что общее количество жирных кислот, вводимое в сутки, составило 0,25 г/кг массы тела. Образцы крови собирали и тестировали до и через 45 дней после начала лечения.
Таблица 1a
% активных веществ
LCFA 97,64%
SFA 14,74%
Миристиновая кислота
0,20%
Пальмитиновая кислота
4,50%
Стеариновая кислота
10,04%
MUFA 23,39%
Олеиновая кислота
21,39%
Докозагексаеновая кислота (DHA)
0,50%
Эйкозапентаеновая кислота (EPA)
1,50%
PUFA 59,51%
Линолевая кислота
49,27%
γ-линоленовая
0,50%
α-линоленовая
9,74%
Витамины 1,64%
В1
0,02%
В2
0,02%
В3
0,02%
В6
0,01%
D3 (15 мкг-600 МЕ)
0,48%
Фолиевая кислота
0,03%
Миоинозитол
1,06%
Ионы металлов 0,10%
Медь
0,01%
Цинк
0,02%
Магний
0,06%
Марганец
0,01%
Аминокислоты
L-глютамин
0,62%
Результаты количества и активности NK клеток периферической крови показаны в таблице 1b.
Таблица 1b: (45 дней)
Пациенты15
День 0
День 45
Среднее снижение %
День 0
День 45
Среднее снижение активности %
NK% количество(среднее)
NK% количество(среднее)
NK активность
NKактивность
20,25
13,59
31
46,26
18,54
59,92
Средний процент NK клеток периферической крови в общем количестве клеток периферической крови составил 20,25 в день 0 до лечения и 13,59 в день 45 после начала лечения. Такое различие было статистически значимым (p значение <0,0001).
Средняя активность NK клеток периферической крови в соотношении 50:1 составила 46,26 в день 0 до лечения и 18,54 в день 45 после начала лечения. Такое различие было статистически значимым (p значение <0,0001).
Пять женщин вышеупомянутой группы продолжили лечение в течение всего 70 дней. Их обследовали в день 70 в отношении активности и количества NK клеток. Результаты показаны в таблице 1c.
Таблица 1c: (70 дней)
Пациенты5
День 0
День 70
Среднее снижение %
День 0
День 70
Среднее снижение активности %
NK% количество(среднее)
NK% количество(среднее)
NK активность
NKактивность
18,42
11,45
37,41
46,54
13,60
70,43
Средний процент NK клеток периферической крови в общем количестве клеток периферической крови составил 18,42 в день 0 до лечения и 11,45 через 70 дней после начала лечения. Указанное различие было статистически значимым (p значение <0,0001).
Средняя активность NK клеток периферической крови в соотношении 50:1 составила 46,54 в день 0 до лечения и 13,60 через 45 дней после начала лечения. Такое различие было статистически значимым (p значение <0,0001).
Все женщины, получавшие указанную композицию, в настоящее время беременны.
Пример 2
Группу из 6 женщин обследовали в день 0 и день 70 в отношении количества и активности NK клеток после введения пероральной композиции 2 один раз в сутки. Композиция находилась в форме перорального раствора, включающего активные ингредиенты, показанные в таблице 2a. Жирные кислоты композиции находились в форме глицеридов. Количество вводимой композиции было таковым, что общее количество вводимых жирных кислоты в сутки составило 0,25 г/кг массы тела.
Таблица 2a
% активных веществ
LCFA 97,84%
SFA 11,29%
Миристиновая кислота
3,05%
Пальмитиновая кислота
6,84%
Стеатовая кислота
1,40%
MUFA 35,85%
Олеиновая кислота
28,85%
Докозагексаеновая кислота (DHA)
1,80%
Эйкозапентаеновая кислота (EPA)
5,20%
PUFA 50,70%
Линолевая кислота
29,28%
γ-линоленовая
18,69%
α-линоленовая
2,73%
MCFA 2%
Каприновая кислота
0,50%
Каприловая кислота
0,50%
Лауриловая кислота
1,00%
Витамины 0,16%
D3
0,10%
Фолиевая кислота
0,03%
Миоинозитол
0,03%
Результаты количества и активности NK клеток периферической крови показаны в таблице 2b.
Таблица 2b
Пациенты6
День 0
День 70
Среднее снижение %
День 0
День 70
Среднее снижение активности %
NK% количество(среднее)
NK% количество(среднее)
NK активность
NKактивность
18,45
12,80
30,62
43,32
19
56,14
Средний процент NK клеток в периферической крови из общего количества клеток периферической крови составил 18,45 в день 0 до лечения и 12,80 в день 70 после начала лечения. Указанное различие было статистически значимым (p значение 0,001).
Средняя активность NK клеток периферической крови в соотношении 50:1 составила 43,32 в день 0 до лечения и 19, в день 70 после начала лечения. Указанное различие было статистически значимым (p значение 0,001).
Пример 3
В указанной группе образцы крови 6 пациенток собирали и тестировали до и через 45 дней после введения пероральной композиции 3 один раз в сутки. Композиция находилась в форме перорального раствора, включающего активные ингредиенты, показанные в таблице 3a. Жирные кислоты композиции находились в форме глицеридов. Количество вводимой композиции было таким, что общее количество жирных кислот, вводимое в сутки, составило 0,25 г/кг массы тела.
Таблица 3a
% активных веществ
LCFA 100%
SFA 25%
Миристиновая кислота
10%
Пальмитиновая кислота
10%
Стеатовая кислота
5%
MUFA 50%
Олеиновая кислота
28,85%
Докозагексаеновая кислота (DHA)
1,80%
Эйкозапентаеновая кислота (EPA)
5,20%
Миристолеиловая кислота
0,2%
Пальмитолеиновая кислота
2,6%
Сапиеновая кислота
0,2%
PUFA 25%
Линолевая кислота
12%
γ-линоленовая
5%
α-линоленовая
8%
Результаты количества или активности NK клеток периферической крови показаны в таблице 3b.
Таблица 3b
Пациенты6
День 0
День 45
Среднее снижение %
День 0
День 45
Среднее снижение активности %
NK% количество(среднее)
NK% количество(среднее)
NK активность
NKактивность
17,84
12,40
30,48
36
16,6
53,88
Средний процент NK клеток периферической крови из общего количества клеток периферической крови составил 17,84 в день 0 до лечения и 12,40 в день 45 после начала лечения. Указанное различие было статистически значимым (p значение <0,001).
Средняя активность NK клеток периферической крови в соотношении 50:1 составила 36 в день 0 до лечения и 16,6 в день 45 после начала лечения. Указанное различие было статистически значимым (p значение 0,001).
Три из шести женщин, получавших лечение указанной композицией, родили и 2 являются беременными.
Пример 4
В этой группе образцы крови 8 пациенток собирали и тестировали до и через 45 дней после введения пероральной композиции 4 один раз в сутки. Композиция находилась в форме перорального раствора, включающего активные ингредиенты, показанные в таблице 4a. Жирные кислоты композиции находились в форме глицеридов. Количество вводимой композиции было таким, что общее количество жирных кислот, вводимое в сутки, составило 0,25 г/кг массы тела.
Таблица 4a
% активных веществ
LCFA 65%
SFA 6,43%
Миристиновая кислота
1,00%
Пальмитиновая кислота
3,00%
Стеариновая кислота
1,40%
MUFA 45,71%
Олеиновая кислота
45,71%
PUFA 12,86%
Линолевая кислота
10,03%
γ-линоленовая
1,93%
α-линоленовая
1,93%
MCFA 30,71%
Каприновая кислота
5,00%
Каприловая кислота
8,71%
Лауриловая кислота
17,00%
Витамины 3,06%
D3
0,80%
В1
0,11%
В2
0,11%
В3
0,13%
В6
0,11%
Фолиевая кислота
0,10%
Инозитол
1,7%
Ионы металлов 0,83%
Медь
0,10%
Цинк
0,13%
Магний
0,50%
Марганец
0,10%
Аминокислоты 1,04%
L-глютамин
0,54%
L-аригинин
0,50%
Результаты количества NK клеток периферической крови показаны в таблице 4b.
Таблица 4b
Пациенты8
День 0
День 45
Среднее снижение %
NK% количество(среднее)
NK% количество(среднее)
18,97
14,55
23,29
Средний процент NK клеток периферической крови среди всех клеток периферической крови составил 18,97 в день 0 до лечения и 14,55 в день 45 после начала лечения. Указанное различие было статистически значимым (p значение <0,017).
Пять из восьми женщин, получавших указанную пероральную композицию, родили здоровых детей, 2 в настоящее время беременны больше 25 недель и у 1 был аборт.