НАБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРМИНАЛЬНЫХ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ RET, АССОЦИИРОВАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬЮ К РАКУ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
SET OF SEQUENCES OF OLIGONUCLEOTIDES FOR DIAGNOSTICS OF GERMINAL MUTATIONS IN GENE RET, ASSOCIATED WITH GENETIC PREDISPOSITION TO CANCER OF THYROID

Изобретение относится к медицине, а именно молекулярной биологии и онкологии.
Известна нуклеотидная последовательность для детекции мутаций 11 экзона гена RET (Патент США №6171791 В1).
Недостатки: небольшая протяженность исследуемой ДНК (только 11 экзон с 1810 по 1845 позиции), отсутствие точного определения рисков развития рака щитовидной железы (РЩЖ), трудоемкость проведения и высокая стоимость исследований (секвенирование).
Известно изобретение, посвященное выявлению онкогенов RET/PTC при папиллярном РЩЖ (Патент Украины №29847 U).
Недостатки: трудоемкость процесса (выделение РНК применением метода обратной транскрипции и амплификации), изучение соматических мутаций, а не герминальных, что не позволяет оценивать риск развития заболевания, изучение только папиллярного рака.
Задачей заявляемого изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для анализа герминальных мутаций в гене RET, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к РЩЖ, исходя из частот мутаций среди пациентов в российской популяции.
Задача решается путем создания оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для детекции точковых герминальных мутаций С634 в 11 экзоне и М918Т в 19 экзоне гена RET с использованием мультиплексной «гнездовой» полимеразной цепной реакции (ПЦР) и аллель-специфичной гибиридизации с набором иммобилизованных дифференцирующих олигонуклеотидов.
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для диагностики герминальных мутаций в гене RET, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к РЩЖ, исходя из частот мутаций среди пациентов в российской популяции.
Технический результат достигается подбором оптимального набора последовательностей олигонуклеотидов для мультиплексной «гнездовой» ПЦР и гибридизации, которые используются для диагностики герминальных мутаций в гене RET, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к РЩЖ, у пациентов в российской популяции, имеющий следующий нуклеотидный состав:
5'-CATGGCCACTCCCAGTGC-3'
5'-CACAGGGACTCCTCAGCAC-3'
5'-CACCCCCACCCACAG-3'
5'-GAGATGGGTGGCTTGTG-3'
5'-GGCTAGTGCTGTCAGGCC-3'
5'-CTAAGCACCCTAGACGCG-3'
5'-CAGGGATAGGGCCTGG-3'
5'-CCCCAAGAGAGCAACACC-3'
TACGAGCCGTGCCT
GATGGGCTGCGCAG
CACGTGCTGGGCCT
TAGAAGCTGTACAT
CACGAGAAGTGGAG
TACGAGCTGAGCTG
GGAAATGGATGGGATTTG
CCATATGGACGGCAATTC
Подбор последовательностей олигонуклеотидов включает: синтез олигонуклеотидов SEQ ID NO:9-16, строго комплементарных целевой последовательности ДНК и соответствующих температурным условиям гибридизации; амплификацию фрагментов гена RET с использованием на I этапе мультиплексной «гнездовой» ПЦР, в которой матрицей служит образец ДНК, набор олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:1-8, с образованием на II этапе ПЦР биотип-меченого ПЦР-продукта; наличие набора иммобилизованных олигонуклеотидов с последовательностями, представленными в SEQ ID NO:9-16; гибридизацию меченого ПЦР-продукта с набором иммобилизованных олигонуклеотидов.
Для проведения молекулярно-генетического исследования биологическим материалом служила геномная ДНК, выделенная из лимфоцитов периферической крови.
Олигонуклеотиды для амплификации и олигонуклеотидные зонды синтезировали с использованием фосфодиэфирного и гидрофосфорильного методов. Синтез олигонуклеотидов осуществляли используя автоматический ДНК/РНК синтезатор.
Олигонуклеотиды для гибридизации аллелей гена RET, ассоциированного с наследственной предрасположенностью к РЩЖ, подбирали таким образом, чтобы идентифицировать все выбранные для анализа точковые мутации
Для определения точковых мутаций гена RET были подобраны и синтезированы 8 высокоспецифичных дифференцирующих олигонуклеотидных зондов, структура которых обеспечивала связывание только с полностью комплементарными ДНК-мишенями.
4
2
4
2
ПЦР проводили с использованием термостабильной Taq-полимеразы в соответствующем буфере на приборе Dyad. Смесь ПЦР I этапа объемом 25 мкл включала в себя: 1×ПЦР-буфер (Трис-HCl 67 мМ, рН 8,6, (NH)SO 166 мМ, Тритон Х-100 0,01%), MgCl 1,5 мМ, 0,2 мМ каждого из дНТФ, Taq-полимеразы 2,5 U, по 0,2 мкМ олигонуклеотидов.
Амплификация включала: денатурацию двухцепочечной ДНК при t=94°C в течение 3 мин 30 сек, далее - 35 циклов полимеразной цепной реакции: при t=94°C в течение 30 сек, при t=60°C в течение 20 сек, при t=72°C в течение 10 сек, затем элонгация при t=72°C в течение 3 мин. Смесь II этапа ПЦР содержала 0.2 мкМ прямого праймера, 2 мкМ обратного биотип-меченого праймера. В качестве матрицы в смесь добавляли 2 мкл продукта I этапа ПЦР и проводили амплификацию, включающую: денатурацию при t=94°C в течение 3 мин 30 сек, далее 35 циклов ПЦР: при t=94°C в течение 30 сек, при t=61°C в течение 20 сек, при t=72°C в течение 10 сек, элонгацию при t=72°C в течение 3 мин. Получали одноцепочечный ампликон, способный к гибридизации с аллель-специфичными ДНК-зондами. Амплификацию каждого образца ДНК проводили в отдельной пробирке. Олигонуклеотиды, используемые для иммобилизации, несут по 5'- или 3'-концу активную группу, обеспечивающую иммобилизацию.
Набор дифференцирующих олигонуклеотидов наносили на поверхность мембраны, содержащей активные группы.
В мультиплексной «гнездовой» реакции I этапа ПЦР использовали олигонуклеотиды SEQ ID NO:1, 2, 5, 6.
В мультиплексной «гнездовой» реакции II этапа ПЦР использовали олигонуклеотиды SEQ ID NO:3, 4, 7, 8.
В таблице 1 представлены последовательности олигонуклеотидов для мультиплексной «гнездовой» реакции I и II этапов ПЦР.
Таблица 1
ДНК-локус
Специфический номер последовательности
Название
Последовательность 5'-3'
Длина, пары нуклеотидов
Температура отжига олигонуклеотидов
С634
1
634_F1
5'-CATGGCCACTCCCAGTGC-3'
18
63
2
634_R1
5'-CACAGGGACTCCTCAGCAC-3'
18
63
3
634_F2
5'-CACCCCCACCCACAG-3'
18
62
4
634_R2
5'-GAGATGGGTGGCTTGTG-3'
18
63
М918Т
5
918_F1
5'-GGCTAGTGCTGTCAGGCC-3'
18
62
6
918_R1
5'-CTAAGCACCCTAGACGCG-3'
18
62
7
918_F2
5'-CAGGGATAGGGCCTGG-3'
16
60
8
918_R2
5'-CCCCAAGAGAGCAACACC-3'
18
60
В таблице 2 представлены последовательности олигонуклеотидных зондов, используемых для гибридизации.
Таблица 2
Специфический номер последовательности
Мутация
Название зонда
Последовательность5'-3'
9
C634WT
c634_wt
TACGAGCCGTGCCT
10
C634R
c634_r
GATGGGCTGCGCAG
11
C634G
c634_g
CACGTGCTGGGCCT
12
C634Y
c634_y
TAGAAGCTGTACAT
13
C634W
c634_w
CACGAGAAGTGGAG
14
C634S
c634_s
TACGAGCTGAGCTG
15
M918WT
m918_wt
GGAAATGGATGGGATTTG
16
М918Т
m918_t
CCATATGGACGGCAATTC
В таблице 3 представлены олигонуклеотиды SEQ ID NO для «гнездовой» ПЦР: 1-4 для ДНК-локуса С634 и 4-8 для ДНК-локуса М918Т.
Таблица 3
С634
1
634F1
5'-CATGGCCACTCCCAGTGC-3'
2
634R1
5'-CACAGGGACTCCTCAGCAC-3'
3
634F2
5'-CACCCCCACCCACAG-3'
4
634R2
5'-GAGATGGGTGGCTTGTG-3'
М918Т
5
918F1
5'-GGCTAGTGCTGTCAGGCC-3'
6
918R1
5'-CTAAGCACCCTAGACGCG-3'
7
918F2
5'-CAGGGATAGGGCCTGG-3'
8
918R2
5'-CCCCAAGAGAGCAACACC-3'
В таблице 4 представлены последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов: 9-16 для гибридизации.
Таблица 4
9
TACGAGCCGTGCCT
10
GATGGGCTGCGCAG
11
CACGTGCTGGGCCT
12
TAGAAGCTGTACAT
13
CACGAGAAGTGGAG
14
TACGAGCTGAGCTG
15
GGAAATGGATGGGATTTG
16
CCATATGGACGGCAATTC
Гибридизационная смесь общим объемом 500 мкл включала формамида 100 мкл, 20×SSPE (sodium chloride, sodium phosphate, EDTA) 100 мкл и амплификата 20 мкл. Готовую гибридизационную смесь денатурировали при t=95°C в течение 5. мин, охлаждали во льду 2 мин, далее мембрану с иммобилизованными олигонуклеотидами инкубировали в гибридизационной смеси в течение 10-12 ч. После завершения инкубации проводили отмывку от непрореагировавшей гибридизационной смеси в 1×SSPE буфере при комнатной температуре в течение 15 мин.
2
2
Затем проводили блокирование мест неспецифического связывания, для этого мембрану инкубировали в блокирующем буфере, в состав которого входил БСА (бычий сывороточный альбумин). Промывали мембрану SSC (saline-sodium citrate) буфером (NaCl 0,15М) два раза. После этого проводили инкубацию с разведенным в буфере конъюгатом (стрептавидин-щелочная фосфатаза). Не связавшийся коньюгат удаляли с мембраны SSC буфером. Мембрану инкубировали с буфером (Трис-HCl 0,1М рН 7.6, MgCl 10 мМ, ZnCl 10 мМ, Тритон Х-100 0.1%) в течение 2 мин. После этого инкубировали мембрану в красящем буфере, содержащим субстраты НСТ и БХИФ (5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат и нитросиний тетразолий). Для прекращения реакции промывали мембрану дистиллированной водой.
Фермент щелочная фосфатаза превращала бесцветный субстрат в конечный продукт реакции сине-сиреневого цвета. Реакцию окрашивания наблюдали в местах связывания зонда и комплементарной последовательности.
Наличие одного из мутантных аллелей (C634WT, C634R, C634G, C634Y, C634W, C634S, M918WT, М918Т) в исследуемом образце определяли с учетом расположения олигонуклеотидных зондов на мембране. Наличие мутаций в генотипе пациента подтверждает генетический диагноз наследственной предрасположенности к РЩЖ или определяет высокий риск его развития в течение жизни.
Изобретение иллюстрируется примерами 1,2:
Пример 1.
Пациент Р., 9 лет
Предварительный диагноз: подозрение на синдром множественных эндокринных неоплазий 2Б типа (МЭН 2Б).
Семейный анамнез: онкологическими заболеваниями не отягощен.
Исследование: определение мутаций в прото-онкогене RET, ассоциированного с развитием синдрома множественных эндокринных неоплазий 2Б (МЭН 2Б).
Материал исследования: ДНК, выделенная из лимфоцитов периферической крови.
Результат: выявлена герминальная миссенс-мутация р.М918Т (с.2753Т>С) в гетерозиготном состоянии в 918 ко доне 16 экзоне протоонкогена RET, ассоциированная с синдромом МЭН2Б. Диагностированная мутация зарегистрирована в международной базе данных MEN2 Database ARUP [arup.utah.edu].
Заключительный диагноз: синдром множественных эндокринных неоплазий тип 2Б (с-м МЭН 2Б). Высокий риск билатеральной феохромоцитомы, множественных неврином желудочно-кишечного тракта.
Учитывая результаты молекулярно-генетического исследования, пациент относится к наивысшей группе риска (уровень D) развития прогностически неблагоприятных (агрессивных) форм медуллярного РЩЖ, с 50%-ным риском развития феохромоцитомы надпочечников.
Тип наследования - аутосомно-доминантный.
Рекомендовано:
1. учитывая полную пенетрантность прото-онкогена RET, пациенту целесообразно проведение хирургического лечения в объеме тотальной тиреоидэктомии с лимфодисекцией;
2. динамическое наблюдение:
- наблюдение онкологом, эндокринологом, генетиком;
- контроль уровня кальцитонина базального и стимулированного в динамике+УЗИ области шеи;
- контроль общего и ионизированного кальция в динамике;
- контроль метанефрина плазмы крови и суточной мочи+УЗИ забрюшинного пространства для своевременной диагностики феохромоцитомы в динамике;
3. ДНК-диагностика на наличие мутации в гене RET родственников 1-11 степени родства.
Пример 2.
Пациентка П., 13 лет
Диагноз: подозрение на синдром множественных эндокринных неоплазий 2А типа (МЭН 2А).
Семейный анамнез: отягощен медуллярным РЩЖ.
Исследование: определение мутаций в прото-онкогене RET.
Материал исследования: ДНК, выделенная из лимфоцитов периферической крови.
Результат: выявлена герминальная миссенс-мутация p.C634Y в гетерозиготном состоянии в 634 кодоне протоонкогена RET. Диагностированная мутация зарегистрирована в международной базе данных MEN2 Database ARUP [amp.utah.edu] как клинически значимый вариант.
Заключение: наследственный RET-ассоциированный медуллярный РЩЖ в составе синдрома МЭН2А.
Учитывая результаты молекулярно-генетического исследования, пациент относится к группе высокого риска (уровень D) развития прогностически неблагоприятных (агрессивных) форм медуллярного РЩЖ с 50%-ным риском развития феохромоцитомы надпочечников.
Рекомендуется:
1. учитывая полную пенетрантность прото-онкогена RET, пациенту целесообразно проведение хирургического лечения в объеме тотальной тиреоидэктомии с лимфодисекцией;
2. динамическое наблюдение:
- определение уровня базального и пентагастрин-стимулированного кальцитонина;
- контроль метанефрина плазмы крови и суточной мочи+УЗИ забрюшинного пространства для своевременной диагностики феохромоцитомы в динамике;
3. ДНК-диагностика на наличие мутации в гене RET родственников I-II степени родства.