Весовые и линейные показатели роста и развития эмбрионов кур с конститутивной экспрессией маркерного гена eGFP

DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10919 УДК 636.5:591.463.1

ВЕСОВЫЕ И ЛИНЕЙНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ РОСТА И РАЗВИТИЯ ЭМБРИОНОВ КУР С КОНСТИТУТИВНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ МАРКЕРНОГО ГЕНА Ев¥Р

Н. А. ВОЛКОВА1, доктор биологических наук, руководитель лаборатории

А. А. НИКИШОВ2, кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

А. Н. ВЕТОХ1, младший научный сотрудник Л. А. ВОЛКОВА1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Н. А. ЗИНОВЬЕВА1, доктор биологических наук, директор

Федеральный научный центр животноводства -ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация

2Российский университет дружбы народов, ул. Миклухо-Маклая, 6, Москва, 117198, Российская Федерация

Резюме. Изучали влияние экспрессии интегрированных ре-комбинантных генов на рост и развитие трансгенных эмбрионов кур. Работу проводили на базе Всероссийского института животноводства им. Л. К. Эрнста в 2018 г. на эмбрионах кур породы Род-Айленд. Сформировали 2 опытные группы трансгенных эмбрионов с конститутивной экспрессией гена eGFP:

I - под контролем промотора RSV (вирус саркомы Рауса),

II - под контролем промотора CAG (гибридный промотор). В качестве контроля использовали эмбрионы отнетрансгенных кур. Оценку по линейным и весовым показателям проводили на 7, 10, 14 и 18 дни инкубации. В каждом случае исследовали по 20 эмбрионов. Патологических отклонений и нарушений в развитии как трансгенных, так и нетрансгенных эмбрионов не выявили. У эмбрионов от трансгенных кур, по сравнению с контролем, наблюдали достоверное уменьшение массы тела и отдельных органов. Эти различия были наиболее значительны во второй половине инкубации у трансгенных эмбрионов I группы. На 14 и 18 дни инкубации у них отмечали достоверно меньшую длину тела на 7 % (56±2 мм) и 6 % (84±2 мм), снижение массы тела - на 21 % (7,02±0,62г) и 16 % (18,25± 0,96 г) соответственно, на 18 день - существенное снижение массы сердца на 10 % (0,155±0,010 г) и печени - на 15 % (0,493±0,032 г), по сравнению с контролем. По длине головы, ног и крыльев, а также массе желудка достоверных различий между опытными и контрольной группами не установлено. Полученные результаты свидетельствуют о негативном влиянии интегрированных рекомбинантных генов на рост и развитие эмбрионов кур.

Ключевые слова: трансгенез, куры, эмбрионы, рост и развитие эмбрионов.

Для цитирования: Весовые и линейные показатели роста и развития эмбрионов кур с конститутивной экспрессией маркерного гена eGFP/Н. А. Волкова, А. А. Никишов, А. Н. Ветох и др. // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 9. С. 81-83. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10919.

рекомбинантными генами, кодирующими белки фармакологического назначения [1, 2, 3]. На сегодняшний день уже отработаны методики по введению генных конструкций в эмбрионы кур, созданы эффективные системы доставки рекомбинантной ДНК в эмбриональные и соматические клетки [4, 5, 6]. Вместе с тем, интеграция рекомбинантных генов в геном сельскохозяйственной птицы может оказывать значительное влияние на рост и развитие трансгенных особей как в эмбриональный, так и постнатальный периоды развития. Степень этого влияния зависит от характера экспрессии интегрированных генов. Она может иметь как конститутивный, так и тканеспецифичный характер. В первом случае рекомбинантные белки синтезируются во всех клетках и тканях организма, во втором - только в клетках отдельных органов, например, яйцеводе. Наиболее выраженное влияние на жизнеспособность и развитие трансгенных особей, в том числе на эмбриогенез, следует ожидать при конститутивной экспрессии интегрированных рекомбинантных генов.

Исходя из этого, цель исследований - изучить весовые и линейные показатели роста и развития эмбрионов от трансгенных кур с конститутивной экспрессией интегрированных генов.

Условия, материалы и методы. Работу проводили на базе ФНЦ ВИЖ им. Л. К. Эрнста в 2018 г. Материалом для исследований послужили эмбрионы от трансгенных кур и их нетрансгенных аналогов породы Род-Айланд. Трансгенные птицы были получены с использованием лентивирусных векторов, обеспечивающих конститутивную экспрессию маркерного гена вОРР. Для конститутивного выражения интегрированного гена использовали промотор вируса саркомы Рауса (ЯБУ) и гибридный промотор САО. В результате сформировали 2 опытные группы трансгенных эмбрионов кур с конститутивной экспрессией гена вОРР: I - под контролем промотора ЯЭУ, II - под контролем промотора САО. В качестве контроля использовали эмбрионы от нетрансгенных кур.

На 7, 10, 14 и 18 дни инкубации определяли массу эмбрионов, их печени, сердца, желудка, длину всего тела, туловища, головы, ног, крыльев. На указанных сроках инкубации исследовали по 20 эмбрионов из каждой группы. Данные, обработанные статистически с помощью программы МюгобоЙ Ехе1 (!-тест), представлены в виде средней арифметической (М) и ее ошибки (т).

Результаты и обсуждение. Проведенные исследования не выявили патологических отклонений и нарушений в развитии как трансгенных, так и нетрансгенных эмбрионов кур. Вместе с тем, были установлены Таблица 1. Изменение массы трансгенных и нетрансгенных эмбрионов кур в течение эмбриогенеза, г

Одно из интенсивно развивающихся направлений геномной инженерии - генетическая модификация сельскохозяйственной птицы с целью улучшения продуктивных качеств и внесения новых признаков. Основные усилия ученых направлены на разработку методических подходов, обеспечивающих высокую эффективность создания птицы с интегрированными *Р>0,95, по сравнению с контролем.

Группа Возраст эмб рионов, дни

7 1 10 14 1 18

контроль I (опыт) II (опыт) 0,58±0,06 0,59±0,03 0,64±0,05 1,66±0,13 1,67±0,18 1,79±0,13 8,91±0,78 7,02±0,62* 8,01±0,51 21,78±0,36 18,25±0,96* 20,12±0,86*

Таблица 2. брионов кур

Масса отдельных органов трансгенных и нетрансгенных эм- составили 8, 7, 11 и 8 % соответственно.

Масса сердца и печени трансгенных эмбрионов была меньше, чем в контроле (табл. 2). На 14 день инкубации различия достигали 16 и 9 % соответственно, на 18 день инкубации - 10 и 15 % (Р>0,95). Различия между опытными и контрольной группами по массе желудка были незначительны.

Трансгенные эмбрионы характеризовались меньшей, по сравнению с контролем, длиной тела. Достоверные различия по величине этого показателя между I опытной и контрольной группами достигали на 14 и 18 дни инкубации 7 и 6 %, соответственно. В основном это происходило из-за уменьшения длина туловища. Таблица 3. Линейные показатели трансгенных и нетрансгенных эмбрионов кур, мм

Возраст Масса, г

сердце 1 печень желудок

контроль

10 дней 0,021±0,003 0,015 ±0,002 0,026±0,003

14 дней 0,075±0,008 0,160 ±0,027 0,230±0,028

18 дней 0,172±0,011 0,578 ±0,041 0,951±0,018

I группа

10 дней 0,020±0,007 0,012 ±0,002 0,024±0,005

14 дней 0,063±0,012 0,145 ±0,014 0,220±0,070

18 дней 0,155±0,010* 0,493 ±0,032* 0,911±0,036

II группа

10 дней 0,019±0,002 0,013 ±0,001 0,025±0,005

14 дней 0,068±0,010* 0,149 ±0,010 0,240±0,060

18 дней 0,169±0,008 0,505 ±0,036* 0,960±0,033

*Р>0,95, по сравнению с контролем.

различия по массе и величине линейных показателей роста и развития между группами.

Трансгенные эмбрионы, по сравнению с контролем, имели большую массу в первой половине инкубации, однако эти различия были недостоверными. Во второй половине инкубации, наоборот, трансгенные эмбрионы уступали по массе эмбрионам контрольной группы (табл. 1). Достоверные различия между I опытной и контрольной группами по величине этого показателя были установлены на 14 и 18 дни инкубации - разница составила 21 и 16 % соответственно в пользу контроля. При этом трансгенные эмбрионы с интегрированным геном eGFP под контролем промотора RSV (I группа) уступали по массе трансгенным эмбрионам II группы: различия на 7, 10, 14 и 18 дни инкубации

Показатель Возраст эмбрионов

7 дней 10 дней 14 дней | 18 дней

контроль

Длина тела 25±1 37±2 60±2 90±1

Длина головы 10±1 12±1 15±1 18±1

Длина туловища 12±1 17±1 33±1 49±1

Длина ноги - - 39±1 62±2

Длина крыла - - 22±1 32±1

I группа

Длина тела 24±1 34±1 56±2* 84±2*

Длина головы 10±1 13±1 14±1 18±1

Длина туловища 11±1 16±1 29±1* 48±1

Длина ноги - - 35±1 57±2

Длина крыла - - 21±1 29±2

II группа

Длина тела 28±1 37±1 57±2 87±2*

Длина головы 9±1 12±1 13±1 17±1

Длина туловища 12±1 17±1 31±1 47±1*

Длина ноги - - 36±1 58±1

Длина крыла - - 20±1 30±1

*Р>0,95, по сравнению с контролем.

Рисунок. Различия по весовым и линейным показателям роста и развития трансгенных эмбрионов кур, выраженные в процентах к контролю: I группа - эмбрионы с конститутивной экспрессией eGFP под контролем промотора RSV; II группа -эмбрионы с конститутивной экспрессией eGFP под контролем промотора CAG: Ц - 1 группа; Ц - 2 группа .

По длине головы, ног и крыльев достоверных различий между опытными и контрольной группами не установлено (табл. 3).

Различия по весовым и линейным показателям роста и развития, по сравнению с контролем, были более выражены у трансгенной птицы с интегрированным геном eGFP под контролем промотора RSV (см. рисунок).

Снижение интенсивности роста и развития трансгенных кур в период эмбриогенеза, по сравнению с контролем, может быть связано с негативным влиянием рекомбинантного белка GFP, синтезируемого в организме генно-модифицированных особей. Ранее было установлено влияние экспрессии интегрированных рекомбинантных генов на показатели яичной продуктивности и спермопродукции у трансгенной птицы [7, 8].

Полученные результаты подтверждают данные других исследователей. Имеется ряд сообщений о негативном влиянии трансгенеза на состояние здоровья модифицированных сельскохозяйственных животных,

в частности, овец [9, 10], свиней [11], кроликов [12].

Выводы. Проведенные исследования не выявили патологических отклонений и нарушений в развитии как трансгенных, так и нетрансгенных эмбрионов кур. Однако установлены различия по массе и величине линейных показателей роста и развития между группами. Наиболее выражены они были у трансгенных эмбрионов I опытной группы с интегрированным геном eGFPпод контролем промотора RSV. Так, на 14 и 18 дни инкубации у них отмечали достоверно меньшую длину тела на 7 и 6 % (Р>0,95), а также снижение массы тела на 21 и 16 % (Р>0,95) соответственно, на 18 день - существенное уменьшение массы сердца на 10 % (Р>0,95), печени - на 15 % (Р>0,95), по сравнению с контролем. Эти различия свидетельствуют о негативном влиянии интегрированных рекомбинантных генов под контролем рассмотренных конститутивных промоторов на рост и развитие эмбрионов кур.

По длине головы, ног и крыльев, а также массе желудка достоверных различий между опытными и контрольной группами не установлено.

Литература.

1. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens / S. G. Lillico, M. J. Sherman, C. D. McGrew, etc. //PNAS. 2007. Vol. 104 (6). Pp. 1771-1776.

2. Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white / S. C. Kwon, J. W. Choi, H. J. Jang, etc.// Biology of Reproduction. 2010. Vol. 82. Pp. 1057-1064.

3. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens/S. J. Byun, S. W. Kim, K. W. Kim, etc. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011. Vol. 75 (4). Pp. 646-649.

4. Chicken oviduct-specific expression of transgene by a hybrid ovalbumin enhancer and the Tet expression system / D. Kodama, D. Nishimiya, K. Nishijima, etc.// J. Biosci Bioeng. 2012. Vol. 113 (2). Pp. 146-153.

5. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase / P. E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D. W. McCoy, etc. // Dev. Dyn. V. 2003. Vol. 226. Pp. 439-445.

6. Applications of avian transgenesis / B. B. Scott, T. A. Velho, S. Sim, etc. // ILAR J. 2010. Vol. 51(4). Pp. 353-361.

7. Сравнительное изучение морфометрических и морфологических показателей яиц трансгенных кур / А. Н. Ветох, Ю. А. Прытков, И. П. Новгородова и др. // Зоотехния. 2015. № 12. С. 9-10.

8. Изменение количественных и качественных показателей семени петухов под влиянием трансгенеза /А. Н. Ветох, М. А. Жилинский, Е. К. Томгорова и др. // Теоретические и прикладные проблемы агропромышленного комплекса. 2017. № 4 (33). С. 41-44.

9. The production of transgenic Merino sheep by microinjection of ovine metallothionein-ovine growth hormone fusion genes / J. D. Murray, C. D. Nancarrow, J. T. Marshall, etc. //Reprod. Fert. Dev. 1989. Vol. 1. Pp. 147-155.

10. Production of transgenic sheep with growth relating genes / C. E. Rexroad, R. E. Hammer, D. J. Bolt, etc. // Molecular Reproduction and Development. 1989. Vol. 1. Pp. 164-169.

11. Эрнст Л. К., Гольдман И. Л., Кадулин С. Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца // Биотехнология. 1993. № 5. C. 2-14.

12. Молекулярно-биологические аспекты проблемы позиционно-независимой экспрессии чужеродных генов в клетках трансгенных животных / И. Л. Гольдман, С. В. Разин, Л. К. Эрнст и др. // Биотехнология. 1994. № 2. C. 3-8.

WEIGHT AND LINEAR INDICATORS OF GROWTH AND DEVELOPMENT OF CHICK EMBRYOS WITH CONSTITUTIVE EXPRESSION OF EGFP MARKER GENE

N. A. Volkova1, А. А. Nikishov2, A. N. Vetokh1, L. A. Volkova1, N. A. Zinovieva1

'Federal Scientific Center of Animal Husbandry - L. K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation

2RUDN University (Peoples' Friendship University of Russia), ul. Miklukho-Maklaya, 6, Moskva, 117198, Russian Federation Abstract. We study the effect of integrated recombinant genes expression on the growth and development of transgenic chick embryos. The research was carried out on Rhode Island Red chick embryos at the premises of the L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry in 2018. It was formed two test groups of transgenic embryos with constitutive expression of eGFP gene: I - under the control of RSV promoter (Rous sarcoma virus); II -under the control of hybrid CAG promoter. Embryos from non-transgenic chickens served as a control. Estimation of embryos according to the weighed and linear indices was carried out on the 7th, 10th, 14th and 18th days of incubation. In each case, 20 embryos were examined. Pathological abnormalities and impairments in the development of both transgenic and non-transgenic chick embryos were not revealed. In embryos obtained from transgenic chickens, compared with the control ones, there was a reliable decrease in both the total weight and the weight of separate organs. The differences between the experimental and control groups for these indicators were the most significant in the second half of incubation. On the 14th and 18th days of incubation, they had a significantly shorter body length by 7% (56 ± 2 mm) and 6% (84 ± 2 mm); the body weight was lower by 21% (7.02 ± 0.62 g) and 16% (18.25 ± 0.96 g), respectively. On the 18th day, a significant decrease in heart weight by 10% (0.155 ± 0.010 g) and liver weight by 15% (0.493 ± 0.032 g) was revealed in comparison with the control. According to the length of a head, legs and wings, as well as the weight of a stomach, significant differences between the experimental and control groups were not established. The data obtained indicate the negative effect of the integrated recombinant genes on the growth and development of chick embryos. Keywords: transgenesis; chickens; embryos; growth and development of embryos.

Author Details: N. A. Volkova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: natavolkova@inbox.ru); А. А. Nikishov, Cand. Sc. (Agr.), assoc. prof.; A. N. Vetokh, junior research fellow; L. A. Volkova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; N. A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), director.

For citation: Volkova N. A., Nikishov А. А., Vetokh A. N., Volkova L. A., Zinovieva N. A. Weight and Linear Indicators of Growth and Development of Chick Embryos with Constitutive Expression of eGFP Marker Gene. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 9. Pp. 81-83 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10919.