СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ЭЛЕКТРОННО-ПАРАМАГНИТНОЙ РЕЗОНАНСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
METHOD OF DETERMINING ANTIOXIDANT ACTIVITY USING ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE SPECTROSCOPY METHOD

Изобретение относится к области физико-химических методов анализа, в частности к анализу растворов на предмет количественного определения антиоксидантной активности веществ.
Известен способ спектрофотометрического определения антиоксидантной активности (АОА) основанный на способности ингибирования стабильного свободного радикала дифенилпикрилгидразила (ДФПГ) веществами с АО свойствами [Tuanjai N., Supalax S., Thawatchai Т., Wittaya N. New approach for evaluation of the antioxidant capacity based on scavenging DPPH free radical in micelle systems // J. Food Research International. 04/2011; 44(3): 798-806]. Сущность способа заключается в измерении снижения оптической плотности раствора ДФПГ в результате реакции с антиоксидантом при длине волны 528 нм. Значения АОА рассчитываются по концентрации анализируемого вещества, необходимого для реагирования с 50% ДФПГ.
Недостаток данного способа заключается в том, что результаты измерений выражаются не в стандартизированных единицах, а в относительных, точнее в эквивалентах галловой кислоты. Значения зависят от эталонного вещества, что не позволяет сравнивать АОА веществ, свойства которых определены в сравнении с разными эталонными веществами. Также к недостаткам данного метода можно отнести ограничения при исследовании окрашенных объектов.
Известен способ электронно-парамагнитной резонансной спектроскопии (ЭПР-спектроскопии) количественного определения АОА растворимого и молотого кофе [ V.,  A.,  F. Coffee as a source of antioxidants: An EPR study // J. Food Chemistry. 114 (2009) 859-868], основанный на использовании в качестве окислителей ряда стабильных свободных радикалов, в т.ч. ДФПГ, ЭПР-спектры которых, после смешения с веществами, обладающими АОА, снижают свою интенсивность. Количественную оценку АОА исследуемых образцов приводят в эквивалентах тролокса.
Недостаток способа заключается в том, что количественные значения АОА представляются в относительных единицах (эквивалентах тролокса), что не позволяет сравнить результат со значениями других методов. Также исходя из результатов данного способа, нельзя описать механизм протекания реакций между свободным радикалом и веществом, обладающим АОА.
Наиболее близким решением служит способ определения АОА растительных экстрактов и соков [Sanna D., Delogu G., Mulas M., Schirra M., Fadda A. Determination of free radical scavenging activity of plant extracts through DPPH assay: an EPR and UV-Vis study // J. Food Analytical Methods. 5 (2012) 759-766], заключающийся в том, что раствор ДФПГ смешивают с образцами (растительные экстракты, соки) обладающими АОА. Количественную оценку АОА проводят по изменению интенсивности ЭПР-спектров раствора ДФПГ, установленных до и после взаимодействия с анализируемыми образцами.
К недостаткам способа относится выражение значения АОА в относительных единицах ЕС50, то есть концентрации экстракта, необходимой для снижения начальной концентрации ДФПГ на 50%. Результаты данного способа не несут информацию о возможных механизмах протекания реакции между свободным радикалом и анализируемым веществом.
Задача настоящего изобретения состоит в преодолении недостатков известных способов и в создании нового способа, позволяющего повысить точность и экспрессность определения, а также позволяющего количественно в стандартизированных единицах установить антиоксидантную активность определяемого вещества в исследуемом образце и механизм взаимодействия АО со свободными радикалами ДФПГ.
Задача решается тем, что в способе определения антиоксидантной активности веществ методом ЭПР-спектроскопии спиртовой раствор стабильного радикала ДФПГ смешивают с раствором, содержащим вещество, обладающее антиоксидантной активностью (АОА), оценку антиоксидантной активности проводят по уменьшению числа парамагнитных центров стабильного радикала, рассчитанных из ЭПР-спектров до реакции и после полного прохождения химической реакции между радикалом и анализируемым веществом, в качестве меры антиоксидантной активности вещества используют моль эквиваленты в литре, полученные из разности количества парамагнитных частиц радикала до и после взаимодействия с АО, а значение АОА рассчитывают по формуле:
,
где АОА - антиоксидантная активность, М-экв;
DPPH
C - концентрация ДФПГ в исходном растворе, М;
s1
n - начальное количество парамагнитных частиц ДФПГ, ед.
s2
n - количество парамагнитных частиц ДФПГ после взаимодействия с анализируемым веществом, ед.
Сущность заявляемого способа заключается в том, что спиртовой раствор ДФПГ имеет длительный стабильный сигнал в виде ЭПР-спектра, из которого можно выразить количество парамагнитных частиц. Число парамагнитных частиц свободного радикала ДФПГ снижается после добавления вещества обладающего АОА в результате протекания химических реакций в соответствии с концентрацией и количеством функциональных групп:
1. n DPPH+m Ar-OH→Ar-О+DPPH-H
2. Ar-О+DPPH→Ar-O-DPPH
3. Ar-О+Ar-О→Ar-О-О-Ar
где DPPH - стабильный радикал ДФПГ,
Ar-ОН - вещество с антиоксидантными свойствами,
Ar-О - промежуточный радикальный продукт взаимодействия АО с ДФПГ,
DPPH-H - восстановленная форма ДФПГ,
Ar-O-DPPH - молекулярный продукт взаимодействия АО с ДФПГ,
Ar-O-O-Ar - молекулярный продукт рекомбинации радикалов АО.
Определение антиоксидантной активности проводят по разности количества парамагнитных частиц стабильного свободного радикала, измеряемых до и после полного прохождения химических реакций (1-2) между свободным радикалом и анализируемым веществом. Определение проводят после завершения химической реакции, которое сопровождается снижением количества парамагнитных частиц свободного радикала после добавления анализируемого вещества. АОА в этом случае рассчитывают по формуле:
,
где АОА - антиоксидантная активность, М-экв;
DPPH
C - концентрация ДФПГ в исходном растворе, М;
s1
n - начальное количество парамагнитных частиц ДФПГ, ед.;
s2
n - количество парамагнитных частиц ДФПГ после взаимодействия с анализируемым веществом, ед.
В качестве реагентов могут быть использованы стабильные катион радикалы, например 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ). В качестве веществ, обладающих АОА, могут быть использованы индивидуальные антиоксиданты, биодобавки, соки, лекарственные экстракты, экстракты различных сортов чая и кофе.
В качестве протонных растворителей могут быть использованы метиловый и этиловый спирты. Также может быть использована смесь растворителей.
Емкость для измерений должна быть изготовлена из кварца или стекла. Указанные отличия существенны. В предложенном способе измеряется на прямую содержание свободного радикала в виде количества парамагнитных частиц. Использование в качестве единиц измерения антиоксидантной активности моль эквивалентов в литре позволяет сравнивать результаты, полученные различными методами. Концентрация исходного раствора стабильного радикала значительно больше концентрации вещества обладающего АОА в исследуемом образце, поэтому химическая реакция протекает быстро, что увеличивает экспрессность метода. Прямой расчет парамагнитных частиц позволяет устанавливать механизм взаимодействия радикала ДФПГ с АО.
В настоящее время из патентной и научно-технической литературы неизвестен способ определения антиоксидантной активности в заявляемой совокупности признаков.
На фиг. 1 представлена зависимость поглощаемой мощности переменного поля от напряженности внешнего магнитного поля. ЭПР-спектры ДФПГ: 1 - до взаимодействия с аскорбиновой кислотой; 2 - после взаимодействия с аскорбиновой кислотой.
На фиг. 2 представлена зависимость поглощаемой мощности переменного поля от напряженности внешнего магнитного поля. ЭПР-спектры ДФПГ: 3 - до взаимодействия с пирокатехином; 4 - после взаимодействия с пирокатехином.
На фиг. 3 представлена зависимость поглощаемой мощности переменного поля от напряженности внешнего магнитного поля. ЭПР-спектры ДФПГ: 5 - до взаимодействия с зеленым чаем; 6 - после взаимодействия с зеленым чаем.
На фиг. 4 представлена зависимость поглощаемой мощности переменного поля от напряженности внешнего магнитного поля. ЭПР-спектры ДФПГ: 7 - до взаимодействия с черным чаем; 8 - после взаимодействия с черным чаем.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1
s1
DPPH
16
-3
Навеску ДФПГ растворили в этаноле с итоговой концентрацией 0,001М. Получили ЭПР-спектр приготовленного раствора ДФПГ. После математической обработки ЭПР-спектра получили значения количества парамагнитных частиц (n=1,95*10 ед.) и концентрации свободного радикала ДФПГ (C=1,03*10 М).
-4
16
s2
Далее в 1 мл приготовленного раствора ДФПГ внесли 1*10 М спиртового раствора аскорбиновой кислоты. Получили ЭПР-спектр приготовленной смеси. Установившееся значение количества парамагнитных частиц после протекания реакции между свободным радикалом ДФПГ и аскорбиновой кислотой составляет n=1,38*10 ед.
ЭПР-спектры свободного радикала ДФПГ до и после взаимодействия с аскорбиновой кислотой приведены на фиг. 1.
Антиоксидантную активность аскорбиновой кислоты рассчитывали по формуле:
,
где АОА - антиоксидантная активность аскорбиновой кислоты, М-экв;
DPPH
C - концентрация свободного радикала ДФПГ в исходном растворе, М;
s1
n - начальное количество парамагнитных частиц свободного радикала ДФПГ;
s2
n - количество парамагнитных частиц свободного радикала ДФПГ после взаимодействия с аскорбиновой кислотой.
-4
Расчет показал, что с учетом разбавления АОА аскорбиновой кислоты равна 3,01*10 М-экв, что свидетельствует протеканию предполагаемых реакций (1 и 2):
2 DPPH+АК→АК*+DPPH-H
АК+DPPH→АК-O-DPPH
где АК - аскорбиновая кислота,
АК - промежуточный радикальный продукт окисления аскорбиновой кислоты.
Получившееся значение АОА объясняется наличием двух функциональных групп в молекуле аскорбиновой кислоты, которые нейтрализуют две молекулы свободного радикала ДФПГ, а также протеканием реакции между продуктом окисления аскорбиновой кислоты и одной молекулой свободного радикала ДФПГ с образованием стабильного молекулярного продукта.
Пример 2
s1
DPPH
16
-3
Навеску ДФПГ растворили в этаноле с итоговой концентрацией 0,001М. Получили ЭПР-спектр приготовленного раствора ДФПГ. После математической обработки ЭПР-спектра получили значения количества парамагнитных частиц (n=1,85*10 ед.) и концентрации свободного радикала ДФПГ (C=0,98*10 М).
-4
16
s2
Далее в 1 мл приготовленного раствора ДФПГ внесли 1*10 М водного раствора пирокатехина. Получили ЭПР-спектр приготовленной смеси. Установившееся значение количества парамагнитных частиц после протекания реакции между свободным радикалом ДФПГ и пирокатехином составляет n=1,09*10 ед.
ЭПР-спектры свободного радикала ДФПГ до и после взаимодействия пирокатехином приведены на фиг. 2.
Антиоксидантную активность пирокатехина рассчитывали по формуле:
,
где АОА - антиоксидантная активность пирокатехина, М-экв;
DPPH
C - концентрация свободного радикала ДФПГ в исходном растворе, М;
s1
n - начальное количество парамагнитных частиц свободного радикала ДФПГ;
s2
n - количество парамагнитных частиц свободного радикала ДФПГ после взаимодействия с пирокатехином.
-4
Расчет показал, что с учетом разбавления значение АОА пирокатехина составляет 4,03*10 М-экв, что свидетельствует о протекании предполагаемых реакций (1 и 2):
2 DPPH+ПК→ПК+2DPPH-H
ПК+DPPH→ПК-O-DPPH
где ПК - пирокатехин,
ПК - промежуточный радикальный продукт окисления пирокатехина.
Получившееся значение АОА объясняется наличием двух функциональных групп в молекуле пирокатехина, которые нейтрализуют две молекулы ДФПГ, а также протеканием реакции между продуктом окисления пирокатехина и двумя молекулами ДФПГ с образованием стабильных молекулярных продуктов.
Пример 3
Чайный пакетик Greenfield (зеленый чай с мелиссой) заливали 100 мл кипятка, настаивали 6-8 мин. Пакетик вынимали, раствор доводили дистиллированной водой до метки (100 мл).
s1
DPPH
16
-3
Навеску ДФПГ растворили в метаноле с итоговой концентрацией 0,001М. Полученный раствор измерили на ЭПР-спектрометре. После математической обработки ЭПР-спектра получили значения количества спинов (n=1,90*10 ед.) и концентрации ДФПГ (C=1,00*10 М).
s2
16
Далее в 1 мл раствора ДФПГ внесли водный раствор зеленого чая. Полученный раствор измерили на ЭПР-спектрометре. Установившееся значение количества спинов после протекания реакции между ДФПГ и зеленым чаем составляет n=1,15*10 ед.
Спектры ДФПГ до и после взаимодействия с зеленым чаем, полученные на ЭПР-спектрометре, приведены на фиг. 3.
Антирадикальную активность зеленого чая рассчитывали по формуле:
,
где АОА - антиоксидантная активность зеленого чая, М-экв;
DPPH
C - концентрация стабильного радикала ДФПГ в исходном растворе, М;
s1
n - начальное количество парамагнитных частиц ДФПГ;
s2
n - количество парамагнитных частиц ДФПГ после взаимодействия с зеленым чаем.
-4
Расчет показал, что с учетом разбавления АОА зеленого чая составляет 3,97*10 М-экв.
Пример 4
Чайный пакетик Принцесса Нури (черный чай классический) заливали 100 мл кипятка, настаивали 6-8 мин. Пакетик вынимали, раствор доводили дистиллированной водой до метки (100 мл).
s1
DPPH
16
-3
Навеску ДФПГ растворили в метаноле с итоговой концентрацией 0,001М. Полученный раствор измерили на ЭПР-спектрометре. После математической обработки ЭПР-спектра получили значения количества спинов (n=1,85*10 ед.) и концентрации ДФПГ (C=0,98*10 М).
s2
16
Далее в 1 мл раствора ДФПГ внесли водный раствора черного чая. Полученный раствор измерили на ЭПР-спектрометре. Установившееся значение количества спинов после протекания реакции между ДФПГ и черным чаем составляет n=0,97*10 ед.
Спектры ДФПГ до и после взаимодействия с зеленым чаем полученные на ЭПР-спектрометре приведены на фиг. 4.
Антиоксидантную активность черного чая рассчитывали по формуле:
,
где АОА - антиоксидантная активность черного чая, М-экв;
DPPH
C - концентрация стабильного радикала ДФПГ в исходном растворе, М;
s1
n - начальное количество спинов ДФПГ;
s2
n - количество спинов ДФПГ после взаимодействия с черным чаем.
-4
Расчет показал, что с учетом разбавления АОА черного чая равна 4,53*10М-экв.
Таким образом, технический результат заключается в повышении точности, сокращении измерительных стадий, что приводит к повышению экспрессности определения, введения универсальных единиц измерения, возможности установления механизма реакции взаимодействия АО со свободным радикалом ДФПГ.