Белково-пептидный комплекс, обладающий протекторным действием на состояние тканей заднего отдела глаза - склеральную оболочку, сетчатку, пигментный эпителий, хороид
PROTEIN-PEPTIDE COMPLEX HAVING A PROTECTIVE ACTION ON THE STATE OF TISSUES OF THE POSTERIOR EYE - SCLERAL SHELL, RETINA, PIGMENT EPITHELIUM, CHOROID

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно - к биологически активному белково-пептидному комплексу (далее - БПК), выделенного из ткани склеры позвоночных животных и содержащему белок - альбумина и пептиды с молекулярными массами от 1000 до 6000 Да, выделенных из ткани склеральной оболочки глаза позвоночных животных.
Заявленный БПК может быть использован в качестве субстанции лекарственного препарата для профилактики и лечения глазных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных, вызванных нарушениями функции склеральной оболочки глаза.
Склеральная оболочка представляет собой наружную тканевую структуру глазного яблока, которая выполняет важнейшую функцию - поддерживает внутриглазное давление, обеспечивающее сохранение организации всех структур глаза
Склеральная оболочка глаза занимает приблизительно 5/6 фиброзной оболочки глазного яблока. В отдельных участках ее толщина варьирует от 0,3-0,5 мм до 1 мм различается. В местах истончения - в области выхода зрительного нерва или экватора глаза, склера образует характерные выпячивания - стафиломы. При глаукоме в этих местах наблюдается формирование экскавации диска зрительного нерва. При механических тупых травмах глазного яблока в данных местах могут возникнуть разрывы (часто в области прикрепления глазодвигательных мышц). Ряд глазных патологий связаны с нарушением анатомического строения и функции склеры, зависящих от состояния образующих ее клеток.
Основные патологии склеральной оболочки обусловлены развитием в ткани воспалительных процессов - склериты, эписклериты. Данные заболевания часто возникают на фоне хронических инфекций как бактериальных, так и вирусных, а также развития аллергии и при других нарушениях иммунных процессов. Прогноз в отношении функций глаза при данных патологиях достаточно благоприятный, однако, эти заболевания характеризуются частыми рецидивами и ремиссиями, которые чередуются на протяжении нескольких лет. Следует отметить, что часто в развитие данных патологий склеры вовлекаются другие ткани глаза - роговица, цилиарное тело, радужная оболочка. Для лечения назначаются антибиотики, иммунодепрессанты, антигистаминные средства, кроме того, рекомендуется прием антибиотиков, салицилатов, а также тепловые процедуры, в основном, УВЧ-терапия, парафиновые аппликации. В результате воспаления и последующего образования соединительно- тканного рубца изменяется прочность ткани склеры. Как последствия долго текущего воспаления в склере могут возникнуть эктазии и стафиломы, образование которых приводит к изменению кривизны роговицы, возникновению астигматизма и, как следствие, - снижению остроты зрения. Необходимо также отметить, что при поражении склеральной части венозного синуса - основного пути оттока жидкости из глаза, повышается внутриглазное давление, а в самой ткани, особенно, в наиболее тонких участках - перикорнеальной зоне и у экватора, возникают бугристые выпячивания черного цвета из-за просвечивания пигмента хороида.
Из других патологий склеральной оболочки глаза следует также упомянуть склеромаляцию, которое, как полагают, протекает по механизму фибриноидной дегенерации склеры. Это заболевание хроническое, наиболее часто возникает у пациентов пожилого возраста, предположительно из-за развития аутоиммунных процессов и колллагенозов. На первой этапе патологии появляется некроз, который далее начинает деструктировать, обнажая сосудистую оболочку. В данном случае показано хирургическое вмешательство для пластического закрытия отверстий.
Особое значение анатомического состояния склеры обнаруживается при миопии - распространенном глазном заболевания (около 30% населения земного шара). Согласно существующим представлениям ведущим фактором прогрессирующей миопии является нарушение структурных, биохимических биомеханических свойств склеральной оболочки глаза (Аветисов Э.С. Близорукость. - М.; Медицина. 1999. С 288; Иомдина Е.Н. Биомеханические и биохимические нарушения склеры при прогрессирующей близорукости и методы их коррекции В кн.: Зрительные функции и их коррекция у детей. Под ред. С.Э. Аветисова, Т.П. Кащенко, A.M. Шамшиновой. М.: Медицина. 2006. С. 163-183; Иомдина Е.Н., Тарутта Е.П., Игнатьева Н.Ю., Костанян И.А., Минкевич Н.И., Какуев Д.Л., Радченко В.В., Шехтер А.Б., Данилов Н.А., Кварцехелия Н.Г., Черышева C.Г. // Российский офтальмологический журнал. 2008. Т 3. С 7-12.). Так, например, было показано, что при прогрессирующей миопии наблюдается изменение конформации ряда белков, синтезируемых фибробластами склеры. В результате происходит изменение пространственной организации коллагенового каркаса склеральной оболочки.
Известен способ лечения врожденной миопии с помощью чрескожной электростимуляции сетчатки и зрительного нерва (Патент РФ №2141293, кл. A61F 9/00, A61N 1/36, 1999). Недостатком данного способа является его малая эффективность для лечения врожденной миопии у детей, имеющих низкую остроту зрения, что связано с патогенезом врожденной миопии.
Еще один способ лечения врожденной миопии у детей, включающий эндоназальный электрофорез с 1,0%-ным раствором рибофлавина-мононуклеотида (витамин В2) с использованием в качестве источника постоянного тока аппарата «Поток-1» (Оковитов В.В. Методы физиотерапии в офтальмологии. М., 1999, с. 52-57). Силу тока с 0,5 мА постепенно увеличивают до 2 мА в зависимости от чувствительности пациента до момента легкого жжения. Продолжительность процедуры составляет 10-20 мин ежедневно, курсом 10 дней. Курс лечения повторяют через 1-2 месяца. Недостатками этого способа являются: непродолжительность терапевтического эффекта и необходимость повторения лечения каждые 1-2 месяца, недостаточное патогенетическое воздействие витаминного комплекса, учитывая тяжелый характер изменений в сетчатке.
Известно средство офтальмологическое, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза, представляющее собой комплекс низкомолекулярных полипептидов, полученных из сетчатки животных путем экстракции 3%-ным уксусной кислоты с добавлением хлористого цинка и обработки надосадочной жидкости ацетоном (RU2073518, 20/02/97). Препарат получил название «Ретилин».
Данное офтальмологическое средство не оказывает специфическое склероукрепляющее воздействие.
Известен способ укрепления склеры глаза, описанный в заявке на изобретение №99120361, опубл. 20.01.2001 г., включающий проведение тренировок аккомодативной способности органа зрения, введение медикаментозных препаратов, улучшающих гемодинамику и укрепляющих склеру глаза, а также дополнительное введение иммуномодуляторов с одновременным введением амино- и нуклеиновых кислот в комплексе с оптимизаторами обмена веществ в пределах возрастных доз.
Однако данный способ не позволяет оказывать специфическое склероукрепляющее воздействие. Он является общеукрепляющим, его действие на склеральную ткань является опосредованным и соответственно не являющимся эффективным.
Также существует способ укрепления склеры глаза (Аветисов Э.С. Близорукость, Медицина, 1986 г., стр. 201-208). Способ заключается во введении инъекционным путем вспенивающейся полимерной композиции, образующей на поверхности склеры упругий пеногель. Экспериментальные исследования на животных (глаза кроликов) показали, что после инъекции образуется скопление пеногеля с последующим образованием гранулемы и преобразованием в соединительную ткань. Через месяц после введения в склере кроликов обнаруживали скопления макрофагов и многоядерные клетки, являющиеся проявлением фибропластической реакции. Через пять месяцев формируется нежноволокнистая соединительная ткань. Через 10 месяцев при гистологических исследованиях определяли грубую волокнистую соединительную ткань; через 15 месяцев гистологически определяли широкие соединительнотканные поверхностные тяжи.
Недостатком данного способа является образование наружной грануляционной ткани на склере глаза как следствие воспалительной реакции после введения пенообразующего компонента. Поэтому эффект воздействия на склеру глаза наступает через 15 месяцев, что увеличивает срок и снижает эффективность воздействия.
Из RU 2232586, С2, 20.07.2004, известно другое офтальмологическое лекарственное средство и способ лечения заболеваний патологических состояний и повреждений сетчатой оболочки глаза. Описанное в известном патенте офтальмологическое лекарственное средство включает препарат сетчатки и фармацевтически приемлемый носитель, причем, оно содержит гликопротеин, выделенный из сетчатки глаза млекопитающих, растворимый в насыщенном растворе сульфата аммония, имеющий изоэлектрическую точку ниже 3,0 и кажущуюся молекулярную массу от 8 до 200 кДа и, а также хлористый кальций.
Средство может быть использовано для лечения миопии, ретинопатии, для снятия дискомфорта и усталости глаз, для предотвращения и лечения отслойки сетчатки различного происхождения, в том числе, для предотвращения отслойки сетчатки при операционном вмешательстве. Изобретение обеспечивает отсутствие побочных и аллергических реакций, а также непереносимость препарата.
Однако, данное средство не обеспечивает необходимое специфическое склероукрепляющее воздействие.
Из RU 215606, С2, 10.12.2006 известно биологически активное вещество, используемое в качестве лекарственного средства для лечения миопии и заболеваний склеральной оболочки глаза позвоночных животных (из свеженуклеированных глаз позвоночных животных) таких как крупный рогатый скот, крысы, лягушки Xeropus laevis.
:
Биологически активное вещество представляет собой регуляторные пептиды с молекулярной массой менее 8 кДа, активность пептидов методом биотестирования равна 125-160%. Способ получения их характеризуется тем, что выделяют из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных ткань центральной области склеральной оболочки, включающей решетчатую пластинку, промывают и выдерживают ее в водно- солевом физиологическом растворе, центрифугируют, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее растворением в 100%-ном растворе сульфата аммония, фильтруют, диализуют до полного удаления ионов аммония, разделяют методом изоэлектрофокусирования в градиенте плотности сахарозы при рН 3,5-10,0, температуре 4-6°С и напряжении 500-2000 В в течение 72-96 часов, после чего собирают фракции кислых белков, объединяют их, диализуют до полного удаления сахарозы и амфолинов, полученный при этом водный раствор белка высушивают до получения сухого вещества, которое очищают методом электрофореза в 7,5-15%-ном полиакриламидном геле, собирают низкомолекулярную фракцию Rf=0,9-0,95,содержащую регуляторный пептид, путем элюирования деионизованной водой из геля в течение 2-5 дней при 4-7°С, полученную фракцию диализуют в диализных мешках с пределом пропускания пор 2-8 кДа при 4-7°С в течение 7-10 дней против деионизованной воды, отдиализованный раствор регуляторного пептида далее повторно высушивают до получения белого хлопьевидного мелкодисперсного порошка, который затем растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Изобретение обеспечивает повышение процента выхода регуляторных пептидов, обладающих биологической активностью в сверхмалых дозах, выделение высокоочищенных полипептидов с низкой молекулярной массой.
Недостатком данного изобретения является неполная очистка биологически активного вещества, выделенного из ткани склеры, и отсутствие его идентификации.
Из монографий, например, В.П. Ямсковой, И.А. Ямскова, М.С. Краснова «Новые экспериментальные и теоретические аспекты в биорегуляции: механизм действия мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов», Lambert Academic Publishing, Saarbrucken, 2012; или «Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови костной ткани» Рыбакова Е.Ю. Автореферат диссертации, 2012, и др., известен биорегулятор группы МГТБ (белково-пептидный комплекс), содержащий смеси небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да и белок семейства альбуминов с молекулярной массой 60000 Да, 68714 Да или 68674 Да. Однако данный биорегулятор не обладает необходимой биологической активностью для использования его в целях профилактики и лечения глазных заболеваний у человека и сельскохозяйственных животных вызванных нарушением функции склеральной оболочки глаза.
Технической задачей заявленного изобретения является получение нового биологически активного вещества в виде белково-пептидного комплекса из свеженуклеированных глаз позвоночных животных, используемого для лечения миопии и заболеваний склеральной оболочки глаза, в частности.
-7
-17
В соответствии с поставленной технической задачей технический результат от реализации назначения заявленного изобретения заключается в обеспечении необходимого специфического склероукрепляющего воздействия его, а именно, в способности в низких дозах, соответствующих диапазону концентраций 10-10 мг белка/мл, оказывать протекторное действие на ткани заднего отдела глаза - склеральную оболочку, пигментный эпителий, хороид, которое выражается в поддержании адгезии между данными тканями, сохранении межклеточных взаимодействий в пределах каждой ткани, а также ответственен за поддержание целостности коллагеновых волокон, увеличение жизнеспособности фибробластов и сохранение пространственной организации тканевой структуры склеральной оболочки.
-7
-17
Поставленная техническая задача достигается фармакологической композицией, обладающей протекторным действием на состояние тканей заднего отдела глаза - склеральную оболочку, сетчатку, пигментный эпителий, хороид, представляющая собой водный раствор в концентрации 10-10 мг/мл и состоящей из проявляющего шаперон-подобную активность белково-пептидного комплекса, содержащего пептиды с молекулярными массами от 1000 до 6000 Да и белок с молекулярной массой 66000-68000 Да, относящийся к семейству альбуминов сыворотки крови, а также липиды и углеводы, полученная выделением из склеральной оболочки глаза позвоночных животных ИЭФ-фракций, разделенных и собранных методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в интервале рн<3,0, смешанных в эквимолекулярных соотношениях и полученных в результате последовательной экстракции склеральной оболочки глаза позвоночных животных, фракционирования и разделения полученных фракций с использованием метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ.
2+
Белково-пептидный комплекс, используемый для получения офтальмологического лекарственного средства для лечения глазных заболеваний, связанных с патологией склеральной оболочки глаза получают из свежеэнуклеированных глаз позвоночных животных выделяют неповрежденную склеральную оболочку, промывают в водно-солевом физиологическом растворе, выдерживают склеру в водно-солевом растворе, центрифугируют тканевой экстракт, собирают надосадочную жидкость, разделяют ее путем растворения в 100% -ном растворе сульфата аммония, фильтруют, диализуют до полного удаления ионов сульфата аммония, разделяют методом высокоэффективной хроматографии в градиенте ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте при рН 2,2-3,0 температуре 22-25°С в течение 60 минут, собирают фракцию гидрофобных белков, из полученного при этом раствора белка удаляют ацетонитрил и трифторуксусную кислоту с помощью центрифужного концентратора, затем раствор фракций гидрофобных белков обрабатывают денатурирующим раствором содержащим 6 М GиHCL, 0.003 М EDTA, 0.3 М NaCl и пять объемов этилового спирта, центрифугируют, собирают надосадочную жидкость, при разделении ее методом обращенно-фазовой ВЭЖХ получают гидрофильные фракции пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да и альбумин, из которых в вакуумном испарителе удаляют ацетонитрил и растворяют в физиологическом водно-солевом растворе и смешивают в присутствии ионов Са в эквимолекулярных количествах. Проводят исследование специфической активности данного БПК на модели органотипического культивирования заднего отдела глаза тритона Pleurodeles waltl in vitro [Краснов M.C., Григорян Э.Н., Ямскова В.П. Изв. РАН, Сер. биол., 2003, 1, 22-36.]. Действие данного ВПК в низких дозах увеличивает жизнеспособность фибробластов ткани склеры,
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами, в которых описан способ получения ВПК (пример 1) и определение специфической активности (примеры 2-11). а также фиг.1 и 2.
Примечание:
Значение рН<3,0 ИЭФ-фракции означает диапазон значений рН=1,5-2,9, то есть менее 3,0; это показатель электродного раствора и обозначает границу с градиентным раствором.
На фиг. 1 показано влияние ВЭЖХ-фракций, выделенных из тканевого экстракта склеры глаза быка, на состояние тканей заднего отдела глаза тритона Pl. waltl при органотипическом культивировании. Ув. ок. ×10, об.×20.
А) контроль; Б) с добавлением в среду БПК.
На фиг.2 показано протекторное действие белково-пептидного комплекса, выделенного из ткани склеры КРС (БПК1) и содержащего выделенные из склеры смеси пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да и альбумин gi| 1351907 с молекулярной массой 66000-68000 Да (БПК2), на фибробласты склеры при органотипическом культивировании тканей в составе заднего сектора глаза in vitro. По оси абсцисс - название экспериментальных серий. По оси ординат - площадь, занимаемая жизнеспособными фибробластами в ткани склере относительно общей площади гистологического среза в %. imagej.
Нижеследующие примеры иллюстрируют изобретение, но не ограничивают его и показывают эффективность БПК в качестве офтальмологического средства.
Пример 1. Выделение из ткани склеры глаза быка Bos Taurus белково-пептидного комплекса, определение его состава и структуры.
-1
-3
-3
-3
2
3
4
Из свежеэнуклеированных глаз крупного рогатого скота выделяют склеральные оболочки, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (1,5×10 М NaC1; 1,0×10 М СаС1; 5×10 М КС1; 1×10 М HEPES) и далее экстрагируют в свежем растворе при 4-5°С в течение 5 ч. Полученный таким образом экстракт центрифугируют (3000 g, 30 мин), добавляют сухой сернокислый аммоний до образования насыщенного раствора (780 г/л), добавляют азид натрия (10 мкг/л) и оставляют суспензию белков на 72 часа при 4-5°С. Центрифугированием (10000 g, 4-5°С, 30 мин) собирают фракцию надосадочной жидкости (супернатант), диализуют против воды (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:100). Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре ниже 40°С, далее разделяют с методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10.0 (Serva, Германия) (Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами // М.: Изд. "Наука". 1983. 304 с). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 0,1%-ный р-р HPO; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:10 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000-6000 Да. Проводят электрофорез ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0 в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок с молекулярной массой 66387 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi| 1351907 в базе данных SwissProt. Методом Эдмана была установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность данного белка (DTHKSEIAHRFKDLGE), которая имеет 100%-ую гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы БСА быка.
Методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-110 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983) определяют значение pl для белка, который предварительно был элюирован из полиакриламидного геля после электрофореза ИЭФ-фракции со значением рН<3,0. Значение pi данного белка находится в интервале рН 3,90-3,96.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 представляет собой БПК, состоящий из белка gi| 1351907 - представителя мультисемейства альбуминов сыворотки крови быка Bos taurus со значением pi в области рН 3,90-3,96, и смеси небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да.
18
3
4
Для определения углеводного состава изучаемой ИЭФ-фракции ее предварительно лиофилизуют. Далее проводят гидролиз 1 мг лиофилизата в 2 мл 4 М трифторуксусной кислоты в стеклянной ампуле с тефлоновой крышкой в течение 3 часов при 110°С, по истечении времени реакции трифторуксусную кислоту удаляют на роторном испарителе. Модификацию моносахаридов - получение 3-метил-1-фенил-2-пиразолин-5-он-(РМР)-производных углеводов проводят по методу [S. Honda, E. Akao, S. Suzuki, M. Okuda, K. Kakehi, J. Nakamura, Anal. Biochem. 180 (1989) 351]. Гидролизованный образец растворяют в 0,5 мл 0,3 М NaOH, к раствору добавляют 0,5 мл 0.5 М раствора РМР в метаноле и инкубируют 2 часа при 70°С. После нейтрализации 0,3 М HCl избыток РМР удаляют экстракцией хлороформом, водную фазу упаривают досуха. Хроматографический анализ РМР-производных проводят на колонне Kromasil C (250×4.6 мм) элюцией 0,1 М CHCOONH, рН 5,6 в 20% ацетонитриле, детекцию проводят при 245 нм. В результате проведенного анализа было установлено, что ИЭФ-фракция содержит 22,5% глюкозы, 22,6% глюкозамина, 20,2% маннозы, 11,6% галактозы, 8,5% ксилозы, 7,4% фукозы, 6,5% N - ацетилглюкозамина.
Полученные данные указывают на присутствие в БПК, выделенном из ткани склеры, ряда гликанов, которые определяют, с одной стороны, его взаимодействие с плазматической мембраной клетки, с другой - тканеспецифический характер его биологического действия.
lin
Для определения липидов в составе ИЭФ-фракции применяют метод газовой хромато-масс-спектрометрии, предварительно получают их дериваты - соответствующие триметилсилиловые и метиловые эфиры. Для получения триметилсилиловых эфиров ВЭЖХ-фракции с временем удерживания 53 мин была обработана силирующим реагентом - N,O-бис(триметилсилил)ацетамидом при 60°С. Для получения метиловых эфиров многокомпонентную пробу обрабатывали метилирующим реагентом - тетраметиламмонийгидроксидом (25%-ный раствор в метаноле). Пиролиз промежуточно образующихся тетраметиламмониевых солей с образованием соответствующих метиловых эфиров проходит непосредственно в колонке при хроматографировании анализируемой фракции. Определение компонентного состава изучаемой фракции проводят на газовом хроматографе Agilent 7890 (США) на колонке НР-5 (США) (50 м×320 мкм×1,05 мкм) оснащенным масс-спектрометрическим детектором 5975С с квадрупольным масс-анализатором. Анализ проводят при температурной программе хроматографирования: изотерма 2 мин при 40°С; нагрев до 250°С со скоростью 5°С/мин; изотерма 15 мин при 250°С; нагрев до 320°С со скоростью 25°С/мин; изотерма 5 мин при 320°С. Температура интерфейса 280°С. Газ носитель - гелий, скорость потока 1 мл/мин. Хроматограмма фракции по полному ионному току. Условия масс-спектрометрического детектирования: энергия ионизирующих электронов 70 эВ; регистрация масс-спектров в положительных ионах в диапазоне (m/z) от 20 до 450 со скоростью 2,5 скан/сек. Программное обеспечение - chemStation Е02.00. Идентификацию компонентного состава (качественный анализ) проводят по библиотеке полных масс-спектров и соответствующим значениям хроматографических линейных индексов удерживания (I).
6:0
8:0
9:0
10:0
12:0
14:0
15:0
16:0
17:0
18:0
16.1
В результате было установлено, что ИЭФ-фракция содержит компоненты, которые являются составляющими глицеридов, фосфолипидов, гликолипидов, а также насыщенные жирные кислоты (С, С, С, С, C, С, С, C. C, С) и моноеновую жирную кислоту (C).
Пример 2. Образование белко-пептидного комплекса взаимодействием выделенных из ткани склеры глаза быка Bos taurus смеси пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да и альбумина gi| 1351907 с молекулярной массой 66387 Да.
-1
-3
-3
-3
2
4
Из свежеэнуклеированных глаз крупного рогатого скота выделяют склеральные оболочки, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (1,5×10 М NaCl; 1,0×10 М CaCl; 5×10 М KCl; 1×10 М HEPES) и далее экстрагируют в свежем растворе при 4-5°С в течение 5 ч. Полученный таким образом экстракт центрифугируют (3000 g, 30 мин), добавляют сухой сернокислый аммоний до образования насыщенного раствора (780 г/л), добавляют азид натрия (10 мкг/л) и оставляют суспензию белков на 72 часа при 4-5°С. Центрифугированием (10000 g, 4-5°С, 30 мин) собирают осадок, диализуют против воды (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:100), затем фракционируют методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на гидрофобной колонке Kromasil С(Россия) (4,6×250 мм) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200 (США) в градиенте вода-ацетонитрил (0-60%), используя 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты (рН 2,2) со скоростью 1 мл/мин в течение 60 мин, детекцию проводят при 214 и 280 нм. Собирают ВЭЖХ-фракцию с временем удерживания 53 мин, анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (BrukerDaltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Определяют белок с молекулярной массой 66387 Да. В 12,5%-ном полиакриламидном геле выделяют белковую фракцию, которая характеризуется полосой, соответствующей мол. массе 66000 Да. Проводят триптический гидролиз данной фракции в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза. Анализ полученных результатов показывает, что данная белковая фракция представляет собой бычий сывороточный альбумин под номером gi|1351907 в базе данных SwissProt с молекулярной массой 66387 Да. Методом Эдмана установлена частичная N-концевая аминокислотная последовательность этого белка (DTHKSEIAHRFKDLG-), которая имеет 100%-ную гомологию с N-концевой последовательностью зрелой молекулы БСА быка.
4
2
-3
Раствор фракций с временем удерживания 53 мин обрабатывают денатурирующим раствором, содержащим 6 М GuHCl, 0,003 MEDTA, 0,3 М NaCl при 45°С в течении 24 часов и пятью объемами этилового спирта при 4°С в течение 72 часов. После 30-минутного центрифугирования при 10000 g собирают осадок и фракционируют его с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на гидрофобной колонке Kromasil С (Россия) (4,6×250 мм) с использованием хроматографа высокого давления Agilent 1200 (США) в градиенте вода-ацетонитрил. Полученные гидрофильные фракции анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (BrukerDaltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты. Выделяют фракцию с временем удерживания 33 мин, содержащую пептиды с молекулярными массами 1000-6000 Да, а также фракцию белка с молекулярной массой 66000 Да с временем удерживания 53 мин. Удаляют ацетонитрил с помощью вакуумного роторного испарителя, растворяют в физиологическом водно-солевом растворе. Смешивают ВЭЖХ-фракцию с временем удерживания 53 мин, представляющую собой бычий сывороточный альбумин под номером gi| 1351907, который характеризуется частичной N-концевой аминокислотной последовательностью (DTHKSEIAHRFKDLG-), с концентрацией белка 200 мкг/мл и ВЭЖХ-фракцию, содержащую пептиды с мол. массами 1000-6000 Да, с концентрацией белка 50 мкг/мл, в соотношении 10:1 в присутствии 10 М CaCl. Получают таким образом БПК, который используют в качестве биологически активной субстанции, оказывающей протекторное действие на ткани склеры, которое выражается в увеличении жизнеспособности фибробластов и поддержании пространственной организации коллагеновых волокон, а также протекторное действие на ткани заднего отдела глаза (см. пример 7).
Пример 3. Влияние белково-пептидного комплекса, выделенного из ткани склеры глаза быка B.taurus, на индуцированную дитиотреитолом агрегацию молекул БСА
Изучают шаперон-подобную активность БПК, выделенного из ткани глаза быка B.taurus - ВЭЖХ-фракции с временем удерживания 53 мин (Пример 2) на модели молекулярной агрегации бычьего сывороточного альбумина (БСА), инициированной дитиотреитолом (ДТТ) (Борзова В.А. Механизмы защитного действия шаперонов при агрегации белков: дис.к-та биол. наук / В.А. Борзова. - Москва, 2016. - 181 с).
Эксперимент проводят в стеклянной кювете цилиндрической формы на анализаторе "Photocor Compact-Z" (Россия), оснащенным термостабилизированным AIGalnP диодным лазером с длиной волны λ=637.4 нм и мощностью 30 мВт, со встроенным многоканальным коррелятором "Photocor-FC", получая корреляционную функцию флуктуаций интенсивности рассеянного света и интегральной интенсивности рассеяния. Для инициации процесса агрегации к 100 мкг/мл БСА (Sigma Aldrich, США) в 0,5 мл реакционной смеси добавляют аликвоту ДТТ до концентрации 10 мМ в растворе. Реакцию проводят при 50°С. Рассеянный свет собирают под углом 90°. Для изучения влияния фракции БПК, выделенного из ткани склеры глаза быка, на ДТТ-индуцированную агрегацию БСА, раствор фракции БПК в концентрации от 1,5 нм до 1,5 мкМ добавляют к раствору БСА перед внесением ДТТ. За шаперон-подобную активность принимают 100-ное ингибирование агрегации БСА, индуцированной ДТТ, выражающуюся в отсутствии интенсивности рассеянного света и наночастиц в реакционной смеси. Полученные результаты показывают, что добавление 15 нМ БПК - ВЭЖХ-фракции с временем удерживания 53 мин (Пример 1) приводит к 100-ному ингибированию агрегации БСА индуцированной ДТТ.
Таким образом, БПК- ВЭЖХ-фракция с временем удерживания 53 мин (Пример 2), предотвращает молекулярную агрегацию БСА, индуцируемую дитиотреитолом и является шапероном белковой природы.
Пример 4. Выделение из ткани склеры глаза крысы Wistar белково-пептидного комплекса, определение его состава и структуры.
Эксперимент проводят на крысах Wistar обоего пола, весом 180-220 г.
-1
-3
-3
-3
2
3
4
Из свежеэнуклеированных глаз крыс микрохирургически выделяют склеральные оболочки, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (1,5×10 М NaCl; 1,0×10 М CaCl; 5x10 М KCI; ×10 М HEPES) и далее экстрагируют в свежем растворе при 4-5°С в течение 5 ч. Полученный тканевой экстракт центрифугируют (3000 g, 30 мин), постепенно при перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до образования насыщенного раствора (780 г/л), добавляют азид натрия (10 мкг/л) и оставляют суспензию белков на 72 часа при 4-5°С. Центрифугированием (10000 g, 4-5°С, 30 мин) собирают фракцию супернатанта, диализуют против воды (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:100). Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре ниже 40°С, далее разделяют с методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами // М.: Изд. "Наука". 1983. 304 с). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 0,1%-ный р-р HPO; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 10 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:10 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000-6000 Да. Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 66000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок с молекулярной массой 66898 Да представляет собой белок семейства альбуминов млекопитающих под номером gi| 124028612 в базе данных SwissProt.
Проводят ИЭФ в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-110 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983), определяют значение pi для белка, который предварительно был элюирован из полиакриламидного геля после электрофореза ИЭФ-фракции со значением рН<3,0. Значение pl данного белка находится в интервале рН 4,0-4,1.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 представляет собой БПК, состоящий из белка gi|124028612-представителя семейства альбуминов сыворотки крови крысы со значением pl в области рН 4,0-4,1 и смеси небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да.
Пример 5. Выделение из склеры глаза лягушки Xenopus laevis белково-пептидного комплекса, определение его состава и структуры.
Эксперимент проводят на лягушках Xenopus laewis_обоего пола, весом 180-220 г.
-1
-3
-3
-3
2
3
4
Из свежеэнуклеированных глаз лягушек микрохирургически выделяют склеральные оболочки, промывают их в водно-солевом физиологическом растворе (1,5×10 М NaCl; 1,0×10 М CaCl; 5×10 М KCl; 1×10 М HEPES) и далее экстрагируют в свежем растворе при 4-5°С в течение 5 ч. Полученный тканевой экстракт центрифугируют (3000 g, 30 мин), постепенно при перемешивании добавляют сухой сернокислый аммоний до образования насыщенного раствора (780 г/л), добавляют азид натрия (10 мкг/л) и оставляют суспензию белков на 72 часа при 4-5°С. Центрифугированием (10000 g, 4-5°С, 30 мин) собирают фракцию супернатанта, диализуют против воды (при соотношении объемов диализируемой фракции и диализирующей жидкости 1:100). Присутствие в растворе ионов аммония определяют реакцией с реактивом Несслера. Фракцию супернатанта концентрируют, используя роторный вакуумный испаритель, при температуре ниже 40°С, далее разделяют с методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-440 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами // М.: Изд. "Наука". 1983. 304 с). Для разделения готовят следующие растворы: тяжелый электродный раствор - 60% сахарозы в 0,1%-ный р-р HPO; легкий электродный раствор - 0,1%-ный NaOH; тяжелый градиентный раствор - 75 г. сахарозы, 100 мл супернатанта, доводят до 200 мл дистиллированной водой; легкий градиентный раствор - 15 г. сахарозы, до 200 мл дистиллированной воды. В колонку наслаивают растворы в следующем порядке: тяжелый электродный раствор, тяжелый и легкий градиентные растворы, которые подают из градиентного смесителя, и затем легкий электродный раствор. ИЭФ проводят при +4°С в течение 96 часов при напряжении 500-1500 В. Собирают фракции объемом 5 мл. Детекцию белков осуществляют на любом спектрофотометре при 280 нм, для каждой фракции определяют значение рН с помощью рН-метра. Согласно полученной картине разделения собирают фракцию в интервале значений рН<3,0, которую далее диализуют против дистиллированной воды до удаления сахарозы в соотношении объемов 1:10 с пятикратной сменой воды. Данную фракцию анализируют методом масс-спектрометрии на времяпролетном масс-анализаторе UltraFlex 2 (Bruker Daltonic, Германия) с использованием в качестве матрицы α-циано-4-гидроксикоричной кислоты, обнаруживают ряд пептидов с молекулярными массами в диапазоне 1000-6000 Да. Проводят электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в денатурирующих условиях ИЭФ-фракции, собранной в интервале значений рН<3,0. Из геля вырезают полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно в 68000 Да. Проведенный триптический гидролиз белка в геле с последующим масс-спектрометрическим исследованием продуктов гидролиза показывает, что выделенный белок с молекулярной массой 67602 Да представляет собой белок семейства альбуминов амфибий под номером gi| 148237263 в базе данных SwissProt.
Проводят ИЭФ в градиенте плотности сахарозы на колонке LKB-110 («LKB», Швеция), используя амфолины диапазона рН 3,5-10,0 (Serva, Германия) (Остерман, 1983), определяют значение pi для белка, который предварительно был элюирован из полиакриламидного геля после электрофореза ИЭФ-фракции со значением рН<3,0. Значение pi данного белка находится в интервале рН 3,9-4,0.
Таким образом, ИЭФ-фракция, собранная в интервале значений рН<3,0 представляет собой БПК, состоящий из альбумина сыворотки крови лягушки Xenopus laevis со значением pi в области рН 3,9-4,0 и смеси небольших пептидов с молекулярной массой 1000-6000 Да.
Пример 6. Получение белково-пептидного комплекса и его растворов в различных концентрациях
Для приготовления растворов БПК, предназначенного для исследования специфической биологической активности и его безопасности, используют два препарата: 1. БПК1- выделенный из тканевого экстракта склеральной оболочки глаза КРС, представляющий собой ИЭФ-фракцию, которая собрана в области рН<3,0 (описана в Примере 1) с концентрацией по белку 100±10 мкг/мл; и 2. БПК2, образованный взаимодействием выделенных из ткани склеры глаза КРС смеси пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да и альбумина gi|1351907 с молекулярной массой 66387 Да, с концентрацией по белку 100±10 мкг/мл.
-1
-19
-4
-12
-19
Во флакон, содержащий 0,1 мл водного раствора БПК, добавляют 0,9 мл дистиллированной воды интенсивно встряхивают 15 раз. Отбирают 0,1 мл образовавшегося раствора в следующий флакон и добавляют 0,9 мл дистиллированной воды, встряхивают 15 раз. Данную процедуру повторяют 17 раз, получая путем 10-кратного последовательного разбавления растворы БПК с концентрациями, соответствующими с 10 по 10 мг/мл (методом потенцирования). В экспериментах по изучению специфической активности на модели культивирования тканей глаза в составе заднего сектора исследовали растворы с концентрациями, соответствующими 10; 10; 10 мг белка/мл.
Аналогично и в таком же диапазоне концентраций были приготовлены растворы БПК на 0,9%-ном растворе NaCl.
-4
-7
-17
-19
В экспериментах по изучению специфической активности БПК, обнаруженного в ткани склеральной оболочки глаза КРС, исследованы растворы в дозах 10, 10-10 и 10 мг/мл.
-12
Все растворы стерилизуют путем пропускания через стерильные мембранные фильтры GV с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», США). В качестве терапевтической дозы исследуют раствор БПК в концентрации, соответствующей 10 мг/мл.
-7
-17
-12
Далее продемонстрировано, что только растворы БПК в дозах 10-10 мг/ мл проявляют биологическое действие. Конкретные данные о проявлении биологического действия БПК показаны в дозе 10 мг белка/мл, однако и другие дозы в диапазоне заявленного изобретения показывают аналогичную активность и достижение указанного технического результата. ЗДЕСЬ
Пример 7. Изучение специфической активности белково-пептидного комплекса на модели органотипического культивирования тканей в составе заднего сектора глаза тритона Pleurodeles waltl in vitro
Биологическое действие заявляемого БПК, обнаруженного в склеральной оболочке глаза КРС, характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности. В связи с этим специфическую активность заявляемого БПК изучают на модели органотипического культивирования тканей глаза в составе заднего сектора глаза тритона Pleurodeles waltl in vitro [Краснов M.C., Григорян Э.Н., Ямскова В.П. Изв. РАН, Сер. биол., 2003, 1, 22-36].
-12
-12
Исследование проводят на взрослых половозрелых особях тритона Pleurodeles waltl, содержащихся в аквариальной Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. Изучают действие БПК в виде двух препаратов: БПК1, выделенного из тканевого экстракта склеральной оболочки глаза КРС - ИЭФ-фракция в дозе, соответствующей 10 мг белка (Пример 1), а также БПК2, образованного взаимодействием смеси пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да и альбумина gi|1351907 с молекулярной массой 66387 Да, в дозе, соответствующей 10 мг белка.
Хирургическим путем выделяют ткани глаза у тритонов, предварительно наркотизированных в 0,1%-ном растворе MS-222, и культивируют в среде, содержащей 350 мл среды 199, 150 мл бидистилированной воды, 0,15 мл 1 М буфера Hepes и 1 мл 4%-ного раствора сульфата гентамицина. Перед культивированием среда проходит холодную стерилизацию через мембранные фильтры GV с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», США). Ткани глаза тритона изолируют с помощью бинокуляра. Сначала освобождают глаз от кожных покровов и жира, затем разрезают по окружности проксимальнее лимба. Отбрасывают ростовую область сетчатки вместе с радужкой, роговицей и хрусталиком. Для последующего культивирования используют задние секторы глаз, в состав каждого из которого входит сетчатка, пигментный эпителий, сосудистая оболочка и склера. Полученные задние отделы глаз помещают в пенициллиновые флаконы, заполненные бессывороточной средой, на целлюлозные фильтры типа А/Е («Gelman», США), отмытые в 70%-ном этаноле и ополоснутые в культуральной среде. Во флаконы 1-ой опытной серии перед началом культивирования добавляют БПК1, во флаконы 2-ой опытной серии аналогично добавляют БПК2; во флаконы контрольной серии в культуральную среду добавляют соответствующий объем физиологического раствора. Все флаконы закрывают стерильными крышками, пленкой Parafilm М, алюминиевой фольгой и культивируют без смены культуральной среды в термостате в темноте при 20-22°С в течение 72 часов. Изучение состояния эксплантатов, после культивирования проводили на сериях парафиновых срезов. Ткани глаза фиксировали в растворе Буэна, после фиксации в течение 12 ч трижды отмывали 70%-ным этанолом, далее обезвоживали и заливали в парафин. Делали парафиновые срезы толщиной 7 мкм, которые после депарафинирования и гидратирования окрашивали гематоксилином и эозином и заключали в канадский бальзам под покровное стекло. Для просмотра гистологических срезов использовали микроскоп "Jenaval" ("CarlZeiss", Германия). Жизнеспособность фибробластов определяют по морфологии их ядер. Оценку количества фибробластов на гистологических срезах осуществляют по программе ImageJ, оценивая площадь клеток в ткани склеры, относительно площади всего среза. Для каждой экспериментальной точки было исследовано не менее 25 срезов. Полученные результаты обрабатывают по критерию Манна-Уитни.
-12
Полученные результаты показывают, что добавление в питательную среду препаратов БПК1 или БПК2 в дозе, соответствующей 10 мг белка при органотипическом культивировании тканей заднего отдела глаза тритона in vitro способствует сохранению пространственной организации тканей заднего отдела глаза. Это выражается в сохранении взаимодействия между сосудистой и склеральной оболочками, причем в пределах хороида отмечается сохранение компактных адгезивных взаимодействий. Монослой пигментного эпителия также находится в лучшем состоянии по сравнению с контролем: пигмент распределен равномерно в клетках, между клетками сохраняются адгезивные взаимодействия. Отмечается поддержание адгезии между пигментным эпителием и нейральной сетчаткой, которая находится в более сохранном состоянии по сравнению с контролем. В склере наблюдается более компактное и плотное расположение волокон, с менее заметными расслоениями, чем в контроле. В основном фибробласты в склере выглядят жизнеспособными, судя по морфологии их ядер (Фиг. 1Б). Таким образом, полученные данные указывают на способность БПК, обнаруженного в склеральной оболочке глаза КРС, препятствовать развитию дегенеративных процессов в склеральной оболочке и поддерживать адгезивные взаимодействия между склерой и прилежащими тканями, т.е. оказывать выраженное протекторное действие на состояние склеры, сосудистой оболочки и ПЭ.
Подсчет фибробластов в ткани склеры культур опытной и контрольной серий показал, что количество жизнеспособных фибробластов при воздействии БПК1 или БПК2 приблизительно в 2,5-2,7 раза больше, чем в контроле (Фиг. 2).
Пример 8
-7
-9
-11
-13
-15
-17
Добавление только фракции пептидов с мол. массами 1000-6000 Да (пример 1) в диапазоне доз, соответствующих 10; 10; 10; 10; 10; 10 мг белка, в бессывороточную среду культивирования заднего отдела глаза тритона in vitro не оказывает влияния на состояние тканей глаза тритона по сравнению с культурой заднего сектора глаза, инкубируемой в бессывороточной среде, в том числе, на состояние фибробластов склеральной оболочки.
Пример 9
-7
-9
-11
-13
-15
-17
На модели органотипического культивирования тканей заднего отдела глаза тритона in vitro в бессывороточной среде изучают биологическое действие фракции белка с мол. массой 66387 Да (пример 1) в диапазоне концентраций, соответствующих 10; 10; 10; 10; 10; 10 мг белка. Показано, что добавление только данной фракции в указанных дозах не приводит к изменению состояния тканей глаза тритона по сравнению с культурой заднего сектора, инкубируемой в бессывороточной среде. Также показано, что добавление данной фракции в среду культивирования не приводит к изменению состояния фибробластов в ткани склеры.
Пример 10 (контрольный для сравнения)
На модели органотипического культивирования тканей заднего отдела глаза тритона in vitro изучают действие двух препаратов БПК:
-4
БПК1 - ИЭФ-фракция выделенная из тканевого экстракта склеральной оболочки глаза КРС в дозе, соответствующей 10 мг белка (Пример 1);
-4
БПК2, образованного взаимодействием смеси пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да и альбумина gi|1351907 с молекулярной массой 66387 Да, в дозе, соответствующей 10 мг белка (Пример 4).
Показано, что добавление обоих препаратов БПК в указанных дозах в бессывороточную питательную среду не приводит к изменению состояния тканей глаза тритона по сравнению с культурой заднего сектора, инкубируемой в бессывороточной среде. Также показано, что добавление обоих препаратов БПК в этой дозе в среду культивирования не приводит к изменению состояния фибробластов ткани склеры.
Пример 11 (контрольный)
-19
-18
На модели органотипического культивирования тканей заднего отдела глаза тритона in vitro изучают действие двух препаратов БПК: выделенного из тканевого экстракта склеральной оболочки глаза КРС (ИЭФ-фракция, пример 1) в дозе, соответствующей 10 мг белка - БПК1, а также БПК2, образованного взаимодействием смеси пептидов с молекулярными массами 1000-6000 Да и альбумина gi|1351907 с молекулярной массой 66387Да (пример 1), в дозе, соответствующей 10 мг белка - БПК2 как это описано в примере 4. Показано, что добавление препаратов БПК в указанной дозе в бессывороточную питательную среду не приводит к изменению состояния тканей глаза тритона по сравнению с культурой заднего сектора, инкубируемой в бессывороточной среде. Также показано, что добавление обоих препаратов БПК и этой дозе в среду культивирования не приводит к изменению состояния фибробластов ткани склеры.
Вывод
Заявляемый БПК, обнаруженный в склеральной оболочке глаза позвоночных животных, может быть использован в качестве фармакологической композиции для лечения ряда глазных заболеваний.
Результаты изучения безопасности БПК представлены в далее приведенных примерах 12-19.
-12
Исследование было проведено на БПК1, выделенном из тканевого экстракта склеральной оболочки глаза КРС в дозе, соответствующей 10 мг белка (ИЭФ-фракция, пример 2).
Эксперименты проводят на кроликах породы «Шиншилла», морских свинках, крысах Wistar и белых беспородных мышах. Животные получены из питомника «Крюково», согласно паспорту молодые, половозрелые. Их содержат в стандартных металлических клетках по 5 особей (кролики содержатся индивидуально). Для кормления используют гранулированный комбинированный корм и свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное, температура воздуха 18-22°С. До начала испытаний все животные проходят двухнедельный карантин. В целях стандартизации, перед началом опыта, животных не кормят в течение суток. Результаты эксперимента обрабатывают методами вариационной статистики по t-критерию Стьюдента.
Пример 12. Оценка способности заявляемого БПК вызывать активную кожную анафилаксию у морских свинок in vivo
Исследование проводят на морских свинках в количестве по 10 голов в каждой исследуемой группе, всего 2 группы. Сенсибилизируют животных по схеме: первая инъекция подкожно, две последующие внутримышечно через день в область бедра. На 14 день на выстриженных участках спины морским свинкам вводят внутрикожно раствор БПК. Для контроля реактивности кожи вводят физиологический раствор тому же животному на другой выстриженный участок кожи. Контрольным животным вводят разрешающую инъекцию препарата (равную сенсибилизирующей дозе). Затем животным вводят внутривенно по 0,5 мл 1%-ного раствора синего Эванса. Через 30 минут животных выводят из эксперимента эфирным наркозом и определяют размер синего пятна на внутренней стороне кожи в месте введения. Положительной считают реакцию при размере пятна выше 6 мм, не более 3 мм в контроле. При подсчете результатов эксперимента обеих групп животных положительных реакций не наблюдалось. При статистической обработке полученных результатов не обнаружено достоверное различие между результатами опытных и контрольной групп (р>0,05).
Пример 13. Влияние заявляемого БПК на реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей
-12
Опыты проводят на белых беспородных мышах, самцы, весом 18-20 г, по 10 животных в группе. Общее количество животных в опыте - 30. Животных опытной группы однократно сенсибилизируют внутрикожно в основании хвоста эмульсией БПК (1:1) в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ). Доза введения составляет 60 мкл. Контрольных животных сенсибилизируют эмульсией НАФ с раствором Хенкса (1:1). Для выявления сенсибилизации через 5 суток мышам в подушечку задней лапы вводят 40 мкл раствора БПК в концентрации 10 мг/мл, приготовленного на растворе Хенкса. Через 24 часа после тестирования измеряют величину отека с помощью инженерного микрометра МК-0-25. Результаты измерения толщины лапы у испытуемых животных приведены в таблице 1.
При статистической обработке полученных результатов не обнаружена достоверная разница в толщине лапок опытных групп и контрольной (р>0,05). Введение раствора БПК не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа.
Пример 14. Влияние заявляемого БПК на фагоцитарную активность макрофагов крысы in vitro
Эксперименты проводят на крысах Wistar, самки, весом 180-200 г, по 10 животных в каждой группе. Общее число животных в опыте 20.
3
Метод основан на определении оптической плотности лизирующего раствора после разрушения фагоцитов, поглотивших частицы нейтрального красного. Крыс, подвергнутых воздействию исследуемого препарата, декапитируют. Асептически внутрибрюшинно вводят 5 мл среды 199, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки. После массажа брюшной полости среду отбирают шприцем. Порции клеточной суспензии, полученные от всей группы животных, объединяют в общий пул. Концентрацию живых клеток доводят до 1,5×10 клеток/мл. Суспензию клеток стерильно разливают по 2 мл в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм и инкубируют 2 часа при 37°С. Надосадочную фракцию, содержащую не прикрепившиеся к пластику клетки, сливают, а фиксированный на пластике монослой дважды промывают средой 199. В слегка подсушенные чашки наливают раствор, содержащий нейтральный красный, и выдерживают при 37°С в течение 1 часа, затем раствор сливают, клетки промывают средой 199. В каждую чашку вносят по 3 мл лизирующего раствора, которым обрабатывают тщательно клетки, совершая вращательное движение чашки. Раствор сливают в пробирки и на спектрофотометре при длине волны 540 нм измеряют оптическую плотность. Результаты исследования светопропускания лизирующего раствора представлены в таблице 2.
При внутрибрюшинном введении раствора БПК не было отмечено изменения фагоцитарной активности макрофагов по сравнению с животными контрольной группы. Статистически достоверных различий между показателями в опытной и контрольной группах нет (р>0,05).
Пример 15. Влияние заявляемого БПК на реакцию дегрануляции тучных клеток у крыс in vitro
Постановку экспериментов проводят на крысах Wistar, самки, весом 180-200 г, общее количество животных в опыте - 30. Животным опытной группы вводят внутрибрюшинно раствор БПК; контрольной группой являются интактные животные.
Для получения взвеси тучных клеток животных декапитируют, в брюшную полость вводят буфер; после массажа передней брюшной стенки взвесь тучных клеток собирают центрифугированием в пробирки (3000 g, 30 мин). Препараты готовят на предметных стеклах, окрашенных 0,3%-ным спиртовым раствором нейтрального красного. К 0,03 мл взвеси тучных клеток добавляют 0,03 мл сыворотки опытного животного и 0,03 мл исследуемого раствора БПК в разведении 1:100. Препараты накрывают покровным стеклом, края которого герметизируют парафином. Затем инкубируют 15 минут в термостате при 37°С. Препараты исследуют микроскопически при увеличении ×40, подсчитывая тучные клетки, подвергшиеся дегрануляции и нормальные, сумму принимают за 100%. Реакцию считают положительной, если степень дегрануляции превышает 20%.
В контроле дегрануляция не превышала 5%. Введение раствора БПК не вызывает дегрануляции тучных клеток: значения параметра дегрануляции не отличаются от контроля и не превышают порогового значения 5%. Результаты контрольной и опытной групп статистически не имеют достоверных отличий (Р>0,05).
Пример 16. Исследование влияния заявляемого БПК на состояние тканей внутренних органов организма млекопитающих
-3
-5
-7
-9
-12
-15
-17
-19
Исследование по изучению острой токсичности раствора БПК, выделенного из сыворотки крови КРС, проводят на 120 белых беспородных мышах, самцы, весом 18-20 г. Животные были разделены на 10 групп, по 12 голов в каждой. Исследуемый препарат вводят животным опытной группы однократно внутримышечно в объеме 0,05 мл в виде стерильных растворов следующих концентраций: 10 мг/мл, 10 мг/мл, 10 мг/мл, 10мг/мл, 10 мг/мл, 10 мг/мл, 10 мг/мл белка, 10 мг/мл, приготовленных на 0,9%-ном растворе NaCl. Животным контрольной группы (12 мышей) в том же объеме аналогичным образом вводят 0,9% раствор NaCl.
-3
-12
9
-12
-3
При изучении острой токсичности показано, что однократное внутримышечное введение раствора БПК крысам Wistar, обоего пола, весом 200-220 г., в концентрации 10 мг/мл, которая превышает рекомендованную для клинического применения норму (10 мг/мл) в 10 раз, не вызывает развития никаких реакций, указывающих на токсическое действие заявляемого БПК. Исследование подострой и хронической токсичности раствора БПК в концентрациях 10 и 10 мг/мл белка также не выявляет развития негативных побочных реакций со стороны отдельных тканей и организма в целом у экспериментальных животных в течение длительного введения раствора БРК.
Патоморфологическими методами изучают состояние головного (гипофиза, гипоталамуса), спинного мозга (спинных ганглиев), костного мозга. Изучают состояние таких желез, как надпочечники, паращитовидные, щитовидная и поджедудочная железы. Кроме того, исследуют сердце, коронарные сосуды, легкие, печень и желчный пузырь, почки, мочевой пузырь, семенники, яичники, желудок, двенадцатиперстную кишку, тонкий и толстый кишечники, а также тимус, селезенку, лимфатические узлы. В периферической крови определяют количество гемоглобина, производят подсчет форменных элементов крови (эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов), определяют лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ). Определяют содержание в сыворотке крови ионов калия и натрия, а также содержание общего белка. В результате было показано отсутствие каких-либо изменений в состоянии внутренних органов и составе периферической крови мышей, которые подвергались воздействию раствора БПК в различных концентрациях.
-12
Эксперимент по исследованию хронической токсичности проводят на кроликах породы Шиншилла, обоего пола, весом 2300-2500 г, по 10 животных в каждой группе. В опытной группе животные употребляют вместо воды раствор БПК в концентрации 10 мг/мл; в контрольной группе животные употребляют для питья воду, на которой приготовляют раствор БПК. После 4-х месяцев проведения эксперимента кроликов обеих групп выводят из эксперимента эмболией. Результаты изучения общего состояния экспериментальных животных, морфологического состояния их внутренних органов, а также показателей, отражающих состояние крови, свидетельствуют об отсутствии каких-либо патологических изменений в отдельных тканях и организме в целом.
Пример 17. Изучение мутагенного и канцерогенного действия, заявляемого БПК на соматических клетках млекопитающих in vivo Исследование потенциальной мутагенной активности заявляемого БПК проводят на млекопитающих в условиях in vivo с помощью методов, входящих в стандартную систему испытаний в соответствии с утвержденными Фармакологическим комитетом МЗ СССР («Методические рекомендации по проверке мутагенных свойств у новых лекарственных препаратов», 1981).
Эксперимент проводят на мышах линии C57BI/6J, самцы, весом 20-22 г, в каждой группе по 6 животных. Мышам опытной группы №1 в течение пяти дней ежедневно внутрибрюшинно вводят по 0,1 мл раствора БПК; животным контрольной группы №2 внутрибрюшинно в течение 5 дней вводят по 0,1 мл физиологического раствора; группа №3 - интактные животные, которые не получают ни БПК, ни физиологического раствора.
Через 7 дней животных всех групп выводят из эксперимента эфирным наркозом, из бедренных костей извлекают мозг и приготовляют цитогенетические препараты по общепринятой методике, включающей предварительное введение колхицина, гипотоническую обработку 0,6%-ным KCl, фиксацию в смеси метанол уксусная кислота (1:3). Результаты обрабатывают с помощью t-критерия Стьюдента. Мутагенный эффект изучают по микроядерному тесту и тесту частоты хромосомных аберраций в клетках костного мозга (таблица 4).
В результате проведенных исследований установлено, что при воздействии заявляемого БПК доля поврежденных клеток и количество аберраций на клетку в костном мозге мышей были такими же, как у интактных и контрольных животных, получавших физиологический раствор.
Пример 18. Изучение иммунотоксических и аллергизирующих свойств раствора заявляемого БПК
-12
Исследование иммунотоксических и аллергизирующих свойств раствора БПК проводят на морских свинках. Раствор БПК наносят на кожу экспериментальным животным в дозе 0,1 мл в концентрации 10 мг/мл в течение 5 дней. Действие препарата определяют, оценивая такие параметры:
• состояние кожных покровов в области нанесения препаратов,
• реакцию специфического лизиса лейкоцитов,
• реакцию специфической агломерации лейкоцитов при накожном применении,
• реакцию бласттрансформации клеток тимуса,
• реакцию бласттрансформации клеток селезенки.
Анализируя результаты проведенных экспериментов по изучению иммунотоксических и аллергенных свойств раствора заявляемого БПК, можно сделать следующее заключение, что исследуемый раствор БПК:
• Не вызывает каких-либо изменений кожных покровов морских свинок.
• При накожном применении не влияет на реакцию специфического лизиса лейкоцитов.
• Не влияет на реакцию специфической агломерации лейкоцитов при накожном применении (опытная серия 3,9±1,1%, контрольная серия 4,1±1,2%).
• Не оказывает влияния на бласттрансформацию клеток тимуса (индекс стимуляции - опытная серия 135,2±8,7; контрольная серия 138,4±6,4).
• Не влияет на бласттрансформацию клеток селезенки (индекс стимуляции - опытная серия 268,4±5,4; контрольная серия 259,8±8,9).
Пример 19. Исследование эмбриотоксичности и тератогенности заявляемого БПК
Экспериментальная оценка токсического действия заявляемого БПК на эмбриональное развитие зародышей, а также выявление нарушений эмбрионального развития, проявляющихся только в постнатальном периоде жизни, проводится на крысах Wistar, самки, весом 200-220 г, по 6 штук в каждой группе. Исследование БПК проводили в течение всего периода беременности - 20 дней. Животным вводили 0,1 мл раствора внутримышечно ежедневно. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств раствора БПК проводят в два этапа: 1-ый - исследуют влияние препарата на эмбриональное развитие в пренатальном периоде, во 2-ом - обследуют потомство в постнатальном периоде. Для оценки влияния раствора БПК на эмбриотоксичность и тератогенность определяют количество выкидышей у крыс, количество крысят в помете, количество выживших крысят, оценивают физическое и эмоциональное состояние потомства, двигательную функцию и скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов. Также изучают изменения половых органов у крыс после введения раствора заявляемого БПК.
-12
Было показано, что при воздействии раствора БПК в концентрации 10 мг/мл у опытных животных не наблюдается выкидышей, потомство рождается в срок, количество крысят в пометах не отличается от количества крысят контрольной группы. Крысята опытной группы имеют тот же вес, что и потомство контрольной группы, выживаемость крысят, испытавших влияние раствора заявляемого БПК, была полной. Их двигательная и эмоциональная активности не отличается от крысят контрольной группы. У экспериментальных животных, получавших раствор БПК, не было обнаружено изменений в половых органах. Таким образом, в ходе проведенных исследований не установлено наличие каких-либо патологических нарушений в ходе эмбрионального и постэмбрионального развития потомства экспериментальных животных после приема раствора заявляемого БПК.
Заключение по безопасности заявляемого БПК
Заявляемый белково-пептидный комплекс, выделенный из ткани склеральной оболочки глаза КРС, может быть использован как субстанция для разработки средства профилактики и лечения глазных болезней, вызванных нарушениями функции склеральной оболочки глаза. Биологическое действие заявляемого БПК характеризуется отсутствием видовой специфичности, так как он может быть получен из ткани склеры различных позвоночных животных.
Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод об отсутствии аллергенных, сенсибилизирующих и иммунотоксических свойств заявляемого БПК.
Экспериментальные данные, полученные в ходе проведенной оценки генетической активности, свидетельствуют об отсутствии мутагенного действия в соматических и генеративных клетках млекопитающих и отсутствии потенциальной канцерогенной активности заявляемого БПК. Данный БПК, исследуемый в виде раствора, не обладает эмбриотоксическим и тератогенным действием, не оказывает влияния на общее физическое развитие потомства, его двигательную активность и эмоциональное состояние, а также на скорость возникновения сенсорно-двигательных рефлексов. Заявляемый БПК рекомендуется принимать в виде глазных капель раствора низкой концентрации, что исключает развитие побочных негативных реакций со стороны как отдельных тканей и органов, так и со стороны организма в целом. Заявляемый БПК является нетоксичным веществом и может быть рекомендован для проведения клинических испытаний.
Список литературы
1. Новые отечественные лекарственные средства (сводный выпуск)2000, с. 489-492.
2. Справочник по клинической фармакологии и фармокотерапии. Под ред. Чекмана И.С, Пелещука А.П., Пятака О.А., Киев, «Здоровье», 1987, с. 517.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств. Москва 2000
4. ГОСТ Р ИСО 10993 Оценка биологического действия. Часть 10. Раздражающее и сенсибилизирующее действие.
5. Новые отечественные лекарственные средства (сводный выпуск) 2000, с. 489-492.
6. Справочник по клинической фармакологии и фармокотерапии. Под ред. Чекмана И.С, Пелещука А.П., Пятака О.А., Киев, «Здоровье», 1987, с. 517.
7. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств. Москва 2000
8. ГОСТ Р ИСО 10993 Оценка биологического действия. Часть 10. Раздражающее и сенсибилизирующее действие.