Фармакокинетические исследования таблеток левофлоксацина оригинального и воспроизведенного препаратов

УДК 615.07

ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТАБЛЕТОК ЛЕВОФЛОКСАЦИНА ОРИГИНАЛЬНОГО И ВОСПРОИЗВЕДЕННОГО ПРЕПАРАТОВ

В.П. Жердев1, А.А. Литвин1, Г.Б. Колыванов1, Е.В. Блынская1, М.К. Седова1, К.В. Алексеев1, С.Э. Кондаков2

Проведена сравнительная оценка фармакокинетического исследования таблеток дже-нерика левофлоксацина (500 мг), изготовленных в ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН, и оригинального препарата содержащего левофлоксацин (500 мг), таблеток «Таваник», производства «Санофи Винтроп Индустрия» (Франция). Предел количественного определения составил 25 нг/мл. Рассчитаны фармакокинетические параметры сравниваемых препаратов. Определена относительная биодоступность воспроизведенного препарата (108,6±25,6%).

Ключевые слова: левофлоксацин, фармакокинетика, высокоэффективная жидкостная хроматография, относительная биодоступность, биоэквивалентность.

Инфекции дыхательных путей по частоте возникновения занимают первое место среди инфекционных заболеваний человека. Рост устойчивости основных возбудителей внебольничных инфекций дыхательных путей, прежде всего пневмонии, к существующим антибактериальным препаратам вызвал интерес к новым антимикробным средствам, характеризующимся меньшим уровнем резистентности бактерий, в частности к фторхинолонам [1]. В конце прошлого века на фармацевтическом рынке появился синтетический антибактериальный препарат широкого спектра действия из группы фторхинолонов - Та -

ваник , содержащий в качестве активного вещества левофлоксацин (левовращающий изомер офлоксаци-на) (рис. 1), выпущенный на рынок компанией Сано-фи-Винтроп Индустрия (Франция).

Левофлоксацин активен в отношении большинства штаммов микроорганизмов как in vitro, так и in vivo и обладает повышенной активностью в отношении пневмококков, улучшенной фармакокинетикой (эффективен при назначении 1 раз в сутки) и практически 100%-й биодоступностью при пероральном приеме. В настоящее время наряду с Р-лактамными антибиотиками и макролидами фторхинолоны относятся к числу наиболее широко используемых средств для борьбы с инфекционными процессами дыхательных путей [2].

Таким образом, фторхинолоны и, в частности левофлоксацин, рассматриваются как серьезная альтернатива высокоактивным парентеральным антибиоти-

кам широкого спектра действия. Поэтому разработка и создание отечественных препаратов - дженериков левофлоксацина, характеризующихся оптимальными значениями фармакокинетических параметров и относительной биодоступности являются важной задачей фармацевтической технологии. Для того чтобы оценить качество/идентичность воспроизведенного препарата (дженерика), а также для изучения новых транспортных форм препаратов [3] требуется определение фармакокинетических параметров регламентированными физико-химическими методами и протоколами [4] в сравнении с препаратом-инноватором.

Цель выполненного исследования - сравнение в эксперименте in vivo на кроликах фармакокинети-ки, относительной биодоступности и биоэквивалентности готовой лекарственной формы таблеток левофлоксацина (500 мг), разработанных в ФГБУ

он

Рис. 1. Левофлоксацин - (-) - (8)-9-фтор-2,3-дигидро-3-ме-тил-10-(4-метил-1-пиперазинил)-7-оксо-7Н-пиридо[1,2,3-de]1,4-бензоксазин-6-карбоновая кислота гемигидрат

«НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН (тест-препарат) и оригинального препарата Таваник, содержащего в каждой таблетке 500 мг левофлоксацина («Санофи Винтроп Индустрия», Франция).

Материалы и методы

В работе использовали хроматограф «Beckman-Coulter» (США), состоящий из изократической помпы «Programmable Module-127», УФ-детектора «Programmable Module-166» и компьютера с пакетом программ для обсчета хроматограмм «Ампер-сенд» версия 1.5 (Россия), колонка Synergi 4р. MAX-RP (250x4,6 мм; 4 мкм; «Phenomenex», США), оснащенная универсальной предколонкой SpheroGuard С18, 4,0x3,0 мм; («Phenomenex», США). Подвижную фазу готовили следующим образом: к 800 мл деио-низированной воды прибавляли 2,4 мл триэтилами-на, рН раствора доводили до 3,4 концентрированной фосфорной кислотой (около 1,2 мл). К полученной смеси прибавляли 200 мл ацетонитрила. Скорость потока подвижной фазы в экспериментах составляла 1,0 мл/мин. Детектирование осуществлялось при длине волны 295 нм. Хроматографирование проводили при комнатной температуре (20-22°С). Перед хроматографированием подвижную фазу фильтровали и дегазировали на ультразвуковой бане. Объем вводимой пробы составлял 100 мкл.

В качестве реактивов использовали ацетонитрил (для хроматографии), триэтиламин, кислоту фосфорную концентрированную («ч.д.а.»), метанол, очищенную и деионизованную воду.

Для приготовления растворов стандартных образцов использовали субстанцию левофлоксацина (серия I0S-019.09.10, производства ФГБУН «Институт органического синтеза им. И.Я. Постовского» Уральского отделения Российской академии наук (ИОС УрО РАН, Екатеринбург), синтезированную по оригинальной технологиии. Матричные растворы левофлоксацина с концентрацией 100 мкг/мл готовили растворением в воде, рН которой доводили до 3,4 фосфорной кислотой. Из этих растворов готовили растворы рабочих стандартных образцов на подвижной фазе. Физико-химические свойства и содержание действующего начала левофлоксацина в препаратах эквивалентны.

Фармакокинетические исследования проводили на восьми кроликах-самцах массой тела 3,34±0,18 кг, полученных из питомника «Столбовая» (Московская обл.). До начала исследования лабораторных животных для адаптации содержали 14 дней в индивидуальных клетках. Во время этого периода у них каждый день контролировали клиническое состояние путем визуального осмотра. Кроликов содержали в

контролируемых условиях окружающей среды (18-26°С и относительной влажности воздуха 30-70%). В комнатах содержания животных поддерживался 12-часовой цикл освещения. В экспериментальную группу отбирали кроликов без признаков отклонений внешнего вида, случайным образом, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения более чем на 10%. За 12 ч до начала эксперимента животных лишали корма. В случайном порядке им с помощью зонда внутрь вводили половину таблетки тест-препарата или половину таблетки препарата сравнения. Исследуемые препараты вводили кроликам согласно плану рандомизации - каждый кролик попеременно получал изучаемый препарат и препарат сравнения через 10 дней.

Образцы крови (1,0 мл) отбирали из краевой ушной вены с помощью игл и переносили в конические полиэтиленовые пробирки (предварительно обработанные гепарином). Взятие образцов крови для последующего определения содержания препарата в плазме крови осуществлялось в дискретные интервалы времени: через 0; 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0; 12,0 и 24,0 ч. Для получения плазмы образцы крови центрифугировали (3000 об/мин в течение 10 мин). Плазма хранилась при температуре -24° С. Для определения процента извлечения левофлокса-цина из плазмы крови был проделан специальный эксперимент. В полиэтиленовую пробирку, которая содержала 0,9 мл плазмы, полученной от кролика, добавляли 0,1 мл одного из стандартных растворов левофлоксацина (500,0, 2500,0 и 5000,0 нг/мл), тщательно перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем в эту же пробирку добавляли 2,0 мл метанола. Тщательно перемешивали и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 мин. Надоса-дочную жидкость переносили в колбу и упаривали в потоке воздуха при 60°С. Сухой остаток растворяли в подвижной фазе (0,3-1,0 мл). При этом было установлено, что процент извлечения левофлоксацина из плазмы крови в среднем составляет 90,6±1,9%.

При изучении фармакокинетики к предварительно размороженным образцам плазмы крови кроликов 0,5-1,0 мл прибавляли двойной объем метанола. Далее работа с плазмой проводилась как описано выше. После упаривания при 60°С сухой остаток растворяли в 0,2 мл подвижной фазы. Определение концентрации левофлоксацина в плазме крови кроликов проводили методом ВЭЖХ по модифицированной методике [4].

Количественное определение левофлоксацина проводили методом абсолютной калибровки. В этих условиях время удерживания исследуемого вещества составило 4,7 мин. На хроматограммах, полученных

в разных условиях, отсутствуют дополнительные пики совместно осаждаемых веществ. Это позволяет сделать вывод, что возможные коэкстрактивные вещества не мешают определению препарата.

Калибровочные кривые строили по результатам хроматографирования не менее семи стандартов ле-вофлоксацина в подвижной фазе: 50,0; 100,0; 250,0; 500,0; 1000,0; 2500,0 и 5000,0 нг/мл. Их готовили разбавлением матричного раствора подвижной фазой. Диапазон калибровки составлял 50,0-5000,0 нг/мл, а предел количественного определения - 25,0 нг/мл.

Установлено, что в диапазоне изучаемых концентраций усредненная калибровочная кривая линейна и описывается уравнением: S = 0,5092хС, (r = 0,9998), где S - площадь хроматографического пика; С - кон -центрация левофлоксацина (нг/мл). Относительная ошибка определения левофлоксацина для концентрации 50,0 нг/мл составила 4,65%. Проведена статистическая обработка полученных данных по регламентированной методике [5]. Параметры, представленные в табл. 1-3, указаны в виде средней арифметической величины (х), соответствующих им стандартных отклонений (SD) и коэффициентов вариации (CV%). Достоверность различий оценивали с помощью /-критерия Стьюдента при Р < 0,05.

Для описания фармакокинетики левофлоксаци-на были рассчитаны следующие параметры: AUC0-/ (мкг/млхч) - площадь под фармакокинетической кривой, рассчитывается от момента введения до последней точки отбора проб); AUC0-a) (мкг/млхч) -площадь под фармакокинетической кривой, рассчитывается от момента введения до бесконечности; /макс (ч) - время достижения максимальной концентрации препарата в плазме крови; Смакс (мкг/мл) - максимальная концентрация левофлоксацина в плазме крови; Смакс/АиС0-ю (ч1) - параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток; MRT (ч) - среднее время удерживания левофлоксацина в организме; Кэл (ч1) - константа элиминации (параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма); /1/2эл (ч) - время, в течение которого концентрация препарата в плазме крови снижается вдвое; F - относительная биодоступность.

Оценка относительной биологической доступности проводилась по формуле:

где AUC^ - площадь под фармакокинетической кривой таблеток тест-препарата; AUCÄ - площадь под фармакокинетической кривой после введения табле-

ток препарата сравнения; - доза таблеток тест-препарата (250 мг); - доза таблеток препарата сравнения (250 мг).

Результаты и обсуждение

На рис. 2 представлены усредненные фармакоки-нетические кривые тест-препарата в плазме крови кроликов после однократного перорального введения животным таблеток в дозе 250 мг и препарата сравнения в той же дозе.

В табл. 1, 2 представлены фармакокинетические параметры левофлоксацина в плазме крови кроликов после введения таблеток тест-препарата и препарата сравнения. Сравнительный анализ основных фар-макокинетических параметров, приведенных в табл. 1, 2, показал, что изучаемое соединение всасывается из желудочно-кишечного тракта при введении его в виде тест-препарата (со скоростью 0,167±0,061 ч-1) и препарата сравнения (со скоростью 0,182±0,066 ч-1). При этом достоверных различий между сравниваемыми параметрами не выявлено. Время достижения максимальной концентрации (макс) для таблеток левофлоксацина наступало через 1,56±0,82 ч, а для ре-ференс-препарата - через 1,0±0,46 ч, т.е. достоверные различия также не выявлены.

Аналогичная ситуация наблюдалась и при оценке параметра, характеризующего продолжительность выведения препарата из организма. Величина /1/2эл составила 5,05±1,42 ч для таблеток тест-препарата и 5,15±1,42 ч для таблеток препарата сравнения.

Рис. 2. Усредненные фармакокинетические профили левофлоксацина в плазме крови кроликов после однократного перорального введения таблеток левофлоксацина (250 мг) и

таблеток Таваник

Т а б л и ц а 1

Фармакокинетические параметры левофлоксацина в плазме крови кроликов после однократного введения таблеток тест-препарата в дозе 250 мг

Номер опыта ЛиС0_„ мкг/мл-ч мкг/мл.ч Фарм г , ч макс ' акокинети Смакс ' мкг/мл ческие параметры Смакс /ЛиС0_„ , ч-1 Кл , ч-1 г1/2эл > ч МЯТ, ч

1 42,94 44,12 1,0 12,4 0,281 0,1497 4,63 5,7

2 40,88 49,23 2,0 11,6 0,236 0,2072 3,34 4,66

3 82,45 85,25 3,0 12,4 0,145 0,1489 4,66 6,78

4 96,81 98,78 2,0 14,3 0,145 0,1674 4,13 6,13

5 58,95 59,92 0,5 9,6 0,160 0,1724 4,02 5,52

6 93,25 101,56 1,0 13,7 0,135 0,1052 6,59 9,23

7 95,16 100,39 2,0 14,1 0,140 0,1266 5,48 7,63

8 91,9 103,54 1,0 9,7 0,094 0,0916 7,57 10,87

X 75,29 80,35 1,56 12,23 0,167 0,1461 5,05 7,07

5В 23,92 25,22 0,82 1,84 0,061 0,0377 1,42 2,09

СУ, % 31,77 31,38 52,55 15,06 36,37 25,77 28,06 29,53

Т а б л и ц а 2

Фармакокинетические параметры левофлоксацина в плазме крови кроликов после однократного введения таблеток препарата сравнения в дозе 250 мг

Номер опыта Фармакокинетические параметры

ЛиС0-„ мкг/мл-ч ЛИС. , мкг/мл.ч г , ч макс С , макс ' мкг/мл Смакс /ЛиС0ю ,ч-1 К, , ч-1 г1/2эл > ч МЯТ, ч

1 58,25 58,64 0,5 11,4 0,194 0,2096 3,31 4,66

2 42,94 44,31 1,0 12,4 0,280 0,1406 4,93 5,82

3 94,18 100,63 2,0 11,1 0,110 0,1152 6,02 8,68

4 110,64 121,20 0,5 15,3 0,126 0,1024 6,77 9,66

5 49,70 50,37 1,0 14 0,278 0,1789 3,87 4,59

6 66,11 70,76 1,0 9,8 0,138 0,1146 6,05 8,50

7 72,65 73,88 1,0 13,4 0,181 0,1727 4,01 5,33

8 79,31 87,87 1,0 13,2 0,150 0,0985 7,04 9,70

71,72 75,96 1,00 12,58 0,182 0,1416 5,25 7,12

£0 22,69 26,15 0,46 1,77 0,066 0,0411 1,42 2,23

СУ, % 31,64 34,42 46,29 14,04 35,95 29,01 26,99 31,32

Средняя максимальная концентрация левофлоксацина (Смакс), определяемая в плазме крови кроликов, составила 12,27±1,84 мкг/мл для таблеток тест-препарата и 12,28±1,77 мкг/мл для препарата сравнения.

Поскольку вклад экстраполированной части фар-макокинетической кривой (разность между значениями ЛиС0ш и АиС0) изучаемых препаратов в среднем составляла менее 7%, для дальнейших расчетов использовали величину ЛиС0ш. Среднее значение этого параметра для тест-препарата и препарата сравнения составляла соответственно 80,35±25,22 и 75,96±26,15 мкг/мл ч.

Относительная биологическая доступность (^ левофлоксацина, определяемая отношением индивидуальных значений ЛиС0 ш с учетом вводимых

Т а б л и ц а 3

Относительная биодоступность таблеток левофлоксацина в сравнении с таблетками Таваник

Значение ЛиС0т , мкг/мл'ч для таблеток F

левофлоксацина Таваник

44,12 58,64 0,752

49,23 44,31 1,111

85,25 100,63 0,847

98,78 121,2 0,815

59,92 50,37 1,190

101,56 70,76 1,435

100,39 73,88 1,359

103,54 87,87 1,178

- X 1,086

- ББ 0,256

- СУ% 23,56

доз для таблеток тест-препарата по отношению к таблеткам препарата сравнения, составила в среднем 108,6±25,6%. (табл. 3). В то же время сравнение полученных выборок значений AUC0_OT двух изучаемых препаратов статистически значимых различий между ними не выявило.

Таким образом, проведенное in vivo исследование сравнительной фармакокинетики и относи-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гучев И.А., Мелехина Е.В., Юденич О.В. // Consilium Medi-cum. 2010. 12. № 3. С. 42.

2. Падейская Е.Н. // Инфекции и антимикробная терапия. 2001. 3. № 1. С. 45.

3. Блынская Е.В., Алексеев К.В., Кондаков С.Э., Аляутдин Р.Н., Балабаньян В.Ю. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2011. 52. № 2. С. 154.

тельной биодоступности двух таблетированных форм на основе одного действующего начала (ле-вофлоксацина) показало, что процессы его всасывания и выведения при применении исследуемых лекарственных форм одинаковы, что позволяет сделать вывод об эквивалентности отечественных таблеток левофлоксацина таблеткам оригинального препарата Таваник.

4. Destage C.J., Pakiz C.B., Larsen C. et al. // J. Antimicrob. Chemother. 2001. 47. Р. 611.

5. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1. М., 2012.

Поступила в редакцию 20.02.13

PHARMACOKINETIC STUDIES OF ORIGINAL AND GENERIC LEVOFLOXACIN TABLETS

V.P. Zherdev A.A. Litvin, G.B. Kolyvanov, E.V. Blynskaya, M.K. Sedova, K.V. Alekseev, S.E. Kondakov

A comparative pharmacokinetic study of generic levofloxacin tablets (500 mg) produced in FSBI "Institute of Pharmacology them. V.V. Zakusov "RAMS, and the original drug containing levofloxacin (500 mg) tablets Tavanic , Sanofi Winthrop Industry, France. The comparative evaluation of pharmacokinetic parameters, determine the relative bioavailability of a generic, which was 108,6 ± 25,6%.

Key words: Levofloxacin, pharmacokinetics, high performance liquid chromatography, relative bioavailability.

Сведения об авторах: Жердев Владимир Павлович - зав. лабораторией фармакокинетики НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, профессор, докт. мед. наук (zherdevpharm@mail.ru); Литвин Александр Алексеевич - вед. науч. сотр. лаборатории фармакокинетики НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, докт. биол. наук (litbiopharm@yandex.ru); Колыванов Геннадий Алексеевич - вед. науч. сотр. лаборатории фармакокинетики НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, докт. биол. наук; Блынская Евгения Викторовна - мл. науч. сотр. лаборатории готовых лекарственных форм НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (eaureus@mail.ru); Седова Мария Константиновна - соискатель НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН (mawyli@mail.ru); Алексеев Константин Викторович - зав. лабораторией готовых лекарственных форм опытно-технологического отдела НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, докт. фарм. наук; Кондаков Сергей Эмильевич - вед. науч. сотр. кафедры химической кинетики химического факультета МГУ, докт. фарм. наук (kse@excite.chem.msu.ru).