СПОСОБ БИОРЕМЕДИАЦИИ ВОДЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ ТРИНИТРОТОЛУОЛОМ
METHOD FOR BIOREMEDIATION OF WATER CONTAMINATED WITH TRINITROTOLUENE

Изобретение относится к области обработки воды и может быть использовано для технологий биоремедиации (биоочистки) природных и сточных вод, загрязненных преимущественно нитроароматическими соединениями.
Известно, что действия, связанные с производством, хранением, использованием и утилизацией нитроароматических соединений, например, 2,4,6-тринитротолуола (далее по тексту ТНТ) и его производных, приводят к их (соединений) широкому распространению в окружающей среде. В результате синтеза, а также захоронения этих соединений происходит загрязнение окружающей среды, например, грунтовых вод, которыми пользуется население.
Эксплуатация и износ оборудования промышленных предприятий, использующих нитроароматические соединения в технологических процессах, ведут к увеличению количества и накоплению отходов. Эти отходы характеризуются высокой токсичностью и кумулятивной способностью, а также могут обладать мутагенным эффектом. Сброс токсичных отходов промышленных предприятий в водоемы и водотоки существенно ухудшает их общее санитарное состояние, оказывая при этом негативное влияние на живые организмы как токсичностью, так и изменением режима биогенных элементов. Для снижения техногенного влияния нитроароматических соединений на объекты природной среды необходимо использование эффективных технологий очистки загрязненных сточных вод.
Известен способ [1] ремедиации ТНТ-загрязненных территорий, основанный на ковалентном связывании ТНТ и его нитропроизводных с органическим матриксом почвы.
Недостатком способа [1] является замедленность процесса ремедиации и его низкая эффективность. Так, после 28-суточной обработки ТНТ-загрязненной почвы в анаэробных и аэробных условиях процент связывания ТНТ и его метаболитов с органическим матриксом почвы составил 40%. Кроме того, существует угроза повторного загрязнения этими соединениями в результате их отщепления от органического матрикса почвы при истощении плодородия. В связи с этим применение способа [1] весьма ограниченное.
Известен способ [2] вымывания и удаления ТНТ из объектов, загрязненных смесями взрывчатых веществ.
Недостатком способа [2] является то, что его применение не сопровождается разрушением и минерализацией ТНТ. Это приводит к сохранению и циркуляции ТНТ и его метаболитов в окружающей среде.
Известен способ [3] небиологической очистки грунтовых вод, загрязненных взрывчатыми веществами, например, ТНТ, осуществляемый дитионит-восстановленными осадками.
Недостатком способа [3] является то, что потенциал трансформации ТНТ по способу существенно ограничен и не превышает 65 мг/л в течение 72 ч (3-х суток). К тому же, в процессе трансформации образуются такие метаболиты, как 2-амино-4,6-динитротолуол (2-АДНТ), 4-амино-2,6-динитротолуол (4-АДНТ), 2,4-диамино-6-нитротолуол (2,4-ДАНТ) и 2,6-диамино-4-нитротолуол (2,6-ДАНТ), которые сохраняют остаточную токсичность и характеризуются повышенной устойчивостью к последующему воздействию.
Известен способ [4] удаления ТНТ из биореакторов путем непрерывного культивирования микробных сообществ в жидкой ТНТ-содержащей среде в аэробных, микроаэрофильных и анаэробных условиях.
Недостатком способа [4] является то, что в процессе непрерывного культивирования микробных сообществ в очищаемой среде образуются следующие метаболиты трансформации ТНТ: гидроксиламино-динитротолуолы (ГАДНТ), амино-динитротолуолы (АДНТ), диамино-нитротолуолы (ДАНТ) и азоксинитротолуолы. Эти метаболиты не подвергаются биологическому разрушению и накапливаются в окружающей среде.
Известен микробиологический способ [5] обезвреживания объектов, загрязненных ТНТ (до 100 мг/л), штаммом гриба Penicillium sp. I-2081.
Недостатком способа [5] является то, что способ очистки с использованием штамма Penicillium sp. I-2081 продолжителен по времени (оптимально 10 суток). Для осуществления способа необходимо присутствие в обезвреживаемой среде высокой концентрации глюкозы (оптимально 15 г/л) и повышенной концентрации биомассы гриба (оптимально 150 г/л), что приводит к усложнению и удорожанию процесса биоремедиации штаммом Penicillium sp. I-2081.
Известен микробиологический способ [6] очистки сточных вод, содержащих ТНТ. Способ осуществляют путем двухэтапного непрерывного культивирования штамма Pseudomonas fluorescens B-3468, иммобилизованного на носителе из стекловолокна.
Недостатком способа [6] является то, что в сточной воде происходит накопление 2-АДНТ, 4-АДНТ и 2,4-ДАНТ, не разлагаемых штаммом Ps. fluorescens B-3468. Это ограничивает возможность осуществления известного способа [6] в природоохранной деятельности.
Наиболее близким по техническому решению к предполагаемому изобретению - прототипом, является способ обезвреживания ТНТ-загрязненной жидкости иммобилизованными клетками гриба Phanerochaete chrysosporium BKM-F-1767 в биореакторе в условиях непрерывного режима культивирования [7].
Недостатком прототипа [7] является то, что процесс биоочистки ТНТ-загрязненной жидкости осуществляют в единичном биореакторе, оснащенном соответствующим оборудованием для проведения и контроля процесса биотрансформации ТНТ. Применение единичного биореактора продиктовано особенностью процесса биотрансформации ТНТ, осуществляемого грибом Ph. chrysosporium BKM-F-1767. Для этого процесса характерна неудовлетворительная (низкая) для практики результативность, ограничивающая применение способа. Другим недостатком является осуществление биологического процесса культурой гриба Ph. chiysosporium BKM-F-1767 возрастом не менее 7 суток. Это продлевает и удорожает биотехнологический процесс. Кроме того, низкая устойчивость известного гриба к токсическому действию ТНТ не позволяет его (гриб) применять для биоремедиации объектов, загрязненных высокими концентрациями ТНТ. К тому же трансформация ТНТ грибом Ph. chiysosporium BKM-F-1767 сопровождается аккумуляцией в очищаемой среде устойчивых метаболитов (2-АДНТ, 4-АДНТ, 2,4-ДАНТ и 2,6-ДАНТ), что снижает эффективность биоремедиации с осуществлением прототипа. При этом средний уровень минерализации ТНТ известным грибом остается на низком уровне (15,3% от исходного содержания ТНТ (50 мг/л) в течение 41 суток).
Целью предлагаемого изобретения является повышение качества и эффективности процесса биоремедиации (обезвреживания, очистки) вод, загрязненных токсичными нитроароматическими соединениями, сокращение времени биоремедиации, расширение области применения биотехнологий для очистки загрязненных объектов, предотвращение загрязнения окружающей среды.
Цели достигают тем, что биоремедиацию вод, загрязненных нитроароматическими соединениями, проводят с помощью штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3492 в последовательно соединенных и оснащенных соответствующим оборудованием трех биореакторах с непрерывным протоком загрязненной и очищаемой среды, с обеспечением (в биореакторах) оптимальных значений температуры, pH среды, аэрации, скорости перемешивания биомассы и среды. В качестве источника углерода и энергии для роста штамма и деградации ТНТ используют моносахариды, трехатомные спирты, алифатические углеводороды.
Способ осуществляют в устройстве, состоящем из резервуара и трех биореакторов, последовательно соединенных трубопроводами с запорно-регулирующим оборудованием, оснащенных пробоотборниками, отводящими воздух каналами, мешалками для перемешивания биомассы и среды, насосами для перекачивания среды, системой аэрации.
Сущность предлагаемого способа заключается в том, что биоремедиацию воды, загрязненной ТНТ, осуществляют с использованием штамма дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3492.
Способ осуществляют непрерывным культивированием штамма в очищаемой среде в устройстве, состоящем из трех биореакторов в виде последовательно соединенных между собой емкостей, оснащенных необходимым эксплуатационным и контрольно-измерительным оборудованием. В ином варианте биотехнологический процесс осуществляют в трех последовательно соединенных между собой водоемах, например, проточных очистных сооружениях, оснащенных необходимым эксплуатационным и контрольно-измерительным оборудованием. Штамм дрожжей Y. lipolytica культивируют в оптимальном диапазоне температур от +24 до +31°C и pH от 3,0 до 7,0; при отклонении от оптимальных значений параметров процесс биоремедиации загрязненных вод замедляется.
Сущность предлагаемого способа поясняется примерами.
Пример 1. Обезвреживание вод, содержащих 2,4,6-тринитротолуол, штаммом дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 в присутствии моносахаридов, например, глюкозы в качестве источника углерода и энергии.
Способ осуществляют в устройстве, состоящем из резервуара и трех биореакторов, последовательно соединенных трубопроводами с запорно-регулирующим оборудованием. Биореакторы оснащены пробоотборниками, отводящими воздух каналами, мешалками, например, магнитными мешалками для равномерного распределения биомассы микроорганизмов и кислорода в толще очищаемой среды, насосами для перекачивания очищаемой среды, системой аэрации.
Обезвреживание осуществляют в установке для непрерывного культивирования дрожжей (Фиг.1), где 1 - первый биореактор; 2 - второй биореактор; 3 - третий биореактор; 4 - резервуар, содержащий жидкую среду с ТНТ; 5, 6, 7 - пробоотборники; 8, 9, 10 - воздухоотводы, оснащенные фильтрами; 11, 12, 13 - магнитные мешалки с магнитами; 14, 15, 16, 17 - система трубопроводов с запорно-регулирующим оборудованием; 18, 19, 20, 21 - насосы; 22, 23, 24 - система аэрации.
Установка состоит из резервуара 4, содержащего жидкую очищаемую (обезвреживаемую) синтетическую среду с ТНТ, и трех биореакторов 1, 2, 3, последовательно соединенных системой трубопроводов 14, 15, 16, 17 и оборудованных насосами, например, перистальтическими насосами 18, 19, 20, 21 для перекачивания очищаемой среды. Все биореакторы оснащены системой аэрации 22, 23, 24, обеспечивающей подачу стерильного воздуха (в биореакторы), а также отводящими воздух каналами 8, 9, 10, оснащенными 0,22 µm фильтрами. Кроме этого, биореакторы оснащены пробоотборниками 5,6,7. Процесс перемешивания очищаемой среды, инокулированной клетками дрожжей (с внесенными клетками) Y. lipolytica, осуществляют магнитными мешалками 11,12,13. Биотехнологический процесс осуществляют в диапазоне температур от +24 до +31°C.
4
2
4
4
2
4
2
4
В качестве очищаемой среды используют, например, синтетическую среду следующего состава: глюкоза - 11,2 мМ, (NH)SO - 7,6 мМ, MgSO - 2,0 мМ, NaHPO - 9,8 мМ, KHPO - 6,2 мМ (pH 7,0). ТНТ вносят из расчета 100 мг/л перед автоклавированием среды. Средой для поддержания штамма Y. lipolytica и накопления биомассы служит агаризованная среда Сабуро, содержащая глюкозу - 10,0 г/л, пептон - 10,0 г/л, дрожжевой экстракт - 5,0 г/л, NaCl - 0,3 г/л, агар - 20,0 г/л. Для приготовления всех сред используют дистиллированную воду.
Процесс биологической деструкции ТНТ и его метаболитов осуществляют в два этапа.
Предварительно резервуар 4 заполняют жидкой ТНТ-содержащей синтетической средой.
На первом этапе биореакторы 1, 2, 3 наполняют на одну треть жидкой ТНТ-содержащей синтетической средой из резервуара 4; включают магнитные мешалки 11, 12, 13 и систему аэрации 22, 23, 24.
600
-
-
В биореактор 1, содержащий жидкую синтетическую среду с ТНТ, через трубопровод 14 вносят суточную культуру У. lipolytica до конечной А 0,2 и культивируют (Y. lipolytica) до полного превращения ТНТ в С-3 моногидридный комплекс Мейзенхеймера (3-Н-ТНТ) темно-красного цвета. В результате трансформации ТНТ штаммом дрожжей в биореакторе 1 накапливается мажорный метаболит - 3-Н-ТНТ (до 85%). При этом поддерживают нейтральное значение pH очищаемой среды.
600
-
-
+
Одновременно с началом работы биореактора 1 в биореактор 2, содержащий жидкую синтетическую среду с ТНТ, через трубопровод 15 вносят суточную культуру Y. lipolytica до конечной А 0,4 и культивируют (Y. lipolytica) до аккумуляции желто-оранжевых С3, С5 дигидридных комплексов Мейзенхеймера (3,5-2Н-ТНТ, изомеры 3,5-2Н-ТНТ·Н, являющихся основными метаболитами превращения исходного ксенобиотика в биореакторе 2. В биореакторе 2 происходит снижение pH до оптимального уровня 4,8-5,4 вследствие интенсивной продукции дрожжами органических кислот.
600
Одновременно с началом работы биореакторов 1 и 2 в биореактор 3, содержащий жидкую синтетическую среду с ТНТ, через трубопровод 16 вносят суточную культуру Y. lipolytica до конечной А 1,0 и культивируют (Y. lipolytica) до полного разрушения ТНТ-дигидридных комплексов. Биоремедиация в биореакторе 3 сопровождается обесцвечиванием очищаемой среды и накоплением нитрат-иона, являющегося конечным азотсодержащем неорганическим продуктом деструкции токсичного ТНТ. В биореакторе 3 происходит снижение pH до оптимальных значений от 3,0 до 3,8 вследствие интенсивного синтеза и экскреции дрожжами органических кислот. На этом завершают выполнение первого этапа.
На втором этапе включают насосы 18, 19, 20, 21, и процесс биодеградации ТНТ и его метаболитов осуществляют в условиях непрерывного режима культивирования клеток дрожжей Y. lipolytica с обеспечением (работы насосов и запорно-регулирующего оборудования) полного обновления среды биореакторов в промежутке времени от 18 до 24 часов.
600
600
В каждом из биореакторов 1, 2, 3 поддерживают оптимальную концентрацию клеток Y. lipolytica (от А 0,2 до А 6,0) путем регулирования скорости поступления жидкой синтетической среды с ТНТ из резервуара 4 в биореактор 1, очищаемой среды из биореактора 1 в биореактор 2, очищаемой среды из биореактора 2 в биореактор 3 и очищенной среды из биореактора 3, например, в систему сбора и удаления очищенной среды (на Фиг.1 не указана, как не имеющая прямого отношения к способу биоремедиации). Скорость протока очищаемой среды через биореакторы устанавливают, сохраняя стабильность биологических процессов и обеспечивая пространственное разделение метаболитов трансформации ТНТ во всех трех биореакторах 1, 2, 3. Процесс контролируют путем отбора проб через пробоотборники 5, 6, 7 и их (проб) последующего анализа и корректируют, например, путем изменения скорости поступления среды (от 10 до 20 мл/ч), интенсивности перемешивания (100-250 об/мин).
В результате осуществления предлагаемого способа биоремедиации по Примеру 1 биодеградация ТНТ через разрушение промежуточных ТНТ-гидридных комплексов достигает 85% за 1 сутки. Оставшиеся 15% ТНТ трансформируются в ГАДНТ, которые ковалентно связываются с биологическими макромолекулами и в последующем не проявляют токсичность.
Пример 1 показывает, что заявляемый способ, обеспечивающий 85% разложение ТНТ в концентрации 100 мг/л за 1 сутки, по сравнению с прототипом, обеспечивающим 15,3% разложение ТНТ в концентрации 50 мг/л за 41 сутки, позволяет существенно повысить качество и эффективность процесса биоремедиации ТНТ-загрязненной воды.
Другим преимуществом предлагаемого способа биологического разрушения ТНТ и его производных в сточных водах является возможность его (способа) осуществления в присутствии более широкого (по сравнению с прототипом) спектра источников углерода и энергии, что доказано в следующих примерах.
Пример 2. Обезвреживание вод, содержащих ТНТ, штаммом дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 с использованием трехатомного спирта, например, глицерина в качестве источника углерода и энергии.
Процесс биологической деструкции ТНТ осуществляют по Примеру 1, с использованием иного источника углерода и энергии - глицерина, например, в концентрации 2,4 мл/л. Осуществлением процесса по Примеру 2 достигают деградации ТНТ в пределах 80%.
Пример 3. Очистка вод, загрязненных ТНТ, штаммом дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 в присутствии алифатического соединения гексадекана в качестве источника углерода и энергии.
Процесс биодеградации ТНТ осуществляют по Примеру 1 с использованием иного источника углерода и энергии - гексадекана, например, в концентрации 3,0 мл/л. Осуществлением процесса по Примеру 3 достигают 30%-ного разложения ТНТ.
В Примерах 2 и 3 эффективность процесса биоремедиации по предлагаемому способу уступает эффективности процесса по Примеру 1, но при этом существенно превосходит эффективность. прототипа. Таким образом, предлагаемый способ позволяет использовать альтернативные, по сравнению с прототипом, источники углерода и энергии для осуществления процесса биоремедиации. Это позволяет расширить область применения биотехнологий для детоксикации природных и сточных вод.
Динамика трансформации ТНТ и его метаболитов, сопровождающаяся изменением цвета очищаемой среды в биореакторах, позволяет осуществлять визуальный (без применения аналитического оборудования) контроль за биотехнологическим процессом в производственных условиях, что существенно упрощает работы по контролю за процессом и сокращает их продолжительность. При необходимости динамику процесса биоремедиации отслеживают путем анализа отобранных проб из биореакторов 1, 2, 3 с помощью пробоотборников 5, 6, 7. В практике очистки природных и сточных вод, загрязненных ТНТ и его метаболитами, достаточен визуальный контроль процесса биоремедиации.
Продукты трансформации ТНТ определяют различными физико-химическими методами, например, УФ-видимой спектрофотометрией, высокоэффективной жидкостной и ионной хроматографией.
-
-
-
+
Спектрофотометрические измерения выполняют на сканирующем двухлучевом спектрофотометре, например, Lambda 35 (Perkin Elmer, USA). Биомассу оценивают по изменению оптической плотности среды с клетками при длине волны 600 нм. Контролем служит лишенная клеток среда. 3-Н-ТНТ обнаруживают по пику поглощения при 476 нм, аккумуляцию 3,5-2Н-ТНТ и сумму изомеров 3,5-2H-THT·H - по спектральным сдвигам в область 440-445 нм.
ТНТ и продукты его трансформации анализируют высокоэффективной жидкостной хроматографией, например, на хроматографе Series 200 (Perkin Elmer, USA), в обращеннофазовом варианте с использованием колонки Supelcosil octyl C-8 (150×4,6 мм; 5 мкМ), с детекцией при 254 и 476 нм. Первоначально мобильная фаза состоит из 99% Na-фосфатного буфера (pH 7,0; 25 мМ) и 1% метанола. В течение 2,0 мин количество метанола увеличивают до 30%, в течение следующих 13,0 мин - до 43%. Последующие 12,5 мин хроматографии связаны с повышением содержания метанола до 100%, данный градиент оставляют неизменным в течение 0,5 мин. В дальнейшем за 1,0 мин соотношение мобильной фазы возвращают к первоначальному уровню и оставляют постоянным в течение следующих 5,0 мин. Скорость потока 1,0 мл/мин, температура +50°C.
3
Нитрит- и нитрат-ионы определяют с помощью ионного хроматографа, например, 761 Compact IC (Metrohm AG, Швейцария), оснащенного разделительной колонкой Metrosep A Supp 5-150 (6.1006.520). Элюцию проводят растворами 1,0 мМ NaHCO и 3,2 мМ Ма2СОз со скоростью 0,7 мл/мин.
Существенным отличием способа непрерывного многостадийного культивирования штамма дрожжей Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 в присутствии ТНТ является более высокая (85%) по сравнению с прототипом (15,3%) эффективность биодеградации ТНТ и его метаболитов, возможность применения предлагаемой биотехнологической схемы очистки в различных отраслях промышленности. Кроме того, предлагаемый способ с использованием штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 позволяет осуществлять очистку вод, загрязненных высокими концентрациями ТНТ, без использования разведении. По сравнению с известными аналогами и прототипом заявленный способ позволяет существенно сократить время биоремедиации (до 1 суток вместо 41 суток у прототипа), повышая при этом производительность и эффективность работы биоочистных сооружений и способствуя сохранности окружающей среды.
Возможность осуществления процесса биоремедиации с использованием альтернативных источников углерода и энергии для роста штамма Y. lipolytica ВКПМ Y-3492 позволяет существенно расширить (по сравнению с прототипом) область применения биотехнологий для охраны окружающей среды.
Применение предлагаемого способа способствует повышению качества и упрощению процесса биоочистки природных и сточных вод, загрязненных токсичными нитроароматическими соединениями (на примере особоустойчивого к разрушению ТНТ), сокращению времени биоремедиации, расширению области применения биотехнологий для очистки экологически опасных объектов, предотвращению загрязнения окружающей среды.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружены способы, которым присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Заявленный способ имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать на очистных сооружениях промышленных предприятий, синтезирующих нитроароматические соединения, а также в деятельности природоохранных организаций, используя известные стандартные технические устройства и оборудования. Это соответствует критерию "промышленная применимость", предъявляемому к изобретениям.
Использованные источники
1. Achtnich C., H.Lenke, U.Klaus, M.Spiteller, H.J.Knackmuss. Stability of immobilized TNT derivatives in soil as a function of nitro group reduction. // Environ. Sci. Technol. - 2000. - V.34. - P.3698-3704.
2. Monteil-Rivera F., S.Deschamps, G.Ampleman, S.Thiboutot, J.Hawari. Dissolution of a new explosive formulation containing TNT and HMX: comparison with octol. // J. Hazardous Materials. - 2010. - V.174. - P.281-288.
3. Boparai H.K., S.D.Comfort, P.J.Shea, J.E.Szecsody. Remediating у explosive-contaminated groundwater by in situ redox manipulation (ISRM) of aquifer sediments. // Chemosphere. - 2008. - V.71. - P.933-941.
4. Gunnison D., H.L.Fredrickson, D.L.Kaplan, A.L.Alien, C.M.MelIo. J.E.Walker, G.Myrick, W.E.Evans, M.Ochman. Application of continuous culture technology for the development of explosives-degrading microorganisms. // Ann. NY Acad. Sci. - 1997. - V.829. - P.230-241.
7
5. Патент РФ «Микробиологический способ удаления нитроароматического соединения, присутствующего в растворе или в почве» RU №2249564, МПК C02F 3/34, B09C 1/10, C12N 1/14, C12R 1:80, приоритет от 29.09.1999. Текст описания от 10.04.2005.
6
6. Патент РФ «Способ биологической очистки сточных вод» RU №1471493, МПК C02F 3/34, приоритет от 08.12.1986. Текст описания от 10.09.1995.
7. Rho D., J.Hodgson, S.Thiboutot, G.Ampleman, J.Hawari. Transformation of 2,4,6-trinitrotoluene (TNT) by immobilized Phanerochaete chiysosporium under fed-batch and continuous TNT feeding conditions. // Biotech. Bioeng. - 2001. - V.73. - P.271-281.