СПОСОБ ОЧИСТКИ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ОТ КОНТАМИНИРУЮЩИХ АГЕНТОВ
METHOD FOR BLOOD SERUM PURIFICATION OF LARGE CATTLE FROM CONTAMINATING AGENTS

Изобретение относится к области биотехнологии, связанной с очисткой сыворотки крови крупного рогатого скота, используемой для культивирования первично трипсинизированных и перевиваемых культур клеток, являющихся исходным биоматериалом для репродукции различных вирусов животных и человека, используемых при получении противовирусных препаратов.
Предложенный способ включает удаление контаминирующих агентов из сыворотки крови крупного рогатого скота путем предварительной микрофильтрации, добавления при перемешивании водного экстракта минерала шунгита, процесса отстаивания, последовательного осветления сепарированием и фильтрацией через стерилизующий микрофильтр.
Технический результат изобретения - высокоэффективное удаление из состава сыворотки контаминирующих агентов вирусной и бактериальной этиологии, содержащих в своем составе нуклеиновый компонент в форме ДНК или РНК.
Общеизвестно, что сыворотка крови, входящая в состав питательных сред, является не только одним из наиболее важных ее ингредиентов, но и одним из наиболее вероятных источников контаминации клеточных культур вирусами, бактериями, микоплазмами, нанобактериями и другими видами контаминант. Эффективность культивирования клеток, как в суспензии, так и в монослое связана с качеством питательной среды, ростовые свойства которой в значительной степени зависят от качества сыворотки крови животных в составе питательной среды. В практической работе чаще всего сыворотку получают из крови убойного скота различного вида и возраста. Такие сыворотки, как правило, содержат контаминанты в виде различных вирусов, дрожжей, грибов, L-форм бактерий, микоплазм, нанобактерий, тяжелых белков, ингибиторов, липидсодержащих компонентов, что отрицательно сказывается на росте и размножении клеток и вирусов в клеточных культурах.
Известен способ очистки сыворотки крови на фильтрах EKS с последующим замораживанием в полиэтиленовых канистрах при -15 -20°C не менее 7 суток, дальнейшим размораживанием и удалением 5% нижних гемолизированных слоев, при этом светлую сыворотку подвергают однократной стерилизующей фильтрации при +2 +6°C. Таким образом, методом замораживания-оттаивания достигается удаление из нативной сыворотки крови бычков веществ, ингибирующих рост клеток. Недостатком данного способа очистки сыворотки крови является непрогнозируемость биохимического состава очищенной сыворотки.
Известен способ деконтаминации сыворотки за счет обработки ее полиэтиленгликолем (ПЭГ). Водорастворимый полимер ПЭГ используют для очистки сывороток от специфических протеинов, микоплазм, вирусов и других контаминантов. Недостатком данного метода является то, что изменяется биохимический состав сыворотки в сторону уменьшения содержания ряда компонентов, например общего белка, до 30% от исходного, при этом растворенный ПЭГ остается в составе сыворотки.
Наиболее близким является способ очистки сыворотки крови от контаминантов с помощью фильтрации через фильтры с диаметром пор 100 нм, что позволяет полностью освободиться от микоплазм, и дальнейшей фильтрацией через фильтры с диаметром пор 40 нм, способных удерживать вирусные частицы размером 60 нм. Недостатком данного способа является то, что при микрофильтрации через фильтры с диаметром пор не более 100 нм задерживаются белки, ферменты, иммуноглобулины, гормоны, белки-ингибиторы и многие другие полезные компоненты, что значительно снижает качество сыворотки. Кроме того, процесс микро- и ультрафильтрации сопровождается неизбежной закупоркой пор фильтра, что также влияет на качественный состав сыворотки в динамике фильтрования.
Задачей предлагаемого изобретения является существенное улучшение качества сыворотки за счет освобождения ее от возможных контаминирующих агентов вирусной и бактериальной этиологии, содержащих в своем составе нуклеиновый компонент в форме ДНК или РНК, с целью предотвращения их попадания в состав питательной среды.
Для решения поставленной задачи в биоматериал в форме сыворотки крови крупного рогатого скота, поставляемый в замороженном виде с боенских предприятий, после оттаивания и прохождения этапа предварительной микрофильтрации добавляют при перемешивании 1% очищенного водного экстракта минерала шунгита, проводят процесс отстаивания, затем последовательно осветляют сепарированием и проводят фильтрование через стерилизующий микрофильтр.
Для приготовления очищенного водного экстракта минерала шунгита используют природный шунгит в виде щебня, изготовленный в соответствии с ТУ 5714-007-12862296-01. В качестве экстрагента при получении экстракта шунгита используют дистиллированную воду. Экстракт шунгита предварительно подвергали очистке от содержащихся в нем микро- и макроэлементов, при этом в экстракте оставались преимущественно редкоземельные ультрамикроэлементы - лантаноиды.
В таблице 1 приведено содержание лантаноидов в очищенном водном экстракте шунгита. Содержание лантаноидов в экстракте шунгита определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией в индуктивно связанной плазме (ELAN DRC II, «Perkin Elmer», США).
Сущность предлагаемого способа очистки сыворотки крови крупного рогатого скота заключается в том, что замороженный исходный материал после оттаивания осветляют микрофильтрацией пропуском через микрофильтр с диаметром пор 450 нм. Затем к осветленной сыворотке добавляют при перемешивании 1% очищенного и концентрированного водного экстракта шунгита, после чего сыворотку оставляют отстаиваться на 18-20 часов при комнатной температуре. Образовавшуюся в сыворотке взвесь из хлопьев и представляющую собой коагулированные частицы отделяют с использованием центробежного проточного сепаратора. Осветленная сыворотка выходит через нижний лоток сепаратора в приемную емкость. Из шламового пространства сепаратора извлекают биосубстрат для контроля, который помещают в стерильный бюкс. По завершении процесса сепарирования осветленную сыворотку фильтруют в условиях ламинарного бокса через стерилизующий микрофильтр с диаметром пор 220 нм.
Определение биохимического состава, pH, контроль на стерильность, а также оценку ростостимулирующих свойств сыворотки крови осуществляют общепринятыми стандартными методами. Биохимический анализ образцов сыворотки на отдельных этапах очистки проводят с помощью автоматического биохимического анализатора «BioChemFC-360» («HTI», США).
При разработке данного способа очистки сыворотки крови крупного рогатого скота от контаминантов учитывалось, что в процессе микрофильтрации использование фильтра с диаметром пор 450 нм является предварительным этапом осветления, при котором бактериальные клетки полностью не задерживаются. Добавление к осветленной сыворотке очищенного и концентрированного экстракта шунгита будет способствовать коагуляции ее компонентов, в состав которых входят и клетки микроорганизмов, с образованием взвеси хлопьев. Предполагается сохранение биохимического и минерального состава компонентов сыворотки на этапах очистки за счет избирательного коагулирования преимущественно бактериальных клеток. Проведение процесса сепарирования с отделением образовавшейся взвеси позволит увеличить прозрачность сыворотки и провести ее деконтаминацию.
Введение в предварительно очищенную сыворотку лантаноидов будет способствовать избирательной коагуляции бактериальных клеток, что обусловлено реакцией комплексообразования трехвалентных катионов лантаноидов с нуклеиновыми кислотами микроорганизмов. Предполагается, что реакция нуклеиновой кислоты с металлом осуществляется посредством фосфатных групп, при этом компоненты сыворотки, не содержащие ДНК или РНК, не принимают участия в реакции комплексообразования.
Очистка сыворотки крови крупного рогатого скота предлагаемым способом иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Биохимические показатели образцов одной из типовых серий сыворотки крови сгруппированы в следующем порядке:
- оценка состояния белкового обмена (табл. 2);
- оценка состояния водно-электролитного и минерального обменов (табл. 3);
- оценка состояния липидного обмена (табл. 4);
- оценка активности ферментов (табл. 5);
Из результатов биохимического контроля следует, что содержание компонентов белкового обмена: общий белок, альбумин, мочевина, мочевая кислота, креатинин, билирубин, в образцах сохраняются на уровне исходной сыворотки. Некоторое увеличение содержания компонентов после фильтра 220 нм обусловлено тем, что образцы сыворотки отбирают на конечном этапе фильтрации. Содержание глюкозы как компонента углеводного обмена также остается без изменений.
В таблице 3 представлены результаты определения компонентов водно-электролитного и минерального обмена сыворотки крови.
Из данных таблицы 3 следует, что по содержанию кальция, магния, фосфора, калия, натрия, меди, алюминия, никеля и стронция различия отсутствуют на всех этапах очистки сыворотки.
Главными липидными компонентами сыворотки крови являются свободный холестерин и триглицериды (таблица 4).
Содержание ферментов в сыворотке крови на этапах очистки представлено в таблице 5.
Из таблицы 5 следует, что ферменты сыворотки аланинаминотрансфераза, альфа-амилаза, креатинкиназа, щелочная фосфатаза и другие в исходном образце и в образцах после сепаратора и микрофильтрации остаются на одном уровне.
Пример 2. В таблице 6 представлены данные биохимического контроля следующих образцов: нативная сыворотка, прошедшая этап микрофильтрации через фильтр 450 нм; сыворотка после внесения лантаноидов и экспозиции в течение 20 часов; после последовательных этапов сепарирования и стерилизующей микрофильтрации. Сыворотка крови, осветленная сепарированием с отделением биосубстрата, в процессе стерилизующей микрофильтрации не вызывает интенсивной закупорки пор фильтра, что значительно упрощает технологию микрофильтрации.
Как следует из данных таблиц 1-5, компоненты сыворотки крови, не содержащие ДНК или РНК, не принимают участия в реакции комплексообразования, так как их содержание в исходной нативной сыворотке не изменяется по сравнению с конечным продуктом. Сыворотка, обработанная лантаноидами, обладает стабильными ростовыми свойствами, обеспечивает стабильное пассирование и криоконсервирование клеток.