СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ В ТРАВЕ ВИДОВ РОДА ФИАЛКА
METHOD FOR POLYSACCHARIDE ANALYSIS IN HERB OF VIOLET SPECIES

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтическому анализу лекарственного растительного сырья.
В настоящее время все большее внимание в лечении и профилактике различных заболеваний уделяют препаратам растительного происхождения. Эффективность применения фитопрепаратов обусловлена комплексом биологически активных веществ, оказывающих терапевтическое действие при минимальной токсичности для организма человека.
Известны различные способы количественного определения полисаридов, содержащихся в растительном сырье.
Так известен способ качественной и количественной оценки содержания полисахаридов в растительном сырье, заключающийся в осаждении этой группы природных соединений из водных извлечений трехкратным объемом спирта этилового 95%-ного (Государственная фармакопея XI издание, т.2 (ФС 20. Листья подорожника большого, стр.264-266).
К недостаткам данного способа, несмотря на его универсальность, следует отнести низкую специфичность и низкую точность, обусловленную соосаждением сопутствующих веществ (белков) (М.Ю.Сафонова. Спектрофотометрический метод определения…. Растительные ресурсы. - 1999. - С.101-105).
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ количественной оценки полисахаридов, содержащихся в траве растений рода фиалка (Бубенчиков Р.А. Фитохимическое и фармакологическое изучение растений рода фиалка. Автореф. дисс. к.м.н.; Изд. Купавна, Курск, 2002, с.8-11).
Известный способ осуществляют следующим образом. Из шрота растительного сырья травы рода фиалка (фиалка трехцветная, фиалка полевая, фиалка душистая) водорастворимые полисахаридные комплексы экстрагируют горячей водой при нагревании, осаждают трехкратным количеством этилового спирта, отфильтровывают, промывают органическими растворителями, высушивают.
Оптимальными условиями для извлечения и осаждения полисахаридов являются: степень измельчения сырья - 2 мм, экстрагент - вода, нагревание в течение 30 минут, трехкратная экстракция этанолом, соотношение сырья и экстрагента 1:10, 4-кратное количество 95%-ного этанола по отношению к извлечению.
Количественное определение суммы полисахаридов проводят гравиметрическим методом.
Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, а затем до постоянной массы при температуре 100-105°С.Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле
1
где m - масса фильтра, в граммах;
2
m - масса фильтра с осадком, в граммах;
m - масса сырья, в граммах;
W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.
Выход полисахаридов составил: из травы фиалки трехцветной, фиалки полевой и фиалки душистой 10,0%, 5,8%, 10,5% соответственно, а из корней фиалки душистой - 10,2% от массы сухого сырья.
К недостаткам известного способа, как и аналогичного, следует отнести низкую точность и специфичность, что связано с соосаждением сопутствующих соединений (белков).
Задачей заявленного технического решения является количественное определение полисахаридного комплекса в траве видов рода фиалка.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности количественного определения группы полисахаридов в траве фиалки, за счет исключения влияния сопутствующих веществ, а также расширение арсенала растительного сырья для получения полисахаридов.
Технический результат достигается тем, что способ количественного определения полисахаридов в траве фиалки включает измельчение сырья, экстракцию полисахаридного комплекса из сырья горячей водой, внесение реагента, фильтрацию и определение содержания полисахаридов по формуле.
Отличия предлагаемого способа заключаются в том, что:
- в качестве растительного сырья используют траву фиалки одноцветковой;
- водную экстракцию на кипящей водяной бане проводят в течение 1 часа, при соотношении сырье:экстрагент, как 1:50;
- экстракт фильтруют и к фильтрату, в соотношении 1:1, добавляют 8%-ную хлористоводородную кислоту;
- смесь выдерживают в течение 2-х часов на кипящей водяной бане, после чего охлаждают и нейтрализуют до pH=6,5-7,0;
- затем добавляют 1%-ный раствор пикриновой кислоты и 20%-ный раствор карбоната натрия, взятые в соотношении 1:3;
- полученную смесь выдерживают на водяной бане в течение 30 минут, после чего фильтруют;
- фильтрат спектрофотометрируют в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см при длине волны λ=460±2 нм;
- определение количественного содержания полисахаридов проводят в пересчете на глюкозу по формуле:
где: X - содержание полисахаридов в пересчете на глюкозу, в %;
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
D - оптическая плотность Государственного стандартного образца глюкозы;
m - масса сырья в граммах;
0
m - масса Государственного стандартного образца глюкозы;
W - потеря в массе при высушивании сырья, в %.
Проведенный сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».
Из проведенного анализа патентной и специальной литературы установлено, что предлагаемый способ имеет признаки, отличающие его не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежных областях фармацевтического анализа лекарственного растительного сырья.
В доступной литературе авторами предлагаемого технического решения не выявлено способа количественного определения полисахаридов в траве фиалки вышеприведенными приемами.
Предлагаемый способ предусматривает экстракцию полисахаридного комплекса и свободных сахаров из сырья, гидролиза и образования окрашенного комплекса продуктов гидролиза (моносахаридов) с пикриновой кислотой в щелочной среде и последующим измерением его оптической плотности.
При изучении спектра поглощения комплекса моносахаридов фиалки авторами заявляемого способа установлено, что окрашенный комплекс имеет максимум поглощения при длине волны 460±2 нм. Аналогичный максимум поглощения имеет комплекс глюкозы с пикриновой кислотой. Поэтому определение суммы моносахаридов после гидролиза полисахаридов проводят в пересчете на глюкозу.
Исследования авторов заявляемого способа свидетельствуют о том, что использование предлагаемого технического решения позволяет повысить точность количественного определения комплекса полисахаридов. Так, количественное содержание комплекса полисахаридов в траве фиалки одноцветковой, определенное по способу-прототипу составило 12,01±5,1%, а по заявляемому способу - 9,25±3,84%. Полученные результаты подтверждают точность предлагаемого способа, достигаемую за счет исключения влияния сопутствующих веществ водного экстракта.
Предлагаемый способ также позволяет расширить арсенал лекарственных средств растительного происхождения для получения полисахаридов, а также фитопрепаратов из них.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии техническому критерию «изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в фармацевтическом анализе лекарственного растительного сырья, который применяют при оценке качества и состава травы видов рода фиалка. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке примерами и, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».
Сущность предложенного способа поясняется примером конкретного выполнения.
Аналитическую пробу сырья травы фиалки одноцветковой измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 1 мм.
Точную навеску (около 1 г) измельченного сырья фиалки одноцветковой помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды, закрывают пробкой и взвешивают с погрешностью ±0,01 г. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 часа. После чего колбу охлаждают и массу колбы доводят водой до первоначальной.
Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (белая лента, под вакуумом), затем 20 мл фильтрата помешают в коническую колбу вместимостью 100 мл и прибавляют 20 мл кислоты хлористоводородной 8%-ной. Колбу соединяют с обратным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане 2 часа. Затем раствор охлаждают до комнатной температуры и с помощью pH-метра доводят pH до нейтральной (6,5-7,0). Раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора водой до метки, перемешивают. Полученный раствор фильтруют через бумажный складчатый фильтр (белая лента).
В две мерные колбы вместимостью 25 мл помещают по 1 мл 1%-ного раствора пикриновой кислоты и 3 мл 20%-ного раствора карбоната натрия. Затем в одну прибавляют 1 мл фильтрата (исследуемый раствор), а в другую 1 мл воды (раствор сравнения). Содержимое колб перемешивают и помещают на водяную баню на 30 мин, после чего колбы охлаждают, объем растворов доводят водой до метки, перемешивают.
Оптическую плотность испытуемого раствора измеряют на спектрофотометре при длине волны 460 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см.
Параллельно измеряют оптическую плотность комплекса глюкозы с пикриновой кислотой в щелочной среде.
Для приготовления раствора Государственного стандартного образца (ГСО) глюкозы берут 0,1500 г (точная навеска) глюкозы, которую помещают в мерную колбу вместимостью 250 мл и доводят объем раствора до метки, перемешивают. 1 мл раствора содержит 0,0006 г глюкозы. Затем 1 мл раствора глюкозы помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл пикриновой кислоты и 3 мл 20%-ного раствора карбоната натрия, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане 1 час. Раствор охлаждают, после чего объем раствора доводят водой до метки, перемешивают.
Содержание суммы моносахаров после гидролиза полисахаридов в пересчете на глюкозу и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле
где X - содержание полисахаридов в %, в пересчете на глюкозу;
D - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
D - оптическая плотность Государственного стандартного образца (ГСО) глюкозы;
m - масса сырья в граммах;
0
m - масса ГСО (Государственный стандартный образец);
W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.
В представленном примере установлено содержание полисахаридов (в пересчете на глюкозу) в траве фиалки одноцветковой 9,25%.
Метрологические характеристики предлагаемого способа представлены в таблице 1 и свидетельствуют об его воспроизводимости с относительной ошибкой ±3,84%.
Таблица 1
n
f
<img file="00000004.tif" he="5" wi="5" img-content="undefined" img-format="tif" />
S<sup>2</sup>
S
точность P, %
t(f, P)
ΔX
Ошибка в % E, %
6
5
9,25
0,0069
0,0831
95
2,78
0,355
±3,84
где n - число степеней свободы (число определений=6);
f=n-1;
x - среднее показание;
2
S- дисперсия (квадратичное отклонение);
S - отклонение;
t - граница вероятности;
ΔX - разность среднего и всех вариантов;
E - относительная ошибка, %.
Для доказательства работоспособности предложенного способа проведены исследования с добавками глюкозы (таблица 2).
Таблица 2
Найдено суммы моносахаров после гидролиза полисахаридов в сырье, г
Добавлено глюкозы
Должно быть, г
Найдено, г
Ошибка
Абсолютная (г)
Относительная (%)
0,0925
0,0018
0,0943
0,0950
+0,0007
+0,74
0,0925
0,0036
0,0961
0,0953
-0,0008
-0,83
0,0925
0,0048
0,0973
0,0985
+0,0012
+1,23
Относительная ошибка опытов с добавками глюкозы находится в пределах случайной ошибки предложенного способа, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.
Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить точность количественного определения полисахаридов, содержащихся в траве фиалки одноцветковой и, тем самым, дает возможность оценить качество лекарственного растительного сырья.
Предлагаемый способ также позволяет расширить арсенал растительного сырья для получения полисахаридов.
Способ не сложен в исполнении, для его осуществления не требуется дорогостоящего оборудования.