Влияние доксорубицина, озона и кислорода на жизнеспособность нормальных и злокачественных клеток печени в культуре

К.Н. Конторщикова, М.В. Ведунова, Е.С. Макарова, Б.Ю. Орлов ВЛИЯНИЕ ДОКСОРУБИЦИНА, ОЗОНА И КИСЛОРОДА НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ НОРМАЛЬНЫХ И ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ В КУЛЬТУРЕ

Нижегородская медицинская академия, Нижний Новгород, Россия Конторщикова Клавдия Николаевна - kontclin@mail.ru

Резюме: В эксперименте изучалось влияние химиопрепарата доксорубицина и окислителей (кислорода и озона) на жизнеспособность культуральных нормальных Chang liver (Ch.l.) и злокачественных SK -HEP-1 клеток печени. Показано, что наибольшей цитотоксичностью обладает доксорубицин в отношении как нормальных, так и злокачественных клеток. Озон как изолированно, так и в комбинации с доксорубицином также проявлял выраженную цитотоксичность. Кислород, напротив, повышал показатель жизнеспособности анализируемых клеток, но в сочетании с доксорубицином также подавлял ферментативную активность. Полученные результаты можно использовать для подбора доз озона и способов его введения при различных локализациях опухолей

Ключевые слова: культивированные клетки, доксорубицин, озон, жизнеспособность.

Summary: An experimental work was done to study the influence of doxorubicin and oxidants (oxygen and ozone) on viability of cultural normal Chang liver (Ch.l.) cells and malignant SK -HEP-1 cells. Doxorubicin was shown to have the highest cytotoxicity, both for normal and malignant cells. Ozone was found to produce marked cytotoxicity when used isolated and in combination with doxorubicin. Oxygen, on the contrary, improved the viability index of the analyzed cells, though in combination with doxorubicin it inhibited enzymatic activity. The received results make it possible to adjust the ozone dose and the route of its administration in various tumor localizations.

Key words: cell culture, doxorubicin, ozone, viability.

Введение

В более ранних публикациях авторами данного исследования в эксперименте на животных при оценке патоморфоза злокачественной опухоли представлены дозы доксорубицина и озона [1]. В то же время механизмы действия этих факторов непосредственно на клетки изучены недостаточно. В связи с этим целью работы явилось изучение жизнеспособности нормальных и злокачественных клеток под влиянием химиотерапии, озона и кислорода.

Материал и методы

Эксперименты проводились на базе отдела молекулярно-клеточных технологий ЦНИЛ. В работе использовались 1/. культивированные клетки нормальной печени человека Chang liver (Ch.l.), культивирование осуществлялось

в среде Игла МЕМ с солями Эрла (ПанЭко) с добавлением 10% сыворотки эмбриональной телячьей (ПанЭко), оптимальная плотность 0,5 -1,0 х 10 5 клеток/мл; 2/. SK-HEP -1 , (человек, аденокарцинома печени, асцитная жидкость), морфология: эпителиоподобная, культивирование осуществлялось в Игла МЕМ с солями Эрла (ПанЭко) с добавлением 10% сыворотки эмбриональной телячьей (ПанЭко) и 1% заменимых аминокислот (ПанЭко), оптимальная плотность 2,0 -4,0х 106 клеток/см 2. Поддержание жизнеспособности культур проводилось в СО2-инкубаторе, при 5% содержании СО2. Эксперимент проводился на 3-5 пассаже. Клетки рассаживали на 48-ми или 6-ти луночные планшеты. При достижении 60% монослоя проводили замену культуральной среды на испытуемые. Готовили их следующим образом: в 50 мл среды для выращивания клеток, вводили а) доксорубицин в дозе 0,004 мг, б) 150 мл кислорода; в) 150 мл озоно - кислородной смеси с концентрацией озона 25 мг/л. г) среда с кислородом + доксорубицин 0,04 мг; д) среда с озоно-кислородной смесью + доксорубицин 0,04 мг. Кислород поступал из концентратора кислорода (США). Озоно - кислородная газовая смесь поступала со скоростью 1 л/мин в течение 5 минут из генератора озона Квазар (Нижний Новгород). Доксорубицин представляет собой антибиотик антрациклинового ряда. Среду, на которой выращивались клетки, заменяли на среды, соответственно а, б, в, г, д. Через 48 часов культивирования клетки, клеточная среда убиралась, клетки промывались полифосфатным буфером и заливались 250 мл смеси Версен (0,02%): трипсин (0,25%) (3:1). Через 10 минут инкубации в СО2-инкубаторе клетки пипетировали и добавляли в каждую лунку по 250 мл 8% формальдегида. После чего производили подсчет количества клеток на автоматическом анализаторе Septer (МiШpore).

Проверку на жизнеспособность проводили по восстановлению клетками солей тетразолия МТТ (Sigma,США) [3] В основе метода лежит реакция восстановления желтой соли тетразолия (бромида 3- (4,5-диметилтиазол -2-ил-2,5-дифенилтетразолий) оксидоредуктазами живых клеток до пурпурных кристаллов формазана [2] Клеточная среда убиралась, клетки промывались раствором PBS (рН=7,4) в каждую ячейку вносят по 300 мкл раствора МТТ бромида (концентрация 0,25 мг/мл в PBS (рН=7,4)). Инкубировали в условиях СО2-инкубатора в течение 30 минут. Далее раствор МТТ убирали и клетки заливали для разрушения клеточных мембран изопропанолом-2. Через 10 минут измеряли оптическую плотность (А) при 570 и 620 нм.

Расчет производили по формулам:

Е=А570-А620;

% жизнеспособных клеток=Еопыта/Еконтроля*100%

При исследовании влияния окислителей и доксирубицина на жизнеспособность за контроль принимали изменение оптической плотности интактных культур.

Результаты исследования представлены в таблице 1. Непосредственный контакт клеток с доксорубицином показал выраженную цитотоксичность в отношении нормальных клеток печени (показатель жизнеспособности 3,5%) и особенно злокачественных клеток печени (показатель жизнеспособности 1,56%). Что касается действия окислителей, то выявились прямо противоположные

эффекты на жизнеспособность клеток. Обработка среды для выращивания клеток кислородом способствовала повышению ферментативной активности как нормальных (до 104%), так и злокачественных (до 115%) клеток. Это свидетельствовало о том, что кислород не изменял состав среды для клеточной культуры, что не мешало им расти, а дополнительный кислород по принципу обратной связи активировал оксидоредуктазы. Введение в культуральную среду озоно-кислородной смесью вызывало образование продуктов взаимодействия озона с биоорганическими соединениями, и эти озониды могли повреждать клеточные мембраны, что проявилось в снижении показателей жизнеспособности (4,54% - для нормальных клеток и 16,5% - для злокачественных клеток печени).

Таблица 1

Показатели жизнеспособности нормальных и злокачественных клеток при

Фактор воздействия Нормальные Злокачественные

клетки печени клетки печени

Кислород 103,2 ±9,7 % 112±17,3%

Озон 4,54±2,7 % 15,7±5,0 %

Доксорубицин 3,6 ± 2,3 % 1,56±0,9%

Доксорубицин + кислород 4,6 ±1,4% 16,5±3,2%

Доксорубицин + озон 7,9±3,2% 2,6±1,8%

Интактные клетки 100±6,4% 100 ±7,9%

Количественные различия можно объяснить более высокой антиоксидантной защитой злокачественных клеток. Сочетанное воздействие на клетки доксорубицина и кислорода показало, что более выраженное воздействие характерно для нормальных клеток, чем для злокачественных, защищенных антиоксидантной системой защиты. Сочетание доксорубицина и озона вызывало снижение жизнеспособности как нормальных клеток до 7,9;%, так и злокачественных до 2,6% Отличие этих показателей при действии изолированного введения доксорубицина и окислителей связано, по всей видимости, с взаимодействием этих факторов между собой и компонентами клеток, в том числе и с антиоксидантами. Отсюда, учитывая, что эффект озона сопоставим с действием доксорубицина на клетки, можно подбирать способы введения озона в зависимости от локализации опухоли

Литература:

1. Алясова А.В., Конторщикова К.Н., Терентьев И.Г., Иванова И.П., Кузнецов С.С., Сазанов А.И. Влияние низких терапевтических концентраций озонированного физиологического раствора на терапевтический патоморфоз опухоли в эксперименте//Современные технологии в медицине, N 4, 2010,c.27-31

2. Аникина Л.В., Пухов С.А., Добровская Е.С., Афанасьева С.В., Клочков С.Г. Сравнительное определение жизнеспособности клеток с помощью ММТ и ресазурина // //Фундаментальные исследования, 2014, N 12-7.-c.1423-1427

3. Mosmann T., 1983, Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays//J.Immunol. Methods. 65:55-63