СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЦЕНТРАТА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК БРУЦЕЛЛ ИЗ ШТАММА Brucella abortus 19 ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНЫХ АНТИГЕНОВ, БРУЦЕЛЛЕЗНЫЕ АНТИГЕНЫ (ТРИ ВАРИАНТА), СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ И ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ (ТРИ ВАРИАНТА)
METHOD FOR PREPARING CONCENTRATED BRUCELLA CELL CULTURE FROM Brucella abortus 19 STRAIN TO PREPARE BRUCELLOUS ANTIGENS, BRUCELLOUS ANTIGENS (THREE VERSIONS), METHOD OF MAKING BRUCELLOSIS DIAGNOSTIC SERUM AND TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING BRUCELLOSIS IN ANIMALS (THREE VERSIONS)

Группа изобретений относится к областям ветеринарии и биотехнологии и может быть использована при производстве тест-систем (наборов) для диагностики бруцеллеза животных: для диагностики бруцеллеза животных в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК); для диагностики бруцеллеза животных в роз-бенгал пробе (РБП); для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции (КР) с молоком; а также способам получения компонентов тест-системы (набора).
При этом наборы для диагностики бруцеллеза животных включают следующие компоненты: соответствующий антиген, который получают из штамма B.abortus 19; сыворотку крови КРС, гипериммунизированного культурой бруцелл вида abortus (диагностическую, положительную); сыворотку крови здорового крупного рогатого скота (отрицательную), которая может быть получена с использованием различных технологий.
В частности, из уровня техники известен способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК (патент на изобретение RU 2085212, МПК: A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20), включающий получение посевного материала (штамма Br.abortus 19) на плотной питательной среде, его глубинное культивирование в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой экстракт и воду, концентрирование и очистку выросшей бакмассы на ультрафильтрационной установке при помощи аппаратов разделительных с использованием 0,5% фенолизированного физраствора, и инактивацию антигена в биореакторе при температуре 80°C в течение часа.
Однако используемый метод концентрирования бактериальной массы на ультрафильтрационных колонках является недостаточно эффективным, энергозатратным и трудозатратным, включает операции сбора и стерилизации ультрафильтрационной установки, требует непрерывного контроля за процессом фильтрации. Кроме того, при использовании ультрафильтрационной колонки существует риск потери бакмассы и ее контаминации посторонней микрофлорой из-за разрыва волокон кассет.
Известен также способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы (РБП) (патент на изобретение RU 2163141, МПК: A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20). Способ включает получение посевного материала и производственное культивирование штамма Brucella abortus 19 в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой аутолизат и воду. Культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19-21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования. После внесения посевного материала с 1 по 6 ч культивирования устанавливают уровень 20-25 pO2, с 6 по 16-18 ч культивирования - 40-45 pO2 и затем с 16-18 по 19-21 ч - 30-35 pO2. Выросшие бактериальные клетки отделяют и концентрируют ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15-50 кД. Инактивируют нагреванием. Окрашивают роз-бенгалом с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацией целевого продукта.
Однако недостатки, перечисленные выше характерны и для данного технического решения.
В отношении изобретения, касающегося способа изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки, из уровня техники известен способ получения поливалентной диагностической бруцеллезной сыворотки (см., например, Сыворотка диагностическая бруцеллезная агглютинирующая. ТУ-316-82 от 01.06.1982, утв. ГУ по производству бактерийных и вирусных препаратов МЗ СССР), по которому иммунизируют крупный рогатый скот в возрасте от 2 до 5-6 лет, при этом используют некастрированных быков-продуцентов. До начала иммунизации животных выдерживают в течение 1 месяца на карантине, после чего проводят грунд-иммунизацию путем однократного введения 10 мл бруцеллезного антигена подкожно, и через 1 месяц приступают к иммунизации. Иммунизацию осуществляют в 2-4 цикла с интервалами 20-30 суток. В течение одного цикла проводят 5 ежедневных инъекций антигена с объемами 10, 15, 20, 30, 40 мл. По окончании цикла иммунизации на 10-ый день после последней инъекции антигена берут контрольную пробу крови для постановки реакции агглютинации. При наличии титра антител в сыворотке крови не ниже 1:3200 проводят кровопускание. Для иммунизации животного применяют антигены, инактивированные нагреванием при температуре 60°C в течение 2 часов с последующим добавлением карболовой кислоты и выдерживанием при 37°C 48 часов. Антигены представляют собой взвеси культур B.abortus 544, B.melitensis 16-М и B.suis 1330.
Недостатками способа являются длительность, трудоемкость процесса, эпидемическая опасность, связанная с использованием вирулентных культур бруцелл, и высокая себестоимость конечного продукта.
Наиболее близкими решениями заявляемой группы изобретений являются решения, представленные в RU 2361610, МПК: A61K 39/10, A61K 39/40, A61P 31/04, а именно способы получения бруцеллезного антигена из штамма Bbrucella abortus 19 для РА, РСК И РДСК, бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) и бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком, а также способ изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки.
3
В частности, способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для РА, РСК и РДСК по патенту RU 2361610 включает получение посевного материала и культивирование бруцелл в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией и их инактивирование нагреванием. При этом культивирование бруцелл в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования осуществляют в следующем режиме: температура 37±0,5°C, pH 6,9-7,2, аэрация с 1 по 3 ч - 20-25 pO2, с 3 по 6 ч - 25-40 pO2, с 6 по 15 ч - 40-45 pO2 и с 15 по 16-18 ч - 30-35 pO2, а отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток ультрафильтрацией осуществляют с использованием мембранных кассет. Культивирование бруцелл в глубинных условиях осуществляют в течение 16-18 ч. Концентрирование осуществляют в течение 2-2,5 ч. При концентрировании бактериальной массы используют мембранные кассеты с пределом задержания 20 КД. По окончании концентрирования полученный антиген ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором до ОК 250-300 млрд м.кл./см. Данный способ получения бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК лежит в основе получения антигена для РБП, для КР с молоком, и для положительной сыворотки диагностической.
Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для роз-бенгал пробы (РБП) по патенту RU 2361610 включает окрашивание концентрата антигена бенгальской розовой, при этом используют концентрат антигена, полученный по вышеописанной технологии, бенгальскую розовую перед окрашиванием титруют в водяной бане при температуре 40°C, а окрашивание антигена проводят при этой же температуре в течение часа.
Способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для кольцевой реакции (КР) с молоком по патенту RU 2361610 включает окрашивание ресуспендированной бактериальной массы антигена тетразолием хлористым или гематоксилином, при этом используют антиген также по описанной выше технологии.
3
3
3
Способом изготовления бруцеллезной диагностической сыворотки по патенту RU 2361610 включает гипериммунизацию животных-продуцентов бруцеллезным антигеном с последующим кровопусканием, отделением сыворотки, ее консервированием и расфасовкой, проверкой на стерильность, активность и специфичность. При этом гипериммунизацию животных-продуцентов осуществляют антигеном, также полученным по описанному выше способу, подкожно в области средней трети шеи КРС по следующей схеме: 1-й день вводят 5 см антигена (75 млрд мк.кл.), 10-й день - 8 см (120 млрд м.кл.), 20-21-й день - 10 см (150 млрд мк.кл.), на 27-28-й день проводят пробное крововзятие, а на 30-31-й день осуществляют производственное кровопускание. Кровь выдерживают при температуре 37-38°C в течение 2-3 ч, а затем помещают в холодильник при 2-8°C на 3-5 суток, после чего отделяют сыворотку, полученную сыворотку консервируют 5%-ным раствором фенола на изотоническом растворе в соотношении 1:10 или путем добавления 4% сухой борной кислоты, после чего прогревают в водяной бане при температуре 50°C в течение 40 мин при постоянном перемешивании, а затем помещают в холодильник при температуре 2-8°C на 10 суток. Сыворотка стерильная имеет титр в РА не ниже 1:1000, а в РСК не ниже 1:20. После расфасовки сыворотку лиофилизируют.
Однако в перечисленные способах также использован концентрат, полученный с применением мембранных кассет. Во время ультрафильтрации нередко наблюдается разрыв волокон, что приводит к потере бактериальной массы и ее контаминации посторонней микрофлорой.
Заявляемое изобретение преодолевает перечисленные выше недостатки.
Задачей заявляемой группы изобретений в части способа получения концентрата культуры клеток бруцелл из штамма Brucella abortus 19 для приготовления бруцеллезных антигенов, используемых в диагностических тест-системах, а также способов получения антигена и сыворотки бруцеллезной диагностической, также используемой в диагностических тест-системах, а также способов получения бруцеллезных антигенов (препаратов) - единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, бруцеллезного антигена для РБП, бруцеллезного антигена для КР с молоком, является увеличение выхода концентрата - сырья для получения антигенов, при снижении риска заражения упрощении и удешевлении технологии получения концентрата и препаратов из них.
3
3
3
Поставленная задача в части способа получения концентрата культуры клеток бруцелл из штамма Brucella abortus 19 для приготовления бруцеллезных антигенов, используемых в диагностических тест-системах решается тем, что он ключает получение посевного материала бактериальных клеток и их культивирование в глубинных условиях на жидкой питательной среде с регулированием уровня концентрации растворенного в культуральной среде кислорода на протяжении всего процесса культивирования, инактивацию выросших бактериальных клеток нагреванием с последующим их концентрированием, при этом процесс культивирования бактериальных клеток осуществляют при температуре 36-38°C, в процессе культивирования на этапе накопления бактериальных клеток от концентрации 1,5-2,5 млрд м.к./см до концентрации 10 млрд м.к./см выдерживают концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в интервале 20-25 мг/л, а свыше 10 млрд м.к./см и до достижения бактериальными клетками стационарной фазы роста обеспечивают концентрацию растворенного кислорода в культуральной среде в интервале значений 40-45 мг/л, а концентрирование выросших бактериальных клеток осуществляют посредством осаждения флокулянтом, в качестве которого используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), который добавляют в культуральную среду в количестве 0, 1-0,15 г по сухому веществу на 1 литр культуральной среды, после чего сливают надосадок с получением концентрата инактивированных бактериальных клеток для последующего приготовления бруцеллезного антигена в РА, РСК, РДСК, антигена РБП; антигена КР с молоком.
3
3
3
В частных вариантах выполнения способа осаждение осуществляют в течение 24-48 часов при температуре от 8 до 12°C; культивирование бактериальных клеток в глубинных условиях на жидкой питательной среде осуществляют доливным методом, включающим культивирование бактериальных клеток в половине объема питательной среды с концентрацией посевного материала 1,5-2,5 млрд м.к./см до достижения концентрации бактериальных клеток в питательной среде 50-60 млрд м.к./см., после чего объем питательной среды увеличивают в два раза - до полного объема и продолжают культивирование до стационарной фазы роста бактериальных клеток, на которой достигается накопление бактериальных клеток 95-105 млрд м.к./см. При этом культивирование бактериальных клеток в половине объема питательной среды осуществляют течение 16-18 часов, и после увеличения объема питательной среды до полного - в течение 7-9 часов, общее время культивирования составляет 23-27 часов. Индикатором достижения клетками стационарной фазы роста является резкое увеличение концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости с 40-45 мг/л до 90 мг/л и выше в течение 1-5 минут при одном и том же уровне подачи воздуха.
3
В качестве питательной среды используют среду следующего состава, об. %: Перевар Хоттингера 15-18, Гидролизат казеина 1,5-2,0, Глицерин 1-1,5, Глюкоза 1-1,5, NaCl - 0,5, Дрожжевой экстракт сухой - 0,5, Вода (водопроводная) - остальное до 100, в которой содержание аминного азота составляет 160-180 мг %. В процессе культивирования автоматически поддерживают pH в интервале значений 6,8-7,2 посредством добавления в культуральную среду 5% раствора NaOH или HCl. Уровень растворенного кислорода в обозначенных интервалах значений поддерживают подачей воздуха в культуральную среду и вращением мешалки с увеличивающейся скоростью мешалки от 100 об/мин на этапе накопления микробных клеток до 10 млрд м.к./см, и до 300-350 оборотов в минуту - до достижения бактериальными клетками стационарной фазы роста. В случае образования пены в процессе перемешивания в культуральную среду добавляют пеногаситель, например, марки «Барванол» от 0,015-0,02 л на 100 литров культуральной среды. Инактивацию бактериальных клеток нагреванием осуществляют после окончания их культивирования в ферментере при температуре плюс 78-80°C, в течение 1-1,2 ч.
3
Культивирование бактериальных клеток в глубинных условиях до достижения накопления бактериальных клеток 60-80 млрд м.к./см без использования доливного метода осуществляют в течение 16-20 ч, доливным методом - в течение 24-26 часов.
3
3
По окончании концентрирования полученный концентрат в виде инактивированных бактериальных клеток ресуспендируют стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором до оптической концентрации 250-300 млрд.м.кл./см для последующего получения антигена в РА, РСК, РДСК и антигена РБП, или стерильной дистиллированной водой (очищенной) до концентрации 200 млрд м.к./смдля последующего получения антигена КР с молоком.
3
Поставленная задача в части способа получения антигена из штамма Brucella abortus 19 для получения сыворотки бруцеллезной диагностической, используемой в диагностических тест-системах, решается тем, что он ключает технологические операции, описанные выше при получении концентрата культуры клеток бруцелл для приготовления бруцеллезных антигенов, за исключением операции инактивации выросших бактериальных клеток и изменением этапа ресуспендирования полученного концентрата. В данном способе по окончании концентрирования полученный концентрат (антиген) ресуспендируют стерильным физиологическим раствором до оптической концентрации 200 млрд м.к./см для последующей иммунизации животных-продуцентов для получения сыворотки.
Поставленная задача в части способа получения сыворотки бруцеллезной диагностической решается тем, что проводят гипериммунизацию животных-продуцентов бруцеллезным антигеном с последующим отбором крови, отделением сыворотки, ее стерилизацией, при этом гипериммунизацию животных-продуцентов осуществляют, по меньшей мере, трехкратным подкожным введением антигена, первые два из которых осуществляют антигеном для получения сыворотки бруцеллезной диагностической, полученным описанным выше способом (без использования операции инактивирования, т.е. «живой» культурой), а третье - антигеном (концентратом), полученным описанным выше способом, включающим инактивирование выросших бактериальных клеток.
3
3
3
В качестве животных-продуцентов используют быков массой не мене 300 кг. Антиген вводят в область средней трети шеи, при этом первое введение антигена осуществляют на первый день в количестве 5 см антигена (75 млрд мк.кл.), второе - на 14 день в количестве 8 см (120 млрд м.кл.), третье - на 21 день в количестве 10 см (150 млрд мк.кл.), после чего на 28 день проводят взятие пробы крови, и при наличии в пробе достаточных титров антител (в РА не ниже 1:800, а в РСК не ниже 1:20) на 29-30 день осуществляют производственный отбор крови. Кровь выдерживают при температуре 37-38°C в течение 2-3 ч, а затем помещают в холодильник при 2-8°C на 3-5 суток, после чего отделяют сыворотку. Стерилизацию сыворотки осуществляют путем ее фильтрации через стерилизующие фильтры «Durapore» размером 30′′ с диаметром пор 0,22 мкм или аналогичные по характеристикам. Полученная сыворотка стерильная имеет титр в РА не ниже 1:800, а в РСК не ниже 1:20. После расфасовки сыворотку лиофилизируют.
3
Поставленная задача в части способа получения единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК решается тем, что получают концентрат бактериальных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором, который выдерживают 7-10 дней при температуре 4-6°C, после чего концентрат разводят 0,5% фенолизированным физиологическим раствором до оптической концентрации 18-22 млрд м.к./см.
3
3
Поставленная задача в части способа получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) решается тем, что получают концентрат бактериальных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильным 1%-ным фенолизированным изотоническим раствором, который окрашивают бенгальской розовой, при этом добавляют 1%-ный раствор бенгальской розовой из расчета 6% раствора на оптическую концентрацию 200 млрд м.к. в 1 см и оставляют на 20-24 часа, затем окрашенный концентрат центрифугируют при 15-17 тыс оборотов в минуту, затем окрашенную массу микробных клеток ресуспендируют до оптической концентрации 90-100 млрд м.к./см буферным разбавителем, состав которого содержит растворенных в 100 литрах очищенной или дистиллированной воды следующих компонентов: гидроокиси натрия - 2,0 кг, фенола - 0,5 кг, молочной кислоты - 20,5 кг, хлористого натрия - 0,9 кг.
3
Поставленная задача в части способа получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком решается тем, что получают концентрат микробных клеток по п. 1, ресуспендированный стерильной дистиллированной водой (очищенной), добавляют 25-35% от объема культуральный среды протраву, в качестве которой используют 0,5%-ный водный раствор сернокислого железа, после чего концентрат с протравой нагревают до 43-45°C и выдерживают 25-35 минут, полученный концентрат окрашивают составом, содержащим гематоксилин или 2,3,5-трифенилтетразоль хлористый, и выдерживают при комнатной температуре в течение 15-24 часа, после чего окрашенный концентрат центрифугируют при 15-17 тыс. оборотов в минуту (пока весь окрашенный концентрат не пройдет через центрифугу), затем окрашенную массу ресуспендируют 1%-ным фенолизированным физраствором до оптической концентрации 100 млрд м.к. в 1 см.
Технический результат, достигаемый заявляемой группой изобретения, заключается в увеличении накопления бруцелл - выхода бактериальных клеток за один цикл, и, соответственно, изготавливаемых из них антигенов, и устранении их контаминации посторонней микрофлорой в процессе концентрирования. Увеличение выхода коцентрата (сырья для получения антигенов) составляет минимум на 15%, при применении доливного метода - в 2 раза.
Технический результат обеспечивается за счет усовершествования заявляемой технологии, в частности изменения технологии культивирования и концентрирования бактериальных клеток, исключения из технологии ультрафтльтационной установки, используемой в известных решениях для концентрирования бактериальных клеток. В заявляемом способе культивирование и концентрирование осуществляется в одной емкости, что исключает потери бактериальных клеток, и, соответственно увеличивает выход готового продукта. Используемые в способе технологические параметры являются легко контролируемыми, что исключает возможность операторской ошибки, и соответственно, положительно сказывается на процессе производства и качестве готового продукта.
В заявляемом способе для концентрирования (осаждения) бактериальной массы предложено использовать КМЦ (карбоксиметилцеллюлозы), что имеет ряд преимуществ: при удлинении на сутки технологического процесса снижаются трудовые затраты (операторы участвуют только при закачке КМЦ и декантации надосадочной жидкости, что составляет по времени 0,5-1 час, в зависимости от объема бактериальной массы); исключается дорогое оборудование, исключается потеря бакмассы из-за возможного разрыва мембран кассеты ее контаминация. Это все ведет к снижению затрат на приготовление антигена. Кроме того, в заявляемом способе в процессе культивирования предложено использовать доливной метод, который заключается в культивировании бактерий при засевной 1,5-2,5 млрд м.к./мл, на половине от всего объема питательной среды в течении 16-18 часов, концентрация микробных клеток при этом достигается 50-60 млрд м.к./мл, затем доливается вторая половина питательной среды и культивирование продолжается до стационарной фазы роста (до 24-26 часов), оптическая концентрация микробных клеток достигается 95-105 млрд м.к./мл, что на 30% увеличивает выход сырья. Растворенный кислород с 16-18 часа поддерживается в культуре на уровне 40-45%, резкое увеличение растворенного кислорода в культуре говорит о наступлении стационарной фазы, что подтверждается методом отбора контрольных проб, pH в культуре поддерживается автоматически 5% растворами NaOH и HCl в пределах 6,8-7,2.
Наиболее близкими решениями, известными из уровня техники, касающимися наборов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК И РДСК, для диагностики бруцеллеза животных в РБП и для диагностики бруцеллеза животных в КР с молоком, являются изобретения, представленные в RU 2361610, МПК: A61K 39/10, A61K 39/40, A61P 31/04.
Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК и РДСК по патенту RU 2361610 содержит антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.
Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в РБП содержит антиген бруцеллезный для РБП, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную и сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.
Диагностический набор для диагностики бруцеллеза животных в КР с молоком содержит антиген бруцеллезный для КР и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную.
Однако в перечисленных наборах присутствуют антигены, полученные способом, характеризующимся высоким риском контаминации антигенов в процессе их получения, и с большими потерями продукта в процессе производства, что уменьшает количественный выход продукта за один цикл.
Задачей изобретения в части наборов компонентов для диагностики бруцеллеза животных является снижение количество брака в процессе производства за счет исключения возможности контаминации антигенов в процессе их получения.
Кроме того, в заявляемых наборах использован антиген и сыворотка, в технологии производства которых изменен режим культивирования, методика концентрирования и состав среды культивирования, что приводит к получению большего количества продукта за один цикл.
Использование для диагностики бруцеллеза наборов из нескольких компонентов позволяет унифицировать серологическую диагностику бруцеллеза животных и контролировать правильность постановки серологических реакций во всех ветеринарных лабораториях страны.
Поставленная задача в части тест-системы (набора компонентов) для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК и РДСК решается тем, что она содержит антиген бруцеллезный единый для РА, РСК и РДСК и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученные по описанным выше способам, а также сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.
Поставленная задача в части тест-системы (набора компонентов) для диагностики бруцеллеза животных в роз-бенгал пробе (РБП) решается тем, что она содержит антиген бруцеллезный для РБП, сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученные по описанным выше способам, а также сыворотку крови здорового крупного рогатого скота лиофилизированную.
Поставленная задача в части тест-системы (набора компонентов) для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции (КР) с молоком решается тем, что она содержит антиген бруцеллезный для КР и сыворотку бруцеллезную диагностическую лиофилизированную, полученные по описанным выше способам.
Группа изобретений характеризуется следующими примерами.
Пример 1. Приготовление концентрата для получения единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, а также для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП)
3
3
3
3
3
3
3
Для производственного культивирования бруцелл использовали посевной материал из штамма Brucella abortus 19 с оптической концентрацией 30 млрд м.к. объемом 10 л, который засевали в биореактор со 150 л стерильной питательной средой, содержащей, об. %: перевар Хоттингера - 15, гидролизат казеина - 1,5, глицерин - 1,0, глюкоза - 1,0, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой экстракт сухой - 0,5, вода - до 100. Содержание аминного азота в питательной среде составило 160 мг %. Концентрация бактериальных клеток при засеве питательной среды составила 1,8 млрд м.кл./см. Производственное культивирование проводили глубинным доливным методом. При культивировании pH поддерживали в пределах 7,0, а температуру - в пределах 37,0°C. Уровень растворенного в культуральной среде кислорода до накопления 10 млрд м.к./см, в течение 4 часов, поддерживали 15 мг/л, скорость оборотов мешалки составляла 100 об/мин; далее уровень растворенного в культуральной среде кислорода поднимали до 40 мг/л и поддерживали в течение 12 часов, а скорость оборотов мешалки увеличивали до 300 об/мин. На высоких оборотах мешалки для предотвращения пенообразования в культуральную среду добавляли Барванол в количестве 25 см. Через 12 часов получали оптическую концентрацию бактериальных клеток в культуральной среде 50 млрд м. к./см. Затем добавили в этот же реактор еще 150 л питательной среды и продолжали культивировать еще 9 часов в этом же режиме (температура в пределах 37,0°C, растворенный кислород в культуральной среде в пределах 40 мг/л). Через 9 часов наблюдали резкое увеличение содержания растворенного кислорода в культуральной среде, при этом оптическая концентрация бактериальных клеток составляла 95 млрд м.кл./см, которую определяли по контрольной пробе, что является критерием того, что культура находится в стационарной фазе. Общее время культивирования составило 25 часов. По окончании культивирования в культуральную среду вносили 30 л 1,25% раствор КМЦ, после чего культуральную среду инактивировали нагревом ее до 80°C и выдерживанием при данной температуре в течение 1 часа. Затем биореактор с культуральной средой охлаждали до 10°C и данную температуру поддерживали в течение 48 часов. Надосадочную жидкость сливали из биореактора, а 70 л осадка - инактивированных клеток бруцелл с оптической концентрацией 400 млрд м.кл./см, ресуспендировали в биореакторе стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором до 300 млрд м.кл./см бактериальной суспензии. Инактивированную бактериальную суспензию сливали в стерильные бутыли и хранили в холодильнике при температуре 6°C 10 дней для последующего использования в приготовлении единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, а также для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП).
Пример 2. Приготовление концентрата для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком
3
3
Концентрат изготавливали аналогично примеру 1, но для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл использовали стерильную питательную среду на основе перевара Хоттингера, содержащую, об. %: перевар Хоттингера - 18, гидролизат казеина - 2, глицерин - 1,0, глюкоза - 1,5, натрия хлорид - 0,5, дрожжевой экстракт сухой - 0,5, вода - до 100. Содержание аминного азота в питательной среде составило 180 мг %. Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus 19 засевали в микроферментер с данной питательной средой. Концентрация посевного материала составила 2,0 млрд м.кл./см. Культивирование осуществляли 22 часа до накопления 42 млрд м.кл./см.
3
3
3
3
3
Производственное культивирование проводили глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. При культивировании pH поддерживали в пределах 7,0, а температуру - в пределах 37,0°C. Уровень растворенного в культуральной среде кислорода до накопления 10 млрд м.к./см, в течение 3 часов, поддерживали 23 мг/л, скорость оборотов мешалки составляла 100 об/мин; далее уровень растворенного в культуральной среде кислорода поднимали до 45 мг/л и поддерживали в течение 13 часов, а скорость оборотов мешалки увеличивали до 350 об/мин. Через 13 часов получали оптическую концентрацию в культуральной среде 60 млрд м.к./см. Затем в реактор добавляли еще 150 л питательной среды и продолжали культивирование еще 10 часов в этом же режиме (температура в пределах 37,0°C, растворенный кислород в культуральной среде в пределах 45 мг/л). Чтобы погасить пену, в культуральную среду вносили 40 мл барванола. Через 10 часов растворенный кислород в культуральной среде резко поднимался, при взятии контрольной пробы в данный момент было определено, что культура находится в стационарной фазе и оптическая концентрация составила 100 млрд м.кл./см. Общее время культивирования составило 26,0 часов. По окончании культивирования в культуральную среду вносили 30 л 1,2% раствора КМЦ, культуральную среду прогревали до 80°C, инактивировали в течение 1 часа, а затем охлаждали биореактор с культуральной средой до 10°C и данную температуру поддерживали в течение 48 часов. Надосадочную жидкость из биореактора сливали, а 85 л осадка - инактивированных клеток бруцелл с оптической концентрацией 400 млрд м.кл./см ресуспендировали стерильной дистиллированной водой (очищенной) до концентрации 200 млрд м.кл./см и использовали для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком.
Пример 3. Получение единого бруцеллезного антигена в РА, РСК и РДСК
3
3
Полученный концентрат бактериальных клеток по примеру 1 ресуспендировали стерильным 1%-ным фенолизированным физиологическим раствором до концентрации 18-20 млрд м.кл./см. Активность и специфичность полученного антигена из концентрата устанавливали при его титровании в РА со стандартным образцом сыворотки против Brucella abortus. Предлагаемый антиген, содержащий меньшее количество клеток (в среднем 19 млрд м.кл./см), дает реакцию интенсивностью в 2 креста с разведением сыворотки 1:500 (конечное разведение 1:1000), что свидетельствует о его соответствии Международному стандарту.
Пример 4. Получение бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП)
3
3
3
Для получения бруцеллезного антигена для роз-бенгал пробы (РБП) концентрат антигена в объеме 50 л с оптической плотностью 300 млрд м.к., изготовленный по примеру 1, ресуспендировали стерильным 1%-ным фенолизированным фенолизированным раствором до 200 млрд м.кл./см с получением 75 л, который окрашивали бенгальской розовой, при этом добавляли 4,5 л 1%-ного раствора бенгальской розовой (из расчета 6% раствора на оптическую концентрацию 200 млрд м.к./см) и оставляли на сутки. Окрашенный концентрат центрифугировали при 15 тыс. оборотов в минуту, затем окрашенную массу ресуспендировали до оптической концентрации 90-100 млрд м.к./см буферным разбавителем. В результате получали быстрое, в течение часа, полное яркое и равномерное окрашивание микробной клетки.
3
Активность и специфичность полученного антигена устанавливали при его титровании в РБП со стандартным образцом сыворотки против Brucella abortus. Предлагаемый антиген, содержащий меньшее количество клеток (90 млрд м.кл./см), дает реакцию интенсивностью в 4 креста с сывороткой в разведении 1:10, содержащей 100 ME, 1-2 креста с сывороткой в разведении 1:20 (50 ME), и отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 1:35 (28,5 ME), что свидетельствует о его стандартности.
Пример 5. Получение бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком
19
15
4
3
Для получения бруцеллезного антигена для кольцевой реакции (КР) с молоком в ресуспендированную бактериальную массу антигена, изготовленного по примеру 2, добавляли 25-35% от объема бактериальной массы протравы, в качестве которой использовали 0,5%-ный водный раствор сернокислого железа, после чего концентрат с протравой нагревали до 45°C и выдерживали 30 минут. Полученный концентрат окрашивали гематоксилином (или 2,3,5-трифенилтетразолем хлористым ТУ 6-09-07-1646-87 (ЧДА, CHCN)) и выдерживали при комнатной температуре 24 часа, после чего окрашенный концентрат центрифугировали при 15 тыс оборотов в минуту, затем окрашенную массу ресуспендировали 1%-ным фенолизированным физраствором до оптической концентрации 95-100 млрд м.к. в 1 см.
Гематоксилиновую краску в одном из вариантов готовили традиционным методом, в другом - ускоренным. Согласно традиционному методу навеску гематоксилина массой 10 г растворяли в 150 мл 95%-ного спирта этилового ректификованного и добавляли к 500 мл насыщенного раствора алюмоаммонийных квасцов (15%-ный раствор в дистиллированной воде), приготовленного в стеклянной посуде. Полученную смесь окисляли озонированным воздухом, образующимся при воздействии ультрафиолетового света, получаемого с использованием ртутно-кварцевой лампы, в открытой стеклянной, фарфоровой или эмалированной емкости с широким горлом при комнатной температуре в течение 3 суток, после чего смесь фильтровали и добавляли 125 мл глицерина и 125 мл метилового спирта. В таком соотношении ингредиентов заготавливали необходимое количество краски. Раствор оставляли при комнатной температуре в открытой бутыли на 1-3 мес для созревания, затем вновь фильтровали через фильтровальную бумагу и хранили в закрытой емкости. Готовая краска имела красно-малиновый цвет. Перед использованием раствор краски перемешивали и фильтровали через бумагу.
4
4
2
3
Для приготовления гематоксилиновой краски ускоренным методом использовали четыре компонента: навеску гематоксилина массой 10 г вносили в колбу с 150 мл спирта этилового ректификованного, нагревали до 50-60°C и растворяли при постоянном перемешивании на магнитной мешалке; навеску алюмоаммонийных квасцов [NHAl(SO)·12 НО] массой 45 г растворяли в 500 мл дистиллированной воды и нагревали до закипания (95-98°C); навеску натрия иодата (NaO) массой 1,0 г растворяли в 10 мл дистиллированной воды, нагретой до кипения; глицерин - 150 мл. В таком соотношении компонентов заготавливали необходимое количество краски. В колбу с горячим раствором алюмоаммонийных квасцов вносили глицерин, добавляли спиртовой раствор гематоксилина и затем раствор иодата натрия. Сразу после внесения последнего компонента краска приобретала интенсивный красно-малиновый цвет. После внесения каждого компонента полученный раствор тщательно перемешивали.
3
Полученный концентрат окрашивают гематоксилином из расчета 3% краски на концентрат культуры клеток с оптической концентрации 200 млрд м.к. в 1 см.
3
3
Активность и специфичность полученного по данному примеру антигена устанавливали при его титровании с 10 пробами свежего парного или охлажденного коровьего молока, содержащими в 2 см 40, 20 и 10 ME антител. Предлагаемый антиген содержит меньшее количество клеток (95-100 млрд м.кл./см), что обусловливает его более высокую активность.