СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ПРЕПАРАТА
METHOD OF PRODUCING ENTOMOPATHOGENIC PREPARATION

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается производства средств защиты растений от вредителей, в частности способа получения грибных энтомопатогенных препаратов. Известны способы получения энтомопатогенных препаратов путем глубинного культивирования микроскопических грибов, таких как Verticillium lecanii, Beauveria bassiana на питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим концентрированием и сушкой концентрата (Вертициллин зерновой ТУ 10.01.28-89 [1], Вертициллин-К ТУ 10.01.29-89 [2]). Недостатками этих препаратов является низкопроизводительный поверхностный способ культивирования, необходимость стадии сушки, которая существенно снижает жизнеспособность спор и усложняет технологический процесс. В случае получения жидких препаратов (Боверин-концентрат Ж ТУ 10.01.26-88 [3]), их применяют сразу после получения. Современными препаративными формами, более экономичными и простыми в получении являются стабилизированные пасты.
Наиболее близким техническим решением к изобретению, взятый за прототип (Патент RU 2035144. Третьяков В.П. Способ получения энтомопатогенного препарата от 22.01.1993 [4]) является способ получения жидкого энтомопатогенного препарата путем глубинного культивирования микроскопических грибов (Verticillium lecanii, Beauveria bassiana или Metarhizium anisopliae) на питательной среде, содержащей глюкозу, глицерин, гидролизат белково-витаминного концентрата, мел и воду, концентрирование культуральной жидкости, введение в концентрат дополнительно глицерина и полиэтиленоксида или поливинилпироллидона.
9
6
Полученный по описанному способу влажный препарат (паста) имеет титр бластоспор 11·10 спор/мл, биологическая эффективность 80% на личинках оранжерейной белокрылки при рабочей концентрации 10·10 спор/мл, срок хранения до трех месяцев при температуре не выше 10°С.
Недостатком известного способа является сравнительно низкая биологическая эффективность биопрепарата и снижение жизнеспособности инфекционных единиц в процессе хранения за счет несбалансированного состава препаративной формы.
Цель изобретения - увеличение биологической эффективности биопрепарата и удлинение срока хранения без ее потери.
2
Сущность способа заключается в следующем. Готовят жидкую стерильную питательную среду (Леднев и др. «Возбудители микозов насекомых», СПб. 2003, с.71 [5]), содержащую, мас.: 20 г глюкозы, 10 г пептона, 2 г дрожжевого экстракта, НО - до 1 л. Доводят до рН 6,5 едким натром. Засевают штаммом гриба Verticillium lecanii P-81 (Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, М. - СПб, РАСХН, 2001, с.14 [6]) и культивируют глубинно, скорость перемешивания 200-220 об/мин. Культивирование осуществляют в течение 5 суток при 27°С до максимального спорообразования. Полученную культуральную жидкость концентрируют до остаточной влажности 73-85% фильтрованием. Для получения пасты в концентрат культуральной жидкости вводят полифункциональную добавку, которая состоит из наполнителя - картофельного крахмала, в качестве эмульгатора и антиоксиданта соевого лецитина или вазелинового масла, ультрафиолетового протектора - диоксида титана, консерванта - борной кислоты (СанПиН 2.3.2.1078-01 Приложение 7, с.577, 578, 611, 616 [7]) и антибиотика - стрептомицина [5, с.70] при соотношении компонентов, мас.%: картофельный крахмал 6-8;.диоксид титана 2-5; борная кислота 0,01-0,03; стрептомицин 0,004-0,008; соевый лецитин 8-14 или вазелиновое масло 4-6; вода - остальное.
Пример 1, иллюстрирующий приготовление составов.
13
12
8
К 5 г концентрата культуральной жидкости с остаточной влажностью 78% и титром жизнеспособных единиц 5,0·10 КОЕ/г добавляли 1 мл 0,1%-ного раствора борной кислоты, 1 мл 0,02%-ного раствора стрептомицина, 10% (0,5 г) соевого лецитина. После частичного растворения гранул лецитина, смешивали образец с 5 г 7,5%-ного картофельного крахмала. Полученный энтомопатогенный препарат, представляющий собой стойкую однородную суспензию (пасту), имеет следующую характеристику: исходный титр жизнеспособных спор 2,3·10 КОЕ/г, срок хранения до четырех месяцев при температуре 4°С, титр после хранения составил 4,3·10 КОЕ/г. Непосредственно перед применением в препарат добавляли 5% (0,25 г) диоксида титана.
6
Биологическая эффективность препарата на виковой тле (Megoura viciae Buckt.) - 100%, на черемухо-злаковой тле (Rhopalosiphum padi L.) - (98,0±3,5)%, на белокрылке - (95,5±7,9)% (рабочая концентрация 5,0·10 спор/мл).
Пример 2. Так же как в примере 1 получали препарат на основе 5 г концентрата культуральной жидкости в такой же последовательности с заменой соевого лецитина на 0,3 г вазелинового масла. Полученный энтомопатогенный препарат, представляющий собой стойкую однородную суспензию (пасту), имеет следующую характеристику:
12
8
6
исходный титр жизнеспособных спор 2,3·10 КОЕ/г, срок хранения до четырех месяцев при температуре 4°С, титр после хранения 2,0·10 КОЕ/г. Биологическая эффективность препарата на виковой тле (Megoura viciae Buckt) - (91,3±4,3)% (рабочая концентрация 5,0·10 спор/мл), на черемухо-злаковой тле (Rhopalosiphum padi L.) - (99,3±1,2)%, на белокрылке - (85,0±7,7)% (рабочая концентрация 5,0·10 спор/мл).
13
3
10
9
Приведенный в примерах 1-2 титр концентрата культуральной жидкости - 5,0·10КОЕ/г является промежуточным параметром при получении препарата. Из литературы известны различные показатели титра спор (спор/мл культуральной жидкости), полученные в результате культивирования штаммов этого вида гриба в глубинных условиях. Эти показатели определяются прежде всего штаммовыми особенностями продуцента. Например, в прототипе получают культуральную жидкость с титром спор гриба 1,5·10 спор/мл, концентрируют до титра 1,3·10 спор/г и в готовом препарате получают в пересчете на граммы 2,27·10 спор/г.
12
8
Титр пасты после внесения добавок (исходный) составил 2,3·10 КОЕ/г. Такие наработки были проведены многократно (таблица 1). Для всех образцов паст, полученных по предлагаемому способу, характерно первоначальное увеличение КОЕ/г (через неделю хранения) за счет частичного использования компонентов полифункциональной добавки и последующее снижение через 4 месяца хранения до уровня (0,5-3,5)·10 КОЕ/г. Паста, полученная по прототипу, не хранится в течение 4-х месяцев (таблица 2).
Таблица 1
Номер наработки
Титр концентрата, КОЕ/г
Титр жизнеспособных единиц в пасте, КОЕ/г
исходный
1 неделя
4 месяца
1
9.3·10<sup>9</sup>
4,6·10<sup>9</sup>
1,4·10<sup>10</sup>
9,7·10<sup>7</sup>
2
4,7·10<sup>12</sup>
2,3·10<sup>12</sup>
1,6·10<sup>13</sup>
3,5·10<sup>8</sup>
3
2.1·10<sup>8</sup>
1.1·10<sup>8</sup>
1,2·10<sup>9</sup>
5,0·10<sup>7</sup>
4
7,4·10<sup>10</sup>
9,8·10<sup>9</sup>
8,0·10<sup>10</sup>
1,2·10<sup>8</sup>
5
2,6·10<sup>10</sup>
1,0·10<sup>10</sup>
1,8·10<sup>11</sup>
3,3·10<sup>8</sup>
Без добавок
6.0·10<sup>9</sup>
3,0·10<sup>9</sup>
2,6·10<sup>10</sup>
не хранится
Универсальность изобретения состоит в том, что при любом значении исходного титра жизнеспособных спор мы имеем эффект сохранения жизнеспособности спор за счет введения полифункциональной добавки, который проявляется в более высоком показателе КОЕ/г в результате хранения.
Таблица 2
Изменение титра образцов паст при хранении.
Композиция
Титр жизнеспособных спор в результате хранения
1 неделя КОЕ/г, ·10<sup>12</sup>
1 месяц КОЕ/г, ·10<sup>12</sup>
2 месяца КОЕ/г, ·10<sup>10</sup>
4 месяца КОЕ/г, ·10<sup>8</sup>
Примеры 1-2 описания:
ЛПФ
20,0±2,8
16,3±0,2
8,5±0,5
4,3±0,1
ВПФ
25,0±0,6
12,6±0,4
3,3±0,3
2,0±0,2
Добавка Твин-80
35,0±0,2
6,3±2,2
2,0±0,2
Не хранится
Контроль (без добавок)
22,5±1,4
8,6±2,5
0,2±0,1
Не хранится
Пример 3. Запредельные параметры полифункциональной добавки приводили к ухудшению препарата (табл.3). При этом оптимальное соотношение концентрата культуральной жидкости к полифункциональной добавке на основе приведенных в таблице 3 и в примерах 1-2 концентраций отдельных компонентов в пересчете стандартными методами составляет 1: 1,2-1,9 соответственно. Это вытекает из известного уровня техники при пересчете процентов в пропорции.
Предлагаемый способ получения энтомопатогенного препарата путем глубинного культивирования гриба Verticillium lecanii при внесении полифункциональной добавки в процессе получения пасты (по сравнению с глицерином и полиэтиленоксидом по прототипу) обладает преимуществом: более высокая биологическая эффективность биопрепарата и жизнеспособность инфекционных единиц в процессе хранения за счет сбалансированного состава препаративной формы.
Источники информации
1. Вертициллин зерновой ТУ 10.01.28-89.
2. Вертициллин-К ТУ 10.01:29-89.
3. Боверин-концентрат Ж ТУ 10.01.26-88.
4. Патент RU 2035144. Третьяков В.П. Способ получения энтомопатогенного препарата от 22.01.1993.
5. Леднев Г.Р., Борисов Б.А., Митина Г.В. Возбудители микозов насекомых, СПб, 2003.
6. Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, Москва-С.Петербург, РАСХН отд. защиты растений. 2001.
7. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов 2002 года. Приложение 7 (Пищевые добавки, не оказывающие вредного воздействия на здоровье человека при использовании для изготовления пищевых продуктов (с изменениями от 15 апреля 2003 г.).