Способ профилактики и снижения инсулинорезистентности у лабораторных животных
METHOD OF PREVENTING AND REDUCING INSULIN RESISTANCE IN LABORATORY ANIMALS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной эндокринологии, кардиологии и может быть использовано для профилактики и снижения инсулинорезистентности с использованием тритерпеноида растительного происхождения.
Предложен способ снижения и профилактики инсулинорезистентности с использованием тритерпеноида растительного происхождения 3-b-метокси-D 18-олеанена в комплексе с раствором нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% - линолевой кислот. Изобретение обеспечивает ограничение отрицательных эффектов инсулинорезистентности.
Под инсулинорезистентностью (ИР) понимают снижение биологического ответа к одному или нескольким эффектам действия инсулина. Однако чаще инсулинорезистентность определяют как состояние, которое сопровождается сниженным поглощением глюкозы тканями организма под влиянием инсулина, т.е. резистентностью клеток различных органов и тканей к сахароснижающему действию инсулина.
Инсулинорезистентность сочетается с рядом метаболических или сосудистых заболеваний. Одним из таких заболеваний является метаболический синдром, описанный G.M. Reaven (1988). Метаболический синдром характеризуется наличием центрального или андроидного типа ожирения, гиперинсулинемией, нарушенной толерантностью к глюкозе или сахарным диабетом (СД) 2 типа, гипертензией, дислипидемией и гиперурикемией. Метаболический синдром, как и СД 2 типа, четко сочетается с ускоренным развитием атеросклероза и сердечнососудистых поражений, которые являются основной причиной снижения качества жизни, ранней инвалидизации и летальности. Инсулинорезистентность встречается не только при СД 2 типа, но и при других заболеваниях, сопровождающихся нарушениями обмена веществ. Инсулинорезистентность встречается более чем в 25% у практически здоровых лиц без ожирения, степень выраженности которой сопоставима с инсулинорезистентностью, наблюдаемой у больных СД 2 типа [1]. Распространенность инсулинорезистентности у больных с нарушением толерантности к глюкозе, СД 2 типа, с дислипидемией, гиперурикемией и гипертензией встречается при СД 2 типа у 83,9% больных; при нарушенной толерантности к глюкозе - у 65,9%; при гиперхолестеринемии - у 53,5%; при гипертриглицеридемии - 84,2%; при снижении липопротеидов высокой плотности - 88,1% и при гипертонии - у 58% больных.
Согласно результатам отечественных и зарубежных авторов, риск сердечнососудистых заболеваний (ССЗ) значительно увеличивается при наличии ИР [2]. Многие физиологические состояния предрасполагают к ИР: пожилой возраст, беременность, ночной сон, гиподинамия [3, 4]. Физические нагрузки в тренировочном режиме в сочетании с рациональной диетой способствуют улучшению обмена глюкозы и липидов, повышению чувствительности тканей к инсулину [5]. Однако чаще ИР вызывают патологические состояния: генетические дефекты, избыточная масса тела, артериальная гипертензия (АГ), дислипидемия.
По данным многих авторов, значительную роль в развитии ИР играет ожирение. Согласно существующим представлениям, более частое возникновение ИР при абдоминальном типе ожирения определяется морфофункциональными особенностями висцеральной жировой ткани [6]. Установлено, что интраабдоминальные адипоциты имеют большую плотность β-адренорецепторов, кортикостероидных и андрогенных рецепторов и относительно меньшую плотность α-2-адренорецепторов и рецепторов к инсулину [7]. Это определяет высокую чувствительность висцеральной жировой ткани к липолитическому действию катехоламинов и низкую - к антилиполитическому действию инсулина. Интенсивный липолиз в интраабдоминальных адипоцитах приводит к высвобождению большого количества свободных жирных кислот, которые поступают по воротной вене в печень, а затем в системный кровоток. Печень подвергается мощному и постоянному воздействию свободных жирных кислот, что способствует целому ряду метаболических нарушений с последующим развитием ИР и системной гиперинсулинемией (ГИ) [8]. По мнению ряда авторов, роль абдоминального ожирения в развитии ИР определяется изменением метаболизма висцеральной жировой ткани, в результате которого повышается уровень факторов, усугубляющих ИР (лептин; резистин; фактор некроза опухоли-α (ФНОα); интерлейкин 6 (ИЛ6); адипсин; белок, стимулирующий ацетилирование; ингибитор 1го типа активатора плазминогена; ангиотензиноген; висфатин; апелин) и снижается уровень факторов, препятствующих ее развитию (адипонектин) [9, 10].
ИР имеет основополагающее значение в формировании артериальной гипертензии, которая зачастую является ее первым клиническим проявлением. В условиях ИР происходит повышение тонуса сосудов и замедление вазодилатации за счет электролитных нарушений, инактивация NO свободными радикалами с последующей выработкой вазоконстрикторных простагландинов, молекул адгезии эндотелия, и факторов роста тромбоцитов [11, 12]. При длительном существовании ИР происходит повышение тонуса симпатической нервной системы (СНС). Это обусловлено увеличенным поглощением и обменом глюкозы в инсулинчувствительных клетках вентромедиального гипоталамуса с последующим растормаживанием симпатических центров ствола головного мозга и повышением активности центральной СНС [13, 14]. К усилению данного процесса приводит снижение тормозящих воздействий с барорецепторов крупных сосудов шеи, эластичность которых изменяется под воздействием ГИ. Центральная гиперсимпатикотония изменяет обмен норадреналина в периферических окончаниях СНС и приводит к выраженной тканевой гиперсимпатикотонии. Симпатическая стимуляция сердца, сосудов, почек ведет к повышению артериального давления (АД). Повышение симпатической активности в скелетной мускулатуре вызывает уменьшение капиллярной сети мышц и количества, медленно сокращающихся мышечных волокон, определяющих уровень чувствительности организма к инсулину, и усугубляет имеющуюся ИР [15]. Доказано, что ГИ увеличивает риск ишемической болезни сердца (ИБС) [13]. Это обусловлено влиянием избытка инсулина на митогенез: происходит сенсибилизация клеток гладкой мускулатуры, эндотелия сосудов к митогенному влиянию различных ростовых факторов [1], что способствует атерогенезу. Доказано, что уровень инсулина крови влияет на все компоненты атеросклеротической бляшки (липидное ядро, коллаген, пенистые макрофаги, гладкомышечные клетки) путем воздействия на липогенные ферменты, стимулирования пролиферации клеток и увеличения синтеза эндогенного холестерола и триглицеридов [16]. Кроме того, инсулин способен усиливать синтез инсулиноподобный фактор роста 1 (ИПФР1), повышать уровень фибриногена крови, увеличивать активность тканевого активатора плазминогена 1го типа [17]. Последствия этих влияний наглядно продемонстрированы в исследовании IRAS в виде утолщения стенки сонной артерии на 30 микрон при повышении индекса ИР на 1 единицу [18]. Так, по данным Фрамингеймского и проспективного Парижского исследований [19], повышенная концентрация инсулина является независимым фактором риска атеросклероза и предрасполагает к развитию инсулинзависимого сахарного диабета (ИНЗСД), АГ, ИБС [6]. Роль ГИ в развитии ССЗ наглядно продемонстрирована и в Квебекском исследовании: у пациентов с ИБС уровень инсулина натощак был на 18% выше, чем в контрольной группе. При этом распространенность ИБС не зависела ни от систолического АД, ни от лекарственной терапии, ни от отягощенной по ИБС наследственности [20]. Исследования, посвященные ИР, свидетельствуют, что ее появление опережает по времени развитие ГИ и может протекать без каких-либо клинических проявлений [21].
Профилактика и снижение инсулинорезистентности, а в последствие и сахарного диабета, метаболического синдрома, атеросклероза, являющегося непосредственной причиной ишемической болезни сердца и цереброваскулярных заболеваний, предполагает значительную экономию государственных средств. Как показывает мировой и отечественный опыт, затраты на профилактические мероприятия несопоставимы с теми потерями, которые несет бюджет из-за снижения работоспособности, ухудшения здоровья и повышения заболеваемости.
Исследованиями последних лет показано, что инсулинорезистентность и недостаточность инсулина при сахарном диабете, артериальной гипертонии, ИБС повышают интенсивность перекисного окисления липидов, что сопровождается относительным или абсолютным снижением активности системы антиоксидантной защиты [22]. Вместе с тем, в настоящее время комплекс исследований, направленных на поиск способов немедикаментозной профилактики и/или снижения инсулинорезистентности ориентирован на изменения образа жизни (правильное питание, физические упражнения), что не всегда оказывается эффективным. По этой причине актуальным представляется применение с целью лечения и профилактики инсулинорезистентности соединений, обладающих способностью снижать интенсивность процессов перекисного окисления липидов [23], обладающих антидиабетической активностью, характеризующихся наряду с гипогликемическим эффектом низкой токсичностью.
В этом отношении обращают на себя внимание тритерпеноиды, обладающие выраженной антиоксидантной активностью, что особенно важно, исходя из представлений о роли активных форм кислорода и продуктов перекисного окисления липидов в механизмах развития инсулинорезистентности [24].
Тритерпеноиды считают наиболее распространенными представителями класса терпеноидов. Они широко распространены в растительном мире и нередко встречаются в продуктах животного происхождения. Тритерпеноиды содержат 30 атомов углерода; их молекулы построены из шести изопреновых фрагментов. Это нелетучие жидкости или воскоподобные вещества. Извлекаются из растительного сырья неполярными растворителями и присутствуют в конкретах. Большинство тритерпеноидов имеют пентациклическую структуру. Пентациклические тритерпеноиды, включающие олеанановую, урсановую и лупановую группы, широко распространены в лекарственных растениях видов Glycyrrhiza, Gymnema, Centella asiatica, Camellia sinensis, Crataegus и Olea europaea, которые обычно используется в народной медицине. Биологически активные пентациклических тритерпеноиды, такие как олеаноловая кислота, глицирризин, глицирретиновая кислота, урсоловая кислота, бетулин, бетулиновая кислота и лупеол, оказывают влияние на метаболизм глюкозы, секрецию инсулина, диабетическую сосудистую дисфункцию, ретинопатию и нефропатию. Универсальность пентациклических тритерпенов обеспечивает перспективный подход к лечению сахарного диабета.
К числу тритерпеноидов, нашедших практическое применение в медицине, относится и милиацин, входящий в состав просяного масла [25], используемого для лечения трофических язв, инфицированных ран и некоторых других заболеваний [26]. Милиацин стимулирует факторы неспецифической защиты и предотвращает их выраженную депрессию в условиях токсического поражения организма тетрахлорметаном [27], вызывает гиперцеллюлярность лимфоидных органов, стимулирует иммунный ответ [28], обладает антиоксидантной [29], мембранопротекторной [30] и антиапоптотической [31] активностью, демонстрирует способность регулировать экспрессию генов, контролирующих редокс-баланс клетки [32], предотвращает структурно-функциональные нарушения органов иммуногенеза и печени при действии ксенобиотика [33; 34; 35], снижает системную патологическую эндотоксинемию при бактериальной инфекции [36; 37], повышая выживаемость зараженных животных и уменьшая выраженность гипоплазии центральных органов иммуногенеза: тимуса и красного костного мозга.
Экпериментально показано, что милиацин обладает широким спектром биологической активности, в том числе, связанной с его способностью предотвращать окислительный стресс, при этом сам тритерпеноид не изменяет редокс-баланс, но протектирует его нарушения в условиях индукции окислительного стресса.
В этой связи закономерным является интерес к исследованию способа снижения инсулинорезистентности у лабораторных животных (крыс линии Wistar) основанный на методике, включающей использование растительного тритерпеноида милиацина в комплексе с раствором нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% - линолевой кислот.
Индуцирование инсулинорезистентности у лабораторных животных достигается использованием диеты повышенной калорийности за счет увеличения содержания в диете липидов в соответствии с рекомендациями R. Buettner [38] и Takahashi и соавт. [39]. Погрешности в диете, а именно превышение ее калорийности над реальными энергозатратами, являются наиболее частой причиной развития инсулинорезистентности. Поэтому заявляемая методика является наиболее приближенной к клинической практике в медицине.
Изучение способов борьбы с инсулинорезистентностью занимает важное место в экспериментальной эндокринологии.
Уровень техники.
В литературе описан «Способ коррекции инсулинорезистентности при метаболическом синдроме» (Патент на изобретение РФ № 2402326. «Способ коррекции инсулинорезистентности при метаболическом синдроме». Авторы: Иванов Е.М., Юбицкая Н.С., Антонюк М.В. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2010 г.) [40]. Он заключается в том, что лицам, с компонентами метаболического синдрома вводят крусмарин. Это средство, полученное из гепатопанкреаса камчатского краба, содержит ПНЖК (полиненасыщенные жирные кислоты) омега-3 и АДГ (антидиуретический гормон) (Патент РФ на изобретение № 2302248. «Средство, обладающее липидкорригирующими, гипокоагуляционными и антиоксидантными свойствами». Авторы: Касьянов С.П., Новгородцева Т.П., Бочаров Л.Н., Акулин В.Н., Блинов Ю.Г., Якуш Е.В., Виткина Т.И., Янькова В.И. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 июля 2007 г.) [41]. Введение крусмарина обеспечивает эффективную коррекцию инсулинорезистентности и отсутствие побочных эффектов у больных с метаболическим синдромом за счет нормализующего синергетического действия омега-3 жирных кислот и алкилдиглицеридов на нормализацию уровня глюкозы крови. Недостатком данного способа является большой перечень противопоказаний: аллергические реакции на компоненты препарата; непереносимость рыбьего жира; хронический панкреатит в стадии обострения, хронический холецистит в стадии обострения. Существенным недостатком способа является дороговизна сырья для получения крусмарина (средняя стоимость камчатского краба - от 2000 до 6000 рублей за килограмм), также технология выделения крусмарина из гепатопанкреаса камчатского краба требует значительных экономических затрат.
Известен «Способ профилактики инсулинорезистентности у мужчин с частичным возрастным андрогенным дефицитом (padam)» (Патент РФ на изобретение № 2236173. «Способ профилактики инсулинорезистентности у мужчин с частичным возрастным андрогенным дефицитом (padam)». Авторы: Великанова Л.И., Карпищенко А.И., Мазуров В.И., Печерский А.В., Семиглазов В.Ф. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 сентября 2004 г.) [42], основанный на снижении у мужчин с частичным возрастным андрогенным дефицитом (PADAM) уровней соматотропного гормона (СТГ), инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1), адренокортикотропного гормона (АКТГ), кортизола, инсулина, глюкозы в плазме крови натощак, в восстановлении импульсного режима секреции СТГ, АКТГ, кортизола, инсулина, получаемом при назначении одного из препаратов тестостерона с индивидуальным подбором дозы до нормализации уровней лютеинизирующего гормона (ЛГ), общего тестостерона, свободного тестостерона, биологически доступного тестостерона, глобулина, связывающего половые гормоны, индекса свободных андрогенов, 5-дигидротестостерона, 17-эстрадиола, восстановления импульсной секреции ЛГ и общего тестостерона. Недостатком является использование данного способа только для мужчин с частичным возрастным андрогенным дефицитом (PADAM). Существенным недостатком данного способа является широкий перечень противопоказаний к применению препарата тестостерона: повышенная чувствительность к тестостерону, карцинома предстательной или молочной железы, нефрит, гиперкальциемия, отеки, нарушение функции печени и почек, сахарный диабет, гипертрофия предстательной железы с нарушениями мочеиспускания, сердечная недостаточность, инфаркт миокарда в анамнезе, атеросклероз у мужчин пожилого возраста. К недостаткам способа также можно отнести и побочные эффекты, вызванные применением тестостерона: рак предстательной железы, повышенное половое возбуждение, приапизм, олигоспермия, снижение объема эякулята, задержка натрия и воды, преждевременное закрытие зон роста костей, головная боль, депрессия, тревожность, нарушение сна, парестезии, желудочно-кишечные кровотечения, тошнота, холестатическая желтуха, андрогенные эффекты (гирсутизм, себорея, акне и др.).
Прототипом
предложенного способа является использование тритерпеноидного соединения для лечения диабета (Патент USA № 5691386. «Triterpenoid compound for the treatment of diabetes». Inman [et al.]. 25.11.1997.). Сущность способа заключается в применение тритерпеноида 3-[5,30-дигидрокси-20(29)-ен-2-она], проявляющего гипогликемическую и антидиабетическую активность в качестве средства для лечения диабета 1 и/или 2 типов. [23]. Способ осуществляется путем введения в организм лабораторных животных (NOD (non-obese diabetic mouse)) и больных с сахарным диабетом 1 и 2 типа тритерпеноида 3-[5,30-дигидрокси-20(29)-ен-2-она], что приводит в итоге к нормализации уровня глюкозы крови на фоне снижения массы тела. Тритерпеноид 3-[5,30-дигидрокси-20(29)-ен-2-она], содержится в растениях рода Salacia, а именно Salacia Reticulata, произрастающих в Индии и Шри-Ланке. Salacia R. применяется в традиционной и альтернативной медицине при лечении сахарного диабета I и II типов. Salacia R. широко изучалась в отношении гипогликемических эффектов на моделях животных и человека.
На наш взгляд существенным недостатком способа является использование соединения для лечения диабета, а не его профилактики, то есть не предусматривает комплекс процедур, направленных на профилактику и снижение инсулинорезистентности. Недостатком способа также является ограниченная доступность сырья для получения тритерпеноида, связанная с зоной произрастания (Индии и Шри-Ланка), дороговизна.
Раскрытие сущности изобретения
Задача изобретения.
Разработать доступный, наиболее приближенный к клинической практике, легко реализуемый способ снижения и профилактики инсулинорезистентности лабораторных животных (крыс линии Wistar) на фоне диеты повышенной калорийности в эксперименте, основанный на методике, включающей использование растительного тритерпеноида милиацина в комплексе с раствором нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% - линолевой кислот.
Новизной изобретения
является то, что впервые с целью снижения и профилактики инсулинорезистентности и уменьшения гиперинсулинемии на фоне повышения калорийности рациона питания применяется перорально милиацин в дозе 2 мг/кг массы тела животного в комплексе с 25 мкл раствора нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% - линолевой кислот.
Раскрытие изобретения
состоит в том, чтопрофилактика и снижение инсулинорезистентности достигается за счет использования 3-b-метокси-D-18-олеанена (милиацина), который относится к группе природных циклических тритерпеноидов, содержится в просяном масле. Милиацин обладает хорошей переносимостью в диапазоне доз от 2 до 1000 мг/кг. ЛД50 (концентрация вещества, вызывающего гибель 50% испытуемых животных) этого соединения больше 1000 мг/кг, что свидетельствует об отсутствии у него токсических свойств. Применение милиацина для профилактики и снижения инсулинорезистентности в эксперименте представляется эффективным даже на фоне диеты повышенной калорийности за счет липидов. Заявляемая методика является наиболее приближенной к клинической практике в медицине.
Химическая структура пентациклического тритерпеноида-милиацина (3-β-метокси-Δ18-олеанена) представлена на фигуре 1.
Технический результат
, обеспечиваемый изобретением, заключается в том, что животным, с экспериментально вызванной инсулинорезистентностью [38, 39], вводят перорально тритерпеноид растительного происхождения 3-b-метокси-D 18 -олеанен (милиацин) в дозе 2 мг/кг массы в комплексе с 25 мкл раствора нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% - линолевой кислот.
На фигуре 2 обозначены достоверные различия концентрации глюкозы крови и инсулина при потреблении милиацина. Установлено, что крысы контрольной группы характеризовались физиологическими уровнями глюкозы и инсулина. Введение милиацина per os приводило к достоверному снижению уровня глюкозы и инсулина на 10 и 51%, соответственно. Введение в рацион животных насыщенных липидов приводило к гипергликемии и гиперинсулинемии, что выражалось в повышении концентрация глюкозы и инсулина в сыворотке крови в группе крыс, содержащихся на диете с повышенной калорийностью. Повышение по исследуемым показателям составило 60 и 55%, в сравнении с контролем. Сравнение концентраций глюкозы и инсулина в группах крыс, получавших насыщенные липиды дополнительно к стандартному рациону, и группой животных, получавших миллиацин, показало достоверное повышение уровней исследуемых показателей в группе крыс, получавших диету повышенной калорийности. Повышение составляло 75% и 135%, соответственно для глюкозы и инсулина. В группе крыс, получавших миллиацин в сочетании с диетой повышенной калорийности, уровень глюкозы и инсулина в сыворотке крови не имел достоверных различий с показателями контрольной группы и группы крыс, получавших миллиацин. Вместе с тем, концентрация глюкозы и инсулина для животных этой группы была, в среднем, на 30% ниже, чем в группе крыс, получавших насыщенные липиды.
В итоге, индекс инсулинорезистентности HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance) в группе животных, получавших милиацин был в 1,7 ниже, чем в контрольной группе; в группе крыс, содержавшихся на диете повышенной калорийности, был в 2,5 выше, чем в контрольной группе; для животных, сочетано с диетой повышенной калорийности получавших милиацин, был в 1,2 раза выше, чем в контрольной группе (для этой группы различия не носили достоверного характера). Сравнения HOMA-IR для групп «диета повышенной калорийности» и «диета повышенной калорийности и милиацин» показали, что потребление милиацина в сочетании с насыщенными липидами приводило к достоверному снижению индекса инсулинорезистентности в 2 раза.
На фигуре 3 представлены графические изображения достоверности различий (p<0,05) показателей теста на толерантность к глюкозе в сравниваемых группах. По гликемической кривой видно, что длительное потребление животными насыщенных жиров отражается на толерантности к глюкозе. Это обусловлено как более высокими значениями концентрации глюкозы натощак (114%)и к 30 минуте (134%) относительно контроля, а также более медленным возвращением ее к исходному уровню на 60 (138%) и 90 (132%) минутах опыта.
Отмечен более низкий уровень глюкозы на протяжении всего теста у животных, регулярно употреблявших милиацин, относительно контрольной группы, но при этом находящихся в пределах нормальных значений.
Глюкозотолерантный тест показал более низкий уровень глюкозы крови у животных, диета которых включала потребление жиров в сочетании с ежедневной дозой милиацина. Так у крыс данной группы концентрация глюкозы достоверно снижалась натощак на 37%, на 30 минуте на 48%, 60 - 42%, 90 - 46%, 120 - 38% по сравнению с животными, получавшими только насыщенные липиды.
На фигуре 4 представлены достоверные различия площади AUC под ROC кривой (area under ROC (receiver operating characteristic) curve) в сравниваемых группах.
Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемый способ снижает инсулинорезистентность.
Способ осуществляется следующим образом: экспериментальных животных, самцов крыс линии Wistar (филиал питомника «Столбовая», Московская обл., п. Столбовая), в количестве 180 особей начальной массой 170 гр., содержали в стандартных пластмассовых клетках при комнатной температуре с соблюдением циклов день/ночь в соотношении 12/12 часов. Крысы находились на стандартном рационе питания (сбалансированный гранулированный корм «ProCorm» (калорийность - 2500 ккал/кг) компании Biopro г. Новосибирск) со свободным доступом к пище и воде.
Животные были разбиты на 4 группы: I - контрольная группа; II - группа животных, которые в течение эксперимента потребляли милиацин; III - группа животных, содержащаяся на диете повышенной калорийности (ДПК); IV - группа животных, дополнительно к диете повышенной калорийности получающая милиацин. Тритерпеноид растительного происхождения 3-b-метокси-D 18 -олеанен (милиацин) был получен по стандартной методике. [27] Каждая крыса в I и III группах получала ежедневно к стандартному рациону по 25 мкл раствора нейтральных жиров (2,25 ккал), используемого в качестве растворителя милиацина у животных II и IV экспериментальных групп. Энергетическая ценность потребляемого за сутки корма каждой крысой - 25-35 г - составляла 62,5-87,5 ккал. Количество корма и воды ежедневно регистрировалось.
Первая группа являлась контрольной, животные содержались на стандартной диете. Животным второй группы вводили перорально тритерпеноид растительного происхождения 3-b-метокси-D 18-олеанена (милиацин) в дозе 2 мг/кг массы в комплексе с 25 мкл раствора нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% - линолевой кислот, натощак. Животные третьей группы, с целью создания у них инсулинорезистентности, получали сливочный маргарин, содержащий насыщенные жирные кислоты: 15% по массе пальмитиновой и 14% - стеариновой кислот (далее насыщенные липиды). Количество маргарина подбиралось таким образом, чтобы увеличение суточной калорийности рациона составило примерно 9 - 10 %, по сравнению с стандартным рационом. Таким образом, масса маргарина, скармливаемая экспериментальным животным в начале опыта, составляла 1,0 грамм (7,63 ккал/г). По мере увеличения массы животных, связанной с их естественным ростом, количество добавляемого продукта пропорционально увеличивалось, причем таким образом, чтобы доля дополнительного введения жира обеспечивала 10% калорийности общего рациона. Животные четвертой группы получали маргарин одновременно с милиацином в дозе 2 мг/кг массы в комплексе с 25 мкл раствора нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% - линолевой кислот, натощак. Общая продолжительность опыта составляла 4 недели.
За неделю до окончания эксперимента у животных проводили глюкозотолерантный тест (ГТТ) и определяли концентрацию глюкозы в крови. Для этого животные получали per os углевод в виде 20% раствора глюкозы из расчета 2 г/кг массы тела. Концентрацию глюкозы определяли в цельной крови с использованием глюкометра Accu Chek Performa. По ходу хвостовой вены ланцетами делали прокол, подносили прибор с вставленной тест-полоской, глюкометр автоматически отбирал 1,5 мкл крови и на дисплее отображал концентрацию глюкозы. При этом оценивался исходный уровень глюкозы (0 мин.), а затем через 30, 60, 90 и 120 минут [43].
Использование насыщенных жиров для развития инсулинорезистентности наиболее точно позволяет воспроизвести модель ожирения в клинической картине развития метаболического синдрома в медицине.
Эксперимент проведен в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, которые отражены в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей» (Страсбург, 1985). Эвтаназию животных осуществляли путем декапитации, после чего собирали кровь в вакуумные пробирки VenoSafe (Бельгия) с активатором свертывания (кремниевое напыление). Для получения сыворотки пробирку со свернувшейся кровью помещали в центрифугу «ЕВА 200» и центрифугировали 15 минут при 2400 об/мин. Затем с помощью дозатора забирали сыворотку для дальнейшего биохимического исследования (определения концентрации глюкозы, инсулина).
Оценка эффективности способа профилактики и снижения инсулинорезистентности проводилась на основе измерения концентрации глюкозы в смешанной крови натощак, уровень инсулина в сыворотке крови натощак с последующим расчетом индекса HOMA-IR [44] рассчитывали по формуле: [глюкоза, натощак, ммоль/л] х [инсулин, натощак, мкЕд/мл]/22.5, а также построением кривой, отражающей глюкозотолерантный тест, для количественной интерпретации ROC-кривой (Receiver Operator Characteristic) был взят показатель AUC (area under ROC curve - площадь под ROC-кривой), который основан на измерении площади под гликемической кривой относительно исходного уровня.
Результаты проведенных исследований обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета программ для ПК Microsoft Excel 7.0, STATISTICA 13.0, включая методы параметрического анализа (критерий Стьюдента). Для выделения значимых коэффициентов корреляции был выбран уровень значимости, принятый для медико-биологических исследований (р < 0,05).
Примеры использования способа
Пример 1. Животные получали перорально тритерпеноид растительного происхождения 3-b-метокси-D 18 -олеанена (милиацин) в дозе 2 мг/кг массы в комплексе с 25 мкл раствора нейтральных жиров триацилглицеринов, содержащих 32% по массе олеиновой и 59% - линолевой кислот, натощак. Введение милиацина per os приводило к достоверному снижению уровня глюкозы и инсулина на 10 и 51%, соответственно, снижению индекса инсулинорезистентности HOMA-IR в 1,7 ниже, чем в контроле. Глюкозотолерантный тест показал более низкий уровень глюкозы крови на протяжении всего теста у животных, регулярно употреблявших милиацин, относительно контрольной группы, но при этом находящихся в пределах нормальных значений.
Пример 2. Животные получали тритерпеноид растительного происхождения 3-b-метокси-D18-олеанен в дозе 2 мг/кг массы тела в комплексе с 25 мкл раствора нейтральных жиров триацилглицеринов, одновременно с насыщенными липидами (в виде маргарина). По окончанию 4 недельного опыта, в группе крыс, получавших милиацин в сочетании с диетой повышенной калорийности, уровень глюкозы и инсулина в сыворотке крови не имел достоверных различий с показателями контрольной группы и группы крыс, получавших милиацин. Вместе с тем, концентрация глюкозы и инсулина для животных этой группы была, в среднем, на 30% ниже, чем в группе крыс, получавших насыщенные липиды. Сравнения HOMA-IR для групп «диета повышенной калорийности» и «диета повышенной калорийности и милиацин» показали, что потребление милиацина в сочетании с насыщенными липидами приводило к достоверному снижению индекса инсулинорезистентности в 2 раза. Глюкозотолерантный тест показал более низкий уровень глюкозы крови у животных, диета которых включала потребление жиров в сочетании с ежедневной дозой милиацина. Так у крыс данной группы концентрация глюкозы достоверно снижалась натощак на 37%, на 30 минуте на 48%, 60 - 42%, 90 - 46%, 120 - 38% по сравнению с животными, получавшими только насыщенные липиды.
Литература, принятая во внимание:
1. Reaven, G. M. Role of insulin resistance in human disease / G. M. Reaven // Diabetes. - 1998. - Vol. 37. - P.1595-1607.
2. Fontbonne, A. Insulinresistance syndrome and cardiovascular complications of non-insulin-dependent diabetes mellitus / A. Fontbonne // Diabetes & Metabolism. - 1996. - Vol. 22, № 5. - P. 305.
3. Балаболкин, М.И., Дедов, И.И. Генетические аспекты сахарного диабета / М.И. Балаболкин, И.И. Дедов // Сахарный диабет. - 2000. - № 1. - С. 18-20.
4. Клебанова, Е.М. Инсулинорезистентность: ее роль в патогенезе СД 2 типа и возможности коррекции / Е.М. Клебанова // Лечащий врач. - 2005. - № 5. - С. 16-20.
5. Effect of physical training and diet therapy on carbohydrate metabolism in patients with glucose intolerance and NIDD mellitus /C. Bogardus [et al.] // Diabetes. - 1984. - Vol. 33. - P. 311-315.
6. Лупанов, В.П. Ожирение как фактор риска сердечно-сосудистых катастроф / В.П. Лупанов // РМЖ. - 2003. - Т. 11, № 6. - С. 19.
7. Бутрова, С.А. Метаболический синдром: патогенез, клиника, диагностика, подходы к лечению / С.А. Бутрова // Российский медицинский журнал. - 2001. - № 2. - С. 21.
8. Митченко, В.И. Эволюция метаболического синдрома / В.И. Митченко // Здоровье Украины. - 2006. - № 22/1. - С. 3.
9. Демидова, Т.Ю. Ожирение и инсулинорезистентность / Т.Ю. Демидова // Трудный пациент. - 2006. - № 7. - С. 34.
10. Дедов, И.И., Балаболкин, М.И. Инсулиновая резистентность в патогенезе сахарного диабета типа 2 и медикаментозная возможность ее преодоления / И.И. Дедов, М.И. Балаболкин // Врач. - 2006. - № 11. - С. 20-23.
11. Harrison, D.G. Endothelial function and oxidant stress / D.G. Harrison // Clin. Cardial. - 1997. - Vol. 20. - P. 11-17.
12. Reaven, G.M. Role of insulinresistence in human disease: an expanded definition / G.M. Reaven // Annual review of Medicine. - 1993. - Vol. 44. - P. 121-131.
13. Зимин, Ю.В. Происхождение, диагностическая концепция и клиническое значение синдрома инсулинорезистентности или метаболического синдрома / Ю.В. Зимин // Кардиология. - 1998. - № 6. - С. 71-81.
14. Relationship of clinical diabetes and asymptomatic hyperglycaemia to risk of cor - onary heart disease mortality in men and women / W.H. Pan [et al.] // Am. J. Epidemiol. - 1986. - Vol. 123. - P. 504-516.
15. Diabetes, other risk factors and 12-yr cardiovascular mortality for men screened in the Multiple Risk Factor Intervention Trial / J. Stamler [et al.] // Diabetes Care. - 1993. - Vol. 16. - P. 434-444.
16. The insulin resistance syndrome and coronary artery disease / M. Kendall [et al.]// Coron. Artery Dis. - 2003. - Vol. 14, № 4. - P.335-348.
17. Metabolic syndrome is associated with extension of coronary artery disease in patients with non-ST segment elevation acute coronary syndromes / M.B. Yilmaz [et al.] // Coron. Artery Dis. - 2005. - Vol. 100. - P. 561-562.
18. Insulin sensitivity in subjects with type 2 diabetes: relationship to cardiovascular risk factors: the Insulin Resistance Atherosclerosis Study / S.M. Haffner [et al.]  // Diabetes Care. - 1999. - Vol. 22. - P. 562-568.
19. Hyperinsulinemia as a predictor of coronary heart disease mortality in a healthy population. The Paris Prospective Study? 15-year follow up / A. Fontbonne [et al.] // Diabetologia. - 1991. - Vol. 34. - P. 356-361.
20. Hyperinsulinemia as an independent risk factor of ischemic disease / J.P. Despres [et al.] // N. Engl. J. Med. - 1996. - Vol. 334. - Р. 952-957.
21. Общность патогенетических механизмов ишемической болезни сердца и инсулиннезависимого сахарного диабета, профилактика, лечение / Я.В. Благосклонная, В.А. Алмазов, Е.И. Красильникова // Кардиология. - 1996. - № 5. - С. 35-39.
22. Клебанова, Е.М. Функциональная активность \Nb-клеток, инсулинорезистентность, перекисное оксиление липидов, и состояние системы антиоксидантной защиты у больных сахарным диабетом типа 2: дисс. канд. мед.наук: 14.00.03 / Елена Михайловна Клебанова; Москва, Эндокрин. науч. центр РАМН. - М., 2004. - 105 с.
23. Патент USA № 5691386. «Triterpenoid compound for the treatment of diabetes». Inman [et al.]. 25.11.1997.
24. Активность антиоксидантной системы в плазме крови при сахарном диабете II типа / О.Е. Акбашева [и др.] // Молодой ученый. - 2018. - №35. - С. 21-22. - URL https://moluch.ru/archive/221/52468/ (дата обращения: 07.11.2019 г.).
25. Химическая природа и биологическая активность милиацина / Л.Е. Олифсон [и др.] // Вопросы питания, 1991. - № 2. - С. 37-59.
26. Нузов, Б.Г. Пути улучшения результатов лечения острого тромбофлебита поверхностных вен нижних конечностей / Б.Г. Нузов, А.А. Стадников, В.И. Бородин // Анн. травм. и ортопедии, 2001. - № 2. - С. 50-51.
18
4
27. Павлова, М.М. Изучение влияния активного стероида проса 3-β-метокси-Δ- олеанена при токсическом поражении печени CCl в эксперименте / М.М. Павлова // Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Оренбург, 1984. - 21 с.
28. Патент на изобретение РФ № 2244548. «Средство, повышающее иммуногенные свойства столбнячного анатоксина». Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В., Медведева И.П., Борисов С.Д., Фролов Б.А. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 января 2005 г.
29. Панфилова, Т.В. Тритерпеноид милиацин снижает индуцированное стрессом ПОЛ / Т.В. Панфилова, А.А. Штиль, Б.А. Фролов // Бюлл. экспер. биол. и мед., 2006. - Т. 141. - № 6. - С. 633-635.
30. Патент РФ на изобретение № 1043860. «Средство, стабилизирующее биологические мембраны. Чернов А.Н., Павлова М.М., Олифсон Л.Е., 1983.
31. Влияние тритерпеноида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки к апоптозу, индуцированному дексаметазоном / Т.В. Панфилова [и др.] // Бюлл. экспер. биол. и мед., 2003. - Т. 136. - № 10. - С. 382-385.
32. Природный тритерпеноид милиацин предотвращает вызванный метотрексатом окислительный стресс и нормализует экспрессию генов Syp 2e1 и глутатионредуктазы в печени / О.В. Калинина [и др.] // Патол. физиол. и экспер. терапия, 2013а. - № 1. - С. 70-74.
33. Железнова, А.Д. Экспериментальное обоснование применения милиацина для коррекции иммуносупрессии, индуцированной метотрексатом / А.Д. Железнова // Автореф. дисс. канд. мед. наук. - Пермь, 2010. - 22 с.
34. Калинина, О.В. Гепатопротеторная активность милиацина при метотрексат-индуцированном повреждении печени / О.В. Калинина // Автореф. дисс. канд. мед. наук. - М., 2013. - 24 с.
35. Преодоление гепатотоксичности метотрексата: роль тритерпеноидов / Б.А. Фролов [и др.] // Клин. Онкогематология, 2013а. - Т. 6. - № 1. - С. 1-10.
36. Патент на изобретение РФ №2564918. «Средство для снижения системной патологической эндотоксинемии». Смолягин А.И., Чайникова И.Н., Филиппова Ю.В., Панфилова Т.В., Железнова А.Д., Фролов Б.А. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 сентября 2015 г.
37. Защитный эффект милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции / Б.А. Фролов [и др.] // ЖМЭИ, 2013б. - № 6. - С. 3-8.
38. Defining high-fat-diet rat models: metabolic and molecular effects of different fat types / R. Buettner [et al.] // Journal of molecular endocrinology. - 2006. - Vol. 36. - №. 3. - P. 485-501.
39. Takahashi, Y. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis / Y. Takahashi, Y. Soejima, T. Fukusato // World J Gastroenterol. - 2012. - Т. 18. - №. 19. - С. 2300-2308.
40. Патент на изобретение РФ № 2402326. «Способ коррекции инсулинорезистентности при метаболическом синдроме». Иванов Е.М., Юбицкая Н.С., Антонюк М.В. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 октября 2010 г.
41. Патент РФ на изобретение № 2302248. «Средство, обладающее липидкорригирующими, гипокоагуляционными и антиоксидантными свойствами». Касьянов С.П., Новгородцева Т.П., Бочаров Л.Н., Акулин В.Н., Блинов Ю.Г., Якуш Е.В., Виткина Т.И., Янькова В.И. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 июля 2007 г.
42. Патент РФ на изобретение № 2236173. «Способ профилактики инсулинорезистентности у мужчин с частичным возрастным андрогенным дефицитом (padam)». Великанова Л.И., Карпищенко А.И., Мазуров В.И., Печерский А.В., Семиглазов В.Ф. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 20 сентября 2004 г.
43. Горячева, М.А., Макарова, М.Н. Особенности проведения глюкозотолерантного теста у мелких лабораторных грызунов (мыши и крысы) / М.А. Горячева, М.Н. Макарова // Международный вестник ветеринарии. 2016. № 3. С. 155-159.
44. Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man / D.R. Matthews [et al.] // Diabetologia. - 1985. - V. 28. №7. - P. 412-419.