От молекулярных моторов к молекулярным биомаркерам

УДК 547.963

Н. В. Кулева

ОТ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МОТОРОВ К МОЛЕКУЛЯРНЫМ БИОМАРКЕРАМ

Санкт-Петербургский университет, кафедра биохимии биолого-почвенного факультета

Но вот случилось что-то в головах — На школы перестали собираться.

Стал Петербургом город Ленинград,

А денег нет — движеньем заниматься.

Развитие молекулярной биологии на кафедре биохимии СПбГУ связано с исследованиями не только на уровне генов, но и белков. Первоначально объектом исследования был один из моторных белков — миозин.

Согласно современным представлениям, моторные белки (миозин, кинезин, динеин, РНК-полимераза, фактор элонгации О), являются механо-химическими преобразователями энергии. Так как активный центр, где осуществляется ферментативный гидролиз АТФ, механически связан с остальной частью молекулы, то события, происходящее в активном центре, могут вызывать структурные изменения в других частях молекулы. Такие изменения во время катализа, по-видимому, происходят во всех ферментах. Особенностью ферментов — моторных белков является то, что они могут усиливать и использовать эти циклические изменения структуры, чтобы двигаться вдоль «путей», построенных из нитей актина, или ДНК, или микротрубочек. В зависимости от стадии гидролиза АТФ (или ГТФ) структура белка находится в той или иной конформации, дающей ему возможность либо прочно связываться с «путями», либо диссоциировать от них. Анализ механизмов сопряжения химических изменений в активном центре с глобальными изменениями структуры молекулы позволяет понять, как работает молекулярный мотор [17, 30].

В 1963 г. на кафедре биохимии СПбГУ профессором Н. С. Пантелеевой, ученицей академика В. А. Энгельгардта, в 1939 г. открывшего способность миозина расщеплять АТФ, были начаты исследования механизма гидролиза АТФ миозином. Надежда Семеновна Пантелеева создала научный коллектив, выполнивший исследование 18О-обменных реакций, сопряженных с гидролизом АТФ миозином (Л. А. Ильин, Э. А. Карандашов, И. Е. Кра-совская, Н. В. Кулева, Е. Г. Скворцевич). Проведение гидролиза АТФ в среде, содержащей тяжелокислородную воду (Н2180), с последующим масс-спектрометрическим анализом содержания 18О в продуктах гидролиза позволило постулировать существование в ходе гидролиза АТ Ф двух основных промежуточных комплексов: М* *АТ Ф и М** *АДФ*Фн [5-9, 19, 36, 47]. В 1975 г. результаты наших и иностранных исследователей по механизмам

© Н. В. Кулева, 2009

действия миозиновой АТ Фазы были обобщены в монографии Н. С. Пантелеевой «Миозин: 18О-обмен и фосфорилирование» [21].

За прошедшие с тех пор более 30 лет в мировой науке был достигнут огромный прогресс в изучении моторных белков. Кроме миозина скелетных мышц, относящегося ко II классу суперсемейства миозинов, показано существование еще около двух десятков классов миозинов немышечных клеток. Созданы искусственные аналоги тех комплексов миозина с АТФ и продуктами ее гидролиза, которые были предсказаны результатами изучения кинетики 18О-обменных реакций. Их структура была исследована физическими методами. Наконец молекулярно-генетические подходы позволили определить функциональную роль отдельных участков головки молекулы миозина, которую теперь называют моторным доменом. Этот домен является общим для всех классов миозинов [13, 34, 42, 44, 45].

При изучении 18О-обменных реакций после 1975 г. нами было показано, что аналогичные постулированным комплексы образуются в системах миозинов из мышц различного типа (гладкие, сердечные), а также немышечных клеток [2, 4, 11, 12, 22-24, 38-41]. Кроме того, 18О-обменные реакции были изучены для аналогичного миозину по функции моторного белка динеина, определяющего движение ресничек и жгутиков [10], и сформулирован механизм действия для динеиновой АТФазы. Многие части этой работы были выполнены совместно с коллегами из Будапештского, Софийского, Киевского и Московского университетов. Э. А. Карандашовым в качестве АТФазы был использован очищенный препарат субфрагмента 1, т. е. непосредственно моторный домен миозина, и именно с ним были показаны те же зависимости величин 18О обмена от природы двухвалентного катиона и нуклеотида, что и для целой молекулы миозина [20, 24, 32, 40]. Поэтому можно полагать, что описанный выше механизм действия мышечной миозиновой АТФазы применим к миозинам всего миозинового суперсемейства.

Однако так успешно проводившиеся на нашей кафедре работы по изучению механизма действия актомиозинового мотора были приостановлены в 1987 г. из-за отсутствия современной модели масс-спектрометра. Продолжить такого рода работу удалось методом поляризационной микрофлуориметрии [3] на базе Института цитологии РАН совместно с доктором биологических наук Ю. С. Боровиковым. Как и в случае 18О обмена, в этих работах была показана универсальность конформационных изменений в актиновой нити в ответ на присоединение моторных доменов миозинов различного типа [14, 25]. Было также показано, что для осуществления этих конформационных изменений необходима целостность С-концевого фрагмента моторного домена миозина в комплексе с легкими цепями. При этом было обнаружено, что актиновые нити являются активным компонентом при осуществлении двигательной функции, и для выполнения этой функции необходимо их нативное состояние [29].

К этому моменту (1995) в ходе развития молекулярной биологии сформировалось два новых направления — геномика и протеомика. Первое связано с анализом работы генома на уровне генов, второе — на уровне белков. Термин «протеом», обозначающий белковый комплемент генома, впервые прозвучал в докладах Международной конференции “2D-Electrophoresis: from Peptide Maps to Genomes” в Италии в 1994 г. Теперь термины «протеом» и «протеомика» стали общепринятыми. Схематически стратегию протеомных исследований для какого-либо объекта можно представить в виде ряда последовательно реализуемых шагов, ключевые позиции среди которых занимают метод двухмерного электрофореза белков, идентификация их с помощью масс-спектрометрии и построение компьютерных банков данных. Роль современной протеомики может быть определена как интегральный анализ функционального состояния генома на уровне

белковых продуктов генной экспрессии, включающий их посттрансляционные модификации.

Протеомный подход оказался очень продуктивным для поиска новых белковых биомаркеров — показателей, позволяющих количественно охарактеризовать токсический или защитный эффект на клетки и ткани организма, возникающий при различных патологических состояниях или воздействиях окружающей среды. Важно найти те биомаркеры, изменение которых позволило бы определить характер заболевания или загрязнения окружающей среды. Сравнение двухмерных электрофореграмм контрольного и подвергшегося воздействию образца позволяет выявить белковые биомаркеры воздействия, а масс-спектрометрический анализ позволяет их идентифицировать.

Одним из биомаркеров, значимость которых для медицины и экотоксикологии была продемонстрирова с применением протеомного подхода, оказался основной цито-скелетный и сократительный белок — актин [43]. Показателями окислительного стресса, который имеет место при многих патологических состояниях организма наземных животных, а также при действии загрязнителей водной среды на гидробионтов, являются посттрансляционные модификации актина — карбонилирование, убиквитинирование и глутатионилирование [37].

Еще до использования протеомного подхода карбонилирование актина было продемонстрировано в наших работах по изучению влияния на структурные и функциональные свойства актина скелетных мышц крыс ионизирующей радиации, диабета и старения [1, 18, 28, 33]. Была также выявлена большая подверженность окислительной модификации P-подобной формы актина, присутствующей в мышцах моллюсков [26, 27, 33]. Использование подходов протеомики на базе лаборатории биоаналитики Лейпцигского университета (зав. проф. Р. Хоффманн) позволило аспирантке кафедры биохимии М. А. Федоровой идентифицировать карбонилированные аминокислотные остатки в молекуле актина [31, 32, 35]. Карбонилирование приводит к агрегации и фрагментированию белков и в то же время нарушает работу протеолитических ферментов, удаляющих поврежденные белки [48]. Накопление поврежденного актина было продемонстрировано нами в совместной работе с сотрудниками университета г. Кальмар (Швеция) по исследованию влияния модельного поллютанта хлористой меди на структурные и функциональные свойства актина беломорской мидии. Филаменты такого актина имеют более низкую скорость скольжения в системе «подвижность in vitro» [46].

Таким образом, проводимое на кафедре биохимии сегодня исследование окислительной модификации актина как биомаркера патологических состояний организма и загрязнения окружающей сред является перспективным направлением молекулярной медицины и экотоксикологии. По этому направлению на кафедре подготовлено 6 магистров и один кандидат наук. Учебные курсы «Молекулярные основы подвижности», «Экотоксикология», «Молекулярные основы адаптации и токсичности» являются частью магистерской программы «Экологическая биохимия» (руководитель д-р биол. наук Кулева Н. В.). Готовится курс практических занятий «Биохимические маркеры в водной экотоксикологии». В 2008 г. опубликовано учебное пособие М. Ю. Еропкина и Н. В. Кулевой «Биохимические методы в токсикологии и экотоксикологии».

Литература

1. Бакланова М. Ю., Залесова З. С., Федорова М. А., Кулева Н. В., Иванов С. Д. Механизмы модификации внутриклеточных белков при гипергликемии и действии ионизирующей радиации // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 3 (№ 19). С. 54-65.

2. Беленкова Т.Д., Герег Д., Красовская И. Е., Кулева Н. В. Энзиматические свойства актомиозина и миозина тимуса теленка // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер. 3. 1981. Вып. 2 (№ 9). С. 97-100.

3. Боровиков Ю. С., Кулева Н. В., Хорошев М. И., Вдовина И. Б. Влияние протеолиза миози-новых головок на индуцированные ими структурные перестройки Ф-актина // Биохимия. 1988. Т. 53. С. 1754-1757.

4. Красовская И. Е., Кулева Н. В., Данилова В. М., Пантелеева Н. С. 18О-обменнные реакции, катализируемые миозином гладких мышц кишечника теленка // Биохимия. 1977. Т. 42. С. 1104-1109.

5. Кулева Н. В., Пантелеева Н. С. Влияние парахлормеркурибензоата на реакцию изотопного обмена кислорода в системе миозин-АТФ // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер. 3. 1968 (№ 3). С. 123-128.

7. Кулева Н. В., Карандашов Э. А., Пантелеева Н. С. Влияние тринитрофенилирования мио-

зина на реакцию изотопного обмена кислорода в системе миозин-АТФ-Н218О // Биохимия. 1970. Т. 35. С. 42-47. 2

8. Кулева Н. В., Мюльрад А., Пантелеева Н. С. Влияние пранитромиофенилирования миозина на реакцию изотопного обмена кислорода в системе миозин-АТФ-Н218О // Биохимия. 1971. Т. 36. С. 857-863.

9. Кулева Н. В., Пантелеева Н. С. К вопросу о роли ДШБ-субъединицы миозина в катализе 18О-обменной реакции // Биофизика и биохимия мышечного сокращения. М., 1976. С. 60-62.

10. Кулева Н. В., Шанина Н. А., Красовская И. Е. Исследование динеиновой АТФазы методом изотопного обмена кислорода // Биохимия. 1983. Т. 48. Вып. 10. С. 1691-1696.

11. Кулева Н. В., Шепелев В. Н. Выделение и исследование миозина из тимуса и коры головного мозга теленка // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер. 3. 1984 (№ 21). С. 129-131.

12. Кулева Н. В., Красовская И. Е., Карандашов Э. А. Исследование миозиновой АТФазы скелетных мышц куриного эмбриона методом изотопного обмена кислорода // Вестн. Ленингр. ун-та. 1986. Вып. 4. Сер. 3 С. 106-109.

13. Кулева Н. В. Миозины немышечных клеток // Вестн. Ленингр. ун-та. Сер. 3. 1989. Вып. 4 (№ 24). С. 53-60.

14. КулеваН. В., Соловьева С. В., БоровиковЮ. С. О взаимодействии гладкомышечного миозина с актином // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 1992. Вып. 3 (№ 17). С. 66-72.

15. КулеваН. В., Коваленко З. С. Изменение функциональных свойств актина при его гликировании in vitro // Биохимия. 1997. Т. 62. Вып. 10. С. 1307-1313.

16. Кулева Н. В. Сопряжение ферментативного гидролиза АТФ с трансформацией энергии в ак-томиозиновом моторе // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 1998. Вып. 4 (№ 24). С. 14-21.

17. КулеваН. В. Современные представления о механизме трансформации энергии молекулярными моторами различной природы // Журн. эволюцион. биохим. физиол. 1999. № 2. С. 78-86.

18. КулеваН. В., Залесова З. С. Исследование неэнзиматического гликозилирования и окислительного повреждения актина in vitro и in vivo // Цитология. 2000. Т. 40. № 1. С. 66-71.

19. Пантелеева Н. С., Кулева Н. В. Образование фосфорилированных интермедиатов в системе транспорта энергии об АТФ на сократительные белки (по данным включения 18О) // Механизмы местной реакции и распространяющегося возбуждения. Л., 1970. С. 33-40.

20. Пантелеева Н. С., Карандашов Э. А., Кулева Н. В. Реакции изотопного обмена, катализируемые ферментативно активными фрагментами миозиновой молекулы // Тез. секц.-докл. IV Междунар. биофизич. конгресса. М., 1972. Т. 2. С. 361-362.

21. ПантелееваН. С. Миозин: 18О обмен и фосфорилирование. Л., 1975.

22. Пантелеева Н. С., Карандашов Э. А., Кулева Н. В., Красовская И. Е. Сходство элементарных стадий гидролиза АТФ в АТФазных системах различной природы // Метаболизм миокарда / Ред. И. Е. Чазов, Х. Е. Морган. М., 1981. С.135-142.

23. Пантелеева Н. С., Карандашов Э. А., Иванов Г. Г., Кулева Н. В., Красовская И. Е., Данилова В. М. 18О-обменные реакции в системе миозина скелетных, сердечной и гладких мышц // Биофизика. 1982. Т. 27. С. 365-367.

24. Пантелеева Н. С., Скворцевич Е. Г., Кулева Н. В., Красовская И. Е., Карандашов Э. А. Механизмы гидролиза АТФ в биологических системах различной природы // Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии / Под ред. С. Г. Инге-Вечтомова. Л., 1986. С.196-208.

25. Хорошев М. И., Кулева Н. В., Боровиков Ю. С. Влияние субфрагмента 1 миозина на структуру актина из скелетных мышц и тромбоцитов // Цитология. 1989. Т. 31. № 9. С. 1133-1135.

26. Федорова М. А., Кулева Н. В. Сравнение структурно- функциональных свойств актина мышц моллюска Mya arenaria и скелетных мышц кролика // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 4 (№ 24). С. 132-136.

27. Федорова М. А., Кулева Н. В. Сравнение гликоокислительной модификации актина из мышц кролика и разных видов моллюсков // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2005. Вып. 4 (№ 27). C. 78-86.

28. Федорова М. А., Кулева Н. В. Нарушение структуры и функции актина скелетных мышц после общего рентгеновского облучения // Нервная система. 2005. Вып. 39. С. 166-177.

29. Borovikov Yu. S., Kuleva N. V., Khoroshev M. I. Polarization microfluorimetry study of interaction between myosin head and F-actin in the muscle fiber // Gen. Physiol. Biophys. 1991. Vol. 10. P. 441-459.

30. CrossR. A. A protein-making motor protein // Nature. 1997. Vol. 385. P. 37-41.

31. Fedorova M. F., Frolov A. A., Kuleva N. V., Hoffman R. Oxidative modification of cysteins residues in muscle proteins caused by X-ray radiation // Abstracts of 36-th European Muscle Conference, Stockholm, September 2007. Р. 73.

32. Fedorova M. A., Kuleva N. V., Hoffman R. Characterization of functional and structural changes in skeletal muscle actin in a rat model for oxidative stress // Biological Motility: Achievments and Perspectives / Eds. Z. A. Podlubnaya, S. L. Malyshev. Vol. 2. Pushchino, 2008. P. 301-303.

33. Fedorova M. A., Zalesova Z. S., Kuleva N. V. Carnosine prevents in vitro and in vivo oxidative alteration of actin // J. Muscle Res. Cell Motility. 2002. Vol. 23. N 1. P. 23-24.

34. Fisher A. J., Smith C. A., Thoden J. B. et al. X-ray structures of the myosin motor domain of Dic-tyostelium discoideum complexed with MgADP*BeFx and MgADP*AlF2+// Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 8960-8972.

35. Kuleva N. V., Filimonov V. B., Fedorova M. A. Actin oxidation at in vitro and in vivo modeling of diabetes // Biological Motility: Achievments and Perspectives. Vol. 2h. Pushchino, 2008. P. 305-306.

36. Levy H. M., Koshland D. E. Mechanism of hydrolysis of adenosine triphosphate by muscle protein and its relation to muscular contraction // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. P. 1102-1110.

37. McDonagh B., Sheehan D. Redox proteomics in the blue mussel Mytulis edulis: Carbonylation is anot a prerequisite for ubiquitinylation in acute free radical mediated oxidative stress // Aquatic Toxicol. 2006. Vol. 79. Р. 325-333.

38. Panteleeva N. S., Karandashov E. A., Biro N. A., Kuleva N. V. 18O-exchange catalyzed by myosin, heavy meromyosin, subfragment 1 and their complexes with actin // Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 1977. Vol. 12(1). P. 37-44.

39. Panteleeva N. S., Karandashov E. A., Krasovskaya I. E., Kuleva N. V., Skvortsevich E. G., Syrtsova L. A. Similarity of elementary stages of ATP hydrolysis in various ATPase systems // Energy transport, protein synthesis and neuronal control of heart metabolism. IV USA — USSR goint Symp. on Myocardial Metabolism. Tashkent, 14-16. Sept. 1979. Bethesda (USA), 1980. P. 247-256.

40. Panteleeva N. S., Ivanov G. G., Karandashov E. A., Krasovskaya I. E., Kuleva N. V. A study of 18O-exchange reactions catalyzed by myosin and its subfragment 1 // Advances in Myocardiology. Plenum Press. Vol. 13. New York, 1982. P. 467-474.

41. Panteleeva N. S., Karandashov E. A., Kuleva N. V., Krasovskaya I. E., Skvortsevich E. G. Oxygen isotope exchange reactions in ATPase systems of different function // The metabolism of myocardium / Ed. by Chazov, Smirnov, Gordon, Brich. New York, 1986. P. 139-145.

42. Rayment J., Rypniewski W., Schmidt-Base K. Three-dimentional structure of myosin subfragment 1: a molecular motor // Science. 1993. Vol. 261. P. 50-58.

43. Rodrigues-Ortega M., Grosvik B. E., Rodrigues-Aziza A. Changes in protein expression profiles in bivalve mollusks (Chamaelea gallina) exposed to four model environmental pollutans // Proteomics. 2003. Vol. 3. P. 2946-2956.

44. Spudich J. A. How molecular motors work // Nature. 1994. Vol. 372. P. 515-518.

45. Titus M. Unconventional myosins: new frontiers in actin-base motors // Trends in Cell Biol. 1997. Vol. 256. P. 10910-10916.

46. Vikhoreva N. N., Vikhorev P. G., Negulyaev Yu. A., Fedorova M. A., Kuleva N. V. Oxidative modification of actin decreases its sliding velocity in the in vitro motility assay // Biological Motility: Achievments and Perspectives / Ed. by Z. A. Podlubnaya, S. L. Malyshev. Vol. 2. Pushchino, 2008. P. 322-323.

47. Wolcott R. G., Boyer P. D. The reversal of the myosin and actomyosin ATPase reaction and the free energy of ATP binding of myosin // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974. Vol. 57. P. 707-716.

48. Zeng J., Dunlop R., Rodgers K., Davies M. Evidence for inactivation of cysteine proteases by reactive carbonyls via glycation of active site thiols // Biochem. J. 2006. Vol. 396. P. 197-206.