Создание генетических экспрессионных конструкций для получения нового семейства полипептидов Кунитц-типа актиний

Вестник ДВО РАН. 2015. № 5

Кветкина

Александра Николаевна

Аспирант лаборатории химии пептидов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. В 2014 г. с отличием окончила Дальневосточный государственный университет (Школа естественных наук) по специальности «биохимия». Студенткой 2-го курса пришла в лабораторию химии пептидов, где начала осваивать методы белковой химии. После успешной защиты дипломной работы поступила в очную аспирантуру ТИБОХ ДВО РАН (руководители к.х.н. Е.В. Лейченко и к.ч.м. М.П. Исаева).

Объектом исследования молодого ученого являются полипептиды Кунитц-типа актиний, их получение в нативной и рекомбинантной форме, изучение их структуры и функций.

А.Н. Кветкина принимает участие в научно-исследовательском проекте, поддержанном грантом РНФ № 14-25-00037. Результаты ее работы были представлены на международных и межрегиональных научных конференциях, в том числе на 40-м Конгрессе ФЕБС «Биохимическая основа жизни» в Берлине 4—9 июля 2015 г. Александра Николаевна является автором и соавтором 5 научных публикаций.

УДК 577.2 АН. КВЕТКИНА

Создание генетических экспрессионных конструкций для получения нового семейства полипептидов Кунитц-типа актиний

Методами молекулярного клонирования и генной инженерии созданы генетические экспрессионные конструкции, несущие гены трех новых IQ-полипептидов Кунитц-типа актиний Heteractis crispa и Heteractis magnifica — потенциальных ингибиторов протеаз.

Ключевые слова: полипептиды Кунитц-типа, актинии, ингибиторы протеаз.

Creating genetic expression constructs for obtaining a new family of Kunitz-type polypeptides from sea anemones. A.N. KVETKINA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

Genetic expression constructs containing the genes of novel sea anemones Heteractis crispa and Heteractis magnifica Kunitz-type polypeptides — potential protease inhibitors — were created using methods of molecular cloning and gene engineering.

Key words: Kunitz-type polypeptides, sea anemones, protease inhibitors.

КВЕТКИНА Александра Николаевна - аспирант (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Еля-кова ДВО РАН, Владивосток). E-mail: sashaledy@gmail.com

Работа выполнена при поддержке РНФ (гранта № 14-25-00037).

Протеолитические ферменты играют ключевую роль в белковом обмене живых организмов и участвуют во многих физиологических процессах, таких как пищеварение, коагуляция крови, фибринолиз, регуляция клеточного цикла, апоптоз и др. [9]. Любые нарушения механизмов регуляции активности протеаз могут привести к серьезным заболеваниям, таким как мышечная дистрофия, эмфизема легких, панкреатит, а также рак, артрит, аутоиммунные, нейродегенеративные, сердечно-сосудистые заболевания и др. [8]. Поэтому регулирование активности этих ферментов играет важную роль в жизнедеятельности организмов. Контроль физиологической активности протеаз осуществляется на посттрансляционной стадии путем активации их предшественников (зимогенов) или ингибирования их активности различными соединениями, в том числе белковой природы.

К настоящему времени выделено большое число ингибиторов сериновых протеаз из наземных и морских ядовитых животных. Многообещающим источником этих соединений являются морские кишечнополостные, актинии. Наиболее распространенный тип ингибиторов сериновых протеаз актиний - ингибиторы Кунитц-типа, структура которых включает шесть цистеиновых остатков, образующих три дисульфидные связи. На сегодняшний день выделено около 40 ингибиторов Кунитц-типа из таких актиний, как Actinia equina, Anemonia sulcata, Stichodactyla helianthus, S. haddoni и др. Некоторые полипептиды Кунитц-типа актиний полифункциональны, т.е. помимо ингибирования протеолитиче-ских ферментов они способны модулировать ионотропные рецепторы (TRPV1) и блокировать Ky каналы [6].

Недавно из тропической актинии Heteractis crispa было выделено мультигенное суперсемейство, включающее четыре отдельных генных семейства, которые кодируют НСGS-, НСGG-, НСRG- и НС^-полипептиды, структурно гомологичные ингибиторам протеаз Кунитц-типа [4]. В настоящее время активно ведутся исследования НСGS- и НСRG-полипептидов. Показано, что некоторые из них проявляют анальгетическую, противовоспалительную, антигистаминную и гипотермическую активность [1-3]. Однако к настоящему времени нет литературных данных о природе разнообразия изоформ HCIQ-полипептидов. Поэтому важными этапами на пути дальнейшего использования этих соединений в качестве моделей для направленного дизайна лекарственных препаратов являются их получение и изучение структурно-функциональных взаимосвязей и биологической активности.

Цель данной работы - создание генетических экспрессионных конструкций, несущих гены трех различных HCIQ-полипептидов. Ранее в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН из актиний H. crispa и H. magnifica методами молекулярной биологии были получены последовательности генов, кодирующих несколько изоформ HCIQ-полипептидов, отличающихся точечными аминокислотными заменами. Известно, что основную роль в специфичности узнавания сериновых протеаз ингибиторами Кунитц-типа играет аминокислотный остаток в Р1-положении. Так, у типичных ингибиторов трипсина в Р1-положении обычно находится Arg или Lys, в то время как у ингибиторов химотрипси-на - Leu или Met [7]. На основе структурно-функционального анализа HCIQ-полипептидов было показано, что в Р1-положении реактивного сайта находится Arg. Следовательно, HCIQ-полипептиды способны, вероятно, проявлять трипсинингибирующую активность. К тому же все HCIQ-полипептиды имеют высокую степень идентичности аминокислотных последовательностей с выделенными ранее ингибиторами протеаз SHPI-1 из актинии S. helianthus (87-94 %) и APHC1 и APHC3 из H. crispa (75-82 %) (рис. 1). Помимо инги-бирования сериновых протеаз APHC1 и APHC3 также способны модулировать болевой ваниллоидный рецептор TRPV1, оказывая анальгетическое действие, сопровождающееся понижением общей температуры тела [3]. Поэтому получение и изучение биологической активности новых полипептидов, проявляющих ингибирующую активность в отношении сериновых протеаз и анальгетическое действие, сопряженное с гипотермическим эффектом, является актуальной исследовательской задачей, решение которой позволит получить соединения, обладающие цитопротекторными свойствами.

Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей полипептидов Кунитц-типа из актиний. Представлены последовательности: полипептидов HCIQ3c1 из актинии H. magnifica; HCIQ1c5, HCIQ2c1, ингибиторов болевого ванилоидного рецептора APHC1 (UniProt B2G331) и APHC3 (UniProt C0HJF3) из актинии H. crispa; ингибитора протеаз SHPI-1 из S. helianthus. Вариабельные аминокислотные остатки показаны на светлом, остатки Cys - на темном фоне. Реактивный сайт связывания с сериновыми протеазами выделен рамкой. Указаны остатки в положении P1

Следует отметить, что HCIQ-полипептвды ранее не были выявлены в ядах и экстрактах актиний H. crispa и H. magnifica, но с помощью методов молекулярной биологии были установлены последовательности кодирующих их генов, что позволит получить рекомби-нантные полипептиды путем экспрессии в прокариотической системе.

Все исследуемые полипептиды содержат в своей структуре по три дисульфидные связи. Поэтому при выборе системы экспрессии было отдано предпочтение вектору pET-32b(+), который дает возможность получать полипептиды в виде слитного белка с фрагментом тиоредоксина в Escherichia coli. Преимущество данного вектора заключается в том, что он обеспечивает высокий выход слитного белка, а ти-оредоксин способствует правильному замыканию дисуль-фидных связей в целевом полипептиде и обеспечивает высокое содержание белка в растворе [5]. Следует также отметить, что гибридный белок содержит в своем составе полигистидиновую последовательность (6His-tag), необходимую для выделения целевого белка из клеточного ли-зата методом металл-аффинной хроматографии.

Для получения экспресси-онной конструкции фрагмент ДНК, кодирующий зрелый полипептид, был амплифицирован с генспецифичными праймерами (Inh_EcoR1_F и Inh_XhoI_Rev), фланкирующими зрелый пептид с N- и С-концов и содержащими сайт рестрикции EcoR1 и кодон

Рис. 2. Схема получения генетических экспрессионных конструкций, несущих гены HCIQ-полипептидов. Нуклеотидные последовательности: Amp - р-лактамаза, Trx - тиоредоксин, lacI - 1ас-репрессор, His-Тег - гистидиновый тег, EcoRI, XhoI - сайты рестриктаз, ori -точка начала репликации, Met - метионин, GN_EcoR_F, Ing_XhoI_ Rev - прямой и обратный праймеры соответственно

метионина (в прямом праймере) и сайт рестрикции XhoI и стоп-кодон (в обратном прай-мере). В качестве матрицы были использованы рекомбинантные плазмиды со вставкой гена целевого пептида (рис. 2). Вставка метионинового кодона на 5'-концевом участке последовательности необходима для расщепления гибридного белка под действием BrCN и получения целевого рекомбинантного полипептида. Полученный ПЦР-продукт был обработан эндонуклеазами EcoRI и XhoI и клонирован в вектор рБТ32Ъ(+) по соответствующим сайтам рестрикции. В результате были получены плазмиды pET32b(+)/HCIQ2c1, pET32b(+)/HCIQ1c5 и pET32b(+)/HCIQ3c1, которые будут в дальнейшем использованы для экспрессии генов и получения рекомбинантных полипептидов.

Таким образом, с помощью генно-инженерных подходов и методов молекулярного клонирования нами созданы три экспрессионные конструкции, несущие гены трех новых HCIQ-полипептидов Кунитц-типа актиний H. crispa и H. magnifica, с целью дальнейшего получения и исследования фармакологического потенциала рекомбинантных полипептидов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Синцова О.В., Монастырная М.М., Пислягин Е.А., Менчинская Е.С., Лейченко Е.В., Аминин Д.Л., Козловская Э.П. Противовоспалительная активность полипептида актинии Heteractis crispa // Биоорган. химия. 2015. № 6 (В печати).

2. Табакмахер В.М., Синцова О.В., Кривошапко О.Н., Зелепуга Е.А., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Анальгетическое действие новых полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa // Докл. АН. 2015. Т. 461, № 2. С. 232-235. doi: 10.7868/S0869565215080277.

3. Andreev Y. A., Kozlov S.A., Korolkova Y.V., Dyachenko I.A., Bondarenko D.A., Skobtsov D.I., Murashev A.N., Kotova P.D., Rogachevskaja O.A., Kabanova N.V., Kolesnikov S.S., Grishin E.V. Polypeptide modulators of TRPV1 produce analgesia without hyperthermia // Mar. Drugs. 2013. Vol. 11. P. 5100-5115.

4. Isaeva M.P., Chausova V.E., Zelepuga E.A., Guzev K.V., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Kozlov-skaya E.P. A new multigene superfamily of Kunitz-type protease inhibitors from sea anemone Heteractis crispa // Peptides. 2012. Vol. 34. P. 88-97.

5. LaVallie E.R., DiBlasio E.A., Kovacic S., Grant K.L. Schendel P.F., McCoy J.M. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm // Biotechnology (N.Y.). 1993. Vol. 11. P. 187-193.

6. Mourao C.B.F., Schwartz E.F. Protease inhibitors from marine venomous animals and their counterparts in terrestrial venomous animals // Marine Drugs. 2013. Vol. 11. P. 2069-2112.

7. Ranasinghe S., McManus D.P. Structure and function of invertebrate Kunitz serine protease inhibitors // Dev. Comp. Immunol. 2013. Vol. 39. P. 219-227.

8. Reich E., Rifldn D.B., Shaw E., eds. Proteases and biological control. N.Y.: Cold Spring Harbour Laboratory, 1975. 1021 p.

9. Scott C.J. Taggart C.C. Biologic protease inhibitors as novel therapeutic agents // Biochimie. 2010. Vol. 92. P. 1681-1688.