УСКОРИТЕЛЬ ПРОДУЦИРОВАНИЯ КАТЕХОЛАМИНА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКАЯ ПИЩЕВАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ КАТЕХОЛАМИНА
ACCELERATOR FOR PRODUCING CATECHOLAMINE AND THERAPEUTIC AND PREVENTIVE AGENT AND THERAPEUTIC AND PREVENTIVE FOOD COMPOSITION FOR DISEASES CAUSED BY CATECHOLAMINE DEFICIENCY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к: ускорителю продуцирования катехоламина; терапевтическому средству и профилактическому средству для заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина; и пищевым композициям для лечения или предотвращения заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Катехоламины представляют собой соединения, содержащие катехол и амин и существующие in vivo в качестве части нейротрансмиттеров. Наиболее распространенными катехоламинами in vivo являются адреналин, норадреналин и дофамин, которые образуются из тирозина. Тирозин превращается в L-ДОФА (L-3,4-дигидроксифенилаланин), который затем превращается в дофамин. Дофамин превращается в норадреналин, а норадреналин превращается в адреналин.
Недостаточность катехоламина подтверждена при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, и исследовали и применяли на практике предотвращение и лечение посредством содействия продуцированию катехоламина. Например, в качестве средств против болезни Паркинсона вводят предшественники адреналина, норадреналина и дофамина, такие как фенилаланин, тирозин и L-ДОФА. Кроме того, для предотвращения метаболизма, вызываемого окислительным удалением аминогрупп с помощью моноаминоксидазы, использовали ингибиторы моноаминоксидазы в качестве средств против болезни Паркинсона. Для болезни Альцгеймера в последние годы преимущественно использовали лекарственную терапию; однако в настоящее время еще предстоит найти основополагающее терапевтическое средство. Тем не менее, проводили исследования важности норадреналина и дофамина и сообщали о снижении концентрации норадреналина в тканях, которое наблюдали в модели болезни Альцгеймера на мышах (непатентные документы с 1 до 4); следовательно, предстоит разработка профилактического или терапевтического способа для болезни Альцгеймера посредством содействия продуцированию катехоламина.
Между тем, преимущественно в восточных странах, экстракты земляного червя и сухие порошки земляного червя используют с древних времен в качестве профилактических средств и терапевтических средств для различных заболеваний, и примеры их использования, которые известны, включают средства, уменьшающие камни мочевого пузыря, средства, способствующие выведению камней мочевого пузыря, терапевтические средства для желчности, утеротоники, тонизирующие средства, средства для роста волос, афродизиаки, жаропонижающие средства, терапевтические средства для судорог, стимуляторы циркуляции крови, терапевтические средства для гемиплегии, непрямые аналгетики, диуретики, средства против астмы и антигипертензивные средства.
Однако не было сообщений об ускорителе продуцирования катехоламина, который содержит земляного червя в качестве активного ингредиента, или использовании земляного червя для предотвращения и терапии болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
ДОКУМЕНТЫ СВЯЗАННОЙ ОБЛАСТИ
НЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
Непатентный документ 1: Francis BM et al., Neuropsychopharmacology (2012) 37:1934-1944
Непатентный документ 2: Szot P, Epilepsia (2012) 53 (Suppl.1):61-66
Непатентный документ 3: Xu Y et al., Progress in Neurobiology (2012) 97:1-13
Непатентный документ 4: Robertson IH, Neurobiology of Aging (2013) 34:298-308
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРОБЛЕМЫ, ПОДЛЕЖАЩИЕ РЕШЕНИЮ С ПОМОЩЬЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Терапия нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, предполагает введение лекарственных средств в течение длительного времени; следовательно, особенно необходимо лекарственное средство, которое безопасно и имеет небольшие побочные эффекты, и, таким образом, существует спрос на ускоритель продуцирования катехоламина, а также на профилактическое и терапевтическое средство для болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона, которые получают из натурального продукта.
Ввиду приведенного выше, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить: ускоритель продуцирования катехоламина, который содержит натуральный продукт в качестве активного ингредиента; профилактическое и терапевтическое средство для заболеваний, обусловленных недостаточностью катехоламина; а также пищевую композицию и фармацевтическую композицию для улучшения симптомов заболеваний, обусловленных недостаточностью катехоламина.
СРЕДСТВО РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ
То есть, ускоритель продуцирования катехоламина в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что содержит сухой порошок, измельченный продукт и/или экстракт земляного червя в качестве активного ингредиента.
Терапевтическое средство или профилактическое средство для заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина, в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что содержит описанный выше ускоритель продуцирования катехоламина.
Терапевтическая или профилактическая пищевая композиция для заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина, в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что содержит описанный выше ускоритель продуцирования катехоламина.
Для терапевтического средства или профилактического средства для заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина, в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно заболевание, обусловленное недостаточностью катехоламина, выбирать из группы, состоящей из болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
Для терапевтической или профилактической пищевой композиции для заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина, в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно заболевание, обусловленное недостаточностью катехоламина, выбирают из группы, состоящей из болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
Способ получения ускорителя продуцирования катехоламина в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что включает использование сухого порошка, измельченного продукта или экстракта земляного червя.
Способ получения терапевтического средства или профилактического средства для заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина, в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что включает использование сухого порошка, измельченного продукта или экстракта земляного червя.
Способ получения терапевтической или профилактической пищевой композиции для заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина, в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что включает использование сухого порошка, измельченного продукта или экстракта земляного червя.
Способ содействия продуцированию катехоламина в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что включает использование сухого порошка, измельченного продукта и/или экстракта земляного червя.
Сухой порошок, измельченный продукт или экстракт земляного червя в соответствии с настоящим изобретением предназначен для использования в лечении заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина.
Способ лечения или предотвращения заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина, в соответствии с настоящим изобретением отличается тем, что включает введение сухого порошка, измельченного продукта и/или экстракта земляного червя субъекту в эффективной дозе.
ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением можно предоставлять ускоритель продуцирования катехоламина, который содержит натуральный продукт в качестве активного ингредиента, профилактическое и терапевтическое средство для заболеваний, обусловленных недостаточностью катехоламина, а также пищевую композицию и фармацевтическую композицию для улучшения симптомов заболеваний, обусловленных недостаточностью катехоламина.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
[Фиг. 1] На фиг. 1 представлен график, показывающий изменения количества секреции катехоламина хромаффинными клетками надпочечника коровы, обусловленные добавлением сухого порошка земляного червя. Абсцисса представляет концентрацию сухого порошка земляного червя. Ордината представляет количество секреции катехоламина. Количество внутриклеточного катехоламина после 5 минут культивирования при концентрации сухого порошка земляного червя 0 мкг/мл принимали за 100%.
[Фиг. 2] На фиг. 2 представлены фотографии, показывающие изменения внутриклеточной концентрации кальция в хромаффинных клетках надпочечника коровы, обусловленные добавлением сухого порошка земляного червя.
[Фиг. 3] На фиг. 3 представлен график, показывающий изменения интенсивности флуоресценции внутриклеточного кальция в хромаффинных клетках надпочечника коровы, обусловленные добавлением сухого порошка земляного червя. Абсцисса представляет концентрацию сухого порошка земляного червя. Ордината представляет интенсивность флуоресценции. Интенсивность флуоресценции клеток, культивируемых при концентрации сухого порошка земляного червя 0 мкг/мл принимали за 100%.
[Фиг. 4] На фиг. 4 представлены фотографии, показывающие результаты Вестерн-блоттинга, который осуществляли для того, чтобы исследовать изменения фосфорилирования тирозингидроксилазы в хромаффинных клетках надпочечника коровы, обусловленные добавлением сухого порошка земляного червя.
ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении земляной червь, используемый в качестве сырья, конкретно не ограничен, и примеры земляного червя, которого можно использовать, включают Lumbricus rubellus, Lumbricus terrestris, Eisenia foetida, Allolobophora caliginosa, Dendrobaena octaedra, Allolobophora japonica Michaelsen, Drawida hattamimizu Hatai, Pheretima divergens Michaelsen, Pheretima communissima, Pheretima agrestis, Pheretima sieboldi Horst, Pheretima hilgendorfi, Pontodrilus matsushimensis Iizuka, Tubifex hattai Nomura, Limnodrilus gotoi Hatai (= L. Socialis Stephenson).
В настоящем изобретении термин «сухой порошок» земляного червя обозначает порошок, получаемый высушиванием измельченного продукта или экстракта необработанного или предварительно обработанного земляного червя. Термин «измельченный продукт» земляного червя обозначает необработанного или предварительно обработанного земляного червя, которого смололи в жидкую или пастообразную форму. Термин «экстракт» земляного червя обозначает экстракт, получаемый посредством растворения необработанного или предварительно обработанного земляного червя или его измельченного продукта в воде, водном растворе или органическом растворителе, и последующего удаления или отделения нерастворимых фракций. Предварительная обработка конкретно не ограничена, и ее примеры включают описанную далее обработку для удаления загрязнения и т. п. Кроме того, сухой порошок, измельченный продукт и экстракт земляного червя также можно подвергать постобработке, примеры которой включают гранулирование, фильтрование, очистку, концентрирование, разведение и корректировку pH.
Способ помола для получения измельченного продукта земляного червя конкретно не ограничен, и помол можно осуществлять с использованием, например, гомогенизатора, измельчителя, смесителя-гомогенизатора, дробилки или аппарата для разрушения клеток под высоким давлением.
Способ экстрагирования для получения экстракта земляного червя конкретно не ограничен, и экстрагирование можно осуществлять посредством, например, растворения сухого порошка или измельченного продукта земляного червя в растворителе для экстрагирования и последующего удаления или отделения нерастворимых фракций. Примеры растворителя для экстрагирования включают воду, водные растворы и органические растворители, такие как этанол, ацетон и этилацетат. Эти растворители для экстрагирования можно использовать отдельно или два или более из них можно использовать в комбинации. Среди них предпочтительно используют воду, этанол или водный этанола раствор.
Способ сушки для получения высушенного продукта земляного червя конкретно не ограничен, и сушку можно осуществлять с помощью такого способа сушки, как лиофилизация, термическая сушка или распылительная сушка. Среди этого предпочтительной является лиофилизация в силу причин, описанных далее.
В настоящем изобретении сухой порошок, измельченный продукт или экстракт земляного червя может быть включен в эффективном количестве в соответствии с его целью. Подходящее количество зависит от различных факторов, таких как предполагаемое назначение, путь и способ введения и способ получения сухого порошка земляного червя или тому подобное; однако с целью предотвращения заболеваний, обусловленных недостаточностью катехоламина, или лечения легкого заболевания подходящее количество предпочтительно составляет от 1 до 15000 мг/сутки, более предпочтительно от 12 до 1800 мг/сутки, еще более предпочтительно от 120 до 180 мг/сутки, в пересчете на массу сухого порошка земляного червя, полученного посредством удаления переваренного вещества, остающегося в пищеварительном тракте земляного червя, а также загрязнений и т. п., прилипающих к коже земляного червя, как описано ниже, перемалывания земляного червя и последующей лиофилизации, которые ведут к измельченному продукту. Кроме того, с целью лечения тяжелого заболевания, обусловленного недостаточностью катехоламина, подходящее количество предпочтительно составляет от 1 до 15000 мг/сутки, более предпочтительно от 18 до 3600 мг/сутки, еще более предпочтительно от 180 до 360 мг/сутки.
Формы ускорителя продуцирования катехоламина, терапевтического средства, профилактического средства и пищевой композиции по настоящему изобретению конкретно не ограничены и могут представлять собой любую твердую форму, порошкообразную форму, полутвердую форму и жидкую форму.
В настоящем изобретении сухой порошок, измельченный продукт или экстракт земляного червя можно использовать как есть. Альтернативно, в частности, ускоритель продуцирования катехоламина, терапевтическое средство и профилактическое средство по настоящему изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель, и их можно вводить перорально или парентерально (например, внутривенное введение или прямое введение в пораженное место) в форме таблетки, гранулы, порошка, капсулы, мягкой капсулы, жидкости, инъецируемого средства, суппозитория или средства с замедленным высвобождением или тому подобного. В качестве фармацевтически приемлемого носителя можно использовать, например, эксципиент, связывающее средство, разрыхлитель, разжижающее средство, смазывающее средство, покрывающее средство, суспендирующее средство, красящее вещество, подсластитель или поверхностно-активное вещество, и получаемому можно придавать форму обычного фармацевтического препарата в соответствии с известным способом. Кроме того, также можно включать другой терапевтический и профилактический компонент(компоненты) и фармацевтически приемлемую добавку(добавки).
В настоящем изобретении, в частности, в ускорителе продуцирования катехоламина и пищевой композиции по настоящему изобретению, также можно включать добавку(добавки), обычно используемую в пищевых продуктах. Примеры добавков, которые можно использовать, включают эксципиенты, связывающие средства, разрыхлители, разжижающие средства, смазывающие средства, покрывающие средства, суспендирующие средства, красящие вещества, подсластители и поверхностно-активные вещества, и получаемому можно придавать форму обычной пищевой композиции в соответствии с известным способом. Кроме того, также можно включать другой пищевой продукт(продукты) или компонент(компоненты) пищевого происхождения.
В настоящем изобретении, среди сухих порошков, измельченных продуктов и экстрактов земляного червя, с точки зрения стабильности хранения в производственном процессе, предпочтительно использовать сухой порошок земляного червя. Сухой порошок земляного червя можно предварительно растворять и/или диспергировать в жидкости, такой как вода, и получаемое впоследствии можно смешивать с другим компонентом(компонентами), примеры которого включают стандартные носители и добавки, которые используют фармацевтически и/или в пищевых продуктах.
В настоящем изобретении, заболевание, обусловленное недостаточностью катехоламина, конкретно не ограничено, и его предпочтительно выбирают из группы, состоящей из болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона.
Для перорального введения земляного червя в качестве сырья предпочтительно удалять переваренное вещество, остающееся в пищеварительном тракте земляного червя, загрязнения, прилипающие к коже, и т. п. В настоящем изобретении способ такого удаления конкретно не ограничен, и удаление можно осуществлять известным способом. Например, можно использовать способ, в котором позволяют живому земляному червю экскретировать желтую почву, содержащуюся в пищеварительном тракте, посредством погружения земляного червя в водный раствор щелочной соли, такой как соль натрия или соль калия (способ описан в публикациях нерассмотренных японских заявок на патенты №№ H1-47718, H1-47719, H1-47720 и H1-268639) или способ удаления отливок из пищеварительного тракта живого земляного червя, оставляя земляного червя в водном растворе кислоты, в котором поддерживают от 6 до 26°C в течение от 0,1 до 5 часов (способ описан в публикации нерассмотренной японской заявки на патент № H3-72427).
В настоящем изобретении, в качестве способа удаления предпочтительно приводить земляного червя в контакт с описанным далее хлоридом металла и/или гидроксикарбоновой кислотой.
Хлорид металла представляет собой хлорид по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция. То есть, хлорид металла представляет собой по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из хлорида калия, хлорида натрия, хлорида магния и хлорида кальция. Кроме того, хлорид металла также может представлять собой смесь этих хлоридов металлов или смесь одного или нескольких этих хлоридов металлов и другого безвредного компонента(компонентов), который можно добавлять в пищевые продукты. Примеры таких смесей включают пищевые соли, каменную соль и осадочную морскую соль. Хлорид металла можно использовать путем посыпания им в порошкообразной форме поверх живого земляного червя, что создает контакт между земляным червем и хлоридом металла.
После того, как хлориду металла позволяют войти в контакт с живым земляным червем, предпочтительно приводить живого земляного червя в контакт с гидроксикарбоновой кислотой описанным далее образом. Альтернативно, земляного червя можно приводить в контакт с гидроксикарбоновой кислотой описанным далее образом без предшествующего контакта с хлоридом металла.
Контакт с гидроксикарбоновой кислотой также можно создавать посредством посыпания гидроксикарбоновой кислотой в порошкообразной форме поверх живого земляного червя. Альтернативно, живого земляного червя можно погружать в водный раствор гидроксикарбоновой кислоты, который имеет pH от 2 до 5. В случае, когда контакт с гидроксикарбоновой кислотой создают после контакта с хлоридом металла, предпочтительно контакт с гидроксикарбоновой кислотой создавать сразу после контакта с хлоридом металла. Также предпочтительно земляного червя моют водой перед приведением в контакт с гидроксикарбоновой кислотой. Удаляя хлорид металла промыванием водой и затем приводя земляного червя в контакт с гидроксикарбоновой кислотой, можно получать сухой порошок земляного червя, который имеет высокую активность фермента. Когда земляного червя промывают водой перед контактом с гидроксикарбоновой кислотой, промывание земляного червя водой осуществляют предпочтительно в пределах 30 минут, более предпочтительно в пределах 20 минут, после начала контакта с хлоридом металла. Способ промывания земляного червя водой конкретно не ограничен, и можно использовать известный способ.
Если живые земляные черви остаются в контакте с порошком гидроксикарбоновой кислоты в течение длительного времени, земляные черви погибают, так что происходит утрата их жизненных функций и более не происходит экскреция переваренного вещества в их пищеварительных трактах. Следовательно, предпочтительно разводить гидроксикарбоновую кислоту водой как можно быстрее, предпочтительно в пределах 30 секунд, более предпочтительно в пределах 20 секунд, чтобы корректировать pH до диапазона от 2 до 5.
Поскольку гидроксикарбоновая кислота создает среду обитания, неприятную для земляных червей, живые земляные черви, следуя своему инстинкту самосохранения, пытаются улучшить среду обитания через выброс текучих веществ организма и экскрецию. Кроме того, поскольку гидроксикарбоновые кислоты обладают дезинфицирующими свойствами, ожидают, что они не только играют роль в содействии экскреции переваренных веществ и т. п., остающихся в пищеварительном тракте, как описано выше, но также оказывают эффект уничтожения бактерий, прилипающих к земляным червям.
В описанном выше способе какую-либо кристаллическую гидроксикарбоновую кислоту можно использовать независимо от числа ее гидроксильных групп и карбоксильных групп до тех пор, пока она принимает кристаллическую форму при условиях ее использования. ТО есть, кристаллическая гидроксикарбоновая кислота может представлять собой любое из моногидроксимонокарбоновых кислот, моногидроксиполикарбоновых кислот, полигидроксимонокарбоновых кислот и полигидроксиполикарбоновых кислот.
Примеры гидроксикарбоновой кислоты, используемой в настоящем изобретении, включают гликолевую кислоту, молочную кислоту, уксусную кислоту, β-гидроксипропановую кислоту, α-гидрокси-н-бутановую кислоту, β-гидрокси-н-бутановую кислоту, α-гидрокси-н-валериановую кислоту, β-гидрокси-н-валериановую кислоту, яблочную кислоту, α-метиляблочную кислоту, α-гидроксиглутаровую кислоту, β-гидроксиглутаровую кислоту, лимонную кислоту, малоновую кислоту и янтарную кислоту. Среди этого, молочная кислота, уксусная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, малоновая кислота и янтарная кислота являются предпочтительными, поскольку их можно использовать в пищевых продуктах и легко получить. Описанные выше гидроксикарбоновые кислоты можно использовать индивидуально или можно использовать две или более из них в комбинации.
Вода составляет 65% тканей живого земляного червя. Несмотря на то, что функции самосохранения живого земляного червя остаются эффективными в течение определенного времени, гибель живого земляного червя ведет к началу активности ферментов; следовательно, необходимо тщательно контролировать время, в течение которого живого земляного червя помещают в неприятную среду обитания. Длительность этого времени варьирует в зависимости от условий; однако обычно она находится в диапазоне от 3 до 180 минут.
Предпочтительно обработанного таким образом гидроксикарбоновой кислотой живого земляного червя промывать водой и затем перемалывать в измельченный продукт в жидкой форме или пастообразной форме. Промывание предпочтительно осуществляют с использованием чистой воды. Способ промывания конкретно не ограничен, и можно использовать известный способ промывания водой. Общее время процесса обработки перед перемалыванием, то есть длительность периода от посыпания живого земляного червя хлоридом металла до завершения удаления гидроксикарбоновой кислоты посредством промывания водой, предпочтительно составляет не долее чем 240 минут.
Способ перемалывания конкретно не ограничен и, например, перемалывание обычно выполняют при 1-25°C с использованием гомогенизатора, измельчителя, смесителя-гомогенизатора, дробилки, аппарата для разрушения клеток под высоким давлением или тому подобного. С точки зрения ингибирования разрушения компонентов земляного червя предпочтительно выполнять перемалывание при низкой температуре, более предпочтительно при температуре от 2 до 15°C.
Измельченный продукт, полученный посредством перемалывания земляного червя, помещают на лоток из нержавеющей стали или тому подобное и подвергают лиофилизации. В этом процессе может происходить образование газа разложения, поскольку ферменты, содержащиеся в живом организме земляного червя, неактивны в живых клетках, но немедленно действуют на погибшие клетки. Для того чтобы ингибировать образование газа разложения, предпочтительно перед лиофилизацией мгновенно охлаждать и замораживать измельченный продукт при от -18°C до -35°C с тем, чтобы подавлять действие ферментов.
Таким образом, для получения порошка земляного червя без ослабления присущего фармакологического действия земляного червя, предпочтительно быстро замораживать перемолотого земляного червя. С другой стороны, чрезмерно быстрая заморозка не предпочтительна, поскольку, когда перемолотого земляного червя замораживают за чрезмерно короткий период времени, примеси, существующие вместе с белками, которые являются основными компонентами пасты земляного червя, могут формировать скопления не замороженных частей и, таким образом, не могут быть отделены. Следовательно, замораживание осуществляют при низкой температуре от -18°C до -35°C в течение периода предпочтительно от 20 до 240 часов, более предпочтительно от 50 до 170 часов.
Для лиофилизации важно выбирать условия, которые делают возможным удаление воды, а также примесей, не оставляя каких-либо примесей. Соответственно, предпочтительно выполнять лиофилизацию при давлении 50 Па или меньше, при этом повышая температуру ступенчато в диапазоне от -60°C до +90°C в течение периода от 10 до 60 часов.
В качестве способа лиофилизации, например, как описано выше, после заморозки измельченного продукта при температуре от -18°C до -35°C в течение периода от 20 до 240 часов, получаемое лиофилизируют в вакууме в течение периода от 10 до 60 часов, при этом повышая температуру за несколько этапов в диапазоне от -60°C до +90°C и понижая давление за несколько этапов в диапазоне от 25 до 40 Па, тем самым можно получать стерильный бледно-желтый сухой порошок земляного червя.
Кроме того, также предпочтительно включать стадии растворения таким образом лиофилизированного измельченного продукта в воде или водном растворе этанола; и удаления или отделения нерастворимых фракций. Стадию удаления или отделения нерастворимых фракций можно осуществлять аналогичным образом, как описано выше, и она содержит преципитацию, которую осуществляют, оставляя получаемый раствор стоять, центрифугируя, фильтруя и т. п. Стадию растворения лиофилизированного измельченного продукта в воде или водном растворе этанола предпочтительно осуществляют при перемешивании или встряхивании. Время, которое необходимо для растворения лиофилизированного измельченного продукта в воде предпочтительно составляет от 1 до 120 минут, более предпочтительно от 5 до 80 минут. Концентрация этанола в водном растворе этанола конкретно не ограничена; однако предпочтительно она составляет от 10 до 70% (об./об.), более предпочтительно от 30 до 60%.
В качестве ускорителя продуцирования катехоламина, терапевтическое средство, профилактическое средство и пищевую композицию по настоящему изобретению, супернатант, получаемый из воды или водного раствора этанола, в котором растворяют лиофилизированного перемолотого земляного червя, как описано выше, можно использовать как есть в состоянии водного раствора или можно использовать в форме концентрата после испарения воды из него. Супернатант также можно сушить для использования в порошкообразной форме, и порошок, полученный посредством сушки супернатанта, можно растворять в воде для использования. Кроме того, порошок, полученный посредством лиофилизации пасты из земляного червя, можно использовать как есть, без растворения в воде или водном растворе этанола.
Кроме того, в настоящем изобретении, в качестве способа удаления, перед обработкой, при которой помещают живых земляных червей в неприятную среду, то есть, перед приведением живых земляных червей в контакт с хлоридом металла или гидроксикарбоновой кислотой как описано выше, предпочтительно переносить живых земляных червей в плоскую коробку, такую как хлебный ящик, и оставлять стоять в течение от 10 до 50 часов в ярком месте, после чего следует удаление загрязнений, прилипающих к коже земляных червей. Длительность пребывания живых земляных червей в ярком месте более предпочтительно составляет от 12 до 24 часов. В этом процессе предпочтительно количество живых земляных червей, содержащихся в плоской коробке, представляет собой такое количество, что земляные черви наслоены до толщины от 30 до 60 мм, предпочтительно от 40 до 50 мм. Следует заботиться о том, чтобы плоская коробка не содержала инородного вещества, такого как песок или глина, и поскольку земляные черви представляют собой ночных животных и, таким образом, активны в своих жизненных активностях в темном месте и это может вести к их физическому истощению, предпочтительно использовать способ культивирования на свету или тому подобное в течение ночи с тем, чтобы содержать плоскую коробку в ярких условиях. Такая обработка заставляет живых земляных червей проявлять свой инстинкт самосохранения и пытаться поддерживать свою среду обитания посредством экскреции переваренного вещества, остающегося в их пищеварительных трактах, покрывая все свое тело экскрементами и, тем самым, предотвращая испарение воды. Таким образом, повторно удаляя это покрывающее загрязнение, а именно экскременты, с помощью подходящего средства можно в конечном итоге удалять переваренное вещество в пищеварительных трактах земляных червей и загрязнения, прилипающие к их коже.
Загрязнения, прилипающие к коже земляных червей можно устранять, например, покрывая живых земляных червей нетканым текстилем и позволяя загрязнениям адсорбироваться на материи. Выполняя этот процесс, в котором земляных червей оставляют в ярком месте и удаляют загрязнения, прилипающие к их коже, в комбинации с описанным выше процессом приведения земляных червей в контакт с хлоридом металла и/или гидроксикарбоновой кислотой, можно ожидать дополнительной экскреции и удаления токсичных веществ, содержащихся в теле земляных червей.
В настоящем изобретении, в качестве способа получения сухого порошка земляного червя следующие способы предпочтительны, в частности, с точки зрения стабильности хранения получаемого сухого порошка.
(A-1) Способ получения сухого порошка земляного червя, способ включает стадии:
приведение живого земляного червя в контакт с хлоридом по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и
впоследствии приведение живого земляного червя в контакт с гидроксикарбоновой кислотой в форме порошка, разведение получаемого водой для того, чтобы корректировать pH от 2 до 5, сохранение получаемого разведения в течение от 3 до 180 минут, промывание живого земляного червя водой, перемалывание живого земляного червя и затем лиофилизация полученного таким образом измельченного продукта.
(A-2) Способ получения сухого порошка земляного червя, способ включает стадии:
приведение живого земляного червя в контакт с хлоридом(хлоридами) металла(металлов), выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и
впоследствии погружение и сохранения живого земляного червя в течение от 3 до 180 минут в водном растворе гидроксикарбоновой кислоты, имеющем скорректированный pH от 2 до 5, промывание живого земляного червя водой, перемалывание живого земляного червя и затем лиофилизация полученного таким образом измельченного продукта.
(A-3) Способ получения сухого порошка земляного червя согласно описанным выше (A-1) или (A-2), который дополнительно включает стадии: растворение лиофилизированного таким образом измельченного продукта в воде или водном растворе этанола; удаление или отделение нерастворимых фракций; и затем дополнительная лиофилизация получаемого.
Кроме того, после лиофилизации измельченного продукта, полученного посредством перемалывания живого земляного червя, с точки зрения стерилизации получаемого высушенного продукта, высушенный продукт предпочтительно термически обрабатывают при температуре 110°C или выше, но ниже чем 130°C. Когда температура нагрева составляет ниже чем 110°C, высушенный продукт может быть не достаточно стерилизован, тогда как при температуре нагрева 130°C или более происходит инактивация ферментов, содержащихся в высушенном продукте из земляного червя, и, таким образом, снижение их активности, что не является предпочтительным. Температура нагрева предпочтительно составляет от 115 до 125°C. Способ нагрева конкретно не ограничен, и его примеры включают способ дутья горячим воздухом; способ с использованием нагревательной рубашки; способ нагрева субъекта на лотке или тому подобное с использованием нагревателя; и способ с использованием термостатного инкубатора. Время нагрева предпочтительно составляет от 30 секунд до 130 минут, более предпочтительно от 30 минут до 90 минут, еще более предпочтительно от 60 минут до 90 минут. Чрезмерно короткое время нагрева может вести к недостаточной стерилизации, тогда как чрезмерно длительное время нагрева может вызывать потерю активности ферментов, ни одно из этого не является предпочтительным. Когда ферменты, содержащиеся в жидкости, подвергают описанной выше тепловой обработке, происходит утрата активности ферментов; следовательно, в настоящем изобретении предпочтительно использовать сухой порошок земляного червя.
В настоящем изобретении, в качестве способа получения измельченного продукта земляного червя предпочтительны следующие способы.
(B-1) Способ получения измельченного продукта земляного червя, способ включает стадии:
приведение живого земляного червя в контакт с хлоридом по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и
впоследствии приведение живого земляного червя в контакт с гидроксикарбоновой кислотой в форме порошка, разведение получаемого водой для того, чтобы корректировать pH от 2 до 5, сохранение получаемого разведения в течение от 3 до 180 минут, промывание живого земляного червя водой и затем перемалывание живого земляного червя.
(B-2) Способ получения измельченного продукта земляного червя, способ включает стадии:
приведение живого земляного червя в контакт с хлоридом(хлоридами) металла(металлов), выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и
впоследствии погружение и сохранение живого земляного червя в течение от 3 до 180 минут в водном растворе гидроксикарбоновой кислоты, который имеет скорректированный pH от 2 до 5, промывание живого земляного червя водой и затем перемалывание живого земляного червя.
В настоящем изобретении, в качестве способа получения экстракта земляного червя предпочтительны следующие способы.
(C-1) Способ получения экстракта земляного червя, способ включает стадии:
приведение живого земляного червя в контакт с хлоридом по меньшей мере одного металла, выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и
впоследствии приведение живого земляного червя в контакт с гидроксикарбоновой кислотой в форме порошка, разведение получаемого водой для того, чтобы корректировать pH от 2 до 5, сохранение получаемого разведения в течение от 3 до 180 минут, промывание живого земляного червя водой, перемалывание живого земляного червя, лиофилизация получаемого измельченного продукта, растворение лиофилизированного таким образом продукта в воде или водном растворе этанола и затем удаление или отделение нерастворимых фракций.
(C-2) Способ получения экстракта земляного червя, способ включает стадии:
приведение живого земляного червя в контакт с хлоридом(хлоридами) металла(металлов), выбранного из группы, состоящей из калия, натрия, магния и кальция; и
впоследствии погружение и сохранение живого земляного червя в течение от 3 до 180 минут в водном растворе гидроксикарбоновой кислоты, который имеет скорректированный pH от 2 до 5, промывание живого земляного червя водой, перемалывание живого земляного червя, лиофилизация получаемого измельченного продукта, растворение лиофилизированного таким образом продукта в воде или водном растворе этанола и затем удаление или отделение нерастворимых фракций.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение далее описан более подробно в виде его примеров. Однако настоящее изобретение не ограничено следующими примерами каким-либо образом. Следует здесь отметить, что все использованные далее «%» приведены по массе, если не указано иное.
[Получение сухого порошка земляного червя]
После пребывания 30 кг живых красных земляных червей (Lumbricus rubellus) в ярком месте в течение 24 часов и удаления загрязнений, прилипающих к их коже, живых красных земляных червей распределяли толщиной приблизительно 5 см на плоском лоте и на них равномерно высыпали 250 г хлорида натрия. Земляных червей промывали водой через 20 минут после этого. Затем, через 15 секунд после высыпания 250 г лимонной кислоты на земляных червей аналогичным образом, туда добавляли 30 л чистой воды для разведения. В этом процессе pH получаемого раствора составлял 2,25 незамедлительно после добавления воды и 2,74 после завершения разведения. Когда посыпают порошком лимонной кислоты, земляные черви немедленно экскретировали желтое текучее вещество организма. После разведения водой, земляных червей сохраняли в этом состоянии в течение 20 минут. Затем живых земляных червей извлекали из получаемого загрязненного водного раствора лимонной кислоты, промывали водой и впоследствии перемалывали при 10°C с использованием гомогенизатора для того, чтобы получать пасту из земляного червя. Затем, после того, как эту пасту из земляного червя подвергали вакуумной дегазации с тем, чтобы удалять газы, содержащиеся в ней, пасту из земляного червя переносили в лоток из нержавеющей стали, где пасту из земляного червя очень быстро охлаждали до -35°C и сохраняли при этой температуре в течение 50 часов для медленного замораживания. Замороженную таким образом пасту из земляного червя сохраняли при -35°C под давлением 0 Па в течение 2 часов. После этого, пасту из земляного червя нагревали и сушили при 25°C под давлением 40 Па в течение 10 часов, при 40°C под давлением 35 Па в течение 14 часов и затем при 65°C под давлением 35 Па в течение 12 часов и, наконец, получаемое сохраняли при температуре 80°C и давлении 25 Па в течение 6 часов, тем самым лиофилизируя в вакууме пасту из земляного червя. Посредством этой обработки получали бледно-желтый сухой порошок земляного червя, имеющий содержание воды 8% по массе.
Полученный таким образом сухой порошок земляного червя термически обрабатывали с использованием нагревательного аппарата RM-50D (производства Okawara MFG. CO., Ltd.). Что касается условий нагрева, сухой порошок земляного червя нагревали до 120°C в течение периода 90 минут, поддерживали при 120°C в течение 20 минут и затем охлаждали до 40°C в течение периода 240 минут. После этого вынимали сухой порошок земляного червя.
Термически обработанный таким образом сухой порошок земляного червя растворяли в 50% водном растворе этанола так, что достигали соотношения этанол:лиофилизированный порошок 20:1 (об./масс.), и получаемый раствор встряхивали в течение 1 часа на 1500 об./мин при комнатной температуре (25°C). Затем раствор центрифугировали в течение 15 минут при 4°C и 10000×g и получаемый супернатант отделяли и концентрировали в вакууме при 75°C в течение 15 минут. Этот супернатант переносили в лоток из нержавеющей стали, где супернатант очень быстро охлаждали до -35°C и сохраняли при этой температуре в течение 50 часов для медленной заморозки. Замороженную таким образом пасту из земляного червя сохраняли при -35°C под давлением 0 Па в течение 2 часов. После этого пасту из земляного червя нагревали и сушили при 25°C под давлением 40 Па в течение 10 часов, при 40°C под давлением 35 Па в течение 14 часов и затем при 65°C под давлением 35 Па в течение 12 часов и, наконец, получаемое сохраняли при температуре 80°C и давлении 25 Па в течение 6 часов, тем самым лиофилизируя в вакууме пасту из земляного червя, чтобы получать сухой порошок земляного червя A-1.
[Культивирование хромаффинных клеток надпочечника коровы]
Хромаффинные клетки надпочечника коровы, выделенные из мозгового вещества надпочечника коровы культивировали в течение 48 часов в среде для культивирования (37°C). В эмбриогенезе хромаффинные клетки надпочечника образуются из нервного гребня; следовательно, их часто используют в качестве модели нейрона.
[Измерение секреции катехоламина]
6
6
Среду для культивирования культивированных таким образом хромаффинных клеток надпочечника коровы (4×10 клеток: чашка 35 мм) заменяли на 1 мл раствора KRP (фосфатный буфер Кребса-Рингера), в котором сухой порошок земляного червя A-1, который получали выше, растворяли в концентрации 0, 0,1, 1, 10 или 100 мкг/мл и получаемое культивировали при 37°C в течение 5 минут. Из каждого раствора KRP, использованного для этого культивирования, в котором растворяли сухой порошок земляного червя, собирали только раствор в количестве 0,1 мл и в него добавляли 0,1 мл 0,2 Н перхлорной кислоты и 0,2 мл 3,4-дигидроксибензиламина (DHBA) с тем, чтобы определять количество секреции катехоламина с использованием ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) и COULOCHEM II производства ESA (электрохимический детектор). На фиг. 1 представлены результаты вычисления количества секреции катехоламина, принимая количество катехоламина в хромаффинных клетках надпочечника коровы (4×10 клеток), которые культивировали при 37°C в течение 5 минут с 0 мкг/мл сухого порошка земляного червя A-1, за 100%.
[Измерение внутриклеточной концентрации кальция]
6
Среду для культивирования хромаффинных клеток надпочечника коровы, которые культивировали выше (4×10 клеток: чашка 35 мм), заменяли на 1 мл раствора KRP, в который добавляли Fluo-4-AM производства Dojindo Laboratories, Ltd. В конечной концентрации 5 мкмоль/мл, и получаемое культивировали при 37°C в течение 30 минут. После этого, культуральную чашку фиксировали на аппарате обратного потока под флуоресцентным микроскопом и осуществляли обратной поток с использованием растворов KRP, в каждом из которых растворяли сухой порошок земляного червя A-1, который получали выше, в концентрации 0, 1, 10 или 100 мкг/мл. Фотографии каждой культуральной чашки делали с интервалами 5 секунд от начала обратного потока и измеряли интенсивность флуоресценции всей фотографии на пике интенсивности флуоресценции (488 нм). На фиг. 2 представлены фотографии, сделанные на пике интенсивности флуоресценции, и на фиг. 3 представлены результаты сравнения измеренных образом интенсивностей флуоресценции, принимая интенсивность флуоресценции, которую определяли на ее пике для культуры, в которую подавали обратный поток с 0 мкг/мл сухого порошка земляного червя A-1, за 100%.
Здесь следует отметить, что известно, что в хромаффинных клетках надпочечников и нервных клетках увеличение внутриклеточной концентрации кальция содействует праймированию катехоламин-содержащих секреторных везикул (слияние мембран секреторных везикул) и тем самым индуцирует секрецию катехоламина.
[Фосфорилирование тирозингидроксилазы]
6
6
Среду для культивирования хромаффинных клеток надпочечника коровы, которые культивировали выше (4×10 клеток: чашка 35 мм), заменяли на 1 мл раствора KRP (фосфатный буфер Кребса-Рингера), в котором растворяли сухой порошок земляного червя A-1, который получали выше, в концентрации 0 или 100 мкг/мл и получаемое культивировали при 37°C в течение 5 минут. Затем, после промывания клеток раствором PBS(-) (4°C), только клетки (4×10 клеток) быстро собирали и обнаруживали фосфорилирование тирозингидроксилазы (TH) с помощью Вестерн-блоттинга. Его результаты представлены на фиг. 4.
Здесь следует отметить, что тирозингидроксилаза представляет собой фермент, который ограничивает скорость биосинтеза катехоламинов, и увеличение внутриклеточной концентрации кальция вызывает фосфорилирование и активацию тирозингидроксилазы.
Как ясно видно на фиг. 1, по сравнению с контролем (раствор KRP, не содержащий сухого порошка земляного червя), сухой порошок земляного червя значительно увеличивал секрецию катехоламина на 85% в концентрации 100 мкг/мл. Как ясно видно на фиг. 2 и 3, сухой порошок земляного червя также увеличивал внутриклеточный кальций по сравнению с контролем. На фиг. 4 ясно видно, что сухой порошок земляного червя увеличивал фосфорилирование (pSer-TH) остатков серина (19, 31 и 40 остатки серина) тирозингидроксилазы, которая является ферментом, ограничивающим скорость биосинтеза катехоламинов, и это приводило к увеличению активности тирозингидроксилазы.