ПЛОДОВО-ЯГОДНЫЙ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКТ С ПРОТИВОМИКРОБНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРОТИВ HELICOBACTER PYLORI
FRUIT-AND-BERRY FOOD PRODUCT WITH ANTI-MICROBIAL EFFECT AGAINST HELICOBACTER PYLORI

Область техники
Изобретение относится к производству функциональных продуктов питания, конкретно, к продукту с противомикробным действием против Helicobacter pylori.
Уровень техники
H.pylori вызывает различные повреждения зон желудка и двенадцатиперстной кишки. Это приводит к хроническим воспалительным процессам слизистой оболочки, которые вызывают язвенную болезнь двенадцатиперстной кишки и желудка, а также повышает риск развития рака желудка (Schreiber S., Konradt М., Groll С., Scheid P., Hanauer G., Werling H-O., Josenhans C, Suerbaum S. The spatial orientation of Helicobacter pylori in the gastric mucus. PNAS. 2004; 101 (14): 5024-5029). H.pylori - это единственный известный микроорганизм, который колонизирует в такой агрессивной среде, как секрет желудка. Для защиты от соляной кислоты H.Pylori в большом количестве синтезирует уреазу, которая расщепляет мочевину до окиси углерода и аммония, которые, в свою очередь, образуют щелочный гидроксид аммония и нейтрализует соляную кислоту. Инфекция H.Pylori затрагивает примерно 50% жителей Земли (Perry S. et al. Gastroenteritis and transmission of Helicobacter pylori infection in households. Emerg. Infect. Dis. 2006; 12 (11): 1701-1708). Обычно инфекция появляется уже в раннем детском возрасте (Sabbi Т. et al. Helicobacter pylori infection in childremmanagement and pharmacotherapy. Expert Opin. Pharmacother. 2008; 9 (4): 577-585) и сохраняется всю жизнь.
Лечение обычной пептической язвы, вызванной H.pylori, начинают с комбинированной трехкомпонентной терапии: ингибиторами протонных насосов и комбинированным антибактериальным лечением амоксицилином и кларитромицином. При развитии резистенции к антибиотикам применяют препараты висмута (Fischbach L., Evans E.L. Meta-analysis: the effect of antibiotic resistance status on the efficacy of triple and quadruple first-line therapies for Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 2007; 26 (3): 343-357). В последние годы резко увеличилась частота резистентности H.pylori к наиболее часто применяемым в терапии упомянутым антибактерицидным средствам (Qasim А., O'Morain С.A. Review article: treatment of Helicobacter pylori infection and factors influencing eradication. Alinment. Pharmacol. Ther. 2002; 16 (1): 24-30). Обширная география распространения H.pylori, всеохватывающий возрастной диапазон пациентов, часто встречающаяся резистентность к антибиотикам, их непереносимость, высокий риск инфицирования в бытовых условиях, рецидивы патологии серьезно затрудняют фармакотерапию упомянутой инфекции. Длительное лечение обременительно, особенно для детей, и характеризуется невысокой готовностью полностью выполнять лечебные рекомендации. Вышесказанное подтверждает мнение о необходимости поиска новых возможностей терапии, альтернативных антибиотикам (Carson C.F., Riley T.V. Non-antibiotic therapies for infectious diseases. Commun. Dis. Intell. 2003; 27 (1): 143-146), для полной или частичной их замены или усиления эффективности. Уже сам факт, что H.pylori колонизирует в пищеварительном тракте, наводит на мысль о возможной связи как развитие, так и лечение соответствующей болезни с пищей. В течение последних 10 лет доказано, что в повышении эффективности фармакотерапии хеликобактериоза большую роль могут играть функциональные продукты питания.
В производстве функциональных продуктов питания с противомикробным действием используют различные биологически активные вещества и композиции - пробиотические бактерии, экстракты растений и. т.п.
Хорошо известна способность кисломолочных бактерий эффективно противодействовать Helicobacter pylori. Lactococcus lactis, Lactobacillus acidophilus оказывают высокую противомикробную активность против Н.pylori (патентная заявка KR 20040044300, опубл. 28.05.2004; патент RU 2253672, опубл. 10.06.2005). Известны растения, содержащие эфирные масла, обладающие противомикробным действием против Н.pylori: болгарская эфиромасличная роза (патент BG 62354, опубл. 30.09.1999), Alpinae Katsumadai Semer. (патентная заявка JP 11001429, опубл. 06.01.1999), а также имбирь (патентная заявка KS 2009104293, опубл. 23.04.2009). В растительных композициях китайской медицины (патентная заявка CN 101284069, опуб. 15.10.2008; патентная заявка KR 20040003200, опуб. 13.01.2004) в качестве одного из популярнейших компонентов используют зеленый чай, который также используют и отдельно, в чистом виде. Функциональность чая выражается в антиоксидантном действии, способности ингибировать пролиферацию и адгезию клеток патогенных микробов к слизистым организма хозяина. Такую активность определяют катехины, полифенолы. Принято считать, что регулярное употребление зеленого чая на завтрак эффективно уничтожает Н.pylori, в основном благодаря полифенолам, которые действуют подобно ингибитору протонного насоса (патентная заявка JP 2002068992, опуб. 08.03.2002). Экстракт зеленого чая способен ингибировать активность уреазы (патентная заявка KR 20060122439, опуб. 30.11.2006).
При рекомендации больным хеликобактериозом функциональных продуктов питания с противомикробным действием необходимо учитывать традиции питания, внешний вид и форму готового продукта, органолептические особенности. В противном случае трудно обеспечить высокую готовность пациентов, особенно детей, выполнять все лечебные предписания. Имеются основания считать, что специфическая активность продуктов питания зависит от фармакогенетических факторов. С точки зрения генетической вариабельности H.pylori подразделяется на семь популяций и субпопуляций с четко выявляемой географией распространения. Пути распространения микроорганизма в мировом масштабе совпадают с путями миграции человека последние десять тысяч лет (Falush D. et al. Traces of human migrations in Helicobacter pylori infections. Science, 2003; 299 (5612): 1582-1585).
В производстве антибактериальных средств логично использовать растения местной флоры. Основываясь на вышеупомянутых фактах, можно предположить, что плоды и ягоды могли бы быть лучшими компонентами, которые можно было бы использовать при разработке функциональных продуктов питания с антимикробным действием против H.pylori. Данные научной литературы и патентных документов свидетельствуют о возможности разработки таких продуктов. Относительно растений северного и западного региона Европы наибольший объем информации связан с клюквой, черникой, клубникой, черной смородиной, брусникой. Хорошо известна способность продуктов, приготовленных из абрикосов (Prunus mume Sieb et Zucc.) уменьшать риск рака желудка, которую объясняют активностью против H.pylori (Otsuka Т. et al. Suppresive effects of fruiy-juice concentrate of Prunus Mume sieb. Et Zucc. (Japanese apricot, Ume) on Helicobacter pylori-induced glandular stomach lesions in mongolian gerbils. Asian Pacific J. Cancer Prevent., 2005; 6: 337-341). В данном аспекте в качестве золотого стандарта принята клюква, которую широко используют в различных видах (Shmuely Н. et al. Effect of cranberry juice on eradication of Helicobacter pylori in patients treated with antibiotics and a proton pump inhibitor. J. Nutr. Food Res., 2007; 51 (6): 746-751). Регулярное потребление клюквенного сока в ходе исследований в Китае в три раза снижало превалирование хеликобактериоза (Zhang L. et al. Efficacy of cranberry juice on Helicobacter pylori infection: randomised placebo-controlled trial. Helicobacter., 2005; 10 (2): 139-145).
Известно, что противомикробное действие плодов и ягод связано с рядом их компонентов прежде всего - с органическими кислотами. Обеспечивая низкий pH пищи, органические кислоты, подобно соляной кислоте, секретируемой желудком, угнетают Н.pylori. В целях профилактики и лечения хеликобактериоза можно также использовать некоторые цитраты (международная патентная заявка № WO 9809652, опуб. 12.03.1998). Однако имеются основания считать, что хотя концентрация ионов Н+ сама по себе играет важную роль, она не является главенствующим фактором. Несмотря на высокое содержание бензойной кислоты в клюкве, бактерицидное воздействие этих ягод связывают с крупномолекулярной фракцией сока, в которую кислоты не входят (Burger О. et al. Inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric mucus by a high-molecular-weight constituent of cranberry juice. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2002; 42 (3): 279-284). Из сказанного можно сделать вывод, что органические кислоты клюквы нельзя причислить к основным компонентам, которые определяют действие этих ягод против Н.pylori.
Аскорбиновая кислота - составная часть многих растений, употребляемых в пищу, теоретически могла бы претендовать на роль важного агента, подавляющего Н.pylori. Возможно, обеспечение адекватного потребления витамина C с фруктами и овощами объясняет относительно низкую частоту проявления негативных последствий хеликобактериоза в южно-европейских странах (Koletzko S. et al. Prospective multicentre study on antibiotic resistance of Helicobacter pylori strains obtained from children living in Europe. Gut, 2006; 55 (12): 1711-1716). В исследовании Жанг X.M. и со-авторов (Zhang Н.М. et. al. Vitamin С inhibits the growth of a bacterial risk factor for gastric carcinoma: Helicobacter pylori. Cancer, 1997; 80 (10): 1897-1903) было продемонстрировано, что аскорбиновая кислота в высокой концентрации 128-2048 мкг/мл ингибирует рост на агаре 90% от числа изученных 64 H.pylori штаммов, независимо от pH питательной среды и что ее высокая доза (10 мг на животное в день) подавляет колонизацию Н.pylori на модели хеликобактериоза у грызуна Meriones unguiculatus.
Однако в наше время выращиваемых плодах и ягодах нельзя идентифицировать какой-то один компонент, который был бы «ответственен» за наблюдаемое противомикробное воздействие. Скорее всего, следует думать действии комплекса соединений.
Ягоды богаты различными фенольными соединениями, которые классифицируют на 4 группы: флавониды, феноловые кислоты, лигнаны и таннины (Nohynek L.J. et al. Berry phenolic: antimicrobial properties and mechanisms of action against severe human pathogens. Nutr. Cancer, 2006; 54 (1): 18-32). Все эти вещества обладают положительным влиянием на здоровье. Особо активный флавоноид антоцианин содержится в чернике, красной смородине, аронии, клубнике, малине.
С полифенолами связывают противомикробное действие фракции яблочного сока (патентная заявка JP 11180888, опуб. 06.07.1999), а также способность водного экстракта кожуры яблок сорта Granny Smith ингибировать синтез уреазы в клетках H.pylori in vitro (Pastene E. et al. Association between polymerisation degree of apple peel polyphenols and inhibition of Helicobacter pylori urease. J. Agric. Food Chem., 2009; 57: 416-424). Интересное исследоване провели итальянские коллеги. Противомикробная активность против H.pylori была отмечена у экстрактов пульпы и кожуры плодов Cydonia oblonga Miller. Концентрация фенольных соединений в пульпе и кожуре отличается не только количественно, (37-47 и 105-157 мг/100 свежей массы), но и качественно; был отмечен синергизм этих веществ в отношении противомикробной активности (Fattouch S. et al. Antimicrobial activity of Tunisian quince (Cydonia olonga Miller) pulp and peel popyphenolic extracts. J. Agric. Food Chem., 2007; 55 (3): 963-969). Известно противомикробное действие клюквы, морошки, малины, земляники и черники против сальмонеллы и стафилококка благодаря высокому содержанию в ягодах фенольных соединений (Puupponen-Pumia R. et al. Bioactive berry compounds - novel tools against human pathogens (mini-review). Appl. Microbiol. Biotechnol., 2005; 67: 8-18).
Для достижения противомикробного эффекта не всегда возможно использовать ягоды в свежем виде, без обработки. Например, длительное употребление клюквы, которую используют для лечения инфекций мочевыводящих путей, увеличивает риск уролитиаза (Terris М.К. et al. Dietary supplementation with cranberry concentrate tablets may increase the risk of nephrolithiasis. Urology, 2001; 54 (1): 26-29).
В связи с тем, что полифенолы считаются ключевыми соединениями, определяющими противомикробное действие плодов и ягод, большое внимание при разработке соответствующих продуктов уделяется выделению этих веществ (патентная заявка JP 11180888, опуб. 06.07.1999). Учитывая тот факт, что включение в рацион продуктов, содержащих полифенолы (например, зеленый чай), не обеспечивает необходимое противомикробное действие, авторы предлагают выделять полифенольные соединения из плодов растений рода Rosaceae и их соков. Для получения композиции активных веществ используют экстракцию органическими растворителями и дальнейшую сушку. Полифенольную смесь, выделенную из яблок, груш и персиков используют как в производстве лекарств, так и различных продуктов питания.
На тех же теоретических принципах основывается патентная заявка US 2003/0161897 опуб. 28.08.2003, в которой, в качестве противомикробных средств, предложены концентраты полифенольных пигментов (антоцианов) клюквы, черники/голубики, винограда и аронии. Согласно этому изобретению, комплекс биологически активных веществ экстрагируют из выраженно пигментированных (желто-сине-красных) растений и ягод при помощи поливинилпирролидона (ПВП) или растворенного в воде поливинилового спирта. Полимер добавляют к плодовым сокам или пульпе и, после адсорбции пигмента, комплекс отделяют от смеси. Манипулируя растворами поваренной соли в воде и ПВП, получают концентрат пигмента/ПВП, которому присуще противовирусное и противомикробное действие.
Два последних изобретения объединяет общая концепция относительно активности полифенолов как главных компонентов с противомикробным действием. Однако механизмы, обеспечивающие способность компонентов плодов и ягод к эрадикации H.pylori, все еще неизвестны. Это относится как к активным против Н.pylori растениям - клюкве (Burger О. et al. Inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric mucus by a high-molecular-weight constituent of cranberry juice. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2002; 42 (3): 279-284), так и к другим растениям. Среди факторов, определяющих противомикробное действие плодов и ягод, не только фенольные соединения. Например, определенную роль играют органические кислоты, определяющие pH соответствующих соков.
В нашем исследовании in vitro продемонстрировано, что бактерицидное действие арониевого, клюквенного и цидониевого сока против Н.pylori уменьшается при повышении pH, достигаемого добавлением щелочных солей (Babarikina A. et al. Helicobacter pylori: food compounds antimicrobial activity in vitro. Baltic conference on food science and technology. Kaunas, 2009; 27).
Ягоды содержат целый ряд других биологически-активных веществ, способствующих улучшению здоровья. Клюква, клубника содержат главное соединение класса фитоэстрогенов растений - лигнаны (Mazur W.M. et al. Phyto-oestrogen content of berries, and plasma concentrations and urinary excretion of enterolactone after a single strawberry-meal in human subjects. Br. J. Nutr., 2000; 83: 381-387). Чернику используют при гастроинтестинальных нарушениях, клюква - хорошо известное средство для лечения инфекций мочевыводящих путей.
Состав плодов и ягод различен, идентифицировать все вещества со специфическим противомикробным воздействием сложно и дорого. Поэтому, в оздоровительных целях логичными кажутся попытки готовить комбинации компонентов различных плодов и ягод. Такая известная биологически активная пищевая добавка, как OptiBerry (экстракт дикорастущей брусники, клубники, клюквы, дикорастущей черники, бузины, малины) in vitro показала большую активность против Н.pylori, чем экстракты отдельных ягод, а также повысила чуствительность микроорганизмов к кларитромицину (Chatterjee A. et al. Inhibition of Helicobacter pylori in vitro by various berry extracts, with enhanced susceptibility to clarithromycin. Mol. Cell Biochem., 2004; 265 (1-2): 19-26).
Широкий спектр факторов противомикробного действия продуктов питания обеспечивает спектр используемых ботанических видов и их географическое происхождение, синергизм действия, способность влиять на функции желудочно-кишечного тракта, способствующая избавлению от хеликобактериоза, а также готовность пациентов выполнять лечебные рекомендации.
Раскрытие изобретения
Целью изобретения является разработка функционального продукта питания (десерта) с противомикробным действием против Н.pylori из растений и ягод, произрастающих в регионе Балтийского моря.
Поставленную цель достигают путем приготовления композиции веществ, которая подавляет патогенную микрофлору кишечника, защищает слизистую оболочку органов пищеварительного тракта от воздействия агрессивных факторов, не выходя за рамки регуляций физиологических процессов. Композицию веществ, полученную согласно предлагаемому изобретению, используют в производстве пищевого продукта (десерта). Данную композицию веществ готовят из цидониевого сока, концентрата арониевого сока (предпочтительно из концентрата сока в пятикратном усилении) и клюквенного сока, к которому добавляют экстракт зеленого чая и витамин C, бензоат натрия и сахар. Далее полученную смесь нагревают, добавляя суспензию кукурузного крахмала в водном экстракте яблочного жмыха и водный экстракт аирного корня. Продукт, перемешивая, доводят до желеобразной консистенции и охлаждают. В результате получают функциональный продукт питания (десерт) с противомикробным воздействием против Н.pylori.
В другом воплощении изобретения на этапе приготовления смеси плодового и ягодного сока к разогретому концентрату арониевого сока добавляют суспензию кукурузного крахмала в водном экстракте яблочного жмыха и, после образования желе, в смесь добавляют цидониевый сок, клюквенный сок, экстракт зеленого чая, водный экстракт аирного корня, витамин C, бензоат натрия и сахар.
Перед разработкой нового продукта были проведены эксперименты в следующем порядке: in vitro скрининг природных веществ, оценка in vitro специфической активности четырех приготовленных вариантов продукта, изучение специфической активности двух вариантов готового продукта in vivo на мышах.
В серии экспериментов было протестировано 99 веществ: соки плодов и ягод, органические кислоты, экстракты лекарственных растений, молочные продукты, продукты пчеловодства. В ходе исследований были выбраны следующие компоненты: клюквенный, цидониевый, арониевый сок, водные экстракты зеленого чая, яблочного жмыха и аирного корня, аскорбиновая кислота, бензоат натрия, а также сахар и кукурузный крахмал. Растительные экстракты, за исключением зеленого чая, были произведены из растений, произраставших в Латвии (в Курземском регионе) Их характеристики указаны в таблице 1.
В экспериментах был использован стандартный штамм Н.pylori - АТСС 43504, который выделен из изолята слизистой оболочки желудка человека. Суспензию бактерий нанесли на субстрат из колумбийского кровяного агара (Columbia blood agar base) и выращивали 3 дня при 37°C в анаэробных условиях. Отбор первичных компонентов нового продукта производили на основании результатов метода диффузии в агаре. Принцип метода диффузии в агаре основывается на способности исследуемого вещества диффундировать в агар и подавлять рост микроорганизмов, создавая зоны ингибирования, у которых измеряется диаметр. Результаты тестирования веществ методом диффузии в агаре показаны в таблице 1.
Таблица 1
Противомикробное действие некоторых веществ и их комбинаций на H.pylori in vitro (метод диффузии в агаре).
Тестируемое вещество или композиция и ее характеристика
Концентрация
pH
Диаметр зоны ингибирования см*
Цидониевый сок {Cydonia oblonga)
100%
неразбавленный
2,81
1,9
Цидониевый сок {Cydonia oblonga)
100%
х 2 разбавленный
2,82
1,2
Клюквенный (культивированной) сок
100%
неразбавленный
2,51
1,9
Клюквенный (дикорастущей) сок
100%
не разбавленный
2,85
1,9
Арониевый сок
100%
неразбавленный
3,83
1,0
Арониевый сок
100%
x 5 разбавленный
3,90
-
Концентрат арониевого сока
100%
концентрат в пятикратном усилении (х5)
3,75
1,2
Цидониевый сок + клюквенный сок
100%/100%
1:1
2,53
1,85
Цидониевый сок + водный экстракт аирного корня
100%/8%
1:1
2,70
1,55
Цидониевый сок+ арониевый сок
100%/100%
1:1
2,94
1,6
Цидониевый сок + водный экстракт яблочного жмыха (10%)
100%/10%
1:1
2,65
1,2
* средний результата трех повторений
Для последующих исследований были подготовлены четыре варианта готового продукта (таблица 2).
Таблица 2
Варианты готового плодово-овощного пищевого продукта.
Код продукта
Компоненты
Кол-во компонентов (массовые доли %)
Вариант A
Клюквенный сок
83,2%
Сахар
16,8%
Вариант B
Цидониевый сок
51,5%
Арониевый сок
12,1%
Клюквенный сок
20,2%
Сахар
16,2%
Вариант C
Цидониевый сок
25,3975%
Арониевый сок
9,5%
Клюквенный сок
14,9%
10% экстракт яблочного жмыха
25,4%
Сахар
24,8%
Аскорбиновая кислота
4 мг/100 г
Бензоат натрия
150 мг/100 г
Вариант D
Цидониевый сок
33,2975%
Концентрат арониевого сока (х5)
7,5%
Клюквенный сок
12,9%
10% водный экст. яблочного жмыха
19,9%
Сахар
19,5%
8% водный экстракт аирного корня
6,3%
Экстракт зеленого чая
0,6%
Аскорбиновая кислота
4 мг/100 г
Бензоат натрия
150 мг/100 г
Вышеуказанные варианты готового продукта были проанализированы методом определения минимальной ингибирующей концентрации. В питательную среду (питательный бульон с дефибринированной кровью) добавляют тестируемое вещество в трех различных концентрациях и суспензию H.pylori, инкубируют 24 часа при 37°C. После инкубации разведенные образцы сеют на питательную среду колумбийского кровяного агара, еще раз инкубируют в течение 24-48 часов, считают колонии и рассчитывают число единиц, образующих колонии (КОЕ).
В плане противомикробной активности анализируемые образцы, в нисходящем порядке, можно расположить следующим образом:
7
7
7
В (0,1×10 КОЕ/мл)>D(0,4×10 КОЕ/мл)>С(0,8×10 КОЕ/мл)>А
7
(0,9×10 КОЕ/мл). Таким образом, специфическая активность клюквенного сока была ниже, чем у комбинации других компонентов.
Перед началом следующего этапа исследований было необходимо решить вопрос консистенции создаваемого продукта, который был сформулирован следующим образом: какие компоненты необходимо включить в рецептуру, чтобы продлить время нахождения продукта в желудке и повысить адгезию десерта к слизистым. Как известно, повышение энергетической ценности пищи подавляет эвакуативную функцию желудка (Murray R. The effects on consuming carbohydrate - electrolyte beverages on gastric emptying and fluid absorption during and following exercise. Sports Med., 1987, 4, 5, 322-51). Для этой цели, учитывая специфику продукта (десерт), был выбран сахар.
Для улучшения адгезии используют ряд гелеобразующих веществ: производные хитозана, пектина, гиалуроновой кислоты, тиолированные полимеры ("thiomers") и другие. Традиционно в производстве ягодных и/или плодовых десертов крахмал является одним из наиболее популярных гелеобразующих компонентов, в частности кукурузный крахмал, который дешевле картофельного. В состав нового продукта включен модифицированый кукурузный крахмал, который используют для загущения варенья.
Для оценки противомикробной активности in vivo были выбраны варианты продукта с наиболее высокой эффективностью in vitro (таблица 3).
Таблица 3
Варианты готовой формы пищевого продукта (десерта) с наиболее высоким противомикробным воздействием in vitro.
Код продукта
Рецептура
Кол-во компонентов (массовые доли %)
Вариант B
Цидониевый сок
33,6975%
Арониевый сок
7,5%
Клюквенный сок
12,9%
Суспензия кукурузного крахмала (Resistamyl 347, NL) в водном экстракте яблочного жмыха (1:3)
26,1%
Сахар
19,8%
Бензоат натрия
150 мг/100 г
Аскорбиновая кислота
100 мг/100 г
Вариант D
Цидониевый сок
33,6975%
Концентрат арониевого сока (х5)
7,5%
Клюквенный сок
12,7%
Суспензия кукурузного крахмала (Resistamyl 347, NL) в водном экстракте яблочного жмыха (1:3)
25,0%
Сахар
19,5%
8% водный экстракт аирного корня
1,0%
Экстракт зеленого чая
0,6%
Бензоат натрия
150 мг/100 г
Аскорбиновая кислота
100 мг/100 г
Варианты B и D нового продукта были протестированы in vivo. ICR-безлинейные мыши были рандомизированы на четыре группы по 10 животных в каждой:
1 группа - контроль (здоровые),
2 группа - инфицированные Н.pylori, не леченные, получавшие вместо воды 1% раствор глюкозы 7 дней до инокуляции H.pylori, а также 14 дней после инокуляции,
3 группа - инфицированные, лечили вариантом B продукта; инокулировали H.pylori, затем, через 7 дней, на протяжении 14 дней получали per os раз в день по 0,5 мл десерта; 1% раствором глюкозы поили 21 день,
4 группа - инфицированные, лечили вариантом D продукта; остальное - так же, как и у 3 группы.
7
Животных поили раствором глюкозы для того, чтобы продлить нахождение пищи в желудке. Для инокуляции мышей была использована культура клеток H.pylori (174×10 КОЕ/1 мл), которую по 0,5 мл per os вводили зондом каждому грызуну из 2, 3, 4 групп. Через 21 день мыши были эвтанизированы диэтилэфиром. Желудок и двенадцатиперстную кишку извлекали для проведения уреазного теста ("HelPil test") и морфологических исследований.
На третьей неделе экспериментов 3 мыши умерли - по одной из 2, 3 и 4 группы. Если животным был обеспечен свободный доступ к исследуемому пищевому продукту, практически все мыши 4 группы его охотно поедали (D вариант), но к варианту B десерта (3 группа) "интерес" проявила примерно только половина грызунов. В таблице 4 показаны результаты уреазного теста. У всех инфицированных животных уреазный тест для желудка был положительным, а двенадцатиперстной кишки - только примерно у 70%. Колонизация H.pylori одновременно в желудке и двенадцатиперстной кишке характерна для особо тяжелых случаев. Результаты лечения инфицированных грызунов были следующими:
В случае варианта B, число больных мышей уменьшилось до 55%, а в случае варианта D - 40%. У 3 и 4 группы животных H.pylori в двенадцатиперстной кишке уреазным тестом обнаружена не была.
Таблица 4
Результаты уреазного теста образцов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки мышей с экспериментальным хеликобактериозом.
Группа
Желудок
Двенадцатиперстная кишка
1 контроль (здоровые)
0 позитивных из 10
0 позитивных из 9*
2 инфицированные
9 позитивных из 9 **
6 позитивных из 9**
3 инфицированные, леченые вариантом В продукта
5 позитивных из 9**
0 позитивных из 9**
4 инфицированные, леченые вариантом D продукта
4 позитивных из 10
0 позитивных из 10
*Результат одного анализа неясен.
**Одно животное в группе умерло перед окончанием эксперимента.
Для гистологического исследования тканей образцы были фиксированы в 10% формалине, обезвожены и импрегнированы парафином. Из блоков готовили срезы толщиной 4 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методу Гымза. Результаты морфологических исследований свидетельствуют, что слизистой оболочке желудка животных, ифицированных H.pylori (2 группа), характерны признаки гастрита. А именно, у главных желез желудка выявлен инфильтрат, как результат воспаления, а также абсцессы. Кроме того, наблюдалась деструкция и слущивание поверхностных мукоцитов. Среди поврежденных клеток видны шаровидные бактерии с примесью спиралевидных. Под тучными клетками слизистой оболочки констатированы признаки дегрануляции.
Морфологическая картина слизистой оболочки желудка третьей группы животных не отличается от второй группы.
Признаки воспаления слизистой оболочки желудка четвертой группы животных были минимальны (фокальные воспалительные инфильтраты встречались редко и не были выраженными). Микроорганизмы H.pylori визуализировались в желудке и двенадцатиперстной кишке у животных с позитивным уреазным тестом согласно данным, указанным в таблице 4.
На основании результатов экспериментов, проведенных in vitro и in vivo, был сделан вывод о том, что оптимальный состав плодово-ягодного десерта с противомикробным воздействием против H.pylori - следующий:
- Цидониевый сок
- 32,0-35,0%
(предпочтительно - 33,6-33,7%»)
- Концентрат арониевого сока в пятикратном усилении (х 5)
- 7,0-8,4%
(предпочтительно - 7,5%)
- клюквенный сок
- 14,9-10,5%
(предпочтительно - 12,7%)
- водный экстракт яблочного жмыха
- 18,5-19,5%
(предпочтительно - 19,0%)
- модифицированный кукурузный крахмал
- 6,5-5,5%
(предпочтительно - 6,0%)
- водный экстракт аирного корня
- 0,8-1,2%
(предпочтительно - 1,0%)
- экстракт зеленого чая
- 0,8-0,4%
(предпочтительно - 0,6%)
- сахар
- 19,5%
- бензоат натрия
- 150 мг/100 г.
- аскорбиновая кислота
- 100 мг/100 г.
Для приготовления пищевого продукта с противомикробным действием против H.pylori в емкость наливают вышеуказанные соки, добавляют экстракты зеленого чая и аирного корня, витамин C, бензоат натрия, сахар. Полученную смесь нагревают до 80°C, постепенно добавляют суспензию кукурузного крахмала в водном экстракте яблочного жмыха. Перемешивая, продукт доводят до желеобразной консистенции. Охлаждают. Готовый продукт хранят при комнатной температуре.
Для обеспечения адсорбции пигмента аронии крахмальным гелем на этапе приготовления смеси плодово-ягодных соков к нагретому до 80°C концентрату арониевого сока (концентрату в пятикратном усилении), добавляют суспензию кукурузного крахмала в водном экстракте яблочного жмыха и, после образования желе, не охлаждая, в смесь добавляют цидониевый сок, клюквенный сок, экстракт зеленого чая, водный экстракт аирного корня, витамин C, бензоат натрия, сахар, затем охлаждают.
На основании результатов исследования можно ожидать, что предложенный новый функциональный продукт будет подавлять патогенную микрофлору кишечника, защищать слизистую оболочку органов пищеварительного тракта от воздействия агрессивных факторов (свободные радикалы-прооксиданты, медиаторы воспаления и т.д.), не выходя за рамки регуляций физиологических процессов, что характерно для компонентов пищи.
Принимая во внимание факт, что в состав плодово-ягодного десерта входят только компоненты, используемые в пищевых продуктах и безопасность которых доказана, новый продукт можно рекомендовать не только больным хеликобактериозом, но и для профилактики здоровым людям в широком возрастном диапазоне. Продукт может быть использован как дополнительное средство для факмакотерапии хеликобактериоза, так и отдельно.