СПОСОБ НАПРАВЛЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА КЛЕТКИ ТКАНЕЙ ЖИВОТНЫХ ОТРЯДА НЕПАРНОКОПЫТНЫХ
METHOD FOR DIRECT IMPACT ON TISSUES CELLS OF ODD-TOED ANIMALS

Изобретение относится к медицине, биотехнологии и ветеринарии, а именно к применению акустических волн для неинвазивного воздействия на клетки-мишени биологических тканей с целью управления процессами жизнедеятельности, пролиферативной активностью клеток/культур клеток и тканей и возможности избирательного подавления или активации их функций. Изобретение также может быть использовано в клеточной и молекулярной биологии, представляет интерес для разработки методов экспериментальной медицины, фармакологии, диагностики злокачественных новообразований, индивидуального подбора лекарственных препаратов и герондопротекторов, при тактике радио-, химио- и озонотерапии.
При воздействии акустических волн за счет сжатия в волне клеточных мембран и реализации пьезоэффекта возможен эффект изменения поверхностного заряда и функционального состояния мембран. Таким образом, мембрана может быть мишенью, на уровне которой реализуется цепь цитологических, биохимических и биофизических эффектов. Клетки, находящиеся в акустическом поле, по сравнению с длиной волны являются точечными, испытывая сжатие и расширения объема, достигающее 20%, что, в свою очередь, может уменьшить количество активных каналов при латеральной диффузии молекул липидного бислоя, изменить проницаемость цитоплазматической мембраны (ЦПМ) и функциональное состояние клетки [1-9].
2
Из уровня техники известен способ иммунокоррекции при аутоиммунном процессе (патент на изобретение RU 2098139, опубл. 10.12.1997). После премедикации осуществляют перфузию крови больного в вено-венозном варианте через срезы ксеноселезенки, предварительно активированные ультразвуком слабой интенсивности 0,3-0,4 Вт/см в импульсном режиме 50 имп/с, в течение 8-10 мин. Способ применяется для упрощения процесса гемоперфузии и увеличения сорбционной способности селезенки при лечении псориаза. Данный способ эффективен при проведении перфузии с объемной скоростью 75-80 мм/мин в течение 40-45 мин 2-3 сеансами с интервалом между ними в 3-5 дней в начале курса традиционной комплексной терапии.
Однако указанный способ является затратным за счет использования дорогостоящего стационарного оборудования и материала. Способ требует при его реализации работы специально обученного персонала, сложен в исполнении методики, длителен по времени, осуществим при работе УЗ аппаратуры в импульсном режиме и на срезе одного типа ткани.
Известен способ неинвазивного разрушения расположенных за костями грудной клетки биологических тканей (патент на изобретение RU 2472545 от 20.01.2013 г., бюл. №2), выбранный в качестве ближайшего аналога. Данный способ основан на воздействии фокусированным УЗ пучком на биологическую ткань для локального разрушения клеток только в месте нахождения основного фокуса, без повреждения в побочных фокусах.
Данный способ применяется в УЗ хирургии только для одновременно теплового и механического воздействий, сопровождается сильным разогревом ткани. Ограничение в применении способа акустического разрушения клеток определяется использованием высокоинтенсивного УЗ, возможностью воздействия только на один вид ткани организма человека - костную, причем на всю ткань одновременно, а не на отдельные клетки (остеобласты), генерацией локального избыточного пикового положительного давления 30-80 МПа в месте воздействия.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа неинвазивного направленного воздействия на клетки ткани животных, безопасного при реализации и не требующего дорогостоящего стационарного оборудования, специально обученного персонала и специально оборудованного помещения; осуществление способа без дополнительных технических средств и химических реагентов; минимальная затрата времени (15-60 с); полная безопасность метода для медицинского персонала и научных сотрудников при максимальном эффекте.
Целью предлагаемого изобретения является плановое неинвазивное воздействие на клетки разных типов и размеров.
Техническим результатом заявленного изобретения является: направленное изменение проницаемости ЦПМ; торможение или активация транспортных систем клеток, фонофорез лекарственных препаратов на клеточном уровне; регуляция активности мембран-связанных ферментов; направленная супрессия роста клеток, в том числе ненормированного, вследствие нарушение аппарата межклеточного взаимодействия и клеточных контактов, опосредованных ЦПМ, что даст возможность проводить купирование заболеваний различной этиологии на клеточном уровне.
2
2
2
Заявленный технический результат осуществляется тем, что воздействие на клеточную суспензию производят непрерывной ультразвуковой волной частотой 0,88 МГц, интенсивностью 0,05-1,0 Вт/см в течение 15-60 с - на ядросодержащие клетки размером более 7 μ, а на безъядерные клетки размером до 6 μ - интенсивностью 0,7-1,0 Вт/смв течение 20-40 с; а также импульсным ультразвуком с частотой генерации 2,64 МГц диапазоном интенсивности 0,4-1,0 Вт/см в течение 20-60 с - на ядросодержащие клетки размером более 7 μ, а на безъядерные клетки размером до 6 μ - интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см в течение 25-60 с с последующим приготовлением мазков, их окраской трипановой синью и дифференциальными красителями, анализом состояния цитоплазматических мембран и жизнеспособности клеток.
Заявленное изобретение осуществляется путем ультразвукового воздействия на ткань, приводящего к избирательному изменению цитоморфологии или к разрушению клеток/клеточных структур животных отряда непарнокопытных.
2
Проведены исследования по определению особенностей поведения клеток крови лошади в УЗ поле, выявлены диапазоны интенсивностей, вызывающих обратимые и необратимые изменения. Обнаружены следующие цитоморфологические эффекты УЗ (несущая частота 880 кГц и 2,64 МГц) на эритроциты: изменение формы, образование симметричных групп вокруг клетки и цепочек эритроцитов без цитолиза, появление теней клеток. Лейкоциты изменялись раньше эритроцитов, спустя 15-30 с от начала инсонации. Действие на гранулоциты, ведущее к изменению ЦПМ, а затем клетки в целом, начиналось раньше, чем на агранулоциты. У всех животных в диапазоне 0,4-1,0 Вт/см, в импульсном и непрерывном режиме УЗ обработки, происходили одинаковые эффекты: деформация и нарушение границ, деструкция и агрегация клеток, разрыв ЦПМ и взрыв ядер, лизис.
Раскрытие изобретения. Кровь брали из яремной вены лошадей во время ежегодного контроля здоровья натощак в утренние часы.
2
2
УЗ обработке подвергали только кровь здоровых животных. Группа животных - верховые лошади (n=10). Объем крови от 5 до 10 мл озвучивали в абсолютно одинаковых условиях по методу автора [4]. Контролем служили интактные клетки тех же животных. Источником УЗ могут быть аппараты для ультразвуковой терапии, работающие на частотах генерации 2,64 МГц и 0,88 МГц - УЗТ-3.06 УЗТ - 1-01 Ф; УЗТ-1.02 С, или любой другой прибор отечественного производства. Интенсивность УЗ варьировала от 0,4 Вт/см до 1,0 Вт/см, что контролировали с помощью дифференциальной термопары, калиброванной по интенсивности. Интенсивность УЗ, прошедшего в ткань in vitro, составляла 90% номинальной интенсивности. Воздействие УЗ волнами проводили в непрерывном (частота 0,88 МГц) и импульсном режиме 10 мс (2,64 МГц). Обработку образцов крови проводили в термостатируемой кювете при температуре 20°С (термостат U-7 с).
x
х
Длительность воздействия изменяли в разных сериях от 15 с до 1 минуты. О действии УЗ на клетки крови судили по количественным и качественным изменениям. Изменения проницаемости ЦПМ всех клеток определяли тестом с трипановой синью [10]. Обратимость изменений проверяли через 20 мин. В случае потери жизнеспособности клетки оставались окрашенными в синий цвет. Делали мазки, окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов набором Диффквик и определяли лейкограмму стандартным методом [7]. Результат воздействия наблюдали в световой микроскоп (иммерсия, микроскоп «ЛОМО», объектив 100/1,25, окуляр 10/18). Референсный ряд клеточных размеров по Н.А. Любину [11]. Статистическая обработка данных - в пакете прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверными считали различия при р<0,05.
Непрерывный УЗ
Особенности воздействия непрерывного УЗ на мембраны клеток и клетки в целом отражены в таблице 1 и на фотографиях мазков крови лошадей (фиг. 1-3). Некоторые примеры цитоморфологических эффектов.
2
0,05 Вт/см 40-50 с. Лейкограмма без особенностей, но от 5% (обработка 40-45 с) до 20% (50 с) лейкоцитов с измененной ЦПМ. Лизис ЦПМ после 60 с обработки.
2
0,2 Вт/см 15-45 с. Лейкограмма без особенностей, но происходит изменение объема цитоплазмы лимфоцитов по сравнению с контролем.
2
0,2 Вт/см 60 с. У 20% сегментоядерных нейтрофилов и эозинофилов лизис ЦПМ. Остальные виды лейкоцитов без особенностей. Изменения лейкограмм в пределах референсного ряда.
2
0,4 Вт/см 30 с. (Фиг. 1) Лейкограмма без особенностей. Начало разрушения лейкоцитов. Сегментоядерные нейтрофилы (Фиг. 1, верх) и лимфоциты с признаками клеточного лизиса и деструкции. После 45 с - изменения в ядрах лимфоцитов и объема их цитоплазмы.
2
2
1,0 Вт/см 20 с. Изменение проницаемости ЦПМ эритроцитов и тромбоцитов, разрушение ЦПМ лейкоцитов. 30-40 с и – агрегация тромбоцитов и лизис лейкоцитов (Фиг. 2). 60 с – тромбоциты в огромных группах. Сохранны только лимфоциты, но 90% из них без цитоплазмы. Других лейкоцитов в мазке нет. Под действием непрерывного УЗ в крови лошади регистрировали изменения эритроцитов. Так, после облучения интенсивностью 1,0 Вт/см более 30 с обнаружены включения в клетки, агрегация. При этом происходили дегенеративные изменения лейкоцитов. На Фиг. 3 показана агрегация клеток: тромбоцитов и лимфоцит в окружении эритроцитов.
Импульсный УЗ
Изменения клеток крови после инсонации импульсным УЗ начинали регистрировать при больших интенсивностях УЗ (Табл. 2 и фиг. 5-7) вследствие уменьшения тепловой компоненты в момент действия излучателя.
2
0,4 Вт/см, 20 с. Дегенеративные изменения нейтрофилов и эозинофилов (Фиг. 4). 30 с - лизис цитоплазмы и дегенеративные изменения ядер лейкоцитов всех видов. Тромбоциты и эритроциты без особенностей. 60 с - полный лизис лейкоцитов, изменение проницаемости ЦПМ тромбоцитов, деформация ЦПМ эритроцитов (лизис лимфоцита на Фиг. 5).
2
0,7 Вт/см, 25 с. Лизис наиболее крупных видов лейкоцитов-моноцитов, дегенеративные изменения нейтрофилов и эозинофилов (Фиг. 6).
Обратимые изменения проницаемости ЦПМ тромбоцитов при сохранении их жизнеспособности. Начало цитоморфологических изменений эритроцитов: единичные клетки имеют булавовидные утолщения.
2
0,7 Вт/см, 60 с. Лизис лейкоцитов. Изменение формы эритроцитов. Появление цитоцепочек (фиг. 7) и теней клеток. Возможен гемолиз.
2
1,0 Вт/см, при облучении более 20 с идентифицировать клетки сложно. Происходят необратимые изменения лейкоцитов. 30 с - вспенивание цитоплазмы и разрыв ядер. Агрегация тромбоцитов. 60 с – лизис ядер и цитоплазмы лейкоцитов.
Выводы
sata
2
1. УЗ воздействие на образцы клеточных суспензий in vitro УЗ волной частоты генерации 2,64 МГц в импульсном режиме, I 0,7-1,0 Вт/см при длительности 25-60 с последовательно изменяет проницаемость, а затем и структуру ЦПМ безъядерных клеток размера 4,5-5,8 мкм.
2
2. Действие импульсным УЗ (2,64 МГц) диапазоном интенсивности 0,4-1,0 Вт/см в течение 20-60 с на ядросодержащие клетки размером более 7 μ изменяет проницаемость, структуру ЦПМ, после чего вызывает их разрушение.
2
3. Интенсивность 0,05-1,0 Вт/см непрерывной ультразвуковой волны частотой 0,88 МГц при облучении в течение 15-60 с суспензии ядросодержащих клеток размером более 7 μ действует на проницаемость и структуру ЦПМ, а затем и на всю клетку в целом, изменяя ее морфологию.
2
4. Воздействовать на мембраны безъядерных клеток размером до 6 μ непрерывной ультразвуковой волны частотой генерации 0,88 МГц можно направленно интенсивностью 0,7-1,0 Вт/см в течение 20-40 с.
Список литературы
1. Олешкевич А.А. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на клетки крови животных in vitro / V Съезд биофизиков России. Материалы докладов: в 2 т. - Ростов-на-Дону: ЮФУ. - Т. 2: 2015. - С. 107.
2. Максутова Д.Ж Применение фокусированного ультразвука под контролем магнитно-резонансной томографии // Проблемы репродукции / Russian Journal of Human Reproduction. 2009. №2. С. 30-36.
3. Олешкевич A.A., Носовский A.M., Каминская Е.В. Экспериментально-теоретическое обоснование методов увеличения продукции клеток различной этиологии после обработки акустическими (ультразвуковыми) волнами. Ч. 1. Метод интенсификации процессов метаболизма бактериальных клеток в суспензии // Биомедицинская радиоэлектроника, 2014. - №2. - С. 53-57.
4. Олешкевич А.А., Каминская Е.В., Носовский A.M. Экспериментально-теоретическое обоснование методов увеличения продукции клеток различной этиологии после обработки акустическими (УЗ) волнами. Ч. 2. Методика акустической стимуляции клеток животного происхождения // Биомед. радиоэлектр. 2014. - №.3. - С. 33-39.
5. Botyan N.I., Akopyan V.B., Oleshkevich A.A. Cytostatic effect of ultrasound combined with medicine on photobacteria // V National conference on biomedical physics & engineering, Bulgaria, 1989, p. 109-110.
6. Шарый Н.И., Ковалева B.M., Крюкова Г.В. Влияние многократного действия УЗ на культуры клеток человека // Гигиена и санитария. 1979. №2. С. 48-50.
7. Олешкевич А.А., Пашовкин Т.Н. Возможность изменения лейкограмм животных при действии непрерывного ультразвука терапевтического диапазона интенсивностей // Аграрная Россия. - №6 (2015). С. 13-17.
8. Пашовкин Т.Н., Садикова Д.Г. Расслаивание, разделение и концентрирование клеток в поле стоячих ультразвуковых волн // Акустич. ж-л. Т. 55. 2009. №4-5. С. 575-585.
9. Акопян В.Б., Ершов Ю.А. Основы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами МГТУ им. Н.Э. Баумана. М., 2005. 223 с.
10. Скибо Ю.В., Абрамова З.И. Методы исследования программируемой клеточной гибели: Учебно-методическое пособие «Теория апоптоза» / Ю.В. Скибо, З.И. Абрамова. - Казань: ФГАОУ ВПО КФУ, 2011. - 61 с.
11. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях // Н.А. Любин, Л.Б. Конова. Ульяновск, 2005 г. - 112 с.