Исследование цитотоксичности in vitro частиц нанокомпозита для прямой реставрации зубов в стоматологии

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ IN VITRO ЧАСТИЦ НАНОКОМПОЗИТА ДЛЯ ПРЯМОЙ РЕСТАВРАЦИИ ЗУБОВ В СТОМАТОЛОГИИ

Г.Т. Салеева 1, А.М. Гималетдинова1, ЕЮ. Тарасова2, Э.В. Рожина2, Е.А. Науменко2, Р.Ф. Фахруллин2, Р.Р. Исламов 1, Р.А. Салеев 1

1 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

2 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

Nanocomposite material for stomatology restovration particles cytotoxicity: an in vitro study

G.T. Saleeva 1, A.M. Gimaletdinova 1, E.Y. Tarasova 2, E.V. Rozhina 2, EA. Naumenko 2, R.F. Fakhrullin 2, R.R. Islamov 1, RA. Saleev1

1 Kazan State Medical University, Kazan, Russia

2 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

Нанокомпозитный материал, применяемый в стома-тологичнеской практике, подвергается механическому истиранию с выделением мелких частичек, в том числе нано-диапазона . Последние способны оказывать специфическое биологическое действие на клетки и ткани пациента . В настоящем исследовании изучена цитотоксичность частиц нанокомпозита 3M™ESPE™FNtek™Ultimate в культуре клеток линии карциномы лёгкого человека (А549) в диапазоне концентраций от 10 до 0,009 мг/мл . Установлена линейная зависимость действия частиц нанокомпо-зита на выживаемость и функциональную активность клеток . Пограничной концентрацией цитотоксичности следует считать 0,313 мг/мл . При концентрациях 0,156 мг/мл и ниже исследуемое вещество не оказывает токсического эффекта на клетки А549 . Учитывая возможное отрицательное влияние частиц нанокомпозита, выделяющихся при истирании материала, на клетки организма, считаем целесообразным ограничить применение исследуемого материала на окклюзионных поверхностях, подвергающихся большей механической нагрузке, приводящей к интенсивному истиранию

Ключевые слова: нанокомпозит 3M™ESPE™Rltek™Ultimate, цитотоксичность, клетки карциномы легкого человека А549

Nanocomposite material applied in dental practice treatment is subjected to mechanical abrasion with the release of material's fine particles, including nanoparticles, which are able to produce a specific biological effect on patient body's tissues and cells . I the present research we studied the cytotoxicity of 3M™ESPE™Filtek™Ultimate nanocomposite particles at concentration ranging from 10 to 0 . 009 mg/ml employing human lung carcinoma cell culture (A549). Linear dependence of nanocomposite particles' action on survival and functional activity of the cells was shown . The crucial concentration of cytotoxicity should be considered as 0 . 313 mg/ml . At 0 . 156 mg/ml or below this concentration the tested substance had no toxic effect on A549 cells Considering the possible negative effect of nanocomposite particles released during the material abrasion on cells we suggest limiting application of the studied nanocomposite material on the surfaces subjected to intensive mechanical impact leading to high abrasion

Keywords: 3M™ESPE™FNtek™Ultimate nanocomposite, cytotoxicity, A549 human lung carcinoma cells .

Введение

В связи с растущей коммерциализацией нано-технологий, наноструктурные материалы всё чаще используются во многих сферах индустрии и в медицинской промышленности в частности . В медицинской практике нанотехнологии широко применяются в стоматологии . Одним из последних достижений производителей реставрационных материалов для восстановления зубов стало создание композитных материалов, в состав которых в качестве наполнителя входят наноразмерные частицы диоксида кремния . Уникальные физико-химические свойства наночастиц диоксида кремния обеспечивают реставрационный материал специфическими манипуляци-онными, эстетическими и прочностными свойствами . Однако, в противоположность хорошо изученному микроразмерному диоксиду кремния, сравнительно небольшая информация существует относительно токсичности его наноразмерных частиц по отношение к эукариотическим клеткам . Поскольку нано-частицы обладают собственными физическими, химическими и биологическими свойствами, их потенциальные биологические эффекты на клетки, ткани и организм в целом могут сильно отличаться от действий микроразмерных частиц [1]. В настоящее время композитная реставрация широко применяются

e-mail: albina . stm@yandex . ru

в стоматологической практике . Известно, что при длительной эксплуатации нанокомпозит подвергается механическому истиранию с выделением мелких частичек материала, в том числе и нано-диапазона, которые контактируют с различными клетками и тканями пациента

композитным материалом называют смесь нескольких компонентов . В случае стоматологических пломбировочных композитов это смесь органической матрицы и неорганических наполнителей. Обычно органическая матрица базируется на метакриловых мономерах типа: 2,2-бис-[4-(2-гидрокси-3-метакрилоилоксипропил) фенил] пропан (Bis-GMA или мономер Bowen), этоксилированный Bis-GMA (EBPDMA), 1,6-бис-[2-метакрилоилоксиэтоксикарбониламино]-2,4,4-триметилгексан (уретан диметакрилат или UDMA), додеканодиолдиметакрилат (D3MA), триэтилен-гликольдиметакрилат (TEGDMA). Типичные наполнители стоматологических композитов включают: аморфный кремнезем (микронаполнитель), кварц, бариевое стекло, стронциевое стекло, силикат циркония, силикат титана, оксиды и соли других тяжелых металлов, полимерные частицы

Универсальной и однозначной классификации стоматологических композитов до сих пор не существует,

композитные пломбировочные материалы классифицируют по типу, размеру и количеству используемых наполнителей, а также по функциональности применения . Наиболее распространенной является классификация композитов по размеру частиц наполнителя: микронаполненные, макронаполненные и гибридные (табл . 1) .

Одним из новых достижений в производстве стоматологических материалов было создание на-нокомпозитов, сочетающих в себе положительные свойства микронаполненных и макронаполненных композитов . Структурной особенностью наноком-позитов является то, что наполнитель представлен комбинацией неагломерированного/неагрегирован-ного 20 нм кремниевого наполнителя, неагломери-рованного/неагрегированного 4—11 нм циркониевого наполнителя и дисперсного циркониевого/кремниевого кластерного наполнителя (состав — частицы кремния размером 20 нм и частицы циркония размером 4—11 нм). Размер частиц кластера составляет 0,6—10 мкм . Хороший эстетический эффект этих материалов обусловлен тем, что при его истирании отделяются мелкие частицы материала (в том числе и наночастицы) не изменяя макроскопическую форму реставрационного материала

Физико-химические характеристики наночастиц отличаются в зависимости от происхождения и могут иметь различные эффекты на живые организмы Исследование цитотоксичности частиц, образующихся при разрушении нанокомпозитных материалов, возникло как актуальная проблема в последнее время вместе с развитием нанотехнологий и широкого применения нанокомпозитов в медицинской промышленности . Наночастицы путём эндоцитоза проникают внутрь клеток и содержатся в пределах эндоцитозных пузырьков . Апоптогенное действие кремниевых наночастиц связано как с цитотоксиче-ским, например усилением перекисного окисления липидов и последующим повреждением плазмолем-мы, так и генотоксическим действием, например хромосомные аберрации при митозе . Цитотоксич-ность наночастиц установлена in vitro и зависит от их физико-химических свойств и концентрации . Установлено дозозависимое снижение жизнеспособности клеток карциномы легкого человека в присутствие 15- или 46-нм SiO2 наночастиц в течение 48 ч . при концентрации вещества от 10 до 100 мкг/мл [5]. В другом исследовании было документировано влияние размера частиц на цитотоксичность . Так, кремневые наночастицы диаметром 14-, 15-, and 16-нм оказывают токсическое действие (TC(50)) при концентрации 33—47 мкг/см-2, а наночастицы диметром 19 и 60 нм — при концентрации 89 и 254 мкг/см-2, соответственно [6] Таким образом, оксид кремния

имеет размерно-, дозо- и время зависимую цитотоксичность . При этом частицы меньшего размера проявляют значительно большую цитотоксичность, чем более крупные частицы . Однако при оценке биобезопасности нанокомпозитного материала следует учитывать типы анализируемых клеток, условия воздействия наночастиц на клетки и методы анализа цитотоксичности

В современной литературе всё чаще встречается информация относительно токсичности оксида кремния [1]. Известны многочисленные исследования, доказывающие цитотоксическое действие наночастиц оксида кремния при попадании их в дыхательную систему на производстве [1]. Помимо ингаляции, наночастицы могут попадать в организм и через ЖКТ . К . Gerloff et al . (2009) исследовали ци-тотоксические свойства наночастиц оксида кремния на эпителиальные клетки ободочной кишки человека in vitro [3]. Наночастицы индуцировали апоптогенное действие в эпителиальных клетках . Гепатоциты человека также вступают в апоптоз после воздействия частиц аморфного кремнезема в наноразмер-ном диапазоне [4].

Несмотря на то, что все реставрационные материалы, применяемые в клинике, сертифицированы и рекомендованы для пломбирования зубных полостей всех классов, остается ряд вопросов, касающихся ограничения применения нанокомпозитов на тех поверхностях зубов, где их истирание происходит быстрее и возможно накопление наночастичек в окружающих тканях . Поэтому для показания использования нанокомпозитов при объёмных реставрациях у одного пациента необходимы дополнительные фундаментальные исследования биосовместимости и биобезопасности современных нанокомпозитных материалов В настоящей работе проводилось исследование цитотоксичности частиц, полученных при экспериментальном истирании нанокомпозитно-го материала 3M™ESPE™Filtek™Ultimate in vitro .

Материал и методы

Получение и физическая характеристика

частиц нанокомпозита

Истирание нанокомпозита 3M™ESPE™Filtek™Ultiiriate имитировали на «Стенде жевательных движений» [2] Стерильную суспензию исследуемых частиц (1,25 мг/мл-1) в 0,15 М NaCl смешивали с культурой клеток карциномы легкого человека А549 (5x105 мл-1) . После инкубации в течение 3 мин с исследуемым веществом клетки центрифугировали для удаления избытка частиц нанокомпозита клетки микроскопиро-вали с помощью темнопольного микроскопа Olympus с конденсором CytoViva . Гидродинамический диа-

Таблица 1. Классификация композитов по типу, размеру и количеству используемых наполнителей

Тип композита Размер частиц, мкм Степень наполнения,% объемный

Средний Максимальный

Микронаполненный 0,04-0,1 0,1-5,0 38-50

Мининаполненный 0,4-0,8 1,0-5,0 56-66

Средненаполненный 1,0-3,0 5,0-15,0 70-77

Обычный 5,0-15,0 50-70 60-70

метр частиц исследуемого вещества и дзета-потенциал определяли с использованием анализатора Malvern Zetasizer Nano ZS .

Пролиферативная активность клеток А545

В качестве клеток-мишеней были выбраны клетки карциномы легкого человека А549, отличающиеся высокой чувствительностью к качеству компонентов питательной среды и обычно используемые для тестирования ее биологических свойств и, в частности, цитотоксичности . До исследования клетки культивировали в среде ДМЕМ с добавлением 10% инак-тивированной фетальной сыворотки коров (FBS), 45 ЕД/мл пенициллина и 45 мг/мл стрептомицина в С02-инкубаторе при 5% CO2 и 37°C .

Клетки А549 для опыта рассеивали в 96-луноч-ные планшеты из расчета 7000 клеток на лунку . Скорость роста и характер формирования монослоя наблюдали в процессе культивирования обработанных исследуемым веществом и интактных клеток, при помощи инвертированного микроскопа (Axio Observer A1). Для подсчета клеток использовали цитометр (Tali Image-Based Cytometer) . Исследуемый препарат вносили через 24 ч . культивирования клеток в концентрации от 10,0 до 0,009 мг/мл питательной среды . Эффект препарата на жизнеспособность и пролиферацию клеток А549 оценивали через 48 и 72 ч . после добавления в культуру клеток.

МТТ-тест

Цитотоксичность исследуемого вещества определяли с использованием MTT-теста . Принцип метода основан на способности сукцинатдегидрогеназы, фермента мембраны митохондрий, восстанавливать желтую соль 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ) до кристаллов формазана фиолетового цвета, накапливающихся в результате этой реакции в цитоплазме живых клеток Таким образом, по интенсивности накопления кристаллов формазана в цитоплазме судили об уровне митохондриального дыхания клетки, что является показателем ее жизнеспособности количество образуемого формазана в клеточном монослое пропорционально соотносится с количеством живых клеток в исследуемом образце

Культуру А549 клеток с препаратом инкубировали при 37°С в СО2 инкубаторе в течение суток, после чего среду удаляли, в лунки вносили 200 мкл свежей ростовой среды, добавляли 20 мкл готового раствора МТТ (5 мг/мл) . Опыты проводили в трех повторностях После 4 ч инкубации ростовую среду с МТТ заменяли на ДМСО для растворения кристаллов формазана и инкубировали 20 мин Оптическую плотность регистрировали при длине волны 540 нм на планшетном спектрофотометре «Multiscan» . Оценку результатов теста МТТ проводили путем сопоставления оптической плотности в опытных и контрольных лунках . По изменению оптической плотности судили о цитотоксической активности препарата

Тест с нейтральным красным

Нейтральный красный — витальный краситель, избирательно накапливающийся в лизосомах живых клеток Катионный краситель проникает через клеточную мембрану и связывается с анионными центрами в лизосомах Данный тест позволяет оценить функциональную активность лизосом, а степень окраски клеток характеризует их жизнеспособность

Погибающие клетки утрачивают способность к аккумуляции нейтрального красного в лизосомах . Рабочий раствор красителя (0,033%) получают в соответствующей питательной среде непосредственно перед экспериментом . Клетки высевали в 96-луноч-ные планшеты при плотности 10 000 клеток на лунку и инкубировали в присутствии кремниевых частиц в увлажненной атмосфере с 5% СО2 при 37°С в течение 24 ч . Затем среду заменяли на 200 мкл рабочего раствора нейтрального красного и планшеты инкубировали в СО2-инкубаторе . После 3 ч . инкубации краситель заменяли фиксирующим раствором (10% формальдегида и 10% СаС12) на 1 мин . и инкубировали при комнатной температуре Затем раствор меняли на 200 мкл растворителя (1% ледяной уксусной кислоты в 50% этаноле, приготовленный непосредственно перед использованием) для извлечения красителя из клеток Оптическую плотность раствора нейтрального красного измеряли при длине волны 540 нм и 690 нм .

Статистический анализ

Достоверность разницы оптической плотности клеток в МТТ и тесте с нейтральным красным в опытных лунках по сравнению с контрольными определяли по ^критерию Стьюден-та, достоверное различие принято при р<0,05 .

Результаты и обсуждение

Гидродинамический диаметр

Анализ пролиферативной активности клеток А549 показал, что при концентрации исследуемого вещества 0,313 мг/мл и ниже клетки не только сохраняют жизнеспособность, но также способны к росту и пролиферации . Через 48 ч . инкубации клетки А549, обработанные исследуемым веществом в данных концентрациях, пролиферировали подобно

*

• ÍA •

Ч

4

* О

Рис. 1. Частицы нанокомпозита 3MTMESPETMFiltekTMUltimate и клетки А549. Темнопольная микросокпия. Ув. х600

интактным клеткам, при этом наблюдалось незначительное отставание в вариантах с концентрациями исследуемого вещества 0,313 и 0,156 мг/мл . Через 72 ч культивирования площадь заполнения лунок в концентрациях 0,313 мг/мл и ниже была примерно одинаковой и составляла около 97%

Через 24 ч культивирования клеток А549 в присутствии исследуемого вещества в различной концентрации установлена линейная зависимость действия частиц нанокомпозита на выживаемость и индуцированный апоптоз . Исследуемое вещество не оказывает токсического эффекта на клетки А549 в концентрациях 0,313 мг/мл и ниже . При этом доля погибших клеток была наиболее выражена (более 10%) при концентрациях исследуемого вещества 2,5; 1,25; 0,625 мг/мл . Показатели апоптоз-индуцирующей активности исследуемого вещества представлены в табл 2

Как показали результаты МТТ-теста (рис . 2), средняя ингибиторная концентрация (1С50) исследуемого вещества — концентрация, которая на 50% подавляет способность клеток переводить соль те-

тразолия в формазан для клеток линии А549, составила 1,25 мг/мл . В лунках с концентрацией исследуемого вещества 0,009—0,156 мг/мл выживаемость клеток составила 94,9—98,9% соответственно . Значительное снижение митохондриальной активности начинается при концентрации частиц нанокомпозита 0,313 мг/мл .

Как следует из рис 2 внесение препарата до концентрации выше 0,156 мг/мл вызывает достоверное снижение митохондриальной активности клеток, при этом доля погибших клеток увеличивается с 16,4 до 81,1% соответственно .

С помощью теста, основанного на способности клеток окрашиваться нейтральным красным, с аккумуляцией красителя в лизосомах, установлено, что концентрация исследуемого препарата, ингибирую-щая на 53% эндоцитозную активность составляет 1,25 мг/мл (рис . 3) . Таким образом, при концентрациях исследуемого вещества выше 0,313 мг/мл эн-доцитозная активность клеток уменьшалась пропорционально росту концентрации частиц нанокомпозита

Таблица 2. Показатели апоптоз-индуцирующей активности частиц нанокомпозита

Концентрация исследуемого вещества, мг/мл Показатели прибора Tali Image-Based Cytometer

Живые клетки, % Погибшие клетки, % Апоптоз,%

Контроль 99 1 -

2,5 53 44 3

1,25 73 17 9

0,625 84 15 1

0,313 91 6 3

0,156 94 5 1

0,078 95 5 1

0,039 95 3 1

0,019 96 3 1

0,009 97 3 -

Рис. 2. Результаты МТТ-теста при воздействии частиц нанокомпозита 3MTMESPETMFiltekTMUltimate на клетки А549

Рис. 3. Результаты теста с нейтральным красным при воздействии частиц нанокомпозита 3MTMESPETMFiltekTMUltimate на клетки А549

Внедрение в практическую медицину новых нано-композитных материалов требует фундаментальных исследования их биобезопасности . Применение таких материалов по-разному может влиять на разные клетки, ткани, органы и организм человека в целом . Проведенное нами исследование цитотоксичности частиц нанокомпозита 3M™ESPE™Filtek™Ultimate in vitro в культуре клеток линии А549 позволило установить, что в диапазоне концентраций от 10 до 0,009 мг/мл, концентрация препарата IC50, ингиби-рующая на 50% клеточные функции, которые были применены в нашем токсикологическом исследовании, составляет 1,25 мг/мл . Пограничной концентрацией цитотоксичности следует считать 0,313 мг/мл . А в концентрациях 0,156 мг/мл и ниже исследуемое вещество не оказывает токсического эффекта на клетки А549

Универсальный реставрационный материал 3M™ESPE™Filtek™Ultimate рекомендован производителями для применения при пломбировании передних и задних групп зубов (включая окклюзионные поверхности), для надстройки культи, шинирования и непрямых реставраций, в том числе вкладок, накладок и виниров . Однако, учитывая возможное отрицательное

влияние частиц нанокомпозита, выделяющихся при истирании материала, на клетки организма, считаем целесообразным ограничить применение материала на окклюзионных поверхностях, так как в этой области реставрации подвергаются большей механической нагрузке и истираются быстрее

Благодарности

Исследования по изучению токсичности были выполнены за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-14-00924). Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров. Часть экспериментов выполнена с использованием оборудования Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета при финансовой поддержке государства в лице Министерства образования и науки России (Ю RFMEFI59414X0003) и Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета

ЛИТЕРАТУРА:

1. Napierska D ., Thomassen L . C . , LisonD . et al . The nanosilica hazard: another variable entity . Part Fibre Toxicol . 2010; 7(1): 39 .

2 . Миргазизов М . З . , Мустафин Р . Р ., Шарипов И . С ., Панин Е . П ., Вареник С . Л .; Стенд жевательных движений . Патент на изобретение №2153197 . МПК G09B23/28, А61С11/00, 2000 июль 20 .

3 . Gerloff К ., Albrecht C., Boots A.W . et al . Cytotoxicity andoxidative DNA damage by nanoparticles in human intestinal Caco-2 cells . Nanotoxicology 2009; 3: 355-64 .

4 . Ye Y., Liu J ., Xu J . et al . Nano-SiO2 induces apoptosis via activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell line . Toxicol in vitro . 2010; 24: 751-8 .

5 . Lin W ., Huang Y .W ., Zhou X . D . et al . In vitro toxicity of silica nanoparticles in human lung cancer cells . Toxicol Appl . Pharmacol . 2006; 217(3): 252-9 .

6 . Napierska D ., Thomassen L . C ., Rabolli V . et al . Size-dependent cytotoxicity of monodisperse silica nanoparticles in human endothelial cells Small 2009; 5(7): 846-53

Поступила: 08.11.2015