ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ЭКСТРАКТЫ ИЗ БАКТЕРИЙ Lactobacillus И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
IMMUNOMODULATORY EXTRACTS OF BACTERIA Lactobacillus AND METHODS FOR PREPARING AND USING THEM

Область, к которой относится изобретение
Варианты осуществления настоящего изобретения включают экстракты из бактерий Lactobacillus, которые могут оказывать иммуномодулирующие эффекты у индивидуумов. Варианты осуществления настоящего изобретения могут применяться, например, в качестве нутрицевтиков или фармацевтических средств для лечения заболеваний, таких как заболевания, связанные с дисбалансом продукции противовоспалительных или провоспалительных цитокинов, таких как инфекции, аллергические состояния, аутоиммунные расстройства и воспаление, или в качестве адъювантов, обеспечивающих оздоровительные благоприятные воздействия у индивидуумов. Наряду с другими аспектами, изобретение также включает способы получения и применения таких экстрактов. Изобретение также относится к конкретным штаммам бактерий Lactobacillus.
Предпосылки и краткое описание сущности изобретения
Иммуномодуляция представляет собой глобальный термин, который относится к широкому диапазону иммунного вмешательства, которое изменяет нормальные или патологические иммунные ответы. Микробы продуцируют и секретируют широкий диапазон молекул, которые могут модулировать эукариотические иммунные ответы (Lavelle et al., Curr Top Med Chem. 2004, 4(5), 499-508). Они включают факторы, которые разрушают защитные механизмы для содействия колонизации и персистенции патогенного возбудителя. Были идентифицированы происходящие из вирусов, бактерий и паразитов молекулы, которые могут ингибировать воспалительные реакции. В дополнение к микробным факторам, которые могут подавлять иммунные ответы, сами мощные иммунные активаторы могут также иметь микробное происхождение. Они включают бактериальные энтеротоксины, экскреторные-секреторные продукты паразитарного происхождения и вирусные нуклеиновые кислоты.
Считается, что семейство, по меньшей мере, 11 рецепторов, называемых толл-подобными рецепторами (TLR), и экспрессируемых организмом хозяина, играет ключевую роль в иммунологическом выявлении и врожденной реактивности в отношении микробов. На фиг. 1 представлен список лигандов TLR (Gay and Gangloff, Ann. Rev. Biochem., 2007, 76:141-65). TLR распознают широкий диапазон молекул, также известных как связанные с патогеном молекулярные типы (PAMP), продуцируемых вирусами, бактериями и грибами (Tse and Horner, Ann Rheum Dis. 2007 Nov; 66 Suppl 3:iii77-80). Связанная с TLR иммуномодуляция применялась при разработке новых способов лечения широкого спектра патологических состояний, включая инфекционные, злокачественные, аутоиммунные и аллергические заболевания.
Агонисты и антагонисты TLR исследовались в качестве потенциальных терапевтических средств для профилактики и лечения заболеваний. В относительно небольших клинических испытаниях, агонисты TLR использовались в качестве адъювантов для вакцин, предназначенных для профилактики инфекций, устранения аллергической гиперчувствительности и удаления злокачественных клеток. Агонисты TLR также исследовались в качестве средств для монотерапии и дополнительной терапии для лечения пациентов и инфекционными, аллергическими и злокачественными заболеваниями. Применение антагонистов TLR также исследовалось в преклинических исследованиях и клинических испытаниях в качестве потенциальных терапевтических средств по поводу аутоиммунных заболеваний и сепсиса.
Пробиотики представляют собой живые микроорганизмы, которые могут оказать оздоровительные эффекты на индивидуума при введении в адекватных количествах (Mottet et al., Digestive and Liver Disease, 2005, 37: 3-6; Ezendam et al., Nutr Rev, Jan. 2006, 64(1): 1-14; Gill and Prasad, Adv Exp Med Biol, 2008, 606: 423-54). Биологические механизмы, участвующие в стимуляции иммунного ответа пробиотическими микроорганизмами и определенными клеточными компонентами этих микроорганизмов, были предметом исследования. Например, грамположительные бактерии имеют характерные макромолекулы, составляющие клеточную стенку, такие как липотейхоевая кислота (LTA). LTA может быть связана с иммуностимулирующей активностью (например, Bhakdi et al., Infect. Immun., 1991, 59: 4614-4620; Setoyama et al., J Gen Microbiol, 1985, 131 (9): 2501-2503; Cleveland et al., Infect Immun, 1996, 64(6): 1906-1912). См. также (Deininger et al., Clin Vaccine Immunol, 2007, 14(2): 1629-1633). Кроме того, пробиотические бактерии могут содержать разнообразные лиганды TLR с иммуномодулирующими характеристиками. Было обнаружено, что фрагменты клеточной стенки из различных бифидобактериальных штаммов стимулируют продукцию интерферона-гамма (IFN-γ) in vitro в мышиных спленоцитах (T. Ambrouche, "Contribution a l'etude du pouvoir immunomodulateur des bifidobacteries: Analyse in vitro et etude ex vivo des mecanismes moleculaires impliques," Ph.D. Thesis, Universite Laval, Quebec, 2005). Капсулы, изготовленные из фрагментов клеточной стенки в виде частиц определенных молочнокислых бактерий (Del-Immune V, Pure Research Products, LLC, Colorado), также предназначены для стимуляции иммунной системы.
Однако прием внутрь пробиотических бактерий в живой или убитой форме или прием внутрь фрагментов клеточной стенки в виде частиц таких бактерий может не быть самым эффективным путем обеспечения иммуномодулирующего эффекта у индивидуумов. Например, живые клеточные экстракты могут содержать крупные белки и липопептиды, размер которых препятствует эффективной абсорбции индивидуумом, таким образом, ограничивая локальную концентрацию полезных молекул из пробиотических бактерий в организме. Условия внутри организма могут также разрушить активные бактериальные компоненты или иным образом модифицировать химические структуры этих компонентов, делая их неактивными. Риски, связанные с пероральным введением живых пробиотических микроорганизмов (Lactobacillus), включают бактериемию и сепсис (Lactobacillus Sepsis Associated With Probiotic Therapy, Pediatrics, Jan. 2005, 115 (1): 178-181). Следовательно, существует потребность в других средствах для обеспечения благоприятных эффектов пробиотических бактерий у нуждающихся в них индивидуумов.
Настоящее изобретение относится к экстрактам Lactobacillus, некоторые варианты осуществления которых могут проявлять высокую иммуномодулирующую активность. Например, варианты осуществления настоящего изобретения относятся к экстрактам из бактериальных штаммов, которые могут быть полезными в качестве нутрицевтиков или в качестве фармацевтических средств, в некоторых случаях для лечения инфекционных заболеваний, аллергии, респираторных расстройств и воспалительных патологических состояний, или действовать в качестве дополнения в связи с протоколом лечения. Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим экстракты, и способам получения экстрактов, например, с использованием сред, которые не создают риск прионовых заболеваний. Способы в соответствии с изобретением включают, например, лизис клеток в щелочных условиях, или в щелочных условиях с последующими кислотными условиями. В некоторых вариантах осуществления, экстракты по изобретению представляют собой растворимые экстракты, означая, что они не содержат значительных количеств твердого или представленного в виде частиц вещества. В некоторых вариантах осуществления, экстракты содержат химически модифицированные лиганды TLR. В некоторых вариантах осуществления, щелочная обработка может вызвать химическую модификацию клеточных материалов, включая лиганды TLR, компоненты клеточной стенки, белки, липотейхоевые кислоты, липопептиды и фосфолипиды.
Некоторые варианты осуществления изобретения могут включать экстракты, полученные из одного или более из следующих видов:
Lactobacillus fermentum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus casei defensis, Lactobacillus casei ssp. casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus lactis и Lactobacillus delbrueckii.
В некоторых вариантах осуществления, экстракты содержат, по меньшей мере, один штамм из каждого из перечисленных выше видов бактерий, тогда как в других вариантах осуществления, один или более определенных штаммов из приведенного выше списка могут быть удалены или замещены одним или более других штаммов. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают экстракт, полученный из одного или более следующих бактериальных штаммов: Lactobacillus fermentum I-3929, Lactobacillus rhamnosus 71.38, Lactobacillus plantarum 71.39, Lactobacillus johnsonii 103782 и Lactobacillus helveticus 103146. Указанные выше штаммы депонированы в соответствии с Будапештским Договором. Каждый из Lactobacillus fermentum I-3929, Lactobacillus rhamnosus 71.38, Lactobacillus plantarum 71.39, Lactobacillus johnsonii 103782 и Lactobacillus helveticus 103146 депонирован в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов Института Пастера Collection Nationale de Culture des Microorganismes at the lnstitut Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris, France. Lactobacillus fermentum I-3929 была депонирована 27 февраля 2008 г. Другие штаммы находятся среди коллекций депозитария и могут быть получены контактом с депозитарием.
Настоящее изобретение также, наряду с другими аспектами, относится к штамму Lactobacillus fermentum I-3929, экстрактам, полученным из этого штамма, способам получения таких экстрактов и видам их применения. Этот штамм был получен предоставлением возможности этим штаммам из Lactobacillus plantarum и Lactobacillus fermentum подвергнуться хромосомному обмену, таким образом, получая новый штамм Lactobacillus. Было обнаружено, что экстракты, полученные из Lactobacillus fermentum I-3929, активны на нескольких моделях in vivo и in vitro, коррелирующих с инфекцией и иммунологическими расстройствами.
В некоторых вариантах осуществления, экстракт получен только из одного определенного бактериального штамма. Альтернативно, может использоваться более чем один штамм. В других вариантах осуществления, может добавляться один или более экстрактов из другого типа микроорганизма, например, бактериального вида, отличного от Lactobacillus.
Экстракты могут быть получены лизисом бактериальных клеток в определенных условиях после того как клетки выращиваются до подходящей концентрации в культуральной среде. В некоторых вариантах осуществления, бактерии выращиваются в среде, которая не создает риска связанных с прионами заболеваний или риска других заболеваний, которые могут передаваться посредством приема внутрь продуктов, полученных из сред на животной основе. Например, в некоторых вариантах осуществления для выращивания клеток используется среда на растительной основе, такая как среда на соевой основе.
Лизаты (т.е., продукты лизиса клеток) могут также фильтроваться для удаления нуклеиновых кислот и более крупных клеточных осколков, таких как нерастворимый или имеющий форму частиц материал. В некоторых вариантах осуществления, количество нуклеиновых кислот, присутствующих в экстрактах, составляет менее чем 100 мкг/мл. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления полученный экстракт содержит растворимые молекулярные компоненты и не содержит значительных количеств нерастворимого или имеющего форму частиц материала.
Молекулы мембран и клеточной стенки, включая липопротеины, липопептиды, пептидогликаны, липополигосахариды, липотейхоевые кислоты и тейхоевые кислоты, могут быть растворены или суспендированы в экстрактах. Во время процесса лизиса, молекулы в клетках, такие как мембраны и клеточные стенки, могут стать химически модифицированными, например, расщепленными на более мелкие структуры, обработкой щелочью. Несмотря на такие химические модификации, варианты осуществления изобретения могут сохранять свою биологическую активность, по сравнению с цельными клетками, или такие варианты осуществления могут даже демонстрировать повышенную биологическую активность, по сравнению с цельными клетками.
Например, щелочная обработка может использоваться для лизиса клеток или может применяться к клеткам, которые ранее были лизированы другим способом. Во время процесса щелочной обработки в соответствии с некоторыми вариантами осуществления изобретения, L-аминокислоты, обнаруживаемые в натуральных белках и липопептидах, по меньшей мере частично рацемизированы в D-аминокислоты. D-аминокислоты могут оказывать благоприятное воздействие в отношении увеличения продолжительности эффективности экстрактов, поскольку они не подвергаются эффективному перевариванию в желудочно-кишечном тракте млекопитающих. D-аминокислоты могут также защитить более мелкие пептиды и белки от разрушения во время переваривания. Примеры D-аминокислот включают связанные с белком D-аминокислоты и в меньшей степени лизиналанин (de Vrese et al., J Nutrition, 2000, 2026-2031). Таким образом, антигенные молекулы в экстрактах, химически модифицированные во время лизиса для содержания D-аминокислот, могут оставаться в организме человека в течение более длительного времени, потенциально обеспечивая возможность более сильного иммуностимулирующего эффекта в некоторых вариантах осуществления.
В некоторых вариантах осуществления, процесс фильтрации может также повлиять на свойства полученных экстрактов, поскольку размер пор фильтра, и в некоторых случаях химические свойства поверхности фильтра (т.е., ее полярность) могут изменить тип материалов, которые удаляются и удерживаются. Например, в некоторых вариантах осуществления используется процесс фильтрации, предназначенный для удерживания представляющих интерес молекул, но удаления других молекул, таких как нуклеиновые кислоты или нерастворимые или имеющее форму частиц материалы.
Фильтрованные экстракты могут также подвергаться дальнейшей очистке органической экстракцией, органо-водной экстракцией, хроматографией, ультрацентрифугированием, ультрафильтрацией или их комбинацией.
Краткое описание чертежей
Фиг.1: Лиганды для семейства из 11 толл-подобных рецепторов (TLR), экспрессируемые организмом хозяина.
Фиг.2: Чертеж устройства для фильтрации в тангенциальном потоке (TFF) для получения бактериальных экстрактов после лизиса бактерий. На чертеже показаны две различные конфигурации для фильтров: параллельного типа, где все фильтры работают одновременно, и змеевикового типа, где фильтры сконфигурированы по серийному типу.
Фиг.3: Обобщенная корреляция между функциональными параметрами и потоком, указывающие области регулировки давления и регулировки переноса массы для способа фильтрации в тангенциальном потоке (TFF).
Фиг.4: Стимуляция клеток селезенки, культивированных в течение 48 ч в присутствии различных разведений лизатов AFer300, CFer300 и DFer300, и ARahr300, CRahr300 и DRahr300. После добавления 30 мкл/лунку раствора Alamar blue, разведенного в соотношении 1:1, к среде для клеточной культуры, клетки далее инкубировали (a) 8,5 ч (первый эксперимент); (b) 24 ч (второй эксперимент). Показана средняя величина эмиссии при 590 нм ± стандартное отклонение культур в двух повторениях.
Фиг.5: Индукция продукции оксида азота (NO) у мышей, получавших лечение экстрактами Lactobacillus fermentum I-3929 и Lactobacillus rhamnosus 71.38, в (a) первом анализе, и (b) втором анализе. Результаты выражены в мкМ оксида азота (NO) в виде средней величины ± стандартное отклонение.
Фиг.6: Воздействие экстрактов по изобретению на гиперреактивность дыхательных путей (AHR), определенное плетизмографией всего тела (Emka) при увеличивающихся концентрациях вдыхаемого метахолина через один день после последней антигенной стимуляции. Результаты (средняя величина увеличенной паузы ± стандартная ошибка средней) показаны для животных из группы отрицательного контроля, получавших лечение солевым раствором с фосфатным буфером (PBS) (n=4), не леченых животных с антигенной стимуляцией LACK (в качестве группы положительного контроля, n=8), мышей, получавших лечение OM-1009A, с антигенной стимуляцией LACK (n=8), и мышей, получавших лечение OM-1009B, с антигенной стимуляцией LACK (n=7).
Детальное описание изобретения
Определения
Экстракт: Экстракт, как определено в настоящем описании, означает материал, полученный после лизиса одного или более бактериальных штаммов. В некоторых случаях, экстракт получают только из одного штамма, тогда как в других экстракт получают из смеси нескольких различных штаммов.
В некоторых случаях, экстракт представляет собой растворимый экстракт, означая, что он не содержит значительных количеств, представленных в виде частиц и нерастворимых материалов, таких как фрагменты в виде частиц или твердых клеточных стенок. Вместо этого, компоненты из клеточных стенок, органелл и клеточных мембран могут содержаться в экстрактах в той степени, в которой они растворены или суспендированы. Например, экстракт может быть обработан для удаления представленных в виде частиц и нерастворимых материалов, например, посредством фильтрации, центрифугирования или другой методики отделения.
Химический лизис: Это способ лизиса бактериальных клеток в основных, кислотных и/или осмотических условиях.
Лизат: Используемый в настоящем описании, этот термин означает экстракт бактерий, полученных в результате процедуры лизиса клеток.
Фильтрация: Процесс фильтрации, как описано в настоящем описании, означает пропускание экстракта или смеси экстрактов через один или более фильтров, таких как микрофильтры (т.е., микрофильтрацию) и/или ультрафильтры (т.е., ультрафильтрацию). Такая фильтрация может необязательно удалять 100% компонентов, для удаления которых она предназначена, но может, в некоторых вариантах осуществления, сделать экстракты по существу свободными от этих компонентов. В некоторых случаях, фильтрация повторяется в несколько прохождений или циклов.
Исходный pH: Этот термин означает pH, измеренный в начале процедуры, такой как лизис или фильтрация.
Сахариды: Сахарид, как определено в настоящем описании, включает моносахариды, дисахариды, а также более крупные сахариды, такие как линейные и разветвленные полисахариды. Сахариды также включают замещенные или химически модифицированные сахариды, такие как липополисахариды (LPS) и их химически модифицированные варианты.
Липопротеины: Этот термин относится к макромолекулам, которые включают и белковые или пептидные цепи, и липиды, например, белок или пептид, ковалентно связанный с липидом. Используемый в настоящем описании термин липопротеин также включает липопептиды.
Пептидогликаны: Этот термин относится к полимерам. Содержащим сахара и аминокислоты.
Липотейхоевая кислота (LTA): Этот термин относится к ассоциированной с поверхностью адгезионной амфифильной молекуле, присутствующей в грамположительных бактериальных штаммах.
Тейхоевая кислота: Этот термин относится к полимерам глицеринфосфата или рибитолфосфата, соединенных вместе посредством фосфодиэфирных связей.
D-аминокислоты: Этот термин относится к аминокислотам, которые существуют в правовращающих изомерных формах, в отличие от биосинтетически полученных L-аминокислот, которые существуют в левовращающих изомерных формах.
Рацемизация: Этот термин указывает, по меньшей мере, частичную химическую модификацию L-аминокислот в D-аминокислоты.
Среда, которая позволяет избежать риска основанных на прионах заболеваний, означает культуральную среду, используемую на любой стадии получения экстрактов, которые не содержат материалы, такие как сыворотка или мясные экстракты, взятые у животных, таких как коровы или овцы, или у любого другого животного, которое может передавать основанные на прионах заболевания. Примеры таких сред включают синтетические среды на растительной основе, а также среды с использованием лошадиной сыворотки или среды, содержащие материалы, взятые у видов животных, которые не передают прионовые заболевания. Примеры основанных на прионах заболеваний включают, например, губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота, почесуху и болезнь Крейтцфельда-Якоба.
Не животная среда представляет собой среду на растительной основе (т.е., растительную) среду, такую как соевая среда и синтетическая среда.
Используемый в настоящем описании термин нутрицевтическая означает любую композицию, которая может оказывать оздоровительные эффекты у индивидуума после введения, где композиция, например, доступна для индивидуума без прописи врача.
Термин лечение, используемый в терапевтическом контексте в настоящем описании, означает и лечение текущих заболеваний и расстройств, а также, например, профилактику или защиту от развития новых заболеваний или расстройств.
Используемый в настоящем описании термин адъювант для характеристики вариантов осуществления изобретения, относится к вариантам осуществления изобретения, проводимых у индивидуума в сочетании с планом медицинского лечения.
Используемые в настоящем описании термины иммуномодуляция, иммуномодулирующий и тому подобные относятся к способности модифицировать иммунные ответы у индивидуума таким образом, который может оказывать оздоровительные эффекты, например, обеспечить противовоспалительный или иммуностимулирующий эффект.
Используемые в настоящем описании термины противовоспалительные и тому подобные относятся к иммуномодулирующим эффектам, служащим для уменьшения воспаления.
Используемые в настоящем описании термины иммуностимулирующие и тому подобные относятся к стимуляции иммунной системы.
Используемый в настоящем описании термин защитный иммунитет означает, что вариант осуществления изобретения применяется у индивидуума с тем, чтобы обеспечить защиту от последующей антигенной стимуляции инфекционным агентом или аллергеном. Как следствие, во время антигенной стимуляции уровень инфекционного агента или аллергена у индивидуума имеет достаточно низкую концентрацию с тем, чтобы не вызвать значительного ущерба здоровью индивидуума. Продолжительность времени, в течение которого эффективна такая защита от антигенной стимуляции, может быть ограничена, например, периодом в несколько часов, дней или недель.
Используемый в настоящем описании термин индивидуум означает любого животного индивидуума, включая млекопитающих индивидуумов, таких как люди и домашние животные. Домашние животные могут, например, включать млекопитающих, таких как собаки, кошки, лошади, свиньи, коровы, овцы, козы или другой скот, а также может включать не млекопитающих, таких как птицы, например, куры, утки, гуси, индейки и другие виды сельскохозяйственных птиц.
Понятно, что определенные бактериальные штаммы, идентифицированные в настоящем описании и используемые в изобретении, могут включать штамм, полученный из первоначального депозита, указанного в настоящем описании, или его генетического клона, включая штамм, который был повторно депонирован в более позднее время под другим депозитным кодовым названием, но который считается генетически таким же штаммом, как первоначально депонированный вариант.
Все числа, используемые в настоящем описании, являются приблизительными, с учетом ошибок, присущих их измерению, округления и цифр статистической значимости.
Получение экстрактов
Настоящее изобретение включает экстракт одного или более бактериальных штаммов Lactobacillus, где экстракт представляет собой растворимый экстракт, и где экстракт содержит химически модифицированные бактериальные молекулы.
Экстракты по настоящему изобретению могут быть получены, например, культивированием клеток с последующим сбором полученной биомассы, лизисом и очисткой. Для каждого штамма для получения достаточного количества материала, ферментационные культуры могут начинаться с лота рабочего посева с последующим внесением посевного материала в более крупные ферментационные контейнеры.
Используемые среды могут быть одинаковыми для каждого вида. В некоторых вариантах осуществления, для выращивания всех подлежащих использованию штаммов может применяться среда, которая избегает риска основанных на прионах заболеваний.
После ферментации полученная биомасса из одного штамма или из набора штаммов может быть инактивирована тепловой обработкой, концентрирована и заморожена. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления исходным материалом, используемым для образования экстрактов, могут быть не подвергнутые лизису цельные клетки.
В других вариантах осуществления исходный материал, используемый для получения экстрактов, может представлять собой биомассу, полученную из клеток, уже, по меньшей мере, частично лизированных механически, ферментативно или химически. В еще одних вариантах осуществления, исходный материал может представлять собой фракцию таких предварительно лизированных клеток, такую как фракция, содержащая клеточные стенки.
В некоторых вариантах осуществления исходный материал обрабатывается щелочной средой, такой как состоящая из сильного основания, такого как гидроксид или другие сильные минеральные или органические основания. На этой стадии лизиса или обработки основанием, не лизированные клетки в исходном материале лизируются, тогда как в некоторых вариантах осуществления, клеточные компоненты могут быть химически модифицированы. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления химически модифицированные бактериальные молекулы получаются обработкой основанием, такой как обработка сильным основанием одного или более бактериальных штаммов Lactobacillus, из которых получен экстракт (т.е., обработка основанием не лизированных клеток или компонентов или фракций из бактериальных клеток, как только что было объяснено).
В некоторых вариантах осуществления обработке основанием может быть подвергнута концентрация сухой массы биомассы от 2 до 90 г/л, например, от примерно 2 до примерно 80 г/л, или от примерно 3 до примерно 40 г/л, например, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, или 40 г/л, или даже от 5 до 50 г/л или другие диапазоны, ограниченные перечисленными выше концентрациями. В некоторых вариантах осуществления, обработке основание подвергаются от примерно 40 до примерно 80 г/л, например, 40, 50, 60, 70 или 80 г/л или другие диапазоны, ограниченные перечисленными выше концентрациями.
Сухая масса биомассы определяется в настоящем описании сухой массой материала в г на литр образца. Она может быть измерена сушкой образца в небольшой фарфоровой чашке примерно при 105°C до тех пор, пока она не достигнет постоянной массы.
Температура может составлять от 30 до 60°C, например, от 30 до 55°C, от 30 до 50°C, от 30 до 45°C, от 30 до 40°C или от 30 до 35°C. В некоторых вариантах осуществления, температура обработки основанием может составлять от 35 до 60°C, например, от 35 до 55°C, от 35 до 50°C, от 35 до 45°C или, например, от 35 до 40°C. В некоторых вариантах осуществления, температура обработки основанием может составлять 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C или даже 40°C, или диапазоны, ограниченные перечисленными выше температурами.
Время обработки основанием может варьироваться от 2 часов до нескольких дней, например, 1, 2, 3, 4, 5 или даже 10 дней, или от 3 до 120 ч, или от 3 до 48 ч, например, 3, 5, 8, 15, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 36, 40, 44 или 48 ч, или от 15 до 120 ч, например, от 60 до 120 ч, например, 60, 72, 84, 96, 108 или 120 ч, или диапазонов, ограниченных перечисленными выше интервалами времени. Понятно, что эти диапазоны времени включают любое фракционное число дней, часов или минут в их пределах.
В некоторых вариантах осуществления, используется концентрация сильного основания от 0,001 N до 1,0 N, например, от 0,001 N до 0,6 N, или от 0,10 N до 0,8 N, или от 0,6 N до 1,0 N, или диапазон, начинающийся или заканчивающийся от 0,001, 0,002, 0,003 или 0,1 N, или от 0,1 N до 0,6 N, или диапазон, начинающийся или заканчивающийся от 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 или 1,0 N или другие диапазоны, ограниченные перечисленными выше концентрациями. В некоторых вариантах осуществления, используется такая концентрация основания. Чтобы достичь первоначальный pH больше чем 9,0, или pH больше чем 9,5, pH больше чем 10,0 и меньше чем 13,5, например, больше чем 11,5, больше чем 12,0, больше чем 12,5, больше чем 13,0 или от pH 9,0 до pH 13,5. В еще одних вариантах осуществления, может использоваться такая концентрация основания, чтобы, например, достичь исходный pH больше чем 10,0 и меньше чем 13,0 или от pH 9,0 до pH 13,0.
В некоторых вариантах осуществления, pH во время обработки основанием может быть снижен после экстракции растворимых компонентов. Например, исходный pH может представлять собой основный pH, такой как от pH 9,0 до pH 13,0, или от pH 9,5 до pH 12,5. Обработке основанием может быть предоставлена возможность продолжаться в течение определенного периода времени, например, от 3 до 120 ч, например, от 3 до 48 ч, или в течение периодов времени, перечисленных выше, при перечисленных выше температурах. Затем, в некоторых вариантах осуществления, возможно придание кислотности pH добавлением, например, хлористоводородной кислоты с тем, чтобы получить pH от 2,0 до 4,5, или pH от 2,5 до 4,5 или pH от 2,5 до 4,0, например, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 или в диапазоне, ограниченном любыми из величин pH, перечисленных выше. Вторая обработка при низком pH может проводиться при температуре от 30 до 60°C, от 35 до 55, или от 35 до 45°C, например, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, 41°C, 42°C, 43°C, 44°C или даже 45°C. Время кислотной обработки может варьироваться от 1 часа до нескольких часов или до 72 ч, например, от 1 часа до 24 ч. или от 1 часа до 6 ч, или от 3 ч до 48 ч, или от 3 ч до 24 ч. или от 4 до 72 ч, или даже от 24 ч до 72 ч, или в любом диапазоне времени, ограниченном перечисленными выше периодами времени.
В некоторых вариантах осуществления изобретения щелочная обработка выполняется на бактериальной биомассе, содержащей, например, материал из Lactobacillus fermentum, имеющий сухую массу биомассы от 10 г/л до 40 г/л. В других вариантах осуществления изобретения щелочная обработка выполняется на бактериальной биомассе, содержащей смесь штаммов Lactobacillus, и имеющей сухую массу биомассы от 10 г/л до 40 г/л. В таких вариантах осуществления, щелочная обработка может выполняться при концентрации иона гидрохлорида от 0,025 N до 0,25 N или при pH от 9,5 до 12,5 при температуре от 35 до 45°C в течение периода времени от 3 ч до 48 ч. В некоторых вариантах осуществления, щелочная обработка выполняется на бактериальной биомассе, содержащей материал из одного или более штаммов Lactobacillus при концентрации иона гидрохлорида от 0,025 N до 0,20 N, от 0,025 до 0,15 N, от 0,025 до 0,10 N, от 0,05 N до 0,25 N, от 0,05 N до 0,20 N, от 0,05 до 0,15 N, от 0,05 N до 0,10 N, от 0,10 N до 0,25 N, от 0,10 N до 0,20 N, от 0,10 N до 0,15 N, от 0,15 N до 0,25 N, от 0,15 N до 0,20 N или даже от 0,20 N до 0,25 N. В таких вариантах осуществления, pH может, например, составлять от 9,5 до 12,0, от 9,5 до 11,5, от 9,5 до 11,0, от 9,5 до 10,5, от 9,5 до 10,0, от 10,0 до 12,5, от 10,0 до 12,0, от 10,0 до 11,5, от 10,0 до 11,0, от 10,0 до 10,5, от 10,5 до 12,5, от 10,5 до 12,0, от 10,5 до 11,5, от 10,5 до 11,0, от 11,0 до 12,5, от 11,0 до 12,0, от 11,0 до 11,5, от 11,5 до 12,5, от 11,5 до 12,0 или даже pH от 12,0 до 12,5. Время щелочной обработки для таких вариантов осуществления может составлять от 3 ч до 36 ч, от 3 ч до 24 ч, от 3 ч до 18 ч, от 3 ч до 12 ч, от 3 ч до 6 ч, от 6 ч до 48 ч, от 6 ч до 36 ч, от 6 ч до 24 ч, от 6 ч до 18 ч, от 6 ч до 12 ч, от 6 ч до 8 ч, от 8 ч до 48 ч, от 8 ч до 36 ч, от 8 ч до 24 ч, от 8 ч до 18 ч, от 8 ч до 12 ч, от 12 ч до 48 ч, от 12 ч до 36 ч, от 12 ч до 18 ч, от 18 ч до 48 ч, от 18 ч до 36 ч, от 18 ч д 24 ч, от 24 ч до 48 ч, от 24 ч до 36 ч или от 36 ч до 48 ч. Щелочная обработка может выполняться в течение любых периодов времени, граничащие с указанными выше диапазонами, например, 3, 6, 8, 12, 18, 24, 36 или даже 48 ч. такие условия могут обеспечить умеренную щелочную обработку.
В других вариантах осуществления 10 г/л и 40 г/л сухой массы биомассы из одного или более штаммов Lactobacillus могут быть подвергнуты воздействию концентрации иона гидроксида от 0,15 N до 0,50 N или pH от 11,5 до 13,5, при температуре от 35 до 45°C в течение периода времени от 15 ч до 120 ч. Например, в некоторых вариантах осуществления концентрация гидроксида может составлять от 0,15 N до 0,45 N, от 0,15 N до 0,40 N, от 0,15 N до 0,35 N, от 0,15 N до 0,30 N, от 0,15 N до 0,25 N, от 0,15 N до 0,20 N, от 0,20 N до 0,50 N, от 0,20 N до 0,40 N, от 0,20 N до 0,30 N, от 0,25 N до 0,50 N, от 0,30 N до 0,50 N, от 0,30 N до 0,40 N или от 0,40 N до 0,50. В таком варианте осуществления pH может составлять, например, от 11,5 до 13,0, от 11,5 до 12,5, от 11,5 до 12,0, от 12,0 до 13,5, от 12,0 до 13,0, от 12,0 до 12,5, от 12,5 до 13,5, от 12,5 до 13,0, от 13,0 до 13,5. Период времени для щелочной обработки может составлять от 15 ч до 100 ч, от 15 ч до 90 ч, от 15 ч до 75 ч, от 15 ч до 60 ч, от 15 ч до 48 ч, от 15 ч до 36 ч, от 24 ч до 120 ч, от 24 ч до 100 ч, от 24 ч до 90 ч, от 24 ч до 75 ч, от 24 ч до 60 ч, от 24 ч до 48 ч, от 36 ч до 120 ч, от 36 ч до 100 ч, от 36 ч до 90 ч, от 36 ч до 75 ч, от 36 ч до 60 ч, от 36 ч до 48 ч, от 48 ч до 120 ч, от 48 ч до 100 ч, от 48 ч до 90 ч, от 48 ч до 75 ч, от 48 ч до 60 ч, от 60 ч до 120 ч, от 60 ч до 100 ч, от 60 ч до 90 ч, от 60 ч до 75 ч, от 75 ч до 120 ч, от 75 ч до 100 ч, от 75 ч до 90 ч, от 90 ч до 120 ч или, например, от 100 до 120 ч. Периоды времени, также предусмотренные для щелочной обработки в таких вариантах осуществления, включают 15, 24, 48, 60, 75, 90, 100 и 120 ч. Такие условиях могут обеспечить обработку сильной щелочью.
В других вариантах осуществления от 10 г/л до 40 г/л исходной сухой массы биомассы могут обрабатываться концентрацией гидроксида от 0,025 N до 0,25 N или pH от 9,5 до 12,5, при температуре от 35 до 45°C в течение периода времени от 3 ч до 48 ч. Затем pH доводиться до уровня от 2,5 до 4,0 добавлением кислоты, такой как хлористоводородная кислота (HCl), что составляет кислотную обработку. Кислотная обработка может выполняться при температуре от 35 до 45°C в течение периода времени от 1 ч до 24 ч. Например, в таких вариантах осуществления, щелочная обработка бактериальной биомассы, содержащей один или более штаммов Lactobacillus может выполняться при концентрации гидроксида от 0,025 N до 0,20 N, от 0,025 до 0,15 N, от 0,025 до 0,10 N, от 0,05 N до 0,25 N, от 0,05 N до 0,20 N, от 0,05 до 0,15 N, от 0,05 N до 0,10 N, от 0,10 N до 0,25 N, от 0,10 N до 0,20 N, от 0,10 N до 0,15 N, от 0,15 N до 0,25 N, от 0,15 N до 0,20 N или даже от 0,20 N до 0,25 N. Во время щелочной обработки в таких вариантах осуществления pH может, например, составлять от 9,5 до 12,0, от 9,5 до 11,5, от 9,5 до 11,0, от 9,5 до 10,5, от 9,5 до 10,0, от 10,0 до 12,5, от 10,0 до 12,0, от 10,0 до 11,5, от 10,0 до 11,0, от 10,0 до 10,5, от 10,5 до 12,5, от 10,5 до 12,0, от 10,5 до 11,5, от 10,5 до 11,0, от 11,0 до 12,5, от 11,0 до 12,0, от 11,0 до 11,5, от 11,5 до 12,5, от 11,5 до 12,0 или даже pH от 12,0 до 12,5. Время щелочной обработки для таких вариантов осуществления может составлять от 3 ч до 36 ч, от 3 ч до 24 ч, от 3 ч до 18 ч, от 3 ч до 12 ч, от 3 ч до 6 ч, от 6 ч до 48 ч, от 6 ч до 36 ч, от 6 ч до 24 ч, от 6 ч до 18 ч, от 6 ч до 12 ч, от 6 ч до 8 ч, от 8 ч до 48 ч, от 8 ч до 36 ч, от 8 ч до 24 ч, от 8 ч до 18 ч, от 8 ч до 12 ч, от 12 ч до 48 ч, от 12 ч до 36 ч, от 12 ч до 18 ч, от 18 ч до 48 ч, от 18 ч до 36 ч, от 18 ч до 24 ч, от 24 ч до 48 ч, от 24 ч до 36 ч, или от 36 ч до 48 ч. Щелочная обработка может выполняться в течение любого периода времени, граничащего с указанными выше диапазонами, например, 3, 6, 8, 12, 18, 24, 36 или даже 48 ч. Затем pH может доводиться до уровня от 2,5 до 3,5, от 2,5 до 3,0, от 3,0 до 4,0, от 3,0 до 3,5 или от 3,5 до 4,0 добавлением кислоты для кислотной обработки после щелочного лизиса. Кислотная обработка может выполняться в течение периода времени от 1 ч до 18 ч, от 1 ч до 12 ч, от 1 ч до 6 ч, от 1 ч до 3 ч, от 3 ч до 24 ч, от 3 ч до 18 ч, от 3 ч до 12 ч, от 3 ч до 6 ч, от 6 ч до 24 ч, от 6 ч до 18 ч, от 6 ч до 12 ч, от 12 ч до 24 ч, от 12 ч до 18 ч, от 18 ч до 24 ч. Периоды времени, также предусмотренные для кислотной обработки, включают 1, 3, 6, 12, 18 и 24 ч.
Лизаты, полученные после описанной выше основной обработки, могут затем очищаться центрифугированием и/или фильтрацией, например, для удаления представленных в виде частиц и нерастворимых компонентов. Например, лизаты могут центрифугироваться при 9000 х гравитацию с последующим одним или более циклами фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм. В некоторых случаях могут использоваться последовательные циклы фильтрации через фильтры с большим размером пор с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Могут также использоваться способы ультрафильтрации для содействия экстракции растворимых материалов из экстракта, например, рециркуляцией пермеата ультрафильтрации для дальнейшей микрофильтрации.
В некоторых вариантах осуществления способ фильтрации может применяться для фильтрации лизатов и для экстракции растворимых молекул из более крупных клеточных осколков (фиг.2). См., например, руководство Separations Technology, Pharmaceutical and Biotechnology Applications, Wayne P. Olson, Editor, lnterpharm Press, Inc., Buffalo Grove, IL, U.S.A., p.126-135 - ISBN:0-935184-72-4. В начале такого процесса, разбавленный бактериальный лизат может храниться в первом резервуаре. Например, при TFF экстракт может быть подвергнут и фильтрации и через микрофильтр, и через ультрафильтр. Например, включается петля микрофильтрации (MF), и производится прокачка продукта. Полученный ретентат MF подвергается рециркуляции, в то время как пермеат MF переносится во второй резервуар.
После достижения подходящей степени концентрации, включается петля ультрафильтрации (UF). Пермеат UF может подвергаться рециркуляции назад в первый резервуар для непрерывной экстракции солюбилизированных экстрактов из лизата, в то время как ретентат UF хранится во втором резервуаре. Во время непрерывной экстракции, объемы в резервуарах 1 и 2 могут подбираться регулировкой скоростей потока пермеатов микрофильтрации и ультрафильтрации.
Могут выполняться несколько таких циклов экстракции, или TFF, или другим способом фильтрации. В вариантах осуществления, в которых используется TFF, в конце последнего цикла петля микрофильтрации может отключаться, и петля микрофильтрации может быть задействована отдельно, и пермеат MF может переноситься в резервуар 2.
nd
Условия поперечного потока и трансмембранного давления определяются независимыми от давления и регулируемыми переносом массы областями в пленочной теории, описанной, например, M. Cheryan (Ultrafiltration and Microfiltration Handbook, 2 Ed., Ch. 4, 1998). На поток пермеата и выход экстракции воздействуют условиях фильтрации (трансмембранное давление (TMP), поперечный поток, температура и т.д.). Тип фильтра может также воздействовать на эффективность фильтрации, как и тип системы пластин (кассетного фильтра). Могут использоваться различные конфигурации, включая параллельный тип и змеевиковый тип (см. фиг.2). Определенные условия разработаны для оптимизированной работы каждой использованной комбинации типа режима и типа фильтра.
2
2
2
Петля микрофильтрации может быть снабжена фильтрами с размером пор от 1,2 мкм до 0,1 мкм, такие как фильтры с размером пор от 0,65 до 0,2 мкм или 0,45 мкм. Поперечный поток может составлять от 100 до 3000 л/ч м (LHM), например, от 300 до 2500 LHM или 2000 LHM при TMP от 0,3 до 2 бар (от 31,5 до 210 Н/м). Петля ультрафильтрации может быть снабжена фильтрами от 10 кДа до 1000 кДа, например, от 10 кДа до 100 кДа, или от 10 кДа до 30 кДа, или от 30 кДа до 100 кДа. Поперечный поток может составлять от 30 до 1000 LHM, например, от 20 до 500 LHM при TMP от 0,2 до 1,5 бар (157,5 Н/м).
От 5 до 20 объемов диафильтрации могут использоваться для экстракции растворимых компонентов из стенок бактериальных клеток. В некоторых вариантах осуществления, используются от 8 до 15 объемов. Следовательно, например, в некоторых вариантах осуществления, могут использоваться от 5 до 15 циклов фильтрации, в некоторых случаях - от 8 до 15 циклов.
При желании, после фильтрации, экстракт может дополнительно концентрироваться или центрифугироваться. Например, может выполняться дальнейшая микрофильтрация с использованием фильтра меньшим размером пор, таким как фильтр с размером пор 0,2 мкм. После фильтрации, экстракт может лиофилизироваться перед включением его в состав для применения.
В некоторых вариантах осуществления, после фильтрации экстракт может очищаться для отделения, устранения или увеличения концентрации одного или более модифицированных компонентов в экстракте. Например, для удаления заряженных компонентов может использоваться стадия сильной ионной хроматографии. Могут использоваться другие способы очистки, такие как гель-фильтрация, хроматография, ультрацентрифугирование, экстракция и преципитация.
Химические свойства бактериальных экстрактов
Обработка основанием может привести к разнообразных химическим модификациям клеточных компонентов. Например, в белках: (1) пептидные связи могут подвергаться частичному расщеплению, генерируя более мелкие полипептиды; (2) натуральные L-аминокислоты могут быть, по меньшей мере, частично рацемизированы в D-аминокислоты; и (3) аспарагиновый и глутаминовый остатки могут стать деаминированными, приводя к изменениям изоэлектрической точки белков. Такие молекулы как липотейхоевая кислота, липопептиды и фосфолипиды могут подвергаться катализируемому основанием гидролизу сложноэфирных связей и/или амидных связей, приводя к модифицированным амфифильным структурам, которые могут иметь новые физико-химические и иммунологические свойства. Примеры других возможных химических модификаций включают частичную солюбилизацию полисахаридов клеточной стенки и полный гидролиз рибонуклеиновой кислоты (RNA) в отдельные рибонуклеотиды, включая перестройку фосфатных групп.
Следовательно, некоторые или все из указанных химических модификаций могут происходить во время обработки основанием клеток Lactobacillus, как описано в настоящей заявке. Такие молекулярные модификации могут воздействовать на виды биологической активности экстрактов.
Например, обработка основанием бактерий в соответствии с настоящим изобретением может привести к частичному гидролизу белков, а также деаминированию, деамидированию и/или частичной рацемизации аминокислот из L в D. В одном аналитическом исследовании экстракта в соответствии с изобретением, наблюдался каждый из пиков, представляющих D-аспарагиновую кислоту, D-глутаминовую кислоту, D-серин, D-метионин, D-гистид, D-аланин, D-аргинин, D-фенилаланин, D-тирозин, D-лейцин и D-лизин. Процентная доля D-аминокислот указанных видов в этом исследовании находилась в диапазоне от 3% до 40%. Следовательно, некоторые варианты осуществления изобретения обеспечивают возможность рацемизации одного или более из серина, треонина, гистидина, аланина, аргинина, тирозина, фенилаланина, лейцина и лизина, например, всех указанных выше аминокислот, или любого выбора более чем одной, но менее чем всех указанных выше аминокислот, таких как, например, аланин, фенилаланин и лизин. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна или более из указанных выше аминокислот могут стать рацемизированными из D в L. В других вариантах осуществления, по меньшей мере, 40% одной или более из указанных выше аминокислот могут стать рацемизированными.
Таким образом, экстракты по настоящему изобретению могут содержать от 1 до 90% D-аминокислот, например, от 1 до 80% или от 1 до 60%. В некоторых вариантах осуществления, экстракт содержит от 10 до 45% D-аминокислот, например, от 25 до 35% D-аминокислот. Экстракты по изобретению могут содержать, по меньшей мере, одну D-аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из D-аспарагиновой кислоты, D-аспарагина, D-глутаминовой кислоты, D-глутамина, D-серина, D-метионина, D-гистидина, D-аланина, D-аргинина, D-фенилаланина, D-тирозина, D-лейцина, D-лизина, D-валина и D-треонина. В некоторых вариантах осуществления, концентрация любой из D-аминокислот составляет от 1 до 50%, например, от 10 до 40% или даже от 15 до 35%.
Некоторые экстракты по настоящему изобретению содержат стенку бактериальной клетки и мембранные компоненты Lactobacillus, такие как липотейховые кислоты, тейхоевую кислоту, пептидогликан или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления, эти компоненты химически модифицированы. Некоторые экстракты также содержат компоненты клеточной стенки и/или клеточной мембраны, такие как липопротеины, которые могут быть также химически модифицированы. В некоторых вариантах осуществления, компоненты клеточной стенки или компоненты клеточной мембраны, например, липопротеины, растворяются или суспендируются в экстрактах и, таким образом, не присутствуют в имеющей форме частиц или нерастворимой форме.
Кроме того, экстракт в соответствии с настоящим изобретением может содержать, например, от 10 до 100 мг/мл растворимой сухой массы (SDW) материала, от 1 до 30 мг/мл белка (Prot.), от 0,5 до 4,0 мг/мл сахара и менее чем 100 мг/мл ДНК. Например, некоторые варианты осуществления содержат примерно от 15 до 35 мг/мл растворимой сухой массы, от 3 до 7 мг/мл белка, от 1,0 до 3,0 мг/мл сахара и от 10 до 40 мкг/мл ДНК. Экстракт в соответствии с настоящим изобретением может содержать, например, 30 мг/мл растворимой сухой массы, 9,6 мг/мл белка, 2,4 мг/мл сахара и 33 мкг/мл ДНК, или в другом примере содержит 32,4 мг/мл растворимой сухой массы, 5,8 мг/мл белка, 2,3 мг/мл сахара и менее чем 100 мкг/мл ДНК. Растворимая Сухая Масса (SDW) в г/л или мг/мл определяется получением 5 мл растворимой фракции в результате лизиса или обработки основанием и его сушкой до постоянной массы в фарфоровой чашке при 105°C.
В некоторых вариантах осуществления экстракты содержат, по меньшей мере, 0,3 мг/мл сахаридов, например, от 0,3 до 4,5 мг/мл сахаридов. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один сахарид выбран из моносахаридов, дисахаридов и полисахаридов. Некоторые экстракты по изобретению содержат, по меньшей мере, один разветвленный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один сахарид химически модифицирован.
Лизис или обработка основанием бактерий в соответствии с настоящим изобретением может привести к уменьшению средней молекулярной массы макромолекул компонента до диапазона, например, от 1 кДа до 300 кДа и 100 кДа, или до диапазона от 1 кДа до 60 кДа и 10 кДа. В некоторых вариантах осуществления, экстракт содержит, по меньшей мере, один белок с молекулярной массой менее чем 50 кДа или менее чем 30 кДа, например, менее чем 10 кДа.
Виды биологической активности бактериальных экстрактов
Экстракты в соответствии с изобретением могут обладать иммуномодулирующей активностью. Например, некоторые экстракты могут стимулировать иммунную систему. Некоторые экстракты могут обладать противовоспалительной активностью. Определенные эффекты экстракта могут зависеть от условий изготовления и вида или штамма Lactobacillus или смеси видов и штаммов, из которых получен экстракт. Соответственно, некоторые экстракты в соответствии с изобретением могут проявлять мощную иммуностимулирующую активность и, таим образом, могут применяться при лечении инфекций или в качестве дополнений к такому лечению, тогда как другие варианты осуществления могут проявлять более слабую иммуностимулирующую активность, но проявлять противовоспалительную активность, таким образом, являясь полезными при лечении воспалительных расстройств, таких как аллергии, астма, аутоиммунные заболевания, колит и воспалительные кишечные заболевания, или в качестве дополнений к такому лечению.
Таким образом, некоторые экстракты в соответствии с изобретением могут быть эффективны для лечения пациентов, страдающих расстройствами, включающими без ограничения микробные инфекции, аллергические заболевания, и расстройства пищеварительного тракта. Некоторые экстракты в соответствии с изобретением могут быть предоставлены пациенту в виде нутрицевтиков, например, в качестве дополнений при лечении разнообразных состояний, включая без ограничения микробные инфекции, аллергические заболевания и расстройства пищеварительного тракта.
Диапазон видов биологической активности экстрактов может определяться несколькими анализами in vitro и in vivo. Например, анализ AlamarBlueTM-Assay включает флюорометрический/колориметрический индикатор роста на основании выявления метаболической активности индикатором окисления-восстановления (REDOX) в ответ на химическое восстановление в результате роста клеток (пример 4).
Клеточные анализы in vitro тестируют продукцию оксида азота (NO) из мышиных макрофагов и используются при скрининге для выявления способности экстракта стимулировать иммунную систему для уничтожения инвазивной бактерии (фиг.5). В некоторых вариантах осуществления, экстракты могут стимулировать продукцию NO в мышиных макрофагах, приводя к измеренным концентрациям NO от 3 мкМ до 60 мкМ, например, от 5 мкМ до 40 мкМ. В некоторых вариантах осуществления, концентрация NO может быть выше 30 мкМ. Тип бактериальных видов может также воздействовать на эти результаты. Например, экстракты из Lactobacillus fermentum могут вызывать большую продукцию оксида азота, чем Lactobacillus rahmnosus (см., например, пример 5 ниже). Для скрининга вариантов осуществления по изобретению для выявления их иммуностимулирующего или противовоспалительного потенциала in vitro, тесты бактериальных экстрактов по изобретению могут выполняться на мононуклеарных клетках периферической крови человека (PBMC). См. публикацию Foligne et al. {World J Gastroenterol, 2007, 13(2):236-243). Может быть измерено высвобождение и IL12p70 (воспалительного цитокина), и IL10 (противовоспалительного цитокина), и рассчитано отношение IL-10/IL-12 (пример 6). Некоторые варианты осуществления изобретения дают более высокое отношение IL10/IL12, чем контроль живой Lactobacteria fermentum, таким образом, свидетельствуя о том, что некоторые экстракты по изобретению могут проявлять эквивалентные или даже более сильные противовоспалительные свойства, чем живой материнский микроорганизм при введении in vivo. Следовательно, изобретение включает экстракты, способные достичь рассчитываемого отношения IL10/IL12 в мононуклеарных клетках периферической крови человека, где отношение равно или больше чем отношение IL10/IL12, достигаемое живым штаммом Lactobacillus strain, из которого получен экстракт.
Иммунные реакции экстрактов по изобретению могут также тестироваться исследованием их воздействий на Толл-подобные рецепторы (TLR), Например, экстракты могут тестироваться на клетках HEK293 в присутствии или в отсутствие агониста TLR2 Pam3Cys, или в присутствии или в отсутствие агониста TLR4 LPS (пример 7). Клеточная линия HEK293 обеспечивает возможность эффективного мониторинга активности TLR с использованием анализов ELISA, таких как титрование IL-8 или основанные на репортере системы, которые обеспечивают мониторинг вызванной TLR активации NF-κB. Некоторые варианты осуществления изобретения могут действовать в качестве антагонистов TLR 2/6 в клетках HEK TLR 2/6. Таким образом, некоторые варианты осуществления могут использоваться для борьбы с инфекциями у индивидуума, тогда как другие варианты осуществления могут быть использованы против воспаления и/или аутоиммунных расстройств.
Скрининг описанных в настоящем описании экстрактов может также проводиться в отношении активности рецепторов TLR и NOD2 (Пример 8). Некоторые варианты осуществления изобретения активируют рецепторы TLR м/ИЛИ или NOD2 in vitro, указывая на то, что они могут быть способны активировать иммунную систему TLRs и/или NOD2.
Методика бляшкообразующих клеток (PFC) может использоваться для оценки неспецифической стимуляции B-лимфоцитов (пример 9). Определенные лимфоидные клетки высвобождают гемолитические антитела, которые диффундируют и вызывают лизис соседних эритроцитов образованием лизисных бляшек в присутствии комплемента. Некоторые варианты осуществления изобретения могут увеличить секрецию иммуноглобулинов B клетками, и, таким образом, могут потенциально использоваться профилактически для примирования иммунной системы у индивидуумов, страдающих рецидивирующими инфекциями.
Противоинфекционная эффективность экстрактов по настоящему изобретению может тестироваться, например, после инфекции Salmonella индивидуумов, такой как инфекция мышей (пример 10). Некоторые варианты осуществления по изобретению могут обеспечить защитный иммунитет против инфекций, таких как бактериальные инфекции, т.е., инфекции Salmonella. Например, некоторые варианты осуществления могут снизить смертность у мышей, вызванную инъекцией Salmonella thyphimurium.
Комбинация активности NO in vitro с определением активности in vivo, измеренной, например, на мышиной модели вызванной аллергеном астмы (пример 11) может обеспечить более полный вид потенциальной клинической активности описанных в настоящей заявке экстрактов. На модели LACK (белка из паразита Leishmania major), число эозинофилов, обнаруживаемое в жидкостях бронхо-альвеолярного лаважа, по сравнению с контрольными животными с астмой (не получавшими лечение) может быть снижено на фактор от 1 до 10, например, снижено от 1,5 раз до 5 раз. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, экстракт снижает число эозинофильных клеток, число нейтрофильных клеток, число лимфоцитарных клеток или любую их комбинацию у страдающего астмой мышиного индивидуума на фактор, по меньшей мере, 1,5 относительно не получавшего лечение контроля с астмой. Некоторые варианты осуществления могут снизить эозинофилию у страдающих астмой индивидуумов и одновременно снизить уровень цитокинов Th2 (таких как IL4, IL5, IL13), которые являются маркерами астмы. Таким образом, такие варианты осуществления, например, могут обладать противовоспалительными видами активности у индивидуумов, страдающих иммунологическими расстройствами, такими как аллергические расстройства, включая астму.
Композиции, содержащие бактериальные экстракты
Экстракты в соответствии с изобретением могут составляться рядом различных путей для конечного введения. Например, могут быть получены пероральные таблетки, капсулы, пилюли, а также жидкие препаративные формы или аэрозоли. Могут быть также получены препаративные формы для вливания или инъекций.
Варианты осуществления настоящего изобретения могут быть составлены, например, в виде твердых лекарственных форм или жидких лекарственных форм. Иллюстративные твердые лекарственные формы могут включать, например, таблетку (например, покрытую таблетку, жевательную таблетку, таблетку, выделяющую газ при растворении, сублингвальную таблетку, гранулированный материал, порошок или капсулу), содержащую экстракт.
Твердые лекарственные формы могут также содержать разбавители, наполнители и/или другие эксципиенты. Могут добавляться другие эксципиенты, так как консерванты, красящие агенты, ароматизаторы и подсластители.
В качестве альтернативы капсулам и таблеткам, могут быть также разработаны для перорального пути введения.
Экстракты по настоящему изобретению могут быть включены в одну или более нутрицевтические композиции, такие как питательные и/или диетические добавки и пищевые добавки, или в одну или более фармацевтические композиции.
Введение бактериальных экстрактов индивидууму
Доза, содержащая, по меньшей мере, один экстракт по настоящему изобретению, может вводиться индивидууму, страдающему, по меньшей мере, одним расстройством, выбранным из расстройства пищеварительного тракта, расстройства дыхательных путей, расстройства мочевых путей и аллергических состояний, или имеющему риск их развития. Например, в некоторых вариантах осуществления экстракты могут вводиться индивидуумам, страдающим инфекциями верхних и нижних отделов легких, обструктивным легочным заболеванием с острой инфекцией нижних отделов дыхательных путей, обструктивным легочным заболеванием в стадии обострения, назофарингитом, синуситом, фарингитом, тонзиллитом, ларингитом, трахеитом, ларингофарингитом, гриппом, пневмонией, бронхопневмонией, бронхитом, ринитом, назофарингитом, фарингитом, синуситом, тонзиллитом, ларингитом, ларинготрахеитом, бронхитом, аллергической астмой, атопическим дерматитом, инфекциями мочевых путей вследствие обструктивной и рефлюксной уропатии, уретритом, тубуло-интерстициальным нефритом, обструктивным пиелонефритом, циститом, включая хронический цистит, синдром боли в тазовой области у мужчин, включая простатит и хронический простатит, простатоцистит, воспалительными заболеваниями тазовых органов у женщин или при риске их развития.
В некоторых вариантах осуществления, экстракты вводятся индивидууму в форме нутрицевтической композиции, такой как питательная добавка и/или пищевая добавка. В других вариантах осуществления, экстракты вводятся индивидууму в форме фармацевтической композиции. Введение может включать введение одной дозы или множественных доз.
В некоторых вариантах осуществления, экстракт может предоставляться в терапевтически эффективной дозе для лечения индивидуума, страдающего одним или более из указанных выше состояний. В некоторых вариантах осуществления, экстракт может предоставляться в качестве дополнения к другому медицинскому лечению.
РАБОЧИЕ ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Бактериальные культуры
ПРИМЕР 1.1: Культура Lactobacillus fermentum I-3929
Первоначальные условия культивирования
Культуральную среду получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л, плотность 1,005 г/мл). После растворения, pH не регулировали. После стерилизации среды, небольшие колбы Эрленмейера отдельно засевали содержимым замороженных флаконов (содержащих 1,5 мл замороженных бактерий) и инкубировали при 37°C в течение 8 часов. Затем аликвоты по 20 мл этой культуры переносили в более крупные колбы Эрленмейера, содержащие 1000 мл культуральной среды и снова инкубировали в таких же условиях. После 16 ч роста, содержимое колбы Эрленмейера емкостью 1 л переносили в возбраживатель.
Условия культивирования во возбраживателях
20 литров культуральной среды получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали. Температуру инкубации регулировали на уровне 37°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин. Во время культивировании pH не регулировали. Через 24 ч 7 литров из возбраживателей переносили в ферментер (оптическая плотность (OD) при 700 нм культуры возбраживателя через 24 ч = 1,24). Культуры возбраживателей в стерильных условиях переносили в ферментеры.
Условия культивирования в ферментерах
70 литров культуральной среды получали в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали.
После стерилизации к культуре добавляли 8 г/л глюкозы. Температуру инкубации регулировали на уровне 37°С при перемешивании со скоростью 100 об/мин и без аэрации. Во время культивирования pH регулировали на уровне 5,7. Через 16 ч культуры (OD культуры при 700 нм 2,30) инактивировали тепловой обработкой при 65°С в течение 35 минут и переносили в резервуар для сбора культуры клеток. После инактивации, культуры переносили в стеллаж ультрафильтрации для отделения биомассы от культуральной среды, концентрировали и промывали NaCl (9 г/л) в очищенной воде. Собранную биомассу делили на аликвотные количества (масса концентрированной бактериальной суспензии 2000 г при 31,8 мг сухой массы биомассы на 1 грамм концентрированной бактериальной суспензии) и затем замораживали при -15°C.
ПРИМЕР 1.2: Культура Lactobacillus helveticus 103146
Первоначальные условия культивирования
Культуральную среду получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали. После стерилизации среды, небольшие колбы Эрленмейера отдельно засевали содержимым замороженных флаконов (содержащих 1,5 мл замороженных бактерий) и инкубировали при 37°C в течение 9 часов. Затем аликвоты по 20 мл этой культуры переносили в более крупные колбы Эрленмейера, содержащие 1000 мл культуральной среды и снова инкубировали в таких же условиях. После 15 ч роста, содержимое колбы Эрленмейера емкостью 1 л переносили в возбраживатель.
Условия культивирования во возбраживателях
20 литров культуральной среды получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали. Температуру инкубации регулировали на уровне 37°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин без аэрации. Во время культивирования pH не регулировали. Через 9 ч 7 литров из возбраживателей переносили в ферментер (OD при 700 нм культуры возбраживателя через 9 ч: 0,14). Культуры возбраживателей в стерильных условиях переносили в ферментеры.
Условия культивирования в ферментерах
70 литров культуральной среды получали в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали.
3
После стерилизации к культуре добавляли 8 г/л глюкозы. Температуру инкубации регулировали на уровне 33°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин и без аэрации. В начале культивировании pH регулировали на уровне 6,7 CHCOOH. Через 24 ч культуры (OD культуры при 700 нм 4,17) инактивировали тепловой обработкой при 65°C в течение 35 мин и переносили в резервуаре для сбора культур клеток. После инактивации, культуры переносили в стеллаж ультрафильтрации для отделения биомассы от культуральной среды, концентрировали и промывали NaCl (9 г/л) в очищенной воде (9 г/л). Собранную биомассу делили на аликвотные количества (масса концентрированной бактериальной суспензии 440 г при 19,1 мг сухой массы биомассы на 1 грамм концентрированной бактериальной суспензии) и затем замораживали при -15°C.
ПРИМЕР 1.3: Культура Lactobacillus plantarum 71.39
Первоначальные условия культивирования
Культуральную среду получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали. После стерилизации среды, небольшие колбы Эрленмейера отдельно засевали содержимым замороженных флаконов (содержащих 1,5 мл замороженных бактерий) и инкубировали при 35°C в течение 9 часов. Затем аликвоты по 20 мл этой культуры переносили в более крупные колбы Эрленмейера, содержащие 1000 мл культуральной среды и снова инкубировали в таких же условиях. После 15 ч роста, содержимое колбы Эрленмейера емкостью 1 л переносили в возбраживатель.
Условия культивирования во возбраживателях
20 литров культуральной среды получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали. Температуру инкубации регулировали на уровне 37°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин без аэрации. Во время культивировании pH не регулировали. Через 9 ч 7 литров из возбраживателей переносили в ферментер (OD при 700 нм культуры возбраживателя через 9 ч = 1,62). Культуры возбраживателей в стерильных условиях переносили в ферментеры.
Условия культивирования в ферментерах
70 литров культуральной среды получали в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали.
После стерилизации к культуре добавляли 8 г/л глюкозы. Температуру инкубации регулировали на уровне 35°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин и без аэрации. Через 24 ч культуры (OD культуры при 700 нм = 6,36) инактивировали тепловой обработкой при 65°C в течение 35 мин и переносили в резервуаре для сбора культур клеток. После инактивации, культуры переносили в стеллаж ультрафильтрации для отделения биомассы от культуральной среды, концентрировали и промывали NaCl (9 г/л) в очищенной воде. Собранную биомассу делили на аликвотные количества (масса концентрированной бактериальной суспензии 600 г при 60,7 мг сухой массы биомассы на 1 грамм концентрированной бактериальной суспензии) и затем замораживали при -15°C.
ПРИМЕР 1.4: Культура Lactobacillus rhamnosus 71.38
Первоначальные условия культивирования
Культуральную среду получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. После растворения, pH не регулировали. После стерилизации среды, небольшие колбы Эрленмейера отдельно засевали содержимым замороженных флаконов (содержащих 1,5 мл замороженных бактерий) и инкубировали при 35°C в течение 9 часов. Затем аликвоты по 20 мл этой культуры переносили в более крупные колбы Эрленмейера, содержащие 1000 мл культуральной среды и снова инкубировали в таких же условиях. После 15 ч роста, содержимое колбы Эрленмейера емкостью 1 л переносили в возбраживатель.
Условия культивирования во возбраживателях
20 литров культуральной среды получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали. Температуру инкубации регулировали на уровне 35°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин без аэрации. Во время культивирования pH не регулировали. Через 9 ч 7 литров из возбраживателей переносили в ферментер (OD при 700 нм культуры возбраживателя через 9 ч: 3,75). Культуры возбраживателей в стерильных условиях переносили в ферментеры.
Условия культивирования в ферментерах
70 литров культуральной среды получали в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали.
После стерилизации к культуре добавляли 8 г/л глюкозы. Температуру инкубации регулировали на уровне 35°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин и без аэрации. Через 14 ч культуры (OD культуры при 700 нм 5,43) инактивировали тепловой обработкой при 65°C в течение 35 мин и переносили в резервуаре для сбора культур клеток. После инактивации, культуры переносили в стеллаж ультрафильтрации для отделения биомассы от культуральной среды, концентрировали и промывали NaCl (9 г/л) в очищенной воде. Собранную биомассу делили на аликвотные количества (масса концентрированной бактериальной суспензии 2798 г при 51,7 мг сухой массы биомассы на 1 грамм концентрированной бактериальной суспензии) и затем замораживали при -15°C.
ПРИМЕР 1.5: Культура Lactobacillus iohnsonii 103782
Первоначальные условия культивирования
Культуральную среду получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали. После стерилизации среды, небольшие колбы Эрленмейера отдельно засевали содержимым замороженных флаконов (содержащих 1,5 мл замороженных бактерий) и инкубировали при 33°C в течение 10 часов. Затем аликвоты по 20 мл этой культуры переносили в более крупные колбы Эрленмейера, содержащие 1000 мл культуральной среды и снова инкубировали в таких же условиях. После 14 ч роста, содержимое колбы Эрленмейера емкостью 1 л переносили в возбраживатель.
Условия культивирования во возбраживателях
20 литров культуральной среды получали растворением в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали. Температуру инкубации регулировали на уровне 35°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин без аэрации. pH культуры доводили до 5,6 уксусной кислотой. Через 24 ч 7 литров из возбраживателей переносили в ферментер (OD при 700 нм культуры возбраживателя через 24 ч: 0,47). Культуры возбраживателей в стерильных условиях переносили в ферментеры.
Условия культивирования в ферментерах
70 литров культуральной среды получали в очищенной воде следующих компонентов: Хлорид натрия: 3 г/л; Моногидрофосфат натрия: 2 г/л; Ацетат натрия: 1 г/л; Пептон сои 50 г/л; Глюкоза: 12 г/л; Хлорид кальция: 0,1 г/л; Хлорид калия: 0,1 г/л; Бикарбонат натрия: 0,5 г/л; пируват: 0,1 г/л; Глутамат: 0,2 г/л; Раствор металлов (сульфат меди: 3 мг/л; хлорид железа: 830 мг/л; сульфат цинка: 860 мг/л; серная кислота: 1,1 мг/л): 0,5 мл/л. Затем добавляли полипропиленгликоль (0,02 мл/л). После растворения, pH не регулировали.
После стерилизации к культуре добавляли 8 г/л глюкозы. Температуру инкубации регулировали на уровне 35°C, при перемешивании со скоростью 100 об/мин и без аэрации. Через 24 ч культуры (OD культуры при 700 нм 0,174) инактивировали тепловой обработкой при 70°C в течение 39 мин и переносили в резервуаре для сбора культур клеток. После инактивации, культуры переносили в стеллаж ультрафильтрации для отделения биомассы от культуральной среды, концентрировали и промывали NaCl (9 г/л) в очищенной воде. Собранную биомассу делили на аликвотные количества (масса концентрированной бактериальной суспензии 61,5 г при 20,2 мг сухой массы биомассы на 1 грамм концентрированной бактериальной суспензии) и затем замораживали при -15°C.
ПРИМЕР 2: Бактериальные лизаты
ПРИМЕР 2.1
Один аликвот биомассы Lactobacillus fermentum I-3929 из примера 1.1, содержащий 6 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 12 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,03 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 10,3. Затем лизат инкубировали в течение 6 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 9,9.
ПРИМЕР 2.2
Один аликвот биомассы Lactobacillus rhamnosus 71.38 из примера 1.4, содержащий 20 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 40 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,03 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 10,3. Затем лизат инкубировали в течение 6 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 9,7.
ПРИМЕР 2.3
Один аликвот биомассы Lactobacillus fermentum I-3929 из примера 1.1, содержащий 6 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 12 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,06 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 12,3. Затем лизат инкубировали в течение 6 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 11,8.
ПРИМЕР 2.4
Один аликвот биомассы Lactobacillus fermentum I-3929 из примера 1.1, содержащий 6 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли 0,2 N раствора NaCl для достижения 12 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Конечная концентрация раствора NaCl составляла 0,15N. Подщелачивание выполняли 0,06 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 6,4. Затем лизат инкубировали в течение 6 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 6,3.
ПРИМЕР 2.5
Аликвот лизата примера 2.1 брали для продолжения процесса лизиса. pH объема доводили до 3,6 25% HCl и затем инкубировали в водяной бане при 40°C в течение 1 ч в статических условиях.
ПРИМЕР 2.6
Аликвот лизата примера 2.4 брали для продолжения процесса лизиса. pH объема доводили до 12,4 10N NaOH и затем инкубировали в водяной бане при 40°C в течение 1 ч в статических условиях.
ПРИМЕР 2.7
Один аликвот биомассы Lactobacillus plantarum 71.39 из примера 1.3, содержащий 0,4 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 7 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,06 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 12,6. Затем лизат инкубировали в течение 2 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 12,4.
ПРИМЕР 2.8
Один аликвот биомассы Lactobacillus johnsonii 103782 из примера 1.5, содержащий 0,3 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 6 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,06 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 12,5. Затем лизат инкубировали в течение 2 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 12,3.
ПРИМЕР 2.9
Один аликвот биомассы Lactobacillus helveticus 103146 из примера 1.2, содержащий 0,4 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 8 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,06 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 12,8. Затем лизат инкубировали в течение 2 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 12,2.
ПРИМЕР 2.10
Один аликвот биомассы Lactobacillus fermentum I-3929 из примера 1.1, содержащий 6,8 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 7 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,08 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 12,2. Затем лизат инкубировали в течение 7 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 12,0. pH лизата доводили до 9,8 HCl.
Лизат содержал солюбилизированную сухую массу (SDW): 20,5 мг/г, белки (Prot): 4,9 мг/г.
ПРИМЕР 2.11
Один аликвот биомассы Lactobacillus fermentum I-3929 из примера 1.1, содержащий 6,8 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 7 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,15 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 13,0. Затем лизат инкубировали в течение 63 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 12,6. pH лизата доводили до 9,9 HCl.
Лизат содержал SDW: 23,7 мг/г, Prot: 5,0 мг/г.
ПРИМЕР 2.12
Один аликвот биомассы Lactobacillus fermentum I-3929 из примера 1.1, содержащий 98 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли очищенной водой для достижения 10 г/л сухой массы бактериальной биомассы. Подщелачивание выполняли 0,08 M гидроксидом натрия. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 12,0. Затем лизат инкубировали в течение 24 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 11,1. pH лизата доводили до 11,5 NaOH.
Лизат содержал SDW: 23,7 мг/г.
ПРИМЕР 2.13
Один аликвот биомассы Lactobacillus fermentum I-3929 из примера 1.1, содержащий 39 г бактериальной сухой массы, оттаивали при комнатной температуре, затем разбавляли 0,2N раствором NaCl для достижения 7,6 г/л сухой массы бактериальной биомассы с целью получения осмотического лизата. pH, измеренный в начале лизиса, составлял 4,4. Затем бактериальный осмотический лизат инкубировали в течение 24 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации, pH составлял 4,2. Затем бактериальный лизат делали щелочным добавлением NaOH для достижения 0,06 N. pH, измеренный в начале щелочного лизиса составлял 10,6. Лизат повторно инкубировали в течение 2,25 ч при 40°C при непрерывном перемешивании. После инкубации pH составлял 10,2.
ПРИМЕР 3: Очистка лизатов
ПРИМЕР 3.1
Лизат примера 2.5 центрифугировали в течение 20 минут при 3000×g. Затем pH супернатанта доводили до 6,8 10N NaOH и фильтровали через последовательные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,2 мкм и, наконец, стерилизационный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Концентрат содержал Prot: 2,8 мг/мл; ДНК: 17,4 мкг/мл. Процентная доля D-Аминокислот: 14,9% D-AIa, 14,4% D-Pro, 14,2% D-Asp.
Продукция NO в мг сухой массы/мл: 0,003 мг/мл (C1) - 0,03 мг/мл (C2) - 0,3 мг/мл (C3) активной сухой массы/мл: C1: 3,3 мкМ, C2: 33,2 мкМ, C3: 52,5 мкМ. Активная Сухая Масса в г/л или мг/мл представляет собой растворимую сухую массу в г/л или мг/мл минус содержание хлорида в г/л или мг/мл.
ПРИМЕР 3.2
Лизат примера 2.6 центрифугировали в течение 20 минут при 3000×g. Затем pH супернатанта доводили до 7 HCl и фильтровали через последовательные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,2 мкм и, наконец, стерилизационный фильтр с размером пор 0,22 мкм. Концентрат содержал Prot: 12,3 мг/мл; ДНК: 27,7 мкг/мл. Процентная доля D-Аминокислот: 15,9% D-Ala, 24,4% D-Pro, 17,4% D-Asp, 45,1% D-Ser, 10,1% D-Met.
Продукция NO в мг сухой массы/мл: 0,003 мг/мл (C1) - 0,03 мг/мл (C2) - 0,3 мг/мл (C3) активной сухой массы/мл: C1: 8,0 мкМ, C2: 56,0 мкМ, C3: 94,3 мкМ.
ПРИМЕР 3.3
300 мл лизата примера 2.1 сначала центрифугировали при 3000×g в течение 20 минут. pH супернатанта доводили до 7,1 HCl. Экстракт концентрировали через мембрану политерсульфона (PES) (Sartorius Stedim Biotech GmbH) с размером пор 0,45 мкм при постоянном потоке 330-350 мл/мин на системе перекрестного потока on a Sartoflow Slice 200 Benchtop Crossflow System. Объем выхода составил 75%. Наконец, концентрат подвергали стерилизационной фильтрации через PES мембрану с размером пор 0,2 мкм (Nalgene).
Концентрат содержал SDW: 30,0 мг/г; Prot: 9,6 мг/мл; ДНК: 32,8 мкг/мл. Процентное содержание D-Аминокислот: 14,3% D-Ala, 13,9% D-Pro, 14,1% D-Asp, 36,9% D-Ser. Продукция NO в мг активной сухой массы/мл: 0,003 мг/мл (C1) - 0,03 мг/мл (C2) - 0,3 мг/мл (C3) активной сухой массы/мл: C1: 5,1 мкМ, C2: 30,0 мкМ, C3: 64,0 мкМ.
ПРИМЕР 3.4
pH 300 мл лизата примера 2.2 доводили до 7,0 HCl. Экстракт фильтровали, как описано в примере 3.3 при постоянном потоке со скоростью 350 мл/мн. Объем выхода составил более 75%. Наконец, концентрат подвергали стерилизационной фильтрации через PES мембрану с размером пор 0,2 мкм (Nalgene).
Концентрат содержал SDW: 49,2 мг/г; Prot: 14,2 мг/мл; ДНК: 34,1 мкг/мл. Процентное содержание D-Аминокислот: 16,0% D-Ala, 13,3% D-Pro, 14,2% D-Asp.
Продукция NO в мг активной сухой массы/мл: 0,003 мг/мл (C1) - 0,03 мг/мл (C2) - 0,3 мг/мл (C3) активной сухой массы/мл: C1: 0 мкМ, C2: 4,1 мкМ, C3: 26,3 мкМ.
ПРИМЕР 3.5
300 мл лизата примера 2.3 сначала центрифугировали при 3000×g в течение 20 минут. pH супернатанта доводили до 7,1 HCl. Экстракт фильтровали, как описано в примере 3.3 при постоянном потоке со скоростью 330-350 мл/мн. Объем выхода составил более 75%. Наконец, концентрат подвергали стерилизационной фильтрации через PES мембрану с размером пор 0,2 мкм (Nalgene).
Концентрат содержал SDW: 34,5 мг/г; Prot: 8,9 мг/мл; ДНК: 16,8 мкг/мл. Процентное содержание D-Аминокислот: 16,4% D-Ala, 24,3% D-Pro, 17,3% D-Asp.
Продукция NO в мг активной сухой массы/мл: 0,003 мг/мл (C1) - 0,03 мг/мл (C2) - 0,3 мг/мл (C3) активной сухой массы/мл: C1: 3,0 мкМ, C2: 36,4 мкМ, C3: 69,5 мкМ.
ПРИМЕР 3.6
1000 мл лизата примера 2.13 центрифугировали в течение 20 минут при 9384×g. Супернатант фильтровали непосредственно через стерилизационный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Концентрат содержал SDW: 32,7 мг/г; Prot: 6,5 мг/г; Сахар: 2,4 мг/г. Концентрацию сахара анализировали в соответствии с процедурой, описанной Herbert et al. (Meth. Microbiol, 1971, 5B:266 et seq.).
Скрининг для выявления биологической активности выполняли на Мононуклеарных Клетках Периферической Крови (PBMC) человека в различных концентрациях, как описано в примере 6. Результаты, полученные при 0,5 мг активной сухой массы/мл, были следующие: TNF-α: 83 пкг/мл; IL-6: 898 пкг/мл; IL-12: 140 пкг/мл (в присутствии 10 нг/мл IFN-γ); и IL-10: 221 пкг/мл (в присутствии IFN-γ).
ПРИМЕР 3.7
2
2
Смесь бактериальных лизатов примера 2.10 переносили в резервуар для микрофильтрации (MF) после доведения pH до 10,2. В блоке микрофильтрации (MF) использовался фильтр для фильтрации в тангенциальном потоке (TF) с размером пор 0,45 мкм (Sartocon Slice Sartorius). Поперечный поток доводили до 290 л/ч•mc (LHM) а Трансмембранное Давление (TMP) - до 0,4-0,5 бар (42-52,5 Н/м). Пермеат переносили в резервуар для ультрафильтрации (UF).
После того как объем лизата в резервуаре для микрофильтрации достигал половины первоначального объема, запускали блок UF. Пермеат UF фильтров использовали в качестве промывного буфера в резервуаре MF. Объемы резервуаров и MF, и UF поддерживали на одинаковом уровне. После прохождения 10 объемов диафильтрации, UF останавливали, и бактериальный лизат концентрировали в резервуарах MF. Извлеченный волюметрический выход составил 83%. pH извлеченного экстракта в резервуаре UF доводили до 7,3 HCl и затем фильтровали через стерилизационный фильтр с размером пор 0,2 мкм.
Концентрат содержал SDW: 17,5 мг/г; Prot: 4,3 мг/г.
ПРИМЕР 3.8
Лизат примера 2.7 центрифугировали в течение 15 минут при 9384×g. Затем pH супернатанта доводили до 7,3 HCl и фильтровали через последовательные фильтры с размерами пор 0,45 мкм и 0,2 мкм, и, наконец, стерилизационный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Мононуклеарные Клетки Периферической Крови (PBMC) с разведенным в 10 раз продуктом: 777 пкг/мл IL-10, 26 пкг/мл IL-12, 13183 пкг/мл IL-6.
ПРИМЕР 3.9
Лизат примера 2.8 центрифугировали в течение 15 минут при 9384×g. Затем pH супернатанта доводили до 7,4 HCl и фильтровали через последовательные фильтры с размерами пор 0,45 мкм и 0,2 мкм, и, наконец, стерилизационный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
PBMC с разведенным в 10 раз продуктом: 904 пкг/мл IL-10, 0 пкг/мл IL-12, 4995 пкг/мл IL-6.
ПРИМЕР 3.10
Лизат примера 2.9 центрифугировали в течение 15 минут при 9384×g. Затем pH супернатанта доводили до 7,6 HCl и фильтровали через последовательные фильтры с размерами пор 0,45 мкм и 0,2 мкм, и, наконец, стерилизационный фильтр с размером пор 0,22 мкм.
PBMC с разведенным в 10 раз продуктом: 476 пкг/мл IL-10, 0 пкг/мл IL-12, 4924 пкг/мл IL-6.
ПРИМЕР 3.11
2
2
Лизат примера 2.11 переносили в резервуар MF после доведения pH до 10,4. Установка TFF была аналогична примеру 3.7. Поперечный поток доводили до 290 л/ч м, а TMP - до 0,4-0,5 бар (42-52,5 Н/м). UF останавливали после 10 объемов диафильтрации. Выход извлеченного объема составил 86%. pH конечного продукта доводили до 7,3 HCl.
Полученный концентрат содержал SDW: 24,2 мг/г; Prot: 4,8 мг/г.
ПРИМЕР 3.12
2
2
Лизат примера 2.12 переносили в резервуар MF после доведения pH до 11,5. Установка TFF была аналогична примеру 3.7. Поперечный поток доводили до 290 л/ч м, а TMP - до 0,4 бар (42 Н/м). UF останавливали после 10 объемов диафильтрации. Выход извлеченного объема составил 74%. pH конечного продукта доводили до 7,2 HCl.
Полученный концентрат содержал SDW: 32,4 мг/г; Prot: 5,8 мг/г; Сахар: 2,3 мг/г.
Скрининг для выявления биологической активности выполняли на Мононуклеарных Клетках Периферической Крови (PBMC) человека в различных концентрациях, как описано в примере 6. Результаты, полученные при 0,5 мг активной сухой массы/мл, были следующие: TNF-α: 37 пкг/мл; IL-6: 1092 пкг/мл; IL-12: 81 пкг/мл (в присутствии 10 нг/мл IFN-γ); и IL-10: 160 пкг/мл (в присутствии 10 нг/мл IFN-γ). Концентрацию белка измеряли с использованием набора для анализа белка DC Protein assay (BioRad, DC Protein assay, kit no. 500-0116). Выполняли протокол анализа на микропланшете. Образцы для анализа (0,1 мл) разбавляли 1,9 мл 25 мМ фосфатного буфера с pH 11. Белковую стандартную кривую строили каждый раз при выполнении анализа с раствором бычьего сывороточного альбумина при 2 мг BSA/мл (BSA, Pierce ref 23210). Раствор BSA разбавляли 25 мМ фосфатным буфером с pH 11 для получения следующих концентраций: 0,18, 0,24, 0,3, 0,36 и 0,42 мг BSA/мл. Образцы (20 мкл) и стандарты BSA (20 мкл) добавляли в четырех повторениях в чистый сухой титровальный микропланшет. В каждую лунку добавляли реагент A (25 мкл) из набора для анализа белка DC Protein assay kit. Через 10 минут, в каждую лунку добавляли реагент B. Содержимое лунное титровального микроплашета смешивали на роторном планшетном шейкере в течение 5 секунд. Через 20 минут при комнатной температуре регистрировали спектральную поглотительную способность при 750 нм. Концентрация белка в каждом образце рассчитывали с использованием крутизны линейной регрессии на белкой стандартной кривой:
OD при 750 нм = a*(концентрация белка)+b мг белка в образце = [20×(OD при 750 нм - b)]/a
Растворимую сухую массу (SDW) определяли получением 5 мл растворимой фракции в результате лизиса и сушки ее до постоянной массы в фарфоровой чашке при 105°C.
ПРИМЕР 4: Активация мышиных селезеночных клеток In Vitro
Иммуностимулирующий эффект вариантов осуществления изобретения анализировали in vitro измерением активации Мышиных Селезеночных Клеток (анализ с использованием красителя аламар синий).
Материал и методы
Стимуляция селезеночных клеток
Анализ AlamarBlueTM-Assay предназначен для количественного измерения роста клеток человека или животных. Анализ включает флюорометрический/колориметрический индикатор роста на основе выявления метаболической активности индикатором окисления-восстановления (REDOX) в ответ на химическое восстановление в результате клеточного роста. В связи с ростом, индикатор REDOX вызывает изменения из окисленной (не флюоресцентной, синей) формы в восстановленную (флюоресцентную, красную) форму.
6
2
Мышей Balb/c (самки, возраст 6-8 недель) получали из Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany, и их умерщвляли смещением позвонков в шейном отделе. Селезенки гомогенизировали с использованием керамического гомогенизатора; клеточные суспензии промывали центрифугированием (280×g, 4°C, 10 мин) и ресуспендировали в 5 мл среды RPMI 1640, содержащей 5% FCS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. 100 мкл селезеночных клеток (2×10/мл) инкубировали с 50 мкл разведений бактериального экстракта в 96-луночных планшетах (Falcon 3072) в течение 48 ч при 37°C и 5% CO в среде для клеточной культуры.
После добавления 30 мкл раствора AlamarBlueTM, разбавленного 1:1 культуральной средой, химическое восстановление AlamarBlueTM измеряли считывающим устройством Fluoroskan Ascent Reader (ThermoLabsystems, Frankfurt, Germany) при длине волн возбуждения 544 нм и волн эмиссии 590 нм.
Тестируемые продукты
Тестировали следующие экстракты:
Afer300: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 (12 г/л), полученный, как описано в примере 3.5 (31,6 мг активной сухой массы/г);
Cfer300: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 (12 г/л), полученный, как описано в примере 3.3 (28,4 мг активной сухой массы/г);
Dfer300: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 (12 г/л), полученный, как описано в примере 2.4, и очищенный с использованием таких же условий как в примере 3.3 (29,5 мг активной сухой массы/г). Этот пример использовали в качестве не щелочного лизированного контроля.
ARahr300: экстракт из Lactobacillus rhamnosus 71.38 (40 г/л), полученный щелочным лизисом NaOH 0,03 M при 40°C в течение 6 часов (49,3 мг активной сухой массы/г);
CRahr300: экстракт из Lactobacillus rhamnosus 71.38 (40 г/л), как описано в примере 3.4 (46,4 мг активной сухой массы/г);
DRahr300: экстракт из Lactobacillus rhamnosus 71.38 (40 г/л), лизированных осмотическим стрессом в 0,15 N растворе NaCl при 40°C в течение 6 часов (46,2 мг активной сухой массы/г). Этот пример использовали в качестве не щелочного лизированного контроля.
Отрицательные контроли
Aqua dest. (дистиллированная вода) или солевой раствор с фосфатным буфером (PBS).
Результаты
Исследования in vitro для определения активации спленоцитов
Увеличение метаболической активности мышиных селезеночных клеток после обработки экстрактом определяли в 2 независимых экспериментах анализом с использованием Alamar Blue (см. фиг.4a и 4b и табл.1).
Селезеночные клетки культивировали в течение 48 ч в присутствии экстракта. После добавления раствора Alamar blue, измеряли величины эмиссии. Как показано на фиг.4a-b, бактериальные экстракты были эффективны при разведениях около 1:300. Все группы сравнивали статистически с контрольными группами с использованием T-критерия Стьюдента.
Таблица 1
Величина p для бактериальных экстрактов в 2 независимых экспериментах анализом с использованием красителя Alamar Blue (см. фиг.4a и 4b)
Партия
Разведение
Величина p тест 1
Величина p тест 2
Afer300
(разведение 1:300)
0,000016 (ФИГ.4a)
0,00016 (ФИГ.4b)
Cfer300
(разведение 1:300)
0,00021 (ФИГ.4a)
0,048 (ФИГ.4b)
Dfer300
(разведение 1:300)
0,00033 (ФИГ.4a)
0,00016 (ФИГ.4b)
ARahr300
(разведение 1:300)
0,0029 (ФИГ.4a)
0,0012 (ФИГ.4b)
CRahr300
(разведение 1:300)
0,0031 (ФИГ.4a)
0,12 (ФИГ.4b)
DRahr300
(разведение 1:300)
0,0025 (ФИГ.4a)
0,08 (ФИГ.4b)
Заключение
Иммуностимулирующий эффект бактериальных экстрактов анализировали in vitro измерением активации мышиных селезеночных клеток анализом Alamar Blue. При этом, в двух независимых экспериментах заявители сравнивали экстракт, полученный осмотическим лизисом (Dfer300), который включает интактные, имеющие форму частиц компоненты клеточных стенок. С двумя экстрактами в соответствии с настоящим изобретением (AFer300 и CFer300). Указанные три экстракта получали из Lactobacillus fermentum I-3929. Каждый из экстрактов AFer300, CFer300 и DFer300 были эффективны при стимуляции метаболизма клеток при разведении 1:300. Заявители не наблюдали различия между контролем осмотического лизиса DFer300 и Afer300 и CFer300.
Заявители также сравнивали три экстракта, полученных из второго штамма, Lactobacillus rhamnosus 71.38 (ARahr300, CRahr300, DRahr300). Как и в предыдущем наборе, ARahr300 и CRahr300 находятся в пределах объема изобретения, тогда как DRahr является контролем осмотического лизиса. В данном случае, экстракт ARahr300 был эффективен в двух независимых анализах при разведении 1:300, тогда как экстракты CRahr300 и DRahr300 проявили более слабую, но значимую стимуляцию в одном из двух анализов при таком же разведении. При сравнении результатов по шести экстрактам, оказывается также, что экстракты Lactobacillus fermentum I-3929 были более эффективны при стимуляции роста селезеночных клеток, по сравнению с экстрактами Lactobacillus rhamnosus 71.38.
ПРИМЕР 5: Продукция оксида азота макрофагами, полученными из костного мозга
Иммуностимулирующий потенциал серии вариантов осуществления в соответствии с изобретением тестировали измерением продукции оксида азота (NO) мышиными макрофагами, полученными из костного мозга.
Материалы и методы
2
2
2
2
Шестинедельных самцов мышей C57/BL6 (шестинедельные самцы, качество SPF, Charles Rivier, FR) умерщвляли ингаляцией CO. Удаляли тазобедренный сустав, бедренную кость и большеберцовую кость удаляли из задней части тела. Костный мозг извлекали из просвета инъекцией модифицированной Дульбекко среды Игла (DH) через кость после разреза обеих концевых частей. После промывания, стволовые клетки ресуспендировали (40000 клеток/мл) в среде DH с добавлением 20% лошадиной сыворотки и 30% супернатанта клеток L929. Клеточную суспензию инкубировали в течение 8 дней в инкубаторе при 37°C в атмосфере 8% CO и насыщения влагой. Затем макрофаги отделяли ледяным PBS, промывали и ресуспендировали в среде DH с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS), аминокислот и антибиотиков (среда DHE). Плотность клеток доводили до 700000 клеток/мл. Водные растворы экстрактов серийно разбавляли в среде DHE непосредственно в титровальных микропланшетах. Экстракты по изобретению тестировали в трех повторениях, и каждый титровальный микропланшет содержал среду в качестве отрицательного контроля. Конечный объем в каждой лунке составлял 100 мкл. 100 мкл клеточной суспензии добавляли к разбавленным экстрактам, и клетки инкубировали в течение 22 часов в инкубаторе при 37°C, в насыщенной влагой атмосфере 8% CO. В конце периода инкубации, 100 мкл супернатанта переносили в другой титровальный микропланшет, и концентрацию продуцируемого нитрита в каждом супернатанте определяли проведением реакции Грисса. 100 мкл реагента Грисса (5 мг/мл сульфаниламида + 0,5 мг/мл гидрохлорида N-(1-нафтил)этилендиамина) в 2,5% водной фосфорной кислоте добавляли в каждую лунку. Титровальные микропланшеты считывали спектрофотометром (SpectraMax Plus, Molecular Devices) при 562 нм в сравнении с эталоном при 690 нм. Концентрация нитрита была пропорциональна содержанию образующегося оксида нитрита. Содержание нитрита определяли на основании стандартной кривой нитрита натрия (от 1 до 70 мкМ NaNO). Результаты были представлены в мкМ оксида азота (NO) в виде средней величины ± стандартное отклонение и наносили на график в виде кривой зависимости реакции от дозы.
Тестируемые продукты
Проводили тестирование следующих:
Первый анализ:
OP0701B4_CFer300: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 (12 г/л), полученный, как описано в примере 3.3.
OP0701B4_Dfer300: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 (12 g/L), полученный, как описано в примере 2.4, и очищенный с использованием таких же условий как в примере 3.3. Этот пример использовали в качестве не лизированного щелочью контроля.
OP0701B4_CRahr300: экстракт из Lactobacillus rhamnosus 71.38 (40 г/л), полученный, как описано в примере 3.4.
OP0701B4_ DRahr300: экстракт из Lactobacillus rhamnosus 71,38 (40 г/л), полученный осмотическим стрессом в 0,15 N растворе NaCl при 40°C в течение 6 часов. Этот пример использовали в качестве не лизированного щелочью контроля.
Второй анализ:
OP0701C_10G0.5P4H: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 в концентрации 10 г/л сухой массы биомассы 0,037M NaOH, инкубированный при 40°C в течение 4 часов.
OP0701C_10G1 P4H: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 в концентрации 10 г/л сухой массы биомассы 0,075M NaOH, инкубированный при 40°C в течение 4 часов.
OP0701C_10G2P4H: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 в концентрации 10 г/л сухой массы биомассы 0,150M NaOH, инкубированный при 40°C в течение 4 часов.
OP0701C_10G1P21H: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 в концентрации 10 г/л сухой массы биомассы 0,075M NaOH, инкубированный при 40°C в течение 21 часа.
OP0701C_10G0.5P21H: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 в концентрации 10 г/л сухой массы биомассы 0,037M NaOH, инкубированный при 40°C в течение 21 часа.
OP0701C_10G2P21 H: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 в концентрации 10 г/л сухой массы биомассы 0,150 M NaOH, инкубированный при 40°C в течение 21 часа.
OP0701C_10G2P45H: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 в концентрации 10 г/л сухой массы биомассы 0,150 M NaOH, инкубированный при 40°C в течение 45 часов.
Результаты первого анализа
В первом анализе (фиг.5a) наблюдалось, что экстракты, полученные в результате щелоченного лизиса в соответствии с настоящим изобретением, имеют такую же активность как экстракты, полученные в результате осмотического лизиса.
2
3
Заявители также наблюдали, что активность иммунной стимуляции была связана с выбранным штаммом. Экстракты, полученные из Lactobacillus fermentum I-3929, вызывали продукцию большего количества NO и NO, чем экстракты, полученные из штамма Lactobacillus rhamnosus 78.31.
Результаты второго анализа
Во втором анализе (фиг.5b), заявители наблюдали, что активность in vitro экстракта коррелировалась с первоначальными условиями лизиса. Активность следующих бактериальных штаммов показана для того же штамма Lactobacillus fermentum I-3929, и для того же количества 10 г сухой массы биомассы, литр лизата: OP0701C_10G0.5P4H, OP0701C_10G1P4H, OP0701C_10G2P4H, OP0701C_10G1P21H, OP0701C_10G0.5P21H, OP0701C_10G2P21H и OP0701C_10G2P45H. Активность in vitro зависело от исходной концентрации NaOH и длительности лизиса.
Заключение
Результаты представленных экспериментов показали, что несмотря на химические модификации, генерированные процессом щелочной обработки, активность вариантов осуществления не снизилась, по сравнению с контрольным экстрактом, полученным осмотическим лизисом, или по сравнению с соответствующими живыми бактериями (в отношении данного аспекта, см. Пример 6 ниже).
ПРИМЕР 6: Скрининг in vitro для выявления про- и противовоспалительной активности
Для скрининга вариантов осуществления изобретения для выявления их иммуностимулирующего или противовоспалительного потенциала in vitro, тесты выполняли на серии бактериальных экстрактов на PBMC человека. Измеряли высвобождение IL12p70 (воспалительного цитокина) и IL10 (противовоспалительного цитокина), и отношение IL-10/IL-12 представляли, как описано в публикации Foligne et al. (World J Gastroenterol 2007 January 14; 13(2): 236-243).
7
Целью было сравнение продукции IL-12p70 и IL-10 на серии из 6 экстрактов, полученных посредством способов экстракции/ очистки. Отношение IL-10/IL-12p70, полученное для каждого экстракта, может коррелироваться с противовоспалительным потенциалом экстрактов. Живых бактерий использовали в качестве контроля, с которым сравнивали активность экстрактов (2x10cfu/ml (колониеобразующих единиц/мл) Lactobacillus fermentum I-3929)).
Материалы и методы
Ступенчатые количества 6 бактериальных экстрактов разбавляли в среду для клеточной культуры в присутствии 10 нг/мл IFN-γ, цитокина, который, как известно, усиливает продукцию IL-12p70, начиная с исходной дозы 1 мг/мл (самой высокой конечной тестированной дозы). PBMC, выделенные из крови здоровых доноров, тестировали в виде серийных разбавлений активной сухой массы экстрактов от 100 нг/мл до 1 мг/мл.
IFN-γ добавляли в среду, по меньшей мере, за 3 часа до лизатов или живого бактериального штамма. Представлены данные двух независимых экспериментов.
Получение PBMC человека
6
PBMC выделяли из периферической крови. Вкратце, после центрифугирования в градиенте фиколла (Pharmacia, Uppsala, Sweden), мононуклеарные клетки собирали, промывали в среде RPMI 1640 (Live technologies, Paisley, Scotland) и их содержание доводили до 2×10 клеток/мл в RPMI 1640 с добавлением гентамицина (150 мкг/мл), L-глутамина (2 ммоль/л) и 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) (Gibco-BRL).
Индукция цитокинов
6
2
PBMC (2×10клеток/мл) высевали в 24-луночные планшеты для культуры ткани (Corning, NY). Клетки стимулировали. Как описано выше. После 24 ч стимуляции при 37°C в атмосфере воздуха с 5% CO, культуральные супернатанты собирали, просветляли центрифугированием и хранили при -20°C до анализа цитокинов. Цитокины измеряли ELISA с использованием пар антител фирмы Pharmingen (BD Biosciences, San Jose, Ca, USA) к IL-10 и IL-12p70, в соответствии с рекомендациями производителя.
Тестируемые продукты
OP0701C_10G2P45H (A): экстракт из лизата Lactobacillus fermentum I-3929 при 10 г сухой массы биомассы/литр лизата, 0,15 M NaOH при 40°C в течение 45 ч.
OP0701C_1OG1P4H (B): экстракт из лизата Lactobacillus fermentum I-3929 при 10 г сухой массы биомассы/литр лизата, 0,075 M NaOH при 40°C в течение 4 ч.
OP0701C_5G4P21H (C): экстракт из лизата Lactobacillus fermentum I-3929 при 5 г сухой массы биомассы/литр лизата, 0,300 M NaOH при 40°C в течение 21 ч.
OP0701C_40G0.5P4H (D): экстракт из лизата Lactobacillus fermentum I-3929 при 40 г сухой массы биомассы/литр лизата, 0,037 M NaOH при 40°C в течение 6 ч.
OP0701B4_CFer150 (E): экстракт из лизата Lactobacillus fermentum I-3929 (12 г/л), полученный, как описано в примере 3.1.
OP0701B4_BFer300 (F): экстракт из лизата Lactobacillus fermentum I-3929 при 6 г сухой массы биомассы/литр лизата, 0,075 M NaOH при 40°C в течение 6 ч.
7
Lactobacillus fermentum I-3929, живые бактерии, замороженные при -80°C при 2×10 кое/мл в 20% глицерине.
Результаты
Целью данного теста было сравнение иммуностимулирующего и противовоспалительного потенциала in vitro вариантов осуществления изобретения с живым штаммом Lactobacillus. Для анализа различных экстрактов и живых бактерий, сравнивали количество каждого из цитокинов IL-10 и IL-12, высвобождаемое из PBMC, а также отношение IL10/IL12.
Если концентрации или IL-10, или IL-12, или обе величины были близки к уровням без стимуляции (т.е., ниже 10 пкг/л), то соотношение не считалось рассчитываемым и метилось буквами N.C. (не рассчитанная величина).
Результаты, полученные по PBMC, выраженные в пкг/мл, показаны в таблицах 2 и 3.
7
В присутствии IFNγ, эффект 6 бактериальных экстрактов по изобретению (с экстракта A по экстракт F) сравнивали с живой формой Lactobacillus fermentum (2×10 бактерий/мл, тестированные дважды в качестве Живого образца 1 и Живого образца 2) на PBMC человека (реакции IL10 и IL12p70 в пкг/мл). Соотношения IL10/IL12 представлены только для доз экстрактов 100 мкг/мл и 1 мг/мл.
Таблица 2
Провоспалительный (иммуностимулирующий) или противовоспалительный (иммуномодулирующий) потенциал in vitro бактериальных экстрактов на PBMC человека
A
B
C
D
E
F
IL10(+IFNγ)
1 мг/мл
146
1089
9
953
961
549
100 мкг/мл
3
232
1
121
106
6
IL12(+IFNγ)
1 мг/мл
8
78
1
94
77
48
100 мкг/мл
1
110
1
59
162
11
IL10/IL12(+IFNγ)
1 мг/мл
N.C.
14,03
N.C.
10,17
12,49
11,40
100 мкг/мл
N.C.
2,11
N.C.
2,05
0,65
0,52
N.C. Не рассчитываемая величина
7
В присутствии IFNγ, эффект 6 бактериальных экстрактов по изобретению (с экстракта A по экстракт F) сравнивали с живой формой Lactobacillus fermentum (2×10 бактерий/мл, тестированные дважды в качестве Живого образца 1 и Живого образца 2) на PBMC человека (реакции IL10 и IL12p70 в пкг/мл). Соотношения IL10/IL12 представлены только для доз экстрактов 100 мкг/мл и 1 мг/мл.
Таблица 3
Провоспалительный (иммуностимулирующий) или противовоспалительный (иммуномодулирующий) потенциал in vitro живого штамма I-3929 Lactobacillus fermentum на PBMC человека
Lactobacillus fermentum I-3929Живой образец 1
Lactobacillus fermentum I-3929Живой образец 2
IL10(+IFNγ)
2×10<sup>7</sup> КОЕ/мл
386
355
IL12(+IFNγ)
2×10<sup>7</sup> КОЕ/мл
187
191
IL10/IL12(+IFNγ)
2×10<sup>7</sup> КОЕ/мл
2,06
1,86
На основании результатов, представленных в таблице 2 и таблице 3, продукция IL10 уменьшалась в следующем порядке:
B≅E≅D>F>live Lactobacillus>A>C
На основании результатов, представленных в таблице 2 и таблице 3, продукция IL12 уменьшалась в следующем порядке:
live Lactobacillus>E>B>D>F>A>C
При рассмотрении соотношения, наблюдался следующий общий тип:
B≅D>E≅F>live Lactobacillus
Результаты соотношений IL10/IL12 для экстрактов A и C не показаны, поскольку было обнаружено, что эти экстракты являются эффективными индукторами цитокинов.
При концентрациях ниже чем 100 мкг/мл, наблюдавшиеся концентрации цитокинов были слишком низкими для того, чтобы делать какие-либо выводы.
Заключение
Полученные соотношения могут свидетельствовать о том, что в экспериментальных условиях, использованных в примере 6, некоторые бактериальные экстракты по изобретению оказывают более выраженные иммуномодулирующие эффекты, чем эффекты живых Lactobacillus fermentum. Например, экстракты B, D, E и F проявили более высокие соотношения IL10/IL12p70, чем контроль в виде живых бактерий. Таким образом, такие экстракты могут быть более активными. Чем живые пробиотические бактерии, против состояний, описанных в настоящей заявке, таких как воспалительные состояния.
ПРИМЕР 7: Действие на Толл-подобные рецепторы
Варианты осуществления изобретения получают из грамположительных бактерий, и поэтому ожидается, что они действуют посредством TLR2 рецепторов. TLR рецепторы экспрессированы главным образом, но не исключительно, иммунными клетками, такими как моноциты, макрофаги, дендритные клетки, T-клетки и т.д., и они являются ключевыми сенсорами микробных продуктов, которые могут распознаваться хозяином в качестве сигналов опасности. Даже хотя TLR рецепторы сначала запускают неспецифический врожденный иммунитет, их активация инициирует полный иммунологический каскад, который в присутствии антигенов приводит к развитию приобретенного иммунитета.
Клетки, которые экспрессируют данный функциональный ген TL, являются ценными инструментами для многих видов применения, таких как исследование механизмов, участвующих в распознавании или передаче сигналов TLR, и разработка новых потенциальных терапевтических лекарственных средств. В описанных ниже Экспериментах тестировалась активность трех бактериальных экстрактов на этих ключевых адаптерах иммунного ответа.
Материалы и методы
Реакции экстрактов по изобретению тестировали (или как таковые для проверки их агонистического эффекта, или в присутствии TLR2 агониста Pam3Cys, или в присутствии TLR4 агониста LPS для проверки антагонистической активности) в двух следующих клеточных системах:
a) HEK-TLR2/6 (ELISA IL-8 через 24 ч)
b) HEK-MD2-TLR4-CD14 (ELISA IL-8 через 24 ч)
a) HEK-TLR2/6
Линию клеток HEK293 выбрали за их нулевую или низкую базальную экспрессию TLR генов. Эти клетки обеспечивают эффективный мониторинг активности TLR с использованием анализа ELISA, такого как титрование IL-8 или основанные на рецепторах системы, которые осуществляют мониторинг вызванной TLR активации NF-κB.
Клетки HEK-TLR2/6 (Invivogen, Toulouse, France) представляют собой созданные методами инженерии клетки HEK293. Устойчиво трансфецированные множественными генами из пути TLR2/6, которые включают TLR2, TLR6 и гены, участвующие в распознавании или вовлечены в каскад передачи сигналов. Эти клетки секретируют IL-8 после стимуляции TLR2/6. Эксперименты выполняли в соответствии с инструкциями производителя.
4
2
Вкратце, 2×10 клеток/лунку (200 мкл среды RPMI) инкубировали при 37°C в течение 3 дней (5% CO). Среду удаляли и в лунки добавляли 90 мкл RPMi+5% FCS. Затем добавляли агонисты и контроли (10 мкл/луку). Клетки возвращали в инкубатор на 24 ч. Супернатанты собирали и ELISA IL-8 выполняли в соответствии с инструкциями производителя.
Тестируемые продукты
OP0701B4_Afer50: экстракт из лизата Lactobacillus fermentum I-3929 в концентрации 12 г веса сухой биомассы/литр лизата, 0,075 M NaOH при 40°C в течение 4 ч, очищенный, как описано в примере 3.6.
OP0701C-Bt1LAC: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929, полученный, как описано в примере 3.7.
OP0701C-Bt2LAC: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929, полученный, как описано в примере 3.11.
Результаты: секреция IL-8
Результаты для контролей (отрицательный = LPS K12 сверхчистый, агонист TLR4; и PAM3CSK4 = положительный, агонист TLR2) представлены в таблицах 4-6. Результаты (выраженные в пкг/мл IL-8) показывают средние величины секреции IL-8, определенные ELISA, через 24 ч после стимуляции контролями.
Линия клеток HEK TLR2/6 реагировала на агонист TLR2 Pam3Cys. Напротив, агонист TLR4 из E coli (LPS K12) был неактивен даже в высокой дозе 0,01 мкг/мл.
Эксперименты с отдельным применением 3 экстрактов
3 бактериальных экстракта, тестированные в данном случае (OP0701B4Afer50, OP0701C-Bt1LAC и OP0701C-Bt2LAC), проявляли более высокие иммуностимулирующие свойства, чем агонист TLR2 Pam3Cys.
Эксперименты с тремя бактериальными экстрактами + Pam3Cvs
Как указано выше, три бактериальных экстракта тестировали также для выявления их предполагаемой антагонистических или аддитивных свойств в сравнении с Pam3Cys, добавленным непосредственно после экстрактов.
Бактериальный экстракт OP0701 B4 AFer50
Результаты, представленные в таблице 4, указывают на то, что экстракт OP0701B4_AFer50 вызывал продукцию высоких уровней IL-8 (агониста TLR 2/6).
Бактериальный экстракт OP0701C-BtILAC
Результаты, представленные в таблице 5, указывают на то, что экстракт OP0701C-Bt1LAC вызывал продукцию высоких уровней IL-8 (агониста TLR 2/6).
Бактериальный экстракт OP0701C-Bt2LAC
Результаты, представленные в таблице 6, указывают на то, что экстракт OP0701C-Bt2LAC не вызывал продукцию IL-8 (агонист TLR 2/6), и в присутствии Pam3Cys оказывал антагонистический эффект на TLR2/6.
Заключение
В зависимости от условий щелочного лизиса (исходная концентрация сухого веса биомассы, исходная концентрация основания и длительность обработки основанием), бактериальные экстракты могли иметь различные типы действия.
OP0701B4_Afer50 и OP0701C-Bt1LAC являлись агонистами TLR2/6, но более сильный щелочной лизис, выполненный на том же бактериальном штамме, привел к антагонистической активности в отношении TLR2/6 (OP0701C-Bt2LAC).
b) HEK-TLR4-MD2-CD14
Проводились обширные исследования TLR4, поскольку он представляет собой основной рецептор, участвующий в распознавании липополисахарида (LPS), ответственного за септический шок.
Клетки HEK-TLR4-MD2-CD14 высоко чувствительны к LPS. Они были получены стабильной трансфекцией клеток HEK293 генами TLR4, MD2 и CD14 и репортерной системой, индуцируемой NF-κB. Эти клетки секретируют IL-8.
Использовали такую же экспериментальную процедуру, как для другой линии клеток HEK TLR2/6, описанную выше. Результаты для контролей и 3 тестированных бактериальных экстрактов по изобретению показаны в таблицах 7-9.
Результаты: Секреция IL-8
Результаты для контролей (положительный = LPS K12C сверхчистый, агонист TLR4; и PAM3CSK4 = отрицательный, агонист TLR2) представлены в таблицах 7-9. Результаты (выраженные в пкг/мл IL-8) показывают средние величины секреции IL-8, определенные ELISA, через 24 ч после стимуляции контролями.
Линия клеток отчетливо реагировала только на агонист TLR4 LPS K12. Напротив, как ожидалось, агонист TLR2 из Pam3Cys был неактивен даже в высокой дозе 0,01 мкг/мл.
Эксперименты с отдельным применением 3 экстрактов
Как ожидалось от агонистов грамположительных бактерий, указанные 3 тестированных бактериальных экстракта (OP0701B4 Afer50: Таблица 7, OP0701C-Bt1LAC: Таблица 8 и OP0701C-Bt2LAC: Таблица 9) не проявляли отчетливых иммуностимулирующих свойств посредством пути TLR4.
Эксперименты с 3 бактериальными экстрактами + LPS K12
Как указано выше, три экстракта по изобретению тестировали только для выявления их предполагаемых антагонистических или аддитивных свойств в сравнении с LPS, добавляемым непосредственно после экстрактов. И снова, на уровне рецептора TLR4 эффект не наблюдался (таблицы 7-9).
Бактериальный экстракт OP0701B4 AFer50
Результаты указывают на то, что экстракт OP0701B4_AFer50 не активировал рецептор TLR4 (Pam3Cys: 138 пкг/мл).
Бактериальный экстракт OP0701CBtI-LAC
Бактериальный экстракт OP0701CBt2LAC
Заключение
Взятые вместе, представленные здесь результаты, полученные на клетках HEK, и результаты, полученные на клетках PBMC человека, свидетельствуют о том, что Afer50 и BT1LAC способны стимулировать иммунную систему посредством пути TLR2. Кроме того, BT2LAC может вести себя как антагонист TLR2/6. Следовательно, экстракты в соответствии с изобретением могут стимулировать иммунную систему посредством пути TLR2 или действовать в качестве антагонистов TLR2/6, таким образом, коррелируясь с антиинфекционной и противовоспалительной активностью in vivo.
ПРИМЕР 8
Клетки, которые экспрессируют данный функциональный ген TLR, представляют собой ценные инструменты для многих видов применения, таких как исследование механизмов, участвующих в распознавании или передаче сигналов TLR, и разработки новых потенциальных терапевтических лекарственных средств. Поэтому целью экспериментов, описанных ниже, является тестирование активности 4 бактериальных экстрактов в отношении этих ключевых адаптеров иммунного ответа.
В этом тесте проводили скрининг рецепторов 8 TLR и NOD2 по 4 бактериальным экстрактам, включая экстракты в соответствии с настоящим изобретением.
Метод
Бактериальные экстракты в соответствии с изобретением тестировали в 96-луночных микропланшетах. Экстракты разбавляли в культуральной среде DMEM, и 20 мкл каждого разведения тестировали в двух повторениях. Объем 180 мкл суспензий клеток HEK293, содержащих 25000 или 50000 клеток в культуральной среде DMEM+10% FCS (одна линия клеток HEK293, специфичных для каждого TLR с репортерным геном секретировала щелочную фосфатазу под контролем NF-kB) добавляли каждую лунку в двух повторениях. После 16 часов инкубации с каждой клеточной линией, от 20 до 50 мкл каждого супернатанта переносили в 96-луночные микроплашеты и завершали 200 мкл Quantiblue (InVivoGen no REP-QB1). Ферментную реакцию с секретируемой щелочной фосфатазой выполняли в течение 30-60 мин для различных серий клеточных линий, экспрессирующих TLR. Считывание выполняли с использованием микропланшетного ридера при 630 нм.
Материал
Список агонистов положительного контроля (и их соответствующих концентраций), использованных в данном скрининговом анализе
TLR2 PAM2 100 нг/мл; TLR3 PoIy(I:C) 100 нг/мл; TLR4 E. coli K12 LPS1 мкг/мл; флагеллин TLR5 S. typhimurium flagellin 1 мкг/мл; TLR7 R848 10 мкг/мл; TLR8 R848 10 мкг/мл; TLR9 CpG ODN 2006 10 мкг/мл; NOD2 Muramyldipeptide 1 мкг/мл.
Отрицательные контроли
Линию рекомбинантных клеток HEK-293 только для репортерного гена (NFkB) использовали в качестве отрицательного контроля для линий клеток TLR. Величина отрицательного контроля для каждого клона представляла собой фоновый сигнал этих не индуцированных клонов. TNF-альфа использовали в качестве положительного контроля для этой линии клеток, не экспрессирующих TLR.
Тестированные продукты
Проводили тестирование следующих бактериальных экстрактов:
OP0701B4_CFer300: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 (12 г/л), полученный, как описано в примере 3.3 (F);
OP0701B4_CRahr300: экстракт из Lactobacillus rhamnosus 71.38 (40 г/л), полученный, как описано в примере 3.4 (G);
OP0701D_10L1 PswitchA: экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 (10 г/л), полученный, как описано в примере 3.12 (I); и
OP0701D_5LOSMOConc: экстракт в результате осмотического лизиса Lactobacillus fermentum I-3929 (7,6 г/л), полученный осмотическим стрессом в 0,16 N растворе NaCl при 40°C в течение 24 ч (H) в качестве контроля.
Получение бактериальных экстрактов
20 мкл подлежащего тестированию образца использовали для стимуляции всех клеточных линий в 200 мкл реакционного объема.
Скрининг выполняли в одной концентрации, обычно 0,5 мг сухого веса/мл. Тесты выполняли в двух повторениях.
Результаты
Бактериальные экстракты и контроли тестировали в двух повторениях на линии рекомбинантных клеток HEK-293, которые функционально экспрессируют данный белок TLR или NOD2, а также репортерный ген, приводимый в действие промотером NFkB. Результаты активации TLR и NOD2 представлены в виде величин оптической плотности (OD). Результаты показаны в таблицах 10-13 и обобщены в таблице 15.
Бактериальный экстракт F (OP0701B4Cfer300)
Таблица 10Активация рецепторов TLR и NOD2 экстрактами OP0701B4Cfer300
hTLR2
hTLR3
hTLR4
hTLR5
hTLR7
hTLR8
hTLR9
hNOD-2
Образец сравнения
3,493
2,052
1,341
3,657
1,480
2,786
1,955
0,576
Экстракт F
3,963
0,051
0,735
0,304
0,070
0,080
0,026
0,503
Бактериальный экстракт F специфически активировал hTLR2, hTLR4 и hNod2, и в меньшей степени, hTLR5.
Бактериальный экстракт G (OP0701B4CRahr300)
Таблица 11Активация рецепторов TLR и NOD2 экстрактами OP0701 B4CRahr300
hTLR2
hTLR3
hTLR4
hTLR5
hTLR7
hTLR8
hTLR9
hNOD-2
Образец сравнения
3,493
2,052
1,341
3,657
1,480
2,786
1,955
0,576
Экстракт G
0,808
0,003
0,177
0,017
0,028
0,044
-0,032
0,369
Бактериальный экстракт G активировал hTLR2, hNOD2, и в гораздо меньшей степени hTLR4.
Бактериальный экстракт H (OP0701D 5LOSMOConc)
Таблица 12Активация рецепторов TLR и NOD2 экстрактами OP0701D_5LOSMOConc
hTLR2
hTLR3
hTLR4
hTLR5
hTLR7
hTLR8
hTLR9
hNOD-2
Образец сравнения
3,493
2,052
1,341
3,657
1,480
2,786
1,955
0,576
Экстракт H
4,537
0,057
0,638
0,050
-0,072
0,054
0,011
0,892
Бактериальный экстракт H специфически активировал hTLR2, hTLR4 и Nod2.
Бактериальный экстракт I (OP0701D_10L1PswitchA)
Таблица 13Активация рецепторов TLR и NOD2 экстрактами OP0701D_10LPswitchA
hTLR2
hTLR3
hTLR4
hTLR5
hTLR7
hTLR8
hTLR9
hNOD-2
Образец сравнения
3,493
2,052
1,341
3,657
1,480
2,786
1,955
0,576
Экстракт I
4,168
0,096
0,342
3,490
-0,024
0,132
0,410
0,790
Бактериальный экстракт I сильно активирует hTLR2, hTLR5, hNOD2, и в меньшей степени, hTLR4 и hTLR9.
Таблица 15Активация рецепторов TLR и NOD2 различными экстрактами, полученными в результате других условий способа в соответствии с настоящим изобретением
hTLR2
hTLR3
hTLR4
hTLR5
hTLR7
hTLR8
hTLR9
hNOD-2
Экстракт F
+
-
+
±
-
-
-
+
Экстракт G
+
-
±
-
-
-
-
+
Экстракт H
+
-
+
-
-
-
-
+
Экстракт I
+
-
±
+
-
-
±
+
Таким образом, бактериальные экстракты в соответствии с настоящим изобретением могут помочь активировать иммунную систему посредством различных TLR, а также Nod2. Поэтому, экстракты по изобретению могут быть хорошими активаторами иммунного ответа.
При сравнении экстракта H с экстрактом G и экстрактом F, становится очевидным, что экстракты имеют такой же путь TLR и Nod, как и экстракты, полученные в результате осмотического лизиса. При сравнении экстракта H и экстракта I, можно было наблюдать активацию пути TLR5 и в меньшей степени пути TLR9 при добавлении кислотного лизата после щелочного лизата. Даже экстракт F, полученный в результате способа с использования слабой щелочи, проявил активацию пути TLR5, в отличие от экстракта H.
Экстракт I действовал на TLR5, что указывает на потенциальную возможность применения при лучевой терапии. Действительно, лучевая терапия представляет собой хорошо установленное и высокоэффективное лечение по поводу определенных типов рака. Однако его побочные эффекты могут быть очень тяжелыми, так как оно может разрушить здоровые клетки в организме, в частности, клетки костного мозга и клетки в желудочно-кишечном тракте. Недавно, Burdelya et al. сообщили, что пептид CBLB502 связывается с TLR5 и активирует передачу сигналов ядерного фактора-κB, путь, которые раковые клетки часто активируют во избежание гибели клеток (Burdelya et al., "An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models," Science, 2008, 320:226-30). У мышей и макак резус, получавших лечение CBLB502 незадолго до воздействия летальных доз облучения всего тела, проявлялось меньшее повреждение здоровых клеток костного мозга и желудочно-кишечного тракта, и они выживали значительно дольше, чем контроли. Важно, что у пораженных опухолью мышей, CBLB502 не нарушал противоопухолевую эффективность лучевой терапии.
ПРИМЕР 9: Способность экстракта продуцировать бляшкообразующие клетки (против бараньих эритроцитов) у мышей
6
Методика бляшкообразующих клеток (PFC) обеспечивает возможность оценки неспецифической стимуляции B-лимфоцитов. Эта методика была впервые описана Cunningham and Seenberg (Immunology, 1968, 14, 599). Было продемонстрировано присутствие гемолитических антител вокруг образующих антитела клеток, как описано ниже. Мышиные лимфоидные клетки, а также плотную популяцию инородных (бараньих) эритроцитов, одновременно помещали на предметное стекло микроскопа. Определенные лимфоидные клетки высвобождают гемолитические антитела, которые диффундируют и вызывают лизис соседних эритроцитов образованием лизисной бляшки в присутствии комплемента. В конце эксперимента, подсчитывали число PFC на 10 клеток или на селезенку.
Материалы и методы
Тестированные продукты
Бактериальный экстракт 1, полученный, как описано в примере 3.5, и бактериальный экстракт 2, полученный, как описано в примере 3.4.
Животные
40 самцов мышей Balb/C/эксперимент (IFFA-CREDO, St. Germain sur I'Arbresle Cedex, France) в возрасте от 5 до 6 недель и со средней массой тела 20±2 г были распределены на 5 групп по 8 животных в каждой.
Структура эксперимента
Животных делили на 5 групп следующим образом:
Группа (a) 8 мышей, получавших 1,2 мг/мышь экстракта 1, как описано в примере 3.5; объем = 0,2 мл.
Группа (b) 8 мышей, получавших 0,6 мг/мышь экстракта 1, как описано в примере 3.5.
Группа (c) 8 мышей, получавших 1,2 мг/мышь экстракта 2, как описано в примере 3.4; объем = 0,2 мл.
Группа (d) 8 мышей, получавших 0,6 мг/мышь экстракта 2, как описано в примере 3.4; объем = 0,2 мл.
Группа (e) 8 мышей, получавших 0,2 мл изотонического солевого раствора.
6
Мыши получали экстракты, описанные выше, в указанных дозах ежедневно per os (пероральным путем) в течение 5 последовательных дней (со дня 1 по день 5). Еще две интубации происходили в 19 и 20 дни. На 29-й день, антиген (10 бараньих эритроцитов) в 0,2 мл изотонического солевого раствора (0,9% NaCl, раствор Олсвера) инъецировали внутривенно через хвостовую вену животного; через 4 дня (33-й день) получали суспензии селезеночных клеток.
Реагенты и оборудование
Раствор Олсвера, свободный от эндотоксина, (Sigma, 38299 St Quentin Fallavier, Cedex France, ref. A 3351)
Основная среда Игла (BME, концентрированная в 10 раз) в не содержащем бикарбонат растворе Игла (Bio-Merieux, 69280 Marcy I'Etoile, France ref: 8 210 2)
Лиофилизированная сыворотка морских свинок (Bio-Merieux, Marcy I'Etoile, France ref: 7 212 2)
Бараньи эритроциты (Bio-Merieux, Marcy I'Etoile, France ref: 7214 1)
Трипановый синий, стерильная дистиллированная вода, NaCl 0,9%, тканевой гомогенизатор, центрифуга, камера Нейбауэра для подсчета клеток, стеклянные пробирки.
Лечение тестируемым или контрольным продуктом
Контрольные животные получали только бараньи эритроциты (SRBC). Животные других групп получали перорально бактериальные экстракты, как указано ранее. Для этого, каждый экстракт растворяли в воде.
Суспензия селезеночных клеток
Через 4 дня после последней инъекции антигена (SRBC), суспензию селезеночных клеток получали для каждой мыши в соответствии со следующей процедурой:
Животное наркотизировали эфиром и затем умерщвляли смещением шейного отдела позвоночника. Селезенку удаляли и раздавливали в стеклянном тканевом гомогенизаторе с 2 мл BME при pH 6,75-6,80. Затем добавляли 3 мл стерильной дистиллированной воды, и смесь перемешивали в течение 20 секунд. Полученную суспензию затем разбавляли 10 BME и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 10 мин при 4°C. Супернатант удаляли, и преципитат суспендировали в 2 мл BME. Клеткам давали возможность восстановиться в течение 5-10 минут на льду. Подсвет жизнеспособных мононуклеарных клеток выполняли следующим образом:
Разведение 1/20 аликвота клеточной суспензии получали солевым раствором, содержащим 0,1% раствор трипанового синего. Не окрашенные клетки, т.е., живые клетки, подсчитывали в камере Нейбауэра.
Клеточную суспензию держали в тающем льду во время подсчета и затем немедленно использовали для лизиса бляшек. Эта методика предотвращает потерю жизнеспособности, которая может произойти при слишком длительном ожидании.
Получение предметных стекол
На обычном предметном стекле микроскопа, тщательно посыпанном порошком и с удаленным любым следом жира, с интервалами примерно 1,5 см приклеивали 3 параллельные полоски (толщиной 0,1 мм) двусторонней ленты. Затем полоски покрывали предварительно очищенными покровными стеклами (22 мм × 22 мм) для образования двух «камер» между предметным стеклом и покровными стеклами.
3
Фракцию суспензии селезеночных клеток доводили до 25000 мононуклеарных клеток на мм. В небольшой стеклянной пробирке смесь следующих элементов (добавленных в указанном порядке) получали посредством автоматической пипетки:
1) 7,5 мл BME
2) 0,5 мл суспензии SRBC, промытой и центрифугированной дважды с солевым раствором, при 50% остатке
3) 0,4 мл нормальной сыворотки морской свинки, используемой в качестве источника комплемента
3
Наконец, 50 мкл суспензии селезеночных клеток при плотности 25000 клеток/мм добавляли к 200 мкл предыдущей смеси. После щадящей гомогенизации, суспензию вводили в «Камеры Каннингхэма» капиллярным действием перед герметизацией свободных сторон парафином. Затем предметные стекла помещали во влажную камеру в термостат при 37°C.
Аннотация
После инкубации в течение 1 часа в термостате, предметные стекла исследовали под микроскопом с увеличением в 100 раз (окуляр 10 X, объектив 10 X).
6
6
Литические бляшки легко распознавались. 5 вертикальных оптических полосок исследовали на каждом предметном стекле и подсчитывали число литических бляшек. Число клеток (N), образующих прямые литические бляшки на 10 клеток подсчитывали экстраполированием. Если x представляет число наблюдаемых бляшек, а X представляет число исследованных клеток, то число прямых литических бляшек на 10 клеток равно:
6
N=(х/X)*10
где X=C*V=C*(n*e*l*L)
C = конечная концентрация селезеночных клеток
V = наблюдаемый объем
n = число оптических полосок
e = толщина лейкопластыря
I = ширина оптического поля
L = длина оптической полоски
6
Число прямых литических бляшек на 10 клеток получали из следующего уравнения:
6
6
PFC (на 10 клеток)=(x*10)/(C*n*e*I*L)
Зная число собранных клеток на одну селезенку, можно было вывести число клеток на одну селезенку, образующих литические бляшки.
У мышей, являвшихся «абсолютным эталоном» спонтанные литические бляшки не наблюдались.
Статистический анализ и результаты
Результаты считались значимыми, когда p<0,05 (t критерий Стьюдента). Результаты показаны в таблице 16.
Таблица 16Способность бактериальных экстрактов 1 и 2 продуцировать бляшкообразующие клетки (против бараньих эритроцитов) у мышей
GRM
PFC/10<sup>6</sup> клеток
Частота PFC
Экстракт 1; см. Пример 3.5(1,2 мг/мышь/введение)
100%100%100%
124%123%114%
119%143%113%
Экстракт 1; см. Пример 3.5(0,6 мг/мышь/введение)
100%100%100%
117%118%112%
103%139%128%
Экстракт 2; см. Пример 3.4(1,2 мг/мышь/введение)
100%100%100%
119%124%117%
109%131%120%
Экстракт 2; см. Пример 3.4(0,6 мг/мышь/введение)
100%100%100%
117%114%113%
112%119%111%
Оказалось, что экстракты по изобретению являются активаторами B-клеток при тестировании в концентрациях 1,2 мг/мышь/в день или 0,6 мг/мышь/в день. Наблюдался незначительный дозозависимый эффект. Следовательно, некоторые экстракты по изобретению могли бы потенциально использоваться для антигенной стимуляции иммунной системы у пациентов, страдающих рецидивирующими инфекциями.
ПРИМЕР 10: Эффект CFer300 при внутрибрюшинной инфекции Salmonella typhimurium у мышей balb/c
Защиту мышей, инфицированных Salmonella typhimurium, тестировали бактериальными лизатами, полученными из Lactobacillus, после перорального введения.
Материалы и методы
Животные и их содержание
Мышей Balb/c содержали в лабораториях Института иммунологии в Москве. Для эксперимента по защите in vivo, не инбредных белых мышей лабораторной породы закупали в Столбовой в Российском Государственном Научном Центре Биомедицинских Технологий (Российской Академии Медицинских Наук). При доставке масса тела мышей составляла 12-14 г. В течение всех экспериментов, мышей содержали в условиях отсутствия патогенов на стандартном рационе для грызунов и подаче воды.
Группы исследования (основной эксперимент)
Две группы по 22 мыши использовали для тестирования антиинфекционной эффективности бактериальных экстрактов, полученных с использованием экспериментальной модели инфекции Salmonella typhimurium у мышей.
Одну группу лечили перорально раствором CFer300, а вторая группа получала ложное лечение (воду) в качестве отрицательного контроля.
0,5 мл раствора вводили каждой мыши перорально один раз в день в течение 10 последовательных дней перед тем как всех мышей подвергали антигенной стимуляции Salmonella typhimurium:
Группа 1: Мыши, получавшие лечение CFer300, вводимого перорально в виде однократных доз 2 мг (0,5 мл).
Группа 2: Мыши, получавшие ложное лечение, с использованием перорального введения 0,5 мл воды ежедневно в течение 10 дней.
Тестируемый продукт
Тестированный бактериальный экстракт представлял собой OP0701B4CFer300 ("CFer300"); экстракт из Lactobacillus fermentum I-3929 (12 г/л), полученный, как описано в примере 3.3 (28,4 мг активной сухой массы/г).
Предварительный эксперимент
3
5
Целью предварительного эксперимента было определение дозы инфекционного агента, который вызвал бы смертность, близкую к 50%. Через 3 недели после антигенной стимуляции. В качестве антигенной стимуляции, суспензию Salmonella enterica, серовар typhimurium strain 415 (Институт Вакцин и Сывороток им. И.Мечникова, Российская Академия Медицинских Наук) инъецировали внутрибрюшинно каждой мыши. Доза антигенной стимуляции находилась в диапазоне от 10 до 10 CFU Salmonellae на мышь.
Наблюдения и регистрация смерти
После антигенной стимуляции, мышей содержали в стандартных условиях для лабораторных животных. Ежедневные наблюдения и регистрацию смерти проводили в течение периода 21 день после инфекции. Антиинфекционную эффективность препаратов оценивали в соответствии с выживанием после инфекции (SR), средней продолжительностью жизни после инфекции (ADL), фактором защиты (DF) и индексом эффективности препарата (El), рассчитанным для каждой экспериментальной группы. За SR принимали процент животных, живых в экспериментальных группах в 21-й день после инфекции. ADL, DF и EI рассчитывали следующим образом:
ADL=(X1+X2+…+Xn)/N
где:
ADL представляет среднюю продолжительность жизни,
С X1 до Xn представляют период после инфекции для экспериментальных мышей с 1 по n, и
N представляет общее число животных в экспериментальной группе.
DF=CD/ED
где:
DF представляет фактор защиты,
CD представляет процент погибших животных в контрольной группе, и
ED представляет процент погибших животных в экспериментальной группе.
EI=[(DF-1)/DF]×100%
где:
EI представляет индекс эффективности препарата, и
DF представляет фактор защиты.
Результаты: переносимость лекарственного средства
Препарат вводили перорально один раз в день в течение 10 дней. В течение 10-дневного периода предварительного лечения не наблюдались доказательства токсичности или побочных эффектов. И он был хорошо переносим.
Титрование Salmonellae
Предварительный эксперимент выполняли для определения дозы антигенной стимуляции Salmonella typhimurium для того, чтобы вызвать смертность приблизительно 50%. Результаты показаны в таблице 17.
Таблица 17Предварительный эксперимент для определения дозы антигенной стимуляции Salmonella typhimurium, соответствующей смертности приблизительно 50%
Доза S.typhi
Мыши/группу
Дни после инфекции
Погибшие мыши/общее количество
Погибшие (%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
10<sup>5</sup>
6
-
-
-
-
<u>1</u>
<u>2</u>
-
-
-
-
<u>1</u>
-
-
4/6
67
10<sup>4</sup>
6
-
-
-
-
-
-
-
<u>1</u>
-
-
-
-
-
1/6
17
10<sup>3</sup>
6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
0/6
0
Подчеркнутые цифры представляют число животных, обнаруженных мертвыми в указанный день (после инфекции).
Заключение
5
На основании полученных данных, доза 10 CFU штамма 415 Salmonella typhimurium strain (67% мертвых животных, выделено жирным шрифтом) была выбрана для последующего исследования.
Основной эксперимент: Антигенная стимуляция мышей, получавших лечение CFer300
Мышей, получавших в течение 10 дней предварительное лечение препаратом CFer300 (n=22), или в контрольной группе, водой (n=22), подвергали антигенной стимуляции в день после окончания предварительного лечения.
5
Суспензию Salmonella typhimurium вводили внутрибрюшинно в виде дозы антигенной стимуляции 10 CFU на мышь. Контрольное наблюдение выполняли в течение 21 дня после инфекции. Смертность в группах животных показана в таблице 18.
Цифры, выделенные курсивом, представляют число животных, обнаруженных мертвыми в указанный день (после инфекции). Эти данные использовали для расчета SR, ADL, DF и EI (таблица 19).
Таблица 19Выживаемость в течение периода наблюдения (21 день)
Предварительное лечение веществами
Смертность (%)
Выживаемость (%)
ADL (дни)
DF
EI (%)
CFer 300
27
73
17,1
1,67
40%
H<sub>2</sub>O
45
55
14,7
1
0
В контрольной группе, получавшей предварительное лечение водой, выживание в течение периода наблюдения (21 день) составило 55%, а ADL составил 14,7 дня. При дозе 2 мг/день, CFer300 проявлял защитный эффект, что привело к SR=73% и ADL=17,1 день, т.е., DF=1,67, а EI=40%.
Резюмируя, 10-дневный курс ежедневного перорального лечения CFer300, вводимого в одной дозе 2 мг, обеспечивал частичную защиту у мышей, инфицированных Salmonella typhimurium. Как показано в данном эксперименте, и показано ранее in vitro и ex-vivo, раскрытые в настоящем описании экстракты могут применяться в дальнейшей разработке терапевтических лекарственных средств.
ПРИМЕР 11: Эффект двух экстрактов Lactobacillus на модели астмы, вызванной LACK
Два варианта осуществления изобретения тестировали на мышиной модели вызванной аллергеном астмы после перорального введения (Julia et al., Immunity, 2002, 16:271-283).
Материал и методы
Животные и содержание
6-недельных самок мышей BALB/c ByJ закупали у Janvier, France. Их содержали и кормили в стандартных условиях.
Группы исследования
Общее количество 27 мышей были разделены на 4 группы следующим образом:
Группа A: не леченые, сенсибилизированные LACK и стимулированные солевым раствором мыши; LACK представляет собой белок из паразита Leishmania major (4 мыши).
Группа B: не леченые, сенсибилизированные LACK и подвергнутые антигенной стимуляции мыши (8 мышей).
Группа C: Получавшие лечение OM-1009A (8 мг сухой массы остатка на введение), сенсибилизированные LACK и подвергнутые антигенной стимуляции мыши (8 мышей).
Группа D: Получавшие лечение OM-1009B (8 мг сухой массы остатка на введение), сенсибилизированные LACK и подвергнутые антигенной стимуляции мыши (7 мышей).
Лечение и его схема тестируемым или контрольным продуктом
Мышей лечили с -3 по 22-ой день. В 0 день и в 7-ой день, мышей сенсибилизировали внутрибрюшинно (i.p.) 10 мкг LACK в присутствии 2 мг квасцов 3. С 17 по 21 день, мыши подвергались 20-минутному воздействию антигенной стимуляции аэрозоля раствора LACK (0,15%) (Группы B, C и D), или солевым раствором (Группа A) в качестве контроля. На 22-ой день проводили анализ способности мышей реагировать на ингаляцию метахолина развитием AHR. На 23-й день мышей умерщвляли и оценивали наличие пневмонии.
Методология
Мышей медикаментозно лечили три раза, как описано выше. Лаважи канюлей, введенной в трахею, выполняли у отдельных мышей после кровопускания. Легкие промывали 3 раза 1 мл согретого PBS. Клетки промывали PBS, ресуспендировали в 300 мкл и подсчитывали с использованием камеры Баркера-Тюрка. Для дифференциального подсчета клеток BAL (бронхо-альвеолярного лаважа), препараты клеток после центрифугирования готовили и окрашивали по Райту/Гимзе. Тестированные группы представляли собой: мыши дикого типа (wt), сенсибилизированные LACK и подвергнутые ложной стимуляции PBS (Контроль), сенсибилизированные LACK и подвергнутые антигенной стимуляции мыши wt (животные с астмой), мыши wt, леченые OM-1009A, и мыши wt, леченые OM-1009B. Общее число клеток в BAL определяли микроскопическим исследованием препаратов клеток после центрифугирования и окрашивания по Райту/Гимзе.
Поскольку у получавших лечение мышей (см. результаты ниже) наблюдалось уменьшение воспаления дыхательных путей, то получали легочные экстракты, и количественное определение IL-4, IL-5 и IL-13 проводили мультиплексным анализом (с использованием программного обеспечения CBA).
Тестированные продукты
Тестировали следующие два бактериальных лизата: экстракт OM-1009A из Lactobacillus fermentum I-3929, полученный как описано в примере 3.7, и экстракт OM-1009B из Lactobacillus fermentum I-3929, полученный, как описано в примере 3.11.
Результаты
a) Гиперреактивность дыхательных путей
На 22-ой день проводили анализ для выявления способности мышей к развитию AHR после ингаляции метахолина в указанных дозах. Результаты представлены на фиг.5. Результаты показывают, что OM-1009-B восстанавливал базальные величины Penh, аналогичные не леченой, страдающей астмой группе, получавшей PBS. OM-1009-A был более эффективен, поскольку полученные величины Penh были даже ниже, чем величины, наблюдавшиеся у не страдающей астмой контрольной группы.
b) Общее и дифференциальное число клеток в жидкостях бронхо-альвеолярного лаважа
На 23-й день мышей умерщвляли и оценивали пневмонию. Общее число клеток в BAL представлено в таблице 20 (правая колонка), А также дифференциальные количества клеток: Количество эозинофилов (Eo), количество нейтрофилов (Neutro), количество лимфоцитов (Lympho) и количество других клеток (Other).
Таблица 20Общее и дифференциальное количество клеток в BAL после лечения двумя экстрактами по изобретению (Группы C и D). Представлены средние величины и величины стандартной ошибки средней
Средняя
Eo
Neutro
Lympho
Другие
Общее количество клеток
(A) Ctrl PBS
901
3178
11796
49125
65000
(B) Ctrl LACK = мыши с астмой
347691
51317
85609
301097
785714
(С) OM-1009A+LACK
115227
27879
54725
158419
356250
(D) OM-1009B+LACK
203834
14210
34523
204575
457143
SEM
Eo
Neutro
Lympho
Другие
Общее количество клеток
(A) Ctrl PBS
166
906
6255
5568
2887
(B) Ctrl LACK
78464
14392
17736
78575
135275
(C) OM-1009A+LACK
36741
10444
27024
34296
94905
(D) OM-1009B+LACK
57955
3220
6731
25311
74992
Оба экстракта значительно снижали общее число клеток в BAL (p<0,01 для OM-1009A; и p<0,03 для OM-1009B. По сравнению с группой B). Количества эозинофилов уменьшились соответственно в 3 и 1,7 раза. Количества нейтрофилов уменьшились соответственно в 1,8 и 3,6 раза. Снижение числа эозинофилов и нейтрофилов указывает на более низкую концентрацию воспалительных клеток в BAL животных, получавших предварительное лечение экстрактами.
c) Th2 цитокины, выявленные в легочных экстрактах и количественно определенные мультиплексным анализом (программное обеспечение CBA)
Таблица 21Индивидуальные уровни IL4 в легких у мышей
пкг/мг
мышь 1
мышь 2
мышь 3
мышь 4
мышь 5
мышь 6
мышь 7
мышь 8
Среда
(A) PBS
0
0,0053
0,0071
0,0157
0,0070
(B) LACK(мыши с астмой)
0,0395
0,0141
0,0279
0,0203
0,0353
0,0574
0,0949
0,0806
0,0462
(С) PO OM 1009A
0,0379
0,0120
0,0066
0,0056
0,0181
0,0146
0,0396
0,0463
0,0226
(D) PO OM 1009B
0,0409
0,0515
0,0414
0,0511
0,0484
0,0300
0,0270
0,0415
Таблица 22Индивидуальные уровни IL5 в легких у мышей
пкг/мг
мышь 1
мышь 2
мышь 3
мышь 4
мышь 5
мышь 6
мышь 7
мышь 8
Среда
(A) PBS
0
0,0004
0,0043
0
0,0012
(B) LACK(мыши с астмой)
0,1141
0,1002
0,1532
0,1115
0,3098
0,5173
0,5385
0,4547
0,2874
(С) PO OM 1009A
0,1817
0,0445
0,0572
0,0364
0,1643
0,0488
0,1917
0,1057
0,1038
(D) PO OM 1009B
0,1518
0,2798
0,1797
0,5439
0,3685
0,1320
0,1705
0,2609
Таблица 23Индивидуальные уровни IL13 в легких у мышей
пкг/мг
мышь 1
мышь 2
мышь 3
мышь 4
мышь 5
мышь 6
мышь 7
мышь 8
Среда
(A) PBS
0
0
0
0,0208
0,0052
(B) LACK(мыши с астмой)
0,2727
0,0896
0,3542
0,2303
0,6178
1,1306
1,1768
1,0244
0,6120
(С) PO OM 1009A
0,3598
0,1231
0,0888
0,0995
0,2975
0,1909
0,5213
0,5463
0,2784
(D) PO OM 1009B
0,3628
0,8919
0,4291
0,7699
0,6441
0,4981
0,4972
0,5847
Уровни Th2 цитокинов (IL4, IL5 и IL13) (см. табл.21, 22, 23), при сравнении с астматической контрольной группой (B), снижались экстрактом OM-1009A, но не экстрактом OM-1009B. Следовательно, бактериальные экстракты, полученные обработкой сильным основанием (OM-1009-B), могут быть менее активны, чем экстракты, полученные в условиях обработки умеренным основанием (OM-1009-A). Даже хотя оба экстракта были активны при анализе фактора Penh (фиг.6), OM-1009A может быть лучшим кандидатом, чем OM-1009B, для лечения или профилактики состояний, относящихся к связанным с Th2 заболеваниям, таким как аллергические заболевания и атопия, или их симптомов.