Способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) К.-Pol.) в условиях in vitro
METHOD FOR OBTAINING ADVENTITIOUS ROOTS OF PHLOJODICARPUS SIBIRICUS (STEPH.) K.-POL. UNDER IN VITRO CONDITIONS

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, культивированию корней растения вздутоплодника сибирского, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений – пиранокумаринов, которые широко используются в фармацевтической промышленности.
Вздутоплодник сибирский зарегистрирован в Государственном Реестре лекарственных средств РФ в качестве лекарственного растительного сырья. Его корневища и корни обладают вазодилатирующими (сосудорасширяющими), гипотензивными, адренолитическими и спазмолитическими свойствами. Используется при производстве препаратов спазмолитического действия «Димидин» и «Фловерин», а также комплексного препарата сердечно-сосудистого действия «Сафинор».
При этом известно, что вздутоплодник сибирский занесен в Красную книгу Якутии. Заготовка растения в природе может привести к уничтожению природных популяций.
Кроме того, корни растения вздутоплодника накапливают тяжелые металлы: цинк, никель, селен и молибден, соответственно использование растений, произрастающих на не контролируемых участках, несет большой риск для здоровья человека (см. Алексеева С.И. Перспективы получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского // Экспериментальная биология растений: фундаментальные и прикладные аспекты: Годичное собрание ОФР, науч. конф. и школа для мол. уч., 18-24 сент. 2017 г., Судак: сб. мат. докл. / Отв. ред. Вл.В. Кузнецов. – М: Изд-во АНО «Центр содействия научной, образовательной и просветительской деятельности «Соцветие», 2017. - 393 с).
Вздутоплодник сибирский растет по склонам сопок, в танацетовых степях и среди разнотравья лесостепей, в моховолишайниковой тундре и в сухих руслах рек (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.). Ареал произрастания вздутоплодника сибирского делят на три фрагмента: селенгинский, даурский и забайкальский. Также существуют отдельные очаги произрастания растения в Красноярском крае, Читинской и Иркутской области, в Якутии и на западе Амурской области. Основные запасы лекарственного сырья вздутоплодника сибирского находятся в Читинской области.
Корни и корневища вздутоплодника сибирского содержат кумарины и пиранокумарины (винсадин и дигидросамидин, изофлоидикарпин, скополетин, умбеллиферон), эфирные масла, гликозиды (мениантин и мелиатин), флавоновые гликозиды (рутин, гиперозид), уксусная и изовалериановая кислота, крахмал. Эфирное масло вздутоплодника сибирского в качестве основных компонентов содержит: лимонен, у-терпинен, терпинолен, спатуленол, гермакрен D, виридифлорол, ß-барбатен, 5-кадинен и ß-акорадиен. Растение концентрирует железо, цинк, никель, селен и молибден (см. Макаров А.А. Лекарственные растения Якутии: 4-е изд. / А.А.Макаров. – Якутск: Бичик, 2001. – 128 с.).
Авторами не установлены данные о получении адвентивных корней in vitro вздутоплодника сибирского.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) с характерными морфологическими параметрами и отсутствием сезонной зависимости их получения.
Поставленная задача решена тем, что получен штамм адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) в условиях in vitro.
Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна», штамм адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) впервые получен в условиях in vitro.
Предлагаемое решение состоит в том, что за основу взяты растения in vitro вздутоплодника сибирского, которые помещают в агаризованную питательную среду соответствующего гормонального состава в качестве экспланта. В результате был получен штамм адвентивных корней.
2
2
Причем, для получения растения in vitro в качестве эксплантов используют зрелые семена вздутоплодника. Семена стерилизуют перекисью водорода (HO) в течение 5 мин. После стерилизации материал ополаскивают, а затем трехкратно отмывают в течение 5 мин в дистиллированной стерильной воде. Стерильные семена помещают на твердую питательную среду без гормонов.
Для экспериментов используют твердую питательную среду следующего состава:
NH<sub>4</sub>NO<sub>3</sub>
1650,000 ±2,0000 мг
KNO<sub>3</sub>
1900,000 ±2,0000 мг
MgSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
370,000 ±1,0000 мг
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
170,000 ±0,1000 мг
CaCl<sub>2</sub>x2H<sub>2</sub>O
440,000 ±0,5000 мг
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
6,200 ±0,0100 мг
MnSO<sub>4</sub>x4H<sub>2</sub>O
22,300 ±0,0200 мг
ZnSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
8,600 ±0,0100 мг
KI
0,830 ±0,0010 мг
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>x2H<sub>2</sub>O
0,250 ±0,0010 мг
CuSO<sub>4</sub>x5H<sub>2</sub>O
0,025 ±0,0001 мг
CoCl<sub>2</sub>x6H<sub>2</sub>O
0,025 ±0,0001 мг
FeSO<sub>4</sub>x7H<sub>2</sub>O
2,785 ± 0,001 мг
Na-ЭДТА
3,725 ±0,001 мг
Тиамин
0,100 ±0,0010 мг
Пиридоксин
0,100 ±0,0010 мг
Сахароза
30000,000 ±100,0000 мг
Вода
1000 мл
Агар
5000 мг
Полученную в результате растение in vitro помещают в аналогичную питательную среду с добавлением ауксина.
Культивирование проводят в темноте, при 26±1°С, влажности помещения 70±5%, в чашках Петри с диаметром 90 мм. Цикл субкультивирования составляет 4 недели. При пересеве используют 1/3 адвентивных корней.
Полученные адвентивные корни выращивают в течение более тридцати циклов. В процессе культивирования определяют морфологические характеристики.
Штамм (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) ВС-1 идентифицирован и депонирован в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН, 127276, Москва, И-276, ул. Ботаническая, 35.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культуральные признаки: корни имеют одинаковые ответвления, темно-оранжевой окраски.
Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяют по сырому и сухому весу биомассы. Для определения веса сырой биомассы корней отделяют от среды культивирования на бумажных фильтрах на вакуумном насосе, промывают водой и взвешивают. Сухую биомассу корней получают после лиофильной сушки.
При анализе представленных кривых роста следует отметить замедление роста на 25 сутки культивирования, что позволяет использовать 4-недельный цикл выращивания. Ростовые параметры (кроме индекса роста) рассчитывали по сухому весу биомассы. Результаты представлены в таблице и свидетельствуют о наличии стабильных ростовых характеристик.
Таким образом, выявлен способ получения адвентивных корней вздутоплодника сибирского (Phlojodicarpus sibiricus (Steph.) K.-Pol.) из семян через растения in vitro, обладающие стабильными ростовыми параметрами и морфологическими характеристиками, причем, получение соединений может быть выполнено вне сезонной зависимости производства.
Таблица
Ростовые параметры адвентивных корней вздутоплодника сибирского
Показатели
Значения
Индексы роста по:весу сухой биомассывесу сырой биомассы
5±0,55±0,5
Удельная скорость роста, сут<sup>-1</sup>
0,12 ±0,05
Время удвоения, сут.
12 ±2