Биогеосорбент для очистки нефтезагрязненных водных объектов
BIOGEOSORBENT FOR CLEANING OIL-CONTAMINATED WATER BODIES

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для очистки загрязненных нефтью водных объектов.
Известен биосорбент для ликвидации нефти с поверхности водоемов [патент РФ № 2 529 771]. Биосорбент содержит (мас.%): глину - 70-80; отходы обогащения бурого угля - 19,5-28,5; штамм Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 - 0,5-1,5. Изобретение направлено на эффективную очистку поверхности водоемов от нефти при сокращении времени и затрат с использованием биосорбента с высокой углеводородокисляющей активностью. Недостатком данного препарата является использование для очистки от нефти жидкой культуры Pseudomonas fluorescens ВКГ RCAM00538 - 0,5-1,5. Известно, что жидкая культура используется сразу после приготовления, т.к. при длительном хранении она портится, т.е. срок годности незначителен.
2
2
2
2
3
2
2
Известен «Экобиопрепарат для очистки воды от нефтепродуктов» [патент РФ № №2393215]. Биопрепарат представляет собой культуру клеток биодеструктора, искусственно иммобилизованную на сорбенте-носителе из полых сферических частиц, внутренняя полость которых заполнена азотом и двуокисью углерода, имеющим состав (мас.%): SiO - 50-60; AlO - 25-30; FeO - 1,8- 2,0; CaO - 1-5; MgO - 0,5-1,5; NaO - 0,3-1,5; КО - 0,2-2,9. В качестве биодеструктора нефтепродуктов применяется штамм Pseudomonas fluorescens ВКГМ 68-44. Недостатком препарата является использование азота и двуокиси углерода - удорожает стоимость известного препарата для очистки воды от нефтепродуктов, что соответственно удорожает процесс очистки. К тому же применение данного препарата позволяет очищать поверхность водоема от нефти и нефтепродуктов в течение не менее 30 суток, что является длительным процессом.
Известно, что для очистки буровых сточных вод используют торф. Перед применением проводят его обработку кислотами и щелочами, подвергают обработке магнитным полем, добавляя хлорид кальция для повышения коэффициента нефтеемкости [Ф.А. Каменщиков, Е.И. Богомольный, «Нефтяные сорбенты», Москва-Ижевск, 2005, с.152-156]. Однако добавление хлоридов еще больше увеличит их содержание в буровой жидкости, что нецелесообразно.
Известен гидрофобный порошкообразный адсорбент, состоящий из гидрофобизованного вспученного перлита, с относительной плотностью меньше единицы и бактериальный препарат, состоящий из жидкой культуры микроорганизмов Pseudomonas putida 36 [а.с. №1710515]. Перлит представляет минеральный материал на основе оксида кремния, содержание которого составляет 75%. Недостатком адсорбента является наличие дополнительной технологии обработки перлита различными химическими веществами, например карбоновыми кислотами и их солей, что значительно удорожает процесс.
Задачей заявленного изобретения является разработка биогеосорбента на основе модифицированной глауконитсодержащей породы и иммобилизованных на нем углеводородокисляющих микроорганизмов для использования в технологиях очистки водных объектов от нефтяных загрязнений.
Микроорганизмы, входящие в состав биогеосорбента, обладают повышенной нефтеокисляющей активностью. Минеральный носитель, на который иммобилизованы штаммы микроорганизмов, обеспечивает сохранность и выживаемость клеток микроорганизмов в экологически неблагоприятных условиях. Способ позволяет использовать биогеосорбент для очистки загрязненных нефтепродуктами водных объектов. В этом состоит технический результат.
Технический результат достигается тем, что биогеосорбент содержит глауконитсодержащую породу и смесь штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum, дрожжей Rhodotorula glutinis, микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa, взятых при соотношении:
штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ B-3033D
с титром клеток 10<sup>12</sup> вкм
40%
штамм дрожжей Rhodotorula glutinis BKM Y-2998D
с титром клеток 10<sup>9</sup>
40%
микроводоросли Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024
с титром клеток 10<sup>8</sup>
20%.
Ниже описаны штаммы микроорганизмов, входящих в состав биогеосорбента.
Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum выделен с грунта, отобранного с участка железнодорожного полотна в г. Сыктывкаре Республики Коми, способен активизировать деструкцию нефти и нефтепродуктов в воде, в дерново-подзолистой почве, а также в масляных грунтах на участках железной дороги. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM В-3033D.
Штамм характеризуется следующими признаками:
I. Культурально-морфологические:
На среде МПА колонии точечные ∅<1 мм, со слизистым чехлом (до 5 мм), палево-желтые, непрозрачные, блестящие, круглые, профиль выпуклый, край ровный. В среду диффундирует неоново-желтый пигмент. На средах Чапека-Докса, Виноградского и КАА окраска колоний палевая, на средах Виноградского и КАА не образует слизи. На средах Эндо и Гисса с глюкозой отмечено обильное образование слизи.
II. Физиолого-биохимические:
Аэроб с окислительным типом метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Каталазаположительный. Способен к нитрификации. Обладает амилолитической активностью. Использует как единственный источник углеводов сахарозу, глюкозу, лактозу, маннит.
III. Данные молекулярно-генетического анализа:
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
4
2
Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды – Пептон –  20 г, NaCl – 3,0 г; KCl – 1,0 г; MgSO×7HO –  0,5 г;  агар микробиологический – 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.
Штамм Rhodotorula glutinis выделен в 2014 году из нефтяного шламонакопителя Усинского района Республики Коми, способный к нефтеокислению. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Скрябина. Штамму присвоен номер VKM Y-2998D.
Культурально-морфологические и физиолого-биохимические особенности штамма
Колонии красные слизистые выпуклые блестящие гладкие, край ровный.
Клетки почкующиеся округлые, овальные, 2.5-6.0 × 4.0-8.5 мкм, с небольшой капсулой. Баллистоспоры и псевдомицелий отсутствуют.
Образование истинного мицелия и телиоспор не наблюдалось как в монокультуре, так и при скрещивании с типами спаривания Rhodosporidium babjevae Golubev, R. paludigenum Fell et Tallman и R. toruloides Banno.
Сахара не сбраживает.
Ассимилирует глюкозу, мальтозу, мелецитозу (слабо), L-арабинозу (слабо), рамнозу (медленно), сорбит, маннит, этанол. Не ассимилирует лактозу, эритрит, арабит, дульцит, инозит, глюкуронат.
Усваивает нитраты, нитриты (медленно), лизин, этиламин (слабо).
Крахмалоподобные вещества не образует.
При +37°С не растет.
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
3
2
4
4
2
Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) – периодические пересевы – 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - Сахароза 30 г, NaNO– 3,0 г; KHPO – 1,0 г; KCl – 0,5 г; MgSO×7HO - 0,5 г;  агар микробиологический – 20,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.
Штамм микроводоросли Chlorella vulgaris f. globosa выделен в 2010 г. из почвы на стоянке оленеводов в Приполярном Урале, способен к нефтеокислению. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Штамму присвоен номер IPPAS-2024.
Морфологическая характеристика штамма:
Форма клеток – шаровидная, размер от 3.3 до 13.3 мкм в диаметре. Пириноид округлый с 2-4 крахмальными зернами, хорошо заметный. Хроматофор чашевидный, зеленый. Жгутиков нет, автоспоры освобождаются путем разрыва материнской оболочки и имеют форму от неправильно шаровидной до тетраэдрической, пустые оболочки материнских клеток двух-трехдольчатые. Особенности морфологии при длительном хранении: увеличение размеров клеток за счет вакуолизации, образование бесцветных капель масла в клетках. Особенности морфологии в условиях оптимального роста: большая часть клеток находится в диапазоне 6-8 мкм.
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
Режим хранения штамма – для подготовки биомассы с целевым использованием – периодические пересевы – 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды Болда (табл.1):
Таблица 1
Состав среды Болда
В 936 мл дистиллированной воды необходимо добавить по 10 мл раствора каждого из 6 макроэлементов и по 1 мл каждого микроэлемента и по 1 мл каждого раствора микроэлементов, затем автоклавировать. рН конечного раствора – 6.6. Среда хранится в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°С.
2
Минеральный носитель – глауконитсодержащая глина (глауконитсодержащий песчаник, песок). Местонахождение – мезозойские отложения Тимано-Североуральского региона. Минеральный состав пород по данным рентгено-фазового анализа - кальцит, кварц, опал, глауконит, иллит, хлорит, апатит, рентгеноаморфные соединения железа. Удельная поверхность – 43.26 м/г. Рабочий номер – 539-40. Модифицирование образца 539-40 проводилось с помощью термической обработки при температурах  370 и 500°С в течение 2 ч.
Для определения сорбционных и деструктивных характеристик биогеосорбента были проведены эксперименты.
Пример 1.
0.5 г нефти добавляли в 100 мл среды Чапека без сахарозы. Аэрировали на шейкере при 180 об/мин в течение 4 суток при комнатной температуре и естественном освещении. Воду отфильтровывали.
В колбы на 250 мл разливали подготовленную загрязненную нефтью воду и добавляли 1 г исходного сорбента (без микроорганизмов) или 1 г биогеосорбента. Эксперимент проводили в течение 4 суток при комнатной температуре, естественном освещении, аэрации на шейкере (180 об/мин).
Содержание нефтепродуктов в образцах модельной воды, отфильтрованных исходных сорбентах и биогеосорбентах анализировали методом флуориметрии на анализаторе жидкости «Флюорат – 02» в соответствии с ПНД Ф 16.1.21-98 [Методика выполнения …, 1998].
Образец исходной глауконитсодержащей породы - сорбент (539-40) обладает высокими сорбционными свойствами. Содержание нефтепродуктов в экспериментальной воде снижается относительно контрольного образца на 80 % за 4 суток (табл.2). Сорбционные свойства минерального носителя снижаются в 3 раза после иммобилизации на нем штаммов биопрепарата (табл.2). Это связано с частичным снижением емкости биогеосорбента за счет уменьшения удельной площади поверхности сорбента адгезионно закрепленной на поверхности биомассой микроорганизмов и снижения пористости.
Отношение величин  остаточного содержания нефтепродуктов в биогеосорбенте (539-40-Б) к сорбенту (539-40) иллюстрирует степень нефтедеструкции иммобилизованными микроорганизмами и составляет 65% за 4 суток (табл.2).
Таблица 2
Изменение концентрации нефтепродуктов в воде в присутствии исходного минерального носителя и биогеосорбента
№ образца
Содержание нефтепродуктов*
№ образца
Содержание нефтепродуктов*
539-40
<u>0.024±0.009</u>58±23
539-40-Б
<u>0.072±0.025</u>20±8
Загрязненная нефтью вода (контроль)
0.12±0.041
3
*Примечание: в числителе содержание нефтепродуктов в экспериментальной воде, мг/дм, в знаменателе – содержание нефтепродуктов в исходном сорбенте и биогеосорбенте после эксперимента, мг/г.
Пример 2. Для анализа различных функциональных показателей иммобилизованных на носителях клеток, таких как жизнеспособность, метаболическая и синтетическая активности, предлагаются биохимические методы. В нашем случае, выбран метод определения дегидрогеназной активности, т.к. культуральные жидкости микроорганизмов-нефтедеструкторов, входящие в состав биогеосорбента, обладают высокой дегидрогеназной активностью. В результате иммобилизации на глауконите клетки микроорганизмов, а также их разнообразные ферменты стабилизируются и длительное время сохраняют свою активность. Следовательно, по дегидрогеназной активности самих биогеосорбентов можно судить о жизнеспособности на них клеток.
Проведено определение дегидрогеназной активности в образцах сорбентов и биогеосорбентов в 3-х повторностях. В таблице 3 даны усредненные данные.
Установлена высокая дегидрогеназная активность в биогеосорбентах, что указывает на наличие в них живых клеток микроорганизмов, т.е. биогеосорбенты способны к деструкции нефтепродуктов.
Таблица 3
Дегидрогеназная активность, мг формазана/ 1 г образца
№
Дегидрогеназная активность биогеосорбента
Дегидрогеназная активность сорбента
539-40-Б исх
3.46±0.17
0.496±0.02
539-40-Б 370°С
8.12±0.41
0.10±0.005
539-40-Б 500°С
3.16±0.16
0.09±0.004
Пример 3
Проведено сравнительное испытание исходного биогеосорбента 539-40-Б исх с модифицированными биогеосорбентами (539-40-Б 370°С  и 539-40-Б 500°С) на снижение содержания нефтепродуктов в загрязненной воде.
В колбы на 250 мл готовили 100 мл среды Чапека без сахарозы, стерилизовали при температуре 121°С, охлаждали, добавляли нефть в количестве 0.5 г и вносили по 1 г исходного и модифицированных биогеосорбентов.
Условия: аэрация при 180 об/мин, комнатная температура, естественное освещение, в течении 14 суток. Контролем был образец загрязненной нефтью воды без внесения биогеосорбентов. Эксперимент был поставлен в 3-х повторностях. В таблице 4 даны усредненные данные.
Как видно, из таблицы 4, как исходный биогеосорбент, так и модифицированные образцы обладают нефтедеструктивными свойствами. Наиболее эффективным оказался образец 539 370°С. Снижение содержания нефтепродуктов в сильно загрязненной экспериментальной воде, при использовании биогеосорбентов составило 40-60 % за 14 суток.
Таблица 4
Содержание нефтепродуктов в экспериментальной воде
№
НП, мг/дм<sup>3</sup>
539-40-Б исх
168±25
539-40-Б 370°С
109±16
539-40-Б 500°С
122±18
Контроль
279±42
Пример 4
Приготовление биогеосорбента включая стадию культивирования штаммов и способа получения конечного продукта.
4
2
Стадия культивирования штаммов. Питательная среда для культивирования штамма бактерий Pseudomonas yamanorum следующего состава: вода, гидролизат куриного белка (HCP Premium), NaCl; KCl; MgSO×7HO г.
3
3
12
Питательную среду для культивирования бактерий Pseudomonas yamanorum, объемом 4.5 л стерилизуют в емкости в автоклаве при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2 в течении 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27°С и подают в ферментер объемом на 5 литров. Добавляют заранее приготовленный (приготовление описано выше) или оставленный после предыдущего ферментирования инокулят штамма Pseudomonas yamanorum по 100 мл из емкости. Параметры культивирования: температура 25-30°С, перемешивание среды с помощью лопастной мешалки 150 об/мин, рН 6-7, аэрация через стерильный фильтр 0.5 дм воздуха на 1 дм культуральной жидкости. Культивирование жидкого препарата продолжается от 3 до 5 суток. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10 КОЕ/мл.
2
4
2
4
4
3
9
Питательная среда для культивирования штамма дрожжей Rhodotorula glutinis следующего состава (М9): вода, дизельное топливо марки «Л», NaHPO; KHPO; NaCl; NHCl. Питательную среду для культивирования дрожжей Rhodotorula glutinis, объемом 4.5 л стерилизуют в емкости в автоклаве при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2, в течении 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27°С и подают в ферментер объемом на 5 литров. Добавляют заранее приготовленный (приготовление описано выше) или оставленный после предыдущего ферментирования инокулят культуры Rhodotorula glutinis, по 100 мл из емкости. Параметры культивирования: температура 25-30 ºС, перемешивание среды с помощью лопастной мешалки 150 об/мин, рН 6-7, аэрация через стерильный фильтр 0.5 дм3 воздуха на 1 дм культуральной жидкости. Культивирование жидкого препарата продолжается от 3 до 5 суток. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10 КОЕ/мл.
При интенсивном пенообразовании в качестве пеногасителя используют стерилизованное подсолнечное масло. Пеногаситель вносят из емкости в ферментеры.
Питательная среда Люка (Патент РФ № 2556126) для культивирования штамма Chlorella vulgaris f. globosa.
8
Питательную среду для культивирования микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa объемом 4.5 л стерилизуют в емкости в автоклаве при температуре 121°С, атмосферном давлении 1.2, в течение 20 минут. Охлаждают до температуры 23-27°С и подают в стеклянный хемостат объемом на 5 литров. Добавляют заранее приготовленный (приготовление описано выше) или оставленный после предыдущего культивирования инокулят культуры Chlorella vulgaris f. globosa по 100 мл из емкости. Параметры культивирования: за хемостатом располагают 6 люминесцентных ламп мощностью 20 Ватт каждая. Аэрирование с помощью аквариумного насоса, подача углекислого газа 1 г/ литр /час из баллона в течение трех суток. Температура 25-27°С. Наработанная культуральная жидкость должна иметь титр клеток 10 кл./мл.
Полученные бактерии, дрожжи и микроводоросли имеют регистрационные номера:
- ВКМ В-3033D - Штамм бактерий Pseudomonas yamanorum;
- ВКМ Y-2998D - Штамм дрожжей Rhodotorula glutinis;
- IPPAS C-2024 - Микроводоросли Chlorella vulgaris f. Globosa.
Стадия смешивания биомассы бактерий, дрожжей и микроводорослей. Смесь штаммов бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D, дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D, микроводорослей Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024 берут при соотношении:
12
- штамм бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D с титром клеток 10 - 40%
9
- штамм дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D с титром клеток 10- 40%
8
- микроводоросли Chlorella vulgaris f. Globosa IPPAS C-2024 с титром клеток 10 - 20%.
Смешивание происходит путем сливания через нижнюю часть ферментеров биомассы дрожжей Rhodotorula glutinis ВКМ Y-2998D, бактерий Pseudomonas yamanorum ВКМ В-3033D и нижнюю часть хемостата биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris f. globosa IPPAS C-2024.
Часть культуральной жидкости остается для последующего цикла культивирования остается в ферментере и хемостате, в которые вносится новая порция простерилизованных питательных сред.
Стадия получения конечного продукта (биогеосорбента). Полученная смесь культуральных жидкостей микроорганизмов поступает в камеру смешения и далее разбрызгивается на минеральный носитель насыпной плотностью не толще 1 см. В качестве носителя берут глауконитсодержащую породу.
Полученный биогеосорбент высушивают в термостате при температуре не выше 30°С. Фасовку биогеосорбента в упаковочную тару осуществляют в ручную.
Упаковка: 3
Биосорбент фасуют от 1 до 15 кг в полиэтиленовый двойные пакеты, которые герметично запаяны со всех сторон.
Маркировка:
Каждую единицу упаковки снабжают этикеткой, характеризующей продукцию:
- наименование организации, в систему которой входит предприятие-изготовитель;
- наименование предприятия-изготовителя;
- масса нетто;
- дата изготовления;
- номер партии;
- гарантийный срок хранения;
- условия хранения;
- количество единиц фасовки;
- обозначение ТУ.
К каждой партии прилагается инструкция по применению биогеосорбента.
Транспортирование биогеосорбента должно производиться в соответствии с ГОСТ 59.04.070.24-83. Биогеосорбент транспортируется всеми видами транспорта с предохранением его от температур выше +40°С и ниже -25°С.
Хранение должно производиться с ГОСТом 59.04.070.24-83 при температуре от +4 до +25°С.
Гарантийный срок хранения препарата 2-3 года со дня изготовления.