Метод хромокристаллоскопии в свете современной биокристалломики: сущность, роль, перспективы

Биология

Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2009, № 1 , с. 78-83

УДК 577.1 : 612.015.347

МЕТОД ХРОМОКРИСТАЛЛОСКОПИИ В СВЕТЕ СОВРЕМЕННОЙ БИОКРИСТАЛЛОМИКИ: СУЩНОСТЬ, РОЛЬ, ПЕРСПЕКТИВЫ

© 2009 г. А.К. Мартусевич \ А.В. Воробьев \ Н.Ф. Камакин 2, Ю.В. Зимин 1

1 Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии 2 Кировская государственная медицинская академия Ассоциация специалистов по биокристалломике

cryst-mart@yandex.ru

Поступила в редакцию 14.10.2008

Приводится общее понятие о биокристалломике как синтетической науке о биогенных кристаллах, раскрываются этапы ее становления и развития, уточняется современное состояние. На основании анализа литературы и собственных исследований дается классификация биокристаллоскопических методов, указывается место метода хромокристаллоскопии (кристаллизация биосубстратов с участием красящих веществ) среди них. Подробно рассматриваются варианты проведения, особенности, проблемы и перспективы данного методического подхода. Показаны потенциальные области применения результатов хромокристаллоскопии. С учетом собственных данных и критического анализа данных других авторов уточняются возможные «подводные камни» метода и способы их преодоления.

Ключевые слова: биокристалломика, хромокристаллоскопия, диагностика, красители, биологические субстраты, биокристаллизация.

Биокристалломика - биологическая наука, изучающая структуру, свойства и функциональное значение биогенных кристаллов. История исследования биоассоциированной кристаллизации начинается от работ Т.Е. Ловица, который описал «метод выветренных солей», ставший впоследствии прообразом всех биокристаллоскопических методов [1]. В современной России временем становления биокристалломики нужно признать 1976 год, когда офтальмологом Е.Г. Рапис была опубликована первая статья, посвященная собенностям кристаллизации стекловидного тела человека и животных [2].

Все время развития биокристалломики с вышеуказанного момента до настоящего времени можно условно подразделить на 3 периода: начальный, связанный с получением первых представлений о феномене биокристаллизации [2-6]; эмпирический, характеризующийся накоплением знаний об особенностях кристаллообразования различных биологических субстратов организма человека и поиском новых методов их исследования, позволяющих решать принципиально отличные от классической кристаллографии задачи [7-18]. Последние возникают в связи с необходимостью учета биологически значимой информации биокристаллов, а не их структурных характеристик. Наконец, в последние 2-3 года складывается относительно благоприятная ситуация для вступления био-

кристалломики в качественно новый этап развития - синтетический [19-23]. С позиций, провозглашенных Ассоциацией специалистов по биокристалломике, он должен характеризоваться интегративным рассмотрением проблемы биоассоциированной кристаллизации на основании объединения усилий заинтересованных лиц всех специальностей: биологов, медиков, химиков, физиков, математиков, минералогов и др. Поэтому принципиален вопрос об унификации терминологии и методического аппарата синтетической дисциплины [24, 25]. К этому дополнительно подталкивает и существующий в настоящее время плюрализм понятий и подходов к проведению биокристаллоскопического анализа [5, 7, 8, 10, 11, 14, 16, 26, 27]. Так, применяемые многими авторами методические приемы и их результат именуются кристаллографическими [3, 5], в то время как в доказательство невозможности применения подобной терминологии имеется достаточно большое количество доводов. Прежде всего, кристаллографическими - давно сформировавшаяся наука физико-мате-матического и материаловедческо-го профиля с соответствующими целью и задачами, коренным образом разнящимися с аналогичными для биокристалломики. Кроме того, терминологическая путаница возникает даже внутри самой «кристаллографии» в ее данном биологическом применении. Это связано с тем

обстоятельством, что под «кристаллографией биологической жидкости» понимается вся совокупность методических вариантов исследования биокристаллизации [28].

Систематизируя их описание, можно сформировать 3 основные группы подходов (рис. 1). В основу этой классификации положены принципиальные особенности манипуляций с высыхающей каплей биоматериала.

К первой группе относятся все методы, имеющие своей сущностью исследование особенностей собственной кристаллизации биологического субстрата. Особенностью отдельных подходов внутри рассматриваемой группы являются варианты проведения кристаллизации (на воздухе - клиновидная дегидратация [10, 13], классическая кристаллоскопия [21, 24, 25]; в закрытой ячейке [8]; в условиях создания вакуума [29]; на модифицируемых поверхностях -профильная дегидратация [30] и др.).

Вторая, наиболее многочисленная группа объединяет все способы дегидратации, основанные на сокристаллизации биосреды и специ-

ально подобранного кристаллообразующего (базисного) вещества. Мы предлагаем выделять внутри данной группы 3 основных метода [25], каждый из которых может иметь большое количество вариантов. Первым из них служит получение и анализ единственного образца, представляющего взаимодействие «биосреда - базисное вещество». Второй основной метод -сравнительная тезиграфия, характеризующаяся сопоставлением двух совместно и параллельно приготовляемых препаратов, один из которых включает систему «биосреда - базисное соединение», а другой - контрольную каплю базисного вещества. Наконец, третий подход основан на многократном использовании сравнительной тезиграфии в одних условиях, но с различными химическими модуляторами биокристаллогене-

за. Остальные предложенные в настоящее время методические приемы являются лишь вариантами трех названных способов.

Третья группа методов, в соответствии с нашими представлениями, интегрирует все подходы, включающие любые манипуляции с био-

Рис. 1. Структура методов биокристалломики

средой до начала и/или в процессе высушивания. Поэтому они получили название экспериментально-кристаллоскопических.

В последние несколько лет привлекает к себе внимание специалистов особый метод, заимствованный на начальном этапе из гистологической практики [21, 26, 27, 31]. Он основан на применении красителей в процессе и/или по окончании дегидратации биосреды. Впервые примененный нами в 2005 году [21, 31], этот подход в соответствии со своей сущностью был назван хромокристаллоскопией (ХКС). Дальнейшие исследования показали, что данный способ является синтетическим и в зависимости от времени внесения красителя может быть отнесен к различным группам (рис. 2). Так, если красящее вещество вносится до начала (фоновая ХКС) или по окончании высушивания биосубстрата (постдегидратационная ХКС), то подобные методические варианты необходимо отнести к первой группе (кристаллоскопической). В случае совместной кристаллизации биосреды и красящего соединения имеет место введение в биосистему не только окрашивающего вещества, но и модулятора биокристал-логенеза. Это обстоятельство позволяет причислить данный вариант (системная ХКС) к тезигра-фическим подходам [21].

Важно, что в качестве вводимого компонента может использоваться система из нескольких красителей. Более того, принципиально возможно неоднократное (в течение процесса дегидратации) внесение одного или нескольких красящих веществ в биоматериал. Вышеперечисленное позволяет отнести этот вариант (дифференциальная ХКС) к экспериментальнокристаллоскопическим тестам.

Подобная многогранность метода ХКС предусматривает широкие перспективы его применения в биокристалломике, что основано на гипотезе о том, что использование теста с красителем позволяет увеличить объем биологически значимой информации, получаемой исследователем при проведении биокристаллоскопиче-ского анализа.

В плане дальнейшего рассмотрения возможностей метода ХКС нам представляется значимым привести специализированную классификацию красящих агентов, потенциально предполагаемых к использованию для задач различных вариантов ХКС (рис. 3).

В соответствии с данной схемой возможно будет проводить направленный подбор красителей для конкретных исследовательских целей, однако ее практическое применение реально лишь после тщательного экспериментального анализа по отнесению отдельных красящих ве-

ществ к каждой из групп. Для начала использования данного алгоритма минимально достаточным условием является присутствие хотя бы одного соединения или их комплекса во всех выделенных группах.

Рассматривая возможные перспективы ХКС, целесообразно указать 3 основных аспекта применения данного метода:

1. Научные исследования. Изучение окрашенных препаратов биологических субстратов может стать одним из подходов к расшифровке механизмов биокристаллогенеза in vitro и, потенциально, in vivo. В этом случае краситель выступает в качестве «биометки», локализация которой в микропрепарате визуализируется микроскопически.

Кроме того, использование различных вариантов ХКС способно явиться дополнительным источником биоинформации о состоянии и закономерностях функционирования организмов разного уровня организации в физиологических и патологических условиях [20].

2. Кристаллодиагностика. Дополнение основных биокристаллоскопических технологий возможностью дифференциального окрашивания отдельных или всех компонентов дегидратирующегося биосубстрата может существенно повысить специфичность и чувствительность проводимого анализа в отношении конкретных диагностируемых состояний человека и животных [21, 25]. Возможно приобретение методом ХКС самостоятельного диагностического значения в будущем. Однако для этой цели необходимы подходы к объективизации результатов подобного биотестирования. Они могут быть реализованы путем использования количественных оценочных параметров [21, 24, 25] или верификацией заключений ХКС другими инструментальными способами, например путем спектрометрического исследования биокристаллов [32, 33].

3. Кристаллоиндикация. Трактуется нами как возможность с помощью метода ХКС визуализировать отдельные процессы и явления, непосредственно не имеющие отношения к кристаллообразованию. Так, в частности, дифференциальная окраска высыхающих смывов с потенциально инфицированных поверхностей может стать дополнительным или основным тестом в оценке ее микробной колонизации, причем принципиально возможно установление видовой принадлежности присутствующей микрофлоры [21].

В то же время на пути практической реализации метода ХКС возникает большое количество не всегда преодолимых трудностей. Так, в

Фоновая ХКС - Система ХКС — Постдегидра- Дифференциаль-

способ выполнения ХКС, способ выполнения тационная ХКС ная ХКС —

основанный на предвари- ХКС, базррующийся — спо соб сып ол- предусматривает

тельном нанесении и вы- на создания на под- нения ХКС , за- неоднократное

сушивании красителя на ложке жидкой системы ключащийся в внесение одного

подложке с последующим «биосреда - краси- нанесении краси- или нескольких

наслоением дегид- тель » с последующей теля иа уже сфор- краеителей

ратирующегося совместной ее дегид- меровеннрю фа-

биосубстрата ратацией цию

Хромокристаллоскопия

Рис. 2. Варианты проведения хромокристаллоскопии

Рис. 3. Классификация красящих агентов для различных вариантов хромокристаллоскопии

некоторых работах, посвященных системной ХКС [26, 27], на основании последовательного применения нескольких стандартных красящих веществ авторами формулируется заключение о характере распределения отдельных «групп белков» по текстуре фации. При этом важно подчеркнуть, что эксперименты проводились с использованием в качестве биоматериала сыворотки крови человека, в которой было обнаружено повышенное содержание отдельных белковых фракций, тогда как возможное изменение концентраций других веществ, учет которых значим при избранных исследователями патологических процессах, в расчет не принято.

Другим значимым моментом является отсутствие включения в гипотетическую схему рас-

пределения частей протеома сыворотки крови небелковых органических (липиды, углеводы и др.) и неорганических компонентов, которые наряду с белками принимают активное участие в процессах дегидратационной самоорганизации биосубстратов, что противоречит традиционным представлениям о строении и генезе те-зиграфической и кристаллоскопической фаций [10-12, 21, 34-39].

Не менее существенным «подводным камнем» всех биокристаллоскопических методов в целом и ХКС в частности является слабое использование исследователями количественных параметров учета результатов биокристаллоге-неза. Большинство работ, посвященных данной проблеме, включают исключительно визуаль-

ное описание картин свободного и инициированного кристаллообразования [2-4, 6-11, 26, 27], что значимо затрудняет стандартизацию, верификацию и использование полученной информации, практически нивелируя возможность формирования объективного заключения по конкретному образцу препарата, приготовленного по любому методу ХКС. Применяемый многими авторами морфологический подход к оценке кристаллоскопических и тезиграфиче-ских фаций имеет большое количество недостатков, в частности выраженную субстратную специфичность, трудность в освоении, необходимость наличия обширного банка морфоструктурных образований, возможность обнаружения переходных кристаллических и псевдо-кристаллических фигур, высокую вариабельность строения, периодически обнаруживаемую повышенную кристаллизуемость биоматериала и т. д.

Альтернативой этому могут явиться применение субстрат-неспецифичных количественных критериев оценки [21, 25, 33, 37, 40] и компьютеризированный морфометрический анализ фаций [13, 15]. Несмотря на стандартизирован-ность результатов морфометрического теста, имеет место ряд обстоятельств, существенно ограничивающих его практическое применение. Это необходимость приобретения специализированного программно-аппаратного комплекса, затруднительность четкого автоматического различения отдельных структурных образований вследствие их выраженной полиморфности, несовершенства имеющегося программного обеспечения и т. д.

Все вышеперечисленное выдвигает на первый план методы, сопряженные с визуальной системной морфометрией биокристаллов [25,

33, 40]. Так, в лабораториях нашей Ассоциации разработана единая 10-параметрическая система критериев количественного описания результатов тезиокристаллоскопии, которая является одновременно субстрат-независимой и не связанной с типом и особенностями конкретных кристаллических и аморфных образований анализируемого образца высушенного биосубстрата [25]. Апробация предлагаемого алгоритма осуществлена на большом материале (более 1800 образцов) и доказала свою валидность в клинико-диагностических исследованиях отдельных заболеваний человека и животных [21,

32, 33, 37, 40-42].

Большинство работ в области изучения возможностей ХКС можно отнести к начальной, зачаточной стадии исследований, на что указывает абсолютная несистематичность в выборе

красящего агента [26, 27]. Проведение углубленных исследований по дальнейшей конкретизации предлагаемого нами алгоритма (рис. 3) позволит более адекватно и целесообразно применять отдельные красители и их системы с учетом решения широкого круга практических задач медико-биологического профиля.

Заключение

Современная биокристалломика как молодая перспективная медико-биологическая дисциплина требует кропотливого подхода к подбору и совершенствованию собственной методологии и методического аппарата. Поэтому разработка и изучение возможностей новых методических приемов являются своевременной тематикой научных исследований в области биокристалломи-ки, что в полной мере относится и к методу ХКС.

Экспериментально-теоретический анализ возможностей и перспектив ХКС позволил установить, что при условии проведения методологически адекватного исследования особенностей взаимодействия широкого спектра красящих веществ с биологическими объектами биокри-сталломика способна пополнить естествознание значительным объемом сведений, ценных как с фундаментальных, так и с прикладных позиций.

Список литературы

1. Ловиц Т.Е. // Технологический журнал. 1804. Т. 1. Ч. 3. С. 27-41.

2. Рапис Е.Г. // Вестник офтальмологии. 1976. № 4. С. 62-67.

3. Неретин В.Я., Кирьяков В.А. // Советская медицина. 1977. № 7. С. 96-102.

4. Каликштейн Д.Б., Мороз Л.А., Черняков В.Л. // Лабораторное дело. 1981. № 2. С. 79-81.

5. Гугутишвили Ц.Г., Симонишвили Л.М. // Педиатрия. 1990. № 12. С. 78-79.

6. Каликштейн Д.Б., Мороз Л.А., Квитко Н.Н. и др. // Клиническая медицина. 1990. № 4. С. 28-31.

7. Савина Л.В. Кристаллоскопические структуры сыворотки крови здорового и больного человека. Краснодар, 1999. 238 с.

8. Антропова И.П., Габинский Я.Л. // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. № 8. С. 36-38.

9. Барер Г.М., Денисов А.Б., Михалева И.Н. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1998. Т. 126, № 12. С. 693-696.

10. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. М.: Хризопраз, 2001. 304 с.

11. Рапис Е.Г. Белок и жизнь. Самоорганизация, самосборка и симметрия наноструктурных супрамо-лекулярных пленок белка. М.: МИЛТА-ПКП ГИТ,

2003. 368 с.

12. Тарасевич Ю.Ю. // Успехи физических наук.

2004. Т. 174, № 7. С. 779-790.

13. Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., Девяткин А.А.

и др. Морфология жидких сред глаза (новая теория инволютивного катарактогенеза). М.: Медицина,

2004. 244 с.

14. Яхно Т.А., Яхно В.Г., Санин А.Г. и др. // Журнал технической физики. 2004. Т. 74. Вып. 8. С. 100-108.

15. Колединцев М.Н. Автореф. ... дисс. д-ра мед. наук. М.: МНТК «Микрохирургия глаза», 2005.

16. Громова И.П. // Гигиена и санитария. 2005. № 2. С. 66-69.

17. Kitamura M., Ueno S., Sato K. Molecular aspects of the polymorphic crystallization of amino acids and lipids / Ed. H. Othaki. Crystallization processes. Chichester: John Wiley and Sons, 1998. Vol. 3. P. 99.

18. Deegan R.D. // Phys. Rev. E. 2000. Vol. 61. P. 475.

19. Залесский М.Г., Эммануэль В.Л., Краснова М.В. // Клиническая лабораторная диагностика. 2004. № 8. С. 20-24.

20. Мартусевич А.К. // Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 9. С. 4-5.

21. Воробьев А.В., Мартусевич А.К., Перетя-гин С.П. Кристаллогенез биологических жидкостей и субстратов в оценке состояния организма. Нижний Новгород: ФГУ «ННИИТО Росмедтехнологий», 2008. 384 с.

22. Мартусевич А.К., Зимин Ю.В. // Вестник новых медицинских технологий. 2008. Т. XV. № 1. С. 14-17.

23. Martusevich A.K. Crystallobiology as nanodiagnostics and nanotherapy direction // Proc. of International Symposium «Biological motility: achievement and perspectives». Pushchino, 2008. Vol. II. P. 306-310.

24. Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф. // Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 6. С. 21-24.

25. Мартусевич А.К. Количественная оценка результата свободного и инициированного кристалло-генеза биологических субстратов: Учебное пособие. Нижний Новгород: ФГУ «ННИИТО Росмедтехноло-гий», 2008. 28 с.

26. Обухова Л.М. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2008. № 2. С. 103-106.

27. Обухова Л.М., Конторщикова К.Н. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2008. № 3. С. 116-119.

28. Мартусевич А.К., Камакин Н.Ф. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т. 143, № 3. С. 358-360.

29. Савина Л.В. // Клиническая лабораторная диагностика. 1999. № 11. С. 48.

30. Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. // Лаборатория. 1999. № 4. С. 3-5.

31. Камакин Н.Ф., Мартусевич А.К. О вариантах выполнения хромокристаллографии биологических жидкостей организма человека // В кн.: Профессионализм и образование: Мат. научно-практической конференции. Кирово-Чепецк, 2005. С. 65-72.

32. Мартусевич А.К., Зимин Ю.В., Норенко-ва Н.В. // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2008. № 2-3. С. 72.

33. Martusevich A.K., Kvitsinskaya N.A., Bochkareva A.V. et al. // Bulletin of International Scientific Surgical Association. 2008. Vol. 3. № 1. P. 72-73.

34. Залесский М.Г. // Вестник новых медицинских технологий. 2005. Т. XII. № 2. С. 93-94.

35. Залесский М.Г., Гетлинг А.В. // Вестник новых медицинских технологий. 2005. Т. XII. № 3-4. С. 43-45.

36. Дерябина Н.И., Залесский М.Г. // Вестник новых медицинских технологий. 2005. Т. XII. № 1. С. 85-87.

37. Мартусевич А.К. // Технологии живых систем. 2008. Т. 5, № 2-3. С. 4-15.

38. Annarelli C., Fornazero J., Bert J. et al. // Eur. Phys. J. E. 2001. Vol. 5. P. 599-603.

39. Annarelli C., Reyes L., Fornazero J. et al. // Cryst. Eng. 2000. Vol. 3, № 3. P. 173-194.

40. Мартусевич А.К., Соловьева А.Г. // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН и АВО. 2008. № 3. C. 46-47.

41. Мартусевич А.К. // Информатика и системы управления. 2008. № 2. С. 145-148.

42. Мартусевич А.К. Биокристалломика как новая наука о биогенных кристаллах // Тез. докл. V Международной науч. конф. «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация для нанотехнологий, техники и медицины». Иваново, 2008. С. 215.

CHROMOCRYSTALLOSCOPY AS A METHOD OF MODERN BIOCRYSTALLOMICS: ESSENCE, ROLE AND PROSPECTS

A.K. Martusevich, A. V. Vorobyov, N.F. Kamakin, Yu. V. Zimin

The general notion of biocrystallomics as a synthetic science of biogenic crystals is given together with the description of its initial stages of formation, development and current state. Biocrystalloscopy methods are classified on the basis of published materials and authors’ own studies and the place of chromocrystalloscopy (a method, based on cocrystallization of bio-substrates and tinctorial substances) among them is pointed out. Possible options, peculiarities and prospects for the use of this method are considered in detail. Potential application areas of chromocrystalloscopy are identified. Some possible pitfalls of the method and the ways to overcome them are specified on the basis of authors’ own data and critical analysis of those published elsewhere.