СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АЛЛЕРГЕНА ИЗ ПЫЛЬЦЫ РАСТЕНИЙ
METHOD FOR MAKING DIAGNOSTIC ALLERGEN OF PLANT POLLEN

Изобретение относится к фармакологии и медицине, конкретно к способу получение диагностического аллергена из пыльцы золотарника канадского.
Известен способ получения аллергена из растительного сырья, в качестве которого используют пыльцу различных трав и деревьев
(RU заявка №2005120017/15, А61K 9/00, 2006 г.).
Наиболее близким является способ получения аллергена путем химической модификации водно-солевых экстрактов пыльцы тимофеевки, полыни, березы
(RU 2205661, А61K 39/36,2003 г.).
В последнее время в средней полосе РФ отличают высокую сенсибилизацию к растению семейства сложноцветных - золотарнику канадскому. По результату последних эпидемиологических исследований в мире 10% детского и 20-30% взрослого населения страдает поллинозом. Чаще всего обнаруживается сенсибилизация к злаковым травам, пыльце деревьев и к растениям семейства сложноцветных.
Задачей изобретения является получение аллергена для диагностики повышенной чувствительности к пыльце золотарника канадского. Полученный аллерген можно использовать как для постановки кожных проб у пациентов, так и для использования в реакциях in vitro. Коммерческого аллергена из пыльцы золотарника в нашей стране нет. Поэтому разработка технологии этого препарата позволит проводить диагностику повышенной чувствительности к пыльце золотарника.
Технически результатом изобретения является расширение номенклатуры диагностических аллергенов и создание высокоэффективного препарата для диагностики заболеваний, вызванных сенсибилизацией к пыльце золотарника канадского.
Для достижения указанного технического результата в способе получения диагностического аллергена из пыльцы растений, включающем водно-солевую экстракцию исходного сырья, согласно изобретению в качестве исходного сырья используют пыльцу золотарника канадского, предварительно обезжиренную этиловым эфиром и высушенную, экстрагирование обезжиренной и высушенной пыльцы золотарника канадского проводят жидкостью Эванс-Кока в течение трех суток с ежедневным встряхиванием при температуре 15-26°С трижды по 30-40 минут с интервалом 1-1,5 часа, в интервалах между встряхиваниями материал поддерживают при температуре 4-8°С, после экстрагирования надосадочную жидкость сливают и проводят центрифугирование при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 минут с последующим фильтрованием через бумажный фильтр, затем осуществляют стерилизующую фильтрацию, стабилизацию маточного раствора аллергена в течение 1-3 месяцев и разведение маточного раствора аллергена до получения готовой формы диагностического аллергена.
Изобретение иллюстрируется на следующих примерах.
Пример 1. Для получения диагностического аллергена в качестве исходного сырья используют пыльцу золотарника канадского. Обезжиривание сырья производят этиловым эфиром. Полностью обезжиренное сырье рассыпают на эмалированные лотки с фильтровальной бумагой и сушат в вытяжном шкафу. Обезжиренное сырье помещают в бутыль и заливают экстрагирующей жидкостью Эванс-Кока в соотношении 3:100 г/мл. Экстрагирование проводят в течение трех суток в режиме: ежедневно содержимое бутыли перемешивают на аппарате для встряхивания при температуре 15°С по 30 минут и интервалом 1 час. Остальное время в холодильной камере с температурой 4°С. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр. Ежедневно контролируют рН раствора и проводят коррекцию рН до значения 7,0±0,2 добавлением 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты.
После окончания экстрагирования надосадочную жидкости сливают и осуществляют центрифугирование при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 мин с последующей фильтрацией через бумажный фильтр.
Проводят стерилизующую фильтрацию, при этом необходимо проведение контроля рН приготовленного препарата аллергена.
Стабилизация маточного раствора. Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических и биологических свойств выдерживают в течение 1-3 месяцев при температуре от 4 до 8°С. В тех случаях, когда содержание белкового азота в маточном растворе аллергена превышает 10000±2000 PNU/мл, маточный раствор аллергена в период стабилизации разводят стерильной экстрагирующей жидкостью.
После разлива аллергена получают готовую форму препарата.
Пример 2. Для получения диагностического аллергена в качестве исходного сырья используют пыльцу золотарника канадского. Обезжиривание сырья производят этиловым эфиром. Полностью обезжиренное сырье рассыпают на эмалированные лотки с фильтровальной бумагой и сушат в вытяжном шкафу. Обезжиренное сырье помещают в бутыль и заливают экстрагирующей жидкостью Эванс-Кока в соотношении 3:100 г/мл. Экстрагирование проводят в течение трех суток в режиме: ежедневно содержимое бутыли перемешивают на аппарате для встряхивания при температуре 26°С по 40 минут и интервалом 1,5 часа. Остальное время в холодильной камере с температурой 8°С. Полученный экстракт фильтруют через бумажный фильтр. Ежедневно контролируют рН раствора и проводят коррекцию рН до значения 7,0±0,2 добавлением 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия или 0,1 моль/л раствора соляной кислоты.
После окончания экстрагирования надосадочную жидкости сливают и осуществляют центрифугирование при 5000-6000 об/мин в течение 30-40 мин с последующей фильтрацией через бумажный фильтр.
Проводят стерилизующую фильтрацию, при этом необходимо проведение контроля рН приготовленного препарата аллергена.
Стабилизация маточного раствора. Стерильный раствор аллергена для стабилизации физических и биологических свойств выдерживают в течение 1-3 месяцев при температуре от 4 до 8°С. В тех случаях, когда содержание белкового азота в маточном растворе аллергена превышает 10000±2000 PNU/мл, маточный раствор аллергена в период стабилизации разводят стерильной экстрагирующей жидкостью.
После разлива аллергена получают готовую форму препарата.
Полученный препарат изучали с помощью методов, позволяющих оценить его физико-химические свойства, а также специфическую активность.
При проверке безвредности аллергена на белых мышах установлено, что доза препарата, которую им вводили (0,5 мл), была в 10000 раз больше дозы, применяемой при постановке скарификационных проб людям, но гибели мышей не отмечали.
Приготовленные серии аллергенов испытывали на стабильность. Препараты хранили при температуре от 4 до 8°С. Определение содержания белка и оценку физических свойств проводили через 1, 1,5, и 2 года. Препараты аллергенов не изменяли физические свойства при хранении более двух лет.
Работа по воспроизведению анафилактического шока проведена на морских свинках. Предварительно на контрольной группе интактных животных была определена максимальная доза аллергена из пыльцы золотарника, которая не оказывала токсического действия. Индекс Вейгла для аллергена из пыльцы составил 1,9. У большинства животных наблюдались слабоположительные реакции на введение разрешающей дозы аллергена.
Специфическую активность аллергенов из пыльцы золотарника оценивали методом твердофазного ИФА и в реакции НДТК. Реакция дегрануляции тучных клеток крыс поставлена с 20 сыворотками пациентов, страдающих поллинозом. При постановке опытов с аллергеном из пыльцы растения: 5% сывороток пациентов дали выраженную реакцию, 35% - слабовыраженную реакцию. В реакции ИФА IgE-AT к аллергену из пыльцы золотарника обнаружены у 35±6,3% пациентов.
Анализ фракционного состава аллергенного экстракта, полученного из пыльцы золотарника, проводили методом вертикального электрофореза в 15% полиакриламидном геле. Результаты электрофотометрического разделения показали, что исследуемый препарат гетерогенен. Электрофоретическое разделение аллергена из пыльцы золотарника позволило определить 4 основные белковые группы данного препарата. Первая высокомолекулярная фракция от 90 кДа и выше, далее следует фракция от 45 до 65 кДа, третья белковая фракция от 25 до 32 кДа и наконец низкомолекулярная 16 кДа и ниже.
Сравнение проводили с коммерческим препаратом из пыльцы амброзии. Высоко- и низкомолекулярные фракции этого аллергена находились примерно в тех же пределах, что и у препарата из пыльцы золотарника. Однако, по литературным данным, самые аллергенные компоненты пыльцы амброзии представлены белками с молекулярной массой 37-38 кДа.
Полученный препарат был изучен в соответствии с «Методическими указаниями к первичной экспериментально-клинической апробации новых форм аллергенов». Таким образом, получен препарат аллерген из пыльцы золотарника канадского, не вызывающий сенсибилизации животных к диагностической дозе препарата, обладающий специфической активностью.