Determination of Glutathione and Its Redox Status in Isolated Vacuoles of Red Beetroot Cells

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 12 No. 1 2016, pp. 87-107 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2016 by Pradedova, Nimaeva, Putilina, Semenova, Sobenin and Salyaev

ORIGINAL ARTICLE

Determination of Glutathione and Its Redox Status in Isolated Vacuoles of Red Beetroot Cells

E.V. Pradedova*, O.D. Nimaeva, T.E. Putilina, N.V. Semenova, A.M. Sobenin, R.K. Salyaev

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Irkutsk, Russia *E-Mail: praded@sifibr.irk.ru

Received January 20, 2016

The glutathione of the red beetroot vacuoles (Beta vulgaris L.) was measured using three well-known methods: the spectrofluorimetric method with orthophthalic aldehyde (OPT); the spectrophotometric method with 5.5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB); the high-performance liquid chromatography (HPLC). The content of reduced (GSH) and oxidized glutathione (GSSG) differed depending on the research method. With OPT the concentration of glutathione was: GSH - 0.059 pmol /mg protein; GSSG - 0.019 pmol/mg protein and total glutathione (GSHtotal) - 0.097 pmol/mg protein. In the case of determining with DTNB the concentration of glutathione was: GSH - 0.091 pmol/mg protein; GSSG - 0.031 pmol/mg protein; GSHtotal - 0.153 pmol/mg protein. HPLC-defined concentration of glutathione was lower: GSH - 0.039 pmol/mg protein; GSSG - 0.007 pmol/mg protein; GSHtotal - 0.053 pmol/mg protein. Redox ratio of GSH/GSSG was also dependent on the method of determination: with OPT - 3.11; with DTNB - 2.96 and HPLC - 5.57. Redox ratio of glutathione in vacuoles was much lower than the tissue extracts of red beetroot, which, depending on the method of determination, was: 7.23, 7.16 and 9.22. The results showed the vacuoles of red beetroot parenchyma cells contain glutathione. Despite the low value of the redox ratio GSH/GSSG, in vacuoles the pool of reduced glutathione prevailed over the pool of oxidized glutathione.

Key words: Beta vulgaris L., vacuole, glutathione

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

88

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

Редокс-система глутатиона вызывает большой концентрации (Queval et al., 2011). На

интерес и всесторонне изучается не только у сегодняшний день установлен избирательный

человека и животных, но и растений. Изменение транспорт глутатиона в вакуоль посредством ABC-

активности этой системы служит критерием транспортеров тонопласта, которые

отклонения от физиологической нормы при преимущественно транспортируют окисленный

патологических состояниях (Arrigo,1999; Forman et глутатон (GSSG). Этот факт позволил

a/., 2008). Количество глутатиона и его редокс- предположить, что центральная вакуоль вносит

состояние являются показателями устойчивости существенный вклад в поддержание высокого

организма к действию срессирующих факторов редокс-соотношения глутатиона (GSH/GSSG) в

биотической и абиотической природы (Agrawal et цитозоле (Coleman et al., 1997; Dixon et al., 1998;

a/., 1992; Dixon et a/., 1998). Однако органы и ткани Zechmann, MCiller, 2010; Noctor et al., 2011).

многоклеточных организмов различаются Несмотря на многочисленные исследования

содержанием глутатиона. Согласно данным функций глутатиона, его компартментация в

литературы, в растениях основной пул глутатиона растительных клетках изучена недостаточно. Мало

сосредоточен в фотосинтезирующих и запасающих информации о пуле вакуолярного глутатиона.

органах (Noctor et al., 2011). В самих клетках Более полное представление о содержании и

глутатион тоже распределен неравномерно по редокс-статусе глутатиона в вакуолях можно

внутриклеточным структурам. В клетках растений получить при изучении разных тканей у растений,

относительно большие концентрации глутатиона находящихся в различных условиях существования.

выявлены в цитозоле, хлоропластах и Целью настоящего исследования явилось

митохондриях. Известно, что в растительной клетке определение глутатиона в вакуолях клеток

запасающую функцию выполняет центральная покоящихся корнеплодов столовой свеклы (Beta

вакуоль. Можно было бы ожидать накопление vulgaris L.). Основная ткань корнеплода -

глутатиона в этом компартменте, но его запасающая паренхима, в клетках которой вакуоль

присутствие в вакуоли до сих пор вызывает занимает 90% клеточного объема. В период

сомнение и, по мнению некоторых исследователей, физиологического покоя корнеплод подвержен

является тканеспецифичным или действию низких температур и других

видоспецифичным (Noctor et al., 2011). Однако стрессирующих факторов. Особенности

отмечено, что на компартментацию глутатиона в исследуемого объекта, а также литературные

клетках растений заметное влияние оказывают данные, указывающие на аккумуляцию глутатиона

факторы среды. В некоторых случаях в стрессовых в запасающих тканях и компартментацию в

условиях глутатион накапливался в вакуолях, что приводило к многократному повышению его вакуолях при стрессе, послужили основанием для

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

89

предположения, что в вакуолях корнеплода может содержаться глутатион в относительно высоких концентрациях. С помощью трех различных методов (спектрофлуориметрического,

спектрофотометрического и хроматографического) была предпринята попытка определить во фракциях изолированных вакуолей содержание глутатиона и соотношение его восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) пулов.

MATERIALS AND METHODS

Выделение вакуолей

Корнеплоды столовой свеклы (Beta vulgaris L.) хранили при 4°С. Из тканей корнеплодов выделяли вакуоли с помощью модифицированного макрообъемного метода (Salyaev et al., 1981). Фракцию изолированных вакуолей дополнительно очищали от примесей органелл (пластид, ядер) и клеточных стенок в ступенчатом градиенте плотности сахарозы-KCl (1.050-1.080-1.145-1.180 г/см3). Растворы разной удельной плотности для градиента готовили, смешивая два матричных раствора: 1 М KCI и 1.8 М сахароза (20 мМ трис-HCl, рН 7.4) (Salyaev et al., 1981). Градиент центрифугировали в течение 20 мин при 125 g. Фракцию вакуолей отделяли и наблюдали с помощью светового микроскопа NU-2E («Carl Zeiss», Германия). Чистоту вакуолярных фракций контролировали биохимическими методами: определяли ДНК (маркер ядер, пластид и митохондрий) и активность маркерных ферментов (NADP- и NAD-малатдегидрогеназы и др.) (Edwards et al., 1985; Levites, 1986).

Стандартная операция экстракции глутатиона

из анализируемого образца

Проводили «кислотную экстракцию». Для этого фракции изолированных вакуолей шокировали в охлажденном растворе для экстракции (5% метафосфорная кислота, 1 мМ EDTA, 0.1% муравьиная кислота), в соотношении 1 : 2 (объем органелл : объем раствора).

В тканях корнеплодов также определяли глутатион. Ткань гомогенизировали в этом же растворе в соотношении 1 : 5 (масса : объем) (Rellan-Alvarez et al., 2006). Экстракты

центрифугировали при 13500 g в течение 15 мин при 4°С.

Нестандартная операция экстракции глутатиона из анализируемого образца

Фракции изолированных вакуолей в

соотношении 1 : 1 (объем органелл : объем

раствора) шокировали в охлажденном

реакционном растворе: 100 мМ Na-фосфатный

буфера (рН 8.3), 5 мМ EDTA, 0.3 мМ NADPH, 0.02

МЕ глутатионредуктазы пекарских дрожжей (GR).

Ткань корнеплода свеклы гомогенизировали в этом

же реакционном растворе в соотношении 1 : 1

(масса ткани : объем раствора). В присутствии

NADPH и GR в вакуолях и гомогенате

восстанавливался окисленный глутатион

до восстановленной формы (GSH). Для

эффективного восстановления образцы

инкубировали 15 мин. Затем проводили «кислотную

экстракцию», как описано выше.

Спектрофлуориметрический метод

определения глутатиона

Метод основан на взаимодействии о-фталевого

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

90

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

альдегида (OPT) с SH-группой GSH, в результате образцы добавляли 2 мМ DTT, ME или NEM,

формируется флуоресцентный конъюгат (Hissin et инкубировали 15 мин, затем вносили 4 мкг/мл OPT

a/., 1976; Agrawal et al., 1992). Определенное и проводили измерение, как описано выше.

количество экстракта, помещали в реакционный Полученные результаты выражали в условных

раствор: 100 мМ Na-фосфатный буфер (рН 8.0), 5 единицах, которые представляли отношение

мМ EDTA, 4 мкг/мл OPT. После 15-мин инкубации величин оптической плотности к молярной

при комнатной температуре проводили измерения концентрации исследуемой аминокислоты.

на спектрофлуориметре «RF-5301 PC» Определение аминокислот

(«Shimadzu», Япония) при длине волны экстинкции В образцах вакуолей и тканевого экстракта

350 нм и эмиссии 420 нм. Сульфгидрильные определяли содержание аминокислот. Измерение

группы GSH экранировали с помощью тиолового проводили согласно протоколу на автоматическом

реагента N-этилмалеимида (NEM), который анализаторе аминокислот ААА 339 (Чехия).

добавляли к экстракту в конечной концентрации 2 Спектрофотометрический метод определения

мМ (Hissin et al., 1976). глутатиона

Для определения общего или суммарного Метод основан на взаимодействии 5.5'-

глутатиона (GSH + GSSG) к образцам добавляли дитиобис-2-нитробензойной кислоты (DTNB) с SH-

аликвоту раствора 100-мМ Na-фосфатного буфера группой GSH (Tietze, 1969). В результате реакции

(рН 8.0) с 2 мM дитиотрейтола (DTT) или 2- образуется хромофор 5-тио-2-нитробензойная

меркаптоэтанола (ME). Эта процедура позволяла кислота (TNB) с максимумом оптической плотности

восстановить дисульфидные группы GSSG при 412 нм (Anderson, 1985). Для определения

экстракцию», как описано выше, и последующее использовали реакционную среду, содержащую

измерение GSH с OPT. 100 мМ Na-фосфатный буфер (рН 8.3 или 9.2), 5

Учитывая разведение, рассчитывали мМ EDTA, 6 мМ DTNB, 0.3 мМ NADPH, в которую

концентрацию глутатиона по калибровочной вносили образец. Реакцию запускали, добавляя

кривой, построенной для стандартных 0.02 МЕ GR дрожжей, и после 3-мин инкубации

концентраций химически чистого GSH. регистрировали образование TNB на

Исследование взаимодействия аминокислот с спектрофотометре «SPECORD S100» («Analytik

о-фталевым альдегидом Jena», Германия) при длине волны 412 нм или

Готовили образцы на основе 100-мМ Na- планшетном фотометре «ImmunoChem-2100»

фосфатного буфера (рН 8.0). Они содержали 100 («High Technology», США) при длине волны 405 нм

мкМ химически чистых аминокислот: цистин; (Smith et al., 1984). Для предотвращения

глутаминовая кислота; глицин и гистидин. В эти специфичного взаимодействия DTNB с SH-

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

91

группами GSH в образцы добавляли тиоловые хроматографирования - градиент 10 мин от 5 до

реагенты NEM (2 мМ) или 2-винилпиридин (2%). В 100% CH3CN. Учитывая разведение, рассчитывали

том случае, когда определяли GSSG, в образцы концентрацию глутатиона по калибровочной

добавляли 2-винилпиридин (2%), затем проводили кривой, построенной для стандартных

такое же измерение, как для GSH^ (Smith et al., концентраций химически чистых GSH и GSSG.

1984). Концентрацию глутатиона рассчитывали с Условные единицы, в которых выражали

помощью калибровочной кривой, построенной для концентрацию глутатиона

стандартных концентраций химически чистого Содержание глутатиона в образцах выражали в

GSH или с помощью коэффициента экстинкции мкмолях или нмолях GSH на мг белка. Последний

для GSH (£412=13.6 мМ-1см-1) (Ellman, 1959). определяли по методу Bredford (1976) или методу

Метод высокоэффективной жидкостной Shafner с соавт. (1973).

хроматографии Используемые реактивы

После «кислотной экстракции» проводили Хлористый калий, сахароза, натрий

пробоподготовку методом твердофазной фосфорнокислый двузамещенный, метанол,

экстракции на картриджах Sep-Pak С18 (Rellan- этанол, соляная и муравьиная кислоты были

Alvarez et al., 2006). Предварительно картриджи отечественного производства, квалификации х.ч.

промывали концентрированным метанолом (5 мл), Остальные перечисленные выше реактивы также

затем 0.5% муравьиной кислотой (5 мл). После соответствовали квалификации х.ч. и были

подготовки на картриджи наносили образцы. произведены фирмой «Sigma» (США).

Затем картриджи промывали деионизованной Статистический анализ

водой, подкисленной муравьиной кислотой, и Все эксперименты выполняли в 4-5

проводили элюирование раствором, содержащим биологических повторностях, каждая из которых

5-% метанол и 0.5-% муравьиную кислоту. Элюат была представлена тремя аналитическими. В

выпаривали на роторном испарителе «IKA RV 10 таблицах и графиках приведены средние

basic» («WENK LabTec GmbH», Германия), арифметические значения и их стандартные

полученный экстракт растворяли в заданном отклонения. Достоверность различий оценивали по

объеме 50% метанола. Измерения проводили на критерию Стьюдента.

жидкостном микроколоночном хроматографе RESULTS

«Милихром А-02» (Россия): колонка 2х75 мм; В вакуолях, изолированных из клеток

сорбент ProntoSil 120-5-С18 AQ-0838 (обращено корнеплодов столовой свеклы, определяли

фазный); элюент А - 0,2 М LiClO4 и 0,005 М HClO4 глутатион с помощью трех широко используемых

в H2O; элюент Б - CH3CN; Т=40°С; т=0,34; А=210 методов. Содержание и редокс-состояние

нм, и=100 мкл/мин; градиентный режим вакуолярного глутатиона сравнивали с

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

92

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

содержанием и редокс-состоянием глутатиона

тканевого экстракта корнеплода.

Определение с помощью

спектрофлуориметрического метода с о-фталевым альдегидом

На растворах химически чистого глутатиона проводили апробирование метода с OPT. Для этого готовили 1-мМ растворы GSH и GSSG (Рис.1). Специфичность взаимодействия OPT с SH-группой проверяли с помощью тиолового реагента - NEM (Pastore et a/., 2003; Forman et a/., 2008; Ranawat, Bansal, 2009). NEM, образующий устойчивую связь с SH-группой, препятствует взаимодействию OPT с GSH (Рис. 1).

Для восстановления SH-групп, а в нашем случае сульфгидрильных групп дисульфидной формы GSSG, при анализе с OPT некоторые авторы рекомендуют применять ME или DTT (Agrawal et al., 1992). В результате восстановления этими соединениями 1 мМ GSSG следует ожидать 2 мМ GSH, так как из одной молекулы GSSG образуется две молекулы GSH. ME или DTT в конечной концентрации 2 мМ добавляли к образцам 1-мМ GSSG. Результаты показали, что оба соединения восстанавливали GSSG, но более эффективным был DTT. В его присутствии в растворах 1-мМ GSSG в среднем определяли 1.8 мМ GSH, что несколько отличалось от ожидаемой концентрации - 2 мМ (Рис. 1).

Убедившись в специфичности метода с OPT и верности расчетов, сделанных на основе калибровочной кривой, построенной для химически чистого GSH, мы провели исследование на

изолированных вакуолях и экстрактах ткани. В вакуолях был выявлен GSH. Его концентрация незначительно отличалась от концентрации глутатиона тканевого экстракта (Рис. 2А). Если пробы прединкубировали с NEM, то вопреки ожиданию, протекала слабо выраженная реакция, которую не наблюдали в случае с растворами химически чистого GSH. По всей видимости, OPT неспецифично взаимодействовал с другими соединениями экстракта. С учетом этого эффекта в исследуемых образцах были определены концентрации GSH, которые представлены в таблице 1.

Когда образцы прединкубировали с DTT или ME, согласно процедуре, предложенной Agrawal с соавт. (1992), количество GSH возрастало на два порядка. Все указывало на неспецифичную реакцию используемых восстановителей и OPT с неустановленными соединениями экстрактов (Табл.1). Подобный эффект ранее описывали и другие исследователи (Scaduto, 1988).

Известно, что с помощью OPT определяют некоторые аминокислоты: глицин; триптофан и гистидин. Однако для визуализации реакций аминокислот с OPT требуются определенные условия, отличные от условий наших экспериментов (Dawson et al., 1986). Тем не менее, мы исследовали аминокислотный состав в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы и выявили разнообразные свободные аминокислоты, в том числе входящие в состав глутатиона глицин, глутамат и цистеин (находился в окисленном состоянии в виде цистина), а также гистидин

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

93

(Табл. 2). Предстояло установить, могут ли экстракцию» глутатиона. В другие образцы

перечисленные свободные аминокислоты добавляли аликвоту охлажденного раствора

взаимодействовать с OPT в условиях нашего фосфатного буфера без GR и NADPH, и сразу

эксперимента. Для этого готовили 100-мкМ подвергали «кислотной экстракции».

растворы цистина, глицина, глутамата и гистидина. Концентрацию глутатиона рассчитывали, учитывая

В эти растворы вносили OPT и испытуемые разведение. Как показали результаты, количество

соединения. В отсутствие восстанавливающих GSH в образцах с GR заметно возрастало (Рис. 3).

агентов в растворах свободных аминокислот Оно представляло суммарное содержание

наблюдали слабую флуоресценцию (Табл. 3). глутатиона:

Однако с DTT и особенно с ME флуоресценция GSHCyM = GSH + 2GSH,

резко увеличивалась, что говорило о выраженных GSSG =

неспецифичных взаимодействиях между где: GS^h - общее содержание GSH и GSSG;

испытуемыми соединениями. Возможно, GSH - восстановленный глутатион; 2GSH - две

молекулы восстановленного глутатиона,

интенсивная флуоресценция, наблюдаемая в образованные при восстановлении GR одной

присутствии DTT и ME в образцах вакуолей и молекулы GSSG.

тканевого экстракта, была вызвана Концентрацию окисленного глутатиона

взаимодействием ряда аминокислот с тиоловыми рассчитывали по формуле 2. В образцах с

реагентами и OPT (Табл. 1). Несмотря на тиоловым реагентом NEM так же, как и в

способность ME и DTT восстанавливать химически предыдущих экспериментах отмечали

чистый GSSG в стандартных образцах, для неспецифичную реакцию, которую учитывали при

определения количества GSSG в растительных расчетах.

образцах, как показал наш опыт, эти соединения После определения концентраций GSH, GSSG

применять не следует. и GSHcj™, можно было установить редокс-

Другой распространенный подход для соотношение восстановленного и окисленного

определения GSSG основан на его пулов глутатиона (GSH/GSSG) и восстановленного

восстановлении до двух молекул GSH с помощью и суммарного пулов глутатиона

фермента глутатионредуктазы (GR) (Noctor et al., (Agrawal et al., 1992; Noctor et al., 2011). В

2011). Согласно методическому подходу Agrawal с результате у вакуолей соотношения GSH/GSSG и

соавт. (1992) в одни образцы сначала добавляли GSH/GSHcум, характеризующие редокс-статус

аликвоту раствора, содержащего фосфатный глутатиона, оказались заметно ниже, чем у

буфер, GR пекарских дрожжей и NADPH, затем тканевых экстрактов. Это было обусловлено

после непродолжительной инкубации при комнатной температуре проводили «кислотную высоким содержанием GSSG в вакуолях (Табл. 1).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

94

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

Определение глутатиона с помощью спектрофотометрического метода с реактивом Эллмана

На сегодняшний день метод с реактивом Эллмана является одним из наиболее используемых подходов для выявления глутатиона, несмотря на то, что он так же, как и метод с OPT, дает приблизительную оценку содержания глутатиона (Bielavski, Joy, 1986; Forman et a/., 2008). Этот метод основан на реакции GSH с DTNB, которую называют реактивом Эллмана. Следует отметить, что DTNB специфично связывается с SH-группами всех соединений, поэтому ее можно использовать для измерения как небелковых, так и белковых тиолов (Owens, Belcher, 1965).

Согласно методическому протоколу в «кислых экстрактах», из которых удалены белки, с помощью DTNB определяют суммарные небелковые тиолы. В ходе реакции DTNB взаимодействует с GSH, образуется конъюгат и анион 5-тио-2-нитробензойной кислоты (TNB). Предполагают следующую последовательность реакций (Pastore et a/., 2003):

GSH + ArSSAr ^ GSSAr + ArSH

ArSSG + GSH ^ GSSG + ArSH

где: GSH - восстановленный глутатион; GSSG

- окисленный глутатион; ArSSAr - DTNB; GSSAR

- конъюгат GSH и красителя; ArSH - TNB.

Таким образом, модификация одной сульфгидрильной группы сопровождается освобождением одного аниона TNB (Owens, Belcher, 1965; Pastore et a/., 2003).

Результаты экспериментов, проводимых с

химически чистым GSH, подтвердили высокую специфичность метода с DTNB, а также корректность наших расчетов (Рис. 4). Был отмечен стабилизирующий эффект на химически чистый GSH раствора MPA. Концентрация GSH в растворе MPA была несколько выше, чем в буферном растворе, что соотносилось с ранее полученными данными, согласно которым глутатион более стабилен в кислых условиях (Pastore et a/., 2003). Для экранирования SH-групп GSH использовали NEM. С NEM реакция практически не развивалась. Однако так же, как и в случае с OPT, происходило неспецифичное взаимодействие, которое в среднем составляло 5% от общей реакции без тиолового реагента (Рис. 4).

Для расчета концентрации GSH в образцах можно использовать как калибровочные кривые, так и коэффициент экстинкции для TNB (Ellman, 1959). Мы применили оба подхода при определении глутатиона в вакуолях и экстрактах ткани. Величины концентраций глутатиона в исследуемых образцах, рассчитываемые двумя способами, практически не различались (Рис. 5). В присутствии тиоловых реагентов NEM и 2-винилпиридина развивалась слабая

неспецифичная реакция. С NEM она была выше, чем с 2-винилпиридином. В дальнейшем для экранирования SH-групп применяли только 2-винилпиридин, в отличие от NEM, это соединение давало низкую неспецифичную реакцию и не подавляло активность GR.

Учитывая неспецифичное взаимодействие, получили величины концентраций, которые

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

95

представлены в таблице 4. Результаты показали препятствуют спонтанному окислению GSH во

довольно высокое содержание GSH в вакуолях, время пробоподготовки, проводится определение

которое всего лишь в 2 раза было ниже GSH^ с помощью рециклирующего анализа с GR и

содержания глутатиона в тканевом экстракте. NADPH (формулы 1-3) (Pastore et al., 2003). Далее

Количество GSSG также было относительно выполняется еще одна процедура, позволяющая

высоким (Табл. 4, Метод I). В целом концентрация определить GSSG, в ходе которой с помощью

глутатиона, определяемая с DTNB, оказалось тиолового реагента

выше, чем определяемая с OPT. Ранее при устраняется GSH (Forman et al., 2008). Затем

сравнении этих методов отмечали завышенные осуществляется каталитическое восстановление

величины концентраций с OPT и объясняли этот GSSG до 2GSH с помощью GR и NADPH (формулы

эффект более низкой специфичностью альдегида 4-6). Таким образом, в образцах определяются

(Scaduto, 1988). В нашем исследовании были GSH^ и GSSG, а содержание тиольной формы

получены противоположные результаты. GSH можно установить, если вычесть

Существенный недостаток методов с DTNB и концентрацию GSSG из концентрации GSH^.

OPT, состоит в том, что они не позволяют без Следует отметить, что рециклирующий метод не

дополнительных процедур выявлять GSSG. отличается высокой точностью из-за возможности

Согласно распространенному подходу после цикличных реакций, если в среде избыточное

«кислотной экстракции» с помощью количество GR и NADPH находятся длительное

рециркулирующего анализа следует: время (Pastore et al., 2003):

I. Определить суммарный восстановленный GSSG + NADPH2 ^ 2GSH + NADP,

глутатион GSH + ArSSAr ^ ArSSG + ArSH,

GSH + GSSG + NADPH2 ^ 3GSH + NADP

3GSH + 3ArSSAr ^ 3GSSAR + 3ArSH,

3ArSSG + 3GSH ^ 3GSSG + 3ArSH,

II. Определить окисленный глутатион, после где: GSH - восстановленный глутатион; GSSG

экранирования SH-групп GSH 2-винилпиридином - окисленный глутатион; ArSSAr - DTNB; ArSH -

GSSG + NADPH2 ^ 2GSH + NADP, (4) TNB; ArSSG - конъюгат GSH и TNB.

GSH + ArSSAr ^ GSSAR + ArSH, (5) Формулы 7 и 8 отражают повторное

ArSSG + GSH ^ GSSG + ArSH, (6) восстановление GSSG и взаимодействие с DTNB

где: GSH - восстановленный глутатион; GSSG - окисленный глутатион; ArSSAr - DTNB; ArSH - образовавшихся молекул GSH, которые уже

TNB; ArSSG - конъюгат GSH и TNB. вступали в реакцию с молекулами красителя. При

Весь метод включает следующие этапы. После наличии в среде избыточного количества NADPH и

«кислотной экстракции» с MPA, которая позволяет DTNB происходит циклическое восстановление

избавиться от белков, а кислые условия GSSG и образование большого количества TNB,

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

96

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

которое не соответствует реальному содержанию «Методом I». «Метод II» позволил избежать этап

GSH. Поэтому, согласно методическому протоколу, дериватизации GSH с 2-винилпиридином, а также

строго лимитируется время инкубации, оно не циклическое восстановление GSSG ферментом

должно превышает 5 мин (Pastore et a/., 2003). В GR, наблюдаемое при рециклирующем анализе

связи с этим считают, что анализ с DTNB дает «Метода I». Снижение величин GSSG привело к

довольно приблизительную оценку содержания снижению показателей редокс-состояния

GSSG (Bielavski, Joy, 1986; Forman et a/., 2008). глутатиона. Тем не менее, при сопоставлении

Действительно, концентрация GSSG, выявляемая данных, полученных разными способами, была

этим методом, оказалась довольно высокой, отмечена одна и та же закономерность. В тканевом

поэтому, как и в случае с OPT-методом, при экстракте концентрации GSH^ и GSH, а также

определении с DTNB применили другой подход. показатели редокс-состояния глутатиона, были

Вышеописанный способ обозначили как «Метод I», выше, чем во фракциях изолированных вакуолей.

а другой подход, о котором речь пойдет ниже, Определение глутатиона с помощью

обозначили как «Метод II». Если по «Методу I» хроматографического метода

инкубацию образцов с GR и NADPH проводили Высокоэффективная жидкостная

после «кислотной экстракции», то по «Методу II» - хроматография (HPLC) считается более

до «кислотной экстракции», так же как это было чувствительным и специфичным способом

описано для метода с OPT. Сначала одну часть определения веществ. Обратно-фазовая HPLC с

исследуемого образца инкубировали в среде с GR УФ-детекцией позволяет определять глутатион без

и NADPH (Wang, 1995), а затем с помощью MPA предварительной дериватизации и не требует

удаляли белок и вносимую GR. Далее в полученном восстановления GSSG (Vignaud et al., 2004) (Рис.

экстракте определяли GSH^. Одновременно 6).

другую часть анализируемого образца сразу Анализ проводили согласно методу, детали

подвергали «кислотной экстракции». На которого описали Rellan-Alvarez и соавт. (2006).

стандартных образцах химически чистого GSH Содержание GSH и GSSG рассчитывали по

была показана высокая стабильность калибровочным кривым, построенным для

сульфгидрильной формы глутатиона в кислых химически чистого глутатиона. Концентрацию

растворах MPA (Рис. 4). В полученных экстрактах GSHсум определяли, суммируя концентрации GSH и

определяли содержание GSH. Концентрацию 2GSSG. Полученные с помощью этого метода

GSSG в этом случае рассчитывали, вычитая величины концентраций GSH и GSH^ в вакуолях и

количество GSH из количества GSHсум (Табл. 4, тканевом экстракте оказались заметно ниже, чем

Метод II). В результате содержание GSSG величины концентраций, установленные методами

оказалось заметно ниже, чем при определении с OPT и DTNB (Табл. 1, 4 и 5). Однако содержание

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

97

GSSG в вакуолях также было относительно высоким, что повлияло на показатели редокс-состояния глутатиона, которые были относительно низкими (Табл. 5).

Таким образом, с помощью методов спектрофлуориметрии, спектрофотометрии и HPLC в вакуолях выявили глутатион. Концентрация вакуолярного глутатиона была лишь в 1.5-2.5 раза ниже концентрации GSH тканевого экстракта. При анализе разными способами соотношение

GSH/GSSG заметно варьировало, однако для вакуолей оно во всех случаях было намного ниже (3.11; 2.96; 6.94; 5.57), чем для экстрактов ткани (7.23; 7.16; 13.88; 9.22). Соотношение GSH/GSH^ у вакуолей также было ниже, чем у тканевого экстракта, и составляло: для вакуолей - 0.61; 0.59; 0.78; 0.74; для экстрактов ткани - 0.78; 0.78; 0.87; 0.82 (Табл. 1, 4, 5). Несмотря на то, что в вакуолях пул окисленного глутатиона был относительно высоким, пул восстановленного глутатиона значительно преобладал.

Figure 1. Исследование эффективности метода с о-фталевым альдегидом (OPT), проводимое с химически чистым глутатионом (Sigma). Готовили 1-мМ растворы GSH и GSSG. Для экранирования SH-групп вносили 2 мМ N-этилмалеимида (NEM), а для восстановления -SS-групп GSSG до SH-групп добавляли 2 мМ 2-меркаптоэтанола (ME) или 2 мМ дитиотрейтола (DTT).

Table 1. Содержание глутатиона в образцах, установленное с помощью метода с OPT

Образец Содержание глутатиона, мкмоль/мг белка

GSH GSSG GSHcум GSH/GSSG GSH/GSHcум GSH с ME GSH с DTT

Вакуоли 0.059 ±0.01 0.019± 0.003 0.097± 0.02 3.11 0.61 9.86±1.28 5.46±0.89

Экстракт ткани 0.094 ±0.01 0.013± 0.002 О о Ll о го -* о 1+ 7.23 0.78 4.91±0.69 4.66±0.54

Гце: GSHcyM - суммарное содержание глутатиона, равное GSH + 2GSSG; GSH с ME - проба с 2 мМ 2-меркаптоэтанола; GSH с DTT - проба с 2 мМ дитиотрейтола. Уровень значимости p < 0.05

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

98

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

Figure 2. Содержание GSH в образцах изолированных вакуолей и тканевого экстракта, определяемое с OPT: А - без восстановителей SH-групп; Б - с 2 мМ 2-меркаптоэтанола (ME) или 2 мМ дитиотрейтола (DTT). Специфичность реакции определяли с тиоловым реагентом N-этилмалеимидом (NEM) (2 мМ).

Figure 3. Определение суммарного глутатион с OPT. Контроль - пробы не инкубировали с глутатионредуктазой дрожжей; GR - пробы прединкубировали с глутатионредуктазой дрожжей в присутствии NADPH; NEM - пробы прединкубировали с NEM.

Table 2. Содержание аминокислот в анализируемых образцах

образец цистин, мкМ глицин, мкМ глутаминовая кислота, мкМ гистидин, мкМ

Вакуоли 0.768 0.819 4.155 0.387

экстракт ткани 0.504 0.213 3.639 0.381

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

99

Table 3. Взаимодействие аминокислот с OPT в условиях проводимого эксперимента

Образец с вносимым реагентом цистин, у.е. глицин, у.е. глутаминовая кислота, у.е. Гистидин, у.е.

контроль 0.755 0.381 0.846 0.373

NEM 0.224 0.228 0.253 0.297

ME 9.135 13.434 29.807 12.862

ME+NEM 8.948 3.082 19.199 2.471

DTT 4.726 3.027 9.025 3.844

DTT + NEM 0.422 0.887 1.092 1.946

Для проведения эксперимента брали: аминокислоты - 100 мкМ; NEM, ME, DTT - 2 мМ. Взаимодействие аминокислоты с о-фталевым альдегидом выражали в удельных единицах (у.е.), представляющих отношение оптической плотности и молярной концентрации исследуемой аминокислоты. Уровень значимости p < 0.001.

Figure 4. Оценка специфичности метода c DTNB. Готовили 1-мМ раствор химически чистого глутатиона в натрий-фосфатном буфере (GSH) или 5-% метафосфорной кислоте (GSH+MPA). Для экранирования SH-групп вносили 2 мМ N-этилмалеимида (NEM).

Figure 5. Содержание GSHoyM в вакуолях и экстракте ткани: (1) - рассчитанное по калибровочной кривой; (2) - с учетом коэффициента экстинкции для TNB. Реагенты, связывающие SH-группы NEM и 2-винилпиридин.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

100

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

Figure 6. Определение глутатиона методом HPLC с УФ-детекцией. Стандартные растворы GSH (1) и GSSG (2).

Table 4. Содержание глутатиона в образцах, установленное с помощью метода с DTNB

образец Содержание глутатиона, мкмоль/мг белка

Метод I инкубация с GR после «кислотной экстракции» Метод II прединкубация с GR до «кислотной экстракции»

GSH GSSG GSHcум GSH/ GSSG GSH/ GSHсум GSH GSSG GSHcум GSH/ GSSG GSH/ GSH^™

Вакуоли 0.091 ±0.013 0.031 ±0.007 0.153 ±0.027 2.94 0.59 0.118 ±0.023 0.017 ±0.003 0.152 ±0.028 6.94 0.78

Экстракт ткани 0.179 ±0.012 0.025 ±0.009 0.229 ±0.031 7.16 0.78 0.222 ±0.028 0.016 ±0.003 0.254 ±0.034 13.88 0.87

Где: GSHcyM - суммарное содержание глутатиона, равное GSH+2GSSG. Уровень значимости p < 0.05.

Table 5. Содержание глутатиона в образцах, установленное с помощью метода HPLC

Образец Концентрация глутатиона, мкмоль /мг белка

GSH GSSG GSHcум GSH/GSSG GSH/ GSH^

Вакуоли 0.039 ±0.009 0.007 ±0.001 0.053 ±0.011 5.57 0.74

Экстракт ткани 0.083 ±0.003 0.009 ±0.002 0.101 ±0.007 9.22 0.82

Статистически достоверны при p < 0.001

DISCUSSION

Содержание глутатиона в растении в значительной степени зависит от вида растения, типа исследуемой ткани, стадии развития, условий произрастания и отчасти от метода анализа (Noctor

et al, 2011). На сегодня разработаны разные методы для определения глутатиона, в их числе количественные методы для измерения в условиях in vitro на основе спектрофлуориметрического, спектрофотометрического анализа и HPLC, а

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

101

также методы для измерения в условиях in situ на данных с данными этих исследований

основе лазерной (конфокальной или концентрацию глутатиона в экстрактах ткани

двухфотонной) сканирующей микроскопии. Однако корнеплодов столовой свеклы пересчитали в

ни один из этих методов не предоставляет нмоль/г сырого веса. Результаты, полученные с

исчерпывающей информации (Noctor et al., 2011). помощью метода с DTNB, показали, что в

Дополнительные трудности при сравнении и корнеплодах столовой свеклы концентрация GSH

обобщении результатов создают единицы, в соответствовала 135.3 нмоль/г сырого веса, а

которых выражаются относительные концентрации GSSG - 6.2-10.9 нмоль/г сырого веса. А в случае

глутатиона. В связи с этим значительное определения методом HPLC с УФ-детекцией она

варьирование полученных данных для одного и была: для GSH - 61.5 нмоль/г сырого веса; для

того же объекта обусловлено не только GSSG - 6.8 нмоль/г сырого веса. При определении

ограничениями используемого метода, но и с DTNB концентрация глутатиона оказалась выше,

условными единицами, когда концентрацию тогда как при определении HPLC несколько ниже

глутатиона выражают на грамм сырого веса или концентраций GSH в корнеплодах сахарной

миллграмм белка, или на отдельную клетку либо свеклы. Наблюдаемые различия могут быть

целое растение. Поэтому у разных видов или обусловлены сортовыми качествами,

разных органов одного вида растений были особенностями используемых методов, а также

определены как десятки наномолей GSH на грамм разными стадиями развития и условиями

сырого веса или миллиграмм белка, так и произрастания растения. В нашем исследовании

миллимоли на отдельную клетку (Zaharieva, Abadia, корнеплоды находились в фазе покоя, тогда как

2003). корнеплоды сахарной свеклы - в фазе активного

Согласно данным литературы, в корнеплодах роста, при этом условия их выращивания в

Beta vulgaris (сахарной свеклы) содержание представленных работах заметно различались

глутатиона, определяемое спектрофотометри- (Zaharieva, Abadia, 2003; Rellan-Alvarez et al.,

ческим методом с DTNB, составило: для GSH - 2006).

28.7-46.1 нмоль/г сырого веса; для GSSG - 8.8-9.2 Довольно часто отмечали выраженную

нмоль/г сырого веса (Zaharieva, Abadia, 2003). А динамику в содержании глутатиона в зависимости

при определении глутатиона в том же объекте от стадии развития растения. Наибольшим

методом HPLC/масс-спектрометрии концентрация содержанием GSH характеризовались активно

глутатиона оказалась заметно выше и составила: фотосинтезирующие листья (Bielavski, Joy, 1986;

для GSH - 92.1 нмоль/г сырого веса; для GSSG - Matamoros et al., 1999; Dixit et al., 2001; Rellan-

46.1 нмоль/г сырого веса (Rellan-Alvarez et al., Alvarez et al., 2006; Requejo, Tena, 2012). К концу

2006б). Для более объективного сравнения наших вегетации у стареющих листьев количество

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

102

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

глутатиона снижалось, тогда как у запасающих тогда как в цитозоле - 3.0-3.5 мМ (Krueger et al.,

органов, наоборот, повышалось. Например, в 2009). Содержание вакуолярного глутатиона,

корнях и корневищах Picrorhiza kurroa концу установленное в диапазоне микромолярных

вегетации содержание глутатиона увеличивалось концентраций, согласуется с более ранними

практически в два раза (Gangola et al., 2013). В исследованиями (Rennenberg, 1982). В другом

период покоя повышение GSH (от 2 до 8 раз) случае, также у A. thaliana, в вакуолях клеток

происходило у хвойных и листопадных деревьев, листьев концентрация GSH составила 17.6 нмоль

что можно объяснить снижением метаболизма при на грамм сырого веса или 30 мкМ при окраске

воздействии низких температур (Siller-Cepeda et MCB. Вакуолярная концентрация GSH при

al., 1991). пересчете на объем органеллы была в среднем в

Следует отметить, что у покоящихся 100 раз меньшей, чем в других компартментах, и

корнеплодов столовой свеклы содержание GSH соответствовала 5.4% от суммарного содержания

оказалось высоким в вакуолях. В то же время, в глутатиона в клетке (Queval et al., 2011).

вакуолях не всех типов тканей удавалось Вычисленная с учетом занимаемого объема

определить GSH. Так, иммуногистохимическим концентрация глутатиона в вакуолях клеток

методом в вакуолях листьев (мезофилл и трихомы) мезофилла N. tabacum составила примерно 20 мкМ

и корней Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum и и соответствовала 17% от общего содержания

Cucurbita pepo либо не выявляли, либо определяли (Rennenberg, 1982). Изучались и другие растения.

незначительное количество GSH (Muller et al., Например, в протопластах, изолированных из

2004; Zechmann et al., 2006; Kolb et al., 2010; мезофилла листьев Hordeum vulgare, содержание

Zechmann, Muiller, 2010). Его отсутствие в вакуолях GSH и GSSG в вакуолях составляло от общего

объясняли возможной быстрой деградацией после содержания 0.9% и 12%, соответственно (Dietz et

транспортировки через тонопласт (MUller et al., al., 1992). Доля вакуолярного глутатиона,

2004; Kolb et al., 2010). Однако те же достигающая 30% от содержания глутатиона целой

исследователи показали GSH в вакуолях клеток- клетки, была определена при помощи безводного

спутниц флоэмы и паренхимных клеток сосудистых фракционирования листьев Pisum sativum

пучков (Zechmann, MUller, 2010). Интересно, что на (Klapheck et al., 1987).

этих же объектах другие исследователи выявляли При исследовании субклеточного

GSH в вакуолях. При безводном перераспределения глутатиона у мутантов A.

фракционировании листьев A. thaliana методом thaliana, дефицитных по каталазе (cat2), которые

HPLC после дериватизации монохлоробиманом испытывали окислительный стресс, отмечали

(MCB) концентрация GSH, определяемая в резкое повышение концентрации GSH в вакуолях: с

вакуолях, находилась в пределах 613-733 мкМ, 5.4%, от общего клеточного содержания в

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

103

контрольных растениях до 26% в опытных. Тогда объектов, довольно широко варьируют. Например,

как в других компартментах, таких как цитозоль, у протопластов Hordeum murianum они изменялись

митохондрии, пероксисомы и ядра, содержание в пределах от 0.62 до 3.81 (Andrzejewska, 2012). У

глутатиона резко снижалось (Queval et al., 2011). низших растений, в частности у Chlorogonium

Благодаря тому, что редокс-пара глутатиона elongatum, соотношение GSH/GSSG варьировало

является одной из наиболее избыточных в клетке, от 1.9 до 2.6 (Agrawal et al., 1992). Зерна разных

соотношение GSH и GSSG (GSH/GSSG) считают зерновых культур отличались содержанием

важным критерием в оценке метаболической глутатиона и его редокс-состоянием, например,

активности и глубины стрессового состояния как GSH/GSSG составило для: Triticum aestivum - 6.8-

целого растения, так и компартментов клетки. 7.5; Hordeum vulgare - 4.6-5.5; Secale cereale - 4.8;

Довольно часто не абсолютную величину пула Avena sativa - 1.9; Fagopyrum esculentum - 11.1

глутатиона, а GSH/GSSG рассматривают, как один (Zielinski et al., 1999). Причину такой широкой

из самых важных факторов, контролирующих вариации величин GSH/GSSG видят как в

генную экспрессию и белковые функции, а также физиологических особенностях и онтогенетических

как важный индикатор редокс-окружения клетки изменениях, так и в адаптации к стрессовым

(Arrigo 1999; Schafer и Buettner 2001). Согласно воздействиям. В некоторых исследованиях

сложившемуся мнению, при определении и показана корреляция между высоким

сравнении устойчивости растений к стрессу, содержанием глутатиона, высоким GSH/GSSG

соотношение GSH/GSSG может быть более соотношением и устойчивостью растений к

важным показателем, чем количество GSH (Wang, неблагоприятным факторам среды. В листьях

1995). Это соотношение в вакуолях клеток растений Cucumis sativus, чувствительных к

корнеплодов в нашем исследовании варьировало в холоду, при пониженных температурах

зависимости от метода определения GSH, однако увеличивалось количество GSSG и не изменялось

оно всегда было меньше, чем у экстрактов ткани, содержание GSHсум, что приводило к снижению

что соотносится с представленными ранее GSH/GSSG соотношения, тогда как в листьях

результатами, свидетельствующими в пользу того, холодоустойчивых растений P. sativum

что у растений соотношение GSH/GSSG в вакуолях увеличивалось содержание не только GSSG, но и

поддерживается на невысоком уровне (Noctor et GSHcj™ (Wise and Naylor, 1987). В целом при

al., 2011). Что же касается тканей покоящихся изменении температурных условий у C. sativus

корнеплодов, то GSH/GSSG у них оказалось величины соотношения GSH/GSSG могли

довольно высоким (7.2; 13.9; 9.2). Следует изменяться от 7.5 до 1.5. Уровень GSH/GSSG

отметить, что величины GSH/GSSG, определяемые напрямую зависел от низкотемпературного

для клеток, тканей и органов разных растительных закаливания или генетически детерминированной

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

104

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

физиологической устойчивости. У растений, компартментах клетки, пул восстановленного

закаленных или устойчивых к пониженным глутатиона преобладает над окисленным. Низкие

температурам, величины GSH/GSSG при показатели редокс-состаяния глутатиона в

низкотемпературной экспозиции были значительно вакуолях свидетельствуют в пользу накопления или

выше (Wise and Naylor, 1987). интенсивного образования окисленного глутатиона.

Довольно часто, наряду с GSH/GSSG, для ACKNOWLEDGMENT

оценки редокс-состояния глутатиона используют Работа выполнена при поддержке Российского

другой показатель, который является отношением фонда фундаментальных исследований и

восстановленного глутатиона к суммарному Правительства Иркутской области, проект № 14-44-

глутатиону (GSH/GSHсум). Это соотношение также служит объективной мерой редокс-состояния 04059 р_сибирь_а.

глутатиона. При оптимальных условиях оно обычно REFERENCES

варьирует в пределах 0.9-0.95 (характерно для Agrawal S.B., Agrawal M., Lee E.H., Kramert G.F. and

листьев растений) (Noctor et al., 2011). Хотя в Pillai P. (1992) Changes in polyamine and

некоторых работах приводят и более низкие glutathione contents of a green alga,

значения. Например, у проростков Glycine max, в Chlorogonium elongatum (dang) france exposed

зависимости от условий, происходило to mercury. Environ. Exp. Botany, 32, 145-151.

варьирование этого показателя в пределах от 0.08 Andrzejewska R. (2012) Induction of glutathione s-

до 0.2 (Chen et al., 2009). tansferase and glutathione content by herbicide

Величины редокс-состояния (GSH/GSSG и and safener treatment in barley Hordeum

GSH/GSHj™) позволяют сопоставить результаты, murianum L. cells culture. Practical Aplications

определяемые разными методами на различных of Environmental Research, 12, 201-210.

растительных объектах, и получить представление Anderson M.E. (1985) Glutathione and Glutathione

об интенсивности редокс-процессов, которая Disulfide in Biological Samples. Methods

может изменяться в онтогенезе растения и при Enzymol., 113, 548-555.

воздействии факторов среды. Arrigo A.P. (1999). Gene expression and the thiol

Применяя разные методы, мы получили redox state. Free Radic. Biol. and Med., 27,

различные концентрации глутатиона. Тем не менее, 936-944.

результаты позволили сделать вывод о том, что в Bielavski W. and Joy K.W. (1986) Reduced and

вакуолях клеток запасающей паренхимы oxidised glutathione and glutathione-reductase

покоящихся корнеплодов столовой свеклы activity in tissues of Pisum sativum. Planta, 169,

присутствует глутатион в относительно высокой концентрации. В вакуолях так же, как и в других 267-272.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

105

Bradford M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Protein Utilising the Principal of Protein-dye Binding. Anal. Biochem., 72, 248254.

Chen L., Liu S.C., Gai1 J.Y., Zhu1 Y.L., Yang L.F. and Wei G.P. (2009) Effects of nitrogen forms on the growth, ascorbate-glutathione cycle and lipid peroxidation in developing seeds of vegetable soybean. Province African Journal of Agricultural Research, 4, 1178-1188.

Coleman J^.D., Blake-Kall M.M.A. and Davies T.G.E.

(1997) Detoxification of xenobiotics by plants: chemical modification and vascular compartmemation. Trends. Plant Sci., 2, 144151.

Dawson R.M.C., Elliot D.C., Elliott W.H. and Jones K.M. (1986) Data for biochemical research. Oxford: Oxford Science Publications, OUP, 580

p.

Dietz, K.-J., Brune A. and Pfanz H. (1992) Trans-Tonoplast Transport of the Sulfur Containing Compounds Sulfate, Methionine, Cysteine and Glutathione. Phyton., 32, 37-40.

Dixit V., Pandey V. and Shiam R. (2001) Differential antioxidative responses to cadmium in roots and leaves of pea (Pisum sativum L. cv. Azad). J. Exp. Botany, 52, 1101-1109.

Dixon D.P., Cummins L., Cole D.J. and Edwards G.E.

(1998) Glutathione-mediated detoxification system in plants. Curr. Opin. Plant Biol., 1, 258266.

Edwards G.E., Nakamoto H., Bunell J.N. and Hatch

M.D. (1985) Pyruvate, Pi dikinase and NADPmalate dehydrogenase in C4 photosynthesis: properties and mechanism of light/dark regulation. Annu. Rev. Plant Physiol., 36, 255-286.

Ellman G. (1959) Tissue sulfhydryl groups. Arc. Biochem. Biophys., 82, 70-77.

Forman H.J., Zhang H. and Rinna A. (2008) Glutathione: Overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis. Molecular Aspects of Medicine.

doi: 10.1016/j.mam.2008.08.006

Gangola M.P., Parkash J., Ahuja P.S. and Dutt S. (2013) Components of antioxidant system of Picrorhiza kurrooa exhibit different spatio-temporal behavior. Mol. Biol. Rep. doi: 10.1007/s11033-013-2772-3

Hissin P.J. and Hilf R. (1976) A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues // Anal. Biochem., 74, 214226.

Klapheck S., Latus C. and Bergmann L. (1987) Localisation of glutathione synthetase and of glutathione in leaf cells of Pisum sativum L. J. Plant Physiol., 101,131-123.

Kolb D., Muller M., Zellnig G. and Zechmann B. (2010) Cadmium induced changes in subcellular glutathione contents within glandular trichomes of Cucurbita pepo L. Protoplasma, 243, 87-94.

Krueger S., Niehl A., Lopez Martin M.C., Steinhauser D., Donath A., Hildebrandt T., Romero L.C., Hoefgen R., Gotor C. and Hesse H.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

106

Determination of Glutathione and Its Redox Status...

Analysis of cytosolic and plastidic serine acetyltransferase mutants and subcellular metabolite distributions suggests interplay of the cellular compartments for cysteine biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell Environ., 32, 349-367.

Levites E.V. (1986) Genetics of plant isozymes.

Nauka: Sibir. Dep., 144 p.

Matamoros M.A., Moran J.F., Iturbe-Ormaetxe I., Rubio M.C. and Becana M. (1999) Glutathione and homoglutathione synthesis in legume root nodules. Plant Physiol., 121,879-888.

Muller M., Zechmann B. and Zellnig G. (2004) Ultrastructural localization of glutathione in Cucurbita pepo plants. Protoplasma, 223, 213219.

Noctor G., Queval G., Mhamdi A., Chaouch S. and Foyer C.H. (2011) Glutathione. The Arabidopsis Book. Published By: The American Society of Plant Biologists URL:

http://www.bioone.org/doi/full/10.1199/tab.0142.

Owens C.W.I. and Belcher R.V. (1965) A Colorimetric Micro-Method for the Determination of Glutathione. Biochem. J., 94, 705-711.

Pastore A., Federici G., Bertini E. and Piemonte F. (2003) Analysis of glutathione: implication in redox and detoxification. Clinica Chimica Acta, 333, 19-39.

Queval G., Jaillard D., Zechmann B. and Noctor G. (2011) Increased intracellular H2O2 availability preferentially drives glutathione accumulation in vacuoles and chloroplasts. Plant Cell Environ., 34, 21-32.

Ranawat P. and Bansal M.P. (2009) Delineating the Molecular Mechanism behind Regulation of Spermatogenesis by Selenium: Involvement of Mitogen Activated Protein Kinase; JNK. Am. J. Biomed. Sci., 1,226-241.

Rellan-Alvarez R. Hernandez L.E., Abadia J. and Alvarez-Fernandez A. (20066) Direct and simultaneous determination of reduced and oxidized glutathione and homoglutathione by liquid chromatography-electrospray/mass spectrometry in plant tissue extracts. Anal. Biochem., 356, 254-264.

Rellan-Alvarez R., Ortega-Villasante C., Alvarez-Fernandez A., del Campo F. F. and Hernandez L.E. (2006) Stress Responses of Zea mays to Cadmium and Mercury. Plant and Soil., 279, 4150.

Rennenberg H. (1982) Glutathione metabolism and possible biological roles in higher plants. Phytochemistry, 21, 2771-2781.

Requejo R. and Tena M. (2012) Influence of glutathione chemical effectors in the response of maize to arsenic exposure. J. Plant Physiol., 169, 649-659.

Salyaev R.K., Kuzevanov V.Y., Khaptogaev S.B. and Kopytchuk V.N. (1981) Isolation and purification of vacuoles and vacuolar membranes from plant cells. Russ. J. Plant Physiol., 25, 1295-1305.

Scaduto R.I. (1988) Dithiothreitol and amino acids interfere with the fluorometric determination of glutathione with orthophthaldehyde. Anal Biochem., 174, 265-70.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

107

Schafer F.Q. and Buettner G.R. (2001) Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radio. Biol. Med, 30, 1191-1212.

Schaffner W. and Weissmann C. (1973) A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Anal. Biochem., 56, 502-514.

Siller-Cepeda J.H., Chen T.H.H. and Fuchigami L.H. (1991) High Performance Liquid Chromatography Analysis of Reduced and Oxidized Glutathione in Woody Plant Tissues. Plant Cell Physiol., 32, 1179-1185.

Smith I.K., Kendall A.C., Keys A.J., Turner J.C. and Lea P.J. (1984) Increased levels of glutathione in a catalase-deficient mutant of barley (Hordeum vulgare L.). Plant Sci. Lett., 37, 2933.

Tietze F. (1969) Enzymic Method for Quantitative Determination of Nanogram Amounts of Total and Oxidized Glutathione: Applications to Mammalian Blood and Other Tissues. Anal. Biochem., 27, 502-522.

Wang C.Y. (1995) Temperature Preconditioning Affects Glutathione Content and Glutathione Reductase Activity in Chilled Zucchini Squash. J. Plant Physiol, 145, 148-152.

Wise R.R. and Naylor A.W. (1987) Chilling-enhanced photooxidation. Evidence for the role of singlet oxygen and superoxide in the breakdown of pigments and endogenous antioxidants. Plant Physiol, 83, 278-282.

Vignaud C., Rakotozafy L., Falguieres A., Potus J. and Nicolas J. (2004) Separation and identification by gel filtration and high-performance liquid chromatography with UV or electrochemical detection of the disulphides produced from cysteine and glutathione oxidation. J. Chromatogr. A., 1031,125-133.

Zaharieva T.B. and Abadia J. (2003) Iron deficiency enhances the levels of ascorbate, glutathione, and related enzymes in sugar beet roots. Protoplasma, 221, 269-275.

Zechmann B. and MCiller M. (2010) Subcellular compartmentation of glutathione in dicotyledonous plants. Protoplasma, 246, 15-24.

Zechmann B., Zellnig G. and Muller M. (2006) Immunocytochemical localization of glutathione precursors in plant cells. J. Electron Microscopy, 55, 173-181.

Zielinski H., Honke J., Troszynska A. and Kozlowska H. (1999) Reduced-Oxidized Glutathione Status as a Potential Index of Oxidative Stress in Mature Cereal Grain. American Association of Cereal Chemists, 76, 944-948.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016