БЕСКЛЕТОЧНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

1. Способ получения лизата клеток для бесклеточного получения рибонуклеиновой кислоты (РНК), причем способ включает
(а) культивирование клеток до желаемой плотности клеток, причем клетки содержат по меньшей мере одну сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей нуклеазу, которая включает в себя узнаваемый протеазой сайт и связана с последовательностью, обеспечивающей попадание в периплазму, где по меньшей мере одна эндогенная рибонуклеаза генетически инактивирована или инактивируется с помощью направленного протеолиза в клетках;
(b) лизис клеток, полученных на стадии (а), с получением таким образом первого клеточного лизата, и
(c) инкубирование первого клеточного лизата в условиях, которые приводят к деполимеризации РНК, с получением таким образом первого клеточного лизата, содержащего нуклеозид-5'-монофосфаты.
2. Способ по п. 1, в котором промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей нуклеазу, является индуцируемым.
3. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий:
(d) культивирование клеток, которые включают (i) по меньшей мере одну сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей соответствующую протеазу, которая расщепляет узнаваемый протеазой сайт в нуклеазе, причем соответствующая протеаза соединена с последовательностью, обеспечивающей попадание в периплазму, (ii) по меньшей мере одну сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей нуклеотидкиназу, (iii) по меньшей мере одну сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей РНК-полимеразу, и (iv) сконструированную матрицу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей РНК, причем по меньшей мере одна эндогенная рибонуклеаза генетически инактивирована или инактивируется посредством направленного протеолиза в клетках; и
(e) лизис культивируемых клеток, полученных на стадии (d), с получением второго клеточного лизата.
4. Способ по п. 3, в котором по меньшей мере один из промоторов (d)(i), (d)(ii) или (d)(iii) является индуцируемым.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором нуклеаза выбрана из группы, состоящей из нуклеазы S1, NucA, PNPазы, РНКазы II, РНКазы III и РНКазы R.
6. Способ по любому из п.п. 1-5, в котором клетки содержат по меньшей мере одну эндогенную рибонуклеазу-мишень для протеазы и/или по меньшей мере одну хромосомную делецию в гене, кодирующем эндогенную рибонуклеазу.
7. Способ по п. 6, в котором по меньшей мере одна эндогенная рибонуклеаза выбрана из группы, состоящей из РНКазы III, РНКазы I, РНКазы R, PNPазы, РНКазы II, РНКазы Т, РНКазы Е и их комбинаций.
8 Способ по любому из пп. 1-7, в котором нуклеотидкиназа представляет собой нуклеозидмонофосфаткиназу.
9. Способ по любому из 8, в котором нуклеозидмонофосфаткиназа выбрана из группы, состоящей из уридилаткиназы, цитидилаткиназы, гуанилаткиназы и аденилаткиназы.
10. Способ по любому из пп. 1-7, в котором нуклеотидкиназа представляет собой нуклеозиддифосфаткиназу.
11. Способ по п. 10, в котором нуклеозиддифосфаткиназа выбрана из группы, состоящей из нуклеозидфосфаткиназы, пируваткиназы и полифосфаткиназы.
12. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере один эндогенный фермент, который разрушает полифосфат, генетически инактивируется в клетках.
13. Способ по п. 12, в котором по меньшей мере один из эндогенного (эндогенных) фермента(ов), обеспечивающих деградацию полифосфата, выбран из группы, состоящей из нуклеозидмонофосфатазы (так называемой 5'-нуклеотидазы), нуклеозиддифосфатазы, нуклеозидтрифосфатазы, нуклеозидтрифосфатфосфогиролазы и экзополифосфатазы.
14. Способ по любому из пп. 12 или 13, в котором клетки содержат по меньшей мере один служащий мишенью для протеазы фермент, обеспечивающий деградацию полифосфата, и/или по меньшей мере одну хромосомную делецию в гене, кодирующем фермент, обеспечивающий деградацию полифосфата.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором РНК-полимераза представляет собой ДНК-зависимую РНК-полимеразу.
16. Способ по п. 15, в котором ДНК-зависимая РНК-полимераза представляет собой Т7 РНК-полимеразу.
17. Способ по любому из пп. 15 или 16, в котором последовательность сконструированной ДНК-матрицы кодирует мРНК, содержащую дополнительные домены, соединенные шарнирной областью.
18. Способ по п. 17, в котором промотор представляет собой промотор Т7, и в котором транскрипционный терминатор Т7 расположен на 3'-конце последовательности, кодирующей мРНК, содержащей дополнительные домены, соединенные шарнирной областью.
19. Способ по любому из пп. 3-14, в котором клетки на стадии (d) содержат по меньшей мере две сконструированные нуклеиновые кислоты, причем каждая из них содержит промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей РНК-полимеразу, где одна из сконструированных нуклеиновых кислот кодирует ДНК-зависимую РНК-полимеразу и одна из сконструированных нуклеиновых кислот кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу.
20. Способ по п. 19, в котором ДНК-зависимая РНК-полимераза представляет собой Т7 РНК-полимеразу, и РНК-зависимая РНК-полимераза представляет собой Ф6 RdRP.
21. Способ по п. 20, в котором последовательность сконструированной ДНК-матрицы содержит промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей мРНК, содержащую единственный целевой домен.
22. Способ по п. 21, в котором промотор представляет собой промотор Т7, и в котором транскрипционный терминатор Т7 расположен на 3'-конце последовательности, кодирующей мРНК, содержащей единственный целевой домен.
23. Способ по любому из пп. 18-22, в котором спроектированная ДНК-матрица расположена на экспрессионном векторе, содержащем сайт рестрикции эндонуклеазы.
24. Способ по п. 23, в котором сайт рестрикции эндонуклеазы представляет собой сайт расщепления эндонуклеазы I-SceI.
25. Способ по любому из пп. 23 или 24, в котором клетки на стадии (d) дополнительно содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую эндонуклеазу, которая расщепляет эндонуклеазный сайт расщепления.
26. Способ по любому из пп. 1 -25, в котором клетки содержат по меньшей мере одну эндогенную служащую мишенью для протеазы РНК-полимеразу и/или по меньшей мере одну хромосомную делецию в гене, кодирующем эндогенную РНК-полимеразу.
27. Способ по любому из пп. 1-25, в котором клетки на стадии (а) и/или стадии (d) дополнительно содержат сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую индуцируемый промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей Т7-фаговый белок Gp2.
28. Способ по любому из пп. 1-27, в котором клетки на стадии (а) и/или стадии (d) культивируют в присутствии сахара.
29. Способ по п. 28, в котором сахар представляет собой глюкозу.
30. Способ по любому из предыдущих пп. 3-29, дополнительно включающий:
объединение первого клеточного лизата, полученного на стадии (b), со вторым клеточным лизатом, полученным на стадии (е), и полифосфатом, в результате чего получают смесь; а также
инкубацию смеси в условиях, которые приводят к получению РНК.
31. Способ по любому из пп. 1-30, в котором РНК является двухцепочечной РНК (дцРНК).
32. Способ получения лизата клеток для бесклеточного получения рибонуклеиновой кислоты (РНК), причем способ включает
(а) культивирование клеток до желаемой плотности клеток, в котором клетки содержат (i) по меньшей мере одну сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей нуклеазу, которая включает в себя узнаваемый протеазой сайт и связана с последовательностью, обеспечивающей попадание в периплазму, и (ii) по меньшей мере одну сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей нуклеотидкиназу, где по меньшей мере одна эндогенная рибонуклеаза генетически инактивирована или инактивируется посредством направленного протеолиза в клетках;
(b) лизис клеток, полученных на стадии (а), с получением таким образом первого клеточного лизата, и
(c) инкубирование первого клеточного лизата в присутствии полифосфата в условиях, которые приводят к деполимеризации РНК, с получением таким образом первого клеточного лизата, содержащего смесь нуклеозид-5'-трифосфатов.
33. Способ по п. 32, дополнительно включающий
(d) культивирование клеток, которые включают (i) по меньшей мере одну сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей соответствующую протеазу, которая расщепляет узнаваемый протеазой сайт в нуклеазе, причем соответствующая протеаза связана с последовательностью, обеспечивающей попадание в периплазму, (ii) по меньшей мере одну сконструированную нуклеиновую кислоту, содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей РНК-полимеразу, и (iii) сконструированную матрицу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей РНК, причем по меньшей мере одна эндогенная рибонуклеаза генетически инактивирована или инактивируется посредством направленного протеолиза в клетках; и
(е) лизирование культивируемых клеток, полученных на стадии (d), с получением второго клеточного лизата.
34. Способ по п. 33, дополнительно включающий
объединение первого клеточного лизата, полученного на стадии (b), второго клеточного лизата, полученного на стадии (е), и необязательно полифосфата, в результате чего получают смесь; и
инкубацию смеси в условиях, которые приводят к получению РНК.
35. Способ по любому из предыдущих пп. 32-34, в котором РНК является двухцепочечной РНК (дцРНК).
36. Клеточный лизат, полученный способом по любому из пп. 1-35.
37. Клеточный лизат, содержащий
нуклеазу, которая включает в себя узнаваемый протеазой сайт;
нуклеотидкиназу; и
нуклеозид-5'-монофосфаты.
38. Клеточный лизат, содержащий
РНК-полимеразу; и
сконструированную ДНК-матрицу, кодирующую РНК.
39. Композиция, содержащая клеточный лизат по п. 37 и клеточный лизат по п. 38.
40. Клеточный лизат по любому из пп.37 или 38, причем клеточный лизат свободен от нуклеазной активности.
41. Бесклеточный способ получения рибонуклеиновой кислоты (РНК), причем способ включает
(а) объединение первого клеточного лизата со вторым клеточным лизатом, причем
первый клеточный лизат содержит (i) нуклеазу, который включает в себя узнаваемый протеазой сайт, и (ii) нуклеозид-5'-монофосфаты, и
второй клеточный лизат содержит (iii) соответствующую протеазу, которая расщепляет узнаваемый протеазой сайт нуклеазы, (iv) нуклеотидкиназу, (v) РНК-полимеразу и (vi) сконструированную матрицу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей РНК, представляющей интерес, образуя таким образом реакционную смесь; и
(b) инкубацию реакционной смеси в условиях, которые приводят к получению РНК, представляющей интерес.
42. Способ по п. 41, в котором интересующая РНК представляет собой двухцепочечную РНК.
43. Бесклеточной способ получения рибонуклеиновой кислоты (РНК), причем способ включает
(a) объединение первого клеточного лизата со вторым клеточным лизатом, причем
первый клеточный лизат содержит (i) нуклеазу, которая включает в себя узнаваемый протеазой сайт, (b) нуклеотидкиназу и (iii) нуклеозид-5'-трифосфаты, и
второй клеточный лизат содержит (iv) соответствующую протеазу, которая расщепляет узнаваемый протеазой сайт нуклеазы, (v) РНК-полимеразу и (vi) сконструированную матрицу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), содержащую промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей РНК, представляющей интерес, образуя таким образом реакционную смесь; и
(b) инкубацию реакционной смеси в условиях, которые приводят к получению РНК, представляющей интерес.
44. Способ по п. 43, в котором интересующая РНК представляет собой двухцепочечную РНК.
45. Способ по любому из предыдущих пп. 41-44, в котором первый клеточный лизат и/или второй клеточный лизат свободны от нуклеазной активности.