Результативность развития эмбрионов кур при введении лентивирусных векторов in vivo

УДК 636.5:591.463.1

результативность развития эмбрионов кур при введении лентивирусных векторов rn vivo

А.Н. ВЕТОХ, младший научный сотрудник

Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, руководитель лаборатории

Э.Р. МЕННИБАЕВА, младший научный сотрудник Е.К. ТОМГОРОВА, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

И.К. ФОМИН, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Д.В. БЕЛОГЛАЗОВ, кандидат биологических наук, научный сотрудник

Н.А. ЗИНОВЬЕВА, доктор биологических наук, академик РАН, директор

Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства им. Л.К. Эрнста, пос. Дубровицы, 60, Подольский р-н, Московская обл., 142132, Российская Федерация

Резюме. Векторные системы, полученные на основе таких интегративных вирусов, как лентивирусы и ретровирусы -эффективный инструмент для введения и выражения генов. В этой связи представляет интерес подбор регуляторных последовательностей в составе генных конструкций, обеспечивающих высокую эффективность трансгенеза. Цель исследований - изучение влияния регуляторных последовательностей в составе лентивирусных векторов на развитие эмбрионов кур и результативность получения птицы. Исследования проводили на базе вивария ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2015-2016 гг. на эмбрионах кур кросса Шейвер Браун (n=519). Использовали лентивирусный вектор pWpxl, на основе которого получили 8 лентивирусных векторов, содержащих репортерный ген eGFP (зелёный флюоресцирующий белок) под контролем конститутивных (векторы pWCAG и pWRSV) и тканеспецифичных (векторы pW2.8, pW1.2, pWC1, pWC2, pWМ1 и pWМ2) регуляторных элементов. Вирусный препарат вводили в эмбрионы кур на 24 и 60 ч инкубации. Изучали динамику развития эмбрионов и результативность получения птицы в зависимости от способа введения лентивирусных векторов и используемых в их составе регуляторных последовательностей. Экспрессию рекомбинантного белка в эмбриональных клетках определяли на 6 день инкубации с использованием проточной цитофлуориметрии. Относительно высокая доля клеток эмбриона, экспрессирующих рекомбинантных белок eGFP, была установлена при трансфекции эмбриональных клеток на 24 ч инкубации - 34,3 %, что на 4,3 % выше, чем при введении лентивирусных векторов в дорсальную аорту эмбрионов на 60 ч инкубации. Наименьшее влияние на эмбриогенез выявлено при использовании лентивирусных векторов с регуляторными элементами, обеспечивающими тка неспе ци фическ ую экспрессию рекомбинантных генов. При использовании лентивирусных векторов с конститутивной экспрессией структурного гена доля развившихся эмбрионов была в среднем на 6,5 % ниже. Ключевые слова: трансгенез, куры, лентивирусные вектора, экспрессия, рекомбинантные белки.

Для цитирования: Результативность развития эмбрионов кур при введении лентивирусных векторов in vivo / А.Н. Ветох, Н.А. Волкова, Э.Р.

Меннибаева, Е.К. Томгорова, И.К. Фомин, Д.В. Белоглазов, Н.А. Зиновьева // Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 12. С. 83-85.

Векторные системы, созданные на основе интегративных вирусов, в том числе лентивирусов, служат эффективным инструментом для интеграции и экспрессии рекомбинатных генов. Природная способность проникать и с высокой эффективностью интегрироваться в геном клетки-хозяина позволяет использовать такие типы векторов для трансгенеза сельскохозяйственной птицы. Это представляется более предпочтительным, по сравнению с применением других методов введения рекомбинантной ДНК, в том числе микроинъекций, что связано, прежде всего, с особенностями развития и воспроизводства сельскохозяйственной птицы, в частности, с развитием эмбрионов вне организма самки [1, 2].

Возможность успешного использования ретро-вирусных и лентивирусных векторов для получения трансгенной птицы была продемонстрирована рядом исследователей: созданы трансгенные куры с интегрированными бактериальными и репортерными генами LacZ, GFP, р-лактамазы, а также генами человека - а2Ь-интерферона, р-интерферона, гранулоцитарного коло-ниестимулирующего фактора, гормона роста и ряда других [4-13]. В этой связи в рамках изучения условий введения трансгенов в эмбриональные клетки кур представляет интерес подбор регуляторных последовательностей в составе генных конструкций, обеспечивающих высокую эффективность трансгенеза.

Цель исследований - изучение влияния регуляторных последовательностей в составе лентивирусных векторов на развитие эмбрионов кур и результативность получения птицы.

Условия, материалы, методы. Исследования проводили на базе вивария ВИЖ им. Л.К. Эрнста в 2015-2016 гг. Объектом исследования служили эмбрионы кур кросса Шейвер Браун (п=519). Генно-инженерные манипуляции осуществляли на 24 и 60 ч инкубации. В работе изучали 8 лентивирусных

Таблица 1. Характеристика использованных лентивирусных векторов

Вектор

Регуляторный элемент

Структурный ген

pWCAG

pWRSV pW2.8

pW1.2 pWCI pWC2

pWMI pWM2

Группа I - конститутивная экспрессия структурного гена

гибридный регуляторный элемент, содержащий эн- еОРР

хансер ранних генов цитомегаловируса человека и промотор гена р-астина птиц

промотор-энхансер вируса саркомы Рауса (^БУ) эЭРР

Группа II - тканеспецифичная экспрессия структурного гена

2,8 т.п.н. гена овальбумина, включающие первый еОРР

экзон, интронную последовательность и часть второго экзона

1,2 т.п.н. гена овальбумина, включающие часть вто- еОРР

рого экзона, без первого экзона и интрона

1,2 т.п.н. гена овальбумина + промотор-энхансер еОРР

ранних генов цитомегаловируса человека

промотор гена овальбумина (300 п.н.) + промотор- еОРР

энхансер ранних генов цитомегаловируса человека

1,2 т.п.н. гена овальбумина + промотор-энхансер еОРР вируса лейкемии мышей Молони (Мо-МЬУ) промотор гена овальбумина (300 п.н.) + промотор- еОРР энхансер вируса лейкемии мышей Молони (Мо-МьУ)_

Таблица 2. развитие эмбрионов кур при введении лентивирусных векторов на различных сроках инкубации

Показатель Группа

I II

Генная конструкция pWCAG pWCAG

Объём ВП1, мкл 1-2 1-2

Сроки введения ВП1, час

инкубации 24 60

Проколото эмбрионов, шт. 20 20

Развилось эмбрионов до 6

дня инкубации, шт.

Доля клеток эмбриона, экс-

прессирующих ввГР, %:

минимальная 28,4 13,7

максимальная 44,8 42,7

в среднем 34,3 30,0

'ВП - вирусный препарат.

векторов, содержащих структурный ген eGFP (зелёный флуоресцирующий белок) под контролем различных регуляторных элементов (табл. 1).

В качестве инъекционного раствора использовали вирусный препарат, который в объёме 1-2 мкл вводили непосредственно в эмбрион (на 24 ч инкубации) или в его дорсальную аорту (на 60 ч инкубации) с использованием капиллярной пипетки (Transferpet-tor. Eppendorf, Германия) через окно, вырезанное в тупом конце яйца.

После генно-инженерных манипуляций эмбрионы инкубировали в течение 21 сут. при температуре 37,5 °С. По окончании инкубации оставшиеся после вывода молодняка яйца вскрывали с целью оценки развития эмбрионов.

Часть эмбрионов обирали на 6 день инкубации для оценки доли клеток, экспрессирующих eGFP. Подсчёт флуоресцирующих клеток осуществляли на проточном цитофлуориметре.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы MS Excel.

результаты и обсуждение. Сравнительный анализ введения лентивирусных векторов в эмбрионы кур на разных сроках их инкубации выявил некоторые различия между экспериментальными группами по показателю развития эмбрионов и эффективности трансформации эмбриональных клеток (табл. 2). Развитие эмбрионов на 6 день инкубации при введении генных конструкций на 60 ч в дорсальную аорту составило 80 %, что на 5 % выше, по сравнению с эмбрионами, которым вводили лентивирусный вектор на 24 ч инкубации. Это может быть связано, прежде всего, с отличиями во введении генных конструкций на разных стадиях развития. Однако доля эмбриональных клеток, экспрессирующих

eGFP, была выше при введении лентивирусного вектора на 24 ч инкубации: разница между экспериментальными группами составила 4,3 %. Учитывая это, в дальнейших исследованиях лентивирусные векторы вводили в эмбрионы кур в указанный период.

При введении в эмбрионы кур лентивирусных векторов, в которых экспрессию гена eGFP обеспечивали конститутивные промоторы CAG и RSV (векторы pWCAG и pWRSV), количество развившихся эмбрионов было в среднем на 6,5 % ниже (табл. 3), чем при использовании лентивирусных векторов с тканеспецифичной экспрессией структурного гена (векторы pW2.8, pW1.2, pWС1, pWС2, pWМ1 и pWМ2). Это может быть связано, прежде всего, с дополнительной экспрессией реком-бинантного белка (eGFP) в эмбриональных клетках. При использовании конститутивных промоторов экспрессию интегрированного гена наблюдали во всех клетках организма, включая эмбриональные, что, возможно, ингибировало развитие зародыша. При использовании тканеспецифичных промоторов экспрессию, как правило, наблюдали только в клетках определенных органов и тканей.

Таблица 3. влияние регуляторных элементов в составе лентивирусных векторов на развитие эмбрионов кур и результативность получения цыплят

Вектор Проколото эмбрионов, шт. Развилось эмбрионов, % Получено цыплят, %

pWCAG 53 60,4±6,8 24,5±6,0

pWRSV 50 64,0±6,9 20,0±5,7

Итого по 103 62,1±4,8 22,3±4,1

группе I

pW2.8 62 67,7±6,0 21,0±5,2

pW1.2 61 66,1±6,1 22,6±5,4

pWCI 66 68,2±5,8 18,2±4,8

pWС2 60 70,0±6,0 35,0±6,2

pWIVI1 64 67,2±5,9 17,2±4,8

pWIVI2 62 71,0±5,8 22,6±5,4

Итого по 376 68,4±2,4 22,6±2,2

группе II

выводы. Проведённые исследования показали влияние способа введения лентивирусных векторов, а также регуляторных элементов в составе генных конструкций на эмбриогенез кур при генно-инженерных манипуляциях с эмбрионами in vivo. Более высокая доля клеток эмбриона, экспрессирующих рекомби-нантных белок eGFP, установлена при трансфекции эмбриональных клеток на 24 ч инкубации. При этом меньшее влияние на эмбриогенез выявлено в случае использования лентивирусных векторов с регулятор-ными элементами, обеспечивающими тканеспецифи-ческую экспрессию рекомбинантных генов.

Литература.

1. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector/ L. Naldini, U. Blomer, P. Gallay, D. Ory, R. Mulligan // Science. 1996. V. 272. Pp. 263-267.

2. Production and purification of lentiviral vectors / G.Tiscornia, O. Singer, I.M. Verma // Nat Protoc. 2006. V. 1(1). Pp. 241-245.

3. Applications of avian transgenesis / B.B. Scott, T.A. Velho, S. Sim, C. Lois // ILAR J. 2010. V. 51(4). Pp. 353-361.

4. Трансгенные сельскохозяйственные животные: современное состояние исследований и перспективы / Н.А. Зиновьева, Н.А. Волкова, В.А. Багиров, Г. Брем// Экологическая генетика. 2015. Т. 13. № 2. С. 58-76.

5. Chicken oviduct-specific expression of transgene by a hybrid ovalbumin enhancer and the Tet expression system / D. Kodama, D. Nishimiya, K. Nishijima, Y. Okino, Y. Inayoshi, Y. Kojima, K.-I. Ono, M. Motono, K. Miyake, Y. Kawabe etal.//JBiosciBioeng. 2012. V. 113 (2). Pp. 146-153.

6. Изучение условий эффективного введения трансгенов в эмбриональные клетки кур с использованием лентивирусной векторной системы / Волкова Н.А., Фомин И.К., Томгорова Е.К., Ветох А.Н., Меннибаева Э.Р., Брем Г., Зиновьева Н.А. // Сельскохозяйственная биология. 2015. Т. 50. № 4. С. 458-466.

7. Интеграция и экспрессия маркерных генов в эмбрионах кур при использовании ретровирусных экспрессирующих векторов/Волкова Н.А., Волкова Л.А., Фомин И.К., Зиновьева Н.А., ГореликЛ.Ш., Лоцманова Н.С. //Сельскохозяйственная биология. 2013. № 2. С. 58-61.

8. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase / P.E. Mozdziak, S. Borwornpinyo, D.W. McCoy, J.N. Petitte//Dev. Dyn. 2003. V. 226. Pp. 439-445.

9. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens/S.G. Lillico, M.J. Sherman, C.D. McGrew, C.D. Robertson, J. Smith, C. Haslam, P. Barnard, P.A. Radcliffe, K.A. Mitrophanous, E.A. Elliot et al. // PNAS. 2007. V. 104 (6). Pp. 1771-1776.

10. Production of biofunctional recombinant human interleukin 1 receptor antagonist (rhIL1RN) from transgenic quail egg white / S.C. Kwon, J.W. Choi, H.J. Jang, S.S. Shin, S.K. Lee, T.S. Park, I.Y. Choi, G.S. Lee, G. Song, J.Y. Han // Biology of Reproduction. 2010. V. 82. Pp. 1057-1064.

11. Oviduct-specific enhanced green fluorescent protein expression in transgenic chickens / S.J. Byun, S.W. Kim, K.W. Kim, J.S. Kim, I.-S. Hwang, H.K. Chung, I.S. Kan, I.-S. Jeon, W.-K. Chang, S.-B. Park, J.G. Yoo//Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011. V. 75 (4). Pp. 646-649.

12. Ubiquitous GFP expression in transgenic chickens using a lentivira vector / S.C. Chapman, A. Lawson, W.C. Macarthur, R.J. Wiese, R.H. Loechel, M. Burgos-Trinidad, J.K. Wakefield, R. Ramabhadran, T.J. Mauch, G.C. Schoenwolf //Development. 2005. V. 132. Pp.935-940.

13. Scott B.B., Lois C. Generation of tissue-specific transgenic birds with lentiviral vectors // PNAS. 2005. V. 102(45). Pp.1644316447.

EFFECTIVENESS OF CHICK EMBRYO DEVELOPMENT WITH THE INTRODuCTION

OF LENTIVIRAL VECTORS IN VIVO

A.N. Vetokh, N.A. Volkova, E.R. Mennibaeva, E.K. Tomgorova, I.K. Fomin, D.V. Beloglasov., N.A. Zinovieva

L.K. Ernst All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, pos. Dubrovitsy, 60, Podol'skii r-n, Moskovskaya obl., 142132, Russian Federation

Summary. Vector systems based on the integrative viruses such as lentiviruses and retroviruses are an effective tool for the introduction and expression of genes. In this regard, the study of the conditions for transgene introduction into embryonic chicken cells is of interest, as well as the selection of regulatory sequences in the composition of gene constructs that provide high efficiency of transgenesis. The aim of the research was to study the influence of regulatory sequences in the composition of lentiviral vectors on development of chick embryos and effectiveness of obtaining chickens. The studies were carried out on the chicken embryo of Shaver Braun cross (n = 519) at the premises of vivarium of the L.K. Ernst Institute of Animal Husbandry in 2015-2016. pWpxl lentiviral vector was used in the study. Eight lentiviral vectors were obtained on its base, containing the reporter gene eGFP (green fluorescent protein) under the control of constitutive (pWCAG and pWRSV vectors) and tissue-specific (pW2.8, pW1.2, pWS1, pWS2, pWM1 and pWM2 vectors) regulatory elements. Viral preparation was injected into chicken embryos at the 24th and 60th hours of incubation. Dynamics of embryo development and efficiency of poultry obtaining were studied depending on introduction method for lentiviral vectors and regulatory sequences in their composition. The expression of the recombinant protein in the embryonic cells was determined at the sixth day of incubation using flow cytofluorometry. A relatively high percentage of embryonic cells that expressed recombinant protein eGFP were established at the transfection of embryonic cells at the 24th hour of incubation - 34.3 %, which was higher by 4.3 % compared with the administration of lentiviral vectors in the dorsal aorta of embryos at the 60th hours of incubation. The least effect on the embryogenesis was observed using lentiviral vectors with regulatory elements that provide tissue specific expression of recombinant genes. The percentage of embryos that developed, when lentiviral vectors with a constitutive expression of the structural gene was used, was lower on average by 6.5 %. Keywords: transgenesis, chickens, lentiviral vectors, expression, recombinant proteins.

Author Details: A.N. Vetokh, junior research fellow (e-mail anastezuya@mail.ru); N.A. Volkova, D. Sc. (Biol.), head of laboratory; E.R. Mennibaeva, junior research fellow; E.K. Tomgorova, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; I.K. Fomin, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; D.V. Beloglasov., Cand. Sc. (Biol.), research fellow; N.A. Zinovieva, D. Sc. (Biol.), member of the RAS, director. For citation: Vetokh A.N., Volkova N.A., Mennibaeva E.R., Tomgorova E.K., Fomin I.K., Beloglasov D.V., Zinovieva N.A. Effectiveness of Chick Embryo Development with the Introduction of Lentiviral Vectors in Vivo. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2016. V. 30. No 12. Pp. 83-85 (in Russ.).

Требования к оформлению статей в журнале «достижения науки и техники АПк»

В статье должно быть кратко изложено состояние дел по изучаемой проблеме со ссылками на публикации (желательно не менее трех ссылок). Затем указаны цели, задачи, условия и методы исследований. Подробно представлены результаты экспериментов и их анализ. Сделаны выводы и даны предложения производству. В статье следует по возможности выделять следующие блоки: введение; цель и задачи исследований; условия, материалы и методы исследований; результаты исследований; выводы.

Вместе со статьей должны быть представлены перевод названия на английский язык; аннотация (200-250 слов) на русском и английском языках; ключевые слова на русском и английском языках; полные почтовые адреса всех учреждений, в которых работают авторы, на русском и английском языке; ученые степени и должности авторов на русском и английском языке код УДК; библиографический список.

В тексте ссылка на источник отмечается соответствующей цифрой в квадратных скобках в порядке цитирования. В списке литературы приводятся только те источники, на которые есть ссылка в тексте. Использование цитат без указания источника информации запрещается.

Материал для подачи в журнал набирается в текстовом редакторе Word версия не ниже 97 файл с расширением *.rtf.

Объем публикации 12-16 стр. машинописного текста набранного шрифтом Times New Roman, размер кегля 14 с полуторным интервалом. На 2,5 страницы текста допускается не более 1 рисунка или таблицы.

Статьи необходимо направлять с сопроводительным письмом с указанием сведений об авторах (фамилия, имя, отчество -полностью, ученая степень, место работы и занимаемая должность) на русском и английском языке, контактных телефонов и адреса электронной почты для обратной связи.

На публикацию представляемых материалов необходимо письменное разрешение и рекомендация руководства организации, на средства которой проводились исследования. Его вместе с одним экземпляром рукописи, подписанным авторами, и статьей в электронном виде нужно отправлять по адресу: 101000, г. Москва, Моспочтамт, а/я 166, ООО «Редакция журнала «Достижения науки и техники АПК». Для ускорения выхода в свет материалы в электронном виде можно направлять по адресу: agroapk@mail.ru.

Плата с аспирантов за публикацию рукописей не взимается.

Несоответствие статьи по одному из перечисленных пунктов может служить основанием для отказа в публикации.

Все рукописи, содержащие сведения о результатах научных исследований, рецензируются, по итогам рецензирования принимается решение о целесообразности опубликования материалов.