Способ идентификации видовой принадлежности тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
METHOD FOR IDENTIFICATION OF RAT AND MOUSE TISSUE SPECIES IN DRY FEED AND SEMI-FENISHED MEAT PRODUCTS

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к методам определения видовой принадлежности мяса с помощью полимеразной цепной реакции.
Известно использование ПНР в реальном времени для определения ДНК тканей животных в мясном продукте (CN 108624659 A, кл C12G 1/6851, 2018 г.)
Также известно использование мультиплексной ГШР для обнаружения материалов, полученных из свиней, собак и крыс, для халяльной аутентификации (WO №2016064264, кл. C12N 15/09, 2016 г.)
Однако в известных способах нуклеотидная последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. Длина фрагмента, который может быть расшифрован этим методом, ограничивается разрешающей способностью метода гель-электрофореза, что влияет на точность диагностирования видовой принадлежности тканей крыс и мышей
3
Наиболее близким по технической сущности является способ идентификации видовой принадлежности тканей животных в продовольственном сырье, кормах и пищевых продуктах (патент РФ №2694713, кл. C12Q 1/68, 2019 г.), включающий выделение ДНК из тканей животных сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участков геномов ДНК животных олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для одного из животных и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси содержащую фрагменты геномов животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проводение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.
Недостатком известного технического решения является недостаточная точность из-за использования суспензии бактериофага, которая требует предварительную обработку, включая центрифугирование, концентрирование и перевод в определенный буферный раствор, что влечет за собой значительную трудоемкость и финансовые затраты.
Техническим результатом является повышение точности идентификации видовой принадлежности, упрощение процесса подготовки и уменьшение его стоимости.
3
Технический результат достигается тем, что в способе идентификации видовой принадлежности тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных полуфабрикатах, включающем выделение ДНК из тканей животных сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 45 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка геномов ДНК животных олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала для одного из животных и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 фаговых частиц на 1 мкл, положительного контрольного образца в виде смеси, содержащую фрагменты геномов животных и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд, взятых в соотношении 1:1:1 и измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проводение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению выделяют ДНК из тканей крыс (Rattus) и мышей (Mus musculus) и для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4, а для положительного контрольного образца - фрагменты геномов нативного бактериофага Т4 и тканей крыс (Rattus) и мышей (Mus musculus) со следующей нуклеотидной последовательностью:
Rat-F: 5'-GCCTTCCTACCATTCCTGCAT-3' прямой праймер
Rat -R: 5'-AGGAGGTTGGCTACTAGGAT-3' - обратный праймер
Rat -Р: 5'-FAM - ACGCAGCTTAACATTCCGCCCA-3'-BHQ1 зонд
Mus-F: 5'-GTTGCTTTGTCTACTGAG-3' - прямой праймер
Mus-R: 5'-ACCTGAAACATTGGAGTA-3' - обратный праймер
Mus-P: FAM-5'-TCGCAGTCATAGCCACAGCA-3-BHQ1 - зонд, при этом для определения ДНК ткани крысы (Rattus) используют флуоресцентный краситель JOE/Yellow, а для ткани мыши (Mus musculus) - FAM/Green.
Новизна заявляемого способа состоит в том, что идентификацию видовой принадлежности тканей крыс и мышей с помощью (ПГДР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, проводят с использованием в контрольных образцах разных видов бактериофага Т4, что в свою очередь позволяет с высокой точностью определить наличие их ингредиентов в сухих кормах и мясных продуктах, упростить процесс подготовки и уменьшить его стоимость.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Способ идентификации видовой принадлежности тканей крыс и мышей в в сухих кормах и мясных полуфабрикатах осуществляется следующим образом.
3
Для исследования кормов, продовольственного сырья и пищевых продуктов на содержание ДНК ткани крыс (Rattus) и мышей (Mus musculus) проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с применением термоциклера типа Rotor-Gene Q при соответствующих температурно-временных режимах амплификации и измеряют накопление флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей: JOE/Yellow для специфического сигнала ткани крыс (Rattus); FAM/Geen - ткани мышей (Mus musculus) и Cy5/Red - для внутреннего контрольного образца. Интерпретацию результатов проводят на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный. Для повышения точности идентификации мяса для внутреннего контрольного образца используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация копий нуклеотидных последовательностей отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов. Для положительного контрольного образца используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани крыс (Rattus), мышей (Mus musculus) и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1 со следующими нуклеотидными последовательностями:
Rat-F: 5'-GCCTTCCTACCATTCCTGCAT-3' - прямой праймер
Rat -R: 5'-AGGAGGTTGGCTACTAGGAT-3' - обратный праймер
Rat-P: 5'-FAM - ACGCAGCTTAACATTCCGCCCA-3'-BHQ1 - зонд
Mus-F: 5'-GTTGCTTTGTCTACTGAG-3' - прямой праймер
Mus-R: 5'-ACCTGAAACATTGGAGTA-3' - обратный праймер
Мus-Р: FAM-5'-TCGCAGTCATAGCCACAGCA-3-BHQ1 зонд.
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд.
Использование для разных видов контроля различные формы материала бактериофага Т4: фаголизата и фрагмента генома нативного бактериофага со специфическими к нему праймерами и зондом обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов. Кроме того, использование фаголизата бактериофага Т4, представляющего собой суспензию бактериофага, полученную после лизиса зараженных фагом клеток ткани, повышает воспроизводительность, чувствительность и упрощает процесс идентификации ткани кошки в продуктах, а использование нативного бактериофага, т.е. неповрежденного при исследовании, улучшает синтез ДНК, что также повышает качество процесса идентификации.
При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комплементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.
Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ГЩР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.
Праймеры, специфичные для ДНК крыс (Rattus) были подобраны на основе нуклеотидной последовательности митохондриального гена цитохрома (Rattus norvegicus mitochondrion, complete genome Sequence ID: KM577634, Length: 16302) на участке между 15000 и 15300 нуклеотидами. Код доступа нуклеотидной последовательности в GeneBank NCBI: КМ577634.1.
Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы на специфичность с использованием программы BLAST на сервере NCBI. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Rat-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, фланкированной позициями для праймеров Rat-F и Rat-R). На 5'-конец зонда Rat-P добавлен флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин (FAM).
Rat-F: 5'-GCCTTCCTACCATTCCTGCAT-3' - прямой праймер
Rat-R: 5'-AGGAGGTTGGCTACTAGGAT-3' - обратный праймер
Rat-Р: 5'-FAM - ACGCAGCTTAACATTCCGCCCA-3'-BHQ1 - зонд.
Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах каких либо животных и птиц (исключая Rattus) и любых видов растений, которые потенциально могут быть использованы при производстве кормов и пищевых продуктов.
Праймеры, специфичные для ДНК мышей (Mus musculus) были подобраны на основе нуклеотидной последовательности митохондриального гена цитохрома (LOCUS KХ519423 897 bp DNA linear ROD 24-MAY-2017, Mus musculus isolate 2015030501 cytochrome b (Cytb) gene, partial cds; mitochondrial) на участке между 500 и 700 нуклеотидами. Код доступа нуклеотидной последовательности в GeneBank NCBI: KХ519423.1
Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы на специфичность с использованием программы BLAST на сервере NCBI. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Mus-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, фланкированной позициями для праймеров Mus -F и Mus-R). На 5'-конец зонда Mus-P добавлен флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин (FAM).
Mus-F: 5'-GTTGCTTTGTCTACTGAG-3' - прямой праймер
Mus-R: 5'-ACCTGAAACATTGGAGTA-3' - обратный праймер
Mus-P: FAM-5'-TCGCAGTCATAGCCACAGCA-3-BHQ1 - зонд.
Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах каких либо животных и птиц (исключая Mus musculus) и любых видов растений, которые потенциально могут быть использованы при производстве кормов и пищевых продуктов.
В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.
Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Т4Р, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров T4F и T4R. Зонд был помечен красителем Су5.
T4F TACATATAAATCACGCAAAGC - прямой праймер
T4R TAGTATGGCTAATCTTATTGG - обратный праймер
Т4Р CY5 ACATTGGCACTGACCGAGTTC - зонд
Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Пример конкретного осуществления способа идентификации видовой принадлежности тканей крыс и мышей в сухих кормах и мясных продуктах.
Для подтверждения эффективности способа были использованы сухие корма в виде рыбной и мясной муки; сырые и термически обработанные мясные продукты, т.е. мясные полуфабрикаты.
От пробы плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированную или консервированную продукцию перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния.
Лабораторные пробы (20-40 мг) отбирают на исследование в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл в двух повторах. Отобранные лабораторные пробы направляют на выделения ДНК.
Исследование проводят с помощью набора реагентов «ПЦР-ГРЫЗУНЫ-ФАКТОР». Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы)
2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).
Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-ГРЫЗУНЫ-ФАКТОР» для определения видовой принадлежности тканей животных видов Rattus (крыс) и Mus musculus (мышей) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. ТУ 21.10.60-173-51062356-2019, http://www. vetfaktor.ru/.
Состав набора приведен в Таблицах 1 и 2.
Исследования состоит из трех этапов:
• экстракция нуклеиновая кислота (НК);
• проведение реакции ПЦР РВ;
• учет результатов анализа.
3
Для экстракции (выделение) НК из исследуемых проб отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для отрицательный контрольный образец (ОКО), вносят по 10 мкл внутренний контрольный образец (ВКО) для крыс и мышей (ГРЫЗУНЫ) в качестве которого используют фаголизат бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 фаговых частиц на 1 мкл.
Следующий этап это подготовка образцов к проведению ПЦР.
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием положительный контрольный образец (ПКО) ГРЫЗУНЫ, ВКО ГРЫЗУНЫ и ДНК буфера. В качестве ПКО используют смесь содержащую фрагменты геномов ткани крыс (Rattus), ткани мышей (Mus musculus) и нативного бактериофага Т4 взятых в соотношении 1:1:1.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ ГРЫЗУНЫ;
10 мкл ПЦР БУФЕР ГРЫЗУНЫ;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE
Перемешивают смесь на вортексе и сбросывают капли кратковременным центрифугированием.
Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и используют программное обеспечение прибора. Далее проводят ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией.
Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» представлены в таблице 3.
Интерпретация результатов анализа.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в соответствии с инструкцией производителя к прибору.
Учет результатов ПЦР РВ проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице 4 результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на каналах FAM/Green и JOE/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Образцы, для которых значение Ct по каналу Cy5/Red отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом не получен положительный результат на каналах JOE/Yellow и/или FAM/Green) требуют повторного проведения исследования с этапа экстракции ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции ПЦР РВ.
В образце обнаружена ДНК ткани Rattus крыс, если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4). В образце обнаружена ДНК ткани Mus musculus мышей, если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале FAM/Green, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).
Если для исследуемого образца по каналам JOE/Yellow и/или FAM/Green значение Ct определяется позднее 37 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей, образец исследуется повторно с этапа экстракция ДНК. Если при повторной постановке Ct более 37 результат считается отрицательным (содержание целевой ДНК ниже предела обнаружения метода).
Образец считается отрицательным (ДНК Rattus и/или Mus musculus не обнаружена) если не определяется значение Ct (не наблюдается рост специфического сигнала) на канале FAM/Green и/или JOE/Yellow при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4), а значение Ct по каналу Cy5/Red менее 35.
Для исследуемых образцов (сухой корм и мясные полуфабрикаты) предел точности содержания ткани крыс и мышей представлен в таблице 5.
Для доказательства эффективности использования ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого способа с прототипом, в котором использовался метод ПЦР с использованием внутреннего контроля в виде суспензии бактериофага, а в заявляемом - использовался фаголизат бактериофага и геном нативного бактериофага. Оказалось чувствительность ПЦР в заявляемом способе при обнаружении примеси тканей крыс и мышей в кормах и в мясных фаршах примерно выше в 1,5 раза. Трудоемкость и стоимость процесса определения ДНК ткани собаки в кормах и фаршах снизилась на 3,2-4%.
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет
имени И.Т. Трубилина».
<120> Способ идентификации видовой принадлежности тканей крыс и мышей
в сухих кормах и мясных полуфабрикатах
<140> 2019133101
<160> 9
<210> 1
< 211> 21
< 212> ДНК
крыса (Rattus)
< 213>
< 400> 1
gccttcctaccattcctgcat                                           21
<210> 2
< 211> 20
< 212> ДНК
крыса (Rattus)
< 213>
< 400> 2
aggaggttggctactaggat                                            20
<210> 3
< 211> 22
< 212> ДНК
крыса (Rattus)
< 213>
< 400> 3
acgcagcttaacattccgccca                                          22
<210> 4
< 211> 18
< 212> ДНК
мышь (Musmusculus)
< 213>
< 400> 4
Gttgctttgtctactgag                                              18
<210> 5
< 211> 18
< 212> ДНК
мышь (Musmusculus)
< 213>
< 400> 5
acctgaaacattggagta                                              18
<210> 6
< 211> 20
< 212> ДНК
мышь (Musmusculus)
< 213>
< 400> 6
tcgcagtcatagccacagca                                            20
<210> 7
< 211> 21
Бактериофаг Т4
< 213>
< 400> 7
tacatataaatcacgcaaagc                                           21
<210> 8
< 211> 21
< 212> ДНК
Бактериофаг Т4
< 213>
< 400> 8
tagtatggctaatcttattgg                                           21
<210> 9
< 211> 21
< 212> ДНК
Бактериофаг Т4
< 213>
< 400> 9
acattggcactgaccgagttc                                           21
<---