МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТЕТЕЛА К CD44, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОЙ КАРЦИНОМЫ ГОЛОВЫ И ШЕИ
MONOCLONAL ANTIBODIES TO CD44, INTENDED FOR USE IN TREATING SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF THE HEAD AND THE NECK

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам предупреждения, лечения или диагностирования плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC) с использованием одного или нескольких модифицирующих злокачественное заболевание антител (cancerous disease modifying antibodies (CDMAB)). В конкретных вариантах осуществления изобретения CDMAB представляет собой антитело, специфическое в отношении CD44. Описаны также способы комбинированной терапии, заключающиеся в том, что применяют CDMAB, предлагаемое в изобретении, необязательно в сочетании с одним или несколькими вторыми CDMAB и/или химиотерапевтическими агентами в качестве средств предупреждения или лечения рака.
Предпосылки создания изобретения
Плоскоклеточная карцинома головы и шеи (HNSCC) представляет собой изнурительное и приводящее к смертельному исходу заболевание, которое присутствует, как правило, в последней стадии и ежегодно поражает 50000 человек в Соединенных Штатах и 500000 человек во всем мире. HNSCC представляет собой заболевание, которое характеризуется выраженными болезненными состояниями, прежде всего связанными с нарушением функции речи и глотательной функции. Общепринятыми путями лечения является хирургическое вмешательство, лучевая терапия, химиотерапия или их комбинация.
Несмотря на применение комбинаций «жестких» методов лечения, включающих хирургическое вмешательство, химиотерапию и лучевую терапию, показатель эффективности лечения на поздних стадиях заболевания достигает лишь 30% и рецидив остается наиболее частой причиной (у 40%-50% пациентов) неблагоприятного исхода после проведения стандартных терапий. Терапия по жизненным показателям включает те же пути лечения, которые применяют для терапии первой линии. Однако паллиативная хирургия часто является сложной и оказывается недостаточной. Кроме того, лучевая терапия редко является осуществимой или оказывает благоприятное воздействие, а химиотерапия не приводит к значительному повышению коэффициента выживаемости страдающих HNSCC пациентов. Прогноз для таких пациентов остается плохим, при этом медианная продолжительность жизни после рецидива составляет лишь примерно шесть месяцев.
Плохой исход может являться результатом неэффективного уничтожения инициирующих образование опухоли клеток или раковых стволовых клеток (CSC). CSC обладают способностью к самообновлению, а также дают потомство с дифференцированным фенотипом и ограниченным самообновлением. CSC, подобно здоровым стволовым клеткам, являются устойчивыми к химиотерапии и лучевой терапии благодаря их обеспечивающим выживаемость преимуществам, таким как повышенная способность к репарации ДНК. Фактически стандартные схемы химиотерапии, например, основанной на применении цисплатина, и лучевой терапии на самом деле увеличивают популяцию стволовых клеток.
+
-
CD44 играет решающую роль в онкогенезе. Трансмембранный гликопротеин, CD44, связывает гиалоурановую кислоту (НА) во внеклеточном матриксе и в белках цитоскелета. Взаимодействия между CD44, НА, компонентами цитоскелета и сигнальными молекулами, такими как циклин D1, EGFR, Rho и Ras, ускоряют рост и миграцию. Кроме того, CD44 высвобождается из мембраны в растворимой форме (solCD44) под действие матриксных металлопротеиназ (ММР), что имеет решающее значение для миграции клеток. Установлено также, что CD44 может являться важным маркером CSC, он обнаружен при раке молочной железы, различных видах колоректального рака и HNSCC. На моделях, созданных с использованием ксенотрансплантатов, установлено также, что CD44 обладает активностью в отношении образования опухолей; опухолевые клетки CD44-HNSCC являются онкогенными для мышей с нарушенным иммунитетом, в то время как контрольные опухолевые клетки CD44-HNSCC не образовывали опухоли при использовании этих же моделей.
99m
VFF-18, обозначенное также как BIWA 1, представляет собой антитело, обладающее высокой аффинностью к v6-варианту CD44, специфическое в отношении области полипептида, включающей положения 360-370. Различные версии или производные BIWA 1 проходили изучение в клинических исследованиях в качестве средств лечения рака. В частности, BIWA 1 применяли в виде меченного с помощью технеция конъюгата на фазе 1 клинического исследования, которое проводили с целью оценки безопасности и способности оказывать целевое воздействие с участием 12 пациентов, страдающих плоскоклеточной карциномой головы и шеи. Через 40 ч после инъекции 14% инъецируемой дозы было поглощено опухолью, при этом накопление в других органах, таких как почки, селезенка и костный мозг, оказалось минимальным. Хотя высокая селективность связывания с опухолью позволяет допустить возможность применения BIWA 1 в радиоиммунотерапии, излишне высокая аффинность этого антитела препятствует проникновению указанного антитела в более глубокие слои опухоли. Кроме того, установлено также, что BIWA 1 обладает выраженной иммуногенностью. У одиннадцати из двенадцати пациентов образовались человеческие антимышиные антитела (НАМА), что характеризовалось гетерогенным накоплением в опухоли и приводило к образованию комплексов антитело-растворимый CD44.
99m
186
186
99m
186
2
186
B WO 02/094879 описаны гуманизированные версии VFF-18, созданные с целью преодоления НАМА-ответа, которые обозначены как BIWA 4 и BIWA 8. Установлено, что BIWA 4 обладал существенно более низкой аффинностью связывания антигена по сравнению с родительским антителом VFF 18. При этом для обладающего пониженной аффинностью антитела BIWA 4 были выявлены более высокие характеристики поглощения опухолью по сравнению с обладающим более высокой аффинностью BIWA 8. Антитела BIWA 4, меченные с как помощью технеция, так и с помощью рения, изучали на фазе 1 клинического исследования, выполненного на 33 пациентах, которое проводили с целью оценки безопасности, накопления опухолью, а в случае меченного с помощью Re BIWA 4 - максимальной переносимой дозы. Обнаружено зависящее от опухоли поглощение меченного с помощью Tc BIWA 4. Не обнаружено никаких ответов опухолей на применение меченного с помощью Re BIWA 4 в любых дозах. Хотя в процессе исследования для нескольких пациентов было достигнуто стабильное состояние болезни; была выявлена ограничивающая дозу токсичность, которая составляла 60 мКи/м. Обнаружено также 50-65% случаев нежелательных явлений, при этом у 12 из 33 пациентов нежелательные явления были классифицированы как серьезные (тромбоцитопения, лейкопения и лихорадка). Кроме того 6 из 12 пациентов, которые все подвергались лечению с использованием меченного с помощью Re BIWA 4, умерли в процессе лечения или в последующий период наблюдения из-за прогрессирующего развития заболевания. У двух пациентов обнаружено также образование человеческих античеловеческих антител (НАНА). Таким образом, для меченных с помощью радиоактивных изотопов VFF-18 не удалось продемонстрировать какие-либо клинические действия.
186
2
Осуществляли также фазу 1 исследования с использованием возрастающих доз меченного с помощью Re BIWA 4 с включением в опыт 20 пациентов. Обнаружены оральный мукозит и ограничивающие дозу тромбоцитопения и лейкоцитопения; у одного пациента обнаружен НАНА-ответ. Стабильное состояние заболевания обнаружено у 5 пациентов, для лечения которых применяли самую высокую дозу 60 мКи/м. Хотя было установлено, что средство являлось приемлемым как с позиций безопасности, так и переносимости при применении в указанном диапазоне доз, исследования продемонстрировали только стабилизацию заболевания. Кроме того, в указанных исследованиях обнаружена более высокая частота побочных явлений по сравнению с другими изученными в клинических исследованиях терапиями, основанными на применении не включающих радиоизотопы конъюгатов биологических агентов.
В заявке на патент США 2003/0103985 описана гуманизированная версия VFF-18 (BIWA 4), конъюгированная с майтансиноидом, которую обозначили как BIWI 1, предназначенная для противоопухолевой терапии. Установлено, что BIWI 1 обладал выраженным противоопухолевым действием на мышиных моделях человеческой эпидермоидной карциномы вульвы, плоскоклеточной карциномы глотки и карциномы молочной железы. Неконъюгированная версия, т.е. BIWA 4, не обладала противоопухолевым действием. Для конъюгированного варианта BIWI 1 отсутствуют данные о безопасности или эффективности для людей.
МАт U3 6 представляет собой мышиное моноклональное антитело в виде IgG1, которое получали путем иммунизации клетками человеческой карциномы гипофаринкса линии UM-SCC-22B, и которое отбирали по признаку специфичности в отношении типа рака и ткани. Характеризация антигена с помощью клонирования кДНК и анализа последовательности позволила идентифицировать эпитоп МАт U36, расположенный в домене v6 специфического для кератиноцитов сплайсингового варианта CD44, обозначенного как эпикан. Иммуногистохимические исследования продемонстрировали, что распознаваемый эпитоп локализован в клеточной мембране. Было установлено, что МАт U36 обладало выраженной способностью связываться с 94% плоскоклеточных карцином головы и шеи (HNSCC) и в этих опухолях обнаружено однородное окрашивание клеток.
99m
У 10 пациентов, которых в опыте обрабатывали меченным с помощью Tc МАт U36, обнаружено избирательное накопление антитела при разных типах HNSCC (20,4±12,4% от инъецируемой дозы/кг через 2 дня); отсутствуют данные о побочных действиях, однако у двух пациентов образовались НАМА. В опыте, в котором использовали мышиное МАт U36, меченное радиоактивным йодом, обнаружено 3 случая НАМА в группе из 18 пациентов и избирательное гомогенное поглощение клетками HNSCC. Для снижения антигенности МАт U36 и снижения уровня НАМА создавали химерное антитело, при этом ни химерное, ни исходное МАт U36, не обладало ADCC-активностью. Однако в исследовании не обнаружена противораковая активность немеченого МАт U36.
186
99m
186
2
2
186
Меченное с помощью Re химерное МАт U36 использовали для решения вопроса о возможности применения МАт U36 в качестве терапевтического средства. На этой фазе 1 исследования с использованием возрастающих доз 13 пациентам вводили предварительную (пробную) дозу меченного с помощью Tc химерного МАт U36, а затем меченного с помощью Re-химерного МАт U36. Не обнаружено острых нежелательных явлений. Однако после обработки ограничивающая дозу миелотоксичность (1,5 ГБк/м) обнаружена у двух из трех пациентов и у одного пациента, обработанного максимальной переносимой дозой (1,0 ГБк/м) выявлена тромбоцитопения. Хотя обнаружено определенное воздействие на размер опухолей, эти воздействия не удовлетворяли критериям объективных ответов на лечение. В другом исследовании меченного с помощью Re химерного МАт U36 применяли стратегию, основанную на использовании реинфузии стимулированной колониестимулирующим фактором цельной крови для достижения удвоенной максимально переносимой активности, составлявшей 2,8 Гр. В этом опыте из девяти пациентов с различным видом рака головы и шеи трем потребовалось переливание крови из-за связанной с лекарственным средством анемии. Другие проявления токсичности включали миелотоксичность 3 степени и мукозит 2 степени. Не обнаружено никаких объективных ответов опухолей, хотя было достигнуто стабильное состояние болезни в течение 3-5 месяцев у 5 пациентов.
Вследствие плохого прогноза для страдающих HNSCC пациентов, воздействия болезни на качество жизни и ограниченных вариантов лечения существует большой интерес и, следовательно, необходимость в разработке новых терапий HNSCC. К настоящему времени отсутствуют данные о так называемых «голых» (т.е. неконъюгированных) антителах к CD44, обладающих эффективностью в отношении HNSCC. Так, хотя CD44, вероятно, является потенциальной мишенью для противораковой иммунотерапии, для достижения противораковых действий антител к CD44 необходимо их применение в виде радиоиммуноконъюгата. Однако исследования, проведенные с меченными с помощью радиоактивных изотопов антителами к CD44, продемонстрировали возникновение ассоциированной с такой терапией нежелательной токсичности, сопровождающей получаемые клинические действия. Таким образом, существует необходимость в разработке новых специфических для HNSCC терапий.
В основу настоящего изобретения была положена техническая задача разработать способы и средства, предназначенные для предупреждения, лечения или диагностирования HNSCC с использованием антител к CD44, и согласно некоторым объектам изобретения, прежде всего немеченых антител к CD44.
Данная техническая задача решается с помощью представленных вариантов осуществления изобретения, охарактеризованных в формуле изобретения.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к новым способам предупреждения, лечения или диагностирования плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC), заключающимся в том, что применяют антитела к CD44. Согласно конкретным объектам изобретения применяют антитела к CD44, которые связываются с аминоконцевым доменом внеклеточного домена CD44 и/или которые иммуноспецифически связываются с одним или несколькими, предпочтительно с множеством вариантов человеческого CD44, которые экспрессируются в организме людей. Согласно конкретным объектам изобретения применяют антител к CD44, продуцируемое гибридомой, которая депонирована в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, и их варианты и/или производные, например, химерные и гуманизированные версии РТА-4621. Изобретение относится также к применению антител и их антигенсвязывающих фрагментов, которые конкурируют за связывание с РТА-4621.
Антитела и фрагменты, которые применяют в способах, предлагаемых в изобретении, являются специфическим в отношении CD44, в частности CD44, который экспрессируется на поверхности клетки, и предпочтительно являются специфическими в отношении аминоконцевого внеклеточного домена одного или нескольких вариантов человеческого CD44, например, который экспрессируется на поверхности раковых клеток при HNSCC. Согласно конкретным объектам изобретения антитела, которые применяют в способах, представленных в настоящем описании, представляют собой гуманизированные или химерные версии антитела, продуцируемого гибридомой, которая депонирована в АТСС под регистрационным номером РТА-4621. В конкретных вариантах осуществления изобретения антитела, которые применяют в способах, представленных в настоящем описании, или их антигенсвязывающие фрагменты содержат один или несколько из следующих участков:
H
CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (V), который имеет аминокислотную последовательность RYWMS (SEQ ID NO:3),
H
CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность EVNPDSTSINYTPSLKD (SEQ ID NO:4),
H
CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность PNYYGSRYHYYAMDY (SEQ ID NO:5),
L
CDR1 вариабельной области легкой цепи (V), который имеет аминокислотную последовательность RASQDINNYLN (SEQ ID NO:6),
L
CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность YTSRLHS (SEQ ID NO:7); и
L
CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность QQGSTLPFT (SEQ ID NO:8).
H
H
H
L
L
L
Антитела, подпадающие под объем изобретения, могут содержать также два или большее количество, три или большее количество, четыре или большее количество, пять или большее количество и в некоторых объектах изобретения все гипервариабельные участки, такие как CDR1 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, CDR3 V CDR3, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, CDR1 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8.
Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые применяют в способах, предлагаемых в изобретении, могут содержать:
H
V-домен, который имеет аминокислотную последовательность
EVKLLESGGGLVQPGGSLKLSCATSGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEVNPDSTSINYTPSLKDQFIISRDNAKNTLDLQMSKVSSEDTALYYCTRPNYYGSRYHYYAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:1),
L
и/или V-домен, который имеет аминокислотную последовательность
DIQMTQTTSSLSVSLGDRVTINCRASQDINNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISNLEKEDVATYFCQQGSTLPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:2).
H
L
Конкретными объектами изобретения является применение антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента, которое/который содержит V-домен, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и V-домсн, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2.
Изобретение относится также к применению антитела к CD44 или его антигенсвязывающих фрагментов для лечения, предупреждения или диагностирования HNSCC, где антитело к CD44 является гуманизированным.
Согласно некоторым объектам изобретения гуманизированное антитело к CD44 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
H
V-домен, который имеет аминокислотную последовательность
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLVWVGEVNPDSTSINYTPSLKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRPNYYGSRYHYYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9) или
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLVWIGEVNPDSTSINYTPSLKDQFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRPNYYGSRYHYYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:10)
L
и/или V-домсн, который имеет аминокислотную последовательность
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPFTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:11).
H
L
H
L
H
L
H
L
Конкретным объектом изобретения является гуманизированное антитело к CD44 или его антигенсвязывающий фрагмент, предназначенное/предназначенный для применения для предупреждения, лечения или диагностирования HNSCC у индивидуума, где гуманизированное антитело к CD44 содержит V-домен, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, и V-домен, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, или где антитело к CD44 содержит V-домен, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, и V-домен, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11. В конкретных объектах изобретения индивидуум представляет собой человека. Изобретение относится также к применению гуманизированного антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента для предупреждения, лечения или диагностирования HNSCC у индивидуума, где гуманизированное антитело к CD44 содержит V-домен, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, и V-домсн, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, или где антитело к CD44 содержит V-домен, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, и V-домен, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11.
Согласно некоторым объектам изобретения антитело или его фрагмент, которое/который применяют согласно способам, предлагаемым в изобретении, распознает эпитоп в аминоконцевом домене внеклеточной области CD44, которая имеет аминокислотную последовательность AFDGPITITIV (SEQ ID NO:12).
Антитела к CD44, предназначенные для применения согласно изобретению, можно конъюгировать с активными фрагментами, такими как терапевтические или репортерные фрагменты. Антитела к CD44 можно конъюгировать также с гематогенными клетками из организма индивидуума. Согласно некоторым объектам изобретения терапевтические фрагменты представляют собой фрагменты, для которых в данной области известно благоприятное действие при лечении, предупреждении или диагностировании HNSCC, такие как (но, не ограничиваясь только ими) цитотоксин, фермент, радиоактивный элемент, цитокин, антиметаболит или интерферон.
Изобретение относится также к применению антител к CD44 или их антигенсвязывающих фрагментов в качестве единственного средства лечения или в сочетании с одним или несколькими другими химиотерапевтическими или диагностическими агентами и/или терапиями. Таким образом, изобретение относится к применению антител к CD44 (например, гуманизированных или химерных антител) или их антигенсвязывающих фрагментов в сочетании со стандартным или экспериментальными схемами лечения HNSCC (например, химиотерапия, радиоиммунотерапия или лучевая терапия). Примеры терапевтических агентов, которые являются наиболее предпочтительными для применения в сочетании с CD44-специфическим антителом или его антигенсвязывающим фрагментом согласно способам, представленным в настоящем описании, для предупреждения, лечения или диагностирования HNSCC, включают (но, не ограничиваясь только ими) химиотерапевтические средства, известные в данной области, алкилирующие агенты, антиметаболиты, продукты естественного происхождения и гормоны. Комбинированные терапии, представленные в настоящем описании, могут позволять снижать дозы антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента и/или уменьшать частоту введения антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента индивидууму, который страдает HNSCC, для достижения терапевтического или профилактического действия. Согласно способам, представленным в настоящем описании, антитела к CD44 или их антигенсвязывающие фрагменты можно вводить совместно, вводить одновременно и/или вводить последовательно с одним или несколькими другими химиотерапевтическими или диагностическими агентами, или их можно применять в сочетании с лучевой терапией или хирургическим вмешательством. Введение антител, фрагментов и/или дополнительных агентов или терапий можно осуществлять с помощью любых методов, известных в данной области, которые пригодны для обеспечения достижения конкретным агентом или терапией месту локализации опухоли. Указанное введение может быть парентеральным (например, IV, внутримышечное или подкожное введение), оральным или в некоторых объектах изобретения, представлять собой непосредственное введение вместо опухоли или вместо ожидаемого распространения опухоли или рецидива опухоли. Антитела, фрагменты и/или композиции можно применять также в виде форм с пролонгированным высвобождением.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, предназначенной для предупреждения, лечения или диагностирования HNSCC у индивидуума, которая содержит (I) в терапевтически эффективном количестве антитело к CD44, представленное в настоящем описании (например, химерное или гуманизированное антитело), или его антигенсвязывающий фрагмент; и (II) фармацевтически приемлемый носитель.
H
H
H
L
L
L
В настоящем описании представлены способы диагностирования HNSCC у индивидуума, который, как предполагается, имеет указанное заболевание, заключающиеся в том, что: (I) приводят в контакт биологический образец, полученный из организма индивидуума, с взятым в эффективном количестве антителом к CD44, представленным в настоящем описании, или его антигенсвязывающим фрагментом; и (II) определяют связывание антитела или его фрагмента, где выявление уровня антитела или фрагмента, превышающего фоновый и стандартный уровень, свидетельствует о наличии HNSCC у индивидуума. Для облегчения выявления антитела к CD44 или его фрагмента можно применять выявляемый маркер, известный в данной области. Изобретение относится также к диагностическому или прогностическому набору, предназначенному для выявления HNSCC в образце ткани из организма пациента, для которого известно или предполагается наличие HNSCC-клеток. Согласно некоторым объектам изобретения набор содержит средства выявления CD44, в частности экспрессируемого HNSCC-клетками и/или в образцах ткани из организма индивидуума, для которого известно или предполагается наличие HNSCC-клеток. Набор может содержать (1) моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой, которая депонирована в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, (2) антитело, которое конкурирует за связывание с моноклональным антителом, продуцируемым гибридомой, которая депонирована в АТСС под регистрационным номером РТА-4621; (3) антитело, которое содержит один или несколько из следующих участков: CDR1 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:3, CDR2 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:4, CDR3 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5, CDR1 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:6, CDR2 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:7 и CDR3 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:8; или (4) антигенсвязывающий фрагмент антитела, указанного в подпункте (1), (2) или (3). Набор может включать также один или несколько следующих компонентов: субстрат или контейнер для содержания биологического образца, референс-стандарт(ы) или биомаркер(ы) в растворе или в твердой форме (например, CD44 или пептид, специфически связанный с антителом, продуцируемым антителом РТА-4621), одно или несколько антител, специфических в отношении биомаркеров (например, антитело РТА-4621 и его антигенсвязывающийся фрагмент или вариант, или производное), и инструкции по осуществлению анализа(ов), предназначенного(ых) для выявления биомаркеров с использованием содержимого набора.
Еще одним объектом изобретения является предложенный способ лечения HNSCC с помощью антитела РТА-4621 или его антигенсвязывающего фрагмента. Другим объектом изобретения является предложенный способ диагностирования HNSCC с помощью антитела РТА-4621 или его антигенсвязывающего фрагмента. Следующим объектом изобретения является предложенное применение РТА-4621 или его антигенсвязывающего фрагмента для прогнозирования или определения стадии HNSCC. Следующим объектом изобретения является предложенное применение РТА-4621 или его антигенсвязывающего фрагмента для выбора пациента, у которого можно лечить HNSCC.
H
L
H
L
H
L
H
L
H
H
H
L
L
L
Согласно некоторым объектам изобретения антитела к CD44 и их антигенсвязывающие фрагменты, предназначенные для применения в способах, представленных в настоящем описании, могут содержать аминокислотную последовательность V-области и/или V-области, которая по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности V-области и/или V-области мышиного моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, которая депонирована в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, при условии, что антитела к CD44 или их фрагменты обладают способностью специфически связываться с CD44 и/или конкурируют за связывание с РТА-4621. Изобретение относится также к применению антител к CD44 или их антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат аминокислотную последовательность V-области и/или V-области, которая по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична V-области, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и/или V-области, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, при условии, что антитела к CD44 или их фрагменты обладают способностью специфически связываться с CD44 и/или конкурируют за связывание с РТА-4621. Некоторыми объектами настоящего изобретения являются антитела или их фрагменты, которые специфически связываются с CD44 и которые содержат аминокислотную последовательность одного или нескольких CDR, которая по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности одного или нескольких CDR мышиного моноклонального антитела, продуцируемого гибридомой, которая депонирована в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, при условии, что антитела или их фрагменты обладают способностью специфически связываться с CD44 и/или конкурируют за связывание с РТА-4621. Изобретение относится также к применению антител к CD44 или их антигенсвязывающих фрагментов, которые содержат аминокислотную последовательность одного или нескольких CDR, которые по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичны одному или нескольким из следующих участков: CDR1 V, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3, CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4, CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, CDR1 V, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 и CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, при условии, что антитела или их фрагменты обладают способностью специфически связываться с CD44 и/или конкурируют за связывание с РТА-4621.
H
L
H
L
Настоящее изобретение относится также к применению гуманизированных антител и фрагментов антител, специфических в отношении CD44, или конкурирующих за связывание с антителом РТА-4621, в котором одна или несколько областей одного или нескольких CDR вариабельных доменов тяжелой и/или легкой цепи человеческого антитела (антитело-реципиент) заменена(ы) аналогичными частями одного или нескольких CDR моноклонального антитела-донора, которое специфически связывается с CD44, например, мышиного моноклонального антитела, продуцируемого клоном РТА-4621. Предпочтительно гуманизированное антитело специфически связывается с тем же эпитопом, что мышиное антитело-донор. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, изобретение относится в целом к трансплантации CDR антител. Согласно конкретным объектам настоящее изобретения относится к применению гуманизированных антител или фрагментов антител, которые специфически связываются с CD44 и/или конкурируют за связывание с РТА-4621, где гуманизированные антитела или фрагменты антител содержат аминокислотную последовательность V-области и/или V-области, которая по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична V-области, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, и/или V-области, аминокислотная последовательность которой представлена в of SEQ ID NO:11.
H
L
H
H
H
H
L
L
L
Антитела к CD44 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые можно применять согласно способам, представленным в настоящем описании, могут кодироваться нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, кодирующей V-область, полную тяжелую цепь, V-область или полную легкую цепь мышиного моноклонального антитела РТА-4621. Согласно другим объектам изобретение относится к применению антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего V-область, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, гибридизующейся в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10. Согласно другим объектам изобретение относится к применению антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего VL-область, которая кодируется нуклеотидной последовательностью, гибридизующейся в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:11. Изобретение относится также к применению антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего один или несколько CDR, кодируемого(ых) нуклеотидной последовательностью, гибридизующейся в строгих условиях с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует один или несколько CDR мышиного моноклонального антитела РТА-4621, или с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько из следующих участков: CDR1 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:3, CDR2 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:4, CDR3 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:5, CDR1 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:6, CDR2 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:7, и CDR3 V, аминокислотная последовательность которого представлена в SEQ ID NO:8. Строгие условия гибридизации включают (но не ограничиваясь только ими) (I) гибридизацию со связанной с фильтром ДНК в 6×растворе хлорида натрия/цитрата натрия (SSC) примерно при 45°С, с последующей(ими) одной или несколькими отмывками в 0,2×SSC/0,1% ДСН примерно при 50-65°С; (II) очень строгие условия, такие как гибридизация со связанной с фильтром ДНК в 6×SSC примерно при 45°С, с последующей(ими) одной или несколькими отмывками 0,1×SSC/0,2% ДСН примерно при 60°С, или (III) любые другие строгие условия гибридизации, известные специалистам в данной области.
L
Изобретение относится также к применению вектора, который содержит нуклеиновые кислоты, представленные в настоящем описании (т.е. нуклеиновые кислоты, кодирующие V-области, VL-области и/или один или несколько CDR антитела к CD44 или его антигенсвязывающие фрагменты). В определенных вариантах осуществления изобретения указанный вектор представляет собой экспрессионный вектор и нуклеотидные последовательности, которые кодируют аминокислотные последовательности, представленные в настоящем описании, функционально связаны с нуклеотидными регуляторными последовательностями или последовательностями, кодирующими аминокислотные регуляторные последовательности (например, сигналы транскрипции, трансляции, транслокации), необходимые для правильной экспрессии кодируемых аминокислотных последовательностей. Изобретение относится также к клеткам-хозяевам, которые содержат векторы или нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или фрагменты антител, представленные в настоящем описании.
Другие объекты и преимущества настоящего изобретения должны стать очевидными из представленного ниже описания, в котором приведены с целью иллюстрации и примера, определенные варианты осуществления настоящего изобретения.
Определения
В целом, использованные в разделах «Краткое изложение сущности изобретения», «Подробное описание изобретения», «Примеры» и «Формула изобретения» понятия и фразы имеют указанные ниже значения.
1
2
3
4
1
2
Понятие «антитело» в контексте настоящего изобретения применяют в наиболее широком смысле, и оно относится, в частности, к индивидуальным моноклональным антителам (включая агонстические, антагонистические и нейтрализующие антитела, деимунизированные (с пониженной иммуногенностью), мышиные, химерные, гуманизированные или человеческие антитела), композиции антител с полиэпитопной специфичностью, одноцепочечные антитела, димерные антитела (диабоди), тримерные антитела (триабоди), иммуноконъюгаты, синтетические антитела, камелизированные антител, одноцепочечные Fv(scFv), Fab-фрагменты, F(ab')-фрагменты, связанные дисульфидным мостиком Fv(sdFv), внутриклеточные антитела (интрабоди) и антиидиотипические антитела (анти-Id) (включая, например, анти-Id и анти-анти-Id антитела к антителам, предлагаемым в изобретении) и эпитопсвязывающие фрагменты любого из перечисленные выше антител. В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е. молекулы, содержащие антигенсвязывающий сайт. Изобретение относится к применению молекул иммуноглобулинов любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA) или подкласса.
2
«Фрагмент антитела» или «антигенсвязывающий фрагмент» содержит часть интактного антитела, предпочтительно включающую его антиген- или эпитопсвязывающую или варабельную область. Примерами фрагментов антител являются фрагменты, длина которых меньше длины полнорназмерных антител, например. Fab, Fab', F(ab'), а также конструкции вариабельных доменов антител, например, Fv-фрагменты; димерные антитела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; одноцепочечные антитела, однодоменные молекулы антител, слитые белки, рекомбинантные белки и мультиспецифические антитела, образованные из фрагмента(ов) антител.
2
«Гуманизированные» и/или «химерные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител/иммуноглобулинов представляют собой антитела, которые содержат специфические химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab') или другие антигенсвязывающие подпоследовательности антител), для которых характерно снижение ответа в виде человеческого антимышиного антитела (НАМА), человеческого антихимерного антитела (НАСА) или человеческого античеловеческого антитела (НАНА) по сравнению с исходным антителом, и которые содержат необходимые участки (например, CDR, антигенсвязывающую(ие) область(и), вариабельную(ые) область(и), вариабельный(ые) домен(ы) и т.д.), выведенные из нечеловеческого иммуноглобулина, необязательно для воспроизводства требуемого действия, которые при этом сохраняют характеристики связывания, сопоставимые с характеристиками с нечеловеческого иммуноглобулина. Главным образом, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельных участков (CDR) антитела-реципиента заменены на остатки из CDR антител видов кроме человека (антитело-донор), таких как мыши, крысы или кролики, имеющих требуемую специфичность, аффинность и свойство (например, специфичность в отношении CD44). В некоторых вариантах остатки Fv каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина заменяют на соответствующие остатки FR нечеловеческого иммуноглобулина. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не присутствуют ни в антителе-реципиенте, ни в импортируемых CDR- или FR-последовательностях. Эти модификации осуществляют с целью дополнительной очистки антитела и оптимизации его характеристик. В целом, гуманизированное антитело должно содержать практически полностью по меньшей мере один, и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или практически все CDR-участки соответствуют участкам нечеловеческого иммуноглобулина и все или практически все остатки FR представляют собой остатки консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Предпочтительно гуманизированное антитело должно содержать также по меньшей мере часть константой области иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина.
H
H
L
L
В контексте настоящего описания понятие «гипервариабельная область» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельная область содержит аминокислотные остатки из «определяющего комплементарность участка» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 31-35 (HI), 50-65 (H2) и 95-102 (ИЗ) в вариабельной области тяжелой цепи согласно номенклатуре Кэбота (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (т.е. остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельной области легкой цепи и 26-32 (HI), 53-55 (H2) и 96-101 (НЗ) в вариабельной области тяжелой цепи (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, сс.901-917). Остатки «каркасного участка» или «FR» представляют собой остатки вариабельной области, отличные от остатков гипервариабельного участка, как он определен в настоящем описании. В контексте настоящего описания понятия «вариабельный домен (вариабельная область) тяжелой цепи», «V-домен» и/или «V» применяют взаимозаменяемо, и они относятся к гипервариабельной области (включающей как CDR-участки, так и каркасные участки) тяжелой цепи антитела; понятия «вариабельный домен (вариабельная область) легкой цепи», «V-домен» и/или «V» применяют взаимозаменяемо, и они относятся к гипервариабельной области (включающей как CDR-участки, так и каркасные участки) легкой цепи антитела.
В контексте настоящего описания клеточные линии гибридомы, а также продуцируемые ими антитела обозначают с помощью регистрационного номера АТСС РТА-4621. Для внутренних целей это антитело обозначают как ARH460-16-2. Таким образом, ссылка на РТА-4621 может относиться к клону клеток гибридомы, депонированной в АТСС, которая продуцирует антитело к CD44, или может относиться к самому продуцируемому гибридомой антителу к CD44. Ссылка на РТА-4621 может относиться также к антителу, обозначенному для внутренних целей как ARH460-16-2. Таким образом, в контексте настоящего описания химерные версии РТА-4621 можно обозначать как «chPTA-4621» или «chARH460-16-2», а гуманизированные версии РТА-4621 можно обозначать как «huPTA-4621» или «huARH460-16-2». Специалисту в данной области из контекста должно быть сразу очевидно, делается ли ссылка на антитело или на клон гибридомы. Мышиное моноклональное антитело к CD44 РТА-4621 открыто с помощью методологии создания специфических для пациента противораковых антител, описанной в US 6180357. Согласно указанному процессу мышей иммунизировали клетками как из биопсии пациента, страдающего раком легкого, так и клеточной линией рака легкого NCI-H460. Антитело, описанное в US 7252821 и клеточная линии гибридомы, экспрессирующая антитело, депонированы в Американской коллекции типовых культур, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 4 сентября 2002 г. под регистрационным номером РТА-4621. Для этого антитела продемонстрирована выраженная противоопухолевая активность на нескольких доклинических моделях, созданных с использованием ксенотрансплантатов, включая как модели для изучения превентивного действия, так и созданные in vivo модели человеческого рака молочной железы (как описано в US 7252821), рака печени (как описано в заявке на патент США 11/786165) и рака предстательной железы (как описано в US 7507537). Кроме того, продемонстрировано, что обработка РТА-4621 в сочетании с химиотерапевтическим лекарственным средством (цисплатин) обладала противоопухолевой активностью на созданной in vivo модели рака предстательной железы (там же). Химерные и гуманизированные версии мышиного антитела PTA-4621/ARH460-16-2 описаны в заявке на патент США 11/807887.
Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, образующие популяцию, идентичны за исключением возможных встречающихся в естественных условиях мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифическими, их мишенью является один антигенный сайт.Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, мишенью которых являются различные антигенные детерминанты (эпитопы), мишенью каждого моноклонального антитела является одна детерминанта на антигене. Помимо их специфичности, преимуществом моноклональных антител является то, что их можно синтезировать в форме, незагрязненной другими антителами. Прилагательное «моноклональный» указывает на характер антитела, т.е. на тот факт, что оно получено из практически гомогенной популяции антител, а не сконструировано для его производства каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно получать с помощью метода гибридом (мышиной или человеческой), впервые описанного Kohler и др., Nature, 256, 1975, с.495, или можно получать методами рекомбинантной ДНК (см., например, US 4816567). «Моноклональные антитела» можно выделять также из фаговых библиотек антител с помощью методов, описанных у Clackson и др., Nature, 352, 1991, cc.624-628 и Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, сс.581-597.
Понятие «модифицирующее злокачественное заболевание антитело» (CDMAB) относится к моноклональному антителу, модифицирующему процесс злокачественного заболевания таким образом, который оказывает благоприятное воздействие на пациента, например, путем снижения опухолевой нагрузки или пролонгирования продолжительности жизни имеющих опухоли индивидуумов, и к его антителам-лигандам.
Антитело или фрагмент антитела, которое/который «связывается» или «специфически связывается» с представляющим интерес антигеном, например, CD44, представляет собой антитело или его фрагмент, обладающее/обладающий способностью связываться с антигеном с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве терапевтического или диагностического агента для направленного воздействия на экспрессию антигена в клетках. Если антитело представляет собой антитело, связывающееся с CD44, то, как правило, оно главным образом связывается с CD44, а не с другими рецепторами, и для него не характерно случайное связывание, такое как неспецифический контакт с Fc, или связывание с пост-трансляционными модификациями, обычными для других антигенов, и оно может представлять собой антитело, для которого не характерна выраженная перекрестная реакция с другими белками. Методы выявления антитела, которое связывается с представляющим интерес антигеном, хорошо известны в данной области и могут представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) такие анализы как FACS, клеточный ELISA и Вестерн-блоттинг.
В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антитела или фрагменты антител, которые можно применять согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, специфически связываются с CD44, в частности, который экспрессируется на HNSCC, и/или конкурирует за связывание с CD44 с мышиным моноклональным антителом РТА-4621, что можно определять с помощью стандартных методов, известных в данной области. CD44 опосредует прямую связь между внеклеточным матриксом и цитосклетом через их консервативные внеклеточные НА-связывающие области и внутриклеточные анкириновые связывающие области. Белки CD44 высвобождаются также в растворимой форме (solCD44) под действие протеаз, и их в норме можно обнаруживать в кровотоке и слюне. Рецептор CD44 содержит семейство изоформ, экспрессируемых во многих типах клеток. Эти изоформы образуются в результате альтернативного сплайсинга области вариабельных экзонов (экзоны 5-14), которые присутствуют в мРНК CD44, что приводит к образованию различных «стеблей», соединяющих аминоконцевой домен внеклеточной области с трансмембранным доменом. Обнаруженные изоформы CD44 обозначают как стандартный CD44 (CD44s) если они присутствуют в здоровых клетках, как эпителиальный CD44 (CD44E) или CD44v8-10 и CD44v3-10 в кератиноцитах. Другие изоформы вариантов CD44 (CD44v) по-разному экспрессируются в некоторых опухолях. В конкретных объектах изобретения антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, предназначенные для применения в способах, предлагаемых в изобретении, иммуноспецифически связываются с аминоконцевым доменом внеклеточной области CD44, при этом они обладают специфичностью в отношении многих, предпочтительно всех, функциональных изоформ CD44, экспрессируемых в организме человека. Конкретные объекты изобретения относятся к применению антител и их антигенсвязывающих фрагментов, которые специфически связываются с CD44, экспрессируемым HNSCC. В некоторых объектах изобретения антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, предназначенные для применения согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, связываются с эпитопом аминоконцевого домена внеклеточной области CD44, который имеет аминокислотную последовательность AFDGPITITIV (SEQ ID NO:12). Предпочтительно антитела, предназначенные для применения согласно способам, представленным в настоящем описании, конкурируют за связывание с CD44 с РТА-4621, что определяют с помощью стандартных методов, известных в данной области.
В настоящем описании понятия «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» применяют взаимозаменяемо, и все такие понятия включают потомство. Подразумевается также, что все потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК вследствие преднамеренных или случайных мутаций. Под объем изобретения подпадает мутантное потомство, обладающее такой же функцией или биологической активностью, что и выявленные у исходной трансформированной клетки. Из контекста ясно следует, когда подразумеваются другие значения.
В контексте настоящего описания фраза «введение непосредственно в область рака или опухоли» и аналогичные фразы относятся к непосредственной или практически непосредственной интродукции, включающей (но, не ограничиваясь только ими) одну или несколько инъекций антител, фрагментов или композиций непосредственно в опухоль или перитум орально, непрерывную или дробную перфузию опухоли или перитуморальную перфузию, интродукции резервуара в опухоль или перитуморально, интродукции устройства для замедленного высвобождения в опухоль или перитуморально, интродукции препаративной формы с замедленным высвобождением в опухоль или перитуморально, непосредственному наложению на опухоль, непосредственной инъекции в артерию, которая практически непосредственно снабжает кровью область опухоли, непосредственной инъекции в лимфатический сосуд, который практически дренируют область опухоли, непосредственной или практически непосредственной интродукции в практически окружающую опухоль полость (например, плевральную полость) или в просвет (например, внутрипузырно). Понятие «псритуморальный» относится к области, расположенной в пределах примерно 10 см, предпочтительно 5 см, более предпочтительно 1 см от опухоли, от области, которая рассматривается как граница опухоли, такой, например, как (но, не ограничиваясь только ею) пальпируемая граница опухоли.
«Непосредственное введение» в контексте предупреждения возникновения или предупреждения рецидива рака обозначает непосредственное введение в область, в которой существует риск развития или рецидива рака.
В контексте настоящего описания понятия «нуклеиновые кислоты», «последовательность нуклеиновой кислоты» и «нуклеотидные последовательности» относятся к молекулам ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), молекулам РНК (например, мРНК), комбинациям молекул ДНК и РНК или гибридным молекулам ДНК/РНК и аналогам молекул ДНК или РНК. Указанные аналоги можно создавать, применяя, например, нуклеотидные аналоги, которые включают (но, не ограничиваясь только ими) инозин или тритилированные основания. Указанные аналоги могут включать также молекулы ДНК или РНК, которые содержат модифицированные каркасы, придающие молекулам дополнительные ценные свойства, такие, например, как устойчивость к нуклеазам или усиленная способность проникать через клеточные мембраны. Нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности могут быть одноцепочечными, двухцепочечными, могут содержать и одноцепочечные, и двухцепочечные участки и могут содержать трехцепочечные участки, но предпочтительно представляют собой двухцепочечную ДНК.
В настоящем описании понятие «гибридизация» или «гибридизуется» может относиться к гибридизации в строгих или расслабленных условиях. Указанные условия гибридизации можно создавать на основе общепринятых протоколов, описанных, например, у Sambrook, Russell, «Molecular Cloning, A Laboratory Manual», изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 2001; Ausubel, «Current Protocols in Molecular Biology», изд-во Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989 или в: «Nucleic acid hybridization, a practical approach», под ред. Higgins и Hames, изд-во IRL Press Oxford, Washington DC, 1985. Выбор условий находится в компетенции специалистов в данной области и его можно определять согласно протоколам, известным в данной области. Так, для определения только специфически гибридизующихся последовательностей, как правило, требуются строгие условия гибридизации и условия отмывки, такие как применение 0,1×SSC, 0,1% ДСН при 65°С. Расслабленные условия гибридизации и отмывки для определения гомологов с не точно комплементарными последовательностями включают применение 6×SSC, 1% ДСН при 65°С. Как хорошо известно, длина зонда и состав нуклеиновой кислоты, подлежащей определению, представляют собой дополнительные параметры условий гибридизации. Следует отметить, что можно вносить вариации в указанные выше условия согласно общепринятым в данной области методам путем включения и/или замены на альтернативные блокирующих реагентов, применяемых для подавления фона в экспериментах по гибридизации. Общепринятыми блокирующими реагентами являются реагент Денхарда, BLOTTO, гепарин, денатурированная ДНК спермы лосося и имеющиеся в продаже патентованные составы. Для включения специфических блокирующих реагентов может требоваться модификация описанных выше условий гибридизации из-за проблем с совместимостью. Гибридизующиеся молекулы нуклеиновых кислот могут представлять собой также фрагменты указанных выше молекул. Указанные фрагменты могут представлять собой нуклеотидные последовательности, которые кодируют белок WAVE1 или его функциональный фрагмент, состоящий по меньшей мере из 12 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере из 15, более предпочтительно по меньшей мере из 18, предпочтительно по меньшей мере из 21 нуклеотида, предпочтительно по меньшей мере из 30 нуклеотидов, еще более предпочтительно по меньшей мере из 40 нуклеотидов и наиболее предпочтительно по меньшей мере из 60 нуклеотидов. Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с любой из вышеуказанных молекул нуклеиновых кислот, включают также комплементарные фрагменты, производные и аллельные варианты этих молекул. Кроме того, понятие «гибридизационный комплекс» относится к комплексу, включающему две нуклеотидные последовательности, который образуется в результате формирования водородных связей между комплементарными основаниями G и С и между комплементарными основаниями А и Т; эти водородные связи можно дополнительно стабилизировать путем «стэкинг»-взаимодействий оснований. Две комплементарные нуклеотидные последовательности, связанные водородной связью, находятся в антипараллельной конфигурации. Гибридизационный комплекс может образовываться в растворе (как, например, при проведении анализа на основе оценки параметров Cot (произведение концентрации РНК на время) или Rot (произведение концентрации ДНК на время)) или между одной нуклеотидной последовательностью, которая присутствует в растворе, и другой нуклеотидной последовательностью, которая иммобилизована на твердой подложке (например, мембраны, фильтры, чипы, булавки или стеклянные предметные стекла, на которых фиксированы, например, клетки). Понятия «комплементарный» или «комплементарность» относятся к встречающемуся в естественных условиях связыванию полинуклеотидов при наличии рекомендованных солей и температурных условий путем спаривания оснований. Например, последовательность «A-G-T» связывается с комплементарной последовательностью «Т-С-А». Комплементарность между двумя одноцепочечными молекулами может быть «частичной», при которой связывается лишь некоторые нуклеиновые кислоты, или может быть полной, когда имеет место общая комплементарность между одноцепочечными молекулами. Степень комплементарности между цепями нуклеиновых кислот оказывает существенное воздействие на эффективность и строгость гибридизации между цепями нуклеиновых кислот. Это особенно важно для реакций амплификации, которые зависят от связывания между цепями нуклеиновых кислот.
H
L
Понятие «гибридизующиеся последовательности» предпочтительно относится к последовательностям, которые являются идентичными по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно по меньшей мере на 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 97% нуклеотидной последовательности, описанной выше (т.е. SEQ ID NO:1-11), которая кодирует V-домен или V-домен антител к CD44 или их антигенсвязывающих фрагментов, предлагаемых в изобретении, и/или CDR указанных антител к CD44 или их фрагментов.
Согласно настоящему изобретению понятие «идентичные» или «процент идентичности» в контексте двух или большего количества нуклеотидных или аминокислотных последовательностей относится к двум или большему количеству последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или которые имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (например, идентичными на 60% или 65%, предпочтительно идентичными на 70-95%, более предпочтительно идентичными по меньшей мере на 95% аминокислотным последовательностям, например SEQ ID NO:1-11, или нуклеотидным последовательностям, кодирующим аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-11) при их сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения или относительно выбранной области, путем использования для оценки алгоритма сравнения последовательностей, известного в данной области, или путем сравнительного анализа вручную и путем визуальной оценки. Последовательности, идентичные, например на 60-95% или более, рассматриваются как практически идентичные. Указанное определение применимо также к комплементу тестируемой последовательности. Специалистам в данной области должно быть очевидно как определять процент идентичности между последовательностями с помощью, например, таких алгоритмов, основой которых является компьютерная программа CLUSTALW (Thompson, Nucl. Acids Res.. 2, 1994, cc.4673-4680) или FASTDB (Brutlag, Сотр. App.Biosci. 6, 1990, cc.237-245), которые известны в данной области.
Хотя в алгоритме FASTDB при расчете, как правило, не рассматривают внутренние не совпадающие делеции или добавления в последовательности, т.е. бреши, это можно корректировать вручную для того, чтобы избежать завышенной оценки % идентичности. Однако в CLUSTALW при расчете идентичности учитываются бреши в последовательностях. Специалистам в данной области доступны также алгоритмы BLAST и BLAST 2.0 (Altschul, Nucl. Acids Res., 25, 1997, сс.3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol., 36, 1993, сс.290-300; Altschul, J. Mol. BioL, 215, 1990, сс.403-410). В программе BLASTN для нуклеотидных последовательностей применяют в качестве задаваемых по умолчанию параметров длину слова (W), равную 11, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=4 и осуществляют сравнение обеих цепей. В применяемой для аминокислотных последовательностей программе BLASTP применяют в качестве задаваемых по умолчанию параметров длину слова (W), равную 3, и ожидание (Е), равное 10. В матрице баллов BLOSUM62 (Henikoff, PNAS, 89, 1989, с.10915) используют выравнивания (В), равные 50, ожидание (Е), равное 10, М=5, N=4, и осуществляют сравнение обеих цепей.
Кроме того, настоящее изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, последовательности которых являются вырожденными при сравнении с последовательностью описанной выше гибридизующейся молекулы. При применении в контексте настоящего изобретения понятие «вырожденная вследствие вырожденности генетического кода» означает, что в результате избыточности генетического кода различные нуклеотидные последовательности кодируют одну и ту же аминокислоту.
Аналогичные компьютерные методы, основанные на использовании BLAST, применяют для поиска идентичных или родственных молекул в базах данных нуклеотидов, таких как GenBank или EMBL. Этот анализ является существенно более быстрым, чем осуществление множества гибридизаций на мембранах. Кроме того, чувствительность компьютерного поиска можно модифицировать для решения вопроса о том, можно ли любое конкретное совпадение классифицировать как точное или сходное. Основой такого поиска является результирующий балл, который определяют следующим образом:
и он учитывает как степень сходства между двумя последовательностями, так и длину совпадения последовательностей. Например, при результирующем балле, равном 40, совпадение должно быть точным с погрешностью 1-2%; а при балле, равном 70, совпадение должно быть точным. Сходные молекулы, как правило, идентифицируют путем отбора тех молекул, для которых результирующие баллы составляют от 15 до 40, хотя и более низкие баллы могут соответствовать родственным молекулам. Другим примером программы, с помощью которой можно осуществлять сравнительный анализ последовательностей, является компьютерная программа CLUSTALW (Thompson, Nucl. Acids Res., 2, 1994, сс.4673-4680) или FASTDB (Brutlag, Comp. App. Biosci. 6, 1990, сс.237-245), которые известны в данной области.
Понятие «лечение или лечить» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, целю которых является предотвращение, облегчение или замедление (уменьшение) целевого патологического состояния или нарушения (например, HNSCC) или одного или нескольких ассоциированных с ним симптомов. В контексте настоящего описания понятие относится также к замедлению возникновения, ингибированию (например, к замедлению или прекращения роста), облегчению воздействий или удлинению жизни пациента, страдающего раком, в частности HNSCC. Пациенты, нуждающиеся в лечении, включают пациентов, у которых диагностировано нарушение, пациентов, у которых предполагается наличие нарушения, пациентов, которые предрасположены к нарушению, а также пациентов, у которых нарушение следует предупреждать. Таким образом, у млекопитающего, подлежащего лечению, наличие нарушения может быть диагностировано или млекопитающее может быть предрасположено, или может быть чувствительным к нарушению. В некоторых вариантах осуществления изобретения лечение предусматривает ликвидацию, удаление, модификацию или контроль первичного, регионального или метастатического рака ткани, что является результатом введения одного или нескольких терапевтических средств согласно способам, предлагаемым в изобретении. В других вариантах осуществления изобретения указанные понятия относятся к минимизации или замедлению распространения рака в результате введения одного или нескольких терапевтических средств индивидууму, страдающему заболеванием. В других вариантах осуществления изобретения указанные понятия относятся к элиминации болезнетворных клеток.
В контексте настоящего описания понятия «предупреждать» и «предупреждение» относятся к предупреждению возникновения и/или рецидива одного или нескольких симптомов ракового заболевания у индивидуума в результате введения профилактического или терапевтического средства.
Воплощение изобретение может оказывать наиболее благоприятное воздействие на индивидуумов, которые рассматриваются, как имеющие риск развития рака, прежде всего потому, что профилактическое лечение начинают до проявления какого-либо признака нарушения (например, на предзлокачественной стадии («предраковое состояние») или на стадии диспластических повреждений, которые можно видеть или не видеть невооруженным глазом, но которые гистологически соответствуют предзлокачественным изменениям). К индивидуумам, «имеющим риск» относятся, например, индивидууму подвергающиеся воздействию канцерогенов, например, при их поглощении, например, путем ингаляции и/или приема внутрь в количествах, которые, как доказано статистически, ускоряют рак у чувствительных особей. К индивидуумам, имеющим риск, относятся индивидуумы, подвергающиеся воздействию ультрафиолетового излучения или имеющие риск в результате воздействия на них окружающей их среды, имеющие риск в связи с их родом деятельности или/или наследственностью, а также индивидуумы, у которых обнаружены признаки предзлокачественного состояния, такого как полипы. Аналогично этому указанное профилактическое лечение может оказывать благоприятное воздействие на индивидуумов с очень ранними стадиями развития рака или развития метастазов (т.е. в организме индивидуума или в конкретной области ткани индивидуума присутствует только одна или лишь небольшое количество аномальных клеток).
В контексте настоящего описания понятие «эффективное количество» и «количество, эффективное в отношении лечения» относится к количеству или концентрации антитела, применяемого в течение периода времени (включая острое или хроническое введение и периодическое или непрерывное введение), введение которых приводит к требуемому действию или физиологическому результату. Эффективные количества антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, представляют собой, например, количества, которые ингибируют развитие рака, например, опухолей и/или опухолевых клеток, улучшается исход для пациента, страдающего раком или имеющего риск возникновения рака, и улучшают результат других противораковых терапий.
Понятия «пациент» и «индивидуум» применяют взаимозаменяемо, и в контексте настоящего описания они относятся к животному, человеку или животному кроме человека, которое лечат или диагностируют согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении.
Понятие «плоскоклеточная карцинома головы и шеи» или HNSCC относится (но, не ограничиваясь только ими) к раку ротовой полости, губ, носовой полости, околоносовой пазухи, глотки, гортани, носоглотки, горла и трахеи.
«Химиотерапевтическое средство» представляет собой химическое соединение, которое можно применять для лечения рака.
«Млекопитающее», подлежащее лечению, представляет собой любое животное, которое согласно классификации относится к млекопитающим, включая человека, мышей, SCID- или «голых» (бестимусных) мышей, домашних и сельскохозяйственных животных и находящихся в зоопарке животных, спортивных или комнатных животных, таких как овцы, собаки, кошки, коровы и т.д. Предпочтительно в контексте настоящего описания млекопитающее представляет собой человека.
В контексте настоящего описания понятие «в сочетании (комбинации)» относится к применению более одного профилактического и/или терапевтического средства, например, профилактического или терапевтического средства, применяемого в дополнении к антителам к CD44 или их антигенсвязывающим фрагментам, представленным в настоящем описании. Применение понятия «в сочетании» не ограничено порядком введения профилактических и/или терапевтических средства индивидууму, страдающему нарушением, например, HNSCC. Первое профилактическое или терапевтическое средство можно вводить перед (например, за 1 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), одновременно или последовательно (например, через 1 мин, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) с введением второго профилактического или терапевтического средства индивидууму, который имеет нарушение или чувствителен к нему. Профилактические или терапевтические средства вводят индивидууму в такой последовательности и с таким интервалом времени, чтобы агент, предлагаемый в изобретении, мог действовать совместно с другим средством, обеспечивая улучшенное благоприятное воздействие по сравнению с иным путем их применения. Любое дополнительное профилактическое или терапевтическое средство можно вводить в любом порядке с другими дополнительными профилактическими или терапевтическим средствами. Понятие «в сочетании» может относиться также к применению антител к CD44 или их антигенсвязывающих фрагментов, представленных в настоящем описании, в комбинации со стандартными противораковыми средствами лечения, известными в данной области, таким, например, как лучевая терапия или хирургическое вмешательство.
В контексте настоящего описания понятие «иммуноконъюгат» относится к любой молекуле или CDMAB, такой/такому, как антитело, химически или биологически связанное с цитотоксинами, радиоактивными агентами, цитокинами, интерферонами, обеспечивающими направленный перенос репортерными фрагментами, ферментами, токсинами, противоопухолевыми лекарственными средствами или терапевтическими средствами. Антитело или CDMAB может быть связано с цитотоксином, радиоактивным агентом, цитокином, интерфероном, обеспечивающим направленный перенос репортерным фрагментом, ферментом, токсином, противоопухолевым лекарственным средством или терапевтическим средством, в любом положении в молекуле, если они обладают способностью связываться с мишенью. Примерами иммуноконъюгатов являются химические конъюгаты антитела и токсина и слитые белки антитело-токсин. Иммуноконъюгаты могут найти конкретное применение в качестве диагностических агентов.
131
211
Радиоактивные агенты, которые можно применять в качестве противоопухолевых средств и/или в сочетании со способами диагностики, представленными в настоящем описании, известны специалистам в данной области. Например, можно применять I или At. Эти изотопы присоединяют к антителу с помощью общепринятых методов (см., например, Pedley и др., Br. J. Cancer 68, 1993, сс.69-73). В альтернативном варианте противоопухолевый агент, который присоединяют к антителу, представляет собой фермент, который активирует пролекарство. Пролекарство может представлять собой соединение, которое при введении должно оставаться в неактивной форме вплоть до достижения области опухоли, где оно превращается в цитотоксичную форму, если его вводят в комплексе с антителом. На практике конъюгат антитело-фермент вводят пациенту и дают локализоваться в области ткани, подлежащей обработке. Затем пациенту вводят пролекарство так, чтобы превращение в цитотоксическое лекарственное средство имело место в области ткани, подлежащей обработке. В альтернативном варианте противоопухолевое средство, конъюгированное с антителом, представляет собой цитокин, такой как интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-4 (IL-4) или фактор некроза опухолей альфа (TNF-α). Антитело обеспечивает направленное введение цитокина в опухоль, таким образом, что цитокин опосредует повреждение или деструкцию опухоли без воздействия на другие ткани. Цитокин сливают с антителом на уровне ДНК с помощью общепринятых методов рекомбинантной ДНК. Можно применять также интерфероны.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг.1 - репрезентативные FACS-гистограммы антител ARH460-16-2 к клеточным линиями HNSCC T.Tn, SCC-15 и Detroit-562 (фиг.1А) и CAL 27 (фиг.1Б), демонстрирующие, что ARH460-16-2 связывается с указанными клеточными линиями. На фиг.1А представлены результаты, полученные для антитела С225 (анти-EGFR), которое служило в качестве контроля; на фиг.1Б - для антитела к CD20 RITUXAN, которое служило в качестве контроля;
на фиг.2 - данные, демонстрирующие воздействие chARH460-16-2 на рост опухолей на модели человеческой HNSCC, созданной с использованием клеток линии T.Tn. Вертикальными штриховыми линиями обозначен период времени, в течение которого внутрибрюшинно вводили антитело. Данные представляют собой средние значения ±CKO;
на фиг.3 - данные, демонстрирующие воздействие химерного антитела РТА-4621 на вес тела мышей, на которых смоделирована человеческая HNSCC, созданная с использованием клеток линии T.Tn. Данные представляют собой средние значения ±СКО;
на фиг.4 - данные, демонстрирующие воздействие гуманизированного антитела РТА-4621 на рост опухолей на модели HNSCC, созданной с использованием клеток линии SCC-15. Вертикальными штриховыми линиями обозначен период времени, в течение которого внутрибрюшинно вводили антитело. Данные представляют собой средние значения ±CKO;
на фиг.5 - данные, демонстрирующие воздействие гуманизированного антитела РТА-4621 на вес тела мышей, на которых смоделирована HNSCC, созданная с использованием клеток линии SCC-15. Данные представляют собой средние значения ±CKO;
на фиг.6 - данные, демонстрирующие воздействие гуманизированного антитела РТА-4621 на рост опухолей на модели HNSCC, созданной с использованием клеток линии Detroit 562. Вертикальными штриховыми линиями обозначен период времени, в течение которого внутрибрюшинно вводили антитело. Данные представляют собой средние значения ±CKO;
на фиг.7 - данные, демонстрирующие воздействие гуманизированного антитела РТА-4621 на вес тела мышей, на которых смоделирована HNSCC, созданная с использованием клеток линии Detroit 562. Данные представляют собой средние значения ±CKO;
на фиг.8 - данные, демонстрирующие воздействие гуманизированного антитела РТА-4621 на относительный объем опухолей на модели HNSCC, созданной с использованием клеток линии CAL 27;
на фиг.9 - данные, демонстрирующие воздействие гуманизированного антитела РТА-4621 на рост опухолей на модели HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата CAL 27. Объем опухолей представлен в виде среднего значения для группы ±CKO. Вертикальными штриховыми линиями обозначены первый и последний дни дозирования;
на фиг.10 - данные, демонстрирующие воздействие гуманизированного антитела РТА-4621 на вес тела мышей, на которых смоделирована HNSCC, созданная с использованием клеток линии CAL 27. Вес тела представлен в виде среднего значения для группы  ±CKO;
H
H
H
H
на фиг.11 - аминокислотная последовательность V-области мышиного моноклонального антитела РТА-4621 (SEQ ID NO:1). Остатки в последовательности пронумерованы в соответствии с номенклатурой Кэбота. CDR подчеркнуты и дополнительно выделены с помощью штриховых линий над последовательностью; CDR1 V (SEQ ID NO:3) соответствуют остатки 31-35, CDR2 V (SEQ ID NO:4) соответствуют остатки 50-65 и CDR3 V (SEQ ID NO:5) соответствуют остатки 95-102;
L
L
L
L
на фиг.12 - аминокислотная последовательность V-области мышиного моноклонального антитела РТА-4621 (SEQ ID NO:2). Остатки в последовательности пронумерованы в соответствии с номенклатурой Кэбота. CDR подчеркнуты и дополнительно выделены с помощью штриховых линий над последовательностью; CDR1 V (SEQ ID NO:6) соответствуют остатки 24-34, CDR2 V (SEQ ID NO:7) соответствуют остатки 50-67 и CDR3 V (SEQ ID NO:8) соответствуют остатки 89-97;
H
на фиг.13 - аминокислотные последовательности двух альтернативных гуманизированных V-областей, созданных на основе мышиного моноклонального антитела РТА-4621 (SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10). Остатки в последовательности пронумерованы в соответствии с номенклатурой Кэбота;
L
на фиг.14 - аминокислотная последовательность гуманизированной V-области, созданной на основе мышиного моноклонального антитела РТА-4621 (SBQ ID NO:11). Остатки в последовательности пронумерованы в соответствии с номенклатурой Кэбота.
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении решена указанная техническая задача, при этом неожиданно было установлено, что антитело к CD44 РТА-4621 обладает эффективностью в отношении лечения HNSCC в виде «голого» (т.е. неконъюгированного) антитела. В частности, в противоположность применяемой ранее терапии на основе антител к CD44 на созданных моделях HNSCC, неконъюгированные химерные и гуманизированные версии РТА-4621 существенно ингибировали и/или уменьшали рост опухолей на моделях HNSCC, созданных с использованием ксенотрансплантатов клеток линий T.Tn, SCC-15, Detroit 562 и Cal 27.
Таким образом, изобретение относится к способам предупреждения, лечения и/или облегчения клинического состояния у пациентов, страдающих HNSCC, заключающимся в том, что применяют антитела к CD44, в частности, антитела к CD44, которые конкурируют за связывание с мышиным моноклональным антителом РТА-4621, согласно методам, известным в данной области, и/или антитела к CD44, которые иммуноспецифически связываются с аминоконцевым доменом внеклеточной области CD44 и распознают одну или несколько изоформ CD44, экспрессируемых в организме человека. Конкретными объектами изобретения являются способы (I) уменьшения размера опухолей, скорости роста, инвазивности, степени злокачественности и/или риска рецидива HNSCC, (II) удлинения периода времени без признаков заболевания после лечения и/или (III) улучшение дыхательной, глотательной и/или речевой функции у пациента, страдающего HNSCC, заключающиеся в том, что вводят пациенту в эффективном количестве антитело к CD44, представленное в настоящем описании, или его антигенсвязывающий фрагмент. Клиническое улучшение можно определять субъективно или объективно, например, оценивая способность индивидуума к менее затрудненному дыханию, способность индивидуума проглатывать жидкости в сравнении с твердыми частицами, степень заторможенности, качества или громкости речи, и другие признаки, известные в клинической области.
Клинические результаты лечения рака с помощью способов, предлагаемых в изобретении, хорошо известны специалисту в соответствующей области, такому как врач. Например, стандартные медицинские анализы, предназначенные для количественной оценки клинических маркеров рака, могут представлять собой надежные индикаторы эффективности лечения. Указанные анализы могут представлять собой (но, не ограничиваясь только ими) физикальное обследование, оценку работоспособности, определение маркеров болезни, ЭКГ с регистрацией 12 отведений, количественную оценку опухоли, биопсию ткани, цитоскопию, цитологию, расчет наиболее длинного диаметра опухоли, радиографию, цифровую визуализацию опухоли, оценку жизненно важных признаков, определение веса, регистрацию нежелательных явлений, оценку случаев инфекционных болезней, оценку сопутствующего медикаментозного лечения, оценку боли, химический анализ крови или сыворотки, анализ мочи, КТ-сканирование и фармакокинетический анализ. Кроме того, можно определять синергетическое действие комбинированной терапии, включающей применение антитела к CD44, фрагмента или композиции, представленных в настоящем описании, согласно способам, предлагаемым в изобретении, и другой противораковой терапии, путем сравнения с пациентами, подвергающимися монотерапии.
В частности, в случае HNSCC можно оценивать улучшение дыхания, глотания, речевой функции и определенных параметров качества жизни. Кроме того, можно оценивать ремиссию HNSCC с помощью критериев, известных специалисту в данной области, например, описанных у Therasse и др., «New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada», J Natl Cancer Inst. 92, 2000, сс.205-216.
В конкретных вариантах осуществления изобретения рак представляет собой рак, который можно лечить путем непосредственного введения антител к CD44, фрагментов или композиций, представленных в настоящем описании. Например, опухолевая масса опухоли-мишени может располагаться близко к поверхности коже. В другом примере пораженная болезнью ткань может быть капсулирована в цисту или находиться практически погруженной в каверну, такую как (но, не ограничиваясь только ею) полость. Антитело к CD44, фрагмент или композицию, представленные в настоящем описании, можно вводить в эффективной дозе с помощью различных путей введения. Для непосредственного введения (например, инъекции внутрь опухоли) в организм требуются существенно более низкие общие дозы указанных антител к CD44 или их фрагментов по сравнению с системным внутривенным введением. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что при местном введении можно использовать более низкие дозы для организма и в таких случаях можно ожидать, и это является желательным, присутствие низкого уровня иммунотоксина в циркулирующей плазме. В указанных случаях антитело к CD44 или его антигенсвязывающий фрагмент, представленное/представленный в настоящем описании, можно вводить внутрь опухоли в общей дозе на цикл, эквивалентной или более низкой, чем максимальная переносимая доза, определенная при изучении безопасности, но при этом дозу стандартизуют относительно объема опухоли. В определенных вариантах осуществления изобретения дозу следует вводить в объеме, не превышающим примерно 20-50% от объема опухоли.
Изобретение относится также к способам снижения риска постхирургических осложнений, заключающимся в том, что вводят в эффективной дозе антитело к CD44, фрагмент или композицию, которые представлены в настоящем описании, до, в течение или после хирургического вмешательства, применяемого для лечения HNSCC.
Изобретение относится также к способам предупреждения возникновения, предупреждения или замедления рецидива или уменьшения скорости рецидива HNSCC, заключающимся в том, что вводят (например, путем непосредственного введения) пациенту, который нуждается в этом, в эффективном количестве антитело к CD44, фрагмент или композицию, которые представлены в настоящем описании. Непосредственное введение антитела к CD44, фрагмента или композиции, которые представлены в настоящем описании, пациенту, нуждающемуся в таком лечении, может приводить к применению пониженных доз другой противораковой терапии, обладающей клинически значимой эффективностью. Указанная эффективность другой противораковой терапии, применяемой в пониженной дозе, может не иметь места без применения способов, предлагаемых в настоящем изобретении. Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы лечения опухоли или рака, заключающиеся в том, что применяют в пониженной дозе одну или несколько других противораковых терапий.
Изобретение относится также к способам повышения чувствительности опухоли или рака к одной или нескольким другим противораковым терапиям, заключающимся в том, что вводят антитело к CD44, фрагмент или композицию, которые представлены в настоящем описании. В не ограничивающем объем изобретения варианте осуществления изобретения другая противораковая терапия представляет собой химиотерапию, которая, как известно в данной области, обладает активностью в отношении HNSCC. В другом, не ограничивающем объем изобретения варианте осуществления изобретения другая противораковая терапия представляет собой облучение. Другие противораковые терапии можно применять до, перекрывая, одновременно и/или после введения антитела к CD44, фрагмента или композиции, которые представлены в настоящем описании. При одновременном применении антитела к CD44, фрагмента или композиции, которые указаны в настоящем описании, и другой противораковой терапии их можно вводить в виде одной препаративной формы или в виде отдельных препаративных форм, и при раздельном введении необязательно можно применять различные пути введения. Таким образом, комбинация одного или нескольких иммунотоксинов и одной или нескольких других противораковых терапий может обладать синергетическим действием в отношении уничтожения опухоли или рака.
H
L
H
H
H
L
L
L
H
L
H
L
H
L
H
H
H
L
L
L
Антитела к CD44, предназначенные для применения в способах, предлагаемых в изобретении, или их антигенсвязывающие фрагменты могут содержать V-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:I, SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, V-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO:11, и/или один или несколько из следующих участков: CDR1 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, CDR1 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8. Конкретным вариантом осуществления изобретения является применение антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего V-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, и V-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2. Другим вариантом осуществления изобретения является применение антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего V-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:9, и V-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11, или содержащего V-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:10, и V-область, которая имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:11. Конкретным вариантом осуществления изобретения является применение антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего каждый из перечисленных ниже CDR: CDR1 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3, CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:4, CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:5, CDR1 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:6, CDR2 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:7, и CDR3 V, который имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:8.
Антитела к CD44 или их антигенсвязывающие фрагменты, предназначенные для применения в способах, предлагаемых в изобретении, можно (I) характеризовать в отношении специфического связывания с CD44, в частности, с аминоконцевым доменом внеклеточной области CD44; (II) характеризовать в отношении специфического связывания с эпитопом аминоконцевого домена внеклеточной области CD44, которая имеет аминокислотную последовательность AFDGPITITIV (SEQ ID NO:12); или (III) можно характеризовать по способности конкурировать за связывание с мышиным моноклональным антителом РТА-4621, с использованием любого иммунологического или биохимического метода, известного в данной области для указанной характеризации, включая количественную оценку взаимодействия (специфического) антитела с CD44 или его эпитопом. Специфическое или конкурентное связывание антитела, предлагаемого в изобретении, с CD44 или его эпитопом можно определять, например, с использованием иммунологических или биохимических методов, включая (но, не ограничиваясь только ими) ELISA-анализ, анализы на основе поверхностного плазменного резонанса (SPR), анализ иммунопреципитации, аффинную хроматографию и уравновешивающий диализ. Иммуноанализы включают (но, не ограничиваясь только ими) системы конкурентного и неконкурентного анализа с использованием таких методов как Вестерн-блоттинг, радиоиммуноанализы, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), «сэндвич»-иммуноанализы, анализы иммунопреципитации, реакции с преципитином, реакции с преципитином с использованием диффузии в геле, анализы иммунодиффузии, анализы агглютинации, анализы фиксации комплемента, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммуноанализы, иммуноанализы с использованием белка А, выше перечислены лишь некоторые из них. Указанные анализы являются рутинными и хорошо известны в данной области.
Гуманизированные антитела, предлагаемые в изобретении, можно анализировать также, используя любые известные в данной области анализы на основе поверхностного плазменного резонанса для характеризации кинетических параметров взаимодействия антитела с антигеном, например, CD44. Согласно настоящему изобретению можно применять любое поступающее в продажу устройство для SPR, известное в данной области.
Изобретение относится также к применению CDMAB, например, антител к CD44 или их антигенсвязывающих фрагментов, с которыми связаны представляющие собой мишень или репортерные фрагменты. Фрагменты-мишени представляют собой первые компоненты связывающихся пар. Противоопухолевые фрагменты, например, конъюгируют со вторыми компонентами указанных пар и тем самым обеспечивают их непосредственное внесение в сайт, с которым связан антигенсвязывающий белок. Репрезентативным примером связывающейся пары является авидин и биотин. В предпочтительном варианте осуществления изобретения биотин конъюгируют с антигеном-мишенью CDMAB, предлагаемого в настоящем изобретении, и тем самым создают мишень для противоопухолевого агента или другого фрагмента, конъюгированного с авидином или стрептавидином. В альтернативном варианте биотин или другой аналогичный фрагмент связывают с антигеном-мишенью CDMAB, предлагаемого в настоящем изобретении, и применяют в качестве репортера, например, в диагностической системе, в которой продуцирующий выявляемый сигнал агент конъюгирован с авидином или стрептавидином. Кроме того, CDMAB, предлагаемый в изобретении, при применении согласно способам, предлагаемым в изобретении, можно конъюгировать с терапевтическим агентом или фрагментом, представляющим собой лекарственное средство, который модифицирует данный биологический ответ. Терапевтические агенты или фрагменты, представляющие собой лекарственное средство, не ограничены классическими химическими терапевтическими агентами. Например, фрагмент, представляющий собой лекарственное средство, может представлять собой белок или полипептид, обладающий требуемой биологической активностью. Указанные белки могут представлять собой, например, токсин (например, абрин, рицин А, экзотоксин Pseudomonas, дифтерийный токсин, рицин, гелонин) и фермент, белок (например, фактор некроза опухолей), интерферон (например, α-интерферон (IFN-α), β-интерферон (IFN-β)), проапоптозный агент, тромботический агент, антиангиогенный агент (например, ангиостатин, эндостатин) или модификатор биологического ответа (например, лимфокин, колониестимулирующий фактор макрофагов или фактор роста), протеазу или рибонуклеазу. CDMAB, предназначенный для применения в способах, предлагаемых в изобретении, можно конъюгировать также с обладающими терапевтической активностью остатками, такими как радиоактивные продукты или макроциклические хелаторы, которые можно конъюгировать с ионами радиоактивных металлов. Репрезентативными примерами макроциклического хелатора является 1,4,7,10-тетраазациклододекан-N,N',N",N"-тетрауксусная кислота (DOTA), которую можно присоединять к антителу через линкерную молекулу. Такие линкерные молекулы хорошо известны и их применение в данной области является общепринятым.
Меченые антитела, в частности, антитела к CD44 или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в настоящем описании, можно применять в способах, предлагаемых в изобретении, для диагностических или прогностических целей для обнаружения, диагностирования, мониторинга ракового заболевания. Метки, представленные в настоящем описании, представляют собой выявляемые сигналы, сшитые с антителом к CD44 или антигенсвязывающим фрагментом, предназначенные для применения, например, в диагностических способах in vivo и in vitro, предлагаемых в изобретении. Продуцирующий сигнал агент образует поддающийся измерению сигнал, который можно выявлять находящимися извне средствами, как правило, путем измерения электромагнитного излучения. В большинстве случаев продуцирующий сигнал агент представляет собой фермент или хромофор, или радионуклид или агент, испускающий свет в результате флуоресценции, фосфоресценции или хемилюминесценции. Хромофоры включают красители, которые абсорбируют свет в ультрафиолетовой или видимой области, и они могут представлять субстраты или продукты расщепления фермента, катализирующего реакции.
Кроме того, под объем настоящего изобретения подпадает применение CDMAB in vivo и in vitro для исследовательских или диагностических способов, которые хорошо известны в данной области. Для осуществления диагностических способов, подпадающих под объем настоящего изобретения, можно использовать также наборы, включающие CDMAB, которые можно применять согласно настоящему изобретению. Указанные наборы должны быть пригодны для идентификации индивидуумов, имеющих риск возникновения определенного типа рака, путем выявления сверхэкспрессии антигена, являющего мишенью CDMAB, на поверхности клеток указанного индивидуума.
Антитела, пригодные для воплощения на практике настоящего изобретения, можно применять в виде композиции, предназначенной для предупреждения, лечения или диагностирования рака. Эти композиции обладают низкой токсичностью и их можно применять в форме жидких препаратов, в которой они находятся, или фармацевтических композиций, пригодных для орального или парентерального (например, внутрисосудистого, внутрибрюшинного, подкожного и т.д.) введения человеку или другому млекопитающему. Антитела, пригодные для воплощения на практике настоящего изобретения, можно вводить индивидуально (в немодифицированной форме) или их можно вводить в составе соответствующих композиций. Композиция, которую можно применять для указанного введения, может содержать фармакологически приемлемый носитель для антитела или его соли, разбавитель или эксципиент. Указанная композиция находится в форме фармацевтических препаратов, пригодных для орального или парентерального применения.
Примерами композиции, пригодной для парентерального введения, являются инъецируемые препараты, суппозитории и т.д. Инъецируемые препараты могут представлять собой лекарственные формы, такие как формы, предназначенные для внутривенных, подкожных, внутрикожных и внутримышечных инъекций, капельных инфузий, внутрисосудистых инъекций и т.д. Указанные инъецируемые препараты можно приготавливать с помощью широко известных методов. Например, инъецируемые препараты можно приготавливать путем растворения, суспендирования или эмульгирования антитела, предлагаемого в изобретении, или его соли в стерильной водной среде или масляной среде, которую обычно применяют для инъекций. В качестве водной среды для инъекций, применяют, например, физиологический раствор, изотонический раствор, содержащий глюкозу и другие вспомогательные агенты, и т.д., которые можно использовать в сочетании с приемлемым солюбилизирующим агентом, таким как спирт (например, этанол), многоатомный спирт (например, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль), неионогенное поверхностно-активное вещество (например, полисорбат 80, НСО-50 (аддукт гидрогенизированного касторового масла, содержащий 50 молей полиоксиэтиленовых звеньев) и т.д. Применяемая масляная среда представляет собой, например, кунжутное масло, соевое масло и т.д., ее можно применять, например, в сочетании с солюбилизирующим агентом, таким как бензилбензоат, бензиловый спирт и т.д. Полученным таким образом раствором для инъекций, как правило, заполняют соответствующую ампулу. Суппозитории, предназначенные для ректального введения, можно приготавливать путем смешения антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, или его соли с общепринятыми основами для суппозиториев. Композиция для орального введения представляет собой твердые или жидкие препараты, в частности, таблетки (в том числе драже и таблетки с пленочным покрытием), пилюли, гранулы, порошкообразные препараты, капсулы (в том числе мягкие капсулы), сироп, эмульсии, суспензии и т.п. Указанную композицию можно приготавливать широко известными методами, и она может содержать наполнитель, разбавитель или эксципиент, общепринятый для применения в фармацевтических препаратах. Примерами наполнителя или эксципиента для таблеток являются лактоза, крахмал, сахароза, стеарат магния и т.д.
Описанные выше композиции для орального или парентерального применения целесообразно приготавливать в виде фармацевтических препаратов, содержащих стандартную дозу, соответствующую требуемой дозе действующих веществ. Указанные препараты в виде стандартных доз представляют собой, например, таблетки, пилюли, капсулы, инъецируемые формы (ампулы), суппозитории и т.д.
Доза вышеуказанного предлагаемого в изобретении профилактического/терапевтического агента, содержащего антитело, которое применяют в способах, предлагаемых в настоящем изобретении, может варьироваться в зависимости от индивидуума, подлежащего обработке, болезни, состояний, подлежащих лечению, пути введения и т.д. Например, при применении с целью лечения/предупреждения, например, HNSCC у взрослого, целесообразно вводить антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, внутривенно в дозе, составляющей примерно от 0,0001 до 200 мг/кг или от 0,0001 до 100 мг/кг веса тела пациента. Согласно другим объектам изобретения вводимая пациенту доза составляет от 0,0001 до 20 мг/кг, от 0,0001 до 10 мг/кг, от 0,0001 до 5 мг/кг, от 0,0001 до 2 мг/кг, от 0,0001 до 1 мг/кг, от 0,0001 до 0,75 мг/кг, от 0,0001 до 0,5 мг/кг, от 0,0001 до 0,25 мг/кг, от 0,0001 до 0,15 мг/кг, от 0,0001 до 0,10 мг/кг, от 0,001 до 0,5 мг/кг, от 0,01 до 0,25 мг/кг или от 0,01 до 0,10 мг/кг веса тела пациента. Как правило, человеческие антитела обладают наиболее продолжительным временем полужизни в организме человека по сравнению с антителами из других видов, что связано с иммунным ответом на чужеродные полипептиды. Таким образом, часто человеческие антитела можно применять в более низких дозах и с меньшей частотой введения. Кроме того, дозу и частоту введения антител, предлагаемых в изобретении, или их фрагментов можно снижать, повышая поглощение и проникновение в ткань препарата антитела путем модификаций, таких, например, как липидирование. Согласно другим объектам изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, применяют в сочетании с другими терапевтическими композициями, и при этом доза, вводимая пациенту ниже, чем в случае, когда указанные антитела применяют в виде монотерапии.
Количество и частота введения доз, представленные в настоящем описании, подпадают под понятия терапевтически эффективной и профилактически эффективной дозы. Доза и частота, как правило, также варьируются в зависимости от факторов, специфических для каждого пациента, они зависят от применяемых конкретных терапевтических или профилактических агентов, серьезности состояния, пути введения, а также возраста, веса тела, ответа, предшествующей истории болезни пациента. Специалист в данной области может выбирать приемлемые схемы, основываясь и следуя таким факторам как, например, дозы, известные из литературы и рекомендованные в Physician's Desk Reference (56-oe изд., 2002). Суточную дозу антитела, фрагмента или композиции, предлагаемых в изобретении, можно вводить в виде однократной болюсной дозы или разделенной на несколько доз, которые подлежат введению в течение 24 ч. В альтернативном варианте общую суточную дозу можно вводить в течение более продолжительного периода времени, например, путем инфузии, например суточную дозу можно вводить в течение 12 ч, 6 ч, 4 ч, 2 ч, 1,5 ч, 1,0 ч, 45 мин, 30 мин, 25 мин, 20 мин, 15 мин, 10 мин, 9 мин, 8 мин, 7 мин, 6 мин, 5 мин, 4 мин, 3 мин, 2 мин или 1 мин. Когда состояние является очень серьезным, дозу можно повышать в зависимости от состояния.
Антитело, предназначенное для применения согласно способам, предлагаемым в настоящем изобретении, можно вводить в немодифицированном виде или в виде соответствующей композиции. Применяемая для введения композиция может содержать фармакологически приемлемый носитель для вышеуказанного антитела или его соли, разбавитель или эксципиент. Указанную композицию применяют в форме фармацевтических препаратов, пригодных для орального или парентерального введения (например, путем внутрисосудистой инъекции, подкожной инъекции и т.д.). Каждая описанная выше композиция может содержать также другие действующие вещества. Кроме того, антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять в сочетании с другими лекарственными средствами, такими, например, как алкилирующие агенты (например, циклофосфамид, изофосфамид и т.д.), антагонисты метаболизма (например, метотрексат, 5-фторурацил и т.д..), противоопухолевые антибиотики (например, митомицин, адриамицин и т.д.), противоопухолевые агенты растительного происхождения (например, викристин, виндезин, таксол и т.д.), цисплатин, карбоплатин, этопозид, иринотекан и т.д. Антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, и описанные выше лекарственные средства можно вводить пациенту одновременно или согласно определенной временной схеме. Методы введения гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, включают (но, не ограничиваясь только ими) парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и введение через слизистую оболочку (например, путем внутриносового и орального введения). В конкретном варианте осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым общепринятым путем, например, посредством инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или слизистые выстилки (например, слизистая рта, слизистая прямой кишки и кишечника и т.д.), и их можно вводить вместе с другими биологически активными действующими веществами. Применение может системным или местным. Кроме того, можно применять ведение в легкие, например, с использованием ингалятора или распылителя, и препаративной формы с агентом, предназначенным для создания аэрозоля.
Схемы применения химиотерапевтического средства/другого антитела включают любую схему, которая рассматривается как оптимальная для лечения состояния у пациента. При различных злокачественных состояниях требуется применение специфических противоопухолевых антител и специфических химиотерапевтических средств, которые варьируются от пациента к пациенту. В предпочтительном варианте осуществления изобретения химиотерапию применяют совместно или более предпочтительно после терапии на основе антитела. Однако, как должно быть очевидно, настоящее изобретение не ограничено каким-либо конкретным методом или путем введения.
Все патенты и публикации, упомянутые в настоящем описании, отражают уровень техники, к которой относится изобретение.
Как должно быть очевидно, хотя изобретение проиллюстрировано на примере конкретных вариантов его осуществления, оно не ограничено конкретной формой или классификацией разделов, представленных и описанных в настоящем описании. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что можно осуществлять различные замены без отклонения от сущности изобретения, и не следует считать, что изобретение ограничено материалом, представленным и изложенным в настоящем описании.
Специалисту в данной области должно быть очевидно, что настоящее изобретение в достаточной мере адаптировано к осуществлению его объектов и достижению указанных в описании результатов и преимуществ, а также других присущих ему преимуществ. Любые олигонуклеотиды, пептиды, полипептиды, родственные биологические соединения, методы, процедуры и методики, представленные в настоящем описании, являются характерными для предпочтительных вариантов осуществления изобретения, и они приведены в качестве примера и не направлены на ограничение объема изобретения. Их изменения и другие варианты применения, как должно быть очевидно специалистам в данной области, соответствуют сущности изобретения и подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения. Хотя изобретение описано со ссылкой на конкретные предпочтительные варианты осуществления изобретения, должно быть очевидно, что изобретение, как оно заявлено в формуле изобретения, не должно быть ограничено указанными конкретными вариантами осуществления изобретения. Так, различные модификации описанных путей осуществления изобретения, очевидные специалистам в данной области, подпадают под объем приведенной ниже формулы изобретения.
Под объем изобретения подпадают также следующие позиции:
Пункт 1: Способ лечения плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC) у млекопитающего, заключающийся в том, что вводят млекопитающему моноклональное антитело к CD44 или его антигенсвязывающий фрагмент в количестве, эффективном для снижения у млекопитающего опухолевой нагрузки.
Пункт 2: Способ по п.1, в котором моноклональное антитело к CD44 представляет собой ARH460-16-2.
Пункт 3: Способ по п.2, в котором моноклональное антитело конъюгируют с цитотоксическим фрагментом.
Пункт 4: Способ по п.1, в котором моноклональное антитело представляет собой гуманизированную версию моноклонального антитела, которое продуцируется гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, или антигенсвязывающий фрагмент, полученный из указанного гуманизированного антитела.
Пункт 5: Способ по п.1, в котором моноклональное антитело представляет собой химерную версию моноклонального антитела, которое продуцируется. гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, или антигенсвязывающий фрагмент, полученный из указанного химерного антитела.
Пункт 6: Применение моноклонального антитела к CD44 или его антигенсвязывающего фрагмента для лечения HNSCC у млекопитающего, заключающееся в том, что вводят млекопитающему моноклональное антитело к CD44 или его антигенсвязывающий фрагмент в количестве, эффективном для снижения у млекопитающего опухолевой нагрузки.
Пункт 7: Применение по п 6, в котором моноклональное антитело к CD44 представляет собой ARH460-16-2.
Пункт 8: Применение по п.7, в котором моноклональное антитело конъюгировано с цитотоксическим фрагментом.
Пункт 9: Применение по п.6, в котором моноклональное антитело представляет собой гуманизированную версию моноклонального антитела, которое продуцируется гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621.
Пункт 10: Применение по п.6, в котором моноклональное антитело представляет собой химерную версию моноклонального антитела, которое продуцируется гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621.
Пункт 11: Способ лечения HNSCC у млекопитающего, заключающийся в том, что вводят млекопитающему моноклональное антитело к CD44 или его антигенсвязывающий фрагмент в сочетании по меньшей мере с одним химиотерапевтическим средством в количестве, эффективном для снижения у млекопитающего опухолевой нагрузки.
Пункт 12. Способ по п.11, в котором моноклональное антитело к CD44 представляет собой ARH460-16-2.
Пункт 13: Способ по п.12, в котором моноклональное антитело или CDMAB конъюгируют с химиотерапевтическим средством.
Пункт 14: Способ по п.13, в котором химиотерапевтическое средство представляет собой цитотоксический фрагмент.
Пункт 15. Способ по п.11, в котором моноклональное антитело представляет собой гуманизированную версию моноклонального антитела, которое продуцируется гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621.
Пункт 16: Способ по п.11, в котором моноклональное антитело представляет собой химерную версию моноклонального антитела, которое продуцируется гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621.
Пункт 17: Композиция, обладающая эффективностью в отношении лечения HNSCC, которая содержит комбинацию, включающую:
моноклональное антитело к CD44, которое продуцируется гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, или его антигенсвязывающий фрагмент; и
фармакологически приемлемый носитель в требуемом количестве;
где композиция обладает эффективностью в отношении лечения HNSCC.
Пункт 18: Композиция по п.17, дополнительно содержащая конъюгат моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с компонентом, выбранном из группы, включающей цитотоксические фрагменты, ферменты, радиоактивные соединения, цитокины, интерфероны, представляющие собой мишень или репортерные фрагменты и гематогенные клетки.
Пункт 19: Набор для анализа, предназначенный для выявления присутствия HNSCC, где HNSCC экспрессирует по меньшей мере один эпитоп антигена, обладающий способностью специфически связываться с моноклональным антителом, которое продуцируется гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, или с его антигенсвязывающим фрагментом, где набор содержит моноклональное антитело, которое продуцируется гибридомой, депонированной в АТСС под регистрационным номером РТА-4621, или его антигенсвязывающий фрагмент, связанное/связанный с полипептидом, присутствие которого в количестве, соответствующем определенному дискриминационному уровню, является диагностическим, свидетельствующим о наличии HNSCC.
Для более полного понимания изобретения ниже представлены примеры, не ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Пример 1
Связывание in vitro с клеточными линиями HNSCC
H
L
H
Химерные и гуманизированные версии РТА-4621 создавали согласно методу, представленному в настоящем описании. Химерное РТА-4621 («chPTA-4621») содержало V- и V-области, аминокислотные последовательности которых представлены в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно. Создавали две гуманизированные версии РТА-4621 (huPTA-4621), имеющие минорные различия в аминокислотной последовательности вариабельных областей их тяжелых цепей. huPTA-4621 содержало V-область, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, и VL-область, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO:11. С помощью стандартных анализов, известных в данной области, не было выявлено различий в аффинности и авидности связывания двух версий huPTA-4621 с антигеном.
++
++
2
2
Связывание chPTA-4621 и huPTA-4621 с клеточными линиями HNSCC T.Tn, SCC-15, Detroit-562 и CALL 27 оценивали с помощью проточной цитометрии (FACS). Клетки подготавливали к FACS путем первоначальной отмывки клеточного монослоя с помощью D-ЗФР (без Са и Mg). Затем для отделения клеток от планшетов для культуры клеток применяли при 37°С либо буфер для диссоциации клеток (фирма INVITROGEN, Берлингтон, провинция Онтарио; для линий T.Tn, SCC-15 и Detroit-562), либо раствор для отделения клеток ACCUTASE™ (фирма SIGMA, Сент-Люис, шт.Миссури; для линии CAL 27). После центрифугирования и сбора клетки ресуспендировали в D-ЗФР, содержащем MgCl, CaCl и 2% (линии клеток T.Tn, SCC-15 и Detroit-562) или 3% (линия клеток CAL 27) фетальной телячьей сыворотки, при 4°С (среда для окрашивания) и подсчитывали их количество, разделяли на аликвоты с соответствующей плотностью клеток, центрифугировали для получения клеточного дебриса и ресуспендировали в среде для окрашивания при 4°С в присутствии тестируемых антител (химерное или гуманизированное РТА-4621) или контрольных антител (контроль изотипа, антитело к EGFR; C225; T.Tn, SCC-15 и Detroit-562) или антитело к CD20 (RITUXAN™; CAL27). Применяемые для контроля изотипа и тестируемые антитела исследовали в концентрации 20 мкг/мл на льду в течение 30 мин. Для выявления связанного антитела применяли вторичное антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 546, для клеток линий T.Tn, SCC-15 и Detroit-562, и вторичное антитело, конъюгированное с АФЦ (аллофикоцианин), в опытах на клетках линии CLA 27. Перед добавлением вторичного антитела клетки отмывали однократно средой для окрашивания. Затем добавляли вторичное антитело в среде для окрашивания согласно инструкциям производителя. Затем клетки отмывали в последний раз и ресуспендировали в фиксирующей среде (среда для окрашивания, содержащая 1,5% параформальдегида). Для оценки методом проточной цитометрии клеток линий T.Tn, SCC-15 и Detroit-562 их анализировали с помощью устройства FACScan, используя программу CellQuest (фирма BD Biosciences, Оаквилл, провинция Онтарио), а для оценки клеток линии CAL 27 образцы оценивали с помощью устройства LSR-II, используя систему программ Diva 6 (фирма BD Biosciences, Роквилл, шт.Мэриленд, США). Рассеивание света на клетках в прямом направление (FSC) и боковом направлении (SSC) регулировали, изменяя напряжение и амплитуду, устанавливаемые на FSC- и SSC-детекторах. Каналы детекторов флуоресценции (ФИТЦ, АФЦ) регулировали, используя неокрашенные клетки (CAL 27) или окрашенные только конъюгированным с Alexa Fluor 546 вторичным антителом (T.Tn, SCC-15 и Detroit-562), в результате чего клетки давали одинаковый пик, медианная интенсивность флуоресценции которого составляла примерно 1-5 единиц. Для каждого образца анализировали примерно 10000 окрашенных фиксированных клеток, и полученные результаты представлены на фиг.1А-Б.
В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что химерные и гуманизированные версии РТА-4621 связывались с клетками линий T.Tn, SCC-15 и Detroit-562 (фиг.1А) и CAL 27 (фиг.1Б).
Пример 2
Эксперимент in vivo с использованием человеческих клеток линии T.Tn
2
4
2
4
Для демонстрации наличия эффективности в отношении человеческой линии раковых клеток HNSCC in vivo оценивали химерное антитело РТА-4621 (chPTA-4621) на модели HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата клеток линии T.Tn. Как продемонстрировано на фиг.2 и фиг.3, самкам SCID-мышей возрастом 6-8 недель имплантировали по 10 млн клеток T.Tn в 100 мкл раствора ЗФР путем подкожной инъекции в правую боковую область. Мышей произвольно разделяли на 2 группы обработки по 10 особей в каждой. Когда средний объем опухолей у мышей достигал примерно 264-268 мм, мышам в каждой группе вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг тестируемое антитело chPTA-4621 или применяемый в качестве контроля буфер в объеме 300 мкл после разведения из маточного концентрированного раствора разбавителем, содержащим 2,7 мМ KCl, 1 мМ КНРО, 137 мМ NaCl и 20 мМ NaHPO. Затем содержащие антитело или контрольные образцы вводили 3 раза в неделю в течение всего времени опыта. Рост опухоли оценивали примерно через каждые 7 дней с помощью штангенциркуля. Опыт завершали после введения 10 доз антитела. Вес тела животных регистрировали один раз в неделю в течение всего времени опыта. В конце эксперимента всех животных умерщвляли согласно руководствам ССАС (Канадский совет по уходу за животными).
Антитело chPTA-4621 снижало рост опухолей на модели in vivo человеческой HNSCC, созданной с использованием клеток T.Tn. Обработка антителом chPTA-4621 приводила к снижению роста Т.Тп-опухолей на 54,9% (р=0,0068, t-критерий) по сравнению с обработанной буфером группой при оценке в день 105, т.е. в последний день периода исследования (фиг.2).
В этом опыте не обнаружено клинических признаков токсичности. Вес тела, измеренный с еженедельными интервалами, представлял собой маркер самочувствия и отрицательного воздействия на развитие (фиг.3). Не обнаружено существенного различия в среднем весе тела между группами в конце периода обработки. Не обнаружено также существенного различия в среднем весе тела внутри каждой группы в период между началом и концом эксперимента.
В целом, chPTA-4621 хорошо переносилось и приводило к значимому снижению опухолевой нагрузки при изучении на указанной модели человеческой HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата.
Пример 3
Эксперимент in vivo с использованием человеческих клеток линии SCC-15
3
Для демонстрации наличия эффективности в отношении человеческой линии раковых клеток HNSCC in vivo оценивали гуманизированное антитело РТА-4621 (huPTA-4621) на модели HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата клеток линии SCC-15. Как продемонстрировано на фиг.4 и фиг.5, самкам SCID-мышей возрастом 6-8 недель имплантировали по 3 млн клеток SCC-15 в 100 мкл раствора ЗФР путем подкожной инъекции в правую боковую область. Мышей произвольно разделяли на 2 группы обработки по 10 особей в каждой. Когда средний объем опухолей у мышей достигал примерно 233-235 мм, мышам в каждой группе вводили внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг тестируемое антитело huPTA-4621 или применяемый в качестве контроля буфер HNT в объеме 100 мкл после разведения из маточного концентрированного раствора разбавителем, содержащим 20 мМ гистидин-HCl, 150 мМ NaCl и 0,01% полисорбата 80, рН 6,0. Затем содержащие антитело или контрольные образцы вводили 1 раз в неделю в течение всего времени опыта. Рост опухоли оценивали примерно через каждые 7 дней с помощью штангенциркуля. Опыт завершали после введения 4 доз антитела. Вес тела животных регистрировали один раз в неделю в течение всего времени опыта. В конце эксперимента всех животных умерщвляли согласно руководствам ССАС.
Антитело huPTA-4621 снижало рост опухолей на модели in viva человеческой HNSCC, созданной с использованием клеток SCC-15. Обработка антителом huPTA-4621 приводила к снижению роста SCC-15-опухолей на 44,5% (р=0,0379, t-критерий) по сравнению с обработанной буфером группой при оценке в день 23, т.е. в последний день периода исследования (фиг.4).
В этом опыте не обнаружено клинических признаков токсичности. Вес тела, измеренный с еженедельными интервалами, представлял собой маркер самочувствия и отрицательного воздействия на развитие (фиг.5). Не обнаружено существенного различия в среднем весе тела между группами в конце периода обработки. Не обнаружено также существенных различий в среднем весе тела внутри каждой группы в период между началом и концом эксперимента.
В целом, huPTA-4621 хорошо переносилось и приводило к значимому снижению опухолевой нагрузки при изучении на указанной модели человеческой HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата.
Пример 4
Эксперимент in vivo с использованием человеческих клеток линии Detroit 562
3
Для демонстрации наличия эффективности в отношении человеческой линии раковых клеток HNSCC in vivo оценивали huPTA-4621 на модели HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата клеток линии Detroit 562. Как продемонстрировано на фиг.6 и фиг.7, самкам SCID-мышей возрастом 6-8 недель имплантировали по 3 млн клеток линии Detroit 562 в 100 мкл раствора ЗФР путем подкожной инъекции в правую боковую область. Мышей произвольно разделяли на 2 группы обработки по 10 особей в каждой. Когда средний объем опухолей у мышей достигал примерно 188-192 мм, мышам в каждой группе вводили внутрибрюшинно в дозе 30 мг/кг тестируемое антитело huPTA-4621 или применяемый в качестве контроля буфер в объеме 100 мкл после разведения из маточного концентрированного раствора разбавителем, содержащим 20 мМ гистидин-HCl, 150 мМ NaCl и 0,01% полисорбата 80, рН 6,0. Затем содержащие антитело или контрольные образцы вводили 1 раз в неделю в течение всего времени опыта. Рост опухоли оценивали примерно через каждые 7 дней с помощью штангенциркуля. Опыт завершали после введения 5 доз антитела. Вес тела животных регистрировали один раз в неделю в течение всего времени опыта. В конце эксперимента всех животных умерщвляли согласно руководствам ССАС.
Антитело huPTA-4621 снижало рост опухолей на модели in vivo человеческой HNSCC, созданной с помощью клеток линии Detroit 562. Обработка антителом huPTA-4621 приводила к снижению роста Detroit 562-опухолей на 52,1% (р=0,0259, t-критерий) по сравнению с обработанной буфером группой при оценке в день 42, т.е. в последний день периода исследования (фиг.6).
В этом опыте не обнаружено клинических признаков токсичности. Вес тела, измеренный с еженедельными интервалами, представлял собой маркер самочувствия и отрицательного воздействия на развитие (фиг.7). Не обнаружено существенного различия в среднем весе тела между группами в конце периода обработки. Не обнаружено также существенных различий в среднем весе тела внутри каждой группы в период между началом и концом эксперимента.
В целом, huPTA-4621 хорошо переносилось и приводило к значимому снижению опухолевой нагрузки при изучении на указанной модели человеческой HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата.
Пример 5
Эксперимент in vivo с использованием человеческих клеток линии CAL 27
2
6
3
2
2
n
0
n
0
Для демонстрации наличия эффективности в отношении человеческих линий раковых клеток HNSCC in vivo оценивали huPTA-4621 на модели HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата клеток линии CAL 27 на бестимусных мышах (NU/J, лот №:002019, фирма Jackson Laboratories), которым имплантировали клетки линии CAL27 (АТСС CRL-2095). Клетки CAL 27 культивировали в среде DMEM (АТСС, каталожный №30-2002), дополненной 10% FBS (АТСС, каталожный №30-2020) в колбах с площадью дна 75 мм при 37°С в воздушной атмосфере с 5% СО до достижения клетками стадии конфлюэнтности. Человеческие клетки линии CAL 27 отделяли от колб, в которых осуществляли культивирование, с помощью 0,25% (мас./об.) трипсина (фирма Invitrogen, каталожный №.25200), подсчитывали, растворяли в ЗФР и инъецировали подкожно в среднюю область спины 7-недельным самцам бестимусных мышей в дозе 3×10 клеток/животное с Matrigel™ (фирма BD Biosciences, каталожный №354248) в объеме 0,2 мл (100 мкл клеток в ЗФР+100 мкл Matrigel). После инъекции клеток в течение двух недель давали образоваться опухолевым узелкам. Объемы опухолей (мм) измеряли с помощью цифрового штангенциркуля (фирма VWR, каталожный №36934-152) и рассчитывали с помощью формулы для определения объема элипсоида: [π/6]xaxb, в которой а и b обозначают первый и второй наиболее длинные ортогональные размеры опухоли в мм. Когда объем опухолей достигал 400-600 мм, животных произвольно разделяли на две группы (n=5). Моноклональное антитело huPTA-4621 и человеческий IgG1 (фирма Sigma, I5154) вводили в дозе 3 мг/кг путем внутрибрюшинной инъекции 3 раза в неделю, вводя в общей сложности 10 доз. Опухолевые узелки оценивали трижды в неделю с помощью цифрового штангенциркуля. Противоопухолевую активность определяли на основе ингибирования роста первичных опухолей, рассчитывая относительный объем опухоли (RTV) согласно следующей формуле: RTV=TV/TV, в которой TV обозначает объем опухоли в день n, a TV обозначает объем опухоли в день 0. Мониторинг размера опухолей осуществляли до дня 27. После обработки в течение 27 дней определяли Т/С% на основе RTV как Т/С%=100×(среднее значение RTV для обработанной группы)/(среднее значение RTV для контрольной группы). В группе, которую обрабатывали антителом, обнаружено 60%-ое ингибирование роста опухолей (фиг.8), что свидетельствует об эффективности обработки в отношении снижения опухолевой нагрузки (Р<0,0002).
Эти данные четко демонстрируют, что huPTA-4621 обладало выраженной терапевтической активностью в отношении ксенотрансплантатов опухолей CAL 27, изученных в данном эксперименте.
Пример 6
Эксперимент in vivo с использованием человеческих клеток линии CAL 27
6
3
2
3
3
Для сравнения эффективности лечения с использованием антитела РТА-4621 со стандартным химиотерапевтическим лечением описанную в примере 5 модельную систему применяли для сравнения лечения с использованием РТА-4621 и лечения с использованием цисплатина. Клетки линии CAL 27 культивировали и собрали согласно методу, описанному в примере 5. Модель на основе ксенотранпслантата клеток линии CAL 27 создавали путем подкожной инъекции 7-недельным самцам бестимусных мышей (NU/J, лот №:002019, фирма Jackson Laboratories) в среднюю область спины 5×10 клеток линии CAL 27 в 100 мкл D-ЗФР и 100 мкл Matrigel. Через 18 дней после инокуляции у мышей оценивали образовавшиеся опухоли и произвольно разделяли на 3 группы (в каждой группе n=6): группа, которую обрабатывали huPTA-4621, группа, которую обрабатывали цисплатином, и контрольная группа (обработка несоответствующим контрольным антителом в виде IgG1). Объемы опухолей (мм) измеряли с помощью цифрового штангенциркуля (фирма VWR, каталожный №36934-152) и рассчитывали с помощью формулы для определения объема элипсоида: [π/6]xaxb, в которой а и b обозначают первый и второй наиболее длинные ортогональные размеры опухоли в мм. Средний объем опухолей у мышей в момент произвольного разделения на группы составлял 84 мм (диапазон 79-94 мм).
Произвольно разделенным на группы животным вводили i.p. тестируемое или контрольное антитело в дозе 3 мг/кг или цисплатин в дозе 0,75 мг/кг. Для всех обработок вводимый объем составлял 6,6 мл/кг. Обработки антителом и контрольные обработки осуществляли 3 раза в неделю в течение первой и третьей недели и дважды в неделю в течение второй недели, осуществляя в общей сложности восемь обработок. Через одну неделю после последней обработки животных умерщвляли в соответствии с руководствам ССАС; опыт завершали в день 46. Рост опухолей и вес тела оценивали трижды в неделю в течение всего эксперимента.
n
0
n
0
Противоопухолевую активность определяли на основе ингибирования роста первичных опухолей, рассчитывая относительный объем опухоли (RTV) согласно следующей формуле: RTV=TV/TV, в которой TV обозначает объем опухоли в день n, a TV обозначает объем опухоли в день 0. Мониторинг размера опухолей осуществляли до дня 46. После завершения эксперимента определяли Т/С% на основе RTV как Т/С%=100×(среднее значение RTV для обработанной группы)/(среднее значение RTV для контрольной группы). В группе, которую обрабатывали антителом, обнаружено 86%-ое ингибирование роста опухолей (фиг.9), что свидетельствует об эффективности лечения в отношении снижения опухолевой нагрузки (Р<0,024). Не обнаружено существенного ингибирования роста опухолей в обработанной цисплатином группе по сравнению с контролем (фиг.9). Таким образом, антитело huPTA-4621 снижало рост опухолей in vivo на созданной с помощью клеток CAL 27 модели человеческой HNSCC.
Не обнаружено значимого различия в среднем весе тела между группами в конце периода обработки. Не обнаружено также значимых различий в среднем весе тела внутри каждой группы между началом и концом эксперимента (фиг.10). Одно животное из контрольной группы, которую обрабатывали IgG1, было умерщвлено в день 26 из-за достижения конечных критериев IACUC (Комитет по уходу за животными и их использованию), принятых для указанного эксперимента.
В целом, huPTA-4621 хорошо переносилось и приводило к значимому снижению опухолевой нагрузки относительно стандартного химиотерапевтического средства (цисплатин) при изучении на указанной модели человеческой HNSCC, созданной с использованием ксенотрансплантата.