ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПРИ ЭКОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ

Мы проанализировали взгляды разных авторов, пришли к тому, что применение клеточных культур в частности методы культуры in vitro следует оценить как достаточно удобный инструмент, с помощью которого можно сохранить ценные жизненные формы растений, а также это надёжный способ изучения механизмов ответных реакций растения на стресс. Так и для извлечения устойчивых к стрессовым факторам растений - конечной поставленной задачей селекции и современной биотехнологии in vitro.

Список использованной литература:

1. Кунах В.А. Геномная изменчивость соматических клеток растений. Изменчивость и отбор в процессе адаптации к условиям выращивания in vitro / В.А. Кунах // Биополимеры и клетка (Biopolymers and Cell). -2000. - Т. 16, № 3. - C. 159-185.

2. Плынская Ж.А. Культивирование в условиях in vitro / Ж.А. Плынская, Е.Н. Алёшина, Н.А. Величко // Хвойные бореал. зоны. - 2008. - Т. 15, № 1/2. - С. 68-71.

3. Третьякова И.Н. Сохранение генофонда хвойных видов Сибири при помощи соматического эмбриогенеза in vitro - современного метода биотехнологии / И.Н. Третьякова, А.В. Барсукова // Хвойные бореал. зоны. - 2010. - Т. 27, № 1/2. - С. 203-206.

4. Malabadi R.B. Genetic transformation of Conifers: Applications in and Impacts on commercial Forestry / R.B. Malabadi, K. Nataraja // Transgenic plant Journal. - 2007. - Т. 1(2). - Р. 289-313.

5. Yadav S., Sharma K.D. Molecular and morphophysiological analysis of drought stress in plants // Plant growth. Chapter 10 / Ed. Е.С. Rigobelo. - 2016. Р. 9-12.

© Катаранова А.А., 2023

УДК 574

Кириллов В.В.

Аспирант 2 курса УлГУ, г. Ульяновск, РФ Научный руководитель: Благовещенская Н.В.,

Доктор биологических наук, УлГУ г. Ульяновск, РФ

ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДА ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ПРИ ЭКОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ

Аннотация

Проведён анализ перспектив применения метода полимеразной цепной реакции в экологическом мониторинге объектов окружающей среды. Проведена оценка возможности дальнейшего развития метода в контексте экологических исследований.

Ключевые слова

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), экологический мониторинг, нуклеиновые кислоты (НК), метод классической ПЦР, метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), фитопатоген, биоиндикатор, электрофорез, амплификация, флюоресценция.

Kirillov V.V.

2nd-year graduate student of UlSU, Ulyanovsk, Russia Scientific supervisor: Blagoveshchenskaya N. V.,

Doctor of Biological Sciences, UlSU Ulyanovsk, Russia

PROSPECTS FOR APPLYING THE POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD IN ECOLOGICAL MONITORING

Annotation

An analysis of the prospects for using the polymerase chain reaction method in environmental monitoring of environmental objects was carried out. The possibility of further development of the method in the context of environmental research was assessed.

Keywords

Polymerase chain reaction (PCR), environmental monitoring, nucleic acids (NA), classical PCR method, real-time PCR method (RT-PCR), phytopathogen, bioindicator, electrophoresis, amplification, fluorescence.

Введение

В современной практике экологического мониторинга окружающей среды используются разнообразные методы, которые служат для оценки состояния исследуемых объектов. Безусловно, важной задачей специалистов-экологов в области контроля окружающей среды является разработка новых и оптимизация уже существующих методов [5].

Одним из направлений в экологии, которое на современном этапе всё более развивается - является изучение генетического материала объектов окружающей среды. В аграрной промышленности можно выделить такие задачи исследования генного материала, как изучение видового разнообразия исследуемой системы, контроль присутствия определённых фитопатогенов и оценка риска их распространения, исследование содержания геномодифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения, исследование мутаций растений, и т.д. [2]

Широкое распространение в данной области находит метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод основан на пошаговом избирательном умножении нуклеиновых кислот (НК) в пробе с помощью фермента полимеразы, и дальнейшей аналитической идентификацией.

Постепенное внедрение ПЦР для реализации различных методов определения генетических маркеров объясняется простотой их, низкой себестоимостью, надёжностью, возможностью автоматизации процесса анализа и высокой поточностью метода. Существуют классическая ПЦР и ПЦР в реальном времени

Метод ПЦР в реальном времени

Один из популярных методов - ПЦР в реальном времени с использованием флюоресцентной детекции, который позволяет отслеживать накопление продуктов умножения (амплификации) НК в течение всего анализа. Регистрация сигнала флюоресценции при этом происходит после каждого цикла умножения.

Своё развитие метод ПЦР также получил в области количественного определения НК (ДНК и РНК) инфекционных агентов, сверхопасных инфекций, имеющих высокую степень риска возникновения пандемий. Широкое распространение метод ПЦР получает и при генотипировании растений в экологическом мониторинге окружающей среды. Схожие задачи сформулированы в области геномики. Важным условием является длительное слежение за состоянием популяционных генофондов, оценка и прогнозирование их изменений во времени и в пространстве, определение границ допустимых изменений [3].

Существует значительное количество способов получения данных о концентрации нуклеиновых кислот в пробе методом ПЦР, но, в отличие от метода ПЦР-РВ, все они требуют трудоемких дополнительных этапов работы, связанных с предварительной подготовкой кратных разбавлений выделенных из пробы НК, или полученных в ходе ПЦР ампликонов (умножающихся участков ДНК), что приводит к увеличению времени, необходимого для проведения анализа и сложности интерпретации полученных результатов. При этом наличие дополнительных этапов работы увеличивает риск ошибки и, как следствие, получение ложноположительных или ложноотрицательных результатов результатов [3].

Метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией обладает высокой чувствительностью и селективностью к исследуемым ДНК/РНК-маркерам.

Отличие данного метода от классической ПЦР заключается в возможности количественного определения ДНК/РНК-маркеров в исследуемом материале без стадии электрофореза, в менее строгих требованиях к организации ПЦР-лаборатории и автоматической интерпретации полученных результатов [6].

Отсутствие стадии электрофореза позволяет снизить риск контаминации (перекрёстного загрязнения проб) продуктами ПЦР и таким образом значительно уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в ходе анализа, весь этап ПЦР-РВ можно проводить в двух помещениях лаборатории и нет необходимости в отдельной зоне для детектирования продуктов реакции. Данная методика на современном этапе успешно применяется во многих научно-исследовательских центрах развитых стран мира и станет так же широко распространена, как классическая ПЦР, благодаря экономии площади лаборатории, уменьшению нужного количества персонала и необходимости проведения количественного определения ДНК/РНК. Использование математических моделей анализа позволяет автоматически обрабатывать полученные результаты и избавляет от субъективности оценки. Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный прибор - амплификатор, отличительной особенностью которого является возможность к возбуждению и регистрации флюоресценции, показывающей степень наработки ампликонов на каждом цикле амплификации. Работа такого прибора заключается в непрерывном пошаговом процессе умножения целевых участков НК биологической пробы (путём поочередного нагревания-охлаждения реакционной смеси), помещенной в блок термостата. Во время температурного циклирования в пробе происходит накопление ампликона (искомого участка ДНК), который взаимодействует с флуоресцентным красителем, добавленным в каждую из пробирок. По мере прохождения циклов, увеличивается количество ампликона (если целевые участки в пробе присутствуют) с удвоением материала на каждом цикле амплификации (вследствие репликации ДНК). После определенного количества циклов, концентрация флюорофора увеличивается до уровня инструментальной регистрации, которая осуществляется путем возбуждения флюоресценции в узком спектральном диапазоне с помощью блока оптических сменных фильтров заданного оптического диапазона, и её регистрации детектором. В блоке регистрации сигнала происходит окончательная обработка информации и вывод её по протоколу передачи информации на компьютер или дисплей прибора. Таким образом, оборудование ПЦР в реальном масштабе времени, в отличие от «классического» ПЦР, является эффективным инструментом генетического контроля биологических проб.

Перспективы метода ПЦР в области экологического мониторинга и аграрной промышленности

Основной задачей, стоящей перед аграрной промышленностью и экологией, является разработка и улучшение методов комплексного мониторинга состояния ключевых групп растений и организмов-биоиндикаторов в соответствии с предполагаемым воздействием на них растительных патогенов.

Существует несколько классификаций биоиндикаторов: например, они подразделяются на экосистемные, факторные индикаторы здоровья (с соответствующими подразделениями), экологические, оценочные, индикаторы исполнения и т.п. [4]. Однако во всех целевых классификациях присутствуют различные меры биологического разнообразия. Поскольку его нарушение является одним из характерных следствий антропогенной нагрузки. В результате этого становится уязвимой устойчивость экосистем и их

способность к саморегуляции и самовосстановлению. Молекулярно-генетическое исследование организмов биоиндикаторов позволяет углубить представления о механизмах функционирования экологической системы. Высокая чувствительность и высокая специфичность метода ПЦР позволяет обеспечить наиболее точный и практичный подход для изучения проблем, связанных с оценкой антропогенной нагрузки и экологической безопасности [1].

Стоит упомянуть возможности метода для изучения биоразнообразия с помощью ДНК-маркеров. Анализ ДНК, который напрямую характеризует геном, а не его фенотипические особенности, может дать устойчивые характеристики растения, нейтральные по отношению к среде обитания и пригодные для определения различных генотипов, регистрации сортов и маркирования ценных для селекции генов и признаков культурных растений. Появилась возможность быстрого картирования генов, несущих нужные признаки, клонирования их и перемещения в другие геномы с целью улучшения сортов и гибридов. Широкое применение нашли варианты ПЦР амплификации ДНК с произвольными праймерами. С их помощью можно быстро обнаружить вариабельность большого числа локусов по всему геному культуры. Заключение

Методика ПЦР в реальном времени анализа растений открывает большие возможности для экологии. С помощью этого метода становится возможным решение как фундаментальных, так и прикладных задач экологии. Главные достоинства метода: высокая чувствительность, высокая специфичность, возможность количественного определения, возможность автоматизации, а также сравнительно небольшое время для проведения анализа. Возможности метода для изучения биоразнообразия с помощью ДНК маркеров делают актуальным его применение для разработки методик экологического мониторинга.

Анализ фитопатогенов с помощью метода ПЦР позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при исследовании растений, и в случае выявления провести более раннюю диагностику потенциального распространения патогенна, принять своевременно меры по обработке растений и снизить риск потери урожайности в сельском хозяйстве или риск потери какого либо вида растения в изучаемой экологической системе, включая редкие виды растений.

Также одним из важных достоинств аппаратного оснащения ПЦР-РВ является возможность соединения аппарата с компьютером и дистанционного отслеживания хода реакции непосредственно с него.

Список использованной литература:

1. Дорогина, О. В. Молекулярно-генетические методы в экологии растений / О. В. Дорогина, Е. В. Жмудь // Сибирский экологический журнал. - 2020. - Т. 27, № 4. - С. 416-432.

2. Исследование сельскохозяйственных культур, выращенных в Амурской области, на содержание трансгенов / Л. Е. Иваченко, Е. М. Стасюк, Е. С. Маскальцова [и др.] // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2010. - № 9. - С. 93-94.

3. Мягков, А. С. Приборная реализация методов цепной реакции генов в проблематике экологического мониторинга / А. С. Мягков, А. А. Тихомиров // Гео-Сибирь. - 2006. - Т. 3, № 1. - С. 122-124.

4. Неверова, О. А. Опыт использования биоиндикаторов в оценке загрязнения окружающей среды / О. А. Неверова, Н. И. Еремеева // Экология. Серия аналитических обзоров мировой литературы. - 2006. - № 80. - С. 1-88.

5. Сокорнова, С. В. Эколого-генетические основы современных агротехнологий: от фундаментальных к прикладным аспектам / С. В. Сокорнова // Защита и карантин растений. - 2016. - № 7. - С. 51-52.

6. Сухарева, А. С. ДНК-маркеры для генетического анализа сортов культурных растений / А. С. Сухарева, Б. Р. Кулуев // Биомика. - 2018. - Т. 10, № 1. - С. 069-084.

Источник: разработано автором

© Кириллов В.В., 2023