СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВОГО ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КОМПЛЕКСА АКТИВАЦИИ КАСПАЗЫ-2 ЧЕЛОВЕКА

1. Способ выделения белкового высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2 человека, формирующегося в раковых клетках в ответ на обработку ДНК-повреждающим химиотерапевтическим препаратом, характеризующийся тем, что включает
получение раковых клеток в количестве не менее, чем 5 млн клеток;
введение в раковые клетки ДНК-повреждающего химиотерапевтического препарата в концентрации, обеспечивающей запуск апоптотической гибели раковых клеток с достижением максимального уровня апоптотической гибели клеток при минимальном уровне некротической гибели клеток, которые определяют с помощью цитометрии;
инкубация раковых клеток в присутствии ДНК-повреждающего химиотерапевтического препарата до получения максимального уровня активации каспазы-2, который определяют предварительно до начала инкубации с помощью анализа методом Вестерн-блота уровня расщепления прокаспазы-2 и накопления каталитически активных фрагментов каспазы-2 и/или с помощью флуоресцентных специфических субстратов;
сбор клеток с последующим добавлением лизирующего буфера, который обеспечивает сохранность высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2;
отделение клеточного дебриса от лизата, содержащего высокомолекулярный комплекс активации каспазы-2,
разделение гель-фильтрацией полученного лизата клеток с обеспечением отделения фракций, содержащих высокомолекулярные формы каспазы-2, от фракций, содержащих ее мономерные формы, которое проводят в условиях, обеспечивающих получение высокомолекулярных форм каспазы-2 молекулярной массой не менее 500000 Да;
выделение из фракции, содержащей высокомолекулярные формы каспазы-2, белкового высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2 с помощью иммунопреципитации, которую проводят в условиях, обеспечивающих минимизацию сорбции неспецифических белков.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что ферментативную активность каспазы-2 в выделенном высокомолекулярном комплексе определяют с помощью флуоресцентных субстратов.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что раковые клетки представляют собой линию карциномы яичника человека Caov-4 или РА-1, или Caov-3, или SW 626, или SK-OV-3.
4. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что ДНК-повреждающий химиотерапевтический препарат представляет собой соединение платины, или алкилирующие агенты, или ингибиторы топоизомераз, или антиметаболиты.
5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что соединение платины представляет собой цисплатин, оксалиплатин, тетраплатин, карбоплатин, фенантриплатин.
6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что концентрацию ДНК-повреждающего химиотерапевтического препарата рассчитывают путем инкубации раковых клеток в присутствии разных концентраций этого агента и дальнейшим определением уровня гибели клеток методом цитометрии.
7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что концентрация ДНК-повреждающего химиотерапевтического препарата составляет не менее 10 мкМ.
8. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что концентрация химиотерапевтического препарата варьирует в пределах 35-100 мкМ.
9. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что продолжительность инкубации определяется путем инкубации клеток с ДНК-
повреждающим химиотерапевтическим препаратом в течение различного количества времени, но не менее часа, с последующим анализом уровня расщепления и активации каспазы-2 в этих клетках методом Вестерн-блота и/или с помощью флуоресцентных специфических субстратов.
10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что лизирующий буфер включает один из следующих детергентов: Nonidet Р-40, Triton Х-100, Tween 20, Tween 80, Brij 35, Brij 58, Octyl glucoside, Octyl thioglucoside, sodium dodecyl sulfate, CHAPS, digitonin, deoxycholate, cholate, sarkosyl в конечной концентрации от 0,01 до 1,5% об. в буфере.
11. Способ по по п. 10, характеризующийся тем, что лизирующий буфер дополнительно содержит пан-каспазный ингибитор zVAD-fmk (carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]fluoromethylketone) в конечной концентрации не менее 10 мкМ в буфере.
5
7
12. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что выбор условий гель-фильтрации включает подбор носителя для гель-фильтрации с разрешающей способностью от 5×10 вплоть до 5×10 Да.
13. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для получения высокомолекулярных форм каспазы-2 молекулярной массой не менее 500000 Да предварительно оценивают накопление в клетках высокомолекулярного комплекса с помощью гель-фильтрации с последующим Вестерн-блотом в зависимости от продолжительности инкубации клеток с ДНК-повреждающим химиотерапевтическим препаратом.
14. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что выделение комплекса активации каспазы-2 осуществляют с помощью иммунопреципитации, включающей выбор носителя для иммунопреципитации с наименьшими параметрами неспецифической сорбции, которую оценивают с помощью электрофореза образцов в полиакриламидном геле после иммунопреципитации с дальнейшим окрашиванием геля.
15. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что определение ферментативной активности каспазы-2 осуществляют на носителе для иммунопреципитации, с которым связан высокомолекулярный комплекс активации каспазы-2.
16. Способ выделения белкового высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2 человека, формирующегося в раковых клетках в ответ на обработку ДНК-повреждающим химиотерапевтическим препаратом, характеризующийся тем, что включает
получение раковых клеток в количестве не менее, чем 5 млн клеток;
введение с помощью трансфицирующего агента в раковые клетки вектора, содержащего генетический конструкт, представляющий собой последовательность гена каспазы-2 и дополнительную аминокислотную последовательность для аффинной хроматографии, в концентрации не менее 0,5 мкг на 1 мл питательной среды;
инкубация раковых клеток в течение времени, достаточного для детектируемой экспрессии генетического конструкта, представляющего собой последовательность гена каспазы-2 и дополнительную аминокислотную последовательность для аффинной хроматографии;
введение в трансформированные клетки ДНК-повреждающего химиотерапевтического препарата, обеспечивающей запуск апоптотической гибели раковых клеток с достижением максимального уровня апоптотической гибели клеток при минимальном уровне некротической гибели клеток, которые определяют с помощью цитометрии;
инкубация раковых клеток в присутствии ДНК-повреждающего химиотерапевтического агента до получения максимального уровня активации каспазы-2, который определяют предварительно до начала инкубации с помощью анализа методом Вестерн-блота уровня расщепления прокаспазы-2 и накопления каталитически активных
фрагментов каспазы-2 и/или с помощью флуоресцентных специфических субстратов;
сбор клеток с последующим добавлением лизирующего буфера, который обеспечивает сохранность высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2;
отделение клеточного дебриса от лизата, содержащего высокомолекулярный комплекс активации каспазы-2,
разделение гель-фильтрацией полученного лизата клеток с обеспечением отделения фракций, содержащих высокомолекулярные формы каспазы-2, от фракций, содержащих ее мономерные формы, которое проводят в условиях, обеспечивающих получение высокомолекулярных форм каспазы-2 молекулярной массой не менее 500000 Да;
выделение из фракции, содержащей высокомолекулярные формы каспазы-2, белкового высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2 с помощью аффинной хроматографии, которую проводят в условиях, обеспечивающих минимизацию сорбции неспецифических белков.
17. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что ферментативную активность каспазы-2 в выделенном высокомолекулярном комплексе определяют с помощью флуоресцентных субстратов.
18. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что раковые клетки представляют собой линию карциномы яичника человека Caov-4 или РА-1, или Caov-3, или SW 626, или SK-OV-3.
19. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что раковые клетки представляют собой линию карциномы яичника человека Caov-4 дефицитную по каспазе-2 - Caov-4-shRNA-каспаза-2.
20. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что раковые клетки представляют собой линию карциномы яичника человека Caov-4 дефицитную по каспазе-2 - Caov-4 caspase-2 CRISPR/Cas9 Knockout.
21. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что генетический конструкт представляет собой последовательность гена каспазы-2, которая соединена с последовательностью Strep-tag с N- и/или С-конца.
22. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что генетический конструкт представляет собой последовательность гена каспазы-2, которая соединена с последовательностью Twin-Strep-tag с N- и/или С-конца.
23. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что генетический конструкт представляет собой последовательность гена каспазы-2, которая соединена с последовательностью GST-tag с N- и/или С-конца.
24. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что генетический конструкт представляет собой последовательность гена каспазы-2, которая соединена с последовательностью Flag-tag с N- и/или С-конца.
25. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что концентрацию вектора, содержащего генетический конструкт, рассчитывают путем инкубации клеток в присутствии разных концентраций вектора и дальнейшим определением уровня экспрессии генетического конструкта методом Вестерн-блота.
26. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что время инкубации раковых клеток после введения вектора определяется путем инкубации клеток в течение разного количества времени, но не менее 6 часов, и последующего анализа экспрессии генетического конструкта, представляющего собой последовательность гена каспазы-2 и дополнительную аминокислотную последовательность для аффинной хроматографии, методом Вестерн-блота.
27. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что химиотерапевтический препарат представляет собой соединение платины или алкилирующие агенты, или ингибиторы топоизомераз, или антиметаболиты.
28. Способ по п. 27, характеризующийся тем, что соединение платины представляет собой цисплатин, оксалиплатин, тетраплатин, карбоплатин, фенантриплатин.
29. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что концентрация ДНК-повреждающего химиотерапевтического препарата рассчитывается путем инкубации клеток в присутствии разных концентраций этого препарата и дальнейшим определением уровня гибели клеток методом цитометрии.
30. Способ по п. 29, характеризующийся тем, что концентрация ДНК-повреждающего химиотерапевтического препарата составляет не менее 10 мкМ.
31. Способ по п. 30, характеризующийся тем, что концентрация ДНК-повреждающего химиотерапевтического препарата варьирует в пределах 35-100 мкМ.
32. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что продолжительность инкубации определяется путем инкубации клеток с ДНК-повреждающим химиотерапевтическим препаратом в течение различного количества времени, но не менее часа, с последующим анализом уровня процессинга и активации каспазы-2 в этих клетках методом Вестерн-блота и/или с помощью флуоресцентных специфических субстратов.
33. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что лизирующий буфер включает один из следующих детергентов: Nonidet Р-40, Triton Х-100, Tween 20, Tween 80, Brij 35, Brij 58, Octyl glucoside, Octyl thioglucoside, sodium dodecyl sulfate, CHAPS, digitonin, deoxycholate, cholate, sarkosyl в конечной концентрации от 0,01 до 1,5% об. в буфере.
34. Способ по п. 33, характеризующийся тем, что лизирующий буфер дополнительно содержит пан-каспазный ингибитор zVAD-fmk (carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspartyl-[O-methyl]fluoromethylketone) в конечной концентрации не менее 10 мкМ в буфере.
5
7
35. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что выбор условий гель-фильтрации включает подбор носителя для гель-фильтрации с разрешающей способностью от 5×10 вплоть до 5×10 Да.
36. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что для получения высокомолекулярных форм каспазы-2 молекулярной массой не менее 500000 Да предварительно оценивают накопление в клетках высокомолекулярного комплекса с помощью гель-фильтрации с последующим Вестерн-блотом в зависимости от продолжительности инкубации клеток с ДНК-повреждающим химиотерапевтическим препаратом.
37. Способ по п. 16, характеризующийся тем, что выделение комплекса активации каспазы-2 осуществляют с помощью аффинной хроматографии, включающей выбор носителя с наименьшими параметрами неспецифической сорбции, которую оценивают с помощью электрофореза образцов в полиакриламидном геле после аффинной хроматографии с дальнейшим окрашиванием геля.
38. Способ по п. 17, характеризующийся тем, что определение ферментативной активности каспазы-2 осуществляют на носителе для аффинной хроматографии, с которым связан высокомолекулярный комплекс активации каспазы-2.