СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ РАЗВИТИЯ И УМЕНЬШЕНИЯ ВЫРАЖЕННОСТИ АЛКОГОЛЬНОЙ МОТИВАЦИИ
METHOD FOR PREVENTING PROGRESSION AND RELIEVING INTENSITY OF ALCOHOLIC IMPULSE

Изобретение относится к медицине, в частности к наркологии, и может быть использовано для угнетения алкогольной мотивации в комплексном лечении хронического алкоголизма, а также в экспериментальной фармакологии для разработки средств направленной коррекции алкогольной зависимости и соматических осложнений алкоголизма у человека.
Алкоголизм является не только социальной, но и сложной медико-биологической проблемой. Развитие алкоголизма и его органных осложнений имеет гетерохимическую природу и связано с нарушением функций опиоидной, дофаминергической и др. систем, а также алко-гольметаболизирующих процессов. В то же время нейрохимические механизмы формирования начальной стадии алкоголизма - алкогольной зависимости, и в первую очередь, становления мотивации к многократному повторному приему этанола - остаются недостаточно выясненными. При этом следует подчеркнуть, что в большинстве исследований основное внимание уделяется выяснению и разработке способов направленной коррекции (см., например, Spanagel R. Alcoholism: A Systems Approach from Molecular Physiology to Addictive Behavior // Physiol. Rev. 2009. V.89. P.649-705) нарушений, обусловленных прямым и косвенным длительным воздействием алкоголя за счет его физико-химических и фармакодинамических влияний на различные нейромедиаторные и нейропептидные системы, обеспечивающих нарушения взаимоотношений мозговых систем подкрепления, отвергания и реагирования организма на стресс.Можно констатировать, что многие применяемые в настоящее время схемы лечения хронического алкоголизма (см., например, там же), являются часто эмпирическими и малоэффективными.
Известно, что ренин-ангиотензиновая система (РАС) играет ведущую роль в регуляции адаптационно-трофических процессов, участвуя в поддержания жизненно-важных физиологических констант организма (артериальное давление, электролитный состав крови, осмотическое давление и др.). Ее отдельные компоненты также вовлечены в опосредование мотивационных и эмоционально-окрашенных состояний, предопределяющие инициацию и субъективную оценку реализации целостных поведенческих актов (см., в частности, Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159. P.1392-1401).
Поскольку алкоголь потребляется, как правило, в виде жидкости, в составе водных растворов, злоупотребление в его приеме сочетается со стойкими нарушениями в механизмах поддержания водно-солевого баланса, а также перестройкой гомеостатических механизмов контроля кардиоваскулярных функций, сопровождающейся дисрегуляцией артериального давления и гемодинамики (Судаков К.В., Котов А.В., Келешева Л.Ф., Мещеряков А.Ф., Азаров А.В. Нейрофизиологические основы формирования алкогольной мотивации в эксперименте // Вопросы наркологии. 1990. №3. С.7-14).
Имеются убедительные сведения, что потребление алкоголя может модулироваться активностью РАС (там же). Однако анализ имеющихся литературных данных показал, что экспериментальные факты о взаимосвязи активности РАС и потребления алкоголя являются несистематизированными, разнородными и противоречивыми. Они касаются, как правило, либо различных особенностей изменения активности РАС в условиях однократного или токсического действия этанола (Cain M.L., Hester R.L., Izevbigie Е.В. Ethanol abrogates Angiotensin II-stimulated vascular smooth muscle cell growth // Med. Sci. Monit. 2006. V.12. N5. P.BR162-168), либо влияния модуляции активности РАС на метаболические изменения, развивающиеся при длительном, принудительном потреблении алкоголя (Kazim Н., Vazquez М., Ansari R.A., Malafa М.Р., Lalla J. Chronic alcohol-induced oxidative endothelial injury relates to angiotensin II levels in the rat // Mol. Cell. Biochem. 2007. DOI 10.1007/s11010-007-9583-6). Данные о систематических и целенаправленных исследованиях механизмов специфического участия РАС в процессах становления алкогольной мотивации в научной литературе не обнаружены.
Известно также, что хроническая алкоголизация сопровождается не только нарушениями регуляции базисных физиологических реакций, но и деструктивными процессами в тканях организма. Изменение содержания продуктов свободнорадикального перекисного окисления липидов, изменение активности протеаз, факторов свертывания крови и др. являются маркерами повреждения тканей при патологических состояниях, в том числе и при алкоголизме. К таким же маркерам относят и содержание в крови факторов антиоксидантной защиты (SH-группы белков, нитраты/нитриты, активность каталазы и др.) (Deng Xin-Sheng, Deitrich R.A. Ethanol Metabolism and Effects: Nitric Oxide and its Interaction // Current Clinical Pharmacology, 2007, 2, 145-153). Считают, что с этим связано токсическое действие алкоголя и его метаболитов на органы и ткани организма, а также развитие неспецифического иммунодефицита и аутоиммунных процессов, по отношению к антигенам мозга, печени, сердца и др. органов (Crews F.T., Nixon K. Mechanisms of Neurodegeneration and Regeneration in Alcoholism // Alcohol & Alcoholism V.44, No.2, pp.115-127, 2009), развивающихся в результате неспецифической модификации белков этими реактогенными соединениями. При этом аутоантитела такого рода рассматривают лишь в качестве маркеров хронического действия этанола. Обнаружено также, что при алкоголизации у животных и человека развивается неспецифическое иммунодефицитное состояние по иммуноцитологическим показателям (там же).
Следует отметить, что повышение уровня свободнорадикальных соединений является также признаком активации РАС, причем эти соединения являются одним из ключевых звеньев в механизмах сигнальной трансдукции, запускающихся при взаимодействии основного пептида PAC - ангиотензина-II (A-II) со специфическими рецепторами (Prasad K. Oxyradicals as a mechanism of angiotensin-induced hypertension // Intern. J. Angiology. 2004. V.13. P.13-59). Напротив, система оксида азота (NO) подавляет образование свободнорадикальных соединений и модулирует деятельность иммунной системы, играя роль физиологического антагониста этих процессов (там же).
Однако, в области изучения алкоголизма и при оценке эффектов этанола в экспериментальных исследованиях, учет динамики таких факторов проводится лишь в единичных случаях. В этой связи задачей, решаемой при создании заявленного способа, является проведение комплексных исследований динамики показателей, отражающих образование свободнорадикальных соединений и состояние систем антиоксидантной защиты, в корреляции с поведенческими и иммунологическими данными на разных стадиях становления и реализации алкогольной зависимости особи - человека и на животных в модельных экспериментах. Результат, который может быть получен при решении такой задачи, состоит в изменении уровня регуляторных пептидов (РП) для модуляции активности РАС в организме.
Для достижения поставленного результата, предлагается способ предупреждения развития и/или уменьшения выраженности алкогольной мотивации, заключающийся в иммунизации особи путем введения ей конъюгата ангиотензина с бычьим сывороточным альбумином (БСА), при этом в качестве ангиотензина предпочтительно использовать ангиотензин-I (A-I).
Способ иллюстрируется рис.1, на котором представлена схема среднесуточного потребления воды и этанола в условиях свободного выбора у крыс, подвергнутых активной иммунизации БПК ангиотензина-I до и после алкоголизации (в процентах к суммарному объему потребляемой жидкости).
Возможность достижения поставленного результата, по мнению авторов, обусловлена следующим.
1-7
1-7
1-7
Известно, что ангиотензиноген (Анг) под воздействием ренина преобразуется в ангиотензин-I (A-I), который характеризуется слабовыраженным сродством к специфическим ангиотензиновым рецепторам и не проявляет отчетливой физиологической активности. A-I под действием ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) превращается в основной эффекторный пептид PAC - А-II, который, в свою очередь, под действием различных амино- и карбоксипептидаз подвергается дальнейшему процессингу с образованием более коротких пептидов: ангиотензина-III (А-III), ангиотензина-IV (A-IV) и ангиотензин-II (A-II). Наиболее изучены физиологическая активность и мембранные рецепторы A-II (ATI или АТ2). A-III сходен по физиологическому действию с A-II, взаимодействует с этими же рецепторами. В отличие от него, пептиды A-IV и A-II имеют собственные специфические рецепторы и физиологическую активность (Albrecht D. Physiological and pathophysiological functions of different angiotensins in the brain // Br. J. Pharmacol. 2010. V.159. P.1392-1401).
1-7
Экспериментальный опыт иммунизации интактных животных конъюгатами некоторых РП (Анг, A-I, А-II, А-III, бета-эндорфин и др.) свидетельствует о возможности достижения эффекта долгосрочного и существенного увеличения содержания указанных эндогенных РП в организме на фоне отчетливого специфического иммунного ответа, а также характерных для данных пептидов проявлений их физиологического действия (по поведенческим и биохимическим показателям). Ранее показано, что процедура иммунизации конъюгатом белка-предшественника всех ангиотензинов - Анг до и после окончании алкоголизации приводит к разнонаправленным эффектам в произвольном потреблении этанола у опытных животных, соответственно подавляя или активируя проявления искусственно выработанной алкогольной зависимости. Эти эффекты сопряжены с фазными изменениям в образовании свободнорадикальных соединений и в процессах антиоксидантной защиты. Выявлены также однонаправленные сдвигов показателей гуморального и клеточного иммунитета в динамике активной иммунизации животных конъюгатом Анг, осуществляемой до и после алкоголизации крыс (Котов А.В., Толпыго С.М., Певцова Е.И. с соавторами Ангиотензиноген в механизмах становления и реализации алкогольной зависимости // Нейрохимия. 2006. Т.23, №2. С.143-155). Увеличение содержания Анг приводит к генерализованной активации РАС и увеличению образования всех ангиотензинов - продуктов его процессинга. Напротив, A-I обладает наименее выраженной физиологической активностью, по сравнению с другими пептидами РАС. Известно, что в A-I при действии АПФ, превращается в А-II, а под действием структурного гомолога АПФ-АПФ2 превращается в А-II, который является функциональным антагонистом А-II. Данный альтернативный путь расщепления A-I является преобладающим в условиях значительного увеличения его концентрации (Kurdi М., De Mello W., Booz G.W. Working outside the system: an update on the unconventional behavior of the renin-angiotensin system components // International J. Biol. Chem. Cell Biol. 2005. V.37. 1357-1367). Это позволяет сделать вывод, что в условиях иммунизации животных БПК A-I и вызванного таким способом длительного повышения уровня A-I в организме можно выявить его собственную, вероятно, компенсаторную роль в нейрохимических механизмах искусственно выработанной алкогольной зависимости у животных.
Пример. Влияние конъюгата ангиотензина-I (A-I) с бычьим сывороточным альбумином (БСА) на процессы формирования и реализации алкогольной мотивации у крыс с искусственно выработанной алкогольной зависимостью.
В первой серии эксперименты были выполнены на 25 крысах-самцах популяции «Wistar» (13 опытных и 12 контрольных животных). Крысы были предварительно иммунизированы конъюгатом A-I с БСА, а затем через 2 недели после иммунизации, также как контрольные животные, были подвергнуты принудительной хронической алкоголизации путем замены воды на 20% раствор этилового спирта в течение 3 месяцев и помещены в условия свободного выбора между водой и 20% раствором этанола.
Во второй серии опыты проводили на 25 крысах-самцах популяции «Wistar» (13 опытных и 12 контрольных животных). В этой серии животные были иммунизированы конъюгатом A-I с БСА после предшествующей хронической алкоголизации в течение 3 месяцев через 2 недели содержания в условиях свободного выбора между водой и 20% раствором этанола. В условиях свободного выбора у всех крыс оценивали суточное количество воды и алкоголя, произвольно потребляемого каждым животным в течение 4 месяцев.
Животные были иммунизированы конъюгатом A-I с БСА в смеси с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, п/к, пятикратно с интервалом 14 дней, в дозе 300 мкг/кг A-I, химически связанного с БСА. Контрольным крысам по такой же схеме инъецировали физиологический раствор.
125
Конъюгат A-I с БСА синтезировали с использованием карбодиимидного метода. При использовании бифункционального связывающего соединения (1-циклогексил-3(2-морфолиноэтил)-карбодиимид) химически соединяли молекулы пептида A-I (фирмы «Ameri-can Peptide Company Inc.», USA) с молекулами БСА (фирмы «Sigma», USA), образуя тем самым конъюгаты ангиотензина-I с белком. Степень связывания пептида с белком-носителем определяли с применением хроматографического анализа по изменению аминокислотного состава кислотных гидролизатов конъюгата и белка-носителя, обработанных связующим соединением. Наряду с этим оценивали включение в состав конъюгата меченого по I пептида. Полученный данным способом конъюгат содержал 10-12 молекул пептида на 1 молекулу белка.
У всех животных на 10-12 день после 2-й и 5-й иммунизации, а также через 1 и 3 месяца после начала алкоголизации отбирали пробы крови для определения титров антител к A-I, биохимических показателей и иммуноклеточного статуса. Определения уровня антител к A-I проводили в сыворотке крови крыс с помощью твердофазного иммуноферментного анализа с использованием микропланшет Costar (фирмы Corning Inc, США), сенсибилизированных Анг или БСА, и последующего связывания исследуемой антисыворотки конъюгатами иммуноглобулинов G против Ig G крысы с пероксидазой хрена. Конечное определение проводили с субстратной смесью, содержащей орто-фенилендиамин и перекись водорода, при сканировании на автоматическом микрофотометре «Multiscan ЕХ» (фирма Lab system, Швейцария) при длине волны 492 нм.
В ходе проведения экспериментов учитывали токсическое действие алкоголя на центральную нервную систему и внутренние органы по ряду биохимических показателей в сыворотке крови крыс. При этом оценивали свободнорадикальное перекисное окисление липидов (ПОЛ) - малоновый диальдегид (МДА), ферментативную (каталаза) и неферментативную (сульфгидрильные группы - SH-группы) антиокислительную активность, а также содержание триглицеридов. Одновременно определяли активность органоспецифических ферментов, как маркеров повреждения тканей, - аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ).
Уровень МДА в плазме крови определяли по методу Gorog P. et al., SH-групп - по методу Wayner D.D. М. et al., активность каталазы по методу Королюк М.А. с соавт. Активность АЛТ, ACT, γ-ГТ и содержание триглицеридов оценивали с использованием стандартных диагностических наборов фирмы Diasys (Германия).
Исследовались следующие показатели иммуноклеточного статуса: общее количество лейкоцитов, процентное и абсолютное количество лимфоцитов, T-лимфоцитов и их субпопуляций - T-хелперов/индукторов и Т-эффекторов/супрессоров, DN-клеток или Т-лимфоцитов с двойной отрицательной меткой, не несущих ни Т-хелперных, ни Т-супрессорных маркеров, В-лимфоцитов, NK-клеток (или естественных киллерных клеток) и клеток фагоцитарной системы: микрофагов - нейтрофилов и эозинофилов, и макрофагов - моноцитов, а также иммунорегуляторный индекс (отношение Т-хелперы/Т-супрессоры). В клетках крови: в фагоцитах, Т-лимфоцитах и тромбоцитах - проводили окрашивание на гистохимический маркер NO-синтазы - НАДФН-диафоразу. Определяли также уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови.
В результате исследования установлено, что активная иммунизация крыс конъюгатом А-I до и после их принудительной алкоголизации оказывает подавляющее действие на проявления алкогольной зависимости. Животные демонстрируют длительные (в течение 4-5 месяцев) однонаправленные эффекты в произвольном потреблении этанола в условиях свободного выбора между водой и раствором этанола, проявлявшиеся в виде уменьшения потребления алкоголя и увеличения приема воды по сравнению с контролем (Рис.1). Суммарный объем потребляемой жидкости при этом достоверно не изменялся. Данное воздействие не вызывало и значимых изменений артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС).
У всех животных после активной иммунизации конъюгатом A-I с БСА регистрировали большие значения титров специфических антител к A-I, причем уровень антител у крыс с предварительно сформированной алкогольной мотивацией был выше, чем у животных, иммунизированных конъюгатом A-I до алкоголизации. Следует отметить, что у неиммунизированных крыс, подвергнутых хронической алкоголизации, в отличие от интактных, не алкоголизированных животных, также были выявлены антитела к A-I, но с относительно небольшими величинами титров (Табл.1).
Установлено, что иммунизация крыс конъюгатом A-I с БСА до их принудительной алкоголизации сопровождается сдвигами иммуноклеточного статуса, характерными для нормального хода развития иммунологических реакций на конъюгат белок-гаптен и предупреждает такие сдвиги иммуноклеточного статуса, как дефицит Т-супрессоров/эффекторов, увеличение количества клеток, готовых к апоптозу, нейтрофилию и эозинофилию в ходе последующей длительной алкоголизации (Табл.2А).
Также установлено, что в ходе хронического потребления этанола наблюдаются вторичное иммунодефицитное состояние, охватывающее многие популяции иммунокомпетентных клеток. Последующая иммунизация крыс конъюгатом A-I с БСА уменьшает выраженность нарушений иммуноклеточного статуса, развившихся в ходе их длительной принудительной алкоголизации (Табл.2Б).
При иммунизации крыс конъюгатом A-I с БСА до алкоголизации выявлен также сдвиг баланса активности разных форм NO-синтазы в пользу iNOS фагоцитов, участвующей в элиминации апоптотических Т-лимфоцитов и в уменьшении риска развития аутоиммунных осложнений (Табл.3A). При иммунизации конъюгатом A-I после хронической принудительной алкоголизации отмечено уменьшение изменений иммуноклеточного статуса, таких как дефицит Т-супрессоров/эффекторов, В-лимфоцитов, увеличение количества клеток, готовых к апоптозу, выявляемых у контрольных крыс при длительном потреблении этанола. При этом показано смещение баланса NO-содержащих продуктов NOS-катализа в пользу оксида азота (Табл.3Б).
Результаты исследований указывают на избирательное вовлечение иммунных механизмов с участием пептидных компонентов ренин-ангиотензиновой системы (РАС) в процессы формирования и реализации алкогольной зависимости у животных.
На фоне иммунизации конъюгатом A-I с БСА не наблюдали достоверных изменений активности АЛТ, ACT и ГТГ. В ходе иммунизации отмечено умеренное возрастание активности каталазы по сравнению с фоновым периодом и с контролем. При этом содержание SH-групп достоверно снижается по сравнению с фоном и соответствующим контролем, что отражает некоторое истощение запасов антиокислительных факторов. Последующая (после иммунизации) алкоголизация в течение 3 месяцев не приводила к изменению активности органоспецифических ферментов и содержания триглицеридов, уменьшала активность каталазы, увеличивала содержания SH-групп, и несколько снижала содержание МДА, что свидетельствует об усилении процессов, как ПОЛ, так и антиоксидантной защиты. Указанное, по-видимому, обусловлено развивающейся при предварительной иммунизации A-I с БСА активацией компенсаторных биохимических процессов, и обеспечивает уменьшение повреждающего действия этанола в ходе последующей принудительной алкоголизации (Табл.4А).
Предварительная алкоголизация животных инициировала значимое повышение активности АЛТ и ГГТ, содержания триглицеридов, МДА, снижение содержания SH-групп и активности каталазы, что является характерным для алкогольной интоксикации и указывает на поражение тканей печени и сердца и нарушения липидного обмена на фоне активации ПОЛ и истощения антиоксидантной защиты. Последующая активная иммунизация конъюгатом A-I с БСА усиливала изменения ПОЛ (по уровню МДА), ослабляла изменения активности ферментов-маркеров повреждения тканей (АЛТ и ГТТ), препятствовала истощению факторов антиоксидантной защиты, главным за счет повышения активности каталазы (Табл.4Б).
Таблица 1.
Средние значения титров антител к ангиотензину-I у крыс, иммунизированных БПК A-I с БСА до и после алкоголизации (M±SD)
Условия иммунизации
Период эксперимента
Опыт
Контроль
до воздействия
1:180±80
1:190±60
до алкоголизации (группа I)
после 2-й иммунизации
1:6400±3500***
1:250±80
после 4-й иммунизации
1:14550±5790***
1:290±80
после 1 мес. алкоголизации
1:8730±3230***
1:470±120*
после 3 мес. алкоголизации
1:4360±1610***
1:740±210**
после алкоголизации (группа II)
после 1 мес. алкоголизации
1:390±90
1:370±80
после 3 мес. алкоголизации
1:530±100*
1:670±150*
после 2-й иммунизации
1:14930±6870***
1:690±140*
после 4-й иммунизации
1:18670±7450***
1:760±200**
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 по сравнению с исходными значениями до воздействия.
Таблица 2А.
Иммуноцитологические показатели (M±SD) у крыс в процессе иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)
Иммунологический показатель
Единица измерения
До воздействия
После 3 мес. алкоголизации
опыт
контроль
опыт
контроль
лейкоциты
тыс./мкл
15,76±1,09
14,67±1,35
13,12±0,77
13,01±1,23
лимфоциты суммарные
%
79,71±2,26
80,44±2,47
62,09±3,39*
64,75±2,96***
тыс./мкл
12,01±0,98
11,62±0,82
8,01±0,41*
8,44±0,93*/**
T-лимфоциты
%
81,00±2,65
81,22±2,35
83,73±2,09
85,17±1,75*
тыс./мкл
10,10±0,81
9,35±0,52
6,73±0,40*
7,22±0,85*
T-хелперы
%
41,0±3,44
42,83±3,53
39,10±3,67
35,75±3,77
тыс./мкл
6,60±0,86
5,46±0,93
3,17±0,85*
3,87±0,78*
Т-супрессоры
%
27,5±1,45
27,0±2,67
24,0±1,27
31,75±3,90<sup>∧</sup>
тыс./мкл
3,70±0,44
2,51±0,86
1,51±0,17*
2,70±0,77 л
Tx/Tc
усл. ед.
1,37±0,67
1,47±0,88
1,21±0,51
1,21±0,25
DN-клетки
%
16,07±0,54
18,33±0,57
8,55±1,27*
15,56±2,30<sup>∧</sup>
тыс./мкл
2,58±0,86
2,67±0,71
0,54±0,33*
1,31±0,89<sup>∧</sup>
В-лимфоциты
%
5,71±0,71
6,89±1,38
3,91±0,77
2,50±0,50*/**
тыс./мкл
0,71±0,10
0,83±0,20
0,31±0,06*
0,19±0,03**
NK-клетки
%
5,14±0,85
4,56±0,91
5,73±1,24
3,75±0,73
тыс./мкл
0,67±0,14
0,58±0,15
0,46±0,10
0,30±0,05
нейтрофилы
%
13,57±2,09
12,78±1,48
28,09±3,30
25,08±3,02**
тыс./мкл
2,12±0,35
1,99±0,45
3,81±0,6
3,28±0,45**
эозинофилы
%
0,43±0,20
1,0±0,33
3,73±0,93*
3,33±0,92**
тыс./мкл
0,07±0,03
0,15±0,05
0,52±0,15
0,42±0,11*/**
моноциты
%
6,29±1,53
5,78±1,35
6,09±1,03
6,83±0,97
тыс./мкл
0,99±0,27
0,89±0,23
0,79±0,13
0,87±0,12
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - достоверность различий по сравнению с предыдущим периодом обследования в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних);
<sup>∧</sup> - р<0.05, <sup>∧∧</sup> - р<0.01, <sup>∧∧∧</sup> - р<0.001 - достоверность различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом с различными дисперсиями).
Таблица 2Б.
Иммунопатологические показатели (M±SD) у крыс в процессе принудительной алкоголизации и последующей иммунизации БПК A-I с БСА (II группа)
Иммунологический показатель
Единица измерения
До воздействия
После 3 мес. алкоголизации
После 5-ой иммунизации
опыт
контроль
опыт
контроль
опыт
контроль
лейкоциты
тыс./мкл
17,3±0,91
16,66±1,77
11,52±0,8**
11,16±1,02**
10,57±0,7
10,74±0,78
лимфоциты суммарные
%
75,86±1,29
75,29±3,50
70,83±2,72
67,09±4,58
57,92±3,24*
62,90±3,90
тыс./мкл
13,11±0,67
12,34±1,14
8,08±0,54**
7,19±0,66**
6,14±0,53**
6,70±0,60
Т-лимфоциты
%
76,43±3,22
83,14±2,77
84,58±1,87
82,91±2,15
82,58±1,67
82,30±1,80
тыс./мкл
10,05±0,76
10,18±0,80
6,86±0,52**
5,89±0,48***
5,06±0,42*/**
5,56±0,55
Т-хелперы
%
39,0±9,37
38,4±5,29
29,5±4,98
23,0±3,29
38,38±2,89*
39,0±9,45*
тыс./мкл
3,97±0,92
4,27±0,88
2,38±0,49*
2,40±0,58*
2,49±0,20
2,60±0,61
Т-супрессоры
%
23,25±3,12
23,50±3,18
20,3±2,88
29,0±4,94
29,45±2,50
20,6±3,95
тыс./мкл
3,21±0,25
2,88±0,35
1,34±0,37*
1,94±0,49
1,87±0,25
1,30±0,39
Тх/Тс
усл. ед.
1,19±0,29
1,81±0,38
1,40±0,75
1,0±0,23
1,43±0,17
1,91±0,85
DN-клетки
%
20,0±3,25
19,5±3,84
32,0±5,78*
27,0±0,23*
13,87±3,42*
24,0±2,8<sup>∧</sup>
тыс./мкл
3,00±0,97
3,56±0,92
3,01±0,92
2,72±0,94
0,96±0,29**
2,05±0,29<sup>∧</sup>
B-лимфоциты
%
6,86±1,29
4,57±0,75
2,50±0,41**
3,18±0,79
2,93±0,54
1,70±0,21<sup>∧</sup>
тыс./мкл
0,91±0,18
0,56±0,11
0,21±0,04**
0,25±0,07**
0,20±0,05
0,11±0,01
NK-клетки
%
5,57±1,32
5,43±1,79
6,0±1,42
4,91±1,25
5,83±0,91
6,20±0,69
тыс./мкл
0,73±0,18
0,71±0,26
0,46±0,10
0,38±0,11
0,35±0,06
0,40±0,04
нейтрофилы
%
13,29±1,50
15,86±3,54
19,67±1,97**
20,64±3,63
29,25±2,03**
25,9±3,22
тыс./мкл
2,28±0,24
2,88±0,76
2,31±0,29
2,47±0,72
3,06±0,26**
2,85±0,46
эозинофилы
%
1,14±0,70
0,29±0,18
2,25±0,69
2,82±0,48***
6,08±0,99**
3,0±0,44
тыс./мкл
0,21±0,13
0,14±0,03
0,26±0,07
0,3±0,04*
0,64±0,11**
0,31±0,06<sup>∧∧</sup>
моноциты
%
9,71±0,77
7,57±1,57
7,33±1,31
9,45±1,69
6,75±1,23
8,3±1,5
тыс./мкл
1,7±0,18
1,29±0,27
0,89±0,2**/***
1,16±0,29
0,73±0,14
0,88±0,16
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - достоверность различий по сравнению с предыдущим периодом обследования в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних);
<sup>∧</sup> - р<0.05, <sup>∧∧</sup> - р<0.01, <sup>∧∧∧</sup> - р<0.001 - достоверность различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом с различными дисперсиями).
Таблица 3A.
Система оксида азота (M±SD) у крыс после иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)
Показатель
Ед. измерения
Период эксперимента
Опыт
Контроль
активность НАДФН-диафоразы - гистохимического маркера NO-синтазы
в фагоцитах
цитохимический индекс
до воздействия
0,05±0,01
0,09±0,03
после 3 месяцев алкоголизации
0,28±0,03###
0,22±0,02#
в Т-лимфоцитах
до воздействия
0,25±0,04
0,23±0,03
после 3 месяцев алкоголизации
0,50±0,06
0,54±0,04
в тромбоцитах
до воздействия
0,06±0,01
0,04±0,01
после 3 месяцев алкоголизации
0,12±0,02
0,14±0,03
уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме
мкМ/л
до воздействия
16,58±1,53
19,33±1,74
после 3 месяцев алкоголизаиии
25,25±2,55
33,06±4,02
# - р<0.05, # - р<0.01, ### - р<0.001 - значимость различий по сравнению с предыдущим периодом в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом для средних).
Таблица 3Б.
Система оксида азота (M±SD) у крыс в процессе алкоголизции и последующей иммунизации БПК A-I с БСА (II группа)
Показатель
Ед. измерения
Период эксперимента
Опыт
Контроль
активность НАДФН-диафоразы - гистохимического маркера NO-синтазы
в фагоцитах в Т-лимфоцитах в тромбоцитах
цитохимический индекс
до воздействия
0,09±0,03
0,04±0,01
5-кратная иммунизация после алкоголизации
0,14±0,02
0,13±0,02
до воздействия
0,30±0,04
0,24±0,03
5-кратная иммунизация после алкоголизации
0,44±0,04
0,38±0,03*
до воздействия
0,07±0,02
0,0±0,01
5-кратная иммунизация после алкоголизации
0,22±0,03
0,18±0,02*
уровень стабильных метаболитов оксида азота в плазме
мкМ/л
до воздействия
9,22±0,83
12,06±2,21
5-кратная иммунизация после алкоголизации
29,69±4,66
28,44±3,46
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 -значимость различий по сравнению с исходным уровнем показателя в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).
Таблица 4A.
Содержание SH-групп, МДА, триглицеридов и активность каталазы, АЛТ, ACT и <u>γ</u>-ГТ (M±SD) в сыворотке крови крыс в процессе иммунизации БПК A-I с БСА и последующей алкоголизации (I группа)
Период эксперимента
Группы
SH-группы, мкмоль/л
МДА, мкмоль/л
Триглицериды, ммоль/л
Каталаза, м кат/л
АЛТ, ед./л
ACT, ед./л
γ-ГТ, ед./л
до воздействия
опыт
134,8±13,2
30,6±1,9
0,99±0,25
97,7±10,2
113,6±4,94
207,4±17,8
2,66±0,83
контроль
130,0±9,9
32,9±2,1
0,84±0,076
117,7±6,3
134,3±7,6
202,3±12,3
2,05±0,6
после 2-ой иммунизации
опыт
108,9±9,4
32,6±1,3
0,91±0,0079
118,4±4,2<sup>∧∧</sup>
139,1±6,18**
218,5±14,6
1,48±0,87
контроль
133,5±8,3
34,5±1,8
1,22±0,094**
96,8±5,5
136,8±5,75
222,8±7,9
1,49±0,49
после 5-ой иммунизации
опыт
101,0±8,6*/<sup>∧∧∧</sup>
34,0±2,5
1,20±0,11
94,5±5,5
109,8±5,87
189,7±5,77
2,94±0,76
контроль
132,6±8,0
35,4±1,9
1,45±0,13
94,6±8,8*
107,8±7,9
181,2±8,7
1,86±0,4
после 1 месяца алкоголизации
опыт
141,3±9,7
25,7±1,1*
1,18±0,17
109,0±5,3
97,4±6,03
161,0±10,3*
4,48±1,58
контроль
169,4±13,9*
27,6±1,1*
1,51±0,2*
86,7±10,2*
100,0±5,0**
153,2±6,96**
2,6±0,56
после 3 месяцев алкоголизации
опыт
187,1±10,4**/<sup>∧</sup>
27,2±0,9
1,0±0,15
78,5±5,1
118,6±4,68
149,5±7,27**
3,0±1,06
контроль
155,6±10,6
28,0±1,1*
0,93±0,17
78,7±10,4*
115,7±5,08
169,0±8,14**
5,38±1,93
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - значимость различий по сравнению с исходным уровнем в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).
<sup>∧</sup> - р<0.05, <sup>∧∧</sup> - р<0.01, <sup>∧∧∧</sup> - р<0.001 - значимость различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом для выборок с различными дисперсиями).
Таблица 4Б
Содержание SH-групп, МДА, триглицеридов и активность каталазы, АЛТ, ACT и γ-ГТ (M±SD) в сыворотке крови крыс, иммунизированных БПК A-I с БСА после алкоголизации (II группа)
Период эксперимента
Группы
SH-группы, мкмоль/л
МДА, мкмоль/л
Триглицериды, ммоль/л
Каталаза, м кат/л
АЛТ, ед./л
ACT, ед./л
γ-ГТ, ед./л
до воздействия
опыт
171,5±2,0
15,0±0,7
1,25±0,09
98,4±7,9
135,6±4,6
191,7±10,3
2,23±0,8
контроль
160,1±14,5
16,0±0,7
0,99±0,12
100,3±4,9
122,9±5,52
204,3±11,6
1,56±0,48
после 1 месяца алкоголизации
опыт
129,3±1,1*/<sup>∧∧</sup>
33,9±1,7***
1,31±0,22
89,9±5,3
119,4±3,4**
174,7±13,3
6,9±1,22**
контроль
159,7±8,5
34,6±1,7***
1,41±0,21
97,3±7,7
130,5±6,14
194,9±5,3
3,41±0,75
после 3 месяцев алкоголизации
опыт
141,3±9,3
28,6±1,4***
1,88±0,23
114,0±3,5<sup>∧∧∧</sup>
105±6,4***
166,4±8,58
4,90±1,3
контроль
157,9±11,8
25,0±1,5***
1,37±0,22
66,1±7,3***
106,1±5,35*
175,4±9,4
1,74±0,5
после 2-ой иммунизации
опыт
89,4±5,7***/<sup>∧</sup>
28,2±1,1***
1,30±0,14
85,5±8,1
115,9±7,5
184,8±15,6
4,81±1,4
контроль
114,1±5,9**
31,3±1,3***
1,43±0,22
67,4±8,1***
119,1±10,0
173,2±7,85
1,8+0,57
после 5-ой иммунизации
опыт
138,5±10,4*/<sup>∧</sup>
36,7±1,4***
1,27±0,12
72,8±4,4*/<sup>∧</sup>
95,7±6,4***
166,9±13,3
7,0+1,6
контроль
175,5±9,4
36,4±1,4***
1,18±0,19
89,0±2,3*
89,1±6,78***
184,3±15,1
12,5±4,2
* - р<0.05, ** - р<0.01, *** - р<0.001 - значимость различий по сравнению с исходным уровнем в одной и той же подгруппе крыс (определялась парным двухвыборочным t-тестом).
<sup>∧</sup> - р<0.05, <sup>∧∧</sup> - р<0.01, <sup>∧∧∧</sup> - р<0.001 - значимость различий между опытной и контрольной подгруппами крыс в один и тот же период обследования (определялась двухвыборочным t-тестом для выборок с различными дисперсиями).