Способ децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса
METHOD OF LUNG DECELLULARISATION FOR PRODUCING EXTRACELLULAR MATRIX

Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для получения внеклеточных матриксов органов и тканей, применяемых в реконструктивной хирургии для замены или поддержания функций пораженных органов и тканей.
Внеклеточный матрикс (ВКМ), который используется в тканевой инженерии, может быть получен различными способами децеллюризации. Известные способы децеллюризации предполагают последовательную многоэтапную обработку ткани растворами детергентов и/или ферментов /1, Hoshiba, Т., Lu, Н., Kawazoe, N. and Chen, G. (2010). Decellularized matrices for tissue engineering. Expert Opinion on Biological Therapy, 10(12), pp. 1717-1728. doi: 10.1517/14712598.2010.534079/. Способы децеллюризации различаются по длительности воздействия и концентрации реагентов, а также способами их введения. Наиболее часто используют такие детергенты, как додецилсульфат натрия, Triton Х-100, дезоксихолат натрия, трипсин в смеси с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА). Децеллюризация осуществляется по следующим схемам: используемую ткань помещают в емкость с реагентом, обеспечивая постоянное перемешивание, или осуществляют перфузию легкого реагентами через кровеносные сосуды.
Существуют различные способы децеллюризации легкого, однако, известные способы обладают рядом недостатков: из обрабатываемой ткани не удаляются все клетки, остаются их ядра или возникают механические повреждения целостности ВКМ.
Известен способ децеллюризации легких /2, см. патент RU 2547799/, заключающийся в постоянной, соответствующей физиологическим параметрам, вентиляции легких атмосферным воздухом через трахею. При этом, в течение 24 часов производится перфузия легких путем последовательного введения через легочную артерию децеллюризирующих растворов: фосфатного буфера, 1% водного раствора дезоксихолата натрия, свиной панкреатической ДНКазы I, очищенной воды с равной продолжительностью времени воздействия.
Недостатки данного метода заключаются в сложности проведения катетеризации легочной артерии у мелких лабораторных животных, а также необходимости использования химических реагентов с высокой стоимостью, таких как ДНКаза и дезоксихолат натрия, что существенно затрудняет проведение данного метода.
Прототипом является способ децеллюризации ткани легкого мыши /3, Nonaka, P., Uriarte, J., Campillo, N., Melo, E., Navajas, D.,  R. and Oliveira, L. (2014). Mechanical properties of mouse lungs along organ decellularization by sodium dodecyl sulfate. Respiratory Physiology & Neurobiology, 200, pp. 1-5. http://dx.doi.org/10.1016/j.resp.2014.04.008/. Данный способ состоит из отмывания комплекса легкого и трахеи от остатков крови, 4 циклов заморозки при -80°С и разморозки при комнатной тепературе, по 10 минут каждый цикл. После чего последовательно через трахею в легкие вводится 2 мл фосфатно-солевого буфера 6-8 раз, 2,5 мл деионизированной воды 6-8 раз, и 2,5 мл 1% раствора додецил сульфата натрия. Далее комплекс органов помещается на 24 часа, последовательно в 1% додецилсульфата натрия при комнатной температуре, затем в фосфатный буфер при постоянном перемешивании при комнатной температуре. После чего легкие перекладываются в чистый раствор фосфатно-солевого буфера для последующего хранения при 4°С.
Основными недостатками данного способа являются недостаточная степень удаления клеток и элементов клеток из ткани, низкая эффективность использования одного агента для децеллюризации, и высокий риск контаминации ткани, из-за длительности протокола и отказа от антибиотиков.
Техническая проблема, решаемая данным изобретением, состоит в создании способа, позволяющего максимально эффективно удалять клеточные структуры из тканей легкого, при этом сохраняя целостность общей структуры ВКМ, снижая риск его контаминации микроорганизмами.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе децеллюризации легкого для получения внеклеточного матрикса, включающем четыре цикла заморозки при -80°С и разморозки при 37°С, по 10 минут каждый цикл, и последовательного промывания правого и левого легких через трахею растворами: 2,5 мл денонсированной воды 6-8 раз, 2 мл фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5%, 6-8 раз, и 5 мл 1% раствора додецил сульфата натрия, с последующим помещением комплекса органов на 24 часа - первые сутки, в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия при постоянном перемешивании, в первые сутки образец помещается в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия при 37°С, а затем - на следующие 24 часа - вторые сутки, образец помещается в 150 мл 1% раствора додецилсульфата натрия + 0,5% этилендиаминтетрауксусной кислоты, при 37°С и постоянном перемешивании, после чего - в раствор фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5% при 4°С, где образец может храниться в течение двух недель до использования.
Способ децеллюризации комплекса из двух легких осуществляется следующим образом. Приготавливают раствор №1 - 1% раствор додецилсульфата натрия на деионизированной воде, емкость помещается в термостат при 37°С до полного растворения додецилсульфата натрия. Приготавливают раствор №2 - 1% раствор додецилсульфата натрия + 0,5% ЭДТА в деионизированной воде, емкость помещается в термостат при 37°С до полного растворения веществ. Приготавливают раствор №3 - 150 мл раствора фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5%. Производится забор комплекса органов крысы, состоящего из трахеи и обоих легких. После чего комплекс подвергается четырем циклам заморозки при -80°С и разморозки при 37°С, по 10 минут каждый цикл. Далее легкие промываются путем введения фосфатно-солевого буфера + пенициллин/стрептомицин 5%. через трахею 6-8 раз по 2 мл. Следующим этапом, легкие промываются путем введения деионизированной воды по 2,5 мл 6-8 раз через трахею. После завершения промывания, в легкие, через трахею медленно вводится 5 мл 1% додецилсульфата натрия, раствор должен наполнить легкие. Далее комплекс помещается в 150 мл 1% раствор додецилсульфата натрия, на 24 ч. (первые сутки), с постоянным перемешиванием при 37°С. После обработки детергентом, легкие извлекаются и промываются путем введения 15 мл фосфатно-солевого буфера через трахею. Следующим этапом органы помещаются в 1% раствор додецилсульфата натрия + 0,5% ЭДТА, на 24 ч.(вторые сутки), при постоянном перемешивании раствора при 37°С. Завершающим этапом является помещения комплекса из легких и трахеи в фосфатно-солевой буфер + пенициллин/стрептомицин 5% и при 4°С. В данном растворе легкие могут храниться в течение двух недель перед использованием.
Изобретение было проверено путем гистологического анализа с использованием окраски гематоксилин-эозина и проведения сканирующей электронной микроскопии полученных децеллюризированных образцов. Окраска с помощью гематоксилина/эозина на световой микроскопии показывает 99,9% удаление клеток и их ядер из тканей легкого. Данные электронной микроскопии демонстрируют сохранение структуры ВКМ легкого, без признаков нарушения его целостности. Признаки бактериальной контаминации отсутствуют.
Технический результат от использования способа - получение децеллюризированного комплекса органов, не содержащего клеточных элементов и нуклеиновых кислот, состоящего из трахеи, правого и левого легкого, который в дальнейшем может использоваться для приготовления 3D биологических каркасов с последующей культивацией различных адгезионных клеточных культур.