АНАЛИТИЧЕСКАЯ ВАННА ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО ДОТ-ИММУНОАНАЛИЗА
ANALYTICAL BATH FOR MULTIPLEX DOT IMMUNOASSAY

Изобретение относится к аналитическим ваннам для проведения иммунохимического анализа в наборах для дот-иммуноанализа, в частности наборах для мультиплексного (многопрофильного) выявления в препаратах крови антител к определенному спектру возбудителей инфекционных заболеваний и может быть использовано в медицине, биотехнологии и вирусологии.
Многопрофильное выявление антител проводится с использованием белковых матриц (иммуночипов), представляющих собой плотную плоскую подложку с дискретно нанесенными на нее антигенами возбудителей инфекционных заболеваний. В процессе анализа белковая матрица последовательно инкубируется в ряде рабочих и отмывочных растворов. Таким образом, для выполнения каждого теста необходим набор реакционных сосудов, количество которых определяется числом этапов процедуры анализа (не менее 6 этапов). В качестве реакционных сосудов могут использоваться пробирки или флаконы, однако при таком подходе растворы используются нерационально, а набор для анализа получается громоздким. Для анализа наиболее целесообразно использовать ванночку, разбитую на необходимое количество изолированных ячеек и заполненную готовыми растворами. В таком случае дот-анализ заключается в последовательном переносе (с заданными временными интервалами) иммуночипа по ряду ячеек. Ячейки и иммуночипы могут быть скомпонованы в блоки с взаимно сопоставимыми размерами для проведения нескольких тестов.
Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемой заявки на полезную модель является проявочная ванна из наборов серии «Immunocomb» франко-израильской фирмы «Orgenics», описанная в докладе «Простые бесприборные тест-системы для подтверждения наличия антител к вирусу иммунодефицита человека 1 и 2 типа», авторы: Дробченко Н.Е.; Марголин О.; Ривец Б. ЗАО «Биоград», Санкт-Петербург, Россия; Орженикс Лтд., Явне, Израиль; Орженикс С.А., Курбевуа, Франция. Доклад сделан на Дальневосточном окружном совещании «Профилактика ВИЧ-инфекции, вирусных гепатитов В и С, выявление и лечение больных СПИД» 10-15 августа 2009 года в г. Якутск ( lectures/lecture/44). Ванна предназначена для проведения дот-иммуноанализа для выявления антител с использованием конъюгатов щелочной фосфатазы и представляет собой монолитный блок, выполненный из термопластичного синтетического материала, объединяющий 6 рядов ячеек для выполнения 12 анализов. Ванна с заполненными ячейками герметизирована фольгой.
Прототип имеет следующие недостатки:
1. Все ячейки имеют прямоугольное сечение, что не исключает прилипание иммуночипа к стенке ячейки. Такое прилипание может ограничивать контакт рабочей поверхности иммуночипа с рабочими растворами и замедлять или блокировать реакцию на этой поверхности, а также ухудшать качество отмывочных процедур, что негативно сказывается на проведении дальнейших операций и может приводить к образованию артефактов.
2. Все ячейки одинаковы по размерам и уровню заполнения реагентами, что нерационально в плане расходования наиболее дорогостоящих компонентов реакции, таких как конъюгат и проявляющий раствор (субстрат). При выполнении анализа такие компоненты требуются в объемах в несколько раз меньших, чем отмывочные растворы.
3. Верхний край ванны выполнен плоскими, что при термической запайке ячеек фольгой может приводить к деформации верхней части ячеек.
4. Число рядов ячеек недостаточно для выполнения анализов с большим числом стадий, например, тестов для выявления антигенов или тестов с использованием коллоидного золота.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение качества проведения иммунохимических реакций в ванне за счет исключения прилипания иммуночипов к внутренней поверхности стенок ячеек и повышение долговечности ванны за счет исключения возможности деформации ячеек ванны в процессе их термической запайки фольгой. Дополнительным техническим результатом является снижение расхода наиболее дорогостоящих реагентов за счет выполнения рядов ячеек ванны разными по объему и размерам
Указанный технический результат достигается тем, что в аналитической ванне для проведения мультиплексного дот-иммуноанализа, представляющая собой монолитный блок, выполненный из химически инертного термопластичного материала, с набором реакционных ячеек для реакционных и отмывочных растворов и термически герметизированных фольгой со слоем полимерного теормопластичного материала согласно изобретения:
- ячейки ванны выполнены в поперечном сечении в виде вытянутого ассиметричного шестиугольника с острыми противоположно расположенными углами, предназначенными в качестве направляющих при введении в ячейки ванны пластин иммуночипа для предотвращения контакта их поверхностей (при этом пластины иммуночипа в ячейках ориентированы рабочей поверхностью в сторону большего объема ячеек для лучшего взаимодействия с большим нормированным количеством рабочего раствора);
- по верхнему краю ванны выполнен выпуклый сварочный профиль в виде клиновидных в сечении буртиков, окантовывающих каждую ячейку, который повышает надежность герметизации ячеек ванны и препятствует их деформации при термической запайке.
- ячейки для рабочих растворов реакции выполнены с меньшей площадью сечения, чем для отмывочных растворов, что способствует рациональному использованию рабочих растворов и снижает стоимость тест-системы.
Кроме того, количество рядов ячеек увеличено до 11, что позволяет реализовывать различные схемы анализа, в том числе по выявлению антигенов и тестов с использованием многостадийных вариантов усиления оптического сигнала.
Описание графических материалов. На фиг.1 приведена схема аналитической ванны для выполнения пяти мультиплексных дот-иммуноанализов с использованием конъюгатов на основе коллоидного золота, с усилением сигнала физическим проявлением и стабилизацией окраски щелочным раствором тиомочевины. На фиг.2 - то же, разрез по А-А. На фиг.3 приведена схема нанесения антигенов и контролей на белковую матрицу, расположенную на пластине иммуночипа, а на фиг.4 представлены результаты дот-иммуноанализа пяти образцов препаратов крови.
Описание конструкции заявляемой аналитической ванны.
Аналитическая ванна изготавливается из инертного термопластичного синтетического материала, например из полипропилена, литьем под давлением в пресс-форме определенной конфигурации (фиг.1). Ванна может быть изготовлена в виде монолитного блока 1, в котором имеется определенное число модулей 2, например 5 модулей, как изображено на фиг.1, каждый из которых рассчитан на выполнение одного анализа. Каждый модуль 2 имеет несколько (по числу операций анализа) малых ячеек 3 и больших ячеек 4 для размещения в них пластин 5 иммуночипа. Каждая ячейка 3 и 4 по верхнему краю имеет буртики 6 (сварочный контур) треугольного сечения, высотой 0,5 мм. В ванне однотипные (одного размера) ячейки 3 или 4 модулей 2 образуют ряды 7, каждый из которых заполнен определенным рабочим или отмывочным раствором. На фиг.1 приведено 11 рядов однотипных ячеек. Ячейки 3 для рабочих растворов реакции выполнены с меньшей площадью сечения, чем для отмывочных растворов, что способствует рациональному использованию рабочих растворов и снижает стоимость тест-системы. Заполненная растворами аналитическая ванна с помощью термопресса запаивается фольгой со слоем полипропилена. При этом температура и давление пресса подбираются таким образом, чтобы расплавлялись только слой полипропилена на фольге и клиновидные буртики 6 (сварочный контур), что устраняет деформацию ячеек 3 и 4 ванны. Готовая ванна маркируется с указанием наименования теста, а также обозначения буквами (А-Е) модулей и цифрами (1-11) рядов однотипных ячеек.
Описание процесса использования заявляемой аналитической ванны.
При выполнении анализа ячейки 3 и 4 вскрывают перфоратором, в первый ряд ячеек вносят исследуемые образцы сыворотки или цельной капиллярной крови и погружают в них пластины 5 иммуночипа. Острые противоположно расположенные углы ячеек 3 и 4 предназначены в качестве направляющих при введении в ячейки ванны пластин 5 иммуночипа для предотвращения контакта их поверхностей со стенками ячеек 3 и 4. При этом пластины 5 иммуночипа в ячейках 3 и 4 ориентированы рабочей поверхностью в сторону большего объема указанных ячеек для лучшего взаимодействия с большим нормированным количеством рабочего раствора. Затем пластины 5 иммуночипа вынимают и через определенные интервалы времени последовательно переносят по следующим рядам 7 ячеек 3 и 4, после выемки из последнего ряда визуально учитывают результат по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения на пластины 5 иммуночипа иммунореагентов. Для одиночных анализов вскрывают и используют отдельные модули 2.
Пример 1. Использование аналитической ванны для выполнения анализа гуморальных антител с использованием конъюгата на основе коллоидного золота.
Ванну для анализа с применением конъюгатов коллоидного золота заполняют растворами:
- ряд 1 - раствор для разведения образцов - ТСБ-Т с 0,05% (в/о) казеина, рН 9,0;
- ряды 2, 3, 5, 6 - раствор для отмывок (ТСБ-Т) - 0,1 М Трис-HCl с 0,15 М NaCl и 0,1% твин-20, рН 7,2-7,4;
- ряд 4 - конъюгат антител против иммуноглобулинов человека или белка A Staphylococcus aureus с коллоидным золотом;
- ряды 7, 8, 9, 11 - дистиллированная вода (ряд 8 заполняется на ½ объема ячейки). При приготовлении проявителя за 3 мин до проявления в ячейки ряда 8 вносят по таблетке сухого компонента проявителя (лимонная кислота и метол в соотношении 5:2, соответственно), а непосредственно перед проявлением - ½ объема ячейки 0,4%-го водного раствора нитрата серебра.
- ряд 10 - стабилизатор оптического сигнала - 1% тиомочевины и 1% - гидроокиси натрия в дистиллированной воде.
Заполненные ванны герметизируют. При выполнении анализа герметизирующее покрытие вскрывают перфоратором. Анализ выполняют при комнатной температуре.
При выполнении анализа используют иммуночипы с нанесенными на пластины 5 антигенами вирусов кори, краснухи и паротита (фиг.3). Перечень и время выполнения отдельных операций при выполнении анализа препаратов крови приведены в таблице 1.
Таблица 1.
Перечень и время выполнения отдельных операций при выявлении специфических антител в препаратах крови
№ ячейки
Операция
Время, мин
1
Инкубация с образцом сыворотки крови в разведении 1:100 или капиллярной крови в разведении 1:50
20
2
Отмывка 1
2
3
Отмывка 2
2
4
Инкубация с рабочим разведением конъюгата
20
5
Отмывка 3
2
6
Отмывка 4
2
7
Отмывка 5
2
8
Проявление иммуночипов
7
9
Отмывка 6
1
10
Усиление и стабилизация оптического сигнала
1
11
Отмывка 7
1
Общее время анализа
60
После выемки из ячейки №11 (табл.1) иммуночипы подсушивают на воздухе и визуально учитывают результаты по наличию темных пятен в местах нанесения вирусных антигенов. Контролем работоспособности теста служит наличие темного пятна в зоне К+, оценку фоновых явлений проводят по зоне, свободной от антигенов (зона К-). Результаты анализа пяти образцов крови приведены на фиг.4.
Таким образом, из изложенного выше видно, что в заявляемом изобретении достигается следующий технический результат:
- повышается качество проведения иммунохимических реакций в ванне за счет исключения прилипания иммуночипов к внутренней поверхности стенок ячеек;
- увеличивается долговечность ванны за счет исключения возможности деформации ячеек ванны в процессе их термической запайки фольгой;.
- снижаются расходы наиболее дорогостоящих реагентов за счет выполнения рядов ячеек ванны разными по объему и размерам.