Изучение способности актиномицетов к биодеградации трудноразлагаемых белков в сточных водах мясокомбинатов

УДК 579.695

ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ АКТИНОМИЦЕТОВ К БИОДЕГРАДАЦИИ ТРУДНОРАЗЛАГАЕМЫХ БЕЛКОВ В СТОЧНЫХ ВОДАХ МЯСОКОМБИНАТОВ

© Л.В. Брындина, О.С. Корнеева, К.К. Полянский

Ключевые слова: биофлокуляция; мясная промышленность; очистка стоков.

Исследована возможность актиномицетов очищать сточные воды мясокомбинатов. Установлено, что уровень флоккулирующего эффекта зависит от протеолитической активности: чем она выше, тем выше эффект. Наибольший флоккулирующий эффект Д = 1,22 показал Str. chromogenes subsp.graecus 0832. Предлагаемый в качестве биофлокулянта микроорганизм проявляет высокую специфичность к белку кератину.

В повышении эффективности биологического способа очистки сточных вод значительную роль играет определение основных видов микроорганизмов, участвующих в процессе очистки, создание оптимальных условий для их деятельности. Управлять этими процессами можно, непосредственно затрагивая тонкие механизмы физиологии и биохимии микроорганизмов. Развитие этого направления дает возможность рационально и научнообоснованно регулировать активность микрофлоры и интенсифицировать процесс биологической очистки сточных вод.

В связи с необходимостью разработки эффективной технологии очистки промышленных сточных вод внимание исследователей все больше привлекают поиски возможности использования чистых культур микроорганизмов, способных трансформировать трудноразла-гаемые органические соединения. Достоинство чистых культур специфических деструкторов еще и в том, что они могут быть использованы в иммобилизованном виде на адсорбентах и биофильтрах для предотвращения отравления активного ила при залповых сбросах и при введении в строй новых технологических схем, когда состав сточных вод резко меняется.

В отработанных технологических жидкостях мясокомбинатов содержится большое количество фибриллярных белков (коллаген, кератин и др.), которые отличаются низкой функциональностью: нерастворимы в воде, имеют небольшую влагоудерживающую способность, очень высокую механическую прочность. Эта особенность объясняется наличием большого числа поперечных дисульфидных связей между полипептидными цепями в структуре таких белков. В связи с этим при выборе микроорганизма-деструктора фибриллярных белков руководствовались наличием у него протео-литической активности, в т. ч. кератиназной (последняя необходима для гидролиза белков кератинов, которые практически не разрушаются в обычных условиях) [1].

Целью исследования было выявление активного продуцента кератинрасщепляющей протеиназы. Были проверены некоторые актиномицеты различных таксономических групп. У 50 штаммов микроорганизмов, взятых для исследования, одновременно определяли протеолитическую активность (ПА) и кератиназную

активность (КА). Протеолитическую активность определяли по ГОСТ 20264.2-88 [2]. Определение керати-назной активности проводили по Кашкину [3-4]. Поверхностные культуры сравниваемых микроорганизмов поддерживали на средах, рекомендованных Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ), научно-исследовательским институтом антибиотиков и ферментов (г. С. -Петербург ВНИТИАФ). Культуры выращивали в термостате при 30 °С в течение 12 суток. В качестве посевного материала использовали 48-часовую культуру, выращенную на среде (г/дм3): картофельный крахмал - 20; соевая мука - 20; (Ж4)^04 - 3,0; CaCO3 - 3,0; КИ2Р04 - 0,5; №С1 - 2,5; рН среды 6,65. Культивирование проводили в глубинных условиях в колбах объемом 750 см3, содержащих 100 см3 среды, при 2830 °С на качалке (220-240 об./мин.). Основную питательную среду состава (г/дм3): картофельный крахмал -40; соевая мука - 10; измельченное перо - 5; (ЫИ4) ^04 - 0,65; KH2PO4 - 0,45; FeSO4 - 0,01; ZnSO4 -0,02; МпС12 - 0,01; СаС03 - 3,0 засевали 5 % по объему посевного материала и выращивали на качалке 120 часов при рН среды 6,80. Культуральную жидкость актиномицетов вносили в количестве 3 % к объему сточной воды, перемешивали в течение 15 минут, отстаивали в течение часа. После чего определяли флоккулирующий эффект (Д). Данные по выбору продуцента кератинрасщепляющей протеиназы представлены в табл. 1.

Результаты, представленные в табл. 1, показывают, что у 48 штаммов актиномицетов из 50 проявлялась протеолитическая активность в той или иной степени, при этом кератиназную активность показали 30 штаммов из 50. Следует отметить, что между значениями ПА и КА нет корреляционной зависимости. Видимо, способность к продуцированию кератинрасщепляющих протеиназ является специфической особенностью отдельных представителей актиномицетов. Так, 7 штаммов проявляли высокую ПА при полном отсутствии КА.

Однако флоккулирующий эффект зависит от значений ПА и КА. Наилучшие показатели соответствовали наибольшим значениям ПА и КА. При этом не было установлено прямой зависимости флоккулирующего

Таблица 1

Сравнительная характеристика биосинтетической способности некоторых актиномицетов

№ п/п Наименование культуры ПА, ед./см3 КА, ед./см3 Флоккулирующий эффект

1 Str. chromogenes subsp.graecus 0832 2,204 3,000 1,22

2 Str. саlifornicus 1015 0,133 2,600 0,98

3 Str. flavovariabilis ВКМ Ас-141 0,187 2,100 0,72

4 Str. diastatochromogenes ВНИИА 1350 0,044 2,100 0,64

5 Str. Kurssanovil ВКМ Ас- 715 0,036 1,600 0,57

6 Str. sp. (S. scabies) ВКМАс-841 0,213 1,200 0,51

7 Str. fradioroseus ВКМАс-155 0,217 0,800 0,49

8 Str. fradiae ЛИАН 0050 0,024 0,713 0,45

9 Str. autotrophica ВКМ Ас-759 0,720 0,600 0,54

10 Str. viridochromogenes 58 0,036 0,600 0,33

11 Str. fradiae ВКМАс-764 0,020 0,500 0,33

12 Str. bikiniensis ВКМАс-999 1,040 0,100 0,50

13 Str. viridochromogenes ЛИАН 0038 0,383 0,100 0,38

14 Str. chromofuscus 6050 0,250 0,084 0,35

15 Str. hygroscopicus ЛИАН 0374 0,784 0,060 0,42

16 Str. vulvoviridis ВКМАс-161 0,173 0,060 0,35

17 Str. olivoviridis ВНИИА 1258 0,089 0,050 0,20

18 Str. firidochromogenes ВКМАс-629 2,500 0,040 0,88

19 Str. hugroscopicus ВКМАс-831 0,175 0,040 0,35

20 Str. sporotumulus ВКМАс-320 0,126 0,030 0,30

21 Str. fradiorectus ВКМАс-154 0,078 0,030 0,25

22 Str. sp. (S. sporocaneris) ВКМАс-310 0,030 0,030 0,18

23 Str. achromogenes 391 0,251 0,027 0,36

24 Str. albus ЛИАН 0012 0,047 0,025 0,20

25 Str. pseudoalbus ВКМАс-267 0,282 0,020 0,38

26 Str. sp. (S. asterosporus) ВКМ Ас-40 0,267 0,017 0,36

27 Str. diastaticus ВКМАс-723 0,080 0,016 0,30

28 Str. diastatochromogenes ЛИАН 0172 0,078 0,013 0,27

29 Str. griscofarillus 187 0,250 0,009 0,35

30 Str. coelicolor ВНИИА 1173 0,070 0,008 0,20

31 Str. cinerosus ВКМАс-84 1,451 0 0,55

32 Str. chromofuscus ВНИИА 1191 1,191 0 0,52

33 Str. olivaceoseleroticus ВНИИА 1445 1,173 0 0,51

34 Str. canarius 1392 0,764 0 0,42

35 Str. griseus subsp. neomycini 0047 0,670 0 0,40

36 Str. argenteus ВКМА^39 0,628 0 0,40

37 Str. aureus 92 0,533 0 0,40

38 Str. sp. (S. aculentosporus) ВКМAc-1 0,392 0 0,38

39 Str. olivaceus ВКМ А^254 0,266 0 0,36

40 Str. achromogenes 1000 0,196 0 0,33

41 Str. calvus ВНИИА 1103 0,196 0 0,33

42 Str. flavovirens ВНИИА 421 0,178 0 0,33

43 Str. albus ВКМ А^35 0,109 0 0,25

44 Str. albocanus ВКМАc-7 0,080 0 0,22

45 Str. olivaceus ВНИИА 519 0,080 0 0,20

46 Str. sp. (S. coeliatus) ВКМА^105 0,064 0 0,18

47 Str. olivochromofuscus ВНИИА-1259 0,062 0 0,18

48 Str. fragilis ВНИИА 1111 0,018 0 0,12

49 Str. pseudogriseolus ВНИИА 1106 0 0 0,10

50 Str. sp. (S. sporocaneus) ВКМ А^311 0 0 0,08

эффекта конкретно от ПА или КА. Он был выше у тех микроорганизмов, которые показали высокие значения ПА или КА. Так, наибольший флоккулирующий эффект Д = 1,22 показал Str. chromogenes subsp.graecus 0832. При этом у него же были максимальные значения

ПА = 2,204 ед./см3 и Ка = 3,00 ед./см3. На втором месте расположился Str. саlifornicus 1015 с Д = 0,98, Но у него в отличие от Str. chromogenes subsp.graecus 0832 ПА была низкой - 0,133 ед./см3, а КА - высокой 2,6 ед./см3. Третье место занял Str. firidochromogenes

ВКМАс-629 с Д = 0,88, который практически не показал КА (всего 0,040 ед./см3), но обладающий высокой ПА = 2,5 ед./см3.

Отсюда можно сделать вывод, что флоккулирующий эффект не связан с проявлением специфичной активности ПА или КА, а наблюдается при наличии общей гидролитической (протеолитической) активности. Однако уровень флоккулирующего эффекта зависит от уровня этой активности: чем она выше, тем выше эффект. Возможно, это связано с тем, что интенсивное высвобождение внеклеточных ферментов акти-номицетов увеличивает количество растворимого белка в стоке, что активизирует ферментные системы и способствует более интенсивному гидролизу этих белков. В свою очередь гидролиз белков приводит к росту общего числа полярных групп, которые, ориентируясь в пространстве, образуют прочный адсорбционный слой. На него сорбируется следующий и т. д. В конечном итоге повышается общий эффект флоккуляции.

На основании вышеизложенного материала, для дальнейших исследований нами был выбран актино-мицет Str. chromogenes subsp.graecus 0832.

Рост и развитие микроорганизмов, биосинтез ими ферментов в значительной степени зависят от кислотности среды. Влияние величины рН на биосинтез ферментов Str. chromogenes s.g. 0832 изучали в диапазоне рН от 5 до 12 (рис. 1).

На рис. 1 видно, что максимальные значения ПА и КА наблюдаются при доведении начальной величины рН до 11,0 (ПА = 3,778 ед./см3; КА = 29,0 ед./см3). Наибольшая растворимость кератина также достигается при этом значении рН и составляет 84 % (рис. 2).

Влияние возраста микроорганизма на синтез ферментов представлено на рис. 3. К 48 часам ее накапливается наибольшее количество. Максимальные значения ПА и КА наблюдаются к 48 часам культивирования: ПА = 6,044 ед./ см3, КА = 34,0 ед./ см3. Заметим, что ПА резко падает уже к 72 часам выращивания в отличие от КА, которая на протяжении 96 часов относительно стабильна (рис. 3).

Через 48 часов культивирования культуральную жидкость вносили в сток в соотношении 3:100 и через 10 мин. определяли показатели, характеризующие качество очистки сточной воды (табл. 2).

Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что предлагаемый микроорганизм в качестве биофло-кулянта позволяет повысить эффективность очистки на 43 % по ХПК в сравнении с нормативными требованиями.

Проведенные исследования позволяют сделать следующий вывод: культура микроорганизма Str. chromo-genes s.g. 0832 может быть использована в очистке сточных вод, содержащих труднорастворимые белки.

о

к

.о

е А,

К

35 30 25 20 15 10 5 0 -5

рН

Рис. 1. Влияние величины рН на биосинтез протеиназ Str. chromogenes s.g. 0832

4,5 4

3,5 3

2,5 2

1,5 1

0,5 0

о

к

д

е А,

П

КА ПА

о в

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

10

11

12

рН

Рис. 2. Влияние величины рН на растворение кератина

5

6

7

8

9

Таблица 2

Физико-химические показатели сточной воды

Показатели Исходный сток КЖ + сток Нормативные требования

ХПК, мг О2/дм3 1500 ± 45,12 200 ± 6,07 350 ± 5,01

Мутность, мг/дм3 4,2 ± 0,11 1,3 ± 0,01 2,5 ± 0,21

Общее железо, мг/дм3 1,15 ± 0,01 0,27 ± 0,01 1,33 ± 0,01

Общий азот, мг/дм3 160 ± 2,03 52,3 ± 1,01 120 ± 17,4

Установлена потенциальная возможность данного ак-тиномицета к биосинтезу кератинрасщепляющей про-теиназы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Брындина Л.В., Корнеева О.С., Перов С.Н. Очистка сточных вод мясокомбинатов биосорбционным способом // Мясная индустрия. 2005. № 9. С. 36-38.

2. ГОСТ 20264.2-88. Методы определения протеолитической активности. Переизд. февр. 1985 с изм. Взамен ГОСТ 20264.1-74; введен с 01.07.88. М.: Изд-во стандартов, 1984. С. 1-11.

3. Кашкин А.П., Воеводин Ю.М., Гринберг Г.Е. Препараты протеоли-тических ферментов Асtinomyces fradiae 0072 // Прикладная биохимия и микробиология. 1974. Т. 10. № 4. С. 515-520.

4. Кашкин А.П., Воеводин Ю.М., Маклова Т.Г. Характеристика внеклеточных протеолитических ферментов Асtinomyces fradiae 0072

// Прикладная биохимия и микробиология. 1976. Т. 12. № 4.

С. 563-571.

Поступила в редакцию 14 апреля 2015 г.

Bryndina L.V., Korneeva O.S., Polyanskiy K.K. STUDY OF ACTINOMYCETE ABILITY TO BIODEGRADATION OF HARD-DEGRADABLE PROTEINS IN SEWAGE OF MEATPACKING PLANTS

The ability of actinomycete to clean the sewage of meatpacking plants is studied. It was determined that the level of flocculation of the effect depends on proteolytic activity: the higher it is, the greater the effect is. The highest flocculation effect D = 1.22 showed Str. chromogenes subsp.graecus 0832. Proposed as biflagellate microorganism exhibits a high specificity for the protein keratin.

Key words: bioflocculation; meat industry; sewage cleaning.

Брындина Лариса Васильевна, Воронежский государственный лесотехнический университет им. Г.Ф. Морозова, г. Воронеж, Российская Федерация, кандидат технических наук, доцент кафедры безопасности жизнедеятельности и правовых отношений, e-mail: lara.bryndina@yandex.ru

Bryndina Larisa Vasilyevna, Voronezh State Academy of Forestry Engineering, Voronezh, Russian Federation, Candidate of Technics, Associate Professor of Life Activities Safety and Legal Relations Department, e-mail: la-ra.bryndina@yandex.ru

Корнеева Ольга Сергеевна, Воронежский государственный университет инженерных технологий, г. Воронеж, Российская Федерация, доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и биохимии, e-mail: la-ra.bryndina@yandex.ru

Korneeva Olga Sergeevna, Voronezh State University of Engineering Technologies, Voronezh, Russian Federation, Doctor of Biology, Professor of Microbiology and Biochemistry Department, e-mail: lara.bryndina@yandex.ru

Полянский Константин Константинович, Воронежский филиал Российского экономического университета им. Г.В. Плеханова, г. Воронеж, Российская Федерация, доктор технических наук, профессор кафедры коммерции и товароведения, e-mail: lara.bryndina@yandex.ru

Polyanskiy Konstantin Konstantinovich, Plekhanov Russian University of Economics, Voronezh Branch, Voronezh, Russian Federation, Doctor of Technics, Professor of Commerce and Studies of Goods Department, e-mail: la-ra.bryndina@yandex.ru