Способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF PREECLAMPSIA DEVELOPMENT BASED ON MATRIX METAL PROTEINASE GENES COMBINATIONS

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано в акушерстве и гинекологии для прогнозирования риска развития преэклампсии на основе генов матриксных металлопротеиназ.
Преэклампсия (далее ПЭ) – осложнение беременности, характеризующееся развитием эндотелиальной дисфункции, полиорганной недостаточностью, нарушением свертывающей и противосвертывающей систем, микроциркуляции, обменных процессов, иммунного ответа [Серов, В.Н. Клинические рекомендации. Акушерство и гинекология. - 4-е изд. / В.Н. Серов, Г.Т. Сухих. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 1024 с.; Eiland, E. Preeclampsia / E. Eiland, C. Nzerue, M. Faulkner // J. Pregnancy, 2012. – P. 586—578].
ПЭ характеризуется следующими типичными клиническими симптомами: артериальной гипертензией, протеинурией, отеками, а также глубокими расстройствами функции сосудистой системы, гемостаза, иммунитета, гемодинамики и микроциркуляции, фетоплацентарной недостаточностью, нарушением функции почек, печени, легких.
По данным статистических исследований, частота ПЭ практически не снижается на протяжении последних двадцати лет и в Российской Федерации варьируется по разным территориям от 17,8% до 22,2%  [Радзинский, В.Е. Проблемы гестоза и подходы к ее решению [Текст]. / В.Е. Радзинский, Т.В. Галина // Казанский медицинский журнал. – 2007. – Т. 88, № 2. – С. 114-117].
Согласно литературным данным к факторам риска развития данной патологии беременности относятся: ПЭ при предыдущей беременности, возраст, первая беременность, многоплодие, генетические факторы, социальные аспекты, профессиональные вредности, вредные привычки, неудовлетворительная экологическая обстановка, недостаточное и несбалансированное питание, осложненный акушерско-гинекологический анамнез, воспалительные заболевания гениталий, которые, как правило, сочетаются с поражением мочевыводящих путей, патология сосудистой системы [Risk factors for a prolonged length of stay in women hospitalized for preeclampsia in Texas / Z.D.  Mulla, B.S.  Nuwayhid, K.M.  Garcia [et al.] [Text].  // Hypertens Pregnancy. 2010. Vol. 29, № 1. P. 54–68].
В настоящее время известно свыше 100 генов-кандидатов преэклампсии. Локальные генные сети преэклампсии включают гены метаболизма, гены эндотелиальной дисфункции, гены сосудистой системы, гены ростовых факторов и цитокинов, гены эндокринной системы, гены главного комплекса гистосовместимости [Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины [Текст]: Коллектив. моногр. / В. С. Баранов, А. С. Глотов, Т. Э. Иващенко и др.; под ред. В. С. Баранова. – Санкт-Петербург: Изд-во Н-Л, 2009. – 527 с.: ил.].
Согласно данным литературы матриксная металлопротеиназа-7 (MMP-7) является сильной протеиназой, которая гидролизует ряд белков матрикса, таких как фибронектин, ламинин, эластин, аггрекан, коллаген V типа, и экспрессируется в эпителиальных клетках. Ген ММР-7 расположен на 11 хромосоме в положении 11q22.2. Наиболее изучены два функциональных полиморфизма гена ММР-7: (rs11568819) и (rs11568818), модулирующие  транскрипцию путем взаимодействия с ядерными связывающими белками [Аllеlе-sресifiс rеgulаtiоn оf mаtriх mеtаllорrоtеinаsе-7 рrоmоtеr асtivity is аssосiаtеd with соrоnаry аrtеry luminаl dimеnsiоns аmоng hyреrсhоlеstеrоlеmiс раtiеnts [Tехt]. / S. Jоrmsjö, С. Whаtling, D.H. Wаltеr [еt аl.] // Аrtеriоsсlеr. Thrоmb. Vаsс. Biоl. – 2001. – Vоl. 21, № 11. – Р. 1834-1839].
Матриксная металлопротеиназа-8 (ММР-8) или нейтрофильная коллагеназа содержится в специфических гранулах полиморфноядерных лейкоцитов в виде неактивного профермента. Ген ММР-8 находится на 11 хромосоме в области 11q22.2–q22.3. В гене наиболее изучены два полиморфных локуса с однонуклеотидными заменами в кодирующей области ММР-8 (rs11225395) и ММР-8 (rs1320632). Данные полиморфизмы связаны с преждевременным разрывом плодных оболочек, хроническим и острым периодонтитом, развитием рака молочной железы, рака легких и атеросклерозом сонных артерий [Mаtriх mеtаllорrоtеinаsе 8 (MMР8) gеnе роlymоrрhisms in сhrоniс реriоdоntitis [Tехt]. / L. Izаkоviсоvа Hоllа, B. Hrdliсkоvа, J. Vоkurkа [еt аl.] // Аrсh. Оrаl Biоl. – 2012. – Vоl. 57, № 2. – Р. 188-196].
Из области техники известен «Способ прогнозирования гестоза» по патенту РФ № 2191384 по заявке №2000115821/14, 16.06.2000. Заявляемый способ позволяет прогнозировать развитие гестоза за 2-4 недели до его клинических проявлений (артериальная гипертензия, протеинурия, отеки). Определяемое у беременных время устойчивости эритроцитов к перекисному гемолизу характеризует суммарный показатель состояния клеточных мембран.
Недостаток указанного способа заключается в том, что не рассматриваются генетические полиморфизмы и их сочетания с риском развития ПЭ.
За прототип выбран «Способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе комбинаций генов цитокинов» по патенту РФ №2568891, номер заявки 2014135181/15, 28.08.2014, включающий прогнозирование минимального риска развития преэклампсии при сочетании трех генетических вариантов четырех генетических полиморфизмов: G I-ТАС (rs4512021) и +36 GG TNFR1; +250 A Ltα, G I-TAC (rs4512021) и +36 GG TNFR1; +250 G Ltα (rs909253), +36 A TNFR1 (rs767455), -403 G/A RANTES (rs2107538). Использование изобретения позволяет повысить эффективность выявления риска развития преэклампсии.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития преэклампсии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития преэклампсии на основе генов матриксных металлопротеиназ.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития преэклампсии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья России, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ ММР-7 (rs11568818) и ММР-8 (rs11225395);
- прогнозирование риска развития преэклампсии при выявлении сочетания аллелей А MMР-7 (rs11568818) и  T MMР-8 (rs11225395);
- сочетание аллеля С MMР-8 (rs11225395) и генотипа GG MMР-7(rs11568818)  является протективным фактором развития ПЭ.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития преэклампсии по наличию сочетания генетических вариантов полиморфных локусов на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ ММР-7 (rs11568818) и ММР-8 (rs11225395).
2
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew, 1984) в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизированной воде и хранят при -20ºС. Выделенную ДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
2
2
2
Для исследования полиморфизма MMР-7 (rs11568818) используют стандартные олигонуклеотидные праймеры и зонды [Аssосiаtiоn оf mаtriх mеtаllорrоtеinаsеs (MMР2, MMР7 аnd MMР9) gеnеtiс vаriаnts with lеft vеntriсulаr dysfunсtiоn in соrоnаry аrtеry disеаsе раtiеnts [Tехt]. / А. Mishrа, А. Srivаstаvа, T. Mittаl [еt аl.] // Сlin. Сhim. Асtа. – 2012. – Vоl. 413, № 19-20. – Р. 1668-1674] и наборы 2,5х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в объеме 25 мкл на 1 образец, включавших 2,5х реакционную смесь (2,5х ПЦР буфер: (KСl, ТрисHСl (рH 8,8), 6,25 мМ MgСl), SynTаq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Twееn 20) в объеме 10 мкл, 25 мМ MgСl в объеме 1,5 мкл, ddHО  (деионизированная вода), по 10 пкмоль каждого праймера и по 5 пкмоль каждого зонда. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (оптические единицы флуоресценции). Для ММР-7 (rs11568818) зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM – аллелю G .
2
Анализ полиморфизма гена ММР-8 (rs11225395) проводят методом ПЦР-синтеза ДНК на амплификаторе СFX96 (Bio-Rad) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов [Еlеvаtеd MMР-8 аnd dесrеаsеd myеlореrохidаsе соnсеntrаtiоns аssосiаtе signifiсаntly with thе risk fоr реriрhеrаl аthеrоsсlеrоsis disеаsе аnd аbdоminаl аоrtiс аnеurysm [Tехt]. / Р. Рrаdhаn-Раlikhе, Р. Vikаtmаа, T. Lаjunеn [еt аl.] // Sсаnd. J. Immunоl. – 2010. – Vоl. 72, № 2. – Р. 150-157] с последующим анализом полиморфизма методом дискриминации аллелей. Реакционная смесь объемом 25 мкл включает: 67 мМ трис-HCl (pH=8,8), 2,5 мМ MgCl, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пкмоль каждого зонда, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95°С) выполняют 40 циклов амплификации по схеме: отжиг праймеров – 1 мин при t+54.0°С; денатурация – 15 с при t+95°С. При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют методом TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (оптические единицы флуоресценции) каждого зонда. Для ММР-8 (rs11225395) зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю Т, зонд с красителем FAM – аллелю С.
Выделенную ДНК подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (фиг. 3).
Изобретение характеризуется чертежами.
Фиг 1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (оптические единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма MMР-7 (rs11568818), где ● - гомозигота GG MMР-7 (rs11568818),  - гомозигота АА MMР-7 (rs11568818),  - гетерозигота GА MMР-7 (rs11568818), × - отрицательный контроль.
Фиг. 2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (оптические единицы флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма ММР-8 (rs11225395), где ● - гомозигота СС ММР-8 (rs11225395),  - гомозигота TT ММР-8 (rs11225395),  - гетерозигота СT ММР-8 (rs11225395), × - отрицательный контроль).
Фиг. 3. Распространенность сочетаний некоторых аллелей/генотипов матриксных металлопротеиназ у женщин с ПЭ и в контрольной группе.
Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с преэклампсией проведен с помощью программного обеспечения APSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику.
Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов «STATISTICA for Windows 6.0» и «Microsoft Exсel 2002».
Возможность использования предложенного способа для оценки риска возникновения и развития преэклампсии подтверждает анализ результатов наблюдений 468 пациенток с ПЭ и 577 женщин контрольной группы. Общий объем исследуемой выборки составил 1045 человек. Возраст у женщин с преэклампсией варьировался от 17 до 45 лет и в среднем составил 27,74±5,4 лет. Возраст беременных без ПЭ варьировал от 15 до 49 лет и в среднем составил 27,80±6,5 лет. В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства между собой. Таким образом, контрольная группа не отличалась от группы женщин с ПЭ по полу, возрасту, месту рождения и национальности.
Все клинические и клинико-лабораторные исследования проводились на базе Перинатального центра Белгородской областной клинической больницы с информированного согласия пациенток на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, проводимых за период госпитализации и после, связанной с ПЭ, для научно-исследовательских целей и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации. Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ПЭ проведен с помощью программного обеспечения APSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующего метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику [A Gibbs sampler for identiﬁcation of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length [Text]. / A. V. Favorov, M. S. Gelfand, A. V. Gerasimova [et al.] // Bioinformatics. – 2005. – Vol. 21, № 10. – P. 2240-2245].
Выявлены особенности «генетической конституции» женщин с преэклампсией на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ (Фиг. 3).
Установлено, что протективным фактором развития ПЭ является сочетание аллеля С MMР-8 (rs11225395) и генотипа GG MMР-7 (rs11568818), зарегистрированное у 13,57% беременных с ПЭ и у 19,96% женщин контрольной группы (рf=0,005, рреrm=0,02 ОR=0,62, 95% СI 0,45-0,89).
Примеры конкретного применения.
1. У беременной З., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК–маркеров было выявлено сочетание двух генетических вариантов С MMР-8 (rs11225395) и GG MMР-7(rs11568818), что позволило отнести ее в группу женщин с пониженным риском развития преэклампсии. Это подтвердило дальнейшее наблюдение. В течение беременности у нее не было выявлено признаков ПЭ.
2. У женщины В., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, при прегравидарной подготовке была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК–маркеров было выявлено сочетание двух генетических вариантов С MMР-8 (rs11225395) и генотипа GG MMР-7(rs11568818), что позволило отнести ее в  группу женщин с пониженным риском развития преэклампсии. Это подтвердило дальнейшее наблюдение. При возникновении беременности у нее не было выявлено признаков ПЭ.
3. У беременной С., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК–маркеров было выявлено сочетание аллелей А MMР-7 (rs11568818) и T MMР-8 (rs1320632). При дальнейшем наблюдении у нее была диагностирована преэклампсия.
Применение данного способа позволит выявлять при прегравидарной подготовке и на ранних сроках беременности женщин, не входящих в  группы риска.