СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ИЗ СПЕРМЫ МУЖЧИНЫ
METHOD OF REMOVING HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS FROM MALE'S SPERM

Настоящее изобретение касается способа удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины перед проведением вспомогательных репродуктивных технологий.
Выделяют три основные составляющие спермы - сперматозоиды, спермоплазму и сопутствующие ядерные клетки. Из спермы ВИЧ-инфицированных мужчин был выделен вирус, а встроенная ДНК ВИЧ обнаруживалась в сопутствующих клетках и даже в неподвижных сперматозоидах. На основании результатов известных исследований был сделан вывод, что жизнеспособные подвижные сперматозоиды, как правило, не несут в себе ВИЧ (Weigel, 1999; Pena, 2003; Gilling-Smith, 2003). Подвижные жизнеспособные сперматозоиды можно выделить из эякулята стандартизованными методами. После отделения сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток их промывают дважды жидкой питательной средой, а затем помещают в свежую питательную среду и инкубируют в течение 20-60 минут. За это время подвижные сперматозоиды всплывают на поверхность среды, верхний слой которой (супернатант) забирают для проведения оплодотворения. Для того чтобы убедиться в отсутствии вирусных частиц в супернатанте, его проверяют на наличие нуклеиновой кислоты ВИЧ, используя высокочувствительные методы обнаружения ВИЧ (Weigel, 2001; Gilling-Smith, 2003). Поскольку теоретически не исключено, что после обработки спермы в супернатанте может содержаться ВИЧ, важно, чтобы способ удаления ВИЧ был настолько эффективен, чтобы концентрация вируса снижалась до неопределяемых значений.
Для удаления ВИЧ из спермы известен способ, включающий процедуру центрифугирования и инкубации (Semprini А.Е, Levi-Setti P., Bozzo М., et al. Insemination of HIV-negative women with processed semen of HIV-positive partners. Lancet 1992; 340:1317-1319). Однако данный метод не гарантирует полного удаления ВИЧ из спермы.
Задача изобретения - исключение заражения женщины ВИЧ-инфекцией за счет полного удаления вируса иммунодефицита человека.
Указанная задача решается с помощью способа удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины, включающего отделение подвижных сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах с целью забора супернатанта, содержащего «отмытые» сперматозоиды, в котором согласно изобретению каждый этап обработки эякулята проводится в новой стерильной пробирке, цетрифугирование проводится при 300 g в растворах Sil-Select Plus в течение 20 минут, затем осадок, содержащий сперматозоиды, аспирируется пипеткой, не задевая стенок пробирки, и инкубируется в растворе среды FertiCult Flushing medium в течение 80-90 минут.
Способ осуществляется следующим образом.
1. Привести семенную жидкость и все необходимые для процедуры принадлежности к температуре 37°C.
2. Поместить 2,5 мл 40% раствора Sil-Select Plus в стерильную центрифужную пробирку (верхний слой).
3. Поместить 2,5 мл 80% раствора Sil-Select Plus под верхний слой.
4. Поместить 2,5 мл спермы на верхний слой.
5. Центрифугировать 20 минут при 300 g.
6. Удалить супернатант до осадка.
7. Осадок аккуратно аспирировать пипеткой (не задевая стенок пробирки), поместить в другую стерильную пробирку, а затем добавить 3 мл среды для промывки спермы FertiCult Flushing medium и ресуспендировать осадок.
8. Центрифугировать 10 минут при 300 g.
9. Удалить супернатант до осадка.
10. Осадок аккуратно аспирировать пипеткой (не задевая стенок пробирки), поместить в другую стерильную пробирку, а затем добавить 3 мл среды для промывки спермы FertiCult Flushing medium и ресуспендировать осадок.
11. Центрифугировать 10 минут при 300 g.
12. Удалить супернатант до осадка.
13. Осадок аккуратно аспирировать пипеткой (не задевая стенок пробирки) и затем поместить в другую стерильную пробирку.
14. Осадок, содержащий сперматозоиды, аккуратно покрыть 2 мл среды FertiCult Flushing medium, и пробирку поместить в инкубатор под углом 45° на 80-90 минут для того, чтобы позволить наиболее подвижным сперматозоидам передвинуться в среду. Затем 0,7 мл аспирировать.
15. В случае достаточного количества и качества сперматозоидов раствор делится на 2 равные части. Первая часть доставляется в ПЦР - лабораторию сразу же после процедуры обработки для тестирования на наличие РНК ВИЧ, вторая часть немедленно подвергается криоконсервации. При получении отрицательного анализа на ВИЧ проводится искусственное оплодотворение.
Примеры конкретного осуществления.
Пример 1. Пациент А. В сперме методом ПЦР было определено 32500 копий РНК ВИЧ. Проводилось центрифугирование спермы в градиентных растворах Sil-Select Plus в течение 20 минут при скорости 300 g. После центрифугирования и забора супернатанта, в осадке, содержащем подвижные сперматозоиды, было обнаружено 1200 копий РНК ВИЧ. С учетом того, что на стенках остается небольшое количество супернатанта, содержащего ВИЧ, аспирация осадка проводилась пипеткой, не задевая стенок пробирки. Осадок переносился в другую стерильную пробирку. Затем к осадку добавляли среду для промывки FertiCult Flushing medium и проводили ресуспендирование. Промывку осадка проводили дважды при скорости 300 g в течение 10 минут. После окончания промывки, в осадке, содержащем подвижные сперматозоиды, обнаружено 150 копий РНК ВИЧ. Осадок аспирировался пипеткой (не задевая стенок пробирки) и затем помещался в другую стерильную пробирку.
В новой пробирке осадок, содержащий сперматозоиды, медленно покрывался 2 миллилитрами среды FertiCult Flushing medium, а затем пробирку помещали в инкубатор под углом 45° на 80 минут для того, чтобы позволить наиболее подвижным сперматозоидам передвинуться в среду. По окончании времени инкубации проводилась аспирация 0,7 мл. супернатанта. В аспирированном супернатанте было определено 34 миллиона сперматозоидов с прогрессивным движением, что является достаточным количеством для проведения вспомогательных репродуктивных технологий. Раствор был разделен на 2 равные части. Первая часть была доставлена в ПЦР - лабораторию сразу же после процедуры обработки для тестирования на наличие РНК ВИЧ, вторая часть немедленно подверглась криоконсервации. При тестировании супернатанта копии РНК ВИЧ были не найдены (заключение лаборатории - target not detected).
Пример 2. Пациент В. В сперме методом ПЦР было определено 53500 копий РНК ВИЧ. Проводилось центрифугирование спермы в градиентных растворах Sil-Select Plus в течение 20 минут при скорости 300 g. После центрифугирования и забора супернатанта, в осадке, содержащем подвижные сперматозоиды, было обнаружено 18000 копий РНК ВИЧ. С учетом того, что на стенках остается небольшое количество супернатанта содержащего ВИЧ, аспирация осадка проводилась пипеткой, не задевая стенок пробирки. Осадок переносился в другую стерильную пробирку. Затем к осадку добавляли среду для промывки FertiCult Flushing medium и проводили ресуспендирование. Промывку осадка проводили дважды при скорости 300 g в течение 10 минут. После окончания промывки в осадке, содержащем подвижные сперматозоиды, обнаружено 1100 копий РНК ВИЧ. Осадок аспирировался пипеткой (не задевая стенок пробирки) и затем помещался в другую стерильную пробирку.
В новой пробирке осадок, содержащий сперматозоиды, медленно покрывался 2 миллилитрами среды FertiCult Flushing medium, а затем пробирку помещали в инкубатор под углом 45° на 90 минут для того, чтобы позволить наиболее подвижным сперматозоидам передвинуться в среду. По окончании времени инкубации проводилась аспирация 0,7 мл супернатанта. В аспирированном супернатанте было определено 19 миллионов сперматозоидов с прогрессивным движением, что является достаточным количеством для проведения вспомогательных репродуктивных технологий. Раствор был разделен на 2 равные части. Первая часть была доставлена в ПЦР - лабораторию сразу же после процедуры обработки для тестирования на наличие РНК ВИЧ, вторая часть немедленно подверглась криоконсервации. При тестировании супернатанта копии РНК ВИЧ были не найдены (заключение лаборатории - target not detected).
Было проведено 52 процедуры очистки спермы от ВИЧ. Во всех случаях после очистки РНК вируса иммунодефицита человека не определялась. Поэтому указанный способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины можно считать эффективным и безопасным.
Выше было указано, для удаления ВИЧ из спермы известен способ, включающий процедуру центрифугирования и инкубации. Как правило, инкубация при применении такого способа проводится 20-60 минут. Однако данный метод не гарантирует полного удаления ВИЧ из спермы. Это является причиной отказа в использования спермы мужчины в процедуре внутриматочной инсеминации или экстракорпорального оплодотворения с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида.
Такая ненадежность способа обусловлена недостаточным временем инкубации. Это связано с тем, что за 60-минутное время инкубации подвижные сперматозоиды всплывают на поверхность среды, но некоторое количество вируса иммунодефицита человека может не опуститься на дно пробирки и оставаться во взвеси. Необходимо отметить, что при проведении центрифугирования менее 20 минут и при скорости менее 300 g, в осадке отмечается низкая концентрация сперматозоидов, недостаточная для оплодотворения яйцеклеток. При проведении центрифугирования более 20 минут и при скорости более 300 g значительно возрастало количество копий РНК ВИЧ.
Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины перед проведением вспомогательных репродуктивных технологий.