Способ оценки риска преждевременного снижения овариального резерва
METHOD FOR ASSESSING THE RISK OF PREMATURE REDUCTION OF OVARIAN RESERVE

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии и может быть использовано для прогнозирования преждевременного снижения овариального резерва, в частности при вспомогательных репродуктивных технологиях.
В настоящее время имеется стойкая тенденция к увеличению возраста деторождения, при этом отмечено ухудшение гинекологического здоровья женщин в России [1]. Как следствие, наблюдается рост женского бесплодия и увеличивается востребованность вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [2].
Важным фактором для успеха программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является овариальный резерв (ОР) [2]. ОР - это функциональный резерв яичника, определяющий его способность к развитию фолликула с полноценной яйцеклеткой (ЯК), а также к адекватному ответу на овариальную стимуляцию [2, 3]. Полноценный овариальный резерв, в программах вспомогательных репродуктивных технологий обеспечивает адекватный ответ яичника на введение индукторов овуляции и определяет успешность таких программ. Чаще низкий ОР встречается в позднем репродуктивном возрасте, но в некоторых случаях эта проблема имеет место быть и у молодых женщин [2, 4].
Важнейшим фактором, определяющим ОР, большинство авторов считают возраст женщины [2, 3]. У большинства женщин резко увеличивается частота элиминации фолликулов в возрасте около 38 лет и после 40 лет наблюдается сниженный ОР [3, 5]. Но под воздействием генетических и средовых факторов снижение овариального резерва может происходить в более молодом возрасте, то есть происходит преждевременное снижение овариального резерва.
Одной из причин преждевременного снижения овариального резерва является генетическая предрасположенность [3, 6, 7]. Выявление генов-кандидатов, ассоциированных с этим состоянием, в перспективе может дать возможность для генетического консультирования с целью ранней диагностики, благодаря чему женщина может принять решение о коррекции своих репродуктивных планов в сторону более раннего деторождения [6].
В научной литературе описано множество генов, которые могут повлиять на репродуктивную функцию женщины [8]. В том числе они могут рассматриваться в качестве генов-кандидатов к преждевременному снижению овариального резерва.
Важными «кандидатами» на роль маркеров ОР и предикторов овариального ответа являются гены эстрогеновых рецепторов (ESR1 и ESR2), так как хорошо изучено влияние эстрогенов на рост фолликулов и созревание ооцитов [9]. Доказано, что изменчивость генов эстрогеновых рецепторов может привести к некоторым формам бесплодия, а также влияет на исходы стимуляции функции яичников и программ ВРТ в целом [10, 11].
Наиболее изученным генетическим фактором, имеющим значение при стимуляции суперовуляции к настоящему времени является ген рецептора фолликул остимулирующего гормона (ФСГ) - FSHR [12, 13]. Хорошо известно, что физиологическое действие ФСГ зависит от активации его рецептора, который экспрессируется гранулезными клетками [12]. ФСГ играет ключевую роль в функционировании яичников, при этом его основное действие связано с пролиферацией гранулезных клеток, созреванием ооцитов, синтезом эстрогенов путем активации гена ароматазы. Предполагается, что наличие полиморфизма в гене FSHR может привести к нарушению оогенеза и снижению числа созревающих фолликулов в программах ВРТ [14].
Ген CYP19A1 кодирует фермент ароматазу (цитохром 19А1). Фермент ароматаза необходим для реакции биосинтеза эстрогенов из их предшественников андрогенов в яичниках и экстрагонадных тканях [15]. Соответственно, данный ген также может влиять на функцию яичников и овариальный ответ, особенно во взаимодействии с другими генами [15, 16].
Достоинством молекулярно-генетических методов является то, что их можно проводить в любом возрасте, генетическую предрасположенность к преждевременному снижению овариального резерва можно оценить до того, как функция яичников начнет снижаться, соответственно это даст возможность женщине скорректировать свои репродуктивные планы.
При оценке генетической предрасположенности важно оценивать не просто отдельные генетические варианты, а проводить анализ их сочетаний, для чего необходимо применение компьютерных программ и математической обработки.
Предлагаемый способ включает в себя анализ трех генетических полиморфизмов: ESR1 С-397Т, FSHR Т1961С и CYP19A1 G681A, которые были определены нами как наиболее значимые при преждевременном снижении овариального резерва.
Из анализа научно-медицинской и патентной литературы нами выявлены следующие технические решения:
- Известен способ оценки состояния овариального резерва яичников (Пат. RU 2646572 С1, 2018), который включает в себя трансвагинальную эхографию яичников с цветовым допплеровским картированием кровотока артерий стромы яичников, определение пульсационного индекса (ПИ) и индекса резистентности (ИР) для правого и левого яичников. Если соотношение ПИ/ИР каждого яичника <1,8, то диагностируют нормальный овариальный резерв.
Недостатком метода является то, что значения ПИ и ИР варьируют в зависимости от дня менструального цикла, а также могут быть вариабельны в разные циклы у одной и той же женщины. Авторами не описаны чувствительность и специфичность метода у пациенток с регулярным и нерегулярным менструальным циклом. Вероятно, для повышения чувствительности и специфичности нужно использовать данный способ у одной женщины в течение нескольких менструальных циклов, однократного измерения будет недостаточно.
- Известен способ диагностики преждевременной недостаточности яичников (Пат. RU 2750159 С1, 2021), при котором проводят измерение ФСГ на 2-3 день менструального цикла, считают количество антральных фолликулов (КАФ) при проведении ультразвукового исследования в 1-7 день менструального цикла и с помощью данных показателей рассчитывают прогностический индекс.
Недостатком метода является то, что он направлен на диагностику, а не на прогнозирование снижения овариального резерва.
3
- Известен способ прогнозирования преждевременной недостаточности яичников у женщин репродуктивного возраста с олигоменореей (Пат. RU 2326386 С1, 2008), который включает в себя эхографическое измерение объема яичников, подсчет числа антральных фолликулов и оценку генов HLA II класса. Преждевременную недостаточность яичников диагностируют при выявлении одного из аллелей DRB1*01, DRB*04, DRB1*03, DQB1*302, DQB1*501 у женщин с флюктуирующим уровнем ФСГ на фоне сохраненного ритма менструаций или первых задержек менструации и объеме яичников <5 см, числа антральных фолликулов <10, и повышении ПИ и ИР при оценке сосудистого кровотока яичников.
Недостатком метода является то, что генетические маркеры используются для диагностики преждевременной недостаточности яичников только в сочетании с клиническими и ультразвуковыми признаками этого состояния, то есть при данном способе невозможно прогнозировать снижение функции яичников заблаговременно. Кроме того, правило ориентировано только на женщин с олигоменореей.
Прототипом заявленного способа стал способ прогнозирования качества гамет при лечении женского бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий на основании генотипа пациенток (Пат. RU 2618421, C1, 2017), при котором проводят генотипирование пациенток по полиморфным локусам FSHR 2039 G>A, SERPINE1 -675 (5G>4G), ESR2 G>A и VEGFA -634 G>C. По результатам генотипирования определяют вероятность получения ооцитов, пригодных для оплодотворения.
Недостатком способа является то, что при его использовании прогнозируют вероятность получения качественных гамет, именно в программах ВРТ. Не учитывается вероятность преждевременного снижения овариального резерва и возможность наступления беременности без использования ЭКО.
Предлагаемый способ прогнозирования преждевременного снижения ОР позволяет своевременно скорректировать репродуктивные планы женщин и повышает шанс избежать использования ВРТ. Для прогнозирования преждевременного снижения ОР с помощью предлагаемого способа требуется лишь оценка генотипа пациентки, поэтому он может использоваться в любом возрасте и при любом клиническом состоянии женщины.
Поставленная задача - создание мультигенной модели прогнозирования преждевременного снижения овариального резерва до появления клинических, лабораторных или ультразвуковых признаков нарушения функции яичников.
Технический результат - повышение эффективности прогнозирования преждевременного снижения овариального резерва у женщины на основе генетической предрасположенности, путем генотипирования пациентки по трем полиморфным локусам: ESR1 С-397Т, FSHR Т1961С и CYP19A1 G681A.
Молекулярно-генетическое исследование проводилось с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием амплификатора ДТ-96 (ООО «ДНК-Технология», Россия). ДНК выделялась из образцов периферической крови.
В исследование было включено 200 пациенток с бесплодием, направленные на ВРТ в возрасте 30-40 лет. В группу 1 мы включили 100 женщин с преждевременным снижением овариального резерва, в группу 2 -100 женщин с нормальным овариальным резервом. Критериями сниженного овариального резерва мы считали уровень антимюллерового гормона (АМГ) <1,2 нг/мл и/или количество антральных фолликулов (КАФ) <5 и бедный ответ на стимуляцию в программе ЭКО (<4 ооцитов). Оперативное вмешательство на яичниках в анамнезе, эндометриоидные кисты яичников, тяжелая экстрагенитальная патология, аномальный кариотип женщины, синдром поликистозных яичников, лучевая или химиотерапия в анамнезе были критериями исключения.
2
Было оценено соответствие распределения генотипов выше указанных генов закону (равновесию) Харди-Вайнберга. Для всех генов распределение аллелей соответствовало равновесию Харди-Вайнберга. Соответствие реального распределения генотипов ожидаемому оценивалось с помощью критерия χ (Пирсона).
Для анализа межгенных сочетаний мы использовали компьютерный анализ методом многофакторного уменьшения размерности (Multifactor dimensionality reduction - MDR) с помощью компьютерной программы MDR 2.0 (SourceForge, США). Было проведено построение трехлокусной модели, включающей гены ESR1, FSHR и CYP19A1.
На Фиг. 1 представлены Межгенные взаимодействия в риске формирования преждевременного снижения овариального резерва (трехлокусная модель). Пояснения к трехлокусной модели на Фиг. 1: Темно-серые квадраты - сочетания, повышающие риск, светло-серые квадраты -сочетания, снижающие риск. Темно-серые столбцы (слева) - группа 1, светло-серые столбцы (справа) - группа 2. 0 - мажорный гомозиготный вариант, 1 - гетерозигота, 2 - полиморфный гомозиготный вариант.
Для оценки риска преждевременного снижения овариального резерва были использованы правила "If - Then", представленные в таблице 1. В случае если (If) в соответствии с комбинацией генотипа определена группа «1», считают (then), что пациентка имеет высокий риск преждевременного снижения ОР, если группа «2» - низкий риск.
2
Для оценки эффективности представленной модели использовали коэффициент перекрестной проверки (КПП) и сбалансированную точность предсказания [17]. КПП составил 10/10, сбалансированная точность - 77,8%, χ=39,56, р<0,001, ОШ 8,53 (ДИ 95% 4,19-17,36). Чувствительность и специфичность способа соответственно 65,1% и 84,4%.
В предлагаемом способе впервые предложено использование комбинаций полиморфных вариантов генов для оценки риска преждевременного снижения овариального резерва, что соответствует критерию «изобретательский уровень».
Прогнозирование преждевременного снижения овариального резерва у женщины на основе генетической предрасположенности может стать основанием для рекомендации женщине реализовать по возможности свою репродуктивную функцию в более молодом возрасте.
Эффективность предложенного способа подтверждается клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка А. 29 лет, не замужем, детей нет, обратилась для оценки состояния здоровья, а также для анализа генетической предрасположенности к нарушению репродуктивной функции в будущем. На момент осмотра жалоб не предъявляла, результаты гормонального обследования соответствовали возрастной норме (АМГ 1,8 нг/мл, ФСГ 6,3 МЕ/мл). При проведении УЗИ на 5 день менструального цикла в каждом яичнике было выявлено по 8 фолликулов, что соответствует норме. Было проведено молекулярно-генетическое исследование, определены следующие генетические варианты:
ESR1 С-397Т: ТТ
FSHR T1961C: TT
CYP19A1 G681A: GA.
В соответствии с правилами при данной комбинации генотипов пациентка относится к группе «1», то есть имеет высокий риск преждевременного снижения овариального резерва. Пациентке было разъяснено, что в более старшем возрасте у нее могут возникнуть проблемы с реализацией репродуктивного потенциала. В случае нежелания иметь детей в ближайшее время было рекомендовано провести криоконсервацию яйцеклеток.
Через 1,5 года пациентка приняла решение о проведении ЭКО с использованием спермы донора. При подготовке к ЭКО выявлено, что уровень АМГ у пациентки снизился до 1,1 нг/мл, КАФ в правом яичнике - 4, в левом - 3 (что свидетельствует о снижении овариального резерва). В программе ЭКО при стимуляции овуляции было получено 3 ооцита (что соответствует сниженному овариальному ответу), которые были оплодотворены. На 5 сутки имелось лишь 2 эмбриона, пригодных для переноса. Был проведен перенос одного эмбриона, второй эмбриона был витрифицирован.
Пример 2. Пациентка Б. 34 лет, замужем, детей нет. В ближайший год пациентка беременность не планирует, но опасается, что в будущем не сможет иметь детей из-за возрастного снижения репродуктивного потенциала.
Проведено молекулярно-генетическое исследование. Определены следующие генетические варианты:
ESR1 С-397Т: ТТ
FSHR T1961C: ТС
CYP19A1 G681A: GG.
В соответствии с правилами при данной комбинации генотипов пациентка относится к группе «2», то есть имеет низкий риск преждевременного снижения овариального резерва.
Повторно пациентка обратилась через год. Для оценки состояния овариального резерва был проведен анализ гормональных показателей. Уровень АМГ был 3,5 нг/мл, ФСГ - 5,32 МЕ/мл. При проведении УЗИ в левом яичнике было 8 антральных фолликулов, в правом - 9. Таким образом в возрасте 35 лет у пациентки был достаточный овариальный резерв.
Через 6 месяцев наступила беременность, использование вспомогательных репродуктивных технологий не потребовалось.
Список литературы.
1. Радзинский В.Е. Портрет современной пациентки. Ориентиры современности // Российский вестник акушера-гинеколога. 2020. Vol. 20, №6. Р. 7-11.
2. Буданова М.А. Оценка причин снижения овариального резерва у женщин репродуктивного возраста // Современная наука актуальные проблемы теории и практики. Серия естественные и технические науки. 2021. №9. Р. 94-102.
3. Гасымова Д.М., Рухляда Н.Н. Овариальный резерв, опосредованное и непосредственное влияние патологических факторов на него (обзор литературы) // Проблемы репродукции. 2017. Vol. 23, №6. Р. 7-11.
4. Jirge P.R. Poor ovarian reserve // Journal of Human Reproductive Sciences. 2016. Vol. 9, №2. P. 63-69.
5. Гаспаров A.C. и др. Клиническое значение овариального резерва в реализации репродуктивной функции // Акушерство и гинекология. 2014. №4. Р. 11-16.
6. Чернуха Г.Е. и др. Гены, вовлеченные в развитие преждевременного недостатосночти яичников // Акушерство и гинекология. 2021. №11. Р. 71-80.
7. Зенкина В.Г. и др. Молекулярные механизмы оогенеза // Бюллетень сибирской медицины. 2021. Vol. 20, №2. Р. 139-147.
8. Ковалев В.В., Кудрявцева Е.В. Молекулярно-генетические девиации и акушерская патология // Акушерство и гинекология. 2020. №1. Р. 26-32.
9. Prenzel Т. et al. Cohesin is required for expression of the estrogen receptor-alpha (ESR1) gene // Epigenetics and Chromatin. 2012. Vol. 5, №1.
10. Loutradis D. et al. Genetic Profile of SNP(s) and Ovulation Induction // Current Pharmaceutical Biotechnology. 2012. Vol. 13, №3. P. 417-125.
11. Paskulin D.D. et al. ESR1 rs9340799 is associated with endometriosis-related infertility and in vitro fertilization failure // Disease Markers. 2013. Vol. 35, №6. P. 907-913.
12. Altmäe S. et al. Genetic predictors of controlled ovarian hyperstimulation: Where do we stand today? // Human Reproduction Update. 2011. Vol. 17, №6. P. 813-828.
13. Allegra A. et al. The carriers of the A_G-G_G allelic combination of the c. 2039 A>G and c-29 G>A FSH receptor polymorphisms retrieve the highest number of oocytes in IVF/ICSI cycles.
14. Лянгасова О.В. и др. Полиморфные варианты гена FSHR и гормональный профиль программ вспомогательных репродуктивных технологий // Живые и биокосные системы. 2017. №19. Р. 6.
15. Praveen V.P. et al. Novel CYP19A1 mutations extend the genotype-phenotype correlation and reveal the impact on ovarian function // Journal of the Endocrine Society. 2020. Vol. 4, №4. P. 1-24.
16. Song D. et al. Sequence variants in FSHR and CYP19A1 genes and the ovarian response to controlled ovarian stimulation // Fertility and Sterility. 2019. Vol. 112, №4. P. 749-757.e2.
17. Пономаренко И.В. Использование метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR) и его модификаций для анализа ген-генных и генно-средовых взаимодействий при генетико-эпидемиологических исследованиях (обзор) // Научные результаты биомедицинских исследований. 2019. Vol. 5, №1. Р. 4-21.
18. Пат. РФ 2646572 Способ оценки состояния овариального резерва яичников / Игнатьева Р.Е., Густоварова Т.А., Дмитриева Е.В. - №201711909 опубл. 05.03.2018, б. 7.
19. Пат. РФ 2750159 Способ диагностики преждевременной недостаточности яичников / Машаева Р.И., Марченко Л.А., Олимпиева СП., Чернуха Г.Е., Гус А.И. - №2020139936, опубл. 22.06.2021, б.17.
20. Пат. РФ 2326386 Способ прогнозирования преждевременной недостаточности яичников у женщин репродуктивного возраста с олигоменореей / Марченко Л.А., Бутарева Л.Б., Александрова Н.В., Гус А.И. - №2006142570, опубл. 10.06.2008, б. 16.
21. Пат. РФ 2618421 Способ прогнозирования качества гамет при лечении женского бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий на основании генотипа пациенток / Владимирова И.В., Калинина Е.А., Донников А.Е., Сухих Г.Т. - №2016147329; опубл. 03.05.2017, б.13.