СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЖЕНСКОГО АНОВУЛЯТОРНОГО БЕСПЛОДИЯ НА КРЫСАХ
METHOD FOR SIMULATING FEMALE ANOVULATORY INFERTILITY IN RATS

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к экспериментальной гинекологии и патофизиологии репродуктивной системы, и может быть использовано для моделирования и последующего изучения женского ановуляторного бесплодия.
По данным отечественной и зарубежной литературы, с проблемой бесплодия сталкиваются и обращаются за медицинской помощью 15% супружеских пар, при этом в более чем половине случаев при обследовании причиной этому является женское бесплодие. Этиология женского бесплодия многообразна, однако, основное место занимают ановуляторные факторы. Несмотря на совершенствование методов диагностики и лечения, ановуляторное бесплодие по-прежнему плохо поддается лечению, а возможность забеременеть у таких женщин остается низкой. Вместе с тем в настоящее время отсутствуют физиологически приближенные экспериментальные модели женского ановуляторного бесплодия, что значительно затрудняет процесс разработки его диагностического алгоритма и программ коррекции.
Именно поэтому исследование ановуляторного бесплодия в экспериментальных условиях остается актуальной задачей.
Известны способы восстановления воспроизводительной функции у бесплодных животных, имеющих функциональные расстройства яичников путем введения стимулирующих лекарственных препаратов, преимущественно гормонов (С.А. Сысоев, Физиология размножения с.-х. животных, М.: "Колос", 1978, с. 142; А.П. Студенцов и др. "Ветеринарное акушерство и гинекология", М.: "Колос", 1980, с. 374-384; И.Е. Мозгов и др. "Гормоны в животноводстве", М.: "Колос", 1977, с. 34, 112, 125, 146; Н.И. Полянцев, А.Н. Синявин "Акушерско-гинекологическая диспансеризация на молочных фермах", М.: Росагропромиздат, 1989, с. 116-125; А.И. Сергиенко "Профилактика бесплодия крупного рогатого скота", М.: "Колос", 1984, с. 136-160; Н.И. Полянцев "Практические советы по борьбе с яловостью коров", М.: Россельхозиздат, 1986, с. 158; А.с. 709063, A61B 17/00; В.Г. Вогралик "Основы китайского лечебного метода чженьцзю", Горький, 1961 и др. (А.с. 1216844, A01K 67/02, 1992, Бюл. N 40).
Недостатками этих способов являются их факультативность, наличие побочных явлений, трудоемкость, нефизиологичность, связанная с дополнительным введением чужеродных для организма веществ, для угнетения половой функции. (Tripathi S.S. Brattacharya А.K. Luhture S.N. Influence of administration of massivedoses of oestrogens and progesterone on reproduction in heifers and conss. "Indian Vet"), 1979, 56, N 1, 41-44).
Также известен способ моделирования синдрома хронической ановуляции на крысах (RU №2076593, A01K 67/02, 02.061994), заключающийся в том, что в качестве медикаментозного средства для индукции экстральных циклов у нециклирующих самок, имеющих функциональные расстройства репродуктивных органов, вводят ганглиоблокатор бензогексоний в дозе 2 мг/кг внутримышечно с интервалом 6 ч до появления признаков течки.
Недостатками этого способа являются:
- модель не соответствует клинической ситуации бесплодия, а значит, данный способ не может считаться полностью физиологичным;
- модель не может быть использована для обработки методов лечения ановуляторного бесплодия, поскольку в ходе создания модели у экспериментального животного вызывается необратимая атрезия фолликулов;
- длительность проводимого эксперимента (не менее 30 дней), что затрудняет и удлиняет сроки исследования.
Данный метод не является физиологичным, поскольку для инициации бесплодия применяются вещества лекарственной природы. Возможны значительные аллергические осложнения и изменения в функционировании сердечно-сосудистой и центральной нервной системы, что затрудняет возможность интерпретации полученных результатов и снижает возможность переноса полученных результатов на женский организм.
В качестве прототипа взят способ моделирования синдрома хронической ановуляции на крысах (RU №2527166, G09B 23/28, 28.07.2013). Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к изучению патофизиологии репродуктивной системы. Для этого используют неполовозрелых самок крыс линии Vistar в возрасте 30 дней, массой 30-35 г, при физиологическом отсутствии регулярных эстральных четырехдневных циклов. Моделирование проводят в течение одного месяца. При этом через питательный зонд ежедневно утром животному вводят раствор, содержащий 2 капли препарата Циклодинон, разведенный в 1 мл дистиллированной воды. Способ обеспечивает развитие атрезии незрелых фолликулов, отсутствие желтых тел в яичниках и циклических изменений в эндометрии.
Недостатком этого способа является его неполная физиологичность, т.к. объектом исследования являются не половозрелые крысы. Также в данной модели использовались крысы с врожденным нарушением эстрального цикла. Вызывает сомнение механизм воздействия циклодинона на формирование ановуляторного бесплодия, поскольку как в настоящее время доказано, повышение уровня пролактина приводит к снижению уровня ЛГ, ФСГ, и развитию ановуляторного бесплодия, и наоборот, снижение уровня пролактина приводит к увеличению выброса ЛГ и ФСГ и восстановлению цикла. Поскольку циклодинон обладает допаминэргическим действием и уменьшает уровень пролактина в крови, непонятно снижение на его фоне уровня ЛГ и ФСГ и возникновение ановуляторного бесплодия.
Задачей настоящего изобретения является создание приближенной к физиологическим условиям экспресс - модели женского ановуляторного бесплодия для разработки дальнейших способов его изучения, диагностики и лечения.
-3
Поставленная задача достигается тем, что моделирование женского ановуляторного бесплодия производят на крысах породы Wistar, при этом используют половозрелых самок крыс с регулярным эстральным циклом в возрасте не менее 120 дней весом 180-210 грамм, которым однократно в фазу диэструса, подтвержденного цитологическим анализом влагалищных мазков, вводят в носовые ходы 10 мкл раствора (2×10 моль) блокатора кисспептинэргических рецепторов - kisspeptin-234 trifluoroacetate salt с последующим цитологическим подтверждением пролангации ановуляторной фазы.
Разработанный авторами способ моделирования женского ановуляторного бесплодия на крысах предполагает существование двухкомпонентной системы, состоящей из модели и прототипа, где роль модели играет животное, а прототипом является человек. При этом исследование модели дает возможность делать выводы о прототипе, в которых биологические посылки относятся к одному объекту, а научное заключение - к другому. В качестве экспериментального животного_для разработки экспериментальной модели ановуляторных нарушений в репродуктивной сфере женщины были выбраны крысы линии Wistar.
На выбор крыс в качестве модели для эксперимента повлияло несколько факторов. В частности, аллометричность функционирования репродуктивной сферы самок крыс и человека. Так, известно, что в норме частота и амплитуда импульсов гонадотропинов у женщин существенно меняется в зависимости от фазы менструального цикла, причем при сопоставлении пульсаций ЛГ и ФСГ в течение всего цикла у женщины и астрального цикла у животных (крыса) выявлена их полная идентичность.
По мнению профессора Raul Gomez (Global Fertility Academy, 2013), высокая аллометричность половых сфер женщин и крыс подтверждается не только схожестью нормального функционирования, формированием бесплодия, но и аналогичностью процессов инволюции половой сферы.
Новизна способа в том, что впервые для получения модели ановуляторного бесплодия использовался блокатор кисппептинэргических рецепторов, что прекращает воздействие на организм кисспептина, кодируемого геном kiSS-1. Поскольку установлено, что это ранее неизвестное, вырабатываемое в организме естественным путем, вещество отвечает за регуляцию репродуктивной функции организма через увеличение активности клеток гипоталамуса, выделяющих гормон гонадолиберин, который, в свою очередь, управляет уровнями лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), от которых зависит возникновение овуляции, а следовательно, возможность зачатия, то его блокада приводит к состоянию, характеризующемуся нарушением ановуляторной регуляции репродуктивной сферы и бесплодию. Таким образом, использование блокатора кисспептинэргических рецепторов - kisspeptin-234 trifluoroacetate salt (Sigma, USA) - полностью моделирует изменения в организме женщин, страдающих эндокринным бесплодием, что делает эту модель не отличимой от бесплодия, развивающегося в естественных условиях. Кроме этого, поскольку блокатор кисспептинэргических рецепторов не изменяет морфологию гонад, то и блокада рецепторов не является окончательной. Естественная активность рецепторов может быть восстановлена либо прекращением введения блокатора, либо повышением уровня кисспептина, либо другими лечебными мероприятиями, что позволяет использовать модель для обработки методов лечения ановуляторного бесплодия.
Способ моделирования ановуляторного бесплодия проводят на самках половозрелых крыс породы Wistar с регулярным эстеральным циклом весом 180-210 грамм, возрастом не менее 120 дней, в фазу диэструса, подтвержденного цитологическим анализом влагалищных мазков и состоит из 2-х этапов. Отобранные для эксперимента животные должны находиться в условиях стандартного режима освещения при температуре 20-22°C. Люминесцентные лампы (освещенность 750 лк на уровне клеток) должны освещать помещение в течение 12 дневных часов, на ночь свет должен отключаться. Кормление крыс производят полнорационным гранулированным кормом при свободном доступе к воде. Организация эксперимента осуществляется с учетом «Правил лабораторной практики в РФ и директив Европейской Конвенции по защите позвоночных животных (Strasbourg, 1986)».
На первом этапе моделирования эндокринного бесплодия оценивают ритмичность функционирования яичников животных и формируют группу животных с синхронизированными эстральными циклами в количестве, необходимом для дальнейших исследований. Оценку фаз эстрального цикла производят при помощи цитологического анализа влагалищных мазков у животных. Материал для цитологического исследования получают путем осторожного прикосновения ватно-марлевым тампоном к боковой стенке влагалища не соскабливая слизистую оболочку. В мазок должны попадать только те клетки, которые свободно отделились от слизистой оболочки влагалища. Взятый материал переносят на предметное стекло. Мазки анализируют с помощью светового микроскопа при увеличении 10×20, после окраски 0,5% спиртовым раствором метиленового синего. Подсчет клеток включает изучение не менее 8-10 полей зрения (200-300 клеток, преимущественно из центра мазка). При цитологической оценке влагалищных мазков крыс применяют упрощенную классификацию Geist, Salmon.
Каждой стадии полового цикла самок млекопитающих соответствует определенная клеточная картина влагалищных выделений.
Диэструс - покой вагинального эпителия, обусловленный низким уровнем эстрогенов в организме. В стадии диэструса, составляющей около 2-х суток эстрального цикла, в мазке у 100,0% животных преобладают слизь и лейкоциты, Фиг. 1.
В стадии проэструса, продолжающейся около 12 ч, мазок состоит почти из одних эпителиальных клеток, слущенных со стенок влагалища. Он совпадает с наиболее высоким уровнем секреции эстрогенов созревающими фолликулами яичника и характеризовался гипертрофией и гиперплазией эпителиальных клеток влагалища и последующим отторжением клеток, секретирующих слизь, Фиг. 2.
В стадии эструса, длительность около 24-27 ч, в мазке содержатся преимущественно чешуйки - безъядерные, ороговевшие клетки, образующиеся из-за расслоения клеток эпителия. Этот период в норме сочетается, обычно, с активизацией полового поведения и по времени примерно совпадает с овуляцией, Фиг. 3.
В метэструс, длительность которого у животных не превышает 6 часов, происходит резкое снижение активности половых гормонов с отторжением базального слоя клеток, Фиг. 4.
Для подтверждения регулярности эстрального цикла у каждого животного фиксируют не менее 3-4-х одинаковых последовательных циклов.
-3
После подтвержденного регулярного эстрального цикла у всех животных, с целью моделирования ановуляторного бесплодия в носовой ход вводят 10 мкл раствора (2×10 моль) блокатора кисспептинергических рецепторов - kisspeptin-234 trifluoroacetate salt (Sigma, USA). Однократное введение блокатора кисспептинергических рецепторов в указанной дозе приводит к удлинению ановуляторной фазы до 6 дней. При необходимости, ее можно продлять повторными аналогичными введениями блокатора кисспептинэргических рецепторов в той же дозировке с интервалом в 5-6 суток. Контроль за состоянием диэструса осуществляют также ежесуточно, с интервалом в 24 часа по анализу цитологической картины влагалища, которая соответствует фазе физиологического покоя - диэструса.
На Фиг. 5 представлена пролонгация диэструса на фоне введения кисспептинэргических рецепторов. На препарате видно большое количество слизи и лейкоцитов, что свидетельствует о низком содержании половых гормонов и отсутствии овуляции, т.е. достигнута цель опыта - получение у крысы ановуляторного бесплодия.
Экспериментальная модель была отработана на 76 животных. Пример полученных результатов представлен в Табл. 1
Способ полностью физиологичен, не требует введения чужеродных лекарственных препаратов, которые могут вызывать побочные эффекты, моделирует естественные условия развития ановуляторного бесплодия, обладает хорошей воспроизводимостью результатов и возможностью продления сроков эксперимента без вреда для жизни животного, что позволяет использовать данную модель для отработки способов диагностики и лечения ановуляторного бесплодия.