Клинико-патогенетическое значение персистенции респираторных вирусов у часто болеющих детей

© Коллектив авторов, 2009

Е.В. Замахина1, В.Л. Фомина2, О.В. Кладова1, Е.П. Бутакова1, А.С. Базанова1, Т.П. Легкова2, В.Ф. Учайкин1

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПЕРСИСТЕНЦИИ РЕСПИРАТОРНЫХ ВИРУСОВ У ЧАСТО БОЛЕЮЩИХ ДЕТЕЙ

1 ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава, 2 Морозовская детская городская клиническая больница, Москва

В статье представлены результаты обследования 43 детей без клинических проявлений острых респираторных инфекций (ОРИ) из группы часто болеющих детей (ЧБД). Выявленные маркеры респираторных вирусов в носоглоточных смывах и лимфоцитарном пуле клеток крови свидетельствуют о вирусной персистенции. Показано, что терапия Вифероном способствует снижению частоты эпизодов ОРИ, элиминации вирусных патогенов с эпителия дыхательных путей, нарастанию титров специфических антител у ЧБД, что можно трактовать как активацию иммунного реагирования.

The article presents the results of examination of 43 infants/children without clinical manifestations of respiratory infection from the group of infants/children suffering from frequent respiratory infectious diseases. Detected markers of respiratory viruses in nasopharyngeal swabs and blood lymphocyte fractions indicate viral persistence. The researchers have established that therapy with viferon reduces frequency of respiratory infections, eliminates viral pathogens from epithelium of respiratory tract, increases titers of specific antiviral antibodies. This effect may be interpreted as an activation of immune response.

Термин «часто болеющие дети» (ЧБД) появился в отечественной литературе в первой половине 80-х годов прошлого века и обозначает группу детей, выделяемую при диспансерном наблюдении, характеризующуюся более высоким, чем их сверстники, уровнем заболеваемости острыми респираторными инфекциями (ОРИ) [1-3]. В настоящее время к ЧБД относят детей, которые болеют ОРИ практически ежемесячно вне зависимости от возраста [4, 5].

В исследованиях, проведенных на кафедре инфекционных болезней у детей РГМУ, было по-

казано, что у ЧБД имеет место повышенное содержание продуктов перекисного окисления липи-дов, повышен уровень клеток, экспрессирующих CD95+, повышена продукция провоспалительных цитокинов ИЛ1р, 2, 4, 6, 8, ФНОа, снижены уровни лизоцима и в^А, хемотаксис и эстеразная активность макрофагов, снижена способность к синтезу а-, у-ИФН, имеет место умеренный дисбаланс субпопуляций Т-лимфоцитов, снижено количество В-лимфоцитов, при этом уровень повышен [6, 7]. В обобщенном виде для ЧБД характерна на-

Е.В. Замахина, В.Л. Фомина, О.В. Кладова и др.

пряженность процессов иммунного реагирования и недостаточность резервных возможностей, что не обеспечивает оптимальной адаптации ребенка к окружающей среде [1,2].

Поскольку у ЧБД нет грубых первичных и приобретенных дефектов в иммунной системе, но имеет место активация цитокинового каскада, что свидетельствует о текущем воспалении, представляется актуальным исследовать роль персистен-ции респираторных вирусов в организме ЧБД как возможную причину частых ОРИ и соответствующих иммунных отклонений.

В литературе можно найти данные, показывающие возможность персистенции различных респираторных вирусов [8-15]. Все основные механизмы развития персистирующей инфекции связаны с ускользанием вирусов от иммунного распознавания с подавлением индукции и (или) реализации иммунного ответа: образование дефектных интерферирующих частиц (ДИ-частиц) и «ускользающих» мутантов (escape mutants), нарушение презентации собственных антигенов путем снижения экспрессии молекул HLA на поверхности зараженных клеток, продукция белков-антога-нистов ИФН, стимуляция продукции иммуносуп-рессивного цитокинаИЛЮи др. Кроме того, одним

из способов уклонения от защитных факторов организма является персистирование непосредственно в клетках иммунной системы, что показано для вирусов гриппа и аденовирусов [16].

Так, персистирующая гриппозная инфекция описана в клеточных культурах, на моделях мышей с развитием медленной гриппозной инфекции, сопровождающейся иммунодефицитом и прогрессирующими дегенеративными изменениями в ЦНС, а также у иммунодефицитных лиц, у детей с врожденной патологией ЦНС, матери которых во время беременности перенесли грипп, и у здоровых людей после перенесенной острой инфекции [8-12]. Вирусы парагриппа в организме человека после перенесенной острой инфекции персистируют до 2-3 мес, а у пациентов с рассеянным склерозом, возможно, пожизненно [8]. Аденовирусы персистируют в Т-лим-фоцитах периферических лимфоидных органов и играют определенную роль в развитии гипертрофии миндалин и аденоидов, хронических тонзиллитов, аденоидитов, ангин, а также могут персистировать в лимфоцитах периферической крови у лиц с иммунодефицит ами, предполагается их участие в опу-холеобразовании [13, 14]. Описана персистенция респираторно-синцитиального вируса (Ив-вируса) в эпителии нижних дыхательных путей у пациентов с

хроническим обструктивным бронхитом и обсуждается его роль в развитии бронхиальной астмы [15].

Таким образом, в настоящее время существуют исследования, подтверждающие возможность персистенции респираторных вирусов в организме человека, однако остается не до конца ясным клиническое значение вирусной персистенции и можно ли рассматривать факт персистенции как показатель иммунной недостаточности.

Материалы и методы исследования

Под нашим наблюдением находились 63 ребенка. Из них было 43 ЧБД без клинических проявлений ОРИ на момент исследования и в течение предыдущего месяца; в их числе 15 (35%) девочек и 28 (65%) мальчиков в возрасте от 10 мес до 5 лет: до 1 года — 4 (9,3%), от 1 до 3 лет — 15 (35%), от 3 до 5 лет — 24 (55,7%). Кроме того, обследованы 20 эпизодически болеющих детей (ЭБД), из них 15 (65,4%) мальчиков и 5 (34,6%) девочек в возрасте от 2 до 7 лет.

Частота эпизодов ОРИ у ЧБД составляла от 7 до 12 раз в год, у ЭБД — до 6 раз в год. В анамнезе до исследования частые ОРИ у ЧБД осложнялись отитами — у 11 детей, ангинами — у 8, гайморитами — у 3, бронхитами — у 8, пневмониями — у 3, по поводу чего они получали антибактериальную терапию, из них 12 детей неоднократно. У 8 детей в анамнезе отмечались рецидивирующие крупы от 3 до 10 раз, 14 детей перенесли дисбактериоз кишечника, 11 — имели гипертрофированные миндалины и/или аденоиды II-III степени, 2 детям была проведена аденотомия.

У всех детей были исследованы носоглоточные смывы с целью детекции респираторных вирусов: гриппа А (H1N1, H3N2) и В, парагриппа, аденовирусов, RS-ви-руса методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием тест-систем Biokom и АмплиСенс. Выделение РНК/ДНК вирусов проводили с помощью тест-системы «Рибосорб» производства АмплиСенс. Одновременно исследовали фракции мононуклеарных клеток крови с целью обнаружения антигенов респираторных вирусов методом иммуноферментного анализа (ИФА). Суммарную фракцию мононуклеарных клеток изолировали из крови путем обработки фенол-верографиновой смесью по методике Soheil D.N. et al. (1987). Выделенные клетки замораживали и оттаивали, центрифугировали, после чего погружали в лизирующий буфер. ИФА проводили с высокоактивными сыворотками кролика, полученными к вирусам гриппа А (H1N1, H3N2) и В, парагриппа, аденовирусам, RS-вирусу. Кроме того, определяли специфические антитела в сыворотках крови: к вирусам парагриппа, аденовирусам, RS-вирусу методом ИФА в модификации Исаевой Е.И. и соавт. (1988), к вирусам гриппа — в реакции торможения гемагглюти-нации (РТГА) с человеческими эритроцитами I (0) группы крови и использованием эталонных штаммов вирусов гриппа А (H1N1, H3N2) и В согласно рекомендациям

ВОЗ. Достоверность различий результатов исследования у ЧБД и ЭБД оценивали по точному критерию Фишера. Различия считали достоверными при уровне доверительной вероятности (р) меньше 0,05.

Результаты и их обсуждение

В результате проведенного исследования носоглоточных смывов респираторные вирусы были обнаружены у 35 (81,4%) из 43 ЧБД. Наиболее часто выявлялись вирусы гриппа, как в моновариантах, так и в ассоциациях, а также аденовирусы. Только у 8 ЧБД были получены отрицательные результаты (рис. 1).

Из 20 ЭБД респираторные вирусы в носоглоточных смывах были обнаружены у 16 (80%). Также чаще выявлялись вирусы гриппа и аденовирусы, кроме того у 4 детей обнаружены вирусы парагриппа, а ИЯ-вирус не встречался. Только у 4 ЭБД получены отрицательные результаты (рис. 2).

В результате проведенного исследования фракций мононуклеарных клеток крови у 23 (53,5%) из 43 ЧБД и у 15 (75%) из 20 ЭБД были получены положительные результаты, совпадающие с результатами исследования носоглоточных смывов (см. таблицу). Следует отметить, что у 8 ЧБД и у 4 ЭБД с отрицательными результатами исследования носоглоточных смывов не обнаруживались антигены респираторных вирусов и в фракциях мононукле-арных клеток крови.

Выявление респираторных вирусов в носоглоточных смывах и их антигенов в фракциях мононуклеарных клеток крови у всех детей соответствовало наличию специфических антител в сыворотках крови.

Рис. 1. Результаты исследования носоглоточных смывов у ЧБД без клинических проявлений ОРИ.

Рис. 2. Результаты исследования носоглоточных смывов у ЭБД без клинических проявлений ОРИ.

Е.В. Замахина, В.Л. Фомина, О.В. Кладова и др.

45

Таблица

Результаты исследования фракций мононуклеарных клеток крови у ЧБД и ЭБД

Вирусы ЧБД

Грипп 19 8

Аденовирусы 3 3

Грипп+аденовирусы 1 2

Грипп+парагрипп 0 1

Парагрипп 0 1

Не обнаружены 20 5

Таким образом, в 81,4% у ЧБД и в 80% у ЭБД (р>0,05) обнаружены респираторные вирусы в смывах из носоглотки и специфические антитела в сыворотках крови, что сопровождалось обнаружением антигенов этих респираторных вирусов в мононуклеарных клетках крови в 53,5% у ЧБД и в 75% у ЭБД (р>0,05).

Сопоставление результатов обследования с анамнестическими данными у ЧБД не выявило связи между обнаружением того или иного вируса и наличием какого-либо заболевания в анамнезе, таких как рецидивирующий круп, гипертрофия миндалин, аденоидов и др. Однако у 7 ЧБД с обнаружением вирусов гриппа удалось установить наличие перенесенного гриппоподобного заболевания за 2-3 мес до настоящего исследования.

Обнаружение маркеров респираторных вирусов в носоглоточных смывах и в фракциях мо-нонуклеарных клеток крови у ЧБД и ЭБД без клинических проявлений ОРИ свидетельствует о вирусной персистенции. Однако надо учесть, что данное состояние у ЧБД сопровождается рекуррентными респираторными инфекциями с соответствующими иммунными изменениями и частым развитием бактериальных осложнений, что обосновывает проведение противовирусной и иммунокорригирующей терапии в этой группе детей.

В настоящее время разработаны различные схемы иммунокоррекции у ЧБД, применяемые в качестве профилактики рекуррентных ОРЗ [3, 4, 6, 7].

С целью иммунореабилитации у 43 ЧБД мы назначали препарат рекомбинатного а2-интерфе-рона в сочетании с антиоксидантами (витаминами Е и С) — Виферон в суппозиториях в дозировке 500 000 МЕ и 1 000 000 МЕ ежедневно в течение 30 дней для детей до 3 лет и старше 3 лет соответственно. Учитывая длительность курса, мы применяли препарат 1 раз в день вечером перед сном. Выбор длительности терапии обоснован результатами исследований, проведенных на нашей кафедре ранее, в которых была показана эффективность профилактики повторных ОРИ при приеме Вифе-рона в течение 1 месяца у ЧБД, а также у детей с рецидивирующим крупом и рецидивирующим брон хитом [6, 7].

Известно, что под влиянием ИФН в организме усиливается активность цитотоксических лимфоцитов, CD4+T-лимфоцитов, фагоцитарная активность, интенсивность дифференцировки В-лим-фоцитов, экспрессия антигенов МНС I и II типа, кроме того, препарат непосредственно ингибирует репликацию и транскрипцию вирусов [17].

Для оценки эффективности проводимой терапии у 43 ЧБД мы учитывали частоту и тяжесть заболеваемости ОРИ в течение месяца терапии и последующих 3 месяцев катамнестического наблюдения, а также проводили повторное исследование носоглоточных смывов, фракций мононуклеарных клеток крови, определение нарастания титров специфических антител (диагностическим считали прирост в 4 раз и более) через 30 дней терапии Вифероном.

На фоне лечения Вифероном в течение месяца ни у одного из детей не было отмечено присоединения ОРИ. За 3 месяца катамнестического наблюдения однократные ОРИ отмечены у 6 (14%) из 43 детей, при этом ОРИ проявлялись в виде назофа-рингита, форма тяжести их была легкой, длительность — непродолжительной, лечение ограничивалось назначением симптоматических средств. Повторных ОРИ зарегистрировано не было.

Через 30 дней терапии Вифероном у 8 из 43 ЧБД с отрицательными результатами исследования носоглоточных смывов до лечения респираторные вирусы не обнаруживались и после терапии Вифероном. Из 35 детей с положительными результатами до лечения полная элиминация респираторных вирусов с эпителия носоглотки отмечена у 16 (45,7%). У 7 (20%) из 35 детей отмечена элиминация одного из двух персистирующих вирусов и сохранение другого (рис. 3).

Таким образом, в целом элиминация (полная или частичная) респираторных вирусов с эпителия носоглотки после лечения Вифероном отмечена у 23 (65,7%) детей. Ни у кого из детей не выявлены новые вирусные патогены.

Через 30 дней терапии Вифероном антигены респираторных вирусов в фракциях мононуклеарных клеток крови обнаружены у 33 (76,7%) из 43 ЧБД. При этом у 22 из 23 детей с положительными результатами при первом исследовании антигены респираторных вирусов продолжали обнару-

грипп 10 не обнаружен 24

аденовирус 2 / \ адено+RS 1

RS-вирус 4 грипп+RS 1

грипп+адено 1

Рис. 3. Результаты исследования носоглоточных смывов у ЧБД без клинических проявлений ОРИ через 30 дней терапии Вифероном.

живаться, у одного ребенка отмечена элиминация антигенов вируса гриппа НШ1. У 11 детей в моно-нуклеарных клетках крови появились антигены тех респираторных вирусов, которые элиминировались с эпителия носоглотки. У 8 детей с отрицательными результатами исследования носоглоточных смывов и фракций мононуклеарных клеток крови до лечения антигены респираторных вирусов не обнаруживались и после терапии Вифероном.

Через 30 дней терапии Вифероном диагностический прирост специфических антител к выявленным до лечения патогенам в носоглоточных смывах отмечался у 33 (94,3%) из 35 детей. У 2 детей нарастания титров специфических антител к обнаруженным в смывах патогенам не выявлено, при этом у одного ребенка на фоне лечения вирус гриппа (НШ1) с эпителия носоглотки элиминировался, у другого продолжали сохраняться оба вируса гриппа (НШ1+Н3М2). У 8 детей с отрицательными результатами исследования носоглоточных смывов и фракций мононуклеарных клеток крови до и после терапии Вифероном не обнаружено и нарастания титров антител ко всем 6 вирусам.

Обнаружение маркеров респираторных вирусов у ЧБД при повторном исследовании подтверждает персистенцию респираторных вирусов, что согласуется с данными литературы [8-15]. Возможно, больший процент обнаружения антигенов респираторных вирусов в мононуклеарных клетках при повторном исследовании обусловлен динамикой формирования персистирующей инфекции и характеризует определенный этап нахождения вирусов в иммунокомпетентных клетках. Возможно также при персистирующей инфекции происходит стимуляция иммунитета и выработка антител, защищающих от повторных ОРИ, что имеет место у ЭБД. Однако у детей из группы ЧБД персистенция респираторных вирусов сопровождается напряженностью процессов иммунного реагирования и недостаточностью резервных возможностей, в результате чего они переносят ОРИ практически ежемесячно.

У ЧБД через 30 дней терапии Вифероном в 65,7% случаев отмечена элиминация респираторных вирусов с эпителия носоглотки, однако сохранялись маркеры респираторных вирусов в мононуклеарных клетках крови, что в 94,3% сопровождалось нарастанием титров специфических антител в крови. На этом фоне у ЧБД не отмечалось присоединения ОРИ, что сопровождалось и отсутствием обнаружения новых вирусных патогенов в носоглоточных смывах и фракциях мононуклеар-ных клеток крови после окончания лечения, в том числе и у 8 детей с отрицательными результатами исследования до лечения. В течение последующих 3 мес ОРИ отмечались в небольшом проценте случаев — 14%, форма тяжести их была легкой. Таким образом, полученные изменения свидетельствуют об активации иммунного реагирования.

Выводы

1. У ЧБД и ЭБД без клинических проявлений ОРИ выявляются маркеры респираторных вирусов в эпителиальных клетках носоглотки и моно-нуклеарных клетках крови, что свидетельствует об их персистенции.

2. Наличие персистирующих респираторных вирусов в организме ЧБД сопровождается рекку-рентными ОРИ, что патогенетически обосновывает проведение этиотропной и иммунокорригирующей терапии, направленной на активацию функционального состояния иммунитета.

3. На фоне терапии Вифероном в течение 30 дней у ЧБД не отмечалось присоединения ОРИ, в течение последующих 3 месяцев наблюдения ОРИ регистрировались только в 14%, причем форма тяжести заболеваний была легкой, что связано с наличием в 65,7% элиминации респираторных вирусов с эпителия носоглотки, сопровождающейся в 94,3% нарастанием титров специфических антител к персистирующим патогенам.

ЛИТЕРАТУРА

1. Альбицкий В.Ю., Баранов A.A., Камаев ИА., Огнева М.Л. Часто болеющие дети. Н. Новгород: ООО «Тактик-Студио», 2003.

2. Самсыгина ГА. Часто болеющие дети: проблемы патогенеза, диагностики и терапии. Педиатрия, 2004; 1: 66-73.

3. Рациональная фармакотерапия часто болеющих детей: пособие для врачей-педиатров, семейных врачей, студентов педиатрических факультетов медицинских ВУЗов. Под ред. М.Г. Романцова. Санкт-Петербург: ООО «Тактик-Студио», 2006.

4. Учайкин В.Ф., Кладова О.В., Щербакова АА., Блистино-ва ЗА. Результаты применения препарата «Афлубин» в неспецифической профилактике острых респираторных заболеваний у часто болеющих детей. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2001; 6: 56-58.

5. Маркова Т.П., Чувиров Д.Г. Профилактика респираторных инфекций. Рус. мед. журнал, 2004; 1: 5-7.

6. Щербакова АА. Клинико-патогенетическое значение системы мононуклеарных фагоцитов при рецидивирующем крупе у детей. Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. М., 2003.

7. Кладова О.В. Иммунопатогенез, клиника и лечение реци-

дивирующего крупа у детей. Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. М., 2003.

8. Фролов А.Ф. Персистенция вирусов (механизмы и кли-нико-эпидемиологические аспекты). Винница: Изд-во Винницкого мед. ун-та им. Н.И. Пирогова, 1995.

9. Зуев В А Медленные вирусные инфекции человека и животных. М.: Медицина, 1988.

10. Rocha E et al. Antigenic and genetic variation in influenza A (H1N1) virus isolates recovered from a persistently infected immunodeficient child. J. Virol. 1991; 65 (5): 2340-2350.

11. Банников А.И., Родионова В.Б., Гринбаум Е.Б. и др. Длительное носительство геномных структур вируса гриппа в лейкоцитах крови детей с врожденной патологией центральной нервной системы. Вестн. РАМН, 1994; 9: 25-27.

12. Исаева Е.И., Ровнова ТА, Алипова ТА и др. Длительность выявления в лимфоцитах крови человека маркеров вируса гриппа. Вопр. вирусологии, 1994; 6: 262-265.

13. Garnett CT, Erdman D, Xu W, Gooding LR. Prevalence and quantitation of species C adenovirus DNA in human mucosal lymphocytes. J. Virol. 2002; 76 (21): 10608-10616.

Е.В. Замахина, В.Л. Фомина, О.В. Кладова и др.

14. Кульчар Г., Дан П., Львов Н.Д. и др. Персистенция вируса простого герпеса и аденовирусов в лимфоцитах больных с опухолями урогенитального тракта. Вопр. вирусологии, 1990; 1: 50-52.

15. Кривицкая В.З., Яковлева Н.В., Александрова Н.И. Особенности анти-респираторно-синцитиального вирусного гуморального иммунитета при персистенции антигенов респиратор-

© Аверьянов А.П., Болотова Н.В., 2009

47

но-синцитиального вируса у взрослых больных хроническим об-структивным бронхитом. Вопр. вирусологии, 1996; 5: 234-237.

16. Железникова Г.Ф. Механизмы взаимодействия возбудителя инфекции и иммунной системы хозяина. Инфекционные болезни, 2006; 3: 69-77.

17. Малиновская. В.В., Деленян Н.В.,Ариненко Р.Ю. Вифе-рон: рук-во для врачей. М.: «ИНКО-ТНК», 2007.