Роль гликопротеидов, регулирующих апоптоз, в дифференцировке лимфоцитов человека

УДК 615.831:616-006.494-092.9

Т. N. Zabotina, Z. G. Kadagidze

THE ROLE OF APOPTOSIS-MEDIATED PROTEINS IN THE DIFFERENTIATION OF HUMAN LYMPHOID CELLS

N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

In the given work we discuss the results of subpopulation expression of proteins regulating apoptosis at various stages of lymphoid cells differentiation in normal peripheral blood, thymus and lymph nodes. A three-color (multiparameter) flow cytometric method has been used to follow the expression of both differentiation antigens and cytoplasmic proteins. The data obtained indicate that CD95 and CD243 the surface proteins as well as Bcl2 and Ki-67 cytoplasmic proteins are involved in the formation of the T- and В-cells repertoire.

Key words: lymphocytes, apoptosis, flow cytometry.

Т. H. Заботина, 3. Г. Кадагидзе

РОЛЬ ГЛИКОПРОТЕИДОВ, РЕГУЛИРУЮЩИХ АПОПТОЗ, В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

ГУ РОНЦгш. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

В данной работе представлены результаты субпопуляционной характеристики экспрессии белков, регулирующих апоптоз, на различных этапах дифференцировки лимфоидных клеток на примере периферической крови, тимуса и лимфатических узлов в норме. Использовался пятипараметровый (трехцветный) проточно-цитофлюо-риметрический анализ поверхностных антигенов, а также внутриклеточных белков. Полученные результаты указывают, что как мембранные CD95, CD243, так и внутриклеточные Вс12, Ki-67 белки играют важную роль в формировании репертуара Т- и В-клеток.

Ключевые слова: лимфоциты, апоптоз, проточная цитофлюориметрия.

Гемопоэтические клетки развиваются из заложенных в онтогенезе стволовых кроветворных клеток и в процессе созревания проходят длинный путь дифференцировки. Процесс этот не хаотичен. В норме созревает ровно столько клеток, сколько их необходимо для поддержания гомеостаза [1, 2, 3, 11, 15, 25]. Нормальная дифференцировка гемопоэтических клеток представляет собой перманентный процесс, в ходе которого некоторые этапы протекают очень быстро, а соответствующие типы клеток представлены в ничтожно малых количествах. Клетки миелоидного ряда проходят созревание в костном мозге и только потом выходят в кровеносное русло в виде гранулоцитов, моноцитов, тромбоцитов. Лимфоидные клетки в незрелом состоянии покидают костный мозг и мигрируют в лимфатические узлы, селезенку (В-клетки) и тимус (Т-клетки), где осуществляются их дальнейшая диф-

ференцировка и селекция, и лишь затем начинают циркуляцию в периферической крови. В процессе дифференцировки выделяются дискретные этапы созревания клеток, которые четко отличаются друг от друга по морфологическим, цитохимическим и иммунологическим характеристикам. Иммунологические методы позволяют определить гетерогенность в пределах морфологически однородной популяции клеток, относящихся к разветвленной иерархии гемопоэтических клеток. Поддержание гомеостаза в многоклеточном организме контролируется не только клеточной пролиферацией и дифференцировкой, но также клеточной смертью. Воспринимая сигналы извне от других клеток или посредством цитокинов, клетка или продолжает дифференцировку, или останавливается на некоторое время в дифференцировке, или погибает [3,11,15, 24].

В норме высокая пролиферативная активность коммутированных предшественников гемопоэза перекрывается физиологической гибелью — апоптозом их избыточного и недифференцирующегося потомства, а возможно, и самих родоначальных клеток. Кроме того, установлено, что в периферических лимфоидных органах на антигензависимой стадии дифференциров-ки В-лимфоцитов большинство клонов с низким аффинитетом к антигену погибают по механизму апопто-за [16, 34]. В процессе созревания большинство Т-кле-ток на тимическом (кортикальные и медуллярные тимоциты) этапе дифференцировки лимфоидных клеток также элиминируют путем апоптоза [5, 12, 20, 28].

В норме в гемопоэтической ткани человека апоп-тоз регулируется кооперацией биохимических сигналов и представляет собой программное ограничение клеточной массы на всех этапах дифференцировки — от клеток-предшественниц в костном мозге до зрелых клеток периферической крови. Нарушение реализации программы апоптоза лежит в основе патогенеза многих гематологических заболеваний [2, 13, 23, 32, 33].

Цель настоящего исследования — изучение особенностей экспрессии белков, регулирующих апоптоз (CD95, CD243, Вс12, Ki-67), на различных этапах нормальной дифференцировки Т- и В-клеток на примере периферической крови, тимуса и лимфатических узлов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Приготовление клеток

Тимоциты выделяли с помощью стеклянного гомогенизатора из тимуса детей в возрасте от 1 года до 14 лет, перенесших открытую операцию на сердце в отделении врожденных пороков сердца Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева РАМН. Взвесь клеток фильтровали через марлевый фильтр и трехкратно отмывали средой RPMI1640 или PBS. Лимфоциты получали из лимфатических узлов, удаленных с профилактической целью у больных с солидными опухолями во время выполнения хирургических операций. Кусочек ткани измельчали с помощью бритвы в чашке Петри в небольшом объеме (0,5 мл) профильтрованного через 0,45-мкм миллипо-ровый фильтр Трис-НС1-буфера (pH 7,4) или физиологического раствора до получения клеточной суспензии. Полученную взвесь клеток далее разделяли на градиенте фиколл-верографина по стандартной методике. Жизнеспособность выделенных клеток оценивали по окрашиванию трипановым синим (Flow Lab., Великобритания). Образцы периферической крови новорожденных детей получены из отделения экстренной кардиохирургии недоношенных детей и детей первого года жизни Научного центра сердечно-сосудистой хирургии им. А. Н. Бакулева РАМН. Образцы периферической крови здоровых доноров получены из отделения переливания крови с банком костного мозга РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (руководитель — д-р мед. наук. Е. В. Огородникова).

Для определения внутриклеточных белков клетки фиксировали в 0,25% формальдегиде в течение 30 мин

при комнатной температуре, отмывали и ресуспенди-ровали в среде, содержащей 10 % сыворотки.

Пермебиализацию клеточной мембраны осуществляли перед окрашиванием МКА с помощью коммерческого раствора BD FACS Permeabilizing Solution (Becton Dickinson, США).

Моноклональные антитела и реагенты

Для определения внутриклеточных белков использовали коммерческие моноклональные антитела, конъюгированные FITC: Anti-Bcl2 (клоны Вс12/100 и МОРС-21, Becton Dickinson, США), BCL2 Oncoprotein (клон 124, DAKO, США), Ki-67 (клон Ki-67, DAKO, Дания), Р53 (клон DO-7, DAKO, Дания).

Субпопуляционный анализ проводили с использованием коммерческих моноклональных антител к поверхностным антигенам CD3, CD8, CD4, CD5, CD45, CD 14, CD95, CD 19, CD20, HLA-Dr, CD243, CDla, конъюгированных FITC, PE, Per-CP (Becton Dickinson, США; DAKO, Дания; Caltag, США; Coulter Beckman, Франция). На первом этапе осуществляли окрашивание поверхностных антигенов, затем клетки обрабатывали реагентами для выявления внутриклеточных структур.

В качестве контроля применяли коммерческие сыворотки, содержащие изотопические антимышиные Ig, конъюгированные соответствующим флюорохромом.

Проточно-цитофлюориметрический анализ

Субпопуляционный анализ образцов проводился на проточном цитофлюориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием коммерческого пакета программ сбора и анализа данных CellQuest. В зависимости от цели исследования при сборе накапливали от 5000 до 500 000 клеток. Дискриминацию исследуемого гейта клеток осуществляли в режиме «DotPlot» по светорассеянию — FSC против SSC с линейным усилением (lin/lin), по связыванию с моноклональными антителами — SSC против FL1,FL2,FL3 в смешанных линейно-логарифмических режимах (lin/log) или только с применением параметров флюоресценции (log/log). При анализе гистограмм оценивали уровень антиген-позитивных клеток (%) и интенсивность флюоресценции (MFI). В случае гомогенного характера гистограмм, т. е. при отсутствии бимодальности, проводили сравнительную гистограммную характеристику в режиме наложения «overlaid» с использованием статистики Kolmogorov-Smimov (K-S) [35].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия антигена CD95 на лимфоцитах периферической крови, тимоцитах

Наиболее изученным механизмом передачи сигнала апоптоза является рецепторно-лигандный путь с участием белков семейства TNF, в состав которого входит CD95. Взаимодействие CD95 с его лигандом (CD95L/FasL/APO-lL) или с моноклональными антителами против CD95 является триггерным моментом для активации процесса апоптоза (С095-рецептор-но-лигандный механизм) [1, 4, 15, 16, 18].

Однопараметровый анализ экспрессии С095 на СБ45+/С014—лимфоцитах периферической крови взрослых доноров («=30) показал, что антиген представлен на клетках в широком диапазоне — от 35 до 75 % (М = 58,3±12,6). Субпопуляционный анализ СБ45+-лимфоцитов выявил, что лишь 40-60 % зрелых СБЗ+-Т-клеток несут на своей поверхности антиген СБ95, в то время как практически все СБ19+-В-лим-фоциты коэкспрессируют мембранную молекулу СБ95 (рис. 1, а, 6).

63,7%

контроль клетки, окрашенные МКА CD95

ш 18,1% 43,5% if Г Ч

гШй " -ї'г' 16,4% \M: и

и 0,7% 6,91% .?fV.

ушгЗ? iffi&L 53,9%

б

Рис. 1. Экспрессия СБ95 на лимфоцитах периферической крови здоровых доноров:

а — экспрессия СБ95 на СБ45+/С014—лимфоцитах: по оси абсцисс — количество клеток, по оси ординат — интенсивность флюоресценции; б — экспрессия СБ95 на субпопуляциях лимфоцитов СОЗ+/СВ45+/СБ14- и С019+/СБ45+/СВ14- (трехцветное окрашивание): 1-й квадрант — клетки, окрашенные только фикоэритрином (РЕ); 2-й квадрант — клетки, окрашенные одновременно фикоэритрином (РЕ) и ПТС, 3-й квадрант — клетки, окрашенные только Р1ТС

Аналогичный анализ периферической крови новорожденных детей (и=7) в возрасте от 2 дней до 1 мес показал, что лимфоидные СВ45+/СБ14—клетки являются абсолютно негативными после обработки моноклональными антителами апй-С095. В то же время лимфоциты детей в возрасте 4—5 лет экспрессируют антиген СБ95 на уровне показателей взрослого человека.

Экспрессия СБ95 на тимоцитах (и=8) сильно варьировала — от 8,7 (фоновый уровень) до 35,2 %, среднее значение составило 24,7±10,3 % антиген-позитив-

ных клеток. При этом гистограмма распределения окрашенных клеток носила гомогенный характер экспрессии. Сравнительный анализ гистограмм распределения тимоцитов, окрашенных МКА anti-CD95, проведен также попарно с применением статистики Kolmogorov-Smimov (К-S). Этот метод позволяет производить количественный анализ различий интенсивности флюоресценции каждой из клеток, составляющих гистограмму (кривую). С этой целью используется режим наложения («overlaid») 2 гистограмм в одной системе координат. Анализ показал, что различия являются статистически достоверными при сравнении гистограмм измерений экспрессии CD95 с контрольным образцом (р<0,001). Индекс сравнения 2 гистограмм, обозначаемый D, составил 0,56. Важно подчеркнуть, что гистограммы считаются идентичными при индексе D=0; чем значения D ближе к единице, тем существеннее отличия сравниваемых кривых [35].

При двухцветном анализе коэкспрессии CD95 на СОЗ+-тимоцитах оказалось, что основной пул клеток является отрицательным, однако четко определялась минорная субпопуляция СОЗ+-тимоцитов, несущих на своей поверхности антиген CD95.

Экспрессия белка CD243 на лимфоцитах периферической крови, тимоцитах

Условно к рецептор-опосредованным механизмам супрессии апоптоза можно отнести экспрессию Р-гаи-копротеина, который на VII Международном рабочем совещании по дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека был отнесен к кластеру дифференци-ровки CD243. В нормальном костном мозге стволовые клетки и ранние предшественники, несущие антиген CD34, экспрессируют функционально активный CD243. В пределах лимфоидной дифференцировки экспрессию гена MDR1, кодирующего мембранный белок CD243, наблюдали в ранних и зрелых В-клетках. В периферической крови CD243 выявлен на некоторых типах Т-лимфоцитов (естественные киллеры и супрессоры), а также большинстве В-клеток. Не обнаруживается CD243 на гранулоцитах и моноцитах [9, 10].

Исследование экспрессии мембранного белка CD243 на лимфоидных CD45+/CD14—клетках периферической крови выявило 7,3+2,1 % антиген-позитив-ных клеток. Однако при субпопуляционном анализе установлено, что CD3+/CD45+/CD14—Т-клетки являются негативными, в то время как все CD19+/CD45+/CD14— В-лимфоциты периферической крови экспрессируют на своей поверхности CD243 (рис. 2).

Функциональную активность CD243 исследовали по уровню интенсивности выброса флюоресцентного родамина (Rh)123, что отражает показатель среднего канала интенсивности флюоресценции (MFI), а в качестве модулятора использовали верапамил [22]. Было выявлено, что лимфоциты периферической крови доноров экспрессируют функционально неактивный белок CD243, поскольку показатели средних каналов интенсивности флюоресценции клеток, обработанных Rh 23, и клеток, обработанных Rh 23 и верапамилом, практически идентичны (MFI равно 255 и 270 соответственно) (рис. 3).

j&k

3

CD19°/CD243d клетки

CD 243 FITC

CD 243 FITC

Рис. 2. Экспрессия белка СЭ243 на субпопуляциях лимфоцитов СБЗ+/С045+/СП14-и СБ19+/С045+/С014-периферической крови:

1-й квадрант — клетки, окрашенные только фико-эритрином (РЕ); 2-й квадрант — клетки, окрашенные одновременно фикоэритрином (РЕ) и БІТС; 3-й квадрант — клетки, окрашенные только БІТС

Рис.' 3. Анализ функциональной активности СБ243 лимфоцитов периферической крови доноров: по оси абсцисс — интенсивность флюоресценции клеток, обработанных Ий 23 (гистограмма с зеленым наполнением), и клеток, преобработанных Шг123 с последующей ингибицией функциональной активности верапамилом; по оси ординат — количество клеток

Анализ экспрессии СБ243 на тимоцитах показал, что, в отличие от периферических лимфоцитов доноров, на ранних этапах созревания Т-клеток белок представлен на 10-30 % тимоцитов, однако его экспрессия крайне слабо выражена, что отражается значением МР1. Так, для контрольного образца 1§С2а, меченного РЕ, МБ1 составляет 13,2, а для тимоцитов, окрашенных МКА анти-СБ243РЕ, — 17,8. Однако наиболее достоверная информация о сравнительной характеристике анализируемых образцов была получена при использовании статистики Ко1гпо§огоу-8гшгпоу (К-8) [35]. Анализ показал, что различия являются статистически достоверными при сравнении гистограмм измерений экспрессии СБ243 с контрольной изотопической сывороткой (р<0,001). Индекс сравнения двух гистограмм, обозначаемый Б, составил 0,45.

Экспрессия белков Вс12, р53, К1-67 на лимфоцитах периферической крови, тимоцитах

Исследования последних лет показали, что СБ95/С095Ь-система — не единственный эффектор-ный путь реализации программы апоптоза. Второй

путь — рецепторно-независимый (митохондриальный) — обычно происходит в ответ на различные клеточные стрессы (радиация, тепловой шок, противоопухолевые препараты), результатом которых могут быть повреждения ДНК, контролируемые проапопто-тическим белком р53. Различные про- и антиапоптоти-ческие белки семейства Вс12 регулируют высвобождение цитохрома С из митохондрий в цитозоль. Высвобождаемый цитохром С связывается с Apafl и прокаспазой-9 и формируют комплекс — апоптосо-му (Apafl и прокаспаза-9). Активированная каспаза-9 расщепляет и активирует нижележащие каспазы — 3, 6 и 7. Рецепторно-опосредованный и митохондриальный пути могут объединяться на уровне активации ка-спазы-3, -6 и -7.

Следовательно, важнейшим механизмом регуляции апоптотической гибели клеток является участие внутриклеточных белков, контролирующих апоптоз.

Изучение особенностей экспрессии белка Вс12 в лимфоидных клетках периферической крови здоровых доноров (и=18) показало, что он представлен на мембранах митохондрий лимфоцитов практически в 100 % случаев, однако интенсивность экспрессии крайне слабая и носит гомогенный характер. Уровни экспрессии антиапоптотического белка р53 и маркера ядерной пролиферации Ki-67 практически не отличались от контрольных образцов.

Исследование экспрессии Вс12 в тимоцитах проводилось с применением трехцветного окрашивания. В качестве примера на DotPlot-цитограмме показан способ выделения субпопуляций тимоцитов в зависимости от экспрессии поверхностных антигенов (рис. 4). В дальнейшем для изучения содержания внутриклеточного митохондриального Вс12 белка использован гистограммный анализ. Так, Вс12 экспрессировался в СВ4~СВ8--дубль-негативных тимоцитах, а также в популяциях тимоцитов CD4+ (1-й и 2-й квадранты) и CD8+ (2-й и 3-й квадранты). Абсолютное большинство С04+С08+-дубль-позитивных тимоцитов также экспрессировали Вс12, однако его экспрессия (MFI) была значительно ниже, чем в других субпопуляциях. Средний канал интенсивности флюоресценции (MFI) клеток, окрашенных FITC-конъюгированными анти-Вс12 МКА, составил от 68 до 74 для субпопуляций CD4-CD8-, CD4+CD8-, CD4CD8+- и 46 для CD4+CD8+-thmo4htob. Надо заметить, что среди тимоцитов с фенотипом CD4+CD8+ часть клеток оказалась отрицательной по связыванию с анти-Вс12 МКА.

Экспрессия белков Bcl2, Ki-67 на лимфоцитах периферических лимфатических узлов

Проведено исследование распределения Вс12 в Т- и В-лимфоцитах, полученных из лимфатических узлов (и=5). Выделение популяций клеток для последующего анализа проводилось в DotPlot-цитограмме по экспрессии поверхностного антигена CD 19 (для В-лимфоцитов) или CD3 (для Т-лимфоцитов) и маркера ядерной пролиферации Ki-67, характеризующего активность клеточного деления (цикла). Белок Вс12 был экспрессирован в Т- и В-клетках, однако Вс12-негатив-

CD4+/CD8-

CD4+/CD8+

Ал

94,7%

10° 10‘ 10* 10* 10*

BcJ-2 FITC

* выделение гейта

74,6У.

CD4-/CD8- ;

91,2%

ш

4 _ 3

10' 101 10* 10* Bd-2 FITC

CD4-/CD8+

94,8%

АЖ

10° 10* 10а ю* 10*

Be»-2FTTC

Рис. 4. Анализ субпопуляций тимоцитов, выделенных по связыванию с МКА анти-С04РЕ, анти-СБ8РегСР

ные клетки выявлялись только среди Кь67+-В-клеток. Количество Кь67-позитивных лимфоцитов варьировало от 1,7-8,9 (среди В-клеток) до 0,5-2,0 % (в Т-клет-ках). При этом уровень экспрессии Вс12 в Кй67+-В-клетках составлял от 12 до 28,3 % и имел бимодальный характер гистограммы распределения окрашенных клеток, который встречается крайне редко при исследованиях экспрессии Вс12. Митохондрии большинства К1-67 СЭ19+-В-клеток экспрессировали белок Вс12, а уровень его экспрессии составил 78-93 %. В отличие от В-лимфоцитов в Т-клетках распределение белка Вс12 не зависело от клеточного цикла (рис. 5, а, б).

кмг *

AL ‘.Ж.

КМ7*

10° 10’ 10-* 10* 10* to 10* Ю* 10*

Bd-2 ПТ С Bd-2FJTC

— контроль ^ОШТС,

гистограмма распределения клеток, экспрессирующих белок Вс1-2

б - экспрессия Вс 1-2 в СЮЗ* Т-лимфоцитах лимфатических узлов

10е 10 10л 10* 10‘ 0О-2 FTTC

к\-ьТ

10 10' 10* 10* 10* Bd-2 ПТС

— контроль ДОШТС.

Ш гистограмма распределения клеток, экспрессирующих белок Вс1 2,

по оси абсцисс - количество клеток,

по оси ординат - интенсивность флюоресценции

Рис. 5. Экспрессия Вс12 в клетках лимфатических узлов:

а — экспрессия Вс12 в СБ19+-В-клетках лимфатических узлов; б — экспрессия Вс12 в СОЗ+-Т-лимфоцитах лимфатических узлов: по оси абсцисс — количество клеток, по оси ординат — интенсивность флюоресценции

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, в данной работе представлены результаты субпопуляционной характеристики экспрессии белков, регулирующих апоптоз, на различных этапах дифференцировки лимфоидных клеток на примере тимуса, лимфатических узлов и периферической крови в норме. Использовался многопараметровый (5-параметровый) проточно-цитофлюориметрический анализ поверхностных антигенов и внутриклеточных белков. Показано, что мембранный антиген CD95 (FAS/APO-1), опосредующий апоптоз, в периферической крови взрослых людей выявляется на 35-75 % лимфоидных клеток, из них на 40-60 % СОЗ+-Т-клет-ках и на всех С019+-В-клетках. Уровень экспрессии антигена CD95 зависит от возраста. У новорожденных детей он отсутствует, однако к 4-5 годам показатели соответствуют уровню здоровых взрослых людей. Надо добавить, что литературные данные о прогрессивном увеличении экспрессии антигена CD95 с возрастом в наших исследованиях не подтвердились [7, 21]. Слабая экспрессия этого антигена на тимической стадии развития Т-клеток указывает на его низко регуляторную роль на данном этапе созревания, хотя известно, что в основном формирование антигенного репертуара Т-лимфоцитов завершается именно в тимусе, а не прошедшие селекцию клетки погибают путем апоптоза [28,30,31]. М. A. Sheard et al. связывают чувствительность тимоцитов CD4+CD8- и CD4 CD8+ к апоптозу со степенью экспрессии на поверхности клеток CD3. Так, тимоциты со слабой экспрессией CD3med более чувствительны к апоптозу, индуцированному in vitro антителами к CD95 или дексаметазо-ном, чем тимоциты CD4+CD8- и CD4CD8+ с высокой экспрессией CD3. По мнению этих авторов, тимоциты с фенотипом CD3medCD4+ или CD3medCD8+ содержат более восприимчивые к апоптозу клетки и именно они являются объектом для негативной селекции. По-видимому, именно слабо экспрессирующие CD95-тимоциты по степени экспрессии на них CD3 фенотипически соответствует клеткам, чувствительным к С095-индуцированному апоптозу [29].

Вопрос о роли транспортного белка CD243 на поздних (периферических) этапах формирования лимфоидной ткани является малоизученным. В литературе встречается информация лишь об экспрессии гена MDR1, кодирующего Р-гликопротеин в В-клетках, и о наличии белка на некоторых типах Т-клеток [9]. Однако проведенный субпопуляционный анализ показал, что в периферической крови здоровых доноров CD3VCD45+/CD14—Т-клетки являются негативными, в то время как все CD19+/CD45+/CD14—В-лимфоциты экспрессируют на своей поверхности функционально неактивный белок CD243. В отличие от периферической крови 10-30 % клеток тимуса несут на своей поверхности Р-тикопротеин, однако обладают крайне слабой экспрессией. В то же время в литературе имеется лишь одна публикация по исследованию значения этого белка на данном этапе дифференцировки Т-лимфоцитов, но на мышиной модели. Было показано, что

CD243 не выявлялся на незрелых тимоцитах CD4~CD8~ и CD4+CD8+, также отсутствовал на зрелой субпопуляции CD4+CD8-, при этом слабо экспрессировался на большей части зрелых CD4 CD8+-mieTOK. Появление Р-гликопротеина на поздних этапах развития лимфоидных клеток в тимусе свидетельствует о его линейно-специфической роли в дифференциров-ке Т-клеток [19].

Исследования экспрессии белка Вс12 проведены нами в лимфоидных клетках периферической крови, тимуса и лимфатических узлов. Во всех образцах крови доноров выявлялась крайне слабая экспрессия Вс12. В некоторых исследованиях такая ситуация объясняется тем, что на терминальной стадии созревания лимфоцитов преобладает рецепторно-лигандный механизм регуляции апоптоза с участием мембранного антигена CD95. Среди других белков семейства Вс12 на лимфоцитах периферической крови при слабой экспрессии Вс12 обнаружена более высокая экспрессия Bcl-х в С08+-Т-клетках по сравнению с СБ4+-Т-клетками, а также зафиксированы отсутствие белка Bim и слабая экспрессия белка Вак. Эти данные свидетельствуют о том, что не только Вс12, но и другие белки этого семейства участвуют в диф-ференцировке лимфоцитов [6, 8, 34]. Мы определили, что белок Вс12 экспрессирован на ранних стадиях развития Т-клеткок в тимусе, в меньшей степени — на СВ4+СБ8+-дублЬ'П03итивных клетках и реэкспресси-рован в зрелых тимоцитах с фенотипами CD4+CD8-и CD4~CD8+. Наличие Вс12-негативных клеток среди С04+С08+-дубль-позитивных тимоцитов может говорить о низко регуляторной роли Вс12 на данном этапе созревания Т-клеток. Об этом также свидетельствуют результаты исследования специфической фрагментации ДНК и коэкспрессии Вс12. Так, было установлено, что in vivo экспрессия Вс12 не отменяет апоптоти-ческой гибели тимоцитов CD4+CD8+ и CD4CD8-[17]. Отмечается также прогрессивное увеличение апоптотического индекса в тимоцитах в процессе возрастной инволюции тимуса. У новорожденных, детей, подростков и взрослых он составил 1,4, 2,9, 2,7 и 3,8 % соответственно [14].

Покоящиеся Т- и В-клетки лимфатических узлов также экспрессируют белок Вс12. Вс12-негативные клетки были обнаружены только среди Ki-67+-cy6no-пуляции В-лимфоцитов. Напротив, Ki-67+- и Ki-67~-T-клетки экспрессировали Вс12. Поскольку антигенный спектр Т-клеток не изменяется при активации в периферических лимфоидных органах, отсутствие регуляторной функции Вс12 в активированных Т-клетках соответствует гипотезе о том, что этот белок является низко регуляторным только при позитивной клеточной селекции [26, 27, 36].

Полученные нами данные субпопуляционного анализа маркеров апоптоза, регулирующих дифферен-цировку лимфоидных клеток, указывают, что как мембранные (CD95, CD243), так и внутриклеточные (Вс12, Ki-67) белки играют важную роль в формировании репертуара Т- и В-клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Барышников А. Ю. Программированная клеточная смерть (апоптоз). В кн.: Клиническая онкогематология / Под ред. М. А. Волковой. — М.: Медицина,

2001. —С. 36-42.

2. Погорелое В. М., Козинец Г. И. Морфология апоптоза при нормальном и патологическом гемопоэзе // Гематология и трансфузиология — 1995. — Т. 40, №5. —С. 17-25.

3. Ярилин А. А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов // Иммунология. — 2004. — № 5. — С. 312-320.

4. Askenasy N., Yolcu Е. S., Yaniv I. et al. Induction of tolerance using Fas ligand: a double-edged immunomodu-lator // Blood. — 2005. — Vol. 105, No. 4. — P. 1396-1404.

5. Adkins B„ Charyulu V, Sun Q. L. et al. Early block in maturation is associated with thymic involution in mammary tumor-bearing mice // J. Immunol. — 2000. — Vol. 164, No. 11. — P. 5635-5640.

6. Benveniste P., Cohen A. p53 expression is required for thymocyte apoptosis induced by adenosine deaminase deficiency // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1995. — Vol. 92, No. 18. —P. 8373-8377.

7. Cossarizza A., Ortolani C., Monti D., Franceschi C. Cytometric analysis of immunosenscence // Cytometry. — 1997. — Vol. 27, No. 4. — P. 297-313.

8. Delfino D. V, Agostini М., Spinicelli S. et al. Decrease of Bcl-xL and augmentation of thymocyte apoptosis in GILZ overexpressing transgenic mice // Blood. — 2004. — Vol. 104, No. 13. — P. 4134-4141.

9. Drach D., Zhao S., Mahadevia R. et al. Subpopulations of normal peripheral blood and bone marrow cells express a functional multidrug resistant phenotype // Blood. — 1992. — Vol. 80, No. 11. — P. 2729-2734.

10. Drach J., Zhao S., Drach D. et al. Expression of MDR1 by normal bone marrow cells and its implication for leukemic hematopoiesis // Leuk Lymphoma. — 1995.

— Vol. 16. — P. 419^124.

11. Grossi С. E., Cicconi E., Tacchetti C. et al. Anatomy of the immune system: fact and problems // Ital. J. Anat. Embriol. — 2000. — Vol. 105, No. 4. — P. 97-124.

12. Hildeman D. A. Regulation of T-cell apoptosis by reactive oxygen species // Free Radic. Biol. Med. — 2004.

— Vol. 36, No. 12. — P. 1496-1504.

13. Kaiser H. E., Bodey B. The role of apoptosis in normal ontogenesis and solid human neoplasms // In vivo.

— 2000. — Vol. 14, No. 6. — P. 789-803.

14. Kanavaros P., Stefanaki K, Rontogianni D. et al. Immunohistochemical expression of p53, p21/wafl, rb, pl6, cyclinDl, p27, Ki-67, cyclin A, cyclinBl, bcl-2, bax and bak proteins and apoptotic index in normal thymus // Histol Histopathol. — 2001. — Vol. 16, No. 4. — P. 1005-1012.

15. Krammer P. H. CD 95’s deadly mission in the immune system // Nature. — 2000. — Vol. 407, No. 6805.

— P. 789-795.

16. Laouar Y, Vasseur F., Moreau G. et al. Selective involvement of the Fas (CD95). Fas ligand pathway in bone marrow B cell progenitors // Eur. J. Immunol. — 2000. — Vol. — 30, No. 5. — P. 1402-1409.

17. Le P. I, Maecker H. I, Cook J. E. In situ detection and characterization of apoptotic thymocytes in human thymus. Expression of bcl-2 in vivo does not prevent apoptosis // J. Immunol. —1995.—Vol. 154, No. 9. — P. 4371^1378.

18. Li J. H„ Rosen D„ Ronen D. et al. The regulation of CD95 ligand expression and function in CTL // J. Immunol. — 1998. — Vol. 161. — P. 3943-3947.

19. MacDonald H. R., Bommhardt U., Cerottini J. C. Developmentally regulated expression of P-glycoprotein (multidrug resistance) activity in mouse thymocytes // Eur. J. Immunol. — 1995. — Vol. 25, No. 5. — P. 1457-1460.

20. MedemaJ. P., BorstJ. T-cell signalling: a decision of life and death // Hum Immunol. — 1999. — Vol. 60, No. 5. — P. 403—411.

21. Miyawaki T., Uehara I, NibuR. et al. Differential expression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulations in human peripheral blood // J. Immunol.

— 1992. — Vol. — 149, No. 11. — P. 3753-3758.

22. Neyfakh A. A. Use of fluorescent dyes as molecular probes for the study of multidrug resistance // Exp. Cell. Res. — 1988. — Vol. 174. — P. 168-176.

23. Ohm J. T., Gabrilovich D. I., Sempowski G. D. et al. VEGF inhibits T-cell development and may contribute to tumor-induced immune suppression // Blood. — 2003.

— Vol. 101, No. 12. — P. 4878-4886.

24. Opferman J. T., Letai A., Beard C. et al. Development and maintenance of B and T lymphocytes requires antiapoptotic MCL-1 // Nature. — 2003. — Vol. 426, No. 6967. — P. 671-676.

24. Plas D. R., Rathmell J. C., Thompson C. B. Homeostatic control of lymphocyte survival: potential origins and implications // Nature Immunology. — 2002. — Vol. 3, No. 6, —P. 515-521.

25. Poapolathep A., Nagata T., Suzuki H. et al. Development of early apoptosis and changes in lympho-

cyte subsets in lymphoid organs of mice orally inoculated with nivalenol // Exp. Mol. Pathol. — 2003. — Vol. 75, No. 1. —P. 74-79.

26. RochardP., Galiegue S., Tinel N. et al. Expression of the peripheral benzodiazepine receptor triggers thymocyte differentiation //Gene Expr. — 2004. — Vol. 12, No. 1. —P. 13-27.

27. Santori F. R., Vukmanovic S. Delineations of signals required for thymocyte positive selection // J. Immunol. —2004. —Vol. 173, No. 9. —P. 5517-5523.

28. Sheard M. A., Liu C„ Takahama Y. Developmental status of CD4 CD8+and CD4+CD8~ thymocytes with medium expression of CD3 // Eur. J. Immunol. — 2004.

— Vol. 34, No. 1. — P. 25-35.

29. Sprent J. Proving negative selection in the thymus // J. Immunol. — 2005. — Vol. 174, No. 7. — P. 3841-3842.

30. Strasser A., Harris A. W., Huang D. C. et al. Bcl-2 and Fas/APO-1 regulate distinct pathways to lymphocyte apoptosis // EMBO J. — 1995. — Vol. 14, No. 24. — P. 6136-6147.

31. Sun E. W, Shi Y. F. Apoptosis: the quiet death silences the immune system // Pharmacol Ther. — 2001.

— Vol. 92, No. (2-3). — P. 135-145.

32. Thompson C. B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science. — 1995. — Vol. 267. — P. 1456-1462.

33. Yokoyama N„ Tanahashi M, Kobayashi Y. et al. The expression of Bcl2 family proteins (Bcl-2, Bcl-x, Bax, Bak and Bim) in human lymphocytes // Immunol. Lett. —

2002. —Vol. 81, No. 2. —P. 107-113.

34. Young Ian T. Use of Kolmogorov-Smimov Test for Analysis of Histograms from Flow Systems and Other Sources // J. Histochem. Cytochem. — 1977. — Vol. 25, No. 7. —P. 935-941.

35. Young K. J., Kay L. S., Phillips M. J., Zhang L. Antitumor Activity Mediated by Double-Negative T-cells // Cancer Res. — 2003. — Vol. 63, No. 22. — P. 8014-8021.