Способ получения лимфоцитов крупнорогатого скота
METHOD FOR PRODUCTION OF BOVINE LYMPHOCYTES

Изобретение относится к биотехнологии, ветеринарной медицине, в частности к генной инженерии, и касается выделения жизнеспособных клеток (лимфоцитов) из периферической крови крупного рогатого скота.
Известен способ получения лимфоцитов из тонкого кишечника мыши (патент RU 2514653 , МПК С12N 5/0781 , C12N 5/0783, опубл. 27.04.2014, бюл. №12), включающий извлечение биологического материала – участка кишечника самок мышей линии СВА в возрасте 5-12 недель, от желудка до слепой кишки, промывание его фосфатно-буферным раствором, удаление пейеровых бляшек, измельчение биологического материала в присутствии фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,1-0,2 мас.% дитиотреитола при перемешивании при комнатной температуре, последующую промывку биологического материала фосфатно-солевым буферным раствором через нейлоновую сетку, собственное выделение лимфоцитов из стенки тонкого кишечника путем последовательного инкубирования материала в растворе фосфатно-солевого буфера, содержащего 0,2-0,3 мас.% бычьего  сывороточного альбумина при перемешивании магнитной мешалкой при +30-40°С в течение 10-15 минут, удаление надосадочной жидкости с помощью нейлоновой сетки, промывание осадка фосфатно-солевым буфером, последующее инкубирование осадка биологического материала фосфатно-буферным раствором, инкубирование биологического материала в клеточной среде RPMI-1640, содержащей 1-5 мас.% телячьей сыворотки, 0,2-0,3 М HEPES и 20-40 U/мл коллагеназы при перемешивании магнитной мешалкой при 30-40°С в течение 10-13 минут, фильтрование полученной суспензии, отмывку суспензии от коллагеназы и осаждение лимфоцитов дважды в клеточной среде RPMI-1640, содержащей 1-5 мас.% эмбриональной телячьей сыворотки и 0,2-0,3 М HEPES, с использованием центрифугирования при 1200-1500 об/мин и при 0+4°С, и далее осуществляют определение выхода живых клеток с помощью камеры Горяева.
Недостатком данного способа является использование большого количества химических реагентов и дорогостоящих компонентов для выделения, таких как бычий сывороточный альбумин, эмбриональная телячья сыворотка, коллагеназа, среда RPMI-1640, камера Горяева, нейлоновая сетка. Способ предполагает эвтаназию животных с извлечением отдела кишечника, очисткой от инородных масс, удаление пейеровых бляшек, продольное и поперечное измельчение кишечника, размягчение кишечных тканей с помощью различных реагентов, ферментативную обработку кишечных тканей (используется различные типы коллагеназы - фермента, разрушающего межтканные связи).
Известнасреда для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов (патент RU 2 393 218 ,  МПК С12N 5/0781, опубл. 27.06.2010, бюл. № 18), содержащая культуральную среду RPMI-1640 (RoswellParkMemorialInstitute), отличающаяся тем, что дополнительно содержит 10%-ный раствор фитогемоагглютинина и сыворотку собственной крови, полученную из любой центральной или периферической вены пациента, для которого выращивают культуру аутологичных лимфоцитов.
Недостатками ее является то, что нет выхода чистой взвеси лимфоцитов для исследования, большая длительность для выращивания культуры аутологичных лимфоцитов (минимум 72 часа), что не позволяет применять способ в ветеринарной медицине, а также использование достаточно дорогостоящих химических реактивов для выращивания культуры, таких какфитогемоагглютинин.
Наиболее близким к заявленному техническому решению является способ выделения мононуклеаров из крови человека (патент РФ 2061958, МПК G01N33/53, МПКG01N33/483, опубл. 10.06.1996), включающий отбор крови, добавление антикоагулянта, нанесение пробы на градиент и центрифугирование в градиенте плотности в растворах, содержащих высокомолекулярное вещество, отличающийся тем, что цельную кровь наслаивают на градиент в соотношении кровь градиент 2:1, центрифугируют при 400 g в течение 30 мин, при этом градиент представляет собой смесь верографина с поливинилпирролидоном, взятых в соотношении 1:4 (по объему).
Недостатком данного способа является применение дорогостоящего препарата поливинилпирролидона, однако есть возможность выделения мононуклеаров без данного препарата.
Технической задачей является создание способа выделения жизнеспособных клеток агрунолоцитов (лимфоцитов) крупного рогатого скота.
Технический результат заключается в выделении жизнеспособных лимфоцитов крупного рогатого скота, обладающих большим выходом мононуклеаров.
Техническая задача решается, а технический результат достигается в способе выделения мононуклеаров из крови крупного рогатого скота, включающем отбор крови, добавление антикоагулянта, нанесение пробы на градиент и центрифугирование в градиенте плотности в растворах, содержащих высокомолекулярное вещество.
Отличием от прототипа является  то, что цельную кровь наслаивают на градиент (PBS - Верографин) в соотношении «кровь-градиент» 1:1, центрифугируют при 3000 оборотах в течение 30 мин, при этом градиент представляет собой смесь верографина с фосфатно-солевым буфером, взятых в отношении 10 (20) мл 76% раствора верографина, 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и 0.45 (0.9) мл фосфатно-солевого буфера.
Способ получения лимфоцитов крупного рогатого скота осуществляется следующим образом.
3
3
Готовят градиент PBS (фосфатно-солевой буфер) - Верографин с плотностью 1,078 г/см.С этой целью 10 (20) мл 76% раствора верографина смешивают с 43.1 (86.2) мл дистиллированной воды и добавляют 0.45 (0.9) мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), доводят до плотности до 1,078 г/см. В2-3 мл раствора PBS-Верографин наслаивают 2-3 мл периферической крови, в соотношении 1:1. Затем проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 30 мин для разделения фракций форменных элементов в градиенте плотности.
При этом плавучая плотность мононуклеаров и лимфоцитов меньше, чем таковая величина используемого градиента, поэтому данные клетки располагаются над градиентом. Гранулоциты и эритроциты, имеющие большую плавучую плотность, в процессе седиментации проходят через градиентный раствор и опускаются на дно пробирки.
В результате центрифугирования кровь разделяется на 4 отдельные фракции: первая фракция на дне пробирки содержит эритроциты и обломки клеток крови. Вторая фракция – это раствор PBS-Верографин. Третья фракция, расположенная над градиентом, представляет собой суспензию лимфоидных клеток. Четвертая фракция образована плазмой с тромбоцитами. Слой лимфоцитов осторожно собирается по всей площади сечения пробирки, переносится в чистую, сухую центрифужную пробирку.
3
Необходимые реагенты, материалы и оборудование: Раствор PBS- Верографин с удельной плотностью ρ = 1, 078г/см; стерильные пластиковые или стеклянные пробирки емкостью 5–10 мл; центрифуга; центрифужные пробирки.
Данный способ может с успехом использоваться в ветеринарной медицине.
Таким образом, предлагаемый способ получения лимфоцитов соответствует критериям изобретения "Новизна", "Изобретательский уровень", "Промышленная применимость".