СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЦИТОПРОТЕКТИВНОГО ЭФФЕКТА ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ ПРИ ТЕРАПИИ ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ И ДИАГНОСТИРОВАННЫМ АНТИФОСФОЛИПИДНЫМ СИНДРОМОМ
METHOD FOR PREDICTING CYTOPROTECTIVE EFFECT OF IMMUNOGLOBULINS FOR INTRAVENOUS ADMINISTRATION IN THERAPY OF FEMALES WITH RECURRENT PREGNANCY LOSS AND DIAGNOSED ANTI-PHOSPHOLIPID SYNDROME

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для прогнозирования цитопротективного эффекта внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ) при терапии женщин с привычным невынашиванием беременности и диагностированным антифосфолипидным синдромом.
В клинической практике ВВИГ стали использовать с 40-х годов XX века, когда Кон с сотрудниками описал метод выделения иммуноглобулинов путем спиртового фракционирования человеческой плазмы. С этого времени начали появляться первые препараты иммуноглобулинов, сначала для внутримышечного введения, а затем с 60-х годов XX века и для внутривенного введения, применяемые при врожденных нарушениях гуморального звена иммунитета. С 80-х годов XX века их стали применять с иммуномодулирующей целью при некоторых аутоиммунных заболеваниях, в том числе и в акушерско-гинекологической практике, в частности, в терапии антифосфолипидного синдрома, привычного невынашивания беременности, бесплодия [Кондратенко И.В., Заплатников А.Л., Бологое А.А. Внутривенные иммуноглобулины: что и когда? // Детская больница. - 2010. - №4, с. 5-10].
С тех пор проведено достаточно много клинических исследований, оценивающих эффект иммуноглобулинов как иммуномодуляторов, но получить однозначные данные о позитивном влиянии препаратов ВВИГ так и не удалось [Stephenson MD, Kutteh WH. Intravenous immunoglobulin and idiopathic secondary recurrent miscarriage: a multicentered randomized placebo-controlled trial/ / Human Reproduction. - 2010. - Vol. 25, No. 9. - P. 2203-220].
Антифосфолипидный синдром на сегодняшний день не включен в список показаний к применению препарата иммуноглобулинов для внутривенного введения, его использование при данной нозологии находится за пределами инструкций («off-label»), так как проведенные исследования не дают однозначных клинических данных о позитивном влиянии препарата при данном виде патологии [Branch DW, Peaceman AM. А multicenter, placebo-controlled pilot study of intravenous immune globulin treatment of antiphospholipid syndrome during pregnancy. The Pregnancy Loss Study Group. // Am J Obstet Gynecol. - 2000. - Jan; 182(1 Pt 1). - 122-7].
Техническим результатом изобретения является создание способа, позволяющего прогнозировать эффективность цитопротективного эффекта внутривенных иммуноглобулинов при терапий женщин с привычным невынашиванием беременности и диагностированным антифосфолипидным синдромом и принять правильное решение об их использовании.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования цитопротективного эффекта иммуноглобулинов для внутривенного введения при терапии женщин с привычным невынашиванием беременности и диагностированным антифосфолипидным синдромом согласно изобретению используют культуру эндотелиальных клеток, часть которых предварительно обрабатывают иммуноглобулином для внутривенного введения, а часть оставляют не обработанными, затем культивируют с сывороткой крови женщины, определяют процент нежизнеспособных эндотелиальных клеток, обработанных иммуноглобулином для внутривенного введения, и процент нежизнеспособных эндотелиальных клеток, не обработанных иммуноглобулином для внутривенного введения, рассчитывают цитопротективный эффект в процентах по следующей формуле:
ЦЭ=100-100Х/Х1,
где
X - процент нежизнеспособных эндотелиальных клеток, обработанных иммуноглобулином, после культивирования с сывороткой крови;
X1 - процент нежизнеспособных эндотелиальных клеток, не обработанных иммуноглобулином, после культивирования с сывороткой крови.
и при ЦЭ>55% прогнозируют цитопротективный эффект как положительный.
В исследование, на котором основано изобретение, было включено 30 беременных женщин. Их разбили на группы. Группа 1 включала 10 женщин с диагнозом привычное невынашивание беременности с повышенным титром антифосфолипидных антител. Группа 2 включала 14 женщин с диагнозом привычное невынашивание беременности без антифосфолипидных антител и третья контрольная группа включала 6 женщин с физиологически протекающей беременностью.
В результате проведенного исследования установлено, что сыворотки крови женщин с физиологически протекающей беременностью оказывают меньшее токсическое действие на эндотелиальные клетки по сравнению с сыворотками крови беременных женщин с диагнозом привычное невынашивание с повышенным титром антифосфолипидных антител и с сыворотками крови беременных женщин с диагнозом привычное невынашивание без антифосфолипидных антител (Фиг. 1).
При анализе данных, полученных в контрольной группе женщин с физиологически протекающей беременностью, показано, что у всех пациенток (n=6) наблюдалось снижение цитотоксического эффекта сыворотки крови после обработки клеток препаратом внутривенных иммуноглобулинов (Табл. 1). В данной группе мы рассчитали цитопротективный эффект, который показывает, на сколько уменьшилась цитотоксичность сыворотки крови в отношении эндотелиальных клеток после обработки эндотелиальных клеток препаратом ВВИГ по сравнению с интактными клетками, рассчитанный по формуле:
ЦЭ=100-100Х/Х1.
Используя процентильное определение нормы, мы получили референсное значение для цитопротективного эффекта внутривенных иммуноглобулинов в отношении эндотелиальных клеток, равное 55%. При этом цитопротективный эффект оценивается как положительный, если он будет более 55%.
При анализе данных, полученных в группе женщин с привычным невынашиванием беременности без антифосфолипидных антител, установлено, что у всех пациенток (n=14) цитотоксический эффект сыворотки периферической крови снижался после обработки клеток препаратом ВВИГ более чем на 55% (табл. 2).
При анализе данных, полученных в группе женщин с повышенным титром антифосфолипидных антител, установлено снижение цитотоксического эффекта сыворотки периферической крови после обработки клеток препаратом ВВИГ более чем на 55%. Следует отметить, что у трех пациенток снижение цитотоксического эффекта сыворотки крови после обработки клеток препаратом ВВИГ было менее чем на 55% (табл. 3).
Способ иллюстрируется фиг. 1-6.
На фиг. 1 представлен график относительного количества погибших эндотелиальных клеток после их культивирования в присутствии сывороток периферической крови для трех групп женщин: группа 1 - женщины с диагнозом привычное невынашивание беременности с повышенным титром антифосфолипидных антител; группа 2 - женщины с диагнозом привычное невынашивание беременности без антифосфолипидных антител; группа 3 - женщины с физиологически протекающей беременностью.
Примечание: ∗ Группа 3 достоверно отличается от групп 1 и 2 (p<0,05).
На фиг. 2 представлено распределение клеток по параметрам интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции по каналу РЕ в контрольной лунке.
На фиг. 3 представлено распределение клеток по параметрам интенсивности прямого светорассеяния и флуоресценции по каналу РЕ без обработки клеток препаратом иммуноглобулинов для внутривенного введения (пример 1).
На фиг. 4 представлено распределение клеток по параметрам интенсивности прямого светорассеяния и флуоресценции по каналу РЕ после обработки клеток препаратом иммуноглобулинов для внутривенного введения (пример 1).
На фиг. 5 представлено распределение клеток по параметрам интенсивности прямого светорассеяния и флуоресценции по каналу РЕ без обработки клеток препаратом иммуноглобулинов для внутривенного введения (пример 2).
На фиг. 6 представлено распределение клеток по параметрам интенсивности прямого светорассеяния и флуоресценции по каналу РЕ после обработки клеток препаратом иммуноглобулинов для внутривенного введения (пример 2).
Способ осуществляют следующим образом.
Для оценки эффективности цитопротективного эффекта внутривенных иммуноглобулинов используют эндотелиальные клетки линии ЕА.Ну926.
I. Порядок исследования
1. Подготовка рабочих растворов
1.1 Питательная среда DMEM/F12 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мг/мл стрептомицина, 100000 ЕД/мл пенициллина, 2 мМ L-глютамина и раствора гипоксантина-аминоптерин-тимидина (HAT).
1.2. Раствор Версена стерильный.
2. Подготовка необходимых материалов
2.1. Планшет 24-луночный, стерильный, с крышкой, прозрачный, для культивирования прилипающих клеточных культур.
2
2.2. Флакон для культивирования прилипающих культур с вентилируемой синей крышкой 25 см.
2
2.3. Флакон для культивирования прилипающих культур с вентилируемой синей крышкой 75 см.
2.4. Камера Горяева.
2.5. Бакпечатка однократного применения, стерильная.
2.6. Стерильные наконечники на 5 мл 1000 мкл.
2.7. Коническая стерильная пробирка объемом 15 мл.
2.8. Раствор Propidium iodide 1 мкг/мл, приготовленный на PBS.
3. Подготовка необходимого оборудования
3.1. Вертикальный ламинарно-потоковый шкаф.
3.2. Набор механических дозаторов переменного объема.
3.3 Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 1000 мкл.
3.4. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл.
3.5. Наконечники для дозаторов переменного объема до 5 мл.
3.6. Центрифуга.
3.7. Термошейкер.
3.8. Термостат.
3.9. Вортекс.
3.10. Холодильник 6±2°C.
2
3.11. СО инкубатор.
3.12. Проточный цитофлюориметр оборудованный 488 нм лазером.
II. Культивирование эндотелиальных клеток линии ЕА.Ну926
Порядок работы
1. До начала процедуры прогреть стерильные контейнеры со средой для культивирования эндотелиальных клеток и стерильным раствором Версена при температуре 37°C.
2. Все необходимые материалы, перечисленные в пункте 2 раздела I, внести стерильно в вертикальный ламинарно-потоковый шкаф для работы с клеточными культурами.
2
2
3. Аккуратно слить старую среду из флакона для культивирования с эндотелиальными клетками, добавить 2,5 мл стерильного раствора Версена (для флакона 25 см) и 5 мл стерильного раствора Версена (для флакона 75 см), чтобы дезинтегрировать монослой клеток. Подождать 30 секунд, аккуратно потрясти флакон и слить Версен. Повторить операцию 2 раза, затем добавить две капли раствора Версена. Закрыть крышку флакона. Покачивать флакон в течение 5 минут так, чтобы клетки все время омывались раствором. Похлопать флакон по бокам, чтобы снять клетки со стенок флакона.
2
2
5. Добавить 3 мл ранее приготовленной среды для эндотелиальных клеток во флакон 25 см и 5 мл среды во флакон 75 см.
2
2
6. Тщательно ресуспендировать. Перенести 1,5 мл среды с клетками в новый флакон 25 см и долить в него еще 3,5 мл среды для культивирования. И 2,5 мл среды с клетками перенести во флакон 75 см и долить в него 10 мл среды для культивирования.
2
7. Культивировать клеточную культуру во влажной атмосфере с 5% СO при 37°C в течение 72 часов.
8. Оставшуюся клеточную суспензию поместить в стерильную пробирку для дальнейшего проведения эксперимента.
III. Проведение эксперимента
1. Засеять 12 лунок 24-луночного планшета эндотелиальными клетками из расчета 180 тысяч клеток в одной лунке. Для этого в бакпечатку однократного применения, стерильную, перенести необходимое количество клеточной суспензии: необходимо 2,2 млн клеток (расчет кол-ва клеток в суспензии проводится с помощью камеры Горяева). Довести общий объем раствора до 6 мл средой для культивирования эндотелиальных клеток. Тщательно ресуспендируя, засеять планшет клетками в объеме 500 мкл на лунку.
2. 6 лунок планшета с клетками покрыть препаратом внутривенных иммуноглобулинов (концентрация препарата 0,625 мг/мл) в объеме 500 мкл на лунку. В оставшиеся 6 лунок добавить среду для культивирования эндотелиальных клеток в объеме 500 мкл на лунку.
2
3. Культивировать клеточную культуру во влажной атмосфере с 5% СО при 37°C в течение 6 часов.
4. Отмыть клетки 1 мл питательной средой DMEM/F12.
5. Наслоить сыворотки пациентов в объеме 1 мл на лунку на эндотелиальные клетки по следующей схеме:
6. В контрольные лунки добавить среду для культивирования эндотелиальных клеток в объеме 1 мл на лунку.
2
7. Культивировать клеточную культуру во влажной атмосфере с 5% СО при 37°C в течение 22-24 часов.
8. Следующие этапы работы, возможно, проводить в нестерильных условиях.
9. Подготовить 12 пробирок на 5 мл для проточного цитометра.
10. Перенести культуральную среду из лунок планшета в соответственно промаркированные пробирки для проточного цитометра.
11. В лунки планшета добавить по 500 мкл раствора Версена.
12. Инкубировать на термошейкере при 37°C и 600 оборотах в течение 10 минут.
13. Аккуратно ресуспендируя, перенести клеточную суспензию в соответственно промаркированные пробирки для проточного цитометра.
14. Центрифугировать 10 минут 200g.
15. Удалить надосадочную жидкость.
16. Добавить по 180 мкл фосфатно-солевого буфера с Propidium iodide из расчета 3,6 мкл раствора Propidium iodide на 180 тыс. клеток. Конечная концентрация Propidium iodide 3,6 нг/мл.
17. Перемешать на вортексе.
18. Инкубировать при +4°C в течение 10 минут.
IV. Проведение анализа и учет результатов
Анализ клеток проводят на проточном цитофлюориметре, оборудованном 488 нм лазером, по трем параметрам: интенсивности прямого и бокового светорассеяния, флуоресценции по каналу РЕ (спектр поглощения 488 нм, спектр эмиссии 578 нм). Анализруется 10 000 событий. Определяют количество событий в квадранте Q2, данное количество соответствует количеству погибших эндотелиальных клеток; количество событий в квадранте Q4 соответствует жизнеспособным эндотелиоцитам (фиг. 2). Гибель клеток в контрольной лунке не должна превышать 8%.
По количеству событий в квадрантах Q2 и Q4 определяют процент нежизнеспособных эндотелиальных клеток, обработанных иммуноглобулином для внутривенного введения, и процент нежизнеспособных эндотелиальных клеток, не обработанных иммуноглобулином для внутривенного введения. Затем рассчитывают цитопротективный эффект в процентах по формуле: ЦЭ=100-100Х/XI.
Цитопротективный эффект прогнозируют как положительный при значениях ЦЭ более 55% и в этом случае можно рекомендовать применение препарата ВВИГ при лечении данной пациентки. При ЦЭ менее 55% цитопротективный эффект оценивают как отрицательный и применение ВВИГ не целесообразно.
Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациентка А. Диагноз: Беременность 6/7 недель, угроза прерывания беременности, привычное невынашивание беременности, антифосфолипидный синдром. При анализе протективного влияния препарата получены следующие данные. Процент нежизнеспособных клеток без обработки препаратом составил 60,0% (квадрант Q2, фиг. 3). Процент нежизнеспособных клеток после обработки препаратом составил 20,2% (квадрант Q2, фиг. 4). Значение ЦЭ по формуле составляет более 55%:
ЦЭ=100-100Х/XI=100-100×20,2/60=67%.
ЦЭ прогнозируют как положительный. Следовательно, противопоказаний для применения препарата иммуноглобулинов нет.
Данная пациентка получала препарат из группы ВВИГ в курсовой дозе 300 мл (15 г). Вводили внутривенно капельно 1 раз в неделю, 3 недели подряд. После проведенной терапии клинические проявления угрозы невынашивания беременности исчезли. Беременность закончилась срочными родами.
Пример 2. Пациентка Б. Диагноз: Беременность 11 недель, угроза прерывания беременности, привычное невынашивание беременности, антифосфолипидный синдром. При анализе протективного влияния препарата получены следующие данные. Процент нежизнеспособных клеток без обработки препаратом составил 73,5% (квадрант Q2, фиг. 5). Процент нежизнеспособных клеток после обработки препаратом составил 60,0% (квадрант Q2, фиг. 6). Значение ЦЭ по формуле составляет менее 55%: ЦЭ=100-100Х/XI=100-100×60/73,5=20%.
ЦЭ прогнозируют как отрицательный. Использование ВВИГ нецелесообразно.
Данная пациентка получала препарат из группы внутривенных иммуноглобулинов в курсовой дозе 300 мл (15 г.). Вводили внутривенно капельно 1 раз в неделю, 3 недели подряд. Беременность закончилась преждевременными родами на сроке 36 недель.
Предлагаемый способ позволяет прогнозировать цитопротективный эффект ВВИГ при терапии женщин с привычным невынашиванием беременности и диагностированным антифосфолипидным синдромом и принять решение об их использовании. Способ может быть использован и для других заболеваний, связанных с повреждением эндотелия и формированием эндотелиальной дисфункции.