СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕДИАТОРА 3-ФЕНИЛИМИНО-3Н-ФЕНОТИАЗИНА ИЛИ 3-ФЕНИЛИМИНО-3Н-ФЕНОКСАЗИНА
METHOD OF PRODUCING 3-PHENYLIMINO-3H-PHENOTHIAZINE OR 3-PHENYLIMINO-3H-PHENOXAZINE MEDIATOR

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение, в широком смысле, относится к способу получения медиатора. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения медиатора, используемого в электрохимическом тест-сенсоре, выполненном с возможностью определения относящейся к аналиту информации.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Количественное определение аналитов в жидкости организма очень важно для диагностики и поддержания определенных физических состояний. Например, у некоторых людей необходимо постоянно контролировать уровень лактата, холестерина и билирубина. В частности, страдающим диабетом людям необходимо часто проверять уровень глюкозы в жидкости организма с целью регулирования потребления глюкозы в своей диете. Результаты таких тестов могут использоваться для определения, если это требуется, инсулина или других обязательных для приема препаратов. В одном из типов систем тестирования глюкозы в крови используются тест-сенсоры для тестирования образца крови.
Тест-сенсор содержит биочувствительный или реакционный материал, который реагирует, например, с глюкозой крови. Один тип электрохимического тест-сенсора представляет собой многослойный тест-сенсор, который содержит основу или субстрат и крышку. Другой тип электрохимического тест-сенсора содержит основу, промежуточный элемент и крышку. Существующие электрохимические тест-сенсоры содержат по меньшей мере два электрода в виде электродного элемента. Через эти электроды прикладывается потенциал, и на рабочем электроде измеряется ток. Измеренный ток прямо пропорционален размеру рабочего электрода.
Электрохимические тест-сенсоры основаны на катализируемых ферментами химических реакциях, в которых принимает участие интересующий аналит. В случае контроля глюкозы релевантной химической реакцией является окисление глюкозы в глюконолактон или соответствующую кислоту. Это окисление катализируется множеством ферментов, некоторые из которых могут использовать коферменты, такие как никотинамид аденин динуклеотид(фосфат) (НАД(Ф)), в то время как другие могут использовать коферменты, такие как флавин аденин динуклеотид (FAD) или пирролохинолинхинон (PQQ).
В случае использования тест-сенсора окислительно-восстановительные эквиваленты, образованные в процессе окисления глюкозы, перемещаются к поверхности электрода, генерируя таким образом электрический сигнал. Затем происходит корреляция величины электрического сигнала с концентрацией глюкозы. Перемещение окислительно-восстановительных эквивалентов из участка химической реакции на ферменте к поверхности электрода происходит благодаря участию медиаторов переноса электронов.
Многие медиаторы, такие как, например, феррицианид, имеют высокий фоновый ток настолько, что отношение сигнала к шуму при определении тест-сенсором уровня глюкозы является низким. Как правило, низкое отношение сигнала к шуму увеличивает погрешность, в частности, при низких уровнях глюкозы и высоком уровне гематокрита в образце. При более быстром тестировании образца (например, когда время теста составляет менее 10 секунд), могут возникать трудности, связанные с подавлением фонового тока в пределах временного промежутка, предназначенного для выполнения теста. В связи с уменьшением времени тестирования образца существует потребность в том, чтобы при нанесении образца активные компоненты взаимодействовали быстро для получения быстрого ответа.
Следовательно, было бы желательно получить медиатор, который имеет низкий фоновый ток и при этом обладает нужными характеристиками медиатора, включая стабильность.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ образования 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора включает предоставление первого реагента, содержащего фенотиазин. Предоставляется первый растворитель, в котором фенотиазин имеет нужную растворимость. Предоставляется второй реагент, принимающий участие в образовании 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора. Предоставляется второй растворитель, в котором второй реагент имеет нужную растворимость. Первый реагент, первый растворитель, второй реагент и второй растворитель объединяют для получения раствора реагентов. К раствору реагентов добавляют персульфат натрия для соединения первого и второго реагентов, что дает в результате реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор. После добавления персульфата натрия реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор, дополнительно обрабатывают для выделения 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора.
Способ образования 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора включает предоставление первого реагента, содержащего феноксазин. Предоставляется первый растворитель, в котором феноксазин имеет нужную растворимость. Предоставляется второй реагент, принимающий участие в образовании 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора. Предоставляется второй растворитель, в котором второй реагент имеет нужную растворимость. Первый реагент, первый растворитель, второй реагент и второй растворитель объединяют для получения раствора реагентов. Для соединения первого и второго реагентов к раствору реагентов добавляют персульфат натрия, что дает в результате реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор. После добавления персульфата натрия реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор, дополнительно обрабатывают для выделения 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора.
Способ образования и стабилизации 3-фенилимино-3H-фенотиазинового или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора включает предоставление первого реагента, содержащего фенотиазин или феноксазин. Предоставляют первый растворитель, в котором фенотиазин или феноксазин имеет нужную растворимость. Предоставляют второй реагент, принимающий участие в образовании 3-фенилимино-3H-фенотиазинового или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора. Предоставляют второй растворитель, в котором второй реагент имеет нужную растворимость. Первый реагент, первый растворитель, второй реагент и второй растворитель объединяют для получения раствора реагентов. Для соединения первого и второго реагентов к раствору реагентов добавляют связующий агент, что дает в результате реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор. После добавления связующего агента реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор, дополнительно обрабатывают для выделения 3-фенилимино-3H-фенотиазинового или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора. 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор стабилизируют путем доведения pH до примерно 5-8.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1a показан тест-сенсор согласно одному из вариантов осуществления.
На фиг.1b показан вид сбоку тест-сенсора по фиг.1a.
Фиг.2 представляет собой график зависимости фонового тока от многочисленных медиаторов по изобретению и медиаторов сравнения.
Фиг.3a представляет собой график фонового тока с использованием нескольких способов нейтрализации или буферизации и нескольких способов без нейтрализации или буферизации.
Фиг.3b представляет собой график изменения фонового тока между базовой линией и измеренным фоновым током, показанным на фиг.3a.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном из способов настоящее изобретение относится к улучшенному способу получения 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора с низким фоновым током. В другом способе настоящее изобретение относится к улучшенному способу стабилизации 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора с низким фоновым током. 3-Фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор является медиатором, используемым в тест-сенсорах, и в одном из примеров используется в электрохимическом восстановлении (окислении) НАДФ.
Медиаторы, образуемые в настоящем изобретении, содержат фенотиазины, имеющие формулу:
и феноксазины, имеющие формулу:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
где R, R, R, R, R, R, R, R и R являются одинаковыми или разными и независимо выбираются из группы, состоящей из водорода, алкила, алкенила, алкинила, арила, гетероарила, циклической группы, гетероцикла, галогена, галогеналкила, карбокси, карбоксиалкила, алкоксикарбонила, арилоксикарбонила, ароматической кетогруппы, алифатической кетогруппы, алкокси, арилокси, нитро, диалкиламино, аминоалкила, сульфо, дигидроксибора и их комбинации. Предполагается, что из них также могут быть сформированы изомеры.
3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор получают для возможности его использования с электрохимическими тест-сенсорами. Электрохимические тест-сенсоры выполнены с возможностью приема жидкого образца и анализа с использованием инструмента или устройства измерения. Тест-сенсор участвует в определении информации, относящейся к аналиту, такой как концентрация аналита. Аналиты, которые могут быть измерены, включает глюкозу, холестерин, липидный профиль, микроальбумин, мочевину, креатинин, креатин, фруктозу, лактат или билирубин. Предполагается, что можно определять концентрации других аналитов. Аналиты могут находиться, например, в образце цельной крови, образце сыворотки крови, образце плазмы крови, других жидкостях организма, например ISF (интерстициальной жидкости) и моче, и жидкостях, не относящихся к организму.
Описанные в настоящей работе тест-сенсоры представляют собой электрохимические тест-сенсоры. Используемые с электрохимическими тест-сенсорами устройства измерения могут иметь оптические компоненты для детектирования калибровочной информации и электрохимические компоненты для определения информации, относящейся к аналиту (например, концентрации аналита в жидком образце). Один из неограничивающих примеров электрохимического тест-сенсора приведен на фиг.1a. На фиг.1a изображен тест-сенсор 10, содержащий основу 11, капиллярный канал и множество электродов 16 и 18. Участок 12 показывает область, определяет капиллярный канал (например, после размещения крышки на основе 11). Множество электродов включает противоэлектрод 16 и рабочий (измеряющий) электрод 18. Электрохимический тест-сенсор может также содержать по меньшей мере три электрода, такие как рабочий электрод, противоэлектрод, триггерный электрод или электрод гематокрита. Рабочий электрод, используемый в тест-сенсорах, согласно вариантам осуществления настоящего изобретения может быть заменен подходящими электродами, включая без ограничения, углерод, платину, палладий, золото, рутений, родий и их комбинации.
Электроды 16, 18 соединены с множеством проводников 15a, b, которые, в иллюстративном варианте осуществления, заканчиваются бóльшими областями, обозначенными в виде контактов 14a и b тест-сенсора. Капиллярный канал обычно расположен в принимающей жидкость области 19. Предполагается, что с медиаторами по настоящему изобретению могут использоваться другие электрохимические тест-сенсоры.
Принимающая жидкость область 19 содержит по меньшей мере один реагент для превращения интересующего аналита (например, глюкозы) в жидком образце (например, крови) в химическое соединение, которое измеряется компонентами электродного элемента электрохимическим способом, в терминах генерируемого им электрического тока. Реагент обычно содержит специфический по отношению к аналиту фермент, который реагирует с аналитом и с акцептором электрона, образуя электрохимически измеряемое соединение, которое может детектироваться электродами. Реагент содержит медиатор, который участвует в передаче электронов между аналитом и электродами. Реагент может содержать связующие агенты, которые удерживают фермент и медиатор вместе, другие инертные компоненты или их комбинации.
Жидкий образец (например, кровь) может наноситься на принимающую жидкость область 19. Жидкий образец реагирует по меньшей мере с одним реагентом. После реакции с реагентом и столкновения с множеством электродов жидкий образец генерирует электрические сигналы, которые помогают определить концентрацию аналита. Проводники 15a и b передают электрический сигнал на второй противоположный конец 42 тест-сенсора 10, откуда электрические сигналы по контактам тест-сенсора 14a и 14b передаются в устройство измерения.
На фиг.1b показан вид сбоку тест-сенсора 10 по фиг.1a. Как показано на фиг.1b, тест-сенсор 10 также содержит крышку 20 и промежуточный элемент 22. Основа 11, крышка 20 и промежуточный элемент 22 могут быть изготовлены из множества материалов, таких как полимерные материалы. Неограничивающие примеры полимерных материалов, которые могут использоваться при изготовлении основы 11, крышки 20 и промежуточного элемента 22 включают поликарбонат, полиэтилентерефталат (РЕТ), полиэтиленнафталат (PEN), полиимид и их комбинации. Предполагается, что при изготовлении основы 11, крышки 20 и/или промежуточного элемента 22 могут использоваться и другие материалы.
Для формирования тест-сенсора 10 по фиг.1a и 1b основу 11, промежуточный элемент 22 и крышку 20 соединяют, например, с помощью пластыря или адгезива или термосклеиванием. При соединении основы 11, крышки 20 и промежуточного элемента 22 формируется принимающая жидкость область 19. Принимающая жидкость область 19 обеспечивает проток для введения жидкого образца в тест-сенсор 10. Принимающая жидкость область 19 формируется на первом конце, или конце 40 тестирования, тест-сенсора 10. Тест-сенсоры согласно вариантам осуществления настоящего изобретения могут быть сформированы с помощью основы и крышки без промежуточного элемента, при этом принимающая жидкость область формируется непосредственно на основе и/или крышке.
Также предполагается, что электрохимический тест-сенсор может быть сформирован без промежуточного элемента. Например, электрохимический тест-сенсор может включать основу и крышку, формируя канал (например, капиллярный канал) при соединении крышки с основой.
Основа, промежуточный элемент и крышка могут быть изготовлены из множества материалов, таких как полимерные материалы. Неограничивающие примеры полимерных материалов, которые могут использоваться для изготовления основы, промежуточного элемента и крышки, включают поликарбонат, полиэтилентерефталат (РЕТ), пенопласт, полиимид и их комбинации. Предполагается, что основа, промежуточный элемент и крышка могут независимо изготавливаться и из других материалов. Электродный элемент может быть изготовлен из множества проводящих материалов, включая, без ограничения, золото, платину, родий, палладий, рутений, углерод или их комбинации.
В другом варианте осуществления 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор может использоваться в оптическом тест-сенсоре. В такой системе 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор может быть стабильным.
Один из способов образования 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора включает предоставление первого реагента, содержащего фенотиазин. Предоставляется первый растворитель, в котором фенотиазин имеет нужную растворимость. Предоставляется второй реагент, для образования 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора. Предоставляется второй растворитель, в котором второй реагент имеет нужную растворимость. Первый реагент и первый растворитель объединяют для образования раствора первого реагента. Второй реагент и второй растворитель объединяют для образования раствора второго реагента. Растворы первого и второго реагентов объединяют вместе для образования раствора реагентов. Готовят раствор персульфата натрия и добавляют его к раствору реагентов. Раствор персульфата натрия обычно готовят с использованием второго растворителя (того же самого растворителя, который используется при образовании раствора второго реагента). Персульфат натрия вызывает соединение первого и второго реагентов, давая в результате реакционный раствор с образованным продуктом.
В этом способе происходит дальнейшая обработка реакционного раствора с целью выделения 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора. В одном из вариантов осуществления 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор находится в виде соли. В другом варианте осуществления 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор находится в виде кислоты. Некоторые 3-фенилимино-3H-фенотиазиновые медиаторы могут не находиться в виде соли или кислоты.
Второй реагент выбирают для образования требуемого 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора. Например, второй реагент может представлять собой анилин-2,5-дисульфокислоту. Если используется анилин-2,5-дисульфокислота, образованный специфический 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор представляет собой медиатор (3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин.
Предполагается, что для образования различных 3-фенилимино-3H-фенотиазиновых медиаторов могут использоваться другие вторые реагенты. Например, второй реагент для образования 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора может быть выбран из следующих соединений: 4-диэтиламиноанилин; 4-хлоранилин; 4-этиланилин; 4-трифторметиланилин; метил-4-аминобензоат; 4-нитроанилин; 4-метоксианилин; 4-(4'-аминофенил)масляная кислота; 4-аминобензиламин; 4-(2'аминоэтил)анилин; 5-амино-1,3-бензолдикарбоксильная кислота; 4-аминобензойная кислота; 2,5-(4'-аминофенил)-1,3,4-оксадиазол; 4-[2'-(2'-этанолокси)этокси]этоксианилин и 2,5-дисульфоанилин. Предполагается, что для образования других 3-фенилимино-3H-фенотиазиновых медиаторов могут использоваться другие вторые реагенты.
Выбирают первый растворитель, который является совместимым с первым реагентом. Как правило, желательно, чтобы первый реагент обладал высокой растворимостью в первом растворителе. В одном из способов первый растворитель представляет собой тетрагидрофуран (THF). Предпочтительно, чтобы первый растворитель был тетрагидрофураном (THF), поскольку фенотиазин обычно обладает в нем высокой растворимостью. Также предпочтительно, чтобы первый растворитель смешивался со вторым растворителем, образуя полностью или по существу однородный раствор.
Предполагается, что вместо тетрагидрофурана (THF) могут использоваться и другие первые растворители, такие как, например, N,N-диметилформамид, метанол, этанол, 1,4-диоксан и сульфолан. Также предполагается, что могут использоваться и другие первые растворители.
Второй растворитель выбирают таким образом, чтобы он был совместим со вторым реагентом. Как правило, предпочтительно, чтобы второй реагент обладал высокой растворимостью во втором растворителе. В одном из способов второй растворитель представляет собой воду. В другом способе второй растворитель представляет собой комбинацию воды и гидроксида натрия (NaOH). Гидроксид натрия является предпочтительным, поскольку растворимость по меньшей мере некоторых вторых реагентов улучшается в щелочной среде. Предполагается, что ко второму растворителю могут быть добавлены другие оснóвные растворители для достижения улучшенной растворимости второго реагента. Предполагается, что вместо воды могут использоваться другие вторые растворители.
Персульфат натрия способствует образованию соединения между первыми и вторыми реагентами. Персульфат натрия является предпочтительным связующим агентом, поскольку предполагается, что он препятствует образованию нежелательных побочных продуктов. Использование персульфата натрия в качестве связующего агента способствует получению приемлемо низкого фонового тока, что означает, как правило, что в растворе образуется и остается относительно малое количество нежелательных побочных продуктов. К тому же, использование персульфата натрия способствует более легкому выделению требуемого 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора из реакционного раствора, облегчая преципитацию органического материала.
Для образования 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора выполняют дальнейшую обработку после добавления связующего агента к раствору реагентов, содержащему первый реагент, первый растворитель, второй реагент и второй растворитель. Первый растворитель (например, тетрагидрофуран) может быть удален или выделен из раствора. Первый растворитель может быть удален, например, этилацетатом. Этилацетат способствует выделению первого растворителя и также может способствовать удалению из реакционного раствора другого нежелательного остаточного органического вещества (например, растворимых в воде органических веществ).
Предполагается, что для удаления первого растворителя могут использоваться другие соединения такие как, например, диэтиловый эфир, хлороформ и дихлорметан.
Второй растворитель (например, воду) удаляют из продукта охлаждением и фильтрацией. Удаление второго растворителя также предотвращает или подавляет разложение. Предотвращение или подавление разложения обычно дает более желательный низкий уровень фонового тока. Остаточный второй растворитель (например, остаточная вода), не удаленный, например, путем охлаждения и фильтрации, может быть удален из продукта несколькими способами. Например, остаточный второй растворитель может быть удален (a) сушкой в вакуумном шкафу, (b) добавлением к продукту соединения или (c) лиофилизацией раствора продукта.
В одном из способов для удаления из раствора остаточного второго растворителя к нему добавляют ацетонитрил. Предполагается, что для удаления остаточного второго растворителя можно использовать другие соединения, такие как, например, ацетон и толуол.
Предполагается, что при образовании 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора можно выполнять другую обработку. Например, стадия обработки перед удалением второго растворителя может включать реконструкцию медиатора в воде, охлаждение и затем фильтрование при комнатной температуре для удаления некоторых из избыточных солей. Также предполагается, что можно выполнять другие стадии обработки.
Другой способ образования 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора включает предоставление первого реагента, содержащего феноксазин. Предоставляется первый растворитель, в котором феноксазин имеет нужную растворимость. Предоставляется второй реагент, участвующий в образовании 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора. Предоставляется второй растворитель, в котором второй реагент имеет нужную растворимость. Первый реагент и первый растворитель объединяют для образования раствора первого реагента. Второй реагент и второй растворитель объединяют для образования раствора второго реагента. Растворы первого и второго реагентов объединяют для образования раствора реагентов. Готовят раствор персульфата натрия и добавляют его в раствор реагентов. Раствор персульфата натрия обычно готовят с использованием второго растворителя (того же самого растворителя, который используется для образования раствора второго реагента). Персульфат натрия инициирует соединение первого и второго реагентов, что дает в результате реакционный раствор, содержащий образованный продукт.
В этом способе проводят дальнейшую обработку реакционного раствора для выделения 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора. В одном из вариантов осуществления 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор находится в виде соли. В другом варианте осуществления 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор находится в виде кислоты. Некоторые 3-фенилимино-3H-феноксазиновые медиаторы могут не находиться в виде соли или кислоты.
В этом способе для образования 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора могут использоваться те же самые или аналогичные вторые реагенты, первые растворители, вторые растворители, как описано выше для способа образования 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора. К тому же обработка для выделения 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора путем по существу удаления по меньшей мере первого и второго растворителей может быть выполнена аналогичным или таким же способом, как описано выше для 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора.
Предполагается, что путем использования способов по изобретению могут быть образованы многие различные 3-фенилимино-3H-фенотиазиновые медиаторы или 3-фенилимино-3H-феноксазиновые медиаторы. Одним из подходящих примеров фенотиазина, который был получен и, как обнаружилось, имел подходящие свойства в качестве НАДФ медиатора, является медиатор 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин. Другим подходящим примером является медиатор 3-(3',5'-дикарбоксифенилимино)-3H-фенотиазин, который был получен и, как обнаружилось, имел подходящие свойства в качестве НАДФ медиатора.
В качестве примера фенотиазинов и феноксазинов, которые были получены и, как обнаружилось, имели подходящие свойства в качестве НАДФ медиаторов, можно привести следующие: 3-(4'-хлорфенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-диэтиламинофенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-этилфенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-трифторметилфенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-метоксикарбонилфенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-нитрофенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-метоксифенилимино)-3H-фенотиазин; 7-ацетил-3-(4'-метоксикарбонилфенилимино)-3H-фенотиазин; 7-трифторметил-3-(4'-метоксикарбонилфенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-ω-карбокси-н-бутилфенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-аминометилфенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-(2"-(5"-(пара-аминофенил)-1,3,4-оксадиазоил)фенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-β-аминоэтилфенилимино)-3H-фенотиазин; 6-(4'-этилфенил)амино-3-(4'-этилфенилимино)-3H-фенотиазин; 6-(4'-[2-(2-этанолокси)этокси]этоксифенил)амино-3-(4'-[2-(2-этанолокси)этокси]этоксифенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-[2-(2-этанолокси)этокси]этоксифенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-фенилимино)-3H-фенотиазинборная кислота, 3-(3',5'-дикарбоксифенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(4'-карбоксифенилимино)-3H-фенотиазин; 3-(3',5-дикарбоксифенилимино)-3H-феноксазин; 3-(2',5'-фенилимино)-3H-фенотиазиндисульфокислота и 3-(3'-фенилимино)-3H-фенотиазинсульфокислота.
Предполагается, что фенотиазины и феноксазины, которые были получены и, как обнаружилось, имели подходящие свойства, можно использовать с флавопротеинами, такими как FAD-глюкозооксидаза, флавин-гексоза-оксидаза и FAD-глюкозодегидрогеназа. Также предполагается, что фенотиазины и феноксазины могут быть получены для использования с хинопротеинами, такими как, например, PQQ-глюкозодегидрогеназа, и иметь для этого подходящие свойства.
В другом способе стабилизация 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора также может быть улучшена путем нейтрализации или буферизации. Стадия нейтрализации или буферизации способствует стабилизации медиатора с тем, чтобы он был устойчивым в вынужденных условиях хранения. Предполагается, что стадию нейтрализации или буферизации можно выполнять до или после проведения дальнейшей обработки для выделения медиатора. Например, стадию нейтрализации или буферизации можно выполнять до сушки медиатора до порошкообразного состояния. В другом примере стадию нейтрализации или буферизации можно выполнять после сушки медиатора до порошкообразного состояния.
Нейтрализующий или буферизующий агент может быть выбран из материалов, включающих, без ограничения, гидроксид натрия, бикарбонат натрия, фосфат натрия, гидроксид тетрабутиламмония, гидроксид кальция, гидроксид калия, фосфат калия, бикарбонат калия и их комбинацию. Предполагается, что в качестве нейтрализующего или буферизующего агента можно использовать другие материалы.
После добавления к раствору медиатора нейтрализующего или буферизующего агента pH, как правило, находится в пределах от примерно 5 до примерно 8. Более предпочтительно, когда после добавления к раствору медиатора нейтрализующего или буферизующего агента pH находится в пределах от примерно 5,5 до примерно 7, и наиболее предпочтительно от примерно 6 до примерно 7.
Примеры
Пример 1
Получение медиатора (3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин
Фенотиазин (1,53 моль, 1,1 эквивалент, 306 г) растворяли в 6,0 л тетрагидрофурана (THF), одновременно перемешивая, и затем охлаждали до 0°C. Анилин-2,5-дисульфокислоту (1,38 моль, 350 г) растворяли в 7,0 л воды и 1М гидроксиде натрия (NaOH) (128 мл), одновременно перемешивая. Раствор анилин-2,5-дисульфокислоты медленно добавляли, в течение примерно более 2 часов, к раствору фенотиазина, получая белую мутную суспензию. Суспензию фенотиазин/анилин получали при температуре примерно 0-4°C. Персульфат натрия (5,52 моль, 4 эквивалента, 1314 г) растворяли в 4,0 л воды, получая раствор персульфата натрия.
2
Раствор персульфата натрия добавляли по каплям в течение более 3 часов к суспензии фенотиазин/анилин при температуре примерно 0-3°C и получали очень темный раствор. Очень темный раствор выдерживали на холоде, используя ледяную баню, и перемешивали в течение ночи. Затем содержимое переносили в ротационный испаритель Buchi и удаляли тетрагидрофуран в течение примерно более 2 часов при температуре ниже 35°C. После стадии испарения оставшийся раствор переносили в 25-л сепаратор и обезжиривали этилацетатом. Оставшийся раствор обезжиривали 3 раза, каждый раз используя 2 л этилацетата. Реакционные жидкости охлаждали до -3°C в бане с раствором ацетон/СО, одновременно перемешивая. Выпавшее в осадок твердое вещество фильтровали через два слоя ткани в двух 24-см воронках Бюхнера в тот же день. Выпавшее в осадок твердое вещество оставляли на ночь в воронках, чтобы дать ему высохнуть, а затем переносили в колбу, содержащую 2 л ацетонитрила, и перемешивали в течение примерно 1 часа при комнатной температуре. Для удаления остаточной воды образец фильтровали и промывали большим количеством ацетонитрила. Медиатор сушили до получения постоянного веса в вакуумном шкафу при 35°C.
Образованный таким способом медиатор представлял собой 3-(2',5'-фенилимино)-3H-фенатиазиндисульфокислоту или 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин. Ниже приведена формула медиатора:
Пример 2
Фоновый ток способа по изобретению и сравнительного способа
Сравнивали фоновый ток медиатора 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин, полученного двумя различными способами. В способе образования медиатора 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин по изобретению в качестве связующего агента использовали персульфат натрия и по существу использовали способ, описанный выше в примере 1. Этот медиатор будет называться медиатором по изобретению. В сравнительном способе образования медиатора 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин в качестве связующего агента использовали персульфат аммония. Сравнительный способ был по существу таким же, как и способ по изобретению, за исключением использования персульфата натрия в качестве связующего агента. Этот медиатор назван медиатором сравнения.
Каждый из медиаторов, медиатор по изобретению и медиатор сравнения, выделяли и добавляли к буферизованному раствору. Каждый из буферизованных растворов содержал 100 мМ фосфат натрия. После добавления медиатора по изобретению и медиатора сравнения к буферизованным растворам pH в обоих растворах доводили до 7,2. Затем медиатор по изобретению и медиатор сравнения растворов по отдельности помещали в углеродные электроды. Через три секунды к углеродным электродам прикладывали потенциал в 250 мВ в течение пяти секунд и регистрировали соответствующие фоновые токи медиаторов.
На фиг.2 приведены графики фоновых токов (в нА) медиаторов 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин для различных партий медиаторов, образованных способом по изобретению и сравнительным способом. Более конкретно, из различных партий были проверены пять разных медиаторов сравнения (обозначенные медиаторами сравнения 1-5) и четыре разных медиатора по изобретению (обозначенные медиаторами по изобретению 1-4).
Как показано на фиг.2, были три партии медиаторов сравнения, у которых фоновый ток был очень высоким. См. медиаторы сравнения 1, 4 и 5 на фиг.2, имеющие фоновые токи, равные соответственно 2687, 1158 и 1971 нА. Медиатор сравнения 2 имел фоновый ток, равный 75 нА, в то время как медиатор сравнения 3 имел фоновый ток, равный 221 нА. Все медиаторы по изобретению 1-4 имели желательный фоновый ток, который не превышал 100 нА. Более конкретно, медиаторы по изобретению 1-4 имели фоновые токи, равные соответственно 88, 93, 106 и 99 нА.
Пример 3
Сравнение стабильности 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазина с помощью различных способов
Сравнивали стабильность 3-(2',5'-дисульфофинилимино)-3H-фенотиазина, полученного двумя различными способами. В способе образования медиатора 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин по изобретению в качестве связующего агента использовали персульфат натрия, и по существу способ был таким же, как описано выше в примере 1. Этот медиатор обозначен медиатором по изобретению. В сравнительном способе образования медиатора 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин в качестве связующего агента использовали персульфат аммония. Сравнительный способ по существу был таким же, как способ по изобретению, за исключением использования в качестве связующего агента персульфата натрия. Этот медиатор обозначен медиатором сравнения.
Сравнивали стабильность медиатора по изобретению и медиатора сравнения. Из медиаторов, полученных способом по изобретению и сравнительным способом, были составлены соответствующие смеси реагентов. Смеси реагентов также включали фосфатный буфер, Fad-GDH, полимер целлюлозу и сурфактант. Смеси реагентов помещали на золотые электроды для получения тест-сенсора глюкозы. Образцы тест-сенсоров с медиатором по изобретению и медиатором сравнения выдерживали при температуре -20°C в течение двух недель. Тест-сенсоры с медиаторами одной и той же партии, полученные способом изобретения и сравнительным способом, выдерживали также при температуре 50°C в течение двух недель.
Смеси реагентов содержали выдержанный медиатор по изобретению или медиатор сравнения. Измеряли ответ электродов при приложении потенциала в 250 мВ, используя образцы цельной крови с четырьмя различными концентрациями (0 мг/дл, 50 мг/дл, 100 мг/дл и 400 мг/дл) глюкозы с помощью анализатора глюкозы Yellow Springs (YSI, Inc., Yellow Springs, Огайо). Выполняли преобразование электрических ответов в концентрации глюкозы, используя наклон и свободный член для соответствующих реагентов согласно YSI измерениям глюкозы. Концентрации глюкозы тестировали и сравнивали для реагентов, содержащих медиатор по изобретению или медиатор сравнения, выдержанный при температурах между -20°C и 50°C, с тем, чтобы заметить какое-либо различие или отклонение между ними. Например, используя 50 мг/дл глюкозы, сравнивали реагенты, содержащие медиаторы по изобретению, выдержанные при температуре между -20°C и температуре 50°C с тем, чтобы заметить какое-либо различие между зарегистрированными значениями. Между этими зарегистрированными значениями определяли выраженную в % систематическую ошибку.
Выраженная в % систематическая ошибка показана для каждой концентрации глюкозы в медиаторах по изобретению и сравнения в приведенной ниже таблице 1:
Таблица 1
<u>Способ по изобретению</u>
<u>Сравнительный способ</u>
0 мг/дл
-0,7%
7,1%
50 мг/дл
-1,8%
5,9%
100 мг/дл
0,2%
4,9%
400 мг/дл
2,4%
-8,2%
Таким образом, как показано в таблице 1, 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин, образованный способом по изобретению, является значительно более стабильным, даже после воздействия температуры 50°C в течение двух недель, чем 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин, образованный сравнительным способом. При использовании способа по изобретению наблюдается высокая стабильность, поскольку отсутствуют большие изменения в концентрации глюкозы даже после воздействия температуры 50°C, о чем свидетельствует низкое значение выраженной в % систематической ошибки. С другой стороны, при использовании сравнительного способа стабильность намного ниже, поскольку в измеренных концентрациях глюкозы после воздействия температуры 50°C наблюдаются большие изменения по сравнению со способом по изобретению, о чем свидетельствуют более высокие значения выраженной в % систематической ошибки.
Пример 4
Влияние нейтрализации или буферизации 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазина на его стабильность
В каждом тесте нейтрализации или буферизации примера 4 использовали один и тот же медиатор 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин. Тот же самый медиатор использовали также в тестах, которые не включали тест нейтрализации или буферизации. Медиатор 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин был образован с использованием в качестве связующего агента персульфата натрия, при этом использовался по существу тот же самый способ, который описан выше в примере 1.
В примере 4 было протестировано три способа с использованием различных нейтрализующих или буферизующих агентов и проведено их сравнение с двумя способами, которые не включали нейтрализующий или буферизующий агент. Обращаясь к фиг.3a и 3b, способы образования медиаторов 1 и 2 не включали никакие стадии нейтрализации или буферизации. Способ образования медиатора 1 включал сушку медиатора в вакуумном шкафу. Способ образования медиатора 2 включал лиофилизацию, которая контролировалась при pH 2,4.
Каждый из способов образования медиаторов 3-5 включал стадию нейтрализации или буферизации. В результате каждой стадии нейтрализации или буферизации получали pH 6,1. Более конкретно, с медиатором 3 использовали 20 мМ фосфат натрия. Этот раствор получали растворением 5 г медиатора 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазина в 20 мМ натрий-фосфатном буфере с pH 7,2. Используя 1M NaOH, доводили pH до 6,1. Использование натрий-фосфатного буфера обычно упоминается для случаев регулирования значений pH.
С медиатором 4 использовали 1M гидроксид натрия. Этот раствор получали растворением 5 г медиатора 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазин в 100 мл холодной воды. 1М раствор гидроксида натрия добавляли по каплям при одновременном перемешивании до тех пор, пока измеряемое значение pH не достигло 6,1. Использование гидроксида натрия в этом способе нейтрализует раствор и, таким образом, может быть названо нейтрализующим агентом.
С медиатором 5 использовали 1M бикарбонат натрия. Этот раствор получали растворением 5 г 3-(2',5'-дисульфофенилимино)-3H-фенотиазина в 100 мл холодной воды. 1М раствор бикарбоната натрия добавляли по каплям при одновременном перемешивании до тех пор, пока измеряемое значение pH не достигло 6,1. Использование бикарбоната натрия в этом способе нейтрализует раствор и, таким образом, называется нейтрализующим агентом.
Затем каждый из медиаторов 3-5 замораживали в бане, содержащей изопропиловый спирт/сухой лед и лиофилизировали до сухого порошка, используя настольный лиофилизатор 4К Freeze Dryer VirTis модель 4KBTXL (Gardiner, Нью-Йорк).
Высушенный порошок медиаторов 1-5 подвергали в течение двух недель воздействию различных условий хранения. Более конкретно, были протестированы девять различных условий, в которых температура находилась в пределах от -40°C до 50°C. До оказания температурных воздействий высушенные образцы помещали в стеклянные сосуды, плотно закрывали крышками и оставляли на хранение. Два теста, в которых был добавлен компонент "использование", выполняли при -40°C и 30°C. Более конкретно, компонент "использование" включал воздействие на медиаторы 1-5 температуры окружающей среды в течение 30 минут до закрытия крышки и повторное воздействие температуры окружающей среды в течение 30 минут через неделю после открытия крышки. Такое воздействие "использование" проводилось только при температурах
-40°C и 30°C, соответственно. "Исходный" тест проводили в виде теста без хранения.
Каждый из образцов медиатора тестировали на фоновый ток, используя скрининговый анализ фонового тока. Образцы медиатора получали, как описано в примере 1, и доводили pH до 7,2, используя 100 мМ фосфат натрия, как описано в примере 2. Эти образцы медиаторов добавляли к углеродному электроду. Через три секунды прикладывали потенциал в 250 мВ в течение пяти секунд и измеряли фоновый ток.
Как показано на фиг.3a, фоновый ток (в нА) был намного ниже у медиаторов, которые включали стадию нейтрализации или буферизации, при воздействии на них повышенной температуры в этот период. Сравните фоновые токи медиаторов 1-5 при температурах, превышающих 25°С. Это особенно проявляется при воздействии самой высокой температуры в 50°C.
На фиг.3b изображено изменение фонового тока (%) между измеренным фоновым током, фиг.3a, относительно базовой линии, которая была измерена до оказания различных воздействий. Аналогично, фоновый ток (%) был намного ниже у медиаторов, которые включали стадию нейтрализации или буферизации, при оказании воздействия более высокими температурами в этот период. Сравните выраженное в % изменение в фоновых токах медиаторов 1-5 при температурах, превышающих 25°C. Это особенно проявляется при воздействии самой высокой температуры в 50°C.
Способ A
Способ образования 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора, включающий стадии, на которых
предоставляют первый реагент, содержащий фенотиазин;
предоставляют первый растворитель, в котором фенотиазин имеет нужную растворимость;
предоставляют второй реагент, участвующий в образовании 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора;
предоставляют второй растворитель, в котором второй реагент имеет нужную растворимость;
объединяют первый реагент, первый растворитель, второй реагент и второй растворитель для образования раствора реагентов;
добавляют персульфат натрия к раствору реагентов для соединения первого и второго реагентов, получая реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор; и
после добавления персульфата натрия дополнительно обрабатывают реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор для выделения 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора.
Способ В
Способ, альтернативный способу А, в котором первый растворитель включает тетрагидрофуран (THF).
Способ С
Способ, альтернативный способу А, в котором второй растворитель содержит воду.
Способ D
Способ, альтернативный способу С, в котором второй растворитель дополнительно содержит гидроксид натрия.
Способ E
Способ, альтернативный способу А, в котором объединение первого реагента, первого растворителя, второго реагента и второго растворителя включает стадии объединения первого реагента и первого растворителя для образования раствора первого реагента и объединение второго реагента и второго растворителя для образования раствора второго реагента до объединения первого реагента, первого растворителя, второго реагента и второго растворителя с целью образования раствора реагентов.
Способ F
Способ, альтернативный способу А, в котором дополнительная обработка включает, как правило, удаление второго растворителя путем добавления ацетонитрила.
Способ G
Способ, альтернативный способу А, в котором дополнительная обработка включает, как правило, удаление первого растворителя путем добавления этилацетата.
Способ H
Способ, альтернативный способу А, в котором второй реагент содержит анилин-2,5-дисульфокислоту.
Способ I
Способ, альтернативный способу А, в котором дополнительная обработка включает по существу удаление по меньшей мере первого растворителя и второго растворителя из второго раствора для выделения 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора.
Способ J
Способ, альтернативный способу А, в котором 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор находится в виде соли.
Способ К
Способ, альтернативный способу А, в котором 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор находится в виде кислоты.
Способ L
Способ образования 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора, включающий стадии, на которых
предоставляют первый реагент, содержащий феноксазин;
предоставляют первый растворитель, в котором феноксазин имеет нужную растворимость;
предоставляют второй реагент, участвующий в образовании 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора;
предоставляют второй растворитель, в котором второй реагент имеет нужную растворимость;
объединяют первый реагент, первый растворитель, второй реагент и второй растворитель для образования раствора реагентов;
добавляют персульфат натрия к раствору реагентов для соединения первого и второго реагентов, получая реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор; и
после добавления персульфата натрия дополнительно обрабатывают реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор для выделения 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора.
Способ М
Способ, альтернативный способу L, в котором первый растворитель содержит тетрагидрофуран (THF).
Способ N
Способ, альтернативный способу L, в котором второй растворитель содержит воду.
Способ О
Способ, альтернативный способу N, в котором второй растворитель дополнительно содержит гидроксид натрия.
Способ P
Способ, альтернативный способу L, в котором объединение первого реагента, первого растворителя, второго реагента и второго растворителя включает стадии объединения первого реагента и первого растворителя для образования раствора первого реагента и объединение второго реагента и второго растворителя для образования раствора второго реагента до объединения первого реагента, первого растворителя, второго реагента и второго растворителя с целью образования раствора реагентов.
Способ О
Способ, альтернативный способу L, в котором дополнительная обработка включает, как правило, удаление остаточного второго растворителя путем добавления ацетонитрила.
Способ R
Способ, альтернативный способу L, в котором дополнительная обработка включает, как правило, удаление первого растворителя путем добавления этилацетата.
Способ S
Способ, альтернативный способу L, в котором дополнительная обработка включает по существу удаление по меньшей мере первого растворителя и второго растворителя из второго раствора для выделения 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора.
Способ T
Способ, альтернативный способу L, в котором 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор находится в виде соли.
Способ U
Способ, альтернативный способу L, в котором 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор находится в виде кислоты.
Способ V
Способ образования и стабилизации 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора, включающий стадии, на которых:
предоставляют первый реагент, содержащий фенотиазин или феноксазин;
предоставляют первый растворитель, в котором фенотиазин или феноксазин имеет нужную растворимость;
предоставляют второй реагент, участвующий в образовании 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора;
предоставляют второй растворитель, в котором второй реагент имеет нужную растворимость;
объединяют первый реагент, первый растворитель, второй реагент и второй растворитель для образования раствора реагентов;
добавляют связующий агент к раствору реагентов для соединения первого и второго реагентов, получая реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор; и
после добавления связующего агента дополнительно обрабатывают реакционный раствор, содержащий 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор для выделения 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора; и
стабилизируют 3-фенилимино-3H-фенотиазиновый медиатор или 3-фенилимино-3H-феноксазиновый медиатор при pH от примерно 5 до примерно 8.
Способ W
Способ, альтернативный способу V, в котором pH находится от примерно 5,5 до примерно 7.
Способ X
Способ, альтернативный способу W, в котором pH находится от примерно 6 до примерно 7.
Способ Y
Способ, альтернативный способу W, в котором стабилизация 3-фенилимино-3H-фенотиазинового медиатора или 3-фенилимино-3H-феноксазинового медиатора включает добавление гидроксида натрия, бикарбоната натрия, фосфата натрия, гидроксида тетрабутиламмония, гидроксида кальция, гидроксида калия, фосфата калия, бикарбоната калия или их комбинации.
Хотя настоящее изобретение было описано относительно одного или нескольких конкретных вариантов осуществления, специалистам в данной области очевидно, что в нем может быть сделано множество изменений без отступления от сути и объема настоящего изобретения. Предполагается, что каждый из этих вариантов осуществления и их очевидные варианты, соответствуют сути и находятся в объеме изобретения.