Средство для коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием
REMEDY FOR DELAYED EFFECTS OF SPERMATOGENESIS DISORDERS CAUSED BY CYTOSTATIC EFFECT

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается средства коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием
Несомненный прогресс в клинической онкологии подтверждается увеличением выживаемости больных злокачественными заболеваниями всех типов нозологий. Сегодня одним из главных критериев успешного лечения онкологической патологии, является оценка качества жизни пациентов. К числу самых важных ее составляющих относится способность к деторождению [1]. Широко известным является тот факт, что созревающие и зрелые половые клетки, в том числе и мужские, являются непреднамеренной мишенью токсического действия цитостатических средств, их гибель и повреждение могут приводить к стерильности. Повреждение стволовых сперматогоний, которые являются источником пролиферативного пула сперматогенеза, может явиться причиной необратимого бесплодия в отдаленные сроки после цитостатической химиотерапии [2]. В связи с этим восстановление сперматогенеза отмечается только у 20-50% этой категории мужчин [3]. Опрос мужчин, обращающихся по поводу злокачественных новообразований в репродуктивном возрасте, показывает, что 75% из них хотели бы иметь детей в будущем. Одним из способов решения проблемы отцовства, у этой категории мужчин, является криоконсервация семенной жидкости до начала лечения. Однако ограниченная доступность этого способа для большинства пациентов, дороговизна, возможность возникновения повреждений после разморозки требует поиска других способов сохранения фертильности. К числу таких путей принадлежит способ фармакотерапии. Поиск средств защиты сперматогенеза при цитостатической химиотерапии является актуальным [4]. Поиск корректоров такого плана должен привести к созданию эффективных препаратов, оказывающих защитное действие на источники пролиферативного пула сперматогенеза - сперматогонии. Это относится, в первую очередь, к стволовым сперматогониям, повреждение которых грозит необратимым бесплодием [5]. Таким образом, цитостатические препараты, повреждающие сперматогонии, оставляют мало перспектив на восстановление сперматогенеза. Лекарственные средства - корректоры такого плана - должны стимулировать пролиферативную активность сперматогониев, в первую очередь стволовых.
Стимуляция стволовых сперматогониальных клеток может осуществляться в результате регулирования их окислительно-восстановительного потенциала посредством использования антиоксидантов [6]. Установлено, что к числу средств, инициирующих пролиферацию стволовых сперматогониальных клеток, относится плейотропный цитокин-гранулоцитарный колониестимулирующий фактор - Г-КСФ [2], который обладает антиоксидантными свойствами [7]. Однако высокая токсичность этого препарата ограничивает его использование и побуждает к поиску новых средств ее снижения. С этой целью была создана усовершенствованная молекула Г-КСФ, пегелированный Г-КСФ (ИМГ-КСФ) [8]. Установлено, что он более эффективно, чем Г-КСФ, восстанавливает сперматогенез после цитостатического повреждения сперматогониальных клеток [9]. Однако исследованиями последних лет установлено, что пегелированная форма этого цитокина обладает более выраженными побочными эффектами на кости и желудочно-кишечный тракт [10]. ИМГ-КСФ является средством, наиболее близким к заявляемому по своему конечному результату - стимулировать сперматогенез при повреждении спермотогоний после цитостатического воздействия. В связи с этим оно выбрано в качестве прототипа.
Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала лекарственных средств для коррекции последствий нарушения сперматогенеза, вызванного цитостатическим воздействием.
Поставленная задача решается, применением лекарственного средства (ЛС) 4-гидроксиметил-2,6-диизоборнилфенола для коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза. Установлено, что ЛС обладает антиоксидантными свойствами по отношению к эпителиальным клеткам предстательной железы [11].
Для решения задачи данного изобретения ЛС вводили крысам-самцам в дозе 10 мг/кг 1 раз в день ежедневно в течение 5 сут до и 5 сут после введения цитостатического препарата, повреждающего сперматогонии.
Следует отметить, что из представленных выше данных о факте более эффективного применения ЛС, по сравнению с ИМГ-КСФ, для коррекции отдаленных последствий нарушения сперматогенеза, вызванного цитостатическим воздействием с достижением нового результата: (создания нового высокоэффективного средства для коррекции отдаленных последствий цитостатического воздействия на сперматогенез) для специалиста является не очевидным.
Тот факт, что данное ЛС обладает антиоксидантными свойствами по отношению к клеткам эпителия простаты, еще не свидетельствует о том, что оно будет обладать теми же свойствами по отношению к стволовым сперматогониям. Это связано с тем, что антиоксиданты обладают избирательным действием по отношению к конкретным тканям и сам факт антиоксидантного воздействия не гарантирует получение ожидаемого эффекта [12]. Эффективность антиоксидантов при мужском бесплодии подтверждена не во всех работах. Степень реакции сперматогенной клетки на антиоксидантное воздействие может быть различной [13]. Иными словами, сам по себе факт использования эффективного антиоксидантного воздействия не гарантирует защитного эффекта на сперматогонии.
Новым в предлагаемом изобретении является использование для коррекции нарушений сперматогенеза, вызванного цитостатическим воздействием на сперматогониальные клетки, ЛС в дозе 10 мкг/ ежедневно 1 раз в день в течение 5 сут до и 5 сут после внутривенного введения цитостатика. В результате проведенных нами экспериментальных исследований впервые обнаружено неизвестное до сих пор свойство ЛС - стимулировать процессы репаративной регенерации сперматогониальных клеток. Свойство 4-гидроксиметил-2,6-диизоборнилфенола обладать избирательной способностью стимулировать пролиферативную активность стволовых клеток сперматогенной ткани не вытекает из уровня техники в данной области и не является для специалиста фактом очевидным, это свойство не описано в патентной и научно-медицинской литературе. Это свойство имеется у лекарственного средства благодаря его новой способности оказывать влияние на окислительно-восстановительный потенциал сперматогенных клеток. Это свойство может быть использовано в практическом здравоохранении для повышения фертильности пациентов, имеющих в анамнезе онкологическую патологию и перенесших цитостатическое лечение. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям патентоспособности изобретения, а именно «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Данное изобретение будет понято из следующего описания.
Лабораторному животному (крысе-самцу) после моделирования повреждения половых желез цитостатическим препаратом, оказывающим токсическое действие на стволовые сперматогонии, в течение 5 сут до и 5 сут после введения цитостатика ЛС вводили ежедневно 1 раз в день перорально в виде суспензии в крахмальном растворе (2%) в дозе 10 мг/кг. Для оценки эффективности использования ЛС в качестве средства стимуляции восстановления мужских половых желез от повреждающего действия паклитаксела была проведена оценка морфологических и функциональных показателей сперматогенеза в срок, соответствующий проявлению воздействия на сперматогонии. Этот срок составляет для крыс - 3 мес после введения паклитаксела. Морфологическое исследование мужских половых желез проводили с изучением количественных показателей, характеризующих степень выраженности структурных повреждений и процессов репаративной регенерации. Интегральная оценка функционального состояния сперматогенеза проводилась по продуктивности сперматогенеза. Кроме того, оценивалось влияние 4-гидроксиметил-2,6-диизоборнилфенола на уровень свободных радикалов, антиоксидантной защиты и окислительно-восстановительный потенциал мужских половых клеток.
Обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики с использованием непараметрического критерия U-критерия Вилкоксона-Манна-Уити.
Пример 1
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на крысах-самцах популяции Вистар в количестве 30 штук, массой 250-300 г. Животные были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга, г. Томск. Повреждение половых желез моделировалось однократным внутривенным введением противоопухолевого препарата, принадлежащего к группе таксанов - паклитаксела (митотакс, Dr. Reddy's Индия). Выбор препарата обусловлен, с одной стороны, тем, что паклитаксел относится к числу наиболее востребованных в онкологической практике цитостатических препаратов, с другой стороны, показано, что таксаны оказывает токсическое действие на стволовые сперматогонии [14].
Истощение пролиферативного пула сперматогенной ткани за счет повреждающего действия на клетки родоначальники (сперматогонии, в том числе и стволовые) может быть причиной развития необратимого бесплодия в отдаленные сроки после цитостатического воздействия. В связи с этим надежным морфологическим критерием для определения прогноза плодовитости является количество сперматогоний [15]. Для этого на гистологических парафиновых срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, определяли численность клеточной популяции сперматогоний. Кроме того, определялись такие показатели, характеризующие сперматогенез, как: количество канальцев с 12-й стадией мейоза, количество клеток Сертоли и степень зрелости сперматогенного пласта (на основании подсчета числа клеток Сертоли). Продуктивность сперматогенеза оценивали по общему количеству зрелых мужских половых клеток, приходящихся на эпидидимис [16].
У оставшейся части животных исследовали антиоксидантно-прооксидантную активность в семенниках. Для этого их препарировали, помещали в физиологический раствор, гомогенизировали. Антиоксидантную и прооксидантную активность определяли с помощью индуцированной люминолом хемилюминесценции и методом гашения интенсивности люминолзависимой хемилюминисценции (ХЛ) в радикалопродуцирующей системе после добавления биологической пробы соответственно [17] с помощью кюветного биолюминометра Lumat LB9507 (Berthold Technologies, США). Количественно уровень хемолюминисценции и антиоксидантной активности определяли с помощью светосуммы хемилюминесценции образца гомогената ткани, которую выражали в RLU/1г ткани/сек, где RLU (относительная единица света relative light units = 10 фотонам). Антиоксидантно-прооксидантный баланс определяли по отношению светосуммы АОА (SmAOA) к светосумме ХЛ (SmХЛ).
В результате проведенных исследований установлено (табл. 1), что через 3 мес после введения паклитаксела численность клеточной популяции сперматогоний оказалась сниженной и составила 60% от фоновых значений (9,43±0,40, у фоновых животных - 15,78±0,48). Эта клеточная популяция гетерогенна, состоит из быстро и медленно обновляющихся сперматогоний и резервных клеток, делящихся только при повреждении. Восстановление пролиферативного пула сперматогенного эпителия при повреждении происходит за счет резервных (стволовых) сперматогоний [5]. Сроком проявления их повреждений, с учетом длительности сперматогенеза, является 3 мес. В связи с этим, полученный факт свидетельствует о сокращении количества стволовых сперматогоний под действием паклитаксела.
Примечание:
# - статистическая значимость различий по сравнению с фоном (p≤0,05);
* - статистическая значимость различий по сравнению с контролем (паклитакселом) (р≤0,05).
Количество сперматогоний на фоне введения паклитаксела оказалось статистически значимо сниженным и составило 60% от контроля. Количество клеток Сертоли достоверно сократилось и составило 68% от фоновых значений. При определении степени зрелости сперматогенного пласта было установлено, что в семенниках крыс, получавших цитостатик, несмотря на невысокое содержание клеток Сертоли, идет обновление ткани семенника. Об этом свидетельствует достоверно более низкий, чем у фона, показатель степени зрелости сперматогенного пласта (5,70±0,04; p≤0,05). Судя по общему количеству зрелых половых клеток (ОКС), приходящихся на эпидидимис, на фоне введения паклитаксела (табл. 1) продуктивность сперматогенеза оказалось сниженной и составила всего 60% от фонового значения. Учитывая то, что общее количество половых клеток является одним из лабораторных показателей фертильности эякулята [5], то отмеченное выше значительное уменьшение их числа может приводить к снижению плодовитости животных. Таким образом, в отдаленные сроки после введения паклитаксела, наблюдается, судя по числу сперматогоний - дефицит пролиферативного пула, судя по ОКС - недостаточность продуктивности сперматогенеза. В то же время имеет место реакция ткани на повреждение - идут процессы репаративной регенерации на уровне ткани в целом (степень зрелости сперматогенного пласта снижена). Однако ее интенсивность невысока, судя по количеству сперматогоний и ОКС.
При морфологическом изучении семенников крыс, получавших на фоне введения паклитаксела препарат сравнения ИМГ-КСФ (табл. 1), было выявлено, что количество сперматогоний статистически значимо превышало (на 60%) таковое при введении одного цитостатика и достигало фоновых значений. Количество клеток Сертоли возрастало в 1,96 раза по сравнению с контролем и не отличалось от фона. Степень зрелости сперматогенного пласта оказалась сниженной по сравнению с контролем и фоном. Это свидетельствует о том, что под действием препарата сравнения идут процессы репаративной регенерации ткани и интенсивность их выше, чем в контроле. Полученные результаты подтверждают данные о том, что ИМГ-КСФ обладает способностью стимулировать сперматогенез животных после цитостатического воздействия. В пользу этого свидетельствует также тот факт, что ОКС на фоне введения ИМГ-КСФ возрастало в 2,2 раза по сравнению с контролем и составляло 130% от фоновых значений.
При совместном введении паклитаксела и лекарственного средства (4-гидроксиметил-2,6-диизоборнилфенол), численность клеточной популяции сперматогоний достоверно возрастала (на 60%) по сравнению с контролем и достигало фоновых значений. Сходные данные были получены и при введении препарата сравнения.
Количество клеток Сертоли достоверно возрастало в 2,3 раза по сравнению с контролем (при введении препарата сравнения в 1,96) и на 44% превосходило фоновые значения.
Степень зрелости сперматогенного пласта снижалась по сравнению с контролем и фоном (также как и у препарата сравнения). Это свидетельствовало в том, что в тестикулярной ткани идут процессы репаративной регенерации. При подсчете продуктивности сперматогенеза было установлено, что ОКС на фоне введения паклитаксела и ЛС возрастало в 2,5 раза (на фоне препарата сравнения - в 2,2 раза). Полученные данные свидетельствуют о том, что ЛС интенсивно стимулирует процессы репаративной регенерации семенников. Его эффективность выше таковой у ИМГ-КСФ, судя по количеству клеток Сертоли, продуктивности сперматогенеза.
В табл. 2 представлены данные о влиянии ЛС на уровень свободных радикалов, уровень антиоксидантной защиты и окислительно-восстановительный потенциал мужских половых клеток.
Примечание:
# - статистическая значимость различий по сравнению с фоном (р≤0,05);
* - статистическая значимость различий по сравнению с контролем (р≤0,05).
Установлено, что уровень свободных радикалов после введения паклитаксела возрастал в 1,6 раза, уровень антиоксидантной активности снижался в 4 раза по сравнению с фоновыми значениями. Окислительно-восстановительный потенциал снижался более чем в 6,6 раз. Эти данные свидетельствуют о том, что через 3 мес после введения паклитаксела в тестикулярная ткань животных характеризуется наличием окислительного стресса. Уровень свободных радикалов в половых клетках крыс, получавших сочетанное введение паклитаксела и ЛС, оказался сниженным по сравнению с контролем почти в 1,8 раз, уровень антиоксидантной защиты повысился почти в 6 раз. Окислительно-восстановительный потенциал достоверно возрастал (в 12 раз) по сравнению с контролем и статистически значимо не отличался от уровня фоновых значений. Полученные данные свидетельствуют о том, что ЛС обладает выраженными антиоксидантными свойствами по отношению к сперматогониям. Благодаря этому выявленному свойству по отношению к сперматогониям он, очевидно, и оказывает стимулирующее воздействие на репаративную регенерацию сперматогенной ткани.
Предлагаемое новое лекарственное средство позволяет провести высокоэффективную коррекцию нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием, за счет ранней стимуляции процессов репаративной регенерации тестикулярной ткани в целом, приводящей к восстановлению численности клеточной популяции сперматогоний. Это в свою очередь, обеспечивает быстрое восстановление сперматогенеза.
Список литературы
1. Киселева М.В., Карпейкина М.М., Денисов М.С. Сохранение фертильности у молодых онкологических пациентов // Материалы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ. 1-10 октября 2010 г. Душанбе. С. 346.
2. Kotzur Т., Benavides-Garcia R., Mecklenburg J., Sanchez J.R., Reilly M. and Hermann B.P. Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) promotes spermatogenic regeneration from surviving spermatogonia after high-dose alkylating chemotherapy // Reproductive Biology and Endocrinology. 2017. Vol. 15. №7. doi: 10.1186/s12958-016-0226-1.
3. Адамян Л.В., Белобородов С.М. Возможность сохранения репродуктивной функции у онкологических больных (обзор литературы) // Проблемы репродукции 2003. №6. C. 29.
4. Khanlarkhani N., Pasbakhsh P., Mortezaee K., Naji M., Amidi F., Najafi A., Sobhani A., Zendedel A. Effect of human recombinant granulocyte colony-stimulating factor on rat busulfan-induced testis injury // Journal of Molecular Histology. 2015. Vol. 47. №1. doi: 10.1007/s10735-015-9647-y.
5. Липатова H.A. Лабораторные критерии фертильности эякулята // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. Т. 5. С. 14.
6. Shaban S., El-Husseny M.W.A., IbrahimAbushouk A., Abdo Salem A M., Mamdouh M., and Abdel-Daim M.M. Effects of Antioxidant Supplements on the Survival and Differentiation of Stem Cells // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017. Vol. 2017. №13. P. 1-16. doi: 10.1155/2017/5032102.
7. Ikonomidis I., Paraskevaidis I., Vamvakou G., Parissis J., Lekakis J. Featured correspondenceLettersThe antioxidant effects of granulocyte colony-stimulating factor // Heart. 2009. Vol. 95. №21. P. 1801. ignoik@otenet. grhttp://dx.doi.org/10.1136/ hrt.2009.179259
8. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Чурин A.A., Жданов В.В., Артамонов А.В. и др. Фармакологические свойства пегелированного с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза соматотропина // Бюлл. эксперим. биол. и мед. 2012. Т153. №3. С 232.
9. Патент РФ №2535002 «Средство коррекции отдаленных последствий нарушений сперматогенеза, вызванных цитостатическим воздействием» // Боровская Т.Г., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., Мадонов П.Г., Полуэктова М.Е., Щемерова Ю.А., Вычужанина А.В., Бекарев А.А., Артамонов А.В. Опубл.: 10.12.2014. Бюл. №34.
10. Ashrafi F, Salmasi M. Comparison of the effects of pegylated granulocyte-colony stimulating factor and granulocyte-colony stimulating factor on cytopenia induced by dose-dense chemotherapy in breast cancer patients // J Res Med Sci. 2018. doi: 10.4103/jrms.JRMS_463_17.
11. Патент РФ №2612268 «Средство для профилактики и лечения доброкачественной гиперплазии предстательной железы» // Боровская Т.Г., Кучин А.В., Чукичева И.Ю., Камалова С.И., Машанова В.А., Полуэктова М.Е., Вычужанина А.В., Плотников М.Б. от 03.03.2017. http://www.findpatent.ru/patent/261/2612268.html
12. Кучин А.В., Чукичева И.Ю. Антиоксиданты: химия и применение // Вестник уральского отделения РАН. 2011. Т. 37. №3. С. 54.
13. Трухан Д.И. Макушин Д.Г. Роль и место антиоксидантов в комплексной терапии мужского бесплодия // Cjnsilium medicum. 2015. Vol. 17. №7. С. 40.
14. Сухачева Т.В. Афтореф. дисс. на соискание ученой степени канд. биол. наук «Роль ДНК-топоизомераз I и II типов в организации синаптонемных комплексов в и хромосом в сперматогенез у мыши». Москва. 2001. С. 18.
15. Ухов Ю.И., Астраханцев А.Ф. Морфологические методы в оценке функционального состояния семенников // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии 1983. №3. С. 68.
16. Саноцкий И.В., Фоменко В.И. Отдаленные последствия влияния химических соединений на организм. М.: Наука. 1979. С. 73, 145.
17. Кузьменко Д.И., Серебров В.Ю., Удинцев С.Н. Свободнорадикальное окисление липидов, активные формы кислорода и антиоксиданты: роль в физиологии и патологии клетки / Учебное пособие. Томск: Издательство Томского политехнического ун-та. 2007. С. 156.