Водорастворимая композиция на основе бетулина
WATER-SOLUBLE COMPOSITION BASED ON BETULIN

Изобретение относится к фармацевтике, фармацевтической промышленности и может быть использовано при создании лекарственных средств и биологически активных добавок на основе бетулина (БЕТ). Композиция включает бетулин и водорастворимые производные глицирризиновой кислоты (ГК) в виде самой кислоты, ее солей или экстракта корней солодки в массовом соотношении 1:(1-10) соответственно. Композицию получают путем механохимического взаимодействия указанных компонентов.
30
50
2
Бетулин (см. Фиг.1) - это тритерпеновый спирт ряда лупана, имеющий брутто-формулу СНО и химическое название бетуленол. Он содержится в большом количестве растений (орешник, календула и пр.), но в промышленных масштабах его можно получить только экстракцией из бересты.
Несмотря на то, что БЕТ давно известен своими целебными свойствами (он был открыт Т.Е. Ловицем - преемником М.В. Ломоносова - в 1778г.), в последние годы в мировой фармакологии наблюдается рост интереса к нему. На текущий момент доказанными считаются следующие свойства [1. Г. А. Толстиков, О. Б. Флехтер, Э. Э. Шульц, Л. А. Балтина, А. Г. Толстиков, Бетулин и его производные. Химия и биологическая активность // Химия в интересах устойчивого развития, 13 (2005) 1-30 ; Белякова А.Ю. Погребняк А.В. Погребняк Л.В, Физико-химические и биологические свойства компонентов внешней коры березы // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 2 (часть 2), URL: https://science-education.ru/ru/article/view?id=22657]:
-антисептическое и ранозаживляющее;
-гепатопротекторные;
-желчегонные;
-антиоксидантные;
-иммуностимулирующие;
-противоопухлевые;
- противовирусная активность бетулина, особенно в отношении всех форм вируса герпеса;
-являются ингибиторами вируса полиомиелита, лихорадочных и респираторных заболеваний;
-бетулин способен ингибировать развитие микобактерий туберкулеза;
-противогрибковое действие (открывает широкие перспективы в его применении, как для профилактики, так и для лечения микозов кожи, ногтей и волос);
- противомеланомная активность самого бетулина и его производных (ученые США и Японии);
- солнцезащитное действие при включении бетулина в крем (UVA-UVB-фильтр);
-активно ингибирует фермент эластазу, ответственный за потерю упругости эластичными волокнами кожи;
-стимулирует синтез коллагена и останавливает воспалительные процессы в коже, защищая ее от воздействия протеинкиназ;
-отбеливает кожу за счет тормозящего действия на меланогенез.
Однако создание лекарственных препаратов и биологически активных добавок на основе БЕТ значительно осложняет его крайне низкая водорастворимость и, соответственно, его малая усвояемость организмом из его оральных форм[2. О.А. Воробьева, Д.С. Малыгина, Е.В. Грубова, Н.Б. Мельникова, Производные бетулина. Биологическая активность и повышение растворимости // Химия Растительного Сырья. 2019. №4. С. 407-430.].
Однако увеличение водорастворимости само по себе не связано напрямую с увеличением биологической активности препаратов. Так, на примере лекарственных средств, известен довольно широкий круг препаратов, имеющих высокую водорастворимость, но плохо проникающих через биологические мембраны [3. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate-Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System. Food and Drug Administration, Rockville, MD, 2000. Available at http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm] и тем самым обладающих недостаточной фармакологической эффективностью. Отсюда следует, что для повышения биологической эффективности применения композиций на основе БЕТ необходимо также повышать проникновение его через биологические мембраны, прежде всего, в ЖКТ - т.н. «биодоступность». К сожалению, к настоящему времени данные о величинах биодоступности БЕТ из оральных препаративных форм отсутствуют.
Задачей настоящего изобретения является:
- увеличение водорастворимости БЕТ;
- увеличение усвояемости БЕТ путем ускорения его абсорбции в ЖКТ из его твердых препаративных форм;
- использование безотходной и производительной технологии получения указанных препаративных форм - композиций на основе БЕТ.
Решение поставленной задачи достигается за счет создания композиций - твердых дисперсий, содержащих БЕТ и водорастворимые производные глицирризиновой кислоты (ГК), используемые в виде самой кислоты, ее солей или экстракта корней солодки (с содержанием ГК до 20-25 вес. %) в массовых соотношениях 1:(1-10), соответственно.
in vitro
Заявленная водорастворимая порошкообразная композиция образует при растворении в воде мицеллы глицирризиновой кислоты, включающие молекулы бетулина, что обеспечивает высокую трансмембранную проницаемость бетулина из водных растворов.
В качестве водорастворимых производных глицирризиновй кислоты композиция включает глициризиновую кислоту, соли глицирризиновой кислоты.
При получении композиции можно также использовать сухой экстракт солодки, содержащий глицирризиновую кислоту.
Водорастворимую композицию получают обработкой исходной смеси в устройствах ударно-истирающего действия.
Дополнительным позитивным фактором является свойство производных ГК встраиваться в липидные биологические мембраны [4. Kim A.V., Shelepova E., et. el., Mechanism of the enhancing effect of glycyrrhizin on nifedipine penetration through a lipid membrane // Journal of Molecular Liquids. - 2021. - Vol. 344. - Art. 117759. ; Selyutina O.Y., Mastova A.V. et el., pH-Sensitive Glycyrrhizin Based Vesicles for Nifedipine Delivery // Molecules. 2021. Vol. 26, 1270; O.Y. Selyutina, N.E. Polyakov, Glycyrrhizic acid as a multifunctional drug carrier - from physicochemical properties to biomedical applications: a modern insight on the ancient drug // Int. J. Pharm., 559 (2019), pp. 271-279.] и, предположительно, являться «носителями» низкомолекулярных биологически активных веществ в трансмембранном переносе. В водных растворах производные ГК образуютвезикулы - мицеллы, состоящие из 60-100 молекул, в которые включаются молекулы малорастворимых в воде биологически активных веществ (БАВ). Такие мицеллы обладают мембранотропными свойствами, позволяющими увеличивать трансмембранный перенос БАВ, тем самым увеличивая его биодоступность. Вместе с тем, далеко не очевидно, что ГК будет способствовать переносу именно БЕТ через биологические мембраны.
Композиция представлена в форме водорастворимого порошка, при растворении ее в воде методом гель-проникающей хроматографии фиксируется образование вышеуказанных мицелл. Это свидетельствует о специфических межмолекулярных взаимодействиях БЕТ и производных ГК, формирующихся в процессе механохимического получения композиций. При этом многократно увеличивается растворимость БЕТ в водной среде, ускоряется его трансмембранный перенос, как основной фактор увеличения биодоступности. Кроме того, производные ГК в целом дополняют факторы вышеуказанной биологической активности БЕТ. Так, например, ГК и ее производные обладают противовирусными, противовоспалительными, анельгизирующими, антиульцерогенными, гепатопротективными и др. полезными свойствами [5. Толстиков Г.А. и др., Солодка: биоразнообразие, химия, применение в медицине - Новосибирск : Академическое издательство «Гео», 2007.-311с.].
Предлагаемая композиция на основе БЕТ обладают следующими преимуществами:
- использование доступных и дешевых материалов, производных ГК, выделяемых
из широко распространенного растительного сырья - корней солодки - и способных
образовывать супрамолекулярные структуры - мицеллы - комплексы с БЕТ;
- повышенная водорастворимость БЕТ;
- повышенная биодоступность - способность проникновения БЕТ через мембраны, моделирующие ЖКТ;
- использование полезных технологических и биологических свойств самих водорастворимых производных ГК, что позволит не только улучшить показатели качества механохимических комплексов/мицелл, но и достичь эффекта синергизма в биологическом действии БЕТ.
Решение поставленной задачи достигается также тем, что заявляемую композицию получают путем механохимического взаимодействия БЕТ и водорастворимых производных ГК в соотношении 1:(1-10). В качестве аппаратов для механохимической обработки могут быть использованы шаровые валковые, планетарные, вибрационные, виброцентробежные и т.п. мельницы, т.е устройства ударно-истирающего воздействия. Процесс масштабируется от шаровых лабораторных мельниц с загрузкой в несколько грамм до проточных виброцентробежных мельниц с производительностью до 100 кг/ч и более.
Смесь БЕТ и производных ГК, взятых в массовом соотношении от 1:1 до 1:10, подвергают механохимической обработке в вышеуказанных измельчителях-активаторах ударно-истирающего типа. В процессе механической обработки происходит частичное диспергирование молекул БЕТ в объем твердых фаз вспомогательных веществ, образуя твердый раствор, представляющий собой разупорядоченную твердую фазу, в которой молекулы БЕТ и вспомогательного вещества, в виде водорастворимых производных глициризиновой кислоты, испытывают нековалентные неионные взаимодействия. Во время растворения этой твердой дисперсии образуются мицеллы ГК, в которые включаются молекулы БЕТ, что обосновывается достигаемым увеличением его водорастворимости [6. А.V. Dushkin, Е.S. Meteleva, et al., Complexing of Pharmacons with Glycyrrhizic Acid as a Route to the Development of the Preparations with Enhanced Efficiency// Chemistry for Sustainable Development 18 (2010) 437-444].
Таким образом, достигаются заявленные преимущества механохимически полученных композиций - включение молекул БЕТ в везикулы/мицеллы ГК и увеличение переноса биологически активного вещества - БЕТ - через биологические мембраны. При этом также достигаются следующие заявленные преимущества способа получения:
- приготовление заявляемых композиций происходит в одну технологическую стадию механической обработки в измельчителе-активаторе, не требуется участия жидких фаз;
- исключается энергоемкий и длительный процесс сушки материала;
- отсутствуют отходы растворителей.
При отсутствии вышеуказанных условий получения - например, использование смешения компонентов в «мягких» условиях, в водный раствор переходят только водорастворимые компоненты композиций, а кристаллическая фаза БЕТ остается в осадке.
Отсутствуют специальные требования к контролю влажности помещений, так как вещества обрабатывают в герметичном внутреннем объеме мельниц. Во всех случаях процесс проводят фактически в одну стадию, он не требует дорогостоящего оборудования и прост в реализации.
Аналогами нашего изобретения являются опубликованные исследования по получению и изучению твердых композиций бетулина и его производных, а именно:
in vitro
[7. T.P.Shakhtshneider, S.A.Kuznetsova, et el, New composites of betulin esters with arabinogalactan as highly potent anti-cancer agents, Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters, 2015, DOI: 10.1080/14786419.2015.1060591; S. A. Kuznetsova, Yu. N. Malyar et el., Mechanochemical Preparation of the Composites of Betulin Esters with Arabinogalactan and Investigation of Their Physicochemical Properties // Chemistry for Sustainable Development 21 (2013) 609-614; T.P. Shakhtshneider , M.A. Mikhailenko, et el., Effect of ball-milling on the formation of betulin and botulin diacetate composites with polyethylene glycol // Materials Today: Proceedings, V. 12, Part 1, 2019, Pages 78-81; S.A. Kuznetsova, T. P. Shakhtshneider, et el.,. // Biointerface Research in Applied Chemistry, V.12, Issue 5, 2022, 6873 - 6894, https://doi.org/10.33263/BRIAC125.68736894; М.А.Михайленко, Т.П.Шахтшнейдер и др., Влияние механической обработки на свойства бетулина, диацетата бетулина и их смеси с водорастворимыми полимерами // Chemistry of Natural Compounds, 2011, №2б с.211-214.]. В этих научных работах показана возможность увеличения растворимости БЕТ и некоторых его производных путем механохимического получения твердых дисперсий с синтетическими полимерами и растительным полисахаридом арабиногалактаном, а также изучена противоопухолевая активность  этих композиций на моделях клеточных монослоев (МТТ тест). Показана возможность увеличения водорастворимости БЕТ до 50 раз. Однако примененный авторами метод определения растворимости по мнению авторов патента недостоверен. При этом результаты исследования противоопухолевого действия неоднозначны, вероятно, в связи с недостатками примененных моделей исследований.
Ближайшим аналогом нашего изобретения является патент [8. РФ RU 2401118 C1, М.А. Михайленко, Т.П. Шахтшнейдер и др., Композиция бетулина с биосовместимыми носителями и способ ее получения, Опубликовано: 10.10.2010 Бюл. № 28]. В этом исследовании описано получение твердых композиций бетулина с синтетическими полимерами - поливинилпирролидоном и полиэтиленгликолем. Заявленное авторами максимальное повышение растворимости БЕТ достигало почти 50 раз. Однако методика определения фазовой растворимости вызывает сомнения, по причине применения метода экстракции БЕТ, а не прямого определения концентрации в равновесном (с твердыми фазами) растворе аналитическими методами. Кроме того, не подвергались изучению другие характеристики полученных композиций - химическая стабильность компонентов при получении композиций, и их важные биофизические свойства - трансмембранную проницаемость - в качестве модели абсорбции БЕТ при оральном приеме этих композиций. Ранее, мы уже указывали, что параметр фазовой растворимости важен, но не является определяющим для оценки повышения биодоступности препаратов. [9. Food and Drug Administration. Guidance for Industry: Waiver of In Vivo Bioavailability and Bioequivalence Studies for Immediate-Release Solid Oral Dosage Forms Based on a Biopharmaceutics Classification System. Food and Drug Administration, Rockville, MD, 2000. Available at http://www.fda.gov/cder/guidance/index.htm, Душкин А.В., Толстикова Т.Г., и др., Супрамолекулярные системы доставки лекарственных молекул на основе растительных метаболитов. Физико-химические, фармакологические свойства и особенности механохимического получения // Химия в интересах устойчивого развития. 2019. № 3. С. 133-244. DOI: 10.15372/KhUR2019129].
in vitro
В нашем изобретении также применен механохимический метод получения твердых дисперсий бетулина. Растворение полученных композиций формирует «мицеллярную» систему «доставки», молекул БЕТ. При этом достигается увеличение его водорастворимости до 1000 раз, что многократно превосходит результаты патента - прототипа. Примененный способ получения и формулируемые составы, препятствуют образованию нежелательных примесей в процессе получения композиций (этот параметр не контролировался в прототипе). Проведенные исследования показывают значительное увеличение скорости трансмембранной проницаемости БЕТ, определенных методом РАМРА [10. Mccallum MM. (2013). High-throughput approaches for the assessment of factors influencing bioavailability of small molecules in pre-clinical drug development (PhD thesis). The University of Wisconsin - Milwaukee].
Дополнительно, преимуществом нашего изобретения является использование сухого экстракта корней солодки, производящегося в РФ содержащего в значительных количествах глицирризиновую кислоту, до 25 вес %, вместо дорогостоящих фармакопейных субстанций глицирризиновой кислоты и ее солей. Последний вариант может быть использован при производстве БАД и ветеринарных препаратов.
Таким образом, обеспечивается преимущество заявляемого состава и способа получения композиций на основе БЕТ.
Техническим результатом нашего изобретения является получение композиции на основе бетулина с повышенной водорастворимостью и трансмембранной проницаемостью.
Предлагаемое техническое решение иллюстрируется нижеследующими примерами его применения.
Пример 1.
Получение и ВЭЖХ анализ водных растворов композиций.
2
Смеси субстанций БЕТ (опытное производство НИОХ им. Ворожцова) с ГК, NaГК (Shaanxi Pioneer Biotech Co., Ltd, КНР) и сухого экстракта корня солодки (Вистерра, Россия)субстанций Глицирризиновой кислоты и ее двунариевой соли Na2ГК (прозводство Shaanxi Sciphar Biotechnology Co. Ltd. Xi’an, КНР), взятые в весовых соотношениях от 1:1 до 1:10, были подвергнуты обработке ударно-истирающими воздействиями в шаровой ротационной/валковой мельнице ВМ-1, в течение 2-24 часов (механохимическое взаимодействие). Затем были определены водорастворимости БЕТ. Для этого навески исследуемого материала (0,02г в пересчёте на БЕТ) суспендировали в 10 мл дистиллированной воды при +37°С на орбитальном шейкере (200 об/мин) в течение 4 часов. Затем суспензию фильтровали и центрифугировали до образования прозрачного над осадочного раствора. Концентрацию БЕТ в растворе определяли методом ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200 (колонка ZorbaxEclipseXDB-C18, 4.6×50 мм; температура колонки 30°С, элюент - система ацетонитрил/вода 90/10, скорость потока 1 мл/мин., объем пробы 10 мкл, детектирование на длине волны 200 нм) относительно приготовленных калибровочных образцов спиртовых растворов.
Таблица 1.Водорастворимость бетулина из полученных композиций
Вещество/композицияСпособ получения
Растворимость БЕТ в воде, мг/л
Увеличение водорастворимости
БЕТ, субстанция
1
-
БЕТ/ГК = 1/1 по массе, смесь
12
12
БЕТ/ГК = 1/10 по массе, обработка в мельнице
1300
1300
БЕТ/Na2ГК = 1/1 по массе, смесь
35
35
БЕТ/Na2ГК = 1/10 по массе, обработка в мельнице
1049
1049
БЕТ/сухой экстракт корня солодки = 1/1 по массе, смесь
16
16
БЕТ/сухой экстракт корня солодки = 1/10 по массе, обработка в мельнице
41
41
Примечание 1. Поскольку растворимость БЕТ из получаемых композиций зависит от времени механохимической обработки, в таблице приведены максимально достигнутые значения.Примечание 2. Содержание БЕТ в механохимически приготовленных образцах, определенное ВЭЖХ, в пределах точности (±1%) соответствует теоретически рассчитанному, исходя из загрузок компонентов. Это свидетельствует о химической стабильности БЕТ в процессе приготовления композиций.
2
Во всех случаях имеет место увеличение водорастворимости БЕТ из механохимически полученных композиций с ГК, NaГК и сухим экстрактом корня солодки по сравнению с исходной субстанцией до ~41 - 1300 раз. Образование ассоциатов ГК с БЕТ подтверждено методом гель-хроматографии - хроматограф Agilent 1200 колонка PL aquel-OH 40, 300×7,5 мм; температура колонки 30°С, элюент - 0,02% раствор азида натрия, скорость потока 1 мл/мин., объем пробы 20 мкл, детектор рефрактометрический. Во всех случаях наблюдался 1 пик высокомолекулярного образования - мицелл ГК. При этом молекулярная масса мицелл в водном растворе ГК и ее производных составляет 70-75 кДА, увеличиваясь в растворах композиций до 80-90 кДа, что обусловлено включением молекул БЕТ в мицеллы ГК.
Пример 2.
Исследование трансмембранной проницаемости БЕТ.
in vitro
Трансмембранная проницаемость БЕТ и его композиций исследовалась методом РАМРА на искусственно приготовленных гидрофобных мембранах по методике, изложенной в [11. Q.Zhang, N.E.Polyakov, Y.S.Chistyachenko, et.el., Preparation of curcumin self-micelle solid dispersion with enhanced bioavailability and cytotoxic activity by mechanochemistry // Drug Delivery, 2018 VOL. 25, NO. 1, 198-209.]. Были исследованы образцы состава БЕТ/ вспомогательное вещество (1/10). Результаты приведены на Фиг. 1 и в Таблице 2.
in vitro.
2
На Фиг. 2 Приведены данные проникновения бетулина через искусственную липофильную мембрану в экспериментах РАМРА 1 - исходный бетулин, 2 - композиция бетулин/NaГК 1/10; 3 - композиция бетулин/сухой экстракт корня солодки 1/10, 4 - композиция бетулин/ГК 1/10.
Таблица 2.Данные трансмембранной проницаемости бетулина из исходной субстанции и его механохимически полученных композиций.
Временныеточки
Перенос бетулина через мембрану, мкг
исходный бетулин
дисперсия бетулин/Na<sub>2</sub>ГК 1/10
дисперсия бетулин/ГК 1/10
дисперсия бетулин/экстакт корня солодки 1/10
1 (8ч)
0
1,7
2,7
1,7
2 (24ч)
0
4,2
7,1
5,4
3 (32ч)
0
5,9
10,0
7,9
4 (46ч)
0
7,9
11,2
10,7
in vivo
Из приведенных данных видно, что транмембранный перенос практически отсутствует в случае исходного БЕТ. В то же время при использовании его композиций, заявляемых в патенте, в зависимости от их состава, он достигает значительных величин, что позволяет обосновать повышение биодоступности БЕТ  в лабораторных доклинических тестах [12. Mccallum MM. (2013). High-throughput approaches for the assessment of factors influencing bioavailability of small molecules in pre-clinical drug development (PhD thesis). The University of Wisconsin - Milwaukee, Q.Zhang, N.E.Polyakov, Y.S.Chistyachenko, et.el., Preparation of curcumin self-micelle solid dispersion with enhanced bioavailability and cytotoxic activity by mechanochemistry // Drug Delivery, 2018 VOL. 25, NO. 1, 198-209.].
Таким образом, приведенные примеры подтверждают формулу изобретения.