СРЕДСТВО (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБЫ ВОССТАНОВЛЕНИЯ МИКРОФЛОРЫ
MEANS (OPTIONS) AND METHODS OF MICROFLORA RECOVERY

Область техники
Изобретение относится к микробиологии и медицине и может быть использовано для предотвращения и лечения заболеваний и состояний, связанных с нарушением нормальной (аутохтонной) микрофлоры (микробиоты) человека или животных.
Уровень техники
Известен широкий спектр заболеваний, которые могут быть вызваны или которые могут сопровождаться изменениями аутохтонной микрофлоры, или микробиоты (здесь и далее в описании термин «микрофлора» будет использоваться взаимозаменяемо с термином «микробиота»). Это связано с той важной ролью, которую играет микробиота в поддержании жизни и здоровья людей и животных. Установлено, что микробиота стимулирует перистальтику и обновление клеток кишечника, способствует элиминации патогенных микроорганизмов, стимулирует иммунитет, вырабатывает различные молекулы, необходимые макроорганизму, включая некоторые витамины, участвует в пищеварении, инактивирует биологически активные компоненты (биогенные амины) и др.
Выявлено много заболеваний различной локализации, которые сопровождаются или которые могут быть вызваны изменениями аутохтонной микрофлоры. К ним относятся язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, синдром повышенной проницаемости кишечника, кандидоз слизистых, дисфункции кишечника, метеоризм, вагиноз и др. Особую опасность представляют изменения аутохтонной микрофлоры, возникающие на фоне гормональных нарушений, длительной антибиотикотерапии, рентгено- и химиотерапии, действия цитостатиков и других лекарственных препаратов, применяемых в трансплантологии, при онкологических заболеваниях, а также в результате применения противоопухолевых лекарственных средств. Кроме того, восстановление микрофлоры улучшает общее самочувствие и тем самым способствует повышению качества жизни.
Для устранения указанных нарушений были предложены разнообразные способы восстановления собственной микрофлоры, в том числе с помощью препаратов, приготовленных из отдельных бактерий аутохтонной микрофлоры (в частности, бифидо- и лактобактерий), комплексов бактерий и комплексов бактерий без их размножения, полученных из фекалий здоровых людей (см. US 6,572,854 "Use of bacteria endowed with arginine deiminase to induce apoptosis and/or reduce an inflammatory reaction and pharmaceutical or dietetic compositions containing such bacteria"; US RE 39,892 "Pharmaceutical compositions containing lactobacilli for treatment of vaginal infections and related method") или из разных бактерий фекалий (см. например, US 6,428,783 "Bank of autochthonous strains of microorganisms and methods of its use for recovery of intestinal microbiocenosis of the men").
Недостатками известных технических решений является отсутствие системного подхода, невысокая эффективность лечения дисбактериоза, обусловленная использованием либо всей микрофлоры кишечника в целом, либо некоторых традиционно применяющихся штаммов, преимущественно штаммов бифидо- и лактобактерий, а также разрозненность сведений и отсутствие научных исследований роли различных микроорганизмов и их различной эффективности для восстановления собственной микрофлоры, что в целом не позволяло до сих пор создать средство, обеспечивающее высокую эффективность лечения дисбактериоза и быстрое выздоровление собственной микрофлоры организма.
Из источников научно-технической и патентной информации неизвестна возможность создания такого банка аутохтонных штаммов микроорганизмов, который, с одной стороны, был бы единообразным, независимо от источника его получения, а с другой стороны, позволял бы получать хорошо воспроизводимые и предсказуемые результаты при восстановлении кишечного микробиоценоза человека.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения лекарственного средства, которое, с одной стороны, было бы индивидуализированным и содержало аутохтонные микроорганизмы, присущие именно данному индивидууму, высокоэффективные для восстановления его кишечной микрофлоры, а с другой стороны, имело бы постоянный состав и обеспечивало хорошо воспроизводимые и предсказуемые результаты.
Настоящее изобретение основано на результатах научных исследований, полученных авторами в ходе изучения состава аутотохтонной микрофлоры разной локализации. В частности, в ходе этих исследований неожиданно было установлено, что микрофлора отделов желудочно-кишечного тракта, в частности слизистой кишечника, ротовой полости и кожи, имеет очень близкий или идентичный качественный состав определенных микроорганизмов, которые условно названы «ядром микрофлоры». В результате исследований было неожиданно установлено, что в пробах слюны, кожи, и в фекалиях содержатся представители одних и тех же таксонов микроорганизмов: в частности, Actinomycetales, Bacteroidales, Flavobacteriales, Bacillales, Lactobacillales, Clostridiales, Erysipelotrichales, Selenomonadales, Fusobacteriales, Neisseriales, Campylobacterales, Pasteurellales. При сходстве качественного состава различия касаются только количественной представленности тех или иных микробов в зависимости от их локализации в организме человека. Возможно, разные условия предпочтительны для определенных микробов, и другие при этом присутствуют в малом количестве, но не исчезают полностью.
Далее, исследования, проведенные в ходе создания настоящего изобретения, показали, что аутохтонная микрофлора наследуется по материнской линии, как это имеет место в случае наследования человеком митохондрий. Таким образом, по меньшей мере митохондрии и ядро микрофлоры детей, вне зависимости от их пола, получены от матери.
Дополнительное исследование было посвящено изучению роли бактериофагов в возникновении изменений микрофлоры, которые называют «болезнями микрофлоры». Известно, что нормальная микрофлора содержит в 10 раз больше бактериофагов, чем бактерий. Бактериофаги играют важную роль в поддержании гомеостаза нормальной микрофлоры. Вместе с тем с едой, питьем и при контакте с другими объектами и субъектами люди постоянно получают из окружающей среды большое число дополнительных бактериофагов, способных вызвать нежелательные изменения микрофлоры, которые могут привести к патологическому состоянию макроорганизма. В экспериментах, проведенных авторами изобретения, введение животным в пищу определенных фагов приводило к возникновению патологического синдрома, который проявляется в виде различных поражений сердца, почек, поджелудочной железы и онкологическими заболеваниями.
Основываясь на этих новых данных, авторы разработали средство и способ профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями функций и/или состава нормальной микрофлоры.
Краткое описание изобретения
Задачей изобретения является разработка нового средства и способа восстановления или создания нормальной аутохтонной микрофлоры.
Поставленная задача решается путем приготовления лекарственного средства для восстановления или создания микрофлоры субъекта, представляющего собой композицию, полученную из микроорганизмов, выделенных из собственной нормальной микрофлоры здоровых людей, при этом с данной целью используют микроорганизмы, выделенные из микрофлоры ротовой полости (слюны, слизистых), других отделов желудочно-кишечного тракта (кишечника, желудка и др.), кожи, фекалий. Дополнительно вместе с бактериями микрофлоры можно собрать, хранить и использовать бактериофаги микрофлоры. Перед употреблением средство может быть обогащено собственными бактериями, выращенными на богатой питательной среде в аэробных и анаэробных условиях, после посева хранящихся проб микробиоты.
В качестве донора микрофлоры могут выступать сам субъект-носитель (собственная микрофлора), мать, родные сестры и братья, а также родственники по материнской линии (сестры матери и их дети, все потомки в первом поколении, дети дочерей во втором поколении и т.д.) и другие доноры при отсутствии перечисленных. Собственная микрофлора может быть отобрана у субъекта в детско-юношеском возрасте.
Средство может быть приготовлено непосредственно, когда в нем возникла необходимость, а может быть приготовлено заранее и храниться в банке микрофлоры.
Согласно одному аспекту изобретения, предложено средство для восстановления или создания микрофлоры субъекта, содержащее активный компонент, содержащий микроорганизмы, выделенные из собственной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора, выбранного из группы, включающей мать и/или других родственников по материнской линии.
Согласно одному из примеров реализации, микроорганизмы представляют собой бактерии, выделенные из собственной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора, выбранного из группы, включающей мать и других родственников по материнской линии.
Согласно одному из примеров реализации, средство может содержать по меньшей мере один микроорганизм, выбранный из микроорганизмов, принадлежащих к: Actinomycetales, Bacteroidales, Flavobacteriales, Bacillales, Lactobacillales, Clostridiales, Erysipelotrichales, Selenomonadales; Fusobacteriales, Neisseriales, Campylobacterales, Pasteurellales.
Согласно одному из примеров реализации, средство может дополнительно содержать по меньшей мере один микроорганизм, выбранный из группы: Aerococcaceae, Burkholderiaceae, Carnobacteriaceae, Coriobacteriaceae, Erysipelotrichaceae, Eubacteriaceae, Lachnospiraceae, Leptotrichiaceae, Micrococcaceae, Peptostreptococcaceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Pseudomonadaceae, Ruminococcaceae, Streptococcaceae, Veillonellaceae.
Согласно одному из примеров реализации, средство может дополнительно содержать археи и грибы, выделенные из собственной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора, выбранного из группы, включающей мать и других родственников по материнской линии.
Согласно одному из примеров реализации, микроорганизмы представляют собой бактериофаги, выделенные из собственной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора, выбранного из группы, включающей мать и других родственников по материнской линии.
Согласно одному из примеров реализации, микроорганизмы представляют собой бактерии и бактериофаги, выделенные из собственной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора, выбранного из группы, включающей мать и других родственников по материнской линии.
Согласно одному из примеров реализации, соотношение бактерий к бактериофагам выбрано из следующих соотношений: от 1000:1 до 100:1, от 100:1 до 10:1, от 10:1 до 1:10; от 1:10 до 1:100; от 1:100 до 1:1000.
Согласно одному из примеров реализации, активный компонент в указанном средстве обогащен дополнительными микроорганизмами микрофлоры, выращенными на питательной среде, причем дополнительные микроорганизмы микрофлоры включают пока не культивируемые в отсутствие организма хозяина микроорганизмы микрофлоры.
Согласно одному из примеров реализации, средство согласно любому из вышеописанных аспектов дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель.
Согласно одному из примеров реализации, фармацевтически приемлемый наполнитель выбран из группы, включающей следующие вещества: изотонический раствор хлорида натрия, активированный уголь, диоксид кремния, мел, сахар, лактоза, желатин, крахмал, поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон (ПВП), целлюлоза, метил целлюлоза (МЦ), оксипропилметил целлюлоза (ОПМЦ), карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ) и другие вещества, традиционно используемые в качестве фармацевтически приемлемых наполнителей.
Согласно одному из примеров реализации, активный компонент получен путем выращивания по меньшей мере части микроорганизмов, выделенных из микрофлоры указанного субъекта или микрофлоры донора, в аэробных и/или анаэробных условиях.
3
5
5
7
7
9
9
12
Согласно одному из примеров реализации, активный компонент получен путем выращивания по меньшей мере от 100 бактерий на 1 мл до 1000 бактерий на 1 мл, от 1000 бактерий на 1 мл до 10000 бактерий на 1 мл, от 10 до 10 бактерий на 1 мл, от 10 до 10 бактерий на 1 мл, от 10 до 10 бактерий на 1 мл, от 10 до 10 бактерий на 1 мл или большего числа бактерий на 1 мл.
Согласно одному из примеров реализации, активный компонент содержит микроорганизмы, выделенные из микрофлоры, полученной из слюны, слизистых, кожи, желудочно-кишечного тракта, фекалий, с добавлением микроорганизмов из этой микрофлоры, выращенных на питательной среде и добавленных непосредственно перед приемом средства.
Согласно одному из примеров реализации, активный компонент содержит микроорганизмы, выделенные из микрофлоры слюны, слизистых, кожи, желудочно-кишечного тракта, фекалий, собранных в момент времени, предшествующий моменту воздействия на организм субъекта, которое может повлиять на состав нормальной микрофлоры.
Согласно одному из примеров реализации, активный компонент содержит микроорганизмы, выделенные из собственной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора с добавлением микроорганизмов из этой микрофлоры, выращенных на питательной среде и добавленных до начала приема средства. В частности, микроорганизмы, предназначенные для добавления к активному компоненту для его обогащения, могут быть выращены на питательной среде и добавлены за период времени от 1 часа до 80 лет, примерно за один час, за период времени от 1 часа до 1 суток, примерно за 1 день, за период времени от 1 суток до 1 месяца, примерно за 1 месяц, за период времени от одного месяца до одного года, примерно за 1 год, за период времени от 1 года до 80 лет, до начала приема средства.
Согласно одному из примеров реализации, момент времени, предшествующий моменту начала воздействия на организм субъекта, представляет собой момент времени в детско-юношеском возрасте субъекта.
Согласно одному из примеров реализации, активный компонент приготовлен в форме, пригодной для замораживания и длительного хранения.
Согласно одному из примеров реализации, средство дополнительно содержит вспомогательные вещества, снижающие текучесть.
Согласно одному из примеров реализации, вспомогательные вещества, снижающие текучесть, выбраны из группы, включающей латекс, сорбент, полиэтиленгликоль, агар-агар, желатин, микробные питательные среды и другие вещества, способные снижать текучесть.
Согласно одному из примеров реализации, средство дополнительно содержит бактерии микрофлоры, повышающие способность микроорганизмов колонизовать определенные участки кожи или слизистой.
Согласно другому примеру реализации, средство содержит бактерии, которые обеспечивают колонизационную резистентность, в частности, вырабатывают вещества, которые подавляют и угнетают развитие чужеродных микробов, и не влияют или способствуют развитию собственных штаммов и видов, благодаря чему возникают ассоциации микроорганизмов, благотворно влияющих на жизнедеятельность организма в целом.
Согласно еще одному аспекту, предложена фармацевтическая дозированная форма для профилактики и/или лечения заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, содержащая средство согласно описанному аспекту и примерам реализации и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Согласно одному из примеров реализации, средство или фармацевтическая дозированная форма могут быть приготовлены в виде капсул, таблеток, пеллет, каплет, порошка, аэрозоля, лиофилизата, геля, крема суспензии, эмульсии, взвеси в питательной среде или другой подходящей жидкости, например, в воде.
Согласно одному из примеров реализации, средство или фармацевтическая дозированная форма могут быть приготовлены в форме, выбранной из форм, пригодных для растворения в ротовой полости, тонком кишечнике, желудке, толстой кишке, форм для буккального или сублингвального введения, форм для трансмукозального введения, например, с помощью эндоскопа, форм для интравагинального введения.
Согласно еще одному аспекту, предложен набор для профилактики и/или лечения заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры, содержащий средство или по меньшей мере одну фармацевтическую дозированную форму согласно любому из описанных аспектов и инструкции по введению субъекту.
Согласно еще одному аспекту, предложен способ профилактики и/или лечения заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, включающий введение субъекту, который в этом нуждается, средства или фармацевтической дозированной формы согласно любому из описанных аспектов.
Согласно примерам реализации, предложенный способ предназначен для быстрого создания нормальной микробиоты у детей, рожденных кесаревым сечением, при этом активный компонент содержит микроорганизмы, выделенные из микрофлоры матери или микрофлоры другого родственника по материнской линии.
Согласно примерам реализации, предложенный способ предназначен для быстрого создания нормальной микробиоты у детей, рожденных естественным путем суррогатной матерью, при этом активный компонент содержит микроорганизмы, выделенные из микрофлоры генетической матери или микрофлоры ее родственника.
Согласно примерам реализации, предложенный способ предназначен для профилактики и/или лечения повышенной проницаемости кишечника и/или коррекции синдрома повышенной проницаемости кишечника (англ. «leaky gut syndrome»), при этом активный компонент содержит микроорганизмы, выделенные из собственной микрофлоры субъекта до начала индукции повышения проницаемости кишечника и/или микрофлоры его родственников по материнской линии в их молодом возрасте, и при этом микроорганизмы включают бактерии, выделенные из указанной микрофлоры, бактерии совместно с бактериофагами, выделенными из указанной микрофлоры, а также только изолированные бактериофаги, выделенные из указанной микрофлоры.
Согласно примерам реализации, предложенный способ предназначен для восстановления состава микрофлоры субъекта с увеличением продолжительности жизни субъекта, при этом активный компонент содержит микроорганизмы, выделенные из собственной микрофлоры субъекта ранее или микрофлоры его родственников по материнской линии в их молодом возрасте, и при этом микроорганизмы включают бактерии, выделенные из указанной микрофлоры, бактерии совместно с бактериофагами, выделенными из указанной микрофлоры, а также только изолированные бактериофаги, выделенные из указанной микрофлоры.
Согласно примерам реализации, предложенный способ предназначен для профилактики и/или лечения опухолевых заболеваний у субъекта, при этом активный компонент содержит микроорганизмы, включающие бактерии и/или бактериофаги, полученные из микрофлоры указанного субъекта ранее или микрофлоры родственников по материнской линии в их молодом возрасте.
Согласно примерам реализации любого из описанных аспектов, заболевания и/или состояния, связанные с и/или сопровождающиеся нарушением или отсутствием микрофлоры субъекта, выбраны из группы, включающей язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, синдром повышенной проницаемости кишечника, кандидоз слизистых, дисфункции кишечника, метеоризм, вагиноз, опухолевые заболевания; заболевания и/или состояния, возникающие на фоне гормональных нарушений, длительной антибиотикотерапии, рентгено- и химиотерапии, действия цитостатиков и лекарственных препаратов, применяемых в трансплантологии, при онкологических заболеваниях, в результате применения противоопухолевых лекарственных средств; заболевания и/или состояния, связанные с рождением кесаревым сечением и рождением естественным путем суррогатной матерью.
Далее, предложен способ стимулирования иммунной системы организма, ослабленной в результате заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, включающий введение средства или фармацевтической дозированной формы согласно любому из описанных аспектов.
Согласно одному аспекту изобретения, предложено применение средства согласно описанным аспектам для восстановления и/или создания микрофлоры субъекта.
Согласно другому аспекту изобретения, предложено применение средства согласно описанным аспектам для профилактики и/или лечения заболеваний и состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры.
Согласно еще одному аспекту изобретения, предложено применение средства, содержащего микроорганизмы, выделенные из организма субъекта, включающие бактерии и/или бактериофаги, полученные из микрофлоры этого же субъекта ранее или полученные из микрофлоры родственников по материнской линии в их молодом возрасте, для восстановления микрофлоры субъекта и увеличения продолжительности жизни.
Согласно еще одному аспекту изобретения, предложено применение средства, содержащего микроорганизмы, выделенные из организма субъекта, включающие бактерии и/или бактериофаги, полученные из микрофлоры этого же субъекта ранее или полученные из микрофлоры родственников по материнской линии в их молодом возрасте, для предотвращения и/или лечения повышенной проницаемости кишечника и устранения симптомов повышенной проницаемости кишечника.
Подробное описание изобретения
В настоящем описании термины «микрофлора», «микробиота», «микробиоценоз» взаимозаменяемы и относятся к совокупности разных типов микроорганизмов, населяющих какую-либо среду обитания.
В настоящем описании термины «микроб» и «микроорганизм» взаимозаменяемы и относятся к группе живых организмов, размеры которых составляют, в частности, менее 1 мм. К ним относят, в частности, простейшие, бактерии, вирусы, грибы, дрожжи.
К вирусам, в свою очередь, относят бактериофаги, которые представляют собой вирусы бактерий.
Некультивируемые или пока некультивируемые формы микроорганизмов представляют собой такие формы микроорганизмов, которые в отсутствие организма хозяина или в ответ на действие неблагоприятных факторов прекращают рост на питательных средах, но сохраняют жизнеспособность, а при улучшении условий культивирования возобновляют пролиферацию. Другими словами, в таком случае микроорганизмы переходят в некультивируемое состояние, в котором они могут находиться длительное время. Термин «пока некультивируемые» или «ранее некультивируемые», относящийся к микроорганизмам, означает, что на момент написания настоящей заявки для таких микроорганизмов неизвестна возможность обеспечения их роста на питательных средах в отсутствие организма хозяина (см., например, Colwell, R., Grimes J. "Nonculturable Microorganisms in the Environment", ASM Press, 2000. pp. 2-3).
Согласно одному из аспектов, предложено средство для восстановления или создания микрофлоры субъекта, содержащее активный компонент, содержащий микроорганизмы, выделенные из собственной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора, выбранного из группы, включающей мать и/или родственников по материнской линии, и дополнительно, компонент, усиливающий действие средства.
Согласно одному из примеров реализации, микроорганизмы представляют собой бактерии, выделенные из материала, полученного у субъекта или донора, а также археи и/или грибы, выделенные из собственной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора, выбранного из группы, включающей мать и/или родственников по материнской линии, и дополнительно, компонент, усиливающий действие средства.
Согласно одному из примеров реализации, в качестве дополнительного компонента, усиливающего действие средства, средство дополнительно содержит бактериофаги, выделенные из материала, полученного у субъекта или донора.
Согласно одному из примеров реализации, материал, полученный у субъекта или донора, может представлять собой материал, полученный из ротовой полости (слюну, соскобы, смывы со слизистой, мокроту), других отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (пищевода, желудка, кишечника), фекалий, кожи, дыхательных путей, половых органов, уретры, конъюнктивы, наружного слухового прохода.
Согласно одному из примеров реализации, соотношение в средстве бактерий, выделенных из собственной микрофлоры, к бактериофагам, выделенным из собственной микрофлоры, составляет от 1000:1 до 1:1000.
Согласно одному из примеров реализации, соотношение бактерий к бактериофагам в средстве выбрано из следующих: от 1000:1 до 100:1, от 100:1 до 10:1, от 10:1 до 1:10; от 1:10 до 1:100; от 1:100 до 1:1000. Согласно одному из примеров реализации, в качестве дополнительного компонента, усиливающего действие средства, средство дополнительно содержит бактерии микрофлоры, выращенные на питательной среде, включающие пока не культивируемые микроорганизмы микрофлоры.
Согласно одному из примеров реализации, средство дополнительно содержит как бактериофаги, выделенные из материала, полученного у субъекта или донора, так и дополнительные микроорганизмы микрофлоры, выращенные на питательной среде, включающие пока не культивируемые микроорганизмы микрофлоры.
Указанные дополнительные микроорганизмы микрофлоры могут быть выращены на питательной среде заранее и храниться до добавления в активный компонент при подходящих условиях, при этом добавление указанных дополнительных микроорганизмов может быть осуществлено непосредственно перед приемом средства, в частности за примерно 1 час, примерно 1 день перед приемом средства.
Согласно одному из вариантов реализации микрофлора может представлять собой нормальную микрофлору здоровых людей, без ограничения перечисленным, микрофлору ротовой полости (слюны, соскобов, смывов со слизистой, мокроты), других отделов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) (пищевода, желудка, кишечника), фекалий, кожи, дыхательных путей, половых органов, уретры, конъюнктивы, наружного слухового прохода. В качестве донора микрофлоры могут выступать сам носитель микрофлоры (собственная (аутохтонная) микрофлора), родные сестры и братья, мать, а также родные по материнской линии (сестры матери и их дети, все потомки в первом поколении, дети дочерей во втором поколении и т.д.) и другие доноры при отсутствии перечисленных (донорская микрофлора). В одном из примеров реализации микрофлора отобрана у субъекта или донора в детско-юношеском возрасте.
В одном из вариантов реализации субъект представляет собой животное, в частности млекопитающее, в частности, человека любого возраста, в том числе ребенка.
Отбор биологического материала у субъекта или донора проводят стандартными способами. В одном из примеров реализации биологический материал, отобранный у субъекта или донора, например, фекалии, размешивают в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия или другого подходящего буфера и фильтруют для удаления частиц непереваренной пищи, после чего микроорганизмы осаждают центрифугированием.
В одном из примеров реализации смывы с кожи или соскобы со слизистой получают стандартными методами, после чего к биологическому материалу добавляют стерильный изотонический раствор хлорида натрия или другой подходящий буфер.
В одном из примеров реализации для приготовления препарата используют свежесобранную слюну, например, объемом 5-10 мл, в которую добавляют смыв с ватного тампона, которым собирают микробы со слизистой щек. Смыв с тампонов проводят с помощью достаточного объема стерильного изотонического раствора хлорида натрия, например, 1,0 мл. В результате можно получить максимальное разнообразие бактерий ротовой полости, которое включает культивируемые и пока не культивируемые микробы. Далее процедура аналогична той, что используется для получения микробов из другого материала. В частности, полученный материал можно поместить в конические пробирки и провести быстрое осаждение центрифугированием. К полученному осадку можно добавить изотонический раствор хлорида натрия и приготовить индивидуальные дозы, включающие микробы в количестве от 0,001 до 10,0 мл исходной микробной смеси.
В одном из примеров реализации бактериофаги из материала субъекта или донора, после удаления из материала бактерий, фильтруют через фильтр с размером пор 0,17-0,25 мкм, после чего фаги смывают с фильтра минимальным количеством использованного буфера или изотоническим раствором хлорида натрия.
Объем биологического материала, отбираемого у субъекта или донора, определяют в зависимости от возраста субъекта или донора и места отбора материала. Специалист в данной области техники определит требуемый объем материала исходя из типа биологического материала, метода приготовления препарата, фармацевтической формы и типа введения, а также других факторов.
Термины «отобранные ранее», «полученные ранее», «выделенные ранее», относящиеся к микрофлоре и/или микроорганизмам согласно настоящему изобретению, в настоящем описании означают, в частности, что материал, микрофлора или микроорганизмы отобраны, получены или выделены у субъекта или донора до начала проведения восстановления или создания микрофлоры у субъекта, профилактики или лечения заболеваний и состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, до начала воздействия на организм субъекта, которое может привести к нарушению, повреждению или уничтожению микрофлоры субъекта, а также до начала развития заболевания или состояния, связанного с и/или сопровождающегося нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта.
Микрофлору, отобранную у субъекта или донора, можно использовать непосредственно или хранить, в частности в банке микрофлоры.
Микрофлору или средство можно хранить при различных условиях, выбранных, в том числе, из следующих: при температуре примерно -70°C - -80°C, температуре жидкого азота или в виде лиофильно высушенного препарата. Пробы микрофлоры или средство согласно примерам реализации можно хранить в замороженном виде в отдельных флаконах для последующего использования.
Для хранения к пробам отобранной микрофлоры могут быть добавлены стабилизаторы, обеспечивающие их длительное сохранение, которое можно контролировать (например, не чаще 1 раза в год) в течение срока хранения по способности давать рост на специально разработанной авторами питательной среде. В одном из примеров реализации стабилизаторы выбраны из группы, включающей глицерин и другие потенциальные (коммерческие) стабилизаторы.
1
10
1
3
1
5
3
5
5
7
6
8
7
10
3
7
1
12
1
3
1
5
3
5
5
7
6
8
7
10
3
12
В одном из примеров реализации средство получают путем отбора у здоровых субъектов и/или доноров (например, родственников по материнской линии) биологического материала (в том числе, слюны, мокроты, фекалий), удаление из него небактериальных примесей, сохранение полученного материала в виде отдельных проб на протяжении жизни субъекта или донора. Количество бактерий в пробах может составлять от 10-10, например, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, и количество бактериофагов в пробах может составлять от 10-10 в 1 мл/проба, например, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10 в 1 мл/проба.
В одном из примеров реализации средство можно использовать для перорального, энтерального, местного, трансбуккального, сублингвального, дуоденального, трансмукозального, интравагинального, ректального введения, в частности в виде клизм.
В одном из примеров реализации средство согласно описанным аспектам, содержащее штаммы аутохтонной микрофлоры здоровых людей, позволяет восстановить поврежденный бактериобиоценоз при нарушениях собственной микрофлоры, связанных с заболеванием, приемом антибиотиков, возрастом и др.
Введение субъекту средства, содержащего микроорганизмы, выделенные из аутохтонной микрофлоры субъекта или микрофлоры донора, обогащенной бактериофагами, выделенными из биологического материала, отобранного у субъекта и/или донора, и/или дополнительными микроорганизмами микрофлоры, выращенными на питательной среде, включающими пока не культивируемые микроорганизмы микрофлоры, позволяет быстро и эффективно восстановить микрофлору организма субъекта с помощью микроорганизмов и бактериофагов, присущих именно данному субъекту.
Обогащение средства дополнительными микроорганизмами микрофлоры, выращенными на питательной среде, включающими пока не культивируемые микроорганизмы микрофлоры, позволяет достичь концентраций микроорганизмов в средстве, максимально приближенных к концентрациям микроорганизмов в условиях организма субъекта в здоровом состоянии.
12
Согласно одному из примеров реализации, активный компонент может быть получен путем выращивания по меньшей мере части микрофлоры, например, по меньшей мере 100 бактерий на 1 мл или большого числа до 10 бактерий на 1 мл в аэробных или анаэробных условиях.
3
5
5
7
7
9
9
12
Согласно примерам реализации, активный компонент может быть получен путем выращивания по меньшей мере от 100 бактерий на 1 мл до 1000 бактерий на 1 мл, от 1000 бактерий на 1 мл до 10000 бактерий на 1 мл, от 10 до 10 бактерий на 1 мл, от 10 до 10 бактерий на 1 мл, от 10 до 10 бактерий на 1 мл, от 10 до 10 бактерий на 1 мл или большего числа бактерий на 1 мл в аэробных или анаэробных условиях.
Согласно примерам реализации, активный компонент может присутствовать в составе средства в любом количестве, которое способно обеспечить требуемый эффект согласно описанным аспектам и примерам реализации, например, в эффективном количестве. Специалист в области медицины сможет без труда подобрать подходящее количество активного компонента для средства согласно настоящему изобретению, необходимое для достижения требуемого эффекта.
С возрастом количество микроорганизмов и бактериофагов микрофлоры может снижаться. Соответственно, в одном из примеров реализации микрофлору субъекта или донора отбирают у субъекта детско-юношеского возраста. Введение субъекту микрофлоры, отобранной в детско-юношеском возрасте, может способствовать более быстрому и более эффективному восстановлению микробиоценоза организма субъекта.
В некоторых случаях достаточно введения только бактериофагов, присущих организму субъекта. Бактериофаги являются вирусами бактерий, способствуют их изменчивости, приспособлению, а также могут вызывать их гибель. Обладая высокой чувствительностью, они действуют избирательно на определенные виды бактерий, не причиняя вреда нормальной микрофлоре кишечника. Соответственно, бактериофаги могут использоваться для лечения и профилактики заболеваний и состояний, связанных с нарушением нормального биоценоза организма.
Известно применение бактериофагов для повышения лечебного эффекта и восстановления нормальной микрофлоры. При отсутствии чувствительных к ним бактерий длительность пребывания бактериофагов в организме человека не более 1-3 дней. Они дают мало побочных реакций и осложнений, повышают эффективность лечения различными антибактериальными препаратами, способствуют повышению иммунитета. Известно, что бактериофаги могут использоваться для лечения дисбактериоза новорожденных и детей первого года жизни.
Однако известные препараты для лечения нарушений микрофлоры с использованием бактериофагов обладают рядом недостатков. Насколько известно авторам настоящего изобретения, имеющиеся препараты на основе бактериофагов узкоспецифичны вследствие использования конкретных фагов, которые разрушают определенные виды бактерий. Кроме того, в организме быстро появляются фагоустойчивые штаммы, поэтому лечение в этом случае не может быть продолжительным. Также бактериофаги могут вызвать аллергические реакции.
В отличие от известных препаратов с использованием бактериофагов, согласно настоящему изобретению используют бактериофаги, выделенные из материала, полученного у субъекта или донора по материнской линии. Это позволяет повысить эффективность восстановления микрофлоры, исключить аллергические реакции и также в частных случаях реализации обеспечить комплексное воздействие на организм, при котором активные компоненты состава согласно изобретению усиливают действие друг друга, в частности, присутствие наряду с бактериями собственной микрофлоры бактериофагов может способствовать подавлению развития чужеродных микроорганизмов и восстановлению нормальной микрофлоры субъекта.
Согласно примерам реализации, средство может быть однокомпонентным или многокомпонентным, например, может быть представлено в виде композиции, состава, препарата, в том числе фармацевтических композиции, состава, препарата, и лекарственного средства, необязательно содержащих по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
В одном из примеров реализаций фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель может быть выбран из группы, включающей следующие вещества: хлорид натрия (например, в виде изотонического раствора), активированный уголь (например, пудра активированного угля), диоксид кремния, мел (например, взвесь частиц мела), сахар, лактоза, желатин, крахмал, поливиниловый спирт (ПВС), поливинилпирролидон (ПВП), целлюлоза, метилцеллюлоза (МЦ), оксипропилметил целлюлоза (ОПМЦ), карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), натрий-карбоксиметилцеллюлоза (Na-КМЦ) и другие вещества, традиционно используемые в качестве фармацевтически приемлемых носителей и/или наполнителей.
Фармацевтические (лекарственные) дозированные формы
Согласно одному из примеров реализации, предложена фармацевтическая дозированная форма для восстановления и/или создания микрофлоры субъекта, а также для профилактики и/или лечения заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры, содержащая средство согласно описанным аспектам и примерам реализации и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Фармацевтические дозированные формы могут быть приготовлены в форме капсул, таблеток, пеллет, каплет, порошка, взвеси в воде, взвеси в питательной среде или другой подходящей жидкости, суспензии, эмульсии, аэрозоля, геля, лиофилизата, крема.
Фармацевтические дозированные формы могут быть приготовлены в форме для перорального, энтерального, местного, трансбуккального, сублингвального, дуоденального, трансмукозального, интравагинального, ректального введения.
Согласно примерам реализации изобретения, предложены фармацевтические дозированные формы, приготовленные в форме, пригодной для растворения в ротовой полости, тонком кишечнике, желудке, толстой кишке.
Согласно примерам реализации изобретения, предложены дозированные формы, подходящие для буккального или сублингвального введения, для трансмукозального введения, например, с помощью эндоскопа, для интравагинального введения.
Согласно примерам реализации изобретения, предложенные средство и/или фармацевтические формы можно использовать для лечения заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием микрофлоры субъекта, таких как язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, синдром повышенной проницаемости кишечника, кандидоз слизистых, дисфункции кишечника, метеоризм, вагиноз, опухолевые заболевания; заболевания и/или состояния, возникающие на фоне гормональных нарушений, длительной антибиотикотерапии, рентгено- и химиотерапии, действия цитостатиков и лекарственных препаратов, применяемых в трансплантологии, при онкологических заболеваниях, в результате применения противоопухолевых лекарственных средств; заболевания и/или состояния, связанные с рождением кесаревым сечением и рождением естественным путем суррогатной матерью.
Согласно еще одному аспекту изобретения, предложен набор для лечения заболеваний и состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры, содержащий средство или по меньшей мере одну единичную дозированную форму согласно описанным аспектам и примерам реализации и инструкции по введению субъекту.
Лекарственные дозированные формы (лекарственное средство, препарат) для введения субъекту могут быть приготовлены с помощью стандартных методов.
В одном из примеров реализации для приготовления энтеральной лекарственной формы в виде кишечнорастворимых капсул к смеси могут быть добавлены пудра активированного угля или диоксида кремния или взвесь частиц мела, или целлюлозы, или иного наполнителя для создания консистентной смеси, пригодной для заполнения капсул. В одном из примеров реализации лекарственное средство применяют перорально с продолжительностью, определяемой состоянием субъекта и типом патологии.
Для энтерального приема также могут быть использованы жидкие лекарственные формы. Такие формы могут быть приготовлены путем разведения проб микрофлоры водой или другой жидкостью, пригодной для питья. Субъект получает препарат в виде капель или жидкости для питья. Препарат может быть обогащен различными консистентными пищевыми добавками для придания гелеобразной формы и/или вкусовыми пищевыми добавками.
Препарат можно также вводить в кишечник ректально, например, с помощью клизм, или перорально, для чего пробы разводят водой или другой жидкостью, пригодной для такого пути введения, и субъект получает препарат в виде капель или жидкости для питья.
Для применения лекарственного препарата местно, например, для нанесения на кожу или слизистые, к микробному материалу могут быть добавлены разрешенные вещества, например, фармацевтически приемлемые, для придания требуемой консистенции и/или адгезивных свойств, и/или вкусовых свойств, и/или окраски, и/или других косметически и потребительски важных свойств.
Способы восстановления состава микрофлоры
Согласно изобретению, предложены способы восстановления состава или создания микрофлоры организма, нарушенной или ослабленной в результате заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, включающие введение средства или фармацевтической дозированной формы согласно любому из описанных выше аспектов.
Согласно примерам реализации, заболевания и/или состояния, связанные с и/или сопровождающиеся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, выбраны из группы, включающей язвенный колит, синдром раздраженного кишечника, синдром повышенной проницаемости кишечника, кандидоз слизистых, дисфункции кишечника, метеоризм, вагиноз, опухолевые заболевания, заболевания и/или состояния, возникающие на фоне гормональных нарушений, длительной антибиотикотерапии, рентгено- и химиотерапии, действия цитостатиков и других лекарственных препаратов, применяемых в трансплантологии, при онкологических заболеваниях, в результате применения противоопухолевых лекарственных средств; заболевания и/или состояния, связанные с рождением кесаревым сечением и рождением естественным путем суррогатной матерью.
Согласно примерам реализации опухолевые заболевания представляют собой заболевания, обусловленные превращением нормальных клеток органов и тканей в склонные к неконтролируемому разрастанию опухолевые клетки. Такие заболевания включают доброкачественные и злокачественные новообразования и могут представлять собой фиброму, миому, остеому, липому, рак, карциному, саркому, бластому, лимфому, лейкоз, меланому, тератому или глиому любого органа, например, органа желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы, дыхательной системы, нервной системы, покровной системы, опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистой системы, системы кроветворения, и, в частности, опухоли кишечника, включая тонкий кишечник, толстый кишечник, прямую кишку, двенадцатиперстную кишку; желудка, пищевода, печени, поджелудочной железы, полости рта и глотки, желчного пузыря, сердца, гортани, легкого, молочной железы, кожи, яичника, предстательной железы, матки, щитовидной железы, головного и спинного мозга, без ограничения перечисленными.
Согласно изобретению, предложенный способ включает введение микроорганизмов, включающих бактерии, выделенные из собственной нормальной микрофлоры здорового субъекта или микрофлоры донора по материнской линии. Дополнительно вместе с бактериями микрофлоры для лечения можно использовать бактериофаги микрофлоры, а также перед началом лечения препарат может быть обогащен собственными бактериями, выращенными на богатой питательной среде в аэробных или анаэробных условиях, после посева хранящихся проб микрофлоры субъекта, подвергаемого лечению, или его родственников по материнской линии.
Согласно одному из вариантов способ восстановления состава микрофлоры организма субъекта, нарушенной или ослабленной в результате заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, включает:
- отбор пробы нормальной микрофлоры субъекта, и/или микрофлоры донора, выбранного из родственников субъекта, например, родственников по материнской линии;
- приготовление средства, содержащего микроорганизмы, выделенные из собственной микрофлоры субъекта и/или его родственников, например, родственников по материнской линии, включая бактерии, выделенные из микрофлоры, и/или бактерии совместно с бактериофагами, выделенными из микрофлоры, и/или только изолированные бактериофаги, выделенные из микрофлоры;
- проведение воздействия на субъект, при котором происходит нежелательное нарушение его микрофлоры;
- введение субъекту эффективного количества приготовленного средства в течение периода времени, достаточного для восстановления нормальной микрофлоры.
Режим введения микрофлоры может составлять от одних суток до одного года, возможно, от 1 суток до 10 суток, от 10 суток до 20 суток, от 10 суток до 30 суток, и более.
В одном из вариантов, предложен способ профилактики и лечения, включающий введение средства, или фармацевтической формы, как описано выше, в течение периода от 1 суток до 5 суток, с перерывом от 1 суток до 20 суток, далее повтор введения от 1 суток до 5 суток.
В одном из вариантов, предложен способ профилактики и лечения, включающий введение средства или фармацевтической формы, как описано выше, в течение периода от 5 суток до 10 суток, с перерывом от 1 суток до 20 суток, далее повтор введения от 5 суток до 10 суток, при необходимости, повтор указанной схемы еще раз.
В одном из вариантов, отбор проб нормальной микрофлоры субъекта проводят перед началом воздействия на субъект, которое может вызвать нарушение состава микрофлоры, например, перед началом лечения антибиотиками, или перед началом лечения другими лекарственными препаратами, которые могут вызвать нарушение микрофлоры, или воздействия излучением, в таких случаях, как например, воздействие на доброкачественные или недоброкачественные опухоли, у субъекта, которому назначено такое лечение, отбирают пробы микрофлоры, которые хранят в соответствующих условиях до окончания поражающего воздействия. После окончания поражающего воздействия готовят препарат, содержащий бактерии, выделенные из здоровой микрофлоры субъекта, как описано выше, для восстановления нормальной микрофлоры субъекта.
В другом варианте, возможно, что на момент обращения к специалисту субъекту уже было проведено лечение препаратами, приводящими к нарушению микрофлоры, или же субъект был подвергнут облучению, приводящему к нарушению нормальной микрофлоры, например, в случае аварии на атомной электростанции, работ по восстановлению аварии, случайного контакта с поражающим излучением, или лечению, такому как протонная, фотонная терапия, или воздействию другого излучения. В этом случае при отсутствии возможности отбора нормальной микрофлоры субъекта, может быть выбран способ лечения с использованием микрофлоры донора, выбранного из родственников субъекта, например, родственников по материнской линии, включая мать, сестер матери и других родственников по материнской линии.
Согласно одному из вариантов, способ восстановления состава микрофлоры организма, нарушенной или ослабленной в результате заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, включает
- отбор микрофлоры донора, выбранного из родственников субъекта по материнской линии;
- приготовление из отобранной микрофлоры средства, содержащего микроорганизмы, выделенные из микрофлоры родственника по материнской линии, включая бактерии, выделенные из микрофлоры, и/или бактерии совместно с бактериофагами, выделенными из микрофлоры, и/или только изолированные бактериофаги, выделенные из микрофлоры;
- введение субъекту эффективного количества приготовленного средства в течение периода времени, достаточного для восстановления нормальной микрофлоры, как описано выше.
В одном из вариантов, предложен способ восстановления микрофлоры субъекта, который включает плановое воздействие на микрофлору субъекта для ослабления или уничтожения патогенной микрофлоры, с последующим восстановлением микрофлоры с использованием микрофлоры, полученной от здорового донора по материнской линии.
Согласно одному из вариантов, способ восстановления состава микрофлоры организма, нарушенной или ослабленной в результате заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, включает
- осуществление воздействия на субъект, вызывающего нарушение, ослабление или уничтожение его микрофлоры;
- отбор микрофлоры донора, выбранного из родственников субъекта по материнской линии;
- приготовление из отобранной микрофлоры средства, содержащего микроорганизмы, выделенные из микрофлоры родственника по материнской линии, включая бактерии, выделенные из микрофлоры, и/или бактерии совместно с бактериофагами, выделенными из микрофлоры, и/или только изолированные бактериофаги, выделенные из микрофлоры;
- введение субъекту эффективного количества приготовленного средства в течение периода времени, достаточного для восстановления нормальной микрофлоры, как описано выше.
В одном из вариантов предложен способ стимулирования иммунной системы организма, ослабленной в результате заболеваний и/или состояний, связанных с и/или сопровождающихся нарушением или отсутствием собственной микрофлоры субъекта, включающий введение средства или фармацевтической дозированной формы согласно любому из описанных аспектов.
Согласно еще одному аспекту изобретения, предложен способ восстановления состава микрофлоры и увеличения продолжительности жизни субъекта посредством введения микроорганизмов, выделенных из собственной микрофлоры субъекта или его родственников по материнской линии в молодом возрасте, включая бактерии, выделенные из микрофлоры, и/или бактерии совместно с бактериофагами, выделенными из микрофлоры, и/или только изолированные бактериофаги, выделенные из микрофлоры.
Согласно еще одному аспекту изобретения, предложен способ восстановления повышенной проницаемости кишечника и/или коррекции синдрома повышенной проницаемости кишечника посредством введения микроорганизмов, выделенных до начала индукции повышения проницаемости кишечника из собственной микрофлоры субъекта и/или его родственников по материнской линии, включая бактерии, выделенные из микрофлоры, и/или бактерии совместно с бактериофагами, выделенными из микрофлоры, и/или только изолированные бактериофаги, выделенные из микрофлоры.
Изобретение иллюстрируют нижеприведенные примеры, которые не ограничивают объем охвата настоящего изобретения, а предназначены лишь для пояснения возможных способов реализации изобретения, которые будут понятны специалисту в данной области при ознакомлении с настоящим описанием.
Примеры
Пример 1
Наследование ядра микробиоты по материнской линии
Для определения передачи ядра микробиоты по материнской линии, авторы провели сравнительное исследование состава микрофлоры членов выбранной для исследования семьи и определили степень ее схожести. Состав семьи:
- Мать, 29 лет
- Отец, 31 год
- Сын, 3 года
- Дочь, 2 года.
ДНК из проб выделяли с использованием набора "ДНКСорб В" ("ИнтерЛабСервис", Россия). Амплификацию проводили, используя универсальные бактериальные праймеры, фланкирующие участок V1-V3 гена 16S рРНК - 9F и 541R. Метагеномное секвенирование фрагмента гена 16S рРНК произведено на секвенаторе Roche-454 (Genome Sequencer FLX Ti).
В результате исследования было получено 53492 прочтений, то есть среднее покрытие составило 53492/4 образца = 13373 прочтения.
Для оценки сходства микробиотического профиля (Таблица 1) использовали UniFrac анализ. При этом для оценки результатов исследования учитывали только виды микроорганизмов, представленные у всех членов семьи, то есть те микроорганизмы, которые формируют ядро микрофлоры.
Как видно из представленной таблицы, наибольшее сходство (меньшее расхождение) обнаружено в парах «Мать/сын», «Мать/дочь» в сравнении с «Отец/сын» и «Отец/дочь», соответственно.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что микрофлора детей наследуется в большей степени от матери.
Пример 2
Ядро микробиоты в пробах микрофлоры разной локализации
Для подтверждения того, что микроорганизмы, формирующие ядро микрофлоры, представлены в микрофлоре разной локализации, оценили распространенность разных видов бактерий в слюне, на коже и в фекалиях одного и того же человека.
ДНК из проб (от «Матери» из Примера 1) выделяли с использованием набора "ДНКСорб В" ("ИнтерЛабСервис", Россия). Амплификацию проводили, используя универсальные бактериальные праймеры 27F-534R, фланкирующие гипервариабельный участок гена 16S рРНК.
27F: '5-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3'
534R: '5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
Метагеномное секвенирование фрагмента гена 16S рРНК произведено на секвенаторе Roche-454 (Genome Sequencer FLX Ti).
В результате эксперимента, установлено, что в пробах слюны, кожи и в фекалиях присутствуют представители одних и тех же таксонов микроорганизмов, в частности:
Actinomycetales
Bacteroidales
Flavobacteriales
Bacillales
Lactobacillales
Clostridiales
Erysipelotrichales
Selenomonadales
Fusobacteriales
Neisseriales
Campylobacterales
Pasteurellales
Таким образом, установлено, что «ядро» микрофлоры в слюне, коже и в фекалиях одного и того же человека представлено бактериями одних и тех же таксонов.
По имеющимся у авторов данным аналогично представлены в микробиоте и представители Архей.
Пример 3
Развитие патологического процесса при действии бактериофагов, не являющихся частью собственной микрофлоры субъекта
Эксперимент проводили на крысах массой 200 г, которые 10 дней получали энтерально с водой набор бактериофагов, избирательно действующих на бактерии родов Staphylococcus, Streptococcus, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, и виды E. coli и K. pneumonia, не являющихся частью собственной микрофлоры субъекта. После 10 дней приема у животных не было зарегистрировано изменений со стороны функций ЖКТ и, в частности, изменения характера стула. Одновременно, после третьего дня у животных зарегистрировано ухудшение состояния, которое проявлялось в изменении состояния шерсти, снижении веса и общей заторможенности. После окончания приема чужеродных бактериофагов у животных определена проницаемость стенки кишки при помощи оценки изменения соотношения лактулоза : маннитол в моче.
Авторы использовали изменение отношения "лактулоза : маннитол" для оценки того, могут ли неродственные бактериофаги вызывать заболевания микрофлоры, проявляющиеся со стороны организма хозяина, предположительно за счет увеличения проницаемости кишечника. С этой целью провели сравнение изменений выделений с мочой маннитола, лактулозы и отношения лактулоза : маннитол у каждого животного перед началом исследования и на 10-й день после использования неродственных бактериофагов.
На 10-й день у животных отмечено незначительное (статистически не достоверное) снижение экскреции маннитола. В то же время зарегистрировано увеличение экскреции лактулозы и резкое увеличение соотношения лактулоза : маннитол, что свидетельствует об увеличении проницаемости кишечника (Таблица 2).
Вывод по результатам эксперимента: Полученные данные свидетельствуют, что пероральный прием бактериофагов, не являющихся частью собственной микрофлоры субъекта, может привести к повышению проницаемости кишечника, то есть к ухудшению состояния организма.
Пример 4
Выращивание собственной микрофлоры в условиях, позволяющих получить рост бактерий, относящихся к пока не культивируемым
Материал от донора засевали на богатую питательную среду. В качестве такой питательной среды можно использовать любую подходящую питательную среду. Перед высевом материал разводили стерильной водой или изотоническим раствором хлорида натрия. Пробы инкубировали при 37°C. Наличие роста (по помутнению агарового зеркала), оценку количества и качества разных бактерий проводили через 48 часов роста. Подавляющее большинство бактерий на среде вырастало в виде смешанных сообществ, похожих на отдельные колонии. В составе смешанных сообществ большинство составляли пока не культивируемые бактерии, не поддающиеся выращиванию на питательных средах.
Материал от донора и совокупность бактерий, выросших на богатой питательной среде, обеспечивающей рост максимально возможного количества разных неродственных микроорганизмов, были исследованы в метагеномном анализе.
В результате пиросеквенирования установлено значительное видовое разнообразие бактерий в мокроте, в составе которого выявлены микроорганизмы 7 порядков, 8 семей, 15 видов. Эти микроорганизмы дали рост на использованной богатой среде, что свидетельствует о ее высокой эффективности для культивирования микробов, которые встречаются в материале донора.
В материале донора при использовании тест-системы по количеству последовательностей преобладали микроорганизмы 2-х порядков: Pseudomonadales и Burkholderiales. Представленность Pseudomonadales и Burkholderiales в материале донора составила 88,3% и 8,5%, а в тест-системе - 76,5% и 1,0%, соответственно. Полученные данные суммированы в таблице 3.
В результате проведенных исследований установлено почти 100% совпадение видов микроорганизмов, дающих рост на богатой питательной среде, в сравнении с видами, находящимися в материале донора. Полученные данные указывают, что представленность выращенных таким образом бактерий из материала донора в максимальной степени соответствует первоначальному составу микробиоты, и поэтому выращенные таким образом бактерии могут быть использованы для включения в лекарственное средство для восстановления или создания микрофлоры.
Пример 5
Приготовление препарата
Для приготовления препарата использовали свежесобранную слюну объемом 5-10 мл, в которую добавляли смыв с ватного тампона, которым собирали микробы со слизистой щек. Смыв с тампонов проводили с помощью 1,0 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Таким образом, получали максимальное разнообразие бактерий ротовой полости, которое включает культивируемые и пока не культивируемые микробы. Полученный материал помещали в конические пробирки и проводили быстрое осаждение центрифугированием. К полученному осадку добавляли изотонический раствор хлорида натрия и готовили индивидуальные дозы, включающие микробы в количестве от 0,001 до 10,0 мл исходной микробной смеси.
Полученную смесь хранили при различных условиях: при -70°C, температуре жидкого азота или в виде лиофильно высушенного препарата. При замораживании к смеси добавляли глицерин в качестве стабилизатора. Пробы хранили в замороженном виде в отдельных флаконах для последующего использования.
Пример 6
Восстановление нормальной микрофлоры после облучения
Для оценки скорости восстановления микробиоты после ее поражения, вызванного облучением, использовали животную модель с применением в качестве терапевтического агента бактерий из микрофлоры животных, не подвергавшихся поражению.
С этой целью использовали половозрелых белых нелинейных крыс массой 180-200 грамм (питомник Рапполово, Ленинградская область). Животные содержались попарно, до появления потомства. После того, как возраст потомства достигал 4 месяцев, животных включали в эксперимент в качестве реципиентов микрофлоры.
Повреждение микрофлоры у крыс вызывали при помощи сочетанного поражения радиацией (18 Грей, день -3) и использования комбинации антибиотиков: тетрациклин, метронидазол за 3 дня до начала эксперимента (дни -3, -2 и -1). В день 0, животные получали 1 раз изолированную микробную смесь, выделенную из фекалий (как описано в работе J. Vaahtovuo et al. Quantification of bacteria in human feces using 16S rRNA-hybridization, DNA-staining and flow cytometry. Journal of Microbiological Methods, Volume 63, Issue 3, December 2005, Pages 276-286.)
Животных разделили в 5 групп:
Группа 1. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии собственной микрофлоры, выделенной до начала лечения.
Группа 2. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии микрофлоры собственной матери.
Группа 3. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии от собственного отца.
Группа 4. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии микрофлоры от неродственных крыс.
Группа 5. Животные с поражением бактерий микрофлоры, получавшие в качестве лечения соответствующий объем растворителя, использованного для приготовления препарата (контрольная группа).
Состав микрофлоры у реципиентов определяли, как описано в предыдущих примерах, в следующие моменты времени: до начала исследования, в день 0 (день -3 после повреждения микрофлоры, но до начала лечения), через 2-4-8-12 недель после начала лечения. Степень восстановления микрофлоры оценивали в процентах восстановления разнообразия филотипов (выражаемого в OTU - оперативная таксономическая единица) микрорганизмов, обнаруженных в фекалиях.
Результаты представлены в таблице 4
Таким образом, использование представителей микробиоты собственной микрофлоры, полученной до воздействия на организм субъекта, или представителей микробиоты матери позволяет эффективно и быстро восстановить состав микрофлоры после негативного воздействия на организм субъекта, приводящего к поражению или уничтожению собственной микрофлоры субъекта.
Пример 7
Восстановление нормальной микрофлоры после облучения
В данном примере использовали схожую экспериментальную модель поражения микрофлоры, что и в предыдущем примере, однако в качестве терапевтического агента применяли как бактерии, так и бактериофаги, выделенные из микрофлоры животных, не подвергавшихся поражению.
Повреждение микрофлоры у крыс вызывали при помощи сочетанного поражения радиацией (18 Гр, день -3) и использования комбинации антибиотиков: тетрациклин, и метронидазол за 3 дня до начала эксперимента (дни -3, -2 и -1). В день 0, животные получали 1 раз бактерии и бактериофаги, выделенные после очищения фекалий от дебриса (как описано в работе J. Vaahtovuo et al. Quantification of bacteria in human feces using 16S rRNA-hybridization, DNA-staining and flow cytometry. Journal of Microbiological Methods, Volume 63, Issue 3, December 2005, Pages 276-286).
Животных разделили в 5 групп:
Группа 1. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги собственной микрофлоры, выделенной до начала воздействия.
Группа 2. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги микрофлоры собственной матери.
Группа 3. Реципиенты микрофлоры, получавшие представителей собственной микрофлоры, выделенной до начала воздействия.
Группа 4. Реципиенты микрофлоры, получавшие представителей микробиоты собственной матери.
Группа 5. Животные с поражением бактерий микрофлоры, получавшие в качестве лечения соответствующий объем растворителя, использованного для приготовления препарата (контрольная группа).
Состав микрофлоры у реципиентов определяли, как описано в предыдущих примерах: до исследования, в день 0 (день -3 после повреждения микрофлоры, но до начала лечения), через 2-4-8-12 недель после начала лечения. Степень восстановления микрофлоры оценивали в процентах восстановления разнообразия филотипов (выражаемого в OTU) микрорганизмов, обнаруженных в фекалиях.
Результаты представлены в таблице 5
Таким образом, использование представителей микробиоты совместно с бактериофагами собственной микрофлоры, полученной до воздействия на организм субъекта, или бактерий и бактериофагов микрофлоры матери, позволяет эффективно и быстро восстановить состав микрофлоры после негативного воздействия на организм субъекта.
Пример 8
Восстановление нормальной микрофлоры после ее повреждения
Для оценки возможности восстановления микробиоты после ее поражения, использовали животную модель с применением в качестве терапевтического агента бактериофагов из микрофлоры самих животных до формирования патологического процесса, или других животных данного выводка, родственных по материнской линии, не подвергавшихся поражению.
Повреждение микрофлоры у крыс вызывали при помощи комбинации ампициллина и метронидазола за 3 дня до начала эксперимента (дни -3, -2 и -1). Клинически поражение микрофлоры оценивали по развитию состояния дисбиоза, проявляющегося в виде антибиотикассоциированной диареи, которая развилась у 20% животных к дню 0.
В день 0, животные получали 1 раз бактериофаги, полученные от животных, родственных по материнской линии, или выделенные у животного до операции по повреждению микрофлоры после очищения фекалий от дебриса, как описано в работе J. Vaahtovuo et al. Quantification of bacteria in human feces using 16S rRNA-hybridization, DNA-staining and flow cytometry. Journal of Microbiological Methods, Volume 63, Issue 3, December 2005, pages 276-286. Некоторым животным по такой же схеме вводили комбинацию бактерий и бактериофагов.
Животных разделили в 5 групп:
Группа 1. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги собственной микрофлоры, выделенной до начала воздействия.
Группа 2. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги микрофлоры матери.
Группа 3. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии собственной микрофлоры, и бактериофаги, собственной микрофлоры, выделенной до начала воздействия.
Группа 4. Реципиенты микрофлоры, получавшие представителей микробиоты собственной матери и бактериофаги микрофлоры матери.
Группа 5. Реципиенты микрофлоры, получавшие представителей микробиоты собственной микрофлоры, выделенной до начала воздействия без бактериофагов.
Группа 6. Животные с поражением бактерий микрофлоры, получавшие в качестве лечения соответствующий объем растворителя, использованного для приготовления препарата (контрольная группа).
Степень восстановления микрофлоры оценивали по числу животных, у которых наблюдалось исчезновение симптомов дисбактериоза и у которых нормализовался стул.
Результаты представлены в таблице 6.
Таким образом, использование представителей бактериофагов, выделенных из собственной микрофлоры, полученных до воздействия на организм субъекта, или бактериофагов, выделенных из микрофлоры матери, позволяет эффективно и быстро восстановить состав микрофлоры после негативного воздействия. Использование бактериофагов совместно с микробиотой более эффективно, чем применение одних бактерий.
Пример 9
Влияние микрофлоры матери на восстановление микрофлоры потомства, рожденного кесаревым сечением
Для оценки влияния микрофлоры матери на восстановление микрофлоры потомства, рожденного кесаревым сечением, использовали модель на белых нелинейных крысах. Известно, что потомство, рожденное кесаревым сечением, демонстрирует замедленную прибавку в весе в сравнении с потомством, рожденным естественным путем. С этой целью беременность части крыс опытной группы разрешали путем кесарева сечения, под наркозом, в соответствии с декларацией Guide for the Care and Use of Laboratory (Institute of Laboratory Animal Resources (US). Committee on Care, Use of Laboratory Animals, & National Institutes of Health (US). Division of Research Resources. (1985). Guide for the care and use of laboratory animals. National Academies.).
Потомство от каждой самки было разделено на следующие группы:
Опытная группа - ежедневно, в виде капель получала смесь бактерий и фагов, предварительно выделенных из фекалий матери.
Группа контроля - получала только молоко матери.
Оценивали динамику прибавки веса в % от нормы на 7 и 14 день после родов (Таблица 7).
Установлено, что введение животным, рожденным при помощи кесарева сечения, бактерий и бактериофагов из микрофлоры матери приводит к нормализации прибавки веса животных.
Пример 10
Оценка возможности дополнительного выращивания представителей микробиоты после хранения для обогащения препарата.
Используя богатые питательные среды, выращивали микроорганизмы, включающие бактерии, выделенные из собственной микробиоты. В качестве питательной среды можно использовать любую доступную питательную среду, подходящую для выращивания микроорганизмов. Было проведено также сравнительное метагеномное исследование с качественным определением представленности микроорганизмов в исходном материале и выросших на использованной питательной среде. Также была оценена возможность сохранения представленности микроорганизмов после длительного хранения (12 месяцев при -70°C).
Выделение ДНК из патологического материала и выросших на среде бактерий проводили при помощи стандартного набора "ДНК сорб-В" (Россия) согласно имеющемуся протоколу. Амплификацию проводили, используя эубактериальные праймеры 27F-534R, фланкирующие гипервариабельный участок гена 16S рРНК.
27F: '5-AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3'
534R: '5-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'
Метагеномное секвенирование фрагмента гена 16S рРНК произведено на пиросеквенаторе Roche/454 Genome Sequencer FLX Titanium. Каждая полученная в ходе пиросеквенирования последовательность была идентифицирована путем сравнения с последовательностями базы данных GenBank и EzTaxon с применением алгоритмов BLASTN поиска и попарного сравнения.
Для идентификации применяли следующие пороги сходства (х = сходство): виды (х≥97%), роды (97>х≥94%), семейства (94>х≥90%), порядки (90>х≥85%), классы (85>х≥80%), филы (80>х≥75%). Для определения видового разнообразия, таксономического состава и сравнения сообществ применяли программу Pyrosequencing pipeline (http://pyro.cme.msu.edu). Полученные последовательности выравнивали и проводили кластерный анализ с помощью программы Complete Linkage Clustering, входящей в состав Pyrosequencing pipeline. Классификация видов на всех этапах работы произведена на основе генотипического подхода в соответствии с международным кодом номенклатуры бактерий (ICNB). В случае если репрезентативная последовательность имела гомологию с последовательностью валидированного микроорганизма более 97%, кластер относили к соответствующему виду.
В результате пиросеквенирования установлено значительное видовое разнообразие микроорганизмов в слюне, в составе которой выявлены микроорганизмы 7 порядков, 8 семейств, 15 видов. Эти же микроорганизмы дали рост на разработанной авторами питательной среде, что свидетельствует о ее высокой эффективности для обеспечения роста всего разнообразия микробов.
В результате проведенных исследований установлено 100% совпадение типов микроорганизмов, дающих рост на разработанной питательной среде, как непосредственно после забора материала, так и после 12 месяцев его хранения.
Пример 11
Оценка продолжительности жизни
Оценивали изменение продолжительности жизни экспериментальных животных, при этом в качестве терапевтического агента применяли как бактерии с бактериофагами, так и бактериофаги, полученные из микрофлоры этих же животных, ранее или у полученных у родственников по материнской линии в их молодом возрасте.
Начиная с 10 месяца жизни, животные получали один раз бактерии и бактериофаги, выделенные после очищения фекалий от дебриса, как описано в работе J. Vaahtovuo et al. Quantification of bacteria in human feces using 16S rRNA-hybridization, DNA-staining and flow cytometry. Journal of Microbiological Methods, Volume 63, Issue 3, December 2005, Pages 276-286.
Животных (белые нелинейные мыши) разделили на 5 групп:
Группа 1. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги, выделенные из собственной микрофлоры в молодом возрасте.
Группа 2. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги, выделенные из микрофлоры собственной матери в ее молодом возрасте.
Группа 3. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги, выделенные из собственной микрофлоры в молодом возрасте.
Группа 4. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги, выделенные из микрофлоры собственной матери в ее молодом возрасте.
Группа 5. Животные, получавшие в качестве лечения соответствующий объем растворителя, использованного для приготовления препарата (контрольная группа).
Результаты представлены в таблице 9.
Таким образом, использование микроорганизмов, выделенных из собственной микробиоты или микрофлоры родственников по материнской линии, совместно с бактериофагами, выделенными из собственной микрофлоры или микрофлоры родственников по материнской линии, а также использование только изолированных бактериофагов, выделенных в молодом возрасте у самого животного или у родственников по материнской линии, позволяет эффективно и быстро восстановить состав микрофлоры после негативного воздействия, что, в свою очередь, способствует увеличению продолжительности жизни, как видно из данных, приведенных в таблице 9.
Пример 12
Оценка коррекции повышенной проницаемости кишечника
Оценивали возможность коррекции увеличения проницаемости кишечника; при этом в качестве терапевтического агента Применяли как бактерии с бактериофагами, так и бактериофаги, выделенные из микрофлоры этих же животных ранее или полученные у родственников по материнской линии в их молодом возрасте. Повышенная проницаемость кишечника, или синдром повышенной проницаемости кишечника (англ. «leaky gut syndrome»), ассоциированы с развитием значительного количества патологий: болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, шизофрения, депрессия, аутизм, биполярное расстройство, аритмии, кахексия, синдром внезапной смерти, почечная и печеночная недостаточность, гломерулонефрит и другие.
Для моделирования увеличения проницаемости кишечника крысам winstar давали по 4 мл 40% этанола из расчета 2 г/кг/сутки. Данную дозу прогрессивно увеличивали таким образом, что к 14-му дню животные получали 8 г/кг/сутки 40% этанола. Через 30 дней животных разделили в 5 групп:
Группа 1. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги собственной микрофлоры, выделенные до начала введения алкоголя.
Группа 2. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги микрофлоры собственной матери, выделенные до начала введения алкоголя.
Группа 3. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги собственной микрофлоры, выделенные до начала введения алкоголя.
Группа 4. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги микрофлоры собственной матери, выделенные до начала введения алкоголя.
Группа 5. Животные, получавшие в качестве лечения соответствующий объем растворителя, использованного для приготовления препарата (контрольная группа).
Группа 6. Животные того же помета, не получавшие этанол (с неизменным показателем проницаемости кишечника).
Через 10 дней лечения у животных на основании лактулозо/маннитолового теста определяли изменение проницаемости кишечника.
Результаты представлены в таблице 10.
Таким образом, использование представителей микробиоты совместно с бактериофагами собственной микрофлоры или микрофлоры родственников по материнской линии, также как и только изолированными бактериофагами, выделенными до индукции повышения проницаемости кишки, у самого животного или у родственников по материнской линии, позволяет эффективно и быстро корректировать синдром повышенной проницаемости кишечника и восстановить проницаемость кишечника.
Пример 13
Предупреждение развития опухолевых процессов
Оценивали возможность предотвращения возникновения опухолевого процесса у экспериментальных животных при применении средства согласно настоящему изобретению, при этом в качестве терапевтического агента применяли как бактерии с бактериофагами, так и бактериофаги, полученные из микрофлоры этих же животных ранее или полученные от родственников по материнской линии в их молодом возрасте.
Начиная с 8 недели жизни, для индукции канцерогенеза животным 1 раз в неделю вводили азоксиметан 10 мг/кг интраперитонеально в течение 6 недель, как описано в работе Fukutake М et al. Suppressive effects of nimesulide, a selective inhibitor of cyclooxygenase-2, on azoxymethane-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis, Volume 19, Issue 3, 1998, Pages 1939-1942.
Начиная с 1-го дня введения азоксиметана, животные получали в качестве терапевтического агента как бактерии с бактериофагами, так и бактериофаги, полученные из микрофлоры этих же животных ранее или полученные у родственников по материнской линии в их молодом возрасте.
Животных (белые нелинейные мыши) разделили на 5 групп:
Группа 1. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги, выделенные из собственной микрофлоры в молодом возрасте.
Группа 2. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги, выделенные из микрофлоры собственной матери в ее молодом возрасте.
Группа 3. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги, выделенные из собственной микрофлоры в молодом возрасте.
Группа 4. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги, выделенные из микрофлоры собственной матери в ее молодом возрасте.
Группа 5. Животные, получавшие в качестве лечения соответствующий объем растворителя, использованного для приготовления препарата (контрольная группа).
Результаты представлены в таблице 11.
Таким образом, из данных, приведенных в таблице 11, видно, что применение микроорганизмов, выделенных из собственной микробиоты животного или микрофлоры родственников по материнской линии, совместно с бактериофагами, выделенными из собственной микрофлоры или микрофлоры родственников по материнской линии, а также применение только изолированных бактериофагов, выделенных в молодом возрасте у самого животного или у родственников по материнской линии, позволяют снизить вероятность развития канцерогенеза.
Пример 14
Лечение опухолевых процессов
Оценивали изменение развития опухолевого процесса у экспериментальных животных при применении средства согласно настоящему изобретению, при этом в качестве терапевтического агента применяли как бактерии с бактериофагами, так и бактериофаги, полученные из микрофлоры этих же животных ранее или полученные у родственников по материнской линии в их молодом возрасте.
Начиная с 8 недели жизни, для индукции канцерогенеза животным 1 раз в неделю вводили азоксиметан 10 мг/кг интраперитонеально в течение 6 недель, как описано в работе Fukutake М et al. Suppressive effects of nimesulide, a selective inhibitor of cyclooxygenase-2, on azoxymethane-induced colon carcinogenesis in mice. Carcinogenesis, Volume 19, Issue 3, 1998, Pages 1939-1942.
Через 7 дней после завершения введения азоксиметана были выбраны животные с положительной индукцией опухоли, и на протяжении последующих 4 недель животные получали в качестве терапевтического агента как бактерии с бактериофагами, так и бактериофаги, полученные из микрофлоры этих же животных ранее или полученные у родственников по материнской линии в их молодом возрасте. Оценивали изменение прогрессии размера опухоли.
Животных (белые нелинейные мыши) разделили на 5 групп:
Группа 1. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги, выделенные из собственной микрофлоры в молодом возрасте.
Группа 2. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактерии и бактериофаги, выделенные из микрофлоры собственной матери в ее молодом возрасте.
Группа 3. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги, выделенные из собственной микрофлоры в молодом возрасте.
Группа 4. Реципиенты микрофлоры, получавшие бактериофаги, выделенные из микрофлоры собственной матери в ее молодом возрасте.
Группа 5. Животные, получавшие в качестве лечения соответствующий объем растворителя, использованного для приготовления препарата (контрольная группа).
Результаты представлены в таблице 12.
Таким образом, из данных, приведенных в таблице 12, видно, что применение микроорганизмов, выделенных из собственной микробиоты или микрофлоры родственников по материнской линии, совместно с бактериофагами, выделенными из собственной микрофлоры или микрофлоры родственников по материнской линии, а также применение только изолированных бактериофагов, выделенных в молодом возрасте у самого животного или у родственников по материнской линии, позволяют затормозить развитие канцерогенеза.
В настоящей заявке описан ряд примеров и вариантов реализации согласно изобретению. Тем не менее необходимо иметь в виду, что можно разработать различные модификации описанных примеров и вариантов, принципиально не отходя от объема и сущности изобретения. С учетом этого другие варианты реализации входят в объем нижеперечисленных пунктов. При этом все числовые диапазоны, приведенные в настоящем описании, включают все поддиапазоны, содержащиеся в них, а также любые индивидуальные значения, входящие в объем указанных диапазонов. Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в данном описании, включены в настоящее описание посредством ссылки.