СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 2,4-ДИХЛОРФЕНОЛА В КРОВИ МЕТОДОМ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА
METHOD FOR MEASURING BLOOD 2,4-DICHLORPHENOL BY GAS CHROMATOGRAPHY ANALYSIS

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности к санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения 2,4-дихлорфенола в крови.
Из уровня техники известен ряд методов определения хлорфенолов в биосредах. Так, например, в статье «Simultaneous determination by gas chromatography of phenol, 2-chlorophenol, 2,4- and 2,6-dichlorophenol, 2,4,6-trichlorophenol, and 2,3,5,6-tetrachlorophenol in the Urine of Industrially Exposed Workers» (P. B. Roosmalen, A. L. Klein and I. Drummond] (International Archives of Occupational and Environmental Health January 1980, Volume 45, Issue 1, pp. 57-62) описывается метод, в котором методом газовой хроматографии проводят одновременное определение фенола, 2-хлорфенола, 2,4- и 2,6-дихлорфенола, 2,4,6-трихлорфенола и 2,3,5,6-тетрахлорфенола в моче рабочих, подвергшихся экспозиции. Фенолы разделяются методом перегонки водяным паром и затем экстрагируются изопропиловым эфиром. Образцы анализировались без использования метода дериватизации, на газовом хроматографе с использованием стеклянной колонки (180 см×2 мм внутренний диаметр), заполненной 60/80 фракции Теnах GC (ENKA NV, Нидерланды) с детектором ионизации в пламени. Пределы обнаружения в моче составили для фенола 0,1 мг/л мочи и 1 мг/л для ди- и трихлорфенолов.
Однако указанный выше способ характеризуется следующими недостатками:
- большими затратами времени на исследования ввиду сложности выполнения пробоподготовки;
- высокой трудоемкостью выделения хлорфенолов из биосреды.
Также известен способ «Методические указания по идентификации гамма-гхцг, его изомеров (альфа, бета и дельта-гхцг) и метаболитов (полихлорированных фенолов) в биологических жидкостях (кровь), органах, тканях и субклеточных фракциях печени теплокровных животных методом тонкослойной хроматографии», утверждены Минздравом СССР 3 января 1985 г., № 3194-85. Известный способ основан на тонкослойном хроматографическом определении гамма-гексахлорциклогексана, его альфа-, бета- и дельта-изомеров и метаболитов при совместном присутствии в биологическом материале теплокровных с пределом обнаружения 0,01 мг/л.
При реализации этого известного метода цельную кровь (1-5 мл) помещают в мерную пробирку на шлифе, приливают 3-5 мл органического экстрагента - н-гексана, перемешивают и далее экстрагируют на аппарате для встряхивания со средней интенсивностью в течение 5-7 мин. После разделения слоев гексановый экстракт (верхний слой) отделяют с помощью пипетки, соединенной с резиновой грушей, и фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенного в коническую воронку с подложкой из обезжиренной ваты. Экстракцию повторяют, экстракты объединяют. Если образуется устойчивая эмульсия и фазы разделить трудно, в пробирку вносят несколько капель этанола или 0,1-0,2 г (на кончике скальпеля) хлорида натрия. Затем проводят хроматографирование в тонком слое сорбента. Аликвотную часть (0,1 мл) экстракта с помощью микропипетки (микрошприца) наносят на хроматографическую пластинку "Силуфол" или "Кизельгель 60" F. Рядом с пробой наносят различные количества стандартных растворов изомеров гексахлорциклогексан (ГХЦГ), хлорированных фенолов (по 0,2; 1; 2; 5 мкг каждого компонента). Пластинку помещают в камеру для хроматографирования, содержащую смесь н-гексана с ацетоном в соотношении 4:1 ("Силуфол") или 6:1 ("Кизельгель 60" F). Время насыщения камеры 30 мин. После хроматографирования (длина пробега растворителя 15-17 см) пластинку проветривают в горизонтальном положении, а затем обрабатывают одним из проявляющих реагентов с помощью пульверизатора, подключенного к воздушному компрессору. Зоны локализации гамма-, альфа-, бета- и дельта-ГХЦГ, пентахлорфенола, 2,3,4,6-тетрахлорфенола, 2,4,6- и 2,4,5-трихлорфенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфенола обнаруживаются на хроматограммах после облучения УФ-светом в виде бурых пятен. Количественную оценку содержания изомеров ГХЦГ и полихлорированных фенолов в пробе проводят визуально или денситометрически на приборе типа "Оптон".
Недостатками указанного известного метода являются:
- сложность подготовки образцов крови к количественному определению, которую осуществляют путем длительной экстракции и перемешивания;
- недостаточная чувствительность, т.к. количественный анализ в тонкослойной хроматографии характеризуется только как полуколичественный.
3
Также известен Способ опеделения монохлорфенолов в водных средах (Патент РФ №2142627), согласно которому проводят химическую модификацию, экстракционное концентрирование и газохроматографическое детектирование электронозахватным детектором (ДЭЗ), при этом в качестве модифицирующего реагента применяется молекулярный бром в количестве 0,05-0,25% к массе пробы, при содержании монохлорфенолов в воде 0,1-10 мгк/дм. Однако указанный известный способ неприменим для определения монохлорфенолов в крови.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения трихлорметафоса-3 и его метаболитов в биологическом материале методом газожидкостной хроматографии, который включает извлечение остатков трихлорметафоса-3 и хлорфенолов из проб биоматериала (печень, почки, головной мозг, мышцы, кровь, кал, моча) смесью органических растворителей - хлористого метилена и гексана (2:1) с добавлением этилового спирта; концентрировании экстракта и последующем определении на газовом хроматографе с ДЭЗ (детектор электронного захвата) или ДПР (детектор постоянной скорости рекомбинации) (МУК. Методические указания по определению трихлорметафоса-3 и его метаболитов в биологическом материале методом газожидкостной хроматографией. Утверждены Минздравом СССР 28 декабря 1982 г., № 2647-82). При указанном определении готовят 10-процентный гомогенат ткани (печени, почек, головного мозга, мышц, крови) в 0,25 М растворе сахарозы. Для анализа берут 1 мл гомогената, который переносят в делительную воронку на 50 или 100 мл, прибавляют 1 мл этилового спирта и экстрагируют 4 мл смеси растворителей - хлористого метилена с гексаном (2:1) трижды, каждый раз отстаивая смесь в течение 10-15 мин. Экстракты объединяют, сушат в течение 1 ч безводным сульфатом натрия и сливают в чистые пробирки. Отработанный сульфат натрия три раза ополаскивают свежими порциями растворителя по 3-5 мл и присоединяют растворитель к основному экстракту. Экстракт упаривают при комнатной температуре досуха, на что уходит обычно 3-4 дня, или отгоняют на ротационном испарителе. Остаток в колбе смывают 1 мл гексана в пробирку. При естественном упаривании к сухому остатку в пробирке прибавляют 1 мл гексана, обмывая стенки пробирки, и количественно определяют на хроматографе. Нижний предел определения трихлорметафоса-3 0,3 мг/кг, хлорфенолов 0,1 мг/кг, минимально детектируемое количество трихлорметафоса-3 0,2 нг, хлорфенолов 0,1 нг.
Недостатком указанного известного способа является высокая трудоемкость выделения хлорфенолов из биосреды, сложность пробоподготовки.
Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в упрощении стадии пробоподготовки при одновременном повышении чувствительности.
Указанный технический результат достигается предлагаемым способом количественного определения 2,4-дихлорфенола в крови методом газохроматографического анализа, включающим отбор пробы крови, экстракцию органическим экстрагентом из указанной пробы 2,4-дихлорфенола и определение его количества методом газохроматографического анализа с использованием градуировочного графика, при этом новым является то, что перед экстракцией пробу крови подкисляют раствором щавелевой кислоты до pH 2-3, при экстракции в качестве органического экстрагента используют толуол, далее к полученному экстракту добавляют бромирующий реагент и разбавленную водой серную кислоту в объемном соотношении вода: концентрированная серная кислота как 3:1 соответственно, проводят бромирование экстракта в течение 5 минут, после завершения которого избыток брома нейтрализуют раствором сернистокислого натрия, затем полученный бромированный экстракт центрифугируют для отделения толуола, и проводят его ацетилирование трифторуксусным ангидридом в среде пиридина в течение 5 минут, при этом пробу крови, органический экстрагент - толуол, бромирующий реагент, трифторуксусный ангидрид и пиридин берут в следующем объемном соотношении 1:0,5:0,4:0,02:0,02 соответственно.
Центрифугирование бромированного экстракта производят в течение 2-3 минут при 8000 об/мин.
В качестве бромирующего реагента используют бромную воду.
В качестве раствора щавелевой кислоты используют 10%-ный водный раствор.
3
Газохроматографическое определение 2,4-дихлорфенола в пробе крови осуществляют с использованием газового хроматографа с детектором электронного захвата на капиллярной колонке DB-XLB-30 м*0,32 мм*0,5 мкм, при температурном режиме: капиллярная колонка - 135°C-250°C; испаритель - 260°C; детектор - 280°C; расход газа-носителя - азота - 20 см/мин, скорость газа 3-30,0 см/с.
Поставленный технический результат достигается за счет следующего.
Экспериментальным путем обнаружено, что указанный технический результат обеспечивается именно совокупностью предложенных признаков, при реализации которых и достигается высокая чувствительность определения 2,4-дихлорфенола в пробе крови, а также упрощается способ.
При реализации предлагаемого способа подготовку пробы крови к газохроматографическому анализу проводят путем химической модификации 2,4-дихлорфенола, которая включает три этапа.
На первом этапе проводят экстракционное концентрирование 2,4-дихлорфенола из пробы крови методом жидкостной экстракции органическим экстрагентом в кислой среде. Эта стадия предназначена для перевода 2,4-дихлорфенола в более удобную для последующего газохроматографического анализа органическую фазу, для повышения его концентрации в экстракте и для отделения мешающих компонентов из биологической матрицы.
На втором этапе проводят бромирование полученного экстракта, содержащего 2,4-дихлорфенол, молекулярным бромом. При бромировании атомы брома замещают атомы водорода в ароматическом ядре 2,4-дихлорфенола в положении 6 и происходит образование бромпроизводного 6-Бром 2,4-дихлорфенола. При комнатной температуре (20±5°C) реакция бромирования 2,4-дихлорфенола завершается в течение 1 мин с количественным образованием 6-бром 2,4-дихлорфенола.
На третьем этапе проводят этерификацию в среде органического растворителя. При этом превращение 6-бром 2,4-дихлорфенола в эфиры осуществляется путем ацетилирования трифторуксусным ангидридом, реакция катализируется пиридином. Ацетилирование улучшает газохроматографические характеристики бромпроизводных: уменьшает полярность соединений, понижает температуры кипения, нейтрализует активный атом водорода ОН-группы, осложняющий газохроматографический анализ.
Таким образом, пробоподготовка в предлагаемом способе является значительно более простой, чем в прототипе, как по времени, так и по трудоемкости.
Благодаря тому, что эфирные производные 6-бром 2,4-дихлорфенола анализируют методом капиллярной газовой хроматографии с детектором электронного захвата, обеспечивает максимально возможное по чувствительности газохроматографическое определение 6-бром 2,4-дихлорфенола.
В лабораторных условиях был проведен ряд опытов для установления существенности признаков, положенных в основу предлагаемого способа.
3
3
3
3
3
Пример. Согласно заявляемому способу, берут анализируемую пробу крови объемом 5 см, помещают ее в пробирку вместимостью 13,0 см, приливают 3,0 см бидистиллированной воды, 1 см 10% раствора щавелевой кислоты до pH 2-3 и 2,5 см органического экстрагента - толуола и проводят экстракционное концентрирование в течение 5 мин.
3
3
3
Затем к полученному экстракту добавляют бромирующий реагент - бромную воду объемом 2 см и 0,4 см разбавленной серной кислоты (1:3) и бромируют в течение 5 мин. После завершения бромирования избыток брома нейтрализуют 0,6 см раствора сернистокислого натрия.
Для отделения органического экстрагента - толуола экстракт центрифугируют в течение 2-3 мин при 8000 об/мин и затем сушат сульфатом натрия массой 0,5 г.
3
3
Затем проводят превращение вышеуказанного бромированного экстракта в простые эфиры путем ацетилирования с помощью трифторуксусного ангидрида (объем 0,1 см) в среде пиридина (объем 0,1 см) в течение 5 минут.
3
3
Полученный эфир (трифторацетата 2,4-дихлорфенол) в объеме 1 мманализируют газохроматографическим методом с использованием детектора электронного захвата на аппаратно-программном комплексе "Кристалл 5000" на капиллярной колонке серии DB-XLB-30 м*0,32 мм*0,5 мкм, при температурном режиме: колонка 135°C-250°C; испаритель  260°C; детектор  280°C; расход газа-носителя - азота  20 см/мин, скорость газа 3-30,0 см/с, (высокая эффективность метода определения 2,4-дихлорфенола в крови достигнута путем подбора оптимальных условий газохроматографического анализа) и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе по градуировочному графику, который строится посредством использования стандартных растворов 2,4-дихлорфенола.
3
Для построения калибровочного графика использовали следующую методику. Градуировочные характеристики устанавливали на градуировочных растворах 2,4-дихлорфенола методом абсолютной градуировки. Приготовленные растворы хроматографировали на капиллярной колонке не менее 5 раз. На полученной хроматограмме определяли площади пиков определяемых компонентов, и по средним результатам измерений по 5 концентрациям для градуировки строили градуировочную характеристику. Она выражает зависимость площади пика исследуемых веществ на хроматограмме (мВ - при автоматическом обсчете с использованием программно-аппаратного комплекса) от содержания (мкг/см).
3
В пробирки, куда предварительно было введено 5,0 см бидистиллированной воды, вводят микрошприцем различные объемы рабочих растворов 2,4-дихлорфенола для градуировки, согласно таблице 1. Каждая серия состоит из 5 растворов для градуировки.
Таблица 1
Стандартные растворы для установления градуировочной характеристики при определении концентраций 2,4-дихлорфенола
Номер рабочего раствора для градуировки
1
2
3
4
5
Объем исходного раствора (с=0,25 мг/см<sup>3</sup>), мм
1
2
4
8
16
Массовая концентрация 2,4-дихлорфенола, мкг/см<sup>3</sup>
0,05
0,1
0,2
0,4
0,8
3
3
3
3
3
3
3
Затем добавляют 2,5 см толуола и проводят экстракционное концентрирование в течение 5 мин. К полученному экстракту добавляют бромирующий реагент объемом 2 см и 0,4 см разбавленной серной кислоты (1:3) и бромируют в течение 5 мин. После завершения бромирования избыток брома нейтрализуют 0,6 см раствора сернистокислого натрия. Для отделения толуола экстракт центрифугируют в течение 2-3 мин при 8000 об/мин, и затем сушат сульфатом натрия массой 0,5 г. Добавляют трифторуксусный ангидрид (V=0,1 см) и пиридин (V=0,1 см) и проводят реакцию ацетилирования (этерификации) в течение 5 минут. Полученный эфир (трифторацетата 2,4-дихлорфенол) в объеме 1 мм анализируют газохроматографическим методом. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора. На полученной хроматограмме определяют площади пиков определяемых компонентов, и по средним результатам из 5 серий строят градуировочный график. Для получения достоверных результатов анализ каждой градуировочной смеси проводят не менее 2-х раз. Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора.
При проведении исследований была изучена эффективность извлечения 2,4-дихлорфенола из крови путем применения ряда органических экстрагентов: хлористый метилен, диэтиловый эфир, хлористый метилен + гексан, гексан, толуол. Средние значения полноты экстракции 2,4-дихлорфенола из крови представлены в таблице 2.
Таблица 2
Зависимость степени экстракции 2,4-дихлорфенола из крови от природы органического экстрагента при n=5, р=0,95
Органический экстрагент
2,4-хлорфенол
Степень экстракции, %
Введено
Найдено
1. Хлористый метилен
0,002±0,0004
1,1
2. Диэтиловый эфир
0,18
0,011±0,0021
6,1
3. Хлористый метилен + гексан (1:1)
0,0002±0,000015
0,11
4. Гексан
9,25
3,57±0,35
38,6
5. Толуол
5,96±0,43
64
n - число серий опытов; р - вероятность
Установлено, что наибольшее извлечение 2,4-дихлорфенола из крови достигается экстракцией его толуолом - 64%.
Определение 2,4-дихлорфенола в крови включает экстракционное концентрирование его из проб крови толуолом при pH=2-3 и последующем определении на газовом хроматографе с детектором электронного захвата. Наибольшая степень экстракции при подобранных оптимальных условиях газохроматографического анализа и органического растворителя была достигнута при использовании толуола и 10% раствора щавелевой кислоты при pH=2-3.
3
3
3
3
3
3
В процессе исследований установлены оптимальные условия бромирования 2,4-хлорфенола: исходная концентрация брома в растворе, pH среды, продолжительность бромирования. С этой целью к 2 см пробы крови (без 2,4-дихлорфенола) добавляют 5 мм исходного стандартного раствора (концентрация 2,4-дихлорфенола 4,6 мкг/см), затем добавляют 3 см бидистиллированной воды, подкисляют 10% раствором щавелевой кислоты до pH=2-3 и экстрагируют 2 см толуолом в течение 5 минут. Полученный экстракт центрифугируют при 8000 об/мин в течение 2-3 минут и сливают в пробирку объемом 10 см.
3
3
Затем устанавливают время бромирования. Для этого проводят бромирование 2,4-дихлорфенола в полученном органическом экстракте в кислой среде. К указанному экстракту добавляют бромирующий реагент в объеме 2 см и 0,4 см разбавленной серной кислоты, и при pH=2-3 и бромируют образец в течение 1, 3 и 5 минут.
3
3
Избыток брома удаляют из органического экстракта раствором сернистокислого натрия объемом 0,4 см и пробирку энергично встряхивают в течение 3 мин. Затем центрифугируют образец при 8000 об/мин, в течение 2-3 минут до разделения водной и органической фракций. После разделения слоев 1 мм органического экстракта анализируют газохроматографическим методом.
3
Для идентификации 2,4-дихлорфенола в крови применяют реакцию взаимодействия хлорпроизводного фенола с молекулярным бромом. В процессе исследований было установлено, что в кислой среде при избытке молекулярного брома (~10-кратный молярный избыток по сравнению с расчетным стехиометрическим соотношением) бромпроизводное 2,4-дихлорфенола образуется в течение 5 минут с количественным выходом, после чего происходит снижение его концентрации, вызванное окислением (таблица 3).
Таблица 3
Полнота экстракции 2,4-дихлорфенола из крови в зависимости от времени бромирования
Время бромирования, мин
Концентрация, мкг/см<sup>3</sup>
Полнота экстракции, %
Введено
Найдено
1,0
1,11
0,19±0,032
17,1
3,0
1,11
0,45±0,071
40,5
5,0
1,11
0,98±0,054
88,3
В ходе экспериментальных работ по выбору органического экстрагента изучали зависимость полноты экстракции 2,4-дихлорфенола различными экстрагентами в кислой среде с последующим бромированием в течение 5 минут органического экстракта бромной водой (таблица 4).
Таблица 4
Полнота экстракции 2,4-дихлорфенола из крови (бромирование органического экстракта бромной водой)
Органический экстрагент
Концентрация 2,4-дихлорфенола, мкг/см<sup>3</sup>
Полнота экстракции, %
Введено
Найдено
Гексан
9,25
4,98±0,44
53,8
Толуол
9,25
7,1±0,42
76,8
Наибольшая степень экстракции при подобранных оптимальных условиях бромирования 2,4-дихлорфенола и органического растворителя была достигнута при использовании толуола для экстракционного концентрирования в кислой среде при pH=2-3, времени бромирования в течение 5 мин и составила для 2,4-дихлорфенола - 76,8%.
Изучена зависимость полноты экстракции 2,4-дихлорфенола из крови от применения органического экстрагента, бромирования органического экстракта в течение 5 мин в избытке молекулярного брома, ацетилирующего реагента - трифторуксусного ангидрида, реакция катализируется пиридином (таблица 5).
Таблица 5
Полнота экстракции 2,4-дихлорфенола из крови (этерификация трифторуксусным ангидридом в присутствии катализатора пиридина)
Органический экстрагент
Концентрация 2,4-дихлорфенола, мкг/см<sup>3</sup>
Полнота экстракции, %
Введено
Найдено
Гексан
9,25
6,12±0,58
66,2
Толуол
9,25
8,2±0,39
88,8
Оптимальный эффект полноты экстракции изучаемых соединений из пробы крови наблюдался при использовании в качестве органического экстрагента - толуола, ацетилирующего реагента - трифторуксусного ангидрида, катализатора - пиридина, при объемных соотношениях проба крови, толуол, бромирующий реагент, трифторуксусный ангидрид и пиридин как 1:0,5:0,4:0,02:0,02 соответственно. При изменении этого соотношения в большую или меньшую стороны полнота экстракции снижалась.
Основные стадии получения производных 2,4-дихлорфенола и полнота экстракции из крови органическим экстрагентом - гексаном при реализации предлагаемого способа представлены в таблице 6.
Таблица 6
Полнота экстракции 2,4-дихлорфенола из крови на различных стадиях получения производных экстракцией гексаном
Стадии пробоподготовки
2,4-дихлорфенол, мкг/см<sup>3</sup>
Полнота экстракции, %
Введено
Найдено
1. Экстракция гексаном
9,25
3,57
38,6
3. Экстракция гексаном + бромирование
4,98
53,8
4. Экстракция гексаном + бромирование + трифторуксусный ангидрид и пиридин
6,12
66,2
Таким образом, при реализации предлагаемого способа на различных этапах происходит следующее: в экстракционной системе толуол - проба крови извлекается до 64% 2,4-дихлорфенола (таблица 2), бромпроизводных 2,4-дихлорфенола - 76,8% (таблица 4), для их эфирных бромпроизводных степень извлечения увеличивается и достигает для 2,4-дихлорфенола - 88,8% (таблица 5). Нижний предел обнаружения 2,4-дихлорфенола в анализируемом объеме образца крови составляет 0,00005 мкг или 0,05 нг. Предлагаемый способ позволяет увеличить чувствительность определения 2,4-дихлорфенола в крови по сравнению с прототипом в 10 раз.