Совершенствование методов серологической диагностики в системе эпидемиологического надзора за риккетсиозами группы клещевой пятнистой лихорадки

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ В СИСТЕМЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА РИККЕТСИОЗАМИ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ

Н. В. Абрамова1, Н. В. Рудаков12, Н. А. Пеньевская1, Н. Н. Седых3, Л. В. Кумпан1, Е. И. Самойленко2, Т. А. Решетникова2, А. С. Оберт3

1 Омская государственная медицинская академия, г.Омск,

2 ФГУН Омск НИИПОИРоспотребнадзора

3 Алтайский государственный медицинский университет, г. Барнаул

В настоящее время известно около двух десятков риккетсиозов из группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ). Из них в России эпидемиологическое значение имеют клещевой риккетсиоз (КР), или клещевой сыпной тиф Северной Азии, с этиологическим агентом Rickettsia sibirica и астраханская пятнистая лихорадка, вызываемая риккетсиями генокомплекса R.conorii. Отмечены единичные завозные случаи везикулезного риккетсиоза, вызываемого R.akari. Выявлен новый риккетсиоз, вызываемый R. heilongjiangensis, названный Дальневосточным клещевым рикке-тсиозом. Методами генотипирования получены данные, свидетельствующие о возможной этиологической роли R.helvetica в развитии острых лихорадочных заболеваний после присасывания клеща на территории Пермского края. В Приморском крае ранее отмечали случаи лихорадки цу-цугамуши, однако сегодня это заболевание не выявляют из-за отсутствия диагностикума, в то время как в соседней Японии наблюдается рост заболеваемости.

Количество видов риккетсий из группы КПЛ, циркулирующих в природных очагах на территории России, не ограничивается только выше перечисленными. Из клещей различных географических зон с достаточным постоянством удается выделять риккетсии и других, в том числе, новых видов риккетсий, с доказанной и пока не установленной патогенностью для человека. Изучение клинико-эпидемиологической роли патогенов риккетсиозной природы, как хорошо известных, так и новых, в значительной степени, сдерживается отсутствием высоко чувствительных и доступных методов серологической диагностики.

«Золотым стандартом» для диагностики риккетсиозов является реакция непрямой им-мунофлюоресценции (РНИФ), рекомендованная ВОЗ. Однако для нее необходимы корпускулярные антигены, коммерческий выпуск которых отсутствует в связи со значительными технологическими сложностями их получения. В связи с чем, РНИФ достаточно трудоёмка и не пригодна для одновременного исследования большого количества проб. Наиболее распространен-

ным методом, применяемым в практическом здравоохранении, остается реакция связывания комплемента (РСК), которая была предложена для диагностики риккетсиозов еще в 1940-х годах прошлого века. Коммерческие цельнораство-римые антигены для РСК позволяют с высокой специфичностью, но с умеренной чувствительностью выявлять комплементсвязывающие антитела (АТ) к R.siЫrica. Однако, для обнаружения АТ к риккетсиям других видов, эти диагностику-мы, по-видимому, менее пригодны.

В 1980-х годах для диагностики риккетсиозов, вызываемых R.rickettsii, R.tsutsugamushi, R.prowazekii и R.conorii, было предложено использовать иммуноферментый анализ (ИФА). Применение этого метода было ограничено исследовательскими работами в рамках специализированных риккетсиозных лабораторий, при этом авторы отмечали высокую специфичность и чувствительность ИФА для выявления АТ в низких титрах в сравнении с РСК и РНИФ.

Цель работы: апробация и изучение эффективности метода ИФА для серологической диагностики инфекций, вызываемых риккетсиями из группы КПЛ, циркулирующими на территории России.

Выявление антител в сыворотках крови пациентов проводили непрямым твердофазным вариантом ИФА (ИФА-^М и ИФА-IgG). Для сенсибилизации полистироловых планшетов использовали цельнорастворимые антигены, приготовленные по общепринятой методике с нашими модификациями из штаммов риккетсий следующих видов: Я.БШтса БиЬБр. БШтса (Я.БШтса); Я.БШтса БиЬБр. ВЛ-90 ^.ВЛ-90); R.tarasevichiae; R.heilongjiangensis; Я.гаоики; R.akari. Эти штаммы, хранящиеся в коллекции Омского НИИПОИ, были изолированы нами из клещей в различных природных очагах Сибири, Алтая и Дальнего Востока. Исследуемые сыворотки разводили в 10 раз. В качестве конъ-югатов использовали коммерческие антивидовые антитела к ^М и IgG человека. Оптическую плотность (ОП) субстратно-индикаторного раствора измеряли на спектрофотометре. Результат оценивали как положительный, если оптическая плотность анализируемой пробы была выше от-

секающего значения (cut off), рассчитанного по формуле: (ОП1+ ОП2)/2 + 0,2, где ОП1 — оптическая плотность контроля конъюгата, ОП2 — оптическая плотность «отрицательной» контрольной сыворотки.

После предварительной оптимизации условий выполнения ИФА для обнаружения противо-риккетсиозных АТ классов IgM и IgG было исследовано 276 сывороток крови пациентов из трех групп. Первая (референтная) группа состояла из 36 больных с типичной клинической картиной клещевого риккетсиоза, госпитализированных в инфекционное отделение МУЗ ГБ № 11 г. Барнаула в эпидемический сезон (с мая по октябрь) 2006 и 2007 гг.Сыворотки крови от 15 больных КР были параллельно исследованы в ИФА и РСК с коммерческим диагностикумом. Вторая (контрольная группа) состояла из 80 клинически здоровых людей г.Омска, обследованных вне эпидемического сезона КР. Обе группы были сопоставимы по возрастному и половому составу. В третью группу (опытную) вошли 58 лихорадящих больных Тар-ского района Омской области, обследованных по подозрению на клещевой энцефалит (КЭ) и ик-содовый клещевой боррелиоз (ИКБ) в мае-сентябре 2008 г.

Результаты применения ИФА для обнаружения антител к антигенам различных видов риккетсий в сыворотках крови пациентов сравниваемых групп представлены в таблице 1. В контрольной группе только одна проба крови давала положительную реакцию на наличие АТ к антигену R.sibirica. С остальными пятью риккетсиозны-ми антигенами для всех сывороток контрольной группы реакция была отрицательной. Результаты ИФА для обнаружения IgG-АТ к риккетсиям также продемонстрировали высокую специфичность метода. Ни одна проба, ни с одним из исследуемых антигенов не давала положительных реакций.

В группе больных с типичной клиникой КР с помощью ИФА в подавляющем большинстве проб удалось выявить АТ классов ^М и (или) IgG к антигенам различных видов риккетсий. В сыворотках крови лихорадящих больных, контактировавших с клещами на территории Тар-ского района Омской области, также обнаружили АТ к изучаемым риккетсиозным антигенам, хотя процент таких находок значительно меньше, чем у алтайских больных. Вместе с тем, факты выявления противориккетсиозных антител у больных этой группы представляют значительный интерес, поскольку до настоящего времени в Омской области не было зарегистрировано ни одного случая КР, однако в клещах были выявлены R.tarasevichiae, R.raoultii и риккетсия, генетически близкая к R.helvetica. Клинико-эпиде-миологический анализ случаев обнаружения АТ к риккетсиям у больных опытной группы будет представлен в отдельном сообщении.

Важно отметить, что у больных КР из референтной группы чаще всего обнаруживаются АТ к антигену Я^Ыпса зиЬзр. БШтса, что вполне закономерно, так как именно этот вид риккетсий является доминирующим в Алтайском крае. На втором месте по частоте положительных реакций — ИФА с антигеном Я.гаоики, на третьем — с антигеном Я.акагп, на четвертом — с антигеном Я.ТагаБеукЫае, на пятом с антигеном R. heilongjiangensis. Только в одной из 65 проб наблюдали положительную реакцию в ИФА-^М с антигеном R.sibirica subsp. В.1-90.

Антитела класса ^М к Я^Ыпса выявлены в среднем в 81,5 % сывороток крови, причем чаще во второй пробе крови, чем в первой (86,2 % и 77,8 % соответственно). Антитела класса к Я.БШтса выявлены в среднем в 69,2 % сывороток крови, причем чаще в первой, чем во второй сыворотках крови (72,2 % и 65,5 % соответс-

Таблица1

Частота обнаружения методом ИФА антител к различным видам риккетсий в сыворотках крови пациентов Алтайского края и Омской области

Виды риккетсий Референтая группа Контрольная группа Опытная группа

IgM IgG IgM IgG IgM IgG

абс % абс % абс % абс % абс % абс %

R.sibirica subsp. sibirica 53 81,5 45 69,2 1 1,2 0 0 12 9,2 7 5,3

R.raoultii 24 36,9 7 10,8 0 0 0 0 14 10,7 2 1,5

R.akarii 22 33,8 9 13,8 0 0 0 0 12 9,2 2 1,5

R.tarasevichiae 7 10,8 30 4,6 0 0 0 0 11 8,4 0 0

R.heilongjiangensis 3 4,6 0 0 0 0 0 0 9 6,9 0 0

R.sibirica subsp. BJ-90 1 1,5 0 0 0 0 0 0 21 16,0 13 9,9

Количество исследованных сывороток 65 100 65 100 80 100 80 100 131 100 131 100

Примечание: референтная группа — больные клещевым риккетсиозом (Алтайский край), контрольная группа — здоровые люди, опытная группа — лихорадящие больные с подозрением на КЭ или ИКБ (Омская область).

Таблица 2

Эффективность различных алгоритмов применения ИФА с антигеном R.sibiгica subsp. sibiгica для серологической верификации КР у больных Алтайского края

Алгоритм применения ИФА Больные (n=36) Здоровые (n=80) Характеристики теста

«+» ИФА

ИФА-^М (1-я проба) 28 8 1 79 77,8 98,8 96,6 90,8

ИФА-^М (парные пробы) 33 3 1 79 91,7 98,8 97,1 97,5

ИФА-^М (парные пробы) + ИФА-^С (парные пробы) 36 0 1 79 100 98,8 97,3 100

Примечание: Se — чувствительность; Sp — специфичность; PV^--прогностическая ценность

положительного результата; PV--прогностическая ценность отрицательного результата.

твенно). В четырех случаях (как на фоне ^М-АТ, так и без них) отмечена обратная сероконверсия IgG к R.siЫrica.

Очень часто в одной и той же пробе обнаруживали антитела к двум и более риккетсиозным антигенам. Только в сыворотках крови 4-х больных КР выявляли ^М-АТ к единственному виду риккетсий — R.siЫrica, тогда как ^М к антигенам других видов риккетсий выявляли всегда в сочетании с ^М к R.siЫrica.

Количество положительных проб, содержащих ^С-АТ только к одному виду риккетсий, было несколько больше, чем при выявлении ^М. Причем «моно-варианты» обнаружены не только к R.sibirica, но и к R. tarasevichiae, и к R. акаги. Однако при этом у больных выявляли ^М к Я^Ыг^а или обнаруживали к Я^Ыг^а, но в другой пробе крови.

Антитела класса к Я.гаоики во всех случаях обнаруживали вместе с к антигенам не менее двух других видов риккетсий. Ни у одного больного не были обнаружены к Я.В,1-90 или к R.heilongjiangensis.

Анализ полученных данных позволил заключить, что для лабораторного подтверждения диагноза «клещевой риккетсиоз» у больных Алтайского края необходимо тестировать сыворотки крови в ИФА на наличие ^М и к антигену Я^Ыг^а

subsp. sibirica. Причем, исследование парных сывороток в ИФА-IgG целесообразно в том случае, если в ИФА-IgM получены отрицательные результаты.

Для оценки эффективности серологической верификации диагноза КР для различных алгоритмов применения ИФА были рассчитаны показатели, рекомендуемые для характеристики лабораторных тестов [6]: чувствительность (sensitivity-Se), специфичность (specificity-Sp); прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value — PV+); прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value — PV-). Результаты и формулы расчетов представлены в табл. 2.

Оказалось, что у большинства больных (77,8 %) для подтверждения диагноза было достаточно исследовать на наличие IgM к R.sibirica только первую сыворотку крови. Тестирование 2-й пробы крови позволяло верифицировать диагноз еще у 13,9 % больных. Таким образом, при исследовании парных проб крови в ИФА для обнаружения IgM к R.sibirica удалось подтвердить диагноз КР у 91,7 % больных. При исследовании в ИФА на наличие IgG к R.sibirica всех (трех) пар сывороток крови, в которых не были выявлены IgM к R. sibirica, обнаружена сероконверсия IgG к изуча-емомму антигену, что повысило «подтверждае-мость» диагноза до 100 %.

Алгоритм применения ИФА Всего больных ИФА РСК Совпадений положительных результатов ИФА и РСК, %

абс % абс %

ИФА-^М (1-я проба) 15 10 66,7 0 0 0

ИФА-^М (парные пробы) 15 12 80,0 8 53,3 66,7

ИФА-^М (парные пробы) и ИФА-^С (парные пробы) 15 15 100 8 53,3 53,3

Таблица 3

Анализ совпадений результатов серологической верификации диагноза клещевого риккетсиоза у больных Алтайского края при использовании ИФА и РСК

Представляло интерес выяснить, совпадают ли результаты лабораторного подтверждения КР с помощью ИФА с результатами серологической верификации с помощью РСК. Для этого сыворотки крови от 15 больных КР были параллельно исследованы в ИФА и в РСК с коммерческим диа-гностикумом. Полученные данные представлены в таблице 3. Оказалось, что исследование парных сывороток в РСК позволило верифицировать диагноз КР только в 66,7 % случаев, верифицированных с помощью ИФА-^М, и в 53,3 % случаев, подтвержденных в результате совместного применения ИФА-^М и ИФА-^С.

Выводы

1. Непрямой твердофазный вариант иммунофер-ментного анализа является высокочувстви-

тельным и специфичным методом обнаружения антител к антигенам риккетсий.

2. Применение экспериментальных иммунофер-ментных тест-систем для обнаружения антител классов ^М и к антигену R.sibirica subsp. sibirica в парных сыворотках крови позволяет верифицировать диагноз клещевого риккетсиоза у больных Алтайского края в подавляющем большинстве случаев, в том числе при отрицательных результатах РСК.

3. Использование риккетсиозных антигенов различной видоспецифичности в качестве основы твердофазного непрямого варианта ИФА открывает перспективы для широкомасштабного се-роэпидемиологического изучения географического распространения «старых» и «новых» видов риккетсий и их роли в патологии человека.

ЭПИДЕМИОЛОГИЯ СИБИРСКОГО КЛЕЩЕВОГО ТИФА В АЛТАЙСКОМ КРАЕ

И. В. Арсеньева, С. Н. Шпынов, В. М. Гранитов, Н. В. Рудаков Алтайский государственный медицинский университет, Барнаул Омский НИИ природноочаговых инфекций, Омск

Сибирский клещевой тиф (СКТ) (клещевой риккетсиоз или клещевой сыпной тиф Северной Азии) — природноочаговая облигатно-трансмис-сивная инфекция, вызываемая Rickettsia sibirica, эпидемически активные очаги которой имеют распространение в Азиатской части России. Эта инфекция зарегистрирована на 18 административных территориях юга Сибири и Дальнего Востока. С начала регистрации в 1936 г. по 2008 г. (включительно) в России зарегистрировано более 70 тысяч случаев клещевого риккетсиоза.

Алтайский край (показатели — 24,3-70,4 на 100 тыс. населения) и республика Алтай (54,297,3) занимают первое место по числу заболеваний СКТ не только в Западной Сибири, но и в Российской Федерации. На втором месте — Красноярский край — показатели — 4,9-9,5. На эти две территории приходится более 80 % всех случаев заболевания в России.

Цель настоящего исследования — анализ современных эпидемиологических особенностей СКТ в Алтайском крае (динамика, сезонность, клинико-серологические данные, территориальное распределения заболеваемости с выявлением территорий повышенного риска заражения населения).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Осуществлен ретроспективный анализ заболеваемости СКТ в Алтайском крае и РФ за весь период регистрации. Изучено территориальное распределение заболеваемости КР в различных районах Алтайского края в разрезе ландшаф-тно-географических зон (подзон) края с опре-

делением среднемноголетних показателей заболеваемости на 100 тыс. населения. Проведен анализ данных серологического обследования больны х СКТ.

Для анализа многолетней заболеваемости использованы архивные данные отчетной документации санитарной службы (Федерального Центра ГСЭН МЗ РФ, Центра ГСЭН, ТУ Роспотреб-надзора и ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Алтайском крае»), истории болезни больных, парные сыворотки от больных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Официальная регистрация СКТ в Алтайском крае ведется с 1942 г. За 66 лет исследований в крае было зарегистрировано 28 244 случаев этой инфекции. Максимальные показатели заболеваемости СКТ приходились на 1990-2004 гг., когда ежегодно регистрировалось от 581 до 1867 случаев заболевания. По данным официальной регистрации в 2001 г. в Алтайском крае было зарегистрировано наибольшее количество случаев СКТ — 1867 (показатель — 70,4 на 100 тыс. населения), что составило 54 % от общего числа случаев заболевания в РФ. С 2002 г. отмечается выраженная тенденция к снижению заболеваемости СКТ (за период 2001-2008 гг. — Тсн = -5,48 %, ^2) — с 1078 (показатель — 40,6 на 100 тыс. населения) в 2002 г. до 802 (30,6) и 849 (33,7) случаев в 2003 и 2008 гг. соответственно. Средний показатель заболеваемости за 20 лет (1989-2008 гг..) составил 36,2±3,0 на 100 тыс. населения.

Первые случаи заболевания отмечаются в апреле, последние — в октябре-ноябре. Эпиде-