N-ТЕРПЕНИЛЗАМЕЩЁННЫЕ БЕНЗИМИДАЗОЛЫ В КАЧЕСТВЕ ФУНГИЦИДОВ
N-TERPENYL-SUBSTITUTED BENZIMIDAZOLES AS FUNGICIDES

Изобретение относится к сельскому хозяйству, точнее, к химическим средствам защиты растений от грибковых заболеваний, конкретно к применению N-терпенилзамещенных бензимидазолов формулы
в качестве фунгицидов.
Наиболее эффективно изобретение может быть использовано в целях профилактики и лечения заболеваний растений при предпосевной обработке семян и посадочного материала, приводящей к повышению урожайности.
Соединения Ia и Iб, относящиеся к терпеновым производным бензимидазола нерегулярного строения, известны: они образуются при теломеризации изопрена с бензимидазолом [Петрушкина Е.А., Брегадзе В.В. Металлокомплексная теломеризация изопрена и бензимидазола. Металлоорган. химия, 1991, 4 (2), 473-474; Петрушкина Е.А., Гавриленко В.В., Опруненко Ю.Ф., Ахмедов Н.Г. Контроль региоселективности теломеризации изопрена с бензимидазолом, катализируемой комплексами палладия. Ж. общ. хим., 1996, 66 (11), 1864-1870] или при аллилировании бензимидазола [Петрушкина Е.А., Полоник Н.Б. Аллильное алкилирование бензимидазола, катализируемое комплексами палладия. Изв. Акад. наук. Сер. химии., 1999, (2), 357-360] и являются экологически безопасными инсектицидами (ювеноидами), применяемыми для защиты растений, в частности зерновых запасов, от насекомых-вредителей вида Tenebrio Molitor L. [Petrushkina E.A., Polonic N.B., Ivanova G.B. Synthesis and juvenile hormone activity of benzimidazolylterpenes possessing a 2,7-dimethyloctane skeleton. Pestic. Sci., 1999, 55 (6), 650-652].
Приоритетной тенденцией в производстве современных пестицидов является использование препаратов, обладающих комплексной активностью. Так, препарат Селест Топ, производимый компанией Сингента, состоит из смеси инсектицида (тиаметоксана) и двух фунгицидов (дифеноконазола и флудиоксонила) и обеспечивает борьбу как с важнейшими насекомыми-вредителями, так и с широким спектром грибковых заболеваний - ризоктониозом, серебристой паршой, фузариозом, фомозом, альтернариозом, антракнозом.
В связи с ужесточением экологических требований к пестицидам перспективным представляется использование соединений, обладающих бинарной активностью и к тому же не оказывающих вредного воздействия на окружающую среду.
Для защиты зерновых, плодовых и овощных культур в сельском хозяйстве широко применяются фунгициды, которые содержат карбаматные производные бензимидазолов (карбендазим и беномил) и 2-гетероарилзамещенные бензимидазолы (тиабендазол и фуберидазол). Они являются системными препаратами (характеризуются как защитным, так и лечебным действием) и по ГОСТ 121.007-76 относятся к 3-му классу «Умеренно опасные вещества» [Попов С.Я., Дорожкина Л.А., Калинин В.А. Основы химической защиты растений. М.: Арт-Лион, 2003. - 208 с; Голышин Н.М. Фунгициды. М.: Колос, 1993. - 319 с]. Однако известные бензимидазольные фунгициды не действуют на полимеризационные энзимы насекомых, ответственные за биосинтез хитина, и потому не могут выступать в качестве инсектицидов.
С другой стороны, в последнее время увеличилось количество исследований, посвященных различным производным терпенов в качестве фунгицидов, инсектицидов и других пестицидов, поскольку терпеновые соединения не оказывают повреждающего действия на растения и на других участников биоценоза и не вызывают формирования устойчивых к терпенам линий насекомых, или штаммов бактерий, или спор вредоносных грибов (см., например, [Pizzolitto R.P., Herrera J.M., Zaio Y.P., Dambolena J.S., Zunino M.P., Gallucci M.N., and Zygadlo J.A. Bioactivities of Ketones Terpenes: Antifungal Effect on F. verticillioides and Repellents to Control Insect Fungal Vector, S. Zeamais. Microorganisms, 2015, 3 (4), 851-865]). Относительно терпеновых производных бензимидазола известно, что, например, 1-геранил-2-метилбензимидазол ингибирует хитин-синтазу, экстрагированную из культуры почвенных патогенных грибов Sclerotium rolfsii, поражающих корневую систему растений [Cohen Е, Kuwano Е. and Eto М. The Use of a Tribalium Chitin Synthetase Assay in Studying the Effects of Benzimidazoles with a Terpene Moiety and Related Compounds. Agric. Biol. Chem., 1984, 48 (6), 1617-1620], что, по-видимому, и обусловливает его инсектицидную активность. Кроме того, как уже отмечалось выше, соединения Iа и Iб обладают рострегулирующей активностью в отношении насекомых - вредителей зерновых запасов [Petrushkina Е.А., Polonic N.B., Ivanova G.B. Synthesis and juvenile hormone activity of benzimidazolylterpenes possessing a 2,7-dimethyloctane skeleton. Pestic. Sci., 1999, 55 (6), 650-652].
Однако данных о фунгицидной активности терпеновых производных бензимидазолов в литературе не обнаружено, так же, как данных об инсектицидной активности известных фунгицидных препаратов бензимидазола.
Задачей настоящего изобретения является обнаружение фунгицидной активности у соединений, обладающих инсектицидным действием, в целях получения пестицидов двойного назначения.
Задача решается применением известных N-терпенилбензимидазольных инсектицидов формулы
и их 1:1 смеси в качестве фунгицидов.
Технический результат состоит в расширении ассортимента фунгицидов, способных подавлять возбудителей болезней зерновых и плодоовощных культур, за счет обнаружения фунгицидной активности у известных соединений, обладающих инсектицидным действием.
Лабораторные тесты на фунгицидную активность in vitro проводили путем обработки питательной среды соединениями Iа, Iб и их 1:1 смесью в дозе 20 мг/л (отметим, что в водном растворе 1 мг/л ~ 1 ppm) аналогично описанному в [ЕР 0551048 А1, 1993] и последующего использования обработанной питательной среды для выращивания в ней фитопатогенных грибов в течение 5 дней при 20°С. Результаты оценивали в процентах снижения роста культуры грибов в обработанной среде по сравнению с необработанной. Соединения, показавшие высокую активность, тестировали в меньших дозах: 10, 5 и 2 мг/л.
Использовали следующие микокультуры:
PIOR - Pyricularia oryzae (вызывает пирикуляриоз риса);
BOCI - Botrytis cinerea S. (провоцирует образование серой гнили у многих культурных растений);
FUOM - Fusarium oxysporum (вызывает фузариозное увядание у многих культурных растений);
FURO - Fusarium roseum (провоцирует фузариозное отравление у людей и животных);
RHS4 - Rhizoctonia solani AG4 (вызывает ризоктониоз, или черную паршу, клубней картофеля);
HELG - Helminthosporium gramineum (вызывает полосатую пятнистость ячменя, или гельминтоспориоз);
CERH - Pseudocercosporella herpotrichoides (вызывает церкоспорелезную прикорневую гниль пшеницы);
PCIT - Phytophthora citrophthora (провоцирует фитофтороз цитрусовых);
ALAL - Alternaria alternata (провоцирует альтернариоз, основные потери на картофеле);
USNU - Ustilago nuda (вызывает пыльную головню ячменя, при которой колос превращается в черную пылящую метелку);
SENO - Septoria nodorum (вызывает септориоз, поражаются пшеница, рожь, ячмень);
PCIV - Phytophthora cinnnamomi (провоцирует коричный фитофтороз, вызывает корневую гниль и отмирание).
Результаты определения фунгицидной активности in vitro соединений Ia, Iб и их 1:1 смеси представлены в табл. 1.
Тесты на фунгицидную активность in vivo бензимидазолов Ia, Iб и их 1:1 смеси в дозе 1000 ppm проводили на растениях в теплицах аналогично описанному в [ЕР 0551048 А1, 1993; US 5246954 А, 1993; ЕР 0486409 А1, 1992]. Соединения, показавшие активность 75% и выше в подавлении болезней, также испытывали в меньших дозах: 333 и 111 ppm.
Исследовали фунгицидное действие в отношении следующих грибковых заболеваний:
серой гнили томатов, провоцируемой BOCI - Botrytis cinerea;
мучнистой росы ячменя, провоцируемой ERGH - Erysiphe graminis;
бурой ржавчины пшеницы, провоцируемой PURE - Puccinia recondita;
картофельной фитофторы, провоцируемой PINF - Phytophthora infestans;
рисовой черной ножки, провоцируемой PIOR - Pyricularia oryzae.
Результаты определения фунгицидной активности in vivo соединений Ia, Iб и их 1:1 смеси представлены в табл. 2.
Данные по снижению роста микокультур in vitro (табл. 1) показывают, что бензимидазол Iа является более активным фунгицидом, чем Iб. При использовании соединения Iа в концентрации 20 мг/л подавление роста микокультуры до 80-90% наблюдается для пирикуляриоза, ризоктониоза, гельминтоспориоза, церкоспорелезной гнили, коричного и цитрусового фитофтороза (высокая активность сохраняется и при более низкой концентрации действующего вещества), альтернариоза, септориоза. Бензимидазол Iа умеренно активен к фузариозу и совсем неактивен к фитофторозу томатов. Бензимидазол Iб проявляет умеренную активность ко всем испытанным микокультурам, за исключением фузариоза, фитофтороза томатов и патогена Ustilago nuda, вызывающего пыльную головню ячменя, на которые он совершенно не влияет. Смесь соединений Iа и Iб состава 1:1 оказывает на микокультуры не аддитивное, а синергетическое действие. При этом в случае пирикуляриоза, коричного и цитрусового фитофтороза при концентрации 20 мг/л рост микокультуры подавляется на 100%. В отношении фитофтороза томатов и патогена Ustilago nuda смесь бензимидазолов Iа и Iб неактивна.
При испытаниях на растениях (табл. 2), наоборот, более высокую активность проявляет бензимидазол Iб: в дозе 1000 ppm он подавляет развитие пирикуляриоза на 90%, а бурой ржавчины пшеницы на 50%, тогда как бензимидазол Iа в дозе 1000 ppm оказывает фунгицидное действие только на бурую ржавчину пшеницы (снижает рост на 75%). Смесь бензимидазолов Iа и Iб состава 1:1 действует синергетически: в дозе 1000 ppm она подавляет развитие пирикуляриоза на 90%, сохраняя высокую активность (порядка 75%) даже при снижении концентрации до 111 ppm, а развитие бурой ржавчины пшеницы на 75%. Более того, 1:1 смесь соединений Iа и Iб подавляет развитие, правда умеренно (на 25% при использовании дозы 1000 ppm), таких зловредных грибковых заболеваний, как картофельная фитофтора и мучнистая роса ячменя, в отношении которых компоненты смеси не проявляют активности вовсе. Заявляемое изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.
Лабораторные тесты на фунгицидную активность in vitro.
Каждый тест проводят следующим образом: питательную среда, состоящую из картофеля, глюкозы и гелозы (среда PDA), вводят в переохлажденном состоянии в серию чашек Петри (100 мл на чашку) после их стерилизации в автоклаве при 120°С. Раствор заявляемого соединения в ацетоне вводят в переохлажденную среду в количестве, необходимом для получения желаемой конечной концентрации. Контроль состоит из чашек Петри, аналогичных описанным выше, которые заполнены питательной средой (100 мл на чашку), не содержащей испытуемого вещества. Через 24 ч в каждую чашку Петри вносят фрагмент измельченного мицелия конкретного исследуемого грибка, полученного из его предыдущей культуры, и выращивают в течение 5 дней при 20°С, после чего рост грибка в чашках, содержащих тестируемый материал, сравнивают с ростом этого же грибка в чашке, используемой в качестве контроля. Степень ингибирования каждой изучаемой микокультуры определяют для индивидуального тестируемого соединения Iа или Iб на примере четырех доз в 20, 10, 5 и 2 мг/л, для 1:1 смеси соединений Iа и Iб - на примере двух доз в 20 и 10 мг/л, т.е. в лаборатории проводят 120 опытов.
Испытания на фунгицидную активность in vivo на растениях в теплицах.
1. Действие соединений Iа и Iб и их 1:1 смеси на пшеницу при заражении патогеном Puccinia reconduct (бурая ржавчина пшеницы) PURE.
Тестируемые соединения используют в виде концентрированных водных эмульсий, имеющих следующий состав:
испытываемые соединения - 90 мг;
10% водный раствор поверхностно-активного агента Tween 80-0,45 мл;
вода - 90 мл.
Эти исходные эмульсии затем разбавляют водой до получения желаемой концентрации тестируемых веществ: 1000, 333 и 111 ppm.
3
Пшеницу, посеянную в горшки с почвой, обрабатывают в стадии, когда размер проростков достигает 10 см, путем опрыскивания приготовленной эмульсией соединений Iа, Iб или их 1:1 смеси при различных концентрациях. Через 24 ч пшеницу опрыскивают водной суспензией спор (50000 ед./см), полученной из зараженных растений. Обработанную пшеницу помещают на 48 ч в изолированные боксы, в которых поддерживается температура 18°С и относительная влажность 100%. После этого относительную влажность снижают до 60%. Состояние растений оценивают между 11-м и 15-м днем с момента заражения и сравнивают с контрольными образцами. Опыты повторяют дважды для каждой концентрации тестируемых соединений.
2. Действие соединений Iа и Iб и их 1:1 смеси на ячмень при заражении патогеном Erysiphe graminis (мучнистая роса ячменя) ERGH.
Тестируемые соединения используют в виде концентрированных водных эмульсий, имеющих следующий состав:
испытываемые соединения - 90 мг;
10% водный раствор поверхностно-активного агента Tween 80-0,45 мл;
вода - 90 мл.
Эти исходные эмульсии затем разбавляют водой до получения желаемой концентрации тестируемых веществ: 1000, 333 и 111 ppm.
Ячмень, посеянный в горшки с почвой, в стадии, когда ростки достигают 10 см, опрыскивают эмульсией соединений Iа, Iб или их 1:1 смеси. Через 24 ч растения опыляют спорами патогена, полученными от больных растений. Состояние ростков ячменя оценивают между 8-м и 12-м днем с момента заражения и сравнивают с контрольными образцами. Опыты повторяют дважды для каждой концентрации тестируемых соединений.
3. Действие соединений Iа и Iб и их 1:1 смеси на рис при заражении патогеном Pyricularia oryzae (рисовая черная ножка) PIOR.
Тестируемые соединения используют в виде концентрированных водных эмульсий, имеющих следующий состав:
испытываемые соединения - 60 мг;
10% водный раствор поверхностно-активного агента Tween 80-0,3 мл;
вода - 60 мл.
Эти исходные эмульсии затем разбавляют водой до получения желаемой концентрации тестируемых веществ: 1000, 333 и 111 ppm.
3
Рис, посеянный в горшки с почвой, обрабатывают в стадии, когда размер проростков достигает 10 см, путем опрыскивания приготовленной эмульсией соединений Iа, Iб или их 1:1 смеси при различных концентрациях. Через 24 ч рис опрыскивают водной суспензией спор Pyricularia oryzae, полученной из 15-дневной культуры и суспендированной до концентрации 100000 ед/см. Растения помещают на 24 ч в изолированные боксы, в которых поддерживают температуру 25°С и относительную влажность 100%. Состояние растений оценивают в тех же условиях через 6 дней с момента заражения и сравнивают с контрольными образцами. Опыты повторяют дважды для каждой концентрации тестируемых соединений.
4. Действие соединений Iа и Iб и их 1:1 смеси на томаты, зараженные патогеном Botrytis cinerea (серая гниль) BOCI.
Тестируемые соединения используют в виде концентрированных водных эмульсий, имеющих следующий состав:
испытываемые соединения - 60 мг;
10% водный раствор поверхностно-активного агента Tween 80-0,3 мл;
вода - 60 мл.
Эти исходные эмульсии затем разбавляют водой до получения желаемой концентрации тестируемых веществ: 1000, 333 и 111 ppm.
3
Помидоры (сорт Марманде), выращенные в теплице, в возрасте от 30 до 40 дней опрыскивают водными эмульсиями соединений Iа, Iб или их 1:1 смеси в различных концентрациях. Через 24 или 48 ч листья нарезают и помещают в две чашки Петри (диаметром 14 см), дно которых предварительно заполняют влажным диском из фильтровальной бумаги. Затем с помощью шприца наносят на листья (3 капли на листочек) суспензию спор Botrytis cinerea, полученную из 15-дневной культуры и суспендированную в питательном растворе до концентрации 100000 ед./см. Состояние листьев оценивают через 3 и 6 дней после заражения и сравнивают с необработанными контрольными образцами. Опыты повторяют дважды для каждой концентрации тестируемых соединений.
5. Действие соединений Iа и Iб и их 1:1 смеси на томаты, зараженные патогенным оомицетом Phytophthora infestans (фитофтора картофеля, «ирландский голод», или поздняя гниль томата) PINF.
Тестируемые соединения используют в виде концентрированных водных эмульсий, имеющих следующий состав:
испытываемые соединения - 60 мг;
10% водный раствор поверхностно-активного агента Tween 80-0,3 мл;
вода - 60 мл.
Эти исходные эмульсии затем разбавляют водой до получения желаемой концентрации тестируемых веществ: 1000, 333 и 111 ppm.
3
Растения томата (сорт Марманде), выращенные в горшках, в возрасте 1 мес (от 5 до 6 листьев, высота от 12 до 15 см) обрабатывают путем распыления водных эмульсий соединений Iа, Iб или их 1:1 смеси при различных концентрациях тестируемых веществ. Через 24 ч каждое растение заражают, опрыскивая водной суспензией спор (30000 ед./см) Phytophthora infestans. После инкубации в течение 7 дней при температуре около 20°С в атмосфере, насыщенной влагой, оценивают состояние растений и сравнивают с результатами, полученными на необработанных контрольных растениях. Опыты повторяют дважды для каждой концентрации тестируемых соединений.