ПРОДУКТ, СОДЕРЖАЩИЙ ЭКЗОСОМЫ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
PRODUCT CONTAINING EXOSOMES OF PLANT ORIGIN

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к продукту, содержащему экзосомы растительного происхождения, который может быть использован для лечения рака и заживления ран.
Уровень техники изобретения
notchligang
В многоклеточных организмах коммуникация, осуществляемая в результате связывания высвобождаемых из клетки белков с рецепторами на поверхности другой клетки, является фундаментальным принципом межклеточной коммуникации. Хотя о экзосомах известно не так много информации, они являются главными молекулами коммуникации, которые в настоящее время значительно востребованы (1-3). Хотя они фигурировали как материал, нежелательный для клетки, и как клеточные отходы, когда их впервые обнаружили, в результате проведенных исследований было доказано, что экзосомы играют существенную роль в иммунной системе (4). Экзосомы представляют собой везикулы размером 20-130 нм (наноразмерные), которые продуцируются всеми клетками в плазме и высвобождаются из клетки (5). Недавно было обнаружено, что эти везикулы играют роль в эндокринной системе, обеспечивая аутокринные и паракринные сигналы для локальных или дистальных клеток-хозяев. Эти экзосомы также отвечают за перенос белков, жиров, нуклеиновых кислот (все типы РНК) и передачу их в клетки-реципиенты. Таким образом, информация, которая должны быть передана от клеток, передается другим соседним клеткам (3). Семейство тетраспанинов является группой белков, которая наиболее часто встречается на поверхности экзосом. Это семейство включает белки CD9, BCD63, CD81, CD82, CD83. Белки семейства тетраспанинов обладают способностью взаимодействовать с белками МНС и интегринами (6). Независимо от того, насколько пытаются обобщить пул белков экзосом, он является в значительной степени клеточноспецифическим, поэтому зависит от клетки, из которой высвобождается. Следовательно, различные белки (теплового шока) являются членами этого пула (hsp70). В то же время белки, обнаруженные в цитоскелете, а именно: β-актин, тубулин, миозин, кофилин, молекулы главного комплекса гистосовместимости I-II класса и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, которые являются основными распространенными белками пула белков экзосом. Для того чтобы экзосома попала в клетки, которым она будет передана, она должна стимулировать рецепторы клеточной поверхности другой клетки. Следовательно, белки сигнального пути Wnt-β-катенин, , дельта-подобный белок 4 и интерлейкины должны находиться на поверхности экзосомы. В противном случае экзосома не сможет стимулировать клетку-хозяина, которой она будет передавать информацию.
В исследовании доказан тот факт, что экзосомы, полученные от клеток млекопитающих, потенциально могут быть использованы при лечении рака (Reghu et al. 2016). Кроме того, было показано, что экзосомы обладают антиканцерогенной активностью в отношении раковых клеток млекопитающих (Ohno et al. 2013). В другом исследовании, проведенном аналогичным образом, было установлено, что экзосомы, полученные из эпителия мозга, демонстрируют активность против рака мозга (Reriro et al. 2015).
Пшеница (Triticum Aestivum) играет важную роль в рационе питания человека в рамках классификации растительной пищи. В соответствии с проведенными эпидемиологическими исследованиями было доказано, что она играет защитную роль у больных хронической талассемией и раком. Для использования в лечении рака было разработано множество форм пшеницы (ростки или семя (зародыш)). Кроме того, антиоксидантами также являются имбирь и чеснок. В проведенных исследованиях, экзосомы животного происхождения использовались для различных применений. При этом, хотя установлено, что экзосомы растительного происхождения являются антиоксидантами, отмечается, что существует колоссальная потребность в их изучении. По имеющимся данным, экзосомы растений проявляют сходные свойства с экзосомами млекопитающих.
Методы лечения, такие как хирургические операции, лучевая терапия и химиотерапия, которые нацелены на делящиеся клетки, часто приводят к рецидиву рака или возникновению большого количества побочных эффектов (Kubota, 2012).
Патентный документ США № US2016346334 раскрывает экзосомы, полученные из здоровых клеток, для использования при лечении рака молочной железы.
Благодаря настоящему изобретению был разработан альтернативный способ лечения, позволяющий вызывать гибель раковых клеток без нанесения вреда здоровым клеткам с помощью продукта, содержащего растительные экзосомы. Кроме того, тот факт, что экзосомы являются продуктами, не содержащими клеток, позволил предотвратить проблемы, которые могут быть вызваны клеточной терапией. Экзосомы представляют собой готовые терапевтические агенты. Они могут храниться при низких температурах, не требуя использования токсичных криоконсервантов и ультранизкотемпературных морозильников, и могут быть безопасно доставлены пациентам. Основываясь на этой информации, способ направлен на использование ростков пшеницы, чеснока и имбиря, которые используются в альтернативной медицине в лечении рака и в качестве целебного средства для ран.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является создание продукта, содержащего экзосомы растительного происхождения, который может быть использован для лечения рака.
Другой целью настоящего изобретения является создание продукта, не оказывает токсического воздействия на организм человека.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание продукта, который эффективен для заживления ран и восстановления поврежденных тканей.
Другой целью настоящего изобретения является создание продукта, при использовании которого не наблюдаются побочные эффекты, возникающие при химиотерапии.
Другой целью настоящего изобретения является создание продукта, который не вызывает повреждения здоровых клеток во время лечения рака.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание продукта, который не представляет никакого риска инфицирования, поскольку он не требует какой-либо процедуры, например, лучевой терапии или оперативного вмешательства.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание недорогого продукта.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание продукта природного происхождения, при котором не происходит химического заражения, возникающее в организме из-за синтетических лекарственных средств.
Другой целью настоящего изобретения является создание практичного и легкодоступного продукта, поскольку растения, используемые для лечения, растут легко, и за короткий период времени получают значительное количество экзосом.
Подробное описание изобретения
«Продукт, содержащий экзосомы растительного происхождения», разработанный для выполнения задач настоящего изобретения, иллюстрируется на прилагаемых фигурах, где
на Фиг. 1-А представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака почки A498.
На Фиг. 1-B представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака почки A498 с окрашиванием аннексином V.
На Фиг. 1-C представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака почки A498 с окрашиванием PI.
На Фиг. 1-D представлены значения гибели клеток рака почки A498, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы пшеницы в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 1-E представлены значения гибели клеток рака почки A498, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы имбиря в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 1-F представлены значения гибели клеток рака почки A498, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы чеснока в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 2-А представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток почки HEK 293.
На Фиг. 2-B представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток почки HEK 293 с окрашиванием PI.
На Фиг. 2-С представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток почки HEK 293 с окрашиванием аннексином V.
На Фиг. 2-D представлены значения гибели эпителиальных клеток почки HEK 293, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы пшеницы в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 2-E представлены значения гибели эпителиальных клеток почки HEK 293, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы имбиря в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 2-F представлены значения гибели эпителиальных клеток почки HEK 293, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы чеснока в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 3-А представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака простаты 22RV1.
На Фиг. 3-B представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака простаты 22RV1 с окрашиванием аннексином V.
На Фиг. 3-C представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака простаты 22RV1 с окрашиванием PI.
На Фиг. 3-D представлены значения гибели клеток рака простаты 22RV1, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы пшеницы в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 3-E представлены значения гибели клеток рака простаты 22RV1, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы имбиря в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 3-F представлены значения гибели клеток рака простаты 22RV1, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы чеснока в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 4-А представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток простаты PNT1A.
На Фиг. 4-B представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток простаты PNT1A с окрашиванием PI.
На Фиг. 4-B представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток простаты PNT1A с аннексином V.
На Фиг. 4-D представлены значения гибели эпителиальных клеток простаты PNT1A, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы пшеницы в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 4-E представлены значения гибели эпителиальных клеток простаты PNT1A, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы имбиря в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 4-F представлены значения гибели эпителиальных клеток простаты PNT1A, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы чеснока в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 5-А представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака молочной железы MCF 7.
На Фиг. 5-B представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака молочной железы MCF 7 с окрашиванием аннексином V.
На Фиг. 5-С представлены значения проточной цитометрии контрольной группы клеток рака молочной железы MCF 7 с окрашиванием PI.
На Фиг. 5-D представлены значения гибели клеток рака молочной железы MCF 7, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы пшеницы в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 5-E представлены значения гибели клеток рака молочной железы MCF 7, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы имбиря в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 5-F представлены значения гибели клеток рака молочной железы MCF 7, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы чеснока в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 6-А представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток молочной железы MCF 10A.
На Фиг. 6-B представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток молочной железы MCF 10A с окрашиванием PI.
На Фиг. 6-С представлены значения проточной цитометрии контрольной группы эпителиальных клеток молочной железы MCF 10A с окрашиванием аннексином V.
На Фиг. 6-D представлены значения гибели эпителиальных клеток молочной железы MCF 10A, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы пшеницы в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 6-E представлены значения гибели эпителиальных клеток молочной железы MCF 10A, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы имбиря в концентрации 15 мг/мл.
На Фиг. 6-F представлены значения гибели эпителиальных клеток молочной железы MCF 10A, полученных методом проточной цитометрии, для которых применяли экзосомы чеснока в концентрации 15 мг/мл.
Фиг. 7 представляет собой электронно-микроскопическое изображение, на котором определяется присутствие растительной экзосомы, полученной из пшеницы.
Фигура 8 представляет собой диаграмму проточной цитометрии, где присутствие растительной экзосомы, полученной из пшеницы, определяют с помощью поверхностного маркера HSP 70.
В соответствии с этими результатами показано, что растительная экзосома приводит к апоптозу только раковых клеток, вызывая гибель указанных клеток, но не вызывает гибели в здоровых клетках.
Экспериментальное исследование
Получение экзосомы растительного происхождения
В заявляемом продукте содержится экзосома растительного происхождения; ростки пшеницы, имбирь и чеснок можно использовать отдельно или в сочетании в качестве растительного источника. Пшеница предпочтительно выбрана в экспериментальных исследованиях, была получена из Турции, Адан, Джейхан, 69 семян. В ходе работы по предварительной пробоподготовке было установлено, что для роста семян достаточно периода 1,5 недели.
Собранные ростки пшеницы сначала измельчали в 1% PBS (фосфатно-солевой буферный раствор) и затем фильтровали. Полученный фильтрат ростков пшеницы центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин, 3200 g в течение 20 мин, 15000 g в течение 60 мин и затем выделяли клеточную культуру, используя набор для выделения экзосом. Выделенные экзосомы растворяли в 0,9% изотонической сыворотке.
Экзосомы продукта по изобретению, которые были выделены и находились в форме сыворотки, наблюдали с помощью сканирующего электронного микроскопа (Фиг. 7). Затем их инкубировали, используя маркер HSP 70, и обнаруживали наличие экзосом методом проточной цитометрии.
Разработка метода лечения
Определение токсичности для клеток
Токсическое действие приготовленного продукта по изобретению определяли с помощью метода MTS-теста, представленного в литературе (Yalvac et al., 2009).
Химические молекулы получали в среде в заданных концентрациях и наносили на клеточные линии HEK (эпителиальные клетки почки человека), MCF 10A (эпителиальные клетки молочной железы человека) и PNT1A (эпителиальные клетки простаты человека), которые высевали на 96-луночные культуральные планшеты, посредством подсчета (5000 клеток на лунку). Реакцию клеток на токсичность химических веществ определяли путем измерения жизнеспособности клеток в течение 4 сут. Анализ жизнеспособности клеток проводили по методу MTS-теста. MTS-тест представляет собой колориметрический метод, используемый для измерения активности митохондриальных ферментов. К клеткам, которые были посеяны в лунки заранее, применяли различные дозы, и изучали влияние применяемого вещества на жизнеспособность в течение определенного периода времени. Применяемое вещество MTS при увеличении количества жизнеспособных клеток при смешивании со средой приобретает темный цвет. Полученное изменение цвета оценивали на основании измерения оптической плотности с использованием ридера для ИФА-планшетов. Продукт, разработанный в рамках настоящего изобретения, получают таким образом, чтобы достичь результатов при концентрациях 5 нг/мл, 10 нг/мл, 15 нг/мл в течение 24, 48, 72 и 96 ч в здоровых клетках.
Анализ гибели раковых клеток
Чтобы изучить влияние на рак продукта по изобретению, было изучено присутствие белка аннексина V, одного из наиболее значимых белков пути апоптоза, который является механизмом самоуничтожения. Для определения наличия некроза использовали краситель PI (пропидий иодид).
Клетки 22RV1 (клетки рака предстательной железы), MCF 7 (клетки рака молочной железы), A498 (клетки рака почки) высевали в 6-луночные планшеты для культивирования при плотности 300000 клеток на лунку. 10% FBS (сыворотка крови эмбрионов коров) и 1% PSA (пенициллин-стрептомицин-амфотерицин) добавляли к средам с высоким содержанием глюкозы RPMI для линии клеток 22RVI и DMEM для линий клеток MCF 7 и A498, позволяя тем самым клеткам расти. Показатели гибели клеток, которые обрабатывали при указанных концентрациях, исследовали через 24 ч. Результаты показали, что клетка, связанная с антителом к аннексину V, подвергалась апоптозу или вскоре подвергалась апоптозу, и что клетка, связанная с антителом, окрашенная PI, подвергалась или вскоре подвергалась некрозу. Учитывая наличие этих антител, было определено, что применяемая обработка уничтожила клетку.
Аналогичный протокол эксперимента также был применен к клеточным линиям MCF10-A, PNT1-A и HEK, которые являются здоровыми клеточными линиями.
Исследование заживления ран
Помимо применения продукта по настоящему изобретению при лечении рака, также изучалось его применение при заживлении ран. В экспериментальном исследовании, проведенном с этой целью, здоровые клетки линии HEK высевали в 6-луночные культуральные планшеты. Модель раны была сформирована путем создания царапины, проходящей через центр лунок. Продукт, содержащий экзосомы, наносили на клетки, в которых была сформирована модель раны. Клетки инкубировали в течение 48 ч в продукте с концентрацией 15 нг/мл и среде DMEM, содержащей 2% FBS. Процесс заживления ран наблюдали последовательно, фотографируя каждый день под микроскопом.
Результаты эксперимента
Экзосома была получена с помощью разработанного способа выделения, предпочтительно с использованием ростков пшеницы. Этот продукт был экспериментально охарактеризован, и его активность по отношению к раку и ранозаживляющие свойства подтверждены результатами. На основе данных, полученных на изображении электронного микроскопа, было обнаружено, что рассматриваемые везикулы имеют сходство с электронно-микроскопическими изображениями экзосом, представленными в литературе (Фиг. 7). Результаты проточной цитометрии показали, что экспрессия маркера поверхности экзосом составляет 84,16%. Это одно из доказательств того, что полученная нами молекула является экзосомой (Фиг. 8).
Результат MTS-теста доказал, что воздействие на здоровые клетки сыворотки с растительными экзосомами вызывает пролиферацию в клетках. Значение оптической плотности, которое увеличилась по сравнению с отрицательным контролем, показало, что жизнеспособность увеличилась. Соответственно, проведенный анализ подтвердил, что экзосомы пшеницы увеличивали скорость деления клеток в здоровых клетках (Фиг. 3).
Через 24 ч после обработки клеток 22RV1 сывороткой в концентрациях 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл применяли аннексин V, используя метод проточной цитометрии для изучения гибели клеток. В соответствии с этими результатами при расчете соотношения некроза и апоптоза соотношения гибели клеток составляли 26,02%, 40,08% и 34,36% соответственно при вышеуказанных концентрациях (Фиг. 3).
Через 24 ч после обработки клеток PNT1A сывороткой в концентрациях 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл применяли аннексин V, используя метод проточной цитометрии для изучения гибели клеток. В соответствии с этими результатами при расчете соотношения некроза и апоптоза соотношения гибели клеток составляли 1,81%, 3,26% и 3,22% соответственно (Фиг. 4).
Через 24 ч после обработки клеток MCF-7 сывороткой в концентрациях 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл применяли аннексин V, используя метод проточной цитометрии для изучения гибели клеток. В соответствии с этими результатами при расчете соотношения некроза и апоптоза соотношения гибели клеток составляли 24,96%, 31,13% и 23,49% соответственно (Фиг. 5).
Через 24 ч после обработки клеток MCF-10A сывороткой в концентрациях 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл применяли аннексин V, используя метод проточной цитометрии для изучения гибели клеток. В соответствии с этими результатами, при анализе соотношения некроза и апоптоза соотношения гибели клеток составляли 1,57%, 1,25% и 2,74% соответственно (Фиг. 6). Через 24 ч после обработки клеток A498 сывороткой в концентрациях 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл применяли аннексин V, используя метод проточной цитометрии для изучения гибели клеток. В соответствии с этими результатами при расчете соотношения некроза и апоптоза соотношения гибели клеток составляли 51,05%, 38,01% и 42,76% соответственно (Фиг. 1).
Через 24 ч после обработки клеток HEK 293 сывороткой в концентрациях 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 15 мкг/мл применяли аннексин V, используя для изучения гибели клеток метод проточной цитометрии. В соответствии с этими результатами при анализе соотношения некроза и апоптоза соотношения гибели клеток составляли 1,79%, 1,63% и 3,16% соответственно (Фиг. 2).
В результате экспериментальных исследований было доказано, что продукт по настоящему изобретению запускает механизм клеточного самоуничтожения в организме, вызывая гибель раковых клеток. Было отмечено, что применяемое лечение настоящим продуктом, устранило недостаток повреждения здоровых клеток при одновременном уничтожении раковых клеток, который часто встречается при химиотерапии.
В результате модели раны, сформированной на основе результата MTS-теста, было доказано, что модель раны в клетках, обработанных продуктом по настоящему изобретению, показала намного более быстрое заживление по сравнению с необработанными контрольными клетками. Это показало, что полученный продукт, в частности продукт, полученный из экзосом пшеницы, положительно влияет и ускоряет процесс в моделях заживления ран и восстановления тканей.
Применение изобретения
Настоящее изобретение в основном применяется при формах рака простаты, молочной железы, почки; и при этом активен в отношении форм рака поджелудочной железы, печени, коcтей, кожи, мозга, легких, плевры, матки, яичников, желудка, кишечника, мочевого пузыря, крови, лимфы, щитовидной железы.
Продукт по настоящему изобретению может быть получен преимущественно в форме сыворотки в жидком состоянии, кроме того, он также может быть получен в твердой или гидрогелевой форме. Он может быть в форме сыворотки, сиропа, таблетки, лекарственного препарата, геля и крема. Кроме того, другое действующее вещество (например, лекарственное средство, химическое вещество) может быть перенесено в клетку, используя молекулу-наноноситель. Этот метод переноса может использоваться в различных формах и композициях, как указано выше.
Ссылочные материалы
1. Johnstone,RM, Adam, M, Hammond,JR,Orr L and Turbide, C(1987). Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma mebrane activities with released vesicles (exosomes)./BiolChem 262: 9412-9460
2. Valadi, H, Ekström, K, Bossios, A, Sjöstrand, M, Lee JJ and Lçtvall JO (2007). Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic Exchange between cells. Nat Cell Biol9:654-659
3. Théry, C, Ostrowski, M and Segura, E (2009). Membrane vesicles as conveyors of immuneresponses. NatRevImmunol 9: 581-593
4. Gogolak P, Rethi B, Hajas G, Rajnavolgyi E.(2003) Targeting dendritic cells for priming cellular immuneresponses. J.Mol.Recognit.; 16:299-317.
5. An,Q, Hücvkelhoven, R,Kogel,KHandvan Bel, Aj(2006). Multi vesicular bodies participate in a cell wall-associated defence response in barley leaves attacked by the pathogenic powdery mildew fungus. Cell Microbial8:1009-1091
6. Escola, J.M., M.J. Kleijmeer, W. Stoorvogel, J.M. Griffth, O. Yoshie, and H.J. Geuze. (1998). Selective enrichment of tetraspan proteins on the internal vesicles of multivesicular endosomesand on exosomes secreted by human B-lymphocytes. J. Biol. Chem. 273:20121-20127.
7. Buschow, S.I., B.W. vanBalkom, M. Aalberts, A.J. Heck, M. Wauben, and W. Stoorvogel. (2010). MHC class II-associatedproteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis. Immunol. Cell Biol. 88:851-856
8. Simpson RJ, Lim JW, Moritz RL, Mathivanan S. (2009) Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert.Rev.Proteomics.; 6:267-283.
9. Gogolak P, Rethi B, Hajas G, Rajnavolgyi (2003) E. Targeting dendritic cells for priming cellular immuneresponses. J.Mol.Recognit.; 16:299-317
10. Vermeulen, P.B.,Verhoeven, D., Hubens, G., Van Marck, E., Goovaerts, G., Huyghe, M., De Bruijn, E.A., Van Oosterom, A.T. and Dirix, L.Y. (1995). Microvessel density, endothelial cell proliferation and tumour cell proliferation in human colorectal adenocarcinomas. Annals of oncology, 6(1), 59-64.
11. Yalvac, M.E.,Ramazanoglu, M., Gumru, O.Z., Sahin, F., Palotás, A. and Rizvanov, A.A. (2009). Comparison and optimisation of transfection of human dental folliclecells, a novel source of stem cells, with different chemical methods and electro-poration. Neuro chemical research, 34(7), 1272-1277.