КОМПОЗИЦИИ АНТИТЕЛ К ВИЧ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
HIV ANTIBODY COMPOSITIONS AND METHODS FOR THEIR APPLICATION

Ссылка на родственные заявки
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США №62/232279, поданной 24 сентября 2015 года; содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством отсылки.
Интересы правительства
[0002] Раскрытое в настоящем документе изобретение было выполнено, по меньшей мере частично, с государственной поддержкой в соответствии с грантом № Р01 AI081677 от Национального института здоровья. Соответственно, правительство США имеет определенные права в настоящем изобретении.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
[0003] Настоящее изобретение относится к антителам к вирусу иммунодефицита человека («ВИЧ») и способам их применения.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
[0004] ВИЧ вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), состояние, характеризующееся у людей истощающими синдромами, дегенерацией центральной нервной системы и иммуносупрессией, что приводит к опасным для жизни инфекциям и злокачественным новообразованиям. ВИЧ типа 1 (ВИЧ-1) привел более чем к 25 миллионам смертей с момента его открытия, и 20-60 миллионов человек, как прогнозируется, заразятся в течение следующих двух десятилетий. Таким образом, необходимы терапевтические средства и способы лечения или ингибирования ВИЧ-инфекции.
[0005] Сыворотка некоторых ВИЧ-инфицированных индивидуумов демонстрирует нейтрализующие антитела широкого спектра действия (bNAb) изотипа IgG. Однако специфичность и активность этих антител остается в значительной степени неизвестной. Пассивная передача нейтрализующих антител может способствовать защите от вирусной угрозы на животных моделях.
[0006] Успех большинства вакцин зависит от антител, и антитела к ВИЧ сопоставляли с защитой в недавнем исследовании против ВИЧ-инфекции. Хотя некоторые пациенты вырабатывали нейтрализующие антитела широкого спектра действия против gpl через 60 лет после заражения, способность аутологичных вирусов к мутации предотвращала защиту от ВИЧ-инфекции. Тем не менее, в целом нейтрализующая активность применяет избирательное давление на вирус; позволяя пассивную передачу (bNAb) макакам для защиты от инфекции SHIV. Таким образом, вакцины, которые индуцируют выработку таких антител, могут защитить людей от ВИЧ-инфекции.
Сущность изобретения
[0007] Настоящее изобретение относится согласно некоторым аспектам к нейтрализующим антителам к ВИЧ широкого спектра действия.
[0008] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, такое как выделенное антитело к ВИЧ, причем антитело к ВИЧ связывается или способно связываться с N-гликановым эпитопом ВИЧ с аффинностью 1 нМ или менее. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело нейтрализует или способно нейтрализовать ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия. Согласно другим вариантам осуществления ВИЧ представляет собой ВИЧ-1. Согласно другим вариантам осуществления ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы М. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1 клады А (включая в себя А1 и/или А2), В, С, D, Е, F (включая в себя F1 и/или F2), G, Н, I, J, K или любую комбинацию, подтип или рекомбинантное производное (включая в себя циркулирующую рекомбинантную форму (CRF)). Согласно некоторым вариантам осуществления рекомбинантные гены ВИЧ-1 (согласно некоторым вариантам осуществления называемые циркулирующими рекомбинантными формами (CRF)) представлены комбинацией двух клад, из которых они получены. Согласно некоторым вариантам осуществления иллюстративные CRF включают в себя АВ, AC, AG, DF, ВС и т.д.
[0009] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело было получено с использованием гликоинженерии для модификации олигосахаридов в Fc-области и причем антитело увеличивало эффекторную функцию ADCC по сравнению с антителом, полученному без использования гликоинженерии. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой полноразмерное антитело класса IgG. Согласно другим вариантам осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела. Согласно другим вариантам осуществления антитело представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
[0010] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело дополнительно содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
[0011] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
[0012] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело дополнительно содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
[0013] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
[0014] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело дополнительно содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
[0015] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
[0016] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело дополнительно содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.
[0017] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.
L
[0018] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42; CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и последовательность V, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.
L
[0019] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и последовательность V, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.
[0020] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело дополнительно содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
[0021] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
[0022] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61.
[0023] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело дополнительно содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело дополнительно содержит CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68.
H
L
H
L
[0024] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1; последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2; или последовательность V, как в (а), и последовательность V, как в (b).
H
L
H
L
[0025] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3; последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4; или последовательность V, как в (а), и последовательность V, как в (b).
H
L
H
L
[0026] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 5; последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6; или последовательность V, как в (а), и последовательность V, как в (b).
H
L
H
L
[0027] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7; последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8; или последовательность V, как в (а), и последовательность V, как в (b).
H
L
[0028] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9; и последовательность V, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10.
H
L
[0029] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 11; и последовательность V, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12.
H
L
H
L
[0030] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13; последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 14; или последовательность V, как в (а), и последовательность V, как в (b).
H
H
L
[0031] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16; или последовательность V, как в (а), и последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.
H
H
L
[0032] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 16; или последовательность V, как в (а), и последовательность V, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 95% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 65.
H
L
[0033] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело не содержит CDR-Н1 таблицы 4, CDR-H2 таблицы 4, CDR-H3 таблицы 4 или любую их комбинацию; CDR-L1 таблицы 5, CDR-L2 таблицы 5, CDR-L3 таблицы 5 или любую их комбинацию; последовательность V таблицы 4, последовательность V таблицы 5 или обе; или любую комбинацию (а), (b) или (с).
[0034] Согласно одному аспекту предусмотрена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая любое из описанных в настоящем документе антител. Согласно одному аспекту предусмотрен вектор, содержащий нуклеиновую кислоту. Согласно одному аспекту предусмотрена клетка-хозяин, содержащая вектор.
[0035] Согласно одному аспекту предусмотрен способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из описанных в настоящем документе антител, с тем, чтобы получить антитело.
[0036] Согласно одному аспекту предусмотрен иммуноконъюгат, содержащий любое из описанных в настоящем документе антител и цитотоксическое средство.
[0037] Согласно одному аспекту предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая описанные в настоящем документе антитела и фармацевтически приемлемый носитель.
[0038] Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрены любые описанные в настоящем документе антитела или иммуноконъюгаты для применения в качестве лекарственного средства.
[0039] Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрены любые описанные в настоящем документе антитела или иммуноконъюгаты для лечения ВИЧ-инфекции или СПИДа.
[0040] Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрены любые описанные в настоящем документе антитела или иммуноконъюгаты для применения в изготовлении лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам осуществления лекарственное средство предназначено для лечения ВИЧ-инфекции или СПИДа. Согласно другим вариантам осуществления лекарственное средство предназначено для нейтрализации ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой нейтрализующее антитело широкого действия. Согласно некоторым вариантам осуществления ВИЧ представляет собой ВИЧ-1. Согласно другим вариантам осуществления ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы М. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1 клады А (включая в себя А1 и/или А2), В, С, D, Е, F (включая в себя F1 и/или F2), G, Н, I, J, K или любую комбинацию, подтип или рекомбинантное производное (включая в себя циркулирующую рекомбинантную форму (CRF)). Согласно некоторым вариантам осуществления рекомбинантные клады ВИЧ-1 (согласно некоторым вариантам осуществления называемые циркулирующими рекомбинантными формами (CRF)) представлены комбинацией двух клад, из которых они получены. Согласно некоторым вариантам осуществления иллюстративные CRF включают в себя АВ, AC, AG, DF, ВС и т.д.
[0041] Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрен способ лечения индивидуума, характеризующегося наличием ВИЧ-инфекции или СПИДа, включающий введение индивидууму эффективного количества любого из описанных в настоящем документе антител или иммуноконъюгатов. Согласно некоторым вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает введение терапевтического средства. Согласно некоторым вариантам осуществления терапевтическое средство представляет собой противовирусное средство.
[0042] Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрен иммуногистохимический анализ ВИЧ, включающий контактирование образца с любым из описанных в настоящем документе антител или иммуноконъюгатов в условиях, допускающих образование комплекса антитело-ВИЧ между антителом и присутствующим в образце ВИЧ, и обнаружение наличия или отсутствия комплекса способом иммунологического анализа. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец крови или образец ткани.
[0043] Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрен способ получения антитела к ВИЧ или его фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую любое из описанных в настоящем документе антител в среде, в условиях, позволяющих экспрессию кодируемого полипептида посредством вектора и сборку антитела или его фрагмента; и очистку антитела или фрагмента от клетки-хозяина или среды клетки-хозяина.
[44] Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрен набор, содержащий фармацевтически приемлемую единицу дозирования фармацевтически эффективного количества по меньшей мере одного описанного в настоящем документе выделенного антитела или иммуноконъюгата к ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления набор дополнительно содержит фармацевтически приемлемую единицу дозирования фармацевтически эффективного количества средства против ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления средство против ВИЧ представляет собой средство, выбранное из группы, состоящей из ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы, ингибитора протеазы, ингибитора входа или слияния и ингибитора интегразы.
[45] Согласно одному аспекту в настоящем документе предусмотрен набор для диагностики, прогнозирования или мониторинга лечения ВИЧ-инфекции или СПИДа у субъекта, содержащий по меньшей мере одно описанное в настоящем документе выделенное антитело или иммуноконъюгат к ВИЧ и один или более реагентов обнаружения, которые специфически связываются с антителами к ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления набор дополнительно содержит реагенты для проведения ПЦР. Согласно некоторым вариантам осуществления набор дополнительно содержит реагенты для проведения масс-спектрометрии.
[46] Согласно одному аспекту слитый белок или конъюгат содержит любое описанное в настоящем документе антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления слитый белок или конъюгат представляет собой химерный рецептор или содержит химерный рецептор, который необязательно представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR).
[47] Согласно некоторым вариантам осуществления химерный антигенный рецептор (CAR) содержит любое описанное в настоящем документе антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой АВ, который дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен, содержащий мотив ITAM. Согласно другим вариантам осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой CAR, который дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен из CD3£. Согласно некоторым вариантам осуществления химерный антигенный рецептор представляет собой CAR, который дополнительно содержит внутриклеточный сигнальный домен из костимулирующей молекулы, выбранной из группы, состоящей из CD28, CD 137, ICOS и 0X40.
Включение посредством ссылки
[48] Все публикации, патенты и заявки на патент в настоящем документе полностью включены посредством ссылки. В случае конфликта между термином в настоящем документе и термином во включенной ссылке, термин в настоящем документе имеет преимущество.
Краткое описание графических материалов
[49] Описанные в настоящем документе новые особенности подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Более полное понимание особенностей и преимуществ описанных в настоящем документе функций будет получено со ссылкой на следующее подробное описание, в котором представлены иллюстративные примеры, в которых используются принципы описанных в настоящем документе особенностей, и сопровождающие их графические материалы:
[50] На фиг.1 изображен график с результатами скрининга с использованием сходства CDR3 тяжелой цепи. Совпадающее сходство, наблюдаемое у здорового добровольца, предполагает «порог значимости» (начальное разрешающее отсечение для кандидатов антител в тяжелых цепях от донора).
[51] На фиг.2 показана диаграмма, показывающая, что обнаруженные антитела филогенетически разделяются с известными Ptl 7 BNAb. Были собраны последовательности BNAb от донора 17. Новые антитела, филогенетически диспергированные этими BNAb, были определены и, вероятно, возникли из одной линии. Филогенетическую связь с BNAb использовали для идентификации новых нейтрализующих антител широкого спектра действия.
[52] На фиг.3 изображена диаграмма известных и новых антител, полученных от донора 17. Новые пары антител пересекаются с известными BNAb (как тяжелой, так и легкой цепью).
[53] На фиг.4 изображена диаграмма, показывающая известные и обнаруженные пары тяжелых и легких цепей антител.
[54] На фиг.5 изображено выравнивание последовательностей вариабельных областей антитела AbVl-9 в сравнении с последовательностями вариабельной области антитела зародышевой линии.
[55] На фиг.6А показаны последовательности выравнивания AbVl-9 зародышевой линии и его клональных вариантов. (А) Аминокислотное выравнивание тяжелых цепей (IgH) антител AbVl-9 и Ун зародышевой линии (GL) для клональных вариантов. Показаны нумерация аминокислот на основе кристаллических структур, каркасная область (FWR) и определяющие комплементарность области (CDR), как определено Kabat (J Exp Med 132 (2): 21 1-250).
[56] На фиг.6 В показаны последовательности выравнивания зародышевой линии и клональных вариантов AbVl-9. Аминокислотное выравнивание легких цепей (IgL) антител AbVl-9 и Vl зародышевой линии (GL) для клональных вариантов. Показана нумерация аминокислот на основе кристаллических структур, каркасной области (FWR) и определяющих комплементарность областей (CDR), как определено Kabat (J Exp Med 132 (2): 21 1-250).
[57] На фиг.7 представлены результаты способа обнаружения bNAb ВИЧ. В- клетки из элитного контроллера ВИЧ вводили в эмульсию, и пары BCR восстанавливали, (фиг.7А). Изотипное распределение тяжелых цепей из 38620 восстановленных пар VhVl, где редкая доля цепей IgG хорошо выровнялась с ранее известными bNAb («PGT- подобные»). (фиг.7 В) Филогенетические древа полных аминокислотных последовательностей VDJ известных bNAB и вновь восстановленных (соединенных линиями, помеченных точечной штриховкой) с тяжелыми (слева) и легкими (справа) цепями, нанесенными отдельно. Потенциально несогласованные антитела представляют собой PGT122.heavy и PGT123.light и РСТ123.heavy и PGT122.light, (фиг.7С). Активность нейтрализации (IC50, мкг/мл) 8 вновь открытых PGT-подобных вариантов против десяти штаммов ВИЧ сравнивали с контрольной линией PGT121.
Подробное описание настоящего изобретения
[58] Согласно некоторым аспектам настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном обнаружении новой категории нейтрализующих антител широкого спектра действия (bNAb) к ВИЧ, которые согласно некоторым аспектам могут распознавать углевод-зависимые эпитопы, такие как N-гликан сложного типа, например, на gpl20.
[59] Среди предусмотренных антител представлены моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела и полиреактивные антитела) и фрагменты антител. Антитела включают в себя конъюгаты антител и содержащие антитела молекулы, такие как химерные молекулы; химерные рецепторы, содержащие один или более стимулирующих, сигнальных и/или костимулирующих доменов; и химерные антигенные рецепторы (CAR). Таким образом, антитело включает в себя, без ограничения, полноразмерные и нативные антитела, а также их фрагменты и части, сохраняющие специфичность связывания, такие как любая их специфическая связывающая часть, включая в себя те, которые имеют любое количество иммуноглобулиновых классов и/или изотипов (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD, IgE и IgM); и биологически релевантные (антигенсвязывающие) фрагменты или их специфические связывающие части, включая в себя, без ограничения, Fab, F(ab')2, Fv и scFv (одноцепочечные или родственные объекты). Моноклональное антитело, как правило, представляет собой антитело в составе по существу гомогенных антител; таким образом, любые отдельные антитела, входящие в состав моноклональных антител, идентичны, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Поликлональное антитело представляет собой препарат, который включает в себя различные антитела с различными последовательностями, которые, как правило, направлены против двух или более различных детерминант (эпитопов).
[60] Также предусмотрены молекулы, такие как химерные и/или слитые молекулы, включающие в себя рецепторы, такие как рекомбинантные рецепторы, которые включают в себя антитело любого из вариантов осуществлений (например, содержащихся или входящих во внеклеточный домен) и дополнительные домены, такие как внутриклеточные сигнальные домены, спейсеры, линкеры и/или трансмембранные домены. Согласно некоторым вариантам осуществления рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор, содержащий внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент по любому из вариантов осуществления, и внутриклеточный сигнальный домен.
[61] Термин «антитело» в настоящем документе, таким образом, используется в самом широком смысле и включает в себя поликлональные и моноклональные антитела, включая в себя интактные антитела и их функциональные (антигенсвязывающие) фрагменты антител, включая в себя антигенсвязывающие фрагменты (Fab), фрагменты F(ab')2, фрагменты Fab, фрагменты Fv, фрагменты рекомбинантного IgG (rlgG), фрагменты одноцепочечных антител, включая в себя одноцепочечные вариабельные фрагменты (sFv или scFv) и однодоменные антитела (например, sdAb, sdFv, наноантитело). Термин охватывает генетически сконструированные и/или иным образом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интратела, пептид-ассоциированные антитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и гетероконъюгатные антитела, мультиспецифические, например, биспецифические, антитела, диатела, триатела и тетратела, тандем di-scFv, тандем tri-scFv. Если не указано иное, термин «антитело» следует понимать как охватывающий фрагменты функциональных антител. Термин также охватывает интактные или полноразмерные антитела, включая в себя антитела любого класса или подкласса, включая в себя IgG и его подклассы, IgM, IgE, IgA и IgD.
[62] Термины «определяющая комплементарность область» и «CDR», которые являются синонимами «гипервариабельной области» или «HVR», известны в настоящей области техники для обозначения несмежных последовательностей аминокислот в вариабельных областях антитела, которые придают антигенную специфичность и/или аффинность связывания. Как правило, имеется три CDR в каждой вариабельной области тяжелой цепи (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) и три CDR в каждой вариабельной области легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). «Каркасные области» и «FR» известны в настоящей области техники для обозначения He-CDR-участков вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. В общем случае имеется четыре FR в каждой полноразмерной вариабельной области тяжелой цепи (FR-H1, FR-H2, FR-H3 и FR-H4) и четыре FR в каждой полноразмерной вариабельной области легкой цепи (FR-L1, FR-L2, FR-L3 и FR-L4).
[63] Точные границы аминокислотной последовательности данного CDR или FR могут быть легко определены с использованием любого из ряда хорошо известных схем, в том числе описанных в Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации “Kabat”), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации “Chothia”), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262,732-745.” (схема нумерации “Contact”), Lefranc MP et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(l):55-77 (схема нумерации “IMGT”) и Honegger A and Pluckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (схема нумерации “Aho”).
[64] Границы данного CDR или FR могут варьировать в зависимости от схемы, используемой для идентификации. Например, схема Kabat основана на структурных выравниваниях, а схема Chothia основана на структурной информации. Нумерация как для схем Kabat, так и для Chothia основана на наиболее распространенных длинах последовательности областей антитела, причем вставки помещаются вставными буквами, например «30а», и делециями, появляющимися в некоторых антителах. Две схемы помещают определенные вставки и удаления («indel») в разных положениях, что приводит к дифференциальной нумерации. Схема Contact основана на анализе сложных кристаллических структур и во многом похожа на схему нумерации Chothia.
[65] В таблице А ниже приведены границы иллюстративных положений CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, как определено схемами Kabat, Chothia и Contact, соответственно. Для CDR-H1 нумерация остатков указана с использованием схем нумерации Kabat и Chothia. FR находятся между CDR, например, с FR-L1, расположенной между CDR-L1 и CDR-L2, и так далее. Следует отметить, что, поскольку показанная схема нумерации Kabat размещает вставки в Н35А и Н35 В, конец петли CDR-H1 Chothia при нумерации с использованием показанного соглашения о нумерации Kabat варьирует от Н32 до Н34 в зависимости от длины петли.
Таблица А
1 - Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
[66] Таким образом, если не указано иное, «CDR» или «определяющая комплементарность область» или отдельные указанные CDR (например, «CDR-Ш, CDR- Н2») данного антитела или его области, такие как его вариабельная область, следует понимать как охватывающую (или конкретную) определяющую комплементарность область, как определено любой из вышеупомянутых схем. Например, когда указано, что конкретная CDR (например, CDR-H3) содержит аминокислотную последовательность соответствующей CDR в данной аминокислотной последовательности Ун или Vl, понятно, что такая CDR имеет последовательность соответствующей CDR (например, CDR-H3) в вариабельной области, как определено любой из вышеупомянутых схем. Согласно некоторым вариантам осуществления указаны указанные последовательности CDR.
[67] Аналогичным образом, если не указано иное, FR или отдельную конкретно указанную FR (например, FR-H1, FR-H2) данного антитела или его области, такую как его вариабельную область, следует понимать как охватывающую (или конкретную) каркасную область, как определено любой из известных схем. В некоторых случаях указывается схема идентификации конкретной CDR, FR или FR или CDR, например, CDR, определенная способом Kabat, Chothia или Contact. В других случаях указывается конкретная аминокислотная последовательность CDR или FR.
[66] Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (Vh и Vl, соответственно) нативного антитела, как правило, характеризуются сходными структурами, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три CDR. (смотрите, например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Единственного домена Vh или Vl может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связывают конкретный антиген могут быть выделены с использованием домена Vh или Vl из антитела, которое связывает антиген, чтобы скринировать библиотеку комплементарных доменов Vl или Vh, соответственно. Смотрите, например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
[67] Среди предусмотренных антител представлены фрагменты антител. «Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают в себя, без ограничения, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv или sFv) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Согласно конкретным вариантам осуществления антитела представляют собой одноцепочечные фрагменты антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, такие как scFv.
[68] Однодоменные антитела представляют собой  фрагменты антител,
содержащие все или часть вариабельного домена тяжелой цепи или все или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления однодоменное антитело представляет собой однодоменное антитело человека.
[69] Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включающими в себя, без ограничения, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также производство рекомбинантными клетками-хозяевами. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела представляют собой рекомбинантно произведенные фрагменты, такие как фрагменты, содержащие положения, которые не встречаются в природе, такие как те, которые содержат две или более областей антител или цепи, соединенные синтетическими линкерами, например, пептидными линкерами, и/или те, которые не производятся ферментативным расщеплением природного интактного антитела. Согласно некоторым аспектам фрагменты антител представляют собой scFv.
[70] «Гуманизированное» антитело представляет собой антитело, в котором все
или практически все аминокислотные остатки CDR получены из отличных от человеческих CDR и все или практически все аминокислотные остатки FR получены из человеческих FR. Гуманизированное антитело необязательно может включать в себя по меньшей мере часть константной области антитела, полученную  из человеческого антитела.
«Гуманизированная форма» отличного от человеческого антитела относится к варианту отличного от человеческого антитела, которое подверглось гуманизации, как правило, для снижения иммуногенности у людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность исходного отличного от человеческого антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе замещены соответствующими остатками из отличного от человеческого антитела (например, антитела, от которого происходят остатки CDR), например, для восстановления или улучшения специфичности антитела или аффинности.
[71] Среди предусмотренных антител представлены человеческие антитела.
«Человеческое антитело» представляет собой  антитело с аминокислотной
последовательностью, соответствующей антителу, производимому человеком или человеческой клеткой, или отличным от человека источником, который использует репертуары антител человека или другие кодирующие человеческие антитела последовательности, включая в себя библиотеки антител человека. Этот термин исключает гуманизированные формы отличных от человеческих антител, содержащие связывающие отличный от человеческого антиген области, такие как те, в которых все или практически все CDR представляют собой отличные от человеческих.
[72] Антитела человека могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для получения интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные, как правило, содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулина или которые присутствуют внехромосомно или интегрированы случайным образом в хромосомы животного. У таких трансгенных животных эндогенные локусы иммуноглобулина, как правило, инактивированы. Человеческие антитела также могут быть получены из библиотек антител человека, включая в себя библиотеки фагового дисплея и свободные от клеток библиотеки, содержащие кодирующие антитела последовательности, полученные из репертуара человека.
[73] Среди предусмотренных антител представлены моноклональные антитела, включающие в себя фрагменты моноклональных антител. Используемый в настоящем документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из или в пределах популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, содержащиеся в популяции, идентичны, за исключением возможных вариантов, содержащих встречающиеся в природе мутации или возникающие при получении препарата моноклонального антитела, причем такие варианты, как правило, присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают в себя различные антитела, направленные против разных эпитопов, каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одного эпитопа на антигене. Этот термин не должен истолковываться как требующий производства антитела каким-либо конкретным способом. Моноклональное антитело может быть получено различными способами, включающими в себя, без ограничения, производство из гибридомы, способы рекомбинантной ДНК, фаговый дисплей и другие способы отображения антител.
[74] Термины «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо, чтобы относиться к полимеру аминокислотных остатков, и не ограничиваются минимальной длиной. Полипептиды, включая в себя предусмотренные антитела и цепи антител и другие пептиды, например, линкеры и связывающие пептиды, могут включать в себя аминокислотные остатки, включающие в себя природные и/или неприродные аминокислотные остатки. Термины также включают в себя постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, сиалилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п.Согласно некоторым аспектам полипептиды могут содержать модификации в отношении нативной или природной последовательности, если белок поддерживает желаемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, например, посредством сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например, посредством мутаций хозяев, которые производят белки или ошибки из-за ПЦР-амплификации.
[75] Процент (%) идентичности последовательности по отношению к эталонной полипептидной последовательности представляет собой процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, чтобы достичь максимального процента идентичности последовательности, и не рассматривает любые консервативные замены как часть идентичности последовательности. Выравнивание для целей определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые известны, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Могут быть определены подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая в себя любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения значения % идентичности аминокислотной последовательности получают с использованием компьютерной программы сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа сравнения последовательностей ALIGN-2 была создана Genentech, Inc., а исходный код был подан с пользовательской документацией в Бюро по защите авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером США №TXU510087. Программа ALIGN-2 общедоступна от Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., или может быть скомпилирована из исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для использования в операционной системе UNIX, включая в себя цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей задаются программой ALIGN-2 и не меняются.
[76] В ситуациях, когда ALIGN-2 используется для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А по отношению к данной аминокислотной последовательностью В (которая может альтернативно быть выражена как указанная аминокислотная последовательность А, которая имеет или содержит определенный % идентичности аминокислотной последовательности по отношению к данной аминокислотной последовательностью В), рассчитывается следующим образом: 100 раз фракция X/Y, где X представляет собой число аминокислотных остатков, набранных как идентичные совпадения программой выравнивания последовательностей ALIGN-2 в выравнивании этой программы А и В, и где Y представляет собой общее количество аминокислотных остатков в В. Будет понятно, что если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, то % идентичности аминокислотной последовательности А по отношению к В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В по отношению к А. Если не указано иное, все значения % идентичности аминокислот, используемые в настоящем документе, получены как описано в предыдущем абзаце, используя компьютерную программу ALIGN- 2.
Композиции и способы
[77] В настоящем изобретении согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены антитела к ВИЧ (включая в себя, без ограничения, антигенсвязывающие фрагменты антител и конъюгатов и/или слитые белки антител, например, фрагменты, такие как химерные белки или химерные рецепторы, например, химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие один или более антител). Такие антитела, слитые белки и/или конъюгаты согласно некоторым вариантам осуществления находят применение при лечении, диагностике и/или прогнозе ВИЧ. Среди предусмотренных антител (и слитых белков и их конъюгатов) представлены те, которые могут нейтрализовать ВИЧ. Антитела могут представлять собой нейтрализующие антитела широкого спектра действия. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела по настоящему изобретению могут нейтрализовать ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Например, согласно некоторым вариантам осуществления антитела по настоящему изобретению могут нейтрализовать ВИЧ-1 группы М, ВИЧ-1 группы N, ВИЧ-1 группы О и/или ВИЧ-1 группы Р. Согласно некоторым вариантам осуществления антитела по настоящему изобретению могут нейтрализовать ВИЧ-1 клады A-В, С, D, Е, F, G, Н, I, J, К или любую комбинацию, подтип или рекомбинантное производное (в том числе циркулирующую рекомбинантную форму (CRF)). Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены антитела, которые связываются с гликопротеином ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены антитела с усиленной эффекторной функцией, которые связываются с ВИЧ. Среди предусмотренных слитых белков и конъюгатов, включая в себя химерные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR), представлены белки и конъюгаты, которые включают в себя любое одно или более из представленных антител, отдельно или в комбинации.
Иллюстративные антитела к ВИЧ
[78] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрены антитела, такие как выделенные антитела, которые связываются с ВИЧ. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-2. ВИЧ может представлять собой ВИЧ- 1 группы М. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1 группы N, ВИЧ-1 группы О и/или ВИЧ- 1 группы Р. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1 клады А (включая в себя А1 и/или А2), В, С, D, Е, F (включая в себя F1 и/или F2), G, Н, I, J, К или любую комбинацию, подтип или рекомбинантное производное (включая в себя циркулирующую рекомбинантную форму (CRF)). Согласно некоторым вариантам осуществления рекомбинантные клады ВИЧ-1 (согласно некоторым вариантам осуществления называемые циркулирующими рекомбинантными формами (CRF)) представлены комбинацией двух клад, из которых они получены. Согласно некоторым вариантам осуществления иллюстративные CRF включают в себя АВ, АС, AG, DF, ВС и т.д. В частности, антитела к ВИЧ обеспечивают связывание с гликопротеином оболочки ВИЧ. Выделенное антитело представляет собой то, которое было отделено от компонента его природного окружения. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело очищают до большей чем 95% или 99% чистоты, как определено, например, электрофоретически (например, посредством ДСН-ПААГ, изоэлектрического фокусирования (IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографией (например, ионобменной или обратно-фазовой ВЭЖХ). (Смотрите, например, Flatman et al., J. Chromatogr., В 848: 79-87 (2007)).
[79] В частности, антитела к ВИЧ обеспечивали связывание с эпитопом N- гликанового комплексного типа ВИЧ человека. В частности, антитела к ВИЧ обеспечивали связывание с gpl20 ВИЧ человека. Антитела к ВИЧ по настоящему изобретению связываются с эпитопом, присутствующим на домене gpl20 человека, содержащим N- гликан типа.
[80] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем изобретении предусмотрены выделенные антитела, которые могут нейтрализовать ВИЧ. Нейтрализующее антитело может представлять собой антитело, которое ингибирует инфекционность вируса. Согласно другим вариантам осуществления в настоящем изобретении предусмотрены выделенные антитела, которые могут неспецифически нейтрализовать ВИЧ. Нейтрализующее антитело широкого спектра действия может представлять собой антитело, которое ингибирует инфекционность двух или более штаммов или подтипов вируса. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-2. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1 группы М. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1 группы N, ВИЧ-1 группы О и/или ВИЧ-1 группы Р. ВИЧ может представлять собой ВИЧ-1 клады А (включая в себя А1 и/или А2), В, С, D, Е, F (включая в себя F1 и/или F2), G, Н, I, J, К или любую комбинацию, подтип или рекомбинантное производное (включая в себя циркулирующую рекомбинантную форму (CRF)).
[81] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела к ВИЧ индуцируют лизис клеток, экспрессирующих ВИЧ. Лизис может быть индуцирован любым механизмом, таким как опосредование эффекторной функции, такой как связывание Clq и зависимая от комплемента цитотоксичность (CDC); связывание рецептора Fc; антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); активация В-клеток или прямая индукция клеточного апоптоза.
[82] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ
сконструировано так, чтобы иметь по меньшей мере одно усиление эффекторной функции по сравнению с несконструированным исходным антителом к ВИЧ. Эффекторными функциями являются биологическая активность, связанная с Fc-областью антитела, которая варьирует в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают в себя: связывание Clq и комплементарную цитотоксичность (CDC); связывание рецептора Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток. Например, антитело к ВИЧ может представлять полученное с использование гликоинженерии антитело, чтобы иметь по меньшей мере одно усиление эффекторной функции по сравнению с негликоинженерным исходным антителом к ВИЧ. Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) представляет собой результат образования комплекса между частью Fab IgG антитела с вирусным белком на поверхности клетки и связыванием части Fc с рецепторами Fc (FcyR) на эффекторных клетках. Усиление эффекторной функции может быть связано с увеличенной аффинностью связывания с рецептором Fc, увеличенной ADCC; повышенным фагоцитоомз; повышенным клеточным иммунитетом; повышенным связыванием с цитотоксическими CD8 Т-клетками; повышенным связыванием с NK-клетками; увеличенным  связыванием  с  макрофагами; повышенным связыванием  с полиморфноядерными клетками; увеличенным связыванием с моноцитами; увеличенным связыванием с макрофагами; увеличенным связыванием с крупными гранулированными лимфоцитами; увеличенным связыванием с гранулоцитами; прямой вызывающей апоптоз сигнализацией; усиленным созреванием дендритных клеток или усиленным примированием Т-клеток. Полученные с использование гликоинженерии антитела к ВИЧ обеспечивают преимущество в выживаемости для пациентов, страдающих от злокачественных опухолей, которые экспрессируют ВИЧ, по сравнению с негликоинжинерными антителами, направленными на тот же эпитоп ВИЧ.
AbVl-9
[83] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Ун, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 16. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Ун, характеризующаяся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Антитело к ВИЧ может сохранять способность связываться с ВИЧ-1. Антитело к ВИЧ может сохранять способность связываться с ВИЧ-2. Антитело к ВИЧ может сохранять способность связываться с ВИЧ-1 группы М. Антитело к ВИЧ может сохранять способность связываться с ВИЧ-1 группы N, ВИЧ-1 группы О и/или ВИЧ-1 группы Р. Антитело к ВИЧ может сохранять способность связываться с ВИЧ-1 клады А (включая в себя А1 и/или А2), В, С, D, Е, F (включая в себя F1 и/или F2), G, Н, I, J, К или любой комбинацией, подтипом или рекомбинантным производным (включая в себя циркулирующую рекомбинантную форму (CRF)). Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 16. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно, антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 и 16, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59 и 61, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18,24,30,36,42,48,54,60 и 63, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61 и 64.
[84] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело
содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, 26, 32, 38, 44, 50 и 56; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, 27, 33, 39, 45, 51 и 57; и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, 28, 34, 40,46, 52 и 58.
[85] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Ун, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11,13, 15 и 16, и последовательность Vlb SEQ ID NO: 2,4, 6, 8,10, 12 и 14, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
[86] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, выбранный из любого Vh в таблице 1. Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vl, выбранный из любого Vlb таблице 2. Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, в котором антитело содержит Vh, выбранный из любого Vh в таблице 1, и Vl, выбранный из любого Vl в таблице 2. Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, выбранный из любого Vh в таблице 1, и Vl, выбранный из любого Vl в таблице 2, причем выбранные Vh и Vl образуют пары в соответствии с таблицей 3.
AbV-1
[87] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну или обе вариабельные области, выбранные из (a) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и (b) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
[88] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (e) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (f) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
[89] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; и (d) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
[90] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; и (d) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
[91] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 17; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 18; (с) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 20; (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 21, и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 22.
[92] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vh, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 19.
[93] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно, антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 2, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
[94] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Ун, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 2, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
ABV-2
[95] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну или обе вариабельные области, выбранные из (а) Ун, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и (b) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
[96] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (e) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и (f) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
[97] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; и (d) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 4.
[98] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную  последовательность  SEQ  ID  NO:  26;  (b)  CDR-L2,  содержащей
аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 27, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 28; и (d) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 3. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную  последовательность  SEQ  ID  N0:  23;  (b)  CDR-H2,  содержащую
аминокислотную  последовательность  SEQ  ID  N0:  24;  (с)  CDR-H3,  содержащую
аминокислотную  последовательность  SEQ  ID  N0:  25;  (d)  CDR-L1,  содержащую
аминокислотную  последовательность  SEQ  ID  NO:  26;  (е)  CDR-L2,  содержащую
аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 27; и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 28.
[99] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh,
характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления  последовательность  Vh, характеризующаяся идентичностью,
составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID N0: 3. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 23, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25.
[100] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 4, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
[101] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 4, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
AbV-3
[102] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну или обе вариабельные области, выбранные из (a) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (b) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
[103] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; (e) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (f) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
[104] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2914; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2914; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; и (d) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
[105] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; и (d) Ун, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
[106] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; (с) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31; (d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; (e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
[107] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Ун, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vh, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31.
[108] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Уь SEQ ID NO: 6, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34.
[109] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 6, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
ABV-4
[110] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну или обе вариабельные области, выбранные из (а) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и (b) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
[111] Согласно одному аспекту в настоящем изобретение предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; (e) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и (I) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.
[112] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 37. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; и (d) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
[113] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и (c) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40; и (d) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 7.
[114] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (с) CDR-H3, содержащую, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; (d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; (e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39; и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.
[115] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Ун, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Ун, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.
[116] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ГО N0:  8. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl,
характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID N0: 8. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно, антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 8, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 38; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 39; и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 40.
[117] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 7, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 8, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
AbV-5
[118] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее обе вариабельные области, выбранные из (a) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 9, и (b) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10.
[119] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42; и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; и по меньшей мере одну, по меньшей мере, две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (е) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45; и (f) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46.
[120] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42; (с) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45; и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46.
[121] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vh, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранные из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43.
[122] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, в котором антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 10, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44: 10; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46.
[123] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 10, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
AbV-б
H
L
[124] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее обе вариабельные области, выбранные из (a) V, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и (b) V, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
[125] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48; и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49; и по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50; (е) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51; и (f) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.
[126] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48; и (с) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49; (d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50; (e) CDR- L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51; и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52.
[127] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Ун, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID N0: 11. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Ун, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Ун аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Ун содержит одну, две или три CDR, выбранные из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49.
[128] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 12, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51; и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 52.
[129] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Ун, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 12, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
AbV-7
[130] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну или обе вариабельные области, выбранные из (a) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (b) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
[131] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 53; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55; (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; (e) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (f) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
[132] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; и (c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54; и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0:  55; и (d) Vl, содержащей
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (a) CDR- L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из (а) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 56; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; и (d) Vh, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.
[133] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 54; (с) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55; (d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 56; (е) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
[134] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 13. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vh, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делении относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Ун аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Ун содержит одну, две или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 55.
[135] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в любой из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно, антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 14, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57; и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.
[136] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 14, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
AbV-8
[137] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее вариабельные области Ун, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 15. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее вариабельные области Ун, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и спаренную область Vl.
[138] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61.
[139] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и (b) спаренную область Vl.
[140] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащей по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Ун, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vl, выбранные из спаренной области Vl.
[141] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; и (с) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и все три последовательности CDR Vl, выбранные из спаренной области Vl.
[142] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Ун, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vh, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61.
[145] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и спаренную последовательность Vl, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
AbV-9
[146] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее вариабельные области Vh, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее вариабельные области, выбранные из (а) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и (b) Vl, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее выбранные вариабельные области из (а) Vh, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и (b) Vl, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65.
[147] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и (c) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.
[148] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело
к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность  SEQ  ID  NO:  62;  (b)  CDR-H2,  содержащей  аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 63; и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность  SEQ  ID  NO:  64;  и  (d) Vl,  содержащей  аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 16.
[149] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело
к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности CDR Vh, выбранные из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность  SEQ  ID  NO:  62;  (b)  CDR-H2,  содержащей  аминокислотную
последовательность SEQ ID NO: 63; и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность  SEQ  ID  NO:  64;  и  (d) Vl,  содержащей  аминокислотную
последовательность SEQ ID N0: 65.
[150] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (e) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и (f) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
[151] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; (с) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; (d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
[152] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее по меньшей мере одну, две, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; (d) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; (e) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и (f) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68.
[153] Согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, содержащее CDR: (a) CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (b) CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; (с) CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; (d) CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; (e) CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и (f) CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68.
AbV-9a
[154] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vh характеризующаяся идентичностью по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранные из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.
[155] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делении относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делении происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 4, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранных из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28.
[156] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 4, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
AbV-9b
[157] Согласно одному аспекту антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh, характеризующуюся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vh, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vh аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vh содержит одну, две или три CDR, выбранные из: (a) CDR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (b) CDR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и (с) CDR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.
[158] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (Vl), характеризующийся идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% по отношению к аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательность Vl, характеризующаяся идентичностью, составляющей по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно эталонной последовательности, но антитело к ВИЧ, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления в общей сложности от 1 до 10 аминокислот были заменены, вставлены и/или удалены в любой из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65. Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции происходят в областях вне CDR (например, в FR). Необязательно антитело к ВИЧ содержит последовательность Vl SEQ ID NO: 65, включая в себя посттрансляционные модификации этой последовательности. Согласно конкретному варианту осуществления Vl содержит одну, две или три CDR, выбранные из (a) CDR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66; (b) CDR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, и (с) CDR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68.
[159] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ, причем антитело содержит Vh, как в любом из представленных выше вариантов осуществления, и Vl, как в любом из представленных выше вариантов осуществления. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело содержит Vh, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, и последовательность Vl в SEQ ID NO: 68, включая в себя посттрансляционные модификации этих последовательностей.
[160] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет
собой человеческое моноклональное  антитело AbV-1.  Аминокислотные
последовательности для тяжелых и легких цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-2. Аминокислотные последовательности для тяжелой и легкой цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 3 и 4, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-З. Аминокислотные последовательности для тяжелых и легких цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 5 и 6, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-4. Аминокислотные последовательности для тяжелой и легкой цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-5. Аминокислотные последовательности для тяжелых и легких цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 9 и 10, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-б. Аминокислотные последовательности для тяжелых и легких цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 11 и 12, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-7. Аминокислотные последовательности для тяжелых и легких цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 13 и 14, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-8. Последовательность нуклеиновой кислоты для тяжелой цепи этого антитела представлена в SEQ ID NO: 15. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-9a. Аминокислотные последовательности для тяжелой и легкой цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 16 и 4, соответственно. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое моноклональное антитело AbV-9b. Аминокислотные последовательности для тяжелых и легких цепей этого антитела представлены в SEQ ID NO: 16 и 65, соответственно.
[161] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой химерное антитело, полученное из любого из представленных выше человеческих антител. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой гуманизированное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой человеческое антитело.
[162] Согласно еще одному аспекту антитело к ВИЧ в соответствии с любым из приведенных выше вариантов осуществления может включать в себя любой из признаков, отдельно или в комбинации, как описано ниже.
СВОЙСТВА АНТИТЕЛ Частота мутаций
[163] Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать последовательность тяжелой цепи с частотой мутации, составляющей по меньшей мере приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% или выше по отношению к последовательности зародышевой линии. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать область CDR3, которая представляет собой последовательность легкой цепи с частотой мутации, составляющей по меньшей мере приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% или выше по отношению к последовательности зародышевой линии. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать последовательность тяжелой цепи и легкой цепи с частотой мутации, составляющей по меньшей мере приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% или 20% или выше по отношению к последовательности зародышевой линии. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать область Vh из семейства Vh, выбранного из группы, состоящей из любого из семейства Vh 4-59.
Длины тяжелых и легких цепей
[164] Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать область CDR3, которая составляет в длину по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислот. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать область CDR3, длина которой составляет по меньшей мере приблизительно 18 аминокислот.
[165] Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать делецию на конце легкой цепи. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать делецию 3 или более аминокислот на конце легкой цепи. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать делецию 7 или менее аминокислот на конце легкой цепи. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать делецию 3, 4, 5, 6 или 7 аминокислот на конце легкой цепи.
[166] Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать вставку в легкую цепь. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать вставку из 1,2, 3,4,5,6,7, 8,9 или Шили более аминокислот в легкой цепи. Антитела согласно настоящему изобретению могут содержать вставку из 3 аминокислот в легкой цепи.
Аффинность
[167] Аффинность представляет собой силу суммы всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, используемый в настоящем документе термин «аффинность связывания» относится к истинной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между представителями пары, участвующими в связывании (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X для ее партнера Y, как правило, может быть представлена константой диссоциации (kd). Аффинность может быть измерена любым из ряда известных способов, включая в себя те, которые, как правило, используются и/или описаны в настоящем документе. Конкретные иллюстративные и примерные варианты осуществления для измерения аффинности связывания описаны ниже.
8
8
13
9
13
-9
-9
-9
-10
-9
-10
-11
-11
-12
-12
[168] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренное в настоящем документе антитело характеризуется константой диссоциации (Kd) приблизительно 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 5 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,5 нМ, 0,1 нМ, 0,05 нМ, 0,01 нМ или 0,001 нМ или менее (например, 10' М или менее, например, от 10' М до 10' М, например, от 10‘ М до 10" М) для мишени антитела. Мишень антитела может представлять собой мишень ВИЧ. Мишень антитела может представлять собой мишень ВИЧ-1. Мишень антитела может представлять собой мишень ВИЧ-2. Мишень антитела может представлять собой мишень ВИЧ-1 группы М. Мишень антитела может представлять собой мишень ВИЧ-1 группы N, мишень ВИЧ-1 группы О и/или мишень ВИЧ-1 группы Р. Мишень антитела может представлять собой ВИЧ клады А (включая в себя А1 и/или А2), В, С, D, Е, F (включая в себя F1 и/или F2), G, Н, I, J, К или любую комбинацию, подтип или рекомбинантное производное (включая в себя циркулирующую рекомбинантную форму (CRF)). Другой аспект настоящего изобретения предусматривает антитело к ВИЧ с повышенной аффинностью к его ВИЧ-мишени, например, антитела с созревшей аффинностью к ВИЧ. Антитело с созревшей аффинностью представляет собой антитело с одним или более изменениями в одной или более гипервариабельных областях (HVR) по сравнению с исходным антителом, которое не обладает такими изменениями, приводящими к улучшению аффинности антитела к антигену. Эти антитела могут связываться с ВИЧ с Kd приблизительно 5×10 М, 2×10 М, 1×10 М, 5×10 М, 2×10 М, 1×10 М, 5×10 М, 1×10 М, 5×10 М, 1×10 М или менее. Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ, которое характеризуется повышенной аффинностью по меньшей мере в 1,5 раза, в 2 раза, в 2,5 раза, в 3 раза, в 4 раза, в 5 раз, в 10 раз, в 20 раз или более по сравнению с антителом к ВИЧ зародышевой линии, содержащим последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 69, последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 70 или и то, и другое. Согласно другим вариантам осуществления предусмотрено антитело, которое конкурирует за связывание с тем же эпитопом, что и антитело к ВИЧ, как описано в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело, которое связывается с одним и тем же эпитопом и/или конкурирует за связывание с тем же эпитопом, что и антитело к ВИЧ, проявляет активность эффекторной функции, такую как, например, опосредованная Fc клеточная цитотоксичность, включая в себя активность ADCC.
[169] Kd можно измерить любым подходящим анализом. Например, Kd можно измерить с помощью радиоактивно меченного антигенсвязывающего анализа (RIA) (смотрите, например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999); Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Например, Kd можно измерить с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса (например, с использованием BIACORE-2000 или BIACORE-3000).
Фрагменты антител
[170] Фрагмент антитела содержит часть интактного антитела, такую как антигенсвязывающая или вариабельная область интактного антитела. Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения антитело к ВИЧ в соответствии с любым из вышеуказанных вариантов осуществления представляет собой моноклональное антитело, включающее в себя химерное, гуманизированное или человеческое антитело. Фрагменты антитела включают в себя, без ограничения, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, диатело, линейные антитела, мультиспецифические, образованные из антител фрагменты антител и scFv-фрагменты, и другие фрагменты, описанные ниже. Согласно другому варианту осуществления антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgGl или другого класса или изотипа антитела, как описано в настоящем документе. (Смотрите, например, Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003); Pluckthiin, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, pp.269-315 (1994); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); WO93/01161 и патенты США №557894, 5866446, 6248516 и 5587458). Полноразмерное антитело, интактное антитело или цельное антитело представляет собой антитело, характеризующееся структурой, по существу сходной с нативной структурой антитела, или содержащее тяжелые цепи, которые содержат область Fc, как определено в настоящем документе. Фрагменты антител могут быть получены различными способами, включая в себя, без ограничения, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также производство рекомбинантными клетками- хозяевами (например, К. coli или фагом), как описано в настоящем документе.
[171] Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий сайт. Этот фрагмент содержит димер домена вариабельной области одной тяжелой и одной легкой цепи в плотной, нековалентной ассоциации. Из складывания этих двух доменов происходят шесть гипервариабельных петель (три петли каждая из Н- и L-цепи), которые вносят аминокислотные остатки для связывания антигена и придают антигенсвязывающую специфичность антителу. Однако даже единственная вариабельная область (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные к антигену), обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низким сродством, чем весь сайт связывания.
[172] Одноцепочечный Fv (sFv или scFv) представляет собой фрагмент антитела, который содержит домены Vh и Vl антитела, связанные в единственную полипептидную цепь. Полипептид sFv может дополнительно содержать полипептидный линкер между доменами Vh и Vl, который позволяет sFv формировать желаемую структуру для связывания антигена. (Смотрите, например, Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp.269-315 (1994); Borrebaeck 1995, ниже). Согласно некоторым вариантам осуществления sFv может присутствовать в химерном антигенном рецепторе (CAR).
[173] Диатело представляет собой небольшой фрагмент антитела, полученный путем конструирования sFv-фрагмента с коротким линкером (приблизительно 5-10 остатков) между доменами Vh и Vl, так что достигается межцепочечное, но не внутрицепочечное спаривание V-доменов, в результате чего образуется двухвалентный фрагмент. Биспецифические диатела представляют собой гетеродимеры двух кроссоверных sFv-фрагментов, в которых домены Vh и Vl двух антител присутствуют в разных полипептидных цепях. (Смотрите, например, Европейский патент ЕР 404097, публикацию международной заявки WO 93/11161 и Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)).
[174] Доменные антитела (dAb), которые могут быть получены в полностью человеческой форме, представляют собой наименьшие известные антигенсвязывающие фрагменты антител в диапазоне от приблизительно 11 кДа до приблизительно 15 кДа. DAb представляют собой функциональные вариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов (соответственно Vh и Vl). Они высоко экспрессируются в культуре микробных клеток, проявляют благоприятные биофизические свойства, включая в себя, например, без ограничения, растворимость и температурную стабильность, и хорошо подходят для селекции и созревания аффинности с помощью систем отбора in vitro, таких как, например, фаговый дисплей. DAb являются биологически активными в качестве мономеров и благодаря своим малым размерам и присущей стабильности могут быть отформатированы в более крупные молекулы для создания лекарственных средств с продолжительным периодом полураспада или другой фармакологической активностью. (Смотрите, например, публикацию международной заявки W09425591 и US20030130496).
[175] Fv и sFv представляют собой виды с интактными сайтами связывания, которые лишены константных областей. Таким образом, они пригодны для уменьшения неспецифического связывания во время использования in vivo. sFv слитые белки могут быть сконструированы для получения слияния эффекторного белка на аминогруппе или карбоксильном конце sFv. Фрагмент антитела также может представлять собой «линейное антитело. (Смотрите, например, патент США №5641870). Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
Химерные антигенные рецепторы (CAR)
[176] Иллюстративные антигенные рецепторы, включая в себя CAR, и способы для разработки и введения таких рецепторов в клетки, включают в себя те, которые описаны, например, в публикациях международной заявки на патент №W0200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, W02013/123061, публикациях заявок на патент США №US2002131960, US2013287748, US20130149337, патентах США №6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209,7354762, 7446191, 8324353 и 8479118, и Европейской заявке на патент №ЕР2537416, и/или те, которые описаны в Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wuetal., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. Согласно некоторым аспектам антигенные рецепторы включают в себя CAR, описанные в патенте США №7446190, и описанные в публикации международной заявки на патент №WO/2014055668 А1. Примеры CAR включают в себя CAR, описанные в любой из представленных выше публикаций, таких как WO 02014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США №7446190, патент США №8389282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701 и Brentjens et al., SciTransl Med. 2013 r. 5 (177). Смотрите также WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США №7446190 и патент США №8389282. Химерные рецепторы, такие как CAR, как правило, включают в себя внеклеточный антигенсвязывающий домен, такой как часть молекулы антитела, как правило, вариабельную область тяжелой (Vh) цепи и/или вариабельную область легкой (Vl) цепи антитела, например, фрагмент scFv-антитела.
[177] Согласно некоторым вариантам осуществления химерный антигенный рецептор (CAR) может включать в себя внутриклеточный домен, содержащий внутриклеточный домен Т-клеточного рецептора, и внеклеточную часть, содержащую антигенсвязывающую часть антитела, например, sFv антитела. Как правило, химерный рецептор (например, CAR) содержит линкерный или спейсерный домен между антигенсвязывающей частью и трансмембранным доменом. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер или спейсер получают из шарнирной области иммуноглобулина. Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая конструкцию CAR, согласно некоторым вариантам осуществления представляет собой вектор CAR в дополнение к кодирующему внутриклеточному домену, содержащему внутриклеточный домен Т-клеточного рецептора, и внеклеточную часть, содержащую антигенсвязывающую часть антитела, например, sFv антитела, может содержать промотор. Например, промотор может представлять собой синтетический промотор, который продолжается в области U3 модифицированного MoMuLV LTR с энхансером вируса миелопролиферативной саркомы. Согласно другим вариантам осуществления промотор может представлять собой промотор EFla или промотор EF1. Согласно некоторым вариантам осуществления CAR может содержать внутриклеточный домен, содержащий костимулирующий домен и внутриклеточный домен Т-клеточного рецептора, и внеклеточную часть, содержащую антитело, такое как одно или более антител, представленных в настоящем документе, которое может представлять собой одноцепочечное антитело или его фрагмент.Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой или содержит sFv или scFv. Согласно некоторым вариантам осуществления CAR может дополнительно включать в себя дополнительную внеклеточную часть(и), такую как спейсер и/или шарнирная область.
[178] Согласно любому из представленных выше вариантов осуществления антитело внутри химерной молекулы, например, химерного рецептора, например, CAR, такое как sFv, может содержать домен Vh и домен Vl антитела. Например, sFv может содержать домен Vh от любого из AbV-1, AbV-2, AbV-3, AbV-4, AbV-5, AbV-6, AbV-7, AbV-8, AbV-9, АЬУ-9а или AbV-9b в сочетании с доменом Уь от любого из Ab-Vl, АЬУ-2, AbV-3, AbV-4, AbV-5, AbV-6, AbV-7, AbV-8, AbV-9, AbV-9a или Abv-9b. Например, sFv может быть создан путем синтеза оптимизированных по кодону последовательностей для тяжелой и легкой цепей, разделенных одним из ряда линкеров.
[179] Согласно некоторым аспектам линкеры, богатые глицином и серином (и/или треонином), включают в себя по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% 97%, 98% или 99% такой аминокислоты (аминокислот). Согласно некоторым вариантам осуществления они включают в себя по меньшей мере приблизительно 50%, 55%, 60%, 70% или 75%, глицина, серина и/или треонина. Согласно некоторым вариантам осуществления линкер содержит по существу или полностью глицин, серин и/или треонин. Линкеры, как правило, составляют от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 50 аминокислот в длину, как правило от приблизительно 10 аминокислотами до приблизительно 30 аминокислот, например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 аминокислот и в некоторых примерах от 10 аминокислот до 25 аминокислот в длину. Иллюстративные линкеры включают в себя линкеры, содержащие различное количество повторов последовательности GGGGS (4GS) или GGGS (3GS), такое как от 2, 3,4 до 5 повторов такой последовательности. Примеры линкеров включают в себя те, которые имеют GGGGGGGGGGGGGS или состоят из нее. Иллюстративные линкеры дополнительно включают в себя те, которые имеют последовательность GSTSGSGKPGSGEGSTKG или состоят из нее.
[180] Согласно некоторым вариантам осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает в себя внутриклеточные сигнальные домены костимуляторных рецепторов, таких как CD28, CD 137 (4-1 ВВ), 0X40 и/или ICOS. Согласно некоторым вариантам осуществления CAR включает в себя первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM. Примеры IT AM, содержащих первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают в себя те, которые получены из TCR£, FcRy, FcR(3, CD3y, CD35, CD3e, CD8, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. Согласно некоторым вариантам осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(ы) в CAR содержит(ат) цитоплазматический сигнальный домен, его часть или последовательность, полученную из CD3£.
+
+
+
+
[181] Иллюстративный вектор АВВ (включая в себя нуклеиновую кислоту, кодирующую CAR) можно трансфицировать в Т-клетки. Т-клетки могут представлять собой CD8Т-клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления CD8Т-клетки, которые были трансфицированы и экспрессируют CAR, могут распознавать инфицированные клетки для пролиферации, уничтожения и/или подавления репликации вируса. Согласно другим вариантам осуществления Т-клетка, трансфицированная CAR, может представлять собой CD4Т-клетку. Согласно некоторым вариантам осуществления CAR модифицированные CD4Т-клетки могут быть дополнительно модифицированы таким образом, что они больше не экспрессируют CD4. Согласно некоторым вариантам существления Т-клетка, трансфицированная CAR, может быть дополнительно модифицирована, чтобы не иметь корецепторов, вовлеченных в ВИЧ-инфекцию, таких как CCR2b, CCR3, CXCR4 и/или CCR5. Например, Т-клетки могут быть трансфицированы реагентами, такими как siRNA, для уменьшения или нокдауна экспрессии одного или более корецепторов, вовлеченных в ВИЧ-инфекцию, таких как CCR2b, CCR3, CXCR4 и/или CCR5. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия одного или более из этих корецепторов, вовлеченных в ВИЧ-инфекцию, может быть уменьшена или подвергнута нокдауну с помощью целевого инструмента для редактирования генома, такого как нуклеаза с цинковыми пальцами (ZFN), подобная активатору транскрипции эффекторная нуклеаза, (TALEN), система CRISPR/Cas, управляемые РНК эндонуклеазы и/или сконструированная мегануклеаза реконструированная хоуминг-эндонуклеаза.
Химерные и гуманизированные антитела
[182] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренное в настоящем документе антитело представляет собой химерное антитело (смотрите, например, патент США №4816567 и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6851- 6855 (1984)). Химерное антитело, как правило, относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи получена от конкретного источника или вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи получена из другого источника или вида. В одном примере химерное антитело содержит отличную от человеческой вариабельную область (например, вариабельную область, полученную от мыши, крысы, хомяка, кролика или нечеловекообразных приматов, таких как обезьяна) и константной области человека. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело с «переключением класса», в котором класс или подкласс был изменен относительно класса исходного антитела. Химерные антитела включают в себя их антигенсвязывающие фрагменты.
[183] Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело (смотрите, например, Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); U.S. Pat. Nos. 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, and 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005); Padlan, Mol. Immunol.28:489-498 (1991); DallAcqua et al., Methods 36:43-60 (2005); Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)).
[184] Отличное от человеческого антитело может быть гуманизировано для снижения иммуногенности у людей, сохраняя при этом специфичность и аффинность исходного отличного от человеческого антитела. Гуманизированное антитело может содержать один или более вариабельных доменов, содержащих один или более CDR или их части, полученные из отличного от человеческого антитела. Гуманизированное антитело может содержать один или более вариабельных доменов, содержащих один или более FR или их части, полученные из последовательностей антител человека. Гуманизированное антитело может необязательно содержать по меньшей мере часть константной области человека. Согласно некоторым вариантам осуществления один или более остатков FR в гуманизированном антителе замещены соответствующими остатками из отличного от человеческого антитела (например, антитела, от которого получены остатки CDR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антител.
[185] Каркасные области человека, которые могут быть использованы для гуманизации, включают в себя, без ограничения: каркасные области, выбранные с использованием способа «наилучшего соответствия»; каркасные области, полученные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи; человеческие созревшие (соматически мутированные) каркасные области или человеческие каркасные области зародышевой линии и каркасные области, полученные из скрининга FR-библиотек (смотрите, например, Sims etal. J. Immunol. 151:2296 (1993); Carteret al. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol.,151:2623 (1993); Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) и Rosok etal., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
Человеческие антитела
[186] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренное в настоящем документе антитело представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных известных способов (смотрите, например, van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)). Человеческие антитела согласно некоторым аспектам могут быть получены путем введения иммуногена (например, иммуногена ВИЧ) трансгенному животному, которое было модифицировано для получения интактных человеческих антител или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенную стимуляцию. (Смотрите, например, Lonberg, Nat. Biotech, 23: 1117-1125 (2005), патенты США №6075181, 6155584, 5770429 и 7041870 и патент США №US 2007/0061900). Человеческие вариабельные области от интактных антител, производимых такими животными, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем комбинирования с другой константной областью человека.
[187] Человеческие антитела согласно некоторым аспектам также могут быть получены с помощью основанных на гибридоме способов. Например, человеческие антитела могут быть получены из клеточных линий миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека, с использованием технологии В-клеточной гибридомы человека и других способов (смотрите, например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (1987); Boerner et al., J. Immunol., 147: 86(1991); Li etal., Proc. Natl. Acad., 103:3557-3562 (2006), патент США №7189826, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006); Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005)). Человеческие антитела также могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельного домена клона Fv, выбранного из полученных от человека библиотек фагового дисплея. Такие последовательности вариабельных доменов затем могут быть объединены с желаемым константным доменом человека.
Получение библиотек
[188] Антитела могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек для антител с желаемой активностью или активностями. (Смотрите, например, в Hoogenboom et al., Methods in Molecular Biology 178:1-37 (2001); McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al.,Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581- 597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004) и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)). Репертуары генов Vh и Vl могут быть клонированы отдельно (например, с помощью ПЦР) и произвольно рекомбинированы в библиотеках (например, фаговых библиотеках) и подвергнуты скринингу (смотрите, например, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433 -455 (1994)). Альтернативно, наивный репертуар может быть клонирован (например, от человека), чтобы обеспечить единый источник антител к широкому спектру неауто-, а также аутоантигенов без какой-либо иммунизации (смотрите, например, Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)). Альтернативно, наивные библиотеки могут быть синтетически получены путем клонирования переаранжированных сегментов V-гена из стволовых клеток и кодирования областей CDR3 с использованием случайных праймеров или для реаранжировки сегментов V-гена in vitro (смотрите, например, Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992), патент США №5750373 и патенты США №US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000, US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764, US 2007/0292936 и US 2009/0002360). Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, считаются человеческими антителами или фрагментами человеческого антитела в данном документе.
Мультиспецифичность
[189] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренное в настоящем документе антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела, как правило, представляют собой моноклональные антитела, которые характеризуются специфичностью связывания по меньшей мере по отношению к двум разным сайтам (смотрите, например, патент США №US 2008/0069820). Согласно некоторым вариантам осуществления одна из специфичностей связывания относится к ВИЧ, а другая относится к любому другому антигену. Согласно некоторым вариантам осуществления биспецифические антитела могут связываться с двумя различными эпитопами ВИЧ. Биспецифические антитела также могут быть использованы для локализации цитотоксических агентов в клетках, инфицированных ВИЧ. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.
[190] Иллюстративные способы получения мультиспецифических антител предусматривают рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь-легкая цепь иммуноглобулина, характеризующихся разной специфичностью, конструирование с использованием эффекта электростатического взаимодействия для получения Fc антитела- гетеродимерные молекулы, сшивание двух или более антител или фрагментов, использование лейциновых молний для получения биспецифических антител с использованием технологии «диатело» для получения фрагментов биспецифических антител, использование одноцепочечных димеров Fv (sFv), получение триспецифических антител и конструирование «выступ во впадине» (смотрите, например, Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983); W009/089004A1; WO93/08829; Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991); патенты США №4676980 и 5731168; Brennan et al., Science, 229: 81 (1985); Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)) и Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)). Также включены сконструированные антитела с тремя или более функциональными сайтами связывания антигенов (смотрите, например, US 2006/0025576).
ВАРИАНТЫ
[191] Согласно некоторым вариантам осуществления рассматриваются предусмотренные в настоящем документе варианты аминокислотных последовательностей антител. Вариант, как правило, отличается от полипептида, конкретно описанного в настоящем документе, одной или более заменами, делециями, добавлениями и/или вставками. Такие варианты могут быть природными или могут быть получены синтетически, например, путем модификации одной или более вышеуказанных полипептидных последовательностей по настоящему изобретению и оценки одной или более биологических активностей полипептида, как описано в настоящем документе, и/или с использованием любого из нескольких известных способов. Например, может быть желательно улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают в себя, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть сделана для достижения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, антигенсвязывающими.
Варианты замен, вставок и удалений
[192] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены варианты антител, содержащие одну или более аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для мутагенеза путем замены, включают в себя CDR и FR. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющее интерес антитело и продукты подвергнуты скринингу на желаемую активность, например, сохраненное/улучшенное связывание антигена, снижение иммуногенности или улучшение ADCC или CDC.
Исходный остаток
Иллюстративные консервативные замены
Туг (Y)
Тгр; Phe; Thr; Ser
Val (V)
Не; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин
[192] Гидрофобные аминокислоты включают в себя: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu и lie. Нейтральные гидрофильные аминокислоты включают в себя: Cys, Ser, Thr, Asn и Gin. Кислотные аминокислоты включают в себя Asp и Glu. Основные аминокислоты включают в себя: His, Lys и Arg. Аминокислоты с остатками, которые влияют на ориентацию цепей, включают в себя: Gly и Pro. Ароматические аминокислоты включают в себя: Тгр, Туг и Phe.
[193] Согласно некоторым вариантам осуществления замены, вставки или делеции могут происходить в одной или более CDR, причем замены, вставки или делеции существенно не уменьшают связывание антитела с антигеном. Например, консервативные замены, которые существенно не уменьшают аффинность связывания, могут быть сделаны в CDR. Такие изменения могут быть вне «горячих точек» CDR или SDR. Согласно некоторым вариантам осуществления последовательностей вариантов Vh и Vl каждая CDR либо не изменяется, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.
[194] Изменения (например, замены) могут быть сделаны в CDR, например, для улучшения аффинности к антителу. Такие изменения могут быть сделаны в кодирующих CDR кодонах с высокой скоростью мутаций во время соматического созревания (смотрите, например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и полученный вариант может быть исследован на аффинность связывания. Для улучшения аффинности антител можно использовать созревание аффинности (например, с использованием ПЦР с внесением ошибок, перетасовки цепи, рандомизации CDR или олигонуклеотид-направленного мутагенеза) (смотрите, например, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1- 37 (2001)). Остатки CDR, участвующие в связывании антигена, могут быть специфически идентифицированы, например, с использованием сканирующего аланином мутагенеза или моделирования (смотрите, например, Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989)). CDR-H3 и CDR-L3, в частности, часто нацелены. Альтернативно или дополнительно кристаллическая структура комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут быть нацелены или исключены в качестве кандидатов для замены. Варианты могут быть подвергнуты скринингу, чтобы определить, содержат ли они требуемые свойства.
[195] Вставки и делеции аминокислотной последовательности включают в себя амино- и/или карбоксил-концевые слияния, составляющие в длину от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки и делеции внутри последовательности одного или множества аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают в себя антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие варианты вставок молекулы антитела включают в себя слияние с N- или С-концом антитела фермента (например, для ADEPT) или полипептида, который увеличивает период полужизни в сыворотке антитела. Примеры вариантов вставки в последовательность молекул антител включают в себя введение 3 аминокислот в легкую цепь. Примеры концевых делеций включают в себя антитело с делецией 7 или менее аминокислот на конце легкой цепи.
Варианты гликозилирования
[196] Согласно некоторым вариантам осуществления антитела изменяются для увеличения или уменьшения их гликозилирования (например, путем изменения аминокислотной последовательности, так что создается или удаляется один или более сайтов гликозилирования). Углевод, присоединенный к Fc-области антитела, может быть изменен. Природные антитела из клеток млекопитающих, как правило, содержат разветвленный двухантенный олигосахарид, присоединенный N-связью к Asn297 домена СН2 области Fc (смотрите, например, Wright et al., TIBTECH 15: 26-32 (1997)). Олигосахарид может представлять собой различные углеводы, например, маннозу, N- ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу, сиаловую кислоту, фукозу, присоединенную к GlcNAc в стволе двухантенной олигосахаридной структуры. Модификации олигосахарида в антителе могут быть сделаны, например, для создания вариантов антител с некоторыми улучшенными свойствами. Варианты гликозилирования антитела могут улучшать функцию ADCC и/или CDC.
[197] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены варианты антител, имеющие углеводную структуру, которая не содержит фукозу, прикрепленную (непосредственно или опосредованно) к области Fc. Например, количество фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют путем вычисления среднего количества фукозы в сахарной цепи в Asn297 по отношению к сумме всех гликоструктур, прикрепленных к Asn297 (смотрите, например, WO 08/077546). Asn297 относится к аспарагиновому остатку, расположенному приблизительно в положении 297 в области Fc (нумерация остатков Ей Fc-области); однако Asn297 также может быть расположен приблизительно на±3 аминокислоты выше или ниже по ходу транскрипции от положения 297, то есть между положениями 294 и 300, из-за незначительных вариаций последовательности антител. Такие варианты фукозилирования могут характеризоваться улучшенной функцией ADCC (смотрите, например, патенты США №US 2003/0157108, US 2004/0093621, US2003/0157108,  WOOO/61739,  WOOl/29246, US 2003/0115614, US 2002/0164328;
2004/0093621, US 2004/0132140, US 2004/0110704, US 2004/0110282, US 2004/0109865, W003/085119, W003/084570, WO05/035586, WO05/035778, WO 05/053742, WO 02/030440; Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336: 1239-1249 (2004) и Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)). Клеточные линии, например, нокаутные клеточные линии, и способы их применения могут быть использованы для производства дефукозилированных антител, например, клеток СНО Lecl3, дефицитных в отношении фукозилирования белка и с нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8) (смотрите, например, Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); W003/085107, EP 1176195A1, WO 04/ 056312, WO 04/007002, WO 03/84570, WO 03/085119, WO 03/056691, WO 04/024927 и патенты США №US 2003/0157108, US 2003/0115614, US 2004/093621, US 2004/110282, US 2004/110704 и US 2004/132140). Также включены другие варианты гликозилирования антител (смотрите, например, патент США №6602684, патент №US 2005/0123546, публикации международных заявок WO 03/087878, WO 97/30087, WO 98/58964 и W099/22764.
[198] Соответственно, антитела к ВИЧ по настоящему изобретению могут быть произведены клеткой-хозяином с одной или более экзогенными и/или высоко эндогенными гликозилтрансферазными активностями. Гены с гликозилтрансферазной активностью включают в себя (1,4)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу III (GnTII), а-маннозидазу II (Manll), Р(1,4)-галактозилтрансферазу (GalT),  (1,2)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу I (GnTI) и (1,2)-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу II (GnTII). Гликотрансферазы могут содержать слияние, содержащее домен локализации Гольджи (смотрите, например, Lifely et al., Lifely et al., Glycobiology 318:813-22 (1995); Schachter, Biochem. Cell Biol. 64:163-81 (1986), заявки на патент США №60/495142 и 60/441307, патенты №US 2003/0175884 и US 2004/0241817 и W004/065540). Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ может быть экспрессировано в клетке-хозяине, содержащей разрушенный или дезактивированный ген гликозилтрансферазы. Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей (а) выделенную нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, кодирующую полипептид, имеющий гликозилтрансферазную активность; и (b) выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело к ВИЧ по настоящему изобретению, которое связывает ВИЧ человека. Согласно конкретному варианту осуществления модифицированное антитело к ВИЧ, производимое клеткой-хозяином, содержит константную область IgG или его фрагмент, содержащий Fc-область. Согласно другому конкретному варианту осуществления антитело к ВИЧ представляет собой гуманизированное антитело или его фрагмент, содержащий Fc-область. Выделенная нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента его природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые, как правило, содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном положении, отличном от ее природного хромосомного положения.
[199] Антитела к ВИЧ с измененным гликозилированием, производимые клетками- хозяевами по настоящему изобретению, могут проявлять повышенную аффинность связывания рецептора Fc (например, повышенное связывание с активирующим рецептором Fey, таким как рецептор FcyRIIIa) и/или усиленную эффекторную функцию. Усиленная эффекторная функция может быть усилена в одном или более из следующих: повышенная антителозависимая клеточная цитотоксичность, повышенный антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), повышенная секреция цитокинов, усиленный опосредованный иммунным комплексом захват антигенов с помощью антигенпрезентирующих клеток, повышенная Fc-опосредованная клеточная цитотоксичность, повышенное связывание с NK-клетками, повышенное связывание с макрофагами, повышенное связывание с полиморфноядерными клетками (PMN), повышенное связывание с моноцитами, усиленное сшивание связанных с мишенью антител, усиленная прямая сигнальная индукция апоптоза, усиленное созревание дендритных клеток и усиленное праймирование Т-клеток. Соответственно, согласно одному аспекту в настоящем изобретении предусмотрены гликоформы антитела к ВИЧ, характеризующиеся повышенной эффекторной функцией по сравнению с антителом к ВИЧ, которое не было получено с применением гликоинженерии. (Смотрите, например, Tang et al„ J. Immunol., 179: 2815-2823 (2007)).
[200] Настоящее изобретение также относится к способу получения антитела к ВИЧ по настоящему изобретению с модифицированными олигосахаридами, включающему (а) культивирование клетки-хозяина, сконструированной для экспрессии по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, имеющий гликозилтрансферазную активность, в условия, которые позволяют производить антитело к ВИЧ в соответствии с настоящим изобретением, причем указанный полипептид, обладающий гликозилтрансферазной активностью, экспрессируется в количестве, достаточном для модификации олигосахаридов в Fc-области указанного антитела к ВИЧ, производимого указанной клеткой-хозяином; и (b) выделение указанного антитела к ВИЧ. Согласно другому варианту осуществления существуют два полипептида, обладающих гликозилтрансферазной активностью. Антитела к ВИЧ, полученные способами по настоящему изобретению, могут иметь повышенную аффинность связывания рецептора Fc и/или усиленную эффекторную функцию.
[201] Согласно некоторым вариантам осуществления процентное разделение пополам N-связанных олигосахаридов в Fc-области антитела к ВИЧ составляет по меньшей мере от приблизительно 10% до приблизительно 100%, в частности по меньшей мере приблизительно 50%, более конкретно по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% или по меньшей мере приблизительно 90-95% от общего количества олигосахаридов. Согласно еще одному варианту осуществления антитело, полученное способами по настоящему изобретению, содержит повышенную долю нефукозилированных олигосахаридов в области Fc в результате модификации его олигосахаридов способами настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления процент нефукозилированных олигосахаридов составляет по меньшей мере от приблизительно 20% до приблизительно 100%, в частности по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере от приблизительно 60% до приблизительно 70% и, более конкретно, по меньшей мере приблизительно 75%. Нефукозилированные олигосахариды могут быть гибридного или сложного типа. Согласно еще одному варианту осуществления антитело, полученное способами по настоящему изобретению, характеризуется увеличенной долей разделенных пополам олигосахаридов в области Fc в результате модификации его олигосахаридов способами настоящего изобретения. Согласно некоторым вариантам осуществления процент разделенных пополам олигосахаридов составляет по меньшей мере от приблизительно 20% до приблизительно 100%, в частности, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере от приблизительно 60% до приблизительно 70% и, более конкретно, по меньшей мере приблизительно 75%.
[202] Согласно другому варианту осуществления настоящее изобретение относится к антителу к ВИЧ, сконструированному с усиленной эффекторной функцией и/или повышенной аффинностью связывания рецептора Fc, полученному способами по настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой интактное антитело. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела, содержащий Fc-область, или слитый белок, который включает в себя область, эквивалентную области Fc иммуноглобулина.
[203] Согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к системам экспрессии клеток-хозяев для производства антител по настоящему изобретению, имеющих модифицированные профили гликозилирования. В частности, настоящее изобретение относится к системам клеток-хозяев для производства гликоформ антител по настоящему изобретению, имеющих улучшенную терапевтическую ценность. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены системы экспрессии клеток-хозяев, выбранные или сконструированные для экспрессии полипептида, обладающего гликозилтрансферазной активностью.
[204] Как правило, любой тип культивируемой клеточной линии, включая в себя рассмотренные выше линии клеток, можно использовать в качестве фона для разработки линий клеток-хозяев по настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки СНО, клетки ВНК, клетки NS0, клетки SP2/0, клетки миеломы YO, клетки миеломы мыши P3X63, клетки PER, клетки PER.C6 или клетки гибридомы, другие клетки млекопитающих, дрожжевые клетки, клетки насекомых или клетки растений используются в качестве фоновой клеточной линии для производства сконструированных клеток-хозяев по настоящему изобретению.
[205] Клетки-хозяева, которые содержат кодирующую последовательность антитела по настоящему изобретению и которые экспрессируют биологически активные продукты гена, могут быть идентифицированы посредством по меньшей мере четырех общих подходов: (а) гибридизации ДНК-ДНК или ДНК-РНК; (b) наличия или отсутствия функций гена «маркера»; (с) оценки уровня транскрипции, измеренной экспрессией соответствующих транскриптов мРНК в клетке-хозяине; и (d) обнаружения продукта гена, измеренного посредством иммунологического анализа или его биологической активности. Варианты области Fc
[206] Согласно некоторым вариантам осуществления одна или более модификаций аминокислот могут быть введены в область Fc антитела, предусмотренного в настоящем документе, тем самым производя вариант области Fc. Область Fc в настоящем документе представляет собой С-концевую область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Область Fc включает в себя природные последовательности областей Fc и варианты областей Fc. Вариант области Fc может содержать последовательность области Fc человека (например, область Fc человека IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более положениях аминокислот.
[207] Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем изобретении рассмотрен вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми, эффекторными функциями, которые делают его желательным кандидатом для применений, в которых важен период полувыведения антитела in vivo, но некоторые эффекторные функции (такие как комплемент и ADCC) являются ненужными или вредными. Анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo могут проводиться для подтверждения сокращения/истощения активности CDC и/или ADCC. Например, могут быть проведены анализы связывания Fc- рецептора (FcR), чтобы гарантировать, что антитело лишено связывания FcyR (следовательно, вероятно, не характеризуется активностью ADCC), но сохраняет способность связывания FcRn. Неограничивающие примеры анализов in vitro для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы описаны в патенте США №5500362 и 5821337. В качестве альтернативы могут быть использованы способы нерадиоактивных анализов (например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ и CytoTox 96). Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают в себя мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и клетки натуральных киллеров (NK). Альтернативно или дополнительно активность ADCC представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, на животной модели (смотрите, например, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)). Анализ связывания Clq также может быть проведен, чтобы подтвердить, что антитело способно или неспособно связывать Clq и, следовательно, характеризуется или не обладает активностью CDC (смотрите, например, публикации международных заявок WO06/029879, W099/51642 и WO05/100402; патент США №6194551 и Idusogie et al., J. Immunol, 164: 4178-4184 (2000)). Для оценки активации комплемента может быть проведен анализ CDC (смотрите, например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003) и Cragg et al., Blood 103:2738-2743 (2004)). Связывание FcRn и определение клиренса in vzvo/полужизни также может быть выполнено с использованием известных способов (смотрите, например, Petkova, SB et al., Int'l. Immunol. 18 (12): 1759-1769 (2006)). Антитела с уменьшенной эффекторной функцией включают в себя те, которые заменяют один или более остатков области Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329; или два или более положений аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, таких как Fc-мутант с заменой остатков 265 и 297 на аланин (смотрите, например, патенты США №6737056 и 7332581). Также включены варианты антител с улучшенным или уменьшенным связыванием с FcR (смотрите, например, патент США №6737056, публикацию международной заявки WO 04/56312 и Shields et al., J. Biol., Chem., 9 (2): 6591-6604 (2001)). Согласно некоторым вариантам осуществления вариант антитела содержит область Fc с одной или более аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC, например, замены в положениях 298, 333 и/или 334 области Fc.
[208] Антитела могут характеризоваться увеличенным периодом полувыведения и улучшенным связыванием с рецептором Fc новорожденного (FcRn) (смотрите, например, US 2005/0014934). Такие антитела могут содержать область Fc с одной или более заменами в ней, которые улучшают связывание области Fc с FcRn и включают в себя те, у которых замены у одного или более остатков области Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312,317, 340, 356, 360, 362,376, 378, 380, 382,413,424 или 434 (смотрите, например, патент США №7371826). Также рассматриваются другие примеры вариантов областей Fc (смотрите, например, Duncan & Winter, Nature 322: 738-40 (1988), патенты США №5664260 и 5624821 и W094/29351).
Варианты сконструированных с цистеином антител
[209] Согласно некоторым вариантам осуществления может быть желательно создать сконструированные с цистеином антитела, например «thioMAb», в которых один или более остатков антитела заменены остатками цистеина. Согласно некоторым вариантам осуществления замененные остатки происходят в доступных сайтах антитела. Реактивные тиоловые группы могут быть расположены в сайтах для конъюгации с другими фрагментами, такими как лекарственные фрагменты или линкер-лекарственные фрагменты, для создания иммуноконъюгата. Согласно некоторым вариантам осуществления любой один или более из следующих остатков могут быть заменены цистеином: V205 (нумерация Kabat) легкой цепи; А118 (нумерация EU) тяжелой цепи и S400 (нумерация EU) области Fc тяжелой цепи. Сконструированные с цистеином антитела могут быть получены, как описано (смотрите, например, патент США №7521541). Производные антител
[210] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренное в настоящем документе антитело может быть дополнительно модифицировано, чтобы содержать дополнительные небелковые фрагменты, которые известны и доступны. Фрагменты, подходящие для дериватизации антитела, включают в себя, без ограничения, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают в себя, без ограничения, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или статистические сополимеры) и полиэтиленгликоль декстрана или поли(н-винилпирролидона), гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества в производстве благодаря его стабильности в воде.
[211] Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, прикрепленных к антителу, может изменяться, и если присоединены два или более полимеров, они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы.
[212] Согласно другому варианту осуществления представлены конъюгаты антитела и непротеиновой части, которые могут избирательно нагреваться под воздействием излучения. Согласно некоторым вариантам осуществления непротеиновый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (смотрите, например, Каш et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и включает в себя, без ограничения, длины волн, которые не вредят обычным клеткам, но которые нагревают небелковый остаток до температуры, при которой клетки, проксимальные к антитело-непротеиновой части, погибают.
РЕКОМБИНАНТНЫЕ СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ
[213] Антитела могут быть получены с использованием рекомбинантных способов и композиций (смотрите, например, патент США №4816567). Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая описанное в настоящем документе антитело к ВИЧ или его фрагмент. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую Vl, и/или аминокислотную последовательность, содержащую Vh антитела. Согласно дополнительному варианту осуществления предусмотрен один или более векторов, содержащих такую нуклеиновую кислоту. Вектор представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, способную распространять другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает в себя вектор как самовоспроизводящую структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрена нуклеиновая кислота и/или вектор, кодирующий АВ, содержащий связывающий домен, полученный из описанного в настоящем документе антитела к ВИЧ.
+
+
[214] Согласно следующему варианту осуществления предусмотрена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. Клетки-хозяева представляют собой клетки, в которые введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая в себя потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают в себя «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают в себя первично трансформированную клетку и полученное из нее потомство без учета количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновой кислоты в исходной клетке, но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое обладает той же функцией или биологической активностью, что и подвергнутые скринингу или выбранные в первоначально трансформированной клетке, включено в настоящий документ.Согласно одному из таких вариантов осуществления клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована с) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую Vl антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую Vh антитела, или первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую Vl антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую Vh антитела. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка-хозяин содержит вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует CAR. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидной клеткой (например, клеткой YO, NSO, Sp20). Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрен способ получения антитела к ВИЧ, причем способ предусматривает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как указано выше, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина или культуры клеток-хозяев. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка-хозяин представляет собой первичную иммунную клетку, например, Т-клетку, полученную от пациента. Согласно некоторым вариантам осуществления Т-клетка представляет собой CD4Т-клетку, CD8Т- клетку, регуляторную Т-клетку или NK-клетку.
[215] Для получения рекомбинантного антитела к ВИЧ выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано выше, вставляют в один или более векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и секвенирована с использованием обычных процедур.
[216] Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитела векторов включают в себя прокариотические или эукариотические клетки, описанные в настоящем документе. Например, антитела могут быть получены у бактерий, например, когда гликозилирование и функция Fc-эффектора не нужны (смотрите, например, патенты США №5664237, 5789199 и 5840523, Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol.248, pp.245-254 (2003)). После экспрессии антитело может быть выделено из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и может быть дополнительно очищено.
[217] В дополнение к прокариотам эукариотические микробы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для кодирующих антитела векторов (смотрите, например, Gemgross, Nat. Biotech, 22: 1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech, 24: 210-215 (2006)). Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела также получают из многоклеточных организмов, включая в себя беспозвоночных и позвоночных животных. Примеры беспозвоночных включают в себя клетки растений и насекомых (смотрите, например, патенты США №5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429). Примеры клеток позвоночных включают в себя линии клеток млекопитающих, линию CV1 почки обезьяны, трансформированную SV40 (COS-7); (293 или клетки 293, как описано, например, в Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клетки эмбриональной почки хомячка (ВНК); мышиные клетки Сертоли (клетки ТМ4); клетки почек обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK, клетки печени крыс буффало (BRL ЗА), клетки легких человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), опухоль молочной железы мыши (ММТ 060562), клетки TR1, клетки MRC 5, клетки FS4, клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая в себя клетки DHFR-CHO и миеломные клеточные линии, такие как Y0, NS0 и Sp2/0 (смотрите, например, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol.248, pp.255-268 (2003).
АНАЛИЗЫ
[218] Предусмотренные в настоящем документе антитела к ВИЧ могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу или охарактеризованы на их физические/химические свойства и/или биологическую активность посредством различных известных анализов.
[219] Согласно одному аспекту антитело по настоящему изобретению исследуют на его антигенсвязывающую активность, например, с помощью ELISA, Вестерн-блоттинга и т.д. Согласно одному аспекту конкурентные анализы могут быть использованы для идентификации антитела, которое конкурирует с антителом к ВИЧ, описанным в настоящем документе для связывания с ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления такое конкурирующее антитело связывается с одним и тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывается описанными в настоящем документе антителами к ВИЧ. Известны способы картирования эпитопов (смотрите, например, Morris “Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 (1996)).
[220] В иллюстративном конкурентном анализе иммобилизованный ВИЧ инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с ВИЧ, и второе немеченое антитело, которое исследуют на его способность конкурировать с первым антителом за связывание с ВИЧ. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный ВИЧ инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе немеченое антитело. После инкубации в условиях, позволяющих связывание первого антитела с ВИЧ, удаляется избыточное несвязанное антитело и измеряется количество метки, связанной с иммобилизованным ВИЧ. Если количество метки, связанное с иммобилизованным ВИЧ, существенно уменьшается в исследуемом образце относительно контрольного образца, то это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с ВИЧ (смотрите, например, Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (1996)).
[221] Согласно одному аспекту предусмотрены анализы для идентификации антител к ВИЧ, имеющих биологическую активность. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены анализы для идентификации антител к ВИЧ, характеризующихся нейтрализующей активностью к ВИЧ. Также предусмотрены антитела, обладающие такой биологической активностью in vivo и/или in vitro. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело по настоящему изобретению исследуют на такую биологическую активность.
ИММУНОКОНЪЮГАТЫ
[222] В настоящем изобретении также предусмотрены иммуноконъюгаты, содержащие антитело к ВИЧ. Иммуноконъюгат представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичными молекулами. Например, иммуноконъюгат может содержать антитело к ВИЧ, конъюгированное с одним или более цитотоксическими средствами, такими как химиотерапевтические средства или лекарственные средства, ингибирующие рост средства, белковые домены, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы. Согласно некоторым вариантам осуществления иммуноконъюгат может содержать антитело к ВИЧ или его фрагмент (например, scFv).
[223] Согласно некоторым вариантам осуществления иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или более лекарственными средствами, включая в себя, без ограничения, майтансиноид; ауристатин, такой как молекулы монометилауристатина DE и DF (ММАЕ и MMAF); доластатин; калихеамицин или его производное; такой антрациклин, как дауномицин или доксорубицин; метотрексат; виндезин; такой таксан, как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тезетаксел и ортатаксел; трихотецен и СС1065 (смотрите, например, патенты США №5208020, 5416064, 5635483, 5780588, 7498298, 5712374, 5714586, 5739116, 5772785, 5770701, 5770710, 577001, 6630579 и 5877296, ЕР0425235 В1, Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998); Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002) и King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)).
[224] Согласно другому варианту осуществления иммуноконъюгат содержит описанное в настоящем документе антитело, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая в себя, без ограничения, цепь дифтерии А, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь экзотоксина А (от Pseudomonas aeruginosa), цепь рицина А, цепь абрина А, цепь модецина А, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРН и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестритоцин, феномицин, эномицин и трихотеценов.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
[225] Согласно другому варианту осуществления иммуноконъюгат содержит описанное в настоящем документе антитело, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Иллюстративные радиоактивные изотопы, доступные для производства радиоконъюгатов, включают в себя At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu. Радиоконъюгат может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфического обнаружения (например, tc99m или 1123 или спиновую метку для ядерного магнитного резонанса (ЯМР), такой как иод-123, иод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо).
[226] Конъюгаты антитела и цитотоксического средства могут быть получены с использованием бифункциональных связывающих белки средств, таких как N- сукцинимидил-3 -(2-пиридилдитио)пропионат  (SPDP),  сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (таких как диметиладипимидат НС1), активные сложные эфиры (например, дисукцинимидилбутират), альдегиды (например, глутаровый  альдегид),  бис-азидосоединения  (например,  бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (например, бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и био- активные соединения фтора (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, может быть получен иммунотоксин рицина (смотрите, например, Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)). Углерод-14-меченная  1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой иллюстративное хелатирующее средство для конъюгации радионуклеотида с антителом (смотрите, например, публикацию международной заявки WO94/11026). Линкер может быть расщепляемым, что облегчает высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Иллюстративные расщепляемые линкеры включают в себя кислотно- лабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер и дисульфидсодержащий линкер (смотрите, например, Chari et al., Cancer Res., 52: 127-131 (1992); патент США №5208020).
[227] Иммуноконъюгаты или ADC в настоящем документе явно рассматривают конъюгаты, полученные с помощью сшивающих реагентов. Иллюстративные сшивающие реагенты включают в себя BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SB АР, SI A, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо- MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, и SVSB (сукцинимидил-(4- винилсульфон)бензоат).
СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ОБНАРУЖЕНИЯ
[228] Согласно некоторым вариантам осуществления любое из предусмотренных в настоящем документе антител к ВИЧ применимо для обнаружения наличия ВИЧ в биологическом образце. Обнаружение предусматривает количественное или качественное обнаружение.
[229] Раскрытые в настоящем документе антитела и композиции могут быть использованы для различных целей, таких как обнаружение ВИЧ-инфекции или диагностика СПИДа у субъекта. Эти способы могут предусматривать контактирование образца у субъекта с диагнозом ВИЧ или СПИД с описанным в настоящем документе антителом и обнаружение связывания антитела с образцом. Увеличение связывания антитела с образцом относительно связывания антитела с контрольным образцом подтверждает, что у субъекта есть ВИЧ-1-инфекция и/или СПИД. Согласно некоторым вариантам осуществления способы дополнительно предусматривают контактирование второго антитела, которое связывает ВИЧ, с образцом и обнаружение связывание второго антитела. В некоторых неограничивающих примерах увеличение связывания антитела с образцом относительно контрольного образца обнаруживает ВИЧ у субъекта. В некоторых неограничивающих примерах антитело специфически связывается с растворимым gpl20 в образце. Согласно некоторым вариантам осуществления способы дополнительно предусматривают контактирование второго антитела, которое специфически распознает антитело ВИЧ, с образцом и обнаружение связывания второго антитела.
[231] В соответствии с другим вариантом осуществления в настоящем изобретении предусмотрены диагностические способы. Диагностические способы, как правило, включают в себя контактирование полученного от пациента биологического образца, такого как, например, кровь, сыворотка, слюна, моча, мокрота, образец микроскопии клеток или биопсия ткани с антителом к ВИЧ и определение того, характеризуется ли антитело преимущественным связыванием с образцом по сравнению с контрольным образцом или предопределенным предельным значением, тем самым указывая на наличие вируса ВИЧ.
[232] В соответствии с другим вариантом осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы обнаружения наличия антител к ВИЧ по настоящему изобретению в биологическом образце от пациента. Способы обнаружения, как правило, предусматривают получение биологического образца от пациента, такого как, например, кровь, сыворотка, слюна, моча, мокрота, мазковая проба клеток или биопсия ткани, и выделение антител к ВИЧ или их фрагментов или нуклеиновых кислот, которые кодируют антитело к ВИЧ, и анализ на наличие антитела к ВИЧ в биологическом образце. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены способы обнаружения нуклеотидной последовательности антитела к ВИЧ в клетке. Нуклеотидная последовательность антитела к ВИЧ также может быть обнаружена с использованием описанных в настоящем документе праймеров. Наличие антитела к ВИЧ в биологическом образце от пациента может быть определено с использованием известных рекомбинантных способов и/или использования масс-спектрометра.
[233] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрено антитело к ВИЧ для применения в способе диагностики или обнаружения. Согласно еще одному аспекту предусмотрен способ обнаружения наличия ВИЧ в биологическом образце. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает контактирование биологического образца с описанным в настоящем документе антителом к ВИЧ в условиях, обеспечивающих связывание антитела к ВИЧ с ВИЧ, и определение того, образуется ли комплекс между антителом к ВИЧ и ВИЧ. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ используют для отбора субъектов, подходящих для терапии антителом к ВИЧ, например, где ВИЧ представляет собой биомаркер для отбора пациентов.
[234] Иллюстративные нарушения, которые могут быть диагностированы с использованием антитела по настоящему изобретению, включают в себя нарушения, характеризующиеся инфекцией ВИЧ, включая в себя СПИД.
32
14
125
3
131
[235] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены меченые антитела к ВИЧ. Метки включают в себя, без ограничения, метки или фрагменты, которые обнаруживаются непосредственно (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно- плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, обнаруживаемые опосредованно, например, посредством ферментативной реакции или взаимодействия с молекулой (например, ферментами или лигандами). Иллюстративные метки включают в себя радиоизотопы (например, Р, С, 1, Н и 1), флуорофоры (например, редкоземельные хелаты или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люцериферазы (смотрите, например, патент США №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, Р-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридные оксидазы, гетероциклические оксидазы, в сочетании с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, биотин/авидин, спиновые метки, метки бактериофага, стабильные свободные радикалы и тому подобное.
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ
[236] Также предусмотрены фармацевтические составы описанного в настоящем документе антитела к ВИЧ путем смешивания такого антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в виде лиофилизированных составов или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, нетоксичны для реципиентов при используемых дозах и концентрациях. Иллюстративные фармацевтически приемлемые носители включают в себя буферы (например, фосфат, цитрат и другие органические кислоты); антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота и метионин); консерванты (например, октадецилдиметилбензиламмонийхлорид); гексаметонийхлорид; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутил или бензиновый спирт; алкилпарабен (например, метил или пропилпарабен); катехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и т-крезол; низкомолекулярные полипептиды (менее 10 остатков); белки (например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); гидрофильные полимеры (например, поливинилпирролидон); аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин); моносахариды, дисахариды и другие углеводы (например, глюкоза, манноза или декстрины); хелатирующие средства (например, ЭДТА); сахара (например, сахароза, маннит, трегалоза или сорбит); солеобразующие противоионы (например, натрий); комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы) и/или неионные поверхностно-активные вещества (например, полиэтиленгликоль (ПЭГ)). Иллюстративные фармацевтически приемлемые носители в настоящем документе также включают в себя инстерстициальные лекарственные дисперсионные средства (например, растворимые нейтрально-активные гиалуронидазные гликопротеины (sHASEGP)) (смотрите, например, патенты США №US 2005/0260186 и US 2006/0104968). Согласно одному аспекту sHASEGP объединяют с одним или более дополнительными гликозаминогликанами (например, хондроитиназами).
[237] Также предусмотрены фармацевтические составы, включающие в себя антитело к ВИЧ или его фрагмент и/или слитый белок, и/или химерный рецептор, и/или сконструированные клетки, экспрессирующие молекулы. Фармацевтические композиции и составы, как правило, включают в себя один или более необязательных фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. Согласно некоторым вариантам осуществления композиция включает в себя по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
[238] Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить эффективную биологическую активность содержащегося в нем активного ингредиента и которая не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому препарат будет вводиться.
[239] «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает в себя, без ограничения, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.
[240] Согласно некоторым аспектам выбор носителя определяется частично конкретной клеткой, связывающей молекулой и/или антителом и/или способом введения. Соответственно, существует множество подходящих составов. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать в себя, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. Согласно некоторым аспектам используется смесь из двух или более консервантов. Консервант или его смеси, как правило, присутствует в количестве от приблизительно 0,0001% до приблизительно 2% от общей массы композиции.
[241] Буферные средства согласно некоторым аспектам включены в композиции. Подходящие буферные средства включают в себя, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. Согласно некоторым аспектам используется смесь двух или более буферных средств. Буферное средство или его смеси, как правило, присутствуют в количестве от приблизительно 0,001% до приблизительно 4% от общей массы композиции. Известны способы получения аддитивных фармацевтических композиций. Иллюстративные способы описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).
[242] Составы антител могут включать в себя лиофилизированные составы и водные растворы.
[243] Состав или композиция могут также содержать более одного активного ингредиента, пригодного для конкретного симптома, заболевания или состояния, подвергаемого лечению антителами или их фрагментами или клетками, предпочтительно с активностью, комплементарной антителу или его фрагменту, или клетку, где соответствующие активности не оказывает неблагоприятного воздействия друг на друга. Согласно некоторым вариантам осуществления состав может также содержать ингредиенты, необходимые для лечения, улучшения, управления, снижения вирусной нагрузки или уменьшения тяжести заболевания конкретного показания (например, ВИЧ- инфекции или СПИДа). Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах которые эффективны для намеченной цели. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит другие фармацевтически активные средства или лекарственные средства, такие как противовирусные средства. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки или антитела вводят в форме соли, например, фармацевтически приемлемой соли. Подходящие фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли включают в себя соли, полученные из таких минеральных кислот, как соляная, бромистоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислоты, и таких органических кислот, как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфоновая кислоты, например, п-толуолсульфоновая кислота.
[244] Составы антител могут быть лиофилизированы (смотрите, например, патент США №6267958). Составы антител могут представлять собой водные антитела (смотрите, например, патент США №6171586 и публикацию международной заявки W006/044908).
[245] Активные ингредиенты могут быть захвачены в микрокапсулы (например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметакрилат)). Активные ингредиенты могут быть захвачены в микрокапсулы в системах доставки коллоидных лекарств (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях, могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают в себя полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, причем матрицы находятся в форме формованных изделий (например, пленок или микрокапсул).
[246] Фармацевтическая композиция согласно некоторым аспектам может использовать системы высвобождения с отсроченным высвобождением, замедленным высвобождением и пролонгированным высвобождением, так что доставка композиции происходит до и с достаточным временем, чтобы вызвать сенсибилизацию сайта, подлежащего воздействию. Известны многие типы систем доставки. Такие системы могут избежать повторного введения композиции, тем самым увеличивая удобство для субъекта и врача.
[247] Фармацевтическая  композиция согласно некоторым вариантам
осуществления содержит антитела или их фрагменты и/или клетки в количествах, эффективных для лечения или профилактики заболевания или состояния, такого как терапевтически эффективное  или профилактически эффективное  количество.
Терапевтическая или профилактическая эффективность согласно некоторым вариантам осуществления контролируется путем периодической оценки подвергнутых лечению субъектов. При повторных введениях в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяется до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов заболевания. Однако могут быть применимы другие схемы дозирования и они могут быть определены. Желаемую дозу можно доставлять посредством одного болюсного введения композиции, путем множественных болюсных введений композиции или путем непрерывного вливания композиции.
[248] Согласно некоторым вариантам осуществления в контексте сконструированных посредством генной инженерии клеток, содержащих антитело или его фрагмент, субъекту вводят диапазон от приблизительно одного миллиона до приблизительно 100 миллиардов клеток, например, от 1 до 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток или диапазон, определенный любыми двумя вышеприведенными значениями), например от приблизительно 10 миллионов до приблизительно 100 миллиардов клеток (например, приблизительно 20 миллионов  клеток, приблизительно 30 миллионов  клеток, приблизительно 40 миллионов клеток, приблизительно 60 миллионов клеток, приблизительно 70 миллионов клеток, приблизительно 80 миллионов клеток, приблизительно 90 миллионов клеток, приблизительно 10 миллиардов клеток, приблизительно 25 миллиардов клеток, приблизительно  50 миллиардов клеток, приблизительно 75 миллиардов клеток, приблизительно 90 миллиардов клеток или диапазон, определенный любыми двумя из вышеперечисленных значений), а в некоторых случаях от приблизительно 100 миллионов клеток до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 120 миллион клеток, приблизительно 250 миллионов клеток, приблизительно 350 миллионов клеток, приблизительно 450 миллионов клеток, приблизительно 650 миллионов клеток, приблизительно  800 миллионов  клеток,
приблизительно 900 миллионов клеток, приблизительно 3 миллиарда клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 45 миллиардов клеток) или любое значение между этими диапазонами, и/или такое количество клеток на килограмм массы тела субъекта.
[249] Композиции можно вводить с использованием стандартных способов введения, составов и/или устройств. Предусмотрены составы и устройства, такие как шприцы и флаконы, для хранения и введения композиций. Введение клеток может быть аутологичным или гетерологичным. Например, иммунореактивные клетки или предшественники могут быть получены от одного субъекта и введены одному и тому же субъекту или другому совместимому субъекту. Полученные из периферической крови иммунореактивные клетки или их потомство (например, полученные in vivo, ex vivo или in vitro) можно вводить посредством локализованной инъекции, включая в себя введение посредством катетера, системную инъекцию, локализованную инъекцию, внутривенную инъекцию или парентеральное введение. При введении терапевтической композиции (например, фармацевтической композиции, содержащей генно-модифицированную иммунореактивную клетку), ее, как правило, будут составлять в виде стандартной дозы (раствор, суспензия, эмульсия).
[250] Составы включают в себя композиции для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, сублингвального или суппозиториального введения. Согласно некоторым вариантам осуществления популяции клеток вводят парентерально.
Используемый в настоящем документе термин «парентеральный» включает в себя внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение. Согласно некоторым вариантам осуществления популяции клеток вводят субъекту с использованием периферической системной доставки путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.
[251] Композиции согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрены в виде стерильных жидких препаратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые согласно некоторым аспектам могут быть забуферены до выбранного значения pH. Жидкие препараты, как правило, готовить легче, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции несколько более удобны для введения, особенно путем инъекции. С другой стороны, вязкие композиции могут быть составлены в соответствующем диапазоне вязкости, чтобы обеспечить более длительные периоды контакта с конкретными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут содержать носители, которые могут представлять собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и подходящие их смеси.
[252] Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения антитела или его фрагмента в растворитель, например, в смеси с подходящим носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, декстроза или т.п. Композиции также могут быть лиофилизированы. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие, диспергирующие или эмульгирующие средства (например, метилцеллюлоза), буферные средства, добавки для повышения гелеобразования или повышения вязкости, консерванты, ароматизаторы, красители и т.п., в зависимости от пути введения и требуемого препарата. Стандартные тексты согласно некоторым аспектам могут быть приведены с целью получения подходящих препаратов.
[253] Могут быть добавлены различные добавки, которые повышают стабильность и стерильность композиций, включая в себя противомикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие средства и буферы. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено различными антибактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой и т.п. Длительная абсорбция инъекционной фармацевтической формы может быть вызвана использованием средств, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
[254] Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают в себя полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, причем матрицы находятся в форме формованных изделий, например, пленок или микрокапсул.
[255] Составы, которые следует использовать для введения in vivo, как правило, являются стерильными (например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны).
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ
[256] Любое из предусмотренных в настоящем документе антител к ВИЧ может быть использовано в терапевтических способах. В настоящем изобретении предусмотрен способ лечения млекопитающего, инфицированного вирусной инфекцией (например, ВИЧ), включающий введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей раскрытые в настоящем документе антитела к ВИЧ. Дополнительно предусмотрены способы снижения увеличения титра вируса ВИЧ, репликации вируса, пролиферации вируса или количества вирусного белка ВИЧ у субъекта.
[257] Согласно одному аспекту предусмотрено антитело к ВИЧ для применения в качестве лекарственного средства. Согласно другим аспектам предусмотрено антитело к ВИЧ для применения при лечении ВИЧ-инфекции. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ нейтрализует ВИЧ. Согласно некоторым вариантам осуществления антитело к ВИЧ представляет собой нейтрализующее антитело широкого спектра действия. Согласно другим вариантам осуществления ВИЧ представляет собой ВИЧ-1. Согласно некоторым вариантам осуществления ВИЧ представляет собой ВИЧ-2. Согласно другим вариантам осуществления ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы М. Согласно некоторым вариантам осуществления ВИЧ представляет собой ВИЧ-1 группы N, ВИЧ-1 группы О и/или ВИЧ-1 группы Р. Согласно другим вариантам осуществления ВИЧ представляет собой кладу А (включая в себя А1 и/или А2), В, С, D, Е, F (включая в себя F1 и/или F2), G, Н, I, J, К или любую комбинацию, подтип или CRF. Согласно другим аспектам предусмотрено антитело к ВИЧ для применения при лечении СПИДа. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрено антитело к ВИЧ для применения в способе лечения. Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело к ВИЧ для применения в способе лечения индивидуума, инфицированного ВИЧ или имеющего СПИД, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела к ВИЧ. Эффективное количество средства представляет собой количество, эффективное в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата. Согласно одному из таких вариантов осуществления способ дополнительно предусматривает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического средства. Индивидуум может представлять собой человека.
[258] Согласно дополнительному аспекту в настоящем изобретении предусмотрено применение антитела к ВИЧ в изготовлении или приготовлении лекарственного средства. Согласно некоторым вариантам осуществления лекарственное средство предназначено для лечения ВИЧ-инфекции. Согласно некоторым вариантам осуществления лекарственное средство предназначено для лечения СПИДа. Согласно дополнительному варианту осуществления лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения ВИЧ-инфекции или СПИДа, включающем введение индивидууму, имеющему ВИЧ- инфекцию или СПИД, эффективного количества лекарственного средства.
[259] Согласно дополнительному аспекту в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения ВИЧ-инфекции или СПИДа. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает введение индивидууму, имеющему такую ВИЧ- инфекцию или СПИД, эффективного количества антитела к ВИЧ.
[260] Согласно некоторым вариантам осуществления при ВИЧ-инфекции или СПИДе экспрессируется gpl20 на поверхности составляющих его вирусов.
[261] В соответствии с другим вариантом осуществления в настоящем изобретении предусмотрены способы получения и введения композиции антитела к ВИЧ, которая подходит для введения пациенту-человеку или нечеловекообразному примату, имеющему ВИЧ-инфекцию или подвергающемуся риску заражения ВИЧ, в количестве и в соответствии со схемой, достаточной для того, чтобы вызвать защитный иммунный ответ к ВИЧ или снижение вируса ВИЧ у человека.
[262] В соответствии с другим вариантом осуществления в настоящем изобретении предусмотрена вакцина, содержащая по меньшей мере одно антитело по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно одному варианту осуществления вакцина представляет собой вакцину, содержащую по меньшей мере одно описанное в настоящем документе антитело и фармацевтически приемлемый носитель. Вакцина может содержать множество антител, имеющих описанные в настоящем документе характеристики, в любой комбинации и может дополнительно содержать дополнительные антитела, такие как другие доступные нейтрализующие ВИЧ антитела.
[263] Следует понимать, что композиции могут представлять собой единственное описанное в настоящем документе антитело или их комбинацию, которые могут быть одинаковыми или различными для профилактики или терапевтического лечения прогрессирования различных подтипов ВИЧ-инфекции после вакцинации. Такие комбинации могут быть выбраны в соответствии с требуемым иммунитетом. Когда антитело вводится животному или человеку, его можно комбинировать с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или адъювантами.
[264] Кроме того, в отношении определения эффективного уровня у пациента для лечения ВИЧ, в частности, имеются подходящие животные модели и широко применяются для оценки эффективности in vivo против ВИЧ различные протоколы генной терапии (Sarver et al. (1993b), смотрите выше). Эти модели включают в себя мышей, обезьян и кошек. Несмотря на то, что эти животные естественным образом не подвержены ВИЧ- инфекции, модели химерных мышей (например, SCID, bg/nu/xid, NOD/SCID, SCID-hu, иммунокомпетентные SCID-hu, BALB/c с подвергнутым абляции костным мозгом), восстановленные посредством мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС), лимфатических узлов, эмбриональной печени/тимуса или других тканей, могут быть инфицированы лентивирусным вектором или ВИЧ и использованы в качестве моделей патогенеза ВИЧ. Аналогичным образом можно использовать модель иммунного дефицита обезьян (SIV), а также модель вируса иммунодефицита кошачьих (FIV). Фармацевтическая композиция может содержать другие фармацевтические препараты в сочетании с вектором в соответствии с настоящим изобретением при использовании для терапевтического лечения СПИДа. Эти другие фармацевтические препараты могут использоваться традиционным способом (то есть в качестве средств для лечения ВИЧ-инфекции). В соответствии с другим вариантом осуществления в настоящем изобретении предусмотрена фармацевтическая композиция на основе антитела, содержащая эффективное количество выделенного антитела к ВИЧ или версия с созревшей аффинностью, которая обеспечивает выбор профилактического или терапевтического лечения для снижения инфицирования вирусом ВИЧ. Фармацевтическая композиция на основе антитела по настоящему изобретению может быть составлена с помощью любого количества общеизвестных стратегий (смотрите, например, McGoff and Scher, 2000, Solution Formulation of Proteins/Peptides: In McNally, E.J., ed. Protein Formulation and Delivery. New York, NY: Marcel Dekker; pp.139-158; Akers and Defilippis, 2000, Peptides and Proteins as Parenteral Solutions.
In: Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins. Philadelphia, PA: Talyor and Francis; pp.145-177; Akers, et al., 2002, Pharm. Biotechnol. 14:47-127).
[265] Согласно другому варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ обнаружения антитела к ВИЧ, содержащего тяжелую цепь, содержащую высококонсервативную консенсусную последовательность, и легкую цепь, содержащую высококонсервативную консенсусную последовательность, в биологическом образце, включающий получение содержащего иммуноглобулин биологического образца от субъекта млекопитающего, выделение антитела к ВИЧ из указанного образца и определение высококонсервативных консенсусных последовательностей тяжелой цепи и легкой цепи. Биологическим образцом может быть кровь, сыворотка, слюна, моча, мокрота, образец клеточного мазка или биопсия ткани. Аминокислотные последовательности могут быть определены известными способами, включая в себя, например, ПЦР и масс- спектрометрию.
[266] Согласно следующему аспекту в настоящем изобретении предусмотрены фармацевтические составы, содержащие любое из антител к ВИЧ, представленных в настоящем документе (например, для применения в любом из вышеуказанных терапевтических способов). Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтический состав содержит любые предусмотренные в настоящем документе антитела к ВИЧ и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно другому варианту осуществления фармацевтическая композиция содержит любые предусмотренные в настоящем документе антитела к ВИЧ и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
[267] Описанные в настоящем документе антитела или их фрагменты могут быть использованы либо отдельно, либо в сочетании с другими средствами в терапии. Например, антитело по настоящему изобретению можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством. Например, антитела или их фрагменты могут использоваться как самостоятельно, так и в сочетании с одним или более антителами (например, множеством или пулом антител). Например, антитела могут использоваться как самостоятельно, так и в сочетании с одним или более другими антителами (например, нейтрализующими ВИЧ антителами), например, но без ограничения, VRC0l, VRC02, VRC03, VRC-PG-04, VRC-PG- 05, bl2, (CD4b), (PGT, PG9 и PG16 (смотрите Science 333 (6049): 1633-1637; Nature 477 (7365): 466-470; Science 334 (6060): 1289-1293; Science 326 (5950): 285-289; Science 334 (6059): 1097-1103 и Nature 480 (7377): 336-343.)
[268] В соответствии с другим вариантом осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ лечения млекопитающего, инфицированного вирусной инфекцией, такой как, например, ВИЧ, включающий введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции, содержащей антитела к ВИЧ, описанные в настоящем документе. Согласно одному варианту осуществления способ лечения млекопитающего, инфицированного ВИЧ, предусматривает введение указанному млекопитающему фармацевтической композиции, которая содержит антитело по настоящему изобретению или его фрагмент.
[269] Такие отмеченные выше комбинированные способы лечения предусматривают комбинированное введение (где два или более терапевтических средств включены в одни и те же или отдельные композиции) и отдельное введение, и в этом случае введение антитела по настоящему изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта.
[270] Также предусмотрены способы и применения адаптивной клеточной терапии. Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают введение клеток или композиции, содержащей клетки, субъекту, в ткань или клетку, таким как имеющие риск или подозреваемые в наличии заболевания, состояния или нарушения. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки, популяции и композиции вводят субъекту, имеющему конкретное заболевание или состояние, подлежащее лечению, например, с помощью адоптивной клеточной терапии, такой как адоптивная терапия Т-клетками. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки или композиции вводят субъекту, таким как субъект, имеющий или подверженный риску заболевания или состояния. Согласно некоторым аспектам способы таким образом лечат, например, улучшают один или более симптомов заболевания или состояния.
[271] Способы введения клеток для адоптивной клеточной терапии известны и могут быть использованы вместе с предусмотренными способами и композициями. Например, способы адоптивной Т-клеточной терапии описаны, например, в публикации заявки на патент США №2003/0170238 на имя Gruenberg et al; патенте США №4690915 на имя Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Смотрите, например, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.
[272] Согласно некоторым вариантам осуществления клеточная терапия, например, адоптивная клеточная терапия, такая как адоптивная терапия Т-клетками, осуществляется путем аутологичного переноса, в котором клетки выделяются и/или иным образом получают у субъекта, который должен получать клеточную терапию, или из образца, полученного от такого субъекта. Таким образом, согласно некоторым аспектам клетки получают от субъекта, например, нуждающегося в лечении пациента, и клетки, после выделения и обработки вводят одному и тому же субъекту.
[273] Согласно некоторым вариантам осуществления клеточная терапия, например, адоптивная клеточная терапия, такая как адоптивная терапия Т-клетками, осуществляется путем аллогенного переноса, в котором клетки выделяют и/или иным образом получают от субъекта, отличного от субъекта, который должен получать или в конечном итоге получать клеточную терапию, например, первый субъект. Согласно таким вариантам осуществления клетки затем вводят другому субъекту, например, второму субъекту, одного и того же вида. Согласно некоторым вариантам осуществления первый и второй субъекты генетически идентичны. Согласно некоторым вариантам осуществления первый и второй субъекты генетически схожи. Согласно некоторым вариантам осуществления второй субъект экспрессирует один и тот же класс HLA или супертип, что и первый субъект.
[274] Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, которому вводят клетки, клеточные популяции или композиции, представляет собой примата, такого как человек. Согласно некоторым вариантам осуществления примат представляет собой мартышку или обезьяну. Субъект может быть мужского или женского пола и может быть любого подходящего возраста, включая детей грудного возраста, детей, подростков, взрослых и пожилых пациентов. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой млекопитающее, не являющееся приматом, такое как грызун. В некоторых примерах пациент или субъект представляет собой проверенную животную модель для лечения заболеваний, адоптивной клеточной терапии и/или для оценки токсических исходов, таких как синдром высвобождения цитокинов (CRS).
[275] Антитело по настоящему изобретению (и любое дополнительное терапевтическое средство) можно вводить любым подходящим способом, включая в себя парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, при желании, для местного лечения, внутривенное введение. Парентеральные инфузии включают в себя внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может осуществляться по любому подходящему маршруту. Например, дозирование может осуществляться путем инъекций (например, внутривенных или подкожных инъекций). В настоящем документе рассматриваются различные схемы дозирования, включая в себя, без ограничения, однократное или множественное введение в различные моменты времени, болюсное введение и пульсовую инфузию.
[276] Антитела по настоящему изобретению будут составлять, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают в себя конкретное нарушение, которое лечат, конкретное рассматриваемое млекопитающее, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, сайт доставки средства, способ введения, планирование введения и другие известные врачам факторы. Антитело не обязательно должно быть с одним или более средствами, которые в настоящее время применяют для предотвращения или лечения рассматриваемого нарушения, но необязательно его так составляют. Эффективное количество таких других средств зависит от количества присутствующего в препарате антитела, типа нарушения или лечения и других факторов, рассмотренных выше. Они, как правило, используются в тех же дозах и теми же путями введения, как описано в настоящем документе, или составляют приблизительно от 1 до 99% дозировок, описанных в настоящем документе, или применяются в любой дозировке и любым путем, который эмпирически/клинически определяется как подходящий.
[277] Для профилактики или лечения заболевания соответствующая доза антитела по настоящем изобретению (когда применяется отдельно или в сочетании с одним или более другими дополнительными терапевтическими средствами) будет зависеть от типа подлежащего лечению заболевания, типа антитела, тяжести и течения заболевания, независимо от того, вводится ли антитело в профилактических или терапевтических целях, предыдущей терапии, клинической истории пациента и ответа на антитело, а также на усмотрение лечащего врача. Антитело подходящим образом вводится пациенту в одно время или в течение ряда процедур. Приблизительно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг-10 мг/кг) антитела может быть исходной дозой для введения пациенту (например, посредством одного или более отдельных введений или путем непрерывной инфузии). Суточная доза может составлять от приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более. Для повторных введений в течение нескольких дней или дольше лечение, как правило, будет поддерживаться до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление инфекции или симптомов заболевания. Одна иллюстративная дозировка антитела будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту может вводиться одна или более доз приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любая их комбинация). Такие дозы можно вводить с перерывами (например, каждую неделю или каждые три недели). Можно вводить начальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следует одна или более более низких доз.
[278] Понятно, что любой из вышеуказанных составов или терапевтических способов может быть осуществлен с использованием иммуноконъюгата по настоящему изобретению вместо антитела к ВИЧ или в дополнение к нему.
[279] Дополнительно предусмотрены способы уменьшения увеличения титра ВИЧ- вируса, репликации вируса, пролиферации вируса или количества вирусного белка ВИЧ у субъекта. В соответствии с другим аспектом способ предусматривает введение субъекту количества антитела к ВИЧ, эффективного для снижения увеличения титра ВИЧ, репликации вируса или количества белка ВИЧ одного или более штаммов или изолятов ВИЧ у субъекта.
[280] В соответствии с другим вариантом осуществления в настоящем изобретении предусмотрен способ уменьшения вирусной репликации или распространения ВИЧ- инфекции на дополнительные клетки-хозяева или ткани, включающий контактирование клетки млекопитающего с антителом или его частью, которая связывается с антигенным эпитопом на gpl20.
[281] Пассивную иммунизацию можно использовать для эффективного и безопасного предупреждения и лечения вирусных заболеваний. (Смотрите, например, Keller et al., Clin. Microbiol. Rev. 13:602-14 (2000); Casadevall, Nat. Biotechnol. 20:114 (2002); Shibata et al, Nat. Med. 5:204-10 (1999) и Igarashi et al, Nat. Med. 5:211-16 (1999)). Пассивная иммунизация с использованием человеческих моноклональных антител обеспечивает немедленную стратегию лечения для экстренной профилактики и лечения ВИЧ.
[282] Субъекты, подверженные риску заболеваний или нарушений, связанных с ВИЧ, включают в себя пациентов, которые вступают в контакт с инфицированным человеком или которые подверглись воздействию ВИЧ каким-либо другим способом. Введение профилактического средства может происходить до проявления симптомов, характерных для ВИЧ-ассоциированного заболевания или нарушения, таким образом, чтобы предотвратить заболевание или нарушение или, альтернативно, задержать его прогрессирование.
ИЗДЕЛИЯ
[283] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предусмотрено изделие, содержащее материалы, применимые для лечения, профилактики и/или диагностики описанных выше нарушений. Изделие содержит контейнер и этикетку или листок-вкладыш внутри контейнера или непосредственно связанный с ним. Подходящие контейнеры включают в себя, например, бутылки, флаконы, шприцы, мешки для в/в раствора и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из множества материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией эффективна для лечения, профилактики и/или диагностики состояния, и может иметь стерильный доступ через порт (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробиваемой иглой пробкой для подкожной инъекции). По меньшей мере одно активное средство в композиции представляет собой антитело по настоящему изобретению. Этикетка или листок-вкладыш указывает на то, что композиция используется для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, причем композиция содержит антитело по настоящему изобретению; и (b) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, причем композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Изделие согласно этому варианту осуществления настоящего изобретения может дополнительно содержать листок-вкладыш, указывающий на то, что композиции могут использоваться для лечения конкретного состояния. Альтернативно или дополнительно изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно содержать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая в себя другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
[284] В настоящем изобретении также предусмотрены выделенные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие полипептиды для тяжелых и легких цепей антител к ВИЧ, перечисленных в таблицах 1 и 2, последовательности для тяжелых и легких цепей SEQ ID NO: 1-16 и 65.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[00285] SEQ ID NO: 1-16 - Последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей:
SEQ ID NO: 1 -
QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSVSGNIWSWIRQSPGKGPEWVGFVSGEYIEYNPSLKSRLTISRDTSKNQLSLTLRSVTAADTAMYYCAKTLRARRIYGVIAFGEVYDYHYFDVWGKGTM VTVSS
SEQ ID NO: 2 -
TDSVASDVAMSVAPGDTATISCGEKSNGARAVQWYQQKPGQAPVLIIYNNQDRPSGIPERFSASPDAGFGTTATLTISRVEAGDEADYYCHIWDSRFPLSWVFAGGTKLTVL
SEQ ID NO: 3 -
QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMNNYYWTWIRQSPGKGLEWIGYVSDRASATYNPSLKSRVVISRDTSKNQLSLKLNSVTLADTAVYYCATARRGQRIYGEVAFGEFFYYYSMDVWGKGTAVTVSS
SEQ ID NO: 4 -
GSVTSFVRPLSVALGETASISCGRQALGSRAVQWYQHRPGQAPVLLIYNNQDRPSGIPERFSGTPDINFGTRATLTISGVEAGDEADYYCHMWDSRSGFSWSFGGATRLTVL
SEQ ID NO: 5 -
QLQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASINDAYWSWIRQSPGKRPEWVGYVHHSGDTNYNPSLKRRVTFSLDTAKNEVSLKLVALTAADSAVYFCARALHGKRIYGTVALGELFVYFHMDVWGKGTAVTVSS
SEQ ID NO: 6 -
HCTGAVSSFVSVAPGQTAMTCGEESLGSRSVIWYQQRPGQAPSLIIYNNNDRPSGIPERFSGSPGSTFGTTATLTITSVEAGDEADYYCHIWDSRRPTNWVFGEGTTLTVL
SEQ ID NO: 7 -
QLQLQESGPGLVKPPETLSLTCSVSGASINDAYWSWIRQSPGICRPEWVGYVHHSGDTNYNPSLKRRVTFSLDTAKNEVSLKLVALTAADSAVYFCARALHGKRIYGTVALGELFVYFYMDV WGKGTAVTVSS
SEQ ID NO: 8 -
HCTGAVSSFVSVAPGQTARITCGEESLGSRSVIWYQQRPGQAPSLIIYNNNDRPSGIPERFSGSPGSTFGTTATLTITSVEAGDEADYYCHIWDSRRPTNWVFGEGTTLTVL
SEQ ID NO: 9 -
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCNVSGTLVRDNYWSWIRQPLGKQPEWIGYVHDSGDTNYNPSLKSRVHLSLDKSKNLVSLRLTGVTAADSAIYYCATTKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDVWGKGTSVTVSS
SEQ ID NO: 10-
HCTASLASSMSVSPGETAKISCGKESIGSRAVQWYQQKPGQPPSLIIYNNQDRPAGVPERFSASPDFRPGTTATLTITNVDAEDEADYYCHIYDARGGTNWVFDRGTTLTVL
SEQ IDNO: 11 -
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCNVSGTLVRDNYWSWIRQPLGKQPEWIGYVHDSGDTNYNPSLKSRVHLSLDKSKNLVSLRLTGVTAADSAIYYCATTKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDVWGKGTSVTVSS
SEQ IDNO: 12-
HCTGSLASSMSVSPGETAKISCGKESIGSRAVQWYQQKPGQPPSLIIYNNQDRPAGVPERFSASPDFRPGTTATLTITNVDAEDEADYYCHIYDARGGTNWVFDRGTTLTVL
SEQ ID NO: 13 -
QMQLQESGPGLVKPSETLSLTCSVSGASISDSYWSWFRRSPGKGLEWIGYVHKSGDTNYSPSLKSRVNLSLDASKNQVSLSLVAATAADSGKYYCARTLHGRRIYGIVAFNEWFTYFYMDVWGNGTQVTVSS
SEQ ID NO: 14 -
HCTASVTSDISVAPGETARISCGEKSLGSRAVQWYQHRAGQAPSLIIYNNQDRPSGIPERFSGSPDSAFGTTATLTITSVEAGDEADYYCHIWDSRVPTKWVFGGGTTLTVL
SEQ IDNO: 15-
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGASTSGQYWSWIRQSPGKGLEWIGYRSDSGDANYNPSLKSRVIISLDTSRNQLSLNVTSVTTADTAMYFCARAQRGKRIYGVVSLGEYYHYYIMDVWGTGTPVTVSS
SEQ ID NO: 16-
QVQLQESGPGLVKPSETLSVTCSVSGDSMNNYYWTWIRQSPGKGLEWIGYISDRASATYNPSLNSRVVISRDTSKNQLSLKLNSVTPADTAVYYCATARRGQRIYGEVSFGEFFYYYSMDVWGKGTAVTVSS
[00286] SEQ ID NO 17-64 - Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелых и легких цепей:
SEQ ID NO: 17 - GNIWS
SEQ ID NO: 18 - FVSGEYIEYNPSLKS
SEQ ID NO: 19 - TLRARRIYGVIAFGEVYDYHYFDV
SEQ ID NO: 20 - GEKSNGARAVQ
SEQ ID NO: 21 - NNQDRPS
SEQ ID NO: 22 - HIWDSRFPLSWV
SEQ ID NO: 23 - NYYWT
SEQ ID NO: 24 - YVSDRASATYNPSLKS
SEQ ID NO: 25 - ARRGQRIYGEVAFGEFFYYYSMDV
SEQ ID NO: 26 - GRQALGSRAVQ
SEQ ID NO: 27 - NNQDRPS
SEQ ID NO: 28 - HMWDSRSGFSWS
SEQ ID NO: 29 - GRQALGSRAVQ
SEQ ID NO: 30 - NNQDRPS
SEQ ID NO: 31 - HMWDSRSGFSWS
SEQ ID NO: 32 - GEESLGSRSVI
SEQ ID NO: 33 - NNNDRPS
SEQ ID NO: 34 - HIWDSRRPTNWV
SEQ ID NO: 35 - DAYWS
SEQ ID NO: 36 - YVHHSGDTNYNPSLKR
SEQ ID NO: 37 - ALHGKRIYGTVALGELFVYFYMDV
SEQ ID NO: 38 - GEESLGSRSVI
SEQ ID NO: 39 - NNNDRPS
SEQ ID NO: 40 - HIWDSRRPTNWV
SEQ ID NO: 41 - DNYWS
SEQ ID NO: 42 - YVHDSGDTNYNPSLKSV
SEQ ID NO: 43 - TKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDV
SEQ ID NO: 44 - GKESIGSRAVQ
SEQ ID NO: 45 - NNQDRPA
SEQ ID NO: 46 - HIYDARGGTNWV
SEQ ID NO: 47 - DNYW
SEQ ID NO: 48 - YVHDSGDTNYNPSLKS
SEQ ID NO: 49 - TKHGRRIYGVVAFKEWFTYFYMDV
SEQ ID NO: 50 - GKESIGSRA
SEQ ID NO: 51 - NNQDRPA
SEQ ID NO: 52 - HIYDARGGTNWV
SEQ ID NO: 53 - DSYWS
SEQ ID NO: 54 - YVHKSGDTNYSPSLKS
SEQ ID NO: 55 - TLHGRRIYGIVAFNEWFTYFYMDV
SEQ ID NO: 56 - GEKSLGSRAVQ
SEQ ID NO: 57 - NNQDRPS
SEQ ID NO: 58 - HIWDSRVPTKWV
SEQ ID NO: 59 - GQYWS
SEQ ID NO: 60 - YRSDSGDANYNPSLKS
SEQ ID NO: 61 - AQRGKRIYGVVSLGEYYHYYIMDV
SEQ ID NO: 62 - NYYWT
SEQ ID NO: 63 - YISDRASATYNPSLNS
SEQ ID NO: 64 - ARRGQRIYGEVSFGEFFYYYSMDV
[00287] SEQ ID NO: 65 - Последовательность вариабельной области легкой цепи:
SEQ ID NO: 65 -
XXXXSYVRPLSVALGETASISCGRQALGSRAVQWYQHRPGQAPILLIYNNQDRPSGIPERFSGTPDINFGTRATLTISGVEAGDEADYYCHMWDSRSGFSWSFGGATRLTVL
[00288] SEQ ID NO 66-68 - Последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи:
SEQ ID NO: 66 - GRQALGSRAVQ
SEQ ID NO: 67 - NNQDRPS
SEQ ID NO: 68 - HMWDSRSGFSWS
[00289] SEQ ID NO 69 и 70 - Последовательности вариабельной области зародышевой линии:
SEQ ID NO: 69 -
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARTQQGKRIYGVVSFGDYYYYYYMDVWGKGTTVTVSS
SEQ ID NO: 70 -
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHPWVFGGGTKLTVL
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1 - Характеристика антител AbV-1-9
[00290] Чтобы лучше понять ответ нейтрализующего антитела на ВИЧ-1 и эпитоп, нацеленный на антитела к AbV1-9, выделяли представителей большого семейства клонов, доминирующих в gp60-спецефическом ответе IgG памяти от пациента, инфицированного кладой А. Последовательность, аффинность связывания, нейтрализующую активность и распознавание углеводов и петлю V3 определяли для антител AbV-1-9. Анализы проводили для выделения клонов В-клеток, кодирующих AbV-1-9. Клоны AbV-1-9 разделяли на две разные группы, отличающиеся последовательностью, аффинностью связывания, распознаванием углеводов и нейтрализующей активностью. Первая группа обладает замечательной эффективностью и широтой, несмотря на то, что она связывается обнаруживаемым образом со свободными от белка гликанами.
d
ПРИМЕР 2 - Определение значений k
d
125
125
[00291] K измеряют с помощью радиоактивно меченного антигенсвязывающего анализа (RIA), выполненного с Fab-версией представляющего интерес антитела и его антигена, как описано в следующем анализе. Аффинность связывания в растворе Fab к антигену измеряли уравновешиванием Fab с минимальной концентрацией (I)-меченого антигена в присутствии серии титрования немеченого антигена, а затем улавливали связанный антиген на планшете, покрытом антителом к Fab (смотрите, например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Чтобы установить условия для анализа, многолуночные планшеты MICROTITER (Thermo Scientific) покрывают в течение ночи улавливающего антитела к Fab в концентрации 5 мкг/мл (Cappel Labs) в карбонате натрия с концентрацией 50 мМ (рН 9,6) и затем блокируют 2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение двух-пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23°С). В неадсорбирующем планшете (Nunc #269620) 100 пМ или 26 пМ [I]-антигена смешивают с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, в соответствии с оценкой антитела к VEGF, Fab-12, в Presta et al., Cancer Res., 57: 4593-4599 (1997)). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубация может продолжаться в течение более длительного периода (например, приблизительно 65 часов), чтобы обеспечить достижение равновесия. После этого смеси переносят на планшет для улавливания для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляют, и планшет промывают восемь раз 0,1% полисорбатом 20 (TWEEN-20) в PBS. Когда планшеты высушивают, добавляют 150 мкл/лунку сцинтиллянта (MICROSCINT-20™, Packard) и планшеты подсчитывают на гамма-счетчике TOPCOUNT™ (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые дают менее 20% от максимального связывания или равное этому значение, выбирают для использования в анализах конкурентного связывания.
d
ПРИМЕР 3 - Определение значений k
d
d
6
-1
-1
[00292] Измерение k проводили с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса с использованием BIACORE-2000 или BIACORE-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) при 25°C с помощью чипов с иммобилизованными антигенами СМ5 при ~ 10 единиц отклика (RU). Вкратце, карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (СМ5, BIACORE, Inc.) активируют с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Антиген разбавляют ацетатом натрия в концентрации 10 мМ, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~ 0,2 мкМ) перед введением со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения приблизительно 10 единиц отклика (RU) связанного белка. После введения антигена вводят этаноламин в концентрации 1М для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений двукратные серийные разведения Fab (0,78 нМ-500 нМ) вводят в PBS с поверхностно-активным веществом полисорбатом 20 (TWEEN-20™) (PBST) в концентрации 0,05% при температуре 25°С со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (коп) и скорости диссоциации (koff) рассчитывают с использованием простой модели связывания Лэнгмюра один к одному (BIACORE Evaluation Software версии 3.2) путем одновременной установки сенсорных диаграмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (k) рассчитывают как отношение koff/kon. Смотрите, например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Если скорость потока превышает 10 Mc способом указанного выше поверхностного плазмонного резонанса, то скорость потока может быть определена с использованием способа гашения флуоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности флуоресцентного излучения (возбуждение = 295 нм, излучение = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при температуре 25°С 20 нМ антитела к антигену (Fab) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, измеренных на спектрометре, таком как оборудованный остановкой потока спектрофотометр (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-AMINCO™ серии 8000 (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.
ПРИМЕР 4 - Секвенирование доноров ВИЧ
[00293] Семь аликвот из биологического образца от пациента, каждый из которых содержит приблизительно 90000 клеток, разделяли на фракции и анализировали достоверность образования пар. Анализ показал приблизительно 100000 возможных пар тяжелых цепей с легкими цепями и приблизительно 37000 высоко достоверных природных пар тяжелых цепей с легкими цепями с использованием технологических способов AbPair, описанных в PCT/US 2014/028925. Аликвоту секвенировали посредством технологических способов AbSeq, описанных в публикациях международных заявок WO 2012048341 и WO 2012048340.
ПРИМЕР 5 - Новое биоинформационное обнаружение bNAb (сходство внутри донора)
[00294] Сходство аминокислот CDR3 AbV1-9 определяли с известными bNAb, полученными от пациента 17 (Pt17). Последовательности здоровых пациентов использовали для калибровки порога ложных срабатываний и для разработки границы отсечения или порога сходства. Филогенетическую связь антител AbV1-9 анализировали по отношению к известным bNAb с использованием полной аминокислотной последовательности. Другие характеристики выбранных антител сравнивали с характеристиками других известных характеристик последовательности bNAb, включая в себя семейство зародышевых линий, уровень мутаций и т.д. Результат: были обнаружены 7 высоко достоверных тяжелых и легких цепей и 2 тяжелые цепи с парами предполагаемых легких цепей (AbV1-9).
ПРИМЕР 6 - Материалы и способы, используемые в примерах 2-5.
[00295] Антитела к ВИЧ клонируют и производят после специфического к gp140 захвата отдельных В-клеток. Гликоинженерные антитела получают путем замены остатков в различных положениях тяжелых цепей. Связывающие свойства антител к gp140 с белками Env ВИЧ анализируют с помощью анализа ELISA, SPR и гликанового микрочипа. Нейтрализацию оценивают с использованием (i) анализа на основе люциферазы в клетках TZM.bl и (ii) анализа на основе РВМС с использованием инфекции с первичными вариантами ВИЧ-1. Структуры связаного и несвязанного с лигандом AbV1-9 и фрагментов Fab GL расшифровывают путем молекулярного замещения с высоким разрешением.
Анализ ПЦР с обратной транскриптазой отдельных В-клеток и генные анализы Ig
+
+
+
H
K
[00296] Выполняют одноклеточную сортировку gp140CD19IgG В-клеток от пациента. Выполняют РВМС, синтез кДНК и вложенные ПЦР-амплификации генов Ig. Гены IgK, экспрессированные клонированными вариантами AbV1-9, амплифицируются ПЦР. Все продукты ПЦР секвенируют и анализируют на использование гена Ig, анализ CDR3 и количество соматических гипермутаций V/V. Множественные выравнивания последовательностей выполняют с использованием программы Mac Vector с помощью функции анализа ClustalW и используют для получения дендрограмм способом объединения соседних пар. Альтернативно, дендрограммы получают с использованием способа UPGMA.
H
H
H
L
L
[00297] Сегменты гена предшественника зародышевой линии (GL) антител AbV1-9 идентифицируют с использованием IgBLAST и IMGTdVV-QUEST. Чтобы создать репрезентативную исходную последовательность GL, последовательности IgH и IgL антитела, содержащего наименьшие соматические гипермутации, выравнивают с последовательностями GL с использованием IgBLAST. Последовательность IgH GL конструируют путем замены зрелых генных сегментов V и J на их GL-аналоги и использования последовательности 10-996 для области CDRH3 с участием нуклеотидов N-области и генного сегмента D. Последовательность GL IgL собирают из последовательностей генных сегментов V 3-21 *02 и J3*02.
Клонирование и производство антител
1
H
[00298] Очищенные расщепленные продукты ПЦР клонировали в векторы, экспрессирующие Igγ или Igλ, человека. Затем векторы, содержащие гены IgH и Igλ., секвенируют и сравнивают с исходными последовательностями продукта ПЦР. Сайт-направленный мутагенез (набор QuikChange Site-Directut Mutagenesis, Stratagene) используют для получения вариантных антител. Для получения His-меченных Fab гены V субклонируют в 6xHis-IgC-экспрессирующий вектор для кодирования домена Сн1 IgG1, за которым следует тег 6х-His. ДНК-фрагменты IgH, кодирующие мутантные антитела, получают в виде синтетического минигена (IDT) и субклонируют в экспрессирующие Igγ1 векторы.
[00299] Антитела и Fab-фрагменты получают путем временной трансфекции экспрессионных плазмид IgH и IgL в экспоненциально растущие клетки HEK 293Т (АТСС, CRL-11268) с использованием способа преципитации полиэтиленимином (PEI). IgG-антитела аффинно очищают с использованием гранул сефарозы белка G (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями производителя. Fab-фрагменты аффинно очищают с использованием кобальтовой смолы HisPur™ (Thermo science), как описано ниже.
Белки Env ВИЧ-1
mutant
[00300] Аланиновые мутации вводят в вектор pYU-2 gp120 с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene) в соответствии с инструкциями производителя. Такую же процедуру используют для получения двойных гликановых мутантов путем введения одиночных аланиновых мутаций в вектор pyU-2 gp120. Сайт-направленные мутации проверяют секвенированием ДНК.
core
[00301] Экспрессирующие векторы, кодирующие YU-2 gp140, YU-2 gp120, НХВ2 с gp120, белки HXB2c2CCcore и мутантные белки YU-2 gp120, используют для трансфекции клеток HEK 293Т. Для получения белка с высоким содержанием только маннозы YU-2 gp120 во время трансфекции добавляют 25 мкМ кифунензина (Enzo Life Sciences). Культуральные супернатанты собирают и концентрируют с использованием основанных на центрифугировании фильтрующих устройств, которые позволяют буферный обмен образцов в имидазоле с концентрацией 10 мМ, фосфате натрия с концентрацией 50 мМ, хлориде натрия с концентрацией 300 мМ; рН 7,4. Белки очищают аффинной хроматографией с использованием кобальтовой смолы HisPur™ (Thermo scientific) в соответствии с инструкциями производителя.
[00302] Для реакций дегликозилирования 50 мкг производимого клетками HK 293Т YU-2 gp120 в PBS расщепляют в течение ночи при температуре 37°С с 200 Ед ПНГазы F (New England Biolabs) или 10000 Ед Endo Hf (New England Biolabs) в их соответствующих реакционных буферах без денатурирующих средств. После замены буфера в PBS с использованием центробежных фильтров (Amicon Ultra, Millipore) обработанные гликозидазой gp120s (200 нг) исследуют с помощью ДСН-ПААГ с использованием 4-12% геля NuPAGE (Invitrogen) с последующим окрашиванием серебром (Pierce Silver Stain Kit, Thermo Scientific). ELISA
[00303] 96-луночные ELISA-планшеты с высоким связыванием (Costar) покрывают в течение ночи 100 нг/лунку очищенным gp120 в PBS. После промывки планшеты блокируют в течение 2 ч BSA в концентрации 2%, ЭДТА в концентрации 1 мкМ, Tween-PBS в концентрации 0,05% (блокирующий буфер), а затем инкубируют в течение 2 ч с IgG в концентрациях 26,7 нМ и 7 последовательных разведениях 1:4 в PBS. После промывки планшеты проявляют путем инкубации с козьими конъюгированными с HRP антителами к человеческому IgG (Jackson ImmunoReseach) (в концентрации 0,8 мкг/мл в блокирующем буфере) в течение 1 часа и добавлением хромогенного субстрата HRP (раствор ABTS, Invitrogen). Связывание антитела с выбранными перекрывающими gp120пeптидaми исследуют с использованием ранее описанного способа пептид-ELISA.
[00304] Для конкурентного анализа ELISA покрытые gp120 планшеты блокируют в течение 2 ч блокирующим буфером и затем инкубируют в течение 2 ч с биотинилированными антителами в последовательно разведенных растворах 1:2 конкурентов антител в PBS (концентрация IgG составляла от 5,2 до 667 нМ). Планшеты проявляют, как описано выше, используя конъюгированньш с HRP стрептавидин (Jackson ImmunoReseach) (в концентрации 0,8 мкг/мл в блокирующем буфере). Все эксперименты выполняют по меньшей мере в двух повторах.
Гликановый микроматричный анализ
[00305] Микрочипы получают роботизированной печатью гликановых зондов, связанных с липидом (неогликолипидами), на стеклянные слайды с покрытием из нитроцеллюлозы на двух уровнях (2 и 5 фмоль/пятно) в двух экземплярах. Анализы связывания выполняют с микрочипами, содержащими 15 неогликолипидов, полученных из N-гликанов с высоким содержанием маннозы и N-гликанов сложного типа. Вкратце, антитела исследуют в концентрации 50 мкг/мл и обнаруживают связывание с биотинилированным антителом к IgG человека (Vector), а затем посредством меченного AlexaFluor 647 стрептавидина (Molecular Probes).
Поверхностный плазменный резонанс
d
&
D
A
-1
-1
-1
-1
[00306] Эксперименты проводят с использованием Biacore Т100 (Biacore, Inc.). Вкратце, белки gp140 и gp120 YU-2 связывают первичными аминами на чипах СМ5 (Biacore, Inc.) при плотности связывания 300 RU. IgG к gp120 и предшественник зародышевой линии (GL) вводят через проточные ячейки в концентрации 1 мкМ и 10 мкМ, соответственно, при скорости потока 35 мкл/мин с 3-минутной стадией ассоциации и 5-минутной стадией диссоциации. Поверхность датчика регенерирует при 30-секундном введении глицин-HCl в концентрации 10 мМ, рН 2,5, со скоростью потока 50 мкл/мин. Диссоциацию (k (s)), ассоциацию (k (М s) и константы связывания (K, (М) или K (М) вычисляют из кинетических анализов после вычитания фона с использованием соотношения 1:1 без коррекции объемного коэффициента отражения (RI) (программное обеспечение Evaluation для Biacore Т100).
Анализы нейтрализации
-/-
50
[00307] Нейтрализацию вируса оценивают с использованием анализа на основе люциферазы в TZM.bl. Псевдовирусы ВИЧ-1 для исследования содержат в основном вирусы уровня 2 и уровня 3. Псевдовирусы с высоким содержанием маннозы производятся в клетках дикого типа, обработанных кифуненсином в концентрации 25 мкМ (Enzo Life Sciences) или в клетках HEK 293 S GnTI. Нелинейный регрессионный анализ используют для расчета концентраций, при которых наблюдается полумаксимальное ингибирование (значения IC). Активность нейтрализации также оценивают с использованием ранее описанного анализа на основе РВМС с использованием инфекции с первичными вариантами ВИЧ-1 (n=95), выделенными из доноров, инфицированных кладой В, с известными датами сероконверсии либо между 1985 и 1989 гг. (исторический, n=14), либо между 2003 и 2006 гг. (современный, n=21).
50
[00308] Активность нейтрализации для каждого антитела рассчитывают с использованием программного обеспечения GraphPad Prism в качестве площади под кривой зависимости концентрации от времени наилучшего согласия, которая соответствует пропорции вирусов, нейтрализованных по значениям IC, в диапазоне от 0,001 до 50 мкг/мл. Относительные значения площади кривой (RAUC) выводятся путем нормализации всех значений AUC по самым высоким значениям. Статистический анализ
[00309] Статистический анализ выполняют с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Эффективность нейтрализации в анализе TZM-bl против выбранной группы вирусных штаммов в сравнении с выраженной аффинностью связывания антител к gp120 и gp140 анализируют с использованием корреляционного теста Спирмена. Тест Манна Уитни используют для сравнения: (i) аффинности к gp120/gp140 антител и (ii) активности нейтрализации против вирусов, выделенных из исторических и современных сероконвертеров.
Кристаллизация и определение структуры
[00310] Экспрессируют 6х-His помеченные AbVT-9 Fab для кристаллизации. Fab очищают от супернатантов временно трансфицированных клеток HEK 293-6Е с помощью последовательной Ni-NTA аффинной (Qiagen) и эксклюзионной хроматографии на основе Superdex200 10/300 (GE Healthcare). Для кристаллов не связанных с лигандами PGT121 Fab IgG PGT121 выделяют из супернатантов временно трансфицированных клеток HEK 293-6Е с помощью аффинной хроматографии на основе белка A (Pierce), а Fab-фрагменты получают путем расщепления папаином IgG и последующей очистки с использованием эксклюзионной хроматографии Superdex200 10/300 (GE Healthcare).
2
3
4
2
[00311] Очищенные Fab концентрируют до 8-20 мг/мл в PBS-буфере. Кристаллы, связанные с лигандом AbV1-9 Fab, получают из образца белка (конечная концентрация: 15 мг/мл), который смешивают с 3-кратным молярным избытком NA2-гликана и инкубируют при температуре 20°С в течение 2 часов. Условия кристаллизации подвергают скринингу при температуре 20°С с использованием робота для кристаллизации Mosquito (ТТР labs) в 400 нл капель с использованием соотношения белка к резервуару 1:1. Кристаллы не связанного с лигандом AbV1-9 Fab получают в 24% ПЭГ 4000, 0,1 М Трис-HCl, рН 8,5, 10 мМ CuCl, и кристаллы связанного с лигандом AbV1-9 Fab росли в 17% ПЭГ 10000, 0,1 М бис-Трис рН 5,5, 0,1 М CHCOOHNH. Кристаллы AbV1-9 Fab получают в 25% ПЭГ 3350, 0,1 М бис-Трис, рН 5,5, 0,2 М NaCl, а кристаллы GL Fab растут в 20% ПЭГ 3350, натрий малонате в концентрации 0,24 М с рН 7,0,10 мМ MnCl. Кристаллы подвергают криозащите путем замачивания в маточном растворе, содержащем 20% глицерина или 20% этиленгликоля, и затем скоростным охлаждением в жидком азоте.
H
L
H
L
[00312] Данные дифракции собирают на линии луча 12-2 на детекторе пикселей Pilatus 6М (Dectris). Данные индексируют, интегрируют и масштабируют с использованием XDS. Используя данные, полученные из не связанных с лигандом кристаллов AbV1-9 Fab, Phenix используют для нахождения раствора для замены молекул для одного Fab на асимметричную единицу с использованием двух моделей поиска, доменов C-C PGT128 Fab (код PDB 3PV3) и доменов V-V 2F5 (код PDB 3 ID J) после удаления остатков в петлях CDRH3 и CDRL3. Впоследствии не связанные с лигандом структуры AbV1-9 используют в качестве поисковой модели для нахождения растворов для замены молекул для связанных с лигандом AbV1-9 Fab (один Fab на асимметричную единицу) и GL (четыре Fab на асимметричную единицу).
[00313] Итеративное уточнение (включая в себя некристаллографические ограничения симметрии для GL) выполняется с использованием моделей Phenix и ручной подгонки карт электронной плотности с использованием Coot. PyMOL используют для молекулярной визуализации и получения фигур структур Fab. Вычисление площади погруженной поверхности производят с помощью Areaimol (ССР4 Suite) с использованием зонда 1,4 А. Структуры Fab выравнивают с использованием сценария Super в PyMOL. Выравнивания парного Са выполняют с использованием PDBeFold.
ПРИМЕР 7 - Идентификация новых уникальных вариантов
[00314] Преобладание и разнообразие специфичных к клонотипу AbV1-9 gp140 В-клеток IgG памяти выделяли от африканского донора, инфицированного кладой А, с использованием тримеров Y-2 gp140 в качестве затравки. Идентифицировали соответствующие гены тяжелой (IgH) и легкой (IgL) цепи иммуноглобулина, соответствующие уникальным клональным семействам. В соответствии с высокими уровнями гипермутации в генах IgH амплифицированные гены Ig сильно мутируют и несут нуклеотидные изменения.
[00315] Экспрессируются новые уникальные варианты и могут демонстрировать связывание с gp120 и gp140 YU-2 с помощью ELISA и поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Если не указано иное, белки gp120 и gp140 для этих и других экспериментов экспрессируются в клетках млекопитающих, которые могут присоединить либо N-гликан сложного типа, либо высокоманнозный N-гликан к PNGS.
ПРИМЕР 8. Роль V3-петли в распознавании антигена.
core
GD324
5AA
GD324
5АА
[00316] Исследовали роль V3 в распознавании антигена антителами AbV1-9. ELISA проводят с использованием капсидных белков НХВ2 gp120, у которых отсутствуют петли VI-V3 (gp120) или сохраняется часть V3 (2СС-соге) и с использованием мутантного белка YU-2 gp120, несущего двойную замену аланина в стволе V3 (gp120-). Антитела могут проявлять сниженную реактивность по сравнению с вариантами, не содержащими петлю V3 и gp120, по сравнению с интактным YU-2 gp120, и можно предположить, что распознавание с помощью AbV1-9 включает в себя детерминанты белка в окрестности петли V3. Ни одно из антител не может связываться с перекрывающимися пептидами, охватывающими V3, и можно предположить, что целевые эпитопы являются прерывистыми и/или требуют определенной конформации, не достигаемой выделенными пептидами.
[00317] Для сравнения общего распознавания гликанов с помощью антител AbV1-9 исследовали их связывание с YU-2 gp120, обработанным ПНГазой F, которая расщепляет N-гликаны как сложного типа, так и с высоким содержанием маннозы. Поскольку gp120 не может быть полностью дегликозилирован ферментативно, если он не денатурирован, обработка ПНГазой F приводит к частичному дегликозилированию gp120 с нативной структурой. Тем не менее реакционная способность каждой группы антител может отличаться тем, что частичное дегликозилирование gp120 посредством ПНГазы F может снижать активность связывания антител AbV1-9. Аналогичные эксперименты проводят с YU-2 gp120, обработанным Endo Н, который расщепляет N-гликаны с высоким содержанием маннозы, но не сложного типа, и может влиять на связывание других антител больше, чем антитела к AbV1-9.
[00318] Микроматрица N-гликана может выявить, что число антител AbV1-9 показывает обнаруживаемое связывание с различными моно- или двухантенными N-гликанами сложного типа. Эксперименты по картированию эпитопа выполняют с двумя репрезентативными представителями каждой группы посредством конкурентного анализа ELISA. Антитела могут проявлять перекрестное конкурирование. Для дальнейшей карты целевых эпитопов антитела к gp120, которые распознают корону петли V3, CD4bs, используют сайт связывания с корецептором, группу N-гликанов с высоким содержанием маннозы (2G12) или петлю V3 и N-связанные гликаны в положениях 301 и 332. Антитела к V3 короны могут ингибировать связывание некоторых из этих антител, но не другие
ПРИМЕР 9 - Широкая и эффективная нейтрализация ВИЧ
[00319] Для оценки нейтрализующей активности вариантов AbV1-9 их способность ингибировать ВИЧ-инфекцию клеток TZM-bl исследуют с использованием вирусных штаммов, включая в себя R1166.cl, который не содержит PNGS в положении 332 gp120. Варианты AbV1-9 нейтрализуют псевдовирусы и никто не нейтрализует контроль. Нейтрализующая активность коррелирует с аффинностью к шипу ВИЧ. Репрезентативная версия зародышевой линии (GL) клонотипа антитела PGT 121/10-1074 не связывает g120/g140 или нейтрализует любые вирусы в панели, подразумевая, что необходима соматическая мутация для связывания и нейтрализации. Образование пар легких цепей GL с мутантными тяжелыми цепями не позволяет сохранить связывание или нейтрализацию, что указывает на то, что обе мутированные цепи способствуют правильной сборке паратопа антитела.
[00320] Следующие анализы проводят для сравнения активности нейтрализации AbV1-9 с расширенной панелью трудно поддающихся нейтрализации псевдовирусов. Как и ожидалось, большинство вирусов, несущих изменения аминокислот в положениях 332 и/или 334 gp120 (охватывающих Asn332-X-Ser334/Thr334 PNGS), устойчивы к нейтрализации. Мутация в этом PNGS приходится на большинство вирусов, устойчивых к нейтрализации. Сравнительная активность нейтрализации наблюдается для IgG и Fab-форм AbV1-9, что указывает на то, что бивалентность не является критичной для их активности.
-/-
-/-
-/-
[00321] Чтобы оценить потенциальную роль N-гликанов сложного типа в оболочке ВИЧ в нейтрализации с помощью AbV1-9, вирионы с высоким содержанием маннозы производятся двумя различными способами: путем сборки псевдовирусов в клетках, обработанных кифуненсином, что приводит к N-связанным гликанам Man9GlcNAc2, или путем сборки в клетках HEK 293 S GnTI, что приводит к N-связанным гликанам Man5GlcNAc2. AbV1-9 нейтрализует 2 из 3 полученных из кифуненсина штаммов эквивалентно их аналогам, производимым в клетках дикого типа. Два вирусных штамма, производимых в клетках GnTI, одинаково чувствительны к AbV1-9 как их аналоги, производимые в клетках дикого типа. В соответствии с предыдущими сообщениями, что N-гликаны сложного типа частично защищают сайт связывания CD4 от связывания антитела, вирусы, производимые в клетках GnTI, более чувствительны к связывающим CD4 сайт антителам.
ПРИМЕР 10 - Вновь переданный ВИЧ-1
[00322] Активность AbV1-9 в отношении переданных вирусов-основателей исследуют путем оценки нейтрализации в анализе на основе мононуклеарной клетки периферической крови (РВМС) с использованием вирусов клады В, выделенных из когорты индивидуумов, которые сероконвертированы между 1985 и 1989 годами (исторический, n=14) или между 2003 и 2006 годами (современный, n=25). AbV1-9 сравнивают с bNAb к CD4bs и другими bNAb, включая в себя VRCO1, PG9/PG16, bl2, 2G12, 4Е10 и 2F5. Анализ кластеризации активности нейтрализации обусловил сегрегацию на две группы; одна группа содержит самые активные нейтрализаторы ВИЧ, включая антитела к CD4bs и PG9. AbV1-9 демонстрируют исключительную эффективность нейтрализации на этой панели вируса клады В.
ПРИМЕР 11 - Кристаллические структуры AbV1-9 и GL
R
L
[00323] Чтобы исследовать структурные детерминанты различий между антителами AbV1-9, определяют кристаллические структуры Fab-фрагментов AbV1-9 и типичного предшественника зародышевой линии (GL). Наложение вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей (V и V) среди трех Fab демонстрирует сохранение основной структуры с различиями, ограниченными небольшими смещениями петель CDRH3 и CDRL3 Fab с созревшей аффинностью относительно GL.
[00324] Сравнения проводят со структурой антител, которые распознают связанные с Asn332gp120 и Asn301gp120 гликаны и V3 и расшифровывают в виде комплекса с петлей внешнего домена/мини-V3 gp120, экспрессируемого в клетках, которые не могут производить модифицированные N-гликаном сложного типа белки.
ПРИМЕР 12 - Кристаллическая структура комплекса AbV1-9-гликан
[00325] Структуры AbV1-9, связанные с сиалилированным двухантенным гликаном сложного типа, расшифровывают с использованием кристаллов, полученных в условиях, включающих в себя NA2.
ПРИМЕР 13 - Замена контактирующих с гликаном остатков антитела влияет на нейтрализацию
[00326] Для оценки вкладов контактирующих с N-гликаном сложного типа остатков, идентифицированных из связанных с лигандом структур AbV1-9, получают мутантные антитела, разработанные для обмена содержащих гликан сложного типа остатков. Полученные с помощью гликоинженерии антитела проявляют кажущуюся аффинность близко к дикому типу для YU-2 gp120/gp140, как измерено с помощью SPR, демонстрируя, что замены не разрушают связывание с шипом оболочки, полученным из вирусного штамма, нейтрализованного обоими AbV1-9. В отличие от AbV1-9 дикого типа, AbV1-9GM не обнаруживают связывания гликанов в микроматричных экспериментах. Затем основанный на TZM-bl анализ используется для сравнения нейтрализации антител дикого типа и гликоинженерных. Исследуют вирусные штаммы.
ПРИМЕР 14 - Пассивная передача нейтрализующих mAb к ВИЧ-1 in-vivo
[00327] Нейтрализующие моноклональные антитела к ВИЧ AbV1-9 вводят макакам резуса и сенсибилизируют их внутриректально через 24 часа двумя разными SHIV. Объединив результаты, полученные от 60 сенсибилизированных животных, титр защитной нейтрализации в плазме, предотвращающий получение вируса у 50% подвергнутых воздействию обезьян, составляет приблизительно 1:100. Эксперименты с животными
[00328] Используемые в настоящем исследовании макаки являются отрицательными по аллелю Мати-А *01 МНС класса I. Конструирование мутагенеза посредством ПЦР R5-тропического SHIVDH12-V3AD8 с праймерами, соответствующими 5'- и 3'-половинам SHIVAD8EO, используют для введения этих последовательностей V3 в генетический фон молекулярного клона pSHIVDH12_CL7 с использованием ДНК-полимеразы Platinum PFX (Invitrogen). После выделения из геля продукт ПЦР обрабатывают полинуклеотид-киназой Т4 (GibcoBRL) и лигазой тупых концов, которая используется для трансформации компетентных клеток. Вирусы
6
[00329] Вирусные запасы получают с помощью первой трансфекции клеток 293Т с молекулярными клонами SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8 с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, СА). Супернатанты культуры собирают через 48 часов, а аликвоты хранят при температуре -80°С до использования. Стимулированные конканавалином А резус-РВМС (2×10 клеток в 500 мкл) инфицируют трансфицированными клеточными супернатантами посредством центрифужной инокуляции в течение 1 часа, смешивают с тем же числом/объемом активированных РВМС и культуры поддерживают в течение по меньшей мере 12 дней с ежедневной заменой культуральной среды. Образцы супернатантной среды объединяют приблизительно во время производства пиковой РТ для подготовки отдельных вирусных запасов. Антитела
[00330] Выделяют и получают одиннадцать моноклональных антител (VRCO1, NIH45-46, 45-46G54W, 45-46m2, 3BNC117, 12А12, 1NC9 и 8ANC195, 10-1074, PGT121 и PGT126). DEN3, специфичное к вирусу лихорадки денге моноклональное антитело IgG1 человека или контроль IgG человека используют в качестве отрицательных контрольных антител в настоящем исследовании. Моноклональные антитела для выбора пассивного переноса перед экспозицией вводят внутривенно за 24 часа до заражения вирусом. Количественное определение уровней вирусной РНК в плазме
[00331] Уровни вирусной РНК в плазме определяют с помощью ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени (система обнаружения последовательности ABI Prism 7900НТ, Applied Biosystems). Концентрации антител в плазме
[00332] Концентрации вводимых моноклональных антител в плазме обезьяны определяют с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) с использованием рекомбинантного gp120 HIV-1JRPL (Progenies Pharmaceuticals) или HIVIIIB (Advanced Biotechnology Inc.). Вкратце, планшеты для микротитрования покрывают gp120 ВИЧ-1 (2 мкг/мл) и инкубируют в течение ночи при 4°С. Планшеты промывают PBS/0,05% Tween-20 и блокируют 1% (об./об.) BSA. После блокировки серийное разведение антител или образцов плазмы добавляют к планшету и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. Связывание обнаруживают с козьим антителом к фрагментам F(ab)2 IgG человека, связанным с щелочной фосфатазой (Pierce) и визуализированным с помощью SIGMAFAST OPD (Sigma-Aldrich). Период полураспада нейтрализации моноклональных антител рассчитывают по формуле одного экспоненциального распада, основанной на концентрациях в плазме, начиная с 5-го дня или 7-го дня после введения антитела. Анализы нейтрализации
50
[00333] Активность in vitro каждого моноклонального антитела и активность нейтрализации, присутствующую в образцах плазмы, собранных от макак резуса, оценивают с помощью двух типов анализов нейтрализации; 1) анализ входа TZM-bl посредством заражения псевдотипированным вирусом или 14-дневный анализ репликации РВМС с помощью репликации компетентного вируса. Для анализа TZM-bl серийно разведенные образцы моноклонального антитела или плазмы инкубируют с псевдотипированными вирусами, экспрессируя ген env, полученный из SHIVAD8EO или SHIVDH12_V3AD8, и получают путем котрансфекции 293Т клеток векторами pNLenvl и pCMV, экспрессирующими соответствующие белки оболочки. Титр 50%> нейтрализующей дозы (IC) рассчитывают как разведение, вызывающее 50%> уменьшение относительных единиц люминесценции (RLU) по сравнению с уровнями в контрольных вирусных лунках после вычитания контрольного RLU клеток. Фенотип нейтрализации (уровни титра) молекулярного клона SHIVDH12_V3AD8 определяют с помощью анализа клеток TZM-bl с использованием образцов плазмы из когортного исследования, которые демонстрируют широкий спектр нейтрализующих активностей против ВИЧ-1 подтипа В.
Определение защитных титров животных и статистические анализы.
[00334] Выполняют расчет нейтрализующего титра в плазме против каждого R5 SHIV, что приводит к предотвращению получения вируса у 50 или 80% зараженных вирусом животных. Рецидив пробит используют для моделирования отношения между титрами в плазме, требуемыми для обеспечения стерилизующего иммунитета in vivo с использованием всех пассивно иммунизированных обезьян, с р-значениями этой модели на основе тестов на отношение правдоподобия. Титры плазмы, необходимые для разных уровней защиты in vivo (33%, 50%, 80%, 90% и 95%>), определяют из оценок модели пробит, а способ бутстреппинга используют для построения доверительных интервалов 90%>.
[00335] Протокол для экспериментов с пассивной передачей заключается в том, чтобы вводить уменьшающиеся количества нейтрализующих моноклональных антител внутривенно и заражать животных внутриректально через 24 часа. Цель состоит в том, чтобы блокировать получение вируса в сочетании с тем знанием, что повторное введение гуманизированных моноклональных антител к ВИЧ отдельным макакам может снизить их эффективность и/или, возможно, вызвать анафилактические ответы, дозу заражения SHIV, достаточную для установления инфекции in vivo после выбора единственной прививки.
[00336] В качестве контроля для первого эксперимента с пассивной передачей моноклональное антитело NS1 IgG1 к вирусу лихорадки денге вводили внутривенно животным, которых позже заражали SHIVAD8EO через 24 часа. VRCO1 представляет собой первое нейтрализующее моноклональное антитело к ВИЧ-1, исследованное на предмет защиты от заражения вирусом, и вводится двум макакам в дозе 50 мг/кг. Один (DEGF) из двух инокулированных макак полностью защищен от заражения SHIVAD8EO. Другой реципиент 50 мг/кг VRCO1 (DEH3) становится инфицированным, но в пике вирусемии в плазме. Двум дополнительным макакам вводят более низкие количества (20 мг/кг) VRCO1 и не защищают от заражения SHIVAD8EO. Аналогично оценивают способность моноклональных антител VRCO1 и AbV1-9 блокировать восприимчивость к SHIVDH12-V3AD8.
[00337] Образцы плазмы, собранные в разное время от макак, подвергнутых пассивному перенесу, анализировали с помощью ELISA HIV-1 gp120 для определения концентраций нейтрализующих моноклональных антител. В общем, концентрации в плазме каждого моноклонального антитела во время заражения (через 24 часа после введения антитела) коррелируют с дозой вводимого антитела.
[00338] Титры нейтрализации измеряют на образцах плазмы, собранных через 24 часа после введения моноклонального антитела, когда макак заражают SHIVAD8EO или SHIVDH12-V3AD8. Затем рассчитывают титры нейтрализации, измеренные в плазме, необходимые для предотвращения заражения вирусом у 50% зараженных обезьян.
ПРИМЕР 15 - Введение нейтрализующих моноклональных антител в хронически инфицированные ВИЧ модели in vivo
+
[00339] Активность нейтрализации нейтрализующих моноклональных антител широкого спектра действия против SHIVAD8EO изначально определяют в клеточной системе TZM-bl против SHIVAD8EO. Их способность блокировать восприимчивость к вирусу или контролировать вирусемию в плазме у хронически инфицированных животных, зараженных R5-тропическим SHIVAD8EO, оценивают путем мониторинга вирусных нагрузок плазмы и связанных с клетками вирусных нуклеиновых кислот; уровни подтипов CD4 Т-клеток измеряют с помощью проточной цитометрии. SGA анализирует циркулирующие вирусные варианты и определение уровней антител в плазме. Концентрацию в плазме NAb определяют путем измерения нейтрализующей активности против препаратов псевдовируса ВИЧ-1, восприимчивых только к 10-1074 или 3BNC117.
ПРИМЕР 16 - Получение библиотеки секвенирования 454
[00340] Обратную транскрипцию выполняют с 10 мкл общей РНК и 2 мкл RT-праймерной смеси (олиго-dT в концентрации 50 мкМ и случайный гексамер в концентрации 25 мкМ). Смесь нагревают при температуре 95°С в течение 1 мин, при температуре 65°С в течение 5 мин, затем охлаждают на льду в течение 1 мин. Для каждой реакции готовят смесь с 4 мкл 5-кратного FS-буфера, 1 мкл 10 мМ смеси dNTP, 1 мкл 0,1 М ДТТ, 1 мкл ингибитора РНКазы (энзиматика) и 1 мкл Superscript III RT (Invitrogen). Эту смесь добавляют к реакции и инкубируют при температуре 25°С в течение 10 мин, при температуре 35°С в течение 5 мин, при температуре 55°С в течение 45 мин и при температуре 85°С в течение 5 мин. РНК/ДНК-гибрид удаляют добавлением 4 мкл РНКазы Н E.coli (энзиматика). Реакции ПЦР собирают с использованием 13,75 мкл воды, 5 мкл кДНК, 5 мкл 5-кратного HF-буфера, 0,5 мкл dNTP в концентрации 10 мМ, 0,25 мкл каждого исходного праймера в концентрации 100 мкМ и 0,25 мкл горячего старта Phusion. Реакцию циклируют при температуре 98°С (60 с), 24 цикла при температуре 98°С (10 с), 62°С (20 с) и 72°С (20 с) с окончательным удлинением при температуре 72°С (5 мин). Образцы очищают на колонке QIAquick и прогоняют на 2%-ном агарозном Е-геле. Желаемые полосы очищают с использованием набора для выделения из геля гена Qiagen MinElute, элюируют дважды 10 мкл буфера ЕВ и количественно определяют на биоанализаторе 2100. Образцы отправляют в SeqWright для секвенирования 454, которое выполняют в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕР 17 - Анализы получения и нейтрализации псевдовируса
[00341] Для получения псевдовирусов кодирующие Env плазмиды совместно трансфицируют дефицитной по Env геномной плазмидой остова (pSG3ΔEnv) в соотношении 1:2 с трансфекционным реагентом Fugene 6 (Promega). Псевдовирусы собирают через 72 часа после трансфекции для использования в анализах нейтрализации. Нейтрализующую активность оценивают с использованием одного раунда анализа репликации псевдовируса и целевых клеток TZM-bl, как описано ранее.
ПРИМЕР 18 - Образцы человека
[00342] Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получают от донора 17, инфицированного ВИЧ-1 донора из когорты. Все образцы людей собирают с информированного согласия в соответствии с клиническими протоколами, одобренными соответствующей институциональной обзорной комиссией.
ПРИМЕР 19 - Сортировка клеток и экстракция РНК
6
31
[00343] Замороженные флаконы 10×10 РВМС подвергают оттаиванию и промывают перед окрашиванием меченными Pacific Blue анти-CD3 (UCHT1), меченными Pacific Blue анти-CD14 (М5Е2), меченными FITC анти-CD19 (HIB19), меченными РЕ-Су5 анти-CD10 (HI10a), меченными РЕ анти-CD27 (М-Т271) и меченными АРС анти-С021 (В-1у4), все из BD Biosciences. Сортировку выполняют на высокоскоростном BD FACSAria в буфере для лизиса miRVana (Ambion). Незрелые В-клетки, истощенная тканеподобная память, активированные зрелые В-клетки, покоящиеся В-клетки памяти и короткоживущие периферические плазмобласты окрашивают с использованием ранее описанных маркеров. Общую РНК из клеток затем экстрагируют с использованием набора для экстракции miRVana РНК (Ambion) в соответствии с инструкциями производителя и количественно определяют на биоанализаторе 2100 (Agilent).
ПРИМЕР 20 - Экспрессия и очистка антител и белков
[00344] Последовательности антител синтезируют и клонируют в ранее описанные векторы тяжелой и легкой цепей. Плазмиды котрансфицируют (соотношение 1:1) в клетки HEK 293Т или клетки FreeStyle 293 с использованием Fugene 6 (Promega) или 293fectin (Invitrogen), соответственно. Трансфекции выполняют в соответствии с протоколом производителя, а супернатанты антител собирают через четыре дня после трансфекции. Антитела, производимые в клетках 293Т, количественно определяют с помощью ELISA и используют непосредственно в анализах нейтрализации. Антитела, производимые в клетках FreeStyle 293, дополнительно очищают на колонке с белком А. Мутации вводят посредством сайт-направленного мутагенеза с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene). Рекомбинантные белки gp120 трансфицируют в клетки 293 FreeStyle с использованием 293fectin (Invitrogen) и очищают с помощью лектиновой колонки Galanthus nivalis с последующим исключением по размеру с использованием Superdex 300 26/60 (GE Healthcare).
ПРИМЕР 21 - Анализы связывания клеточной поверхности
2
70
[00345] Титровальные количества моноклонального антитела добавляют к трансфицированным по Env ВИЧ-1 клеткам 293Т и инкубируют в течение 1 часа при температуре 4°С в 1×PBS. После промывки клетки фиксируют 2% PFA (PolySciences) в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем клетки промывают и окрашивают 1:200 разведением конъюгированного с фикоэритрином козьего антитела к F(ab') IgG человека (Jackson)) в течение 1 часа при комнатной температуре. Связывание анализируют с использованием проточной цитометрии. Конкурентные связывания выполняют путем титрования количества моноклональных антител конкурента перед добавлением биотинилированного антитела в концентрации, необходимой для получения IC, а затем путем измерения связывания с меченым фикоэритрином стрептавидином (Invitrogen). Программное обеспечение FlowJo используют для интерпретации данных.
ПРИМЕР 22. Анализы ELISA.
2
[00346] Выполняют связывание с помощью ELISA. Вкратце, планшеты покрывают козьим антителом к Fc IgG человека (Pierce) или gp120, и связывание обнаруживают с использованием козьего антитела к F(ab') IgG человека, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Pierce). Для связывания с gp120, экстрагированного из лизированных вирионов, планшеты покрывают 5 нг/мкл овечьего антитела D7324 к gp120 (реактивы Aalto Bio). Супернатанты вируса лизируют с использованием конечной концентрации 1% NP-40 и инкубируют на покрытых планшетах в течение 2 часов при температуре 37°С. Обнаружение измеряют с использованием козьего антитела к F(ab')2 IgG человека, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Pierce). Концентрацию антитела рассчитывают линейной регрессией с использованием стандартной кривой концентрации очищенного белка IgG.
ПРИМЕР 23 - Экспрессия, очистка, кристаллизация и рентгеноструктурный анализ Fab зародышевой линии AbV1-9
[00347] Fab зародышевой линии AbV1-9 производят в клетках HEK 293Т и очищают. Вкратце, через три дня после трансфекции генами тяжелой и легкой цепи собирают среду для экспрессии и секретируемые Fab очищают с помощью аффинной матрицы легкой цепи человека (CaptureSelect Fab X; ВАС) с последующей катионообменной хроматографией и эксклюзионной хроматографией. Кристаллы качества дифракции рентгеновских лучей получают в условиях, содержащих ацетата магния в концентрации 0,2 М, 20% мас./об. ПЭГ 8000, какодилат натрия в концентрации 0,1 М, рН 6,5. Перед установкой и быстрым замораживанием кристаллов в жидком азоте, маточный раствор дополняют глицерином в концентрации 20% для криозащиты. Собирают полный набор данных. Обработку данных выполняют с использованием XDS. Структуру зародышевой линии PGT121 определяют с использованием PHASER в космических группах Р212121 со структурой Fab PGT123 в качестве модели поиска. Уточнение выполняют с использованием комбинации PHENIX и COOT.
ПРИМЕР 24 - Обработка необработанных данных: выравнивание VDJ и определение клона
[00348] Необработанные данные секвенирования обрабатывают с использованием собственных инструментальных средств, написанных на языке python. Считывание разделяют на штрих-коды, фильтрованные по размеру и выровненные по базе данных ссылок VDJ зародышевой линии IMGT. Оценки сохраняют низкими для последовательностей, которые очень сильно мутируют. Область V сначала выравнивают, затем удаляют, затем следует J, затем удаляют, а затем D. Затем экстрагируют определенную IMGT последовательность CDR3 каждого считывания. Последовательности CDR3 сортируют по численности и кластеризуют с USEARCH5.1. Наконец, каждую последовательность CDR3 выравнивают с последовательностями целевого антитела AbV1-9, чтобы определить значение расхождения этих антител.
ПРИМЕР 25 - Идентификация и анализ вариантов антител
[00349] Графики расхождения-мутации используют в качестве инструмента для идентификации считываний, которые аналогичны известным антителам. Высокоидентичные кластеры последовательностей и кластеры, которые находятся выше фона, идентифицируют вручную и используют в качестве входных данных для вывода филогенеза с Immunitree. Immunitree реализует байесовскую модель соматической гипермутации клонов, включая в себя вероятностные модели SHM и ошибки секвенирования, и выполняет анализ Монте-Карло с использованием цепей Маркова над иерархической структурой, временем рождаемости/смерти субклонов, рождаемостью/смертью, мутацией и частотой чередования ошибок, консенсусных последовательностей субклонов и присваивания считываний узлам. Иерархическая структура также используется для нескольких вычислений и для наложения различной информации. Давление отбора, которое испытывал данный узел, оценивают с использованием алгоритма BASELINe. Он выполняет байесовскую оценку давления отбора, сравнивая наблюдаемое количество замещающих/молчащих мутаций в CDR/FWR узловой консенсусной последовательности.
H
L
ПРИМЕР 26 - Восстановление известных низкочастотных пар VV от элитного контроллера ВИЧ
H
L
H
L
H
H
H
L
H
L
H
L
H
L
H
L
H
L
[00350] В качестве дополнительной проверки чувствительности образования пар и точности анализа обрабатывали образец, в котором уже общеизвестно несколько редких (<1 клетки в 10000) природных пар VV. Получали периферические В-клетки от пациента элитного контролера ВИЧ, чьи В-клетки памяти в последние годы активно исследовали на антитела, проявляющие активность в нейтрализации ВИЧ. 350000 В-клеток обрабатывали для получения в общей сложности 38620 фильтрованных пар VV. Интересно, что этот индивидуум показал большую долю IgG, чем предыдущий здоровый образец (фиг. 3А) или типичные здоровые периферические репертуары В-клеток. Последовательности V из этого набора данных сравнивали со всеми сообщаемыми нейтрализующими антителами широкого спектра действия (bNAb) от этого индивидуума, включая в себя PGT121, и обнаружили восемь близких или идентичных последовательностей V, что указывает на то, что это семейство bNAb составляет менее 0,03% циркулирующих В-клеток. Существенно, что все легкие цепи, соединенные в пары с этими тяжелыми цепями, были ожидаемой и аналогичной редкой линии bNAb, отображая ту же реаранжировку IgX,-V3-21/J3 и вставку тройного кодона, как сообщалось ранее, поддерживая высокую точность и чувствительность способа авторов настоящего изобретения. Кроме того, на филогенетическом дереве всех известных и вновь полученных подобных PGT121 пар VV от этого индивидуума (фиг. 3В) деревья V и V демонстрируют поразительно подобную топологию с парными последовательностями V и V, занимающими зеркальные положения, что, вероятно, отражает общую филогенетическую историю. Открытые в настоящем документе пары вариантов хорошо сочетаются с этим правилом. Интересно, что два опубликованных антитела PGT122 и PGT123 являются исключениями; поддержка этих двух спариваний не была найдена, но были найдены пары подобные PGT122V:PGT123V и подобные PGT123V:PGT122V, обращаясь к непроверенному спариванию в исходном отчете. Синтезировали ДНК, кодирующие полные области V(D)J из 8 новых подобных PGT пар VV, экспрессирующие антитела в виде полного IgG, и исследовали их способность нейтрализовать множественные псевдоштаммы ВИЧ (фиг. 6С). Антитела хорошо экспрессировались, и все они проявляли сильную нейтрализующую активность против вируса, демонстрируя полезность подхода авторов настоящего изобретения при быстром получении вариантов природных пар функциональных антител из соответствующего биологического образца.
ПРИМЕР 27 - Образцы человека
[00351] Образец крови для проверки здорового репертуара собирали с одобрения Проекта личного генома. РВМС для эксперимента bNAb ВИЧ получали от донора 17, инфицированного ВИЧ-1 донора из когорты протокола G IAVI. Все образцы ВИЧ-инфекции человека собирали с письменным информированным соглашением в соответствии с клиническими протоколами, одобренными Национальным комитетом по этике республики Руанда, институциональным наблюдательным советом университета Эмори, Комитетом по этике исследований университета Замбии, Комитетом по этике исследований Чаринг-Кросс, Комитетом по науке и этики UVRI, Комитетом по этике научных исследований университета Нового Южного Уэльса, больницей Сент-Винсента и службой здравоохранения района Сидней, Комитетом по этике и исследованиям национальной больницы Кеньятты, Комитетом по этике научных исследований университета Кейптауна, Международным институциональным наблюдательным советом, Комитетом по этике университета Махидола, институциональным наблюдательным советом НИИ сухопутных войск им. Уолтера Рида (WRAIR) и Комитетом по делам побережья Кот-д'Ивуара «National d'Ethique des Sciences de la Vie et de la Sante» (CNESVS). Криоконсервированную, диссоциированную иссеченную аденокарциному яичника у одного донора получали из Conversant Biologies с письменным информированным согласием в соответствии с протоколом, утвержденным IRB.
ПРИМЕР 28. Химерный антигенный рецептор к ВИЧ (CAR) Т-клеток
[00352] Гены для версий одноцепочечного вариабельного фрагмента (sFv или scFv) к ВИЧ AbV-1-9 создают путем синтеза оптимизированных по ко дону последовательностей для тяжелых и легких цепей, которые разделяются линкером, таким как линкер (GGGGS)3.
+
+
Для каждого антитела к ВИЧ ген scFv включают в вектор, кодирующий CAR, такой как вектор, кодирующий CAR, содержащий полученный из 4-1 ВВ сигнальный домен, слитый с сигнальным доменом CD3 для создания CAR-кодирующего вектора к ВИЧ, такого как лентивирусный вектор. Первичные CD4 и CD8 Т-клетки трансдуцируют с помощью CAR-кодирующего вектора к ВИЧ.
Характеристика Т-клеток, экспрессирующих CAR к ВИЧ
NL4-3
[00353] Обогащенные трансдуцированными CAR к ВИЧ Т-клетки исследовали на их способность к пролиферации в ответ на инфицированные ВИЧ-1 клетки. Т-клетки с трансдуцированными CAR к ВИЧ метят CellTrace Violet и затем совместно культивируют с инфицированными ВИЧ-1 клетками (такими как клетки Jurkat, SupTl, HEK293T или HeLa). Пролиферацию Т-клеток с трансдуцированными CAR к ВИЧ измеряют проточной цитометрией, и, как показано, она увеличивается по сравнению с нетрансдуцированными Т-клетками.
[00354] Обогащенные трансдуцированными CAR к ВИЧ Т-клетки исследуют на их способность к опосредованному специфическому уничтожению инфицированных ВИЧ-1 клеток. Т-клетки с трансдуцированными CAR к ВИЧ анализируют в анализе высвобождения хрома при совместном культивировании с инфицированными ВИЧ-1 клетками-мишенями. Измеряют специфический лизис инфицированных ВИЧ-1 клеток, и показано, что специфический лизис происходит благодаря Т-клеткам с трансдуцированными CAR к ВИЧ. Лечение экспрессирующими CAR Т-клетками,
[00355] Т-клетки от инфицированного ВИЧ субъекта трансдуцируют векторами CAR к ВИЧ, чтобы экспрессировать CAR к ВИЧ. Субъекту вводят Т-клетки с трансдуцированными CAR к ВИЧ. Клетки, экспрессирующие целевой антиген CAR к ВИЧ, уничтожаются Т-клетками с трансдуцированными CAR к ВИЧ, которые уменьшают или убирают ВИЧ-инфекцию и/или уменьшают ее симптомы у субъекта.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> АБВИТРО ЭЛЭЛСИ
<120> КОМПОЗИЦИИ АНТИТЕЛ К ВИЧ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 13986.0017-00304
<140> PCT/US2016/053599
<141> 2016-09-24
<150> 62/232,279
<151> 2015-09-24
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 131
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 1
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Gly Asn
20                  25                  30
Ile Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Phe Val Ser Gly Glu Tyr Ile Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
50                  55                  60
Arg Leu Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Thr
65                  70                  75                  80
Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Lys
85                  90                  95
Thr Leu Arg Ala Arg Arg Ile Tyr Gly Val Ile Ala Phe Gly Glu Val
100                 105                 110
Tyr Asp Tyr His Tyr Phe Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr
115                 120                 125
Val Ser Ser
130
<210> 2
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 2
Thr Asp Ser Val Ala Ser Asp Val Ala Met Ser Val Ala Pro Gly Asp
1               5                   10                  15
Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Glu Lys Ser Asn Gly Ala Arg Ala Val
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Ile Ile Tyr
35                  40                  45
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50                  55                  60
Pro Asp Ala Gly Phe Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ile Trp Asp Ser Arg
85                  90                  95
Phe Pro Leu Ser Trp Val Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 3
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Met Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Val Ser Asp Arg Ala Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Val Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Leu Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Thr Ala Arg Arg Gly Gln Arg Ile Tyr Gly Glu Val Ala Phe Gly Glu
100                 105                 110
Phe Phe Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Ala Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 4
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 4
Gly Ser Val Thr Ser Phe Val Arg Pro Leu Ser Val Ala Leu Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser Ile Ser Cys Gly Arg Gln Ala Leu Gly Ser Arg Ala Val
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln His Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Thr
50                  55                  60
Pro Asp Ile Asn Phe Gly Thr Arg Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Met Trp Asp Ser Arg
85                  90                  95
Ser Gly Phe Ser Trp Ser Phe Gly Gly Ala Thr Arg Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 5
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 5
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Pro Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Asn Asp Ala
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Arg Pro Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Tyr Val His His Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ala Lys Asn Glu Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Val Ala Leu Thr Ala Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85                  90                  95
Arg Ala Leu His Gly Lys Arg Ile Tyr Gly Thr Val Ala Leu Gly Glu
100                 105                 110
Leu Phe Val Tyr Phe His Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Ala Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 6
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 6
His Cys Thr Gly Ala Val Ser Ser Phe Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Glu Glu Ser Leu Gly Ser Arg Ser Val
20                  25                  30
Ile Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Ile Ile Tyr
35                  40                  45
Asn Asn Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Pro Gly Ser Thr Phe Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ile Trp Asp Ser Arg
85                  90                  95
Arg Pro Thr Asn Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 7
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 7
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Pro Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Asn Asp Ala
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Arg Pro Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Tyr Val His His Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Arg Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ala Lys Asn Glu Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Val Ala Leu Thr Ala Ala Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85                  90                  95
Arg Ala Leu His Gly Lys Arg Ile Tyr Gly Thr Val Ala Leu Gly Glu
100                 105                 110
Leu Phe Val Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Ala Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 8
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 8
His Cys Thr Gly Ala Val Ser Ser Phe Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Glu Glu Ser Leu Gly Ser Arg Ser Val
20                  25                  30
Ile Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ser Leu Ile Ile Tyr
35                  40                  45
Asn Asn Asn Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Pro Gly Ser Thr Phe Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ile Trp Asp Ser Arg
85                  90                  95
Arg Pro Thr Asn Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 9
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 9
Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asn Val Ser Gly Thr Leu Val Arg Asp Asn
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Leu Gly Lys Gln Pro Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Val His Asp Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val His Leu Ser Leu Asp Lys Ser Lys Asn Leu Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Arg Leu Thr Gly Val Thr Ala Ala Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Thr Thr Lys His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Val Val Ala Phe Lys Glu
100                 105                 110
Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 10
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 10
His Cys Thr Ala Ser Leu Ala Ser Ser Met Ser Val Ser Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Ala Lys Ile Ser Cys Gly Lys Glu Ser Ile Gly Ser Arg Ala Val
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Ser Leu Ile Ile Tyr
35                  40                  45
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50                  55                  60
Pro Asp Phe Arg Pro Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val
65                  70                  75                  80
Asp Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ile Tyr Asp Ala Arg
85                  90                  95
Gly Gly Thr Asn Trp Val Phe Asp Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 11
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 11
Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asn Val Ser Gly Thr Leu Val Arg Asp Asn
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Leu Gly Lys Gln Pro Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Val His Asp Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val His Leu Ser Leu Asp Lys Ser Lys Asn Leu Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Arg Leu Thr Gly Val Thr Ala Ala Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Thr Thr Lys His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Val Val Ala Phe Lys Glu
100                 105                 110
Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Ser Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 12
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 12
His Cys Thr Gly Ser Leu Ala Ser Ser Met Ser Val Ser Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Ala Lys Ile Ser Cys Gly Lys Glu Ser Ile Gly Ser Arg Ala Val
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Ser Leu Ile Ile Tyr
35                  40                  45
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Ala Ser
50                  55                  60
Pro Asp Phe Arg Pro Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val
65                  70                  75                  80
Asp Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ile Tyr Asp Ala Arg
85                  90                  95
Gly Gly Thr Asn Trp Val Phe Asp Arg Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 13
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 13
Gln Met Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Ser Gly Ala Ser Ile Ser Asp Ser
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Phe Arg Arg Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Asn Leu Ser Leu Asp Ala Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu
65                  70                  75                  80
Ser Leu Val Ala Ala Thr Ala Ala Asp Ser Gly Lys Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ile Val Ala Phe Asn Glu
100                 105                 110
Trp Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val Trp Gly Asn Gly Thr Gln Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 14
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 14
His Cys Thr Ala Ser Val Thr Ser Asp Ile Ser Val Ala Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Ser Cys Gly Glu Lys Ser Leu Gly Ser Arg Ala Val
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln His Arg Ala Gly Gln Ala Pro Ser Leu Ile Ile Tyr
35                  40                  45
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Pro Asp Ser Ala Phe Gly Thr Thr Ala Thr Leu Thr Ile Thr Ser Val
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Ile Trp Asp Ser Arg
85                  90                  95
Val Pro Thr Lys Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 15
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 15
Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Ala Ser Thr Ser Gly Gln
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Arg Ser Asp Ser Gly Asp Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Ile Ile Ser Leu Asp Thr Ser Arg Asn Gln Leu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Asn Val Thr Ser Val Thr Thr Ala Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Ala
85                  90                  95
Arg Ala Gln Arg Gly Lys Arg Ile Tyr Gly Val Val Ser Leu Gly Glu
100                 105                 110
Tyr Tyr His Tyr Tyr Ile Met Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Pro Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 16
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 16
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Asp Ser Met Asn Asn Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Asp Arg Ala Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Asn
50                  55                  60
Ser Arg Val Val Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Asn Ser Val Thr Pro Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Thr Ala Arg Arg Gly Gln Arg Ile Tyr Gly Glu Val Ser Phe Gly Glu
100                 105                 110
Phe Phe Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Ala Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 17
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 17
Gly Asn Ile Trp Ser
1               5
<210> 18
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 18
Phe Val Ser Gly Glu Tyr Ile Glu Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 19
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 19
Thr Leu Arg Ala Arg Arg Ile Tyr Gly Val Ile Ala Phe Gly Glu Val
1               5                   10                  15
Tyr Asp Tyr His Tyr Phe Asp Val
20
<210> 20
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 20
Gly Glu Lys Ser Asn Gly Ala Arg Ala Val Gln
1               5                   10
<210> 21
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 21
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser
1               5
<210> 22
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 22
His Ile Trp Asp Ser Arg Phe Pro Leu Ser Trp Val
1               5                   10
<210> 23
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 23
Asn Tyr Tyr Trp Thr
1               5
<210> 24
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 24
Tyr Val Ser Asp Arg Ala Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 25
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 25
Ala Arg Arg Gly Gln Arg Ile Tyr Gly Glu Val Ala Phe Gly Glu Phe
1               5                   10                  15
Phe Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val
20
<210> 26
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 26
Gly Arg Gln Ala Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln
1               5                   10
<210> 27
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 27
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser
1               5
<210> 28
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 28
His Met Trp Asp Ser Arg Ser Gly Phe Ser Trp Ser
1               5                   10
<210> 29
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 29
Gly Arg Gln Ala Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln
1               5                   10
<210> 30
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 30
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser
1               5
<210> 31
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 31
His Met Trp Asp Ser Arg Ser Gly Phe Ser Trp Ser
1               5                   10
<210> 32
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 32
Gly Glu Glu Ser Leu Gly Ser Arg Ser Val Ile
1               5                   10
<210> 33
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 33
Asn Asn Asn Asp Arg Pro Ser
1               5
<210> 34
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 34
His Ile Trp Asp Ser Arg Arg Pro Thr Asn Trp Val
1               5                   10
<210> 35
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 35
Asp Ala Tyr Trp Ser
1               5
<210> 36
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 36
Tyr Val His His Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Arg
1               5                   10                  15
<210> 37
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 37
Ala Leu His Gly Lys Arg Ile Tyr Gly Thr Val Ala Leu Gly Glu Leu
1               5                   10                  15
Phe Val Tyr Phe Tyr Met Asp Val
20
<210> 38
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 38
Gly Glu Glu Ser Leu Gly Ser Arg Ser Val Ile
1               5                   10
<210> 39
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 39
Asn Asn Asn Asp Arg Pro Ser
1               5
<210> 40
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 40
His Ile Trp Asp Ser Arg Arg Pro Thr Asn Trp Val
1               5                   10
<210> 41
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 41
Asp Asn Tyr Trp Ser
1               5
<210> 42
<211> 17
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 42
Tyr Val His Asp Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
Val
<210> 43
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 43
Thr Lys His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Val Val Ala Phe Lys Glu Trp
1               5                   10                  15
Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val
20
<210> 44
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 44
Gly Lys Glu Ser Ile Gly Ser Arg Ala Val Gln
1               5                   10
<210> 45
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 45
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ala
1               5
<210> 46
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 46
His Ile Tyr Asp Ala Arg Gly Gly Thr Asn Trp Val
1               5                   10
<210> 47
<211> 4
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 47
Asp Asn Tyr Trp
1
<210> 48
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 48
Tyr Val His Asp Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 49
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 49
Thr Lys His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Val Val Ala Phe Lys Glu Trp
1               5                   10                  15
Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val
20
<210> 50
<211> 9
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 50
Gly Lys Glu Ser Ile Gly Ser Arg Ala
1               5
<210> 51
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 51
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ala
1               5
<210> 52
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 52
His Ile Tyr Asp Ala Arg Gly Gly Thr Asn Trp Val
1               5                   10
<210> 53
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 53
Asp Ser Tyr Trp Ser
1               5
<210> 54
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 54
Tyr Val His Lys Ser Gly Asp Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 55
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 55
Thr Leu His Gly Arg Arg Ile Tyr Gly Ile Val Ala Phe Asn Glu Trp
1               5                   10                  15
Phe Thr Tyr Phe Tyr Met Asp Val
20
<210> 56
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 56
Gly Glu Lys Ser Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln
1               5                   10
<210> 57
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 57
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser
1               5
<210> 58
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 58
His Ile Trp Asp Ser Arg Val Pro Thr Lys Trp Val
1               5                   10
<210> 59
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 59
Gly Gln Tyr Trp Ser
1               5
<210> 60
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 60
Tyr Arg Ser Asp Ser Gly Asp Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210> 61
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 61
Ala Gln Arg Gly Lys Arg Ile Tyr Gly Val Val Ser Leu Gly Glu Tyr
1               5                   10                  15
Tyr His Tyr Tyr Ile Met Asp Val
20
<210> 62
<211> 5
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 62
Asn Tyr Tyr Trp Thr
1               5
<210> 63
<211> 16
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 63
Tyr Ile Ser Asp Arg Ala Ser Ala Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Asn Ser
1               5                   10                  15
<210> 64
<211> 24
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 64
Ala Arg Arg Gly Gln Arg Ile Tyr Gly Glu Val Ser Phe Gly Glu Phe
1               5                   10                  15
Phe Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Val
20
<210> 65
<211> 112
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(4)
<223> Любая аминокислота
<400> 65
Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Tyr Val Arg Pro Leu Ser Val Ala Leu Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Ala Ser Ile Ser Cys Gly Arg Gln Ala Leu Gly Ser Arg Ala Val
20                  25                  30
Gln Trp Tyr Gln His Arg Pro Gly Gln Ala Pro Ile Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Thr
50                  55                  60
Pro Asp Ile Asn Phe Gly Thr Arg Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Met Trp Asp Ser Arg
85                  90                  95
Ser Gly Phe Ser Trp Ser Phe Gly Gly Ala Thr Arg Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210> 66
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 66
Gly Arg Gln Ala Leu Gly Ser Arg Ala Val Gln
1               5                   10
<210> 67
<211> 7
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 67
Asn Asn Gln Asp Arg Pro Ser
1               5
<210> 68
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид
<400> 68
His Met Trp Asp Ser Arg Ser Gly Phe Ser Trp Ser
1               5                   10
<210> 69
<211> 132
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 69
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Thr Gln Gln Gly Lys Arg Ile Tyr Gly Val Val Ser Phe Gly Asp
100                 105                 110
Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val
115                 120                 125
Thr Val Ser Ser
130
<210> 70
<211> 109
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 70
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20                  25                  30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35                  40                  45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85                  90                  95
Pro Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105
<---