Способ оценки степени влияния экспериментальной ишемии на нервную ткань головного мозга белых крыс при окрашивании препаратов гематоксилином и эозином
METHOD FOR ASSESSING THE DEGREE OF EFFECT OF EXPERIMENTAL ISCHEMIA ON BRAIN NERVE TISSUE OF WHITE RATS WHEN STAINING PREPARATIONS WITH HAEMATOXYLIN AND EOSIN

Изобретение относится к области медицины, в частности, к совершенствованию методов морфометрии в нейроморфологии.
Известные способы оценки степени влияния ишемии на нервную ткань при гистологическом исследовании основываются главным образом на характере и особенностях изменений клеточных элементов: нейронов, глии и эндотелиоцитов. Как правило, критериями степени ишемии являются изменения формы, размеров, особенностей гистологической окраски как клеток, так и их компонентов. Эти способы достаточно широко представлены в литературе [Коржевский Д.Э. Молекулярная нейроморфология. Нейродегенерация и оценка реакции нервных клеток. Издательство: Спец Лит, 2015; 109 с.]. При использовании этих критериев высока доля субъективной трактовки гистологической картины исследователем.
Из уровня техники известно, что в целях объективизации при гистологическом исследовании определения каких-либо визуализируемых гистологических структур применяются способы использования метрических сеток различной конструкции [Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.; Mayhew Т.М. Basic stereological relationships for quantitative microscopical anatomy - a simple systematic approach // J Anat. - 1979. - Vol. 129. - P. 95-105]. Данные способы трудоемкие и требуют длительного времени. Кроме того, при их использовании невозможно измерить точную площадь сложных структур. Все это приводит к появлению систематических ошибок и затрудняет интерпретацию полученных данных. Кроме того, при использовании решетки в ряде случаев субъективно сложно определять изучаемые объекты, что приводило к различающимся результатам при одинаковой патологии. Особенно это было характерно при изучении отделов мозга с высокой плотностью нейронов, например, зубчатой фасции гиппокампа или мозжечка [Mayhew Т.М. Basic stereological relationships for quantitative microscopical anatomy - a simple systematic approach // J Anat. - 1979. - Vol. 129. - P. 95-105].
Известны способы анализа гистологических изображений с помощью компьютерных программ обработки и анализа оцифрованных гистологических изображений. Ряд исследователей считают маркером ишемии содержание патологически измененных гипер- и гипохромных нейронов на оцифрованных изображениях гистологических препаратов [Коржевский Д.Э. Молекулярная нейроморфология. Нейродегенерация и оценка реакции нервных клеток. Издательство: СпецЛит, 2015; 109 с.]. Но и эти способы не отвечают требованиям сопоставимости результатов (кроме того, необходима оценка степени согласованности альфа-Кронбаха, Каппа) [Боровиков В.П., Боровиков И.П. STATISTICA. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. Издательство: М.: Филинъ, 1998. 608 с.; Landis, Koch. The measurement of observer agreement for categorical data. Biometrics. 1977; 33:159-174; Raykov, Tenko. Coefficient alpha and composite reliability with interrelated nonhomogeneous items Applied Psychological Measurement. 1998; 22(4), 375-385].
Ранее было представлено применение для исследования сложных пространственных структур нервной ткани автоматическое, с помощью программы, построение гистограмм распределения цветных пикселей на изображениях серийных срезов ткани мозга. Определение структурно-функционального состояния клеток, характеризующей окраску (тинкториальные свойства) в норме и при ишемии. Этот подход позволяет проводить объективный, быстрый и точный анализ цветных изображений гистологического препарата, с любым диапазоном оттенков цветов палитры. Используется программа ImageJ 1.46, которая обеспечивает быстрый и качественный анализ размера и состава пикселей графических объектов [Ferreira Т.A. The ImageJ user guide version 1.43 / T.A. Ferreira, W. Rasband. - 2010. http:// rsbweb.nih.gov/ij/docs/user-guide.pdf.; Ho S-Y. NeurphologyJ: An automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery / S-Y. Ho, C-Y. Chao, H-L. Huang et al. // BMC Bioinformatics. - 2011. - V.12. - Р. 1-18]. Однако, сведений о применении этой программы для определения содержания гиперхромных нейронов на препаратах мозга, подвергнутого острой ишемии, не имеется. Слабым местом в рутинной работе патоморфологических отделений, являются гистологические препараты недостаточного качества. Данная проблема может быть решена повышением требований и обучения на рабочем месте препараторов и лаборантов.
Нами разработан способ оценки степени влияния ишемии на нервную ткань при гистологическом исследовании, преимуществами которого являются определение разных состояний гиперхромных нейронов, оценка состояния нормохромных и гипохромных нейронов, качественную и количественную характеристику глии и сосудистого русла, объемное содержание клеточного и межклеточного пространства, а также оценку нейроно-глиального индекса. Данное морфометрическое исследование структуры ткани головного мозга позволит определить долю пространств, занятых патологически измененными нейронами и сведет к минимуму субъективную оценку врача.
При окрашивании гематоксилин-эозином гистологических препаратов (тинкториальные свойства) происходит построение гистограмм распределения цветных пикселей на изображениях серийных срезов ткани мозга после ишемии. С помощью микроскопа Nikon Eclipse 200 делались цифровые микрофотографии зубчатой фасции гиппокампа на различных увеличениях. Далее проводилась обработка цифровых изображений при помощи, нами написанного плагина «Гистограмма», к программе ImageJ 1.46. Процедура включала в себя морфометрическое изучение полученных цветных изображений (Фиг. 1), на которых оригинальное цифровое изображение зубчатой фасции гиппокампа через 1 сутки после острой ишемии: белые стрелки - типичные нормохромные нейроны; черные стрелки - гиперхромные нейроны в гранулярном слое. Окраска гематоксилин-эозином, объекта × 100. Представление составляющих каждого изображения в виде гистограмм распределения пикселей (Фиг. 2), на которой гистограммы пиксельного состава оригинального изображения: одного нормохромного нейрона (а), группы только нормохромных нейронов (б), одного гиперхромного нейрона (в) и группы только гиперхромных нейронов (г). Мы использовали палитровое изображения размером 3780 × 2835 пикселей, расширение tif.
Нами были созданы условия для последующего выделения видимых структур нервной ткани (например, только нейроны) на гистограммах растровых изображений. Затем запускался плагин "Гистограмма", который создавал гистограмму, отражающую палитру и количественное распределение составляющих изображение пикселей. При окраске гематоксилин-эозином выделялись нормохромные и гиперхромные нейроны (Фиг. 1). На гистограммах цветного палитрового изображения нормохромные и гиперхромные нейроны занимали по шкале яркости 0-255 совершенно разные неперекрывающиеся зоны (Фиг. 2). Для тестового изображения (Фиг. 1) пиксели нормохромного нейрона располагались в диапазоне 98-198, мода 160, а гиперхромного - 7-74, мода 29. Это позволяло проводить сравнительное количественное изучение нейронов в полях зрения препарата со смешанным составом клеток, где черные стрелки пиксели гиперхромных нейронов, белые - нормохромных нейронов (Фиг. 3). Таким образом, по палитре 8-битового изображения и распределению пикселей на гистограмме можно точно судить о площади неизмененных (нормохромных) и измененных гиперхромных нейронов, а также о площади пространства между телами нейронов, т.е. межклеточного пространства после ишемии. По данным общего дискриминантного анализа, корректная статистически значимая дискриминация тинкториальных свойств нормохромных и гиперхромных нейронов распределение пикселей в гистограммах) отмечалась на уровне 85-95%.
Найденные особенности представления нормохромных и гиперхромных нейронов на гистограммах палитровых изображений позволили, по соотношению этих клеток между собой, проводить оценку степени влияния ишемии на нервную ткань, измеряя распределение пикселей на палитровой гистограмме. Зная количество и размер пикселей, соответствующих нормохромным и гиперхромным нейронам, можно точно вычислить долю площади нейронов и межклеточного пространства при ишемии и в постишемическом периоде. Следовательно, используя написанный нами плагин "Гистограмма" к программе ImageJ 1.46, появилась возможность оценить степень ишемического воздействия.
Пример
Данный способ был применен при морфометрическом исследовании зубчатой фасции гиппокампа 35 белых крыс, перенесших острую ишемию, и показал высокую эффективность при своем применении.
Использование полученных данных для морфометрического исследования серии полей зрения по 110 полей на группу, зубчатой фасции позволило очень точно показать, что при острой ишемии, вызванной 20-минутной окклюзией общих сонных артерий отмечались очаговые скопления ишемически измененных гиперхромных нейронов. Это сопровождалось статистически значимым уменьшением относительной площади тел нейронов и увеличением площади пространства между телами (таблица). На гистограммах цветного палитрового изображения нормохромные и гиперхромные нейроны занимали по шкале яркости 0-255 совершенно разные неперекрывающиеся зоны. Так в участках гранулярного слоя зубчатой фасции гиппокампа с преобладанием нормохромных нейронов перикарионы занимали 82,5-95,7%, а доля пикселей нормохромного нейрона располагались в диапазоне 98-198, мода 160. В ишемически измененных участках с преобладанием гиперхромных нейронов перикарионы занимали только 48,4-59,5% поля зрения, а доля пикселей гиперхромного нейрона располагались в диапазоне 7-74, мода 29. То есть происходило существенное (статистически значимое) уменьшение доли тел нейронов за счет их дегидратации. При этом нормохромные нейроны превращались в гиперхромные, а общая численная плотность нейронов не изменялась. Способ позволил также оценить ишемически измененные участки со смешанным составам нейронов (Фиг. 3, таблица).
Таким образом, гистограммы палитровых изображений могут быть использованы для морфометрической оценки содержания нормохромных и гиперхромных нейронов нервной ткани по количеству пикселей. Последнее имеет очень большое практическое значение, так как позволяет по тинкториальным свойствам (оттенкам цвета) на гистологических препаратах очень точно определить пространство, занимаемое телам и реактивно измененных и не измененных нейронов в нервной ткани.