РЕАКТИВ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ТРОМБОЦИТОВ, НАБОР РЕАКТИВОВ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ТРОМБОЦИТОВ И СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ТРОМБОЦИТОВ
REAGENT FOR THROMBOCYTE MEASUREMENT, REAGENTS KIT FOR THROMBOCYTE MEASUREMENT AND METHOD FOR THROMBOCYTE MEASUREMENT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к реактиву для измерения тромбоцитов, набору реактивов для измерения тромбоцитов и способу измерения тромбоцитов с их использованием. Более конкретно, настоящее изобретение относится к реактиву для измерения тромбоцитов, содержащему нильский голубой, в частности гидросульфат нильского голубого.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Известны способы, основанные на принципе проточной цитометрии, которые позволяют быстро измерять клетки крови, т.е. лейкоциты, ретикулоциты, эритроциты и т.п.
В качестве одного из таких способов измерения, например, в патенте США №6114173 раскрыт способ подсчета и определения ретикулоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в образцах цельной крови, а также композиция, содержащая реактивы, используемые в этом способе. В частности, ретикулоциты окрашивают смесью реактивов, содержащих катионный краситель, в частности Oxazine 750, и их сигнал светорассеяния и сигнал светопоглощения измеряют с помощью проточной цитометрии. Затем эритроциты и ретикулоциты в образцах крови дифференцируют по различиям в сигналах поглощения, а группу из эритроцитов и ретикулоцитов и тромбоцитов дифференцируют по различиям в сигналах светорассеяния с тем, чтобы определить общее количество клеток каждого вида.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Известно, что фрагментированные эритроциты, липиды и прочее, встречающееся в крови, по размеру похожи на тромбоциты, так что они действуют на измерения как загрязнители. В особенности, образцы, содержащие небольшое количество тромбоцитов, при котором может потребоваться переливание крови, в большей степени подвержены действию этих загрязнителей на измерения. Такая проблема может возникать при осуществлении способа, раскрытого в патенте США №6114173. Однако в патенте США №6114173 не говорится о том, что при измерении тромбоцитов противодействуют какому-либо действию загрязнителей.
Кроме того, красители, которыми можно окрашивать тромбоциты, со временем могут разлагаться в растворе. Измерение тромбоцитов с помощью проточной цитометрии осуществляют посредством обнаружения рассеянного света и флуоресценции, которые возникают при попадании света на клетки, окрашенные красителем в образцах. Однако, когда используют раствор красителя, в котором снижено количество красителя, содержащегося для окрашивания тромбоцитов, нельзя добиться правильного рассеяния света или флуоресценции и нельзя получить точные результаты измерений.
Настоящее изобретение было осуществлено, принимая во внимание вышеупомянутые обстоятельства, и предназначено для того, чтобы предоставить реактив и набор реактивов для измерения тромбоцитов, которые делают возможным измерение тромбоцитов с более высокой точностью, предотвращая действие загрязнителей, которые могут содержаться в образцах, и предотвращают обнаружение тромбоцитов, и которые имеют высокую устойчивость при хранении. Настоящее изобретение также предназначено для того, чтобы предоставить способ измерения тромбоцитов, который делает возможным измерение тромбоцитов с более высокой точностью.
Средства решения проблем
Следовательно, настоящее изобретение относится к реактиву для измерения тромбоцитов, в котором в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов содержится нильский голубой, содержащий гидросульфат-ион в качестве противоиона.
Настоящее изобретение также относится к набору реактивов для измерения тромбоцитов, содержащему:
первый реактив, в котором в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов содержится нильский голубой, содержащий гидросульфат-ион в качестве противоиона, и
второй реактив, содержащий буферное вещество.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу измерения тромбоцитов, включающему стадии:
смешивание первого реактива, который в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов содержит нильский голубой, содержащий гидросульфат-ион в качестве противоиона, и образца с добавлением второго реактива, содержащего буферное вещество, или без добавления второго реактива, чтобы получить образец для измерений;
освещение клеток в полученном образце для измерений, чтобы обнаружить рассеянный свет и флуоресценцию, излучаемую клетками; и
обнаружение тромбоцитов, содержащихся в образце для измерений на основании обнаруженного рассеянного света и флуоресценции.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к реактиву для измерения тромбоцитов, который в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов содержит нильский голубой, содержащий ион неорганической кислоты в качестве противоиона, и кислоту.
Кроме того, настоящее изобретение относится к набору реактивов для измерения тромбоцитов, содержащему:
первый реактив, который содержит, в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов, нильский голубой, содержащий ион неорганической кислоты в качестве противоиона, и кислоту, и
второй реактив, содержащий буферное вещество.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу измерения тромбоцитов, включающему в себя стадии:
смешивание реактива для измерения тромбоцитов, содержащего нильский голубой и кислоту, и образца с добавлением или без добавления второго реактива, содержащего буферное вещество, чтобы получить образец для измерений;
освещение клеток в полученном образце для измерений, чтобы обнаружить рассеянный свет и флуоресценцию, излучаемую клетками; и
обнаружение тромбоцитов, содержащихся в образце для измерений, на основании обнаружения рассеянного света и флуоресценции.
Как применяют в настоящем документе, «нильский голубой» обозначает красители, состоящие из соединения, которое может быть представлено, например, с помощью следующей формулы (II):
-
где X представляет собой анион;
-
-
и находится в форме соли, образованной с противоионом, обозначенным как X. В настоящем описании красители, представленные формулой (II), в которой противоион, обозначенный как X, конкретно не ограничен, называются просто «нильский голубой», а красители, представленные формулой (II), в которых противоион конкретно задан, называются «XXX нильского голубого» (XXX обозначает соль, образуемую конкретным ионом). Например, краситель, содержащий сульфат-ион (1/2 ) в качестве противоиона, называется «сульфат нильского голубого», а краситель, содержащий гидросульфат-ион  в качестве противоиона, называется «гидросульфат нильского голубого».
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
На фиг.1 изображены контейнеры, в которых может содержаться набор реактивов для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению.
На фиг.2 изображен вид спереди схематической конструкции анализатора образцов.
На фиг.3 изображена блочная диаграмма, на которой показана схематическая конструкция анализатора образцов.
На фиг.4 изображена схема расположения, на которой показано устройство блока обнаружения.
На фиг.5 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 9.
На фиг.6 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 10.
На фиг.7 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 11.
На фиг.8 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 12.
На фиг.9 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием красящего реактива в экспериментальном примере 13.
На фиг.10 показаны диаграммы рассеивании, полученные при измерении содержащихся в крови фрагментированных эритроцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 9.
На фиг.11 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении содержащихся в крови липидных частиц с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 9.
На фиг.12 показаны диаграммы рассеивании, полученные при измерении содержащихся в крови фрагментированных эритроцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 10.
На фиг.13 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении содержащихся в крови липидных частиц с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 10.
На фиг.14 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении образцов с использованием реактивов для измерения тромбоцитов в экспериментальных примерах с 14 до 24.
На фиг.15 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении образцов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 25.
На фиг.16 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 45.
На фиг.17 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 46.
На фиг.18 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 47.
На фиг.19 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении тромбоцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 48.
На фиг.20 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении содержащихся в крови фрагментированных эритроцитов с использованием реактива для измерения тромбоцитов в экспериментальном примере 45.
На фиг.21 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении содержащихся в крови липидных частиц с использованием реактива для измерения тромбоцитов из экспериментального примера 45.
ОПИСАНИЕ ОБОЗНАЧЕНИЙ ПОЗИЦИЙ
A Первый контейнер
В Второй контейнер
1 Анализатор образцов
2 Измерительный блок
3 Блок обработки данных
4 Блок управления
5 Блок обнаружения
6 Блок подготовки образцов
7 Интерфейс
8 Блок управления
9 Блок анализа данных
10 Блок вывода
11 Блок ввода
12 Интерфейс
51 Проточная кювета
52 Источник лазерного излучения
53 Линзы для фокусировки луча
54 и 57 Фотодиоды
54a Шторка для луча
54b Усилитель
55 Боковая собирающая линза
56 Дихроическое зеркало
57 Фотодиод
57a и 58b Усилители
58 Фотоумножитель
58a Оптический фильтр
ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Реактив для измерения тромбоцитов
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что тромбоциты можно четко отличать от загрязнителей в крови, таких как компоненты клеток крови, отличные от тромбоцитов, или липидные частицы, используя нильский голубой в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов в способах измерения тромбоцитов с помощью проточной цитометрии.
Кроме того, авторы настоящего изобретения проводили экстенсивные исследования условий для измерения тромбоцитов с использованием нильского голубого и обнаружили, что реактивы для измерения тромбоцитов обладают более высокой устойчивостью при хранении, когда (1) они содержат гидросульфат нильского голубого; или (2) они содержат нильский голубой и кислоту, с тем чтобы выполнить настоящее изобретение.
-
-
В приведенной выше формуле (II) анион (противоион) X включает ион неорганической кислоты, такой как сульфат-ион (1/2 ), хлорид-ион (Cl), гидросульфат-ион , перхлорат-ион .
Вышеупомянутые виды нильского голубого коммерчески доступны и были приобретены, например, в Sigma Aldrich, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Nacalai Tesque, Inc., Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Kishida Chemical Co., Ltd. и т.п.
В частности, гидросульфат нильского голубого приобретали в Wako Pure Chemical Industries, Ltd. и Kishida Chemical Co., Ltd.
Нильский голубой, содержащийся в реактиве для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению (например, гидросульфат нильского голубого), предпочтительно содержится в красящем реактиве в некотором диапазоне концентраций, с тем чтобы получить концентрацию от 0,05 до 5,0 м.д., более предпочтительно от 0,1 до 0,6 м.д., более предпочтительно от 0,2 до 0,5 м.д., когда реактив для измерения тромбоцитов смешивают с образцом. Например, когда реактив для измерения тромбоцитов смешивают с образцом при степени разбавления 1/50, концентрация нильского голубого в реактиве для измерения тромбоцитов предпочтительно составляет от 2,5 до 250 м.д.
Тромбоциты можно более четко отличать от компонентов клеток крови, отличных от тромбоцитов, или загрязнителей, когда нильский голубой присутствует в вышеприведенном диапазоне концентраций.
В том аспекте, в котором реактив для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению содержит нильский голубой и кислоту, кислота может представлять собой или органическую кислоту, или неорганическую кислоту, предпочтительно неорганическую кислоту. Неорганическая кислота включает оксокислоты, такие как серная кислота, фосфорная кислота, перхлорная кислота, и бескислородные кислоты, такие как соляная кислота, фтороводородная кислота, йодистоводородная кислота, бромистоводородная кислота, синильная кислота, гидроизоциановая кислота, сероводород, азотистоводородная кислота.
В вышеупомянутом аспекте реактива для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению кислота содержится в реактиве для измерения тромбоцитов в концентрации, которая равна или ниже молярной концентрации нильского голубого в реактиве для измерения тромбоцитов. В частности, отношение молярных концентраций нильского голубого и кислоты в реактиве для измерения тромбоцитов предпочтительно составляет от 10:1 до 1:1. Когда кислота представляет собой соляную кислоту, отношение молярных концентраций нильского голубого и соляной кислоты предпочтительно составляет от 3:1 до 1:1. Когда кислота представляет собой серную кислоту, отношение молярных концентраций нильского голубого и серной кислоты предпочтительно составляет от 4:1 до 1:1. Используя кислоту в вышеупомянутых концентрациях, снижение концентрации эффективного красящего компонента нильского голубого в реактиве для измерения тромбоцитов со временем можно эффективно предотвратить с тем, чтобы можно было улучшить устойчивость при хранении реактива для измерения тромбоцитов.
В вышеупомянутом аспекте реактива для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению можно использовать любое сочетание нильского голубого и кислоты. Более предпочтительные сочетания:
(A) сульфат нильского голубого и оксокислота или бескислородная кислота;
(B) хлорид нильского голубого и серная кислота; и
(C) гидросульфат нильского голубого и оксокислота или бескислородная кислота.
В другом аспекте реактива для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению, когда нильский голубой представляет собой голубой гидросульфат нильского голубого, в реактиве для измерения тромбоцитов не обязательно должна содержаться кислота. Когда нильский голубой представляет собой гидросульфат нильского голубого, снижение концентрации эффективного красящего компонента нильского голубого в реактиве для измерения тромбоцитов со временем можно эффективно предотвратить без использования кислоты с тем, чтобы можно было улучшить устойчивость при хранении реактива для измерения тромбоцитов.
Следующие две гипотезы можно выдвинуть в отношении вопроса о том, почему реактивы для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению в двух вышеупомянутых аспектах имеют улучшенную устойчивость при хранении.
(1) Предполагается, что нильский голубой обладает высокой стабильностью, когда он присутствует в форме соли гидросульфата.
+
Когда к сульфату нильского голубого добавляют кислоту, протон (H), который образуется при диссоциации кислоты, связывается с  сульфата нильского голубого с образованием , так что  и нильский голубой находятся в равновесии 1:1 и стабилизированы.
Когда нильский голубой представляет собой соль, отличную от вышеупомянутых, можно добавлять серную кислоту, так что , образованный серной кислотой, может стабилизировать нильский голубой.
Таким образом, реактив для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению может представлять собой реактив, содержащий нильский голубой и необязательно кислоту с тем, чтобы в реактиве существовал гидросульфат-ион.
-
(2) Нильский голубой содержит три атома азота в своей диэтиламиногруппе, аминогруппе и феноксазиновой структуре. Среди этих атомов азота атомы азота, отличные от тех, которые образуют соль с противоанионом, обозначенным X в приведенной выше формуле, образуют кислотно-аддитивную соль, так что улучшается стабильность атомов азота и растворимость красителя, а также улучшается стабильность реактива для измерения тромбоцитов.
+
То есть, гидросульфат нильского голубого может образовывать протон (H) и сульфат-ион  в результате диссоциации гидросульфат-иона  Этот протон может связываться с любым атомом азота в нильском голубом и образовывать протонированный атом азота. Предполагается, что этот протонированный атом азота образует межмолекулярную соль с помощью серной кислоты, и таким образом, могут быть улучшены растворимость и стабильность красителя.
Когда кислоту добавляют к нильскому голубому, отличному от соли гидросульфата, предполагается, что протон и анион, образующиеся при диссоциации кислоты, участвуют в образовании межмолекулярных солей нильского голубого, так что растворимость и стабильность красителя могут быть улучшены.
Таким образом, реактив для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению может представлять собой реактив, содержащий нильский голубой и необязательно кислоту, с тем чтобы нильский голубой мог образовать межмолекулярную соль.
Реактив для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению предпочтительно содержит водорастворимый органический растворитель. Водорастворимый органический растворитель конкретно не ограничен при условии, что он может растворять вышеупомянутый нильский голубой и включает протонные растворители, такие как этиленгликоль, диэтиленгликоль, поли(этиленгликоль).
Реактив для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению можно получить растворением вышеупомянутого нильского голубого и, необязательно, кислоты в водорастворимом органическом растворителе при вышеупомянутой желаемой концентрации.
Набор реактивов для измерения тромбоцитов
Вышеупомянутый реактив для измерения тромбоцитов можно комбинировать с реактивом, содержащим буферное вещество для разведения реактива для измерения тромбоцитов, содержащего краситель, чтобы сформировать набор реактивов.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к набору реактивов для измерения тромбоцитов, содержащему:
первый реактив, содержащий гидросульфат нильского голубого, или нильский голубой и кислоту (в дальнейшем в этом документе также обозначаемый как «красящий реактив»); и
второй реактив, содержащий буферное вещество (в дальнейшем в этом документе также обозначаемый как «реактив для разведения»).
Особенности первого реактива совпадают с особенностями, описанными выше для реактива для измерения тромбоцитов.
Буферное вещество, содержащееся во втором реактиве, может быть конкретно не ограничено при условии, что оно сможет удерживать pH второго реактива в желаемом диапазоне и может представлять собой карбоксилаты, фосфаты, Good Buffers, таурин, триэтаноламин, в зависимости от желаемого pH. Буферное вещество предпочтительно содержится в реактиве для разведения с тем, чтобы получить диапазон pH реактива для разведения от 6,0 до 11,0, более предпочтительно от 7,0 до 10,0 и более предпочтительно от 8,0 до 9,5. Когда pH реактива для разведения составляет 6,0 или выше, эритроциты становятся устойчивыми к лизису и можно снизить загрязнение фрагментированными эритроцитами при смешивании реактива для разведения и образца. Когда pH равен 11,0 или ниже, можно снизить неспецифическое окрашивание фрагментированных эритроцитов.
Таким образом, второй реактив предпочтительно представляет собой буфер с pH от 6,0 до 11,0.
В дополнение к буферному веществу, реактив для разведения может содержать другие компоненты, такие как регуляторы осмотического давления, средства для ускорения окрашивания для ускорения окрашивания тромбоцитов нильским голубым.
Регулятором осмотического давления может быть любое соединение при условии, что оно удерживает осмотическое давление реактива для разведения в соответствующем диапазоне и может включать соли щелочных металлов и органических кислот, таких как пропионовая кислота, сахариды, такие как глюкоза, манноза. Также можно использовать галиды щелочных металлов, такие как NaCl, и галиды щелочноземельных металлов. Можно использовать один или несколько регуляторов осмотического давления.
Регулятор осмотического давления предпочтительно содержится в реактиве для разведения для того, чтобы регулировать осмотическое давление реактива для разведения от 150 до 600 мосм/кг и более предпочтительно от 200 до 300 мосм/кг. Регулируя осмотическое давление в пределах вышеуказанного диапазона, осмотическое давление смеси реактивов в наборе реактивов и образце может быть ближе к физиологичесому осмотическому давлению, так что можно предотвратить гемолиз, вызванный гипотоничностью, сдерживать увеличение количества фрагментированных эритроцитов, а измерение тромбоцитов сделать более точным. Когда осмотическое давление реактива для разведения может удерживаться в вышеуказанном диапазоне посредством использования вышеупомянутого буферного вещества, регулятор осмотического давления может не потребоваться.
Средство для ускорения окрашивания может представлять собой любое соединение, которое может увеличивать проницаемость нильского голубого внутрь тромбоцитов, и включает поверхностно-активные вещества, особенно предпочтительны катионные поверхностно-активные вещества.
Предпочтительным катионным поверхностно-активным веществом является вещество, представленное следующей формулой (I):
11
12
13
14
-
где R представляет собой алкильную группу, содержащую от 8 до 12 углеродных атомов; R, R и R являются одинаковыми или отличающимися друг от друга и представляют собой алкильную группу, содержащую от 1 до 6 углеродных атомов; и Y представляет собой анион.
В приведенной выше формуле (I) алкильная группа из R11, содержащая от 8 до 12 углеродных атомов, может быть линейной или разветвленной и включает, например, октил, децил, лаурил, цетил, миристил и прочие подобные группы.
12
13
14
Алкильная группа из R, R и R, содержащая от 1 до 6 углеродных атомов, может быть линейной или разветвленной и включает, например, метил, этил, пропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, гексил и прочие подобные группы. Среди них предпочтительными являются метильная и этильная группы.
-
Анион Y предпочтительно представляет собой ион хлора или брома.
Предпочтительные катионные поверхностно-активные вещества с формулой (I) включают децилтриметиламмоний бромид (DTAB), октилтриметиламмоний бромид (OTAB), лаурилтриметиламмоний хлорид (LTAC), цетилтриметиламмоний хлорид (CTAC), миристилтриметиламмоний бромид (MTAB) и т.п. Можно использовать одно или несколько катионных поверхностно-активных веществ.
Катионное поверхностно-активное вещество предпочтительно содержится в реактиве для разведения в концентрации от 50 до 20000 м.д. В частности, предпочтительная концентрация может зависеть от типа катионного поверхностно-активного вещества и предпочтительно составляет от 500 до 3000 м.д. при использовании DTAB и от 100 до 500 м.д. при использовании LTAC. Когда реактив для разведения содержит катионное поверхностно-активное вещество в такой концентрации, можно предотвратить гемолиз и ускорить окрашивание тромбоцитов при смешивании реактивов из набора реактивов для измерения тромбоцитов и образца.
Реактив для разведения может содержать, в дополнение к вышеупомянутым компонентам, консервант, такой как 2-пиридилтио-1-оксид натрия, β-фенеэтиловый спирт.
Буферное вещество, которое содержится в реактиве для разведения, и другие компоненты, которые необязательно могут содержаться в реактиве для разведения, можно заранее смешивать с красящим реактивом. Однако поскольку нильский голубой, содержащийся в красящем реактиве, может разлагаться под действием воды или щелочных компонентов, то набор реактивов, отдельно содержащий красящий реактив и реактив для разведения, предпочтителен с точки зрения устойчивости при хранении.
Набор реактивов для измерения тромбоцитов согласно настоящему варианту осуществления может содержаться в первом контейнере A для хранения красящего реактива и во втором контейнере В для хранения реактива для разведения, как показано на фиг.1. Когда красящий реактив и реактив для разведения содержатся в раздельных контейнерах, разложение нильского голубого, содержащегося в красящем реактиве, можно предотвратить за счет того, что вода или щелочные компоненты содержатся в реактиве для разведения, так что можно предоставить набор реактивов для измерения тромбоцитов, обладающий более высокой устойчивостью при хранении.
Способ измерения тромбоцитов
Реактив или набор реактивов для измерения тромбоцитов смешивают с образцом, который может содержать тромбоциты, и таким образом окрашивают тромбоциты.
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к способу измерения тромбоцитов посредством использования реактива или набора реактивов для измерения тромбоцитов.
Способ измерения по настоящему изобретению содержит стадии:
смешивание первого реактива, содержащего гидросульфат нильского голубого или нильский голубой и кислоту, с образцом, чтобы получить образец для измерений;
освещение клеток в полученном образце для измерений, чтобы обнаружить рассеянный свет и флуоресценцию, излучаемую клетками; и
обнаружение тромбоцитов, содержащихся в образце для измерений на основании обнаруженного рассеянного света и флуоресценции.
На стадии смешивания первого реактива и образца в вышеупомянутом способе дополнительно можно необязательно примешивать второй реактив, содержащий буферное вещество. Предпочтительно дополнительно примешивать второй реактив.
Особенности первого и второго реактивов совпадают с особенностями, описанными выше для набора реактивов для измерения тромбоцитов.
Образец включает кровь (цельную кровь, обогащенную тромбоцитами плазму (PRP) и т.д.) и жидкий костный мозг, полученные из организмов, в частности из млекопитающих, включая человека. Образец может представлять собой кровь или жидкий костный мозг, разбавленный подходящим раствором, таким как буфер.
Первый реактив и образец предпочтительно смешивают для того, чтобы добиться концентрации нильского голубого в образце для измерений от 0,05 до 5,0 м.д., предпочтительно от 0,1 до 0,6 м.д. и более предпочтительно от 0,2 до 0,5 м.д.
Первый реактив можно разводить вторым реактивом для того, чтобы достичь вышеуказанной концентрации нильского голубого в образце для измерений после смешивания с образцом.
Когда используют второй реактив, первый и второй реактивы и образец предпочтительно смешивают при соотношении объемов (первый реактив + второй реактив): образец = от 100:1 до 1000:1.
Когда используют второй реактив, соотношение объемов первого и второго реактивов предпочтительно составляет от 1:10 до 1:100 и более предпочтительно от 1:20 до 1:75.
Когда на стадии смешивания добавляют второй реактив, порядок смешивания первого реактива, второго реактива и образца конкретно не ограничен.
Стадию смешивания можно осуществлять при температуре приблизительно от 25 до 50°C, более предпочтительно приблизительно от 35 до 45°C.
Время перемешивания предпочтительно составляет от 10 секунд до 5 минут, более предпочтительно от 10 секунд до 2 минут и более предпочтительно от 10 секунд до 60 секунд.
В способе измерения по настоящему изобретению клетки в образце для измерений освещают таким образом, чтобы добиться обнаружения и рассеивания света и флуоресценции, излучаемой клетками.
Устройство для освещения предпочтительно представляет собой проточный цитометр. В проточном цитометре образец для измерений вводят в проточную кювету проточного цитометра и освещают клетки в образце для измерений, проходящем через проточную кювету.
Источник света проточного цитометра конкретно не ограничен и может представлять собой любой источник света, подходящий для возбуждения нильского голубого (например, приблизительно от 600 до 680 нм). Источник света включает, например, красный полупроводниковый лазер и He-Ne лазер. Полупроводниковый лазер можно использовать, поскольку он дешевле, чем газовый лазер.
Рассеянный свет, излучаемый клетками, освещенными в проточном цитометре, может представлять собой или прямой рассеянный свет (угол падения света составляет приблизительно от 0 до 20 градусов), или боковой рассеянный свет (угол падения света составляет приблизительно 90 градусов). Прямой рассеянный свет может представлять собой или прямой рассеянный свет с малым углом (угол падения света составляет приблизительно от 1 до 5 градусов), или прямой рассеянный свет с большим углом (угол падения света составляет приблизительно от 6 до 20 градусов).
Флуоресценцию, излучаемую клетками, освещенными в проточном цитометре, можно обнаружить, выбрав длину волны падающего света, подходящую для нильского голубого (приблизительно от 630 до 680 нм).
На основании рассеянного света и флуоресценции, полученных как описано выше, получают диаграмму рассеивания для того, чтобы обнаружить тромбоциты путем дифференцирования тромбоцитов от загрязнителей, таких как компоненты клеток крови, отличные от тромбоцитов, липидные частицы. Также можно посчитать обнаруженные таким образом тромбоциты. Обнаружение и/или подсчет тромбоцитов предпочтительно осуществляют при помощи подходящего аналитического программного обеспечения.
Далее будет описано измерение тромбоцитов, используя анализатор образцов, оснащенный проточным цитометром, со ссылками на приложенные фигуры.
На фиг.2 изображен вид спереди схематической конструкции анализатора образцов. Анализатор образцов 1 представляет собой устройство, используемое, например, для гематологических тестов, и в общих чертах оно состоит из измерительного блока 2 и блока обработки данных 3. В измерительном блоке 2 измеряют определенные компоненты, содержащиеся в образце крови, а блок обработки данных 3 принимает данные об измерении для того, чтобы осуществлять аналитическую обработку.
На фиг.3 изображена блочная диаграмма, на которой показана схематическая конструкция анализатора образцов 1. Как показано на фиг.3, измерительный блок 2 содержит блок управления 4 управления работой соответствующих блоков; блок обнаружения 5 оснащен проточным цитометром для обнаружения частиц, подлежащих анализу в образце; блок подготовки образцов 6 для получения образца для измерений и предоставления подготовленного образца для измерений в блок обнаружения 5; и интерфейс 7 для передачи данных из блока обработки данных 3. Блок обработки данных 3 содержит блок управления 8 для управления работой соответствующих блоков; блок анализа данных 9 для анализа обнаруженных данных, принятых от измерительного блока 2; блок вывода 10, который отображает результаты анализа из блока анализа данных 9 в виде диаграмм рассеивания; блок ввода 11, который воспринимает команды оператора; и интерфейс 12 для передачи данных из измерительного блока 2.
Далее будет описано устройство блока обнаружения 5, оснащенного проточным цитометром, со ссылками на фиг.4. На фиг.4 изображена схема расположения, на которой показано устройство блока обнаружения. В блоке обнаружения 5 предусмотрен полупроводниковый источник лазерного излучения 52 для того, чтобы испускать лазерный луч в направлении проточной кюветы 51. Между полупроводниковым источником лазерного излучения 52 и проточной кюветой 51 предусмотрены линзы для фокусировки луча 53, состоящие из нескольких линз. На световой оси, проходящей линейно от полупроводникового источника лазерного излучения 52, предусмотрена шторка для луча 54a так, чтобы располагаться за проточной кюветой 51 напротив линз для фокусировки луча 53, так что прямому свету от полупроводникового источника лазерного излучения 52 препятствует шторка для луча 54a. Далее по ходу световой оси за шторкой для луча 54a предусмотрен фотодиод 54.
Когда образец для измерений проходит через проточную кювету 51, сигналы рассеянного света и флуоресценции образуются благодаря лазерному лучу. Из этих сигналов прямой световой сигнал испускается в направлении фотодиода 54. Наряду с лучами света, которые идут вдоль световой оси, линейно распространяющимися от полупроводникового источника лазерного излучения 52, прямому свету от полупроводникового источника лазерного излучения 52 препятствует шторка для луча 54a, и на фотодиод 54 в основном падает рассеянный свет, который идет от источника света (в дальнейшем в этом документе обозначается как «прямой рассеянный свет»). Прямой рассеянный свет, испускаемый из проточной кюветы 51, подвергается фотоэлектрическому преобразованию в фотодиоде 54, и, таким образом, образовавшийся электрический сигнал (в дальнейшем в этом документе обозначается как «прямой сигнал светорассеяния») усиливается в усилителе 54b. Прямой сигнал светорассеяния передается в блок управления 4, а затем передается в блок обработки данных 3 через интерфейс 7 и обрабатывается в блоке анализа данных 9 блока обработки данных 3.
Такой прямой сигнал светорассеяния отражает размер обнаруживаемых частиц. При помощи обработки прямого сигнала светорассеяния в блоке анализа данных 9 получают размеры обнаруженных частиц.
В направлении, которое под прямым углом пересекается со световой осью, которая линейно идет от полупроводникового источника лазерного излучения 52 к фотодиоду 54, предусмотрена боковая собирающая линза 55 для того, чтобы с помощью боковой собирающей линзы 55 собирать боковой свет, который образуется, когда полупроводниковым лазером освещают подлежащие обнаружению частицы, проходящие через проточную кювету 51 (свет, который испускается в направлении под прямым углом к световой оси). Далее по ходу, за боковой собирающей линзой 55, в направлении бокового света, предусмотрено дихроическое зеркало 56 для того, чтобы делить световой сигнал, поступающий от боковой собирающей линзы 55, на компоненту рассеянного света и флуоресцентную компоненту. Сбоку от дихроического зеркала 56 (в направлении, которое пересекает световую ось, соединяющую боковую собирающую линзу 55 и дихроическое зеркало 56) предусмотрен фотодиод 57, на который падает боковой рассеянный свет, и далее по ходу световой оси, за дихроическим зеркалом 56, предусмотрен оптический фильтр 58a и фотоумножитель 58. Боковая компонента рассеянного света, отделенная дихроическим зеркалом 56, подвергается фотоэлектрическому преобразованию в фотодиоде 57, и, таким образом, образующийся электрический (в дальнейшем в этом документе обозначается как «боковой сигнал светорассеяния») усиливается в усилителе 57a. Боковой сигнал светорассеяния подается в блок управления 4, а затем подается в блок обработки данных 3 через интерфейс 7 и обрабатывается в блоке анализа данных 9 блока обработки данных 3.
Сигнал бокового светорассеяния отражает внутреннюю информацию об обнаруженных частицах (например, размер ядра лейкоцита и т.п.). Обрабатывая сигнал бокового светорассеяния в блоке анализа данных 9, получают размер ядра лейкоцитов и т.п.
Боковая флуоресцентная компонента испускается дихроическим зеркалом 56, выбранным в зависимости от длины волны, в оптический фильтр 58a и подвергается фотоэлектрическому преобразованию в фотоумножителе 58. Таким образом, образованный электрический сигнал (сигнал боковой флуоресценции) усиливается в усилителе 58b. Сигнал боковой флуоресценции подается в блок управления 4, а затем подается в блок обработки данных 3 через интерфейс и обрабатывается в блоке анализа данных 9 блока обработки данных 3.
Сигнал боковой флуоресценции отражает информацию о степени окрашивания обнаруженных частиц. Обрабатывая сигнал боковой флуоресценции в блоке анализа данных 9, получают степень окрашивания обнаруженных частиц.
Блок анализа данных 9 блока обработки данных 3 может анализировать полученный таким образом сигнал прямого светорассеяния, сигнал бокового светорассеяния и сигнал флуоресценции, чтобы обнаружить подлежащие обнаружению частицы, и, кроме того, может считать обнаруженные частицы. Кроме того, блок анализа данных 9 создает диаграммы рассеивания на основании результатов анализа сигнала прямого светорассеяния, сигнал бокового светорассеяния и сигнала флуоресценции. Созданная диаграмма рассеивании отображается в блоке вывода 10.
Используя такой анализатор образцов, можно измерять тромбоциты.
Сначала в блоке подготовки образцов 6 образец смешивается с реактивом для измерения тромбоцитов или с реактивами, содержащимися в наборе реактивов для измерения тромбоцитов, чтобы получить образец для измерений. Подлежащие использованию реактив и набор реактивов для измерения тромбоцитов могут представлять собой реактив и набор реактивов для измерения тромбоцитов, описанные выше. В реактиве для измерения тромбоцитов или в красящем реактиве набора реактивов для измерения тромбоцитов содержится нильский голубой, так что тромбоциты, содержащиеся в образце, окрашиваются нильским голубым.
В блоке подготовки образцов 6 образец для измерений предпочтительно подготавливается посредством смешивания образца и реактива для измерения тромбоцитов или реактивов, содержащихся в наборе реактивов для измерения тромбоцитов, для того, чтобы достичь концентрации нильского голубого в образце для измерений, равной от 0,05 до 5,0 м.д. (от 0,00014 до 0,014 ммоль/л), предпочтительно от 0,1 до 0,6 м.д., более предпочтительно от 0,2 до 0,5 м.д. Температура реакции и время подготовки образца для измерений предпочтительно соответствуют вышеописанным значениям температуры реакции и времени для реактива для измерения тромбоцитов.
Образец для измерений, подготовленный в блоке подготовки образцов 6, затем поступает в блок обнаружения 5. В блоке обнаружения 5 образец для измерений вводится в проточную кювету 51 проточного цитометра, а лазерный луч из полупроводникового источника лазерного излучения 52 освещает подлежащие обнаружению частицы в образце для измерений. Сигнал прямого светорассеяния, сигнал бокового светорассеяния и сигнал флуоресценции, полученные посредством освещения частиц лазерным лучом, обрабатываются в блоке анализа данных 9 блока обработки данных 3.
В блоке анализа данных 9 тромбоциты в образце для измерений четко дифференцируются от других компонентов, таких как фрагментированные эритроциты или липидные частицы, содержащиеся в образце, на основании сигнала прямого светорассеяния и сигнала флуоресценции. В блоке анализа данных 9 также может происходить подсчет обнаруженных таким образом тромбоцитов. Для того, чтобы обнаружить и подсчитать тромбоциты на основании сигнала прямого светорассеяния и сигнала флуоресценции, обработка сигнала в блоке анализа данных 9 предпочтительно осуществляется посредством использования соответствующего аналитического программного обеспечения.
Выше приведено устройство, в котором тромбоциты обнаруживаются на основании сигнала прямого светорассеяния и сигнала флуоресценции. Однако можно использовать другие устройства, такие как те, в которых тромбоциты обнаруживаются на основании сигнала бокового светорассеяния и сигнала флуоресценции.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно. Однако эти примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Экспериментальные примеры 1-8: устойчивость при хранении реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих гидросульфат нильского голубого
Для того чтобы продемонстрировать устойчивость при хранении красящего реактива, получали реактивы для измерения тромбоцитов (красящие реактивы), которые содержат нильский голубой, которые содержали нильский голубой, указанный в таблице 1, в концентрациях, указанных в таблице 1, и измеряли оптическую плотность, параметр, отражающий концентрацию эффективного красящего компонента нильского голубого в красящих реактивах для того, чтобы оценить устойчивость при хранении нильского голубого в красящих реактивах.
Реактивы для измерения тромбоцитов:
Краситель
В концентрации, указанной в таблице 1
Этилен гликоль
5 мл
Таблица 1
Экспериментальные примеры
Краситель
Концентрация
1
гидросульфат нильского голубого (гидросульфат нильского голубого, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
18,4 м.д.
2
гидросульфат нильского голубого (гидросульфат нильского голубого, Kishida Chemical Co., Ltd.)
18,4 м.д.
3
сульфат нильского голубого (сульфатная соль нильского голубого, Sigma)
16,0 м.д.
4
сульфат нильского голубого (нильский голубой, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
16,0 м.д.
5
сульфат нильского голубого (сульфат нильского голубого, Nacalai Tesque, Inc.)
16,0 м.д.
6
сульфат нильского голубого (нильский голубой A, Nacalai Tesque, Inc.)
16,0 м.д.
7
хлорид нильского голубого (хлорид нильского голубого, Kishida Chemical Co., Ltd.)
16,0 м.д.
8
сульфат нильского голубого (нильский голубой A, Kishida Chemical Co., Ltd.)
16,0 м.д.
Полученные красящие реактивы разводили этанолом в соотношении 1/10 и с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность каждого красящего реактива при длине волны 630 нм, около которой находится максимум в спектре поглощения красителя. При осуществлении измерения оптической плотности этанол использовали в качестве эталона. Оптическую плотность разведенных реактивов измеряли после 2, 4 и 7 месяцев хранения при 45°C и вычисляли скорости изменения оптической плотности. Результаты измерений оптической плотности и скоростей изменения оптической плотности приведены в таблицах 2-1 и 2-2, соответственно.
«Скорость изменения оптической плотности» обозначает скорость измерения оптической плотности в процентах, вычисленную с использованием значения максимальной измеренной оптической плотности в качестве эталонного значения для всех значений оптической плотности, полученных для соответствующего экспериментального примера.
Таблица 2-1
Экспериментальный пример
Сразу после разведения
через 2 месяца
через 4 месяца
через 7 месяцев
1
0,3223
0,3141
0,3063
0,3001
2
0,3369
0,3250
0,3138
0,2799
3
0,3316
0,2919
0,2583
0,2285
4
0,3297
0,2803
0,2484
0,2178
5
0,3217
0,2729
0,2441
0,2117
6
0,3248
0,2790
0,2443
0,2119
7
0,3184
0,2696
0,2335
0,2023
8
0,3319
0,2825
0,2426
0,2234
Таблица 2-2
Экспериментальный пример
Сразу после разведения
через 2 месяца
через 4 месяца
через 7 месяцев
1
0,0%
-2,5%
-5,0%
-6,9%
2
0,0%
-3,5%
-6,9%
-16,9%
3
0,0%
-12,0%
-22,1%
-31,1%
4
0,0%
-15,0%
-24,7%
-33,9%
5
0,0%
-15,2%
-24,1%
-34,2%
6
0,0%
-14,1%
-24,8%
-35,0%
7
0,0%
-15,3%
-26,7%
-36,5%
8
0,0%
-14,9%
-26,9%
-32,7%
Как показано в таблице 2-2, снижение оптической плотности красящего реактива в экспериментальном примере 1, в котором в качестве красителя содержался гидросульфат нильского голубого, составило 2,5%, 5,0% и 6,9% после 2 месяцев, 4 месяцев и 7 месяцев, соответственно. Снижение оптической плотности красящего реактива в экспериментальном примере 2, в котором также в качестве красителя содержался гидросульфат нильского голубого, составило 3,5%, 6,9% и 16,9% после 2 месяцев, 4 месяцев и 7 месяцев, соответственно.
С другой стороны, оптическая плотность красящих реактивов из экспериментальных примеров 3-8, в которых содержался нильский голубой, содержащий противоионы, отличные от гидросульфат-иона, снижалась более чем на 10%, более чем на 20% и более чем на 30% после 2 месяцев, 4 месяцев и 7 месяцев, соответственно.
При сравнении с этими экспериментальными примерами 3-8 было обнаружено, что красящие реактивы, которые содержат нильский голубой, содержащий гидросульфат-ион в противоиона, проявляют меньшее снижение оптической плотности со временем и более высокую устойчивость при хранении по сравнению с красящими реактивами, которые содержат нильский голубой, содержащий противоионы, отличающиеся от гидросульфат-иона.
Экспериментальные примеры 9-13: Способность реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих гидросульфат нильского голубого, к окрашиванию тромбоцитов
Следующие эксперименты осуществляли для того, чтобы продемонстрировать способность реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих гидросульфат нильского голубого, к окрашиванию тромбоцитов.
Изготавливали наборы реактивов, состоящие из красящих реактивов, содержащих следующие композиции, и реактивов для разведения.
(1) Красящие реактивы
Красители для окрашивания
В концентрации тромбоцитов, приведенной в Таблице 3
Этилен гликоль
1 л
(2) Реактив для разведения
Трицин (буферное вещество)
1,8 г
Лаурилтриметиламмоний хлорид (LTAC)
0,15 г
Очищенная вода
1 л
(pH доводили до 9,0, а осмотическое давление до 200 мосм/кг H<sub>2</sub>O)
Использованные красители для измерения тромбоцитов приведены в таблице 3 в концентрациях, приведенных в таблице 3. Конечные концентрации красителей после смешивания реактивов с образцом приведены в скобках.
Химические формулы красителей приведены в таблице 3.
Реактив для разведения (аликвоты 1 мл) в пробирках нагревали на водяной бане при 40°C. К реактиву для разведения добавляли 20 мкл красящего реактива и 5 мкл цельной крови здорового человека в качестве образца, и реакцию осуществляли при 40°C в течение 25 секунд, чтобы подготовить образцы для измерений. Образцы для измерений вводили в блок обнаружения проточного цитометра, оснащенного источником света, испускающим свет с длиной волны 633 нм, клетки в образцах для измерений освещали возбуждающим светом, обнаруживали сигнал светорассеяния и сигнал флуоресценции, излучаемые клетками, полученные сигналы анализировали и измеряли тромбоциты в образцах для измерений. Подготовку образцов для измерений и измерение тромбоцитов с помощью проточного цитометра осуществляли в гематологическом анализаторе XE-2100 (Sysmex Corporation). Выходную мощность источника света гематологического анализатора модифицировали до 9 Вт при нормальной мощности 3 Вт.
Таблица 3
Краситель
Конц.
Структура
Результаты
Пр.9
Гидросульфат нильского голубого A (Wako Pure Chemicals)
18,4 м.д. (0,3 м.д.)
<img file="00000013.tif" he="15" wi="38" img-content="undefined" img-format="tif" />
Достаточное окрашивание тромбоцитов
Пр.10
Гидросульфат нильского голубого A (Kishida Chemical)
18,4 м.д. (0,3 м.д.)
<img file="00000013.tif" he="15" wi="38" img-content="undefined" img-format="tif" />
Достаточное окрашивание тромбоцитов
Пр.11
Метиленовый синий NNX (Sigma)
102,5 м.д. (2 м.д.)
<img file="00000014.tif" he="12" wi="34" img-content="undefined" img-format="tif" />
Недостаточноеокрашиваниетромбоцитов
Пр.12
Крезил-виолет ацетат (Sigma)
1025 м.д. (20 м.д.)
<img file="00000015.tif" he="15" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
Окрашивание отсутствует
Пр.13
Основной зеленый 5 (Tokyo Chemical Industry)
1025 м.д. (20 м.д.)
<img file="00000016.tif" he="12" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
Недостаточное окрашивание тромбоцитов
Диаграммы рассеивания, полученные в экспериментальных примерах 9-13, приведены на фиг.5-9, соответственно. На каждой фигуре (a) представляет собой диаграмму рассеивания, на которой по оси y отложена интенсивность прямого рассеянного света, а по оси x отложена интенсивность флуоресценции, и (b) представляет собой диаграмму рассеивания, на которой ось y диаграммы рассеивания (a) переведена в логарифмическую шкалу. На (b) область, в которой появляются тромбоциты, показана сплошной линией. Результаты измерений из экспериментальных примеров приведены в таблице 3.
Как показано на фиг.5-9, когда в экспериментальных примерах 9 и 10 использовали краситель, который содержал гидросульфат нильского голубого в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов, тромбоциты окрашивались в достаточной степени по сравнению с экспериментальными примерами 11-13, в которых содержались красители, отличные от нильского голубого, так что тромбоциты могут быть обнаружены в области с более высокой интенсивностью флуоресценции.
Таким образом, когда гидросульфат нильского голубого использовали в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов, тромбоциты можно было измерять при более четкой дифференциации от других компонентов клеток крови.
Затем проверяли, могут ли тромбоциты избирательно окрашиваться при использовании красящих реактивов из экспериментальных примеров 9 и 10, содержащих гидросульфат нильского голубого, даже когда кровь содержит загрязнители, такие как липидные частицы.
Измерение тромбоцитов в крови, содержащей фрагментированные эритроциты, и в крови, содержащей липидные частицы, осуществляли с использованием красящих реактивов из экспериментальных примеров 9 и 10. Экспериментальные процедуры соответствовали описанным выше, за исключением того, что вместо цельной крови здорового человека использовали кровь, содержащую фрагментированные эритроциты, и кровь, содержащую липидные частицы.
Диаграммы рассеивания, полученные в результате измерений крови, содержащей фрагментированные эритроциты, и крови, содержащей липидные частицы, с использованием красящего реактива из экспериментального примера 9, приведены на фиг.10 и 11. Диаграммы рассеивания, полученные в результате измерений крови, содержащей фрагментированные эритроциты, и крови, содержащей липидные частицы, с использованием красящего реактива из экспериментального примера 10 приведены на фиг.12 и 13. На каждой фигуре (a) представляет собой диаграмму рассеивания, на которой по оси y отложена интенсивность прямого рассеянного света, а по оси x интенсивность флуоресценции, (b) представляет собой диаграмму рассеивания, на которой ось y диаграммы рассеивания (a) переведена в логарифмическую шкалу, и (c) представляет собой увеличенную область, в которой появляются тромбоциты на (b). На (c) область, в которой появляются тромбоциты, показана сплошной линией.
На фиг.10-13 результаты показывают, что красящие реактивы из экспериментальных примеров 9 и 10 могут избирательно окрашивать тромбоциты при четкой дифференциации от фрагментированных эритроцитов или липидных частиц в крови. Таким образом, когда для окрашивания тромбоцитов используют гидросульфат нильского голубого, тромбоциты можно измерять при четком отличии от других компонентов клеток крови, даже когда кровь содержит загрязнители, такие как фрагментированные эритроциты или липидные частицы.
Согласно экспериментальным примерам 1 и 2, показано, что красящие реактивы, содержащие гидросульфат нильского голубого, обладают меньшим снижением оптической плотности со временем и более высокой устойчивостью при хранении. Кроме того, экспериментальные примеры 9 и 10 показывают, что гидросульфат нильского голубого, в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов, может избирательно окрашивать тромбоциты в крови, и это дает возможность осуществления точных измерений тромбоцитов, даже когда кровь содержит загрязнители, такие как фрагментированные эритроциты или липидные частицы.
Экспериментальные примеры 14-24: Способность реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих гидросульфат нильского голубого, к окрашиванию тромбоцитов при различных концентрациях
Изготавливали красящие реактивы, содержащие гидросульфат нильского голубого (Merck Co.) в этиленгликоле в концентрациях, указанных в таблице 4.
Полученные красящие реактивы объединяли с реактивом для разведения, описанным в экспериментальных примерах 9-13, чтобы измерить тромбоциты в следующих образцах: цельная кровь здорового человека, кровь, содержащая фрагментированные эритроциты, и кровь, содержащая липидные частицы, подобно экспериментальным примерами 9-13.
Таблица 4
Экспериментальный пример
Концентрация красителя в красящем реактиве (мг/л)
Конечная концентрация красителя в смеси реактивов и образца (мг/л)
14
6,0
0,12
15
8,0
0,16
16
9,1
0,18
17
12,5
0,24
18
15,0
0,29
19
16,6
0,32
20
18,3
0,36
21
20,3
0,40
22
22,5
0,44
23
25,5
0,50
24
29,3
0,57
Полученные диаграммы рассеивания приведены на фиг.14.
На фиг.14 результаты показывают, что тромбоциты в достаточной мере поддавались измерению при использовании гидросульфата нильского голубого при всех протестированных концентрациях.
Среди них тромбоциты можно было более четко отделить от других компонентов клеток крови и загрязнителей, когда образец, кровь, содержащую фрагментированные эритроциты, тестировали с реактивами для измерения тромбоцитов из экспериментальных примеров 17-22 (конечная концентрация гидросульфата нильского голубого: от 0,24 до 0,44 мг/л).
Экспериментальный пример 25: Устойчивость при хранении реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих гидросульфат нильского голубого
Изготавливали красящий реактив, содержащий 14,4 м.д. гидросульфата нильского голубого (Merck Co.) в этиленгликоле. Красящий реактив хранили при температурном режиме 45°C в течение 16 недель и использовали для измерения образцов.
Использованные образцы представляли собой кровь, взятую у здорового человека, кровь с низким содержанием тромбоцитов, кровь, содержащую искусственный липид, и кровь, содержащую фрагментированные эритроциты. Тромбоциты измеряли как описано в экспериментальных примерах 9-13.
Полученные диаграммы рассеивания приведены на фиг.15.
Диаграммы рассеивания на фиг.15 указывают на то, что можно измерять тромбоциты при четком отличии от загрязнителей во всех образцах.
Эти результаты показывают, что когда в качестве красителя для окрашивания тромбоцитов используется гидросульфат нильского голубого, тромбоциты можно точно измерять при небольшом влиянии загрязнителей, даже когда красящий реактив хранится при неблагоприятных для красителя условиях.
Изменение концентрации красителя в ходе хранения при вышеупомянутых условиях исследовали с помощью следующих экспериментов.
Оптическую плотность измеряли, как описано в экспериментальных примерах 1-8, за исключением того, что только что изготовленный красящий реактив и красящий реактив после 16 недель хранения разводили этанолом в соотношении 1/10 и измеряли оптическую плотность при 628 нм. На основании скорости уменьшения измеряемой оптической плотности, вычисляли концентрацию красителя в красящем реактиве после 16 недель хранения. Результаты приведены в следующей таблице 5.
Таблица 5
Сразу после изготовления
После 16 недель хранения
Оптическая плотность
0,288
0,262
Скорость уменьшения (%)
0,00%
-9,03%
Концентрация красителя (м.д.)
14,40
13,10
Как показано в таблице 5, вычисленная концентрация красителя в неразведенном растворе после 16 недель хранения составляла 13,1 м.д. Следовательно, было показано, что подходящая концентрация красителя для измерения тромбоцитов может сохраняться даже после хранения при вышеуказанных условиях.
Экспериментальные примеры 26-29: Устойчивость при хранении реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих нильский голубой и кислоту
Эксперименты осуществляли для того, чтобы исследовать устойчивость при хранении растворов нильского голубого, содержащих соляную кислоту или гидроксид натрия. Устойчивость при хранении растворов нильского голубого оценивали путем измерения оптической плотности, которая является параметром, отражающим концентрацию эффективного красящего компонента нильского голубого в растворе.
В следующем описании «скорость изменения оптической плотности» обозначает скорость изменения оптической плотности в процентах, вычисленную при использовании значения максимальной измеренной оптической плотности в качестве эталонного значения среди всех значений, полученных в соответствующем экспериментальном примере.
В настоящих экспериментальных примерах использовали нильский голубой, содержащий сульфат-ион в качестве противоиона (нильский голубой A, Sigma). Этот раствор нильского голубого растворяли в этиленгликоле при концентрации 0,02 ммоль/л, чтобы изготовить раствор нильского голубого (Сравнительный пример 1).
К 5 мл раствора нильского голубого добавляли следующее вещество в следующей концентрации, чтобы осуществить экспериментальные примеры с 26 до 29.
Экспериментальный пример
26
Соляная кислота
2 ммоль/л
27
Соляная кислота
0,02 ммоль/л
28
Гидроксид натрия
2 ммоль/л
29
Гидроксид натрия
0,02 ммоль/л
Каждый раствор разводили этанолом в соотношении 1/5 и с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность каждого раствора при длине волны 630 нм, около которой находится максимум в спектре поглощения красителя. Разведенные растворы хранили при температурном режиме 60°C и измеряли оптическую плотность через 2 недели и через 4 недели после разбавления, чтобы вычислить скорость изменения оптической плотности. При измерении оптической плотности этанол использовали в качестве контроля. Результаты измерения оптической плотности и скорости изменения оптической плотности приведены в таблицах 6-1 и 6-2, соответственно.
Таблица 6-1
Сразу после изготовления
После 2 недель
После 4 недель
Сравнительный пример 1
0,5158
0,5033
0,4306
Экспериментальный пример
26 (HCl 2 мМ)
0,5388
0,0800
0,0055
27 (HCl 0,02 мМ)
0,5319
0,5286
0,4741
28 (NaOH 2 мМ)
0,0065
0,0017
0,0047
29 (NaOH 0,02 мМ)
0,4948
0,4721
0,3825
Таблица 6-2
Сразу после изготовления
После 2 недель
После 4 недель
Сравнительный пример 1
0,0%
-2,4%
-16,5%
Экспериментальный пример
26 (HCl 2 мМ)
0,0%
-85,2%
-99,0%
27 (HCl 0,02 мМ)
0,0%
-0,6%
-10,9%
28 (NaOH 2 мМ)
0,0%
-73,8%
-27,7%
29 (NaOH 0,02 мМ)
0,0%
-4,6%
-22,7%
Как показано в таблице 6-1, начальная оптическая плотность в сравнительном примере 1 составляла 0,5158, в котором не добавляли соляную кислоту или гидроксид натрия. Скорости изменения оптической плотности в сравнительном примере 1 составляли, как показано в таблице 6-2, -2,4% и -16,5% через 2 и 4 недели после изготовления, соответственно.
Начальные оптические плотности в экспериментальных примерах 26 и 27, содержащих соляную кислоту, составляли, как показано в таблице 6-1, 0,5388 и 0,5319, соответственно, и эти значения значительно не отличались от начальной оптической плотности из сравнительного примера 1.
Скорости изменения оптической плотности в экспериментальном примере 26, содержащем соляную кислоту в концентрации 2 ммоль/л, составляли -85,2% и -99,0% через 2 и 4 недели, показывая значительное снижение оптической плотности со временем по сравнению со сравнительным примером 1. Это указывает на то, что устойчивость при хранении растворов нильского голубого была снижена.
С другой стороны, скорости изменения оптической плотности в экспериментальном примере 27, содержащем соляную кислоту в концентрации 0,02 ммоль/л, составляли -0,6% и -10,9% через 2 и 4 недели, указывая на то, что снижение оптической плотности со временем было умеренным по сравнению со сравнительным примером 1. Это указывает на то, что устойчивость при хранении растворов нильского голубого была улучшена.
Начальные оптические плотности экспериментальных примеров 28 и 29, содержащих гидроксид натрия, составляли, как показано в таблице 6-1, 0,0065 и 0,4948, соответственно, указывая на то, что начальная оптическая плотность была снижена по сравнению со сравнительным примером 1.
Скорости изменения оптической плотности в экспериментальных примерах 28 и 29 составляли, как показано в таблице 6-2, ниже -20% через 4 недели после изготовления, что указывает на значительное снижение оптической плотности со временем. Это указывает на то, что устойчивость при хранении растворов нильского голубого была снижена.
Эти экспериментальные результаты показывают, что добавление соляной кислоты в определенной концентрации к растворам нильского голубого может улучшить устойчивость при хранении растворов нильского голубого.
Экспериментальные примеры 30-36: Влияние соотношения молярных концентраций нильского голубого и соляной кислоты на устойчивость при хранении реактивов для измерения тромбоцитов
Обнаружено, что устойчивость при хранении растворов нильского голубого улучшается при добавлении соляной кислоты в определенной концентрации, на основании экспериментальных примеров 26-29.
Предполагается, что снижение устойчивости при хранении растворов нильского голубого, а именно снижение концентрации эффективного красящего компонента нильского голубого, происходит из-за разложения эффективного красящего компонента, так что следует исследовать, в какой концентрации следует добавлять соляную кислоту в растворы по отношению к числу молекул нильского голубого.
Таким образом, в настоящих экспериментальных примерах исследовали связь между соотношением нильского голубого и соляной кислоты (соотношение молярных концентраций) и устойчивостью при хранении растворов нильского голубого, меняя соотношение соляной кислоты и нильского голубого (соотношение молярных концентраций) в растворах нильского голубого.
Устойчивость при хранении растворов нильского голубого исследовали путем оценки оптической плотности растворов нильского голубого, подобно экспериментальным примерам 26-29.
Подобно экспериментальным примерам 26-29, нильский голубой A (Sigma) растворяли в этиленгликоле в концентрации 0,02 ммоль/л, чтобы получить раствор нильского голубого (сравнительный пример 2).
К 5 мл раствора нильского голубого добавляли соляную кислоту в следующей концентрации, чтобы осуществить экспериментальные примеры 30-36. Соотношения молярных концентраций нильского голубого и соляной кислоты в растворах указаны в скобках.
Экспериментальный пример
30
Соляная кислота
0,002 ммоль/л (10:1)
31
Соляная кислота
0,006 ммоль/л (3:1)
32
Соляная кислота
0,02 ммоль/л (1:1)
33
Соляная кислота
0,06 ммоль/л (1:3)
34
Соляная кислота
0,2 ммоль/л (1:10)
35
Соляная кислота
0,6 ммоль/л (1:30)
36
Соляная кислота
2 ммоль/л (1:100)
Полученные растворы красителя разводили этанолом в соотношении 1/20 и с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность каждого раствора при длине волны 630 нм, около которой находится максимум в спектре поглощения красителя. Растворы красителя хранили при температурном режиме 45°C и измеряли оптическую плотность через 4 недели, 9 недель и 18 недель после изготовления, чтобы вычислить скорость изменения оптической плотности. При измерении оптической плотности этанол использовали в качестве контроля.
Результаты измерения оптической плотности и скорости изменения оптической плотности приведены в таблицах 7-1 и 7-2, соответственно.
Таблица 7-1
Сразу после изготовления
После 4 недель
После 9 недель
После 18 недель
Сравнительный пример 2
0,1342
0,1208
0,1174
0,0986
Экспериментальный пример
30 (HCl 0,002 мМ)
0,1369
0,1246
0,1225
0,1051
31 (HCl 0,006 мМ)
0,1371
0,1277
0,1244
0,1084
32 (HCl 0,02 мМ)
0,1380
0,1303
0,1308
0,1148
33 (HCl 0,06 мМ)
0,1381
0,1211
0,0838
0,0245
34 (HCl 0,2 мМ)
0,1394
0,0255
0,0001
0,0000
35 (HCl 0,6 мМ)
0,1399
0,0282
0,0006
0,0000
36 (HCl 2 мМ)
0,1399
0,0466
0,0014
0,0000
Таблица 7-2
Сразу после изготовления
После 4 недель
После 9 недель
После 18 недель
Сравнительный пример 2
0,0%
-10,0%
-12,5%
-26,5%
Экспериментальный пример
30 (HCl 0,002 мМ)
0,0%
-9,0%
-10,5%
-23,2%
31 (HCl 0,006 мМ)
0,0%
-6,9%
-9,3%
-20,9%
32 (HCl 0,02 мМ)
0,0%
-5,6%
-5,2%
-16,8%
33 (HCl 0,06 мМ)
0,0%
-12,3%
-39,3%
-82,3%
34 (HCl 0,2 мМ)
0,0%
-81,7%
-99,9%
-100,0%
35 (HCl 0,6 мМ)
0,0%
-79,8%
-99,6%
-100,0%
36 (HCl 2 мМ)
0,0%
-66,7%
-99,0%
-100,0%
Как показано в таблице 7-1, начальная оптическая плотность в сравнительном примере 2, в котором добавляли соляную кислоту, составляла 0,1342. Скорости изменения оптической плотности в сравнительном примере 2 составляли, как показано в таблице 7-2, -10,0%, -12,5% и -26,5% через 4, 9 и 18 недель после изготовления, соответственно.
Начальные оптические плотности в экспериментальных примерах 30-36 значительно не отличались от таковой из сравнительного примера 2, как показано в таблице 7-1.
Скорости изменения оптической плотности в экспериментальном примере 30, в котором соотношение молярных концентраций нильского голубого и соляной кислоты составляло 10:1, составляли -9,0%, -10,5% и -23,2% через 4, 9 и 18 недель после изготовления, соответственно.
Скорости изменения оптической плотности в экспериментальном примере 31, в котором соотношение молярных концентраций нильского голубого и соляной кислоты составляло 3:1, составляли -6,9%, -9,3% и -20,9% через 4, 9 и 18 недель после изготовления, соответственно.
Скорости изменения оптической плотности в экспериментальном примере 32, в котором соотношение молярных концентраций нильского голубого и соляной кислоты составляло 1:1, составляли -5,6%, -5,2% и -16,8% через 4, 9 и 18 недель после изготовления, соответственно.
Как видно из сравнения со сравнительным примером 2, снижение оптической плотности в экспериментальных примерах 30-32, в которых молярная концентрация соляной кислоты ниже молярной концентрации нильского голубого, обладает умеренным характером во все моменты времени по сравнению со сравнительным примером 2, в котором не содержалась соляная кислота. Таким образом, устойчивость при хранении растворов нильского голубого улучшена.
В частности, экспериментальный пример 32, в котором соотношение молярных концентраций нильского голубого и соляной кислоты составляло 1:1, имел более высокую устойчивость при хранении, чем другие экспериментальные примеры.
Экспериментальные примеры 37-44: Устойчивость при хранении реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих нильский голубой и серную кислоту
Затем исследовали устойчивость при хранении растворов нильского голубого, в которых содержалась серная кислота вместо соляной кислоты.
Подобно экспериментальным примерам 26-36, нильский голубой A (Sigma) растворяли в этиленгликоле при концентрации 0,02 ммоль/л, чтобы изготовить раствор нильского голубого (сравнительный пример 3).
К 5 мл раствора нильского голубого добавляли серную кислоту в следующей концентрации, чтобы осуществить экспериментальные примеры 37-40. Соотношения молярных концентраций нильского голубого и серной кислоты в растворах указаны в скобках.
Экспериментальный пример
37
Серная кислота
0,005 ммоль/л (4:1)
38
Серная кислота
0,01 ммоль/л (2:1)
39
Серная кислота
0,02 ммоль/л (1:1)
40
Серная кислота
0,05 ммоль/л (1:2,5)
Растворы нильского голубого изготавливали с использованием нильского голубого A, содержащего сульфат-ион в качестве противоиона (Nacalai Tesque, Inc.), вместо нильского голубого A (Sigma), использованного в экспериментальных примерах 37-40 (сравнительный пример 4).
К 5 мл раствора нильского голубого добавляли серную кислоту в следующей концентрации, чтобы осуществить экспериментальные примеры с 41 по 44. Соотношения молярных концентраций нильского голубого и серной кислоты в растворах указаны в скобках.
Экспериментальный пример
41
Серная кислота
0,005 ммоль/л (4:1)
42
Серная кислота
0,01 ммоль/л (2:1)
39
Серная кислота
0,02 ммоль/л (1:1)
44
Серная кислота
0,05 ммоль/л (1:2,5)
Оптические плотности растворов из экспериментальных примеров 37-44 измеряли сразу после изготовления. Каждый раствор хранили при температурном режиме 45°C, и через 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца и 4 месяца после изготовления измеряли оптические плотности, чтобы вычислить скорость изменения оптической плотности.
Результаты измерения оптической плотности и скорости изменения оптической плотности из экспериментальных примеров 37-40 приведены в таблицах 8-1 и 8-2, соответственно.
Результаты измерения оптической плотности и скорости изменения оптической плотности из экспериментальных примеров 41-44 приведены в таблицах 9-1 и 9-2, соответственно.
Как видно из таблицы 8-2, снижение оптической плотности в экспериментальных примерах 37-39, в которых молярная концентрация содержавшейся серной кислоты ниже, чем молярная концентрация нильского голубого, обладает умеренным характером во все моменты времени по сравнению со сравнительным примером 3, в котором не содержалась серная кислота. Таким образом, устойчивость при хранении растворов нильского голубого улучшена.
Кроме того, из таблицы 9-2 видно, что снижение оптической плотности в экспериментальных примерах 41-43, в которых молярная концентрация содержавшейся серной кислоты ниже, чем молярная концентрация нильского голубого, обладает умеренным характером во все моменты времени по сравнению со сравнительным примером 4, в котором не содержалась серная кислота. Таким образом, устойчивость при хранении растворов нильского голубого улучшена.
В частности, скорости изменения оптической плотности после 4 месяцев в экспериментальных примерах 39 и 42, в которых соотношение молярных концентраций нильского голубого и серной кислоты составило от 2:1 до 1:1, составляли 0,0% и -4,2%, соответственно, указывая на особенно благоприятную их устойчивость при хранении.
Таким образом, продемонстрировано, что устойчивость при хранении растворов нильского голубого улучшена путем добавления кислоты в растворы нильского голубого в концентрации, которая ниже или равна молярной концентрации нильского голубого.
К тому же, оптимальные концентрации серной кислоты в растворах нильского голубого различались между экспериментальными примерами 37-40 и 41-44. Посчитали, что это произошло из-за различий в чистоте нильского голубого, содержавшегося в коммерческих реактивах нильского голубого, и может быть в пределах погрешности.
Экспериментальные примеры 45-48: Способность реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих нильский голубой и кислоту, к окрашиванию тромбоцитов
Следующие эксперименты осуществляли для того, чтобы изучить способность реактивов для измерения тромбоцитов, содержащих нильский голубой, к окрашиванию тромбоцитов.
Изготавливали реактивы для измерения тромбоцитов и реактивов для разведения, содержащие следующие композиции.
(1) Реактивы для измерения тромбоцитов
Красители для окрашивания
В концентрации тромбоцитов, приведенной в Таблице 10
Этилен гликоль
1 л
(2) Реактив для разведения
Трицин (буферное вещество)
1,8 г
Лаурилтриметиламмоний хлорид (LTAC)
0,15 г
Очищенная вода
1 л
(доводили pH до 9,0, а осмотическое давление до 200 мосм/кг H<sub>2</sub>O)
Использованные красители для измерения тромбоцитов представляют собой красители, приведенные в таблице 10, в концентрациях, приведенных в таблице 10. В скобках приведены конечные концентрации красителя в смеси реактива, раствора для разведения и образца. Химические формулы красителей приведены в таблице 10.
Измерения тромбоцитов осуществляли, как описано в экспериментальных примерах 9-13.
Таблица 10
Краситель
Конц.
Структура
Результаты
Пр.45
Нильский голубой A (Wako Pure Chemicals)
18,4 м.д. (0,3 м.д.)
<img file="00000021.tif" he="15" wi="38" img-content="undefined" img-format="tif" />
Достаточное окрашивание тромбоцитов
Пр.46
Метиленовый синий NNX (Sigma)
102,5 м.д. (2 м.д.)
<img file="00000022.tif" he="12" wi="34" img-content="undefined" img-format="tif" />
Недостаточное окрашивание тромбоцитов
Пр.47
Крезил-виолет ацетат (Sigma)
1025 м.д. (20 м.д.)
<img file="00000023.tif" he="15" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
Окрашивание отсутствовало
Пр.48
Основной зеленый 5 (Tokyo Chemical Industry)
1025 м.д.(20 м.д.)
<img file="00000024.tif" he="12" wi="37" img-content="undefined" img-format="tif" />
Недостаточное окрашивание тромбоцитов
Диаграммы рассеивания, полученные в экспериментальных примерах 45-48, приведены на фиг.16-19, соответственно. На каждой фигуре (a) представляет собой диаграмму рассеивания, на которой по оси y отложена интенсивность прямого рассеянного света, а по оси x отложена интенсивность флуоресценции, и (b) представляет собой диаграмму рассеивания, на которой ось y диаграммы рассеивания (a) переведена в логарифмическую шкалу. На (b) область, в которой появляются тромбоциты, обозначена сплошной линией.
Результаты измерений с экспериментальными примерами приведены в таблице 10.
Как показано на фиг.16, когда использовали экспериментальный пример 45, в котором использовали нильский голубой в качестве красителя, группа тромбоцитов, появившаяся в области, которая обладала сильной флуоресценцией на диаграмме рассеивания, что указывает на то, что тромбоциты окрашивались в достаточной степени.
С другой стороны, когда использовали экспериментальные примеры 46-48, в которых использовали красители, отличные от нильского голубого, группа тромбоцитов собиралась в области, которая обладала слабой флуоресценцией на диаграмме рассеивания, что указывает на недостаточную способность к окрашиванию тромбоцитов.
Таким образом, предполагается, что когда нильский голубой используют в качестве красителя для измерения тромбоцитов, тромбоциты могут окрашиваться в достаточной степени по сравнению с другими красителями. Кроме того, это указывает на то, что когда тромбоциты окрашивали нильским голубым, тромбоциты можно было точно обнаруживать по интенсивности прямого рассеянного света и интенсивности флуоресценции.
Затем исследовали способность к избирательному окрашиванию тромбоцитов при использовании реактива для измерения тромбоцитов из экспериментального примера 45, содержащего нильский голубой и кислоту, даже когда кровь содержала загрязнители, такие как липидные частицы, согласно подобным экспериментам, как описано в примерах 9-13.
На фиг.20 и 21 показаны диаграммы рассеивания, полученные при измерении крови, содержащей фрагментированные эритроциты, и крови, содержащей липидные частицы, с использованием реактива для измерения тромбоцитов из экспериментального примера 45. На каждой фигуре (a) представляет собой диаграмму рассеивания, на которой по оси y отложена интенсивность прямого рассеянного света, а по оси x отложена интенсивность флуоресценции, (b) представляет собой диаграмму рассеивания, на которой ось y диаграммы рассеивания (a) переведена в логарифмическую шкалу, и (c) представляет собой увеличенную область, в которой появляются тромбоциты на (b). На (c) область, в которой появляются тромбоциты, показана сплошной линией.
На фиг.20 и 21 результаты указывают на то, что группы тромбоцитов, содержащихся в образцах, появляются на диаграммах рассеивания отдельно от других компонентов в образцах, таких как фрагментированные эритроциты или липидные частицы. На основании этих результатов продемонстрировано, что тромбоциты можно отчетливо обнаруживать и точно измерять с использованием реактивов для измерения тромбоцитов по настоящему изобретению, даже когда кровь содержит загрязнители, такие как фрагментированные эритроциты или липидные частицы.
Настоящая заявка относится к японским патентным заявкам №2008-36013, 2008-79785 и 2008-247484, поданным 18 февраля 2008 года, 26 марта 2008 года и 26 сентября 2008 года, соответственно, пункты формул изобретений, описания, рисунки и рефераты которых включены в настоящий документ в качестве ссылки.