РЕКОМБИНАНТНАЯ ВАКЦИНА НА ОСНОВЕ ИНАКТИВИРОВАННОГО ВИРУСНОГО ВЕКТОРА
RECOMBINANT VACCINE OF INACTIVATED VIRAL VECTOR

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к методам, применяемым для предотвращения и лечения заболеваний, предпочтительно у птиц, и, более конкретно, оно относится к рекомбинантным вакцинам, содержащим инактивированный вирусный вектор, имеющий введенную экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий антигенную активность заболевания; и фармацевтически приемлемые носитель, адъювант или эксципиент.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Как хорошо известно, вакцины против вирусных патогенных агентов составляют из соответствующего вируса, выделяемого для дальнейшего применения при получении вакцин, вводимых животным или людям посредством разнообразных композиций.
С одной стороны, существуют композиции вакцин, в которых используются цельные и активные вирусы, проявляющие низкую патогенность в полевых условиях, или с усиленной в лаборатории патогенностью, которые, однако, при введении вызывают антигенную реакцию, достаточную для обеспечения защиты против таких же видов вирусных штаммов, имеющих более высокую патогенность.
Paramyxoviridae
Avulavirus
Например, болезнь Ньюкасла (ND по ее английским начальным буквам) имеет вирусное происхождение и является в высокой степени заразной, включительно, она может быть смертельной. Указанное заболевание поражает домашних и диких птиц, вызывая высокую заболеваемость и смертность. ND вызывается вирусом, принадлежащим к семейству , роду . В соответствии с их патогенностью и степенью вирулентности штаммы классифицируют как: лентогенные, мезогенные и велогенные, т.е. с низкой, умеренной и высокой патогенностью, соответственно (Office International des Epizooties (2008). Newcastle Disease. 5 OIE Manual of Diagnostic Tests и Vaccines for Terrestrial Animals. Office International des Epizooties. France, p.576-589).
Существует множество источников передачи для вируса ND (NDV). Например непосредственно, через живых или мертвых птиц и их продукты или субпродукты, или опосредованно, через векторы, такие как инфицированные насекомые или другие животные, включая человека. Инкубационный период для велогенного типа NDV (VNDV, по его английским начальным буквам), вызывающего высокую смертность, составляет приблизительно 21 день, с проявлением респираторных и/или нервных признаков, таких как учащенное дыхание, чихание и нарушение координации, нахохленные крылья, волочение ног, искривленное положение головы и шеи, мышечные подергивания, смещенная круговая активность, депрессия, отсутствие аппетита и полный паралич. Дополнительно, проявляются частичное или полное прерывание яйценоскости, или наличие деформированных или имеющих тонкую и шероховатую скорлупу яиц, содержащих водянистый альбумин.
Одной из стратегий для борьбы и предотвращения ND является применение вакцин, содержащих активный вирус, обычно полученных из лентогенных штаммов. Живые вакцины против ND индуцируют защиту на респираторном слизистом уровне и применяются в промышленности в течение более 50 лет. Эти вакцины с активным вирусом в основном базируются на применении лентогенных вирусов из штаммов Hitchner B1 и LaSota, причем последний является наиболее популярной вакциной (Op.Cit., Office International des Epizooties (2008) Newcastle).
in situ
Однако, поскольку активный вирус может быть инактивирован компонентами эмульсии, стабильность эмульгированных вакцин является ограниченной. Таким образом, они обычно применяются в другом виде готовых форм или они доставляются посредством смесей , которые затрудняют их применение в крупномасштабном птицеводстве.
Основная проблема с активными вирусами состоит в том, что их не всегда можно использовать в качестве вакцин вследствие их высокой способности к генетической изменчивости, рекомбинации с другими активными вирусами или предрасположенности к их изменениям патогенности так, как у вируса гриппа. Грипп представляет собой респираторное заболевание, поражающее как млекопитающих, так и птиц. Распространение штамма вируса гриппа в определенной популяции может иметь тяжелые последствия для индивидуумов, как для домашних птиц, так и для людей или других млекопитающих. Когда вирус инфицирует домашних кур и млекопитающих, он быстро мутирует, чтобы адаптировать себя к этой новой популяции, и, во время указанного процесса развития адаптации, это может вызывать важные биологические изменения у того же вируса, приводящие к фатальным результатам для хозяина и животного или человеческого населения.
Orthomyxoviridae
gallinaceae
Конкретно, птичий грипп (AI, по его английским начальным буквам) представляет собой болезнь, имеющую в высокой степени заразную вирусную этиологию, вызываемую вирусом типа А из семейства . Наибольшее количество вируса AI (AIV, по его английским начальным буквам) было выделено из диких птиц, особенно из водоплавающих птиц, действующих в качестве резервуара и являющихся переносчиками вируса AI с низкой патогенностью (LPAIV, по его английским начальным буквам). Когда эти вирусы инфицируют неприродного хозяина вируса, такого как домашняя птица, в основном  (т.е. кур, индеек и перепелов, среди других), вирус подвергается мутациям в высокопатогенную форму (HPAIV, по ее английским начальным буквам) через процесс адаптации.
AIV может быть классифицирован в соответствии с двумя вирусными внешними белками. Первый представляет собой гемагглютинин, имеющий наибольшую важность, так как он является ответственным за нейтрализующий ответ антител у инфицированных или вакцинированных птиц, с 16 различными подтипами или серотипами, о которых, следовательно, сообщается. Второй белок представляет собой нейраминидазу, с 9 различными подтипами, о которых, следовательно, сообщается. Конкретно, наиболее важными вирусами для птиц являются те, которые имеют серотипы гемагглютинина Н5 и Н7, которые при мутации в высокопатогенные формы являются способными приводить к показателям смертности, близким к 100%.
Аналогично, болезнь AI у птиц проявляется в двух клинических формах: первая является птичьим гриппом с низкой патогенностью (LPAI, по его английским начальным буквам), вызывающим умеренное заболевание, иногда выражающееся в аспекте плохого состояния оперения, снижении яйценоскости. Но AI, в основном, является важным для птиц вследствие высокой мутагенной способности вируса, неизменно приводящей ко второй клинической форме, представляющей собой птичий грипп с высокой патогенностью (HPAI, по его английским начальным буквам), способный вызывать показатели смертности, близкие к 100%.
Конкретно, клинические признаки AI являются изменчивыми, и на них влияют вовлеченный подтип вируса, его патогенность, иммунное состояние и пораженные виды птиц. Инкубационный период для HPAIV составляет 21 день, и клинические признаки изменяются от конъюнктивита до повышения температуры, характеризуемого нахохливанием перьев, депрессией, прострацией и смертью. Наиболее часто описанными повреждениями являются гиперемия легких, кровотечения и отеки.
Как только AIV внедряется на птицеферму, он выделяется в окружающую среду через фекалии и респираторные текучие среды. Передача вируса и распространение на других птиц, в основном, осуществляется посредством прямого контакта с выделениями инфицированных птиц, особенно загрязненными фекалиями, пищей, водой, оборудованием и одеждой. Подверженность инфекции и проявление клинических признаков заболевания являются очень изменчивыми.
Для этих видов заболеваний, с затрудненным контролем и где вакцина с активным вирусом может представлять риск для животных и даже для здоровья человека, в том случае, когда может быть утерян контроль во время ее введения, предпочтительно использовать вакцину с инактивированным вирусом, обычно эмульгированную.
В предшествующем уровне техники было разработано несколько вакцин для предотвращения разнообразных вирусных заболеваний, таких как описанный выше AI. Что касается этого последнего заболевания, то уже существуют эмульгированные вакцины, включающие цельный вирус AI, которые получают в эмбрионах цыплят. Этот вирус инактивируют и эмульгируют в системе вода-масло для его подкожного или внутримышечного введения у промышленных птиц (Office International des Epizooties (2008). Avian Influenza. OIE Manual of Diagnostic Test and Vaccines for Terrestrial Animals, Office International des Epizooties France, p. 465-481).
Более конкретно, вакцины, полученные с инактивированным вирусом AI, стимулируют сильный иммунный ответ на системном уровне и для них получены положительные результаты для контроля обеих форм AI. Вакцинацию применяют как для предотвращения клинических признаков заболевания, а также для снижения, насколько возможно, выведения вируса из инфицированных птиц в окружающую среду. Снижение выделения вируса уменьшает вероятность диссеминации вируса от вакцинированных птиц, становящихся инфицированными, к неинфицированным подверженным птицам (Swayne, D, y Kapczynski, D (2008), Vaccines, Vaccination and Immunology for avian influenza in poultry. In Avian Influenza. Ed by David Swayne. Blackwell 5 Publishing, USA, p.407-451.)
Дополнительно, эмульгированные вакцины с инактивированным вирусом имеют повышенную стабильность, что обеспечивает лучшее распределение вакцины и более долгий срок хранения вакцины. Следовательно, ND вакцины также были составлены как эмульгированный инактивированный вирус.
Важно учитывать, что одним из основных различий между вакциной с активным вирусом и вакциной с инактивированным вирусом является количество вируса, требуемое для достижения антигенного ответа при введении.
Поскольку активные вирусы сохраняют свою способность к репликации самих себя в клетках, количество вируса, представляющего интерес, требуемое в вакцине, является ниже, чем доза, вызывающая антигенный ответ, и это делается для предотвращения заболевания у пациентов, которым вводится вакцина, с учетом того, что вирус будет естественно реплицироваться и при попадании в организм он будет достигать достаточных количеств для достижения желательного антигенного ответа.
С другой стороны, вакцины с инактивированным вирусом требуют значительно большей концентрации вируса, чем вакцины с активным вирусом, как правило, по меньшей мере, в 10 раз выше, для достижения такой же антигенной активности, поскольку с вирусом проводят операции для удаления его способности к репликации, так, чтобы количество всего антигена, требуемое для вызывания иммунного ответа, должно было присутствовать во время введения вакцины, поскольку организм не будет нормально реплицировать вирус и, следовательно, его количество не увеличится.
С другой стороны, одним из наиболее значительных достижений в области биотехнологии стало применение рекомбинантных вакцин. Способность выделять и сплайсировать (или рекомбинировать) специфические фрагменты ДНК организма с размером гена и переносить их в другой организм посредством вектора или ДНК плазмиды для стимуляции выработки антигена, способного индуцировать образование защитных антител, привело к внедрению новых вакцин. В противоположность к общепринятым вакцинам рекомбинантная технология предоставляет очень важные преимущества по отношению к заболеваниям, таким как AI, описанный выше, где отсутствует возможность применять цельные активные вирусы вследствие их высокой мутагенной способности и где применение полностью инактивированного вируса всегда имеет риск, если процесс инактивации не осуществляют должным образом. Рекомбинантные вакцины, в их активной форме, поскольку имеют введенные необходимые нуклеотиды для экспрессии антигенов против заболевания, представляющего интерес, могут быть безопасно введены для индуцирования местного иммунитета на респираторном слизистом уровне в активном вирусном векторе заболевания с низкой патогенностью, для которого было бы невозможным применение нерекомбинантного живого вируса вследствие включенных рисков.
Еще одно преимущество рекомбинантных вакцин состоит в том, что используемый вирусный вектор обычно не соответствует заболеванию, от которого защищаются, что облегчает их применение в области ветеринарной диагностики методов профилактики по типу, позволяющему различать вакцинированных животных от инфицированных животных, лучше известный как DIVA (Capua, I et al., "Development of DIVA (differentiating infected from vaccinated animals) strategy using vaccine containing heterologous neuraminidase for control of avian influenza". Avian Pathology 32(1) pp. 47-55).
Собственно говоря, вакцины, применяемые в настоящее время для борьбы с AI (эмульгированные в масле, с полностью инактивированным вирусом) и другими аналогичными заболеваниями предотвращают смертность, вызываемую HPAIV, но не позволяют избежать инфекции и репликации AIV у птиц, следовательно, снижение выделения и распространения вируса достигается частично.
Следовательно, в предшествующем уровне техники были разработаны вирусные векторы от заболеваний с низкой патогенностью, таких как болезнь Ньюкасла, имеющие введенные гены, кодирующие антигенные участки заболеваний, трудно поддающихся контролю, такие как птичий грипп. Это изложено в документе Ge, Deng, Tian et al. "Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice", J. Vir. Vol. 81, No. 1, p. 150-158", который раскрывает рекомбинантную вакцину в активной форме. Конкретно, указанный документ раскрывает результат клинических испытаний с использованием штамма LaSota, имеющий ген подтипа H5N1 птичьего гриппа.
Еще одним документом предшествующего уровня техники из этой же области является Park, Man Seong et AI. "Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian Influenza и Newcastle disease". PNAS Vol. 103, No. 21, May 12, 2006 p. 8203-8208. Указанный документ относится к технологии повышения экспрессии гена птичьего гриппа, такая технология далее в данном описании именуется "фиксацией".
Несмотря на то, что некоторые рекомбинантные вакцины заменили вакцины с активным вирусом вследствие упомянутых выше преимуществ, рекомбинантные вакцины еще не достигли преимуществ вакцин с инактивированным цельным вирусом, и, прежде всего, они не способны обеспечить надлежащий иммунитет в отношении к введенному экзогенному гену, в основном вследствие того факта, что рекомбинантные вакцины, такие как против описанных выше болезни Ньюкасла с гриппом, вызывают антигенную активность против обоих заболеваний, но требуют более высокой экспозиции экзогенных антигенных участков, введенных в вектор. Как следствие, необходимо развитие технологий, таких как фиксация, которые посредством генетических модификаций, как в случае гриппа, описанного выше, дают на выходе лучшую экспрессию антигена в вирусном векторе. Однако такие технологии не стали полностью успешными.
Таким образом, рекомбинантные вакцины из активного вируса обычно составляют с концентрацией вируса, приблизительно в 10 раз более высокой, чем концентрация, применяемая для нерекомбинантной вакцины из активного вируса, соответствующего используемому вирусному вектору, с целью достижения подходящей экспозиции антигенных участков представляющего интерес микроорганизма.
Аналогично, рекомбинантные вакцины не применяли в инактивированной форме, поскольку это подразумевало бы достижение концентраций вирусного вектора в 100 раз более высоких, чем концентрации, требуемые для обычного вируса (в 10 раз выше, чем для рекомбинантного активного вируса), что было бы очень затруднительным на промышленном уровне. Следовательно, в целом, эти рекомбинантные вакцины с активным вирусом никогда не применяли в виде эмульсий вследствие ограниченной стабильности и поскольку эмульсия не является преимущественной в данном отношении вследствие активной природы активного вирусного вектора.
Подводя итог, из приведенного выше видно, что существует очень большая потребность в вакцинах против разнообразных заболеваний, полученных посредством рекомбинантной технологии более безопасным и эффективным образом, так, чтобы лучшая стабильность достигалась в полученных вакцинах, при соответствующем контроле и результатах эффективности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
При разработке настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что вакцина, содержащая рекомбинантный инактивированный вирусный вектор, имеющий введенную экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный участок заболевания, представляющего интерес, и фармацевтически приемлемые эмульгированный носитель, адъювант или эксципиент, предоставляет необходимую защиту против указанного заболевания посредством применения титра вирусного вектора, сходного с титром, требуемым для рекомбинантной вакцины с активным вирусом, основанной на том же вирусном векторе.
Mycoplasma hyopneumonieae
В варианте осуществления изобретения экзогенную нуклеотидную последовательность выбирают из последовательностей антигенных участков против гриппа, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, инфекции сумки Фабрициуса (Гумборо), гепатита, вирусного ринотрахеита, инфекционного ринита, , пастереллеза, свиного респираторного и репродуктивного синдрома (PRPS), цирковируса, бордетеллеза, парагриппа, или другого антигена, размер которого позволяет его введение в соответствующий вирусный вектор. Предпочтительно используют антиген, выбранный из птичьего гриппа, ларинготрахеита, инфекционного бронхита, инфекции сумки Фабрициуса (Гумборо), гепатита, PRRS и цирковируса.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения экзогенная нуклеотидная последовательность содержит ген, кодирующий гемагглютинин (HA) вируса птичьего гриппа, выбранный из 16 подтипов гемагглютинина или иммуногенного варианта вируса гриппа, который более предпочтительно кодирует, по меньшей мере, один из подтипов H1, H2, H3, H5, H6, H7 или H9 указанного белка.
В конкретном варианте осуществления изобретения ген белка H5 получают из мексиканского подтипа вируса птичьего гриппа H5N2 или имеющего азиатское происхождение подтипа H5N1, наблюдая превосходную защиту для обоих подтипов против смертности, индуцируемой подтипом H5N2 HPAIV.
Что касается вирусного вектора настоящего изобретения, в предпочтительном варианте осуществления, где вирус болезни Ньюкасла (rNDV) соответствует вирусному вектору, имеющему введенную экзогенную нуклеотидную последовательность, указанный вирусный вектор предпочтительно выбирают из вакцинальных штаммов, таких как штаммы LaSota, Ulster, QV4, B1, CA 2002, Roakin, Komarov, Clone 30 или VGGA, или штаммов из генетических групп от I до V болезни Ньюкасла. Предпочтительно рекомбинантный вирус представляет собой штамм LaSota (rNDV/LS).
Аналогично, в дополнительном конкретном варианте осуществления, где вирусный вектор представляет собой аденовирус, аденовирус выбирают из птичьего и свиного аденовирусов и более предпочтительно из типа 9 птичьего аденовируса (rFAdV/9) и типа 5 свиного аденовируса (rSAdV/5).
В соответствии с полученными результатами, подробно изложенными ниже, заключают, что посредством настоящего изобретения возможно применять экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую специфичные антигенные детерминанты рассматриваемого заболевания, в вирусном векторе для получения рекомбинантной вакцины с инактивированным вирусом в эмульсии или в других фармацевтически приемлемых адъювантах.
Результат, достигаемый с вакциной настоящего изобретения (rNDV/LS-H5), является неожиданным, поскольку традиционно полагают, что в случае вирусного вектора рекомбинантных вакцин требуется репликация вирусного вектора в хозяйских клетках для достижения достаточной экспрессии рекомбинантного белка для стимуляции пригодного иммуногенного ответа, однако в настоящем изобретении полученный результат показывает, что антигенный белок заболевания, представляющего интерес, в достаточной степени и должным образом экспрессируется на поверхности вирусного вектора, и только его присутствие в неактивной форме обеспечивает подходящий антигенный и защитный ответ против указанного заболевания, представляющего интерес.
Конкретно, в случае высокой патогенности и трудностями с контролем над заболеваниями, такими как птичий грипп, преимущество рекомбинантной вакцины настоящего изобретения состоит в том, что цельный вирус не используется, посредством чего подавляется риск вспышки заболевания от несоответствующей инактивации вакцинального вируса. Кроме того, вакцина настоящего изобретения позволяет достичь местного иммунного ответа на респираторном слизистом уровне птиц, а также иммунного ответа на системном уровне, которые можно дифференцировать посредством конкретных лабораторных тестов, от иммунных ответов, индуцируемых посредством контакта птиц с цельными вирусами либо вакцинальными или полевыми, что представляет важное достижение в эпидемиологической области.
Вакцину составляют для подкожного введения; однако может успешно применяться любой системный путь, такой как внутримышечный или подкожный. Для вакцины предпочтительно применяют жидкий носитель, более предпочтительно применяют эмульсию вода-в-масле, но также можно успешно применять другой вид адъювантов или модуляторов иммунного ответа.
С рекомбинантной вакциной настоящего изобретения снижается выделение полевого типа вируса в окружающую среду, что способствует значительному уменьшению степени распространения вируса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Новые аспекты, учитывающие характеристики настоящего изобретения, будут конкретно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Однако вакцина настоящего изобретения, наряду с другими ее целями и преимуществами, будет более понятной из следующего подробного описания некоторых конкретных вариантов осуществления при чтении по отношению к прилагаемым чертежам, где
Фигура 1 представляет собой диаграмму результатов смертности (M) и показателя заболеваемости (MI) из Примера 6A, полученных при контрольном заражении велогенным NDV (VNDV).
Фигура 2 представляет собой диаграмму результатов смертности (M) и показателя заболеваемости (MI) из Примера 6A, полученных при контрольном заражении подтипом H5N2 вируса AI высокой патогенности (HPAIV).
Фигура 3 представляет собой диаграмму результатов смертности (M) и показателя заболеваемости (MI) из Примера 6B, полученных при контрольном заражении VNDV.
Фигура 4 представляет собой диаграмму результатов смертности (M) и показателя заболеваемости (MI) из Примера 6B, полученных при контрольном заражении подтипом H5N2 HPAIV.
Фигура 5 представляет собой диаграмму результатов смертности (M) и показателя заболеваемости (MI) из Примера 6C, полученных при контрольном заражении VNDV.
Фигура 6 представляет собой диаграмму результатов смертности (M) и показателя заболеваемости (MI) из Примера 6C, полученных при контрольном заражении подтипом H5N2 HPAIV.
Фигура 7 представляет собой диаграмму результатов смертности (M) и показателя заболеваемости (MI) из Примера 6D, полученных при контрольном заражении VNDV.
Фигура 8 представляет собой диаграмму результатов смертности (M) и показателя заболеваемости (MI) из Примера 6D, полученных при контрольном заражении подтипом H5N2 HPAIV.
Фигура 9 представляет собой диаграмму результатов титров вирусно-сывороточной нейтрализации (ВСН) из Примера 13А, полученных при контрольном заражении аденовирусом подтипа 5.
Фигура 10 представляет собой диаграмму результатов титров вирусно-сывороточной нейтрализации (ВСН) из Примера 13А, полученных при контрольном заражении штаммом Purdue вируса GET.
Фигура 11 представляет собой диаграмму результатов титров вирусно-сывороточной нейтрализации (ВСН) из Примера 13А, полученных при контрольном заражении аденовирусом подтипа 5 и штаммом Purdue вируса GET.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
При разработке настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что вакцина, содержащая инактивированный вирусный вектор, имеющий введенную экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую заболевание, представляющее интерес, и фармацевтически приемлемые носитель, адъювант или эксципиент, предоставляет необходимую защиту против указанного заболевания посредством применения титра вирусного вектора, сходного с титром, требуемым для вакцины с активным вирусом, основанной на том же вирусном векторе.
В настоящем изобретении является существенным, чтобы вирусный вектор был инактивированным, инактивированный означает, что рекомбинантный вирус, действующий в качестве вирусного вектора и содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую антигенный участок заболевания, представляющего интерес, потерял свойство репликации. Инактивации достигают посредством физических или химических методик, хорошо известных в данной области, предпочтительно посредством химической инактивации формальдегидом или бета-пропиолактоном (Office International des Epizooties (2008). Newcastle Disease. OIE Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. Office International des Epizooties. France, p. 576-589). Напротив, живой или активный вирус означает сохранение его способности к репликации.
Mycoplasma hyopneumonieae
Вирусный вектор, предпочтительно выбранный из аденовируса или парамиксовируса, инактивируют и вводят экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую, по меньшей мере, один антигенный участок заболевания, представляющего интерес, предпочтительно из, по меньшей мере, одного заболевания, выбранного из гриппа, инфекционного ларинготрахеита, инфекционного бронхита, инфекции сумки Фабрициуса (Гумборо), гепатита, вирусного ринотрахеита, инфекционного ринита, , пастереллеза, свиного респираторного и репродуктивного синдрома (PRPS), цирковируса, бордетеллеза, парагриппа или любого другого антигена, размер которого позволяет проводить его введение в соответствующий вирусный вектор. Более предпочтительно, применяют антиген, выбранный из птичьего гриппа, ларинготрахеита, инфекционного бронхита, инфекции сумки Фабрициуса (Гумборо), гепатита, PRRS и цирковируса.
В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения экзогенная нуклеотидная последовательность содержит ген, кодирующий гемагглютинин (HA) вируса птичьего гриппа, выбранный из 16 подтипов гемагглютинина или иммуногенного варианта вируса гриппа, который более предпочтительно кодирует, по меньшей мере, один из подтипов H1, H2, H3, H5, H6, H7 или H9 указанного белка.
Что касается вирусного вектора настоящего изобретения, в предпочтительном варианте осуществления, где вирус болезни Ньюкасла (rNDV) соответствует вирусному вектору, в который введена экзогенная нуклеотидная последовательность, указанный вирусный вектор предпочтительно выбирают из вакцинальных штаммов, таких как штаммы LaSota, Ulster, QV4, B1, CA 2002, Roakin, Komarov, Clone 30, VGGA или штаммы из генетических групп болезни Ньюкасла от I до V. Предпочтительно рекомбинантный вирус представляет собой штамм LaSota (rNDV/LS).
Аналогично, в дополнительном варианте осуществления, где вирусный вектор представляет собой аденовирус, аденовирус выбирают из птичьего и свиного аденовируса и, более предпочтительно, из птичьего аденовируса типа 9 (rFAdV/9) и свиного аденовируса типа 5 (rSAdV/5).
Что касается антигенного участка, когда грипп является заболеванием, представляющим интерес, антигенный участок соответствующий белку гемагглютинина птичьего гриппа (HA), является предпочтительным, предпочтительно получают ген из вируса птичьего гриппа, и кодирующий любой из существующих 16 подтипов, предпочтительно H5, H7 и H9, предпочтительно кодирующий подтип H5, который предпочтительно получают из штаммов: Bive, 435 и Viet (VT), описанных ниже. В данном отношении можно сделать вывод, что штамм, являющийся источником гена, кодирующего HA подтип H5, не является решающим для настоящего изобретения, поскольку экспериментальные результаты показывают, что любой штамм может предоставить генетический материал, применимый для достижения цели настоящего изобретения.
Что касается предпочтительных источников гена, заслуживает упоминания то, что H5-ген из штамма Bive соответствует LPAIV-H5N2, выделенному в Мексике в 1994 г. из биологических образцов бройлеров и идентифицированных мексиканским правительством как (A/chicken/Mexico/232/CPA). Указанный штамм вируса зарегистрирован "Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Desarrollo Rural, Pesca y AIimentacion (SAGARPA, по его испанскому акрониму)" для применения в производстве эмульгированных инактивированных вакцин, таким образом, рекомбинация этого вируса с рассматриваемым геном также обеспечивает биологическую безопасность в рекомбинантной вакцине настоящего изобретения.
Что касается второго предпочтительного источника генетического материала, являющегося геном H5-435, то он был получен в результате выделения LPAIV-H5N2, выделенного в Мексике в 2005 г. из биологических образцов бройлеров.
Вирусный вектор вакцины настоящего изобретения может быть получен посредством амплификации ПЦР нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, посредством идентификации антигенных участков из выделения патогена происхождения, для дальнейшего введения, амплификации в вирусном векторе, предпочтительно выбранного из аденовируса или парамиксовируса. Введение проводят, используя стандартные методы молекулярной биологии, такие как рестрикционные ферменты и ДНК-лигазы, среди прочих. Полученный таким образом инфекционный клон внедряют в клеточную линию для получения рекомбинантного вируса в соответствии с вирусным вектором.
В зависимости от природы вирусного вектора вирус реплицируется в любой подходящей системе для роста, такой как зародыши цыплят SFP, или промышленные клеточные линии, или конкретно сконструированные для роста вируса.
2
10
Как только достигается концентрация вируса, требуемая для достижения антигенного ответа, предпочтительно между 10 и 10 DI50%/мл, в зависимости от используемого вирусного вектора, проводят инактивацию вируса. Предпочтительно инактивацию осуществляют посредством физических или химических методик, хорошо известных в данной области, предпочтительно посредством химической инактивации формальдегидом или бета-пропиолактоном.
4
10
2
8
Фармацевтически активные носители для вакцин настоящего изобретения предпочтительно представляют собой водные растворы или эмульсии. Более конкретно, применение носителя эмульсии вода-в-масле является предпочтительным. Конкретная готовая форма вакцины будет зависеть от применяемого вирусного вектора, а также от введенной экзогенной нуклеотидной последовательности. Однако в предпочтительном варианте осуществления, где вирусный вектор представляет собой вирус болезни Ньюкасла, предпочтительная доза составляет между 10 и 10 DIEP50%/мл. В варианте осуществления, где аденовирус является вирусным вектором, предпочтительная доза составляет между 10 и 10DIEP50%/мл.
Что касается введения вакцины, то ее предпочтительно вводят посредством подкожного пути в заднюю среднюю часть шеи птицы. Вакцину настоящего изобретения вводят домашним птицам, таким как бройлеры, яйценесущие птицы, репродуктивные птицы, индейки, бойцовые петухи, цесарки, куропатки, перепела, утки, гуси, лебеди или страусы. Предпочтительно вакцину вводят подкожно, хотя для некоторых видов ее можно вводить внутримышечно птицам любого возраста.
8
9
8,5
Когда вакцину применяют у цыплят в эмульгированном векторе Ньюкасла, вакцина предпочтительно содержит от 10 до 10 DIEP50%/0,5 мл на цыпленка, и более предпочтительно, вакцина содержит 10 DIEP50%/0,5 мл на цыпленка. Вакцинация цыплят может легко проводиться в возрасте 10 дней.
Настоящее изобретение предоставляет очень важные конкурентные преимущества. Рекомбинантная неактивная вакцина настоящего изобретения делает возможным устанавливать программы вакцинации, исключительно применяя рекомбинантные вакцины в вирусном векторе, и с введением генов от патогенных агентов, трудно поддающихся контролю, которые приводят в результате к способу идентификации инфицированных животных, от животных, получивших только одну вакцину (DIVA), применимому при борьбе с заболеванием и его искоренении, включающему в себя:
а) подвергание первому способу обнаружения антител, по меньшей мере, одного образца от, по меньшей мере, одного животного, получившего рекомбинантную вакцину с инактивированным вирусным вектором, имеющим введенную экзогенную нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген заболевания, вызываемого патогеном, для обнаружения в указанном образце присутствия антител, соответствующих указанному антигену;
b) подвергание второму способу обнаружения антител, по меньшей мере, одного образца от того же животного, образец от которого был подвергнут первому способу обнаружения антител, для обнаружения в указанном образце присутствия антител, соответствующих патогену, вызывающему заболевание;
с) определение того, является ли животное инфицированным или вакцинированным, исходя из результатов первого и второго способов обнаружения антител.
Например, когда патоген трудно поддается контролю, такой как AIV, в основном H5 и H7, вызывающие высокую смертность в птицеводстве, с рекомбинантной инактивированной вакциной настоящего изобретения, достигается превосходная защита на системном уровне с обеспечением также высокой степени биологической безопасности по сравнению с применением цельного вируса AI, составляющего высокую степень риска в том случае, если он не был должным образом инактивирован. Это риск возрастает во время процесса производства, где вирусы являются активными. Настоящее изобретение также позволяет проводить эпидемиологическую дифференциацию вакцинированных птиц от других птиц, подвергнутых воздействию цельных вирусов (система DIVA), поскольку, когда вводят только ген гемагглютинина вируса птичьего гриппа (HA), лабораторный тест, применяемый для обнаружения антител, индуцированных вакциной против птичьего гриппа, представляет собой ингибирование гемагглютинации (HI). Применяемые в настоящее время иммунологические тесты, такие как ELISA и другие тесты, как диффузия в агаровом геле, являются отрицательными к обнаружению антител против птичьего гриппа, индуцированных рекомбинантной вакциной настоящего изобретения, поскольку они сконструированы для обнаружения антител, индуцируемых другим видов антигенов, содержащихся в цельных вирусах. Когда птицы, вакцинированные рекомбинантной вакциной настоящего изобретения, инфицируются вирусом полевого типа, эти тесты являются положительными к обнаружению антител против птичьего гриппа, посредством чего инфицированные птицы могут быть отличены.
Дополнительно, настоящее изобретение позволяет устанавливать совместные программы исключительно с применением рекомбинантных вакцин в неактивной и активной форме, причем первая будет обеспечивать вышеуказанный системный иммунитет, а рекомбинантная активная вакцина будет дополнять иммунитет на слизистом уровне, обеспечивая на выходе степени защиты, равные или близкие к 100% на полевом уровне. С этой программой также применяют вышеуказанную систему DIVA.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, где рекомбинантный вектор эмульгированной инактивированной вакцины представляет собой Ньюкасл с введенным геном гриппа в случае обеих контрольных заражений с VNDV и HPAIV, его можно одновременно вводить с активной вакциной с теми же вектором и антигеном, непосредственно в респираторную слизистую оболочку либо посредством внутриглазного пути, распылением или в питьевой воде, так, чтобы ответ на местном уровне был стимулирован в высокой степени (в респираторной и пищеварительной слизистой), с продуцированием секреторных иммуноглобулинов типа А (IgA), посредством чего значительно снижая репликацию вируса полевого типа, таким образом значительно снижая его выделение и распространение.
С другой стороны, вакцина настоящего изобретения позволяет устанавливать контрольные программы и возможное искоренение посредством различения вакцинированных птиц от инфицированных птиц, поскольку возможно, при введении рекомбинантных инактивированных вакцин настоящего изобретения, отличать вакцинированных птиц от инфицированных птиц с вирусом полевого типа (система DIVA), так как рекомбинантные вакцины содержат только гемагглютинин AIV в качестве антигена, позволяя применять диагностические тесты, такой как ELISA, который обнаруживает антитела, индуцированные другими антигенами вируса, а не только антитела, индуцированные гемагглютинином.
Рекомбинантная вакцина против гриппа настоящего изобретения будет более понятно иллюстрирована посредством следующего описания конкретных примеров, которые предоставлены только с иллюстративными целями, а не для ограничения изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Получение вектора Newcastle-LaSota
Чтобы клонировать геном штамма LaSota вируса Ньюкасла и таким образом получить вирусный вектор, первоначально получали промежуточный вектор, именуемый "pNDV/LS". Экстракцию полной вирусной РНК осуществляли для штамма Newcastle-LaSota триазольным методом. Синтез кДНК (комплементарной ДНК) проводили из очищенной РНК вирусного генома, используя ранее очищенную полную РНК в качестве матрицы. С целью клонирования всех генов из генома Ньюкасла (15183 пар оснований (по)) 7 фрагментов, имеющих "перекрывающиеся" концы и сцепленные сайты рестрикции, амплифицировали посредством ПЦР. Фрагмент 1 (F1) содержит от нуклеотида (нт) 1-1755, F2 от нт 1-3321, F3 содержит от нт 1755-6580, F4 от 6151-10210, F5 содержит от нт 7381-11351, F6 от 11351-14995 и F7 содержит от нт 14701-15186. Сборку 7 фрагментов осуществляли в клонирующем векторе, именуемом pGEM-T, используя стандартные методы связывания, посредством этого воссоздавая геном Newcastle-LaSota, который после клонирования имеет единичный сайт рестрикции SacII, между генами P и M, служащий для клонирования любого представляющего интерес гена в этой векторной вирусной области.
ПРИМЕР 2
Клонирование HA-гена из AIV подтипа H5N2 435 штамма 435
Экстракцию полной вирусной РНК осуществляли триазольным методом для клонирования HA-гена AIV 435 штамма. Эту очищенную полную РНК применяли позже для синтеза кДНК (комплементарной ДНК), и посредством метода ПЦР, HA-ген из вируса AI амплифицировали, применяя специфические олигонуклеотиды. Ген HA из 435 далее вводили в pGEM-T вектор, применяя стандартные методы клонирования и получая плазмиду: p-GEMT-435.
ПРИМЕР 3
Клонирование HA-гена AI 435 в сайте Sacll pNDV/LS вектора для получения плазмиды: pNDV/LS-435
Получение промежуточного вектора pSacIIGE/GS:
Новый промежуточный вектор, именуемый pSacIIGE/GS, был построен для введения транскрипционных последовательностей из Newcastle, именуемых GE/GS по 5'-концу гена HA 435, посредством первоначальной амплификации ПЦР последовательностей GE/GS, используя геном Newcastle в качестве матрицы, и более позднего введения этих последовательностей в pGEM-T.
B.
Субклонирование HA-гена до вектора SacIIGE/GS:
Плазмиду pGEMT-435 обрабатывали с помощью Hpal-Ndel и далее клонировали в pSacllGE/GS, для получения плазмиды pSacllGE/GS-HA435.
C.
Субклонирование GE/GS-HA435 до вектора pNDV-LS
Обе плазмиды: pSacllGE/GS-HA435 и pNDV/LS, обрабатывали с помощью Sacll, продукты обработки очищали, и область GE/GS-24 HA435 очищали и вводили в сайт Sacll pNDV/LS, посредством чего получали инфекционный клон, именуемый pNDV/LS-435.
ПРИМЕР 4
Получение рекомбинантного вируса rNDV/LS-HA435 в клеточной культуре
2
Клетки Hep-2 и A-549 первоначально инфицировали вирусом MAV-7 при множественности инфекции (MOI), равной 1. После инкубации в течение 1 часа при 37°C в атмосфере 5% CO клетки трансфицировали 1 микрограммом (мкг) ДНК клона pNDVLS-435, вместе с 0,2 мкг ДНК из плазмиды экспрессии: pNP, pP и pL, которые кодируют вирусные белки P, NP и L, необходимые для получения рекомбинанта в обоих типах клеток. Через 12 часов после трансфекции, рекомбинантный вирус, продуцированный в обоих типах клеток, собирали и вводили эмбрионам цыплят SPF с возрастом 10 дней для амплификации полученного вируса. Аллантоидную жидкость, собранную через 48 часов, титровали с помощью теста на плашках в клетках Vero, получая, таким образом, окончательный рекомбинантный вирус, используемый для получения вакцины.
Рекомбинантный вирус, имеющий гены, полученные из штаммов Bive и Viet, получали, как описано выше.
ПРИМЕР 5
Способ производства эмульгированной инактивированной вакцины с рекомбинантным вирусом Newcastle-LaSota, имеющим вставку H5 из вируса птичьего гриппа: rNDV/LS-H5
Получение антигена
Начиная с засевания для получения, яйца с зародышем цыплят, без специфичных патогенов (SPF), инокулировали ранее определенной инфицирующей дозой. Зародыши инкубировали при 37°C в течение 72 часов, проверяя смертность ежедневно. После этого периода живые зародыши замораживали на период от одного дня до следующего дня, предпочтительно в течение 24 часов, и амниоаллантоидную жидкость (FAA, по ее испанскому акрониму) собирали в асептических условиях. FAA осветляли посредством центрифугирования и инактивировали формальдегидом, несмотря на то, что может применяться любой другой инактивирующий агент, обычно применяемый при получении данного вида вакцины. FAA подвергали тестам, подтверждающим ее инактивацию, чистоту, стерильность и титр как для DIEP, так и для HA.
Получение эмульсии
Вакцину получали в эмульсии типа вода-в-масле. В масляной фазе применяли минеральное масло и поверхностно-активные вещества типа Спан 80 и Твин 80. Для получения водной фазы FAA смешивали с раствором консерванта (тимеросала). Для получения эмульсии водную фазу медленно добавляли в масляную фазу при постоянном перемешивании. Для достижения установленного размера частиц использовали гомогенизатор или коллоидную мельницу.
Содержание антигена
8,5
Вакцину составляли с получением минимально 10DIEP50%/0,5 мл, чтобы использовать дозу, равную 0,5 мл на птицу.
Основываясь на указанной выше методике, было получено шесть рекомбинантных вакцин: три, имеющие вектор штамма Newcastle-LaSota (rNDV/LS) с фиксацией HA для вируса AI, именуемые (Rd), и еще три, имеющие тот же вектор, но без фиксации, именуемый (Re); каждый геном Rd и Re клонировали с тремя различными HA-генами, указанными ниже с получением 6 вакцин:
1. H5-Bive ген: получен из LPAIV подтипа H5N2 штамма (A/chicken/Mexico/232/CPA), выделенного в Мексике в 1994 г. из биологических образцов бройлеров, и соответствующего вирусному штамму, зарегистрированному SAGARPA для получения эмульгированных инактивированных вакцин.
2. H5-435 ген: получен в результате выделения HPAIV подтипа H5N2, выделенного в Мексике в 2005 г. из биологических образцов бройлеров, 435 штамм показал различные антигенные характеристики в тестах по ингибированию гемагглютинина (HI) со штаммом Bive и важные изменения в нуклеотидных последовательностях.
3. H5-Vt ген: Этот ген был выделен во Вьетнаме и соответствует H5-гену AI вируса подтипа H5N1.
ПРИМЕР 5A
Эмульгированную, инактивированную, рекомбинантную с фиксацией (Rd), и геном H5-Bive, в (rNDV/LS) векторе, экспериментальную вакцину получали в соответствии со способом, описанным в примере 5, в виде фармацевтической формы вода/масло, которую назвали Emi Rd-Bive.
ПРИМЕР 5B
Эмульгированную, инактивированную, рекомбинантную с фиксацией (Rd), и геном H5-435, в (rNDV/LS) векторе, экспериментальную вакцину получали в соответствии со способом, описанным в примере 5, в виде фармацевтической формы вода/масло, которую назвали Emi Rd-435.
ПРИМЕР 5C
Эмульгированную, инактивированную, рекомбинантную с фиксацией и геном H5-Vt, в векторе (rNDV/LS), экспериментальную вакцину получали в соответствии со способом, описанным в примере 5, в виде фармацевтической формы вода/масло, которую назвали Emi Rd-Vt.
ПРИМЕР 5D
Эмульгированную, инактивированную, рекомбинантную, без какой-либо фиксации и геном H5-Bive, в векторе (rNDV/LS), экспериментальную вакцину получали в соответствии со способом, описанным в примере 5, в виде фармацевтической формы вода/масло, которую назвали Emi Re-Bive.
ПРИМЕР 5E
Эмульгированную, инактивированную, рекомбинантную, без какой-либо фиксации и геном H5-435, в векторе (rNDV/LS), экспериментальную вакцину получали в соответствии со способом, описанным в примере 5, в виде фармацевтической формы вода/масло, которую назвали Emi Re-435.
ПРИМЕР 5F
Эмульгированную, инактивированную, рекомбинантную, без какой-либо фиксации и геном H5-Vt, в векторе (rNDV/LS), экспериментальную вакцину получали в соответствии со способом, описанным в примере 5, в виде фармацевтической формы вода/масло, которую назвали Emi Re-Vt.
ПРИМЕР 6
in vivo
Оценка иммуногенности для рекомбинантных вакцин в векторе ND-LaSota с фиксацией и без фиксации для HA-гена вируса AI
Для определения эффективности эмульгированных рекомбинантных инактивированных вакцин настоящего изобретения было определено и продемонстрировано, что их можно получать с различными клонированными генами гемагглютинина от различных антигенных подтипов и вариантов вируса AI, и тестировали их эффективность для предотвращения смертности, вызываемой вирусом HPAI подтипом H5N2 и VNDV у SPF птиц и, с другой стороны, у промышленных бройлеров, имеющих первичный иммунитет к AIV и NDV.
Штаммы, используемые при различных экспериментах по контрольному заражению для измерения эффективности вакцины, были следующими:
(HPAIV-H5N2):
1. Птичий грипп
8,0
Вирус с высокой патогенностью подтипа H5N2, A/chicken/Queretaro/14588-19/95 штамм с титром 10DIEP50%/мл, эквивалентный 100 DLP50%/0,3мл/цыпленка.
2. VNDV
вирус:
8,0
65
Штамм Chimalhuacan штамм, содержащий 10DIEP50%/мл, эквивалентный 10 DIEP50%/0,03мл/цыпленка.
Контрольные заражения были проведены у 35-дневных цыплят (21 день после вакцинации -ДПВ-) в изолированных блоках в INIFAP-CENID-Microbiology, в кабинетах акрилового выделения, имеющих уровень биологической безопасности 3. Для контрольных заражений каждую экспериментальную группу делили на две подгруппы и каждую подгруппу содержали в соответствующем изолированном блоке в соответствии с предварительно установленными методиками биологической безопасности.
HPAIV-H5N2 разбавляли при соотношении 1:10 с помощью PBS при pH 7,2 и 0,06 мл (2 капли) вводили каждому цыпленку в каждый глаз и 0,09 мл (3 капли) в каждую ноздрю, эквивалентно 0,3 мл или 100 DLP50%.
8,5
6,5
Контрольное заражение вирусом VNDV было проведено с помощью введения посредством внутриглазного пути 0,03 мл вирусной суспензии, содержащей 10DIEP50%/мл, эквивалентной 10 DLP50%/птицу.
Для оценки состояния после контрольного заражения (PC) все группы ежедневно проверяли для регистрации смертности и заболеваемости, включая клинические признаки тяжести состояния, обследуя птиц индивидуально в каждой группе каждый день PC (DPC), присваивая им числовое значение в соответствии с критериями в Таблице 1:
ТАБЛИЦА 1
Значения регистрируемых показателей смертности и заболеваемости
Клинические признаки
Умеренные
Тяжелые
Без явных клинических признаков
0
Конъюнктивит
1
2
Конъюнктивит + нахохленное оперение
3
4
Конъюнктивит + нахохленное оперение + прострация
5
6
Смерть
7
Оценку PC в случае с VNDV осуществляли в течение 14 дней, в то время как оценку PC в случае с HPAIV-H5N2 осуществляли в течение 10 дней в соответствии с рекомендациями, предложенными OIE.
Показатель заболеваемости (MI) для каждой группы рассчитывали по уравнению, полученному из данных, соответствующих дню с более тяжелыми клиническими признаками во время периода наблюдения PD.
MI=(A) (100)/B
Где A=сумма всех индивидуальных значений для тяжести повреждения на день наблюдения.
B=максимально возможное значение показателя тяжести клинического состояния в один день.
Эксперименты проводили, как описано ниже.
ПРИМЕР 6A
Контрольные заражения проводили с VNDV и HPAIV-H5N2 на 21 ДПВ в группах птиц SPF птиц, которых иммунизировали, как указано в Таблице 2, инактивированными вакцинами настоящего изобретения, полученными в соответствии с Примерами 5A (Emi Rd-Bive), 5B (Emi Rd-435) и 5C (Emi Rd-Vt). Для целей сравнения, две другие группы иммунизировали двумя эмульгированными промышленными вакцинами против птичьего гриппа и болезни Ньюкасла, полученными из эмульгированного инактивированного цельного вируса, под названиями E. ND/AI-435 и E. ND/AI-Bive, соответственно.
ТАБЛИЦА 2
Иммуногенность у SPF птиц, иммунизированных инактивированными вакцинами, полученными с рекомбинантным вирусом rNDV/LS-H5 с фиксацией (Rd)
Группа
Число цыплят
Введенные вакцины при возрасте 14 дней ПК-путем
Число SPF птиц на штамм контр. заражения, вводимый на 21 ДПВ
VAIAP-H5N2
VVENV
1
50
Emi Rd-Bive
25
25
2
50
Emi Rd-435
25
25
3
50
Emi Rd-Vt
25
25
4
50
E. ND/AI-435
25
25
5
50
E. ND/AI-Bive
25
25
6
50
Положительный контроль
25
25
7
20
Отрицательный контроль
-
-
Результаты иммуногенности против VNDV и HPAIV-H5N2 графически показаны на Фигурах 1 и 2, соответственно.
8,6
8,0
Результаты показывают, что все три рекомбинантные инактивированные вакцины rNDV/LS-H5 с фиксацией, настоящего изобретения, способны обеспечить у SPF цыплят 100% защиту против смертности (M), индуцируемой вирусом VNDV контрольного заражения. Аналогично и независимо от H5-гена, с которым они были клонированы, все три рекомбинантные инактивированные вакцины также обеспечивают 100% защиту против смертности (M) индуцируемой HPAIV-H5N2 (Фигура 2), в равной степени с общепринятыми инактивированными вакцинами, полученными с цельным вирусом, зарегистрированными в настоящее время во всем мире для применения в контроле над ND и AI, которые обычно получают с включением в состав штамм LaSota вируса болезни Ньюкасла с титром, равным 10 DIEP50%/мл, и низкопатогенным вирусом птичьего гриппа с титром, равным 10 DIEP50%/мл, химически инактивированным формальдегидом и эмульгированным в масле. Результаты защиты показывают, что рекомбинантные инактивированные вакцины rNDV/LS-H5 с фиксацией соответствуют Мексиканским и Международным стандартам по их применению для контроля над ND и AI, и тогда эта рекомбинантная версия с фиксацией, настоящего изобретения, оказалась успешной.
ПРИМЕР 6B
ND/AI-435
ND/AI-Bive
Emi-Re-Bive
Emi-Re-435
Emi-Re-Vt
В качестве второго экспериментального проекта для определения эффекта фиксации были проведены контрольные заражения VNDV и HPAIV-H5N2 на 21 ДПВ в группах птиц SPF, которые были иммунизированы, как показано в Таблице 3, двумя промышленными эмульгированными вакцинами против птичьего гриппа и болезни Ньюкасла, полученными с эмульгированным инактивированным цельным вирусом, именуемым E.  и E. , а также тремя эмульгированными инактивированными вакцинами настоящего изобретения, без фиксации, полученными из Примеров 5D (), 5E () и 5F ().
ТАБЛИЦА 3
Иммуногенность у SPF птиц, иммунизированных инактивированными вакцинами, полученными с рекомбинантным вирусом rNDV/LS-H5 без фиксации (Re)
Группа
Число птиц
Введенные вакцины при возрасте 14 дней ПК-путем
Число SPF птиц на штамм контр. заражения, вводимый на 21 ДПВ
HPAIV-H5N2
VVNDV
1
50
Emi Re-Bive
25
25
2
50
Emi Re-435
25
25
3
50
Emi Re-Vt
25
25
4
50
E. ND/AI-435
25
25
5
50
E. ND/AI-Bive
25
25
6
50
Положительный контроль
25
25
7
20
Отрицательный контроль
-
-
Результаты иммуногенности против VNDV и HPAIV-H5N2 графически показаны на Фигурах 3 и 4 соответственно.
Неожиданно результаты показывают, что все три рекомбинантные инактивированные вакцины rNDV/LS-H5 без фиксации, настоящего изобретения, также являются способными к обеспечению у SPF птиц 100% защиты против смертности (M), индуцируемой вирусом VNDV контрольного заражения. Аналогично и независимо от H5-гена, с которым они были клонированы, все три рекомбинантные инактивированные вакцины также обеспечивали 100% защиту против смертности (M), индуцируемой HPAIV-H5N2, в равной степени с рекомбинантными инактивированными вакцинами rNDV/LS-H5 с фиксацией, и общепринятыми эмульгированными вакцинами, полученными с инактивированным цельным вирусом ND/AI-Bive и ND/AI-435.
Результаты из Примеров 6A и 6B показывают, что рекомбинантные инактивированные вакцины, полученные в векторе с фиксацией или без фиксации и с H5-генами AIV различного происхождения и антигенными характеристиками в тестах на HI (H5N2 или H5N1), способны к обеспечению такой же защиты от контрольного заражения с HPAIV-H5N2. Результаты позволяют предположить, что рекомбинантные инактивированные вакцины, полученные с любым Н5-геном AIV, могут обеспечить защиту против контрольного заражения HPAIV с любым из подтипов вируса гриппа, имеющим гемагглютинин H5, причем вид нейраминидазы не имеет значения.
Inactivated mexican H5N2 avian influenza vaccine protects chickens from the asiatic highly pathogenic H5N1 avian influenza virus.
Vaccines, Vaccination and Immunology for avian influenza viruses in poultry.
Avian Influenza
Следовательно, было показано, что настоящее изобретение является эффективным включительно к различным типам нейраминидазы, что согласуется с обнаруженными результатами для традиционных инактивированных вакцин с цельным вирусом (Soto et al., Proceedings of the 56th Western Poultry Disease Conference (WPDC). USA, p. 79. (2007) и Swayne, D. and Kapczynski, D. (2008). In . Ed. By David Swayne. Blackwell Publishing, USA, p. 407-451).
ПРИМЕР 6C
E. ND/AI-435 и E. ND/AI-Bive,
(Emi-Rd-Bive),
(Emi-Rd-435) и
(Emi-Rd-Vt).
Третий эксперимент осуществляли для тестирования вакцин настоящего изобретения у промышленных птиц для симуляции полевых условий, где контрольные заражения были проведены с использованием VNDV и HPAIV-H5N2 на 21 ДПВ у промышленных бройлеров с первичным иммунитетом к ND и AI, которые были иммунизированы, как указано в Таблице 4, двумя эмульгированными промышленными вакцинами против птичьего гриппа и болезни Ньюкасла, полученные с эмульгированным инактивированным цельным вирусом, именуемым а также инактивированными вакцинами настоящего изобретения, полученными в соответствии с Примерами 5A  5B5C
ТАБЛИЦА 4
Иммуногенность у промышленных бройлеров с первичным иммунитетом к ND и AI, иммунизированных инактивированными вакцинами, полученными с рекомбинантным вирусом rNDV/LS-H5 с фиксацией (Rd)
Группа
Число цыплят
Введенные вакцины при возрасте 14 дней ПК-путем
Число промышленных бройлеров на штамм контрольного заражения, вводимый на 21 ДПВ
VAIAP-H5N2
VVNDV
1
50
Emi Re-Bive
25
25
2
50
Emi Re-435
25
25
3
50
Emi Re-Vt
25
25
4
50
E. ND/AI-435
25
25
5
50
E. ND/AI-Bive
25
25
6
50
Положительный контроль
25
25
7
20
Отрицательный контроль
Результаты иммуногенности против VNDV и HPAIV-H5N2 графически показаны на Фигурах 5 и 6 соответственно.
Результаты показывают, что все три рекомбинантные инактивированные вакцины rNVD/LS-H5 с фиксацией, настоящего изобретения, являются способными к обеспечению у промышленных бройлеров, имеющих первичный иммунитет к вирусам ND и AIV, степеней защиты, равных или выше чем 90% от смертности (М), индуцируемой вирусом VNDV контрольного заражения (Фигура 5). Дополнительно и независимо от Н5-гена, с которым они были клонированы, все три рекомбинантные инактивированные вакцины также обеспечивали степени защиты, равные или больше 80% от смертности (М), индуцируемой HPAIV-H5N2, в равной степени с общепринятыми эмульгированными вакцинами, полученными с инактивированными цельными вирусами, применяемыми для контроля над ND и AIV.
Результаты защиты указывают, что рекомбинантные инактивированные вакцины rNDV/LS-H5 с фиксацией, настоящего изобретения, могут успешно применяться для борьбы с HPAI у промышленных бройлеров с первичным иммунитетом к вирусам AIV и ND, при степенях защиты, сходных с теми, которые были обеспечены промышленными вакцинами, полученными с инактивированным цельным вирусом AIV, но имеющих дополнительное преимущество в том, что исключительное применение рекомбинантных активных и неактивных вакцин обеспечивает полную биологическую безопасность, и может быть установлена система DIVA, позволяющая проводить совместное применение программ вакцинации и искоренение AIV.
ПРИМЕР 6D
Для определения эффекта фиксации в реальных полевых условиях были проведены контрольные заражения с использованием VNDV и HPAIV-H5N2 на 21 ДПВ в группах промышленных бройлеров с первичным иммунитетом к ND и AIV, которых иммунизировали, как указано в Таблице 5, двумя эмульгированными промышленными вакцинами против птичьего гриппа и болезни Ньюкасла, полученные с эмульгированным инактивированным цельным вирусом, именуемым Е.ND/AI-435 и Е.ND/AI-Bive, также тремя эмульгированными инактивированными вакцинами настоящего изобретения, без фиксации, полученными в соответствии с Примерами 5D (Emi-Re-Bive), 5Е (Emi-Re-435) и 5F (Emi-Re-Vt).
ТАБЛИЦА 5
Иммуногенность у промышленных бройлеров, имеющих первичный иммунитет к ND и AIV, иммунизированных инактивированными вакцинами, полученными с рекомбинантным вирусом rNDV/LS-H5 без фиксация (Re)
Группа
Число цыплят
Введенные вакцины при возрасте 14 дней ПК-путем
Число промышленных бройлеров на штамм контрольного заражения, вводимый на 21 ДПВ
HPAIV-H5N2 WNDV
1
50
Emi Re-Bive
25
25
2
50
Emi Re-435
25
25
3
50
Emi Re-Vt
25
25
4
50
E.ND/AI-435
25
25
5
50
E.ND/AI-Bive
25
25
6
50
Положительный контроль
25
25
7
20
Отрицательный контроль
-
-
Результаты иммуногенности против VNDV и HPAIV-H5N2 графически показаны на Фигурах 7 и 8 соответственно.
Неожиданно, результаты показывают, что все три рекомбинантные инактивированные вакцины rNVD/LS-H5 без фиксации также являются способными к обеспечению у промышленных бройлеров, имеющих первичный иммунитет, степеней защиты, равных или выше, чем 90% от смертности (М), индуцируемой вирусом VNDV контрольного заражения (Фигура 7), в равной степени и независимо от Н5-гена, с которым все три рекомбинантные инактивированные вакцины были клонированы, все также обеспечивали степени защиты, равные или больше 80% от смертности (М), индуцируемой HPAIV-H5N2, подобно рекомбинантным инактивированным вакцинам rNDV/LS-Н5 с фиксацией и общепринятым эмульгированным вакцинам, полученным с инактивированными цельными вирусами ND/AI-Bive и ND/AI-435.
Эти исследования подтверждают успех настоящего изобретения, поскольку было доказано, что рекомбинантные вакцины против AIV в инактивированной форме, с использованием эмульсии или фармацевтически приемлемых носителя, адъюванта или эксципиента для их применения у подверженных птиц, обеспечивают превосходный иммунный ответ, способный к предоставлению степеней защиты, равных 100%, к контрольным заражениям с HPAIV у SPF цыплят и выше 80% у бройлеров, имеющих первичный иммунитет к вирусам ND и AIV, причем данный результат противоречит тому, и не предполагалось, что при репликации рекомбинантного вируса у иммунизированной птицы является существенным для белка, представляющего интерес, экспрессировать себя в достаточном количестве для получения подходящего иммунного ответа у птицы.
Применение инактивированных вакцин является существенным для достижения подходящей защиты на полевом уровне для предотвращения смертности, вызываемой HPAIV и VNDV, поскольку в полевых условиях при промышленной эксплуатации птицеводства, применение только общепринятой активной вакцины против ND или рекомбинантной активной против AIV может быть недостаточным.
Несмотря на то, что конкретные варианты осуществления изобретения были иллюстрированы и описаны, следует учитывать, что возможны их некоторые модификации, что касается используемого штамма вируса AIV или аденовируса, применяемых типа эмульсии или носителя. Следовательно, настоящее изобретение не должно рассматриваться как ограниченное, исключая сведения из предшествующего уровня техники и прилагаемой формулы изобретения.
ПРИМЕР 7
Получение вектора подтипа 5 свиного аденовируса
Для клонирования генома подтипа 5 Свиного Аденовируса (Ad5) и получения вирусного вектора или инфекционного клона из него осуществляли амплификацию ПЦР левых и правых концов генома из экстрагированной формы ДНК вируса Ad5, выращенного в клетках ST. Оба амплифицированных конца затем клонировали на сайте Pacl pBg-вектора. Новую плазмиду pBg-Izq-Der затем обрабатывали и линеаризовали перед рекомбинацией с вирусной ДНК из генома Ad5 в бактериях BJ5183 посредством стандартной методики бактериальной трансформации. Геном Ad5 клонировали таким образом в плазмиде pBg, получая новый аденовирусный вектор pBg-Ad5.
ПРИМЕР 8
Получение свиного промежуточного вектора для клонирования генов, представляющих интерес
Для клонирования гена S1 вируса свиного гастроэнтерита (GET) в аденовирусный вектор pBg-Ad5 первоначально необходимо построить промежуточный вектор. По этому концу вирусная ДНК от Ad5 была обработана ферментом Mlul для выделения полосы “B”, соответствующей области Е3, которая не является существенной для репликации Ad5 и, следовательно, может быть удалена, или, в данном случае, “замещена” геном, представляющим интерес. Полосу “B” сначала клонировали в плазмиде pJET. Позже ее субклонировали в векторе pTRE, имеющем 2 единичных сайта рестрикции по концам (lCeu-l и Pl-Scel), получая, таким образом, вектор pTRE-B. Чтобы иметь возможность клонировать ген, представляющий интерес, или экспрессионную кассету интересующего гена только сайт Swal вводили в полосу “B”, получая, таким образом, плазмиду pTRE-B-Swal.
На основании данной методики получали эмульгированную рекомбинантную инактивированную вакцину в векторе (PadV5)- c геном S1-Purdue (GET) в фармацевтической готовой форме вода/масло/вода, которую назвали PadV5-S1GET.
ПРИМЕР 9
Клонирование гена S1 из вируса свиного инфекционного гастроэнтерита (GET)
Для клонирования гена S1 из вируса GET экстракцию полной вирусной РНК осуществляли триазольным методом. Эту полную РНК очищали для более позднего применения в синтезе кДНК (комплементарной ДНК), и, посредством применения специфических олигонуклеотидов с помощью метода ПЦР, 2.2 Кb гена S1 из вируса GET были амплифицированы. Ген S1 далее вставляли в вектор pGEM-T, применяя стандартные методы клонирования, посредством чего получали плазмиду pGMET-2.2 S1. Для построения экспрессионной кассеты для гена S1 и обеспечения его промотором (CMV), чтобы направить транскрипцию гена S1 и сигнала poliA к их окончанию, указанный ген S1 субклонировали в плазмиду pVAX, таким образом, получая плазмиду pVAX-2.2S1.
ПРИМЕР 10
E. coli
Клонирование гена S1 вируса GET в геноме Ad5 посредством гомологичной рекомбинации в
A: Субклонирование гена S1 в промежуточном векторе pTRE-B-Swal:
экспрессионную кассету, образованную промотором CMV-2,2Kb гена S1 и сигнальную последовательность poliA обрабатывали и экстрагировали из pVAX-2,2 S1 и клонировали в сайте Swal промежуточной аденовирусной плазмиды для генерации плазмиды pTRE-B-Swal-2.2 S1.
E. coli
B: Введение экспрессионной кассеты в вектор pBgAd5 посредством гомологичной рекомбинации в
Экспрессионную кассету CMV-2.2-PoliA вместе с плечами для рекомбинации с Ad5 получали посредством обработки промежуточной плазмиды ферментами lCeu-l и Pl-Scel. Обработанный фрагмент был очищен и трансформирован вместе с плазмидой pBgAd5, производя, таким образом, инфекционный клон Ad5, имеющий экспрессионную кассету с геном S1 GET внутри аденовирусной области Е3, получая посредством этого клон pAd5-2.2S1.
ПРИМЕР 11
Получение рекомбинантного вируса pAd5-2.2S1 в клеточной культуре
2
Клетки ST, выращенные до слияния, равного 90% при 37°С в атмосфере 5% СО, трансфицировали 5 микрограммами (мкг) ДНК из клона pAd5-2.2S1, прежде обработанного Pacl, так, что только Ad5, содержащий экспрессионную кассету с геном S1, вводили в клетки. Трансфицированные клетки наблюдали каждые 24 часа до появления цитопатического эффекта. На шестой день как супернатант, так и клетки извлекали и подвергали 3 циклам замораживания и оттаивания. Супернатант извлекали и применяли для инфицирования свежих клеток. Проводили два пассажа через клетки ST до тех пор, пока вирус не достигал достаточного вирусного титра для проведения тестов ПЦР, чтобы обнаружить вставку 2.2 Kb, а также вектор Ad5 (волокнистый ген). Как только тесты показали положительные результаты, полученный вирус, названный padV5-S1GET, использовали для приготовления вакцины.
ПРИМЕР 12
Способ производства эмульгированной инактивированной вакцины с рекомбинантным вирусом из Ad5, со вставкой S1 вируса GET: PadV5-S1GET
Получение антигена
Начиная с засевания для получения, линию клеток ST инокулировали ранее определенной инфицирующей дозой. Культуру клеток инкубировали при 37°С в течение периода, равного 5 дням, ежедневно проверяя слияние клеток и ЕСР. После этого периода сборы замораживали (-70°С) при трех различных моментах времени и клеточную жидкость собирали в асептических условиях. Клеточную жидкость осветляли посредством центрифугирования и отбирали супернатант, титровали DICC50% и инактивировали формальдегидом, несмотря на то, что может применяться любой другой физический или химический инактивирующий агент, обычно применяемый для данного вида вакцин. Супернатант подвергали тестам для определения его инактивации, чистоты и стерильности.
Получение эмульсии
Вакцину получали в эмульсии типа вода-масло-вода (ВМВ). При получении масляной фазы применяли минеральное масло, а также поверхностно-активные вещества типа Спан 80 и Твин 80. Для получения водной фазы супернатант смешивали с раствором консерванта (тимеросала). Для получения эмульсии, водную фазу медленно добавляли в масляную фазу при постоянном перемешивании и далее вторую водную фазу получали, используя такую же методику. Для достижения установленного размера частиц использовали гомогенизатор или коллоидную мельницу.
Содержание антигена
6,1
Вакцину составляли с получением минимально 10DICC50%/0,5 мл, чтобы использовать дозу, равную 2,0 мл на свинью.
Основываясь на указанной выше методике, получали эмульгированную рекомбинантную инактивированную вакцину, в векторе (PadV5) с геном S1-Purdue (GET) в фармацевтической форме вода/масло/вода, которую назвали pAdV5-S1GET.
ПРИМЕР 13
in vivo
Оценка иммуногенности для рекомбинантных вакцин в векторе (PadV5) подтипа 5 свиного аденовируса для гена S1 из вируса свиного инфекционного гастроэнтерита (GET)
Для определения эффективности эмульгированных рекомбинантных вакцин настоящего изобретения и для доказательства того, что они могут быть получены с геном S1, клонированным из штамма Purdue вируса GET, тестировали их эффективность по предотвращению смертности, вызываемой вирусом GET у SPF свиней.
Контрольные заражения проводили при среднем возрасте свиней, равном 98 дней (56 ДПВ), в изолированных блоках INIFAP-CENID-Microbiology, при уровне 2 биологической безопасности помещений. Для проведения контрольных заражений каждую экспериментальную группу локализовали в соответствующих изолированных блоках с последующими предварительно установленными процедурами биологической безопасности.
5,0
Вирус GET разбавляли при подходящем соотношении с помощью PBS при рН 7,2, и пероральную дозу, равную 2,0 мл/свинью, вводили каждой свинье, эквивалентно 10 DICC50%/мл.
Для оценки PD все группы ежедневно наблюдали для регистрации смертности и заболеваемости, включая тяжесть клинического состояния, следовательно, свиней в каждой группе проверяли индивидуально каждый ДПД, присваивая им числовое значение в соответствии с критериями в Таблице 6
ТАБЛИЦА 6
Значения регистрационных записей для смертности и заболеваемости
Клинические признаки
Присвоенные числа
1. ВНЕШНИЙ ВИД
a. Нормальный
0
b. Депрессивный
1
c. Возбужденный
2
d. Коматозный/мертвый
3
2. ДЫХАНИЕ
a. Нормальное
0
b. Чихание
1
c. Кашель
1
d. Быстрое/короткое
2
e. Одышка
3
3. ФЕКАЛИИ
a. Нормальные
0
b. Сухие
1
c. Рыхлые
2
d. Жидкие
3
4. ГЛАЗА
a. Нормальные
0
b. Водянистые
1
c. Сухие
2
d. Запавшие
3
5. НОЗДРИ
0
a. Нормальные
1
b. С водными выделениями
2
c. Красные/воспаленные
3
d. Покрытые струпьями/изъязвленные
6. РОТ
a. Нормальный
0
b. С пеной
2
c. Язвы
3
7. АКТИВНОСТЬ
Неприменимые
8. АППЕТИТ
a. Нормальный
0
b. Пониженный
1
c. Анорексия
3
9. ДРУГОЕ
Краткое описание
Оценку PD в случае вируса GET проводили в течение 15 дней, в соответствии с рекомендациями, предложенными OIE.
Показатель заболеваемости (MI) для каждой группы рассчитывали из средних значений клинических наблюдений для каждой группы, выраженный в виде процента и отнесенный к 100%.
Вследствие специфических характеристик вируса GET и заболевания, которое он продуцирует (он не вызывает смертности по возрасту), тест на иммуногенность осуществляли посредством обнаружения антител, нейтрализующих вирус, против вируса GET и сравнения их с антителами, продуцируемыми живой рекомбинантной
вакциной против GET. Тест считали удовлетворительным, когда вакцинированные группы представляли различие, равное, по меньшей мере, 2 log основания 2, в сравнении с невакцинированными группами, аналогично, определяли существующее различие между вакцинированными группами, когда между ними было различие, равное, по меньшей мере 2 log основания 2.
ПРИМЕР 13А
5,0
Контрольные заражения проводили с штаммом Purdue вируса GET при титре, равном 10 DICC 50%/мл, 2,0 мл перорально/свинью, в группе свиней SPF (без специфических патогенов), которых иммунизировали, как указано в Таблице 7, инактивированной вакциной настоящего изобретения, полученной в соответствии с Примером 12.
ТАБЛИЦА 7
Иммуногенность у свиней, иммунизированных инактивированными вакцинами, полученными с рекомбинантным вирусом PadV5-S1GET (rGET)
Группа
Число свиней
Вакцины, вводимыев возрасте 21 и 35 дней
Число свиней на штамм контр. заражения, вводимый на 56 ДПВ
Штамм GET-Purdue
1
15
PadV5-S1GET
15
2
5
Невакцинированные(отрицательный контроль)
0
3
5
Невакцинированные (положительный контроль)
5
4
10
Живая rGET
10
Результаты иммуногенности против GET показаны на Фигурах 9, 10 и 11.
Результаты указывают на то, что рекомбинантная инактивированная вакцина rGET (PadV5-S1GET) настоящего изобретения является способной к обеспечению у SPF свиней 100% защиты от смертности (М), индуцированной штаммом Purdue вируса контрольного заражения GET, в равной степени с инактивированными общепринятыми вакцинами, полученными с цельным вирусом, в настоящее время зарегистрированными во всем мире для применения в борьбе с GET, при оценке посредством теста по сывороточной нейтрализации вируса - ВСН- (Фигура 11 и Таблица 8). Результаты защиты указывают на то, что рекомбинантная инактивированная вакцина PadV5-S1GET соответствует мексиканским и международным правилам, чтобы применяться для борьбы со Свиным Инфекционным Гастроэнтеритом, доказывая, таким образом, что эта рекомбинантная инактивированная версия настоящего изобретения является успешной.
ТАБЛИЦА 8
Титры ВСН для рекомбинантной живой вакцины, контрольных групп и рекомбинантной инактивированной вакцины rGET (PadV5-S1GET)
Обработка
Титр на ВСН log основания 2
Различия в log основания 2
GET
Отрицательный контроль
Рекомбинантная живая вакцина
Невакцинированные(отрицательный контроль)
3,04
НО
НО
Невакцинированные (положительный контроль)
3,6
НО
НО
Живая rGET
5,3
2,26
НО
ИнактивированнаяPadV5-S1GET
7,46
4,42
2,16
Несмотря на то, что конкретные варианты осуществления изобретения были иллюстрированы и описаны, следует учитывать, что возможны их некоторые модификации, что касается используемого штамма вируса AI или аденовируса, применяемых типа эмульсии или носителя. Следовательно, настоящее изобретение не должно рассматриваться как ограниченное, исключая сведения из предшествующего уровня техники и прилагаемой формулы изобретения.