Способ повышения жизнеспособности лактобактерий
METHOD FOR INCREASING VIABILITY OF LACTOBACILLI

Изобретение относится к микробиологии и сельскому хозяйству, а конкретно к способу повышения устойчивости микроорганизмов на основе молочнокислых бактерий для получения пробиотической добавки с целью повышения мясной продуктивности птицы.
Современное птицеводство многими путями решает проблему максимальной реализации биоресурсного потенциала птицы и сохранения при этом ее продуктивного здоровья. Ускорение динамики роста и повышение суточных приростов живой массы птицы при снижении экономических затрат на 1 кг прироста живой массы тела является одной из основных задач птицеводства.
Немаловажным показателем пробиотических свойств молочнокислой флоры является их способность колонизировать желудочно-кишечный тракт, а также их резистентность к биологическим жидкостям организма-хозяина (Выделение и отбор бактерий рода Lactobacillus - основы пробиотических препаратов / И.А. Буряко [и др.] // Пробиотики, пребиотики и синбиотики и функциональные продукты питания: мат. Междунар. конф. - М., 2004. - С. 19; Андрейчин, М.А. Антимикробные свойства желчи и желчных кислот / М.А. Андрейчин // Антибиотики. - 1980. - №25 (12). - С. 936-939; Петров Л.Н. Основы конструирования пробиотиков повышенной терапевтической активности / Л.Н. Петров // Пробиот. микроорганизмы - современное состояние вопроса и перспективы использования: тез. докл. Междунар. науч.-практ. конф. - М., 2002. - С. 12). Последний показатель возможно визуализировать in vitro путем использования экспериментальных агрессивных сред (Кощаев А.Г. Биотехнология производства и применение функциональных кормовых добавок для птицы: дис. докт. биол. наук: 16.00.04 / Кощаев А. Г. - 2008. - 425 с.).
Известен способ, предусматривающий внесение в питательную среду пектина, из расчета 5-6 г/л (0,5-0,6%), обеспечивающего накопление биомассы микроорганизмов и придачу кисломолочному продукту пребиотических свойств (Патент РФ №2023396, МПК А23С 9/12, А23С 9/127, 02.03.1993 г.).
Недостатком способа является отсутствие информации о виде пектина, его консистенции, при какой температуре он добавляется, что в целом не может гарантировать положительный результат.
2
4
Известен способ, предусматривающий применение в составе рациона перепелов пробиотической добавки, состоящей из мелассы кормовой, КНРО, дрожжевого экстракта и воды (Интенсификация процесса культивирования физиологически-адаптированных штаммов лактобацилл как основа создания биопрепаратов микробного происхождения для птицеводства / А.Г. Кощаев, Ю.А. Лысенко, Мищенко В.А. [и др.] // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. - 2017. - №04 (128). - С. 1102-1115).
Наиболее близким является техническое решение, в котором используют питательную среду для культивирования Lactobacillus salivarius, состоящей из мелассы кормовой, К2НРО4 и дрожжевого экстракта (Патент РФ №2698213, МПК А23К 50/70, А23К 10/33, А23К 10/18, 23.08.2019 г.).
Недостатком данного способа является то, что при использовании данной пробиотической добавки в рационе птицы будет происходить гибель живой культуры микроорганизма из-за агрессивной среды желудочно-кишечного тракта.
Техническим результатом является повышение устойчивости молочнокислых культур, за счет использования в питательной среде порошкообразного яблочного пектина.
2
4
Технический результат достигается тем, что в способе повышения жизнеспособности лактобактерий, в питательную среду для культивирования Lactobacillus salivarius, состоящей из мелассы кормовой, КНРО, дрожжевого экстракта и воды, согласно изобретению при температуре 30-40°С питательной среды добавляют порошкообразный яблочный пектин из расчета 2,0-4,0 г на 1 л воды.
Новизна заявляемого технического решения обусловлена тем, что используется мелассная среда, отличающаяся включением в ее состав порошкообразного яблочного пектина из расчета 2,0-4,0 г на 1 л воды при температуре 30-40°С для равномерного распределения и полного растворения.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемых технических решений критерию «новизна».
Соответствие заявляемого решения критерию патентоспособности «промышленная применимость» обусловлено тем, что предлагаемое техническое решение работоспособно и возможно его использование в качестве пробиотической добавки для сельскохозяйственной птицы.
Способ повышения жизнеспособности лактобактерий воспроизводится следующим образом.
2
4
5
Культивирование микроорганизмов Lactobacillus salivarius осуществляют в среде, состоящей из мелассы кормовой - 45,0 г, КНРО - 2,0 г, дрожжевого экстракта - 0,02 г и порошкообразного яблочного пектина, взятого в количестве 3,0 г в расчете на 1 литр воды и внесенного в питательную среду при температуре 30-40 С для равномерного его распределения и полного растворения. Затем в полученную смесь добавляют микроорганизмы Lactobacillus salivarius с титром не менее 1,0×10 КОЕ/мл в количестве 100,0 г/л и культивируют при температуре 37 С, в течение 24 ч.
При использовании порошкообразного яблочного пектина в количестве менее 3,0 г/л, не будет обеспечиваться максимальной жизнеспособности культур в пробиотической добавке.
При использовании порошкообразного яблочного пектина в количестве более 3,0 г/л, достигается та же жизнеспособность культур в пробиотической добавке, поэтому не имеет смысла брать большее количество.
При внесении порошкообразного яблочного пектина в питательную среду при температуре ниже 30°С не происходит его полного растворения и равномерного распределения, что соответственно не приводит к желаемому эффекту для микроорганизмов.
При внесении порошкообразного яблочного пектина в питательную среду при температуре выше 40°С происходит частичное разрушение пектина, что соответственно не приводит к желаемому эффекту для микроорганизмов.
Первый этап исследований включает изучение выращивания бактерий на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов без применения пектина. Устойчивость лактобактерий визуализировали по наличию или отсутствию роста изучаемой микрофлоры в жидкой питательной среде (мелассной), содержащей натуральный желудочный сок лошади (препарат «Эквин», 90%), желчь крупного рогатого скота медицинская консервированная (20%, 30%, 40%), фенол (0,4%) и NaCl (2%, 4%). Время выращивания культуры составляло 48 ч, температурный оптимум 37°С.
Результаты по влиянию агрессивных сред на выживаемость лактобактерий без применения полисахаридного компонента (пектина) представлены в таблице 1.
Результаты исследований показали, что культуры изучаемых лактобактерий проявили хороший рост только на среде с содержанием 2,0 и 4,0% хлорида натрия, а также при наличии в среде желчи в концентрации 20%. Незначительный рост дала культура на питательной среде, содержащей 30% желчи. В остальных случаях рост исследуемой культуры не проявился.
Следующим этапом исследований является обоснование использования порошкообразного яблочного и цитрусового пектинов для выращивания Lactobacillus salivarius на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов. Выбор пектинов обусловлен тем, что на данные пектины существует стандарт, позволяющий их применять для пищевых целей («ГОСТ 29186-91. Пектин. Технические условия»).
Для проведения эксперимента микроорганизмы Lactobacillus salivarius выращивали на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов с применением различных доз порошкообразного яблочного пектина:
2
4
1. Состав среды №1: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 1,0 г/л.
2
4
2. Состав среды №2: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 2,0 г/л.
2
4
3. Состав среды №3: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 3,0 г/л.
2
4
4. Состав среды №4: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 4,0 г/л.
2
4
5. Состав среды №5: 45 г/л мелассы кормовой, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, яблочный пектин - 5,0 г/л.
Результаты влияния различных доз полисахарида растительного происхождения (яблочного пектина) на устойчивость лактобактерий Lactobacillus salivarius к агрессивным средам представлены в таблице 2.
Из таблицы 2 видно, что наилучшие результаты исследований проявились с применением в составе питательной среды, на которой выращивали изучаемые лактобактерий, яблочного пектина в дозе - 3,0; 4,0 и 5,0 г/л. В дозе 2,0 г/л яблочного пектина в составе мелассной среды выявлена устойчивость ко всем растворам NaCl и желчи, также незначительный рост в среде, содержащей 0,4% фенола, однако наблюдалось отсутствие роста в желудочном соке. При дозе 1,0 г/л яблочного пектина в составе питательной среды выявлена жизнеспособность как без отсутствия пектина.
Третьим этапом исследований является изучение выращивания Lactobacillus salivarius на мелассной питательной среде с добавлением в ее состав агрессивных компонентов с применением различных доз порошкообразного цитрусового пектина:
2
4
1. Состав среды №1: 45 г/л мелассы кормовой, KHPO - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 1,0 г/л.
2
4
2. Состав среды №2: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 2,0 г/л.
2
4
3. Состав среды №3: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 3,0 г/л.
2
4
4. Состав среды №4: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 4,0 г/л.
2
4
5. Состав среды №5: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, цитрусовый пектин - 5,0 г/л.
Результаты влияния различных доз полисахарида растительного происхождения (цитрусового пектина) на устойчивость лактобактерий Lactobacillus salivarius к агрессивным средам представлены в таблице 3.
Из таблицы 3 видно, что наилучшие результаты исследований проявились с применением в составе питательной среды, на которой выращивали изучаемые лактобактерий, цитрусового пектина в дозе - 5,0 г/л.
2
4
Результаты проведенных исследований показали, что наиболее эффективной и оптимальной питательной средой является мелассная среда следующего состава: 45 г/л мелассы кормовой, КНРО - 2 г/л, дрожжевого экстракта - 0,02 г/л, порошкообразного яблочного пектина - 3,0 г/л и остальное вода. Разработанная пробиотическая добавка может быть использована в производственных условиях при кормлении сельскохозяйственной птицы, в частности для перепелов.
Для доказательства эффективности полученной пробиотической добавки на основе микроорганизмов Lactobacillus salivarius, выращенных на мелассной среде с добавлением порошкообразного яблочного пектина были проведены научные исследования на перепелах породы Фараон.
Методом групп аналогов было сформировано пять групп перепелов по 200 голов в каждой: контрольная группа - в рационе присутствовал только основной полноценный комбикорм и питьевая вода; 1-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали разработанную пробиотическую добавку в дозе 0,25 мл/гол; 2-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,5 мл/гол; 3-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 0,75 мл/гол; 4-я опытная группа - с основным рационом и питьем воды птице, также выпаивали пробиотическую добавку в дозе 1,0 мл/гол. Применение пробиотической добавки в опытных группах осуществлялось ежедневно (таблица 4).
Перепела выращивались в полупромышленных многоярусных металлических клетках.
Результаты хозяйственных показателей при выращивании перепелов представлены в таблице 5.
Изучение сохранности птиц в процессе их выращивания (56 дней) показало, что наибольшая выживаемость птиц зафиксирована в экспериментальных группах. Так, наибольший уровень сохранности был зафиксирован во второй и третьей опытных группах и составил 98,5%, в первой и четвертой группах - 95,5 и 97,5%, соответственно. Из данных таблицы видно, что самый низкий показатель сохранности птицы (93,5%) зафиксирован в контрольной группе.
Установлено, что показатели живой массы перепелов в течение первой недели жизни имели незначительную тенденцию к увеличению в опытных группах. Так в 1-й, 2-й, 3-й и 4-й опытных группах на 7-е сутки выращивания данный показатель был незначительно выше, чем в контрольной на 1,2; 2,4; 2,9 и 1,7%, соответственно. Аналогичная картина отмечалась до 35-х суток выращивания птицы. При этом к 42-дневному возрасту и до конца эксперимента у перепелов 2-4-й опытных групп была установлена статистически достоверная разница по изучаемому показателю по отношению к контрольной группе птиц. При взвешивания перепелов на 42-е сутки установлено, что масса птиц во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах была достоверно выше, чем в контрольной на 6,9; 7,4 и 6,5% (Р<0,05). При этом в 1-й опытной группе в данный период и до конца опыта, статистически достоверной разницы не выявлено, но наблюдалась положительная динамика в изучаемом показателе в сравнении с контрольной группой. На 49-е сутки выращивания живая масса перепелов 2-4-й опытных групп была выше, чем в контрольной на 6,8; 6,6 и 6,4% (Р<0,05). На 56-й день были также зафиксированы достоверные различия во 2-й, 3-й и 4-й опытных группах в сравнении с контрольной и были выше на 7,2; 6,9 и 6,4% (Р<0,05), соответственно. В то время как масса перепелов 1-й опытной группы на 4,4% превышала данные показатели контрольной.
При расчете прироста живой массы за весь период выращивания птицы установлено, что в опытных группах изучаемый показатель превосходит идентичный показатель в контрольной группе: на 4,6% - в 1-й опытной группе; во 2-й группе на 7,4%; в 3-й - 7,1% и в 4-й - 6,6%.
Анализ конверсии показал, что в контрольной группе на 1 кг прироста требуется 3,31 кг комбикорма, в то время как в 1-4-й опытных группах необходимо 3,31; 3,25 и 3,28 кг. Из полученных данных следует, что оптимальное значение показателя было выявлено во 2-й опытной группе, что на 1,8% ниже по отношению к показателям контроля. В 3-й и 4-й опытных группах значение показателя было ниже на 0,9%. Показатели конверсии в контрольной и 1-й опытной группах идентичны.
Таким образом, результаты испытаний показали, что выращивание перепелов с использованием разработанной пробиотической добавки на основе культуры Lactobacillus salivarius, а также выращенная на мелассной среде с добавлением порошкообразного яблочного, в испытуемых дозах обеспечивает повышение продуктивности перепелов, за счет повышения устойчивости микроорганизмов Lactobacillus salivarius к агрессивным средам ЖКТ птицы.