Клинико-диагностические аспекты верификации мышечной дистрофии дюшенна

заболеваниях печени. Автореф дисс. канд. мед. наук, Астрахань, 1999, 24 с.

6. Камалов Ю.Р., Северов М.В., Олейникова Е.Б. Значение ультразвукового исследования вен портальной системы для выявления синдрома портальной гипертензии у больных циррозом печени, 1-й Съезд Ассоциации специалистов ультразвуковой диагностики в медицине. Тезисы докладов, М., 1991, с. 96.

7. Кунцевич Г.И., Скуба Н.Д., Белолапотко Е.А. Роль комплексного ультразвукового исследования в дифференциальной диагностике очаговых образований печени. Методические рекомендации, М., 1997, 23 с.

8. Кунцевич Г.И., Белолапотко Е.А. Цветное допплеровское картирование и импульсная допплерография абдоминальных сосудов. В кн: Ультразвуковая допплеровская диагностика сосудистых заболеваний. Под ред. Никитина Ю.М. и Труханова А.И. М., 1998, с. 297-329.

9. Bolondi L, Gaiani S., Barbara L. Doppler flowmetry - clinical applications in portai hypertensive patients. Portal hypertension (clinical and physiological aspects). Springer Verlag, 1991, Ch.13, p. 161-182.

10. Koslin D.B., Berland L.L. Duplex Doppler examination of the liver and portal venous system. J. Clin. Ultrasound, 1987, 15: 675-686.

11. Seitz К., Wermke W., Haag К. Sonography in Portal Hypertension and TIPS. Freiburg, 1998, 64.

12. Кунцевич Г.И. Ультразвуковая диагностика в абдоминальной и сосудистой хирургии// Минск. - Кавалер Паблишерс. - 1999. - С.9

13. Левитан Б.Н., Гринберг Б.А. Особенности портального кровотока при хронических гепатитах и циррозах печени//Визуализация в клинике.-№18.- 2001.- С.16-20.

14. Цвибель В.Д., Пеллерито Д.С. Ультразвуковое исследование сосудов. Пер. с англ.//М.-Видар.- 2008.- С.-551-569.

Материал поступил в редакцию 28.07.2012 г.

УДК 61:575 Ж. Абдрахманова

АО «Медицинский университет Астана», г. Астана, Казахстан

клинико-диагностические аспекты верификации мышечной дистрофии дюшенна

Стремительный прогресс в расшифровке генома человека и идентификации генов, а также успехи биотехнологии делают актуальной разработку научных основ генной терапии тяжелых наследственных заболеваний.

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее частым нервно-мышечным наследственным заболеванием человека. Частота встречаемости составляет 1 на 5000 новорожденных мальчиков [1]. Отсутствие эффективного медикаментозного лечения делает актуальной разработку новых методов диагностики и геноте-рапевтических подходов к лечению.

МДД относится к группе прогрессирующих генетических обусловленных миопатий и является наиболее частым среди слепленных с полом рецессивных заболеваний человека. Так как это заболевание сцеплено с полом, им страдают почти исключительно мальчики, тогда как женщины с поврежденным геном в одной из Х-хромосом являются бессимптомными но-

сительницами заболевания. Около 95% МДД пациентов диагностируются до 6 лет [2]. Заболевание характеризуется прогрессирующим нарастанием мышечной слабости, которая сначала захватывает проксимальные мышцы нижних конечностей, затем распространяется на тазовый пояс, туловище и, в меньшей степени, на плечевой пояс и проксимальные мышцы верхних конечностей. Некоторые мышцы, особенно икроножные, а также дельтовидные, первоначально демонстрируют местную гипертрофию, позднее развивается псевдогипертрофия с замещением мышечных волокон соединительной и жировой тканью. На ранних этапах заболевания наблюдается повышенная утомляемость при ходьбе, трудности при поднимании по лестнице, изменяется походка. При МДД пациенты перестают ходить до возраста 13 лет, а к 20-25 лет больные, как правило, умирают от дыхательной или сердечной недостаточности. Приблизительно в 2/3 случаев сын получает хромосому с повреж-

денным геном от матери-носительницы, которая фенотипически здорова.

Гистологические исследования мышечной ткани обнаруживают патологию почти сразу после рождения, показывая некроз коротких сегментов мышечных фибрилл, сопровождающийся регенерацией фибрилл с возрастом регенерация становится все менее эффективной и происходит развитие плотной соединительной и жировой тканей между пучками фибрилл [3]. Этот процесс обуславливает наблюдаемую у большинства пациентов мышечную псевдогипертрофию, когда значительно увеличенные мышцы состоят в основном из фиброзной и жировой тканей.

Обобщая вышеизложенное, отметим, что МДД - это заболевание мышечной ткани, которое относится к наиболее частым моногенным наследственным заболеваниям, развивается по прогрессирующему типу и имеет Х-сцепленный характер наследования и гистологически заболевание выражается в дегенерации мышечных фиброцит с замещением их плотной соединительной тканью.

Характерной особенностью МДД является отсутствие четко выраженного метаболического дефекта, и поэтому долгое время причина патологии на биохимическом уровне не была ясна. Однако доказано, что заболевание сопровождается повышением уровня мышечных энзимов, в частности креатинфосфокиназы в сыворотке крови. У носительниц поврежденного гена уровень креатинфосфокиназы повышен незначительно и примерно каждая третья облигатная носительница имеет нормальный уровень КФК в крови [4].

В 1988 году методом «обратной генетики» был идентифицирован белковый продукт гена, ответственного за проявление болезни. Методами молекулярной генетики ген дистрофина (ГД) был картирован в средней части короткого плеча Х-хромосомы (Хр21) и оказался самым крупным из всех известных генов млекопитающих. Он состоит из 79 экзонов, его размер около 2,5 м.н.п. В 50-60% случаев манифестация МДД связана с достаточно крупными делециями [5].

Накоплены обширные данные в отношении делеционных спектров в различных популяциях мира, установлены пределенные популяци-онные различия. Изучение спектров делеций в гене дистрофина с точной локализацией их де-леционных точек разрыва представляет собой уникальную возможность для выяснения механизмов крупных перестроек на молекулярном уровне. Характер локализации делеции относительно функционально важных доменов дистрофина, а также эффект ее влияния на трансля-

ционную рамку считывания позволяет провести анализ корреляции клинических проявлений пациентов МДД и типа генетического изменения в ГД [6,7,8,9].

Исследование мутаций в ГД необходимо для проведения прямой ДНК-диагностики у больных МДД: дифференциальной, пресимтоматической и пренатальной. Изучение мутаций является также обязательным условием для прямой диагностики носительства в семьях высокого риска для женщин - родственниц больных МДД. Традиционно используемые для этой цели методы (например, анализ родословной, определение уровня креатинфосфокиназы в сыворотке крови) могут быть существенно уточнены и дополнены результатами молекулярно-генетического обследования, в частности, данными мПЦР, mSSCP, анализа наследования аллелей внутригенных полиморфных ДНК-маркеров [10].

Мутационная частота для ГД составляет 1 на 104 Х-хромосом и является самой высокой среди известных наследственных моногенных нозологий. Приблизительно 1/3 всех случаев МДД связана с мутациями de novo. Рекомбина-ционная частота гена в 4 раза выше, чем можно предполагать исходя из его длины. Все эти факты говорят об отсутствии накопления в популяции мажорных мутаций или определенных му-тантных гаплотипов. В связи с такими особенностями ГД прямая ДНК-диагностика сталкивается с необходимостью выявления индивидуальных мутаций в каждой отдельной семье [11,12,13].

Приблизительно 1/3 пациентов МДД крупные перестройки, такие как делеции или дупликации, в гене отсутствуют. Выявление точковых мутаций, а также маленьких делеций и дупликаций чрезвычайно затруднено огромными размерами гена. В настоящее время разработка новых технологий обнаружения точковых мутаций позволила успешно проводить их скрининг [14]. Первые удачные результаты по клонированию гена были получены с применением подхода выделения фаговых клонов из Х-хромосомных библиотек. Были найдены ДНК-зонды, тесно сцепленные с МДД. Таким методом были выделены проксимальный клон 754 и несколько дисталь-ных зондов: C7, B24. Ни один из этих зондов не принадлежит непосредственно локусу МДД и не дает возможность изучить мутации в этом гене, однако позволяет провести анализ сцепления в семьях, используя эти зонды как фланкирующие ген. Эффективность, стратегий позиционного клонирования для гена МДД была продемонстрирована двумя группами исследователей, каждая из которых решала проблему по своему. Так, группа ученых из США клонировала ДНК из области генома, которая была делегирована

у больного с крупной, цигогенетически выявляемой делецией. Группа из Канады клонировала фрагменты ДНК из области транслокации X/21 у девочки с МДД, которая, как полагали, разрывала ген дистрофина. С помощью маркеров, тесно сцепленных с тогда неизвестным геном МДД была осуществлена первая ДНК-диагностика носительства мутации МДД у женщины, а также первая диагностика. Была разработана специфическая технология конкурентной реассоци-ации, которая позволила получить библиотеку плазмидных клонов. Эта библиотека была обогащена теми фрагментами ДНК, которые отсутствовали у пациента с делецией в Хр2. Можно заключить, что ген МДД является самым большим из известных сейчас человеческих генов и составляет почти 0,1% от всей геномной ДНК. Ген содержит 79 коротких экзонов и 78 длинных нитронов, с него транскрибируется мРНК длиной около 14 т.н.п. Количество этой мРНК составляет 0,01-0,001% от суммарной мРНК клеток мышечной ткани. Ген МДД является единственным представителем семейства «громадных генов».

Для объяснения патологии заболевания предлагалось несколько гипотез, наиболее известными из них были следующие: сосудистая гипотеза (vascular hypothesis), по которой дегенерация мышц связана с замедлением кровотока в кровеносных сосудах мышечной ткани; нейрогенетическая гипотеза, утверждавшая, что причина дегенерации в отмирании нейронов, иннервирующих мышц; мембранная гипотеза, объяснявшая дегенерацию как прямой или косвенный результат аномальной структуры и/или функции мембраны мышечных клеток.

В дальнейшем, признание получила третья гипотеза, которая соответствовала наблюдаемому у пациентов оттоку мышечных энзимов из мышц в сыворотку крови, что объясняется повышенной проницаемостью мембран мышечных клеток или наличием в мембране физических разрывов, характерных для пренекротических и некротических волокон. При электронно-микроскопических исследованиях биотатов мыши пациентов такие разрывы получили название «delta lesions». Были обнаружены также плотные гиперкотрактированые участки миофибрил, что указывало на нарушение кальциевого гоме-остаза [15]. Перенапряженные волокна, в свою очередь, растягивают соседние миофибриллы; это приводит к появлению разрывов в сарколемме и инициации некроза и дегенерации миофи-бриллы. Некротическому процессу также может способствовать повышенная концентрация кальция, приводящая к активации внутриклеточных протеаз. При этом дегенерация мышц может компенсироваться активной регенерацией фи-

брилл только на первых стадиях заболевания, однако эффективность этого процесса с возрастом ослабевает и мышечная деградация нарастает. После клонирования и полного сиквенса к ДНК гена МДД стала возможна идентификация белка, дефект которого запускает каскад реакций, приводящих к некрозу мышечной ткани. Он был назван дистрофиком (длиной 3685 аминокислот, массой 427 кДа), и, в свою очередь, ген МДД получил синоним - ген дистрофина.

После того, как была выяснена полная аминокислотная последовательность дистрофина, появилась возможность создания поликлональ-ных антител к этому белку. Антитела же позволили показать экспрессию дистрофина не только в скелетных мышцах, но и в некоторых других тканях (сердечные, гладкие мышцы, мозг, легкие, почки). Более того, с применением методов флуоресценции удалось локализовать дистро-фин на внутренней поверхности плазматической мембраны мышечных клеток и на мембранах Т-каналов[16]. Белок дистрофина состоит из 4 доменов. Первый N-терминальиый домен (примерно 240 аминокислот) - актин-связывающий - гомологичен в последовательность с соответствующими доменами р-спектрина и а-актинина. Второй длинный домен - rod domain - состоит из 25 сегментов, каждый из которых содержит 3-спирали, соединенных изгибами. Этот домен аналогичен графа "невралгические данные» содержит информацию о комплексном обследовании больных врачами-неврологами.

Качественное динамическое наблюдение за больными и их семьями и медико-генетическое консультирование родственников больных невозможно без регулярного анализа генеалогических, клинических и молекулярно-генетических данных. В 1970 году А.Эмери показал, отсутствие необходимой консультативной помощи в отношении более 85% родственников больных с высоким генетическим риском тяжелых заболеваний на примере западной Европы [16]. Наиболее важными из них являются систематический сбор информации и ее постоянное обновление создание регистров зависит от того, для каких целей они предназначены,

Примерами успешной работы регистров являются Уэльс (Великобритания), где функционирует генетический регистр, ряд регистров в США: "jenfiles" в Сан-Франциско» «recap» в Далласе. Хеке shrv» в Кливленде, база данных университета Южной Алабамы и другие. В странах СНГ функции регистров выполняют 2 системы в Белоруссии: проблемно-ориентированная прикладная программа «омега» и созданный в НИИ наследственных и врожденных заболеваний регистр для эпидемиологических исследований и

изучения генетики врожденных пороков развития. Сотрудникам и Московского НИИ педиатрии и детской хирургии создан типовой автоматизированный регистр детей-инвалидов [17].

Таким образом, по данным литературы, прямая ДНК-диагностика МДД с одной стороны, сталкивается с необходимостью выявления индивидуальных мутаций в каждой отдельной

семье, с другой стороны, она облегчается тем, что около 60% случаев МДД связана с крупными делециями. Делеции выявляются либо методом гибридизации по Southern, либо методом мПЦР Самые последние варианты мПЦР-систем по эффективности почти не уступают методом гибридизации по Southern, однако являются более экономичными.

Литература

1. Ермолаева Ю.Н., Ермолаев Д.О., Сердюков А.Г., Красовский С.С., Хазова Е.В., Сулейманова Н.В. Детская инвалидность: проблемы и пути решения// монография, Астрахань, 2007. - 133 с.

2. Гринио Л.П. Дюшенновская миодистрофия. Н.Новгород: Изд-во НГМА,- 1998. -192 с.

3. Emery A.E.H. Population frequency of inherited neuromuscular desea-ses a world survey// Neuromuscular Disorders.-1991 .-V. 1 .-P.19-29.

4. Koenig M., Beggs A.H., Moyer M. et al. The molecular basis for Duchenne versus Becker muscular dystrophy: correlation of severity with type of deletion // Am.J.Hum.Genet.-1989.-V.45.-P.498-506.

5. Todorova A. et al. Mutation analysis in Duchenne and Becker muscular dystrophy patients from Bulgaria shows a peculiar distribution of breakpoints by intron//Am.J.Med.Genet.-1996.-V.65.-N.I.-P.40-43.

6. Fajkusova L., Kuhrova V., Hajek J., Fajkus J. Distribution of dystrophin gene deletions mapped by multiplex PCR in the Moravian population // Mol.Cell.Probes.-1997.- V.ll.-N.l.- P.85-87.

7. Singh V., Sinha S., Mishra S. et al. Proportion and pattern of dystrophin gene deletions in noth Indian Duchenne and Becker muscular dystrophy patients // Hum.Genet.-1997.-V.99.-N.2.-P.206-208.

8. Чухрова A.JI. Анализ мутаций в гене дистрофина // Автореф. дис. канд. мед. наук.- М.: Ин-т клинической генетики Медико-генетич. научного центра РАМН, -1997.- 25с.

9. Edwards J.H. The population genetics of Duchenne: natural and artificial selection//J.Med.Genet.-1986,- V.23.- P.521-530.

10. Bakker E., van Ommen G.J.B. to (DMD and BMD). In: «Neuromuscular disorders: Clinical and molecular genetics (Edited by A.E.H. Emery).-1998.-P.59-85. John Wiley and sons: Chichester.

11. Oudet C., Hanauer A., Clemens P., Caskey Th., Mandel J.-L. Two hot spots of recombination in the DMD gene correlate with the deletion prone regions //Hum. Mol. Genet. -1992.-Vol.1-P.599-603.

12. Евграфов О.В., Макаров В.Б. ДНК-диагностика наследственных заболеваний // Итоги науки и техники: Генетика человека.- 1991,- Т.9,- С.53-126.

13. Евграфов О.В., Макаров В.Б. Диагностика миодистрофии Дюшенна с помощью зондов ДНК // Журн. невропатол. и психиатрии.-1987.-Т.87,- N.11.-^1732-1736.

14. П.Лобзин B.C., Сайкова Л.А., Шиман А.Г. Нервно-мышечные болезни. -СПб.: Гиппократ, 1998. -224 с.

15. Зелинская Д.И. Актуальные проблемы детской инвалидности//Детский доктор 2000-№4-С.48-51.

16. Ермолаева Ю.Н., Ермолаев Д.О., Хазова Е.В., А.Эмери Медико-социальные проблемы семей, имеющих ребенка-инвалида // Современные технологии в педиатрии и детской хирургии. -М., 2003.

17. Дьячкова М.Г, Вязьмин A.M., Макарова В.М. Концептуальные подходы к организации медико-социальной помощи детям. //Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины.-2001-№3-С.35-40.

Материал поступил в редакцию 06.11.2012 г.