СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ РЕПЛИКАТИВНОЙ ЧАСТИЦЫ ВИРУСА ГРИППА, КОМПОЗИЦИЯ КЛЕТОК (ВАРИАНТЫ), КОМПОЗИЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
METHOD FOR PRODUCING REPLICATIVE INFLUENZA VIRUS PARTICLES, CELL COMPOSITION (VERSIONS), CELL CULTURE COMPOSITION AND APPLICATION THEREOF

Данное изобретение относится к области получения противовирусной вакцины.
Вирусы гриппа (Orthomyxoviridae) являются РНК-вирусами с «минус-цепью» с сегментированным геномом (Taubenberger and Layne, Molecular Diagnosis Vol.6 No.4 2001). Они подразделяются на две группы: одну, включающую в себя вирусы гриппа А и В, и другую, состоящую из вируса гриппа С, на основе существенных антигенных различий между их нуклеопротеином и матриксными белками. Эти три типа вирусов различаются также по патогенности и организации генома. Тип А обнаружен в широком диапазоне теплокровных животных, а типы В и С являются преимущественно патогенами человека. Вирусы гриппа А дополнительно подразделяются посредством антигенной характеристики гемагглютинина (НА) и гликопротеинов поверхности NA, которые выступают от поверхности вириона. В настоящее время имеются 15 подтипов НА и девять подтипов NA. Вирусы типа А инфицируют большое разнообразие животных, в том числе птиц, свиней, лошадей, людей и других млекопитающих. Водоплавающие птицы служат в качестве природного резервуара для всех известных подтипов вирусов гриппа А и, возможно, являются источником генетического материала для пандемичных штаммов вируса гриппа человека.
В отличие от родственных парамиксовирусов, вирусы гриппа имеют сегментированный РНК-геном. Вирусы гриппа А и В имеют сходную структуру, тогда как вирус гриппа С является более дивергентным. Если вирусы типа А и В, каждый, содержат восемь дискретных генных сегментов, кодирующих по меньшей мере один белок каждый, вирус типа С содержит семь дискретных сегментов, с объединением сегментов 4 и 6 типов А и В. Вирусы гриппа А и В покрыты выступами из трех белков: НА, NA и матриксного белка 2 (M2). Вирусы гриппа С имеют только один поверхностный гликопротеин. Каждый сегмент РНК вируса гриппа инкапсидирован нуклеопротеинами (NP) с образованием рибонуклеотиднуклеопротеиновых (РНП) комплексов. Три белка полимеразы ассоциированы с одним концом этого РНП-комплекса. РНП окружены мембраной с матриксным белком (matrix 1) в виде интегральной части. Фосфолипидная часть этой оболочки образуется из клеточной мембраны хозяина. В вирусной частице обнаружен также неструктурный белок 2 (NS2).
Руководящие указания Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) являются следующими. Сначала обозначают тип вируса (А, В и С), затем хозяина (если им не является человек), место выделения, количество выделений и год выделения (отделенный наклонными штрихами). Для вируса типа А подтипы НА и NA отмечают в скобках). Например, штаммами, включенными в недавно разработанную трехвалентную вакцину для сезона 2000-2001, являются: А/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1) и B/Yamanashi/16/98. С 1977 года были обнаружены два подтипа вируса гриппа А, совместно циркулирующие в людях: H1N1 и H3N2.
Вирусы гриппа накапливают точковые мутации во время репликации, так как их РНК-полимеразный комплекс не имеет корректирующей активности. Мутации, которые изменяют аминокислоты в антигенных частях поверхностных гликопротеинов, могут придавать селективные преимущества вирусному штамму, позволяя ему ускользнуть от предсуществующего иммунитета. Молекула НА инициирует инфицирование связыванием с рецепторами на определенных клетках-хозяевах. Антитела против белка НА предотвращают связывание рецептора и являются очень эффективными в предотвращении повторной инфекции тем же самым штаммом. НА может ускользать от ранее приобретенного иммунитета либо посредством антигенного дрейфа, в котором мутации циркулирующего в данный момент гена НА разрушают связывание антитела, либо посредством антигенной изменчивости, когда вирус приобретает НА нового подтипа. Давления антигенного дрейфа являются неодинаковыми на протяжении молекулы НА, причем положительно отобранные изменения встречаются преимущественно в глобулярной головке белка НА. Эти изменения накапливаются также в большей степени в НА, чем NA. Изменения в других белках вируса гриппа происходят более медленно. Подобным образом, давление антигенного дрейфа является наивысшим в адаптированных к человеку штаммах гриппа, промежуточным в адаптированных к синьям и лошадям штаммах гриппа и наименьшим в адаптированных к птицам штаммах.
Поскольку вирусы гриппа имеют сегментированный геном, совместная инфекция двух различных штаммов в одного и того же хозяина может приводить к получению новых реарранжированных штаммов гриппа, содержащих различные комбинации исходных генных сегментов. Известно, что существуют пятнадцать подтипов НА в диких птицах, они обеспечивают источник НА и являются новыми для людей. Появление в кровотоке человека штамма гриппа с новым подтипом антигенной изменчивости было причиной двух последних пандемий в 1957 и 1968 годах и, наиболее вероятно, причиной пандемии гриппа в 1918 году. Чтобы соответствовать всему, что известно относительно появления пандемичных вирусов гриппа, пандемичный штамм должен иметь НА-антигенность, отличающуюся от НА-антигенности, преобладающей в данный момент; этот НА не может циркулировать в кровотоке людей в течение 60-70 лет; и этот вирус должен быть передающимся от человека к человеку. Как в 1957 году, так и в 1968 году пандемии происходили из изменчивости в НА, и в обоих случаях НА пандемичных штаммов были близкородственными птичьим штаммам. Хотя одним из абсолютных требований для пандемии является то, что НА должен изменяться, степень, до которой может или должен изменяться этот вирус, является неизвестной. Только пандемичные вирусы 1957 и 1968 года являются доступными для непосредственного исследования, причем пандемичный вирус 1918 года характеризуют с использованием молекулярной археологии. В 1957 году три гена были заменены генами, подобными птичьим генам: НА, NA и субъединицы полимеразного комплекса (РВ1). В 1968 году были заменены только НА и РВ1.
Специфическая диагностика инфекции гриппа может быть выполнена посредством выделения вируса, теста ингибирования гемагглютинации (HI), детектирования антигена при помощи иммуноанализа, серологических тестов, демонстрации NA-активности в секрециях или на основе молекулярных анализов. Пробы могут быть собраны в виде слюны, назофарингеального (носоглоточного) мазка или назофарингеального промывания, полученного полосканием забуференным солевым раствором. Стандартом для диагностики гриппа была иммунологическая характеристика после культивирования. Серологический анализ обеспечивает точный, но ретроспективный способ для инфекции гриппа, так как он требует сбора сывороток как в остром периоде, так и во время выздоровления.
Вирусы гриппа могут выращиваться в содержащих зародыш куриных яйцах или в ряде систем культуры ткани. Добавление трипсина (для активации расщеплением НА) делает возможным размножение вируса гриппа в клетках почки собаки Madin-Darby (MDCK) и других линиях. Первичным способом получения вакцины является все еще культивирование вирусов гриппа в яйцах. Культивирование в клеточных линиях обычно используют для первичного выделения вирусов гриппа человека (как типа А, так и типа В). Многие вирусы гриппа человека могут культивироваться непосредственно в аллантоисной полости содержащих зародыш яиц. Некоторые вирусы гриппа А и В требуют начального культивирования в амниотической полости и последующей адаптации к аллантоисной полости. После выделения культуры большинство изолятов гриппа точно идентифицируют с использованием иммуноанализов или иммунофлуоресценции. Молекулы НА вирусов гриппа связывают остатки сиаловой кислоты на поверхности респираторных клеток для достижения вхождения вируса.
Штаммы гриппа могут быть охарактеризованы антигенно с использованием способности вирусов гриппа агглютинировать эритроциты in vitro. Анти-НА-антитела могут ингибировать агглютинацию. Таким образом, анализ ингибирования гемагглютинации (HI) является одним из стандартных способов, используемых для характеристики штаммов гриппа. HI-анализы используют для определения, являются ли штаммы проб иммунологически родственными (т.е. перекрестно-реактивными) с современными вакцинными штаммами. Типирующие сыворотки, обычно продуцируемые у хорьков, добавляют в лунки в серии двукратных разведений, и лаборанты оценивают лунки для анализа путем сравнительного наблюдения суспендированных эритроцитов с агглютинированными эритроцитами. В большинстве ситуаций используют панель сывороток для сопоставления штаммов проб с вакцинными и ссылочными штаммами, и во время каждого конкретного сезона гриппа, и огромное количество штаммов проб последовательно сопоставляют при помощи HI-анализов. ВОЗ обеспечивает руководящие указания и сотрудничающие с ВОЗ центры обеспечивают руководство в отношении идентификации антигенных характеристик индивидуальных вирусных штаммов и может обеспечивать эти штаммы тем, кто желает их получить. Штаммы проб распределяют по категориям в соответствии с иммунологическими родословными, например, A/Moscow/10/99 (H3N2)-подобные, A/New Caledonia/20/99 (H1N1)-подобные, и B/Beijing/184/93-подобные вирусы. Например, штаммы проб, которые не поддаются характеристике в HI-анализах, лабораторные работники должны инокулировать в хорьков для получения штамм-специфической антисыворотки. Когда новая антисыворотка готова, опять выполняют HI-анализы, как описано. Если эта новая сыворотка обнаруживает значительные гэпы в перекрестной реактивности (обычно определяемые как четырехкратное различие между пробой и вакцинными штаммами), ее включают в рутинную лабораторную панель и используют для обнаружения новых эпидемических штаммов. Таким образом, HI-анализы являются чрезвычайно важными в достижении контроля вируса гриппа для отбора вакцинного штамма и являются наиболее часто используемыми способами для оценки антигенного дрейфа.
Штаммы гриппа могут быть охарактеризованы путем генетического сравнения последовательностей отдельных генных сегментов, и опять руководящие указания ВОЗ и сотрудничающих с ВОЗ центров обеспечивают руководство в отношении идентификации индивидуальной идентичности РНК-сегментов, содержащих геном вируса гриппа; сегментов нуклеиновой кислоты вируса гриппа А и В, кодирующих нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (РВ1), основную полимеразу 2 (РВ2), кислую полимеразу (РА), гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки (М1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2), и сегментов нуклеиновой кислоты вируса гриппа С, кодирующих нуклеопротеин (NP), основную полимеразу 1 (РВ1), основную полимеразу 2 (РВ2), гемагглютинин-нейраминидаза-подобный гликопротеин (HN), матриксные белки (М1 и М2) и неструктурный белок (NS1 и NS2).
Запросы на ссылочные штаммы, например, для антигенного анализа, для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот и для идентификации вакцинных вирусов могут адресоваться ВОЗ Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, 45 Poplar Road, Parkville, Victoria 3052, Australia (fax: +61 3 9389 1881, web site: http//www.influenza centre.org); the WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute of Infections Diseases, Gakuen 4-7-1, Musashi Murayama, Tokyo 208-0011, Japan (fax: -81 42 5610812 или +81 42 5652498); WHO Collaborating Center for Surveillance, Epidemiology and Control of Influenza, Centers for Disease Control and Prevention 1600 Clifton Road, Mail stop G16, Atlanta, GA 30333, United States of America (fax: +1 404 639 23 34); или the WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Influenza, National Institute for Medical Research, The Ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA, England (fax: +44 208 906 4477). Обновленная эпидемиологическая информация доступна на веб-сайте ВОЗ в  и в системе географической информации, FluNet, в . Осознание воздействия гриппа и пользы для здоровья и экономических преимуществ его предупреждения являются растущими, и в период последнего десятилетия наблюдали применение и выгоды вакцинации, и количество лекарственных средств против гриппа существенно увеличивается. Вследствие более длинной ожидаемой продолжительности жизни во многих странах, все большее количество людей находятся при риске осложнений, нагрузка на системы здравоохранения во время эпидемий гриппа все более широко признается, и более частые международные путешествия создали возможности для распространения этого вируса, в то время как введение новых продуктов увеличило возможности предупреждения и лечения этого заболевания. Около 50 стран имеют финансируемые правительством национальные программы иммунизации, и эта вакцина является доступной во многих других странах. Конкретные рекомендации в отношении применения этой вакцины варьируются, но обычно включают в себя ежегодную иммунизацию для индивидуумов пожилого возраста и индивидуумов старше 6 месяцев, которые находятся при увеличенном риске тяжелого заболевания вследствие предсуществующего хронического медицинского состояния. В некоторых странах вакцину используют для уменьшения распространения гриппа на индивидуумов, находящихся при увеличенном медицинском риске. Страны-участники должны рассматривать пользу активностей предупреждения гриппа в контексте их приоритетов общественного здравоохранения в целом. Инактивированные вакцины классифицируют в виде нескольких типов, в зависимости от того, содержат ли они целые вирусные частицы, частично разрушенные вирусные частицы (расщепленные вакцины) или очищенные антигены оболочки (субъединичные вакцины). Некоторые субъединичные вакцины были объединены с адъювантом или системой доставки.
Несколько стран лицензировали живые аттенуированные вакцины против гриппа для определенных групп-мишеней. Две различных композиции вакцины 1 использовали на здоровых взрослых людях и детях в Российской Федерации, а другая живая вакцина была интенсивно испытана, но еще не была лицензирована. Пока более доступными являются живые аттенуированные вакцины, обычно они еще не рекомендованы для предупреждения гриппа.
Два класса антивирусных агентов были разработаны для предупреждения и лечения гриппа. Ингибиторы М2, амантадин и римантадин, ограничиваются лечением вирусов гриппа А, и сообщалось, что они являются эффективными в предупреждении инфекции. Хотя оба продукта вызывают некоторые побочные действия, значительные неврологические побочные действия являются более частыми с амантадином. Ингибиторы нейраминидазы, такие как занамивир и озелтамивир, были недавно лицензированы для лечения гриппа типов А и В в ряде стран, и сообщалось, что они являются эффективными для профилактики. В пациентах, получающих оба класса антивирусного агента, были детектированы устойчивые мутанты. Хотя это не считают в настоящее время важной проблемой общественного здравоохранения, ситуация может измениться, если эти лекарственные средства используются в очень большом масштабе.
ВОЗ поддерживает глобальную программу международного надзора, осуществляемую кооперацией 110 национальных центров гриппа, расположенных в 82 странах, и 4 сотрудничающих с ВОЗ центрах по изучению гриппа, расположенных в Атланте (Соединенные Штаты), Лондоне (Соединенное Королевство Великобритании и Северной Ирландии), Мельбурне (Австралия) и Токио (Япония). Эти центры обеспечивают раннюю систему предостережения в отношении появляющихся штаммов с эпидемическим потенциалом. Эта система является важной, так как эффективность вакцин гриппа уменьшается, если они не содержат штаммов, циркулирующих в настоящее время. ВОЗ публикует рекомендации в отношении состава вакцин, которые могут быть найдены в Weekly Epidemiological Record (например, см. публикацию 9, 2004, 79, стр. 88 или ), опубликованную Всемирной Организацией Здравоохранения, в феврале в отношении вакцин, используемых в северном полушарии, и в сентябре в отношении вакцин, используемых в южном полушарии. Поскольку грипп имеет менее выраженные сезонные распределения в экваториальных районах, эпидемиологические рассмотрения будут влиять на то, какие из этих рекомендаций (февраля или сентября) являются подходящими для вакцин при использовании в экваториальных странах.
Центры совместного сотрудничества проводят антигенные и генетические анализы изолятов гриппа, предоставляемых национальными центрами. Когда наблюдается доказательство изменчивости антигенов, это сопоставляют с эпидемиологическими данными для оценки эпидемиологического значения вариантов. Репрезентативные изоляты сравнивают с существующими вакцинными штаммами с использованием панелей сывороток человека, собранных до и после вакцинации, для оценки того, можно ли ожидать, что существующие вакцины будут защищать против этих вирусов. После публикации ВОЗ ежегодных рекомендаций в отношении вакцин изготовителям обеспечивают поставки быстро размножающихся штаммов для облегчения генерирования посевного материала вирусов для получения вакцин. Тесты на безопасность и эффективность вакцин против гриппа включают в себя инактивацию вируса, микробную стерильность, измерение химикалиев, используемых для разрушения вируса и подтверждение рекомендуемой концентрации антигена. Рекомендуется, что вакцины должны соответствовать требованиям ВОЗ, однако национальные регулирующие ведомства должны одобрить конкретные вакцинные вирусы, используемые в каждой стране. Национальные ведомства общественного здравоохранения являются ответственными за рекомендации в отношении применения этой вакцины. ВОЗ опубликовала также рекомендации в отношении предупреждения инфекций, вызываемых вирусом гриппа. (См. WER No. 35, 2002, pp.281-288). Вакцины против гриппа получали в содержащих зародыш куриных яйцах в течение более 50 лет, но недавно были предприняты значительные усилия для развития систем культуры клеток для получения вакцин. Общепринятая стандартная методология в содержащих зародыш куриных яйцах является крайне трудоемкой и имеет несколько главных недостатков: требуются миллионы яиц; в США более чем 100 миллионов на сезон, яйца должны быть инокулированы и собраны по отдельности; требуется экстенсивная очистка с рядом стадий фильтрации и центрифугирования для гарантии освобождения от белка яйца для минимизации риска аллергий; требуются многие стадии производства, которые являются трудными для автоматизации и являются трудоемкими, не говоря уже о затратах времени и подвергании загрязнению.
Таким образом, существует давнишняя потребность в индустрии для развития технологии производства вакцин, которая демонстрирует преимущества над существующей технологией производства вакцин, т.е. посредством развития протоколов приготовления, которые будут использовать особые штаммы клеток, способные поддерживать рост вируса гриппа и адаптированные к росту в автоматизированных биореакторах, на биологических носителях или в других системах культуры клеток, для замены существующей методологии производства вакцин.
Часто предлагаются охарактеризованные непрерывные клеточные линии, такие как клетки Vero или другие клетки, полученные из приматов, для использования в получении вакцин вирусов гриппа. Однако регистрирующие ведомства в наши дни уклоняются от вакцин, получаемых в клетках приматов, которые предназначаются для использования в отношении человека. Все более и более такие ведомства рекомендуют, чтобы все продукты, полученные из клеток приматов (таких как Vero), были свободны от оставшихся интактных клеток, и выражают продолжающуюся озабоченность в отношении уровня остаточного материала, такого как ДНК клеток приматов, в продуктах, изготовляемых из этих клеток. Хотя Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) считает приемлемым предел остаточной ДНК из непрерывных клеточных линий 10 нг на дозу для противовирусных вакцин при парентеральном введении, регистрирующие ведомства продолжают считать этот уровень риском, создаваемым на случайной основе клеточным материалом приматов, таким как ДНК, для противовирусных вакцин.
В течение продолжительного времени фундаментальное исследование вирусов гриппа А затруднялось отсутствием доступности эффективных систем обратной генетики. Хотя самые ранние способы обратной генетики для РНК-вирусов с минус-цепью были фактически разработаны для вируса гриппа А, получение этого вируса исключительно из рекомбинантной ДНК было достигнуто лишь недавно.
Рекомбинантный вирус гриппа получали после трансфекции эукариотических клеток набором из восьми плазмид, из которых каждый из сегментов геномной вирусной РНК (вРНК) транскрибировался РНК-полимеразой I, и набором из четырех дополнительных плазмид, экспрессирующих нуклеопротеин (NP) и белки полимеразы PB1, PB2 и PA. Сообщенные эффективности получения вируса с использованием этих 12-плазмидных систем были относительно низкими.
После коэкспрессии пяти дополнительных плазмид, кодирующих гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), матриксные белки 1 и 2 (М1 и М2) и неструктурный белок 2 (NS2), титры вируса в супернатантах могли быть увеличены. Изящной модификацией этих 12- и 17-плазмидных систем является обеспечение двунаправленных векторов для уменьшения количества трансфицированных плазмид до восьми. С этой системой вирусная РНК с минус-цепью и мРНК с плюс-цепью могут быть синтезированы из одной и той же плазмиды.
Способность получать рекомбинантный вирус гриппа А облегчает будущее исследование вируса гриппа, однако все еще не было найдено практическое решение использования рекомбинантного вируса гриппа А, полученного способами обратной генетики, до достаточно высоких титров в получении вакцин, вследствие того факта, что большинство клеточных систем, если не все клеточные системы, используемые в получении вакцин, не позволяют или позволяют только в небольшой степени, реплицировать вышеописанные рекомбинантные вирусы вследствие несовместимости между полимеразами, участвующими в системах обратной генетики, и наиболее часто используемыми разновидностями клеток.
Вирус гриппа А является РНК-вирусом с минус-цепью. Это означает, что в одном цикле репликации продуцируются три типа РНК: отрицательная смысловая вРНК, положительная смысловая кРНК и положительная смысловая мРНК. В отличие от вирусной РНК (вРНК) эта мРНК является кэппированной и имеет поли(А)-хвост. Первые А-остатки этого поли(А)-хвоста мРНК соответствуют короткому участку U-остатков в этом геноме, который считают сигналом остановки транскрипции/полиаденилирования. Считается, что полимераза, когда она достигает этого участка U-остатков, подвергается повторяющимся циклам обратного смещения и таким путем создает полный поли(А)-хвост мРНК.
Сущность изобретения
Данное изобретение обеспечивает систему обратной генетики для вируса гриппа, которая может быть применена в типах клеток различных видов. Полимераза I является ядрышковым ферментом, который транскрибирует рибосомную РНК и в изобилии экспрессируется в растущих клетках. рРНК, подобно вРНК, не имеет кэпа и поли(А)-хвоста, и, следовательно, полимераза I может быть использована для получения вРНК из кДНК. Транскрипция вирусной кДНК полимеразой I позволяет генерировать вирус-подобные РНК с правильными 5'- и 3'-концами. Однако в то время как аппарат транскрипции полимеразы II часто является совместимым с генами из различных видов, транскрипция полимеразы I проявляет строгую, хотя и не абсолютную видоспецифичность. Эта видоспецифичность сообщается взаимодействием факторов транскрипции с промотором и, в меньшей степени, белок-белковыми взаимодействиями между этими факторами. Эта видоспецифичность основанных на полимеразе I систем обратной генетики является основным недостатком развития вакцин, прежде всего потому, что промоторы полимеразы I для клеток других видов, чем человек, такие как промотор собачьей или птичьей полимеразы I, еще не были описаны, тогда как в промышленности часто используются хорошо определенные собачьи (например, клетки почки собаки Madin Darby (MDCK)) или птичьи клетки (фибробласты куриного зародыша (CEF)) для получения вакцины против вируса гриппа.
Данное изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую генный сегмент вируса гриппа и промотор полимеразы бактериофага, или комплементарную цепь указанной нуклеиновой кислоты. В противоположность открытию Neuman & Kawaoka (Virology 287, 243-240, 2001), показывающему, что, в отличие от несегментированных вирусов, бросающимся в глаза исключением, где, как считали, не работает полимераза Т7, был вирус гриппа, генерирование которого включает в себя дополнительную сложность синтеза восьми вирусных РНК, наряду с этой полимеразой и нуклеопротеином из клонированной кДНК, данное изобретение обеспечивает значительную гибкость (свободу) в отношении плазмидных векторов для этой основанной на полимеразе бактериофага технологии обратной генетики, и в отношении элементов, которые они содержат. Например, авторы этого изобретения использовали РНК-полимеразу бактериофага Т7 для получения вРНК или кРНК-подобных молекул РНК, но могут быть использованы различные другие РНК-полимеразы, такие как РНК-полимераза бактериофага SP6. В предпочтительном варианте осуществления, изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, содержащую генный сегмент вируса гриппа и промотор Т7, или комплементарную цепь указанной нуклеиновой кислоты, позволяющую авторам основать систему этого изобретения для экспрессии генных сегментов вируса гриппа под контролем промотора Т7. В одном варианте осуществления, терминатор полимеразы отсутствует. Предпочтительно, указанная нуклеиновая кислота была обеспечена одним или двумя дополнительными остатками гуанина после промотора. Для создания вакцины получена нуклеиновая кислота согласно изобретению, которая содержит генный сегмент, который происходит из вируса гриппа, который рекомендован ВОЗ для вакцинации. В предпочтительном варианте осуществления изобретение связано с нуклеиновой кислотой, содержащей генный сегмент вируса гриппа А и промотор Т7 или комплементарную цепь указанной нуклеиновой кислоты.
4
7
В частности, в двунаправленной системе предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота согласно изобретению не содержала терминатор Т7. Поскольку эта полимераза предпочтительно экспрессируется из плазмиды, трансфицированной вместе с плазмидами, экспрессирующими этот вирус, предложенная здесь система не ограничена определенными видами. Хотя системы обратной генетики на основе полимеразы Т7 используют иногда для высвобождения от несегментированных вирусов с минус-цепью, система обратной генетики для сегментированного вируса гриппа, основанная на технологии полимеразы бактериофага, ранее никогда не использовалась успешно. Один лимитирующий фактор в системах обратной генетики, использующих полимеразу Т7 для транскрипции кДНК, иногда пытаются преодолеть путем введения остатков G в сайт инициации транскрипции для усиления запускаемой полимеразой Т7 транскрипции. Этот подход использовали в спасении, например, RV, VSV и SV, однако, Zobel et al (Virology, 1994 Jul; 202(1):477-9; Nucleic Acids Res. 1993 Aug 11; 21(16):3607-14) указывают на то, что как 5'-, так и 3'-концы генного сегмента вируса гриппа А не должны быть точно определены для правильного функционирования вирусной полимеразы; таким образом, дополнительное добавление нуклеотидов в сайты транскрипции и введение остатков G в сайт инициации транскрипции не являются необходимыми. Однако неожиданно в предпочтительном варианте осуществления изобретения авторы получили нуклеиновую кислоту согласно изобретению, имеющую по меньшей мере один дополнительный остаток гуанина после промотора Т7, и даже предпочтительно, чтобы два дополнительных остатка гуанина следовали после промотора Т7. Данное изобретение связано также с клетками почки собаки Madin Darby (MDCK) или фибробластной клеткой куриного зародыша (CEF), содержащей полимеразу Т7. В частности, данное изобретение связано с клеткой, снабженной по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Данное изобретение облегчает использование мультиплазмидной системы, такой как 17-плазмидная или 12-плазмидная или 8-плазмидная система, и, поскольку изобретение связано с клеткой, содержащей нуклеиновую кислоту согласно изобретению, дополнительно содержащую полимеразу Т7, предпочтительно экспрессируемую из плазмиды, трансфицированной вместе с одной или несколькими плазмидами, способными экспрессировать генный сегмент вируса гриппа согласно изобретению, эта система не ограничена определенными видами. Заявлено также применение клетки согласно изобретению, где указанная полимераза Т7 содержит сигнал ядерной локализации. В предпочтительном варианте осуществления клетка не является клеткой приматов, в результате чего можно избежать введения ДНК приматов в клеточный материал или вакцину, полученную из нуклеиновой кислоты или клетки согласно изобретению. Предпочтительно используют клетку MDCK или клетку CEF. Преимуществом изобретения является то, что для этой системы обратной генетики не нужен вирус-помощник (хелперный вирус), все вирусные частицы, полученные путем трансфекции, содержат желаемую нуклеиновую кислоту и могут быть использованы без разработки процедур клонирования в последующей системе получения вакцины. Данное изобретение впервые связано с реплицирующейся вирусной частицей, содержащей нуклеиновую кислоту согласно изобретению. В US 5166057 такая вирусная частица, способная к репликации, не была получена, и другие попытки использования системы Т7 для сегментированного вируса гриппа были также безуспешны до создания данного изобретения. Композиции культур клеток с титрами вируса ~10 вирусных частиц согласно изобретению могут быть легко получены без репликации вируса в культуре трансфицированных клеток, которые могут быть повышены до >10, когда вирусу дают реплицироваться. Особенно важно, что репликация частицы согласно изобретению достигается без вируса-помощника (хелперного вируса). Такая композиция культуры клеток, содержащая клетку или материал, полученные из клетки согласно изобретению, или вирус или материал, полученные из вирусной частицы согласно изобретению, может быть предпочтительно использована для приготовления фармацевтической композиции, направленной на генерирование иммунологической защиты против инфицирования субъекта вирусом гриппа. Определенно клетки согласно изобретению не были получены в US 5166057. Таким образом, данное изобретение связано также со способом получения реплицирующейся (репликативной) частицы вируса гриппа, предусматривающим культивирование клетки по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой согласно изобретению. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере одна нуклеиновая кислота, используемая в указанном способе, содержала по меньшей мере один, а предпочтительно, семь или восемь генных сегментов вируса гриппа и промотор полимеразы бактериофага или комплементарную цепь указанной нуклеиновой кислоты или нуклеиновых кислот. Кроме того, предпочтительно, чтобы указанный сегмент не содержал терминатора полимеразы бактериофага, причем предпочтительно, чтобы такой сегмент был обеспечен по меньшей мере одним дополнительным остатком гуанина, следующим за промотором, или был обеспечен двумя дополнительными остатками гуанина, следующими за промотором. Предпочтительно указанные сегменты происходят из вируса гриппа, который рекомендован ВОЗ для целей создания вакцины, например, генный сегмент вируса гриппа А. Наконец, данное изобретение обеспечивает репликативную частицу вируса гриппа, получаемую по описанному здесь способу. Таким образом, изобретение связано также со способом генерирования иммунологической защиты против инфицирования субъекта вирусом гриппа, предусматривающим введение нуждающемуся в этом субъекту композиции согласно изобретению. Такие композиции предпочтительно получены в виде вакцины, т.е. путем смешивания вирусных частиц или вирусных белков, полученных из таких частиц (субъединичные вакцины) с подходящим фармацевтическим носителем, таким как солевой раствор или адъювант (например, соль алюминия или другой обычно используемый эксципиент (см., например, http://www.cdc.gov/nip/publications/pink/Appendices/A/Excipient.pdf.).
Подписи к фигурам
Фиг.1. Конструкции, использованные для системы обратной генетики на основе T7pol. См. текст подробного описания стратегий клонирования.
Фиг.2. FACS-анализ клеток 293Т, трансфицированных конструкциями, кодирующими GFP-минигеномы (0,6 мкг), гены T7pol (0,6 мкг) и полимеразы вируса гриппа А (каждого по 1 мкг). Левая панель: % GFP-положительных клеток спустя 30 часов после трансфекции. Правая панель: уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции. На оси Х, показаны трансфицированные конструкции GFP-минигеномов либо в смысловой (S), либо в антисмысловой (AS) ориентации, с указанным количеством дополнительных нуклеотидов G. Черные столбцы показывают котрансфекции всех 4 компонентов комплекса полимеразы вируса гриппа А (PB2, PB1, PA и NP), белые столбцы показывают контрольные трансфекции, из которых исключена конструкция pHMG-NP.
Фиг.3. FACS-анализ клеток 293Т, трансфицированных 0,6 мкг антисмысловых GFP-минигеномов с двумя дополнительными остатками G, 4 мкг конструкций полимеразы вируса гриппа А и 0,6 мкг каждого из T7pol (C) дикого типа, T7pol, содержащего сигнал ядерной локализации (N), или обеих конструкций в соотношении 1:1 (C/N). Левая панель: % GFP-положительных клеток спустя 30 часов после трансфекции. Правая панель: уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции.
Фиг.4. FACS-анализ клеток 293Т или BSR-T7, трансфицированных 0,6 мкг конструкции, кодирующей антисмысловой GFP-минигеном с двумя дополнительными остатками G, и 4 мкг конструкций полимеразы вируса гриппа А. Показан уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции клеток. Клетки трансфицировали плазмидой или не трансфицировали плазмидой, экспрессирующей T7pol, содержащей сигнал ядерной локализации (293Т против 293 N или BSR-T7 против BSR-T7 N). Черные столбцы показывают котрансфекции всеми 4 компонентами комплекса полимеразы вируса гриппа А (PB2, PB1, PA и NP), белые столбцы показывают контрольные трансфекции, из которых была исключена конструкция pHMG-NP.
Фиг.5. FACS-анализ клеток 293Т, трансфицированных 0,6 мкг конструкции, кодирующей антисмысловой GFP-минигеном с двумя дополнительными остатками G (AS-2G) или смысловой GFP-минигеном (S-0G), и 0,6 мкг плазмиды, экспрессирующей T7pol с сигналом ядерной локализации, и 4 мкг плазмид, экспрессирующих гены полимеразы вируса гриппа А. Левая панель: % GFP-положительных клеток спустя 30 часов после трансфекции. Правая панель: уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции. Черные столбцы показывают котрансфекции всеми 4 компонентами комплекса полимеразы вируса гриппа А (PB2, PB1, PA и NP), белые столбцы показывают контрольные трансфекции, из которых была исключена конструкция pHMG-NP.
Фиг.6. FACS-анализ клеток 293Т и MDCK, трансфицированных 0,6 мкг конструкций, кодирующих GFP-антисмысловой минигеном с двумя дополнительными остатками G (AS-2G), 0,6 мкг плазмиды, экспрессирующей T7pol с сигналом ядерной локализации, и 4 мкг плазмид, экспрессирующих гены полимеразы вируса гриппа А. Левая панель: % GFP-положительных клеток спустя 30 часов после трансфекции. Правая панель: уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция) в GFP-положительной фракции. Черные столбцы показывают котрансфекции всеми 4 компонентами комплекса полимеразы вируса гриппа А (PB2, PB1, PA и NP), белые столбцы показывают контрольные трансфекции, из которых была исключена конструкция pHMG-NP.
Подробное описание
Пример 1
Генерирование рекомбинантного вируса гриппа А с использованием основанной на РНК-полимеразе Т7 системы обратной генетики
Введение
В течение продолжительного времени фундаментальное исследование вирусов гриппа А затруднялось отсутствием доступности эффективных систем обратной генетики. Хотя самые ранние способы обратной генетики для РНК-вирусов с минус-цепью были фактически разработаны для вируса гриппа А (7, 18), получение этого вируса исключительно из рекомбинантной ДНК было достигнуто лишь недавно (9, 20).
Вирус гриппа А является РНК-вирусом с минус-цепью. Во время цикла репликации этого вируса образуются три типа РНК: отрицательная смысловая геномная вирусная РНК (вРНК), положительная смысловая РНК, комплементарная этой геномной РНК (кРНК) и положительная смысловая мессенджер-РНК (мРНК). В то время как вРНК и кРНК содержат по существу немодифицированные концы, мРНК является кэппированной и имеет поли(А)-хвост (16).
РНК-полимераза I (PolI) является ядрышковым ферментом, который транскрибирует рибосомную РНК (рРНК) и в изобилии экспрессируется в растущих клетках. Подобно вРНК, рРНК не имеет кэпа и поли(А)-хвоста (23). Hobom et al. (19, 21, 29) успешно получали искусственные подобные вРНК вируса гриппа сегменты с точными 5'- и 3'-концами с использованием PolI. Транскрипция кДНК, клонированной в контексте промотор PolI-терминатор-кассеты позволила генерировать вРНК-подобные молекулы с правильными 5'- и 3'-концами (29). Последующие исследования, которые включали в себя хелперный вирус гриппа, продемонстрировали, что эти геномные молекулы вРНК могли узнаваться и реплицироваться комплексом полимеразы вируса гриппа и упаковываться в вирусы, являющиеся потомством вируса гриппа. Эта система позволяла генерировать вирусы гриппа, содержащие мутации в одном из вирусных генных сегментов или дополнительный генный сегмент, что позволило исследовать вирусные гены и их продукты. В результате применения хелперного вируса, требовался отбор вируса-трансфектанта, что является довольно трудоемким.
3
4
7
6
4
7
Neumann et al. создали систему PolI для извлечения вирусов гриппа А полностью из клонированной кДНК (20). кДНК, кодирующие полноразмерные вРНК вируса гриппа А, клонировали между промотором PolI человека и терминатором PolI мыши. В принципе, трансфекция этих восьми плазмид в эукариотические клетки должна была привести к синтезу всех восьми вРНК гриппа. Эмбриональные клетки почки человека (293Т) котрансфицировали этими восемью экспрессионными плазмидами и плазмидами, экспрессирующими вирусный нуклеопротеин и белки полимеразы PB2, PB1 и РА от промотора РНК-полимеразы II (PolII). Эти вРНК, синтезированные клеточной PolI, упаковывали в РНП и извлекали количества, превышающие 1×10 бляшкообразующих единиц инфекционного вируса на мл (бое/мл) супернатанта. Котрансфекция плазмидами, экспрессирующими остальные структурные вирусные белки, приводила к существенному увеличению продукции вируса, а именно 3×10-5×10 бое/мл (20). Fodor et al. сообщали о сходной системе для извлечения вируса гриппа А (9). Эта система зависела от восьми плазмид, кодирующих все восемь кДНК вРНК, фланкированных промотором PolI человека, но она содержала последовательность рибозима вируса гепатита δ (HδVrib), а не последовательность терминатора PolI. Эти плазмиды котрансфицировали в клетки Vero с четырьмя плазмидами, экспрессирующими белки PB1, PB2, PA и NP от основного позднего промотора типа 2 аденовируса. С использованием равных количеств каждой из экспрессионных плазмид Fodor et al. сообщили степень высвобождения 1-2 инфекционных вирусных частиц из 10 трансфицированных клеток (9). Авторы данного изобретения сконструировали сходную систему обратной генетики для продуцирования рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34. Авторы сделали вывод, что титры вируса ~10 могут быть получены без репликации вируса в культуре трансфицированных клеток, и эти титры могут быть увеличены до >10, когда вирусу дают реплицироваться (4). Поскольку эти запускаемые полимеразой PolI системы требовали котрансфекции 12-16 плазмид, было необходимым применение клеточных линий, которые могли быть трансфицированы с высокой эффективностью, для эффективного продуцирования рекомбинантного вируса.
7
Затем Hoffmann et al. разработали двунаправленную систему транскрипции PolI-PolII для генерирования вируса гриппа А только из восьми плазмид (12). В этой двунаправленной системе кДНК вРНК встраивали между промотором PolI человека и минимальными последовательностями терминатора PolI мыши. Всю эту конструкцию встраивали между промотором PolII и сайтом полиаденилирования. Это делало возможной транскрипцию вРНК и мРНК от промоторов PolI и PolII соответственно из единой конструкции. Котрансфекция восьми плазмид PolI-PolII, каждая из которых кодирует один из генных сегментов вируса гриппа А, в клетках 293Т, сокультивируемых с клетками почки собаки Madin Darby, приводила к извлечению инфекционного вируса гриппа А с выходами до 2×10 бое/мл супернатанта (12). Применение одной матрицы для синтеза как мРНК, так и вРНК уменьшало количество плазмид, требуемых для генерирования вируса. Сообщалось, что эффективность генерирования вируса в этой системе было сходным с эффективностью однонаправленной (12-16 плазмид) системы PolI.
В то время как промоторы PolII часто являются совместимыми с аппаратом транскрипции из различных видов, транскрипция от промоторов PolI проявляет строгую, хотя и не абсолютную видоспецифичность. Эта видоспецифичность сообщается взаимодействием факторов транскрипции с промотором и, в меньшей степени, белок-белковыми взаимодействиями между этими факторами (23).
Эта видоспецифичность основанных на PolI (полимеразе I) систем обратной генетики образует главный недостаток. Описанные выше системы обратной генетики использовали промотор PolI человека, ограничивающий продуцирование рекомбинантного вируса только клетками, происходящими из приматов, такими как клетки 293Т или клетки Vero. Хотя промоторы PolI были охарактеризованы для нескольких видов, в том числе для человека, мыши, крысы и свиньи (8, 14, 17), они остаются неизвестными для многих других видов. Клетки собак и птиц рутинным образом используют для исследования вируса гриппа А и получения вакцин, но промоторы PolI собак и птиц до сих пор не были описаны. Для улучшения гибкости технологии обратной генетики для вируса гриппа авторы данного изобретения пытались разработать универсальную систему обратной генетики. Авторы решили создать систему на основе экспрессии генных сегментов вируса гриппа А под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 (pT7). Поскольку РНК-полимераза бактериофага Т7 (T7pol) может подаваться в клетки трансфекцией или посредством использования стабильно модифицированных клеточных линий, эта система не ограничивается клетками из конкретных видов.
7
Системы обратной генетики на основе T7pol используют для получения несегментированных вирусов с минус-цепью. Schnell et al. были первыми в получении несегментированных вирусов с минус-цепью только из клонированной кДНК (27). Клон кДНК делали кодирующим полноразмерную анти-геномную РНК вируса бешенства (RV). Эта кДНК была фланкирована pT7 и последовательностью НδVrib после последовательности терминатора T7pol (tT7). После транскрипции с использованием T7pol точный 3'-конец генома получают аутолитическим отщеплением последовательности НδVrib на 3'-конце. Эту плазмиду котрансфицировали с экспрессионными плазмидами, кодирующими вирусный N-белок и белки полимеразы L и Р под контролем pT7 в клетки, экспрессирующие T7pol. Эта процедура приводила к высвобождению рекомбинантного RV, но только приблизительно из 1 из 2×10 трансфицированных клеток (27). С тех пор сходные системы были описаны для семейств Paramyxoviridae, Rhabdoviridae и Filoviridae несегментированных NSV (10).
Для успешного извлечения несегментированных вирусов с минус-цепью из кДНК, очень часто получают положительную смысловую антигеномную РНК (кРНК), а не отрицательную смысловую вРНК. Считают, что одновременное присутствие голой отрицательной смысловой вРНК и положительной смысловой мРНК, кодирующих вирусные белки, будет приводить к гибридизации, предотвращающей сборку генома в рибонуклеопротеиновые комплексы (РНП) (27). Вирусы с минус-цепью обычно не встречаются с такой проблемой, так как они всегда сохраняют их геном в форме РНП, что препятствует гибридизации. Извлечение вируса Сендаи (15), вируса парагриппа типа 3 (6) и метапневмовируса человека (11) сообщалось с кДНК, кодирующей антисмысловую геномную РНК; однако эффективности были значимо более низкими, чем результаты с положительной смысловой РНК. Этот принцип был также применен для высвобождения рекомбинантного вируса гриппа. Hoffmann et al. (13) также определяли эффективность получения рекомбинантного вируса гриппа из антигеномной положительной смысловой РНК. В противоположность несегментированным и сегментированным вирусам с минус-цепью, реплицирующимся только в цитоплазме, вирус гриппа А мог быть получен как из геномных, так и антигеномных векторов со сходными эффективностями.
Одним из ограничивающих факторов в системах высвобождения вирусов с использованием рТ7 является то, что остатки в положениях +1 - +3 могут влиять на транскрипцию. Наблюдали, что транскрипция кДНК может быть увеличена введением 2 или 3 остатков G непосредственно ниже рТ7 (22). Это наблюдение было применено для получения, например, рекомбинантного RV (27), вируса везикулярного стоматита (28), респираторного синтициального вируса (3) и метапневмовируса человека (11). По-видимому, для этих вирусов дополнительные остатки G в одном из концов генома не влияли на репликацию вируса, но оказывали положительное действие на запускаемую T7pol транскрипцию.
Системы на основе T7pol использовали широко для исследований обратной генетики вируса гриппа (18), но до настоящего времени не было описано получение на основе плазмид рекомбинантного вируса гриппа. Здесь авторы изобретения впервые описывают систему обратной генетики на основе T7pol для получения рекомбинантного вируса гриппа.
Материалы и способы
Клетки и вирусы
8
50
Клетки почки собаки Madin Darby (MDCK) культивировали в среде ЕМЕМ (BioWhittaker), дополненной 10% ФТС, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамином, 1,5 мг/мл бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES и заменимыми аминокислотами. Клетки 293Т культивировали в DMEM (BioWhittaker), дополненной 10% ФТС, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамином, 1 мМ пируватом натрия и заменимыми аминокислотами. Клетки BSR-T7, линию клеток детеныша хомячка, стабильно экспрессирующую РНК-полимеразу Т7 (2). Клетки BSR-T7 выращивали в DMEM, дополненной 10% ФТС, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамином, 1 мМ пируватом натрия и 0,5 мг/мл G418 (Life Technologies, Breda, The Netherlands). Вирус гриппа А/PR/8/34, адаптированный для репликации в содержащих зародыш куриных яйцах и не способный к оптимальной репликации в культурах клеток млекопитающих, пассировали семь раз при низкой множественности заражения в клетках MDCK, выращиваемых в среде Episerf (Gibco BRL), дополненной 10 МЕ/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина. После седьмого пассажа рутинным образом получали титры вируса 10 TCID/мл.
Трансфекция клеток 293Т
Транзиторные опосредованные фосфатом кальция трансфекции клеток 293Т выполняли по существу, как описано (24). Клетки высевали за день до трансфекции в желатинизированные культуральные чашки с диаметром 100 мм для получения 50% конфлюэнтных монослоев. После ночной трансфекции среду для трансфекции заменяли свежей средой, дополненной 2% ФТС, для получения вируса или 10% ФТС для всех других трансфекций. Клетки инкубировали в течение 30-72 часов, после чего супернатанты собирали и клетки анализировали на флуоресценцию, если необходимо. Плазмиду pEGFP-N1 (Clontech, BD Biosciences, Amsterdam, The Netherlands) трансфицировали параллельно во всех экспериментах и процент флуоресцентных клеток измеряли в FACSCalibur (Becton Dickinson) проточном цитометре, подтверждая, что эффективность трансфекции была в диапазоне 95-100 процентов. Содержащие вирус супернатанты осветляли центрифугированием в течение 10 минут при 300 × g. Титры вируса в супернатанте определяли либо сразу же, либо после хранения при 4°С в течение менее, чем одной недели, или при -80°С не дольше, чем одна неделя.
Трансфекция клеток MDCK
6
Транзиторную трансфекцию клеток MDCK выполняли по существу, как описано ранее (1). Вкратце, 240 мкл среды Optimem I (Gibco BRL) добавляли к 10 мкл Липофектамина 2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. К этой смеси добавляли предназначенное количество ДНК, доведенное до объема 50 мкл с использованием среды Optimem I. Эту смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. После инкубирования добавляли 200 мкл культуральной среды MDCK (см. выше) без пенициллина и стрептомицина и эту смесь добавляли к 1×10 клеток MDCK в суспензии в 6-луночном планшете. После 5 часов инкубации клетки промывали дважды PBS и культивировали в 2 мл культуральной среды MDCK без пенициллина и стрептомицина. Эту среду заменяли культуральной средой MDCK, содержащей 2% ФТС, после ночного инкубирования.
Трансфекция клеток BSR-T7
Для транзиторной трансфекции клеток BSR-T7, 400000 клеток высевали в 6-луночную культуральную чашку за день перед трансфекцией с получением 50-70% конфлюэнтных монослоев. Бессывороточную DMEM (240 мкл) добавляли к 10 мкл Липофектамина 2000 и инкубировали при комнатной температуре в течение 4 минут. К этой смеси добавляли ДНК, доведенную до 50 мкл бессывороточной DMEM, и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Перед трансфекцией среду заменяли 2 мл бессывороточной DMEM. После инкубации смесь для трансфекции добавляли по каплям к этим клеткам и инкубировали в течение 5 часов при 37°С. После трансфекции клетки промывали один раз PBS и добавляли 2 мл DMEM, дополненной 2% ФТС, для получения вируса или 10% ФТС для FACS-анализов.
Плазмиды
Использовали эукариотические экспрессионные векторы, кодирующие T7pol (pAR3126 и pAR3132). Тогда как плазмида pAR3126 кодирует T7pol дикого типа, плазмида pAR3132 экспрессирует T7pol, содержащий сигнал ядерной локализации (NLS), который эффективно нацеливает T7pol на ядро клетки (5). Эукариотические экспрессионные плазмиды, из которых экспрессируются белки полимеразы вируса гриппа А, использовали промотор гидроксиметилглутарил-кофермент А-редуктазы мыши, pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA и pHMG-NP (25).
НδVrib pPolI-Cat-RT (25) амплифицировали при помощи ПЦР и клонировали в сайты XbaI-BamHI pSP72. Последовательность tT7, расщепленную BamHI-EcoRV, клонировали в сайты BamHI-HpaI pSP72-НδVrib с получением pSP72-НδVrib-tT7 (MS24). Олигонуклеотид, кодирующий рТ7, лигировали в сайты NdeI-XbaI pSP72-НδVrib-tT7 в подходящем контексте относительно введенных сайтов BbsI с получением вектора pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 (MS25, фиг.1). Открытую рамку считывания зеленого флуоресцентного белка (GFP), фланкированную NCR из сегмента 5 вируса гриппа А/PR/8/34, клонировали в сайты BbsI pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 с использованием pSP-Hu-GFP-Mu (4) в качестве матрицы. Этот GFP-минигеном клонировали, как в смысловой, так и в антисмысловой ориентациях, и он содержал 0/2/3 дополнительных остатков G непосредственно ниже рТ7 (фиг.1).
Для клонирования генных сегментов вируса гриппа А/PR/8/34 в pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 двунаправленные конструкции вируса гриппа А/PR/8/34, описанные de Wit et al. (4), использовали в качестве матрицы для ПЦР (четвертый 3'-нуклеотид соответствовал последовательностям вируса гриппа А/PR/8/34, сообщенным в базе данных National Influenza sequence Database). Праймеры, содержащие сайт рестрикции AarI, использовали для клонирования сегментов 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, и лигирование тупых концов использовали для сегмента 5; эти генные сегменты клонировали в сайты BbsI в антисмысловой ориентации, и они содержали 2 дополнительных остатка G после рТ7.
Двунаправленный вектор pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV (MS65, фиг.1) получали клонированием промотора CMV (pCMV) ниже tT7 для создания возможности получения мРНК из соответствующих генных сегментов. pCMV амплифицировали при помощи ПЦР с использованием праймеров, содержащих сайты рестрикции AseI. pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 частично расщепляли AseI и pCMV лигировали ниже tT7 в подходящем направлении для получения мРНК из генного сегмента.
Сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 снова клонировали для получения каждой из двунаправленных запускаемых T7pol конструкций вируса гриппа А/PR/8/34.
Авторы изобретения генерировали также набор двунаправленных векторов, из которых был делетирован tT7. Это выполняли расщеплением pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV BamHI-BpeEI, обработкой ферментом Кленова и повторным лигированием с получением pSP72-рТ7-НδVrib-pCMV (MS90, фиг.1).
Сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 снова клонировали для получения каждой из двунаправленных запускаемых T7pol конструкций вируса гриппа А/PR/8/34.
Все плазмиды секвенировали с использованием набора для секвенирования Big Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) и Генетического Анализатора 3100 (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Получение рекомбинантного вируса с использованием системы на основе T7pol
Клетки 293 Т трансфицировали, как описано выше, 5 мкг из каждой из однонаправленных плазмид, содержащих генный сегмент PR/8/34, 5 мкг каждой из экспрессионных плазмид HMG-PB2, HMG-PB1, HMG-PA, HMG-NP и 15 мкг pAR3132. Альтернативно, авторы трансфицировали 5 мкг из каждой из двунаправленных плазмид, содержащих генный сегмент PR/8/34, и 15 мкг pAR3132. Супернатанты собирали спустя 72 часа после трансфекции и 1 мл использовали для инфицирования конфлюэнтного монослоя клеток MDCK.
Инфицирования и определения титров вируса
Перед инокуляцией клетки MDCK промывали дважды PBS и 1 мл супернатанта клеток 293Т использовали для инокуляции конфлюэнтного монослоя клеток MDCK в 6-луночном планшете; 40 мкг трипсина (2,5%, Bio Whittaker) добавляли во время инфицирования. Планшеты выдерживали при 37°С в течение 1 часа и промывали два раза PBS, после чего добавляли 2 мл среды ЕМЕМ (BioWhittaker), дополненной 4% БСА, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамином, 1,5 мг/мл бикарбоната натрия, 10 мМ HEPES, заменимыми аминокислотами и 20 мкг/мл трипсина (среда для инфицирования). Через 3 дня после инфицирования супернатанты этих культур собирали и испытывали на активность НА в качестве индикатора инфицирования этих клеток. Определения титров вируса выполняли, как описано ранее (26). Вкратце, готовили десятикратные серийные разведения супернатантов трансфицированных клеток в среде для инфицирования. Перед инокуляцией эти клетки промывали два раза PBS. 100 мкл разведенных культуральных супернатантов использовали для инокуляции конфлюэнтного монослоя клеток MDCK в 96-луночных планшетах. После 1 часа при 37°С эти клетки промывали опять PBS и в каждую лунку добавляли 200 мкл свежей среды для инфицирования. Через 3 дня после инфицирования супернатанты этих культур испытывали на активность НА в качестве индикатора инфицирования клеток в отдельных лунках. Титры инфицирования рассчитывали из 10 повторностей в соответствии со способом Spearman-Karber (26).
Результаты
Анализы GFP-минигеномов с использованием однонаправленной системы обратной генетики на основе T7pol
Конструировали однонаправленный вектор, содержащий рТ7, НδVrib и tT7. Открытую рамку считывания GFP, фланкированную некодирующими районами (NCR) сегмента 5 вируса гриппа А/PR/8/34, клонировали в pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 в смысловой (S) и антисмысловой (AS) ориентации с 0, 2 или 3 дополнительными остатками G (фиг.1 и приложения 2 и 3). Эти конструкции были названы S-0G, S-2G, S-3G, AS-0G, AS-2G и AS-3G соответственно. Авторы изобретения испытывали, какие из этих возможных конструкций приводили к наилучшей эффективности.
Авторы трансфицировали клетки 293Т одним из этих GFP-минигеномов (S-0G, S-2G, S-3G, AS-0G, AS-2G, AS-3G), плазмидой экспрессии T7pol (pAR3132) и четырьмя плазмидами, экспрессирующими белки РВ2, РВ1, РА и NP (pHMG-PB2, pHMG-PB1, pHMG-PA, pHMG-NP). В качестве контролей, авторы выполняли те же самые трансфекции, из которых исключали pHMG-NP, что должно было приводить к отсутствию репликации этого GFP-минигенома. Через 30 часов после трансфекции эти клетки анализировали на предмет флуоресценции в FACSCalibur. Эти результаты изображены на фиг.2. Из левой панели можно видеть, что наивысшую долю GFP-положительных клеток наблюдали после трансфекции GFP-минигенома в антисмысловой ориентации, с двумя дополнительными остатками G.
Другие конструкции GFP-минигеномов также давали долю GFP-положительных клеток, но несколько более низкую. При сравнении средней флуоресценции GFP-положительных клеток (фиг.2, правая панель), опять GFP-минигеномы в антисмысловой ориентации с двумя дополнительными остатками G показывали наилучшую производительность. В этом эксперименте GFP-минигеном в смысловой ориентации с двумя дополнительными остатками G обнаруживал самую плохую производительность, а другие конструкции были промежуточными.
Хотя авторы изобретения наблюдали некоторую вариацию в отношении доли GFP-экспрессирующих клеток и уровней экспрессии GFP между различными плазмидами GFP-минигеномов от эксперимента к эксперименту (данные не показаны), GFP-минигеном в антисмысловой ориентации с двумя дополнительными остатками G обычно был наиболее производительным, и, следовательно, эта конструкция была отобрана для последующих экспериментов.
Ядерная экспрессия T7pol против цитоплазматической экспрессии T7pol
Одной проблемой, которая потенциально должна была быть решена авторами изобретения, была экспрессия T7pol. Для обратной генетики парамиксовируса, использовали T7pol, экспрессируемый первично в цитоплазме клетки, что является желательным, так как репликация парамиксовируса также имеет место в цитоплазме. Вирусы гриппа реплицируются в ядре клетки, и, следовательно, экспрессия T7pol в цитоплазме не является наилучшим выбором. Таким образом, авторы изобретения хотели сравнить уровень экспрессии GFP, когда либо используется цитоплазматическая версия T7pol (плазмида AR3126), либо используется T7pol, содержащий сигнал ядерной локализации (NLS, плазмида pAR3132).
Результаты этого эксперимента показаны на фиг.3. При использовании плазмиды экспрессии T7pol дикого типа, средняя флуоресценция GFP в положительных клетках была равна 521. Этот уровень экспрессии GFP мог быть увеличен значимо с использованием T7pol, который содержал сигнал ядерной локализации (средняя флуоресценция равна 1106). При объединении конструкций T7pol с сигналом ядерной локализации и без сигнала ядерной локализации (в отношении 1:1, при поддержании неизменным общего количества трансфицированной плазмиды) наблюдали промежуточный уровень экспрессии GFP (средняя флуоресценция была равна 775). В многочисленных независимых экспериментах с использованием большого разнообразия экспрессирующих GFP-минигеном плазмид эти результаты были воспроизводимыми; наблюдали 2-10-кратное увеличение экспрессии GFP при использовании ядерной версии T7pol (данные не показаны). Таким образом, в последующих экспериментах авторы использовали T7pol, содержащий сигнал ядерной локализации.
Транзиторная экспрессия T7pol против стабильной экспрессии T7pol
Для некоторых систем обратной генетики парамиксовирусов T7pol подается не посредством плазмидной трансфекции, а посредством использования клеточной линии, которая делает возможной стабильную экспрессию T7pol. Для этой цели доступны клетки детеныша хомячка (BSR-T7). Авторы изобретения испытывали, могут ли клетки BSR-T7 использоваться для транскрипции минигенома вируса гриппа-GFP, который мог бы затем реплицироваться комплексом полимеразы вируса гриппа, приводя к экспрессии GFP (фиг.4).
Как можно видеть на фиг.4, высокая флуоресценция GFP в клетках 293Т в сильной степени зависит от экспрессии T7pol. В клетках BSR-T7 наблюдали относительно высокие уровни экспрессии GFP после котрансфекции GFP-минигенома с комплексом полимеразы вируса гриппа в отличие от трансфекций, из которых была исключена плазмида pHMG-NP. Было обнаружено, что после добавления плазмиды, экспрессирующей ядерную версию T7pol, экспрессия GFP была еще более высокой. Относительно высокие уровни экспрессии GFP в клетках BSR-T7 предполагают, что стабильная экспрессия T7pol является более эффективной, чем транзиторная (временная) экспрессия вследствие трансфекции. Однако эксперимент, в котором ядерный T7pol был обеспечен трансфекцией, предполагает, что для обратной генетики вируса гриппа стабильная клеточная линия, экспрессирующая ядерный T7pol, могла бы быть даже более эффективной, чем T7pol дикого типа.
Получение рекомбинантного вируса с использованием однонаправленной системы обратной генетики на основе T7pol
Затем генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 клонировали в вектор pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 для генерирования рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34.
1
7
50
50
Авторы трансфицировали клетки 293Т восемью конструкциями, кодирующими генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34, pT7pol (pAR3132), pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA и pHMG-NP. После трансфекции к среде добавляли трипсин для создания возможности репликации получаемых вирусов. Через 72 часа после трансфекции супернатанты собирали и использовали для инокуляции клеток MDCK. Через 3 дня после инокуляции выполняли НА-тест на супернатанте этих клеток MDCK в качестве указания на репликацию вируса. НА-тест был положительным. Затем определяли титр вируса супернатантов 293Т и MDCK. Было показано, что титр вируса в супернатанте 293Т был равен 1,6×10 TCID/мл; было показано, что титр вируса в супернатанте MDCK был равен 2,0×10 TCID/мл. Несколько более низкие титры вируса в клетках 293Т и MDCK получали, когда трипсин не добавляли к клеткам 293Т после трансфекции (данные не показаны). Таким образом, это показывает впервые высвобождение вируса гриппа А с использованием плазмиды только с рекомбинантным вирусом гриппа А, которое не использует промотор PolI.
Двунаправленная система Т7
Затем авторы изобретения хотели разработать двунаправленную систему обратной генетики под контролем рТ7. Плазмидный вектор получали клонированием pCMV в pSP72-рТ7-НδVrib-tT7 с получением вектора pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV (фиг.1). Открытую рамку считывания GFP, фланкированную некодирующими районами (NCR) сегмента 5 вируса гриппа А/PR/8/34, клонировали в pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV в антисмысловой (AS) ориентации с 2 дополнительными остатками G. Поскольку авторы изобретения ожидали, что эта плазмида будет приводить к экспрессии GFP без необходимости репликации минигенома комплексом полимеразы вируса гриппа, (pCMV находится в смысловой ориентации относительно этого минигенома), авторы изготовили также сходную конструкцию, содержащую этот минигеном (0 остатков G) в смысловой ориентации относительно рТ7 (следовательно, в антисмысловой ориентации относительно pCMV). Эти минигеномные плазмиды трансфицировали в клетки 293Т вместе с плазмидами, экспрессирующими ядерный T7pol и pHMG-PB1, pHMG-PB2, pHMG-PA и pHMG-NP. Клетки анализировали FACS спустя 30 часов (фиг.5).
Трансфекция смыслового GFP-минигенома (S-0G) неполным комплексом полимеразы вируса гриппа приводила к очень небольшому количеству GFP-положительных клеток (фиг.5, левая панель) с очень низкой экспрессией GFP (фиг.5, правая панель). В присутствии полного комплекса полимеразы вируса гриппа ~7% клеток были GFP-положительными со средней флуоресценцией ~1200. С использованием этой плазмиды с антисмысловым GFP-минигеномом относительно большая доля клеток (~10%) экспрессировала GFP в отсутствие полного комплекса полимеразы вируса гриппа, но только при низких уровнях (средняя флуоресценция GFP 182). После котрансфекции полного комплекса полимеразы вируса гриппа доля клеток, экспрессирующих GFP, не увеличивалась, тогда как уровень экспрессии GFP на клетку значимо увеличивался (средняя флуоресценция GFP 1205). Таким образом, из этого эксперимента авторы смогли сделать вывод, что двунаправленный экспрессионный вектор был функциональным; авторы наблюдали низкие уровни экспрессии GFP без необходимости комплекса полимеразы вируса гриппа вследствие образования мРНК GFP из pCMV. Следует отметить, что это было подтверждено трансфекцией клеток 293Т только плазмидой AS-2G GFP-минигенома, приводящей к сходным уровням экспрессии GFP (~19% клеток, экспрессирующих при средней флуоресценции 128, данные не показаны). Кроме того, авторы наблюдали увеличенные уровни экспрессии GFP в присутствии комплекса полимеразы вируса гриппа как результат репликации минигенома, транскрибируемого от рТ7. Таким образом, двунаправленная экспрессионная плазмида рТ7-pCMV была функциональной.
Продуцирование рекомбинантного вируса с использованием двунаправленной системы обратной генетики на основе T7pol
Затем генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 клонировали в вектор pSP72-рТ7-НδVrib-tT7-pCMV для генерирования рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34.
Авторы изобретения трансфицировали клетки 293Т восемью конструкциями, кодирующими генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 и pT7pol (pAR3132). После трансфекции к среде добавляли трипсин для создания возможности репликации продуцируемых вирусов. Через 72 часа после трансфекции супернатанты собирали и использовали для инокуляции клеток MDCK. Через 3 дня после инокуляции выполняли НА-тест на супернатанте этих клеток MDCK в качестве указания на репликацию вируса. Этот НА-тест был отрицательным, свидетельствуя о том, что не был извлечен рекомбинантный вирус.
5
50
Из репортерных анализов минигеномов с использованием двунаправленных векторов для экспрессии генов РВ2, РВ1, РА и NP, авторы получили доказательство того, что экспрессия белка из этих плазмид была очень низкой (данные не показаны). Авторы предположили, что последовательность tT7 препятствовала транскрипции от pCMV, приводя к низкому продуцированию кодируемых генов. Таким образом, авторы генерировали новую двунаправленную плазмиду, из которой была удалена последовательность tT7 (pSP72-рТ7-НδVrib-pCMV). Генные сегменты вируса гриппа А/PR/8/34 клонировали в вектор pSP72-рТ7-НδVrib-pCMV для генерирования рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34. В начальных попытках опять не продуцировался рекомбинантный вирус. Однако после некоторой оптимизации количества плазмид, использованных для трансфекции, авторы успешно получали рекомбинантный вирус. Количества плазмид, используемые для этого эксперимента, были 10 мкг каждой из конструкций, кодирующих РВ2, РВ1, РА и НА, и 5 мкг каждой из конструкций, кодирующих NP, NA, MA и NS. Хотя титры рекомбинантного вируса были недетектируемыми в клетках 293Т, последующая инокуляция клеток MDCK приводила к вирусу с начальным титром 1,3×10 TCID/мл.
T7pol-система в клетках MDCK
Для обеспечения дополнительного доказательства универсального характера системы обратной генетики на основе T7pol авторы испытывали репликацию GFP-минигенома в клетках MDCK, а не в клетках 293Т. Хотя эксперименты с клетками BSR-T7 уже обеспечили доказательство того, что система обратной генетики на основе T7pol работает в клетках, происходящих не из клеток приматов (фиг.4), клетки MDCK более широко используются для исследования вируса гриппа и получения вакцины.
Как можно видеть на фиг.6, было обнаружено, что система обратной генетики на основе T7pol является функциональной в клетках MDCK. Вместе с результатами на клетках BSR-T7 (фиг.4) эти эксперименты указывают на то, что система обратной генетики на основе T7pol действительно представляет «универсальную» систему, применимую для большого разнообразия типов клеток. Из этого эксперимента можно также сделать вывод, что теперь является возможным получение рекомбинантного вируса гриппа из клеток, не являющихся клетками приматов.
Здесь авторы изобретения впервые показали получение рекомбинантного вируса гриппа А/PR/8/34 (MDCK-адаптированного штамма NIBSC) с использованием системы на основе T7pol в клетках 293Т. Однако нет никаких предположений, которые ограничивают применение этих способов только в отношении вируса гриппа А А/PR/8/34; они могут быть применены ко всем вирусам гриппа типов А, В и С, а также к другим сегментированным РНК-вирусам с минус-цепью. Нет также предположений, которые ограничивают применение этих способов только в отношении клеток 293Т, BSR-Т7 и MDCK; T7pol может поставляться, например, трансфекцией широкого диапазона клеточных линий, в которых мог бы затем продуцироваться рекомбинантный вирус.
Существует также значительная гибкость (свобода) в отношении плазмидных векторов для технологии обратной генетики на основе T7pol и в отношении элементов, которые они содержат. Здесь авторы использовали РНК-полимеразу бактериофага Т7 для получения вРНК или кРНК-подобных молекул РНК, но могли бы также использоваться различные другие РНК-полимеразы, такие как РНК-полимераза бактериофага SP6. В показанных здесь экспериментах РНК-полимераза Т7 была модифицирована таким образом, что она содержит сигнал ядерной локализации большого Т-антигена SV40, но РНК-полимераза может быть модифицирована с использованием различных других сигналов ядерного нацеливания (например, сигналов белка К hnRNP). Здесь авторы изобретения использовали последовательность рибозима вируса гепатита дельта, но были описаны другие последовательности рибозимов, которые могли бы использоваться альтернативно. Наконец, описанная здесь система не зависит от применения экспрессирующих векторов белков полимеразы вируса гриппа, основанных на мышином промоторе гидроксиметилглутарил-кофермент А-редуктазы (pHMG-конструкции); могут быть использованы белки полимеразы из широкого диапазона вирусов гриппа, и они могут быть экспрессированы с использованием широкого диапазона экспрессирующих векторов.
Пример 2
5
50
Рекомбинантный вирус получают, как описано выше, на основе высокопроизводительного молекулярного скелета вируса (например, полученного из вакцинного штамма А/PR/8/34) с генами НА и NA релевантного эпидемического вируса (например, А/Moscow/10/99). После получения рекомбинантного вируса трансфекцией, этот вирус амплифицируют в подходящем клеточном субстрате (например, яйцах, клетках MDCK, клетках Vero) до достаточно высоких количеств. После размножения в содержащих зародыш куриных яйцах аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием в течение 10 минут при 1000 × g и фильтрованием через фильтр 0,45 микрометров. После этого этот вирус осаждают центрифугированием в течение 1,5 часов при 150000 × g при 4°С и ресуспендируют в забуференном фосфатом солевом растворе (PBS). Затем вирус обрабатывают 2% деканоил-N-метилглюкамидом (MEGA), наносят на слой 25% сахарозы в PBS и центрифугируют в течение 1,5 часов при 250000 × g при 4°С. Затем верхний слой, содержащий белки НА и NA, диализуют против PBS и чистоту и количество этого белкового препарата подтверждают с использованием 12,5% ДСН-полиакриламидных гелей, окрашенных Кумасси бриллиантовым синим. Хорьков иммунизируют внутримышечно ~10 микрограммами белков НА/NA. Если желательно, вакцинации могут выполняться с использованием последовательного множественного введения доз или с использованием адъювантов (MF59, ISCOM). Титры антител против НА и NA в пробах сыворотки, собранной до и после вакцинации, определяют с использованием анализов ингибирования гемагглютинации, анализов ингибирования нейраминидазы, ELISA, анализов нейтрализации вируса и т.д. Вакцинированных и контрольных животных повторно иммунизируют спустя 6 недель после вакцинации с использованием дозы, инфицирующей 50% клеток культуры ткани 1×10 (TCID), вируса гриппа А/Moscow/10/99 или гетерологичного изолята вируса. После иммунизации берут пробы в виде мазков из носа и глотки животных ежедневно в течение 10 дней и количество вируса, экскретируемого инфицированными животными, определяют количественными ПЦР-анализами или определениями количеств вируса. Таким образом, полученный индуцированный вакциной иммунитет может быть подтвержден количественным определением увеличения титров антител и уровня защиты против инфицирования введенным вирусом.
Ссылки