СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ САНИТАРНО-ПОКАЗАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ И СТАРТОВЫХ КУЛЬТУР В МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ
METHOD FOR DETECTING SANITARY INDICATOR BACTERIA AND STARTER CULTURE IN MEAT PRODUCTS

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологии. Изобретение обеспечивает комплексное выявление санитарно-показательных бактерий (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes), регламентированных СанПиНом 2.3.2.1078-01 и стартовых культур родов Lactobacillus, Staphylococcus, Pediococcus в мясных продуктах. Питательная среда содержит пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, глюкозу, твин-80, натрий фосфорнокислый, магний сернокислый, железо сернокислое, дистиллированную воду. Идентификацию осуществляют посредством метода ПЦР-анализа с электрофоретической схемой детекции [2, 3, 7].
Обеспечение безопасности пищевых продуктов является важной частью санитарно-эпидемиологического благополучия населения. Некачественные пищевые продукты, в т.ч. мясные продукты, могут привести к заболеваниям различной этиологии. Для предотвращения риска возникновения заболеваний, вызываемых бактериями видов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, которые могут присутствовать в мясных продуктах, необходимо проводить их своевременное выявление, включающее выявление с помощью среды обогащения и идентификацию на основе молекулярно-генетических методов исследования.
При изготовлении ферментированных (сырокопченых и сыровяленых) мясных продуктов для гарантии безопасности предусматривается добавление в рецептуру эффективных ингибиторов в отношении санитарно-показательной микрофлоры - стартовых культур, относящихся к родам Lactobacillus, Staphylococcus и Pediococcus. Чтобы контролировать процесс развития стартовых культур, необходимо проводить их мониторинг на всем протяжении технологического процесса. Поэтому так же, как и для санитарно-показательных бактерий необходим простой и доступный способ выявления бактерий родов Lactobacillus, Staphylococcus и Pediococcus в мясных продуктах для последующей их идентификации молекулярно-генетическими методами исследования.
Необходимо отметить, что стартовые культуры рода Staphylococcus выделены из мясных образцов и адаптированы к культивированию на богатой питательной среде.
Для решения этих проблем требуется создание эффективного способа выявления санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясных продуктах.
Известен способ выявления санитарно-показательной микрофлоры на питательной среде Луриа-Бертани [1, 4], которая характеризуется простотой изготовления и широко используется на стадии обогащения в практических лабораториях, осуществляющих молекулярно-генетические исследования. Готовят среду Луриа-Бертани по нижеследующей прописи, г/л:
Пептон
10,00
Дрожжевой экстракт
5,00
Натрия хлорид
5,00
Конечное значение pH (при 25°С)
7,0±0,2
Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Бактерии инкубируют при 37°С в термостате в течение 18-24 ч.
Недостатком этого способа является обедненный состав среды Луриа-Бертани. Бактериям для синтеза компонентов клеток необходимы углерод, азот, сера и фосфор плюс небольшое количество щелочных и щелочноземельных металлов, а также следовое количество микроэлементов.
Пептон является источником азота и серы, дрожжевой экстракт - витаминов группы В, хлорид натрия - ионов натрия для мембранного транспорта и поддержания оптимального осмотического давления. Однако этих компонентов достаточно лишь для удовлетворения минимальных потребностей санитарно-показательных бактерий.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа для выявления санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур является способ выявления стартовых культур на среде MRS [5, 6]. Готовят среду MRS по нижеследующей прописи, г/л:
Протеозопептон
10,00
Мясной экстракт
10,00
Дрожжевой экстракт
5,00
Глюкоза
20,00
Твин-80
1,00
Аммония цитрат
2,00
Натрия ацетат
5,00
Магния сульфат
0,10
Марганца сульфат
0,05
Натрия гидрофосфат
2,00
Конечное значение pH (при 25°С)
6,5±0,2
Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде и стерилизуют при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. Бактерии инкубируют при 37°С в термостате в течение 18-24 ч.
Среда MRS содержит, наряду с пептоном и дрожжевым экстрактом, ряд других необходимых для роста стартовых культур ингредиентов. В состав мясного экстракта входят такие компоненты, как азот, органические вещества, нерастворимый и свертывающий протеин, альбумоза, минеральные и др. вещества. Глюкоза является источником углерода, твин-80 - жирных кислот. Натрий гидрофосфат является источником фосфора, который встречается в природе обычно в виде фосфатов. Сульфат магния - источник щелочноземельных металлов, а сульфат марганца - микроэлементов.
К недостаткам этого способа можно отнести то, что для создания селективности в отношении стартовых культур в среде используется ацетат натрия и цитрат аммония, что не позволяет использовать ее для выявления санитарно-показательных бактерий. Кроме того, применение указанных режимов стерилизации может привести к карамелизации глюкозы, снижению ее содержания в питательной среде и нехватке в качестве источника углерода для роста и развития бактерий.
Общим недостатком вышеперечисленных способов является то, что они не позволяют осуществлять одновременное выявление санитарно-показательной микрофлоры и стартовых культур в мясных продуктах.
Задача предлагаемого изобретения направлена на разработку способа для одновременного выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах для последующей их идентификации методом ПНР с электрофоретической схемой детекции.
Поставленная задача решается в предлагаемом способе выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах, включающем приготовление среды обогащения по прописи, контроль pH, стерилизацию, выявление санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах и их идентификацию, в котором согласно изобретению для приготовления среды по прописи в 950 мл дистиллированной воды растворяют 10,00 г пептона, 5,00 г мясного экстракта, 5,00 г дрожжевого экстракта, 1,00 г твина-80, 3,00 г натрия фосфорнокислого, 0,10 г магния сернокислого, 0,01 г железа сернокислого, среду стерилизуют при 1,1 атм в течение 15 мин, далее в 50 мл дистиллированной воды растворяют 20 г глюкозы, полученный 40%-ный раствор глюкозы стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин, затем в асептических условиях добавляют к среде и перемешивают, а для выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур, в стерильных условиях отбирают 25 г образца мясного продукта и помещают в колбу, содержащую 250 мл среды, затем инкубируют при 37°С в течение 16 ч, после чего бактерии отделяют от среды центрифугированием при 4000 об/мин, отмывают от остатков питательной среды физиологическим раствором и вновь центрифугируют при 4000 об/мин, из полученных бактериальных клеток выделяют геномную ДНК и идентифицируют с помощью ПЦР-анализа с электрофоретической схемой детекции с использованием родо- и видоспецифических праймеров для каждого искомого микроорганизма [2, 3, 7].
Техническим результатом при осуществлении изобретения является комплексное выявление санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах.
Чувствительность среды определяли по росту тест-штаммов: Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (ВКПМ B-6646), Escherichia coli K 12 С 600 (ВКПМ B-1010), Proteus vulgaris ATCC 13315 (ВКПМ В-1667), Salmonella typhimurium LT2 (ВКПМ В-3533), Listeria monocytogenes 766 (ГИСК им Л.А.Тарасевича), Lactobacillus curvatus 1 (ВКПМ В-8889), Lactobacillus plantarum 21 (ВКПМ В-8654), Pediococcus acidilactici 34 (ВКПМ В-8887), Pediococcus pentosaceus 28 (ВКПМ В-8888), Staphylococcus carnosus 108 (ВКПМ В-8953), Staphylococcus xylosus 45 (ВКПМ В-8945). Сравнительная характеристика чувствительности заявляемой среды и сред прототипов представлена в табл.1.
Приведенные данные свидетельствуют, что заявляемая среда является более чувствительной и эффективной, т.к. на ней наблюдался рост всех тест-штаммов, а на среде MRS только стартовых культур. На среде Луриа-Бертани рост стартовых культур отсутствовал, однако наблюдался активный рост санитарно-показательных бактерий.
Была изучена возможность практического использования заявляемого способа выявления санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясном сырье и готовых ферментированных продуктах (табл.2).
Объектами исследования служили охлажденная свинина (длиннейшая мышца спины) и 2 образца ферментированного мясного продукта. В первом случае ферментация осуществлялась бактериями Lactobacillus plantarum 21 (ВКПМ В-8654), Staphylococcus carnosus 108 (ВКПМ В-8953) (образец №1), во втором - Lactobacillus curvatus 1 (ВКПМ В-8889), Staphylococcus carnosus 108 (ВКПМ В-8953), Pediococcus pentosaceus 28 (ВКПМ В-8888) (образец №2).
С помощью опытной среды и среды Луриа-Бертани в охлажденной свинине были выявлены Escherichia coli и Staphylococcus aureus. При использовании среды MRS в качестве среды обогащения эти бактерии не были выявлены, т.к. ацетат натрия и цитрат аммония ингибировали их рост. Другие санитарно-показательные и стартовые культуры в исследуемой охлажденной свинине не были обнаружены.
В изучаемых ферментированных мясных продуктах были обнаружены стартовые культуры Lactobacillus spp. и Staphylococcus carnosus для образца №1 и Lactobacillus spp., Staphylococcus carnosus и Pediococcus spp. для образца №2 с помощью предлагаемой среды и среды MRS. Малокомпонентный состав среды Луриа-Бертани не позволил выявить эти бактерии. Присутствие санитарно-показательных бактерий в готовых ферментированных продуктах не было выявлено. Идентификация бактерий, выявленных как на заявляемой среде, так и на средах-прототипах, осуществлялась с помощью ПЦР-анализа с электрофоретической схемой детекции с использованием родо- и видоспецифических праймеров для каждого искомого вида микроорганизма [2, 3, 7].
Предлагаемый способ выполняется следующим образом.
Первый этап заключается в приготовлении среды.
В 950 мл дистиллированной воды растворяют 10,00 г пептона; 5,00 г мясного экстракта; 5,00 г дрожжевого экстракта; 1,00 г твина-80; 3,00 г натрия фосфорнокислого; 0,10 г магния сернокислого; 0,01 г железа сернокислого; контролируют pH при помощи pH-метра (pH 7,0±0,2), стерилизуют в автоклаве при 1,1 атм (121°С) в течение 15 мин. С целью исключения карамелизации глюкозы во время стерилизации отдельно готовят 40%-ный раствор глюкозы: 20 г глюкозы растворяют в 50 мл дистиллированной воды, стерилизуют при 0,5 атм (112°С) в течение 20 мин. Затем в асептических условиях к среде добавляют 50 мл раствора глюкозы, перемешивают. Среду можно хранить в холодильнике до 2-х месяцев.
Затем проводят второй этап - выявление санитарно-показательных бактерий и стартовых культур в мясных продуктах на питательной среде.
Из сырья и готовых мясных продуктов, в т.ч. ферментированных, отбирают 25 г образца и помещают в колбу, содержащую 250 мл среды, затем инкубируют при 37°С в течение 16 ч. Бактерии отделяют от среды центрифугированием при 4000 об/мин. Затем бактерии отмывают от остатков питательной среды физиологическим раствором и вновь центрифугируют при 4000 об/мин. Из полученных бактериальных клеток выделяют геномную ДНК, которую идентифицируют с помощью ПЦР-анализа с электрофоретической схемой детекции с использованием родо- и видоспецифических праймеров для каждого искомого микроорганизма [2, 3, 7].
При подготовке пробы ДНК-матрицы (выделение ДНК) использовался набор «AxyPrep Bacterial Genomic DNA Miniprep Kit» компании Axygen Scientific, Inc. США. Подбор праймеров для ПЦР-анализа осуществляли, используя литературные данные, а также применяли готовые наборы для амплификации компании «Литех», Россия. При проведении ПЦР-реакции использовали набор реагентов для ПЦР амплификации ДНК «GenPak PCR Core» компании «Изоген», Москва. ПЦР-реакцию проводили в объеме 25 мкл в стандартных пластиковых пробирках объемом 0,5 мл (Sarstedt, Германия) на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Для визуализации ампликонов 10 мкл ПЦР-продукта разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Результаты регистрировали с помощью фотодокументирующей системы Vitran. Размер фрагментов определяли в сравнении с «100 bp ДНК маркером М 15», от 100-1000 п.н.
Полученные результаты доказывают, что заявляемый способ позволяет упростить стадию обогащения за счет исключения использования двух сред для отдельного культивирования санитарно-показательных бактерий видов Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes и стартовых культур родов Lactobacillus, Staphylococcus, Pediococcus в мясных продуктах, расширить ассортимент сред обогащения, а также снизить материальные затраты, связанные с приготовлением двух видов сред. Использование молекулярно-генетических методов при проведении бактериологического анализа позволит существенно сократить длительность анализа, а также более точно оценить санитарно-гигиеническую картину мясных продуктов.
Таблица 1
Свойства среды обогащения в сравнении со средами-прототипами
Индикаторные культуры
Рост на заявляемой среде обогащения
Рост на среде Луриа-Бертани
Рост на среде MRS
Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (ВКПМ В-6646)
+
+
-
Escherichia coli K 12 С 600 (ВКПМ В-1010)
+
+
-
Proteus vulgaris ATCC 13315 (ВКПМ В-1667)
+
+
-
Salmonella typhimurium LT2 (ВКПМ В-3533)
+
+
-
Listeria monocytogenes 766 (ГИСК им. Л.А.Тарасевича)
+
+
-
Lactobacillus curvatus 1 (ВКПМ В-8889)
+
-
+
Lactobacillus plantarum 21 (ВКПМ В-8654)
+
-
+
Pediococcus acidilactici 34 (ВКПМ В-8887)
+
-
+
Pediococcus pentosaceus 28 (ВКПМ В-8888)
+
-
+
Staphylococcus carnosus 108 (ВКПМ В-8953)
+
-
+
Staphylococcus xylosus 45 (ВКПМ В-8945)
+
-
+
Таблица 2
Апробация среды обогащения на охлажденной свинине и готовых ферментированных мясных продуктах в сравнении со средами-прототипами
Выделенные культуры
Заявляемая среда обогащения
Среда Луриа-Бертани
Среда MRS
Охлажденная свинина (длиннейшая мышца спины)
Staphylococcus aureus
+
+
-
Escherichia coli
+
+
-
Proteus vulgaris
-
-
-
Salmonella typhimurium
-
-
-
Listeria monocytogenes
-
-
-
Staphylococcus carnosus
-
-
-
Lactobacillus spp.
-
-
-
Pediococcus spp.
-
-
-
Ферментированный мясной продукт (образец №1)
Staphylococcus aureus
-
-
-
Escherichia coli
-
-
-
Proteus vulgaris
-
-
-
Salmonella typhimurium
-
-
-
Listeria monocytogenes
-
-
-
Staphylococcus carnosus
+
-
+
Lactobacillus spp.
+
-
+
Pediococcus spp.
-
-
-
Ферментированный мясной продукт (образец №2)
Staphylococcus aureus
-
-
-
Escherichia coli
-
-
-
Proteus vulgaris
-
-
-
Salmonella typhimurium
-
-
-
Listeria monocytogenes
-
-
-
Staphylococcus carnosus
+
-
+
Lactobacillus spp.
+
-
+
Pediococcus spp.
+
-
+