Изучение иммуногенной активности аллергенных экстрактов пыльцы растений для выявления минорных чужеродных антигенов

infertility with gonadotropin and ovarian antibodies. Am. J. Reprod. Immunol. 2006; 56(5-6): 286-91.

16. Platia M.P., Bloomquist G., Williams R.F., Hodgen G.D. Refractoriness to gonadotropin therapy: how to distinguish ovarian failure versus pseudoovarian resistance caused by neutralizing antibodies. Fertil. andSteril. 1984; 42: 779-84.

17. Meyer W.P., Lavy G., DeCherney A.H., Visintin I., Economy K., Luborsky J.L. Evidence of gonadal and gonadotropin antibodies in women with a suboptimal ovarian response to exogenous gonadotropin. Obstet. and Gynecol. 1990; 75: 795-9.

18. Amato F., Warnes G.M., Kirby C.A., Norman R.J. Infertility caused by hCG autoantibody. J. Clin. Endocrinol. Metabol. 2002; 87(3): 993-7.

19. Menzhinskaya I.V., Van'ko L.V., Kiryushchenkov P.A., Ter-Avanesov G.V., Gavrilov Yu.A., Sukhikh G.T. Correlation between antibodies to gonadotropin-releasing hormone and reproductive disorders in humans. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2013; 155

20. Matsubayashi H., Sugi T., Arai T., Shida M., Kondo A., Suzuki T. et al. IgG-antiphospholipid antibodies in follicular fluid of IVF ET patients are related to low fertilization rate of their oocytes. Am. J. Reprod. Immunol. 2006; 55(5): 341-8.

21. Lee S.-R., Park E.-J., Kim S.-H., Chae H., Kim C.-H., Kang B.-M. Influence of antiphospholipid antibodies on pregnancy outcome in women undergoing In Vitro Fertilization and Embryo Transfer. Am. J. Reprod. Immunol. 2006; 57: 34-9.

22. Ponomareva I.V., Sukhikh G.T., Nikitin E.B., Kiryushchenkov P.A., Sidel'nikova V.M., Van'ko L.V. Autoantibodies against human chorionic gonadotropin in recurrent pregnancy loss. Byul-

leten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 1996; 4: 450-2.

23. Buckingham K.L., Stone P.R., Smith J.F., Chamley L.W. An-tiphospholipid antibodies in serum and follicular fluid: is there a correlation with IVF implantation failure? Hum. Reprod. 2006; 21: 728-34.

24. Matsubayashi H., Sugi T., Arai T., Kondo A., Suzuki T., Izumi S. et al. Different antiphospholipid antibody specificities are found in association with early repeated pregnancy loss versus recurrent IVF-failure patients. Am. J. Reprod. Immunol. 2001; 46(5): 323-9.

25. Haller K., Sarapik A., Talja I., Salumets A, Uibo R. Controlled ovarian hyperstimulation changes the prevalence of serum au-toantibodies in in vitro fertilization patients. Am. J. Reprod. Immunol. 2006; 56(5-6): 364-70.

26. Thomas J.W. Antigen-specific responses in autoimmunity and tolerance. Immunol. Res. 2001; 23: 235-44.

27. Pennell L.M., Galligan C.L., Fish E.N. Sex affects immunity. J. Autoimmunity. 2012; 38 (Issues 2-3): J282-J291.

28. Yu B., Ruman J., Christman G. The role of peripheral gonadotro-pin-releasing hormone receptors in female reproduction. Fertil. Steril. 2011; 95(2): 465-73.

29. Wu H.M., Wang H.S., Huang H.Y., Soong Y.K., MacCalman C.D., Leung P.C. GnRH signaling in intrauterine tissues. Reproduction. 2009; 137(5): 769-77.

30. Hammaden M.E., Ertan A.K., Zeppezauer M., Baltes S., Georg T., Rosenbaum P. et al. Immunoglobulins and cytokines level in fol-licular fluid in relation to etiology of infertility and their relevance to IVF outcome. Am. J. Reprod. Immunol. 2002; 47: 82-90.

Received 02.12.14

МЕТОДЫ

© АХАПКИнА И.Г., ЖЕлтИКОвА т.М., 2015 УдК 616-056.43-085.37-078.33

Ахапкина И.Г., Желтикова Т.М.

изучение иммуногенной активности аллергенных экстрактов пыльцы растений для выявления минорных чужеродных антигенов

ФгБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, 105064, Москва

В настоящее время для проведения аллергенспецифической иммунотерапии используют аллергенные экстракты (Аг), характеризующиеся биологической активностью, при этом обычно не учитывают компонентный состав. Однако минорные примеси могут корригировать общий иммунный ответ пациента с генетической предрасположенностью к гиперчувствительности.

Цель работы заключалась в выявлении в коммерческих Аг пыльцы ветроопыляемых растений минорных примесей антигенов грибов, ассоциированных с пыльцой в природных условиях, путем изучения иммуногенной активности Аг. Методом иммуноферментного анализа изучали степень иммунохимического связывания поликлональных кроличьих антисывороток, полученных против Аг пыльцы ольхи клейкой (Alnus glutinosa), березы повислой (Betula pendula), лещины обыкновенной (Corylus avellana), ежи сборной (Dactylis glomerata), полыни горькой (Artemisia absinthium), тимофеевки (Phleum pretense), с суспензиями мицелиальных и дрожжевых грибов (106 КОЕ/мл) и коммерческими Аг грибов (1 мкг/мл).

Показано, что Аг пыльцы растений индуцировали продукцию IgG, обладавших иммунохимическим сродством в отношении некоторых суспензий и Аг мицелиальных и дрожжевых грибов.

Таким образом, изучение иммуногенной активности позволяет косвенно выявлять в составе аллергенных препаратов минорные примеси чужеродных антигенов. Соответственно данный параметр следует считать еще одним критерием биологической активности Аг.

Ключевые слова: иммуногенность; аллерген; компонентный состав аллергенных экстрактов.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(3): 172-175.

Для корреспонденции: Ахапкина Ирина Гавриловна, isun17@yandex.ru For correspondence: Akhapkina Irina Gavrilovna, isun17@yandex.ru

Akhapkina I.G., Zheltikova T.M.

STUDYING OF IMMUNOGENIC ACTIVITY OF ALLERGENIC EXTRACTS OF POLLEN OF PLANTS FOR IDENTIFICATION OF MINOR FOREIGN ANTIGENS

I.I. Mechnikov Federal State Budgetary Institution Research Institute for Vaccines and Sera of the Russian Academy of Medical Science, 105064, Moscow, Russian Federation

Now for carrying out an allergenspecific immunotherapy use the allergenic extracts (AG), being characterized biological activity, thus the component structure usually isn't considered. However minor impurity can correlate the general immune answer of the patient with genetic predisposition to hypersensitivity.

The purpose of work consisted in identification in commercial AG of pollen of anemogamous plants of minor impurity of antigens of fungi associated with pollen in nature by studying of immunogenic activity of AG.

Immunochemical binding of rabbit polyclonal antisera against pollen AG of Alnus glutinosa, Betula pendula, Corylus avellana, Dactylis glomerata, Artemisia absinthium, Phleum pretense with suspensions of mycelial and yeast fungi (106 CFU/ml) and commercially available fungal AG (1 mkg/ml) was studied by ELISA.

It is shown that AG of pollen of plants induced production of IgG possessing immunochemical affinity concerning several suspensions and AG the mycelial and yeast fungi.

Thus, studying of immunogenic activity allows to reveal minor impurity of foreign antigens in allergenic preparations indirectly. Respectively, this parameter should be considered as one more criterion of biological activity of AG.

Keywords: immunogenicity; allergen; component composition of allergenic extracts.

citation: Immunologiya. 2015; 36

В настоящее время для проведения аллергенспецифиче-ской иммунотерапии (АСИТ) в нашей стране используют аллергенные препараты, представляющие собой сложную смесь соединений разной химической природы - белки, гликопро-теиды, полисахариды и др. Начальными этапами приготовления данных препаратов является сбор сырья и водно-солевая экстракция. Последующие этапы у разных производителей могут значительно отличаться. В результате готовые аллергенные препараты обладают разной биологической активностью. Попытки выработать общемировые требования к стандартизации пока не увенчались успехом [1]. Параллельно с этой задачей не прекращаются исследования в области общих подходов к проведению АСИТ. В данном случае имеется в виду дискуссия о составе аллерговакцин. Так, одна из точек зрения заключается во введении в состав препаратов комплекса основных аллергенов, другая предполагает проведение АСИТ одним аллергенным соединением, специфическая реакция на которое была выявлена в данный момент. На наш взгляд, необходимо учитывать не только аллергенспецифическую активность, но и иммуногенную активность аллергенных препаратов, особенно экстрактов, получаемых из природного сырья, как, например, из пыльцы растений, поскольку она несет на себе споры грибов в среднем 104 КОЕ на 1 г пыльцы [2, 3]. Было доказано, что зараженность пыльцы грибами не является случайным фактором внешнего поражения: при изучении ассоциации грибов с мужскими соцветиями березы повислой (Betula pendula) грибы высевались как с раскрывшихся соцветий, так и с внутренней части, после предварительной дезинфицирующей обработки внешней части соцветий (личное сообщение А.Б. Антроповой). Можно предположить, что на стадии экстракции некоторое количество грибных антигенов также экстрагируется и в дальнейшем вносит свой вклад в качественную характеристику иммуногенной активности аллергенного экстракта, расширяя спектр индуцированных антител. Поэтому, на наш взгляд, иммуногенная активность представляется опосредованной характеристикой антигенного состава аллергенных препаратов.

В связи с вышесказанным цель работы заключалась в анализе степени сродства поликлональных антисывороток (ПА), полученных против коммерческих аллергенных (АГ) экстрактов пыльцы ольхи клейкой (Alnus glutinosa), березы повислой (Betula pendula), ежи сборной (Dactylis glomerata), полыни горькой (Artemisia absinthium), тимофеевки (Phleum pratense) к коммерческим грибным аллергенным препаратам разных производителей и суспензиям Candida oleophila, Rhodotorula mucilaginosa, Debaryomyces hansenii, Aureobasidium pullulans.

Материал и методы

В работе использовали АГ экстракты грибов Alternaria al-ternata, Cladosporium herbarum, Rhizopus nigricans, Penicillium

notatum, Aspergillus fumigatus («Allergopharma», Германия), Д18 P. Chrysogenum, Д14 M. Racemosus, Д 9 C. herbarum, A. fumigatus, Д2 A. niger, Д22 R. nigricans, Д1 A. alternata («Бул Био - НЦЗПБ ЕООД»), АГ пыльцы ольхи клейкой (Alnus glutinosa), березы повислой (Betula pendula), лещины обыкновенной (Corylus avellana), ежи сборной (Dactylis glomerata), полыни горькой (Artemisia absinthium), тимофеевки (Phleum pratense) («Микроген», Москва), антитела диагностические против IgG(H+L) кролика, меченные пероксидазой (Предприятие по производству бактерийных препаратов НИИЭМ им. Н Ф. Гамалеи РАМН), суспензии дрожжей Candida oleophila, Rhodotorula mucilaginosa, Debaryomyces hansenii, суспензия гриба Aureobasidium pullulans.

ПА против коммерческих пыльцевых АГ получали путем иммунизации кроликов один раз в 28 дней в течение 3 мес по 500 мкг соответствующего АГ экстракта, причем первая инъекция проводилась в присутствии полного адъюванта Фрейнда (Sigma). ПА разливали по 50 мкл и хранили при температуре -20° С.

Степень сродства ПА к АГ определения методом обратного (непрямого) иммуноферментного анализа на твердой фазе. Для этого в карбонат-бикарбонатном буфере рН 9,6 (КББ) готовили разведения АГ концентрацией 1 мкг/мл. Далее 100 мкл полученных разведений сорбировали в двух лунках 96-луночного планшета («Costar», кат. № 2592), инкубировали 1 ч при 37° С, затем ночь при 4° С, удаляли жидкость из лунок, промывали 245 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,4 в присутствии 0,5% твина-20. В лунки вносили по 100 мкл соответствующих ПА в разведении 1:1000, инкубировали 45 мин при 37° С. Лунки освобождали от реакционной массы, промывали 3 раза ФСБ, прибавляли по 100 мкл конъюгата (антитела диагностические против IgG(H+L) кролика, меченные пероксидазой) в разведении 1:2000, инкубировали 30 мин при 37° С. Реакционную смесь удаляли из лунок, промывали 3 раза ФСБ, затем 2 раза дистиллированной водой. В лунки вносили по 100 мкл субстрата - тетраметилбензидин (ТМБ). Инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 3-5 мин. Реакцию останавливали прибавлением 100 мкл 5% раствора серной кислоты. Измеряли оптическую плотность (ОП) растворов в лунках при длине волны, равной 450 нм.

результаты и обсуждение

Ранее было показано (данные не представлены), что ПА, полученные против суспензий грибов и грибных АГ, не демонстрировали какой-либо степени сродства по отношению к суспензиям пыльцы растений, взятых в концентрации 60 мкг/мл, за исключением ПА, полученной против C. albi-cans. Поэтому на данном этапе исследования была изучена степень сродства ПА, полученных против АГ пыльцы

со ю

О)

2 1

1,5"

с

О

1 -

0,5-

см ю

и

со

Гч1

и

см го"

и

(О

о> со о"

га

-ч-

оо о

о о

см со см

о

о"

<0

со со о

1234567891

I I

ю

СП

>

о см

щ. о

со

о //

Ш. о

V//. //

9 1 2

ч-

о

2 3 4 5 6 7 8 Покровный антиген

ПА, полученная против АГ пыльцы березы повислой

ПА, полученная против АГ пыльцы ольхи клейкой

ПА, полученная против АГ пыльцы лещины обыкновенной

с О

оо

см а - со

Рис. 1. Степень сродства ПА, полученных против АГ пыльцы березы повислой, ольхи клейкой и лещины обыкновенной, к коммерческим аллергенам и суспензиям дрожжей, взятых в концентрации 1 мкг/мл и 106 КОЕ/мл соответственно.

Здесь и на рис. 2: 1 - АГ пыльцы березы повислой; 2 - АГ пыльцы ольхи клейкой; 3 - АГ пыльцы лещины обыкновенной; 4 - АГ ежи сборной; 5 - АГ пыльцы тимофеевки; 6 - суспензия дрожжей С. о1еоркйа; 7 - суспензия дрожжей D. катепи; 8 - суспензия дрожжей R. mucilaginosa; 9 - АГ С. herbarum.

растении, по отношению к суспензиям дрожжей, частота встречаемости которых на пыльце растений достаточно высока: С. о1еоркИа - 43%; D. катепи - 33,5%; R. тиЫ-¡а§тоза - 95% (личное сообщение А.М. Глушаковой). На рис. 1, 2 представлены полученные данные. Очевидно, что иммуногенность АГ пыльцы березы повислой демонстрировала самый широкий спектр продукции антител, способных активно реагировать, как с АГ других растений, так и с суспензией D. катепи и АГ С. кегЬагит. При этом частота встречаемости этого гриба на пыльце березы составляет 83% (личное сообщение А.Б. Антроповой). АГ пыльцы ольхи клейкой продемонстрировал очень высокую степень специфичности. Однако индуцировал образование антител, способных вступать в иммунохимическое взаимодействие с суспензиями дрожжей и АГ С. кегЬагит, причем активность названных антител составляла 15,08 - 33,28% от специфической активности. ПА, полученная против АГ пыльцы лещины обыкновенной, также отличалась высокой степенью сродства к суспензии С. о1еоркИа - 57,17%. ПА, полученные против АГ пыльцы ежи сборной и пыльцы тимофеевки, продемонстрировали высокую перекрестную реактивность - 95,19 и 89,78% соответственно. Более того, степень сродства ПА, полученной против АГ пыльцы тимофеевки, по отношению к суспензиям дрожжей и АГ С. кегЬагит практически приближалась к таковой по отношению к АГ пыльцы ежи. Безусловно, подобная степень обсемененности пыльцы растений (исходного сырья для производства АГ), как использованная в исследовании, в природе не встречается. Высокая концентрация суспензий дрожжей позволила выявить в коммерческих АГ пыльцы растений антигены, способные выступать иммуногенами, близкородственными антигенам дрожжей и грибов. Аналогичное исследование проведено в отношении коммерческих АГ грибов разных производителей и суспензии гриба А. ри11и1ат. Следует отметить, что частота встречаемости мицелиальных грибов

на пыльце рассматриваемых растений колеблется от 6 до 100% (личное сообщение А.Б. Антроповой). Результаты представлены в табл. 1. Как видно из данных, в отношении АГ производства «Бул-Био НЦЗПБ ЕООД» наиболее активны ПА, полученные против АГ пыльцы березы повислой и тимофеевки. В отношении АГ производства «AПergopharma» высокую степень сродства проявили ПА, полученные против АГ пыльцы полыни и тимофеевки. На следующем этапе для изучения качественной характеристики степени иммунохимического связывания ПА с АГ грибов последние были взяты в разных концентрациях. Данные приведены в табл. 2. При изменении концентрации покровного антигена в 10 раз не во всех случаях изменялась степень сродства ПА к АГ. Можно предположить, в каких случаях имеет место неспецифичное связывание. Для более полного понимания иммунохимического процесса взаимодействия, вероятно, следует провести дополнительные исследования индукции цитокинового ряда либо истощения ПА и анализа показателей иммуноблоттинга.

Основная задача АСИТ - это переключение №2-типа иммунологического ответа при контакте сенсибилизированного пациента с причинным аллергеном на ТЫ-тип, иными словами стимулирование продукции специфических IgG-антител разных классов. В результате иммунизации животных АГ получают гипериммунные ПА, содержащие антитела класса G, против практически всех компонентов АГ. При

3 4 5 6 7 8 9

1,4

1,2

0,8

0,6

0,4

0,2

г-- о о о о" Щ

ТГ

оо о"

3

оо со о"

И

см о> см

ч-ч-

о о"

д

1 2 3 4 5

6 7 8 9 1 2 3 4 Покровный антиген

5 6 7 8

ПА, полученная против АГ пыльцы ежи сборной ПА, полученная против АГ пыльцы тимофеевки

Рис. 2. Степень сродства ПА, полученных против АГ пыльцы ежи сборной и пыльцы тимофеевки, к коммерческим аллергенам и суспензиям дрожжей, взятых в концентрации 1 мкг/мл и 106 КОЕ/мл соответственно.

Таблица 1

степень иммунохимического сродства ПА, выраженная в оптических единицах

Покровный антиген ПА

производства «Бул-Био НЦЗПБ ЕООД» 1 мкг/мл полученная против АГ пыльцы березы полученная против АГ пыльцы ольхи полученная против АГ пыльцы ежи полученная против АГ пыльцы тимофеевки полученная против АГ пыльцы полыни

Д18 P. chrysogenum Д14 M. racemosus Д 9 C. herbarum A. fUmigatus Д2 A. niger Д22 R. nigricans Д1 A. alternata A. pullulans106 КОЕ/мл

A. alternata A. fumigatus C. herbarum P. notatum R. nigricans иммуноген

0,858 0,016 0,0 0,202 0,041

0,0 0,03 0,0 0,088 0,082

0,818 0,153 0,011 0,594 0,148

0,016 0,0 0,0 0,0 0,0

1,048 0,118 0,074 0,567 0,180

0,843 0,019 0,012 0,186 0,013

0,855 0,028 0,010 0,182 0,097

0,021 0,023 0,0 0,520 0,050

Покровный антиген производства «Allergopharma» 16 мкл/мл

0,0 0,0 0,0 0,246 0,147

0,148 1,102 0,250 1,750 1,613

0,489 0,403 0,251 0,954 0,452

0,043 0,054 0,120 0,646 1,005

0,241 0,023 0,011 1,960 1,971

0,896 0,934 1,256 1,278 1,194

Таблица 2

влияние концентрации покровного антигена на степень иммунохимического сродства Па

Покровный антиген АГ производства «Allergopharma» ПА

полученная против АГ пыльцы березы полученная против АГ пыльцы ольхи полученная против АГ пыльцы ежи полученная против АГ пыльцы тимофеевки полученная против АГ пыльцы полыни

A. alternata* 0,0 0,0 0,0 1,046 0,584

A. alternata** 0,0 0,0 0,0 0,280 0,376

A. fumigatus* 0,029 1,688 0,377 2,224 2,194

A. fumigatus** 0,057 1,522 0,210 2,010 2,104

C. herbarum* 0,604 0,504 0,283 1,396 0,674

C. herbarum** 0,122 0,088 0,0 0,525 0,232

P. notatum* 0,0 0,0 0,119 1,222 1,785

P. notatum** 0,022 0,0 0,050 1,120 1,208

R. nigricans* 0,465 0,004 0,044 2,175 2,275

R. nigricans** 0,272 0,0 0,0 1,811 2,080

Примечание. * - концентрация покровного антигена равна 16 мкл/мл, ** - концентрация покровного антигена равна 1,6 мкл/мл.

этом концентрационное соотношение антител различной специфичности будет зависеть от степени иммуногенности компонентов, т.е. можно предположить, что низкая концентрация определенного соединения в составе АГ не станет препятствием для более активной продукции IgG-антител. И таким образом в результате АСИТ в макроорганизме соотношение концентрации IgG-антител разной специфичности может не соответствовать концентрации соответствующих компонентов в сложной смеси АГ. В настоящее время для проведения АСИТ используют АГ, характеризующиеся биологической активностью или индексом реактивности, т.е. не учитывается массовое содержание компонентов. Поэтому изучение степени иммунохимического сродства ПА, полученных против АГ пыльцы растений, сырье для которых в естественных условиях ассоциировано с другими источниками аллергенов - мицелиальными и дрожжевыми грибами, к суспензиям или готовым аллергенам, может служить дополнительным критерием компонентного состава, а, следовательно, и биологической активности, ответственной за специфичность аллерговакцин.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, номер проекта 11-04-01063-а.

литература

1. Желтикова Т.М., Hrabina M., Антропова А.Б. Современные проблемы стандартизации аллерговакцин. Российский аллергологи-ческий журнал. 2011: 68-72.

2. Ахапкина И.Г. Иммунохимическая активность пыльцы березы (.Betula pendula). Иммунология. 2007; 28(6): 362-4.

3. Глушакова А.М., Желтикова Т.М., Чернов И.Ю. Дрожжи, ассоциированные с пыльцой ветроопыляемых растений. Микология и фитопатология. 2013; 47(5): 294-9.

Поступила 20.12.13

references

1. Zheltikova T.M., Hrabina M., Antropova A.B. Modern problems of standardization allergovaccines. Rossiyskiy allergologicheskiy zhur-nal. 2011; 2: 68-72.

2. Akhapkina I.G. Immunochemical activity of pollen of a birch

3. Glushakova A.M. Zheltikova T.M. Chernov I.Yu. The yeast associated with pollen of anemogamous plants. Mycologiya i fitopatologiya. 2013; 47

Received 20.12.13