Активность ингибиторов целлюлаз, пектиназ в клубнях и листьях картофеля

Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Саляхова А.Ф., Цветков В.О., Марданшин И.С., Ибрагимов Р.И.

Башкирский государственный университет, г.Уфа

АКТИВНОСТЬ ИНГИБИТОРОВ ЦЕЛЛЮЛАЗ, ПЕКТИНАЗ В КЛУБНЯХ И ЛИСТЬЯХ КАРТОФЕЛЯ

Одним из механизмов защиты растений от стрессовых воздействий является их способность подавлять активность гидролитических ферментов фитопатогенных организмов. Статья посвящена исследованию активности ингибиторов пектинолитических и целлюлолитических ферментов Leptinotarsa decemlineata из тканей картофеля. Установлено, что клубни и листья различных сортов и гибридов картофеля содержат ингибиторы, подавляющие активность гидролаз колорадского жука. Показатели активности ингибиторов целлюлаз и пектиназ в тканях растений могут служить в качестве критерия их устойчивости к фитофагам.

Ключевые слова: пектиназы, целлюлазы, ингибиторы гидролитических ферментов, колорадский жук, картофель.

Растения противостоят инфекциям и стрессовым воздействиям окружающей среды посредством проявления комплекса физиолого-биохи-мических реакций [1] , важным составляющим которых является подавление активности гидролитических ферментов [2,3]. Ткани растений содержат соединения, способные ингибировать активность гидролаз патогенных микроорганизмов, насекомых, млекопитающих. Наибольшее число работ посвящено исследованию ингибиторов, подавляющих активность протеолитичес-ких ферментов [4, 5]. Сведения об ингибиторах, подавляющих активность других гидролаз пока в литературе малочисленны [2].

Целлюлазы (КФ 3.2.1.4 и 3.2.1.74) и пектиназы ( КФ 3.1.1.11) участвуют в гидролизе материала клеточных стенок растений, уровень активности этих ферментов является важным фактором агрессивности и патогенности микроорганизмов и насекомых — фитофагов [6]. Соответственно, уровень антицеллюлазной активности растительных тканей может служить одним из важных показателей их устойчивости к фитофагам. В связи с этим, исследование относительной активности ферментов и их ингибиторов в системе «растение - насекомое» представляется актуальным и имеет научное и практическое значение.

В данной работе определяли активность ингибиторов из листьев, клубней и проростков картофеля различных сортов, подавляющих действие ферментов колорадского жука.

Материалы и методы

В работе были использованы клубни, листья, проростки картофеля сортов и гибридных

сортообразцов (Невский, Луговской, Удача, 4292-149, 4281-7, 9513). Клубни картофеля были выращены в ОПХ Башкирского НИИ сельского хозяйства РАСХН (г. Бирск).

Для получения растворов с ферментативной активностью, навеску имаго колорадского жука (1г) гомогенизировали в ступке и экстрагировали охлажденной дистиллированной водой (5 мл) в течение 1 ч. Центрифугировали в центрифуге МРШ-310 (Польша) при 7000 об/ мин, 10 мин. Для получения растворов с ингибиторной активностью, 1г растительной ткани экстрагировали в 5 мл охлажденной дистиллированной воды, осадок отделяли центрифугированием при 7000 об/ мин, 10 мин.

Способность экстрактов тканей картофеля подавлять активность целлюлаз определяли по разнице значений активности фермента с водой (контроль) и фермента с ингибитором (растительный экстракт). Активность ингибиторов определяли в экстрактах без нагревания и прогретых при 60°С в течение 10 мин.

Измерение ферментативной и ингибиторной активности проводили методом гелевых пластин [7]. В качестве субстрата для целлюлаз использовали 1% раствор карбоксиметил-целлюлозы, для пектиназ - 1% раствор яблочного пектина. За 1 миллиединицу активности фермента (мЕ) принимали такое его количество, которое гидролизовало субстрат геля размером 1 мм2. За 1 миллиингибиторную единицу активности (мИЕ) - количество ингибитора, необходимое для подавления 1 мЕ активности фермента в стандартных условиях (1ИЕ = 1000 мИЕ).

1 2 3 4 5

Рисунок 1. Гидролиз субстрата КМЦ, иммобилизованного в агарозный гель, ферментами колорадского жука и Trichoderma геезеі; 1,2 -колорадский жук; 3,4,5- Т. геезеі

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлен результат измерения активности цел-люлолитических ферментов, гидролизующих иммобилизованную в агарозный гель карбоксиметилцел-люлозу. Как видно, экстракты го-могената колорадского жука обладают высокой целлюлолитической активностью, сопоставимой с активностью коммерческого препарата целлюлазы (ТпеЬоёегша гее8е1) в концентрации 1 мг/мл.

В листьях исследованных сортов картофеля выявлена активность ингибиторов, подавляющих действие целлюлолитических и пектинолитических ферментов (табл.1). Уровень ингибиторной активности в листьях значительно различается в зависимости от сорта. Так, экстракты листьев гибрида 4281-7 обладают наибольшей антицеллюлазной активностью, причем практически в равной степени подавляют активность целлюлаз колорадского жука и Т. гее8еь В сортах Невский, Удача активность свободных ингибиторов целлюлаз в листьях не выявляется. Антицел-люлазная активность у этих сортов выявляется лишь после прогревания экстрактов. В любом случае, прогревание экстрактов при-

водит либо к появлению, либо к повышению активности целлюлитических ферментов. По-видимому, определенная часть молекул ингибиторов целлюлаз в растительных тканях находится в составе комплексов с термолабильными компонентами клетки.

Наши эксперименты показывают, что ткани картофеля не обладали целлюлолитичес-кой активностью. Ранее показано, что белковые ингибиторы протеолитических ферментов из растений обладают высокой термостабильностью, и могут быть выделены из комплекса с ферментом путем селективной денатурацией конформационно лабильных молекул фермента при нагревании экстрактов [4]. По нашим данным, растительные ингибиторы целлюлаз

Таблица 1. Активность ингибиторов целлюлаз и пектиназ (ИЕ/г сырой массы) в листьях различных сортов картофеля

Сорт картофеля Ингибиторы целлюлаз Ингибиторы пектиназ

Trichoderma reesei Имаго Leptinotarsa decemlineata имаго Leptinotarsa decemlineata

1 2 1 2 1 2

Невский 0 11,8 ± 0,4 9,4 % 4,6 ± 0,9 3,9% 20,1 ± 0,7 17,0% 14,9± 0,8 19,0% 14,9±0,8 19,0%

Удача 0 5,6±0,6 4,4% 0 5 ,5 2 ± , ОО 6 0, % -н о оС 41 ,7 % 0% -н О ,9 9 4 1

Луговской 2,3 ±0,4 1,8% 14,8 ±0,7 11,8% 2,8±0,6 2,4% 19,7±0,8 16,6%) 21,8 ±0,5 27,8% 14,9±0,8 19,0%

4281-7 2,3± 0,3 1,8% 28,3 ±1,2 22,6% 5,6±0,5 4,7% 27,1±0,6 23,1% 11,4 ±0,6 14,4% 8 0, % -Н о оС 41

9513 0 5,6±0,5 4,4% - - ,8 0, % И 4 3, 18, 2 3,9±0,9 4,9%

Примечание: 1- экстракт без прогревания; 2-экстракт после прогревания при 60° С, 10 мин.

В процентах выражена доля подавления активности фермента.

Активность целлюлаз Т. теезеі - 125,2 Е/мг; активность целлюлаз Ь. йесетііпеаіа - 117,9 Е/г активность пектиназ Ь. decemlineata — 78,5 Е/г

Таблица 2. Активность ингибиторов целлюлаз (ИЕ/г сырой массы) колорадского жука

в клубнях и проростках картофеля

Сорт Проростки Клубни

1 2 1 2

Невский 13,3+ 0,5 13,3% 19,1+0,8 19,2% 9,3±0,4 9,3% 8 0, % ,1 6 6

Удача 0 11,4 + 0,5 11,4% 8,3+0,6 8,3% 13,5+0,7 13,5%

4281-7 0 10,6+ 0,5 11,8+0,4 10,2+0,4

10,6% 11,8% 10,2%

4292-149 0 12,1± 0,4 4,2+0,3 13,3± 0,5

12,1% 4,3% 13,3%

1- экстракт без прогревания; 2-экстракт после прогревания при 60 єС, 10 мин. Активность целлюлаз Ь. йесетИиеМа - 117,9 Е/г .

В процентах выражена доля подавления активности фермента

и пектиназ также термостабильны и не теряют активности при прогревании экстрактов.

Интересно отметить, что прогревание экстрактов листьев картофеля не приводит к повышению активности ингибиторов пектиназ. Этот факт свидетельствует о том, что в листьях картофеля ингибиторы не способны образовывать комплексы с эндогенными пектиназами, хотя пектинолитическая активность в листьях картофеля присутствует.

Проростки и клубни картофеля также обладают антицеллюлазной активностью (табл.2). Как видно, ингибиторы в проростках находятся в связанном состоянии и их активность определяется только после прогревания экстрактов. В

клубнях картофеля определяется активность как свободных, так и связанных ингибиторов. Изученные образцы картофеля характеризуются значительными различиями по показателям активности свободных и связанных ингибиторов целлюлаз в проростках и клубнях.

Таким образом, в тканях картофеля нами выявлены водорастворимые соединения, способные подавлять активность целлюлолити-ческих и пектинолитических ферментов ЬерйпоЬака йесешИпесйа и ТпоНойегша гее$е1. Изученные сорта и гибриды картофеля имеют существенные различия по уровню антицеллю-лазной и антипектиназной активности в клубнях и листьях.

Список использованной литературы:

1. Яруллина Л. Г., Ибрагимов Р.И. Клеточные механизмы формирования устойчивости растений к грибным патогенам.-уфа:Гилем, 2006.-232с.

2. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений //Успехи биологической химии.-2002.-Т.42.-С.193-216.

3. Дунаевский Я.Е., Цыбина Т.А., Белякова Г.А., Домаш В.И., Шарпио Т.П., Забрейко С.А., Белозерский М.А. Ингибиторы протеиназ как антистрессовые белки высших растений //Прикладная биохимия и микробиология.-2005.-т.41№4 .-с.392-396.

4. Ибрагимов Р.И., Яруллина Л.Г., Ахметов Р.Р. Активность свободных и связанных ингибиторов протеиназ в проростках пшеницы при поражении корневой гнилью//Сельскохозяйственная биология.-2000.-№3.- С.89-92.

5. Озерецковская О.Л., Васюкова Н.И., Панина Я.С., Чаленко Г.И. Действие иммуномодуляторов на устойчивость и восприимчивость картофеля к Phytophtora infestans // Физиология растений.-200б.- т.53 №4.- С. 546-553.

6. Абдеев Р.М., Голденкова К.А., Мусийчук К.А., Пирузян Э.С. Свойства термостабильной целлюлазы CeIE Clostridium thermocellum // Биохимия. - 2001. - Т.66 №7.- С. 991 - 992.

7. Шевченко Н.Д., Шпирная И.А., Ибрагимов Р.И. Метод измерения пектиназ по гидролизу иммобилизованного субстра-та//Аграрная Россия.- 2009.-С.133