Искусственная питательная среда для культивирования гусениц непарного шелкопряда Lymantria dispar L.
ARTIFICIAL NUTRIENT MEDIUM FOR GYPSY MOTH CATERPILLARS (LYMANTRIA DISPAR L.) CULTIVATION

Изобретение относится к питательным средам для выращивания гусениц непарного шелкопряда (Lymantria dispar L) и может быть использовано в биотехнологии для культивирования вируса ядерного полиэдроза в гусеницах непарного шелкопряда при производстве вирусных энтомопатогенных препаратов, лесном хозяйстве при защите растений от насекомых-вредителей, а также в массовом разведении целевых насекомых для научных целей.
Известна питательная среда, содержащая фолиевую кислоту, агар-агар, набор витаминов и минеральных солей (Цветаева И.А., Питательные среды для насекомых, «Защита растений», 1976, №3, с. 27).
Известна также питательная среда для разведения гусениц непарного шелкопряда (авторское свидетельство СССР №577001, МПК А01К 67/00, опубл. 26.10.1977 г.), включающая глюкозу, агар-агар, метабен, холин-хлорид, льняное масло, аскорбиновую кислоту, калий фосфорнокислый двузамещенный, формалин и воду. С целью удешевления и упрощения среды, в нее введена в качестве источника клетчатки свекловичный жом, в качестве источника белков введены фасолевая мука, кормовые дрожжи и солодовые ростки, а в качестве источников солей и витаминов - премикс для птиц. Причем, компоненты взяты в следующем соотношении, вес.%: кормовые дрожжи 2,70-3,40; фасолевая мука 0,75-3,42; солодовые ростки 0,95-1,91; свекловичный жом 3,40-6,90; глюкоза 0,82-1,23; калий фосфорнокислый двузамещенный 0,12-0,27; агар-агар 0,82-1,40; формалин 10%-ный, мл 0,12-0,20; льняное масло сырое, мл 0,12-0,23; метабен 0,12-0,21; холин-хлорид технический 70%-ный, мл 0,06-0,20; аскорбиновая кислота 0,20-0,43; премикс для птиц 0,68-1,36; вода - остальное до 100%.
Известна питательная среда (авторское свидетельство СССР №681761, МПК А01К 67/00, опубл. 1979 г.), содержащая кормовые дрожжи (40 г), агар-агар (15 г), солодовые ростки (60 г), кукурузную муку (100 г), спирт этиловый (10 г.), формалин 20% (5 мл) и воду (остальное). Однако такая питательная среда имеет низкую выживаемость гусеиц.
Известна питательная среда (авторское свидетельство СССР №731938, МПК А01К 67/00, опубл. 05.05.1980 г.), содержащая глицерофосфат кальция, свекловичный жом, кормовые дрожжи, премикс для птиц, аскорбиновую кислоту, метабен и воду. Компоненты взяты в соотношении, вес.%: свекловичный жом 18,00-22,00; кормовые дрожжи 3,10-3,30; премикс для птиц 1,50-1,70; аскорбиновая кислота 0,14-0,16; метабен (20%-ный в спирте-ректификате) 0,10-0,14; глицерофосфат кальция 0,35-0,45; вода остальное. Однако такая питательая среда имеет низкий выход живых гусениц.
Известна питательная среда для разведения гусениц насекомых, в частности гусениц непарного шелкопряда (авторское свидетельство СССР №884643, МПК А01К 67/00, опубл. 30.11.1981 г.), содержащая агар-агар, семена бобовых, порошок из сухих листьев дуба, яблони, тополя, березы и липы, льняное масло, аскорбиновую кислоту, витамины В1, В2, В6, и фолиевую кислоту, сорбиновую кислоту, автолизат пивных дрожжей и воду. В качестве семян бобовых среда содержит проросшие семена маша. Питательная среда имеет следующее количественное содержание компонентов, вес.%: агар-агар (1,13-1,59), семена бобовых (проросшие семена маша - 12,06-15,26), порошок из сухих листьев дуба (5,28-5,72), яблони (2,26-3,18), тополя (2,26-3,18), березы (0,75-1,91) и липы (0,75-1,91), льняное масло (1,13-1,59), аскорбиновая кислота (0,19-0,48), витамины В1, В2, В6 + фолиевая кислота (0,16-0,19), сорбиновая кислота (0,11-0,16), автолизат пивных дрожжей (13,57-13,99) и вода дистиллированная (остальное до 100%). Питательная среда обеспечивает расширение питающегося видового состава листогрызущих насекомых.
Известна питательная среда для выращивания гусениц насекомых - фитофагов (авторское свидетельство СССР №1161046, МПК А01К 67/00, опубл. 15.06.1985 г.), включающая кормовые дрожжи (3,0-5,0), солодовые ростки (5,0-7,0), аскорбиновую кислоту (0,3-0,5), бензойную кислоту (0,25-0,35), этиловый спирт (1,0-1,2), хлопковый жмых (2,0-4,0), пшеничные отруби (2,0-4,0), свекловичный жом (11,0-13,0), фолиевую кислоту 0,0008-0,0012), уксусную кислоту 4,5%-ную (2,0-4,0) и воду (остальное до 100 масс. %). Однако такая питательная среда имеет недостаточную выживаемость гусениц насекомых - фитофагов.
Известны питательные среды для получения тест - гусениц непарного шелкопряда природной кладки и гусениц младших и старших возрастов лабораторной выкормки (авторское свидетельство СССР №1209131, МПК А01К 67/00, опубл. 07.02.1986 г.). Питательная среда для получения гусениц старших возрастов лабораторной выкормки содержит свекловичный жом, дрожжевой компонент, солодовые ростки, премикс для птиц, дисахара, агар-агар, муку фасолевую, водный раствор формалина, аскорбиновую кислоту, калий двузамещенный фосфорно-кислый, метабен, масло льняное, холинхлорид и воду. С целью повышения качества среды за счет приближения ее состава к природному корму, в качестве дрожжевого компонента она содержит дрожжи пивные, в качестве дисахаров - сахарозу, формалин в виде 40%-ного водного раствора, а также дополнительно казеин и фолиевую кислоту при следующем соотношеии компонентов, масс. %: свекловичный жом 5,6-5,8; дрожжевой компонент (дрожжи пивные) 3,14-3,18; солодовые ростки 2,2-2,22; казеин 2,2-2,22; премикс для птиц 1,57-1,59; дисахара (сахароза) 1,41-1,44; агар-агар 1,25-1,28; мука фасолевая 0,86-0,88; 40%-ный водный раствор формалина 0,78-0,81; аскорбиновая кислота 0,65-0,68; калий двузамещенный фосфорно-кислый 0,31-0,33; метабен 0,31-0,33; масло льняное 0,22-0,25; холинхлорид 0,22-0,25; фолиевая кислота 0,001-0,003; вода остальное. Состав среды обеспечивает круглогодичное получение гусениц и приближен к естественному корму.
Непрерывное получение тест-гусениц непарного шелкопряда необходимо для оперативной оценки качества инсектицидов при их промышленном производстве. Постоянно высокая жизнеспособность тест-насекомых и их стандартность обеспечивает высокое качество оценки инсектицидов в любое время года, а также возможность получения бабочек лабораторной выкормки, не уступающих по биологическим показателям природным особям.
Известна питательная среда для гусениц дендрофильных фитофагов (авторское свидетельство СССР №1507277, МПК А01К 67/00, опубл. 15.09.1989 г.), в частности непарного шелкопряда, включающая верхний слой лесной подстилки (6,0-17,0), свекловичный жом (3,0-10,0), кормовые дрожжи (3,0-5,0), солодовые ростки (5,0-7,0), хлопковый жмых (2,0-4,0), пшеничные отруби (2,0-4,0), аскорбиновая кислота (0,3-0,5), фолиевая кислота (0008-0,012), уксусная кислота 4,5%-ная (2,0-4,0), бензойная кислота (0,25-0,35), этиловый спирт (1,0-1,2), вода (остальное до 100 мас. %). Питательная среда обеспечивает повышение синхронности и скорости развития гусениц за счет использования дополнительного компонента - верхнего слоя лесной подстилки.
Известна питательная среда для гусениц лесных насекомых-фитофагов (авторское свидетельство СССР №1824126, МПК А01К 67/00, опубл. 30.06.1993 г.), содержащая (масс. %): агар-агар 2,0, соевую муку 3,0, зародыши пшеницы 14,0, кормовые дрожжи 2,4, аскорбиновую кислоту 0,6, бензойную кислоту 0,3, этиловый спирт 1,2, фильтровальную бумагу 0,5, льняное семя 0,4, 0,6%-ный раствор глутамевита 0,3 и воду 75,3 мас. %. Искусственная питательная среда (ИПС) обеспечивает повышение выхода гусениц при разведении непарного шелкопряда за счет увеличения их выживаемости. ИПС содержит повышенное количество белка за счет введения в нее соевой муки, фагостимулятора в виде фильтровальной бумаги; линолевую и линоленовую кислоты, содержащиеся в льняном семени; набор необходимых витаминов и минеральных солей, содержащихся в препарате «Глутамевит» и бензойную кислоту в качестве консерванта
Наиболее близким аналогом (прототипом) является искусственная питательная среда (Ильиных А.В. Оптимизированная искусственная питательная среда для культивирования непарного шелкопряда // Биотехнология. - 1996. - №7. - С.42-43) для культивирования гусениц непарного шелкопряда (Lymantria dispar L), содержащая измельченные зернобобовые культуры (кукурузная мука, соевая мука), дрожжи кормовые, агар-агар, стимулятор роста гусениц (аскорбиновая кислота), консервант (метабен и 50%-ная уксусная кислота) и дистиллированную воду.
При разработке оптимального состава искусственной питательной среды при культивировании непарного шелкопряда для получения препаративной формы вирусного препарата перед исследователями стоят следующие проблемы:
- наработка гусеницами оптимальной жировой массы;
- наиболее быстрое достижение целевого возраста гусеницами;
- легкая подверженность заражению.
Анализ выше приведенных аналогов ИПС, в том числе прототипа показывает, что известные составы ИПС содержат большое количество дорогостоящих, а в некоторых случаях и токсичных компонентов. Кроме того, время развития гусениц на данных средах является достаточно длительным, что делает их ресурсо- и энергозатратными, а также обеспечивают низкий выход гусениц непарного шелкопряда.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение выхода гусениц непарного шелкопряда.
Указанный технический результат достигается тем, что в искусственной питательной среде для культивирования гусениц непарного шелкопряда (Lymantria dispar L), содержащей измельченные зернобобовые культуры, дрожжи кормовые, агар-агар, стимулятор роста гусениц, консервант и дистиллированную воду, согласно изобретения, питательная среда дополнительно содержит масло льняное пищевое, в качестве зернобобовых культур она содержит измельченные бобы чечевицы, муку ржаную и муку гречневую, в качестве консерванта - 10%-ный спиртовый раствор бензойной кислоты, а в качестве стимулятора роста гусениц - раствор комплекса витаминов и микроэлементов при следующем соотношении компонентов, масс. %:
измельченные бобы чечевицы
10,0-15,0
мука ржаная
3,0-7,0
мука гречневая
5,0-10,0
дрожжи кормовые
3,0-6,0
агар-агар
1,0-3,0
масло льняное пищевое
3,0-7,0
водный раствор комплекса витаминов и микроэлементов
3,0-5,0
10%-ный спиртовый раствор
бензойной кислоты
2,0-3,0
вода дистиллированная
остальное до 100%.
Водный раствор комплекса витаминов и микроэлементов содержит воду дистиллированную, витамины С (аскорбиновая кислота), А (ретинол) - 0,7912 мг, В1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В5 (пантотеновая кислота), В6 (пиридоксин), В12 (цианокобаламин), Е (токоферол), D2 (эргокальциферол), Р (рутин), РР (никотиновая кислота), микроэлементы Са (кальций), Mg (магний), Р (рутин), Fe (железо), Сu (медь), Zn (цинк), Мn (марганец), I (иод), Se (селен) при следующем соотношении компонентов, мг/литр:
Витамины:
С (аскорбиновая кислота)
50,0
А (ретинол)
0,7912
B1 (тиамин)
1,0
B2 (рибофлавин)
1,0
B5 (пантотеновая кислота)
5,0
B6 (пиридоксин)
1,5
В12 (цианокобаламин)
0,003
Е (токоферол)
10,0
D2 (эргокальциферол)
0,0025
Р (рутин)
10,0
РР (никотиновая кислота)
7,5
микроэлементы:
Са (кальций)
35,0
Mg (магний)
22,0
Р (фосфор)
27,0
Fe (железо)
10,0
Сu (медь)
0,004
Zn (цинк)
0,05
Мn (марганец)
0,05
I (иод)
0,04
Se (селен)
0,1
вода дистиллированная
остальное до 1 литра
Предлагаемый состав искусственной питательной среды является более богатым белками, углеводами, витаминами и микроэлементами, чем рецептура у известных аналогов, а также исключает использование формалина или метабена.
На фиг. 1 представлены данные общего веса гусениц при культивировании на предлагаемой ИПС (в граммах).
Ниже приведены примеры 1-3 составов заявляемой питательной среды.
Пример 1. Искусственная питательная среда для культивирования гусениц непарного шелкопряда с минимальным содержанием компонентов, масс. %:
измельченные бобы чечевицы
10,0
мука ржаная
3,0
мука гречневая
5,0
дрожжи кормовые
3,0
агар-агар
1,0
масло льняное пищевое
3,0
водный раствор комплекса
витаминов и микроэлементов
3,0
10%-ный спиртовый раствор
бензойной кислоты
2,0
вода дистиллированная
остальное до 100%.
Водный раствор комплекса витаминов и микроэлементов содержит следующие компоненты, мг/литр:
Витамины:
С (аскорбиновая кислота)
50,0
А (ретинол)
0,7912
B1 (тиамин)
1,0
B2 (рибофлавин)
1,0
B5 (пантотеновая кислота)
5,0
B6 (пиридоксин)
1,5
В12 (цианокобаламин)
0,003
Е (токоферол)
10,0
D2 (эргокальциферол)
0,0025
Р (рутин)
10,0
РР (никотиновая кислота)
7,5
микроэлементы:
Са (кальций)
35,0
Mg (магний)
22,0
Р (фосфор)
27,0
Fe (железо)
10,0
Сu (медь)
0,004
Zn (цинк)
0,05
Мn (марганец)
0,05
I (иод)
0,04
Se (селен)
0,1
вода дистиллированная
остальное до 1 литра
Пример 2. Искусственная питательная среда для культивирования гусениц непарного шелкопряда со средним содержанием компонентов, мас. %:
измельченные бобы чечевицы
12,5
мука ржаная
5,0
мука гречневая
7,5
дрожжи кормовые
4,5
агар-агар
2,0
масло льняное пищевое
5,0
водный раствор комплекса
витаминов и микроэлементов
4,0
10%-ный спиртовый раствор
бензойной кислоты
2,5
вода дистиллированная
остальное до 100%.
Состав водного раствора комплекса витаминов и микроэлементов приведен в примере 1.
Пример 3. Искусственная питательная среда для культивирования гусениц непарного шелкопряда с максимальным содержанием компонентов, мас. %:
измельченные бобы чечевицы
15,0
мука ржаная
7,0
мука гречневая
10,0
дрожжи кормовые
6,0
агар-агар
3,0
масло льняное пищевое
7,0
водный раствор комплекса
витаминов и микроэлементов
5,0
10%-ный спиртовый раствор
бензойной кислоты
3,0
вода дистиллированная
остальное до 100%.
Состав водного раствора комплекса витаминов и микроэлементов приведен в примере 1.
Пример. 4. Способ приготовления искусственной питательной среды
Искусственную питательную среду готовят следующим образом. В емкости вместимостью 500 мл помещают (10±0,1) г агар-агара, добавляют к нему (300±1) мл дистиллированной воды и выдерживают на кипящей водяной бане в течение (45±3) мин. Отдельно готовят и смешивают кормовую часть (мучные компоненты) в емкости вместимостью 500 мл согласно приведенной рецептуре, также добавляют масло льняное пищевое нерафинированное прессовое и витаминный раствор. Бобы чечевицы промывают под проточной водой и ополаскивают дистиллированной водой, замачивают бобы чечевицы за сутки до приготовления ИПС в дистиллированной воде, перед использованием в составе корма размоченные бобы гомогенизируют.
После охлаждения агар-агара до температуры (53±2)°С обе части смешивают согласно рецептуре. Перемешивание осуществляется гомогенизатором при скорости вращения 4000 об/мин.
Среду разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по (9±2) мл в центр чашки. После этого поверхность корма стерилизуют бактерицидными лампами в течение (40±10) мин.
Среду хранят в холодильнике при температуре (4±1)°С не более 7 сут.
Пример 5. Оценку качества искусственной питательной среды проводили посредством учета таких показателей: соотношение в составе корма макронутриентов, скорости достижение целевого возраста и веса насекомых.
Как показывают полученные экспериментальные данные (таблицы 1, 2 и фиг. 1), при использовании заявляемого состава ИПС скорость достижения целевого возраста гусеницами непарного шелкопряда возрастает, общий вес насекомых имеет положительную тенденцию к росту, а количество макронутриентов и витаминов получаемых вместе с новым кормом в два раза превышает известный наиболее близкий аналог (прототип).
Таким образом, применение предлагаемой ИПС позволит оптимизировать процесс культивирования целевых насекомых и повысить выход гусениц непарного шелкопряда.