СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI ИЛИ SALMONELLA В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ БИОРЕАКТОРАХ
METHOD FOR OBTAINING ENTEROBACTERIUM ESCHERICHIA COLI OR SALMONELLA BIOMASS IN PRODUCTION BIOREACTORS

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для интенсификации производства вакцинных препаратов на основе биомассы микроорганизмов - энтеробактерий  вида Escherichia coli и видов Salmonella.
Известны периодические процессы культивирования с добавлением субстрата (см. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, т. 2, гл. 9.1.1. - М.: Мир, 1989), где производится одноразовая загрузка питательной среды в биореактор, стерилизация, инокуляция посевным материалом, культивирование при непрерывном перемешивании и аэрации или в анаэробных условиях и дробное введение субстрата/ов. Эти процессы стараются проводить при поддержании постоянных физиологических условий культивирования: pH, скорость массопередачи кислорода на стадиях активного роста биомассы и иногда окислительно-восстановительный потенциал.  Однако при ведении периодических процессов технически сложно, а подчас и невозможно обеспечить оптимальные значения иных физиологических параметров на более низком молекулярном и клеточном уровнях, необходимых для полноценного роста и деления клеток, как то оптимальные концентрации отдельных компонентов питания для быстрейшего протекания биохимических процессов, что говорит о наступлении условий несбалансированности питательной среды. Причиной несбалансированности питательной среды может являться различная скорость потребления каждого отдельного компонента, что приводит часто к исчерпанию одних компонентов и избытку иных компонентов, т.е. происходит разбалансирование питательной среды, что сопровождается снижением скорости роста биомассы, вплоть до полной остановки роста. Например, исчерпание глюкозы в питательной среде приводит к резкому снижению скорости роста клеток при переключении их на иной источник углерода и энергии. Другой крайностью может быть избыточная концентрация субстратов, что тоже влечёт снижение скорости роста клеток и часто может полностью остановить рост биомассы по причине возникающего ингибирования отдельных клеточных реакций и роста в целом.
Известен Способ промышленного культивирования штаммов E.coli, с повышенным синтезом биомассы и выходом целевого белка в тельцах включения по патенту РФ №2473683, опубл. 27.01.2013.  Способ культивирования основан на использовании созданных на основе штамма BL21(DE3) рекомбинантных штаммов-продуцентов и предусматривает их глубинное культивирование на питательной среде при дробном добавлении питательных субстратов, являющихся ингибитором, нейтральным веществом и индуктором по отношению к lacUV5 промотору, в процессе биосинтеза. Предусматривающий: выращивание инокулята до середины логарифмической фазы роста на питательной среде, где в качестве источника углерода используют глюкозу в концентрации 10 г/л, при температуре 38°С, перемешивании 200 об/мин, времени культивирования 3 ч; засев ферментера инокулятом с посевной дозой 10%;  культивирование микроорганизмов при 38°С, концентрации растворенного кислорода 80% при максимальной скорости перемешивания 1200 об/мин, максимальном уровне аэрации 1 объем воздуха/мин: 1,2 объема культуральной жидкости, рН=7,00; - окончание ферментации на 12-13 ч культивирования; осаждение клеток штамма-продуцента E.coli, при этом вначале культивирования добавляют 50%-ный (мас.%) раствор глюкозы, в середине логарифмической фазы роста производится порционная добавка 80%-ного (мас.%) раствора глицерина и с конца логарифмической фазы роста культуры осуществляются дробные добавки 25%-ного (мас.%) раствора лактозы. Процесс длится до 12 часов, количество биомассы до 85 о.е.
Однако недостатками предлагаемого способа являются:
2
2
- Более низкий уровень массопередачи кислорода, который можно оценочно определить из представленных в патенте данных. Для середины процесса ~4 часа роста (середина логарифмической фазы роста согласно патента 2473683) - биомасса составляет около 10 г/л. Если принять значение экономического коэффициента по глюкозе для экспоненциальной фазы роста, Y = 0,6-0,7 [Таблица 1 в https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3698069/] то оцениваемое суммарное потребление этого субстрата за 4 часа будет равно ~14 г/л или, в среднем, 3,5 г/(л*ч), что соответствует ~2 ммоль O/(л*мин). При этом если учитывать, что значительная часть глюкозы распадается на продукты неполного окисления при высоких значениях pO, как положено по условиям известного решения, то реальный массообмен по кислороду должен быть ещё ниже.
3
- Низкий объём реакторов/ферментёров для производственного процесса - до 30 литров общего объёма, в то время как предлагаемый способ рассчитан на реакторы/ферментёры объёмом до 1 м.
- Комплексный характер углеродного субстрата, состоящего из 3 веществ - глюкозы, глицерина и лактозы.
- Отсутствие единообразного алгоритма подпитки иными компонентами для преодоления различных биохимических барьеров, связанных с ингибированием или лимитированием этими компонентами по отдельности или вместе.
- Подпитки, которая имела бы простоту использования при реализации технологического процесса.
- Использование алгоритма исследовано только для вида E.coli, а другие энтеробактериальные виды не исследовались.
Для преодоления вышеуказанных негативных тенденций используется культивирование с подпитками. Подпиткой может быть как отдельный компонент, например глюкоза или источник азота, так и смесь компонентов.
2
3
Известен Способ получения биомассы аэробнорастущих микроорганизмов  по патенту РФ №2111246, опубл. 20.05.1998, где используется концентрированная подпитка, компоненты которой сбалансированы в определённом соотношении, включающий периодическое культивирование и подпитку питательной средой, что проводят культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при массообмене 0,40 - 1,50 моль О/(м·мин) или уменьшением его в последние 3 ч культивирования на 50%, и подпитку концентрированной средой той же основы, что и первоначальная среда засева, при соотношении C : N : P : Mg в пределах (7,0 ± 2,0) : (1,2 ± 0,5) : (0,5 ± 0,2) : (0,15 ± 0,09), обеспечивающую конечный расход компонентов среды в реакционном объеме в количестве, превышающем их ингибирующие концентрации или составляющем не менее двухкратной от обычной концентрации.
2
Но соблюдение условий приблизительно соответствующим распространённому элементному составу сухой биомассы и данный способ применяется для условий культивирования, когда исходный состав питательной среды не проявляет ингибирующие свойства в самом начале ферментации. При этом область значений скорости потребления кислорода находится в пределах 0,4-1,5 ммоль O на 1 л среды в 1 мин.
Однако использование данного способа затруднительно для получения повышенных концентраций биомассы, если исходная питательная среда обогащена питательными веществами в такой значительной степени, что это может вызывать ингибирование компонентами питания.
Способ получения биомассы E.coli и Salmonella согласно известному решению, выбранному в качестве прототипа, проводят следующим образом. Выращенную и проверенную на чистоту роста посевную (матровую) культуру засевают в биореакторы через пробоотборник в количестве 8 – 10% от объема питательной среды следующего состава:
- бульон Хоттингера, состоящий из: основного перевара Хоттингера, разведенного водой до содержания аминного азота 250-300 мг%,
- 0,5% пептона, 0,5% хлористого натрия,
- 0,3% химически чистого двуосновного фосфорнокислого натрия
Культивируют микроорганизмы 12 – 14 часов при:
- температуре 37 ±1°С,
- непрерывной аэрации (1,5 – 2 объема воздуха на объем среды в мин),
- непрерывном перемешивании при 120 – 150 об/мин.
Через каждые 2 часа культивирования из реактора берут пробы для определения концентрации, чистоты культуры и рН,
Для улучшения роста микроорганизмов и снижения рН  добавляют стерильный 40%-ный раствор глюкозы из расчета 1 л раствора на 100 л среды при достижении значений 7,8-8,0.
Культивирование прекращают, когда концентрация микробов не повышается или повышается незначительно. Концентрация на выходе- 40 – 45 млрд. микробных клеток для обоих видов микроорганизмов.
Данный способ предусматривает дополнительное введение отдельных других компонентов питания в качестве подпитки, если это необходимо достижения концентрации микроорганизмов 40-45 миллиардов клеток/мл.
Однако данный способ не обеспечивает повышенных концентраций - до 82 миллиардов клеток/мл для E.coli и 65 миллиардов клеток для Salmonella.
Целью изобретения и достигаемым техническим результатом является повышение выхода биомассы аэробнорастущих клеток биомассы микроорганизмов - энтеробактерий вида Escherichia coli, и видов Salmonella, которая достигается тем, что  в способе получения биомассы энтеробактерий Еscherichiа coli и Salmonella с повышенной урожайностью в производственных биореакторах, включающий операции периодического культивирования при кислородном лимитировании и подпитки биомассы питательной средой той же основы, что и первоначальная среда засева, с поддержанием оптимальных физиологических значений рН по показаниям датчика биореактора,  при этом
2
- проводят культивирование при кислородном лимитировании, достигаемом выращиванием при скоростью массопередачи кислорода в диапазоне 2,5±0,5 ммоль O на 1 л в 1 мин, при аэрации 1 объём воздуха на 1 объём среды в 1 мин и непрерывном перемешивании, при поддержании избыточного давления в реакторе 0,4-0,8 атм, в диапазоне pH  6,5-7,0 с преимуществом для низких значений;
- при получении двух компонентной питательной среды перед засевом биореактора, изначально в виде  раствора хлорида натрия  (0,9% раствор хлористого натрия), предварительно простерилизованного в реакторе с последующим смешиванием с концентратом питательной среды при соотношении C : N : P : Mg в пределах (7,0 ± 2,0) : (1,2 ± 0,5) : (0,5 ± 0,2) : (0,15 ± 0,09),  в диапазоне соотношений  от   5:1 до 2,5:1 , где 5 и 2,5, соответственно, доли раствора хлористого натрия для нижнего и верхнего значения  исходного объёма раствора хлористого натрия в реакторе, с последующим посевом микроорганизмов,
0
0
0
- при этом последовательная подача концентрированной подпитки осуществляются: первая через 2 часа после посева в количестве 2*V/90 л/биореактор, вторая подача через 3 часа после начала роста в количестве 4*V/90 л/биореактор, третья - начиная с 3,5 часов подачи подпитки 1,7*V0/90  мл/сек в постоянном режиме, где V-исходный объём физиологического раствора в биореакторе, меняющийся в диапазоне 90-300 л.
При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован в биореакторе  с  общим объём 1000 л  и максимальный  рабочим объёмом в конце культивирования от 140 до 450 л.
При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован при условии, что процесс культивирования проводят при отсутствии пептона в исходной питательной среде и подпитке.
При этом способ получения биомассы энтеробактерий может быть реализован при  предварительной стерилизации раствора хлорида натрия в реакторе при 120 градусах Цельсия в течение 60 мин, в количестве 90-300 л.
В связи с тем, что в предлагаемом способе конечный объём ферментационной жидкости увеличивается по ходу процесса культивирования до 1,5 раз по сравнению с исходным объёмом культивирования, для оценки урожая биомассы используется показатель общего съёма урожая, равный произведению действующей концентрации микроорганизмов на рабочий объём в реакторе в данный момент времени, триллионы клеток/биореактор. Примеры реализации приведены ниже.
Влияние пропорции добавленной первоначально концентрированной подпитки при последующей подпитке растущих культур микроорганизмов с разными скоростями подпитки для разных исходных объёмов согласно предлагаемому способу позволило получить кривые с оптимумами накопления биомассы, в триллионах клеток на биореактор в зависимости от процентного содержания подпитки, добавленной в реактор перед посевом, Фиг. 1 и 2. Оптимальные пропорции добавленной подпитки находятся в пределах 33,3%-66,7%, что по предлагаемому способу позволяет увеличить в 1,5-2 раза съём урожая биомассы для E.coli и в 1,4-1,65 раза для Salmonella  по сравнению с имеющейся технологией.
Сущность изобретения заключается в том, что с целью повышения урожая при ферментациях.
Процесс культивирования проводят при отсутствии дорогостоящего пептона в исходной питательной среде и подпитке.
Процесс культивирования проводят в диапазоне pH  6,5-7,0 при добавлении 10% раствора NaOH по показаниям датчика pH - с преимуществом для низких значений.
В начале процесса культивирования используется следующая схема приготовления питательной среды перед засевом биореактора: раствор хлорида натрия  (0,9% раствор хлористого натрия), предварительно простерилизованный при 120 градусах Цельсия в реакторе, в количестве 90-300 л смешивается с концентратом питательной среды (Подпиткой), в диапазоне соотношений от 5:1 до 2,5:1, где 5 и 2,5, соответственно, доли раствора хлористого натрия для нижнего и верхнего значения исходного объёма раствора хлористого натрия в реакторе, с последующим посевом микроорганизмами.
Подпитка имеет следующий состав на 1 л: 0,1 кг сухой глюкозы, до 1 л основного перевара Хоттингера с содержанием аминного азота 1000 мг%, 0,005 кг натрия фосфорнокислого 12-водного, 0,0015 кг магния сернокислого 7-водного.
0
0
0
0
Подачи концентрированной подпитки осуществляются по следующей схеме: Первая подача подпитки осуществляется через 2 часа после посева в количестве до 2*V/90 л/биореактор. Через 3 часа после начала роста – вторая подача подпитки в количестве до 4*V/90  л/биореактор. Далее, начиная с 3,5 часов, включаем предварительно оттарированный по воде насос на скорость подачи подпитки до 1,7*V/90  мл/сек в постоянном режиме, где V-исходный объём физиологического раствора в реакторе, который может изменяться в диапазоне 90-300 л.
9
9
3
Окончанием процесса считается накопление не менее 50х10 микробных клеток/мл для Salmonella при конечном рабочем объеме не менее 150 л (урожайность 7500 триллионов клеток - произведение концентрации микроорганизма на конечный объём в реакторе перед сливом урожая) или накопление не менее 65х10 микробных клеток/мл для E.coli при конечном рабочем объеме не менее 130 л  (урожайность 8450 триллионов клеток) или до исчерпания подпитки. В результате культивирования обеспечиваются  концентрации от 56 до 82 млрд/см, соответственно, для Salmonella и E.coli.
На фиг.1 и 2 представлены Зависимости процента прироста (показатель эффективности увеличения выхода биомассы, в %) съёма урожаев биомассы для видов E.coli  и Salmonella, %, в предлагаемой схеме, с исследованием влияния различных количеств (объёмов) первоначально добавленных компонентов в питательную среду, в %, на общий выход биомассы, в %, по сравнению с обычным культивированием с подачей глюкозы по значениям pH и 10%-ным раствором едкого натрия. Показатель эффективности представляет собой отношение между разностью микробных концентраций в конце культивирования по новому способу и регламентной культуры к концентрации по регламентному способу, т.е. это есть отношение прибавления к имеющейся регламентной технологии.
Примеры реализации способа при первоначальном количестве Подпитки азотными веществами и витаминным комплексом при его первоначальной подаче 1/3 от общего количества данной Подпитки-48 литров:
Пример 1. Культивирование E.coli, смесь штаммов: 733, 1308, 1370, 1463.  Ферментация 28.02.2018 г.
Исходный объём раствора хлористого натрия – 70 л.
Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.
Объем матровой расплодки – 40 л.
Подача подпитки на 2-ой час роста – 3 л/ч.
Подача подпитки на 3-ий час роста – 3,5 л/ч.
Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы - 4 л/ч.
Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.
Общий объём в конце процесса – 162 л.
Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 80 миллиардов клеток/мл.
Общий съём урожая – 12,96 триллионов клеток/биореактор.
3
Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным растовором едкого натрия, при концентрации клеток E.coli 45 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 148 л, даёт общий выход биомассы 45 млрд/мл*144*10 мл=6480 триллинов клеток.
Эффективность =100%*(12,96-6,48)/6,48= 100%.
Пример 2. Культивирование E.coli, штаммы 320, 1330, 1230, 1092. Ферментация 13.03.2018 г.
Исходный объём раствора хлористого натрия – 70 л.
Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.
Объем матровой расплодки – 40 л.
Подача подпитки на 2-ой час роста – 3,5 л/ч.
Подача подпитки на 3-ий час роста - 3,5 л/ч.
Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы-3,5 л/ч.
Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.
Общий объём в конце процесса – 156,5 л.
Концентрация микроорганизмов в конце процесса- 82 миллиардов клеток/мл.
Общий съём урожая – 12,8 триллионов клеток/биореактор.
3
Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным растовором едкого натрия., при концентрации клеток E.coli 40 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 142 л, даёт общий выход биомассы 45 млрд/мл*142*10 мл=6400 триллинов клеток.
Эффективность =100%*(12,8 – 6,4)/6,4= 100%.
Пример 3. Культивирование Salmonella dublin, штамм Армавирской биофабрики. Ферментация 28.03.2018 г.
Исходный объём раствора хлористого натрия – 90 л.
Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.
Объем матровой расплодки – 20 л.
Подача подпитки на 2-ой час роста – 4 л/ч.
Подача подпитки на 3-ий час роста - 4 л/ч.
Подача подпитки на 4-й час роста и в последующие часы - 4 л/ч.
Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.
Общий объём в конце процесса – 166,5 л.
Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 55 миллиардов клеток/мл.
Общий съём урожая – 9,157 триллионов клеток/ на биореактор.
3
Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10 %-ным раствором едкого натрия, при концентрации клеток Salmonella dublin 41,6 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 160 л, даёт общий выход биомассы 41,6 млрд/мл*160*10 мл=6660 триллионов клеток.
Эффективность =100%*(9,157-6,66)/6,66= 37,5%.
Пример 4. Культивирование Salmonella typhymurium, штамм Армавирской биофабрики. Ферментация  29.03.2018 г.
Исходный объём раствора хлористого натрия – 90 л.
Исходное количество подпитки, поданное в реактор перед посевом - 16 л.
Объем матровой расплодки – 20 л.
Подача подпитки на 2-ой час роста – 4 л/ч.
Подача подпитки на 3-ий час роста - 4 л/ч.
Подача подпитки на 4-ый час роста и в последующие часы - 4 л/ч.
Глюкоза (40%-ный раствор) и едкий натр (10%-ный раствор) подаются отдельно по pH.
Общий объём в конце процесса – 165 л.
Концентрация микроорганизмов в конце процесса - 62 миллиардов клеток/мл.
Общий съём урожая – 10,23 триллионов клеток/на биореактор.
3
Параллельно проводилось культивирование в отдельном реакторе с подачей глюкозы по значениям pH (обычный способ) и 10%-ным растовором едкого натрия., при концентрации клеток Salmonella dublin 40 миллиардов клеток в 1 мл культуральной жидкости и конечном объёме в конце процесса ферментации 165 л, даёт общий выход биомассы 40 млрд/мл*165*10 мл=6600 триллионов клеток.
Эффективность=100%*(10,23-6,6)/6,6= 55%.
Пример 5. Сводные данные по увеличению эффективности прироста биомассы для различных первоначальных количеств добавляемой азотно-витаминно-фосфорно-магниевой подпитки.
Процент изначально загруженной среды
Вид
Процент эффективности
100
E.coli IV(контроль)
0
33
E.coli I*
100
33
E.coli II
50
33
E.coli III
100
67
E.coli IV
93
0
E.coli шт.727(декабрь 2017)
25
33
Sal.dublin
37,5
33
Sal. Th.murium
55
0
Sal.dublin
25
0
Sal.dublin
40
100
Сальмонеллы (контроль)
0
67
Sal.dublin
39,8
*В данной Таблице штаммы E.coli сгруппированы по общепринятой классификации в группы, В отличие от предыдущих Примеров, здесь даны номера групп.