СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ YERSINIA PESTIS И YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS И ОДНОВРЕМЕННОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ YERSINIA PESTIS ОСНОВНОГО И ЦЕНТРАЛЬНОАЗИАТСКОГО ПОДВИДОВ МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР
METHOD FOR IDENTIFYING YERSINIA PESTIS AND YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS AND SIMULTANEOUS DIFFERENTIATION OF YERSINIA PESTIS OF MAIN AND CENTRAL ASIAN SUBSPECIES BY MULTIPLEX PCR

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности, к идентификации Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis, молекулярному типированию и подвидовой дифференциации Yersinia pestis и может быть использовано в научно-исследовательских и практических учреждениях Роспотребнадзора.
Бактерия Y. pestis является возбудителем особо опасной инфекции - чумы, способной приводить к возникновению чрезвычайных ситуаций в области общественного здравоохранения [Международные медико-санитарные правила, WHO, 2005]. Y. pestis - одна из ветвей эволюции широко распространенной в почве бактерии Y. pseudotuberculosis, которая может вызывать острые кишечные инфекции. Идентичность нуклеотидной последовательности генов-гомологов обеих бактерий Y. pestis и Y. pseudotuberculosis составляет 97-99%, а гена 16S рРНК - 100%. Несмотря на высокую степень сходства, эти возбудители вызывают заболевания, отличающиеся путями заражения, патогенезом и клиническими проявлениями. Чума является системной болезнью и передается преимущественно трансмиссивным путем, в то время как псевдотуберкулез клинически проявляется в виде различных гастроэнтеритов и передается фекально-оральным способом. В тоже время Y. pestis и Y. pseudotuberculosis близки по фенотипическим и генетическим свойствам.
Вид Y. pestis включает в себя основной подвид Y. pestis subspecies pestis, отличающийся высокой вирулентностью и эпидемиологической значимостью, и ряд неосновных подвидов, которые эпидемически малозначимы. Штаммы неосновных подвидов избирательно вирулентны в отношении мелких грызунов и зайцеобразных, однако, большинство из них способно вызывать случаи чумы у людей. Исключение составляют штаммы центральноазиатского подвида Y. pestis subspecies central asiatica, для которых случаи чумы у человека не зарегистрированы. Центральноазиатский подвид делится на четыре биовара - алтайский, гиссарский, таласский и microtus, которые распространены в центральноазиатской зоне природной очаговости чумы. Штаммы центральноазиатского подвида циркулируют в Горном Алтае в России и Монголии (алтайский биовар), в Таджикистане (гиссарский биовар), в Кыргызстане (таласский биовар), в Монголии и Китае (биовар microtus). В этих же географических регионах распространены высоковирулентные для человека штаммы Y. pestis основного подвида, а также встречаются энтеропатогенные штаммы Y. pseudotuberculosis. Эти патогенные иерсинии вызывают различные по степени опасности для человека заболевания, поэтому дифференциация Y. pestis и Y. pseudotuberculosis и дифференциация основного и центральноазиатского подвида возбудителя чумы является актуальной задачей. Установление принадлежности выделенного штамма Y. pestis к основному или центральноазиатскому подвиду позволит оценить его вирулентный и эпидемиологический потенциал, определить его происхождение и установить источник инфекции. Чрезвычайно актуальной задачей является разработка высокоэффективных и чувствительных способов быстрой идентификации и дифференциации штаммов патогенных иерсиний, вызывающих у человека различные по тяжести заболевания.
Современный уровень молекулярно-генетических методов исследования позволяет разрабатывать быстрые и эффективные способы индикации и дифференциации Y. pestis и других возбудителей инфекционных болезней на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), обладающие высокой эффективностью, чувствительностью и надежностью. Для этих целей используются ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. На текущий момент разработано несколько способов идентификации и дифференциации штаммов возбудителя чумы при помощи ПЦР.
Зарегистрирована «Тест-система для выявления ДНК Yersinia pestis методом ПЦР «ГенПест». Эта система основана на использовании ДНК мишеней - участков генов cafl и pla, находящихся на плазмидах pFra и pPst возбудителя чумы, соответственно. Однако эта тест-система не предназначена для внутривидовой дифференциации и идентификации штаммов центральноазиатского подвида и штаммов Y. pseudotuberculosis.
Известен способ экспресс-диагностики бактерий рода Yersinia, который основан на методе мультиплексной ПЦР с последующим анализом длин амплифицированных фрагментов гена порина - OmpF (патент RU 2385941, опубл. 10.04.2010). Метод позволяет осуществлять одновременную детекцию и дифференциальную диагностику патогенных и непатогенных видов иерсиний, а также видовую идентификацию патогенных для человека видов: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica. Однако этот способ не предназначен для проведения подвидовой дифференциации штаммов Y. pestis.
Внутривидовая дифференциация штаммов возбудителя чумы описана в патенте (RU №2425891, дата опубликования 10.08.2011). При помощи указанного способа, возможно разделение штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с дальнейшей дифференциацией штаммов Y. pestis по их принадлежности к основному и неосновным подвидам. В тоже время этот способ не предусматривает идентификацию штаммов Y. pestis центральноазиатского подвида.
Известен способ дифференциации биоваров и геновариантов штаммов Y. pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции (патент RU №2565554, опубликован 20.10.2015). Способ обеспечивает разделение античного, средневекового биоваров основного подвида возбудителя чумы, а также филогенетических линий 1.ANT/1.ORI и 2.ANT/2.MED основного подвида. Однако способ не пригоден для установления принадлежности штаммов Y. pestis к центральноазиатскому подвиду и для идентификации штаммов Y. pseudotuberculosis.
Опубликован способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (Патент RU №2621869, опубликован 07.06.2017). Способ обеспечивает разделение основного, кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов, но не решает проблемы идентификации штаммов Y. pestis и штаммов Y. pseudotuberculosis.
Известен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции (Патент RU №2552611, опубликован 10.06.2015 г.). Способ предусматривает выделение ДНК, проведение ПЦР с применением сконструированных праймеров для амплификации фрагментов межгенных участков wzyE-dapF и YPDF_0064-YPDSF_0065 исследуемого штамма. Дифференциацию осуществляют путем сравнения размеров полученных ампликонов исследуемого штамма с размерами аналогичных фрагментов, характерных для штаммов основного (151 п.н. и 374 п.н.), кавказского (185 п.н. и 434 п.н.), алтайского и гиссарского (202 п.н. и 374 п.н.), а также улегейского (185 п.н. и 374 п.н.) подвидов. Изобретение позволяет эффективно проводить подвидовую дифференциацию штаммов Y. pestis и значительно сократить время выполнения анализа. Однако способ не пригоден для определения принадлежности штаммов к Y. pseudotuberculosis или Y. pestis, и к центральноазиатскому подвиду Y. pestis.
Известен способ дифференциации штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов методом ПЦР в режиме реального времени (RU 2642273, опубл. 24.01.2018). Способ предусматривает выделение хромосомной ДНК из исследуемого материала, постановку ПЦР со специфическими праймерами и аллель-специфическими зондами и учет полученных результатов. Способ обеспечивает разделение Y. pestis основного и неосновных подвидов, но не решает проблемы дифференциации штаммов Y. pestis центральноазиатского подвида и штаммов Y. pseudotuberculosis
Известен способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом секвенирования (RU 2404256, опубл. 20.11.2010), который предусматривает амплификацию фрагментов генов rhaS и araC, а также определение их нуклеотидных последовательностей. Генотип исследуемого штамма устанавливают по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS и 773 гена araC. Подвидовую принадлежность штамма определяют путем сравнения его генотипа с известными генотипами штаммов Y. pestis. Однако этот способ не позволяет дифференцировать штаммы основного и центральноазиатского подвидов Y. pestis и идентифицировать вид Y. pseudotuberculosis.
Также известен способ подвидовой дифференциации штаммов Y. pestis методом мультилокусного сиквенс-типирования (RU 2415948, опубл. 10.04.2011), предусматривающий определение нуклеотидных последовательностей ряда генов жизнеобеспечения (rhaS, araC, metB, aspA, thiH) с применением секвенационных технологий. Генотип исследуемого штамма устанавливают по нуклеотидам, находящимся в позициях 482, 494, 671 гена rhaS, в позиции 773 гена araC, в позициях 988 и 989 гена metB, в позициях 1087-1089 гена aspA и 552 гена thiH. По аллелям генов rhaS, агаС, metB, aspA и thiH определяют сиквенс-тип (ST) штамма Y. pestis с его последующей подвидовой дифференциацией путем сравнения с сиквенс-типами основного и неосновных подвидов. Данные способы с применением технологии секвенирования позволяют определять подвидовую принадлежность штаммов возбудителя чумы, однако, являются трудоемкими, дорогостоящими, а также требуют соответственного технического оснащения и специальной подготовки исследователей.
В научной и специальной литературе отсутствуют другие данные о способах идентификации Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, и дифференциации штаммов Y. pestis центральноазиатского и основного подвидов от других подвидов и биоваров возбудителя чумы методом мультиплексной ПЦР с электрофоретическим или гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени.
Технический результат изобретения заключается в обеспечении высокоэффективной и надежной идентификации штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, с одновременной дифференциацией штаммов Y. pestis основного и центральноазиатского подвидов методом мультиплексной ПЦР с электрофоретическим или гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени.
Технический результат достигается способом идентификации штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, и одновременной дифференциации штаммов Y. pestis основного и центральноазиатского подвидов методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, который предусматривает проведение мультиплексной ПЦР в один этап в одной реакционной смеси с праймерами и электрофоретическим учетом результатов (ПЦР-ЭФ) или праймерами и зондами в формате TaqMan с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на мишени: «Pestis-Pseudo» для штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, «45» для штаммов Y. pestis основного подвида, «СА-509» для штаммов Y. pestis центральноазиатского подвида, имеющими последовательность: SEQ ID NO: 1-7 с идентификацией штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis и дифференциацией штаммов Y. pestis основного и центральноазиатского подвидов по размерам образуемых ПЦР фрагментов и по наличию и отсутствию сигналов с указанными праймерами в соответствии с таблицей.
Используемые ДНК-мишени находятся в следующих областях генома Y. pestis: «Pestis-Pseudo» в позиции 3025402-3025654 межгенное пространство между геном AK38_2746, кодирующим карбогидрат-киназу, и геном AK38_2747, кодирующим гипотетический протеин-регулятор транскрипции, «45» в позиции 2579997-2580134 генов ilvB-ilvN кодирующих ацетолактат-синтазу, «СА-509» в позиции 2351984-2351475 гена YPO2071, кодирующего предположительно DEAD-бокс-хеликазу. Названия генов и участков генома, их координаты даны по геному штамма Y. pestis CO92, номер доступа в NCBI GenBank NC_003143.1.
Идентификация Y. pestis и Y. pseudotuberculosis методом ПЦР-ЭФ с праймерами на мишень «Pestis-Pseudo» основана на наличии маркерной инсерции размером 110 п.н. в хромосомном локусе у штаммов чумы. У штаммов псевдотуберкулеза отсутствует эта инсерция.
Идентификация Y. pestis и Y. pseudotuberculosis методом ПЦР-РВ с праймерами и зондами на мишень «Pestis-Pseudo» основана на наличии маркерного SNP, на который рассчитаны два варианта зонда содержащих LNA звено: один вариант специфичен для нуклеотида, характерного для Y. pestis, другой - для Y. pseudotuberculosis.
Мишень «45» - обеспечивает идентификацию штаммов основного подвида по наличию в хромосомном локусе маркерной делеции в 45 п.н. Мишень «СА-509» позволяет проводить идентификацию центральноазиатского подвида по наличию в хромосомном локусе делеции размером 509 п.н.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
Мультиплексную полимеразную цепную реакцию осуществляют с использованием предложенных праймеров и зондов на мишени «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509». Олигонуклеотидные праймеры, применяемые для амплификации в ПЦР с электрофоретическим учетом результатов, а также олигонуклеотидные праймеры и зонды, применяемые для амплификации в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени, на мишени «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509» рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих участков у штаммов Y. pestis CO92, KIM, Antiqua, Nepal516, 91001, Y. pseudotuberculosis IP32953, нуклеотидные последовательности которых представлены в базе данных NCBI GenBank. С помощью указанных праймеров в ПЦР-ЭФ проводят амплификацию этих участков в один этап в одной реакционной смеси. Для проведения мультиплексной ПЦР-РВ в один этап в одной реакционной смеси используют зонды в формате TaqMan и применяют следующие (общие для ПЦР-ЭФ и ПЦР-РВ) условия реакции: 1 цикл 95°С 2 мин; 35 циклов 95°С 10 с, 59°С 50 с.
Принадлежность выделенной ДНК к видам Y. pestis или Y. pseudotuberculosis, а так же одновременную дифференциацию Y. pestis основного или центральноазиатского подвида устанавливают по результату проведенной мультиплексной реакции в соответствии с таблицей.
При проведении ПЦР с электрофоретическим учетом результатов с праймерами на ДНК мишень «Pestis-Pseudo» у вида Y. pestis обнаруживается ампликон размером 253 п.н. (за счет наличия инсерции размером 110 п.н. в этой ДНК мишени у Y. pestis). У вида Y. pseudotuberculosis и других видов при электрофоретическом учете результатов по ДНК мишени «Pestis-Pseudo» ампликона размером 253 п.н. не образуется. При электрофоретическом учете результатов с праймерами на ДНК мишень «Pestis-Pseudo» у вида Y. pseudotuberculosis образуется ампликон размером 143 п.н., у других видов такой ампликон не образуется за счет отсутствия гомологичных областей генома для гибридизации олигонуклеотидных праймеров по ДНК мишени «Pestis-Pseudo». При электрофоретическом учете результатов с праймерами на ДНК мишень «45» у штаммов вида Y. pestis (кроме основного подвида Y. pestis), Y. pseudotuberculosis обнаруживается ампликон размером 183 п.н. У основного подвида Y. pestis при электрофоретическом учете результатов размер ампликонов с праймерами на мишень «45» составляет - 138 п.н. У вида Y. pestis центральноазиатского подвида с праймерами на ДНК мишень «СА-509» при электрофоретическом учете результатов ампликоны отсутствуют, у видов Y. pestis (кроме центральноазиатского подвида Y. pestis) и Y. pseudotuberculosis присутствуют ампликоны размером 157 п.н.
При проведении ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени присутствует сигнал флуоресценции по мишени «Pestis-Pseudo» с зондом Pestis-P у вида Y. pestis. При гибридизационно-флуоресцентном учете результатов у вида Y. pseudotuberculosis детектируется сигнал флуоресценции по мишени «Pestis-Pseudo» с зондом Pseudo-P. У других видов из-за отсутствия у них специфических нуклеотидных последовательностей для гибридизации олигонуклеотидных праймеров и зондов по мишени «Pestis-Pseudo» сигнал флуоресценции не детектируется.
У штаммов основного подвида Y. pestis отсутствует сигнал флуоресценции на мишень «45», поскольку рассчитанный на эту мишень ДНК зонд комплементарен участку делеции в 45 п. н., маркерной для штаммов основного подвида. У видов Y. pestis (кроме основного подвида Y. pestis) и Y. pseudotuberculosis детектируется флуоресцентный сигнал по мишени «45». У центральноазиатского подвида Y. pestis отсутствует сигнал флуоресценции на мишень «СА-509», поскольку рассчитанные на эту ДНК мишень праймеры и зонд комплементарны участку делеции в 509 п. н., маркерной для центральноазиатского подвида. У вида Y. pseudotuberculosis детектируется флуоресцентный сигнал по мишени «СА-509».
Сущность изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Идентификация Y. pestis и дифференциация основного подвида методом мультиплексной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов (модельный эксперимент).
Выделение ДНК исследуемого образца проводят с помощью коммерческих наборов для выделения ДНК. Мультиплексную ПЦР осуществляют с праймерами, рассчитанными на ДНК мишени «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509». Получают следующие результаты. При электрофоретическом учете результатов присутствует ампликон размером 253 п.н. по мишени «Pestis-Pseudo», образуется ампликон размером138 п.н. по мишени «45» и ампликон размером 157 п.н. по мишени «СА-509». Следовательно, исследуемый штамм относится к виду Y. pestis, основному подвиду.
Пример 2. Идентификация Y. pestis и дифференциация центральноазиатского подвида методом мультиплексной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов.
Исследование выделенной ДНК проводят аналогично примеру №1. Мультиплексную ПЦР проводят с праймерами, рассчитанными на ДНК мишени «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509». Получают следующие результаты. При электрофоретическом учете результатов обнаруживается ампликон размером 253 п.н. по мишени «Pestis-Pseudo», присутствует ампликон размером 183 п.н. по мишени «45» и отсутствует ампликон размером 157 п.н. по мишени «СА-509». Следовательно, исследуемый штамм относится к виду Y. pestis, центральноазиатскому подвиду.
Пример 3. Идентификация Y. pseudotuberculosis методом мультиплексной ПЦР с электрофоретическим учетом результатов.
Исследование выделенной ДНК проводят аналогично примеру №1. Мультиплексную ПЦР проводят с праймерами, рассчитанными на ДНК мишени «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509». Получают следующие результаты. При электрофоретическом учете результатов присутствует ампликон размером 143 п. н. по мишени «Pestis-Pseudo», присутствует ампликон размером 183 п.н. по мишени «45» и присутствует ампликон размером 157 п.н. по мишени «СА-509». Следовательно, исследуемый штамм относится к виду Y. pseudotuberculosis.
Пример 4. Идентификация Y. pestis и дифференциация основного подвида методом мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени.
Исследование выделенной ДНК проводят аналогично примеру №1. Мультиплексную ПЦР осуществляют с праймерами и зондами, рассчитанными на ДНК мишени «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509». Получают следующие результаты. При гибридизационно-флуоресцентном учете результатов в режиме реального времени присутствует сигнал флуоресценции по мишени «Pestis-Pseudo» с зондом Pestis-P, отсутствует сигнал флуоресценции по мишени «45» и присутствует сигнал по мишени «СА-509». Следовательно, исследуемый штамм относится к виду Y. pestis, основному подвиду.
Пример 5. Идентификация Y. pestis и дифференциация центральноазиатского подвида методом мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального.
Исследование выделенной ДНК проводят аналогично примеру №1. Мультиплексную ПЦР проводят с праймерами и зондами, рассчитанными на ДНК мишени «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509». Получают следующие результаты. При гибридизационно-флуоресцентном учете результатов в режиме реального времени проявляется сигнал флуоресценции по мишени «Pestis-Pseudo» с зондом Pestis-P, присутствует сигнал флуоресценции по мишеням «45» и отсутствует сигнал по мишени «СА-509». Следовательно, исследуемый штамм относится к виду Y. pestis, центральноазиатскому подвиду.
Пример 6. Идентификация Y. pseudotuberculosis методом мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени.
Исследование выделенной ДНК проводят аналогично примеру №1. Мультиплексную ПЦР проводят с праймерами и зондами, рассчитанными на ДНК мишени «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509». Получают следующие результаты. При гибридизационно-флуоресцентном учете результатов в режиме реального времени присутствуют сигналы по мишени «Pestis-Pseudo» с зондом Pseudo-P, «45» и «СА-509». Следовательно, исследуемый штамм относится к виду Y. pseudotuberculosis.
Таким образом, заявленный способ идентификации штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis и одновременной дифференциации штаммов Y. pestis основного и центральноазиатского подвидов при помощи мультиплексной ПЦР с электрофоретическим или гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов с использованием мишеней «Pestis-Pseudo», «45», «СА-509» позволяет быстро и эффективно определять принадлежность штаммов к видам Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, и проводить дифференциацию штаммов возбудителя чумы основного и центральноазиатского подвидов.
Последовательности праймеров и зондов
SEQ ID NO:1
Pestis-Pseudo-S – GTCTTTGCCGCCGATATTAT
Pestis-Pseudo-As  – CTGGCGGAATTAGACGTG
SEQ ID NO:2
C-LNA
T-LNA
G-LNA
Pestis-P – Cy5-GGTTTATTTAA()()()TTCT-RTQ2
SEQ ID NO:3
C-LNA
G-LNA
G-LNA
Pseudo-P – ROX-GGCTTATTTAA()()()TTCT-RTQ2;
SEQ ID NO:4
45-S – GTGGATGAGAAAGTTTACCC
45-As – ATCACACCTGGATGGTTAC
SEQ ID NO:5
45-P – R6G-ACTCAGCAAGCATCTGCTCAACATG-RTQ1;
SEQ ID NO:6
СА-509-S – CGGACTGGGTAATAACAAG
СА-509-As – CCCGTTGTCTGTTTCTGA
SEQ ID NO:7
CA-509-P – FAM-TAGCCCTAAGCGCAACGTGAA-RTQ1