Культивирование как способ выявления и реализации биологических и терапевтических эффектов стромальный фракции стволовых и прогениторных клеток костного мозга

Биомедицина • № 4, 2013, С. 134-138

МЕТОДЫ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Культивирование как способ выявления и реализации биологических и терапевтических эффектов стромальный фракции стволовых и прогениторных клеток костного мозга

О.И. Степанова, Х.Х. Семенов, А.О. Ревякин, Н.В. Касинская, О.В. Баранова

ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область Контактная информация: Степанова Ольга Ивановна scbmt@yandex.ru

Отработан метод выделения из костного мозга (стромальной фракции) стволовых и прогениторных клеток с культивированием их в ростовой среде для идентификации специфичности клеток в культуре мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.

Ключевые слова: костный мозг, стромальная фракция, идентификация.

В эмбриогенезе каждый орган развивается из разных стволовых компар-тментов и с участием различных клеток предшественников, которые, мигрируя в него по строгим законам развития, обеспечивают информационный обмен и создание соответствующих клеточных линий. Во взрослом организме клеточный состав каждого органа жестко фиксирован. Именно поэтому при гибели паренхимы органов процессы восстановительной регенерации в них могут быть эффективно воспроизведены путем рекапитуляции эмбриогенеза, за счет активной и возросшей миграции региональных стволовых клеток в зоны тканевого повреждения.

Известно, что миграционной и, следовательно, регенерационной способностью, во взрослом организме, обладают клетки иммунной системы и, прежде всего, костный мозг (КМ), который является самым мощным в организме донором стволовых и прогениторных клеток.

КМ сам по себе относится к органам, имеющим мезенхимальное происхождение, а т.к. практически все органы и ткани содержат в своей структуре клетки мезенхимы, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) из костного мозга (гемопоэтические и стромаль-ные) должны быть наиболее активными участниками восстановительных процессов в органах при их повреждении.

Регенерационные эффекты МСК костного мозга гемопоэтической (преимущественно лимфоидной) и стромальной фракций клеток реализуются не только за счет стимуляции ими неоангиогенеза и предифференцировки МСК стромаль-ного ряда в специализированные клетки, но и за счет продукции ими широкого спектра цитокинов и ростовых факторов в процессе жизнедеятельности. Процесс культивирование клеток костного мозга является способом не только их клонирования но варьируя режимами и условиями культивирования клеток можно так же изменять их пластические свойства и влиять на некоторые механизмы межклеточного взаимодействия.

Цель: Отработать технологические режимы культивирования и предиффе-ренцировки стволовых клеток костного мозга в другие типы клеток (фибробла-стоподобные) и идентифицировать их и использовать для восстановления структуры и функции пораженных органов на моделях с хроническими патологиями.

Перед нами были поставлены следующие задачи работы:

Отработать технологию раздельного выделения из костного мозга мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток и идентифицировать в культуре мезенхимальные стволовые клетки.

Отработать технологий получения и идентификации клеточных культур.

Получить первичную культуру МСК и предифференцировать МСК в фибро-бластоподобные (ФМСК),

Материалы и методы

Донорами стволовых и прогенитор-ных клеток костного мозга были использованы здоровые доноры - мыши 2-х линий:

- мыши линии B10.GFP (n=30) для получения как терапевтического эффекта и для маркировки введенных клеток в организм реципиента при аллогенной трансплантации;

- гетерозиготные мыши db/+ (n=30), для получения терапевтического эффекта при изогенной трансплантации.

Технология проведения культуральных исследований.

Работа по выделению клеток и их культивированию проводилась в соответствии с общими принципами осуществления культуральных исследований.

Получение культур мультипотент-ных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ).

У животных под эфирным наркозом, получали стерильно клеточный аспират из костномозгового канала трубчатых костей путем вымывания из полости раствором Хенкса (без Са+2 и Mg+2). Суспензию клеток центрифугировали 5 мин. при 1500 об/мин; осадок клеток ресуспенди-ровали в лизирующем растворе (114 mM NH4Cl; 7,5 mM KHCO3; 100 мкМ EDTA) из расчета 1:1 при комнатной температуре t0=(220C) в течение 1 мин. и центрифугировали 3 мин. при 1500 об/мин, добиваясь полного лизиса эритроцитов. Гемолизиро-ванный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий МНК и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК КМ) ресуспендировали в ростовой среде DMEM (ПанЭко), с добавлением 25мМ HEPES, 0,58 г/л глютамина, 100мкг/л гентамицина, 10% бычьей эмбриональной сыворотки (HyClone, USA), 5 мкг/л инсулина. Через 3-5 суток непри-крепившиеся клетки отбирали, а к оставшимся пластикадгезивным клеткам в ростовую среду добавляли основной фактор

роста фибробластов (bFGF) (Sigma, USA) 20 нг/мл. Культивировали ММСК КМ для наращивания клеточной массы в течение 14 суток с постоянной заменой ростовой среды через каждые 3 дня. Через 2 недели клеточный материал, представлявший собой прикрепившиеся к пластику распластанные фибробластоподобные клетки (стромальные стволовые клетки), был готов для трансплантации (рис. 1).

Методы идентификации специфичности клеток в культуре ММСК КМ

Использовали иммуногистохимиче-ский метод выявления коллагена I типа [Лейси А., 1992].

Иммуногистохимическое опреде-

ление коллагена I типа, проводили в ММСК КМ (фибробластоподобные клетки).

Для этого плашку с культурой клеток отмывали PBS, после чего клетки фиксировали 100% метанолом при 200С в течение 20 минут.

А, Б - 7 суточная культура ММСК КМ (фибробластоподобные клетки) от доноров мышей B10.GFP: А. - Увел. Х200, фазовый контраст; Б. - Увел. Х200; люминесцентная микроскопия; В, Г - 14 суточная культура ММСК КМ (фибробла-стоподобные клетки) от доноров мышей B10.GFP для аллотрансплантации: В. -Увел. Х100, фазовый контраст; Г. - Увел. Х600; люминесцентная микроскопия; Д

- 14 суточная культура ММСК КМ (фи-бробластоподобные клетки) от доноров гетерозиготных мышей db/+ для изотрансплантации; Увел. Х200, фазовый контраст.

Эндогенную пероксидазную активность неспецифическое окрашивание блокировали последовательной обработ-

Рис. 1. Культура мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у мышей разных линий и на разных сроках культивирования.

кой свежеприготовленными растворами: 3% перекиси водорода (10 мин), 2,28% periodic acid (5 мин), и 0,02% боргидрата натрия [borhydride] (5 мин). Затем клетки инкубировали в 3% растворе нормальной лошадиной сыворотки (в 0,005М Tris-HCl; 0,15M NaCl; pH=7.6) в течение 30 мин и далее инкубировали 36-48 часов при 40С с первичной антисывороткой. Эту антисыворотку готовили рутинным способом в концентрации 1:10.000. Козью антисыворотку разбавляли до нужной концентрации 1%-м раствором нормальной лошадиной сыворотки в Tris-буфере. После инкубации с первичной антисывороткой, препараты инкубировали при комнатной температуре 30 мин с кроличьими антикозьими g-глобулинами (1:100), затем с кролик-перокси-даза-антипероксидаза (1:50) 30 мин. Обе антисыворотки были разбавлены в 1%-м растворе нормальной козьей сыворотки в Tris-буфере. Полученные срезы тканей далее проявляли обработкой 0,05% -м раствором diaminobenzidine-4HCl в 0,1М PBS при pH=5,8 в течение 5 мин. Коричневое окрашивание клеток на коллаген I типа (рис.2) наблюдали в световом микроскопе и фотографировали с помощью цифровой фотокамеры фирмы «OLYMPUS» (Япония) на компьютере с программным обеспечением. При окрашивании на остеопонтин и кальцитонин специфического окрашивания не наблюдали, что свидетельствовало об отсутствии остеобластной дифференцировки.

Применив иммуногистохимический метод идентификации мезенхимальных клеток по соответствующему маркеру белка - коллаген I типа, мы установили, в культуре ММСК КМ (фибробласто-подобных) коллаген I типа выявляется у 100% адгезированных клеток. Этот

Рис. 2. Идентификация мезенхимальных стволовых клеток мыши в культуре маркером на коллаген I типа. 7-е сутки культивирования ММСК КМ; Окраска на коллаген I типа. Увел. х 400.

факт доказывает однородность культуры адгезированных мезенхимальных стромальных клеток и пригодность метода для их выделения и последующего применения с лечебными целями.

Необходимость предифференцировки МСК перед трансплантацией диктовалась еще и тем, что стволовым клеткам КМ присущ эффект хоминга (homing) и поэтому для удержания МСК КМ в очаге повреждения (в зоне трансплантации) эти клетки должны иметь свойства клеток соответствующего органа (ткани) фенотипа. Основываясь на представлениях о необходимости направленной фенотипической индукции процессов регенерации в поврежденном органе для восстановления его функции нами была проведена работа по отработке режимов предифференцировки МСК в фибробластоподобные клетки.

Фибробластоподобные клетки из МСК образуются постоянно, как фидерные клетки - сопутствующие клетки, вне зависимости от состава среды. Однако, их процентное содержание зависит от присутствия факторов роста и субстратспецифических добавок.

Подготовка клеточного материала для трансплантации.

Подготовка ММСК КМ. Через 2 недели культивирования клеточный материал использовали для трансплантации. Культуру адгезированных на пластике ММСК КМ дважды отмывали от среды с сывороткой с помощью раствора Хэнкса без Mg2+ и Са2+. Затем для снятия клеток с пластика в культуру вносили раствор Хэнкса без Mg2+ и Са2+, содержащий 0,25% раствор трипсина и инкубировали 3-5 мин. при 370С в условиях медленного перемешивания. После пи-петирования клетки ресуспендировали в растворе Хэнкса при 40С, содержащем 10% фетальную бычью сыворотку, центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин. и снова ресуспендировали в растворе Хэнкса; производили подсчет полученных клеток в камере Горяева. Подготовленные для трансплантации клетки ресу-спендировали в 500-1000 мкл. раствора Хенкса при при 40С. В контрольной серии животным вводили такой же объем физиологического раствора без ККМ.

Все выше изложенное позволяет придти к заключению, что процедура культивирования клеток КМ важна не только для клонирования клеток и наращивания

клеточной массы, не только важна для предифференцировки мезенхимальных (стромальных) стволовых ККМ (путем подбора состава культуральных сред и условий культивирования) и подготовки их к выполнению регионарных прогени-торных функций после трансплантации.

Наши исследования показали, что состав культуральной среды и необходимость его обновления в процессе культивирования играют определяющую роль в индукции направления диф-ференцировки МСК.

Выводы

Отработанная технология раздельного выделения из костного мозга и культивирования мезенхимальных (ст-ромальных) стволовых клеток является адекватной (подтверждена методами фенотипического и иммуногистохими-ческого исследования), воспроизводимой и пригодной для применения в культуральной - исследовательской работе.

Предифференцировка мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга в фибробластоподобные клетки наступает в условиях постоянного присутствия инсулина, и основного фактора роста фибробластов.

Cultivation as way of identification and realization of biological and therapeutic effects stromal fractions of stem and progenitor cells of marrow

O.I. Stepanova, Kh.Kh. Semenov, A.O. Revyakin, N.V. Kasinskaya, O.V. Baranova

Worked out a method derived from bone marrow (stromal fraction) of stem and progenitor cells by culturing them in a growth medium for proxy authentication specificity of cells in culture of pluripotent mesenchymal stem cells from bone marrow.

Key words: stem cells, hematopoietic and progenitor cells, stromal fraction, identification.

Биомедицина • № 4, 2013 138