СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ  СУХОГО ПОЛИМИКРОБНОГО  ПРОДУКТА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
METHOD FOR OBTAINING DRY POLYMICROBIAL PRODUCT TO BE USED IN FOOD INDUSTRY

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к пищевой, биотехнологической промышленности, медицинской микробиологии, производящей препараты профилактического назначения и касается производства биологически активных продуктов питания на основе микроорганизмов, обладающих способностью регулировать ряд функций в организме человека.
Изобретение предназначено для использования на предприятиях пищевой и биотехнологической промышленности, решающих вопросы производства продуктов функционального питания, в том числе ферментируемых напитков.
Изобретение представляет собой способ получения сухого полимикробного продукта, содержащего консорциум микроорганизмов, состоящий из штамма лактобактерий Lactobacillus acidophilus La5 и штамма дрожжей Pichia anomala 9а или Pichia anomala P1, методом твердофазной ферментации вышеуказанного микробного консорциума на отрубях зерновых пшеничных ГОСТ 7169-66 и последующей сушке. Полученный полимикробный продукт может быть применен как самостоятельно, так и для получения на его основе кисломолочных и других растительных ферментируемых продуктов в лечебно-профилактических целях.
Уровень техники
Такие функции нормальной микрофлоры кишечника в организме человека, как синтезирующая, регуляторная, десенсибилизирующая, дезинтоксикационная, ферментативная, защитная и иммуностимулирующая являются жизненно важными. Адекватное, сбалансированное питание при нормальном функционировании органов и систем предотвращает развитие дисбактериозов (Бабин В.Н. Дисбактериоз / В.Н.Бабин, И.В.Домарадский, В.Н.Дубинин // Рос.хим.журнал - 1994 г. - Т.39 - №6 - с.66-78).
При изменениях микрофлоры необходима коррекция питания с учетом моторики, секреторных изменений ЖКТ, ферментативной активности пищеварительного тракта и с дополнительным введением витаминно-минеральных комплексов. В настоящее время широкое распространение получает функциональное питание, которое подразумевает ежедневное применение продуктов, оказывающих благоприятное действие на макроорганизм.
Широкое распространение получили бактерийные препараты на основе микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры - пробиотики. Препараты и продукты, содержащие в своем составе лактобактерии, широко используются для профилактики и лечения дисбактериозов и нормализации микрофлоры кишечника людей, перенесших стрессовые воздействия, антибиотико- и химиотерапию.
В то же время при производстве пищевых продуктов с биологически активными свойствами экономически выгодным, легко воспроизводимым, доступным и экологически безопасным сырьем служат дрожжи как специально выращиваемые, так и являющиеся побочным продуктом основного производства. При промышленном получении вина, спирта, пива, кваса и ряда другой продукции накапливающаяся масса дрожжей после ферментации практически не используется, а если используется, то весьма неэффективно.
Известен способ получения биологически активного препарата и биологически активная добавка к пище пребиотического действия (БАД) «Эубикор» (Патент RU 2233320, кл. C12L 1/16 от 2004.07.27), рекомендуемая в качестве средства, улучшающего функциональное состояние желудочно-кишечного тракта, состоящая из биомассы Saccharomyces, иммобилизованной на пшеничных экструдированных отрубях зерновых культур, биотрансформированных органических веществ, представленных углеводами, белками, жирами, витаминами, пищевыми волокнами и неорганическими веществами. Данная БАД обладает выраженными пребиотическими и сорбционными свойствами и ее назначением является нормализация микрофлоры кишечника.
Недостатком данного способа является отсутствие жизнеспособных клеток микроорганизмов, способных стимулировать рост и развитие облигатных представителей микрофлоры ЖКТ, к которым относятся молочнокислые бактерии, то есть отсутствие пробиотических свойств.
7
8
В смеси с лактобактериями дрожжи используют для повышения неспецифической резистентности организма и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (Патент RU 2302877, кл. А61К, C12N, C12R от 07.06.2005). Предложенная активная биологическая добавка «Биобаланс-В» предназначена для непосредственного употребления в пищу и способствует профилактике и лечению дисбактериоза, нормализации функций желудочно-кишечного тракта, улучшению обменных процессов, повышению неспецифической резистентности организма и представляет собой биомассу штамма лактобактерий Lactobacillns rhamnosus ВКПМ В-9072, наращенную в питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина, дрожжи хлебопекарские прессованные, глюкозу и воду очищенную в заданном соотношении компонентов. При этом дрожжи прессованные хлебопекарские ГОСТ-171-81 используются при получении только жидкого препарата, в котором количество живых бактерий равняется 1×10-1×10 КОЕ/мл.
Недостатком предложенного способа является дорогое сырье для питательной среды и достаточно низкое содержание молочнокислых бактерий в жидком препарате. При выпуске же данного препарата в виде порошка и таблеток применяется лиофильная сушка. Эти формы имеют длительные сроки годности (до 1 года) и не требовательны к непродолжительным изменениям температуры хранения. Существенным их недостатком является то, что процесс лиофилизации переводит бактерии в анабиоз (неактивное состояние). Для возвращения в активное физиологическое состояние им требуется 8-10 часов, а за это время большая часть бактерий уже выводится из кишечника человека. Кроме того, в процессе лиофилизации бактериальные клетки теряют специфические рецепторы, которые помогают им закрепляться на поверхностях, поэтому время их пребывания в кишечнике еще более снижается.
4
5
Известен способ получения закваски для приготовления сброженного продукта типа "Курунга" (Патент RU 2059380, кл. А23С 9/12, 10.05.1996), предусматривающий культивирование симбиоза мезофильных, термофильных лактобактерий, ароматообразующих, уксуснокислых бактерий и дрожжей с внесением хлебных крошек в соотношении 1,5:0,5, предусматривающем пастеризацию обезжиренного молока, охлаждение до температуры заквашивания, сквашивание, перемешивание и охлаждение, сквашивание осуществляют кефирной грибковой закваской и хлебными крошками, взятыми в соотношении 1,5:0,5 соответственно, при этом процесс сквашивания ведут в деревянной таре. Известно, что готовая кефирная грибковая закваска отличается сложным и стабильно сложившимся симбиозом мезофильных стрептококков, термофильных палочек, ароматообразующих и уксуснокислых бактерий, а также дрожжей, титр которых достигает 10-10 кл/мл закваски.
Недостатком этого способа является использование в качестве питательной среды для приготовления бактериальных заквасок молока, которое считается дорогим сырьем, а также низкое количество жизнеспособных клеток дрожжей. При этом вышеприведенный способ отличается трудоемкой и сложной технологией.
Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности признаков является способ получения съедобного биологически активного полуфабриката, предусматривающий выделение дрожжей из спонтанных микробных ценозов желудочно-кишечного тракта человека или животного на агаровые питательные среды, затем выделение из них чистой культуры термотолерантных дрожжей или дрожжеподобных грибов, которыми засевают углеводистую питательную среду с нейтральной реакцией, которую наносят на твердый носитель, обеспечивая при этом влажность 30-75%, и проводят твердофазное культивирование в аэробных условиях, а затем выращенную культуру инактивируют с получением целевого продукта (Патент RU 2231271, кл. A23L 1/29, 1/30, 27.06.2004).
Недостатком данного способа является отсутствие в полученном полуфабрикате жизнеспособных клеток микроорганизмов, способных к регуляции микробиоценозов желудочно-кишечного тракта путем увеличения колонизационной способности собственной микрофлоры конкретного организма.
Задача изобретения состояла в получении твердофазных аэробных высушенных культур, содержащих дрожжевые клетки, в качестве источника белка, витаминов и ферментов, и клетки лактобактерий, стимулирующие развитие гуморальной и клеточной защитных систем организма, а также обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре.
Сущность изобретения
8
9
Техническим результатом, достигаемым настоящим изобретением, является получение сухого полимикробного продукта, богатого биологически активными компонентами и белком, содержащего живые клетки промышленного штамма лактобактерий Lactobacillus acidophilus La5 на уровне 1·10 КОЕ/г и штамма дрожжей рода Pichia anomala 9a или Pichia anomala P1 на уровне 1·10 КОЕ/г, что позволяет получать ферментированные продукты, в том числе напитки, обладающие функциональными свойствами и обогащающие микрофлору желудочно-кишечного тракта конкретного организма.
9
Указанный технический результат достигается за счет того, что способ получения сухого полимикробного продукта включает твердофазное культивирование микробных консорциумов в аэробных условиях на увлажненных пористых субстратах с последующей сушкой при щадящем температурном режиме. При этом используют только штаммы дрожжевых культур вида Pichia anomala, интенсивно накапливающие биомассу в течение 48 часов на твердом растительном сырье до уровня 4·10 KOE/г и выше. Из протестированных нами 17 штаммов дрожжевых культур рода Pichia, взятых из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Биотехнология» МГУПП (культуры выделены в рамках известной диссертационной работы на соиск. уч.ст. к.т.н. Горина К.В. Разработка технологии микробных нутриентов-биокорректоров на базе целлюлозосодержащего сырья, М., 2011) интенсивно накапливают биомассу на твердых растительных субстратах только штаммы 9а и Р1 (табл.1). Вышеуказанные штаммы отнесены методом ПЦР-анализа к виду Pichia anomala.
Таблица 1
№п/п
Штамм дрожжей
Накопление биомассы дрожжевыми культурами в течение 48 ч, при температуре 30°С на отрубях, увлажненных водой до уровня влажности 55%, 10<sup>9</sup> КОЕ/г
1
H1
2,44
2
A1
1,28
3
25
0,96
4
A2
0,44
5
I1
2,68
6
12
0,44
7
13
0,96
8
L1
1,36
9
9B
3,80
10
T1
0,40
11
19
3,08
12
11
0,44
13
14
1,04
14
Р1
5,36
15
8
2,84
16
17
0,60
17
9А
4,84
С целью создания устойчивых микробных консорциумов с лактобактериями используют характерный представитель пробиотиков - промышленный штамм лактобактерий Lactobacillus acidophilus La5 (бактериальная закваска прямого внесения промышленного изготовления в лиофильно-высушенной форме, термофильная, моноштаммовая производства Chr. Hansen, Дания). Микробный консорциум позволяет расширить диапазон полезных свойств и повысить пробиотические свойства готовых продуктов. По сравнению с монокультурами консорциум более технологичен в практическом использовании, менее подвержен контаминациям со стороны посторонней микрофлоры и поражению бактериофагами. Ингибирующее и стимулирующее влияние бактериальной составляющей на накопление биомассы дрожжей установлено не было (табл.2).
Таблица 2
№п/п
Штамм дрожжей Pichia anomala
Накопление биомассы дрожжами, 10<sup>9</sup> КОЕ/г на отрубях с
молочной сывороткой
Молочной сывороткой+La5
водой
Водой+La5
1
9а
5,68
5,2
4,36
3,92
2
Р1
5,04
5,12
4,2
4,16
Как было установлено оптимальными параметрами для поверхностного твердофазного культивирования дрожжей Р.anomala 9а и Р.anomala P1 являются влажность питательной среды на уровне 55-65%, время культивирования - 36-48 ч., температура - 28-30°С. В качестве питательной среды для поверхностного культивирования могут быть использованы различные пористые растительные субстраты, такие как пшеничные отруби, так как они являются отличным источником клетчатки, незаменимых макро- и микроэлементов, витаминов группы В, витаминов Е и А. Клетчатка особенно важна для хорошей работы кишечника и нормального функционирования пищеварительной системы в целом. Однако сами по себе отруби это не только высокоценный кормовой продукт, но и хорошая добавка к пище, к применению которой население адаптировано. Возможно также использование сенной муки, растительных компонентов сельскохозяйственных культур (стебли и початки кукурузы) и других растительных субстратов (табл.3).
Таблица 3
Продуктивность дрожжей при ТФФ на растительных субстратах с добавлением различных увлажняющих компонентов
Штамм м/о
Накопление биомассы дрожжевыми культурами, 10<sup>9</sup> КОЕ/г на
отрубях с
сенной муке с
натуральной кукурузе с
высушенной кукурузе с
П.Б.
М.С.
вода
П.Б.
М.С.
вода
П.Б.
М.С.
вода
П.Б.
М.С.
вода
P.anomala P1
3,64
5,68
4,36
5,68
5,32
4,92
4,64
5,68
5,96
3,76
3,92
3,88
P.anomala 9a
4,8
5,46
4,2
4,48
3,84
3,6
4,56
4,96
5,08
2,6
3,64
3,24
3
Отруби или другие растительные субстраты предварительно стерилизовали автоклавированием при избыточном давлении 1,0 атм в течение 30-40 мин. В качестве увлажняющего компонента возможно использование жидких отходов пищевых производств, таких как молочная сыворотка и послеспиртовая барда, или же использовали воду. Молочную сыворотку, пропастеризованную автоклавированием при температуре 75°С в течение 15 минут, послеспиртовую барду и воду, простерилизованную автоклавированием при избыточном давлении 1,0 атм в течение 30-40 мин, добавляли в отруби с таким расчетом, чтобы обеспечить влажность получаемой питательной среды на уровне 55-65%. Посевным материалом служил смыв культур Р.anomala 9a или Р.anomala P1, выращенной на скошенном Сабуро-агаре при температуре 30°С в течение двух суток. Для приготовления смыва из одной пробирки с культурой на скошенном агаре использовали 5 см сыворотки, пропастеризованной, как описано выше, или послеспиртовой барды или воды, простерилизованной, как описано выше.
7
6
При культивировании высота слоя увлажненного твердого субстрата должна соответствовать 1,5-2,5 см. Установили, что наибольший прирост биомассы наблюдается при посевной дозе дрожжевых культур (1÷2,5)×10 КОЕ/г (табл.4) и внесении культур лактобактерий L.acidophilus La5 в количестве (6÷7)×10 КОЕ/г.
Таблица 4
Влияние посевной дозы дрожжей на накопление ими биомассы
Посевная доза дрожжевых культур, lg КОЕ/г
Титр жизнеспособных клеток дрожжей на конец ТФФ (через 48 ч), lg КОЕ/г
P.anomala 9a
P.anomala P1
3,07
3,95
3,93
5,17
6,69
6,60
7,01
9,41
9,47
9,11
10,07
10,14
При хранении состав и свойства полимикробных продуктов могут меняться. Этому способствует довольно большая влажность среды. Возможно обсеменение посторонней микрофлорой, изменение рН среды и активности культур. Для увеличения сроков хранения и возможности транспортировки продуктов их сушат. При этом важно подобрать такой режим сушки, чтобы наименее травмировать живые клетки микроорганизмов в составе полимикробных продуктов. Известно, что максимальной температурой для роста дрожжевых культур является 30°С, поэтому было предложено несколько температурных режимов сушки - при 35, 40 и 50°С (табл.5). Экспериментальные данные позволили выбрать режимы сушки при температурах 35 и 40°С, при которых действие на жизнеспособные клетки дрожжевых культур не так травматично, погибло всего 10-20% дрожжевых клеток.
Таблица 5
Влияние различных температурных режимов сушки на дрожжевые культуры в составе полимикробных продуктов
№п/п
Штамм дрожжей Pichia anomala и L.acidophilus La5
Жидкий компонент
Количество жизнеспособных клеток дрожжей, 10<sup>9</sup> КОЕ/г культуры
До сушки
После сушки при температуре
35°С
40°С
50°С
1
9a+La5
6% молочная сыворотка
3
2,6
2,4
0,0022,
вода
3,1
3
2,8
0,0031
2
P1+La5
6% молочная сыворотка
3,3
3,2
3
0,0027
вода
3.2
3
2,8
0,0016
При изучении влияния различных температурных режимов сушки - при 35, 40 и 50°С на лактобактерии просматривалась та же зависимость, что и для дрожжевых культур (табл.6). Наиболее приемлемыми определены режимы сушки при температуре 35 и 40°С, при которых погибло 22÷35% клеток лактобактерии, при температуре же 50°С происходило почти полное отмирание клеток лактобактерии - живыми остается менее 0,1%.
Таблица 6
Влияние различных температурных режимов сушки на культуры латобактерий в составе полимикробных продуктов
№п/п
Штамм дрожжей Pichia anomala и L.acidophilus La5
Жидкий компонент
Количество жизнеспособных клеток лактобактерии, 10<sup>9</sup> КОЕ/г культуры
До сушки
После сушки при температуре
35°С
40°С
50°С
1
9a+La5
6% молочная сыворотка
0,38
0,25
0,25
0,000025
вода
0,36
0,3
0,25
0,000013
2
P1+La5
6% молочная сыворотка
0,52
0,42
0,4
0,00002
вода
0,38
0,3
0,29
0,00003
Таким образом, целесообразна сушка при температуре 40°С, при которой действие на жизнеспособные клетки культур микроорганизмов не так травматично, а высушивание происходит намного быстрее, чем при 35°С.
Высушивание проводится до показателя влажности в сухом полимикробном продукте на уровне не более 12%.
Сухой полимикробный продукт на основе пшеничных отрубей по основным физико-химическим и микробиологическим показателем должен соответствовать требованиям, указанным в табл.7.
Таблица 7
Наименование показателя
Норма
1. Влажность, % не более
12
2. Содержание дрожжей, КОЕ/г
не менее 1·10<sup>9</sup>
3. Содержание молочнокислых бактерий, КОЕ/г
не менее 1·10<sup>8</sup>
4. Внешний вид
Сыпучая крупка от светло-коричневого до коричневого цвета
5. Запах
Свойственный дрожжевым закваскам
Особенно важными показателями с технологической точки зрения использования сухих полимикробных продуктов являются сроки и условия их хранения. Наиболее значимой характеристикой режима хранения для активных культур микроорганизмов является температура хранения, т.е. температура воздуха в хранилище. Поскольку способность товаров к сохранению обусловлена замедлением всех происходящих в них процессов, то для большинства используемых заквасок, содержащих активные культуры пониженные, близкие к 0°С, температуры хранения предпочтительнее, чем повышенные. Сухие полимикробные продукты помещали в прохладные помещения и хранили при температуре 15°С и относительной влажности 70-75%, либо замораживали при температуре -18°С и хранили в морозильнике при температуре - 18°С.
Таким образом, исследования срока хранения сухих микробных консорциумов на основе Lactobacillus acidophilus La5 и штаммов дрожжей Pichia anomala P1 и Pichia anomala 9a, показали, что при хранении в течение 100 суток (табл.8), т.е. более 3-х месяцев, количество жизнеспособных клеток дрожжей и лактобактерий в составе сухих полимикробных продуктов соответствовало требованиям, указанным в табл.7.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1.
3
7
Отруби или другие растительные субстраты, предварительно простерилизованные автоклавированием при избыточном давлении 1,0 атм в течение 30-40 мин, увлажняют до уровня 55% (молочной сывороткой, послеспиртовой бардой, водой или другим влажным материалом), при этом молочную сыворотку пастеризуют автоклавированием при температуре 75°С в течение 15 минут, а другие увлажняющие материалы стерилизуют автоклавированием при избыточном давлении 1,0 атм в течение 30-40 мин. Посевным материалом служит смыв культуры Р.anomala P1, взятой из коллекции микроорганизмов МГУПП, данный штамм отнесен к роду Pichia методом ПЦР-анализа и проверен на токсичность в испытательном лабораторном центре «Биотест», выращенной на скошенном Сабуро-агаре при температуре 30°С в течение двух суток. Для приготовления смыва из одной пробирки с культурой на скошенном агаре использовали 5 смсыворотки, пропастеризованной, как описано выше. Посевная доза дрожжевой культуры должна составлять (1÷2,5)×10 КОЕ/г. Далее вносят L.acidophilus La5 в соотношении 1:0,8 соответственно. При культивировании высота слоя увлажненного твердого субстрата должна соответствовать 1,5-2,5 см.
8
9
Полученный полимикробный продукт высушивают при температуре 40°С до значения остаточной влажности на уровне не более 12%. Сухой полимикробный продукт содержит жизнеспособные клетки пробиотических лактобактерий - не менее 1·10 КОЕ/г и жизнеспособные клетки дрожжей Р.anomala P1 - не менее 1·10 КОЕ/г и имеет 3-месячный срок хранения при температуре 15°С и относительной влажности 70-75%.
Пример 2. Способ по пр. 1, отличающийся тем, что посевным материалом служит смыв штамма культуры Р.anomala 9a, отнесенный к данному виду методом ПЦР-анализа и проверенный на токсичность.
Пример 3. Использование способа получения сухого полимикробного продукта для ферментации кисломолочных напитков.
Способ по пр.1 или пр.2, отличающийся тем, что после получения сухого полимикробного продукта его вносят в молоко с различной массовой долей жира, в зависимости от получаемого целевого кисломолочного продукта, предварительно пропастеризованное при температуре 95°С в течение 3 минут и охлажденное до температуры заквашивания (30°С). Продолжительность свертывания молока при внесении 10% сухого препарата составляет 12-15 ч. После заквашивания получается однородный, довольно плотный сгусток с приятным кисломолочным вкусом и ароматом. Кислотность продукта, полученного в результате сквашивания молока сухим полимикробным продуктом, составляет 80-100° по Тернеру. После сквашивания полученный продукт охлаждают до температуры 4±1°С и хранят при данной температуре в холодильнике.
Физико-химические, микробиологические и органолептические показатели полученных продуктов представлены табл.9.
Таблица 9
Органолептические, химические и микробиологические показатели разработанных новых ферментированных напитков на молочной основе
Наименование показателя
Значение показателя для молочных напитков (питьевых йогуртов)
6. Массовая доля белка, % не менее
3,0
7. Содержание СВ, % не менее,в том числе отруби, не более
1710
8. Активная кислотность среды, рН не менее
4,5
9. Титруемая кислотность среды, в С° Тернера не более
110
10. Содержание дрожжей, КОЕ/г
не менее 1·10<sup>7</sup>
11. Содержание молочнокислых бактерий, КОЕ/г
не менее 1·10<sup>9</sup>
12. БГКП (колиформы), КОЕ в 0,01 г
Не допускается
13. Патогенные м/о, в т.ч. сальмонеллы, КОЕ в 25 г
Не допускается
14. Споры грибов, КОЕ в 1 г
Не допускается
15. Внешний вид, цвет и консистенция
Однородная, в меру вязкая, молочно-белая с наличием включений зерновых отрубей
16. Запах и вкус
Свойственный молочнокислым продуктам
17. Масса нетто, упакованной единицы, л, не менее
0,1
Пример 4. Использование способа получения сухого полимикробного продукта для ферментации сахарного раствора.
Способ по пр. 1 и пр. 2, отличающийся тем, что после получения сухого полимикробного продукта его вносят в 7% сахарный раствор, предварительно простерилизованный при избыточном давлении 1,0 атм в течение 30-40 мин. Продолжительность ферментации напитка при внесении 10% сухого препарата составляет 48-72 ч. Для получения лучших органолептических свойств проводили фракционирование напитков на твердую (может использоваться в качестве обогатителя пищевых продуктов) и жидкую (питьевой напиток) фазы.
Физико-химические, микробиологические и органолептические показатели полученных продуктов представлены в табл.10.
Таблица 10
Органолептические, химические и микробиологические показатели разработанных новых ферментированных напитков и обогатителей пищевых продуктов
Наименование показателя
Значение показателя
для пищевого обогатителя (твердая фаза)
для питьевого напитка (жидкая фаза)
1. Массовая доля белка, % не менее
5
0,5
2. Содержание СВ, % не менее
35
8
3. Содержание дрожжей, КОЕ/г
не менее 1·10<sup>6</sup>
не менее 1·10<sup>7</sup>
4. Содержание молочнокислых бактерий, КОЕ/г
не менее 1·10<sup>8</sup>
не менее 1·10<sup>9</sup>
5. БГКП (колиформы), КОЕ в 0,01 г
Не допускается
Не допускается
6. Патогенные м/о, в т.ч. сальмонеллы, КОЕ в 25 г
Не допускается
Не допускается
7. Споры грибов, КОЕ в 1 г
Не допускается
Не допускается
8. Внешний вид, цвет и консистенция
Однородная влажная крупка от светло -коричневого до коричневого цвета
Однородная, прозрачно-бежевая жидкость
9. Запах и вкус
Свойственный зерновым продуктам
Свойственный сахаристым напиткам
10. Масса нетто, упакованной единицы,
л, не менее
-
0,1
кг, не менее
0,9
-