ПРИМЕНЕНИЕ АНГИОГЕНИНА ИЛИ АГОНИСТОВ АНГИОГЕНИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ И НАРУШЕНИЙ
APPLICATION OF ANGIOGENIN OR ANGIOGENIN AGONISTS FOR TREATING DISEASES AND DISORDERS

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к способам лечения мышечных нарушений, в том числе вызывающих мышечное истощение нарушений, и способам улучшения мышечной формы посредством улучшения функции, силы, массы мышц или толерантности к физической нагрузке. Это изобретение относится также к способам уменьшения жира, улучшения отношения мышцы - жир и лечения заболеваний, вызываемых субоптимальным отношением мышцы - жир или включающим в себя субоптимальное отношение мышцы - жир. Это изобретение относится также к лечению заболеваний, которые могут лечиться улучшением опосредованной фоллистатином стимуляции клеток.
Уровень техники
Хотя мышца имеет ее собственную клетку-предшественник для регенерации, утраченная вследствие заболевания или повреждения масса и сила мышц зачастую никогда не восстанавливаются полностью. Таким образом, терапии, которые могут стимулировать рост мышц и предотвращать потерю мышц, будут полезными значительной доле населения.
Увеличение роста, массы или функции мышцы являются важными для лечения вредных состояний этой мышцы, включающих в себя, например, повреждение мышцы, мышечное истощение, мышечную дегенерацию, мышечную атрофию или уменьшенные скорости мышечной репарации. Такие вредные состояния мышцы могут происходить из нормальных состояний употребления мышцы или травмы, или очень часто в результате состояний хронических заболеваний.
Кроме различных мышечных нарушений, которые могут требовать лечения, улучшение отношения мышц к жиру, так чтобы иметь большую нежирную массу, предлагалось для улучшения плотности костей. Была показана корреляция между нежирной массой и более высокой общей плотности костей тела в мышах и людях. Напротив, было показано, что люди с более высокой массой жира имеют уменьшенную плотность костей. Таким образом, улучшение отношения мышц к жиру может улучшать плотность костей и быть особенно полезным в лечении нарушений костей, таких как остеопороз.
Кроме того, совершенно здоровые люди могут желать улучшенную форму или функцию мышц. Может быть желательным улучшение способности ношения тяжестей, выносливости, скорости или общей конституции (телосложения), все из которых могут быть достигнуты улучшением массы или функции мышц. Кроме того, может быть желательным улучшение восстановления мышцы из повреждения или уменьшения времени, требующегося мышце для восстановления из продолжительного употребления, например, для уменьшения времени между тренировками для спортсменов, с улучшением посредством этого толерантности к физической нагрузке.
В животноводческом хозяйстве, таком как хозяйство для разведения животных в качестве источника пищи, способы, которые увеличивают долю и массу мышц, будут очень полезными в этой отрасли промышленности.
При условии важности этой области большое количество исследований развертывается для развития способов контроля развития или роста мышц. Многие исследования сосредоточены на обнаружении ингибиторов миостатина, так как миостатин, во взрослых, является негативным регулятором мышечного роста (т.е. он подавляет мышечный рост).
Фоллистатин является гликопротеином 35 кД, который синтезируется во многих тканях и действует в качестве связывающего белка для активина и других членов суперсемейства TGFβ, таких как миостатин и некоторые морфогенетические белки костей. Сообщается, что фоллистатин является одним из нескольких природных ингибиторов миостатина, хотя его физиологическая роль в регуляции мышц в настоящее время является неизвестной. Тем не менее, наблюдали, что введение фоллистатина в мышцу приводило к увеличению мышечной массы, что обусловлено, как считается, его связыванием с миостатином и нейтрализацией миостатина. Одной из трудностей использования фоллистатина в качестве терапевтического вещества является то, что фоллистатин связывает другие лиганды TGFβ, наряду с миостатином, например, активин. Потеря активности активина в мышах приводит к многочисленным дефектам развития и неонатальной смерти. Активин также ограничивает рост многих типов эпителиальной ткани, так что ингибирование действия активина через введение фоллистатина могло бы приводить к отклоняющемуся от нормы росту этих тканей и, в конечном счете, к раку.
В настоящее время не существует одобренный коммерческий фармацевтический способ для ингибирования активности миостатина, который не изменяет одновременно активность активина. Были разработаны антитела против миостатина, которые связывают и нейтрализуют миостатин без связывания других лигандов семейства TGFβ. Однако антитела могут иметь определенные недостатки, которые могут ограничивать их применимость в качестве терапевтических веществ для нарушений с мышечным истощением, и определенно применение антител для мышечного роста вне терапевтического места действия было бы слишком дорогим, чтобы быть применимым коммерчески.
Одной целью предпочтительного варианта осуществления данного изобретения является решение одной или нескольких из вышеуказанных проблем и в идеале обеспечение лечения мышечных нарушений для улучшения мышечной функции, силы, массы и/или толерантности к физической нагрузке.
Все ссылки, включающие в себя любые патенты или заявки на патент, цитируемые в этом описании, включены здесь в качестве ссылки. Будет ясно понятно, что, хотя здесь делаются ссылки на ряд публикаций предшествующего уровня техники, эта ссылка не является признанием того, что какие-либо из этих документов образует часть обычного общего знания в данной области.
Раскрытие изобретения
Это изобретение, в общем, обеспечивает способы увеличения мышц и уменьшения жира введением ангиогенина.
Первый аспект обеспечивает способ лечения нарушения, характеризуемого повышенным или имеющим нарушенную регуляцию миостатином в индивидууме, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Второй аспект обеспечивает способ лечения нарушений, где взаимодействие между фоллистатином и ангиогенином может быть использовано для улучшения функции в тканях введением эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Третий аспект обеспечивает способ стимуляции мышечного роста в индивидууме, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Четвертый аспект обеспечивает способ улучшения восстановления мышцы из повреждения или применения в индивидууме, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Пятый аспект обеспечивает способ улучшения мышечной силы в индивидууме, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Шестой аспект обеспечивает способ улучшения толерантности к физической нагрузке индивидуума, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Седьмой аспект обеспечивает способ увеличения доли мышц в индивидууме, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Восьмой аспект обеспечивает способ уменьшения жира в индивидууме, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Девятый аспект обеспечивает способ уменьшения отношения жира к мышцам индивидуума, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Вследствие связи между массой мышц или отношением мышц к жиру и чувствительностью к инсулину/метаболическим синдромом (Guo Т, Jou W, Chanturiya T, Portas J, Gavrilova O, McPherron AC. PLoS ONE. 2009; 4 (3):e4937. Epub 2009 Mar 19), предполагается, что способы седьмого - девятого аспектов могут лечить метаболический синдром или усиливать чувствительность к инсулину.
Десятый аспект обеспечивает способ улучшения плотности костей индивидуума улучшением их отношения мышц к жиру в соответствии со способом девятого аспекта.
Предполагается, что ангиогенин способен подавлять или обращать действие миостатина в качестве негативного регулятора роста мышц.
Предполагается также, что миостатин и/или фоллистатин и/или ангиогенин действуют на клетки, другие чем мышечные клетки; они могут действовать на нервные клетки, клетки костей (остеокласты) и эндотелиальные клетки.
Таким образом, одиннадцатый аспект обеспечивает способ лечения неврологических заболеваний или нарушений, повреждений или заболеваний спинного мозга, заболеваний или нарушений костей, заболеваний, включающих в себя гомеостаз глюкозы, заживления ран или обеспечения нейропротекции, функциональной поддержки нервной системы и лечения метаболических заболеваний, предусматривающий введение эффективного количества ангиогенина или агониста ангиогенина.
Хотя предполагается, что введение ангиогенина перорально может действовать вместе с эндогенным фоллистатином, авторами этого изобретения было показано, что ангиогенин или агонист ангиогенина, вводимый с фоллистатином (одновременно или последовательно), имеет более чем аддитивное действие в сравнении с введением одного фоллистатина или одного ангиогенина.
Будет понятно, что будет верным обратное положение открытий авторов этой заявки, заключающееся в том, что ингибиторы или антагонисты ангиогенина могут быть полезными для лечения заболеваний или состояний, в которых является желательным уменьшение роста или массы мышц или увеличение жира или отношения жира к мышцам или увеличенный миостатин.
Авторы этого изобретения изучали действие коровьего ангиогенина, экстрагированного из молока и клеток человека. Они определили, что коровий ангиогенин способен индуцировать васкулярное развитие эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) на матригеле таким же образом, что и эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF).
Затем авторы этого изобретения тестировали действие коровьего ангиогенина, экстрагированного из молока, в здоровых мышах. Тест-группа обнаруживала увеличенную мышечную массу четырехглавых мышц и уменьшенную массу абдоминальных жировых скоплений при кормлении пищевым рационом, включающим в себя коровий ангиогенин. Продемонстрированная роль ангиогенина в увеличении массы нежирных мышц и уменьшении массы жира показывает, что способы, предусматривающие введение ангиогенина или агониста ангиогенина, имеют большое разнообразие применений, в которых увеличение мышечной ткани было бы терапевтически полезным, например, в животноводстве, мышечных нарушениях, и для общего фитнеса и физического развития (телосложения). Это изобретение может быть также полезным для лечения заболеваний и нарушений, связанных с метаболизмом и жировой тканью.
Это открытие авторов данного изобретения является особенно удивительным при условии, что в известном уровне техники предлагалось введение фоллистатина для увеличения мышечной массы и уменьшения массы жира. Не желая быть связанными теорией, авторы этого изобретения предполагают, что ангиогенин и фоллистатин стимулируют образование мышечных трубочек и что миостатин существенно ингибирует образование мышечных трубочек. Предполагается, что ангиогенин существенно обращает это действие миостатина. Авторы этого изобретения предполагают, что взаимодействие между ангиогенином и фоллистатином является механизмом, который важен для стимуляции, пролиферации и развития и типов клеток, других чем только мышечные клетки. Таким образом, введение ангиогенина может быть использовано для лечения состояний, в которых улучшение опосредованных фоллистатином действий на клетки является полезным для лечения заболевания или состояния.
Это предположение, что механизм действия ангиогенина на рост мышц и потерю жира осуществляется через его взаимодействие с фоллистатином, подтверждается исследованиями in vitro авторов этого изобретения, в которых обработка миобластов мышц либо ангиогенином, либо фоллистатином не стимулирует рост мышц выше контроля, в то время как введение как ангиогенина, так и фоллистатина стимулирует рост мышц.
В одном варианте любого из первого - одиннадцатого аспектов ангиогенин или агонист ангиогенина вводят вместе с фоллистатином.
В одном варианте любого из первого - одиннадцатого аспектов ангиогенин или агонист ангиогенина вводят перорально.
В одном варианте любого из первого - одиннадцатого аспектов ангиогенин или агонист ангиогенина вводят перорально, а фоллистатин вводят парентерально.
Двенадцатый аспект обеспечивает композицию, содержащую ангиогенин или агонист ангиогенина и фоллистатин.
В одном варианте любого из первого - двенадцатого аспектов ангиогенин обеспечивают в виде обогащенного экстракта из молока или плазмы, в частности, из коровьего молока или из плазмы коровы или человека. Такой обогащенный экстракт является агонистом ангиогенина в том смысле, что он не является чистым ангиогенином, но обеспечивает активность ангиогенина.
Фоллистатин, используемый в этих способах или в этой композиции, может быть рекомбинантным или обеспеченным в виде обогащенного экстракта из молока или плазмы, в частности, из коровьего молока или плазмы коровы или человека.
Тринадцатый аспект обеспечивает композицию, пищевую добавку или нутрицевтик, содержащие ангиогенин или агонист ангиогенина, для лечения нарушения, характеризуемого повышенным миостатином, для лечения нарушений, в которых взаимодействие между фоллистатином и ангиогенином может быть использовано для улучшения функции в тканях, для стимуляции мышечного роста, для улучшения мышечной силы, для улучшения толерантности к физической нагрузке, для увеличения доли мышц, для уменьшения жира, для уменьшения отношения жира к мышцам индивидуума, для лечения неврологических заболеваний или нарушений, для лечения повреждений или заболеваний позвоночника, для лечения заболеваний или нарушений костей, для лечения заболеваний, включающих в себя гомеостаз глюкозы, для заживления ран или для обеспечения нейропротекции, функционального поддержания нервной системы, лечения метаболических заболеваний и/или увеличения плотности костей индивидуума.
Четырнадцатый аспект обеспечивает применение ангиогенина или агонистов ангиогенина в приготовлении лекарственного средства для лечения нарушения, характеризуемого повышенным миостатином, для лечения нарушений, в которых взаимодействие между фоллистатином и ангиогенином может быть использовано для улучшения функции в тканях, для стимуляции роста мышц, для улучшения восстановления мышц от повреждения или применения, для улучшения мышечной силы, для улучшения толерантности к физической нагрузке, для увеличения доли мышц, для уменьшения жира, для уменьшения отношения жира к мышцам индивидуума и/или для увеличения плотности костей индивидуума.
В одном варианте четырнадцатого аспекта это лекарственное средство содержит также фоллистатин.
В другом варианте четырнадцатого аспекта это лекарственное средство предназначено для введения индивидууму, который лечится фоллистатином.
Краткое описание фигур
Фигура 1 показывает эндотелиальные клетки (HUVEC), сфотографированные при увеличении 10X. А показывает развитие сосудов, вызываемое обработкой ангиогенином (100 нг/мл), В показывает положительный контроль VEGF (10 нг/мл) и С является отрицательным контролем.
Фигура 2 показывает диаграмму в виде столбцов, иллюстрирующую рост мышиных миобластов C2C12 in vitro при введении казеина, БСА, фоллистатина, ангиогенина или фоллистатина + ангиогенина или положительного контроля (DMEM и 10% ФТС).
Фигура 3 показывает, что ангиогенин коровы (bAngiogenin) и ангиогенин человека (hAngiogenin) могут индуцировать дифференцировку миобластов в мышечные трубочки в отсутствие сыворотки зависимым от дозы образом. Миобластные клетки C2C12 культивировали в 6-луночных чашках в DMEM (контроль), дополненной ангиогенином коровы (bAngiogenin) (bANG) или ангиогенином человека (hAngiogenin) (hANG). Изображения, полученные спустя 96 часов, показывают, что как bANG, так и hANG индуцируют образование мышечных трубочек в сравнении с контрольной культурой DMEM.
Фигура 4 показывает, что ангиогенин коровы индуцирует образование мышечных трубочек в присутствии 2% HS зависимым от дозы образом. Миобластные клетки C2C12 культивировали в среде для дифференцировки (DMEM + 2% HS; контроль), дополненной ангиогенином коровы (bAngiogenin) (bANG) или ангиогенином человека (hAngiogenin) (hANG). Изображения, полученные спустя 96 часов, показывают, что bANG индуцирует образование мышечных трубочек в сравнении с контрольной культурой. rhANG подтверждает, что ангиогенин является индуцирующим фактором.
Фигура 5 показывает, что ангиогенин коровы взаимодействует с FS с усилением образования мышечных трубочек. Миобластные клетки C2C12 культивировали в среде для дифференцировки (DMEM + 2% HS; контроль), дополненной ангиогенином коровы (bANG), фоллистатином (FS) или их комбинацией. Изображения (а) и CK-анализ (b) при 96 часах показывают, что bANG взаимодействует с FS с синергической индукцией образования мышечных трубочек в сравнении с любым реагентом по отдельности.
Фигура 6 показывает иерархическую кластеризацию дифференциально экспрессируемых генов (на основе кратного изменения ±1,6 и Р<0,05) в клетках С2С12 после 2 часов дифференцировки с образованием мышечных трубочек. Миобластные клетки С2С12 культивировали в среде для дифференцировки (DMEM + 2% HS; контроль), дополненной ангиогенином коровы, фоллистатином или их комбинацией. Гены, обнаруживающие увеличенную экспрессию, представлены красным цветом, гены с уменьшенной экспрессией синим цветом, гены без изменения экспрессии представлены желтым цветом.
Фигура 7 показывает, что блокирующий ангиогенин пептид ингибирует образование мышечных трубочек. Этот пептид (VFSVRVSILVF) специфически блокирует взаимодействие ангиогенин/актин и ингибирует индукцию ангиогенином образования мышечных трубочек.
Фигура 8 показывает, что ангиогенин коровы может регулировать действия миостатина на образование мышечных трубочек. Ангиогенин способен устранять отрицательное действие миостатина (Myo) на образование мышечных трубочек. Синергический механизм ангиогенина-фоллистатина восстанавливает образование мышечных трубочек до контрольных уровней в присутствии миостатина.
Фигура 9 показывает, что ангиогенин может регулировать действия миостатина на образование мышечных трубочек. Ангиогенин способен устранять отрицательное действие миостатина (Myo) на образование мышечных трубочек мышц. Синергический механизм ангиогенина-фоллистатина восстанавливает образование мышечных трубочек до контрольных уровней в присутствии миостатина.
Фигуры 10 и 11 показывают защиту клеток PC12 против смерти клеток после сывороточного голодания в присутствии rhAngiogenin + rhFollistatin (рекомбинантного ангиогенина человека + рекомбинантного фоллистатина человека) относительно одного rhAngiogenin (рекомбинантного ангиогенина человека) или одного rhFollistatin (рекомбинантного фоллистатина человека). Результаты представлены в виде Среднего ±SEM повторяемых культур (12 повторностей для среды, содержащей только контроль; 6 повторностей для rhAngiogenin (рекомбинантного ангиогенина человека) (1,0 мкг/мл), bAngiogenin (рекомбинантного ангиогенина коровы) (10 мкг/мл) и rhFollistatin (рекомбинантного фоллистатина человека) (0,1 мкг/мл); 3 повторности для rhNGF-контролей).
Фигура 12 показывает, что ангиогенин, предоставляемый в рационе при 2,5 мкг/г корма в условиях кормления ad libitum, увеличивает массу четырехглавых мышц в мышах, получавших такой рацион в течение 1 месяца, и позволял свободно бегать на стандартных колесах для бега грызунов.
Фигура 13 показывает, что ангиогенин, предоставляемый в рационе при 2,5 мкг/г корма в условиях кормления ad libitum, увеличивает результаты изменений площади поперечного среза мышечного волокна (SA) в мышах, получавших этот рацион в течение 1 месяца, и позволял свободно бегать на стандартных колесах для бега грызунов. Средние величины для контрольных животных представлены белыми столбцами, а средние величины для обработанныых ангиогенином животных представлены черными столбцами. Приведены стандартные отклонения.
Фигура 14 показывает, что ангиогенин, предоставляемый в рационе при 2,5 мкг/г корма в условиях кормления ad libitum, увеличивает расстояние, пробегаемое в день, в мышах, получавших этот рацион в течение 1 месяца, и позволял свободно бегать на стандартных колесах для бега грызунов.
Фигура 15 показывает, что ангиогенин, предоставляемый в рационе при 2,5 мкг/г корма в условиях кормления ad libitum, уменьшает площадь мышечного некроза в четырехглавых мышцах мышей и позволял свободно бегать на стандартных колесах для бега грызунов.
Осуществление изобретения
Ангиогенин является негликозилированным полипептидом 14 кДа, который продуцируется несколькими растущими типами клеток, включающими в себя эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц аорты, фибробласты и некоторые опухоли, такие как карциномы ободочной кишки, карциномы яичника и раковые опухоли молочной железы. Ангиогенин был выделен из ряда источников, включающих в себя нормальную плазму человека, плазму коровы, коровье молоко и сыворотки мыши, кролика и свиньи.
Ангиогенин является гомологом панкреатической рибонуклеазы и имеет специфическую рибонуклеолитическую активность. Этот белок способен индуцировать рост новых кровеносных сосудов; однако установлено, что рибонуклеолитическая активность ангиогенина играет роль в ангиогенезе, индуцируемом этим белком.
Было показано также, что, наряду с тем, что ангиогенин является сильным стимулятором ангиогенеза, он имеет ряд других активностей. Однако не существует предшествующего описания действия ангиогенина на мышцы, другого чем увеличение ангиогенеза.
Авторы этого изобретения показали, что богатые ангиогенином очищенные препараты, получаемые катионообменной хроматографией фракций молока, содержат также фоллистатин, белок со значимо отличающимися свойствами заряда относительно ангиогенина (данные не показаны). В известном уровне техники было показано, что ангиогенин и фоллистатин связываются один с другим в двухгибридной модели дрожжей. Авторы изобретения впервые показывают биологически значимое взаимодействие между ангиогенином и фоллистатином в клетках млекопитающих. Фоллистатин известен как антагонист миостатина, белка, который, как указано, регулирует рост и развитие мышц.
Это изобретение в одном аспекте относится к лечению нарушений. Термины "лечение" и "обработка", используемые здесь, относятся к уменьшению тяжести и/или частоты симптомов, элиминации симптомов и/или лежащей в основе нарушения причины, предупреждению возникновения симптомов (профилактике) и/или лежащей в их основе причины и улучшению или излечению повреждения. Так, например, данный способ "лечения" нарушения включает в себя как предупреждение этого нарушения в предрасположенном индивидууме, так и лечение этого нарушения в клинически симптоматическом индивидууме.
"Лечение" включает в себя, в данном контексте, любую обработку или предупреждение состояния в позвоночном, млекопитающем, в частности, человеке, и включает в себя: ингибирование этого состояния, т.е. остановку его развития; или облегчение или ослабление эффектов этого состояния, т.е. вызывание регресса эффектов этого состояния.
"Профилактика" или "профилактическая" или "превентивная" терапия включает в себя, в данном контексте, предотвращение возникновения состояния или ослабление последующего прогрессирования этого состояния в субъекте, который может быть предрасположен к этому состоянию, но еще не диагностирован как имеющий его.
В известном уровне техники сообщается, что миостатин играет роль в развитии мышц и ряде связанных с этим нарушений или заболеваний. У взрослых, мРНК миостатина детектируется первично в скелетных мышцах, хотя более низкие концентрации обнаруживаются также в жировой ткани и ткани сердца. Мыши с нокаутом миостатина имеют в два-три раза большую массы мышц, чем их однопометные животные дикого типа. Увеличенная масса мышц является результатом гипертрофии и гиперплазии волокон. Кроме того, мыши с нокаутом миостатина накапливали меньше жира, чем однопометные животные дикого типа, но в остальном казались нормальными и здоровыми. Недавно было показано, что миостатин является важным регулятором липогенеза. Кроме того, недавно была изучена структура и содержание костной массы в миостатин-недостаточных мышах.
Поскольку авторы этого изобретения предполагают, что миостатин действительно противодействует действию ангиогенина на мышцы, они предполагают, что ангиогенин может быть использован для лечения любого заболевания, в котором ранее предполагалось ингибирование миостатина.
Таким образом, ангиогенин может быть использован в соответствии с данным изобретением для увеличения массы мышц, плотности костей, уменьшения гипотрофии (истощения) мышц или может быть использован для лечения или предупреждения состояний, в которых присутствие миостатина вызывает нежелательные патологические действия или способствует нежелательным патологическим действиям или уменьшение уровней миостатина имеет полезное терапевтическое действие, в млекопитающих, предпочтительно в людях. Кроме того, ангиогенин может быть использован для лечения состояний, в которых регуляция миостатина не нарушена, но улучшенная опосредованная фоллистатином стимуляция клеток может достигаться добавлением экзогенного ангиогенина.
Ангиогенин может быть использован для уменьшения тяжести патологического состояния, которое характеризуется, по меньшей мере частично, аномальным количеством, развитием или аномальной метаболической активностью мышечной или жировой ткани в субъекте. Он может быть введен для предупреждения, облегчения или уменьшения тяжести вызывающего истощение нарушения, такого как кахексия, анорексия, синдром истощения СПИДа, мышечные дистрофии, нервно-мышечные заболевания, заболевания двигательных нейронов (мотонейронов), заболевания нервно-мышечных синапсов (соединений) и воспалительные миопатии.
Термин "нарушение, ассоциированное с миостатином" относится к нарушениям мышцы, кости или гомеостаза глюкозы и включает в себя нарушения, ассоциированные с отклоняющимся от нормы миостатином.
Это изобретение включает в себя также лечение мышечных нарушений и заболеваний, ассоциированных с признаками мышечной дегенерации. Не ограничивающими изобретение примерами таких нарушений являются различные нервно-мышечные заболевания, сердечная недостаточность, слабость одиночных мышц, таких как, например, сфинктер мышцы мочевого пузыря, гипо- или гипертензия, вызываемая проблемами констрикторной функции клеток гладких мышц сосудов, импотенция/эректильная дисфункция, недержание, связанная со СПИДом слабость мышц и общая или связанная со старением амиотрофия.
Приведенные здесь нарушения мышц включают в себя, в частности, состояния или нарушения гипотрофии мышц (истощения мышц), в которых истощение мышц является одним из первичных симптомов.
Мышца является тканью тела, которая первично функционирует в качестве источника силы. В теле имеются три типа мышц: a) скелетная мышца - поперечно-полосатая мышца, ответственная за генерирование силы, которая переносится к скелету для возможности движения, поддержания осанки и дыхания; b) сердечная мышца (миокард) - мышца сердца и c) гладкая мышца - мышца, которая находится в стенках артерий и пищеварительного тракта. Способ этого изобретения особенно применим к скелетной мышце, но может иметь некоторое действие на сердечную и/или гладкую мышцу.
Волокна скелетных мышц обычно классифицируются как волокна типа I (оксилительные/медленные) или типа II (гликолитические/быстрые). Они проявляют заметные различия в отношении концентраци, метаболизма и предрасположенности к усталости. Волокна типа I является богатыми митохондриями и используют в основном окислительный механизм для производства энергии, который обеспечивает стабильную и продолжительную подачу АТФ, и, следовательно, являются резистентными в отношении усталости. Волокна типа II содержат три подтипа: IIa, IIx и IIb. Волокна типа IIb имеют самые низкие уровни содержания митохондрий и окислительных ферментов и являются предрасположенными к усталости, в то время как окислительные и сократительные функции типа На и Их лежат между типом I и типом IIb. Скелетная мышца взрослых обнаруживает пластичность и может подвергаться превращению между различными типами волокон в ответ на физическую тренировку или модуляцию активности двигательных нейронов (мотонейронов).
Определение состава мышечных волокон у спортсменов выявило, что участвующие в соревнованиях выносливые спортсмены имеют относительно больше волокон типа I, чем волокон типа II в тренированной маскулатуре. Бегуны в марафоне также обнаруживают тенденцию большего наличия волокон типа I. Было сделано предположение, что волокно типа I может быть фактором, управляющим способностью к физической выносливости.
Напротив, старение и физическая неактивность являются условиями, ассоциированными с уменьшением волокон типа I, окислительной способности и чувствительности к инсулину. По-видимому, окислительная способность мышц является критическим фактором для определения выносливости и резистентности к усталости. По-видимому, существует адаптивная метаболическая реакция скелетных мышц на тренировку выносливости посредством регуляции количества окислительных мышечных волокон (волокон типа I).
Превращение волокна типа IIb скелетной мышцы в тип IIa и тип I регулируется различными путями передачи сигналов, таких как, например, Ras/митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK), кальцинейрин, кальций/кальмодулин-зависимая протеинкиназа FV и коактиватор 1 пролифератора γ пероксисом (PGC-I). Ангиогенин может модулировать эти пути и таким образом влиять на волокна скелетных мышц.
"Истощение мышц" относится к прогрессирующей потере массы мышц и/или прогрессирующему ослаблению и дегенерации мышц, в том числе скелетных мышц или произвольно сокращающихся мышц, которые контролируют движение, сердечных мышц, которые контролируют сердце, и гладких мышц. В одном варианте, состоянием или нарушением с истощением мышц является состояние или нарушение хронического мышечного истощения "Хроническое мышечное истощение" определяется здесь как хроническая (т.е. персистирующая на протяжении продолжительного периода времени) прогрессирующая потеря мышечной массы и/или хроническое прогрессирующее ослабление и дегенерация мышцы.
Потеря мышечной массы, которая происходит во время мышечного истощения (мышечной гипотрофии) может быть охарактеризована распадом или деградацией мышечного белка, катаболизмом мышечного белка. Катаболизм белков происходит вследствие атипично высокой скорости деградации белка, атипично низкой скорости синтеза белка или их комбинацией. Катаболизм или уменьшение белка, независимо от того, вызывается ли он высокой степенью деградации белка или низкой степенью синтеза белка, приводит к уменьшению мышечной массы и истощению (гипотрофии) мышц. Термин "катаболизм" имеет значение, обычно известное в данной области, конкретно, обозначает сжигающую энергию форму метаболизма.
Мышечное истощение может иметь место как результат патологии, заболевания, состояния или нарушения. В одном варианте, эти патология, болезнь, заболевание или состояние являются хроническими. В другом варианте, эти патология, болезнь, заболевание или состояние являются генетическими. В другом варианте, эти патология, болезнь, заболевание или состояние являются неврологическими. В другом варианте, эти патология, болезнь, заболевание или состояние являются инфекционными. Как описано здесь, эти патологии, заболевания, состояния или нарушения, для которых вводят соединения и композиции данного изобретения, являются патологиями, заболеваниями, состояниями или нарушениями, которые прямо или опосредованно производят истощение (т.е. потерю) мышечной массы, т.е. являются нарушением с гипотрофией мышц.
Особенно предпочтительным является лечение нервно-мышечных заболеваний, которые находятся в одном ряду с дефектами суставов или скелета. В одном варианте, истощение мышц в субъекте является результатом того, что этот субъект имеет мышечную дистрофию; мышечную атрофию или X-связанную спинально-бульбарную мышечную атрофию (SBMA).
Мышечные дистрофии являются генетическими заболеваниями, характеризуемыми прогрессирующей слабостью и дегенерацией скелетных или произвольно сокращающихся мышц, которые контролируют движение. Мышцы сердца и некоторые другие произвольно сокращающиеся мышцы также подвергаются воздействию в некоторых формах мышечной дистрофии. Основными формами мышечной дистрофии (MD) являются: мышечная дистрофия Дюшенна, миотоническая дистрофия, мышечная дистрофия Беккера, тазово-плечевая мышечная дистрофия, плече-лопаточно-лицевая дистрофия, врожденная мышечная дистрофия, глазофарингеальная дистрофия, дистальная мышечная дистрофия и мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса.
Мышечная дистрофия может поражать людей во всех возрастах. Хотя некоторые формы сначала становятся очевидными в младенчестве или в детстве, другие могут не появляться, пока не наступит пожилой возраст или позже. MD Дюшенна является наиболее обычной формой, обычно поражающей детей. Миотоническая дистрофия является наиболее обычным из этих заболеваний у взрослых.
Мышечная дистрофия (MA) характеризуется истощением и уменьшением мышцы и уменьшением массы мышц. Например, постполиомиелитное мышечное истощение является мышечным истощением, которое встречается в качестве части синдрома постполиомиелитного синдрома (PPS). Эта атрофия включает в себя слабость, мышечную усталость и боль.
Другим типом МА является X-связанная спинально-бульбарная мышечная атрофия (SBMA - также известная как болезнь Кеннеди). Это заболевание возникает из дефекта в гене рецептора андрогена на X-хромосоме, поражает только мужчин, и его появление имеет место только в состоянии зрелости.
Саркопения является истощающим заболеванием, которое поражает пожилых и хронически больных пациентов и характеризуется потерей мышечной массы и функции. Далее, увеличенная нежирная масса тела ассоциирована с пониженной болезненностью и смертностью для некоторых нарушений с мышечным истощением. Кроме того, другие обстоятельства и состояния связаны с истощающими нарушениями и могут вызывать истощающие нарушения. Например, исследования показали, что в тяжелых случаях хронической боли нижней части спины имеется паравертебральное (вдоль позвоночника) истощение мышц.
Мышечное истощение и истощение других тканей ассоциировано также с престарелым возрастом. Считается, что общая слабость в старом возрасте обусловлена мышечным истощением. По мере старения организма, увеличивающаяся доля скелетных мышц заменяется волокнистой соединительной (фиброзной) тканью. Результатом является значительное уменьшение мышечной силы, трудоспособности и выносливости.
Продолжительная госпитализация вследствие болезни или повреждения или детренированность, которая имеет место, например, при иммобилизации конечности, может также приводить к истощению мышц или истощению другой ткани. Исследования показали, что в пациентах, страдающих от повреждений, хронических болезней, ожогов, травмы или рака, которые госпитализированы в течение продолжительных периодов времени, имеется долго длящееся истощение односторонней мышцы и уменьшение массы тела.
Повреждения или поражение центральной нервной системы (ЦНС) также ассоциированы с мышечным истощением и другими истощающими нарушениями. Повреждения или поражения ЦНС могут быть, например, обусловлены заболеваниями, поранениями или химикалиями. Примерами являются повреждение или поражение центральных нервов, повреждение или поражение периферических нервов и повреждение или поражение спинного мозга. В одном варианте, поражение или повреждение ЦНС включает в себя болезни Альцгеймера (AD); инсульт, гнев (настроение); анорексию, нервную анарексию, анорексию, ассоциированную со старением, и/или чрезмерную настойчивость (настроение).
В другом варианте, мышечное истощение или истощение других тканей может быть результатом алкоголизма.
В одном варианте, мышечное истощение, нарушение или состояние, которое подвергается лечению, ассоциированы с хронической болезнью.
Этот вариант осуществления направлен на лечение, в некоторых случаях, любого истощающего нарушения, которое может находить выражение в мышечном истощении, потере массы, нарушении питания, голодании или любом истощении или утрате функционирования вследствие потери массы ткани.
В некоторых вариантах осуществления, истощающие болезни или нарушения, такие как кахексия; нарушение питания, туберкулез, проказа, диабет, болезнь почек, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), рак, почечная недостаточность последней стадии, саркопения, эмфизема, остеомаляция или кардиомиопатия, могут лечиться способами этого изобретения.
В некоторых вариантах осуществления, истощение обусловлено инфицированием энтеровирусом, вирусом Эпштайна-Барр, опоясывающим герпесом, ВИЧ, трипаносомами, вирусом гриппа, вирусом Коксаки, риккетсиями, трихинеллами, шистосомами или микобактериями.
Кахексия является слабостью и потерей массы, вызываемыми заболеванием или побочным эффектом заболевания. Сердечная кахексия, т.е. истощение мышечного белка как сердечной, так и скелетной мышцы, является характеристикой застойной сердечной недостаточности. Раковая кахексия является синдромом, который встречается в пациентах с солидными опухолями и гематологическими злокачественностями и проявляется потерей массы с массивной деплецией как жировой ткани, так и массы нежирных мышц.
Кахексия наблюдается также в синдроме приобретенного иммунодефицита (СПИД), ассоциированной с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) миопатии, и/или слабость/истощение мышц является относительно обычным клиническим проявлением СПИДа. Индивидуумы с ВИЧ-ассоциированной миопатией или мышечной слабостью или истощением мышц обычно испытывают значительную потерю массы, генерализованную или проксимальную слабость, болезненность мышц и мышечную атрофию.
Не получающие лечения нарушения с мышечным истощением могут иметь серьезные последствия для здоровья. Изменения, которые встречаются во время мышечного истощения, могут приводить к ослабленному физическому состоянию, приводящему к слабой дееспособности организма и вредным для здоровья эффектам.
Таким образом, мышечная атрофия может серьезным образом ограничивать восстановление здоровья пациентов после иммобилизаций. Мышечное истощение вследствие хронических заболеваний может приводить к преждевременной потере подвижности и увеличению риска связанной с заболеванием болезненности. Мышечное истощение вследствие выхода из употребления является особенно серьезной проблемой в случае пожилых людей, которые могут уже страдать от связанных с возрастом дефицитов мышечной функции и массы, приводящих к долговременной недееспособности и преждевременной смерти, а также к увеличенной степени переломов костей. Несмотря на клиническую важность этого состояния, мало способов лечения существует для предотвращения или обращения этого состояния. Авторы этого изобретения предполагают, что ангиогенин может быть использован для предотвращения и лечения истощения или атрофии мышц, ассоциированных с любым из вышеописанных состояний.
Здесь показано, что ангиогенин, особенно в комбинации с фоллистатином или при пероральном введении, является нейропротективным и, следовательно, находит применение в лечении неврологических нарушений или заболеваний, поражающих нервную систему, в частности, заболеваний двигательных нейронов (мотонейронов). Примеры заболеваний двигательных нейронов, который могут лечиться ангиогенином, включают в себя амиотрофический боковой склероз (ALS) (также известный как болезнь Верднига-Гоффмана), юношескую прогрессирующую спинальную мышечную атрофию (SMA, SMA1 или WH) (также известную как атрофия типа, Верднига-Гоффмана), промежуточную спинальную мышечную атрофию (SMA или SMA2) (также известную как SMA Типа 2), юношескую спинально-мышечную атрофию (SMA, SMA3 или KW) (также известную как SMA Типа 3, Кугельберга-Веландера), спинально-бульбарную мышечную атрофию (SBMA) (также известную как болезнь Кеннеди и X-связанная SBMA) и спинально-мышечную атрофию взрослых (SMA).
Примеры воспалительных миопатий, которые могут лечиться ангиогенином, включают в себя дерматомиозит (PM/DM), полимиозит (PM/DM) и миозит с тельцами включения (IBM).
Примеры заболеваний нервно-мышечного синапса, которые могут лечиться ангиогенином, включают в себя: тяжелую псевдопаралитическую миастению (MG), синдром Ламберта-Итона (LES) и врожденный миастенический синдром (CMS).
Примеры миопатий вследствие эндокринных отклонений от нормы, которые могут лечиться ангиогенином, включают в себя гипертиреоидную миопатию (HYPTM) и гипотиреоидную миопатию (HYPOTM).
Примеры заболеваний периферического нерва, которые могут лечиться ангиогенином, включают в себя болезнь Шарко-Мари-Тута (CMT), болезнь Дежерина-Сотта (DS) и атаксию Фридрейха (FA).
Другие примеры миопатий, которые могут лечиться ангиогенином, включают в себя врожденную миотонию (MC), врожденную парамиотонию (PC), врожденную миопатию с поражением сердцевины мышечных волокон (CCD), немалиновую миопатию (врожденную непрогрессирующую) (NM), миотубулярную миопатию (МТМ или ММ) и периодический паралич (РР).
Ангиогенин может быть также использован для стимуляции заживления ран и для лечения ран, причем оба из этих применений предлагались ранее для ингибиторов миостатина.
Примеры метаболических заболеваний мышц, которые могут лечиться ангиогенином, включают в себя дефицит фосфорилазы (MPD или PYGM), дефицит кислой мальтазы (AMD), дефицит фосфофруктокиназы (PFKM), дефицит деветвящего фермента (DBD), митохондриальную миопатию (MITO), дефицит карнитина (CD), дефицит карнитинпальмитилтрансферазы (CPT), дефицит фосфоглицераткиназы (PGK), дефицит фосфоглицератмутазы (PGAM или PGAMM), дефицит лактатдегидрогеназы (LDHA) и дефицит миоаденилатдеаминазы (MAD). Ранее предлагалось лечение этих заболеваний ингибиторами миостатина.
В сопутствующих экспериментах авторы этого изобретения показывают, что ангиогенин уменьшает жир. Это было показано ранее для ингибиторов миостатина, и это показывает, что ангиогенин может быть использован для лечения заболевания, связанного с нарушенным метаболизмом липидов, такого как гиперлипидемия, гиперхолестеринемия, гипертриглицеридемия и смешанная дислипидемия.
Дислипидемия характеризуется ненормальностями в уровне циркулирующих липидов вследствие изменений в метаболизме липидов. Эти ненормальности могут включать в себя любую или несколько из различных циркулирующих фракций липидов (холестерин, триглицерид, липопротеин). Дислипидемия включает в себя гиперхолестерниемию, которая является повышением сывороточного холестерина выше нормального предела (нормальный безопасный предел находится приблизительно в диапазоне 125-200 мг/дл в крови человека), гипертриглицеридемию, которая является увеличением сывороточных триглицеридов выше нормального уровня (нормальный безопасный предел находится приблизительно в диапазоне 30-140 мг/дл в крови человека), и смешанные липидные нарушения.
Дислипидемия включает в себя гипертриглицеридемию и смешанную дислипидемию (гиперлипидемию). Гипертриглицеридемия включает в себя повышение уровней липопротеина очень низкой плотности (VLDL), тогда как смешанная дислипидемия (гиперлипидемия) включает в себя комбинацию как гипертриглицеридемии, так и гиперхолестеринемии и также часто ассоциирована с падением уровней липопротеина высокой плотности (HDL). Таким образом, дислипидемия является также нарушением метаболизма липопротеинов, которое приводит к сверхпродуцированию или недостаточности липопротеинов. Дислипидемия обычно характеризуется любым одним или несколькими из следующих признаков: повышенными триглицеридами плазмы, повышенным общим холестерином плазмы, низким холестерином липопротеинов высокой плотности (HDL-c), повышенными уровнями холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-c). Например, дислипидемия может быть одним или несколькими из следующих состояний: низкий HDL-c (<35 или 40 мг/дл), высокие триглицериды (>200 мг/дл), высокий LDL-c (>150 мг/дл), повышенный холестерин (>200 мг/дл).
Дислипидемия широко рассматривается как один из основных факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний (CVD) и ангиогенеза. Сердечно-сосудистые нарушения находятся среди главных причин недееспособности и смерти по всему миру. Высокий сывороточный холестерин, в частности, холестерин, ассоциированный с LDL и VLDL, является одним из основных факторов риска для атерогенеза. Высокие триглицериды, увеличенный малый LDL и уменьшенные уровни HDL являются, по-видимому, независимо атерогенными. Имеется сильная обратная ассоциация между HDL плазмы и риском CVD. Существует положительная ассоциация между холестерином LDL и риском CVD. Таким образом, риск заболевания коронарной артерии увеличивается при увеличении уровней LDL и VLDL, тогда как высокие уровни холестерина, несомого в HDL, являются протективными против заболевания коронарной артерии. По-видимому, триглицериды играют важную роль в CVD. Высокий уровень триглицеридов, измеренный натощак, является сильным фактором риска для ишемической болезни сердца у пожилых людей независимо от других основных факторов риска, включающих в себя HDL-холестерин. Люди с комбинированной гиперлипидемией, которая характеризуется повышенными сывороточными уровнями как холестерина, так и триглицеридов, подвергаются более высокому риску сердечного заболевания, чем люди с высоким уровнем только LDL-холестерина. Таким образом, желаемой задачей является снижение обоих уровней.
Заболевания, связанные с нарушенным метаболизмом глюкозы и нарушенным действием инсулина, включают в себя сахарный диабет, особенно сахарный диабет типа 1 и 2, более существенно (неаутоиммунный) инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM; так называемый диабет типа 2). Другим таким заболеванием является синдром Х или метаболический синдром.
Сахарный диабет определяет комплекс метаболических заболеваний, происходящих из множественных этиологических факторов, и характеризуется нарушенным метаболизмом глюкозы, обычно ассоциированным с нарушенным метаболизмом белка и жира. Это приводит к повышенной натощак и возникающей после приема пищи глюкозы, что приводит к осложнениям, если не применяется лечение. Известны четыре различные формы сахарного диабета, (1) сахарный диабет типа 1, (2) сахарный диабет типа 2, (3) так называемый гестационный сахарный диабет, который начинается или распознается впервые во время беременности, и (4) некоторые другие формы, которые в основном вызываются генетическими дефектами.
Термин "сахарный диабет" включает в себя, но не ограничивается ими, метаболические отклонения от нормы, такие как увеличенный уровень глюкозы в крови, ассоциированные с ожирением патологии, нарушенную толерантность к глюкозе, увеличенную инсулинорезистентность, гиперлипидемию, дислипидемию, увеличение холестерина (гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию), гиперинсулинемию, гипертензию и микроальбуминурию. Нарушенная толерантность к глюкозе и нарушенная глюкоза при голодании (натощак) являются двумя симптомами, называемыми пресахарным диабетом. Эта стадия ассоциирована с так называемой инсулинорезистентностью, одной из групп метаболических заболеваний, называемых "синдромом X" или "метаболическим синдромом", в частности, ассоциирована с высоким отношением жира к белку. Поскольку сахарный диабет типа 2 часто ассоциирован с другими симптомами из синдрома X, такими как гипертриглицеридемия или дислипидемия, и применение ангиогенина должно сильно улучшать отношение жира к мышцам субъекта, способы данного изобретения также применимы для лечения или предотвращения синдрома X.
Двумя основными формами сахарного диабета являются сахарный диабет типа 1 и сахарный диабет типа 2, из которых сахарный диабет типа 2 является преобладающей формой. Сахарный диабет типа 1 и сахарный диабет типа 2 ассоциированы с гипергликемией, гиперхолестеринемией и гиперлипидемией. Нечувствительность к инсулину и абсолютная недостаточность инсулина в сахарном диабете типа 1 и 2 приводит к уменьшению утилизации глюкозы печенью, мышцами и жировой тканью и к увеличенным уровням глюкозы. Нерегулируемая гипергликемия ассоциирована с дисфункцией и декомпенсацией различных органов, таких как глаза, сердце, кровеносные сосуды, почки и нервы, приводя, следовательно, к увеличенной и преждевременной смертности вследствие увеличенного риска в отношении микроваскулярных и макроваскулярных заболеваний, включающих в себя нефропатию, невропатию, ретинопатию, образование язв ног и стоп, жировую инфильтрацию (жировой метаморфоз) печени, гипертензию, сердечно-сосудистые заболевания и цереброваскулярные заболевания (инсульт), так называемые диабетические осложнения.
Недавние результаты показали, что строгий гликемический контроль является главным фактором в предотвращении этих осложнений в диабете как типа 1, так и типа 2. Таким образом, оптимальный гликемический контроль с использованием лекарственных средств или терапевтических программ является важным подходом к лечению сахарного диабета.
Сахарный диабет типа 1 является формой сахарного диабета, которая обычно начинается с детства или пубертатного периода и характеризуется аутоиммунным разрушением инсулинпродуцирующих β-клеток, приводящим к полному отсутствию секреции инсулина.
Сахарный диабет типа 2 является формой сахарного диабета, которая встречается преимущественно во взрослых, в которой адекватное продуцирование инсулина является доступным в ранней стадии этого заболевания, но все еще существует недостаточность чувствительности к инсулину, особенно в опосредованных инсулином утилизации и метаболизме глюкозы в периферических тканях. Эти изменения в различных тканях, ассоцированные с сахарным диабетом типа 2, существуют даже перед детектированием клинических симптомов.
Обсуждается также лечение инсулинорезистентности, индуцируемой травмой (например, ожогами или нарушением баланса азота) и нарушениями жировой ткани (например, ожирением).
Другие применения для ангиогенина в соответствии с этим изобретением включают в себя лечение остеопороза, особенно в пожилых людях и/или постменопаузальных женщинах; индуцированного глюкокортикоидами остеопороза; остеопении; остеоартрита; связанных с остеопорозом переломов и травматического или хронического повреждения мышечной ткани. Следующие применения ангиогенина включают в себя лечение низкой массы костей вследствие продолжительной глюкокортикоидной терапии, преждевременной гонадной недостаточности, андрогенной супрессии, недостаточности витамина D, вторичного гиперпаратироидизма, дефицита питательных веществ и нервной анорексии.
Это изобретение в других аспектах рассматривает также лечение здоровых индивидуумов для вызывания увеличения мышечной массы, силы, функции или общего физического развития. Ангиогенин предлагается также для стимуляции восстановления мышцы из поранения или травмы или повреждения или перегрузки при тренировке и, следовательно, увеличения толерантности к физической нагрузке.
Термин "увеличение мышечной массы" относится к присутствию большей величины мышечной массы после обработки ангиогенином относительно величины мышечной массы, присутствующей перед этой обработкой.
Термин "увеличение мышечной силы" относится к присутствию мышцы со способностью генерировать большую силу после обработки ангиогенином относительно силы, присутствующей перед этой обработкой.
Термин "увеличение мышечной функции" относится к присутствию мышцы с большим разнообразием функции после обработки ангиогенином относительно функции, присутствующей перед обработкой.
Термин "увеличение толерантности к физическим упражнениям" относится к способности выносить физические упражнения с меньшим отдыхом между физическими упражнениями после обработки ангиогенином относительно отдыха, требующегося перед этой обработкой.
Мышца является тканью тела, которая первично функционирует в качестве источника силы. В теле имеются три типа мышц: a) скелетная мышца - поперечно-полосатая мышца, ответственная за генерирование силы, которая переносится к скелету для возможности движения, поддержания осанки и дыхания; b) сердечная мышца (миокард) - мышца сердца и c) гладкая мышца - мышца, которая находится в стенках артерий и пищеварительного тракта. Способы этого изобретения особенно применимы к скелетной мышце, но могут иметь некоторое действие на сердечную и/или гладкую мышцу. Ссылка на скелетную мышцу в данном контексте включает в себя также взаимодействия между костью, мышцей и сухожилиями и включает в себя мышечные волокна и суставы.
Хотя ранее предполагалось, что ангиогенин оказывает действие на сердечную мышцу вследствие его ангиогенной активности и способности обеспечивать увеличенный приток крови в мышцу, это действие ограничивалось окислительными мышцами (типа I и типа IIa). Опосредуемые фоллистатином действия ангиогенина на мышцу, наблюдаемые в данном изобретении, отличаются от действий, связанных с ангиогенезом, как показано воздействием на все мышечные волокна.
Термин "уменьшение жира" относится к присутствию уменьшенного количества жира после обработки ангиогенином относительно количества жира, присутствующего перед этой обработкой. Данное изобретение особенно применимо к висцеральному жиру, жиру, локализованному внутри брюшной полости и вокруг внутренних органов. Ангиогенин может также влиять на подкожный жир и/или внутримышечный жир.
Предлагаемые применения ангиогенина на здоровых индивидуумах будут применимы к атлетам, как к спортсменам, так и любителям, занимающимся бодибилдингом, индивидуумам, желающим потери массы увеличенной конституции, и рабочим физического труда.
Поскольку ангиогенин является высоко консервативным в последовательности и функции среди видов, способы данного изобретения применимы к видам млекопитающих (не человеку) и видам птиц [например, домашним животным (например, собачьим и кошачьим), спортивным животным (например, лошадиным), животным-источникам пищи (например, коровьим, свиным и овечьим), видам птиц (например, курице, индейке, другим, охотничье-промысловым птицам или домашней птице)], у которых присутствие миостатина вызывает нежелательные патологические эффекты или способствует нежелательным патологическим эффектам или уменьшение уровней миостатина имеет терапевтическую пользу.
Ангиогенин может быть обеспечен в фармацевтической, ветеринарной или нутрицевтической композиции или в виде пищевого продукта.
Фармацевтическая композиция является композицией, которая подходит для введения людям. Ветеринарная композиция является композицией, которая подходит для введения животным. Обычно такие композиции будут содержать очищенный ангиогенин или агонист ангиогенина или в очень крайнем случае все компоненты этой композиции будут верифицируемыми.
Композиции, используемые в способах этого изобретения, могут содержать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей и необязательно другие терапевтические агенты. Каждый носитель, разбавитель, адъювант и/или эксципиент должен быть фармацевтически "приемлемым".
Под "фармацевтически приемлемым носителем" имеется в виду материал, который не является биологически или иным образом нежелательным, т.е. этот материал может вводиться индивидууму вместе с селективным активным агентом без вызывания каких-либо нежелательных биологических эффектов или взаимодействия вредным образом с любым из других компонентов фармацевтической композиции, в который он содержится. Подобным образом, "фармацевтически приемлемые" соль или эфир обеспеченного здесь нового соединения являются солью или эфиром, которые не являются биологически или иным образом нежелательными.
В данном контексте "фармацевтический носитель" является фармацевтически приемлемым растворителем, суспендирующим агентом или носителем для доставки этого агента субъекту. Этот носитель может быть жидкостью или твердым веществом и выбирается в соответствии с планируемым способом введения. Каждый носитель должен быть фармацевтически "приемлемым" в том смысле, что он не является биологически или иным образом нежелательным, т.е. этот носитель может вводиться субъекту вместе с этим агентом без вызывания какой-либо или существенно вредной реакции.
Эта композиция может вводиться перорально, местно или парентерально в готовых формах, содержащих общепринятые нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители.
Термин парентеральный в данном контексте включает в себя внутривенную, внутриартериальную, внутрибрюшинную, внутримышечную, внутриполостную, чрескожную и подкожную инъекцию, аэрозоль для введения в легкие или в полость носа или введение инфузией, например, при помощи осмотического насоса.
Ангиогенин может вводиться перорально в виде таблеток, водных или масляных суспензий, смазывающих веществ, пастилок, гранул, эмульсий, капсул, сиропов или эликсиров. Композиция для перорального введения может содержать один или несколько агентов, выбранных из группы, состоящей из подслащивающих агентов, придающих вкус и запах агентов, красящих агентов и консервирующих агентов, для получения фармацевтически изящных и годных в пищу препаратов. Подходящие подслащивающие агенты включают в себя сахарозу, лактозу, глюкозу, аспартам или сахарин. Подходящие дезинтегрирующие агенты включают в себя кукурузный крахмал, метилцеллюлозу, поливинилпирролидон, ксантановую камедь, бентонит, альгиновую кислоту или агар. Подходящие ароматизирующие агенты включают в себя масло мяты перечной, масло грушанки, вишневый, апельсиновый или малиновый ароматизатор. Подходящие консерванты включают в себя бензоат натрия, витамин Е, альфа-токоферол, аскорбиновую кислоту, метилпарабен, пропилпарабен или бисульфит натрия. Подходящие смачивающие вещества включают в себя стеарат магния, стеариновую кислоту, олеат натрия, хлорид натрия или тальк. Подходящие пролонгирующие время действия агенты включают в себя глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. Таблетки могут содержать этот агент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые пригодны для приготовления таблеток.
Этими эксципиентами могут быть, например, (1) инертные разбавители, такие как карбонат кальция, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; (2) гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, такие как кукурузный крахмал или альгиновая кислота; (3) связывающие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; и (4) смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Эти таблетки могут не иметь покрытия или могут быть покрыты известными способами для замедления дезинтеграции и абсорбции в желудочно-кишечном тракте и обеспечения посредством этого пролонгированного действия на протяжении более длительного периода времени. Например, может быть использован такой пролонгирующий время действия материал, как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.
Препараты для парентерального введения включают в себя стерильные водные и неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают в себя воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включающие в себя солевой раствор и забуференные среды. Парентеральные носители включают в себя раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактированные внутривенные носители Рингера включают в себя жидкость и нутриент и пополняющие питательные вещества агенты (такие как агенты на основе декстрозы Рингера) и т.п. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, антимикробные агенты, антиоксиданты, хелатообразующие агенты, факторы роста и инертные газы и т.п.
Эти композиции могут также содержать другие активные соединения, обеспечивающие дополнительные, аддитивные или усиленные терапевтические функции. Эти фармацевтические композиции могут быть также заключены в контейнер, упаковку или раздаточное устройство с инструкциями для введения.
Другие терапевтически применимые агенты, такие как факторы роста (например, BMP, TGF-P, FGF, IGF), цитокины (например, интерлейкины и CDF), антибиотики и любой другой агент, полезный для состояния, подлежащего лечению, могут быть необязательно включены или введены одновременно или последовательно с ангиогенином или агонистом ангиогенина.
Ангиогенин или его агонисты могут быть также предоставлены для применения в форме ветеринарных композиций, которые могут быть приготовлены, например, при помощи способов, общепринятых в данной области. Примеры таких ветеринарных композиций включают в себя композиции, адаптированные для:
(a) перорального введения, наружного нанесения, например, орошений (намачиваний) (например, водными или неводными растворами или суспензиями); таблеток или пилюль; порошков, гранул или шариков для смешивания с кормами; паст для нанесения на язык, в частности, адаптированных для защиты при прохождении через рубец при введении жвачным животным;
(b) парентерального введения, например, подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекцией, например, в виде стерильного раствора или стерильной суспензии; или (в случае необходимости) инъекцией в молочную железу, когда суспензию или раствор вводят в вымя через сосок;
(c) локальных нанесений, например, в виде крема, мази или спрея, наносимых на кожу; или
(d) внутривагинально, например, в виде пессария, крема или пены.
Особенно предпочтительно готовить эти композиции в виде унифицированных (стандартных) лекарственных форм для легкости введения и однородности дозы. Унифицированной (стандартной) лекарственной формой называют в данном контексте физически дискретные унифицированные (стандартные) дозы для введения получающему лечение субъекту; каждая стандартная доза содержит заранее определенное количество соединения, которое производит желаемое терапевтическое действие, в ассоциации с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для унифицированных (стандартных) лекарственных форм диктуется уникальными характеристиками активного соединения и конкретным терапевтическим эффектом, который должен быть достигнут, и непосредственно зависит от них, и ограничениями, присущими области компаундирования такого активного соединения для лечения индивидуумов.
Композиции, содержащие ангиогенин или его агонист, должны вводиться в терапевтически эффективных количествах. В данном контексте, "эффективным количеством" ангиогенина является доза, которая является достаточной для уменьшения активности миостатина для достижения желаемого биологического результата. Желаемым биологическим результатом может быть любая терапевтическая польза, в том числе увеличение мышечной массы, увеличение мышечной силы, улучшенный метаболизм, уменьшенное ожирение или улучшенный гомеостаз глюкозы. Такие улучшения могут быть измерены различными способами, в том числе способами, которые измеряют массу нежирной (мышечной) части и жира тела (например, duel ray scanning analysis), мышечную силу, липиды сыворотки, лептин сыворотки, глюкозу сыворотки, гликозилированный гемоглобин, толерантность к глюкозе и улучшение во вторичных осложнениях диабета.
Обычно, терапевтически эффективное количество может варьироваться в зависимости от возраста, состояния и пола субъекта, а также от тяжести медицинского состояния в этом субъекте. Эта доза может быть определена лечащим врачом и скорректирована, по мере необходимости, для соответствия наблюдаемым эффектам этого лечения. Подходящие дозы для введения ангиогенина или его агонистов могут находиться в диапазоне от 5 мг до 100 мг, от 15 мг до 85 мг, от 30 мг до 70 мг или от 4 мг до 60 мг. Эти композиции могут вводиться в одной дозе или с интервалами, например, один раз в день, один раз в неделю и один раз в месяц.
Схемы введения доз могут корректироваться в зависимости от полупериода существования ангиогенина или его агонистов в организме или от тяжести состояния пациента.
Обычно, эти композиции вводят в виде болюсной дозы для максимизации циркулирующих уровней ангиогенина в течение наибольшей продолжительности времени после этой дозы. После этой болюсной дозы может быть также использована непрерывная инфузия.
Обсуждается также, что эти способы используют нутрицевтическую композицию для обеспечения ангиогенина. Обеспечена нутрицевтическая композиция для применения в этих способах.
Термин "нутрицевтический" относится в данном контексте к годному в пищу продукту, выделенному или очищенному из пищевого продукта, в этом случае молочного продукта, который, как демонстрируется, имеет физиологическую пользу или обеспечивает защиту от острого или хронического заболевания или повреждения или ослабление острого или хронического заболевания или повреждения, при пероральном введении. Таким образом, этот нутрицевтический агент может предоставляться в форме диетического препарата или добавки, либо отдельно, либо в смеси с годными в пищу пищевыми продуктами или напитками.
Эта нутрицевтическая композиция может быть в форме растворимого порошка, жидкости или готовой для питья формой. Альтернативно, эта нутрицевтическая композиция может находиться в форме твердого вещества в виде продукта питания; например, в форме готовой для еды плитки (брикета) или зернового завтрака. Могут также присутствовать различные улучшающие вкус и запах агенты, волокна, подслащиватели и другие добавки.
Нутрицевтик имеет предпочтительно приемлемые сенсорные свойства (такие как приемлемые запах, привкус и вкусовые качества) и может дополнительно содержать витамины и/или минеральные вещества, выбранные по меньшей мере из витаминов A, B1, B2, B3, B5, B6, B11, B12, биотина. C, D, E, H и K и кальция, магния, калия, цинка и железа.
Эта нутрицевтическая композиция может быть получена общепринятым образом; например, эта композиция может быть получена смешиванием вместе белка и других добавок. При использовании эмульгатора, он может быть включен в эту смесь. Дополнительные витамины и минеральные вещества могут быть добавлены в этот момент, но обычно их добавляют позднее во избежание термической деградации.
Если желательным является получение порошкообразной нутрицевтической композиции, этот белок может быть смешан с дополнительными компонентами в порошкообразной форме. Этот порошок должен иметь содержание влаги, меньшее приблизительно 5 масс.%. Может быть также примешана вода, предпочтительно вода, которая была подвергнута обратному осмосу, для образования жидкой смеси.
Если эта нутрицевтическая композиция должна быть обеспечена в готовой для употребления жидкой форме, она может быть нагрета для уменьшения бактериальной нагрузки. Если желательно получить жидкую нутрицевтическую композицию, эту жидкую смесь предпочтительно асептически вводят в подходящие контейнеры. Асептическое наполнение этих контейнеров может проводиться с использованием способов, обычно доступных в данной области. Подходящий аппарат для асептического наполнения такого характера является коммерчески доступным.
Предпочтительно, эта нутрицевтичсекая композиция содержит также один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или эксципиентов. Нутрицевтические композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный солевой раствор, забуференный фосфатом солевой раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны; маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатообразующие агенты, такие как ЭДТА; адъюванты и консерванты.
Этот нутрицевтик может быть детской смесью, в частности, смесью из гуманизированного молока для предоставления младенцам. Такая смесь для младенцев может найти применение в лечении декомпенсации для быстро растущих или недоношенных младенцев или младенцев с низкой массой тела. Она может также вводиться младенцам или детям для улучшения когнитивной функции.
Ангиогенин, используемый в способах этого изобретения, может происходить из любого источника. Он может быть природным, синтетическим или рекомбинантным по происхождению. Рекомбинантный ангиогенин может быть основан на последовательности ангиогенина из любых видов, в том числе человека, коровы, овцы, мыши и т.д. Рекомбинантный ангиогенин человека доступен из R&D Systems.
Известно, что ангиогенин присутствует в плазме нормального человека, в плазме коровы, молоке коровы, плазме коровы и мыши, сыворотках кролика и свиньи. Последовательности ДНК и белка по меньшей мере ангиогенина человека коммерчески доступны из Abnova Corporation (Taiwan) для применений низкого масштаба.
В одном варианте осуществления, ангиогенин готовят из плазмы или молока скота в качестве легкодоступных источников коммерческого масштаба.
Молоко может быть получено из любого имеющего лактацию животного, например, из жвачных, таких как коровы, овцы, буйволы, козы и олени, нежвачных животных, включающих в себя приматов, например, человека, и моногастрических животных, таких как свиньи. В предпочтительном варианте осуществления, ангиогенин экстрагируют из молока коровы. Животное, из которого получают ангиогенин, может быть трансгенным животным, предназначенным для сверхэкспрессии ангиогенина человека или коровы в его молоке.
Авторы данной заявки показали, что в коровьем молоке ангиогенин присутствует в наиболее высоком или наиболее концентрированном количестве (до 12 мг/л) в пределах первых 1-14 дней лактации. После этого, эта концентрация падает до уровня фона приблизительно 1-2 мг/литр. Таким образом, предпочтительно использовать в качестве источника ангиогенина в способах первого - одиннадцатого аспектов коровье молоко, которое получали в пределах первых 14 дней лактации. При условии остаточных уровнен ангиогенина в коровьем молоке из более поздней лактации, его все еще можно использовать в качестве источника для способов этого изобретения.
Ангиогенин, используемый в способах этого изобретения, может быть выделенным или очищенным. Очищенный или выделенный ангиогенин является по существу свободным по меньшей мере от одного агента или соединения, с которыми он ассоциирован в природе. Например, выделенный белок по существу свободен по меньшей мере от некоторой части клеточного материала или примесного белка из клеточного или тканевого источника, из которых он получен. Фраза "по существу свободные от клеточного материала" относится к препаратам, в которых ангиогенин является по меньшей мере на 50-59% (м/м) чистым, по меньшей мере на 60-69% (м/м) чистым, по меньшей мере на 70-79% (м/м) чистым, по меньшей мере на 80-89% (м/м) чистым, по меньшей мере на 90-95% чистым или по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, 99% или 100% (м/м) чистым.
Рекомбинантные препараты ангиогенина в бактериях могут быть использованы в качестве источника ангиогенина и могут быть обеспечены в форме белковых агрегатов.
Поскольку коровье молоко является природным продуктом, который находился в сети пищевых продуктов в течение сотен лет, ангиогенин, используемый в качестве нутрицевтика, не должен быть полностью чистым. Однако, для уменьшения количества вводимой композиции предпочтительно, чтобы ангиогенин значительно концентрировался в отношении его концентрации в молоке. Предпочтительно, ангиогенин вводят при концентрации, по меньшей мере в 10 раз превышающей его концентрацию в молоке, и более предпочтительно в 20, 30, 40 или 50 раз превышающей его концентрацию в молоке.
При обеспечении в виде пищевого продукта, ангиогенин может быть в форме пищевой добавки, питательного препарата, питательной добавки для спортсменов или детской смеси.
Квалифицированным в данной области лицам будет понятно, что в природе существуют варианты коровьего ангиогенина, и они могут быть получены. Применение таких вариантов рассматривается в данном изобретении.
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что ангиогенин может содержать любое количество консервативных изменений его аминокислотной последовательности без изменения его биологических свойств. Такие консервативные модификации аминокислот основаны на относительном сходстве заместителей боковых цепей аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и т.п. Примерные консервативные замены, которые учитывают предыдущие свойства, хорошо известны квалифицированным в данной области специалистам и включают в себя аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серин и треонин; глутамин и аспарагин и валин, лейцин и изолейцин.
Данное изобретение включает в себя также применение вариантов, гомологов и фрагментов ангиогенина. Например, нуклеотидная или аминокислотная последовательность для ангиогенина может содержать последовательность, по меньшей мере на 70%-79% идентичную нуклеотидной или аминокислотной последовательности нативного белка, или по меньшей мере на 80%-89% идентичную или по меньшей мере на 90%-95% идентичную, или по меньшей мере на 96%-100% идентичную.
Квалифицированные в данной области специалисты могли бы высоко оценить многочисленные пакеты программ, позволяющих им создавать гомологи нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, например, программу "BLAST" или другие подходящие пакеты программ.
Квалифицированному в данной области специалисту понятно, что определенные аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами в структуре белка без вредного действия на активность ангиогенина. Таким образом, авторы этого изобретения полагают, что могут быть произведены различные замены в аминокислотных последовательностях ангиогенина без заметной потери их биологической применимости или активности. Такие изменения могут включать в себя делеции, инсерции, укорочения, замены, слияния, перетасовку последовательностей-мотивов и т.п.
Кроме того, ангиогенин может быть модифицирован, например, гликозилированием, конъюгированием с полимером для увеличения его полужизни в кровотоке, пэгилированием или другой химической модификацией. Такие модифицированные белки также предполагаются для применения в способе данного изобретения.
Квалифицированным в данной области лицам будет понятно, что используемый ангиогенин может быть модифицирован для улучшения стабильности при хранении, биоактивности, времени полужизни в кровотоке или для любой другой цели с использованием способов, доступных в данной области. Например, может быть желательным введение модификации для улучшения стабильности при хранении. Однако, поскольку ангиогенин является особенно устойчивым к деградации, такая модификация может быть необязательной.
Это изобретение относится к агонистам ангиогенина. Агонистом является соединение, которое способно прямо или опосредованно действовать через рецептор, активируемый ангиогенином. Предпочтительно агонисты ангиогенина действуют через рецептор ангиогенина и предпочтительно связывают этот рецептор. Квалифицированным в данной области лицам будет понятно, как создать агонисты ангиогенина. Подходящие агонисты включают в себя антитела-агонисты ангиогенина и миметические соединения.
Ангиогенин, его агонисты и варианты могут быть использованы в приготовлении лекарственного средства для применения в способах этого изобретения.
В предпочтительном варианте этих способов и применений данного изобретения ангиогенин вводят перорально, в частности, в форме обогащенного ангиогенином экстракта из молока или плазмы или в форме рекомбинантного ангиогенина.
В частности, перорально вводимый ангиогенин получают из коровьего молока или его фракции, например, с использованием способа (процесса), описанного в примере 1. Было обнаружено, что такая фракция обеспечивает ангиогенин, способный действовать системно, без существенной деградации в кишечнике. Такая фракция может быть обеспечена перорально без использования носителей или других механизмов для усиления биодоступности ангиогенина.
Предполагается, что ангиогенин, вводимый в соответствии со способами первого - одиннадцатого аспектов, взаимодействует с эндогенным фоллистатином (при использовании рекомбинантного ангиогенина), или обогащенный ангиогенином эстракт может также содержать фоллистатин. Здесь показано, что введение ангиогенина плюс фоллистатина (либо одновременно, либо последовательно в любом порядке) имеет более чем аддитивное действие и, следовательно, обеспечена композиция, содержащая ангиогенин и фоллистатин, а также каждый из способов лечения предполагает введение фоллистатина с ангиогенином. Особенно важно совместно вводить (либо одновременно, либо последовательно) фоллистатин с ангиогенином в ситуациях, когда индивидуум является фоллистатин - недостаточным. Поскольку уровни фоллистатина уменьшаются с возрастом, совместное введение фоллистатина с ангиогенином предполагается, в частности, при лечениии пожилых людей.
В схеме совместного введения ангиогенин может вводиться перорально, а фоллистатин может вводиться перорально или другими способами.
Во всем этом описании, за исключением случаев, когда контекст диктует другое, слово "содержат" или его вариации, такие как "содержит" или "содержащий", будут пониматься в смысле включения указанного элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел, но не для исключения любого другого элемента или целого числа или группы элементов или целых чисел.
Следует также отметить, что единственные формы "a", "and" и "the" включают в себя множественные аспекты, если контекст не указывает явно обратное.
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что, хотя это изобретение было описано в некоторых деталях для целей ясности и понимания, могут быть произведены различные модификации и изменения описанных здесь вариантов и способов без отклонения от объема идеи изобретения, раскрытой в этой заявке.
Теперь это изобретение будет дополнительно описано подробно посредством ссылки на следующий пример. Этот пример обеспечен только для целей иллюстрации и не предназначен для ограничения, если нет другого указания. Таким образом, это изобретение включает в себя любые и все вариации, которые будут очевидными в качестве результата обеспеченного здесь описания.
Пример 1: Способ получения обогащенной ангиогенином фракции из обезжиренного молока
Глубокую колонку 10 см заполняли SP Сефарозой с большими гранулами (GE Healthcare), так что общий объем слоя колонки составлял 29,7 литров. На эту колонку наносили поток обезжиренного коровьего молока при линейной скорости потока 331 см/ч (34 литра обезжиренного молока на литр смолы в час) в течение 2 часов, пока объем нанесенного обезжиренного молока не становился равным 68 колоночным объемам смолы, упакованной в эту колонку.
Молоко, остающееся в этой колонке, удаляли добавлением 2,5 колоночных объемов (CV) воды при линейной скорости потока 147 см/ч (15 литров буфера на литр смолы в час) или 0,25 CV/мин, в течение 10 минут.
Истощенную в отношении ангиогенина фракцию лактопероксидазы элюировали из этой колонки 2,5 CV буфера, содержащего ионы натрия, эквивалентные 2,0% (0,34 М) NaCl, при pH 6,5, протеканием раствора катионного буфера при линейной скорости потока 75 см/ч (7,5 литров раствора катионного буфера на литр смолы в час), или 0,125 CV/мин, в течение 20 минут. Первые 0,5 литров раствора катионного буфера на литр смолы выбрасывали для дренажа, а следующие 2,5 литра раствора катионного буфера на литр смолы собирали в качестве истощенной по ангиогенину фракции лактопероксидазы (включающей в себя 0,5 литров раствора катионного буфера на литр смолы, с перекрыванием времени нанесения следующего буфера, т.е. времени проскока).
Затем обогащенную ангиогенином фракцию элюировали из этой колонки 2,5 CV буфера, содержащего ионы натрия, эквивалентные 2,5% (0,43 М) NaCl, при pH 6,5, протеканием раствора катионного буфера при линейной скорости потока 75 см/ч (7,5 литров раствора катионного буфера на литр смолы в час), или 0,125 CV/мин, в течение 20 минут. Первые 0,5 литров раствора катионного буфера на литр смолы выбрасывали для дренажа, а следующие 2,5 литра раствора катионного буфера на литр смолы собирали в качестве обогащенной ангиогенином фракции (включающей в себя 0,5 литров раствора катионного буфера на литр смолы, с перекрыванием времени нанесения следующего буфера).
Наконец, фракцию лактоферрина элюировали из этой колонки 2,5 CV буфера, содержащего ионы натрия, эквивалентные 8,75% (1,5 М) NaCl, при pH 6,5, протеканием раствора катионного буфера при линейной скорости потока 75 см/ч (7,5 литров раствора катионного буфера на литр смолы в час), или 0,125 CV/мин, в течение 20 минут. Первые 0,5 литров раствора катионного буфера на литр смолы выбрасывали для дренажа, а следующие 2,5 литра раствора катионного буфера на литр смолы собирали в качестве фракции лактоферрина.
Обогащенную ангиогенином фракцию, которая была собрана, подвергали ультрафильтрации (NMWCO 5 кДа) для концентрирования и уменьшения содержания соли. Полученный конъюгат лиофилизировали и хранили при комнатной температуре для последующего использования.
Эту обогащенную ангиогенином фракцию анализировали на содержание ангиогенина при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ, и было обнаружено, что эта фракция содержала 57% (в расчете на белок) низкомолекулярного белка (14 кДа), который, как было подтверждено, является ангиогенином согласно масс-спектрометрии MALDI-TOF/TOF MS (результаты не показаны).
Квалифицированным в данной области лицам будет понятно, что ангиогенин, происходящий из других источников или очищенный другими способами, может быть использован в способах этого изобретения. Приведенный выше пример лишь показывает, как может быть приготовлен фактический источник ангиогенина, используемый в следующих экспериментах, и не предназначен для ограничения.
Хотя можно предположить, что обогащенная ангиогенином фракция может содержать дополнительные биологически активные компоненты, которые имеют какое-то действие, сравнимое количество ангиогенина, доступное в обезжиренном молоке (концентрация 2%), имело сравнимую активность в примерах, показанных для обогащенной ангиогенином фракции (данные не показаны).
Пример 2: In Vitro анализ - коровий ангиогенин является активным на клетках человека
Ангиогенин обеспечивали в обогащенном экстракте, полученном из коровьего обезжиренного молока в соответствии с описанным выше способом.
4
Для определения, является ли коровий ангиогенин активным на клетках человека, использовали анализ ангиогенеза, использующий эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECS). Клетки HUVEC рутинным образом поддерживали в базальной среде для эндотелиальных клеток (ECB), дополненной экстрактом головного мозга коровы, EGF, гидрокортизоном и 10% ФТС (Clonetics). Анализы выполняли в трех повторностях в 48-луночных планшетах для культуры ткани. 150 микролитрам (мкл) Матригеля (BD biosciences) давали сначала полимеризоваться на дне каждой лунки. Клетки HUVEC ресуспендировали в ECB теперь с 1% ФТС и коровьим ангиогенином, при 0,55×10 клеток/мл. Затем эти клетки (2,5×10 клеток на лунку) высевали на матрикс из матригеля и инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Эндотелиальный фактор роста сосудов человека (VEGF) 10 нг/мл заменял ангиогенин в качестве положительного контроля и только среду ЕСВ с 1% ФТС использовали в качестве отрицательного контроля. Развитие сосудов наблюдали и фотографировали при увеличении 10Х и эти результаты показаны на фигуре 1.
Эти результаты показывают, что коровий ангиогенин индуцирует развитие сосудов HUVEC на матригеле таким же образом, что и VEGF человека, и, следовательно, было показано, что коровий ангиогенин является активным на клетках человека.
Пример 3: In vitro анализ роста мышечных клеток
4
2
2
Мышечные клетки (C2C12; миобласты мыши) высевали в 96-луночные планшеты при начальной плотности 1×10 клеток на лунку в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (ФТС). Эти клетки культивировали в течение ночи при 37°C; 5% CO. На следующий день эту содержащую сыворотку среду удаляли и клетки промывали в ЗФР. Затем эти клетки культивировали в 100 мкл бессывороточной DMEM, дополненной тест-агентами (n=7), в течение 48 часов при 37°C; 5% CO. Для количественного определения роста этих клеток в каждую из лунок добавляли 10 мкл реагента пролиферации клеток WST-1 (Roche) и эти клетки инкубировали в течение дополнительных 3 часов при 37°C. На протяжении этого времени жизнеспособные клетки превращают реагент WST-1 в растворимый формазановый краситель, который измеряли в микропланшет-ридере, оптическая плотность при 450 нм прямо коррелирует с количеством клеток. Стимуляцию роста клеток этими агентами сравнивали с положительным контролем (10% ФТС) и отрицательными контролями (DMEM + контроль-носитель; DMEM, содержащая БСА или казеин при подходящих нагрузках белка).
4
Для исследований дифференцировки мышечных клеток, миобласты C2C12 высевали в 6-луночные планшеты при 25×10 клеток в 2 мл среды (DMEM, 10% ФТС) и давали им прикрепляться в течение ночи. Для индукции дифференцировки в миобласты культуральную среду удаляли и заменяли только DMEM или DMEM, дополненной 2% лошадиной сывороткой. Тестировали эффекты коровьего ангиогенина (bAngiogenin) (0,1 мкг/мл - 100 мкг/мл; 10 мкг/мл не определяли), рекомбинантного ангиогенина человека (rhAngiogenin) (0,1 мкг/мл - 10 мкг/мл; 1 мкг/мл не определяли), рекомбинантного фоллистатина человека (rhFollistatin) (0,1 мкг/мл) и рекомбинантного миостатина человека (rhMyostatin) (50 нг/мл). Все рекомбинантные белки приобретали из RnD Systems. Получали изображения клеток и измеряли активность креатинкиназы (CK) после обработки в течение 96 часов или 48 часов для экспериментов, включающих в себя миостатин. Авторы измеряли активность креатинкиназы, активируемой N-ацетилцистеином (NAC) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вкратце, для каждого анализа использовали свежий флакон реагента CK-NAC (Thermo Cat # TR14010), в который добавляли 10 мл стерильной воды. Затем 17,5 мкл каждой пробы смешивали с 350 мкл реагента CK-NAC и три аликвоты 100 мкл анализировали в 96-луночных планшетах. Затем измеряли оптическую плотность при 340 нм в течение пяти минут. Активность CK рассчитывали из изменения в OD/мин с использованием следующих уравнений:
Активность (Е/л) = ΔOD мин-1 × Фактор
Фактор = Общий объем × 1000/6,3 × объем пробы × длина пути кюветы
=0,1×1000/(6.3×0,005×1)
=3174,6
CK-активность (Е/л)=ΔOD мин-1×3174,6
Для анализов микроматриц (ДНК-микроанализа, ДНК-чипа, биочипа) клеточных культур из культивируемых клеток экстрагировали общую (тотальную) РНК с использованием мини-набора для выделения РНК RNeasy (Qiagen) и количественно определяли измерением оптической плотности при 260 нм при помощи спектрофотометра Nanodrop 1000. Чистоту оценивали получением отношений 260 нм/280 нм и 260 нм/230 нм. Целостность РНК оценивали определением пробы каждой РНК на Биоанализаторе 2100 с использованием набора RNA 6000 Nano LabChip (Agilent).

100 нг тотальной РНК амплифицировали для получения биотин-меченой кДНК с использованием анализа мечения GeneChip Whole Transcript (WT) Sense Target Labeling Assay (Affymetrix) в соответствии с протоколом, обеспеченным изготовителем. Меченую кДНК применяли в рекомендуемых количествах к матрицам Mouse Gene 1.0 ST (Affymetrix) перед промыванием и окрашиванием с использованием Affymetrix 450 Fluidics Station и рекомендуемых растворов 0 (Affymetrix). Сканирование матриц выполняли на Affymetrix GeneChip Scanner 3000 7G перед извлечением данных интенсивности с использованием программы Affymetrix GeneChip Command Console (AGCC). Полученные. CEL-файлы использовали для анализа данных в Partek Genomics Suite ver.6.4 (Partek) с использованием нормализации RMA по умолчанию и ANOVA.
Результаты экспериментов дифференцировки мышечных клеток показаны на фигурах 3, 4 и 5. Фигура 3 показывает, что в бессывороточных не допускающих дифференцировки условиях коровий ангиогенин и рекомбинантный ангиогенин человека делали возможной дифференцировку клеток и образование мышечных трубочек в присутствии 2% HS зависимым от дозы образом. Включение рекомбинантного ангиогенина человека при уровне единственной дозы доказывает, что этим индуцирующим фактором является ангиогенин. Фигура 5 показывает синергические эффекты коровьего ангиогенина и рекомбинантного ангиогенина человека. При условиях нормальной дифференцировки размер мышечных трубочек увеличивается после культивирования с коровьим ангиогенином и рекомбинантным ангиогенином человека в сравнении со стандартными условиями или культивированием с ангиогенином или фоллистатином по отдельности (фигура 5a). Увеличенная дифференцировка доказывается анализами креатинкиназы (5b), показывающими значимо более высокие уровни при объединенной обработке ангиогенином и рекомбинантным фоллистатином человека в сравнении с обработками по отдельности или контролем.
Синергические действия коровьего ангиогенина и рекомбинантного ангиогенина человека на глобальные профили экспрессии генов во время начальной фазы образования мышечных трубочек (первые 2 часа после дифференцировки) испытывали с использованием анализа микроматриц (фигура 6). Минорные различия в профилях экспрессии генов наблюдали во время начальной дифференцировки миобластов в контрольной обработке или в присутствии рекомбинантного фоллистатина человека или коровьего ангиогенина. Заметные различия видны в объединенной обработке рекомбинантным фоллистатином человека и коровьим ангиогенином человека в сравнении с другими обработками.
Эту специфическую роль ангиогенина в процессе дифференцировки испытывали повторением условий культуры с дифференцировкой с пептидом VFSVRVSILVF (AUSPEP), который специфически блокирует взаимодействие ангиогенин/актин (фигура 7). Этот ангиогенинблокирующий пептид ингибировал bAngiogenin-специфическую дифференцировку, как измерено по увеличенной активности креатинкиназы в сравнении с контрольной группой, демонстрируя, что реакция, наблюдаемая на фигуре 5, обусловлена специфически ангиогенином.
Способность ангиогенина восстанавливать дифференцировку мышечных клеток испытывали инкубированием мышечных миобластов С2С12 с рекомбинантным миостатином человека (rhMyostatin), коровьим ангиогенином (bAngiogenin) и рекомбинантным фоллистатином человека (rhFollistatin) при условиях дифференцировки. Миостатин является отрицательным регулятором дифференцировки мышечных клеток и ингибирует связывания с высокой аффинностью с фоллистатином. Фигура 8 демонстрирует, что миостатин ингибирует дифференцировку мышечных клеток в мышечные трубочки и что один фоллистатин не может восстанавливать дифференцировку клеток. Включение коровьего ангиогенина в инкубационную среду восстанавливало наибольшую часть активности креатинкиназы, однако комбинация коровий ангиогенин плюс рекомбинантный фоллистатин человека восстанавливала уровни креатинкиназы до контрольных уровней, показывая, что ангиогенин делает возможным обход ангиогенином нормальной передачи сигналов дифференцировки миостатином-фоллистатином. Этот эксперимент повторяли с использованием рекомбинантного ангиогенина человека (rhAngiogenin) для доказательства специфичности этого механизма в отношении ангиогенина (фигура 9). Эта фигура показывает, что с использованием рекомбинантного ангиогенина человека (rhAngiogenin) восстановление индуцированного миостатином уменьшения активности креатинкиназы является идентичным восстановлению коровьим ангиогенином, включающим в себя синергический механизм с фоллистатином.
Пример 4: Ангиогенин является нейропротективным

Для испытания, является ли ангиогенин активным в комбинации с фоллистатином на нервных клетках, клетки PC12 культивировали с коровьим ангиогенином (bAngiogenin), рекомбинантным ангиогенином человека (rhAngiogenin) и рекомбинантным ангиогенином человека плюс рекомбинантным фоллистатином человека (rhAngiogenin + rhFollistatin) и выживание клеток измеряли в отсутствие сыворотки. Фигура 10 и фигура 11 показывают защиту клеток PC 12 против смерти клеток после сывороточного голодания в присутствии (rhAngiogenin + rhFollistatin) относительно одного rhAngiogenin или одного rhFollistatin. Коровий ангиогенин также имеет протективное действие. После 22-24 часов предобработки в присутствии обработок в полной среде (в DMEM с 10% лошадиной сывороткой и 5% инактированной нагреванием ФТС) эти клетки промывали дважды 300 мкл на лунку бессывороточной DMEM и добавляли белковые реагенты. После трех дней инкубирования, жизнеспособность клеток измеряли на основе уровней АТФ с использованием реагента CellTiterGlo (Promega, Madison, WI). Люминесценцию считывали с использованием планшет-ридера для мультимеченых планшетов Victor3 (Perkin Elmer, Waltham, MA) при комнатной температуре. Фигура 10 и фигура 11 показывают защиту клеток РС12 против смерти клеток после сывороточного голодания.
Фигура 5: Исследования in vivo на животных:
Для анализа in vivo действий ангиогенина на мышечном фенотипе в нормальных и имеющих мышечную дистрофию мышах были предприняты исследования на животных. Все исследование было одобрено Комитетом по этике Университета Западной Австралии.
Мышей кормили 2 пищевыми рационами во время каждого испытания; контрольным пищевым рационом и рационом, содержащим обогащенную коровьим ангиогенином фракцию (bAngiogenin), полученную в соответствии с примером 1, при 2,5 мкг/г массы мыши. Эти исследования проводили на взрослых (8-недельных) самцах (С57) и дистрофических (mdx) мышах с n=8 для каждого штамма мышей на пищевой рацион для каждого эксперимента.
Нормальных мышей подвергали одному месяцу периода соблюдения диеты с доступом ad libitum к пище и произвольной двигательной активностью; для произвольной двигательной активности внутри клетки помещали металлическое колесо для мышей и расстояние, пробегаемое отдельной мышью, регистрировали бициклическим устройством (шагомером), присоединенным к этому колесу. MDX-мышей подвергали тому же самому одномесячному периоду соблюдения диеты. В отдельных экспериментах, mdx-мышам предоставляли возможность произвольной двигательной активности, описанной выше, или не предоставляли колесо для произвольной двигательной активности.
Экспериментальный анализ:
Во время этих экспериментов все параметры: массу тела, количество съеденной пищи и мышечную силу (тест силы хватания) измеряли два раза в неделю. При завершении каждого эксперимента мышей умерщвляли анестезией галотаном и дислокацией шеи.
Затем экспериментальных мышей использовали для следующего анализа для определения каких-либо изменений в фенотипе в качестве результата обработок на дистрофических и нормальных мышцах.
1) Анализ состава тела: Половину каждой тушки со снятой кожей анализировали на состав тела. Кроме того, иссекали и взвешивали индивидуальные мышцы ножек, в том числе четырехглавые (quad), большеберцовые передние (ТА) и икроножные мышцы, а также абдоминальные жировые скопления и сердце, данные регистрировали для определения макроскопических фенотипических изменений, индуцируемых этими диетами.
2) Гистологический анализ: Собирали пробы скелетных мышц и сердца и готовили как для гистологического исследования замороженных срезов, так и для гистологического исследования в залитых в парафин срезов. Гистологический анализ проводили на следующих мышцах: четырехглавых (quad), TA и диафрагме. Краситель Гематоксилин и Эозин, судановый краситель Sudan Black и различные иммуногистологические красители использовали на этих мышцах. Определяли некроз мышечного волокна, гипертрофию мышечного волокна и содержание жира мышц.
Результаты in vivo экспериментов в здоровых мышах показаны на фигурах 12-15. Ясно, что получающие пищевой рацион, дополненный обогащенной ангиогенином фракцией при 2,5 мкг/г, индуцирует мышечный прирост (фигура 12) до 50% в сравнении с контрольной группой. Увеличение мышечной массы обеспечивалось увеличенной площадью поперечных срезов большинства типов мышечных волокон, за исключением популяции малых темных мышечных волокон, соответствующих медленно подергивающимся окислительным волокнам (фигура 13). Мыши, получающие обогащенный ангиогенином пищевой рацион, также бегали на 30% дольше, чем мыши с контрольным пищевым рационом, как измерено по произвольной двигательной активности (фигура 14). Взятые вместе, эти данные показывают, что ангиогенин влияет на размер мышц и фитнес in vivo.
При кормлении mdx-мышей, ангиогенин уменьшал долю мышц, которые были некротическими, при предоставлении доступа к произвольной двигательной активности (фигура 15). Это демонстрирует, что ангиогенин способен ингибировать действия двигательной способности на распад мышечной ткани в mdx-мышах.