КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦАХ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF NUCLEIC ACID SEQUENCES IN BIOLOGICAL SAMPLES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение, в общем, относится к композициям и способам для обнаружения, идентификации и, необязательно, количественного определения фрагментов нуклеиновых кислот в популяции выделенных полинуклеотидов, такой как полученная из биологического образца. В частности, композиции и способы по изобретению могут сохраняться при комнатной температуре в течение длительного периода времени без ущерба для целостности компонентов или точности анализа.
Предпосылки создания изобретения
Микобактерии являются одноклеточными аэробными грамположительными бактериями. Обычно микобактерии имеют толстую гидрофобную клеточную стенку и не имеют наружной клеточной мембраны. Инфекции, вызванные микобактериями, могут быть активными в организме хозяина или могут быть скрытыми и бессимптомными. Появление штаммов с множественной лекарственной устойчивостью, необходимость длительной антибактериальной терапии и плохое соблюдение пациентами схемы лечения затрудняют лечение микобактериальных инфекций, особенно в развивающихся странах. В частности, появление штаммов M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) сделало диагностику и лечение туберкулеза высоко приоритетными в развивающихся африканских странах.
Микобактерии обычно относят к кислотоустойчивым грамположительным бактериям из-за отсутствия у них внешней клеточной мембраны. Часто используемыми способами окрашивания кислотоустойчивых микроорганизмов являются окрашивание по Цилю-Нильсену или способом Киньона. Они обычно не сохраняют окрашивание кристаллическим фиолетовым и поэтому не считаются типичными представителями грамположительных бактерий. Однако они имеют уникальную структуру клеточной стенки, которая толще, чем у большинства других видов бактерий. Как правило, имеющая палочкообразную форму клеточная стенка состоит из гидрофобного миколятного слоя (содержащего миколовые кислоты) и пептидогликанового слоя, удерживаемых вместе полисахаридом арабиногалактаном. Эта структура клеточной стенки микобактерий помогает им выживать при резких изменениях в окружающей среде и вносит вклад в выносливость микобактерий, а также является причиной трудности лечения туберкулеза и лепры, поскольку оба эти заболевания вызываются различными видами микобактерий. Миколовые кислоты являются высокогидрофобными молекулами, которые образуют липидную оболочку вокруг организма и влияют на свойства проницаемости клеточной поверхности. Миколовые кислоты считаются существенным фактором вирулентности у некоторых видов микобактерий. Наиболее вероятно, они предупреждают атаку микобактерий катионными белками, лизоцимом и кислородными радикалами в фагоцитарных гранулах. Они также защищают микобактерии вне клетки от осаждения системой комплемента в сыворотке крови.
Кроме того, микобактерии, как правило, являются медленно растущими микроорганизмами, что усложняет культивирование различных видов микобактерий. Благодаря своей уникальной клеточной стенке они могут выживать при длительном воздействии кислот, щелочей, моющих средств, окислителей, комплемент-опосредованного лизиса и многих антибиотиков. Большинство микобактерий восприимчивы к антибиотикам кларитромицину и рифамицину, но уже появились устойчивые к этим антибиотикам штаммы.
Возбудители туберкулеза, члены комплекса Mycobacterium tuberculosis, а именно, M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. cannetti, M. caprae и M. pinnipedi, имеют все вышеуказанные характеристики микобактерий. Главным следствием микобактериальной инфекции (в частности, инфекции одним или более видами из рода Mycobacterium) у человека является туберкулез (TB), заразная болезнь, вызванная членами «комплекса M. tuberculosis», которые включают, например, патогенные штаммы видов M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. cannetti, M. caprae и M. pinnipedi. TB обычно поражает легкие млекопитающих-хозяев, но также может распространиться на другие органы и области тела, включая, например, кости, суставы, почки и брюшную полость, и т.д. Члены комплекса M. tuberculosis тесно связаны генетически и обладают высококонсервативными последовательностями 16S рРНК у всех представителей рода.
TB может быть приобретен в результате вдыхания капелек в воздухе, образовавшихся при кашле или чихании инфицированного человека. Соответственно, сбор биологических образцов, предположительно содержащих члены комплекса M. tuberculosis, включает сбор мокроты у пациентов с подозрением на эту инфекцию. Мокрота представляет собой откашливаемое отделяемое из дыхательных путей и в идеале содержит очень мало или практически не содержит слюны или выделений из носа, чтобы избежать загрязнения образца мокроты бактериями из полости рта. Мокрота в основном содержит слизь, вязкий коллоидный раствор, богатый гликопротеинами. Пациенты с подозрением на туберкулез обычно имеют повышенную вязкость слизи, а также увеличенное слизеобразование. В дополнение к слизи, мокрота может содержать кровь, т.е. может возникать кровохаркание, и/или гной, т.е. иметь гнойный характер. Симптомы активной туберкулезной инфекции могут включать хронический кашель (обычно с кровянистой мокротой), лихорадку, ночную потливость, хроническую усталость, бледность, потерю веса и болезненное истощение («общее истощение»). Другие симптомы могут включать затрудненное дыхание, боль в груди и хрипы ("Pulmonary Tuberculosis", PubMed Health). Если вдыхаемые туберкулезные палочки оседают в альвеолах легких, то происходит заражение с последующим расширением капилляров альвеол и набуханием эндотелиальных клеток. Альвеолит приводит к внутриклеточной репликации туберкулезных палочек и притоку полиморфноядерных лейкоцитов в альвеолы. Организмы затем распространяются через лимфатическую систему в кровеносную систему, а затем по всему телу.
Хотя в Соединенных Штатах M. tuberculosis инфицируется менее 200000 человек в год, по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) во всем мире могут быть инфицированы около двух миллиардов человек, 90% из которых могут не иметь симптомов в течение многих лет после заражения. При отсутствии лечения туберкулез является фатальным более чем у 50% инфицированного населения, а при диссеминированных формах заболевания смертность приближается к 90%.
Вследствие хронического и изнуряющего течения туберкулезной инфекции также широко распространена коинфекция одним или более вторичными патогенами, включая, в частности, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). В 2007 году было зарегистрировано по меньшей мере 1370000 случаев ВИЧ-положительного TB, сосредоточенных в основном в развивающихся странах, где диагностика и лечение зачастую ограничены, неэффективны и/или непомерно дороги.
Стандартная диагностика туберкулезной инфекции, как правило, опирается на сочетание физического обследования (например, хронический кашель, увеличенные или болезненные лимфатические узлы, плеврит, необычные звуки при дыхании, и, на более поздних стадиях заболевания, характерные «барабанные» пальцы рук или ног) и диагностического обследования (например, исследование мокроты, исследование посева на микроорганизмы и исследование нуклеиновых кислот из образцов, бронхоскопия, компьютерная томография или рентген грудной клетки, биопсия легкого, торакоцентез, исследование на интерферон-γ (гамма) крови и туберкулиновый кожный тест).
«Стандарт» диагностики туберкулеза, культивирование клеток микобактерий, является трудновыполнимым, отчасти из-за их продолжительного периода удвоения, а именно, двадцать четыре часа для M. tuberculosis. Кроме того, у инфицированных людей микобактерии обычно присутствуют на низком уровне. Поэтому получение культуры из клинического образца может занять от четырех до восьми недель, в течение которых пациент может тяжело заболеть и стать заразным для других. Кроме того, культивирование клеток требует сбора, транспортировки и сохранения жизнеспособных микобактерий в образце до анализа образца в лабораторных условиях. В странах с распространенным туберкулезом и минимальным здравоохранением это может быть неосуществимым вариантом, что повышает риск распространения инфекции.
К несчастью для регионов с ограниченным доступом к медицинской помощи, цельная кровь должна быть проанализирована в течение 12 часов после получения образца, а эффективность теста не была проверена на пациентах с другими заболеваниями, такими как ВИЧ, СПИД, диабет, силикоз, хроническая почечная недостаточность, гематологические заболевания, на лицах, которые получали лечение от туберкулезной инфекции, а также не была проверена на беременных и несовершеннолетних («Clinicians Guide to QuantiFERON-TB Gold», Cellestis). Для того чтобы подтвердить наличие микобактерий туберкулеза в биологических пробах, прочие некультуральные способы, такие как радиоиммунонализ, латекс-агглютинация и иммуноферментные методы анализа (ELISA), использовались с ограниченным успехом.
В большинстве клинических диагностических лабораторий для идентификации патогенов используется традиционное культивирование, которое обычно требует 3-7 дней для большинства вирусов и большего времени для некоторых бактериальных штаммов, в том числе, примерно до 21 дня для культивирования M. tuberculosis. Традиционная культура требует сбора образцов жизнеспособных микроорганизмов, перевозку в замороженном состоянии, а также размножение и работу с потенциально заразными и часто неизвестными микроорганизмами. Кроме того, многие инфекционные агенты, например, высокопатогенный птичий грипп, тяжелый острый респираторный синдром, комплекс M. tuberculosis, и т.д., являются патогенами 3-го уровня биологической опасности (BSL-3), которые требуют специальных служб и мер предосторожности для анализа. Существуют проблемы в получении, пересылке и сохранении высококачественных, жизнеспособных биологических образцов для культивирования. Пересылка образцов должна осуществляться с использованием холодовой цепи, наиболее часто сухого льда. Транспортировка потенциально инфекционных образцов из удаленных регионов или через международные границы с использованием коммерческих перевозчиков может быть дорогостоящей и трудоемкой, особенно когда образцы должны быть получены замороженными.
Сбор образцов является первым шагом в диагностических платформах или молекулярных протоколах, требующих обнаружения потенциально незначительных количеств нуклеиновых кислот из микроорганизмов. Вне зависимости от используемого метода исследования нуклеиновых кислот или протокола выделения РНК/ДНК, сбор образцов, особенно инактивация потенциально инфекционных агентов, а также сохранение и стабильность РНК/ДНК возбудителя, остаются критическим этапом в клинической диагностике, особенно при использовании во всем мире.
Как правило, для получения образцов мокроты пациентов с подозрением на туберкулез просят сильно покашлять, а затем выплюнуть откашливаемое в чашку для образцов. Обычно эту процедуру проводят в хорошо проветриваемом помещении, чтобы свести к минимуму возможность распространения инфекционных микобактерий. Пациентов могут попросить повторить эту процедуру для того, чтобы собрать достаточное количество мокроты для анализа, обычно в количестве от примерно 5 мл до примерно 20 мл. Как правило, собранные образцы мокроты хранят в холодильнике до проведения дальнейших аналитических процедур, таких как культивирование клеток или дезактивационные процедуры для инактивации или уничтожения любых микроорганизмов, содержащихся в образце. С целью обнаружения Mycobacterium tuberculosis в образце мокроты необходимо более 10000 бактерий на мл мокроты для визуализации палочки с использованием 100× объектива микроскопа (1000-кратное увеличение). Прямое микроскопическое исследование мазков образцов мокроты от больных туберкулезом обычно считается эффективным средством для контроля ответа пациента на лечение. Как правило, более кислотоустойчивые палочки можно найти в гнойных участках мокроты.
Область клинической молекулярной диагностики радикально изменилась с появлением полимеразной цепной реакции (ПЦР), а впоследствии, ПЦР в реальном времени. ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) и обратная транскрипция с ПЦР в реальном времени (ОТ-РВ-ПЦР) могут обеспечить получение результатов с превосходной чувствительностью и специфичностью за часы. Таким образом, большинство современных диагностических лабораторий перешли от традиционного культивирования к исследованию нуклеиновых кислот (NAT), такому как ПЦР в реальном времени.
Тестирование на TB с помощью амплификации нуклеиновых кислот включает использование методики стандартной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения ДНК микобактерий в образцах пациента, нуклеотидных зондов для выявления микобактерий в культуре, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (RFLP) для сравнения различных штаммов TB для эпидемиологических исследований и генетическое определение чувствительности для выявления лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий. Полная последовательность генома M. tuberculosis была определена и опубликована; в настоящее время Управлением по контролю за продуктами и лекарственными препаратами (FDA) для использования в США были одобрены два теста на туберкулез на основе амплификации нуклеиновых кислот. Первый, известный как «Усиленный амплификацией прямой тест на Mycobacterium tuberculosis» (E-MTD, Gen-Probe, San Diego, CA, USA), предназначен для обнаружения бактерий комплекса M. tuberculosis среди кислотоустойчивых палочек в образцах из дыхательных путей пациентов с подозрением на туберкулез, как с положительными, так и с отрицательными мазками. E-MTD тест объединяет изотермическую транскрипционно-опосредованную амплификацию участка 16S рРНК со способом обнаружения, в котором используется гибридизационный зонд, специфичный к бактериям комплекса M. tuberculosis. Второй, известный как тест на Mycobacterium tuberculosis AMPLICOR (AMPLICOR, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland), был одобрен для выявления бактерий комплекса M. tuberculosis в образцах из дыхательных путей пациентов с подозрением на туберкулез только с положительными мазками. В этом тесте используют ПЦР для амплификации участка гена 16S рРНК, содержащего последовательность, которая гибридизуется с олигонуклеотидным зондом, специфичным к бактериям комплекса M. tuberculosis. («Report of an Expert Consultation on the Uses of Nucleic Acid Amplification Tests for the Diagnosis of Tuberculosis», Centers for Disease Control and Prevention).
Результаты показали, что чувствительность и специфичность этих тестов имеет тенденцию меняться в зависимости от географического положения и факторов риска. Кроме того, эти методики для своего выполнения требуют сложных лабораторных условий и оборудования, тем самым снижая скорость и чувствительность теста. По этим и другим причинам в данной области существует потребность в надежных и точных способах обнаружения патогенных микобактерий в клинических образцах и, в частности, в способах быстрого выявления таких патогенов в полевых условиях, удаленных местах и в развивающихся странах, где отсутствуют стандартные лаборатории и ограничены финансовые ресурсы. В частности, весьма необходимы композиции для безопасного сбора, работы и транспортировки патогенных образцов, а также молекулярно-биологические методы быстрого обнаружения и точной идентификации TB-специфичных нуклеиновых кислот в таких образцах.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение преодолевает проблемы и недостатки, связанные с текущими стратегиями и схемами, и обеспечивает новую композицию, средства и способы обнаружения и идентификации последовательностей нуклеиновых кислот.
Один вариант осуществления изобретения относится к готовым для ПЦР композициям для обнаружения микроорганизма в биологическом образце, включающим в качестве компонентов: термостабильную полимеразу, присутствующую в количестве от примерно 0,05 Ед. до примерно 1 Ед.; смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, содержащую примерно равные количества дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ, совместно присутствующих в композиции в концентрации от примерно 0,1 мМ до примерно 1 мМ; хелатирующий агент, выбранный из группы, состоящей из этиленгликольтетрауксусной кислоты, гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусной кислоты, диэтилентриаминпентауксусной кислоты, N,N-бис(карбоксиметил)глицина, этилендиаминтетрауксусной кислоты, безводного цитрата, цитрата натрия, цитрата кальция, цитрата аммония, бицитрата аммония, лимонной кислоты, цитрата диаммония, цитрата калия, цитрата магния, цитрата железистого аммония, цитрата лития и любой их комбинации, присутствующий в композиции в концентрации от примерно 0,01 мМ до примерно 1 мМ; агент для осмолярности ПЦР, выбранный из группы, состоящей из Ν,Ν,Ν-триметилглицина (бетаина), диметилсульфоксида (ДМСО), формамида, глицерина, неионных детергентов, полиэтиленгликоля, хлорида тетраметиламмония и любой их комбинации, присутствующий в композиции в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 1 М; альбумин, выбранный из группы, состоящей из альбумина бычьей сыворотки, альбумина человеческой сыворотки, альбумина козьей сыворотки, альбумина млекопитающих и любой их комбинации, присутствующий в композиции в концентрации от примерно 5 нг/мл до примерно 100 нг/мл; по меньшей мере две соли, первая из которых представляет собой соль калия, выбранную из группы, состоящей из хлорида калия и глутамата калия, а вторая представляет собой соль магния, выбранную из группы, состоящей из хлорида магния и сульфата магния, совместно присутствующие в композиции в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 1 М; и буфер, выбранный из группы, состоящей из трис(гидроксиметил)аминометана (Tris), цитрата, 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES), N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (BES), 1,3-бис(трис(гидроксиметил)метиламино)пропана (Bis-Tris), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты (MOPS), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицина (бицина), N-[трис(гидроксиметил)метил]глицина (трицина), N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусной кислоты (ADA), N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновой кислоты (ACES), пиперазин-1,4-бис(2-этансульфоновой кислоты) (PIPES), бикарбоната, фосфата и любой их комбинации, присутствующий в композиции в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 1 М и с рН от примерно 6,5 до примерно 9,0, причем pKa буфера находится в пределах примерно одной единицы рН при выбранной температуре, причем компоненты объединены с безнуклеазной водой. Предпочтительно термостабильная полимераза представляет собой Taq-полимеразу, высокоточную полимеразу, Pfu-полимеразу и полимеразу с «горячим стартом» или полимеразу следующего поколения. Предпочтительно композиция дополнительно содержит один или более красителей, выбранных из группы, состоящей из флуоресцеина, 5-карбокси-X-родамина и ROX. Предпочтительно рН буфера или общей композиции составляет от примерно 6,5 до примерно 7,5, а pKa буфера находится в пределах 0,5 единицы от рН буфера при температуре окружающей среды, более предпочтительно pKa буфера находится в пределах 0,2 единицы от рН буфера при температуре окружающей среды. Предпочтительно композиция дополнительно содержит пару ПЦР-праймеров, выполненных с возможностью амплификации с помощью ПЦР последовательности нуклеиновой кислоты, специфичной к микроорганизму, в совокупности присутствующих в композиции в концентрации от примерно 0,5 мкМ до примерно 50 мкМ, причем каждый ПЦР-праймер составляет от примерно 5 до примерно 50 нуклеотидов в длину. Более предпочтительно каждый праймер из указанной пары ПЦР-праймеров составляет от примерно 18 до 35 нуклеотидов в длину. Предпочтительно детектируемый микроорганизм представляет собой патоген, который может быть бактериальным, вирусным, грибковым и паразитарным патогеном. Более предпочтительно бактерия представляет собой микобактерию или вирус представляет собой вирус гриппа, такой как, например, штамм H1N1, H2N2, H3N3 или H5N1 вируса гриппа. Предпочтительно композиция дополнительно содержит контрольную нуклеиновую кислоту, присутствующую в концентрации от примерно 1 фг до примерно 1 нг, что обеспечивает качественное или количественное измерение ПЦР-амплификации. Предпочтительная контрольная нуклеиновая кислота содержит, например, последовательность SEQ ID NO:8, последовательность SEQ ID NO:12 или последовательность SEQ ID NO:21. Предпочтительно композиция может дополнительно содержать детекционный зонд, такой как, например, детекционный зонд, который специфично связывается с ПЦР-амплифицированной нуклеиновой кислотой, специфичной для указанного микроорганизма. Предпочтительная композиция по изобретению содержит примерно 50 мМ Tris; 70 мМ хлорида калия; примерно 3 мМ сульфата магния; примерно 45 мМ бетаина; примерно 0,03 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина; примерно 0,1 мМ EDTA; примерно 0,05 мкМ красителя; пару ПЦР-праймеров с концентрацией примерно 8 мкМ. Предпочтительно один праймер из пары ПЦР-праймеров содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:5, а другой праймер из пары ПЦР-праймеров содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:6. Также предпочтительной является композиция, в которой детекционный зонд представляет собой специфичную для микобактерий последовательность, составляющую от примерно 20 до примерно 35 нуклеотидов в длину, и содержит последовательность SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:7.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения включает готовые для ПЦР композиции для обнаружения микроорганизмов в биологическом образце, содержащие в качестве компонентов: термостабильную полимеразу; смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, содержащую примерно равные количества дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ; хелатирующий агент; агент для осмолярности ПЦР; альбумин; по меньшей мере две соли; и буфер, который присутствует в композиции в концентрации по меньшей мере 50 мМ и имеет рН от примерно 6,5 до примерно 9,0, причем pKa буфера находится в пределах примерно одной единицы от рН буфера при выбранной температуре, причем компоненты объединены с безнуклеазной водой. Предпочтительно термостабильная полимераза присутствует в количестве от примерно 0,05 Ед. до примерно 10 Ед.; смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов присутствует в композиции в концентрации от примерно 0,1 мМ до примерно 10 мМ; хелатирующий агент присутствует в композиции в концентрации от примерно 0,01 мМ до примерно 10 мМ; агент для осмолярности ПЦР присутствует в композиции в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 10 М; альбумин присутствует в композиции в концентрации от примерно 5 нг/мл до примерно 1 мг/мл; по меньшей мере две соли совместно присутствуют в композиции в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 10 М; и буфер присутствует в композиции в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 10 М.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам обнаружения микроорганизмов в биологическом образце, включающим: приведение биологического образца в контакт с композицией по любому из п.п.1-22 с образованием смеси; проведение множества стадий циклических изменений температуры (термоциклирования) смеси с образованием продукта амплификации, который получен из нуклеиновой кислоты, специфичной для микроорганизма; определение присутствия или отсутствия продукта амплификации для определения присутствия или отсутствия микроорганизма в биологическом образце. Предпочтительно способ дополнительно включает обнаружение амплифицированной последовательности контрольной нуклеиновой кислоты и определение качества и количества амплификации, прошедшей за множество стадий термоциклирования. Также предпочтительно, биологический образец содержит биологический материал, полученный от человека, одно или более хаотропных соединений, один или более детергентов, один или более восстанавливающих агентов, один или более хелатирующих агентов и один или более буферов.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способам, обеспечивающим обнаружение микроорганизма в биологическом образце, которые включают обеспечение готовой для ПЦР композиции, содержащей в качестве компонентов: термостабильную полимеразу, присутствующую в количестве от примерно 0,05 Ед. до примерно 1 Ед.; смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, содержащую примерно равные количества дАТФ, дЦТФ, дГТФ и дТТФ, совместно присутствующих в композиции в концентрации от примерно 0,1 мМ до примерно 1 мМ; один или более хелатирующих агентов, присутствующих в композиции в концентрации от примерно 0,01 мМ до примерно 1 мМ; один или более агентов для осмолярности ПЦР, присутствующих в композиции в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 1 М; один или более альбуминовых белков, присутствующих в композиции в концентрации от примерно 5 нг/мл до примерно 100 нг/мл; одну или более солей, присутствующих в композиции в концентрации от примерно 50 мМ до примерно 1 М; и один или более буферов, присутствующих в композиции в концентрации от примерно 1 мМ до примерно 1 М и с рН от примерно 6,5 до примерно 9,0, причем pKa буфера находится в пределах примерно одной единицы от рН буфера при выбранной температуре, причем компоненты объединены с безнуклеазной водой. Предпочтительно рН буфера составляет от примерно 6,5 до 7,5, а pKa буфера находится в пределах 0,5 единицы от рН буфера при температуре окружающей среды. Предпочтительно способ дополнительно включает приведение биологического образца в контакт с композицией и проведение реакции термоциклирования на смеси. Предпочтительно один или более хелатирующих агентов включают этиленгликольтетрауксусную кислоту, гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусную кислоту, диэтилентриаминпентауксусную кислоту, N,N-бис(карбоксиметил)глицин, этилендиаминтетрауксусную кислоту, безводный цитрат, цитрат натрия, цитрат кальция, цитрат аммония, бицитрат аммония, лимонную кислоту, цитрат диаммония, цитрат калия, цитрат магния, цитрат железистого аммония, цитрат лития или любую их комбинацию, один или более агентов для осмолярности ПЦР включают Ν,Ν,Ν-триметилглицин (бетаин), диметилсульфоксид (ДМСО), формамид, глицерин, неионные детергенты, дезоксиинозин, глицерин, 7-деазадезоксигуанозинтрифосфат, гидроксид натрия, полиэтиленгликоль, хлорид тетраметиламмония или любую их комбинацию, один или более альбуминов включают альбумин бычьей сыворотки, альбумин человеческой сыворотки, альбумин козьей сыворотки, альбумин млекопитающих или любую их комбинацию, одна или более солей включают хлорид калия, глутамат калия, хлорид магния, сульфат магния и любую их комбинацию, один или более буферов включают трис(гидроксиметил)аминометан (Tris), цитрат, 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (BES), 1,3-бис(трис(гидроксиметил)метиламино)пропан (Bis-Tris), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту (MOPS), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (бицин), N-[трис(гидроксиметил)метил]глицин (трицин), N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусную кислоту (ADA), N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (ACES), пиперазин-1,4-бис(2-этансульфоновую кислоту) (PIPES), бикарбонат, фосфат или любую их комбинацию.
Другой вариант осуществления изобретения относится к наборам, включающим композицию по изобретению, содержащуюся в стерильном сосуде, выполненном с возможностью добавления биологического образца и термоциклирования, и инструкции для определения присутствия или отсутствия патогена по результатам термоциклирования.
Другие варианты осуществления и преимущества изобретения изложены частично в нижеследующем описании и частично могут быть очевидны из этого описания или могут быть обнаружены при осуществлении изобретения на практике.
Описание чертежей
Фигура 1 иллюстрирует анализ с помощью ПЦР в реальном времени туберкулезной ДНК из положительных по мазку образцов мокроты, хранящихся в PrimeStore в соотношении 1:1. Кроме того, эти же положительные по мазку образцы мокроты собирали на тампон, в результате получая от примерно 50 до примерно 400 мкл образца на тампон, и тампоны помещали в 1,5 мл PrimeStore. ДНК экстрагировали из каждого образца мокроты в PrimeStore, используя AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit (AMPLICOR, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) в соответствии с инструкциями производителя. 4 мкл выделенной ДНК использовали для ПЦР в реальном времени, используя набор LightCycler Mycobacterium detection kit, в соответствии с инструкциями производителя. Полученные значения Cτ для каждого из образцов приведены в таблице 2;
Фигура 2 иллюстрирует анализ с помощью ПЦР в реальном времени туберкулезной ДНК из семи отрицательных по мазку и положительных по культуре образцов мокроты и трех скудных (т.е. положительных по мазку, когда окрашивание едва видно на слайде) образцов на тампонах, хранящихся в PrimeStore. ДНК выделяли, используя AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit и Invitrogen™ iPrep™ Purelink™ Virus Kit (Carlsbad, CA, USA), в соответствии с инструкциями производителя. Использовали набор LightCycler Mycobacterium detection kit в соответствии с инструкциями производителя. Полученные значения Cτ для каждого из образцов приведены в таблице 8;
На фигуре 3 показана диаграмма результатов ПЦР в реальном времени с использованием PrimeMix Universal MTB Assay, компоненты которого после хранения при температуре -20°C помещали в комнатную температуру различное число раз, т.е. один, три, пять и десять раз, а затем использовали в PrimeMix Universal MTB Assay;
На фигуре 4 показана диаграмма результатов анализа с помощью ПЦР в реальном времени, когда одноцепочечную ДНК внутреннего положительного контроля (IPC) детектировали в анализе PrimeMix с использованием детекционных зондов, меченных либо 6-FAM (FAM), либо красителем VIC™;
На фигуре 5 показана диаграмма результатов анализа с помощью ПЦР в реальном времени, когда различные количества ДНК, выделенной у пациентов с туберкулезом, а именно, 2 мкл, 3 мкл, 4 мкл и 5 мкл матричной ДНК, использовали в PrimeMix Universal MTB Assay;
На фигуре 6 показана диаграмма результатов ПЦР в реальном времени при проведении мультиплексного PrimeMix Universal MTB Assay, в котором одноцепочечную ДНК внутреннего положительного контроля (IPC) добавляют к раствору, содержащему туберкулезный образец, по сравнению с моноплексным анализом, в котором исходный раствор содержит только биологический образец, полученный от пациента, и раствор для хранения, т.е. PrimeStore;
-5
-6
-7
-8
На фигуре 7 показана диаграмма результатов анализа с помощью ПЦР в реальном времени, когда меняется концентрация внутреннего положительного контроля («IPC»), помещенного в PrimeStore, т.е. 10, 10, 10 и 10 нг/мкл IPC помещали в одинаковое количество PrimeStore. Зонды для IPC были помечены либо 6-FAM («IPC Fam»), либо красителем VIC™ («IPC Vic»). Также проводили мультиплексную реакцию, в которой специфичные к комплексу M. tuberculosis праймеры и зонды также добавляли в PrimeMix (результаты приведены в колонке, названной «MTB в мультиплексном анализе») вместе с IPC-праймерами и зондами (результаты показаны в колонке, названной «IPC Vic в мультиплексном анализе»);
На фигуре 8 показана диаграмма результатов анализа с помощью ПЦР в реальном времени, когда исходное количество образца M. tuberculosis составляет 15 мкл и 150 мкл (10-кратная разница), причем каждый исходно хранят в 1,5 мл PrimeStore (PS). Этот анализ проводили для IPC-зондов, меченных 6-FAM («IPC Fam») и красителем VIC™ («IPC Vic»), а также для моноплексного обнаружения M. tuberculosis («MTB») и мультиплексного обнаружения M. tuberculosis («MTB в мультиплексном анализе») и IPC, в котором зонд помечен красителем VIC™ («IPC Vic в мультиплексном анализе»);
На фигуре 9 показана диаграмма результатов анализа с помощью ПЦР в реальном времени, когда различные штаммы микобактерий, то есть пять различных штаммов M. tuberculosis, два различных штамма M. avium, один штамм M. intracellularae, один штамм M. gondii и один штамм M. kansasii, помещали в PrimeStore и затем выделяли из него, а затем анализировали, используя как моноплексный («MTB моноплексный»), так и мультиплексный («MTB в мультиплексном анализе») форматы процедуры PrimeMix. В моноплексном анализе используются только праймеры и зонды, специфичные к комплексу M. tuberculosis, тогда как в мультиплексном анализе используются как специфичные к комплексу M. tuberculosis праймеры и зонды, так и IPC-специфичные праймеры и зонды;
-4
-3
-2
-1
-1
-2
-3
-4
На фигуре 10 показана диаграмма результатов анализа с помощью ПЦР в реальном времени, когда количество M. tuberculosis из каждого конкретного очищенного штамма меняется, а именно 10, 10, 10, 10 представляют собой десятикратные разведения, в которых 10 представляет концентрацию ДНК 330 нг/мкл, 10 представляет концентрацию ДНК 33 нг/мкл, 10 представляет концентрацию ДНК 3,3 нг/мкл и 10 представляет концентрацию ДНК 0,33 нг/мкл. Проводили моноплексную реакцию, используя PrimeMix Universal MTB Assay со специфичными к комплексу M. tuberculosis праймерами и зондами (результаты показаны в колонке «МТВ моноплексный»), а также проводили мультиплексный PrimeMix assay, в котором присутствовали как специфичные к комплексу M. tuberculosis праймеры и зонды, так и IPC-специфичные праймеры и зонды (результаты показаны в колонках «МТВ в мультиплексном анализе» и «IPC в мультиплексном анализе»); и
-4
-3
-2
-1
-1
-2
-3
-4
На фигуре 11 показана диаграмма результатов анализа с помощью ПЦР в реальном времени, когда количество M. tuberculosis из конкретного очищенного штамма меняется, а именно 10, 10, 10, 10 представляют собой десятикратные разведения, в которых 10 представляет концентрацию ДНК 33 нг/мкл, 10 представляет концентрацию ДНК 3,3 нг/мкл, 10 представляет концентрацию ДНК 0,33 нг/мкл и 10 представляет концентрацию ДНК 0,033 нг/мкл, а для IPC-специфичного зонда используются различные метки - либо 6-FAM («IPC Fam»), либо краситель VIC™ («IPC Vic»).
Т
На фигуре 12 показана диаграмма, изображающая значения пороговых циклов (С) относительно концентрации неацетилированного BSA (конечная концентрация в мг/мл).
Описание изобретения
Настоящее изобретение преодолевает эти и другие недостатки, присущие предшествующему уровню техники, обеспечивая полезные, неочевидные и новые композиции для безопасного сбора, обращения и транспортировки биологических образцов, предположительно содержащих патогенные микроорганизмы, а также способы быстрого обнаружения, идентификации и количественного анализа этих патогенов посредством молекулярно-биологического анализа нуклеиновых кислот. В частности, изобретение относится к способам специфичного обнаружения одного или более штаммов патогенных микроорганизмов, таких как бактерии, вирусы, грибки и паразиты. В конкретных вариантах применения изобретение охватывает диагностический продукт, который позволяет осуществлять сбор образца-мишени, подготовку образца-мишени для анализа, выделение геномного материала из образца и последующую обработку геномного материала для идентификации одного или более организмов, если они присутствуют, в биологическом образце. В сочетании с одним или более устройствами для сбора образцов композиции, раскрытые в настоящем документе, позволяют безопасные сбор, транспортировку и хранение биологических образцов, даже в случае образцов, собранных в удаленной местности или в «полевых» условиях, причем время от сбора образца до анализа образца может составлять от нескольких часов до нескольких дней или даже недель.
Изобретение дополнительно охватывает композиции и способы, которые позволяют упростить и ускорить сбор образцов, подготовку и молекулярное обнаружение микроорганизмов, особенно таких микроорганизмов, как возбудители гриппа и туберкулеза. В конкретных вариантах применения изобретение охватывает диагностический продукт, посредством которого образец собирают, транспортируют и быстро подготавливают для последующей ПЦР без необходимости в холодовой цепи или дорогостоящих и трудоемких дезактивации и эмульгирования образца. Молекулярно-диагностический продукт включает термостабильную полную ПЦР-смесь праймеров, зондов и ферментов в готовых к использованию растворе или суспензии. Этот диагностический продукт можно использовать в центральных лабораториях и с высокопропускными системами или в сельских или мобильных клиниках с минимальными возможностями и в отсутствие надежного энергоснабжения, или даже с ручным устройством. Изобретение также охватывает способ эпидемиологического наблюдения и контроля за вспышкой заболевания, отслеживания пандемии и эпидемии и секвенирование нуклеотидных последовательностей микроорганизмов непосредственно из «полевых» образцов на месте сбора или используя недорогую, упрощенную, безопасную пересылку груза обычной почтой при температуре окружающей среды. Это изобретение также охватывает диагностический набор молекулярной детекции для безопасного сбора на месте лечения, быстрого выделения и быстрого ПЦР-обнаружения микроорганизмов, особенно патогенов.
С использованием специфичных к патогенам зондов для обнаружения нуклеиновых кислот (детекционных зондов) и праймеров для амплификации, раскрытых в настоящем документе, настоящее изобретение также относится к легкому обнаружению патогенов в собранных образцах и позволяет безопасную, экономичную и быструю оценку инфекции, в том числе, например, в качестве средства наблюдения для борьбы с потенциальной эпидемией, мониторинга вспышек, оценки развития заболевания у пострадавших или подверженных риску, и/или определения конкретных видов и/или штаммов микроорганизма для диагностического тестирования или определения конкретного терапевтического воздействия.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения популяции конкретных полинуклеотидов из образца, предположительно содержащего один или более патогенных микроорганизмов, или патогенные или инфицированные клетки (в общем, «патогены»). В общем смысле, этот способ обычно включает приведение в контакт с образцом, предположительно содержащим один или более патогенов в течение достаточного времени и с достаточным количеством композиции, которая содержит: a) один или более хаотропов, b) один или более детергентов, c) один или более восстанавливающих агентов, d) один или более хелатирующих агентов и e) одно или более поверхностно-активных веществ, чтобы убить по существу все, и предпочтительно, чтобы убить все патогенные микроорганизмы в образце, включая, например, патогенные бактерии, грибки и вирусы (если они присутствуют в образце). При осуществлении способа на практике по существу все (и предпочтительно, все) клетки и микроорганизмы, содержащиеся в образце, лизируются, и их клеточное содержимое высвобождается в раствор. Предпочтительно, по существу все (и более предпочтительно, все) клеточные ферменты, белки, пептиды, липопротеины и другое клеточное содержимое денатурируются и/или инактивируются, включая любые экзогенные или эндогенные нуклеазы, которые могут присутствовать в образце, так что полученная смесь становится по существу безопасной (и предпочтительно, безопасной) для обращения, хранения и/или транспортировки работниками без излишних затруднений и без необходимости беспокойства по поводу патогенности, токсичности или опасности обращения с образцом после его очистки, и любые патогенные организмы изначально присутствующие в нем, уничтожены, инактивированы, убиты и/или лизированы, что таким образом обезвреживает их. Композиции для сбора биологических образцов можно хранить в готовых к использованию концентрациях или в концентрированных формах, таких как, например, 2×, 5×, 10×, 20× 25×, 30× или более концентрированная форма, как это удобно или необходимо для конкретного применения.
Предпочтительно полученная таким способом популяция полинуклеотидов может быть по существу стабильной, так что нуклеиновые кислоты по существу не деградируют, и целостность полученной популяции полинуклеотидов будет предпочтительно по меньшей мере по существу сохраняться, так что полученные полинуклеотиды будут по существу неизменными и будут присутствовать в образце в форме, в которой они находились, когда клетки, содержащие их изначально, были разрушены/лизированы в результате действия компонентов, присутствующих в композиции. Как указано в настоящем документе, в предпочтительных вариантах изобретения популяция патоген-специфичных полинуклеотидов, полученных с использованием раскрытых способов, по существу стабильна и не деградирована, так что она может сохраняться в течение значительного времени даже при менее чем идеальной температуре окружающей среды (например, при температуре от примерно 0°C до даже примерно 40°C или выше) в течение длительных периодов времени (например, в течение периода от нескольких часов до нескольких дней, до нескольких недель или даже месяцев) без значительного ухудшения высвобожденных нуклеиновых кислот, что делает их подходящими для проведения последующего молекулярного анализа (например, матрично-зависимых реакций амплификации и др.) через несколько дней и до нескольких недель после экстракции нуклеиновых кислот, даже при невозможности хранения популяции полинуклеотидов, выделенных из образцов, в замороженном состоянии, на льду или в холодильнике между исходным сбором образцов и последующим молекулярным анализом.
Как указано в настоящем документе, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения (i) один или более хаотропов предпочтительно включают гуанидина тиоцианат, гуанидина изоцианат, гуанидина гидрохлорид или любую их комбинацию; (ii) один или более детергентов предпочтительно включают додецилсульфат натрия, додецилсульфат лития, тауродезоксихолат натрия, таурохолат натрия, гликохолат натрия, дезоксихолат натрия, холат натрия, алкилбензолсульфонат натрия, N-лауроилсаркозин или любую их комбинацию; (iii) один или более восстанавливающих агентов предпочтительно включают 2-меркаптоэтанол, трис(2-карбоксиэтил)фосфин, дитиотреитол, диметилсульфоксид или любую их комбинацию; (iv) один или более хелатирующих агентов предпочтительно включают этиленгликольтетрауксусную кислоту, гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусную кислоту, диэтилентриаминпентауксусную кислоту, N,N-бис(карбоксиметил)глицин, этилендиаминтетрауксусную кислоту, цитрат безводный, цитрат натрия, цитрат кальция, цитрат аммония, бицитрат аммония, лимонную кислоту, диаммония цитрат, цитрат железистого аммония, цитрат лития или любую их комбинацию; или (v) один или более буферов предпочтительно включают трис(гидроксиметил)аминометан, цитрат, 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту, N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту, 1,3-бис(трис(гидроксиметил)метиламино)пропан, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту, 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту, бикарбонат, фосфат или любую их комбинацию.
Предпочтительные составы, которые представляют собой готовые к использованию концентрации, включают: (а) (i) примерно 3 М гуанидина тиоцианата; (ii) примерно 1 мМ TCEP; (iii) примерно 10 мМ цитрата натрия; (iv) примерно 0,5% N-лауроилсаркозина; (v) примерно 0,0002% силиконового полимера; (vi) примерно 100 мМ 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диола (TRIS); и (vii) примерно 0,1 мМ EDTA, или (b) (i) примерно 3 М гуанидина тиоцианата; (ii) 1 мМ TCEP; примерно 10 мМ цитрата натрия; (iii) примерно 0,5% N-лауроилсаркозина натриевой соли; (iv) примерно 0,0002% силиконового полимера; (v) примерно 100 мМ TRIS; (vi) примерно 0,1 мМ EDTA; и (vii) примерно от 10% до примерно 25% этанола (об./об.).
Благодаря замечательной эффективности раскрытых составов в отношении легкости уничтожения и лизиса клеток, денатурации белковых клеточных компонентов и инактивации ферментов, таких как эндогенные и экзогенные нуклеазы, которые препятствуют сохранению интактных нуклеиновых кислот, авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что в некоторых случаях, по существу все микроорганизмы, присутствующие в образце, уничтожаются и/или лизируются в течение первых нескольких минут контакта с композицией. В некоторых случаях, уничтожение и лизис клеток по существу выполняется в течение примерно 3, или примерно 4, или примерно 5 минут, или примерно этого времени после контакта образца с композицией. Аналогично, в других случаях, приведение образца в контакт с композицией в течение примерно 6, или примерно 7, или примерно 8, или примерно 9, или примерно 10 минут или примерно этого же времени достаточно для того, чтобы по существу уничтожить и/или лизировать все патогены, которые могут присутствовать в собранном образце. Аналогичным образом, по существу все белки, ферменты, нуклеазы и т.п., высвобожденные из лизированных клеток, присутствующих в образце, по существу все инактивируются и/или денатурируются в течение всего лишь нескольких минут после приведения образца в контакт с композицией.
Предпочтительно образцы будут иметь биологическое, клиническое, ветеринарное или экологическое происхождение, а в некоторых вариантах осуществления образцы предпочтительно будут получены от человека, и в частности, от людей, которые имеют микробную инфекцию, у которых предполагается микробная инфекция, или которые подвержены риску развития микробной инфекции, такой как туберкулезная инфекция, вызванная одним или более штаммами или видами из рода Mycobacterium. Лицами, от которых получают образцы, могут быть пациенты, которые также имеют, предположительно имеют или имеют риск развития одного или более вторичных или третичных заболеваний, и в частности, вторичную и/или третичную инфекцию одним или более непатогенными видами бактерий, либо одним или более патогенными видами грибков или вирусов, или любой их комбинацией.
Предпочтительно популяция сегментов нуклеиновых кислот, содержащаяся с множеством выделенных и очищенных полинуклеотидов, полученных из образца, будет пригодна для праймер-зависимой амплификации, и особенно, когда полинуклеотиды хранятся в композиции в течение периода времени от примерно 1 до примерно 90 дней от сбора образцов до молекулярного анализа, даже при хранении в менее чем идеальных условиях, включая, например, хранение при температуре окружающей среды от примерно 0°С до примерно 40°С, предпочтительно при комнатной температуре.
В некоторых вариантах осуществления изобретения способ дополнительно включает стадию обнаружения в полученной популяции патоген-специфичных полинуклеотидов присутствие по меньшей мере первого патоген-специфичного сегмента нуклеиновой кислоты путем приведения популяции в контакт с меченым олигонуклеотидным детекционным зондом, причем присутствие меченого продукта гибридизации указывает на присутствие одного или более патоген-специфичных сегментов нуклеиновых кислот в полученной популяции полинуклеотидов.
В типовых вариантах осуществления изобретения меченый олигонуклеотидный детекционный зонд включает по меньшей мере область первой последовательности, которая состоит из последовательности SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:7. Композиция может дополнительно включать исходно известное количество по меньшей мере сегмента нуклеиновой кислоты первого внутреннего положительного контроля, составляющего в длину от примерно 50 до примерно 500, в альтернативном варианте, от примерно 70 до примерно 250 или, в другом альтернативном варианте, от примерно 90 до примерно 150 нуклеотидов, причем сегмент нуклеиновой кислоты внутреннего положительного контроля по существу не гибридизуется ни с геномными нуклеиновыми кислотами организма-хозяина, от которого был получен образец, ни с геномными нуклеиновыми кислотами патогена. Такие IPC подробно раскрыты в настоящем документе и могут включать одноцепочечную ДНК, двухцепочечную ДНК, одноцепочечную РНК, двухцепочечную РНК или двухцепочечный ДНК:РНК-гибрид. В некоторых вариантах осуществления сегмент нуклеиновой кислоты IPC включает по меньшей мере 40-нуклеотидную непрерывную последовательность, по меньшей мере 50-нуклеотидную непрерывную последовательность, по меньшей мере 60-нуклеотидную непрерывную последовательность, по меньшей мере 70-нуклеотидную непрерывную последовательность или по меньшей мере 80-нуклеотидную непрерывную последовательность из SEQ ID NO:8, или комплементарную ей последовательность.
В типовых вариантах осуществления изобретения IPC включает: (a) первый участок последовательности, который специфично связывается с меченым олигонуклеотидным детекционным зондом, имеющим примерно от 15 до примерно 40 нуклеотидов в длину, от примерно 18 до примерно 35 нуклеотидов в длину или от примерно 20 до примерно 30 нуклеотидов в длину, который специфичен к сегменту нуклеиновой кислоты первого внутреннего положительного контроля; (b) второй участок последовательности, который специфично связывается с прямым праймером для ПЦР-амплификации, имеющим примерно от 15 до примерно 45 нуклеотидов в длину, от примерно 25 до примерно 35 нуклеотидов в длину или от примерно 20 до примерно 30 нуклеотидов в длину; и (c) третий участок последовательности, который специфично связывается с обратным праймером для ПЦР-амплификации, имеющим примерно от 15 до примерно 45 нуклеотидов в длину, от примерно 18 до примерно 40 нуклеотидов в длину, от примерно 21 до примерно 35 нуклеотидов в длину или от примерно 24 до 30 нуклеотидов в длину, причем второй и третий участки последовательности функционально расположены, соответственно, выше и ниже (в 5′- и 3′-направлении) первого участка последовательности для осуществления ПЦР-направленной амплификации по меньшей мере первой части нуклеотидного сегмента первого внутреннего положительного контроля с прямого и обратного праймеров при условиях, эффективных для амплификации по меньшей мере первой части.
Способ, предпочтительно, также может дополнительно включать по меньшей мере следующие стадии: (a) выполнение по меньшей мере одной стадии термоциклирования, причем термоциклирование включает по меньшей мере первую стадию амплификации и по меньшей мере первую стадию гибридизации, причем по меньшей мере первая стадия амплификации включает приведение полученной популяции полинуклеотидов в контакт с композицией, которая содержит по меньшей мере пару различных, независимо выбранных специфичных праймеров для амплификации, термостабильную полимеразу, первый агент для осмолярности, содержащий бетаин или другое катионно-функционализированное цвиттерионное соединение, по меньшей мере первый референсный краситель и набор дезоксинуклеозидтрифосфатов для получения по меньшей мере первого патоген-специфического продукта амплификации; и (b) обнаружение присутствия полученного таким образом продукта амплификации путем приведения его в контакт с первым меченым патоген-специфичным олигонуклеотидным детекционным зондом, причем присутствие меченого продукта гибридизации указывает на присутствие одного или более патоген-специфичных сегментов нуклеиновых кислот в полученной популяции полинуклеотидов. В таких вариантах осуществления изобретения два различных, независимо выбранных, патоген-специфичных амплификационных праймера могут предпочтительно включать первый олигонуклеотидный праймер, имеющий от 18 до примерно 30 нуклеотидов в длину, и второй олигонуклеотидный праймер, имеющий от 18 до примерно 30 нуклеотидов в длину, причем каждый из первого и второго праймеров специфично гибридизуется с первой и второй различными областями последовательности, соответственно. Для обнаружения и идентификации микобактерий пара праймеров предпочтительно содержит последовательность 5′′-SEQ ID NO:1 или комплементарную ей последовательность.
В родственных вариантах осуществления изобретения способ по изобретению необязательно может дополнительно включать стадию выполнения праймер-зависимой амплификации по меньшей мере первого участка последовательности нуклеотидного сегмента внутреннего положительного контроля в полученной популяции полинуклеотидов и количественного определения нуклеотидного сегмента внутреннего положительного контроля, присутствующего в полученной популяции полинуклеотидов.
Аналогичным образом, способ необязательно может дополнительно включать стадию сравнения количества нуклеотидного сегмента внутреннего положительного контроля, присутствующего в композиции, на одной или более стадиях в течение аналитического процесса, с количеством IPC, который присутствовал в исходной композиции до первого добавления образца к среде для лизиса/хранения/транспортировки, или с количеством нуклеиновых кислот-мишеней, которые присутствуют в исходной композиции. Такое сравнение может служить для демонстрации того, что количество IPC, еще содержащееся в образце в более поздний момент анализа, сравнимо или по существу такое же, как известное количество IPC, которое присутствовало в композиции IPC до добавления образца в нее, и может служить для определения количества представляющих интерес нуклеиновых кислот-мишеней в собранных образцах, или позже анализируемых компонентов. Такая информация может также являться показателем количества нуклеиновых кислот, остающихся в образце по сравнению с изначально присутствующими, и может обеспечить оценку степени деградации исходно присутствующего образца полинуклеотидов с течением времени.
В некоторых случаях применения технологии по настоящему изобретению, праймер-зависимую амплификацию по меньшей мере первой области последовательности нуклеотидного сегмента внутреннего положительного контроля осуществляют после амплификации специфичного для патогена нуклеотидного сегмента, в то время как в других аспектах праймер-зависимую амплификацию по меньшей мере первой области последовательности нуклеотидного сегмента внутреннего положительного контроля осуществляют по существу одновременно с амплификацией специфичного для патогена нуклеотидного сегмента.
Продукт амплификации нуклеотидного сегмента внутреннего положительного контроля может быть обнаружен с использованием подходящего олигонуклеотидного детекционного зонда, содержащего первую детектируемую метку, а продукт амплификации патоген-специфичного нуклеотидного сегмента обнаруживается с использованием олигонуклеотидного детекционного зонда, содержащего вторую детектируемую метку, отличную от первой.
Такой способ необязательно может также дополнительно включать обнаружение присутствия одного или более генов лекарственной устойчивости в популяции полученных полинуклеотидов.
Изобретение также относится к композиции, совместимой с праймер-зависимой реакцией амплификации, которая предпочтительно включает: (a) один или более буферов; (b) один или более агентов для осмолярности; (c) один или более альбуминовых белков; (d) один или более хелатирующих агентов; (e) одну или более солей; (f) по меньшей мере пару различных, независимо выбранных, патоген-специфичных амплификационных праймеров, причем каждый из первого и второго праймеров специфически гибридизуется с первой и второй различными областями последовательности; (g) патоген-специфичный олигонуклеотидный детекционный зонд, содержащий первую детектируемую метку, которая специфично гибридизуется с третьей областью последовательности; (h) по меньшей мере одну термостабильную полимеразу, способную к праймер-зависимой реакции амплификации; и (i) множество дезоксинуклеозидтрифосфатов, причем каждый присутствует в количестве, достаточном для амплификации по меньшей мере первого патоген-специфичного продукта амплификации. Композиции, готовые для термоциклирования (например, готовые для ПЦР), можно хранить в готовых к использованию концентрациях или в концентрированных формах, таких как, например, 2×, 5×, 10×, 20× 25×, 30× или более концентрированная форма, как это удобно или необходимо для конкретного применения.
В иллюстративных вариантах осуществления изобретения (a) один или более буферов предпочтительно включают трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS); (b) один или более агентов для осмолярности полимеразной цепной реакции предпочтительно включают Ν,Ν,Ν-триметилглицин (бетаин), диметилсульфоксид (ДМСО), формамид, глицерин, неионные детергенты, бычий сывороточный альбумин (BSA), полиэтиленгликоль, хлорид тетраметиламмония или любую их комбинацию; (c) один или более альбуминовых белков предпочтительно включают BSA, HAS или любой альбумин млекопитающего; (d) один или более хелатирующих агентов предпочтительно включают этиленгликольтетрауксусную кислоту, гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусную кислоту, диэтилентриаминпентауксусную кислоту, N,N-бис(карбоксиметил)глицин, этилендиаминтетрауксусную кислоту, безводный цитрат, цитрат натрия, цитрат кальция, цитрат аммония, бицитрат аммония, лимонную кислоту, цитрат диаммония, цитрат железистого аммония, цитрат лития или любую их комбинацию; и (e) одна или более солей предпочтительно включают хлорид калия, сульфат магния, глутамат калия или любую их комбинацию; и пара праймеров предпочтительно включает: (i) первый олигонуклеотидный праймер, имеющий от 18 до примерно 30 нуклеотидов в длину, который предпочтительно включает по меньшей мере первую область последовательности, которая состоит из последовательности, идентичной по меньшей мере на 95% патоген-специфичной нуклеотидной последовательности; и (ii) второй олигонуклеотидный праймер, имеющий от 18 до примерно 30 нуклеотидов в длину, который предпочтительно включает по меньшей мере первую область последовательности, которая состоит из последовательности, по меньшей мере примерно на 90% идентичной, предпочтительно по меньшей мере примерно на 95% идентичной и еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 98% идентичной патоген-специфичной нуклеотидной последовательности или комплементарной ей последовательности.
Патоген-специфичный олигонуклеотидный детекционный зонд предпочтительно составляет от 24 до примерно 35 нуклеотидов в длину и более предпочтительно включает по меньшей мере первую область последовательности, которая состоит из последовательности, которая по меньшей мере на 85% идентична, по меньшей мере на 90% идентична, по меньшей мере на 95% идентична или по меньшей мере на 98% или в большей степени идентична по меньшей мере первой непрерывной нуклеотидной последовательности из патоген-специфичной последовательности или комплементарной ей последовательности. Композиция необязательно может дополнительно включать один или более внутренних референсных красителей, совместимых с полимеразной цепной реакцией, таких как те, которые включают один или более флуорофоров, один или более гасителей, одну или более репортерных молекул, один или более агентов, интеркалирующих в нуклеиновые кислоты, или любую их комбинацию.
В иллюстративных вариантах осуществления изобретения композиция в готовых к применению концентрациях предпочтительно включает: (a) примерно 50 мМ TRIS; (b) примерно 70 мМ хлорида калия; (c) примерно 3 мМ сульфата магния; (d) примерно 45 мМ бетаина; (e) примерно 0,03 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина; (f) примерно 0,1 мМ EDTA; (g) примерно от 0,01 мкМ до примерно 1 мкМ красителя; (h) примерно 4 мкМ первого олигонуклеотидного праймера от 18 до примерно 30 нуклеотидов в длину; (i) примерно 4 мкМ второго олигонуклеотидного праймера от 18 до примерно 30 нуклеотидов в длину; (j) примерно 6 мкМ патоген-специфичного олигонуклеотидного детекционного зонда от 24 до примерно 35 нуклеотидов в длину; (k) примерно 1 Ед. Taq-полимеразы; и (l) примерно 0,2 мМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.
Детектируемая метка может предпочтительно включать одну или более радиоактивных меток, одну или более люминесцентных меток, одну или более хемилюминесцентных меток, одну или более флуоресцентных меток, одну или более фосфоресцирующих меток, одну или более магнитных меток, одну или более спиновых меток, одну или более ферментативных меток или любую их комбинацию. Примерные детектируемые метки включают, без ограничения, флуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM), 6-карбоксифлуоресцеина N-сукцинимидиловый эфир (6-FAMSE), краситель VIC или любую их комбинацию.
Как указано в данном описании, изобретение также относится к диагностическим наборам, которые предпочтительно включают одну или более композиций, раскрытых в настоящем документе, и инструкции по применению набора для обнаружения патоген-специфичного сегмента нуклеиновой кислоты в водном образце; необязательно набор может дополнительно включать (обычно в отдельном, другом контейнере) первую МТМ-композицию, которая содержит: a) один или более хаотропов, b) один или более детергентов, c) один или более восстанавливающих агентов, d) один или более хелатирующих агентов; и e) одно или более поверхностно-активных веществ, причем каждое присутствует в количестве, достаточном для того, чтобы по существу убить или лизировать одну или более патогенных или инфицированных клеток, или для денатурации или инактивации одного или более белков, ферментов или нуклеаз, высвобожденных из клеток после внесения в композицию на достаточное время. В некоторых вариантах осуществления изобретения набор может также дополнительно включать (предпочтительно в МТМ-композицию) известное количество по меньшей мере нуклеотидного сегмента первого внутреннего положительного контроля (и предпочтительно, составляющего от примерно 50 до примерно 500 нуклеотидов в длину), причем нуклеотидный сегмент внутреннего положительного контроля по существу не гибридизуется (и предпочтительно, специфично не гибридизуется) ни с геномными нуклеиновыми кислотами организма-хозяина, от которого был получен образец, ни с геномными нуклеиновыми кислотами одного или более микробных патогенов, присутствие которых предполагается в образце. Как указано в настоящем описании, такие наборы необязательно могут также дополнительно включать одно или более экстракционных устройств для выделения и очистки популяции полинуклеотидов из лизированного/высвобожденного/денатурированного образца после приведения в контакт с МТМ-составом. Такое экстракционное устройство может быть портативным, настольным или даже ручным устройством, которое предпочтительно включает: (i) фильтрационный сосуд, который имеет по меньшей мере один приемный конец и который содержит мембранный фильтр, приспособленный для связывания популяции полинуклеотидов на себе, причем мембранный фильтр расположен по меньшей мере по существу по всей ширине фильтрационного сосуда и по меньшей мере частично в нем, и (ii) дозатор, приспособленный для контролируемого дозирования и принудительного введения определенного количества жидкости, функционально связанный с фильтрационным сосудом для осуществлении фильтрации жидкости через него; и b) инструкции по использованию экстракционного устройства для получения популяции очищенных полинуклеотидов из водного образца, предположительно содержащего по меньшей мере первый патоген.
Настоящее изобретение преимущественно улучшает традиционный сбор образцов, гарантирует лизис любых патогенных микроорганизмов, содержащихся в них, и облегчает безопасную и эффективную транспортировку и хранение таких образцов от точки сбора до точки идентификации и анализа. Более того, раскрытые в настоящем документе композиции среды для транспортировки молекул облегчают стабилизацию нуклеиновых кислот, высвобожденных из собранных микроорганизмов, а также поддерживают качество и сохраняют целостность высвобожденных нуклеиновых кислот в течение длительного времени, даже при температуре окружающей среды или менее чем идеальных условиях хранения.
Соответственно, настоящее изобретение преимущественно предоставляет состав для сбора и сохранения образцов, который лизирует биологические патогены, стабилизирует высвобожденные нуклеиновые кислоты (как РНК, так и ДНК) и предпочтительно по меньшей мере по существу сохраняет, и предпочтительно полностью сохраняет, целостность собранных полинуклеотидов, так что по меньшей мере первая часть из них легко доступна и идеально подходит для последующего молекулярно-диагностического анализа нуклеиновых кислот, содержащихся в собранном образце.
Раскрытые в настоящем документе составы для «одностадийного» выделения/хранения/транспортировки предпочтительно выполняют по меньшей мере одну или более, предпочтительно все из следующих основных функций: инактивацию или уничтожение патогенов в образце; лизис клеток и высвобождение нуклеиновых кислот из клеток; инактивацию клеточных ферментов, включая эндогенные и экзогенные нуклеазы, для предупреждения деградации высвобожденных нуклеиновых кислот; обеспечение легкого сбора и безопасного обращения с образцом/транспортировки образца выделенных полинуклеотидов при температуре окружающей среды в течение длительных периодов времени без необходимости охлаждения или стандартных минусовых температур хранения; эффективную стабилизацию нуклеиновых кислот во время последующего обращения с образцом, транспортировки и/или хранения образца; и сохранение и/или поддержание целостности по меньшей мере первой части популяции полинуклеотидов, содержащихся в нем, в течение времени, достаточного для молекулярной характеристики и идентификации по меньшей мере первого нуклеотидного сегмента, содержащегося в нем.
В конкретных аспектах, описанных в настоящем документе, в частности, при выполнении способа анализа образцов, собранных в удаленной местности или «полевых» условиях, композиции среды для транспортировки молекул (MTM) по настоящему изобретению предпочтительно стабилизируют собранный биологический образец по меньшей мере на время, достаточное для обеспечения последующего молекулярного анализа, без существенной деградации или потери по меньшей мере первой популяции нуклеиновых кислот, полученной из собранного образца. Предпочтительно, MTM-композиции по изобретению облегчают сбор/транспортировку/хранение биологических образцов, собранных в них, в течение длительных периодов времени (от нескольких часов до нескольких дней, или даже до несколько недель или месяцев и в течение более длительного времени) при температуре окружающей среды, так что собранные образцы не требуют охлаждения и/или замораживания для их сохранности для последующего молекулярного анализа. Еще более предпочтительно, раскрытые в настоящем документе МТМ-составы стабилизируют и сохраняют собранные нуклеиновые кислоты в достаточной степени для проведения последующей амплификации и идентификации по меньшей мере первой нуклеотидной последовательности по меньшей мере первого патогенного микроорганизма, присутствующего в собранном образце.
В иллюстративных вариантах осуществления изобретения МТМ-составы, описанные в настоящем документе, необязательно дополнительно включают по меньшей мере первый внутренний положительный контроль (IPC), способствующий улучшенному выделению микробных полинуклеотидов, а также обеспечивающий определение точности последовательности и сохранности собранного образца. Типичные известные полинуклеотидные последовательности могут присутствовать в лизирующем реагенте во время сбора образцов, и последующий анализ этого известного количества IPC можно использовать для достоверного мониторинга точности популяции полинуклеотидов на протяжении фаз сбора/транспортировки/анализа в описанных способах идентификации.
В практическом осуществлении изобретения примеры патогенов, идентифицируемых с использованием раскрытой в настоящем документе среды для транспортировки, включают, но не ограничиваются ими, один или более видов микобактерий, в том числе, без ограничения, один или более видов или штаммов рода Mycobacterium, в том числе, один или более возбудителей туберкулеза.
Целостность популяции полинуклеотидов по меньшей мере по существу сохраняется, и популяция полинуклеотидов остается по существу недеградированной, когда популяция полинуклеотидов хранится при температуре от примерно 10°С до примерно 40°С в течение примерно от 1 до примерно 30 дней перед стадией термоциклирования в композиции, которая включает: (а) (i) примерно 3 М тиоцианата гуанидина; (ii) примерно 1 мМ TCEP; (iii) примерно 10 мМ цитрата натрия; (iv) примерно 0,5% N-лауроилсаркозина; (v) примерно 0,0002% силиконового полимера; (vi) примерно 100 мМ 2-амино-2-гидроксиметилпропан-1,3-диола (TRIS); и (vii) примерно 0,1 мМ EDTA; или (b) (i) примерно 3 М тиоцианата гуанидина; (ii) 1 мМ TCEP; примерно 10 мМ цитрата натрия; (iii) примерно 0,5% N-лауроилсаркозина натриевой соли; (iv) примерно 0,0002% силиконового полимера; (v) примерно 100 мМ TRIS; (vi) примерно 0,1 мМ EDTA; и (vii) от примерно 10% до примерно 25% этанола (об./об.). В некоторых вариантах осуществления изобретения целостность популяции полинуклеотидов по меньшей мере по существу сохраняется, и популяция полинуклеотидов остается по существу недеградированной, когда композиция, содержащая популяцию полинуклеотидов, хранится при температуре от примерно 10°С до примерно 40°С в течение периода от примерно 1 до примерно 7 дней или в течение периода от примерно 7 дней до примерно 14 дней, или 14 дней до примерно 28 дней.
В конкретных вариантах осуществления изобретения целостность полинуклеотидов в популяции по существу сохраняется таким образом, что по меньшей мере примерно 75% или по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85% или по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 98%, а в некоторых случаях по меньшей мере примерно 99% от исходных полинуклеотидов остаются по меньшей мере по существу полноразмерными при хранении композиции при температуре от примерно 10°С до примерно 40°С в течение периода от примерно 1 до примерно 30 дней, а в некоторых вариантах осуществления изобретения в течение периода от примерно 1 до 14 дней.
При осуществлении изобретения на практике анализируемую таким образом популяцию полинуклеотидов предпочтительно получали из биологического образца, причем биологические образцы получали от млекопитающего (включая, например, людей, приматов, кроме человека, домашний скот и т.д.). Образцы могут быть получены в любое подходящие время до амплификации и последующего обнаружения продуктов амплификации, но в конкретных аспектах изобретения время между сбором образцов, выделением популяции полинуклеотидов из образцов и амплификацией/детекционным анализом нуклеиновых кислот-мишеней, представляющих интерес, является довольно коротким, например, составляет от нескольких минут до нескольких часов от сбора образцов до обнаружения продукта амплификации, в то время как в других вариантах осуществления изобретения амплификация/детекционный анализ нуклеиновых кислот-мишеней, представляющих интерес, может быть более длительным.
В одном варианте осуществления изобретения способ сбора биологического образца, предположительно содержащего по меньшей мере первую популяцию полинуклеотидов, выделенную из патогена, включает: помещение биологического образца в первое устройство для сбора, содержащее по меньшей мере первый раствор, содержащий: a) один или более хаотропов; b) один или более детергентов; c) один или более восстанавливающих агентов; d) один или более хелатирующих агентов; и e) одно или более поверхностно-активных веществ, причем каждое присутствует в количестве, достаточном для денатурации одного или более белков или инактивации одной или более нуклеаз; причем раствор для сбора уничтожает, инактивирует или дезактивирует любые патогены, которые присутствуют в образце, для безопасного обращения и транспортировки; и причем целостность популяции полинуклеотидов по меньшей мере по существу сохраняется, и популяция полинуклеотидов остается по существу недеградированной, когда раствор для сбора, содержащий популяцию полинуклеотидов, хранится при температуре от примерно 10°С до примерно 40°С в течение периода от примерно 1 до примерно 42 дней до выделения популяции полинуклеотидов из раствора для сбора.
В дополнительном варианте осуществления изобретения уничтожение, инактивация или дезактивация происходят в течение примерно пяти минут или меньшего времени после контакта с раствором для сбора. В некоторых вариантах осуществления изобретения уничтожение, инактивация или дезактивация происходят в течение примерно двух минут после контакта с раствором для сбора. В других вариантах осуществления изобретения уничтожение, инактивация или дезактивация происходят в течение примерно одной минуты после контакта с раствором для сбора.
В некоторых вариантах осуществления изобретения популяцию полинуклеотидов, полученную из биологического образца, дополнительно анализируют. Изобретение также охватывает смесь реагентов для обнаружения микробных последовательностей, причем смесь реагентов включает один или более специфичных к микроорганизмам праймеров, зонды или ферменты, или их комбинацию, присутствующую в смеси, которая по меньшей мере по существу стабильна при температуре окружающей среды и адаптирована и выполнена с возможностью использования с устройством для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). В одном варианте осуществления изобретения смесь реагентов по существу стабильна при температуре окружающей среды в течение по меньшей мере примерно 5 дней и до двух недель. В другом варианте осуществления изобретения обнаружение микробных последовательностей происходит в течение примерно 90 минут после выделения их из образца. Смесь реагентов можно использовать для идентификации микробных последовательностей, таких как последовательности патогенов, бактерий или вирусов, или их комбинации. Смесь реагентов по настоящему изобретению, также называемая в настоящем документе «PrimeMix», а в некоторых случаях - «PrimeMix Universal MTB», также может быть использована для идентификации последовательностей вирусных или бактериальных штаммов, или даже видоспецифичных штаммов туберкулеза.
Дополнительный вариант осуществления изобретения может включать композицию, содержащую по меньшей мере одну специфичную для микроорганизма последовательность нуклеиновой кислоты или биологический образец, предположительно содержащий по меньшей мере одну специфичную для микроорганизма последовательность нуклеиновой кислоты; раствор, содержащий: (i) один или более буферов (причем каждый предпочтительно присутствует в композиции в количестве от примерно 1 мМ до примерно 1 М); (ii) один или более агентов для осмолярности или альбуминовых белков, по меньшей мере один из которых содержит бетаин (причем каждый предпочтительно присутствует в композиции в количестве от примерно 1 мМ до примерно 1 М); (iii) один или более хелатирующих агентов (причем каждый предпочтительно присутствует в композиции в количестве от примерно 0,01 мм до примерно 1 мМ); (iv) один или более референсных красителей (причем каждый предпочтительно присутствует в композиции в количестве от примерно 0,01 мкМ до примерно 50 мМ, более предпочтительно от примерно 0,02 мкМ до примерно 1 мкМ); и (v) одну или более солей (причем каждая предпочтительно присутствует в композиции в количестве от примерно 50 мМ до примерно 1 М); и первую пару специфичных для патогенного организма праймеров амплификации. В некоторых вариантах осуществления изобретения композиция дополнительно содержит специфичный для патогена зонд. В одном варианте осуществления изобретения референсный краситель присутствует в количестве от примерно 0,01 мкМ до примерно 1 мкМ. Предпочтительно композиция включает одну или более солей. Предпочтительными солями являются хлорид калия, хлорид магния, сульфат магния, глутамат калия или любая их комбинация. Предпочтительно, концентрация соли в композиции составляет от примерно 0,5 мМ до примерно 50 мМ.
Для регулирования рН составов желательно включать один или более буферов, которые стабилизируют нуклеиновые кислоты и ферменты. Предпочтительный диапазон рН составляет от примерно 6,0 до примерно 9,5, предпочтительно от примерно 6,5 до примерно 8,0 и более предпочтительно от примерно 6,5 до примерно 7,5. Предпочтительно, рН буфера и/или общей композиции находится в пределах одной единицы от pKa буфера, более предпочтительно в пределах примерно 0,5 единицы, более предпочтительно в пределах примерно 0,2 единицы и более предпочтительно в пределах примерно 0,1 единицы, причем все показатели измерены при выбранной температуре, предпочтительно при температуре окружающей среды. Типичные буферы включают, без ограничения, трис(гидроксиметил)аминометан (Tris), цитрат, 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (BES), 1,3-бис(трис(гидроксиметил)метиламино)пропан (Bis-Tris), 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), 3-(N-морфолино)пропансульфоновую кислоту (MOPS), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (бицин), N-[трис(гидроксиметил)метил]глицин (трицин), N-2-ацетамидо-2-иминодиуксусную кислоту (ADA), N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (ACES), пиперазин-1,4-бис(2-этансульфоновую кислоту) (PIPES), бикарбонат, фосфат или любую их комбинацию. В предпочтительном варианте осуществления буфер включает TRIS.
Для оптимизации условий реакции можно использовать по меньшей мере первый агент для осмолярности, особенно при высоком содержании остатков гуанина и цитозина в последовательности, который может включать, без ограничения, бетаин, триметилглицин, глицин бетаин, диметилсульфоксид (ДМСО), формамид, дезоксиинозин, глицерин, 7-деазадезоксигуанозина трифосфат или гидроксид натрия, или любую их комбинацию.
Типичные хелатирующие агенты включают, без ограничения, этиленгликольтетрауксусную кислоту (EGTA), гидроксиэтилэтилендиаминтриуксусную кислоту (HEDTA), диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), N,N-бис(карбоксиметил)глицин (NTA), этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), цитрат безводный, цитрат натрия, цитрат кальция, цитрат аммония, бицитрат аммония, лимонную кислоту, цитрат диаммония, цитрат калия, цитрат магния, цитрат железистого аммония, цитрат лития или любую их комбинацию. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения хелатирующий агент включает EDTA, цитрат или их комбинацию. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения хелатирующий агент включает EDTA.
По меньшей мере первый референсный краситель, предпочтительно инертный химически, необязательно можно использовать со способом для нормализации результатов, полученных при использовании флуоресцентных соединений, таких как те, которые используют в методах FRET. Референсный краситель (если он включен) может обеспечить внутренний стандарт, на который можно нормализовать сигнал репортерного красителя. Такой референсный краситель может включать, без ограничений, пассивные референсные красители, такие как флуоресцеин, 5-карбокси-X-родамин и коммерческие препараты, такие как ROX™, или их комбинации. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения референсный краситель включает ROX™.
Предпочтительно, композиции дополнительно включают дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), такие как дезоксиаденозинтрифосфат, дезоксигуанозинтрифосфат, дезоксицитидинтрифосфат, дезокситимидинтрифосфат или дозоксиурозинтрифосфат, или их комбинацию, в количестве от примерно 0,1 мМ до примерно 50 мМ.
Композиции по изобретению могут дополнительно включать один или более дополнительных соединений или реагентов, в том числе, без ограничения, альбумин. Альбумин в общем относится к любому белку, который растворим в воде, умеренно растворим в концентрированных растворах соли и претерпевает тепловую денатурацию. Альбумины обычно присутствуют в плазме крови и отличаются от других белков крови тем, что они не гликозилированы. Предпочтительно альбумин представляет собой бычий сывороточный альбумин (BSA), сульфат магния, воду и кислоту или основание, такие как хлористоводородная кислота и гидроксид натрия. Кислоты или основания могут быть добавлены в конечный раствор для регулирования рН. Предпочтительно, BSA добавляют в концентрации от примерно 0,01 мкг/ мкл до примерно 0,5 мкг/мкл.
Композиции по изобретению могут дополнительно включать одну или более полимераз. Одна или более полимераз могут включать, но не ограничиваться ими, Taq-полимеразу и высокоточные полимеразы. Предпочтительно, одна или более полимераз присутствуют в количестве от примерно 1 Ед. фермента до примерно 10 на примерно 50 мкл конечного раствора.
В конкретных вариантах осуществления изобретения композиция также предпочтительно включает по меньшей мере первый олигонуклеотидный детекционный зонд, который включает радиоактивную, люминесцентную, хемилюминесцентную, флуоресцентную, ферментативную, магнитную или спиновую метку, или их комбинацию. Флуоресцентные метки могут включать флуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM) или 6-карбоксифлуоресцеин-N-сукцинимидиловый эфир (6-FAMSE), или т.п., или их комбинацию. Предпочтительная концентрация праймера и/или зонда для каждой нуклеиновой кислоты составляет от примерно 1 пмоль до примерно 10 мкМ.
Изобретение дополнительно относится к способу обнаружения присутствия или отсутствия патоген-специфичного сегмента нуклеиновой кислоты в популяции полинуклеотидов, полученных из биологического образца, причем способ включает: (a) проведение по меньшей мере одной стадии термоциклирования, при этом термоциклирование включает по меньшей мере первую стадию амплификации и по меньшей мере первую стадию гибридизации, причем по меньшей мере первая стадия амплификации включает приведение в контакт популяции полинуклеотидов, полученной из биологического образца, предположительно содержащего патоген-специфичный сегмент нуклеиновой кислоты, с композицией, которая содержит по меньшей мере два различных, независимо выбранных, патоген-специфичных амплификационных праймера, полимеразу, первый агент для осмолярности, содержащий бетаин, необязательно (но предпочтительно) по меньшей мере первый референсный краситель и множество дезоксинуклеозидтрифосфатов, получая патоген-специфичный продукт амплификации, когда патоген-специфичный сегмент нуклеиновой кислоты присутствует в образце; и (b) обнаружение присутствия продукта амплификации путем приведения в контакт продукта амплификации с патоген-специфичным олигонуклеотидным детекционным зондом, содержащим первую детектируемую метку, причем присутствие меченого продукта гибридизации указывает на присутствие одного или более патоген-специфичных нуклеотидных сегментов в популяции полинуклеотидов, причем пара различных, независимо выбранных, патоген-специфичных амплификационных праймеров содержит первый олигонуклеотидный праймер от 18 до примерно 30 нуклеотидов в длину и второй олигонуклеотидный праймер от 18 до примерно 30 нуклеотидов в длину, причем каждый из первого и второго праймеров специфично гибридизуется, соответственно, с первой и второй отдельными областями последовательности в патоген-специфичной последовательности, либо комплементарной или обратно-комплементарной ей последовательности.
4
Типичные составы Mycobacterium PrimeMix по изобретению описаны в примерах настоящего документа и включают, без ограничения, композицию, которая включает: (a) примерно 1 Ед. Taq-полимеразы; (b) примерно 6 мкМ детекционного зонда, который включает нуклеотидную последовательность, содержащую, по существу состоящую из или альтернативно состоящую из нуклеотидной последовательности 5′-ACCAGCACCTAACCGGCTGTGGGTA-3′ (SEQ ID NO:4) или 5′-AGGGTTCGCCTACGTGGCCTTTGT-3′ (SEQ ID NO:7); (c) примерно 4 мкМ обратного олигонуклеотидного праймера менее чем примерно 50, предпочтительно, менее чем примерно 40, и еще более предпочтительно, менее чем примерно 30 нуклеотидов в длину, который содержит, по существу состоит из, или альтернативно, состоит из нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична одной или более из последовательностей 5′-ACAAAGGCCACGTAGGCGA-3′ (SEQ ID NO:3) или 5′-ACCGACGCCTACGTCGCA-3′ (SEQ ID NO:6), или их комплементарным последовательностям; (d) примерно 4 мкМ прямого олигонуклеотидного праймера менее чем примерно 50, предпочтительно менее чем примерно 40, и еще более предпочтительно, менее чем примерно 30 нуклеотидов в длину, который содержит, по существу состоит из, или альтернативно, состоит из нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 98% идентична одной или более из последовательностей 5′-CTCGTCCAGCGCCGCTTC-3′ (SEQ ID NO:2) или 5′-ACCAGCACCTAACCGGCT-3′ (SEQ ID NO:5), или их комплементарным последовательностям; (e) примерно 50 мМ Tris; (f) примерно 70 мМ KCl; (g) примерно 3 мМ MgSO; (h) примерно 45 мМ бетаина; (i) примерно 0,05 мкМ ROX или аналогичного референсного красителя; (j) примерно 0,025 мкг/мкл сверхчистого BSA; (k) примерно 0,2 мМ всех dNTP; и (l) примерно 0,1 мМ EDTA.
Дополнительный вариант осуществления изобретения включает способ обнаружения микробных последовательностей, который включает получение геномной нуклеиновой кислоты из биологического образца и анализ геномного материала путем добавления нуклеиновой кислоты к реакционной смеси из одного или более специфичных к микроорганизму праймеров, зондов или ферментов, или их комбинации, причем смесь по существу стабильна при комнатной температуре и приспособлена для использования с ПЦР-устройством. В другом варианте осуществления изобретения ПЦР-устройство включает оборудование для обнаружения флуоресценции для детекции ПЦР в режиме реального времени.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу обнаружения присутствия или отсутствия специфичного для микобактерий сегмента нуклеиновой кислоты и, в конкретных аспектах, относится к способу обнаружения присутствия или отсутствия определенного типа, подтипа или штамма M. tuberculosis. В типовых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу идентификации видов и штаммов микобактерий, которые содержат один или более специфичных для IS6110 нуклеотидных сегментов в популяции полинуклеотидов, которая предпочтительно получена из биологического образца.
m
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу быстрого обнаружения в биологическом образце конкретной полинуклеотидной последовательности, такой как специфичная для микобактерий последовательность IS6110. Во всеобъемлющем и общем смысле этот способ включает амплификацию популяции нуклеотидов, предположительно содержащей конкретную последовательность, с использованием стандартных способов, таких как ПЦР, и прямого и обратного праймеров, специфичных к целевой последовательности, гибридизацию специфичного набора зондов с полученным одноцепочечным ПЦР-продуктом, проведение анализа кривой плавления и анализ изменения T гибрида одноцепочечного ПЦР-продукта с гибридизационными зондами.
Метка на зонде может включать, без ограничения, радиоактивную, люминесцентную, хемилюминесцентную, флуоресцентную, ферментативную, магнитную или спиновую метки, известные в данной области молекулярной биологии. В иллюстративных вариантах осуществления изобретения меченый зонд содержит по меньшей мере первое соединение, связывающееся с малой бороздкой нуклеиновых кислот. В одном таком способе для обнаружения полинуклеотидов с использованием последовательности меченого «зонда» используется процесс резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). Типовые методики FRET-детекции часто включают пару флуорофоров, включающую донорный флуорофор и акцепторный флуорофор, где донорный флуорофор способен передавать резонансную энергию акцепторному флуорофору. В типовых методах FRET-анализа спектр поглощения донорного флуорофора по существу не перекрывает спектр поглощения акцепторного флуорофора. Используемый в настоящем документе термин «донорный олигонуклеотидный зонд» относится к олигонуклеотиду, который помечен донорным флуорофором из флуоресцентной пары резонансной передачи энергии. Используемый в настоящем документе термин «акцепторный олигонуклеотидный зонд» относится к олигонуклеотиду, который помечен акцепторным флуорофором из флуоресцентной пары передачи резонансной энергии. Используемый в настоящем документе термин «FRET-олигонуклеотидная пара» обычно включает «якорный» или «донорный» олигонуклеотидный зонд и «акцепторный» или «сенсорный» олигонуклеотидный зонд, и такая пара образует FRET-взаимодействие, когда донорный олигонуклеотидный зонд и акцепторный олигонуклеотидный зонд оба гибридизуются с комплементарными последовательностями нуклеиновой кислоты-мишени. Подходящие пары флуорофоров для использования в качестве пар передачи флуоресцентной резонансной энергии хорошо известны специалистам в данной области и включают, но не ограничиваются ими, флуоресцеин/родамин, фикоэритрин/Cy7, флуоресцеин/Cy5, флуоресцеин/Cy5.5, флуоресцеин/LC Red 640 и флуоресцеин/LC Red 705 и т.п.
В обычном применении способа на практике можно также проводить стадию термоциклирования на одном или более «отрицательных» и/или «положительных» контрольных образцах, как обычно делается в области молекулярно-генетического анализа для обеспечения целостности, правильности и точности способа. Использование таких контролей является обычным для специалиста в данной области техники и не нуждается в дальнейшем описании в настоящем документе. Аналогичным образом, при осуществлении изобретения на практике также может быть желательным включение в популяцию выделяемых полинуклеотидов одного или более известных «внутренних положительных контролей» (IPC), чтобы дополнительно гарантировать целостность, правильность и/или точность раскрытого способа.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предполагается, что добавление нуклеиновых кислот (например, РНК и/или ДНК) полезно для различных целей и вариантов применения раскрытых способов: a) в качестве «носителя» (ранее было показано, что добавление небольшого количества дополнительной РНК/ДНК повышает/увеличивает общий выход образцов, в частности, образцов, которые могут содержать небольшое количество мишени, т.е. клеток, вирусов, бактерий); b) в качестве IPC для последующих молекулярных процессов и для отслеживания или мониторинга точности препарата нуклеиновой кислоты из образца от момента сбора до обнаружения; и c) для сравнения с «калибратором» для последующего количественного анализа, например, qRT-PCR и т.п. В таких вариантах осуществления изобретения одна или более из известных или «контрольных» нуклеиновых кислот могут быть добавлены к композиции в конечной концентрации от примерно 1 аг до примерно 1 мг, более предпочтительно от примерно 1 фг до примерно 1 мкг, и еще более предпочтительно, от примерно 1 пг до примерно 1 нг.
В иллюстративном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенной одноцепочечной (оц) или двухцепочечной (дц) РНК, ДНК, ПНК или их гибриду, которые пригодны: (a) в качестве молекулы-носителя для помощи при выделении полинуклеотидов из биологического образца, предположительно содержащего нуклеиновые кислоты; и/или (b) в качестве IPC (т.е. «известной», «репортерной», «контрольной», «стандартной» или «маркерной») последовательности для мониторинга целостности и точности сбора образцов и выделения/стабилизации полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к выделенным дцРНК, дцДНК, дцПНК или их гибриду, которые можно использовать в качестве молекулы-носителя и/или IPC. В других вариантах осуществления изобретение относится к выделенным оцРНК, оцДНК, оцПНК или их гибриду, которые можно использовать в качестве молекулы-носителя и/или IPC. В типовых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенной молекуле оцРНК, которая пригодна в качестве как молекулы-носителя, так и последовательности IPC.
Такие молекулы могут быть выделены из природных источников, получены в лаборатории, или в альтернативном варианте, могут представлять собой гибрид, содержащий как природную, так и неприродную последовательности. Как указано в настоящем документе, вследствие того, что композиции по изобретению особенно пригодны для выделения и характеристики биологических образцов, полученных от млекопитающих (и в частности, от человека), которые предположительно содержат полинуклеотиды патогенного происхождения, предпочтительно, чтобы последовательность(и), используемые в качестве носителя и/или соединений положительного контроля, по существу содержали первичную нуклеотидную последовательность, которая обычно не встречается в геноме млекопитающего, либо в геноме организма, который является патогенным для такого млекопитающего. Примеры млекопитающих включают, без ограничения, коров, овец, свиней, волков, собак, лошадей, кошек, медведей, мышей, львов, зайцев, коз и приматов, кроме человека.
Предпочтительно, эта последовательность, не принадлежащая млекопитающему, не специфичная ни для патогенной, ни для репортерной последовательностям, не имеет перекрестной реактивности, т.е. по существу не гибридизуется или, предпочтительно, не гибридизуется, с последовательностями млекопитающего или специфичными для патогена последовательностями, и, таким образом, некодирующие, невырожденные (т.е. несмысловые) последовательности особенно предпочтительны в составе контрольных последовательностей/последовательностей-носителей для того, чтобы минимизировать гибридизацию контрольных последовательностей/последовательностей-носителей с членом выделенной популяции полинуклеотидов, полученной из собранного образца. Поэтому типичные контрольные последовательности/последовательности-носители по существу, или предпочтительно, не связываются (например, не гибридизуются в жестких условиях) с популяцией полинуклеотидов, выделенной из генома млекопитающих, или с популяцией полинуклеотидов, выделенной из геномов бактерий, грибов, вирусов, которые являются патогенными для млекопитающего. Типичные жесткие условия гибридизации, известные специалистам в данной области, включают, без ограничения: (a) предварительную промывку в растворе, содержащем примерно 5× SSC, 0,5% SDS и 1,0 мМ EDTA (рН 8,0); (b) гибридизацию при температуре от примерно 60°С до примерно 70°С в 5× SSC в течение ночи; и (c) последующую промывку при температуре от примерно 65°С до примерно 70°С в течение 20 мин. каждым из растворов 2×, 0,5× и 0,2× SSC, содержащих 0,1% SDS; или условия гибридизации, эквивалентные указанным.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к смеси реагентов, включающей вышеуказанные праймеры и зонды, а также к наборам, содержащим такие композиции для проведения способа термоциклической амплификации. В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к диагностическому набору для амплификации/обнаружения нуклеиновых кислот, который обычно включает (в подходящем контейнере) набор патоген-специфичных олигонуклеотидных амплификационных праймеров, описанных в настоящем документе, и инструкции по использованию набора праймеров в ПЦР-амплификации популяции полинуклеотидов, полученной из биологического образца или пробы. Такие наборы необязательно могут дополнительно включать (в том же или в других контейнерах) олигонуклеотидный детекционный зонд, который специфично связывается с продуктом амплификации, полученным ПЦР-амплификацией популяции полинуклеотидов, полученной из биологического образца или пробы, содержащих или предположительно содержащих специфичный для патогена сегмент нуклеиновой кислоты. Такие наборы необязательно могут также дополнительно включать (в том же или в другом контейнере) любой один или более реагентов, разбавителей, ферментов, детектируемых меток (включая, без ограничения, одну или более радиоактивных, люминесцентных, хемилюминесцентных, флуоресцентных, ферментативных, магнитных или спиновых меток), dNTP и т.п., которые могут потребоваться для проведения одной или более термоциклических амплификаций популяции полинуклеотидов, описанных в настоящем документе.
Другой аспект настоящего изобретения относится к набору для сбора и/или хранения, и/или транспортировки биологического образца до генетического анализа популяции полинуклеотидов, находящейся в нем. Настоящее изобретение позволяет собирать минимальное количество биологического материала, такого как мокрота, а именно, можно использовать от примерно 0,01 мл до примерно 25 мл, предпочтительно от примерно 0,05 мл до примерно 10 мл, более предпочтительно от примерно 0,1 мл до примерно 5 мл. В таких вариантах осуществления изобретения набор предпочтительно включает один или более буферов, поверхностно-активных веществ, хаотропных веществ, ДНКаз, РНКаз или других подобных реагентов для выделения и/или очистки нуклеиновых кислот, которые могут потребоваться для получения образца для анализа, такого как описано выше.
В дополнительных вариантах осуществления изобретения наборы по настоящему изобретению также необязательно могут дополнительно включать одно или более устройств или аппаратов для выделения, описанных выше, для того, чтобы облегчить выделение или разделение нуклеиновых кислот из собранного биологического образца. Наборы по изобретению также необязательно могут дополнительно включать одну или более портативных, прочных или применимых в полевых условиях термоциклических систем для ПЦР-амплификации и/или одной или более систем, устройств или инструментов для облегчения обнаружения, количественного определения и/или распределения детектируемой(ых) метки(ок), используемых для визуализации продуктов амплификации, получаемых в ходе осуществления способа на практике.
Диагностические реагенты и наборы по настоящему изобретению могут быть упакованы для коммерческого распространения и необязательно могут дополнительно включать одно или более устройств для сбора, доставки, транспортировки или хранения, предназначенных для сбора, обращения или анализа образца или пробы. Контейнер(ы) для таких наборов, как правило, могут включать по меньшей мере один флакон, пробирку, колбу, бутылку, чашку для образцов или другой контейнер, в которых может быть помещена(ы) композиция(и), и, предпочтительно, разделена на аликвоты для индивидуального сбора, транспортировки и хранения образцов. Набор может также включать более крупную емкость, например, коробку, которая включает указанные выше контейнеры вместе с другим оборудованием, инструкциями и т.п. Набор может также необязательно включать один или более дополнительных реагентов, буферов или соединений, а также необязательно может дополнительно включать инструкции по применению набора при сборе клинических, диагностических, экологических или судебных образцов, а также инструкции по хранению и транспортировке таких образцов после их внесения в одну или более раскрытых композиций.
Предусмотрено, что в некоторых вариантах осуществления изобретения композиции, описанные в настоящем документе, могут быть составлены таким образом, что сбор образцов и процесс амплификации/обнаружения нуклеиновых кислот полностью можно осуществлять в удаленном месте, полевых условиях, в условиях боевых действий, в сельских условиях или в других нелабораторных условиях, не ограничивая по существу правильность, точность или эффективность методики амплификации/обнаружения. Такие аспекты настоящего изобретения обеспечивают особенное преимущество по сравнению со стандартными трудоемкими протоколами выделения/сбора/транспортировки/хранения/анализа, для выполнения которых требуется от нескольких дней до нескольких недель, и которые часто необходимо проводить в условиях, требующих охлаждения или замораживания образца и/или аналитических реагентов для должного выполнения анализа. Обеспечивая реакционные смеси, которые включают смесь со всеми необходимыми компонентами для выделения, хранения и стабилизации полинуклеотидов, а также смеси со всеми необходимыми реагентами для амплификации выбранных нуклеотидов-мишеней (включая, без ограничения, амплификационные праймеры и детекционные зонды, описанные в настоящем документе, отдельно или в комбинации с одним или более ПЦР-буферами, разбавителями, реагентами, полимеразами, детектируемыми метками и т.п.), в стабильной при хранении, устойчивой при температуре окружающей среды смеси реагентов, настоящее изобретение позволяет значительную экономию затрат, сокращение времени и другую экономию за счет масштаба по сравнению со многими коммерчески доступными стандартными термоциклическими методами анализа на основе олигонуклеотидных зондов. Когда для амплификации используется методика ПЦР в реальном времени, обнаружение необязательно можно проводить в конце заданного числа циклов, или в альтернативном варианте, после одного или более циклических повторов в протоколе амплификации.
Композиции и способы по настоящему изобретению направлены на сбор клинического или ветеринарного образца, или на систему сбора судебных образцов или образцов из окружающей среды и могут включать одно или более устройств для сбора и один или более реагентов для эффективного: 1) получения высокого выхода соответствующего образца, который превышает доступный на сегодняшний день в данной области; 2) инактивации потенциально инфекционных биологических патогенов, таких как члены комплекса M. tuberculosis, в результате которой они становятся нежизнеспособными и обеспечивается возможность работы с ними, их пересылки или транспортировки с минимальной вероятностью высвобождения патогена или загрязнения им; или 3) фактически стабилизации и предохранения лизированных «голых» РНК/ДНК-полимеров от гидролиза или разрушения нуклеазами в течение длительного периода при температуре окружающей среды до поступления образцов в диагностическую лабораторию; и, предпочтительно, для достижения двух или нескольких, или всех трех этих целей. Сбор образцов по настоящему изобретению обеспечивает следующие преимущества: инактивацию, уничтожение, и/или лизис микроорганизмов, вирусов или патогенов; разрушение и/или инактивацию экзогенных или эндогенных нуклеаз, включая, без ограничения, РНКазу и/или ДНКазу; совместимость с различными стандартными системами выделения, очистки и амплификации нуклеиновых кислот; сохранение целостности РНК и/или ДНК в образце; облегчение транспортировки и пересылки при температуре окружающей среды или тропической температуре, даже в течение длительных периодов времени или в условиях значительных температурных перепадов; и пригодность для короткого (от нескольких часов до нескольких суток), среднего (от нескольких дней до нескольких недель) или длительного (от нескольких недель до нескольких месяцев) срока хранения выделенных нуклеиновых кислот. Подходящие композиции (также именуемые «PrimeStore») и способы можно найти в принадлежащей заявителю патентной публикации США № 2009-0312285, поданной 1 октября 2008 (полное содержание которой специально включено в настоящий документ путем прямой ссылки на нее).
В типовых вариантах осуществления изобретения целостность популяции полинуклеотидов в биологическом образце и/или правильность по меньшей мере первой последовательности по меньшей мере одного из полинуклеотидов, полученных из образца, по меньшей мере по существу сохраняется (т.е. по меньшей мере 75%, в некоторых случаях примерно 80%, в других вариантах осуществления изобретения по меньшей мере примерно 85% или даже по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95% или по меньшей мере примерно 98% нуклеотидов в популяции являются по существу полноразмерными), когда композиция, включающая образец, хранится при температуре от примерно -20°С до примерно 40°С, или от примерно -10°С до примерно 40°С, или от примерно 0°С до примерно 40°С, или от примерно 10°С до примерно 40°С на протяжении от примерно 1 до примерно 7 дней или более длительного времени; в альтернативном варианте, при температуре от примерно -20°С до примерно 40°С, или от примерно -10°С до примерно 40°С, или от примерно 0°С до примерно 40°С, или от примерно 10°С до примерно 40°С на протяжении от примерно 7 до примерно 14 дней или более длительного времени; или в альтернативном варианте, при температуре от примерно -10°С до примерно 40°С, или от примерно 0°С до примерно 40°С, или от примерно 10°С до примерно 40°С, или от примерно 20°С до примерно 40°С на протяжении от примерно 14 до примерно 42 дней или более продолжительного времени. Кроме того, целостность полинуклеотидов в популяции может по существу сохраняться таким образом, что по меньшей мере примерно 80% исходных полинуклеотидов остаются по меньшей мере по существу полноразмерными при хранении композиции при температуре от примерно -20°С до примерно 40°С, предпочтительно от примерно 10°С до примерно 40°С на протяжении от примерно 1 до примерно 14 дней или более длительного времени; или в альтернативном варианте, при температуре от примерно -20°С до примерно 40°C, предпочтительно от примерно 10°С до примерно 40°С на протяжении от примерно 14 до примерно 42 дней или более длительного времени.
В альтернативном варианте, целостность популяции полинуклеотидов в биологическом образце, по меньшей мере по существу поддерживается таким образом, что по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 85%, по меньшей мере примерно 90% или по меньшей мере примерно 95%, 96%, 97%, 98% или 99% или более нуклеотидов в популяции присутствуют в растворе по сравнению с количеством, присутствующим в растворе после сбора образца. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения целостность образца будет по существу поддерживаться таким образом, что все или почти все специфичные для бактерии полинуклеотиды, присутствующие в исходном образце, будут сохраняться (т.е. их деградация не обнаруживается) в течение продолжительного периода.
При осуществлении на практике раскрытых способов предпочтительно, чтобы от времени сбора до времени выделения, очистки или характеристики популяции полинуклеотидов в образце менее чем примерно 20% популяции полинуклеотидов, первоначально присутствующих в собранном образце, деградировало с течением времени при последующем хранении. Предпочтительно, чтобы по существу менее чем примерно 15% популяции полинуклеотидов, первоначально присутствующих в собранном образце, деградировало с течением времени при последующем хранении, более предпочтительно, менее чем примерно 10% популяции полинуклеотидов, первоначально присутствующих в собранном образце, деградировало с течением времени при последующем хранении, и еще более предпочтительно, менее чем примерно 5% популяции полинуклеотидов, первоначально присутствующих в собранном образце, деградировало с течением времени при последующем хранении. В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения не более чем примерно 5%, примерно 4%, примерно 3%, примерно 2% или примерно 1% популяции полинуклеотидов, первоначально присутствующих в собранном образце, деградировало с течением времени при последующем хранении. Такое сохранение высокой целостности образца является предпочтительным независимо от условий хранения образца и будет по существу сохраняться на протяжении по меньшей мере примерно 1 дня, по меньшей мере примерно 5 дней, по меньшей мере примерно 7 дней, по меньшей мере примерно 14 дней, по меньшей мере примерно 21 дня, по меньшей мере примерно 30 дней, по меньшей мере примерно 45 дней, по меньшей мере примерно 60 дней, по меньшей мере примерно 90 дней или даже по меньшей мере примерно 120 дней и более длительного времени.
Т
Хотя присутствие, целостность или правильность для конкретной полинуклеотидной последовательности, полученной в результате или используемой в осуществлении настоящего изобретения на практике, могут быть определены с использованием любой стандартной методики, известной специалистам в данной области молекулярной биологии, в одном варианте осуществления изобретения используется ПЦР-амплификация. Аналогичным образом, определение целостности интересующего полинуклеотида может включать определение порогового цикла ПЦР (С) при заданных условиях, а определение правильности последовательности, качественной целостности собранных нуклеиновых кислот могут быть проведены стандартными способами секвенирования ДНК или РНК, включая, без ограничения, химические способы по Максаму-Гилберту, способ дидезокси-терминации цепи по Sanger et al., способы с использованием флуорофоров по Mathies et al. или способы пиросеквенирования, описанные Nyren и Ronaghi. Например, секвенирование нуклеотидной последовательности можно провести путем клонирования очищенных ампликонов с использованием TOPO 2.0 Cloning Kit (Invitrogen™), а затем секвенирования с использованием набора реагентов BigDye Terminator v3.1. Не включенные флуоресцентные нуклеотиды можно удалить с помощью 96-луночного планшетного набора DyeEx в соответствии с рекомендациями производителя (Qiagen). Кроме того, нуклеотидное секвенирование можно провести с использованием ABI 3100 Genetic Analyzer (ABI Inc., Foster City, CA, USA).
ВНУТРЕННИЙ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ («IPC»)
В некоторых вариантах осуществления изобретения раствор и способы сбора могут дополнительно включать по меньшей мере один внутренний положительный контроль (IPC) для мониторинга правильности обработанных образцов, для мониторинга целостности и правильности сбора образцов и выделения/стабилизации полинуклеотидов, и/или для мониторинга последующих молекулярных процессов или анализа. Способы включают помещение по меньшей мере одного нуклеотидного сегмента IPC в растворы для сбора образцов по настоящему изобретению или объединение нуклеотидного сегмента IPC с выделенной популяцией полинуклеотидов для мониторинга последующего молекулярного процессинга образца и/или выделенной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления IPC присутствует в качестве компонента раствора PrimeStore и, как таковой, является по существу стабильным и по существу недеградированным при хранении в растворе в течение длительного времени при комнатной температуре. В этих случаях IPC может рассматриваться как часть популяции полинуклеотидов при выделении из раствора для сбора образцов.
Предпочтительно, последовательность IPC не является перекрестно-реактивной, т.е. по существу, или предпочтительно, не гибридизуется с последовательностями млекопитающего или патоген-специфичными последовательностями, и, таким образом, особенно предпочтительными в составе контрольных последовательностей/последовательностей-носителей являются некодирующие, невырожденные (т.е. несмысловые) последовательности для того, чтобы минимизировать гибридизацию контрольных последовательностей/последовательностей-носителей с членом выделенной популяции полинуклеотидов, полученной из собранного образца. Поэтому типичные контрольные последовательности/последовательности-носители по существу, или предпочтительно, не связываются (например, не гибридизуются в жестких условиях) с популяцией полинуклеотидов, выделенной из генома млекопитающих, или с популяцией полинуклеотидов, выделенной из геномов бактерий, грибов, простейших, вирусов, которые являются патогенными для млекопитающего.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным одноцепочечной (оц)-РНК, оц-ДНК, оц-ПНК, двухцепочечной (дц)-РНК, дц-ДНК, дц-ПНК или их гибриду, которые пригодны в качестве IPC. В предпочтительных вариантах осуществления, если желательно выделение и обнаружение нуклеиновой кислоты, специфичной для комплекса M. tuberculosis, то используют одноцепочечный сегмент дезоксирибонуклеиновой кислоты. В иллюстративных вариантах осуществления изобретение относится к IPC-последовательностям, которые включают, состоят по существу из или состоят из нуклеотидной последовательности, которая предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 96%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 98% или по меньшей мере примерно на 99% или в большей степени идентична любой одной из SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:21.
Если дальнейший молекулярный процессинг образца или выделенной нуклеиновой кислоты состоит из идентификации нуклеиновых кислот, специфичных для комплекса M. tuberculosis, то IPC-последовательности по настоящему изобретению должны содержать по меньшей мере первый участок последовательности, который специфично гибридизуется (т.е. связывается) с соответствующим детектируемым зондом, включая, без ограничения, молекулярно-меченные зонды и их производные. Примерами меченых зондов являются те, которые включают радиоактивные, люминесцентные, хемилюминесцентные, флуоресцентные, ферментативные, магнитные или спиновые метки, известные в данной области молекулярной биологии. В предпочтительных вариантах осуществления зонд помечен 6-FAM или красителем VIC™. В иллюстративных вариантах осуществления изобретения меченый зонд содержит по меньшей мере первое вещество, связывающееся с маленькой бороздкой. В других вариантах осуществления изобретения, в которых будут использовать стратегии амплификации, такие как ПЦР, IPC-последовательности по настоящему изобретению содержат по меньшей мере второй участок последовательности, который специфично связывается с прямым праймером для ПЦР-амплификации, и третий участок последовательности, который специфично связывается с обратным праймером для ПЦР-амплификации.
ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ РАСТВОРОВ, СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБРАЗЦЫ, И РАСТВОРА(ОВ) ДЛЯ СБОРА ОБРАЗЦОВ ПО ИЗОБРЕТЕНИЮ
Как известно любому среднему специалисту в данной области, после сбора популяции полинуклеотидов из биологического образца, можно осуществить любой способ выделения или отделения нуклеиновых кислот из/от раствора для сбора и дебриса микроорганизма, такого как белки, липиды и углеводы, включая, но не ограничиваясь этим, использование стандартной очистки смесью фенол/хлороформ, способы на основе кремниевых смол и способы выделения на основе магнитных стеклянных частиц. Композиции и способы, используемые в настоящем изобретении, совместимы с большинством, но не со всеми, коммерчески доступными композициями и способами для выделения нуклеиновых кислот, такими как, но не ограниченными этим, набор QiaAmp DNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany), система MagNA Pure 96 System (Roche Diagnostics, USA) и система для выделения NucliSENS easyMAG extraction system (bioMérieux, France). Как правило, выделенная геномная нуклеиновая кислота присутствует в количестве от примерно 0,1 микролитра до примерно 10000 микролитров, более предпочтительно от примерно 1 микролитра до примерно 1000 микролитров и более предпочтительно от примерно 10 микролитров до примерно 100 микролитров. Типичное количество нуклеиновой кислоты составляет 25 микролитров.
В типичных композициях и способах PrimeMix праймеры и зоны по изобретению добавляют к определенному составу, обеспечивая возможность проведения ПЦР. Предпочтительно, примерно 8 мкМ прямого и обратного праймеров, примерно 6 мкМ зонда и примерно 1 Ед. Taq-полимеразы присутствуют в PrimeMix. Примеры диапазонов концентраций дополнительных компонентов PrimeMix можно найти в таблице 1A и PrimeStore в таблице 1B.
ТАБЛИЦА 1А
ДИАПАЗОНЫ СОСТАВОВ ТИПОВЫХ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИЙ PRIMEMIX
Реагент
Диапазоны конечных концентраций компонентов
1. Один или более буферов, например: Tris, цитрат, MES, BES, Bis-Tris, HEPES, MOPS, бицин, трицин, ADA, ACES, PIPES, бикарбонатный, фосфатный
от примерно 1 мМ до примерно 1 М
2. Один или более агентов для осмолярности полимеразной цепной реакции, катионные функционализированные цвиттерионные соединения, например: бетаин, ДМСО, формамид, глицерин, неионные детергенты, BSA, полиэтиленгликоль, хлорид тетраметиламмония
от примерно 1 мМ до примерно 1 М
3. Один или более хелатирующих агентов, например: EGTA, HEDTA, DTPA, NTA, EDTA, безводный цитрат, цитрат натрия, цитрат кальция, цитрат аммония, бицитрат аммония, лимонная кислота, цитрат диаммония, цитрат калия, цитрат магния, цитрат железистого аммония, цитрат лития
от примерно 0,01 мМ до примерно 1 мМ
4. Один или более красителей, например: флуоресцеин, 5-карбокси-X-родамин, ROX™
от примерно 0,01 мМ до примерно 50 мМ
5. Одна или более солей, например: хлорид калия, сульфат магния, глутамат калия
от примерно 50 мМ до примерно 1 М
6. Одна или более полимераз, например: Taq, Pfu, KOD, полимеразы с горячим стартом, полимеразы следующего поколения
от примерно 0,05 Ед. до примерно 1 Ед.
7. Дезоксинуклеозидтрифосфаты, например: дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ, дУТФ
от примерно 0,1 мМ до примерно 1 мМ
Предпочтительно добавить к этому составу такое достаточное количество праймеров и зонда, чтобы амплифицировать и обнаружить целевую мишень.
2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол (TRIS) был получен от Applied Biosystems/Ambion (Austin, TX, USA). 2-[2-(Бис(карбоксиметил)амино)этил(карбоксиметил)амино]уксусная кислота (EDTA), GIBCO UltraPure BSA были получены от Invitrogen™ Corp. (Carlsbad, CA, USA). Все другие реагенты коммерчески доступны от Sigma-Aldrich или USB Corporation.
В одном варианте осуществления изобретения 10× буферный раствор готовят следующим образом:
Добавить 2500 мкл 2 M Tris (pH 8,0) в стерильную криопробирку объемом 5,0 мл.
Добавить 3500 мкл 2 M KCl в пробирку.
4
Добавить 300 мкл MgSO в пробирку.
Добавить 900 мкл 5M бетаина в пробирку.
Добавить 200 мкл ROX™ в пробирку.
Добавить 50 мкл BSA в пробирку.
Добавить 800 мкл смеси dNTP в пробирку.
Добавить 20 мкл 0,5 M EDTA в пробирку.
Добавить 1600 мкл + 130 мкл безнуклеазной воды в пробирку.
Закрыть пробирку и быстро смешать на вортексе для тщательного смешивания содержимого.
Довести рН раствора до рН 8,1-8,3, используя 38% HCl.
Сделать аликвоты раствора или перенести раствор в стерильный контейнер. Хранить при температуре примерно -20°C до использования.
При использовании с PrimeMix этот 10× буферный раствор разбавляют от примерно 0,5× до примерно 2×, предпочтительно, до 1×.
Таблица 1В
ДИАПАЗОНЫ СОСТАВОВ ТИПОВЫХ КОМПОНЕНТОВ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИЙ PRIMESTORE™
Реагент
Диапазоны конечных концентраций компонентов
1. Хаотропный агент, например:
гуанидина тиоцианат
от примерно 0,5 М до примерно 6 М
или гуанидина гидрохлорид
от примерно 0,5 М до примерно 6 М
или гуанидина изоцианат
от примерно 0,5 М до примерно 6 М
2. Анионный детергент, например:
N-лауроилсаркозин (в частности, натриевая соль)
от примерно 0,15% до примерно 1% (мас./об.)
или додецилсульфат натрия
то же самое
додецилсульфат лития
то же самое
гликохолат натрия
то же самое
дезоксихолат натрия
то же самое
тауродезоксихолат натрия или
то же самое
холат натрия
от примерно 0,1% до примерно 1% (мас./об.)
3. Восстанавливающий агент, например:
ТСЕР
от примерно 0,5 мМ до примерно 30 мМ
или β-МΕ, DTT, формамид или ДМСО
от примерно 0,05 М до примерно 0,3 М
4. Хелатирующий агент, например:
цитрат натрия
от примерно 0,5 мМ до примерно 50 мМ
или EDTA, EGTA, HEDTA, DTPA, NTA или APCA
от примерно 0,01 мМ до примерно 1 мМ
5. Буфер (например, TRIS, HEPES, MOPS, MES, Bis-Tris и т.д.)
от примерно 1 мМ до примерно 1 М
6. Кислота (например, HCl или лимонная кислота
Достаточное количество до рН примерно 6-7, предпочтительно 6,4-6,8
7. Безнуклеазная вода
Достаточное количество до заданного объема
Необязательно, один или более из:
8. Поверхностно-активное вещество/противовспенивающее вещество, например:Antifoam A или Tween
от примерно 0,0001% до примерно 0,3% (мас./об.)
9. Алканол (например, метанол, этанол, пропанол и т.д.)
от примерно 1% до примерно 25% (об./об.)
10. РНК или ДНК
от примерно 1 пг до примерно 1 мкг/мл
Композиции и способы для мультиплексного анализа биологических образцов
В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть желательным обеспечить реакционные смеси, которые включают более одной пары амплификационных праймеров и детекционного зонда, специфичного для данной нуклеотидной последовательности-мишени. Например, если желательно определить наличие двух или более различных типов патогенных микроорганизмов, то можно составить композиции по изобретению, содержащие первую пару амплификационных праймеров, которые специфично связываются по меньшей мере с первой областью-мишенью специфичного для одного патогена полинуклеотида, и вторую пару амплификационных праймеров, которые специфично связываются по меньшей мере с первой областью-мишенью специфичного для другого патогена полинуклеотида.
В альтернативном варианте, если желательно определить присутствие двух или более различных штаммов, то можно составить композиции по изобретению, содержащие первую пару амплификационных праймеров, которые специфично связываются по меньшей мере с первой областью-мишенью специфичного к конкретному патогену полинуклеотида, и вторую пару амплификационных праймеров, которые специфично связываются по меньшей мере с первой областью-мишенью второго, отличного от первого специфичного к патогену полинуклеотида.
Кроме того, если желательно определить присутствие одного или более дополнительных микроорганизмов, т.е. определить, имеет ли пациент сочетанную инфекцию, другую бактериальную, грибковую или вирусную инфекцию, например, грамположительными и грамотрицательными бактериями, вирусом иммунодефицита человека, пневмококками, гриппом, Yesinia pestis, Pseudomonas sp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Streptococcus sp., Moraxella catarrhalis, Enterobacteriaceae, Haemophilus sp., Staphylococcus sp., Rhinovirus, Respiratory syncytial virus, Coronavirus, Adenovirus, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Pneumocystis jiroveci и т.п.
В некоторых случаях желательно провести тестирование на гены лекарственной устойчивости или мутации в полинуклеотиде, специфичном для комплекса M. tuberculosis. Мультирезистентные (MDR) штаммы туберкулеза могут возникнуть в результате последовательного накопления мутаций, придающих устойчивость к монотерапии, или в результате одностадийного процесса, такого как приобретение MDR-элемента. Был обнаружен ряд различных мутаций, придающих устойчивость к рифампину, INH, стрептомицину, этамбутолу, ETH, PZA, канамицину и хинолонам. Некоторые из этих MDR-изолятов возникают потому, что случайные мутации в генах, которые кодируют мишени отдельных противомикробных агентов, отбираются на субтерапевтических уровнях препаратов в результате ошибок в процессе лечения, плохого соблюдения схем лечения или других факторов.
В этих вариантах осуществления изобретения композиция по изобретению может быть составлена таким образом, что она содержит первую пару амплификационных праймеров, которые специфично связываются по меньшей мере с первой областью-мишенью конкретного патоген-специфичного полинуклеотида, и вторую пару амплификационных праймеров, которые специфично связываются по меньшей мере с первой областью-мишенью полинуклеотида лекарственной устойчивости, найденного, например, в мультирезистентных штаммах или широкорезистентных штаммах. Например, эта резистентность может включать устойчивость к рифампицину и/или изониазиду (устойчивость к этим противотуберкулезным препаратам первой линии классически определяет мультирезистентный [MDR] туберкулез), а также к одному или более членов хинолонового семейства, или канамицину, капреомицину или амикацину, или любую их комбинацию.
Для обнаружения конкретного(ых) продукта(ов) амплификации, получаемых с помощью таких композиций, они также дополнительно включают первый детекционный зонд, который специфично связывается с продуктом амплификации, полученным с первой парой амплификационных праймеров, и второй отличный от первого детекционный зонд, который специфично связывается с амплификационным продуктом, полученным со второй парой амплификационных праймеров. В таких композициях предпочтительно, чтобы два, три или четыре детекционных зонда, присутствующих в препарате, отличались друг от друга, так что каждый из зондов (при специфичном связывании с мишенью в полученной амплификационной смеси) можно индивидуально обнаружить с помощью стандартных методик. Такие отличия между зондами легко достижимы в данной области, например, с использованием детекционных зондов, которые включают детектируемые элементы, которые флуоресцируют на двух, трех или четырех явно отличающихся длинах волн.
В некоторых аспектах изобретения амплификацию и/или обнаружение целевых нуклеиновых кислот можно осуществлять последовательно, тогда как в других аспектах может быть желательным амплифицировать и/или детектировать множество целевых нуклеиновых кислот одновременно. Например, данный биологический образец можно сначала скринировать на присутствие целевой(ых) последовательности(ей), специфичных для M. tuberculosis, и, если ничего не найдено, то образец затем повторно скринируют на присутствие последовательностей-мишеней, специфичных для M. bovis, M. africanum, M. microti, M. cannetti, M. caprae и M. pinnipedi.
ТИПИЧНЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В соответствии с устоявшимся соглашением патентного права единственное число, используемое в данной заявке, включая формулу изобретения, означает «один или более».
Используемые в настоящем документе термины «примерно» и «приблизительно» являются взаимозаменяемыми и в общем должны пониматься, как относящиеся к диапазону чисел вокруг данного числа, а также ко всем числам в указанном диапазоне (например, «примерно от 5 до 15» означает «от примерно 5 до примерно 15», если не указано иное). Более того, следует понимать, что все числовые диапазоны в настоящем документе включают все целые числа в диапазоне.
Используемый в настоящем документе термин «нуклеиновая кислота» включает один или более типов полидезоксирибонуклеотидов (содержащих 2-дезокси-D-рибозу), полирибонуклеотидов (содержащих D-рибозу) и любой другой тип полинуклеотида, который представляет собой N-гликозид пуринового или пиримидинового основания, или модифицированного пуринового или пиримидинового основания (в том числе основания, лишенного гетероциклического кольца). Термин «нуклеиновая кислота» в контексте настоящего изобретения также включает полимеры рибонуклеозидов или дезоксирибонуклеозидов, субъединицы которых ковалентно связаны между собой, как правило, фосфодиэфирной связью, но в некоторых случаях фосфоротиоатной, метилфосфонатной и т.п. «Нуклеиновые кислоты» включают одно- и двухцепочечную ДНК, а также одно- и двухцепочечную РНК. Примеры нуклеиновых кислот включают, без ограничения, геномную ДНК (гДНК), гетерогенную ядерную РНК (гяРНК), матричную РНК (мРНК), рибосомную РНК (рРНК), транспортную РНК (тРНК), микро-РНК, малую интерферирующую РНК (миРНК), малую ядрышковую РНК (мякРНК), малую ядерную РНК (мяРНК) и малую временную РНК и т.п., а также любую их комбинацию.
Фраза «по существу идентичные» в контексте двух нуклеиновых кислот относится к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые имеют по меньшей мере примерно 90%, предпочтительно 91%, наиболее предпочтительно примерно 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 98,5%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% или большую степень идентичности по нуклеотидным остаткам при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, измеренную с использованием алгоритма сравнения последовательностей или визуально. Такие «по существу идентичные» последовательности, как правило, считаются «гомологичными», без ссылки на фактическое происхождение.
Микроорганизмы (включая, без ограничения, прокариоты, такие как архебактерии и эубактерии; цианобактерии; грибы, дрожжи, плесень, актиномицеты; спирохеты и микоплазмы), вирусы (включая, без ограничения, ортогепаднавирусы [включая, например, вирусы гепатитов A, B и C], вирус папилломы человека, флавивирусы [включая, например, вирус лихорадки Денге], лиссавирусы [включая, например, вирус бешенства], морбилливирусы [включая, например, вирус кори], симплексвирусы [включая, например, вирус простого герпеса], полиомавирусы, рубулавирусы [включая, например, вирус эпидемического паротита], рубивирусы [включая, например, вирус краснухи], варицелловирус [включая, например, вирус ветряной оспы], ротавирус, коронавирус, цитомегаловирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, бакуловирус, парвовирус, ретровирус, вирус осповакцины, поксвирус, и т.п.), водоросли, простейшие, протисты, растения, бриофиты и т.п., а также любая комбинация любого из вышеуказанного.
Изобретение также может использоваться для мониторинга вспышки заболевания, развития, распространения или одного или более других эпидемиологических статистических показателей в пределах, среди или между одной или более популяциями земного шара, включая, без ограничения, распространение микобактериальных инфекций, развитие клинических признаков туберкулеза и/или сопутствующих заболеваний с одной или более дополнительными инфекциями, такими как, без ограничения, синдром истощения, лихорадка Денге, Эбола, ВИЧ, атипичная пневмония (SARS), и одну или более бактериальных или вирусных инфекций, включая, без ограничения, пневмонию, грипп и т.п. В некоторых вариантах осуществления изобретения образцы будут предпочтительно принадлежать млекопитающему, более предпочтительно человеку.
Термины «по существу свободный» или «практически свободный», в контексте настоящего документа, обычно означают, что композиция содержит менее чем примерно 10 массовых процентов, предпочтительно менее чем примерно 5 массовых процентов и более предпочтительно менее чем примерно 1 массовый процент соединения. В предпочтительном варианте осуществления изобретения эти термины относятся к менее чем примерно 0,5 массового процента, более предпочтительно к менее чем примерно 0,1 массового процента или даже к менее чем примерно 0,01 массового процента. Эти термины также охватывают композицию, полностью свободную от соединения или другого указанного свойства. В отношении деградации или ухудшения термин «существенный» может также относиться к указанным выше массовым процентам, так что предупреждение существенного ухудшения будет относиться к менее чем примерно 15 массовым процентам, менее чем примерно 10 массовым процентам, предпочтительно менее чем примерно 5 массовым процентам и т.д., потерянным вследствие деградации. В других вариантах осуществления изобретения эти термины относятся к простым процентам, а не массовым процентам, как, например, в отношении термина «по существу непатогенные», в котором термин «по существу» означает менее чем примерно 10 процентов, менее чем примерно 5 процентов, и т.д., остаточной патогенной активности.
Используемый в настоящем документе термин «гетерологичный» определен относительно заданной ссылочной нуклеотидной последовательности. Например, в отношении последовательности структурного гена гетерологичный промотор определен как промотор, который в природе не примыкает к указанному структурному гену, но который помещен в эту позицию человеком в результате одной или более лабораторных манипуляций, которые обычно используются рядовыми специалистами в данной области молекулярной биологии. Аналогичным образом, гетерологичный ген или сегмент нуклеиновой кислоты определены как ген или сегмент нуклеиновой кислоты, которые в природе не примыкают к указанной последовательности, промотору и/или энхансерному(ым) элементу(ам) и т.д.
Используемый в настоящем документе термин «гомологичный» означает (в отношении полинуклеотидов) последовательности, которые имеют по существу одинаковую нуклеотидную последовательность, несмотря на происхождение из различных источников. Как правило, гомологичные последовательности нуклеиновых кислот получены из близкородственных генов или организмов, обладающих одной или более по существу аналогичными геномными последовательностями. В противоположность этому, «аналогичным» полинуклеотидом является тот, который имеет ту же функцию, что и полинуклеотид из другого вида или организма, но может иметь значительно отличающуюся первичную нуклеотидную последовательность, которая кодирует один или более белков или полипептидов, которые выполняют аналогичные функции или обладают сходной биологической активностью. Аналогичные полинуклеотиды часто могут быть получены из двух или более организмов, которые не являются близкородственными (например, либо генетически, либо филогенетически).
Термины «идентичный» или процент «идентичности», в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полинуклеотидных последовательностей, относятся к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент нуклеотидов, которые являются одинаковыми, после сравнения и выравнивания для максимального соответствия на сравниваемом участке, измеряемого с использованием алгоритма сравнения последовательностей или путем ручного выравнивания и визуального сравнения.
Используемый в настоящем документе термин «по существу гомологичные» включает две или более последовательностей биомолекул, которые по существу похожи друг на друга на уровне первичной нуклеотидной последовательности. Например, в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот, «по существу гомологичные» может относиться к по меньшей мере примерно 75%-й, предпочтительно по меньшей мере примерно 80%-й, более предпочтительно по меньшей мере примерно 85%-й или по меньшей мере примерно 90%-й идентичности, и еще более предпочтительно, по меньшей мере примерно 95%-й, более предпочтительно по меньшей мере примерно 97%-й идентичности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 98%-й идентичности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 99%-й идентичности, и даже еще более предпочтительно, полной идентичности (т.е. 100%-й идентичности или «инвариантной последовательности»).
Аналогичным образом, в контексте настоящего изобретения, термин «по существу идентичные» включает две или более последовательностей биомолекул (и, в частности, полинуклеотидных последовательностей), которые имеют высокую степень идентичности между собой на нуклеотидном уровне. Например, в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот, «по существу идентичные» может относиться к последовательностям, которые по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 85% или по меньшей мере примерно на 90% идентичны друг другу, и даже более предпочтительно, идентичны по меньшей мере примерно на 95%, более предпочтительно идентичны по меньшей мере примерно на 97%, более предпочтительно идентичны по меньшей мере примерно на 98%, более предпочтительно идентичны по меньшей мере примерно на 99%, и даже еще более предпочтительно, полностью идентичны (т.е. идентичны на 100% или «не вырождены»).
Используемый в настоящем документе термин «функционально связанные» означает функциональную взаимосвязь двух или более полинуклеотидов или двух или более нуклеотидных последовательностей. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она находится в функциональном взаимодействии с другой нуклеотидной последовательностью. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию кодирующей последовательности. «Функционально связанные» означает, что «связанные» последовательности нуклеиновых кислот являются, как правило, непрерывными или по существу непрерывными и, в случае необходимости объединения двух кодирующих белок областей, являются непрерывными и находятся в одной рамке считывания. Однако поскольку энхансеры обычно функционируют, когда отделены от промотора несколькими тысячами пар нуклеотидов, и интронные последовательности могут иметь переменную длину, то некоторые полинуклеотидные элементы могут быть функционально связанными, но не непрерывными.
Нижеследующие примеры иллюстрируют варианты осуществления изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
Примеры
Пример 1 - Сбор биологических образцов, выделение нуклеиновых кислот и последующий молекулярный анализ
В применении изобретения на практике образцы изо рта и глотки, носа, трахеи и/или бронхов у субъекта с подозрением на туберкулезную инфекцию собирают, как правило, в форме образцов мокроты или лаважа. В этом примере описано применение PrimeStore (Longhorn Vaccines & Diagnostics, San Antonio, TX, USA) (также подробно описанного в публикации патентной заявки США № 2009/0312285, полное содержание которой специально включено в настоящий документ путем прямой ссылки на нее), системы для сбора клинических образцов и образцов из окружающей среды, специально составленной для последующей молекулярной диагностики.
Четыре положительные по мазку образца мокроты, полученные из банка мокроты (University of Pretoria, South Africa), с качественной оценкой +, ++ или +++, измеренной с помощью световой микроскопии, и с различной вязкостью собирали, прося пациентов откашливать мокроту в чашку для образцов. Типичный объем откашливаемого материала составлял от примерно 5 мл до примерно 20 мл мокроты. Образы качественно оценивали как кровянистые, гнойные, пузырящиеся, пенящиеся или содержащие слюну. Образцы, указанные как «гнойные», содержали гной, тогда как образцы, указанные как «содержащие слюну», содержали большое количество слюны относительно других компонентов, таких как слизь. Для сбора небольшого количества образцов слюны использовали флок-тампоны (Copan Italia S.p.A., Brescia, Italy) путем пятикратного вращения тампона в каждом контейнере для образца мокроты. Образцы мокроты взвешивали до и после отбора образца флок-тампоном для оценки объема взятого образца. Каждый тампон содержал приблизительно от 25 мл до 500 мл мокроты. Индивидуальные тампоны переносили в пробирки для сбора образцов, содержащие по 1,5 мл состава по настоящему изобретению для сбора и хранения ("PrimeStore"). Отбор образцов флок-тампонами проводили трехкратно для каждого образца мокроты. PrimeStore также добавляли к остатку образца мокроты в соотношении 1:1 в качестве контроля и затем помещали на -4°C до анализа. Образцы, ресуспендированные в PrimeStore в пробирках для сбора образцов, хранили при комнатной температуре в течение приблизительно двенадцати часов до забора образца для анализа нуклеиновых кислот путем выделения нуклеиновых кислот и ПЦР в режиме реального времени. ДНК выделяли из 100 мкл аликвот из оставшихся контрольных образцов мокроты и пробирок с тампонами, используя набор AMPLICOR MTB Respiratory Kit (Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Все образцы обрабатывали на вортексе при максимальной скорости в течение 10 секунд для выделения нуклеиновых кислот. Концентрации ДНК после выделения измеряли, используя спектрофотометр NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, DE, USA) в соответствии с инструкциями производителя, а вычисленные результаты показаны в таблице 2. 4 микролитра выделенной ДНК использовали для ПЦР в реальном времени с использованием набора LightCycler Mycobacterium Detection Kit (Roche Diagnostics, USA).
Инактивация микроорганизмов и сохранение нуклеиновых кислот микроорганизмов в PrimeStore
Было показано, что применение PrimeStore эффективно для получения нуклеиновых кислот из биологических образцов для ДНК и/или методик выделения ДНК, и последующего молекулярного анализа. Как видно из таблицы 2, объемы, собранные после каждого использования флок-тампонов, варьировали от примерно 0,05 мл до примерно 0,5 мл. Концентрация ДНК после выделения варьировала от примерно 231 до 281 нг/мкл. Не было получено достоверной разницы при сравнении концентрации ДНК в контрольных образцах с концентрацией ДНК в образцах, полученных с использованием флок-тампонов.
ТАБЛИЦА 2
КОНЦЕНТРАЦИЯ ДНК В ОБРАЗАХ МОКРОТЫ ПОСЛЕ СБОРА И ХРАНЕНИЯ В PRIMESTORE
Образец
Статус образца по мазку
Качество
Объем образца с тампона 1 (мл)
Объем образца с тампона 2 (мл)
Объем образца с тампона 3 (мл)
Контрольный объем (мл)
Концентрация ДНК (нг/мкл)
Контроль
Тампон 1
Тампон 2
Тампон 3
А
+
содер-жит слюну/кровя-нистый
0,05
0,05
0,15
1,20
258,05
243,68
238,15
235,15
В
+++
гнойный
0,05
0,45
0,25
1,70
251,76
240,34
238,43
231,54
С
+++
гнойный
0,15
0,10
0,05
1,65
248,60
261,86
246,75
246,66
D
++
гнойный/содер-жит слюну
0,25
0,30
0,15
17,90
258,32
281,31
241,89
246,66
ПЦР в реальном времени была положительной для всех образцов, за исключением одного, в котором произошло ингибирование ПЦР.
Результаты показаны в таблице 3 и на фиг.1.
ТАБЛИЦА 3
РЕЗУЛЬТАТЫ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ПОСЛЕ ВНЕСЕНИЯ В PRIMESTORE И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НАБОРА LIGHTCYCLER MYCOBACTERIUM DETECTION KIT
Образец
Значение Сτ
Положительный
27,28
Отрицательный
-
А*
31,54
А-1
32,14
А-2
32,75
А-3
34,97
В*
31,56
В-1
31,77
В-2
32,03
В-3
32,14
С*
23,8
С-1
26,62
С-2
26,56
С-3
26,5
D*
26,64
D-1
29,63
D-2
ингибирование
D-3
28,95
*Оставшийся образец (контроль) - 1/-2/-3 указывает на порядок отбора образцов тампонами
Процедура отбора образцов тампоном представляет собой пригодный способ сбора образцов напрямую из собранного образца мокроты для последующего молекулярного анализа. В этом исследовании концентрации ДНК после выделения имели похожие диапазоны как для образцов, отобранных тампоном, так и для оставшихся образцов мокроты (контроля). Даже объем мокроты 50 мкл, разведенный в 1,5 мл PrimeStore, был достаточным для ПЦР-анализа. Однако в двух образцах отмечалось падение значения Сτ примерно на 3 порядка. В единственном случае ингибирования, оно могло быть следствием остаточного присутствия раствора PrimeStore в результате его попадания в ПЦР через процесс выделения ДНК.
Простая и быстрая молекулярная диагностика напрямую из обработанных PrimeStore образцов с тампонов, а также обычное стандартное исследование, были проведены на одиночных образцах мокроты. Результаты молекулярного анализа на малых количествах положительных по мазку туберкулезных образцов мокроты, полученных переносом в PrimeStore с использованием тампона, являются практически осуществимыми и точными.
Пример 2 - Инактивация микроорганизмов в туберкулезных образцах с использованием PrimeStore
Для оценки степени инактивации туберкулезных бактерий в образцах мокроты при воздействии PrimeStore проводили три исследования:
В первом исследовании известный штамм M. tuberculosis MDR выращивали в жидкой системе MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube, Becton Dickinson, USA). Изолят штамма был кислотоустойчивым (AF) и положительным по мазку, а мультилекарственная устойчивость (MDR) была подтверждена с использованием Line Probe Assay (гибридизационного анализа на панели проб) (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany). 0,15 мл или 0,5 мл культуры известного MDR-штамма туберкулеза помещали в 1,5 мл PrimeStore и инкубировали в течение 2 или 10 минут. Затем каждый раствор встряхивали на вортексе и далее культивировали в жидкой системе MGIT в соответствии с инструкциями производителя. Контрольный образец, который не помещали в PrimeStore, также переносили в жидкую культуру MGIT.
Во втором исследовании помещали известные положительные по мазку образцы мокроты (для каждого >10 кислотоустойчивых палочек [AFB]/в поле зрения с большим увеличением [hpf]) в 1,5 мл PrimeStore либо на 1 минуту, либо на 5 минут, с последующим окрашиванием аурамином O и по Цилю-Нильсену для наблюдения морфологии и целостности клеточных стенок.
5
6
В третьем исследовании использовали от 10 до 10 концентрации референсного штамма микобактерий, а именно, H37rv (University of Pretoria, South Africa), для проведения исследования временной зависимости уничтожения микроорганизмов. 0,5 мл культуры штамма помещали в 1,5 мл PrimeStore на 5, 10, 20, 40, 80 или 160 секунд, а затем 2 капли из каждого полученного раствора субкультивировали на агаре Middlebrook 7H11 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Контрольные образцы, не обработанные PrimeStore, также высевали аналогичным образом. В одном контроле 0,5 мл штамма H37rv помещали в 1,5 мл физиологического раствора. В другом контроле 0,5 мл культуры H37rv переносили напрямую на агар Middlebrook 7H11. Чашки выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут, затем запечатывали и инкубировали в аэробных условиях при 37°C в течение 6 недель. Это исследование проводили в двух повторах.
В первом исследовании не наблюдалось никакого роста в жидких культурах MGIT ни для одного из MDR-туберкулезных образцов, хранившихся в PrimeStore, даже после 42-дневной инкубации. Контрольный образец, не обработанный PrimeStore, показал положительный рост через 9 дней. Последующее выделение и амплификация ДНК из двух образцов, которые хранились в PrimeStore, продемонстрировали хорошие ПЦР-полосы и подтвердили стабильность нуклеиновых кислот в PrimeStore.
Во втором исследовании AFB не наблюдались ни в одном образце, инкубированном в PrimeStore, ни для одного времени воздействия.
В третьем исследовании никакого роста не наблюдалось через 42 дня инкубации ни для одной временной точки. На контрольной чашке колониеобразующие единицы были обнаружены через 7 дней.
PrimeStore убивал ряд штаммов M. tuberculosis за очень короткое время, тем самым подтверждая, что PrimeStore обеспечивает возможность безопасного и быстрого сбора образцов в месте оказания медпомощи и транспортировки биологических образцов, предположительно содержащих M. tuberculosis.
Пример 3 - Хранение, выделение нуклеиновых кислот, молекулярный анализ туберкулезных образцов и диагноз туберкулеза
Образцы мокроты обрабатывали с использованием такой же методики отбора образцов тампоном, как описано в примере 1, а также с использованием соотношения PrimeStore к слюне 1:1. Образцы мокроты, используемые в этих экспериментах, были получены из банка мокроты, как и ранее, и перед этим были классифицированы с помощью микроскопических исследований мазка и посева. Все образцы первоначально были охарактеризованы как кислотоустойчивые (т.е. при микроскопическом исследовании мазка имели показатели +, ++ или +++) и впоследствии, по результатам культивирования, были классифицированы или как положительные, отрицательные, или скудные по M. tuberculosis.
ДНК выделяли из образца мокроты в PrimeStore в различных временных точках, варьирующих от 6 дней до 6 недель. Как показано в таблице 4, образцы в PrimeStore хранили при комнатной температуре в течение различного времени до проведения выделения нуклеиновых кислот. Выделение с использованием набора QiaAmp DNA Mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) и системы MagNA Pure 96™ System (Roche Diagnostics, USA) проводили в соответствии с инструкциями производителя. До проведения амплификации все выделенные нуклеиновые кислоты хранили при температуре -20°C.
Выделенную ДНК амплифицировали либо с использованием набора LightCycler Mycobacterium detection kit (Roche), либо используя первичную смесь (prime mix) по настоящему изобретению, далее именуемую «Prime Mix Universal TB kit», «PrimeMix Universal TB kit» или просто «PrimeMix». 4 микролитра раствора выделенных нуклеиновых кислот использовали с Prime Mix Universal TB kit. Все вышеуказанные системы представляют собой платформы для ПЦР в реальном времени с включенной в них возможностью обнаружения продуктов. Амплификацию выделенных с помощью Qiagen нуклеиновых кислот проводили в трех повторах для определения воспроизводимости LightCyler Mycobacterium detection kit и Prime Mix Universal TB kit.
Как видно из таблицы 4, четыре образца были положительными по мазку, семь образцов были отрицательными по мазку и три образца были скудными.
ТАБЛИЦА 4
ВРЕМЯ НАХОЖДЕНИЯ ОБРАЗЦОВ В PRIMESTORE ДО ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Методика выделения
Время до выделения (дни)
Отрицательные по мазку/скудные
Положительные по мазку
QiaAmp DNA Mini Kit (Qiagen)
6
28
MagNA Pure™ 96 (Roche)
20
42
ТАБЛИЦА 5
РЕЗУЛЬТАТЫ ОКРАШИВАНИЯ МАЗКА И ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (ЗНАЧЕНИЯ Сτ) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ НАБОРОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ, СОБРАННЫХ ТАМПОНАМИ
Выделение QiaAmp/PrimeMix
Выделение QiaAmp/LightCyler
Выделение MagNA Pure™/ LightCyler
Выделение MagNA Pure™/ PrimeMix
№ образца
Мазок
1
2
3
1
2
3
1
+
35,00
X
X
-
X
X
-
35,00
4
++
X
X
X
X
X
X
30,98
28,97
2
+++
32,18
X
X
34,19
X
X
34,60
35,00
3
+++
X
X
X
X
X
X
27,94
27,12
5
Отриц.
35,00
35,00
35,00
34,71
-
-
-
35,00
6
Отриц.
-
35,00
-
-
-
-
-
-
10
Отриц.
35,00
35,00
35,00
36,48
-
36,20
-
35,00
11
Отриц.
32,96
32,70
32,85
35,71
35,17
33,83
35,21
35,00
12
Отриц.
34,54
35,00
34,56
34,14
34,83
34,18
33,54
35,00
13
Отриц.
-
35,00
-
-
-
-
-
-
14
Отриц.
28,15
28,07
28,60
29,56
29,61
29,10
30,34
29,34
8
Скудн. 1
32,36
32,28
32,42
34,46
34,47
35,31
34,62
35,00
7
Скудн. 7
31,79
31,73
31,83
32,10
32,79
32,08
32,70
33,53
9
Скудн. 9
33,15
33,51
33,43
36,10
34,53
34,56
34,27
35,00
X указывает, что эксперимент не проводился; (-) указывает, что результаты были отрицательными
Итоговые результаты анализов (число полученных значений Сτ/число протестированных образцов)
Выделение QiaAmp/ PrimeMix
Выделение QiaAmp/ LightCyler
Выделение MagNA Pure™/ LightCyler
Выделение MagNA Pure™/ PrimeMix
Мазок
1
2
3
1
2
3
Положительные по мазку
2/2
Х
Х
1/2
Х
Х
3/4
4/4
Отрицательные по мазку
5/7
7/7
5/7
5/7
3/7
4/7
3/3
5/7
Скудные
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
3/3
ТАБЛИЦА 6
РЕЗУЛЬТАТЫ ОКРАШИВАНИЯ МАЗКА И ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ (ЗНАЧЕНИЯ С<sub>Т</sub>) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ НАБОРОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ОБРАЗЦОВ МОКРОТЫ, СМЕШАННЫХ С PRIMESTORE В СООТНОШЕНИИ 1:1
№ образца
Мазок
Выделение MagNA Pure™/PrimeMix
Выделение MagNA Pure™/LightCyler
1
+
35,00
33,02
2
+++
28,96
33,62
3
+++
23,97
25,53
4
++
26,30
28,27
5
отриц.
35,00
34,00
6
отриц.
-
-
7
скудн. 7
30,20
30,72
8
скудн. 1
33,59
32,85
9
скудн. 9
31,76
31,81
10
отриц.
35,00
35,19
11
отриц.
30,05
30,70
12
отриц.
32,68
32,90
13
отриц.
-
-
14
отриц.
26,16
26,74
(-) указывает, что не было получено результатов
Как видно из таблицы 5, для отобранных тампоном образцов в ДНК, выделенной с использованием либо набора QiaAmp DNA mini kit, либо системы MagNA Pure™ 96 System, а затем проанализированной с использованием PrimeMix по настоящему изобретению, было обнаружено присутствие ДНК туберкулезных бактерий, когда мазок указывал на слабоположительный результат (т.е. «+»), в отличие от ДНК, выделенной с использованием либо набора QiaAmp DNA mini kit, либо системы MagNA Pure™ 96 System, а затем проанализированной с использованием набора LightCycler Mycobacterium detection kit, который не обнаружил никаких нуклеиновых кислот, специфичных для бактерий туберкулеза. Важно, что методы анализа PrimeMix способны обнаруживать нуклеиновые кислоты бактерий, вызывающих туберкулез, в большем числе отрицательных по мазку, положительных по посеву образцов, чем можно было обнаружить с набором LightCycler Mycobacterium kit. ДНК бактерий, вызывающих туберкулез, равноценно обнаруживались с использованием методик как PrimeMix, так и Lightcycler, при анализе большего количества мокроты.
В общем, методики отбора образца тампоном и использования PrimeStore показали сходные результаты при использовании PrimeMix по сравнению с отличающимися результатами для набора LightCycler. Для PrimeStore была показана совместимость с различными системами выделения ДНК, и ни в одном из случаев ингибирование ПЦР не являлось причиной отрицательного результата.
Пример 4 - Совместимость PrimeStore с диагностическими методами анализа
Пятнадцать положительных по мазку и пятнадцать отрицательных по мазку образцов мокроты (окрашенных аурамином O) были получены от пациентов с подозрением на легочный туберкулез. Положительные по мазку образцы были исследованы с использованием Line Probe Assay, с последующим посевом. Отрицательные по мазку образцы также высевали в культуру. Затем все необработанные образцы мокроты обычно обеззараживали и концентрировали, используя методику NaLc/NaOH («DTT/NaOH»), известную среднему специалисту в данной области и описанную в публикациях Kubica, G.P., et al. (1963) Sputum Digesting and Decontamination with N-acetyl-L-cysteine as a Sputum Digestant for the Isolation of Mycobacteria, Amer. Rev. Resp. Dis.; 89:284-286 и Kubica, G.P., et al. (1963) Sputum Digesting and Decontamination with N-acetyl-L-cysteine-sodium hydroxide for Culture of Mycobacteria, Amer. Rev. Resp. Dis.; 87:775-779, полное содержание которых включено в настоящий документ прямой ссылкой. Как правило, методика NaLc/NaOH используется перед культивированием и исследованием нуклеиновых кислот на M. tuberculosis. Аликвоты по 0,5 мл обработанных NaCl/NaOH образцов затем добавляли к PrimeStore и оставляли на ночь. Также использовался контроль, в котором аликвоты по 0,5 мл обработанных NaCl/NaOH образцов не добавляли в PrimeStore. Выделение осуществляли набором AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit (Roche). Для обнаружения присутствия или отсутствия специфичных для M. tuberculosis нуклеиновых кислот использовали два коммерческих метода анализа, LightCycler Mycobacterium Detection kit (Roche) и Genotype MTBDRplus (Hain Lifesciences GmbH). Было найдено, что метод анализа Genotype MTBDRplus совместим с использованием PrimeStore, контактирующим с необработанными образцами слюны, и с использованием этого метода анализа были обнаружены лекарственно-устойчивые штаммы туберкулеза.
В таблице 7 продемонстрированы результаты, полученные с набором LightCycler Mycobacterium Detection kit (LC).
ТАБЛИЦА 7
ПРИГОДНОСТЬ PRIMESTORE ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО АНАЛИЗА ПОСЛЕ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ
DTT/NaOH - без PRIMESTORE
DTT/NaOH - с PRIMESTORE
Положитель-ные по мазку
Отрицатель-ные по мазку
Положитель-ные по мазку
Отрицатель-ные по мазку
LC-положи-тельные
13
0
LC-положи-тельные
13
130
LC-отрица-тельные
2
15
LC-отрица-тельные
2
14
15
15
15
15
Как видно из таблицы 7, после хранения в PrimeStore анализ LightCycler был положительным на M. tuberculosis в отрицательном по мазку образце, что не было получено без использования PrimeStore. Таким образом, PrimeStore может обладать более высокой способностью к обнаружению малого количества M. tuberculosis. Иным образом, полученные результаты были совместимы, и, таким образом, PrimeStore совместим с коммерчески доступными детекционными методами анализа.
Пример 5 - Чувствительность обнаружения M. tuberculosis после хранения в PrimeStore
В это исследование были включены семь отрицательных по мазку и положительных по посеву образцов и три скудных образца (SC1, SC7 и SC9) из банка мокроты (University of Pretoria, South Africa). Флок-тампоны (Copan) использовались для отбора небольшого количества мокроты путем вращения тампона в каждом образце мокроты (500 мкл в криопробирке). Индивидуальные тампоны переносили в пробирки для сбора образцов PrimeStore, содержащие по 1,2 мл раствора PrimeStore. Образцы мокроты взвешивали до отбора тампонами и после каждого отбора образцов тампоном для оценки объема мокроты, забираемой из образца. К остатку образца мокроты также добавляли раствор PrimeStore в соотношении 1:1 в качестве контроля. Тампоны, погруженные в раствор PrimeStore в каждой пробирке для сбора образцов, хранили при комнатной температуре в течение приблизительно двенадцати часов перед проведением ПЦР в реальном времени. ДНК выделяли из оставшихся образцов мокроты (контроль) и пробирок с тампонами, используя набор AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit. Образцы мокроты, полученные из одноименных посевов, также обрабатывали в соответствии с традиционными методиками NaLc/NaOH и выделяли, используя протокол AMPLICOR. На этих образцах также оценивали дополнительный способ выделения с использованием набора Invitrogen™ iPrep™ Purelink™ Virus Kit (Carlsbad, CA, USA) из необработанной мокроты. Все образцы в течение 10 сек. встряхивали на вортексе при максимальной скорости и аликвоты по 100 мкл использовали для выделения. Концентрацию ДНК после выделения определяли, используя аппарат NanoDrop 1000. 4 микролитра выделенной ДНК использовали для ПЦР в реальном времени с использованием LightCycler Mycobacterium detection kit.
Как можно видеть в таблице 8, объем образцов, собранных тампонами, составлял от примерно 0,05 мл до примерно 0,1 мл. Концентрация ДНК после выделения варьировала от примерно 205 до примерно 706 нг/мкл на тампон для образцов в PrimeStore (1:1) и после обработки NaLc/NaOH. Концентрация ДНК выделенной из необработанных образцов мокроты с помощью набора Invitrogen™ iPrep™ Purelink™ Virus Kit (Carlsbad, CA, USA) составляла от примерно 7,0 до примерно 22,6 нг/мкл.
Результаты ПЦР в реальном времени можно найти в таблице 9 и на фиг.2.
ТАБЛИЦА 9
РЕЗУЛЬТАТЫ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ДЛЯ ОБРАЗЦОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАБОРА LIGHTCYCLER MYCOBACTERIUM DETECTION KIT
Номер в банке мок-роты
Мазок
Посев
ID
Значения Сτ
Набор Invitrogen™ для выделения из необрабо-танной мокроты
PrimeStore + тампон; выделение с помощью AMPLICOR
PrimeStore (1:1); выделение с помощью AMPLICOR
DTT/NaOH; выделе-ние с помощью AMPLICOR
57
отриц.
полож.
MTB
35,33
-
-
-
95
отриц.
полож.
MTB
32,12
39,49
32
34,79
96
отриц.
полож.
MTB
27,41
29,26
37,75
26,24
198
отриц.
полож.
MTB
-
-
-
-
224
отриц.
полож.
MTB
30,77
33,28
31,87
-
347
отриц.
полож.
MTB
-
37,45
33,03
-
402
отриц.
полож.
MTB
-
-
-
-
72
скудн.1
полож.
MTB
34,3
-
32,11
34,25
394
скудн.7
полож.
MTB
31,9
34,09
29,51
31,59
88
скудн.9
полож.
MTB
31,9
-
31,01
32,51
(-) указывает на то, что не было получено результатов.
Амплификации не наблюдалось в двух скудных образцах (а именно, скудном образце 1 и скудном образце 9) в случае отбора образца тампоном. 100%-е увеличение чувствительности для отрицательных по мазку, положительных по посеву образцов наблюдалось при использовании PrimeStore в соотношении 1:1 или при отборе образцов тампоном по сравнению со стандартной методикой NaLc/NaOH. В действительности, использование PrimeStore, либо с тампоном, либо в соотношении 1:1, привело к обнаружению двух дополнительных отрицательных по мазку, положительных по посеву образцов по сравнению с традиционной методикой NaLc/NaOH. В общем, набор Invitrogen™ является более эффективным, чем AMPLICOR, поэтому любые вариации между данными для PrimeStore и полученными с использованием Invitrogen™ могут объясняться этой разницей.
Пример 6 - Составы PrimeStore, содержащие IPC
В этом примере описано применение неспецифичных экзогенных полинуклеотидов внутреннего положительного контроля (IPC) для отслеживания целостности образца от начала сбора до молекулярного анализа с использованием системы для сбора образцов PrimeStore (Longhorn Vaccines & Diagnostics, San Antonio, TX, USA).
6
10
Для оценки обеззараживающей способности PrimeStore использовали способ фильтрования через мембрану для выделения бактерий и грибов. Для определения того, может ли PrimeStore эффективно уничтожать и инактивировать ряд бактерий и грибов (дрожжей и нитчатых грибов), использовали Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus [метициллин-нерезистентный Staphylococcus aureus (MRS A)], Candida albicans, Bacillus subtilis и Aspergillus brasiliensis. Положительные контроли, инкубированные в водной среде, проводили только в 0-й день. Популяцию 1×10 КОЕ для каждого бактериального штамма высевали в 0,5 мл PrimeStore в каждой временной точке и далее инкубировали при 20-25°C. Контейнерам присваивали номера и оценивали в 0-й, 1-й, 7-й, 14-й и 28-й дни. Высеянную культуру асептически пропускали через стерильное фильтрующее устройство и затем промывали три раза 100 мл стерильной нейтрализующей жидкости D [1 г пепсинового гидролизата животной ткани (пептона) и 1 мл полисорбата 80, разведенных в 1,0 л стерильной воды (конечный рН 7,1±0,2)]. При необходимости разбавляли высеянную культуру, чтобы получить конечное количество бактерий на фильтр, составляющее 25-250 КОЕ. Для каждой временной точки высеянные отрицательные контроли обрабатывали аналогичным образом. Фильтры с образцами, содержащими бактерии, помещали на триптоновый соевый агар (TSAP) с лецитином и полисорбатом 80 и инкубировали при 30-35°C в течение 72 ч. Фильтры с образцами, содержащими дрожжи или плесневые грибы, помещали на Сабуро-декстрозный агар (SAB) и инкубировали при 20-25°C не менее 72 ч, но не более 5 дней. Колонии подсчитывали, чтобы вычислить log выделения и процент (%) обеззараживания для каждого организма, используемого для посева.
8
Бактерии с исходной чашки, содержащей примерно 10 КОЕ MRS A (ATCC 33592), переносили в TSB, быстро встряхивали на вортексе и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. По 0,1 мл бактериальной суспензии переносили в 0,9 мл PrimeStore и встряхивали на вортексе в течение 60 сек. По 0,1 мл суспензии переносили в 0,3 мл TSB (разведение 1:4) и 100 мкл переносили на чашки с кровяным агаром (5% овечьих красных клеток крови (RBC) в TSA) через 0, 5 и 15 мин. Положительные контроли включали равные объемы MRSA и TSB. Чашкам давали высохнуть, инкубировали в течение ночи при 37°C и анализировали по КОЕ/мл.
Было показано, что PrimeStore быстро инактивирует микроорганизмы, включая грибы, грамположительные и грамотрицательные бактерии, а также вирусы. Исследование противомикробного действия проводили с использованием методики фильтрации через мембрану для количественной оценки бактерий и грибов. В первом исследованном временном периоде (24 ч.) 100% бактерий и грибов были убиты по сравнению с положительными контролями. В отношении этих микроорганизмов PrimeStore соответствовал критериям обеззараживания, описанным для продуктов 1-й категории в фармакопее США (инъекционные продукты, эмульсии, глазные продуты, стерильные назальные продукты и офтальмологические продукты, полученные на водных основах или носителях). Дополнительно, проводили заражение спорами Bacillus subtilis с использованием способа, описанного в фармакопее США № 51, для дополнительной оценки способности PrimeStore инактивировать популяции микроорганизмов. Количество спор B. subtilis сокращалось на 99% за 24 ч воздействия. В исследовании временной зависимости обеззараживающего действия на MRSA, помещенных в PrimeStore, жизнеспособные бактерии не обнаруживались (100% обеззараживание) при наименьшем исследуемом времени инкубации (5 мин. после внесения бактерий) или при любом из исследуемых более длительных периодов инкубации. Данные также продемонстрировали, что PrimeStore быстро убивает M. tuberculosis в клинических образцах мокроты.
5
В иллюстративных вариантах осуществления изобретения описана уникальная оцРНК IPC, которую можно добавить заранее (например, в количестве примерно 3×10 копий-мишеней на 0,5 мл) в PrimeStore и использовать в качестве внутреннего контроля для подтверждения стабильности образца от времени сбора образца до процессов выделения и обнаружения. Дополнительно, оцРНК IPC пригодна в качестве образца-носителя (в частности, для образцов, содержащих очень низкие уровни целевых нуклеиновых кислот) и служит в качестве контроля для мониторинга целостности, эффективности и правильности процесса выделения нуклеиновых кислот от точки сбора до анализа нуклеиновых кислот. Типовые IPC, подходящие для введения в состав PrimeStore, включают, без ограничения, экзогенные и/или синтетически полученные (in vitro) оцДНК или оцРНК и предпочтительно включают такие полимеры, которые не гомологичны (как определено, например, с помощью компьютерного анализа BLAST) полинуклеотидным последовательностям, найденным у млекопитающего-хозяина или у одного или более патогенов, или у нормальной бактериальной флоры, присутствующих в нем.
Было показано, что PrimeStore облегчает стандартное секвенирование и мета-геномный анализ исходных клинических образцов путем улучшения качества микробных нуклеиновых кислот-мишеней в исходно собранных образцах, даже когда они поступают в аналитическую лабораторию в рабочее время, или даже днями спустя, включая образцы, которые хранились и транспортировались при менее чем идеальных условиях или даже в условиях окружающей среды. Наблюдали образование фрагментов более 1400 п.н. после РВ-ПЦР амплификации на вирусной РНК, сохраненной и загруженной в PrimeStore при температуре окружающей среды в течение нескольких недель. В жестких условиях, т.е. инкубации при 38°C, наблюдали РВ-ПЦР амплификацию фрагментов 574 п.н. и 825 п.н. на вирусе, сохраненном в PrimeStore, тогда как никакой амплификации не наблюдали на вирусе, хранившемся в коммерческой VTM.
τ
Важно отметить, что PrimeStore продемонстрировал совместимость со многими коммерческими наборами для выделения нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты выделяли непосредственно из PrimeStore в соответствии со стандартным протоколом производителя только с небольшими различиями, заметными по значениям С, между наборами на основе колонок или шариков. Более того, в отношении PrimeStore получено разрешение от FDA (Управления по контролю качества пищевых и лекарственных продуктов США) на использование в экстренных ситуациях как части полного аналитического метода Longhorn Influenza A/H1N1-09 Prime RRT-PCR Assay™. PrimeStore представляет собой первую среду для транспортировки молекул, которая получила одобрение FDA на использование в экстренных ситуациях (EUA), а также представляет собой первую среду, которая содержит IPC для контроля разрушения образца от сбора до анализа.
Пример 7 - PrimeStore для длительного хранения образцов микроорганизмов и выделенной РНК
7
50
В этом примере продемонстрирована практическая ценность составов PrimeStore для инактивации патогенных организмов одновременно со способностью к длительному хранению и сохранению РНК, выделенной из таких инактивированных организмов. В качестве примера варианта осуществления изобретения, PrimeStore использовали для сбора биологических образцов, содержащих вирус гриппа A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). Результаты продемонстрировали, что состав не только инактивировал вирус H5N1 и A/Mexico/4108/09 (H1N1, клинический изолят) в собранных образцах, но также сохранял микробную РНК для последующего ПЦР-анализа. Исследование продемонстрировало отсутствие цитопатических эффектов (CPE) или CPE-подобных реакций реагента PrimeStore (в разведении 1:100) на монослой клеток почки собаки Мадин-Дарби, эффективность PrimeStore в отношении инактивации жизнеспособного вируса H5N1 (1,26×10 TCID) и способность PrimeStore сохранять вирусную РНК из H5N1 и H1N1 до 62 дней в условиях окружающей среды для анализа с помощью ПЦР в реальном времени, в результате которого было обнаружено высокое содержание РНК продукта.
Первая часть исследования состояла из двух разделов: (1) оценки токсичности in vitro реагента PrimeStore на клетки эпителия почки собаки Мадин-Дарби (MDCK); и (2) исследования эффективности инактивации H5N1 реагентом PrimeStore. Во второй части исследования оценивали качество РНК H5N1 и H1N1, влияние на которое было прямым результатом длительного хранения вируса гриппа в PrimeStore.
40
Оценку токсичности in vitro в первой части проводили путем нанесения на тампоны для сбора образцов в трех повторах по 0,1 мл буфера для хранения вируса (полной клеточной культуральной среды или минимальной необходимой среды + 10% фетальной бычьей сыворотки), внесения их в пробирки объемом 5 мл, которые содержали 1,5 мл PrimeStore, и инкубации при комнатной температуре (температуре окружающей среды) в течение 10, 30 или 60 минут. После инкубации анализ тампонов проводили двумя способами: (1) отбирали аликвоту из образца буфера для хранения вируса + PrimeStore и готовили серию разведений (10-кратных) до 10 в полной клеточной культуральной среде в 96-луночном планшете, который содержал монослой клеток MDCK. Клетки инкубировали до 96 часов и затем визуально оценивали на наличие цитопатических эффектов (СРЕ) и определяли разведение, которое не давало видимых СРЕ. (2) Каждый из тампонов, содержащих буфер для хранения вируса, извлекали из PrimeStore и помещали в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл полной культуральной среды. Тампоны встряхивали при 200 об/мин в течение 15 мин и аликвоты из каждого экстракта отбирали и серийно разводили (10-кратно) в полной культуральной среде в 96-луночном планшете, который содержал монослой клеток MDCK. Клетки инкубировали до 96 часов, а затем визуально исследовали на наличие СРЕ и определяли разведение, которое не дает видимых СРЕ.
50
50
Эффективность инактивации в первой части исследования определяли исходя из результатов оценки токсичности in vitro. На тампоны для сбора образцов (n=6) наносили 0,1 мл H5N1 (1-5×10 TCID/мл) или буфера для хранения вируса (отрицательные контроли, n=3), помещали в 5-мл пробирки, содержащие 1,5 мл PrimeStore, и инкубировали в комнатных условиях в течение 10, 30 или 60 мин. После инкубации тампоны анализировали, используя наиболее подходящий метод, определенный в исследовании токсичности in vitro. Клетки инкубировали до 96 часов и затем визуально оценивали на наличие цитопатических эффектов (CPE) и определяли общую TCID. Эффективность инактивации вычисляли как логарифм снижения по сравнению с необработанными контролями.
5
50
Исследование продолжительного хранения при комнатных условиях для второй части включало хранение РНК H5N1 и H1N1 в PrimeStore до 62 дней при комнатной температуре. Временными точками были 0-й день (день внесения H5N1 в PrimeStore), +1, +2, +5, +7, +14, +30 и +62 дня от даты внесения вируса. Перед внесением в PrimeStore вирусы разбавляли до 1×10 TCID. В каждой временной точке выделяли РНК, используя RNAqueous-Micro Kit (Ambion Cat. No. AM1931, Austin, TX, USA), на образцах H5N1 и H1N1, хранившихся в PrimeStore. Полученную РНК хранили при температуре ниже -80°C до выделения РНК на всех временных точках. ПЦР в реальном времени проводили на системе Applied Biosystems (Forster City, CA, USA) 7900HT (скоростная система для проведения ПЦР в реальном времени).
Первый способ, использованный в оценке токсичности in vitro 1-й части (аликвоту из образца, содержащего буфер для хранения вируса + PrimeStore, отбирали, серийно разводили и затем добавляли в 96-луночный планшет), показал присутствие СРЕ и СРЕ-подобных реакций в монослое клеток MDCK при разведении 1:10000 для всех временных точек (10, 30 и 60 мин). Второй способ, использованный в оценке токсичности in vitro 1-й части (каждый из тампонов с нанесенным на него буфером для хранения вируса удаляли из PrimeStore и помещали в 50-мл коническую пробирку, которая содержала 10 мл полной культуральной среды; тампоны встряхивали в течение 15 мин и аликвоту каждого экстракта удаляли и серийно разводили), показал СРЕ и СРЕ-подобную реакцию в монослое клеток MDCK при разведении 1:100 для всех временных точек. Поэтому, с помощью оценки токсичности in vitro в первой части исследования было определено, что второй способ выделения образца приводил к СРЕ или СРЕ-подобной реакции клеток MDCK в результате действия PrimeStore, и этот второй способ сочли подходящим для проверки эффективности инактивации в первой части. Для исследования эффективности была выбрана 60-минутная временная точка (т.е. наиболее длительное исследованное время), поскольку не было определено соответствие СРЕ или СРЕ-подобных реакций с какой-либо временной точкой. СРЕ или СРЕ-подобные реакции для наиболее длительного времени были одинаковыми с наиболее коротким временем (10 мин), ясно показывая, что СРЕ или СРЕ-подобные реакции зависят от разведения (1:100) и способа выделения (второй способ).
7
50
Проверка эффективности инактивации в первой части показала в результате отсутствие обнаруживаемого, жизнеспособного H5N1, поскольку сохранность вируса была одинаковой с отрицательным контролем (т.е. PrimeStore без добавления вируса). Тогда как и ожидалось, положительный контроль (т.е. без добавления PrimeStore, вместо реагента PrimeStore использовалась клеточная культуральная среда, вирус добавлен) показывал прекрасную сохранность вируса (средняя сохранность 67,59%) H5N1. Результаты указывают на то, что реагент PrimeStore был способен инактивировать высокий титр H5N1 (1,26×10 TCID) через 60 мин до уровня отрицательного контроля.
τ
ПЦР в реальном времени при исследовании продолжительного хранения при комнатной температуре для второй части показала, что обнаружение мишени для всех четырех анализов (BBRC H1N1, BBRC H5N1, Longhorn H1N1 и Longhorn H5N1) на РНК, выделенной после наибольшего времени хранения 62 дня, было таким же чувствительным (все средние значения С составляли меньше 26,00), как и для 0-й временной точки (день внесения вируса). Результаты указывают на то, что реагент PrimeStore не имеет отрицательных эффектов на РНК в процессе продолжительного хранения при комнатных условиях.
Пример 8 - Анализ образцов, содержащих специфичные для микобактерий нуклеиновые кислоты
Мишенью универсальных специфичных к биологическому виду методов анализа является высококонсервативная область гена IS6110, инсерционного элемента, встречающегося практически только у членов комплекса Mycobacterium tuberculosis. Множество копий элемента IS6110 можно найти в различных положениях в геномах членов комплекса M. tuberculosis, так что эти праймеры могут также использоваться в генотипировании штаммов. Все праймеры и пробы получены от Applied Biosystems (Foster City, CA, USA).
Лабораторный аппарат LightCycler 2.0 (Roche Molecular Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) и его более легкая переносная версия (50 фунтов, 22,7 кг), Ruggedized Advanced Pathogen Identification Device (R.A.P.I.D., Idaho Technologies, Salt Lake City, UT, USA), оба представляют собой 32-луночные капиллярные аппараты для анализа в режиме реального времени, в которых используются аналогичные компоненты и системное программное обеспечение. R.A.P.I.D. выполнен в упрочненном корпусе и может использоваться удаленно (например, в полевых условиях или в месте оказания медицинской помощи).
Последовательности праймеров и зондов показаны выше. Точки плавления пары праймеров находятся в пределах 2°C, и отжиг/удлинение происходит при 58-60°C. Температура отжига/удлинения для соответствующих зондов на 8-10°C выше, чем для праймеров. Термоциклирование осуществляют в быстром, 2-температурном формате с отжигом и удлинением, каждое при 60°C в течение всего по меньшей мере примерно 30 секунд, которым способствует короткая длина соответствующих ампликонов.
4
Амплификацию в режиме реального времени проводили в одностадийном формате «одной пробирки». Используя PrimeMix Universal MTB Assay (Longhorn Vaccines & Diagnostics, USA), добавляли по 2 мкл, 3 мкл, 4 мкл или 5 мкл нуклеиновых кислот к 18 мкл, 17 мкл, 16 мкл или 15 мкл, соответственно, основной смеси (т.е. PrimeMix), содержащей следующие компоненты в указанных конечных концентрациях: (a) 1× реакционный буфер, содержащий 50 мМ Tris, pH 8,0, 70 мМ KCl, 3 мМ MgSO, 45 мМ бетаина, 0,05 мкМ ROX™, 0,025 мкг/мкл ультрачистого BSA, 0,2 мМ смеси dNTP и 0,1 мМ EDTA; (b) 1× смесь ферментов, содержащую по 20 мкМ каждого праймера, 1 единицу Taq-полимеразы и 20 мкМ меченого зонда. Прямой праймер для амплификации последовательности-мишени из M. tuberculosis состоял из следующей последовательности: 5′-CTCGTCCAGCGCCGCTTC-3′ (SEQ ID NO:2). Обратный праймер для амплификации последовательности-мишени из M. tuberculosis состоял из следующей последовательности: 5′-ACAAAGGCCACGTAGGCGA-3′ (SEQ ID NO:3). Меченый зонд для обнаружения присутствия последовательности-мишени из M. tuberculosis состоял из следующей последовательности: 5э-6FAM-ACCAGCACCTAACCGGCTGTGGGTA-MGBNFQ-3′ (SEQ ID NO:4). На фиг.5 показано, что добавление большего количества ДНК-матрицы M. tuberculosis, т.е. 5 мкл, а не 2 мкл из выделенной у пациента ДНК, приводит к немного лучшим результатам РВ-ПЦР-амплификации и обнаружения, а именно, среднее значение Сτ составляет 25,1 для 2 мкл относительно среднего значения Сτ для 5 мкл, составляющего 23,4.
(-1/тангенс угла наклона)
Термоциклирование проводили следующим образом: исходный «горячий старт» при 95°C с течение 5 мин с последующими 40 циклами денатурации при 95°C в течение 10 сек. и объединенными отжигом и удлинением при 60°C в течение 32 сек. Эффективность амплификации определяли, используя способ наклона кривой Сτ, согласно уравнению: E=[10-1]×100. Все методы анализа, описанные в настоящем документе, имели эффективность более 98,5%.
В каждый анализ включали контроли «без матрицы» и «положительные» контроли. Базовую флуоресценцию для каждого анализа вручную доводили до наблюдаемой в контрольной реакции «без матрицы». «Положительный» контроль дает превышение в интенсивности флуоресценции относительно базовой линии «без матрицы». «Положительный» неизвестный образец определяют как амплификацию, превышающую базовую флуоресценцию с соответствующим значением Сτ, не превышающим 36 за 40-циклов анализа.
Образцы собирали, вращая флок-тампоны Copan пять раз в образце мокроты и погружая их в пробирку для сбора образцов в PrimeStore, содержащую 1,5 мл раствора PrimeStore. Также использовали отношение 1:1 образца к PrimeStore, как описано выше. Перед анализом отобранного тампоном материала выделяли нуклеиновые кислоты, используя AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit, и амплифицировали, используя набор LightCycler Mycobacterium Detection Kit. Образцы хранили при комнатной температуре в течение приблизительно 6-30 дней до выделения нуклеиновых кислот и амплификации с использованием анализа PrimeMix™ Universal MTB Assay, описанного выше. Набор для анализа PrimeMix™ Universal MTB Assay был отправлен в лабораторию из Соединенных Штатов при 4°C (4 дня) и по прибытии оставался при комнатной температуре в течение 48 часов перед хранением при -20°С.
Выделение нуклеиновых кислот проводили, используя QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. 200 мкл отобранного тампоном материала в PrimeStore быстро встряхивали на вортексе (например, в течение 5-10 сек.) и использовали в качестве исходного материала для процедуры выделения.
Амплификацию нуклеиновых кислот проводили, используя PrimeMix™ Universal MTB Assay. Прямой праймер для амплификации последовательности-мишени из M. tuberculosis состоял из следующей последовательности: 5′-CTCGTCCAGCGCCGCTTC-3′ (SEQ ID NO:2). Обратный праймер для амплификации последовательности-мишени из M. tuberculosis состоял из следующей последовательности: 5′-ACAAAGGCCACGTAGGCGA-3′ (SEQ ID NO:3). Меченый зонд для обнаружения присутствия последовательности-мишени из M. tuberculosis состоял из следующей последовательности: 5′-6FAM-ACCAGCACCTAACCGGCTGTGGGTA-MGBNFQ-3′ (SEQ ID NO:4). ПЦР содержала по 18 мкл PrimeMix™ Universal MTB и по 2 мкл выделенных нуклеиновых кислот. Профиль амплификации состоял из исходного «горячего старта» при 95°C с течение 5 мин, с последующими 40 циклами денатурации при 95°C в течение 10 сек. и объединенными отжигом и удлинением при 60°C в течение 32 сек., как описано выше. Амплификацию проводили на платформе LightCycler 480 platform (Roche), а обнаружение ампликона осуществлялось за счет FAM-мечения зонда.
Аналогично описанным выше примерам проводили сравнительные исследования, используя следующие протоколы: (1) процедуру обеззараживания NaLc/NaOH с последующим выделением нуклеиновых кислот с помощью набора AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit и амплификацией с использованием набора LightCycler Mycobacterium Detection (MTB); (2) отбор культуры тампоном в PrimeStore, с последующим выделением нуклеиновых кислот с помощью набора AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit и амплификацией с использованием набора LightCycler MTB; (3) смешивание образцов с PrimeStore в соотношении 1:1, с последующим выделением нуклеиновых кислот с помощью набора AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit и амплификацией с использованием LightCycler MTB; (4) отбор культуры тампоном в PrimeStore, с последующим выделением нуклеиновых кислот с помощью набора AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit и амплификацией с использованием PrimeMix Universal MTB Assay; и (5) отбор культуры тампоном в PrimeStore, с последующим выделением нуклеиновых кислот с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit и амплификацией с использованием набора LightCycler MTB.
Результаты анализа PrimeMix Universal MTB Assay приведены в таблицах 10 и 11.
ТАБЛИЦА 10
ИНФОРМАЦИЯ ОБ ОБРАЗЦАХ
Номер образца
Мазок
Идентификация культуры
Объем образца на тампоне (мкл)
Длительность нахождения образца на тампоне в PrimeStore при комнатной температуре до амплификации (дни)
1
+
M. tuberculosis
50
28
2
+++
M. tuberculosis
50
28
3
+++
M. tuberculosis
150
28
4
++
M. tuberculosis
250
28
5
Отриц.
M. tuberculosis
100
6
6
Отриц.
M. tuberculosis
100
6
7
Скудн. 7
M. tuberculosis
50
6
8
Скудн. 1
M. tuberculosis
50
6
9
Скудн. 9
M. tuberculosis
50
6
10
Отриц.
M. tuberculosis
50
6
11
Отриц.
M. tuberculosis
50
6
12
Отриц.
M. tuberculosis
50
6
13
Отриц.
M. tuberculosis
50
6
14
Отриц.
M. tuberculosis
100
6
ТАБЛИЦА 11
СРАВНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЦР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ ОБРАБОТКИ ОБРАЗЦОВ И АНАЛИЗА
Номер образца
Мазок
NaLc/NaOH; набор LightCycler MTB
Тампон в PrimeStore; набор LightCycler MTB
Образец в PrimeStore (1:1); набор LightCycler MTB
Тампон в PrimeStore; PrimeMix Universal MTB Assay
Тампон в PrimeStore; Qiagen; набор LightCycler MTB
Значение Сτ
Значение Сτ
Значение Сτ
Значение Сτ
Значение Сτ
1
+
27,00
31,34
31,54
35,00
31,67
2
+++
28,82
31,77
31,56
33,43
32,74
3
+++
29,21
26,62
23,80
26,24
26,56
4
++
28,04
29,63
26,64
27,51
28,96
5
Отриц.
-
37,45
33,03
35,00
33,11
6
Отриц.
-
-
-
-
-
7
Скудн. 7
34,25
34,09
29,51
33,03
31,85
8
Скудн. 1
31,59
-
32,11
35,00
34,21
9
Скудн. 9
32,51
-
31,01
35,00
33,75
10
Отриц.
-
-
-
35,00
33,89
11
Отриц.
-
33,28
31,87
35,00
33,59
12
Отриц.
34,79
39,49
32,00
35,00
32,72
13
Отриц.
-
-
-
-
34,47
14
Отриц.
26,24
29,26
37,75
35,00
29,19
(-) указывает на то, что не было получено результатов
С помощью анализа PrimeMix™ Universal MTB Assay было обнаружено 71% отрицательных по мазку образцов, а также 100% положительных по мазку образцов. С использованием PrimeMix™ Universal MTB Assay было обнаружено более высокое число положительных по посеву образцов, чем с использованием LightCycler MTB. PrimeMix™ Universal MTB Assay был совместим с раствором PrimeStore.
Пример 9 - Стабильность PrimeMix Universal MTB Assay
Компоненты PrimeMix Universal MTB Assay, описанные выше, после хранения при -20°C несколько раз переносили в комнатную температуру, а именно, один, три, пять и десять раз, чтобы определить стабильность объединенных вместе реагентов и будут ли повторные циклы оттаивания и замораживания ингибировать способность PrimeMix Universal MTB Assay обнаруживать комплекс M. tuberculosis в образцах нуклеиновых кислот. Все компоненты метода анализа находились в одной пробирке и размораживались при комнатной температуре в течение примерно от трех до примерно пяти минут. Пробирку затем помещали при -20°C примерно на один час, чтобы провести следующий цикл замораживания-оттаивания. После последнего цикла замораживания-оттаивания проводили РВ-ПЦР, как описано выше для PrimeMix Universal MTB Assay, используя ранее идентифицированный штамм MDR-TB (University of Pretoria, South Africa). Эксперименты проводили в трех повторах для каждого числа циклов замораживания-оттаивания и усредняли полученные значения Сτ.
τ
τ
Результаты PrimeMix Universal MTB Assay после прохождения нескольких циклов замораживания-оттаивания можно увидеть на фиг.3. Как можно увидеть из данной диаграммы, PrimeMix Universal MTB Assay не показывал снижения в ПЦР-амплификации, на что указывали полученные значения Сτ, которые по существу не отличались друг от друга, даже когда компоненты PrimeMix Universal MTB Assay были разморожены и повторно заморожены 10 раз. Средние значения Сτ после одного цикла замораживания-оттаивания (С=23,6) и после десяти циклов замораживания-оттаивания (С=23,7) по существу не отличались. Таким образом, PrimeMix Universal MTB Assay содержит стабильные компоненты, которые не разрушаются при меняющихся температурных условиях, что делает этот метод анализа особенно подходящим для использования в «полевых условиях» вдали от традиционных лабораторных условий.
Пример 10 - Обнаружение IPC для мониторинга целостности образца/точности нуклеиновых кислот в методах анализа PrimeMix
Дизайн внутреннего положительного контроля для PrimeStore, вместе с праймерами и пробами для его обнаружения
Как отмечено в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления изобретения желательно включать молекулу-носитель нуклеиновых кислот и/или последовательность IPC, чтобы облегчить получение, стабилизацию и количественное определение выделенных полинуклеотидов. IPC по изобретению могут быть напрямую химически синтезированы с использованием традиционных способов, или в альтернативном варианте, получены с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Желательно составить последовательность IPC таким образом, чтобы она не соответствовала обоим геномам, и по существу не гибридизовалась ни с геномом млекопитающих, ни с геномом представляющих интерес патогенных видов. Конкретные композиции и способы применения можно найти в принадлежащей авторам настоящего изобретения совместно поданной патентной заявке США (№ публикации 2009/0233309, зарегистрирована 20 апреля 2009 г.), полное содержание которой специально включено в настоящий документ путем ссылки.
В одном варианте осуществления изобретения авторы использовали одноцепочечную молекулу ДНК, содержащую последовательность SEQ ID NO:8 (5′-
в качестве внутреннего контроля для мониторинга правильности и целостности анализируемых нуклеиновых кислот. Как правило, в PrimeStore помещали примерно 0,02 пг/мл одноцепочечной ДНК-мишени. В типовых вариантах осуществления изобретения выбранные амплификационные праймеры и меченые олигонуклеотидные детекционные зонды, предпочтительно все, связываются по меньшей мере с первой выделенной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:8. При использовании следующих специфичных амплификационных праймеров полученный продукт амплификации составляет примерно 100 п.н. в длину:
Прямой праймер: 5′-GTGCAGTCAGTCCCTCGGTTA-3′ (SEQ ID NO:9).
Обратный праймер: 5′-TTGACTTTGAAACCTGGACTGATC-3′ (SEQ ID NO:10).
В качестве иллюстративного олигонуклеотидного детекционного зонда, специфичного для этого продукта амплификации, авторы выбрали последовательность SEQ ID NO:11 (5′-[FAM]-AAATATCCGTACCGTAGTCG-[MGB]-3′).
IPC, которые подходят для осуществления настоящего изобретения на практике, не должны обязательно включать одну или более описанных в настоящем документе иллюстративных последовательностей, и даже не должны быть по существу гомологичны любой из IPC-последовательностей, раскрытых в настоящем документе. Для иллюстрации этого, нижеследующие последовательности представляют варианты SEQ ID NO:8, которые также функционируют в качестве ДНК-носителя/IPC-последовательностей, несмотря на то, что они имеют вырожденную последовательность:
IPC по настоящему изобретению не должны в точности соответствовать иллюстративному ампликону ДНК, раскрытому в настоящем документе как SEQ ID NO:8. Дополнительные примеры ДНК-последовательностей, пригодных для in vitro получения молекул-носителей РНК, включают, без ограничения, одну или более из нижеследующих последовательностей. В каждом случае, сайт транскрипции полимеразы показан одной чертой, а последовательности участков связывания типовых прямых и обратных ПЦР-праймеров показаны двойной чертой. Типовые последовательности, с которыми связаны подходящие меченые молекулярные зонды, выделены полужирным шрифтом.
причем Х является любым нуклеотидом, а n является любым целым числом от 0 до примерно 500.
Пример 11 - Обнаружение флуоресцентного зонда к ДНК IPC
Зонды для обнаружения IPC могут включать радиоактивную, люминесцентную, хемилюминесцентную, флуоресцентную, ферментативную, магнитную или спиновую метку, или их комбинации. Флуоресцентные метки могут включать флуоресцеин, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM) или 6-карбоксифлуоресцеин-N-сукцинимидиловый эфир (6-FAMSE), краситель VIC™ или т.п., или их комбинации.
τ
τ
τ
Зонд для обнаружения IPC (SEQ ID NO:11) был помечен либо 6-FAM (FAM), либо красителем VIC™ способами, известными среднему специалисту в данной области, для того чтобы оценить их эффект на обнаружение IPC в образцах после проведения РВ-ПЦР. Для амплификации и последующего обнаружения присутствия IPC использовали PrimeMix, содержащий эти зонды, а также IPC-праймеры (SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10). Эксперимент проводили четыре раза для каждого типа меченого зонда. Детекцию проводили, используя систему для ПЦР в реальном времени ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems™, Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA). Как видно из фиг.4, не наблюдается достоверной разницы между значениями С для детекционного зонда, меченного красителем VIC™ (величина C=32,5) и меченного 6-FAM (величина C=31,5). Таким образом, тип используемой метки зонда имел минимальный эффект или не имел эффекта на проведение анализа и оценку присутствия и количества IPC.
Пример 12 - Мультиплексный анализ: внутренний положительный контроль в комбинации с PrimeMix Universal MTB Assay
Как указано выше, желательно составить последовательность IPC таким образом, чтобы она не соответствовала обоим геномам, и которая по существу не гибридизовалась бы ни с геномом млекопитающих, ни с геномом представляющих интерес патогенных видов. Это необходимо для того, чтобы избежать потенциального обнаружения IPC-праймерами и зондами других нуклеиновых кислот, присутствующих в образце от пациента, таких как ДНК самого пациента или ДНК других не представляющих интерес микроорганизмов, которые могут присутствовать в образце.
τ
τ
Для подтверждения того, что IPC, IPC-праймеры и IPC-зонды по настоящему изобретению не влияют на амплификацию или обнаружение последовательностей M. tuberculosis в образцах или не ингибируют их, одноцепочечную ДНК IPC помещали в PrimeStore, содержащий примерно 33 нг/мкл ранее идентифицированной ДНК MDR-M. tuberculosis. Затем нуклеиновые кислоты выделяли, используя QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen), а PrimeMix, содержащий как праймеры, так и зонды на M. tuberculosis и IPC, описанные выше, использовали в мультиплексном PrimeMix Universal MTB Assay. Для сравнения, такую же процедуру проводили на том же штамме M. tuberculosis, но без добавления IPC, IPC-праймеров или зондов. Этот эксперимент проводили в трех повторах для каждой из мультиплексной и моноплексной процедуры. Как видно из фиг.6, мультиплексная процедура существенно не влияла на амплификацию и детекцию нуклеиновых кислот M. tuberculosis, т.е. среднее значение С для мультиплексной процедуры («MTB мультиплексный») составляло 24,6, тогда как значение С для моноплексной процедуры («MTB») составляло 23,6.
Пример 13 - Моноплексные и мультиплексные методы анализа: различные концентрации IPC
-5
-6
-7
-8
Меняли концентрацию IPC, внесенного в PrimeStore. IPC в количестве 10, 10, 10 и 10 нг/мкл вносили в одинаковое количество PrimeStore. В зависимости от проводимой реакции (моноплексной или мультиплексной) специфичный к комплексу M. tuberculosis набор праймеров и зондов также вносили в PrimeMix. В раствор PrimeStore не добавляли специфичных к комплексу M. tuberculosis нуклеиновых кислот. Как можно увидеть на фиг.7, изменение концентрации IPC в PrimeStore в мультиплексном анализе PrimeMix Universal MTB Assay («IPC Vic в мультиплексном анализе») не показало значительной разницы по сравнению с такими же изменениями концентраций в моноплексном анализе PrimeMix (только на IPC) («IPC Fam» и «IPC Vic»). Кроме того, не наблюдалось значительных отличий между IPC-зондами, меченными 6-FAM и меченными красителем VIC™ в моноплексном формате при изменении концентрации IPC.
Пример 14 - Моноплексные и мультиплексные методы анализа: изменение концентрации образца M. tuberculosis
τ
τ
τ
τ
τ
Как можно увидеть на фиг.8, увеличение исходного количества образца M. tuberculosis с 15 мкл до 150 мкл (10-кратная разница) при исходном хранении в 1,5 мл PrimeStore немного улучшало результаты, полученные в моноплексном PrimeMix Universal MTB Assay (среднее значение С для 15 мкл образца = 26,5, среднее значение С для 150 мкл образца = 24,1) и в мультиплексном PrimeMix Universal MTB Assay (среднее значение С для 15 мкл образца = 26,8, среднее значение С для 150 мкл образца = 24,2). Как и ожидалось, на детекцию IPC это не влияло. Наблюдалась небольшая разница в MTB ПЦР-амплификации по значениям С между моноплексным и мультиплексным анализам PrimeMix Universal MTB Assay.
Пример 15 - Моноплексные и мультиплексные методы анализа: детекция штаммов микобактерий
Различные штаммы микобактерий (а именно, пять различных штаммов M. tuberculosis, два различных штамма M. avium, один штамм M. intracellularae, один штамм M. gondii и один штамм M. kansasii) тестировали как в моноплексном («МТВ моноплексный»), так и в мультиплексном («МТВ мультиплексный») анализах PrimeMix, с помощью процедур, аналогичных описанным выше. Количество выделенных нуклеиновых кислот менялось (в зависимости от содержания образца мокроты) от примерно 80 до примерно 180 нг/мкл. Как можно увидеть на фиг.9, оба метода анализа, моноплексный и мультиплексный, легко обнаруживали пять различных штаммов M. tuberculosis, но не обнаружили ни одного из других штаммов (не относящихся к M. tuberculosis). Это указывает на то, что анализ PrimeMix легко детектирует возбудителей туберкулеза, а не другие виды микобактерий. Не было обнаружено существенных различий между результатами моноплексного и мультиплексного анализов в отношении обнаружения МТВ, так что чувствительность практически не теряется между моноплексным и мультиплексным анализами. IPC легко детектировался во всех мультиплексных анализах вне зависимости от используемого штамма микобактерий.
Пример 16 - Моноплексные и мультиплексные методы анализа: разбавление патогена-мишени M. tuberculosis
-4
-3
-2
-1
-1
-2
-3
-4
Как можно увидеть на фиг.10, изменение концентрации последовательности-мишени M. tuberculosis из конкретного очищенного штамма, а именно, 10, 10, 10, 10, представляющие собой десятикратные разведения, в которых 10 представляет концентрацию ДНК 330 нг/мкл, 10 представляет концентрацию ДНК 33 нг/мкл, 10 представляет концентрацию ДНК 3,3 нг/мкл, а 10 представляет концентрацию ДНК 0,33 нг/мкл, значительно увеличивало способность анализа PrimeMix обнаруживать M. tuberculosis, как в моноплексном, так и в мультиплексном анализах. Концентрация последовательности-мишени IPC составляла 0,02 пг/мл для каждого анализа. Наивысшая концентрация нуклеиновых кислот M. tuberculosis минимально влияла на обнаружение IPC, как и ожидалось при проведении мультиплексных анализов, в которых концентрация последовательности-мишени обычно значительно выше концентрации IPC. Это можно решить путем увеличения концентрации последовательности-мишени IPC в анализе или дополнительной молярной оптимизацией IPC-праймеров и/или зонда в мультиплексной реакции.
Пример 17 - Мультиплексные методы анализа: разведение штамма M. tuberculosis
-4
-3
-2
-1
-1
-2
-3
-4
τ
Как можно увидеть на фиг.11, изменение количества нуклеиновых кислот M. tuberculosis из конкретного очищенного штамма, а именно, 10, 10, 10, 10, представляющие собой десятикратные разведения, в которых 10 представляет концентрацию ДНК 33 нг/мкл, 10 представляет концентрацию ДНК 3,3 нг/мкл, 10 представляет концентрацию ДНК 0,33 нг/мкл, а 10 представляет концентрацию ДНК 0,033 нг/мкл, не имело значительного эффекта на обнаружение IPC при использовании IPC-зондов, меченных либо 6-FAM, либо красителем VIC™. В общем, зонды, меченные 6-FAM, давали более низкие значения С, но оба способа детекции были равноценно эффективными.
Пример 18 - Изменения порогового цикла в ПЦР в реальном времени при различных концентрациях BSA
ДНК и/или РНК-ферменты для ПЦР и 10× ПЦР-буферы, как правило, поставляются в отдельных пробирках и хранятся при постоянной температуре -20 градусов Цельсия. «Основную смесь» обычно готовят, размораживая и смешивая фермент и 10× ПЦР-буфер с праймерами для амплификации. Настоящее изобретение представляет собой включающую все компоненты смесь, которая включает буферы, соли, ферменты, а также праймеры и зонд для амплификации в режиме реального времени в 1× одноразовой пробирке, и которая гораздо более термостабильна, чем ПЦР-буферы в данной области. Например, в отличие от коммерческого 10× ПЦР-буфера, поставляемого с Platinum Taq ДНК-полимеразой (Invitrogen, кат. №№ 10966-018 и 10966-026), настоящее изобретение включает добавление BSA для стабилизации ПЦР-ферментов в реакции.
Бычий сывороточный альбумин (BSA) используют обычно в реакциях ферментативной рестрикции для стабилизации некоторых ферментов в процессе расщепления ДНК и для предупреждения адгезии фермента на реакционные пробирки, в частности, стеклянные капиллярные пробирки, используемые для ПЦР. Вследствие своих стабилизирующих характеристик в продолжительных, а именно, в течение ночи, рестрикционных ферментативных реакциях, вероятно, что BSA может усиливать стабильность и целостность ДНК- и РНК-полимераз, используемых в ПЦР и РВ-ПЦР амплификациях, особенно, когда эти ферменты хранятся при температурах ниже -20°С. Опубликовано, что BSA стабилизирует реакции, мешая ингибирующим веществам и загрязнению ДНК. Присутствие BSA в концентрации 0,1-0,5 мг/мл в конечной реакции не имело отрицательных эффектов на последующие полимеразные цепные реакции (ПЦР), как было определено по значениям пороговых циклов в ПЦР в реальном времени.
Бетаин улучшает совместную амплификацию двух альтернативно сплайсированных вариантов мРНК простат-специфичного мембранного антигена и амплификацию кДНК c-jun. Бетаин и катионно-функционализированные цвиттерионные соединения улучшают амплификацию генов за счет уменьшения образования вторичной структуры, вызываемого GC-богатыми областями, и поэтому может, как правило, применяться для улучшения амплификации любой GC-богатой последовательности ДНК. Бетаин в PrimeMix сохраняет и стабилизирует индивидуальные нуклеотиды (A, T, C, G) и предупреждает отжиг, стабильность, гидролиз и окислительную деградацию ПЦР-праймеров и зондов в растворах PrimeMix. Бетаин, присутствующий в конечной концентрации 10-100 мМ, обладает аддитивным эффектом на ПЦР-амплификацию, как было определено по значениям пороговых циклов в процессе амплификации в реальном времени. Бетаин является стабилизированной молекулой и хорошо подходит для ПЦР-смесей, хранящихся при температурах выше -20°С, поскольку он не усиливает частоту мутаций в процессе амплификации и не разрушается так легко, как DTT и ДМСО.
Конечный рН буфера имеет огромное влияние на общую стабильность в процессе ПЦР-амплификации. Предпочтительным рН для ПЦР обычно является 8,4, хотя буферы, имеющие основность до 9,0, также были эффективны. В настоящем изобретении, содержащем включающую всю смесь ферментов, буферов и праймеров, авторы изобретения обнаружили, что оптимальный рН должен составлять 8,2 (+/-0,1). Было показано, что несколько менее основный буфер усиливает ПЦР-амплификацию при ПЦР в реальном времени, особенно, когда составы PrimeMix хранятся при температурах выше -20°С.
2
50
Вирус гриппа A (H3N2) (10 TCID/мл) амплифицировали, используя PrimeMix Universal Influenza A в 0,1-0,5 мг/мл градиенте BSA (см. фиг.12). Как можно видеть, при этих концентрациях не наблюдается никакой разницы в пороговых циклах при ПЦР в реальном времени, что указывает на отсутствие ингибирования ПЦР в результате действия BSA.
Другие варианты осуществления и применения изобретения будут очевидны опытным специалистам в данной области с учетом описания и осуществления на практике изобретения, описанных в настоящем документе. Все цитируемые в настоящем документе ссылки, включая все публикации, патенты и патентные заявки США и других стран, специально и полностью включены путем ссылки. Предполагается, что термин «содержащий», когда он используется, включает термины содержащий и включающий и не считается ограничивающим. Предполагается, что описание и примеры считаются только примерами с действительными объемом и сутью настоящего изобретения, указанными в формуле.