МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ КОМПЛЕКС БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА
MACROMOLECULAR COMPLEX OF BACTERIAL ORIGIN AND USE THEREOF FOR PREVENTING OR TREATING RHEUMATOID ARTHRITIS

Настоящее изобретение касается макромолекулярного комплекса бактериального происхождения и также применения указанного макромолекулярного комплекса для профилактики и лечения ревматоидного артрита.
Многие научные исследования продемонстрировали роль, которую играет флора кишечника в патогенезе хронических ревматических воспалительных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит или постинфекционный ревматизм.
Например, никаких симптомов артрита не наблюдаются у стерильных животных (трансгенные крысы или мыши), в то время как их однопометные животные, имеющие кишечную флору демонстрируют симптомы артрита (Rath НС, et al; J. Clin. Invest; 98(4); 945-953; 1996 and Abdollahi-Roodsaz S., et al; J. Clin. Invest; 118; 205-216; 2008)
Кроме того, исследования на людях показали, что пациенты, у которых был недавно диагностирован ревматоидный артрит, имели незначительное число бифидобактерий по сравнению с контрольными субъектами (Vaahtovuo J, et al; J. Rheumatol; 35; 690-693; 2008) и, было найдено, что когда равновесие кишечной флоры было частично восстановлено посредством введения вегетарианской диеты, состояние пациента, как улучшалось (Peltonen R, et al; J. Rheumatol; 36; 64-68; 1997). Наконец, известно, что использование некоторых антибиотиков, которые изменяют состав кишечной флоры, улучшает симптомы ревматоидного артрита (Stone M. et al.; J. Rheumatol; 30; 2112-2122; 2003).
Один из механизмов, который объясняет причастность кишечной флоры к патогенезу хронического ревматического заболевания, заключается в ее способности регулировать транслокацию бактерий. Механизм транслокации бактерий определяется как пересечение кишечного барьера кишечными бактериями. Эти кишечные бактерии поглощаются и затем транспортируются клетками иммунной системы кишечника, такими как дендритные клетки или макрофаги, в межсуставные участки, становясь источником воспаления ревматического типа, причиняющего боль в суставах.
Состав кишечной флоры оказывает влияние на этот процесс.Таким образом, когда бифидобактерии широко колонизируют нижнюю часть кишечника, они демонстрируют способность уменьшать транслокацию бактерий (Romond MB, et al.; Anaerobe; 14; 43-48; 2008).
Кроме того, состав кишечной флоры также оказывает влияние на уровень экспрессии генов, вовлеченных в воспалительный ответ, таких как галектины (Romond MB, et al; Ferns Immunol Med Microbiol; 55; 85-92; 2009).
Существует в настоящее время много продуктов, способных модифицировать кишечную флору, такие как пребиотики или пробиотики. С другой стороны, незначительное их количество оказывает положительное влияние на транслокацию бактерий. Среди продуктов, которые имеют благоприятное действие относительно транслокации бактерий, находится макромолекула, выделенная из культуры Bifidobacterium breve. Действительно, было продемонстрировано в документах WO 2004/093898 и WO 2006/040485, что пероральный прием этой макромолекулы приводит к уменьшению транслокации и бактериальной диссеминации и что упомянутая молекула демонстрирует профилактическую активность против коллаген-индуцированного артрита у мышей. Однако, остаточная провоспалительная активность всегда наблюдается при использовании макромолекулы, выделенной из культуры Bifidobacterium breve, таким образом, ограничивая ее использование в области воспалительных заболеваний. Поэтому было бы полезно иметь продукт, который позволял бы уменьшать получаемую транслокацию бактерий и который не проявлял какой-либо остаточной провоспалительной активности.
Заявитель случайно обнаружил, что применение макромолекулярного комплекса, выделенного из комплекса Bifidobacterium longurn, позволяет удовлетворить эти требования.
Макромолекулярный комплекс в соответствии с настоящим изобретением, продуцированный посредством Bifidobacterium longum штамм CBi0703, депонированный в соответствии с Будапештским договором под номером CNCM 1-3994 от имени BIFINOVE, 23 мая 2008, в Национальной Коллекции Культур Микроорганизмов находящаяся в собственности (поддерживаемая) Institut Pasteur, 25 rue du docteur Roux 75015 Paris.
Указанный макромолекулярный комплекс состоит из цепей, объединяющих липопротеин и олигосахарид, в котором:
- липопротеин имеет молекулярную массу от 30 кДа до 60 кДа;
- олигосахарид имеет молекулярную массу меньше чем 15 кДа и предпочтительно меньше чем 10 кДа;
- липопротеиновая компонента, которая состоит из всех липопротеинов каждой цепи, составляет от 75 до 99%, предпочтительно от 80 до 98%, более предпочтительно от 85 до 95% по массе от общей массы комплекса, и олигосахаридная компонента, который состоит из всех олигосахаридов, связанных с каждой из цепей, составляет от 1 до 25%, предпочтительно от 2 до 20%, и более предпочтительно от 5 до 15% от общей массы комплекса.
Макромолекулярный комплекс включает несколько цепей, объединяющих липопротеин и олигосахарид, причем указанные цепи, являются идентичным или отличаются по природе.
В соответствии с настоящим изобретением, для макромолекулярного комплекса, содержащего несколько цепей, необходимо быть в агломерированной форме, чтобы наблюдался противоревматический эффект. Действительно, введение низкомолекулярных (как правило приблизительно 15-50 кДа) мономерных структур мышам привело к существенному увеличению артритного показателя.
У макромолекулярного комплекса в соответствии с настоящим изобретением поэтому обязательно должна быть молекулярная масса больше чем 150 кДа, предпочтительно больше, чем 400 кДа и особенно предпочтительно больше, чем или равно 600 кДа.
В соответствии с настоящим изобретением, липопротеин содержит аминокислотную последовательность SEQ ID No.1:
Аминокислотная последовательность липопротеина является SEO ID No.2:
Сахариды, образующие олигосахаридную компоненту макромолекулярного комплекса в соответствии с настоящим изобретением могут быть выбраны из галактозы (Gal), N-ацетилгалактозамина (Gal Nac), глюкозы (Glc), N-ацетилглюкозамина (Glc Nac), рамнозы (Rham) и маннозы (Man) и смеси вышеперечисленного.
В соответствии с настоящим изобретением массовая доля сахара, который является частью композиции макромолекулы, составляет от 1% до 25%, предпочтительно от 2% до 20% и еще более предпочтительно от 5% до 15%.
Средняя массовая доля галактозы находится между 1 и 50 мкг/мг макромолекулярного комплекса, предпочтительно между 5 и 20 мкг/мг макромолекулярного комплекса, и маннозы между 0,5 и 10 мкг/мг макромолекулярного комплекса, предпочтительно между 1 и 10 мкг/мг макромолекулярного комплекса; средняя массовая доля глюкозы находится между 3 и 80 мкг/мг макромолекулярного комплекса, предпочтительно между 5 и 50 мкг/мг макромолекулярного комплекса и еще более предпочтительно между 10 и 50 мкг/мг макромолекулярного комплекса; средняя массовая доля N-ацетилгалактозамина находится между 2 и 30 мкг/мг макромолекулярного комплекса, предпочтительно между 2 и 20 мкг/мг макромолекулярного комплекса и еще более предпочтительно между 2 и 10 мкг/мг макромолекулярного комплекса; средняя массовая доля N-ацетилглюкозамина находится между 1 и 10 мкг/мг макромолекулярного комплекса, предпочтительно между 1 и 5 мкг/мг макромолекулярного комплекса; средняя массовая доля рамнозы находится между 0,05 и 10 мкг/мг макромолекулярного комплекса, предпочтительно между 0,05 и 5 мкг/мг макромолекулярного комплекса и еще более предпочтительно между 1 и 5 мкг/мг макромолекулярного комплекса.
Липиды, составляющие липидную компоненту макромолекулярного комплекса в соответствии с настоящим изобретением, могут быть выбраны из группы, состоящей из длинных С14, С16 и С18 насыщенных жирных кислот и их смесей.
Кроме того, было показано, что эта макромолекулярная структура узнается галектином-1 и TLR 6, которые показывают, во-первых, что галактозные остатки находятся во внешнем положении, доступном для рецептора галектина-1 (галектин-1 узнает галактозу, присутствующую в лактозе, и особенно галактозу во внешнем положении, находящуюся в гликоконъюгатах) и, во-вторых, что макромолекулярный комплекс сохраняет липопротеиновые фрагменты, которые могут быть узнаны с помощью липопротеин-специфичной субъединицы комплекса TLR2/6.
Исследования, выполненные заявителем, показали, что введение указанного макромолекулярного комплекса вызывает противоревматическую активность у мышей в модели коллаген-индуцированного артрита.
Эта противоревматическая активность была продемонстрирована посредством нескольких наблюдений:
- улучшение транскриптомного ответа дендритных клеток на транслокацию бактерий у мышей, ассоциированных с биотопом пациента, страдающего от артрита;
- кондиционирование этих дендритных клеток, приводящих к коэволюции с популяцией регуляторных Т-лимфоцитов, ответственных за продукцию интерлейкина-10 (цитокин, который играет важную роль в иммуномодуляции в пищеварительной системе и который имеет, в частности, противовоспалительные эффекты).
Макромолекулярный комплекс в соответствии с настоящим изобретением получали посредством способа, включающего следующие стадии:
(i) инокуляция и инкубация в течение 16-60 ч при анаэробных условиях и при температуре между приблизительно 30°С и 39°С, штамма Bifidobacterium longum, депонированного в соответствии с Будапештским договором под номером CNCM 1-3994 в Collection Nationale de Cultures de Microorga nismes (CNCM) [Национальная Коллекция Культур Микроорганизмов] в питательной среде, содержащей природную или гидролизованную фракцию белка молочной сыворотки, лактозу и антиоксидант;
(ii) отделение указанных бактерий от указанной питательной среды;
(iii) ультрафильтрация супернатанта на фильтрующих мембранах, которых имеют порог фильтрации от 10 до 100 кДа, приводящая к получению концентрированного ультраконцентрата;
(iv) обогащение макромолекулярным комплексом с помощью промывки объемом от 5 до 50 кратного объема концентрированного ультраконцентрата;
(v) очистка макромолекулярного комплекса с помощью хроматографии на молекулярных ситах (гельпроникающей хроматографии) в стерильных условиях, например на геле Superdex 200;
(vi) обработка фракции, выходящей с исключенным объемом и содержащей бактериальный макромолекулярный комплекс
Важно предотвратить окисление во время проведения методики, следовательно, необходимо вводить антиоксидант, такой как аскорбиновая кислота, гидрохлорид цистеина или тиогликолят.
В соответствии с одним примером осуществления питательная среда также содержит другие соединения, такие как дигидрофосфат калия, необходимый для стабилизации значения рН.
В соответствии с одним примером осуществления, инокуляция бифидобактерий в указанную питательную среду может быть выполнена с использованием замороженного концентрата или 16-24 ч прекультур, которые способствуют быстрой пролиферации бактерий.
5
10
В соответствии с другим примером осуществления, который может быть объединен с предыдущим, бактерии инокулируют в указанную питательную среду в пропорции 10-10 колоние-формирующих единиц на мл среды.
В соответствии с одним предпочтительным примером осуществления изобретения, питательная среда содержит 1-20 г/л среды природных или гидролизованных белков молочной сыворотки, 30-80 г/л среды лактозы и 0,1-0,5 г/л среды аскорбиновой кислоты.
В соответствии с другим предпочтительным примером осуществления изобретения, питательная среда содержит 1-20 г/л среды природных или гидролизованных белков молочной сыворотки, 30-80 г/л лактозной среды, 0,1-0,5 г/л среды аскорбиновой кислоты и 0,5-3 г/л среды дигидрофосфата калия.
В соответствии с одним примером осуществления, который может быть объединен с предыдущими примерами, значение рН указанной питательной среды не регулируется во время инкубации.
Наконец, в соответствии с другим примером осуществления, значение рН указанной питательной среды поддерживается между 4 и 7 во время инкубации.
Настоящее изобретение касается применения макромолекулярного комплекса бактериального происхождения в соответствии с настоящим изобретением для предотвращения и лечения болезней суставов, и для регуляции кишечной флоры и транслокации бактерий.
В соответствии с другим аспектом, предметом в соответствии с настоящим изобретением является применение указанного макромолекулярного комплекса бактериального происхождения, полученного в соответствии со способом, описанным ранее, в продуктах, предназначенных для фармацевтической, пищевой и/или нутрицевтической промышленности.
Предметом изобретения является, в частности, фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере указанный макромолекулярный комплекс в качестве активного ингредиента и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Массовая концентрация указанного макромолекулярного комплекса составляет от 0,1 мкг/г до 50 мкг/г фармацевтической композиции.
Термин "фармацевтически приемлемый" предназначен, чтобы означать любой носитель, который позволяет не только сохранить иммуномодуляторные свойства макромолекулярного комплекса, полученного в соответствии со способом, описанным ранее, но также и заключать в себе указанный макромолекулярный комплекс.
Применение фармацевтической композиции позволяет регулировать кишечную флору и транслокацию бактерий. Она, следовательно, предназначена для профилактики и лечения воспалительного ревматизма, такого как ревматоидный артрит и анкилозирующий спондилоартрит, остеоартрит и фибромиалгия.
Настоящее изобретение поэтому касается применения фармацевтической композиции для получения лекарства, предназначенного для регуляции кишечной флоры и транслокации бактерий.
Таким образом, изобретение касается фармацевтической композиции для применения для регулирования кишечной флоры и транслокации бактерий.
Изобретение также касается использования фармацевтической композиции для того, чтобы получить лекарство, предназначенное для лечения или предотвращения ревматоидного артрита, остеоартрита и фибромиалгии.
Таким образом, изобретение касается фармацевтической композиции для применения в лечении и профилактике ревматоидного артрита, остеоартрита и фибромиалгии.
Изобретение также касается использования фармацевтической композиции для того, чтобы получить лекарство, предназначенное для лечения ревматоидного артрита и анкилозирующего спондилоартрита, остеоартрита и фибромиалгии.
Таким образом, настоящее изобретение касается фармацевтической композиции для применения в лечении ревматоидного артрита и анкилозирующего спондилоартрита и фибромиалгии. Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть в любой галеновой форме, требуемой для введения либо перорально людям или животным, например в жидкой форме (сироп, раствор, спрей), либо в твердой форме (порошок, таблетка, гелевая капсула, капсула, порошковый спрей, жевательная резинка, паста, гранулы в их различных формах, для немедленного или программированного высвобождения), или ректально, интраназально, через легочный путь, или парентерально, или в форме, удобной для введения ингаляцией или вдуванием. Предпочтительным способом введения является в большинстве случаев пероральное введение.
Фармацевтическая композиция, содержащая указанный макромолекулярный комплекс, может храниться при температуре от -70°С до +4°С для жидких форм и до +40°С для твердых форм в течение 3 лет.
Кроме того, макромолекулярный комплекс, полученный в соответствии со способом, описанным ранее, может также быть включен как компонент в пищевые композиции.
Следовательно, предметом изобретения является также пищевая композиция, содержащая по меньшей мере макромолекулярный комплекс и по меньшей мере один компонент пищевого продукта. Компонент пищевого продукта может быть, например, молочным препаратом, хлебными злаками и т.д.
Такая пищевая композиция может быть предназначена для людей или животных, и может, в частности, быть в форме диетических или недиетических пищевых продуктов для госпитального использования и использования вне больниц. В частности, эта композиция может быть кишечным раствором.
Массовая концентрация указанного макромолекулярного комплекса составляет от 10 нг/г до 2 мкг/г, предпочтительно от 10 нг/г до 1 мкг/г пищевой композиции.
Наконец, макромолекулярный комплекс, полученный в соответствии со способом, описанным ранее, может быть включен, как компонент пищевого продукта, в нутрицевтические композиции.
Предметом настоящего изобретения является поэтому нутрицевтическая композиция, содержащая по меньшей мере указанный макромолекулярный комплекс и по меньшей мере нутрицевтически приемлемый носитель.
Массовая концентрация указанного макромолекулярного комплекса составляет от 10 нг/г до 5 мкг/г нутрицевтической композиции.
Предполагается, что термин "нутрицевтическая композиция" означает композицию, которая имеет полезные или защитные физиологические эффекты, превышающие те, которых могла бы предоставить обычная пища.
Такая нутрицевтическая композиция может быть в форме пищевых добавок. Эти пищевые добавки могут быть в твердой форме, такой как таблетки, порошки, гелевые капсулы или капсулы или в жидкой форме, такие как напитки или эмульсии.
Нутрицевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может поэтому использоваться для предотвращения ревматоидного артрита, остеоартрита и фибромиалгии.
Настоящее изобретение поэтому касается применения указанной нутрицевтической композиции для получения пищевой добавки, предназначенной для предотвращения ревматоидного артрита, остеоартрита и фибромиалгии.
Таким образом, изобретение касается нутрицевтической композиции для применения в профилактике ревматоидного артрита, остеоартрита и фибромиалгии.
Фиг.1 изображает узнавание in vitro галектином-1 макромолекулярного комплекса, полученного ферментацией либо при регулируемом рН, либо без регуляции рН в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг.2 изображает узнавание, in vitro, рецептором TLR-6 макромолекулярного комплекса, полученного ферментацией либо при регулируемом рН, либо без регуляции рН в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг.3 изображает артритный показатель у мышей DBA1 после двух инъекций коллагена с или без лечения с макромолекулярным комплексом, полученным в соответствии с примером 2 (0,2 мг/л, то есть 30-40 мкг/кг).
Фиг.4 изображает развитие артрита, индуцированного коктейлем антител и ЛПС, у мышей DBA1.
Фиг.5 изображает изменение артритного показателя у мышей DBA1, леченных (обработанных) гидролизованным макромолекулярным комплексом (0,2 мг гидролизованного макромолекулярного комплекса/л).
Фиг.6а изображает суставы левых задних конечностей (которые не подверглись инъекции иодацетата натрия: MIA) крыс, принадлежащих контрольной группе, не леченных макромолекулярным комплексом в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг.6b изображает суставы левых задних конечностей (которые не подвергались инъекции MIA) крыс, принадлежащих к группе, леченных макромолекулярным комплексом в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг.7а и 7b представляют суставы правых задних конечностей (подвергавшихся инъекции MIA) крыс, принадлежащих контрольной группе, не леченных макромолекулярным комплексом в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг.7с и 7d представляют суставы правых задних конечностей (подвергавшихся инъекции MIA) крыс, принадлежащих группе, леченных макромолекулярным комплексом в соответствии с настоящим изобретением.
Настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Приготовление и выделение макромолекулярного комплекса в соответствии с настоящим изобретением (рН, регулируемый во время ферментации)
Готовили питательную среду, содержащую следующие компоненты:
- 1-20 г/л белковой основы, составленной из пермеата молочных белков, которые были гидролизированы или находились в нативной форме
- 30-80 г/л лактозы
- 0,1-0,5 г/л аскорбиновой кислоты
- 0,5-3 г/л дигидрофосфата калия.
Первый раствор разводили только с лактозой и стерилизовали при 108°С в течение 130 минут. Второй раствор разводили с оставшимися компонентами и стерилизовали при 121°С в течение 20 минут.
Ферментацию проводили как периодическую ферментацию с регулируемым рН в течение 24 часов.
1 - Периодическая ферментация с регулируемым рН:
6
8
8
10
Значение рН доводили до значения 6,5, как только два раствора выливали в ферментатор. Питательную среду инокулировали 6-10% (объем/объем) 24-часовым иноку лятом, содержащим между 1×10 и 2×10 колоние-формирующих единиц (CFU) бифидобактерий, производных от штамма Bifidobacterium longum, депонированного под номером CNCM I-3994 в Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) [Национальная Коллекция Культур Микроорганизмов] на мл питательной среды. Бактерии культивировали при встряхивании без аэрации среды и при температуре 37°С. Значение рН поддерживали при 6,5, добавляя гидроокись натрия (1 н.-3 н.) во время ферментации. Ферментация продолжалась 24 часа, и популяция Bifidobacterium longum в конце культивирования составляла между 2×10 и 1×10 CFU на мл питательной среды.
2 - Выделение макромолекулярного комплекса
В конце культивирования бактерии удаляли центрифугированием при 13000 g в течение 30 минут при температуре 4°С или микрофильтрацией на кассетах Millistack (Millipore), имеющих площадь поверхности, подходящую для объема ферментации.
Супернатант подвергали ультрафильтрации при температуре окружающей среды и в стерильных условиях на приборе Amicon Pro flux M12 (Millipore). Первую ультрафильтрацию осуществляли на Helicon spiral-wound cartridge (Millipore) с порогом фильтрации 10 кДа.
Супернатант концентрировали более чем 15-кратно, затем промывали непрерывно стерильной водой после осмоса 30-кратным объемом. Полученный 10 кДа ультраконцентрат (ретентат) хранили при 4°С или замораживали для второй ультрафильтрации.
2
Вторую ультрафильтрацию также осуществляли при температуре окружающей среды и в стерильных условиях на том же самом аппарате как ранее, но оборудованном держателем кассет Pellicon (Millipore). Используемая кассета имеет Biomax type с площадью поверхности 0,5 м и порогом фильтрации 100 кДа. 10 кДа ультраконцентрат концентрировали более чем 2-кратно и затем промывали непрерывно 30 объемами воды после осмоса.
Ультраконцентрат >100 кДа хранили до очистки в замороженной или лиофилизованной форме.
Макромолекулярный комплекс, содержавший >100 кДа ультраконцентрат, впоследствии получали в стерильных условиях с помощью эксклюзионной хроматографии на геле Superdex 200 (GE Healthcare). Макромолекулярный комплекс таким образом отделяли и затем элюировали во фракции, выходящей с исключенным объемом (>600 кДа), буфером Трис/50 мМ HCl - 150 мМ NaCl, pH 8,0.
Эту фракцию, выходящую с исключенным объемом, затем обессоливали фильтрацией, затем подвергали диафильтрации с 5-7 объемами стерильной воды после осмоса. Макромолекулярный комплекс таким образом извлекали и хранили в лиофилизованной форме.
Пример 2: Приготовление и выделение макромолекулярного комплекса в соответствии с настоящим изобретением (pH, нерегулируемый во время ферментации)
Состав питательной среды и стадии те же самые, что в примере 1, за исключением того, что в этом примере pH не регулировали во время ферментации, стадия 1 таким образом заменена стадией, описанной ниже.
1 - Периодическая ферментация с нерегулируемым pH во время ферментации:
6
8
7
9
Значение pH доводили до значения 6,5, как только два раствора выливали в ферментатор. Питательную среду инокулировали с 6 - 10% (объем/объем) 24-часового инокулята, содержащего между 1×10 и 2×10 колоние-формирующих единиц (CFU) бифидобактерий, производных от штамма Bifidobacterium longum, депонированного под номером CNCM 1-3994 в Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) [Национальная Коллекция Культур Микроорганизмов] на мл питательной среды. Бактерии культивировали при встряхивании без аэрации среды и при температуре 37°С. Значение pH не поддерживали во время ферментации. Ферментация продолжалась 24 часа, и популяция Bifidobacterium longum в конце культивирования составляла между 2×10 и 1×10 CFU на мл питательной среды.
Выделение макромолекулярного комплекса может быть впоследствии осуществлено в соответствии с стадией 2 примера 1.
В оставшейся части настоящего текста С1 обозначает макромолекулярный комплекс, полученный в соответствии с примером 2 настоящего изобретения.
Пример 3: Характеристика макромолекулярного комплекса
Сахарид, белок и липидные компоненты, которые составляют макромолекулярный комплекс, характеризовали качественно и количественно с использованием различных аналитических методов.
Концентрацию белка определяли методом Лори. Она составляла от 80 до 400 мкг/мг порошка (8-40% макромолекулярного комплекса).
Концентрацию сахарида определяли газовой хроматографией после метанолиза (в 0,5 н.
MeOH/HCl), затем дериватизировали с помощью гептафторбутанового ангидрида (20 мкл в 100 мкл безводного ацетонитрила). Она составляла от 20 до 150 мкг/мг порошка (2-15% макромолекулярного комплекса).
- Липопротеин: последовательность SEQ ID No.2 является следующей:
Кроме того, липидная композиция, установленная с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии, демонстрирует присутствие главных пиков жирных кислот длиной С14:0, С16:0 и С18:0.
- Сахар: сахаридная компонента макромолекулы содержит сахариды, упомянутые в таблице 1 в соответствии со следующими мольными отношениями:
Таблица 1
Массовое распределение сахаров, которые входят в состав макромолекулярного комплекса
Gal
Man
Glc
Gal NAc
Glc NAc
Rham
Массовая доля (мкг/мг макромолекулярного комплекса)
15,35
4,95
35,10
6,75
1,5
1,45
- Макромолекулярный комплекс узнается in vitro галектином-1 (Фиг.1).
В настоящем примере макромолекулярный комплекс в соответствии с настоящим изобретением и получающийся в результате ферментации с регулируемьм или нерегулируемым рН узнается после адсорбции в ячейках микроплашек галектином-1 (визуализация с использованием системы биотин-стрептоавидин). В соответствии с Фиг.1 насыщение наблюдается для концентраций приблизительно от 10 до 20 мкг макромолекулярного комплекса на 10 нг галектина-1.
- Макромолекулярный комплекс узнается in vitro TLR-6 (Фиг.2).
В настоящем примере макромолекулярный комплекс в соответствии с настоящим изобретением, получающийся в результате ферментации с регулируемым или нерегулируемым рН, узнается после адсорбции в ячейках микроплашек TLR6 (визуализация с использованием системы биотин-стрептоавидин). В соответствии с Фиг.2, насыщение наблюдается для концентраций приблизительно от 10 до 20 мкг макромолекулы на 10 нг TLR6. Экспрессия с точки зрения пептидогликанового фрагмента составляет приблизительно от 0,2 до 0,4 мкг пептидогликана на 1 мкг макромолекулы.
Пример 4: Эффект макромолекулярного комплекса С1 у мышей с флорой артрических больных
Для этого исследования используемые мышей разделяли на две группы:
- исследовательская группа, в которой аксенические мыши были ассоциированы с флорой пациента, страдающего от прогрессирующего артрита (FA);
- контрольная группа, в которой аксенические мыши были инокулированы флорой здорового добровольца (FN).
Для исследования использовали потомков от первого до четвертого поколения.
Макромолекулярный комплекс С1 [нерегулируемый рН], вводили перорально в течение 15 дней в дозе 0,2 мг/л (средняя доза, приходящаяся на мышь, находится между 25-50 мкг/кг).
Мышей, которых не кормили с предыдущего дня, подвергали эвтаназии. Селезенку удаляли в стерильных условиях и обрабатывали коллагеназой, чтобы высвободить спленоциты. Дендритные клетки CD11c и лимфоциты CD4(+) Th и Treg выделяли, используя систему MACs. Кишечную флору анализировали в подвздошной кишке, слепой кишке и толстом кишечнике. Транслокацию бактерий оценивали с помощью бактериологического анализа Пейеровых бляшек, печени, легкого, почек и крови.
Результаты сопоставляются в таблице 2 и ясно демонстрируют увеличение уровня бифидобактерий на протяжении всего кишечника мышей, обработанных (леченных) С1, и таким образом показывает благоприятное воздействие введения последнего на флору кишечника.
Таблица 2
Эффект введения макромолекулярного комплекса С1 на кишечную флору
Контроль
Исследование
Р
Мыши (n)
6
5
Подвздошная кишка
E.coli
5,38±0,6 (5)
4,89±1,3 (5)
NS
Bifidobacteria
2,68±0,7 (2)
3,49±1,7 (5)
0,0398
Слепая кишка
E.coli
7,89±0,3 (6)
7,52±0,4 (5)
NS
Bifidobacteria
3,06±0,4 (3)
6,43±1,5 (5)
0,0061
Толстая кишка
E.coli
7,61±1,4 (6)
8,11±0,4(5)
NS
Bifidobacteria
3,0±0,8 (6)
6,56±1,5 (5)
0,0057
Пример 5: Вовлеченность кишечных бактерий в артрит у мышей DBA1 и эффект макромолекулярного комплекса С1 в соответствии с настоящим изобретением
Для этого исследования были созданы две модели в соответствии с типом выбранной инъекции:
- модель 1: две дозы коллагена с промежутком в три недели вводили мышам DBA1;
- модель 2: инъекция коктейля антиколлагеновых антител (MD Biosciences) с последующей через три дня инъекцией ЛПС (липополисахарида) мышам DBA1.
Независимо от модели эти инъекции вызывают клиническую картину, которая наводит на мысль о РА (ревматоидный артрит). Артритный показатель устанавливали, оценивая покраснение и оттек лап.
Лечение посредством макромолекулярного комплекса С1 начинали либо за 15 дни до первой инъекции индуктора (модель 1 - Фиг.3), либо после появления симптомов (модель 2 - Фиг.4). Концентрации макромолекулярного комплекса С1 находятся между 0,1 мг/л и 0,5 мг/л, то есть оценочные суточные дозы находятся между 10 и 100 мкг/кг массы тела. Эффективная доза находится в пределах диапазона от 30 до 90 мкг/кг в зависимости от артрит-индуцирующей модели (Фиг.3 и 4).
Показатель увеличивается спустя приблизительно десять дней после второй инъекции коллагена в первой модели и спустя 3-4 дня после инъекции ЛПС во втором случае. После трех дней без лечения (модель 2), лечение снова применили (в количественном соотношении 0,2 мг/л, то есть 0,01-0,05 мг макромолекулярного комплекса С1/кг массы тела).
Таблица 3 представляет конкомитантный анализ кишечной флоры и показывает, что интенсивность воспаления суставов более сильное, когда число дендритных клеток селезенки понижается в процессе лечения макромолекулярным комплексом С1 в соответствии с настоящим изобретением, в то время как нет никакой зависимости между этими двумя факторами в отсутствии лечения.
Дело в том, что у леченных мышей наблюдается, что число дендритных клеток селезенки связано не только с популяцией lactobacillae (Lb09), но также и с популяцией Bacteroides caecaux. В отсутствие лечения число дендритных клеток определяется исключительно популяцией lactobacillae. В двух группах мышей чем выше число Lactobacillus 09 в толстом кишечнике, тем меньше дендритных клеток заселяется в селезенку. Однако, корреляция между Lactobacillus 09 и интенсивностью воспаления суставов становится существенной только, когда лечение аннулирует эффект второй популяции lactobacillae (Lactobacillus 081) на дендритные клетки (таблица 3). Корреляция поэтому отмечена между этой популяцией lactobacillae (Lb 081), локализованной в слепой кишке и Пейеровых бляшках, и интенсивностью воспаления в отсутствие лечения, в то время как никакая зависимость не найдена с лечением, хотя популяция Lactobacillus 081 не уменьшается (таблица 3).
В заключение: лечение поэтому не имеет никакого антибактериального эффекта относительно популяции lactobacillus, но влияет на метаболический баланс Lb 081 lactobacillae, один или более конечных продуктов которого могли быть вовлечены в воспаление суставов.
Таблица 3
Корреляция между популяциями бактерий кишечника, артритным показателем и дендритными клетками в соответствии с лечением
Контрольная мышь
rs*
Р
против артритного показателя
Расположение
Бактерия
Тонкий кишечник
Lactobacillus reuteri
-0,736
0,04
Streptococcus sp.
-0,812
0,02
Слепая кишка
Lactobacillus sp. 081
0,88
0,01
Bacteroides fragilis
-0,862
0,006
Толстый кишечник
Streptococcus sp.
-0,986
0,0004
Пейеровы бляшки
Lactobacillus sp. 081
0,88
0,01
Streptococcus sp.
-0,736
0,05
против DCs селезенки
Тонкий кишечник
Lactobacillus sp. 081
0,771
0,05
Толстый кишечник
Lactobacillus sp. 09
-0,829
0,01
Мыши, леченные макромолекулярным комплексом
rs*
Расположение
против артритного показателя
Слепая кишка
Bacteroides sp.
-0,791
0,05
Толстый кишечник
Lactobacillus sp.09
0,805
0,02
Пейеровы бляшки
Lactobacillus sp.082
-0,77
0,02
против CD
против
Слепая кишка
Bacteroides fragilis
DCs селезенки
0,05
Слепая кишка
Lactobacillus sp.09
-0,829**
0,05
* rs = коэффициент Спирмена** корреляция артритного показателя как функция количества дендритных клеток rs=-0,812р<0,05
Пример 6: Важность агрегации цепей, составляющих макромолекулярный комплекс С1 в соответствии с настоящим изобретением
Этот пример демонстрирует эффект кислотного гидролиза на противоревматическую эффективность.
28 мг макромолекулярного комплекса, полученного в соответствии с примером 2, растворяли в 100 мл 70% раствора уксусной кислоты. Раствор выдерживали при 75°С в течение 100 минут. Деградацию в низкомолекулярных молекул проверяли хроматографией на Superdex 200 (остаточная концентрация макромолекул составляет около 2,5%). После лиофилизации продукта деградации, которая позволяет удалить уксусную кислоту, порошок растворяют в эквивалентном объеме стерилизованной воды для введения мышам DBA1 (модель 1).
-8
В соответствии с Фиг.5, наблюдается эффект, усугубляющий артрит, причем артритный показатель повышается со временем в группе, в которой лечение проводилось гидролизованной макромолекулой (двумерные повторные измерения Anova, р=5,43852×10). В заключение: для того, чтобы наблюдалась противоревматическая активность, необходимо, чтобы фрагменты расщепленного липопротеина, связанного с олигосахаридами, были агрегированы в форме макромолекул.
Пример 7: Сравнение между эффектами введения макромолекулярного комплекса, полученного из штамма Bifidobacterium breve, и комплекса, полученного из штамма Bifidobacterium longum
Таблица 4 демонстрирует эффект лечения посредством макромолекулярного комплекса, полученного из штамма_Bifidob acterium longum (С1), в первую очередь, и сравнивает последний с эффектом, полученным в результате введения макромолекулярного комплекса, полученного из Bifidobacterium breve (как это описано в WO 2006/040485).
В оставшейся части настоящего текста С2 обозначает макромолекулярный комплекс, полученный в соответствии с примером 1 из WO 2006/040485.
Экспериментальный протокол идентичен описанному в примере 4.
Результаты, приведенные в таблице 4, показывают что:
- количество CD4(+) Th лимфоцитов селезенки ниже у мышей, леченных С2 (макромолекулярный комплекс, полученный из штамма Bifidobacterium breve) no сравнению с контрольными мышами или с теми, которых лечили С1 (макромолекулярный комплекс, полученный из штамма Bifidobacterium longum);
- количество Treg лимфоцитов (регуляторные клетки) ниже у мышей, леченных С2 по сравнению с контрольными мышами или с теми, с которых лечили С1. Эти результаты, таким образом, показывают, что лечение менее эффективно в случае введения макромолекулярного комплекса, полученного из штамма Bifidobacterium breve, чем макромолекулярным комплексом, полученным из штамма Bifidobacterium longum, депонированного под номером CNCM 1-3994. Действительно, введение комплекса в соответствии с настоящим изобретением поддерживает продукцию регуляторных Т-лимфоцитов, причем они являются клетками, которые играют доминирующую роль в противовоспалительном ответе.
Таблица 4
Клеточная популяция как функция применяемого лечения
FA
Дендритные клетки
Т лимфоциты
Th
Treg
мыши (n)*
CDllc
CD4+
CD4+, CD25+
лечение
контроль (4)
3,6±0,9<sup>a**</sup>
5,30±0,6
0,32±0,04
C1(4)
3,04±0,3
5,2±0,3
0,30±0,07
С2(4)
3,28±0,6
4,07±1,0
0,22±0,03
* мыши имеют сопоставимый возраст (приблизительно 7 месяцев)а: представлено как % спленоцитов** мыши ассоциированы с флорой здорового добровольца CD11 с=4,76±1,6
Кроме того, таблица 5 представляет корреляцию Спирмена между клеточными популяциями.
В этой таблице продемонстрировано, что уровни дендритных клеток селезенки и Т-лимфоцитов коррелируют у мышей, леченных макромолекулярным комплексом С1, полученным из штамма Bifidobacterium longum (Корреляция Спирмена близка к 1), в то время как клеточная популяция являются номинально независимой у мышей с макромолекулярным комплексом С2, полученным из штамма Bifidobacterium breve (Корреляция Спирмена близка к 0).
В частности, уровень дендритных клеток у мышей, леченных макромолекулярным комплексом С1, полученным из штамма Bifidobacterium longum, коррелирует с субпопуляцией Т-лимфоцитов, CD4, CD25, Treg лимфоцитов, продуцирующими противовоспалительный интерлейкин 10. Две клеточные популяции поэтому изменяется в зависимой манере с лечением макромолекулярным комплексом С1, полученным из штамма Bifidobacterium longum. Макромолекулярный комплекс С1, полученный из штамма Bifidobacterium longum, поэтому специфически воздействует на дендритные клетки, таким образом облегчая рекрутинг этими клетками лимфоцитов, продуцирующих интерлейкин 10.
Таблица 5
Корреляция Спирмена между клеточными популяциями в соответствии с лечением
rs*
CD11 с против Th p
CD11c
против
Th p
CD4+
CD4+,
CD25+
Лечение
Контроль (9)
0,45
NS
0,45
NS
С1(7)
0,81
0,05
0,79
0,05
С2(7)
0,16
NS
0,07
NS
Пример 8: Модификация генной экспрессии
Таблицы 6 и 7 (см. Фиг.8 и 9)демонстрируют эффект лечения, связанного с введением макромолекулярного комплекса С1, что касается генной экспрессии, посредством сравнения генной экспрессии дендритных клеток мышей, ассоциированными с флорой пациента, страдающего от артрита относительно мышей, ассоциированных с флорой здорового добровольца (FA против FN в таблице 6) с теми из дендритных клеток мышей, ассоциированных с флорой пациента, страдающего от артрита, которых лечили в течение 15 дней 0,2 мг/л макромолекулярного комплекса С1, относительно нелеченных мышей (FAt против FA в таблице 6). Эти результаты показывают, что при гиперстимуляции флоры иммунная система возвращается к нормальному состоянию при лечении.
Действительно, в случае мышей, заселенных артритной флорой, определенное число генов сверхэкспрессируется, такие как гены для протеолиза или для гидролиза сахаров, вовлеченные в расщепление антигенов, поглощенных дендритными клетками, а также гены, вовлеченные в воспаление (эластаза). После лечения (FAt против FA), экспрессия, подобная экспрессии у мышей, которые заселены флорой здоровых субъектов, найдено: в качестве примера, для эластазы, отношение FC ее экспрессии у мышей, заселенных артритной флорой (FA) против мышей, заселенных флорой здорового субъекта (FN) (FA против FN перед лечением), равняется +24,725. После лечения мышей, заселенных артритной флорой, макромолекулярным комплексом С1, отношение FC, сравнивающее его экспрессию с экспрессией из нелеченных мышей, заселенных флорой пациента, страдающего от артрита (FAt против FA) (после лечения), равняется -23,92, что означает возвращение к ее экспрессии базового уровня у мыши, которая заселена флорой здоровых субъектов.
Кроме того, таблица 7 демонстрирует гены, которые не были сверхактивированы артритной флорой, по сравнению с флорой здорового субъекта, но экспрессия которых модифицирована проведением лечения с помощью С1. Например, сверхэкспрессируется простагландинредуктаза 2, что свидетельствует об уменьшении воспаления. Аналогично, ген Ednrb, вовлеченный в воспалительные процессы, экспрессируется в значительно меньшей степени после лечения.
Пример 9: Профилактика химически вызванного остеоартрита у крыс введением макромолекулярного комплекса
Методика:
Остеоартрит индуцировали у крыс CD-штамма мужского пола, весящих 125-150 г (Charles River) инъекцией в правый большеберцово-бедренный сустав 3 мг (0,05 мл раствора с концентрацией 60 мг/мл) йодацетата натрия (MIA).
Животных затем наблюдали (степень хромоты) в течение послеоперационного периода приблизительно 15 дней перед непрерывным введением макромолекулярного комплекса С1, полученного из штамма Bifidobacterium longum (водный раствор 0,3 мг макромолекулярного комплекса С1/л, полученного из штамма Bifidobacterium longum), перорально в течение 3 недель (адаптационный период).
В течение следующих 5 недель тот же самый раствор макромолекулярного комплекса С1, полученного из штамма Bifidobacterium longum, вводили порциями (чередование между введением воды в течение 3-4 дней и введением раствора, содержащего макромолекулярный комплекс С1, в течение 3-4 дней). Таким образом дозы, полученные крысами во время адаптационного периода, составляли 26,3±7 мкг макромолекулярного комплекса С1/кг массы тела, затем во время периода введения в течение следующих 5 недель, составляли 18,9±6 мкг макромолекулярного комплекса С1/кг массы тела.
В конце эксперимента крыс подвергали эвтаназии с помощью внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (CEVA Sante animale) спустя 2-4 часа после удаления питья и пищи.
Кроме того, крыс, которым не вводили макромолекулярный комплекс С1, полученный из штамма Bifidobacterium longum, также подвергали эвтаназии (контрольная группа).
Суставы задних конечностей крыс, принадлежащих группе, леченных макромолекулярным комплексом С1, полученным из штамма Bifidobacterium longum, и крыс контрольной группы удаляли, и исследовали большеберцово-бедренное суставное соединение (Фиг.6 и 7).
На Фиг.6 и 7 фотография 1 изображает бедро, фотография 2 изображает хрящ, фотография 3 изображает синовиальную мембрану, фотография 4 изображает коленную чашечку и фотография 5 изображает большую берцовую кость.
Кроме того, осуществили бактериологический анализ следующих органов: кровь, легкое, печень, селезенка, почка, Пейеровы бляшки, подвздошная кишка (три фрагмента), слепая кишка, толстая кишка.
Результаты:
Фиг.6а и 6b не демонстрируют никаких деформаций суставов задних конечностей. Правые задние конечности (инъекция MIA) крыс, не леченных макромолекулярным комплексом С1, показывают деформацию, свидетельствующую об остеоартритных повреждениях (Фиг.7а и 7b). С другой стороны никакая деформация не отмечена у крыс, получавших макромолекулярный комплекс С1 (50% ответивших на лечение крыс) (Фиг.7с и 7d).
Кроме того, бактериологический анализ позволяет зафиксировать следующие наблюдения. У крыс, ответивших на лечение, кишечная флора модифицирована в нескольких местах:
- стафилококки не обнаруживаются в дистальных отделах подвздошной кишки,
- энтеробактерии (кроме Е. coli) не обнаруживаются в толстом кишечнике,
- уменьшение клостридий наблюдается в слепой кишке (<2,7 против 3,2±0,5 log cfu/r у контрольных крыс),
- уменьшение энтерококков наблюдается в толстом кишечнике (<5 log cfu/r против 6,2±0,5 log cfu/r у контрольных крыс).
Кроме того, отмечена транслокация лактобацилл в легкие (4,2±2,5 log cfu/r), в то время как легкие незащищенных крыс являлись стерильными или контаминированными стафилококками.
Выводы:
Когда введение макромолекулярного комплекса в соответствии с настоящим изобретением модифицирует баланс кишечной флоры в модели остеоартрита и транслокации бактерий, это эффективно защищает животное от дегенеративного процесса, индуцированного инъекцией MIA.