СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ В ПЕРЕМЕННОМ МАГНИТНОМ ПОЛЕ
METHOD OF INVESTIGATION OF BIOLOGICAL LIQUIDS IN THE VARIABLE MAGNETIC FIELD

Заявляемое изобретение относится к области биофизических экспериментов и наблюдений за биологическими жидкостями, находящимися в переменном магнитном поле. Оно предназначено для автоматизированного исследования влияния переменного магнитного поля на биологические жидкости и может найти широкое применение в биологии, сельском хозяйстве, экологии, медицине, пищевой промышленности и в других отраслях, в которых производятся исследования, а именно физический анализ жидких биологических материалов.
Известно о высокой биологической активности электромагнитного поля во всех частотных диапазонах. Низкочастотное электромагнитное поле с диапазоном частот 3-30 Гц используется для увеличения всхожести прорастания семян, что ведет к повышению урожайности растений [1-2] (установки, на которых реализуются эти способы, см., например, в патентах №№2179792, 2175179, 2175180, 2175181, 2175824, 2175825, 2175826, 2134944 и др.), изменения скорости ряда важных биохимических процессов: репарации отдельных участков ДНК с выделенными соматическими мутациями, генерации активных форм кислорода нейтрофилами, изменения уровня содержания цитокинов и др. [3-4].
Наиболее близким к заявляемому изобретению является описанный в патенте №2342658 [5] способ определения оптимальных параметров магнитного поля для регулирования всхожести семян, который включает определение чувствительности биологического объекта к параметрам магнитного поля, для чего из пробы этого объекта экстрагируют макромолекулы, отделяют клеточные оболочки и получают водный биологический раствор, содержащий макромолекулы белков, который подвергают одновременному воздействию магнитным полем с частотой 3-300 Гц, напряженностью 0,15-10 А/м и переменным электрическим полем с частотой 1-30 Гц, напряженностью 0,01-0,07 мВ/м, при этом в течение 10-120 с измеряют сдвиг фазы между током и напряжением, создаваемым электрическим полем, и производят подсчет количества изменений фазы с уровнем более 10°, по этим данным строят график зависимости числа сдвигов фазы между током и напряжением, создаваемым электрическим полем, от частоты магнитного поля и по этому графику выявляют области частот магнитного поля с максимальным количеством сдвигов фаз, обеспечивающим стимуляцию активности биологических процессов, повышающую всхожесть, и минимальным, обеспечивающим подавление их активности, понижающее всхожесть. Этот способ выбран в качестве прототипа предлагаемого технического решения.
Основными недостатками прототипа являются невозможность оценки изменений, происходящих с биомакромолекулами, содержащимися в биологической жидкости или экстракте из биообъекта, которые происходят под действием электромагнитного поля, а также необходимость контакта с биологической жидкостью путем погружения в нее электродов для измерения сдвига фазы между током и напряжением, что может привести к загрязнению биологической жидкости. Кроме того, после каждого измерения сдвига фазы необходимо производить тщательную очистку электродов от продуктов окисления.
Технической задачей заявляемого изобретения является создание более простого и менее длительного способа исследования изменений, происходящих с биомакромолекулами, содержащимися в биологической жидкости (водные растворы белков животного или растительного происхождения, водные растворы нуклеиновых кислот) или экстракте из биообъекта, которые происходят под действием электромагнитного поля.
Эта задача решается следующим образом. Способ исследования биологических жидкостей в переменном магнитном поле включает воздействие на биологическую жидкость переменным магнитным полем, получают водный биологический раствор, содержащий макромолекулы белков, который подвергают воздействию магнитным полем. При этом частота переменного магнитного поля составляет 1-30 Гц, а напряженность находится в диапазоне от 5 до 50 А/м. После обработки переменным магнитным полем регистрируют спектр испускания флуоресценции биологической жидкости в интервале от 290 до 500 нм при длине волны возбуждения 295 нм, находят величину интенсивности флуоресценции в максимуме спектра, по этим данным строят график зависимости величины интенсивности флуоресценции биологической жидкости от частоты магнитного поля и по этому графику выявляют области частот магнитного поля с максимальными значениями интенсивности флуоресценции, при которых происходит максимальное сжатие биомолекулы, обеспечивающее стимуляцию ее активности, и области частот магнитного поля с минимальными значениями интенсивности флуоресценции, при которых происходит разворачивание вторичной структуры биомолекулы, что приводит к уменьшению ее активности, выбирая в зависимости от поставленной задачи активизацию или подавление биологических процессов.
Техническим результатом является возможность получения ценной информации об изменении конформационного состояния биомакромолекул в растворе по анализу увеличения или уменьшения их флуоресценции и осуществление оценки изменения структуры биомакромолекул, происходящих под воздействием переменного магнитного поля, а также бесконтактность метода исследования биологической жидкости.
Данный способ может быть реализован с помощью установки, блок-схема которой представлена на фиг. 1.
Устройство включает генератор низкочастотных электрических колебаний, выполненный на основе микроконтроллера 1, соединенного с ЦАП 2, к которому подключен излучатель 3, создающий магнитное поле. Модуль для измерения физических характеристик биологических жидкостей 4 представляет собой спектрофлуориметр. Он установлен в магнитном поле излучателя 3 и соединен с микроконтроллером 1, который служит также и для вычисления требуемых параметров магнитного поля. Излучатель 3 и модуль для измерения физических характеристик биологических жидкостей 4 помещены в заземленную экранированную камеру 5 из ферромагнитного материала. В этой же камере 5 в поле излучателя 3 установлена специальная площадка 6, на которую помещают емкость с биологическим объектом, который подлежит воздействию магнитным полем, а также датчик температуры 7, подключенный к микроконтроллеру 1. К микроконтроллеру 1 подключены блок управления 8 и блок индикации 9 для управления режимами работы устройства и отображения задаваемых и текущих значений параметров магнитного поля, а также персональный компьютер 10 для более гибкого управления работой устройства.
Способ реализуется следующим образом. Предварительно получают биологическую жидкость, содержащую макромолекулы белков или нуклеиновых кислот. Жидкость помещают в модуль для измерения физических характеристик биологических жидкостей (спектрофлуориметр 4) и запускают микроконтроллер 1. При этом от ЦАП 2 подается напряжение на излучатель 3. Создается магнитное поле, в силовых линиях которого находится исследуемая биологическая жидкость. Частота и напряженность магнитного поля дискретно изменяются в пределах диапазонов, задаваемых микроконтроллером 1. После каждого изменения частоты или напряженности микроконтроллером 1 производится регистрация интенсивности флуоресценции биологической жидкости или водного экстракта объекта при соответствующей длине волны возбуждения в интервале от 290 до 500 нм с помощью модуля 4 и запоминается микроконтроллером. На основании полученных значений микроконтроллер 1 строит зависимость интенсивности флуоресценции биологической жидкости от частоты магнитного поля при различных значениях напряженности, находит максимум интенсивности флуоресценции, соответствующий резонансному поглощению магнитного поля макромолекулами, содержащимися в биологической жидкости (ДНК, белки, полифенолы и др.) и минимум интенсивности флуоресценции. Оценивают воздействие переменного магнитного поля на биологические жидкости по уменьшению (тушению) или увеличению (разгоранию) триптофановой флуоресценции биологической жидкости.
Многие молекулы биологических веществ являются природными или естественными флуорофорами. Длинноволновые полосы поглощения и флуоресценции многих веществ, в том числе белков, нуклеиновых кислот, коферментов, при комнатной температуре представляют собой обычно пологие кривые с одним максимумом, по форме близкие к кривой нормального распределения. Установлено, что флуоресцировать в белках способны только ароматические аминокислоты, обладающие системой сопряженных двойных связей [6]. Собственная флуоресценция простых белков обусловлена наличием ароматических аминокислот - фенилаланина, триптофана и тирозина. Максимумы флуоресценции фенилаланина, тирозина и триптофана имеют место при 282, 303, 348 нм соответственно при возбуждении в максимумах их поглощения (фенилаланин - 258 нм, тирозин - 276 нм, триптофан - 290 нм). Известно [6], что основным флуоресцирующим компонентом в белках является триптофан, который обусловливает около 90% всей белковой флуоресценции при возбуждении в максимуме поглощения. Положение максимума флуоресценции триптофана варьирует от 335 до 360 нм в зависимости от локализации триптофана в белковой молекуле. В качестве примера можно привести положение максимумов триптофановой флуоресценции водных растворов белков: лизоцим (341 нм), трипсин (335 нм), трипсиноген (335 нм), химотрипсиноген (337 нм), сывороточный альбумин человека (339 нм), бычий сывороточный альбумин (348 нм), пепсин (342 нм), фибриноген (337 нм). Положение максимума флуоресценции для ДНК составляет 358 нм и совпадает с максимумом гуанина [7].
При длинах волн более 295 нм оптическое излучение поглощает главным образом триптофан. Поэтому предполагается, что его флуоресценция может быть селективно возбуждена в диапазоне 290-305 нм [6]. Для уточнения длины волны возбуждения флуоресценции были сняты спектры флуоресценции водного раствора триптофана при разных длинах волн возбуждения в диапазоне от 285 до 310 нм. На фиг. 2 представлены спектры флуоресценции водного раствора триптофана при разных длинах волны возбуждения, t=20°С, рН 5,7. Как видно из представленных спектров, наибольшая величина интенсивности триптофановой флуоресценции наблюдается при длине волны возбуждения 295 нм.
Производилась оценка воздействия переменного магнитного поля на водные растворы ДНК и растворы изолированных белков.
Примеры реализации способа.
Пример 1
В модуль для измерения физических характеристик биологических жидкостей 4 (фиг. 1) наливали водный раствор сывороточного альбумина, который был получен путем разведения белка до концентрации 5 мкМ в буферной системе (рН 5,7). Сывороточный альбумин (66,4 кДа) представляет собой глобулярный белок плазмы крови. Единственный аминокислотный остаток триптофана Trp-214 в альбумине расположен в домене II [8]. Температура раствора контролировалась с помощью датчика температуры 7 с точностью до 0,2°С и составляла 23°С, задавалась начальная частота магнитного поля 3 Гц и напряженность 10 А/м, и проводилась обработка образца в течение 10 мин. Затем регистрировался спектр триптофановой флуоресценции раствора сывороточного альбумина при длине волны возбуждения 295 нм в интервале от 290 до 500 нм. На фиг. 3 представлены полученные спектры триптофановой флуоресценции раствора сывороточного альбумина с концентрацией 5 мкМ при обработке магнитным полем разной частоты, Гц: 3 (1), 3,5 (2), 4 (3), 4,5 (4), 5 (5), 5,5 (6), 6 (7), 6,5 (8), 7 (9), 7,5 (10), 8 (11), 8,5 (12), 9 (13), 9,5 (14), 10 (15). Время облучения образцов 10 мин, t=23°С, рН 5.7, длина волны возбуждения флуоресценции 295 нм, напряженность магнитного поля 10 А/м.
Находилась величина интенсивности флуоресценции в максимуме спектра триптофана при 348 нм (фиг. 3). Далее микроконтроллер 1 изменял частоту магнитного поля с шагом в 0,5 Гц в диапазоне от 3 до 10 Гц. После каждого изменения частоты магнитного поля и обработки образца регистрировалась интенсивность флуоресценции раствора альбумина в интервале от 290 до 500 нм и делалась пауза в течение 30 с.
По этим данным строился график зависимости величины интенсивности триптофановой флуоресценции водного раствора альбумина от частоты магнитного поля.
На фиг. 4 представлена зависимость интенсивности триптофановой флуоресценции раствора сывороточного альбумина от частоты воздействующего магнитного поля. По этому графику производили оценку воздействия переменного магнитного поля на макромолекулы альбумина, т.е выявляли области частот магнитного поля с максимальными величинами интенсивности флуоресценции, при которых происходит сворачивание вторичной структуры молекулы альбумина и увеличение ее активности, и области частот магнитного поля с минимальными величинами интенсивности флуоресценции, при которых происходит разворачивание вторичной структуры молекулы альбумина и уменьшение ее активности. Как видно из фиг. 4, при частотах переменного магнитного поля 3,5 Гц, 6,5 Гц и особенно 9 Гц происходит уменьшение интенсивности триптофановой флуоресценции, а при частотах 5,5 Гц и 8 Гц увеличение интенсивности.
Уменьшение (тушение) триптофановой флуоресценции белков объясняется разворачиванием глобулы альбумина (вторичной структуры), вследствие чего хромофорная группа триптофана становится доступной для молекул воды, тушащих ее флуоресцентное свечение, и наоборот, увеличение триптофановой флуоресценции свидетельствует об уплотнении вторичной структуры сворачивания альбумина [7]. Таким образом, флуоресцентные свойства аминокислотного остатка триптофана в молекуле сывороточного альбумина окружены гидрофобной оболочкой и весьма чувствительны к перестройкам макромолекулы белка.
Осуществлялось воздействие магнитным полем с найденными параметрами (напряженностью 10 А/м и частотой 8,0 Гц) на водный раствор альбумина, содержащий гормон щитовидной железы тироксин. В результате обработки данного раствора магнитным полем с частотой 8,0 Гц и напряженностью поля 10 А/м в течении 5 минут увеличилось связывание тироксина альбумином на 15% по сравнению с контрольными значениями.
Пример 2
Аналогично примеру 1 проводили оценку воздействия переменного магнитного поля на водный раствор ДНК, предварительно выделенной из клеток пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), концентрация ДНК в растворе составляла 30 мкг/мл.
На фиг. 5 представлены спектры триптофановой флуоресценции водного раствора ДНК, выделенной из клеток пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) при обработке магнитным полем разной частоты, Гц: 3 (1), 5 (2), 6 (3), 10 (4), 8 (5).
5
По этим данным строился график зависимости величины интенсивности триптофановой флуоресценции водного раствора ДНК от частоты магнитного поля. После определения оптимальных значений частоты и напряженности магнитного поля осуществлялось воздействие магнитным полем с данными параметрами (напряженностью 10 А/м и частотой 8,0 Гц) на водную суспензию пекарских дрожжей. Для этого пробирка с суспензией микроорганизмов помещалась на площадку в заземленной камере, на расстоянии 10 см от излучателя. В результате обработка суспензии пекарских дрожжей магнитным полем с частотой 8,0 Гц и напряженностью поля 10 А/м в течение 3 минут привела к увеличению их жизнеспособности, концентрация клеток увеличилась на 3⋅10/мл по сравнению с контрольным значением.
Собственная флуоресценция является мощным инструментом для исследования структуры, динамики и процессов сворачивания-разворачивания биомолекул и, следовательно, изменения их активности ввиду высокой чувствительности параметров флуоресценции триптофановых остатков к внешним воздействиям. Использование предлагаемого способа расширяет возможности проведения экспериментов над биологическими жидкостями или водными экстрактами биологических объектов при воздействии на них переменного магнитного поля и оценке данного воздействия на биомолекулы.
На графиках фиг. 2, 3, 4, 5 изображены:
Фиг. 2. Спектры флуоресценции водного раствора триптофана при разных длинах волны возбуждения, t=23°С, рН 5,7;
Фиг. 3. Спектры триптофановой флуоресценции раствора сывороточного альбумина с концентрацией 5 мкМ при обработке магнитным полем разной частоты, Гц: 3 (1), 3,5 (2), 4 (3), 4,5 (4), 5 (5), 5,5 (6), 6 (7), 6,5 (8), 7 (9), 7,5 (10), 8 (11), 8,5 (12), 9 (13), 9,5 (14), 10 (15). Время облучения образцов 10 мин, t=23°C, рН 5.7, длина волны возбуждения флуоресценции 295 нм, напряженность магнитного поля 10 А/м;
Фиг. 4. График зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции раствора сывороточного альбумина от частоты магнитного поля;
Фиг. 5. Спектры триптофановой флуоресценции водного раствора ДНК, выделенной из клеток пекарских дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), при обработке магнитным полем разной частоты, Гц: 3 (1), 5 (2), 6 (3), 10 (4), 8 (5).
Приведенные данные демонстрируют, что использование предлагаемого способа позволяет проще и оперативнеее находить зависимости физических характеристик биологических жидкостей или водного экстракта биологического объекта от изменения напряженности и частоты переменного магнитного поля по изменению их собственной или индуцированной флуоресценции.
Источники информации
1. Пат. Российской Федерации №2051552, МПК А01С 1/10. Способ обработки семян и устройство для его осуществления / Цугленок Н.В., Шахматов С.Н., Цугленок Г.И. - заявл. 20.03.92, опубл. 10.01.96, бюл. №36.
2. Пат. Российской Федерации на полезную модель №156336, МПК G01N 33/487. Устройство для автоматизированного исследования биологических жидкостей в переменном магнитном поле / Барышев М.Г., Ильченко Г.П., Текуцкая Е.Е., Ломакина Л.В. - №2014150523/15; заявл. 12.12.2014; зарег. 12.10.2015, опубл. 10.11.2015, бюл. №31.
3. Текуцкая Е.Е., Василиади Р.А., Храмцова А.А. Влияние внешних факторов на повреждение и репарацию ДНК лимфоцитов периферической крови человека // Российский иммунологический журнал, 2015, Т. 9 (18), №3 (1), С. 223-225.
4. Пат. Российской Федерации №2342658, МПК G01N 33/487, G01N 27/74, А01С 1/00. Способ определения оптимальных параметров магнитного поля для регулирования всхожести семян / Барышев М.Г. - 2007121626/13; заявл. 08.06.2007, опубл. 27.12.2008, бюл. №36.
5. Владимиров Ю.А. Фотохимия и люминесценция белков. Москва: Наука, 1965.
6. Власова И.М., Салецкий A.M. Поляризованная флуоресценция в исследовании вращательной диффузии альбумина человека при денатурации под действием ДСН. ВМУ, 2011, Серия 3. Физика. Астрономия, №1. с. 58-62.
7. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. Москва: Мир, 1991.