СПОСОБ ПОСМЕРТНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИФФУЗНОГО АКСОНАЛЬНОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ МОЗГА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕГО ДАВНОСТИ
METHOD FOR POSTMORTEM DIAGNOSIS OF DIFFUSE AXONAL BRAIN INJURY AND DETERMINATION OF ITS PRESCRIPTION

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к судебной медицине и может быть использовано для посмертной диагностики черепно-мозговой травмы (ЧМТ), её отдельной формы - диффузного аксонального повреждения (ДАП), а также для установления давности повреждения головного мозга при ДАП, определяющей время возникновения травмы. Кроме того, полученными результатами могут воспользоваться клиницисты и специалисты, изучающие головной мозг.
Уровень техники
Посмертная диагностика ДАП, в основе которого лежит повреждение головного мозга при резком внезапном угловом вращении головы с ротационным смещением головного мозга, остаётся серьёзной проблемой судебно-медицинской экспертной практики, требующей дальнейшего изучения его морфологических аспектов.
ДАП относится к категории тяжких телесных повреждений по признаку опасности для жизни [п.6.1.3 приложения к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 24 апреля 2008 г. N 194н] и в случае смертельного исхода, в независимости от длительности посттравматического периода и развившихся осложнений находится в прямой причинной связи со смертью. Достоверная верификация, доказательность именно этой формы ЧМТ, установление времени травматического повреждения головного мозга имеют важное значение в юридической практике при квалификации действий подозреваемого, обвиняемого или подсудимого.
Диагностика ДАП сложна, так как при этой форме ЧМТ зачастую макроскопически не выявляются какие-либо значимые морфологические проявления повреждений мягких тканей головы, костей черепа, головного мозга, а проведённые гистологические исследования на бессистемно забранном биоматериале не вносят диагностической ясности, что существенно затрудняет экспертную оценку характера повреждений, механизма и условий образования ЧМТ, а также определение давности посттравматического периода.
Патоморфологическая картина ДАП характеризуется рядом особенностей и проявляется диффузным повреждением аксонов (первичная и вторичная аксотомия) с наличием ретракционных шаров в мозолистом теле, семиовальном центре, подкорковых образованиях, стволе мозга, а также точечными и мелкоочаговыми кровоизлияниями в этих структурах [Касумова, С. Ю. Патологическая анатомия черепно-мозговой травмы / С. Ю. Касумова // Руководство по черепно-мозговой травме под ред. А. Н. Коновалова, Л. Б. Лихтермана, А. А. Потапова. - Москва: Антидор, 1998. - Т. 1. - С. 169-225. - Текст: непосредственный; Adams, J. H. Diffuse axonal injury in non-missile head injury / J. H. Adams, D. I. Graham, T. A. Gennarelli [et al.]. - DOI: 10.1136/jnnp.54.6.481. - Текст: электронный // Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. - 1991. - Vol. 54 (6). - P. 481-483].
Однако, как показали приведённые в публикациях результаты посмертных и экспериментальных исследований, ретракционные шары, которые появляются не ранее 3 часов после повреждения аксонов, могут встречаться как при ЧМТ, так и быть проявлением изменений в головном мозге нетравматического характера - гемодинамических, ишемических, метаболических нарушений [Johnson, V. E. Axonal pathology in traumatic brain injury / V. E. Johnson, E. W. Stewart, D. H. Smith. - DOI: 10.1016/j.expneurol.2012.01.013. - Текст: электронный // Experimental Neurology. - 2013. - Vol. 246. - P. 35-43]. Таким образом, ретракционные шары не могут служить патогномоничным диагностическим признаком ДАП.
В настоящее время продолжается поиск морфологических признаков травматического повреждения аксонов, так как доказано, что именно механическое повреждение аксонов обусловливает тяжесть посттравматического течения ДАП. На экспериментальных моделях установлено, что при ДАП первичным ответом нейронов на травматическое воздействие является прерывание аксонального транспорта, которое влечёт за собой изменение клеточного состава и проявляется в виде своеобразного отёка аксонов, называемого «варикозом аксонов», образующегося в течение 2-3 часов после травмы [Tang-Schomer, M. D. Partial interruption of axonal transport due to microtubule breakage accounts for the formation of periodic varicosities after traumatic axonal injury / M. D. Tang-Schomer, V. E. Johnson, P. W. Baas [et al.]. - DOI: 10.1016/j.expneurol.2011.10.030. - Текст: электронный // Journal Experimental Neurology. - 2012. - Vol. 233. - P. 364-372]. Кроме того, в повреждённых нейронах обнаружили изменения в нейрофиламентах и микротрубочках, возникающие в течение 15 минут после травмы [Farkas, O. Cellular and subcellular change evoked by diffuse traumatic brain injury: а complex web of change extending far beyond focal damage / O. Farkas, J. T. Povlishock. - DOI: 10.1016/S0079-6123(06)61004-2. - Текст: электронный // Progress in Brain Research. - 2007. - Vol. 161. - P. 43-59]. Douglas H. et al. [Douglas, H. High tolerance and delayed elastic response of cultured axons to dynamic stretch injury / H. Douglas, D. H. Smith, J. A. Wolf [et al.]. - DOI: 10.1523/JNEUROSCI.19-11-04263.1999. - Текст: электронный // Journal Neuroscience. - 1999. - Vol.19. - P. 4263-4269] выявили, что при растяжении отростки аксонов неровные, с волнистым ходом из-за потери эластичности и повреждения цитоскелета. Волнообразный ход аксонов, по мнению Chung R.S. et al. [Chung, R. S. Mild axonal stretch injury in vitro induces a progressive series of neurofilament alterations ultimately leading to delayed axotomy / R. S. Chung, J. A. Staal, G. H. McCormack [et al.]. - DOI: 10.1089/neu.2005.22.1081. - Текст: электронный // Journal Neurotrauma. - 2005. - Vol.22. - P. 1081-1091], свидетельствует о первичной цитоскелетной недостаточности, обусловленной механической травмой, и всегда присутствует в остром периоде ЧМТ у людей.
В судебной медицине также ведётся поиск информативных маркёров для выявления повреждений нервной ткани при ДАП, степени выраженности реактивных изменений в целях установления давности ЧМТ. Большинство проведённых работ основано на посмертном изучении повреждений аксонов [Шай, А. Н. Значение белков-маркеров нервной ткани для морфологической диагностики черепно-мозговой травмы / А. Н. Шай, М. В. Федулова, Ю. Е. Квачева [и др.]. - Текст: непосредственный // Судебно-медицинская экспертиза. - 2017. - № 4. - С. 40-45]. При этом состояние аксонов исследовалось без учёта особенностей пространственной их ориентации в различных отделах головного мозга, без взаимосвязи их с кровоизлияниями и посттравматической перифокальной зоной. Так, применяя иммуногистохимические реакции, визуализировать повреждённые нервные волокна у умерших оказалось возможным в течение 1-1,5 часов после получения ЧМТ. Большинство работ основано на использовании маркировки аксонов β-APP. Однако необходимо сдержанно относиться к чрезмерной интерпретации результатов использования β-APP при ДАП, поскольку паттерны повреждения аксона, визуализированные маркировкой β-APP, могут быть обнаружены при других патологических процессах без травматического воздействия (гипоксия, инсульт, отек мозга, отравление окисью углерода, гипогликемия, нейродегенеративные заболевания) [Ikonomovic, M. D. Alzheimer’s pathology in human temporal cortex surgically excised after severe brain injury / M. D. Ikonomovic, K. Uryu, E. E. Abrahamson [et al.]. - DOI: 10.1016/j.expneurol.2004.06.011. - Текст : электронный // Experimental Neurology. - 2004. - Vol. 190 (1). - P. 192-203]. Некоторые авторы указывают на необходимость применения одновременно нескольких иммуногистохимических реакций для полной оценки общего аксонального ответа на травму [Hostiuc, S. Detection of diffuse axonal injury in forensic pathology / S. Hostiuc, N. Davceva, V. Janevska [et al.]. - DOI: 10.4323/rjlm.2014.145. - Текст : электронный // Romanian Journal of Legal Medicine. - 2014. - Vol. 22. - P. 145-152].
Помимо повреждений аксонов, при ЧМТ выявлены изменения и в глиальных клетках, являющиеся неспецифическими [Ogata, M. Early diagnosis of diffuse brain damage as a result of blunt head injury / M. Ogata. - DOI: 10.1016/j.legalmed.2006.11.013. - Текст: электронный // Legal Medicine. - 2007. - Vol. 9. - №2. - P. 105-108; Морозов, Ю. Е. Определение давности повреждений головного мозга по изменениям ядрышкового организатора в астроцитах / Ю. Е. Морозов, Е. М. Колударова, Д. В. Горностаев [и др.]. - Текст: непосредственный // Судебно-медицинская экспертиза. - 2018. - № 4. - С. 16-18].
Ковалев А.В. с соавт. [Ковалев, А. В. Алгоритмы диагностики диффузного аксонального повреждения / А. В. Ковалев, Ю. Е. Квачева, А. Н. Шай. - Текст: непосредственный // Сборник трудов VIII Всероссийского съезда судебных медиков с международным участием. - Москва, - 2019. - Т. 1. - С. 155-157] в предложенном алгоритме посмертной диагностики ДАП указывали, что без ЧМТ в анамнезе картину аксонального повреждения, имитирующую ДАП, не следует однозначно квалифицировать как травматическую.
В судебно-медицинском аспекте важным является решение вопроса определения давности ДАП. Установлено, что при ДАП реактивные изменения в головном мозге отличаются от классического посттравматического нейровоспаления, развивающегося при других формах ЧМТ [Lin, Y. Inflammatory response following diffuse axonal injury / Y. Lin, L. Wen. - DOI: 10,7150/ijms.5423. - Текст: электронный // International Journal of Medical Sciences. - 2013. - Vol. 10. - № 5. - P. 515-521], и представлены каскадом клеточно-тканевых реакций, состав и степень выраженности которых в различные посттравматические периоды ДАП на сегодняшний день не представлены.
Таким образом, проведённый обзор литературы [Колударова, Е. М. Аспекты посмертной диагностики диффузного аксонального повреждения мозга / Е. М. Колударова, Е. С. Тучик. - Текст: непосредственный // Вестник судебной медицины. - Новосибирск. - 2019. - № 3. - Т. 8.- С. 44-49] показал, что на сегодняшний день отсутствуют достоверные и объективные диагностические морфологические критерии ДАП, не выявлена динамика структурно-функциональных изменений вещества мозга в различные сроки посттравматического периода, не установлен достаточный для дифференциальной диагностики перечень специальных методов исследования с применением доступных и эффективных гистологических методик.
Установлено, что при ДАП в 90% случаев повреждается мозолистое тело [Blumbergs, P. C. Diffuse axonal injury in head trauma / P. C. Blumbergs, N. R. Jones, J. B. North. - DOI: 10.1136/ jnnp.52.7.838. - Текст: электронный // Journal of neurology, neurosurgery and psychiatry. - 1989. - Vol. 52. - P. 838-841; Пиголкин, Ю. И. Черепно-мозговая травма. Механогенез, морфология и судебно-медицинская оценка / Ю. И. Пиголкин, И. А. Дубровин, С. В. Леонов [и др.]. - Москва, 2018. - 248 с.]. Существующие на сегодняшний день методы секционного исследования головного мозга не включают всестороннее анатомо-топографическое изучение мозолистого тела, конкретных его отделов [Солохин, А. А. Руководство по судебно-медицинской экспертизе трупа / А. А. Солохин, Ю. А. Солохин. - Москва: РМАПО, 1997. - 264 с. - Текст: непосредственный; Судебная медицина и судебно-медицинская экспертиза: национальное руководство / под ред. Ю. И. Пиголкина. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 728 с. - Текст: непосредственный]. Так, методы по С.А. Громову, И.В. Буяльскому, по В.А. Свешникову, по В.Л. Попову не предусматривают поисковые разрезы мозолистого тела. Используя наиболее распространенный метод Фишера, а также метод Курвиля, мозолистое тело исследуется только при четырёх, при методе Питре - трёх и при методе П.Е. Снесарева - одного поперечных разрезах во фронтальной плоскости, а метод Остертага предусматривает один косопоперечный разрез толщи мозолистого тела. При методах Науменко-Грехова и Т.Т. Шишкова производится множество поперечных разрезов (с шагом 1-2 см) мозолистого тела во фронтальной плоскости. П.О. Ромодановский рекомендует продольный разрез мозолистого тела в сагиттальной плоскости при извлечении головного мозга из полости черепа и последующие множественные поперечные разрезы во фронтальной плоскости разделённых полушарий с половинами мозолистого тела. Таким образом, не один из методов секционного исследования головного мозга не предусматривает изучение мозолистого тела как отдельной анатомической структуры с учётом диагностически значимой архитектоники строения его отделов (колена, ствола и валика) и поверхностей (дорсальной и вентральной).
Однако при ЧМТ, по мнению П.О. Ромодановского [Ромодановский, П. О. Комплексная судебно-медицинская диагностика и экспертная оценка повреждений головного мозга при травме головы: специальность 14.00.24 «Судебно-медицинская экспертиза»: диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук / Ромодановский Павел Олегович; Московский медицинский стоматологический институт. - Москва, 1996. - 310 с. - Текст: непосредственный], её отдельной форме ДАП, особо важное судебно-медицинское экспертное значение будет иметь выявление конкретных зон повреждений мозолистого тела, их морфологии, локализации в целях обоснования механогенеза и экспертной объективизации обстоятельств причинения травмы головного мозга.
Диагностическую оценку выявленных патоморфологических изменений в мозолистом теле необходимо проводить с учётом особенностей строения его структур. Несмотря на кажущуюся изученность строения мозолистого тела, на сегодняшний день остаётся ряд следующих спорных вопросов:
1. До сих пор не изучены особенности гистостроения и функциональное значение серого покрова мозолистого тела (indusium griseum). Некоторые авторы [Di Ieva, A. The indusium griseum and the longitudinal striae of the corpus callosum / A. Di Ieva, H. Fathalla, M. D. Cusimano [et al.]. - DOI: 10.1016/j.cortex.2014.06.016. - Текст: электронный // Cortex. - 2015. - Vol. 62. - P. 34-40]. Tubbs R.S. et al. [Tubbs, R. S. The indusium griseum: anatomic study with potential application to callosotomy / R. S. Tubbs, M. Prekupec, M. Loukas. [et al.]. - DOI: 10.1227/01.neu.0000430293.39046.59. - Текст: электронный // Neurosurgery. - 2013. - Vol.73. - P. 312-315] на трупном материале определили, что серый покров гистологически представляет собой тонкий слой гипоклеточной гипомиелинизированной глиальной ткани без содержания нейронов, помещенной между мягкой оболочкой и веществом мозолистого тела.
2. Не представлены цельная картина миелоархитектоники и кровоснабжения мозолистого тела, топологическое соотношение между артериальным и венозным отделами кровеносного русла. О. Boiagina [Boiagina, О. General principle of the corpus callosum internal structure in adult human / O. Boiagina. - Текст: непосредственный / Georgian Med News. - 2017. - Vol. 262. - P. 82-87] обнаружила, что мозолистое тело человека состоит из ряда поперечно ориентированных полос миелиновых нервных волокон с олигодендроцитами, в совокупности образующих сложную трёхмерную сетевую структуру с характерным ветвлением сосудов капиллярного типа. Также в литературе нет прямых указаний на то, что мягкая оболочка покрывает дорсальную поверхность мозолистого тела [Боягина, О. Д. Современные представления о мозолистом теле как о системе нового плаща / О. Д. Боягина. - Текст: непосредственный // Актуальные проблемы современной медицины: Вестник украинской стоматологической академии. - 2015. - Т. 15. - С. 293-299].
Раскрытие изобретения
Достигаемым техническим результатом является посмертная диагностика ДАП и его давности с высокой степенью достоверности (до 95%) на основе разработанного комплекса диагностических патоморфологических критериев по динамике морфологических изменений в мозолистом теле при его секционном исследовании.
Технический результат достигается при реализации способа, включающего выделение по срединной линии из левого и правого полушария головного мозга двух прямоугольных фрагментов сагиттальных срезов мозолистого тела и его серого покрова толщиной 1 см ± 0,2 см без его повреждения; фиксацию фрагментов сагиттальных срезов мозолистого тела в 10% растворе забуференного формалина на 24-48 часов; выделение из каждого фрагмента ствола мозолистого тела с сегментацией его на два участка: до зоны перехода в колено правого D1 или левого L1 фрагмента мозолистого тела, до зоны перехода в валик правого D2 или левого L2 фрагмента мозолистого тела с последующей гистологической проводкой и заливкой парафином; изготовление гистологических срезов полученных участков каждого фрагмента ствола мозолистого тела и его серого покрова толщиной 4-5 мкм с окрашиванием срезов гематоксилином и эозином для выявления (анализа) морфологии кровоизлияний в мозолистом теле, а для установления давности ДАП методами Ниссля и AgNor, постановкой иммуногистохимической реакции с антителами к нейрофиламентам.
При выявлении в гистологических срезах любого участка ствола мозолистого тела и его сером покрове мелкоочаговых кровоизлияний в количестве не менее трёх, вытянутой формы, максимальной длинной не более 4 мм, линейно направленных от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела делают вывод о том, что смерть наступила от диффузного аксонального повреждения мозга.
Доступ к секционному исследованию мозолистого тела осуществляют посредством выделения из левого и правого полушария головного мозга двух прямоугольных фрагментов сагиттальных срезов ствола мозолистого тела и его серого покрова, которое проводят следующим образом: после извлечения головного мозга из полости черепа стволовой отдел головного мозга с мозжечком отделяют плоскостным поперечным разрезом на уровне ножек мозга, большой мозг укладывают на базальную поверхность затылочными долями к прозектору, большие полушария разводят в стороны для визуализации дорсальной поверхности мозолистого тела, производят срединный разрез головного мозга в сагиттальной плоскости, проходят продольно по мозолистому телу и всем подлежащим анатомическим структурам, оба полушария располагают медиальной поверхностью к прозектору, в каждом полушарии производят разрезы на глубину 1 см ± 0,2 см: первый разрез тотчас кверху от мозолистого тела, вдоль оси его ствола; второй - спереди от колена мозолистого тела, поперечно оси его ствола; третий - тотчас позади валика мозолистого тела и поперечно оси его ствола, при этом выделение двух прямоугольных фрагментов мозолистого тела толщиной 1 см ± 0,2 см из левого и правого полушария осуществляют плоскостным разрезом в направлении от базальной поверхности головного мозга к дорсальной поверхности мозолистого тела.
Для определения давности диффузного аксонального повреждения мозга оценивают на гистологических сагиттальных срезах ствола мозолистого тела и его серого покрова состояние нейронов серого покрова, а именно, форму тела нейрона, форму ядра нейрона, локализацию ядрышка, наличие аргирофильных гранул и хроматолиза; состояние кровеносной системы, а именно кровенаполнение артериального, венозного, микроциркуляторного русла перифокальной зоны кровоизлияний; состояние отростков нейронов, а именно толщину, контуры, их целостность; наличие некроза вещества мозолистого тела; тип клеток перифокальной зоны кровоизлияний, а именно глиальных, лейкоцитарных или макрофагальных; наличие ретракционных шаров.
Вывод о том, что смерть от диффузного аксонального повреждения мозга наступила в течение 1 часа после травмы делают при выявлении следующего комплекса параметров: нейроны серого покрова мозолистого тела округлой формы с ядрами округлой формы, ядрышко расположено по центру, наличие перинуклеарного хроматолиза на расстоянии до 1 мкм от оболочки ядра; в перифокальной зоне кровоизлияний спазм и малокровие артерий и артериол, неравномерное кровенаполнение вен, полнокровие венул и капилляров; отростки нервных клеток неравномерной толщины 3,11 мкм ± 0,9, с неровными контурами, с расширениями, структурами типа «чёток», с нарушенной целостностью; отсутствие некроза вещества мозолистого тела; в перифокальном зоне кровоизлияний отсутствие глиальных, лейкоцитарных и макрофагальных клеток; отсутствие ретракционных шаров.
Вывод о том, что смерть от диффузного аксонального повреждения мозга наступила в течение от 1 часа до 12 часов после травмы делают при выявлении следующего ком-плекса параметров: наличие в сером покрове мозолистого тела нейронов с неправильной формой тел и ядер, ядрышко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны или отсутствие ядрышка в отдельных нейронах, наличие аргирофильных гранул в ядрах, перинуклеарный хроматолиз на расстоянии 2-3 мкм от оболочки ядра; в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий и артериол с отделением плазмы от клеток крови, полнокровие вен, венул и капилляров, с перераспределением лейкоцитов и лейкостазами в некоторых венулах и капиллярах; отростки нервных клеток неравномерной толщины 3,2 мкм ± 1,2, с неровными контурами, с расширениями, структурами типа «чёток», с нарушенной целостностью; отсутствие некроза вещества мозолистого тела; в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты; отсутствие ретракционных шаров.
Вывод о том, что смерть от диффузного аксонального повреждения мозга наступила в течение от 12 до 48 час после травмы делают при выявлении следующего комплекса параметров: наличие в кровоизлияниях среди эритроцитов единичных лейкоцитов и макрофагов; нейронов серого покрова мозолистого тела с неправильной формой тел и ядер, ядрышко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны или отсутствие ядрышка в отдельных нейронах, в ядрах нейронов аргирофильные гранулы, тотальный хроматолиз; в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий, полнокровие артериол, венул, капилляров и вен, эритростазы и лейкостазы в венулах и капиллярах; отростки нервных клеток неравномерной толщины 5,38 мкм ± 2,7 с неровными контурами, с расширениями, структурами типа «чёток», с нарушенной целостностью; отсутствие некроза вещества мозолистого тела; в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты и клетки макроглии; отсутствие ретракционных шаров.
Вывод о том, что смерть от диффузного аксонального повреждения мозга наступила в посттравматический период длительностью более 48 час делают при выявлении следующего комплекса параметров: наличие некроза в центре кровоизлияний с лейкоцитами и макрофагами; нейроны серого покрова мозолистого тела с неправильной формой тел и ядер, ядрышко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны, отсутствие ядрышка в некоторых нейронах, в ядрах нейронов аргирофильные гранулы, тотальный хроматолиз, наличие клеток-«теней»; в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий, артериол, венул, капилляров и вен, эритростазы и лейкостазы в венулах и капиллярах; отростки нервных клеток неравномерной толщины 5,8 мкм ± 2,9 с неровными контурами, с расширениями, структурами типа «чёток», с нарушенной целостностью; в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты, макроглиоциты и некроз вещества мозолистого тела с лейкоцитами и макрофагами; наличие ретракционных шаров размером 15,5 мкм ± 6,33.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
На фиг. 1 представлено изображение способа секционного исследования мозолистого тела. Расположение полушарий головного мозга, вид их медиальных поверхностей с плоскостным разрезом мозолистого тела после проведения срединного сагиттального разреза.
На фиг. 2 представлено изображение способа секционного исследования мозолистого тела. Произведение первого разреза тотчас кверху от мозолистого тела, вдоль оси его ствола на глубину 1 см ± 0,2 см.
На фиг. 3 представлено изображение способа секционного исследования мозолистого тела. Произведение второго разреза тотчас спереди от колена мозолистого тела, поперечно оси его ствола на глубину 1 см ± 0,2 см.
На фиг. 4 представлено изображение способа секционного исследования мозолистого тела. Произведение третьего разреза тотчас позади валика мозолистого тела, поперечно оси его ствола на глубину 1 см ± 0,2 см.
На фиг. 5 представлено изображение способа секционного исследования мозолистого тела. Произведение плоскостного разреза в направлении от базальной поверхности мозга к дорсальной поверхности мозолистого тела с отделением прямоугольного фрагмента толщиной 1 см ± 0,2 см.
На фиг. 6 представлена схема сегментации мозолистого тела для гистологического исследования. Участки ствола мозолистого тела: до зоны перехода в колено правого D1 или левого L1 фрагмента мозолистого тела, до зоны перехода в валик правого D2 или левого L2 фрагмента мозолистого тела.
На фиг. 7 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) по примеру 1. Линейно направленные мелкоочаговые кровоизлияния в веществе ствола вытянутой формы в количестве четырёх, длиной от 161 до 632 мкм. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 40.
На фиг. 8 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) и его серого покрова по примеру 1. Кровоизлияния в сером покрове. Окраска гематоксилином и эозином. Нейроны серого покрова (указаны стрелками) с телами и ядрами округлой формы. Ув. 400.
На фиг. 9 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) на уровне серого покрова по примеру 1. Перинуклеарный хроматолиз на расстоянии до 1 мкм от ядра. Окраска по методу Ниссля. Ув. 630.
На фиг. 10 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) по примеру 1. Отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 3,11 мкм ± 0,9, с неровными контурами, с расширениями (указаны стрелками). Ретракционные шары отсутствуют. ИГХ с антителами к нейрофиламентам. Ув. 400.
На фиг. 11 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) и его серого покрова по примеру 1. Отростки нервных клеток в перифокальной зоне кровоизлияния неравномерной толщины с нарушенной целостностью (указаны стрелками) и разделением на отдельные фрагменты. ИГХ с антителами к нейрофиламентам. Ув. 400.
На фиг. 12 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) по примеру 1. Отростки нервных клеток с образованием на концах утолщений, которые имеют форму овала или круга с неровными контурами (указаны стрелками). Ретракционные шары отсутствуют. ИГХ с антителами к нейрофиламентам. Ув. 1000.
На фиг.13 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела и его серого покрова (участок L1) по примеру 2. Кровоизлияние в сером покрове. Тела и ядра нейронов серого покрова неправильной формы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 630.
На фиг. 14 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела и его серого покрова (участок L1) по примеру 2. Тела и ядра нейронов серого покрова неправильной формы (указаны стрелками), в ядрах некоторых нейронов рассеяны аргирофильные гранулы. Окраска методом AgNor. Ув. 630.
На фиг. 15 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок L1) по примеру 2. В перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты, отсутствует некроз вещества мозолистого тела. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.
На фиг. 16 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок L2) по примеру 3. Состояние кровеносной системы перифокальной зоны кровоизлияний: полнокровие артериол, венул и капилляров. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.100.
На фиг. 17 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок L2) по примеру 3. Состояние кровеносной системы: полнокровие венул и капилляров, лейкостазы в венулах и капиллярах. Окраска гематоксилином и эозином. Ув.200.
На фиг. 18 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок L2) по примеру 3. Отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 5,4 мкм ± 0,3, с расширениями (указаны стрелками), ретракционные шары отсутствуют. ИГХ с антителами к нейрофиламентам. Ув. 630.
На фиг. 19 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок L2) по примеру 3. Отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины, с неровными контурами, наличием структур типа «чёток» (указаны стрелками), ретракционные шары отсутствуют. ИГХ с антителами к нейрофиламентам. Ув. 630.
На фиг. 20 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) по примеру 4. В центре кровоизлияния некроз вещества с лейкоцитами и макрофагами (макрофаги указаны стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.
На фиг. 21 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D2) по примеру 4. В центре кровоизлияния некроз вещества с ретракционными шарами (указаны стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.
На фиг. 22 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) по примеру 4. В перифокальной зоне кровоизлияния микроглиоциты, макроглиоциты, наличие ретракционных шаров (указаны стрелками). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.
На фиг. 23 представлена фотография сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D2) по примеру 4. Ретракционные шары (указаны стрелками) в перифокальной зоне кровоизлияний размером 15,5 мкм ± 6,33 мкм. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.
На фиг. 24 представлена фотография срединного разреза головного мозга в сагиттальной плоскости, проходящего продольно по мозолистому телу, при использовании заявленного способа секционного исследования по примеру 6. Выявлена зона кровоизлияний (указана стрелкой) в веществе зоны перехода колена в ствол мозолистого тела.
Осуществление изобретения
Для установления диагностического комплекса морфологических критериев ДАП и давности посттравматического периода были исследованы 112 мозолистых тел от 112 трупов мужчин (81) и женщин (31), в возрасте от 5 месяцев до 93 лет, умерших при обстоятельствах травматического воздействия в область головы в различные посттравматические периоды (до 1 часа, от 1 до 12 часов, от 12 часов до 48 часов, более 48 часов). Все умершие согласно классификации ВОЗ от 2016 г. принадлежали к следующим возрастным группам, а именно: до 18 лет - 13, 18-44 года (молодой возраст) - 68, 45-59 лет (средний возраст) - 24, 60-74 (пожилой возраст) - 4, 75-90 (старческий возраст) - 1, старше 90 лет (долгожители) - 2.
Группой контроля послужило исследование мозолистых тел от 31 трупа мужчин (23) и женщин (8), в возрасте от 10 до 73 лет, умерших от различных причин ненасильственной и насильственной смерти: от сердечно-сосудистых заболеваний (острой коронарной недостаточности, кардиомиопатии, ишемической болезни сердца), воспалительных заболеваний легких, почек, тромбофлебита с тромбоэмболией легочной артерии, онкологических заболеваний различных областей без повреждения головного мозга, острых отравлений алкоголем, наркотическими и психотропными средствами, механической асфиксии (утопление, повешение). Все умершие согласно классификации ВОЗ от 2016 г. принадлежали к следующим возрастным группам, а именно: до 18 лет - 5, 18-44 года (молодой возраст) - 10, 45-59 лет (средний возраст) - 10, 60-74 (пожилой возраст) - 6.
Для исследования мозолистого тела применяют следующий способ секционного исследования мозолистого тела. После извлечения головного мозга из полости черепа стволовой отдел головного мозга с мозжечком отделяют плоскостным поперечным разрезом на уровне ножек мозга. Большой мозг укладывают на базальную поверхность затылочными долями к прозектору. Большие полушария разводят в стороны для визуализации дорсальной поверхности мозолистого тела. Далее производят срединный разрез головного мозга в сагиттальной плоскости, проходящий продольно по мозолистому телу и всем подлежащим анатомическим структурам. После проведения этого разреза оба полушария располагают медиальной поверхностью к прозектору (фиг. 1). Далее в каждом полушарии производят три разреза на глубину 1 см ± 0,2 см: первый разрез тотчас кверху от мозолистого тела, вдоль оси его ствола (фиг. 2); второй - спереди от колена мозолистого тела, поперечно оси его ствола (фиг. 3); третий - тотчас позади валика мозолистого тела, поперечно оси его ствола (фиг. 4). Проведением плоскостных разрезов в направлении от базальной поверхности мозга к дорсальной поверхности мозолистого тела из левого и правого полушария выделяют два прямоугольных фрагмента толщиной 1 см ± 0,2 см (фиг. 5). Прямоугольные фрагменты помещают в фиксирующую жидкость (10% раствор забуференного формалина) на 24-48 часов.
Для гистологического исследования из каждого фрагмента выделяют ствол мозо-листого тела с сегментацией его на два участка: D1 - ствол до зоны перехода в колено правого фрагмента мозолистого тела, D2 - ствол до зоны перехода в валик правого фраг-мента мозолистого тела, L1 - ствол до зоны перехода в колено левого фрагмента мозоли-стого тела, L2 - ствол до зоны перехода в валик левого фрагмента мозолистого тела (фиг. 6) с последующей стандартной гистологической проводкой и заливкой парафином, изготовлением гистологических срезов толщиной 4-5 мкм с окрашиванием срезов ге-матоксилином и эозином, методами Ниссля и AgNor, с иммуногистохимическим исследо-ванием с антителами к нейрофиламентам.
Гистологическая проводка участков мозолистого тела проводилась по стандартным протоколам, после заливки в парафин изготавливались гистологические срезы толщиной 4-5 мкм. По стандартным протоколам проведено гистологическое окрашивание срезов гематоксилином и эозином, методами Ниссля и AgNor [Коржевский, Д. Э. Морфологическая диагностика. Подготовка материала для гистологического исследования и электронной микроскопии: руководство / Д. Э. Коржевский, Е. Г. Гилерович, О. В. Кирик [и др.]; под ред. Д. Э. Коржевского. - СПб.: СпецЛит, 2013. - 127 с. - ISBN 978-5-299-00569 -1. - Текст: непосредственный]. Иммуногистохимическое исследование проводилось по стандартным протоколам с использованием антител к нейрофиламентам [Коржевский, Д. Э. Теоретические основы и практическое применение методов иммуногистохимии: руководство / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, М. Н. Карпенко [и др.]; под ред. Д. Э. Коржевского. - СПб.: СпецЛит, 2012. - 110 с. - ISBN 978-5-299-00508-0. - Текст: непосредственный].
Морфологические критерии мозолистого тела изучались на светооптическом уровне с применением гистологических методов исследования: микроскопического с гистологической окраской гематоксилином и эозином, с использованием специальных окрасок по Нисслю (для окраски хроматофильной субстанции в нейронах), AgNor (для окраски ядрышкового организатора), иммунногистохимического метода (ИГХ) с применением антител к нейрофиламентам (для визуализации отростков нейронов), а также морфометрического и микрофотографического методов.
Гистологические препараты исследовали в проходящем свете с помощью микроскопа Axio Imager.A2 (Zeiss) с использованием объективов Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 4х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 10х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 20х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 40х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 63х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 100х. Фотографирование производилось цифровым фотоаппаратом «Canon Power Shot SX60 HS».
При помощи цифровой камеры AxioCam HRc с максимальным разрешением 3600х3030 пикселей и программного обеспечения ZEN lite 2012 (CarlZeiss) проведена морфометрия и изготовлены микрофотографии.
Для морфометрии объектом-микрометром ОМ-П ГОСТ 07.91 №2919 со шкалой с ценой деления 0,005 мм (5 мкм) при каждом рабочем увеличении микроскопа проведена калибровки цифровой системы визуализации. Определён коэффициент пересчёта единицы длины в международной системе СИ (микрометр) при каждом рабочем увеличении микроскопа.
Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0. При проверке статистических гипотез, рассчитанных для связанных выборок, использовался парный t-критерий Стьюдента. Данные считали достоверными при р≤0,05.
При проведении исследований был выявлен комплекс следующих значимых параметров патоморфологических изменений в мозолистом теле для посмертной диагностики диффузного аксонального повреждения мозга и его давности, а именно:
- наличие кровоизлияний в веществе ствола мозолистого тела и его сером покрове: локализация, форма, количество, размер и направленность кровоизлияний, клеточный состав;
- состояние нейронов серого покрова: форма тел, форма ядра, локализация ядрышка, наличие аргирофильных гранул, хроматолиз;
- состояние сосудистого русла перифокальной зоны кровоизлияний (артериального, венозного, микроциркуляторного): кровенаполнение, распределение клеточных элементов крови в просвете сосуда;
- состояние отростков нервных клеток: толщина, контуры, целостность, наличие ретракционных шаров в зоне кровоизлияний и перифокально;
- наличие некроза вещества мозолистого тела и клеток (микроглиоцитов, макроглиоцитов, лейкоцитов, макрофагов) в зоне кровоизлияний и перифокально.
В соответствии с выявленной закономерностью морфологических изменений в мозолистом теле также был установлен диагностический комплекс патоморфологических критериев ДАП в зависимости от длительности посттравматического периода (табл. 1):
в первый час после травмы:
а)
- мелкоочаговые кровоизлияния в стволе мозолистого тела и его сером покрове, в количестве не менее трёх, вытянутой формы, максимальной длиной не более 4 мм, линейно направленные от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела;
- нейроны серого покрова с телами округлой формы, ядрами округлой формы, ядрышко расположено по центру, на расстоянии до 1 мкм от оболочки ядра перинуклеарный хроматолиз;
- в перифокальной зоне кровоизлияний спазм и малокровие артерий и артериол, неравномерное кровенаполнение вен, полнокровие венул и капилляров; в просветах сосудов контурирующиеся эритроциты;
- отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 3,11 мкм ± 0,9, с неровными контуры, извитостью хода с наличием расширений, структур типа «чёток», с нарушением целостности и фрагментацией, с образованием на концах утолщений, которые на сагиттальных срезах имеют форму овала или круга с неровными контурами и диаметром в пределах 3,2-4,7 мкм. Ретракционные шары отсутствуют;
- в зоне кровоизлияний и перифокально отсутствуют некроз вещества мозолистого тела, микроглиоциты, макроглиоциты, лейкоциты и макрофаги.
в посттравматический период от 1 часа до 12 часов
б):
- мелкоочаговые кровоизлияния в стволе мозолистого тела и его сером покрове, в количестве не менее трёх, вытянутой формы, максимальной длиной не более 4 мм, линейно направленные от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела;
- нейроны серого покрова с телами и ядрами неправильной формы, ядрышко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны, в некоторых нейронах ядрышко отсутствует, в ядрах некоторых нейронов аргирофильные гранулы, перинуклеарный хроматолиз на расстоянии 2-3 мкм от ядра;
- в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий и артериол с отделением плазмы от клеток крови, полнокровие вен, венул и капилляров, перераспределение лейкоцитов, лейкостазы в некоторых венулах и капиллярах;
- отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 3,2 мкм ± 1,2, с неровными контурами, извитостью хода с наличием расширений, структур типа «чёток», с нарушением целостности и фрагментацией, с образованием на концах утолщений, которые на сагиттальных срезах имеют форму овала или круга с неровными контурами и диаметром в пределах 3,2-5,1 мкм. Ретракционные шары отсутствуют;
- в зоне кровоизлияний и перифокально отсутствуют некроз вещества мозолистого тела;
- в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты, отсутствие лейкоцитов, макрофагов;
с посттравматическим периодом от 12 до 48 часов:
в)
- мелкоочаговые кровоизлияния в стволе мозолистого тела и его сером покрове, в количестве не менее трёх, вытянутой формы, максимальной длиной не более 4 мм, линейно направленные от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела. В кровоизлияниях среди эритроцитов единичные лейкоциты и макрофаги;
- нейроны серого покрова с телами и ядрами неправильной формы, ядрышко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны, в некоторых нейронах ядрышко отсутствует, в ядрах многих нейронов рассеяны аргирофильные гранулы, тотальный хроматолиз;
- в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий, полнокровие артериол, венул, капилляров и вен, эритростазы и лейкостазы в венулах и капиллярах;
- отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 5,38 мкм ± 2,7, с неровными контурами, извитостью хода с расширениями, структурами типа «чёток», с нарушенной целостностью и образованием фрагментов отростков нейронов, при этом на концах фрагментов образуются утолщения, которые на сагиттальных срезах имеют форму овала или круга с неровными контурами и диаметром в пределах 5,8-7,1 мкм. Ретракционные шары отсутствуют.
- в зоне кровоизлияний и перифокально отсутствуют некроз вещества мозолистого тела;
- в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты и клетки макроглии, отсутствуют лейкоциты и макрофаги;
с посттравматическим периодом более 48 часов:
г)
- мелкоочаговые кровоизлияния в стволе мозолистого тела и его сером покрове, в количестве не менее трёх, вытянутой формы, максимальной длиной не более 4 мм, линейно направленные от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела. В центре кровоизлияний некроз вещества мозолистого тела с лейкоцитами и макрофагами;
- нейроны серого покрова мозолистого тела с неправильной формой тел и ядер, ядрышко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны, отсутствие ядрышка в некоторых нейронах, в ядрах нейронов аргирофильные гранулы, тотальный хроматолиз, наличие клеток-«теней»;
- в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий, артериол, венул и капилляров, вен, эритростазы и лейкостазы в некоторых венулах и капиллярах;
- отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 5,8 мкм ± 2,9, с неровными контурами, извитостью хода с расширениями, структурами типа «чёток», с нарушенной целостностью и участками фрагментации с образованием на концах фрагментов утолщений. Ретракционные шары в зоне некроза центра кровоизлияний, по краям кровоизлияний и в перифокальной зоне размером 15,5 мкм ± 6,33;
- в перифокальной зоне кровоизлияний некроз вещества мозолистого тела с лейкоцитами и макрофагами;
- в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты, макроглиоциты.
Таблица 1.
<b>Комплекс патоморфологических критериев установления ДАП</b><b>и его давности</b>
<b></b><b><i>основные </i></b><b></b><b></b><b><i>морфологические</i></b><b></b><b></b><b><i>критерии</i></b><b></b>
<b></b><b><i>первый час</i></b><b></b><b></b><b><i>после травмы</i></b><b></b>
<b></b><b><i>от 1 часа до 12 часов</i></b><b></b>
<b></b><b><i>от 12 до 48</i></b><b></b><b></b><b><i>часов</i></b><b></b>
<b></b><b><i>более 48 часов</i></b><b></b>
<b>КРОВОИЗЛИЯНИЯ в веществе ствола мозолистого тела и в его сером покрове:</b>
• мелкоочаговые,• в количестве не менее трёх,• вытянутой формы, максимальной длиной не более 4 мм,• линейно направленные (однонаправленные) от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела с отклонением от условно проведенной срединной линии не более чем на 60°
<b></b><b><i>дополнительные</i></b><b></b><b></b><b><i>морфологические</i></b><b></b><b></b><b><i>критерии</i></b><b></b>
<b></b><b><i>первый час</i></b><b></b><b></b><b><i>после травмы</i></b><b></b>
<b></b><b><i>от 1 часа до 12 часов</i></b><b></b>
<b></b><b><i>от 12 до 48</i></b><b></b><b></b><b><i>часов</i></b><b></b>
<b></b><b><i>более 48 часов</i></b><b></b>
<b>состояние нейронов серого покрова мозолистого тела</b>
форма тел
округлая
неправильная
неправильная
неправильная
форма ядра
округлая
неправильная
неправильная
неправильная
смещение ядрышка на периферию ядра
-
+
+
+
аргирофильные гранулы
-
+
+
+
хроматолиз
до 1 мкм от оболочки ядра
2-3 мкм от оболочки ядра
тотальный
тотальный
клетки-«тени»
-
-
-
+
<b>состояние сосудистого русла перифокальной зоны кровоизлияний</b>
артерии
малокровие
неравномерное кровенаполнение
неравномерное кровенаполнение
неравномерное кровенаполнение
артериолы
малокровие
неравномерное кровенаполнение
полнокровие
неравномерное кровенаполне-ние
капилляры
полнокровие
полнокровие
полнокровие
неравномерное кровенаполнение
венулы
полнокровие
полнокровие
полнокровие
неравномерное кровенаполнение
вены
неравномерное кровенаполнение
полнокровие
полнокровие
неравномерное кровенаполне-ние
эритростазы
-
+
+
+
лейкостазы
-
+
+
+
<b>клетки</b><b>перифокальной зоны кровоизлияний</b>
микроглиоциты
-
+
+
+
макроглиоциты
-
-
+
+
лейкоциты
-
-
-
+
макрофаги
-
-
-
+
<b>некроз вещества мозолистого тела</b>
в центре кровоизлияния
-
-
-
+
в перифокальной зоне кровоизлияния
-
-
-
+
<b>состояние отростков нервных клеток</b>
неровные контуры
+
+
+
+
неравномерная толщина
+
+
+
+
участки расширений
+
+
+
+
структуры типа«чёток»
+
+
+
+
нарушение целостности
+
+
+
+
толщина отростков, мкм
3,11 ± 0,9
3,2 ± 1,2
5,38 ± 2,7
5,8 ± 2,9
ретракционные шары, мкм(15,5 ± 6,33)
-
-
-
+
<u>Примечание: </u>«-» - отсутствие признака; «+» - присутствие признака.
В результате проведённого исследования предложено секционное исследование мозолистого тела, установлен диагностический комплекс патоморфологических критериев ДАП и выявлена динамика структурных изменений для определения давности посттравматического периода.
Установленные диагностический комплекс патоморфологических критериев и динамика структурных изменений в различные сроки посттравматического периода при использовании заявляемого способа секционного исследования мозолистого тела позволяют на светооптическом уровне с применением доступных и эффективных гистологических методик диагностировать ДАП, его давность и объективировать экспертные выводы.
Примеры реализации изобретения
Пример 1.
Труп Б., мужчина, 52 лет.
Обстоятельства дела. Труп обнаружен в помещении с повреждениями в области головы.
При судебно-медицинском исследовании трупа в области головы обнаружены следующие повреждения: ушибленные раны лобной области, верхней и нижней губ, множественные ссадины и кровоподтёки лица с размозжением подлежащих мягких тканей, кровоизлияния в мягкие ткани теменно-затылочной области. Переломов костей черепа и лицевого скелета, оболочечных кровоизлияний и кровоизлияний в ткань мозга, в том числе в мозолистое тело не выявлено.
Исследование мозолистого тела проводилось с использованием заявляемого способа его секционного исследования. После извлечения головного мозга из полости черепа стволовой отдел головного мозга с мозжечком отделяли плоскостным поперечным разрезом на уровне ножек мозга. Большой мозг укладывали на базальную поверхность затылочными долями к прозектору. Большие полушария разводили в стороны для визуализации дорсальной поверхности мозолистого тела, производили срединный разрез головного мозга в сагиттальной плоскости, проходящий продольно по мозолистому телу и всем подлежащим анатомическим структурам. После проведения этого разреза оба полушария располагали медиальной поверхностью к прозектору. При оценке поверхностей срединного сагиттального разреза мозолистого тела слева и справа кровоизлияний в мозолистом теле не выявлено. В каждом полушарии производили три разреза на глубину 1 см: первый разрез тотчас кверху от мозолистого тела, вдоль оси его ствола; второй - спереди от колена мозолистого тела, поперечно оси его ствола; третий - тотчас позади валика мозолистого тела и поперечно оси его ствола. Проведением плоскостных разрезов в направлении от базальной поверхности мозга к дорсальной поверхности мозолистого тела из левого и правого полушария выделяли два прямоугольных фрагмента толщиной 1 см.
Прямоугольные фрагменты мозолистого тела фиксировали в 10% растворе забуференного формалина в течение 24 часов.
Для гистологического исследования из каждого фрагмента выделяли ствол мозолистого тела с сегментацией его на два участка (D1, D2, L1, L2) с последующей стандартной гистологической проводкой и заливкой парафином, изготовлением гистологических срезов толщиной 4-5 мкм с окрашиванием срезов гематоксилином и эозином, методами Ниссля и AgNor. ИГХ исследование проводилось по стандартным протоколам с использованием антител к нейрофиламентам.
Гистологические препараты исследовались в проходящем свете с помощью микроскопа Axio Imager.A2 (Zeiss) с использованием объективов Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 4х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 10х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 20х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 40х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 63х, Zeiss EC Plan-NEOFLUAR 100х. При помощи цифровой камеры AxioCam HRc с максимальным разрешением 3600х3030 пикселей и программного обеспечения ZEN lite 2012 (CarlZeiss) проводилась морфометрия и были изготовлены фотографии. Морфометрия проводилась с коэффициентом пересчёта единицы длины в международной системе СИ (микрометр) при каждом рабочем увеличении микроскопа после проведения калибровки цифровой системы визуализации объект-микрометром ОМ-П ГОСТ 07.91 №2919 со шкалой с ценой деления 0,005 мм (5 мкм).
При гистологическом исследовании сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок D1) выявлено:
- мелкоочаговые кровоизлияния в веществе в количестве четырёх, вытянутой формы, длиной от 161 до 632 мкм, линейно направленные (однонаправленные) от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела (фиг. 7);
- мелкоочаговые кровоизлияния в сером покрове мозолистого тела в количестве трёх, длиной от 106 до 171 мкм. Нейроны серого покрова с телами и ядрами округлой формы (фиг. 8), ядрышко расположено по центру;
- в нейронах серого покрова перинуклеарный хроматолиз на расстоянии до 1 мкм от ядра (фиг. 9);
- в перифокальной зоне кровоизлияний спазм и малокровие артерий и артериол, неравномерное кровенаполнение вен, полнокровие венул и капилляров;
- отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 3,11 мкм ± 0,9, с неровными контурами, извитостью хода с наличием расширений (фиг. 10), структур типа «четок», участками фрагментации (фиг. 11) с образованием на концах утолщений, которые на сагиттальных срезах имеют форму овала или круга с неровными контурами (фиг. 12); ретракционные шары отсутствуют;
- отсутствует некроз вещества мозолистого тела;
- в перифокальной зоне кровоизлияний отсутствие глиальных, лейкоцитарных и макрофагальных клеток.
Таким образом, установленный при гистологическом исследовании комплекс патоморфологических изменений в мозолистом теле свидетельствует, что мужчина Б., 52 лет, умер от диффузного аксонального повреждения мозга в первый час после травмы.
В ходе проведения расследования установлено… из допроса подозреваемого «… я тыльной стороной ладони нанёс ему всего лишь один удар в область носа по направлению снизу вверх, после чего Б. резко сполз по стене, начал хрипеть, примерно через 30 секунд я подошел к нему, Б. уже не хрипел».
Пример 2.
Труп Ш., женщина, 18 лет.
Обстоятельства дела. Пострадавший при дорожно-транспортном происшествии пешеход. Оказана скорая медицинская помощь на месте (пострадавший в коме), госпитализирован в стационар.
При судебно-медицинском исследовании трупа в области головы обнаружены следующие повреждения: кровоизлияния в мягкие ткани затылочной и теменной областей; перелом костей свода черепа; субарахноидальные кровоизлияния выпуклых поверхностей лобной и височной долей обоих больших полушарий, базальной поверхности левой височной доли; множественные точечные кровоизлияния в веществе мозолистого тела.
Исследование мозолистого тела проводилось аналогично примеру 1, при этом в каждом полушарии производили три разреза на глубину 1,1 см и выделяли два прямоугольных фрагмента толщиной 1,1 см, которые фиксировали в 10% растворе забуференного формалина в течение 36 часов.
При макроскопической оценке поверхностей срединного сагиттального разреза мозолистого тела слева в зоне перехода колена в ствол выявлены едва определяемые множественные мелкоочаговые (пылевидные) кровоизлияния несколько вытянутой в направлении сверху вниз и спереди кзади формы.
При гистологическом исследовании сагиттального среза ствола мозолистого тела, в участке L1 выявлено:
- мелкоочаговые кровоизлияния в веществе ствола мозолистого тела и его сером покрове в количестве семи, вытянутой формы, длиной от 184 до 272 мкм, линейно направленные от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела;
- нейроны серого покрова с телами и ядрами неправильной формы (фиг. 13), ядрышко резко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны, ядрышко в некоторых нейронах отсутствует, в ядрах некоторых нейронов рассеяны аргирофильные гранулы (фиг. 14), перинуклеарный хроматолиз на расстоянии 2-3 мкм от ядра;
- в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий и артериол с отделением плазмы от клеток крови, полнокровие вен, венул и капилляров, перераспределение лейкоцитов и лейкостазы в некоторых венулах и капиллярах;
- отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины, 3,3 мкм ± 0,9, с неровными контурами, с расширениями, структурами типа «четок», с нарушенной целостностью; ретракционные шары отсутствуют;
- в зоне кровоизлияний и перифокально отсутствуют некроз вещества;
- в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты с отсутствием лейкоцитов и макрофагов (фиг. 15);
Таким образом, установленный при гистологическом исследовании комплекс па-томорфологических изменений в мозолистом теле свидетельствует, что женщина Ш., 18 лет, умерла от диффузного аксонального повреждения мозга с давностью посттравматического периода от 1 часа до 12 часов.
Из медицинской карты стационарного больного. При поступлении 15.09.2016 в 21.00 час уровень сознания - кома. На рентгенограмме костей черепа перелом теменной кости справа, разрыв атлантозатылочного сочленения. В виду неэффективности реанимационных мероприятий, направленных на восстановление жизненно важных функций в течение 30 минут, 15.09.2016 в 23.40 час, через 2 час 30 мин после поступления в стационар констатирована смерть.
Пример 3.
Труп К., мужчина, 23 лет.
Обстоятельства дела. Пострадавший в результате дорожно-транспортного происшествия водитель мотоцикла. Оказана скорая медицинская помощь на месте происшествия (пострадавший в коме), транспортирован в стационар.
При судебно-медицинском исследовании в области головы обнаружены следующие повреждения: перелом основания черепа; двусторонние пластинчатые субдуральные гематомы на уровне выпуклых поверхностей лобных, теменных и височных долей незначительного объёма (справа 10 мл, слева 8 мл); слабо выраженные субарахноидальные кровоизлияния выпуклых поверхностей лобных, теменных и височных долей обоих полушарий; мелкоочаговые (размерами до 0,7 см) кровоизлияния по типу пропитывания в коре и белом веществе полюсов височных долей; мелкоочаговые кровоизлияния в веществе мозолистого тела.
Исследование мозолистого тела проводилось аналогично примеру 1, при этом в каждом полушарии производили три разреза на глубину 1,2 см с выделением двух прямоугольных фрагментов толщиной 1,2 см, которые фиксировали в 10% растворе забуференного формалина в течение 48 часов.
При макроскопической оценке поверхностей срединного сагиттального разреза мозолистого тела слева и справа, на уровне ствола мозолистого тела, от его условного центра и до границы с валиком выявлена группа пылевидных кровоизлияний на участке без чётких границ размером около 0,8х2,5 см. Зона кровоизлияний располагается преимущественно слева от срединной линии в сагиттальной плоскости, ориентирована продольно оси ствола мозолистого тела.
При гистологическом исследовании сагиттального среза ствола мозолистого тела (участок L2) в области ствола выявлено:
- мелкоочаговые кровоизлияния в веществе ствола в количестве четырех, вытянутой формы, длиной от 113 до 512 мкм, линейно направленные от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела. В кровоизлияниях среди эритроцитов единичные лейкоциты и макрофаги;
- нейроны серого покрова с неправильной формой тел и ядер, ядрышко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны, отсутствие ядрышка в отдельных нейронах, в ядрах нейронов аргирофильные гранулы, тотальный хроматолиз;
- в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий, полнокровие артериол, венул, капилляров и вен (фиг. 16), эритростазы и лейкостазы в венулах и капиллярах (фиг. 17);
- отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 5,4 мкм ± 2,3, с неровные контурами, с расширениями (фиг. 18), структурами типа «чёток» (фиг. 19), с нарушенной целостностью; ретракционные шары отсутствуют;
- в зоне кровоизлияний и перифокально отсутствуют некроз вещества;
- в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоцитарная реакция с наличием клеток макроглии, отсутствие лейкоцитов и макрофагов.
Таким образом, установленный при гистологическом исследовании комплекс патоморфологических изменений в мозолистом теле свидетельствует, что мужчина К., 23 лет, умер от диффузного аксонального повреждения мозга с давностью посттравматического периода от 12 часов до 48 часов.
Из медицинской карты стационарного больного. Поступил в стационар 15.08.2019 года в 03:35. КТ головного мозга: оболочечные гематомы малого объёма в обоих полушариях головного мозга, признаки субарахноидального кровоизлияния, отёка головного мозга, данных за очаговое поражение головного мозга нет. Смерть констатирована 17.08.2019 года в 01:05 (через 45 час 30 мин после поступления в стационар констатирована смерть).
Пример 4.
Труп И., женщина, 41 года.
Обстоятельства дела. Дорожно-транспортное происшествие, пешеход, сбитый мотоциклом. При оказании скорой медицинской помощи на месте, последующей транспортировке в стационар и при поступлении в стационар - уровень сознания оценен как глубокая кома.
При судебно-медицинском исследовании в области головы обнаружены следующие повреждения: ушибленная рана правой височной области; кровоизлияния в мягкие ткани лица справа, переломы костей лицевого скелета слева; эпидуральная гематома передней черепной ямки незначительного объема, субарахноидальные кровоизлияния выпуклых поверхностей и полюсов лобных долей, полюса правой височной доли, выпуклой поверхности правой затылочной доли, верхних поверхностей мозжечка; кровоизлияния в вещество мозолистого тела.
Исследование мозолистого тела проводилось аналогично примеру 1, при этом в каждом полушарии производили три разреза на глубину 0,9 см с выделением двух прямоугольных фрагментов толщиной 0,9 см, которые фиксировали в 10% растворе забуференного формалина в течение 30 часов.
При макроскопической оценке поверхностей срединного сагиттального разреза мозолистого тела на всём протяжении ствола мозолистого тела и в зоне перехода ствола в колено выявлены мелкоочаговые кровоизлияния овальной, вытянутой и округлой формы в количестве более десяти.
При гистологическом исследовании сагиттального среза ствола мозолистого тела (участках D1 и D2) выявлено:
- мелкоочаговые кровоизлияния в веществе ствола в количестве пяти, вытянутой формы, длиной до 2150 мкм, линейно направленные от вентральной до дорсальной поверхностей сагиттального среза мозолистого тела;
- в центре кровоизлияний некроз вещества с макрофагами и лейкоцитами (фиг. 20);
- нейроны серого покрова с неправильной формой тел и ядер, ядрышко смещено на периферию ядра, вплоть до ядерной мембраны, отсутствие ядрышка в некоторызх нейронах, в ядрах рассеяны аргирофильные гранулы, тотальный хроматолиз, наличие клеток-«теней»;
- в перифокальной зоне кровоизлияний неравномерное кровенаполнение артерий, артериол, венул, капилляров и вен, эритростазы и лейкостазы в венулах и капиллярах;
- отростки нервных клеток вокруг кровоизлияний и перифокально неравномерной толщины 5,8 мкм ± 2,9, с неровными контурами, с расширениями, структурами типа «чёток», с нарушенной целостностью. Ретракционные шары в зоне некроза центра кровоизлияний (рис. 21), по краям кровоизлияний (фиг. 22), в перифокальной зоне кровоизлияний (фиг. 23) размером 15,5 мкм ± 6,3.
- в перифокальной зоне кровоизлияний микроглиоциты, макроглиоциты, некроз вещества мозолистого тела с лейкоцитами и макрофагами.
Таким образом, установленный при гистологическом исследовании комплекс патоморфологических изменений в мозолистом теле свидетельствует, что женщина И., 41 год, умерла от диффузного аксонального повреждения мозга с давностью посттравматического периода более 48 часов.
Из медицинской карты стационарного больного. Вызов принят 25.10.2019 года в 18:20. При КТ головного мозга: перелом костей лицевого скелета с распространением линий переломов на височную поверхность и лобный бугор, лобные кости справа и на малое крыло и латеральную стенку клиновидной кости справа, переломы стенок правой верхнечелюстной пазухи, скуловой кости справа, субарахноидальные пространства не расширены, очаговых изменений вещества головного мозга не определяется. Смерть констатирована 30.10.2019 года в 00:05 (в стационаре проведено 5 дней).
Пример 5.
Труп Ч., мужчина, 49 лет.
Обстоятельства дела. Труп обнаружен на улице без внешних повреждений.
При судебно-медицинском исследовании трупа в области головы повреждений не выявлено.
Исследование мозолистого тела проводилось аналогично примеру 1, при этом в каждом полушарии производили три разреза на глубину 0,8 см с выделением двух прямоугольных фрагментов толщиной 0,8 см, которые фиксировали в 10% растворе забуференного формалина в течение 42 часов.
При оценке поверхностей срединного сагиттального разреза мозолистого тела слева и справа кровоизлияний в мозолистом теле не выявлено.
При гистологическом исследовании мозолистого тела в веществе ствола (участки D1, D2, L1, L2) и сером покрове кровоизлияний не выявлено. В сером покрове нейроны с телами округлой формы, ядрами округлой формы, ядрышко расположено по центру, хроматин представлен глыбками. Неравномерное кровенаполнение артерий и артериол, полнокровие вен, венул и капилляров. Отростки нейронов неравномерной толщины 3,3 мкм ±1,9, с неровными контурами, извитостью хода.
Таким образом, при гистологическом исследовании признаки комплекса патоморфологических изменений в мозолистом теле, характерного для ДАП, не выявлены. Смерть мужчины Ч., 49 лет, наступила от другой причины.
Из акта судебно-медицинского исследования трупа: смерть Ч., 49 лет, наступила от острой сердечно-сосудистой недостаточности, обусловленной диффузным мелкоочаговым кардиосклерозом на фоне артериальной гипертензии, что подтверждается морфологическими данными. При судебно-химическом исследовании крови и мочи этиловый, метиловый и пропиловые спирты не обнаружены. При судебно-химическом исследовании крови не обнаружено кодеина, морфина и его аналогов, производных барбитуровой кислоты, седуксена, элениума, тазепама, аминазина, тизерцина, мажептила, дипразина, трифтазина, имизина и его аналогов.
Пример 6.
Труп Ч., женщина, 59 лет.
Обстоятельства дела. Травма во время бури в мегаполисе - падение дерева на прохожего. Пострадавшая доставлена в стационар в состоянии комы, умерла через 3 часа, не приходя в сознание.
При судебно-медицинском исследовании в области головы обнаружены следующие повреждения: ушибленная рана лобной области, кровоизлияние в мягкие ткани затылочной области; субарахноидальные кровоизлияния верхней поверхности обоих полушарий мозжечка, выпуклой поверхности левого большого полушария. Головной мозг исследован по методу Вирхова (продольные разрезы полушарий головного мозга от мозолистого тела вглубь с отсечением мозолистого тела на уровне колена). Кровоизлияний в ткань головного мозга, в том числе мозолистого тела не выявлено. На гистологическое исследование были направлены участки вещества головного мозга, в том числе один участок мозолистого тела на уровне колена.
При первичном гистологическом исследовании кровоизлияний в вещество головного мозга, в том числе мозолистого тела не выявлено. Предварительно причина смерти не установлена.
Для установления непосредственной причины смерти из влажного архива был взят образец мозолистого тела, фиксированного в 10% растворе забуференного формалина. Было проведено повторное исследование мозолистого тела с использованием сагиттального разреза. При этом на уровне перехода колена в ствол справа выявлена зона повреждения в виде группы мелких кровоизлияний (фиг. 24) на участке без чётких границ размером около 0,8х0,5 см. Кровоизлияния штриховидные, толщиной менее 0,1 см, длиной 0,2-0,3 см, количеством около десяти, имеют один вектор направленности - сверху вниз, спереди кзади. Для гистологического исследования проведена сегментация мозолистого тела с выделением участков ствола согласно предложенной схеме (D1 и D2) с последующей стандартной гистологической проводкой и заливкой парафином, изготовлением гистологических срезов толщиной 4-5 мкм с окрашиванием срезов гематоксилином и эозином, методами Ниссля и AgNor, с использованием ИГХ исследования по стандартным протоколам с антителами к нейрофиламентам.
При гистологическом исследовании сагиттального среза мозолистого тела в веществе ствола установлены мелкоочаговые кровоизлияния, в количестве 10, вытянутой формы, длиной до 3370 мкм.
Таким образом, применение заявляемого способа исследования мозолистого тела с сегментацией ствола по предложенной схеме для гистологического исследования позволило выявить зону повреждения в области ствола и установить морфологический субстрат непосредственной причины смерти, свидетельствующий о ДАП травматического генеза.