СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ГИДРОЛИЗАТОВ БЕЛКОВ
METHOD OF PRODUCING PROTEIN HYDROLYSATES

Изобретение касается способа производства гидролизатов из сырья растительного и животного происхождения, содержащего белок.
Содержащие белок природные продукты и продукты расщепления растительного и животного происхождения могут быть разнообразными способами подготовлены для дальнейшего материального использования. Как правило, для этого необходимо, с одной стороны, расщепить макромолекулы (белки) в аминокислотах, а с другой стороны, пептиды, которые состоят из нескольких аминокислот.
Известен гидролиз белков, который за счет добавления кислот или щелочей под воздействием температуры ведет к образованию смеси аминокислот. После расщепления белка необходимо нейтрализовать раствор. Однако при гидролизе кислот разрушается важная, имеющая экономическое значение, кислота триптофан.
Расщепление белков может проводиться также ферментативно с помощью протеаз микробного происхождения. При этом используются как эндопептидазы, которые разлагают пептидные цепочки на различные фрагменты в соответствии со спецификой расщепляющего воздействия, так и экзопептидазы, которые дают аминокислоты.
Методы и способы ферментативного гидролиза белка в зависимости от значения рН, представлены среди прочих в GB 846682, RU 2132142 и US 6221423.
Макромолекулы сложных материалов из животных и растительных отходов, такие как углеводороды, жиры и белки, могут быть также расщеплены под воздействием повышенного давления и повышенной температуры. Возникшие таким образом фрагменты становятся доступными микробно поддерживаемой энергетической обработке, например образованию метана.
В US 6365047, ES 2162462T и DE 10117321 представлен уровень техники гидролиза под воздействием давления и температуры в отношении технологических решений.
В DE 10113537 описывается обработка под давлением / воздействием температуры для мясокостной муки. Преимущественно с точки зрения деактивации возбудителя BSE инфицированной мясокостной муки и мясного фарша в щелочной среде на водную суспензию мясокостной муки воздействуют давление в 2,5 бара и температура в 150°С по меньшей мере в течение 15 минут.
Согласно ЕР 1406508 мясокостная мука, не содержащая BSE, расщепляется в ходе тотального гидролиза белка мясокостной муки на аминокислоты с добавлением кислот/щелочей и при необходимости в ходе последующей обработки протеазами. За процессом расщепления должна следовать нейтрализация (прототип).
Однако все эти способы, включая прототип, не обеспечивают возможность производства гидролизатов с молекулярным весом в определенном диапазоне без регулирования значения Ph и/или использования ферментов.
Задачей настоящего изобретения является создание способа, с помощью которого можно производить гидролизаты белка определенного диапазона молекулярного веса без использования регулирования значения рН и без использования ферментов.
Решение этой задачи достигается с помощью признаков пункта 1 формулы изобретения.
Согласно ему способ производства гидролизатов белка из растительного или животного сырья, содержащего белок, характеризующийся тем, что расщепление сырья проводят в водной среде при температуре в диапазоне от 180 до 220°С в течение времени реакций от 25 до 45 мин, при этом поддерживают давление в реакционной камере в диапазоне от 50 до 75 бар, полученную суспензию после процесса расщепления разделяют на осадок, который содержит нерастворимые компоненты исходного материала и верхний водный слой, в котором растворены продукты расщепления сырья.
Предпочтительные варианты усовершенствования изобретения указаны в зависимых пунктах формулы.
В одном варианте реализации изобретения расщепление происходит непрерывно в трубчатых реакторах (фиг.1) или по интервальному принципу.
В еще одном варианте изобретения процесс расщепления контролируют посредством текущих измерений размера молекул пептидов в верхнем водном слое.
В еще одном варианте реализации предусмотрено, что перед помещением в реактор сырье перерабатывают с водой в коллоидной мельнице с определенной степенью измельчения и в течение определенного времени, предпочтительно от 15 до 60 минут. Преимущественным образом при этом достигается предварительное раскрытие молекулы.
Еще один вариант реализации предусматривает, что температурный диапазон расщепления выбирают от 180°С до 220°С и устанавливают целенаправленное давление величиной, равной от 1,1 до 10-кратного значения давления пара при соответствующей температуре. Таким образом преимущественно обеспечивается единое жидкое состояние фазы внутри системы. За счет постоянно жидкого состояния суспензии обеспечивается ее непрерывная и бесперебойная подача.
В еще одном варианте реализации в качестве сырья для расщепления белка предпочтительно используют прошедшие предварительную обработку в ходе шагов очистки и экстракции растительные и животные материалы, в частности мясокостную муку.
В еще одном варианте реализации сырье просеивают для получения определенного размера частиц, предпочтительно менее 2 мм.
В еще одном варианте реализации перерабатывают молотую массу при ее концентрации от 5 до 40% в водном растворе и/или после осаждения молотой массы перерабатывают верхний водный слой суспензии.
Еще один вариант реализации предусматривает, что осуществляют циркуляцию суспензии. В частности для того, чтобы подавать суспензию в циркуляционный контур, подходит бустерный насос. Технологический насос подключается для обеспечения требуемого давления суспензии.
В еще одном варианте реализации изобретения предусматривается, что после снятия давления с продукта реакции отделяют твердые компоненты от растворенных в воде.
Растворимый продукт расщепления в жидкой или высушенной форме может быть использован для химических процессов. При этом растворимая смесь продуктов расщепления в жидкой или высушенной форме может быть использована для питательных сред для культивации микробов.
Посредством таких параметров, как температура, давление и время реакции, в реакторе задается образец условий расщепления белка. При этом, в частности, давление постоянно находится выше собственного давления водяного пара, чтобы обеспечить постоянное соблюдение однофазной системы в процессе реакции.
Удивительным образом было установлено, что посредством управляемого воздействия давления/температуры и времени реакции, также и без изменения значения рН и добавления ферментов, можно получить определенную смесь пептидов и аминокислот из сырья, содержащего белок. При строгом соблюдении заданных систематических кривых (фиг.2) с помощью предлагаемого способа получают продукт, который может быть использован в качестве сырья для биотехнологических и химических процессов.
За счет анализа размера молекул пептидов и микробной применимости продуктов расщепления осуществляется контроль над процессом. Благодаря использованию защитного газа можно исключить нежелательные побочные реакции.
Настоящее изобретение предоставляет собой способ для материальной обработки мясокостной муки, который можно вариативно использовать в зависимости от требуемых технологических условий, зависящих от конкретного продукта.
Способ, положенный в основу изобретения, вместе с тем подходит и для обеспечения разрушения возбудителя BSE, если управление процессом согласно изобретению осуществляется таким образом, что молекулярный вес отдельных компонентов смеси пептидов и аминокислот составляет менее 20 кДа. Известно, что молекулярный вес BSE-возбудителя составляет от 27 кДа до 30 кДа (Prusiner, St. В. (1996) TIBS 21, 482-487: Molecular biology and pathogenesis of priori diseases).
Способ может реализовываться как в непрерывно работающих трубчатых реакторах, так и в периодически действующих реакторах. Трубчатые реакторы обеспечивают наибольшее преимущество, поскольку объем реактора можно в любое время скорректировать в зависимости от изменяющегося качества исходного материала.
Далее изобретение поясняется чертежами.
Фиг.1 представляет схему, иллюстрирующую технологический процесс,
Фиг.2 - примерное представление системных кривых (температура-время реакции) в реакторе непрерывного режима работы,
Фиг.3 - примерное представление зависимости способа по настоящему изобретению от времени реакции и температуры,
Фиг.4 - примеры реализации (с примера R1 по пример R5).
На Фиг.1 представлен пример, схематично поясняющий реализацию способа согласно изобретению.
Перед подачей сырья в бункер 1 сырье просеивается, чтобы удалить посторонние и слишком крупные частицы. Затем сырье выводится из бункера 1 посредством известного разгрузочного устройства 2 и смешивается в резервуаре 3 для перемешивания с водой, затем измельчается и преобразуется в суспензию с определенным размером частиц посредством коллоидной мельницы 4. Благодаря измельчению в коллоидной мельнице 4 суспензии придается однородность, и за счет механического растворения биомассы достигается лучшее гидротермальное расщепление белка. Чтобы предотвратить образование осадка и отложений, суспензия перемешивается в резервуаре 3 для перемешивания.
После получения суспензии бустерный насос 5, обычный, имеющийся в продаже, всасывает суспензию и подает ее по циркуляционному контуру обратно в резервуар 3 для перемешивания. В резервуаре 3 опять производится перемешивание.
Подвод в технологический насос 6 осуществляется из напорного трубопровода бустерного насоса 5. Благодаря технологическому насосу 6 со стороны установки устанавливается давление в 5-220 бар, предпочтительно в 40-100 бар.
Затем суспензия сначала попадает в теплообменник 7, в котором она нагревается за счет противоположного потока продукта расщепления, выходящего из реактора 8. При этом суспензия нагревается, примерно с 20 до 120-140°С. Продукт расщепления охлаждается при этом, примерно с 140-250°С до 30-60°С.
После теплообменника 7 суспензия направляется в реактор 8. Реакционное пространство содержит несколько трубчатых реакторов, которые включены последовательно. Реактор 8 нагревается снаружи, и суспензия нагревается до температуры в 140-250°С. После поступления в реактор 8 под воздействием давления и температуры белки в сырье расщепляются на пептиды и аминокислоты.
Посредством статических смесительных устройств в теплообменнике 7 и/или перед реактором 8 и/или в реакторе 8 существует возможность перемешать поток вещества.
После выхода продукта расщепления из реактора 8 и охлаждения его в теплообменнике 7 его давление снижается посредством редукционного клапана 9 до давления окружающей среды. Это уменьшение давления может быть одноступенчатым и/или двухступенчатым, однако предпочтительно одноступенчатое. Газы, образующиеся в камере 10 снятия давления, отводятся во внешний очиститель 15 отработанных газов, чтобы отделить возможно содержащиеся в них пахучие вещества.
Гидролизат, собранный в камере 10 снятия давления, далее обрабатывается в центрифуге/декантаторе 11 таким образом, что при этом отделяется имеющийся осадок. Осадок собирается в резервуаре 12 для осадка. Затем полученная таким образом растворимая фаза (верхний водный слой) отделяется посредством фильтра 13, предпочтительным образом посредством мембранного фильтра. Полученный таким образом фильтрат можно просушить в сушилке 14 или использовать в полученном виде или в жидкой форме.
На Фиг.2 показаны системные кривые температура-время реакции при непрерывном осуществлении способа. При соблюдении определенных параметров температуры и времени реакции при заданном давлении в способе гидролиза посредством температуры и давления достигается определенный средний молекулярный вес белков. В качестве дополнительных факторов влияния рассматриваются параметры установки и содержание сухой субстанции в суспензии. Можно констатировать явное влияние времени реакции и температуры. Чтобы получать одинаковые продукты, необходимо повышать температуру при меньшем времени реакции и выбирать более длительное время реакции при более низких температурах. При реализации способа согласно верхней системной линии в среднем получают молекулы с молекулярным весом в 10 кДа.
При реализации способа согласно средней линии в среднем получают молекулы с молекулярным весом в 15 кДа, а при реализации способа согласно нижней линии в среднем получают молекулы с молекулярным весом в 25 кДа.
На Фиг.3 показана зависимость способа согласно настоящему изобретению (расщепление белка) от времени реакции и температуры расщепления. Можно констатировать следующие зависимости:
1. С повышением температуры снижается средний молекулярный вес пептидов. При этом расщепляется больше белка и получаются более мелкие фрагменты белка (пептиды и аминокислоты).
2. С повышением времени реакции средний молекулярный вес снижается при равной температуре. Соответственно, более длительное время реакции вызывает дальнейшее расщепление белков на более мелкие фрагменты.
3. Данные записывались по каждой установке при определенных значениях давления. Изменения этих факторов воздействия вызывают различные результаты расщепления при гидролизе под высоким давлением.
На Фиг.4 представлены примеры R1, R2, R3, R4 и R5 реализации изобретения. Представлены различные технологические параметры (давление, температура, время реакции). На примерах доказывается, что при определенных установках давления, температуры и времени реакции получают различные значения среднего молекулярного веса.
Изобретение поясняется подробнее на примерах реализации.
Пример 1
В качестве сырьевого продукта используется производимая на предприятиях, перерабатывающих побочные продукты убоя скота, мясокостная мука. Мясокостная мука просеивается, чтобы удалить посторонние и слишком крупные частицы (>2 мм). В резервуаре 3 для перемешивания при перемешивании с помощью коллоидной мельницы 4 создается 30%-ная суспензия мясокостной муки с водой. Технологический насос 6 подает суспензию из приемного резервуара и уплотняет ее до давления в >50 бар (избыточн.). Температура в реакторе 8 составляет >200°C, время реакции - 30 минут и расход 100 кг/ч. После расщепления суспензия гидролизата проходит одноступенчатое уменьшение давления с технологического давления до давления окружающей среды.
Затем собранный гидролизат отделяется посредством сепарации и фильтрации от осадка. Затем проводится фильтрация с помощью мембранного фильтра 13 с частотой среза, соответствующей молекулярной массе от 20 кДа. Фильтрат предпочтительным образом высушивается в распылительной сушилке 14. При температуре приточного воздуха 300°С и температуре вытяжного воздуха 95°С получают сухой сыпучий порошок.
Выход сухого порошка составляет 35% относительно сухой субстанции исходного вещества. Протеиногенные соединения (пептиды, аминокислоты) составляют около 89% сухой субстанции продукта. Гель-хроматография продукта показывает, что средний молекулярный вес пробы составляет около 7 кДа.
Пример 2
В качестве сырьевого продукта используется производимая на предприятиях, перерабатывающих побочные продукты убоя скота, мясокостная мука категории II. Создается молотая масса из 70 г мясокостной муки в 350 мл воды. Эта масса подается в периодический реактор. При помешивании доводится до температуры в 200°С. В азотной атмосфере давление увеличивается до 100 бар. Время реакции составляет 120 минут.
Проба сепарируется в центрифуге в течение 20 минут при 3000 г. Нерастворимые компоненты (осадок) отделяются, а верхний водный слой используется как продукт реакции для дальнейшей аналитики.
Выход продукта составляет 58% относительно сухой субстанции исходного вещества. Протеиногенные соединения (пептиды, аминокислоты) составляют около 81% сухой субстанции продукта. Гель-хроматография продукта показывает, что 100% пробы имеет молекулярный вес <20 кДа.
Пример 3
В качестве сырьевого продукта используется производимая на предприятиях, перерабатывающих побочные продукты убоя скота, мясокостная мука категории III. Создается молотая масса из 70 г мясокостной муки в 350 мл воды. Эта масса подается в периодический реактор и при помешивании доводится до температуры в 140°С. В азотной атмосфере давление увеличивается до 100 бар. Время реакции составляет 120 минут.
Проба сепарируется в центрифуге в течение 20 минут при 3000 г. Нерастворимые компоненты (осадок) отделяются, а верхний водный слой используется как продукт реакции для дальнейшей аналитики.
Выход продукта составляет 40% относительно сухой субстанции исходного вещества. Протеиногенные соединения (пептиды, аминокислоты) составляют около 84% сухой субстанции продукта расщепления. Гель-хроматография продукта показывает, что 56,2% пробы имеет молекулярный вес <20 кДа.
Пример 4
В качестве сырьевого продукта используется пшеничный хлебопекарный шрот. Создается молотая масса из 87,5 г пшеничного хлебопекарного шрота в 350 мл воды. Эта масса подается в периодический реактор. При помешивании доводится до температуры в 180°С. В азотной атмосфере давление увеличивается до 50 бар. Время реакции составляет 30 минут.
Проба сепарируется в центрифуге в течение 20 минут при 3000 г. Нерастворимые компоненты (осадок) отделяются, а верхний водный слой фильтруется 0-45-мкм-фильтром, фильтрат используется как продукт реакции для дальнейшей аналитики. Выход продукта составляет 79,5% относительно сухой субстанции исходного вещества. Протеиногенные соединения составляют около 6 % сухой субстанции продукта расщепления. Гель-хроматография продукта показывает, что 99,5% пробы имеет молекулярный вес <20 кДа.
Названные примеры сопровождаются и контролируются следующими методами:
Определение сухой субстанции для определения выхода продукта
Сухой вес охватывает растворенные и нерастворенные ингредиенты пробы, которые остаются после сушки при 103°С. Сушка выполняется до тех пор, пока не будет получен постоянный вес. Для оценки вес соотносится с использованным объемом.
Для определения сухого веса используется стандартный способ по DIN 3 8409 - Н 1 - 1. Сухой вес определяется как для 20 мл верхнего водного слоя, так и для осадка 80 мл расщепленной суспензии мясокостной муки.
Определение протеиногенных соединений
Неорганически и органически связанный азот окисляется в щелочной среде за счет растворения с персульфатом до нитрата. Ионы нитрата вступают в серо- и фосфорнокислом растворе в реакцию с 2,6-диметилфенолом, при этом получают нитрофенол. Работа ведется в соответствии с DIN EN ISO 11905-1 с помощью теста с кюветами (фирма Dr. Lange, LCK338). Из всей азотной смеси можно после отделения неорганических фракций азота рассчитать количество протеиногенных соединений (пептидов, аминокислот).
Гель-хроматография
Гель-хроматография - это способ, при котором посредством пористого гелевого материала происходит разделение молекул по их размеру. Более крупные молекулы вымываются первыми, позднее - более мелкие. На основе подходящего стандарта с определенными размерами молекул посредством сравнения можно определять размер молекул. Гель-хроматография выполнялась на фармацевтической установке с колонкой (диаметр: 1,6 см, длина: 30 см, объем колонки: 60,3 мл). Определение белков и пептидов происходит при 280 нм. В качестве стационарной фазы используется материал колонки Sephadex G-100 (диапазон разделения в 4-150 кДа). В качестве мобильной фазы используется PBS-буфер. Для определения размера частиц в качестве маркерной субстанции используется стандарт гель-хроматографии фирмы Biorad.
Определение роста микроорганизмов
Для проверки пригодности полученных гидролизатов белка для выращивания микробов определяется рост микроорганизмов с использованием пробы гидролизатов в качестве питательного субстрата. Отдельная колония из культуры микроорганизмов, находящейся на агаровой питательной среде, засевается на питательный раствор в колбе для взбалтывания и культивируется при соответствующих условиях в течение 18 часов. Для основной культуры используется 100 мл среды в 500 мл колбе для взбалтывания. На отдельные среды засеваются по 1% предварительной культуры. При соответствующей температуре и вентиляции (устройство для встряхивания) эти культуры выращиваются. Прохождение кривой роста записывается путем определения мутности в фотометре и определения количества живых микроорганизмов с почасовым ритмом и затем анализируется.
Определение количества микроорганизмов путем измерения мутности
6
Определение количества микроорганизмов путем измерения мутности в фотометре является методом косвенного определения количества микроорганизмов в суспензии микроорганизмов. При измерении пробы в фотометре видимый свет определенной длины волн (600 нм) частично поглощается, частично рассеивается, и можно определить оптическую плотность (OD) на шкале фотометра. Оптическая плотность увеличивается пропорционально количеству микроорганизмов. Для измерения необходимо минимальное количество микроорганизмов 5×10 КОЕ/мл. Так как измерение OD линейно пропорционально количеству клеток только до значения около 0,3, при более высокой OD необходимо разбавлять пробу.
Определение количества микроорганизмов с помощью лопаточки
8
При определении количества живых микроорганизмов определяются клетки, которые в состоянии образовать колонию. Результат указывается в „колониеобразующих единицах" (КОЕ). При разбавлении в соотношении 1:10 из пробы получают серию разбавлений до ожидаемого количества клеток (например, 10 клеток/мл), а последние три разбавления наносятся лопаточкой на пластины. Пластины выращиваются в течение 24 часов, высчитывается количество колоний и рассчитывается на КОЕ/мл.
Обозначения:
1) бункер,
2) разгрузочное устройство,
3) резервуар для перемешивания,
4) коллоидная мельница,
5) бустерный насос,
6) технологический насос,
7) теплообменник,
8) реактор,
9) редукционный клапан,
10) камера для снятия давления,
11) центрифуга/декантатор,
12) резервуар для осадка,
13) фильтр,
14) распылительная сушилка,
15) очиститель отработанных газов.