Молекулярно-генетическая характеристика коллекционного штамма Lactobacillus fermentum 34

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КОЛЛЕКЦИОННОГО ШТАММА LACTOBACILLUS FERMENTUM 34

Алексеева Анна Евгеньевна

Канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории метагеномики и молекулярной индикации патогенов Нижегородского НИИ Эпидемиологии и Микробиологии им. академика И.Н. Блохиной, г. Нижний Новгород

Точилина Анна Георгиевна

Канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории микробиома и средств его коррекции Нижегородского НИИ

эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной, г. Нижний Новгород

Белова Ирина Викторовна

Канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиома и средств его коррекции Нижегородского НИИ

эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной, г. Нижний Новгород

Бруснигина Нина Федоровна

Канд. мед. наук, заведующий лабораторией метагеномики и молекулярной индикации патогенов Нижегородского НИИ

Эпидемиологии и Микробиологии им. академика И.Н. Блохиной, г. Нижний Новгород

АННОТАЦИЯ

Проведено полногеномное секвенирование коллекционного штамма Lactobacillus fermentum 34, выделенного из кишечника здорового человека, на высокопроизводительном секвенаторе второго поколения MiSeq. В результате секвенирования получена нуклеотидная последовательность общей длиной 1 745 412 пар оснований. Филогенетический анализ показал, что наиболее близкородственными являются штаммы L. fermentum 90TC-4 и L. fermentum MTCC 8711. При аннотировании с помощью сервера RAST установлено наличие 1575 белок кодирующих последовательностей, 58 транспортных РНК и 21 рибосомальных РНК. Также обнаружены последовательности 114 мобильных элементов, ген капсидного белка бактериофага, CRISPR/Cas гены. В составе мобильных элементов трансмиссивных детерминант антибиотикоустойчивости не выявлено.

ABSTRACT

A whole genome sequencing of Lactobacillus fermentum strain 34 isolated from the gut of a healthy person was conducted on the next-generation sequencer MiSeq. Nucleotide sequence total length of the 1 745 412 nucleotides was obtained. Phylogenetic analysis has established that the strains L. fermentum 90TC-4 and L. fermentum MTCC 8711 are the most closely related. Using RAST annotation server the presence of 1575 protein-coding sequences, 58 tRNAs and 21 rRNA was revealed. Also the sequences of 114 transposable elements, minor capsid protein gene and CRISPR/Cas system genes. None of transmissible antibiotic resistance determinants were detected.

Ключевые слова: полногеномное секвенирование, Lactobacillus fermentum, филогенетический анализ, аннотирование генома.

Keywords: Lactobacillus fermentum, whole genome sequencing, phylogenetic analysis, genome annotation

Вид Lactobacillus fermentum является представителем гетероферментативных молочнокислых бактерий, широко используемых при производстве различных видов молочнокислых продуктов и пробиотических препаратов. Применение L. fermentum в качестве пробиотика обусловлено отсутствием патогенности для человека, высокой устойчивостью к среде желудочно-кишечного тракта, выраженной антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным бактериям и благотворным влиянием на иммунную систему человека [3, 5].

При характеристике пробиотических бактерий важным критерием является не только определение их фенотипи-ческих свойств, но также и генетической структуры с помощью различных молекулярно-генетических методов с целью оценки их безопасности в плане распространения признака антибиотикоустойчивости [2].

Наибольшей разрешающей способностью обладают современные технологии массивного параллельного секвени-

рования (next-generation sequencing - NGS), позволяющие получать информацию о полногеномных последовательностях широкого спектра бактерий и вирусов, и проводить молекулярно-генетические исследования на качественно новом уровне [1].

Объектом исследования являлся штамм L. fermentum 34 из Государственной коллекции лактобацилл Нижегородского НИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной, выделенный из кишечника здорового человека.

Материалы и методы.

Выделение и очистку ДНК исследуемого штамма проводили с использованием набора «Ампли-Сенс ДНКсорб В» (ЦНИИЭ, Москва). Концентрацию ДНК в образцах определяли с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, Австрия). Подготовку библиотеки ДНК для секвенирования осуществляли с использованием набора Nextera XT (Illumina, США) на 500 циклов согласно инструкции производителя. Секве-нирование генома проводили на платформе NGS MiSeq

(Illumina, США) в режиме ресеквенирования. В качестве референса служила полногеномная последовательность штамма L. fermentum F6 (номер GenBank NC_021235.1). Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали программу Burrows-Wheeler Aligner (BWA), для поиска однонуклеотидных полиморфизмов, инсерций и де-леций - программное обеспечение Genome Analysis Toolkit (GATK). Визуализацию и анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения UGENE [6]. Аннотацию генома проводили с использованием сервера RAST (Rapid Annotation using Subsystem Technology) [7]. Филогенетическое дерево строили с помощью программы Mega 6.0 [8] методом ближайших соседей (neighbor-joining), предварительно проведя множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей 19 геномов L. fermentum, задепонированных в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) и L. fermentum 34 с помощью сервера RALPHY 1.10 (Reference sequence Alignment based

Phylogeny builder) [4].

Результаты и обсуждение.

В результате полногеномного секвенирования было получено 4 474 960 коротких чтений длиной до 250 нуклеоти-дов. При вторичном биоинформационном анализе короткие чтения были объединены в 477 контигов с общей длиной нуклеотидной последовательности - 1 745 412 пар нукле-отидов. Средний уровень покрытия составил 40,2, процент ГЦ пар - 52,3%. Плазмидной ДНК обнаружено не было. При аннотировании с помощью сервера RAST в геноме L. fermentum 34 было выявлено 1575 белок кодирующих последовательностей, 58 последовательностей тРНК и 21 рРНК.

В таблице 1 дана сравнительная характеристика структур 15 неполных геномов штаммов L. fermentum, задепониро-ванных в базе данных Whole Genome Shotgun contigs (WGS) NCBI (по данным на январь 2016) и генома исследуемого штамма L. fermentum 34.

Таблица 1.

Сравнительная характеристика структур геномов L. fermentum 34 и задепонированных в базе данных WGS NCBI

Штамм L. fermentum Размер, Mb % ГЦ Число белок кодирующих последовательностей Кол-во тРНК Кол-во рРНК

34 1,74541 52,30 1575 58 21

ATCC 14931 1,86701 52,60 1656 56 4

28-3-CHN 2,02652 52,00 1806 53 4

FTDC8312 1,96655 51,80 1718 16 2

NB-22 2,01131 51,80 1826 31 4

LfQi6 2,1998 51,50 1847 56 8

DSM 20055 1,90005 52,40 1713 47 3

Lf1 1,81565 52,50 1633 57 15

MTCC8711 2,5663 46,65 1911 57 15

39 1,82966 51,60 1658 51 13

90 TC-4 1,82248 51,90 1571 54 11

L930BB 1,97184 52,10 1767 56 7

779_LFER 1,93581 52,10 1729 49 15

HFB3 2,04336 51,80 1382 58 20

UCO-979C 2,01183 51,90 1492 57 13

222 1,95041 52,10 1864 54 4

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности исследуемого штамма с последовательностями полных и неполных геномов L. fermentum, представленных в базе данных NCBI показал, что штамм L. fermentum 34 является близкородственным штаммам L. fermentum 90ТС-4 (номер GenBank GCA_001010245.1) и ^ fermentum МТСС

8711 (номер GenBank GCA_000477515.1) (рис. 1). Известно, что L. fermentum 90ТС-4 был выделен в России, однако сведения об источнике потеряны, штамм L. fermentum МТСС 8711 был выделен индийскими исследователями из йогурта и используется в качестве пробиотика [5].

100

100

100 100

100

100

100

- Lactobacillus_fermentum_3872

- Lactobacillus_fermentum_FIDC8312

- Lactobacillus_termentum_Lt1

- Lactobacillus fermentum CECT 5716

100

99

- Lactobacillus_fermentum_HFB3

- Lactobacillus_fermentum_L930BB -Lactobacillus fermentum F-6

95 100

- Lactobacillus_fermentum_IFO_3956

— Lactobacillus_fermentum_LfQi6 -Lactobacillus fermentum 28-3-CHN

100

Lactobacillus_fermentum_UCO-979C  Lactobacillus fermentum 39

100

100 L Lactobacillus_fermentum_NB-22

-Lactobacillus fermentum MTCC 8711

I Lactobacillus fermentum 34

100 1 Lactobacillus_fermentum_90TC-4 - Lactobacillus fermentum 222

100

- Lactobacillus_fermentum_779_LFER

-Lactobacillus fermentum strain DSM 20055

h

4

0.002

Рисунок 1. Филогенетическое дерево штаммов L. fermentum, построенное на основании анализа нуклеотидных последовательностей геномов методом ближайших соседей. Цифрами указана статистическая значимость порядка ветвления (в %), определенная с помощью бутстрап-анализа 1000 альтернативных деревьев.

При аннотировании генома L. fermentum 34 с помощью сервера RAST среди 1575 белок кодирующих последовательностей - 251 являются гипотетическими, функция которых неизвестна. Также было выявлено 114 последовательностей мобильных элементов, кодирующих несколько типов транс-позаз и не несущих гены устойчивости к антибиотикам. В связи с этим можно сказать, что проявление устойчивости к антибиотикам штамма L. fermentum 34 носит исключительно природный характер или обусловлено мутацией хромосомных генов, вероятность передачи которых другим микроорганизмам низка [2]. В структуре генома имеется 7 генов CRISPR/Cas системы (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated genes) расположенные в следующей последовательности: Cas3^ Cse1 ^ Cse4 ^ Cas5e ^ Cse3 ^ Cas1 ^ Cas2, а также ген, кодирующий малый капсидный белок бактериофага.

Заключение.

Таким образом, в результате секвенирования на высокопроизводительном секвенаторе MiSeq была получена почти полная нуклеотидная последовательность генома штамма L. fermentum 34. Выявлены и проанализированы последовательности мобильных элементов, фаговых белков, гены CRISPR/Cas системы. Установлено отсутствие в составе генома трансмиссивных детерминант антибиотикоустой-чивости. По данным филогенетического анализа штаммы L. fermentum 90ТС-4 и L. fermentum MTCC_8711 являются наиболее близкородственными исследуемому штамму и ис-

пользуются в качестве пробиотиков.

Список литературы:

1. Алексеева А.Е. Бруснигина Н.Ф. Полногеномное секвенирование в системе эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями// ВИНИТИ РАН. 2015. № 130-В2015. 14с.

2. Ботина С.Г. и др. Характеристика устойчивости к антибиотикам потенциальных пробиотических бактерий рода Lactobacillus из гастроинтестинальной микробиомы человека// Микробиология. 2011. Т. 80. № 2. С. 175-183.

3. Соловьева И.В. и др. Коррекция микробиоты как неотъемлемая часть педиатрической практики/Медицинский альманах. 2010. №2. С. 277-280.

4. Bertels F. et al. Automated reconstruction of whole genome phytogenies from short sequence reads// Mol. Biol. Evol. 2014. vol. 31. № 5. Р. 1077-1088.

5. Jayashree S. et al. Genome sequence of Lactobacillus fermentum strain MTCC 8711, a probiotic bacterium isolated from yogurt// Genome Announc. 2013. vol. 1. Issue 5. 2 р. URL: http://genomea.asm.org/content/1/5/e00770-13 (дата обращения 26 ноября 2014).

6. Okonechnikov K. et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit//Bioinformatics. 2012. №28. P. 11661167.

7. Overbeek R. et al. The SEED and the Rapid Annotation of microbial genomes using Subsystems Technology (RAST)//

Nucleic Acids Res. 2014. №42.

8. Tamura K. et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0// Mol. Biol. Evol. 2013. vol .30. № 12. P. 2725-2729.

ОЦЕНКА СОЛЕУСТОИЧИВОСТИ СОРТОВ ВИНОГРАДА ПО МОРФОГЕНЕЗУ СТЕБЛЕВЫХ ЧЕРЕНКОВ В УСЛОВИЯХ

ЗАСОЛЕНИЯ

Алиева Земфира Магомедовна

Магистрант 2 года обучения, Биологический факультет ФБГОУ «Дагестанский государственный университет», г. Махачкала

ASSESSMENT SALT TOLERANCE OF VARIETIES OF GRAPES ON MORPHOGENESIS STEM CUTTINGS IN SALINE CONDITIONS

АННОТАЦИЯ

В статье представлены результаты лабораторных исследований влияния засоления среды на морфогенез черенков винограда разных сортов

ABSTRACT

The article presents the results of laboratory studies of the effect of salinity on the environment morphogenesis cuttings of different varieties of grapes

Ключевые слова: солеустойчивость, засоление, виноград, черенки

Keywords: salt tolerance, salinity, grape, cuttings

Введение

Природные экологические системы суши в настоящее время почти везде изменены хозяйственной деятельностью человека. Неразумная хозяйственная деятельность человека приводит к нарушениям целостности, как отдельных биоценозов, так и биосферы в целом. Средняя распаханность суши составляет около 10 - 11 %, постоянные пастбищные угодья - более 20 %. В ряде регионов распаханность суши достигает 30 - 50 и даже 70 - 80 %. Экологическая обстановка на планете характеризуется резко выраженными колебаниями температур и осадков, общей тенденцией аридизации, некоторого похолодания и переувлажнения севера. Участились засухи, и обозначилось опустынивание больших территорий. Антропогенные экосистемы разного типа вытеснили и заместили природные экосистемы. Почвы на многих территориях разрушаются опустыниванием, эрозией, засолением, высокой кислотностью [2]. В настоящее время в мире около 25 % суши засолено в той или иной степени. Ежегодные потери высокоценных поливных земель составляют до 10 млн. га [5]. На сельскохозяйственных угодьях Российской Федерации засоленные, солонцеватые земли, а также земли с солонцовыми комплексами занимают 20,1 %, из них пашни 6,8 %. Наибольшие площади засоленных земель находятся в Южном, Сибирском, Приволжском и Уральском федеральных округах, в том числе и в Дагестане [1, 3].

В связи с этим возникает необходимость поиска сельскохозяйственных культур, устойчивых к засолению. Одной из ценных многолетних теплолюбивых культур является

виноград. Для его выращивания в республике имеются все условия.

Материал и методы исследования

Целью наших исследований было изучение влияния уровня и типа засоления среды на морфогенез стеблевых неодревесневших черенков винограда сортов Агадаи и Ху-сайне, отличающихся по своей солеустойчивости. С кустов винограда срезали неодревесневшие побеги, которые в свою очередь нарезали на черенки с двумя или тремя глазками. Эти черенки постоянно культивировали в растворах хлорида и сульфата натрия в концентрации 10-1, 10-2 и 10-3 М. Контрольные черенки культивировались в водопроводной воде. В вариантах по 30 черенков. Растворы менялись каждые двое суток. О влиянии засоления судили по темпам распускания побегов из пазушных почек и корнеобразова-ния, выживаемости черенков. Опыты проводили в летнее время в лаборатории при температуре 28 - 30°С в условиях естественного освещения и влажности.

Результаты и обсуждение

Пробуждение почек у Агадаи было отмечено уже на 4 день опыта в вариантах №С1 10-2М (7 %) и контроле (14 %). К 7 дню начало побегообразования было отмечено во всех вариантах культивирования у Агадаи и в 10-3М у Ху-

сайне, причем в №С1 % пробуждения почек в 10-2М в 2 раза выше, чем в 10-3М. Распускание почек у Хусайне началось позже, чем у Агадаи, лишь к 10 дню в №С1, в контроле - на 9 день. В 10-2М у Хусайне пробуждение почек отме-

чено на 12 день.