МУКОАДГЕЗИВНЫЙ МИКРООРГАНИЗМ
MUCOADHESIVE MICROORGANISM

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по дате подачи предварительной заявки на патент США №62/394,024, поданной 13 сентября 2016 г.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[002] Настоящая заявка включает перечень последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и включенный в настоящий документ полностью посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 11 сентября 2017 г., имеет название 205350-0031-00-WO_SL.txt и размер 122 643 байтов.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[003] Генетически модифицированные микроорганизмы (например, бактерии) применялись для доставки терапевтических молекул в ткани слизистой оболочки. См., например, Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789; Robert S. and Steidler L., Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11; Braat et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2006, 4(6):754-759; и Steidler et al., Science 2000, 289(5483):1352-1355.
[004] В данной области техники существует потребность в микробных (например, бактериальных) штаммах с усовершенствованными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами, и потребность в эффективных нацеленных и контролируемых способах лечения различных заболеваний, поддающихся лечению с применением таких генетически модифицированных бактерий. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение указанных потребностей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[005] Согласно настоящему изобретению предложены микроорганизмы (например, бактерии или дрожжи) с усиленными клеточно-адгезивными и/или муцин-связывающими свойствами. Например, согласно настоящему изобретению предложены бактерии, проявляющие повышенное связывание с клетками Сасо-2 in vitro и повышенное связывание с муцинами in vitro. Такие микроорганизмы (например, бактерии) могут применяться, например, для доставки биоактивных полипептидов в желудочно-кишечный тракт субъекта-млекопитающего, а описанные генетические модификации позволяют обеспечить модуляцию удержания в ЖКТ и времени транзита указанного микроорганизма (например, бактерии). Описанная технология позволяет обеспечить модуляцию фармакокинетических и фармакодинамических свойств биоактивных полипептидов, экспрессируемых указанным микроорганизмом (например, бактерией). Например, экспрессия, секреция и заякоривание гибридного белка, содержащего фактор «трилистника» (TFF) и клеточно-адгезивный полипептид, такой как CmbA (см., например, Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681) (например, TFF3-CmbA), в клеточной стенке молочнокислой бактерии (МКБ), такой как Lactococcus lactis, делает возможной адгезию указанной бактерии к эпителиальным клеткам кишечника и дополнительно позволяет обеспечить связывание указанной бактерии с муцинами.
Композиции
[006] Согласно некоторым аспектам настоящего изобретения предложены микроорганизмы (например, бактерии или дрожжи), содержащие экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, содержащий клеточно-адгезивный полипептид. В некоторых примерах согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм (например, бактерия или дрожжи), содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, при этом указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, содержит последовательность, кодирующую клеточно-адгезивный полипептид. В некоторых примерах указанный клеточно-адгезивный полипептид выбран из группы, состоящей из связывающего клетки и слизь белка A (CmbA) (см., например, Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681), связывающего слизь белка или белков с доменом mub (Mub) (см., например, Boekhorst et al., Microbiology 2006, 152(1):273-280), белка, способствующего адгезии к слизи (МарА) (см., например, Miyoshi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70(7): 1622-8), лактококкового муцин-связывающего белка (MbpL) (см., например,  et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000). Может быть добавлен пептид для заякоривания в клеточной стенке, такой как заякоривающий фрагмент (SpaX) белка А Staphylococcus aureus (см., например, Steidler et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(l):342-5). В некоторых примерах согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм (например, бактерия или дрожжи), содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, при этом указанный гибридный белок включает полипептид CmbA. В некоторых примерах указанный полипептид CmbA представляет собой CmbA из Lactobacillus reuteri. См., например, АТСС РТА6474, например, описание у Jensen с соавторами, выше. В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой полипептид CmbA, имеющий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1. В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой полипептид CmbA, кодируемый экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 2.
[007] В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный гибридный белок содержит муцин-связывающий полипептид, такой как полипептид фактора «трилистника» (TFF) (например, TFF1, TFF2 или TFF3) или полипептид MucBP (см., например, Lukic et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000). Соответственно, в некоторых примерах согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм (например, бактерия или дрожжи), содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, при этом указанный гибридный белок содержит клеточно-адгезивный полипептид (например, полипептид CmbA) и муцин-связывающий полипептид (например, полипептид TFF). В некоторых примерах указанный полипептид TFF представляет собой полипептид TFF человека (например, hTFF1, hTFF2 или hTFF3). В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный муцин-связывающий полипептид представляет собой полипептид TFF3 человека, имеющий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный муцин-связывающий полипептид представляет собой полипептид TFF3 человека, кодируемый экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых примерах указанный полипептид TFF представляет собой полипептид TFF млекопитающего, такой как TFF коровы, свиньи, овцы, собаки, кошки или лошади. В дополнительных примерах указанный TFF представляет собой TFF амфибий. Примеры полипептидов TFF описаны, например, в источнике: Conlon et al., Peptides 2015, 72:44-49 и упоминаемых в нем источниках, каждый из которых включен в настоящий документ полностью посредством ссылки. В других примерах указанный полипептид TFF представляет собой подобный фактору трилистника домен. Примеры полипептидов, соответствующих указанному варианту реализации, описаны в источнике: Fujita et al., Mol. Reprod. Dev. 2006, 75(7): 1217-1228, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
[008] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации настоящего изобретения, предложена бактерия (например, молочнокислая бактерия, такая как Lactococcus lactis), содержащая экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, содержащий (1) муцин-связывающий полипептид, выбранный из полипептида TFF (например, TFF1 человека, TFF2 человека или TFF3 человека), и полипептид MucBP; и (2) клеточно-адгезивный полипептид, выбранный из полипептида CmbA, полипептида Mub, полипептида МарА, полипептида MbpL и полипептида SpaX. В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанный гибридный белок содержит полипептид CmbA (например, CmbA Lactobacillus reuteri) и полипептид TFF (например, TFF1 человека, TFF2 человека или TFF3 человека).
[009] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, интегрирована в хромосому указанного микроорганизма, например, в хромосому бактерии. В некоторых примерах указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, конститутивно экспрессируется в указанном микроорганизме (например, бактерии). В других примерах указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, локализована в плазмиде.
[0010] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, микроорганизм (например, бактерия) экспрессирует указанный гибридный белок. В других примерах указанный гибридный белок заякорен в клеточной стенке указанного микроорганизма (например, бактерии). Например, указанный гибридный белок экспонирован на поверхности (т.е. внешней мембране) указанного микроорганизма (например, бактерии).
[0011] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, дополнительно включает лидерную последовательность секреции, кодирующую сигнальный пептид секреции. В некоторых примерах указанная лидерная последовательность секреции содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую лидер секреции неидентифицированного секретируемого белка 45 кДа (Usp45). Такая лидерная последовательность или лидерный пептид секреции в настоящем документе названа SSusp45. В некоторых примерах SSusp45 имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 5. В других примерах SSusp45 кодирует последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичная последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7. Любая лидерная последовательность секреции, происходящая из грамположительной бактерии, например, любая лидерная последовательность секреции, происходящая из Lactococcus lactis, подходит для применения в контексте вышеописанных вариантов реализации. В дополнительных примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный сигнальный пептид секреции (например, SSusp45) связан с муцин-связывающим полипептидом, таким как полипептид TFF. В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, SSusp45 связан с полипептидом TFF человека. Например, указанный гибридный белок может включать последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 8. В других примерах указанный гибридный белок может кодировать экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичная последовательности SEQ ID NO: 9.
[0012] В других примерах указанный микроорганизм (например, бактерия) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, содержащий полипептид TFF и полипептид CmbA, при этом сигнальный пептид секреции связан с указанным полипептидом TFF (например, SSusp45). Например, указанный гибридный белок может включать последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 10 (или состоять из указанной последовательности аминокислот). В других примерах указанный гибридный белок может кодировать экзогенная последовательность нуклеиновой кислоты, содержащая последовательность, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 11 (или состоящая из указанной последовательности).
[0013] В некоторых примерах указанный сигнальный пептид секреции включает линкерный пептид. В некоторых примерах указанный сигнальный пептид секреции отщепляется от гибридного белка, например, при заякоривании указанного гибридного белка в клеточной стенке указанного микроорганизма (например, бактерии).
[0014] В некоторых примерах указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок, транскрипционно регулирует промотор (например, ее помещают под контроль промотора), который является эндогенным для указанного микроорганизма (например, бактерии). В других примерах экспрессию указанного гибридного белка контролирует экзогенный промотор. В некоторых примерах указанный промотор выбирают из промотора thyA (PthyA), промотора hlla (PhllA) и промотора gapB. В некоторых примерах указанную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, транскрипционно регулирует промотор PthyA. В других примерах указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок транскрипционно регулирует промотор PhllA. Другие промоторы включают промоторы, предшествующие генам holA, soda, enoA, tufa, fbaA, acpA, ps431, malG, ptsH, dpsA, pgk, ahpC, pdhD, pts_II, pfk, trePP, ptnD, pgiA, usp45. Другие подходящие промоторы описаны, например, в опубликованной заявке на патент США 2014/0105863, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
[0015] Согласно настоящему изобретению также предложен микроорганизм (например, бактерия), содержащий гибридный белок (например, заякоренный в клеточной стенке указанного микроорганизма, например, бактерии), отличающийся тем, что указанный гибридный белок содержит полипептид TFF и полипептид CmbA. В некоторых примерах указанный микроорганизм (например, бактерия) включает экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую лидерную последовательность секреции, последовательность, кодирующую полипептид TFF, и последовательность, кодирующую полипептид CmbA. В некоторых примерах указанная лидерная последовательность секреции кодирует сигнальный пептид секреции, который отщепляется от гибридного белка, например, при прохождении указанного гибридного белка через цитоплазматическую мембрану (например, заякоривании в клеточной стенке) указанного микроорганизма (например, бактерии).
[0016] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный микроорганизм представляет собой бактерию. В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, такая бактерия представляет собой грамположительную бактерию, например, непатогенную грамположительную бактерию. В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный бактерия представляет собой молочнокислую бактерию (МКБ). В настоящем документе приведены примеры молочнокислых бактерий, каждая из которых может применяться в контексте описанных вариантов реализации. Согласно некоторым вариантам реализации указанная МКБ выбрана из группы, состоящей из бактерии вида (sp.) Lactococcus, бактерии Lactobacillus sp., бактерии Bifidobacterium sp., бактерии Streptococcus sp. и бактерии Enterococcus sp. В некоторых примерах указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis. В других примерах указанную МКБ выбирают из Lactococcus lactis подвида cremoris, Lactococcus lactis подвида hordniae и Lactococcus lactis подвида lactis. В некоторых примерах указанная Lactococcus lactis представляет собой Lactococcus lactis подвида cremoris, например, штамм Lactococcus lactis MG1363.
[0017] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, содержащий полипептид TFF и клеточно-адгезивный полипептид (например, CmbA). В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанный полипептид TFF выбирают из TFF1, TFF2 и TFF3. В других примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанный полипептид TFF выбирают из TFF человека, TFF мыши, TFF свиньи, TFF собаки, TFF кошки, TFF коровы и TFF овцы. В некоторых примерах указанный полипептид TFF представляет собой TFF человека. В других примерах указанный полипептид TFF выбирают из TFF1 человека, TFF2 человека и TFF3 человека. В еще одном примере указанный полипептид TFF представляет собой TFF3 человека. Согласно определенному примеру указанный полипептид TFF имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В других примерах указанный полипептид TFF представляет собой вариант полипептида TFF, например, вариант полипептида TFF с усиленной муцин-связывающей способностью по сравнению с соответствующим полипептидом TFF дикого типа. В других примерах указанный полипептид TFF представляет собой полипептид TFF амфибий или рыб.
[0018] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) дополнительно содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один терапевтический полипептид. В некоторых примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой цитокин, такой как интерлейкин (ИЛ). Выбор цитокина осуществляют с учетом того, какие ответы хозяина требуется активировать или подавить. В некоторых примерах указанный цитокин представляет собой ИЛ-2, ИЛ-10 или ИЛ-22. В других примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой антиген. В других примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой антиген и интерлейкин, такой как ИЛ-2, ИЛ-10 или ИЛ-22. В некоторых примерах, соответствующих любым из указанных вариантов реализации, указанный антиген представляет собой аутоантиген, например, T1D-специфический антиген. Примеры T1D-специфических антигенов включают проинсулин (PINS), декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD65), ассоциированный с инсулиномой белок 2 (IA-2), специфический островковый связанный с каталитической субъединицей глюкоза-6-фосфатазы белок (IGRP), цинковый транспортер 8 (ZnT8), хромогранин А, островковый амилоидный (препро)полипептид (ppIAPP), периферии, цитруллинированный регулируемый глюкозой белок (GRP) и комбинации перечисленного. Примеры последовательностей аминокислот и последовательностей нуклеиновых кислот вышеописанных T1D-специфических антигенов раскрыты, например, в опубликованной международной заявке на патент WO2017/122180, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. В других примерах указанный антиген представляет собой аллерген, такой как аллерген пыльцы деревьев, аллерген пыльцы сорных трав, аллерген пыльцы травянистых растений, пищевой аллерген, аллерген клеща домашней пыли, аллерген плесневых грибов, аллерген частиц эпителия животных или комбинацию перечисленного. В некоторых примерах указанный аллерген представляет собой аллерген пыльцы сорных трав, например, аллерген пыльцы амброзии. В других примерах указанный аллерген представляет собой аллерген пыльцы деревьев, такой как аллерген пыльцы березы или аллерген пыльцы японского кедра. В других дополнительных примерах указанный аллерген представляет собой пищевой аллерген, такие как аллерген арахиса, аллерген молока, аллерген яйца, аллерген глютена (эпитоп глиадина) или комбинацию перечисленного.
[0019] В дополнительных примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой антитело или его фрагмент. Например, указанное антитело представляет собой однодоменное антитело (например, антитело верблюдовых или акул) или нанотело. Примеры антител включают нейтрализующие цитокины антитела, такие как антитела к ИЛ-4, антитела к ИЛ-5, антитела к ИЛ-7, антитела к ИЛ-13, антитела к ИЛ-15, а также антитела против ФНО-α, антитела к иммуноглобулину Е (IgE) и любые их фрагменты. В некоторых примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой гибридный белок. Например, указанный терапевтический полипептид содержит растворимый рецептор, такой как ФНО-рецептор (например, растворимый ФНО-рецептор 2) и антитело, или фрагмент антитела, например, Fc-область антитела. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанный терапевтический полипептид содержит Fc-область иммуноглобулина человека (например, Fc IgG1 человека). В некоторых примерах указанный терапевтический полипептид содержит растворимый ФНО-рецептор 2, гибридный с Fc IgG1 человека). В некоторых примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой этанерцепт.
[0020] В других дополнительных примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой фермент или его фрагмент (например, функциональный фрагмент), например, фенилаланинаммиаклиазу (ФАЛ), декарбоксилазу аминокислот или их комбинацию. В одном примере указанный терапевтический полипептид представляет собой ФАЛ или его функциональный фрагмент.
[0021] В дополнительных примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой глюкагоноподобный пептид-1 (ГПП-1), глюкагоноподобный пептид 2 (ГПП-2), глюкагон, эксендин-4 или любую комбинацию перечисленного. В других примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой фактор роста, такой как эпидермальный фактор роста (ЭФР), например, ЭФР человека или свиной ЭФР. В других дополнительных примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой TFF, такой как TFF1, TFF2, TFF3, или комбинацию перечисленного.
[0022] Указанный терапевтический полипептид может представлять собой комбинацию любых вышеупомянутых терапевтических полипептидов.
[0023] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один терапевтический полипептид, транскрипционно регулирует промотор, выбранный из промотора gapB (PgapB), промотора thyA (PthyA) и промотора hlla (PhllA). В некоторых примерах указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один терапевтический полипептид, транскрипционно регулирует промотор gapB (например, указанная нуклеиновая кислота находится под контролем указанного промотора). Другие промоторы включают промоторы, предшествующие генам holA, soda, enoA, tufa, fbaA, acpA, ps431, malG, ptsH, dpsA, pgk, ahpC, pdhD, pts_II, pfk, trePP, ptnD, pgiA, usp45. Другие подходящие промоторы описаны, например, в опубликованной заявке на патент США 2014/0105863, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
[0024] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, МКБ) дополнительно содержит комбинацию мутаций и инсерций, способствующую накоплению трегалозы, что усиливает вероятность выживаемости МКБ при воздействии солей желчных кислот и высушивании. Например, указанные мутации могут представлять собой
(i) хромосомно-интегрированные транспортеры трегалозы, например, PhllA >> транспортер 1 >> межгенная область >> транспортер 2, например, llmg_0453 и/или llmg_0454, для поглощения трегалозы;
(ii) хромосомно-интегрированный ген трегалоза-6-фосфатфосфатазы (otsB; идентификатор гена: 1036914), расположенный в 3'-направлении от usp45 (идентификатор гена: 4797218), для облегчения конверсии трегалоза-6-фосфата в трегалозу;
(iii) инактивированный (например, путем делеции гена) ген трегалоза-6-фосфатфосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140); и
(iv) инактивированный компонент IIС целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (идентификатор гена: 4796893), ptcC, (например, tga в положении кодона 30 из 446; tga30).
[0025] Например, экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая трегалоза-6-фосфатфосфатазу, например, otsB, такую как otsB Escherichia coli. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанную трегалоза-6-фосфатфосфатазу, является хромосомно-интегрированной. В некоторых примерах указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанную трегалоза-6-фосфатфосфатазу, интегрирована в хромосому в направлении 3' от гена неидентифицированного секретируемого белка 45 кДа (usp45). В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанная МКБ содержит вторую полицистронную экспрессионную кассету, содержащую промотор usp45, ген usp45 (например, в направлении 3' от промотора) и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую трегалоза-6-фосфатфосфатазу (например, в направлении 3' от гена usp45). В некоторых примерах указанная вторая полицистронная экспрессионная кассета дополнительно содержит межгенную область между геном usp45 и экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей трегалоза-6-фосфатфосфатазу. В некоторых примерах указанная вторая полицистронная экспрессионная кассета представлена следующим образом: Pusp45 >> usp45 >> межгенная область >> otsB. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанная межгенная область представляет собой rpmD согласно описанию в настоящем документе выше (например, с последовательностью SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9). Указанная вторая полицистронная экспрессионная кассета может, таким образом, быть представлена следующим образом: Pusp45 >> usp45 >> rpmD >> otsB.
[0026] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, ген трегалоза-6-фосфатфосфорилазы (trePP) в указанном микроорганизме (например, МКБ) был разрушен или инактивирован. Например, указанный trePP был инактивирован путем удаления гена trePP или его фрагмента, или указанный trePP был разрушен путем инсерции стоп-кодона. Соответственно, в некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, у указанного микроорганизма (например, МКБ) отсутствует активность trePP.
[0027] В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, в указанном микроорганизме (например, МКБ) был разрушен или инактивирован ген компонента IIС целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (ptcC). Например, указанный ptcC был разрушен путем инсерции стоп-кодона или был инактивирован путем удаления указанного ptcC или его фрагмента. Соответственно, в некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, у указанного микроорганизма (например, МКБ) отсутствует активность ptcC.
[0028] В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанная МКБ дополнительно содержит один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы. В некоторых примерах указанный один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, являются эндогенными для указанной МКБ. В некоторых примерах указанная МКБ сверхэкспрессирует указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, расположены в направлении 3' от экзогенного промотора, например, промотора hllA (PhllA). Например, указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, транскрипционно регулирует PhllA. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, выбирают из llmg_0453, llmg_0454 и любой их комбинации. В некоторых примерах llmg_0453 и llmg_0454 транскрипционно регулирует PhllA.
[0029] В некоторых примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, включают два гена, кодирующих два или более транспортеров трегалозы, где межгенная область локализована между двумя генами. В некоторых примерах указанная межгенная область представляет собой rpmD, например, с последовательностью SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9. В некоторых примерах указанный микроорганизм (например, МКБ) содержит полицистронную экспрессионную кассету, содержащую две последовательности нуклеиновых кислот (например, гены), кодирующие два разных транспортера трегалозы (последовательности транспортера 1 и транспортера 2), и межгенную область между указанными двумя нуклеиновыми кислотами, кодирующими указанные два разных транспортера трегалозы. Такая экспрессионная кассета может быть представлена следующим образом: PhllA >> транспортер 1 >> межгенная область >> транспортер 2. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанная межгенная область представляет собой rpmD согласно описанию в настоящем документе выше (например, с последовательностью SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9). Указанная полицистронная экспрессионная кассета может, таким образом, быть представлена следующим образом: PhllA >> транспортер 1 >> rpmD >> транспортер 2.
[0030] Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации указанная МКБ содержит, в единственном штамме, несколько полезных признаков. Согласно одному варианту реализации указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis, содержащую:
(A) хромосомно-интегрированный промотор >> сигнал секреции >> гибридный белок адгезии к муцинам и клеткам;
(B) что-либо одно или более из хромосомно-интегрированного промотора >> сигнала секреции >> терапевтического белка;
(C) комбинацию мутаций и инсерций, способствующих накоплению трегалозы, что усиливает вероятность выживаемости МКБ при воздействии солей желчных кислот и высушивании. Указанные мутации выбирают из
(i) хромосомно-интегрированных транспортеров трегалозы, например, PhllA >> транспортер 1 >> межгенная область >> транспортер 2, например, llmg_0453 и/или llmg_0454, для поглощения трегалозы;
(ii) хромосомно-интегрированного гена трегалоза-6-фосфатфосфатазы (otsB; идентификатор гена: 1036914), расположенного в 3'-направлении от usp45 (идентификатор гена: 4797218), для облегчения конверсии трегалоза-6-фосфата в трегалозу;
(iii) инактивированного (например, путем делеции гена) гена трегалоза-6-фосфатфосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140); и
(iv) инактивированного компонента IIС целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (идентификатор гена: 4796893), ptcC, (например tga в положении кодона 30 из 446; tga30).
Указанная МКБ может также содержать ауксотрофную мутацию для биологического ограничения, такую как мутация thyA. Одна или более из указанных функций (т.е. адгезии к муцинам и клеткам, терапевтического белка, накопления трегалозы) может быть заключены в полицистронном опероне, причем каждый ген может быть отделен межгенной областью.
[0031] Согласно одному варианту реализации указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis, содержащую
(A) мутацию thyA, для биологического ограничения
(B) хромосомно-интегрированный PthyA >> SSusp45-hTFF3-cmbA для экспорта и связывания с клеточной стенкой связывающего слизь и клетки гибридного белка.
(C) хромосомно-интегрированный PgapB >> gapB >> межгенную область (например, rpmD) >> SSusp45 >> pal, для секреции зрелого ФАЛ из МКБ;
(D) хромосомно-интегрированные транспортеры трегалозы, например, PhllA >> транспортер 1 >> межгенная область >> транспортер 2, например, llmg_0453 и/или llmg_0454, для поглощения трегалозы;
(E) инактивированный (например путем делеции гена) ген трегалоза-6-фосфатфосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140);
(F) хромосомно-интегрированный ген трегалоза-6-фосфатфосфатазы (otsB; идентификатор гена: 1036914) (расположенный в 3'-направлении от usp45 (идентификатор гена: 4797218) для облегчения конверсии трегалоза-6-фосфата в трегалозу; и
(G) инактивированный компонент IIС целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (идентификатор гена: 4796893), ptcC, (например tga в положении кодона 30 из 446; tga30).
[0032] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) отличается повышенным временем транзита через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) по сравнению с соответствующим микроорганизмом (например, бактерией), не содержащим описанную генетическую модификацию, т.е. не содержащим указанной экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный гибридный белок, или не содержащим указанный гибридный белок. В некоторых примерах время транзита через ЖКТ увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 80%, или по меньшей мере приблизительно на 100% (до приблизительно 2×). В других примерах время транзита через ЖКТ увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%-500%, по меньшей мере приблизительно на 20%-400%, по меньшей мере приблизительно на 20%-300%, по меньшей мере приблизительно на 20%-300%, или по меньшей мере приблизительно на 30%-300%.
[0033] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) проявляет увеличенную муцин-связывающую способность in vitro по сравнению с соответствующим микроорганизмом (например, бактерией), генетически не модифицированной согласно описанию в настоящем документе, т.е. не содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, или не содержащей гибридного белка. В некоторых примерах указанная муцин-связывающая способность in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90% или по меньшей мере приблизительно на 100% (до приблизительно 2×). В других примерах указанная муцин-связывающая способность увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%-500%, по меньшей мере приблизительно на 10%-400%, по меньшей мере приблизительно на 10%-300%, по меньшей мере приблизительно на 10%-200%, по меньшей мере приблизительно на 20%-200%, по меньшей мере приблизительно на 20%-300%, или по меньшей мере приблизительно на 20%-500%.
405
595
[0034] Муцин-связывающая способность может быть измерена в соответствии с любым принятым в данной области техники способом, например, со способами, описанными в настоящем документе. В некоторых примерах муцин-связывающую способность in vitro измеряют путем приведения указанного микроорганизма (например, бактерии) в контакт и связывания с иммобилизованными муцинами (например, муцинами из свиного желудка), и измерения числа микробных клеток (например, бактериальных клеток), связавшихся с муцином, например, по детекции поглощения света при подходящей длине волны, например, при 405 нм (OD); или путем окрашивания связавшихся микробных клеток (например, связавшихся бактериальных клеток) красителем (например, кристаллическим фиолетовым) с последующей детекцией поглощения света при длине волны, подходящей для использованного красителя. Например, при использовании кристаллического фиолетового для окрашивания бактериальных клеток, связанных с муцином, поглощение света может быть измерено при 595 нм (OD).
[0035] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) проявляет увеличенную способность к связыванию клеток Сасо-2 in vitro по сравнению с соответствующим микроорганизмом (например, бактерией) без описанной генетической модификации, т.е. не содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок, или не содержащей указанный гибридный белок. В некоторых примерах указанная способность к связыванию Сасо-2 in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 100% (до приблизительно 2×), по меньшей мере приблизительно на 200%, по меньшей мере приблизительно на 300%, или по меньшей мере приблизительно на 400% (приблизительно 5×). В других примерах указанная способность к связыванию Сасо-2 in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%-200%, по меньшей мере приблизительно на 10%-300%, по меньшей мере приблизительно на 10%-400%, или по меньшей мере приблизительно на 10%-500%. Способность к связыванию клеток Сасо-2 может быть измерена в соответствии с любым принятым в данной области техники способом, например, со способами согласно описанию в настоящем документе. Например, способность к связыванию Сасо-2 измеряют путем: (i) приведения в контакт указанного микроорганизма (например, бактерии), например, культуры указанного микроорганизма (например, бактерии) с клетками Сасо-2; (ii) промывания клеток Сасо-2 для удаления несвязанных микробных (например, бактериальные клетки); (iii) отсоединения микробных клеток (например, бактериальных клеток), связанных с клетками Сасо-2; и (iv) определения числа отсоединившихся бактериальных клеток (т.е. определения титра отсоединившихся клеток), например, согласно описанию в настоящем документе.
[0036] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) проявляет повышенную адгезию к слизистой оболочке кишечника по сравнению с соответствующим микроорганизмом (например, бактерией) без описанной генетической модификации, т.е. не содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок, или не содержащей указанный гибридный белок. В некоторых примерах адгезия указанного микроорганизма (например, бактерии) к слизистой оболочке кишечника увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%-100% (до приблизительно 2×), по меньшей мере приблизительно на 10%-200%, по меньшей мере приблизительно на 10%-400%, или по меньшей мере приблизительно на 10%-500%.
[0037] Согласно настоящему изобретению также предложена композиция, содержащая микроорганизм (например, бактерию) согласно настоящему описанию, например, микроорганизм (например, бактерию) согласно описанию любых из вышеперечисленных вариантов реализации. Например, согласно настоящему изобретению предложена композиция, содержащая микроорганизм (например, бактерию), содержащий гибридный белок (например, заякоренный в клеточной стенке указанного микроорганизма, например, бактерии), при этом указанный гибридный белок содержит полипептид TFF и полипептид CmbA. В некоторых примерах указанный микроорганизм (например, бактерия) включает экзогенную нуклеиновую кислоту, содержащую лидерную последовательность секреции (например, SSusp45), последовательность, кодирующую полипептид TFF, и последовательность, кодирующую полипептид CmbA. В некоторых примерах указанная лидерная последовательность секреции кодирует сигнальный пептид секреции, который отщепляется от гибридного белка, например, при прохождении указанного гибридного белка через цитоплазматическую мембрану бактерии.
[0038] Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая микроорганизм (например, бактерию) согласно настоящему описанию и фармацевтически приемлемый носитель. Например, указанная фармацевтическая композиция содержит микроорганизм (например, бактерию) согласно описанию любых из вышеперечисленных вариантов реализации.
[0039] Согласно настоящему изобретению также предложен микроорганизм (например, бактерия) согласно настоящему описанию или композиция (например, фармацевтическая композиция) согласно настоящему описанию для применения в лечении заболевания. Согласно настоящему изобретению также предложен микроорганизм (например, бактерия) или композиция (например, фармацевтическая композиция) для применения при получении лекарственного средства для предотвращения или лечения заболевания. В некоторых примерах, соответствующих любым из указанных вариантов реализации, указанное заболевание выбрано из аутоиммунного заболевания, аллергии, связанного с питанием или метаболического заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта и генетического расстройства. Дополнительные заболевания, лечение которых может проводиться с применением микроорганизмов (например, бактерий) и композиций согласно настоящему изобретению, описаны в настоящем документе.
[0040] Согласно настоящему изобретению также предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, содержащая: (i) последовательность, кодирующую муцин-связывающий полипептид, такой как полипептид TFF (например, TFF1, TFF2 или TFF3) или полипептид MucBP; и (ii) последовательность, кодирующую клеточно-адгезивный полипептид, такой как полипептид CmbA, полипептид Mub, полипептид МарА или полипептид MbpL. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой полипептид CmbA. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, при этом указанная нуклеиновая кислота содержит (i) последовательность, кодирующую полипептид TFF, такой как TFF1 (например, TFF1 человека), TFF2 (например, TFF2 человека) или TFF3 (например, TFF3 человека), и (ii) последовательность, кодирующую полипептид CmbA.
[0041] Согласно настоящему изобретению также предложена плазмида, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту согласно настоящему описанию, например, выделенную нуклеиновую кислоту, соответствующую любым из вышеописанных вариантов реализации.
[0042] Согласно настоящему изобретению также предложена микробная (например, бактериальная) клетка-хозяин, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту согласно настоящему описанию или плазмиду согласно настоящему описанию.
[0043] Согласно настоящему изобретению также предложен набор, содержащий (1) микроорганизм (например, бактерию), композицию, фармацевтическую композицию или единичную лекарственную форму согласно настоящему описанию; и (2) инструкции по введению указанного микроорганизма (например, бактерии), указанной композиции, указанной фармацевтической композиции или указанной единичной лекарственной формы млекопитающему, такому как субъект-животное, субъект-человек или пациент.
Способы
[0044] Согласно настоящему изобретению также предложен способы лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта. Примеры способов включают: введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, бактерии), композиции или фармацевтической композиции согласно настоящему описанию. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический полипептид согласно описанию в настоящем документе. Примеры заболеваний, лечение которых может проводиться с применением таких микроорганизмов (например, бактерий) и композиций согласно настоящему изобретению, описаны в настоящем документе. В некоторых примерах указанное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, аллергию, связанное с питанием или метаболическое заболевание, заболевание желудочно-кишечного тракта, генетическое расстройство или любые комбинаций перечисленного. В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, такое как диабет I типа (T1D). В других примерах указанное заболевание представляет собой метаболическое заболевание, такое как фенилкетонурия (ФКУ). В других примерах указанное заболевание представляет собой заболевание желудочно-кишечного тракта, такое как целиакия, или воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), например, болезнь Крона или язвенный колит. В дополнительных примерах указанное заболевание представляет собой задержку роста.
[0045] Согласно некоторым вариантам реализации указанное заболевание представляет собой фенилкетонурия (ФКУ). В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, например, фермент, который способен к разложению фенилаланина (Phe), например, в ЖКТ, например, до абсорбции Phe субъектом, которому вводят указанный микроорганизм. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую фенилаланинаммиаклиазу (ФАЛ), фермент, преобразующий Phe в коричную кислоту. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены способы лечения ФКУ у нуждающегося в этом субъекта. Примеры способов включают: введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, бактерии), композиции или фармацевтической композиции согласно настоящему описанию, при этом указанный микроорганизм (например, бактерия) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую ФАЛ. Ингибирование абсорбции Phe и лечение ФКУ может быть проанализировано с применением модели ФКУ на мышах, например, с использованием мышей (enu2/2) (см., например, Sarkissian, С.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 2339-2344), или с применением модели на крысах (см., например, Chang et al., Artif. Cells Blood Substit. Immobil Biotechnol. 1995, 23(1): 1-21).
[0046] Согласно настоящему изобретению также предложены способы получения генетически модифицированного микроорганизма (например, бактерии). Примеры способов включают: приведение экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, в контакт с микроорганизмом (например, бактерией), при этом указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, содержит последовательность, кодирующую клеточно-адгезивный полипептид, такой как полипептид CmbA, полипептид Mub, полипептид МарА или полипептид MbpL. В некоторых примерах указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой CmbA, например, CmbA Lactobacillus reuteri. В некоторых примерах осуществление вышеописанного способа (т.е. приведение микроорганизма в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой) приводит к получению микроорганизма (например, бактерии), содержащего экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок. В других примерах приведение микроорганизма (например, бактерии) в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой приводит к получению микроорганизма (например, бактерии), содержащего экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок, и, соответственно, к экспрессии указанного гибридного белка, кодируемому указанной экзогенной нуклеиновой кислотой. В некоторых примерах указанный способ дополнительно включает культивирование указанного микроорганизма (например, бактерии) и экспрессию указанного гибридного белка в указанном микроорганизме (например, бактерии). В некоторых примерах приведение в контакт происходит в условиях, достаточных для интернализации указанной экзогенной нуклеиновой кислоты указанной бактерией. В некоторых примерах, соответствующих любым из указанных вариантов реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота локализована в плазмиде. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота интегрирована в хромосому бактерии.
[0047] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, дополнительно содержит последовательность, кодирующую муцин-связывающий полипептид, такой как полипептид фактора «трилистника» (TFF) или полипептид MucBP. В некоторых примерах указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, содержит последовательность, кодирующую CmbA, и последовательность, кодирующую полипептид TFF. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложен способ получения генетически модифицированного микроорганизма (например, бактерия), содержащего: приведение экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующая гибридный белок, в контакт с микроорганизмом (например, бактерией), при этом указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, содержит (i) последовательность, кодирующую полипептид TFF (например, TFF1, TFF2 или TFF3) и (ii) последовательность, кодирующую CmbA. В некоторых примерах, соответствующих любым из указанных вариантов реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, является хромосомно-интегрированной (например, интегрирована в хромосому бактерии), например, с применением гомологичной рекомбинации. В соответствии с указанным вариантом реализации, указанный способ может также включать получение плазмиды (т.е. интегративной плазмиды), содержащей указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок.
[0048] В одном примере, соответствующем любому из вышеописанных вариантов реализации, указанный способ дополнительно включает приведение указанного микроорганизма (например, бактерии) в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей терапевтический полипептид, например, до или после приведения указанного микроорганизма (например, бактерии) в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей указанный гибридный белок.
[0049] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный генетически модифицированный микроорганизм (например, бактерия), полученный с применением вышеперечисленных способов, проявляет повышенные мукоадгезивные и/или клеточно-адгезивные свойства согласно описанию в настоящем документе по сравнению с соответствующим микроорганизмом (например, бактерией), не модифицированным в соответствии с настоящим способом, т.е. не содержащим экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок.
[0050] Согласно родственным вариантам реализации адгезия к слизи и/или клеткам является специфической в отношении типов слизи и/или клеток. В результате преимущественного связывания со специфическими рецепторами, обнаруживаемыми в специфических клетках или слизи, бактерия может быть локализована в специфических сайтах. Таким образом, возможно обеспечить локализацию бактерии в том сайте, доставка специфических молекул в который будет наиболее эффективной. Согласно некоторым вариантам реализации указанная локализация может быть представлена слизистыми оболочками (кишечника, ротовой полости, глаза, уха, мочеполовой системы). Согласно некоторым вариантам реализации указанная локализация может быть представлена тонкой кишкой, согласно некоторым вариантам реализации указанная локализация может быть представлена верхним отделом тонкой кишки.
[0051] В некоторых примерах указанный способ дополнительно включает комбинирование культуры генетически модифицированной бактерии по меньшей мере с одним агентом для криоконсервации с получением бактериальной смеси. Указанный способ может дополнительно включать высушивание (например, сублимационную сушку или высушивание распылением) указанной бактериальной смеси с получением высушенной (например, высушенной сублимацией) композиции. Указанный способ может также включать комбинирование генетически модифицированной бактерии или высушенной композиция (например, высушенной сублимацией композиции) с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции. Указанный способ может дополнительно включать введение указанной генетически модифицированной бактерии, указанной высушенной (например, высушенной сублимацией) композиции или указанной фармацевтической композиции в состав фармацевтической единичной лекарственной формы, такой как таблетка, капсула или гранула.
[0052] Согласно настоящему изобретению также предложена единичная лекарственная форма, содержащая по меньшей мере один микроорганизм (например, бактерию), композицию или фармацевтическую композицию согласно настоящему описанию. В некоторых примерах такая единичная лекарственная форма представляет собой лекарственную форму для перорального применения. В других примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанная единичная лекарственная форма представляет собой капсулу (например, капсулу, содержащую порошок или содержащую микропеллеты или микрогранулы), таблетку, гранулу, саше или упакованную жидкость, например, суспензию. Согласно другим вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма представляет собой дозированный аэрозоль или суппозиторий.
[0053] Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм (например, непатогенная грамположительная бактерия), содержащийся в лекарственной форме, находится в форме сухого порошка или его прессованного варианта.
4
12
6
12
9
12
[0054] Согласно настоящему изобретению также предложена единичная лекарственная форма, содержащая от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизма согласно настоящему описанию, например, непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно некоторым вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) указанного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) указанного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии).
[0055] Согласно некоторым вариантам реализации любых из вышеперечисленных способов микроорганизм (например, бактерию) вводят субъекту перорально. Например, указанный микроорганизм (например, бактерию) вводят указанному субъекту в форме фармацевтической композиции для перорального введения (например, капсулы, таблетки, гранулы, суспензии или жидкости), содержащей указанный микроорганизм (например, бактерию) и фармацевтически приемлемый носитель. В других примерах указанный микроорганизм (например, бактерию) вводят указанному субъекту в форме пищевого продукта или добавляют в пищу (например, в напиток). В других примерах указанный микроорганизм (например, бактерию) вводят указанному субъекту в форме диетической добавки. В других дополнительных примерах указанный микроорганизм (например, бактерию) вводят указанному субъекту в форме суппозитория. В некоторых примерах композиции согласно настоящему описанию адаптированы для доставки в слизистую оболочку полипептидов, которые экспрессирует указанный микроорганизм (например, бактерия). Например, композиции могут быть введены в состав для эффективного высвобождения терапевтического полипептида в кишечном тракте субъекта.
[0056] Согласно настоящему изобретению также предложена генетически модифицированная бактерия, композиция, фармацевтическая композиция или единичная лекарственная форма, полученная с применением способа, соответствующего любым из вышеописанных вариантов реализации.
[0057] Согласно настоящему изобретению также предложены способы усиления роста у млекопитающего. Примеры способов включают введение млекопитающему эффективного количества микроорганизма (например, бактерии), композиции, фармацевтической композиции или единичной лекарственной формы согласно настоящему описанию. В некоторых примерах указанное млекопитающее представляет собой человека, сельскохозяйственное животное (например, свинью, корову, козу или овцу), собаку, кошку или другое домашнее животное. В некоторых примерах указанный микроорганизм (например, бактерия), указанная композиция, фармацевтическая композиция или указанная единичная лекарственная форма представлена составом для введения млекопитающему, например, введена в состав для перорального введения. В некоторых примерах микроорганизм (например, бактерия), задействованный в указанном способе, содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор роста или гормон роста. В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанный микроорганизм (например, бактерия) конститутивно экспрессирует указанный фактор роста или гормон роста. В некоторых примерах указанный фактор роста представляет собой ЭФР. В других примерах указанный млекопитающее представляет собой свинью и указанный ЭФР представляет собой свиной ЭФР.
[0058] Согласно настоящему изобретению также предложен способ увеличения связывания микроорганизма (например, бактерии) со слизистой оболочкой кишечника (например, по оценке с применением связывания с муциновым составом in vitro). Примеры способов включают приведение микроорганизма (например, бактерия) в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей гибридный белок, при этом указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, содержит последовательность, кодирующую полипептид CmbA; и экспрессию указанной экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, в указанном микроорганизме (например, бактерии). В некоторых примерах указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, дополнительно содержит последовательность, кодирующую муцин-связывающий полипептид, такой как полипептид TFF. В некоторых примерах при экспрессии экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, указанным микроорганизмом (например, бактерия) продуцируется гибридный белок, содержащий указанный полипептид TFF и указанный полипептид CmbA.
[0059] В некоторых примерах, соответствующих с любым из вышеописанных композиций и способов, указанный микроорганизм представляет собой непатогенный микроорганизм, например, любой микроорганизм, употребление которого безопасно для субъекта-млекопитающего. Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм, используемый в вышеперечисленных композициях и способах, представляет собой дрожжи. Указанные дрожжи могут быть выбраны из вида Saccharomyces, вида Hansenula, вида Kluyveromyces, вида Schizzosaccharomyces, вида Zygosaccharomyces, вида Pichia, вида Monascus, вида Geothchum и вида Yarrowia. В некоторых примерах указанные дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae.
[0060] Согласно другим вариантам реализации вышеперечисленных композиций и способы указанный непатогенный микроорганизм представляет собой непатогенную бактерию. В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанная непатогенная бактерия представляет собой грамположительную бактерию. В других примерах указанная грамположительная бактерия представляет собой способную к молочнокислому брожению бактерию (МКБ), например, выбранную из вида Lactococcus (например, Lactococcus lactis), вида Lactobacillus и вида Bifidobacterium. В других примерах указанная непатогенная бактерия представляет собой вид Streptococcus или вид Enterococcus. Дополнительные бактериальные виды описаны в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0061] На Фиг. 1 представлена плазмидная карта PthyA >> SSusp45-htff3-CmbA экспрессия/thyA интегративного вектора pAGX2005. Сокращения: thyA5': фланкирующая 5'-область гена тимидинсинтазы A (thyA) MG1363; PthyA: промотор thyA MG1363; SSups45: ген, который кодирует сигнал секреции белка MG1363 usp45; hTFF3: ген, который кодирует фактор «трилистника» 3 человека с оптимизированной для L. lactis частотой использования кодонов; CmbA: ген, который кодирует связывающий клетки и слизь белок А АТСС РТА6474 Lactobacillus reuteri; thyA3': фланкирующая 3'-область гена thyA MG1363; ORI: точка начала репликации плазмиды pORI19; Em: маркер устойчивости к эритромицину.
405
[0062] На Фиг. 2А-В приведены графики, демонстрирующие усиленное связывание бактериальных (Lactococcus lactis) клеток с муцинами, где связывание муцинов измеряют с использованием OD (Фиг. 2А) или окрашивания кристаллическим фиолетовым (Фиг. 2В). pAGX1417: штамм L. lactis LL108, несущий пустую плазмиду; pAGX1894: штамм L. lactis LL108, несущий плазмиду для экспрессии hTFF1-SpaX на бактериальной поверхности; pAGX2005: штамм L. lactis LL108, несущий плазмиду для экспрессии hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности. Муцин типа II = муцин из свиного желудка, связанная сиаловая кислота, ~1%; муцин типа III = муцин из свиного желудка, связанная сиаловая кислота (0,5-1,5%).
[0063] На Фиг. 3 продемонстрирована усиленная адгезия бактериальных (Lactococcus lactis) клеток к клеткам Сасо-2. pAGX1417: штамм L. lactis LL108, несущий пустую плазмиду; pAGX1893: штамм L. lactis LL108, несущий плазмиду для экспрессии CmbA на бактериальной поверхности; pAGX1894: L. lactis штамм LL108, несущий плазмиду для экспрессии hTFF1-spaX на бактериальной поверхности; pAGX2005: штамм L. lactis LL108, несущий плазмиду для экспрессии hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности.
[0064] На Фиг. 4 представлен пример конструкции SSusp45-htff3 (последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот: SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно).
[0065] Фиг. 5A-D в совокупности иллюстрируют пример SSusp45-hTFF3-CmbA конструкция (последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот: SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11, соответственно).
-
-
-
[0066] На Фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий усиленную адгезию бактериальных (Lactococcus lactis) клеток к клеткам Сасо-2, при этом указанные клетки либо эписомально, либо конститутивно экспрессируют пример клеточно-адгезивного полипептида (CmbA) или пример гибридного белка (hTFF3-CmbA).% выделения = % клеток L. lactis, выделенных из покрытой муцином лунки после промывания, относительно общего числа внесенных клеток L. lactis на основании подсчета колониеобразующих единиц. pAGX1893: штамм L. lactis LL108, несущий плазмиду для экспрессии CmbA на бактериальной поверхности; pAGX2005: штамм L. lactis LL108, несущий плазмиду для экспрессии hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности; sAGX0618: штамм L. lactis MG1363, конститутивно экспрессирующий пример терапевтического полипептида ФАЛ (PgapB >> pal) и конститутивно экспрессирующий CmbA на бактериальной поверхности (thyA; PthyA >> cmbA); sAGX644: штамм L. lactis MG1363, конститутивно экспрессирующий пример терапевтического полипептида ФАЛ (PgapB >> pal) и конститутивно экспрессирующий гибридный белок hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности, при этом экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок, транскрипционно регулирует эндогенный промотор thyA в локусе thyA (thyA; PthyA >> SSusp45-htff3-mbA); sAGX660: штамм L. lactis MG1363, конститутивно экспрессирующий пример терапевтического полипептида ФАЛ (PgapB >> pal) и конститутивно экспрессирующий гибридный белок hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности, при этом экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок, транскрипционно регулирует промотор hllА в локусе thyA (thyA; PhllA >> SSusp45-htff3-cmbA).
405
-
-
-
[0067] На Фиг. 7 приведен график, иллюстрирующий усиленное связывание бактериальных (Lactococcus lactis) клеток с муцинами, при этом указанные клетки либо эписомально, либо конститутивно экспрессируют пример клеточно-адгезивного полипептида (CmbA) или пример гибридного белка (hTFF3-CmbA), где связывание муцина измеряют с использованием OD (Фиг. 7А) или окрашивание кристаллическим фиолетовым (Фиг. 7В) согласно описанию в настоящем документе, например, в примере 6. pAGX1893: штамм L. lactis LL108, несущий плазмиду для экспрессии CmbA на бактериальной поверхности; pAGX2005: штамм L. lactis LL108, несущий плазмиду для экспрессии hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности; SAGX0618: штамм L. lactis MG1363, конститутивно экспрессирующий пример терапевтического полипептида ФАЛ (PgapB >> pal) и конститутивно экспрессирующий CmbA на бактериальной поверхности (thyA; PthyA >> cmbA); sAGX644: штамм L. lactis MG1363 конститутивно экспрессирующий пример терапевтического полипептида ФАЛ (PgapB >> pal) и конститутивно экспрессирующий гибридный белок hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности, при этом экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок, транскрипционно регулирует эндогенный промотор thyA в локусе thyA (thyA; PthyA >> SSusp45-htff3-cmbA); sAGX660: штамм L. lactis MG1363 конститутивно экспрессирующий пример терапевтического полипептида ФАЛ (PgapB >> pal) и конститутивно экспрессирующий гибридный белок htf3-CmbA на бактериальной поверхности, при этом экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный гибридный белок, транскрипционно регулирует промотор hllА в локусе thyA (thyA; PhllA >> SSusp45-htff3-cmbA).
-
-
9
[0068] На Фиг. 8 представлен график, иллюстрирующий продуцирование примера терапевтического полипептида (ФАЛ) бактериальными клетками, либо не экспрессирующими мукоадгезивный полипептид (sAGX0599), либо экспрессирующими пример клеточно-адгезивного полипептида CmbA (sAGX0618) на бактериальной поверхности, или пример гибридного белка hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности (sAGX0644 (thyA; PthyA >> SSusp45-htff3-cmbA) и sAGX0660 (thyA; PhllA >> SSusp45-htff3-cmbA)). Было обнаружено, что продуцирование ФАЛ в мкг на 10 клеток было сопоставимо у всех продуцирующих ФАЛ штаммов.
[0069] На Фиг. 9А-D показано, что пероральное введение L. lactis, экспрессирующей ФАЛ, понижает концентрации фенилаланина в крови. Отрицательный контроль = без L. lactis, только болюс; положительный контроль = штамм L. lactis NZ9000[pAGX1886], индуцированная низином ФАЛ (AGX №3151); L. lactis-ФАЛ = sAGX0599 (AGX №2947), секретирующий ФАЛ; L. lactis-ФАЛ + TFF3-CmbA = мукоадгезивный штамм sAGX0645 (AGX №3290), секретирующий ФАЛ и содержащий поверхностный TFF3-CmbA, клеточно- и мукоадгезивный. На Фиг. 9А-В показаны уровни Phe и Tyr в крови, измеренные в различные моменты времени после введения болюса меченого радиоактивной меткой Phe; на Фиг. 9С-D показаны соответствующие AUC. Указанные новые конструкции ассоциированы с более низкими уровнями Phe в крови. Итоговый уровень Phe был минимальным у мышей, которым вводили L. lactis, экспрессирующий ФАЛ и гибридный белок TFF3-CmbA.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0070] Согласно настоящему изобретению предложены микроорганизмы (например, молочнокислые бактерии, такие как Lactococcus lactis), проявляющие усиленное связывание с муцинами in vitro и усиленное связывание с клетками in vitro, например, адгезию к клеткам Сасо-2. Согласно некоторым вариантам реализации такие микроорганизмы отличаются увеличенной продолжительностью времени транзита через ЖКТ. Например, такой микроорганизм может дополнительно экспрессировать терапевтический полипептид. В некоторых примерах при пероральном введении таких бактерий субъекту-млекопитающему время пребывания указанных бактерий в разных частях ЖКТ увеличивается, и субъект подвергается действию терапевтического полипептида в ЖКТ на протяжении более длительного периода времени. Например, после освобождения бактерий, например, из капсул с защитным покрытием в двенадцатиперстной кишке, время пребывания указанных бактерий в тощей кишке и подвздошной кишке продлевается за счет поверхностного экспонирования/экспрессии муко- и клеточно-адгезивных белков, которые связываются или взаимодействуют со слизистой оболочкой кишечника. Следовательно, могут быть снижены дозы бактерий, микроорганизмы с менее выраженными профилями экспрессии становятся приемлемыми для введения терапевтически эффективных доз, могут быть разработаны единичные лекарственные формы с меньшими дозами и могут применяться режимы с менее частым введением (например, увеличивающие комплаентность пациентов).
[0071] Например, согласно настоящему изобретению предложены микроорганизмы, содержащие экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок гибридный фактора «трилистника» 3 человека (hTFF3) со связывающим клетки и слизь белком A (CmbA) Lactobacillus reuteri на поверхности Lactococcus lactis. Пример гибридного белка состоит из белка сигнала секреции Lactococcus lactis usp45 (см., например, Van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet. 1993, 240:428-434), гибридного с hTFF3 (см., например, Tomasetto et al., Gastroenterology 2000, 118(1):70-80) и CmbA Lactobacillus reuteri (например, без его сигнала секреции), гибридный белок SSusp45-hTFF3-CmbA секретируется за счет сигнала секреции usp45, и сигнальный пептид секреции отщепляется при прохождении гибридного белка hTFF3-CmbA через цитоплазматическую мембрану Lactococcus lactis. Внешняя часть CmbA может связывать эпителиальные клетки кишечника. Путем слияния hTFF3 с белком CmbA добавляют дополнительную связывающую слизь единицу. Экспрессия и экспонирование на поверхности hTFF3-CmbA позволило обеспечить увеличенную адгезию к слизистой оболочке кишечника и увеличить продолжительность времени транзита через ЖКТ модифицированных клеток Lactococcus lactis.
Определения
[0072] В настоящем описании и формуле изобретения термины, приведенные в единственном числе, в том числе сопровождаемые уточнением «указанный», включают соответствующие термины во множественном числе, если иное явным образом не следует из контекста. Например, термин «клетка» включает множество клеток, в том числе их смеси. Аналогичным образом, применение «соединения» для лечения или получения лекарственных средств согласно описанию в настоящем документе включает применение одного или более соединений согласно настоящему изобретению для такого лечения или состава, если иное явным образом не следует из контекста.
[0073] Термин «приблизительно» в отношении упоминаемой численной величины, а также его грамматические эквиваленты, в настоящем документе может включать собственно упоминаемую численную величину и величины в диапазоне ±10% от указанной упоминаемой численной величины. Например, термин «приблизительно 10» включает 10 и любые количества от 9 до 11, включительно. В некоторых случаях, термин «приблизительно» в отношении упоминаемой численной величины может также включать величины в диапазоне ±10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от указанной упоминаемой численной величины. Согласно некоторым вариантам реализации «приблизительно» в контексте количества или диапазона, измеряемых с применением конкретного способа, показывает, что заданная численная величина включает величины, определяемые вариабельностью измерений при применении указанного способа.
[0074] В настоящем документе термин «содержащий» означает, что композиции и способы включают перечисленные элементы, без исключения других элементов. «Состоящий по существу из» при использовании для определения композиций и способов означает исключение других элементов, имеющих сколько-либо существенное значение для указанной комбинации. Соответственно, композиция, состоящая по существу из элементов согласно определению в настоящем документе, не исключает следовых примесей, обусловленных способом выделения и очищения, и фармацевтически приемлемых носителей, таких как забуференный фосфатом солевой раствор, консерванты и т.п. «Состоящий из» означает исключение более чем следовых элементов других ингредиентов и существенных этапов способа введения композиций согласно настоящему изобретению. Варианты реализации, определяемые каждым из указанных переходных терминов, входят в объем настоящего изобретения
[0075] Процент идентичности последовательностей полипептидов может быть вычислен с использованием коммерчески доступных алгоритмов сравнения референсной последовательности с исследуемой последовательностью. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды на 70%, по меньшей мере на 70%, на 75%, по меньшей мере на 75%, 80%, по меньшей мере на 80%, на 85%, по меньшей мере на 85%, на 90%, по меньшей мере на 90%, на 92%, по меньшей мере на 92%, на 95%, по меньшей мере на 95%, на 97%, по меньшей мере на 97%, на 98%, по меньшей мере на 98%, на 99% или по меньшей мере на 99% или на 100% идентичны референсному полипептиду или его фрагменту (например, по оценке с применением BLASTP или CLUSTAL, или другого программного обеспечения для выравнивания) при устанавливаемых по умолчанию параметрах. Аналогичным образом, нуклеиновые кислоты могут также быть описаны относительно стартовой нуклеиновой кислоты, например, они могут быть на 50%, по меньшей мере на 50%, на 60%, по меньшей мере на 60%, на 70%, по меньшей мере на 70%, на 75%, по меньшей мере на 75%, на 80%, по меньшей мере на 80%, на 85%, по меньшей мере на 85%, 90%, по меньшей мере на 90%, на 95%, по меньшей мере на 95%, на 97%, по меньшей мере на 97%, на 98%, по меньшей мере на 98%, на 99%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичны референсной нуклеиновой кислоте или ее фрагменту (например, по оценке с применением BLASTN или CLUSTAL, или другого программного обеспечения для выравнивания при устанавливаемых по умолчанию параметрах). Если указано, что одна молекула отличается определенным процентом идентичности последовательности большей молекулы, это означает, что при проведении оптимального выравнивания двух молекул в молекуле  размера имеются совпадающие остатки для указанного процента остатков в молекуле меньшего размера, расположенные в соответствии с порядком проведения оптимального выравнивания указанных двух молекул; «%» (процент) идентичности вычисляют в соответствии с длиной молекулы меньшего размера.
[0076] Следует понимать, что для экспрессии чужеродного белка в бактерии, как правило, требуются модификации. Указанные модификации включают модификацию нуклеиновой кислоты для удаления интронов и других эукариотических мотивов нуклеиновых кислот, не распознаваемых бактериями, и оптимизации для хозяина частоты использования кодонов.
[0077] Сходным образом, белки модифицируют для удаления мотивов, необходимых для правильного процессинга у естественного хозяина, но не распознаваемых бактериальным хозяином, таких как сигналы секреции эукариот или других видов бактерий. Соответственно, специалисту будет понятно, что при упоминании экспрессии чужеродного белка у бактерий имеется в виду зрелая форма. Например, ИЛ-10 человека транслируется в клетке человека с лидерной последовательностью секреции, не присутствующей в зрелом ИЛ-10, секретируемом указанной клеткой. Указанная эукариотическая лидерная последовательность секреции нефункциональна у бактерий. Соответственно, L. lactis, которая дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, экспрессирующую «ИЛ-10», содержит зрелый белок ИЛ-10.
[0078] В настоящем документе термины «экспрессирующий» ген или полипептид, или «продуцирующий» полипептид (например, ФАЛ, или полипептид ИЛ-2, или полипептид T1D-специфического антигена) включают термины «способный экспрессировать» и «способный продуцировать», соответственно. Например, микроорганизм, который содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, может, в достаточных условиях (например, при достаточном увлажнении и/или в присутствии питательных веществ), продуцировать полипептид, кодируемый указанной экзогенной нуклеиновой кислотой). Однако указанный микроорганизм не обязательно постоянно активно продуцирует кодируемый полипептид. Указанный микроорганизм (например, бактерия) может быть высушен (например, высушен сублимацией) и в указанном состоянии может считаться находящимся в состоянии покоя (т.е. активно не продуцирующим полипептид). Однако после того как указанный микроорганизм помещают в достаточные условия, например, вводят субъекту, и он высвобождается (например, в желудочно-кишечном тракте указанного субъекта), он может снова начать продуцировать полипептид. Соответственно, микроорганизм, «экспрессирующий» ген или полипептид, или «продуцирующий» полипептид согласно настоящему изобретению, включает микроорганизм, находящийся «в состоянии покоя».
[0079] В настоящем документе термин «конститутивный» в контексте промотора (или, в более широком смысле, в отношении генной экспрессии или секреции полипептида) относится к промотору, который позволяет обеспечить постоянную транскрипцию ассоциированного с ним гена.
[0080] Термин «хромосомно-интегрированный», или «интегрированный в хромосому», или любой вариант приведенных терминов означает, что последовательность нуклеиновой кислоты (например, ген; открытая рамка считывания; экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид; промотор; экспрессионная кассета; и т.п.) локализована на микробной (например, бактериальной) хромосоме (интегрирована в микробную хромосому), т.е. не локализована на эписомном векторе, таком как плазмида. Согласно некоторым вариантам реализации, где последовательность нуклеиновой кислоты является хромосомно-интегрированной, полипептид, кодируемый такой хромосомно-интегрированной нуклеиновой кислотой, экспрессируется конститутивно.
[0081] Термины «лидерная последовательность секреции», «лидер секреции» и «сигнальная последовательность секреции» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Указанные термины используют в соответствии с принятым в данной области техники значением и, как правило, они относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует «сигнальный пептид» или «сигнальный пептид секреции», приводит к экспрессии полипептида микроорганизмом, включая секрецию сигнального пептида указанным микроорганизмом, т.е. приводит к выходу полипептида из внутриклеточного пространства, например, его секреции в окружающую среду или заякориванию в клеточной стенке при экспонировании по меньшей мере части полипептида в окружающей среде, например, на поверхности микроорганизма.
Терапевтический полипептид
[0082] Термин «терапевтический полипептид» включает любой полипептид, обладающий терапевтической, профилактической или другой биологической активностью (например, у субъекта-млекопитающего), или потенциально способный вызывать биологическую активность. Примеры включают известные биологические средства (одобренные и исследуемые) и любые сигнальные полипептиды, такие как гормоны и цитокины, а также их рецепторы, агонисты и антагонисты. «Терапевтический полипептид» может представлять собой соответствующий модифицированный полипептид дикого типа. В некоторых примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой цитокин, например, интерлейкин (ИЛ), такой как ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, ИЛ-16, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-19, ИЛ-20, ИЛ-21 или ИЛ-22.
[0083] В других примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой антиген. В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанный антиген представляет собой «аутоантиген» или собственный антиген. Термины «собственный антиген» или «аутоантиген» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Указанные термины используют в настоящем документе в соответствии с принятым в данной области техники значением собственного антигена или аутоантигена, и, как правило, относятся к полипептиду/белку, происходящему из собственного организма субъекта (продуцируемому собственным организмом субъекта), причем собственная иммунная система субъекта распознает указанный антиген и, как правило, продуцирует антитела против такого антигена. Аутоиммунные заболевания обычно ассоциированы с определенными специфическими для заболевания собственными антигенами. Например, при T1D иммунная система субъекта может продуцировать антитела против по меньшей мере одного антигена, ассоциированного с процессом уничтожения бета-клеток. В некоторых примерах указанный аутоантиген представляет собой T1D-специфический антиген. Примеры T1D-специфических антигенов включают проинсулин (PINS), декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD65), ассоциированный с инсулиномой белок 2 (IA-2), специфический островковый связанный с каталитической субъединицей глюкоза-6-фосфатазы белок (IGRP), цинковый транспортер 8 (ZnT8) и любые комбинации перечисленного. Клинический T1D может дополнительно быть ассоциирован с дополнительными кандидатными целевыми молекулами, экспрессируемыми бета-клетками, такими как хромогранин А, островковый амилоидный (препро)полипептид (ppIAPP), периферии и цитруллинированный регулируемый глюкозой белок (GRP), а также любыми комбинациями перечисленного. Примеры последовательностей аминокислот и последовательностей нуклеиновых кислот вышеперечисленных T1D-специфических антигенов раскрыты, например, в предварительной заявке на патент 62/350472 (поданной 15 июня 2016 г.), содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. В некоторых примерах указанный T1D-специфический антиген представляет собой PINS, такой как PINS человека дикого типа. См., например, CDS (кодирующая последовательность) из последовательности с номером доступа NM_000207.2, или последовательность, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичную такой последовательности PINS человека дикого типа. Дополнительные примеры последовательностей нуклеотидов PINS представлены кодирующими последовательностями из последовательностей с номерами доступа NCBI AY899304 (полная CDS, альтернативный сплайсинг); NM_000207 (вариант транскрипта 1); NM_001185097 (вариант транскрипта 2); NM_001185098 (вариант транскрипта 3); NM_001291897 (вариант транскрипта 4) и частями указанных последовательностей. Примеры последовательностей аминокислот PINS включают последовательности, кодируемые любыми из вышеперечисленных последовательностей нуклеиновых кислот PINS.
[0084] В других примерах указанный антиген представляет собой аллерген, такой как аллерген пыльцы деревьев, аллерген пыльцы сорных трав, аллерген пыльцы травянистых растений, пищевой аллерген, аллерген клеща домашней пыли, аллерген плесневых грибов, аллерген частиц эпителия животных, или комбинацию перечисленного. В некоторых примерах указанный аллерген представляет собой аллерген пыльцы сорных трав, например, аллерген пыльцы амброзии. В других примерах указанный аллерген представляет собой аллерген пыльцы деревьев, такой как аллерген пыльцы березы или аллерген пыльцы японского кедра. В других дополнительных примерах указанный аллерген представляет собой пищевой аллерген, такой как аллерген арахиса, аллерген молока, аллерген яйца, аллерген глютена (эпитоп глиадина), или комбинацию перечисленного. В других примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой антиген и интерлейкин, такой как ИЛ-2, ИЛ-10 или ИЛ-22.
[0085] В дополнительных примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой антитело или его фрагмент. Например, указанное антитело представляет собой однодоменное антитело или нанотело. Примеры антител включают нейтрализующие цитокины антитела, такие как антитела к ИЛ-4, антитела к ИЛ-5, антитела к ИЛ-7, антитела к ИЛ-13, антитела к ИЛ-15, а также антитела против ФНО-α, антитела к иммуноглобулин Е (IgE), антитела к Р40 и любые их фрагменты.
[0086] В других дополнительных примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой фермент или его фрагмент (например, функциональный фрагмент), например, фенилаланинаммиаклиазу (ФАЛ), декарбоксилазу аминокислот или комбинацию перечисленного. В одном примере указанный терапевтический полипептид представляет собой ФАЛ или ее функциональный фрагмент. Примеры последовательностей ФАЛ, подходящих для указанного варианта реализации, раскрыты, например, в опубликованной международной заявке на патент WO 2014/066945, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. ФАЛ метаболизирует фенилаланин и таким образом может уменьшать уровень Phe, абсорбируемый из кишечника в кровь; и, соответственно, может применяться для лечения фенилкетонурии. Для разложения Phe могут также применяться другие ферменты, такие как декарбоксилазы ароматических аминокислот, например, декарбоксилазы фенилаланина. Согласно некоторым вариантам реализации субъекту вводят бактерию, которая экспрессирует и секретирует ФАЛ и второй разлагающий фенилаланин фермент. Согласно другому варианту реализации субъекту вводят бактерию, которая экспрессирует и секретирует ФАЛ, и другую бактерию, которая экспрессирует и секретирует второй разлагающий фенилаланин фермент.
[0087] В дополнительном примере конструируют бактерии для усиления поглощения и утилизации Phe в клетке. Введение таких бактерий может дополнительно снижать абсорбируемое количество Phe у пациента.
[0088] В дополнительных примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой глюкагоноподобный пептид-1 (ГПП-1), глюкагоноподобный пептид 2 (ГПП-2), глюкагон, эксендин-4, или любую комбинацию перечисленного. В других примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой фактор роста, такой как эпидермальный фактор роста (ЭФР), например, ЭФР человека или свиной ЭФР. В других дополнительных примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой TFF, такой как TFF1, TFF2, TFF3, или комбинацию перечисленного.
[0089] В некоторых примерах указанный терапевтический полипептид представляет собой иммуномодулирующее соединение. Термины «иммуномодулирующее соединение» или «иммуномодулятор» используют в настоящем документе в соответствии с принятым в данной области техники значением. Указанное иммуномодулирующее соединение может представлять собой любое иммуномодулирующее соединение, известное специалисту в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой индуцирующее толерантность соединение. Индукция толерантности может быть достигнута, например, путем индукции регуляторных Т-клеток, или непрямым образом, например, путем активации незрелых дендритных клеток с получением толеризующих дендритных клеток, и/или ингибирования Th2 иммунного ответа, индуцирующего экспрессию «костимулирующих» факторов на зрелых дендритных клетках. Иммуномодулирующие и иммуносупрессорные соединения известны специалистам в данной области техники и включают, не ограничиваясь перечисленными, бактериальные метаболиты, такие как спергуалин, метаболиты грибов и стрептомицетов, такие как такролимус или циклоспорин, иммуносупрессорные цитокины, такие как ИЛ-4, ИЛ-10, ИФН-α, ТФР-β (в качестве селективного адъюванта для регуляторных Т-клеток), Flt3L, TSLP и Rank-L (в качестве селективных индукторов толерогенных ДК), антитела и/или антагонисты (например, антител), например, против CD40L, против CD25, против CD20, против IgE, против CD3, и белки, пептиды или гибридные белки, такие как гибридный белок с CTL-41g или агонистом CTLA-4. Согласно некоторым вариантам реализации указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой иммуносупрессорное соединение. Согласно другим вариантам реализации указанное иммуносупрессорное соединение представляет собой иммуносупрессорный цитокин или антитело. Согласно другим вариантам реализации указанный иммуносупрессорный цитокин представляет собой повышающий толерантность цитокин или антитело. Специалисту в данной области техники будет ясно, что термин «иммуномодулирующее соединение» также включает его функциональные гомологи. Функциональный гомолог представляет собой молекулу, обладающую по существу такой же или аналогичной функцией для предусмотренного использования, однако может иметь структурные отличия. В некоторых примерах указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой антитело против CD3 или его функциональный гомолог.
[0090] Микроорганизм согласно настоящему описанию может экспрессировать более чем один или по меньшей мере один терапевтический полипептид. Указанный терапевтический полипептид может представлять собой комбинацию любых вышеупомянутых терапевтических полипептидов.
Заболевания
[0091] Микроорганизмы (например, бактерии), композиции и способы согласно настоящему описанию могут применяться для лечения или предотвращения любого заболевания, например, заболеваний, лечение которых может проводиться с применением биоактивного полипептида, активного в сайте слизистой оболочке, например, слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта. Примеры заболеваний лечение или предотвращение которых может проводиться с применением способов согласно настоящему описанию, включают аутоиммунное заболевание, аллергии, связанные с питанием или метаболические заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта и генетические расстройства, или любые комбинации перечисленного.
[0092] Термин «заболевание, связанное с питанием» включает любое заболевание, ассоциированное с неспособностью перерабатывать пищу или питательные вещества, и может приводить, например, к недостаточности питательных веществ, низкой массе тела или другим вторичным состояниям (таким как вздутие живота). «Заболевание, связанное с питанием» может быть ассоциировано с недостаточным продуцированием определенных ферментов, перерабатывающих пищу или компоненты пищи, такие как липиды и углеводы (такие как липазы, протеазы или разлагающие сахара ферменты). Термин «заболевание, связанное с питанием» включает любой метаболический процесс в организме, который может быть усилен даже в отсутствие определенного состояния или заболевания («усиление метаболизма»), например, может проводиться обработка определенных сельскохозяйственных животных, таких как свиньи, коровы, птицы или овцы, для более быстрого роста или набора большей массы тела. В некоторых примерах указанное «заболевание, связанное с питанием» представляет собой непереносимость определенных видов пищи или компонентов пищи, основанную на недостаточном или аномальном метаболизме такой пищи или компонента пищи, например, непереносимость лактозы. Термин «заболевание, связанное с питанием» близок к терминам «метаболическое заболевание» или «метаболическое расстройство», которые используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Термин «метаболическое заболевание» применяют в настоящем документе в соответствии с принятым в данной области техники значением, и, как правило, он относится к любому состоянию, при котором аномальные химические реакции в организме изменяют нормальный метаболический процесс. В некоторых примерах указанное метаболическое заболевание вызвано генетическим дефектом и может быть наследуемым. Примеры метаболических расстройств включают кислотно-щелочной дисбаланс, метаболические заболевания головного мозга, расстройства метаболизма кальция, связанные с дефицитом репарации ДНК расстройства, расстройства метаболизма глюкозы, гиперлактатемию, расстройства метаболизма железа и расстройства метаболизма липидов.
[0093] Другие примеры связанных с питанием или метаболических заболеваний включают мальабсорбцию глюкозы и/или галактозы, синдром Леша-Найхана, синдром Менкеса, ожирение, рак поджелудочной железы, синдром Прадера-Вилли, порфирию, болезнь Рефсума, танжерскую болезнь, болезнь Вильсона, синдром Гурлер (например, характеризующийся аномальной структурой костей и задержкой развития), болезнь Ниманна-Пика (например, при которой у детей развиваются увеличение печени, затруднения при кормлении и повреждения нервов), болезнь Тея-Сакса (например, характеризующуюся прогрессирующей слабостью у детей младшего возраста, переходящей в тяжелое повреждение нервов), болезнь Гоше (например, характеризующуюся болью в костях, увеличением печени и низким числом тромбоцитов); болезнь Фабри (например, характеризующуюся болью в конечностях в детстве, с заболеваниями почек и сердца и инсультами во взрослом возрасте), болезнь Краббе (например, характеризующуюся прогрессирующими повреждениями нервов, задержкой в развитии у детей младшего возраста); галактоземию (например, характеризующуюся нарушением расщепления сахара галактозы, может приводить к желтухе, рвоте и увеличению печени после кормления новорожденного грудным молоком или молочной смесью); болезнь кленового сиропа (например, характеризующуюся дефицитом фермента BCKD (дегидрогеназа кетокислот с разветвленной цепью), который вызывает отложение аминокислот в организме); фенилкетонурия (ФКУ), болезни накопления гликогена (например, характеризующиеся низкими уровнями сахара в крови, мышечной болью и слабостью); митохондриальные расстройства, атаксию Фридрейха (например, характеризующуюся проблемами, связанными с белком фратаксином, которые могут вызывать повреждения нервов, проблемы с сердцем, неспособность ходить) и пероксисомные расстройства (например, характеризующиеся неудовлетворительным функционированием ферментов в пероксисомах, что может приводить к отложению токсических метаболитов). Примеры пероксисомных расстройств включают, например, синдром Цельвегера (например, характеризующийся аномальными чертами лица, увеличением печени и повреждениями нервов у детей первых лет жизни) и адренолейкодистрофию (например, характеризующуюся симптомами повреждения нервов в детстве или в возрасте раннего совершеннолетия). Другие связанные с питанием или метаболические расстройства включают расстройства метаболизма металлов (например, характеризующиеся нарушениями функционирования белков и токсическим накоплением металлов в организме). Примеры включают, например, болезнь Вильсона (например, характеризующуюся накоплением токсических уровней меди в печени, головном мозге и других органах) и гемохроматоз (например, наследственный гемохроматоз), например, при котором избыток железа поглощается в кишечнике и накапливается в печени, поджелудочной железе, суставах и сердце, вызывая повреждения. Дополнительные примеры связанных с питанием или метаболических расстройств включают органические ацидемии (такие как метилмалоновая ацидемия и пропионовая ацидемия), расстройства цикла мочевины (такие как дефицит орнитинтранскарбамилазы и цитруллинемия). В определенном примере указанное связанное с питанием или метаболическое заболевание представляет собой фенилкетонурию (ФКУ). В других примерах указанное связанные с питанием или метаболическое заболевание представляет собой метаболическое расстройство, связанное с дисрегуляцией энергии (например, неалкогольный стеатогепатит).
[0094] В некоторых примерах указанное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание. Примеры аутоиммунных заболеваний включают миокардит, постинфарктный синдром, посткардиотомный синдром, подострый бактериальный эндокардит (ПБЭ), нефрит, обусловленный антителами к гломерулярной базальной мембране, интерстициальный цистит, волчаночный нефрит, аутоиммунный гепатит, первичный билиарный цирроз (ПБЦ), первичный склерозирующий холангит, антисинтетазный синдром, очаговую алопецию, аутоиммунный ангионевротический отек, аутоиммунный прогестероновый дерматит, аутоиммунную крапивницу, буллезный пемфигоид, рубцовый пемфигоид, герпетиформный дерматит, дискоидную красную волчанку, приобретенный буллезный эпидермолиз, узелковую эритему, гестационный пемфигоид, гнойный гидраденит, плоский лишай, склеротический лишай, линейный IgA-зависимый дерматоз (LAD), локализованную склеродермию, обыкновенную пузырчатку, острый лихеноидный и вариолиформный питириаз, болезнь Муха-Габерманна, псориаз, системную склеродермию, витилиго, болезнь Аддисона, аутоиммунный полиэндокринный синдром (АПС) типа 1, аутоиммунный полиэндокринный синдром (АПС) типа 2, аутоиммунный полиэндокринный синдром (АПС) типа 3, аутоиммунный панкреатит (АИП), сахарный диабет I типа, аутоиммунный тиреоидит, тиреоидит Орда, болезнь Грейвса, аутоиммунный оофорит, эндометриоз, аутоиммунный орхит, синдром Шегрена, аутоиммунную энтеропатию, целиакию, болезнь Крона, микроскопический колит, язвенный колит, антифосфолипидный синдром (АФС, АФЛС), апластическую анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, аутоиммунную нейтропению, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, болезнь холодовых агглютининов, эссенциальную смешанную криоглобулинемию, синдром Эванса, ночную пароксизмальную гемоглобинурию, пернициозную анемию, истинную эритроцитарную аплазию, тромбоцитопению, адипозалгию, болезнь Стилла взрослого возраста, анкилозирующий спондилит, CREST-синдром, лекарственную волчанку, энтезит-связанный артрит, эозинофильный фасциит, синдром Фелти, IgG4-связанное заболевание, ювенильный артрит, болезнь Лайма (хроническую), смешанное заболевание соединительной ткани (СЗСТ), палиндромный ревматизм, синдром Парри-Ромберга, синдром Парсонеджа-Тернера, псориатический артрит, реактивный артрит, рецидивирующий полихондрит, забрюшинный фиброз, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, саркоидоз, синдром Шницлера, системную красную волчанку (СКВ), недифференцированное заболевание соединительной ткани (НЗСТ), дерматомиозит, фибромиалгию, миозит с тельцами включений, миозит, тяжелую миастению, нейромиотонию, паранеопластическую мозжечковую дегенерацию, полимиозит, острый рассеянный энцефаломиелит (ОРЭМ), острую моторную аксональную нейропатию, анти-NMDA-рецепторный (с антителами к N-метил-D-аспартатным рецепторам) энцефалит, концентрический склероз Бало, энцефалит Бикерстаффа, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию, синдром Гийена-Барре, энцефалопатию Хашимото, идиопатические воспалительные демиелинизирующие заболевания, миастенический синдром Ламберта-Итона, рассеянный склероз (PC) с паттерном II типа, ошторанский синдром, детское аутоиммунное нервно-психическое расстройство, ассоциированное со стрептококковой инфекцией (синдром PANDAS), прогрессирующую воспалительную нейропатию, синдром беспокойных ног, синдром скованного человека, хорея Сиденгама, поперечный миелит, аутоиммунную ретинопатию, аутоиммунный увеит, синдром Когана, офтальмопатию Грейвса, промежуточный увеит, деревянистый конъюнктивит, язву Мурена, нейромиелит зрительного нерва, опсо-миоклональный синдром, оптический неврит, склерит, синдром Сусака, симпатическую офтальмию, синдром Толоса-Ханта, аутоиммунное заболевание внутреннего уха (АЗВУ), болезнь Меньера, болезнь Бехчета, эозинофильный гранулематоз с полиангиитом (ЭГПА), гигантоклеточный артериит, гранулематоз с полиангиитом (ГПА), IgA-васкулит (IgAV), болезнь Кавасаки, лейкоцитокластический васкулит, волчаночный васкулит, ревматоидный васкулит, микроскопический полиангиит (МПА), узелковый полиартериит (УПА), ревматическую полимиалгию, уртикарный васкулит, васкулит и первичный иммунодефицит. В некоторых примерах указанное аутоиммунное заболевание представляет собой диабет I типа (T1D).
[0095] В других примерах указанное заболевание представляет собой заболевание желудочно-кишечного тракта, такое как синдром короткой кишки, целиакия или воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), например, болезнь Крона или язвенный колит.
[0096] В некоторых примерах указанное заболевание представляет собой воспалительное заболевание (например, запускаемое Th2 и/или IgE воспаление). Примеры воспалительных заболеваний включают обыкновенные угри, астму, аутовоспалительные заболевания, хронический простатит, гломерулонефрит, гиперчувствительность, воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), воспалительное заболевание органов таза, реперфузионное повреждение, ревматическую лихорадку, ревматоидный артрит, саркоидоз, отторжение трансплантата, болезнь «трансплантат против хозяина», васкулит, гнойный гидраденит, дивертикулит, интерстициальный цистит. Примеры ауто воспалительных заболеваний включают семейную средиземноморскую лихорадку (ССЛ), гипериммуноглобулинемию D с периодической лихорадкой (HIDS), мевалоновую ацидурию, дефицит мевалонаткиназы, ассоциированный с ФНО-рецептором периодический синдром (TRAPS), синдром Макла-Уэлса (крапивница, глухота и амилоидоз), семейную холодовую крапивницу, мультисистемное воспалительное заболевание неонатального возраста (NOMID), периодическую лихорадку, афтозный стоматит, фарингит и аденит (PFAPA-синдром), синдром Блау, пиогенный стерильный артрит /гангренозную пиодермию/ акне (РАРА-синдром), дефицит антагониста рецептора интерлейкина-1 (DIRA).
[0097] В дополнительных примерах указанное заболевание представляет собой задержку роста. В других примерах указанное заболевание представляет собой диабет II типа (T2D), ожирение или боль (например, нейропатическую боль).
[0098] В других примерах указанное заболевание представляет собой аллергию, например, аллергию на аллерген, выбранный из аллергена пыльцы деревьев, аллергена пыльцы сорных трав, аллергена пыльцы травянистых растений, пищевого аллергена, аллергена клеща домашней пыли, аллергена плесневых грибов, аллергена частиц эпителия животных или комбинации перечисленного. В некоторых примерах указанное заболевание представляет собой аллергию на аллерген пыльцы сорных трав, например, аллерген пыльцы амброзии. В других примерах указанное заболевание представляет собой аллергию на аллерген пыльцы деревьев, такой как аллерген пыльцы березы или аллерген пыльцы японского кедра. В других дополнительных примерах указанное заболевание представляет собой аллергию на пищевой аллерген, такой как аллерген арахиса, аллерген молока, аллерген яйца, аллерген глютена (эпитоп глиадина) или комбинацию перечисленного.
Фенилкетонурия
[0099] В некоторых примерах согласно настоящему изобретению предложены способы лечения фенилкетонурии (ФКУ). Термин «фенилкетонурия» применяют в настоящем документе в соответствии с принятым в данной области техники значением. Фенилкетонурия (ФКУ) представляет собой одно из наиболее распространенных расстройств метаболизма аминокислот. Генетические дефекты (дефицит фермента ФАГ) приводят к высоким уровням фенилаланина (Phe) в крови, который может приводить к тяжелой умственной отсталости без постановки диагноза и начала лечения в раннем возрасте. Даже при соблюдении диеты у ФКУ-пациентов имеется риск возникновения когнитивных нарушений в подростковом возрасте и позднее.
Промотор
[00100] Под «промотором» понимают в общем смысле область на молекуле нуклеиновой кислоты, например, молекуле ДНК, с которой связывается и инициирует транскрипцию РНК-полимераза. Промотор, например, расположен выше, т.е. в направлении 5' от последовательности, транскрипцию которой он контролирует. Специалисту будет понятно, что промотор может быть ассоциирован с дополнительными природными регуляторными последовательностями или областями, например, операторами. Конкретная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии, может варьировать от организма к организму, однако они должны, в общем случае, включать промоторную область, которая у прокариот содержит как промотор (который направляет инициацию транскрипции РНК), так и последовательности ДНК, которые, после транскрипции в РНК, обеспечивают сигнал инициации синтеза белка. Такие области обычно включают некодирующие 5'-последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции, такие как бокс Прибнова (см. также ТАТА-бокс), последовательность Шайна-Дальгарно и т.п.
[00101] Термин «функционально связанный» относится к смежному расположению, при котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать заданным образом. Контрольная последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия указанной кодирующей последовательности происходит в условиях, совместимых с контрольными последовательностями. Например, указывается, что промотор функционально связан с геном, открытой рамкой считывания или кодирующей последовательностью, если указанная связь или соединение позволяет или обеспечивает осуществление транскрипции указанного гена. В дополнительном примере указано, что 5'- и 3'-ген, цистрон, открытая рамка считывания или кодирующая последовательность функционально связаны в полицистронной экспрессионной единицей, если указанная связь или соединение позволяет или обеспечивает осуществление трансляции по меньшей мере 3'-гена. Например, указывается, что последовательности ДНК, такие как, например, промотор и открытая рамка считывания, функционально связаны, если природа связи между указанными последовательностями (1) не приводит к введению мутации со сдвигом рамки, (2) не влияет на способность указанного промотора направлять транскрипцию указанной открытой рамки считывания, или 25 (3) не влияет на способность указанной открытой рамки считывания к транскрипции под действием последовательности области промотора.
Экспрессионная кассета
[00102] Термин «экспрессионная кассета», или «экспрессионная единица» используется в соответствии с общепринятым в данной области техники значением и относится к нуклеиновой кислоте, содержащей один или более генов, а также последовательности, контролирующие экспрессию указанных одного или более генов. Примеры экспрессионных кассет содержат по меньшей мере одну последовательность промотора и по меньшей мере одну открытую рамку считывания.
Полицистронная экспрессионная кассета
[00103] Термины «полицистронная экспрессионная кассета», «полицистронная экспрессионная единица» или «полицистронная экспрессионная система» используются в настоящем документе взаимозаменяемо, в соответствии с их общепринятым значением в данной области техники. Они относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, отличающейся тем, что экспрессию двух или более генов регулируют общие регуляторные механизмы, такие как промоторы, операторы и т.п. Термин «полицистронная экспрессионная единица» в настоящем документе синонимичен мультицистронной экспрессионной единице. Примерами полицистронных экспрессионных единиц являются, без ограничения, бицистронные, трицистронные, тетрацистронные экспрессионные единицы. Любая мРНК, содержащая две или более, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более открытых рамок считывания или кодирующих областей, кодирующих индивидуальные продукты экспрессии, такие как белки, полипептиды и/или пептиды, охвачена термином «полицистронная». Полицистронная экспрессионная кассета включает по меньшей мере один промотор и по меньшей мере две открытые рамки считывания, контролируемые указанным промотором, при этом между указанными двумя открытыми рамками считывания необязательно размещена межгенная область.
[00104] В определенном примере «полицистронная экспрессионная кассета» включает один или более эндогенных генов и один или более экзогенных генов, которые транскрипционно контролирует промотор, эндогенный для указанного микроорганизма (например, МКБ). Согласно другому варианту реализации указанная полицистронный экспрессионная единица или система согласно описанию в настоящем документе транскрипционно контролирует промотор, экзогенный для указанного микроорганизма (например, МКБ). Согласно дополнительному варианту реализации указанные трансляционно или транскрипционно сопряженные один или более эндогенных генов и один или более экзогенных генов согласно описанию в настоящем документе транскрипционно контролирует природный промотор (одного из) указанных одного или более эндогенных генов. Согласно другому варианту реализации указанную полицистронную экспрессионную единицу транскрипционно контролирует природный промотор (одного из) указанных одного или более эндогенных генов, содержащихся в указанной полицистронной экспрессионной единице. Согласно другому варианту реализации указанная полицистронная экспрессионная единица функционально связана с эндогенным промотором грамположительной бактерии. Согласно примеру варианта реализации указанный промотор может быть расположен выше, т.е. в направлении 5' от открытой рамки или рамок считывания, с которой (которыми) он функционально связан. Согласно дополнительному варианту реализации указанный промотор представляет собой природный промотор эндогенного гена, расположенного с 5'-стороны, т.е. ближе всего к 5'-концу, в полицистронной экспрессионной единице. Соответственно, в некоторых примерах указанный полицистронная экспрессионная единица содержит эндогенный ген и один или более экзогенных генов, транскрипционно сопряженных с 3'-концом указанных одного или более эндогенных генов, например, отличающихся тем, что указанные один или более экзогенных генов расположены с 3'-стороны полицистронной экспрессионной единицы.
[00105] В настоящем документе термин «трансляционно сопряженный» синонимичен термину «трансляционно связанный» или «трансляционно соединенный». Указанные термины по существу относятся к полицистронным экспрессионным кассетам или единицам. Два или более генов, две или более открытых рамок считывания или кодирующих последовательностей называются трансляционно сопряженными, если общий регуляторный элемент или элементы, такие как, в частности, общий промотор, осуществляют транскрипцию указанных двух или более генов в виде одной мРНК, кодирующей указанные два или более генов, две или более открытых рамок считывания или кодирующих последовательностей, которая может быть затем транслирована в две или более индивидуальных последовательностей полипептидов. Специалисту будет понятно, что бактериальные опероны представляют собой встречающиеся в природе полицистронные экспрессионные системы или единицы, в которых два или более генов трансляционно или транскрипционно сопряжены.
Межгенная область
[00106] В настоящем документе термин «межгенная область» синонимичен термину «межгенный линкер» или «межгенный спейсер». Межгенная область определена как последовательность поли нуклеиновой кислоты между смежными (т.е. локализованными на одной и той же последовательности полинуклеиновой кислоты) генами, открытыми рамками считывания, цистронами или кодирующими последовательностями. В более широком смысле межгенная область может включать стоп-кодон 5'-гена и/или стартовый кодон 3'-гена, которые соединены указанной межгенной областью. Согласно определению в настоящем документе термин «межгенная область» относится, в частности, к межгенным областям между смежными генами в полицистронной экспрессионной единице. Например, межгенная область согласно определению в настоящем документе может находиться между смежными генами в опероне. Соответственно, согласно варианту реализации межгенная область согласно определению в настоящем документе представляет собой межгенную область оперона.
[00107] В некоторых примерах указанные межгенную область, линкер или спейсер выбирают из межгенных областей, предшествующих, т.е. расположенных в направлении 5', более конкретно, непосредственно предшествующих с 5' стороны rplW, rpl Р, rpmD, rplB, rpsG, rpsE или rplN грамположительной бактерии. Согласно некоторым вариантам реализации указанная грамположительная бактерия представляет собой молочнокислую бактерию, например, вид Lactococcus, например, Lactococcus lactis, и любой ее подвид или штамм. Согласно варианту реализации указанная межгенная область охватывает стартовый кодон rplW, rpl Р, rpmD, rplB, rpsG, rpsE или rplN, и/или стоп-кодон предшествующего, т.е. расположенного в направлении 5', гена. Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение относится к грамположительной бактерии или рекомбинантной нуклеиновой кислоте согласно описанию в настоящем документе, в которой эндогенный ген и один или более экзогенных генов транскрипционно сопряжены посредством межгенной области или областей, активных в указанной грамположительной бактерии, например, указанные межгенная область или области являются эндогенными для указанной грамположительной бактерии, например, указанную эндогенную межгенную область выбирают из межгенных областей, предшествующих rplW, rplP, rpmD, rplB, rpsG, rpsE или rplN, rplM, rplE и rplF.
[00108] Специалисту будет понятно, что в тех случаях, когда межгенная область охватывает 5' стоп-кодон и/или 3' стартовый кодон, указанные соответствующие кодоны в некоторых случаях не присутствуют в генах, которые соединены указанными межгенными областями, чтобы избежать удвоения стартовых кодонов и/или стоп-кодонов, что может влиять на корректную инициацию и/или терминацию трансляции. Способы идентификации межгенных областей известны в данной области техники. В качестве дополнительных указаний, межгенные области могут, например, быть идентифицированы на основании предсказания оперонов и ассоциированных промоторов и открытых рамок считывания, для чего в данной области техники известно и доступно программное обеспечение. Примеры межгенных областей описаны в опубликованной международной заявке на патент WO 2012/164083, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Субъект
[00109] «Субъект» представляет собой организм, для которого может быть благоприятным введение композиции согласно настоящему описанию, например, в соответствии со способами согласно настоящему описанию. Указанный субъект может представлять собой млекопитающее («субъект-млекопитающее»). Примеры субъектов-млекопитающих включают человека, сельскохозяйственных животных (таких как коровы, свиньи, лошади, овцы, козы), домашних животных (таких как собаки, кошки и кролики) и других животных, таких как мыши, крысы и приматы. В некоторых примерах субъект-млекопитающее представляет собой пациента-человека.
Слизистая оболочка
[00110] Термин «слизистая оболочка» или «слизистая мембрана» используют в настоящем документе в соответствии с принятым в данной области техники значением. «Слизистая оболочка» может представлять собой любую слизистую оболочку, обнаруживаемую в организме, такую как слизистая оболочка полости рта, ректальная слизистая оболочка, слизистая оболочка желудка, слизистая оболочка кишечника, слизистая оболочка мочеиспускательного канала, слизистая оболочка влагалища, слизистая оболочка глаза, буккальная слизистая оболочка, слизистая оболочка бронхов или легкого, и назальная или обонятельная слизистая оболочка. Слизистая оболочка может также относиться к поверхностной слизистой оболочке, например, обнаруживаемой у рыб и амфибий.
[00111] Термин «доставка в слизистую оболочку» в настоящем документе используют в соответствии с принятым в данной области техники значением, т.е. он означает доставку в слизистую оболочку, например, посредством приведения композиции согласно настоящему описанию в контакт со слизистой оболочкой. Доставка в слизистую оболочку полости рта включает буккальный, сублингвальный и гингивальный маршруты введения. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации «доставка в слизистую оболочку» включает доставку в желудок, доставку в кишечник, ректальную доставку, буккальную доставку, легочную доставку, доставку в глаза, назальную доставку, вагинальную доставку и пероральную доставку. Специалисту будет понятно, что пероральная доставка может влиять на доставку в отдаленные части желудочно-кишечного тракта.
[00112] Термин «толерантность слизистой оболочки» относится к ингибированию специфической иммунореактивности в отношении антигена у субъекта-млекопитающего (например, пациента-человека) после воздействия антигена на указанного субъекта через слизистую оболочку. В некоторых случаях толерантность слизистой оболочки представляет собой системную толерантность. Низкодозовая пероральная толерантность представляет собой пероральную толерантность, индуцируемую низкими дозами антигенов, которая характеризуется активным подавлением иммунитета, опосредованным чувствительными к циклофосфамиду регуляторными Т-клетками, которые могут передавать толерантность нестимулированным хозяевам. Высокодозовая пероральная толерантность представляет собой пероральную толерантность, индуцируемую высокими дозами антигенов, нечувствительную к лечению циклофосфамидом и переходящую в индукцию Т-клеточной гипореактивности за счет анергии и/или удаления антиген-специфических Т-клеток. Различие в чувствительности к циклофосфамиду может быть использовано для различения низкодозовой и высокодозовой толерантности (Strobel et al., 1983). В некоторых случаях пероральная толерантность представляет собой низкодозовую пероральную толерантность согласно описанию у Mayer и Shao (2004).
Муцин
[00113] Термин «муцин» используют в настоящем документе в соответствии с принятым в данной области техники значением. Муцины представляют собой семейство гликозилированных белков (гликоконъюгатов) с высокой молекулярной массой, продуцируемых эпителиальными тканями у человека и животных. Муцины обладают способностью образовывать гели и являются ключевым компонентом секретируемых гелеобразных выделений. Некоторые муцины являются мембраносвязанными за счет наличия гидрофобного трансмембранного домена. Большинство муцинов секретируются в качестве главных компонентов слизи слизистыми мембранами или секретируются, чтобы стать компонентом слюны. Гены муцинов включают MUC1, MUC2, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7, MUC8, MUC12, MUC13, MUC15, MUC16, MUC17, MUC19, MUC20 и MUC21. MUC2 секретируется в основном в кишечнике, но также и в дыхательных путях. Зрелые муцины состоят из двух отдельных областей: амино- и карбоксиконцевые области незначительно гликозилированы, но богаты остатками цистеина. Остатки цистеина принимают участие в образовании дисульфидных связей внутри мономеров и между мономерами муцина. Большая центральная область образована несколькими тандемными повторами из последовательностей длиной 10-80 остатков, где до половины аминокислот представлены серином или треонином. Указанная область насыщается в основном О-связанными олигосахаридами. Избыточная экспрессия муциновых белков (например, MUC1) ассоциирована со многими типами рака. В контексте настоящего изобретения «муцин» может также означать «состав с муцином» или «слизистый или другой состав, содержащий муцины».
Лечение
[00114] Термины «лечение», «лечить» и т.п. в настоящем документе означает облегчение или смягчение характерных симптомов или проявлений заболевания или состояния, например, ФКУ или T1D. Например, лечение T1D может приводить к восстановлению или индукции антиген-специфической иммунотолерантности у субъекта. В других примерах лечение означает приостановку аутоиммунного диабета или обращение аутоиммунного диабета. В настоящем документе указанные термины также охватывают предотвращение или задержку возникновения заболевания или состояния, или симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием, в том числе уменьшение тяжести заболевания или состояния, или ассоциированных с ним симптомов, до поражения указанным заболеванием или состоянием. Такое предотвращение или уменьшение до поражения относится к введению указанного микроорганизма (например, бактерии) или композиции согласно настоящему описанию пациенту, не пораженному в момент введения указанным заболеванием или состоянием. «Предотвращение» также охватывает предотвращение повторного возникновения или рецидива заболевания или состояния, или ассоциированных с ним симптомов, например, после периода улучшения.
[00115] Лечение «нуждающегося в этом» субъекта означает, что у указанного субъекта имеется заболевание или состояние, и терапевтический способ согласно настоящему изобретению реализуют с преднамеренной целью лечения указанного специфического заболевания или состояния.
Терапевтически эффективное количество
[00116] В настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству непатогенного микроорганизма или композиции согласно настоящему описанию, вызывающей требуемый терапевтический эффект или ответ при введении в соответствии с требуемой схемой лечения. В некоторых случаях предложены соединения или композиции в составе единичной лекарственной формы, например, таблетки или капсулы, которая содержит количество активного компонента, эквивалентное терапевтически эффективному количеству при введении один раз или несколько раз в сутки.
[00117] Специалисту в данной области техники будет понятно, что терапевтически эффективное количество рекомбинантного микроорганизма, которое необходимо для достижения требуемого терапевтического эффекта (например, для эффективного лечения T1D), варьирует, например, в зависимости от природы полипептида, экспрессируемого указанным микроорганизмом, маршрута введения и возраста, массы тела и других характеристик реципиента.
9
[00118] Количество секретируемого полипептида может быть определено на основании количества КОЕ, определенного с применением известных в данной области техники способов, таких как количественная ПЦР или ИФА ELISA. Например, конкретный микроорганизм может секретировать по меньшей мере от приблизительно 1 нг до приблизительно 1 мкг активного полипептида на 10 КОЕ. На основании указанных данных специалист может рассчитать диапазон количества антигенного полипептида, секретируемого при других дозах КОЕ.
[00119] Терапевтически эффективные количества могут вводиться в рамках любого режима дозирования согласно описанию в настоящем документе. Ежедневная доза активного полипептида может вводиться в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 частях на протяжении дня. Также ежедневные дозы могут вводиться в течение любого количества дней, с любым количеством периодов отдыха между периодами введения. Например, доза активного агента (например, интерлейкина) от приблизительно 0,01 до приблизительно 3,0 ММЕ/сутки/субъект может вводиться раз в двое суток в общей сложности на протяжении 6 недель. В других примерах ФАЛ вводят в дозах в диапазоне от 0,1 до 1000 мг в сутки, например, в дозах 1-100 мг при каждом приеме пищи.
T1D-специфический антиген
[00120] Согласно некоторым вариантам реализации в любых из вышеперечисленных композиций и способов T1D-специфический антиген выбирают из известных аутоантигенов, вовлеченных в T1D, в том числе проинсулина (PINS); инсулина (INS); декарбоксилазы глутаминовой кислоты (GAD) (например, GAD65, GAD67 или GAD2); ассоциированного с инсулиномой белка 2 (островковый антиген-2; IA-2) (также называемого белковой тирозинфосфатазой рецепторного типа N (PTPRN), тирозинфосфатаза-подобным белком, или ICA512), (см., например, Long et al., Diabetes 2013, 62 (6), 2067-2071); специфического островкового связанного с каталитической субъединицей глюкоза-6-фосфатазы белка (IGRP), цинкового транспортера 8 (ZnT8), хромогранина А, островкового амилоидного (препро)полипептида (ppIAPP), периферина, цитруллинированного регулируемого глюкозой белка (например, GRP78); см., например, Rondas et al., Diabetes 2015; 64(2):573-586; и Ye et al., Diabetes 2010, 59(1):6-16), а также комбинаций двух или более из указанных антигенов. Согласно другим вариантам реализации в вышеперечисленных композициях и способах T1D-специфический антиген представляет собой PINS, GAD65 или IA-2. Согласно другим вариантам реализации в вышеперечисленных композициях и способах T1D-специфический антиген представляет собой PINS. Согласно различным вариантам реализации указанный T1D-специфический антиген кодирует вариант последовательности нуклеиновой кислоты, более короткий по сравнению с полноразмерным геном (например, геном дикого типа), поскольку такие «обрезанные» версии часто более эффективно экспрессируются и/или секретируются используемыми микроорганизмами (например, Lactococcus lactis). Наряду с большей эффективностью секреции многие «обрезанные» версии полностью (или по существу) сохраняют биологическую активность, например, сохраняют достаточную способность к стимуляции Treg и/или индукции толерантности.
Микроорганизм
[00121] В некоторых примерах, соответствующих любым из вариантов реализации, представленных в настоящем документе, указанный микроорганизм представляет собой непатогенный микроорганизм, например, непатогенную и неинвазивную бактерию. Согласно другим вариантам реализации указанный микроорганизм представляет собой непатогенные и неинвазивные дрожжи.
[00122] Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм представляет собой штамм дрожжей, выбранный из группы, состоящей из Saccharomyces sp., Hansenula sp., Kluyveromyces sp., Schizzosaccharomyces sp. Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Monascus sp., Geothchum sp. и Yarrowia sp. Согласно некоторым вариантам реализации указанные дрожжи представлены Saccharomyces cerevisiae. Согласно другим вариантам реализации S. cerevisiae представлен подвидом boulardii. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения векторная система на основе рекомбинантных дрожжей-хозяев представляет собой биологически ограниченную систему. Биологическое ограничение известно специалистам в данной области техники и может быть реализовано путем введения ауксотрофной мутации, например, суицидной ауксотрофной мутации такие как мутация thyA или ее эквиваленты. Как вариант, указанное биологическое ограничение может быть реализовано на уровне плазмиды, несущей ген, кодирующий полипептид, такие например, с применением нестабильной эписомной конструкции, которая через несколько поколений утрачивается. Несколько уровней ограничения, таких как нестабильность плазмиды и ауксотрофность, могут быть скомбинированы для обеспечения, при необходимости, высокого уровня ограничения.
[00123] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм представляет собой бактерию, такую как непатогенная бактерия, например, бактериальный штамм пищевого качества. В некоторых примерах указанная непатогенная бактерия представляет собой грамположительную бактерию, например, грамположительный бактериальный штамм пищевого качества. Согласно некоторым вариантам реализации указанный грамположительный бактериальный штамм пищевого качества представляет собой способный к молочнокислому брожению бактериальный штамм (т.е. молочнокислую бактерию (МКБ)) или бифидобактерию).
[00124] Согласно некоторым вариантам реализации указанный способный к молочнокислому брожению бактериальный штамм представляет собой вид Lactococcus, Lactobacillus или Bifidobacterium. В настоящем документе Lactococcus или Lactobacillus не ограничены конкретным видом или подвидом; подразумевается, что включен любой из видов или подвидов Lactococcus или Lactobacillus. Примеры видов Lactococcus включают Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum и Lactococcus rafflnolactis. В некоторых примерах указанный Lactococcus lactis представляет собой Lactococcus lactis подвида cremoris, Lactococcus lactis подвида hordniae или Lactococcus lactis подвида lactis.
[00125] Примеры видов Lactobacillus включают Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus aviarius подвида araffinosus, Lactobacillus aviarius подвида aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei подвида alactosus, Lactobacillus casei подвида casei, Lactobacillus casei подвида pseudoplantarum, Lactobacillus casei подвида rhamnosus, Lactobacillus casei подвида tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis подвида coryniformis, Lactobacillus coryniformis подвида torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus подвида curvatus, Lactobacillus curvatus подвида melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii подвида bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii подвида delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii подвида lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei подвида paracasei, Lactobacillus paracasei подвида tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei подвида camosus, Lactobacillus sakei подвида sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius подвида salicinius, Lactobacillus salivarius подвида salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus uli, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis подвида mali, Lactobacillus yamanashiensis подвида Yamanashiensis, Lactobacillus zeae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium infantis. В некоторых примерах указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis (LL).
[00126] Согласно дополнительным примерам указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из Enterococcus alcedinis, Enterococcus aquimarinus, Enterococcus asini, Enterococcus avium, Enterococcus caccae, Enterococcus camelliae, Enterococcus canintestini, Enterococcus canis, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus devriesei, Enterococcus diestrammenae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus eurekensis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus hirae, Enterococcus italicus, Enterococcus lactis, Enterococcus lemanii, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus olivae, Enterococcus pallens, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus quebecensis, Enterococcus raffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus rivorum, Enterococcus rotai, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus silesiacus, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus, Enterococcus termitis, Enterococcus thailandicus, Enterococcus ureasiticus, Enterococcus ureilyticus, Enterococcus viikkiensis, Enterococcus villorum и Enterococcus xiangfangensis.
[00127] Согласно дополнительным примерам указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus constellatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus salivarius, Streptococcus tigurinus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Streptococcus viridans и Streptococcus zooepidemicus.
[00128] Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения указанный грамположительный бактериальный штамм пищевого качества представляет собой Lactococcus lactis или любой из ее подвидов, в том числе Lactococcus lactis подвида cremoris, Lactococcus lactis подвида hordniae и Lactococcus lactis подвида lactis. Согласно другому аспекту настоящего изобретения указанный рекомбинантный грамположительный бактериальный штамм представляет собой биологически ограниченную систему, такую как бесплазмидный штамм Lactococcus lactis MG1363, утративший способность к нормальному росту и продуцированию кислоты в молоке (Gasson, M.J. (1983) J. Bacteriol. 154:1-9); или ауксотрофные по треонину и пиримидину производные штаммы L. lactis (Sorensen et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258; Glenting et al. (2002) 68:5051-5056).
[00129] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанная бактерия не является Е. coli.
[00130] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная векторная система на основе рекомбинантного бактериального хозяина представляет собой биологически ограниченную систему. Биологическое ограничение известно специалистам в данной области техники и может быть реализовано путем введения ауксотрофной мутации, например, суицидной ауксотрофной мутации, такой как мутация thyA или ее эквиваленты. Как вариант, указанное биологическое ограничение указанное биологическое ограничение может быть реализовано на уровне плазмиды, несущей ген, кодирующий полипептид, например, с применением нестабильной эписомной конструкции, которая через несколько поколений утрачивается. Несколько уровней ограничения, таких как нестабильность плазмиды и ауксотрофность, могут быть скомбинированы для обеспечения, при необходимости, высокого уровня ограничения.
Связывание и адгезия молекул
[00131] Термины «связывание» и «адгезия» в настоящем документе являются в значительной мере синонимичными. Связывание/адгезия с клетками млекопитающих и/или биологическими поверхностями, такими как слизь, фибронектин, коллаген или другими поверхностями неживой материи могут быть оценены в моделях in vitro; и in vivo путем, например, измерений колонизации, персистенции или на основании биологического эффекта.
[00132] Такое связывание/адгезия, как правило, является специфическим в отношении целевой молекулы, клетки или сайта. Организмы могут продуцировать широкий спектр молекул (часто представляющих собой полипептиды, гликопротеины и углеводы), способствующих связыванию и адгезии к другим клеткам, неживым объектам и клеточным продуктам, таким как слизь. Такие молекулы, способствующие связыванию и адгезии, обладают различными степенями специфичности в отношении целевой молекулы, как правило, другого белка, гликопротеина или углевода. Экспрессия разных связывающих молекул приводит к преимущественному связыванию с разными биологическими поверхностями. Например, разные клетки ЖКТ экспрессируют разные поверхностные молекулы, и частота встречаемости специфических поверхностных молекул на протяжении ЖКТ может различаться. Соответственно, бактериальная клетка может преимущественно связываться со специфической клеткой-хозяином, или со специфической областью ЖКТ. Связывание может быть ассоциировано с повышенной колонизацией, доставкой целевых белков в целевой сайт, увеличенной продолжительностью времени транзита через ЖКТ и так далее. В то же время связывание с одним сайтом в ЖКТ может быть ассоциировано с пониженным связыванием с другим сайтом в ЖКТ.
[00133] Естественная изменчивость бактериальных связывающих белков может быть дополнена мутациями и рекомбинацией для экспрессии мотивов из других связывающих молекул, в том числе из других организмов. Такие рекомбинантные связывающие белки могут быть экспрессированы по отдельности или в виде гибридных белков, с обеспечением нескольких типов связывающей специфичности у одной молекулы.
[00134] Для связывания бактерии с биологической поверхностью с помощью белка, связывающий полипептид, как правило, экспортируется из цитоплазмы и заякоривается на поверхности бактерии. У грамположительных бактерий, таких как Lactococcus, молекулы адгезии, как правило, экспрессируются с (а) N-концевым сигналом секреции, направляющим секрецию через цитоплазматическую мембрану и (b) C-концевым заякоривающим доменом, который заякоривает указанный полипептид в клеточной стенке (т.е. «домен заякоривания в клеточной стенке»). В отсутствие заякоривающего домена указанный полипептид высвобождается во внеклеточное окружение.
[00135] Например, факторы «трилистника» (TFF) секретируются животными клетками, связываются со слизью и оказывают ряд биологических эффектов, в том числе обеспечивают заживление слизистой мембраны. Может быть сконструирована бактерия, секретирующая TFF во внеклеточное окружение, чтобы способствовать заживлению слизистой мембраны, путем добавления бактериального сигнала секреции к TFF рекомбинантным способом. Может быть также сконструирована бактерия со связывающими слизь свойствами, путем добавления к TFF как сигнала секреции, так и сигнала заякоривания.
Клеточно-адгезивный полипептид
[00136] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм (например, бактерия) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, содержащий клеточно-адгезивный полипептид. Любой полипептид, проявляющий клеточно-адгезивные свойства, например, связывающийся с клетками кишечника или линиями клеток кишечника (например, с клетками Сасо-2, IEC-18 или НТ29-МТХ), подходит для применения в контексте настоящего изобретения. Клеточно-адгезивные свойства могут быть измерены с применением принятых в данной области техники способов, например, описанных в настоящем документе. В некоторых примерах указанный клеточно-адгезивный полипептид выбирают из связывающего клетки и слизь белка A (CmbA) (см., например, Jensen et al., Microbiology 2014, 160(4):671-681), связывающего слизь белка или белков с доменом mub (Mub) (см., например, Boekhorst et al., Microbiology 2006, 152(1):273-280), белка, способствующего адгезии к слизи (МарА) (см., например, Miyoshi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2006, 70(7): 1622-8), лактококкового муцин-связывающего белка (MpbL) (см., например,  et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000). В некоторых примерах указанный гибридный белок может включать пептид заякоривания в клеточной стенке, такой как заякоривающий фрагмент белка А Staphylococcus aureus (SpaX) (см., например, Steidler et al., Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64(1):342-5). Содержание всех вышеперечисленных источников включено в настоящий документ полностью посредством ссылки. В некоторых примерах указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой полипептид CmbA, такой как CmbA из Lactobacillus reuteri. См., например, АТСС РТА6474, например, согласно описанию в Jensen et al., выше.
[00137] В некоторых примерах, соответствующих вышеописанным вариантам реализации, указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой полипептид CmbA, имеющий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1. В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой полипептид CmbA, кодируемый экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 2.
Муцин-связывающий полипептид
[00138] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения микроорганизм (например, бактерия) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, содержащий муцин-связывающий полипептид. Любой полипептид, проявляющий муцин-связывающие свойства, например, связывающийся с муциновыми составами in vitro, подходит для применения в контексте настоящего изобретения. Муцин-связывающая способность может быть измерена с применением известных в данной области техники способов, таких как описанные в настоящем документе. Примеры муцин-связывающих полипептидов включают полипептиды фактора «трилистника» (TFF) (например, TFF1, TFF2 или TFF3) (см., например, Caluwaerts, S. et al., Oral. Oncol. 2010, 46:564-570) и полипептиды MucBP (см., например, Lukic et al., Appl. Environ. Microbiol. 2012, 78(22):7993-8000). В некоторых примерах согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм (например, бактерия), содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, при этом указанный гибридный белок содержит клеточно-адгезивный полипептид (например, полипептид CmbA) и муцин-связывающий полипептид (например, полипептид TFF). В некоторых примерах указанный полипептид TFF представляет собой полипептид TFF человека (например, hTFF1, hTFF2 или hTFF3). В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный муцин-связывающий полипептид представляет собой полипептид TFF3 человека, имеющий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. В других примерах, соответствующих любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный муцин-связывающий полипептид представляет собой полипептид TFF3 человека, кодируемый экзогенной последовательностью нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых примерах указанный муцин-связывающий полипептид представляет собой полипептид TFF рыб, или полипептид TFF амфибий. В других дополнительных примерах указанный муцин-связывающий полипептид включает подобный фактору трилистника домен, такой как описанный в источнике: Fujita et al., Mol. Reprod. Dev. 2006, 75(7): 1217-1228 (или состоит из указанного домена).
Конструкции
[00139] Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм (например, бактерия, такая как Lactococcus lactis) содержит экспрессионный вектор, способный экспрессировать указанный гибридный белок и, необязательно, терапевтический полипептид. Например, указанный гибридный белок экспонирован на поверхности клеток в условиях, обеспечиваемых на слизистой оболочке, например, в желудочно-кишечном тракте. Указанный микроорганизм (например, бактерия) может содержать экспрессионные векторы, способные экспрессировать указанный гибридный белок таким образом, чтобы указанный гибридный белок был экспонирован на поверхности клеток в достаточной для обеспечения требуемого удержания в ЖКТ степени. Специалист в данной области техники может скорректировать количество микроорганизмов (например, бактерии), вводимое указанному субъекту, для доставки требуемого количества терапевтического полипептида.
[00140] Обычно экспрессионная система содержит генетическую конструкцию, содержащую по меньшей мере одну последовательность нуклеотидов, кодирующую по меньшей мере один гибридный белок, например, функционально связанный с промотором, способным направлять экспрессию указанной последовательности или последовательностей в микроорганизме-хозяине. В соответствующих случаях подлежащий экспрессии гибридный белок может кодировать последовательность нуклеиновой кислоты, адаптированную в соответствии с предпочтительным использованием кодонов у хозяина. Указанная конструкция может дополнительно содержать (все) другие подходящие элементы, в том числе энхансеры, последовательности инициации транскрипции, сигнальные последовательности, репортерные гены, последовательности терминации транскрипции и т.п., функциональные у выбранного хозяина, как известно специалисту в данной области техники.
[00141] В некоторых примерах указанная конструкция находится в форме, подходящей для трансформации хозяина, и/или в форме, которая может стабильно поддерживаться хозяином, такой как вектор, плазмида или минихромосома. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие нуклеиновую кислоту для введения в микроорганизмы (например, бактерии), которые содержат подходящие регуляторные последовательности, в том числе промоторные последовательности, терминаторные фрагменты, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности, по мере целесообразности. Векторы могут быть плазмидными, вирусными (например, фаговыми или фагмидными) по мере целесообразности. Дополнительную информацию можно найти, например, в источнике: Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, релевантное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
[00142] Многие известные методики и протоколы для манипуляций с нуклеиновыми кислотами, например, при получении конструкций нуклеиновых кислот, мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и генной экспрессии, а также анализа белков, подробно описаны в источнике: Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, 1992, релевантное содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки. Согласно одному варианту реализации кодирующая последовательность гибридного белка содержится в опероне, т.е. в конструкции нуклеиновой кислоты для полицистронной экспрессии. В опероне транскрипция с промотора приводит к образованию мРНК, которая содержит более чем одну кодирующую последовательность, при этом каждая из последовательностей имеет собственный подходящим образом расположенный сайт связывания рибосомы в 5'-направлении. Таким образом, с одной мРНК может быть транслировано более одного полипептида. Применение оперона позволяет обеспечить скоординированную экспрессию гибридного белка и терапевтического полипептида. Полицистронные экспрессионные системы в бактериальных клетках-хозяевах описаны, например, в заявке на патент США №2014/0105863 Vanden-Broucke с соавторами, которая включена в настоящий документ полностью посредством ссылки.
[00143] Согласно варианту реализации настоящее изобретение относится к стабильно трансфицированным микроорганизмам (например, бактериям). В некоторых примерах согласно настоящему изобретению предложены микроорганизмы (например, бактерии), в которых экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный гибридный белок, была интегрирована в хромосому клетки-хозяина. Методики получения стабильно трансфицированных микроорганизмов известны в данной области техники. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, может быть клонирована в хромосому хозяина посредством гомологичной рекомбинации. В некоторых примерах имеющий существенное значение ген хозяина разрушают с применением гомологичной рекомбинации, например, делеции указанного гена, одной или более замен аминокислот, приводящих к получению неактивной формы белка, кодируемого указанным имеющим существенное значение геном, или мутации со сдвигом рамки, приводящей к получению усеченной формы белка, кодируемого указанным имеющим существенное значение геном. Согласно варианту реализации указанный имеющий существенное значение ген представляет собой ген thyA. Пример методики описан, например, в WO 02/090551, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки. Трансформирующая плазмида может представлять собой любую плазмиду, при условии, что она не может дополнять разрушенный имеющий существенное значение ген, например, ген thyA. Указанная плазмида может быть самореплицирующейся, может нести один или более генов, представляющих интерес, и может нести один или более маркеров устойчивости. В некоторых примерах указанная плазмида представляет собой интегративную плазмиду (т.е. плазмиду для интеграции). Такая интегративная плазмида может применяться для разрушения имеющего существенное значение гена, обеспечивая интеграцию в локусе указанного имеющего существенное значение гена, например, в сайте thyA, с разрушением в результате функции указанного имеющего существенное значение гена, например, гена thyA. В некоторых примерах указанный имеющий существенное значение ген, такой как ген thyA, посредством двойной гомологичной рекомбинации заменяют кассетой, содержащей ген или гены, представляющие интерес, фланкированные нацеливающими последовательностями, которые нацеливают инсерцию на имеющий существенное значение ген, например, целевой сайт thyA. Следует понимать, что указанные нацеливающие последовательности обладают достаточной длиной и достаточной гомологией, чтобы обеспечивать интеграцию представляющего интерес гена в целевой сайт.
[00144] Генетическая конструкция, кодирующая указанный гибридный белок, может присутствовать в клетке-хозяине экстрахромосомно, например, автономно реплицироваться с использованием собственной точки начала репликации, или может быть интегрирована в микробную геномную ДНК, например, в бактериальную или дрожжевую хромосому, например, хромосому Lactococcus. В последнем случае может быть интегрирована одна копия или несколько копий нуклеиновой кислоты; интеграция может происходить в случайном сайте хромосомы или, согласно описанию выше, в заранее заданном сайте хромосомы, например, в локусе thyA Lactococcus, например, Lactococcus lactis.
[00145] Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации генетическая конструкция, кодирующая указанный гибридный белок, может дополнительно содержать последовательности, способные осуществлять инсерцию указанной генетической конструкции в хромосому клетки-хозяина. В некоторых примерах инсерции указанной генетической конструкции в конкретные сайты в микробном геноме, например, в хромосоме клетки-хозяина, может содействовать гомологичная рекомбинация. Например, генетическая конструкция согласно настоящему описанию может содержать одну или более областей гомологии указанному сайту интеграции в хромосоме клетки-хозяина. Последовательность в указанном хромосомном сайте может быть естественной, т.е. встречающейся в природе, или может представлять собой экзогенную последовательность, введенную путем генетического конструирования ранее.
[00146] В некоторых примерах размер указанной области или областей гомологии может составлять по меньшей мере 50 пар оснований (п.о.), 100 п.о., 200 п.о., 300 п.о., 400 п.о., 500 п.о., 600 п.о. 700 п.о., 800 п.о., 900 п.о., 1000 п.о. или более.
[00147] Согласно одному примеру могут быть включены две области гомологии, по одной фланкирующей области с каждой стороны релевантных экспрессионных единиц, присутствующих в генетической конструкции. Такая конфигурация может обеспечивать благоприятное встраивание релевантных последовательностей в клетки-хозяева. Способы проведения гомологичной рекомбинации, в частности, у бактериальных хозяев, и отбора рекомбинантных хозяев общеизвестны в данной области техники.
[00148] Специалисту в данной области техники известны способы трансформации микроорганизмов, такие как, например, трансформация протопластов и электропорация.
[00149] Высокая степень экспрессии может быть достигнута путем применения гомологичных сигналов экспрессии и/или секреции на экспрессионных векторах, присутствующих в микроорганизме, например, Lactococcus lactis. Сигналы экспрессии будут понятны для специалиста в данной области техники. Указанный экспрессионный вектор может быть оптимизирован для экспрессии с учетом микроорганизма, в который его включают. Например, известны специфические экспрессионные векторы, обеспечивающие достаточные уровни экспрессии у Lactococcus, Lactobacillus lactis, casei и plantarum. Кроме того, известны системы, которые были разработаны для экспрессии гетерологичных антигенов в непатогенной, неколонизирующей неинвазивной бактерии пищевого качества Lactococcus lactis (см. патент Великобритании GB 2278358 B, который включен в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых примерах конструкция согласно настоящему описанию содержит мультикопийный экспрессионный вектор, описанный в PCT/NL95/00135 (WO-A-96/32487), в который была включена последовательность нуклеотидов, кодирующая гибридный белок. Такая конструкция подходит, в частности, для экспрессии требуемого полипептида молочнокислой бактерией, в частности, Lactobacillus, на высоком уровне, а также может применяться для направления экспрессированного продукта к поверхности бактериальной клетки. Указанные конструкции (например, согласно PCT/NL95/00135) могут характеризоваться наличием содержащей по меньшей мере минимальную последовательность, необходимую для распознавания рибосомы и стабилизации РНК, нетранслируемой 5'-последовательности нуклеиновой кислоты, которая предшествует последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный гибридный белок. За указанной последовательностью может следовать кодон инициации трансляции, за которым может (непосредственно) следовать фрагмент из по меньшей мере 5 кодонов 5'- концевой части транслируемой последовательности нуклеиновой кислоты гена молочнокислой бактерии, или структурный или функциональный эквивалент указанного фрагмента. Указанный фрагмент может также находиться под контролем промотора. Содержание PCT/NL95/00135, включая раскрытые различающиеся варианты реализации, и все другие документы, упоминаемые в указанном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки. Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ, который позволяет обеспечить высокий уровень регулируемой экспрессии гетерологичных генов у хозяина и сопряжение экспрессии с секрецией. Согласно другому варианту реализации используют РНК-полимеразу бактериофага Т7 и когнатный промотор для разработки мощной экспрессионной системы в соответствии с WO 93/17117, включенным в настоящий документ посредством ссылки. Согласно одному варианту реализации экспрессионная плазмида происходит из pT1 NX.
[00150] Согласно некоторым вариантам реализации указанная бактерия конститутивно экспрессирует используемый в соответствии с настоящим изобретением промотор. Применение конститутивного промотора позволяет избежать необходимости добавления индуктора или другого регуляторного сигнала для осуществления экспрессии. Например, указанный промотор направляет осуществление экспрессии на уровне, при котором бактериальная клетка-хозяин остается жизнеспособной, т.е. сохраняет некоторую метаболическую активность, даже если не поддерживается рост. Такая экспрессия может предпочтительным образом осуществляться на незначительном уровне. Например, если продукт экспрессии накапливается внутри клеток, указанный уровень экспрессии может приводить к накоплению указанного продукта экспрессии на уровне менее чем приблизительно 10% клеточного белка, или приблизительно или менее чем приблизительно 5%, например, приблизительно 1-3% клеточного белка. Указанный промотор может быть гомологичным для используемой бактерии, т.е. представлять собой промотор, обнаруживаемый в указанной бактерии в природе. Например, промотор лактококков может применяться для Lactococcus. Примером промотора для применения в Lactococcus lactis (или других лактококков) является «Р1», происходящий из хромосомы Lactococcus lactis (Waterfield, N.R., Lepage, R.W.F., Wilson, P.W., et al. (1995). "The isolation of lactococcal promoters and their use in investigating bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis" Gene 165(1):9-15). Другим примером промотора является промотор usp45. Другие подходящие промоторы описаны в патенте США 8759088, авторы Steidler et al., и в заявке на патент США №2014/0105863, авторы Vandenbroucke et al., содержание которых включено в настоящий документ полностью посредством ссылок.
[00151] Конструкция или конструкции нуклеиновых кислот могут содержать секреторную сигнальную последовательность. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, может обеспечивать секрецию полипептидов, например, путем сопряжения надлежащим образом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный полипептид). Способность бактерии, несущей указанную нуклеиновую кислоту, к секреции антигена может быть протестирована in vitro в условиях культивирования, поддерживающих жизнеспособность указанного организма. Примеры последовательностей сигналов секреции включают любые такие последовательности, активные в грамположительных организмах, таких как Bacillus, Clostridium и Lactobacillus. Такие последовательности могут включать лидер секреции α-амилазы Bacillus amyloliquefaciens или лидер секреции фермента стафилокиназы, секретируемого некоторыми штаммами Staphylococcus, который, как известно, функционирует как в грамположительных, так и в грамотрицательных хозяевах (см. «Gene Expression Using Bacillus,» Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnology 1:21-27), или лидерные последовательности многих других ферментов Bacillus или белков S-слоя (см. стр. 341-344 источника: Harwood and Cutting, «Molecular Biological Methods for Bacillus», John Wiley & Co. 1990). Согласно одному варианту реализации указанный сигнал секреции происходит из usp45 (Van Asseldonk et al., Mol. Gen. Genet. 1993, 240:428-434). Согласно некоторым вариантам реализации указанный гибридный белок секретируется конститутивно.
Составы и режимы
[00152] Согласно описанным в настоящем документе способам один микроорганизм или разные микроорганизмы могут экспрессировать несколько терапевтических полипептидов. Например, (а) ФАЛ и де карбоксил азу аминокислот; (b) T1D-специфический антиген, такой как PINS, и активирующий Treg цитокин, такой как ИЛ-2 или ИЛ-10 (с) глютеновый антиген и ИЛ-2 или ИЛ-10, и т.п. При экспрессии в отдельных организмах одна или, предпочтительно, обе бактерии экспрессируют связывающие муцин и/или клетки факторы. Если два полипептида экспрессируют разные микроорганизмы, указанные микроорганизмы могут вводиться указанному субъекту в одном составе (например, комбинированном) или в отдельных (например, разных) составах. Отдельные составы могут вводиться в одно и то же время или в разные моменты времени. Например, продуцирующие первый и второй терапевтический полипептид микроорганизмы в соответствующих составах могут быть введены указанному субъекту одновременно или последовательно, например, с периодом отдыха между введениями.
[00153] Согласно некоторым вариантам реализации микроорганизмы, продуцирующие указанные первый и второй терапевтический полипептид, вводят одновременно. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, микроорганизм, продуцирующий указанный первый терапевтический полипептид, и микроорганизм, продуцирующий указанный второй терапевтический полипептид входят в один и тот же фармацевтический состав, или в более чем один фармацевтический состав, принимаемые одновременно. Согласно некоторым вариантам реализации указанные два биоактивных полипептида доставляют указанному субъекту с применением микроорганизма, продуцирующего как ИЛ-2, так и T1D-специфический антиген.
[00154] Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм вводят один, два, три, четыре, пять или шесть раз ежедневно, например, используя пероральный состав. Согласно некоторым вариантам реализации указанные микроорганизмы вводят ежедневно, один раз в двое суток, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю или четыре раза в неделю. Согласно другим вариантам реализации лечение проводят один раз в две недели. Согласно другим вариантам реализации лечение проводят один раз в три недели. Согласно другим вариантам реализации лечение проводят один раз в месяц.
[00155] Продолжительность цикла лечения с применением указанного способа составляет, например, 7 дней на протяжении жизни субъекта, при необходимости, для лечения или обращения заболевания, или предотвращения рецидива. Согласно некоторым вариантам реализации цикл лечения продолжается от приблизительно 30 дней до приблизительно 2 лет. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 1,5 лет. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 1 года. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 11 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 10 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 9 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 8 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 7 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 6 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 5 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 4 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 3 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 2 месяцев.
[00156] Ежедневные поддерживающие дозы могут вводиться на протяжении клинически целесообразного для субъекта периода, например, от 1 дня до нескольких лет (например, на протяжении всей оставшейся жизни субъекта); например, от приблизительно (2, 3 или 5 дней, 1 или 2 недель, или 1 месяца) и дольше, и/или, например, до приблизительно (5 лет, 1 года, 6 месяцев, 1 месяца, 1 недели, либо 3 или 5 дней). Типичным является введение ежедневной поддерживающей дозы в течение приблизительно 3 - приблизительно 5 дней, или приблизительно 1 недели - приблизительно 1 года. Единицы дозы могут вводиться от двух раз в сутки до одного раза в две недели до достижения наблюдаемого терапевтического эффекта.
[00157] Микроорганизмы, продуцирующие указанные первый и второй терапевтические полипептиды, могут быть доставлены для лечения заболевания в рамках монотерапии или комбинированной терапии. Согласно некоторым вариантам реализации композиции согласно настоящему описанию включают дополнительные терапевтически активные агенты. Согласно некоторым вариантам реализации в композициях согласно настоящему описанию и при лечении субъекта не задействованы другие активные компоненты, например, не задействованы дополнительные иммуномодулирующие вещества, такие как антитела (например, антитела против CD3 для лечения T1D). Соответственно, в некоторых примерах фармацевтические композиции согласно настоящему описанию состоят по существу из микроорганизма согласно описанию в настоящем документе (экспрессирующего терапевтический ИЛ-2 и полипептидные антигены) и фармацевтически приемлемого носителя.
Фармацевтические композиции и носители
[00158] Микроорганизмы (например, бактерии или дрожжи согласно описанию в настоящем документе) могут быть введены в чистом виде, скомбинированы с другими активными ингредиентами и/или скомбинированы с фармацевтически приемлемыми (т.е. нетоксичными) вспомогательными веществами или носителями. Термин «фармацевтически приемлемый» применяют в настоящем документе в соответствии с принятым в данной области техники значением, и он относится к носителям, совместимым с другими ингредиентами фармацевтической композиции и не оказывающим пагубного действия на реципиента.
[00159] Композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены в любой известной или иной эффективной дозировке или форме продукта, подходящей для обеспечения системной доставки указанного микроорганизма (например, бактерий) в слизистую оболочку, что включает фармацевтические композиции и лекарственные формы, а также формы питательных продуктов.
[00160] Согласно некоторым вариантам реализации указанный состав представляет собой пероральный состав или фармацевтическую композицию. В некоторых примерах, соответствующих указанному варианту реализации, указанный состав или указанная фармацевтическая композиция содержит непатогенный микроорганизм в форме сухого порошка (например, в высушенной сублимацией форме) или его прессованного варианта, необязательно в комбинации с другими сухими носителями. Составы для перорального применения обычно включают инертный разбавляющий носитель или съедобный носитель.
[00161] В некоторых примерах указанный пероральный состав содержит покрытие или получен с применением стратегии инкапсуляции, что облегчает доставку указанного состава в кишечный тракт, и/или позволяет обеспечить высвобождение и увлажнение указанного микроорганизма в кишечном тракте (например, в подвздошной кишке, тонком кишечнике или ободочной кишке). После высвобождения микроорганизма из состава и достаточного увлажнения он начинает экспрессировать биоактивный полипептид, который затем высвобождается в окружающую среду, или экспрессируются на поверхности микроорганизма. Такие стратегии нанесения покрытий и инкапсуляции (т.е. стратегии отсроченного высвобождения) известны специалистам в данной области техники. См., например, источники: U.S. 5972685; WO 2000/18377; и WO 2000/22909, содержание которых включено в настоящий документ полностью посредством ссылок.
[00162] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая микроорганизм (например, непатогенные бактерии) в лиофилизированной или сублимированной форме, необязательно в сочетании с другими компонентами, такими как декстраны, глутамат натрия и многоатомные спирты. Примеры сублимированных композиций описаны, например, в заявке на патент США №2012/0039853, авторы Corveleyn et al., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Примеры составов включают высушенные сублимацией бактерии (например, терапевтически эффективное количество бактерий) и фармацевтически приемлемый носитель. Высушенные сублимацией бактерии могут быть введены в состав капсул, таблеток, гранулятов и порошков, каждый из которых может вводиться перорально. Как вариант, высушенные сублимацией бактерии могут быть введены в состав водный или масляных суспензий в подходящих средах, или лиофилизированные бактерии могут быть суспензированы в подходящей среде, такой как напиток, непосредственно перед применением.
th
nd
[00163] Состав для перорального введения может представлять собой гастрорезистентную лекарственную форму для перорального применения. Например, указанная лекарственная форма для перорального применения (например, капсулы, таблетки, пеллеты, микропеллеты, грануляты и т.п.) может быть покрыта тонким слоем вспомогательного вещества (обычно полимерами, целлюлозными производными и/или липофильными материалами), устойчивого к растворению или разрушению в желудке, однако не в кишечнике, с обеспечением таким образом транзита через желудок, способствующего распадению, растворению и абсорбции в кишечнике (например, в тонком кишечнике или ободочной кишке). В некоторых примерах составы для перорального применения могут включать соединения, обеспечивающие контролируемое высвобождение, продолжительное высвобождение или пролонгированное высвобождение микроорганизма, с обеспечением таким образом контролируемого высвобождения требуемого кодируемого им белка. Указанные лекарственные формы (например, таблетки или капсулы), как правило, содержат стандартные и хорошо известные вспомогательные вещества, такие как липофильные, полимерные, целлюлозные, нерастворимые, набухающие вспомогательные вещества. Составы для контролируемого высвобождения могут также применяться для любых других сайтов доставки, включая доставку в кишечник, ободочную кишку, биоадгезивную или сублингвальную доставку (т.е. доставку в слизистую оболочку зубов) и доставку в бронхи. Если композиции согласно настоящему изобретению предназначены для ректального или вагинального введения, фармацевтические составы могут включать суппозитории и кремы. В указанном случае клетки-хозяева суспензируют в смеси обычных вспомогательных веществ, включающих также липиды. Все вышеупомянутые составы хорошо известны в данной области техники и описаны, например, например, в следующих источниках: Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5 edition, William and Wilkins); Chien 1992, (Novel drug delivery system, 2 edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug delivery, J. Wiley & Sons); Gazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for colonic specific delivery, Int. J. Pharm. 108:77-83).
[00164] Согласно некоторым вариантам реализации указанный пероральный состав включает соединения, которые могут улучшать доставку в слизистую оболочку и/или поглощение в слизистой оболочке биоактивных полипептидов, экспрессируемых микроорганизмом. В других примерах указанный состав включает соединения, который повышают жизнеспособность микроорганизма в указанном составе и/или после высвобождения.
[00165] Бактерии согласно настоящему изобретению могут быть суспензированы в фармацевтическом составе для введения человеку или животному, страдающему заболеванием, подлежащим лечению. Такие фармацевтические составы включают, не ограничиваясь перечисленными, живые грамположительные бактерии и среду, подходящую для введения. Указанные бактерии могут быть лиофилизированы в присутствии обычных вспомогательных веществ, таких как лактоза, другие сахара, стеарат, карбонат и/или сульфат щелочного и/или щелочно-земельного металла (например, стеарат магния, карбонат натрия и сульфат натрия), каолин, кремнезем, вкусоароматические вещества и ароматизаторы. Бактерии, лиофилизированные таким образом, могут быть получены в форме капсул, таблеток, гранулятов и порошков (например, ополаскивателя для полости рта в виде порошка), любые из которых могут вводиться перорально. Как вариант, некоторые грамположительные бактерии могут быть введены в состав водных суспензий в подходящих средах, или лиофилизированные бактерии могут быть суспензированы в подходящей среде непосредственно перед применением, при этом такая среда включает вспомогательные вещества, упомянутые в настоящем документе, и другие вспомогательные вещества, такие как глюкоза, глицин и сахаринат натрия.
[00166] В некоторых примерах указанный микроорганизм доставляют локально в желудочно-кишечный тракт субъекта с применением любого подходящего способа. Например, системы доставки на основе микросфер могут быть использованы для улучшения доставки в кишечник. Системы доставки на основе микросфер включают микрочастицы с покрытием, которое обеспечивает локализованную доставку в желудочно-кишечный тракт субъекта (например, составы для контролируемого высвобождения, такие как покрытые кишечнорастворимой оболочкой составы и составы для толстой кишки).
[00167] Могут быть получены гастрорезистентные лекарственные формы для перорального применения, которые могут также включать соединения, обеспечивающие контролируемое высвобождение грамположительных бактерий с обеспечением таким образом контролируемого высвобождения требуемого кодируемого ими белка (например, ИЛ-2). Например, указанная лекарственная форма для перорального применения (в том числе капсулы, таблетки, пеллеты, грануляты, порошки) может быть покрыта тонким слоем вспомогательного вещества (например, полимерами, целлюлозными производными и/или липофильными материалами), устойчивыми к растворению или разрушению в желудке, однако не в кишечнике, обеспечением таким образом транзита через желудок, способствующего распадению, растворению и абсорбции в кишечнике.
th
nd
[00168] Может быть разработана лекарственная форма для перорального применения, позволяющая обеспечить медленное высвобождение грамположительных бактерий и продуцированных экзогенных белков, например, в виде таблеток или капсул для контролируемого высвобождения, для продолжительного высвобождения, для пролонгированного высвобождения, для продолжительного действия. Указанные лекарственные формы обычно содержат стандартные и хорошо известные вспомогательные вещества, такие как липофильные, полимерные, целлюлозные, нерастворимые, набухающие вспомогательные вещества. Такие составы хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в следующих источниках: Hansel et al., Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5 edition, William and Wilkins, 1990; Chien 1992, Novel drug delivery system, 2 edition, M. Dekker; Prescott et al., Novel drug delivery, J. Wiley & Sons, 1989; и Gazzaniga et al., Int. J. Pharm. 108:77-83 (1994).
[00169] Указанная фармацевтическая лекарственная форма (например капсула) содержит покрытие из рН-зависимых полимеров Eudragit для обеспечения устойчивости к желудочному соку и запланированной доставки в терминальный отдел подвздошной кишки и ободочную кишку, где указанные полимеры растворяются при рН 6,5. Путем применения других полимеров Eudragit или другой пропорции полимеров профиль отсроченного высвобождения может быть скорректирован для высвобождения указанных бактерий, например, в двенадцатиперстной кишке или тощей кишке.
[00170] Фармацевтические композиции содержат по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Неограничивающие примеры подходящих вспомогательных веществ, разбавителей и носителей включают консерванты, неорганические соли, кислоты, основания, буферы, питательные вещества, витамины, наполнители и агенты для увеличения объема, такие как крахмал, сахара, маннит и производные кремнезема; связующие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; увлажняющие агенты, такие как глицерин/ агенты для улучшения распадаемости, такие как карбонат кальция и бикарбонат натрия; агенты для замедления растворения, такие как парафин; ускорители резорбции, такие как четвертичные соединения аммония; поверхностно-активные агенты, такие как ацетиловый спирт, моностеарат глицерина; адсорбционные носители, такие как каолин и бентонит; такие носители, как пропиленгликоль и этиловый спирт, и смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция и магния, и твердые полиэтилгликоли.
[00171] Фармацевтически совместимые связующие агенты и/или адъювантные материалы могут быть включены в состав композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, троше и т.п. могут содержать любые из следующих ингредиентов, или соединения аналогичной природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, диспергирующий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подслащивающий агент, такой как сахароза или сахарин; или вкусоароматический агент, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый вкусоароматический агент. Если единичная лекарственная форма представлена капсулой, она может содержать, помимо материалов вышеописанных типов, жидкий носитель, такой как жирное масло. Кроме того, единичные лекарственные формы могут содержать различные другие материалы, модифицирующие физическую форму единицы дозирования, например, например, покрытия из сахара, шеллак или кишечнорастворимые агенты. Кроме того, сироп может содержать, помимо активных соединений, сахарозу в качестве подслащивающего агента, а также определенные консерванты, красители, подкрашивающие вещества и вкусоароматизаторы. Следует понимать, что форму и характеристики фармацевтически приемлемого носителя определяет количество активного ингредиента, с которым его требуется скомбинировать, маршрута введения и других хорошо известных переменных. Носитель или носители должны быть «приемлемыми» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава, и не должны оказывать пагубного воздействия на реципиента.
[00172] Альтернативные варианты составов для введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются диметилсульфоксид, спирты, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и подходящие для инъецирования органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают смеси спиртов и воды, забуференные среды и солевой раствор. Внутривенные основы включают восполнители жидкости и питательных веществ, восполнители электролитов, например, на основе раствора Рингера с декстрозой, и т.п. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и т.п. Для указанных способов доставки подходят различные жидкие составы, в том числе солевой раствор, растворы на основе спиртов, ДМСО и воды.
[00173] Пероральные водные составы включают вспомогательные вещества, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и/или т.п., фармацевтического качества. Указанные композиции принимают форму растворов, например, ополаскивателей и средств для полоскания рта, дополнительно содержащих водный носитель, такой как, например, вода, спиртовые/водные растворы, солевые растворы, парентеральные основы, такие как раствор хлорида натрия, раствор Рингера с декстрозой и т.п.
[00174] Водные составы для полоскания рта хорошо известны специалистам в данной области техники. Составы, относящиеся к жидкостям для полоскания рта и пероральным ополаскивателям подробно описаны, например, в источниках: патенте США 6,387,352, патенте США 6,348,187, патенте США 6,171,611, патенте США 6,165,494, патенте США 6,117,417, патенте США 5,993,785, патенте США 5,695,746, патенте США 5,470,561, патенте США 4,919,918, заявке на патент США №2004/0076590, заявке на патент США №2003/0152530 и заявке на патент США №2002/0044910, каждый из которых конкретным образом включен посредством ссылки в данный раздел настоящего описания и во все другие разделы настоящего описания.
[00175] В составах согласно настоящему описанию могут присутствовать другие добавки, вкусоароматические агенты, подслащивающие или красящие агенты, или консерванты. Мята, например, мята перечная или мята кудрявая, корица, эвкалипт, цитрусовые, кассия, анис и ментол являются примерами подходящих вкусоароматических агентов. Вкусоароматические агенты могут присутствовать в пероральных композициях в количестве, находящемся в диапазоне от 0 до 3%, например, до 2%, например, до 0,5%, например, около 0,2%, в случае жидких композиций.
[00176] Подсластители включают искусственные или естественные подслащивающие агенты, такие как сахарин натрия, сахароза, глюкоза, сахарин, декстроза, левулоза, лактоза, маннит, сорбит, фруктоза, мальтоза, ксилит, тауматин, аспартам, D-триптофан, дигидрохалконы, ацесульфам и любые их комбинации, которые могут присутствовать в количестве, находящемся в диапазоне от приблизительно 0 до 2%, например, до 1%, например, от 0,05 до 0,3% от массы указанной пероральной композиции.
[00177] Красящие агенты представлены подходящими естественными или синтетическими красителями, такими как диоксид титана или CI 42090, или их смесями. Красящие агенты могут присутствовать в указанных композициях в количестве, находящемся в диапазоне от 0 до 3%; например, до 0,1%, например, до 0,05%, например, приблизительно 0,005-0,0005% в случае жидких композиций. В некоторых примерах в качестве консерванта добавляют бензоат натрия, например, в концентрациях, недостаточных по существу для изменения рН композиции, в ином случае может быть необходимо скорректировать количество буферного агента для достижения требуемого значения рН.
[00178] Другие необязательные ингредиенты включают увлажнители, поверхностно-активные вещества (неионогенные, катионные или амфотерные), загустители, камеди и связующие агенты. Увлажнитель улучшает консистенцию состава и удерживает влагу в композиции для ухода за зубами. Кроме того, увлажнитель помогает предотвратить микробное разложение при хранении состава. Он также способствует поддержанию стабильности фазы и позволяет получить прозрачных или полупрозрачных средств для ухода за зубами.
[00179] Подходящие увлажнители включают глицерин, ксилит, глицерол и гликоли, такие как пропиленгликоль, каждый из которых может присутствовать, например, в количестве до 50% по массе, однако общее содержание увлажнителя составляет, например, не более чем приблизительно 60-80% от массы композиции. Например, жидкие композиции могут содержать до приблизительно 30% глицерина и до приблизительно 5%, или приблизительно 2% ксилита по массе. В некоторых примерах поверхностно-активные вещества не являются анионными и могут включать полисорбат 20 или кокоамидобетаин, или т.п., в количестве до приблизительно 6%, или от приблизительно 1,5 до 3% от массы композиции.
[00180] В некоторых примерах, когда пероральные композиции согласно настоящему изобретению представлены жидкой формой, может быть добавлен пленкообразующий агент в количестве до приблизительно 3% от массы указанной пероральной композиции, например, в диапазоне от 0 до 0,1%, или от приблизительно 0,001 до 0,01%, например, приблизительно 0,005% от массы указанной пероральной композиции. Подходящие пленкообразователи включают (помимо гиалуроната натрия) продаваемые под торговым названием Gantrez.
[00181] Жидкие питательные составы для перорального или энтерального введения могут содержать одно или более питательных веществ, таких как жиры, углеводы, белки, витамины и минеральные вещества. Известно множество разных источников и типов углеводов, липидов, белков, минеральных веществ и витаминов, которые могут быть использованы для питательных жидких составов согласно вариантам реализации настоящего изобретения, при условии, что такие питательные вещества совместимы добавленными в выбранный состав ингредиентами, безопасны и эффективны для предполагаемого применения, и иным образом излишне не влияют на результативность продукта.
[00182] Состав указанных питательных жидкостей может обладать достаточной вязкостью, текучестью или другими физическими или химическими характеристиками, обеспечивающими более эффективное и мягкое покрытие слизистой оболочки при питье или введении питательной жидкости. Указанные варианты реализации питательных составов могут также представлять собой сбалансированный источник питания, подходящий для удовлетворения всех, основных или дополнительных потребностей индивидуума в питании.
[00183] Неограничивающие примеры подходящих питательных жидкостей описаны в патенте США 5700782 (Hwang et al.); в патенте США 5869118 (Morris et al.); и в патенте США 5223285 (DeMichele et al.), содержание которых включено в настоящий документ полностью посредством ссылок.
[00184] Питательные белки, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, могут быть гидролизованными, частично гидролизованными или негидролизованными, и могут происходить из любого известного или иного подходящего источника, такого как молоко (например, казеин, сыворотка), животные (например, мясо, рыба), злаки (например, рис, кукуруза), растения (например, соя), или из комбинаций перечисленного.
[00185] Жиры или липиды, подходящие для применения в питательных жидкостях включают, не ограничиваясь перечисленными, кокосовое масло, соевое масло, кукурузное масло, оливковое масло, сафлоровое масло, высокоолеиновое сафлоровое масло, МСТ-масло (триглицериды со средней цепью), подсолнечное масло, высокоолеиновое подсолнечное масло, структурированные триглицериды, пальмовое и пальмоядровое масло, пальмовый олеин, масло канолы, масла из рыбы и морепродуктов, хлопковые масла и комбинации перечисленного. Углеводы, подходящие для применения в питательных жидкостях, могут быть простыми или сложными, содержать лактозу или быть безлактозными, или представлять собой любой комбинации перечисленного. Неограничивающие примеры подходящих углеводов включают гидролизованный кукурузный крахмал, мальтодекстрин, полимеры глюкозы, сахарозу, кукурузный сироп, сухая кукурузная патока, углеводы риса, глюкоза, фруктоза, лактоза, высокофруктозный кукурузный сироп и неперевариваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды (ФОС) и комбинации перечисленного.
[00186] Питательные жидкости могут дополнительно содержать любые из разнообразных витаминов, неограничивающие примеры которых включают витамин А, витамин D, витамин Е, витамин K, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, витамин В12, ниацин, фолиевую кислоту, пантотеновую кислоту, биотин, витамин С, холин, инозит, их соли и производные, а также комбинации перечисленного.
[00187] Питательные жидкости могут дополнительно содержать любые из разнообразных минеральных веществ, известных или иным образом подходящих для применения у пациентов, подверженных риску или страдающих T1D, неограничивающие примеры которых включают кальций, фосфор, магний, железо, селен, марганец, медь, йод, натрий, калий, хлорид и комбинации перечисленного.
[00188] Микроорганизмы и, в частности, дрожжи и бактерии согласно настоящему изобретению могут также быть введены в состав эликсиров или растворов для удобного перорального или ректального введения, или растворов, подходящих для парентерального введения, например, внутримышечным, подкожным или внутривенным путем. Кроме того, нуклеозидные производные также хорошо подходят для получения лекарственных форм с продолжительным или пролонгированным высвобождением, в том числе лекарственных форм, которые высвобождают активный ингредиент исключительно или в некоторых случаях кишечного тракта, например, на протяжении продленного или пролонгированного периода времени для дополнительного повышения эффективности. Покрытия, оболочки и защитные матрицы в таких лекарственных формах могут быть изготовлены, например, из полимерных веществ или восков, хорошо известных в области фармацевтики.
[00189] Композиции согласно настоящему изобретению включают такие фармацевтические лекарственные формы, как леденцы для рассасывания, троше или пастилки. Они, как правило, представлены твердым веществом, которому придают дисковидную форму, содержащим активный ингредиент в подходящим образом ароматизированной базе. Указанная база может представлять собой твердый леденцовый сахар, глицеринированный желатин или комбинацию сахара с достаточным количеством клейкого вещества для придания формы. Троше помещают в ротовую полость, где они медленно растворяются, высвобождая активный ингредиент, непосредственно контактирующий со слизистой оболочкой.
[00190] Троше согласно вариантам реализации настоящего изобретения могут быть получены, например, путем медленного добавления воды к смеси порошка активного вещества, сахарной пудры и камеди до формирования пластичной массы. Для придания указанной массе достаточной адгезивности может быть использован 7% порошок аравийской камеди. Массу раскатывают и троше поштучно вырезают из плоско раскатанной массы, либо из указанной массы может быть сформирован цилиндр и разделен на фрагменты. Всем вырезанным или отделенным штучным фрагментам придают форму и оставляют для высушивания, с получением таким образом лекарственной формы троше.
[00191] Если активный ингредиент термолабилен, он может быть введен в состав леденцов для рассасывания путем прессования. Например, этап грануляции указанного состава осуществляют способом, аналогичным используемому для любых прессованных таблеток. Леденцы для рассасывания изготавливают с применением мощного компрессионного оборудования для получения более твердой, чем обычно, таблетки, поскольку для указанной лекарственной формы желательным является медленное растворение или распадение в полости рта. В некоторых случаях выбирают ингредиенты, способствующие медленному растворению.
[00192] В конкретном составе согласно настоящему изобретению микроорганизмы микроорганизмы включают в биоадгезивный носитель, содержащий прежелатинизированный крахмал и перекрестно-сшитую поли(акриловую кислоту) с получением биоадгезивной таблетки и биоадгезивного геля, подходящих для буккального применения (т.е. обеспечивающих пролонгированную биоадгезию и продолжительную доставку лекарственных средств). Например, из порошковой смеси непатогенной и неинвазивной бактерии в соответствии с настоящим изобретением, биоадгезивных полимеров (прежелатинизированного крахмала и перекрестно-сшитой поли(акриловой кислоты), совместно обработанных путем высушивания распылением), стеарилфумарата натрия (смазывающее вещество) и диоксида кремния (скользящее вещество) получают таблетки (масса: 100 мг; диаметр: 7 мм). Способы получения указанных таблеток хорошо известны специалисту в данной области техники; ранее была описана успешная разработка с применением указанных способов биоадгезивных таблеток, содержащих различные лекарственные средства (миконазол, тестостерон, фторид, ципрофлоксацин) (Bruschi М.L. and de Freitas О., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2005 31:293-310). Все вспомогательные материалы коммерчески доступны в фармацевтическом качестве.
[00193] Для оптимизации состава используют варьирующие лекарственную нагрузку в таблетках и пропорцию крахмала и поли(акриловой кислоты). На основании предыдущих исследований максимальная лекарственная нагрузка в совместно обработанном биоадгезивном носителе составляет приблизительно 60% (по массе), а пропорция крахмала/поли(акриловой кислоты) может варьировать от 75/25 до 95/5 (по массе). При исследовании оптимизации основными оценочными параметрами являются биоадгезивные свойства таблеток и высвобождение лекарственного средства из таблеток, а стандартные свойства таблеток (твердость, истираемость) представляют собой вторичные оценочные критерии.
[00194] Указанные бактерии вводили в водную дисперсию прежелатинизированного крахмала и перекрестно-сшитой поли(акриловой кислоты). Указанную дисперсию полимеров получают путем проведения стандартной процедуры с использованием смесителя с высоким усилием сдвига.
[00195] Как и в случае таблеток, лекарственную нагрузку в геле и пропорцию крахмала/поли(акриловой кислоты) необходимо оптимизировать для получения геля с оптимальной адгезией к слизистой оболочке пищевода. В случае геля концентрация полимеров в дисперсии представляет собой дополнительную переменную, так как она определяет вязкость геля и, следовательно, его мукоадгезивные свойства.
[00196] Модель для скрининга биоадгезивных свойств дисперсий полимеров в отношении слизистой оболочки пищевода была подробно описана Batchelor с соавторами (Batchelor et al. Int. J. Pharm., 238:123-132, 2002).
[00197] Другие маршруты и формы введения включают пищевые составы, содержащие живые микроорганизмы. В некоторых примерах экспрессирующий биоактивный полипептид микроорганизм может быть включен в молочный продукт.
[00198] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены любым известным или иным эффективным способом получения или изготовления выбранной лекарственной формы. Например, микроорганизмы могут быть введены в состав с обычными, например, фармацевтически приемлемыми носителями, такими как вспомогательные вещества и разбавители, с получением пероральных таблеток, капсул, спреев, леденцов для рассасывания, обработанных субстратов (например, тампонов, прокладок для перорального или местного применения или неусвояемого субстрата для однократного применения, обработанного композициями согласно настоящему изобретению); пероральных жидкостей (например, суспензий, растворов, эмульсий), порошков, суппозиториев или любой другой подходящей лекарственной формы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения фармацевтической композиции. Примеры способов включают: приведение микроорганизма (например, непатогенной бактерии) в контакт с фармацевтически приемлемым носителем, с получением таким образом фармацевтической композиции. В некоторых примерах указанный способ дополнительно включает: культивирование указанного микроорганизма в среде. Указанный способ может дополнительно включать высушивание (например, сублимационную сушку) жидкости, содержащей микроорганизм, причем указанная жидкость необязательно включает фармацевтически приемлемый носитель.
Единичные лекарственные формы
3
14
4
13
4
12
5
12
6
12
8
12
9
12
9
11
9
10
7
11
8
10
[00199] Согласно настоящему изобретению также предложены единичные лекарственные формы, содержащие определенное количество микроорганизма (например, бактерии) согласно настоящему описанию, необязательно, в комбинации с носителем пищевого качества или фармацевтически приемлемым носителем. Примеры единичных лекарственных форм содержат от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Другие примеры единичных лекарственных форм содержат от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии), или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии).
9
10
9
9
[00200] Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1×10 до приблизительно 100×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии).
[00201] Указанная единичная лекарственная форма может находиться в любом физическом состоянии или принимать любую форму. Согласно некоторым вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма адаптирована для перорального введения. В некоторых примерах, соответствующих указанным вариантам реализации, указанная единичная лекарственная форма находится в форме капсулы, таблетки или гранулы. Примеры капсул включают капсулы, наполненные микрогранулами. Согласно некоторым вариантам реализации непатогенный микроорганизм (например, непатогенная грамположительная бактерия), содержащийся в указанной лекарственной форме, находится в форме сухого порошка. Например, указанный микроорганизм находится в форме высушенного сублимацией порошка, необязательно прессованного и с нанесенным покрытием.
[00202] Настоящее изобретение может быть лучше понято путем обращения к приведенным ниже примерам, однако специалистам в данной области техники будет понятно, что указанные примеры служат исключительно для иллюстрации настоящего изобретения, более подробно представленного в формуле изобретения ниже. Кроме того, в тексте настоящей заявки цитируются различные публикации. Содержание указанных публикаций полностью включено в настоящий документ посредством ссылок для более полного описания уровня техники, к которой относится настоящее изобретение.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение штаммов Lactococcus lactis, экспрессирующих CmbA на бактериальной поверхности
(a) Эписомальная экспрессия CmbA
[00203] Использование кодонов в кодирующем CmbA гене (см. SEQ ID NO: 2 и кодирующая область CmbA в SEQ ID NO: 11, Фиг. 5А-D) оптимизировали для L. lactis MG1363. Итоговую последовательность ДНК получали синтетическим способом. Используя ПЦР-сборку с перекрывающимися праймерами, PthyA>>SSusp45 (сигнал секреции usp45) и cmbA сливали с получением одного ПЦР-фрагмента. Экспрессионную единицу PthyA>>SSusp45-cmbA помещали между областями 5' thyA и 3' thyA штамма L. lactis MG1363 с применением ПЦР. Итоговый ПЦР-фрагмент: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-cmbA>>3'thyA субклонировали в плазмиду pORI19 (см., например, Law et al., J. Bacteriol. 1995, 177(24):7011-7018) с получением плазмиды pAGX1893. Плазмидой pAGX1893 трансформировали в штамм Lactococcus lactis LL108 с получением штамма LL108[pAGX1893].
(b) Хромосомная интеграция (конститутивная экспрессия CmbA)
[00204] Интегративный вектор pAGX1893 с применением электропорации вводили в два разных штамма L. lactis, содержащих бицистронную экспрессионную кассету, содержащую гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терапевтический полипептид ФАЛ (gapB>>rpmD>>pal) (SEQ ID NO: 24 и 25). Указанные два штамма были представлены штаммами sAGX0599 и sAGX0585 (накапливающий трегалозу штамм). Инсерцию SSusp45-cmbA путем гомологичной рекомбинации (двойного кроссинговера) в локус thyA подтверждали посредством ПЦР и секвенирования ДНК по Сэнгеру. Итоговые штаммы назвали sAGX0618 и sAGX0619, соответственно.
Пример 2
Получение штаммов Lactococcus lactis, экспрессирующих MbpL на бактериальной поверхности
(a) Эписомальная экспрессия MbpL (с применением природного сигнального пептида)
[00205] Конструирование интегративного/экспрессионного вектора [PthyA>>mbpL] thyA pAGX1903: использование кодонов кодирующего MbpL гена (с сигнальным пептидом; SSmbpL) оптимизировали для L. lactis MG1363. Итоговую последовательность ДНК получали синтетическим способом. Используя ПЦР-сборку с перекрывающимися праймерами, PthyA и mbpL сливали с получением одного ПЦР-фрагмента. Экспрессионную единицу PthyA>>SSmbpL>>mbpL (SEQ ID NO: 17) помещали между областями 5'thyA и 3'thyA штамма L. lactis MG1363 с применением ПЦР. Итоговый ПЦР-фрагмент: 5'thyA>>PthyA>>SSmbpL>>mbpL>>3'thyA субклонировали в плазмиду pORI19 с получением плазмиды pAGX1903, которой трансформировали штамм L. lactis LL108, получая штамм LL108[pAGX1903].
(b) Эписомальная экспрессия MbpL (с применением SSusp45)
[00206] Другая конструкция, которая включает mbpL, может включать лидерную последовательность секреции SSusp45 вместо собственного сигнального пептида MbpL. Интегративный/экспрессионный вектор [PthyA>>SSusp45-mbpL] thyA может быть получен в соответствии с процедурой, описанной в примере 1, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая cmbA, может быть заменена на последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид MbpL, без собственного сигнального пептида. Кодирующий MbpL ген (без сигнального пептида) может быть оптимизирован для L. lactis MG1363. Итоговая последовательность ДНК может быть получена синтетическим способом. PthyA>>SSusp45 и mbpL могут быть гибридны с получением одного ПЦР-фрагмента с использованием ПЦР-сборки с перекрывающимися праймерами. Экспрессионная единица PthyA>>SSusp45-mbpL (SEQ ID NO: 15) может быть помещена между областями 5'thyA и 3'thyA штамма L. lactis MG1363 с применением ПЦР. Итоговый ПЦР-фрагмент: 5'thyA>>PthyA>>SSups45>>mbpL>>3'thyA может быть субклонирован, например, в плазмиду pORI19 для получения другой плазмиды, которой может быть трансформирована L. lactis, например, штамм LL108.
Пример 3
Получение штаммов Lactococcus lactis, экспрессирующих МарА на бактериальной поверхности
(a) Эписомальная экспрессия МарА (с применением природного сигнального пептида)
[00207] Конструирование интегративного/экспрессионного вектора [PthyA>>mapA] thyA pAGX1946: кодирующий mapA ген (с сигнальным пептидом) оптимизировали для L. lactis MG1363. Итоговую последовательность ДНК получали синтетическим способом. Используя ПЦР-сборку с перекрывающимися праймерами, PthyA и mapA сливали с получением одного ПЦР-фрагмента. Экспрессионную единицу PthyA>>SSmapA>>mapA (SEQ ID NO: 21) помещали между областями 5'thyA и 3'thyA штамма L. lactis MG1363 с применением ПЦР. Итоговый ПЦР-фрагмент: 5'thyA>>PthyA>>SSmapA>>mapA>>3'thyA субклонировали в плазмиду pORI19 с получением плазмиды pAGX1946, которой трансформировали штамм L. lactis LL108, получая штамм LL108[pAGX1946].
(b) Эписомальная экспрессия МарА (с применением SSusp45)
[00208] Другая конструкция, которая включает mapA, может включать лидерную последовательность секреции SSusp45 вместо собственного сигнального пептида МарА. Интегративный/экспрессионный вектор [PthyA>>SSusp45>>mapA] thyA может быть получен, например, в соответствии с процедурой из примера 1, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая cmbA, может быть заменена на последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид МарА без сигнального пептида. Кодирующий mapA ген может быть оптимизирован для L. lactis MG1363. Итоговая последовательность ДНК может быть получена синтетическим способом. PthyA>>SSusp45 и mapA (без сигнального пептида) может быть гибридизован с получением одного ПЦР-фрагмента с использованием ПЦР-сборки с перекрывающимися праймерами. Экспрессионная единица PthyA>>SSusp45-mapA (SEQ ID NO: 19) может быть помещена между областями 5'thyA и 3'thyA штамма L. lactis MG1363 с применением ПЦР. Итоговый ПЦР-фрагмент: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-mapA>>3'thyA может быть субклонирован, например, в плазмиду pORI19 для получения другой плазмиды, которой может быть трансформирован штамм L. lactis, например, LL108.
Пример 4
Штаммы Lactococcus lactis, экспрессирующие гибридный белок hTFF3-CmbA на бактериальной поверхности
(a) Экспрессия hTFF3
[00209] На Фиг. 4 представлен пример конструкции SSusp45-htff3 (последовательности аминокислот и нуклеиновых кислот), которая может применяться в качестве N-концевой части гибридного белка с С-концевым адгезивным полипептидом. С-концевой адгезивный полипептид может быть добавлен путем ПЦР-слияния или более традиционного лигирования.
(b) Эписомальная экспрессия hTFF3-CmbA
[00209] Конструировали интегративный/экспрессионный вектор для thyA [PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA]. Использование кодонов в кодирующих hTFF3 и CmbA (без сигнального пептида) генах оптимизировали для L. lactis MG1363. Итоговые последовательности ДНК htff3 и cmbA получали синтетическим способом. Используя ПЦР-сборку с перекрывающимися праймерами, PthyA>>SSusp45, hTFF3 и cmbA сливали с получением одного ПЦР-фрагмента. Экспрессионную единицу PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA (см. SEQ ID NO: 11 и Фиг. 5A-D) помещали между областями 5'thyA и 3'thyA штамма L. lactis MG1363 с применением ПЦР. Итоговый ПЦР-фрагмент: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA>>3'thyA субклонировали в плазмиду pORI19 (Law et al., 1995, выше) с получением плазмиды pAGX2005 (см. Фиг. 1), которой трансформировали штамм L. lactis LL108, получая штамм LL108[pAGX2005].
(b) Хромосомная интеграция (конститутивная экспрессия hTFF3-cmbA; промотор thyA)
[00210] Интегративный вектор pAGX2005 (см. выше и см. Фиг. 1) с применением электропорации вводили в два разных штамма Lactococcus lactis с thyA дикого типа, L. lactis sAGX0599 и sAGX0585 (накапливающий трегалозу штамм), содержащие бицистронную экспрессионную кассету, кодирующую терапевтический полипептид ФАЛ (gapB>>rpmD>>pal). Инсерцию SSusp45-hTFF3-CmbA (см., например, SEQ ID NO: 11 и Фиг. 5A-D) путем гомологичной рекомбинации (двойного кроссинговера) в локус thyA подтверждали с применением ПЦР и секвенирования ДНК по Сэнгеру. Итоговые штаммы назвали sAGX0644 и sAGX0645.
(с)Хромосомная интеграция (конститутивная экспрессия hTFF3-CmbA; промотор PhllA)
[00211] Вектор для замены промотора pAGX2041 (PthyA→PhllA) с применением электропорации вводили в штамм L. lactis sAGX0644 (см. выше), содержащий бицистронную экспрессионную кассету, кодирующую терапевтический полипептид ФАЛ (gapB>>rpmD>>pal) и PthyA>>SSusp45-hTFF3-cmbA. Замену PthyA на PhllA путем гомологичной рекомбинации (двойного кроссинговера) подтверждали с применением ПЦР и секвенирования ДНК по Сэнгеру. Итоговый штамм был назван: sAGX0660.
Пример 5
Штаммы Lactococcus lactis, экспрессирующие hTFF1-SpaX на бактериальной поверхности
(а) Эписомальная экспрессия hTFF1-spaX
[00212] Конструирование интегративного/экспрессионного вектора [PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX] (SEQ ID NO: 22 и 23) с thyA pAGX1894: использование кодонов кодирующего hTFF1 гена оптимизированы для L. lactis MG1363. Итоговую последовательность ДНК получали синтетическим способом. Используя ПЦР-сборку с перекрывающимися праймерами, PthyA>>SSusp45, hTFF1 и ген, кодирующий фрагмент заякоривания в клеточной стенке белка A Staphylococcus aureus (SpaX, Steidler et al., 1998), сливали с получением одного ПЦР-фрагмента. Экспрессионную единицу PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX помещали между областями 5'thyA и 3'thyA штамма L. lactis MG1363 с применением ПЦР. Итоговый ПЦР-фрагмент: 5'thyA>>PthyA>>SSusp45-hTFF1-spaX>>3'thyA субклонировали в плазмиду pORI19 с получением плазмиды pAGX1894, которой трансформировали штамм L. lactis LL108, получая штамм LL108[pAGX1894].
Пример 6
Штаммы Lactococcus lactis, эписомально экспрессирующие муцин-связывающие и связывающие клетки полипептиды
[00213] Получали представленные ниже плазмиды и штаммы Lactococcus lactis согласно описанию в настоящем документе и тестировали их на способность связывать муцины и клетки (клетки Сасо-2, IEC-18 и НТ29-МТХ). Плазмиды, перечисленные в таблице 1 ниже, с применением электропорации вводили в штамм L. lactis LL108.
(а) Связывание Lactococcus lactis LL108[pAGX2005] с муцинами
600
[00214] Экспериментальная процедура: муцинами (Sigma, тип II, кат. № M2378-100G, муцины из свиного желудка, и Sigma, тип III, кат. № М1778-10G, муцин из свиного желудка, связанная сиаловая кислота (0,5-1,5%), частичное очищение) в концентрации 500 мкг/мл в 50 мМ карбонатном буфере покрывали планшеты Nunc MaxiSorp. Планшеты 3 раза промывали ФСБ, блокировали ФСБ + Tween20; и 3 раза промывали ФСБ. Насыщенные ночные культуры L. lactis разводили в ФСБ до OD=1. Культуры промывали ФСБ + 0,05% Tween20 и ресуспензировали в 1 объеме ФСБ + 0,05% Tween20. 100 мкл бактериальной суспензии вносили в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение 16 часов при 4°С. Планшеты промывали 3 раза ФСБ + 0,05% Tween20. Планшеты высушивали в течение 1 часа при 55°С. (A) OD измеряли при 405 нм. (В) добавляли по 100 мкл кристаллического фиолетового на лунку (1 мг/мл) и инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре. Затем измеряли OD при 595 нм.
Результат:
[00215] На Фиг. 2 показано, что штамм LL108[pAGX1894], экспрессирующий на поверхности фактор «трилистника» человека 1 (hTFF1), за счет применения заякоривающего фрагмента SpaX белка A Staphylococcus aureus (Steidler et al., 1998, выше), и штамм LL108[pAGX2005], экспрессирующий на поверхности hTFF3-CmbA, связываются с муцинами с сопоставимой силой (Sigma, тип II и тип III) по результатам измерений с применением двух разных способов считывания. И напротив, контрольный штамм, содержащий пустой контрольный вектор, LL108[pAGX1417], не демонстрировал какого-либо связывания с муцинами по результатам применения двух способов считывания.
(b) Адгезия Lactococcus Lactis LL108[pAGX2005] к клеткам Сасо-2
4
2
[00216] Экспериментальная процедура: клетки Сасо-2 высевали в 12-луночный планшет с плотностью 5×10 клеток/см. Клетки культивировали в течение 17 дней для дифференцировки. Насыщенные ночные культуры L. lactis разводили 1/1000 в DMEM и 3 раза промывали DMEM. Наконец, клетки L. lactis ресуспензировали в DMEM. 1 мл бактериальных суспензий вносили к клеткам в 12-луночном планшете и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Клетки промывали DMEM 3 раза. Клетки собирали, лизируя Triton-X100 (1 мл 0,1% Triton-Х100 в ФСБ добавляли к клеткам, инкубировали 5-10 минут до полного отсоединения клеток). Суспензии собранных клеток надлежащим образом разводили и высевали на чашки GM17E. Количество бактерий на чашках измеряли через 24 часа инкубации при 30°С. Процент выделения определяли как результат деления количества клеток L. lactis, выделенных после высевания суспензий собранных клеток на число клеток, изначально добавленных к клеткам Сасо-2.
[00217] На Фиг. 3 показано, что штамм LL108[pAGX1893], экспрессирующий CmbA на поверхности, и штамм LL108[pAGX2005], экспрессирующий hTFF3-CmbA на поверхности, демонстрируют сопоставимую адгезию к клеткам Сасо-2. И напротив, контрольный штамм LL108[pAGX1417] (контроль) и штамм LL108[pAGX1894], экспрессирующий hTFF1-SpaX на поверхности, не демонстрировали усиленной адгезии к клеткам Сасо-2.
Заключение:
[00218] Штаммы L. lactis, экспрессирующие гибридный полипептид hTFF3-CmbA на поверхности, демонстрируют in vitro усиленное связывание с муцинами и усиленную адгезию к клеткам Сасо-2 по сравнению с соответствующими штаммами, не экспрессирующими гибридный полипептид hTFF3-CmbA.
Пример 7
Конструирование интегративных плазмид, содержащих бицистронные экспрессионные единицы
[00219] Интегративные плазмиды, перечисленные в таблице 2 ниже, получали согласно описанию в настоящем документе с применением конструкции, включающей межгенную область (например, межгенную область, предшествующую rplN), и могут быть протестированы на способность связывать муцин и клетки согласно описанию в настоящем документе. Плазмиды, перечисленные в таблице 2, могут быть путем электропорации введены в клетку-хозяина, например, штамм L. lactis LL108, с получением бактерий, экспрессирующих (например, конститутивно экспрессирующих) полипептиды, кодируемые указанными конструкциями.
Пример 8
Штаммы Lactococcus lactis, содержащие хромосомно-интегрированные экспрессионные единицы
[00220] Представленные ниже плазмиды и штаммы Lactococcus lactis получали согласно описанию в настоящем документе и тестировали на способность связывать муцин и клетки согласно описанию в примере 6. Результаты проиллюстрированы Фиг. 6 и 7. Плазмиды, перечисленные в таблице 3 ниже, были интегрированы в клетки штамма-хозяина L. lactis, содержащие хромосомно-интегрированную экспрессионную единицу ФАЛ (PgapB>>gapB>>rpmD>>pal). Некоторые из штаммов-хозяев дополнительно включали генетические модификации, приводящие к внутриклеточному накоплению трегалозы (*). В примерах накапливающих трегалозу штаммов (i) отсутствует функциональная трегалоза-6-фосфатфосфорилаза (ΔtrePP) и отсутствуют гены функционального компонента IIC целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (ΔptcC); (ii) указанные штаммы экспрессируют трегалоза-6-фосфатфосфатазу Е. coli (otsB Е. coli) и (iii) экспрессируют гены транспортеров трегалозы (гены PTS). См., например, патент США 9200249 и опубликованную заявку на патент США 2014/0234371, содержание которых полностью включено в настоящий документ.
9
[00221] Выбранные штаммы также тестировали на экспрессию ФАЛ. Результаты (обобщенные на Фиг. 8) показывают, что экспрессия клеточно-адгезивных и мукоадгезивных полипептидов не оказывала значимого влияния на экспрессируемое в перерасчете на клетку количество ФАЛ (мкг/10 клеток).
Пример 9
Конструирование штаммов Lactococcus lactis, содержащих хромосомно-интегрированные экспрессионные единицы
[00222] Штаммы Lactococcus lactis, перечисленные в таблице 4 ниже, могут быть получены согласно описанию в настоящем документе с применением подходящих конструкций и могут быть протестированы на способность связывать муцин и клетки согласно описанию в настоящем документе.
[00223] Для каждого из указанных бактериальных штаммов, экспрессирующих муцин-связывающие и клеточно-адгезивные полипептиды на поверхности (например, штаммов Lactococcus lactis, экспрессирующих на поверхности гибридные белки hTFF3-CmbA) может быть проведена оценка времени транзита через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) и сравнение с соответствующими штаммами, не экспрессирующими указанные муцин-связывающие и клеточно-адгезивные полипептиды (например, соответствующими штаммами, не экспрессирующими гибридный полипептид hTFF3-CmbA).
[00224] Например, равное число бактериальных клеток (например, на основании подсчета КОЕ) бактериальных штаммов, которые либо экспрессируют hTFF3-CmbA, либо не экспрессируют гибридный белок, может быть введено индивидууму (человеку или животному). Неэписомные штаммы +/- hTFF3-CmbA могут быть снабжены селективным маркером устойчивости к антибиотику (например, pT1NX, придающим устойчивость к эритромицину). Эписомные штаммы могут проходить дополнительный отбор на основании устойчивости к эритромицину. Время транзита через ЖКТ может быть измерено одним из описанных ниже способов:
[00225] (1) Может производиться сбор всех экскрементов с регулярными (например, 1-часовыми) интервалами, и число выделенных КОЕ может быть определено для каждого штамма, например, путем проведения количественной ПЦР или посева методом разведений на твердый агар с эритромицином. Указанный способ позволяет определить кинетику выделения для каждого штамма; таким образом можно определить точку времени сбора, в которой число выделенных КОЕ является максимальным. Согласно наблюдениям, в точках времени позже указанного максимума выделяется большее количество КОЕ штаммов hTFF3-CmbA+.
[00226] (2) Тестируемые животные (например, мыши) могут умерщвляться с регулярными (например, 1-часовыми) интервалами, и число бактериальных КОЕ, выделенных из указанных животных, может быть определено путем посева методом разведений на твердый агар с эритромицином. Результаты показывают, что с течением времени выделяется большее количество КОЕ штаммов hTFF3-CmbA+.
Пример 10
Лечение ФКУ - разложение в желудочно-кишечном тракте фенилаланина C с применением ФАЛ, экспрессируемой генетически модифицированными бактериями согласно настоящему изобретению
[00227] Фермент фенилаланинаммиаклиазу (ФАЛ), который преобразует Phe в коричную кислоту и не нуждается в кофакторе, использовали для лечения фенилкетонурии (ФКУ). См., например, Sarkissian, С.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105: 20894-20899. Поскольку ФАЛ быстро разрушается в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), пероральная доставка трудноосуществима. Исследование для подтверждения концепции показало, что пероральное введение ФАЛ, экспрессируемой генетически сконструированной Е. coli у мышей с ФКУ (enu2/2) приводило к значимому снижению уровней Phe в плазме. См., например, Sarkissian, С.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96:2339-2344. Однако вопросы безопасности, ассоциированные с введением Е. coli, предотвращают применение указанной стратегии у человека. Был получен штамм Lactococcus lactis, экспрессирующий ФАЛ, и проведена его оценка в модели ФКУ на мышах. Пероральное введение рекомбинантных бактерий приводило к снижению абсорбции дейтерированного Phe. См., например, опубликованную международную заявку на патент WO 2014066945.
[00228] Чтобы обеспечить введение генетически модифицированных бактерий, экспрессирующих ФАЛ, пациентам-людям с ФКУ, авторы настоящего изобретения получили штаммы «клинического качества», которые конститутивно экспрессируют фермент ФАЛ и дополнительно модифицированы для увеличения времени транзита через ЖКТ, большей стабильности в условиях ЖКТ и самоограничения. Хромосомная интеграция биоактивного полипептида важна, поскольку эписомальная экспрессия ассоциирована с вопросами безопасности. Например, эписомы могут легко передаваться другими бактериям в желудочно-кишечном тракте. Кроме того, поддержание в виде эписом может вызывать затруднения при получении. Кроме того, известные продуцирующие ФАЛ штаммы быстро разрушаются в проксимальных отделах ЖКТ. Кроме того, имеются основания полагать, что известные продуцирующие ФАЛ бактерии не способны выживать и размножаться вне организма.
[00229] Несколько штаммов L. lactis с одним или более из следующим усовершенствованных признаков получали, например, согласно описанию в настоящем документе выше в примере 8: 1) экспрессионная кассета ФАЛ, интегрированная в бактериальную хромосому и управляемая конститутивным промотором для повышения безопасности и простоты получения; 2) модификации, которые способствуют накоплению трегалозы, что улучшает выживаемость L. lactis в ЖКТ (см., например, Termont, S. et al., Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72: 7694-7700); 3) включение ауксотрофной зависимости от тимидина для предотвращения выживания не организма человека (см., например, Steidler, L. et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21: 785-789); и 4) генетические модификации для экспрессии мукоадгезивных поверхностных белков для улучшения удержания в проксимальных отделах ЖКТ и пролонгированного разложения Phe (см., например, Caluwaerts, S. et al., Oral. Oncol. 2010, 46:564-570). Оценивали экспрессию ФАЛ указанными штаммами и соответствующие клеточно-адгезивные и мукоадгезивные свойства согласно описанию в примерах 6 и 8. Поверхностная экспрессия белка адгезии улучшала удержание бактерий на монослое Сасо-2 приблизительно в 8 раз. Адгезия к муцинам как типа II, так и типа III усиливалась аналогичным образом. Важно отметить, что трегалозная модификация для улучшения выживания в ЖКТ и экспрессия молекулы адгезии не изменяли уровни экспрессируемой указанными бактериями ФАЛ.
[00230] Выбранные бактериальные штаммы, например, штаммы Lactococcus lactis (например, штаммы, конститутивно экспрессирующие ФАЛ; например, sAGX0599, sAGX0644, aAGX0585 и sAGX0645), могут быть протестированы на эффективность в модели «ФКУ» на мышах enu2/2 для идентификации штаммов, подходящих для клинических испытаний на людях.
9
[00231] В первом исследовании sAGX0599 и sAGX0645 тестировали на мышах ФКУ, получавших дозу дейтерированного Phe одновременно с 10 КОЕ L. lactis через зонд. Образцы крови брали с 15-минутными интервалами на протяжении 1 часа и анализировали на дейтерированный Phe. Животные для положительного контроля получали известный штамм с рекомбинантными эписомами, например, согласно описанию в опубликованной международной заявке на патент WO 2014066945). Животные для отрицательного контроля не получали бактерии. Как показано на Фиг. 9, общее количество абсорбированного Phe было минимальным у мышей, получавших sAGX0599 (секретирующий ФАЛ) и sAGX0645 (ФАЛ и TFF3-CmbA), превосходило количество у положительного контроля. Интересно, что итоговый уровень Phe были минимальным у мышей, получавших sAGX0645 (ФАЛ и TFF3-CmbA), однако Cmax Phe была выше. Эти результаты могут отражать более медленное продвижение sAGX0645 вниз по тонкой кишке в направлении конкретного сайта поглощения Phe по сравнению с L. lactis без гибридного белка адгезии. Меньшие Cmax и AUC могут быть обеспечены путем введения разлагающих Phe бактерий до кормления. Меньшие Cmax и AUC могут также быть обеспечены путем регулярного введения бактерий с пищей, чтобы разлагающие Phe в дистальных отделах бактерии для снижения поступления Phe с пищей уже присутствовали после предыдущего приема пищи.
[00232] Следует отметить, что кормление Phe представляет собой искусственную модель ФКУ. Одиночные аминокислоты абсорбируются очень эффективно. В стандартной ситуации белки расщепляются по мере прохождения через кишечник, таким образом, свободные аминокислоты, доступные для абсорбции, появляются в первую очередь в участках, расположенных дистальнее верхних отделов тонкого кишечника. Соответственно, секретирующая ФАЛ бактерия, локализованная в более дистальном участке кишечника, может быть способна эффективнее блокировать поглощение Phe из пищи, чем при экспериментальном введении непосредственно Phe.
[00233] Кроме того, L. lactis может быть модифицирована с включением разных молекул адгезии к клеткам и слизи для локализованной доставки ФАЛ в оптимальный отдел или отделы кишечника.
[00234] Во втором исследовании может быть проведена оценка фармакодинамики выбранных бактериальных штаммов, например, штаммов Lactococcus lactis. Бактерии могут вводиться в течение периода до шести часов перед введением дейтерированного Phe. Анализ крови может быть проведен согласно описанию выше. Полученные данные могут обеспечить информацию для планирования последующих исследований и релевантную информацию для клинического применения. Например, у человека может использоваться одна единичная лекарственная форма (например, капсула), содержащая указанные бактерии, при каждом приеме пищи.
[00235] В третьем исследовании может быть проведена оценка долгосрочной эффективности указанных бактерий для снижения уровней Phe в крови. Животные могу получать через зонд выбранный бактериальный штамм (например, штамм Lactococcus lactis), например, оптимальный штамм из первого исследования, а затем стандартный корм. Например, может проводиться два ассоциированных с L. lactis кормления ежедневно, при этом продолжительность каждого кормления определяют на основании исхода второго исследования. Оценка уровней Phe в крови может проводиться регулярно, например, два раза в неделю на протяжении трех недель. Контрольные животные могут быть такими же, как и задействованные в первом исследовании, и могут также включать когорту на диете с низким содержанием Phe. Примечание: в указанном исследовании не обязательно используется дейтерированный Phe. Положительный исход может быть представлен статистически значимым улучшением уровней Phe в крови, например, достаточным для вероятного обеспечения клинической эффективности. В других исследованиях бактериальная терапия (например, терапия L. lactis) может быть скомбинирована с соблюдением диеты.
[00236] В каждом исследовании могут быть использованы когорты по 5 мышей для обеспечения мощности, достаточной для статистического анализа; мыши могут быть использованы повторно после отмывочного периода. Анализ на Phe может быть проведен с применением метода тандемной масс-спектрометрии, одновременно чувствительного и специфичного, и требующего использования минимального количества крови.
Пример 11
Лечение мукозита слизистой оболочки полости рта
[00237] Мукозит слизистой оболочки полости рта представляет собой распад слизистой оболочки полости рта и представляет собой распространенное осложнение терапии рака, в частности, лечения рака головы и шеи. TFF1 секретируется в верхних отделах ЖКТ и ассоциирован с защитой и заживлением поверхности слизистых оболочек. TFF1 кажется перспективным вариантом для лечения мукозита слизистой оболочки полости рта. Для улучшения доставки TFF1 в слизистую оболочку полости рта конструируют L. lactis, экспрессирующую как гибридный hTFF1-CmbA, так и «свободный» hTFF1, оба из которых расположены на хромосоме. При поэтапном осуществлении указанного конструирования имеется риск рекомбинации одного гена htff1 с другим геном htff1 на хромосоме. Для минимизации указанного риска при конструировании hTFF1-cmbA и htff1 могут быть размещены полицистронно и, соответственно, способны к трансформации и интеграции в хромосому за один этап. Кроме того, в каждом кодоне одной последовательности tff1 может быть изменено третье основание, таким образом, чтобы последовательность нуклеотидов отличалась от другой последовательности tff1, однако транслируемые hTFF1 были идентичными. Например, существует шесть аланиновых кодонов, встречающихся со следующей частотой: UCU (18,6), UCC (4,0), UCA (20,6), UCG (3,9), AGU (16,7) и AGC (7,3). Соответственно, UCC и UCG могут быть взаимозаменяемыми. UCU, UCA и в меньшей степени AGU могут быть взаимозаменяемыми.
[00238] После модификации частоты использования кодонов конструируют Ph11A>>SSusp45>>hTFF1>>rpmD>>SSusp45>>hTFF1-CmbA с применением ПЦР и клонируют между 5' thyA и 3' thyA на условно-репликативной плазмиде-носителе, происходящей из pORI19. Трансформация L. lactis и отбор согласно описанию в тексте настоящего документа приводят к интеграции в хромосомный локус thyA.
[00239] Показано, что полученный штамм секретирует TFF1 и экспрессирует гибридный белок TFF-CmbA, который опосредует повышенное связывание со слизью оболочек ротовой полости по сравнению со штаммом, экспрессирующим отдельно TFF1. Указанный штамм тестируют в моделях мукозита; присутствие TFF-CmbA увеличивает персистенцию в полости рта и улучшает доставку терапевтического TFF1, таким образом, может быть снижена частота дозирования.
Пример 12
Лечение диабета
[00240] Штамм Lactococcus lactis, секретирующий hTFF3-CmbA согласно описанию выше, модифицировали для экспрессии проинсулина PINS человека и ИЛ-10 человека. Например, конструкция для экспрессии hPINS может представлять собой hPINS с лидером секреции SSUsp45 под контролем сильного промотора gapB, расположенный после гена gapB и спейсера rpmD (т.е. PgapB>>gapB>>rpmD>>usp45>>PINS). В случае hIL-10 (чИЛ-10), конструкция может представлять собой PhllA>>SSusp45>>hil-10.
[00241] Поскольку hTFF3-CmbA уже встроены в локус thyA, PINS и ИЛ-10 могут быть встроены в другой геномный сайт, такой как ptcC или trePP. Мутации PtcC и trePP ассоциированы с накоплением трегалозы. Итоговый штамм тестируют на экспрессию hIL-10, PINS и hTFF3-CmbA. Затем указанный штамм тестируют на мышах NOD, в модели диабета I типа на животных, наряду со штаммом без hTFF3-CmbA. Штамм без hTFF3-CmbA ранее продемонстрировал способность стимулировать ответ Treg на PINS, обращать аутоиммунный ответ на бета-клетки поджелудочной железы с лечением таким образом диабета. Указанное лечение, в частности, эффективно при недавно возникшем заболевании. Присутствие hTFF-CmbA может улучшать колонизацию и персистенцию в кишечнике, что приводит к более выраженному ответу Treg.
[00242] Хотя в настоящем документе были показаны и описаны некоторые варианты реализации, такие варианты реализации предложены в качестве примеров. Многочисленные варианты, изменения и замены без отступления от сути настоящего изобретения будут понятны для специалистов в данной области техники. Следует понимать, что при практической реализации настоящего изобретения будут задействованы различные альтернативы вариантам реализации настоящего изобретения, описанным в настоящем документе.
Примеры вариантов реализации
1. Бактерия, содержащая экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, отличающаяся тем, что указанный гибридный белок содержит клеточно-адгезивный полипептид.
2. Бактерия согласно варианту реализации 1, отличающаяся тем, что указанный клеточно-адгезивный полипептид выбран из группы, состоящей из связывающего клетки и слизь белка A (CmbA), связывающего слизь белка (Mub), белка, способствующего адгезии к слизи (МарА), лактококкового муцин-связывающего белка (MbpL) и любой их комбинации.
3. Бактерия согласно варианту реализации 2, отличающаяся тем, что указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой CmbA.
4. Бактерия согласно варианту реализации 3, отличающаяся тем, что указанный CmbA представляет собой CmbA Lactobacillus reuteri.
5. Бактерия по любому из предшествующих вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанный гибридный белок дополнительно содержит муцин-связывающий полипептид.
6. Бактерия согласно варианту реализации 5, отличающаяся тем, что указанный муцин-связывающий полипептид представляет собой полипептид фактора «трилистника» (TFF).
7. Бактерия согласно варианту реализации 6, отличающаяся тем, что указанный гибридный белок содержит CmbA и TFF.
8. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 17, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, интегрирована в хромосому указанной бактерии.
9. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 17, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, локализована на плазмиде.
10. Бактерия по любому из предшествующих вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная бактерия экспрессирует указанный гибридный белок.
11. Бактерия согласно варианту реализации 10, отличающаяся тем, что указанный гибридный белок заякорен в клеточной стенке указанной бактерии.
12. Бактерия по любому из предшествующих вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, дополнительно содержит лидерную последовательность секреции, кодирующую сигнальный пептид секреции.
13. Бактерия согласно варианту реализации 12, отличающаяся тем, что указанная лидерная последовательность секреции представляет собой SSusp45.
14. Бактерия согласно варианту реализации 13, отличающаяся тем, что указанная лидерная последовательность секреции кодирует сигнальный пептид секреции, имеющий последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90% идентичную последовательности SEQ ID NO: 5.
15. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 12-14, отличающаяся тем, что указанный сигнальный пептид секреции связан с указанным муцин-связывающим полипептидом.
16. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 12-15, отличающаяся тем, что указанный сигнальный пептид секреции связан с линкером.
17. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 12-16, отличающаяся тем, что указанный сигнальный пептид секреции отщепляется от указанного гибридного белка.
18. Бактерия согласно варианту реализации 17, отличающаяся тем, что указанный сигнальный пептид секреции отщепляется от указанного гибридного белка при заякоривании указанного гибридного белка в клеточной стенке указанной бактерии.
19. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-18, отличающаяся тем, что указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, транскрипционно регулирует промотор, выбранный из группы, состоящей из промотора thyA (PthyA), промотора hlla (PhllA) и промотора gapB.
20. Бактерия согласно варианту реализации 19, отличающаяся тем, что указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, транскрипционно регулирует PthyA.
21. Бактерия согласно варианту реализации 19, отличающаяся тем, что указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок, транскрипционно регулирует PhllA.
22. Бактерия, содержащая гибридный белок, заякоренный в клеточной стенке указанной бактерии, отличающаяся тем, что указанный гибридный белок содержит полипептид TFF и полипептид CmbA.
23. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-22, отличающаяся тем, что указанная бактерия представляет собой грамположительную бактерию.
24. Бактерия согласно варианту реализации 23, отличающаяся тем, что указанная грамположительная бактерия является непатогенной.
25. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-24, отличающаяся тем, что указанная бактерия представляет собой молочнокислую бактерию (МКБ).
26. Бактерия согласно варианту реализации 25, отличающаяся тем, что указанная МКБ выбрана из группы, состоящей из бактерии вида (sp.) Lactococcus, бактерии Lactobacillus sp., бактерии Bifidobacterium sp., бактерии Streptococcus sp. и бактерии Enterococcus sp.
27. Бактерия согласно варианту реализации 25, отличающаяся тем, что указанная МКБ выбран из группы, состоящей из Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum, Lactococcus raffinolactis, Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus aviarius подвида araffinosus, Lactobacillus aviarius подвида aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei подвида alactosus, Lactobacillus casei подвида casei, Lactobacillus casei подвида pseudoplantarum, Lactobacillus casei подвида rhamnosus, Lactobacillus casei подвида tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis подвида coryniformis, Lactobacillus coryniformis подвида torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus подвида curvatus, Lactobacillus curvatus подвида melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii подвида bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii подвида delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii подвида lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus keflri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei подвида paracasei, Lactobacillus paracasei подвида tolerans, Lactobacillus parakeflri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei подвида camosus, Lactobacillus sakei подвида sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius подвида salicinius, Lactobacillus salivarius подвида salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus uli, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis подвида mali, Lactobacillus yamanashiensis подвида Yamanashiensis, Lactobacillus zeae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Enterococcus alcedinis, Enterococcus aquimarinus, Enterococcus asini, Enterococcus avium, Enterococcus caccae, Enterococcus camelliae, Enterococcus canintestini, Enterococcus canis, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus devriesei, Enterococcus diestrammenae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus eurekensis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus hirae, Enterococcus italicus, Enterococcus lactis, Enterococcus lemanii, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus olivae, Enterococcus pollens, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus quebecensis, Enterococcus raffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus rivorum, Enterococcus rotai, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus silesiacus, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus, Enterococcus termitis, Enterococcus thailandicus, Enterococcus ureasiticus, Enterococcus ureilyticus, Enterococcus viikkiensis, Enterococcus villorum, Enterococcus xiangfangensis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus constellatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus salivarius, Streptococcus tigurinus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis, Streptococcus viridans и Streptococcus zooepidemicus.
28. Бактерия согласно варианту реализации 27, отличающаяся тем, что указанная бактерия представляет собой Lactococcus lactis.
29. Бактерия согласно варианту реализации 28, отличающаяся тем, что указанная Lactococcus lactis выбран из группы, состоящей из Lactococcus lactis подвида cremoris, Lactococcus lactis подвида hordniae и Lactococcus lactis подвида lactis.
30. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 6-29, отличающаяся тем, что указанный полипептид TFF выбран из группы, состоящей из TFF1, TFF2 и TFF3.
31. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 6-29, отличающаяся тем, что указанный полипептид TFF выбран из группы, состоящей из TFF человека, TFF мыши, TFF свиньи, TFF собаки, TFF кошки, TFF коровы, TFF овцы, TFF рыб и TFF амфибий.
32. Бактерия согласно варианту реализации 31, отличающаяся тем, что указанный полипептид TFF представляет собой TFF человека.
33. Бактерия согласно варианту реализации 32, отличающаяся тем, что указанный TFF человека представляет собой TFF3 человека.
34. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 6-29, отличающаяся тем, что указанный полипептид TFF имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3.
35. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 6-29, отличающаяся тем, что указанный полипептид TFF представляет собой вариант полипептида TFF.
36. Бактерия согласно варианту реализации 35, отличающаяся тем, что указанный вариант полипептида TFF обладает усиленной муцин-связывающей способностью по сравнению с соответствующим полипептидом TFF дикого типа.
37. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-36, отличающаяся тем, что указанный полипептид CmbA имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 80% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1.
38. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-37, дополнительно содержащий экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один терапевтический полипептид.
39. Бактерия согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид представляет собой цитокин.
40. Бактерия согласно варианту реализации 38 или 39, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид представляет собой интерлейкин (ИЛ).
41. Бактерия согласно варианту реализации 40, отличающаяся тем, что указанный интерлейкин выбран из группы, состоящей из ИЛ-2, ИЛ-10, ИЛ-18 и любых комбинаций перечисленного.
42. Бактерия согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид представляет собой антиген.
43. Бактерия согласно варианту реализации 42, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид представляет собой антиген и интерлейкин.
44. Бактерия согласно варианту реализации 43, отличающаяся тем, что указанный интерлейкин представляет собой ИЛ-2 или ИЛ-10.
45. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 42-44, отличающаяся тем, что указанный антиген представляет собой аутоантиген.
46. Бактерия согласно варианту реализации 45, отличающаяся тем, что указанный аутоантиген представляет собой специфический для диабета I типа (T1D) антиген.
47. Бактерия согласно варианту реализации 46, отличающаяся тем, что указанный T1D-специфический антиген выбран из группы, состоящей из проинсулина (PINS), декарбоксилазы глутаминовой кислоты (GAD65), ассоциированного с инсулиномой белка 2 (IA-2), специфического островкового связанного с каталитической субъединицей глюкоза-6-фосфатазы белка (IGRP), цинкового транспортера 8 (ZnT8), хромогранина А, островкового амилоидного (препро)полипептида (ppIAPP), периферина, цитруллинированного регулируемого глюкозой белка (GRP) и любых комбинаций перечисленного.
48. Бактерия согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид представляет собой антитело или его фрагмент.
49. Бактерия согласно варианту реализации 48, отличающаяся тем, что указанное антитело представляет собой однодоменное антитело или нанотело.
50. Бактерия согласно варианту реализации 48 или 49, отличающаяся тем, что указанное антитело выбрано из группы, состоящей из антитела против ФНО-α, антитела к ИЛ-4, антитела к ИЛ-5, антитела к ИЛ-13, антитела к ИЛ-15, антитела к иммуноглобулину Е (IgE) и любых комбинаций перечисленного.
51. Бактерия согласно варианту реализации 48 или 49, отличающаяся тем, что указанное антитело представляет собой гибридный белок, содержащий растворимый ФНО-рецептор и Fc-область антитела.
52. Бактерия согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид представляет собой фермент или его фрагмент.
53. Бактерия согласно варианту реализации 52, отличающаяся тем, что указанный фермент или его фрагмент функционален.
54. Бактерия согласно варианту реализации 52 или 53, отличающаяся тем, что указанный фермент или его фрагмент выбран из группы, состоящей из фенилаланинаммиаклиазы (ФАЛ), декарбоксилазы аминокислот и любых комбинаций перечисленного.
55. Бактерия согласно варианту реализации 54, отличающаяся тем, что указанный фермент или его фрагмент представляет собой ФАЛ.
56. Бактерия согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид выбран из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1), глюкагоноподобного пептида 2 (ГПП-2), глюкагона, эксендина-4 и любых комбинаций перечисленного.
57. Бактерия согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид представляет собой фактор роста.
58. Бактерия согласно варианту реализации 57, отличающаяся тем, что указанный фактор роста представляет собой эпидермальный фактор роста (ЭФР).
59. Бактерия согласно варианту реализации 58, отличающаяся тем, что указанный ЭФР представляет собой человека ЭФР или свиной ЭФР.
60. Бактерия согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанный по меньшей мере один терапевтический полипептид представляет собой TFF.
61. Бактерия согласно варианту реализации 60, отличающаяся тем, что указанный TFF выбран из группы, состоящей из TFF1, TFF2, TFF3 и любых комбинаций перечисленного.
62. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 38-61, отличающаяся тем, что указанный терапевтический полипептид представляет собой полипептид человека.
63. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 42-44, отличающаяся тем, что указанный антиген представляет собой аллерген.
64. Бактерия согласно варианту реализации 63, отличающаяся тем, что указанный аллерген выбран из группы, состоящей из аллергена пыльцы деревьев, аллергена пыльцы сорных трав, аллерген пыльцы травянистых растений, пищевого аллергена, аллергена клеща домашней пыли, аллергена плесневых грибов, аллергена частиц эпителия животных и любых комбинаций перечисленного.
65. Бактерия согласно варианту реализации 64, отличающаяся тем, что указанный аллерген представляет собой аллерген пыльцы сорных трав.
66. Бактерия согласно варианту реализации 65, отличающаяся тем, что указанный аллерген пыльцы сорных трав представляет собой аллерген пыльцы амброзии.
67. Бактерия согласно варианту реализации 64, отличающаяся тем, что указанный аллерген представляет собой аллерген пыльцы деревьев.
68. Бактерия согласно варианту реализации 67, отличающаяся тем, что указанный аллерген пыльцы деревьев представляет собой аллерген пыльцы березы или аллерген пыльцы японского кедра.
69. Бактерия согласно варианту реализации 64, отличающаяся тем, что указанный аллерген представляет собой пищевой аллерген.
70. Бактерия согласно варианту реализации 69, отличающаяся тем, что указанный пищевой аллерген выбран из группы, состоящей из аллергена арахиса, аллергена молока, аллергена яйца, аллергена глютена (эпитопа глиадина) и любых комбинаций перечисленного.
71. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 38-70, отличающаяся тем, что указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один терапевтический полипептид, транскрипционно регулирует промотор gapB.
72. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-71, отличающаяся тем, что указанная бактерия отличается повышенным временем транзита через желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) по сравнению с соответствующей бактерией, не содержащей указанной экзогенной нуклеиновой кислоты или не содержащей указанного гибридного белка.
73. Бактерия согласно варианту реализации 72, отличающаяся тем, что время транзита через ЖКТ увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%.
74. Бактерия согласно варианту реализации 73, отличающаяся тем, что время транзита через ЖКТ увеличивается по меньшей мере приблизительно на 30%.
75. Бактерия согласно варианту реализации 72, отличающаяся тем, что время транзита через ЖКТ увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%-50%.
76. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-75, отличающаяся тем, что указанная бактерия обладает повышенной муцин-связывающей способностью in vitro по сравнению с соответствующей бактерией, не содержащей указанной экзогенной нуклеиновой кислоты или не содержащей указанного гибридного белка.
77. Бактерия согласно варианту реализации 76, отличающаяся тем, что указанная муцин-связывающая способность in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 20%.
78. Бактерия согласно варианту реализации 77, отличающаяся тем, что указанная муцин-связывающая способность in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 50%.
79. Бактерия согласно варианту реализации 78, отличающаяся тем, что указанная муцин-связывающая способность in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 100% (приблизительно 2×).
80. Бактерия согласно варианту реализации 76, отличающаяся тем, что указанная муцин-связывающая способность in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 20%-500%.
81. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 76-80, отличающаяся тем, что указанную муцин-связывающую способность in vitro измеряют по связыванию указанной бактерии с муцинами из свиного желудка с последующими:
405
(a) детекцией поглощения света при 405 нм (OD); или
595
(b) окрашиванием указанной бактерии кристаллическим фиолетовым, а затем детекцией поглощения света при 595 нм (OD).
82. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-81, отличающаяся тем, что указанная бактерия обладает повышенной способностью к связыванию клеток Сасо-2 in vitro по сравнению с соответствующей бактерией, не содержащей указанной экзогенной нуклеиновой кислоты или не содержащей указанного гибридного белка.
83. Бактерия согласно варианту реализации 82, отличающаяся тем, что указанная способность к связыванию Сасо-2 in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%.
84. Бактерия согласно варианту реализации 83, отличающаяся тем, что указанная способность к связыванию Сасо-2 in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 100% (приблизительно 2×).
85. Бактерия согласно варианту реализации 84, отличающаяся тем, что указанная способность к связыванию Сасо-2 in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 400% (приблизительно 5×).
86. Бактерия согласно варианту реализации 82, отличающаяся тем, что указанная способность к связыванию Сасо-2 in vitro увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%-500%.
87. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 82-86, отличающаяся тем, что указанную способность к связыванию Сасо-2 in vitro измеряют путем:
(а) приведения культуры указанной бактерии в контакт с клетками Сасо-2;
(b) промывания указанных клеток Сасо-2 для удаления несвязанных бактериальных клеток;
(c) отсоединения бактериальных клеток, связанных с указанными клетками Сасо-2, с получением таким образом отсоединившихся бактериальных клеток; и
(d) определение титра указанных отсоединившихся бактериальных клеток.
88. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-87, отличающаяся тем, что указанная бактерия проявляет повышенную адгезию к слизистой оболочке кишечника по сравнению с соответствующей бактерией, не содержащей указанной экзогенной нуклеиновой кислоты или не содержащей указанного гибридного белка.
89. Бактерия согласно варианту реализации 88, отличающаяся тем, что указанный адгезия к слизистой оболочке кишечника увеличивается по меньшей мере приблизительно на 10%-500%.
90. Композиция, содержащая бактерию согласно любому из вариантов реализации 1-89.
91. Фармацевтическая композиция, содержащая бактерию согласно любому из вариантов реализации 1-89 и фармацевтически приемлемый носитель.
92. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-89, композиция согласно варианту реализации 90 или фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 91 для применения в лечении или предотвращении заболевания, выбранного из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, аллергии, метаболического заболевания и заболевания желудочно-кишечного тракта.
93. Бактерия согласно любому из вариантов реализации 1-89, композиция согласно варианту реализации 90 или фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 91 для применения при получении лекарственного средства для лечения или предотвращения заболевания.
94. Бактерия, композиция или фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 93, отличающаяся тем, что указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, аллергии, метаболического заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта и пищевого нарушения.
95. Способ лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества бактерии согласно любому из вариантов реализации 1-89, композиции согласно варианту реализации 90 или фармацевтической композиции согласно варианту реализации 91.
96. Способ согласно варианту реализации 95, отличающийся тем, что указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, аллергии, метаболического заболевания, заболевания желудочно-кишечного тракта и любой их комбинации.
97. Способ согласно варианту реализации 96, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание.
98. Способ согласно варианту реализации 97, отличающийся тем, что указанное аутоиммунное заболевание представляет собой диабет I типа (T1D).
99. Способ согласно варианту реализации 96, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой метаболическое заболевание.
100. Способ согласно варианту реализации 99, отличающийся тем, что указанное метаболическое заболевание представляет собой фенилкетонурию (ФКУ).
101. Способ согласно варианту реализации 96, отличающийся тем, что указанное заболевание представляет собой заболевание желудочно-кишечного тракта.
102. Способ согласно варианту реализации 101, отличающийся тем, что указанное заболевание желудочно-кишечного тракта представляет собой целиакию.
103. Способ согласно варианту реализации 101, отличающийся тем, что указанный заболевание желудочно-кишечного тракта представляет собой воспалительное заболевание кишечника (ВЗК).
104. Способ согласно варианту реализации 103, отличающийся тем, что указанный ВЗК представляет собой болезнь Крона или язвенный колит.
105. Способ получения генетически модифицированной бактерии, включающий приведение бактерии в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей гибридный белок, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, содержит последовательность, кодирующую клеточно-адгезивный полипептид.
106. Способ согласно варианту реализации 105, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт происходит в условиях, достаточных для интернализации указанной бактерией указанной экзогенной нуклеиновой кислоты.
107. Способ согласно варианту реализации 105 или 106, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота локализована на плазмиде.
108. Способ согласно варианту реализации 106 или 107, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота интегрирована в хромосому указанной бактерии.
109. Способ согласно любому из вариантов реализации 105-108, дополнительно включающий культивирование указанной бактерии и экспрессию указанного гибридного белка в указанной бактерии.
110. Способ согласно любому из вариантов реализации 105-109, отличающийся тем, что указанный клеточно-адгезивный полипептид выбран из группы, состоящей из связывающего клетки и слизь белка A (CmbA), Mub, МарА, MbpL и любых комбинаций перечисленного.
111. Способ согласно варианту реализации 110, отличающийся тем, что указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой CmbA.
112. Способ согласно варианту реализации 111, отличающийся тем, что указанный CmbA представляет собой CmbA Lactobacillus reuteri.
113. Способ согласно любому из вариантов реализации 105-112, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, дополнительно содержит последовательность, кодирующую муцин-связывающий полипептид.
114. Способ согласно варианту реализации 113, отличающийся тем, что указанный муцин-связывающий полипептид представляет собой полипептид фактора «трилистника» (TFF).
115. Способ согласно варианту реализации 114, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, содержит последовательность, кодирующую CmbA, и последовательность, кодирующую полипептид TFF.
116. Способ согласно любому из вариантов реализации 105-115, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, интегрирована в хромосому указанной бактерии.
117. Способ согласно варианту реализации 116, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота интегрирована в хромосому указанной бактерии с применением гомологичной рекомбинации.
118. Способ согласно любому из вариантов реализации 105-117, дополнительно содержащий приведение указанной бактерии в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей терапевтический полипептид.
119. Способ согласно варианту реализации 118, отличающийся тем, что указанное приведение указанной бактерии в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей терапевтический полипептид, происходит до указанного приведения указанной бактерии в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей гибридный белок.
120. Способ согласно варианту реализации 118, отличающийся тем, что указанное приведение указанной бактерии в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей терапевтический полипептид, происходит после указанного приведения указанной бактерии в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей гибридный белок.
121. Способ согласно любому из вариантов реализации 105-120, отличающийся тем, что указанная генетически модифицированная бактерия проявляет повышенные мукоадгезивные и клеточно-адгезивные свойства по сравнению с соответствующей бактерией, не содержащий указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую гибридный белок.
122. Способ согласно любому из вариантов реализации 105-121, дополнительно включающий комбинирование культуры указанной генетически модифицированной бактерии по меньшей мере с одним агентом для криоконсервации с получением бактериальной смеси.
123. Способ согласно варианту реализации 122, дополнительно включающий сублимационную сушку указанной бактериальной смеси с получением высушенной сублимацией композиции.
124. Способ согласно любому из вариантов реализации 105-121 или варианту реализации 123, дополнительно включающий комбинирование указанной генетически модифицированной бактерии или указанной высушенной сублимацией композиции с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции.
125. Способ согласно варианту реализации 123 или 124, дополнительно включающий получение из указанной высушенной сублимацией композиции или указанной фармацевтической композиции фармацевтической лекарственной формы.
126. Генетически модифицированная бактерия, полученная с применением способа согласно любому из вариантов реализации 105-125.
127. Единичная лекарственная форма, содержащая бактерию согласно любому из вариантов реализации 1-89, композицию согласно варианту реализации 90 или фармацевтическую композицию согласно варианту реализации 91.
128. Единичная лекарственная форма согласно варианту реализации 127, отличающаяся тем, что указанная единичная лекарственная форма представляет собой лекарственную форму для перорального применения.
129. Единичная лекарственная форма согласно варианту реализации 128, отличающаяся тем, что указанная лекарственная форма для перорального применения выбрана из группы, состоящей из таблетки, капсулы, саше и упакованной жидкости.
130. Способ усиления роста у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему эффективного количества бактерии согласно любому из вариантов реализации 1-89, композиции согласно варианту реализации 90, фармацевтической композиции согласно варианту реализации 91 или единичной лекарственной формы согласно любому из вариантов реализации 127-129.
131. Способ согласно варианту реализации 130, отличающийся тем, что указанное млекопитающее выбрано из группы, состоящей из человека, свиньи, коровы и овцы.
132. Способ согласно варианту реализации 130 или 131, отличающийся тем, что указанная бактерия, указанная композиция, указанная фармацевтическая композиция или указанная единичная лекарственная форма представлена составом для введения указанному млекопитающему.
133. Способ согласно любому из вариантов реализации 130-132, отличающийся тем, что указанная бактерия содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор роста.
134. Способ согласно варианту реализации 133, отличающийся тем, что указанная бактерия конститутивно экспрессирует указанный фактор роста.
135. Способ согласно варианту реализации 133 или 134, отличающийся тем, что указанный фактор роста представляет собой ЭФР.
136. Способ согласно варианту реализации 135, отличающийся тем, что указанное млекопитающее представляет собой свинью и указанный ЭФР представляет собой свиной ЭФР.
137. Способ увеличения связывания бактерии со слизистой оболочкой кишечника, включающий:
(а) приведение указанного микроорганизма в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей гибридный белок, при этом указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, содержит последовательность, кодирующую полипептид CmbA; и
(b) экспрессию указанной экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, в указанной бактерии.
138. Способ согласно варианту реализации 137, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, дополнительно содержит последовательность, кодирующую полипептид TFF.
139. Способ согласно варианту реализации 138, отличающийся тем, что при экспрессии указанной экзогенной нуклеиновой кислоты, кодирующей гибридный белок, продуцируется гибридный белок, содержащий указанный TFF и указанный CmbA.
140. Набор, содержащий (1) бактерию согласно любому из вариантов реализации 1-89, композицию согласно варианту реализации 90, фармацевтическую композицию согласно варианту реализации 91 или единичную лекарственную форму согласно любому из вариантов реализации 127-129; и (2) инструкции по введению указанной бактерии, указанной композиции, указанной фармацевтической композиции или указанной единичной лекарственной формы млекопитающему.
141. Набор согласно варианту реализации 140, отличающийся тем, что указанное млекопитающее представляет собой человека.
142. Нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок, содержащая:
(i) последовательность, кодирующую клеточно-адгезивный полипептид, выбранный из группы, состоящей из связывающего клетки и слизь белка А (CmbA), Mub, MapA, MbpL и любых комбинаций перечисленного; и
(ii) последовательность, кодирующую муцин-связывающий полипептид, выбранный из полипептида TFF, MubBP и их комбинации.
143. Нуклеиновая кислота согласно варианту реализации 142, отличающаяся тем, что указанный муцин-связывающий полипептид представляет собой полипептид TFF.
144. Нуклеиновая кислота согласно варианту реализации 143, отличающаяся тем, что указанный полипептид TFF представляет собой TFF3.
145. Нуклеиновая кислота согласно любому из вариантов реализации 142-144, отличающаяся тем, что указанный клеточно-адгезивный полипептид представляет собой CmbA.
146. Плазмида, содержащая нуклеиновую кислоту согласно любому из вариантов реализации 142-145.
147. Бактериальная клетка-хозяин, содержащая плазмиду согласно варианту реализации 146.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> INTREXON ACTOBIOTICS N.V. / ИНТРЕКСОН АКТОБИОТИКС Н.В.
<120> MUCOADHESIVE MICROORGANISM / МУКОАДГЕЗИВНЫЙ МИКРООРГАНИЗМ
<130> 205350-0031-00-WO
<140>
<141>
<150> 62/394,024
<151> 2016-09-13
<160> 25
<170> PatentIn, версия 3.5
<210> 1
<211> 838
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Lactobacillus reuteri
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (1)..(50)
<223> Сигнальная последовательность
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (51)..(838)
<223> Зрелый белок
<400> 1
Met Leu Ser Arg Lys Asn Tyr Lys Glu Thr Ile Arg Lys Gln Thr Pro
1 5 10 15
Thr Lys Gln Tyr Tyr Thr Ile Lys Lys Leu Thr Val Gly Val Thr Ser
20 25 30
Val Leu Ile Gly Leu Ser Phe Met Gly Glu Leu Glu Gly Asp Ser Val
35 40 45
His Ala Asp Thr Met Thr Ala Ser Ser Glu Ser Thr Ser Val Thr Ser
50 55 60
Thr Thr Ala Gln Asp Gly Leu Lys Lys Ser Pro Gln Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Val Thr Asp Thr Asn Asn Pro Ser Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ser Thr
85 90 95
Gly Thr Ser Lys Asn Val Thr Ser Ser Ala Ala Val Gln Val Lys Ser
100 105 110
Ala Ser Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ser Thr Leu Ala Lys Gly Glu Asn
115 120 125
Lys Phe Ala Arg Ser Ala Val Lys Asp Ser Val Thr Asp Gly Lys Thr
130 135 140
Ser Thr Ala Glu Ile Asn Pro Ala Lys Leu Ser Ser Pro Ala Leu Ile
145 150 155 160
Thr Gln Leu Asn Gln Ser Leu Ala Lys Ser Ser Thr Ser Asp Ala Ala
165 170 175
Lys Ala Asn Asp Glu Leu Glu Ile Lys Ala Thr Asp Pro Thr Asn Tyr
180 185 190
Pro Asn Cys Gly Asp Val Tyr Gly Pro Leu Phe Glu Leu Asp Ala Ser
195 200 205
Gly Gln Leu Val Asn Lys Asp Glu Val Ile Ser Leu Lys Asp Met Tyr
210 215 220
Ile Phe Gln Ile Leu Lys Leu Val Asn Thr Lys Asp Ser Asp Phe Gln
225 230 235 240
Tyr Val Ile Leu Thr Met Asn Arg Lys Asp Thr Ala Asp Arg Ser Val
245 250 255
Tyr Leu Phe Val Thr Gly Ser Asn Tyr Ser Asn Ala Val Val Val Lys
260 265 270
Val Lys Pro Asn Asp Thr Tyr Glu Leu Ser Lys Thr Gly Tyr Ser Val
275 280 285
Thr Tyr Thr Glu Pro Thr Thr Ile Asn Gly His Tyr Val Asp Gly Thr
290 295 300
Phe Tyr Val Thr Gly Ser Thr Tyr Asp Asp Gly Phe Ile Met Pro Asp
305 310 315 320
Trp Gln Leu Gln His Leu Gln Ile Ile Tyr Ser Leu Gly Asn Tyr Asp
325 330 335
Pro Ser Asn Thr Asp Ala Thr Ser Val Cys Glu Ile Met Pro Ser Tyr
340 345 350
Glu Lys Val Pro Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Pro Ser Asn Ile Ser
355 360 365
Gln Pro Lys Val Tyr Ile Thr Gly Phe Thr Gly Gln Glu Phe Asn Val
370 375 380
Thr Asp Ile Ile Asn Asn Tyr Lys Lys Val Phe Lys Gly Tyr Tyr Leu
385 390 395 400
Gln Asn Pro Asn Val Ala Ser Met Gly Thr Leu Ser Gln Phe Glu Asn
405 410 415
Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys Thr Tyr Tyr Asp Asn Asp Gly Asn Val Asp
420 425 430
Phe Lys Gly Leu Tyr His Gln Ile Asp Asp Gln Gly Thr Met Ser Val
435 440 445
Ser Val Leu Asn Ala Asp Asn Lys Thr Ile Val Gly Pro Glu Asn Ile
450 455 460
Leu Ala Gly Lys Ser His Asn Phe Asn Phe Asn Gly His Asn Trp Ile
465 470 475 480
Ala Arg Asn Pro Tyr Val Thr Ser Ser Ala His Glu Val Ile Leu Lys
485 490 495
Tyr Ala Lys Leu Gly Ser Val Ile Pro Val Asp Glu Asn Gly Asn Lys
500 505 510
Ile Asn Asp Gly Trp Gln Tyr Val Asn Asp Pro Asp Asp Ala Ser Lys
515 520 525
Ala Thr Ser Pro Tyr Glu Lys Ala Pro Val Ile Asp Gly Tyr Val Ala
530 535 540
Val Asn Pro Asp Glu Thr Ile Val Leu Pro His Asn Leu Ser Ser Asp
545 550 555 560
Thr Lys Ile Tyr Tyr Arg Lys Arg Ile Lys Val Thr Tyr Ser Gly Ser
565 570 575
Asp Ser Lys Thr Tyr Asp Gly Asn Pro Ala Asn Phe Glu Pro Thr Thr
580 585 590
Val Gln Trp Ser Gly Leu Lys Gly Leu Asn Thr Ser Thr Leu Thr Ser
595 600 605
Ala Asp Phe Thr Trp Asn Thr Ala Asp Lys Lys Ala Pro Thr Asp Ala
610 615 620
Gly Lys Tyr Thr Leu Ser Leu Asn Thr Thr Gly Glu Ala Ala Leu Arg
625 630 635 640
Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Lys Thr Ile Ser Gly Ser Tyr Thr
645 650 655
Tyr Thr Ile Asn Pro Leu Gly Ile Val Thr Val Asn Tyr Lys Gly Tyr
660 665 670
Asp Lys Lys Val Tyr Asp Gly Gln Pro Gly Thr Ile Asn Pro Gly Lys
675 680 685
Leu Thr Trp Ser Lys Leu Pro Asp Gly Thr Ser Leu Lys Met Pro Thr
690 695 700
Trp Ser Ile Asp Asp Phe Ala Trp Glu Thr Ala Asp Gly Leu Ala Pro
705 710 715 720
Thr Ala Val Gly Thr Tyr Arg Ile Ile Leu Thr Asp Ala Gly Lys Ala
725 730 735
Ala Leu Lys Lys Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Ser Ser Ile Thr Gly
740 745 750
Val Phe Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Ala Gln Thr Pro Glu Ile Leu Gly
755 760 765
Gln Thr Pro Glu Gln Gln Pro Gly Gln Asn Thr Asn Gln Ser Gly Ala
770 775 780
Glu Asn Gly Phe Gly Ser Ser Thr Arg Pro Asn Ala Ser Thr Asn Ser
785 790 795 800
Asn Leu Asn Gln Leu Pro Gln Thr Gly Asn Glu His Ser Asn Thr Ala
805 810 815
Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala Met Leu Gly Leu Gly
820 825 830
Lys Lys Arg Lys His Asp
835
<210> 2
<211> 2517
<212> DNA/ ДНК
<213> Lactobacillus reuteri
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (1)..(150)
<223> Сигнальная последовательность
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (151)..(2514)
<223> Зрелый белок
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (2515)..(2517)
<223> Стоп-кодон
<400> 2
atgctatcaa gaaaaaatta taaggaaact atacgaaaac agacacctac aaaacagtac 60
tatactatta agaaattaac tgttggggtt acttcggtat taattggtct atcctttatg 120
ggagaactag aaggggatag cgttcatgcg gacacgatga cagcaagcag tgagtcaaca 180
agtgttacgt cgacgactgc tcaggatggt ttaaaaaaat ctccacaact ctatttgcaa 240
gttactgata caaataaccc aagtacacca ttaagtgctt catccacagg gactagtaag 300
aatgttacct catcagctgc ggtacaagtg aagtccgcta gtgatgaaga agatagtgat 360
tctacactag ctaagggaga aaataaattt gctcggtcag cagtaaaaga ttcagtcact 420
gatgggaaaa caagtacagc agaaattaat ccggcaaaat taagcagtcc tgctttaata 480
acgcaactca accaatcctt agctaagagc agtacgagtg atgcagcaaa agctaatgat 540
gagttagaaa ttaaagcaac agatccgact aattatccaa actgtggcga tgtgtatggg 600
ccattatttg aattggatgc tagcggacag cttgttaata aagatgaagt tatatctctt 660
aaagatatgt atattttcca aatattgaaa ttagtaaata caaaagatag tgactttcaa 720
tatgtaatat taacaatgaa tcgtaaagat actgcagata ggtctgtata tctttttgta 780
actggaagca attatagtaa tgctgttgtt gttaaagtaa agccaaatga tacttatgaa 840
ttaagtaaaa ctggatatag tgttacttat acagaaccaa caactataaa tggacattat 900
gttgatggaa ctttttatgt tacaggaagt acttacgatg atggttttat aatgccagat 960
tggcaactgc agcaccttca gattatatat agtttaggaa attatgatcc aagcaatact 1020
gacgcaacat cagtttgtga aataatgcca agttatgaaa aggtaccggt aattaaatat 1080
agtggagtac cttcaaatat tagccaacct aaggtttaca ttaccgggtt tacgggtcaa 1140
gagtttaacg ttacagatat tattaacaat tataagaaag tttttaaggg ctactatctt 1200
caaaatccta atgtggcgtc catgggaact ctttcccaat ttgagaatgg tggttattac 1260
ttaaagacat attatgataa tgatggtaat gttgacttta agggcttgta tcatcaaatt 1320
gatgatcagg gaacaatgag tgtgagtgtt cttaatgcag ataataaaac aattgttgga 1380
cctgaaaata ttcttgctgg taaatcgcat aactttaact ttaatggtca taactggatt 1440
gcgcggaatc cttatgtcac tagttcagct cacgaagtca tattaaagta tgctaagtta 1500
ggttcagtta ttcctgttga tgaaaacgga aataaaataa acgatggatg gcaatatgtt 1560
aatgatccag atgatgcttc caaagccact agcccatatg aaaaagcgcc agttatcgat 1620
ggttatgtag ctgtaaatcc agatgaaacg atcgttcttc ctcataactt aagtagtgac 1680
acaaagattt attaccgaaa gaggattaaa gttacctata gtggtagtga cagcaagacc 1740
tacgatggta acccagctaa cttcgagcca acgacagttc agtggagtgg cttgaaagga 1800
ctgaacactt caaccttaac gtccgctgac ttcacgtgga atactgcgga taagaaggca 1860
ccaacggatg ccggtaagta cacacttagt ttgaatacga ccggagaagc agccttacgt 1920
aaggctaacc cgaactatga tctcaagaca attagcggta gttacaccta cacgattaat 1980
ccactaggga ttgtgactgt aaattacaag ggctatgata agaaagtcta tgatggtcaa 2040
cctggaacga ttaatccggg taaattaacg tggagtaagt tgccagatgg tacttcattg 2100
aagatgccaa catggagtat agatgatttc gcttgggaaa cagctgatgg cttagcacca 2160
acggcagtag gaacttatcg gattatcttg acggatgctg gtaaggctgc actaaagaag 2220
attaatccaa attatgactt aagcagtatt actggtgtct ttacttatga aattaagcca 2280
gcacagacac cagaaatctt aggccaaaca cctgagcaac aaccaggcca aaatactaat 2340
caatcaggag ctgaaaacgg ctttggttct tctacaaggc ctaatgcatc aactaactcc 2400
aatcttaatc aacttccaca gactggtaat gagcattcta atactgcact tgctggtcta 2460
gcattggctt tcttgactgc tatgcttggt ttgggcaaga agcgtaaaca tgattaa 2517
<210> 3
<211> 59
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Glu Glu Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys
1 5 10 15
Asp Arg Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn
20 25 30
Asn Arg Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys
35 40 45
Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe
50 55
<210> 4
<211> 180
<212> DNA/ ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
gaagaatacg ttggtctttc agctaaccaa tgtgctgttc cagctaaaga tcgtgttgat 60
tgtggttacc cacacgttac tccaaaagaa tgtaacaacc gtggttgttg ttttgattca 120
cgtatcccag gtgttccatg gtgttttaaa ccacttcaag aagctgaatg tactttttaa 180
<210> 5
<211> 27
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Lactococcus lactis
<400> 5
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala
20 25
<210> 6
<211> 81
<212> DNA/ ДНК
<213> Lactococcus lactis
<400> 6
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc c 81
<210> 7
<211> 81
<212> DNA/ ДНК
<213> Lactococcus lactis
<400> 7
atgaagaaga aaatcattag tgccatctta atgtctacag tgattctttc agctgcagct 60
cctttatcag gcgtttatgc a 81
<210> 8
<211> 86
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (1)..(27)
<223> SSusp45
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (28)..(86)
<223> hTFF3
<400> 8
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Glu Tyr Val Gly
20 25 30
Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys
35 40 45
Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys
50 55 60
Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln
65 70 75 80
Glu Ala Glu Cys Thr Phe
85
<210> 9
<211> 261
<212> DNA/ ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> CDS/ Кодирующая последовательность
<222> (1)..(258)
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (1)..(81)
<223> SSusp45
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (82)..(258)
<223> hTFF3
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (259)..(261)
<223> Стоп-кодон
<400> 9
atg aaa aaa aag att atc tca gct att tta atg tct aca gtg ata ctt 48
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
tct gct gca gcc ccg ttg tca ggt gtt tac gcc gaa gaa tac gtt ggt 96
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Glu Tyr Val Gly
20 25 30
ctt tca gct aac caa tgt gct gtt cca gct aaa gat cgt gtt gat tgt 144
Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys
35 40 45
ggt tac cca cac gtt act cca aaa gaa tgt aac aac cgt ggt tgt tgt 192
Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys
50 55 60
ttt gat tca cgt atc cca ggt gtt cca tgg tgt ttt aaa cca ctt caa 240
Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln
65 70 75 80
gaa gct gaa tgt act ttt taa 261
Glu Ala Glu Cys Thr Phe
85
<210> 10
<211> 874
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (1)..(27)
<223> SSusp45
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (28)..(86)
<223> hTFF3
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (87)..(874)
<223> CmbA
<400> 10
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Glu Tyr Val Gly
20 25 30
Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys
35 40 45
Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys
50 55 60
Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln
65 70 75 80
Glu Ala Glu Cys Thr Phe Asp Thr Met Thr Ala Ser Ser Glu Ser Thr
85 90 95
Ser Val Thr Ser Thr Thr Ala Gln Asp Gly Leu Lys Lys Ser Pro Gln
100 105 110
Leu Tyr Leu Gln Val Thr Asp Thr Asn Asn Pro Ser Thr Pro Leu Ser
115 120 125
Ala Ser Ser Thr Gly Thr Ser Lys Asn Val Thr Ser Ser Ala Ala Val
130 135 140
Gln Val Lys Ser Ala Ser Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ser Thr Leu Ala
145 150 155 160
Lys Gly Glu Asn Lys Phe Ala Arg Ser Ala Val Lys Asp Ser Val Thr
165 170 175
Asp Gly Lys Thr Ser Thr Ala Glu Ile Asn Pro Ala Lys Leu Ser Ser
180 185 190
Pro Ala Leu Ile Thr Gln Leu Asn Gln Ser Leu Ala Lys Ser Ser Thr
195 200 205
Ser Asp Ala Ala Lys Ala Asn Asp Glu Leu Glu Ile Lys Ala Thr Asp
210 215 220
Pro Thr Asn Tyr Pro Asn Cys Gly Asp Val Tyr Gly Pro Leu Phe Glu
225 230 235 240
Leu Asp Ala Ser Gly Gln Leu Val Asn Lys Asp Glu Val Ile Ser Leu
245 250 255
Lys Asp Met Tyr Ile Phe Gln Ile Leu Lys Leu Val Asn Thr Lys Asp
260 265 270
Ser Asp Phe Gln Tyr Val Ile Leu Thr Met Asn Arg Lys Asp Thr Ala
275 280 285
Asp Arg Ser Val Tyr Leu Phe Val Thr Gly Ser Asn Tyr Ser Asn Ala
290 295 300
Val Val Val Lys Val Lys Pro Asn Asp Thr Tyr Glu Leu Ser Lys Thr
305 310 315 320
Gly Tyr Ser Val Thr Tyr Thr Glu Pro Thr Thr Ile Asn Gly His Tyr
325 330 335
Val Asp Gly Thr Phe Tyr Val Thr Gly Ser Thr Tyr Asp Asp Gly Phe
340 345 350
Ile Met Pro Asp Trp Gln Leu Gln His Leu Gln Ile Ile Tyr Ser Leu
355 360 365
Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Asn Thr Asp Ala Thr Ser Val Cys Glu Ile
370 375 380
Met Pro Ser Tyr Glu Lys Val Pro Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Pro
385 390 395 400
Ser Asn Ile Ser Gln Pro Lys Val Tyr Ile Thr Gly Phe Thr Gly Gln
405 410 415
Glu Phe Asn Val Thr Asp Ile Ile Asn Asn Tyr Lys Lys Val Phe Lys
420 425 430
Gly Tyr Tyr Leu Gln Asn Pro Asn Val Ala Ser Met Gly Thr Leu Ser
435 440 445
Gln Phe Glu Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys Thr Tyr Tyr Asp Asn Asp
450 455 460
Gly Asn Val Asp Phe Lys Gly Leu Tyr His Gln Ile Asp Asp Gln Gly
465 470 475 480
Thr Met Ser Val Ser Val Leu Asn Ala Asp Asn Lys Thr Ile Val Gly
485 490 495
Pro Glu Asn Ile Leu Ala Gly Lys Ser His Asn Phe Asn Phe Asn Gly
500 505 510
His Asn Trp Ile Ala Arg Asn Pro Tyr Val Thr Ser Ser Ala His Glu
515 520 525
Val Ile Leu Lys Tyr Ala Lys Leu Gly Ser Val Ile Pro Val Asp Glu
530 535 540
Asn Gly Asn Lys Ile Asn Asp Gly Trp Gln Tyr Val Asn Asp Pro Asp
545 550 555 560
Asp Ala Ser Lys Ala Thr Ser Pro Tyr Glu Lys Ala Pro Val Ile Asp
565 570 575
Gly Tyr Val Ala Val Asn Pro Asp Glu Thr Ile Val Leu Pro His Asn
580 585 590
Leu Ser Ser Asp Thr Lys Ile Tyr Tyr Arg Lys Arg Ile Lys Val Thr
595 600 605
Tyr Ser Gly Ser Asp Ser Lys Thr Tyr Asp Gly Asn Pro Ala Asn Phe
610 615 620
Glu Pro Thr Thr Val Gln Trp Ser Gly Leu Lys Gly Leu Asn Thr Ser
625 630 635 640
Thr Leu Thr Ser Ala Asp Phe Thr Trp Asn Thr Ala Asp Lys Lys Ala
645 650 655
Pro Thr Asp Ala Gly Lys Tyr Thr Leu Ser Leu Asn Thr Thr Gly Glu
660 665 670
Ala Ala Leu Arg Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Lys Thr Ile Ser
675 680 685
Gly Ser Tyr Thr Tyr Thr Ile Asn Pro Leu Gly Ile Val Thr Val Asn
690 695 700
Tyr Lys Gly Tyr Asp Lys Lys Val Tyr Asp Gly Gln Pro Gly Thr Ile
705 710 715 720
Asn Pro Gly Lys Leu Thr Trp Ser Lys Leu Pro Asp Gly Thr Ser Leu
725 730 735
Lys Met Pro Thr Trp Ser Ile Asp Asp Phe Ala Trp Glu Thr Ala Asp
740 745 750
Gly Leu Ala Pro Thr Ala Val Gly Thr Tyr Arg Ile Ile Leu Thr Asp
755 760 765
Ala Gly Lys Ala Ala Leu Lys Lys Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Ser
770 775 780
Ser Ile Thr Gly Val Phe Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Ala Gln Thr Pro
785 790 795 800
Glu Ile Leu Gly Gln Thr Pro Glu Gln Gln Pro Gly Gln Asn Thr Asn
805 810 815
Gln Ser Gly Ala Glu Asn Gly Phe Gly Ser Ser Thr Arg Pro Asn Ala
820 825 830
Ser Thr Asn Ser Asn Leu Asn Gln Leu Pro Gln Thr Gly Asn Glu His
835 840 845
Ser Asn Thr Ala Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala Met
850 855 860
Leu Gly Leu Gly Lys Lys Arg Lys His Asp
865 870
<210> 11
<211> 2625
<212> DNA/ ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> CDS/ Кодирующая последовательность
<222> (1)..(2622)
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (1)..(81)
<223> SSusp45
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (82)..(258)
<223> hTFF3
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (259)..(2622)
<223> CmbA
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (2623)..(2625)
<223> Стоп-кодон
<400> 11
atg aaa aaa aag att atc tca gct att tta atg tct aca gtg ata ctt 48
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
tct gct gca gcc ccg ttg tca ggt gtt tac gcc gaa gaa tac gtt ggt 96
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Glu Tyr Val Gly
20 25 30
ctt tca gct aac caa tgt gct gtt cca gct aaa gat cgt gtt gat tgt 144
Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys
35 40 45
ggt tac cca cac gtt act cca aaa gaa tgt aac aac cgt ggt tgt tgt 192
Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys
50 55 60
ttt gat tca cgt atc cca ggt gtt cca tgg tgt ttt aaa cca ctt caa 240
Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln
65 70 75 80
gaa gct gaa tgt act ttt gac acg atg aca gca agc agt gag tca aca 288
Glu Ala Glu Cys Thr Phe Asp Thr Met Thr Ala Ser Ser Glu Ser Thr
85 90 95
agt gtt acg tcg acg act gct cag gat ggt tta aaa aaa tct cca caa 336
Ser Val Thr Ser Thr Thr Ala Gln Asp Gly Leu Lys Lys Ser Pro Gln
100 105 110
ctc tat ttg caa gtt act gat aca aat aac cca agt aca cca tta agt 384
Leu Tyr Leu Gln Val Thr Asp Thr Asn Asn Pro Ser Thr Pro Leu Ser
115 120 125
gct tca tcc aca ggg act agt aag aat gtt acc tca tca gct gcg gta 432
Ala Ser Ser Thr Gly Thr Ser Lys Asn Val Thr Ser Ser Ala Ala Val
130 135 140
caa gtg aag tcc gct agt gat gaa gaa gat agt gat tct aca cta gct 480
Gln Val Lys Ser Ala Ser Asp Glu Glu Asp Ser Asp Ser Thr Leu Ala
145 150 155 160
aag gga gaa aat aaa ttt gct cgg tca gca gta aaa gat tca gtc act 528
Lys Gly Glu Asn Lys Phe Ala Arg Ser Ala Val Lys Asp Ser Val Thr
165 170 175
gat ggg aaa aca agt aca gca gaa att aat ccg gca aaa tta agc agt 576
Asp Gly Lys Thr Ser Thr Ala Glu Ile Asn Pro Ala Lys Leu Ser Ser
180 185 190
cct gct tta ata acg caa ctc aac caa tcc tta gct aag agc agt acg 624
Pro Ala Leu Ile Thr Gln Leu Asn Gln Ser Leu Ala Lys Ser Ser Thr
195 200 205
agt gat gca gca aaa gct aat gat gag tta gaa att aaa gca aca gat 672
Ser Asp Ala Ala Lys Ala Asn Asp Glu Leu Glu Ile Lys Ala Thr Asp
210 215 220
ccg act aat tat cca aac tgt ggc gat gtg tat ggg cca tta ttt gaa 720
Pro Thr Asn Tyr Pro Asn Cys Gly Asp Val Tyr Gly Pro Leu Phe Glu
225 230 235 240
ttg gat gct agc gga cag ctt gtt aat aaa gat gaa gtt ata tct ctt 768
Leu Asp Ala Ser Gly Gln Leu Val Asn Lys Asp Glu Val Ile Ser Leu
245 250 255
aaa gat atg tat att ttc caa ata ttg aaa tta gta aat aca aaa gat 816
Lys Asp Met Tyr Ile Phe Gln Ile Leu Lys Leu Val Asn Thr Lys Asp
260 265 270
agt gac ttt caa tat gta ata tta aca atg aat cgt aaa gat act gca 864
Ser Asp Phe Gln Tyr Val Ile Leu Thr Met Asn Arg Lys Asp Thr Ala
275 280 285
gat agg tct gta tat ctt ttt gta act gga agc aat tat agt aat gct 912
Asp Arg Ser Val Tyr Leu Phe Val Thr Gly Ser Asn Tyr Ser Asn Ala
290 295 300
gtt gtt gtt aaa gta aag cca aat gat act tat gaa tta agt aaa act 960
Val Val Val Lys Val Lys Pro Asn Asp Thr Tyr Glu Leu Ser Lys Thr
305 310 315 320
gga tat agt gtt act tat aca gaa cca aca act ata aat gga cat tat 1008
Gly Tyr Ser Val Thr Tyr Thr Glu Pro Thr Thr Ile Asn Gly His Tyr
325 330 335
gtt gat gga act ttt tat gtt aca gga agt act tac gat gat ggt ttt 1056
Val Asp Gly Thr Phe Tyr Val Thr Gly Ser Thr Tyr Asp Asp Gly Phe
340 345 350
ata atg cca gat tgg caa ctg cag cac ctt cag att ata tat agt tta 1104
Ile Met Pro Asp Trp Gln Leu Gln His Leu Gln Ile Ile Tyr Ser Leu
355 360 365
gga aat tat gat cca agc aat act gac gca aca tca gtt tgt gaa ata 1152
Gly Asn Tyr Asp Pro Ser Asn Thr Asp Ala Thr Ser Val Cys Glu Ile
370 375 380
atg cca agt tat gaa aag gta ccg gta att aaa tat agt gga gta cct 1200
Met Pro Ser Tyr Glu Lys Val Pro Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Pro
385 390 395 400
tca aat att agc caa cct aag gtt tac att acc ggg ttt acg ggt caa 1248
Ser Asn Ile Ser Gln Pro Lys Val Tyr Ile Thr Gly Phe Thr Gly Gln
405 410 415
gag ttt aac gtt aca gat att att aac aat tat aag aaa gtt ttt aag 1296
Glu Phe Asn Val Thr Asp Ile Ile Asn Asn Tyr Lys Lys Val Phe Lys
420 425 430
ggc tac tat ctt caa aat cct aat gtg gcg tcc atg gga act ctt tcc 1344
Gly Tyr Tyr Leu Gln Asn Pro Asn Val Ala Ser Met Gly Thr Leu Ser
435 440 445
caa ttt gag aat ggt ggt tat tac tta aag aca tat tat gat aat gat 1392
Gln Phe Glu Asn Gly Gly Tyr Tyr Leu Lys Thr Tyr Tyr Asp Asn Asp
450 455 460
ggt aat gtt gac ttt aag ggc ttg tat cat caa att gat gat cag gga 1440
Gly Asn Val Asp Phe Lys Gly Leu Tyr His Gln Ile Asp Asp Gln Gly
465 470 475 480
aca atg agt gtg agt gtt ctt aat gca gat aat aaa aca att gtt gga 1488
Thr Met Ser Val Ser Val Leu Asn Ala Asp Asn Lys Thr Ile Val Gly
485 490 495
cct gaa aat att ctt gct ggt aaa tcg cat aac ttt aac ttt aat ggt 1536
Pro Glu Asn Ile Leu Ala Gly Lys Ser His Asn Phe Asn Phe Asn Gly
500 505 510
cat aac tgg att gcg cgg aat cct tat gtc act agt tca gct cac gaa 1584
His Asn Trp Ile Ala Arg Asn Pro Tyr Val Thr Ser Ser Ala His Glu
515 520 525
gtc ata tta aag tat gct aag tta ggt tca gtt att cct gtt gat gaa 1632
Val Ile Leu Lys Tyr Ala Lys Leu Gly Ser Val Ile Pro Val Asp Glu
530 535 540
aac gga aat aaa ata aac gat gga tgg caa tat gtt aat gat cca gat 1680
Asn Gly Asn Lys Ile Asn Asp Gly Trp Gln Tyr Val Asn Asp Pro Asp
545 550 555 560
gat gct tcc aaa gcc act agc cca tat gaa aaa gcg cca gtt atc gat 1728
Asp Ala Ser Lys Ala Thr Ser Pro Tyr Glu Lys Ala Pro Val Ile Asp
565 570 575
ggt tat gta gct gta aat cca gat gaa acg atc gtt ctt cct cat aac 1776
Gly Tyr Val Ala Val Asn Pro Asp Glu Thr Ile Val Leu Pro His Asn
580 585 590
tta agt agt gac aca aag att tat tac cga aag agg att aaa gtt acc 1824
Leu Ser Ser Asp Thr Lys Ile Tyr Tyr Arg Lys Arg Ile Lys Val Thr
595 600 605
tat agt ggt agt gac agc aag acc tac gat ggt aac cca gct aac ttc 1872
Tyr Ser Gly Ser Asp Ser Lys Thr Tyr Asp Gly Asn Pro Ala Asn Phe
610 615 620
gag cca acg aca gtt cag tgg agt ggc ttg aaa gga ctg aac act tca 1920
Glu Pro Thr Thr Val Gln Trp Ser Gly Leu Lys Gly Leu Asn Thr Ser
625 630 635 640
acc tta acg tcc gct gac ttc acg tgg aat act gcg gat aag aag gca 1968
Thr Leu Thr Ser Ala Asp Phe Thr Trp Asn Thr Ala Asp Lys Lys Ala
645 650 655
cca acg gat gcc ggt aag tac aca ctt agt ttg aat acg acc gga gaa 2016
Pro Thr Asp Ala Gly Lys Tyr Thr Leu Ser Leu Asn Thr Thr Gly Glu
660 665 670
gca gcc tta cgt aag gct aac ccg aac tat gat ctc aag aca att agc 2064
Ala Ala Leu Arg Lys Ala Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Lys Thr Ile Ser
675 680 685
ggt agt tac acc tac acg att aat cca cta ggg att gtg act gta aat 2112
Gly Ser Tyr Thr Tyr Thr Ile Asn Pro Leu Gly Ile Val Thr Val Asn
690 695 700
tac aag ggc tat gat aag aaa gtc tat gat ggt caa cct gga acg att 2160
Tyr Lys Gly Tyr Asp Lys Lys Val Tyr Asp Gly Gln Pro Gly Thr Ile
705 710 715 720
aat ccg ggt aaa tta acg tgg agt aag ttg cca gat ggt act tca ttg 2208
Asn Pro Gly Lys Leu Thr Trp Ser Lys Leu Pro Asp Gly Thr Ser Leu
725 730 735
aag atg cca aca tgg agt ata gat gat ttc gct tgg gaa aca gct gat 2256
Lys Met Pro Thr Trp Ser Ile Asp Asp Phe Ala Trp Glu Thr Ala Asp
740 745 750
ggc tta gca cca acg gca gta gga act tat cgg att atc ttg acg gat 2304
Gly Leu Ala Pro Thr Ala Val Gly Thr Tyr Arg Ile Ile Leu Thr Asp
755 760 765
gct ggt aag gct gca cta aag aag att aat cca aat tat gac tta agc 2352
Ala Gly Lys Ala Ala Leu Lys Lys Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Leu Ser
770 775 780
agt att act ggt gtc ttt act tat gaa att aag cca gca cag aca cca 2400
Ser Ile Thr Gly Val Phe Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Ala Gln Thr Pro
785 790 795 800
gaa atc tta ggc caa aca cct gag caa caa cca ggc caa aat act aat 2448
Glu Ile Leu Gly Gln Thr Pro Glu Gln Gln Pro Gly Gln Asn Thr Asn
805 810 815
caa tca gga gct gaa aac ggc ttt ggt tct tct aca agg cct aat gca 2496
Gln Ser Gly Ala Glu Asn Gly Phe Gly Ser Ser Thr Arg Pro Asn Ala
820 825 830
tca act aac tcc aat ctt aat caa ctt cca cag act ggt aat gag cat 2544
Ser Thr Asn Ser Asn Leu Asn Gln Leu Pro Gln Thr Gly Asn Glu His
835 840 845
tct aat act gca ctt gct ggt cta gca ttg gct ttc ttg act gct atg 2592
Ser Asn Thr Ala Leu Ala Gly Leu Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala Met
850 855 860
ctt ggt ttg ggc aag aag cgt aaa cat gat taa 2625
Leu Gly Leu Gly Lys Lys Arg Lys His Asp
865 870
<210> 12
<211> 16
<212> DNA/ ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестной последовательности:
последовательность rpmD
<400> 12
taaggaggaa aaaatg 16
<210> 13
<211> 10
<212> DNA/ ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестной последовательности:
последовательность rpmD
<400> 13
ggaggaaaaa 10
<210> 14
<211> 985
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 14
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Phe Asn Gly Ala Val
20 25 30
Val His Ala Asp Thr Pro Ser Asn Asp Lys Pro Val Val Val Thr Thr
35 40 45
Ile Ala Ser Asn Ser Ser Ala Val Glu Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser
50 55 60
Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys
85 90 95
Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr
100 105 110
Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val
145 150 155 160
Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ala Asp
165 170 175
Thr Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ser Asp Ser Ser Leu
180 185 190
Val Lys Gly Arg Val Tyr Ala Ser Thr Tyr Leu Glu Ser Asn Lys Asn
195 200 205
Tyr Tyr Thr Asp Pro Ala Ile Ser Arg Gly Phe Leu Asp Ser Pro Ile
210 215 220
Ser Lys Glu Leu Leu Gly Asp Gln Asn Trp Asn Met Phe Gln Val Ala
225 230 235 240
Val Ser Lys Asn Leu Val Ser Tyr Asn Pro Gly Met Thr Phe Asn Gln
245 250 255
Tyr Tyr Leu Ala Asn Asn Ile Ser Pro Glu Asp Asn Phe Ile Val Tyr
260 265 270
Pro Arg Leu Thr Asn Gln Ile Val Arg Leu Lys Ser Gly Ala Tyr Leu
275 280 285
Asn Ala Asn Pro Asn Pro Lys Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Ile
290 295 300
Val Asp Tyr Ile Thr Tyr Val Gly Pro Thr Asp Asp Arg Gly Ala Tyr
305 310 315 320
Trp Gly Asp Lys Glu Leu Glu Asp Pro Val Leu Phe Ser Arg Leu Thr
325 330 335
Val Gly Glu Leu Pro Ser Ala Ser Glu Gly Thr Leu Gly Leu Phe Asn
340 345 350
Ser Gly Thr Tyr Leu Phe Pro Thr Gln Ile Gly Tyr Gly Glu Asn Ala
355 360 365
Thr Val Asn Asp Tyr Met Leu Thr Pro Gly Asn Asp Phe Ile Ile Pro
370 375 380
Thr Arg Phe Asn Thr Ile Arg Asn Asp Val Tyr Leu Thr Met Arg Ser
385 390 395 400
Arg Ala Tyr Phe Gly Ala Gly Leu Gln Gly Ala Gln Ala Ser Leu Thr
405 410 415
Ala Thr Ser Asn Gly Lys Pro Val Val Gly Ser Ser Glu Asn Ser Lys
420 425 430
Phe Tyr Ile Asp Thr Asp Ser Asn Val Tyr Leu Thr Lys Gln Gly Phe
435 440 445
Asp Gln Leu Gly Asn Phe Gly Lys Ile Met Ala Pro Phe Val Tyr Thr
450 455 460
Ser Ala Ser Asn Asp Leu Lys Lys Val Gly Ile Asp Lys Phe Ser Ala
465 470 475 480
Met Met Asn Gln Gly Leu Ser Ser Ile Gln Ser Lys Ser Gly Ala Asn
485 490 495
Thr Ile Val Ser Gly Asn Gly Gly Gln Ile Gln Leu Ser Gly Phe Asn
500 505 510
Arg Glu Thr Asp Leu Asp Gly Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ser Asp Arg
515 520 525
Glu Asn Asp Ala Leu Lys Asn Thr Asp Val Asn Phe Tyr Met Tyr Thr
530 535 540
Lys Gly Asn Thr Glu Thr Asn Val Thr Thr Pro Leu Ala Pro Asn Gly
545 550 555 560
Tyr His Leu Tyr Ser Pro Asn Val Ser Glu Phe Lys Ile Gln Thr Thr
565 570 575
Arg Pro Tyr Phe Ser Trp Thr Gly Asp Ile Ser Asn Ala Ile Lys Ile
580 585 590
Ser Glu Ala Asn Ala Asp Phe Asp Asp Leu Leu Gly Ser Asn Ser Leu
595 600 605
Gln Val Thr Asp Asn Gly Val Asp Ser Asp Gly Thr Pro Ile Ser Val
610 615 620
Asp Leu Asn Arg Val Arg Ile Arg Ile Ser Glu Asp Gly Gly Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Ser Asn Asp Ser Tyr Thr Leu Asn Asp Leu Lys Ala Leu Leu Thr
645 650 655
Ser Gly Asn Ile Thr Val Pro Lys Ile Val Ile Ala Tyr Thr Tyr Ser
660 665 670
Ala Thr Asp Ser Lys Thr Asp Asn Ile Gly Lys Leu Pro Ser Glu Ile
675 680 685
Asp Asp Asn Thr Gly Ala Tyr Ala Val Pro Phe Thr Arg Thr Leu Thr
690 695 700
Asn Asp Ile Pro Asp Lys Lys Ser Asn Ile Thr Val Lys Tyr Ile Asp
705 710 715 720
Ile Ser Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Ile Val Lys Ala Gly Asn Val
725 730 735
Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe
740 745 750
Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln
755 760 765
Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly Gly Ser Val
770 775 780
Thr Ala Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Asn Ala Ile Ser Asp Asn Val
785 790 795 800
Val Lys Thr Gly Asn Ile Gly Asp Thr Tyr Ser Thr Lys Gln Lys Thr
805 810 815
Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Glu Val Gln Gly Ser Val Ser Gly Gln
820 825 830
Phe Thr Asn Gln Glu Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro
835 840 845
Val Ala Gly Ala His Ile Ile Ala Lys Tyr Val Asp Glu Asn Gly Asn
850 855 860
Thr Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Ser Gly Asn Ile Gly Asp Ser Tyr
865 870 875 880
Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln
885 890 895
Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr
900 905 910
Ile Tyr Thr Lys Val Lys Thr Ser Gly Gly Ser Glu Thr Pro Thr Pro
915 920 925
Ser Lys Thr Ile Ala Thr Lys Ser Ser Thr Asn Thr Ile Ser Ser Ser
930 935 940
Thr Leu Pro Lys Thr Gly Asp Ser Gln Val Ser Thr Leu Phe Gly Met
945 950 955 960
Val Val Gly Phe Phe Ile Phe Gly Ala Gly Thr Leu Ser Leu Phe Phe
965 970 975
Asn Ser Lys Arg Lys Arg Lys Ser Lys
980 985
<210> 15
<211> 3180
<212> DNA/ ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> CDS/ Кодирующая последовательность
<222> (208)..(3162)
<400> 15
agctttagaa gaagaaaaag cagctgttga attagagggt tcagaaactg cctgatggat 60
attttttata aatctggttt gaacaaatta tattgacatc tctttttcta tcctgataat 120
tctgagaggt tattttggga aatactattg aaccatatcg aggtggtgtg gtataatgaa 180
gggaattaaa aaagatagga aaatttc atg aaa aaa aag att atc tca gct att 234
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile
1 5
tta atg tct aca gtg ata ctt tct gct gca gcc ccg ttg tca ggt gtt 282
Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val
10 15 20 25
tac gct ttc aat gga gcg gtc gtg cac gcg gat aca ccg agc aat gac 330
Tyr Ala Phe Asn Gly Ala Val Val His Ala Asp Thr Pro Ser Asn Asp
30 35 40
aaa cct gtg gtt gta aca acc att gcg tca aac tca tct gcc gtt gaa 378
Lys Pro Val Val Val Thr Thr Ile Ala Ser Asn Ser Ser Ala Val Glu
45 50 55
gct gag act gcc agc agt tct tca tca agt gcc gta aaa gcg gaa acg 426
Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr
60 65 70
acc agc gcc tct tct tca agt gct gta aaa gct gag aca gcc tct agc 474
Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser
75 80 85
agt tca agc tca gcc gta aag gca gaa act acg agt gca tca tct tca 522
Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser
90 95 100 105
tca gcg gta aag gcg gag acc gct agc tct tct tct agt agt gct gtg 570
Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val
110 115 120
aaa gcc gag acg acg agc gca tct tca tct tct gct gtt aag gcg gaa 618
Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu
125 130 135
aca aca agc gct tct agc tca agc gcc gtc aaa gca gaa aca gcg agt 666
Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser
140 145 150
tca tct tct agt agt gca gtt aaa gcc gaa act acc tct gcc agc tca 714
Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser
155 160 165
tct tca gca gca aag gcg gat acc acc agc gca gct agt tca tct gcg 762
Ser Ser Ala Ala Lys Ala Asp Thr Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala
170 175 180 185
gca aag agc gac agt tca ctt gtg aaa ggg cgt gtt tat gcc tct acg 810
Ala Lys Ser Asp Ser Ser Leu Val Lys Gly Arg Val Tyr Ala Ser Thr
190 195 200
tat tta gag tca aac aag aac tat tat acc gat ccg gct atc agt cgt 858
Tyr Leu Glu Ser Asn Lys Asn Tyr Tyr Thr Asp Pro Ala Ile Ser Arg
205 210 215
ggc ttt tta gac agt ccg ata tct aaa gag tta ctt ggt gat caa aat 906
Gly Phe Leu Asp Ser Pro Ile Ser Lys Glu Leu Leu Gly Asp Gln Asn
220 225 230
tgg aat atg ttt caa gtt gct gtc agc aag aac ctt gtc tca tat aat 954
Trp Asn Met Phe Gln Val Ala Val Ser Lys Asn Leu Val Ser Tyr Asn
235 240 245
cca gga atg acg ttt aac caa tat tac ttg gcg aat aat atc tca cca 1002
Pro Gly Met Thr Phe Asn Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Asn Ile Ser Pro
250 255 260 265
gaa gat aat ttc atc gtt tat cct cgt tta acc aat caa ata gta aga 1050
Glu Asp Asn Phe Ile Val Tyr Pro Arg Leu Thr Asn Gln Ile Val Arg
270 275 280
tta aag agt gga gcc tat ttg aac gcg aac cct aac cct aag ggg gcg 1098
Leu Lys Ser Gly Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Pro Asn Pro Lys Gly Ala
285 290 295
aaa gac gat agt ggc aac ata gtc gac tac ata act tat gtt ggc cct 1146
Lys Asp Asp Ser Gly Asn Ile Val Asp Tyr Ile Thr Tyr Val Gly Pro
300 305 310
acg gac gat cgt ggt gcg tac tgg ggg gac aaa gag ctt gaa gat ccg 1194
Thr Asp Asp Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Asp Lys Glu Leu Glu Asp Pro
315 320 325
gtg ctt ttc tct cga ctt act gtg ggt gag ttg ccg agt gct tct gag 1242
Val Leu Phe Ser Arg Leu Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Ala Ser Glu
330 335 340 345
ggc acg ctt ggc ttg ttt aac agt gga aca tat ctt ttc cct aca caa 1290
Gly Thr Leu Gly Leu Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Leu Phe Pro Thr Gln
350 355 360
ata ggc tac ggt gaa aac gcc aca gtt aac gat tac atg ctt acc cct 1338
Ile Gly Tyr Gly Glu Asn Ala Thr Val Asn Asp Tyr Met Leu Thr Pro
365 370 375
ggt aat gac ttc atc ata cca act cga ttt aat acg atc cgt aat gac 1386
Gly Asn Asp Phe Ile Ile Pro Thr Arg Phe Asn Thr Ile Arg Asn Asp
380 385 390
gtg tac tta acg atg cga tct cgt gca tac ttc ggg gct gga tta caa 1434
Val Tyr Leu Thr Met Arg Ser Arg Ala Tyr Phe Gly Ala Gly Leu Gln
395 400 405
ggg gca cag gca agt tta acc gca acc tct aat gga aaa ccg gta gtg 1482
Gly Ala Gln Ala Ser Leu Thr Ala Thr Ser Asn Gly Lys Pro Val Val
410 415 420 425
ggg tca tca gag aac agc aaa ttt tac ata gac aca gac agt aat gtc 1530
Gly Ser Ser Glu Asn Ser Lys Phe Tyr Ile Asp Thr Asp Ser Asn Val
430 435 440
tat ctt aca aaa cag ggg ttt gat caa ctt ggt aac ttt ggt aaa ata 1578
Tyr Leu Thr Lys Gln Gly Phe Asp Gln Leu Gly Asn Phe Gly Lys Ile
445 450 455
atg gct cca ttc gtt tat acg agc gct tca aac gat ttg aag aag gtc 1626
Met Ala Pro Phe Val Tyr Thr Ser Ala Ser Asn Asp Leu Lys Lys Val
460 465 470
gga ata gac aaa ttc tca gcc atg atg aac caa ggg ttg agt agc ata 1674
Gly Ile Asp Lys Phe Ser Ala Met Met Asn Gln Gly Leu Ser Ser Ile
475 480 485
caa agc aag tct ggg gca aac acc atc gta tca ggg aac ggc ggc cag 1722
Gln Ser Lys Ser Gly Ala Asn Thr Ile Val Ser Gly Asn Gly Gly Gln
490 495 500 505
att caa ttg agc ggt ttc aat aga gaa aca gac ttg gat gga gca ttc 1770
Ile Gln Leu Ser Gly Phe Asn Arg Glu Thr Asp Leu Asp Gly Ala Phe
510 515 520
tca tct tca ata agc gat cgt gag aac gat gca tta aag aat aca gat 1818
Ser Ser Ser Ile Ser Asp Arg Glu Asn Asp Ala Leu Lys Asn Thr Asp
525 530 535
gtc aac ttc tat atg tat acg aaa ggc aac aca gaa act aat gtg acg 1866
Val Asn Phe Tyr Met Tyr Thr Lys Gly Asn Thr Glu Thr Asn Val Thr
540 545 550
acg ccg ttg gcc ccg aat ggg tac cac ctt tac tca cca aac gta tct 1914
Thr Pro Leu Ala Pro Asn Gly Tyr His Leu Tyr Ser Pro Asn Val Ser
555 560 565
gaa ttc aag ata cag act acc aga cct tac ttc tca tgg acg gga gac 1962
Glu Phe Lys Ile Gln Thr Thr Arg Pro Tyr Phe Ser Trp Thr Gly Asp
570 575 580 585
ata agt aat gct ata aaa att tct gaa gcc aat gcg gat ttc gat gat 2010
Ile Ser Asn Ala Ile Lys Ile Ser Glu Ala Asn Ala Asp Phe Asp Asp
590 595 600
tta ctt ggt agt aac tca tta cag gtt act gat aat ggg gtg gac agc 2058
Leu Leu Gly Ser Asn Ser Leu Gln Val Thr Asp Asn Gly Val Asp Ser
605 610 615
gac ggt acc cct ata tct gtc gac ctt aat cgt gtc aga ata aga ata 2106
Asp Gly Thr Pro Ile Ser Val Asp Leu Asn Arg Val Arg Ile Arg Ile
620 625 630
tct gag gac gga ggg agt aca tat tct aac gat tct tat acg ctt aat 2154
Ser Glu Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Asp Ser Tyr Thr Leu Asn
635 640 645
gac tta aaa gcc tta ttg acc agc gga aac atc act gtc cct aag ata 2202
Asp Leu Lys Ala Leu Leu Thr Ser Gly Asn Ile Thr Val Pro Lys Ile
650 655 660 665
gtt atc gct tat acc tac tct gcg act gat tca aaa act gat aac atc 2250
Val Ile Ala Tyr Thr Tyr Ser Ala Thr Asp Ser Lys Thr Asp Asn Ile
670 675 680
ggt aag tta ccg tct gaa att gac gac aac aca ggc gcg tac gcc gtt 2298
Gly Lys Leu Pro Ser Glu Ile Asp Asp Asn Thr Gly Ala Tyr Ala Val
685 690 695
ccg ttc aca cgt acg ttg acg aat gac att cca gat aaa aaa agt aac 2346
Pro Phe Thr Arg Thr Leu Thr Asn Asp Ile Pro Asp Lys Lys Ser Asn
700 705 710
att acg gtc aag tat atc gat atc tct ggt aat acc ata tct gat aac 2394
Ile Thr Val Lys Tyr Ile Asp Ile Ser Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn
715 720 725
ata gtt aaa gcc ggt aat gtt ggc gat tca tat aca aca gaa caa aaa 2442
Ile Val Lys Ala Gly Asn Val Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys
730 735 740 745
gca ata ccg gga tac acc ttc aaa gcc gta caa ggt aat cca acc ggt 2490
Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly
750 755 760
caa ttc acg tct gat gct caa aca gtg acg tac gtt tac acg aag gat 2538
Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp
765 770 775
cca gtg gca ggc ggc agc gtc acc gct aag tat gtc gat acc agt ggg 2586
Pro Val Ala Gly Gly Ser Val Thr Ala Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly
780 785 790
aac gcc atc tct gat aac gtt gtt aaa acc ggt aac atc ggc gat acc 2634
Asn Ala Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Thr Gly Asn Ile Gly Asp Thr
795 800 805
tac agt act aag cag aag acc ata ccg gga tat act ttc aaa gag gtt 2682
Tyr Ser Thr Lys Gln Lys Thr Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Glu Val
810 815 820 825
caa gga tct gtt agc gga caa ttt acc aat cag gaa caa acg gtc act 2730
Gln Gly Ser Val Ser Gly Gln Phe Thr Asn Gln Glu Gln Thr Val Thr
830 835 840
tat gta tac act aaa gat ccg gtc gct ggt gcc cat atc ata gca aaa 2778
Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly Ala His Ile Ile Ala Lys
845 850 855
tac gta gac gag aat ggt aac acg ata tca gac aac gtt gtg aag tca 2826
Tyr Val Asp Glu Asn Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Ser
860 865 870
ggt aac att ggg gat tct tac act act gag caa aag gca att cct gga 2874
Gly Asn Ile Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly
875 880 885
tac act ttt aaa gct gtt cag gga aac cca acg gga caa ttc acc agt 2922
Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser
890 895 900 905
gac gcc cag acg gtg acc tac ata tac act aaa gtg aaa aca tct ggt 2970
Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr Ile Tyr Thr Lys Val Lys Thr Ser Gly
910 915 920
ggg agc gaa acc cca acg ccg tca aaa acg att gca acc aag tca agt 3018
Gly Ser Glu Thr Pro Thr Pro Ser Lys Thr Ile Ala Thr Lys Ser Ser
925 930 935
aca aac aca atc tct agt tct aca ctt ccg aag acg ggc gat agt caa 3066
Thr Asn Thr Ile Ser Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Gly Asp Ser Gln
940 945 950
gtg tct act tta ttc ggc atg gtg gtg ggg ttc ttc ata ttt ggg gcg 3114
Val Ser Thr Leu Phe Gly Met Val Val Gly Phe Phe Ile Phe Gly Ala
955 960 965
gga acc ttg agc tta ttt ttt aac agt aag cga aaa aga aag tca aag 3162
Gly Thr Leu Ser Leu Phe Phe Asn Ser Lys Arg Lys Arg Lys Ser Lys
970 975 980 985
taaattaatc tataagtt 3180
<210> 16
<211> 998
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 16
Met Val Ser Lys Asn Asn Val Gln Phe Tyr Asp Lys Lys Asn Asp Asn
1 5 10 15
Gln Gln Arg Trp Gly Leu Arg Lys Thr Ser Phe Gly Leu Ala Ser Leu
20 25 30
Leu Leu Gly Thr Ser Phe Val Leu Phe Asn Gly Ala Val Val His Ala
35 40 45
Asp Thr Pro Ser Asn Asp Lys Pro Val Val Val Thr Thr Ile Ala Ser
50 55 60
Asn Ser Ser Ala Val Glu Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser
65 70 75 80
Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys
85 90 95
Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr
100 105 110
Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser
115 120 125
Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser
130 135 140
Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val
145 150 155 160
Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu
165 170 175
Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ala Asp Thr Thr Ser
180 185 190
Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ser Asp Ser Ser Leu Val Lys Gly
195 200 205
Arg Val Tyr Ala Ser Thr Tyr Leu Glu Ser Asn Lys Asn Tyr Tyr Thr
210 215 220
Asp Pro Ala Ile Ser Arg Gly Phe Leu Asp Ser Pro Ile Ser Lys Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Asp Gln Asn Trp Asn Met Phe Gln Val Ala Val Ser Lys
245 250 255
Asn Leu Val Ser Tyr Asn Pro Gly Met Thr Phe Asn Gln Tyr Tyr Leu
260 265 270
Ala Asn Asn Ile Ser Pro Glu Asp Asn Phe Ile Val Tyr Pro Arg Leu
275 280 285
Thr Asn Gln Ile Val Arg Leu Lys Ser Gly Ala Tyr Leu Asn Ala Asn
290 295 300
Pro Asn Pro Lys Gly Ala Lys Asp Asp Ser Gly Asn Ile Val Asp Tyr
305 310 315 320
Ile Thr Tyr Val Gly Pro Thr Asp Asp Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Asp
325 330 335
Lys Glu Leu Glu Asp Pro Val Leu Phe Ser Arg Leu Thr Val Gly Glu
340 345 350
Leu Pro Ser Ala Ser Glu Gly Thr Leu Gly Leu Phe Asn Ser Gly Thr
355 360 365
Tyr Leu Phe Pro Thr Gln Ile Gly Tyr Gly Glu Asn Ala Thr Val Asn
370 375 380
Asp Tyr Met Leu Thr Pro Gly Asn Asp Phe Ile Ile Pro Thr Arg Phe
385 390 395 400
Asn Thr Ile Arg Asn Asp Val Tyr Leu Thr Met Arg Ser Arg Ala Tyr
405 410 415
Phe Gly Ala Gly Leu Gln Gly Ala Gln Ala Ser Leu Thr Ala Thr Ser
420 425 430
Asn Gly Lys Pro Val Val Gly Ser Ser Glu Asn Ser Lys Phe Tyr Ile
435 440 445
Asp Thr Asp Ser Asn Val Tyr Leu Thr Lys Gln Gly Phe Asp Gln Leu
450 455 460
Gly Asn Phe Gly Lys Ile Met Ala Pro Phe Val Tyr Thr Ser Ala Ser
465 470 475 480
Asn Asp Leu Lys Lys Val Gly Ile Asp Lys Phe Ser Ala Met Met Asn
485 490 495
Gln Gly Leu Ser Ser Ile Gln Ser Lys Ser Gly Ala Asn Thr Ile Val
500 505 510
Ser Gly Asn Gly Gly Gln Ile Gln Leu Ser Gly Phe Asn Arg Glu Thr
515 520 525
Asp Leu Asp Gly Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ser Asp Arg Glu Asn Asp
530 535 540
Ala Leu Lys Asn Thr Asp Val Asn Phe Tyr Met Tyr Thr Lys Gly Asn
545 550 555 560
Thr Glu Thr Asn Val Thr Thr Pro Leu Ala Pro Asn Gly Tyr His Leu
565 570 575
Tyr Ser Pro Asn Val Ser Glu Phe Lys Ile Gln Thr Thr Arg Pro Tyr
580 585 590
Phe Ser Trp Thr Gly Asp Ile Ser Asn Ala Ile Lys Ile Ser Glu Ala
595 600 605
Asn Ala Asp Phe Asp Asp Leu Leu Gly Ser Asn Ser Leu Gln Val Thr
610 615 620
Asp Asn Gly Val Asp Ser Asp Gly Thr Pro Ile Ser Val Asp Leu Asn
625 630 635 640
Arg Val Arg Ile Arg Ile Ser Glu Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Ser Asn
645 650 655
Asp Ser Tyr Thr Leu Asn Asp Leu Lys Ala Leu Leu Thr Ser Gly Asn
660 665 670
Ile Thr Val Pro Lys Ile Val Ile Ala Tyr Thr Tyr Ser Ala Thr Asp
675 680 685
Ser Lys Thr Asp Asn Ile Gly Lys Leu Pro Ser Glu Ile Asp Asp Asn
690 695 700
Thr Gly Ala Tyr Ala Val Pro Phe Thr Arg Thr Leu Thr Asn Asp Ile
705 710 715 720
Pro Asp Lys Lys Ser Asn Ile Thr Val Lys Tyr Ile Asp Ile Ser Gly
725 730 735
Asn Thr Ile Ser Asp Asn Ile Val Lys Ala Gly Asn Val Gly Asp Ser
740 745 750
Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val
755 760 765
Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr
770 775 780
Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly Gly Ser Val Thr Ala Lys
785 790 795 800
Tyr Val Asp Thr Ser Gly Asn Ala Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Thr
805 810 815
Gly Asn Ile Gly Asp Thr Tyr Ser Thr Lys Gln Lys Thr Ile Pro Gly
820 825 830
Tyr Thr Phe Lys Glu Val Gln Gly Ser Val Ser Gly Gln Phe Thr Asn
835 840 845
Gln Glu Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly
850 855 860
Ala His Ile Ile Ala Lys Tyr Val Asp Glu Asn Gly Asn Thr Ile Ser
865 870 875 880
Asp Asn Val Val Lys Ser Gly Asn Ile Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu
885 890 895
Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro
900 905 910
Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr Ile Tyr Thr
915 920 925
Lys Val Lys Thr Ser Gly Gly Ser Glu Thr Pro Thr Pro Ser Lys Thr
930 935 940
Ile Ala Thr Lys Ser Ser Thr Asn Thr Ile Ser Ser Ser Thr Leu Pro
945 950 955 960
Lys Thr Gly Asp Ser Gln Val Ser Thr Leu Phe Gly Met Val Val Gly
965 970 975
Phe Phe Ile Phe Gly Ala Gly Thr Leu Ser Leu Phe Phe Asn Ser Lys
980 985 990
Arg Lys Arg Lys Ser Lys
995
<210> 17
<211> 3240
<212> DNA/ ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> CDS/ Кодирующая последовательность
<222> (208)..(3201)
<400> 17
agctttagaa gaagaaaaag cagctgttga attagagggt tcagaaactg cctgatggat 60
attttttata aatctggttt gaacaaatta tattgacatc tctttttcta tcctgataat 120
tctgagaggt tattttggga aatactattg aaccatatcg aggtggtgtg gtataatgaa 180
gggaattaaa aaagatagga aaatttc atg gtg tca aag aat aac gtg cag ttt 234
Met Val Ser Lys Asn Asn Val Gln Phe
1 5
tac gac aag aaa aat gat aat caa cag cga tgg ggc ttg aga aaa act 282
Tyr Asp Lys Lys Asn Asp Asn Gln Gln Arg Trp Gly Leu Arg Lys Thr
10 15 20 25
tca ttt ggt tta gcg agc ctt ttg ctt ggc acg tct ttc gtt tta ttc 330
Ser Phe Gly Leu Ala Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ser Phe Val Leu Phe
30 35 40
aat gga gcg gtc gtg cac gcg gat aca ccg agc aat gac aaa cct gtg 378
Asn Gly Ala Val Val His Ala Asp Thr Pro Ser Asn Asp Lys Pro Val
45 50 55
gtt gta aca acc att gcg tca aac tca tct gcc gtt gaa gct gag act 426
Val Val Thr Thr Ile Ala Ser Asn Ser Ser Ala Val Glu Ala Glu Thr
60 65 70
gcc agc agt tct tca tca agt gcc gta aaa gcg gaa acg acc agc gcc 474
Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala
75 80 85
tct tct tca agt gct gta aaa gct gag aca gcc tct agc agt tca agc 522
Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser
90 95 100 105
tca gcc gta aag gca gaa act acg agt gca tca tct tca tca gcg gta 570
Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val
110 115 120
aag gcg gag acc gct agc tct tct tct agt agt gct gtg aaa gcc gag 618
Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu
125 130 135
acg acg agc gca tct tca tct tct gct gtt aag gcg gaa aca aca agc 666
Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser
140 145 150
gct tct agc tca agc gcc gtc aaa gca gaa aca gcg agt tca tct tct 714
Ala Ser Ser Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Ala Ser Ser Ser Ser
155 160 165
agt agt gca gtt aaa gcc gaa act acc tct gcc agc tca tct tca gca 762
Ser Ser Ala Val Lys Ala Glu Thr Thr Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala
170 175 180 185
gca aag gcg gat acc acc agc gca gct agt tca tct gcg gca aag agc 810
Ala Lys Ala Asp Thr Thr Ser Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Lys Ser
190 195 200
gac agt tca ctt gtg aaa ggg cgt gtt tat gcc tct acg tat tta gag 858
Asp Ser Ser Leu Val Lys Gly Arg Val Tyr Ala Ser Thr Tyr Leu Glu
205 210 215
tca aac aag aac tat tat acc gat ccg gct atc agt cgt ggc ttt tta 906
Ser Asn Lys Asn Tyr Tyr Thr Asp Pro Ala Ile Ser Arg Gly Phe Leu
220 225 230
gac agt ccg ata tct aaa gag tta ctt ggt gat caa aat tgg aat atg 954
Asp Ser Pro Ile Ser Lys Glu Leu Leu Gly Asp Gln Asn Trp Asn Met
235 240 245
ttt caa gtt gct gtc agc aag aac ctt gtc tca tat aat cca gga atg 1002
Phe Gln Val Ala Val Ser Lys Asn Leu Val Ser Tyr Asn Pro Gly Met
250 255 260 265
acg ttt aac caa tat tac ttg gcg aat aat atc tca cca gaa gat aat 1050
Thr Phe Asn Gln Tyr Tyr Leu Ala Asn Asn Ile Ser Pro Glu Asp Asn
270 275 280
ttc atc gtt tat cct cgt tta acc aat caa ata gta aga tta aag agt 1098
Phe Ile Val Tyr Pro Arg Leu Thr Asn Gln Ile Val Arg Leu Lys Ser
285 290 295
gga gcc tat ttg aac gcg aac cct aac cct aag ggg gcg aaa gac gat 1146
Gly Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Pro Asn Pro Lys Gly Ala Lys Asp Asp
300 305 310
agt ggc aac ata gtc gac tac ata act tat gtt ggc cct acg gac gat 1194
Ser Gly Asn Ile Val Asp Tyr Ile Thr Tyr Val Gly Pro Thr Asp Asp
315 320 325
cgt ggt gcg tac tgg ggg gac aaa gag ctt gaa gat ccg gtg ctt ttc 1242
Arg Gly Ala Tyr Trp Gly Asp Lys Glu Leu Glu Asp Pro Val Leu Phe
330 335 340 345
tct cga ctt act gtg ggt gag ttg ccg agt gct tct gag ggc acg ctt 1290
Ser Arg Leu Thr Val Gly Glu Leu Pro Ser Ala Ser Glu Gly Thr Leu
350 355 360
ggc ttg ttt aac agt gga aca tat ctt ttc cct aca caa ata ggc tac 1338
Gly Leu Phe Asn Ser Gly Thr Tyr Leu Phe Pro Thr Gln Ile Gly Tyr
365 370 375
ggt gaa aac gcc aca gtt aac gat tac atg ctt acc cct ggt aat gac 1386
Gly Glu Asn Ala Thr Val Asn Asp Tyr Met Leu Thr Pro Gly Asn Asp
380 385 390
ttc atc ata cca act cga ttt aat acg atc cgt aat gac gtg tac tta 1434
Phe Ile Ile Pro Thr Arg Phe Asn Thr Ile Arg Asn Asp Val Tyr Leu
395 400 405
acg atg cga tct cgt gca tac ttc ggg gct gga tta caa ggg gca cag 1482
Thr Met Arg Ser Arg Ala Tyr Phe Gly Ala Gly Leu Gln Gly Ala Gln
410 415 420 425
gca agt tta acc gca acc tct aat gga aaa ccg gta gtg ggg tca tca 1530
Ala Ser Leu Thr Ala Thr Ser Asn Gly Lys Pro Val Val Gly Ser Ser
430 435 440
gag aac agc aaa ttt tac ata gac aca gac agt aat gtc tat ctt aca 1578
Glu Asn Ser Lys Phe Tyr Ile Asp Thr Asp Ser Asn Val Tyr Leu Thr
445 450 455
aaa cag ggg ttt gat caa ctt ggt aac ttt ggt aaa ata atg gct cca 1626
Lys Gln Gly Phe Asp Gln Leu Gly Asn Phe Gly Lys Ile Met Ala Pro
460 465 470
ttc gtt tat acg agc gct tca aac gat ttg aag aag gtc gga ata gac 1674
Phe Val Tyr Thr Ser Ala Ser Asn Asp Leu Lys Lys Val Gly Ile Asp
475 480 485
aaa ttc tca gcc atg atg aac caa ggg ttg agt agc ata caa agc aag 1722
Lys Phe Ser Ala Met Met Asn Gln Gly Leu Ser Ser Ile Gln Ser Lys
490 495 500 505
tct ggg gca aac acc atc gta tca ggg aac ggc ggc cag att caa ttg 1770
Ser Gly Ala Asn Thr Ile Val Ser Gly Asn Gly Gly Gln Ile Gln Leu
510 515 520
agc ggt ttc aat aga gaa aca gac ttg gat gga gca ttc tca tct tca 1818
Ser Gly Phe Asn Arg Glu Thr Asp Leu Asp Gly Ala Phe Ser Ser Ser
525 530 535
ata agc gat cgt gag aac gat gca tta aag aat aca gat gtc aac ttc 1866
Ile Ser Asp Arg Glu Asn Asp Ala Leu Lys Asn Thr Asp Val Asn Phe
540 545 550
tat atg tat acg aaa ggc aac aca gaa act aat gtg acg acg ccg ttg 1914
Tyr Met Tyr Thr Lys Gly Asn Thr Glu Thr Asn Val Thr Thr Pro Leu
555 560 565
gcc ccg aat ggg tac cac ctt tac tca cca aac gta tct gaa ttc aag 1962
Ala Pro Asn Gly Tyr His Leu Tyr Ser Pro Asn Val Ser Glu Phe Lys
570 575 580 585
ata cag act acc aga cct tac ttc tca tgg acg gga gac ata agt aat 2010
Ile Gln Thr Thr Arg Pro Tyr Phe Ser Trp Thr Gly Asp Ile Ser Asn
590 595 600
gct ata aaa att tct gaa gcc aat gcg gat ttc gat gat tta ctt ggt 2058
Ala Ile Lys Ile Ser Glu Ala Asn Ala Asp Phe Asp Asp Leu Leu Gly
605 610 615
agt aac tca tta cag gtt act gat aat ggg gtg gac agc gac ggt acc 2106
Ser Asn Ser Leu Gln Val Thr Asp Asn Gly Val Asp Ser Asp Gly Thr
620 625 630
cct ata tct gtc gac ctt aat cgt gtc aga ata aga ata tct gag gac 2154
Pro Ile Ser Val Asp Leu Asn Arg Val Arg Ile Arg Ile Ser Glu Asp
635 640 645
gga ggg agt aca tat tct aac gat tct tat acg ctt aat gac tta aaa 2202
Gly Gly Ser Thr Tyr Ser Asn Asp Ser Tyr Thr Leu Asn Asp Leu Lys
650 655 660 665
gcc tta ttg acc agc gga aac atc act gtc cct aag ata gtt atc gct 2250
Ala Leu Leu Thr Ser Gly Asn Ile Thr Val Pro Lys Ile Val Ile Ala
670 675 680
tat acc tac tct gcg act gat tca aaa act gat aac atc ggt aag tta 2298
Tyr Thr Tyr Ser Ala Thr Asp Ser Lys Thr Asp Asn Ile Gly Lys Leu
685 690 695
ccg tct gaa att gac gac aac aca ggc gcg tac gcc gtt ccg ttc aca 2346
Pro Ser Glu Ile Asp Asp Asn Thr Gly Ala Tyr Ala Val Pro Phe Thr
700 705 710
cgt acg ttg acg aat gac att cca gat aaa aaa agt aac att acg gtc 2394
Arg Thr Leu Thr Asn Asp Ile Pro Asp Lys Lys Ser Asn Ile Thr Val
715 720 725
aag tat atc gat atc tct ggt aat acc ata tct gat aac ata gtt aaa 2442
Lys Tyr Ile Asp Ile Ser Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Ile Val Lys
730 735 740 745
gcc ggt aat gtt ggc gat tca tat aca aca gaa caa aaa gca ata ccg 2490
Ala Gly Asn Val Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro
750 755 760
gga tac acc ttc aaa gcc gta caa ggt aat cca acc ggt caa ttc acg 2538
Gly Tyr Thr Phe Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr
765 770 775
tct gat gct caa aca gtg acg tac gtt tac acg aag gat cca gtg gca 2586
Ser Asp Ala Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr Thr Lys Asp Pro Val Ala
780 785 790
ggc ggc agc gtc acc gct aag tat gtc gat acc agt ggg aac gcc atc 2634
Gly Gly Ser Val Thr Ala Lys Tyr Val Asp Thr Ser Gly Asn Ala Ile
795 800 805
tct gat aac gtt gtt aaa acc ggt aac atc ggc gat acc tac agt act 2682
Ser Asp Asn Val Val Lys Thr Gly Asn Ile Gly Asp Thr Tyr Ser Thr
810 815 820 825
aag cag aag acc ata ccg gga tat act ttc aaa gag gtt caa gga tct 2730
Lys Gln Lys Thr Ile Pro Gly Tyr Thr Phe Lys Glu Val Gln Gly Ser
830 835 840
gtt agc gga caa ttt acc aat cag gaa caa acg gtc act tat gta tac 2778
Val Ser Gly Gln Phe Thr Asn Gln Glu Gln Thr Val Thr Tyr Val Tyr
845 850 855
act aaa gat ccg gtc gct ggt gcc cat atc ata gca aaa tac gta gac 2826
Thr Lys Asp Pro Val Ala Gly Ala His Ile Ile Ala Lys Tyr Val Asp
860 865 870
gag aat ggt aac acg ata tca gac aac gtt gtg aag tca ggt aac att 2874
Glu Asn Gly Asn Thr Ile Ser Asp Asn Val Val Lys Ser Gly Asn Ile
875 880 885
ggg gat tct tac act act gag caa aag gca att cct gga tac act ttt 2922
Gly Asp Ser Tyr Thr Thr Glu Gln Lys Ala Ile Pro Gly Tyr Thr Phe
890 895 900 905
aaa gct gtt cag gga aac cca acg gga caa ttc acc agt gac gcc cag 2970
Lys Ala Val Gln Gly Asn Pro Thr Gly Gln Phe Thr Ser Asp Ala Gln
910 915 920
acg gtg acc tac ata tac act aaa gtg aaa aca tct ggt ggg agc gaa 3018
Thr Val Thr Tyr Ile Tyr Thr Lys Val Lys Thr Ser Gly Gly Ser Glu
925 930 935
acc cca acg ccg tca aaa acg att gca acc aag tca agt aca aac aca 3066
Thr Pro Thr Pro Ser Lys Thr Ile Ala Thr Lys Ser Ser Thr Asn Thr
940 945 950
atc tct agt tct aca ctt ccg aag acg ggc gat agt caa gtg tct act 3114
Ile Ser Ser Ser Thr Leu Pro Lys Thr Gly Asp Ser Gln Val Ser Thr
955 960 965
tta ttc ggc atg gtg gtg ggg ttc ttc ata ttt ggg gcg gga acc ttg 3162
Leu Phe Gly Met Val Val Gly Phe Phe Ile Phe Gly Ala Gly Thr Leu
970 975 980 985
agc tta ttt ttt aac agt aag cga aaa aga aag tca aag taaattaatc 3211
Ser Leu Phe Phe Asn Ser Lys Arg Lys Arg Lys Ser Lys
990 995
tataagttac tgacaaaact gtcagtaac 3240
<210> 18
<211> 262
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 18
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ser Ser Ala Val Asn
20 25 30
Ser Glu Leu Val His Lys Gly Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly Thr
35 40 45
Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Arg Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe Glu
50 55 60
Val Asp Leu Gly Lys Ala Val Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala Asn
65 70 75 80
Phe Val Pro Thr Lys Trp Asp Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser Gly
85 90 95
Lys Phe Asp Val Val Met Asn Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg Ala
100 105 110
Lys Gln Tyr Asn Phe Ser Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala Leu
115 120 125
Ile Val Pro Thr Asp Ser Asn Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys Gly
130 135 140
Lys Lys Ile Ile Ala Gly Thr Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Lys Gly Asn Leu Thr Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser Leu
165 170 175
Asp Met Ile Lys Gln Gly Arg Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg Glu
180 185 190
Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser Lys Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys Met
195 200 205
Ile Asp Val Ser Ser Glu Gln Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu Phe
210 215 220
Asn Lys Lys Asp Thr Ala Ile Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys
225 230 235 240
Glu Leu Gln Gln Asp Gly Thr Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Phe
245 250 255
Gly Ala Asp Ile Thr Glu
260
<210> 19
<211> 957
<212> DNA/ ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> CDS/ Кодирующая последовательность
<222> (153)..(938)
<400> 19
tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60
ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120
atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tc atg aaa aaa aag att atc tca 173
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser
1 5
gct att tta atg tct aca gtg ata ctt tct gct gca gcc ccg ttg tca 221
Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser
10 15 20
ggt gtt tac gct tca tca gct gtt aat tca gaa tta gtt cat aag gga 269
Gly Val Tyr Ala Ser Ser Ala Val Asn Ser Glu Leu Val His Lys Gly
25 30 35
gaa tta aca att ggt ctt gag gga acg tac tct ccg tac tct tat cgt 317
Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Arg
40 45 50 55
aaa aat aac aaa tta act ggc ttt gaa gta gat ctt ggt aaa gca gtt 365
Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe Glu Val Asp Leu Gly Lys Ala Val
60 65 70
gct aaa aag atg ggc tta aaa gct aac ttt gta cca act aaa tgg gat 413
Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala Asn Phe Val Pro Thr Lys Trp Asp
75 80 85
tcg cta att gcc ggt ctt ggt tca ggt aag ttt gat gta gta atg aac 461
Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser Gly Lys Phe Asp Val Val Met Asn
90 95 100
aac att aca cag aca cct gaa cgg gcc aag caa tat aat ttc tct acc 509
Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg Ala Lys Gln Tyr Asn Phe Ser Thr
105 110 115
cca tat atc aag tcc cgg ttt gca tta att gtt cct act gat agt aac 557
Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala Leu Ile Val Pro Thr Asp Ser Asn
120 125 130 135
atc aaa agc ttg aag aat att aaa ggc aag aag att att gct ggt acg 605
Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys Gly Lys Lys Ile Ile Ala Gly Thr
140 145 150
gga act aat aat gcg aat gtg gta aaa aaa tat aag ggt aac ctt aca 653
Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val Lys Lys Tyr Lys Gly Asn Leu Thr
155 160 165
cca aat ggc gat ttt gct agt tcc tta gat atg atc aag caa ggt cgg 701
Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser Leu Asp Met Ile Lys Gln Gly Arg
170 175 180
gct gcc ggg aca att aac tcc cgt gaa gct tgg tac gct tac agc aag 749
Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg Glu Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser Lys
185 190 195
aag aac agt act aag ggt ctc aag atg att gat gtt tct agt gaa caa 797
Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys Met Ile Asp Val Ser Ser Glu Gln
200 205 210 215
gat cca gct aag att tca gca ctt ttt aac aag aaa gat act gct att 845
Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu Phe Asn Lys Lys Asp Thr Ala Ile
220 225 230
caa tct tcc tac aac aag gca ctt aag gaa ctt caa caa gac gga aca 893
Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gln Gln Asp Gly Thr
235 240 245
gtc aag aag cta tct gaa aag tac ttc ggt gca gat att act gaa 938
Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Phe Gly Ala Asp Ile Thr Glu
250 255 260
taaattaatc tataagtta 957
<210> 20
<211> 263
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 20
Met Lys Phe Trp Lys Lys Ala Leu Leu Thr Ile Val Ala Leu Thr Val
1 5 10 15
Gly Thr Pro Ala Gly Ile Thr Ser Val Ser Ala Ala Ser Ser Ala Val
20 25 30
Asn Ser Glu Leu Val His Lys Gly Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly
35 40 45
Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr Arg Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe
50 55 60
Glu Val Asp Leu Gly Lys Ala Val Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala
65 70 75 80
Asn Phe Val Pro Thr Lys Trp Asp Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser
85 90 95
Gly Lys Phe Asp Val Val Met Asn Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg
100 105 110
Ala Lys Gln Tyr Asn Phe Ser Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala
115 120 125
Leu Ile Val Pro Thr Asp Ser Asn Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys
130 135 140
Gly Lys Lys Ile Ile Ala Gly Thr Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val
145 150 155 160
Lys Lys Tyr Lys Gly Asn Leu Thr Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser
165 170 175
Leu Asp Met Ile Lys Gln Gly Arg Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Glu Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser Lys Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys
195 200 205
Met Ile Asp Val Ser Ser Glu Gln Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu
210 215 220
Phe Asn Lys Lys Asp Thr Ala Ile Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu
225 230 235 240
Lys Glu Leu Gln Gln Asp Gly Thr Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr
245 250 255
Phe Gly Ala Asp Ile Thr Glu
260
<210> 21
<211> 960
<212> DNA/ ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> CDS/ Кодирующая последовательность
<222> (153)..(941)
<400> 21
tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60
ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120
atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tc atg aaa ttt tgg aag aaa gca 173
Met Lys Phe Trp Lys Lys Ala
1 5
cta tta aca att gta gcc tta acg gtc ggt acc cct gca gga atc aca 221
Leu Leu Thr Ile Val Ala Leu Thr Val Gly Thr Pro Ala Gly Ile Thr
10 15 20
agt gtt tct gct gct tca tca gct gtt aat tca gaa tta gtt cat aag 269
Ser Val Ser Ala Ala Ser Ser Ala Val Asn Ser Glu Leu Val His Lys
25 30 35
gga gaa tta aca att ggt ctt gag gga acg tac tct ccg tac tct tat 317
Gly Glu Leu Thr Ile Gly Leu Glu Gly Thr Tyr Ser Pro Tyr Ser Tyr
40 45 50 55
cgt aaa aat aac aaa tta act ggc ttt gaa gta gat ctt ggt aaa gca 365
Arg Lys Asn Asn Lys Leu Thr Gly Phe Glu Val Asp Leu Gly Lys Ala
60 65 70
gtt gct aaa aag atg ggc tta aaa gct aac ttt gta cca act aaa tgg 413
Val Ala Lys Lys Met Gly Leu Lys Ala Asn Phe Val Pro Thr Lys Trp
75 80 85
gat tcg cta att gcc ggt ctt ggt tca ggt aag ttt gat gta gta atg 461
Asp Ser Leu Ile Ala Gly Leu Gly Ser Gly Lys Phe Asp Val Val Met
90 95 100
aac aac att aca cag aca cct gaa cgg gcc aag caa tat aat ttc tct 509
Asn Asn Ile Thr Gln Thr Pro Glu Arg Ala Lys Gln Tyr Asn Phe Ser
105 110 115
acc cca tat atc aag tcc cgg ttt gca tta att gtt cct act gat agt 557
Thr Pro Tyr Ile Lys Ser Arg Phe Ala Leu Ile Val Pro Thr Asp Ser
120 125 130 135
aac atc aaa agc ttg aag aat att aaa ggc aag aag att att gct ggt 605
Asn Ile Lys Ser Leu Lys Asn Ile Lys Gly Lys Lys Ile Ile Ala Gly
140 145 150
acg gga act aat aat gcg aat gtg gta aaa aaa tat aag ggt aac ctt 653
Thr Gly Thr Asn Asn Ala Asn Val Val Lys Lys Tyr Lys Gly Asn Leu
155 160 165
aca cca aat ggc gat ttt gct agt tcc tta gat atg atc aag caa ggt 701
Thr Pro Asn Gly Asp Phe Ala Ser Ser Leu Asp Met Ile Lys Gln Gly
170 175 180
cgg gct gcc ggg aca att aac tcc cgt gaa gct tgg tac gct tac agc 749
Arg Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ser Arg Glu Ala Trp Tyr Ala Tyr Ser
185 190 195
aag aag aac agt act aag ggt ctc aag atg att gat gtt tct agt gaa 797
Lys Lys Asn Ser Thr Lys Gly Leu Lys Met Ile Asp Val Ser Ser Glu
200 205 210 215
caa gat cca gct aag att tca gca ctt ttt aac aag aaa gat act gct 845
Gln Asp Pro Ala Lys Ile Ser Ala Leu Phe Asn Lys Lys Asp Thr Ala
220 225 230
att caa tct tcc tac aac aag gca ctt aag gaa ctt caa caa gac gga 893
Ile Gln Ser Ser Tyr Asn Lys Ala Leu Lys Glu Leu Gln Gln Asp Gly
235 240 245
aca gtc aag aag cta tct gaa aag tac ttc ggt gca gat att act gaa 941
Thr Val Lys Lys Leu Ser Glu Lys Tyr Phe Gly Ala Asp Ile Thr Glu
250 255 260
taaattaatc tataagtta 960
<210> 22
<211> 271
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид
<400> 22
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Glu Ala Gln Thr Glu
20 25 30
Thr Cys Thr Val Ala Pro Arg Glu Arg Gln Asn Cys Gly Phe Pro Gly
35 40 45
Val Thr Pro Ser Gln Cys Ala Asn Lys Gly Cys Cys Phe Asp Asp Thr
50 55 60
Val Arg Gly Val Pro Trp Cys Phe Tyr Pro Asn Thr Ile Asp Val Pro
65 70 75 80
Pro Glu Glu Glu Cys Glu Phe Asp Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys
85 90 95
Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys
100 105 110
Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys
115 120 125
Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys
130 135 140
Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys
145 150 155 160
Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly
165 170 175
Val His Val Val Lys Pro Gly Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala
180 185 190
Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp
195 200 205
Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln
210 215 220
Pro Ala Asn His Ala Asp Ala Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr
225 230 235 240
Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser
245 250 255
Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu
260 265 270
<210> 23
<211> 1020
<212> DNA/ ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> CDS/ Кодирующая последовательность
<222> (153)..(965)
<400> 23
tggatatttt ttataaatct ggtttgaaca aattatattg acatctcttt ttctatcctg 60
ataattctga gaggttattt tgggaaatac tattgaacca tatcgaggtg gtgtggtata 120
atgaagggaa ttaaaaaaga taggaaaatt tc atg aaa aaa aag att atc tca 173
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser
1 5
gct att tta atg tct aca gtg ata ctt tct gct gca gcc ccg ttg tca 221
Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser
10 15 20
ggt gtt tac gcc gaa gct caa act gaa act tgt act gtt gct cca cgt 269
Gly Val Tyr Ala Glu Ala Gln Thr Glu Thr Cys Thr Val Ala Pro Arg
25 30 35
gaa cgt caa aac tgt ggt ttt cca ggt gtt act cca tca caa tgt gct 317
Glu Arg Gln Asn Cys Gly Phe Pro Gly Val Thr Pro Ser Gln Cys Ala
40 45 50 55
aac aaa ggt tgt tgt ttt gat gat act gtt cgt ggt gtt cca tgg tgt 365
Asn Lys Gly Cys Cys Phe Asp Asp Thr Val Arg Gly Val Pro Trp Cys
60 65 70
ttt tac cca aac act atc gat gtt cca cca gaa gaa gaa tgt gaa ttt 413
Phe Tyr Pro Asn Thr Ile Asp Val Pro Pro Glu Glu Glu Cys Glu Phe
75 80 85
gat cca aaa gag gaa gac aac aac aag cct ggt aaa gaa gac ggc aac 461
Asp Pro Lys Glu Glu Asp Asn Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn
90 95 100
aaa cct ggt aaa gaa gac ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac aac aaa 509
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys
105 110 115
aaa cct ggc aaa gaa gac ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac aac aaa 557
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Asn Lys
120 125 130 135
aaa cct ggc aaa gaa gat ggc aac aaa cct ggt aaa gaa gac ggc aac 605
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn
140 145 150
aag cct ggt aaa gaa gat ggc aac aag cct ggt aaa gaa gat ggc aac 653
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn
155 160 165
aag cct ggt aaa gaa gac ggc aac gga gta cat gtc gtt aaa cct ggt 701
Lys Pro Gly Lys Glu Asp Gly Asn Gly Val His Val Val Lys Pro Gly
170 175 180
gat aca gta aat gac att gca aaa gca aac ggc act act gct gac aaa 749
Asp Thr Val Asn Asp Ile Ala Lys Ala Asn Gly Thr Thr Ala Asp Lys
185 190 195
att gct gca gat aac aaa tta gct gat aaa aac atg atc aaa cct ggt 797
Ile Ala Ala Asp Asn Lys Leu Ala Asp Lys Asn Met Ile Lys Pro Gly
200 205 210 215
caa gaa ctt gtt gtt gat aag aag caa cca gca aac cat gca gat gct 845
Gln Glu Leu Val Val Asp Lys Lys Gln Pro Ala Asn His Ala Asp Ala
220 225 230
aac aaa gct caa gca tta cca gaa act ggt gaa gaa aat cca ttc atc 893
Asn Lys Ala Gln Ala Leu Pro Glu Thr Gly Glu Glu Asn Pro Phe Ile
235 240 245
ggt aca act gta ttt ggt gga tta tca tta gcg tta ggt gca gcg tta 941
Gly Thr Thr Val Phe Gly Gly Leu Ser Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu
250 255 260
tta gct gga cgt cgt cgc gaa cta taaaattaat ctataagtta ctgacaaaac 995
Leu Ala Gly Arg Arg Arg Glu Leu
265 270
tgtcagtaac tttttttgtg ggaaa 1020
<210> 24
<211> 716
<212> PRT/ БЕЛОК
<213> Petroselinum crispum
<400> 24
Met Glu Asn Gly Asn Gly Ala Thr Thr Asn Gly His Val Asn Gly Asn
1 5 10 15
Gly Met Asp Phe Cys Met Lys Thr Glu Asp Pro Leu Tyr Trp Gly Ile
20 25 30
Ala Ala Glu Ala Met Thr Gly Ser His Leu Asp Glu Val Lys Lys Met
35 40 45
Val Ala Glu Tyr Arg Lys Pro Val Val Lys Leu Gly Gly Glu Thr Leu
50 55 60
Thr Ile Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Ala Arg Asp Gly Ser Gly Val
65 70 75 80
Thr Val Glu Leu Ser Glu Ala Ala Arg Ala Gly Val Lys Ala Ser Ser
85 90 95
Asp Trp Val Met Asp Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser Tyr Gly Val
100 105 110
Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys Gln Gly Gly
115 120 125
Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly Ile Phe Gly
130 135 140
Asn Gly Ser Asp Asn Thr Leu Pro His Ser Ala Thr Arg Ala Ala Met
145 150 155 160
Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly Ile Arg Phe
165 170 175
Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Lys Phe Leu Asn Gln Asn Ile Thr Pro
180 185 190
Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp Leu Val Pro
195 200 205
Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn Ser Lys Ala
210 215 220
Val Gly Pro Thr Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Glu Ala Phe Lys Leu
225 230 235 240
Ala Gly Val Glu Gly Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys Glu Gly Leu
245 250 255
Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Met Ala Ser Met Val
260 265 270
Leu Phe Glu Ala Asn Ile Leu Ala Val Leu Ala Glu Val Met Ser Ala
275 280 285
Ile Phe Ala Glu Val Met Gln Gly Lys Pro Glu Phe Thr Asp His Leu
290 295 300
Thr His Lys Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala Ala Ala Ile
305 310 315 320
Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ala Tyr Val Lys Ala Ala Gln Lys
325 330 335
Leu His Glu Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp Arg Tyr Ala
340 345 350
Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu Val Ile Arg
355 360 365
Ser Ser Thr Lys Met Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val Asn Asp Asn
370 375 380
Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly Gly Asn Phe
385 390 395 400
Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg Leu Ala Ile
405 410 415
Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu Leu Val Asn
420 425 430
Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly Gly Arg Asn
435 440 445
Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala Met Ala Ser
450 455 460
Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr Asn His Val
465 470 475 480
Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu Gly Leu Ile
485 490 495
Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu Ala Val Glu Ile Leu Lys Leu Met Ser
500 505 510
Thr Thr Phe Leu Val Gly Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu Arg His Leu
515 520 525
Glu Glu Asn Leu Lys Ser Thr Val Lys Asn Thr Val Ser Ser Val Ala
530 535 540
Lys Arg Val Leu Thr Met Gly Val Asn Gly Glu Leu His Pro Ser Arg
545 550 555 560
Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Arg Val Val Asp Arg Glu Tyr Ile Phe
565 570 575
Ala Tyr Ile Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu Met Gln Lys
580 585 590
Leu Arg Gln Thr Leu Val Glu His Ala Leu Lys Asn Gly Asp Asn Glu
595 600 605
Arg Asn Leu Ser Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Ala Thr Phe Glu Asp
610 615 620
Glu Leu Lys Ala Leu Leu Pro Lys Glu Val Glu Ser Ala Arg Ala Ala
625 630 635 640
Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile Pro Asn Arg Ile Glu Glu Cys Arg
645 650 655
Ser Tyr Pro Leu Tyr Lys Phe Val Arg Lys Glu Leu Gly Thr Glu Tyr
660 665 670
Leu Thr Gly Glu Lys Val Thr Ser Pro Gly Glu Glu Phe Glu Lys Val
675 680 685
Phe Ile Ala Met Ser Lys Gly Glu Ile Ile Asp Pro Leu Leu Glu Cys
690 695 700
Leu Glu Ser Trp Asn Gly Ala Pro Leu Pro Ile Cys
705 710 715
<210> 25
<211> 3300
<212> DNA/ ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> CDS/ Кодирующая последовательность
<222> (1091)..(3238)
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (1091)..(3241)
<223> ФАЛ
<220>
<221> MISC_FEATURE/ Другие признаки
<222> (3239)..(3241)
<223> Стоп-кодон
<400> 25
ttgttaactt agtcaattta aaaggtttgc cttttataaa atctaatccc tataaggagg 60
aaactactaa tggtagttaa agttggtatt aacggtttcg gtcgtatcgg tcgtcttgct 120
ttccgtcgta ttcaaaatgt tgaaggtgtt gaagttgttg caatcaacga cttgacagat 180
ccagcaatgc ttgctcactt gcttaaatac gatacaactc aaggtcgttt tgatggtaaa 240
gttgaagtta aagatggtgg ttttgaagtt aacggtaaat tcgttaaagt tactgctgaa 300
tctaacccag ctaacatcaa ctgggctgaa gttggtgcag aaatcgttct tgaagcaact 360
ggtttcttcg caactaaaga aaaagctgaa caacacttgc acgctaatgg tgctaagaaa 420
gttgttatca ctgcacctgg tggatcagat gttaaaacaa tcgttttcaa cactaaccac 480
gaagtacttg atggaactga aacagtaatt tcagctggtt catgtacaac caactgtctt 540
gctccaatgg ctgatacttt gaacaaacaa ttcggtatca aagttggtac aatgactaca 600
gttcacggtt acactggtga ccaaatgact cttgatggcc cacaccgtgg tggagatttc 660
cgtcgcgcac gtgctgcagc tgaaaacatc gtacctaact caacaggtgc tgctaaagcc 720
atcggtcttg tattgccaga acttcaaggt aaacttcaag gacatgctca acgtgtacca 780
gttccaactg gttcattgac tgaacttgtt actatccttg ataaagaagt tacagttgac 840
gaaatcaacg cagctatgaa agctgcttca aatgaatcat ttggttacaa cgaagaccaa 900
atcgtttcat ctgatatcgt tggtatctca aactcttcac tctttgatgc tactcaaact 960
gaagttactt cagctaacgg agctcaactt gttaaaactg tatcttggta cgataacgaa 1020
atgtcataca cttcaaacct tgttcgtaca cttgcatact tcgctaaaat cgctaaataa 1080
ggaggaaaaa atg gaa aat ggt aat ggt gca act acg aat ggg cat gtg 1129
Met Glu Asn Gly Asn Gly Ala Thr Thr Asn Gly His Val
1 5 10
aac ggg aat gga atg gac ttc tgt atg aag aca gaa gat cct ctt tat 1177
Asn Gly Asn Gly Met Asp Phe Cys Met Lys Thr Glu Asp Pro Leu Tyr
15 20 25
tgg ggt att gca gct gaa gcg atg act ggt tca cac ttg gat gaa gta 1225
Trp Gly Ile Ala Ala Glu Ala Met Thr Gly Ser His Leu Asp Glu Val
30 35 40 45
aaa aaa atg gtc gcc gag tac aga aaa cct gtc gtt aaa tta gga gga 1273
Lys Lys Met Val Ala Glu Tyr Arg Lys Pro Val Val Lys Leu Gly Gly
50 55 60
gag aca ctt aca att agt cag gtt gct gct att agt gcg cga gat gga 1321
Glu Thr Leu Thr Ile Ser Gln Val Ala Ala Ile Ser Ala Arg Asp Gly
65 70 75
agt ggt gta act gtg gaa ctt agt gag gca gca cgc gct gga gtt aaa 1369
Ser Gly Val Thr Val Glu Leu Ser Glu Ala Ala Arg Ala Gly Val Lys
80 85 90
gct tct tct gat tgg gta atg gac agt atg aat aaa gga act gat tca 1417
Ala Ser Ser Asp Trp Val Met Asp Ser Met Asn Lys Gly Thr Asp Ser
95 100 105
tac ggt gta aca act ggt ttc ggc gct act tct cat cgt cgt acg aaa 1465
Tyr Gly Val Thr Thr Gly Phe Gly Ala Thr Ser His Arg Arg Thr Lys
110 115 120 125
cag gga gga gct ctt caa aaa gaa ctt att aga ttt ctt aac gca gga 1513
Gln Gly Gly Ala Leu Gln Lys Glu Leu Ile Arg Phe Leu Asn Ala Gly
130 135 140
att ttc ggt aat ggc tca gat aat act ctt cca cat tct gca aca cga 1561
Ile Phe Gly Asn Gly Ser Asp Asn Thr Leu Pro His Ser Ala Thr Arg
145 150 155
gct gca atg ctt gtc aga att aat act tta ctt caa gga tac tca ggc 1609
Ala Ala Met Leu Val Arg Ile Asn Thr Leu Leu Gln Gly Tyr Ser Gly
160 165 170
att cgt ttt gaa ata ctt gaa gca att aca aaa ttt ttg aac caa aat 1657
Ile Arg Phe Glu Ile Leu Glu Ala Ile Thr Lys Phe Leu Asn Gln Asn
175 180 185
att act cct tgc tta cca ctt cgt gga aca att aca gct tca ggt gat 1705
Ile Thr Pro Cys Leu Pro Leu Arg Gly Thr Ile Thr Ala Ser Gly Asp
190 195 200 205
tta gtt cca tta tct tac att gct ggt ctt ctt act ggt cga cct aat 1753
Leu Val Pro Leu Ser Tyr Ile Ala Gly Leu Leu Thr Gly Arg Pro Asn
210 215 220
agt aaa gct gta ggt cct acg ggg gtt att tta tct cca gaa gag gca 1801
Ser Lys Ala Val Gly Pro Thr Gly Val Ile Leu Ser Pro Glu Glu Ala
225 230 235
ttc aag tta gct ggt gtt gaa ggt ggg ttt ttc gaa ttg caa cca aag 1849
Phe Lys Leu Ala Gly Val Glu Gly Gly Phe Phe Glu Leu Gln Pro Lys
240 245 250
gaa gga ctt gca ttg gtg aat ggc aca gct gtt ggc tct gga atg gct 1897
Glu Gly Leu Ala Leu Val Asn Gly Thr Ala Val Gly Ser Gly Met Ala
255 260 265
agt atg gtt tta ttt gaa gct aat att ctt gcg gta tta gct gaa gta 1945
Ser Met Val Leu Phe Glu Ala Asn Ile Leu Ala Val Leu Ala Glu Val
270 275 280 285
atg tct gca att ttt gcc gaa gtc atg caa gga aaa cca gaa ttt act 1993
Met Ser Ala Ile Phe Ala Glu Val Met Gln Gly Lys Pro Glu Phe Thr
290 295 300
gat cat tta act cac aaa ttg aaa cac cat cct gga caa atc gaa gca 2041
Asp His Leu Thr His Lys Leu Lys His His Pro Gly Gln Ile Glu Ala
305 310 315
gct gca att atg gaa cat ata tta gat ggg tca gct tat gtt aaa gct 2089
Ala Ala Ile Met Glu His Ile Leu Asp Gly Ser Ala Tyr Val Lys Ala
320 325 330
gct cag aaa ctt cac gaa atg gat cct tta caa aaa cct aag caa gat 2137
Ala Gln Lys Leu His Glu Met Asp Pro Leu Gln Lys Pro Lys Gln Asp
335 340 345
cgt tat gct ctt aga acg agt cca caa tgg ttg ggg cca caa att gag 2185
Arg Tyr Ala Leu Arg Thr Ser Pro Gln Trp Leu Gly Pro Gln Ile Glu
350 355 360 365
gtt att cgc tca tca act aaa atg att gaa aga gaa atc aat tca gtt 2233
Val Ile Arg Ser Ser Thr Lys Met Ile Glu Arg Glu Ile Asn Ser Val
370 375 380
aat gac aat cct tta att gat gtt tca cgt aat aaa gcg att cat ggt 2281
Asn Asp Asn Pro Leu Ile Asp Val Ser Arg Asn Lys Ala Ile His Gly
385 390 395
ggt aac ttc caa gga aca cca atc ggt gtt tca atg gat aat act aga 2329
Gly Asn Phe Gln Gly Thr Pro Ile Gly Val Ser Met Asp Asn Thr Arg
400 405 410
tta gct att gcg gct att gga aaa ctt atg ttt gca caa ttt tct gaa 2377
Leu Ala Ile Ala Ala Ile Gly Lys Leu Met Phe Ala Gln Phe Ser Glu
415 420 425
ctt gtt aac gat ttc tat aac aac gga tta cca tca aat tta agt ggc 2425
Leu Val Asn Asp Phe Tyr Asn Asn Gly Leu Pro Ser Asn Leu Ser Gly
430 435 440 445
ggg cgc aat cca agt ttg gat tat ggt ttt aaa ggt gct gaa att gcc 2473
Gly Arg Asn Pro Ser Leu Asp Tyr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Ile Ala
450 455 460
atg gca tct tat tgt tca gaa ctt caa ttt tta gcc aat cca gtt aca 2521
Met Ala Ser Tyr Cys Ser Glu Leu Gln Phe Leu Ala Asn Pro Val Thr
465 470 475
aac cac gta caa agt gcg gaa caa cat aat caa gat gtc aac tct ttg 2569
Asn His Val Gln Ser Ala Glu Gln His Asn Gln Asp Val Asn Ser Leu
480 485 490
ggc ctt att tct tca cga aaa aca agt gag gcc gtc gag ata tta aaa 2617
Gly Leu Ile Ser Ser Arg Lys Thr Ser Glu Ala Val Glu Ile Leu Lys
495 500 505
tta atg tca aca aca ttt ctt gtc ggc ctt tgc caa gca att gat tta 2665
Leu Met Ser Thr Thr Phe Leu Val Gly Leu Cys Gln Ala Ile Asp Leu
510 515 520 525
cgt cat ctt gaa gaa aat tta aaa tca act gtt aaa aac aca gta tct 2713
Arg His Leu Glu Glu Asn Leu Lys Ser Thr Val Lys Asn Thr Val Ser
530 535 540
tct gtt gct aaa cga gtt tta acc atg gga gtt aat ggt gaa tta cat 2761
Ser Val Ala Lys Arg Val Leu Thr Met Gly Val Asn Gly Glu Leu His
545 550 555
cca tca cgc ttt tgt gaa aaa gat ctt tta cgc gtc gtc gat cgt gaa 2809
Pro Ser Arg Phe Cys Glu Lys Asp Leu Leu Arg Val Val Asp Arg Glu
560 565 570
tat att ttt gca tat att gat gac cca tgt agt gca aca tat cct tta 2857
Tyr Ile Phe Ala Tyr Ile Asp Asp Pro Cys Ser Ala Thr Tyr Pro Leu
575 580 585
atg cag aaa ctt aga caa aca tta gtt gag cat gcc ttg aag aat ggt 2905
Met Gln Lys Leu Arg Gln Thr Leu Val Glu His Ala Leu Lys Asn Gly
590 595 600 605
gat aat gag cgt aat ctt tct aca tca att ttt caa aaa att gca acc 2953
Asp Asn Glu Arg Asn Leu Ser Thr Ser Ile Phe Gln Lys Ile Ala Thr
610 615 620
ttc gag gac gaa ctt aaa gca tta tta cct aaa gaa gtg gaa tca gct 3001
Phe Glu Asp Glu Leu Lys Ala Leu Leu Pro Lys Glu Val Glu Ser Ala
625 630 635
aga gcc gct ttg gaa agt gga aac cca gcc att cca aat cga att gaa 3049
Arg Ala Ala Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile Pro Asn Arg Ile Glu
640 645 650
gaa tgt cgt tca tat cct ctt tat aaa ttt gtt cga aaa gag ctt ggt 3097
Glu Cys Arg Ser Tyr Pro Leu Tyr Lys Phe Val Arg Lys Glu Leu Gly
655 660 665
acg gaa tat ctt act ggc gaa aag gta aca tca cct ggt gaa gag ttt 3145
Thr Glu Tyr Leu Thr Gly Glu Lys Val Thr Ser Pro Gly Glu Glu Phe
670 675 680 685
gaa aaa gtt ttt att gcc atg agt aaa ggt gaa att att gat cct tta 3193
Glu Lys Val Phe Ile Ala Met Ser Lys Gly Glu Ile Ile Asp Pro Leu
690 695 700
ctt gaa tgt ctt gag tca tgg aat gga gcc cct tta cct atc tgt 3238
Leu Glu Cys Leu Glu Ser Trp Asn Gly Ala Pro Leu Pro Ile Cys
705 710 715
taattttccg attttaacgg tataaaaacc agtcttcggg ctggtttttt tattttataa 3298
ag 3300
<---