Способ оценки степени тяжести овариальной дисфункции у девочек с пубертатной гиперандрогенией
METHOD FOR ESTIMATING DEGREE OF SEVERITY OF OVARIAN DYSFUNCTION IN GIRLS WITH PUBERAL HYPERANDROGENISM

Изобретение относится к области медицины, а именно гинекологии, эндокринологии и найдет широкое применение для оценки степени тяжести овариальной дисфункции у девочек-подростков с синдромом гиперандрогении.
Гиперандрогения - патологический процесс, ассоциированный с избыточными эффектами андрогенов в женском организме. Причиной гиперандрогении могут быть совершенно разные по патогенезу состояния, вероятным следствием которых, является патология функции воспроизводства в различные возрастные периоды жизни женщины. Клиническими признаками гиперандрогении является группа симптомов, таких как гирсутизм, акне, жирная себорея и андрогенная алопеция, развивающихся под генерализованным или локальным воздействием избытка андрогенов на волосяные луковицы, сальные железы и другие компоненты кожи и может существовать как проявление системного заболевания, протекающего с избыточной продукцией андрогенов, так и самостоятельно в результате повышенной чувствительности рецепторов андрогенов или измененного метаболизма стероидных гормонов (Schaefer I., Rustenbach S., Zimmer L. et al. 2008).
Проблема гиперандрогении касается не только женщин репродуктивного возраста, но и девочек-подростков. Пубертат относят критическому периоду в развитии женского организма, так как на его фоне генетические и средовые факторы способствуют манифестации различных нейроэндокринных синдромов. При этом возможен вариант существования как серьезных нарушений менструального цикла и репродуктивных проблем, так и полное их отсутствие при сходных клинико-биохимических проявлениях синдрома гиперандрогении (Чагай Н.Б., Фадеев В.В., 2009). В условиях синдрома гиперандрогении особый интерес вызывает изучение факторов, которые влияют на фолликулогенез, так как высокие уровни андрогенов подавляют созревание фолликулов на разной стадии и приводят к формированию типичных увеличенных яичников с множеством мелких фолликулов. Кроме того при сходных клинико-биохимических вариантах гиперандрогении необходимо выявить критерии и оценить степень тяжести развития овариальной дисфункции.
Метод диагностики степени тяжести овариальной дисфункции на основании только клинической симптоматики весьма неспецифичен, поскольку нарушения менструального цикла могут встречаться в пубертатном периоде достаточно часто и носить при этом функциональный транзиторный характер, будучи обусловлены несовершенством и незрелостью репродуктивной системы. Подобные нарушения в этом возрасте могут зависеть от длительности становления менархе, эмоционального состояния подростка, степени выраженности умственных и физических нагрузок, воздействия различных негативных факторов внутренней и внешней среды, для которых организм девочки - подростка в данный возрастной период наиболее уязвим.
Также весьма неспецифичен способ оценки овариальной дисфункции у подростков на основании У3-эхографии, так как множественные кисты в яичниках считаются нормальным, физиологическим явлением в пубертате, они регрессируют параллельно с развитием овуляторной функции (Богданова Е.С., Карева М.А., 2010). Кроме того, увеличение объема яичников встречается в норме у 25% здоровых женщин. Хотя для повышения точности эхографической диагностики СПКЯ выделяют количественные показатели -ЯМИ (в норме 3,5), повышение которого имеет важное значение для уточнения диагноза СПКЯ, однако у подавляющего большинства больных -91%, выявляется уменьшение переднезаднего размера матки при одновременном увеличении размеров и объема яичников -98%. (Парамонова О.В., 2012).
Известен также способ, выбранный в качестве прототипа (Чайка В.К., Матыцина Л.А., Иотенко Б.А., Способ диагностики синдрома поликистозных яичников у девочек-подростков, 1999), предусматривающий определение уровня гормонов в крови у девочек со времени начала менархе, оценку численного значения степени гирсутизма и яичниково-маточного индекса, после чего рассчитывают степень тяжести СПКЯ по формуле:
y=0,02012p1+040292Iп(t)+0,07243р-1,12114п(tm)-0,04008b+0,07146gir+0,07565ями+3,74045, где у - степень тяжести заболевания; p1 - уровень пролактина, определяемый в крови иммунофлюоресцентным методом, нг/л; р - уровень прогестерона в сыворотке крови, нмоль/л; t - уровень тестостерона в сыворотке крови, нмоль/л; b - уровень тестостерон-эстрадиол (связывающего глобулина), нмоль/л; gir - степень гирсутизма; ями - яичниково-маточный индекс; tm - толщина матки, мм; при этом, если значение у 0,5, считают девочку здоровой; 0,5<у<1,0 - относят к группе риска по развитию СПКЯ; 1,0<у<2,0 - диагностируют легкую степень течения СПКЯ; 2,0<у<3,0 - средняя степень течения СПКЯ; у>3,0 - тяжелое течение СПКЯ.
Недостатками данного способа являются:
- его трудоемкость,
- арифметическая сложность для поликлинического врача,
- не учитывается высокая вариабельность значений пролактина и прогестерона в зависимости от фазы менструального цикла,
- не оправдана привязка к гирсутному числу, так как тяжесть андрогензависимой дермопатии не коррелирует с выраженностью овариальной дисфункции, а определяется активностью соответствующего рецепторного аппарата. Данные недостатки способа-прототипа снижают его точность и достоверность.
Задача изобретения: разработка доступного, точного, достоверного способа оценки степени тяжести овариальной дисфункции у девочек-подростков с гиперандрогенией.
Поставленная задача достигается тем, что у девочек-подростков с клинической гиперандрогенией при нарушениях менструального цикла на 4-5 день цикла в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа проводят определение уровня антимюллерова гормона (АМГ) и фоллистатина, при повышении уровня АМГ до 10 нг /мл и фоллистатина до 1000 пг/мл диагностируют овариальную дисфункцию легкой степени, при повышении уровня АМГ более 10 нг/мл и фоллистатина более 1000 пг/мл диагностируют овариальную дисфункцию тяжелой степени.
Технический результат от использования метода: четкие критерии диагностики степени тяжести заболевания, повышение точности, расширение возрастного диапазона обследуемых пациентов, что позволит своевременно провести дифференцированные лечебные мероприятия, что в дальнейшем будет способствовать сохранению репродуктивного здоровья будущих женщин.
Сложность и многофакторность патогенеза гиперандрогении связаны с тем, что функция яичников, надпочечников, гипоталамуса и гипофиза тесно переплетены друг с другом, и порой представляется весьма затруднительным выделить какое-либо одно ведущее патогенетическое звено в формировании нарушений менструального цикла (Шилин Д.Е., 2004).
Данные многочисленных исследований свидетельствуют о тесной патогенетической связи между повышением уровня АМГ и синдромом поликистозных яичников у женщин вследствие нарушения стероидогенеза в яичниках (Александрова Н.В., 2007). В литературе ведется дискуссия о верхнем пределе значений АМГ в качестве диагностического и прогностического маркера СПКЯ у женщин. Называются значения (с различной степенью специфичностью и достоверности) - от 3,15 ng/ml до 8,4 ng/ml (Budi W., Mai-darti M., 2014). Была доказана прогностическая значимость АМГ в подростковом возрасте со значением cut-off 3,15 нг/мл для СПКЯ, диагностированном в возрасте 26 лет у когорты женщин (Shahrzad Zadehmodarres М., Zahra Heidar М., 2015). Исследование АМГ при различных вариантах течения СПКЯ выявило, что самые высокие уровни АМГ были обнаружены в случаях, когда присутствовали наиболее выраженные его формы, охватывающие все три основных диагностических критерия синдрома (Homburg R., Ray А., 2007).
Также одним из факторов, влияющих на фолликулогенез, является фоллистатин - гликозилированный полипептид, выделенный в фолликулярной жидкости, который опосредует большинство своих эффектов через нейтрализацию стимулирующего действия белка активина на фолликулостимулирующий гормон (La Marca G., Stabile, А., 2006). Есть основания предполагать, что именно генетически детерминированные изменения секреции фоллистатина играют ключевую роль в нарушении фолликулогенеза при синдроме гиперандрогении (Дедов И.И., 2007). Кроме того, по данным Urbanek et al., изучившего 37 кандидатных генов СПКЯ, полиморфизм гена фоллистатина показал наиболее сильную связь с гормональными и метаболическими проявлениями этого заболевания (Urbanek М., Legro R.,1999). Накоплено много данных, свидетельствующих о важном клинико-диагностическом значении АМГ и фоллистатина у женщин с СПКЯ (Ramaswamy S., Subbian М., 2010). Проведенное нами, комплексное изучение маркеров фолликулогенеза у девочек с синдромом гиперандрогении в зависимости от степени выраженности овариальной дисфункции показало необходимость выделения группы риска по формированию синдрома поликистозных яичников и разработки дифференцированных подходов к лечению.
Подробное описание способа и примеры его конкретного выполнения.
У пациенток 15-17 лет, с нарушениями менструального цикла, с признаками клинической гиперандрогении определяют исходный уровень АМГ и фоллистатина в сыворотке крови на 4-5 день менструального цикла.
Уровень АМГ в сыворотке крови пациентов определяют методом имму-ноферментного анализа с помощью набора DSL-10-14400 ACTIVE Mullerian Inhibiting Substance/Anti-Mullerian Hormone (MIS/АМН) Enzyme-Linked Immunosorbent (ELISA (США). Стандартные растворы, растворы конъюгатов, промывочный буфер готовят согласно инструкции к набору. Все реагенты и образцы перед началом анализа должны быть выдержаны при комнатной температуре (~25о С) и тщательно перемешаны перед использованием осторожным переворачиванием. Вносят по 20 мкл стандартов, контролей и образцов в соответствующие лунки планшета. Добавляют по 100 мкл раствора рабочего буфера АМН GEN II в каждую ячейку, используя полуавтоматический диспенсер. Затем инкубируют в течение 1 часа при ~25°С на орбитальном шейкере при 600-800 об/мин. Используя автоматическую вошер, промывают 5 раз промывочным буфером и высушивают планшет, перевернув его на фильтрованную бумагу. Далее добавляют по 100 мкл раствора биотинового коньюгата в каждую ячейку, по окончании инкубации 5 раз промывают планшет, как описано выше. Затем добавляют 100 мкл раствора стрептавидин-ферментного конъюгата в каждую лунку. Вновь по окончании инкубации проводят пятикратную промывку планшета и высушивают его, перевернув на фильтрованную бумагу. Добавляют 100 мкл хромо-генного раствора ТМБ в каждую лунку, используя полуавтоматический диспенсер. Добавляют 100 мкл стоп-реагента в каждую лунку, также используя полуавтоматический диспенсер. Измеряют оптическую плотность ячеек при 450 нм измерение оптической плотности микропланшета должно быть выполнено в течение 30 минут после добавления стоп-реагента раствора. Выражают уровень АМГ в сыворотке крови пациента в нг/л.
Уровень фоллистатина в сыворотке крови пациентов определяют методом иммуноферментного анализа с помощью набора R&D Systems (USA).
Определение фоллистатина основано на технологии двухстадийного «сэндвич-анализа», когда реакция протекает в лунках с предварительно нанесенными в них моноклональными антителами к определяемому анализу. На первой стадии в лунку вносятся стандартные исследуемые образцы проб, которые специфически реагируют с нанесенными в лунку антителами и определяемое вещество из этих образцов связывается с соответствующими антителами и остается в лунке. На втором этапе после предварительной промывки и удаления всех несвязавшихся веществ в лунку вносится специфический конъюгат моноклональных антител, меченных ферментом пероксидазой хрена. Конъюгат количественно связывается с соответствующим аналитом, который перешел из исследуемой пробы на поверхность лунки, а фермент, который присутствовал в его составе затем вступает в цветную реакцию с субстратом тетраметиленбензидином и, таким образом, позволяет количественно измерить уровень фоллистатина в соответствии с величиной оптической плотности в каждой лунке. Аналитическая чувствительность метода составляла 29 пг/мл. О высокой воспроизводимости методов свидетельствовали следующие коэффициенты вариации внутри серии и между сериями соотвественно, - 2,7% и 16,3%.
На основании определения фоллистатина и АМГ предложена классификация тяжести течения овариальной дисфункции:
- нерегулярный м/цикл + синдром ГА + повышение АМГ не более 10 нг/мл и фоллистатина не более 1000 пг/мл - овариальная дисфункция легкой степени;
- нерегулярный м/цикл + синдром ГА + повышение АМГ более 10 нг/мл и фоллистатина более 1000 пг/мл - овариальная дисфункция тяжелой степени.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими конкретными примерами.
Пример 1.
Пациентка С-ова, 17 лет, страдает, угревой сыпью, ростом волос в атипичных местах. Менструальный цикл с 12 лет, регулярно, через 24-26 дней. Об-но: гирсутное число - 12 баллов.
3
3
УЗИ органов малого таза: объем правого яичника-8,7 см; объем левого яичника 7,1 см, в проекции обоих яичников единичные незрелые фолликулов до 5-7 мм в диаметре.
Результаты исследования: 17-ОН - 0,9 нг/мл; ДГЭА - 12,9 нг/мл; ДГЭА-С - 3,7 мкг/мл; тестостерон - 4,1 нмоль/л; тестостерон свободный - 3,9 пг/мл, АМГ - 4,1 нг/мл; фоллистатин - 300 пг/мл.
Нормальный уровень фоллистатина и АМГ свидетельствовал об отсутствии овариальной дисфункции.
Пример 3.
Пациентка Н-ко, 16 лет, страдает нерегулярным менструальным циклом, ростом волос в атипичных местах. Менструальный цикл с 14 лет, с задержками до 2-3-х месяцев с периода менархе. У матери был установлен диагноз-синдром поликистозных яичников.
Результаты исследования: 17-ОН - 0,8 нг/мл; ДГЭА-10,2 нг/мл; ДГЭА-С-4,1 мкг/мл; тестостерон - 4,8 нмоль/л; тестостерон свободный- 5,3 пг/мл, андростендион - 7,1 нг/мл, АМГ - 9,2 нг/мл; фоллистатин - 900 пг/мл.
3
УЗИ органов малого таза: объем правого яичника- 11,2 см; объем левого яичника 10,8 см, в проекции обоих яичников множество незрелых фолликулов до 4-5 мм в диаметре.
Повышение АМГ 9,2 нг /мл и фоллистатина 900 пг/мл свидетельствовал о легкой степени овариальной дисфункции, в сочетании увеличение объема яичников и наличием множества фолликулов в структуре обоих яичников.
Пример 4.
Пациентка К-ова, 17 лет, страдает нерегулярным менструальным циклом с менархе, по типу олиго и аменореи, жалобами на угревую сыпь в области лица и спины, жирность кожи и волос. Менструальный цикл с 14 лет, кровотечения чередуются с задержками менструаций до 4-6 месяцев.
3
УЗИ органов малого таза: объем правого яичника- 14,9 см; объем левого яичника 15,2 см, в проекции обоих яичников увеличение числа и объема фолликулов до 8-9 мм в диаметре.
Результаты исследования: 17-ОН - 2,1 нг/мл; ДГЭА - 9,3 нг/мл; ДГЭА-С - 3,9 мкг/мл; тестостерон - 5,4 нмоль/л; тестостерон свободный - 5,8 пг/мл, андростендион - 8,9 нг/мл, АМГ - 13,2 нг/мл; фоллистатин - 1400 пг/мл.
Повышение АМГ 13,2 нг/мл и фоллистатина 1400 пг/мл свидетельствовал о тяжелой степени овариальной дисфункции.
По заявляемому способу обследовано 125 пациенток в возрасте от 15 до 17 лет с нарушениями менструального цикла и различными клиническими проявлениями синдрома гиперандрогении. Медиана АМГ составила 5,9 (4,90; 8,10), медиана фоллистатина 725,0, (193,5; 1457,7).
- регулярный м/цикл + синдром ГА + норма АМГ и фоллистатина, нормальная УЗ структура яичников у 19 человек (31,4%);
- регулярный м/цикл + синдром ГА + повышение АМГ более 5 нг /мл и фоллистатина более 600 пг/мл, нормальная УЗ структура яичников у 28 человек (45,9%);
- нерегулярный м/цикл + синдром ГА + повышение АМГ не более 10 нг/мл и фоллистатина не более 1000 пг/мл, при УЗИ: увеличение объема яичников количества фолликулов >10 у 21 человека (32,8%);
- нерегулярный м/цикл + синдром ГА + повышение АМГ более 10 нг/мл и фоллистатина более 1000 пг/мл, при УЗИ увеличение объема яичников, количества и диаметра фолликулов у 30 человек (46,8%).
Таким образом, определение показателей АМГ и фоллистатина у девочек-подростков с нарушениями менструального цикла является информативным и объективным критерием для оценки степени тяжести и выявления сублинической формы овариальной дисфункции с целью выделения групп риска по СПКЯ среди пациенток. Точность заявляемого способа достигает 80,6%.
Исходя из вышеизложенного, заявляемый способ оценки тяжести овариальной дисфункции у девочек-подростков имеет следующие преимущества:
1. Способ позволяет осуществить оценку степени тяжести овариальной дисфункции с целью выделения групп риска по формированию СПКЯ и оптимизации подходов к лечению.
2. Данный способ объективен, точен, не зависит от вариабельности значений в зависимости от эмоционального состояния, не связан с клиническими проявлениями гиперандрогении, такими как гирсутное число и степень дермопатии, не имеет противопоказаний и позволяет достоверно оценить наличие и степень тяжести овариальной дисфункции у девочек-подростков.
3. Предлагаемый способ прост и удобен в исполнении и найдет широкое применение в гинекологической и эндокринологической практике.