СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВРОЖДЕННОЙ НЕМАЛИНОВОЙ МИОПАТИИ
METHOD FOR DIAGNOSTICS OF CONGENITAL NEMALINE MYOPATHY

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, патологической анатомии, а также к гистологии, цитологии и клеточной биологии, и может быть использовано для диагностики немалиновой миопатии.
Немалиновая миопатия - один из вариантов врожденной непрогрессирующей миопатии, ассоциированный с "палочковидными" ("немалиновыми") структурами в мышечных волокнах. Дифференциальный диагноз на наличие различных форм немалиновой миопатии следует проводить с другими болезнями и синдромами, при которых наблюдается симптомокомплекс "вялого ребенка", болезнью Краббе, хромосомными синдромами. Главной патоморфологической характеристикой немалиновой миопатии является наличие в мышечных волокнах скоплений т.н. "палочковидных телец" или "палочек" (rod bodies). "Палочки" имеют 0,5-3 мкм в ширину и до 7 мкм в длину и располагаются субсарколеммально (Dubowitz V., Sewry С.А., Oldfors А. Muscle biopsy. Saunders Elsevier, 2013, p. 371-377).
Изменения, типичные для данной болезни, не могут быть установлены при гематоксилин-эозиновой окраске фиксированного в формалине и залитого в парафин материала. Предпочтительнее фиксация в растворе Bouin или Zenker и последующая окраска фосфорно-вольфрамовой кислотой - эозином. При окраске по Гомори-Энгелу палочковидные структуры окрашиваются в более темный зеленый цвет по сравнению с нормальными мышечными волокнами.
Известен способ морфологического выявления немалиновых телец посредством трансмиссионной электронной микроскопии (Morris Е.Р., Nneji G., and Squire J.M. The Three-dimensional Structure of the Nemaline Rod Z-Band. The Journal of Cell Biology, 1990; 111: 6: 2: 2961-2978). Срезы толщиной около 80 нм из блоков мышечных биоптатов, залитых в аралдит, готовят на ультратоме как в поперечном, так и в продольном направлении. Анализ изображения проводят с помощью электронного микроскопа JEOL 1200ЕХ или аналогичного с гониометром и вращающимся держателем образцов. Признаком немалиновой миопатии служит обнаружение продольных и поперечных срезов немалиновых телец, а также немалиноподобных утолщений Z-полосок. Однако этот способ имеет недостатки: трудоемкость метода электронной микроскопии, повышенная частота как ложноотрицательных, так и ложноположительных ответов из-за малого поля зрения.
Известен другой способ морфологического выявления немалиновых телец, присутствующих в мышечных волокнах больных с врожденной немалиновой миопатией (Wallgren-Pettersson CI, Jasani В, Newman GR, Morris GE, Jones S, Singhrao S, Clarke A, Virtanen I, Holmberg C, Rapola J. Alpha-actinin in nemaline bodies in congenital nemaline myopathy: immunological confirmation by light and electron microscopy. Neuromuscul Disord. 1995 Mar; 5 (2): 93-104). Изучают биоптаты мышц с использованием моноклональных антител к альфа-актинину в сочетании с модифицированным трехцветным методом Гомори. Электронная и световая микроскопия используются для иммуногистохимического определения участков локализации альфа-актинина и десмина. При немалиновой миопатии световая микроскопия срезов при выявлении альфа-актинина показывает наличие поперечной исчерченности мышечных волокон, фокальное утолщение Z-полос и наличие немалиновых тел. Электронная микроскопия подтверждает наличие альфа-актинина в немалиновых телах и Z-полосах. Результаты дают прямые доказательства наличия альфа-актининовых немалиновых тел.
Таким образом, морфологическая диагностика, обладающая значительно большей чувствительностью, чем молекулярно-генетическое исследование, тем не менее, остается чрезвычайно трудоемким и капризным методом выявления признаков немалиновой миопатии. В связи с этим чрезвычайно актуально расширение спектра морфологических методов, способных выявлять маркеры немалиновой миопатии.
Наиболее близким аналогом к патентуемому (прототипом) является способ выявления немалиновых телец с помощью окраски свежезамороженных срезов мышечной ткани по Гомори-Энгелу (Engel W.K., Cunningham G.G. - Rapid examination of muscle tissue: An improved trichrome stain method for fresh frozen biopsy sections. / Neurology, 1963, v. 13, p. 919-926). Проводят морфологическое исследование мышечной ткани больных с врожденными миопатиями (в том числе немалиновой) - биоптаты мышц с использованием трехцветной окраски по Гомори, модифицированной для замороженных срезов мышечной ткани. Готовят краситель, содержащий хромотроп 2R (600 мг), прочный зеленый FSF (300 мг), фосфорно-вольфрамовую кислоту (600 мг), ледяную уксусную кислоту (1 мл), дестиллированную воду (100 мл). Замороженные срезы предварительно окрашивают одним из квасцовых гематоксилинов по стандартной методике, промывают водой и окрашивают вышеуказанным красителем 60 минут при комнатной температуре. Окрашенные срезы заключают под покровное стекло в глицерин-желатиновую смесь. При светомикроскопическом анализе немалиновые тельца видны в виде темно-зеленых палочковидных телец на светло-зеленом фоне саркоплазмы мышечных волокон.
Недостатком этого метода является необходимость использования только свежезамороженных срезов непосредственно после взятия мышечной биопсии, а также низкая чувствительность и высокая вероятность ложноотрицательных результатов.
Задачей изобретения является создание надежного и чувствительного морфологического метода диагностики врожденной немалиновой миопатии.
Техническим результатом является повышение надежности диагностики немалиновой миопатии за счет расширения технических возможностей исследования биоптатов скелетных поперечнополосатых мышц пациентов при использовании иммуногистохимического метода на парафиновых биопсийных препаратах.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Для диагностики немалиновой миопатии у пациента с клинической картиной врожденной миопатии осуществляют забор биоптата скелетной поперечнополосатой мышечной ткани. Проводят иммуногистохимическое выявление фактора, индуцируемого гипоксией -1-альфа (HIF-1α). Для чего готовят гистологические образцы-срезы, наносят на них усилитель флуоресцентного сигнала, далее на срезы наносят белок-блокатор, обеспечивая уменьшение фонового неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубируют с поликлональными антителами кролика к белку HIF-1α. После промывки наносят на срезы соответствующие вторичные флуоресцентные антитела, покрывают фотозащитным реагентом и исследуют с помощью люминесцентного микроскопа, а при выявлении локусов округлой и/или овальной формы красной окраски диаметром 3-5 мкм под оболочкой мышечного волокна диагностируют немалиновую миопатию.
Способ осуществляется следующим образом.
У больного с признаками врожденной миопатии с целью дифференциальной диагностики проводят иммуногистохимическое выявление фактора, индуцируемого гипоксией -1-альфа (HIF-1α). Для этого после взятия мышечной биопсии проводят химическую фиксацию материала в 10% нейтральном (рН-7,4) забуференном формалине в течение 24 часов, после чего материал обезвоживают с использованием ксилола и заливают в парафин. С парафиновых блоков получают срезы толщиной 4 мкм, которые наносят на высокоадгезивные стекла, а затем высушивают в течение 24 часов при температуре 48°С.
Срезы депарафинируют поочередно в трех порциях ксилола по 5 минут в каждом, регидрируют трехкратно в 96% спиртовых растворах по 5 минут в каждом, промывают в дистиллированной воде 3 раза по 5 минут. Затем на 30 минут на образцы наносят усилитель флуоресцентного сигнала (Image-iT FX signal enhancer, Thermo Fisher Scientific), с последующей промывкой в фосфатном буфере (PBS).
На следующем этапе на срезы на 30 минут наносят белок-блокатор (Novocastra Protein Block, Leica), для уменьшения фонового неспецифического окрашивания. Затем срезы инкубируют во влажной камере в течение 60 минут при комнатной температуре с поликлональными антителами кролика к белку HIF-la (Thermo Fisher Scientific, США; разведение 1:100). После чего срезы промывают в фосфатном буфере 3 раза по 5 минут и на 60 минут на них наносят соответствующие вторичные флуоресцентные антитела (антитела к поликлональным антителам кролика) (Антитела козы к IgG кролика (Alexa Fluor 555) Thermo Fisher Scientific, США, Разведение 1:2000). Затем срезы промывают в фосфатном буферном растворе 3 раза по 5 минут и покрывают фотозащитным реагентом ProLong Gold (страна производитель США) и заключают под покровные стекла.
При последующем анализе с помощью люминесцентного микроскопа при немалиновой миопатии в различных участках мышечных волокон (чаще непосредственно под оболочкой волокна) определяются ярко красные локусы. Их форма приближена к округлой или овальной. Диаметр: 3-5 мкм. При других формах врожденных миопатий такие локусы не обнаруживаются.
Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Клинический пример 1.
Пациенту 2 лет с клиникой врожденной миопатии проведено исследование скелетной мышечной ткани по предлагаемому способу. Приводим описание микрофотографии (Фиг. 1). Скелетная мышечная ткань, увеличение ×600. Иммуногистохимическое распределение флуоресцентного маркера HIF-1α (красный). Определяются выраженные скопления маркера HIF-1α под оболочкой мышечного волокна (на периферии мышечных волокон) в виде четко очерченных кластеров. Диагностирована немалиновая миопатия. При исследовании биоптата скелетных мышц, окрашенного по методу Гомори, диагноз был верифицирован.
Клинический пример 2.
Пациенту 4 лет с клиникой врожденной миопатии проведено исследование скелетной мышечной ткани по предлагаемому способу. Приводим описание микрофотографии (Фиг. 2). Иммуногистохимическое распределение флуоресцентных маркеров наружной митохондриальной мембраны (зеленый) и HIF-1α (красный). Увеличение ×400. Определяются множественные локусы интенсивной флуоресценции маркера HIF-1α. Диагностирована немалиновая миопатия. При исследовании биоптата скелетных мышц, окрашенного по методу Гомори, диагноз был верифицирован.