Отопротективный эффект мелатонина при аминогликозидной сенсоневральной тугоухости

2014

ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

Сер. 11

Вып. 3

ОТОРИНОЛАРИНГОЛОГИЯ

УДК 616.28-008.14-08:615.357

Н. Н. Петрова, В. Н. Перевозчикова, Ю. А. Маслова, Н. Г. Перевозчикова

ОТОПРОТЕКТИВНЫЙ ЭФФЕКТ МЕЛАТОНИНА ПРИ АМИНОГЛИКОЗИДНОЙ СЕНСОНЕВРАЛЬНОЙ ТУГОУХОСТИ

Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова, Российская Федерация, 191015, Санкт-Петербург, Кирочная ул., 41

В работе представлены результаты изучения антисурдитантной активности мелатонина при аминогликозидной сенсоневральной тугоухости. С этой целью проводилось гистологическое исследование сосудистой полоски внутреннего уха 24 морских свинок. Животные были разделены на 3 группы: первая получала гентамицин в ототоксической дозе и препарат мелатони-на; вторая получала только гентамицин в ототоксической дозе; интактная не получала никаких препаратов. Данные исследования показали, что при сенсоневральной тугоухости аминогли-козидного генеза имеют место глубокие морфологические изменения внутреннего уха, проявляющиеся нарушениями капиллярной системы сосудистой полоски и гибелью эпителиальных клеток путем апоптоза. У животных первой группы признаки повреждения сосудистой полоски были выражены слабее, чем у животных, получавших только гентамицин. Таким образом, можно говорить об отопрективном действии мелатонина, связанном со способностью этого гормона ингибировать апоптические процессы. Библиогр. 24 назв. Ил. 3.

Ключевые слова: аминогликозидная ототоксичность, гентамицин, апоптоз, мелатонин, ото-протекция.

OTOPROTECTIVE EFFECT OF MELATONIN IN AMINOGLYCOSIDE OTOTOXICITY

N. N. Petrova, V. N. Perevozchikova, Yu. A. Maslova, N. G. Perevozchikova

North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov, 41, Kirochnaya ul., St. Petersburg, 191015, Russian Federation

The objective of this work is to examine the otoprotective effect of melatonin in aminoglycoside model of sensorineural hearing loss. For this purpose, a histological study was carried out on the stria vascularis of the inner ear of 24 guinea pigs. The animals were divided into 3 groups: experimental (8 animals) — received gentamicin in ototoxic dose and melatonin, a control group (8 animals) — received only gentamicin in ototoxic dose; intact (8 animals) — did not receive any drugs. These data demonstrate that the aminoglycoside ototoxicity causes deep morphological changes in the inner ear, impaired capillary vascular system strips and loss of epithelial cells are manifested. Moreover, cell death occurs by apoptosis. The animals of the experimental group signs of damage vascular strips are less pronounced than in the control group. In this regard, we can talk about otoprektivnom action of melatonin associated with the ability of this hormone to inhibit apoptotic processes. Refs 24. Figs 3.

Keywords: aminoglycoside ototoxicity, gentamicin, apoptosis, melatonin, otoprotection.

Вопросы этиопатогенеза сенсоневральной тугоухости (СНТ) активно изучаются учеными всего мира. Это обусловлено, в первую очередь, широкой распростра-

ненностью данной патологии. По данным литературы, за последние два десятилетия численность населения, имеющего проблемы со слухом, увеличилась примерно в два раза [1], а доля СНТ среди всей патологии уха составляет по разным оценкам от 75 до 90% [2]. Потеря слуха входит в число наиболее распространенных заболеваний взрослого населения и занимает третье место после сердечно-сосудистых заболеваний и гипертонии [3] .

В настоящее время существует множество теорий этиопатогенеза СНТ. В возникновении данной патологии доказана роль инфекционных заболеваний, ототок-сического воздействия ряда лекарственных препаратов, сердечно-сосудистой патологии, стрессовых ситуаций, механической, акустической и баротравм, воздействия бытового и производственного шума [4-7]. В основе патогенеза СНТ вне зависимости от воздействующего фактора лежат гемодинамические нарушения во внутреннем ухе [4, 6]. Многие авторы ведущую роль в развитии тугоухости отдают изменениям в сосудистой полоске[8-10].

В связи с развитием современной концепции апоптоза имеются данные о том, что как при острой, так и при хронической СНТ происходит гибель клеток спирального органа путем апоптоза [11-14]. Апоптоз представляет собой запрограммированную гибель клеток и является физиологическим процессом. К его функциям относятся: поддержание постоянства численности популяции клеток, определение формы организма и его частей, обеспечение необходимого соотношения различных клеток, удаление генетически дефектных клеток [15].

Вместе с тем, апоптоз может развиваться как патологический процесс, когда повреждающие факторы воздействуют на гены, контролирующие включение программы гибели клеток. Активировать апоптоз могут стероидные гормоны, противовоспалительные цитокины, свободные радикалы и другие вещества, спектр которых при СНТ может изменяться. Программа гибели состоит из следующих основных этапов: индукция апоптоза; активация проапоптотических белков и ферментов, расщепляющих белки-мишени; разрушение внутриклеточных органелл; фрагментация клетки на апоптотические тельца; удаление клетки и ее фрагментов из ткани макрофагами или соседними клетками [16]. Учитывая, что в современной литературе в настоящее время имеются отдельные сведения о вариантах гибели клеток при ототоксикозе, представляется актуальным изучение экспериментальных гистологических механизмов апоптоза не только в клетках спирального органа, но и в сосудистой полоске.

Целью исследования явилось изучение отопротективного эффекта мелатонина у экспериментальных животных при экспериментальной сенсоневральной тугоухости.

Материалы и методы. Изучение морфофункционального состояния клеток внутреннего уха в условиях экспериментальной тугоухости ототоксического генеза проводили на 3-6-месячных морских свинках массой 350-400 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при освещенности, имитирующей естественное чередование светлого и темного времени суток. Все животные получали готовый лабораторный корм и воду без ограничений. Работа выполнена с соблюдением международных принципов Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным (1964, 2008).

Моделирование стойкой СНТ у онтологически здоровых лабораторных животных проводили путем внутримышечного введения ототоксического антибиотика — гентамицина сульфата — в дозе 120 мг/кг веса тела/сут в течение 17 дней [12, 17, 18].

В последние годы большое значение уделяется изучению роли нарушений ней-роэндокринной системы и, в частности, роли мелатонина в развитии различных патологических состояний в организме человека. Мелатонин, являясь гормоном шишковидной железы, участвует в регуляции функций таких важнейших систем организма, как нейроэндокринная и иммунная. Этот гормон обладает антиоксидантными, иммуномодулирующими, геропротекторными, вазодилатирующими свойствами. Мелатонину свойственно также пролиферативное действие, осуществляемое путем модулирования дифференцировки и апоптоза клеток.

Для исследования активности мелатонина, применяемого в качестве антисур-дитанта, одновременно с антибиотиком животные экспериментальной группы в вечерние и ночные часы получали с питьевой водой мелатонин в разведении 10 мг/л [19]. В работе был использован мелатонин в форме лекарственного препарата «Ме-лаксен» производства фармацевтической компании «Юнифарм, Инк». Животные интактной группы не подвергались какому-либо воздействию.

Таким образом, все животные были разделены на 3 группы по 8 животных (16 улиток) в каждой. В первую группу вошли животные, которые получали гента-мицин и мелатонин; вторая группа животных получала только гентамицин; третья (интактная) служила контролем.

Слуховую функцию оценивали по методике С. Г. Журавского и соавт. [20] до и после воздействия с помощью рефлекса Preyer (реакция животных в виде подергивания ушей при звуковом воздействии). До начала воздействия у животных всех групп отмечался нормальный живой рефлекс Preyer. По окончании воздействия у животных контрольной группы рефлекс Preyer был отрицательным, что свидетельствовало об угнетении функции органа слуха. У морских свинок, получавших мелатонин, по окончании воздействия рефлекс Preyer был положительным во всех случаях, что свидетельствовало о сохранности слуховой функции у этих животных.

После эксперимента улитки морских свинок подвергались морфологическому исследованию с использованием методики прижизненной изоляции лабиринтов, разработанной Я. А. Винниковым и Л. К. Титовой [21]. Сосудистые полоски выделяли под бинокулярной лупой. Перед тимпанопункцией и декапитацией все животные подвергались общему обезболиванию (2% рометар внутримышечно в сочетании с парами эфира или кетамин 4 мг/кг и реланиум 0,35 мг/кг внутримышечно).

Для светооптического исследования материал фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации заливали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Под световым микроскопом при увеличении 90x15 подсчитывали количество ядер с признаками апоптоза на 100 клеток.

Результаты исследования. При исследовании с помощью световой микроскопии гистологических препаратов спирального органа здоровых животных интакт-ной группы эпителий сосудистой полоски состоял из клеток различной формы и высоты, имеющих отростки. Ядра этих клеток располагались на разных уровнях, т. е. в несколько рядов (рис. 1). В толще эпителия сосудистой полоски были видны многочисленные кровеносные сосуды, что представляет исключительное явление

для эпителия. У здоровых животных отсутствовали спазм и расширение сосудов сосудистой полоски.

Рис. 1. Нормальная сосудистая полоска внутреннего уха морской свинки. Ув. х 400

При микроскопическом исследовании у животных второй группы с экспериментальной аминогликозидной тугоухостью выявлены нарушения капиллярной системы сосудистой полоски, проявляющиеся в чередовании спазмированных и расширенных участков просветов сосудов. В расширенных просветах капилляров сосудистой полоски отмечаются скопления адгезированных эритроцитов (рис. 2). Стаз и полнокровие капилляров свидетельствует о значительных гемостатических сдвигах и нарушении кровоснабжения спирального органа.

Рис. 2. Сосудистая полоска внутреннего уха морской свинки с экспериментальной тугоухостью ототоксического генеза. Ув. х 400. Стаз и полнокровие капилляров

В эпителиальных клетках сосудистой полоски выявлены патоморфологические изменения, характерные для различных стадий апоптоза. На ранней стадии апоп-тоза отмечается уплотнение и маргинация ядерного хроматина. Межклеточные промежутки расширены, клетки уменьшены в размерах и деформированы, их ядра имеют грубодисперсный конденсированный хроматин, крупные ядрышки смещены на периферию ядра. В единичных клетках плотные гиперхромные ядра фрагменти-рованы, крупнозернистая цитоплазма не имеет контакта с соседними клетками, что свидетельствует о глубоко зашедших необратимых процессах апоптоза (рис. 3).

Рис. 3. Сосудистая полоска внутреннего уха морской свинки с экспериментальной тугоухостью ототоксического генеза. Ув. х 400. Апоптоз клеток

На конечных стадиях апоптоза отмечается фрагментация ядер и формирование апоптических телец. Важно отметить, что описанные изменения не сопровождаются признаками воспалительной реакции и затрагивают отдельные клетки, не распространяясь на соседние участки.

У животных, получавших наряду с ототоксичным антибиотиком препарат мела-тонина, патоморфологические признаки повреждения капилляров и эпителиальных клеток сосудистой полоски выражены слабее. Так, у морских свинок этой группы число ядер клеток с признаками апоптоза было на 17% ниже, чем в контрольной группе.

Обсуждение результатов. Современные научные данные свидетельствуют о том, что ототоксические антибиотики способны инициировать апоптотические процессы за счет участия в биохимических механизмах функционирования сенсорного эпителия, прежде всего таких, как свободно-радикальное окисление липи-дов мембран, белков и ДНК. При этом одной из наиболее важных мишеней являются митохондрии, которые выполняют функции не только поставщиков энергии, но и мощных кальциевых депо [22, 23]. Изменение структур митохондрий способствует повышению входа кальция в клетку, активации протеолитических ферментов лизосом, которые, в свою очередь, активируют факторы транскрипции, регулирующие экспрессию гена в механизмах апоптоза [13]. Изменение цитозольной концентрации свободного кальция обеспечивает передачу сигналов от специализированных структур плазматической мембраны к внутриклеточным системам, запуская ряд важнейших цитоплазматических процессов, лежащих в основе клеточной возбудимости, метаболизма, пластичности и регуляции генетического аппарата [24]. Образование митохондриальных пор ведет к снижению уровня мембранного потенциала, которое наблюдается при апоптозе, а также выходу из митохондрий проапоптотичного фактора АЩ действие которого относительно ядра проявляется конденсацией хроматина и фрагментацией ДНК. Таким образом, кальциевый сигнал в клетке, являясь результатом сложнейшей пространственной и временной интеграции ее молекулярных механизмов, определяет не только возможность исполнения им многочисленных клеточных функций, но и нарушение жизнедеятельности клетки.

Наиболее характерными патоморфологическими изменениями апоптоза являются агрегация хроматина, конденсация цитоплазмы и ядра, а также фрагментация ядра и цитоплазмы на покрытые плазматической мембраной везикулы (апоптоти-ческие тельца), содержащие конденсированный ядерный материал, митохондрии, рибосомы и другие клеточные структуры. In vivo апоптотические тельца довольно трудно выявить, поскольку они быстро подвергаются фагоцитозу макрофагами и расположенными вблизи эпителиальными клетками, причем такое удаление апоп-тотических телец in vivo не сопровождается воспалительным процессом, который встречается при некротическом отмирании клеток [14].

При экспериментальном моделировании СНТ ототоксического генеза в воло-сковых клетках улитки зафиксирована этапная апоптотическая гибель клеток спирального органа, происходящая на фоне гибели эпителия спиральной связки [13]. У экспериментальных крыс наряду с уплотнением и маргинацией ядерного хроматина, характерных для ранней стадии апоптоза, обнаружены также фрагментация ядер и формирующиеся апоптотические тельца как элементы поздней стадии апоптоза. В исследованиях С. Г. Журавского (2006) при моделировании хронической и острой СНТ с помощью световой и сканирующей электронной микроскопии выявлены процессы дистрофии, некроза и апоптоза клеток Кортиева органа, причем степень патоморфологических изменений коррелировала с интенсивностью повреждающего фактора и не зависела от природы ототоксического действия.

Для клеток сосудистой полоски характерен высокий уровень Na-АТФазы и наличие К-помпы. Сосудистая полоска производит эндолимфу, в которой отмечается высокое содержание ионов калия и низкая концентрация ионов натрия, что обеспечивает наличие эндокохлеарного потенциала. Эндолимфа играет ключевую роль в трофике волосковых клеток, а также благодаря разности потенциалов увеличивает чувствительность Кортиева органа в рецепции звуков. Учитывая, что именно спиральная связка с расположенной на ней сосудистой полоской ответственна за гомеостаз эндолимфы, можно предположить, что изменения в сосудистой полоске влекут за собой изменение состава эндолимфы, что, в свою очередь, может приводить к повреждению волосковых клеток.

Таким образом, результаты проведенных исследований сосудистой полоски внутреннего уха при экспериментальной тугоухости, вызванной аминогликозидны-ми антибиотиками, выявили глубокие морфологические изменения, развивающиеся как в кровеносных сосудах, так и в эпителиальных клетках сосудистой полоски. Данные морфологические изменения протекают по типу механизмов апоптоза и, вероятно, могут расцениваться как морфологический субстрат развивающейся тугоухости. Степень дегенеративных изменений на фоне отсутствия пролиферативной активности высокодифференцированных тканевых элементов приводит к необратимым нарушениям морфологических структур и, как следствие, к потере слуховой функции. Выявленные в сосудистой полоске изменения носят мозаичный характер, что свидетельствует о дискретной гибели популяции эпителиальных клеток, характерной для апоптоза, в отличие от тотальной дегенерации, являющейся признаком некроза. Экспериментальные данные свидетельствуют также о возможности предотвращения клеточной гибели и возможной регуляции развивающегося при СНТ апоптоза путем использования мелатонина. Важным аспектом отопротектив-ного эффекта мелатонина является его способность ингибировать процессы апоп-

тоза, препятствуя развитию морфологических изменений структур внутреннего уха и развитию тугоухости. Таким образом, мелатонин может рассматриваться как одно из возможных новых антисурдитантных средств для лечения сенсоневральной тугоухости.

Литература

1. Байраков В. И. Инвалидность вследствие болезней уха у взрослого населения и пути развития социальной реабилитации и интеграции инвалидов: автореф. дис. ... докт. мед. наук. М., 2007. 41 с.

2. Бабияк В. И., Гофман В. Р., НакатисЯ. А. Нейрооториноларингология: руководство для врачей. СПб.: Гиппократ, 2002. 728 с.

3. Pawlaczyk-Luszczynska M., Dudarewicz A., Zaborowski K. et al. Noise induced hearing loss: Research in central, eastern and south-eastern Europe and newly independent states // Noise and Health. 2013. Vol. 15, N 62. P. 55-66.

4. Говорун М. И., Гофман В. Р., Парфенов В. Е. Кохлеопатия. СПб.: ВМедА, 2003. 173 с.

5. Митрофанов В. В., Пащинин А. Н., Бабияк В. И. Физические факторы среды и внутреннее ухо. СПб.: Гиппократ, 2003. 336 с.

6. Морозова С. В. Нейросенсорная тугоухость: основные принципы диагностики и лечения // Рос. мед. журнал. 2001. Т. 9, № 15. С. 15-18.

7. Петрова Н. Н. Сенсоневральная тугоухость: распространенность и основные этиопатогенети-ческие факторы // Медицинский академический журнал. 2010. Т. 10, № 3. С. 122-129.

8. Павлюшина Е. М., Морозова С. В. Современные методы диагностики и лечения ятрогенной ототоксичности // Вестник оториноларингологии. 2007. №5. С. 38-43.

9. Schuknecht H. F., Watanuki K., Takahashi T. et al. Atrophy of the stria vascularis, a common cause for hearing loss // Laryngoscope. 1974. Vol. 84, N 10. P. 1777-1821.

10. Suzuki T., Nomoto Y., Nakagawa T. et al. Age-Dependent Degeneration of the Stria Vascularis in Human Cochleae // Laryngoscope. 2006. N 116. P. 1846-1850.

11. Журавский С. Г., Бородулин В. Г., Томсон В. В., Лопотко А. И. Патоморфологические особенности повреждения волосковых клеток спирального органа при экспериментальной сенсоневральной тугоухости // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 141, № 3. С. 356-360.

12. Золотова Т. В., Панченко С. Н. Экспериментальная сенсоневральная тугоухость ототоксиче-ского генеза у животных: апоптический путь гибели клеток спирального органа // Вестник оториноларингологии. 2010. № 4. С. 29-32.

13. Белоусов Ю. Б., Абакаров М. Г., Магомедов М. М. Фармакогенетика аминогликозидной тугоухости // Качественная клиническая практика. 2006. № 2. С. 72-75.

14. Яшан O. I., Хоружий I. B. Волосковi клитини слухового аналiзатора: основш ультраструктурш та биохiмiчнi характеристики // Журнал вушних, носових i горлових хвороб. 2009. № 1. С. 84-91.

15. Программированная клеточная гибель = Programmed cell death / под ред. В. С. Новикова. ВМА. СПб., 1996. 275 с.

16. Барышников А. Ю., Шишкин Ю. В. Програмированная клеточная смерть (апоптоз) // Российский онкологический журнал. 1996. № 1. С. 58-60.

17. Ye L-F., Tao Z., Hua Q. et al. Protective effect of melatonin against gentamicin ototoxicity // The Journal of laryngology and otology. 2009. Vol. 12, N 123. P. 151-157.

18. Ильинская Е. В., Атаманова Н. В. Экспериментальное исследование ультраструктуры спирального органа при введении канамицина и церулоплазмина // Вестн. оторинолар. 1997. № 4. C. 2427.

19. Анисимов В. Н. Мелатонин. Роль в организме, применение в клинике. СПб.: Система, 2007. 40 с.

20. Журавский С. Г., Томсон В. В., Цвылева И. Д., Иванов А. Г. Патоморфологические аспекты действия аминогликозидных антибиотиков на слуховой анализатор // Вестн. оторинолар. 2003. № 2. С. 5-60.

21. Винников Я. А., Титова Л. К. Кортиев орган. Гистофизиология и гистохимия. М.; Л., 1961.

22. Костюк П. Г., Костюк О. П., Лук'янець О. О. 1они кальцш у функци мозку — ввд фiзiологii до патологи. Киев: Наукова думка, 2005. 200 с.

23. Nicholls D. G. Mitochondria and Calcium Signalling // Cell Calcium. 2005. Vol. 38. P. 311-317.

24. Костюк П. Г. Кальцш: юн життя, юн смери // Вксник НАН Украши. 2001. № 2. С. 6-8.

Статья поступила в редакцию 20 июня 2014 г.

Контактная информация

Петрова Наталья Николаевна — доктор медицинских наук, профессор; Natalya.Petrova@spbmapo.ru

Перевозчикова Вера Николаевна — аспирант; verashka2@rambler.ru Маслова Юлия Анатольевна — аспирант; ulenka7@rambler.ru

Перевозчикова Надежда Георгиевна — кандидат медицинских наук, доцент; verashka2@rambler.ru

Petrova Natalya N. — Doctor of Medicine, Professor; Natalya.Petrova@spbmapo.ru Perevozchikova Vera N. — post graduate student; verashka2@rambler.ru Maslova Yulia A. — post graduate student; ulenka7@rambler.ru

Perevozchikova Nadejda G. — Candidate of Medicine, Associate Professor; verashka2@rambler.ru