Создание генетических конструкций, содержащих нуклеотидные последовательности гена транспортного белка ВККМ на основе модифицированного бинарного вектора

УДК 577.218

СОЗДАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ, СОДЕРЖАЩИХ НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА ТРАНСПОРТНОГО БЕЛКА ВККМ НА ОСНОВЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО БИНАРНОГО ВЕКТОРА

Ю.Ф. Мытницкая, В.В. Заякин, И.Я. Нам

ВККМ - один из наиболее опасных патогенов малины, наносящий значительный экономический ущерб промышленным насаждениям данной культуры. Для борьбы с распространением вируса кустистой карликовости единственным эффективным способом является создание устойчивых растений. Нами было разработано несколько вариантов генетических конструкций, содержащих фрагменты гена транспортного белка ВККМ для изучения механизмов устойчивости и получения искусственной резистентности, основанной на запуске механизма РНК-интерференции.

Ключевые слова: вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), вирусоустойчивость, генетические конструкции, трансгенные растения, РНК интерференция.

В последние десятилетия проблема поражения вирусами различных сельскохозяйственных культур, в том числе и малины, становится все более острой. Так, идентифицировано свыше 30 различных вирусных инфекций, поражающих растения рода ЯиЪш, однако лишь небольшое число наносит значительный экономический ущерб промышленным насаждениям из-за снижения вегетативной продуктивности и урожайности побегов [1, с. 266; 2 с. 176]. К числу наиболее опасных патогенов малины в Европе и Северной Америке относят вирус кустистой карликовости малины (ВККМ), который даже при бессимптомном протекании инфекции приводит к потере до 50% урожая [3, с. 24; 4, с. 186]. К настоящему времени ВККМ распространился практически повсеместно. Так, данный вирус был идентифицирован в посадках малины Северной и Южной Америки, Восточной и Западной Европы, Скандинавии, Южной Африке, Азии и Австралии [5, с. 7].

На данный момент времени не известно эффективных методов оздоровления посадочного материала малины от ВККМ, а также не найдено генетических источников резистентности растений КиЬшБр. для создания устойчивых к данному патогену сортов методами традиционной селекции [6]. Поэтому единственным эффективным способом защиты растений от поражения ВККМ является получение трансгенной устойчивости на основе вирусных нуклео-тидных последовательностей [1, с. 268].

Для решения данной проблемы нами был получен ряд генетических конструкций, содержащих фрагменты гена транспортного белка ВККМ, клонированных в бинарном векторе рВш19. Такие векторные конструкции можно использовать для получения вирусоустойчивых трансгенных растений малины путем агробактериальной трансформации.

Материалы и методы

Основой для создания генетической конструкции с фрагментами гена транспортного белка ВККМ является вектор рВш19. Данная плазмида несет ген прШ, обусловливающий устойчивость в антибиотику канамицину и находящийся под контролем промотора гена нопалинсинтазы (Pnos), а также полилинкер с множественными сайтами клонирования (рис 1).

£со РI Крп | 5тэ I Взт Н1 ХЬэ I 1 №п(1111

V Г гт ¡и- Н л м сайт ^

для клон к розан и я ___-——

^^^ (лолилинкер) ^— 1_В \ __^

Рпоз

Г>В|л 19 1 1

Ют.пл, I

Рисунок1. Структура бинарного вектора pBin19. LB, RB - левая и правая границы, lac - а-комплементарная область lac оперона, Pnos - промотор гена нопалинсинтазы, nptlI - кодирующая последовательность неомицинфосфотранс-феразы II из Tn5, noA - сайт полиаденилирования гена нопалинсинтазы; точками обозначены последовательности плазмиды pRK252, содержащие начало репикации из плазмиды RK2 с широким кругом хозяев.

Для модификации данного вектора использовали нуклеотидные последовательности плазмиды pFF19 (рис. 2).

амтзгзевсгооютз«

^ 3 а 3 ° " ^ х — _ х —

Рисунок 2. Карта плазмиды pFF19. (35Senh - энхансер, 35Sprom - 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты,

35SpolyA - сайт полиаденилирования)

Фрагменты гена транспортного белка ВККМ синтезировали с помощью ПЦР. ПЦР-смесь содержала прямой и обратный праймеры, 250 мкМ каждого нуклеозидтрифосфата, 2,5 единицы Taq-полимеразы и 2,5 мкл стандартного буфера для Taq-полимеразы (СибЭнзим, Новосибирск). Оптимальное количество каждого праймера составляло 12,5 пмолей на пробу. Конечный объем смеси составлял 25 мкл. Для амплификации использовались следующие температурные условия:

1. Предварительная денатурация 94°С - 3 мин

2. 10 циклов: денатурация 94°С - 1 мин, отжиг 50°С - 1 мин, синтез 72°С - 1 мин

3. 20 циклов: денатурация 94°С - 1 мин, отжиг 45°С - 1 мин, синтез 72°С - 1 мин

4. Заключительная элонгация 72°С - 3 мин.

Элюировали фрагменты из 1%-ного агарозного геля с использованием методики, рекомендованной фирмой «Евроген». Рестрикция стандартного и модифицированного вектора pBin19 осуществлялась ферментами BamHI, SaR, HindIII и EcoRI, а также лигирование целевых генов и векторов Т4-лигазой осуществлялось по стандартным методикам, предложенным фирмой-производителем (СибЭнзим, Новосибирск).

Генетические конструкции на основе вектора pBin19 вводились в клетки E. coli штамма JM 109 методом элек-тропорации с помощью прибора производства Biorad (Bio-Rad Laboratories, США).

Рестрикционный и ПЦР-анализ полученных клонов также проводились по стандартным методикам. Результаты анализов визуализировали с помощью электрофореза и обрабатывали с использованием системы гель-документирования GelDoc и программного обеспечения Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве калибровочных маркеров использовали 100 bp +1.5 Kb DNA Ladder (СибЭнзим, Новосибирск).

Результаты и их обсуждение

Генетические конструкции для клонирования интересующих генов должны содержать следующие структурные элементы: целевой ген (или ген интереса), промотор и терминатор, узнаваемые ферментами систем репликации растительных клеток, а также селективный ген, позволяющий производить отбор трансформированных клеток (рис. 3) [7, с. 106].

Рисунок 3. Схема генетической конструкции для агробактериальной трансформации

Для переноса таких конструкций в клетки растений, как правило, используют бинарные вектора, позволяющие проводить клонирование в E. coli и трансформировать растения с помощью A. tumefaciens, поскольку в их состав входят соответствующие регуляторные элементы. Так, бинарный вектор pBin19 содержит Т-область, фланкированную левой и правой границей (LB и RB), которая в процессе трансформации переносится в геном растения. В Т-ДНК данного вектора расположен также селективный ген nptlI, кодирующий последовательность неомицинфос-фотрансферазы II и придающий трансформированным клеткам устойчивость к антибиотику канамицину. NptlI находится под контролем промотора и терминатора гена нопалинсинтазы (nos), позволяющих экспрессировать данный ген в эукариотических клетках. Для клонирования целевых генов в векторе pBin19 имеется полилинкер, расположенный внутри гена lacZ. Но около полилинкера отсутствует промотор эукариотического типа, поэтому данный вектор не является экспрессирующим для растений. Чтобы клонированные в данном векторе гены могли экспрессиро-ваться, требуется ввести дополнительный промотор, способный функционировать в составе растительного генома.

Промотор является одним из основных регуляторных элементов бинарных векторов [8, с. 142]. «Сила» промотора, а, соответственно, возможность его использования в генной инженерии, определяется легкостью связывания с промотором фермента РНК-полимеразы и образования открытого комплекса, необходимого для инициации транскрипции [7, с. 108]. Одним из наиболее широко используемых является конститутивный 35S-промотор вируса мо-

заики цветной капусты (СаМУ) [9, с. 285], который активен во всех тканях растения на протяжении всего цикла развития. Так, количественные исследования уровней транскрипции в трансгенных растениях табака показали, что 35 S-промотор СаМУ, по меньшей мере, в 30 раз сильнее NOS-промотора нопалинсинтазы [10, с. 184].

Последовательность гена 35S-промотора длиной 994 Ьр была выделена из плазмидной ДНК pFF19 с помощью эндонуклеаз HindШ и EcoRI. Затем проводили лигирование промотора и вектора рВш19 (молярное соотношение вектор/вставка = 1:3) по сайтам рестрикции HindШ и EcoRI (рис. 4 А, Б). На рис. 4 (Б) представлена полученная в результате лигирования конструкция Т-области модифицированного вектора (pBin19mod35S).

RB

4

1_ Nos-pro NptII Nos-ter

J

Т-обпасть векгоаЫЗЫ?

3JS-Pro

Б

ЕВ <

35S polyA

LB

Nos-pro NptII Wnñ-t.fif

3ÍS-Pro

35S polyA

Вектор

pBinl9rnod35S

Ват El

ISoí I

MPBKKM Í03bp

EamHI

В RB

Sd¡

<M

LB

Nos- pro I

NptII

Hcs-ter

353-Pro

Вектор pBinl9mod35S со вставкой гена MP ВККМ

MP БКЕМ 3SS 303 Ъв I POlyA

Рис. 4. Схема получения одной из генетических конструкций. LB, RB - левая и правая границы Т-области, Nos-pro- промотор гена нопалинсинтазы, NptII - кодирующая последовательность неомицинфосфотрансферазы II из Tn5, Nos-ter - сайт полиаденилирования гена нопалинсинтазы; 35S-pro- промотор CaMV, MP ВККМ - фрагмент целевого гена транспортного белка вируса, 35S-polyA- сайт полиаденилирования CaMV;

Полученным вектором pBin19mod35S трансформировали клетки E. coli штамма JM 109. Рестрикционный анализ полученных клонов на наличие вставки 358-промотора вируса мозаики цветной капусты проводился по сайтам рестрикции HindIII и EcoRI (рис.5).

Из данной электрофореграммы следует, что в одном из клонов вставка промотора прошла успешно, что подтверждается наличием на треке №6 полосы длиной 994 bp, соответствующей длине последовательности 358-промотора CaMV Таким образом, нами был получен экспрессирующий бинарный вектор pBin19mod35S, который можно использовать для клонирования целевых генов, их интеграции в геном растений и эффективной экспрессии в растительных клетках.

М27

1

'JíSÍ.-

3 4 5

еэиа —

U-Í Ш

6 7

8 9 10

. - ^

Í.-4S-

3000 Ьр

1000 Ья.

я

Рис. 5. Электрофореграмма продуктов рестрикционного анализа клонов, полученных в результате трансформации. Треки 1-5 - нерестрицированная плазмидная ДНК клонов, 6-10 - плазмидная ДНК клонов, обработанная рестриктазами Ит&П и EcoRI.

pBin19mod35S затем был использован для клонирования по сайтам рестрикции BamHI и Sali фрагмента гена транспортного белка (MP) ВККМ (рис. 4 Б, В). Данный фрагмент был ранее клонирован в pAL-TA-вектор фирмы «Евроген» (Россия) и введен в клетки E. шИ. С помощью ПЦР на плазмидной ДНК pAL-TA со вставкой синтезировали целевой фрагмент длиной 503 bp. В ходе ПЦР использовали праймеры RBDV-MP+5Bam и RBDV-MP-5Sal, в состав которых входят сайты узнавания рестриктаз BamHI и Sali, что позволило получить фрагменты гена с сайтами рестрикции данных эндонуклеаз.

Для дальнейшей работы по созданию устойчивых к ВККМ трансгенных растений малины нами было получено несколько вариантов генетических конструкций, содержащих фрагмент вирусного транспортного белка. На рис. 4 (В) показано схематичное изображение одной из конструкций, в которой целевой ген лигируется по двум сайтам рестрикции. В других конструкциях несколько копий целевого фрагмента объединялись в прямой и обратной ориентации как показано на рис. 6.

Рис. 6. Схема образования многокопийной вставки фрагмента гена транспортного белка ВККМ

Для этого pBin19mod35S обрабатывали только одной из рестриктаз (BamHI или Sali), вследствие чего в процессе лигирования целевая вставка могла быть пришита к вектору только одним концом, несущим соответствующий сайт рестрикции. Другой конец оставался свободным, что способствовало присоединению к нему других копий фрагмента. Предполагается, что такие конструкции могут быть более эффективны для создания трансгенной устойчивости, основанной на механизме РНК-интерференции. В результате РНК-интерфереции происходит специфичная деградация экзогенной РНК в присутствии гомологичной дцРНК, либо локально введенной, либо транскрибируемой с области инвертированных повторов трансгена [11, с. 180]. Данный клеточный процесс деградации гомологичных дцРНК происходит с участием малых дцРНК. Это способствует разрушению РНК вирусов.

Так, нами было получено 14 клонов, из которых только в двух содержится конструкция с единичной вставкой фрагментом MP ВККМ.

При клонировании по одному сайту рестрикции (BamHI или Sali) было получено 12 клонов, результаты ПЦР-анализа девяти из которых представлены на рис. 7. Для проведения данного анализа использовались праймеры RBDV-MP+5Bam и RBDV-MP-5Sal , что позволяет синтезировать фрагмент гена MP длиной 503 bp.

Рис. 7. Электрофореграмма продуктов ПЦР-анализа клонов, полученных в результате трансформации вектором pBin19mod35S, несущим фрагменты гена транспортного белка ВККМ

Исходя из данных электрофореграммы, можно сделать вывод, что в шести из девяти клонов произошло лиги-рование, по меньшей мере, шести копий фрагмента вирусного гена транспортного белка (треки 1,3, 6, 7, 8 и 9). В ходе ПЦР на плазмидной ДНК данных клонов было синтезировано четыре фрагмента размером от 500 до 2000 bp, причем каждая полоса отличается от предыдущей примерно на 500 bp. На треках 2, 4 и 5 обнаруживается только две полосы, что может свидетельствовать о встраивании димеров целевых фрагментов. Таким образом, можно предположить, что во всех полученных генетических конструкциях содержится несколько копий участков MP ВККМ длиной 503 bp, при транскрипции которых возможно формирование шпилечных структур мРНК.

Данные генетические конструкции на основе вектора pBin19mod35S, содержащие последовательности вирусного гена MP можно использовать для трансформации клеток малины и, в дальнейшем, получения вирусоустойчи-вых растений и изучения взаимодействия вирус-растение.

Raspberry bushy dwarf virus (RBDV) is one of the most dangerous pathogens of a raspberry, causing significant economic damage to industrial plantations of this crop. The only effective way to control the spread of the RBDV is a creation of resistant plants. We have developed a number of genetic constructions containing the fragment of the viral transport protein gene. These constructions may be used for studying the mechanisms of resistance and for development of artificial resistance, based on the triggering of the RNA interference mechanism. Keywords: raspberry bushy dwarf virus (RBDV), resistance to viruses, genetic constructions, transgenic plants, RNA interference.

Список литературы

1. Martin R.R. Virus diseases of rubus and strategies for their control // Acta Horticulturae (ISHS). 2002. №585. Р. 265-270.

2. Martin R.R., MacFarlane S., Sabanadzovic S., Quito-Avila D.F., Poudel B., and Tzanetakis I.E. Viruses and virus diseases of Rubus // Plant Diseases. 2013. Vol. 97. P. 168-182.

3. Converse R.H., Auger J. Identification of the Tomato Ring Spot Virus (TomRSV) and Raspberry Bushy Dwarf Virus (RBDV) in raspberry in Chile // Fitopatología. 1984. Vol. 19. №1. Р. 22-26.

4. Martin R.R., Keller K.E., Mathews H. Development of resistance to Raspberry Bushy Dwarf Virus in 'Meeker' Red Raspberry // Acta Horticulturae. 2004. Vol. 656. P.186-191.

5. Немцова Е.В. Оптимизация диагностики вируса кустистой карликовости малины методом RT-PCR // Авто-реф. дис. к. б. наук. М. 2009. 20 с.

6. Hall H. K., Hummer K., Jamieson A. J., Jennings S. N., Weber C. A. Raspberry Breeding and Genetics // Plant Breeding Reviews. 2009. Vol. 32. P. 1-290.

7. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Т.1. Генная и белковая инженерия. М. Наука. 2004. 530 с.

8. Carter B.T., Lin H., Cornish V. W. Yeast n-hybrid system for molecular evolution. Directed evolution of proteins, or how to improve enzymes for biocatalysis. N.Y. Wiley. 2002. P. 127-158.

9. Frank A., Guilley H., Jonard G. Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA // Cell. 1980. V 21. P. 285-294.

10. Harpster M.H., Townsend, J.A., Jones, J.D.G., Bedbrook, J. Dunsmuir, P. (1988) Relative strengths of the 35S cauliflower mosaic virus, 1', 2' and nopaline synthase promoters in transformed tobacco, sugarbeet and oilseed rape callus tissue. // Mol. Genet. Vol, 212. P. 182-190.

11. Tavernarakis N., Wang, S. L., Dorovkov, M., Ryazanov, A. Driscoll, M. Heritable and inducible genetic interference by double-stranded RNA encoded by transgenes. // Nat. Genet. 2000. Vol. 24. P. 180-183.

Обавторах

Мытницкая Ю.Ф. - аспирант кафедры биологии Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, mytnickaya_yulia@mail.ru

Заякин В.В. - доктор биологических наук, профессор кафедры биологии Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, iyanam1@yandex.ru

Нам И.Я.- доктор биологических наук, директор ИННО-центра биотехнологии и экологии Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, iyanam1@yandex.ru