Каллусные культуры сибирских видов хвойных

43. Прима В.М. Субнивальная флора Восточного Кавказа: ее состав, эколого-биологический и географический анализ // Флора и растительность Восточного Кавказа. - Орджоникидзе, 1974. - С. 46-69.

44. Тайсумов М.А., Умаров М.У. Флористические районы петрофитов Восточной части Скалистого хребта // Вестн. КрасГАУ. - 2010. - №3. - С. 45-49.

45. Меницкий Ю.Л. Проект «Конспект флоры Кавказа». Карта районов флоры // Бот. журн. - 1991. - №1. -а 1513-1521.

46. Федоров Ан. История высокогорной флоры Кавказа в четвертичное время как пример автохтонного развития третичной флористической основы // Мат-лы по изучению четвертичного периода СССР. -Вып.3. - М.: Изд-во АН СССР, 1952. - С. 230-248.

47. Гаджиев В.Д. Флора и растительность скальных обнажений Баба-Дагского массива // Мат-лы 5-го Все-соз. совещ. по вопросам изучения и освоения флоры и растительности высокогорий. - Баку, 1972. - С. 126-138.

УДК 57.086.83 И.П. Филиппова

КАЛЛУСНЫЕ КУЛЬТУРЫ СИБИРСКИХ ВИДОВ ХВОЙНЫХ*

Изучено влияние условий культивирования на каллусогенез, структуру и рост сибирских видов хвойных. Установлено, что для получения долгоживущих каллусов необходимо добавление в среду ауксинов (2,4-Д, НУК) и цитокинина (6-БАП). Интенсивность роста каллусов зависит от типа среды, концентрации фитогормонов и сахарозы.

Ключевые слова: Picea obovata, Pinus sylvestris, Pinus sibirica, Laiix sibiiica, каллус, 2-4 дихлорфенок-сиуксусная кислота, нафтилуксусная кислота, 6-бензиламинопурин.

I.P. Filippova

CALLUS CULTURES OF CONIFEROUS SIBERIAN SPECIES

Cultivation condition influence on callusogenesis, structure and growth of coniferous Siberian species is researched. It is determined that in order to produce long-lived calluses it is necessary to introduce growth substances (2,4-D, NAA) and cytokinine (6-BAP) into the environment. Callus growth rate depends on environment type, phytohormone and saccharose concentration.

Key words: Picea obovata, Pinus sylvestris, Pinus sibirica, Larix sibirica, callus, 2,4-dichlorphenoxy acetic acid, naphthalene acetic acid, 6-benzylaminopurine.

Каллусные культуры растений широко используются для изучения синтеза различных соединений, закономерностей ксилогенеза, органогенеза и соматического эмбриогенеза. Индукция каллусной ткани у хвойных была получена у эксплантов Ртив radiata на среде МЭ [1], Ртив Ьапкз1апа на среде / ЭИ [2], Рсеа chihuahuana на среде ЭИ [3], Ртив taeda на среде Т-ЭЭ [4], 1.апх дтеНпИ на среде / МЭ [5] и др. Цель данной работы: изучить влияние условий культивирования на каллусогенез, структуру и рост каллусов сибирских видов хвойных.

Материал и методы

Почки деревьев, двухнедельные проростки и зиготические зародыши Рсеа obovata, 1.апх вЬтса, Р-пив ву^евМв и Р. вЬтса культивировали на средах МЭ, 1_Р, В5 и Т-ЭЭ при полном составе и в разведении 1:1 с добавлением фитогормонов [6]. Индуцированные каллусы пересаживали на свежую среду каждые 3035 суток. Культуры содержали при 16-часовом фотопериоде и температуре 23-250С.

* Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ 08-04-00613.

54

Из образцов растительного материала приготовляли временные или постоянные препараты по стандартной методике [7]. Полученные препараты просматривали на световом микроскопе Axiostar plus. Прирост биомассы рассчитывали по формуле К= (М-М0)/М, где М - масса каллуса в конце субкультуры (пассажа); М0 - масса в начале субкультуры (пассажа).

Результаты и обсуждения

Проведенные исследования показывают, что все типы тестируемых эксплантов у исследуемых видов хвойных на средах MS, / MS, LP и / LP, с различным содержанием ауксинов (2,4-Д, НУК) и цитокинина (6-БАП) способны к каллусогенезу, но с разной интенсивность. Минеральный состав сред В5 и T-SS вообще не способствует каллусообразованию. Показатели частоты каллусообразования у эксплантов четырех видов хвойных на средах с ауксинами и цитокининами варьировали в пределах от 8-20 % (почки деревьев) до 100 % (проростки и зиготические зародыши).

Гистологический анализ эксплантов зиготических зародышей лиственницы, сосны и ели на 10 сутки культивирования, когда индукция каллуса на них уже становится очевидна, показывает, что каллус первоначально образуется из первичной коры. Клетки ее вытягиваются и увеличиваются в размерах, некоторые достигают 106 мкм в длину, расположены рыхло. При более длительном культивировании (на 21 сутки) в образование каллуса вовлечены и другие ткани зародышей. Дифференцировавшиеся трахеиды в каллусогенезе не участвуют.

Изучение анатомической структуры каллуса во время второго пассажа, проведенное на временных препаратах, показало, что в каллусе преобладают группы крупных, вакуолизированных клеток диаметром 15-20 мкм. Форма их может быть различной - от прямоугольной до изогнутой и угловатой. Среди них располагаются группы мелких клеток, заполненные более густым содержимым. Среди недифференцированных клеток встречаются трахеиды, характерные для хвойных.

Полученные результаты отражают общие закономерности каллусогенеза других высших растений. Увеличение размеров клеток перед началом каллусообразования, наблюдаемое у хвойных, относится к процессам первичных преобразований клеток in vitro [8]. Вслед за этим происходит обособление центров ростовой активности. Как показано на эксплантах Pinus banksiana [9], мелкие клетки группируются в центрах кал-лусных новообразований, более крупные приурочены к поверхностной зоне.

Сравнение сырой биомассы первичных каллусов в зависимости от типа среды и концентрации фитогормонов проведено на исследуемых видах хвойных, где в качестве эксплантов использовали двухнедельные проростки (рис. 1).

Рис 1. Биомасса первичного каллуса из гипокотилей проростков хвойных на средах МБ и 1А МБ с добавлением 2,4-Д 1 мг/л

Полученные результаты показывают, что увеличение концентрации 2,4-Д (с 1 до 2 мг/л) в среде приводит к увеличению биомассы первичных каллусов. Снижение концентрации макросолей MS среды в два

раза благоприятнее сказывается на интенсивности каллусогенеза. Добавление в среду цитокинина 6-БАП (1 мг/л) вместе с ауксином также способствует росту биомассы. Однако повышение концентрации 6-БАП при постоянном количестве ауксина в питательной среде не приводит к заметному отличию показателей биомассы от предыдущего варианта. Известно, что цитокинины увеличивают чувствительность клеток к ауксинам и изменяют эндогенный метаболизм ауксина, уменьшая активность оксидаз ауксинов [10, 11].

Наряду с 2,4-Д в нашей работе был использован и другой синтетический ауксин - НУК. Эти два ауксина не являются взаимозаменяемыми [12]. В зависимости от концентрации и видовой принадлежности растений 2,4-Д либо увеличивает рост клеток растяжением, либо стимулирует клеточные деления [13]. НУК влияет не только на деление и растяжение клеток, но и на скорости синтеза вторичных метаболитов [14]. Мы также сравнили воздействие 2,4-Д и НУК на некоторые характеристики каллусных тканей ели и лиственницы.

На среде / MS с 2,4-Д для каллусов обоих видов хвойных прирост сырой биомассы за время второго пассажа был выше в полтора раза, чем на той же среде, но с добавлением НУК (/ MS+НУК) (табл. 1). Замена 2,4-Д на НУК в среде культивирования также значительно повлияла на количество дифференцированных трахеид, их размеры и величину митотического индекса. Подсчет митозов в популяциях клеток, проведенный в конце субкультуры, показал, что наибольшая митотическая активность наблюдается на среде с 2,4-Д (2,17 и 2,42 %о), а в присутствии НУК митотический индекс не поднимается выше 0,39 %о.

Таблица 1

Характеристика каллусных тканей ели сибирской и лиственницы сибирской в зависимости от типа

используемого ауксина

Вид Ауксин Дифференцированные трахеальные элементы Интенсивность прироста биомассы Митотический индекс, %

Количество, шт/на поле Длина, мкм Ширина, мкм

Picea obovata 2,4-Д 4,47±2,43 35,12±1,07 25,76±1,54 11,69 2,17

НУК 10,19±1,94 42,31±0,98 41,32±1,17 6,65 0,25

Lar^x sibirica 2,4-Д 5,71±1,78 36,67±1,03 24,34±0,80 10,52 2,42

НУК 12,34±2,15 40,58±0,85 38,90±1,93 7,09 0,39

О влиянии НУК на параметры ростовых характеристик в литературе нет однозначного мнения. Так, подавление роста наблюдалось у культур клеток женьшеня настоящего [15] и у гетеротрофного каллуса чайного растения. В то же время у других штаммов чайного растения замена 2,4-Д на НУК при той же концентрации не приводила к заметному снижению пролиферации культуры [16], а суспензионная культура клеток женьшеня японского демонстрировала хороший рост [12].

Обнаружено увеличение размеров клеток каллусов исследуемых видов хвойных на среде с НУК. Визуально размер самых крупных клеток был примерно в 1,5-2 раза больше, при этом более мелкие клетки формировали многоклеточные агрегаты. На среде с 2,4-Д клеточные агрегаты состояли из 4-8 клеток. Это согласуется со структурой каллусов, поскольку каллусы, росшие на среде с 2,4-Д, были рыхлыми, тогда как на среде с НУК имели более плотную консистенцию.

И у лиственницы, и у ели трахеальные элементы в каллусах, образовавшиеся в ходе субкультуры, имели более крупные размеры в варианте с НУК, и их длина практически была равна ширине. При содержании в среде 2,4-Д трахеиды характеризуются более мелкими размерами, и их длина в 1,5 раза превышает ширину. Число трахеид в поле зрения микроскопа также зависит от типа используемого ауксина от 4-5 шт. на среде с 2,4-Д, до 10-12 шт. на среде с НУК (см. табл. 1).

Исходя из вышесказанного, в дальнейшей работе с каллусными культурами эти два ауксина (2,4-Д и НУК) использовали совместно, в результате чего были получены каллусные линии, которые росли 15-18 и более пассажей. С.П. Макаренко с соавт. [5] культивировали каллусы лиственницы Гмелина в течение 36 месяцев.

Изучение интенсивности прироста сырой биомассы семи каллусных линий в ходе 11 субкультур показало (рис. 2), что более высокие темпы прироста биомассы каллусов у трех исследуемых видов хвойных наблюдаются во время 2 субкультуры (каллусы 1-1, 2-1, 3-1) либо 3 субкультуры (каллусы 2-2, 3-2, 3-3). Затем скорости роста замедлялись и оставались постоянными в ходе следующих пассажей, однако присущая им светло-зеленая окраска сохранялась.

Рис. 2. Рост каллусных культур ели

Анализ литературы показал, что у одних видов растений получены быстрорастущие и медленнорастущие каллусные штаммы и характер их роста сохраняется в течение многих пассажей [16]. Каллусные линии других видов увеличили темпы роста при продолжительном культивировании на 20 % [17]. По-видимому, замедление роста каллусов исследуемых видов следует отнести к специфическим особенностям в культуре in vitro клеток голосеменных и хвойных. Так, медленный рост характерен и для каллусной ткани тиса ягодного [18].

Из литературы известно, что некоторые каллусные культуры, ранее индуцированные в присутствии экзогенных регуляторов роста, можно приучить к росту в отсутствие этих веществ [19]. Нами также проверена способность каллусов исследуемых видов хвойных расти на безгормональной среде. Для этого часть материнского каллуса после второго пассажа переносили на среду / MS-0, контролем служили части каллуса, пересаженные на среду / MS с фитогормонами.

Результаты, представленные в таблице 2, показывают, что в то время как каллусы продолжают интенсивный рост на среде с гормонами, каллусы на среде в отсутствие гормонов последовательно снижают прирост сырой биомассы и во время шестого пассажа останавливаются в росте и погибают.

Таблица2

Изменение индекса прироста сырой биомассы каллуса Larixsibirica на среде % MS без регуляторов роста (контроль % MS с 2,4-Д 1 мг/л, НУК 1 мг/л, 6-БАП 1 мг/л) в зависимости от количества пересадок

Среда Номера пассажей

3 4 5

/ MS-0 7 ,0 0, +1 6 ,7 5, 5 ,2 0, +1 7 ,5 3, ,51 0, +1 5 ,9

Контроль 11,06 ± 1,70 2 ,7 +1 3 ,8 9, 8 ,2 2, +1 3 ,7 7,

Способность каллусов существовать и расти некоторое время на среде без гормонов, по-видимому, связана с тем, что часть молекул фитогормонов, поступающих в клетки каллуса, могут запасаться, образуя гликозилированные формы, которые по мере необходимости становятся активными и участвуют в регуляции процессов деления и роста клеток.

Еще одним важным фактором, определяющим успешный рост и существование изолированных органов и тканей растений in vitro, является количество углеводов в среде. Для оценки влияния количества углеводов в среде на прирост биомассы каллусных культур исследуемых видов хвойных, исходные каллусы, росшие на среде / MS (2,4-Д 1 мг/л, НУК 1 мг/л, 6-БАП 1 мг/л), содержащей 3 % сахарозу, были пересажены на две среды, отличающиеся концентрацией углевода.

Интенсивность прироста биомассы каллусов исследуемых видов хвойных на 7 сутки роста на среде / MS с добавлением 1 % сахарозы существенно не отличается от данного показателя для среды с 3 % содер-

жанием сахарозы (рис. 3). Рост каллусных культур в течение первой недели, видимо, также частично идет за счет углевода, поглощенного в ходе предыдущего пассажа. Существенные отличия наблюдаются в конце пассажа (30 суток). Прирост биомассы на среде с 1 % сахарозой был ниже в 1,5 и более раз, что свидетельствует о значительной степени гетеротрофности, несмотря на зеленый цвет каллусов.

8,00

7.00

6.00 3 5,00 14,00 |3,00 10 2,00

1,00

0,00

3%-7

1%-7

3%-30

1%-30

1 2 3 3 45 45

—

каллусы

Рис. 3. Интенсивность прироста биомассы каллусов хвойных в зависимости от концентрации сахарозы в среде (1 и 3%)и времени культивирования (7 суток и 30 суток): 1-2 - каллусы ели сибирской;

3-4 - сосны обыкновенной; 5-6 - лиственницы сибирской

Все каллусы, полученные на средах с добавлениями ауксинов, не образовывали каких-либо органоподобных структур. В работе, посвященной исследованию влияния различных концентраций ауксинов на процессы каллусообразования и регенерацию растений у злаков, показано, что эффективность регенерации у каллусных культур ячменя составляет всего 1,2-5,4 % [20].

В результате проведенных исследований установлено, что для каллусогенеза лучшими эксплантами являются проростки и зиготические зародыши исследуемых видов хвойных. Максимальный прирост биомассы каллусов отмечен на среде / MS + 2,4-Д (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л). Для получения долгоживущих каллусных линий необходимо совместное присутствие в среде с 6-БАп разных ауксинов (2,4-Д и НУК). Концентрация сахарозы также существенно влияет на рост каллусов.

6

Литература

1. Regeneration of whole plants from apical meristems of Pinus radiate / D. Prehn [end al.] // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2003. - V. 73. - P. 91-94.

2. Charbonneau J., Laliberte S. In vitro and cellular responses of jack pine embryos to three imbibition parameters // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. - 2004. - V. 40. - P. 559-566.

3. Rosas M.M., Avila V.M., Boettler R.B. In vitro regeneration of plantlets from immature zygotic embryos of Picea chihuahuana martianez, an endemic mexican endangered species.// In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. -2001. - V. 37. - P. 73-78.

4. Tang W., Ouyang F. Plant regeneration via organogenesis from six families of loblolly pine // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1999. - V. 58. - P. 223-226.

5. Особенности жирнокислотного состава липидов каллусов лиственницы Гмелина двух географических популяций / С.П. Макаренко [и др.] // Физиология растений. - 2005. - Т. 52. - № 3. - С. 343-348.

6. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с.

7. Биотехнология растений: культура клеток: пер. с англ.; предисл. Р.Г. Бутенко.- М.: Агропромиздат, 1989.- 280с.

8. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. - М:ФБК-ПРЕСС, 1999. - 160 с.

9. Chalupa V., Durzan D. J., Mia A.J. Growth and metabolism of cells and tissue of jack pine (Pinus banksia-na).// Can. J. Bot. - 1976. - V. 54. - P. 446-455.

10. Гаманец Л.В., Гамбург К.З., Швецов С.Г., Рекославская Н.И. Взаимодействие ауксина и цитокинина в регуляции роста культуры семядольного каллуса сои // Физиол. и биохим. культ. раст. - 1989. - Т. 21.

- № 2. - С. 147-153.

11. Palni L. M. S., Burch L., Horgan R. The effect of auxin concentrations on cytokinin stability and metabolism // Planta. - 1988. - V. 174. - P. 213-234.

12. Суспензионная культура клеток Panax japonicus var. repens. 1. Параметры роста и цитогенетические характеристики / И.Н. Смоленская [и др.] // Биотехнология. - 2005. - № 5. - С. 21-28.

13. Campanoni P., Nick P. Auxin-dependent cell devision and cell elongation. 1-naphthalene-acetic acid and 2,4-dichlorphenoxyacetic acid activate different pathways // Plant Physiol. - 2005. - V. 137. - P. 939-948.

14. Скуратова В.В., Гольд В.М., Юшкова Е.В. Влияние фитогормонов на накопление и выделение бербе-рина в каллусной культуре василисника малого. // Биотехнология. - 2004. - № 1. - С. 24-30.

15. Противоположное влияние синтетических ауксинов 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 1-нафтилуксусной кислот на рост культуры клеток женьшеня настоящего и синтез гинзенозидов / И.Н. Смоленская [и др.] // Физиология растений. - 2007. - Т. 54. - № 2. - С. 243-252.

16. Николаева Т.Н., Загоскина Н.В., Запрометов М.Н. Образование фенольных соединений в каллусных культурах чайного растения под действием 2,4-Д и НУК // Физиология растений. - 2009. - Т. 56. - № 1.

- С. 53-58.

17. Культуры клеток экдистероид содержащих растений Ajuga reptans и Serratula согопа1а / В.Н. Филиппова [и др.] // Физиология растений. - 2003. — Т. 50. - № 4. - С. 564-572.

18. Цитологическая характеристика формирования каллусной ткани у тиса ягодного Taxus baccata / Л.В. Малышева [и др.] // Цитология. - 1999. - Т. 41. - № 2. - С. 150-154.

19. Гамбург К.З., Рекославская Н.И., Швецов С.Г. Ауксины в культурах тканей и клеток растений. - Новосибирск: Наука, 1990. -243 с.

20. Танасиенко И.В., Емец А.И., БлюмЯ.Б. Оценка эффективности каллусообразования и регенерации яровых сортов ячменя, районированных на территории Украины // Цитология и генетика. - 2009. - № 4. - С. 12-19.

---------♦------------

УДК 581.55.087.1 Т.В. Ким, О.В. Злотникова

ВЛИЯНИЕ ГЕРБИЦИДОВ НА КОНКУРЕНТНЫЕ ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МЕЖДУ ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЕЙ

И СОРНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТЬЮ

Показаны особенности конкурентной борьбы яровой пшеницы и сорных растений в составе агрофитоценоза при воздействии на него гербицида сульфонилмочевинной природы и его смеси с граминицидом. Выявлена связь между проективным покрытием каждого из членов агрофитоценоза на начальных стадиях развития культуры и дальнейшим исходом конкурентной борьбы. Обнаружен потенцирующий эффект баковой смеси гербицидов. Поставлена проблема риска возникновения резистентных форм сорняков к сульфо-нилмочевинам. Предложен более экологичный принцип подхода к химической защите растений от сорняков.

Ключевые слова: пшеница, сорняки, гербициды, химическая защита.

T.V. Kim, O.V. Zlotnikova HERBICIDE INFLUENCE ON COMPETITIVE RELATIONS BETWEEN SPRING WHEAT AND WEED VEGETATION

Peculiarities of competitive struggle of spring wheat and weed plants in agrophytocenosis structure in the process of influence on it of sulfonilcalurea nature herbicide and its mix with graminicide are shown. Correlation between a projective covering of each of the agrophytocenosis members at the initial stages of culture development and the further outcome of competitive struggle is revealed. Exponential effect of the tank herbicide mix is discovered. The problem of risk of the weed forms occurrence resistant to sulfonilcalurea is set. More harmless principle of the approach to chemical plant protection against weeds is offered.

Key words: wheat, weeds, herbicides, chemical protection.

Развитие адаптивно-ландшафтных систем земледелия характеризуется, помимо прочего, тенденцией к минимизации обработки почвы. В связи с этим в агрофитоценозах возрастает доля сорных растений, что обусловливает обострение межвидовой конкуренции между ними и культурой. Конкурентоспособность сельскохозяйственных культур различается довольно существенно, мало того, меняется в зависимости от фазы развития и погодных условий (Часовенная А.А., 1975). Конкурентоспособность яровой пшеницы в борьбе с