Исследование резистома микробных сообществ человека с помощью таргетной панели генов антибиотикорезистентности у пациентов с COVID-19

несомненно, может использоваться и в этом случае. С этой точки зрения можно говорить не столько о принадлежности к научной школе с научной точки зрения (мы не можем избежать здесь тавтологии), сколько о наличии свойственной связи. И в этом случае Г.Ф. Ланга можно рассматривать как «внука» С.П. Боткина, а В.Н. Виноградова - как «внука» Г.А. Захарьина.

Таким образом, мы имеем дело с уникальным для советской/российской внутренней медицины фактом и можем свидетельствовать о наличии постоянно действующего вот уже на протяжении ста лет связующего звена для всего терапевтического сообщества, которое в настоящее время существенно расширилось за счет разделения терапии на многочисленные ответвления.

Наличие общественной площадки, позволяющей представителям разных течений не просто обмениваться мнениями, но и полемизировать, иногда в достаточно эмоциональной форме, является несомненным плюсом не только для научной, но и для широкой врачебной аудитории. И в

этой связи журнал «Терапевтический архив» можно рассматривать как такую площадку, которая уже целый век трудится на благо отечественной медицины!

Раскрытие интересов. Автор декларирует отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Disclosure of interest. The author declares that he has no competing interests.

Вклад автора. Автор декларирует соответствие своего авторства международным критериям ICMJE.

Author's contribution. The author declares the compliance of his authorship according to the international ICMJE criteria.

Источник финансирования. Автор декларирует отсутствие внешнего финансирования для проведения исследования и публикации статьи.

Funding source. The author declares that there is no external funding for the exploration and analysis work.

Список сокращений

1-й МОЛМИ - 1-й Московский ордена Ленина медицинский АГ - артериальная гипертония институт ИМ - инфаркт миокарда

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Беляева В.С. Ланг Георгий Федорович (к 135-летию со дня рождения). Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2010;6:85-8 [Belyayeva VS. Lang Georgii Fedorovich (on the 135th anniversary of his birth). Experimental and Clinical Gastroenterology. 2010;6:85-8 (in Russian)].

2. Бородулин В.И., Тополянский А.В. Московские терапевтические школы (1920-1940-е годы). Терапевтический архив. 2013;85(8):101-4 [Borodulin VI, Topolianskii AV. Moscow therapeutic schools (from the 1920s to the 1940s). Terapevticheskii Arkhiv (Ter. Arkh.). 2013;85(8):101-4 (in Russian)].

3. Бородулин В.И., Тополянский А.В. Московские терапевтические школы. 20-40-е годы 20-го века. М.: НИИ истории медицины РАМН, 2013 [Borodulin VI, Topolianskii AV. Moskovskie

terapevticheskie shkoly. 20-40-e gody 20-go veka. Moscow: NII istorii meditsiny RAMN, 2013 (in Russian)].

4. Люсов В.А. Роль кафедры госпитальной терапии №1 лечебного факультета РГМУ в развитии отечественной науки и здравоохранения (1911-2006). Российский кардиологический журнал. 2006;(S):4-12 [Lusov VA. The role of hospital therapy chair №1 of the therapy faculty RSMU in development of native science and public health (1911-2006). Russian Journal of Cardiology. 2006;(S):4-12 (in Russian)].

5. Чазов Е.И. Жизнь прожить - не поле перейти. М.: СЛОН ПО, 2019 [Chazov EI. Zhizn' prozhit' - ne pole pereiti. Moscow: SLON PO, 2019 (in Russian)].

Статья поступила в редакцию / The article received: 06.09.2023

нйяи

omnidoctor.ru

I (cc)]by-nc-sa 4.0 ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

Исследование резистома микробных сообществ человека с помощью таргетной панели генов антибиотикорезистентности у пациентов с COVID-19

О.О. Янушевич1, И.В. Маев1, Н.И. Крихели1, О.В. Левченко1, Ю.С. Галеева2, Е.В. Старикова2, Д.Н. Андреев1, Ф.С. Соколов™, А.К. Фоменко1, М.К. Девкота1, Н.Г. Андреев1, А.В. Заборовский1, В.В. Евдокимов1, С.В. Царегородцев1, Е.Н. Ильина2, В.М. Говорун2, П.А. Белый1, Е.А. Сабельникова1,3, А.А. Солодов1, С.В. Черёмушкин14, Р.И. Шабуров14, А.Л. Кебина1

'ФГБОУ ВО «Российский университет медицины» Минздрава России, Москва, Россия;

2ФБУН «Научно-исследовательский институт системной биологии и медицины» Роспотребнадзора, Москва, Россия;

3ГБУЗ «Московский клинический научно-практический центр им. А.С. Логинова» Департамента здравоохранения г. Москвы, Москва, Россия;

4ЧУЗ «Центральная клиническая больница "РЖД-Медицина"», Москва, Россия

Аннотация

Цель. Изучение совокупности генов лекарственной устойчивости (резистома) в микробиоме кишечника человека и изменений, происходящих с такими генами на фоне терапии COVID-19 в условиях стационара.

Материалы и методы. Проведено одноцентровое ретроспективное когортное исследование. Анализу подлежали только случаи с лабора-торно подтвержденной детекцией РНК вируса SARS-CoV-2 c помощью полимеразной цепной реакции в образцах оро-/назофарингеаль-ного мазка. Из общего списка ретроспективных данных исключены пациенты с документированной (по анамнестическим данным и/или по данным обследования в период госпитализации) органической патологией со стороны гепатобилиарной системы, злокачественными новообразованиями любой локализации, системными и аутоиммунными заболеваниями, а также беременные. У всех участников исследования производился сбор кала для последующего проведения метагеномного секвенирования. Итоговая когорта разделена на 2 группы в зависимости от динамики течения заболевания: легкое течение (группа 1) и тяжелое течение (группа 2). Внутри группы 2 сформированы 5 подгрупп в зависимости от наличия приема антибактериальных препаратов (АБП): группа 2А (с приемом АБП), группа 2АС (прием АБП до госпитализации), группа 2АD (прием АБП во время госпитализации), группа - 2AE (прием АБП во время и до госпитализации), группа 2B (без приема АБП).

Результаты. Медиана количества генов антибиотикорезистентности - АБР (кумулятивное во всех временных точках) оказалась достоверно выше в группе пациентов, принимавших АБП: 81,0 (95% доверительный интервал - ДИ 73,8-84,5) против 51,0 (95% ДИ 31,1-68,4). В группе пациентов, принимавших АБП (2А), среднее количество генов множественной лекарственной устойчивости (эффлюксные системы) оказалось значимо выше, чем у лиц контроля (группа 2В): 47,0 (95% ДИ 46,0-51,2) против 21,5 (95% ДИ 7,0-43,9). У пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции отмечалась тенденция к выявлению более высокой медианы количества генов АБР, однако без статистической достоверности. Пациенты из группы с тяжелым течением COVID-19, не принимавшие АБП до момента госпитализации и не имеющие среди назначений АБП, тоже обладали большим числом генов резистентности, чем пациенты противоположной группы. Заключение. Настоящее исследование демонстрирует, что в группе с более легкой динамикой течения заболевания выявлено меньшее количество генов АБР, чем в группе с более тяжелым течением заболевания, где отмечалось увеличение генов АБР, среди которых доминировали отдельные 5 генов (SULI, MSRC, ACRE, EFMA, SAT).

Ключевые слова: коронавирус, COVID-19, SARS-CoV-2, антибиотикорезистентность, тяжесть течения заболевания, ген, резистом, секве-нирование, эффлюксный насос

Для цитирования: Янушевич О.О., Маев И.В., Крихели Н.И., Левченко О.В., Галеева Ю.С., Старикова Е.В., Андреев Д.Н., Соколов Ф.С., Фоменко А.К., Девкота М.К., Андреев Н.Г., Заборовский А.В., Евдокимов В.В., Царегородцев С.В., Ильина Е.Н., Говорун В.М., Белый П.А., Сабельникова Е.А., Солодов А.А., Черёмушкин С.В., Шабуров Р.И., Кебина А.Л. Исследование резистома микробных сообществ человека с помощью таргетной панели генов антибиотикорезистентности у пациентов с COVID-19. Терапевтический архив. 2023;95(12):1103-1111. DOI: 10.26442/00403660.2023.12.202490 © ООО «КОНСИЛИУМ МЕДИКУМ», 2023 г.

Информация об авторах / Information about the authors

нСоколов Филипп Сергеевич - преподаватель каф. фармакологии лечебного фак-та НОИ «Высшая школа клинической медицины им. Н.А. Семашко» ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». E-mail: phlppsokolov@gmail.com; ORCID: 0000-0003-2813-6498

Янушевич Олег Олегович - акад. РАН, д-р мед. наук, проф., ректор, зав. каф. пародонтологии ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-4293-8465

Маев Игорь Вениаминович - акад. РАН, д-р мед. наук, проф., зав. каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0001-6114-564X

Крихели Нателла Ильинична - д-р мед. наук, проф., зав. каф. клинической стоматологии ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-8035-0638

Левченко Олег Валерьевич - д-р мед. наук, проф., зав. каф. нейрохирургии и нейрореанимации ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0003-0857-9398

Галеева Юлия Сергеевна - мл. науч. сотр. ФБУН НИИ СБМ. ORCID: 0000-0001-6304-4607

HPhilipp S. Sokolov. E-mail: phlppsokolov@gmail.com; ORCID: 0000-0003-2813-6498

Oleg O. Yanushevich. ORCID: 0000-0002-4293-8465 Igor V. Maev. ORCID: 0000-0001-6114-564X

Natella I. Krikheli. ORCID: 0000-0002-8035-0638 Oleg V. Levchenko. ORCID: 0000-0003-0857-9398 Julia S. Galeeva. ORCID: 0000-0001-6304-4607

ORIGINAL ARTICLE

Study of the resistome of human microbial communities using a targeted panel of antibiotic resistance genes in COVID-19 patients

Oleg O. Yanushevich1, Igor V. Maev1, Natella I. Krikheli1, Oleg V. Levchenko1, Julia S. Galeeva2, Elizaveta V. Starikova2, Dmitry N. Andreev1, Philipp S. SokolovH1, Aleksei K. Fomenko1, Mikhail K. Devkota1, Nikolai G. Andreev1, Andrew V. Zaborovsky1, Vladimir V. Evdokimov1, Sergey V. Tsaregorodtsev1, Elena N. Ilina2, Vadim M. Govorun2, Petr A. Bely1, Elena A. Sabelnikova1,3, Aleksandr A. Solodov1, Sergei V. Cheremushkin1,4, Rafik I. Shaburov1,4, Anastasii L. Kebina1

'Russian University of Medicine, Moscow, Russia;

2Research Institute for Systems Biology and Medicine, Moscow, Russia;

3Loginov Moscow Clinical Scientific Center, Moscow, Russia;

4Central Clinical Hospital «Russian Railways Medicine», Moscow, Russia

Abstract

Aim. To study overall drug resistance genes (resistome) in the human gut microbiome and the changes in these genes during COVID-19 in-hospital therapy.

Materials and methods. A single-center retrospective cohort study was conducted. Only cases with laboratory-confirmed SARS-CoV-2 RNA using polymerase chain reaction in oro-/nasopharyngeal swab samples were subject to analysis. The patients with a documented history of or current comorbidities of the hepatobiliary system, malignant neoplasms of any localization, systemic and autoimmune diseases, as well as pregnant women were excluded. Feces were collected from all study subjects for subsequent metagenomic sequencing. The final cohort was divided into two groups depending on the disease severity: mild (group 1) and severe (group 2). Within group 2, five subgroups were formed, depending on the use of antibacterial drugs (ABD): group 2A (receiving ABD), group 2AC (receiving ABD before hospitalization), group 2AD (receiving ABD during hospitalization), group 2AE (receiving ABD during and before hospitalization), group 2B (not receiving ABD). Results. The median number of antibiotic resistance (ABR) genes (cumulative at all time points) was significantly higher in the group of patients treated with ABD: 81.0 (95% CI 73.8-84.5) vs. 51.0 (95% CI 31.1-68.4). In the group of patients treated with ABD (2A), the average number of multidrug resistance genes (efflux systems) was significantly higher than in controls (group 2B): 47.0 (95% CI 46.0-51.2) vs. 21.5 (95% CI 7.0-43.9). Patients with severe coronavirus infection tended to have a higher median number of ABR genes but without statistical significance. Patients in the severe COVID-19 group who did not receive ABD before and during hospitalization also had more resistance genes than the patients in the comparison group. Conclusion. This study demonstrated that fewer ABR genes were identified in the group with a milder disease than in the group with a more severe disease associated with more ABR genes, with the following five being the most common: SULI, MSRC, ACRE, EFMA, SAT.

Keywords: coronavirus, COVID-19, SARS-CoV-2, antibiotic resistance, disease severity, gene, resistome, sequencing, efflux pump For citation: Yanushevich OO, Maev IV, Krikheli NI, Levchenko OV, Galeeva JS, Starikova EV, Andreev DN, Sokolov PhS, Fomenko AK, Devkota MK, Andreev NG, Zaborovsky AV, Evdokimov VV, Tsaregorodtsev SV, Ilina EN, Govorun VM, Bely PA, Sabelnikova EA, Solodov AA, Cheremushkin SV, Shaburov RI, Kebina AL. Study of the resistome of human microbial communities using a targeted panel of antibiotic resistance genes in COVID-19 patients. Terapevticheskii Arkhiv (Ter. Arkh.). 2023; 95(12):1103-1111. DOI: 10.26442/00403660.2023.12.202490

Информация об авторах / Information about the authors

Старикова Елизавета Валентиновна - науч. сотр. ФБУН НИИ СБМ. ORCID: 0000-0001-6582-210X

Андреев Дмитрий Николаевич - канд. мед. наук, доц., доц. каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-4007-7112

Фоменко Алексей Константинович - преп. каф. фармакологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-1794-7263

Девкота Михаил Кумарович - преп. каф. фармакологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-3736-4196

Андреев Николай Германович - канд. мед. наук, доц., доц. каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-5136-0140

Заборовский Андрей Владимирович - д-р мед. наук, доц., зав. каф. фармакологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-7923-9916

Евдокимов Владимир Вячеславович - д-р мед. наук, проф. каф. клинической функциональной диагностики ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0001-9281-579X

Царегородцев Сергей Вадимович - преп. каф. фармакологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-0254-0516

Ильина Елена Николаевна - чл.-кор. РАН, проф. РАН, д-р биол. наук, гл. науч. сотр. ФБУН НИИ СБМ. ORCID: 0000-0003-0130-5079

Elizaveta V. Starikova. ORCID: 0000-0001-6582-210X Dmitry N. Andreev. ORCID: 0000-0002-4007-7112

Aleksei K. Fomenko. ORCID: 0000-0002-1794-7263 Mikhail K. Devkota. ORCID: 0000-0002-3736-4196 Nikolai G. Andreev. ORCID: 0000-0002-5136-0140

Andrew V. Zaborovsky. ORCID: 0000-0002-7923-9916 Vladimir V. Evdokimov. ORCID: 0000-0001-9281-579X Sergey V. Tsaregorodtsev. ORCID: 0000-0002-0254-0516 Elena N. Ilina. ORCID: 0000-0003-0130-5079

Введение

Антибиотикорезистентность

Устойчивость бактериальной флоры к противоми-кробным препаратам, возникающая на фоне терапии антибиотиками (АБ), становится одной из значимых проблем медицины XXI в. На распространение устойчивых бактерий во время пандемии влияют такие факторы, как чрезмерное назначение АБ, самолечение и отсутствие диагностических тестов для определения конкретной причины заболевания [1, 2].

По данным крупного исследования по устойчивости к противомикробным препаратам, инициированного премьер-министром Британии в июле 2014 г., антибиотикорезистентность (АБР) может стать причиной летальных исходов до 10 млн человек в год к 2050 г. [3, 4]. Результаты, полученные C. Murray и соавт., указывают на то, что 4,95 млн смертей во всем мире за 2019 г. связаны наличием АБР бактерий к назначаемым АБ [5]. Специалисты Всемирной организации здравоохранения и многочисленные исследователи также подчеркивают, что распространение АБР к противомикробным препаратам является актуальной проблемой, требующей глобального, скоординированного алгоритма действий, направленных на решение складывающейся ситуации [1, 6-9].

Согласно данным специального отчета о влиянии схем лечения COVID-19 в США на устойчивость к противоми-кробным средствам, опубликованного в 2022 г. [2], до октября 2020 г. почти 80% пациентов, госпитализированных с COVID-19, получали АБ, и только к концу 2021 г. назначения АБ-препаратов (АБП) начали сокращать. По данным W. Cong и соавт. установлено, что общий показатель назначения АБ пациентам с COVID-19 снизился с 82,3 до 39,7% в период с декабря 2019 по июнь 2020 г. и с июня 2020 по март 2021 г. соответственно [6].

Некоторые исследования показали более высокую распространенность бактериальных инфекций с множественной лекарственной устойчивостью у пациентов с ко-ронавирусной инфекцией по сравнению с пациентами, не страдающими СОУГО-19, особенно в отделениях интенсивной терапии (74,2% против 60,3%; р=0,052) [8]. Согласно систематическому обзору В. Ьап^ог! и соавт. (2023 г.), частота бактериальных инфекций, устойчивых к противо-микробным препаратам, у госпитализированных пациентов с СОУШ-19 и бактериальными инфекциями составила примерно 60,8%, также установлено, что приблизительно 37,5% бактериальных изолятов тоже проявляли устойчивость [7].

Эти данные подчеркивают необходимость глобальных скоординированных действий для решения проблемы АБР.

Цель исследования - изучение совокупности генов лекарственной устойчивости (резистома) в микробиоме кишечника человека и изменений, происходящих с такими генами на фоне терапии СОУШ-19 в условиях стационара.

Материалы и методы

Дизайн исследования

В Клиническом центре СОУГО-19 на базе клинического медицинского центра «Кусково» ФГБОУ ВО «Российский университет медицины» проведено проспективное сравнительное исследование в 2 параллельных когортах (группах).

В исследование включены 60 пациентов, госпитализированных в период с апреля по июнь 2021 г. с верифицированным диагнозом СОУГО-19 на основании лабораторно подтвержденной детекции РНК вируса 8ЛЕ5-СоУ-2 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в образцах оро-/назофарингеального мазка. Пациенты с подозрением на СОУГО-19 на основании одних только симптомов или

Информация об авторах / Information about the authors

Говорун Вадим Маркович - акад. РАН, д-р биол. наук, проф., дир. ФБУН НИИ СБМ. ORCID: 0000-0003-0837-8764

Белый Петр Александрович - канд. мед. наук, доц. каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0001-5998-4874

Сабельникова Елена Анатольевна - д-р мед. наук, проф. каф.

пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного фак-та ФГБОУ ВО «Российский университет медицины», зам. дир. по научной работе ГБУЗ «МКНЦ им. А.С. Логинова». ORCID: 0000-0001-7519-2041

Солодов Александр Анатольевич - д-р мед. наук, дир. НОИ «Высшая школа клинической медицины им. Н.А. Семашко» ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-8263-1433

Черёмушкин Сергей Викторович - канд. мед. наук, доц. каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного фак-та НОИ «Высшая школа клинической медицины им. Н.А. Семашко» ФГБОУ ВО «Российский университет медицины», зам. гл. врача по терапевтической деятельности ЧУЗ «ЦКБ "РЖД-Медицина"». ORCID: 0000-0002-0982-2006

Шабуров Рафик Исхакович - канд. мед. наук, доц. каф. пропедевтики внутренних болезней и гастроэнтерологии лечебного фак-та НОИ «Высшая школа клинической медицины им. Н.А. Семашко» ФГБОУ ВО «Российский университет медицины», гл. врач ЧУЗ «ЦКБ "РЖД-Медицина"». ORCID: 0000-0001-9741-0150

Кебина Анастасия Леонидовна - зам. глав. врача НОИ «Высшая школа клинической медицины им. Н.А. Семашко» Университетской клиники, ассистент каф. терапии, клинической фармакологии и скорой медицинской помощи ФГБОУ ВО «Российский университет медицины». ORCID: 0000-0002-7570-9650

Vadim M. Govorun. ORCID: 0000-0003-0837-8764 Petr A. Bely. ORCID: 0000-0001-5998-4874

Elena A. Sabelnikova. ORCID: 0000-0001-7519-2041

Aleksandr A. Solodov. ORCID: 0000-0002-8263-1433 Sergei V. Cheremushkin. ORCID: 0000-0002-0982-2006

Rafik I. Shaburov. ORCID: 0000-0001-9741-0150 Anastasii L. Kebina. ORCID: 0000-0002-7570-9650

данных компьютерной томографии (КТ) без верификации вируса методом ПЦР в исследование не включались.

Пациенты соответствовали всем перечисленным критериям включения в исследование:

• мужчины и женщины в возрасте от 18 лет с подтвержденным диагнозом «Ц07.2 Коронавирусная инфекция СОУШ-19, вызванная вирусом 8ЛЕ5-СоУ-2» по данным ПЦР (оро-/назофарингеальный мазок);

• легкая и тяжелая динамика течения коронавирусной инфекции (1-3-я степень тяжести пневмонии по данным КТ);

• подписанное добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

Пациента не включали в исследование или исключали из него, если он соответствовал хотя бы одному из приведенных критериев невключения/исключения:

• злокачественные новообразования любой локализации;

• хронические заболевания печени инфекционной и неинфекционной этиологии;

• хронические заболевания почек;

• хроническая печеночная и почечная недостаточность;

• системные и аутоиммунные заболевания;

• сопутствующие тяжелые соматические и психические патологии;

• беременность;

• участие в другом клиническом исследовании в настоящее время или в последние 30 дней;

• любые другие причины медицинского и немедицинского характера, которые, по мнению врача, могут препятствовать участию пациента в исследовании.

Пациенты распределялись на 2 группы исходя из тяжести течения заболевания на пациентов со стабильной динамикой, более легким течением заболевания (группа 1) и пациентов с более тяжелым течением и эпизодами отрицательной динамики (прогрессирование пневмонии по данным КТ, развитие осложнений заболевания, перевод пациентов в отделение реанимации и интенсивной терапии, летальный исход, клинические состояния, требующие усиления фармакотерапии и применения интервенционных методов лечения, включая дополнительную инсуффляцию кислорода и искусственную вентиляцию легких - группа 2); рис. 1.

Критерии оценки тяжести, схемы лечения, как и интерпретация клинических данных, основывались на актуальных на тот момент временных методических рекомендациях от Минздрава России (версия 10, 08.02.2021).

Классификация COVID-19 по степени тяжести

Легкое течение (группа 1): Т тела >38°С, кашель, слабость, боли в горле; одышка при физических нагрузках; отсутствие критериев тяжелого течения; 8р02<95%; С-реактивный белок сыворотки крови >10 мг/л, повышение до 60 мг/л; изменения в легких при КТ (рентгенографии), типичные для вирусного поражения; степень поражения КТ-1-2.

Тяжелое течение (группа 2): частота дыхательных движений >30/мин; 8рО2<93%; Ра02/БЮ2<300 мм рт. ст.; снижение уровня сознания, ажитация; нестабильная гемодинамика (систолическое артериальное давление менее 90 мм рт. ст. или диастолическое артериальное давление менее 60 мм рт. ст., диурез - менее 20 мл/ч); С-реактивный белок - повышение >60 мг/л; изменения в легких при КТ (рентгенографии), типичные для вирусного поражения; степень поражения КТ 3-4.

Внутри группы 2 сформированы 4 подгруппы в зависимости от наличия приема АБП: группа 2А (с приемом АБП), группа 2АС (прием АБП до госпитализации), груп-

Рис. 1. Распределение пациентов по группам. Fig. 1. Distribution of patients by groups.

па 2AD (прием АБП во время госпитализации), группа -2AE (прием АБП во время и до госпитализации); из когорты выделена группа 2B (без приема АБП).

При анализе данных также учитывалась длительность госпитализации, количество АБП, которые могли назначаться 1 пациенту, и общее количество лекарственных препаратов за весь курс госпитализации на 1 пациента. Длительность госпитализации составляла от 6 до 19 дней в зависимости степени тяжести заболевания.

Образцы

Сбор образцов кала производился у пациентов в момент поступления в госпиталь. Образец кала объемом от 5 до 15 мл помещался в стерильный контейнер и хранился при -70°С.

Выделение ДНК, подготовка библиотек

и секвенирование

Выделение ДНК производилось с помощью набора MagMAX™ Microbiome Ultra Nucleic Acid Isolation Kit и KingFisher™ Purification System согласно инструкции производителя. Выделенная ДНК (100 нг) использована для приготовления библиотек с использованием KAPA HyperPlus Kit (Roche, Switzerland) и KAPA HyperExplore MAX (Roche, Switzerland) согласно инструкции производителя.

Высокопроизводительное секвенирование полученных библиотек выполнено на платформе MGI DNBSEQ-G400 с использованием наборов реагентов MGIEasy Universal Library Conversion Kit (App-A), High-throughput Sequencing Primer Kit-C (App-C), DNBSEQ-G400RS High-throughput Rapid Sequencing Kit (FCS PE100) и DNBSEQ-G400RS Rapid Sequencing Flow Cell (FCS) в соответствии с протоколом производителя.

Контроль качества и деконтаминация

Удаление адаптеров и фильтрация ридов по качеству производилась с применением инструмента Trimmomatic (v.0.39-2) со следующими параметрами: SLIDINGWIND0W:10:20, LEADING:20, TRAILING:20, MINLEN:75. Таким образом, в дальнейшем анализе использовались только риды длиннее 75 п.н.

Для удаления контаминантных последовательностей риды картировались на последовательность генома человека GTCh38 (hg38) с применением инструмента bowtie2 (v2.4.2). Риды, картировавшиеся на последовательность генома человека, удаляли и не использовали в дальнейшем анализе.

Представленность генов АБР

Риды, не картировавшиеся на последовательность генома человека, картировались на референсную базу из 4937 последовательностей детерминант АБР. Последовательно-

сти, картировавшиеся амбивалентно на разные гены АР (например, ERMB и ERMF), удаляли и не использовали в дальнейшем анализе.

Для каждого из 646 генов, представленных в 4937 ге-новариантах, получены значения суммы ридов, картировавшихся на все геноварианты данного гена. Эти значения использовались в дальнейшем анализе дифференциальной представленности последовательностей детерминант АБР.

Производили фильтрацию, в ходе которой отбрасывали редко встречающиеся гены, представленные менее чем в 20% образцов, как неинформативные для проведения сравнительного анализа между группами. В сравнительном анализе использовали 185 генов АБР, присутствующих более чем в 20% образцов.

Сравнение представленности генов АБР

между группами пациентов

Мы произвели сравнение групп пациентов «легкое течение» и «тяжелое течение» с применением DeSeq2 (Differential Expression analysis for Sequence Count data) с помощью R-па-кета DESeq2. Данный метод позволяет анализировать дифференциальную представленность последовательностей в биологических образцах 2 групп и более. Данный метод использует нормализацию данных, при которой учитываются различия в глубине покрытия каждого образца и дисперсия, также производится поправка на множественные сравнения по методу Бенджамини-Хохберга.

Таргетная панель зондов на основе базы MEGARes 2.0

Разработана таргетная панель зондов на основе базы данных MEGARes 2.0, которая содержит информацию об устойчивости микроорганизмов к противомикробным препаратам. Из базы отобрано 4937 генов, детерминирующих устойчивость к основным АБ, используемым в клинической практике. С использованием панели отсеквенированы образцы мазков фекалий.

Проанализирована совокупность генов устойчивости к АБ в микробных сообществах кишечника (резистом), что позволило определить принадлежность микроорганизмов к определенному классу, порядку, семейству, роду и иногда виду на основе различия в последовательности генов, кодирующих бактериальную рРНК.

Общая длина 4937 нуклеотидных последовательностей составила 4 803 602 п.н. На основе 4937 последовательностей получено 5277 зондов: 4621 последовательность покрыта 1 зондом, 294 последовательности покрыты 2 зондами, 20 последовательностей покрыты 3 зондами и 2 последовательности покрыты 4 зондами.

Лекарственные препараты

и схемы лечения пациентов

Перечень лекарственных групп, используемых в стандартных схемах лечения пациентов с диагнозом COVID-19 в больнице «Кусково» ФГБОУ ВО «Российский университет медицины»:

1. Ингибиторы протонной помпы (омепразол).

2. Глюкокортикостероиды - ГКС (дексаметазон).

3. Антикоагулянты (эноксапарин натрия, аторвастатин, гепарин).

4. Муколитики (АЦЦ).

5. АБП (пенициллины, цефалоспорины, макролиды, фторхинолоны).

6. Противовирусные средства (Арбидол).

7. Гипотензивные средства ф-адреноблокаторы, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, бло-

каторы кальциевых каналов, антагонисты альдосте-роновых рецепторов).

8. Гипогликемические средства (Актрапид, инсулин гларгин).

9. Пробиотики (Энтерол, Линекс).

10. Анальгетические средства/нестероидные противовоспалительные препараты (парацетамол, Нурофен).

Список АБП, применяемых самостоятельно пациентами до госпитализации: пенициллины, цефалоспорины, макролиды, фторхинолоны.

Стандартная схема лечения для пациентов с легким течением заболевания включала ГКС, муколитик, противовирусное средство, антикоагулянты, нестероидные противовоспалительные препараты, а также другую симптоматическую терапию. У пациентов с тяжелым течением увеличивали дозировки ГКС и антикоагулянтов, при присоединении бактериальной инфекции добавляли АБ.

Статистический анализ

Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием специального программного обеспечения MedCalc 22.014 (Бельгия) в среде Microsoft Windows 11 (США). Проверку статистических гипотез проводили с помощью непараметрического (7-критерия Манна-Уитни и Т-критерия Уил-коксона, а также параметрического критерия Фишера. Различия между группами считались достоверными при р<0,05.

Результаты

Популяция пациентов

В проспективное сравнительное исследование включены 60 пациентов с верифицированным диагнозом «U07.2 Коронавирусная инфекция COVID-19, вызванная вирусом SARS-CoV-2» согласно критериям включения/невключения. Средний возраст обследованных больных составил 56,0 года (95% доверительный интервал - ДИ 53,8-58,0), в гендерном составе преобладали женщины (n=34, 57%) над мужчинами (n=26, 43%).

Состояние пациентов оценивалось по шкале оценки тяжести состояния пациента по версии ECOG/WHO PS (The Eastern Cooperative Oncology Group/World Health Organization Performance Status) следующим образом:

0 баллов - пациент полностью активен, способен выполнять те же действия, что и до заболевания;

1 балл - пациент не может выполнять тяжелую, но может выполнять легкую или сидячую работу;

2 балла - пациент лечится амбулаторно, способен к самообслуживанию, но не может выполнять работу, более 50% времени бодрствования проводит активно, в вертикальном положении;

3 балла - пациент способен только к ограниченному самообслуживанию, проводит в кресле или постели более 50% времени бодрствования;

4 балла - инвалид, не способен к самообслуживанию, прикован к креслу или кровати;

5 баллов - пациент мертв.

Оценивали также степень поражения легких на основании данных КТ следующим образом: КТ-1 - не более 25% легких вовлечено в патологические процессы, связанные с COVID-19; КТ-2 - не более 50% легких вовлечено в патологические процессы, связанные с COVID-19; КТ-3 - не более 75% легких вовлечено в патологические процессы, связанные с COVID-19; КТ-3 - более 75% легких вовлечено в патологические процессы, связанные с COVID-19.

На основании данных шкалы оценки тяжести состояния пациента по версии ECOG/WHO PS и данных о степени

Таблица 1. Распределение пациентов 2 групп в зависимости от оценки тяжести состояния пациента по шкале ECOG/ WHO PS и степени поражения легких по данным КТ Table 1. Distribution of patients of study groups depending on the severity of the patient's condition according to the ECOG/WHO PS scale and the degree of lung damage according to CT

Балл ECOG/ WHO PS Степень по КТ Пациенты, абс. Степень тяжести состояния пациента

0 1 3 Легкая

2 1 Легкая

1 1 2 Легкая

2 2 3 Легкая

3 1 Тяжелая

1 20 Легкая

3 2 16 Тяжелая

3 2 Тяжелая

1 3 Тяжелая

4 2 6 Тяжелая

3 3 Тяжелая

Таблица 2. Результаты сравнения представленности генов АБР в 2 группах пациентов методом DESeq2

Table 2. Comparison of the representation of antibiotic resistance genes in two groups of patients using the DESeq2 method

Ген log2foldchange Группа p

ARR 7,37192 2 0,00090996

IBCR 5,80273 2 0,00090996

EFMA 5,74948 2 0,00000201884

FLOR 3,98372 2 0,0164373

MSRC 3,91812 2 0,00227008

ACI 3,61031 2 0,0309283

OXA 3,33427 2 0,00090996

MPRF 3,07489 2 0,0338557

QACE 2,96247 2 0,0327348

ERMR 2,83844 2 0,011262

SAT 2,72467 2 0,00654748

SULI 2,47976 2 0,011262

MVRC 2,20784 2 0,00654748

ACRE 1,91187 2 0,0288561

LSAC -2,29444 1 0,0243637

КТ-1

КТ-2

КТ-3

Легкая степень

Тяжелая степень

Рис. 2. Распределение пациентов 2 групп в зависимости от оценки тяжести состояния пациента по шкале ECOG/ WHO PS и степени поражения легких по данным КТ.

Fig. 2. Distribution of patients of study groups depending on the severity of the patient's condition according to the ECOG/WHO PS scale and the degree of lung damage according to CT.

ARR IBCR EFMA FLOR MSRC ACI OXA MPRF QACE ERMR SAT SULI MVRC ACRE LSAC

Antibiotic_group

ц Aminoglycosides Beta-lactam CAMP MLS Multiple Phenicol Rifampin В Sulfonamides

*р<0,05, ***p<0,01

-2,5

0,0

2,5 log2FC

5,0

7,5

поражения легких (КТ) состояние пациентов ранжировано на «легкое» и «тяжелое» следующим образом (табл. 1, рис. 2). С учетом указанных параметров в группу 1 пациентов отобраны 29 человек, а в группу 2 - 31 больной.

Сравнение представленности генов АБР между группами пациентов

В результате анализа значений покрытия генов с помощью DESeq2 нами выявлено 15 генов, дифференциально

Рис. 3. Значения log2foldchange, полученные в результате анализа с помощью DESeq2. Положительные значения log2FC (справа) соответствуют генам, перепредставленным в группе 2 (тяжелое течение) больных, отрицательные значения log2FC (слева) соответствуют генам, перепредставленным в группе 1 (легкое течение) больных.

Fig. 3. The log2foldchange values obtained from the DESeq2 analysis. Positive log2FC values (right) correspond to genes overrepresented in group 2 (severe) patients, and negative log2FC values (left) correspond to genes overrepresented in group 1 (mild) patients.

представленных между 2 группами с уровнем значимости 0,05. Из них 14 генов перепредставлены в группе тяжелых больных и 1 - в группе легких (табл. 2, 3, рис. 3). Аннотации выявленных детерминант устойчивости и список соответствующих им АБ приведены в табл. 4.

Для каждого из 15 генов, дифференциально представленных между 2 группами пациентов, мы рассчитали их количество и долю от общего числа ридов, приходящегося

Рис. 4. Доля прочтений, картировавшихся на каждый из 15 генов, значимо различающихся в представленности между 2 группами больных [красный - прочтения, относящиеся к образцам из группы 2 (тяжелое течение) больных, голубой - прочтения, относящиеся к группе 1 (легкое течение) больных].

Fig. 4. The proportion of readings mapped to each of 15 genes with significantly different representation between two groups of patients [red - readings related to samples from group 2 (severe) patients, blue - readings related to group 1 (mild) patients].

Таблица 3. Распределение количества прочтений, картировавшихся на 15 генов, дифференциально представленных между группами пациентов

Table 3. Distribution of the number of readings mapped to 15 genes differentially represented between patient groups

Группа 1 Группа 2

Ген прочтения прочтения

абс. % абс. %

ARR 7 0,0002 38 945 1,2169

IBCR 47 0,0015 48 466 1,5144

EFMA 9869 0,3083 426 536 13,3279

FLOR 1894 0,0592 33 130 1,0352

MSRC 18 669 0,5833 539 004 16,8422

ACI 490 0,0153 14 992 0,4684

OXA 2755 0,0861 57 153 1,7858

MPRF 30 0,0009 1035 0,0323

QACE 1818 0,0568 9892 0,3091

ERMR 4874 0,1523 18 698 0,5842

SAT 12 041 0,3762 383 459 11,9819

SULI 154 412 4,8249 852 222 26,6292

MVRC 2088 0,0652 21 673 0,6772

ACRE 120 379 3,7615 425 264 13,2881

LSAC 372 0,0116 106 0,0033

на все 15 генов (всего 3 200 320). Количество и доля прочтений для каждого из генов в образцах разных групп приведены в табл. 3 и на рис. 4.

Клиническая интерпретация полученных данных

На основании проведенных исследований продемонстрировано, что в группе 1 с более легкой динамикой течения заболевания, без выраженных осложнений выявлено

Таблица 4. Выявленные детерминанты устойчивости и список соответствующих им АБП Table 4. The identified determinants of stability and the list of corresponding antibacterial drugs

Механизм Число

Ген Группа АБ устойчивости (по базе MEGARes) геновари-антов в базе MEGARes

ARR Рифампицин Rifampin_ADP-rib o syltransferase 16

Устойчивость MDR_ acetyltransferase

IBCR к ряду соединений 1

EFMA Устойчивость к ряду соединений Drug_and_biocide_ MFS_efflux_pumps 1

FLOR Хлорамфени-кол MLS (ма- Phenicol_resistance_ MFS_efflux_pumps 21

MSRC кролиды, линкозамиды, стрептограми-ны) MLS_resistance_ ABC_efflux_pumps 2

ACI р-лактамные АБ Class_A_ betalactamases 1

OXA р-лактамные АБ Class_D_ betalactamases 894

MPRF Катионные антимикробные пептиды Defensin-resistant_ mprF 4

QACE Устойчивость к ряду соединений MLS (ма- Drug_and_biocide_ SMR_efflux_pumps 2

ERMR кролиды, линкозамиды, стрептограми-ны) 23S_rRNA_ methyltransferases 2

SAT Нуклеозиды Streptothricin_ acetyltransferase Sulfonamide- 14

SULI Сульфона-миды resistant_ dihydroptero ate_ synthases 38

MVRC Устойчивость к ряду соединений Drug_and_biocide_ SMR_efflux_pump s 1

ACRE Устойчивость к ряду соединений Drug_and_biocide_ RND_efflux_pumps 1

LSAC Устойчивость к ряду соединений Multi-drug_ABC_ efflux_pumps 1

меньшее количество генов АБР, чем в группе 2 с более тяжелым течением заболевания, где отмечалось увеличение генов АБР, среди которых доминировали отдельные 5 генов (SULI, MSRC, ACRE, EFMA, SAT); рис. 5. Вместе с тем мы можем говорить только о найденной тенденции на границе статистической достоверности (p=0,0773).

Рис. 5. Медиана количества генов АБР (кумулятивное во всех временных точках) у пациентов с легким (группа 1) и тяжелым течением коронавирусной инфекции (группа 2).

Fig. 5. The median number of antibiotic resistance genes (cumulative at all time points) in patients with mild (group 1) and severe coronavirus infection (group 2).

Рис. 6. Медиана количества генов резистентности в группе пациентов, принимавших АБП (группа 2А) и пациентов, не принимавших АБП (группа 2В).

Fig. 6. The median number of resistance genes in patients of group 2A (receiving ABD) and group 2B (not receiving ABD).

У пациентов с тяжелым течением коронавирусной инфекции (группа 2) отмечалась тенденция к выявлению более высокой медианы количества генов АБР (кумулятивное во всех временных точках), однако без статистической достоверности (см. рис. 5).

Медиана количества генов резистентности оказалась достоверно выше в группе тяжелых пациентов, принимавших АБП (группа 2А): 81,0 (95% ДИ 73,8-84,5) против 51,0 (95% ДИ 31,1-68,4); рис. 6. При этом у части пациентов группы 2 с тяжелым течением заболевания, получавших АБП до прибытия и во время госпитализации в стационар на протяжении 7-10 дней (группа 2АЕ), количество генов резистентности было значительно выше, чем у пациентов этой же группы, которые принимали АБП только в рамках текущей госпитализации (группа 2AD): 94,0 (95% ДИ 90,5112,1) против 82,0 (95% ДИ 74,9-90,0); рис. 7.

На этом основании выдвинута гипотеза о том, что за этот временной промежуток происходит закрепление генов резистентности в микробиоте желудочно-кишечного тракта. На фоне предшествующей «премедикации» такое состояние микробиоты этих пациентов на момент госпитализации в ряде случаев могло приводить к менее выраженному ответу на таргетную терапию в рамках стандартных протоколов лечения в специализированном стационаре.

Вместе с тем во время проведения исследования отмечено, что пациенты группы 2B, не принимавшие АБП как

Рис. 7. Медиана количества генов резистентности в группе пациентов 2АЕ и 2AD.

Fig. 7. The median number of resistance genes in patients of group 2AE and 2AD.

Рис. 8. Медиана количества генов множественной лекарственной устойчивости (эффлюксные системы) в контрольной группе 1 и группе 2 В. Fig. 8. The median number of multidrug resistance genes (efflux systems) in control patients group 1 and group 2B.

до момента госпитализации, так и во время пребывания в стационаре, все равно имели большее число генов АБР по сравнению с пациентами группы 1, что во многом определялось количеством генов, ответственных за активацию эффлюксных насосов (ACRE, EFMA); рис. 8.

В группе пациентов с тяжелым течением заболевания, не принимавших АБП (группа 2В), среднее количество генов множественной лекарственной устойчивости (эффлюксные системы) оказалось значимо выше, чем у лиц контроля: 47,0 (95% ДИ 46,0-51,2) против 21,5 (95% ДИ 7,0-43,9); см. рис. 8.

Литературные источники не привязывают увеличение этих генов к конкретным АБП, а скорее к общему действию лекарственной терапии.

В группе 2 с более тяжелым клиническим течением COVID-19 пациенты получали до 20 мг ГКС в сутки, для уменьшения рисков венозных тромбоэмболических осложнений (тромбоэмболии легочной артерии, тромбоза глубоких вен) назначали антикоагулянты (гепарин до 7500 ед). Кроме этого, у 6 пациентов на фоне отрицательной динамики респираторных показателей возникла потребность в подключении аппарата искусственной вентиляции легких. Возможно, более интенсивная терапия и высокие дозировки лекарственных препаратов, которые назначали пациентам группы 2, могли повлиять на потребность бактерий приобретать дополнительные гены эффлюксных насосов за счет горизонтального переноса. Таким образом, вместе с ними в составе единой кассеты могла осуществляться передача генов АБР.