Влияние рекомбинантного интерлейкина-5 на апоптотическую гибель эо3инофилов периферической крови больных бронхиальной астмой

Краткие сообщения

© 2004, СПб РО РААКИ

ВЛИЯНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА - 5 НА АПОПТОТИЧЕСКУЮ ГИБЕЛЬ Э03ИН0ФИЛ0В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

Иванчук И.И., Огородова Л.М., Сазонов А.Э.,

Лещева И.С., Копьева А.П., Петрова И.В.,

Малышев И.Ю.*

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск *Институт патологии и патофизиологии, г. Москва, Россия

Резюме. Изучали эффект рекомбинантного интерлейкина-5 на апоптоз эозинофилов перферической крови больных бронхиальной астмой и модулирующее влияние растворимой формы рецептора интерлейкина-5. Установили, что интерлейкин-5 пролонгирует время жизни эозинофилов, добавление растворимого рецептора интерлейкина-5 ингибирует этот эффект в группе здоровых доноров. В группе больных бронхиальной астмы данного эффекта не обнаружено.

Ключевые слова: бронхиальная астма, IL-5, рецептор IL-5, эозинофилы.

Ivanchuk I.I., Ogorodova L.M., Sazonov А.Е., Lesheva I.S., Koljeva A.P., Petrova I.V., Malyshev I.Yu.

THE INFLUENCE OF RECOMBINANT INTERLEUKIN-5 ON EOSINOPHIL APOPTOSIS

IN PATIENTS WITH BRONCHIAL ASTHMA

Abstract. Recombinant soluble interleukin-5 receptor influence upon interleukin-5 dependent modulation of eosinophil apoptosis was studied. It was found that interleukin-5 prolonged survival of eosinophils obtained from healthy controls and asthmatics. Interleukin-5 receptor inhibited survival prolongation of eosinophils obtained from healthy controls and had no effect on asthmatics eosiniphils.

Интерлейкин-5 (IL-5), наряду с IL-3 и грануло- Апоптоз - программируемая клеточная гибель, про-цитарно-макрофагальным колониестимулирующим является известными изменениями морфологии фактором (GM-CSF), является одним из основных клетки, которые включают цитоплазматическую и цитокинов, который модулирует функции эозипо- ядерную конденсацию, фрагментацию ДНК. Это филов. IL-5 стимулирует дифференцировку эозино- важный процесс, при котором эозинофилы элими-филов из костномозговых клеток-предшественни- нируются из тканей, минуя воспаление [8]. Установ-ков, активирует их дегрануляцию и высвобождение лсно, что в культуре клеток IL-5 увеличивает проактивных продуктов [3, 4], регулирует экспрессию должительность жизни эозинофилов до 2-х недель, интегринов (адгезивных молекул CD 11 b/CD 18), Ингибированиеапоптозаэозинофилов интерлейки-приводящих к увеличению циркулирующих эозино- нами рассматривается как важный механизм разви-филов [1, 7], и, посредством ингибирования апоп- тия эозииофилии крови и тканей при различных тоза, пролонгирует время жизни эозинофилов [9]. заболеваниях, в частности при бронхиальной астме

(БА).

Адрес для переписки: Специфическое и неспецифическое действие IL-

634050, г.Томск, Московский тракт 2, 5 на эозинофилы осуществляется через рецептор -

СибГМУ ЦНИЛ. опосредованную активацию внутриклеточных сиг-

Тел/факс: (3822) 52-99-16, нальных путей, которые регулируют экспрессию

E-mail: molbiol@ssmu.net.ru, molbiol@land.ru различных генов [2, 5]. Рецепторный комплекс IL-5

представляет собой гетеродимер, состоящий из а и (3 - субъединиц, а - субъединица обеспечивает ли-гаид-специфическое связывание и состоит из растворимой и мембраносвязанной форм, которые конкурируют друг с другом за связывание IL-5, тогда как р - субъединица необходима для проведения специфического сигнала внутрь клетки [6].

Цель настоящего исследования - изучить влияние растворимой формы рецептора IL-5 (pPIL-5a) на антиапоптотический эффект IL-5 в культуре эозинофилов.

Материалы и методы

Объектом исследования были эозинофилы, полученные из венозной крови больных (35 человек, возраст 14-55 лет) бронхиальной астмой (БА) тяжелого течения. Больных обследовали в Областном астма-центре г. Томска. Тяжелую форму Б А устанавливали на основании критериев GINA 2002. Больные БА не получали в течение 3-4 недель перед исследованием кортикостероиды (системные и ингаляционные), антилейкотриеновые препараты, теофиллины длительного действия. Контрольную группу составили добровольцы (20 человек), не имеющие БА, других аллергических заболеваний, и гельминтных инвазий, с отрицательным результатом кожных аллергопроб.

Эозинофилы выделяли на градиенте плотности фиколла и 35% раствора урографина. Эозииофиль-ный концентрат переносили в раствор Хенкса (без ионов Са2 и Mg2) с добавлением 2 % инактивированной фетальной телячьей сыворотки (ФТС) и

0,02М ЭДТА. Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с трипановым синим (обычно она составляла более 97 %). Изолированные эозинофилы отмывали и культивировали в концентрации 3x106 клеток/мл в RPMI1640 с L-глутамином (SIGM A, UK),

содержащим 10% ФТС и антибиотики. В культуру эозинофилов добавляли: рекомбинантный препарат IL-5 (R&D Systems, USA) в количестве 2,5 нг/мл; инкубировали в течение 1 ч, затем добавляли pIL-5a (R&D Systems, USA) в количестве ЮОнМ; контролем служила интактная культура. Клетки инкубировали в течение 24 ч при 37°С (02-95% и С02-5%). Мазки готовили через 0, 6, 12, 24 ч культивирования клеток. Препараты окрашивали по Нохта-Максимову (азур Н-эозин). Морфологический анализ апоптотической гибели клеток проводили с использованием критериев, характеризующих карио-патологические и цитопатологические изменения в клетках при апоптозе.

Оценку нормальности распределения полученных результатов по каждой величине проводили с помощью критерия Колмагорова-Смирнова. Статистическую обработку результатов для признаков с нормальным распределением проводили с использованием t-критерия Стьюдента, для признаков, не соответствующих нормальному закону распределения, применяли U-тест Манна-Уитни. Различия между показателями считали достоверными при значении Р < 0,05.

Результаты и обсуждение

В результате оценки апоптоза эозинофилов, полученных из крови больных Б А, установлено значительное снижение количества клеток с морфологическими признаками апоптоза в сравнении со значениями в группе здоровых доноров (рис. 1). Наблюдаемое количество эозинофилов с признаками апоптотической морфологии (через 12, 24 часа культивирования) в группе больных БА было значительно ниже по сравнению с группой здоровых доноров (рис. 1).

В группе здоровых доноров при добавлении в культуру эозинофилов IL-5 наблюдалось значи-

Больные БА

6 12 Время, ч

Показатель 0ч 6ч 12ч 24 ч

Больные БА 0 2 14 21

Здоровые доноры 0 4 30 45

Рис. 1. Содержание эозинофилов с морфологическими признаками апоптоза в течение 24 ч культивирования. *- Р < 0,01; ** - Р < 0,05 по сравнению с показателями в группе здоровых доноров.

2004, Т. 6, № 1-2

Влияние IL-5 на апаптоз зозинофилов...

тельное снижение апоптотической активности зозинофилов по сравнению с интактной культурой (рис. 2А). Добавление в культуру одновременно IL-5 и растворимой формы рецептора IL-5a приводило к восстановлению апоптотической активности зозинофилов периферической крови здоровых доноров. Показатели апоптотической активности в этой группе не отличались от значений в интактной культуре (рис. 2 А). Возможно, что pIL-5a, действуя на культуру зозинофилов in vitro, конкурирует с нативным рецептором за связывание IL-5 таким образом, что не происходит связывание IL-5 с его рецептором на клетке, это приводит к нарушению проведения специфического сигнала внутрь клетки, и тем самым блокируется его антиапопто-тическое действие.

Ранее в работах Yasruel Z. [10] было показано, что присутствие мРНК pIL-5a - позитивных клеток у больных БА коррелирует с улучшением пульмональных функций, тогда как присутствие мРНК мембрансвязанной формы рецептора IL-5a - позитивных клеток ассоциировано с дыхательной обструкцией. Полученные нами данные показывают, что в культуре зозинофилов больных БА, на фоне низких показателей апоптотической гибели в интактной культуре, добавление IL-5 не вызывает изменений в активности апоптоза зозинофилов. Совместное культивирование зозинофилов с IL-5 и растворимой формой рецептора IL-5a также не оказывает влияния на активность программируемой ги-

Время, ч

бели зозинофилов (рис. 2Б). Отсутствие антиапоп-тотического эффекта IL-5 как и антагонистического эффекта pIL-5 в группе больных БА может быть связано с развитием функциональной резистентности зозинофилов больных с тяжелой формой БА к действию IL-5.

Таким образом, можно предположить, что растворимая форма рецептора IL-5a может быть использована как потенциальный антагонист 1L-5-опосредованных эффектов. Однако при этом необходимо учитывать возможность резистентности кле-ток'мишений к действию эффектора.

Список литературы

1. Сазонов А.Э., Иванчук И.И., Петровский Ф.И., Геренг Е.А., Огородова Л.М. Экспрессия интерлейкина-5 (IL-5) в мокроте больных бронхиальной астмой // Бюл. экспер. биол. и медицины. -2003. -Т.135, №4. - С. 437-440.

2. Freidin М.В., Kobyakova О.S., Ogorodova L.M., Puzyrev V.P. // Comp. Funct. Genom. 2003. N 4. P.346-350.

3. Gleich, G. J„ Motojima S., Frigas E., Kephart G. M„ Fujisawa Т., Kravis L. P. The eosinophilic leukocyte and the pathology of fatal bronchial asthma: evidence for pathologic heterogeneity //J, Allergy Clin. Immunol. -1987. -Vol. 80. -P.412-415.

4. Kita, H., Weiler D. A., Abu R., Ghazaleh, Sanderson C. J., Gleich G. J. Release of granule proteins from

Время, ч

Показатель Оч 6ч 12ч 24 ч

Интакгная культура 0 4 30 45

+IL-5 0 3 19 23

+IL-5 /+PIL-5 5 28 40

Показатель Оч 6ч 12ч 24 ч

Интактная культура 0 2 14 21

+IL-5 0 3 13 19

+IL-5 /+РІІ-5 4 14 26

Рис. 2. Содержание зозинофилов с морфологическими признаками апоптоза в течение 24 ч культивирования с интерлейкином-5 (+ІІ.-5); интерлейкином-5 и рецептором интерлейкина-5 (+11-5/+р11-5). А • культура зозинофилов периферической крови здоровых доноров. * - Р < 0,05 по сравнению с показателями в интактной культуре зозинофилов.

Рис. 2. Содержание зозинофилов с морфологическими признаками апоптоза в течение 24 ч культивирования с интерлейкином-5 (+ІІ.-5); интерлейкином-5 и рецептором интер-лейкина-5 (+И-5/+р11-5). Б - культура зозинофилов периферической крови больных БА. * - Р < 0,05 по сравнению с показателями в интактной культуре зозинофилов.

eosinophils cultured with IL-5 //]. Immunol. -1992. -Vol. 149. -P. 629-635.

5. Palframan R.T, Collins P.D, Severs N.J, Rothery

S, Williams T.J, Rankin S.M Mechanisms of acute eosinophil mobilization from the bone marrow stimulated by interleukin 5: the role of specific adhesion molecules and phosphatidylinositol 3-kinase //] Exp Med. -1998. -Vol. 188. -P.1621-1632.

6. Tominaga, A., Takaki S., Hitoshi Y., Takatsu K. Role of the interleukin-5 receptor system in hemato-poiesis molecular basis for overlapping function of cytokines // Bioessays. -1992. -Vol. 14. -P.527.

7. Walsh, G. M„ Symon F. A., Wardlaw A. J. Human eosinophils preferentially survive on tissue fi-

bronectin compared with plasma fibronectin // Clin Exp. Allergy. -1995. -Vol. 25. -P.l 128-1136.

8. Wooley K.L., Gibson P.G., Carty A.J., et al. Eosinophil apoptosis and the resolution of airway inflammation in asthma//Am.J.Respir.Crit.Care Med. -1996 -Vol. 154. -P.237-43.

9. Yamaguchi Y.T., Sudo S., Ohata K., et al. Analysis of the survival of mature eosinophils: interleukin-5 prevents apoptosis in mature human eosinophils // Blood. -1991. -Vol.78. -P.2542-2547.

10. Yasruel Z, Humbert M, Kotsimbos T.C. Membrane-bound and soluble alpha IL-5 receptor mRNA in the bronchial mucosa of atopic and nonatopic asthmatics //

Am.J.Respir.Crit.Care Med.-1997.-Vol.155.-P.1413-1418.

поступила в редакцию 15.12.2003 отправлена на доработку 10.02.2004 принята к печати 17.02.2004