Способ оценки эффективности вакцинации против коклюша, дифтерии и столбняка
METHOD FOR ESTIMATION OF EFFECIENCY OF VACCINATION AGAINST PERTUSSIS, DIPHTHERIA AND TETANUS

Изобретение относится к медицине, а именно инфекционной иммунологии и клинической лабораторной диагностике, и касается разработки тест-системы, предназначенной для единовременной полуколичественной оценки напряженности гуморального поствакцинального иммунитета к коклюшу, дифтерии и столбняку на основе определения уровня антител к коклюшному цельноклеточному антигену, а также дифтерийному и столбнячному анатоксинам, как результат профилактической вакцинации соответствующими вакцинными препаратами.
Массовая иммунизация населения коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной (КДСВ) является основным инструментом профилактики коклюша, дифтерии и столбняка в РФ. Заболеваемость дифтерией и столбняком в РФ благодаря этой мере находится на спорадическом уровне, в то время как реальные цифры заболеваемостью коклюшем достаточно сложно оценить, они, очевидно, значительно ниже приводимых в отраслевых отчетах. Все перечисленные заболевания представляют серьезную опасность для здоровья людей, прежде всего детского населения. Мониторинг успешности иммунизации населения является необходимой мерой для контроля над заболеваемостью инфекциями, оценки состояния иммунитета в группах риска (прежде всего для детей) и оперативного выявления и устранения случаев низкой реактивности иммунной системы в ответ на введение вакцины среди населения. Подобные случаи могут быть вызваны рядом факторов: воздействием техногенного загрязнения, нарушениями в системе транспортировки и хранения вакцин, систематического нарушения техники введения вакцин.
Для мониторинга эффективности вакцинации используется целый ряд серологических методов.
Реакция агглютинации является классическим методом полуколичественной оценки противококлюшного иммунитета. Метод базируется на визуальной детекции осадка иммунных комплексов, образующихся при смешивании позитивной сыворотки крови и диагностикума. Диагностикум представляет собой инактивированные клетки коклюшного микроба вакцинных штаммов Bordetella pertussis (1.2.0, 1.0.3, 1.2.3). Полуколичественный вариант метода позволяет определить титр противококлюшных антител. Титр образца определяют по наибольшему разведению исследуемой сыворотки крови, которое дает при взаимодействии с диагностикумом осадок определенной плотности. Плотность осадка оценивается визуально. Реакция агглютинации является неинструментальным методом, его постановка не требует наличия считывающей аппаратуры. Между тем полуколичественная оценка противококлюшного иммунитета требует приготовления кратных разведений сыворотки, что усложняет процесс анализа. Длительность инкубации диагностикума с образцом происходит в течение суток, что существенно отдаляет получение результатов теста, а также ограничивает возможность проведения анализа в рамках жесткого временного регламента работы лабораторий.
Альтернативным методом оценки напряженности противококлюшного иммунитета является иммуноферментный анализ (ИФА). Принцип метода заключается в детекции антител класса IgG, специфичных к антигенам коклюшного микроба (прежде всего коклюшному токсину и гемагглютинину), при помощи антивидовых антител, меченных ферментом, в частности пероксидазой хрена. Фермент обеспечивает протекание цветной реакции, субстратом которой является хромоген. Интенсивность цветной реакции тем выше, чем больше концентрация в реакционной среде фермента, количество которого в свою очередь пропорционально концентрации противомикробных антител. Интенсивность цветной реакции оценивается спектрофотометрически, как правило, количественно. Иммуноферментный анализ позволяет осуществлять количественную детекцию антител класса IgG, которые делают наибольший вклад в защиту организма от инфекции, хотя в отношении коклюша не стоит недооценивать роль IgA, основного иммуноглобулина слизистых оболочек дыхательных путей. Иммуноферментный анализ более оперативен, чем реакция агглютинации, лучше приспособлен для автоматизации, не требует приготовления кратных разведений исследуемой сыворотки крови. В настоящее время именно ИФА является основным методом оценки противококлюшного иммунитета в мире. Однако оценка агглютининов не утрачивает своей актуальности, поскольку до настоящего времени не подтверждена роль IgG против отдельных антигенов коклюшного микроба или их смесей (ссылка ВОЗ), в то время как ряд исследований, проведенных в 40-50-х годах прошлого столетия, продемонстрировали роль агглютининов в защите от коклюшной инфекции.
Иммуноферментный анализ является основным методом детекции противостолбнячных и противодифтерийных антител. Для этих двух инфекций показана четкая протективная роль иммуноглобулинов класса G, специфичных к дифтерийному и столбнячному анатоксину, установлены защитные уровни антител.
Помимо ИФА в клинической практике существенна роль реакции пассивной гемагглютинации для оценки защищенности от дифтерии и столбняка. Принцип реакции агглютинации заключается в визуальной детекции осадка, образующегося при смешивании исследуемого образца сыворотки крови с эритроцитарным диагностикумом. Эритроцитарный диагностикум представляет собой инактивированные танизированные эритроциты барана, конъюгированные с антигеном: дифтерийным или столбнячным анатоксином. Наличие в исследуемом образце антител против инфекций приводит к агглютинации эритроцитов и выпадению их в осадок. Реакцию проводят в лунках полистирольных планшетов. Реакция гемагглютинации позволяет осуществлять полуколичественную оценку содержания антител в сыворотке крови, титр антител определяют по наибольшему разведению образца, которое приводит к формированию осадка определенной плотности. Постановка метода примерно аналогична таковой ИФА, однако пробоподготовка занимает значительное время: исследуемую сыворотку необходимо титровать, а также подвергнуть истощению в отношении неспецифических агглютининов при помощи инкубации с формалинизированными эритроцитами барана в течение нескольких часов. Метод может быть автоматизирован, возможен приборный учет степени агглютинации в лунках.
«Золотым стандартом» при оценке напряженности противодифтерийного и противостолбнячного иммунитета является реакция нейтрализации. Для оценки концентрации антител к столбнячному токсину используется мышиная модель, количественную детекцию антител к дифтерийному токсину проводят при помощи клеток линии Vero. Реакция нейтрализации является чувствительным, специфичным и, что немаловажно, функциональным тестом, позволяющим оценить концентрацию «полезных» антител, способных не просто связывать токсин, а подавлять его негативное воздействие на организм или отдельные клетки. Тем не менее, применение реакции нейтрализации на практике сильно ограничено ввиду длительности и дороговизны анализа.
Основным и наиболее близким по технической сущности к разработанному методу является метод иммуноферментного анализа. Сущность метода заключается в следующем.
Диагностикум представляет собой конъюгат моноклональных антител против IgG человека с ферментом, в частности пероксидазой хрена. Реакция проводится в лунках прозрачного 96-луночного планшета из полистирола, стенки и дно которого сенсибилизированы антилигандом (дифтерийным анатоксином, столбнячным анатоксином, антигеном возбудителя коклюша). В лунки вносят исследуемую сыворотку крови, разведенную до необходимого титра. В ходе инкубации происходит связывание антител, содержащихся в образце с антилигандом иммуносорбента. Детекция антител производится при помощи ферментного конъюгата. Количество связываемого конъюгата прямо пропорционально концентрации искомых антител, оно оценивается по интенсивности ферментативной реакции в каждой лунке планшета. Для этого в лунки вносят хромогенный субстрат, например тетраметилбензидин, а затем одновременно останавливают ферментативную реакцию во всех лунках. Концентрация цветного продукта тем выше, чем больше концентрация целевых антител в образце сыворотки крови. Интенсивность цветной реакции оценивают, как правило, спектрофотометрически.
Основными недостатками метода является необходимость использования считывающего оборудования для оценки результатов, дорогостоящего и требующего участия высоко квалифицированных специалистов, что ограничивает возможность повсеместного использования метода. Кроме того, использование метода не удобно в ходе оценки поствакцинального иммунитета, индуцируемого комплексной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной, поскольку требует проведения трех отдельных анализов для каждого пациента.
Предлагаемое изобретение решает задачу по созданию более простой диагностической системы, позволяющей осуществлять оценку наличия протективного титра антител одновременно к антигенам коклюшного, дифтерийного и столбнячного возбудителей.
Решение задачи возможно благодаря тому, что предлагаемая тест-система выполнена в формате дот-иммуноанализа, причем на каждую твердую фазу сорбированы антигены возбудителей коклюша, дифтерии и столбняка одновременно. Оценка результатов анализа производится при помощи сканирования тест-полосок с последующей обработкой полученных изображений при помощи специализированной программы, в частности ImageJ (NIH, США) или иной программы, позволяющей оценивать интенсивность окрашивания отдельных пикселов.
Новизна используемого метода заключается в использовании иммуносорбента, представляющего собой белый пористый материал, в частности нитроцеллюлозу, сенсибилизированный антигенами коклюша, дифтерии и столбняка, а также диагностикума, представляющего собой конъюгат частиц коллоидного углерода с G белком стрептококка. Идентичность антигенов, используемых для иммуноанализа с теми, которые входят в состав цельноклеточной трехкомпонентной вакцины против коклюша, дифтерии и столбняка, позволяет использовать метод для мониторинга напряженности поствакцинального иммунитета.
Описание разработанного способа.
В качестве твердой фазы использовали нитроцеллюлозную мембрану, приготовленную в виде полосок. На твердую фазу сорбировали антигены возбудителей коклюша, дифтерии и столбняка, разведенные до конечной концентрации в физиологическом растворе, забуференном натрий-фосфатами до рН 7,25 (ЗФР). В качестве внутреннего положительного контроля на полоски сорбировали IgG мыши.
После высушивания стрипы помещали в блокирующий буфер, ЗФР с 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и с 0,1% твина-20 (ЗФРТ), для исключения возможного неспецифического взаимодействия компонентов аналитической системы. Далее стрипы инкубировали с контрольными сыворотками крови, а также сыворотками вакцинированных детей, разведенными в блокирующем буфере в 40 раз.
Детекцию связанных антител производили при помощи углеродного диагностикума, представляющего собой конъюгат углеродных наночастиц с G белком стрептококка. Диагностикум готовили по оригинальному методу (Раев М.Б. Нанобиотехнологии в неинструментальной иммуноаналитике. Монография. РИО УрО РАН. Екатеринбург, 2012, С. 140).
Пример. В качестве твердой фазы использовали полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны с диаметром пор 0,45 мкм размером 0,5×2 см.
На стрипы сорбировали по 3,5 мкл дифтерийного анатоксина (0,1 мг/мл), столбнячного анатоксина (0,05 мг/мл), суспензии клеток коклюшного микроба (20 МОЕ) и IgG мыши (положительный контроль, 0,1 мг/мл), разведенных в ЗФР. Стрипы высушивали и помещали в лунки пластикового планшета. Затем в лунки вносили блокирующий буфер (ЗФРТ) и размещали планшеты на шейкере в термостате при температуре +37°С на 60 мин. На следующем этапе стрипы трехкратно промывали ЗФРТ (длительность одного цикла промывки 5 минут) и в лунки вносили:
1. Образцы сывороток крови детей, вакцинированных цельноклеточной коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакциной, разведенные 1:40 в ЗФРТ.
2. Контрольные образцы:
A. Пулы сывороток крови детей, содержащих коклюшные агглютинины в титрах 1:40 (слабоположительный образец) и 1:640 (сильноположительный образец), разведенные в блокирующем буфере в 40 раз;
Б. Международный стандарт ВОЗ (10/262, 1-й Международный стандарт) дифтерийного антитоксина, разведенный блокирующим буфером до концентраций 0,025 МЕ/мл и 0,0025 МЕ/мл (что соответствует концентрации антитоксинов в цельной сыворотке 1 и 0,1 МЕ/мл соответственно);
B. Международный стандарт ВОЗ (ТЕ-3, 1-й Международный стандарт) столбнячного антитоксина, разведенный блокирующим буфером до концентраций 0,025 МЕ/мл и 0,0025 МЕ/мл (что соответствует концентрации антитоксинов в цельной сыворотке 1 и 0,1 МЕ/мл соответственно).
После получасовой инкубации при +37°С стрипы промывали и в лунки вносили диагностикум в разведении 1:45 в ЗФРТ, что соответствует массовой доле углеродных частиц 0,02%. Спустя 60 минут диагностикум из лунок удаляли, стрипы промывали, высушивали и сканировали (сканер Canon Canoscan Lide 600f, программа CanoScan Toolbox v. 5.0, режим сканирования оттенки серого, разрешение 300 точек на дюйм). Полученные изображения обрабатывали при помощи программы ImageJ, оценивая интенсивность окрашивания твердой фазы в виде темных пятен в зонах нанесения антилигандов.
Полученные результаты для дифтерийных и столбнячных антител сравнивали с контрольными образцами, в результате чего сыворотки относили к одной из трех групп, в зависимости от концентрации антитоксинов: <0,1 МЕ/мл, 0,1-1 МЕ/мл, >1 МЕ/мл. Принадлежность к определенной группе определяла заключение, касающееся наличия протективного титра антитоксинов и длительности защиты (на основании данных работ  J. et al. Knowledge-based approach to clinical decision-support system, with an application in tetanus serology // Clinica Chimica Acta. 1993. V. 222. P. 79-83, Scheibel I. et al. Duration of Immunity to Diphtheria and Tetanus after Active Immunization // Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. 1966. V. 67. P. 380; Pietsch M. Impfserologie zur Erganzung von Impfungen  // Der Allgemeinarzt. 1993. V. 18.):
Наличие протективного титра противококлюшных антител оценивали, сравнивая интенсивность окрашивания образца с пороговым значением. Величину порогового значения рассчитывали следующим образом:
X=0,128(A-В)+В,
где X - пороговое значение оптической плотности, А - оптическая плотность сильноположителъного образца, В - оптическая плотность слабоположительного образца
Числовой коэффициент 0,128 был выведен экспериментально на основании сопоставления данных дот-иммуноанализа и агглютинационного теста методом ROC-анализа. Если полученное значение оптической плотности образца выше порогового значения, то он содержит защитный уровень противококлюшных антител.
В результате исследования 135 сывороток крови детей с различным прививочным анамнезом в отношении коклюшно-дифтерийно-столбнячной вакцины в параллельном сравнении сконструированной тест-системы с традиционными методами детекции антител (ИФА на антитела к дифтерийному и столбнячному анатоксинам, реакция агглютинации на антитела к коклюшному микробу) было продемонстрировано, что чувствительность и специфичность метода в отношении детекции антител к коклюшу равны 88%, чувствительность выявления антител к столбняку составила 93,5%, специфичность - 90,9%, чувствительность выявления антител к дифтерийному анатоксину составила 92,4%, специфичность - 85%.
Таким образом, разработанный метод позволяет упростить и ускорить оценку напряженности поствакцинального иммунитета к коклюшу, дифтерии и столбняку. Он предоставляет возможность использовать одну процедуру для оценки иммунного ответа одновременно к антигенам трех различных инфекций и фактически является альтернативой существующим методам серодиагностики коклюша, дифтерии и столбняка. Разработанный метод не требует применения дорогостоящего регистрирующего оборудования, вместо которого для регистрации результатов предполагается использовать доступное и простое сканирующее оборудование с последующей компьютерной обработкой полученных сканированных изображений.
Таким образом, технический результат от использования изобретения заключается в упрощении, ускорении и унификации процедуры оценки напряженности поствакцинального иммунитета к коклюшу, дифтерии и столбняку, а также возможности длительного сохранения результатов анализа.
Заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленное применение», так как применяемые реагенты доступны, а исследования легко выполняемы.