ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БАКТЕРИИ, СТАБИЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ИЛ-10 И ИНСУЛИН
GENETICALLY MODIFIED BACTERIA STABLY EXPRESSING IL-10 AND INSULIN

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
[001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по дате подачи предварительной заявки на патент США №62/383079, поданной 2 сентября 2016 г.
ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[002] Настоящая заявка включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и включен в настоящий документ полностью посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 30 августа 2017 г., имеет название 205350_0032_WO_567020_ST25.txt и размер 43 027 байтов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[003] Генетически модифицированные микроорганизмы (например, бактерии) применялись для доставки терапевтических молекул в ткани слизистой оболочки. См., например, Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789; и Robert S. and Steidler L.,Microb. Cell Fact. 2014, 13 Suppl. 1: S11.
[004] Ранее были описаны продуцирующие интерлейкин 10 (IL-10, или ИЛ-10) молочнокислые бактерии; были также описаны вводимые через слизистую оболочку для лечения диабета I типа (T1D) ИЛ-10, и/или инсулин или проинсулин. См. например, опубликованную международную заявку на патент WO 2007/063075; Robert S. et al., Diabetes 2014, 63: 2876-2887; Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789; и Takiishi Т. et al., J. din. Invest. 2012, 122(5): 1717-1725.
[005] Однако в данной области техники до сих пор существует потребность в стабильных генетически модифицированных бактериальных штаммах, конститутивно экспрессирующих более чем один биоактивный полипептид и подходящих для клинического применения, например, для лечения T1D. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение указанных потребностей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[006] Согласно настоящему изобретению предложены генетически модифицированные микроорганизмы, содержащие хромосомно-интегрированные нуклеиновые кислоты, кодирующие ИЛ-10 и проинсулин (PINS), способы получения таких микроорганизмов и способы применения таких микроорганизмов. Указанные генетически модифицированные микроорганизмы могут подходить для терапии у человека, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, для лечения диабета, например, T1D.
Микроорганизмы и композиции
[007] Согласно настоящему изобретению предложены микроорганизмы, например, грамположительные бактерии, такие как молочнокислая бактерия (МКБ), содержащие экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид интерлейкин-10 (ИЛ-10), и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид T1D-специфического антигена, такого как проинсулин (PINS), причем и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ИЛ-10, и экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая T1D-специфический антиген (например, полипептид PINS), являются хромосомно-интегрированными, т.е. интегрированы в бактериальную хромосому (или локализованы на ней).
[008] Указанный микроорганизм может представлять собой грамположительную бактерию, такую как МКБ. Указанная МКБ может представлять собой вид бактерии Lactococcus. Согласно другим вариантам реализации указанная МКБ представляет собой вид Lactobacillus или вид Bifidobacterium. Согласно некоторым вариантам реализации указанная МКБ может представлять собой Lactococcus lactis. Указанная МКБ может представлять собой Lactococcus lactis подвида cremoris. Другой пример МКБ представлен штаммом Lactococcus lactis MG1363. См., например, Gasson, M.J., J. BacterioL 1983, 154: 1-9.
[009] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, полипептид ИЛ-10 представляет собой ИЛ-10 человека (hIL-10, или чИЛ-10). Согласно другим примерам указанный ИЛ-10 представляет собой вариант полипептида ИЛ-10, например, в том числе содержащий по меньшей мере одну точечную мутацию, например, для увеличения экспрессии полипептида ИЛ-10 указанной бактерией. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, указанный ИЛ-10 является «зрелым» ИЛ-10 человека (чИЛ-10), т.е. без сигнального пептида. Согласно некоторым вариантам реализации указанный чИЛ-10 содержит замену пролина (Pro) на аланин (Ala) в положении 2 при учете аминокислот в зрелом пептиде. См., например, SEQ ID NO: 1. Такие полипептиды описаны, например, в источнике: Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789, содержание которого включено в настоящий документ полностью посредством ссылки. Согласно некоторым примерам полипептид ИЛ-10 представляет собой ИЛ-10 человека дикого типа. Согласно другим примерам полипептид ИЛ-10 представляет собой ИЛ-10 человека дикого типа без собственного сигнального пептида и имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно другим примерам экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ИЛ-10, имеет последовательность нуклеотидов, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 2.
[0010] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, полипептид T1D-специфического антигена представляет собой полипептид PINS, такой как PINS человека (hPINS), например, PINS человека дикого типа. Согласно некоторым примерам полипептид PINS имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 5. PINS дикого типа может кодировать последовательность нуклеотидов, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичная последовательности SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7. Согласно другим примерам полипептид PINS представляет собой PINS человека без сигнального пептида и имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3. Согласно другим примерам экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид PINS, имеет последовательность нуклеотидов, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 4.
[0011] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный микроорганизм (например, МКБ) экспрессирует (например, конститутивно экспрессирует) полипептид ИЛ-10. Согласно другим примерам указанный микроорганизм (например, МКБ) конститутивно экспрессирует и секретирует полипептид ИЛ-10 (например, чИЛ-10). В других примерах, соответствующих любым из описанных выше вариантов реализации, указанная МКБ конститутивно экспрессирует полипептид T1D-специфического антигена (например, полипептид PINS). Согласно другим примерам указанный микроорганизм (например, МКБ) конститутивно экспрессирует и секретирует полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS). Согласно другим дополнительным примерам указанный микроорганизм (например, МКБ) конститутивно экспрессирует и секретирует полипептид ИЛ-10 (например, чИЛ-10) и полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS) (например, hPINS).
[0012] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ИЛ-10, располагается в направлении 3' от промотора hllA (PhllA), такого как PhllA Lactococcus lactis. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанному варианту реализации, экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ИЛ-10, транскрипционно регулирует PhllA. Согласно другим примерам указанная МКБ включает экспрессионную кассету с ИЛ-10, содержащую промотор PhllA (например, PhllA Lactococcus lactis), последовательность секреции ИЛ-10 (например, расположенную в направлении 3' от PhllA) и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ИЛ-10 (например, расположенную в направлении 3' от последовательности секреции ИЛ-10). Согласно некоторым примерам экспрессионная кассета с ИЛ-10 является хромосомно-интегрированной. Согласно некоторым примерам экспрессионная кассета с ИЛ-10 является хромосомно-интегрированной, соответственно, заменяя или частично заменяя другой ген. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанному варианту реализации, экспрессионная кассета с ИЛ-10 интегрирована в хромосому в локусе thyA, например, заменяя эндогенный ген thyA, например, согласно описанию в источнике: Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789. Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, последовательность секреции ИЛ-10 представляет собой последовательность нуклеотидов, кодирующую лидерную последовательность секреции неидентифицированного секретируемого белка 45 кДа (Usp45). Такая последовательность секреции называется в настоящем документе SSusp45. Согласно некоторым примерам SSusp45 имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 10. Согласно другим примерам SSusp45 кодирует последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12. В некоторых примерах SSusp45 в экспрессионной кассете с ИЛ-10 кодирует последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичную последовательности SEQ ID NO: 11. Согласно некоторым примерам указанная экспрессионная кассета с ИЛ-10 представлена следующим образом: PhllA>>SSusp45>>чИЛ-10. Последовательность нуклеотидов примера экспрессионной кассеты с ИЛ-10 представлена на фиг. 11.
[0013] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), располагается в направлении 3' от промотора gapB, например, промотора gapB, эндогенного для указанного микроорганизма (например, МКБ). Согласно другим примерам, соответствующим указанному варианту реализации, экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), транскрипционно регулирует промотор gapB. Согласно другим примерам экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), располагается в направлении 3' от гена gapB (gapB) и его промотора gapB. Согласно другим примерам указанная МКБ содержит первую полицистронную экспрессионную кассету (например, двойной цистрон), содержащую промотор gapB, расположенный в направлении 5' от гена gapB, последовательность секреции T1D-специфического антигена (например, последовательность секреции PINS) (например, расположенную в направлении 3' от gapB) и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS) (например, в направлении 3' от последовательности секреции PINS). Согласно некоторым примерам, соответствующим указанному варианту реализации, указанная полицистронная экспрессионная кассета дополнительно включает межгенную область, например, между gapB и последовательностью секреции PINS. Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, промотор gapB и ген gapB являются эндогенными для указанного микроорганизма (например, МКБ). Согласно некоторым примерам последовательность секреции PINS представлена SSusp45. Согласно другим примерам, соответствующим вышеописанным вариантам реализации, указанная первая полицистронная экспрессионная кассета является хромосомно-интегрированной. Согласно другим примерам указанная первая полицистронная экспрессионная кассета представлена следующим образом: PgapB>>gapB>>межгенная область>>SSusp45>>PINS. Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, межгенная область в первой полицистронной экспрессионной кассете представляет собой межгенную область, расположенную в направлении 5' от гена rpmD (т.е. область, предшествующую rpmD). Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный rpmD имеет последовательность нуклеотидов, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 8 (которая включает стоп-кодон первого гена и стартовый кодон второго гена). Без стартового кодона и стоп-кодонов межгенная область rpmD имеет последовательность нуклеиновой кислоты, соответствующую последовательности SEQ ID NO: 9.
[0014] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, указанный микроорганизм (например, МКБ) дополнительно содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую трегалоза-6-фосфат-фосфатазу, например, otsB, такую как otsB Escherichia coli. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая трегалоза-6-фосфат-фосфатазу, является хромосомно-интегрированной. Согласно некоторым примерам указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая трегалоза-6-фосфат-фосфатазу, интегрирована в хромосому в направлении 3' от гена неидентифицированного секретируемого белка 45 кДа (usp45). Согласно некоторым примерам, соответствующим указанному варианту реализации, указанная МКБ содержит вторую полицистронную экспрессионную кассету, содержащую промотор usp45, ген usp45 (например, в направлении 3' от указанного промотора) и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую трегалоза-6-фосфат-фосфатазу (например, в направлении 3' от гена usp45). Согласно некоторым примерам указанная вторая полицистронная экспрессионная кассета дополнительно содержит межгенную область между геном usp45 и экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей трегалоза-6-фосфат-фосфатазу. Согласно некоторым примерам указанная вторая полицистронная экспрессионная кассета представлена следующим образом: Pusp45>>usp45>>межгенная область>>otsB. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, межгенная область представляет собой область rpmD согласно описанию выше в настоящем документе (например, содержит SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9). Указанная вторая полицистронная экспрессионная кассета может, таким образом, быть представлена следующим образом: Pusp45>>usp45>>rpmD>>otsB.
[0015] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, в микроорганизме (например, МКБ) разрушают или инактивируют ген трегалоза-6-фосфат-фосфорилазы (trePP). Например, указанный trePP был инактивирован путем удаления гена trePP или его фрагмента, или указанный trePP был разрушен путем инсерции стоп-кодона. Соответственно, согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, у указанного микроорганизма (например, МКБ) отсутствует активность trePP.
[0016] В других примерах, соответствующих любым из описанных выше вариантов реализации, в микроорганизме (например, МКБ) разрушен или инактивирован ген компонента IIC целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (ptcC). Например, указанный ptcC разрушен путем инсерции стоп-кодона, или ptcC был инактивирован путем удаления ptcC или его фрагмента. Соответственно, согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, у указанного микроорганизма (например, МКБ) отсутствует активность ptcC.
[0017] В других примерах, соответствующих любым из описанных выше вариантов реализации, МКБ дополнительно содержит один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы. Согласно некоторым примерам указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, являются эндогенными для указанной МКБ. Согласно некоторым примерам указанная МКБ сверхэкспрессирует указанные один или более генов, кодирующие указанные один или более транспортеров трегалозы. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, указанные один или более генов, кодирующие указанные один или более транспортеров трегалозы, располагаются в направлении 3' от экзогенного промотора, например, промотора hllA (PhllA). Например, указанные один или более генов, кодирующие указанные один или более транспортеров трегалозы, транскрипционно регулирует PhllA. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, указанные один или более генов, кодирующие указанные один или более транспортеров трегалозы, выбирают из llmg_0453, llmg_0454 и любой их комбинации. Согласно некоторым примерам llmg_0453 и llmg_0454 транскрипционно регулирует PhllA.
[0018] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, содержат два гена, кодирующих два транспортера трегалозы, при этом межгенная область локализована между указанными двумя генами. Согласно некоторым примерам указанная межгенная область представляет собой область rpmD, например, содержащую SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым примерам указанный микроорганизм (например, МКБ) содержит полицистронную экспрессионную кассету, содержащую две последовательности нуклеиновых кислот (например, гены), кодирующие два разных транспортера трегалозы (последовательности транспортера 1 и транспортера 2), и межгенную область между указанными двумя нуклеиновыми кислотами, кодирующими указанные два разных транспортера трегалозы. Такая экспрессионная кассета может быть представлена следующим образом: PhllA>>транспортер 1>>межгенная область>>транспортер 2. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, указанная межгенная область представляет собой область rpmD согласно описанию выше в настоящем документе (например, содержащую SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9). Указанная полицистронная экспрессионная кассета может, таким образом, быть представлена следующим образом: PhllA>>транспортер 1>>rpmD>>транспортер 2.
[0019] Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации указанная МКБ содержит, в единственном штамме, несколько полезных признаков. Согласно одному варианту реализации указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis, содержащую:
(A) хромосомно-интегрированный промотор»сигнал секреции» терапевтический белок, такой как интерлейкин, антиген или фермент;
(B) хромосомно-интегрированный промотор » сигнал секреции»необязательный второй терапевтический белок.
(C) комбинацию мутаций и инсерций, способствующих накоплению трегалозы, которое улучшает выживаемость МКБ при воздействии желчных солей и высушивании. Указанные мутации выбирают из
(i) хромосомно-интегрированных транспортеров трегалозы, таких как PhllA>>транспортер 1>>межгенная область>>транспортер 2, например, llmg_0453 и/или llmg_0454, для поглощения трегалозы;
(ii) хромосомно-интегрированного гена трегалоза-6-фосфат-фосфатазы (ptsB; идентификатор гена: 1036914), расположенного в направлении 3' от usp45 (идентификатор гена: 4797218) для облегчения конверсии трегалоза-6-фосфата в трегалозу;
(iii) инактивированного (например, путем делеции гена) гена трегалоза-6-фосфат-фосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140); и
(iv) инактивированного компонента ПС целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (идентификатор гена: 4796893), ptcC, (например tga в положении кодона 30 из 446; tga30).
Указанная МКБ может также содержать ауксотрофную мутацию для биологического ограничения, например, в thyA.
[0020] Согласно одному варианту реализации указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis, содержащую:
(A) хромосомно-интегрированный промотор»сигнал секреции»чИЛ-10 для секреции зрелого чИЛ-10 из МКБ, например, PhllA>>SSusp45>>чИЛ-10;
(B) хромосомно-интегрированный промотор>>сигнал секреции>>PINS, для секреции зрелого PINS из МКБ; например, PgapB>>gapB>>межгенная область>>SSusp45>>PINS. Указанная межгенная область может представлять собой, например, rpmD;
(С) комбинацию мутаций и инсерций, способствующих накоплению трегалозы, которое улучшает выживаемость МКБ при воздействии желчных солей и высушивании. Указанные мутации выбирают из
(i) хромосомно-интегрированных транспортеров трегалозы, таких как PhllA>>транспортер 1>>межгенная область>>транспортер 2, например, llmg_0453 и/или llmg_0454, для поглощения трегалозы;
(ii) хромосомно-интегрированного гена трегалоза-6-фосфат-фосфатазы (otsB; идентификатор гена: 1036914), расположенные в направлении 3' от usp45 (идентификатор гена: 4797218), для облегчения конверсии трегалоза-6-фосфата в трегалозу;
(iii) инактивированного (например, путем делеции гена) гена трегалоза-6-фосфат-фосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140); и
(iv) инактивированного компонента ПС целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (идентификатор гена: 4796893), ptcC, (например, tga в положении кодона 30 из 446; tga30).
Указанная МКБ может также содержать ауксотрофную мутацию для биологического ограничения, например, в thyA.
[0021] Согласно одному варианту реализации указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis, содержащую
(A) мутацию thyA для биологического ограничения
(B) хромосомно-интегрированный PhllA>>SSusp45>>чИЛ-10 для секреции зрелого чИЛ-10 из МКБ;
(C) хромосомно-интегрированный PgapB>>gapB>>межгенная область>>SSusp45>>PINS, где указанная межгенная область выбрана из rpmD, для секреции зрелого PINS из МКБ;
(D) хромосомно-интегрированные транспортеры трегалозы, например, PhllA>>транспортер 1>>межгенная область>>транспортер 2, например, llmg_0453 и/или llmg_0454, для поглощения трегалозы;
(Е) инактивированный (например, путем делеции гена) ген трегалоза-6-фосфат-фосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140);
(F) хромосомно-интегрированный ген трегалоза-6-фосфат-фосфатазы (otsB; идентификатор гена: 1036914) (расположенный в направлении 3' от usp45 (идентификатор гена: 4797218) для облегчения конверсии трегалоза-6-фосфата в трегалозу; и
(G) инактивированный компонент IIC целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (идентификатор гена: 4796893), ptcC, (например tga в положении кодона 30 из 446; tga30).
[0022] Согласно настоящему изобретению также предложены композиции, содержащие микроорганизм (например, МКБ) согласно описанию в настоящем документе, например, микроорганизм (например, МКБ) в соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации.
[0023] Согласно настоящему изобретению также предложены фармацевтические композиции, содержащие микроорганизм (например, МКБ) согласно описанию в настоящем документе, например, микроорганизм (например, МКБ) в соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации, и дополнительно содержащие фармацевтически приемлемый носитель.
[0024] Согласно настоящему изобретению также предложена микробная суспензия (например, бактериальная суспензия), содержащая микроорганизм (например, МКБ) в соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации, и дополнительно содержащая растворитель и стабилизирующий агент. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанному варианту реализации, растворитель выбирают из воды, масла и любой их комбинации. Например, согласно настоящему изобретению предложена бактериальная суспензия, содержащая МКБ согласно настоящему описанию, водную смесь (например, напиток) и стабилизирующий агент. Примеры стабилизирующих агентов выбирают из белка или полипептида (например, гликопротеина), пептида, моно-, ди- или полисахарида, аминокислоты, геля, жирной кислоты, многоатомного спирта (например, сорбита, маннита или инозита), соли (например, соли аминокислоты) или любой их комбинации.
[0025] Согласно настоящему изобретению также предложен микроорганизм согласно описанию в настоящем документе (например, МКБ, соответствующая любым из описанных выше вариантов реализации), композиция согласно описанию в настоящем документе или фармацевтическая композиция согласно описанию в настоящем документе для применения в лечении диабета I типа (T1D).
[0026] Согласно настоящему изобретению также предложен микроорганизм согласно описанию в настоящем документе (например, МКБ, соответствующая любым из описанных выше вариантов реализации), композиция согласно описанию в настоящем документе или фармацевтическая композиция согласно описанию в настоящем документе для применения при получении медикамента, например, для лечения заболевания, например, аутоиммунного заболевания, такого как диабет I типа (T1D).
Способ 1: Способы лечения заболевания
[0027] Согласно настоящему изобретению также предложены способы лечения T1D у нуждающегося в этом субъекта. Примеры способов включают введение субъекту терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно описанию в настоящем документе (например, МКБ, соответствующей любым из описанных выше вариантов реализации), композиции согласно описанию в настоящем документе или фармацевтической композиции согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из указанных вариантов реализации, указанный субъект представляет собой человека, например, пациента-человека. Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из указанных вариантов реализации, указанный способ дополнительно включает введение иммуномодулирующего агента (например, антитела против CD3) указанному субъекту. Например, указанный иммуномодулирующий агент (например, антитело против CD3) вводят субъекту с применением режима котерапии, т.е. указанный субъект (например, человек) одновременно получает лечение другим иммуномодулирующим агентом, таким как антитело против CD3. Соответственно, согласно некоторым примерам в настоящем изобретении предложен способ лечения T1D у нуждающегося в этом субъекта-человека. Примеры способов включают введение указанному субъекту-человеку терапевтически эффективного количества МКБ согласно описанию в настоящем документе (например, МКБ, соответствующей любым из описанных выше вариантов реализации), композиции согласно описанию в настоящем документе или фармацевтической композиции согласно описанию в настоящем документе, при этом указанному субъекту-человеку дополнительно вводят антитело против CD3 (например, одновременно проводят лечение антителом против CD3) или его фрагмент.
[0028] Согласно некоторым примерам указанное антитело против CD3 представляет собой моноклональное антитело. Согласно другим примерам указанное антитело против CD3 представляет собой гуманизированные моноклональное антитело. Согласно другим примерам указанное антитело против CD3 представляет собой отеликсизумаб или теплизумаб. Согласно некоторым примерам при введении в качестве комбинированной терапии с МКБ указанное антитело против CD3 вводят субъекту в дозе, отличной от обычно используемой для монотерапии. Оптимальная доза антитела против CD3 для применения в комбинированной терапии может быть определена с применением моделей на животных и на основании клинических испытаний. Предпочтительно; доза антитела против CD3 меньше дозы, в норме необходимой для эффективной монотерапии антителом против CD3, т.е. представляет собой субтерапевтическую дозу. Доза, эффективная для монотерапии, может быть определена путем обращения к моделям на животных и на основании клинических испытаний, а также практического опыта специалистов в данной области техники, и может представлять собой нормативно утвержденную дозу. Согласно некоторым примерам субъекту, получающему комбинированную терапию МКБ, вводят дозу антитела против CD3, которая по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80% или по меньшей мере приблизительно на 90% меньше стандартной дозы антитела против CD3 при монотерапии. Согласно другим примерам доза антитела против CD3, вводимая при комбинированной терапии, приблизительно на 10-100% меньше, приблизительно на 10-90% меньше, приблизительно на 10-70% меньше, приблизительно на 10-60% меньше, приблизительно на 10 50% меньше, приблизительно на 50-100% меньше, или приблизительно на 20-50% меньше дозы антитела против CD3 при монотерапии. Эксперименты показали, что введение 6 ежедневных доз по 48 или 64 мг отеликсизумаба позволяет подавлять активность Т-клеток в достаточной степени для того, чтобы через 36 месяцев в группе лечения функция бета-клеток сохранялась на 80% лучше, чем в контрольной группе, получавшей плацебо. Однако такая доза была ассоциирована с реактивацией латентной инфекции вируса Эпштейна-Барр. Доза 3,1 мг/сутки в течение 8 дней не обеспечивала сохранение функции бета-клеток. Соответственно, лечение, включающее дозы по меньшей мере на 10% меньше 48 мг (т.е. 43 мг), считается «субтерапевтическим».
[0029] Согласно некоторым вариантам реализации у указанного субъекта-млекопитающего, для применения у которого подходят вышеописанные способы, недавно был диагностирован T1D (т.е. имеется недавно возникший T1D). Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, у указанного субъекта был диагностирован T1D в пределах 12 месяцев, 24 месяцев или 36 месяцев, предшествующих введению указанного микроорганизма (например, МКБ).
+
-
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
[0030] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вариантов реализации способа 1, указанный способ дополнительно включает измерение клинического маркера (например, иммунного биомаркера) у субъекта, например, в органе или крови субъекта. Например, указанный способ может дополнительно включать измерение связанного с T1D антитела в крови субъекта. Согласно некоторым примерам указанный способ может также включать измерение аутоантитела к инсулину (IAA) в крови субъекта. Согласно некоторым примерам количество IAA в крови субъекта указывает на прогрессирование заболевания T1D, например, на то, может ли указанный субъект быть классифицирован как имеющий недавно возникший T1D, и может указывать на вероятность того, что лечение принесет пользу указанному субъекту. Соответственно, измерение IAA может быть проведено до введения указанного микроорганизма субъекту. Согласно некоторым примерам положительность по IAA в момент возникновения заболевания является прогностическим фактором положительного терапевтического исхода. Однако измерение IAA может также применяться для мониторинга и оценки исхода лечения, и может, соответственно, применяться во время лечения (например, интервально на протяжении всего периода лечения) для мониторинга эффективности лечения или исхода, и/или после периода лечения, например, для мониторинга сохранения результатов лечения у субъекта (например, нормогликемии) после прекращения лечения. Согласно некоторым примерам снижение положительности по IAA указывает на положительный терапевтический исход. Согласно другим примерам указанный способ дополнительно включает измерение регуляторных Т-клеток у субъекта. Регуляторные Т-клетки включают Treg17, Tr1 Th3, CD8CD28, Qa-1-ограниченные Т-клетки, CD4Foxp3CD25 и/или CD4Foxp3CD25 Т-клетки, предпочтительно, CD4Foxp3CD25 и/или CD4Foxp3CD25 Т-клетки. Согласно другим примерам указанный способ дополнительно включает измерение начальной концентрации глюкозы в крови у субъекта. Согласно другим примерам указанный способ дополнительно включает измерение уровней С-пептида у субъекта.
[0031] Согласно родственным вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ увеличения активности клеток Treg в отношении подавления аутоиммунного ответа на бета-клетки и/или T1D-ассоциированный антиген, предпочтительно, подавления аутоиммунного ответа на все T1D-ассоциированные антигены. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ снижения по существу, предпочтительно, остановки аутоиммунного ответа на бета-клетки и/или любой T1D-ассоциированный антиген. Предпочтительно, указанное снижение по существу аутоиммунного ответа приводит к снижению по существу или к остановке прогрессирования заболевания.
[0032] Согласно некоторым вариантам реализации любых из вышеописанных способов указанный микроорганизм (например, МКБ) вводят субъекту перорально. Например, указанный микроорганизм (например, МКБ) вводят субъекту в форме фармацевтической композиции для перорального введения (например, капсулы, таблетки, гранулы или жидкости), содержащей указанный микроорганизм (например, МКБ) и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно другим примерам указанный микроорганизм (например, МКБ) вводят субъекту в форме пищевого продукта, или добавляют в пищу (например, в напиток). Согласно другим примерам указанный микроорганизм (например, МКБ) вводят субъекту в форме диетической добавки. Согласно другим дополнительным примерам указанный микроорганизм (например, МКБ) вводят субъекту в форме продукта в виде суппозитория. Согласно некоторым примерам композиции согласно настоящему описанию адаптированы для доставки через слизистую оболочку полипептидов, которые экспрессирует указанный микроорганизм (например, МКБ). Например, композиции могут быть введены в состав для эффективного высвобождения в желудочно-кишечном тракте (например, в кишечнике) субъекта.
[0033] В соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации, согласно настоящему изобретению также предложены способы создания толерантности к полипептиду T1D-специфического антигена (например, PINS) у нуждающегося в этом субъекта. Примеры способов включают введение субъекту терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно описанию в настоящем документе (например, МКБ, соответствующей любым из описанных выше вариантов реализации), композиции согласно описанию в настоящем документе или фармацевтической композиции согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из указанных вариантов реализации, указанный субъект представляет собой человека, например, пациента-человека.
+
+
[0034] В соответствии с любым из вышеописанных вариантов реализации, согласно настоящему изобретению также предложены способы уменьшения IAA у нуждающегося в этом субъекта или увеличения числа CD4Foxp3 Т-клеток у нуждающегося в этом субъекта. Примеры способов включают введение субъекту терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно описанию в настоящем документе (например, МКБ, соответствующей любым из описанных выше вариантов реализации), композиции согласно описанию в настоящем документе или фармацевтической композиции согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из указанных вариантов реализации, указанный субъект представляет собой человека, например, пациента-человека.
[0035] Согласно некоторым примерам введение терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно настоящему изобретению и антитела против CD3 согласно настоящему изобретению субъекту (например, в соответствии с любыми из вышеописанных способов) уменьшает количество инсулина, которое вводят субъекту (т.е. необходимое) для контроля уровней глюкозы в крови или поддержания определенного уровня глюкозы в крови (например, рекомендованной лечащим врачом, или обычно рассматриваемой как безопасная). Например, введение терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно настоящему изобретению и антитела против CD3 согласно настоящему изобретению субъекту (например, в соответствии с любыми из вышеописанных способов) уменьшает количество инсулина, требуемое для контроля уровней глюкозы в крови или поддержания определенного уровня глюкозы в крови у субъекта по сравнению с количеством инсулина, требующимся соответствующему субъекту, которому не вводят указанный микроорганизм (например, МКБ) и указанное антитело против CD3, или по сравнению с количеством инсулина, требующимся соответствующему субъекту, получающему лечение отдельно антителом против CD3.
[0036] Согласно другим примерам введение терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно настоящему изобретению и антитела против CD3 согласно настоящему изобретению субъекту (например, в соответствии с любыми из вышеописанных способов) обеспечивает сохранение функции бета-клеток у субъекта (например, обеспечивает сохранение функции бета-клеток, измеренной в начале лечения) у субъекта, например, по результатам измерений с применением известных в данной области техники способов. Примеры способов измерения функции бета-клеток (например, с применением уровней С-пептида) также описаны в настоящем документе. Согласно некоторым примерам функция бета-клеток у субъекта сохраняется на протяжении по меньшей мере приблизительно 2 месяцев, по меньшей мере приблизительно 4 месяцев, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 8 месяцев, по меньшей мере приблизительно 10 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 14 месяцев, по меньшей мере приблизительно 16 месяцев, по меньшей мере приблизительно 18 месяцев, по меньшей мере приблизительно 20 месяцев, по меньшей мере приблизительно 22 месяцев или по меньшей мере приблизительно 24 месяцев после начала введения указанного микроорганизма (например, МКБ) и указанного антитела против CD3. Согласно другим примерам введение терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно настоящему изобретению и антитела против CD3 согласно настоящему изобретению субъекту (например, в соответствии с любыми из вышеописанных способов) увеличивает продолжительность времени, на протяжении которого у субъекта сохраняется функция бета-клеток, по сравнению с продолжительностью времени, на протяжении которого функция бета-клеток сохраняется у соответствующих субъектов, которым не вводят указанный микроорганизм (например, МКБ) и указанное антитело против CD3, или у соответствующего субъекта, получающего лечение отдельно антителом против CD3.
[0037] Согласно другим примерам введение терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно настоящему изобретению и антитела против CD3 согласно настоящему изобретению субъекту (например, в соответствии с любыми из вышеописанных способов) поддерживает нормальную гликемию у субъекта, например, по результатам измерений с применением известных в данной области техники способов. Диапазоны уровней глюкозы в крови, коррелирующие с нормальной гликемии, описаны в настоящем документе. Например, нормальная гликемия у субъекта-человека может быть скоррелирована с результатами двух последовательных измерений уровня глюкозы в крови натощак, составляющими 126 мг/дл или менее. Примеры способов измерения уровней глюкозы в крови известны в данной области техники и описаны в настоящем документе. Согласно некоторым примерам нормальная гликемия у субъекта (проходящего лечение) сохраняется на протяжении по меньшей мере приблизительно 2 месяцев, по меньшей мере приблизительно 4 месяцев, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 8 месяцев, по меньшей мере приблизительно 10 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 14 месяцев, по меньшей мере приблизительно 16 месяцев, по меньшей мере приблизительно 18 месяцев, по меньшей мере приблизительно 20 месяцев, по меньшей мере приблизительно 22 месяцев или по меньшей мере приблизительно 24 месяцев после начала введения указанного микроорганизма (например, МКБ) и указанного антитела против CD3. Согласно другим примерам введение терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно настоящему изобретению и антитела против CD3 согласно настоящему изобретению субъекту (например, в соответствии с любыми из вышеописанных способов) увеличивает продолжительность времени, на протяжении которого у субъекта поддерживается нормальная гликемия, по сравнению с продолжительностью времени, на протяжении которого поддерживается нормальная гликемия у соответствующего субъекта, которому не вводят указанный микроорганизм (например, МКБ) и указанное антитело против CD3, или по сравнению с продолжительностью времени, на протяжении которого нормальная гликемия поддерживается у соответствующего субъекта, получающего лечение отдельно антителом против CD3.
[0038] Согласно другим примерам введение терапевтически эффективного количества микроорганизма (например, МКБ) согласно настоящему изобретению и антитела против CD3 согласно настоящему изобретению субъекту (например, в соответствии с любыми из вышеописанных способов) поддерживает нормальный уровень гемоглобина Ale (HbAlc) у субъекта, например, по результатам измерений с применением известных в данной области техники способов. Согласно некоторым примерам нормальный уровень HbAlc у субъекта (проходящего лечение) поддерживается на протяжении по меньшей мере приблизительно 2 месяцев, по меньшей мере приблизительно 4 месяцев, по меньшей мере приблизительно 6 месяцев, по меньшей мере приблизительно 8 месяцев, по меньшей мере приблизительно 10 месяцев, по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 14 месяцев, по меньшей мере приблизительно 16 месяцев, по меньшей мере приблизительно 18 месяцев, по меньшей мере приблизительно 20 месяцев, по меньшей мере приблизительно 22 месяцев или по меньшей мере приблизительно 24 месяцев после введения указанного микроорганизма (например, МКБ) и указанного антитела против CD3.
[0039] Согласно альтернативному варианту реализации терапевтический способ согласно настоящему изобретению смягчает заболевание, таким образом, что у получающих лечение субъектов степень и частота гипергликемии снижаются по сравнению с не получающими лечение субъектами. Такое снижение может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% от показателей у не получающих лечение субъектов.
[0040] Без лечения T1D развивается с течением времени, и ухудшение прогрессирует по мере уничтожения бета-клеток поджелудочной железы. Соответственно, так как предложенный способ может обеспечить остановку заболевания, целесообразно начинать лечение субъектов как можно раньше в ходе прогрессирования заболевания. Такие маркеры прогрессирования заболевания включают, без ограничения, гликемический индекс, уровни аутоантитела к инсулину (IAA), уровни фрагмента С и инсулит. Соответственно, согласно близкому варианту реализации терапевтический способ согласно настоящему изобретению также включает измерение прогрессирования заболевания до терапии и во время терапии.
[0041] Например, субъект-человек может быть категоризирован как имеющий ранний T1D на основании любых из представленных ниже результатов измерений у субъекта: (1) результаты двух последовательных тестов на уровень глюкозы в крови натощак, равные или превышающие 126 мг/дл; (2) результат любого случайного измерения уровня глюкозы в крови выше 200 мг/дл; (3) уровень гемоглобина А1 с (HbAlc), равный или превышающий 6,5 процентов (HbAlc представляет собой анализ крови, позволяющий определить среднее содержание сахара в крови за три месяца); или (4) результат двухчасового перорального теста на толерантность к глюкозе соответствует любой величине выше 200 мг/дл; или их комбинаций. Соответственно, нормальная гликемия может характеризоваться чем-либо из перечисленного ниже: (1) результаты двух последовательных тестов на уровень глюкозы в крови натощак ниже 126 мг/дл, ниже 120 мг/дл или ниже 100 мг/дл; (2) результат любого случайного измерения уровня глюкозы в крови ниже 200 мг/дл, ниже 180 мг/дл, ниже 160 мг/дл или ниже 140 мг/дл; (3) уровень гемоглобина Alc (HbAlc) по результатам теста ниже 6,5 процентов или ниже 6%; или (4) результат двухчасового перорального теста на толерантность к глюкозе соответствует значению ниже 200 мг/дл, ниже 180 мг/дл, ниже 160 мг/дл или ниже 140 мг/дл; или любой комбинации перечисленного.
[0042] После того как прогрессирование заболевания по существу уменьшается (и, предпочтительно, прекращается, в частности, в отношении аутоиммунитета, лежащего в основе патогенного процесса), субъект может получать дополнительное лечение с применением способов восстановления функции бета-клеток. Соответственно, согласно дополнительному варианту реализации указанный субъект может получать лечение посредством трансплантации бета-клеток, и/или лечение лекарственными средствами, вызывающими пролиферацию эндогенных бета-клеток. Поскольку указанный способ может обеспечивать обращение аутоиммунитета, который лежит в основе T1D, он не ограничен ранним диабетом. После элиминации уничтожающего бета-клетки аутоиммунитета функция бета-клеток может быть восстановлена путем трансплантации, и/или путем стимуляции роста и развития эндогенных бета-клеток. Соответственно, указанный способ может применяться у субъектов с хроническим диабетом.
[0043] Согласно дополнительному варианту реализации терапевтический способ согласно настоящему изобретению смягчает прогрессирование заболевания, таким образом, что скорость усугубления составляет три четверти, половину, четверть или менее от скорости усугубления указанного заболевания при отсутствии лечения. Оценка такого усугубления может быть проведена, например, на основании гликемического индекса, уровней аутоантитела к инсулину (IAA), уровней фрагмента С и инсулита.
[0044] Согласно дополнительному варианту реализации терапевтический способ согласно настоящему изобретению применяют для предотвращения T1D, например, путем введения до появления каких-либо клинических симптомов. Предпочтительно, указанный субъект идентифицирован как имеющий факторы риска T1D, в том числе на основании семейного анамнеза, повышенных (но не диабетических) уровней сахара в крови и моче; наличия антител к ассоциированным с T1D антигенам и прогрессирующего усугубления указанных маркеров со временем.
Способ 2: Способ получения генетически-модифицированного организма для лечения T1D
[0045] Согласно настоящему изобретению также предложены способы получения генетически модифицированного микроорганизма (например, МКБ согласно описанию в настоящем документе. Примеры способов включают (i) приведение микроорганизма (например, МКБ) в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид ИЛ-10; и (ii) приведение микроорганизма в контакт (например, МКБ) с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), причем указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ИЛ-10, и экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), интегрированы в хромосому (т.е. интегрированы в хромосому микроорганизма, например, МКБ). При интеграции указанных нуклеиновых кислот в микробный (например, бактериальный) геном, например, в хромосоме, образуется генетически модифицированный микроорганизм (например, МКБ). Микроорганизм (например, МКБ), который подвергают генетической модификации согласно настоящему способу, может представлять собой любой микробный штамм, например, может представлять собой бактериальный штамм дикого типа, или он может быть генетически модифицирован до приведения в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид ИЛ-10, и экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS).
[0046] Согласно некоторым примерам в вышеописанных способах задействована гомологичная рекомбинация для интеграции указанных нуклеиновых кислот в микробную (например, бактериальную) хромосому. Соответственно, согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ИЛ-10, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), интегрированы в хромосому с применением гомологичной рекомбинации (например, задействующей одну или более интегративных плазмид, содержащих соответствующие нуклеиновые кислоты). Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из указанных вариантов реализации, приведение микроорганизма (например, МКБ) в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид ИЛ-10 (например, интегративной плазмидой, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ИЛ-10), происходит перед приведением указанной МКБ в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS) (например, интегративной плазмидой, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PINS). Согласно другим примерам, соответствующим любым из указанных вариантов реализации, приведение микроорганизма (например, МКБ) в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид ИЛ-10 (например, интегративной плазмидой, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ИЛ-10), происходит после приведения указанной МКБ в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS) (например, интегративной плазмидой, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PINS). Согласно другим примерам, соответствующим любым из указанных вариантов реализации, микроорганизм (например, МКБ) одновременно приводят в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид ИЛ-10 (например, интегративной плазмидой, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ИЛ-10) и экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS) (например, интегративной плазмидой, содержащей экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PINS), или с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей и чИЛ-10, и PINS.
[0047] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из указанных вариантов реализации, указанный способ дополнительно включает комбинирование культуры генетически модифицированного микроорганизма (например, МКБ) по меньшей мере с одним стабилизирующим агентом (например, агентом для криоконсервации) с получением микробной (например, бактериальной) смеси. Согласно некоторым примерам указанный способ дополнительно включает удаление воды из указанной микробной (например, бактериальной) смеси с получением высушенной композиции. Например, указанный способ может также включать сублимационную сушку указанной микробной (например, бактериальной) смеси с получением высушенной сублимацией композиции. Согласно другим примерам указанный способ может дополнительно включать комбинирование генетически модифицированного микроорганизма (например, МКБ) или высушенной композиции (например, высушенной сублимацией композиции) с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции. Указанный способ может дополнительно включать введение указанной высушенной композиции (например, высушенной сублимацией композиции) или указанной фармацевтической композиции в состав фармацевтической лекарственной формы.
[0048] Согласно настоящему изобретению также предложен генетически модифицированный микроорганизм (например, генетически модифицированная МКБ), полученный с применением способа, описанного в настоящем документе (например, способа, соответствующего любым из вышеописанных вариантов реализации способа 2).
Способ 3: Способ получения фармацевтической композиции
[0049] Согласно настоящему изобретению также предложены способы получения фармацевтической композиции. Примеры способов включают приведение культуры микроорганизма (например, МКБ) согласно описанию в настоящем документе (например, МКБ, соответствующей любым из описанных выше вариантов реализации) в контакт по меньшей мере с одним стабилизирующим агентом (например, агентом для криоконсервации), с получением таким образом микробной (например, бактериальной) смеси. Согласно некоторым примерам указанный по меньшей мере один стабилизирующий агент включает по меньшей мере один агент для криоконсервации. Согласно некоторым примерам указанный микроорганизм (например, МКБ) содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид интерлейкин-10 (ИЛ-10), и дополнительно содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), причем и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид ИЛ-10, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), являются хромосомно-интегрированными, т.е. интегрированы в микробную (например, бактериальную) хромосому (или локализованы на ней).
[0050] Такие способы могут дополнительно включать удаление воды из указанной микробной (например, бактериальной) смеси с получением таким образом высушенной композиции. Например, указанные способы могут включать сублимационную сушку указанной микробной (например, бактериальной) смеси с получением таким образом высушенной сублимацией композиции.
[0051] Согласно некоторым примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации способа 3, указанный способ дополнительно включает приведение высушенной композиции (например, высушенной сублимацией композиции) в контакт с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции. Указанные способы могут дополнительно включать введение указанной высушенной композиции (например, высушенной сублимацией композиции) в состав фармацевтической лекарственной формы, такой как таблетка, капсула или саше.
Единичные лекарственные формы
[0052] Соответственно, согласно настоящему изобретению также предложена единичная лекарственная форма, содержащая микроорганизм (например, МКБ) согласно настоящему описанию, высушенную композицию согласно настоящему описанию (например, высушенную сублимацией композицию согласно настоящему описанию) или фармацевтическую композицию согласно настоящему описанию. Согласно некоторым примерам указанная единичная лекарственная форма представляет собой лекарственную форму для перорального применения, такую как таблетка, капсула (например, капсула, содержащая порошок или содержащая микропеллеты или микрогранулы), гранула или саше (например, содержащие высушенные бактерии для суспензирования в жидкости для перорального введения). Согласно некоторым вариантам реализации непатогенный микроорганизм (например, МКБ), содержащийся в указанной лекарственной форме, представлен в виде сухого порошка или его прессованного варианта.
4
12
6
12
8
11
9
12
[0053] Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизма (например, МКБ). Согласно другим примерам указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизма (например, МКБ). Согласно другим примерам указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 КОЕ. Согласно другим дополнительным примерам указанная единичная лекарственная форма содержит приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 КОЕ.
Наборы
[0054] Согласно настоящему изобретению также предложены наборы, содержащие (1) микроорганизм (например, МКБ), соответствующий любым из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, композицию, содержащую микроорганизм (например, МКБ), соответствующий любым из вариантов реализации описанных в настоящем документе, фармацевтическую композицию, содержащую микроорганизм (например, МКБ), соответствующий любым из вариантов реализации, описанных в настоящем документе, или единичную лекарственную форму, содержащую микроорганизм (например, МКБ), соответствующий любым из вариантов реализации, описанных в настоящем документе; и (2) инструкции по введению указанных микроорганизма (например, МКБ), композиции, фармацевтической композиции или единичной лекарственной формы млекопитающему, например, человеку (например, пациенту-человеку).
[0055] Согласно родственным вариантам реализации указанный набор может дополнительно содержать тесты для определения прогрессирования заболевания и успешности лечения (например, тесты на гликемический индекс, уровни аутоантитела к инсулину (IAA), уровни фрагмента С и инсулит). Указанный набор может дополнительно содержать бета-клетки для трансплантации.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0056] На фиг. 1А представлен график, демонстрирующий, что пример антиген-специфической терапии согласно настоящему изобретению стабильно обращает впервые возникший диабет у мышей NOD. Мыши NOD с впервые возникшим диабетом получали указанное лечение; концентрации глюкозы в крови отслеживали на протяжении 14 недель после начала лечения. Показан процент мышей, у которых диабет сохранялся после лечения. Символ «**|» соответствует погибшим или умирающим мышам. На всех кривых выживания Каплана-Майера статистическую значимость различий между группами определяли с использованием логарифмического рангового критерия по Мантелу-Коксу; * Р<0,05, ****, Р<0,0001.
[0057] На фиг. 1В приведены графики, демонстрирующие, что пример антиген-специфической терапии в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает сохранение остаточной функции бета-клеток у мышей NOD. Внутрибрюшинные тесты на толерантность к глюкозе (IPGTT) проводили на мышах NOD с впервые возникшим диабетом помимо получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) мышей (как отвечающих, так и не отвечающих) за 1-2 недели до прекращения лечения. Показана соответствующая площадь под кривой толерантности к глюкозе (AUC глюкозы; мг/дл х 120 минут) на протяжении 2 часов. «Отвечающий» в настоящем документе означает субъекта, который возвращается к нормогликемии (например, отсутствию глюкозурии и уровню глюкозы в крови при измерениях >200 мг/дл) после лечения.
[0058] На фиг. 1С представлен график, демонстрирующий, что пример антиген-специфической терапии в соответствии с настоящим изобретением останавливает прогрессирование инсулита у мышей NOD. Оценку инсулита проводили в слепом режиме на залитых в парафин срезах поджелудочной железы мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих на терапию), как указано, в конце лечения. Статистическую значимость различий между группами рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; ** Р<0,01.
[0059] На фиг. 2А представлен график, отражающий показатель ремиссии диабета, соответствующий стартовым концентрациям глюкозы в крови. Мышей NOD с впервые возникшим диабетом стратифицировали на основании стартовой гликемии ниже или выше 350 мг/дл в момент начала исследования. Показан процент мышей, у которых диабет сохранялся после комбинированного лечения (КТ) штаммом L. lactis клинического качества согласно настоящему описанию. На кривой выживания Каплана-Майера статистическую значимость различий между группами определяли с использованием логарифмического рангового критерия по Мантелу-Коксу; ** Р<0,01.
[0060] На фиг. 2В представлен график, отражающий показатель ремиссии диабета, соответствующий положительности по аутоантителу к инсулину (IAA) в момент начала исследования. Мышей NOD с впервые возникшим диабетом стратифицировали на основании стартовой гликемии ниже или выше 350 мг/дл в момент начала исследования. Показан процент мышей, у которых диабет сохранялся после комбинированного лечения (КТ) штаммом L. lactis клинического качества согласно настоящему описанию.
[0061] На фиг. 2С представлен график, показывающий, что стартовая гликемия и положительность по антителам IAA в начальный момент коррелировали с терапевтическим успехом. Мышей NOD с впервые возникшим диабетом стратифицировали на основании стартовой гликемии ниже или выше 350 мг/дл и положительности по IAA в момент начала исследования. Показан процент мышей толеризованных после терапии.
[0062] На фиг. 2D приведены графики, показывающие, что изменение
положительности по IAA до и после терапии значимо отличалось у отвечающих на терапию мышей. Показаны уровни IAA в момент диагностирования диабета и при последующем наблюдении после комбинированного лечения на основе L. lactis у отвечающих на терапию (верхняя панель) и отвечающих на терапию (нижняя панель) мышей. Статистическую значимость различий между группами рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; ** Р<0,01. Для одной мыши стартовый уровень IAA составлял 139, вне пределов оси Y, и, соответственно, не показан.
+
+
+
-
+
+
+
[0063] На фиг. 3А приведены графики, показывающие, что комбинированная терапия на основе L. lactis индуцирует более высокие уровни Foxp3 Т-клеток. Показаны проценты CD25 Foxp3 клеток (левая панель), CD25Foxp3 клеток (средняя панель) и общий процент Foxp3 клеток (правая панель) в популяции CD4 Т-клеток в периферической крови мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
+
+
+
-
+
+
+
[0064] На фиг. 3В приведены графики, показывающие, что комбинированная терапия на основе L. lactis индуцирует более высокие уровни Foxp3 Т-клеток. Показаны проценты CD25Foxp3 клеток (левая панель), CD25Foxp3 клеток (средняя панель) и общий процент Foxp3 клеток (правая панель) в популяции CD4 Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах поджелудочной железы мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
+
+
-
+
+
+
[0065] На фиг. 3С приведены графики, показывающие, что комбинированная терапия на основе L. lactis индуцирует более высокие уровни Foxp3 Т-клеток. Показаны проценты CD25+Foxp3 клеток (левая панель), CD25Foxp3 клеток (средняя панель) и общий процент Foxp3 клеток (правая панель) в популяции CD4 Т-клеток в поджелудочной железе мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
[0066] На фиг. 3D приведены графики, показывающие, что комбинированная терапия на основе L. lactis индуцирует более высокие уровни Foxp3 Т-клеток. Показаны проценты CD25 Foxp3CTLA4 клеток (левая панель), CD25Foxp3CTLA4 клеток (средняя панель) и Foxp3CTLA4 клеток (правая панель) в популяции CD4 Т-клеток в периферической крови мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
[0067] На фиг. 3Е приведены графики, показывающие, что комбинированная терапия на основе L. lactis индуцирует более высокие уровни Foxp3 Т-клеток. Показаны проценты CD25Foxp3CTLA4 клеток (левая панель), CD25Foxp3CTLA4 клеток (средняя панель) и Foxp3CTLA4 клеток (правая панель) в популяции CD4 Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах поджелудочной железы мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
[0068] На фиг. 3F приведены графики, показывающие, что комбинированная терапия на основе L. lactis индуцирует более высокие уровни Foxp3 Т-клеток. Показаны проценты CD25Foxp3CTLA4 клеток (левая панель), CD25Foxp3CTLA4 клеток (средняя панель) и Foxp3CTLA4 клеток (правая панель) в популяции CD4 Т-клеток в поджелудочной железе мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
+
+
-
+
+
+
+
+
eff
-
[0069] На фиг. 4 приведены графики, показывающие, что комбинированная терапия на основе L. lactis индуцирует супрессорные секретирующие ИЛ-10 Foxp3 Т-клетки у отвечающих и не отвечающих мышей. Для проведения поликлонального супрессорного анализа in vitro CD4CD25 эффекторные Т-клетки (T) выделяли из нормогликемических мышей NOD, метили красителем и стимулировали в течение 72 часов с применением растворимого антитела против CD3 в присутствии вспомогательных клеток и возрастающих относительных количеств CD4CD25Foxp3 или CD4CD25Foxp3 Т-клеток (Treg), выделенных из организма получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) мышей NOD.Foxp3.hCD2 (как отвечающих, так и не отвечающих на терапию) в конце назначенного 6-недельного лечения. Пролиферация клеток Teff была измерена путем проточно-цитометрического анализа разведения красителя и показана в виде процента клеток Teff, прошедших два или более делений, нормированного по культуре, содержащей только эффекторы. Активация клеток Teff была измерена путем проточно-цитометрического анализа CD69 и показана в виде средней интенсивности флуоресценции (MFI), нормированной по культуре, содержащей только эффекторы. Высокочувствительный мультиплексный анализ по методу Meso Scale Discovery (MSD-анализ) концентраций ИФН-γ и ИЛ-10 в культурах Treg:Teff. Статистическую значимость различий между группами рассчитывали с применением критерия Краскела-Уоллиса, а затем критерия множественных сравнений Даннетта; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; * Р<0,05, ** Р<0,01.
+
-
+
+
+
[0070] На фиг.5А представлен график, показывающий, что контроль ответов эффекторных Т-клеток индуцированными комбинированной терапией на основе L. lactis Treg зависит от CTLA4 и ТФР-β. Пролиферация Т-эффекторов (Teff) показана в виде процента клеток Teff, прошедших два или более делений, нормированного по пролиферации при использовании культуры, содержащей только эффекторы. Меченые красителем CD4CD25 Т-клетки (Teff) стимулировали антителом против CD3 (0,5 мкг/мл) в присутствии вспомогательных клеток и CD4CD25Foxp3, выделенных из организма получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) мышей NOD.Foxp3.hCD2 (как отвечающих, так и не отвечающих на терапию), и указанных нейтрализующих антител (10 мкг/мл). Статистическую значимость различий между группами рассчитывали с применением критерия Краскела-Уоллиса, а затем критерия множественных сравнений Даннетта; * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001.
+
-
+
-
+
[0071] На фиг. 5В представлен график, показывающий, что контроль ответов эффекторных Т-клеток индуцированными комбинированной терапией на основе L. lactis Treg зависит от CTLA4 и ТФР-β. Пролиферация Т-эффекторов (Teff) показана в виде процента клеток Teff, прошедших два или более делений, нормированного по пролиферации при использовании культуры, содержащей только эффекторы. Меченые красителем CD4CD25 Т-клетки (Teff) стимулировали антителом против CD3 (0,5 мкг/мл) в присутствии вспомогательных клеток и CD4CD25Foxp3 клеток (Treg), выделенных из организма получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) мышей NOD.Foxp3.hCD2 (как отвечающих, так и не отвечающих на терапию), и указанных нейтрализующих антител (10 мкг/мл). Статистическую значимость различий между группами рассчитывали с применением критерия Краскела-Уоллиса, а затем критерия множественных сравнений Даннетта; * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001.
[0072] На фиг. 5С представлен график, показывающий, что контроль ответов эффекторных Т-клеток индуцированными комбинированной терапией на основе L. lactis Treg зависит от CTLA4 и ТФР-β. Вылеченным с применением комбинированной терапии на основе L. lactis мышам инъецировали антитела против CTLA4 и против ТФР-β (n=5) и отслеживали повторное возникновение диабета (глюкозурия и измеренный уровень глюкозы в крови >200 мг/дл).
[0073] На фиг. 6А представлена схема лечения, включающая одновременное проведение комбинированной терапии на основе L. lactis (КТ) и введение специфического ингибитора FOXP3 Р60 (в/б, 50 мкг/ежедневно) у мышей NOD с впервые возникшим диабетом.
[0074] На фиг. 6В представлен график, показывающие, что специфическое ингибирование функции Treg нарушает индуцированную терапией толерантность. Показан процент мышей, у которых диабет сохранялся после лечения. На кривой выживания Каплана-Майера статистическую значимость различий между группами определяли с использованием логарифмического рангового критерия по Мантелу-Коксу; * Р<0,05.
+
[0075] На фиг. 7А представлена схема лечения истощения по Foxp3 Т-клеткам дифтерийным токсином (ДТ) у излеченных с применением комбинированной терапии на основе L. lactis (КТ) мышей NOD.Foxp3.DTR.
+
[0076] На фиг. 7В представлен график, показывающий, что истощение по Foxp3 Т-клеткам нарушает индуцированную комбинированной терапией на основе L. lactis-толерантность у мышей NOD.Foxp3.DTR. Измерения уровня глюкозы в крови у мышей NOD.Foxp3.DTR с впервые возникшим диабетом в ходе комбинированной терапии на основе L. lactis (n=7) и после лечения ДТ (n=4). Излечением у мышей считали (белые символы) восстановление случайных концентраций глюкозы в крови до уровней ниже 200 мг/дл; или отсутствием излечения (черные символы) - продолжительные концентрации глюкозы в крови мышей выше 200 мг/дл.
[0077] На фиг. 7С представлен график, отражающий оценку инсулита в поджелудочной железе излеченных с применением терапии мышей NOD.Foxp3.DTR до и после лечения ДТ.
[0078] На фиг. 7D представлен график, отражающий количественное определение
+
+
+
+
резидентных островковых Foxp3 Т-клеток в поджелудочной железе излеченных с применением терапии мышей NOD.Foxp3.DTR до и после лечения ДТ. Окрашивание срезов поджелудочной железы толеризированных комбинированной терапией мышей на инсулин (красный), CD4 (лиловый) и Foxp3 (зеленый), где белыми стрелками отмечено присутствие Foxp3 Т-клеток в островке Лангерганса с некоторым уровнем положительности по инсулину. При рассмотрении заключенной в рамку области с большим увеличением ясно видно, что Foxp3 клетки представляют собой CD4 Т-клетки. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; ****, Р<0,0001.
+
+
+
+
+
-
+
+
+
[0079] На фиг. 8А приведены графики, показывающие проценты CTLA4 клеток в популяциях Т-клеток CD4CD25Foxp3 (слева), CD4CD25Foxp3 (посередине) и CD4Foxp3 (справа) в периферической крови мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих на терапию). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
+
+
+
+
+
-
+
+
+
[0080] На фиг. 8В приведены графики, показывающие проценты CTLA4 клеток в популяциях Т-клеток CD4CD25Foxp3 (слева), CD4CD25Foxp3 (посередине) и CD4Foxp3 (справа) в дренирующих лимфатических узлах поджелудочной железы мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих на терапию). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
+
+
+
+
+
-
+
+
+
[0081] На фиг. 8С приведены графики, показывающие процент CTLA4 клеток в популяциях Т-клеток CD4CD25Foxp3 (слева), CD4CD25Foxp3 (посередине) и CD4Foxp3 (справа) в поджелудочной железе мышей с впервые возникшим диабетом и мышей, получавших комбинированную терапию на основе L. lactis (КТ) (как отвечающих, так и не отвечающих на терапию). Каждый символ соответствует одной мыши, горизонтальные столбцы отражают медианное значение. Статистическую значимость рассчитывали с использованием t-теста Манна-Уитни; * Р<0,05, ** Р<0,01, ***, Р<0,001; ****, Р<0,0001.
7
[0082] На фиг. 9 приведен график, показывающий, что у толеризированных комбинированной терапией на основе L. Lactis мышей отсутствует истощение по патогенным эффекторным Т-клеткам. Адоптивный перенос тотальных спленоцитов (1×10), выделенных из организма мышей с явным диабетом (белые ромбы), отвечающих (белые кружки) или не отвечающих (закрашенные кружки) на комбинированную терапию (КТ). Статистические расчеты выполняли с использованием логарифмического рангового критерия по Мантелу-Коксу; «н/з»: незначимый.
+
[0083] На фиг. 10А приведена схема истощения по Foxp3 клеткам с применением ДТ в мышей NOD.Foxp3.DTR. На схеме показаны четыре последовательных в/б (внутрибрюшинных) инъекций ДТ (на 1, 2, 5 и 7 дни (d)) (40 мкг/кг массы тела/день).
+
+
+
[0084] На фиг. 10В приведены графики показывающие истощение по Foxp3 клеткам с применением ДТ у мышей NOD.Foxp3.DTR. Проточно-цитометрический анализ периферической крови продемонстрировал эффективное истощение по Foxp3 клеткам у получавших ДТ мышей NOD.Foxp3.DTR. Окрашивание на Foxp3 срезов поджелудочной железы показало эффективное истощение по резидентным островковым Foxp3 клеткам получавших ДТ мышей NOD.Foxp3.DTR.
+
[0085] На фиг. 10С представлены репрезентативные профили проточной цитометрии, отражающие процент CD4 Т-клеток, положительных по Foxp3 и слитому белку DTR-GFP, до (d0) и после двух последовательных инъекций ДТ (d3 и 5) у мышей NOD.Foxp3.DTR (левая панель).
+
[0086] На фиг. 10D представлен график, демонстрирующий быстрое возникновение диабета при остром истощении по Foxp3 Treg у мышей NOD.Foxp3.DTR.
[0087] На фиг. 11 представлен собой пример экспрессионной кассеты с ИЛ-10 (SEQ ID NO: 13), содержащей промотор hllA (PhllA), последовательность секреции ИЛ-10 (SSusp45) и пример последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ИЛ-10 человека (и соответствующей последовательности аминокислот), которую используют без ее природного сигнального пептида и которая включает точечную мутацию (Pro→Ala) в положении 2 указанной последовательности ИЛ-10 (hIL10aPxA). SEQ ID NO: 14 представляет собой последовательность аминокислот последовательности секреции ИЛ-10, соединенной с последовательностью ИЛ-10 человека.
[0088] На фиг. 12А и 12В в совокупности представлен пример полицистронной экспрессионной кассеты с PINS (SEQ ID NO: 15), содержащей промотор gapB (PgapB), ген gapB, пример межгенной области (rpmD), пример последовательности секреции PINS (SSusp45), трансляционно сопряженной с примером последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей PINS человека. SEQ ID NO: 16 представляет собой последовательность аминокислот, кодируемую геном gapB. SEQ ID NO: 17 представляет собой последовательность аминокислот, кодируемую последовательностью секреции PINS и трансляционно сопряженной последовательностью PINS человека.
[0089] На фиг. 13А, 13В и 13С (SEQ ID NO: 18) в совокупности представлена делеция гена трегалоза-6-фосфат-фосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140); Инсерция конститутивного промотора гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (PhllA; идентификатор гена: 4797353) перед предполагаемыми генами фосфотрансферазы в трегалозном опероне (trePTS; llmg_0453 и llmg_0454; ptsI и ptsII; идентификатор гена: 4797778 и идентификатор гена: 4797093 соответственно), инсерция межгенной области, предшествующей экспрессируемому на высоком уровне гену белка L30 рибосомальной субъединицы 50S L. lactis MG1363 (rpmD; идентификатор гена: 4797873), между ptsI и ptsII.
[0090] На фиг. 14А и 14В (SEQ ID NO: 19) в совокупности представлена инсерция гена трегалоза-6-фосфат-фосфатазы (otsB; идентификатор гена: 1036914) в направлении 3' от гена не идентифицированного секретируемого белка 45 кДа (usp45; идентификатор гена: 4797218). Инсерция межгенной области, предшествующей экспрессируемому на высоком уровне гену белка L30 рибосомальной субъединицы 50S L. lactis MG1363 (rpmD; идентификатор гена: 4797873), между usp45 и otsB.
[0091] На фиг. 15A и 15B (SEQ ID NO: 20, 21 и 25) в совокупности представлена инсерция tga в положении кодона 30 из 446 (tga30) наряду с введением сайта рестрикции EcoRI для разрушения гена, кодирующего компонент IIC целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (ptcC; идентификатор гена: 4796893).
[0092] На фиг. 16 (SEQ ID NO: 22) представлена инсерция гена, кодирующего слияние лидерной последовательности секреции usp45 (SSusp45) с геном pins, кодирующим проинсулин человека (PINS; UniProt: Р01308, аминокислоты 25-110), в направлении 3' от экспрессируемого на высоком уровне гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gapB; идентификатор гена: 4797877). Инсерция межгенной области, предшествующей экспрессируемому на высоком уровне гену белка L30 рибосомальной субъединицы 50S L. lactis MG1363 (rpmD; идентификатор гена: 4797873), между gapB и pins.
[0093] На фиг. 17 (SEQ ID NO: 23) представлена делеция гена тимидилатсинтазы (thyA; идентификатор гена: 4798358). Инсерция в направлении 3' от конститутивного промотора гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (PhllA; идентификатор гена: 4797353) гена, кодирующего слияние (SEQ ID NO: 24) SSusp45 с геном hil-10, кодирующим интерлейкин-10 человека (чИЛ-10; UniProt: Р22301, АК 19 178, вариант Р2А, Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789), позволяющая обеспечить экспрессию и секрецию чИЛ-10.
[0094] На фиг. 18: Схематический обзор релевантных генетических локусов SAGX0407 согласно описанию: trePTS, AtrePP; otsB; ptcC-; gapB>>pins и ΔthyA, чИЛ-10 с указанием релевантных сайтов связывания олигонуклеотидов (oAGXno), сайта рестрикции EcoRI, (/усеченных/) генетических признаков, межгенных областей (IR), размеров продуктов ПЦР-амплификации (п.о.).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0095] Предложены композиции и способы для лечения T1D, и/или для восстановления толерантности к T1D-специфическим антигенам (т.е. PINS) у субъекта.
Определения
[0096] В описании настоящего изобретения и описании вариантов реализации термины, приведенные в единственном числе, в том числе сопровождаемые уточнением «указанный», включают соответствующие термины во множественном числе, если иное явным образом не следует из контекста. Например, термин «клетка» включает множество клеток, в том числе их смеси. Аналогичным образом, применение «соединения» для лечения или получения медикаментов согласно описанию в настоящем документе включает применение одного или более соединений согласно настоящему изобретению для такого лечения или состава, если иное явным образом не следует из контекста.
[0097] В настоящем документе термин «содержащий» означает, что композиции и способы включают перечисленные элементы, однако не исключает другие элементы. «Состоящий по существу из» при использовании для определения композиций и способов означает исключение других элементов, имеющих сколько-либо существенное значение для указанной комбинации. Соответственно, композиция, состоящая по существу из элементов согласно определению в настоящем документе, не исключает следовых примесей, обусловленных способом выделения и очищения, и фармацевтически приемлемые носители, такие как забуференный фосфатом солевой раствор, консерванты и т.п. «Состоящий из» означает исключение более чем следовых элементов других ингредиентов и существенных этапов способа введения композиций согласно настоящему изобретению. Варианты реализации, определяемые каждым из указанных переходных терминов, входят в объем настоящего изобретения.
[0098] В настоящем документе термин «экспрессирующий» ген или полипептид, или «продуцирующий» полипептид (например, полипептид ИЛ-10 или полипептид T1D-специфического антигена), или «секретирующий» полипептид означает в том числе «способный экспрессировать» и «способный продуцировать», или «способный секретировать», соответственно. Например, микроорганизм, который содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, может в достаточных условиях (например, при достаточной влажности и/или в присутствии питательных веществ) экспрессировать и секретировать полипептид, кодируемый экзогенной нуклеиновой кислотой. Однако указанный микроорганизм не обязательно всегда активно экспрессирует кодируемый полипептид. Указанный микроорганизм (например, бактерия) может быть высушен (например, высушен сублимацией), и в указанном состоянии может считаться находящимся в состоянии покоя (т.е. активно не продуцирующим полипептид). Однако после того как указанный микроорганизм помещают в достаточные условия, например, вводят субъекту, и он высвобождается (например, в желудочно-кишечном тракте субъектов), он может снова экспрессировать и секретировать полипептид. Соответственно, микроорганизм «экспрессирующий» ген или полипептид, «продуцирующий» полипептид или «секретирующий» полипептид согласно настоящему изобретению включает указанный микроорганизм «в состоянии покоя». В настоящем документе «секретировать» означает, что белок экспортируется из клетки в культуральную среду/супернатант или другое внеклеточное окружение.
[0099] В настоящем документе термин «конститутивный» в контексте промотора (или, в более широком смысле, в отношении генной экспрессии или секреции полипептида) относится к промотору, который позволяет обеспечивать постоянную транскрипцию ассоциированного с ним гена. Конститутивному промотору противопоставлен «индуцируемый» промотор.
[00100] Термин «приблизительно» в отношении упоминаемой численной величины, а также его грамматические эквиваленты, в настоящем документе может включать собственно упоминаемую численную величину и величины в диапазоне ±10% от указанной упоминаемой численной величины. Например, термин «приблизительно 10» включает 10 и любые количества от 9 до 11, включительно. В некоторых случаях термин «приблизительно» в отношении упоминаемой численной величины может также включать величины в диапазоне ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% или ±1% от указанной упоминаемой численной величины. Согласно некоторым вариантам реализации «приблизительно», связанный с количеством или диапазоном, измеряемыми с применением конкретного способа, показывает, что заданная численная величина включает величины, определяемые вариабельностью измерений при применении указанного способа.
[00101] «Ген ИЛ-10» относится к гену интерлейкина 10, кодирующему «полипептид ИЛ-10». Термин «ген ИЛ-10» включает «варианты генов ИЛ-10», кодирующие «варианты полипептидов ИЛ-10». Последовательность ДНК, кодирующая ИЛ-10 в МКБ, может быть кодон-оптимизирована для облегчения экспрессии в МКБ, и, таким образом, может отличаться от последовательности природного организма (например, человека).
[00102] Термин «ИЛ-10» или «полипептид ИЛ-10» относится к функциональному полипептиду ИЛ-10 (например, полипептиду ИЛ-10 человека), содержащему по меньшей мере последовательность аминокислот зрелой формы (т.е. без сигнала секреции), однако также включает мембраносвязанные формы и растворимые формы, а также «варианты полипептидов ИЛ-10».
[00103] «Вариант ИЛ-10» или «вариант полипептида ИЛ-10» относится к модифицированному (например, усеченному или мутированному), однако функциональному полипептиду ИЛ-10, например, к усеченной или мутированной версии ИЛ-10 человека. Термин «вариант полипептида ИЛ-10» включает полипептиды ИЛ-10 с усиленной активностью или ослабленной активностью по сравнению с соответствующим полипептидом ИЛ-10 дикого типа. «Вариант полипептида ИЛ-10» сохраняет по меньшей мере некоторую активность ИЛ-10 (функциональный полипептид).
[00104] «Процент идентичности» последовательностей полипептидов может быть
вычислен с использованием коммерчески доступных алгоритмов сравнения референсной последовательности с исследуемой последовательностью. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды на 70%, по меньшей мере на 70%, на 75%, по меньшей мере на 75%, на 80%, по меньшей мере на 80%, на 85%, по меньшей мере на 85%, на 90%, по меньшей мере на 90%, на 92%, по меньшей мере на 92%, на 95%, по меньшей мере на 95%, на 97%, по меньшей мере на 97%, на 98%, по меньшей мере на 98%, на 99% или по меньшей мере на 99%, или на 100% идентичны референсному полипептиду или его фрагменту (например, по оценке с использованием BLASTP или CLUSTAL, или другого программного обеспечения для выравнивания) при устанавливаемых по умолчанию параметрах. Аналогичным образом, нуклеиновые кислоты могут также быть описаны относительно стартовой нуклеиновой кислоты, например, они могут быть на 50%, по меньшей мере на 50%, на 60%, по меньшей мере на 60%, на 70%, по меньшей мере на 70%, на 75%, по меньшей мере на 75%, на 80%, по меньшей мере на 80%, на 85%, по меньшей мере на 85%, на 90%, по меньшей мере на 90%, на 95%, по меньшей мере на 95%, на 97%, по меньшей мере на 97%, на 98%, по меньшей мере на 98%, на 99%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичны референсной нуклеиновой кислотой или ее фрагменту (например, по оценке с применением BLASTN или CLUSTAL, или другого программного обеспечения для выравнивания с использованием устанавливаемых по умолчанию параметров). Если указано, что одна молекула отличается определенным процентом идентичности последовательностей относительно молекулы большего размера, это означает, что при проведении оптимального выравнивания двух молекул в молекуле большего размера имеются совпадающие остатки для указанного процента остатков в молекуле меньшего размера, расположенные в соответствии с порядком проведения оптимального выравнивания указанных двух молекул; «%» (процент) идентичности вычисляют в соответствии с длиной молекулы меньшего размера.
[00105] Термин «хромосомно-интегрированный», или «интегрированный в хромосому», или любой вариант приведенных терминов означает, что последовательность нуклеиновой кислоты (например, ген; открытая рамка считывания; экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид; промотор; экспрессионная кассета; и т.п.) локализована на микробной (например, бактериальной) хромосоме (интегрированы в микробную хромосому), т.е. локализована не на эписомном векторе, таком как плазмида. Согласно некоторым вариантам реализации, если последовательность нуклеиновой кислоты является хромосомно-интегрированной, кодируемый такой хромосомно-интегрированной нуклеиновой кислотой полипептид экспрессируется конститутивно.
[00106] Термины «собственный антиген» или «аутоантиген» используются в настоящем документе взаимозаменяемо. Указанные термины используют в настоящем документе в соответствии с известным в данной области техники значением собственного антигена или аутоантигена; как правило, они относятся к полипептиду/белку, происходящему из собственного организма субъекта (продуцируемому собственным организмом субъекта), при этом собственная иммунная система субъекта распознает указанный антиген и, как правило, продуцирует антитела против такого антигена. Аутоиммунные заболевания обычно ассоциированы с определенными специфическими для заболевания собственными антигенами. Например, при T1D иммунная система субъекта может продуцировать антитела против по меньшей мере одного антигена, ассоциированного с процессом уничтожения бета-клеток. Такие собственные антигены включают проинсулин (PINS), декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD65), ассоциированный с инсулиномой белок 2 (IA-2), специфический островковый связанный с каталитической субъединицей глюкоза-6-фосфатазы белок (IGRP) и цинковый транспортер (ZnT) 8. Клинический T1D может дополнительно быть ассоциирован с дополнительными кандидатными целевыми молекулами, экспрессируемыми бета-клетками, такими как хромогранин А, островковый амилоидный (препро)полипептид (ppIAPP), периферии и цитруллинированный регулируемый глюкозой белок (GRP).
[00107] Термин «ген T1D-специфического антигена» относится к гену, кодирующему вышеописанный «T1D-специфический антиген». Термин «ген T1D-специфического антигена» включает «варианты генов T1D-специфического антигена», кодирующие «варианты полипептидов T1D-специфического антигена». Последовательность ДНК, кодирующая антиген ТШ в МКБ, может быть кодон-оптимизирована для облегчения экспрессии в МКБ, и, таким образом, может отличаться от последовательности в природном организме (например, человека).
[00108] Термин «полипептид T1D-специфического антигена» относится к функциональному, например, полноразмерному полипептиду, а также «вариантам полипептидов T1D-специфического антигена», которые могут обладать усиленной активностью или ослабленной активностью по сравнению с соответствующим полипептидом дикого типа. Также в T1D-специфическом антигене могут отсутствовать эукариотические сигнальные последовательности.
370-575
635-979
[00109] Термин «вариант T1D-специфического антигена» или «вариант полипептида T1D-специфического антигена» относится к модифицированному (например, усеченному или мутированному), однако функциональному полипептиду, например, к усеченной или мутированной версии PINS человека. Термин «вариант полипептида» включает полипептиды с усиленной активностью или ослабленной активностью по сравнению с соответствующим полипептидом дикого типа. «Вариант полипептида» сохраняет по меньшей мере некоторую биологическую активность (функциональный полипептид). Примеры вариантов GAD65 и IA-2 включают их обрезанные версии (например, GAD65 и IA-2, соответственно; соответствуют номерам доступа NCBI NP_000809.1 и NP_002837.1, сохраняют антигенные свойства и, соответственно, подходят для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению, например, для стимуляции Treg и индукции толерантности у субъекта. Как правило, микроорганизм (например, Lactococcus lactis) эффективно экспрессирует и секретирует обрезанные или усеченные версии T1D-специфического антигена.
[00110] Термин «функционально связанный» относится к смежному расположению, при котором описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать заданным образом. Контрольная последовательность, «функционально связанная» с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия указанной кодирующей последовательности происходит в условиях, совместимых с контрольными последовательностями. Например, указывается, что промотор функционально связан с геном, открытой рамкой считывания или кодирующей последовательностью, если указанная связь или соединение позволяет или обеспечивает осуществление транскрипции указанного гена. Согласно дополнительному примеру указывается, что 5'- и 3'-ген, цистрон, открытая рамка считывания или кодирующая последовательность функционально связаны в полицистронной экспрессионной единице, если указанная связь или соединение позволяет или обеспечивает осуществление трансляции по меньшей мере 3'-гена. Например, указывается, что последовательности ДНК, такие как, например, промотор и открытая рамка считывания, функционально связаны, если природа связи между указанными последовательностями (1) не приводит к введению мутации со сдвигом рамки, (2) не влияет на способность указанного промотора направлять транскрипцию указанной открытой рамки считывания, или (3) не влияет на способность указанной открытой рамки считывания к транскрипции под действием последовательности области промотора.
Антитело против CD3
[00111] «Антитело против CD3» может представлять собой любое антитело, которое связывается с рецептором CD3 на поверхности Т-клетки, например, антитело, нацеленное на цепь эпсилон CD3 (CD3E). Термин «антитело против CD3» включает любой фрагмент такого антитела, например, Fab-фрагменты, однодоменные антитела, нанотела и т.п. Согласно некоторым примерам указанное антитело против CD3 или его фрагмент представляет собой моноклональное антитело. Согласно другим примерам указанное антитело против CD3 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, например, химерное или гуманизированное гибридное антитело. Согласно некоторым примерам указанное антитело против CD3 представляет собой однодоменное антитело или нанотело. Согласно другим примерам указанное антитело против CD3 представляет собой муромонаб-CD3. Другие известные моноклональные антитела против CD3 включают отеликсизумаб, теплизумаб и визилизумаб, и их фрагменты. В настоящее время исследуют возможность лечения указанными антителами таких состояний, как болезнь Крона, язвенный колит и диабет I типа (см., например, Herold K.С. and Taylor L.; "Treatment of Type 1 diabetes with anti-CD3 monoclonal antibody: induction of immune regulation?". Immunologic Research 2003, 28 (2): 141-50), и индукции иммунотолерантности. См., например, Bisikirska et al. "TCR stimulation with modified anti-CD3 mAb expands CD8+ T cell population and induces CD8+CD25+ Tregs" (2005), и Bisikirska et al, "Use of Anti-CD3 Monoclonal Antibody to Induce Immune Regulation in Type 1 Diabetes". Annals of the New York Academy of Sciences 2004, 1037: 1-9. Согласно некоторым примерам указанное антитело против CD3 блокирует функцию эффекторных Т-клеток (например, Т-клеток, которые атакуют и уничтожают продуцирующие инсулин бета-клетки) и/или стимулирует регуляторные Т-клетки. Соответственно, согласно некоторым примерам указанное антитело против CD3 защищает субъекта от повреждения эффекторными Т-клетками, например, сохраняя способность бета-клеток продуцировать инсулин. Согласно некоторым примерам указанное антитело против CD3 подходит для введения человеку, например, субъекту в ходе клинического испытания, или уже было одобрено контролирующим органом. Согласно некоторым примерам указанное антитело против CD3 представляет собой отеликсизумаб или теплизумаб.
Недавно возникший T1D
[00112] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что субъекты с определенными минимальными уровнями остаточной функции бета-клеток особенно хорошо отвечают на применение терапевтических способов, описанных в настоящем документе. Остаточная функция бета-клеток может быть измерена в соответствии с известными в данной области техники способами и согласно описанию в настоящем документе. Однако достаточная остаточная функция бета-клеток, как правило, обнаруживается у субъектов, которые не подвергались пагубному действию аутоиммунной функции, нацеленной на бета-клетки субъекта, в течение слишком длительного периода. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации у указанного субъекта-млекопитающего, для применения у которого подходят вышеописанные способы, недавно был диагностирован T1D. Например, может быть сказано, что у такого субъекта имеется «недавно возникший T1D» или «впервые возникший T1D» (используются взаимозаменяемо в настоящем документе). Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, у указанного субъекта был диагностирован T1D в пределах 12 месяцев, 18 месяцев или 24 месяцев, предшествующих введению композиции в соответствии с настоящим изобретением. Согласно другим примерам указанный субъект получал лечение инсулином в течение менее чем приблизительно 12 недель, менее чем приблизительно 8 недель, менее чем приблизительно 6 недель или менее чем приблизительно 4 недель. Согласно другим примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, у указанного субъекта дали положительный результат тесты на по меньшей мере одно аутоантитело, например, тесты на аутоантитело к инсулину (IAA), аутоантитела к островковым клеткам, аутоантитела к декарбоксилазе глутаминовой кислоты {например, GAD65) и/или антитела ICA512. Согласно другим примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, уровень глюкозы в плазме натощак у субъекта превышает приблизительно 100 мг/дл, или превышает приблизительно 120 мг/дл, или превышает приблизительно 126 мг/дл. Согласно другим примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, уровень глюкозы в плазме натощак у субъекта составляет от приблизительно 180 до приблизительно 250 мг на децилитр (мг/дл), или от приблизительно 10 ммоль/л до приблизительно 14 ммоль/л. Согласно другим примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации, уровень глюкозы в плазме субъекта составляет от приблизительно 100 до приблизительно 500 мг/дл. Согласно другим примерам, соответствующим любым из вышеописанных вариантов реализации полиурия у субъекта наблюдается на протяжении менее чем приблизительно 8 месяцев, менее чем приблизительно 6 месяцев или менее чем приблизительно 4 месяцев.
[00113] Согласно некоторым примерам субъект-человек может быть категоризирован как имеющий ранний T1D, если у указанного субъекта наблюдается любой из следующих результатов измерений: (1) результаты двух последовательных тестов на уровень глюкозы в крови натощак, равные или превышающие 126 мг/дл; (2) результат любого случайного измерения уровня глюкозы в крови выше 200 мг/дл; (3) уровень гемоглобина Alc (HbA1c) по результатам теста, равный или превышающий 6,5 процентов (HbA1c представляет собой анализ крови, позволяющий определить среднее содержание сахара в крови за три месяца); или (4) результат двухчасового перорального теста на толерантность к глюкозе, соответствующий любой величине выше 200 мг/дл; или комбинации перечисленного. Соответственно, нормальная гликемия может характеризоваться чем-либо из перечисленного ниже: (1) результаты двух последовательных тестов на уровень глюкозы в крови натощак ниже 126 мг/дл, ниже 120 мг/дл или ниже 100 мг/дл; (2) результат любого случайного измерения уровня глюкозы в крови ниже 200 мг/дл, ниже 180 мг/дл, ниже 160 мг/дл или ниже 140 мг/дл; (3) уровень гемоглобина Alc (HbA1c) по результатам теста ниже 6,5 процентов, или менее чем 6%; или (4) результат двухчасового перорального теста на толерантность к глюкозе соответствует значению ниже 200 мг/дл, ниже 180 мг/дл, ниже 160 мг/дл или ниже 140 мг/дл; или любой комбинацией перечисленного.
[00114] Субъект, возвращающийся к нормогликемии {например, к отсутствию глюкозурии и уровню глюкозы в крови при измерениях >200 мг/дл) после лечения, может считаться «отвечающим» на лечение. Субъект, по существу не возвращающийся к нормогликемии, «не отвечает» на лечение.
[00115] Концентрации С-пептида в крови или моче субъекта могут быть использованы для оценки функции бета-клеток у субъекта и статуса заболевания T1D, при этом более высокие концентрации С-пептида указывают на более выраженную функцию бета-клеток. Согласно некоторым примерам у указанного субъекта {например, пациента-человек) имеется недавно возникший ТШ, характеризующийся концентрацией С-пептида в крови натощак менее чем приблизительно 1 нмоль/л, но по меньшей мере приблизительно 0,2 нмоль/л. Согласно другим вариантам реализации стимулированная концентрация С-пептида в крови у указанного субъекта (например, пациента-человека) с недавно возникшим диабетом, например, во время 4-часового теста на толерантность к смешанной пище (ТТСП), составляет менее чем приблизительно 5 нмоль/л, но по меньшей мере приблизительно 0,2 нмоль/л, или менее чем приблизительно 4 нмоль/л, но по меньшей мере приблизительно 0,5 нмоль/л. Другие подходящие диапазоны концентраций С-пептида описаны в настоящем документе. Концентрации стимулированного С-пептида могут, соответственно, быть измерены по площади под кривой для С-пептида (AUC CP) при ТТСП, или могут, как вариант, быть измерены по концентрации стимулированного 90-минутным ТТСП CP (90СР после ТТСП, или 90СР).
Промотор
[00116] Под «промотором» понимают в общем смысле область на молекуле нуклеиновой кислоты, например, молекуле ДНК, с которой связывается РНК-полимераза и инициирует транскрипцию. Промотор, например, расположен выше, т.е. в направлении 5' от последовательности, транскрипцию которой он контролирует. Специалисту будет понятно, что промотор может быть ассоциирован с дополнительными природными регуляторными последовательностями или областями, например, операторами. Конкретная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии, может варьировать у разных организмов, однако в общем случае должна включать промоторную область, которая у прокариот содержит как промотор (который управляет инициацией транскрипции РНК), так и последовательности ДНК, которые после транскрибирования в РНК обеспечивают сигнал инициации синтеза белка. Такие области в норме включают некодирующие 5'-последовательности, вовлеченные в инициацию транскрипции и трансляции, такие как бокс Прибнова (см. также ТАТА-бокс), последовательность Шайна-Дальгарно и т.п.
Экспрессионная кассета
[00117] Термин «экспрессионная кассета», или «экспрессионная единица» используется в соответствии с общепринятым в данной области техники значением и относится к нуклеиновой кислоте, содержащей один или более генов, а также последовательности, контролирующие экспрессию указанных одного или более генов. Примеры экспрессионных кассет содержат по меньшей мере одну последовательность промотора и по меньшей мере одну открытую рамку считывания.
Полицистронная экспрессионная кассета
[00118] Термины «полицистронная экспрессионная кассета», «полицистронная экспрессионная единица» или «полицистронная экспрессионная система» используют в настоящем документе взаимозаменяемо, в соответствии с их общепринятым значением в данной области техники. Они относятся к последовательности нуклеиновой кислоты, отличающейся тем, что экспрессию двух или более генов регулируют общие регуляторные механизмы, такие как промоторы, операторы и т.п. Термин «полицистронная экспрессионная единица» в настоящем документе синонимичен мультицистронной экспрессионной единице. Примерами полицистронных экспрессионных единиц являются, без ограничения, бицистронные, трицистронные, тетрацистронные экспрессионные единицы. Любая мРНК, содержащая две или более, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более открытых рамок считывания или кодирующих областей, кодирующих индивидуальные продукты экспрессии, такие как белки, полипептиды и/или пептиды, охвачена термином «полицистронная». Полицистронная экспрессионная кассета включает по меньшей мере один промотор и по меньшей мере две открытые рамки считывания, контролируемые указанным промотором, при этом между указанными двумя открытыми рамками считывания необязательно размещена межгенная область.
[00119] Согласно определенному примеру «полицистронная экспрессионная кассета» включает один или более эндогенных генов и один или более экзогенных генов, которые транскрипционно контролирует промотор, эндогенный для указанного микроорганизма (например, МКБ). Полицистронную экспрессионную единицу или систему согласно описанию в настоящем документе может транскрипционно контролировать промотор, экзогенный для указанного микроорганизма (например, МКБ). Согласно дополнительному варианту реализации указанные трансляционно или транскрипционно сопряженные один или более эндогенных генов и один или более экзогенных генов согласно описанию в настоящем документе транскрипционно контролирует природный промотор (одного из) указанных одного или более эндогенных генов. Согласно другому варианту реализации указанную полицистронную экспрессионную единицу транскрипционно контролирует природный промотор (одного из) указанных одного или более эндогенных генов, содержащихся в указанной полицистронной экспрессионной единице. Согласно другому варианту реализации указанная полицистронная экспрессионная единица функционально связана с грамположительным эндогенным промотором. Согласно примеру реализации указанный промотор может быть расположен выше, т.е. в направлении 5' от открытой рамки или рамок считывания, с которой (которыми) он функционально связан. Согласно дополнительному варианту реализации указанный промотор представляет собой природный промотор эндогенного гена, расположенного с 5'-стороны, т.е. ближе всего к 5'-концу полицистронной экспрессионной единицы. Соответственно, согласно некоторым примерам указанная полицистронная экспрессионная единица содержит эндогенный ген и один или более экзогенных генов, транскрипционно сопряженных с 3'-концом указанных одного или более эндогенных генов, при этом, например, указанные один или более экзогенных генов расположены с 3'-стороны полицистронной экспрессионной единицы.
[00120] В настоящем документе термин «трансляционно сопряженный» синонимичен термину «трансляционно связанный» или «трансляционно соединенный». Указанные термины по существу относятся к полицистронным экспрессионным кассетам или единицам. Два или более генов, две или более открытых рамок считывания или кодирующих последовательностей называются трансляционно сопряженными, если общий регуляторный элемент или элементы, такие как, в частности, общий промотор, осуществляют транскрипцию указанных двух или более генов в виде одной мРНК, кодирующей указанные два или более генов, две или более открытых рамок считывания или кодирующих последовательностей, которая может быть затем транслирована в две или более индивидуальных последовательностей полипептидов. Специалисту будет понятно, что бактериальные опероны представляют собой встречающиеся в природе полицистронные экспрессионные системы или единицы, в которых два или более генов трансляционно или транскрипционно сопряжены.
Межгенная область
[00121] В настоящем документе термин «межгенная область» синонимичен термину «межгенный линкер» или «межгенный спейсер». Межгенная область определена как последовательность полинуклеиновой кислоты между смежными (т.е. локализованными на одной и той же последовательности полинуклеиновой кислоты) генами, открытыми рамками считывания, цистронами или кодирующими последовательностями. В более широком смысле межгенная область может включать стоп-кодон 5'-гена и/или стартовый кодон 3'-гена, которые соединены указанной межгенной областью. Согласно определению в настоящем документе термин «межгенная область» относится, в частности, к межгенным областям между смежными генами в полицистронной экспрессионной единице. Например, межгенная область согласно определению в настоящем документе может находиться между смежными генами в опероне. Соответственно, согласно варианту реализации межгенная область согласно определению в настоящем документе представляет собой межгенную область оперона.
[00122] Согласно некоторым примерам указанные межгенную область, линкер или спейсер выбирают из межгенных областей, предшествующих, т.е. расположенных в направлении 5', более конкретно, непосредственно предшествующих rp/W, rpfP, rpmD, rp/8, rpsG, rpsE или rp/N грамположительной бактерии. Согласно варианту реализации указанная грамположительная бактерия представляет собой молочнокислую бактерию, например, вид Lactococcus, например, Lactococcus lactis, и любой ее подвид или штамм. Согласно варианту реализации указанная межгенная область включает стартовый кодон rp/W, rp/P, rpmD, rp/8, rpsG, rpsE или rp/N, и/или стоп-кодон предшествующего, т.е. расположенного в направлении 5', гена. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящее изобретение относится к грамположительной бактерии или рекомбинантной нуклеиновой кислоте согласно описанию в настоящем документе, в которой эндогенный ген и один или более экзогенных генов транскрипционно сопряжены посредством межгенной области или областей, активных в указанной грамположительной бактерии, например, указанные межгенная область или области являются эндогенными для указанной грамположительной бактерии, например, указанную эндогенную межгенную область выбирают из межгенных областей, предшествующих rp/W, rpf Р, rpmD, rp/8, rpsG, rpsE, rp/N, rplM, rplE и rplF.
[00123] Специалисту будет понятно, что в тех случаях, когда межгенная область охватывает 5'стоп-кодон и/или 3' стартовый кодон, соответствующие указанные кодоны в некоторых случаях не присутствуют в генах, которые соединены указанными межгенными областями, чтобы избежать удвоения стартовых кодонов и/или стоп-кодонов, что может влиять на корректную инициацию и/или терминацию трансляции. Способы идентификации межгенных областей известны в данной области техники. В качестве дополнительных указаний, межгенные области могут, например, быть идентифицированы на основании предсказания оперонов и ассоциированных промоторов и открытых рамок считывания, для чего в данной области техники известно и доступно программное обеспечение. Примеры межгенных областей описаны в международной опубликованной заявке на патент WO 2012/164083, содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Субъект
[00124] «Субъект» представляет собой организм, для которого может быть благоприятным введение композиции согласно настоящему описанию, например, в соответствии со способами согласно настоящему описанию. Указанный субъект может представлять собой млекопитающее («субъект-млекопитающее»). Примеры субъектов-млекопитающих включают человека, сельскохозяйственных животных (таких как коровы, свиньи, лошади, овцы, козы), домашние или одомашненные животные (такие как собаки, кошки и кролики), а также других животных, такие как мыши, крысы и приматы. Согласно некоторым примерам субъект-млекопитающее представляет собой пациента-человека.
[00125] Термин «международная единица» (ME) применяют в настоящем документе в соответствии с признанным в данной области техники значением и соответствует количеству вещества (например, полипептида). Масса или объем, составляющие одну международную единицу, варьируют в зависимости от измеряемого вещества.
Всемирная организация здравоохранения (WHO) предоставляет характеристики единиц биоактивных полипептидов.
T1D-специфический антиген
[00126] Указанный по меньшей мере один микроорганизм согласно настоящему описанию содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один ген специфического для заболевания (т.е. T1D-специфического) собственного антигена, и может экспрессировать такой ген в условиях, достаточных для экспрессии. Примеры T1D-специфических собственных антигенов включают островковые антигены, ассоциированные с процессом уничтожения бета-клеток. Согласно некоторым вариантам реализации любых из вышеописанных композиций и способов T1D-специфический антиген выбирают из известных аутоантигенов, ассоциированных с T1D, включая проинсулин (PINS); инсулин (INS); декарбоксилазу глутаминовой кислоты (GAD) (например, GAD65, GAD67, или GAD2); ассоциированный с инсулиномой белок 2 (островковый антиген-2; IA-2) (также называемые белком-тирозинфосфатазой рецепторного типа N (PTPRN), тирозинфосфатаза-подобным белком, или ICA512), (см., например, Long et al., Diabetes 2013, 62 (6), 2067-2071); специфический островковый связанный с каталитической субъединицей глюкоза-6-фосфатазы белок (IGRP), цинковый транспортер 8 (ZnT8). Другие примеры включают молекулы, экспрессируемые бета-клетками, такие как хромогранин А, островковый амилоидный (препро)полипептид (ppIAPP), периферии, цитруллинированный регулируемый глюкозой белок (например, GRP78); см., например, Rondas et al., Diabetes 2015; 64(2):573-586; и Ye et al., Diabetes 2010, 59(1):6-16), и комбинации двух или более указанных антигенов. Согласно другим вариантам реализации вышеописанных композиций и способов T1D-специфический антиген представляет собой PINS, GAD65 или IA-2. Согласно другим вариантам реализации вышеописанных композиций и способов T1D-специфический антиген представляет собой PINS. Согласно различным вариантам реализации указанный T1D-специфический антиген кодирует вариант последовательности нуклеиновой кислоты, более короткий, чем полноразмерный ген (например, ген дикого типа), так как такие «обрезанные» версии часто боле эффективно экспрессируются и/или секретируются используемыми микроорганизмами (например, Lactococcus lactis). Наряду с повышением эффективности секреции многие «обрезанные» версии полностью сохраняют (или сохраняют существенную часть) биологической активности, например, сохраняют достаточную способность к стимуляции Treg и/или индукции толерантности.
[00127] Примеры полипептидов PINS включают PINS человека дикого типа и полипептиды, последовательности которых по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичны последовательностям таких PINS человека дикого типа. Примером последовательности аминокислот PINS человека дикого типа является SEQ ID NO: 5; пример последовательности нуклеиновой кислоты представлен последовательностью SEQ ID NO: 6 (см. CDS, включенную в номер доступа NM 000207.2). Согласно некоторым примерам полипептид PINS имеет последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 3, которая кодирует последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 4.
[00128] Дополнительные примеры последовательностей нуклеотидов PINS представлены кодирующими последовательностями с номерами доступа NCBI AY899304 (полный CDS, альтернативный сплайсинг; SEQ ID NO: 7); NM_000207 (вариант транскрипта 1); NM_001185097 (вариант транскрипта 2); NM_001185098 (вариант транскрипта 3); NM_001291897 (вариант транскрипта 4), и частями указанных последовательностей. Примеры последовательностей аминокислот PINS включают последовательности, кодируемые любыми из вышеописанных последовательностей нуклеиновых кислот PLNS.
[00129] Может быть использована любая последовательность нуклеотидов, кодирующая последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 3, или любая последовательность нуклеотидов, кодирующая по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, или по меньшей мере приблизительно 80 ее последовательных аминокислот, или любая последовательность нуклеотидов, кодирующая полипептид, последовательность которого по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 3.
[00130] Дополнительные полипептиды PINS описаны, например, в записи UniProtKB Р01308 с приведенными ссылками. Согласно некоторым примерам полипептид PINS представлен остатками аминокислот 25-110 (нумерация соответствует последовательности SEQ ID NO: 5).
[00131] Примеры полипептидов GAD (например, GAD65) включают GAD65 человека дикого типа и полипептиды, последовательности которых по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере приблизительно на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере приблизительно на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98% или по меньшей мере приблизительно на 99% идентичны последовательностям таких GAD65 дикого типа. См., например, CDS, включенную в номер доступа М81882.1.
[00132] Может быть использована любая последовательность нуклеотидов, кодирующая вышеописанную последовательность аминокислот, или любая последовательность нуклеотидов, кодирующая по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200, по меньшей мере приблизительно 300, по меньшей мере приблизительно 400 или по меньшей мере приблизительно 500 ее последовательных аминокислот, или любая последовательность нуклеотидов, кодирующая полипептид, отличающийся по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере приблизительно 99% идентичностью последовательностей.
[00133] Другие примеры последовательностей глутаматдекарбоксилазы (например, GAD65) описаны, например, в записи UniProtKB Q05329 с приведенными ссылками. Согласно определенному примеру полипептид GAD представляет собой обрезанный вариант, содержащий менее чем приблизительно 500, менее чем приблизительно 400 или менее чем приблизительно 300 аминокислот дикого типа. Примеры фрагментов полипептида (обрезанные варианты GAD65) описаны, например, в источнике: Robert et al., Benef. Microbes 2015, 6(4): 591-601, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Согласно некоторым примерам обрезанные варианты GAD эффективно экспрессирует и секретирует грамположительная бактерия (т.е. Lactococcus lactis). Примером обрезанного варианта GAD является GAD65370-575 (нумерация аминокислот соответствует номеру доступа NCBI NP_000809.1).
[00134] Другие примеры последовательностей нуклеотидов GAD представлены номерами доступа NCBI М81882 (GAD65); М81883 (GAD67); NM_000818 (GAD2 вариант 1); и NM_001134366 (вариант 2 GAD2); и заключенными в них открытыми рамками считывания (CDS). Примеры последовательностей аминокислот включают последовательности, кодируемые вышеописанными последовательностями нуклеотидов с номерами доступа М81882, М81883, NM_001134366 и NM_000818.
[00135] Специалисту в данной области техники будет понятно, что оптимальное количество собственного антигена для доставки субъекту с применением способов согласно настоящему описанию варьирует, например, в зависимости от типа антигена, микроорганизма, экспрессирующего указанный антиген, и генетической конструкции, например, силы промотора, используемого в генетической конструкции. Как правило, микроорганизм вводят в количестве, эквивалентном конкретному количеству экспрессированного антигена, или в количестве, которое обеспечивает достижение требуемого ФК-профиля для соответствующего антигенного полипептида у соответствующего субъекта. Примеры ежедневных доз антигена: от приблизительно 10 фг до приблизительно 100 мкг активного полипептида в сутки. Другие примеры диапазонов доз: от приблизительно 1 пг до приблизительно 100 мкг в сутки; или от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мкг в сутки.
4
12
6
12
9
12
[00136] Вышеуказанные дозы антигена могут быть достигнуты путем введения субъекту эффективных количеств микроорганизма в сутки, при этом указанный микроорганизм адаптирован для экспрессии достаточного количества биоактивного полипептида для достижения требуемой дозы, такой как представленные выше. Микроорганизм, секретирующий антигенный полипептид, может быть доставлен в дозе от приблизительно 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) до приблизительно 10 КОЕ в сутки, например, от приблизительно 10 КОЕ до приблизительно 10 КОЕ в сутки, или от приблизительно 10 КОЕ до приблизительно 10 КОЕ в сутки.
[00137] Количество секретируемого антигенного полипептида может быть определено на основании КОЕ, например, в соответствии со способами, описанными в источнике: Steidler et al., Science 2000; 289(5483): 1352-1355, или с применением ИФА ELISA. Например, конкретный микроорганизм может секретировать по меньшей мере от приблизительно 1 нг до приблизительно 1 мкг активного полипептида на 109 КОЕ. На основании указанных данных специалист может рассчитать диапазон количества антигенного полипептида, секретируемого при других дозах КОЕ.
[00138] Любые из представленных выше доз/диапазонов доз могут вводиться в рамках любого режима дозирования согласно описанию в настоящем документе. Ежедневная доза активного полипептида может вводиться в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 частях на протяжении дня. Также ежедневные дозы могут вводиться в течение любого количества дней, с любым количеством периодов отдыха между периодами введения. Например, доза от приблизительно 0,01 до приблизительно 3,0ММЕ ИЛ-10 в сутки на субъекта может вводиться раз в двое суток в общей сложности на протяжении 6 недель.
Лечение
[00139] Термины «лечение», «лечить» и т.п. в настоящем документе означает облегчение или смягчение характерных симптомов или проявлений заболевания или состояния, например, T1D. Например, лечение T1D может приводить к восстановлению или индукции антиген-специфической иммунотолерантности у субъекта. Согласно другим примерам лечение означает приостановку аутоиммунного диабета или обращение аутоиммунного диабета. В настоящем документе указанные термины также охватывают предотвращение или задержку возникновения заболевания или состояния, или симптомов, ассоциированных с заболеванием или состоянием, в том числе уменьшение тяжести заболевания или состояния, или ассоциированных с ними симптомов до поражения указанным заболеванием или состоянием. Такое предотвращение или уменьшение до поражения относится к введению соединения или композиции согласно настоящему изобретению пациенту, не пораженному в момент введения указанным заболеванием или состоянием. «Предотвращение» также охватывает предотвращение повторного возникновения, или предотвращение рецидива заболевания или состояния, или ассоциированных с ними симптомов, например, после периода улучшения. Лечение «нуждающегося в этом» субъекта означает, что у указанного субъекта имеется заболевание или состояние, и терапевтический способ согласно настоящему изобретению реализуют с преднамеренной целью лечения специфического заболевания или состояния.
Субпопуляции пациентов
[00140] Согласно некоторым вариантам реализации у указанного субъекта, лечение которого проводят с применением способов согласно настоящему описанию, присутствует значимая (например, измеряемая) остаточная функция бета-клеток. В таких обстоятельствах у указанного субъекта может наблюдаться ремиссия заболевания даже после прерывания или полной остановки лечения. У пациентов с недавно поставленным диагнозом часто имеется определенное минимальное число бета-клеток островков поджелудочной железы (бета-клеток), сохранившихся к моменту постановки диагноза, таким образом, такие пациенты способны продуцировать определенное минимальное количество эндогенного инсулина. Для популяции таких пациентов может быть особенно полезным лечение с применением композиций и способов согласно настоящему изобретению (например, терапия ИЛ-10 и PINS). Варианты лечения, описанные в настоящем документе, могут предотвращать дальнейшее уничтожение бета-клеток и могут, соответственно, индуцировать ремиссию заболевания. Неожиданным образом, авторы настоящего изобретения обнаружили, что начальная масса бета-клеток может быть важна для эффективности лечения. Однако после уничтожения бета-клеток субъекта описанное лечение может более не приносить такому субъекту подобную пользу.
[00141] Без лечения T1D развивается с течением времени, и ухудшение прогрессирует по мере уничтожения бета-клеток поджелудочной железы. Соответственно, поскольку предложенный способ может обеспечивать остановку заболевания, целесообразно начинать лечение субъектов как можно раньше в ходе прогрессирования заболевания. Соответственно, согласно близкому варианту реализации терапевтический способ согласно настоящему изобретению также включает измерение прогрессирования заболевания до терапии и во время терапии.
[00142]
Терапевтически эффективное количество
[00143] В настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству непатогенного микроорганизма или композиции согласно настоящему описанию, вызывающей требуемый терапевтический эффект или ответ при введении в соответствии с требуемой схемой лечения. В некоторых случаях предложены соединения или композиции в составе единичной лекарственной формы, например, таблетки или капсулы, которая содержит количество активного компонента, эквивалентное терапевтически эффективному количеству при введении один раз или несколько раз в сутки.
[00144] Специалисту в данной области техники будет понятно, что терапевтически эффективное количество рекомбинантного микроорганизма, которое необходимо для достижения требуемого терапевтического эффекта (например, для эффективного лечения T1D), варьирует, например, в зависимости от природы полипептида ИЛ-10, экспрессируемого указанным микроорганизмом, природы антигенного полипептида, экспрессируемого указанным микроорганизмом, маршрута введения, а также возраста, массы тела и других характеристик реципиента.
Слизистая оболочка
[00145] Термин «слизистая оболочка» или «слизистая мембрана» применяют в настоящем документе в соответствии с известным в данной области техники значением. «Слизистая оболочка» может представлять собой любую слизистую оболочку, обнаруживаемую в организме, такую как слизистая оболочка полости рта, ректальная слизистая оболочка, слизистая оболочка желудка, слизистая оболочка кишечника, слизистая оболочка мочеиспускательного канала, слизистая оболочка влагалища, слизистая оболочка глаза, буккальная слизистая оболочка, слизистая оболочка бронхов или легкого, и назальная или обонятельная слизистая оболочка.
[00146] Термин «доставка в слизистую оболочку» в настоящем документе применяют в соответствии с известным в данной области техники значением, т.е. это доставка в слизистую оболочку, например, путем приведения композиции согласно настоящему описанию в контакт со слизистой оболочкой. Доставка в слизистую оболочку полости рта включает буккальный, сублингвальный и гингивальный маршруты введения. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации «доставка в слизистую оболочку» включает доставку в желудок, доставку в кишечник, ректальную доставку, буккальную доставку, легочную доставку, доставку в глаза, назальную доставку, вагинальную доставку и пероральную доставку.
[00147] Термин «толерантность слизистой оболочки» относится к ингибированию специфической иммунореактивности в отношении антигена у субъекта-млекопитающего (например, пациента-человека) после воздействия антигена на указанного субъекта через слизистую оболочку. В некоторых случаях толерантность слизистой оболочки представляет собой системную толерантность. Низкодозовая пероральная толерантность представляет собой пероральную толерантность, индуцируемую низкими дозами антигенов, и характеризуется активным подавлением иммунитета, опосредованным чувствительными к циклофосфамиду регуляторными Т-клетками, которые могут передавать толерантность нестимулированным хозяевам. Высокодозовая пероральная толерантность представляет собой пероральную толерантность, индуцируемую высокими дозами антигенов, нечувствительную к лечению циклофосфамидом и переходящую в индукцию T-клеточной гипореактивности за счет анергии и/или удаления антиген-специфических Т-клеток. Различие в чувствительности к циклофосфамиду может быть использовано для различения низкодозовой и высокодозовой толерантности (Strobel et al., 1983). В некоторых случаях пероральная толерантность представляет собой низкодозовую пероральную толерантность согласно описанию у Mayer и Shao (2004).
Иммуномодулирующее соединение
[00148] Термины «Иммуномодулирующее соединение» или «иммуномодулятор» используют в настоящем документе в соответствии с признанным в данной области техники значением. Иммуномодулирующее соединение может представлять собой любое Иммуномодулирующее соединение, известное специалисту в данной области техники.
[00149] Согласно некоторым вариантам реализации указанное Иммуномодулирующее соединение представляет собой индуцирующее толерантность соединение. Индукция толерантности может быть достигнуто, например, путем индукции регуляторных Т-клеток, или непрямым образом, например, путем активации незрелых дендритных клеток с получением толеризирующих дендритных клеток, и/или ингибирования иммунного ответа Th2, индуцирующего экспрессию «костимулирующих» факторов на зрелых дендритных клеток. Иммуномодулирующие и иммуносупрессорные соединения известны специалисту в данной области техники и включают, не ограничиваясь перечисленными, бактериальные метаболиты, такие как спергуалин, метаболиты грибов и стрептомицетов, такие как такролимус или циклоспорин, иммуносупрессорные цитокины, такие как ИЛ-4; ИЛ-10; ИФН-α, ТФР-β (в качестве селективного адъюванта для регуляторных Т-клеток), Flt3L, TSLP и Rank-L (в качестве селективных толерогенных индукторов клеток ДК), антитела и/или антагонисты, такие как антитела против CD40L, против CD25, против CD20, против IgE, антитело против CD3, и белки, пептиды или слитые белки, такие как слитый белок с CTL-41g или агонистом CTLA-4. Согласно некоторым вариантам реализации указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой иммуносупрессорное соединение. Согласно другим вариантам реализации указанное иммуносупрессорный соединение представляет собой иммуносупрессорный цитокин или антитело. Согласно другим вариантам реализации указанный иммуносупрессорный цитокин представляет собой повышающий толерантность цитокин или антитело. Специалисту в данной области техники будет ясно, что термин «иммуномодулирующее соединение» также включает его функциональные гомологи. Функциональный гомолог представляет собой молекулу, обладающую по существу такой же или аналогичной функцией для предусмотренного использования, однако может иметь структурные отличия. Согласно некоторым примерам указанное иммуномодулирующее соединение представляет собой антитело против CD3 или его функциональный гомолог.
Микроорганизмы
[00150] Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного микроорганизма. Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм представляет собой непатогенную и неинвазивную бактерию. Согласно другим вариантам реализации указанный микроорганизм представляет собой непатогенные и неинвазивные дрожжи.
[00151] Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм представляет собой штамм дрожжей, выбранный из группы, состоящей из Saccharomyces sp., Hansenula sp., Kluyveromyces sp., Schizzosaccharomyces sp., Zygosaccharomyces sp., Pichia sp., Monascus sp., Geothchum sp и Yarrowia sp. Согласно некоторым вариантам реализации указанные дрожжи представляют собой Saccharomyces cerevisiae. Согласно другим вариантам реализации указанные S. cerevisiae относятся к подвиду boulardii. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная векторная система на основе рекомбинантных дрожжей-хозяев представляет собой биологически ограниченную систему. Биологическое ограничение известно специалистам в данной области техники и может быть реализовано путем введения ауксотрофной мутации, например, суицидной ауксотрофной мутации, такой как мутация ThyA, или ее эквивалентов.
[00152] Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм представляет собой бактерию, такую как непатогенная бактерия, например, бактериальный штамм пищевого качества. Согласно некоторым примерам указанная непатогенная бактерия представляет собой грамположительную бактерию, например, грамположительный бактериальный штамм пищевого качества. Согласно некоторым вариантам реализации указанный грамположительный бактериальный штамм пищевого качества представляет собой способный к молочнокислому брожению бактериальный штамм (т.е. молочнокислую бактерию (МКБ) или бифидобактерию).
[00153] Согласно некоторым вариантам реализации указанный способный к молочнокислому брожению бактериальный штамм представляет собой вид Lactococcus, Lactobacillus или Bifldobacterium. В настоящем документе Lactococcus или Lactobacillus не ограничены конкретным видом или подвидом; подразумевается, что включен любой из видов или подвидов Lactococcus или Lactobacillus. Примеры видов Lactococcus включают Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum и Lactococcus raffinolactis. Согласно некоторым примерам Lactococcus lactis представляет собой Lactococcus lactis подвида cremoris, Lactococcus lactis подвида hordniae или Lactococcus lactis подвида Lactis.
[00154] Примеры видов Lactobacillus включают Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus agilis, Lactobacillus algidus, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylophilus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus animalis, Lactobacillus aviarius, Lactobacillus aviarius подвида araffinosus, Lactobacillus aviarius подвида aviarius, Lactobacillus bavaricus, Lactobacillus bifermentans, Lactobacillus brevis, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus carnis, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei подвида alactosus, Lactobacillus casei подвида casei, Lactobacillus casei подвида pseudoplantarum, Lactobacillus casei подвида rhamnosus, Lactobacillus casei подвида tolerans, Lactobacillus catenaformis, Lactobacillus cellobiosus, Lactobacillus collinoides, Lactobacillus confusus, Lactobacillus coryniformis, Lactobacillus coryniformis подвида coryniformis, Lactobacillus coryniformis подвида torquens, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus curvatus подвида curvatus, Lactobacillus curvatus подвида melibiosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii подвида bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii подвида delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii подвида lactis, Lactobacillus divergens, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus fornicalis, Lactobacillus fructivorans, Lactobacillus fructosus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus graminis, Lactobacillus halotolerans, Lactobacillus hamsteri, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus heterohiochii, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus homohiochii, Lactobacillus iners, Lactobacillus intestinalis, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus kandleri, Lactobacillus kefiri, Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum, Lactobacillus kunkeei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus leichmannii, Lactobacillus lindneri, Lactobacillus malefermentans, Lactobacillus mali, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus manihotivorans, Lactobacillus minor, Lactobacillus minutus, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus murinus, Lactobacillus nagelii, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus parabuchneri, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus paracasei подвида paracasei, Lactobacillus paracasei подвида tolerans, Lactobacillus parakefiri, Lactobacillus paralimentarius, Lactobacillus paraplantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus perolens, Lactobacillus piscicola, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pontis, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus rimae, Lactobacillus rogosae, Lactobacillus ruminis, Lactobacillus sakei, Lactobacillus sakei подвида camosus, Lactobacillus sakei подвида sakei, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus salivarius подвида salicinius, Lactobacillus salivarius подвида salivarius, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus sharpeae, Lactobacillus suebicus, Lactobacillus trichodes, Lactobacillus uli, Lactobacillus vaccinostercus, Lactobacillus vaginalis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus vitulinus, Lactobacillus xylosus, Lactobacillus yamanashiensis, Lactobacillus yamanashiensis подвида mali, Lactobacillus yamanashiensis подвида Yamanashiensis, Lactobacillus zeae, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium infantis. Согласно некоторым примерам указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis (LL).
[00155] Согласно дополнительным примерам указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из Enterococcus alcedinis, Enterococcus aquimarinus, Enterococcus asini, Enterococcus avium, Enterococcus caccae, Enterococcus camelliae, Enterococcus canintestini, Enterococcus canis, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus cecorum, Enterococcus columbae, Enterococcus devriesei, Enterococcus diestrammenae, Enterococcus dispar, Enterococcus durans, Enterococcus eurekensis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus gilvus, Enterococcus haemoperoxidus, Enterococcus hermanniensis, Enterococcus hirae, Enterococcus italicus, Enterococcus lactis, Enterococcus lemanii, Enterococcus malodoratus, Enterococcus moraviensis, Enterococcus mundtii, Enterococcus olivae, Enterococcus pallens, Enterococcus phoeniculicola, Enterococcus plantarum, Enterococcus pseudoavium, Enterococcus quebecensis, Enterococcus raffinosus, Enterococcus ratti, Enterococcus rivorum, Enterococcus rotai, Enterococcus saccharolyticus, Enterococcus silesiacus, Enterococcus solitarius, Enterococcus sulfureus, Enterococcus termitis, Enterococcus thailandicus, Enterococcus ureasiticus, Enterococcus ureilyticus, Enterococcus viikkiensis, Enterococcus villorum и Enterococcus xiangfangensis.
[00156] Согласно дополнительным примерам указанная бактерия выбрана из группы, состоящей из Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis. Streptococcus constellatus, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus equinus, Streptococcus iniae, Streptococcus intermedius, Streptococcus milleri, Streptococcus mitis. Streptococcus mutans, Streptococcus oralis. Streptococcus parasanguinis, Streptococcus peroris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pseudopneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti, Streptococcus salivarius, Streptococcus tigurinus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus vestibularis. Streptococcus viridans и Streptococcus zooepidemicus.
[00157] Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения указанный грамположительный бактериальный штамм пищевого качества представляет собой Lactococcus lactis или любой его подвид, в том числе Lactococcus lactis подвида Cremoris, Lactococcus lactis подвида Hordniae и Lactococcus lactis подвида Lactis. Согласно другому аспекту настоящего изобретения указанный рекомбинантный грамположительный бактериальный штамм представляет собой биологически ограниченную систему, такую как бесплазмидный штамм Lactococcus lactis MG1363, утративший способность к нормальному росту и продуцированию кислоты в молоке (Gasson, M.J. (1983) J. Bacteriol. 154:1-9); или ауксотрофные по треонину и пиримидину производные штаммы L. lactis (Sorensen et al. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1253-1258; Glentmg et al. (2002) 68:5051-5056).
[00158] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанная векторная система на основе рекомбинантного бактериального хозяина представляет собой биологически ограниченную систему. Биологическое ограничение известно специалистам в данной области техники и может быть реализовано путем введения ауксотрофной мутации, например, суицидной ауксотрофной мутации, например, мутации ThyA или ее эквивалентов, расстраивающих синтез ДНК. Другие примеры ауксотрофных мутаций могут расстраивать синтез РНК, клеточной стенки или белков. Как вариант, указанное биологическое ограничение может быть реализовано на уровне плазмиды, несущей ген, кодирующий полипептид ИЛ-10 или вариант ИЛ-10, например, с применением нестабильной эписомной конструкции, которая через несколько поколений утрачивается. Несколько уровней ограничения, таких как нестабильность плазмиды и ауксотрофность, могут быть скомбинированы для обеспечения, при необходимости, высокого уровня ограничения.
Конструкции
[00159] Согласно настоящему изобретению указанный микроорганизм (например, непатогенная грамположительная бактерия) доставляет полипептид ИЛ-10 и T1D-специфический антиген (например, PINS) в нужный сайт, т.е. слизистую оболочку. Например, указанный микроорганизм (например, МКБ) экспрессирует полипептид ИЛ-10, после чего полипептид ИЛ-10 секретируется (при использовании секретируемой формы ИЛ-10). Соответственно, согласно конкретному варианту реализации указанный микроорганизм (например, МКБ), такой как L. lactis, экспрессирует ИЛ-10 и PINS в сайте нужной слизистой оболочки, например, в желудочно-кишечном тракте.
[00160] Применение оперона позволяет обеспечить скоординированную экспрессию полипептида ИЛ-10 и полипептида T1D-специфического антигена (например, PINS). Полицистронные экспрессионные системы в бактериальных клетках-хозяевах описаны, например, в заявке на патент США №2014/0105863, Vanden-Broucke et al., которая включена в настоящий документ полностью посредством ссылки.
[00161] Согласно варианту реализации настоящее изобретение относится к стабильно трансфицированным микроорганизмам, т.е. микроорганизмам, в которых ген, кодирующий полипептид ИЛ-10, и ген T1D-специфического антигена (например, PINS) были интегрированы в геном клетки-хозяина. Методики создания стабильно трансфицированных микроорганизмов известны в данной области техники. Например, ген полипептида ИЛ-10 и T1D-специфического антигена (например, PINS) может быть клонирован в геном хозяина, например, в хромосому, путем гомологичной рекомбинации. Согласно некоторым вариантам реализации имеющий существенное значение ген хозяина разрушают с применением гомологичной рекомбинации, например, делеции указанного гена, одной или более замен аминокислот, приводящих к получению неактивной формы белка, кодируемого указанным имеющим существенное значение геном, или мутации со сдвигом рамки, приводящей к получению усеченной формы белка, кодируемого указанным имеющим существенное значение геном. Согласно варианту реализации указанный имеющий существенное значение ген представляет собой ген thyA. Предпочтительная техника описана, например, в WO 02/090551, который включен в настоящий документ полностью посредством ссылки. Указанная плазмида может быть самореплицирующейся, может нести, например, один или более представляющих интерес генов и один или более маркеров устойчивости. Далее, трансформирующая плазмида может представлять собой любую плазмиду, при условии, что она не способна дополнять разрушенный имеющий существенное значение ген, например, ген thyA. Как вариант, указанная плазмида представляет собой интегративную плазмиду. В последнем случае интегративная плазмида сама по себе может быть использована для разрушения имеющего существенное значение гена за счет интеграции в локус указанного имеющего существенное значение гена, например, в сайте thyA, с разрушением в результате функции указанного имеющего существенное значение гена, например, гена thyA. В некоторых случаях указанный имеющий существенное значение ген, такой как ген thyA, посредством двойной гомологичной рекомбинации заменяют кассетой, содержащей ген или гены, представляющие интерес, фланкированные нацеливающими последовательностями, которые нацеливают инсерцию на имеющий существенное значение ген, такой как целевой сайт thyA. Следует понимать, что указанные нацеливающие последовательности обладают достаточной длиной и достаточной гомологией, чтобы позволять интеграцию представляющего интерес гена в целевой сайт. Согласно некоторым примерам экспрессионная кассета с ИЛ-10 согласно настоящему описанию интегрирована в локус thyA.
[00162] Генетическая конструкция, кодирующая полипептид ИЛ-10 и T1D-специфический антиген (например, PINS), может быть интегрирована в микробную геномную ДНК, например, бактериальную или дрожжевую хромосому, например, хромосому Lactococcus. В последнем случае может быть интегрирована одна или несколько копий нуклеиновой кислоты; интеграция может происходить в случайном сайте хромосомы или, согласно описанию выше, в заранее заданном сайте хромосомы, например, в таком заранее заданном сайте, согласно неограничивающему примеру, как локус thyA Lactococcus, например, Lactococcus lactis.
[00163] Соответственно, согласно варианту реализации указанная генетическая конструкция, кодирующая полипептид ИЛ-10 и T1D-специфический антиген (например, PINS), может дополнительно содержать последовательности, способные осуществлять инсерцию указанной генетической конструкции в геном клетки-хозяина, например, в хромосому.
[00164] Согласно некоторым примерам инсерцию указанной генетической конструкции в конкретные сайты в геноме, например, в хромосоме клетки-хозяина может облегчать гомологичная рекомбинация. Например, генетическая конструкция согласно настоящему изобретению может содержать одну или более областей гомологии указанному сайту интеграции в геноме, например, в хромосоме клетки-хозяина. Последовательность в указанном геномном, например, хромосомном сайте может быть естественной, т.е. встречающейся в природе, или может представлять собой экзогенную последовательность, введенную путем генетического конструирования ранее. Например, размер указанной области или областей гомологии может составлять по меньшей мере 50 п.о., 100 п.о., 200 п.о., 300 п.о., 400 п.о., 500 п.о., 600 п.о. 700 п.о., 800 п.о., 900 п.о., 1000 п.о. или более.
[00165] Согласно одному примеру могут быть включены две области гомологии, по одной фланкирующей области с каждой стороны релевантных экспрессионных единиц, присутствующих в генетической конструкции согласно настоящему изобретению. Такая конфигурация может обеспечивать благоприятное встраивание релевантных последовательностей, т.е. по меньшей мере тех последовательностей, которые кодируют и осуществляют экспрессию представляющего интерес антигена, в клетки-хозяева. Способы проведения гомологичной рекомбинации, в частности, у бактериальных хозяев, и отбор рекомбинантных хозяев общеизвестны в данной области техники.
[00166] Специалисту в данной области техники известны способы трансформации микроорганизмов, такие как, например трансформация протопластов и электроперация.
[00167] Высокая степень экспрессии может быть достигнута с применением гомологичных сигналов экспрессии и/или секреции на экспрессионных векторах, присутствующих в микроорганизме, например, L. lactis. Сигналы экспрессии очевидны для специалиста в данной области техники. Указанный экспрессионный вектор может быть оптимизирован для экспрессии с учетом микроорганизма, например, L. lactis, в который его включают. Например, известны специфические экспрессионные векторы, обеспечивающие достаточные уровни экспрессии у Lactococcus, Lactobacillus lactis, casei и plantarum. Кроме того, известны системы, которые были разработаны для экспрессии гетерологичных антигенов в непатогенной, неколонизирующей неинвазивной бактерии Lactococcus lactis пищевого качества (см. патент Великобритании GB2278358B, который включен в настоящий документ посредством ссылки). В частности, предпочтительная конструкция в соответствии с настоящим изобретением содержит мультикопийный экспрессионный вектор, описанный в PCT/NL95/00135 (WO-A-96/32487), в который была включена последовательность нуклеотидов, кодирующая полипептид ИЛ-10 и/или T1D-специфический антиген (например, PINS). Такая конструкция подходит, в частности для экспрессии требуемого антигена молочнокислой бактерией, в частности, Lactobacillus, на высоком уровне, а также может благоприятным образом применяться для направления экспрессированного продукта на поверхность бактериальной клетки. Указанные конструкции (например, согласно PCT/NL95/00135) могут характеризоваться наличием нетранслируемой 5'-последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей по меньшей мере минимальную последовательность, необходимую для распознавания рибосомы и стабилизации РНК, предшествующей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид ИЛ-10 и/или TlD-специфический антиген (например, PINS). За указанной последовательностью может следовать кодон инициации трансляции, за которым может (непосредственно) следовать фрагмент из по меньшей мере 5 кодонов 5'-концевой части транслируемой последовательности нуклеиновой кислоты гена молочнокислой бактерии, или структурный или функциональный эквивалент указанного фрагмента. Указанный фрагмент может также находиться под контролем промотора. Содержание PCT/NL95/00135, в том числе раскрытые различающиеся варианты реализации и все другие документы, упоминаемые в указанном описании, включены в настоящий документ посредством ссылки. Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложен способ, который позволяет обеспечить высокий уровень регулируемой экспрессии гетерологичных генов у хозяина и сопряжение экспрессии с секрецией. Согласно другому варианту реализации для разработки эффективной экспрессионной системы используют РНК-полимеразу бактериофага Т7 с когнатным промотором, в соответствии с WO 93/17117, который включен в настоящий документ посредством ссылки. Согласно одному варианту реализации указанная экспрессионная плазмида происходит из pTI NX (GenBank: НМ585371.1).
[00168] В некоторых случаях бактерия конститутивно экспрессирует промотор, используемый в соответствии с настоящим изобретением. Применение конститутивного промотора позволяет избежать необходимости добавления индуктора или другого регуляторного сигнала для осуществления экспрессии. В некоторых случаях указанный промотор направляет осуществление экспрессии на уровне, при котором бактериальная клетка-хозяин остается жизнеспособной, т.е. сохраняет некоторую метаболическую активность, даже если не поддерживается рост. В указанном случае такая экспрессия может предпочтительным образом осуществляться на незначительном уровне. Например, если продукт экспрессии накапливается внутри клеток, указанный уровень экспрессии может приводить к накоплению указанного продукта экспрессии на уровне менее чем приблизительно 10% клеточного белка, приблизительно или менее чем приблизительно 5%, например приблизительно 13%. Указанный промотор может быть гомологичным для используемой бактерии, т.е. представлять собой промотор, обнаруживаемый в указанной бактерии в природе. Например, промотор лактококков может применяться для Lactococcus. Предпочтительный промотор для применения в Lactococcus lactis (или других лактококках) представлен «Р1», происходящим из хромосомы Lactococcus lactis (Waterfield, N R, Lepage, R W F, Wilson, P W, et al. (1995). "The isolation of lactococcal promoters and their use in investigating bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis" Gene 165(1):9-15). Другие примеры промотора включают промотор usp45, промотор gapB и промотор hllA. Другие подходящие промоторы описаны в патенте США 8759088, авторы Steidler et al., и в заявке на патент США №2014/0105863, авторы Vanden-Broucke et al., содержание которых включено в настоящий документ полностью посредством ссылки. Согласно некоторым примерам нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ИЛ-10, помещают под контроль промотора hllA.
[00169] Конструкция или конструкции нуклеиновых кислот могут содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую секреторную сигнальную последовательность. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации указанная нуклеиновая кислота, кодирующая ИЛ-10 и/или T1D-специфический антиген (например, PINS), может обеспечивать секрецию указанных полипептидов, например, путем сопряжения надлежащим образом последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнальную последовательность, с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный полипептид). Способность бактерии, несущей указанную нуклеиновую кислоту, к секреции антигена может быть протестирована in vitro в условиях культивирования, поддерживающих жизнеспособность указанного организма. Предпочтительные последовательности сигналов секреции включают любые такие последовательности, активные в грамположительных организмах, таких как Bacillus, Clostridium и Lactobacillus. Такие последовательности могут включать лидерную последовательность секреции α-амилазы Bacillus amyloliquetaciens или лидерную последовательность секреции фермента стафилокиназы, секретируемого некоторыми штаммами Staphylococcus, которые, как известно, функционируют как в грамположительных, так и в грамотрицательных хозяевах (см. "Gene Expression Using Bacillus," Rapoport (1990) Current Opinion in Biotechnology 1:21-27), или лидерные последовательности многих других ферментов Bacillus или белков S-слоя (см. стр. 341 344 источника: Harwood and Cutting, "Molecular Biological Methods for Bacillus," John Wiley & Co. 1990). Согласно одному варианту реализации указанный сигнал секреции происходит из usp45 (Van Asseldonk et al. (1993) Mol. Gen. Genet. 240:428-434). Такая лидерная последовательность секреции называется в настоящем документе, например, SSusp45. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ИЛ-10 конститутивно секретируют с применением SSusp45. Согласно другим примерам полипептид PINS секретируют с применением SSusp45. Согласно другим дополнительным примерам и полипептид ИЛ-10, и полипептид PINS секретируют с применением SSusp45.
[00170] Специалисту в данной области техники будет понятно, что оптимальное количество ИЛ-10 и PINS для доставки субъекту с применением способов согласно настоящему описанию варьирует, например, в зависимости от микроорганизма, экспрессирующего полипептид ИЛ-10 и полипептид PINS, и генетических конструкций, например, силы промотора, используемого в генетических конструкциях. Как правило, указанный микроорганизм вводят в количестве, эквивалентном конкретному количеству экспрессированного полипептида ИЛ-10 и полипептида PINS, или в количестве, которое обеспечивает достижение требуемого ФК-профиля для соответствующего полипептида ИЛ-10 или полипептида PINS у соответствующего субъекта. Примеры ежедневных доз полипептида ИЛ-10 или полипептида PINS: от приблизительно 10 фг до приблизительно 100 мкг активного полипептида в сутки. Другие примеры диапазонов доз: от приблизительно 1 пг до приблизительно 100 мкг в сутки; или от приблизительно 1 нг до приблизительно 100 мкг в сутки.
4
12
6
12
9
12
9
[00171] Вышеописанные дозы могут быть достигнуты путем введения субъекту эффективных количеств микроорганизма в сутки, при этом указанный микроорганизм адаптирован для экспрессии достаточного количества ИЛ-10 и T1D-специфического антигена (например, PINS) для достижения требуемой дозы, такой как представленные выше. Микроорганизм, секретирующий полипептид ИЛ-10 и T1D-специфический антиген (например, полипептид PINS), может быть доставлен в дозе от приблизительно 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) до приблизительно 10 КОЕ в сутки, в частности, от приблизительно 10 КОЕ до приблизительно 10 КОЕ в сутки, более конкретно, от приблизительно 10 КОЕ до приблизительно 10 КОЕ в сутки. Количество секретируемых ИЛ-10 и T1D-специфического антигена (например, полипептида PINS) может определено на основании КОЕ, например, в соответствии со способами, описанными в источнике: Steidler et al., Science 2000; 289(5483): 1352-1355, или с применением ИФА ELISA. Например, конкретный микроорганизм может секретировать по меньшей мере от приблизительно 1 нг до приблизительно 1 мкг ИЛ-10 на 10 КОЕ. На основании этих данных специалист может вычислить диапазон количества полипептида ИЛ-10, секретируемого при других дозах КОЕ.
[00172] Любая из представленных выше доз/диапазонов доз может вводиться в рамках любого режима дозирования согласно описанию в настоящем документе. Ежедневная доза может вводиться в 1, 2, 3, 4, 5 или 6 частях на протяжении дня. Также ежедневные дозы могут вводиться в течение любого количества дней, с любым количеством периодов отдыха между периодами введения. Например, субъекту может быть введен микроорганизм в дозе, эквивалентной приблизительно 0,01 -приблизительно 3 ММЕ ИЛ-10/сутки или один раз в двое суток, на протяжении периода, составляющего по меньшей мере приблизительно 1 неделю, по меньшей мере приблизительно 2 недели, по меньшей мере приблизительно 3 недели, по меньшей мере приблизительно 4 недели, по меньшей мере приблизительно 5 недель или по меньшей мере приблизительно 6 недель. Согласно некоторым примерам субъекту вводят микроорганизм в дозе, эквивалентной приблизительно 0,1 приблизительно 5 ММЕ/сутки, или приблизительно 0,3 до приблизительно 3 ММЕ, например, в течение приблизительно 5 дней, приблизительно 7 дней или приблизительно 14 дней. Примеры доз описаны, например, в источнике: Hartemann et al., Lancet Diabetes Endocrinol. 2013, 1(4): 295-305, содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылок полностью.
Составы и режимы
[00173] Согласно некоторым описанным в настоящем документе способам полипептид ИЛ-10 и T1D-специфический антиген (например, PINS) вводят (доставляют) субъекту (например, пациенте-человеку с T1D) с применением микроорганизма (например, МКБ), продуцирующего и полипептид ИЛ-10, и полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS).
[00174] Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм (например, МКБ), необязательно включенный в композицию (например, фармацевтическую композицию) согласно настоящему описанию или единичную лекарственную форму согласно настоящему описанию, вводят один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз или шесть раз ежедневно, например, с применением состава для перорального применения. Согласно некоторым вариантам реализации указанный микроорганизм вводят ежедневно, один раз в двое суток, один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю или четыре раза в неделю. Согласно другим вариантам реализации лечение проводят один раз в две недели. Согласно другим вариантам реализации лечение проводят один раз в три недели. Согласно другим вариантам реализации лечение проводят один раз в месяц.
[00175] Продолжительность цикла лечения составляет, например, 7 дней на протяжении жизни субъекта, для лечения или обращения T1D, или для предотвращения рецидива, согласно необходимости. Согласно некоторым вариантам реализации цикл лечения продолжают на протяжении от приблизительно 30 дней до приблизительно 2 лет. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 1,5 лет. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 1 года. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 11 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 10 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 9 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 8 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 7 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 6 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 5 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 4 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 3 месяцев. Согласно другим вариантам реализации цикл лечения у указанного субъекта продолжается от 30 дней до 2 месяцев.
[00176] Согласно дополнительным вариантам реализации цикл лечения основан на уровне маркеров для отслеживания прогрессирования заболевания, в том числе гликемического индекса, уровнях аутоантитела к инсулину (IAA), уровнях фрагмента С и инсулита. Предпочтительно, у субъекта ранний диабет. Также у субъекта может быть оценен уровень клеток Treg, которые подавляют иммунный ответ на бета-клетки. Согласно примеру реализации субъект получает лечение по меньшей мере до прекращения дальнейшего прогрессирования заболевания, предпочтительно до возвращения нормогликемии. Указанный пациент может получать лечение на протяжении дополнительного периода, чтобы гарантировать наличие популяции клеток Treg, которые подавляют и обращают заболевание. У субъекта могут также проводиться мониторинг и лечение при первом появлении каких-либо признаков возвращения заболевания.
[00177] Ежедневные поддерживающие дозы могут вводиться субъекту на протяжении клинически целесообразного периода, например от 1 дня до нескольких лет (например, на протяжении всей оставшейся жизни субъекта); например, от приблизительно (2, 3 или 5 дней, 1 или 2 недель, или 1 месяца) и дольше, и/или например, до приблизительно (5 лет, 1 года, 6 месяцев, 1 месяца, 1 недели, или 3 или 5 дней). Типичным является введение ежедневной поддерживающей дозы в течение от приблизительно 3 до приблизительно 5 дней, или в течение от приблизительно 1 недели до приблизительно 1 года. Однако при этом единицы дозы, например, вводят от двух раз в сутки до одного раза в две недели до достижения наблюдаемого терапевтического эффекта.
[00178] Микроорганизмы, продуцирующие полипептид ИЛ-10 и полипептид T1D-специфического антигена (например, PINS), может вводиться субъекту в виде монотерапии или комбинированной терапии (например, с применением режима котерапии) для лечения T1D. Термин «котерапия», «котерапевтический» или его варианты относится к схеме лечения, согласно которой субъекту вводят по меньшей мере один дополнительный терапевтически активный агент, такой как дополнительное иммуномодулирующее соединение. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации композиции согласно настоящему описанию включают дополнительные терапевтически активные агенты. Согласно некоторым вариантам реализации композиции согласно настоящему описанию содержат по меньшей мере одно дополнительное иммуномодулирующее вещество, например, антитела (например, антитела против CD3). Согласно некоторым примерам способы согласно настоящему описанию дополнительно включают введение субъекту (например, пациенту-человеку) дополнительного иммуномодулирующего вещества, например, антител (например, антител против CD3).
Фармацевтические композиции и носители
[00179] Микроорганизм (например, бактерии, такие как МКБ, описанные в настоящем документе) может вводиться в чистом виде, быть скомбинирован с другими активными ингредиентами, и/или скомбинирован с фармацевтически приемлемыми (т.е. нетоксичными) вспомогательными веществами или носителями. Термин «фармацевтически приемлемый» применяют в настоящем документе в соответствии с признанным в данной области техники значением и относится к носителям, которые совместимы с другими ингредиентами фармацевтической композиции, и не наносят вреда реципиенту.
[00180] Могут быть получены композиции согласно настоящему описанию с любой известной или иной эффективной дозировкой или формой продукта, подходящей для доставки микроорганизма (например, бактерий) в слизистую оболочку, включая фармацевтические композиции и лекарственные формы, а также формы питательных продуктов.
[00181] Согласно некоторым вариантам реализации указанная фармацевтическая композиция (т.е. состав) представляет собой пероральную фармацевтическую композицию. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанному варианту реализации, указанный состав или указанная фармацевтическая композиция содержит непатогенный микроорганизм в высушенной форме (например, в форме сухого порошка; например, в высушенной сублимацией форме) или в прессованной форме, необязательно, в комбинации с другими сухими носителями. Составы для перорального применения обычно включают инертный разбавляющий носитель или съедобный носитель.
[00182] Согласно некоторым примерам состав для перорального применения содержит покрытие или получен с применением стратегии инкапсуляции, что облегчает доставку указанного состава в кишечный тракт, и/или позволяет обеспечить высвобождение и увлажнение указанного микроорганизма в кишечном тракте (например, подвздошной кишке, тонком кишечнике или ободочной кишке). После высвобождения микроорганизма из состава и достаточного увлажнения он начинает экспрессировать биоактивные полипептиды, которые затем высвобождаются в окружающую среду, или экспрессируюгся на поверхности микроорганизма. Такие стратегии нанесения покрытий и инкапсуляции (т.е. стратегии отсроченного высвобождения) известны специалистам в данной области техники. См., например, U.S. 5972685; WO 2000/18377; и WO 2000/22909, содержание которых включено в настоящий документ полностью посредством ссылки.
[00183] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая микроорганизм (например, непатогенные бактерии) в лиофилизированной или сублимированной форме, необязательно в сочетании с другими компонентами, такими как декстраны, глутамат натрия и многоатомные спирты. Примеры сублимированных композиций описаны, например, в заявке на патент США №2012/0039853, авторы Corveleyn et al., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Примеры составов включают высушенные сублимацией бактерии (например, терапевтически эффективное количество указанных бактерий) и фармацевтически приемлемый носитель. Высушенные сублимацией бактерии могут быть введены в состав капсул, таблеток, гранулятов и порошков, каждый из которых может вводиться перорально. Как вариант, высушенные сублимацией бактерии могут быть введены в состав водных суспензий в подходящих средах, или лиофилизированные бактерии могут быть суспензированы в подходящей среде, такой как напиток, непосредственно перед применением. Такие композиция может, кроме того, содержать стабилизирующий агент, подходящий для поддержания стабильности суспензии, например, без осаждения, агрегации или всплывания бактериальной биомассы.
[00184] Состав для перорального введения может представлять собой гастрорезистентную лекарственную форму для перорального применения. Например, указанная лекарственная форма для перорального применения (например, капсулы, таблетки, пеллеты, микропеллеты, грануляты и т.п.) может быть покрыта тонким слоем вспомогательного вещества (как правило, полимерами, целлюлозными производными и/или липофильными материалами), устойчивого к растворению или деградации в желудке, однако не в кишечнике, с обеспечением таким образом транзита через желудок, способствующего распадению, растворению и абсорбции в кишечнике (например, в тонком кишечнике или ободочной кишке).
nd
[00185] Согласно некоторым примерам составы для перорального применения могут включать соединения, обеспечивающие контролируемое высвобождение продолжительное высвобождение или пролонгированное высвобождение указанного микроорганизма, с обеспечением таким образом контролируемого высвобождения кодируемого им требуемого белка. Указанные лекарственные формы (например, таблетки или капсулы), как правило, содержат стандартные и хорошо известные вспомогательные вещества, такие как липофильные, полимерные, целлюлозные, нерастворимые и/или набухающие вспомогательные вещества. Составы для контролируемого высвобождения могут также применяться для любых других сайтов доставки, включая доставку в кишечник, ободочную кишку, биоадгезивную или сублингвальную доставку (т.е. доставку в слизистую оболочку зубов) и доставку в бронхи. Если композиции согласно настоящему изобретению предназначены для ректального или вагинального введения, фармацевтические составы могут включать суппозитории и кремы. В указанном случае клетки-хозяева суспензируют в смеси обычных вспомогательных веществ, включающих также липиды. Все вышеупомянутые составы хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в следующих источниках: Hansel et al. (1990, Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5th edition, William and Wilkins); Chien 1992, Novel drug delivery system, 2 edition, M. Dekker); Prescott et al. (1989, Novel drug delivery, J. Wiley & Sons); Gazzaniga et al., (1994, Oral delayed release system for colonic specific delivery. Int. J. Pharm. 108:77-83).
[00186] Согласно некоторым вариантам реализации указанный состав для перорального применения включает соединения, которые могут усиливать доставка в слизистую оболочку и/или поглощение в слизистой оболочке биоактивных полипептидов, экспрессируемых микроорганизмом. Согласно другим примерам указанный состав включает соединения, которые повышают жизнеспособность микроорганизма в составе и/или после высвобождения.
[00187] Бактерии согласно настоящему изобретению могут быть суспензированы в фармацевтическом составе для введения человеку или животному, страдающему заболеванием, подлежащим лечению. Такие фармацевтические составы включают, не ограничиваясь перечисленными, живые грамположительные бактерии и среду, подходящую для введения. Указанные бактерии могут быть лиофилизированы в присутствии обычных вспомогательных веществ, таких как лактоза, другие сахара, стеарат, карбонат и/или сульфат щелочного и/или щелочно-земельного металла (например, стеарат магния, карбонат натрия и сульфат натрия), каолин, кремнезем, вкусоароматические вещества и ароматизаторы. Лиофилизированные таким образом бактерии могут быть введены в состав капсул, таблеток, гранулятов и порошков (например, ополаскивателя для полости рта в виде порошка), любые из которых могут вводиться перорально. Как вариант, некоторые грамположительные бактерии могут быть введены в состав водных суспензий в подходящих средах, или лиофилизированные бактерии могут быть суспензированы в подходящей среде непосредственно перед применением, при этом такая среда включает вспомогательные вещества, упомянутые в настоящем документе, и другие вспомогательные вещества, такие как глюкоза, глицин и сахаринат натрия.
[00188] Согласно некоторым примерам указанный микроорганизм локально доставляют в желудочно-кишечный тракт субъекта с применением любого подходящего способа. Например, для улучшения доставки в кишечник могут применяться системы доставки на микросферах. Системы доставки на микросферах включают микрочастицы с покрытием, которое обеспечивает локализованное высвобождение в желудочно-кишечном тракте субъекта (как, например, составы для контролируемого высвобождения, такие как покрытые кишечнорастворимой оболочкой составы и составы для толстой кишки).
[00189] Могут быть получены гастрорезистентные лекарственные формы для перорального применения, которые могут также включать соединения, обеспечивающие контролируемое высвобождение грамположительных бактерий, с обеспечением таким образом контролируемого высвобождения требуемого кодируемого ими белка (например, ИЛ-10). Например, лекарственная форма для перорального применения (в том числе капсулы, таблетки, пеллеты, грануляты, порошки) может быть покрыта тонким слоем вспомогательного вещества (например, полимерами, целлюлозными производными и/или липофильными материалами), устойчивыми к растворению или деградации в желудке, однако не в кишечнике, с обеспечением таким образом транзита через желудок, способствующего распадению, растворению и абсорбции в кишечнике.
[00190] Может быть разработана лекарственная форма для перорального применения, позволяющая обеспечить медленное высвобождение грамположительных бактерий и продуцированных экзогенных белков, например, в виде таблеток или капсул для контролируемого высвобождения, продолжительного высвобождения,
th
nd
пролонгированного высвобождения, продолжительного действия. Указанные лекарственные формы обычно содержат стандартные и хорошо известные вспомогательные вещества, такие как липофильные, полимерные, целлюлозные, нерастворимые и/или набухающие вспомогательные вещества. Такие составы хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в следующих источниках: Hansel et al., Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems, 5 edition, William and Wilkins, 1990; Chien 1992, Novel drug delivery system, 2 edition, M. Dekker; Prescott et al., Novel drug delivery, J.Wiley & Sons, 1989; и Gazzaniga et al., Int. J. Pharm. 108: 77-83 (1994).
[00191] Указанная фармацевтическая лекарственная форма {например, капсула) может быть покрыта рН-зависимыми полимерами Eudragit для обеспечения устойчивости к желудочному соку и запланированной доставки в терминальный отдел подвздошной кишки и ободочную кишку, где указанные полимеры растворяются при рН 6,5. Путем применения других полимеров Eudragit или другой пропорции полимеров профиль отсроченного высвобождения может быть скорректирован для высвобождения указанных бактерий, например, в двенадцатиперстной кишке или тощей кишке.
[00192] Фармацевтические композиции содержат по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Неограничивающие примеры подходящих вспомогательных веществ, разбавителей и носителей включают консерванты, неорганические соли, кислоты, основания, буферы, питательные вещества, витамины, наполнители и агенты для увеличения объема, такие как крахмал, сахара, маннит и производные кремнезема; связующие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин и поливинилпирролидон; увлажняющие агенты, такие как глицерин/ агенты для улучшения распадаемости, такие как карбонат кальция и бикарбонат натрия; агенты для замедления растворения, такие как парафин; ускорители резорбции, такие как четвертичные соединения аммония; поверхностно-активные агенты, такие как ацетиловый спирт, моностеарат глицерина; адсорбционные носители, такие как каолин и бентонит; носители, такие как пропиленгликоль и этиловый спирт, и смазывающие вещества, такие как тальк, стеарат кальция и магния, и твердые полиэтилгликоли.
[00193] Фармацевтически совместимые связующие агенты и/или адъювантные материалы могут быть включены в состав композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, троше и т.п. могут содержать любые из следующих ингредиентов, или соединения аналогичной природы: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза, диспергирующий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; скользящее вещество, такое как коллоидный диоксид кремния; подслащивающий агент, такой как сахароза или сахарин; или вкусоароматический агент, такой как перечная мята, метилеалицилат или апельсиновый вкусоароматический агент. Если единичная лекарственная форма представлена капсулой, она может содержать, помимо материалов описанного выше типа, жидкий носитель, такой как жирное масло. Кроме того, единичные лекарственные формы могут содержать различные другие материалы, модифицирующие физическую форму единицы дозирования, например, покрытия из сахара, шеллака или кишечнорастворимые агенты. Кроме того, сироп может содержать, помимо активных соединений, сахарозу в качестве подслащивающего агента и определенные консерванты, красители, подкрашивающие вещества и вкусоароматизаторы. Следует понимать, что форму и характеристики фармацевтически приемлемого носителя определяет количество активного ингредиента, с которым его комбинируют, маршрута введения и других хорошо известных переменных. Носитель или носители должны быть «приемлемыми» в смысле совместимости с другими ингредиентами состава и не наносить вреда реципиента.
[00194] Альтернативные варианты составов для введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются диметилсульфоксид, спирты, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и подходящие для инъецирования органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают смеси спиртов и воды, забуференные среды и солевой раствор. Внутривенные основы включают восполнители жидкости и питательных веществ, восполнители электролитов, например, на основе раствора Рингера с декстрозой, и т.п. Могут также присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты, инертные газы и т.п. Для указанных способов доставки подходят различные жидкие составы, в том числе солевой раствор, растворы спиртов, ДМСО и растворы на водной основе.
[00195] Пероральные водные составы включают вспомогательные вещества, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния и/или т.п., фармацевтического качества. Указанные композиции принимают форму растворов, такие как ополаскиватели и средства для полоскания рта, дополнительно содержащих водный носитель, такой как, например, вода, спиртовые /водные растворы, солевые растворы, парентеральные основы, такие как хлорид натрия, раствор Рингера с декстрозой и т.п.
[00196] Водные составы для полоскания рта хорошо известны специалистам в данной области техники. Составы, относящиеся к жидкостям для полоскания рта и пероральным ополаскивателям подробно описаны, например, в патенте США 6387352, патенте США 6348187, патенте США 6171611, патенте США 6165494, патенте США 6117417, патенте США 5993785, патенте США 5695746, патенте США 5470561, патенте США 4919918, заявке на патент США №2004/0076590, заявке на патент США №2003/0152530 и заявке на патент США №2002/0044910, каждый(ая) из которых конкретным образом включен(а) посредством ссылки в данный раздел настоящего описания и во все другие разделы настоящего описания.
[00197] В составах согласно настоящему описанию могут присутствовать другие добавки, такие как вкусоароматические агенты, подслащивающие или красящие агенты, или консерванты. Мята, например, мята перечная или мята кудрявая, корица, эвкалипт, цитрусовые, кассия, анис и ментол являются примерами подходящих вкусоароматических агентов. Вкусоароматические агенты, например, присутствуют в пероральных композициях в количестве, находящемся в диапазоне от 0 до 3%; до 2%, например, до 0,5%, например, около 0,2%, в случае жидких композиций.
[00198] Подсластители включают искусственные или естественные подслащивающие агенты, такие как сахарин натрия, сахароза, глюкоза, сахарин, декстроза, левулоза, лактоза, маннит, сорбит, фруктоза, мальтоза, ксилит, тауматин, аспартам, D-триптофан, дигидрохалконы, ацесульфам и любая их комбинация, которые могут присутствовать в указанной пероральной композиции в количестве, находящемся в диапазоне от 0 до 2%, например, до 1% по массе, например, от 0,05 до 0,3% по массе.
[00199] Красящие агенты представлены подходящими естественными или синтетическими красителями, такими как диоксид титана или CI42090, или их смесями. Красящие агенты предпочтительно присутствуют в указанных композициях в количестве, находящемся в диапазоне от 0 до 3%; например, до 0,1%, например, до 0,05%, например, около 0,005-0,0005%, в случае жидких композиций. Среди обычных консервантов предпочтительным является бензоат натрия в концентрациях, недостаточных по существу для изменения рН композиции, в ином случае может быть необходимо скорректировать количество буферного агента для достижения требуемого значения рН.
[00200] Другие необязательные ингредиенты включают увлажнители, поверхностно-активные вещества (неионогенные, катионные или амфотерные), загустители, камеди и связующие агенты. Увлажнитель улучшает консистенцию состава и удерживает влагу в композиции для ухода за зубами. Кроме того, увлажнитель помогает предотвратить микробное разложение при хранении состава. Он также способствует поддержанию стабильности фазы и обеспечивает возможность получения прозрачных или полупрозрачных средств для ухода за зубами.
[00201] Подходящие увлажнители включают глицерин, ксилит, глицерин и гликоли, такие как пропиленгликоль, каждый из которых может присутствовать, например, в количестве до 50% по массе, однако общее содержание увлажнителя в некоторых случаях составляет не более чем приблизительно 60-80% композиции по массе. Например, жидкие композиции могут содержать до приблизительно 30% глицерина и до приблизительно 5%, например, приблизительно 2% ксилита по массе. Поверхностно-активные вещества предпочтительно не являются анионными и могут включать полисорбат 20 или кокоамидобетаин, или т.п., в количестве до приблизительно 6%, например, приблизительно 1,5-3% композиции по массе.
[00202] В тех случаях, когда пероральные композиции согласно настоящему изобретению представлены жидкой формой, предпочтительно включение пленкообразующего агента в количестве до приблизительно 3% пероральной композиции по массе, такие как в диапазоне от от 0 до 0,1%, например, от приблизительно 0,001 до 0,01%, например, приблизительно 0,005% пероральной композиции по массе. Подходящие пленкообразователи включают (помимо гиалуроната натрия) продаваемые под торговым названием Gantrez.
[00203] Жидкие питательные составы для перорального или энтерального введения могут содержать одно или более питательных веществ, таких как жиры, углеводы, белки, витамины и минеральные вещества. Известно множество разных источников и типов углеводов, липидов, белков, минеральных веществ и витаминов, которые могут быть использованы для питательных жидких составов согласно вариантам реализации настоящего изобретения, при условии, что такие питательные вещества совместимы с добавленными ингредиентами в выбранном составе, безопасны и эффективны для предполагаемого применения, и иным образом излишне не снижают функциональную эффективность продукта.
[00204] Состав указанных питательных жидкостей обладает, например, достаточной вязкостью, текучестью или другими физическими или химическими характеристиками, обеспечивающими более эффективное и мягкое покрытие слизистой оболочки при питье или введении питательной жидкости. Указанные варианты реализации питательных составов также в некоторых случаях представляют собой сбалансированный источник питания, подходящий для удовлетворения всех, основных или дополнительных потребностей индивидуума в питании.
[00205] Неограничивающие примеры подходящих питательных жидкостей описаны в патенте США 5700782 (Hwang et al.); патенте США 5869118 (Morris et al.); и патенте США 5223285 (DeMichele et al.), содержание которых включено в настоящий документ полностью посредством ссылки.
[00206] Питательные белки, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, могут быть гидролизованными, частично гидролизованными или негидролизованными, и могут происходить из любого известного или иного подходящего источника, такого как молоко (например, казеин, сыворотка), животные (например, мясо, рыба), злаки (например, рис, кукуруза), растения (например, соя) или любая их комбинация.
[00207] Жиры или липиды, подходящие для применения в питательных жидкостях, включают, не ограничиваясь перечисленными, кокосовое масло, соевое масло, кукурузное масло, оливковое масло, сафлоровое масло, высокоолеиновое сафлоровое масло, МСТ-масло (триглицериды со средней цепью), подсолнечное масло, высокоолеиновое подсолнечное масло, структурированные триглицериды, пальмовое и пальмоядровое масло, пальмовый олеин, масло канолы, масла из рыбы и морепродуктов, хлопковое масло и любую комбинацию перечисленного. Углеводы, подходящие для применения в питательных жидкостях, могут быть простыми или сложными, содержать лактозу или быть безлактозными, или соответствовать любой комбинации перечисленного. Неограничивающие примеры подходящих углеводов включают гидролизованный кукурузный крахмал, мальтодекстрин, глюкоза полимеры, сахароза, кукурузный сироп, кукурузный сироп твердые вещества, углеводы из риса, глюкоза, фруктоза, лактоза, высокофруктозный кукурузный сироп и неперевариваемые олигосахариды, такие как фруктоолигосахариды (ФОС), и любую комбинацию перечисленного.
[00208] Питательные жидкости могут дополнительно содержать любые из разнообразных витаминов, неограничивающие примеры которых включают витамин А, витамин D, витамин Е, витамин К, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, витамин В12, ниацин, фолиевую кислоту, пантотеновую кислоту, биотин, витамин С, холин, инозит, их соли и производные, и любую их комбинацию.
[00209] Питательные жидкости могут дополнительно содержать любые из разнообразных минеральных веществ, известных или иным образом подходящих для применения у пациентов, подверженных риску или страдающих T1D, неограничивающие примеры которых включают кальций, фосфор, магний, железо, селен, марганец, медь, йод, натрий, калий, хлориды и любую их комбинацию.
[00210] Микроорганизмы и, в частности, дрожжи и бактерии согласно настоящему изобретению могут также быть введены в состав эликсиров или растворов для удобного перорального или ректального введения, или растворов, подходящих для парентерального введения, например, внутримышечным, подкожным или внутривенным путем. Кроме того, нуклеозидные производные также хорошо подходят для получения лекарственных форм с продолжительным или пролонгированным высвобождением, в том числе лекарственных форм, которые высвобождают активный ингредиент исключительно или в некоторых случаях в конкретной части кишечного тракта, например, на протяжении продленного или пролонгированного периода времени для дополнительного повышения эффективности. Покрытия, оболочки и защитные матрицы в таких лекарственных формах могут быть изготовлены, например, из полимерных веществ или восков, хорошо известных в области фармацевтики.
[00211] Композиции согласно настоящему изобретению включают такие фармацевтические лекарственные формы, как леденцы для рассасывания, троше или пастилки. Они, как правило, представлены твердым веществом, которому придают дисковидную форму, содержащим активный ингредиент в подходящим образом ароматизированной базе. Указанная база может представлять собой твердый леденцовый сахар, глицеринированный желатин или комбинацию сахара с достаточным количеством клейкого вещества для придания формы. Троше помещают в ротовую полость, где они медленно растворяются, высвобождая активный ингредиент, непосредственно контактирующий со слизистой оболочкой.
[00212] Варианты реализации настоящего изобретения в виде троше могут быть получены, например, путем медленного добавления воды к смеси порошка активного вещества, сахарной пудры и камеди до формирования пластичной массы. Для придания достаточной адгезивности указанной массе может быть использован 7% порошок аравийской камеди. Массу раскатывают и троше поштучно вырезают из плоско раскатанной массы, либо из указанной массы может быть сформирован цилиндр и разделен на фрагменты. Всем штучным фрагментам, вырезанным или отделенным, придают форму и оставляют для высушивания, с получением таким образом лекарственной формы троше.
[00213] Если активный ингредиент термолабилен, он может быть введен в состав леденцов для рассасывания путем прессования. Например, этап грануляции указанного состава осуществляют аналогичным используемому для любых прессованных таблеток образом. Леденцы для рассасывания изготавливают с применением мощного компрессионного оборудования для получения более твердой, чем обычно, таблетки, поскольку для указанной лекарственной формы желательным является медленное растворение или распадение в полости рта. В некоторых случаях ингредиенты выбирают таким образом, чтобы они способствовали медленному растворению.
[00214] В конкретном составе согласно настоящему изобретению микроорганизмы включают в биоадгезивный носитель, содержащий прежелатинизированный крахмал и перекрестно-сшитую поли(акриловую кислоту) с получением биоадгезивной таблетки и биоадгезивного геля, подходящих для буккального применения (т.е. обеспечивающих пролонгированную биоадгезию и продолжительную доставку лекарственных средств).
[00215] Согласно альтернативному варианту реализации из порошковой смеси непатогенной неинвазивной бактерии в соответствии с настоящим изобретением, биоадгезивных полимеров (прежелатинизированного крахмала и перекрестно-сшитой поли(акриловой кислоты), обработанных совместно путем высушивания распылением), стеарилфумарата натрия (смазывающее вещество) и диоксида кремния (скользящее вещество) получают таблетки (масса: 100 мг; диаметр: 7 мм). Способы получения указанных таблеток хорошо известны специалисту в данной области техники; ранее была описана успешная разработка с применением указанных способов биоадгезивных таблеток, содержащих различные лекарственные средства (миконазол, тестостерон, фторид, ципрофлоксацин) (Bruschi М.L. and de Freitas О., Drug Development and Industrial Pharmacy, 2005 31:293-310). Все материалы вспомогательных веществ коммерчески доступны в фармацевтическом качестве.
[00216] Для оптимизации состава используют варьирующие лекарственную нагрузку в таблетках и пропорцию крахмала и поли(акриловой кислоты). На основании предыдущих исследований максимальная лекарственная нагрузка в совместно обработанном биоадгезивном носителе составляет приблизительно 60% (по массе), а пропорция крахмала/поли(акриловой кислоты) может варьировать от 75/25 до 95/5 (по массе). При исследовании оптимизации основными оценочными параметрами являются биоадгезивные свойства таблеток и высвобождение лекарственного средства из таблеток, а стандартные свойства таблеток (твердость, истираемость) представляют собой вторичные оценочные критерии.
[00217] Указанные бактерии вводили в водную дисперсию прежелатинизированного крахмала и перекрестно-сшитой поли(акриловой кислоты). Указанную дисперсию полимеров получают путем проведения стандартной процедуры с использованием смесителя с высоким усилием сдвига.
[00218] Аналогично таблеткам, лекарственную нагрузку геля и пропорция крахмала/поли(акриловой кислоты) необходимо оптимизировать для получения геля с оптимальной адгезией к слизистой оболочке пищевода. В случае геля концентрация полимеров в дисперсии представляет собой дополнительную переменную, так как она определяет вязкость геля и, следовательно, его мукоадгезивные свойства.
[00219] Модель для скрининга биоадгезивных свойств дисперсий полимеров в отношении слизистой оболочки пищевода была подробно описана Batchelor с соавторами (Batchelor et al. Int. J. Pharm., 238:123-132, 2002).
[00220] Другие маршруты и формы введения включают пищевые составы, содержащие живые микроорганизмы. Согласно некоторым примерам экспрессирующий биоактивный полипептид микроорганизм может быть включен в молочный продукт.
[00221] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены любым известным или иным эффективным способом получения или изготовления выбранной лекарственной формы. Например, микроорганизмы могут быть введены в состав с обычными, например, фармацевтически приемлемыми носителями, такими как вспомогательные вещества и разбавители, с получением пероральных таблеток, капсул, спреев, леденцов для рассасывания, обработанных субстратов (например, тампонов, прокладок для перорального или местного применения или неусвояемого субстрата для однократного применения, обработанного композициями согласно настоящему изобретению); пероральных жидкостей (например, суспензий, растворов, эмульсий), порошков, суппозиториев или любой другой подходящей лекарственной формы. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен способ получения фармацевтической композиции. Примеры способов включают: приведение микроорганизма (например, непатогенной бактерии), содержащего ген ИЛ-10 и ген T1D-специфического антигена (или способного экспрессировать указанные ИЛ-10 и T1D-специфический антиген), в контакт с фармацевтически приемлемым носителем, с получением таким образом фармацевтической композиции. Согласно некоторым примерам указанный способ дополнительно включает: культивирование указанного микроорганизма в среде. Указанный способ может дополнительно включать сублимационную сушку жидкости, содержащей указанный микроорганизм, причем указанная жидкость необязательно включает фармацевтически приемлемый носитель.
Единичные лекарственные формы
3
14
4
13
4
12
5
12
6
12
8
12
9
12
9
11
9
10
7
11
8
10
[00222] Согласно настоящему изобретению также предложены единичные лекарственные формы, содержащие определенное количество непатогенного микроорганизма, необязательно в комбинации с носителем пищевого качества или фармацевтически приемлемым носителем, при этом указанный непатогенный микроорганизм (например, непатогенная грамположительная бактерия) содержит: экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид ИЛ-10; и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую специфический для сахарного диабета I типа (T1D) антиген (например, PINS). Примеры единичных лекарственных форм содержат от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Другие примеры единичных лекарственных форм содержат от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии) или от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии). Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии).
9
10
9
9
[00223] Согласно другим дополнительным вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 1 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), или от приблизительно 1 × 10 до приблизительно 100 × 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) непатогенного микроорганизма (например, непатогенной грамположительной бактерии).
[00224] Указанная единичная лекарственная форма может принимать любое физическое состояние или форму. Согласно некоторым вариантам реализации указанная единичная лекарственная форма адаптирована для перорального введения. Согласно некоторым примерам, соответствующим указанным вариантам реализации, указанная единичная лекарственная форма находится в форме капсулы, таблетки или гранулы. Примеры капсул включают капсулы, наполненные микрогранулами. Согласно некоторым вариантам реализации непатогенный микроорганизм (например, непатогенная грамположительная бактерия), содержащийся в указанной лекарственной форме, находится в форме сухого порошка. Например, указанный микроорганизм находится в форме высушенного сублимацией порошка, необязательно прессованного и с нанесенным покрытием.
[00225] Указанные композиции и способы можно лучше понять путем обращения к приведенным ниже примерам, однако специалистам в данной области техники будет понятно, что указанные примеры служат исключительно для иллюстрации настоящего изобретения, более подробно представленного в описании вариантов реализации и формуле изобретения ниже. Кроме того, в тексте настоящей заявки цитируются различные публикации. Содержание указанных публикаций полностью включено в настоящий документ посредством ссылок.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Конструирование Lactococcus lactis клинического качества, секретирующей hPINS и hIL10
[00226] Штамм Lactococcus lactis (sAGX0407), секретирующий PINS человека и ИЛ-10 человека получали путем замены локализованного в хромосоме гена тимидилатсинтазы (thyA) в исходном штамме MG1363 на экспрессионную кассету с PINS и ИЛ-10 человека с применением ранее описанных способов. См., например, Steidler L. et al., Nat. Biotechnol. 2003; 21:785-789; и Steidler L, Rottiers P; Annals of the New York Academy of Sciences 2006; 1072:176-186. В способах введения изменений в хромосому L. lactis задействовано применение двойной гомологичной рекомбинации. Конструировали условно-репликативную плазмиду-носитель, происходящую из pORI19 и содержащую селективный маркер устойчивости к эритромицину, в штамме repA+L. lactis LL108. Плазмиды-носители разрабатывали таким образом, чтобы клонировать представляющую интерес карго-последовательность между областями кроссинговера (ХО) размером до 1 т.п.н., идентичными областям, фланкирующим последовательность дикого типа на бактериальной хромосоме. Указанную плазмиду вводили в MG1363 или любые его производные (repA-). Устойчивые колонии отбирали на чашках с агаром, содержащим эритромицин, и первую гомологичную рекомбинацию в 5' или 3' целевом сайте верифицировали путем ПЦР-скрининга. Отмена отбора по устойчивости к эритромицину позволяла обеспечить эксцизию плазмиды-носителя из бактериальной хромосомы при второй гомологичной рекомбинации, в 5' или 3' целевом сайте. Итоговая генетическая структура штамма клинического качества была тщательно документирована путем секвенирования полного генома по методу как Сэнгера, так и Illumina. Итоговый клинический штамм не содержит плазмид и не обладает остаточной устойчивостью к эритромицину. См., например, Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789.
[00227] sAGX0407 представляет собой производное Lactococcus lactis (L. lactis) MG1363. В sAGX0407:
• Ген тимидилатсинтазы (thyA; идентификатор гена: 4798358) отсутствует, чтобы гарантировать средовое ограничение (Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789).
• В положении, где был делетирован thyA, и в направлении 3' от конститутивного промотора гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (РМЛ; идентификатор гена: 4797353), встроен ген, кодирующий лидерную последовательность секреции гена неидентифицированного секретируемого белка 45 кДа (usp45; идентификатор гена: 4797218; SSusp45), слитый с геном hil-10, кодирующим интерлейкин-10 человека (чИЛ-10; UniProt: Р22301, АК 19-178, вариант Р2А; Steidler, L., et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789), что позволяет обеспечить экспрессию и секрецию чИЛ-10.
• Ген трегалоза-6-фосфат-фосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140) отсутствует, что позволяет обеспечить накопление экзогенно добавляемой трегалозы.
• Ген трегалоза-6-фосфат-фосфатазы (otsB; идентификатор гена: 1036914) расположен в направлении 3' от usp45 (идентификатор гена: 4797218) для облегчения конверсии трегалоза-6-фосфата в трегалозу. Экспрессионная единица otsB была транскрипционно и трансляционно сопряжена с usp45 с использованием межгенной области (IR), предшествующей экспрессируемому на высоком уровне гену белка L30 рибосомальной субъединицы 50S L. lactis MG1363 (rpmD; идентификатор гена: 4797873).
• Конститутивный промотор гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (PhllA; идентификатор гена: 4797353) предшествует предполагаемым генам фосфотрансферазы в трегалозном опероне (trePTS; llmg_0453 и llmg_0454; идентификатор гена: 4797778 и идентификатор гена: 4797093, соответственно) для потенцирования поглощения трегалозы.
• Ген, кодирующий компонент ПС целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (идентификатор гена: 4796893), ptcC, был разрушен (tga в положении кодона 30 из 446; tga30). Указанная мутация гарантирует удержание трегалозы после накопления.
• Ген, кодирующий слияние лидерной последовательности секреции usp45 (SSusp45) с геном pins, кодирующим проинсулин человека (PINS; UniProt: Р01308, аминокислоты 25-110), располагается в направлении 3' от гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gapB; идентификатор гена: 4797877), что позволяет обеспечить экспрессию и секрецию PINS. Экспрессионная единица pins была транскрипционно и трансляционно сопряжена с gapB с использованием IRrpmD.
[00228] Все генетические признаки sAGX0407 располагаются на бактериальной хромосоме. Генетический фон SAGX0407 обеспечивает:
• Конститутивную секрецию PINS и чИЛ-10.
• Строгую зависимость от экзогенно добавляемого тимидина для роста и выживания.
• Способность накапливать и удерживать трегалозу, и таким образом приобретать способность противостоять токсичному воздействию желчных кислот.
[00229] На фиг.18 показан схематический обзор релевантных генетических локусов SAGX0407 согласно описанию: trePTS, ΔtrePP; otsB; ptcC-; gapB>>pins и ΔthyA, чИЛ-10 с указанием релевантных сайтов связывания олигонуклеотидов (oAGXno), сайта рестрикции EcoRI, (/усеченных/) генетических признаков, межгенных областей (IR), размеров продуктов ПЦР-амплификации (п.о.).
trePTS, ΔtrePP
[00230] Делеция гена трегалоза-6-фосфат-фосфорилазы (trePP; идентификатор гена: 4797140); инсерция конститутивного промотора гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (PhllA; идентификатор гена: 4797353) перед предполагаемыми генами фосфотрансферазы в трегалозном опероне (trePTS; llmg_0453 и llmg_0454; ptsI и ptsII; идентификатор гена: 4797778 и идентификатор гена: 4797093 соответственно), инсерция межгенной области, предшествующей экспрессируемому на высоком уровне гену белка L30 рибосомальной субъединицы 50S L. lactis MG1363 (rpmD; идентификатор гена: 4797873), между ptsI и ptsII (фиг.13А, 13В и 13С).
otsB
[00231] Инсерция гена трегалоза-6-фосфат-фосфатазы (otsB; идентификатор гена: 1036914) в направлении 3' от гена неидентифицированного секретируемого белка 45 кДа (usp45; идентификатор гена: 4797218). Инсерция межгенной области, предшествующей экспрессируемому на высоком уровне гену белка L30 рибосомальной субъединицы 50S L. lactis MG1363 (rpmD; идентификатор гена: 4797873), между usp45 и otsB (фиг.14А и 14В).
ptcC -
[00232] Инсерция tga в положении кодона 30 из 446 (tga30) наряду с введением сайта рестрикции EcoRI для разрушения гена, кодирующего компонент IIC целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (ptcC; идентификатор гена: 4796893) (фиг.15А и 15В).
gapB>>pins
[00233] Инсерция гена, кодирующего слияние лидерной последовательности секреции usp45 (SSusp45) с геном pins, кодирующим проинсулин человека (PINS; UniProt: Р01308, аминокислоты 25-110), в направлении 3' от экспрессируемого на высоком уровне гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (gapB; идентификатор гена: 4797877). Инсерция межгенной области, предшествующей экспрессируемому на высоком уровне гену белка L30 рибосомальной субъединицы 50S L. lactis MG1363 (rpmD; идентификатор гена: 4797873), между gapB и pins (фиг.12А, 12В и 16)
ΔthyA, чИЛ-10
[00234] Делеция гена тимидилатсинтазы (thyA; идентификатор гена: 4798358). Инсерция гена, кодирующего слияние SSusp45 с геном hil-10, кодирующим интерлейкин-10 человека (чИЛ-10; UniProt: Р22301, АК 19-178, вариант Р2А, Steidler et al., Nat. Biotechnol. 2003, 21(7): 785-789), в направлении 3' от конститутивного промотора гена HU-подобного ДНК-связывающего белка (PhllA; идентификатор гена: 4797353), что позволяет обеспечить экспрессию и секрецию чИЛ-10 (фиг.17).
Пример 2
Лечение диабета у мышей
9
[00235] Проводили скрининг возникновения диабета у мышей NOD путем оценки уровней глюкозы в моче (индикаторные полоски Diastix, Bayer, Леверкузен, Германия) и венозной крови (AccuCheck, Roche Diagnostics, Вилворде, Бельгия). У мышей диагностировали диабет при наличии глюкозурии и результатах двух последовательных измерений уровня глюкозы в крови, превышающих 200 мг/дл. После определения диабета мыши NOD или трансгенные мыши NOD получали лечение внутривенно (в/в) в течение 5 последовательных дней (0-4 дни; 2,5 мкг/мышь) антителами хомяка против CD3 мыши (клон 145-2С11, BioXCell, Западный Ливан, Нью-Гэмпшир). Указанную терапию проводили в комбинации с пероральным введением либо управляемых плазмидой штаммов L. lactis, либо штаммов L. lactis клинического качества (2×10 КОЕ) 5 раз в неделю в течение 6 недель. Контрольных мышей оставляли без лечения. Регистрировали индивидуальные концентрации глюкозы в крови в начале лечения. Мышей тестировали 3 раза еженедельно для определения массы тела и статуса уровня глюкозы в крови. Ремиссию определяли как отсутствие глюкозурии и возвращение к нормальным концентрациям глюкозы в крови. Экспериментальных животных умерщвляли немедленно или через продолжительное время после остановки терапии (через 6 или 14 недель после начала лечения). Собирали периферическую кровь, лимфоидные органы и поджелудочную железу, и оценивали фенотип одиночных клеток согласно описанию в дополнительном разделе дизайна и методов исследования. Мышей отстраняли от исследования до наступления конечной точки 14 недель в тех случаях, когда концентрации глюкозы в крови превышали 600 мг/дл при двух последовательных измерениях.
Тест на толерантность к глюкозе
[00236] Через одну или две недели до умерщвления проводили внутрибрюшинные тесты на толерантность к глюкозе (IPGTT). Мыши находились без пищи в течение 16 часов, после чего им внутрибрюшинно (в/б) инъецировали глюкозу (2 г/кг) и измеряли концентрации глюкозы в крови через 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минут.
Измерение IAA
[00237] Собирали гепаринизированную плазму от мышей NOD с впервые возникшим диабетом до рандомизации по группам лечения и в момент прекращения терапии, и анализировали на IAA в отделении патологии, иммунологии и лабораторной медицины Медицинского колледжа Университета Флориды, Гейнсвилл, Флорида, согласно описанию в Robert S. et al., Diabetes 2014, 63: 2876-2887.
Блокирование CTLA4 и ТФР-β in vivo
[00238] Мышам, толеризированным терапией на основе L. lactis, после отмены терапии инъецировали внутрибрюшинно (в/б) блокирующие антитела против CTLA4 (клон UC10-4F10, Bioceros) и ТФР-β (клон 1D11.16.8, BioXCell) с использованием следующего режима дозирования: 250 мкг на 1 день и 3, а затем по 100 мкг на 6, 8, 10, 13 и 18 дни для антител к CTLA4; 200 мкг 3 раза в неделю в течение 3 недель для антител к ТФР-β. Концентрации глюкозы в крови измеряли ежедневно до 25 дней после первой инъекции.
Адоптивный перенос диабета
7
[00239] Для оценки диабетогенного потенциала клеток Teff тотальные Т-клетки селезенки (1 × 10 клеток) контрольных мышей с впервые возникшим диабетом, отвечающие и не отвечающие на терапию на основе L. lactis, переносили в/в (внутривенно) в хвостовые вены 6-8-недельных мышей NOD-scid с иммунодефицитом. Мониторинг развития диабета у мышей-Реципиентов проводили дважды в неделю до 100 дней после переноса клеток.
+
Опосредованное ДТ истощение по Foxp3 Т-клеткам у мышей NOD.Foxp3.DTR
+
+
[00240] У мышей NOD.Foxp3.DTR (экспрессирующих рецептор дифтерийного токсина (DTR) человека под контролем элементов контроля транскрипции Foxp3) позволяют развиться истощению Foxp3 Т-клеток после введения ДТ (дифтерийного токсина). См., например, Feuerer М. et al., How punctual ablation of regulatory T cells unleashes an autoimmune lesion within the pancreatic islets. Immunity 2009; 31:654-664. Для истощения по Treg мышам NOD.Foxp3.DTR (не подвергавшимся манипуляциям или толеризированным после остановки терапии на основе L. lactis) инъецировали в/б по 40 мкг ДТ /кг массы тела (Sigma) на 1, 2, 4 и 7 дни, и исследовали на 8 день. После инъекций ДТ проводили мониторинг массы тела и статуса уровня глюкозы в моче и в крови мышей. Мониторинг Foxp3 Т-клеток в периферической крови и поджелудочной железе проводили с помощью проточной цитометрии и гистологического исследования, соответственно, согласно описанию. См., например, Tian L. et al., Foxp3(+) regulatory T cells exert asymmetric control over murine helper responses by inducing Th2 cell apoptosis. Blood 2011; 118:1845-1853.
FOXP3-ингибиторный пептид P60 в комбинации с терапией на основе L. lactis
[00241] Р60 (15-мер, синтетический пептид, который может связывать и блокировать FOXP3, в/б, 50 мкг/дозу ежедневно, до 14 доз) вводили либо в начале терапии на основе L. lactis, согласно приведенному ранее описанию. См., например, Casares N. et al., А peptide inhibitor of FOXP3 impairs regulatory T cell activity and improves vaccine efficacy in mice. Journal of Immunology 2010, 185:5150-5159.
Гистологическое исследование поджелудочной железы и ранжирование инсулита
[00242] Готовили и собирали срезы фиксированных в формалине залитых в парафин тканей поджелудочной железы толщиной 6 мкм на расстоянии 100 мкм друг от друга, после чего окрашивали гематоксилином-эозином. Островки исследовал под световым микроскопом при 20× или 40× увеличении, нумеровал и ранжировал независимый исследователь в слепом режиме. Инфильтрацию островков оценивали по меньшей мере на 25 островках из каждого образца поджелудочной железы следующим образом: 0 -инфильтрация отсутствует; 1 - периинсулит; 2 - островки с инфильтрацией лимфоцитами менее чем на 50% площади, 3, островки с инфильтрацией лимфоцитами более чем на 50% площади или полностью уничтоженные.
+
Детекция резидентных островковых Foxp3 Т-клеток
+
[00243] Ткани поджелудочной железы мгновенно замораживали в 2-метилбутане 99% и готовили срезы ткани толщиной 12 мкм. Детекцию Foxp3 Т-клеток выполняли согласно описанию. См., например, Takiishi Т. et al., Reversal of autoimmune diabetes by restoration of antigen-specific tolerance using genetically modified Lactococcus lactis in mice. J. Clin. Invest. 2012, 122:1717-1725.
Статистика
[00244] Все данные анализировали с использованием GraphPad Prism 6 (Graphpad Prism, Ла-Хойя, Калифорния). Кривые выживания рассчитывали с использованием критерия Каплана-Майера и сравнивали с логарифмическим ранговым критерием. Группы анализировали, используя ANOVA (непараметрический критерий Краскела-Уоллиса) с критерием множественных сравнений Данна или U-критерием Манна-Уитни по мере целесообразности. Планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего (SEM). Если не указано иное, различия не значимы (н/з). * Р<0,05, ** Р<0,01, *** Р<0,001, **** Р<0,0001.
Бактерии и среды
9
9
[00245] L. lactis-pT1NX представляет собой штамм MG1363, содержащий пустой вектор pT1NX, и служит в качестве контроля. Управляемый плазмидой штамм L. lactis (sAGX0328, секретирующий кодируемый плазмидой PINS человека и хромосомно-интегрированный ИЛ-10) культивировали согласно приведенному ранее описанию. См., например, Takiishi Т. et al., J. Clin. Invest. 2012, 122:1717-17253. Поскольку рост и выживание дефицитных по thyA штаммов L. lactis зависит от присутствия тимидина в ростовой среде, L. lactis клинического качества (секретирующий хромосомно-интегрированный PINS человека и ИЛ-10) культивировали в GM17T, т.е. бульоне М17 (BD, Франклин Лейке, Нью-Джерси) с добавлением 0,5% глюкозы (Merck KGaA, Дармштадт, Германия) и 200 мкМ тимидина (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Для внутрижелудочной инокуляции, стоковые суспензии 1000-кратно разводили в ростовых средах и инкубировали в течение 16 часов при 30°С до достижения насыщающей плотности 2×10 КОЕ/мл. Бактерии собирали путем центрифугирования и 10-кратно концентрировали в среде ВМ9. Лечебные дозы включали 100 мл указанной бактериальной суспензии. Для внутрижелудочной инокуляции стоковые суспензии 1000-кратно разводили в ростовых средах и инкубировали в течение 16 часов при 30°С до достижения насыщающей плотности 2×10 КОЕ/мл. Бактерии собирали путем центрифугирования и 10-кратно концентрировали в среде ВМ9. Лечебные дозы включали 100 мл указанной бактериальной суспензии.
Проточная цитометрия
[00246] Периферическую кровь и указанные органы собирали через 6 недель после начала лечения, обрабатывали и инкубировали с мечеными флуорохромом антителами или соответствующими изотипическими контрольными антителами для проточно-цитометрического анализа. Treg окрашивали антителами против CD3 мыши (145-2С11), CD4 (GK1.5), CD8a (53-6,7), CD25 (РС61.5 или 7D4 (BD, Эрембодегем, Бельгия)) и FR4 (eBiol2A5) (все антитела от eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, если не указано другое) в течение 20 минут на льду. Антитела для внутриклеточного окрашивания против Foxp3 (FJK-16s) и CTLA4 (UC10-4B9) получали от eBioscience и использовали в соответствии с инструкциями производителя. Необученные Т-клетки, эффекторный Т-клетки памяти и Т-клетки центральной памяти определяли путем окрашивания антителами против CD3 мыши (145-2С11), CD4 (GK1.5), CD8a (53-6,7), CD44 (IM7), CD62L (MEL-14), CD69 (H1.2F3) и CCR7 (4В12). Клетки анализировали в проточном цитометре Gallios™ с использованием программного обеспечения Kaluza (Beckman Coulter, Суарле, Бельгия) или FlowJo (Treestar, Ашленд, Орегон).
Супрессорные анализы in vitro
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
[00247] Патогенные клетки CD4CD25 Teff выделяли из клеток селезенки 10-недельных мышей NOD путем отрицательного отбора с применением антител к CD25, CD8α, В220, CD11c, CD11b, МНС класса II и гранулами Dynabeads с антителами овцы против IgG крысы (Invitrogen, Мерелбеке, Бельгия). CD4CD25Foxp3 и CD4CD25Foxp3 Treg выделяли из объединенных клеток лимфатических узлов и селезенок мышей NOD.Foxp3.hCD2 (несущих слитый белок CD2-CD52 человека наряду с внутренним участком посадки рибосомы в 3'-нетранслируемой области эндогенного локуса foxp3). См., например, Culina S. et al., Clin. Dev. Immunol. 2011; 2011: 286248. Вкратце, образцы клеток пропускали через клеточное сито с размером пор 70 мкм и суспензировали в среде RPMI1640, центрифугировали в течение 5 минут при 1500 об/мин и суспензировали в среде RPMI1640. В полученной суспензии клеток подсчитывали клетки, суспензию промывали и сначала истощали по CD8α, В220, CD11c, CD11b, МНС и адгезивным клеткам с применением пэннинга и окрашивали конъюгированными с биотином антителами против CD4 и против hCD2. Затем клетки инкубировали с покрытыми антителом к биотину микрогранулами (Miltenyi Biotec B.V., Лейден, Нидерланды) и разделяли на колонках для ЖХ или МС (Miltenyi Biotech). Полученные hCD2 или hCD2 клетки дополнительно очищали с применением антител против CD25. Проводили поликлональные супрессорные анализы in vitro. Цитокины (ИФН-γ, ИЛ-10 и ТФР-β) измеряли в бесклеточных супернатантах с применением мультиплексного иммунологического анализа (Mesoscale Discovery, Роквилл, Массачусетс) или проточно-цитометрического анализа на гранулах (Bender MedSystems FlowCytomix™, eBioscience) согласно описанию. См., например, Ludvigsson J. et al., GAD65 antigen therapy in recently diagnosed type 1 diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 2012, 366: 433-442.
[00248] В культуры добавляли блокирующие антитела против CTLA4 (UC10-4F10), ИЛ-10 (клон JES5-2A5, BioXCell) и ТФР-β (клон 1D11.16.8, который нейтрализует все три изоформы ТФР-β млекопитающих (β1, β2 и β3), BioXCell) в концентрации 10 мкг/мл.
Результаты
Вакцина на основе самоограничивающего L. lactis клинического качества в комбинации с низкодозным антителом против CD3 стабильно обращала впервые возникший диабет, сохраняла остаточную функцию бета-клеток и останавливала прогрессирование инсулита у мышей NOD.
[00249] При применении самоограничивающего штамма L. lactis клинического качества, секретирующего PINS человека наряду с ИЛ-10, в комбинации с субтерапевтическими дозами антител против CD3 у 66% (23 из 35) мышей происходило возвращение к нормогликемии на протяжении по меньшей мере 14 недель после возникновения заболевания, что статистически значимо превосходило результат, равный 43%, у мышей, получавших лечение отдельно антителом против CD3 (фиг. 1А). У животных, не получавших лечения (n=20) или получавших пустой вектор с бактериальным штаммом L. Zactis-pT1NX (n=9) гипергликемия сохранялась; после потери 20% стартовой массы тела их умерщвляли. Монотерапия штаммом L. lactis клинического качества или управляемым плазмидой, секретирующим PINS и ИЛ-10, была значимо менее эффективна, чем комбинация с антителом против CD3 (0% (n=8) и 17% (n=8), соответственно) (фиг. 1А).
[00250] При последующем наблюдении контрольных мышей с впервые возникшим диабетом, мышей, защищенных терапией на основе L. lactis, и мышей, не защищенных такой терапией, подвергали IPGTT и умерщвляли через 6 недель после начала лечения; в указанный момент оценивали ткани поджелудочной железы путем проведения гистологического исследования. Только у получавших успешное лечение животных сохранялась остаточная функция бета-клеток (оцениваемая на основании площади под кривой толерантности к глюкозе (AUC глюкозы)) и тяжелый инсулит наблюдался в меньшем относительном количестве островков (фиг. 1В). Интересно, что к концу комбинированной терапии у отвечающих и не отвечающих на терапию мышей не наблюдалось различий в тяжести инсулита (фиг. 1С).
Стартовая гликемия и положительность по IAA предсказывают терапевтический успех терапии на основе L. lactis.
[00251] Влияния возраста или пола мышей на терапевтический успех терапии на основе L. lactis не наблюдалось. Однако гликемические концентрации в начале терапии предсказывали успешность, с излечением 82% мышей со стартовой гликемией ниже 350 мг/дл (n=22) относительно 38% мышей со стартовой гликемией выше 350 мг/дл (n=13) (фиг. 2А). Кроме того, положительность по антителам IAA в начальный момент, по-видимому, коррелировала с терапевтическим успехом (фиг. 2В). Интересно, что у мышей с концентрациями глюкозы в крови <350 мг/дл и положительностью по IAA в начале терапии наблюдался явно более высокий показатель ремиссии диабета (89%, n=8), чем у мышей с уровнями глюкозы в крови >350 мг/дл и отрицательных по IAA (33%; n=5; Р=0,07). (фиг. 2С). Кроме того, терапия на основе L. lactis значимо снижала уровни IAA, в особенности у мышей, отвечающих на указанную терапию (фиг. 2D).
+
Терапия на основе L. lactis индуцирует более высокие уровни Foxp3 Т-клеток с регуляторной способностью, без изменений, касающихся клеток Teff
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
[00252] Механизмы, лежащие в основе ремиссии заболевания, индуцированной лечением на основе L. lactis, исследовали путем разделения терапевтических иммунных эффектов у мышей, отвечающих или не отвечающих на указанное вмешательство. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что проценты CD4Foxp3 (как CD25, так и CD25) Т-клеток, наблюдаемых в периферической крови (фиг. 3А), дренирующих лимфатических узлах поджелудочной железы (фиг. 3В) и поджелудочной железе (фиг. 3С) были значимо выше у мышей, получавших терапию на основе L. lactis, по сравнению с не получавшими лечения контрольными мышами. Интересно, что в дренирующих лимфатических узлах поджелудочной железы и поджелудочной железе, однако не в периферической крови увеличение частоты встречаемости CD4Foxp3 Т-клеток было менее выраженным у отвечающих на терапию мышей по сравнению с неотвечающими. С применением многоцветовой проточной цитометрии авторы настоящего изобретения установили, что большинство CD4Foxp3 Treg были положительными по CTLA4, и что экспрессия указанного ингибиторного маркера была значимо выше у получавших лечение мышей в дренирующих лимфатических узлах поджелудочной железы (как у отвечающих, так и у не отвечающих на терапию мышей) и поджелудочной железе (только у отвечающих) по сравнению с не получавшими лечения контрольными мышами (фиг. 8В и 8С). Интересно, что различий в процентном содержании CD4Foxp3CTLA4 Т-клеток в периферической крови получавших лечение мышей по сравнению с не получавшими лечения контрольными мышами не наблюдалось (фиг. 3D). Проценты необученных CD4Т-клеток (CD44CD62LCCR7), эффекторных CD4Т-клеток памяти (CD44CD62LCCR7) и CD4Т-клеток центральной памяти (CD44CD62LCCR7) не изменялись на в одной реципиентной группе независимо от терапевтического успеха или неудачи. Перенос спленоцитов от отвечающих и не отвечающих на лечение на основе L. lactis мышей вызывал диабет у реципиентов NOD-scid с аналогичной кинетикой заболевания, что и перенос спленоцитов, выделенных из организма не получавших лечения контрольных мышей с впервые возникшим диабетом, что предполагает отсутствие истощения по циркулирующим диабетогенным клеткам у получавших лечение мышей (фиг. 9).
+
Обращение диабета, индуцируемое терапией на основе L. Lactis, сопровождается продуцированием функциональных Foxp3 Treg и зависит от него
+
+
+
+
-
+
-
+
[00253] С использованием мышей NOD.Foxp3.hCD2, получавших терапию на основе L. lactis, авторам настоящего изобретения удалось выделить CD4CD25Foxp3Т-клетки для функциональных исследований in vitro, в ходе которых они подавляли пролиферацию, активацию CD69 и продуцирование ИФН-γ патогенными CD4CD25 клетками Teff. Указанные Treg продуцировали ИЛ-10 (и ТФР-β) при совместном культивировании и стимуляции антителом против CD3 в присутствии антигенпрезентирующих клеток (АПК) селезенки, выделенных из организма мышей NOD-scid γс -/- (фиг. 4). Различий в регуляторной способности CD4CD25Foxp3 Т-клеток у отвечающих на терапию и не отвечающих на терапию мышей обнаружено не было.
+
+
+
+
+
+
+
-
+
[00254] Добавление Ig против CTLA4 (клон UC10-4F10) или нейтрализующего ТФР-β антитела (клон 1D11.16.8) значимо снижало супрессию CD4CD25Foxp3 Т-клетками (фиг. 5А), предполагая, что CD4CD25Foxp3 Treg у излечившихся мышей ингибируют пролиферацию Teff in vitro CTLA4- и ТФР-β-зависимым образом. Добавление антитела против ИЛ-10 (клон JES5-2A5) не изменяло прямой супрессорный эффект Treg. С другой стороны, указанные регуляторные механизмы не были продемонстрированы во фракции CD4CD25Foxp3 Т-клеток от отвечающих и не отвечающих на терапию мышей (фиг. 5В). Введение стабильно излечившимся мышам in vivo комбинации Ig против CTLA4 (клон UC10-4F10) и против ТФР-β (клон 1D11.16.8) приводило к повторному возникновению диабета у 2 из 5 мышей (фиг. 5С).
+
[00255] Наконец, авторы настоящего изобретения исследовали зависимость терапевтического успеха терапия на основе L. lactis от присутствия и функциональности Foxp3 Т-клеток. Для этого у мышей NOD с впервые возникшим диабетом одновременно применяли терапию на основе L. lactis и РОХР3-ингибиторный пептид Р60 на протяжении периода, составляющего 14 дней (фиг. 6А). Интересно, что ни у одной из мышей (n=6) не развилась нормогликемия, при этом показатель ремиссии диабета у мышей, получавших терапию на основе L. lactis и основу (n=11), составил 60%, что указывает на критическую важность Treg для индукции индуцированной терапией толерантности (фиг. 6В).
+
+
+
+
+
+
+
[00256] Мыши NOD.Foxp3.DTR с впервые возникшим (спонтанным) диабетом получали терапию на основе L. lactis; после наблюдаемого стабильного обращения диабета Foxp3 Т-клетки элиминировали с применением ДТ согласно описанию на схеме с фиг. 7А. Сначала авторы настоящего изобретения установили с использованием не подвергавшихся манипуляциям мышей NOD.Foxp3.DTR, что выбранный режим введения ДТ элиминировал более 90% CD4Foxp3 Т-клеток в периферической крови в пределах 3 дней после первой инъекции ДТ, а оставшиеся Treg экспрессировали незначительные уровни или не экспрессировали CD25, (фиг. 10А-С). Прогрессирующая репопуляция указанных клеток начиналась с 5 дня после первой инъекции ДТ, что было описано для нескольких линий Foxp3.DTR. См., например, Kim J.M. et al.,Nat. Immunol. 2007, 8: 191-197; Suffner J. et al., J. Immunol. 2010, 184: 1810-1820; и Mayer C.T. et al., Immun. Inflamm. Dis. 2014, 2: 162-165. Указанный режим введения ДТ также резко уменьшал количество резидентных Foxp3 Т-клеток поджелудочной железы, в результате приводя к развитию аутоиммунного диабета (фиг. 10 В и 10D). Далее, по сравнению с мышами NOD дикого типа, лечение на основе L. lactis индуцировало ремиссию аутоиммунного диабета у 57% мышей NOD.Foxp3.DTR (4 мышей из 7) (фиг. 7А и 7В). Транзиентное истощение по Foxp3 Т-клеткам приводило к полному возвращению в диабетическое состояние у всех мышей (n=4), изначально вылеченных с применением указанной терапии, на что указывает повторное возникновение глюкозурии наряду с тяжелой гипергликемией, начиная со 2 дня после первой инъекции ДТ (фиг. 7В). Указанное нарушение иммунотолерантности к продуцирующим инсулин бета-клеткам также сопровождалось индукцией тяжелого инсулита (фиг. 7С) и абляцией пула резидентных островковых Foxp3 Treg (фиг. 7D). В совокупности, указанные данные продемонстрировали что терапевтический эффект вмешательства на основе L. lactis зависел от присутствия и функциональности Foxp3 Treg.
Обсуждение
[00257] Пероральную толерантность как способ вмешательства для остановки заболевания изучали в моделях аутоиммунных заболеваний, в том числе T1D, на животных. См., например, Commins SP, Pediatr. Clin. North. Am. 2015; 62: 1523-1529.
[00258] В указанном примере получали самоограничивающий штамм L. lactis клинического качества для перорального применения, секретирующий хромосомно-интегрированный PINS человека и ИЛ-10 человека. В комбинации с коротким курсом введения субтерапевтических доз антитела против CD3 указанное вмешательство было безопасным и эффективным для индукции долгосрочной нормогликемии у мышей с впервые возникшим диабетом. Начальные концентрации глюкозы в крови (<350 мг/дл), помимо положительности по IAA при возникновении заболевания, представляли собой прогностический фактор терапевтического исхода, тогда как сохранение остаточной функции бета-клеток и снижение положительности по IAA представляли собой маркеры терапевтического успеха.
[00259] Таким образом, некоторый уровень остаточной массы бета-клеток необходим для терапевтического успеха при вмешательстве в момент диагностирования диабета, а именно, при наличии дисгликемии.
+
+
+
-
+
+
+
[00260] Природа и роль иммунных процессов, сопровождающих указанное лечение, были дополнительно охарактеризованы путем разделения иммунных эффектов вмешательства на основе L. lactis у мышей, отвечающих или не отвечающих на терапию. Терапия на основе L. lactis индуцировала супрессорные секретирующие ИЛ-10 CD4Foxp3(как CD25, так и CD25) Т-клетки в дренирующих лимфатических узлах поджелудочной железы и поджелудочной железе у отвечающих и даже в большей степени у не отвечающих на терапию мышей, что предполагает увеличение рекрутинга клеток Treg в воспаленные целевые ткани. На периферии частота встречаемости CD4Foxp3 Т-клеток также увеличивалась у получавших лечение мышей по сравнению с не получавшими лечения контрольными мышами, что указывает на возможность применения указанной популяции клеток в качестве иммунного маркера. Интересно, что частота встречаемости CTLA4 Т-клеток в различных подгруппах Treg была значимо выше в поджелудочной железе получавших комбинированную терапию отвечающих мышей по сравнению мышами с впервые возникшим диабетом, в отличие от получавших комбинированную терапию не отвечающих мышей. Различий в степени инсулита у отвечающих и не отвечающих мышей не наблюдалось, что предполагает изменения в подгруппах лимфоцитов, отличных от Treg.
+
+
+
[00261] Периферические Treg могут использовать разные регуляторные механизмы, соответствующие их окружению и стимулирующим условиям. См., например, Liston А. et al., Nature Reviews Immunology 2014; 14: 154-165. В указанных экспериментах CTLA4 и ТФР-β были важны для регуляторной активности размножающихся под действием терапии CD4CD25Foxp3 Т-клеток in vitro и частично in vivo, тогда как ИЛ-10 не был важен.
[00262] Хотя предполагалось, что ИЛ-10 является хорошим маркером для идентификации индуцированных предложенной авторами настоящего изобретения терапией на основе L. lactis Treg, другие исследователи продемонстрировали, что антитела против ИЛ-10 не устраняли установившуюся толерантность in vivo. См., например, Fowler S. and Powrie F, European Journal of Immunology 2002, 32: 2997-3006.
[00263] Как и у мышей, Treg у человека определены как имеющие супрессорный фенотип, обеспечиваемый продолжительной экспрессией на высоком уровне транскрипционного фактора Foxp3 (см., например, Hori S. et al., Science 2003; 299: 1057-1061); утрата функции/мутация в гене Foxp3 приводит к тяжелым фатальным аутоиммунным расстройствам (см., например, Kim J.M., et al., Nature Immunology 2007; 8: 191-197; и Mayer С.Т. et al., European Journal of Immunology 2014, 44: 2990-3002).
+
+
[00264] Специфическое ингибирование функциональности Treg пептидом P60 (см., например, Casares N. et al., Journal of Immunology 2010; 185: 5150-5159) в начале терапии на основе L. lactis нарушало индукцию индуцированной терапией толерантности. Кроме того, для индукции полного рецидива заболевания у всех животных было достаточно транзиентного истощения по Foxp3 Treg у толеризированных терапией мышей NOD.Foxp3.DTR, что демонстрирует важность присутствия Foxp3 Т-клеток для поддержания терапевтической толерантности и контроля патогенных клеток Teff, которые все еще присутствовали у мышей, отвечающих на терапию на основе L. lactis.
+
+
+
+
[00265] Текущие данные демонстрируют, что комбинация самоограничивающего L. lactis клинического качества, секретирующего PINS человека и ИЛ-10 человека, с низкодозным антителом против CD3 повышала частоту обращения диабета по сравнению с монотерапией антителом против CD3. Как у отвечающих, так и у не отвечающих на терапию наблюдалась повышенная частота встречаемости CD4Foxp3 Т-клеток, что предполагает, что иммунные эффекты, индуцированные терапией на основе L. lactis, возникали у всех индивидуальных реципиентов, однако терапевтический успех (определяемый как возвращение к стабильной нормогликемии) зависел от других показателей, таких как масса функциональных бета-клеток, все еще присутствующих при возникновении заболевания. Терапевтический успех был дополнительно скоррелирован со стартовой гликемией. Наряду с исходной концентрацией глюкозы в крови в начальный момент, исход указанной терапии на основе L. lactis с использованием PINS в качестве антигена также предсказывали на основе уровней IAA. Текущие данные демонстрируют, что Foxp3 Treg играют существенную роль в индукции и поддержании активной толерантности и контроля диабетогенных иммунных ответов у толеризированных мышей. Указанные результаты обеспечивают инструменты для тестирования воздействия на человека: самоограничивающий L. lactis клинического качества, секретирующий антиген(ы) к островковым клеткам, биомаркеры для предсказания терапевтического успеха, и демонстрируют, что в основе терапии на основе L. lactis лежит индукция Foxp3 Т-клеток.
[00266] Хотя в настоящем документе были показаны и описаны некоторые варианты реализации, такие варианты реализации предложены в качестве примеров. Многочисленные варианты, изменения и замены без отступления от сути настоящего изобретения будут очевидны для специалистов в данной области техники. Следует понимать, что при практической реализации настоящего изобретения будут задействованы различные альтернативы вариантам реализации настоящего изобретения, описанным в настоящем документе.
Примеры вариантов реализации
1. Молочнокислая бактерия (МКБ) содержащая экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую интерлейкин-10 (ИЛ-10), и экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую проинсулин (PINS), отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая ИЛ-10, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая PINS, интегрированы в хромосому.
2. МКБ согласно варианту реализации 1, отличающаяся тем, что указанная МКБ представляет собой вид бактерии Lactococcus.
3. МКБ согласно варианту реализации 2, отличающаяся тем, что указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis.
4. МКБ согласно варианту реализации 3, отличающаяся тем, что указанная МКБ представляет собой Lactococcus lactis подвида cremoris.
5. МКБ согласно варианту реализации 4, отличающаяся тем, что указанная МКБ представляет собой штамм Lactococcus lactis MG1363.
6. МКБ согласно любому из вариантов реализации 15, отличающаяся тем, что указанный ИЛ-10 представляет собой ИЛ-10 человека (чИЛ-10).
7. МКБ согласно варианту реализации 6, отличающаяся тем, что указанный чИЛ-10 при секреции в виде зрелого чИЛ-10 без сигнального пептида содержит аланин (Ala) вместо пролина (Pro) в положении 2.
8. МКБ согласно любому из вариантов реализации 17, отличающаяся тем, что указанный ИЛ-10 имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 1.
9. МКБ согласно любому из вариантов реализации 18, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая ИЛ-10, имеет последовательность нуклеотидов, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 2.
10. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанный PINS представляет собой PINS человека (hPINS).
11. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанный PINS имеет последовательность аминокислот, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 3.
12. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая PINS, имеет последовательность нуклеотидов, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности SEQ ID NO: 4.
13. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная МКБ конститутивно экспрессирует указанный ИЛ-10.
14. МКБ согласно варианту реализации 13, отличающаяся тем, что указанная МКБ секретирует указанный ИЛ-10.
15. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная МКБ конститутивно экспрессирует указанный PINS.
16. МКБ согласно варианту реализации 15, отличающаяся тем, что указанная МКБ секретирует указанный PINS.
17. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная МКБ конститутивно экспрессирует и секретирует указанный ИЛ-10 и указанный PINS.
18. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая ИЛ-10, располагается в направлении 3' от промотора hllA (PhllA).
19. МКБ согласно варианту реализации 18, отличающаяся тем, что указанный PhllA представляет собой YhllA Lactococcus lactis.
20. МКБ согласно варианту реализации 18, отличающаяся тем, что указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую ИЛ-10, транскрипционно регулирует указанный PhllA.
21. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная МКБ содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор hllA, последовательность секреции ИЛ-10 и указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую ИЛ-10.
22. МКБ согласно варианту реализации 21, отличающаяся тем, что указанная экспрессионная кассета является хромосомно-интегрированной.
23. МКБ согласно варианту реализации 22, отличающаяся тем, что указанная экспрессионная кассета интегрирована в хромосому в локусе thyA.
24. МКБ согласно любому из вариантов реализации 21-23, отличающаяся тем, что указанная последовательность секреции ИЛ-10 представляет собой последовательность нуклеотидов, кодирующую лидерную последовательность секреции неидентифицированного секретируемого белка 45 кДа (Usp45) (SSusp45).
25. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая PINS, располагается в направлении 3' от промотора gapB.
26. МКБ согласно варианту реализации 25, отличающаяся тем, что указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую PINS, транскрипционно регулирует указанный промотор gapB.
27. МКБ согласно варианту реализации 25 или 26, отличающаяся тем, что указанная МКБ содержит первую полицистройную экспрессионную кассету, содержащую промотор gapB, расположенный в направлении 5' от гена. gapB, последовательность секреции PINS и указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую PINS.
28. МКБ согласно варианту реализации 27, отличающаяся тем, что указанная МКБ дополнительно содержит межгенную область между указанным геном gapB и указанной последовательностью секреции PINS.
29. МКБ согласно варианту реализации 28, отличающаяся тем, что указанная межгенная область представляет собой область rpmD, содержащую SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
30. МКБ согласно любому из вариантов реализации 27-29, отличающаяся тем, что указанный промотор gapB и указанный ген gapB являются эндогенными для указанной МКБ.
31. МКБ согласно любому из вариантов реализации 27-30, отличающаяся тем, что указанная первая полицистронная экспрессионная кассета является хромосомно-интегрированной.
32. МКБ согласно любому из вариантов реализации 27-31, отличающаяся тем, что указанная последовательность секреции PINS представляет собой последовательность нуклеотидов, кодирующую SSusp45.
33. МКБ согласно варианту реализации 32, отличающаяся тем, что указанная SSusp45 имеет последовательность нуклеотидов, представленную в SEQ ID NO: 11 или SEQ ID NO: 12.
34. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная МКБ дополнительно содержит экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую трегалоза-6-фосфат-фосфатазу.
35. МКБ согласно варианту реализации 34, отличающаяся тем, что указанная трегалоза-6-фосфат-фосфатаза представляет собой OtsB Escherichia coli.
36. МКБ согласно варианту реализации 34 или 35, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая трегалоза-6-фосфат-фосфатазу, является хромосомно-интегрированной.
37. МКБ согласно варианту реализации 36, отличающаяся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая трегалоза-6-фосфат-фосфатазу, интегрирована в хромосому в направлении 3' от гена неидентифицированного секретируемого белка 45 кДа (usp45).
38. МКБ согласно варианту реализации 37, отличающаяся тем, что указанная МКБ содержит вторую полицистроиную экспрессионную кассету, содержащую промотор usp45, указанный usp45 и указанную экзогенную нуклеиновую кислоту, кодирующую трегалоза-6-фосфат-фосфатазу.
39. МКБ согласно варианту реализации 38, отличающаяся тем, что указанная вторая полицистронная экспрессионная кассета дополнительно содержит межгенную область между указанным usp45 и указанной экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей трегалоза-6-фосфат-фосфатазу.
40. МКБ согласно варианту реализации 39, отличающаяся тем, что указанная межгенная область представляет собой область rpmD, содержащую SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
41. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что ген трегалоза-6-фосфат-фосфорилазы (trePP) в указанной МКБ разрушают или инактивируют.
42. МКБ согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанный trePP инактивируют путем удаления указанного trePP или его фрагмента.
43. МКБ согласно варианту реализации 41, отличающаяся тем, что указанный trePP разрушают путем инсерции стоп-кодона.
44. МКБ согласно любому из вариантов реализации 41 43, отличающаяся тем, что в указанной МКБ отсутствует активность trePP.
45. МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации, отличающаяся тем, что ген компонента IIC целлобиоза-специфической фосфотрансферазной (PTS) системы (ptcC) в указанной МКБ разрушен или инактивирован.
46. МКБ согласно варианту реализации 45, отличающаяся тем, что указанный ptcC разрушен путем инсерции стоп-кодона.
47. МКБ согласно варианту реализации 45, отличающаяся тем, что указанный ptcC инактивируют путем удаления указанного ptcC или его фрагмента.
48. МКБ согласно любому из вариантов реализации 45 47, отличающаяся тем, что в указанной МКБ отсутствует активность ptcC.
49. МКБ согласно любому из описанных выше вариантов реализации, отличающаяся тем, что указанная МКБ дополнительно содержит один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы.
50. МКБ согласно варианту реализации 49, отличающаяся тем, что указанный один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, является эндогенным для указанной МКБ.
51. МКБ согласно варианту реализации 49 или 50, отличающаяся тем, что указанная МКБ сверхэкспрессирует указанный один или более транспортеров трегалозы.
52. МКБ согласно любым из вариантов реализации 49-51, отличающаяся тем, что указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, расположены в направлении 3' от промотора hllA (PhllA).
53. МКБ согласно варианту реализации 52, отличающаяся тем, что указанный один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, транскрипционно регулирует указанный PhllA.
54. МКБ согласно любому из вариантов реализации 47-51, отличающаяся тем, что указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, выбраны из группы, состоящей из llmg_0453, llmg_0454 и любой их комбинации.
55. МКБ согласно варианту реализации 54, отличающаяся тем, что указанные один или более генов, кодирующих один или более транспортеров трегалозы, включают два гена, кодирующие два транспортера трегалозы, при этом межгенная область локализована между указанными двумя генами.
56. МКБ согласно варианту реализации 55, отличающаяся тем, что указанная межгенная область представляет собой область rpmD, содержащую SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 9.
57. Композиция, содержащая МКБ согласно любому из вышеописанных вариантов реализации.
58. Фармацевтическая композиция, содержащая МКБ согласно любому из вариантов реализации 1 56, и фармацевтически приемлемый носитель.
59. МКБ согласно любому из вариантов реализации 1 56, композиция согласно варианту реализации 57 или фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 58, для применения в лечении диабета I типа (T1D).
60. МКБ согласно любому из вариантов реализации 1-56, композиция согласно варианту реализации 57 или фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 58, для применения при получении медикамента для лечения T1D.
61. МКБ, композиция или фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 60, отличающаяся тем, что указанный T1D представляет собой недавно возникший T1D.
62. Способ лечения T1D у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества МКБ согласно любому из вариантов реализации 1-56, композиции согласно варианту реализации 57 или фармацевтической композиции согласно варианту реализации 58.
63. Способ согласно варианту реализации 62, отличающийся тем, что указанный T1D представляет собой недавно возникший T1D.
64. Способ согласно варианту реализации 62 или 63, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой человека.
65. Способ согласно любому из вариантов реализации 62-64, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение терапевтически эффективного количества антитела против CD3 указанному субъекту.
66. Способ согласно варианту реализации 65, отличающийся тем, что указанное антитело против CD3 представляет собой моноклональное антитело.
67. Способ согласно варианту реализации 65 или 66, отличающийся тем, что указанное антитело против CD3 представляет собой отеликсизумаб или теплизумаб.
68. Способ согласно любому из вариантов реализации 65-67, отличающийся тем, что указанное антитело вводят указанному субъекту с применением режима котерапии.
69. Способ согласно любому из вариантов реализации 65-68, отличающийся тем, что указанное введение указанной МКБ и указанное введение указанного антитела против CD3:
(i) уменьшает количество инсулина, необходимого субъекту для поддержания нормального уровня глюкозы в крови, по сравнению с соответствующим субъектом, получающим лечение антителом против CD3 отдельно, или по сравнению с соответствующим субъектом, которому не вводят указанную МКБ и указанное антитело против CD3;
(ii) сохраняет исходную функцию бета-клеток у указанного субъекта на протяжении по меньшей мере приблизительно 2 месяцев по оценке на основании уровня С-пептида;
(iii) поддерживает нормальную гликемию у субъекта на протяжении по меньшей мере приблизительно 2 месяцев;
(iv) поддерживает нормальный уровень гемоглобина Ale (HbAlc) у указанного субъекта на протяжении по меньшей мере приблизительно 2 месяцев; или
(v) обеспечивает любую комбинацию перечисленного.
70. Способ согласно любому из вариантов реализации 62-69, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно содержит измерение уровня аутоантитела к инсулину (IAA) у указанного субъекта.
71. Способ получения генетически модифицированной МКБ, включающий (i) приведение МКБ в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей ИЛ-10; и (ii) приведение указанной МКБ в контакт с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей PINS, причем указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая ИЛ-10, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая PINS, являются хромосомно-интегрированными.
72. Способ согласно варианту реализации 71, отличающийся тем, что указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая ИЛ-10, и указанная экзогенная нуклеиновая кислота, кодирующая PINS, интегрированы в хромосому с применением гомологичной рекомбинации.
73. Способ согласно варианту реализации 71 или 72, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт указанной МКБ с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей ИЛ-10, происходит до указанного приведения в контакт указанной МКБ с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей PINS.
74. Способ согласно варианту реализации 71 или 72, отличающийся тем, что указанное приведение в контакт указанной МКБ с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей ИЛ-10, происходит после указанного приведения в контакт указанной МКБ с экзогенной нуклеиновой кислотой, кодирующей PINS.
75. Способ согласно любому из вариантов реализации 71-74, дополнительно включающий комбинирование культуры указанной генетически модифицированной МКБ по меньшей мере с одним стабилизирующим агентом для получения бактериальной смеси.
76. Способ согласно варианту реализации 75, дополнительно включающий удаление воды из указанной бактериальной смеси с образованием высушенной композиции.
77. Способ согласно варианту реализации 76, включающий сублимационную сушку указанной бактериальной смеси для получения высушенной сублимацией композиции.
78. Способ согласно варианту реализации 77, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один стабилизирующий агент содержит по меньшей мере один агент для криоконсервации.
79. Способ согласно любому из вариантов реализации 71-78, дополнительно включающий комбинирование указанной генетически модифицированной МКБ, указанной высушенной композиции или указанной высушенной сублимацией композиции с фармацевтически приемлемым носителем для получения фармацевтической композиции.
80. Способ согласно любому из вариантов реализации 76-79, дополнительно включающий введение указанной сухой композиции, указанной высушенной сублимацией композиции или указанной фармацевтической композиции в состав фармацевтической лекарственной формы.
81. Генетически модифицированная бактерия, полученная с применением способа согласно любому из вариантов реализации 71-80.
82. Способ получения фармацевтической композиции, включающий приведение в контакт культуры МКБ согласно любому из вариантов реализации 1-56 по меньшей мере с одним стабилизирующим агентом с получением бактериальной смеси.
83. Способ согласно варианту реализации 82, дополнительно включающий удаление воды из указанной бактериальной смеси, с получением таким образом высушенной композиции.
84. Способ согласно варианту реализации 82 или 83, включающий сублимационную сушку указанной бактериальной смеси с получением таким образом высушенной сублимацией композиции.
85. Способ согласно любому из вариантов реализации 82-84, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один стабилизирующий агент содержит по меньшей мере один агент для криоконсервации.
86. Способ согласно варианту реализации 84 или 85, дополнительно включающий приведение в контакт указанной высушенной сублимацией композиции с фармацевтически приемлемым носителем с получением фармацевтической композиции.
87. Способ согласно любому из вариантов реализации 84-86, дополнительно включающий введение указанной высушенной сублимацией композиции в состав фармацевтической лекарственной формы.
88. Способ согласно варианту реализации 87, отличающийся тем, что указанная фармацевтическая лекарственная форма выбрана из группы, состоящей из таблетки, капсулы, гранулы и саше.
89. Единичная лекарственная форма, содержащая МКБ согласно любому из вариантов реализации 1-56, композиция согласно варианту реализации 57 или фармацевтическая композиция согласно варианту реализации 58.
90. Единичная лекарственная форма согласно варианту реализации 89, отличающаяся тем, что указанная единичная лекарственная форма представляет собой лекарственную форму для перорального применения.
91. Единичная лекарственная форма согласно варианту реализации 90, отличающаяся тем, что указанная лекарственная форма для перорального применения выбрана из группы, состоящей из таблетки, капсулы, гранулы и саше.
6
12
92. Единичная лекарственная форма согласно любому из вариантов реализации 89-91, отличающаяся тем, что указанная единичная лекарственная форма содержит от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) указанной МКБ.
8
11
93. Единичная лекарственная форма согласно варианту реализации 92, содержащая от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 КОЕ.
94. Набор, содержащий (1) МКБ согласно любым из вариантов реализации 1-56, композицию согласно варианту реализации 57, фармацевтическую композицию согласно варианту реализации 58 или единичную лекарственную форму согласно любому из вариантов реализации 89-93, а также (2) инструкции по введению указанной МКБ, указанной композиции, указанной фармацевтической композиции или указанной единичной лекарственной формы млекопитающему.
95. Набор согласно варианту реализации 94, отличающийся тем, что указанное млекопитающее представляет собой человека.
96. Бактериальная суспензия, содержащая МКБ согласно любому из вариантов реализации 1-56, растворитель и стабилизирующий агент.
97. Бактериальная суспензия согласно варианту реализации 96, отличающаяся тем, что указанный растворитель выбирают из воды, масла и любой их комбинации.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Интрексон Актобиотикс НВ
<120>  ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ БАКТЕРИИ, СТАБИЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ
ИЛ-10 И ИНСУЛИН
<130>  205350-0032-00-US-586376
<140>  US 16/329,321
<141>  2019-02-28
<150>  PCT/IB2017/055287
<151>  2017-09-02
<150>  US62/383,079
<151>  2016-09-02
<160>  25
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  160
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(160)
<223>  последовательность ИЛ-10 человека без сигнального пептида
<400>  1
Ser Ala Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro
1               5                   10                  15
Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg
20                  25                  30
Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu
35                  40                  45
Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala
50                  55                  60
Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala
65                  70                  75                  80
Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu
85                  90                  95
Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu
100                 105                 110
Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe
115                 120                 125
Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp
130                 135                 140
Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
145                 150                 155                 160
<210>  2
<211>  480
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(480)
<223> кодирующая последовательность ИЛ-10 человека без сигнального
пептида
<400>  2
tcagctggtc aaggtactca atcagaaaac tcatgtactc actttccagg taacttgcca       60
aacatgcttc gtgatttgcg tgatgctttt tcacgtgtta aaactttttt tcaaatgaaa      120
gatcaacttg ataacttgct tttgaaagaa tcacttttgg aagattttaa aggttacctt      180
ggttgtcaag ctttgtcaga aatgatccaa ttttaccttg aagaagttat gccacaagct      240
gaaaaccaag atccagatat caaagctcac gttaactcat tgggtgaaaa ccttaaaact      300
ttgcgtcttc gtttgcgtcg ttgtcaccgt tttcttccat gtgaaaacaa atcaaaagct      360
gttgaacaag ttaaaaacgc ttttaacaaa ttgcaagaaa aaggtatcta caaagctatg      420
tcagaatttg atatctttat caactacatc gaagcttaca tgactatgaa aatccgtaac      480
<210>  3
<211>  86
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(86)
<223>  проинсулин человека (PINS) без сигнального пептида
<400>  3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20                  25                  30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35                  40                  45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50                  55                  60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65                  70                  75                  80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210>  4
<211>  258
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(258)
<223>  кодирующая последовательность проинсулина человека (PINS)
без сигнального пептида
<400>  4
tttgtgaacc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg       60
gaacgaggct tcttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg      120
caggtggagc tgggcggggg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg      180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag      240
ctggagaact actgcaac                                                    258
<210>  5
<211>  110
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(110)
<223>  последовательность проинсулина человека (PINS) дикого типа
<400>  5
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1               5                   10                  15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly
20                  25                  30
Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe
35                  40                  45
Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly
50                  55                  60
Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu
65                  70                  75                  80
Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys
85                  90                  95
Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
100                 105                 110
<210>  6
<211>  333
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(333)
<223>  открытая рамка считывания PINS человека дикого типа
<400>  6
atggccctgt ggatgcgcct cctgcccctg ctggcgctgc tggccctctg gggacctgac       60
ccagccgcag cctttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac      120
ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac      180
ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg      240
gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc      300
tccctctacc agctggagaa ctactgcaac tag                                   333
<210>  7
<211>  300
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(300)
<223>  вариант сплайсинга PINS человека; AY899304; кодирующая
последовательность представлены нуклеотидами 56–388
<400>  7
gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt tgcgtcagat cactgtcctt ctgccatggc       60
cctgtggatg cgcctcctgc ccctgctggc gctgctggcc ctctggggac ctgacccagc      120
cgcagccttt gtgaaccaac acctgtgcgg ctcacacctg gtggaagctc tctacctagt      180
gtgcggggaa cgaggcttct tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca      240
ggtggggcag gtggagctgg gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct      300
<210>  8
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(16)
<223>  5' межгенная область гена rpmD; нуклеотиды 1-3: стоп-кодон
предшествующего гена; нуклеотиды 14-16: ATG последующего гена
<400>  8
taaggaggaa aaaatg                                                       16
<210>  9
<211>  10
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(10)
<223>  5' межгенная область гена rpmD без стоп-кодона и стартового кодона
<400>  9
ggaggaaaaa                                                              10
<210>  10
<211>  27
<212>  БЕЛОК
<213>  Lactococcus lactis
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(27)
<223>  Лидерная последовательность секреции SSusp45
<400>  10
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala
20                  25
<210>  11
<211>  81
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезирована
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(81)
<223>  Кодирует лидерную последовательность секреции SSusp45
<400>  11
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc       60
ccgttgtcag gtgtttacgc c                                                 81
<210>  12
<211>  81
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химически синтезирована
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(81)
<223>  Кодирует лидерную последовательность секреции SSusp45
<400>  12
atgaagaaga aaatcattag tgccatctta atgtctacag tgattctttc agctgcagct       60
cctttatcag gcgtttatgc a                                                 81
<210>  13
<211>  720
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  генно-инженерная конструкция
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(720)
<223>  экспрессионная кассета с ИЛ-10
<220>
<221>  Кодирующая последовательность
<222>  (105)..(665)
<223>  нуклеотиды 105-185 кодируют лидерную последовательность секреции SSusp45;
нуклеотиды 185-665 кодируют hIL10aPxA; стоп-кодон - нуклеотиды 666-668
<400>  13
aaaacgcctt aaaatggcat tttgacttgc aaactgggct aagatttgct aaaatgaaaa       60
atgcctatgt ttaaggtaaa aaacaaatgg aggacatttc taaa atg aaa aaa aag       116
Met Lys Lys Lys
1
att atc tca gct att tta atg tct aca gtg ata ctt tct gct gca gcc        164
Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala
5                   10                  15                  20
ccg ttg tca ggt gtt tac gcc tca gct ggt caa ggt act caa tca gaa        212
Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ser Ala Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu
25                  30                  35
aac tca tgt act cac ttt cca ggt aac ttg cca aac atg ctt cgt gat        260
Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp
40                  45                  50
ttg cgt gat gct ttt tca cgt gtt aaa act ttt ttt caa atg aaa gat        308
Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp
55                  60                  65
caa ctt gat aac ttg ctt ttg aaa gaa tca ctt ttg gaa gat ttt aaa        356
Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys
70                  75                  80
ggt tac ctt ggt tgt caa gct ttg tca gaa atg atc caa ttt tac ctt        404
Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu
85                  90                  95                  100
gaa gaa gtt atg cca caa gct gaa aac caa gat cca gat atc aaa gct        452
Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala
105                 110                 115
cac gtt aac tca ttg ggt gaa aac ctt aaa act ttg cgt ctt cgt ttg        500
His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu
120                 125                 130
cgt cgt tgt cac cgt ttt ctt cca tgt gaa aac aaa tca aaa gct gtt        548
Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val
135                 140                 145
gaa caa gtt aaa aac gct ttt aac aaa ttg caa gaa aaa ggt atc tac        596
Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr
150                 155                 160
aaa gct atg tca gaa ttt gat atc ttt atc aac tac atc gaa gct tac        644
Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr
165                 170                 175                 180
atg act atg aaa atc cgt aac taactagaat taatctataa gttactgaca           695
Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
185
aaactgtcag taactttttt tgtgg                                            720
<210>  14
<211>  187
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  14
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ser Ala Gly Gln Gly
20                  25                  30
Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn
35                  40                  45
Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe
50                  55                  60
Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile
85                  90                  95
Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro
100                 105                 110
Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu
115                 120                 125
Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
130                 135                 140
Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr
165                 170                 175
Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
180                 185
<210>  15
<211>  1680
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  генно-инженерная конструкция
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (1)..(1680)
<223>  полицистронная экспрессионная кассета с PINS
<220>
<221>  Кодирующая последовательность
<222>  (277)..(1284)
<223>  кодирующая последовательность гена gapB
<220>
<221>  MISC / Другие признаки_feature
<222>  (1285)..(1300)
<223>  межгенная область (rpmD); 1285-1287: стоп-кодон предшествующей
кодирующей последовательности и 1298-1300: ATG последующей кодирующей
последовательности
<220>
<221>  Кодирующая последовательность
<222>  (1298)..(1636)
<223>  Последовательность секреции SSusp45 кодируемая нуклеотидами 1298-1378;
PINS человека, кодируемый нуклеотидами 1379-1636
<400>  15
aataaaaatt actgacagcc tgctcagtaa tttttttagt cataattttt aggtggaaag       60
tcaaagatta ttgccaaaag tattagcttt tttaatgtta accgctttca gaagaagggg      120
agttcatttg cttttgtaga gcgctttcta aggtagttta tgtttgcaaa ttttaaaaaa      180
agtgttaaaa taaaagagta agttaaattg ttaacttagt caatttaaaa ggtttgcctt      240
ttataaaatc taatccctat aaggaggaaa ctacta atg gta gtt aaa gtt ggt        294
Met Val Val Lys Val Gly
1               5
att aac ggt ttc ggt cgt atc ggt cgt ctt gct ttc cgt cgt att caa        342
Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu Ala Phe Arg Arg Ile Gln
10                  15                  20
aat gtt gaa ggt gtt gaa gtt gtt gca atc aac gac ttg aca gat cca        390
Asn Val Glu Gly Val Glu Val Val Ala Ile Asn Asp Leu Thr Asp Pro
25                  30                  35
gca atg ctt gct cac ttg ctt aaa tac gat aca act caa ggt cgt ttt        438
Ala Met Leu Ala His Leu Leu Lys Tyr Asp Thr Thr Gln Gly Arg Phe
40                  45                  50
gat ggt aaa gtt gaa gtt aaa gat ggt ggt ttt gaa gtt aac ggt aaa        486
Asp Gly Lys Val Glu Val Lys Asp Gly Gly Phe Glu Val Asn Gly Lys
55                  60                  65                  70
ttc gtt aaa gtt act gct gaa tct aac cca gct aac atc aac tgg gct        534
Phe Val Lys Val Thr Ala Glu Ser Asn Pro Ala Asn Ile Asn Trp Ala
75                  80                  85
gaa gtt ggt gca gaa atc gtt ctt gaa gca act ggt ttc ttc gca act        582
Glu Val Gly Ala Glu Ile Val Leu Glu Ala Thr Gly Phe Phe Ala Thr
90                  95                  100
aaa gaa aaa gct gaa caa cac ttg cac gct aat ggt gct aag aaa gtt        630
Lys Glu Lys Ala Glu Gln His Leu His Ala Asn Gly Ala Lys Lys Val
105                 110                 115
gtt atc act gca cct ggt gga tca gat gtt aaa aca atc gtt ttc aac        678
Val Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ser Asp Val Lys Thr Ile Val Phe Asn
120                 125                 130
act aac cac gaa gta ctt gat gga act gaa aca gta att tca gct ggt        726
Thr Asn His Glu Val Leu Asp Gly Thr Glu Thr Val Ile Ser Ala Gly
135                 140                 145                 150
tca tgt aca acc aac tgt ctt gct cca atg gct gat act ttg aac aaa        774
Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Met Ala Asp Thr Leu Asn Lys
155                 160                 165
caa ttc ggt atc aaa gtt ggt aca atg act aca gtt cac ggt tac act        822
Gln Phe Gly Ile Lys Val Gly Thr Met Thr Thr Val His Gly Tyr Thr
170                 175                 180
ggt gac caa atg act ctt gat ggc cca cac cgt ggt gga gat ttc cgt        870
Gly Asp Gln Met Thr Leu Asp Gly Pro His Arg Gly Gly Asp Phe Arg
185                 190                 195
cgc gca cgt gct gca gct gaa aac atc gta cct aac tca aca ggt gct        918
Arg Ala Arg Ala Ala Ala Glu Asn Ile Val Pro Asn Ser Thr Gly Ala
200                 205                 210
gct aaa gcc atc ggt ctt gta ttg cca gaa ctt caa ggt aaa ctt caa        966
Ala Lys Ala Ile Gly Leu Val Leu Pro Glu Leu Gln Gly Lys Leu Gln
215                 220                 225                 230
gga cat gct caa cgt gta cca gtt cca act ggt tca ttg act gaa ctt       1014
Gly His Ala Gln Arg Val Pro Val Pro Thr Gly Ser Leu Thr Glu Leu
235                 240                 245
gtt act atc ctt gat aaa gaa gtt aca gtt gac gaa atc aac gca gct       1062
Val Thr Ile Leu Asp Lys Glu Val Thr Val Asp Glu Ile Asn Ala Ala
250                 255                 260
atg aaa gct gct tca aat gaa tca ttt ggt tac aac gaa gac caa atc       1110
Met Lys Ala Ala Ser Asn Glu Ser Phe Gly Tyr Asn Glu Asp Gln Ile
265                 270                 275
gtt tca tct gat atc gtt ggt atc tca aac tct tca ctc ttt gat gct       1158
Val Ser Ser Asp Ile Val Gly Ile Ser Asn Ser Ser Leu Phe Asp Ala
280                 285                 290
act caa act gaa gtt act tca gct aac gga gct caa ctt gtt aaa act       1206
Thr Gln Thr Glu Val Thr Ser Ala Asn Gly Ala Gln Leu Val Lys Thr
295                 300                 305                 310
gta tct tgg tac gat aac gaa atg tca tac act tca aac ctt gtt cgt       1254
Val Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Met Ser Tyr Thr Ser Asn Leu Val Arg
315                 320                 325
aca ctt gca tac ttc gct aaa atc gct aaa taaggaggaa aaa atg aag        1303
Thr Leu Ala Tyr Phe Ala Lys Ile Ala Lys                Met Lys
330                 335
aag aaa atc att agt gcc atc tta atg tct aca gtg att ctt tca gct       1351
Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu Ser Ala
340                 345                 350
gca gct cct tta tca ggc gtt tat gca ttt gtg aac caa cac ctg tgc       1399
Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Phe Val Asn Gln His Leu Cys
355                 360                 365                 370
ggc tca cac ctg gtg gaa gct ctc tac cta gtg tgc ggg gaa cga ggc       1447
Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly
375                 380                 385
ttc ttc tac aca ccc aag acc cgc cgg gag gca gag gac ctg cag gtg       1495
Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val
390                 395                 400
ggg cag gtg gag ctg ggc ggg ggc cct ggt gca ggc agc ctg cag ccc       1543
Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro
405                 410                 415
ttg gcc ctg gag ggg tcc ctg cag aag cgt ggc att gtg gaa caa tgc       1591
Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys
420                 425                 430
tgt acc agc atc tgc tcc ctc tac cag ctg gag aac tac tgc aac           1636
Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
435                 440                 445
taattttccg attttaacgg tataaaaacc agtcttcggg ctgg                      1680
<210>  16
<211>  336
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  16
Met Val Val Lys Val Gly Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Leu
1               5                   10                  15
Ala Phe Arg Arg Ile Gln Asn Val Glu Gly Val Glu Val Val Ala Ile
20                  25                  30
Asn Asp Leu Thr Asp Pro Ala Met Leu Ala His Leu Leu Lys Tyr Asp
35                  40                  45
Thr Thr Gln Gly Arg Phe Asp Gly Lys Val Glu Val Lys Asp Gly Gly
50                  55                  60
Phe Glu Val Asn Gly Lys Phe Val Lys Val Thr Ala Glu Ser Asn Pro
65                  70                  75                  80
Ala Asn Ile Asn Trp Ala Glu Val Gly Ala Glu Ile Val Leu Glu Ala
85                  90                  95
Thr Gly Phe Phe Ala Thr Lys Glu Lys Ala Glu Gln His Leu His Ala
100                 105                 110
Asn Gly Ala Lys Lys Val Val Ile Thr Ala Pro Gly Gly Ser Asp Val
115                 120                 125
Lys Thr Ile Val Phe Asn Thr Asn His Glu Val Leu Asp Gly Thr Glu
130                 135                 140
Thr Val Ile Ser Ala Gly Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Met
145                 150                 155                 160
Ala Asp Thr Leu Asn Lys Gln Phe Gly Ile Lys Val Gly Thr Met Thr
165                 170                 175
Thr Val His Gly Tyr Thr Gly Asp Gln Met Thr Leu Asp Gly Pro His
180                 185                 190
Arg Gly Gly Asp Phe Arg Arg Ala Arg Ala Ala Ala Glu Asn Ile Val
195                 200                 205
Pro Asn Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Ile Gly Leu Val Leu Pro Glu
210                 215                 220
Leu Gln Gly Lys Leu Gln Gly His Ala Gln Arg Val Pro Val Pro Thr
225                 230                 235                 240
Gly Ser Leu Thr Glu Leu Val Thr Ile Leu Asp Lys Glu Val Thr Val
245                 250                 255
Asp Glu Ile Asn Ala Ala Met Lys Ala Ala Ser Asn Glu Ser Phe Gly
260                 265                 270
Tyr Asn Glu Asp Gln Ile Val Ser Ser Asp Ile Val Gly Ile Ser Asn
275                 280                 285
Ser Ser Leu Phe Asp Ala Thr Gln Thr Glu Val Thr Ser Ala Asn Gly
290                 295                 300
Ala Gln Leu Val Lys Thr Val Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Met Ser Tyr
305                 310                 315                 320
Thr Ser Asn Leu Val Arg Thr Leu Ala Tyr Phe Ala Lys Ile Ala Lys
325                 330                 335
<210>  17
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  17
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Phe Val Asn Gln His
20                  25                  30
Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu
35                  40                  45
Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp Leu
50                  55                  60
Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu
85                  90                  95
Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys
100                 105                 110
Asn
<210>  18
<211>  3289
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Генно-инженерная конструкция
<400>  18
gatggctgaa gctccaactc atgaacaagt tgaccatgtt gtggatacaa ttgttgaagt       60
tgttgaagag gaaattggtg tgaaataaag aaaagacaag gagaatattc ttcttgtctt      120
ttttcatatc ctaaaactct acctactgtg gtagagtttt tttatctttt ttggcgtcta      180
gcaaactctg taaaacgaaa acggtcaacc tgatgtcgtg attcagtata ctggaaaagt      240
gtattatcgg caagatagac atgagatttc acggaaacaa catgatggtc cttcggattt      300
aaatcaagat atgtaaaatc atcttcacaa gcaaaatcaa tggtaacttc tttttgggca      360
taggcaatat caagtcccaa agccccttct aaataatcgt aagtagaatt ttgggcatgt      420
gcgggggtca aaccatcagc gtatttttct aaaaataaat cccaatccaa aatggaaaat      480
ttaccatcta cttttcttct tctaagaata ctaagggctt ggtcgccgat ggcgaatcca      540
gtagtttctg aaagagctgg ggtaattttt atactttcaa attttattac ttcagtttca      600
ctgtgaaaac ccattgaagt ttgcaattct ttatatgaag ttaagccgga aatagggaaa      660
aggagccgat cgtgagcgag gacaatgctg ccatagccat gtcttctttg gatgagccct      720
ttttcttcta aaatttttaa agcttgtctg acggttgaac ggctactttc ataactaata      780
gaaagttcat tctcgcttgg aagaatatcg ttcgttttat agatatcatt aaaaatcttt      840
ttttctaaat cttgcaaaat cacttcatat ttcttcatac tttatatttt atcataaaaa      900
taattgttaa cgcttgctga aaacgttttt atgaaaacgc cttaaaatgg cattttgact      960
tgcaaactgg gctaagattt gctaaaatga aaaatgccta tgtttaaggt aaaaaacaaa     1020
tggaggacat ttctaaaatg tttggaatag gaaaaaagaa agaattgaga gatgataaaa     1080
gcctttatgc tccagtttct ggggaagtta tcaacctttc aacagtcaac gaccccgtat     1140
tttcaaaaaa gataatggga gacgggttcg cggttgagcc aaaagaaaat aaaatttttg     1200
ccccagtttc tgcaaaagta actttggttc aaggacatgc aattggtttt aaacgtgctg     1260
atggcttaga tgtactttta catcttggaa ttgatacagt agctcttaaa ggtcttcatt     1320
ttaaaatcaa ggtcaaagtt gatgatattg tcaatggtgg tgatgagctt ggaagcgttg     1380
attgggcaca gattgaagct gcaggtttag ataaaacgac aatggttatc tttacaaata     1440
caaaagataa actctctgag ttcaatgtca attatggacc agctacttct ggaagtgaac     1500
ttggtaaggc aagtgttaaa taaggaggaa aaaatggcaa attattcaca acttgcgaca     1560
gaaattatcg caaatgtagg tggcgctgag aatgtcacaa aagttattca ctgtatcact     1620
cgtcttcgtt ttaccttgaa agacaaagat aaagcagata cggcggcgat tgaagcctta     1680
cctggtgtcg ctggagctgt ttataactca aacttgaatc aatatcaagt agttattgga     1740
caagctgtag aagatgttta tgacgaggtt gttgaacagc ttggagattc agttgttgat     1800
gaagatgcaa cggcgcaagc acttactgca acagcaccgg ctagtggtaa aaaacaaaat     1860
ccaattgttc atgctttcca agtggttatt gggacaatta caggttcgat gattccaatt     1920
attggtttac ttgcggctgg tgggatgatt aatggattat taagtatctt tgttaaagga     1980
aatcgtttaa ttgaagtgat tgaccctgca agttcaactt acgtcattat ctcaactcta     2040
gcaatgacac cattttattt cttacctgtt ttagtaggat tttcagcagc aaaacaatta     2100
gcacctaaag atactgtttt acaatttatt ggtgctgctg ttggtggttt catgattaat     2160
ccagggatta ctaacttggt aaatgctcat gttggaacaa atgcggccgg taaaaatgtt     2220
gttgttgaag cagcagctcc agtagcaaat ttccttggag tcacttttaa tacaagttat     2280
tttggaattc cggttgcttt gccaagttat gcttatacaa ttttcccaat cattgtggcg     2340
gtagcaatcg ctaaaccttt gaatgcttgg ttgaaaaagg ttttaccact tgccttgcgt     2400
ccaattttcc aaccgatgat tactttcttc atcactgctt caatcatttt actcttggtc     2460
ggtcctgtta tttcaacaat ttcatctggt ttgtcattcg ttattgacca tatcttgtca     2520
ttaaacttag ggattgcaag tattatcgtc ggtggtttgt atcaatgttt ggttatattt     2580
ggtttgcact ggttggttgt accacttatt tcacaagagt tggcagcaac aggagcaagc     2640
tcacttaata tgattgttag cttcacaatg cttgcgcaag gagttggtgc cttgactgtc     2700
ttctttaaat ctaaaaaagc tgaccttaaa ggactttctg ctccagctgc catttcggct     2760
ttttgtggag taactgaacc tgccatgtac ggaattaact tgaaatatgt tcgcgtcttc     2820
atcatgtctt caattggtgc agcaattggt gctgggattg ccggatttgg tggcttacaa     2880
atgtttggat tttcagggtc attgattagt tttcctaact ttatctctaa tccattgacg     2940
catcatgcac ctgcgggtaa cttaatgctc ttctggattg ccactgcggt atgtgctgtt     3000
gccactttct tattagtttg gttctttggt tacaaggata ctgatgtcat gggacaagga     3060
gttgaacaaa aaaatgcatt taaggatgct gtaaaataaa tagttttgct cttaataaag     3120
ttttgataca aggatttaca attatttttt gataaaaaaa ttactgatag aaatgaaaaa     3180
aattctgtca gtaattttgg aaagtcattc taaaaaattc attttaaaat gacgagaaag     3240
aaggtaaaaa gatgtttaaa gcagtattgt ttgatttaga tggcgtaat                 3289
<210>  19
<211>  1700
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Генно-инженерная конструкция
<400>  19
gtaattctaa tgctggtggg aatacaaatt caggcactag tactggaaat actggaggaa       60
caactactgg tggtagcggt ataaatagtt caccaattgg aaatccttat gctggtggtg      120
gatgtactga ctatgtatgg caatactttg ctgcacaagg aatttatatc agaaatatca      180
tgcctggtaa tggtggacaa tgggcttcta atggacctgc ccaaggcgtg ctccatgttg      240
taggagctgc tcctggtgtt atcgcatcaa gcttctcagc tgattttgtt ggatatgcaa      300
actcacctta cggtcacgta gctattgtaa aatcagttaa ttcagatggt acaattacta      360
tcaaagaagg cggatatggt acaacttggt ggggacatga acgtactgta agtgcgtctg      420
gtgttacttt cttgatgcca aactaaggag gaaaaaatga cagaaccgtt aaccgaaacc      480
cctgaactat ccgcgaaata tgcctggttt tttgatcttg atggaacgct ggcggaaatc      540
aaaccgcatc ccgatcaggt cgtcgtgcct gacaatattc tgcaaggact acagctactg      600
gcaaccgcaa gtgatggtgc attggcattg atatcagggc gctcaatggt ggagcttgac      660
gcactggcaa aaccttatcg cttcccgtta gcgggcgtgc atggggcgga gcgccgtgac      720
atcaatggta aaacacatat cgttcatctg ccggatgcga ttgcgcgtga tattagcgtg      780
caactgcata cagtcatcgc tcagtatccc ggcgcggagc tggaggcgaa agggatggct      840
tttgcgctgc attatcgtca ggctccgcag catgaagacg cattaatgac attagcgcaa      900
cgtattactc agatctggcc acaaatggcg ttacagcagg gaaagtgtgt tgtcgagatc      960
aaaccgagag gtaccagtaa aggtgaggca attgcagctt ttatgcagga agctcccttt     1020
atcgggcgaa cgcccgtatt tctgggcgat gatttaaccg atgaatctgg cttcgcagtc     1080
gttaaccgac tgggcggaat gtcagtaaaa attggcacag gtgcaactca ggcatcatgg     1140
cgactggcgg gtgtgccgga tgtctggagc tggcttgaaa tgataaccac cgcattacaa     1200
caaaaaagag aaaataacag gagtgatgac tatgagtcgt ttagtcgtag tatctaaaaa     1260
aaagtcttaa taaataaaaa atagtggttt gatagtgggg aataattttc cttctgtcaa     1320
atcatttttt attattgtgg tataataata aggaaaaatg ataaggggat agatacaaat     1380
gtgtggaatt gtcggcttta ttgaccggat cgatcaaaat gataaatcaa aaactttaga     1440
agaaatgatg gatacaatcg ctcaccgagg tccaagtagt tcaggtgaat ttattgacga     1500
aggagcagca attggttttc gtcgcctgag tattattgac cttgagggtg gagatcaacc     1560
tatctttaat gaagataaaa ctaaacttat aacctttaat ggcgaaattt ataatttccg     1620
tgaattgcgt gaagacctta tctctaaagg tcatgatttt actactcatg ctgatacaga     1680
agtgctttta catggttacg                                                 1700
<210>  20
<211>  1029
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Генно-инженерная конструкция
<220>
<221>  MISC / Другие признаки
<222>  (389)..(1029)
<223>  Кодирующая последовательность ptcC с инсерцией tga30 в положении кодона
30 из 446 (tga30) наряду с сайтом EcoRI для разрушения гена ptcC
<400>  20
caccgaatta acacgcatta tgacttaacg aggcaattac ctacggtcta tttgacagaa       60
cgtttaacag atctcgttta tcaacgttcc aactaaaaaa gccaatctgg cttttttcta      120
tgctctgtcg ttcctaatgg tttgatatct aaaagtaaaa aagttaaatt gagataacaa      180
atataattat caaggctgaa cctcgcaagc ttaaaggaaa cttatatgac aattttggta      240
caggagtctt caaaagtggc acagaaccaa agtgatggaa aaataagaaa ctgctttctt      300
tactttgcct attaatgcta taatgaaaat gtagaaaaga tggacgtgaa accagttcat      360
caaaaaaagt aaaggagact gttcaaccat gaacaatttt attcaaaaca aaatcatgcc      420
tccaatgatg aaatttttga atacccgtgc agtcacggca atcaaaaatg gtatgtgaat      480
tcctatccca tttatcatta ttggttcagt attcttgatt cttggtcaac tgccattcca      540
agcaggacaa gacttcatga acaaaatcaa attgggccca ctctttttac aaattaataa      600
tgcttcattt ggtattatgg ctttgcttgc cgtgttcggt attgcttacg cttgggttcg      660
agatgcaggt tatgaaggag tacccgctgg tttaacaggt gtcattgttc acatcttgtt      720
gcaaccagac acaatccatc aagtaacaag tgttactgac ccaactaaaa catcaacagc      780
atttcaagta ggtggtgtca ttgaccgagc ttggttaggt gggaaaggga tggttctctc      840
aatcatcgtt ggactcttag taggttggat ttacactggc tttatgcgtc ggaacatcac      900
aatcaaaatg ccagaacaag ttccagaaaa cgttgccgca tcatttactt cacttgtacc      960
tgcaggagca atcattacaa tggctggtgt ggttcatgga atcacaacga ttggcttcaa     1020
cacaacttt                                                             1029
<210>  21
<211>  29
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223> Генно-инженерная
<220>
<221>  MISC / Другие признаки_FEATURE
<222>  (1)..(29)
<223>  Последовательность, кодированная от кодона 1 до кодона 29 гена ptcC,
нарушенного кодоном tga30 и сайтом EcoRI
<400>  21
Met Asn Asn Phe Ile Gln Asn Lys Ile Met Pro Pro Met Met Lys Phe
1               5                   10                  15
Leu Asn Thr Arg Ala Val Thr Ala Ile Lys Asn Gly Met
20                  25
<210>  22
<211>  500
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Генно-инженерный конструкт
<400>  22
tcagctaacg gagctcaact tgttaaaact gtatcttggt acgataacga aatgtcatac       60
acttcaaacc ttgttcgtac acttgcatac ttcgctaaaa tcgctaaata aggaggaaaa      120
aatgaagaag aaaatcatta gtgccatctt aatgtctaca gtgattcttt cagctgcagc      180
tcctttatca ggcgtttatg catttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga      240
agctctctac ctagtgtgcg gggaacgagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga      300
ggcagaggac ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct      360
gcagcccttg gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac      420
cagcatctgc tccctctacc agctggagaa ctactgcaac taattttccg attttaacgg      480
tataaaaacc agtcttcggg                                                  500
<210>  23
<211>  1000
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Генно-инженерный конструкт
<220>
<221>  Кодирующая последовательность
<222>  (312)..(872)
<223> Ген, кодирующий слияние SSusp45 (нуклеотиды 312-392) и hIL-10 (нуклеотиды
393-876)
<400>  23
aatccaatga cggcacttct tccttggacg acaccagcac ctgtgagaat ggccatttca       60
ggtggacttc catttttgat tatttttgca atctgtttag tcttgaatgt tcttatttac      120
tacccattct ttaaggtggc gtataataaa gctttagaag aagaaaaagc agctgttgaa      180
ttagagggtt cagaaactgc ctgatggaaa acgccttaaa atggcatttt gacttgcaaa      240
ctgggctaag atttgctaaa atgaaaaatg cctatgttta aggtaaaaaa caaatggagg      300
acatttctaa a atg aaa aaa aag att atc tca gct att tta atg tct aca       350
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr
1               5                   10
gtg ata ctt tct gct gca gcc ccg ttg tca ggt gtt tac gcc tca gct        398
Val Ile Leu Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ser Ala
15                  20                  25
ggt caa ggt act caa tca gaa aac tca tgt act cac ttt cca ggt aac        446
Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn
30                  35                  40                  45
ttg cca aac atg ctt cgt gat ttg cgt gat gct ttt tca cgt gtt aaa        494
Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys
50                  55                  60
act ttt ttt caa atg aaa gat caa ctt gat aac ttg ctt ttg aaa gaa        542
Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu
65                  70                  75
tca ctt ttg gaa gat ttt aaa ggt tac ctt ggt tgt caa gct ttg tca        590
Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser
80                  85                  90
gaa atg atc caa ttt tac ctt gaa gaa gtt atg cca caa gct gaa aac        638
Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn
95                  100                 105
caa gat cca gat atc aaa gct cac gtt aac tca ttg ggt gaa aac ctt        686
Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu
110                 115                 120                 125
aaa act ttg cgt ctt cgt ttg cgt cgt tgt cac cgt ttt ctt cca tgt        734
Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys
130                 135                 140
gaa aac aaa tca aaa gct gtt gaa caa gtt aaa aac gct ttt aac aaa        782
Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys
145                 150                 155
ttg caa gaa aaa ggt atc tac aaa gct atg tca gaa ttt gat atc ttt        830
Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe
160                 165                 170
atc aac tac atc gaa gct tac atg act atg aaa atc cgt aac                872
Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
175                 180                 185
taactagaat taatctataa gttactgaca aaactgtcag taactttttt tgtgggaaaa      932
atgtattttt atgaccgtaa agaatctgtc agtagaagtc tgaaattcgt ttaaaaatcg      992
actagaat                                                              1000
<210>  24
<211>  187
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетическая конструкция
<400>  24
Met Lys Lys Lys Ile Ile Ser Ala Ile Leu Met Ser Thr Val Ile Leu
1               5                   10                  15
Ser Ala Ala Ala Pro Leu Ser Gly Val Tyr Ala Ser Ala Gly Gln Gly
20                  25                  30
Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn
35                  40                  45
Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe
50                  55                  60
Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile
85                  90                  95
Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro
100                 105                 110
Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu
115                 120                 125
Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys
130                 135                 140
Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu
145                 150                 155                 160
Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr
165                 170                 175
Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn
180                 185
<210>  25
<211>  183
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Генно-инженерная
<220>
<221>  MISC / Другие признаки_FEATURE
<222>  (1)..(183)
<223>  Последовательность, кодируемая после кодона tga30 и сайта EcoRI
разрушенного гена ptcC до аминокислоты 213 ptcC
<400>  25
Ile Pro Ile Pro Phe Ile Ile Ile Gly Ser Val Phe Leu Ile Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Leu Pro Phe Gln Ala Gly Gln Asp Phe Met Asn Lys Ile Lys Leu
20                  25                  30
Gly Pro Leu Phe Leu Gln Ile Asn Asn Ala Ser Phe Gly Ile Met Ala
35                  40                  45
Leu Leu Ala Val Phe Gly Ile Ala Tyr Ala Trp Val Arg Asp Ala Gly
50                  55                  60
Tyr Glu Gly Val Pro Ala Gly Leu Thr Gly Val Ile Val His Ile Leu
65                  70                  75                  80
Leu Gln Pro Asp Thr Ile His Gln Val Thr Ser Val Thr Asp Pro Thr
85                  90                  95
Lys Thr Ser Thr Ala Phe Gln Val Gly Gly Val Ile Asp Arg Ala Trp
100                 105                 110
Leu Gly Gly Lys Gly Met Val Leu Ser Ile Ile Val Gly Leu Leu Val
115                 120                 125
Gly Trp Ile Tyr Thr Gly Phe Met Arg Arg Asn Ile Thr Ile Lys Met
130                 135                 140
Pro Glu Gln Val Pro Glu Asn Val Ala Ala Ser Phe Thr Ser Leu Val
145                 150                 155                 160
Pro Ala Gly Ala Ile Ile Thr Met Ala Gly Val Val His Gly Ile Thr
165                 170                 175
Thr Ile Gly Phe Asn Thr Thr
180
<---