ПОЛИКАПРОЛАКТОНОВЫЙ МИКРОСФЕРНЫЙ ФИЛЛЕР, СОДЕРЖАЩИЙ КОЛЛАГЕНОВЫЙ ПЕПТИД, И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ
POLYCAPROLACTONE MICROSPHERIC FILLER CONTAINING COLLAGEN PEPTIDE AND METHOD FOR ITS PRODUCTION

Область техники
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ(ЫЕ) ЗАЯВКУ(И)
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании патентной заявки Кореи № 10-2018-0003585, поданной 10 января 2018 г. в Ведомство по интеллектуальной собственности Республики Корея, раскрытие которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Данное изобретение относится к поликапролактоновому микросферному филлеру, и способу его изготовления, и, в частности, к поликапролактоновому микросферному филлеру, для которого не только решены проблемы стабильности коллагенового пептида in vivo за счет содержания в нем коллагенового пептида, но также при применении к живому организму, демонстрирует быстрый эффект после применения и далее поддерживает эффект в течение длительного периода времени, а также способ его изготовления.
Уровень техники

Дермальные филлеры - это медицинский инструмент инъекционного типа, который вводит материалы, безопасные для человеческого тела, в дермальный слой лица, чтобы заполнить кожные ткани, например разгладить морщины и создать объем в эстетическом виде, и используются для так называемого противодействия старению, включая ботулотоксин (BOTOX), аутотрансплантацию жировой ткани, нитиевый лифтинг, микроиглы, лазерную обработку, дермабразию и т.п.
Дермальный филлер первого поколения, разработанный первым, представляет собой коллагеновый филлер животного происхождения и редко используется в последние годы, так как эффект после применения длится недолго, от 2 до 4 месяцев, и проблему составляет то, что за один месяц до применения должно быть проведено тестирование на реакцию гиперчувствительности.
Дермальный филлер второго поколения представляет собой филлер с гиалуроновой кислотой и в настоящее время является наиболее часто используемым филлером, так как он имеет более длительное время действия, чем коллагеновый филлер, и имеет значительно меньшие побочные эффекты, такие как реакция гиперчувствительности, потому что состоит из полисахаридов, аналогичных компонентам человеческого тела и поэтому не требует тестирования на реакцию гиперчувствительности как коллагеновые филлеры. В частности, гиалуроновая кислота проста в применении и удалении, обладает высокой вязкоупругостью, поддерживает содержание влаги и объем и эластичность кожи, что таким образом очень подходит в качестве сырьевого материала для дермальных филлеров. В последнее время активно проводились исследования по продлению эффекта за счет образования поперечных связей гиалуроновой кислоты для увеличения размера частиц и молекулярной массы, но так как длительность эффекта относительно короткая, от 6 до 12 месяцев, проблему составляет то, что применение необходимо повторять каждые 6-12 месяцев.
Дермальный филлер третьего поколения, являющийся филлером из синтетического полимера, например полимолочной кислотой (ПМК) или поликапролактоном (ПКЛ), распадается очень постепенно в человеческом организме, и, таким образом, используется в целях демонстрации более длительного эффекта по сравнению с филлерами с коллагеном и гиалуроновой кислотой, являющимися абсорбирующими филлерами. В частности, поликапролактон на 100 % абсорбируется человеческим организмом и поэтому является безопасным компонентом, и его преимуществом является то, что он абсорбируется медленнее, чем полимолочная кислота после введения в кожу, способствует образованию коллагена, и эффект длится от 1 до 4 лет, при этом ощущается мягкость тканей без чувства инородного тела. Тем не менее, поликапролактоновый филлер является филлером в форме микросферы, и его необходимо принимать посредством суспендирования в гелевом носителе, таком как карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ), и он демонстрирует эффект только через 6-8 недель после введения под кожу. Таким образом, недостатком является то, что удовлетворенность от применения ниже, чем для филлера с гиалуроновой кислотой, который демонстрирует немедленный эффект после применения.
В то же время известно, что биоактивные пептиды, такие как KTTKS, являются веществами, производными от коллагена, что препятствует синтезу коллагеназы или способствует образованию внеклеточного матрикса (ВКМ), а также способствует экспрессии коллагена типа I и типа III и фибронектина. Однако фактом является то, что в связи с низкой стабильностью пептидов in vivo и низкой проницаемостью через кожу биоактивные пептиды используются исключительно в косметике и т. п. для устранения морщин и восстановления кожи за счет использования различных производных.
Таким образом, существует необходимость разработать новый поликапролактоновый микросферный филлер с улучшенной эффективностью, решая проблему стабильности коллагенового пептида in vivo, используя свойства существующих поликапролактоновых микросферных филлеров и инкапсулируя коллагеновый пептид в поликапролактоновых микросферах.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
Настоящее изобретение задумано для решения вышеуказанных проблем стабильности коллагенового пептида in vivo и повышения эффективности поликапролактонового микросферного филлера, и задачей настоящего изобретения является предложение поликапролактоновой микросферы, содержащей коллагеновый пептид, которая при применении на живом организме быстро демонстрирует эффект от применения и поддерживает его в течение длительного времени, а также содержащий ее филлер и способ изготовления.
Техническое решение
Для решения вышеуказанных задач в качестве одного объекта настоящего изобретения предложена поликапролактоновая микросфера, содержащая коллагеновый пептид, которая содержит коллагеновый пептид в количестве от 0,01 масс.% до 7 масс.% от общей массы микросферы и имеет средний размер частиц от 10 до 100 мкм.
В качестве другого объекта настоящего изобретения предложен способ изготовления поликапролактоновой микросферы, содержащей коллагеновый пептид, включающий следующие этапы: (a) изготовление дисперсной фазы путем растворения поликапролактона в первом растворителе и растворения коллагенового пептида во втором растворителе для приготовления каждого раствора и последующего равномерного смешивания двух растворов для приготовления одного раствора; (b) изготовление эмульсии путем смешивания дисперсной фазы с водным раствором (диспергирующей фазой), содержащим поверхностно-активное вещество для приготовления эмульсии; (c) формирование микросферы путем экстракции и выпаривания органических растворителей из дисперсной фазы в диспергирующую фазу в эмульсии, приготовленной на этапе (b); и (d) извлечение микросферы из диспергирующей фазы этапа (c).
В качестве еще одного объекта настоящего изобретения предложен филлер, содержащий поликапролактоновую микросферу, содержащую коллагеновый пептид, по настоящему изобретению; и фармацевтически приемлемый водный носитель и поликапролактоновую микросферу.
ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Филлер, содержащий поликапролактоновую микросферу, содержащую коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению не только демонстрирует эффект быстрого образования коллагена при применении в живом организме и высокую способность к восстановлению тканей, но и поддерживает эффект в течение длительного периода времени, демонстрируя таким образом отличную способность мягких тканей, таких как щеки, грудь, нос, губы и ягодицы, к восстановлению, увеличению объема или разглаживанию морщин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1а представляет собой фотографию формы поликапролактоновой микросферы, содержащей пальмитоил-KTTKS (Пальмитоил-KTTKS), приготовленной в соответствии с Примером 1-1, сделанную с использованием оптического микроскопа. Как видно на фотографии, можно подтвердить, что изготовленные микросферы поддерживают сферическую форму, и размер частиц может быть отрегулирован в зависимости от диаметра пор мембраны, использованной при изготовлении.
ФИГ. 1b представляет собой фотографию формы поликапролактоновой микросферы, содержащей пальмитоил-KTTKS, приготовленной с избытком аскорбиновой кислоты в соответствии со Сравнительным Примером 3-1, сделанную при помощи оптического микроскопа. Как видно на фотографии, можно подтвердить, что изготовленные микросферы поддерживают сферическую форму, и размер частиц может быть отрегулирован в зависимости от диаметра пор мембраны, использованной при изготовлении.
ФИГ. 1c представляет собой фотографию формы поликапролактоновой микросферы, содержащей пальмитоил-KTTKS, приготовленной с избытком аскорбиновой кислоты в соответствии со Сравнительным Примером 3-2, сделанную при помощи оптического микроскопа. Как видно на фотографии, можно подтвердить, что изготовленные микросферы поддерживают сферическую форму, и размер частиц может быть отрегулирован в зависимости от диаметра пор мембраны, использованной при изготовлении.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно.
Коллагеновый пептид согласно настоящему изобретению относится к пептиду, демонстрирующему эффект продвижения восстановления коллагена in vivo, и может быть как минимум одним из группы, состоящей из KTTKS, GHK, AHK и их производных. Примеры производных коллагеновых пептидов, не имеющие ограничительного характера, содержат пальмитоил-KTTKS, GHK-Cu, AHK-Cu и т.п. Предпочтительно использовать KTTKS, пальмитоил-KTTKS, GHK, AHK и их смеси. Более предпочтительно использовать KTTKS или пальмитоил-KTTKS.
В одном примере осуществления содержание (капсулированное количество) коллагенового пептида в поликапролактоновой микросфере согласно настоящему изобретению может составлять от 0,01 масс.% до 7 масс.%, предпочтительно от 0,05 масс.% до 6 масс.% от общей массы микросферы. Такое количество капсулируемого вещества оптимизируют таким образом, что характерная физиологическая активность коллагенового пептида может демонстрировать синергетический эффект в месте введения, обеспечивая стабильность коллагенового пептида in vivo. Когда капсулированное количество коллагенового пептида составляет менее 0,01 масс.%, не демонстрируется достаточный синергетический эффект продвижения образования коллагена, который может быть выражен коллагеновым пептидом. Когда капсулированное количество коллагенового пептида превышает 7 масс.%, эффективность капсулирования коллагенового пептида в поликапролактоновой микросфере снижается, и коллагеновый пептид образует неравномерные каналы внутри микросфер, и коллагеновый пептид быстро выделяется за счет диффузии в сформированный канал, что не является предпочтительным.
Поликапролактоновую микросферу, содержащую коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению изготавливают с использованием поликапролактона, при этом инкремент вязкости поликапролактона, являющегося биоразлагаемым полимером, составляет от 0,16 до 1,90 дл/г. Инкремент вязкости поликапролактона, используемого в данном изобретении, измеряют в хлороформе при 25°C с использованием вискозиметра Ubbelohde. Примерами вышеуказанного поликапролактонового полимера являются Resormer C209, C212 и C217 производства Evonik, Purasorb PC02, PC04, PC08, PC12 и PC17 производства Corbion и т. п. Когда инкремент вязкости использованного поликапролактона ниже 0,16 дл/г, в связи с его низкой вязкостью поликапролактоновая микросфера не формируется надлежащим образом, или микросфера распадается слишком быстро при введении в живой организм, и, таким образом, начальный выход коллагенового пептида может быть быстро увеличен. Когда вязкость превышает 1,90 дл/г, скорость распада микросферы снижается при введении в живой организм, и благодаря влиянию низкой скорости распада полимера снижается скорость, с которой коллагеновый пептид из микросферы распространяется в живом организме, что усложняет демонстрацию эффекта продвижения достаточного образования коллагена.
Поликапролактоновая микросфера, содержащая коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению имеет средний размер частиц 10 мкм и более и 100 мкм и менее, например, предпочтительно от 10 до 30 мкм, от 10 до 50 мкм или от 10 до 100 мкм, от 20 до 50 мкм, от 30 до 60 мкм или от 40 до 70 мкм. Под «средним размером частиц» в смысле настоящего изобретения понимают средний диаметр, то есть размер частиц, соответствующий 50 % объемного содержания в процентах на кривой распределения размера частиц, выраженного как D50 или D (v, 0,5).
Когда средний размер частиц поликапролактоновой микросферы, содержащей коллагеновый пептид, составляет менее 10 мкм, она может быть фагоцитирована макрофагами при применении на живом организме. Когда средний размер частиц составляет более 100 мкм, способность проходить через иглу шприца снижается, и инъекционная игла должна делаться толще, что вызывает большую болезненность при введении, что не является предпочтительным.
Предпочтительно, чтобы поликапролактоновая микросфера, содержащая коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению обладала равномерным распределением частиц. Микросфера, обладающая равномерным распределением частиц, имеет меньшее отклонение остаточного количества в шприце или игле во время введения и меньший феномен забивания инъекционной иглы по сравнению с неравномерной микросферой, и, таким образом, может быть использована тонкая инъекционная игла. Предпочтительно, чтобы диапазон распределения размеров или величина диапазона значений размеров поликапролактоновых микросфер согласно настоящему изобретению составлял 1,0 или менее. В более предпочтительном варианте диапазон размеров составляет 0,8 и менее. Диапазон распределения размеров (или величина диапазона значений размеров), используемый в настоящей заявке, представляет собой индекс, указывающий на постоянство размера частиц микросфер, и означает величину, рассчитываемую по формуле распределения размеров (диапазон) = (Dv0,9-Dv0,1) /Dv0,5. Здесь Dv0,1 означает размер частиц, соответствующий 10 % объемного содержания на кривой распределения размеров частиц микросфер, Dv0,5 - размер частиц, соответствующий 50 % объемного содержания на кривой распределения размеров частиц микросфер, а Dv0,9 - размер частиц, соответствующий 90 % объемного содержания на кривой распределения размеров частиц микросфер. Поликапролактоновая микросфера, содержащая коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению характеризуется тем, что демонстрирует постоянное распределение размера, демонстрируя при этом размер частиц от 10 мкм и более и 100 мкм и менее, сокращая таким образом забивание иглы и улучшая способность проходить через иглу.
Диапазон распределения размеров или величина диапазона значений размеров, как раскрыто выше, оптимизируют таким образом, чтобы включить количество капсулируемого вещества, которое позволяет коллагеновому пептиду в поликапролактоновой микросфере быть элюированным в соответствующем количестве в течение длительного периода времени. Поликапролактоновые микрочастицы, содержащие коллагеновый пептид согласно настоящему изобретению с такими характеристиками, характеризуются тем, что выпускают эффективное количество коллагенового пептида в течение длительного периода времени. В частности, поликапролактоновая микросфера, содержащая коллагеновый пептид согласно настоящему изобретению, постепенно выпускает коллагеновый пептид, предпочтительно в течение 30 дней, более предпочтительно - от 35 до 42 дней, еще более предпочтительно - от 56 до 60 дней.
Дополнительно коллагеновый пептид согласно настоящему изобретению демонстрирует суммарную степень элюирования от 0,1 до 10 % по завершении 1 дня после элюирования при измерении суммарной степени элюирования микросфер in vitro. Он демонстрирует суммарную степень элюирования от 40 до 65 % по завершении 14 дней и суммарную степень элюирования от 70 до 100 % по завершении 56 дней.
Поликапролактоновая микросфера, содержащая коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению может быть изготовлена, например, с использованием «способа экстракции/выпаривания растворителем», но не ограничивается им.
В качестве специального примера способа изготовления поликапролактоновой микросферы, содержащей коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению данный способ изготовления содержит следующие этапы: (a) изготовление дисперсной фазы путем растворения поликапролактона в первом растворителе и растворения коллагенового пептида во втором растворителе для приготовления каждого раствора и последующего равномерного смешивания двух растворов для приготовления одного раствора; (b) изготовление эмульсии путем смешивания дисперсной фазы с водным раствором (диспергирующей фазой), содержащим поверхностно-активное вещество; (c) формирование микросферы путем экстракции и выпаривания органических растворителей из дисперсной фазы в диспергирующую фазу в эмульсии, приготовленной на этапе (b); и (d) извлечение микросферы из диспергирующей фазы этапа (c) для изготовления поликапролактоновой микросферы, содержащей коллагеновый пептид.
На этапе (а) предпочтительно поликапролактон имеет инкремент вязкости в диапазоне от 0,16 до 1,90 дл/г.
Первый растворитель, использованный для растворения поликапролактона на этапе (а), предпочтительно должен обладать свойствами несмешивания с водой. За счет свойств органического растворителя, смешивающегося с водой, дисперсная фаза может равномерно смешиваться и диспергировать в водном растворе, содержащем поверхностно-активное вещество, что является диспергирующей фазой на этапе (b), раскрытом ниже, образуя таким образом эмульсию. Тип растворителя, растворяющего поликапролактон, не имеет конкретных ограничений и предпочтительно может быть выбран из группы, состоящей из дихлорометана, хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и смешанного из них растворителя. Более предпочтительно использовать дихлорометан, этилацетат или смешанный из них растворитель.
Второй растворитель для растворения коллагенового пептида на этапе (а) может быть выбран из группы, состоящей из метилового спирта, этилового спирта, ацетона, ацетонитрила, диметилсульфоксида, диметилформамида, N-метилпирролидона, уксусной кислоты и их смеси. Предпочтительно использовать метиловый спирт, диметилсульфоксид или смешанный из них раствор.
На этапе (а) смешивают поликапролактон и коллагеновый пептид для приготовления равномерно смешанного раствора, изготавливая таким образом дисперсную фазу. Предпочтительно, чтобы смешанный раствор поликапролактона и коллагенового пептида был равномерно размешан, чтобы коллагеновый пептид был надлежащим образом капсулирован в поликапролактоновой микросфере. В качестве примера при использовании дихлорометана в качестве растворителя для поликапролактона и использовании диметилсульфоксида в качестве растворителя для коллагенового пептида количество метилового спирта предпочтительно должно составлять от 2 масс.% до 50 масс.% относительно массы дихлорометана. Когда количество метилового спирта составляет менее 2 масс.%, высока вероятность того, что коллагеновый пептид выпадет в осадок в связи со снижением растворимости дихлорометана. Когда оно превышает 50 масс.%, велика вероятность, что поликапролактон будет осажден метиловым спиртом, что не является предпочтительным.
На этапе (b) способ для равномерного смешивания дисперсной фазы и водного раствора, содержащего поверхностно-активное вещество, не имеет конкретных ограничений, и предпочтительно смешивание может быть выполнено с использованием высокоскоростного миксера, встраиваемого миксера, способа мембранной эмульсификации, способа микроструйной эмульсификации и т.п. В качестве примера, при смешивании с использованием способа мембранной эмульсификации дисперсную фазу, приготовленную на этапе (а), пропускают через мембрану с микропорами равного размера и направляют в диспергирующую фазу, содержащую поверхностно-активное вещество, для приготовления эмульсии.
Тип поверхностно-активного вещества, используемого на этапе (b), не имеет конкретных ограничений, и поверхностно-активное вещество может быть использовано без ограничений, если оно способствует дисперсной фазе в образовании стабильной капельной эмульсии в диспергирующей фазе. Предпочтительно, поверхностно-активное вещество может быть выбрано из группы, состоящей из метилцеллюлозы, поливинилпирролидона, карбоксиметилцеллюлозы, лецитина, желатина, поливинилового спирта, сложных полиоксиэтиленовых эфиров сорбита и жирной кислоты, полиоксиэтиленовых производных касторового масла и их смесей. Наиболее предпочтителен поливиниловый спирт.
На этапе (b) содержание поверхностно-активного вещества в дисперсионной среде может составлять от 0,01 масс./об.% до 20 масс./об.%, предпочтительно, от 0,1 масс./об.% до 5 масс./об.% от общего объема дисперсионной среды, содержащей поверхностно-активное вещество. Если содержание поверхностно-активного вещества составляет менее 0,01 масс./об.%, образование дисперсной фазы или эмульсии в форме капель в дисперсионной среде может оказаться невозможным. Если содержание поверхностно-активного вещества превышает 20 масс./об.%, выведение поверхностно-активного вещества после образования тонких частиц в диспергирующей фазе может быть затруднено вследствие избыточного количества поверхностно-активного вещества. В примере осуществления настоящего изобретения поликапролактоновую микросферу, содержащую коллагеновый пептид, изготавливают с использованием от 1 масс./об.% до 5 масс./об.% поливинилового спирта.
На этапе (с) эмульсию, содержащую дисперсную фазу в форме капель и диспергирующую фазу, содержащую поверхностно-активное вещество, можно перемешивать в течение 48 часов или менее, предпочтительно от 1 до 36 часов, более предпочтительно от 3 до 24 часов, с поддержанием температуры ниже точки кипения органического растворителя, например от 5 до 39,6°C, предпочтительно от 10 до 35°C, более предпочтительно от 15 до 30°C, но не ограничиваясь этим, удаляя таким образом органический растворитель. Скорость перемешивания не имеет конкретных ограничений, но подходящей является скорость от 10 до 300 об/мин. Часть органического растворителя, экстрагированного в дисперсионную среду, может быть испарена с поверхности дисперсионной среды. Поскольку органический растворитель удаляют из раствора в форме капель, дисперсная фаза в форме капель затвердевает для образования микросфер, и, таким образом, достигается форма суспензии, содержащей микросферы (микросферная суспензия).
Для дальнейшего эффективного удаления органического растворителя на этапе (с) дисперсионную среду можно нагревать в течение определенного периода времени.
На этапе (d) может быть применен способ извлечения поликапролактоновых микросфер с использованием нескольких известных методов, например, способом фильтрации или способом центрифугирования.
Между этапами (с) и (d) остатки поверхностно-активного вещества можно удалить фильтрацией и промывкой, а микросферы могут быть извлечены путем фильтрации.
Этап промывки для удаления остатков поверхностно-активного вещества обычно может выполняться с использованием воды и может повторяться несколько раз.
Далее, как раскрыто выше, при образовании эмульсии с использованием высокоскоростного миксера и встроенного миксера на этапе (b) однородная микросфера может быть получена с использованием дополнительного процесса просеивания между этапами (c) и (d). Процесс просеивания может быть осуществлен с использованием известной техники, и микросферы с маленькими и большими частицами могут быть отфильтрованы с использованием просеивающей мембраны различных размеров для получения микросфер одинакового размера.
В качестве еще одного объекта настоящего изобретения предложен филлер, содержащий поликапролактоновую микросферу, содержащую коллагеновый пептид, по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый водный носитель.
В качестве фармацевтически приемлемого водного носителя может быть использован водный раствор для инъекций, например очищенная вода, физиологический раствор или фосфатный буфер. Кроме того, филлер в дополнение к поликапролактоновой микросфере, содержащей коллагеновый пептид, и фармацевтически приемлемому водному носителю может содержать как минимум одно вещество, выбранное из группы, состоящей из производных целлюлозы, таких как карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) и гидроксипропилметилцеллюлоза (ГПМЦ), растворов, таких как гиалуроновая кислота, лидокаин, полидеоксирибонуклеотид (ПДРН), полинуклеотид (ПН) и смазочное вещество, такое как глицерин, при необходимости, но не ограничивается этим. Предпочтительными растворами являются карбоксиметилцеллюлоза или гиалуроновая кислота.
В одном примере осуществления содержание каждого компонента, содержащегося в филлере, содержащем поликапролактоновую микросферу, содержащую коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению может составлять от 2 масс.% до 50 масс.% поликапролактоновой микросферы, содержащей коллагеновый пептид (содержание коллагенового пептида в поликапролактоновой микрочастице составляет от 0,01 масс.% до 7 масс.%), от 15 масс.% до 97,9 масс.% фармацевтически приемлемого водного носителя, от 0,1 масс.% до 5 масс.% раствора и от 0 масс.% до 48 масс.% смазочного вещества от суммарного количества 100 масс.% массы филлера, но не ограничивается этим. Когда в качестве раствора добавляют гиалуроновую кислоту, может быть использована гиалуроновая кислота со степенью образования поперечных связей от 0 до 5 %.
Филлер, содержащий поликапролактоновую микросферу, содержащую коллагеновый пептид, согласно настоящему изобретению не только демонстрирует эффект быстрого образования коллагена в месте применения сразу после применения, но также демонстрирует свойство восстановления тканей с естественным и идеальным ощущением объема, а также поддерживает стабильность коллагенового пептида in vivo, обладает хорошей способностью проходить через иглу при введении препарата и демонстрирует отличный эффект в течение длительного периода времени, и, таким образом, может быть эффективно использован в косметических и терапевтических целях.
В качестве специального примера филлер, содержащий эту поликапролактоновую микросферу, может быть использован для заполнения биологических тканей, устранения морщин посредством их заполнения, ремоделирования лица или восстановления или увеличения объема мягких тканей, таких как губы, нос, ягодицы, щеки или грудь. Филлер, содержащий поликапролактоновые микросферы, может применяться в дозировке, подходящей для такого применения, и предпочтительно в форме инъекций.
В качестве другого объекта настоящее изобретение предлагает предварительно наполненный шприц, заполненный филлером, содержащим поликапролактоновые микросферы.
Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно посредством примеров. Тем не менее, эти примеры приведены только для наглядности, и объем настоящего изобретения не ограничен ими.
Пример 1: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,99 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,01 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 39,96 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 2,02 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 3200 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 1-1: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 39,92 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 2,52 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4000 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 1-2: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,9 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,1 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 39,6 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 4,0 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 5000 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 1-3: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,5 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,5 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 38,0 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 6,19 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 3 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 5400 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 1-4: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 1 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 36,0 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 10,77 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 3 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4800 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 2: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 24,95 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 1,57 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 2500 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросферы перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросферы была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 2-1: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 12 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 55,44 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 3,5 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 6700 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 2-2: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 17 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 83,16 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 5,25 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 12500 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 3: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 39,92 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 2,52 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4000 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 5 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 3-1: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 39,92 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 2,52 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4000 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 30 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 3-2: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 39,92 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 2,52 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 2 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4000 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 40 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 4: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом с использованием высокоскоростного миксера
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 39,92 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 2,52 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 1 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4000 мл диспергирующей фазы было размещено в контейнере для приготовления, и во время перемешивания высокоскоростным миксером со скоростью 4500 об/мин дисперсную фазу вводили со скоростью потока 7 мл/мин. Суспензию микросфер перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 5: Изготовление поликапролактоновой микросферы с инкапсулированным GHK-Cu
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г GHK-Cu (производитель: Incospharm, Корея) как биоактивного материала в 39,92 г дихлорометана (производитель: J.T. Baker, США) и 60 мл фосфатного буфера (pH 7,2) соответственно и смешивания двух растворов вихревым способом. В качестве диспергирующей фазы использовали 1 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4800 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 5-1: Изготовление поликапролактоновой микросферы с инкапсулированным AHK-Cu
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г AHK-Cu (производитель: Incospharm, Корея) как биоактивного материала в 39,92 г дихлорометана (производитель: J.T. Baker, США) и 70 мл фосфатного буфера (pH 7,2) соответственно и смешивания двух растворов вихревым способом. В качестве диспергирующей фазы использовали 1 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4800 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Пример 6: Изготовление филлера с поликапролактоновой микросферой с использованием карбоксиметилцеллюлозы в качестве раствора
Поликапролактоновый микросферный филлер был изготовлен посредством приготовления раствора для суспендирования микросфер и последующего перемешивания микросфер. В частности, 2 г карбоксиметилцеллюлозы (производитель: Ashland, США) было добавлено в фосфатный буфер при 75°C, растворено и охлаждалось при перемешивании со скоростью 100 об/мин в течение 3 часов. Когда температура раствора достигла 25°C, в него было добавлено 18 г глицерина, и наконец поликапролактоновые микросферы с капсулированным коллагеновым пептидом согласно Примерам 1-2 были смешаны в пропорции 30 масс./масс.% для завершения изготовления поликапролактонового микросферного филлера.
Пример 6-1: Изготовление филлера с поликапролактоновой микросферой с использованием гиалуроновой кислоты в качестве раствора
Поликапролактоновый микросферный филлер был изготовлен посредством приготовления раствора для суспендирования микросфер и последующего перемешивания микросфер. 1 г гиалуроновой кислоты (производитель: Bloomage Freda Biopharm, Китай) был добавлен в фосфатный буфер при 55°C, растворен и охлажден. Когда температура раствора достигла 25°C, в него было добавлено 18 г глицерина, и наконец поликапролактоновые микросферы с капсулированным коллагеновым пептидом согласно Примеру 1-2 были смешаны в пропорции 30 масс./масс.% относительно общей массы поликапролактоновой микросферы для завершения изготовления поликапролактонового микросферного филлера.
Сравнительный пример 1: Изготовление микросферы с инкапсулированным коллагеновым пептидом
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 8 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 2 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 32,0 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 15,32 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 3 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4800 мл диспергирующей фазы было подано в устройство для эмульсификации, оснащенное пористой мембраной с диаметром пор 10 мкм, и в то же время была введена приготовленная дисперсная фаза для изготовления микросферы. Полученную суспензию микросфер поместили в контейнер для приготовления и перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру мембранного эмульсификатора и контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Сравнительный пример 2: Изготовление микросферы с инкапсулированным биоактивным пептидом с использованием высокоскоростного миксера
Дисперсную фазу изготовили путем полного растворения 9,98 г биосовместимого полимера Purasorb PC 04 (производитель: Corbion, Нидерланды) и 0,02 г пальмитоил-KTTKS (производитель: Incospharm, Корея) в 39,92 г дихлорметана (производитель: J.T. Baker, США) и 2,52 мл метилового спирта (производитель: Sigma Aldrich, США) соответственно и смешивания двух растворов. В качестве диспергирующей фазы использовали 1 масс./об.% водный раствор поливинилового спирта (вязкость: от 4,8 до 5,8 мПа⋅с), и 4000 мл диспергирующей фазы было размещено в контейнере для приготовления, и во время перемешивания высокоскоростным миксером со скоростью 4500 об/мин дисперсную фазу вводили со скоростью потока 7 мл/мин. Суспензию микросфер перемешивали со скоростью 150 об/мин. Температуру контейнера для приготовления поддерживали на уровне 25°С.
Когда введение дисперсной фазы было завершено, суспензию микросфер перемешивали при 25°C в течение 12 часов со скоростью 150 об/мин для удаления органического растворителя. По завершении удаления органического растворителя суспензия микросфер была повторно несколько раз промыта дистиллированной водой для удаления и получения остаточного поливинилового спирта, и полученные микросферы были лиофилизированы.
Экспериментальный пример 1: Морфологический анализ под электронным микроскопом
В этом эксперименте морфологические характеристики изготовленных микросфер были подвергнуты анализу под электронным микроскопом. Эксперимент выполнялся следующим образом. 5 мг микросфер, изготовленных в Примерах 1-1, 3-1 и 3-2, поместили на алюминиевый стержень с углеродной лентой и покрыли платиной с помощью ION-COATER (COXEM, Корея). Алюминиевый стержень установили в растровый электронный микроскоп (COXEM EM-30, Корея), после чего исследовали морфологические характеристики микросфер при ускоряющем напряжении 15 кВ, результаты показаны на ФИГ. 1a (Пример 1-1), ФИГ. 1b (Пример 3-1) и ФИГ. 1c (Пример 3-2).
Как показано на ФИГ. 1a, ФИГ. 1b и ФИГ. 1c, было подтверждено, что микросферы поддерживают сферическую форму и размер частиц может быть отрегулирован в зависимости от диаметра пор мембраны, использованной при изготовлении.
Экспериментальный пример 2: Анализ размера частиц микросферы способом лазерной дифракции
В этом эксперименте количественно измеряли средний размер частиц, распределение микросфер и однородность частиц. Эксперимент выполнялся следующим образом.
50 мг микросфер смешали с 1 мл дистиллированной воды в вихревом смесителе в течение 20 секунд, а затем диспергировали в ультразвуковом генераторе в течение 1 минуты. Дисперсию микросфер загружали в анализатор размера частиц (Microtrac Bluewave, Япония) и измеряли в течение 20 секунд. Диапазон распределения размеров в качестве показателя однородности размера частиц был найден с помощью следующей формулы.
Формула 1
v,0,9
v, 0,1
v,0,5
Диапазон распределения размеров = (D - D) / D
Таблица 1
D<sub>v,0.5 </sub>(мкм)
Диапазон распределения размеров
Пример 1
38,9
0,67
Пример 1-1
37,2
0,62
Пример 1-2
36,3
0,74
Пример 1-3
36,7
0,68
Пример 1-4
35,1
0,70
Пример 2
34,7
0,62
Пример 2-1
36,9
0,65
Пример 2-2
36,8
0,66
Пример 3
15,2
0,68
Пример 3-1
56,8
0,72
Пример 3-2
103,3
0,71
Пример 4
33,5
0,92
Сравнительный пример 1
32,4
0,69
Сравнительный пример 2
37,7
1,38
v,0.5
Как показано в Таблице 1 выше, было подтверждено, что Пример 1, Пример 1-1, Пример 1-2, Пример 1-3, Пример 1-4 и Сравнительный Пример 1 характеризуются одинаковым средним размером частиц в столбце Dи диапазоном распределения размеров, измеренным анализатором размера частиц. В Примере 1-1, Примере 3, Примере 3-1 и Примере 3-2 были представлены микросферы, изготовленные с использованием мембран с различным диаметром пор соответственно и имеющие средний размер частиц от 10 до 100 мкм. В то же время все микросферы имели диапазон распределения размеров 1,0 или менее и, таким образом, равномерное распределение частиц. Отсюда было подтверждено, что было возможно изготовить микросферы со средним размером частиц от 10 до 100 мкм и диапазоном распределения размеров 1,0 или менее и, таким образом, с равномерным распределением частиц.
В случае Примера 2 и Примера 2-1 типы полимеров, использованных для изготовления дисперсной фазы, различались, но было подтверждено, что было возможно отрегулировать размер изготовленной дисперсной фазы и размер мембраны устройства для изготовления микросфер, отрегулировав его таким образом до аналогичного среднего размера частиц.
В случае Примера 1-1, Примера 4 и Сравнительного Примера 2 разница состояла в способе смешивания дисперсной фазы с водным раствором, содержащим поверхностно-активное вещество, и изготовленные микросферы демонстрировали различные средние размеры частиц и диапазоны распределения размеров в зависимости от способа. В частности, в случае Примера 4 и Сравнительного Примера 2 с использованием высокоскоростного миксера диапазон значений мог быть отрегулирован до 1,0 и менее за счет просеивания, что является процессом отбора микрочастиц. В случае Сравнительного Примера 2 без отдельного процесса просеивания диапазон распределения размеров составлял 1,38 и, таким образом, соответствовал относительно широкому распределению размера частиц.
Экспериментальный пример 3: Анализ содержания коллагенового пептида
Данный эксперимент был проведен для количественного анализа коллагенового пептида, капсулированного в микросфере, и количественный анализ проводился с применением жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЖХ-МС/МС). Эксперимент выполнялся следующим образом.
100 мг микросфер полностью растворили в смешанном растворе диметилсульфоксида и метилового спирта, а затем разбавили мобильной фазой. Мобильная фаза, использованная для анализа, была использована за счет смешивания раствора ацетата аммония и ацетонитрила в пропорции 30:70 (об/об), и была изготовлена с содержанием уксусной кислоты 0,05 %. Для этих измерений была использована колонка C8 (2,0 × 100 мм, 5 мкм). Измеренное капсулированное количество представлено в Таблице 2 ниже.
Таблица 2
Капсулированное количество (% по массе)
Пример 1
0,09
Пример 1-1
0,17
Пример 1-2
0,83
Пример 1-3
3,99
Пример 1-4
5,54
Пример 2
0,17
Пример 2-1
0,19
Пример 2-2
0,18
Пример 3
0,17
Пример 3-1
0,18
Пример 3-2
0,18
Пример 4
0,16
Сравнительный пример 1
8,92
Сравнительный пример 2
0,18
Как показано в Таблице 2 выше, капсулированное количество (содержание) увеличивалось пропорционально количеству коллагенового пептида, использованного для приготовления дисперсной фазы, и эффективность капсулирования снижалась в обратной пропорции количеству использованного коллагенового пептида. Содержание коллагенового пептида в Примере 1-1, Примере 3, Примере 3-1 и Примере 3-2 было одинаковым, что подтверждает, что размер частиц не повлиял на степень капсулирования.
Экспериментальный пример 4: Выход коллагенового пептида in vitro
Этот эксперимент был проведен для подтверждения выхода активного вещества коллагенового пептида, капсулированного в поликапролактоновой микросфере, и процедура эксперимента выполнялась следующим образом.
100 мг микросфер, изготовленных в Примерах 1-1, 1-2, 1-4, 2 и 2-2 и Сравнительном Примере 1, было помещено в бутылку с широким горлом объемом 250 мл, содержащую 200 мл буфера HEPES с молярной массой 10 ммоль. В течение заранее установленного временного интервала 1 мл раствора брали из бутылки с широким горлом и к нему добавляли равное количество свежего буфера HEPES. Собранный раствор помещали в пробирку 1,5 мл, центрифугировали со скоростью 13000 об/мин в течение 5 минут, а затем степень элюирования была подтверждена посредством жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией аналогично способу анализа содержания коллагенового пептида.
Как показано в Таблице 3 выше, посредством суммарной степени элюирования в Примере 1, Примере 1-2 и Примере 1-4 согласно настоящему изобретению было подтверждено, что выход коллагенового пептида, капсулированного в поликапролактоновых микросферах, постепенно происходил в течение 56 дней.
Более подробно, было подтверждено, что чем больше количество коллагенового пептида, капсулированного в микросфере, тем больше начальный выход и больше степень выхода. С другой стороны, микросфера, изготовленная в соответствии со Сравнительным Примером 1, которая не соответствует настоящему изобретению, демонстрирует высокую степень элюирования, начиная с начальной стадии элюирования, и быстрый выход около 69% капсулированного коллагенового пептида в течение 4 дней. Было подтверждено, что в течение приблизительно 14 дней элюирование коллагенового пептида было практически завершено и длительность была недолгой. Учитывая то, что количество коллагенового пептида и растворителя, использованного для изготовления дисперсной фазы было чрезмерно выше, чем в Примере 1, Примере 1-2 и Примере 1-4, и эффективность капсулирования также была снижена, было спрогнозировано, что коллагеновые пептиды сформировали неравномерные каналы внутри микросфер, и коллагеновый пептид быстро выпускался за счет диффузии в сформированный канал.
Посредством суммарной степени элюирования из Примеров 1-1, 2 и 2 было подтверждено, что когда вязкость полимера, использованного для изготовления дисперсной фазы, увеличилась, степень выхода капсулированного коллагенового пептида снизилась. Прогнозировалось, что это происходит не только, потому что скорость распада микросферы снижается с увеличением молекулярной массы полимера, но также скорость диффузии коллагенового пептида в микросфере в элюат снижается благодаря эффекту медленной скорости распада полимера.
Пример 3-2
0,18
Пример 4
0,16
Сравнительный пример 1
8,92
Сравнительный пример 2
0,18
Как показано в Таблице 2 выше, капсулированное количество (содержание) увеличивалось пропорционально количеству коллагенового пептида, использованного для приготовления дисперсной фазы, и эффективность капсулирования снижалась в обратной пропорции количеству использованного коллагенового пептида. Содержание коллагенового пептида в Примере 1-1, Примере 3, Примере 3-1 и Примере 3-2 было одинаковым, что подтверждает, что размер частиц не повлиял на степень капсулирования.
Экспериментальный пример 4: Выход коллагенового пептида in
vitro
Этот эксперимент был проведен для подтверждения выхода активного вещества коллагенового пептида, капсулированного в поликапролактоновой микросфере, и процедура эксперимента выполнялась следующим образом.
100 мг микросфер, изготовленных в Примерах 1-1, 1-2, 1-4, 2 и 2-2 и Сравнительном Примере 1, было помещено в бутылку с широким горлом объемом 250 мл, содержащую 200 мл буфера HEPES с молярной массой 10 ммоль. В течение заранее установленного временного интервала 1 мл раствора брали из бутылки с широким горлом и к нему добавляли равное количество свежего буфера HEPES. Собранный раствор помещали в пробирку 1,5 мл, центрифугировали со скоростью 13000 об/мин в течение 5 минут, а затем степень элюирования была подтверждена посредством жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией аналогично способу анализа содержания коллагенового пептида.