СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТУБЕРКУЛИНА ДЛЯ МАССОВОЙ ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
METHOD FOR PREPARING TUBERCULIN FOR MASS DIAGNOSIS AND PREVENTION OF TUBERCULOSIS

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении, предназначенного для диагностики туберкулеза.
Туберкулез - серьезное заболевание, как правило, поражающее легкие, которое может угрожать жизни, если не назначить своевременное и правильное лечение. Передается воздушно-капельным путем от людей с активной формой заболевания.
Своевременное выявление туберкулеза во всех возрастных группах способствует уменьшению числа запущенных форм заболевания, сокращению бактериовыделителей и, следовательно, уменьшению резервуара инфекции в обществе.
Очищенный туберкулин в стандартном разведении представляет собой фильтрат смеси убитых нагреванием культур микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов, очищенный путем ультрафильтрации, осажденный трихлоруксусной кислотой, обработанный этиловым спиртом и эфиром для наркоза, растворенный в стабилизирующем растворителе.
Активное вещество препарата - аллерген туберкулопротеин - вызывает при постановке внутрикожной туберкулиновой пробы у инфицированных или вакцинированных лиц специфическую реакцию гиперчувствительности замедленного типа в виде местной реакции - гиперемии и инфильтрата (папулы).
С целью улучшения качества препарата проведены исследования, направленные на изыскание способа получения высокоочищенного аллергена туберкулопротеина, свободного от балластных веществ, не обладающего сенсибилизирующими свойствами, обладающего высокой специфичностью и дающего минимальное количество ложноположительных реакций на введение туберкулина.
Известный способ получения туберкулина - способ Ф. Зейберт (Пономарев А.В., Специфическая профилактика инфекционных болезней / Лянда-Геллер Б.А., Современное состояние вопроса о биологической химии туберкулина, Москва, 1959 - С. 289-302). Технологией предусматривались физико-химическая очистка и концентрирование фильтрата с применением процесса ультрафильтрации культуральной жидкости, осаждение активного туберкулопротеина с применением трихлоруксусной кислоты с последующим удалением кислоты эфиром, лиофилизация эфиром конечного субстрата.
2
4
Способ получения туберкулина А.Л. Лозовской (Фрадкин В.А. Диагностические и лечебные аллергены / Туберкулины, Москва «Медицина», 1990 - С. 168-174) предполагал исключение процесса ультрафильтрации. Апробированный ею способ предусматривал осаждение активного туберкулопротеина с применением трихлоруксусной кислоты с последующей обработкой 1% раствором ТХУ, 0,3% раствором KHPO, этиловым спиртом, ацетоном и эфиром. Данный способ не нашел широкого применения в производстве.
В данном изобретении для производства аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении используется синтетическая питательная среда, прототипом которой послужила «классическая» среда Линниковой и Могилевского, описанная в патенте № SU 1069783 A «Способ получения туберкулезного диагностикума».
Оптимальная среда для выращивания микобактерий туберкулеза, обеспечивающая туберкулинообразование и отличающаяся по составу от аналогичных синтетических питательных сред, применяемых для культивирования микобактерий туберкулеза, тем, что в ней вместо аспарагина присутствует гликокол. Гликокол служит источником азота, глицерин - источником углеводов и энергетических ресурсов, калий фосфорнокислый, магний сернокислый, натрий хлористый и натрий углекислый, железо и аммоний лимоннокислый - источником микроэлементов.
Состав синтетической питательной среды, описанный в данном изобретении, отличается от состава «классической» питательной среды Линниковой и Могилевского по следующим показателям:
Таблица 1
Наименование компонента питательной среды
Патент SU 1069783 A «классическая» питательная среда
Заявка P №2013140658 синтетическая питательная среда
Комментарии
на 200 л питательной среды
в пересчете на 1 л
на 1 л питательной среды
Гликокол (кислота аминоуксусная)
1,7 кг
8,50 г
7,73 г
Загрузка на 10% меньше
Аммоний лимоннокислый однозамещенный или
1,0 кг
5,0 г
4,54 г
Загрузка на 10% меньше
Лимонная кислота +
-
-
4,18 г
Аммиак водный
-
-
1,18 л
Калий фосфорнокислый двухзамещенный
0,6 кг
3,0 г
2,72 г
Загрузка на 10% меньше
Натрий углекислый безводный или
0,6 кг
3,0 г
2,72 г
Загрузка на 10% меньше
Натрия карбонат 10-водный
-
-
7,36 г
Натрий хлористый
0,4 кг
2,0 г
1,82 г
Загрузка на 10% меньше
Магний сернокислый
0,2 кг
1 г
0,91 г
Загрузка на 10% меньше
Продолжение таблицы 1
Наименование компонента питательной среды
Патент SU 1069783 A «классическая» питательная среда
Заявка P №2013140658 синтетическая питательная среда
Комментарии
на 200 л питательной среды
в пересчете на 1 л
на 1 л питательной среды
Железо лимоннокислое окисное
0,01 кг
0,05 г
0,045 г
Загрузка на 10% меньше
Глицерин
14 кг
70 г
63,63 г
Загрузка на 10% меньше
Кислота ортофосфорная
60-90 мл
0,30-0,45 мл
до pH 7,0±0,1
регламентировано значение pH среды
Вода очищенная
До 200 л
до 1,0 л
до 1,0 л
до 1,0 л
Питательная среда данного состава обеспечивает активный рост туберкулезной культуры и высокое туберкулинообразование.
Изменение состава питательной среды путем пересмотра соотношения компонентов и четкое регламентирование значение рН среды позволило получить питательную среду с оптимальными параметрами, обеспечивающими возможность равномерного роста микобактерий туберкулеза в процессе культивирования.
На базе ФГУП СПбНИИВС ФМБА России были проведены сравнительные испытания образцов аллергена туберкулопротеина, полученных по одной и той же технологии, но с применением двух типов питательных сред: «классической» и синтетической питательной среды.
Все образцы прошли контроль качества в соответствии с требованиями НД на токсичность, специфическую безвредность, отсутствие сенсибилизирующих свойств, содержание белка, растворимость.
Установлено, что аллерген-туберкулопротеин, полученный с применением синтетической питательной среды, описанной в формуле изобретения, указанной в заявке №2013140658, обладает более высокой специфической активностью, по сравнению с аналогичным продуктом, полученным с применением «классической» питательной среды описанной в патенте.
Результаты сравнительных исследований специфической активности образцов, полученных с применением различных питательных сред, представлены в Таблице 2.
Образцы аллергена-туберкулопротеина - очищенные порошки туберкулина отдельных осаждений.
Образцы №1-10 - получены с применением «классической» среды Линниковой и Могилевского.
Образцы №11-20 - получены с применением синтетической питательной среды.
Таблица 2
Сравнение специфической активности образцов аллергена-туберкулопротеина, приготовленных с применением «классической» и синтетической питательных сред
Номера образцов
Специфическая активность (R)
«классическая» питательная среда
синтетическая питательная среда
Доза-навеска0,4 мг/мл
Доза-навеска0,5 мг/мл
Доза-навеска0,6 мг/мл
Доза-навеска0,4 мг/мл
Доза-навеска0,5 мг/мл
Доза-навеска0,6 мг/мл
1
0,70
0,79
0,88
2
0,64
0,77
0,85
3
0,75
0.83
0,98
4
0,69
0,8
0,97
5
0,79
0,83
0,90
6
0,74
0,88
0,98
7
0,71
0,80
0,95
8
0,63
0,80
0,94
9
0,66
0,85
0,99
10
0,73
0,88
1,00
11
0,79
1,00
1,25
12
0,75
1,20
1,38
13
0,80
1,10
1,40
14
1,10
1,40
1,70
15
0,76
0,90
1,20
16
0,85
1,15
1,40
17
0,79
1,10
1,45
18
0,65
1,00
1,37
19
0,82
1,19
1,47
20
0,80
1,30
1,60
Представленные данные позволяют сделать вывод, что при эквивалентных дозах-навесках порошков туберкулина, полученных с применением разных питательных сред, специфическая активность зависит от типа питательной среды, используемой в процессе получения полупродуктов.
Состав синтетической питательной среды:
Гликокол (кислота аминоуксусная)
7,73 г
Аммоний лимоннокислый однозамещенный
4,54 г или
(лимонная кислота - 4,18 г и аммиак водный - 1,18 л)
Калий фосфорнокислый двухзамещенный
2,72 г
Натрий углекислый безводный
2,72 г или
(натрия карбонат 10-водный - 7,36 г)
Натрий хлористый
1,82 г
Магний сернокислый
0,91 г
Железо лимоннокислое окисное
0,045 г
Глицерин
63,63 г
Кислота ортофосфорная
до pH 7,0±0,1
Вода очищенная
до 1,0 л
Микобактерии туберкулеза засеваются на синтетическую питательную среду и культивируются при температуре от 37 до 38°C в течение 6-8 недель. Сроки культивирования микобактерий туберкулеза определены 6-8 неделями, вместо 8-12 недель, поскольку к этому сроку культивирования количество образующегося туберкулопротеина достаточно велико, и в нем содержится максимум активного вещества. При более длительных сроках выращивания образуется большое количество туберкулопротеина, но последний содержит меньшее количество активного начала.
2
По окончании сроков культивирования предусматривается стерилизация туберкулезной культуры в автоклаве паром под давлением при температуре (101±1)°C, давлении (0,10±0,05) кгс/см в течение (60±5) минут. Стерилизация обеспечивает не только гибель микроорганизмов и, вследствие этого, безопасность дальнейшего получения и применения препарата. В процессе нагревания происходит частичная денатурация находящегося в культуральной среде туберкулопротеина, но и дезинтеграция его крупных мицелл с образованием высокомолекулярных туберкулополипептидов. Это способствует утрате туберкулином его антигенных свойств, то есть способности образовывать специфические антитела и вызывать сенсибилизацию здорового организма. Вместе с тем, несмотря на частичную денатурацию туберкулопротеина, препарат сохраняет способность вызывать специфическую реакцию замедленного типа у инфицированных микобактериями туберкулеза или инфицированных лиц.
Следующим этапом технологического процесса является приготовление фильтрата смеси туберкулезных культур. Удаление микробных тел происходит с применением предфильтров типа АР-20, АР-25 фирмы «Миллипор» вместо асбестовых фильтрующих пластин, применяемых ранее. Дальнейшая очистка и концентрирование фильтрата туберкулезных культур проводится путем ультрафильтрации с применением мембран из полисульфона с номинальной отсечкой по молекулярной массе 10 кДа. В процессе ультрафильтрации из раствора туберкулина удаляются неколлоидные составные части - вода, соли, глицерин и остатки питательной среды, низкомолекулярные продукты азотистого, углеводного и липидного метаболизма микобактерий туберкулеза, выделившихся при их культивировании в питательную среду. Пик специфической реакции гиперчувствительности замедленного типа выявляется белками, молекулярная масса которых более 10 кДа.
Активный белок туберкулопротеин осаждают с применением 50% раствора трихлоруксусной кислоты, затем проводят дополнительную очистку материала путем центрифугирования со скоростью (2000±500) об/мин убывающими концентрациями трихлоруксусной кислоты, этиловым спиртом и эфиром наркозным.
В процессе химической очистки происходит освобождение осадка туберкулопротеина и пептидов от полисахаридов, липидов, пигментов и других примесей.
Активный белок туберкулопротеин осаждают с применением 50% раствора трихлоруксусной кислоты. Для полного осаждения раствор с осадком выдерживают при температуре от 2 до 8°C не менее 3 ч.
Полученный осадок центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Затем обрабатывают убывающими концентрациями трихлоруксусной кислоты - 10%-ным раствором ТХУ и центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин и 5%-ным раствором ТХУ и центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин.
Обработку осадка этиловым спиртом проводят несколько раз до обесцвечивания надосадочной жидкости. Центрифугируют при температуре от 0 до 5°C со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Обработка материала этиловым спиртом на холоду, предусмотренная данным способом, предложена с целью более полной очистки осадка и создания гидрофильной промежуточной стадии от водного раствора трихлоруксусной кислоты к наркозному эфиру. Это также позволило сократить объемы наркозного эфира в дальнейшей обработке.
Обработку осадка эфиром наркозным проводят 7 раз. Центрифугируют при температуре от 0 до 5°C со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Продолжительность 5, 6 и 7-й обработок составляет (20±5) мин.
Технический результат заключается в том, что способ получения аллергена туберкулопротеина - полуфабриката аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении позволяет получить диагностический препарат, не обладающий сенсибилизирующими свойствами, обладающий стабильностью всех показателей качества в течение установленного срока годности (2 года). Кроме того, технический результат заключается в следующем:
- Аллерген-туберкулопротеин, полученный с применением заявляемой синтетической питательной среды, описанной в формуле изобретения, обладает более высокой специфической активностью, по сравнению с аналогичным продуктом, полученным с применением «классической» питательной среды, и позволяет получать продукт заданного качества при использовании сравнительно меньшей дозы-навески аллергена-туберкулопротеина.
- Сроки культивирования микобактерий туберкулеза определены 6-8 неделями, что дает высокий выход туберкулопротеина, содержащего максимум активного вещества. Сокращение сроков культивирования позволило сократить энергозатраты и трудозатраты на производство 1 г аллергена - туберкулопротеина.
2
- Стерилизация микобактерий туберкулеза в автоклаве паром под давлением при температуре (101±1)°C, давлении (0,10±0,05) кгс/см в течение (60±5) минут обеспечивает не только гибель микроорганизмов и, вследствие этого, безопасность дальнейшего получения и применения препарата. В процессе нагревания происходит, как частичная денатурация находящегося в культуральной среде туберкулопротеина, так и дезинтеграция его крупных мицелл с образованием высокомолекулярных туберкулополипептидов. Это способствует утрате туберкулином его антигенных свойств, то есть способности образовывать специфические антитела и вызывать сенсибилизацию здорового организма. Вместе с тем, несмотря на частичную денатурацию туберкулопротеина, препарат сохраняет способность вызывать специфическую реакцию замедленного типа у инфицированных микобактериями туберкулеза или инфицированных лиц.
- В процессе ультрафильтрации из раствора туберкулина удаляются неколлоидные составные части - вода, соли, глицерин и остатки питательной среды, низкомолекулярные продукты азотистого, углеводного и липидного метаболизма микобактерий туберкулеза, выделившихся при их культивировании в питательную среду, что позволяет получить аллерген-туберкулопротеин высокой степени очистки и снизить количество неспецифических аллергических реакций при применении конечного продукта.
- Обработка материала этиловым спиртом на холоду, предусмотренная данным способом, создает гидрофильную промежуточную стадию при переходе от обработки водным раствором трихлоруксусной кислоты к обработке наркозномым эфиром. Это также позволило сократить количество обработок полупродукта наркозным эфиром в 2 раза и, соответственно, сократить объемы наркозного эфира, используемого для очистки полупродукта.
Пример осуществления способа.
1. Приготовление синтетической питательной среды.
В качестве питательной среды для массового культивирования микобактерий туберкулеза в целях получения туберкулина используют жидкую синтетическую питательную среду с гликоколом и глицерином.
Состав синтетической питательной среды:
Гликокол (кислота аминоуксусная)
7,73 г
Аммоний лимоннокислый однозамещенный
4,54 г или
(лимонная кислота - 4,18 г и аммиак водный - 1,18 л)
Калий фосфорнокислый двухзамещенный
2,72 г
Натрий углекислый безводный
2,72 г или
(натрия карбонат 10-водный - 7,36 г)
Натрий хлористый
1,82 г
Магний сернокислый
0,91 г
Железо лимоннокислое окисное
0,045 г
Глицерин
63,63 г
Кислота ортофосфорная
до pH 7,0±0,1
Вода очищенная
до 1,0 л
2
Расчет компонентов питательной среды производят, исходя из регламентированного объема готовой серии питательной среды, который составляет 50 л. Питательную среду, разливают по 0,6 л в матрацы вместимостью 1,5 л и стерилизуют в автоклаве паром под давлением при температуре (120±1)°C, давлении (1,0±0,1) кгс/см в течение (60±5) мин.
2. Приготовление маточной культуры.
Ампулу с лиофилизированной культурой микобактерий туберкулеза вскрывают. Содержимое ампулы туберкулезной культурой человеческого вида штамма "ДТ/St" и бычьего вида штамма "Vallee" растворяют в 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида.
Культуральную взвесь засевают на пробирки с питательной средой Павловского из расчета: 1 ампула на 1 пробирку. Засеянные пробирки со средой Павловского инкубируют в термостате при температуре (37,5±0,5)°C в течение (21±2) сут.
После получения доброкачественных культур обоих штаммов (не менее 2-х пассажей) с хорошим обильным ростом и наличием пленки на жидкой фазе среды Павловского, пленку пересевают на жидкую картофельную среду. Засеянные колбы с жидкой картофельной средой инкубируют в термостате при температуре (37,5±0,5)°C в течение (16±2) сут.
Выросшую на жидкой картофельной среде туберкулезную культуру обоих штаммов (рост в виде пленки) пересевают в матрацы с синтетической средой.
Засеянные туберкулезной культурой матрацы помещают в термостатную комнату и инкубируют при температуре (37,5±0,5)°C в течение 5-10 сут. Выросшая в матрацах на синтетической среде культуральная пленка является первичной маточной культурой (матрицей).
3. Посев маточных культур на синтетическую среду и их культивирование.
Полученную при инкубации в матрацах пленку туберкулезной культуры человеческого вида штамма "ДТ/St" и бычьего вида штамма "Vallee" в возрасте 5-10 сут (маточную культуру) рассевают на матрацы с синтетической средой. Засевают по 20 матрацев (24 л) синтетической питательной среды каждым штаммом микобактерий туберкулеза.
Засеянные туберкулезной культурой матрацы с синтетической средой помещают в термостатную комнату и инкубируют при температуре (37,5±0,5)°C в течение (49±7) сут.
4. Стерилизация туберкулезных культур.
2
Стерилизацию туберкулезных культур проводят в автоклаве паром под давлением при температуре (101±1)°C, давлении (0,10±0,05) кгс/см в течение (60±5) минут
5. Приготовление фильтрата смеси туберкулезных культур.
Туберкулезную культуру человеческого и бычьего видов сливают из матрацев в промежуточную емкость в поштаммно равном соотношении. Смесь культур фильтруют в промежуточную емкость через предфильтры для удаления микробной биомассы (объем микробной биомассы составляет от 2 до 4 л), затем фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в стерильную емкость. Объем фильтрата смеси туберкулезных культур составляет 10-12 л.
6. Приготовление концентрированного фильтрата.
Проводят ультрафильтрацию фильтрата смеси туберкулезных культур. Процесс ультрафильтрации продолжают до тех пор, пока объем фильтрата туберкулезных культур не сконцентрируется в 8-10 раз от первоначального объема. В бутыль с концентратом добавляют стерильный 0,25% раствор фенола до первоначального объема фильтрата смеси туберкулезных культур. Раствор перемешивают и проводят повторное концентрирование до тех пор, пока объем разбавленного концентрата не сконцентрируется в 8-10 раз от первоначального объема. Объем концентрата составляет 1-1,2 л.
7. Осаждение концентрированного фильтрата. 0,15 л
В бутыль с концентрированным фильтратом прибавляют 1/8 часть от его объема (порядка 0,15 л) 50% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Бутыль 2-3 раза встряхивают. Для полного осаждения раствор с осадком выдерживают при температуре от 2 до 8°C не менее 3 ч.
8. Обработка осадка 10% раствором ТХУ.
Полученный раствор с осадком центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин для удаления надосадочной жидкости. Затем в центрифужные стаканы с осадком вносят порядка 0,10 л 10%-ного раствора ТХУ, тщательно перемешивают стеклянной лопаткой и центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин.
9. Обработка осадка 5% раствором ТХУ.
В центрифужные стаканы с осадком вносят порядка 0,10 л 5%-ного раствора ТХУ, тщательно перемешивают стеклянной лопаткой и центрифугируют со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Обработку проводят двукратно.
10. Обработка осадка этиловым спиртом.
В центрифужные стаканы с осадком вносят 0,20 л 96° этилового спирта, тщательно перемешивают стеклянной лопаткой и центрифугируют при температуре от 0 до 5°C со скоростью (2000±500) об/мин (EI-30) в течение (15±5) мин. Обработку осадка этиловым спиртом проводят трижды до обесцвечивания надосадочной жидкости. Объем этилового спирта, израсходованного на стадии суммарно, составляет 0,60 л.
11. Обработка осадка эфиром наркозным.
В центрифужные стаканы с осадком вносят 0,15 л эфира наркозного, тщательно перемешивают стеклянной лопаткой и центрифугируют при температуре от 0 до 5°C со скоростью (2000±500) об/мин в течение (15±5) мин. Обработку эфиром проводят 7 раз. Продолжительность 5, 6 и 7-й обработок (20±5) мин. Объем эфира наркозного, израсходованного на стадии суммарно, составляет 1,05 л.
Образовавшийся осадок стеклянной лопаткой распределяют по стенкам центрифужного стакана и помещают для высушивания в настольный защитный бокс. Выход очищенного порошка-полуфабриката туберкулина - аллергена туберкулопротеина составляет (5±2) г.
12. Контроль показателей качества аллергена-туберкулопротеина.
Контроль качества аллергена туберкулопротеина проводят в соответствии с требованиями Промышленного Регламента на производство Аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении (очищенного туберкулина в стандартном разведении), раствора для внутрикожного введения. Испытания стабильности препарата Аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении (очищенного туберкулина в стандартном разведении), проведенные в период с 2009 года по 2011 год, подтвердили стабильность всех показателей качества препарата в течение 2 лет 3 месяцев с момента производства и соответствие препарата требованиям Нормативной документации. Способ позволил увеличить срок годности препарата до 2 лет.
В 2012 году ФГУП СПбНИИВС ФМБА России разработана и зарегистрирована в России новая форма выпуска Аллергена туберкулезного очищенного в стандартном разведении (очищенного туберкулина в стандартном разведении).
До 2012 года выпуск препарата осуществлялся в ампулах по 3 мл (30 доз) по 10 ампул в упаковке №10.
В настоящее время препарат выпускается в комплекте: 1 ампула по 1 мл (10 доз) препарата в комплекте с пятью одноразовыми туберкулиновыми шприцами, оснащенными механизмом, исключающим их повторное применение, с инструкцией по применению и скарификатором.
По сравнению с предыдущей формой выпуска, за счет уменьшения количества доз препарата в ампуле, исключается необходимость хранения препарата в ампуле после вскрытия, тем самым исключается вероятность микробной контаминации неизрасходованных доз препарата.
Наличие в комплекте одноразовых самоблокирующихся туберкулиновых шприцов повышает удобство применения препарата, а также соответствует современным рекомендациям ВОЗ.