Микробные лиганды toll-подобных рецепторов (TLRs) - индукторы созревания дендритных клеток

УДК 61

МИКРОБНЫЕ ЛИГАНДЫ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ (TLRS) —

ИНДУКТОРЫ СОЗРЕВАНИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

112

Э.А. Ахматова , З.Ш. Манасова , О.В. Мотузова

1 Кафедра патологической физиологии,

Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова,

Москва, Россия

2

ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова»,

Москва, Россия

Аннотация. Повсеместная распространенность стафилококковой инфекции, сложность и высокая себестоимость лечения диктуют необходимость разработки новых способов лечения и профилактики данной инфекции. В настоящее время актуален поиск препаратов, активирующих антигенпрезентирующие клетки. Наиболее перспективным считается применение препаратов микробного происхождения, поскольку они несут лиганды для TLRs системы врожденного иммунитета.

Цель исследования: Изучить влияние комплекса антигенов стафилококка на костномозговые предшественники ДК мышей.

В культуре ДК, при инкубации их с вакциной, увеличивалось содержание клеток с экспрессией маркеров межклеточной адгезии CD38, маркера антигенного представления MHCII и маркера терминальной дифференцировки ДК CD83. На полученных клетках также отмечена экспрессия СD34 и CD14, что может свидетельствовать о частичной направленности дифференцировки клеток в сторону макрофагов.

Исследование функциональной активности клеток показало, что антигены стафилококка способствовали индукции широкого спектра цитокинов, преимущественно Th-1 типа.

Ключевые слова: дендритные клетки, TLRs, Th1 цитокины.

Введение. Дендритные клетки (ДК) представляют гетерогенную популяцию клеток, участвующих в эндоцитозе, процессинге и представлении антигенов лимфоцитам и, следовательно, они являются ключевым типом

клеток на всех этапах реализации эффектор-ных функций иммунитета [1; 3].

Способность ДК эффективно представлять антиген Т-лимфоцитам активно используется для генерации специфических иммун-

~ 156 ~

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации по отраслям «Медицинские науки» и «Социологические науки»

Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437

Ахматова Э.А., Манасова З.Ш., Мотузова О.В. Микробные лиганды toll-подобных рецепторов (TLRS)...

—-------------------------—

ных клеток-эффекторов и для создания противоинфекционных и противоопухолевых вакцин [2; 5; 7].

В настоящее время актуален поиск препаратов, активирующих ДК. Наиболее перспективным считается применение препаратов микробного происхождения, поскольку они несут лиганды для TLRs системы врожденного иммунитета.

Цель исследования: изучить влияние комплекса антигенов стафилококка на костномозговые предшественники ДК мышей.

Материалы и методы. Препараты. В работе использовали комплекс антигенов клеточной стенки стафилококка (4-х штаммов S. aureus), выращенных на плотной питательной среде), содержащие пептидогликан, тей-хоевые кислоты, липопротеины. Антигены добавляли в культуру незрелых ДК в дозе 50 мкг/мл.

Иммунофенотип ДК определяли методом проточной цитометрии с применением моноклональных антител (МКА) (e-bioscience, США).

Культивирование ДК. ДК получали из клеток костного мозга мышей линии C57/BL. Костномозговые клетки культивировали в полной среде RPMI-1640 (с добавлением 0,1 мг/мл

гентамицина сульфата и 10% ЭТС, «ПанЭко». К суспензии клеток (106 кл/мл) вносили по 10 нг/мл рекомбинантных GM-CSF и IL-4 (Biosource, США). На шестые сутки производили смену среды с добавлением антигенов S. aureus (50 мкг/мл) или фактора некроза опухоли (TNF-a, 20 нг/мл) для индукции созревания ДК.

Уровень цитокинов определяли иммуноферментным методом с использованием тестсистем фирмы Bender MedSystems (США).

Статистическую обработку данных проводили при использовании программного обеспечения STATISTICA 8. Достоверность различий между сравниваемыми группами определяли методом Манна-Уитни для независимых выборок. Различия считали статистически значимыми приp < 0,05.

Результаты. Введение в культуру мышиных ^57BL) незрелых ДК антигенных комплексов S. aureus индуцировало экспрессию костимулирующих молекул CD80 и СD86, причем в большей степени, чем классический индуктор созревания — TNF-a. Антигены также повышали численность зрелых ДК с маркером CD83+ и CD34~ что свидетельствует о созревании ДК под воздействием антигенов стафилококка (табл. 1).

Иммунофенотип ДК мышей костномозгового происхождения

Таблица 1

Маркеры Содержание клеток, %

Незрелые ДК TNF-а Аг. S. aureus

1 группа 2 группа 3 группа

CD83 3,7 ± 0,5 26,1 ± 3,1* 18,1 ± 1,9*#

CD38 0,3 ± 0,02 17,5 ± 1,5* 11,8 ± 0,8*#

I-AK (MHCII) 12,5 ± 1,2 25,2 ± 2,3* 20,2 ± 2,8*

CD38/MHCII 0,9 ± 0,2 5,8 ± 0,8* 4,1 ± 0,5*

CD34 21,7 ± 2,5 2,5 ± 0,3* 4,2 ± 0,6*#

H-2Db (MHCI) 6,14 ± 0,7 19 ± 2* 13,8 ± 1,5*#

CD34/MHCI 6,1 ± 0,6 2,1 ± 0,4* 4,3 ± 0,7#

~ 157 ~

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации по отраслям «Медицинские науки» и «Социологические науки»

Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437

The Journal of scientific articles “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 4

—--------------------------—

Окончание таблицы 1

Маркеры Содержание клеток, %

Незрелые ДК TNF-а Аг. S. aureus

1 группа 2 группа 3 группа

CD86 9,2 ± 0,7 16,1 ± 1,1* 13,9 ± 1,4*

CD80 4,2 ± 0,5 6,5 ± 0,8 5,9 ± 0,7

CD11c 6,1 ± 0,4 9,8 ± 0,8 6,3 ± 0,9#

CD11c/CD80 2,2 ± 0,2 2,5 ± 0,4 2 ± 0,4

F4/80 45,5 ± 3,5 27,9 ± 3,1* 18,3 ± 1,8*#

CD14 2,3 ± 0,3 2,5 ± 0,6 7,1 ± 0,6*#

TLR2 2,5 ± 0,7 5,1 ± 0,3 14,4 ± 1,5*#

TLR4 0,3 ± 0,04 1,3 ± 0,3 1,5 ± 0,4

TLR9 0,4 ± 0,05 0,9 ± 0,3 1,4 ± 0,3

p < 0,05 — достоверность различий между группами: *р1и2,3 < 0,05; #р2и 3 по сравнению с контрольной группой по критерию Манна-Уитни для независимых выборок.

Липотейхоевые кислоты S. aureus обладают мощной способностью стимулировать экспрессию TLR2, пептидогликан стимулирует макрофаги и ДК через TLR2 [4; 6]. В культуре ДК, стимулированных антигенами S. aureus, существенно увеличивалось содержание клеток, экспрессирующих TLR2.

Дендритные клетки, сформировавшиеся под воздействием стафилококковой вакцины отличались способностью продуцировать Th1/Th2 цитокины c преимущественным повышением уровня IL-6 и TNF-a, и в меньшей

степени IL-1 в, IL-12 и IL-10 (табл. 2). Обращает на себя внимание, что уровень IL-1 в был невысок в культурах, созревших под воздействием классического индуктора созревания (15 ± 0,6 пкг/мл), а в культурах с СВ IL-1 в повышался в 5,35 раз (до 80,25 пкг/мл).

Повышенная концентрация IL-12 в культуральной среде, генерированных клеток, индуцирует образование IFN-y в Т-лимфоцитах, который в свою очередь, влияет на приобретение Т-лимфоцитами свойств Th1 типа [6; 8].

Содержание цитокинов в культуре ДК

Таблица 2

Цитокины Препараты, внесенные в культуру ДК

— TNF Аг S. aureus

IL— 1 в 0,5 ± 0,1* 15 ± 0,6 80,25 ± 15,3*

IL-6 873,5 ± 125 841,5 ± 96 2572,5 ± 356*

IL-10 21,5 ± 4,26 17,7 ± 2,84 27,5 ± 5,44

IL-12 10,78 ± 1,1* 100,44 ± 11,5 165,14 ± 29,2

IL-4 1,57 ± 0,3 4 ± 0,4 4,14 ± 0,6

IL-5 8,5 ± 0,6* 0,75 ± 0,3 1 ± 0,3

IFN 0 3 ± 0,3 64,67 ± 15,1*

TNF 63 ± 12,3* 248 ± 22 852 ± 164*

p < 0,05 — достоверность различий между группами: *р1и2,3 < 0,05; #р2и 3 < 0,05 — по сравнению с контрольной группой по критерию Манна-Уитни для независимых выборок.

~ 158 ~

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации по отраслям «Медицинские науки» и «Социологические науки»

Since 1999 p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437

Ахматова Э.А., Манасова З.Ш., Мотузова О.В. Микробные лиганды toll-подобных рецепторов (TLRS)...

—-------------------------—

Таким образом, в наших исследованиях продемонстрирована возможность получения культуры клеток, состоящей как из зрелых ДК, так и макрофагов из костномозговых предшественников мышей при цитокиновой стимуляции с использованием в качестве индуктора созревания ДК не только TNF-a, но и комплекса антигенов стафилококка. Возможно, создание вакцин на основе ДК для адаптивной иммунотерапии может быть перспективным в профилактике и терапии инфекционных заболеваний, а также может служить критерием оценки эффективности разрабатываемых препаратов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и про-тивоинфекцонный. M.: Практическая медицина, 2008.

2. Doherty M.T., Arditi M. TB, or not TB: that is the question — does TLR signaling hold the

answer? // Clin Invest. 2004. V. 114(12). P. 1699— 1703.

3. Gessani S., Conti L., Del Corno M., Belar-delli F. Type I interferons as regulators of human antigen presenting cell functions. Toxins (Basel). 2014; 6(6):1696—723.

4. Morath S., Stadelmaier A., Geyer A. et al. Synthetic lipoteicoic acid from Staphylococcus aureus is a potent stimulus of cytokine release // J. Exp. Med. 2002. V. 195. P. 1635—1640.

5. Shah S., Grotenbreg G.M., Rivera A., Yap G.S. An extrafollicular pathway for the generation of effector CD8(+) T cells driven by the proinflammatory cytokine, IL-12. Elife. 2015 Aug 5;4. doi: 10.7554/eLife.09017.

6. Shmaler M., Jann N.J., Gotz F., Landmann R. Staphylococcal lipoproteins and their role in bacterial survival in mice // Int. J. Med. Microbiol. 2009. V. 255. P. 1753—1762.

7. Sui C.G., Wu D., Meng F.D., Yang M.H., Jiang Y.H. Anti-prostate cancer effects of CTL cell induction in vitro by recombinant adenovirus mediated PSMA/4-1BBL dendritic cells: an immunotherapy study // Genet Mol Res. 2015; 14(2):7208—17.

MICROBIAL LIGANDS

OF TOLL-LIKE RECEPTORS INDUCERS

OF MATURATION OF DENDRITIC CELLS

E.A. Akhmatova , Z.Sh. Manasova , O. V. Motuzova

1 First Moscow State Medical University name after I.M. Sechenov,

Department of Physiopathology,

Moscow, Russia

2

Institute of poliomyelitis and viral encephalitis named after M.P. Chumakov,

Moscow, Russia

Annotation. The high prevalence of staphylococcal infection, the complexity and high cost of treatment necessitate the development of new methods of treatment and prevention of this infection. The current search for agents that activate antigen-presenting cells. The most promising is the use of products of microbial origin, as they are ligands for TLRs of the innate immune system. The aim of the study was to Explore the influence of the complex of antigens of Staphylococcus in bone marrow precursors of DC mice. In the culture of DC during incubation

~ 159 ~

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК при Министерстве образования и науки Российской Федерации по отраслям «Медицинские науки» и «Социологические науки»

Since 1999

p-ISSN 2226-7425, e-ISSN 2412-9437

The Journal of scientific articles “Health and Education Millennium”, 2015. Vol. 17. No 4

—----------------------------—

with the vaccine, increased content of cells with expression of intercellular adhesion marker CD38, a marker of antigen presentation and MHCII marker of terminal differentiation of CD83 DC. The obtained cells marked by the expression of CD34 and CD14, which may indicate partial orientation of differentiation of the cells towards macrophages. The study of the functional activity of the cells revealed that the antigens of Staphylococcus contributed to the induction of a wide range of cytokines, predominantly Th-1 type.

Key words: dendritic cells, TLRs, Th1 cytokines.

REFERENCES

1. Akhmatova N.K., Kiselevsky M.V. Innate immunity: antitumor and antiinfective. Moscow: Practical Medicine, 2008. (In Russian).

2. Doherty M.T., Arditi M. TB, or not TB: that is the question — does TLR signaling hold the answer? Clin Invest. 2004. V. 114(12). P. 1699—1703.

3. Gessani S., Conti L., Del Corno M., Belar-delli F. Type I interferons as regulators of human antigen presenting cell functions. Toxins (Basel). 2014; 6(6):1696—723.

4. Morath S., Stadelmaier A., Geyer A. et al. Synthetic lipoteicoic acid from Staphylococcus aureus is a potent stimulus of cytokine release. J. Exp. Med. 2002. V. 195. P. 1635—1640.

5. Shah S., Grotenbreg G.M., Rivera A., Yap G.S. An extrafollicular pathway for the generation of effector CD8(+) T cells driven by the proinflammatory cytokine, IL-12. Elife. 2015 Aug 5;4. doi: 10.7554/eLife.09017.

6. Shmaler M., Jann N.J., Gotz F., Landmann R. Staphylococcal lipoproteins and their role in bacterial survival in mice. Int. J. Med. Microbiol. 2009. V. 255. P. 1753—1762.

7. Sui C.G., Wu D., Meng F.D., Yang M.H., Jiang Y.H. Anti-prostate cancer effects of CTL cell induction in vitro by recombinant adenovirus mediated PSMA/4-1BBL dendritic cells: an immunotherapy study. Genet Mol Res. 2015; 14(2):7208—17.