Флокуляция клеток Saccharomyces cerevisiae

ТЕХНОЛОГИЯ И АППАРАТЫ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ

УДК 541.18.041.2:661.185

Е. М. Кулагина, Р. И. Юсупова, М. В. Потапова

ФЛОКУЛЯЦИЯ КЛЕТОК SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Ключевые слова: биосуспензия, микроорганизмы, клетки дрожжей, культуральная жидкость, полиамфолиты,

флокулянты, флокуляция.

Исследовано влияние полимерных флокулянтов на основе акриалмида на дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae.

Keywords: bio-suspension, microorganism, cells of yeast, cultural liquid, polyampholit, flocculants, flocculation.

The influence ofpolymer flocculants on the basis of acrilamide on the Saccharomyces cerevisiae yeast culture has been investigated.

Введение

Развитие биотехнологии и создание биопрепаратов привело к необходимости разработки коллоидно-химических методов сгущения и концентрирования микроорганизмов из среды, в которой они выращивались.

Стадия отделения биомассы от культуральной жидкости, как правило, является обязательной независимо от того, содержится целевой продукт в клеточной массе или нативном растворе. В настоящее время применяют ряд методов выделения, которые подразделяются на реагентные и безреагентные.

В качестве безреагентных методов применяют физико-механические способы: сепарирование, фильтрование, электросорбция. Однако все они дорогостоящие и

низкопроизводительные. Наиболее целесообразным считается сочетание предварительного реагентного сгущения (коагуляция, флокуляция) с последующей передачей агрегированной биомассы на сепаратор или фильтр [1 - 3].

Суспензию микроорганизмов можно рассматривать как коллоидную дисперсную систему. Основой флокуляции и коагуляции коллоидных систем и в том числе биосуспензий является процесс агрегации частиц или клеток микроорганизмов.

Если агрегация (связывание) частиц дисперсной фазы вызвана добавкой в систему неорганических электролитов, то используется термин «коагуляция». Если агрегация частиц происходит путем их связывания через макромолекулы, адсорбированные на их поверхности, то используется термин «флокуляция» [4 - 6].

Одним из методов концентрирования микроорганизмов является их флокуляции с помощью полиэлектролитных флокулянтов. Выявление закономерностей агрегирующего действия как природных, так и синтетических полиамфолитов, отличающихся по составу и массе, имеет важное значение для изучения

взаимодействия клеток с макромолекулами полиамфолитов, что позволяет осуществить их обоснованное промышленное использование в качестве флокулянтов биосуспензий.

Несмотря на имеющиеся в литературе сведения об агрегации клеток полимерами, сам процесс изучен недостаточно. Отсутствуют физико-химические исследования устойчивости

биосуспензий и факторов, определяющих ее. Не изучено влияние химической природы, ионогенной способности и заряда полимеров на их агрегирующую способность, не выявлен механизм агрегирующего действия полиамфолитов. Однозначного вывода о влиянии молекулярной массы полимеров на флокуляцию в настоящее время так же не выработано.

Процесс флокуляции полимерами начинается с адсорбции последних на поверхности клеток микроорганизмов. Поэтому очевидно, что электростатическое взаимодействие

функциональных групп будет играть существенную роль.

Понятно, что для флокуляции отрицательно заряжённых микробных клеток необходимо применение флокулянтов катионного характера. При этом плотность зарядов полимерных молекул на поверхности клеток будет определять интенсивность процесса.

Известно [6, 7], что заряд клеток различных микроорганизмов сильно меняется в процессе роста клеток и зависит от их физиологического состояния. В то же время вещества, выделяемые в процессе метаболизма, и питательные среды, в которых выращиваются клетки, также оказывают влияние [8, 9]. Несмотря на важность этой проблемы в литературе отсутствуют данные о влиянии плотности заряда макромолекул на эффективность процесса.

Конформационное состояние полимерных макромолекул и его взаимосвязь с флокулирующей способностью изучены недостаточно. Имеющиеся сведения носят крайне противоречивый характер [10].

Так, одними авторами показано наибольшее флокулирующее действие макромолекул линейного строения по сравнению с клубкообразной конформацией. Другие считают что, сильно разветвленные макромолекулы (например диамиламин) более эффективно флокулируют бактерии активного ила, чем линейные аналоги.

Конформация полимеров в растворе сильно влияет на характер адсорбции. Для полиамфолитов в изоэлектрическом состоянии имеющих наиболее компактную конформацию, адсорбция

макромолекул на поверхности практически отсутствует [11, 12].

Экспериментальная часть

В работе использовались дрожжи рода Засскаготусе^' сегеуг^чае, штамм У-355, взятый из коллекции промышленных микроорганизмов при КНИТУ (КХТИ). Штамм не патогенен.

Для выращивания оптимальными условиями является раствор дрожжевого экстракта с температурой 30°С, содержащий пептон и глюкозу.

Засскаготусе^' сегеуг^чае (рис. 1) и некоторые родственные им виды (например, ЗассИагошусеБ иуагиш и 8ассИагошусе8 сагкЬегдеш^) - вид одноклеточных микроскопических (5 - 10 микрон в диаметре) грибков из рода сахаромицетов, широко используемый в производстве алкогольной и хлебопекарной продукции, а также в научных исследованиях.

Клетки дрожжей могут пребывать в одном из двух стабильных состояниях: гаплоидном (сфероиды) и диплоидном (эллипсоиды). Засскаготусе^' сегеуг^чае - один из наиболее изученных организмов, на примере которого происходит исследование клеток эукариотов, они легко выращиваются и не являются патогенными для человеческого организма.

Рис. 1 - Пекарские дрожжи под микроскопом

Для исследования флокулирующей активности в работе использовались:

1) Четыре вида полиакриламидных полимеров Sedipur (BASF), флокулянты,

основанные на акриламиде (ПАА):

• Катионный - СБ 803, со средней молекулярной массой;

• Анионный - ТБ 2-ТЯ, с высокой молекулярной массой;

• Анионный АБ 404, с очень высокой молекулярной массой;

• Неионогенный - МБ 104, с высокой молекулярной массой;

сн3

сош2 о=с о с2н4 ш сГ

чсн3

Содержание ионогенных звеньев в полимерах (Р) = 35%-40% мол.

Предельное число вязкости в 0.5 Н ЫаО! [ц] = 16.5 - 19.5 (дл\г).

2) Сополимер акриловой кислоты с 2-метил-5 винилпиридином (СП АК-2М5ВП). Характеристика СП представлена в табл. 1.

Таблица 1 - Характеристика сополимеров АК-2М5ВП

Обозначение образца Состав, % М*10-3 ИЭТ

АК 2М5ВП

СП-3 21.3 78.7 200 6.0

Результаты и обсуждение

Была выполнена работа по изучению флокулирующих свойств ПАА различного характера.

Экспериментальные исследования

показали, что анионные и неионогенные полиакриамиды проявили малую флокулирующую способность. Катионный полиакриамид СБ 803 и СП АК-2М5ВП оказали флокулирующее действие на суспензию Засскаготусе^' сегеуг^чае. На рис. 2 представлены зависимости изменения оптической плотности бактериальной суспензии от рН в присутствии полимеров.

Как видно из рисунка, катионный полиэлектролиты показывали флокулирующее действие при рН 6.5 и выше. Таким образом, знак заряда полимерной цепи полиэлектролитов оказывает прямое влияние на дестабилизацию систем «клетки-культуральная жидкость».

Флокуляция происходит только в том случае, когда знак заряда клеток и макромолекул полиэлектролитов противоположны или

макромолекулы не заряжены, а рН системы переведен в щелочную область.

Потеря устойчивости в системе «клетки-культуральная жидкость» как в присутствии

полиэлектролитов, так и без них наступает только в диапазоне рН = 6.5 и выше.

Рис. 2 - Зависимость оптической плотности системы «клетки-культуральная жидкость» от рН в отсутствии и присутствии полиэлектролитов.

С = 0.5 мг\дл. 1 - контроль; 2 - СЕ 803; 3 - АК-2М5ВП

Степень ионизации полиэлектролитов, количество заряда на полимерной цепи и степень асимметрии макромолекул определяется величиной рН, поэтому большинство флокулянтов может действовать только в ограниченной области рН, зависящей от природы полимера.

Таким образом, агрегация клеток в системе будет определяться, прежде всего, потерей

устойчивости системы в результате

фазообразования при pH = 6.5 и выше.

Литература

1. Щукин, Е.Д. Коллоидная химия, М.: МГУ, 1982, 348 с.

2. И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. Биология дрожжей, М.: МГУ, 1992, 96 с.

3. Шлегель Г. Общая микробиология. Пер. с немецкого Н.В. Алексеевой и Н.Ю. Несиловой. - М.: Мир, 1987, 502 с.

4. Я.Я. Шкоп, Н.В. Фомченко. Агрегация клеток микроорганизмов в процессе разделения микробных суспензий М.: ОНТИТЭИ микробиопром, 1981, 56 с.

5. Кулагина Е.М. [и др.] Вестник Казанского технологического университета, 6, 225-228, (2011).

6. Archibald, A.R., Hancock I.C., Harwood C.R. In: Cell wall structure, synthesis, and turnover, American Society for Microbiology, Washington, D.C. 381-410, (1993).

7. Seltmann, G., Holst, O. In The Bacterial Cell Wall, Springer-Verlag, New York, Incorporated. 2002.

8. Г.Я. Калюжный, Г.М. Петрушко сб. трудов ВНИИ гидролиза растительных материалов, 21, 10-127 (1971).

9. А.И. Курмаева, Р.И. Юсупова [и др.]. Коллоидный журнал. 53, 5, 866-873, (1991).

10. Тажибаева, С.М. [и др.]. Коллоидый журнал.. 65, 1, 132-135 (2003).

11. Юсупова, Р.И. [и др.]. Вестник Казанского технологического университета, 1, 244-249, (2010).

12. Кулагина, Е.М. [и др.]. // Вестник Казанского технологического университета, 17, 10, 134-137 (2014).

© Е. М. Кулагина - к.х.н., доц. каф. физической и коллоидной химии КНИТУ, kyllen@mail.ru; Р. И. Юсупова - к.х.н., доцент той же кафедры; М. В. Потапова - к.х.н., доцент той же кафедры.

© E. M. Kulagina - Ph.D, docent the Department FCH KNRTU, kyllen@mail.ru; R. I Yusupova - Ph.D, docent the Department FCH KNRTU; M. V. Potapova - Ph.D, docent the Department FCH KNRTU.