КОРМ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ХАРАКТЕРИСТИК РОСТА
ANIMAL FEED FOR IMPROVING THE GROWTH CHARACTERISTICS

Конденсированные растворимые остатки водорослей оказались полезным ингредиентом корма для кормления животных, в частности для улучшения характеристик роста мясного крупного рогатого скота.
Настоящее изобретение было создано при государственной поддержке в рамках грантов 2016-31100-06031 и NA/NI18HFPXXXXXG045 и NA/NI17HFPXXXXXG047, предоставленных Министерством сельского хозяйства США. Правительство имеет определенные права на настоящее изобретение.
С ростом интереса к производству омега-3 жирных кислот, полученных из водорослей, как для продуктов питания человека, так и для кормов для животных, побочные продукты производства водорослей могут стать альтернативным ингредиентом кормов для крупного рогатого скота. Биомасса водорослей является потенциальным источником белка, клетчатки и жира, которые могут вносить важные питательные вещества в рационы крупного рогатого скота. Конденсированные растворимые остатки водорослей (CARS; Veraferm, Veramaris, Делфт, Нидерланды) коммерчески производят из гетеротрофных водорослей в результате производства омега-3 жирных кислот для применения в отрасли кормов для животных, прежде всего в аквакультуре и кормах для домашних животных. CARS получают путем конденсации остатков, полученных в результате ферментации декстрозы, осуществляемой водорослями, после того, как масло извлекают из клеток водорослей без органических растворителей, и они имеют сиропообразную консистенцию. Штамм водорослей, который использовали для получения CARS, представляет собой штамм микроводорослей Schizochytrium, принадлежащий к группе Stramenopiles. CARS получают путем концентрирования делипидизированной биомассы Schizochytrium до содержания сухого вещества от 30 до 50 вес. %, предпочтительно приблизительно 40 вес. %. Поэтому CARS согласно настоящему изобретению также называют суспензией делипидизированной биомассы Stramenopiles или суспензией делипидизированной биомассы Schizochytrid.
Морские водоросли, обычно фотоавтотрофные, применяют в рационах животных в течение многих лет, и они применяют фотосинтез с использованием простых неорганических веществ для получения энергии и питательных веществ (Lum et al., 2013). Гетеротрофные водоросли, выращенные с применением сложных органических веществ в качестве кормовых продуктов, могут привести к повышению урожайности и эффективности роста и, таким образом, улучшить экономические показатели применения водорослей в качестве корма для домашнего скота (Ogbonna et al., 1997; Bryant et al., 2012). Согласно Van Emon et al. (2015) скармливали муку из гетеротрофных микроводорослей (57% микроводорослей, 43% шелухи сои) растущему крупному рогатому скоту. Наблюдали более высокий DMI, тенденцию к увеличению ADG и снижение G:F по мере того, как содержание муки из водорослей увеличивалось с 0 до 45% DM рациона, заменяя влажный кукурузно-глютеновый корм. Аналогичную муку из водорослей (43% частично обезжиренных гетеротрофных микроводорослей и 57% шелухи сои) скармливали крупному рогатому скоту при откорме в заключительный период (Stokes et al., 2016), заменяя кукурузу в количестве от 0 до 42% DM рациона. Сообщали об отсутствии изменений в HCW и о линейном снижении расчетного содержания NEg в рационе по мере увеличения включения в рацион. Эти результаты позволяют предположить, что продукт из водорослей является подходящим кормом для крупного рогатого скота при смешивании с соевой шелухой. Проводилось недостаточное количество исследований водорослей в качестве ингредиента корма, и не проводились исследования в отношении кормления CARS крупного рогатого скота; таким образом, целью данного исследования была оценка безопасности CARS в качестве кормового ингредиента в рационах крупного рогатого скота и его отклика характеристик при увеличении включения в рацион.
Неожиданно было обнаружено, что в соответствии с настоящим изобретением смесь CARS с дополнительными ингредиентами кормового продукта оказывает значительное положительное влияние на характеристики мясного крупного рогатого скота, в частности, на потребление сухого вещества (DMI), среднесуточный привес (ADG), отношение прироста массы к потреблению корма (G:F), чистую энергию для поддержания (NEm) и чистую энергию для роста (NEg).
Таким образом, первым объектом настоящего изобретения является корм для животных, содержащий
a) от 50 до 80 вес. % сухого вещества зерна злаков;
b) от 0,1 до 15 вес. %, предпочтительно от 0,5 до 10 вес. %, в частности от 1 до 6 вес. % сухого вещества биомассы Stramenopiles;
по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, три или четыре дополнительных компонента, выбранных из
c) побочных продуктов перегонки/производства этанола в количестве не более 40 вес. % сухого вещества;
d) фуража в количестве не более 20 вес. % сухого вещества;
e) белковой муки в количестве не более 20 вес. % сухого вещества;
f) дополнительного источника жира в количестве не более 4 вес. % сухого вещества;
g) дополнительного жидкого побочного продукта в количестве не более 10 вес. % сухого вещества.
Оптимальное количество различных компонентов может быть рассчитано с помощью компьютерной программы для определения компонентов и их оптимального количества для реализации оптимизированного и предпочтительно дешевого кормового рациона для животных, которых кормят данным кормовым продуктом, при этом полученный корм предпочтительно соответствует потребностям в питательных веществах для соответствующего животного, как указано в таблицах NRC, или, более предпочтительно, превышает их, что хорошо известно специалистам по вопросам кормления животных.
Показатели вес. % по отношению к компонентам корма для животных в соответствии с настоящим изобретением всегда относятся к содержанию сухого вещества в корме для животных, если явно не указано иное.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в частности, в корме для кормления мясного крупного рогатого скота корм для животных характеризуется содержанием сырого белка, составляющим более 20 вес. %, в частности от 20 до 40 вес. %, предпочтительно от 25 до 35 вес. % сухого вещества и/или содержанием нейтрально-детергентной клетчатки (NDF), составляющим более 25 вес. %, в частности от 25 до 45 вес. %, предпочтительно от 30 до 40 вес. % сухого вещества.
В кормовом продукте согласно настоящему изобретению зерна злаков предпочтительно выбраны из кукурузы, ячменя, сорго, пшеницы и их смесей, при этом предпочтительной является кукуруза.
Кроме того, побочные продукты перегонки/производства этанола предпочтительно содержатся, если они присутствуют, в количестве от 0,5 до 40 вес. %, в частности от 2 до 40 вес. %, более предпочтительно от 5 до 30 вес. %, в частности от 10 до 25 вес. % или от 10 до 20 вес. %, и они предпочтительно выбраны из продуктов перегонки кукурузы, продуктов перегонки ячменя, продуктов перегонки сорго, продуктов перегонки пшеницы и их смесей, при этом предпочтительными являются продукты перегонки кукурузы.
Кроме того, фураж предпочтительно содержится, если он присутствует, в количестве от 0,1 до 20 вес. %, более предпочтительно от 1 до 20 вес. %, в частности от 5 до 15 вес. %, и предпочтительно выбран из травяного сена, сена люцерны, травяного силоса, кукурузного силоса, ржаного силоса и их смесей.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения белковая мука составляет часть кормового продукта предпочтительно в количестве, составляющем от 0,5 до 20 вес. %, в частности от 2 до 20 вес. %, при этом белковая мука предпочтительно выбрана из муки из канолы, соевого шрота и их смеси.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения дополнительный источник жира составляет часть кормового продукта предпочтительно в количестве, составляющем от 0,5 до 4 вес. %, в частности от 1 до 4 вес. %, причем источник жира предпочтительно выбран из сала, жира домашней птицы, растительных масел, таких как кукурузное масло и масло канолы, и их смесей.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения дополнительный жидкий побочный продукт составляет часть кормового продукта предпочтительно в количестве, составляющем от 0,5 до 10 вес. %, в частности от 1 до 10 вес. %, при этом дополнительный жидкий побочный продукт предпочтительно выбран из продуктов из мелассы, кукурузных жидких экстрактов, глицерина и их смесей.
Корм для животных предпочтительно дополнительно содержит минеральные и витаминные добавки, предпочтительно в количестве, составляющем от 0,05 до 2 вес. % сухого вещества.
Особенно предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является корм для животных, содержащий
a) от 50 до 80 вес. % сухого вещества зерна злаков;
b) от 0,1 до 15 вес. %, предпочтительно от 0,5 до 10 вес. %, в частности от 1 до 6 вес. % сухого вещества биомассы Stramenopiles;
c) побочные продукты перегонки/производства этанола в количестве не более 40 вес. % сухого вещества, предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 20 вес. % сухого вещества, более предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 30 вес. % сухого вещества;
d) фураж в количестве не более 20 вес. % сухого вещества, предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 15 вес. % сухого вещества.
Биомасса Stramenopiles в соответствии с настоящим изобретением представляет собой предпочтительно лизированную биомассу или ее водную суспензию, более предпочтительно делипидизированную биомассу или ее водную суспензию. Лизированную биомассу Stramenopiles или ее водную суспензию можно получить с помощью способов, известных специалистам в данной области, путем применения механической нагрузки по отношению к клеткам и/или путем ферментативной обработки. Делипидизированную биомассу или ее водную суспензию можно получить в соответствии с тем, как раскрыто, например в WO 2018/011275 и WO 2018/011286.
Соответственно, «делипидизированная биомасса» относится к остаткам биомассы Stramenopiles, в частности в соответствии с тем, как раскрыто, дополнительно ниже, после того, как она подвергалась способу выделения масла, в частности раскрытому в WO 2018/011275 и WO 2018/011286.
Следовательно, дополнительным особенно предпочтительным объектом настоящего изобретения является корм для животных, содержащий
a) от 50 до 80 вес. % сухого вещества зерна злаков;
b) от 0,1 до 15 вес. %, предпочтительно от 0,5 до 10 вес. %, в частности от 1 до 6 вес. % сухого вещества делипидизированной биомассы Stramenopiles или ее водной суспензии;
по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, три или четыре дополнительных компонента, выбранных из
c) побочных продуктов перегонки/производства этанола в количестве не более 40 вес. % сухого вещества;
d) фуража в количестве не более 20 вес. % сухого вещества;
e) белковой муки в количестве не более 20 вес. % сухого вещества;
f) дополнительного источника жира в количестве не более 4 вес. % сухого вещества;
g) дополнительного жидкого побочного продукта в количестве не более 10 вес. % сухого вещества.
Следовательно, дополнительным особенно предпочтительным объектом настоящего изобретения также является корм для животных, содержащий
a) от 50 до 80 вес. % сухого вещества зерна злаков;
b) от 0,1 до 15 вес. %, предпочтительно от 0,5 до 10 вес. %, в частности от 1 до 6 вес. % сухого вещества делипидизированной биомассы Stramenopiles или ее водной суспензии;
c) побочные продукты перегонки/производства этанола в количестве не более 40 вес. % сухого вещества, предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 20 вес. % сухого вещества, более предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 30 вес. % сухого вещества;
d) фураж в количестве не более 20 вес. % сухого вещества, предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 15 вес. % сухого вещества.
Клетки биомассы Stramenopiles в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно выбраны из следующих групп микроорганизмов: Hamatores, протеромонады, опалины, Developayella, Diplophrys, лабиринтулиды, траустохитриды, Biosecids, оомицеты, гифохитриомицеты, Commation, Reticulosphaera, Pelagomonas, Pelagococcus, Ollicola, Aureococcus, Parmales, диатомовые водоросли, ксантофиты, феофиты (бурые водоросли), эустигматофиты, рафидофиты, синуриды, аксодины (включая Rhizochromulinales, Pedinellales, Dictyochales), Chrysomeridales, Sarcinochrysidales, Hydrurales, Hibberdiales и Chromulinales.
Биомасса в соответствии с настоящим изобретением, которая используется в частности для получения лизированной и/или делипидизированной биомассы, предпочтительно содержит клетки организмов из таксона Labyrinthulomycetes (Labyrinthulea, лабиринтуломицетовые грибы, лабиринтулы), в частности клетки организмов из семейства Thraustochytriaceae, и предпочтительно по сути состоит из таких клеток. Семейство Thraustochytriaceae (траустохитриды) включает роды Althomia, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Botryochytrium, Elnia, Japonochytrium, Oblongichytrium, Parietichytrium, Schizochytrium, Sicyoidochytrium, Thraustochytrium и Ulkenia. Биомасса, в частности, предпочтительно содержит клетки организмов из родов Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Schizochytrium или Thraustochytrium, главным образом организмы из рода Schizochytrium.
Следовательно, дополнительным особенно предпочтительным объектом настоящего изобретения является корм для животных, содержащий
a) от 50 до 80 вес. % сухого вещества зерна злаков;
b) от 0,1 до 15 вес. %, предпочтительно от 0,5 до 10 вес. %, в частности от 1 до 6 вес. % сухого вещества делипидизированной биомассы Schizochytrid или Thraustochytrid или ее водной суспензии;
по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, три или четыре дополнительных компонента, выбранных из
c) побочных продуктов перегонки/производства этанола в количестве не более 40 вес. % сухого вещества;
d) фуража в количестве не более 20 вес. % сухого вещества;
e) белковой муки в количестве не более 20 вес. % сухого вещества;
f) дополнительного источника жира в количестве не более 4 вес. % сухого вещества;
g) дополнительного жидкого побочного продукта в количестве не более 10 вес. % сухого вещества.
Следовательно, дополнительным особенно предпочтительным объектом настоящего изобретения также является корм для животных, содержащий
a) от 50 до 80 вес. % сухого вещества зерна злаков;
b) от 0,1 до 15 вес. %, предпочтительно от 0,5 до 10 вес. %, в частности от 1 до 6 вес. % сухого вещества делипидизированной биомассы Schizochytrid или Thraustochytrid или ее водной суспензии;
c) побочные продукты перегонки/производства этанола в количестве не более 40 вес. % сухого вещества, предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 20 вес. % сухого вещества, более предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 30 вес. % сухого вещества;
d) фураж в количестве не более 20 вес. % сухого вещества, предпочтительно в количестве, составляющем от 5 до 15 вес. % сухого вещества.
Биомасса в соответствии с настоящим изобретением представляет собой предпочтительно делипидизированную биомассу или ее водную суспензию. Делипидизированная биомасса представляет собой биомассу, из которой основная часть липидов была удалена, предпочтительно с помощью способа, раскрытого в WO 2018/011275 или WO 2018/011286. Поскольку отделение масла от биомассы является очень эффективным, оставшееся масло в биомассе составляет предпочтительно менее 20 вес. %, предпочтительно менее 15 вес. %, более предпочтительно менее 10 вес. %, от масла, первоначально содержавшегося в биомассе. Но поскольку масло невозможно полностью удалить с помощью такого способа, значительное количество масла все еще содержится в делипидизированной биомассе в соответствии с настоящим изобретением. Это означает, что термин «делипидизированная биомасса» в соответствии с настоящим изобретением относится к лизированной биомассе, из которой основная часть масла была удалена, предпочтительно с помощью процесса или способа, раскрытых в WO 2018/011275, но которая все еще содержит значительную часть липидов, в частности липидов, содержащих PUFA. Таким образом, «делипидизированная биомасса» в соответствии с настоящим изобретением может также называться «частично делипидизированная биомасса» или «практически делипидизированная биомасса».
Биомасса в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно практически не содержит неполярные органические растворители, более предпочтительно не содержит органические растворители, в целом, и содержит предпочтительно только небольшое количество хлорида натрия, предпочтительно небольшое количество хлоридных солей, в целом. Она предпочтительно содержит неполярные органические растворители, в частности органические растворители в целом, если они вообще присутствуют, в количестве, составляющем менее 0,2 вес. %, более предпочтительно в количестве, составляющем менее 0,1 вес. %.
Делипидизированная биомасса Stramenopiles в соответствии с настоящим изобретением может использоваться в качестве ингредиента корма в различных формах применения, в частности в виде высушенной биомассы или в виде водной суспензии. «Высушенная биомасса» в соответствии с настоящим изобретением относится к биомассе с содержанием сухого вещества, составляющим по меньшей мере 90 вес. %, предпочтительно по меньшей мере 95 вес. %.
Если высушенную биомассу Stramenopiles применяют в качестве ингредиента корма, то высушенная биомасса предпочтительно содержит липиды (неочищенный жир) в количестве, составляющем от приблизительно 3 до 14 вес. %, в частности от приблизительно 4 вес. % до приблизительно 14 вес. %, предпочтительно в количестве, составляющем от приблизительно 4,5 вес. % до приблизительно 12 вес. %, более предпочтительно в количестве, составляющем от приблизительно 5 вес. % до приблизительно 10 вес. %. Дополнительно, липид предпочтительно предусматривает по меньшей мере один липид, содержащий PUFA, выбранный из DHA и EPA, предпочтительно в количестве, составляющем от 10 до 70 вес. %, более предпочтительно в количестве, составляющем от 30 до 60 вес. %. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липид предусматривает смесь DHA и EPA, где отношение DHA к EPA составляет предпочтительно от 3:2 до 4:1, и где количество DHA составляет предпочтительно от 30 до 50 вес. % от общего количества содержащихся липидов, и количество EPA составляет предпочтительно от 10 до 20 вес. % от общего количества содержащихся липидов.
Высушенная биомасса предпочтительно дополнительно содержит аминокислоты в количестве, составляющем от 15 до 25 вес. %, более предпочтительно в количестве, составляющем от 17 до 23 вес. %, и предпочтительно характеризуется содержанием сырого белка, составляющим от 25 до 35 вес. %. Биомасса предпочтительно дополнительно характеризуется содержанием сырой клетчатки, составляющим менее 5 вес. %, предпочтительно менее 2 вес. %, более предпочтительно приблизительно 0 вес. %.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения водную суспензию делипидизированной биомассы Stramenopiles, в частности делипидизированной биомассы Schizochytrid или Thraustochytrid, применяют в качестве добавочных кормов, где водная суспензия характеризуется содержанием сухого вещества, составляющим предпочтительно от 20 до 55 вес. %, более предпочтительно от 30 до 50 вес. %, в частности от 35 до 45 вес. %. Получение такой суспензии предпочтительно осуществляют начиная с делипидизированной биомассы, при этом оно раскрыто более подробно в WO 2018/011275.
Если применяют водную суспензию делипидизированной биомассы Stramenopiles, в частности делипидизированной биомассы Schizochytrid или Thraustochytrid, то водная суспензия предпочтительно содержит липиды (неочищенный жир) в количестве, составляющем от 2 до 10 вес. %, более предпочтительно от 3 до 8 вес. %, в частности от 4 до 6 вес. %. Дополнительно, липид предпочтительно предусматривает по меньшей мере один липид, содержащий PUFA, выбранный из DHA и EPA, предпочтительно в количестве, составляющем от 10 до 70 вес. %, более предпочтительно в количестве, составляющем от 30 до 60 вес. %. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения липид предусматривает смесь DHA и EPA, где отношение DHA к EPA составляет предпочтительно от 3:2 до 4:1, и где количество DHA составляет предпочтительно от 30 до 50 вес. % от общего количества содержащихся липидов, и количество EPA составляет предпочтительно от 10 до 20 вес. % от общего количества содержащихся липидов.
Водная суспензия предпочтительно дополнительно содержит сырой белок в количестве, составляющем от 8 до 18 вес. %, более предпочтительно от 10 до 16 вес. %, и/или минеральные вещества в количестве, составляющем от 8 до 14 вес. %, более предпочтительно в количестве, составляющем от 9 до 13 вес. %, и/или сырую клетчатку в количестве, составляющем менее 1 вес. %, более предпочтительно менее 0,2 вес. %, в частности в количестве, составляющем приблизительно 0 вес. %.
Водную суспензию можно преобразовывать в высушенную биомассу, например путем распылительной грануляции биомассы с применением грануляции в псевдоожиженном слое. Распылительная грануляция, осуществляемая с применением средств для грануляции в псевдоожиженном слое, более подробно раскрыта в EP13176661.0.
Интактные клетки делипидизированной биомассы предпочтительно вырабатывают полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA). Предпочтительными PUFA являются омега-3 жирные кислоты и омега-6 жирные кислоты, при этом омега-3 жирные кислоты являются особенно предпочтительными. Более предпочтительные омега-3 жирные кислоты представляют собой эйкозапентаноевую кислоту (EPA, 20:5ω-3), в частности (5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-эйкозa-5,8,11,14,17-пентаноевую кислоту, и докозагексаноевую кислоту (DHA, 22:6ω-3), в частности (4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-докоза-4,7,10,13,16,19-гексаноевую кислоту.
В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения применяют клетки для обеспечения делипидизированной биомассы, в частности клетки штамма Schizochytrium, которые продуцируют одновременно значительное количество EPA и DHA, при этом DHA предпочтительно продуцируется клетками в количестве по меньшей мере 20 вес. %, предпочтительно в количестве по меньшей мере 30 вес. %, в частности в количестве от 30 до 50 вес. %, и EPA продуцируется в количестве по меньшей мере 5 вес. %, предпочтительно в количестве по меньшей мере 10 вес. %, в частности в количестве от 10 до 20 вес. % (относительно общего количества липида, содержащегося в клетках, соответственно). Предпочтительные виды микроорганизмов рода Schizochytrium, которые продуцируют одновременно EPA и DHA в значительных количествах, как указано выше, депонированы под № доступа ATCC PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210 или PTA-10211, PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215.
Корм для животных в соответствии с настоящим изобретением может применяться в виде корма для разных видов животных, в частности для кормления домашней птицы, свиней, норок, жвачных животных, в частности мясного крупного рогатого скота или телят, овец, коз, домашних питомцев или животных, содержащихся в объектах аквакультуры. В более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения корм для животных применяют для кормления мясного крупного рогатого скота.
Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения является способ кормления животных, домашней птицы, свиней, норок, жвачных животных, в частности мясного крупного рогатого скота или телят, овец, коз, домашних питомцев или животных, содержащихся в объектах аквакультуры, где животных кормят кормом для животных в соответствии с настоящим изобретением.
Более предпочтительным объектом настоящего изобретения является способ кормления мясного крупного рогатого скота, где мясной крупный рогатый скот кормят кормом для животных в соответствии с настоящим изобретением.
Способ в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно осуществляют для улучшения потребления сухого вещества, среднесуточного привеса, отношения прироста массы к потреблению корма, чистой энергии для поддержания и/или чистой энергии для роста животных и/или для повышения содержания PUFA в мясе животных.
Дополнительным объектом настоящего изобретения также является способ обеспечения улучшения потребления сухого вещества, среднесуточного привеса, отношения прироста массы к потреблению корма, чистой энергии для поддержания и/или чистой энергии для роста животных и/или для повышения содержания PUFA в мясе животных, где животных кормят кормом для животных, который содержит биомассу или суспензию биомассы в соответствии с настоящим изобретением.
Материалы и способы
Следующий эксперимент был проведен в Центре исследований и распространения знаний в Восточной Небраске (ENREC; недалеко от Мида, штат Небраска, США), в комплексе наук о животноводстве Университета Небраски (Линкольн, штат Небраска, США) и в Ветеринарном диагностическом центре Университета Небраски (UNL VDC; Линкольн, штат Небраска, США). Обращение с животными и пространство для эксперимента соответствовали Руководству по уходу и использованию сельскохозяйственных животных в сельскохозяйственных исследованиях и обучении (FASS, 2010).
Все процедуры, описанные в рамках этого исследования, были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Университета Небраски-Линкольна (номер протокола 1517). Поскольку CARS в настоящее время не одобрен FDA для скармливания крупному рогатому скоту, входящему в пищевую цепь человека, весь крупный рогатый скот кремировали по завершении эксперимента после интенсивного отбора проб тканей.
CARS получали, как описано в примере 1 WO 2018/011275, путем ферментативного лизиса биомассы Schizochytrid и последующего концентрирования смеси лизированных клеток. После деэмульгирования лизированной биомассы, нейтрализации и отделения неочищенного масла оставшийся клеточный дебрис ресуспендировали в водной фазе, как описано в примере 1 WO 2018/011275. Полученную таким образом водную фазу концентрировали путем испарения до содержания сухого вещества около 40 вес. %, в результате чего получали CARS, применяемый в испытаниях на животных согласно настоящему изобретению.
План эксперимента
Испытание проводили на сорока кроссбредных особях крупного рогатого скота (20 бычков и 20 телок, при начальном BW, составляющем 255 кг, SD = 14). При получении весь крупный рогатый скот вакцинировали против Mannheimia haemolytica, вируса ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи крупного рогатого скота (типа 1 и 2), парагриппа-3, а также комбинированной вакциной против респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота (Bovi-shield One Shot, Zoetis, Парк Флорхэм, штат Нью-Джерси, США), бактериальным токсоидом против семи клостридиальных заболеваний и Haemophilus somnus (Ultrabac-7, Zoetis), интраназальной вакциной против ринотрахеита крупного рогатого скота, парагриппа-3 и респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота (Inforce 3, Zoetis), лечили от гельминтов с помощью 1% вес/объем дорамектина (10 мг/мл, Dectomax, Zoetis) и обрабатывали 10 мл гамма-цигалотрина наружно (StandGuard, Elanco, Гринфилд, штат Индиана, США). Крупный рогатый скот помечали одной 4-значной биркой, металлическим зажимом с таким же четырехзначным идентификатором и электронным ID. Весь крупный рогатый скот кормили по отдельности с использованием системы ворот Calan (American Calan Inc., Нортвуд, штат Нью-Хэмпшир, США) в двух загонах, разделяющих бычков и телок. Телята прошли 3-недельный период обучения для акклиматизации к системе ворот Calan до начала испытания.
Для каждого животного выделяли примерно 46 погонных сантиметров помещения для содержания. В исследовательском центре после кормления за каждым отдельным животным обученный персонал по уходу за животными записывал ежедневные наблюдения; велись формуляры ежедневных наблюдений.
За пять дней до начала испытания крупный рогатый скот кормили в ограниченном количестве при 2% BW обычным рационом из 50% сладких отрубей (Cargill Corn Milling, Блэр, штат Небраска, США) и 50% сена люцерны (Watson et al., 2013). Перед кормлением крупный рогатый скот взвешивали 3 дня подряд для уменьшения погрешности, связанной с наполнением кишечника, и среднее значение использовали в качестве начального BW. Значения веса в день 1 и 2 были усреднены, и крупный рогатый скот был ограничен стратами начального BW в 10 блоках, где блоки 1, 3, 5, 7 и 9 представлены от самых тяжелых до самых легких бычков, а блоки 2, 4, 6, 8 и 10 представлены от самых тяжелых до самых легких телок, причем каждая обработка представлена в каждом блоке. На третий день взвешивания крупному рогатому скоту дополнительно размещали метку на ухо с соответствующим ID помещения для содержания.
Животным в блоке случайным образом назначали четыре вида рациона для обработки. Рационы состояли из увеличения включения CARS (0, 2,5, 5 и 7,5% от DM рациона; таблица 1), вытесняющего из рациона кукурузу сухого плющения (70,0, 67,5, 65,0 и 62,5%). Все рационы содержали 15% влажной зерновой барды, 10% травяного сена и 5% добавок (в пересчете на DM). По причине высокого содержания Na в CARS (таблица 2; 8,5% DM) были составлены 2 добавки, одна как обработка с CARS 0%, а другая как обработка с CARS 7,5%. Обе добавки смешивали вместе для использования в рационах с 2,5% и 5% CARS. Добавки составлены для ограничения содержания натрия в рационе до 1% от DM рациона. Добавки включали известняк, мочевину, премикс с микроэлементами, премикс с витаминами ADE, талловый жир, Rumensin (330 мг/животное в день; Elanco Animal Health) и Tylan (90 мг/животное в день; Elanco Animal Health) с кукурузой мелкого помола в качестве носителя. Крупный рогатый скот кормили без ограничений один раз в день (07:00).
Остатки корма собирали еженедельно, взвешивали и затем сушили в сушильном шкафу с принудительной подачей воздуха при 60°C в течение 48 часов для расчета точного DMI на особь. Еженедельно отбирали примерно 400 г каждого общего смешанного рациона и отдельных ингредиентов (CARS, кукурузы сухого плющения, влажной зерновой барды, травяного сена и добавки). Образцы объединяли за 3-недельные периоды (6 смешанных образцов каждого из 4 рационов и каждого ингредиента) и впоследствии анализировали в отношении уровня DM, OM, NDF, ADF, CP, содержания макро- и микроминералов (Ward Laboratories, Inc., Карни, штат Небраска, США) и докозагексаеновой кислоты (DHA) и эйкозапентаеновой кислоты (EPA; Eurofins Scientific, Де-Мойн, штат Айова, США; таблица 3). Уровни DHA и EPA в рационах применяли для подтверждения дозы CARS, поскольку CARS являлся единственным источником DHA и EPA в рационах. Расчеты чистой энергии проводили с помощью решения квадратичного уравнения, использованного Васконселосом и Галианом (2008).
Анализы крови и мочи
Промежуточные показатели BW, мочи, крови и ветеринарные наблюдения получали в дни 0, 33, 61, 90 и в день отбора для исследования.
В каждый день сбора крупный рогатый скот прогоняли через трап, взвешивали, и ветеринар их визуально оценивал на предмет нормального поведения и общего состояния здоровья. Затем крупному рогатому скоту вводили дозу фуросемида (2 мл/45 кг BW, Lasix, Validus Pharmaceuticals LLC, Парсиппани, штат Нью-Джерси, США), представляющего собой мочегонное средство, для стимуляции мочеиспускания. Для забора пробы мочи использовали коническую пробирку объемом 50 мл.
Во время сбора мочу охлаждали и образцы немедленно отправляли в UNL VDC (Линкольн, штат Небраска, США) для исследования мочи, в том числе в отношении уровня белка, pH, кетоновых тел, билирубина, уробилиногена, глюкозы (Chemstrip 2 GP, 2 LN, 9, 10 с SG, Roche Diagnostics, Индианаполис, штат Индиана, США) и микроскопического исследования. Образцы крови собирали путем пункции яремной вены с использованием 2 пробирок Vacuette объемом 6 мл с K2E K2EDTA (Greiner Bio-One GmbH, Монро, штат Северная Каролина, США) и 2 объединенных пробирок Corvac для отделения сыворотки крови (Covidien, Мансфилд, штат Массачусетс, США) на животное. После забора образцы крови охлаждали и немедленно отправляли в лабораторию питания жвачных животных UNL (Линкольн, штат Небраска, США). В лаборатории образцы пробирок с сывороткой крови помещали в холодильник при 4°C на 1 час перед центрифугированием при 1250 × g в течение 10 мин. при 4°C. Образцы крови и сыворотки крови отправляли в лабораторию ветеринарной патологии Университета штата Айова (Эймс, штат Айова, США) накануне вечером для общих гематологических и биохимических анализов крови. Гематологический анализ включал количество лейкоцитов (WBC), количество эритроцитов (RBC), средний корпускулярный объем (MCV), средний корпускулярный гемоглобин (MCH), среднюю концентрацию корпускулярного гемоглобина (MCHC), распределение эритроцитов по объему (RDW), средний объем тромбоцитов (MPV), количество тромбоцитов и концентрации нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, базофилов, белков плазмы крови, фибриногена, гематокрита и гемоглобина. Измерения химического состава крови включали измерение уровня Na, K, Cl, Ca, P, Mg, N мочевины крови (BUN), креатинина, глюкозы, общего белка, альбумина, аланинаминотрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST), щелочной фосфатазы (ALP), гамма-глутамилтранспептидазы (GGT), лактатдегидрогеназы (LDH), креатинкиназы, общих желчных кислот, бикарбоната и холестерина.
Сбор органов
Блоки отбирали для исследования при целевой массе 454 кг (419 ± 22 кг), блоки 1 и 2 в день 97, 3 и 4 в день 104, 5 и 6 в день 111, 7 и 8 в день 118 и 9 и 10 в день 125.
В каждый день отбора весь крупный рогатый скот взвешивали индивидуально в 06:30 в ENREC перед кормлением.
У 8 голов крупного рогатого скота, которые подлежали убою в тот день, брали образцы крови из яремной вены, когда они находились в узком проходе, и затем их помещали в сортировочный загон. Оставшийся крупный рогатый скот также взвешивали и затем возвращали в загон. За всеми животными велись записи ветеринарных наблюдений. Затем 8 отобранных животных были доставлены в комплекс наук о животноводстве Университета Небраски (Линкольн, штат Небраска, США), где они содержались в двух загонах размером 3,6 × 6 м (бычки отдельно от телок) и имели доступ к воде.
Крупный рогатый скот доставляли из комплекса наук о животноводстве в UNL VDC группами по 2 особи для отбора для исследования. Порядок убоя был назначен случайным образом в пределах блока, во избежание предвзятости во времени эвтаназии. Сначала производили отбор для исследования бычков, затем телок. Крупному рогатому скоту вводили пентобарбитал натрия (390 мг/мл, 1 мл/45 кг массы тела, Fatal-Plus, Vortech Pharmaceuticals, Дирборн, штат Мичиган, США) для эвтаназии и обескровливания животного.
Патоморфолог, работающий в слепом режиме в отношении обработок, контролировал вскрытие и фиксировал общие результаты.
Ноги удаляли в коленях и сухожилиях скакательного сустава. Голову удаляли по атланту и снимали шкуру с грудной клетки. Сбор мочи производили посмертно с помощью иглы и шприца непосредственно из мочевого пузыря. После потрошения остальную часть шкуры удаляли. Органы выделяли, удаляли, промывали, взвешивали, а затем отбирали образцы в двух экземплярах (примерно 10 г на образец). Оцениваемые органы и ткани включали: головной мозг, спинной мозг (2 сегмента), селезенку, легкое, поджелудочную железу, скелетные мышцы, рубец, сетку, книжку, сычуг, двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, слепую кишку, толстую кишку, почки, мочевой пузырь, гипофиз, щитовидную железу, надпочечники, печень, желчный пузырь, сердце, мезентериальный лимфатический узел, кожу, предстательную железу, глаз, кость и костный мозг, мазок костного мозга, подвздошную кишку и тимус. У телок также оценивали яичники, молочную железу и матку. После полного сбора тканей и вскрытия крупный рогатый скот кремировали в VDC UNL.
Вследствие механических неисправностей рельсов и подъемной системы в первый день отбора для исследования телок блока 2 (4 животных) содержали в течение ночи в комплексе наук о животноводстве Университета Небраски.
Телок содержали в индивидуальном загоне, им был предоставлен доступ к воде и назначенному им рациону, соответствующему обработке (такое же количество, как и в предыдущий день). За ночь была отремонтирована система рельсов и подъемников, и телок отбирали для исследования на следующий день в соответствии с теми же процедурами. Остальные сроки отбора для исследования проходили, как и планировалось, при отборе для исследования 8 особей в день.
Предварительные эксперименты на мышах
Перед исследованием кормления крупного рогатого скота безопасность этого нового ингредиента корма оценивали с помощью анализа обратных мутаций у бактерий (тест Эймса) и микроядерного теста in vivo на незрелых эритроцитах мышей, а также исследований токсичности повторных доз на крысах. Все исследования проводились лабораториями безопасности продуктов Eurofins (Дейтон, штат Нью-Джерси, США) в соответствии с правилами GLP, выпущенными FDA США (раздел 21 CFR, часть 58; действует с 1987 г.), а также в соответствии с Руководством по испытанию химических веществ и пищевых ингредиентов, выпущенного Организацией экономического сотрудничества и развития (OECD), раздел 4, части 471, 474 и 408.
В тесте Эймса (Ames et al., 1973) CARS исследовали в отношении его способности вызывать мутации генов в соответствии с тестом включения в чашку с использованием штаммов TA 98, TA 100, TA 1535, TA 1537 Salmonella typhimurium и штамма-анализатора WP2 uvrA Escherichia coli . В двух независимых экспериментах использовали несколько концентраций не более 5000 мкг/чашка образца для тестирования.
Каждый эксперимент проводили с метаболической активацией и без нее. Ни в одном из пяти штаммов-анализаторов не отмечали токсических эффектов тестового вещества. Не наблюдали никакого биологически релевантного увеличения количества ревертантных колоний после обработки CARS при любом уровне концентрации, ни в присутствии, ни в отсутствие метаболической активации в обоих экспериментах, что указывает на отсутствие мутагенного потенциала CARS.
Безопасность CARS также оценивалась в 14-дневном исследовании токсичности рациона на крысах с последующим субхроническим 90-дневным исследованием рациона на крысах линии Sprague-Dawley. В 90-дневном исследовании (OECD Test Guideline 474) тестируемый материал добавляли к основному рациону при уровнях в рационе, составляющих 0,5% (5000 ppm), 1,5% (15000 ppm) и 5,0% (50000 ppm). Каждая экспериментальная группа состояла из 10 животных каждого пола. Стабильность, однородность и концентрацию CARS в рационе подтверждали с помощью анализа, основанного на содержании докозагексаеновой кислоты (DHA) в рационе (Eurofins Central Analytical Laboratories, Метари, штат Луизиана, США). Отмечали отсутствие изменений в BW, приросте BW, потреблении корма или эффективности корма у самцов и самок крыс, связанных с введением тестового вещества. Отмечали отсутствие связанных с тестовым веществом изменений в показателях гематологии, коагуляции, клинической химии и параметрах анализа мочи. Отмечали отсутствие макроскопических изменений или изменений веса органов, связанных с CARS. Микроскопические наблюдения, относящиеся к тестовому веществу, включали гиперплазию ацинарных клеток поджелудочной железы, наблюдаемую у самцов при высоких дозах (50000 ppm) (обнаруженную у 3 из 10 животных).
Следовательно, в условиях исследования и на основе оцененных токсикологических конечных точек уровень отсутствия неблагоприятных эффектов для введения CARS в рацион для грызунов определили как 1,5% от рациона (15000 ppm), что эквивалентно общему среднему значению CARS, составляющему 1071 мг/кг BW в сутки для самцов и самок крыс. Данные предварительные эксперименты были завершены до настоящего испытания относительно кормления крупного рогатого скота и не свидетельствовали о токсических эффектах CARS.
Статистические анализы
Данные о характеристиках (BW, ADG, DMI, G:F, HCW, NEm, NEg, и показатели веса органов) анализировали с применением комплексной процедуры SAS (SAS Inc., Кэри, штат Северная Каролина, США) в виде рандомизированного плана с завершенными блоками с обработкой, полом и обработкой по гендерным зависимостям в качестве фиксированных эффектов, блоком BW в качестве случайного эффекта и отдельным животным в качестве экспериментальной единицы. Зависимости удаляли из модели, если они не являлись значительными. Ортогональные контрасты использовали для проверки значимости линейных, квадратичных и кубических откликов по причине включения CARS. Данные крови и мочи анализировали как повторные измерения с оптимизированной структурой ковариата, выбранной на основе самой низкой оценки информационного критерия Акаике, предполагающей наилучшее соответствие модели (Littell et al., 1998). Для нескольких переменных, измеренных в моче (эпителиальные клетки, аморфные кристаллы, кристаллы трипельфосфата, WBC, кровь, белок, анизоцитоз, акантоциты и эхиноциты), были собраны качественные данные, которые затем преобразовывали в численные обозначения для анализа (0 = нет, 1 = незначительное количество, 2 = умеренно, 3 = много).
Вероятности меньше или равные 0,05 считались значимыми, меньше или равные 0,10 признавались тенденциями.
Результаты и обсуждение
Характеристики крупного рогатого скота
Для данных о характеристиках не отмечалось зависимостей между полом и обработкой (P ≥ 0,25).
Пол являлся значимым для всех переменных (P ≤ 0,04), при этом бычки характеризовались более высоким уровнем DMI, начального BW, ADG, HCW и конечного BW по сравнению с телками. Отмечали отсутствие различий в начальном BW между обработками CARS (P ≥ 0,27). Отмечали квадратичный отклик (P = 0,01; таблица 4) для DMI, при этом крупный рогатый скот, который кормили 2,5% CARS характеризовался наибольшим уровнем DMI, составляющим 8,98 кг/день. Отмечали квадратичный (P < 0,01) отклик для ADG, при этом крупный рогатый скот, который кормили 2,5% и 5% CARS характеризовался наибольшими числовыми значениями, составляющими 1,40 и 1,37 кг соответственно. Актуальный конечный BW характеризовался квадратичным окликом (P < 0,01) и являлся наибольшим для крупного рогатого скота, которого кормили 2,5% и 5% CARS, 428 и 427 кг соответственно. У крупного рогатого скота, которого кормили 7,5% CARS, отмечали самые низкие уровни DMI и ADG (P ≤ 0,01); однако эта обработка вызывала большее значение G:F, составляющее 0,186, линейно (P < 0,01) увеличивающееся с увеличением включения водорослей в рацион. Как NEm, так и NEg линейно увеличивались (P < 0,01) с увеличением включения CARS. Крупный рогатый скот, который кормили рационами, содержащими 2,5, 5 или 7,5% CARS, характеризовался улучшениями показателя G:F на 4,2, 11,4 и 12,0% по сравнению с контрольным рационом из кукурузы.
CARS, оцениваемые в данном испытании, отличаются от других кормовых продуктов на основе водорослей, которыми кормят крупный рогатый скот и которые оценивали в предыдущих исследованиях (Franklin et al., 1999; Drewery et al., 2014; Van Emon et al., 2015; Costa et al., 2016; Stokes et al., 2016). Набор питательных веществ является уникальным как вследствие исходного сырья, представляющего собой водоросли, так и вследствие способов обработки для получения CARS. В большинстве предыдущих исследований остатки водорослей также скармливали в сочетании с другими кормами, такими как соевая шелуха (Van Emon et al., 2015; Stokes et al., 2016) для выращивания крупного рогатого скота (Drewery et al., 2014; Van Emon et al., 2015; Costa et al., 2016). В испытании с крупным рогатым скотом при откорме в заключительный период мука, состоящая из 43% остатков частично обезжиренных микроводорослей и 57% соевой шелухи, заменяла до 42% кукурузы сухого плющения в рационе (Stokes et al., 2016). Авторы сообщали об отсутствии различий в уровнях конечного BW или ADG, но наличии линейного уменьшения показателя G:F по мере замены в рационе мукой из водорослей кукурузы. Это привело к линейному снижению как ME, так и NEg в рационе по мере увеличения включения муки из водорослей. Результаты настоящего испытания предполагают, что скармливание остатков водорослей в количестве не более 7,5% DM в рационе линейно увеличивает показатели G:F и NEg в рационе. Это являлось бы аналогичным включением водорослей самому низкому включению муки из водорослей (14% DM в рационе) в испытании Stokes et al. (2016). Остатки водорослей в некоторой степени различаются в зависимости от выращиваемых видов и способа получения, используемого для производства. Продукт на основе CARS, оцениваемый в настоящем испытании, по-видимому, является подходящей заменой кукурузы в рационах для откорма в заключительный период до включительно 7,5% DM рациона и улучшает показатели ADG и G:F до включительно 5% включения DM в рацион.
Показатели веса органов
Показатели веса органов анализировали в виде абсолютного веса органа, а также в виде веса органа, выраженного как процентная доля уменьшенного BW (SBW, окончательный BW уменьшился на 4% для учета наполнения кишечника).
Отмечали отсутствие значительных различий (P ≥ 0,16) среди обработок по показателю веса органа для селезенки, легких, рубца, сетки, книжки, подвздошной кишки, слепой кишки, почек, гипофиза, надпочечников, глаза, тимуса, матки, яичников, предстательной железы и семенной железы.
Вес поджелудочной железы линейно увеличивался (P = 0,02) по мере увеличения включения CARS в рацион; однако это может быть связано с трудностью различения поджелудочной железы и жира, связанного с поджелудочной железой. Для показателя веса головного мозга наблюдали квадратичный отклик (P = 0,04); при этом крупный рогатый скот, который кормили 5% CARS, характеризовался наибольшим показателем веса головного мозга, составляющим 387 г, что не отличалось от крупного рогатого скота, которого кормили 0 и 2,5% CARS (P ≥ 0,10), но было больше, чем у крупного рогатого скота, которого кормили 7,5% CARS, при 356 г (P = 0,01). Масса печени линейно увеличивалась (P < 0,01) по мере увеличения включения CARS в рацион. Показатель веса щитовидной железы характеризовался квадратичным откликом (P = 0,02), при этом крупный рогатый скот, который кормили 2,5% CARS, характеризующийся наибольшим показателем веса, составляющим 31,8 г, статистически отличался от крупного рогатого скота, которого кормили 0% CARS (P < 0,01), но не отличался от крупного рогатого скота, которого кормили 5% и 7,5% CARS (P ≥ 0,11). Отмечали квадратичный (P = 0,04) отклик для показателя веса сычуга, при этом крупный рогатый скот, который кормили 0% CARS, характеризовался самым низким показателем веса, составляющим 1,25 кг, и крупный рогатый скот, который кормили 5% CARS, характеризовался наибольшим показателем веса, составляющим 1,41 кг. Подобным образом отмечали квадратичный отклик (P = 0,03) для показателя веса двенадцатиперстной кишки, при этом крупный рогатый скот, который кормили 0% CARS, характеризовался самым низким весом, составляющим 273 г, и крупный рогатый скот, который кормили 5% CARS, характеризовался наибольшим весом, составляющим 326 г. Разница в показателях веса двенадцатиперстной кишки между обработками может быть связана с различием в выборе того, где заканчивается двенадцатиперстная кишка и начинается тощая кишка. Отмечали кубический отклик для показателя веса мочевого пузыря, при этом крупный рогатый скот, который кормили 2,5% CARS, характеризовался наибольшим показателем веса, составляющим 116 г, и крупный рогатый скот, который кормили 5% CARS, характеризовался наименьшим показателем веса, составляющим 96,4 г. Различия в показателях веса мочевого пузыря были небольшими, а кубический отклик предполагает, что различия были вызваны вариациями и ошибками в измерениях, а не биологическими различиями вследствие обработки.
Отмечали тенденцию в отношении зависимости «пол × обработка» (P = 0,08) для показателя веса тощей кишки, при этом бычки, которых кормили 7,5% CARS, характеризовались наибольшим показателем веса, составляющим 6,33 кг, и телки, которых кормили 5% CARS, характеризовались наибольшим показателем веса, составляющим 5,69 кг. Отмечали зависимость «пол × обработка» (P = 0,02) для показателя веса желчного пузыря с квадратичным (P < 0,01) откликом. У бычков, которых кормили 2,5% CARS, наибольший вес составлял 81,6 г, в то время как у телок, которых кормили 5% CARS, наибольший вес составлял 107 г. Для сердца также отмечали зависимость «пол × обработка» (P = 0,04); при этом бычки, которых кормили 7,5% CARS, характеризовались наибольшим показателем веса сердца (2,21 кг), и телки при обработке 5% CARS характеризовались наибольшим показателем веса сердца (2,07 кг). Показатели толстой кишки также характеризовались зависимостью «пол × обработка» (P = 0,02), при этом бычки, которых кормили 7,5% CARS, характеризовались наибольшим показателем веса толстой кишки (4,38 кг), и телки, которых кормили 2,5% CARS, характеризовались наибольшим показателем веса толстой кишки (4,93 кг).
Вес органа в виде % от SBW
Отмечали отсутствие значительных отличий (P ≥ 0,07) между обработками по показателю веса органа в виде % SBW для селезенки, легких, рубца, сетки, книжки, сычуга, двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, почек, мочевого пузыря, головного мозга, гипофиза, надпочечников, тимуса, предстательной железы, семенных желез, матки, яичников и толстой кишки. Отмечали разницу в показателе веса печени в виде % SBW с квадратичным откликом (P < 0,01); при этом крупный рогатый скот, который кормили 7,5% CARS, характеризовался наибольшим показателем веса (2,05 кг). Показатель щитовидной железы также характеризовался квадратичным откликом (P = 0,04), но различия, связанные с обработкой, были небольшими, варьируясь от 0,006 до 0,008% SBW. Показатель веса как поджелудочной железы, так и глаза линейно (P ≤ 0,01) увеличивался по мере увеличения включения CARS в рацион.
Показатель тощей кишка характеризовался зависимостью «пол × обработка» (P = 0,04) и линейно (P < 0,01) увеличивался по мере увеличения CARS в рационе. Отмечали зависимость «пол × обработка» (P = 0,04) в показателе веса толстой кишки, при этом бычки, которых кормили 2,5% и 5% CARS, характеризовались наименьшим размером толстой кишки, и увеличение показателя веса толстой кишки для телок, которых кормили 2,5% и 5% CARS (P ≤ 0,04). Наблюдали тенденцию (P = 0,07) в отношении увеличения веса толстой кишки в виде % SBW у телок, а не у бычков. Наблюдали зависимость «пол × обработка» (P = 0,01) в показателе веса желчного пузыря в виде % SBW, при этом бычки, которых кормили 2,5% CARS, характеризовались наибольшим весом желчного пузыря, и телки, которых кормили 5% CARS, характеризовались наибольшим весом желчного пузыря. Для показателя веса сердца в виде % SBW наблюдали зависимость «пол × обработка» (P = 0,03).
Показатель веса сердца линейно увеличивался (P = 0,01) с 0,444% до 0,554% SBW у бычков и с 0,454% до 0,515% у телок по мере увеличения включения CARS в рацион.
Абсолютный вес органов и вес органов в виде % SBW аналогичны значениям, опубликованным в литературе (Hersom et al., 2004; McCurdy et al., 2010). Различия вследствие включения CARS были относительно незначительными и, вероятно, вследствие нагрузки по питательным веществам. Различия в показателях веса печени, поджелудочной железы и желчного пузыря между обработками были наиболее выраженными. Эти органы участвуют в переваривании питательных веществ и выведении их избытка. С увеличением включения CARS, уровни некоторых минералов, в первую очередь Na, были увеличены в рационе и перерабатывались бы печенью.
Гематологический анализ
Концентрации как гемоглобина, так и гематокрита квадратично уменьшались (P = 0,05) с увеличением включения CARS. Для обоих показателей минимальные концентрации наблюдали для крупного рогатого скота, которого кормили 2,5% CARS. Распределение эритроцитов по объему (RDW) линейно увеличивалось (P = 0,02) с 20,9 до 22,0% с увеличением включения CARS. Наблюдали линейную тенденцию (P = 0,09) в отношении увеличения концентраций моноцитов по мере увеличения включения CARS в рацион, но все виды обработки находились в пределах ожидаемого лабораторного диапазона референтных значений. Для концентраций моноцитов отмечали отсутствие различий, обусловленных полом (P = 0,80), и не наблюдали зависимость «обработка × пол» (P = 0,48).
Пол не являлся значимым (P ≥ 0,16), и не отмечали зависимостей «обработка × пол» (P ≥ 0,42) для концентраций WBC, RBC, гемоглобина, гематокрита, MCHC, RDW, количества тромбоцитов, MPV и лимфоцитов, эозинофилов, базофилов и фибриногена (данные не показаны). Пол являлся значимым (P = 0,02) для MCV, при этом у телок средний объем составлял 40,8 фл, а у бычков средний объем составлял 38,6 фл, но отмечали отсутствие зависимости «обработка × пол» (P = 0,38).
Пол являлся значимым (P = 0,02) для концентраций нейтрофилов, при этом у телок была более высокая концентрация нейтрофилов, составляющая 3,57 ×103/мкл, а у бычков была концентрация, составляющая 2,84 ×103/мкл, но отмечали отсутствие отличий между обработками (P = 0,18). Отмечали различие, обусловленное полом (P = 0,02), в концентрации белка плазмы крови, при этом у телок концентрация составляла 8,36 г/дл, а у бычков концентрация составляла 8,09 г/дл, а также наблюдали тенденцию в отношении зависимости «обработка × пол» (P = 0,08), но отмечали отсутствие отличий между обработками (P = 0,11).
Лабораторные референтные интервалы гематологических переменных, измеряемых у крупного рогатого скота, находятся в пределах ожидаемого диапазона (Veterinary Pathology, 2011). Почти все переменные находились в пределах предписанного ожидаемого диапазона. Уровень RDW был больше, чем ожидали, в среднем 21,4% для всех обработок, при этом диапазон от 8,0 до 15% считался ожидаемым. Концентрации фибриногена были немного выше лабораторного диапазона референтных значений для крупного рогатого скота, которого кормили 0% и 2,5% CARS, при 516 и 582 мг/дл соответственно. Максимальный верхний предел лабораторного диапазона референтных значений составляет 500 мг/дл. Значение MCV для крупного рогатого скота, которого кормили 2,5% CARS, было немного ниже, чем ожидали, и составило 38,9 фл, при этом нижний край ожидаемого диапазона составлял 40,0 фл. Уровень MPV крупного рогатого скота, которого кормили 7,5% CARS, оказался выше ожидаемого и составлял 8,27 фл, а верхний край ожидаемого диапазона составлял 8,0 фл. Концентрации белков в плазме крови для всех видов обработки были выше, чем ожидали, составляя в среднем 8,22 г/дл, а верхний край ожидаемого диапазона составлял 7,7 г/дл. Эти ожидаемые диапазоны могли быть установлены с использованием популяций различных животных, которые могут не соответствовать нормальным животным на кормовой площадке с рационом для откорма. Все ежедневные наблюдения за крупным рогатым скотом и визуальные наблюдения за состоянием здоровья позволяли предположить, что крупный рогатый скот был здоров и не продемонстрировал никаких неблагоприятных эффектов, связанных с любым видом рациона для обработки.
Биохимический анализ крови
Отмечали отсутствие различий, обусловленных полом (P ≥ 0,11), отсутствие зависимостей «обработка × пол» (P ≥ 0,29) и отсутствие различий между видами обработки (P ≥ 0,10) для показателей уровня Na в крови, K в крови, P в крови, Ca в крови, BUN, глюкозы в крови, общих желчных кислот и концентраций AST. Отмечали тенденцию к линейному снижению (P = 0,06) концентрации ALT по мере увеличения включения CARS.
Отмечали отсутствие зависимостей «обработка × пол» (P = 0,46) и отсутствие различий, обусловленных полом (P = 0,47), для концентрации ALT. Наблюдали линейное снижение (P ≤ 0,01) концентрации Cl в крови по мере увеличения CARS в рационе и различие, обусловленное полом (P ≤ 0,01), при этом у телок концентрация составляла 101 мэкв./л, а у бычков концентрация составляла 100 мэкв./л. Отмечали отсутствие зависимостей «обработка × пол» (P = 0,45) для концентрации Cl, и показатели концентрации Cl в крови находились в пределах ожидаемых диапазонов для крупного рогатого скота. Наблюдали линейное увеличение (P < 0,01) концентрации бикарбоната в крови по мере увеличения CARS в рационе и различия, обусловленные полом (P = 0,03), при этом у телок концентрация была ниже, чем у бычков, 27,7 и 28,5 мэкв./л соответственно. В отношении концентрации бикарбоната в крови не отмечали зависимостей «обработка × пол» (P = 0,55), и измеренные значения находились в пределах ожидаемых диапазонов для крупного рогатого скота. Отмечали кубический отклик (P = 0,03) для уровня Mg в крови у крупного рогатого скота, которого кормили 5% CARS, при этом самая высокая концентрацией Mg в крови составляла 2,07 мг/дл. Отмечали отсутствие различий, обусловленных полом (P = 0,11), и отсутствие зависимости «обработка × пол» (P = 0,50) для концентрации Mg в крови. Stokes et al. (2016) сообщили об отсутствии различий, обусловленных включением муки из водорослей в рацион, в отношении уровней Mg в плазме крови; значения, о которых сообщали, являются аналогичными значениям, полученным в результате настоящего испытания, составляющим в среднем 2,36 мг/дл.
Отмечали тенденцию в отношении кубического отклика (P = 0,09) для концентраций альбумина в крови у крупного рогатого скота, которого кормили 5% CARS, при этом наибольшие концентрации составляли 3,27 г/дл; все показатели для видов обработки находились в пределах ожидаемого диапазона для крупного рогатого скота. Концентрация креатинина в крови линейно увеличивалась (P < 0,01) с 1,07 до 1,16 мг/дл по мере увеличения включения CARS в рацион. Отмечали тенденцию в отношении зависимости «обработка × пол» (P = 0,09) в концентрации общего белка; однако отмечали отсутствие различий между видами обработки (P ≥ 0,10), а измеренные значения находились в пределах ожидаемого диапазона для крупного рогатого скота. Пол не являлся значимым (P = 0,50) для концентраций креатинкиназы в крови; тем не менее, отмечали тенденцию а отношении зависимости «обработка × пол» (P = 0,10) и наблюдали квадратичное снижение (P = 0,02) у крупного рогатого скота, которого кормили 7,5% CARS, при этом наибольшие концентрации составляли 217 МЕ/л.
Концентрация креатинкиназы для всех видов обработок находилась в ожидаемом диапазоне для крупного рогатого скота.
Концентрации щелочной фосфатазы линейно снижались (P < 0,01) с 65,4 до 43,7 МЕ/л по мере увеличения включения CARS в рацион, но находилась в пределах ожидаемого диапазона для крупного рогатого скота. Отмечали тенденцию в отношении различия, обусловленного полом (P = 0,08), для GGT, а квадратичный (P < 0,01) отклик отмечали для крупного рогатого скота, которого кормили 0 и 7,5% CARS, при этом наибольшие концентрации составляли 46,8 и 45,1 МЕ/л соответственно. Концентрация общего билирубина характеризовалась кубическим откликом (P < 0,01) для крупного рогатого скота, которого кормили 5% CARS, при этом наибольшая концентрация составляла 0,366 мг/дл. Пол являлся значимым (P = 0,04) для уровня общего билирубина, при этом у телок была более высокая концентрация, составляющая 0,351 мг/дл, и у бычков уровень составлял 0,323 мг/дл. Все обработки характеризовались более высокими концентрациями данного показателя, чем можно было бы ожидать для крупного рогатого скота, при этом верхний предел составлял 0,18 мг/дл. Отмечали тенденцию (P = 0,08) в отношении различия для бычков и телок по уровню общих желчных кислот; у бычков концентрация составляла 38,8 мкмоль/л, у телок составляла 29,4 мкмоль/л,
но отмечали отсутствие отличия для разных видов обработок (P ≥ 0,10). Отмечали тенденцию в отношении зависимости «обработка × пол» (P = 0,09) для уровня холестерина, но отсутствие отличий, обусловленных полом (P = 0,70). Уровень холестерина характеризовался тенденцией к линейному увеличению (P = 0,07) по мере увеличения включения CARS в рацион. Различия в уровнях LDH были обусловлены полом (P = 0,02); у телок уровни LDH составляли 4390 МЕ/л, у бычков уровни составляли 4120 МЕ/л. Отмечали квадратичный (P = 0,04) отклик, наблюдаемый для уровня LDH у крупного рогатого скота, которого кормили 7,5% CARS, при этом наибольшая концентрация LDH составляла 4494 МЕ/л, которая находилась выше верхнего предела ожидаемого диапазона, 410 МЕ/л. Крупный рогатый скот, содержащийся на кормовых площадках, характеризовался большой метаболической активностью, обусловленной высокоэнергетическим рационом. Это может привести к большему набуханию и утечке клеток печени, которые являются основным источником LDH. Кроме того, у более молодых животных уровни LDH обычно выше.
Ожидаемый диапазон был разработан для разных видов крупного рогатого скота, скорее всего коров, получавших рационы на основе фуража, поскольку у крупного рогатого скота при всех видах обработки наблюдали повышенные концентрации LDH по сравнению с ожидаемым диапазоном.
Лабораторные референтные интервалы для переменных биохимических показателей крови, измеряемых у крупного рогатого скота, находятся в пределах ожидаемого диапазона. Почти все переменные находились в пределах предписанного ожидаемого диапазона. Однако эти ожидаемые диапазоны могли быть установлены с использованием популяций различных животных, которые могут не соответствовать нормальным животным на кормовой площадке с рационом для откорма. Уровень общего билирубина находился выше, чем ожидалось, в среднем составляя 0,338 мг/дл, в то время как верхний край ожидаемого диапазона составляет 0,18 мг/дл. Концентрации Ca и P в крови также были выше, чем ожидалось, составляя в среднем 10,3 и 8,17 мг/дл, в то время как ожидаемые верхние пределы составляют 10,1 и 7,9 мг/дл. Концентрация Mg в крови составляла в среднем 2,00 мг/дл, что было меньше ожидаемого значения, составляющего 2,10 мг/дл. Все ежедневные наблюдения за крупным рогатым скотом и визуальные наблюдения за состоянием здоровья предполагали, что крупный рогатый скот был здоров и не выявлял никаких неблагоприятных эффектов любой обработки.
Анализ мочи
Пол не оказывал влияние на показатель pH (P = 0,45) или удельный вес (P = 0,95) мочи. Для PH мочи не отмечали зависимости «обработка × пол» (P = 0,21), но отмечали квадратичный ответ (P < 0,01) по мере увеличения содержания CARS в рационе, при этом крупный рогатый скот, который кормили 5% CARS, характеризовался наибольшим показателем pH (8,70).
Отмечали отсутствие различий между видами обработки (P ≥ 0,96) по удельному весу.
Отмечали отсутствие различий между видами обработки и отсутствие зависимостей «обработка × пол» (P ≥ 0,17) для показателей эпителиальных клеток, аморфных кристаллов, WBC, белка или крови, измеренных в анализе мочи. Количество эпителиальных клеток было определено как незначительное количество (1-10 клеток/поле) для всех видов обработки. Уровни аморфных кристаллов, WBC, белка и крови определили количественно как отсутствующие для всех видов обработки. В отношении кристаллов трипельфосфата отмечали отсутствие численной разницы для крупного рогатого скота, которого кормили 0% CARS, и незначительное количество (1-10 кристаллов/поле) для крупного рогатого скота, которого кормили 2,5, 5 или 7,5% CARS, но отмечали отсутствие статистической разницы между видами обработки (P = 0,10).
Патологическая гистология
Для всех гистопатологических анализов сравнивали два вида обработки (крупный рогатый скот, который кормили 0% CARS и 7,5% CARS). Патоморфолог работал в слепом режиме в отношении видов обработки, и срезы тканей крупного рогатого скота, которого кормили 0 и 7,5% CARS, оценивали либо как 0 = нормальный, либо как 1 = аномальный. Отмечали отсутствие значительных различий вследствие обработки (P ≥ 0,24) для: головного мозга (оценивали 5 срезов), спинного мозга (2), глаза, селезенки, левой краниальной доли легкого, правой каудальной доли легкого, поджелудочной железы, длиннейшей мышцы (скелетная мышца), грудины (скелетная мышца), рубца (3), сетки, книжки, сычуга, двенадцатиперстной кишки, тощей кишки (3), слепой кишки, подвздошной кишки, вилочковой железы, толстой кишки (2), правой почки, левой почки, мочевого пузыря, гипофиза, щитовидной железы, надпочечника, левой доли печени, правой доли печени, желчного пузыря, левой стороны сердца, правой стороны сердца, мезентериального лимфатического узла (2), предстательной железы, яичника (2), кожи, c-образной перевязи копыта, роговой стенки копыта, подошвы копыта и костного мозга. Предполагалось, что при отсутствии различий между 2 крайними включениями CARS (0 в противоположность 7,5%) промежуточные виды обработки также не подвергались воздействию. Результаты гистологического исследования для 0 и 7,5% CARS предполагают, что отсутствовали различия в здоровом состоянии тканей крупного рогатого скота, независимо от того, был ли CARS включен в рацион или нет.
Выводы
Было показано, что кормовой продукт на основе CARS является безопасным и эффективным ингредиентом корма в рационах крупного рогатого скота. Скармливание CARS крупному рогатому скоту при откорме в заключительный период улучшало G:F по мере того как включение в рацион увеличивали до включительно 7,5% DM рациона. Все показатели HCW, ADG и DMI у крупного рогатого скота квадратично увеличивались и достигали максимальных значений при кормлении крупного рогатого скота 2,5 или 5% CARS. В отношении гематологических, биохимических или гистопаталогических анализов крови не наблюдали неблагоприятных эффектов при скармливании CARS. При скармливании CARS наблюдали увеличение показателей веса органов для печени, щитовидной железы, желчного пузыря, поджелудочной железы, тощей кишки и сердца, но не наблюдали воздействия на состояние здоровье и не обнаруживали различий в тканях. Необходимы дальнейшие исследования для определения оптимального содержания включения CARS в отношении характеристик и мясных качеств туши при кормлении в течение всего периода кормления, а также возможности использования CARS в рационах для выращивания крупного рогатого скота.
Приведенные источники литературы
• Ames, B. N., W. E. Durston, E. Yamasaki, F. D. Lee. 1973. Carcinogens are mutagens: a simple test system combining liver homogenates for activation and bacteria for detection. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70:2281-2285.
• Bryant, H. L., L. Gogichaishvili, D. Anderson, J. W. Richardson, J. Sawyer, T. Wickersham, M. L. Drewery. 2012. The value of post-extracted algae residue. Algal Research 1:185-193.
• Costa, D. F. A., S. P. Quigley, P. Isherwood, S. R. McLennan, D. P. Poppi. 2016.
• Supplemenation of cattle fed tropical grasses with microalgae increases microbial protein production and average daily gain. J. Anim. Sci. 94:2047-2058.
• Drewery, M. L., J. E. Sawyer, W. E. Pinchak, T. A. Wickersham. 2014. Effect of increasing amounts of post extraction algal residue on straw utilization in steers. J. Anim. Sci. 92:4642-4649.
• FASS, 2010. Guide for the Care and Use of Agricultural Animals in Agricultural Research and Teaching. 3rd rev. ed. FASS Inc., Champaign, IL.
• Franklin, S. T., K. R. Martin, R. J. Baer, D. J. Schingoethe, A. R. Hippen. 1999. Dietary marine algae (Schizochytrium sp.) increases concentrations of conjugated linoleic, docosahexaenoic and transvaccenic acids in milk of dairy cows. J. Nutr. 129:2048-2052.
• Hersom, M. J., C. R. Krehbiel, G. W. Horn. 2004. Effect of live weight gain of steers during winter grazing: II. Visceral organ mass, cellularity, and oxygen consumption. J. Anim. Sci. 82:184-197.
• Littell, R. C., P. R. Henry, C. B. Ammerman. 1998. Statistical analysis of repeated measures data using SAS procedures. J. Anim. Sci. 76:1216-1231.
• Lum, K. K., J. Kim, X. G. Lei. 2013. Dual potential of microalgae as a sustainable biofuel feedstock and animal feed. J. Anim. Sci. and Biotechnology 4:53-60.
• McCurdy, M. P., C. R. Krehbiel, G. W. Horn, P. A. Lancaster, J. J. Wagner. 2010. Effects of winter growing program on visceral organ mass, composition, and oxygen consumption of beef steers during growing and finishing. J. Anim. Sci. 88:1554-1563.
• Ogbonna, J. C., H. Masui, H. Tanaka. 1997. Sequential heterotrophic/autotrophic cultivation - An efficient method of producing Chlorella biomass for health food and animal feed. J. Applied Phycology 9: 359-366.
• Stokes, R. S., D. D. Loy, S. L. Hansen. 2016. Effects of increased inclusion of algae meal on finishing performance and carcass characteristics. J. Anim. Sci. 94:687-696.
• Van Emon, M. L., D. D. Loy, S. L. Hansen. 2015. Determining the preference, in vitro digestibility, in situ disappearance, and grower period performance of steers fed a novel algae meal derived from heterotrophic microalgae. J. Anim. Sci. 93:3121-3129.
• Vasconcelos, J.T, M. L. Galyean. 2008. Technical Note: Do dietary net energy values calculated from performance data offer increased sensitivity for detecting treatment differences? J. Anim. Sci. 86:2756-2760.Veterinary Pathology. 2011. Reference intervals from Clinical Pathology Laboratory. Department of Veterinary Pathology, College of Veterinary Medicine, Iowa State https://www.vetmed.iastate.edu/vpath/services/diagnostic-services/clinical-pathology/testing-and-fees/reference-intervals.
• Watson, A. K., B. L. Nuttelman, T. J. Klopfenstein, L. W. Lomas, G. E. Erickson. 2013. Impacts of a limit-feeding procedure on variation and accuracy of cattle weights. J. Anim. Sci. 91:5507-5517.