Сравнение пролиферативной активности и фенотипа МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика

УДК 616.71-018.46-013.385

сравнение пролиферативной активности и фенотипа мск, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика

А.А. Айзенштадт 1-3, Н.И. Енукашвили2, Т.Л. Золина3, Л.В. Александрова3, А.Б. Смолянинов 1,3 1 ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И.И. Мечникова, НИЛ клеточных технологий, Санкт-Петербург, Россия 2 Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия 3 ООО «Покровский банк стволовых клеток», Санкт-Петербург, Россия

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) успешно применяются при лечении и профилактике различных заболеваний. При этом все больше внимания уделяется перспективам использования МСК пупочного канатика (МСК ПК), получаемым неинвазивным, нетравматичным методом из относительно доступного биоматериала. Однако неясно, насколько МСК ПК по иммунофенотипу, дифференцировочному потенциалу, пролиферативной активности и другим свойствам близки к МСК жировой ткани (МСК ЖТ) или традиционно используемым МСК костного мозга (МСК КМ). Целью исследования являлось сравнение МСК ПК с МСК ЖТ и КМ по иммунофенотипическим признакам и пролиферативной активности. Показано, что МСК, полученные из разных источников, имеют в целом сходные морфологические и иммунофено-типические характеристики. МСК ПК отличаются от других культур постоянным уровнем экспрессии CD105, наличием минорных популяций, не экспрессирующих CD10 и СD13, а также более высокой пролиферативной активностью. МСК КМ характеризуются сниженным уровнем экспрессии CD90, по сравнению с МСК ПК и ЖТ. Полученные данные подтверждают сходство МСК ПК с МСК из других источников и подтверждают возможность их использования в медицине вместо труднодоступных МСК КМ.

ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, CD90, CD105, CD10, CD13, иммунофе-нотипирование.

Введение

Мезенхимные стромальные клетки (МСК) -мультипотентные клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью, способностью дифференцироваться в клетки мезенхимного ряда (например, в остеоциты и хондроциты). Широкий спектр биологически активного действия МСК сделал их востребованным источником для клеточной терапии различных заболеваний.

Впервые МСК были выделены из костного мозга [3], поэтому исторически сложилось, что большинство исследований посвящено изучению свойств МСК, полученных из этого источника. Однако МСК могут быть выделены также из других тканей, например жировой ткани, пе-риваскулярного пространства пупочного канатика, плаценты, пульпы зуба, периферической крови и др [4-7].

Все большее внимание исследователей привлекают МСК, которые могут быть получены из тканей человека в ходе неинвазивных или мало-инвазивных процедур, например, из жировой ткани или пупочного канатика.

Высокая пролиферативная активность и медленное старение культуры - являются одними из важнейших характеристик МСК для клини-

ческого применения. Возможность получения достаточной дозы клеток, а значит и успешность клинического применения, напрямую зависят от пролиферативной активности МСК in vitro.

Согласно определению Международного общества по клеточной терапии, МСК обладают следующим иммунофенотипом: CD90+, CD105+, CD44+, CD29+, CD105+, CD73+, CD166+, CD45-, CD34 - (8). При этом даже для общепринятых маркеров идентификации МСК показана вариабельность экспрессии [1, 9-10]. С другой стороны, уровень экспрессии какого-либо одного антигена на МСК может иметь существенное значение при их потенциальном терапевтическом применении [11].

Таким образом, учитывая отсутствие однозначного ответа на вопрос о сходстве или различии характеристик МСК, полученных из разных источников или от разных доноров, при выборе клеточного материала для клинического применения необходим подробный сравнительный анализ характеристик МСК.

В настоящей работе на большой выборке образцов было проведено сравнение пролифера-тивной активности и особенностей иммунофе-нотипа МСК, выделенных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Было

показано, что МСК, полученные из разных источников, имеют в целом, сходные морфологические и иммунофенотипические характеристики, за исключением экспрессии уровня CD10, CD13, CD90 и CD105. МСК пупочного канатика обладают более высокой пролиферативной активностью по сравнению с МСК, полученными из костного мозга и жировой ткани.

Цель: сравнение МСК ПК с МСК ЖТ и КМ по иммунофенотипическим признакам и пролиферативной активности.

Материалы и методы

Получение и культивирование МСК

МСК выделяли из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика как было описано ранее [1]. Необходимым условием получения биологического материала было наличие информированного согласия доноров.

Костный мозг получали в ходе пункции подвздошной кости у здоровых доноров (20 человек). Аспират костного мозга разделяли центрифугированием (400 g, 30 мин) на градиенте фиколла (Биолот, Россия). Фракцию лейкоцитов собирали на границе фаз, промывали раствором фосфатно-солевого буфера (ФСР), после чего вносили в полную питательную среду (Advanced Mesenchymal Stem Cells Media, HyClone, Новая Зеландия) c добавлением 20% заменителя сыворотки (Hyclone, Новая Зеландия), 50 ед/мл. пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина и высевали во флаконы (площадь 75 см2, плотность 100 тыс. кл/см2). Возраст доноров костного мозга составлял от 21 года до 80 лет (46,2 ± 15,8), жировой ткани - от 37 до 90 лет (59 ± 20,4).

Образцы подкожной жировой ткани были получены от 20 здоровых доноров. Ткань механически измельчали, затем инкубировали при 37оС в 0,2 % растворе коллагеназы (тип I, Sigma-Aldrich, США) в ФСР. Диссоциированные клетки отмывали от фермента центрифугированием (400 G, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100-400 тыс. кл/см2.

Пупочный канатик был получен при неос-ложненных родах. Транспортировку из родильных домов г.Санкт-Петербурга осуществляли в стерильном контейнере с 1% раствором смеси пенициллина, стрептомицина и фунгизона в физиологическом растворе. Сосуды канатика промывали PBS, заполняли 0,2 % раствором коллагеназы IV типа в том же буфере, промывали и повторно заполняли раствором коллагена-зы, затем клеммировали с двух сторон и инку-

бировали в течение 1 ч при 37°С. Полученную взвесь клеток отмывали от фермента центрифугированием (400 g, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100-400 тыс. кл/см2. Всего было проанализировано 20 культур МСК, полученных из пупочного канатика.

Смену среды проводили через 3 суток после эксплантации. Щ достижении 70-80 % конфлю-ентности монослоя МСК, вне зависимости от источника их получения, пересевали при плотности 1000 кл/см2 и культивировали в полной питательной среде с добавлением 10 % заменителя сыворотки и антибиотиков пенициллина и стрептомицина.

МСК культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 и 20% (условия нормоксии) или 5% (условия гипоксии) О2 с использованием муль-тигазовых инкубаторов (BBD 6220, Thermo Scientific, США) с возможностью подачи азота.

Иммунофенотипирование культур МСК

Поверхностные маркеры МСК выявляли с помощью меченных флуорохромами антител против CD34, CD45, CD90, CD105, CD73, CD13, CD10, CD44, CD14, CD117 на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для этого культуры МСК обрабатывали 0,02% раствором Версена (Биолот) и 0,25% раствором трипсина (HyClone, Новая Зеландия). Действие раствора трипсина останавливали внесением ФСР с 10% заменителя сыворотки. Полученную суспензию дважды отмывали ФСР и суспендировали в 200 мкл ФСР для последующего анализа на проточном цитофлуориметре. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения СХР. Уровень экспрессии оценивали по показателю средней интенсивности флуоресценции (MFI - mean fluorescence intensity), зависящий от плотности изучаемого антигена на поверхности клеток.

Морфологическая характеристика МСК

Морфологическую характеристику МСК проводили с помощью программы CapturePro v2.8.8. при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового инвертированного микроскопа Axiovert 40C, оснащенного системой анализа изображения Progress CT3 (Zeiss, Германия). Морфологию клеток оценивали на 2-7 пассаже при степени конфлюентности 60-75%. Определение среднего размера клеток проводили для МСК, снятых с подложки во время пассирования культуры, с помощью автоматического клеточного счетчика Beckman Coulter.

о<ххххххххххх><х><х>оо<хххххххх^

Определение пролиферативной активности МСК

Количество и жизнеспособность МСК определяли с помощью автоматического клеточного счетчика Beckman Coulter. Среднее время удвоения популяции Td считали по

формуле Td=(log22)V[log2(Nt/N0)], где t -

время прироста популяции, Nt - количество клеток через время t, N0 - исходное количество клеток.

Результаты и их обсуждение

МСК, выделенные из разных источников, обладают сходными морфологическими характеристиками (рис. 1).

В начале культивирования в популяции присутствуют только фибробласто-подобные клетки размером 25-60 мкм и вытянутые ве-ретеновидные клетки с линейными размерами 50-100 мкм. После 3 пассажа в популяции появляются более крупные клетки (100-250 мкм) полигональной формы с большим количеством отростков (рис. 2).

Рис. 2. МСК полигональной формы с отростками (отмечены стрелками) в культурах, полученных из жировой ткани (А, интерференционно-контрастная микроскопия) и костного мозга (Б, световая микроскопия). Шкала - 50 мкм.

Средние размеры обработанных трипсином и ресуспендированных МСК, полученных из костного мозга, достоверно выше по сравнению с МСК (18,5 ± 1,1мкм), полученными из жировой ткани (15,1 ± 1,3 мкм) и пупочного канатика (16,1 ± 1,25 мкм), (Р < 0,05). Пролиферация 8 из 20 культур МСК костного мозга сохранялась в течение 6 пассажей, остальные культуры пролиферировали 12 пассажей. После этого не происходило прироста популяции, при этом большинство клеток в культуре были крупными (более 250 мкм) и имели полигональную форму с «рваными» краями и множеством отростков. В течение 7-10 дней после прекращения пролиферации наблюдали массовое открепление клеток от культурально-го пластика и значительное увеличение доли погибших клеток. На данной стадии отмечали гибель культуры и ее утилизировали.

Время удвоения популяции МСК костного мозга было достоверно выше на всех пассажах по сравнению с МСК, полученными из других источников (Р < 0,05) Время удвоения популяции МСК, полученных из жировой ткани и пупочного канатика, было схожим до 6 пассажа, но при дальнейшем культивировании (после 7 пассажа включительно) было достоверно выше (Р<0,05) для МСК жировой ткани сравнению с МСК пупочного канатика. Пролиферативная активность МСК пупочного канатика сохранялась в течение максимального количества пассажей, по сравнению с МСК, полученными из костного мозга и жировой ткани. 13 культур МСК пупочного канатика пролиферировали до 8 пассажа включительно, 4 культур - до 9 и

1 Ш ^Ш mi

Ш ^шШ- > т •'-./ ЩН к

i ~ г.. ЩМ

• г -ни- . \

р

•

v 7 Ш  1 . ' .

i

Kl • '

:1 у.с

.

Рис. 1. Общий вид культур МСК, полученных из костного мозга (1), жировой ткани (2) и пупочного канатика (3) при культивировании в условиях гипоксии. Темные округленные клетки - МСК, находящиеся на стадии митотического деления. Шкала - 100 мкм

3 культуры - до 10 пассаж (рис. 3). Время удвоения популяции МСК пупочного канатика для проанализированных культур было практически одинаковым на 3-5 пассажах, но с 6 пассажа существенно различалось между культурами, полученными от различных доноров (от 52 до 194 часов).

Минимальное (относительно других пассажей для одной культуры) время удвоения для МСК вне зависимости от источника их получения наблюдали на 3 пассаже (рис. 3). В связи с этим, в последующих экспериментах использовали культуры на 2-4 пассажах.

рис. 3. Среднее время удвоения популяций МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Указано стандартное отклонение

При иммунофенотипировании культур МСК на 2 пассаже показано, что процентное содержание клеток, положительных по экспрессии поверхностных антигенов CD90, CD44, CD73, и отрицательных по экспрессии CD45, CD34, CD117, CD14, в культурах МСК, полученных из разных источников, было схожим и превышало 95%. Наибольшая вариабельность наблюдалась по экспрессии поверхностных антигенов CD13 (аминопептидаза N и CD10 (нейтральная эндопептидаза) в культурах МСК пупочного канатика (табл. 1). При дальнейшем культивировании (начиная с 3 пассажа) CD10 и CD13 экспрессировали 83 ± 10% и 71 ± 12,5 клеток, соответственно. Кроме того, в части культур МСК пупочного канатика и костного мозга присутствовали минорные популяции клеток, не экс-прессирующие CD105.

В культурах, полученных из разных источников, все клетки (более 99%) экспрессировали антиген СD90, при этом уровень экспрессии существенно различался. Средняя интенсивность флуоресценции в культурах МСК, полученных из пупочного канатика, составляла 123,5 ± 51, костного мозга - 48,3 ± 26 , жировой ткани -109 ± 48. (рис. 5.). Максимальные значения были получены для двух культур МСК пупоч-

ного канатика (Хсредн = 238 и 254), в то время как минимальные - для культуры МСК костного мозга (Хсредн = 13,4).

Таблица 1

Доля клеток, экспрессирующих указанные поверхностные антигены в культурах МСк (2 пассаж), полученных из разных источников*

Источник МСК Антиген Пупочный канатик Жировая ткань Костный мозг

СD90+ 99,2 ± 0,5 99,3 ± 0,4 99 ±0,4

CD 105+ 89,7 ± 6,9 99 ± 0,8 93,3 ± 6,5

CD 73+ 99,3 ± 0,7 98,2 ± 0,6 95 ± 3,2

CD 10+ 37,8 ± 19,3 81 ± 13,5 98 ± 0,9

CD 13+ 34,6 ± 15,7 97,3± 2,1 96,1 ± 1,9

CD 44+ 99 ± 0,9 99,8 ± 0,05 97.5 ± 2,3

HLA-ABC 99,5 ± 0,2 99,8 ± 0,1 99,2 ± 0,1

CD 45- 3 ± 2,4 2,5 ± 1,2 1,9 ± 1,6

CD14- 3,8 ± 3,5 2,4 ± 1,6 1,5 ± 0,8

CD117- 4,2 ± 3,8 1,8 ± 0,5 1,1 ± 0,4

CD34- 2,1 ± 1,8 3,4 ± 2,1 3,1 ± 2,8

примечание: * Полужирным шрифтом выделены маркеры, по которым выявлены достоверные различия между МСК из разных источников

рис. 5. А. Средняя интенсивность флуоресценции МСК из разных источников, экспрессирующих антиген С090. Указаны стандартные отклонения. * -достоверные различия при р<0,05. Б. Пример гистограмм интенсивности флуоресценции МСК, экспрессирующих антиген СЭ90, в трех первичных культурах, полученных из костного мозга (зеленый цвет), жировой ткани (желтый цвет) и пупочного канатика (синий цвет). Пунктирная линия - изотипический контроль.

Аналогично, для МСК, полученных из разных источников, существенные различия были показаны в уровне экспрессии CD105. Средняя интенсивность флуоресценции МСК, полученных из пупочного канатика, является достаточно постоянной в различных культурах и, в среднем, составляет 14,9±6,8. В тоже время была показана значительная разнородность культур

МСК жировой ткани и костного мозга, полученных от разных доноров (рис. 6).

костный мозг жировая ткань пупочный канатик

рис. 6. Средняя интенсивность флуоресценции МСК из разных источников, экспрессирующих антиген CD90.

Указаны стандартные отклонения

МСК всех проанализированных культур экс-прессировали HLA I. Уровень экспрессии HLA I был одинаковым для культур МСК, полученных из костного мозга, пупочного канатика и жировой ткани (рис. 7). Для проверки существующего в литературе мнения о низком уровне экспрессии HLA I (Newman et al., 2009; Franquesa et al., 2012; Климович В.Б., 2014) было проведено сравнение данного показателя между культурами МСК жировой ткани и лимфоцитами периферической крови, полученными от одних и тех же доноров (3 здоровых донора). Эксперименты были поставлены в двух повторностях для каждого донора с использованием МСК на 2 и 3 пассажах. Было показано, что средняя интенсивность флуоресценции МСК и лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих HLA I, практически не отличается (рис. 7.).

3

рис. 7. Уровень экспрессии HLA I на МСК и лимфоцитах периферической крови. А - Гистограмма интенсивности флуоресценции МСК

жировой ткани (гистограмма с серым фоном) и лимфоцитов периферической крови (черная линия),

экспрессирующих HLA I. Пунктирная линия -изотипический контроль. Б - Средняя интенсивность флуоресценции МСК и лимфоцитов периферической крови. Указано стандартное отклонение

Таким образом, МСК, полученные из разных источников, практически не отличаются по морфологическим характеристикам, но имеют различную пролиферативную активность и отличия в экспрессии CD10, CD13, CD105 и CD90.

Выполненные в ходе настоящей работы эксперименты демонстрируют повышенную про-лиферативную активность МСК, полученных из пупочного канатика, по сравнению с МСК костного мозга. Аналогичные результаты были получены ранее (12). Также были показаны различия между пролиферативной активностью МСК пупочного канатика и жировой ткани, которые, однако, возникали только при длительном культивировании. Вероятно, подобные отличия могут быть связаны с возрастом доноров, поскольку в случае МСК ПК он минимален относительно других типов МСК.

Несмотря на сходство МСК по экспрессии большинства анализированных антигенов, в ходе более подробной характеристики иммуно-фенотипа было показано, что клетки, выделенные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, могут иметь различный уровень экспрессии CD10, CD13, CD105 и CD90. Уровень экспрессии данных антигенов может влиять на их функциональную активность МСК, что в свою очередь может сказываться на эффективности их клинического применения.

CD10 вовлечен в активацию опосредованной киназой фокальных контактов клеточной адгезии, способствуя, таким образом, усилению адгезии. CD10 может снижать способность клеток к миграции [13]. Ранее на МСК жировой ткани было показано, что доля клеток, экспрессирую-щих CD10 сильно варьирует от образца к образцу и снижается в процессе культивирования c 2 по 10 пассаж (1). При анализе использованных в нашей работе культур МСК жировой ткани также была показана гетерогенность клеток по экспрессии CD10. По данным Siegel с соавторами, в среднем на первом пассаже, доля CD10+, клеток среди МСК костного мозга составляла 84,2% ± 11,7%. При этом, авторы наблюдали прямую корреляцию между уровнем экспрессии CD10 и эффективностью адипогенной диф-ференцировки [10]. В нашей работе доля МСК, экспрессирующих CD10+ составляла 98 ± 0,9%, что может быть связано с культивированием в условиях гипоксии. Кроме того, ранее было показано, что в культурах МСК пупочного канатика все клетки экспрессируют данный маркер [14]. Согласно нашим результатам, содержание CD10+ клеток среди МСК, полученных из пу-

почного канатика, существенно ниже, чем МСК, полученных из костного мозга и жировой ткани.

Активация CD13,, также как и CD10, может приводить к усилению клеточной адгезии [15]. В литературе существуют данные об однородности МСК костного мозга и жировой ткани относительно экспрессии CD13 [16-17]. Аналогично, согласно ряду работ, в культурах МСК пупочного канатика более 90% клеток экспрес-сируют CD13 [18-20]. Однако в цитируемых исследованиях иммунофенотипирование проводили для небольшого количества культур МСК. Кроме того, для анализа использовали МСК на 3, 4 или даже 8 пассаже. Согласно нашим результатам, МСК пупочного канатика гетеро-генны по экспрессии CD13. На втором пассаже только 34,6 ± 15,7% МСК пупочного канатика экспрессируют CD13, однако уже на 3 пассаже доля МСК пупочного канатика, экспрессирую-щих CD13 возрастает почти в два раза и составляет в среднем 71 ± 12,5%. Стоит отметить, что доля МСК пупочного канатика, экспрессирую-щих CD13, сильно варьировала между разными культурами. При этом во всех культурах МСК, полученных из костного мозга и жировой ткани, вне зависимости от пассажа, CD13 экспрессируют более 90% клеток. Учитывая вовлеченность CD10 и CD13 в регуляцию процессов миграции и клеточной адгезии, это наблюдение может быть существенным при системном введении МСК, эффективность которого во многом зависит от способности МСК к миграции.

CD90 также участвует в регуляции межклеточной адгезии, усиливая ее. Экспрессия CD90 была показана для всех клеток (более 98-99%) во всех культурах МСК, но ее уровень зависел от источника получения МСК. МСК костного мозга характеризовались более низкими значениями средней интенсивности флуоресценции МСК, экспрессирующих CD90, по сравнению с МСК пупочного канатика и жировой ткани. Это свидетельствует о различной плотности изучаемого антигена на поверхности клеток, полученных из разных источников. Существуют данные, свидетельствующие о том, что низкая экспрессия CD90 на поверхности МСК коррелирует со снижением их иммуносупрессорной активности [21], что опосредовано, как предполагают авторы, снижением продукции неклассического антигена НЬА^ и 1Ь-10. Кроме того, в более ранней работе той же группы авторов на МСК, полученных из костного мозга пациентов с онкогематологическими заболеваниями, была показана обратная корреляция между

уровнем экспрессии CD90 и пролиферативной активностью [22]. Приведенные выше результаты, наоборот, свидетельствуют, о большей пролиферативной активности МСК, характеризующихся более высоким уровнем экспрессии CD90 - МСК пупочного канатика. Некоторое расхождение, возможно, обусловлено тем, что Campioni D. с соавторами в исследовании использовали МСК, полученные не от здоровых доноров. Кроме того, МСК культивировали в присутствии ангиогенных факторов. Высокий уровень экспрессии CD90 в МСК пупочного канатика может быть частично связан с возрастом донора биологического материала. Так, в работе Siegel с соавторами была показана обратная зависимость уровня экспрессии CD90 от возраста донора [10]. Однако данное объяснение не подходит для МСК жировой ткани, поскольку возраст доноров жировой ткани составлял от 46 до 90 лет. Кроме того, культуры МСК пупочного канатика характеризовались максимальной внутригрупповая дисперсия показателей интенсивности флуоресценции CD90. При этом не удалось выявить корреляции уровня экспрессии с каким-либо параметром в анамнезе роженицы (возраст, срок гестации, наличие гипоксии плода и т.д.) либо в процедуре выделения клеток (время между родами и выделением клеток, свойства пупочного канатика).

МСК пупочного канатика, в отличие от МСК костного мозга и жировой ткани были однородны по экспрессии CD105. Ранее различия в уровне экспрессии CD105 также были показаны для МСК костного мозга и жировой ткани [23-25]. МСК пупочного канатика при этом характеризуются постоянным, но достаточно низким уровнем экспрессии CD105. Одним из важных факторов, влияющих на долю клеток, несущих на своей поверхности CD105, является срок культивирования in vitro. Так, на МСК жировой ткани человека продемонстрировали, что экспрессия антигена CD105 отличается в образцах клеток от разных индивидов и в процессе пассирования, снижаясь после 2 пассажа до 7 [1]. CD105 (эндоглин) - это мембранный гликопротеин I типа, который функционирует в качестве дополнительного рецептора для ли-гандов TGF-бета-суперсемейства. CD105 участвует в регуляции миграции и организации цитоскелета. Кроме того, на МСК, полученных из пуповинной крови человека, показано, что снижение экспрессии CD105 наблюдается в ходе дифференцировки клеток в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях

[26]. Per Anderson с соавторами (2013) разделили МСК жировой ткани мыши на CD105+ и CD105 - клетки, которые, по мнению авторов, представляют собой не отражение стадии диф-ференцировки МСК, а являются отдельными субпопуляциями, обладающими различными свойствами. CD105- МСК обладают большей способностью дифференцироваться в адипо-генном и остеогенном направлениях по сравнению с CD105+. Кроме того, CD105- МСК обладали более выраженным иммуносупрес-сивным действием по отношению к пролиферации Т-лимфоцитов in vitro. При этом CD105- и CD105+ МСК характеризуются одинаковым пролиферативным потенциалом, способностью к колониеобразованию и уровнем экспрессии остальных поверхностных антигенов [27].

При иммунофенотипировании культур МСК также анализировали уровень экспрессии HLA I класса. Ранее показано, что МСК экспрессиру-ют HLA I класса [28], но в ряде статей упоминается низкий уровень экспрессии HLA I в качестве одной из характеристик фенотипа МСК [2, 29-31]. Однако экспериментального подтверждения данному факту найти не удалось. Напротив, наши результаты свидетельствуют о том, что МСК, полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, экспрес-сируют HLA I класса практически на том же уровне, что и лимфоциты периферической крови. Это согласуется с работой Crop с соавторами, в которой высокий по сравнению с другими типами клеток уровень экспрессии HLA I был продемонстрирован с помощью микрочипов [32]. Как известно, HLA I класса необходимы для защиты клеток от лизиса естественными киллерами, одной из основных функций которых является разрушение опухолевых клеток, у которых снижена или отсутствует экспрессия HLA I («положительное» распознавание) [33]. Наши данные были получены с использованием поликлональных антител к белкам, кодируемым генами системы HLA I класса всех трех локусов - А, В и С.

Таким образом, на большой выборке образцов было показано, что МСК пупочного кантика обладают значительно более высокой проли-феративной активностью по сравнению с МСК костного мозга. Различия в пролиферативной активности между МСК пупочного канатика и жировой ткани не так существенны и наблюдаются только на поздних пассажах. При этом сравнение иммунофенотипа МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного

канатика, проведенное в данной работе, свидетельствует о сходстве между клетками, полученными из разных источников, за исключением экспрессии CD10, CD13, CD90 и CD105.

литература

1. Пиневич, А.А. Характеристика мезенхи-мальных стромальных клеток при раке молочной железы / А.А. Пиневич, М. П. Самойлови., О.А. Шашкова, Н.Л. Вартанян, В.Н. Полысалов, Л.Н. Киселева, А.В. Карташев, А.А. Айзенштадт,

B.Б. Климович // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2014. - N 2. - С. 84-91.

2. Климович, В. Б. Иммуномодулирующая активность мезенхимальных стромальных (стволовых) клеток / В.Б. Климович // Медицинская иммунология. - 2014. - Т. 16, № 2. - С. 107-126.

3. Friedenstein, A. J., Chailakhjan R. K., Lalyki-na K. S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea pig bone marrow and spleen cells //Cell Proliferation. - 1970. - Т. 3. -№. 4. - С. 393-403.

4. Erices, A., Conget P., Minguell J. J. Mesen-chymal progenitor cells in human umbilical cord blood //British journal of haematology. - 2000. -Т. 109. - №. 1. - С. 235-242.

5. Fukuchi, Y, Nakajima H., Sugiyama D., Hi-rose I., Kitamura T., Tsuji K. Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential //Stem cells. - 2004. - Т. 22. - №. 5. -

C. 649-658.

6. Zvaifler, N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., Edwards C.J., Moss J., Burger J.A. Mesen-chymal precursor cells in the blood of normal individuals. Arthritis Res 2000 V.2. P. 477 - 488.

7. Nagatomo, K., Komaki M., Sekiya I., Sakagu-chi Y., Noguchi K., Oda S. Stem cell properties of human periodontal ligament cells. J Periodontal Res. Arthritis research. - 2000. - Т. 2. - №. 6. -С. 477-488.

8. Dominici, M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. // Cytotherapy. - 2006. -Т. 8. - №. 4. - С. 315-317.

9. Rada, T, Reis RL, Gomes ME. 2011. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential // Stem Cell Reviews and Reports. - 2011. - Т. 7. - №. 1. -С. 64-76.

10. Siegel, G, Kluba T, Hermanutz-Klein U, Bie-back K, Northoff H, Schäfer R. Phenotype, donor

age and gender affect function of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells // BMC medicine. - 2013. - T. 11. - №. 1. - C. 146.

11. Campioni, D, Rizzo R, Stignani M, Mel-chiorri L, Ferrari L, Moretti S, Russo A, Bagnara GP, Bonsi L, Alviano F, Lanzoni G, Cuneo A, Bari-cordi OR, Lanza F. 2009. A decreased positiv-ity for CD90 on human mesenchymal stromal cells (MSCs) is associated with a loss of immuno-suppressive activity by MSCs //Cytometry Part B: Clinical Cytometry. - 2009. - T. 76. - №. 3. -C. 225-230.

12. Baksh, D, Yao R., Tuan R.S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow //Stem cells. - 2007. - T. 25. - №. 6. - C. 1384-1392.

13. Sumitomo, M, Shen R., Walburg M., Dai J., Geng Y., Navarro D., Boileau G., Papandreou C.N., Giancotti F.G., Knudsen B., Nanus D.M. Neutral endopeptidase inhibits prostate cancer cell migration by blocking focal adhesion kinase signaling. // Journal of Clinical Investigation. - 2000. -T. 106. - №. 11. - C. 1399-1407.

14. Farias, VA, Linares-Fernández J.L., Peñal-ver J.L., Payá Colmenero J.A., Ferrón G.O., Duran E.L., Fernández R.M., Olivares E.G., O'Valle F., Puertas A., Oliver F.J., Ruiz de Almodóvar J.M. Human umbilical cord stromal stem cell express CD10 and exert contractile properties // Placenta. - 2011. - T. 32. - №. 1. - C. 86-95.

15. Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target //Trends in molecular medicine. - 2008. - T. 14. - №. 8. -

C. 361-371.

16. Musina R.A., Bekchanova E.S., Sukhikh G.T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues //Bulletin of experimental biology and medicine. - 2005. - T. 139. -№. 4. - C. 504-509.

17. Vishnubalaji R., Al-Nbaheen M., Kadal-mani B., Aldahmash A., Ramesh T. Comparative investigation of the differentiation capability of bone-marrow-and adipose-derived mesenchymal stem cells by qualitative and quantitative analysis // Cell and tissue research. - 2012. - T. 347. -№. 2. - C. 419-427.

18. Panepucci, R.A., Siufi J.L., Silva W.Ar, Proto-Siquiera R., Neder L., Orellana M., Rocha V., Covas

D.T., Zago M.A. Comparison of gene expression of umbilical cord vein and bone marrow-derived mesenchymal stem cells // Stem cells. - 2004. - T. 22. -№. 7. - C. 1263-1278.

19. Weiss, M.L., Troyer D.L. Stem cells in the umbilical cord // Stem cell reviews. - 2006. -T. 2. - №. 2. - C. 155-162.

20. Ishige, I., Nagamura-Inoue T., Honda M.J., Harnprasopwat R., Kido M., Sugimoto M., Nakauchi H., Tojo A. Comparison of mesen-chymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord // International journal of hematology. -2009. - T. 90. - №. 2. - C. 261-269.

21. Campioni, D., Rizzo R., Stignani M., Mel-chiorri L., Ferrari L., Moretti S., Russo A., Bagnara G.P., Bonsi L., Alviano F., Lanzoni G., Cuneo A., Baricordi O.R., Lanza F. A decreased positivity for CD90 on human mesenchymal stromal cells (MSCs) is associated with a loss of immunosuppressive activity by MSCs // Cytometry Part B: Clinical Cytometry. - 2009. - T. 76. -№ 3. - C. 225-230.

22. Campioni, D., Moretti S., Ferrari L., Puntur-ieri M., Castoldi G.L., Lanza F. Immunophenotypic heterogeneity of bone marrow-derived mesenchy-mal stromal cells from patients with hematologic disorders: correlation with bone marrow microenvironment // Haematologica. - 2006. - T. 91. -№ 3. - C. 364-368.

23. Rada, T, Reis R.L., Gomes M.E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential // Stem Cell Reviews and Reports. - 2011. - T. 7. - № 1. - C. 64-76.

24. Asian, H, Zilberman Y., Kandel L., Liebergall M., Oskouian R.J., Gazit D., Gazit Z. Osteo-genic differentiation of noncultured immunoiso-lated bone marrow-derived CD105+ cells // Stem Cells. - 2006. - T. 24. - №. 7. - C. 1728-1737.

25. Jiang, T., Liu W., Lv X., Sun H, Zhang L, Liu Y, Zhang WJ, Cao Y, Zhou G. Potent in vitro chondrogenesis of CD105 enriched human adipose-derived stem cells // Biomaterials. - 2010. -T. 31. - №. 13. - C. 3564-3571.

26. Jin H.J., Park S.K., Oh W., Yang Y.S., Kim S.W., Choi S.J. Down-regulation of CD105 is associated with multi-lineage differentiation in human umbilical cord blood-derived mesenchy-mal stem cells // Biochemical and biophysical research communications. - 2009. - T. 381. - №. 4. -C. 676-681.

27. Anderson, P., Carrillo-Gâlvez A.B., Garcia-Pérez A.,Cobo M., Martin F. CD105 (endoglin)-negative murine mesenchymal stromal cells define a new multipotent subpopulation with distinct differentiation and immunomodulatory capacities // PloS one. - 2013. - T. 8. - №. 10. - C. e76979.

28. Le Blanc, K, Rasmusson I., Gotherstrom C. Mesenchymal stem cells inhibit the expression of CD25 (interleukin_2 receptor) and CD38 on phy-tohaemagglutinin activated lymphocytes //Scandinavian journal of immunology. - 2004. - T. 60. -№. 3. - C. 307-315.

29. Sotiropoulou, P.A., Perez S.A., Gritza-pis A.D., Baxevanis C.N., Papamichail M. Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells //Stem cells. - 2006. - T. 24. -№. 1. - C. 74-85.

30. Newman, R.E., Yoo D., LeRoux M.A., Danilkovitch-Miagkova A. Treatment of inflammatory diseases with mesenchymal stem cells // Inflammation & Allergy-Drug Targets (Formerly Current Drug Targets-Inflammation & Allergy). -2009. - T. 8. - №. 2. - C. 110-123.

31. Franquesa, M., Herrero E., Torras J., Ripoll E., Flaquer M., Goma M. Lloberas N., Anegon I., Cru-

zado J.M., Grinyó J.M., Herrero-Fresneda I. Mesenchymal stem cell therapy prevents interstitial fibrosis and tubular atrophy in a rat kidney allograft model // Stem cells and development. - 2012. -T. 21. - №. 17. - C. 3125-3135.

32. Crop, MJ, Baan C.C., Korevaar S.S., Ijzer-mans J.N., Pescatori M., Stubbs A.P., van Ijck-en W.F., Dahlke M.H., Eggenhofer E., Weimar W., Hoogduijn M.J. Inflammatory conditions affect gene expression and function of human adipose tissue-derivedmesenchymal stem cells. //Clinical & Experimental Immunology. - 2010. - T. 162. -№. 3. - C. 474-486.

33. Ruggeri, L, Capanni M., Martelli M.F., Velardi A. Cellular therapy: exploiting NK cell alloreactivity in transplantation. //Current opinion in hematology. - 2001. - T. 8. - №. 6. -C. 355-359.

А.А. Айзенштадт Тел. +79217741547 Е-mail: aizendt@gmail.com

А.А. Айзенштадт, Н.И. Енукашвили, Т.Л. Золина, Л.В. Александрова, А.Б. Смолянинов Сравнение пролиферативной активности и фенотипа МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика // Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова. — 2015. — Том 7, № 2. - С. 14-22.

COMPARISON OF PROLIFERATION AND IMMUNOPHENOTYPE OF MSC, OBTAINED FROM BONE MARROW, ADIPOSE TISSUE AND UMBILICAL CORD

A.A. Aisenstadt13, N.I. Enukashvili23, T.L. Zolina3, L.V. Alexandrov3, A.B. Smoljaninov 1,3

Mesenchymal stem cells (MSC) can be applied for treatment of different diseases. Human MSC have been isolated from bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood. Umbilical cord MSCs (UC-MSC) are obtained during birth with non-invasive, non-traumatic methods and thus seem a good candidate for clinical practice instead of bone-marrow MSC (BM-MSC). It is yet unknown whether the immunophenotype and proliferation capacity of UC-MSC are similar to adipose-derived stem cells (ADSCs) or BM-MSC. The goal of this research was to study the immunophenotype and proliferation capacity of UC-MSC, ADSCs and BM-MSC. The results indicated that MSC of different origin had similar morphological and immunophenotypic characteristics with minor differences. UC-MSC differed from other cultures by constant level of CD105 expression, the presence of minor CD10 - and CD13 - populations and higher proliferative activity. BM-MSC were characterized by reduced expression levels of CD90, compared with the UC-MSCs and ADSCs. These data confirm the similarity of UC-MSC with BM-MSCs and ADSCs and the possibility of their use in clinical practice instead of hard-to-obtain BM-MSC.

Keywords: mesenchymal stem cells, CD90, CD105, CD10, CD13, immunophenotyping.

Authors

A.A. Aisenstadt Те1.: +79217741547 E-mail: aizendt@gmail.com

A.A. Aisenstadt, N.I. Enukashvili, T.L. Zolina, L.V. Alexandrov, A.B. Smoljaninov Comparison of proliferation and immunophenotype of MSC, obtained from bone marrow, adipose tissue and umbilical cord // Herald of the Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov. - 2015. - Vol. 7, № 2. - P. 14-22.