ВИЧ ВАКЦИНА, ОСНОВАННАЯ НА НАПРАВЛЕННОСТИ МАКСИМИЗИРОВАННЫХ Gag И Nef НА ДЕНДРИТНЫЕ КЛЕТКИ
HIV VACCINE BASED ON MAXIMISED Gag AND Nef TARGETING ON DENDRITE CELLS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится, в общем, к области агентов, которые направляют вирусные белки на дендритные клетки.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Не ограничивая объем изобретения, его предпосылки описываются в связи с презентацией антигена.
Дендритные клетки играют ключевую роль в контроле границы врожденного и приобретенного иммунитета путем обеспечения растворимых и внутриклеточных сигналов, с последующим распознаванием патогенов. Эти функции ДК (дендритные клетки, или DC) в значительной степени зависят от экспрессии специализированных поверхностных рецепторов, 'образораспознающих рецепторов' (PRR), представленных, что особо касается, toll-подобными рецепторами (TLR) и лектинами С-типа или лектин-подобными рецепторами (LLR).
В существующей парадигме главная роль TLR состоит в том, чтобы предупреждать продуцирование ДК интерлейкина 12 (IL-12) и другие воспалительные цитокинов для первичных иммунных ответов. LLR С-типа работают как компоненты мощного механизма захвата и поглощения антигена макрофагами и ДК. По сравнению с TLR, тем не менее, LLR вероятно имеют более широкие диапазоны биологических функций, которые включают клеточные миграции, межклеточные взаимодействия. Эти множественные функции LLR вероятно обусловлены теми фактами, что LLR, в отличие от TLR, могут распознавать как свое, так и чужое. Тем не менее, сложность LLR, включая избыточное количество LLR, экспрессированных на иммунных клетках, являлась одной из главных помех к пониманию подробных функций отдельных LLR. Кроме того, естественные лиганды для большинства из этих рецепторов остаются неопределенными. Несмотря на это, данные последних исследований показывают, что LLR, совместно с TLR, могут вносить вклад в активацию иммунных клеток в ходе микробных инфекций.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном варианте осуществления, данное изобретение включает композиции и способы повышения эффективности презентации антигена антигенпрезентирующей клеткой путем выделения и очищения ДК-специфического антитела или его фрагмента, к которому сконструированный Gag антиген прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Gag антиген является менее чувствительным к протеолитическому распаду путем отщепления одного или более протеолитических сайтов; и контакта антигенпрезентирующей клетки при условиях, где комплекс антитело-антиген обрабатывают и представляют для Т клеточного распознавания. В одном аспекте антигенпрезентирующая клетка включает дендритную клетку. В другом аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент связывается с одной половиной когерин-докериновой пары, или ДК-специфическое антитело или его фрагмент связывается с одной половиной когерин-докериновой пары и сконструированный Gag антиген связывается с комплементарной половиной когерин-докериновой пары для образования комплекса. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает один или более новых сайтов гликозилирования, или комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, которые обеспечивают повышенную гибкость между антителом и антигеном, пониженный протеолиз на линкере и повышенную секрецию. В еще одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном, который включает один или более линкеров, выбранных из SEQ ID NOS. 4 и 6.
В другом аспекте данного изобретения комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, выбранных из линкерной последовательности, полученной из организма, разлагающего целлюлозу. В одном аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент является гуманизированным. В одном специфическом аспекте комплекс антитело-антиген выбран из SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 или 32. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает маркерную последовательность, используемую для очищения или определения комплекса. В еще одном аспекте ДК-специфическое антитело или связи фрагмента выбрано из антитела, которое специфически связывается с МНС (главный комплекс гистосовместимости) класса I, МНС класса II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, рецептором маннозы, Лангерином, DECTIN-1, B7-1, В7-2, IFN-γ рецептором и IL-2 рецептором, ICAM-1, Fcγ рецептором, LOX-1 и ASPGR.
Другой вариант осуществления данного изобретения включает композиции и способы повышения эффективности презентации антигена антигенпрезентирующей клеткой путем: выделения и очищения ДК-специфического антитела или его фрагмента, к которому сконструированный Nef антиген прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Nef антиген включает оптимизацию частоты использования одного или более кодонов, которая повышает секрецию комплекса антитело-антиген; и контакт антигенпрезентирующей клетки при условиях, где комплекс антитело-антиген обрабатывают и представляют для Т клеточного распознавания. В одном аспекте антигенпрезентирующая клетка включает дендритную клетку. В другом аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент связывается с одной половиной когерин-докериновой пары, или ДК-специфическое антитело или его фрагмент связывается с одной половиной когерин-докериновой пары и сконструированный Nef антиген связывается с комплементарной половиной когерин-докериновой пары для образования комплекса. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Nef антигеном. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает один или более новых сайтов гликозилирования, или комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Nef антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, что обеспечивает повышенную гибкость между антителом и антигеном, пониженный протеолиз на линкере и повышенную секрецию. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Nef антигеном, который включает один или более линкеров, выбранных из SEQ ID NOS. 4 и 6. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Nef антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, выбранных из линкерной последовательности, полученной из организма, разлагающего целлюлозу. В одном аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент является гуманизированным. В еще одном аспекте комплекс антитело-антиген включает SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15, 16 и 17. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает маркерную последовательность, используемую для очищения или определения комплекса. В одном аспекте ДК-специфическое антитело или связи фрагмента выбран из антитела, которое специфически связывается с МНС класса I, MHC класса II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, рецептором маннозы, Лангерином, DECTIN-1, B7-1, B7-2, IFN-γ рецептором и IL-2 рецептором, ICAM-1, Fcγ рецептором, LOX-1 и ASPGR.
Еще один вариант осуществления данного изобретения представляет собой вакцину, включающую ДК-специфическое антитело или его фрагмент, к которому сконструированный Gag антиген прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Gag антиген является менее чувствительным к протеолитическому распаду путем отщепления одного или более протеолитических сайтов. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном. В еще одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает один или более новых сайтов гликозилирования. В еще одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, что обеспечивает повышенную гибкость между антителом и антигеном, пониженный протеолиз на линкере и повышенную секрецию. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном, который включает один или более линкеров, выбранных из SEQ ID NOS. 4 и 6. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, выбранных из линкерной последовательности, полученной из организма, разлагающего целлюлозу. В одном аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент является гуманизированным. В одном специфическом аспекте комплекс антитело-антиген выбран из SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 или 32. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает маркерную последовательность, используемую для очищения комплекса. Специалисту в данной области техники понятно, что комплекс антитело-антиген может быть образован с помощью ковалентной или нековалентной связи между ДК-специфическим антителом или фрагментом и антигеном или в форме слитого белка, с любой из частей на амино или карбокси-конце или даже как контактамеры или одна или более из любой части. В одном аспекте ДК-специфическое антитело или связи фрагмента выбран из антитела, которое специфически связывается с МНС класса I, МНС класса II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, рецептором маннозы, Лангерином, DECTIN-1, B7-1, В7-2, IFN-γ рецептором и IL-2 рецептором, ICAM-1, Fcγ рецептором, LOX-1 и ASPGR.
Еще один вариант осуществления данного изобретения представляет собой вакцину, включающую ДК-специфическое антитело или его фрагмент, к которому сконструированный Nef антиген прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Nef антиген включает оптимизацию частоты использования одного или более кодонов, которая повышает комплекс антитело-антиген секреция. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Nef антигеном. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает один или более новых сайтов гликозилирования. В еще одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Nef антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, что обеспечивает повышенную гибкость между антителом и антигеном, пониженный протеолиз на линкере и повышенную секрецию. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Nef антигеном, который включает один или более линкеров, выбранных из SEQ ID NOS. 4 и 6. В еще одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Nef антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, выбранных из линкерной последовательности, полученной из организма, разлагающего целлюлозу. В одном специфическом аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент является гуманизированным. В другом специфическом аспекте комплекс антитело-антиген включает SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 или 32. В еще одном аспекте, комплекс антитело-антиген дополнительно включает маркерную последовательность, используемую для очищения комплекса. Специалисту в данной области техники понятно, что комплекс антитело-антиген может быть образован ковалентной или нековалентной связью между ДК-специфическим антителом или фрагментом и антигеном или в форме слитого белка, с любой из частей на амино или карбокси-конце или даже как контактамеры или одна или более каждой части. В другом аспекте ДК-специфическое антитело или связи фрагмента выбрано из антитела, которое специфически связывается с МНС класса I, МНС класса II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, рецептором маннозы, Лангерином, DECTIN-1, B7-1, В7-2, IFN-γ рецептором и IL-2 рецептором, ICAM-1, Fcγ рецептором, LOX-1 и ASPGR.
Еще один вариант осуществления данного изобретения представляет собой вакцину, включающую: ДК-специфическое антитело или его фрагмент, к которому сконструированный Gag антиген прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Gag антиген является менее чувствительным к протеолитическому распаду путем отщепления одного или более протеолитических сайтов; и ДК-специфическое антитело или его фрагмент, к которому сконструированный Nef антиген прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Nef антиген включает оптимизацию частоты использования одного или более кодонов, что повышает секрецию комплекса антитело-антиген, где вакцина способна вызвать ВИЧ-специфический Т-клеточный иммунный ответ на Gag p17, Gag p24 и Nef. В одном аспекте Gag и Nef антигены включают слитый белок. В другом аспекте Gag и Nef антигены включают слитый белок, отделенный одним или более гибкими линкерами. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag или Nef антигеном, который включает один или более линкеров, выбранный из SEQ ID NOS. 4 и 6. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Gag антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, выбранных из линкерной последовательности, полученной из организма, разлагающего целлюлозу. В одном аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент является гуманизированным. В одном специфическом аспекте вакцина выбрана из SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 или 32. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает маркерную последовательность, используемую для очищения комплекса.
В еще одном варианте осуществления данное изобретение представляет собой вакцину, включающую ДК-специфическое антитело или его фрагмент, к которому сконструированный Gag антиген прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Gag антиген является менее чувствительным к протеолитическому распаду путем отщепления одного или более протеолитических сайтов; и сконструированный Nef антиген, который прикреплен к ДК-специфическому антителу или его фрагменту или к сконструированному Gag антигену, образуют комплекс антитело-антиген, где Nef антиген включает оптимизацию частоты использования одного или более кодонов, что повышает секрецию комплекса антитело-антиген, где вакцина способна вызвать ВИЧ-специфический Т-клеточный иммунный ответ на Gag p17. Gag p24 и Nef. В одном аспекте Gag и Nef антигены для ДК-специфического антитела или его фрагмента включают слитый белок. В одном аспекте Gag и Nef антигены включают слитый белок, отделенный одним или более гибкими линкерами.
Еще один вариант осуществления данного изобретения включает способ повышения эффективности дендритных клеток путем выделения дендритных клеток пациента; экспонирования дендритных клеток в активационных количествах вакцины, включающей: ДК-специфическое антитело или его фрагмент, к которому сконструированный Gag антиген прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Gag антиген является менее чувствительным к протеолитическому распаду путем отщепления одного или более протеолитических сайтов; и сконструированный Nef антиген, который прикреплен к ДК-специфическому антителу или его фрагменту или к сконструированному Gag антигену, образуют комплекс антитело-антиген, где Nef антиген включает оптимизацию частоты использования одного или более кодонов, что повышает секрецию комплекса антитело-антиген, где вакцина способна вызвать ВИЧ-специфический Т-клеточный иммунный ответ на Gag p17, Gag p24 и Nef; и введение вновь нагруженных антигеном, активированных дендритных клеток пациенту.
Еще один вариант осуществления данного изобретения включает вакцину, включающую ДК-специфическое антитело или его фрагмент, к которому сконструированный антиген, включающий Циклин D1 или фрагменты, прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Циклин D1 антиген является менее чувствительным к протеолитическому распаду путем отщепления одного или более протеолитических сайтов. В одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Циклин D1 антигеном. В другом аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает один или более новых сайтов гликозилирования. В еще одном аспекте комплекс антитело-антиген дополнительно включает гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Циклин D1 антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, что обеспечивает повышенную гибкость между антителом и антигеном, пониженный протеолиз на линкере и повышенную секрецию. Например, комплекс антитело-антиген может дополнительно включать гибкий линкер между ДК-специфическим антителом или его фрагментом и Циклин D1 антигеном, который включает один или более сайтов гликозилирования, выбранных из линкерной последовательности, полученной из организма, разлагающего целлюлозу. В одном аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент является гуманизированным. В другом аспекте ДК-специфическое антитело или его фрагмент связывается с одной половиной когерин-докериновой пары и сконструированный Циклин D1 антиген связывается с комплементарной половиной когерин-докериновой пары для образования комплекса. Данное изобретение также включает способ повышения эффективности дендритных клеток, включающий: выделение дендритных клеток пациента; экспонирование дендритных клеток в активирующих количествах вакцины, включающей: ДК-специфическое антитело или его фрагмент, к которому сконструированный антиген, включающий Циклин D1 или его фрагмент(ы), прикреплен для образования комплекса антитело-антиген, где Циклин D1 антиген является менее чувствительным к протеолитическому распаду путем отщепления одного или более протеолитических сайтов или введение сайтов гликозилирования или улучшение экспрессии путем отбора одного или более кодонов, которые улучшают экспрессию; и введение вновь нагруженных антигеном активированных дендритных клеток пациенту.
Еще один вариант осуществления данного изобретения включает изолированную и очищенную нуклеиновую кислоту, которая кодирует полипептид, выбранный из SEQIDNO.: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 или 32. Еще один вариант осуществления данного изобретения включает изолированный и очищенный полипептид, выбранный из SEQ ID NO.: 1, 2, 3, 4, 5, 7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 31 или 32.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Для более полного понимания характеристик и преимуществ данного изобретения, сейчас сделали ссылку на детальное описание изобретения вместе с сопроводительными фигурами и в которых:
Фигура 1 показывает анализ электрофореза ДСН-ПААГ (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, или SDS PAGE) в восстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси синим очищенных с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А слитых белков gag р24-антитело, полученных из CHO-S или 293F клеток, временно трансфектированных с векторами экспрессии, кодирующими слияние Н цепь - gag р24, с диаграммами конструктов и предполагаемыми молекулярными массами;
Фигура 2 показывает анализ электрофореза ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси синим очищенного с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А слитого белка gag р24-антитело, полученного из CHO-S или 293F клеток, временно трансфектированных с векторами экспрессии, кодирующими слияние Н цепь - gag р24, где линкер Н цепь - gag р24 получена из предшественника целлюлосомного фиксирующего В белка [Bacteroides cellulosolvens] и соответствующей плазмиды экспрессии легкой [L] цепи, с диаграммами конструктов и предполагаемыми сайтами гликозилирования и молекулярными массами;
Фигуры 3А-3С показывают структурную схему домена для cipA;
Фигуры 4А-4С показывают структурную схему домена для предшественника целлюлосомного фиксирующего В белка [Bacteroides cellulosolvens];
Фигура 5 показывает гель с приблизительным положением, предполагаемым для С535-кодируемой Н цепи, с диаграммами конструктов и предполагаемыми молекулярными массами;
Фигура 6 показывает гель частично очищенного продукта экспрессии [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-varl-Viralgag-p40-varl-6×His] C601, котрансфектированного с соответствующей плазмидой экспрессии L цепи, с диаграммами конструктов и предполагаемыми сайтами гликозилирования и молекулярными массами;
Фигура 7 показывает различные конструкты Н цепь-антиген, временно котрансфектированные в 293F клетки с идентичными соответствующими конструктами экспрессии L цепи, с диаграммами конструктов и предполагаемыми сайтами гликозилирования и молекулярными массами;
Фигура 8 представляет собой график скрининга для определения подкласса анти-CD40 антител, которые связывают и активируют CD40;
Фигура 9 показывает анализ FACS (флуоресцентная сортировка клеток) CD8+окрашивания [горизонтальная ось] по сравнению с окрашиванием Flu М1-тетрамером [вертикальная ось], что установлено с помощью диапазона доз от 10 мкг/мл до отсутствия конъюгата анти-CD4012E12-hIgG4 Докерин - Когезин Flu Ml;
Фигура 10 показывает анализ FACS CD8+окрашивания [горизонтальная ось] по сравнению с окрашиванием Flu M1-тетрамером [вертикальная ось], что установлено с помощью диапазона доз от 10 мкг/мл до отсутствия контрольного hIgG4 Докерин - Когезин Flu Ml конъюгата;
Фигура 11 отображает протокол, используемый для анализа in vitro силы Направляющих Молекул (ТМ) анти-ДК рецептор - антиген для того, чтобы вызвать распространение антиген-специфических Т клеток в контексте культуры МНПК (мононуклеарные клетки периферической крови, или РВМС);
Фигура 12 показывает эффект направленности ДК [в МНПК] с анти-СП4012Е12 gag p17 nefgag p24 вакциной;
Фигура 13 показывает, что вакцина вызывает распространение CD4+Т клеток со специфичностями ко всем gag p24 пептидным кластерам;
Фигура 14 представляет собой данные FACS - вертикальная ось показывает процентное соотношение IFNγ-продуцирующих клеток [верхняя панель]. Нижняя панель показывает сходные результаты для CD8+Т клеток в МНПК культуре, и эти данные также показывают, что все пептидные кластеры, покрывающие gag p 17 последовательность, вызывали значительно большую продукцию IFNγ-продуцирующих Т клеток, чем непептидный контроль;
Фигура 15 показывает такие данные в графической формы, что вакцина вызывает распространение CD4+Т клеток со специфичностями к большинству ВИЧ nef пептидным кластерам - даже при самой низкой анализируемой дозе вакцины процентное соотношение IFNγ-продуцирующих CD4+T клеток было значительно большим, чем когда клетки не обрабатывались пептидами;
Фигура 16 представляет собой данные FACS, которые показывают, что вакцина вызывает распространение CD4+Т клеток со специфичностям к большинству ВИЧ nef пептидным кластерам - даже при самой низкой анализируемой дозе вакцины процентное соотношение IFNγ-продуцирующих CD4+T клеток было значительно большим, чем когда клетки не обрабатывались пептидами.
Фигура 17 показывает данные в графической форме - вертикальная ось показывает процентное соотношение IFNγ-продуцирующих клеток [верхняя панель]. Нижняя панель показывает сходные результаты для CD8+Т клеток в культуре МНПК, и эти данные также показывают, что все пептидные кластеры, покрывающие nef последовательность, вызывали значительно большую продукцию IFNγ-продуцирующих Т клеток, чем непептидный контроль;
Фигура 18 показывает план протокола для анализа способности вакцины, состоящей из анти-С040-12Е12, связанного с PSA [специфический антиген простаты], вызывать распространение из нативной популяции Т клеток PSA-специфических CD4+Т клеток, отвечающих за широкий круг PSA эпитопов;
Фигура 19 показывает, что многие PSA пептиды вызывают сильные ответы в виде IFNγ-продукции, означая, что анти-С04012Е12 и сходные анти-С040 агенты могут эффективно доставлять антиген на ДК, приводя к примированию иммунных ответов против множественных эпитопов антигена;
Фигура 20 показывает, что ДК, направляемые с помощью анти-CD40-PSA, направляемого на ДК, вызывают PSA-специфические CD8+Т клеточные ответы. IFN-ДК направляются с 1 мкг MAT слитого белка с PSA. Очищенные аналогичные CD8+Т клетки сокультивировались в течение 10 дней. Клетки окрашивали анти-CD8 и PSA (KLQCVDLHV)-тетрамером. Клетки были от HLA-A*0201 позитивного здорового донора. Результаты демонстрируют, что анти-CD40 эффективно доставляет PSA на ДК, которая, в свою очередь, вызывает распространение PSA-специфических CD8+Т клеток;
Фигура 21 схематически изображает протокол ДК направленности для анализа направляющих вакцин с анти-ДК рецептором на их способность направлять распространение антиген-специфических Т клеток, полученных от направленного захвата ДК и презентации антигенных эпитопов на их клеточной поверхности;
Фигура 22 [верхняя панель] показывает сравнение эффективности анти-CD4012E12 nef, анти-С04012Е12 gag p24 и анти-С04012Е12 gag p17 nef gag p24 вакцин [пациент Aph002];
Фигура 22 [нижняя панель] показывает сравнение эффективности анти-С04012Е12 nef, анти-С04012Е12 gag p24 и анти-СВ4012Е12 gag p17 nef gag p24 вакцин [пациент Aph002];
Фигура 23 [верхняя панель] показывает сравнение эффективности анти-CD4012E12 nef, анти-С04012Е12 gag p24 и анти-С04012Е12 gag p17 nef gag p24 вакцин [пациент AphO10];
Фигура 23 [нижняя панель] показывает сравнение эффективности анти-С04012Е12 nef, анти-С04012Е12 gag p24 и анти-С04012Е12 gag p17 nef gag p24 вакцин [пациент Aph002];
Фигура 24 представляет собой гель, который показывает анализ взаимодействия слитого белка когезин-циклин Die рекомбинантным антителом анти-ДК рецептор-докерин;
Фигура 25 показывает схему перекрывающихся пептидов их Циклина D1;
Фигура 26 показывает схему (слева) плана исследования для изучения способности комплексов анти-С040-Циклин D1 вызывать распространение in vitro Циклин D1-специфических CD4+Т клеток, и результаты FACS, полученные таким образом (справа).
Фигура 27 представляет собой анализ FACS, сходный с таковым, который описан детально на Фигуре 26, с другим нормальным донором - в этом случае анти-С040-Циклин D1 комплекс вызывал распространение IFNg позитивных пролиферирующих CD4+Т клеток, специфических для Циклин D1 пептидов Р4, Р43, и Р70;
Фигура 28 показывает схему (слева) и анализ (справа), сходный с тем, что показан на Фигуре 26, за исключением того, что использовались CD8+Т клетки;
Фигура 29 показывает сходные данные от того же донора, как на Фигуре 28, но проанализированного с отдельными пептидами из пулов пептидов.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
При создании и применении различных вариантов осуществления данного изобретения, которые обсуждаются детально ниже, следует понимать, что данное изобретение обеспечивает многие применимые идеи изобретения, которые могут осуществляться в широком разнообразии специфических контекстов. Специфические варианты осуществления, обсуждаемые здесь, являются только иллюстративными для специфических путей выполнения и применения изобретения и не ограничивают объем изобретения.
Для облегчения понимания изобретения ряд выражений определяется ниже. Выражения, определенные здесь, имеют значения, которые обычно понятны специалисту в областях техники, относящихся к данному изобретению. Не подразумевается, что выражения, такие как формы единственного числа относятся только к форме единственного числа, а включают общий класс, из которого специфический пример может использоваться для иллюстрации. Терминология в данном описании используется для описания специфических вариантов осуществления изобретения, но их использование не ограничивает изобретения, за исключением тех случаев, которые указаны в формуле изобретения.
Дендритные клетки (ДК, или DC) являются антигенпрезентирующими клетками, которые играют ключевую роль в регуляции антиген-специфического иммунитета (Mellman and Steinman 2001), (Banchereau, Briere et al. 2000), (Cella, Sallusto et al. 1997). ДК захватывают антигены, обрабатывают их до пептидов и представляют Т клеткам. Тем самым, доставка антигенов прямо к ДК представляет собой приоритетное направление для улучшенных вакцин. Одним из таких примеров является разработка основанных на ДК вакцин, использующих ex-vivo нагрузку антигеном аутологических ДК, которые затем вновь вводят пациентам (Banchereau, Schuler-Thurner et al. 2001), (Steinman and Dhodapkar 2001). Другой стратегией для улучшения эффективности вакцины является специфическая направленность на ДК антигена, конъюгированного с антителами против интернализированных ДК-специфических рецепторов. Возможность направленности ДК для вакцинации освещается в ключевых исследованиях на мышах. In vivo, направленность с анти-LOX-l MAT (моноклональное антитело, или mAb), соединенным с овалбумином (OVA), индуцировала защитный CD8+Т клеточный ответ, посредством кросс-презентации экзогенного антигена по пути МНС класса I (Delneste, Magistrelli et al. 2002). Также, OVA, конъюгированный с анти-ОЕС205 MAT в комбинации с CD40L, стимулом созревания усиливал МНС класса I-ограниченную презентацию ДК in vivo и приводил к долговременному образованию эффекторных CD8+Т клеток памяти (Bonifaz, Bonnyay et al. 2004). Оба эти исследования показали резкое щадящее дозирование (т.е., сильные иммунные ответы при очень низких дозах антигена) и показали более широкие ответы, чем в норме наблюдалось с другими типами OVA иммунизации. Недавняя работа с направленностью ВИЧ gag антигена к ДК посредством DEC205 распространила эти сведения на клинически компетентный антиген и подтвердила удерживающие направленности антигена к ДК - резкому щадящему дозированию, защитные реакции от отдельной вакцинации и распространение антиген-специфических Т клеток как в CD8, так и CD4 компартментах (Trumpfheller, Finke et al. 2006).
Данное изобретение обеспечивает образование комплекса множественных антигенов или белков (сконструированных, экспрессированных и очищенных независимо от первичного MAT), контролируемым способом с изменяющимися параметрами, с одним отдельным первичным рекомбинантным МАТ. В настоящее время, существуют способы конструирования сайт-специфических сайтов биотинилирования, что обеспечивает добавление различных белков (каждый из сконструированных отдельно присоединен к стрептавидину) к первичному МАТ. Тем не менее, данное изобретение обеспечивает добавление к первичному MAT множественных комбинаций, в неизменных эквимолярных соотношениях и положениях, отдельно сконструированных белков.
Как используется здесь, выражение "антитело или его фрагмент" используется для описания системы рекомбинантного антитела, которая была сконструирована для обеспечения целевого специфического антитела. Моноклональное антитело получали с использованием стандартных гибридомных методик, дисплея рекомбинантных антител, гуманизированных моноклональных антител и подобного. Антитело может использоваться для, например, направления (посредством одного первичного рекомбинантного антитела против интернализированного рецептора, например, рецептора дендритной клетки человека) множественных антигенов и/или антигенов, и активации цитокином дендритных клеток (ДК).
2
Антиген-связывающая часть антитела включает один или более фрагментов (т.е., его фрагментов), которые могут включать один или более вариабельных доменов, один или более вариабельных и первый константный домен, Fab фрагмент, Fab' фрагмент, F(ab) фрагмент, и Fv фрагмент, и Fabc фрагмент и/или Fab фрагмент с частями Fc домена, к которым добавляются когнантные модульные связывающие части к аминокислотной последовательности и/или связи. Антитело для использования может быть любого изотипа или класса, подкласса или из любого источника (животное и/или рекомбинантное). В некоторых аспектах антигенсвязывающие сайты получают из нечеловеческих моноклональных антител, которые пересаживают, используя методики, известные из уровня техники, на остов антитела человека, тем самым "гуманизируя" антитело.
Выражение "антиген", как используется здесь, относится к молекуле, которая может вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ у реципиента антигена. Антиген может использоваться в двух различных контекстах в данном изобретении: как мишень для антитела или другого домена распознавания антигена, сконструированного или рекомбинантного антитела (rAb) или как молекула, которая переносится к и/или внутрь клетки или направляется с помощью aAb как конъюгат (связанный ковалентно или нековалентно) или слитый белок. Антиген обычно представляет собой агент, который вызывает заболевание, для которого вакцинация будет эффективным лечением. Когда антиген представлен на МНС, пептид часто составляет около 8 - около 25 аминокислот. Антигены включают любой тип биологической молекулы, включая, например, простые промежуточные метаболиты, сахара, липиды и гормоны, а также макромолекулы, такие как сложные углеводороды, фосфолипиды, нуклеиновые кислоты и белки. Общие категории антигенов включают, но не ограничиваются, следующим: вирусные антигены, бактериальные антигены, грибковые антигены, протозойные и другие паразитические антигены, опухолевые антигены, антигены, вовлеченные в аутоиммунное заболевание, аллергию и отторжение трансплантата и другие разнообразные антигены. Данное изобретение использует антигены от вирусов, которые имеют улучшенные характеристики (например, пониженный протеолиз, усиленную секрецию, усиленную экспрессию или стабильность) и которые направляются на антигенпрезентирующие клетки, используя антитело или его фрагменты.
Примеры вирусных антигенов включают, но не ограничиваются, следующим, например, ретровирусные антигены, такие как ретровирусные антигены из антигенов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такие как генные продукты gag, pol, и env генов, Nef белок, обратная транскриптаза и другие ВИЧ компоненты; вирусные антигены гепатита, такие как S, М и L белки вируса гепатита В, пре-S антиген вируса гепатита В и других гепатитов, например гепатита А, В, и С, вирусные компоненты, такие как вирусная РНК гепатита С; вирусные антигены гриппа, такие как гемагглютинин и нейраминидаза и другие вирусные компоненты гриппа; вирусные антигены кори, такие как слитый белок вируса кори и другие вирусные компоненты кори; вирусные антигены краснухи, такие как белки Е1 и Е2 и другие вирусные компоненты краснухи; ротавирусные антигены, такие как VP7sc и другие ротавирусные компоненты; цитомегаловирусные антигены, такие как гликопротеин В оболочки и другие цитомегаловирусные антигенные компоненты; респираторные синцитиальные вирусные антигены, такие как RSV слитый белок, М2 белок и другие респираторные синцитиальные вирусные антигенные компоненты; вирусные антигены простого герпеса, такие как немедленно-ранние белки, гликопротеин D, и другие вирусные антигенные компоненты простого герпеса; вирусные антигены ветряной оспы, такие как gpI, gpII и другие вирусные антигенные компоненты ветряной оспы; вирусные антигены японского энцефалита, такие как белки Е, М-Е, M-E-NS1, NS1, NS1-NS2A, 80% Е и другие вирусные антигенные компоненты японского энцефалита; вирусные антигены бешенства, такие как гликопротеин вируса бешенства, нуклеопротеин вируса бешенства и другие вирусные антигенные компоненты бешенства. Смотри Fundamental Virology, Второе Издание, ред. Fields, В.N. и Knipe, D. M. (Raven Press, Нью-Йорк, 1991) для дополнительных примеров вирусных антигенов.
Антигенные мишени, которые могут быть доставлены с использованием rAB-ДК/ДК-антиген вакцин данного изобретения, включают гены, кодирующие антигены, такие как вирусные антигены, бактериальные антигены, грибковые антигены или паразитические антигены. Вирусы включают пикорнавирус, коронавирус, тогавирус, флавирвирус, рабдовирус, парамиксовирус, ортомиксовирус, буньявирус, аренавирус, реовирус, ретровирус, папиломавирус, парвовирус, герпесвирус, поксвирус, гепаднавирус и губчатый вирус. Другие вирусные мишени включают грипп, вирус простого герпеса 1 и 2, корь, лихорадку денге, натуральную оспу, полиомиелит или ВИЧ. Патогены включают следующее: трипаносомы, ленточные черви, круглые черви, гельминты, малярию. Опухолевые маркеры, такие как фетальный антиген или специфический антиген простаты, могут быть направлены таким образом. Другие примеры включают: ВИЧ env белки и поверхностный антиген гепатита В. Введение вектора согласно данному изобретению для целей вакцинации будет требовать того, чтобы связанные с вектором антигены были достаточно неиммуногенными, чтобы обеспечить длительную экспрессию трансгена, для которого желателен сильный иммунный ответ. В некоторых случаях, вакцинация особи может понадобиться лишь изредка, например раз в год или раз в два года, и обеспечивает длительную иммунологическую защиту против инфекционного агента. Специфические примеры организмов, аллергенов и нуклеиновых и аминокислотных последовательностей для использования в векторах и, в конечном счете, в качестве антигенов по данному изобретению, могут быть обнаружены в Патенте США №6541011, соответствующие части включены в данное описание посредством ссылки, в частности, таблицы, которые сопоставляют организмы и специфические последовательности, которые могут быть использованы по данному изобретению.
Антигены на поверхности иммунных клеток, например антигенпрезентирующих клеток или дендритных клеток, которые могут направляться с использованием rAb данного изобретения, будут, в целом, выбираться на основании ряда факторов, включая: сходство интернализации, уровень специфичности иммунной клетки, тип направленной иммунной клетки, уровень зрелости иммунной клетки и/или активации и подобное. Примеры маркеров клеточной поверхности для дендритных клеток включают, но не ограничиваются следующим, МНС класса I, MHC класса II, В7-2, CD18, CD29, CD31, CD43, CD44, CD45, CD54, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR и/или ASPGR и подобное; тогда как в некоторых случаях имеет место отсутствие CD2, CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD 19, CD20, CD56 и/или CD57. Примеры маркеров клеточной поверхности для антигенпрезентирующих клеток включают, но не ограничиваются следующим: MHC класса I, MHC класса II, CD40, CD45, В7-1, В7-2, IFN-γ рецептор и IL-2 рецептор, ICAM-1, Fcγ рецептор, LOX-1 или ASPGR. Примеры маркеров клеточной поверхности для Т клеток включают, но не ограничиваются следующим: CD3, CD4, CD8, CD 14, CD20, CD11b, CD16, CD45 и HLA-DR.
Как используется здесь, выражение "эпитоп(ы)" относится к пептидному или белковому антигену, который включает первичную, вторичную или третичную структуру, подобную эпитопу, расположенному внутри любого из ряда патогенных полипептидов, кодируемых патогенной ДНК или РНК. Уровень сходства будет обычно до такой степени, что моноклональные или поликлональные антитела, направленные против таких полипептидов, будут также связываться с, реагировать с или другим образом распознавать пептидный или белковый антиген. Различные способы иммуно-анализа могут использоваться совместно с такими антителами, такие как, например, вестерн-блоттинг, ELISA (фермент-связанный иммуносорбентный анализ), RIA (радиоиммунный анализ) и подобное, из которых все являются известными специалисту в данной области техники. Определение патогенных эпитопов, и/или их функциональных эквивалентов, пригодных для использования в вакцинах, является частью данного изобретения. После выделения и определения, можно без труда получить функциональные эквиваленты. Например, можно использовать способы Норр, как изложено в Патенте США №4554101, включенном в данное описание посредством ссылки, который сообщает об определении и получении эпитопов из аминокислотных последовательностей на основе гидрофильности. Способы, описанные в некоторых других статьях и основанные на них компьютерные программы, могут также использоваться для определения эпитопных коровых последовательностей (см., например, Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al, 1988; Патент США №4554101). Аминокислотная последовательность этих "эпитопных коровых последовательностей" может затем без труда встраиваться в пептиды, либо через применение синтеза пептида, либо рекомбинантной технологией.
2
Как используется здесь, выражение "моноклональные антитело" относится к композиции антител, которая имеет гомогенную популяцию антител. Выражение не ограничивается в отношении видов или источника антитела, а также не подразумевается, что ограничивается способом, которым оно произведено. Выражение включает целые иммуноглобулины, а также фрагменты, такие как Fab, Р(ab'), Fv, и другие фрагменты, которые проявляют иммунологические связывающие свойства молекулы родительского моноклонального антитела.
Как используется здесь, выражение "антиген-связывающий сайт" или "связывающая часть" относится к части молекулы иммуноглобулина, которая принимает участие в связывании антигена. Антигенсвязывающий сайт образован аминокислотными остатками N-терминальных вариабельных ("V") областей тяжелых ("Н") и легких ("L") цепей. Три высокодивергентных участка в V областях тяжелых и легких цепей называются "гипервариабельные области", которые включены между более консервативными фланкирующими участками, известными как "каркасные области" (FR). Как используется здесь, выражение "FR" относится к аминокислотным последовательностям, которые обнаруживаются в природе между и прилегающе к гипервариабельным областями в иммуноглобулинах. В молекуле антитела, три гипервариабельные области легкой цепи и три гипервариабельные области тяжелой цепи расположены по отношению друг к другу в трехмерном пространстве для образования антигенсвязывающей поверхности. Антигенсвязывающая поверхность является комплементарной трехмерной поверхности связанного антигена, и три гипервариабельные области каждой из тяжелой и легкой цепей называются "определяющие комплементарность области", или "CDR".
Как используется здесь, выражение "гуманизированное" антитело относится к таким молекулам, включающим антиген-связывающий сайт, полученным из нечеловеческого иммуноглобулина, которые были описаны, включая химерные антитела, имеющие V области грызуна и их связанные CDR, слитые с человеческими константными доменами, CDR грызуна, пересаженные человеку, дополняя FR до слияния с приемлемым константным доменом антитела человека, и CDR грызуна, дополненные рекомбинантно покрытыми FR грызуна. Эти "гуманизированные" молекулы разработаны для минимизации нежелательного иммунологического ответа по отношению к молекулам антител грызуна против человека, который ограничивает длительность и эффективность терапевтических применений этих частей у людей-реципиентов.
Препарат композиций вакцины, которые включают нуклеиновые кислоты, которые кодируют антигены изобретения в качестве активного ингредиента, может быть получены в виде вводимых с помощью инъекции, либо как жидкие растворы, либо суспензии; твердые формы, пригодные для раствора в, или суспензии в жидкости до инфицирования также могут быть получены. Препарат может быть эмульсифицирован, инкапсулирован в липосомы. Активные иммуногенные ингредиенты часто смешиваются с носителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом.
Выражение "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю, который не вызывает аллергическую реакцию или другой нежелательный эффект у субъектов, которым он вводится. Соответствующие фармацевтически приемлемые носители включают, например, один или более из следующего: вода, солевой раствор, солевой раствор с фосфатным буфером, декстроза, глицерол, этанол или подобное и их комбинацию. Кроме того, при необходимости, вакцина может содержать незначительные количества вспомогательных материалов, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН буферные агенты и/или адъюванты, которые усиливают эффективность вакцины. Примеры вспомогательных веществ, которые могут быть эффективными, включают, но не ограничиваются следующим: гидроксид алюминия, N-ацетил-мурамил-L-треонил-О-изоглютамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-О-изоглютамин, МТР-РЕ и RIBI, который содержит три компонента, экстрагированных из бактерий, монофосфориловый липид А, трегалоза димиколат и скелет клеточной стенки (MPL+TDM+CWS) в эмульсии 2% сквален/Твин 80. Другие примеры адъювантов включают DDA (диметилдиоктадециламмония бромид), полные и неполные адъюванты Фрейнда и QuilA. Кроме того, иммуномодулирующие вещества, такие как лимфокины (например, IFN-γ, IL-2 и IL-12) или синтетические IFN-γ индуцирующие факторы, такие как поли 1:С, могут использоваться в комбинации с адъювантами, описанными здесь.
Фармацевтические продукты, которые могут включать оголенный полинуклеотид с одной или множественными копиями специфических нуклеотидных последовательностей, которые связываются со специфическими ДНК-связывающими сайтами аполипопротеинов, присутствуют на липопротеинах плазмы, как описано в данном изобретении. Полинуклеотид может кодировать биологически активный пептид, антисенсовую РНК или рибозим и будет обеспечиваться в физиологически приемлемой форме, пригодной для введения. Другой фармацевтический продукт, который может брать начало из данного изобретения, может включать высокоочищенную липопротеиновую фракцию плазмы, выделенную согласно методике, описанной здесь либо из крови пациента, либо из другого источника, и полинуклеотид, содержащий одну или множественные копии специфических нуклеотидных последовательностей, которые связываются со специфическими ДНК-связывающими сайтами аполипопротеинов, присутствующих на липопротеинах плазмы, предварительно связанных с очищенной липопротеиновой фракцией в физиологически приемлемой, пригодной для введения форме.
Еще один фармацевтический продукт может включать высокоочищенную липопротеиновую фракцию плазмы, которая содержит рекомбинантные аполипопротеиновые фрагменты, содержащие одну или множественные копии специфических ДНК-связывающих мотивов, предварительно связанные с полинуклеотидом, содержащим одну или множественные копии специфических нуклеотидных последовательностей, в физиологически приемлемой, пригодной для введения форме. Еще один фармацевтический продукт может включать высокоочищенную липопротеиновую фракцию плазмы, которая содержит рекомбинантные аполипопротеиновые фрагменты, содержащие одну или множественные копии специфических ДНК-связывающих мотивов, предварительно связанные с полинуклеотидом, содержащим одну или множественные копии специфических нуклеотидных последовательностей, в физиологически приемлемой, пригодной для введения форме.
Доза для введения зависит в большой степени от веса тела и физического состояния субъекта, который подлежит лечению, а также пути введения и частоты лечения. Фармацевтическая композиция, которая включает оголенный полинуклеотид, предварительно связанный с высокоочищенной липопротеиновой фракцией, может быть введен в количествах в диапазоне от 1 мкг до 1 мг полинуклеотида и 1 мкг до 100 мг белка.
Введение вакцины пациенту будет следовать общим протоколам для введения химиотерапевтических агентов, принимая во внимание токсичность, если имеет место, вектора. Ожидается, что циклы лечения будут повторяться при необходимости. Также предполагается, что различные стандартные терапии, а также хирургическое вмешательство, может применяться в комбинации с описанной генной терапией.
Если подразумевается клиническое применение генной терапии, будет необходимо приготовить комплекс в виде фармацевтической композиции, соответствующей предполагаемому применению. В общем, это будет содержать в себе приготовление фармацевтической композиции, которая является, по сути, свободной от пирогенов, а также любых других примесей, которые могут быть вредны для людей или животных. Также, в общем, будет желательным использовать соответствующие соли и буферы для обеспечения стабильности комплекса и обеспечения захвата комплекса клетками-мишенями.
Водные композиции данного изобретения могут включать эффективное количество соединения, растворенного или диспергированного в фармацевтически приемлемом носителе или водной среде. Такие композиции могут также называться инокулятами. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда любые общепринятые среды или агент является несовместимым с активным ингредиентом, предусматривается его использование в терапевтических композициях. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции. Композиции данного изобретения могут включать классические фармацевтические препараты. Дисперсии также могут быть приготовлены в глицероле, жидких полиэтиленгликолях и их смесях и в маслах. При обычных условиях хранения и применения, эти препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Стадии заболевания. В зависимости от конкретного заболевания, подлежащего лечению, введение терапевтических композиций согласно данному изобретению будет осуществляться посредством любого общепринятого пути, поскольку ткань-мишень доступна через этот путь для того, чтобы максимизировать доставку антигена на сайт для максимального (или в некоторых случаях минимального) иммунного ответа. Введение будет главным образом осуществляться путем ортотопической, внутрикожной, подкожной, внутримышечной, интраперитонеальной или внутривенной инъекции. Другие области для доставки включают: оральную, назальную, буккальную, ректальную, вагинальную или местную. Местное введение будет особенно предпочтительным для лечения раков кожи. Такие композиции будут в норме вводится как фармацевтически приемлемые композиции, которые включают физиологически приемлемые носители, буферы или другие вспомогательные вещества.
Вакцина или лечебные композиции изобретения могут быть введены парентерально, путем инъекции, например, либо подкожно, либо внутримышечно. Дополнительные составы, которые приемлемы для других способом введения, включают суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные составы или составы, приемлемые для распыления в виде аэрозолей. В случае пероральных составов, манипуляция с подклассами Т-клеток использует адъюванты, упаковку антигена или добавление отдельных цитокинов к различному составу, что приводит к улучшенным пероральным вакцинам с оптимизированными иммунными ответами. Для суппозиториев, традиционные связующие вещества и носители могут включать, например, полиалкиленгликоли или триглицериды;
такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в диапазоне 0,5%-10%, предпочтительно 1%-2%. Пероральные составы включают такие обычно применяемые вспомогательные вещества, как, например, фармацевтические квалификации маннитола, лактозы, крахмала стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и подобного. Эти композиции принимают форму растворов, суспензий, таблеток, пилюлей, капсул, составов замедленного высвобождения или порошков и содержат 10%-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие антиген изобретения, могут быть составлены в вакцину или лечебные композиции в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными аминогруппами пептида) и которые образованы с органическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или с органическими кислотами, такие как уксусная, щавелевая, винная, малеиновая и подобное. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут также быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидрид натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, 2-этиламиноэтанол, гистидин,прокаин и подобное.
Вакцина или лечебные композиции вводятся способом, совместимым с дозированным составом, и в таком количестве, которое будет профилактически и/или терапевтически эффективным. Количество, подлежащее введению, зависит от субъекта, подлежащего лечению, включая, например, способность иммунной системы субъекта синтезировать антитела, и необходимой степени защиты или лечения. Приемлемые диапазоны дозировок составляют порядка нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на вакцинацию с диапазоном от около 0,1 мг до 1000 мг, например, в диапазоне от около 1 мг до 300 мг, и предпочтительно в диапазоне от около 10 мг до 50 мг. Приемлемые режимы начального введения и вторичных вакцинаций также являются изменчивыми, но характеризуются начальным введением с последующими дополнительными инокуляциями или другими введениями. Точные количества активного ингредиента, необходимые для введения, зависят от решения практикующего врача и могут быть специфичными для каждого субъекта. Специалистам в данной области техники понятно, что терапевтически эффективное количество молекулы нуклеиновой кислоты или слитых полипептидов по данному изобретению будет зависеть, среди прочего, от схемы введения, вводимой унифицированной дозы антигена, от того, вводится ли молекула нуклеиновой кислоты или слитый полипептид в комбинации с другими терапевтическими агентами, иммунного статуса и здоровья реципиента и терапевтической активности конкретной молекулы нуклеиновой кислоты или слитого полипептида.
Композиции могут быть введены в режиме однократных доз или в режиме многократных доз. Режим многократных доз представляет собой режим, при котором первичный курс вакцинации может включать, например, 1-10 отдельных доз, с последующими другими дозами, которые вводят с последующими промежутками времени, необходимыми для поддержания и/или усиления иммунного ответа, например, через 1-4 месяца для второй дозы, и если необходимо, последующей дозой(ами) через нескольких месяцев. Периодические вторичные вакцинации с интервалами в 1-5 лет, обычно 3 года, являются желательными для поддержания желательных уровней защитного иммунитета. Курс иммунизации может сопровождаться in vitro анализами пролиферации лимфоцитов периферической крови (ЛПК, или PBL), кокультивированных с ESAT6 или ST-CF, и измерением уровней IFN-γ, высвободившегося из примированных лимфоцитов. Анализы могут быть проведены с использованием общепринятых меток, таких как радионуклеиды, ферменты, флуоресцентные метки и подобного. Эти методики известны специалисту в данной области техники и могут быть обнаружены в Патентах США №№3791932, 4174384 и 3949064, соответствующие части которых включены сюда посредством ссылки.
Вакцина данного изобретения может обеспечиваться в одной или более "унифицированных дозах" в зависимости от того, используются ли векторы нуклеиновой кислоты, конечные очищенные белки, или используется конечная форма вакцины. Унифицированная доза определяется как содержащая предварительно определенное количество терапевтической композиции, рассчитанное для получения желательных ответов в сочетании с ее введением, т.е., приемлемым путем и схемой лечения. Количество, подлежащее введению, и конкретный путь и состав, определяются специалистами в области клинической медицины. Субъекта, подлежащего лечению, можно также оценить, в частности, по состоянию иммунной системы субъекта и необходимой защите. Нет необходимости вводить унифицированную дозу в виде отдельной инъекции, но она может включать продолжительную инфузию в течение определенного периода времени. Унифицированная доза данного изобретения может условно быть описана в выражениях ДНК/кг (или белок/кг) массы тела, с диапазонами для введения от около 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,5, 1, 10, 50, 100, 1000 или более мг/ДНК или белок/кг массы тела. Аналогично, доставляемое количество rAb-ДК/ДК-антиген вакцины может варьировать от около 0,2 до около 8,0 мг/кг массы тела. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления, 0,4 мг, 0,5 мг, 0,8 мг, 1,0 мг, 1,5 мг, 2,0 мг, 2,5 мг, 3,0 мг, 4,0 мг, 5,0 мг, 5,5 мг, 6,0 мг, 6,5 мг, 7,0 мг и 7,5 мг вакцины может быть доставлено особи in vivo. Дозировка вакцины, подлежащая введению, зависит в большой степени от веса и физического состояния субъекта, подлежащего лечению, а также пути введения и частоты лечения. Фармацевтическая композиция, которая включает оголенный полинуклеотид, предварительно соединенный с липосомой или вирусным вектором доставки, может быть введена в количествах, лежащих в диапазоне от 1 мкг до 1 мг полинуклеотида до 1 мкг - 100 мг белка. Таким образом, конкретные композиции могут включать от около 1 мкг, 5 мкг, 10 мкг, 20 мкг, 30 мкг, 40 мкг, 50 мкг, 60 мкг, 70 мкг, 80 мкг, 100 мкг, 150 мкг, 200 мкг, 250 мкг, 500 мкг, 600 мкг, 700 мкг, 800 мкг, 900 мкг или 1000 мкг полинуклеотида или белка, который связан независимо в 1 мкг, 5 мкг, 10 мкг, 20 мкг, 3.0 мкг, 40 мкг 50 мкг, 60 мкг, 70 мкг, 80 мкг, 100 мкг, 150 мкг, 200 мкг, 250 мкг, 500 мкг, 600 мкг, 700 мкг, 800 мкг, 900 мкг, 1 мг, 1,5 мг, 5 мг, 10 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 50 мг, 60 мг, 70 мг, 80 мг, 90 мг или 100 мг вектора.
Данное изобретение может также использоваться для создания модульного rAb носителя, который является, например, рекомбинантным гуманизированным MAT (направленным на специфический рецептор дендритной клетки человека) в комплексе с защитными антигенами из рицина, сибиреязвенного токсина и энтеротоксина стафилококка В. Потенциальным рынком этого объекта является вакцинация всего военного персонала и хранящаяся вакцина, находящаяся в запасе для введения в центрах с большим населением в ответ на любой биологической опасности, связанной с этими агентами. Данное изобретение имеет широкое применение для разработки вакцин в общем, как для применения у людей, так и животных. Целевые отрасли промышленности включают фармацевтические и биотехнологические отрасли промышленности.
Данное изобретение включает композиции и способы, включая вакцины, которые специфически направляют (доставляют) антигены на антигенпрезентирующие клетки (АПК, или АРС) с целью вызвать сильные и широкие иммунные ответы, направленные против антигена. Эти композиции индуцируют защитные или терапевтические иммунные ответы против агента (патогена или рака), от которого происходит антиген. Дополнительно изобретение создает агенты, которые являются непосредственно, или вместе с другими агентами, терапевтическими посредством их специфического взаимодействия с антиген-презентирующими клетками.
Gag-Nef вакцина. Последовательность, показанная ниже, представляет собой слитый белок тяжелая цепь (Н) - ВИЧ gag p24, где р24 область [выделенная курсивом] связана с С-концом hIgG4H через короткий спейсер [жирным], полученным из гибкой петли DR альфа предшественника главного комплекса гистосовместимости человека, класса II. Подчеркнутые AS остатки кодируются рестрикционными сайтами, используемыми для целей конструкции [в этом случае Nhe I]. Этот тип слитого белка антитело-р24 был описан в научной литературе [например, Antigen targeting to dendritic cells elicits long-lived Т cell help for antibody responses (2006) Boscardin et al., JEM, Том 203, Выпуск 3, 599-606].
Улучшенные антитело-антиген линкерные последовательности. [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-Viralgag] C241 представляет собой:
Фигура 1, ряды 1 и 2 показывают анализ электрофореза ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси синим очищенных с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А слитых белков gag р24-антитело, полученных из CHO-S или 293F клеток, временно трансфектированных с векторами экспрессии, кодирующими Н цепь - gag p24 слияние [кодирующие, например, С241 выше с предшествующей нативной сигнальной последовательностью] и соответствующей плазмидой экспрессии легкой цепи [L]. Типично для продукции секретируемого белка, культура котрансфекции обрабатывается до нескольких дней перед отбором культурального супернатанта для последующего очищения. Полноразмерная [~77 кДа] слитая цепь Н цепь- gag p24 обозначена верхней стрелкой. Также показан расщепленный продукт Н цепи [нижняя стрелка], который мигрирует немного более медленно, чем Н цепь, не слитая с другим белком [показана на ряде 4 как полоса ~50 кДа]. Эти результаты предполагают, что линкерная последовательность Н цепь - p24 является чувствительной к протеолитическому расщеплению, таким образом, подвергая опасности целостность полученного секретируемого слитого белка антитело-антиген.
В отличие от этого, слитый белок антитело - Грипп НА 1-1 может секретироваться и восстанавливаться без существенного наблюдаемого расщепления между С- концом Н цепи и НА1-1 доменом. [mAnti-LOX-115C4H-LV-hIgG4H-C-Flex-FluHA1-1-6×His] C114 представляет собой:
В этом случае, короткий линкер [жирным], полученный из предшественника целлюлосомного фиксирующего В белка [CipA из Clostridium thermocellum ATCC 27405], был вставлен между С-концом Н цепи [посредством соединяющей последовательности, показанной подчеркиванием] и грипп НА1-1 доменом [выделен курсивом]. Не наблюдалось явного протеолитического расщепления между С-концом Н цепи и НА1-1 доменом [Фигура 1, ряд 3].
Фигура 2, ряд 3 показывает анализ электрофореза ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси синим очищенного с помощью аффинной хроматографии с использованием белка А слитого белка gag р24 -антитело, полученного из CHO-S или 293F клеток, временно трансфектированных с векторами экспрессии, кодирующими слияние Н цепь - gag р24, с линкером Н цепь - gag р24, полученным из предшественника целлюлосомного фиксирующего В белка [Bacteroides cellulosolvens] и соответствующей плазмидой экспрессии легкой [L] цепи.
[mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-var1-Viralgag-var1-6×His] C560 показан ниже [подчеркнутые остатки из соединяющих последовательностей рестрикционного сайта и жирным выделены остатки гибкого линкера]:
Вышеописанный слитый белок антитело-gag р24 получают интактным без очевидного расщепления между С-концом Н цепи и gag р24 доменом. Таким образом, QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP (SEQ ID NO.:4) линкерная последовательность является наилучшей для целей продукции gag р24 вакцины.
Предпочтительные линкерные последовательности, полученные из фиксирующих белков и родственных белков. Последовательность ниже представляет собой CipA - фиксирующий белок из бактерии, разлагающей целлюлозу. Этот белок содержит множественные когезиновые домены, рассеянные в линкерных последовательностях [выделены курсивом], по-видимому, образованные, чтобы быть гибким - отражая роль этого белка: (i) закрепляться в целлюлозной матрице посредством углеводород-связывающего домена [СВМ-3, фигура 3]; и (ii) связывать разлагающие целлюлозу ферменты, такие как эндоглюканаза D посредством фермент-связывающих докериновых доменов.
>gi|2506991|sp|Q06851|CIPA_CLOTM Предшественник целлюлосомного фиксирующего А белка (Целлюлосомный гликопротеин S1/SL) (интегрирующий целлюлозу белок А) (Когезин) [Clostridium thermocellum ATCC 27405]. Жирные остатки представляют собой линкерную последовательность, используемую в вышеописанном С114 конструкте.
Фигуры 3А-3С показывают структурную схему домена для cipA. Фигура 3А показывает структурную схему домена, которая представляет собой NetOGlyc 1.0 Server и NetNGlyc 1.0 Server анализы для cipA, показывающие в высокой степени прогнозированные 0-связанные (Фигура 3С) и N-связанные сайты гликозилирования (Фигура 3С). В частности, 0-связанные сайты, главным образом, находятся внутри линкерных последовательностей.
Другой пример, сходный с cipA А, показан ниже. Линкерная последовательность, показанная выше в С560 [QTPTNTISVTPTNNSTPTNTSTPKPNP] (SEQ ID NO.: 6), получена из этой последовательности [показана ниже жирным курсивом, за исключением замещения N на Т] и содержит два потенциальных N-связанных сайта гликозилирования [подчеркнуты]. Другие линкерные последовательности, используемые с конструктах, описанных ниже и/или в описании ВИЧ пептида, показаны жирным.
>gi|50656899[gb|AAT79550.1|предшественник целлюлосомного фиксирующего В белка [Bacteroides cellulosolvens]
Фигуры 4А-4С показывает структурную схему домена предшественника целлюлосомного фиксирующего В белка [Bacteroides cellulosolvens]. Фигура 4А показывает структурную схему домена, которая представляет собой NetOGlyc 1.0 Server и NetNGlyc 1.0 Server анализы для cipA, показывающие в высокой степени прогнозированные 0-связанные (Фигура 4В) и N-связанные сайты гликозилирования (ФИГУРА 4С). В частности, О-связанные сайты, главным образом, находятся внутри линкерных последовательностей.
Данное изобретение включает композиции и способы для применения межструктурных доменных линкерных последовательностей, полученных из разлагающих целлюлозу организмов, что является предпочтительным, междоменных линкерных последовательностей в белковой инженерии - особенно те, которые имеют в высокой степени прогнозированные сайты гликозилирования для применения в инженерии белков, продуцируемых в эукариотических хозяинах экспрессии. Было обнаружено, что среди улучшенных свойств, полученных с использованием этих последовательностей, находятся: i) присущая гибкость, тем самым облегчая отделение соединенных доменов, которая может в большой степени помочь правильному фолдингу соединенных доменов в ходе синтеза и поддержанию свободного доступа путем соответствия В клеточных рецепторов конформационным эпитопам антигена; ii) гликозилирование, тем самым помогая секреции и растворимости продукта - слитого белка, и экранируя линкерные последовательности от протеаз.
Удаление сайтов протеолитического расщепления с gag последовательностью. Фигура 5, ряд 1 [ниже] показывает очищенный продукт экспрессии [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Viralgag-p40] C535, котрансфектированного с соответствующей плазмидой экспрессии L цепи. Зрелая последовательность Н цепи С535 [gag остатки выделены курсивом и соединяющие остатки, кодируемые рестрикционным сайтом подчеркнуты] представляет собой:
Верхняя стрелка на Фигуре 5 показывает приблизительное положение, предполагаемое для С 5 35-кодируемой В цепи - только малая часть продукта имеет полосу в этом положении. Основная масса продукта, обозначенная нижней стрелкой, представляет собой более короткую Н цепь размером, который предполагает существование сайта, чувствительного к протеазе, примерно в границе gag p17-p24.
Фигура 6 ряд 3 [ниже] показывает частично очищенный продукт экспрессии [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-var1-Viralgag-p40-var1-6×His] C601, котрансфектированного с соответствующей плазмидой экспрессии L цепи. Зрелая последовательность Н цепи С535 [gag остатки выделены курсивом, соединенные остатки, кодируемые рестрикционным сайтом подчеркнуты, и остатки гибкого линкера выделены жирным шрифтом] представляет собой:
Вышеописанная gag последовательность имеет замену последовательности ККК на VDESF [показаны выше подчеркнутыми], удаляя потенциальный сайт, чувствительный к протеазе по направлению к С-концу gag p17 и Фигура 6 показывает, что эта альтернативная форма производится с Н цепью, которая является в большой степени неполноценной [полосы более низкой молекулярной массы в ряду 3 являются 'фоновыми примесями' - см. Фигуру 7].
В одном специфическом варианте осуществления данное изобретение включает варианты gag р40 [p17+р24] с заменами около ККК последовательности, обозначенной выше, что предотвращает протеолитическое расщепление секретируемых соединенных gag p17+р24 белков.
Антитела, соединенные с предпочтительным ВИЧ nef антигеном. Данное изобретение включает, но не ограничивается этим, одну предпочтительную вакцину, направляющую ВИЧ антигены на дендритные клетки, которая будет иметь максимальное количество gag антигена, соединенного с максимальным количеством nef антигена. Фигура 7, ряд 4 [ниже] показывает частично очищенный продукт экспрессии [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-vl-ViralNef] С757, котрансфектированный с соответствующей плазмидой экспрессии L цепи. Зрелая последовательность Н цепи С757 [nef Consensus Clade В остатки выделены курсивом, соединяющие остатки, кодируемые рестрикционным сайтом, подчеркнуты, и гибкий линкер выделен жирным шрифтом] представляет собой:
Анализ продукта антитело-антиген, представленный на Фигуре 7, показывает различные конструкты Н цепь-антиген, временно котрансфектированные в 293F клетки с идентичными соответствующими конструктами экспрессии L цепи. Каждый ряд представляет продукт из 5 мл супернатанта клеточной трансфекции [продукция 3 дней], который связывали с избытком гранул Белка А, отмывали 2х с PBS (фосфатно-солевой буфер)+1М NaCl, элюировали с 20 мМ НСl, высушенный, растворяли в буфере для образца восстанавливающего ДСН-ПА, и анализировали с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях с окрашиванием Кумасси синим. Эта методика позволяет не только оценить целостность предполагаемого продукта Н цепи, но обеспечивает оценку относительных уровней продукции продуктов антитело-антиген. Вопрос об относительном уровне продукции является очень важным, так как стоимости продукции вакцины будут сильно зависеть от выхода интактной секретируемой вакцины в широкомасштабных системах ферментации клеток млекопитающих. Поскольку уровни экспрессии могут быть в значительной степени повышенными посредством альтернативных систем векторов - особенно, несущих ДНК элементы, способствуя усиленной транскрипции, будучи интегрированными в геном клетки млекопитающего и селекции трансфектированных клеточных клонов с высокой продукцией, то эти подходы, в значительной степени, опосредуются благодаря начальному этапу с конструктами, которые экспрессируют интактный секретируемый продукт с достаточным выходом без применения этих дополнительных подходов. Огромное колебание в продукции секретируемых слияний антитело-антиген из трансфектированных клеток млекопитающих было хорошо освещено в предыдущих патентных заявках [когезин-докерин и DCIR], и эти данные показывают, что уровень продукции, главным образом, независим от переносчика антитела [вариабельных и константных областей], но скорее является свойством, присущим самому антигену. Таким образом. Фигура 7, ряд 4 показывает очень эффективную продукцию [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-ViralNef], показывая, что эта конфигурация антитела, слитого с nef Consensus Clade В антигеном, соединенным посредством QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP, является очень благоприятной.
Антитела, соединенные с определенными предпочтительными ВИЧ gag и nef антигенами. [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Viralgag-p40-ViralNef] С758 имеет nef Consensus Clade В антиген, прикрепленный непосредственно вблизи к вариантному gag p40 антигену, описанному выше [соединяющие остатки подчеркнуты и последовательность гибкого линкера выделена жирным]:
Фигура 7, ряд 5 показывает, что эта плазмида экспрессии направляет синтез этого слияния Н цепь-антиген, будучи котрансфектированным с соответствующей L цепью, экспрессируется очень слабо как секретируемый продукт. Ряды 6-9 показывают секретируемые продукты из 293F клеток, котрансфектированные с плазмидой экспрессии L цепи и конструктами экспрессии Н цепь-gag, имеющими вставки кодирующей последовательности nef Consensus Clade В антигена, связанные с проксимальными и/или дистальными последовательностями гибкого линкера. Добавление последовательностей гибкого линкера облегчает секрецию интактной вакцины слияния антитело-gag/nef. Один предпочтительный конструкт для продукции самых высоких уровней вакцины представляет собой [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-p17-f3-nef-f4-p24-6×His] C791 [см. ряд 9]. Так как относительные уровни слияний антитело-антиген в таких системах экспрессии млекопитающих, главным образом, не зависимы от V-области антитела, то вакцины антитело-gag/nef антиген, направляющие различные ДК рецепторы, должны иметь сходное преимущество в продукции, если [-Flex-v1-p17-f3-nef-f4-p24-6×His] прикреплена к их С-концу Н цепи.
Ряд 6, Н цепь представляет собой [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Viralgag-p40-f4-nef] C767 [соединяющие остатки подчеркнуты, остатки гибкого линкера выделены жирным шрифтом, и остатки антигена выделены курсивом]:
Ряд 7, Н цепь представляет собой [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-p17-nef-f4-p24-6×His] C790 C767 [соединяющие остатки подчеркнуты, остатки гибкого линкера выделены жирным шрифтом, и остатки антигена выделены курсивом]:
Ряд 8, Н цепь представляет собой [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-p17-D-nef-p24-6×His] C797 С767 [соединяющие остатки подчеркнуты, остатки гибкого линкера выделены жирным шрифтом, и остатки антигена выделены курсивом]:
Ряд 9, Н цепь представляет собой [mAnti-DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-p17-f3-nef-f4-p24-6×His] C791 С767 [соединяющие остатки подчеркнуты, остатки гибкого линкера выделены жирным шрифтом, и остатки антигена выделены курсивом]:
Дополнительная модификация, которая анализировалась для удаления остаточного разложения, определяемого при жестких условиях ферментации в продукции CHO-S клетками вышеописанного белка, показана ниже с заменой ККК на NKQ показаны выделенными подчеркиванием, жирным, курсивом:
Определенные слияния gag-nef антигена с максимальными антигенными эпитопами, как было обнаружено, имеют эффективные свойства секреции/продукции. Было обнаружено, что варианты gag p40 со вставками или дополнениями nef антигена, фланкированного предпочтительными последовательностями гибкого линкера, являются особенно хорошо продуцируемыми и секретируемые. Было обнаружено, что последовательности гибкого линкера, раскрытые здесь и которые возможно получить из организмов, разлагающих целлюлозу, были способны облегчать секрецию интактных антигенов и/или соединенных антигенов в виде слитых белков антитело-антиген.
ДНК последовательности антиген-кодирующей последовательности: С757 антигенная область представляет собой [выделенные жирным последовательности являются соединяющими сайтами или стоп-кодоном]:
С791 линкер и антиген-кодирующая последовательность представляет собой [выделенные жирным последовательности являются соединяющими сайтами или стоп-кодоном]:
Следующие примеры показывают, что данное изобретение было способно направлять ВИЧ и другие антигены на ДК человека посредством CD40. Образование сильных активирующих анти-СВ40 моноклональных антител. Мыши были иммунизированы слитым белком мышиный IgG2b- человеческий CD40 и В клетки из лимфатических узлов, дренируя место инъекции, последовательно иммортализовали в виде гибридом. Супернатанты из 35 гибридом, секретирующих анти-С040 реактивные антитела, что определяли с помощью FACS по сравнению с 293F клетками, трансфектированными с CD40 кДНК, анализировали в ночных культурах дендритных клеток человека для индукции секреции цитокина. Фигура 8 показывает пример этого типа скрининга, разработанного для определения подкласса анти-С040 антител, которые могут связываться и активировать CD40. Этот набор данных показывает, что две гибридомы 12Е12 и 9А11 были особенно эффективными в направлении ДК на секретируемый IL-12p40. кДНК, кодирующие 12Е12 тяжелые и легкие цепи, были выделены с использованием стандартных технологий клонирования и секвенирования и вариабельные области были сконструированы в векторы, экспрессирующие мышиные 12Е12 вариабельные области, пересаженные на IgG4 константные области человека.
С269 rAB-pIRES2[mAnti-CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C] ДНК последовательность ниже показывает химерную кодирующую область легкой цепи и аминокислотную последовательность предполагаемой секретируемой зрелой легкой цепи, где мышиная вариабельная область выделена курсивом.
С230 rAB-pIRES2[mAnti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C] ДНК последовательность ниже показывает химерную кодирующую область тяжелой цепи и аминокислотную последовательность предполагаемой секретируемой зрелой цепи, где мышиная вариабельная область выделена курсивом.
Варианты С230 были сконструированы для кодирования CD4012E12 Н цепей с антигенами, слитыми с С-концом человеческого IgG4, например С291 гАВ-pIRES2[mAnti-CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C-Flex-FluHA1-1-6×His] кодирует Н цепь с последовательностью, показанной ниже, где область антигена гриппа НА 1-1 показана курсивом и последовательность гибкого линкера и С-терминальная полигистидиновая метка показаны жирным:
Другой тип вариантного конструкта Н цепи представляет собой С450 rAB-pIRES2[mAnti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Докерин-varl], кодирует Н цепь с последовательностью, показанной ниже, с С-терминальной областью докеринового домена антигена, показанной курсивом:
Таким образом, векторы экспрессии, кодирующие описанные выше и сходные вариантные Н цепи, могут быть котрансфектированы в 293F или CHO-S клетки, приводя к секреции слитых белков анти-CD4012E12-hIgG4 антитело, которые могут быть без труда очищены аффинной хроматографией с использованием белка А.
Такие белки антитело-антиген могут быть использованы как вакцины для доставки антигена с высокой эффективностью на дендритные клетки человека in vitro или in vivo. Анти-CD4012E12-hIgG4 докериновый белок может быть использован подобным образом для доставки слитых белков когезин-антиген. Например: С32 Ecoli-pET28[Когезин-FluM1-6×His] кодирует последовательность, показанную ниже, где белок гриппа Ml показан курсивом:
Вышеописанный белок может быть экспрессирован как растворимый белок в Е.coli и приготовлен как чистый продукт с помощью ионообменной и металл-аффинной хроматографий. Высокостабильные комплексы или конъюгаты между слитым белком анти-CD4012E12-hIgG4 докерин и слитым белком когезин Flu M1 могут собираться посредством высокоаффинного докерин-когезинового взаимодействия.
Диапазон доз таких конъюгатов aHTH-CD4012E12-hIgG4 Докерин - Когезин Flu M1 был проинкубирован с дендритными клетками человека в течение одного дня, затем были добавлены сингенные CD8+Т клетки и инкубацию продолжали еще несколько дней. Клетки затем окрашивали анти-CDS антителом и реагентом HLA-А2 тетрамер, специфическим для Т клеток, несущих TCR, соответствующий иммунодоминантному Flu M1 эпитопу 58-66. Тетрамер-позитивные клетки показаны в заделанном впуске. Эти данные показывают, что концентрации конъюгатов анти-CD4012E12-hIgG4 докерин-когезин Flu M1 настолько низкие, как 0,001 мкг/мл вызывают пролиферацию Flu M1-специфических CD8+Т клеток на уровнях, существенно более высоких, чем когда не добавляли конъюгат или [следующая панель на фигуре], чем параллельные серии диапазона доз контрольных конъюгатов IgG4 Докерин Когезин Flu M1. Эти данные демонстрируют, что анти-С04012Е12 антитело в высшей степени эффективно в доставке антигена на ДК, приводя к обработке и презентации антигена, что видно по пролиферации антиген-специфических Т клеток.
Фигура 9 показывает FACS анализ CD8+окрашивания [горизонтальная ось] по сравнению с окрашиванием Flu M1-тетрамером [вертикальная ось], что установлено с помощью диапазона доз от 10 мкг/мл до отсутствия конъюгата анти-CD4012E12-hIgG4 Докерин - Когезин Flu M1.
Фигура 10 показывает FACS анализ CD8+окрашивания [горизонтальная ось] по сравнению с окрашиванием Flu M1-тетрамером [вертикальная ось], что установлено с помощью диапазона доз от 10 мкг/мл до отсутствия контрольного конъюгата hIgG4 Докерин - Когезин Flu M1.
Выравнивание С269 (seqA) анти-С04012Е12 последовательности легкой цепи с вариантами, сконструированными для сохранения CD40 связывания и увеличения сходства с вариабельными последовательностями легкой цепи человека - и путем включения предпочтительных кодонов для усиления экспрессии секретируемого продукта.
Выравнивание С268 (seqA) анти-С04012Е12 последовательности тяжелой цепи с вариантами, сконструированными для сохранения CD40 связывания и увеличения сходства с вариабельными последовательностями легкой цепи человека - и путем включения предпочтительных кодонов для усиления экспрессии секретируемого продукта.
(SEQ ID NO.: 29, 30, соответственно)
Фигура 11 отображает протокол, используемый для исследования in vitro силы направляющих молекул [ТМ] анти-ДК рецептор - антиген для того, чтобы вызвать распространение антиген-специфических Т клеток в контексте МНПК культуры. Кратко, 2Е6 МНПК из афереза ВИЧ пациентов инкубировали с диапазоном доз направляющей вакцины и 100 ед/мл IL-2. Среды меняли каждые два дня. На 7 день кластеры пептидов, соответствующие антигену, добавляли для индукции IFNγ продукции Т клетками с TCR специфичностями для пептидных последовательностей в каждом кластере. Через 4 часа инкубации с пептидным кластером и агентом, который блокирует секрецию цитокина, клетки окрашивали анти-СВ4, анти-CDS, анти-1b-13 и анти-IFNγ реагентами и анализировали с помощью FACS.
Фигуры 12 и 13 показывают эффекты направленности ДК [внутри МНПК] с анти-CD4012E12 gag p17 nef gag р24 вакциной - композиция Н цепи показана ниже:
С818 rAB-cetHS-puro[mAnti-CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Viralgag-р17-G-nef-f4-p24-6×His] соединяющие остатки подчеркнуты, остатки гибкого линкера выделены жирным шрифтом и остатки антигена выделены курсивом]:
Фигура 12 показывает, что вакцина вызывает распространение CD4+Т клеток со специфичностями ко всем gag p24 пептидным кластерам - даже при самой низкой анализируемой дозе вакцины процентное соотношение IFNγ-продуцирующих CD4+T клеток было значительно больше, чем когда клетки не обрабатывались пептидами. Фигура 13 [верхняя панель] показывает эти данные в графической форме - вертикальная ось показывает процент (%) IFNγ-продуцирующих клеток. Нижняя панель показывает сходные результаты для CD8+Т клеток внутри МНПК культуры, и эти данные также показывают, что все пептидные кластеры, покрывающие gag p24 последовательность, вызывали значительно большую продукцию IFNγ-продуцирующих Т клеток, чем непептидный контроль. Таким образом, вакцина вызывала сильные ответы против множественных эпитопов внутри ВИЧ gag p24.
Фигура 14 показывает, что вакцина вызывает распространение CD4+Т клеток со специфичностями ко всем gag p17 пептидным кластерам - даже при самой низкой анализируемой дозе вакцины процентное соотношение IFNγ-продуцирующих CD4+T клеток было значительно больше, чем когда клетки не обрабатывались пептидами. Фигура 15 показывает эти данные в графической форме - вертикальная ось показывает процентное соотношение IFNγ-продуцирующих клеток [верхняя панель]. Нижняя панель показывает сходные результаты для CD8+Т клеток внутри МНПК культуры, и эти данные также показывают, что все пептидные кластеры, покрывающие gag p17 последовательность, вызывали значительно большую продукцию IFNγ-продуцирующих Т клеток, чем непептидный контроль. Таким образом, вакцина вызывала сильные ответы против множественных эпитопов внутри ВИЧ gag p17.
Фигура 16 показывает, что вакцина вызывает распространение CD4+Т клеток со специфичностями к большинству ВИЧ nef пептидных кластеров - даже при самой низкой анализируемой дозе вакцины процентное соотношение IFNγ-продуцирующих CD4+T клеток было значительно больше, чем когда клетки не обрабатывались пептидами. Фигура 17 показывает эти данные в графической форме - вертикальная ось показывает процентное соотношение IFNγ-продуцирующих клеток [верхняя панель]. Нижняя панель показывает сходные результаты для CD8+Т клеток внутри МНПК культуры, и эти данные также показывают, что все пептидные кластеры, покрывающие nef последовательность, вызывали значительно большую продукцию IFNγ-продуцирующих Т клеток, чем непептидный контроль. Таким образом, вакцина вызывала сильные ответы против множественных эпитопов внутри ВИЧ nef.
Было обнаружено, что данные показывают, что вакцина [Анти-CD4012E12 -соединенный со специально сконструированным gag p17 nef gag p24 слитым белком] может, даже при низких дозах, вызывать широкие иммунные ответы - т.е., широкое представление эпитопов как в CD4+, так и CD8+Т клеточных компартментах. Эти данные дополнительно демонстрируют, что каждая из двух частей вакцины [анти-С04012Е12 и другие антитела со сходными специфичными свойствами, и gag-nef антиген, сконструированный для максимального представления эпитопа, соответствующий эффективной продукции] - т.е., анти-CD40 компонент может быть носителем для доставки других антигенов, и антигенный компонент может быть доставлен другими носителями анти-ДК рецептора. Результаты также демонстрируют способность основанной на CD40 направленности расширять широкий круг антиген-специфических CD4+и CD8+Т клеток как из Т клеточных популяций памяти [ВИЧ пациенты, дающие ВИЧ вакцину], так и нативных клеток [нормальные доноры, дающие PSA антиген].
4
+
ДК, направляемые анти-С040-Р8А, вызывают PSA-специфические CD  Т клеточные ответы. Фигура 18 показывает план протокола для исследования способности вакцины, содержащей анти-С040-12Е12, связанный с PSA [специфический антиген простаты] вызывать распространение из нативной Т клеточной популяции PSA-специфических CD4+Т клеток, соответствующих широкому кругу PSA эпитопов. Кратко, ДК, полученные из культуры с IFNα и ГМКСФ (гранулоцито-макрофаго-колониестимулирующий фактор) моноцитов от нормального донора, инкубировали с вакциной. На следующий день клетки помещали в свежую среду, и добавляли чистые CD4+Т клетки от того же донора. Через несколько дней добавляли PSA пептиды и, через четыре часа определяли секретируемые IFNγ уровни в супернатантах культуры.
Фигура 19 показывает, что многие PSA пептиды вызывают сильные ответы в виде IFNγ-продукции, означая, что анти-CD4012E12 и сходные анти-CD40 агенты могут эффективно доставлять антиген на ДК, приводя к примированию иммунных ответов против множественных эпитопов антигена.
Фигура 20 показывает, что ДК, направленные aHTH-CD40-PSA, направленным на ДК, вызывают PSA-специфические CD8+Т клеточные ответы. IFNDC направлялись 1 мкг MAT слитого белка с PSA. Очищенные аналогичные CD8+Т клетки кокультивировались в течение 10 дней. Клетки окрашивали анти-CD8 и PSA (KLQCVDLHV)-тетрамером. Клетки были от HLA-A*0201 позитивного здорового донора. Результаты демонстрируют, что анти-С040 эффективно доставляет PSA на ДК, которая, в свою очередь, вызывает распространение PSA-специфических CD8+Т клеток.
Фигура 21 кратко описывает протокол направленности ДК для анализа направляющей вакцины анти-ДК рецептора на ее способность направлять распространение антиген-специфических Т клеток, полученных от направленного захвата ДК и презентации антигенных эпитопов на их клеточной поверхности. Кратко, моноциты ВИЧ пациента дифференцируются в ДК с помощью культивирования в течение 3 дней в IFNα и ГМКСФ. Вакцину [FP] затем добавляют в концентрации 10 мкг/мл наряду с аутологичными Т клетками. Через 10 дней в культуре антигенные пептидные кластеры добавляют для распространения Т клеток и через 4 часа измеряют внутриклеточный IFNα.
Фигура 22 [верхняя панель] показывает сравнение эффективности анти-CD4012E12 nef, анти-С04012Е12 gag p24 и анти-С04012Е12 gag p 17 nef gag p24 вакцин [пациент Aph002]. Анти-С04012Е12 nef вакцина [зеленые столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD4+Т клеток, реагирующих только на nef пептидные эпитопы, анти-СС4012Е12 gag p24 [синие столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD4+Т клеток, реагирующих только на p24 пептидные эпитопы, тогда как анти-С04012Е12 gag р17 nef gag p24 стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD8+Т клеток, реагирующих на gag р17, nef и p24 пептидные эпитопы.
Фигура 22 [нижняя панель] показывает сравнение эффективности анти-С04012Е12 nef, анти-СЭ4012Е12 gag p24 и анти-С04012Е12 gag р17 nef gag p24 вакцин [пациент Aph002]. Анти-С04012Е12 nef вакцина [зеленые столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD8+Т клеток, реагирующих только на nef пептидные эпитопы, тогда как анти-С04012Е12 gag р17 nef gag p24 [оранжевые столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD8+Т клеток, реагирующих как на gag р17, так и nef пептидные эпитопы.
Фигура 23 [верхняя панель] показывает сравнение эффективности анти-CD4012E12 nef, анти-С04012Е12 gag p24 и анти-С04012Е12 gag p 17 nef gag p24 вакцин [пациент Aph010]. Анти-С04012Е12 nef вакцина [зеленые столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD4+Т клеток, реагирующих только на nef пептидные эпитопы, анти-С04012Е12 gag p24 [синие столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD4+Т клеток, реагирующих только на p24 пептидные эпитопы, тогда как анти-С04012Е12 gag р17 nef gag p24 стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD8+Т клеток, реагирующих на gag р17, nef и p24 пептидные эпитопы.
Фигура 23 [нижняя панель] показывает сравнение эффективности анти-СD4012Е12 nef, анти-СD4012Е12 gag p24 и анти-СD4012Е12 gag р17 nef gag p24 вакцин [пациент Aph002]. Анти-СD4012Е12 nef вакцина [зеленые столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD8+Т клеток, реагирующих только на nef пептидные эпитопы, анти-СD4012Е12 gag p24 [синие столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD8+Т клеток, реагирующих только на p24 пептидные эпитопы, тогда как анти-С04012Е12 gag р17 nef gag p24 [оранжевые столбики] стимулировала распространение IFNα-продуцирующих CD8+Т клеток, реагирующих как на gag р17, так и nef пептидные эпитопы.
Эти данные демонстрируют, что анти-CD4012E12 gag р17 nef gag p24 вакцина может вызывать широкий круг Т клеточных ответов, покрывающих множественные эпитопы во всех трех антигенных элементах вакцины - ВИЧ gag р17, ВИЧ gag p24 и ВИЧ nef.
Последовательность ниже представляет собой аминокислотную последовательность слитого белка Когезин [остатки жирным] - Циклин D1 [подчеркнутые остатки], экспрессируемого С515 вектором.
С515 Е.соli-рЕТ28 [Когезин-hЦиклинD1-6×His]
coli.
Экспрессия и очищение СоП.Циклин D1 белка, полученного в Е.
coli
++
4
Coh.Циклин D1 экспрессировали в штамме Е. T7 Express (NEB), выращенном в среде Лурия (Difco) при 37°С с селекцией по устойчивости к канамицину (40 мкг/мл) и встряхиванием при частоте 200 вращений/мин до фазы среднелогарифмического роста. Затем 120 мг/л IPTG (Bioline) добавляли и через дополнительных 3 часа клетки собирали центрифугированием и хранили при -80°С. Клетки Е.Coli от каждой 1 л ферментации ресуспендировали в 50 мл ледяного 50 мМ Трис, 1 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) рН 8,0 с 0,2 мл смеси II ингибитора протеазы (Calbiochem). Клетки обрабатывали ультразвуком дважды на льду в течение 4 мин с установкой 18 (Fisher Sonic Dismembrator 60) с 5 мин периодом покоя и затем откручивали при 17000 об/мин (Sorvall SA-600) в течение 20 мин при 4°С. 50 мл супернатанта клеточного лизата пропускали через 10 мл ANX сефарозных гранул (GE Healthcare), затем пропусканием доводят до буферного раствора с 7,5 мл 160 мМ Трис, 40 мМ имидазола, 4 М NaCl рН 7,9 и загружают в 5 мл HiTrap хелатирующую ВЭ (высокоэффективная, или HP) колонку (GE Healthcare), заряженную Ni. Связанный белок отмывали 20 мМ NaPO, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола рН 7,6 (буфер А) и элюировали с градиентом 10-500 мМ имидазола в буфере А. Пиковые фракции анализировали с помощью ДСН-ПААГ, суммарно. Приблизительно 15 миллиграммов суммарного элюированного слитого белка Когезин-Циклин D1 приводили в реакцию в течение ночи при комнатной температуре с 10 миллиграммами реагентом mPEG-MAL 20k (Nektar), который прикрепляет 20 кДа пегилированную группу к свободным цистеиновым остаткам [из которых некоторые находятся в домене Циклина D1]. Часть этой реакции А диализировали против DPBS (фосфатно-солевой буфер Дюльбекко) [Gibco] и часть доводили до рН 7,5, затем DTT (дитиотреитол) добавляли до 10 мМ в течение 1,5 часов при комнатной температуре для восстановления любых дисульфидных связей, с последующим добавлением 25 мМ йодацетамида в течение 1,5 часов при комнатной температуре, чтобы алкилировать свободные цистеиновые остатки, с последующим добавлением 20 мМ DTT в течение 1,5 часов при комнатной температуре, с последующим диализом против DPBS. Пегилирование было необходимым для того, чтобы убедиться, что белок оставался растворимым в DPBS и алкилирование [которое не является необходимым для активности белка в контексте in vitro анти-CD40 направленности] служило для того, чтобы убедиться, что продукт был свободен от внутримолекулярных дисульфидных поперечно-связанных форм.
Фигура 24. Анализ взаимодействия слитого белка Когезин-Циклин D1 с рекомбинантным антителом анти-ДК рецептор-Докерин. Слитый белок антитело-Докерин или антитело-ВИЧ nef [20 мкг] инкубировали с 100 мкл белок А-сефарозных гранул [GE Biosciences], затем отмывали дважды DPBS. Пегилированный [peg] или пегилированный и алкилированный [peg alk] Когезин-Циклин D1 [Coh.Циклин D1] добавляли [20 мкг] и через 30 минут при комнатной температуре супернатант отделяли от гранул путем центрифугирования. Гранулы элюировали с 20 мМ НСl и элюат и супернатант высушивали, ресуспендировали в ДСН-ПААГ загрузочном буфере и разгоняли на ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и визуализировали окрашиванием Кумасси синим. Ряд 1 показывает супернатант из гранул, нагруженных антитело-Докерин+peg Coh.Циклин D1, и Ряд 2 соответствует элюату гранул. Ряд 3 показывает супернатант из гранул, нагруженных антитело-ВИЧ nef+peg Coh.Циклин D1, и Ряд 4 соответствует элюату гранул. Ряд 5 показывает супернатант из гранул, нагруженных антитело-Докерин+peg alk Coh.Циклин D1 и Ряд 6 соответствует элюату гранул. Ряд 7 показывает супернатант из гранул, нагруженных антитело-ВИЧ nef+peg alk Coh.Циклин D1 и Ряд 8 соответствует элюату гранул. Ряд 9 показывает антитело-Докерин отдельно, ряд 10 показывает антитело-ВИЧ nef отдельно, Ряд 11 показывает peg Coh.Циклин D1 отдельно, и Ряд 12 показывает peg alk Coh.Циклин D1 отдельно. Стрелки [сверху вниз] показывают: 1) высокомолекулярные пегилированные формы Coh.Циклин D1, 2) положение тяжелой цепи антитела, 3) положение непегилированного Coh.Циклин D1 [который составляет около 50% препаратов], 4) положение легкой цепи антитела.
Вышеописанный анализ показывает, что антитело-Докерин, но не антитело-ВИЧ nef, эффективно захватывает большинство из Coh.Циклин D1. Это демонстрирует, что Coh.Циклин D1 препараты могут объединяться с направляющими носителями анти-ДК рецептор-Докерин.
Лимфома из клеток мантийной зоны (MCL) представляет собой В-клеточную неходжкинскую лимфому, которая представляет 5-10% всех неходжкинских лимфом, преимущественно у мужчин в пожилом возрасте. Она представляет собой очень агрессивный рак с наихудшим прогнозом после консервативного лечения, частые рецидивы и относительно короткую выживаемость. Она имеет генетический признак: t (11;14) (q13; q32) транслокация-- ведущая к сверхэкспрессии Циклина D1.
G1/S-специфический циклин-D1 - альтернативно называемый PRAD1, Вс1-1 функционирует в клеточном цикле как контроль прогрессирования G1 и перехода G1/S посредством формирования комплексов с CDK4 и 6. В зрелых лимфоцитах отсутствует нормальная экспрессия, так как экспрессия является зависимой от клеточного цикла, причем она максимальна в G1, минимальна в S. Таким образом, появление цитотоксических Т клеточных ответов, специфически направленных на клетки, сверхэкспрессирующие Циклин D1, представляет собой привлекательную стратегию MCL вакцинации.
Фигура 25 показывает схему перекрывающихся пептидов от Циклина D1. Их добавляют к Т клеточным культурам, либо как отдельные пептиды, либо как пулы пептидов, когда они могут присутствовать на МНС и, тем самым, стимулировать пролиферацию пептид-специфических Т клеток.
Фигура 26 показывает схему [левая панель] плана исследования для анализа способности анти-СD40-Циклин D1 комплексов вызывать распространение in vitro Циклин D1-специфических CD4+Т клеток. После инкубации ДК с направляющим комплексом, аутологические CD4+Т клетки [т.е., от того же донора], помеченные красителем CFSC, добавляли, и культивирование продолжали дополнительные 8 дней с IL-2, затем на 2 дня оставляли без IL-2. Далее, культуру разделяли и стимулировали отдельными Циклин D пептидами, или отсутствием пептида, в течение 8 часов с последующим окрашиванием на внутриклеточный IFNg и IL-2 [индикаторы Т клеточной активации] и анализировали с помощью FACS.
Анализ показывает, что Циклин D пептиды Р8, Р16, и Р54 стимулируют значительно большую продукцию пролиферирующих [т.е., помеченные разведением CFSC] CD4+Т клеток, чем клетки, проинкубированные без пептида [или других Циклин D1 пептидов [не показано]. Таким образом, анти-CD40-Циклин D1 комплекс функционирует, чтобы вызывать распространение из Т клеток нормального донора Циклин D1-специфических Т клеток с фенотипом эффекторной функции.
Фигура 27 показывает исследование и анализ, сходный с тем, что описан детально на Фигуре 26, за исключением того, что другой нормальный донор был использован - в этом случае анти-CD40-Циклин D1 комплекс вызывал распространение IFNg позитивных пролиферирующих CD4+Т клеток, специфических для Циклин D1 пептидов Р4, Р43 и Р70.
Фигура 28 показывает схему и анализ, сходный с тем, что описан детально на Фигуре 26, за исключением того, что использовались CD8+Т клетки. В этом доноре анти-CD40-Циклин D1 комплекс вызывал распространение Циклин D1-специфических CD8+Т клеток, в частности тех, которые имеют специфичности, соответствующие пептидам, содержащимся внутри пула I и пула II.
Фигура 29 показывает сходные данные от того же донора, но проанализированные с отдельными пептидами из этих пулов. В частности, эти Т клетки показывают специфичность для пептидов Р7, Р8 и Р10.
Предусматривается, что любой вариант осуществления, обсуждаемый в данном описании изобретения, может быть реализован в отношении любого способа, набора, реагента или композиции изобретения, и наоборот. Более того, композиции изобретения могут быть использованы для достижения способов изобретения.
Следует понимать, что конкретные варианты осуществления, описанные здесь, показаны с целью иллюстрации, а не как ограничения изобретения. Принципиальные особенности данного изобретения могут использоваться в различных вариантах осуществления без отклонения от объема изобретения. Специалистам в данной области техники понятно или они смогут установить с использованием не более чем рутинного эксперимента, различные эквиваленты специфических процедур, описанных здесь. Такие эквиваленты рассматриваются как находящиеся в объеме данного изобретения и охраняются формулой изобретения.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании изобретения, являются показателями уровня специалистов в данной области техники, к которой принадлежит изобретение. Все публикации и патентные заявки включены сюда посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была специфически и индивидуально показана для того, чтобы быт включенной посредством ссылки.
Использование форм единственного числа, когда оно используется совместно с выражением "включающий" в формуле изобретения и/или описании изобретения, может означать "один", но также оно соответствует значению "один или более", "по меньшей мере, один", и "один или более, чем один". Использование выражения "или" в формуле изобретения используется для обозначения "и/или", если только явно не указано для обозначения только альтернатив или альтернативы являются взаимоисключающими, хотя описание изобретения обеспечивает определение, которое относится к только альтернативам и "и/или." Везде в этой заявке, выражение "около" используется для обозначения того, что величина включает присущее отклонение погрешности для устройства, способа, который применяется для определения величины, или отклонение, которое присутствует между субъектами исследования.
Как используется в данном описании изобретения и формуле изобретения, слова "содержащий" (и любая форма содержащего, такая как "содержат" и "содержит"), "имеющий" (и любая форма имеющего, такая как "имеют" и "имеет"), "включающий" (и любая форма включающего, такая как "включает" и "включают") или "вмещающий" (и любая форма вмещающего, такая как "вмещает" и "вмещают") являются включающими или ничем не ограниченными, и не исключают дополнительные, не перечисленные элементы или этапы способа.
Выражение "или их комбинация", как используется здесь, относится ко всем перестановкам и комбинациям перечисленных объектов, предшествующих выражению. Например, "А, В, С или их комбинация", как подразумевается, включает, по меньшей мере, один из: А, В, С, АВ, АС, ВС или АВС, и если порядок важен в конкретном контексте, также ВА, СА, СВ, СВА, ВСА, АСВ, ВАС или CAB. Продолжая этот пример, специально включены комбинации, которые содержат повторы одного или более объектов или выражений, такие как ВВ, ААА, MB, ВВС, АААВСССС, СВВААА, САВАВВ и тому подобное. Специалисту в данной области техники понятно, что типично не существует ограничения в числе объектов или выражений в любой комбинации, если только обратное не очевидно из контекста.
Все из композиций и/или способов, раскрытых и заявленных здесь, могут быть созданы и выполнены без проведения чрезмерной экспериментальной работы в свете данного раскрытия изобретения. Поскольку композиции и способы данного изобретения были описаны в выражениях предпочтительных вариантов осуществления, для специалиста в данной области техники понятно, что можно применить вариации в композициях и/или способах и в этапах или в последовательности этапов способа, описанных здесь, не выходя за пределы идеи, сущности и объема изобретения. Подразумевается, что все подобные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, находятся в пределах сущности, объема и идеи изобретения, что определено в прилагаемой формуле изобретения.