ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИЙ ШТАММ ACINETOBACTER SPECIES С ФУНГИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ
PHOSPHATE-DISSOLVING STRAIN ACINETOBACTER SPECIES WITH FUNGICIDAL PROPERTIES

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового бактериального штамма Acinetobacter species 305, обладающего способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья и подавлять рост фитопатогенных грибов рода Fusarium, который может быть использован для получения биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами.
Проблема фосфорного питания растений остается одной из самых острых в земледелии, что объясняется двумя основными причинами: ограниченным запасом фосфатных руд и быстрым связыванием этого элемента в почве при внесении с удобрениями. Только 5-25% вносимого с химическими удобрениями фосфора ассимилируется растениями (Sample E.C., Soper R.J., Racz G.J. Reactions of phosphate fertilizers in soils // The role of phosphorus in agriculture / Ed. Khasawneh F.E, Sample E.C, Kamprath E.J. Madison, WI: American Society of Agronomy, 1980. P. 263-310; Муромцев Г.С., Маршунова Г.Н., Павлова В.Ф., Зольникова Н.В. Роль почвенных микроорганизмов в почвенном питании растений // Успехи микробиол. 1985. Т.20. С.174-198). Остальная часть фосфатов вымывается или переходит в почве в нерастворимую форму и становится недоступной для растений. При этом производство фосфорсодержащих химических удобрений является энергоемким и дорогостоящим процессом, чрезвычайно загрязняющим окружающую среду. Увеличение норм внесения удобрений нарушает баланс питания растений, снижает качество продукции и нарушает экосистему почв, грунтовых вод и водоемов. В связи с этим в настоящее время во многих странах ведутся интенсивные исследования возможности замены промышленного химического производства фосфорных удобрений микробиологическим (Vassilev N., Vassileva M. Biotechnological solubilization of rock phosphate on media containing agro-industrial wastes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.61. P.435-440; Anandham R., Choi K.H., Gandhi P.I., Yim W.J., Park S.J., Kirn K.A., Madhaiyan M., Sa T.M. Evaluation of shelf life and rock phosphate solubilization of Burkholderia sp.in nutrient-amended clay, rice bran and rock phosphate-based granular formulation // World J. Microbiol. Biotechnol. 2007. V.23. №8. P.1121-1129).
В то же время в современном зернопроизводстве очень актуальна проблема борьбы с поражениями посевов хлебных злаков и продуктов их урожая фузариозными гнилями (Соколов М.С., Коломбет Л.В. Агротехногенные факторы минимизации вредоносности фузариоза колоса пшеницы // Агрохимия. 2007. №12. С.63-80). Пшеница, кукуруза и ячмень, составляющие две трети мирового производства злаковых, наиболее подвержены заражению фузариозами. Возбудителями фузариозов колоса зерновых являются в основном грибы рода Fusarium, которые не только снижают урожай, но и загрязняют зерно и производимые из него продукты питания микотоксинами, делая эти продукты опасными для здоровья человека и животных.
Если в качестве микроорганизмов, растворяющих фосфатную руду в полевых условиях, будут использованы антагонисты патогенов сельскохозяйственных культур, и прежде всего возбудителей фузариозов, это позволит значительно снизить применение химических фунгицидов, повысит экологическую безопасность и безопасность продовольствия. Создание комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами позволит дополнительно повысить экологическую безопасность, в том числе и за счет снижения загрязнения окружающей среды, сопровождающего производство и применение традиционных химических фосфорных удобрений.
В настоящее время известны фосфатрастворяющие микроорганизмы (например, патент США №5026417; Y.P.Chen, P.D.Rekha, A.B.Arum, F.T.Shen, W.-A. Lai, C/C/ Young. Phophate solubilising bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solu-bilizing abilities // Applied Soil Ecology. - 2006. - V.34. - P.34-41) и микроорганизмы, на основе которых созданы препараты для борьбы с болезнями растений (например, патент РФ №2019966; В.А.Павлюшин, С.Л.Тютерев, Э.В.Попова, И.И.Новикова, Г.А.Быкова, Н.С.Домнина. Новые комплексные биопрепараты для защиты овощных культур от грибных и бактериальных болезней // Биотехнология. - 2010. - №4 - С.69-80).
Известен штамм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390, предназначенный для защиты растений от грибных патогенов, в том числе от грибов рода Fusarium, для очистки почв от мышьяка и растворяющий фосфаты (Патент РФ №2323967).
rd
Однако антагонистическая и фосфатрастворяющая активность этого штамма характеризуются только качественно, причем последняя констатируется по наличию зоны просветления в агаре, содержащем нерастворимое фосфатное сырье. Известно, что результаты определения растворения фосфатов микроорганизмами, полученные на плотных и жидких средах, часто не совпадают, и для количественной оценки фосфатрастворяющей активности необходимы исследования в жидкой среде (Gupta R., Singal R., Shankar A., Kuhad R.C., Saxena R.K. A modified plate assay for screening phosphate solubilizing microorganisms // J. Gen. Appl. Microbiol. 1994. V.40. P.255-260; Deubel A., Fankem H., Nwaga D., Antoun Y., Merbach W. In vitro mobilization of calcium, iron and aluminum phosphate by rhizosphere bacteria of African oil palm // Proceedings of 3 International Symposium on Phosphorus Dynamics in the Soil-Plant Continuum / Ed. Alves V.M.C. et al. Uberlandia, Brazil: Embrapa Milho e Sorgo, 2006. P. 232-233). He подтверждено также влияние заявленного штамма на повышение урожайности.
3
4
2
Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм Pseudomonas sp.NJ-101, который давал зоны ингибирования до 1,8 мм с культурами фитопатогенов, таких как Fusarium oxysporum, F. solani и F. udum, и переводил в раствор до 74,6 мкг/мл фосфата из Са(РO) (Bano N., Musarrat J. Characterization of a novel carbofuran degrading Pseudomonas sp.with collateral biocontrol and plant growth promoting potential // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V.231. P.13-17). Однако активность этого штамма низка и его влияние на повышение урожайности также не подтверждено.
Задачей изобретения является получение нового штамма, обладающего высокой фосфатрастворяющей активностью и способностью к подавлению фитопатогенных грибов рода Fusarium для борьбы с фузариозами и повышения урожайности.
3
4
2
3
4
2
Поставленная задача решается тем, что предлагается штамм Acinetobacter species 305, выделенный из грунта Краснодарского края с использованием селективной минимальной минеральной среды, содержащей нерастворимый фосфат кальция (Са(РO)). Основными критериями отбора служили степень растворения Са(РO), подавление роста фитопатогенных грибов рода Fusarium, стимуляция роста растений и безвредность для теплокровных.
Предлагаемый штамм Acinetobacter species 305 обладает высокой способностью растворять фосфаты, подавляет рост фитопатогенных грибов рода Fusarium и стимулирует рост растений.
Предлагаемый штамм Acinetobacter species 305 депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск. Серпуховского р-на Московской обл.) под номером В-6645.
Штамм бактерий Acinetobacter species 305 характеризуется следующими свойствами.
Культурально-морфологические признаки
Клетки неподвижные, короткие, палочковидные, грамотрицательные, спор не образуют.
2
4
2
4
4
4
4
2
4
2
4
2
4
2
Штамм хорошо растет на следующих средах: гидролизат рыбной муки (ГРМ)-бульон (ФГУН ГНЦПМБ, п.Оболенск)+2% глюкозы, на минеральной среде состава (г/л): KНРO 1,5; KНРO 3,0; NHCl 0,5; глюкоза 20,0; дрожжевой экстракт 2,0; MgSO 0,4; NaCl 3,0, раствор микроэлементов 10 мл/л (состав раствора микроэлементов, %: сульфат железа (FeSO×7HO) 0,01; сульфат меди (CuSO×5HO) 0,1; сульфат марганца (MnSO×2HO) 0,1; сульфат цинка (ZnSO×7HO) 0,01).
Морфологию колоний на питательных средах определяют после 1-2 суток роста при 28°С. Колонии на среде ГРМ-агар (ФГУН ГНЦПМБ, п. Оболенск) непрозрачные, круглые, выпуклые, гладкие, слизистые, белого цвета, диаметр 3-4 мм. Штамм формирует на агаре Endo слизистые ярко малиновые колонии без металлического блеска, на агаре Левина - розовые слизистые колонии, на агаре McConkey - фиолетовые колонии, на TSI агаре - выделение газа и изменение цвета агара из малинового в желто-красный.
Физиолого-биохимические признаки
Облигатный аэроб, температурный оптимум роста 28-30°С, не растет при 41°С; растет в пределах рН среды от 3,5 до 8.0.
В дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф). Метаболизм глюкозы окислительный. Молекулярный азот не фиксирует. Крахмал гидролизует. Клетчатку не разлагает. Штамм не продуцирует индол, фосфатазу и сероводород, обладает уреазой и b-галактозидазой, b-глюкозидазой, у-глютамилтрансферазой, не разлагает орнитин, аргинин, фенилаланин.
Отношение к источникам углерода
Усваивает с образованием кислоты адонитол, ацетоин, галактозу, глюкозу, дульцитол, инозитол, ксилозу, лактозу, лизин, малонат, мальтозу, маннитол, меллибиозу, рамнозу, рафинозу, сахарозу, сорбитол, трегалозу, фруктозу, целлобиозу, цитрат Симмонса, эскулин.
Отношение к источникам азота
Использует аммиачные и нитратные соли азота в качестве единственного источника азота.
Сапрофит. Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.
8
Штамм не патогенен для теплокровных: не вызывает гибели мышей линии СВА при подкожном введении 10 КОЕ.
Условия хранения
Штамм бактерий Acinetobacter species 305 хранят на чашках или косяках с ГРМ-агаром при 5-7°С. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Долгосрочное хранение в лиофильно высушенном состоянии в лактозно-полиглюкиновой защитной среде. Хранить при температуре (4-8)°С, перезакладка через 3 года.
У штамма Acinetobacter species 305 отсутствует фитотоксичность. Показатели фи-тотоксичности штамма Acinetobacter species 305 имеют отрицательные значения (таблица 1), свидетельствующие о наличии стимулирующего рост растений эффекта.
Штамм Acinetobacter species 305 угнетает рост следующих фитопатогенных грибов: Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum.
Возможность осуществления изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Получение культуры бактерий Acinetobacter species 305.
9
Культуру клеток штамма Acinetobacter species 305 для испытаний готовят следующим образом: в колбу емкостью 750 мл наливают 150 мл стерильной среды ГРМ-бульон, добавляют 6 мл стерильного 50%-раствора глюкозы и вносят 1-2 мл стационарной культуры штамма Acinetobacter species 305. Культивирование проводят с аэрацией (160-250 об/мин) при 28°С в течение 12-15 ч до конечного титра культуральной жидкости 5-10×10кл/мл.
Пример 2. Демонстрация отсутствия фитотоксичности у штамма Acinetobacter species 305.
8
Из культуральной жидкости, полученной по примеру 1, готовят 1% (v/v) суспензию клеток в стерильной дистиллированной воде (0,5-1,0×10 кл/мл). В полученной суспензии замачивают семена пшеницы сорта "Иволга" в течение 2 ч. В контрольном опыте семена замачивают в дистиллированной воде. По 50 семян каждого варианта раскладывают на увлажненную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, которую помещают в чашки Петри, и выдерживают в термостате при 28°С в течение 4 суток, постоянно увлажняя. Через сутки оценивают всхожесть семян (таблица 1), а через 4 суток проростки морфометрируют, измеряя длину всех корней и стебля.
Фитотоксическую активность штамма рассчитывают по формуле:
0
к
А=(100-Д/Д×100)%,
где А - показатель фитотоксичности;
0
Д - средний показатель параметра в опыте;
к
Д - средний показатель параметра в контроле.
Отрицательные значения показателя А свидетельствуют о стимулирующем эффекте.
Таблица 1
Показатель фитотоксичности штамма Acinetobacter species 305 для проростков пшеницы сорта Иволга
Вариант обработки семян
Всхожесть семян, % к контролю
Показатель фитотоксичности, %
Корни
Стебель
Суспензия клеток Acinetobacter species 305
100
-29,4
-19,8
Пример 3. Демонстрация фосфатрастворяющей активности штамма Acinetobacter species 305.
4
4
2
3
4
2
2
Для определения фосфатрастворяющей активности в колбы вместимостью 750 мл вносят 100 мл стерильной минеральной среды следующего состава (г/л): NHCl 0,16; MgSO×7HO 0,2; Са(РO)×2НO 5,0; глюкоза 10. В среду вносят 2-3 мл культуры Acinetobacter species 305, выращенной по примеру 1. Инкубирование ведут на качалке New Brunswick при 160-180 об/мин при 28°С.
Для определения количества фосфата, перешедшего в раствор, используют одностадийный метод, основанный на измерении интенсивности окраски его молибденового комплекса с Твином 80 при 350 нм (Пупышев, А.Б. Стабильный реактив для одностадийного определения неорганического фосфата // Лабораторное дело. - 1991. - №9. - С.12-16). Измерение фосфата в растворе проводят в трех повторностях. Через двое суток концентрация фосфата в растворе составляет 2560±140 мкг/мл, что более чем в 30 раз выше, чем у прототипа.
Пример 4. Демонстрация антагонизма штамма Acinetobacter species 305 в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium.
В качестве тест-объектов используют следующие штаммы фитопатогенных грибов рода Fusarium (в скобках указано вызываемое патогенном заболевание): F. graminearum Schwabe 1838 К-33 (фузариоз колоса и зерна), F. culmorum (W.G.Smith 1884) Saccardo 1895 (корневая гниль злаковых), F. oxysporum Schlecht №6 (фузариоз).
5
Для определения супрессивных свойств используют метод лунок. Суспензии фитопатогенных грибов (10KОЕ/мл) готовят, смывая мицелиальную и споровую массу с газонов грибов на картофельно-глюкозном агаре (КГА) (Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 217 с.) стерильным раствором 0,9% хлористого натрия. Полученные суспензии в количестве 0,1 мл засевают на поверхность КГА в чашках Петри и растирают шпателем. В центре засеянных патогенами чашек Петри с КГА делают лунки диаметром 4-5 мм, в которые вносят 0,1 мл культуральной жидкости Acinetobacter species 305, полученной по примеру 1. Чашки инкубируют при 28°С в течение 4 суток. Для F. graminearum и F. culmorum зона угнетения составляет 1,5 мм, для F. oxysporum 2 мм.
Пример 5. Демонстрация повышения урожайности пшеницы в результате применения штамма Acinetobacter species 305.
В качестве тест-культуры используют яровую пшеницу сорта «Иволга».
2
5
Субстратом для растений служит супесчаная почва с низким содержанием доступного фосфора (менее 3 мг РО/100 г почвы по Кирсанову) и рН 6,8. Предварительно почву тщательно перемешивают и просеивают через сито с размером ячеек 2,5 мм, затем стерилизуют автоклавированием в течение 2 часов при давлении 2 атм.
5
В качестве сосудов для выращивания используют горшки объемом 1,5 л. Для искусственного инфицирования семена обрабатывают суспензией фитопатогена F. graminearum Schwabe 1838 К-33. Для обработки 100 г семян используют 50 мл суспензии конидий гриба F. graminearum с титром 3х10 КОЕ/мл, выращенного на КГА.
Семена высевают по 10 шт.в каждый горшок. После появления всходов часть растений выпалывают с целью выравнивания по высоте, оставляя в каждом горшке по 6 растений. На каждый вариант использовали по 4 горшка.
2
5
2
2
5
6
Источники минерального питания азота и калия вносят дробно в течение вегетационного периода в виде растворов солей. В качестве источника фосфора используют измельченную фосфоритную руду Егорьевского месторождения (содержание оксида фосфора (РO) 19,6%). Руду вносят в полной норме однократно, непосредственно перед посевом, перемешивая с почвенной навеской каждого горшка. В вариантах с использованием штамма Acinetobacter species 305 руду сначала перемешивают с биомассой, а затем вносят в почву из расчета 10 клеток на 1 г почвы. Суммарное внесение элементов питания в пересчете на NPK за весь вегетационный период составляет, г на 1 кг сухой почвы: азота (N) 0,15; окиси калия (KО) 0,1; РO 0,1.
Растения выращивают в течение 3 месяцев. Результаты по средней массе зерен приведены в таблице 2.
Таблица 2
Влияние штамма Acinetobacter species 305 на урожай пшеницы при различных вариантах обработки
№ варианта
Характеристика варианта
Средняя масса зерна, г
Инфицирование F. graminearum
Внесение штамма Acinetobacter species 305
1
+
4,95±0,20
2
+
+
5,68±0,43
3
5,80±0,35
4
+
6,94±0,55
В вариантах с применением штамма Acinetobacter species 305 отмечают более раннее наступление сроков основных фаз развития растений в среднем на 5-7 дней. Также в вариантах с применением штамма Acinetobacter species 305 масса зерна увеличилась на 15-20% по сравнению с соответствующими инфицированным и неинфицированным вариантами.
Таким образом, штамм Acinetobacter species 305 обладает высокой способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья, подавляет рост фитопатогенных грибов рода Fusarium, основных возбудителей болезней зерновых культур, и повышает урожайность. Штамм не токсичен для растений, стимулирует их рост и может быть рекомендован для создания на его основе биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами.