СПОСОБ СОЗДАНИЯ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВЫХ К БУРОЙ ЛИСТОВОЙ РЖАВЧИНЕ
METHOD TO DEVELOP SOFT WHEAT LINES RESISTANT TO BROWN LEAF RUST

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в селекции и генетике сельскохозяйственных растений.
В связи с изменяющимися экологическими условиями возрастает необходимость в создании и вовлечении в селекционные процессы новых форм мягкой пшеницы, характеризующихся высоким уровнем устойчивости к болезням, вредителям и неблагоприятным факторам внешней среды.
Одним из эффективных способов защиты мягкой пшеницы от болезней является создание сортов, обладающих генетически детерминированной устойчивостью к патогенам. Генетическое разнообразие мягкой пшеницы по генам, обеспечивающим устойчивость к болезням, крайне ограничено. Большая часть эффективных генов устойчивости перенесена в геном мягкой пшеницы от видов рода эгилопс, пырея, ржи (Aegilops, Agropyron, Secale), а также от некоторых диплоидных и тетраплоидных видов пшениц [1]. Тетраплоидный вид Triticum timopheevii регулярно вовлекается в селекционный процесс для создания новых форм пшеницы с улучшенными свойствами в связи с тем, что данный вид проявляет устойчивость к биотическим (например, к различным расам патогенных грибов) и к абиотическим (например, к засухо- и к солеустойчивости) факторам. Несмотря на это, число генов, перенесенных в геном мягкой пшеницы от Т. timopheevii и впоследствии интегрированных в коммерческие сорта пшеницы, весьма ограничено.
1
1
2
Ближайшим к заявленному способу - прототипом является способ создания иммунных аналогов мягкой пшеницы сорта Саратовская 29 с комплексной устойчивостью к болезням путем скрещивания мягкой пшеницы с гексаплоидной синтетической пшеницей, в состав которой входит тетраплоидный геном Т. timopheevii и диплоидный геном Aegilops tauschii [2]. Синтетическая пшеница (далее - синтетик) объединяет признаки дикорастущих родительских видов. Известный способ заключается в получении гибридов F между сортом мягкой пшеницы Саратовская 29 и синтетиком. Из гибридных растений, полученных после однократного беккроссирования сортом Саратовская 29 и самоопыления (BCF), отбирают 42-хромосомные линии с фенотипом сорта Саратовская 29 и с устойчивостью к грибным болезням. С отобранными устойчивыми растениями дополнительно проводят восемь-девять беккроссов, при этом после проведения каждого беккросса растения тестируют на устойчивость к болезням в полевых условиях. Иммунные растения девятого беккросса были изучены с использованием молекулярных маркеров и показано, что устойчивость к бурой ржавчине связана с переносом генов из хромосомы 2G Т. timopheevii и из хромосомы 2D Ae. tauschii [3].
Недостатками известного способа являются:
1. Длительность способа. В целом при использовании данного способа для создания иммунных аналогов мягкой пшеницы затрачивается более 9 лет, поскольку каждое поколение после каждого беккросса необходимо проверять на признак устойчивости раз в год в полевых условиях.
2. Трудоемкость способа. Необходимо проводить от четырех и выше этапов самоопыления для получения гомозиготных линий, чтобы избежать в дальнейшем расщепления на устойчивые и чувствительные формы.
Технической задачей изобретения является сокращение времени создания линий мягкой пшеницы, устойчивых к болезням.
Поставленная техническая задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.
Из набора гибридных линий, созданных на основе скрещивания мягкой пшеницы и Т. timopheevii, выбирают линию-донор устойчивости, определяют в ее геноме хромосомную локализацию фрагментов Т. timopheevii и их количество. Определяют хромосомную локализацию гена устойчивости и проводят подбор ДНК-маркеров к этому гену.
1
2
1
3
2
Коммерческий сорт мягкой пшеницы скрещивают с линией-донором, содержащей ген устойчивости. В качестве донора устойчивости используют гибридную линию, содержащую в составе генома не более шести фрагментов хромосом Т. timopheevii, для которой предварительно проведен молекулярно-генетический анализ, установлена хромосомная локализация генов устойчивости и определены ДНК-маркеры для генов устойчивости. Гибриды первого поколения (F) беккроссируют двукратно на исходный сорт мягкой пшеницы. Потомство BCF тестируют ДНК-маркерами к генам устойчивости и отбирают линии, несущие ДНК-маркеры. Отобранные линии, содержащие ДНК-маркеры к генам устойчивости, беккроссируют третий раз, проводят самоопыление потомства и в потомстве BCF отбирают линии, несущие ДНК-маркеры к генам устойчивости в гомозиготном состоянии.
3
3
На заключительном этапе потомство BCF тестируют в полевых условиях на устойчивость к заболеваниям и, если это необходимо, на сходство с исходным коммерческим сортом мягкой пшеницы.
В результате за шесть поколений, т.е. за два года при сочетании условий искусственного и полевого выращивания растений, получают новые линии пшеницы, устойчивые к болезням.
Основными определяющими отличиями предлагаемого способа от прототипа являются:
- использование в качестве донора генов устойчивости гибридной линии мягкой пшеницы, содержащей в составе генома не более шести фрагментов хромосом Т. timopheevii, что позволяет значительно сократить количество генетического материала Т. timopheevii, переносимого в геном коммерческого сорта мягкой пшеницы, влияет на цитологическую стабильность создаваемых линий и позволяет уменьшить число беккроссов, необходимых для получения устойчивых линий;
- выявление ДНК-маркеров для генов устойчивости и использование этих маркеров для отбора растений, содержащих ген устойчивости, что позволяет вести отбор устойчивых растений на первых этапах создания линий без проведения полевых тестов на устойчивость и сокращает время создания устойчивых линий мягкой пшеницы.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.
Пример 1.
Из серии гибридных линий, полученных ранее от скрещивания мягкой пшеницы сорта Саратовская 29 с тетраплоидной пшеницей Т. timopheevti, в качестве донора генов устойчивости к бурой листовой ржавчине была отобрана линия 832-2, проявляющая высокую устойчивость как к суммарной популяции, так и к отдельным физиологическим расам бурой листовой ржавчины. Линия 832-2 содержала шесть фрагментов генома Т. timopheevii в хромосомах 1А, 2А, 2В, 5А, 5В и 6В. Тестирование линии 832-2 молекулярными маркерами определило локализацию гена устойчивости к бурой листовой ржавчине (далее Lr-ген) в дистальном районе хромосомы 5В. В районе локализации Lr-гена расположено несколько молекулярных маркеров, из которых наиболее оптимальными для маркирования данного гена от Т. timopheevii оказались микросателлитные маркеры cfe229 и cfe204. Информация о структуре маркеров находится в свободном доступе и опубликована на web-сайтах (http://grain.jouy.inra.fr/cgi-bin/graingenes/report.cgi?class=probe;querv=;name=CFE229;
http://grain.jouy.inra.fr/cgi-bin/graingenes/report.cgi?class=probe:query=;name=CFE204). Эти маркеры были использованы для отбора устойчивых к бурой листовой ржавчине растений при создании устойчивых линий мягкой пшеницы. Основные этапы применения маркеров cfe204 и cfe229 для отбора устойчивых линий мягкой пшеницы представлены на чертеже.
На последнем этапе оценивали устойчивость полученных линий в полевых условиях. Устойчивость оценивали дважды - на стадиях колошения и молочной спелости. Учет поражения растений проводили по шкале иммунности Майнса и Джексона [4]. Линии, содержащие ДНК-маркеры для Lr-гена, перенесенного от Т. timopheevii, показали высокую устойчивость (балл 0-2) к бурой листовой ржавчине. Характеристика устойчивых линий пшеницы, созданных на основе сорта Саратовская 29, представлена в таблице.
№ линии
Маркер cfe204 от Т. timopheevii
Маркер cfe229 от Т. timopheevii
Учет поражения растений по шкале Майнса и Джексона
64
присутствует
присутствует
1-2
70
присутствует
присутствует
0-2
73
присутствует
присутствует
0-1
75
присутствует
присутствует
0-1
103
присутствует
присутствует
0-2
146
присутствует
присутствует
1-2
180
присутствует
присутствует
1-2
Пример 2.
Гибридная линия 842 (T. aestivum × T. timopheevii) была использована в качестве дополнительного доказательства эффективности использования молекулярных маркеров для отбора растений, содержащих гены устойчивости к бурой листовой ржавчине. Предварительный молекулярный анализ линии 842 показал, что в геноме данной линии содержатся 5 фрагментов генома Т. timopheevii в хромосомах 2А, 2В, 3В, 5В и 6В. Тестирование линии 842 молекулярными маркерами определило локализацию гена устойчивости к бурой листовой ржавчине (Lr-ген) в дистальном районе хромосомы 5В. Линия 842 была использована в качестве донора гена устойчивости к бурой листовой ржавчине. Получение гибридов первого поколения, проведение беккроссов и тестирование гибридных потомков на основе данной линии проводили аналогично примеру 1. Анализ с помощью молекулярных маркеров гибридных растений, полученных от линии 842, показал, что все растения, характеризующиеся устойчивостью к бурой листовой ржавчине, несут ДНК-маркеры cfe229 и cfe204, которые выявляли ген устойчивости у линии 832 (пример 1). И наоборот, у растений, характеризующихся чувствительностью к бурой листовой ржавчине, отсутствовали ДНК-маркеры cfe229 и cfe204. Таким образом, на примере линии 842 было получено дополнительное доказательство эффективности ДНК-маркеров cfe229 и cfe204 для маркирования гена устойчивости к бурой листовой ржавчине и отбора устойчивых растений при создании устойчивых линий мягкой пшеницы.
Таким образом, созданные предложенным способом линии могут пополнить генофонд мягкой пшеницы по генам устойчивости и могут быть использованы в селекционных программах как доноры генов для получения устойчивых сортов мягкой пшеницы. Молекулярные ДНК-маркеры, подобранные к генам устойчивости, позволят отбирать линии, содержащие гены устойчивости, без проведения полевых тестов и, соответственно, сократить срок создания новых форм мягкой пшеницы.
Источники информации
1. Friebe В., Jang J., Raupp W.J., Mclntosh R.A., Gill B.S. 1996. Characterization of wheat-alien translocations conferring resistance to diseases and pests: current status. Euphytica, v. 91, p.59-87.
2. Laikova L., Arbusova V., Efremova Т., Popova 0., Leonova I., Ermakova M. 2003. Resistant analogues of cultivar Saratovskaya-29 as donors of the complex resistance against fungal diseases. In: Pros. 1st Central Asian Wheat Conf., June 10-13, Almaty, Kazakhstan.
3. Leonova I.N., L.I.Laikova, O.M.Popova, O.Unger, A.Börner, M.S.Röder. 2007. Detection of quantitative trait loci for leaf rust resistance in wheat-T. timopheevii/T. taushii introgression lines. Euphytica, v. 155, p.79-86.
4. Mains E.B., Jackson H.S. 1926. Physiological specialization in the leaf rust of wheat, Puccinia triticina Erikss. Phytopathol, v. 16, p.89-120.