Влияние стресса на функциональную активность вkca-каналов коронарных сосудов

ВЛИЯНИЕ СТРЕССА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ВКса-КАНАЛОВ коронарных сосудов

МАЙОРОВА С.С.. ЛАЗУКО С.С.. СОЛОДКОВ А.П.

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский

университет»

Резюме. Целью исследования было выяснить характер влияния блокатора Kca-каналов тетраэтиламмония на ауторегуляцию коронарного потока. выраженность реактивной гиперемии. величину коронарного расширительного резерва и сократительную функцию миокарда в изолированных сердцах крыс. перенесших 6-часовой иммобилизационный стресс.

Опыты были проведены на изолированных сердцах крыс - самок. в полость левого желудочка которых вводили латексный баллончик. соединенный с электроманометром. Каждый эксперимент состоял из двух этапов. На первом этапе сердце перфузировали раствором Кребса - Хензелайта. на втором - этим же раствором. но с добавлением тетраэтиламмония (1мМ). В ходе опыта перфу-зионное давление ступенчато повышали от 40 до 120мм рт. ст. с шагом в 20 мм рт. ст. (коронарная ауторегуляция).

У крыс. перенесших иммобилизацию. эффект тетраэтиламмония на тонус сосудов сердца и выраженность максимального гиперемического коронарного потока был ниже на 12%. чем в контроле. КСа-каналы наряду с монооксидом азота и эйкозаноидами представляют собой локальную систему регуляции мио-генного тонуса сосудов сердца крыс. расположенную в их стенке. во-вторых. иммобилизация крыс существенно подавляет активность КСа-каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов.

Ключевые слова, ауторегуляция. коронарные сосуды. КСа-калиевые каналы. стресс.

Abstract. The study was aimed to detect the character of the influence of tetrae-thylamonium KCa _ channels blockers to autoregulation of coronary flow . expression of reactive hyperthermia. the value of coronary dilative reserve and contractile myocardial function in the isolated rat hearts. underwent 6-houres immobilization stress. Experiments were conducted on isolated hearts from female rats. In the cavity of left ventricle the latex balloon connected with electromanometer has been inserted. On the first step of experiment the left ventricle was perfused by Krebs-Henseleit solution; on the second step it was perfused with the same solution in which tetraethyl-monium (1 ^M) was added. During the experiment. the perfusion pressure was stepwise elevated from 40 to 120 mm Hg with 20 mm intervals (coronary autoregulation).

Tetraethylamonium effect on vascular tone and manifestation of maximum hyperemic coronary flow was lower in adapted rats as distinct from control rats. K-channels as nitric monoxide and eicosanoids present the local regulatory system of myogenic vascular tone of rat hearts sited in their wall. secondary _ immobilization

of rats significantly inhibits KCa - channel activity of smooth muscular cells of coronary vessels.

Key words, autoregulation. coronary vessels. KCa - channels. stress.

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь. 210023. г. Витебск. пр. Фрунзе. 27. Витебский государственный медицинский университет.

Кровоток в сердце регулируется путем изменения диаметра. главным образом. резистивных кровеносных сосудов. Одним из важнейших регуляторов сосудистого диаметра является внутрисосудистое давление. Растяжение им сосудистой стенки лежит в основе создания миогенного тонуса. Наряду с этим в сосудистой стенке образуются многочисленные вещества. способные снижать сосудистый тонус и расширять сосуд. Основным источником подобных веществ служит эндотелий. Веществами эндотелиального происхождения. обладающими выраженными дилататорными свойствами. являются оксид азота (NO). простациклин и эндотелиальный фактор гиперполяризации [7].

Однако не только эндотелий способен модулировать тонус сосудистой стенки. Сами гладкомышечные клетки обладают способностью противодействовать увеличению их сократительной активности. Подобное возможно благодаря тому. что в мембране гладкомышечных клеток находятся несколько видов калиевых каналов. Наиболее значимую роль в регуляции миогенного тонуса сосудов. в том числе и коронарных. играют кальцийактивируемые калиевые каналы [8].

При деполяризации мембраны гладкомышечной клетки открываются потенциалзависимые кальциевые каналы. расположенные в мембране. и/или происходит высвобождение ионов кальция из саркоплазматического ретикулума гладкомышечной клетки. В свою очередь. это стимулирует открытие кальций-активируемых калиевых каналов большой проводимости. расположенных в сарколемме гладкого миоцита [1]. Это приводит к выходу калия из клетки и развитию гиперполяризации мембраны [1]. Гиперполяризация сарколеммы сопровождается закрытием потенциал-зависимых и чувствительных к растяжению кальциевых каналов. Таким образом. потенциал-зависимые калиевые каналы представляют собой буферную систему. предназначенную для предупреждения избыточного накопления ионов кальция в саркоплазме гладкомышечной клетки и развития их чрезмерного сокращения.

Экспрессия уникальной популяции К+- каналов в эндотелиоцитах и гладкомышечных клетках изменяется во время сердечно-сосудистых заболеваний. в частности при артериальной гипертензии [6]. Дефект функции К+- каналов может привести к вазоконстрикции или даже развитию вазоспазма. а также стать причиной нарушения способности артерий к вазодилатации (Gauthier R.M.. Rusch N.. 2003г).

При длительном эмоциональном стрессе. по сути. являющемся дистрессом. происходит значительное нарушение как системного. так и локального

кровообращения. Важную роль в механизмах нарушения локального кровотока и тонуса сосудов сердца может играть дисфункция эндотелия и гладкомышечных клеток. в частности. нарушение функций их калиевых каналов. Ранее нами было показано. что при стрессе наблюдается гиперпродукция монооксида азота эндотелиального происхождения [2] и уменьшается функциональная активность АТФ-чувствительных калиевых каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов [5]. Остается не ясным вопрос о том. является ли данное снижение активности АТФ-чувствительных калиевых каналов. наблюдаемое при иммобилизационном стрессе. характерным только для данной субпопуляции каналов или неспецифическим явлением. распространяющимся и на КСа калиевые каналы большой проводимости. находящиеся в гладкомышечных клетках коронарных сосудов. Кроме того. совершенно новым представляется исследование степени базальной активности КСа калиевых каналов. проявляющаяся в модуляции сократительной активности гладкой мышцы и эндотелий зависимых механизмов регуляции тонуса сосудов сердца.

В связи с этим целью исследования было выяснить характер влияния бло-катора К^-каналов тетраэтиламмония на ауторегуляцию коронарного потока. выраженность реактивной гиперемии. величину коронарного расширительного резерва и сократительную функцию миокарда в изолированных сердцах крыс. перенесших 6-часовой иммобилизационный стресс.

Методы

Коронарный поток и сократительную функцию миокарда изучали на препаратах изолированного сердца 21 крысы _ самки. перфузируемого в условиях постоянного давления. которое сокращалось в спонтанном ритме 256±18 уд/мин. Сердца крыс выделяли под уретановым наркозом (0.1 г/100 г массы тела). Перфузию проводили раствором Кребса - Хензелайта следующего состава (мМ/л): NaCl _ 118; KCl _ 4.8; MgSO4 1.18; KH2PO4 -1.2; CaCb _ 2.5; NaHCOs _ 25.0; глюкоза - 5.5; pH _ 7.3-7.4; насыщенным карбогеном (95% О2 и 5% СО2) при температуре 37°С. Постоянную температуру поддерживали при помощи ультратермостата UTU-4 (Польша). Перфузат не рециркулировал. что позволяло поддерживать его состав постоянным на протяжении всего опыта. Величину объемной скорости коронарного потока определяли при помощи электромагнитного флоуметра EFM (HSE Harvard apparatus. Германия). датчик которого находился вблизи аортальной канюли.

Каждый опыт состоял из двух этапов. На первом этапе сердце перфузиро-вали раствором Кребса - Хензелайта. содержащим растворитель в концентрации 0.05% (v/v). на втором _ этим же раствором. но с добавлением тетраэти-ламмония (1 мкМ). В ходе опыта перфузионное давление ступенчато повышали от 40 до 120 мм рт. ст. с шагом в 20 мм рт. ст. (коронарная ауторегуляция). Степень изменения коронарного потока по мере увеличения перфузионного давления. оценивали по индексу ауторегуляции. предложенному Е.Б. Новиковой (1972) [3].

Ар, - Ар,

ИЛ = ——-------------¥.2-

Agi

где AQ1 _ изменение исходного коронарного потока в момент подъема перфузионного давления. AQ2 _ разность между величиной исходного потока и потока. установившегося в процессе ауторегуляторной реакции при новом уровне давления. Коронарный расширительный резерв определяли при перфу-зионном давлении 80 и 120 мм рт.ст. как отношение между величиной коронарного потока. найденного после 60-ти секундного прекращения перфузии (максимальный гиперемический коронарный поток) и исходным потоком.

С целью определения сократительной функции миокарда в полость левого желудочка вводили латексный баллончик постоянного объема. Давление в латексном баллончике регистрировали с помощью датчика Isotec электроманометра HSE Harvard apparatus (Германия) на самописце WeKagraph (Швейцария). В начале каждого эксперимента диастолическое давление в левом желудочке устанавливалось 5-8 мм рт.ст. путем изменения объема жидкости в баллончике. Интенсивность перфузии рассчитывали как отношение объемной скорости коронарного потока к произведению частоты сердечных сокращений и развиваемого внутрижелудочкового давления [4]. Интенсивность перфузии миокарда характеризовала количество перфузионной жидкости. приходящейся на единицу функционирующего миокарда левого желудочка с массой 1 грамм.

Все животные были подразделены на 2 группы: 1-ую - контрольную (n=12). во 2-ую - сердца крыс. перенесших 6-часовую иммобилизацию (n=9).

Концентрация тетраэтиламмония (ТЭА) была выбрана 1Мм. так как при этой концентрации он блокирует кальций-активируемые калиевые каналы эндотелия и гладкомышечных клеток сосудов. В связи с тем. что мы изучали мио-генный ответ стенки коронарных сосудов (ауторегуляцию коронарного потока). то полагали. что изменения объемной скорости коронарного потока. вызываемые тетраэтиламмонием обусловлены изменением функциональной активности кальций-активируемых калиевых каналов большой проводимости (ВКса). находящихся в сарколемме гладких миоцитов сосудистой стенки.

Цифровой материал обработали общепринятыми методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и программы “Statistica 6.0”.

Результаты

В изолированных сердцах крыс. перфузируемых раствором Кребса-Хензелайта. содержащим тетраэтиламмоний по сравнению с контрольной группой животных наблюдалось снижение объемной скорости коронарного потока при перфузионном давлении 80-120 мм рт.ст. в среднем на 23% (р<0.05)(рис.1).

О

о

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0

40

60 80

ПД, мм р.ст.

100

Контроль

контроль+ТЭА

120

Рисунок 1 Влияние тетраэтиламмония на объемную скорость коронарного потока в контрольной группе животных *-р< 0.05 по отношению к той же группе. не содержащей тетраэтиламмо-

ний.

При этом увеличивался индекс ауторегуляции при перфузионном давлении от 60 до 80 на 88% и от 100 до 120 мм рт. ст. на 34%. После блокады тетра-этиламмонием КСа-каналов максимальный гиперемический коронарный поток, определяемый при перфузионном давлении 80 и 120 мм рт.ст., снизился на 2115% соответственно (р<0,05) (рис.4).

*

25 * 20

I

0

1 О

15

10

5

0

80 120

ПД, мм

Контроль  Стресс

Рисунок 4 Изменения. вызванные тетраэтиламмонием в отношении максимального коронарного потока до и после перенесенного стресса

*-р< 0.05 по сравнению с контролем.

*

*

Однако в связи с тем. что одновременно уменьшалась базальная объемная скорость коронарного потока при этих же уровнях перфузионного давления коронарный расширительный резерв достоверно не изменялся. Блокатор кальций-активируемых калиевых каналов не оказывал влияния на сократительную функцию миокарда.

После перенесенного 6-часового иммобилизационного стресса. как уже нами было описано [5. 2]. объемная скорость коронарного потока увеличилась при перфузионном давлении от 80 до 120 мм рт.ст. на 15-29% (рис.2). индекс ауторегуляции уменьшался на 17-40%. максимальный гиперемический коронарный поток не изменялся. а коронарный расширительный резерв снижался при перфузионном давлении 80 и 120 мм рт.ст. на 10-12% соответственно из-за возрастания исходной объемной скорости коронарного потока.

20

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0

40

60

80

ПД, мм рт.ст

100

120

Стресс

Стресс+ТЭА

Контроль

*

Рисунок 2 Влияние тетраэтиламмония на объемную скорость коронарного потока в группе животных. перенесших стресс *-р< 0.05 по сравнению с контролем.

30 п

ПД, мм рт.ст

Контроль+ТЭА  Стресс+ТЭА

Рисунок 3 Изменения. вызванные тетраэтиламмонием в отношении объемной скорости коронарного потока до и после перенесенного стресса

*-р< 0.05 по сравнению с контролем.

Под влиянием иммобилизации развиваемое внутрижелудочковое давление снижалось на 33-28% при перфузионном давлении от 40 до 80 мм рт.ст. по сравнению с контролем. а интенсивность перфузии увеличилась на 54%. что свидетельствовало о развитии явления гиперперфузии миокарда. вызванной по-стрессорным нарушением способности коронарных сосудов к ауторегуляции [1].

Введение в коронарное русло изолированного сердца крыс. перенесших 6-часовую иммобилизацию тетраэтиламмония. сопровождалось снижением объемной скорости коронарного от 100 до 120 мм рт.ст. на 12-10% (р>0.05 по сравнению с контролем) (рис.2. 3) и увеличением индекса ауторегуляции при перфузионном давлении от 60 до80 и от80 до 100 мм рт.ст. на 38% и 67% соответственно. Под влиянием тетраэтиламмония в изолированных сердцах крыс. перенесших иммобилизацию. максимальный гиперемический коронарный поток уменьшался при перфузионном давлении 80 и 120 мм рт.ст. на 9% и 14% соответственно (р<0.05) (для сравнению в контроле - на 22-17%) (рис.4). а коронарный расширительный резерв. как и в контроле не изменялся. Развиваемое внутрижелудочковое давление снижалось в среднем на 9% (р>0.05). Следовательно. иммобилизация сопровождалась снижением эффективности действия тетраэтиламмония в отношении величины объемной скорости коронарного потока и максимального гиперемического коронарного потока. что может быть обусловлено снижением функциональной активности КСа-каналов гладкомышечных клеток.

Обсуждение

В основе ауторегуляции коронарного кровотока лежит способность сосудов суживаться в ответ на увеличение внутрисосудистого давления (феномен Остроумова Бейлиса). При резком увеличении перфузионного давления перво-

начально кровоток избыточно возрастает. а затем устанавливается на уровне. который зависит от активности гладкомышечных клеток. эндотелиоцитов и интенсивности метаболизма мышцы сердца. В первую очередь. это становится возможным благодаря миогенным реакциям. присущим самим гладкомышечным клеткам. сокращающимся в ответ на их растяжение.

Применяемая нами доза тетраэтиламмония (1мМ). как известно. селективно блокирует КСа каналы большой проводимости [8]. Снижение объемной скорости коронарного потока и значительное увеличение индекса ауторегуляции. наблюдаемое после блокады кальцийактивируемых калиевых каналов. свидетельствовало о повышении тонуса сосудов сердца. а степень изменения этих показателей под влиянием тетраэтиламмония выявляла их функциональное значение. Необходимо отметить две особенности действия тетраэтиламмония. Во-первых. в связи с тем. что тетраэтиламмоний изменял эффективность ауторегуляции коронарного потока. которая. главным образом. обусловлена функцией резистивных сосудов сердца. можно заключить. что КСа каналы большой проводимости играют важную роль в регуляции тонуса миокардиальных сосудов сопротивления. Во-вторых. эффект тетраэтиламмония наблюдался не на всех уровнях прфузионнго давления. а начиная с 80 мм рт.ст.. то есть в области ауторегуляции. Следовательно. функциональная активность ВКСа каналов проявляется только в момент сокращения гладкомышечных клеток. возникающего в ответ на растяжение сосудистой стенки

увеличивающимся перфузионным давлением. и представляющим собой основу ауторегуляции коронарного потока. Этот факт отличает их от АТФ-чувствительных калиевых каналов. которые обладают базальной активностью. принимают участие в формировании потенциала покоя и поэтому

коронароконстрикторное влияние их блокатора глибенкламида осуществляется при всех уровнях перфузионного давления. а не только в области ауторегуляции в момент активного сокращения гладкой мышцы сосудистой стенки.

Таким образом. в виде КСа каналов большой проводимости сами гладкомышечные клетки обладают способностью противодействовать

увеличению их сократительной активности. Очевидно. что наиболее значимыми в регуляции миогенного тонуса сосудов в области ауторегуляции. в том числе и коронарных. являются кальцийактивируемые калиевые каналы.

Под влиянием стресса коронароконстрикторное действие тетраэтиламмония оказалось ниже в среднем на 12% (р<0.05). Кроме того. снижение объемной скорости коронарного потока. вызываемое тетраэтиламмонием у стрессированных животных наблюдалось в более узком диапазоне перфузионного давления - лишь при 100 и 120 мм рт.ст. (у животных контрольной группы действие тетраэтиламмония начинало проявляться начиная с 80 мм рт.ст.). После перенесенной 6-часовой иммобилизации индекс ауторегуляции под влиянием блокатора ВКСа каналов снижался на 50% по сравнению с контрольной группой животных. а максимальный гиперемический коронарный поток - на 12%. Следовательно. функциональная активность ВКСа каналов. возникающая в момент сокращения гладкой мышцы. при стрессе

ослаблялась. Необходимо заметить. что данное ослабление обнаруживалось нами у здоровых крыс и происходило на фоне характерного для стресса увеличения продукции монооксида азота [2]. обладающего выраженным вазодилататорным эффектом.

Известно. что монооксид азота и продукты свободнорадикального окисления имеет важное значение в регуляции функциональной активности КСа каналов. В связи с этим можно предположить. что характерное для стресса увеличение в эндотелии. а возможно и в гладкомышечных клетках продукции N0 и продуктов свободнорадикального окисления (супероксид анионы. перекись водорода и др.) [2] вносит существенный вклад в модуляцию функциональной активности калиевых каналов. Очевидно. что дальнейшее изучение особенностей снижения активности КСа-каналов не только гладкомышечных клеток. но и эндотелиоцитов при стрессе создаст условия для понимания механизма нарушений коронарного кровообращения на клеточном уровне при этом состоянии.

Заключение

На основании представленных данных можно заключить:

1. КСа- каналы наряду с монооксидом азота. КАТФ-каналами. эндотелиальным фактором гиперполяризации и эйкозаноидами представляют собой локальную систему регуляции миогенного тонуса сосудов сердца. расположенную в их стенке;

2. КСа- каналы большой проводимости представляют собой одну из систем. расположенных в мембране гладкомышечных клеток и противодействующих увеличению их сократительной активности;

3. Иммобилизация крыс существенно подавляет активность КСа-каналов гладкомышечных клеток коронарных сосудов.

Литература

1. Исследование действия N0 на кальцийактивируемый калиевый канал гладкомышечных клеток артерии крысы / И. В. Грибкова [и др.] // Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. - 2002. - №9 - С. 1199-1200.

2. Солодков. А. П. К механизму развития изменений ауторегуляции коронарного кровотока у крыс с различной чувствительностью к стрессу / А. П. Солодков. И. Ю. Щербинин // Рос. физол. журн. им. И.М. Сеченова. -2002. - Т. 88. №2. - С. 166-175.

3. Новикова. Е. Б. Об ауторегуляции в коронарной системе / Е. Б. Новикова // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 1972. - Т. 58. N 1. - С. 6172.

4. Божко. А.П. Предупреждение стрессорных изменений коронарной ауторегуляции. расширительного резерва коронарных сосудов и сократительной функции изолированного сердца малыми дозами тиреодиных гормонов / А. П. Божко. А. П. Солодков // Физиол. журн. - 1990. - Т. 36. №1. - С. 30-35.

5. Солодков. А. П. Участие АТФ-чувствительных калиевых каналов в ауторегуляции коронарного кровотока при ограничении двигательной

активности крыс. / А. П. Солодков. С. С. Лазуко // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2005. - Т. 91. № 10. - С. 1149-1161.

6. Cytochrome P-450 pathway in acetylcholine-induced canine coronary microvascular vasodilation in vivo / M. D. Widman [et al.] // Am. J. Physiol. - 1998. - Vol. 274. - P. H283-H289.

7. Ion channels in vascular endothelium / B. Nilius [et al.] // Annu. Rev. Physiol. - 1997a. - Vol. 59. - P. 145-170.

8. Role for endothelium derived hyperpolarizing factor in vascular tone in

rat mesenteric and hind limb circulations in vivo / H. C. Parkington [et al.] // J. Physiol. - 2002. - Vol. 542. - P. 929-937.

9. Vanhoutte. P. Endothelium-derived free radicals: for worse and for better

/ P. Vanhoutte // J. Clin. Ivestig. - 2001. - Vol. 107. N 1. - P. 23-25.