Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, и индекс ДНК опухолевых клеток рака молочной железы

THE EXPRESSION OF APOPTOSIS CONTROLLING PROTEINS AND DNA INDEX OF BREAST CANCER PATIENTS CELLS______________________________________________________________

E. I. Glukhova, M. I. Lukashina, V. N. Bogatyrev, A. Yu. Baryshnikov Russian N.N. Blokhin memorial cancer research center RAMS

ABSTRACT

The permanent consistency of cell cycle and death is provided by cell apoptosis. The regulation of apoptosis process is controlled by such genes as p53, bcl-2, bax, etc. Changes of DNA content in living cells leads to increasing of genetic destabilization. So the investigation of correlation of expression of controlling apoptosis genes p53, bcl-2, bax, CD95 and ploidy of tumor cells were the goal of the current study. We have analyzed 128 tissue samples of breast cancer patients. For the assessment of expression of p53, bcl-2, bax, CD95 the immunofluorescence reaction and immunoferment analysis (ABC-method) were used; the ploidy of cells were measured by flow cytofluorimetry. It was showed that the expression of bax is increased and the expression of CD95 is decreased accordingly to the stage of disease development and malignancy of the tumor (p=0.05 and p=0.006, respectively). The expression of p53 has grown accordingly to the stage of disease development but there was not significant statistic value in results. The analysis of marker’s expression in dependence on ploidy has demonstrated the same tendency as in the whole group. So, aneuploidy, increasing of bax and p53 expression, decreasing of CD95 expression can be assessed as indexes of malignant aggression measurement.

Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, и индекс ДНК опухолевых клеток рака молочной железы

Е.И. Глухова, М.И.Лукашина, В.Н.Богатырев, А.Ю.Барышников Российский онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина РАМН

РЕЗЮМЕ

Сохранение клеточного баланса в организме поддерживается засчет апоптоза. Апоптоз регулируют такие гены, как р53, Ьс1-2, Ьах и др. Изменение содержания ДНК в клетках ведет к нарастанию генетической нестабильности. Поэтому изучение взаимосвязи экспрессии р53, Ьс1-2, Ьах и С095, контролирующих апоптоз, и плоидности опухолевых клеток являлось целью данной работы. Было исследовано 128 образцов ткани, полученных от больных раком молочной железы. Для определения экспрессии р53, Ьс1-2, Ьах и СВ95 использовали реакцию иммунофлуоресценции и иммуно-ферментный анализ (АВС-метод), плоидность оценивали методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты свидетельствуют, что экспрессия Ьах нарастает, а СВ95 - снижается в зависимости от стадии за-

болевания и степени злокачественности (р=0,05 and р=0,006, соответсвенно). Экспрессия р53 нарастала в зависимости от стадии заболевания, но статистической значимости достигнуто не было. Анализ экспрессии маркеров в зависимости от плоидности клеток показал такую же тенденцию, что и в целом по группе. По результатам исследования можно сделать вывод, что ане-уплоидия, увеличение экспрессии Ьах и р53, снижение экспрессии CD95 являются показателями агрессивности опухолевого процесса.

Введение

В онкологической практике к группе прогностических факторов рака молочной железы (РМЖ) относят такие клинические признаки, как возраст больной, менструальный статус, размер первичного очага, гис-

тологический тип опухоли, стадию заболевания. Однако, как показывает анализ материалов по раку молочной железы, только клинические признаки не дают четкого ответа на вопросы, связанные с прогнозом [3, 10]. Уровень рецепторов стероидных гормонов - эстрогенов, прогестерона, андрогенов и глюкокортикои-дов также влияет на прогноз и чувствительность РМЖ к гормональному лечению [17]. И тем не менее, клинический опыт свидетельствует о том, что даже в однородных по этим параметрам группах больных, течение опухолевого процесса существенно различается, и поиск дополнительных критериев, отражающих агрессивность опухоли, ее биологические особенности, попреж-нему актуален [1, 4]. В последние годы поиск факторов прогноза сосредоточен на клеточном и субклеточном (молекулярном) уровне. Большое внимание в последние несколько лет уделяют изучению функционирования антионкогенов и онкогенов, таких как bcl-2, Ьах, р53, c-erbB-2, c-myc, int-2 [2,21]. Особое место принадлежит Р53, изменения в котором, как предполагают, запускают развитие опухоли [7,16].

Апоптоз играет важную роль в поддержании гомеостаза, сохранении клеточного баланса, при удалении клеток с генетическими повреждениями, росте и терминальной дифференцировке. До конца не ясен механизм запуска и исполнения программированной клеточной смерти, хотя имеются доказательства, что апоптоз регулируют гены р53, bcl-2, Ьах и другие. Обнаружено также, что процесс ДНК фрагментации ассоциирован с ненормальной экспрессией таких генов, как Fas, ICE (интерлейкин 1 бетта-конвергируемый энзим), р53 и с-тус или bcl-2 [8,9, 26].

Одним из следствий нарушения прохождения фаз клеточного цикла в опухолевых клетках является изменение содержания ДНК (анеуплоидия, полиплоидия), что ведет к нарастанию генетической гетерогенности клеточной популяции. Оценка распределения опухолевых клеток новообразований человека по содержанию ДНК является дополнительным маркером злокачественности карцином человека [18,19].

Некоторые авторы в своих работах подчеркивают значимость изучения корреляции экспрессии Р53, Вс1-2 и плоидности опухолевых клеток в оценке злокачественного потенциала новообразований [13,24,25].

В последние годы сложилось стойкое мотивированное мнение о том, что некоторые биологические характеристики опухоли, например, способность клеток к пролиферации, содержание ДНК, экспрессия некоторых онкогенов и антионкогенов и кодируемых ими белков, несут в себе наравне с классическими клиническими и морфологическими признаками важную дополнительную прогностическую информацию об агрессивности опухолевого процесса.

Материалы и методы исследования

Настоящее исследование основано на анализе данных 128 образцов больных раком молочной железы, получавших лечение в клинике РОНЦ им.Н.Н.Б-лохина РАМН в период с 1999 по 2000год. В исследование включены данные о больных, получивших оперативное лечение в объеме радикальной мастэктомии в различных ее модификациях.

Основную возрастную группу составили больные в возрасте от 31 до 79 лет, средний возраст 53,03+/-11,92. Менструальный статус сохранен у 51 женщины (39,5%), не регулярный у 10 женщин (7,8%), менопауза у 68 женщин (52,7%).

Были исследованы 128 образцов ткани рака молочной железы. Из них 85 (66,4%) - инфильтративного протокового рака (ИПР); 19 (14,8%) - инфильтративного долькового рака (ИДР); 24 (18,8%) - редкие формы рака.

Изучаемый материал - кусочки ткани молочной железы, полученные во время операции, биопсии или трепанобиопсии (94 - полученный при оперативном вмешательстве; 25 - при биопсии опухоли; 10 - трепанобиопсии опухоли). В дальнейшем из этого материала готовили цитопрепараты и суспензию клеток. Клеточную суспензию фиксировали в 70% этаноле для определения плоидности клеток. Цитологические препараты красили по Лейшману для верификации материала. Цитопрепараты хранили при -20°С, после чего их фиксировали в охлажденном (-20°С) 96% этиловом спирте и затем в охлажденном ацетоне и использовали для определения экспрессии биомаркеров Вс1-2, Вах, Р53рап, Р53т1:, 1СО 160 (С095), (таблица 1).

Таблица 1. Характеристика антител, использованных в работе на цитопрепаратах

Маркер Клон Характеристика антител Локализация Разведение Фирма производитель

Bcl-2 МКА, 124 Реагируют с Вс1-2 онкобелком цитоплазма 1:100 DAKO

Вах ПКА Индуктор апоптоза цитоплазма 1:500 DAKO

Р53рап МКА, DO-7 Реагируют с ^-терминальным доменом р53 белка ядро, редко цитоплазма 1:100 DAKO

P53mt МКА, АЬ-3 Реагируют с Р53т1 ядро 1:80 Calbiochem

CD95 МКА, IC0160 Против антигена СБ95 (РавХАро-І), опосредующе-го апоптоз мембрана, цитоплазма 1:100 НПЦ “Медбиоспектр”

Реакция иммунофлуоресценции

Для определения экспрессии поверхностных маркеров, таких как ICO 160 (CD95), цитопрепараты обрабатывали 1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) в течение 15-20 минут. Удаляли р-р BSA и не промывая, наносили первичные МКАТ, инкубировали во влажной камере 1 час при комнатной температуре. После инкубации отмывали дважды в PBS (5-10 минут) и наносили Р(аЬ)2-фрагменты антител против мы-шинных иммуноглобулинов, конъюгированных с Fite в рабочем разведении (1:200). После 30 минутной инкубации в холодильнике при +4°С трижды отмывали в PBS 5-10 минут, покрывали нефлуоресцирующей средой (50% глицерином).

Для определения экспрессии внутриклеточных биомаркеров, таких как Bcl-2, P53pan, P53mt, Вах, проводили дополнительную обработку охлажденным 1% тритоном-Х-100 при +4°С в течение 1-2 минут, затем дважды отмывали в PBS. Далее цитопрепараты окрашивали и оценивали по методике, описанной выше.

Реакцию оценивали в полях с максимальной эксп-рессей маркеров на флуоресцентном микроскопе “Opton” при увеличении х400 в течение 24 часов после постановки, предохраняя от воздействия прямого интенсивного света.

Иммуноферментный анализ

Экспрессию Вах в опухолевых клетках оценивали с помощью пероксидазной реакции.

После обработки цитопрепаратов охлажденным 1% тритоном-Х-100 в течении 1-2 мин при +4°С, блокирование эндогенной пероксидазы проводили 3% перекисью водорода в темноте при комнатной температуре в течении 20 минут, затем отмывали дважды в PBS по 5 минут. После 20 минутной инкубации с 1% BSA наносили первичные МКАТ и инкубировали 16-18 часов в холоде при +4°С. Дважды отмывали в PBS по 5-10 минут. Для визуализации реакции применяли систему LSAB+Detection System (Dako Согр) согласно инструкции, выявление пероксидазной активности проводили с помощью 3,3-диаминобензидина (DAB). Докрашивали ядра гемотоксилином Эрлиха 1 -2 минуты, отмывали, заключали в бальзам. Реакцию оценивали на световом микроскопе “Axiolab” (Zeiss, Германия). Подсчет проводили в областях с максимальным окрашиванием.

Методика лазерной ДНК-проточной цитофлуориметрии

Для лазерной ДНК-проточной цитофлуориметрии использовали суспензию клеток, фиксированную холодным забуференным 70° этанолом (рН=7,2-7,4) (в соотношении 1:3) в течении 24 часов и более. После фиксации клетки окрашивали флуорохромом - пропи-диум йодидом. Фиксированную этанолом клеточную суспензию отмывали трис-НС1-буфером (рН=7,4), центрифугируя 10 минут при 1000 об\мин. К осадку добавляли 1,0 мл трис-НС1-буфера, тщательно ресуспен-дировали. Отбирали 0,4 мл суспензии и добавляли 1,0

мл красителя.

Исследование ДНК проводили на проточном анализаторе EPICS-XL (Coulter, США) с лазерным источником излучения.

Методика анализа клеток в фазах клеточного цикла

Для характеристики степени анеуплоидии клеток опухоли с помощью компьютерных программ анализатора EPICS-XL (Coulter,США) и Multicycle (Phoenix Flow Systems, США) вычисляли индекс ДНК (ИДНК), который характеризовал отношения интенсивности флуоресценции пика анеуплоидных клеток (его номер канала) к диплоидному. Диплоидными опухолями мы считали новообразования, у которых G0/1 пик находится в пределах контрольного пика диплоидных стандартов и соответственно их ИДНК всегда равен 1.0. В анеуплоидных новообразованиях он был больше или меньше 1.0.

В полученной ДНК-гистограмме процент клеточных ядер с различным содержанием ДНК вычисляли по отношению к общему числу исследованных клеток с помощью компьютерной программы Multicycle (Phoenix Flow systems, США, 1994). Программа автоматически расчитывала плоидность опухоли и число клеток в S-фазе клеточного цикла.

Статистическая обработка полученных данных

Статистическую обработку данных проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ Statistica v5.5.A. Непараметрические данные в зависимости от количества наблюдений анализировали с использованием теста с2 или точного критерия Фишера. Различия считали статистически достоверными при р<0,05.

Результаты исследования

Экспрессию онкомаркеров (CD95, Вс1-2, Вах, P53pan, P53mt) оценивали на 128 образцах РМЖ, она различалась по интенсивности и локализации окрашивания. За положительную реакцию принимали окрашивание с интенсивностью 2+/3+ более чем в 10% опухолевых клеток. Окрашивание со слабой интенсивностью и с несоответствующей локализацией относили к отрицательной реакции.

В ходе исследований установили, что наблюдается низкая экспрессия CD95 (рис!). Этот маркер отсутствует в 94 случаях из 124 (75,8%), а обнаружен лишь в 30 (24,2%) случаях (таблица 2). Вс1-2 (рис 2) экспрессировался в 85 случаях из 128 (66,4%). Гиперэкспрессию Вах наблюдали в 33 случаях из 75 (44%). Положительную экспрессию Р53рап (рис 3) и P53mt наблюдали в 42 из 119 (35,3%) и в 50 из 74 (67,6%) случаях соответственно.

При анализе экспрессии биомаркеров установили прямую корреляцию между экспрессией Вс1-2 и Вах (г=0,40; р<0,05), Р53рап и P53mt (г=0,50; р<0,05), Вах и CD95 (г=0,33; р<0,05), Р53рап и Вах (г=0,32; р<0,05), прямую связь между наличием уровнем рецепторов эс-

Рис. 1. Экспрессия С095, окрашивание мембраны опухолевых клеток рака молочной железы, х400.

Таблица 2. Экспрессия онкобелков при РМЖ

экспрессия онкобелков Общее кол-во случаев кол-во положительных случаев

абс. %

СБ95 124 30 24,2

Вс1-2 128 85 66,4

Вах 75 33 44

Р53рап 119 42 35,3

Р53пИ 74 50 67,6

Рис. 2. Цитоплазматическое окрашивание Вс1-2 клеток рака молочной железы, х400.

трогена и экспрессией СБ95 (г=0,3; р<0,05). Зависимость экспрессии онкобелков от возраста и менструального статуса не наблюдали.

При анализе экспрессии биомаркеров, контролирующих апоптоз, в зависимости от ТИМ-стадии, в соответствии с классификацией ВОЗ (таблица 3) отмечали тенденцию увеличения экспресии Вах в зависимости от прогрессирования заболевания (р=0,054). При I стадии Вах экспрессировался в 1 случае из 8 (12,5%), II стадии-в 11 из 33 (38,2%), III стадии-в17 из 28 (60,7%), IV стадии - в 2 случаях из 3 (66,7%). Отметили общую тенденцию к увеличению экспрессии Р53пи в зависимости от увеличения стадии: при I стадии положительных было 8 из 12 (66,7%),а IV -12 случаев из 14 (85,7%).

Таблица 3. Экспрессия Вах при РМЖ в зависимости от ТЫМ-стадии

Вах I стадия П стадия Ш стадия IV стадия р

абс. % абс. % абс. % абс. %

+ 1 12,5 11 38,2 17 60,7 2 66,7 0,05 4

- 7 87,5 21 61,8 11 39,3 1 33,3

“+” - положительная экспрессия; - отрицательная экспрессия

Рис. 3. Экспрессия Р53, опухолевые клетки рака молочной железы окрашены с различной интенсивностью, х400.

В зависимости от стадии заболевания наблюдали достоверное различие в экспрессии СБ95 (р=0,006), Вах (р=0,05). При чем с увеличением распространенности заболевания экспрессия Вах возрастала: с 12,5% случаев на I стадии до 66,7% на IV стадии, для экспрессии СБ95 какой-либо закономерности распределения не наблюдали.

В зависимости от степени злокачественности наблюдали достоверное отличие экспрессии СБ95 (р=0,006) и Вах (р=0,049) (таблица 4).Наблюдали возрастающий уровень экспрессии Вах с увеличением степени злокачественности при РМЖ. Для СБ95 четкой зависимости нет, при низкой степени злокачественности положительную экспрессию наблюдали в 18,8%) случаев, при умеренной - лишь в 6,3% случаев, при высокой - в 32,4%) случаев.

При анализе данных в зависимости отметастазиро-вания исследованный материал разделили на 2 группы: I - без метастазов, II - с метастазами (таблица 5). Отметили достоверное отличие экспрессии Вах (р=0,038) при сравнении этих групп: с появлением метастазов увеличивается уровень экспрессии данного маркера. Так в группе без метастазов положительную экспрессию Вах наблюдали в 3 (18,8%) случаях, а в группе с метастазами - в 22 (51,2%) случаях. Экспрес-

Таблица 4. Экспрессия СР95 и Вах при РМЖ в зависимости от степени злокачественности

Экспрессия онкобелков Ісгепень злокач. Пстепень злокач. Шстепень злокач. Р

абс. % абс. % абс. %

СШ5+ 3 18,8 2 6,3 4 32,4 0,006

СЮ5- 13 81,2 30 93,7 50 67,6

Вах+ 1 12,5 4 30,8 27 51,9 0,049

Вах- 7 87,5 9 69,2 25 48,1

+ - положительная экспрессия;

отрицательная экспрессия.

сию СБ95 в I группе обнаруживали в 5 (12,5%) случаях, а во II группе - в 23 (30,3%) случаях (р-0,058). Уровень Вс1-2, Р53рап, Р53пй в обеих группах практически не отличался (62,5% и 64,9%>, 30,8%о и 37,3%, 71% и 65,1% соответственно). При дальнейшем анализе экспрессии онкобелков II группу разделили на 2 подгруппы: 1 - метастазы в регионарные лимфоузлы и 2 -отдаленные метастазы (печень, легкие, кости и пр.), но ка-ких-либо дополнительных закономерностей и взаимосвязей выявлено не было.

В зависимости от гистологической формы РМЖ отметили достоверное отличие экспрессии Р53т1 (р=0,014) (таблица б), при ИПР и ИДР экспрессию р53 наблюдали значительно чаще, чем в группе редких форм рака. При ИПР СБ95 экспрессировался в 21 случае из 82 (25,6%), Вс1-2 - в 57 случаях из 85 (67,1%>), Вах - в 17 случаях из 44 (40%), Р53рап - в 28 из 79 (35,4%), Р53пй - в 36 случаях из 56 (68,3%). При ИДР СБ95 экспрессировался лишь в 4 случаях из 18 (22,2%), положительную экспрессию Вс1-2 отмечали в 14 случаях из 19 (73,7%>), Вах- в 7 случаях из 12 (58,3%), Р53рап - в 4 из 16 (25%), Р53т1 - в 5 случаях из 7 (71,4%). В группе редких форм рака молочной железы СБ95 экспрессировался в 4 случаях из 21 (19%), Вс1-2 - в 14 из 24 (58,3%), Вах - в 7 из 16 (43,7%), Р53рап - в 8 случаях из 21 (38,Р/о), Р53пй - в 2 случаях из 11 (18,2%>).

В дальнейшем анализировали экспрессию онкобелков внутри групп, разделенных по гистологической форме РМЖ. В группе ИПР экспрессия СБ95 различалась в зависимости от степени злокачественности, но статистической достоверности достигнуто не было (р=0,073). В данной группе экспрессия Вах подчинялась тенденции, обнаруженной при анализе всех случаев, т.е., увеличение экспрессии Вах при прогрессировании заболевания (р=0,062). Анализ экспрессии Р53рап в зависимости от степени злокачественности показал, что между I и II степенью различий нет, а между II и III - наблюдали статистически значимые различия (р=0,04), при увеличении злокачественности возрастает экспрессия Р53рап. Анализ экспрессии онкобелков при ИДР и редких формах рака в зависимости от стадии заболевания и степени злокачественности, достоверных различий не показал.

Эстрогенположительных опухолей было 74 случая (57,8%>), а эстрогенотрицательных - 54 случая (42,2%). При анализе экспрессии онкобелков в зависимости от гормонального статуса не было обнаружено статистически достоверных различий.

Таблица 5. Экспрессия Сй95 и Вах при РМЖ в зависимости от наличия метастазов

Онко- белки Экспрессия Количество случаев Р

без метастазов с метастазами

абс. % абс. %

СБ95 + 5 12,5 23 30,3 0,058

- 35 87,5 53 69,7

Вах + 3 18,8 22 51,2 0,038

- 13 81,8 21 48,8

Таблица 6. Экспрессия в зависимости от формы РМЖ

Онко- белки Эксп- рессия ПИР дир редкие формы Р

абс. % абс. % абс. %

Р53т1 + 36 68,3 5 71,4 2 18,2 0,014

- 20 35,7 2 28,6 9 92,8

Диплоидных опухолей было 43 образца (40,6%), анеуплоидных- 63 образца (59,4%>). Увеличение ане-уплоидии наблюдали при увеличении распространенности процесса и злокачественности опухоли. При анализе зависимости плоидности опухолевых клеток и стадии установили достоверное различие (р=0,048) между этими параметрами. При прогрессировании и распространении опухолевого процесса увеличивается количество анеуплоидных опухолей (р=0,025) (таблица 7).

При ИПР наблюдали большее количество анеуплоидных опухолей (66,2%), чем при других гистологических формах (р=0,027) (таблица 8). При ИДР обнаруживали больше диплоидных случаев (71,1%), при редких формах рака количество диплоидных и анеуплоидных опухолей было примерно поровну. В ИПР эс-трогенположительные опухоли были диплоидными в 10 случаях (23,8%о), анеуплоидными - в 32 случаях (76,2%>); эстрогенотрицательные опухоли были диплоидными в 14 случаях (45,2%>), анеуплоидными - в 17 случаях (54,8%) (р=0,078).

Анализ взаимосвязи пловдности и метастазирова-ния внутри одной гистологической группы показал, что в группе ИПР без метастазов диплоидных опухолей насчитывали 13 случаев (50%), анеуплоидных - 13

20

БИОМАРКЕРЫ

Таблица 7. Плоидность при РМЖ в зависимости от метастазирования

плоидность л\у без метастаз л\у с метастаз отдаден, метастаз р

абс. % абс. % абс. %

диплоидные 20 55,6 21 35,6 0 0 0,02 5

анеуплоидные 16 44,4 38 64,4 5 100

(50%); в группе с метастазами диплоидных было 12 (25%), анеуплоидных-36 (15%) (р=0,04). В группе ИДР и редких форм достоверных отличий не обнаружили.

Анализ экспрессии онкобелков в группе диплоидных опухолей молочных желез в зависимости от степени злокачественности показал, что есть тенденция к повышению уровня экспрессии Вах и P53mt (р=0,042 и р=0,042 соответственно) сростом злокачественности. В диплоидных опухолях увеличивалась экспрессия Р53рап в зависимости от стадии (р=0,037), а экспрессия CD95 снижалась (р=0,059). Экспрессия CD95 в анеуплоидных опухолях достоверно снижалась в зависимости от роста степени злокачественности (р=0,016).

Обсуждение

Нарушение экспрессии онкогенов оказывает существенное влияние на нормальное развитие организма и его гомеостаз, а также вовлечено в различные патологические процессы, включая рак. Поэтому в настоящее время все больше работ посвещено детальному изучению их функционирования и экспрессии соответствующих белков.

Вс1-2 подавляет апоптоз в клетках и его соотношение с проапоптотическим гомологом Вах является важной определяющей клеточной чувствительности к индукции апоптоза. По данным литературы высокая экспрессия Вс1-2 ассоциируется с низким уровнем апоптоза (р<0,001), Вах не коррилирует с Вс1-2, а высокий уровень пролиферации и высокая степень злокачественности связаны с отсутствием экспрессии Вс1-2 (р<0,001) (van Slooten, 1996). По нашим данным существует корреляция между Вс1-2 и Вах (г=0,40; р<0,05).

R.Silvestrini и соавторы (1994) указывали на взаимосвязь между Вс1-2-экспрессией и размером опухоли ((2 и (2) (р=0,01). Van Slooten и соавторы (1996) установили обратную корреляцию между высокой Вс1-2-экс-прессией и большими размерами опухоли (р=0,006). В отличии от других авторов (R.Silvestrini, 1994; van Slooten, 1996; Steck,1996; Joosens,1998), нам не удалось подтвердить связь между экспрессией Вс1-2, эстрогено-выми рецепторами, степенью злокачественности и размером опухоли.

Некоторые литературные данные указывают на связь между экспрессией Вах и стадией (р<0,001), эст-рогеновым статусом (р<0,001), а также о незначительной взаимосвязи с метастазами в лимфоузлы (C.Binder,1996). По этим же данным нет связи между Вах и различными гистологическими типами и размером опухоли. Нами же установлена зависимость меж-

Таблица 8. Распределение плоидности в зависимости от формы РМЖ

плоидность ПИР ДИР редкие формы Р

абс. % абс. % абс. %

диплоидные 25 33,8 10 71,1 8 47,1 0,02 7

анеуплоидные 49 66,2 4 28,9 9 52,9

ду экспрессией Вах и стадией (р=0,05), степенью злокачественности (р=0,05), наличием метастазов (р=0,038); обнаружена прямая корреляция между экспрессией Вах и CD95 (г=0,33; р<0,05).

Анализируя экспрессию Р53рап, мы обнаружили прямую связь с количеством пораженных лимфоузлов (г=0,32; р<0,05), экспрессией Вах (г=0,32; р<0,05) и P53mt (г=0,50; р<0,05). Экспрессия P53mt также коррелировала с количеством пораженных лимфоузлов (г=0,46; р<0,05).

По одним данным литературы нет достоверной связи Р53 с возрастом, гистологической формой, размером, стадией (E.Ioachim,1998; S.Regele,1999), по другим—Р53 коррелирует со стадией и степенью злокачественности (р=0,002 и 0,0025) (Ioakim-Liossi,1998; Hardy-Bessard,1998). В работе van Slooten и соавт. (1996) установили негативную корреляцию между экспрессией Р53 и Вс1-2.

Ioakim-Liossi (1997) утверждал о корреляции плоидности с гистологической формой и клинической стадией (р(0,001 и (0,05); R.Silvestrini (1993) указывал на достоверность связи плоидности с размерами опухоли (р=0,03) и эстрогеновымирецепторами (р=0,05). В нашей работе установлена зависимость плоидности и стадии заболевания (р=0,048), плоидности и наличия метастазов (р=0,025), плоидности и гистологической формы (р=0,027).

В заключении следует отметить, что анеуплоидия, увеличение экспрессии Вах и Р53, снижение экспрессии CD95 являются показателями агрессивности опухолевого процесса. Опухолям молочных желез с такими параметрами необходимо уделять более пристальное внимание.

Список литературы

1. Двойрин В.В., Аксель Е.М., Трапезников Н.Н. Заболеваемость и смертность от злокачественных новообразований населения России и некоторых других стран СНГ в 1993г.// Москва, 1995.

2. Имянитов Е.Н., Князев П.Г. Активация онкогена ERB-b-2 и прогноз течения рака молочной железы у человека.// Вопр. онкологии, 1991, т.37, №5, С.527-

534,.

3. Летягин В.П. Лечение первичного рака молочной железы, отдаленные результаты.// Терапевт.архив, 1992, т.64, №10, С.33-37,.

4. Albanell М., Belluht М., Sole S. Factores prognosticos del cancer de mama con ganglios negativos./ / Med.Clin., 1992, V.99, N 17, P.668-674,.

5. Binder C., Hiddemann W. Programmtd cell death -many questions still to be answered // Ann. Hematol. 1994. V.69, №1. P. 45-55.

6. Binder C., Marx D., Binder L., et al. Expression of Bax in relation to Bcl-2 amd other predictive parameters in breast cancer.// Annals of Oncology, 1996, V7, P. 129-

133..

7. Eriksson E.T. Immunohistochemical expression of the mutant p53 protein and nuclear DNA content during the transition from benign to malidnant breast disease.// Human Pathol., 1994, V.25, N11, P.1228-1233,.

8. Evan G.I., Wyllie A.H., Gilbert C.S., et al.// Cell. 1992, V.69, P.l 19-128.

9. Fernandes-Alhemri T.,Litwack G.,Alnemri E.S.// J.Biol.Chem. 1994, V.269, P.30761-30764.

10. Garne J.P., Aspegren K., Linell F. Primary prognostic factors in invasive breast cancer with special reference to ductal carcinoma and histologic malignancy grade.// Cancer, 1994, V.73, N5, p. 1438-1448.

11. Hardy-Bessard A.C., De Roquancourt A., De Cremoux P., et al. Prognostic value of p53 and Her-2 (over) expression in premenopausal women with node negative breast cancer prospectively treated with no or adjuvant CMF// Annals of Oncology, 1998 V.9, supp 4.

12. Ioacim E., Skopelitou A., Kamina S., et al. p53 protein expression in human breast cancer: an immunohistochemical study including correlation with steroid receptor status, proliferation indices, collagen type

IV, laminin, C-erbB2 oncoprotein and cathepsin.// D. Off. J. of the European Society of Mastology the Breast. 1998.

V.7, p.42-48.

13. loakim-Liossi A., Karakitsos P., Aroni K., et al. p53 Protein expression and DNA ploidy in common epithelial tumors of the ovary.11 Acta Cytol, 1997; V41, P.1714-1718.

14. loakim-Liossi A., Markopoulos C., Karakitsos P., et al. P53 Protein Expression in Benign and Malignant Breast Lesions.// Acta Cytol, 1998; V.42, P.918-922.

15. Joosens E., Makar A., Van Leuven H., et al. Bcl-2 expression and apoptosis in ductal breast cancer. // Annals of Oncology, 1998, V.9, supp. 4.

16. Keiichi I., Hitochi T., Hiraide H., et al. Nuclear p53 immunoreaction associated with poor prognosis of breast cancer. // Jap.J.Cancer Res., 1991, V.82, N 7,

P.835-840.

17. Kommos F., Pfisteres J., Idris T. Steroid receptors in carcinoma of the breast: Results of immunocytochemical and biochemical determination and their effects on shortterm prognosis. // Anal.Quant.Cytol.Histol, 1994, V.16, N3, P.203-210.

18. 0“Reilly S.M., Camplejohn R.S., Barnes D.M., Milis R.R., Allen D., Rubens R.D., Richards M.A. DNA indecs, S-phase fraction, histological grade and prognosis in breast cancer. // Br.J.Cancer, 1990, V.61, N5, P.671-674.

19. Raju U., Zarbo R.J., Kubus J., Schultz D.S. The histologic spectrum of apocrine breast proliferations: A comparative study of morphology and DNA content by Image analysis. //Hum-Pathol, 1993, V.24, N2, P. 173-181.

20. Regele S., Kohlberger P., Vogl F.D., et al. Serum p53 autoantibodies in patients with minimal lesions of ductal carcinoma in situ of the breast. // Br J. Cancer, 1999,

V.81, P.702-704.

21. Sellers H.T., Bunken S.W., Crowe D.R., Conner M.M. Multivariate analysis of clinical and molecular prognostic factors in breast cancer: a 16- year follow-up. / / South.Med, 1994, V.87, N9, P.l 17.

22. Silvestrini R., Daidone M.G., et al. Prognostic sidnificance of proliferative activity and ploidy in nodenegative breast cancer. // Annals of Oncology, 1993, V.4, P.213-219.

23. Silvestrini R., Veneroni S., Daidone M.G., et al. The bcl-2 protein: A prodnostic indicator strongly related to p53 in lymph nodenegative breast cancer patients. // J.Nat.Cancer Inst, 1994, V.86, P.499-504.

24. Stek K., McDonnely T., Sneige N., El-Naggar A. Flow cytometric analysis of apoptosis and bcl-2 in primary breast carcinomas: Clinical and biological implications. / / Cytometry, 1996, V.24, N 2, P.l 16-122.

25. Van Slooten H-J., Clahnen P.C., van Dierendonck J.H., et al. Expression of bcl-2 in node-negative breast cancer is associated with various prognostic factors, but does not predict response to one course of perioperative chemotherapy. // Br J Cancer, 1996, V.74, P.78-85.

26. Yonish-Rounash E., Grunwald D., Wilder S. et al. P53-mediated cell death: relationship to cell cycle control. // Mol Cell Biol, 1993, V.13, P.1415-1423.