Ингибитор вируса гепатита В (ВГВ)
HEPATITIS B VIRUS (HBV) INHIBITOR

Настоящее изобретение относится к новым ингибиторам вируса гепатита В (ВГВ, HBV) в качестве химиотерапевтических средств для лечения ВГВ.
Гепатит В - это инфекционное воспалительное заболевание печени, возникающее вследствие внедрения в организм ВГВ и представляющее серьезную глобальную проблему здравоохранения. Он может вызывать как острые, так и хронические заболевания и подвергать людей высокому риску смерти от цирроза и рака печени. Лечения острого и хронического гепатита В является одной из основных проблем здравоохранения. Острый гепатит В характеризуется неблагоприятным клиническим течением - в условиях стандартной терапии 1% случаев заканчивается летально, в 10% случаев заболевание переходит в хронический гепатит. Развившийся хронический гепатит приводит, в свою очередь, к циррозу и первичному раку печени.
Россия относится к странам со средней степенью распространенности ВГВ. В 2016 году смертность от вирусных гепатитов составила около 1,4 млн человек [http://www.vector.nsc.ru/virasnyie-gepatity/]. Важно отметить, что 98% смертей обусловлены развитием конечных стадий хронических гепатитов В (ХГВ) и С (ХГС). Для решения проблемы мировой эпидемии хронического гепатита В необходим постоянный поиск новых препаратов для лечения гепатита В.
Основные усилия в последние 10 лет были направлены на профилактику гепатита В путем внедрения повсеместной вакцинации. С 1982 года доступна вакцина против гепатита В. Эта вакцина эффективна в предотвращении инфекции и ее хронических последствий на 95%. Однако предотвращение инфекции не решает вопрос необходимости лечения как минимум 3 млн. больных хроническим гепатитом В в России и еще порядка 240-350 млн. в мире. Таким образом, хронический гепатит В продолжает оставаться глобальной проблемой.
В настоящее время существует только 2 варианта лечения ХГВ:
иммуномодуляторами (препараты интерферона интерферон альфа-2а, пэгилированный интерферон альфа-2а) или аналогами нуклеотидов или нуклеозидов (АН). Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. К преимуществам терапии интерфероном можно отнести отсутствие генотипической резистентности вируса, а к недостаткам широкий спектр противопоказаний (например, декомпенсированный цирроз печени), широкий спектр побочных эффектов, включая слабость, гриппоподобные симптомы, депрессию, подавление функций костного мозга, обострение аутоиммунных заболеваний, а также неудобство использования (часто препарат вводится подкожно) [https://ru.wikipedia.org/]. У большинства людей терапия не излечивает инфекцию ВГВ, а только подавляет репликацию вируса. Поэтому лечение ВГВ должно продолжаться в течение всей жизни [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/].
Терапия аналогами нуклеотидов или нуклеозидов демонстрирует выраженное противовирусное действие, имеет удобный режим дозирования (перорально), сравнительно редкие побочные реакции. В настоящее время одобрено 5 препаратов -аналогов нуклеотидов или нуклеозидов для лечения ХГВ: ламивудин (аналог цитидина), энтекавир (нуклеозидный аналог гуанозина), телбивудин (нуклеозидный аналог тимидина), тенофовир (нуклеотидный аналог аденина), адефовир (нуклеозидный аналог аденина) [http://infectious.ru/docs/rekomendacii_gepatit_b.pdf]. Механизм действия указанных препаратов связан с ингибированием реакций обратной транскрипции РНК вируса гепатита В в одноцепочечную ДНК. В целом, аналоги нуклеотидов или нуклеозидов хорошо переносятся пациентами, не вызывая значительных побочных эффектов. Однако, в некоторых случаях наблюдается лактатный ацидоз и нефротоксичность. Нуклеозиды ламивудин, телбивудин и нуклеотид адефовир морально устарели и не рекомендуются ввиду низкого порога резистентности и возможности формирования перекрестной резистентности вируса к энтекавиру и препаратам тенофовира соответственно. Прием энтекавира противопоказан при беременности; а тенофовир обладает нефротоксичностью [http://kna-s31.edu.27.ru/files/documents/898_gepatit_v.docx].
Основной проблемой терапии ХГВ с помощью АН является возникающая устойчивость ВГВ к препаратам. В гене обратной транскриптазы вируса происходят мутации, которые предотвращают связывание препаратов с ферментом в активном сайте. При отмене терапии наблюдается быстрый рецидив заболевания, что не позволяет спрогнозировать сроки лечения.
Самой важной задачей в терапии ХГВ на сегодняшний момент является разработка новых перспективных препаратов, способных воздействовать на жизненный цикл вируса в организме, которые могут быть использованы в комбинации с иммуномодулирующими агентами, что, в конечном итоге, должно привести к полной элиминации вируса из организма, недостижимой в настоящий момент.
Ниже приведены определения терминов, которые использованы в описании этого изобретения.
1
6
«Алкил» относится к насыщенным с линейной или разветвленной цепью углеводородным радикалам, содержащим от одного до шести атомов углерода. Примеры алкильных радикалов C-С, включают, но не ограничиваются ими, метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил и трет-бутил.
«Арил» означает ароматическую моноциклическую или полициклическую систему, включающую от 6 до 14 атомов углерода, преимущественно от 6 до 10 атомов углерода. Арил может содержать один или более «заместителей циклической системы», которые могут быть одинаковыми или разными.
«Галоген» означает фтор, хлор, бром и йод. Предпочтительными являются фтор, хлор и бром.
3
«Метокси группа» обозначает группу -О-СН.
2
«Карбокси группа» означает группу -СОН.
Термин «необязательно замещенный» означает, что упомянутая группа может быть замещена в одном или более положениях любым одним или любой комбинацией радикалов.
Термин «кристаллическая форма» означает структуру вещества, характеризующуюся упаковкой образующих ее молекул в один из видов кристаллической решетки.
Термин «поликристаллическая форма» означает структуру вещества, имеющую поликристаллическое строение, т.е. состоящую из множества мелких монокристаллов, т.е. кристаллитов определенной кристаллической формы.
Термин «активный компонент» (лекарственное вещество) относится к физиологически активному веществу синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, бактериального и так далее) происхождения, обладающему фармакологической активностью, которое является активным ингредиентом фармацевтической композиции.
«Лекарственное начало» (лекарственная субстанция лекарственное вещество, drug-substance) означает физиологически активное вещество синтетического или иного (биотехнологического, растительного, животного, микробного и прочего) происхождения, обладающее фармакологической активностью и являющееся активным началом фармацевтической композиции, используемой для производства и изготовления лекарственного препарата (средства).
«Лекарственное средство (препарат)» - вещество (или смесь веществ в виде фармацевтической композиции), в виде таблеток капсул инъекций, мазей и др. готовых форм предназначенное для восстановления, исправления или изменения физиологических функций у человека и животных, а также для лечения и профилактики болезней, диагностики, анестезии, контрацепции, косметологии и прочего.
Предметом данного изобретения являются новые ингибиторы вируса гепатита В (ВГВ, HBV) в качестве химиотерапевтических средств для лечения ВГВ, представляющие собой эфиры 4-аминофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты общей формулы 1,
1
где R представляет собой метил или этил,
2
R представляет собой алкил или арил,
3
R представляет собой водород, алкил или арил,
4
5
R, R представляют собой водород, алкил, арил, необязательно одинаковые, а также циклические заместители, содержащие атомы азота, кислорода или серы, предпочтительно, пирролидинил, пиперидил, пиперазинил, возможно содержащие алкильные, арильные заместители или сложноэфирную или амидную группы.
Предпочтительно предметом данного изобретения являются новые ингибиторы вируса гепатита В (ВГВ, HBV) в качестве химиотерапевтических средств для лечения ВГВ, представляющие собой соединения формул 1.1, 1.2, 1.3
Заявляемые ингибиторы представляют собой соединения, не являющиеся новыми, поскольку их структурные формулы известны из коммерчески доступных баз данных. Заявляемые соединения попадают под общую формулу соединений, которые обладают свойствами ингибиторов казеинкиназы 1 дельта (CKldelta), и могут быть применены при лечении нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера [WO 2012080729, «CASEIN KINASE 1 delta (CKl delta) INHIBITORS», ELECTROPHORETICS LIMITED (GB), 21.06.2012]. Однако в научной и патентной литературе отсутствуют данные о способе их получения, физико-химических, спектральных свойствах, а также об их биологической активности в отношении ВГВ инфекции. Отсутствуют источники, в которых соединения общей формулы 1 были бы описаны в качестве лекарственного средства для лечения вирусного гепатита. Авторы выявили их новое свойство, а именно, способность ингибировать вирус гепатита В (ВГВ, HBV), что является техническим решением в качестве предмета «применение продукта или способа по определенному (новому) назначению», а именно, в качестве лекарственного средства для лечения вирусного гепатита В, и таким образом соединения общей формулы 1 обладают новизной и изобретательским уровнем.
Предметом данного изобретения является также способ получения эфиров 4-аминофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты общей формулы 1.
3
Способ получения эфиров 4-аминофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты общей формулы 1 представлен на схеме 1. Он заключается в конденсации эфира 2-хлорацетоуксусной кислоты 2 с малонодинитрилом 3, ведущей к образованию эфиров 2-амино-3-цианофуран-4-карбоновой кислоты 4, последующем ее гидролизе с образованием эфиров 2-амино-3-карбоксамидофуран-4-карбоновой кислоты 5. Последующая конденсация продуктов 5 с орто-эфирами 6 приводит к эфирам 4-оксо-3,4-дигидрофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 7. Обработка продукта 7 POCl и взаимодействие образующихся эфиров 4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8 с аминами 9 дает заявляемые эфиры 4-аминофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты общей формулы 1.
Схема 1. Получение эфиров 4-аминофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты общей формулы 1.
Предметом настоящего изобретения является активный компонент, обладающий свойством ингибитора ВГВ, представляющий собой эфир 4-аминофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты общей формулы 1.
Предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, для лечения инфекции гепатита В, содержащая в эффективном количестве соединение формулы общей 1 и фармацевтически приемлемые добавки.
Предпочтительно предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция в которой соединение общей формулы 1 содержится в количестве от 1 до 1000 мг.
Предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция в которой фармацевтически приемлемые добавки выбирают из применяемых в сфере фармацевтики разбавителей, вспомогательных агентов и носителей.
Предметом настоящего изобретения является способ лечения гепатита В и/или других вирусных инфекций посредством введения в эффективном количестве соединения общей формулы 1 или фармацевтической композиции нуждающемуся в этом реципиенту.
Предметом настоящего изобретения является применение соединения формулы 1 для получения лекарственного средства для лечения гепатита В и/или других вирусных инфекций.
Настоящее изобретение далее будет описано в связи с определенными вариантами осуществления, которые не предназначены для ограничения его объема. Напротив, настоящее изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем формулы изобретения. Таким образом, следующие примеры, которые включают в себя конкретные варианты, иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.
Пример 1. Синтез этилового эфира 2-амино-5-метил-3-цианофуран-4-карбоновой кислоты 4.
Металлический натрий (23 г, 1 моль) растворяли в абсолютном этаноле (1000 мл). К полученному раствору добавляли малонодинитрил 3 (66 г, 1 моль) и охлаждали до - 10°С. Затем к реакционной массе добавляли по каплям раствор этилового эфира 2-хлорацетоуксусной кислоты 2 (164,6 г, 1 моль) в абсолютном этаноле (500 мл) при перемешивании с такой скоростью, чтобы температура реакционной массы не превышала 20°С. Реакционную смесь перемешивали еще в течение 30 минут при комнатной температуре и выливали в воду (4500 мл). Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили на воздухе. Получали 134 г (69%) этилового эфира 2-амино-5-метил-3-цианофуран-4-карбоновой кислоты 4.
Пример 2. Синтез этилового эфира 2-амино-3-карбоксамидо-5-метилфуран-4-карбоновой кислоты 5.
2
4
Этиловый эфир 2-амино-5-метил-3-цианофуран-4-карбоновой кислоты 4 (97,1 г, 0,5 моль) растворяли по порциям в концентрированной HSO (873 мл) при 20°С при интенсивном перемешивании. Затем реакционную массу нагревали до 50-55°С и выдерживали при этой температуре в течение 3 часов. Затем реакционную смесь выливали на лед и подщелачивали водным раствором аммиака до рН=8-9. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили. Получали 65,8 г (62%) этилового эфира 2-амино-3-карбоксамидо-5-метилфуран-4-карбоновой кислоты 5.
Пример 3. Синтез этилового эфира 6-метил-4-оксо-3,4-дигидрофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 7.1.
Этиловый эфир 2-амино-3-карбоксамидо-5-метилфуран-4-карбоновой кислоты 5 (53 г, 0,25 моль) растворяли по порциям в уксусном ангидриде (340 мл), добавляли 1,1,1-триэтоксиметан 6.1 (47 г, 0,25 моль). Реакционную массу нагревали до 120-130°С и перемешивали при этой температуре в течение 8 часов. Затем реакционную смесь охлаждали до 0°С и выдерживали при этой температуре для образования осадка. На следующий день, образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали холодным EtOH и сушили. Получали 37,8 г (68%) этилового эфира 6-метил-4-оксо-3,4-дигидрофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 7.1.
Пример 4. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-оксо-3,4-дигидрофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 7.2.
Аналогично Примеру 3 из этилового эфира 2-амино-3-карбоксамидо-5-метилфуран-4-карбоновой кислоты 5 (53 г, 0,25 моль) и 1,1,1-триэтоксиэтана 6.2 (40,5 г, 0,25 моль) получали 40,8 г (69%) этилового эфира 2,6-диметил-4-оксо-3,4-дигидрофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 7.2.
Пример 5. Синтез этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1.
3
3
4
К перемешиваемой суспензии этилового эфира 6-метил-4-оксо-3,4-дигидрофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 7.1 (33,3 г, 0,15 моль) в сухом толуоле (200 мл) добавляли N,N-диметиланилин (18,25 г, 0,15 моль), POCl (115 г, 0,75 моль) и кипятили при перемешивании в течение 5 часов. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь выливали на лед и подщелачивали водным раствором NaOH до рН=8-9. Органический слой отделяли, а водный экстрагировали толуолом. Объединенный экстракт промывали последовательно водным раствором HCl, водой и 5% водным раствором NaHCO. Экстракт сушили над MgSO в присутствии активированного угля и упаривали. Остаток кристаллизовали из гексана, отфильтровывали и сушили в эксикаторе под вакуумом. Получали 31 г (86%) этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1.
Пример 6. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2.
Аналогично примеру 5 из этилового эфира 2,6-диметил-4-оксо-3,4-дигидрофуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 7.2 (35,4 г, 0,15 моль) получали 31,3 г (82%) этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2.
Пример 7. Синтез этилового эфира 6-метил-4-[4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.1.
1
К раствору этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) в сухом диоксане (5 мл) добавляют триэтиламин (0,21 г, 1,2 ммоль) и 1-(4-метоксифенил)пиперазин 9.1 (0,21 г, 1,2 ммоль). Реакционную смесь перемешивают 4-6 часов при 45-55°С. После охлаждения смесь разбавляют водой и экстрагируют толуолом. Экстракт упаривают и хроматографируют на силикагеле (элюент гексан : этилацетат 9:1). Получают 0,31 г (79%) этилового эфира 6-метил-4-[4-(4-метоксифенил)пиперазин-1-ил]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.1. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.24 (с, 1H), 6.82 (д, J=8.0 Гц, 2Н), 6.73 (д, J=8.0 Гц, 2Н), 4.32 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.74-3.66 (м, 7Н), 3.09 (t, J=7.0 Гц, 4Н), 2.67 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 8. Синтез этилового эфира 6-метил-4-[4-(пиримидин-2-ил)пиперазин-1-ил]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.2.
1
Аналогично Примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и 2-(пиперазин-1-ил)пиримидина 9.2 (0,20 г, 1,2 ммоль) получали 0,29 г (78%) этилового эфира 6-метил-4-[4-(пиримидин-2-ил)пиперазин-1-ил]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.2 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.28-8.22 (м, 3Н), 6.50 (т, J=6.6 Гц, 1Н), 4.35 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.94-3.85 (м, 4Н), 3.64-3.56 (м, 4Н), 2.67 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 9. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-[3-(этоксикарбонил)пиперидин-1-ил]фуро[2,3-е]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.3.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (35,4 г, 0,15 моль) и этилового эфира пиперидин-3-карбоновой кислоты 9.3 (0,19 г, 1,2 ммоль) получали 0,29 г (80%) этилового эфира 2,6-диметил-4-[3-(этоксикарбонил)пиперидин-1-ил]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.3 Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 4.30 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.07-3.96 (м, 3Н), 3.90-3.80 (м, 1Н), 3.20-3.05 (м, 2Н), 2.66-2.54 (м, 4Н), 2.44 (с, 3Н), 2.04-1.92 (м, 1Н), 1.74-1.42 (м, 3Н), 1.30 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.15 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 10. Синтез этилового эфира 4-(3-гидрокси-1-этокси-1-оксобутан-2-иламино)-6-метилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.4.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и этилового эфира 2-амино-3-гидроксимасляной кислоты 9.4 (0,18 г, 1,2 ммоль) получали 0,25 г (71%) этилового эфира 4-(3-гидрокси-1-этокси-1-оксобутан-2-иламино)-6-метилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.4. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.64 (д, J=7.0 Гц, 1H), 8.23 (с, 1Н), 5.28 (с, 1Н), 4.72 (д, J=7.0 Гц, 1Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.28 (квn, J=7.0 Гц, 1Н), 4.09 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.70 (с, 3Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.24-1.10 (м, 6Н).
Пример 11. Синтез этилового эфира 6-метил-4-[3-(трифторметил)фениламино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.5.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и 3-(трифторметил)анилина 9.5 (0,19 г, 1,2 ммоль) получали 0,25 г (70%) этилового эфира 6-метил-4-[3-(трифторметил)фениламино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.5. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 10.30 (с, 1H), 8.24 (с, 1Н), 8.02 (с, 1Н), 7.75 (д, J=8.0 Гц, 1H), 7.51 (т, J=8.0 Гц, 1H), 7.40 (д, J=8.0 Гц, 1Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.67 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 12. Синтез этилового эфира 6-метил-4-(3-хлорфениламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.6.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и 3-хлоранилина 9.6 (0,15 г, 1,2 ммоль) получали 0,24 г (72%) 6-метил-4-(3-хлорфениламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.6. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 10.33 (с, 1Н), 8.24 (с, 1Н), 7.82 (с, 1Н), 7.45 (д, J=8.0 Гц, 1H), 7.31 (т, J=8.0 Гц, 1H), 7.04 (д, J=8.0 Гц, 1H), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2H), 2.67 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 13. Синтез этилового эфира 6-метил-4-(3-метоксифениламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.7.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и 3-метоксианилина 9.7 (0,15 г, 1,2 ммоль) получали 0,25 г (75%) этилового эфира 6-метил-4-(3-метоксифениламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.7.Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 10.22 (с, 1Н), 8.24 (с, 1Н), 7.38 (с, 1Н), 7.22-7.06 (м, 2Н), 6.57 (д, J=8.0 Гц, 1Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.84 (с, 3Н), 2.67 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 14. Синтез этилового эфира 6-метил-4-[(тетрагидрофуран-2-ил)метиламино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.8.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и (тетрагидрофуран-2-ил)метанамина 9.8 (0,12 г, 1,2 ммоль) получали 0,22 г (72%) этилового эфира 6-метил-4-[(тетрагидрофуран-2-ил)метиламино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.8.H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.30 (т, J=7.0 Гц, 1Н), 8.24 (с, 1Н), 4.35 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.05 (квn, J=7.0 Гц, 1Н), 3.82 (кв, J=7.0 Гц, 1H), 3.64 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.55-3.48 (м, 1Н), 2.66 (с, 3Н), 2.02-1.82 (м, 3Н), 1.56 (квn, J=7.0 Гц, 1Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 15. Синтез этилового эфира 6-метил-4-(фуран-2-илметиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.9.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и фуран-2-илметанамина 9.9 (0,12 г, 1,2 ммоль) получали 0,24 г (80%) этилового эфира 6-метил-4-(фуран-2-илметиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.9. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.48 (т, J=7.0 Гц, 1Н), 8.25 (с, 1Н), 7.52 (д, J=4.0 Гц, 1Н), 6.35 (т, J=4.0 Гц, 1Н), 6.23 (д, J=4.0 Гц, 1Н), 4.72 (д, J=7.0 Гц, 2Н), 4.25 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.63 (с, 3Н), 1.25 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 16. Синтез этилового эфира 6-метил-4-(4-этоксифениламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.10.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и 4-этоксианилина 9.10 (0,16 г, 1,2 ммоль) получали 0,25 г (73%) этилового эфира 6-метил-4-(4-этоксифениламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.10. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 10.15 (с, 1Н), 8.25 (с, 1Н), 7.68 (д, J=7.6 Гц, 2Н), 6.85 (д, J=7.6 Гц, 2Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.02 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.70 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.30 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 17. Синтез этилового эфира 4-(2,5-диметоксифениламино)-6-метилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.11.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и 2,5-диметоксианилина 9.11 (0,19 г, 1,2 ммоль) получали 0,25 г (70%) этилового эфира 4-(2,5-диметоксифениламино)-6-метилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.11. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 10.15 (с, 1Н), 8.24 (с, 1Н), 7.36 (с, 1Н), 7.15 (д, J=8.0 Гц, 1Н), 6.57 (д, J=8.0 Гц, 1Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.84 (с, 3Н), 3.78 (с, 3Н), 2.67 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 18. Синтез этилового эфира 6-метил-4-(3-этоксипропиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.12.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и 3-этоксипропиламина 9.12 (0,12 г, 1,2 ммоль) получали 0,23 г (75%) этилового эфира 6-метил-4-(3-этоксипропиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.12. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.24 (с, 1Н), 8.18 (т, J=7.0 Гц, 1H), 4.34 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.55 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.50-3.38 (м, 4Н), 2.63 (с, 3Н), 1.60 (квn, J=7.0 Гц, 2Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.09 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 19. Синтез этилового эфира 6-метил-4-(1-этокси-1-оксопропан-2-иламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.13.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и этилового эфира 2-аминопропионовой кислоты 9.13 (0,14 г, 1,2 ммоль) получали 0,23 г (72%) этилового эфира 6-метил-4-(1-этокси-1-оксопропан-2-иламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.13. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.51 (д, J=7.0 Гц, 1Н), 8.26 (с, 1H), 4.72 (квn, J=7.0 Гц, 1Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.13 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.70 (с, 3Н), 1.49 (д, J=7.0 Гц, 3Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.15 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 20. Синтез этилового эфира 6-метил-4-[2-(тиофен-3-ил)этиламино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.14.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и 2-(тиофен-3-ил)этиламина 9.14 (0,15 г, 1,2 ммоль) получали 0,26 г (79%) этилового эфира 6-метил-4-[2-(тиофен-3-ил)этиламино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.14. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.25 (с, 1Н), 8.20 (т, J=7.0 Гц, 1H), 7.45 (с, 1Н), 7.24 (д, J=6.4 Гц, 1Н), 7.05 (д, J=6.4 Гц, 1Н), 4.30 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.75 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.81 (т, J=7.0 Гц, 2Н), 2.65 (с, 3Н), 1.30 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 21. Синтез этилового эфира 4-(бензиламино)-6-метилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.15.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и бензиламина 9.15 (0,13 г, 1,2 ммоль) получали 0,26 г (84%) этилового эфира 4-(бензиламино)-6-метилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.15. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.52 (т, J=7.0 Гц, 1H), 8.25 (с, 1H), 7.35-7.20 (м, 5Н), 4.75 (д, J=7.0 Гц, 2Н), 4.33 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.65 (с, 3Н), 1.29 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 22. Синтез этилового эфира 6-метил-4-(пропиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.16.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и пропиламина 9.16 (0,08 г, 1,5 ммоль) получали 0,22 г (84%) этилового эфира 6-метил-4-(пропиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.16. H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.24 (с, 1Н), 8.20 (т, J=7.0 Гц, 1H), 4.32 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.46 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.62 (с, 3Н), 1.60 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 0.97 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 23. Синтез этилового эфира 4-(3-гидрокси-1-этокси-1-оксопропан-2-иламино)-6-метилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.17.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 6-метил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.1 (0,24 г, 1 ммоль) и этилового эфира 2-амино-3-гидроксипропионовой кислоты 9.17 (0,16 г, 1,2 ммоль) получают 0,24 г (71%) этилового эфира 4-(3-гидрокси-1-этокси-1-оксопропан-2-иламино)-6-метилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.17. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.72 (д, J=7.0 Гц, 1H), 8.26 (с, 1Н), 5.25 (т, J=7.0 Гц, 1H), 4.82 (д, J=7.0 Гц, 1Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.13 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.95-3.80 (м, 2Н), 2.72 (с, 3Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.20 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 24. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-(циклогексиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.18.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и циклогексиламина 9.18 (0,12 г, 1,2 ммоль) получали 0,24 г (76%) этилового эфира 2,6-диметил-4-(циклогексиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.18. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.18 (д, J=7.0 Гц, 1H), 4.35 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.18-4.05 (м, 1Н), 2.66 (с, 3Н), 2.40 (с, 3Н), 1.98-1.88 (м, 2Н), 1.73-1.50 (м, 3Н), 1.44-1.26 (м, 8Н).
Пример 25. Синтез этилового эфира 4-(2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-иламино)-2,6-даметилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.19.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и 2,3-дигидробензо[b][1,4]диоксин-6-амина 9.19 (0,18 г, 1,2 ммоль) получали 0,26 г (70%) этилового эфира 4-(2,3-дигадробензо[b][1,4]диоксин-6-иламино)-2,6-диметилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.19.H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 10.26 (с, 1H), 7.55 (д, J=2.4 Гц, 1Н), 6.98 (dd, J1=8.0 Гц, J2=2.4 Гц, 1Н), 6.83 (д, J=8.0 Гц, 1Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.28-4.20 (м, 4Н), 2.67 (с, 3Н), 2.48 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 26. Синтез этилового эфира 4-(бутан-2-иламино)-2,6-диметилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.20.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d] пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и 2-аминобутана 9.20 (0,09 г, 1,2 ммоль) получали 0,21 г (72%) этилового эфира 4-(бутан-2-иламино)-2,6-диметилфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.20. H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.02 (д, J=7.0 Гц, 1Н), 4.34 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.19 (квn, J=7.0 Гц, 1Н), 2.65 (с, 3Н), 2.40 (с, 3Н), 1.55 (квn, J=7.0 Гц, 2Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.18 (д, J=7.0 Гц, 3Н), 0.90 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 27. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-(2-метоксиэтиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.21.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и 2-метоксиэтиламина 9.21 (0,09 г, 1,2 ммоль) получали 0,22 г (75%) этилового эфира 2,6-диметил-4-(2-метоксиэтиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.21. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.14 (т, J=7.0 Гц, 1Н), 4.34 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.65 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.53 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.31 (с, 3Н), 2.65 (с, 3Н), 2.40 (с, 3Н), 1.34 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 28. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-(диэтиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.22.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и диэтиламина 9.22 (0,09 г, 1,2 ммоль) получали 0,20 г (70%) этилового эфира 2,6-диметил-4-(диэтиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.22. H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 4.28 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.50 (кв, J=7.0 Гц, 4Н), 2.55 (с, 3Н), 2.45 (с, 3Н), 1.31 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.07 (т, J=7.0 Гц, 6Н).
Пример 29. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-(3-метилбутиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.23.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и 3-метилбутан-1-амина 9.23 (0,11 г, 1,2 ммоль) получали 0,25 г (82%) этилового эфира 2,6-диметил-4-(3-метилбутиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.23. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.01 (т, J=7.0 Гц, 1Н), 4.34 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.53 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.65 (с, 3Н), 2.40 (с, 3Н), 1.68 (ср, J=7.0 Гц, 1Н), 1.48 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 0.94 (д, J=7.0 Гц, 6Н).
Пример 30. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-(1-этокси-1-оксопропан-2-иламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.24.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и этилового эфира 2-аминопропионовой кислоты 9.13 (0,14 г, 1,2 ммоль) получали 0,25 г (75%) этилового эфира 2,6-диметил-4-(1-этокси-1-оксопропан-2-иламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.24. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.33 (д, J=7.0 Гц, 1H), 4.68 (квn, J=7.0 Гц, 1Н), 4.37 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 4.13 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.64 (с, 3Н), 2.39 (с, 3Н), 1.49 (д, J=7.0 Гц, 3Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.15 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 31. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-[(фуран-2-илметил)(метил)амино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.25.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и N-метил-1-(фуран-2-ил)метанамина 9.24 (0,13 г, 1,2 ммоль) получали 0,23 г (70%) этилового эфира 2,6-диметил-4-[(фуран-2-илметил)(метил)амино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.25. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 7.55 (д, J=4.5 Гц, 1Н), 6.39 (т, J=4.5 Гц, 1Н), 6.35 (д, J=4.5 Гц, 1Н), 4.78 (с, 2Н), 4.25 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.96 (с, 3Н), 2.55 (с, 3Н), 2.46 (с, 3Н), 1.25(т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 32. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-[3-(2-метилпиперидин-1-ил)пропиламино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.26.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и 3-(2-метилпиперидин-1-ил)пропан-1-амина 9.25 (0,19 г, 1,2 ммоль) получали 0,26 г (70%) этилового эфира 2,6-диметил-4-[3-(2-метилпиперидин-1-ил)пропиламино]фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.26. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.08 (д, J=7.0 Гц, 1Н), 4.34 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.46 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.82-2.62 (м, 5Н), 2.39 (с, 3Н), 2.26-2.18 (м, 2Н), 2.03 (т, J=7.0 Гц, 1H), 1.70 (квn, J=7.0 Гц, 2Н), 1.58-1.42 (м, 4Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 1.24-1.16 (м, 2Н), 0.97 (д, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 33. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-(пропиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.27.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и пропиламина 9.16 (0,08 г, 1,5 ммоль) получали 0,27 г (83%) этилового эфира 2,6-диметил-4-(пропиламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.27. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 8.04 (т, J=7.0 Гц, 1Н), 4.32 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 3.44 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.62 (с, 3Н), 2.40 (с, 3Н), 1.60 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 1.35 (т, J=7.0 Гц, 3Н), 0.97 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 34. Синтез этилового эфира 2,6-диметил-4-(4-метилфениламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.28.
1
Аналогично примеру 7 из этилового эфира 2,6-диметил-4-хлорфуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 8.2 (0,25 г, 1 ммоль) и 4-метиланилина 9.26 (0,13 г, 1,2 ммоль) получали 0,24 г (74%) этилового эфира 2,6-диметил-4-(4-метилфениламино)фуро[2,3-d]пиримидин-5-карбоновой кислоты 1.28. Н ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ: 10.35 (с, 1H), 7.67 (д, J=7.6 Гц, 2Н), 7.15 (д, J=7.6 Гц, 2Н), 4.40 (кв, J=7.0 Гц, 2Н), 2.70 (с, 3Н), 2.48 (с, 3Н), 2.30 (с, 3Н), 1.39 (т, J=7.0 Гц, 3Н).
Пример 35. Исследование подавления развития ВГВ в культуре гепатомы человека HepG2 и цитотоксического эффекта ингибиторов ВГВ общей формулы 1
В экспериментальной in vitro модели инфекции вируса гепатита В использовалась линия гепатомы человека HepG2, которая для способности к инфицированию ВГВ и поддержанию полного цикла его репликации in vitro стабильно трансфицирована геном NTCP.
В качестве источника инфекционных вирусных частиц для инфицирования клеточной линии HepG2/NTCP была выбрана клеточная линия гепатомы человека HepAD38, несущая стабильно интегрированный геном вируса ВГВ под контролем тетрациклин-регулируемого промотора, и секретирующая вирусные частицы в культуральную среду в отсутствие терациклина.
Препарат ВГВ получали с использованием линии HepAD38 по следующему протоколу: Клетки HepAD38 пассировали в среде ДМЕМ, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллин/стрептомицин и заменимые аминокислоты. Культуральную среду отбирали раз в 2 дня, осветляли центрифугированием (200 g, 15 мин) и хранили при 4°С не дольше 7 дней. Далее к культуральным средам добавляли сухой ПЭГ 8000 до конечной концентрации 7,5%, и инкубировали при 4°С на ротационной платформе в течение ночи. Вирусный преципитат отделяли центрифугированием (2000 g, 30 мин) и осадок суспендировали в 1/100 первоначального объема в среде OPTI-MEM. Полученный таким образом вирусный препарат аликвотировали и хранили при -80°С.
2
2
Инфицирование проводили следующим образом: Клеточную суспензию HepG2-NTCP распределяли по 96-луночным планшетам по 2000 клеток на каждую лунку. После прикрепления клеток (в тот же или на следующий день) исходный раствор удаляли аспирацией и к каждой лунке добавляли по 50 мкл раствора тестируемых соединений, растворенных в среде OPTI-MEM (с финальной концентрацией ДМСО 2%), или OPTI-MEM с 2% ДМСО (в лунки положительного и отрицательного контролей инфекции) и по 50 мкл мкл препарата ВГВ, разведенного в среде OPTI-MEM с 2% ДМСО (кроме отрицательного контроля инфекции). После инкубации в течение 24 часов в увлажненной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа СО, среду с ВГВ удаляли аспирацией и к культурам добавляли 200 мкл культуральной среды ДМЕМ, содержащей соответствующие тестируемые соединения в интересующей концентрации. Клетки инкубировали дополнительно в течение 6 дней при 37°С в увлажненной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа СО. Далее, клеточные супернатанты (50 мкл) исследовали на содержание вирусного антигена ИФА анализом при помощи коммерческого набора HBeAg ELISA 4.0 (Creative Diagnostics, каталожный номер DEIA003) по протоколу производителя набора и измеряли оптическую плотность каждой анализируемой лунки при длине волны 450 нм, используя планшетный денситометр.