НОВЫЕ КОМБИНАЦИИ ГАСИТЕЛЯ И РЕПОРТЕРНОГО КРАСИТЕЛЯ
NEW COMBINATIONS OF ANTIGUANT AND REPORTER DYE

Область техники
[1] Настоящее описание в целом относится к FRET парам, содержащим комбинации гасителя и репортерного красителя для биологического применения, включая, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), такую как ПЦР в реальном времени или количественная ПЦР (кПЦР).
Уровень техники
[2] Флуоресцентный перенос энергии (FRET) в олигонуклеотидных зондах с двойной меткой находит широкое применение в испытаниях для проведения генетического анализа. FRET применяют для изучения гибридизации и амплификации ДНК, динамики сворачивания белка, протеолитической деградации и взаимодействий между другими биомолекулами. В способах обнаружения/амплификации нуклеиновых кислот, таких как полимеразные цепные реакции в реальном времени, для обнаружения и/или количественного определения целевых нуклеиновых кислот, таких как последовательности конкретных генов или экспрессированные последовательности матричной РНК применяют зонды с двойной меткой. Флуорогенные зонды для применения в таких способах часто метят как фрагментом репортером, так и фрагментом гасителем. В таких случаях флуоресценция от репортера не гасится, когда два красителя физически разделены посредством гибридизации зонда с матрицей нуклеиновой кислоты и/или под действием экзонуклеазной активности, которая обеспечивает удаление одного из компонентов гасителя или репортерного красителя из зонда.
[3] Флуоресцентный резонансный перенос энергии представляет собой форму передачи молекулярной энергии (MET), процесс, при котором происходит безызлучательная (англ. non-radioactively) передача энергии между молекулой-донором и молекулой-акцептором. FRET возникает благодаря свойствам определенных химических соединений; при возбуждении воздействием света определенной длины волны они излучают свет (т.е. флуоресцируют) с другой длиной волны. Такие соединения называют флуорофорами. В FRET происходит безызлучательная передача энергии на большое расстояние (например, 10-100 ангстрем) между молекулой донора, которая является флуорофором, и молекулой акцептора, которая является либо другим флуорофором, либо гасителем. Донор поглощает фотон и передает эту энергию акцептору безызлучательным путем.
[4] Когда два флуорофора, спектры возбуждения и излучения которых перекрываются, находятся в непосредственной близости, возбуждение одного флуорофора будет вызывать передачу энергии от первого флуорофора второму флуорофору, что, в свою очередь, вызывает флуоресценцию второго флуорофора. Другими словами, энергия возбужденного состояния первого (донорного) флуорофора передается за счет вызванного резонансом диполь-дипольного взаимодействия соседнему второму (акцепторному) флуорофору. В результате время жизни молекулы-донора уменьшается, и ее флуоресценция гасится, а интенсивность флуоресценции молекулы-акцептора увеличивается и деполяризуется. Когда энергия возбужденного состояния донора передается акцептору, не являющемуся флуорофором, например, гасителю, флуоресценция донора гасится без последующего испускания флуоресценции акцептором. Пары молекул, которые могут участвовать в FRET, называют FRET парами. Для передачи энергии молекулы донора и акцептора обычно должны находиться в непосредственной близости (например, вплоть до 70 и до 100 ангстрем).

[5] Обычно используемые способы для обнаружения продуктов амплификации нуклеиновых кислот требуют, чтобы продукт амплификации (т.е., ампликон) был отделен от непрореагировавших праймеров. Обычно этого достигают либо с помощью гель-электрофореза, который обеспечивает отделение продукта амплификации от праймеров на основе разницы в размерах, либо путем иммобилизации продукта, что позволяет смыть свободный праймер. Были описаны другие способы мониторинга процесса амплификации без отделения праймеров от ампликона. Примеры соединений, применяемых в таких способах, включают зонды TaqMan, молекулярные маяки, индикаторный краситель SYBR GREEN, праймеры LUX и другие. Основным недостатком обнаружения накопления продуктов ПЦР на основе интеркалятора, например, с помощью индикаторного красителя SYBR GREEN, является то, что специфические и неспецифические продукты генерируют сигнал.

[6] Системы реального времени для количественной ПЦР (кПЦР) были улучшены с помощью определения продуктов ПЦР на основе зондов, а не на основе интеркалятора. Одним из способов для обнаружения продукта амплификации на основе зонда без отделения от праймеров является 5'-экзонуклеазный ПЦР анализ (также называемый как TaqMan анализ или анализ с гидролизом зонда). Этот альтернативный способ обеспечивает способ в реальном времени для обнаружения только определенных продуктов амплификации. Во время амплификации при отжиге зонда, часто называемого «зондом TaqMan», к его целевой последовательности образуется субстрат, который расщепляется под действием 5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, такой как Taq, когда фермент перемещается от расположенного выше праймера в область зонда. Эта зависимость от полимеризации гарантирует, что расщепление зонда происходит только в том случае, если целевая последовательность амплифицируется.
[7] Как правило, зонд TaqMan представляет собой неудлиняемый олигонуклеотид, присоединенный к флуоресцентному репортерному красителю (т.е. флуорофору) и фрагменту гасителя. Когда зонд TaqMan является интактным, фрагменты репортера и гасителя находятся в непосредственной близости, в результате чего гаситель значительно снижает флуоресценцию, испускаемую репортерным красителем за счет Фёрстеровского резонансного переноса энергии (FRET). Конструкция и синтез зонда были упрощены благодаря открытию того, что соответствующее гашение наблюдается для зондов с репортером на 5'-конце и гасителем на 3'-конце.
[8] Во время фазы удлинения ПЦР, если целевая последовательность присутствует, зонд отжигается ниже одного из сайтов праймера и расщепляется под действием 5'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы, обладающей такой активностью, такой как полимераза Taq, поэтому данный праймер удлиняется. Расщепление зонда обеспечивает отделение репортерного краситель от фрагмента гасителя, увеличивая сигнал репортерного красителя. Расщепление также удаляет зонд от цепи-мишени, обеспечивая удлинение праймера до конца матричной цепи. Таким образом, включение зонда не препятствует процессу ПЦР в целом. Дополнительные молекулы репортерного красителя отщепляются от соответствующих зондов в каждом цикле, что влияет на увеличение интенсивности флуоресценции, пропорциональное количеству продуцируемого ампликона.

[9] Преимуществом флуорогенных зондов над ДНК-связывающими красителями, такими как SYBR GREEN, является то, что для генерации флуоресцентного сигнала требуется специфическая гибридизация между зондом и мишенью. Таким образом, при применении флуорогенных зондов неспецифическая амплификация из-за неправильного праймирования или артефакта праймер-димер не генерирует сигнал. Еще одно преимущество флуорогенных зондов состоит в том, что они могут быть помечены разными, различимыми репортерными красителями. При применении зондов, меченных разными репортерами, амплификация нескольких отдельных последовательностей может быть обнаружена в одной реакции ПЦР, часто называемой мультиплексным анализом.
[10] В настоящее время анализы функциональности клеток и тканей часто требуют извлечения как можно большего количества информации из материалов, количество которых часто ограничено. Например, такие образцы, как биопсия опухоли, трудно собрать, и обычно они обеспечивают лишь небольшое количество пригодной для применения нуклеиновой кислоты. Обнаружение и измерение посредством ПЦР одного целевого аналита, называемое одноплексным анализом, было золотым стандартом для анализа клинических образцов для исследования на уровне нуклеиновых кислот и уже более четверти века имеет неоценимое значение для расширения границ знаний в области биологии.
[11] Однако ограниченное количество нуклеиновой кислоты, полученной из образцов для клинических исследований, часто вынуждает делать выбор о том, как лучше всего использовать эти ценные образцы. Кроме того, если количество образца ограничено, количество локусов, которые можно проанализировать, также ограничено, что сокращает объем информации, которую можно извлечь из образца. Наконец, дополнительное время и материалы, необходимые для проведения нескольких анализов, включающих одну реакцию, могут значительно увеличить стоимость проекта в целом.
[12] Мультиплексный ПЦР-анализ нуклеиновых кислот, стратегия, при которой более одной мишени амплифицируется и количественно определяется из одной аликвоты образца, является привлекательным решением этих проблем. В мультиплексной ПЦР аликвоту образца исследуют с помощью нескольких зондов, содержащих флуоресцентные красители, в одной реакции ПЦР. Это увеличивает количество информации, которую можно извлечь из данного образца. С помощью мультиплексной ПЦР можно значительно сэкономить на образце и материалах. Чтобы повысить применимость этого способа, была разработана мультиплексная ПЦР с применением нескольких пар геноспецифичных праймеров и зондов для одновременной амплификации и измерения нескольких целевых последовательностей. Мультиплексная ПЦР обеспечивает следующие преимущества: 1) Эффективность: мультиплексная ПЦР помогает сохранить материал образца и избежать вариаций от лунки к лунке за счет объединения нескольких анализов ПЦР в одну реакцию. Мультиплексирование позволяет более эффективно применять ограниченные по количеству образцы, например, содержащие редкую мишень, которую нельзя разделить на несколько аликвот без снижения чувствительности; 2) Экономичность: даже несмотря на то, что мишени амплифицируются синхронно, каждая из них выявляется независимо с помощью геноспецифичного зонда с уникальным репортерным красителем для различения амплификаций на основе их флуоресцентного сигнала. После оптимизации мультиплексный анализ оказывается более экономичным, чем те же самые анализы, которые амплифицируют независимо.
[13] Однако в настоящее время существуют ограничения на количество мишеней, которые могут быть проанализированы в одном анализе мультиплексной ПЦР. Дизайн эксперимента для мультиплексной ПЦР является более сложным, чем для одиночных реакций. Зонды, применяемые для обнаружения отдельных мишеней, должны содержать уникальные репортерные красители с различными спектрами. Настройки фильтров возбуждения и излучения систем обнаружения в реальном времени варьируются от производителя к производителю; поэтому приборы должны быть откалиброваны для каждого красителя как часть процесса оптимизации эксперимента. Таким образом, одним из ограничений при разработке анализов мультиплексной ПЦР является количество флуорофоров и, следовательно, зондов, которые можно эффективно измерить в одной реакции. Например, в мультиплексной ПЦР перекрестные помехи сигналов между различными репортерами флуоресценции могут снизить корректность количественной оценки или обеспечить ложноположительные результаты. Поэтому важно выбирать флуорофоры с минимальным наложением спектров. Кроме того, флуорофоры и, в частности, их спектры излучения и возбуждения, также должны быть совместимы с применяемым прибором для ПЦР и, в частности, характеристиками полосы пропускания для каждого набора фильтров.
[14] Кроме того, также важно свести к минимуму перекрестные помехи сигналов с помощью хорошо гасящих зондов. При разработке флуоресцентного зонда необходимо гарантировать, что пара флуорофора и гасителя совместима, учитывая тип химии обнаружения. Кроме того, при разработке мультиплексных реакций наложение спектров флуорофоров и гасителей для различных целей должно быть минимизировано, чтобы избежать возможных перекрестных помех. Ранее одной из наиболее распространенных комбинаций краситель/гаситель для зонда TaqMan был флуорофор FAM с гасителем TAMRA. Сегодня «темные гасители» в значительной степени вытеснили гасители флуоресценции, такие как TAMRA. Темные гасители излучают энергию, которую они поглощают от флуорофора, в виде тепла, а не света с другой длиной волны. «Темные гасители», как правило, обеспечивают результаты с более низким фоном и особенно подходят для мультиплексной реакции, где важно избегать излучения света от гасителя, создающего перекрестный сигнал с одним из репортерных красителей. Таким образом, высокоэффективные «темные гасители» значительно снижают фоновую флуоресценцию, что приводит к повышению чувствительности и конечного сигнала. Это особенно подходит для мультиплексных реакций, поскольку наличие нескольких флуорофоров в одной пробирке вызывает более высокую фоновую флуоресценцию.
[15] В целом, мультиплексные реакции ПЦР были ограничены 4 комбинациями зондов, где для дуплексных реакций наиболее популярной комбинацией является FAM и HEX (JOE/VIC); для триплексных - FAM, HEX (JOE/VIC) и Cy5 или NED, FAM и VIC; и для квадруплексных - красители FAM, HEX (JOE/VIC), Texas Red и Cy5 или FAM, VIC, ABY и JUN. До сих пор большинство приборов для мультиплексной ПЦР могли использовать только четыре уникальные пары краситель-гаситель. Однако многие из этих приборов обладают оптической способностью к осуществлению более высоких уровней мультиплексирования, например, 5-плексной и 6-плексной ПЦР.
[16] Таким образом, существует потребность в дополнительных зондах, содержащих уникальные комбинации флуорофор/гаситель, которые позволяют проводить мультиплексные реакции, выходящие за рамки применения только четырех спектральных каналов (т.е. 4-плексных), например, для применения в 5-плексных и 6-плексных мультиплексных ПЦР-анализах.
Раскрытие сущности изобретения
[17] В одном аспекте в настоящем документе предложен зонд, содержащий продукт ковалентной конъюгации: красителя, имеющего общую формулу Ia, формулу Ib, формулу Ic или формулу Id; гасителя, имеющего общую формулу II; и линкера, соединяющего краситель и гаситель. В одном варианте реализации линкер представляет собой или включает олигонуклеотид.
[18] Формулы Ia, Ib, Ic и Id представляют собой следующие:
Формула Ia
Формула Ib
Формула Ic
Формула Id
4
13
14
3,
3
5
6
7
8
9
10
15
16
17
18
19
20
21
22
3
2
12
3
2
2
2
2
2
2
2
z
2
2
3
2
3
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
+
+
2+
Каждый из R, R и R и R когда они присутствуют, являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, алифатической группы, гетероалифатической группы, сульфоалкила, гетероалифатической группы с концевой SO, бензила и замещенного бензила, где замещенный бензил содержит по меньшей мере одну карбоксигруппу, по меньшей мере одну сульфонатную группу, -F, -Cl, -Br или их комбинацию. В одном варианте реализации замещенный бензил представляет собой бензоат, присоединенный через линкер L. Каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO. Каждый из R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO. X выбран из группы, состоящей из -OH, -SH, -NH, -NH-NH, -F, -Cl, -Br, I, -O-NHS (гидроксисукцинимидил/сульфосукцинимидил), -O-TFP (2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-STP (4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-бензотриазола, -бензотриазола, -NR-L-OH, -NR-L-O-фосфорамидита, -NR-L-SH, -NR-L-NH, -NR-L-NH-NH, -NR-L-COH, -NR-L-CO-NHS, -NR-L-CO-STP, -NR-L-CO-TFP, -NR-L-CO-бензотриазола, -NR-L-CHO, -NR-L-малеимида, NH(CHCHO)CHCHN и -NR-L-NH-CO-CH-I, где R представляет собой -H или алифатическую или гетероалифатическую группу, z представляет собой целое число от 1 до 5 включительно, и L выбран из группы, состоящей из двухвалентной линейной, разветвленной или циклической алкильной группы, необязательно замещенной по меньшей мере одним атомом кислорода и/или атомом серы. В одном варианте реализации X представляет собой азид-(N)-содержащую группу. В одном варианте реализации азидсодержащая группа включает алифатический линкер с концевым азидом. В одном варианте реализации алифатический линкер с концевым азидом выбран из NH-CH-CH-CH-N или NH-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-N. Вышеописанное соединение дополнительно содержит противоион Kat, который представляет собой количество Na, K, Ca, аммония или другого катиона(ов), необходимого для компенсации отрицательного заряда, переносимого цианином. В формулах m представляет собой целое число от 0 до 5 включительно; n представляет собой целое число от 1 до 3 включительно; o представляет собой целое число от 0 до 12 включительно; и p представляет собой целое число от 0 до 5 включительно.
[19] Формула II представляет собой следующую:
Формула II
23
24
25
26
27
28
29
30
3
[20] Каждый из R, R, R, R, R, R,R и R являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из H или SO. Z представляет собой OR, где R представляет собой H или алкил, или NH-L, где L представляет собой , и Y представляет собой или H, или связь с твердой подложкой.
[21] Другой аспект, представленный в настоящем документе, представляет собой способ конъюгирования или мечения биомолекулы красителем и/или гасителем с применением красителя, дериватизированного азидом, или гасителя для мечения биомолекулы, имеющей циклооктиновый фрагмент, посредством «клик-реакции» без Cu. В одном варианте реализации биомолекула представляет собой олигонуклеотид. В одном варианте реализации циклооктиновый фрагмент представляет собой дибензоциклооктин (DIBO). В одном варианте реализации способ конъюгирования или мечения обеспечивает получение зонда, как описано в настоящем документе.
[22] Другой аспект, представленный в настоящем документе, представляет собой способ обнаружения или количественного определения молекулы целевой нуклеиновой кислоты в образце с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, путем количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (кПЦР). В одном варианте реализации способ включает: (i) приведение образца, содержащего одну или более молекул целевой нуклеиновой кислоты, в контакт с а) по меньшей мере одним зондом, таким как описанные в настоящем документе, который представляет собой последовательность, специфичную для молекулы целевой нуклеиновой кислоты, где по меньшей мере один зонд демонстрирует детектируемое изменение флуоресценции при амплификации одной или более молекул целевой нуклеиновой кислоты; и с b) по меньшей мере одной парой олигонуклеотидных праймеров; (ii) инкубирование смеси со стадии (i) с ДНК-полимеразой в условиях, достаточных для амплификации одной или более молекул целевой нуклеиновой кислоты; и (iii) обнаружение присутствия или отсутствия или количественное определение содержания амплифицированных молекул целевой нуклеиновой кислоты путем измерения флуоресценции зонда. В некоторых вариантах реализации ДНК-полимераза обладает 5'-экзонуклеазной активностью. В некоторых других вариантах реализации ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу Thermus aquaticus (Taq). В некоторых вариантах реализации зонд представляет собой гидролизуемый зонд, такой как зонд TaqMan.
[23] Другой аспект, представленный в настоящем документе, представляет собой набор для ПЦР, такой как количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (кПЦР) и полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В некоторых вариантах реализации набор включает зонд, такой как описанные в настоящем документе, инструкции по проведению ПЦР и одно или более из следующего: буферный агент, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), органический растворитель, фермент, кофакторы ферментов и ингибитор фермента. В другом варианте реализации набор для ПЦР включает описанный краситель и/или фрагмент гасителя, инструкции по конъюгированию или мечению красителя и/или фрагмента гасителя с биомолекулой, такой как олигонуклеотид, инструкции по проведению ПЦР и одно или более из следующего: буферный агент, дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), органический растворитель, фермент, кофакторы фермента и ингибитор фермента.
[24] В других дополнительных аспектах, представленных в настоящем документе, предложены композиции, такие как «мастер-микс» для ПЦР, содержащий описанный зонд вместе с другими компонентами, которые применяют в ПЦР. В некоторых вариантах реализации мастер-микс готовят таким образом, что перед его применением в ПЦР необходимо разведение менее 3-кратного, например, 2-кратное разведение, 1,5-кратное разведение, 1,2-кратное разведение и т. д.
Подробное описание изобретения
[25] В анализе с гидролизом зонда применяют 5'-экзонуклеазную активность некоторых ДНК-полимераз, таких как Taq, для расщепления меченого зонда во время ПЦР. Одним из конкретных примеров гидролизуемого зонда является зонд TaqMan. В одном варианте реализации гидролизуемый зонд содержит репортерный краситель на 5'-конце зонда и фрагмент гаситель на 3'-конце зонда. Во время реакции ПЦР расщепление зонда обеспечивает разделение репортерного красителя и фрагмента гасителя, что приводит к усилению флуоресценции репортера. Накопление продуктов ПЦР выявляется непосредственно путем мониторинга увеличения флуоресценции репортерного красителя. Когда зонд является интактным, непосредственная близость репортерного красителя к фрагменту гасителя приводит к подавлению флуоресценции репортера, главным образом, за счет Фёрстеровской передачи энергии (Förster, 1948; Lakowicz, 1983). Во время ПЦР, если присутствует представляющая интерес мишень, зонд специфически отжигается между сайтами прямого и обратного праймера. 5'-3'-нуклеолитическая активность ДНК-полимеразы Taq расщепляет зонд между репортером и гасителем, только если зонд гибридизуется с мишенью. Затем фрагменты зонда вытесняются из мишени, и полимеризация цепи продолжается. 3'-конец зонда заблокирован, чтобы предотвратить удлинение зонда во время ПЦР. Этот процесс происходит последовательными циклами и не мешает экспоненциальному накоплению продукта.
m
m
[26] Без привязки к этим параметрам, общие рекомендации по созданию зондов и праймеров TaqMan заключаются в следующем: следует конструировать праймеры как можно ближе к зонду, но не перекрывая его; T зонда должна быть примерно на 10 °C выше, чем T праймеров; следует выбирать цепь, которая дает зонду больше оснований C, чем G; пять нуклеотидов на 3'-конце праймера должны иметь не более двух оснований G и/или C, и реакцию следует проводить с двухступенчатым термическим профилем с отжигом и удлинением при той же температуре 60°C.
[27] Чтобы облегчить понимание настоящего описания, ряд терминов определен ниже.
[28] Применяемый в настоящем документе термин «образец» относится к любому веществу, содержащему или предположительно содержащему нуклеиновые кислоты, и может включать образец клеток, образец ткани или образец жидкости, выделенные у индивидуума или индивидуумов.
[29] Применяемый в настоящем документе термин «ПЦР», если не указано иное, относится к одноплексным или мультиплексным ПЦР-анализам и может представлять собой ПЦР в реальном времени или количественную ПЦР (при которой обнаружение происходит во время амплификации), ПЦР по конечной точке (когда обнаружение происходит в конце амплификации) или ПЦР с обратной транскрипцией.
[30] Применяемые в настоящем документе термины «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» относятся к праймерам, зондам, фрагментам олигомеров, подлежащим обнаружению, олигомерным контролям и немеченым блокирующим олигомерам, и должны быть общими для полидезоксирибонуклеотидов (содержащих 2-дезокси-D-рибозу), полирибонуклеотидов (содержащих D-рибозу) и любого другого типа полинуклеотида, который представляет собой N-гликозид пуринового или пиримидинового основания или модифицированных пуриновых или пиримидиновых оснований. Не существует предполагаемого различия в длине между терминами «нуклеиновая кислота», «полинуклеотид» и «олигонуклеотид», и эти термины будут использованы взаимозаменяемо. «Нуклеиновая кислота», «ДНК», «РНК» и подобные термины также могут включать аналоги нуклеиновых кислот. Олигонуклеотиды, как описано в настоящем документе, не обязательно физически происходят из какой-либо существующей или природной последовательности, но могут быть получены любым способом, включая химический синтез, репликацию ДНК, обратную транскрипцию или их комбинацию.
[31] Когда два разных неперекрывающихся (или частично перекрывающихся) олигонуклеотида отжигаются к разным участкам одной и той же линейной комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты, и 3'-конец одного олигонуклеотида направлен к 5'-концу другого, первый может быть назван «вышестоящим» олигонуклеотидом, а последний - «нижестоящим» олигонуклеотидом.
[32] В настоящем документе термины «целевая последовательность», «целевая нуклеиновая кислота», «последовательность целевой нуклеиновой кислоты» и «представляющая интерес нуклеиновая кислота» используются взаимозаменяемо и относятся к желаемой области, которая должна быть либо амплифицирована, либо обнаружена, либо и то, и другое.
[33] «Зонд» в контексте настоящего описания представляет собой неудлиняемый олигонуклеотид, присоединенный к флуоресцентному репортерному красителю и фрагменту гасителя.
[34] «Праймер» в настоящем документе может относиться более чем к одному праймеру и относится к олигонуклеотиду, встречающемуся в природе или полученному синтетически, который способен действовать как точка инициации синтеза при помещении в условия, при которых индуцируется синтез продукта удлинения праймера, который комплементарен цепи нуклеиновой кислоты, т.е. в присутствии нуклеотидов и агента полимеризации, такого как ДНК-полимераза, при подходящей температуре в течение достаточного количества времени и в присутствии буферного агента. Такие условия могут включать, например, присутствие по меньшей мере четырех различных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (таких как G, C, A и T) и агента, индуцирующего полимеризацию, такого как ДНК-полимераза или обратная транскриптаза, в подходящем буфере («буфер» включает заместители, которые являются кофакторами или которые влияют на pH, ионную силу и т.д.) и при подходящей температуре. В некоторых вариантах реализации праймер может быть одноцепочечным для максимальной эффективности амплификации. Приведенные в настоящем документе праймеры выбраны таким образом, чтобы они были по существу комплементарными разным цепям каждой конкретной последовательности, подлежащей амплификации. Это означает, что праймеры должны быть в достаточной степени комплементарными для гибридизации с соответствующими цепями. Некомплементарный нуклеотидный фрагмент может быть присоединен к 5'-концу праймера, при этом оставшаяся часть последовательности праймера комплементарна или частично комплементарна целевой области целевой нуклеиновой кислоты. Обычно праймеры являются комплементарными, за исключением случаев, когда некомплементарные нуклеотиды могут присутствовать в заданном области последовательности, таком как конец праймера, как описано.
[35] Комплемент последовательности нуклеиновой кислоты в контексте настоящего описания относится к олигонуклеотиду, который при выравнивании с последовательностью нуклеиновой кислоты таким образом, что 5'-конец одной последовательности спарен с 3'-концом другой, находится в «антипараллельной ориентации». Комплементарность не обязательно должна быть идеальной; стабильные дуплексы могут содержать несовпадающие пары оснований или несовпадающие основания.
m
m
[36] Стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты измеряется температурой плавления, или «T». T конкретного дуплекса нуклеиновой кислоты при определенных условиях представляет собой температуру, при которой диссоциировала половина пар оснований.
[37] Термин «комплементарный» в настоящем документе применяется по отношению к нуклеотиду, который может образовывать пару оснований с другим конкретным нуклеотидом. Так, например, аденозин комплементарен уридину или тимидину, а гуанозин комплементарен цитидину.
[38] Термин «идентичный» означает, что две последовательности нуклеиновых кислот имеют одинаковую или комплементарную последовательность.
[39] В настоящем документе термин «амплификация» обозначает применение любых методик амплификации для увеличения концентрации конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в смеси последовательностей нуклеиновых кислот.
[40] «Полимеризация», которая также может называться «синтезом нуклеиновой кислоты», относится к процессу удлинения последовательности нуклеиновой кислоты праймера за счет применения полимеразы и матрицы нуклеиновой кислоты.
[41] В настоящем документе термин «метка» относится к любому атому или молекуле, которые можно применять для обеспечения или помощи в обеспечении обнаруживаемого (например, количественно определяемого) сигнала и которые могут быть присоединены к нуклеиновой кислоте или белку. Метки могут обеспечивать сигналы, обнаруживаемые с помощью флуоресценции, радиоактивности, колориметрии, гравиметрии, магнетизма, ферментативной активности и т. п. Метки, которые обеспечивают сигналы, обнаруживаемые с помощью флуоресценции, также называются в настоящем документе «флуорофорами» или «репортерными красителями» или «красителями».
[42] Термин «смежный» или «по существу смежный» в контексте настоящего описания относится к расположению двух олигонуклеотидов на их комплементарной цепи матричной нуклеиновой кислоты. Два олигонуклеотида могут быть разделены посредством от 0 до примерно 60 нуклеотидов, например, посредством 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов. Нулевой разрыв нуклеотида означает, что два олигонуклеотида непосредственно примыкают друг к другу. Другими словами, две области матрицы, гибридизованные двумя олигонуклеотидами, могут быть смежными, то есть между двумя областями матрицы нет разрыва. В качестве альтернативы, две матричные области, гибридизованные олигонуклеотидами, могут быть разделены посредством от 1 до примерно 60 нуклеотидов.
[43] В настоящем документе термин «перекрывающийся» относится к расположению двух олигонуклеотидов на их комплементарной цепи матричной нуклеиновой кислоты. Два олигонуклеотида могут перекрываться посредством от 1 до примерно 40 нуклеотидов, например, примерно от 1 до 10 нуклеотидов. Другими словами, две области матрицы, гибридизованные олигонуклеотидами, могут иметь общую область, комплементарную обоим олигонуклеотидам.
[44] Термины «термическое циклирование», «термоциклирование», «термические циклы» или «термический цикл» относятся к повторяющимся циклам изменения температуры от температуры общей денатурации до температуры отжига (или гибридизации), до температуры удлинения и обратно до температуры общей денатурации. Термины также относятся к повторяющимся циклам температуры денатурации и температуры удлинения, где температуры отжига и удлинения объединены в одну температуру. Температура полной денатурации разматывает все двухцепочечные фрагменты на одноцепочечные. Температура отжига позволяет праймеру гибридизоваться или отжигаться с комплементарной последовательностью отделенной цепи матрицы нуклеиновой кислоты. Температура удлинения позволяет синтезировать образующуюся цепь ДНК ампликона. Термин «один цикл термоциклирования» обозначает один цикл температуры денатурации, температуры отжига и температуры удлинения. Например, в одном цикле термоциклирования могут быть внутренние повторяющиеся циклы температуры отжига и температуры удлинения. Например, один цикл термоциклирования может включать температуру денатурации, температуру отжига (т.е. первую температуру отжига), температуру удлинения (т.е. первую температуру удлинения), другую температуру отжига (т.е. вторую температуру отжига) и другую температуру удлинения (т. е. вторую температуру удлинения).
2+
[45] Термины «реакционная смесь», «смесь для амплификации» или «смесь для ПЦР» в контексте настоящего описания относятся к смеси компонентов, необходимых для амплификации по меньшей мере одного ампликона из матриц нуклеиновых кислот. Смесь может содержать нуклеотиды (dNTP), термостабильную полимеразу, праймеры и множество матриц нуклеиновых кислот. Смесь может дополнительно содержать буфер трис (англ. Tris), одновалентную соль и/или Mg. Диапазон рабочих концентраций каждого компонента хорошо известен в данной области техники и может быть дополнительно оптимизирован при необходимости обычным квалифицированным специалистом.
2
[46] Термин «мастер-микс» обозначает предварительно приготовленный концентрированный раствор, который содержит все компоненты для реакции ПЦР в реальном времени, которые не зависят от образца. Мастер-микс обычно содержит термостабильную ДНК-полимеразу, dNTP, MgCl и патентованные добавки в буфере, оптимизированном для ПЦР.
[47] Термины «амплифицированный продукт» или «ампликон» относятся к фрагменту ДНК, амплифицированному полимеразой с применением пары праймеров в способе амплификации, таком как ПЦР.
.
E. coli
[48] Как определено в настоящем документе, «5′→3′-экзонуклеазная активность» или «5'-3'-экзонуклеазная активность» или «5'-экзонуклеазная активность» относится к той активности реакции расщепления, которая включает либо 5'-3'-экзонуклеазную активность, традиционно связанную с некоторыми ДНК-полимеразами, при которых нуклеотиды удаляются с 5'-конца олигонуклеотида последовательным образом (т.е ДНК-полимераза I  обладает такой активностью, а фрагмент Кленова нет), либо 5'-3'-экзонуклеазную активность, при которой происходит расщепление более чем одной фосфодиэфирной связи (нуклеотида) от 5'-конца, или обеих, либо группу гомологичных 5'-3' экзонуклеаз (также известных как 5'-экзонуклеазы), которые урезают раздвоенные молекулы, разветвленные структуры ДНК, образующиеся при репликации, рекомбинации и репарации ДНК. В некоторых вариантах реализации такую 5'-экзонуклеазу можно применять для расщепления меченого олигонуклеотидного зонда, отожженного к последовательности целевой нуклеиновой кислоты.
[49] Следующее описание репортерных (или флуоресцентных) красителей, то есть флуорофоров, и соединений-гасителей предоставляет общую информацию относительно конструкции описанных зондов. Как описано в настоящем документе, репортерные красители и соединения-гасители могут быть ковалентно связаны друг с другом через линкер. В некоторых вариантах реализации линкер представляет собой или включает олигонуклеотид.
[50] Репортерные красители
[51] В некоторых вариантах реализации репортерный краситель, также называемый флуорофором, может быть модифицированным карбоцианиновым красителем. Например, эти соединения могут иметь по меньшей мере одну замещенную кольцевую систему индолия, в которой заместитель на 3-м атоме углерода кольца индолия содержит химически реакционноспособную группу или конъюгированное вещество. Другие примеры соединений включают кольцевой фрагмент азабензазолия и по меньшей мере один сульфонатный фрагмент.
[52] Карбоцианиновые красители обычно содержат две гетероциклические кольцевые системы, связанные вместе полиметиновым линкером в соответствии с формулой:
А-МОСТИКОВЫЙ ФРАГМЕНТ-B
где A представляет собой первую гетероциклическую кольцевую систему, которая представляет собой замещенное кольцо бензазолия, которое необязательно включает один или более атомов азота (кольца азабензазолия), B представляет собой вторую гетероциклическую кольцевую систему, которая представляет собой замещенное кольцо бензазолия или азабензазолия, и МОСТИКОВЫЙ ФРАГМЕНТ представляет собой полиметиновый линкер, который является необязательно замещенным. Первая и вторая кольцевые системы и полиметиновый линкер необязательно дополнительно замещены множеством заместителей или конденсированы с дополнительными кольцами, которые необязательно дополнительно замещены. В одном аспекте карбоцианиновый краситель содержит химически реакционноспособную группу или конъюгированное вещество, которое присоединено к атому углерода 3 кольцевой системы индолия. В одном варианте реализации карбоцианиновый краситель дополнительно замещен посредством сульфо или сульфоалкила один или более раз.
[53] Под «сульфо» подразумевается сульфоновая кислота или соль сульфоновой кислоты (сульфонат). Аналогичным образом, под «карбокси» подразумевается карбоновая кислота или соль карбоновой кислоты. «Фосфат» в настоящем документе представляет собой сложный эфир фосфорной кислоты и включает соли фосфата. «Фосфонат» в контексте настоящего описания обозначает фосфоновую кислоту и включает соли фосфоната. В настоящем документе, если не указано иное, алкильные части заместителей, такие как алкил, алкокси, арилалкил, алиламино, диалкиламино, триалкиламмоний или перфторалкил, необязательно являются насыщенными, ненасыщенными, линейными или разветвленными, и все алкил, алкокси, алкиламино и диалкиламино заместители сами по себе необязательно дополнительно замещены посредством карбокси, сульфо, амино или гидрокси.
[54] В некоторых вариантах реализации фрагмент A имеет формулу:
1
2
1
β
x
c
1
6
1
6
1
6
2
12
где Y представляет собой атомы, необходимые для образования от одного до двух конденсированных ароматических колец, содержащих 6 атомов в каждом кольце, причем эти атомы выбраны из -CH, -C, -CR и -N(R), где каждый β составляет 0 или 1, и каждый R независимо представляет собой -L-R; или -L-S; или амино, сульфо, трифторметил или галоген; или C-C алкил, C-C алкокси, C-C алкиламино, C-C диалкиламино, необязательно дополнительно замещенный. Включение одного или более не являющихся водородом заместителей в конденсированные кольца можно применять для точной настройки спектра поглощения и излучения получаемого красителя. В одном варианте реализации присутствует по меньшей мере один заместитель, не являющийся водородом, например, сульфо, алкокси или галоген; в одном варианте реализации галоген представляет собой бром.
5
3
4
3
x
c
5
3
4
3
4
3
[55] В одном варианте реализации X представляет собой один из O, S, Se или NR, где R представляет собой H или алкильную группу, содержащую 1-22 атома углерода, которая необязательно замещена один или более раз посредством гидрокси, карбокси, сульфо, амино, алкиламино, содержащим 1-6 атомов углерода, или диалкиламино, содержащим 2-12 атомов углерода. В качестве альтернативы, X представляет собой O, S или -CRR, где R и R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой алкил или арилалкил и являются необязательно дополнительно замещенной. В одном варианте реализации каждый из R и R являются одинаковыми или разными, и выбраны из группы, состоящей из H, алифатической группы, гетероалифатической группы, сульфоалкила, гетероалифатической группы с концевым SO, бензила и замещенного бензила, где замещенный бензил содержит по меньшей мере одну карбоксильную группу, по меньшей мере одну сульфонатную группу, -F, -Cl, -Br или их комбинацию. В одном варианте реализации замещенный бензил представляет собой бензоат, присоединенный через линкер L. Например, R представляет собой -L-R или -L-S (как определено ниже).
2
4
12
3
4
4
4
4
4
21
4
3
x
c
1
22
7
22
1
6
1
6
2
12
3
18
x
c
x
c
[56] В некоторых вариантах реализации заместители R, R и R независимо представляют собой -L-R; или -L-S; или C-C алкил или C-Cарилалкил, каждая алкильная часть которого необязательно включает до шести гетероатомов, выбранных из N, O и S, и каждая алкильная часть которого необязательно замещена один или более раз фтором, хлором, бромом, йодом, гидрокси, карбокси, сульфо, фосфатом, амино, сульфатом, фосфонатом, циано, нитро, азидо, C-C алкокси, C-C алкиламино или C-C диалкиламино, или C-C триалкиламмонием; или R и R, взятые в комбинации, образуют пяти- или шестичленное насыщенное или ненасыщенное кольцо, которое замещено посредством -L-R; или -L-S. В некоторых вариантах реализации R представляет собой алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, необязательно замещенный один или более раз фтором, хлором, бромом, йодом, гидрокси, карбокси, сульфо или амино; например, R представляет собой метил или этил. В одном аспекте R представляет собой метил. В качестве альтернативы, R в комбинации с R образует 6-членное кольцо, как описано ниже; или R, взятый в комбинации с R, образует насыщенный или ненасыщенный кольцевой заместитель, который замещен посредством -L-R или -L-S.
2
12
2
12
2
12
2
12
2
12
[57] В некоторых вариантах реализации R и R независимо представляют собой алкил с 1-6 атомами углерода, который не замещен или замещен один раз посредством гидрокси, сульфо, карбокси или амино. Если R или R замещен посредством гидрокси, сульфо, карбокси или амино, заместитель может быть отделен от атома азота индолия или другого бензазолия 2-6 атомами углерода. Если R и R представляют собой незамещенные алкильные группы, они могут представлять собой метил или этил. В некоторых вариантах реализации R и R представляют собой метил. Обычно R и R являются одинаковыми и представляют собой метил, этил, сульфопропил или сульфобутил.
[58] В некоторых вариантах реализации фрагмент B имеет формулу:
1
12
1
β
x
c
1
6
1
6
1
6
2
12
где W представляет собой атомы, необходимые для образования от одного до двух конденсированных ароматических колец, содержащих 6 атомов в каждом кольце, причем эти атомы выбраны из -CH, -C, -CR′ и -N(R)′, где каждый β′ составляет 0 или 1, и каждый R′ независимо представляет собой -L-R; или -L-S; или амино, сульфо, трифторметил или галоген; или C-C алкил, C-C алкокси, C-C алкиламино, C-C диалкиламино, каждый из которых необязательно дополнительно замещен посредством карбокси, сульфо, амино или гидрокси. Когда шестичленные кольца образуют азабензазольную кольцевую систему, они обычно включают 1-3 атома азота или 1-2 атома азота, обычно включенные в первое 6-членное ароматическое кольцо, конденсированное с азольным кольцом. В одном варианте реализации кольцевая система W содержит только атомы углерода и представляет собой бензазольную кольцевую систему.
12
[59] Когда А или В представляет собой азабензазолий, конденсированные ароматические кольца обычно включают 1-3 атома азота или 1-2 атома азота, обычно включенные в первое 6-членное ароматическое кольцо, конденсированное с азольным кольцом. Варианты реализации азабензазольного фрагмента включают без ограничения следующие структуры (и эквивалентные структуры, в которых азот кватернизован посредством R):
[60] Когда Y или W включает атом азота, по меньшей мере один из атомов азота азабензазола кватернизован, что приводит к формальному положительному заряду. В одном варианте реализации азольный атом азота кватернизован, и атом азота в бензо является незамещенным. В некоторых вариантах реализации азольный атом азота является незамещенным, и по меньшей мере один атом азота в бензо является кватернизованным. Обычно кватернизованы не более одного азольного азота в данном азабензазоле, т.е. α составляет 0 или 1, β составляет 0 или 1, и α + все β = 1; и δ составляет 0 или 1, β′ составляет 0 или 1, и δ + все β′ = 1. Атом азота сдвигает спектры излучения в сторону большей длины волны по сравнению с красителями, имеющими атом углерода в том же положении. Присутствие дополнительных конденсированных 6-членных колец (как в последней структуре выше) смещает длину волны еще больше.
15
15
13
14
13
14
3
4
13
14
[61] Выбор групп X и Z может также влиять на свойства поглощения и испускания флуоресценции красителя. X и Z необязательно являются одинаковыми или разными, и спектральные свойства полученного красителя могут быть подобраны путем тщательного выбора X и Z. В одном варианте реализации Z представляет собой один из O, S, Se или NR, где R представляет собой H или алкильную группу, содержащую 1-22 атома углерода, которая необязательно замещена один или более раз посредством гидрокси, карбокси, сульфо, амино, алкиламино, содержащим 1-6 атомов углерода, или диалкиламино, содержащим 2-12 атомов углерода. В качестве альтернативы Z представляет собой O, S или -CRR, где R и R, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой алкил или арилалкил и необязательно являются дополнительно замещенными. Обычно X и Z представляют собой -CRR и -CRR соответственно.
13
14
13
14
13
14
13
14
13
14
13
14
13
14
13
14
x
c
1
22
7
22
1
6
1
6
2
12
3
18
13
14
3
x
c
x
c
[62] Когда Z представляет собой -CRR, заместители R и R, которые могут быть одинаковыми или разными, независимо представляют собой -L-R; или -L-S; или C-C алкил или C-Cарилалкил, каждая алкильная часть которого необязательно включает до шести гетероатомов, выбранных из N, O и S, и каждая алкильная часть которого необязательно замещена один или более раз фтором, хлором, бромом, йодом, гидрокси, карбокси, сульфо, фосфатом, амино, сульфатом, фосфонатом, циано, нитро, азидо, C-C алкокси, C-C алкиламино или C-C диалкиламино, или C-C триалкиламмонием. В одном варианте реализации каждый из R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, алифатической группы, гетероалифатической группы, сульфоалкила, гетероалифатической группы с концевым SO, бензила и замещенного бензила, где замещенный бензил содержит по меньшей мере одну карбоксильную группу, по меньшей мере одну сульфонатную группу, -F, -Cl, -Br или их комбинацию. В одном варианте замещенный бензил представляет собой бензоат, присоединенный через линкер L. В качестве альтернативы R и R в комбинации образуют пяти- или шестичленное насыщенное или ненасыщенное кольцо, которое необязательно замещено посредством -L-R; или -L-S; или R или R объединены с метиновым заместителем с образованием кольца, как описано ниже. В некоторых вариантах реализации R и R независимо представляют собой алкил с 1-6 атомами углерода, который не замещен или замещен один раз посредством гидрокси, сульфо, карбокси или амино. Если R или R замещен посредством гидрокси, сульфо, карбокси или амино, заместитель может быть отделен от атома азота индолия или другого бензазолия 2-6 атомами углерода в некоторых вариантах реализации. В одном аспекте R и R представляют собой алкилы, содержащие 1-6 атомов углерода, например, метилы. В другом аспекте один из R и R представляет собой метил, и другой представляет собой алкил, имеющий 1-6 атомов углерода, который замещен посредством карбокси, или сульфо или гидрокси или -L-R или-L-S.
[63] В некоторых вариантах реализации МОСТИКОВЫЙ фрагмент имеет формулу:
13
14
где a и b независимо составляют 0 или 1. В одном аспекте азакарбоцианиновых красителей либо a, либо b составляют 1, но не оба. Длина полиметинового мостика между гетероциклическими кольцевыми системами также влияет на абсорбционные и эмиссионные свойства красителя. Если Z представляет собой CRR, а и b = 0, и гетероцикл индолия не конденсирован с дополнительными кольцами, полученный «индокарбоцианиновый» краситель обычно демонстрирует максимум поглощения около 550 нм. Когда a = 1 и b = 0, «индодикарбоцианины» обычно имеют максимум поглощения около 650 нм. «Индотрикарбоцианиновые» красители, где a и b оба составляют 1, обычно имеют максимум поглощения около 750 нм.
21
22
23
24
25
26
27
21
22
23
24
25
26
27
21
4
23
25
26
13
14
[64] Каждый из R, R, R, R, R, R и R, когда присутствует, независимо представляет собой H, F, Cl, алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, алкокси, содержащий 1-6 атомов углерода, арилокси, N-гетероароматический фрагмент или ион иминия. В качестве альтернативы, два заместителя R, R, R, R, R, R и R, взятые в комбинации, образуют 4-, 5- или 6-членное насыщенное или ненасыщенное углеводородное кольцо, которое является незамещенным или необязательно замещенным один или более раз насыщенным или ненасыщенным алкилом, содержащим 1-6 атомов углерода, галогеном или карбонильным кислородом. В еще одном варианте реализации R объединен с R с образованием 6-членного кольца, которое необязательно замещено алкилом, содержащим 1-6 атомов углерода. В качестве альтернативы, R (где a и b оба составляют 0), R (где a = 1 и b = 0) или R (где a и b оба составляют 1), взятые в комбинации с одним из R и R, образуют 6-членное кольцо, которое необязательно замещено алкилом, содержащим 1-6 атомов углерода.
21
22
23
24
25
26
27
21
22
23
24
25
26
27
22
23
24
[65] Обычно каждый из R, R, R, R, R, R и R, если присутствует, представляет собой H. Когда один из R, R, R, R, R, R и R не представляет собой водород, обычно он является заместителем на центральном атоме углерода МОСТИКОВОГО ФРАГМЕНТА, то есть R, где a = 0 и b = 0, R, где a = 1 и b = 0, и R , где a = 1 и b = 1. Аналогичным образом, если МОСТИКОВЫЙ ФРАГМЕНТ включает 4-, 5- или 6-членное кольцо, оно обычно находится в центре фрагмента МОСТИКОВОГО ФРАГМЕНТА, например, как показано ниже для пентаметинового красителя:
[66] Один вариант реализации представляет собой соединение формулы:
2
3
4
12
21-23
21-27
и его соли, где R, R, R, R, α, δ, W, Y и Z имеют значения, определенные ранее. Для простоты R независимо представляют собой как определено ранее для R, и n = 1, 2 или 3. Когда n>3, спектры красителей еще больше смещены в инфракрасную область.
[67] Другой вариант красителя имеет формулу:
6
9
Заместители R-R независимо выбраны из H, алкила, содержащего 1-6 атомов углерода, алкокси, содержащего 1-6 атомов углерода, амино, алкиламино, содержащего 1-6 атомов углерода, или диалкиламино, содержащего 2-12 атомов углерода, сульфо, карбокси, перфторалкила, содержащего 1-6 атомов углерода, или галогена.
[68] В одном аспекте как A, так и B представляют собой кольца бензазолия формулы:
16
19
где заместители R-R независимо выбраны из H, алкила, содержащего 1-6 атомов углерода, алкокси, содержащего 1-6 атомов углерода, амино, алкиламино, содержащего 1-6 атомов углерода, или диалкиламино, содержащего 2-12 атомов углерода, сульфо, карбокси, перфторалкила, содержащего 1-6 атомов углерода, или галогена.
6
7
8
9
16
17
18
19
6
9
16
19
6
9
16
19
[69] Включение одного или более не являющихся водородом заместителей в одно или оба кольца бензазолия подходит для точного подбора спектра поглощения и излучения. Обычно в каждом кольце бензазолия присутствует по меньшей мере один заместитель, не являющийся водородом, например, сульфо, алкокси или галогеновый заместитель. Обычно заместители в бензокольцах представляют собой H или сульфо. В одном варианте реализации один из R, R, R и R или один из R, R, R и R представляет собой диалкиламино, который представляет собой насыщенный 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, такой как пиперидин. Кроме того, любые два смежных заместителя R-R и R-R необязательно взяты в комбинации с образованием одного или более конденсированных ароматических колец. Эти дополнительные кольца необязательно дополнительно замещены, как описано выше для R-R и R-R, и, в частности, сульфоновыми кислотами.
[70] Ниже приведены избранные примеры вариантов реализации карбоцианиновых красителей, содержащих дополнительные конденсированные ароматические кольца (для простоты все возможные заместители, кроме нескольких, показаны как водород с самым коротким полиметиновым мостиком):
Эти базовые структуры и их длинноволновые аналоги могут быть необязательно замещенными, как описано в данном разделе. Дополнительные варианты, конкретно не изображенные выше, также входят в объем данного раскрытия.
7
17
2
12
7
17
2
12
2
12
3
7
17
2
12
[71] В одном аспекте карбоцианиновые красители сульфированы один или более раз. Если краситель замещен посредством сульфо, он может быть сульфирован по R или R или по обоим, или сульфоалкилирован по R или R или по обоим, или одновременно сульфирован и сульфоалкилирован. Обычно, когда ароматическое кольцо Y или W содержит один или более атомов азота, кольцо не сульфировано. Обычно коммерчески доступные реакционноспособные карбоцианиновые красители сульфированы не более трех раз (в положениях, соответствующих R и R, и в виде сульфоалкила в одном из R и R), оставляя один из R и R для размещения реакционноспособной группы. Напротив, путем присоединения реакционноспособной группы (или конъюгированного вещества) к R некоторые варианты реализации карбоцианиновых красителей могут быть сульфированы по меньшей мере четыре раза (по R, по R и в форме сульфоалкила по R и R). Это дополнительное сульфирование, а также изменение точки присоединения приводит к получению реакционноспособных красителей и конъюгатов красителей, которые становятся ярче, лучше растворимы в водных растворах и более устойчивы к гашению флуоресценции, которое возникает в результате взаимодействия краситель-краситель. Однако сульфирование четырьмя или более сульфоновыми кислотами не требуется для того, чтобы красители имели спектральные свойства, превосходящие свойства аналогичных по структуре красителей, которые не связаны через положение 3 кольца индолия.
x
C
x
C
x
C
x
C
x
C
x
C
x
C
2
3
4
13
14
2
12
3
4
13
14
21
22
23
24
25
26
27
[72] Кроме того, в некоторых вариантах реализации красители замещены одной или более химически реакционноспособными группами (-L-R) или конъюгированными веществами (-L-S), как описано ниже. Обычно фрагменты -L-R или -L-S связаны с красителем по R, R, R, R или R. В качестве альтернативы,-L-R или -L-S могут быть связаны с красителем по ароматическому атому углерода кольца азабензазолия или кольца бензазолия. В одном варианте реализации один или более из R и R представляют собой -L-R или -L-S. В еще одном варианте реализации один или более из R, R, R и R представляют собой -L-R или -L-S. В качестве альтернативы, один или более из R, R, R, R, R, R и R представляют собой -L-R или -L-S. В одном варианте реализации краситель замещен только одним -L-R или -L-S.
[73] Примеры флуоресцентных красителей включают, но не ограничиваются:
[74] Многие варианты реализации соединений обладают полным электронным зарядом. Следует понимать, что, когда показано присутствие таких электронных зарядов, они уравновешиваются наличием соответствующего противоиона Kat, который может быть или не может быть явно идентифицирован. Биологически совместимый противоион не токсичен для биологических применений и не оказывает существенного вредного воздействия на биомолекулы. Когда соединение заряжено положительно, противоион обычно выбран из хлорида, бромида, йодида, сульфата, алкансульфоната, арилсульфоната, фосфата, перхлората, тетрафторбората, тетраарилборида, нитрата и анионов ароматических или алифатических карбоновых кислот, но не ограничиваются ими. Когда соединение заряжено отрицательно, противоион обычно выбран из ионов щелочных металлов, ионов щелочноземельных металлов, ионов переходных металлов, аммония или замещенных ионов аммония или пиридиния, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации любой необходимый противоион является биологически совместимым, не токсичным в том виде, в котором он применяется, и не оказывает существенно вредного воздействия на биомолекулы. Противоионы легко заменить способами, хорошо известными в данной области, такими как ионообменная хроматография или селективное осаждение.
[75] Следует понимать, что описанные в настоящем документе красители изображены в виде той или иной определенной структуры электронного резонанса. Каждый аспект, обсужденный выше, в равной степени относится к красителям, которые формально изображены с другими разрешенными резонансными структурами, поскольку электронный заряд на рассматриваемых красителях делокализован по всему красителю.
[76] В одном варианте реализации краситель включает несколько сульфонатных групп. В некоторых вариантах реализации краситель включает реакционноспособную функциональную группу или ее защищенную версию для связывания красителя с другим веществом. В некоторых вариантах реализации краситель предложен в защищенной форме, например, в форме производного фосфорамидита, которое можно применять для конъюгирования красителя с молекулой, такой как олигонуклеотид, во время автоматического синтеза нуклеиновых кислот, как известно в данной области. Типичные структуры карбоцианинового красителя, как описано в настоящем документе, показаны ниже.
или
[77] Конъюгаты реакционноспособных красителей
x
x
x,
x
c
c
[78] В одном варианте реализации краситель содержит по меньшей мере одну группу -L-R, где R представляет собой реакционноспособную группу, которая присоединена к красителю ковалентной связью L. В некоторых вариантах реализации ковалентная связь, присоединяющая краситель к R содержит несколько промежуточных атомов, которые служат спейсером. Красители с реакционноспособной группой (R) метят широкий спектр органических или неорганических веществ, которые содержат или модифицированы, чтобы содержать функциональные группы с подходящей реакционной способностью, что приводит к химическому присоединению конъюгированного вещества (S), представленного посредством -L-S.
x
c
[79] В настоящем документе термин «реакционноспособная группа» обозначает фрагмент соединения, который способен химически реагировать с функциональной группой другого соединения с образованием ковалентной связи. Обычно реакционноспособная группа представляет собой электрофил или нуклеофил, который может образовывать ковалентную связь посредством воздействия на соответствующую функциональную группу, которая является нуклеофилом или электрофилом, соответственно. В качестве альтернативы реакционноспособная группа представляет собой фотоактивируемую группу и становится химически реакционноспособной только после освещения светом соответствующей длины волны. Обычно реакция конъюгации между реакционноспособным красителем и веществом, которое должно быть конъюгировано, приводит к тому, что один или более атомов реакционноспособной группы R включены в новую связь L, связывающую краситель с конъюгированным веществом S. Выбранные примеры реакционноспособных групп и связей показаны ниже в таблице 1, где взаимодействие электрофильной группы и нуклеофильной группы приводит к образованию ковалентной связи.
ТАБЛИЦА 1 - Примеры некоторых путей образования ковалентных связей
Электрофильная группа
Нуклеофильная группа
Полученная ковалентная связь
активированные сложные эфиры*
амины/анилины
карбоксамиды
акриламиды
тиолы
простые тиоэфиры
ацилазиды**
амины/анилины
карбоксамиды
ацилгалогениды
амины/анилины
карбоксамиды
ацилгалогениды
спирты/фенолы
сложные эфиры
ацилнитрилы
спирты/фенолы
сложные эфиры
ацилнитрилы
амины/анилины
карбоксамиды
альдегиды
амины/анилины
имины
альдегиды или кетоны
гидразины
гидразоны
альдегиды или кетоны
гидроксиламины
оксимы
алкилгалогениды
амины/анилины
алкиламины
алкилгалогениды
карбоновые кислоты
сложные эфиры
алкилгалогениды
тиолы
простые тиоэфиры
алкилгалогениды
спирты/фенолы
простые эфиры
алкилсульфонаты
тиолы
простые тиоэфиры
алкилсульфонаты
карбоновые кислоты
сложные эфиры
алкилсульфонаты
спирты/фенолы
простые эфиры
ангидриды
спирты/фенолы
сложные эфиры
ангидриды
амины/анилины
карбоксамиды
арилгалогениды
тиолы
тиофенолы
арилгалогениды
амины
ариламины
азиридины
тиолы
простые тиоэфиры
боронаты
гликоли
боронатные сложные эфиры
карбодиимиды
карбоновые кислоты
N-ацилмочевины или ангидриды
диазоалканы
карбоновые кислоты
сложные эфиры
эпоксиды
тиолы
простые тиоэфиры
галогенацетамиды
тиолы
простые тиоэфиры
галогенплатинат
амино
платиновый комплекс
галогенплатинат
гетероцикл
платиновый комплекс
галогенплатинат
тиол
платиновый комплекс
галогентриазины
амины/анилины
аминотриазины
галогентриазины
спирты/фенолы
триазиниловые простые эфиры
сложные имидоэфиры
амины/анилины
амидины
изоцианаты
амины/анилины
мочевины
изоцианаты
спирты/фенолы
уретаны
изотиоцианаты
амины/анилины
тиомочевины
малеимиды
тиолы
простые тиоэфиры
фосфорамидиты
спирты
сложные эфиры фосфита
силилгалогениды
спирты
простые эфиры силила
сложные эфиры сульфоновой кислоты
амины/анилины
алкиламины
сложные эфиры сульфоновой кислоты
тиолы
простые тиоэфиры
сложные эфиры сульфоновой кислоты
карбоновые кислоты
сложные эфиры
сложные эфиры сульфоновой кислоты
спирты
простые эфиры
сульфонилгалогениды
амины/анилины
сульфаниламиды
сульфонилгалогениды
фенолы/спирты
сложные эфиры сульфоновой кислоты
* Активированные сложные эфиры, как известно в данной области техники, обычно имеют формулу -COΩ, где Ω представляет собой хорошую уходящую группу (например, сукцинимидилокси (-OC4H4N3);
сульфосукцинимидилокси (-OC4H3O2SO3H), -1-оксибензотриазолил (-OC6H4N3); или арилокси-группу, или арилокси, замещенные один или более раз электроноакцепторными заместителями, такими как нитро, фтор, хлор, циано или трифторметил, или их комбинации, применяемые для образования активированных ариловых сложных эфиров; или карбоновую кислоту, активированную карбодиимидом, с образованием ангидрида или смешанного ангидрида -OCORa или -OCNRaNHRb, где Ra и Rb, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой C1-C6 алкил, C1-C6 перфторалкил или C1-C8 алкокси; или циклогексил, 3-диметиламинопропил или N-морфолиноэтил).
**Ацилазиды также могут перегруппироваться в изоцианаты.
x
c
2
d
2
e
z′
2
d
2
4
2
e
z′
2
d
2
e
2
z′
2
d
2
e
z′
[80] Ковалентная связь L связывает реакционноспособную группу R или конъюгированное вещество S с соединением либо напрямую (L представляет собой одинарную связь), либо посредством комбинации стабильных химических связей, необязательно включающей одинарные, двойные, тройные или ароматические углерод-углеродные связи, а также связи углерод-азот, связи азот-азот, связи углерод-кислород, связи углерод-сера, связи фосфор-кислород, связи фосфор-азот и связи азот-платина. L обычно включает простые эфирные, тиоэфирные, карбоксамидные, сульфонамидные, мочевинные, уретановые или гидразиновые фрагменты. Типичные фрагменты L содержат 1-20 не являющихся водородом атомов, выбранных из группы, состоящей из C, N, O, P и S, и состоят из любой комбинации простой эфирной, тиоэфирной, аминной, сложноэфирной, карбоксамидной, сульфонамидной, гидразидной связей и ароматических или гетероароматических связей. В некоторых вариантах реализации L представляет собой комбинацию одинарных углерод-углеродных связей и карбоксамидных или тиоэфирных связей. Самый длинный линейный сегмент связующего фрагмента L может содержать 4-10 не являющихся водородом атомов, включая один или два гетероатома. Примеры L включают замещенный или незамещенный полиметилен, арилен, алкиларилен, ариленалкил или арилтио. В одном варианте реализации L содержит 1-6 атомов углерода; в другом L содержит тиоэфирную связь. В еще одном варианте реализации L представляет собой или включает формулу-(CH)(CONH(CH))-, или -(CH)(CON(CH)NH(CH))-, -(CH)(CONH(CH)NH)-, -(CH)(CONH(CH)NHCO)-, где d составляет 0-5, e составляет 1-5, и z′ составляет 0 или 1.
[81] Выбор реакционноспособной группы, применяемой для присоединения красителя к конъюгируемому веществу, обычно зависит от функциональной группы конъюгируемого вещества и типа или длины желаемой ковалентной связи. Типы функциональных групп, обычно присутствующих в органических или неорганических веществах, включают, но не ограничиваются ими, амины, амиды, азиды, тиолы, спирты, фенолы, альдегиды, кетоны, фосфаты, имидазолы, гидразины, гидроксиламины, дизамещенные амины, галогениды, эпоксиды, сложные эфиры карбоновых кислот, сложные эфиры сульфоновой кислоты, пурины, пиримидины, карбоновые кислоты, олефиновые связи или комбинацию этих групп. На веществе может быть доступен один тип реакционноспособного сайта (типично для полисахаридов), или может встречаться множество сайтов (например, аминный, тиольный, спиртовой, фенольный), что типично для белков. Конъюгированное вещество может быть конъюгировано более чем с одним красителем, который может быть одинаковым или разным, или с веществом, которое дополнительно модифицировано гаптеном, например, биотином. Хотя некоторая селективность может быть достигнута путем тщательного контроля условий реакции, селективность мечения лучше всего достигается путем выбора подходящего реакционноспособного красителя.
x
x
x
[82] Обычно R будет реагировать с амином, тиолом, спиртом, альдегидом или кетоном. В некоторых вариантах реализации R взаимодействует с аминной или тиоловой функциональной группой. В одном варианте реализации R представляет собой акриламид, реакционноспособный амин (включая кадаверин или этилендиамин), активированный сложный эфир карбоновой кислоты (обычно сукцинимидиловый сложный эфир карбоновой кислоты), ацилазид, ацилнитрил, альдегид, алкилгалогенид, ангидрид, анилин, арилгалогенид, азид, азиридин, боронат, карбоновую кислоту, диазоалкан, галогенацетамид, галогентриазин, гидразин (включая гидразиды), сложный имидоэфир, изоцианат, изотиоцианат, малеимид, фосфорамидит, сульфонилгалогенид или тиоловую группу.
x
x
[83] Когда R представляет собой активированный сложный эфир карбоновой кислоты, реакционноспособный краситель может быть использован для получения конъюгатов красителей с белками, нуклеотидами, олигонуклеотидами или гаптенами. Когда R представляет собой малеимид или галогенацетамид, реакционноспособный краситель может быть использован для конъюгации с тиолсодержащими веществами.
x
x
x
[84] В некоторых вариантах реализации R представляет собой карбоновую кислоту, сукцинимидиловый сложный эфир карбоновой кислоты, галогенацетамид, гидразин, изотиоцианат, малеимидную группу, алифатический амин, перфторбензамидо, азидоперфторбензамидогруппу или псорален. В некоторых вариантах реализации R представляет собой сукцинимидиловый сложный эфир карбоновой кислоты, малеимид или йодацетамид. В одном варианте реализации R представляет собой сукцинимидиловый сложный эфир карбоновой кислоты.
x
[85] В некоторых вариантах реализации R включает азид, и использована промотируемая напряжением азид-алкиновая клик-реакция, которая обеспечивает селективное, биоортогональное и не требующее катализатора лигирование между азидом и напряженным циклическим алкином, таким как дибензоциклооктин.
c
[86] В некоторых вариантах реализации S представляет собой основание нуклеиновой кислоты, нуклеозид, нуклеотид или полимер нуклеиновой кислоты, в том числе те, которые модифицированы, чтобы иметь дополнительный линкер или спейсер для присоединения красителей, таких как алкинильный связующий фрагмент, аминоаллильный фрагмент, или линкер, замещенный гетероатомом, или другой связующий фрагмент.
[87] В другом варианте реализации конъюгированное вещество представляет собой аналог нуклеозида или нуклеотида, который связывает пуриновое или пиримидиновое основание с фосфатным или полифосфатным фрагментом через нециклический спейсер.
[88] В другом варианте реализации краситель конъюгирован с углеводной частью нуклеотида или нуклеозида, обычно через гидроксильную группу, но, возможно, также через тиольную или аминогруппу. Обычно конъюгированный нуклеотид представляет собой нуклеозидтрифосфат или дезоксинуклеозидтрифосфат или дидезоксинуклеозидтрифосфат. Также может быть подходящим включение метиленовых фрагментов или гетероатомов азота или серы в фосфатный или полифосфатный фрагмент. Непуриновые и непиримидиновые основания, такие как 7-деазапурины, и нуклеиновые кислоты, содержащие такие основания, также могут быть связаны с красителями. Аддукты нуклеиновых кислот, полученные реакцией депуринированных нуклеиновых кислот с производными амина, гидразида или гидроксиламина, обеспечивают дополнительные средства мечения и обнаружения нуклеиновых кислот.
[89] В некоторых вариантах реализации полимерные конъюгаты нуклеиновой кислоты представляют собой меченые, одно- или многоцепочечные, природные или синтетические ДНК или РНК, ДНК или РНК-олигонуклеотиды, или гибриды ДНК/РНК, или включают необычный линкер, такой как дериватизированные морфолином фосфаты (AntiVirals, Inc., Corvallis Oreg.) или пептидные нуклеиновые кислоты, такие как N-(2-аминоэтил) глициновые звенья. Когда нуклеиновая кислота представляет собой синтетический олигонуклеотид, она обычно содержит менее 50 нуклеотидов, чаще менее 25 нуклеотидов. Конъюгаты пептидо-нуклеиновых кислот (ПНК) можно применять для некоторых случаев вследствие их обычно более высокой скорости гибридизации.
[90] В другом варианте реализации флуоресцентные полимеры нуклеиновых кислот могут быть получены из меченых нуклеотидов или олигонуклеотидов с применением полимеризации ДНК с олигонуклеотидным праймером, например, с применением полимеразной цепной реакции или путем удлинения праймера, или путем присоединения меченого нуклеотида, катализируемого концевой трансферазой, к 3′-концу полимера нуклеиновой кислоты. В данном варианте реализации флуоресцентные полимеры РНК обычно получают из меченых нуклеотидов путем транскрипции. Обычно краситель присоединен через одно или более пуриновых или пиримидиновых оснований посредством амидной, сложноэфирной, простой эфирной или простой тиоэфирной связи; или присоединен к фосфату или углеводу связью, которая представляет собой сложноэфирную, сложнотиоэфирную, амидную, простую эфирную или простую тиоэфирную. В качестве альтернативы, конъюгат красителя может быть одновременно мечен гаптеном, таким как биотин или дигоксигенин, или ферментом, таким как щелочная фосфатаза, или белком, таким как антитело. Конъюгаты нуклеотидов легко включаются ДНК-полимеразой и могут использоваться для гибридизации in situ и секвенирования нуклеиновых кислот.
[91] В другом аспекте олигонуклеотид может включать алифатический амин, который впоследствии может быть конъюгирован с амино-реакционноспособным красителем или тиолом или тиофосфатом, которые, в свою очередь, могут быть конъюгированы с тиол-реакционноспособным красителем.
[92] В одном варианте реализации конъюгаты биологических полимеров, таких как олигонуклеотиды и полимеры нуклеиновых кислот, также метят по меньшей мере вторым флуоресцентным или нефлуоресцентным красителем для образования пары для переноса энергии. В одном варианте реализации второй нефлуоресцентный краситель представляет собой гаситель. В некоторых аспектах меченый конъюгат действует как субстрат фермента, и ферментативный гидролиз нарушает перенос энергии. Более конкретно, и в одном варианте реализации 5'-3'-экзонуклеазная активность полимеразы нуклеиновой кислоты расщепляет олигонуклеотид, высвобождая, таким образом, флуорофор и гаситель из их ближайшего местоположения и тем самым устраняя или по существу устраняя эффект гашения флуорофора гасителем.
[93] Гасители
[94] В одном варианте реализации гаситель представляет собой производное 3- и/или 6-амино ксантенов, которые замещены по одному или более атомам азота аминогруппы ароматическим или гетероароматическим гасящим фрагментом, Q. В одном варианте реализации описанные соединения-гасители обычно обладают максимумом абсорбции при длине волны выше 530 нм, имеют небольшую или совсем не наблюдаемую флуоресценцию и эффективно гасят широкий спектр флуоресценции, такой как излучаемый флуорофорами, как описано в настоящем документе. В одном варианте реализации гасящее соединение представляет собой замещенный родамин. В другом варианте реализации гасящее соединение представляет собой замещенный родол. В еще одном варианте реализации соединение-гаситель представляет собой химически реакционноспособное соединение. Химически реакционноспособные гасящие соединения подходят для мечения широкого спектра веществ, включая биомолекулы, такие как нуклеиновые кислоты. Эти меченые вещества очень подходят для различных анализов и применений на основе передачи энергии, особенно при применении в комбинации с флуорофором.
[95] В настоящем документе каждый гасящий фрагмент Q представляет собой ароматическую или гетероароматическую кольцевую систему, содержащую 1-4 конденсированных ароматических или гетероароматических кольца, присоединенных к азоту аминогруппы посредством одной ковалентной связи. Если фрагмент Q полностью ароматический и не содержит гетероатома, Q включает 1-4 конденсированных шестичленных ароматических кольца. Если фрагмент Q является гетероароматическим, Q включает по меньшей мере один 5- или 6-членный ароматический гетероцикл, который содержит по меньшей мере от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из О, N и S в любой комбинации, который необязательно конденсирован с дополнительным шестичленным ароматическим кольцом или конденсирован с одним 5- или 6-членным гетероароматическим кольцом, которое содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из O, N и S в любой комбинации.
[96] В одном варианте реализации каждый Q-фрагмент связан с ксантеновыми соединениями по азоту 3- или 6-аминогруппы посредством одинарной ковалентной связи. В некоторых вариантах реализации заместители азота аминогруппы, взятые в комбинации, образуют 5- или 6-членный гетероцикл, который представляет собой пиперидин, морфолин, пирролидин, пиразин или пиперазин, и фрагмент Q конденсирован с полученным гетероциклом, смежным с азотом ксантена таким образом, чтобы формально связываться с азотом аминогруппы посредством одинарной связи. Фрагмент Q может быть связан с атомом азота аминогруппы в ароматическом или гетероароматическом кольце при условии, что он присоединен к атому углерода этого кольца.
[97] Обычно фрагменты Q представляют собой замещенный или незамещенный фенил, нафтил, антраценил, бензотиазол, бензоксазол или бензимидазол. Когда заместители азота аминогруппы образуют 5- или 6-членный гетероцикл, и Q-фрагмент конденсирован с образующимся гетероциклом, гетероцикл обычно представляет собой пирролидиновое кольцо, и Q-фрагмент обычно представляет собой конденсированное шестичленное ароматическое кольцо. В некоторых вариантах реализации Q представляет собой фенил или замещенный фенил.
[98] В различных вариантах реализации каждый фрагмент Q необязательно и независимо замещен водородом, галогеном, циано, сульфо, щелочной или аммониевой солью сульфо, карбокси, щелочной или аммониевой солью карбокси, нитро, алкилом, перфторалкилом, алкокси, алкилтио, амино, моноалкиламино, диалкиламино или алкиламидо.
[99] В одном варианте реализации гасящие соединения имеют формулу
+
18
19
где фрагмент K представляет собой O или NRR.
8
9
18
19
8
9
18
19
8
9
18
19
8
9
18
19
[100] Для всех гасящих соединений по меньшей мере один из R, R, R и R представляет собой фрагмент Q. В качестве альтернативы, либо R, взятый в комбинации с R, либо R, взятый в комбинации с R, образует насыщенный 5- или 6-членный гетероцикл, который представляет собой пиперидин или пирролидин, который конденсирован с Q-фрагментом. Обычно каждый из R и R и один из R и R представляет собой фрагмент Q, которые являются одинаковыми или разными. В другом варианте реализации каждый из R, R, R и R представляет собой фрагмент Q, который может быть одинаковым или разным.
8
9
18
19
8
9
18
19
8
2
9
3
18
4
19
5
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
2
3
[101] Остальные R, R, R и R независимо представляют собой H, C-C алкил, С-C карбоксиалкил, C-C сульфоалкил, соль C-C карбоксиалкила или соль C-C сульфоалкила, где алкильные части необязательно замещены амино, гидрокси, карбоновой кислотой, солью карбоновой кислоты или сложным эфиром карбоновой кислоты и C-C алкила. В качестве альтернативы, когда R в комбинации с R или R в комбинации с R или оба, образуют насыщенное 5- или 6-членное гетероциклическое кольцо, оно представляет собой пиперидин, морфолин, пирролидин, пиразин или пиперазин, которое необязательно замещено метилом, сульфоновой кислотой, солью сульфоновой кислоты, карбоновой кислотой, солью карбоновой кислоты или сложным эфиром карбоновой кислоты и C-C алкила. В качестве альтернативы, один или более из R в комбинации с R, R в комбинации с R, R в комбинации с R или R в комбинации с R образуют 5- или 6-членное кольцо, которое является насыщенным или ненасыщенным, и которое необязательно замещено одним или более C-C алкилами или -CHSOX, где X представляет собой H или противоион.
1
6
1
2
6
5
[102] В одном варианте реализации R и R представляют собой H, или один или более из R в комбинации с R, или R в комбинации с R представляет собой конденсированное шестичленное ароматическое кольцо.
2
3
4
5
1
18
1
18
1
6
3
[103] В одном варианте реализации заместители R, R, R и R независимо представляют собой H, F, Cl, Br, I, CN; или C-C алкил, или C-C алкокси, где каждый алкил или алкокси необязательно дополнительно замещен посредством F, Cl, Br, I, карбоновой кислотой, солью карбоновой кислоты или сложным эфиром карбоновой кислоты и C-C спирта; или -SOX.
10
10
10
1
6
1
18
1
6
3
[104] В одном варианте реализации боковая группа R представляет собой H, CN, карбоновую кислоту, соль карбоновой кислоты или сложный эфир карбоновой кислоты и C-C спирта. В качестве альтернативы R представляет собой насыщенный или ненасыщенный, разветвленный или неразветвленный C-C алкил, который необязательно один или более раз замещен посредством F, Cl, Br, карбоновой кислотой, солью карбоновой кислоты, сложным эфиром карбоновой кислоты и C-C спирта, -SOX, амино, алкиламино или диалкиламино, алкильные группы которых содержат 1-6 атомов углерода. В другом варианте реализации R имеет формулу
12
13
14
15
16
13
14
14
15
15
16
3
1
18
1
18
1
18
1
18
1
18
2
36
1
18
7
18
1
6
3
где R, R, R, R и R независимо представляют собой H, F, Cl, Br, I, -SOX, карбоновую кислоту, соль карбоновой кислоты, CN, гидрокси, амино, гидразино, азидо; или C-C алкил, C-C алкокси, C-C алкилтио, C-C алканоиламино, C-C алкиламинокарбонил, C-C диалкиламинокарбонил, C-C алкилоксикарбонил, или C-C арилкарбоксамидо, алкильная или арильная части которого необязательно замещены один или более раз посредством F, Cl, Br, I, гидрокси, карбоновой кислотой, солью карбоновой кислоты, сложным эфиром карбоновой кислоты и C-C спирта, -SOX, амино, алкиламино, диалкиламино или алкокси, алкильные части каждого из которых содержат 1-6 атомов углерода. В качестве альтернативы, пара смежных заместителей R и R, R и R или R и R, взятые в комбинации, образуют конденсированное 6-членное ароматическое кольцо, которое необязательно дополнительно замещено карбоновой кислотой или солью карбоновой кислоты.
x
c
x
c
x
c
x
c
x
c
x
c
8
9
12
13
14
15
16
18
19
12
16
12
14
15
8
9
12
13
14
15
16
18
19
12
13
14
15
16
12
14
15
[105] Соединения необязательно замещены реакционноспособной группой (R) или конъюгированным веществом (S), которое присоединено к соединению ковалентной связью L, как подробно описано выше. Обычно соединение замещено фрагментом -L-Rили -L-S у одного или более из R, R, R, R, R, R, R, R или R, например, у одного из R-R или у R, R или R, или в качестве заместителя в фрагменте Q. В качестве альтернативы, -L-R или -L-S фрагмент присутствует в качестве заместителя в алкильном, алкокси, алкилтио или алкиламино заместителе. В одном варианте реализации точно один из R, R, R, R, R, R, R, R или R представляет собой фрагмент -L-Rили -L-S. В другом варианте реализации точно один из R, R, R, R или R представляет собой фрагмент-L-Rили -L-S. В одном варианте реализации один из R, R и R представляет собой фрагмент -L-R или -L-S.
+
18
19
[106] В вариантах реализации, где K-фрагмент представляет собой NRR, соединения представляют собой родамины и имеют формулу
8
9
18
19
8
9
18
19
[107] где по меньшей мере один из R, R, Rи R представляет собой фрагмент Q. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из R и R представляет собой фрагмент Q и по меньшей мере один из R и R представляет собой фрагмент Q, которые могут быть одинаковыми или разными.
[108] В вариантах реализации, где фрагмент K представляет собой O, соединения представляют собой родолы и имеют формулу
8
9
где по меньшей мере один из R и R представляет собой фрагмент Q.
[109] В одном варианте реализации соединения согласно настоящему изобретению имеют формулу
7
18
19
1
19
где J представляет собой O-Rили NRR, и каждый из R-R имеет указанные выше значения.
7
7
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
[110] Предшественники гасящих соединений обычно не действуют как гасители до тех пор, пока не будет восстановлена ароматичность кольцевой системы, как для гасящих соединений, описанных выше. В этих предшественниках R представляет собой H, C-C алкил, С-C карбоксиалкил, C-C сульфоалкил, соль C-C карбоксиалкила или соль C-C сульфоалкила, где алкильные части необязательно замещены амино, гидрокси, карбоновой кислотой, солью карбоновой кислоты или сложным эфиром карбоновой кислоты и C-C алкила. В качестве альтернативы, R представляет собой одновалентный радикал, формально полученный путем удаления гидроксигруппы из карбоновой кислоты, сульфоновой кислоты, фосфорной кислоты или моно- или полисахарида, такого как гликозид.
10
11
10
11
11
12
[111] В одном варианте реализации R имеет значение, определенное ранее, и R представляет собой H, гидрокси, CN или алкокси, имеющий 1-6 атомов углерода. В качестве альтернативы, R в комбинации с R образует 5- или 6-членное спиролактоновое кольцо, или R в комбинации с R образует 5- или 6-членное спиролактоновое кольцо или 5- или 6-членное сульфоновое кольцо.
x
c
[112] Эти соединения-предшественники легко превращаются в полностью конъюгированные гасящие соединения химическими, ферментативными или фотолитическими способами. Обычно бесцветные предшественники замещены фрагментом -L-R или конъюгированы с желаемым веществом (S).
[113] Примеры гасящих соединений включают, но не ограничиваются ими, следующие:
[114] В одном варианте реализации гаситель представляет собой
.
3
[115] В одном варианте реализации гаситель включает один или более заместителей, таких как сульфонат или SOH, таких как, например,
.
[116] Конъюгаты реакционноспособных соединений
x
x
x
c
c
[117] В одном варианте реализации соединение (гасящее соединение или его соединение-предшественник) замещено по меньшей мере одной группой -L-R, где R представляет собой реакционноспособную группу, которая присоединена к соединению ковалентным связующим фрагментом L, как подробно описано выше для красителей. Соединения с реакционноспособной группой (R) метят широкий спектр органических или неорганических веществ, которые содержат или модифицированы, чтобы содержать функциональные группы с подходящей реакционной способностью, что приводит к химическому присоединению конъюгированного вещества (S), представленного посредством -L-S.
c
[118] В одном варианте реализации конъюгированное вещество (S) представляет собой основание природной или синтетической нуклеиновой кислоты, нуклеозид, нуклеотид или полимер нуклеиновой кислоты, включая те, которые защищены или модифицированы, чтобы иметь дополнительный линкер или спейсер для присоединения соединений, например, такой как алкинильный связующий фрагмент, аминоаллильный связующий фрагмент или другой связующий фрагмент. В некоторых вариантах реализации конъюгированный нуклеотид представляет собой нуклеозидтрифосфат или дезоксинуклеозидтрифосфат или дидезоксинуклеозидтрифосфат.
[119] Хотя обычно предпочтительно включать краситель в нуклеиновую кислоту с применением автоматического синтезатора ДНК, красители, недоступные в форме амидита или неспособные сохраняться в жестких условиях расщепления/снятия защиты (C/D), обычно вводят после синтеза в олигонуклеотиды, функционализированные аминогруппами, через их производные сложного эфира NHS. Однако такие реакции мечения обычно требуют большого избытка сложный эфир NHS-краситель, например, в 10-20-кратном молярном эквиваленте, по сравнению с аналогом нуклеиновой кислоты, вследствие конкурирующих побочных реакций, включая гидролиз и аминолиз остаточных аминовых примесей из синтеза.
[120] Ввиду этого авторы настоящего изобретения разработали альтернативную стратегию с применением азидодериватизированного красителя для мечения нуклеиновой кислоты, такой как олигонуклеотид, имеющий напряженный циклооктинный фрагмент, посредством высокоэффективной клик-реакции, не требующей Cu. Вследствие специфической природы образования триазола между азидными и циклооктиновыми функциональными группами, очень немногие побочные реакции конкурируют или мешают таким реакциям. В качестве примера, азидопроизводное цианинового красителя взаимодействует с циклооктинсодержащим олигонуклеотидом во время стадии концентрирования после C/D, благодаря преимуществу более быстрой кинетики клик-реакции при высокой концентрации азидных и октиновых фрагментов. Следовательно, почти количественное преобразование олигонуклеотида, содержащего циклооктин, в азидодериватизированный краситель достигалось с применением только 20% молярного избытка (или 1,2 эквивалента) красителя над олигонуклеотидом.
[121] Эта альтернативная схема мечения, основанная на клик-химии азида/циклооктина без применения Cu для получения конъюгатов краситель-олигонуклеотид, имела следующие преимущества по сравнению с обычно применяемой химией сложный эфир NHS/амин: 1. Для конъюгации необходима более низкая молярная эквивалентность азидокрасителя, чем у его аналога на основе сложного эфира NHS, что приводит к снижению затрат на реагенты; 2. Вследствие их химической инертности азидокрасители можно готовить в виде растворов и хранить в форме готовых к применению растворов намного дольше, чем их аналоги на основе эфиров NHS (или более длительный срок хранения); и 3. Рабочий процесс очистки после мечения можно дополнительно оптимизировать для снижения трудозатрат.
[122] Азиды и алкины могут претерпевать [3+2] циклоприсоединение без Cu, т.е. без катализатора, с применением взаимодействия активированных алкинов с азидами. Такое бескаталитическое [3+2] циклоприсоединение можно применять в описанных в настоящем документе способах для конъюгирования красителя с биомолекулой, такой как олигонуклеотид. Алкины могут быть активированы напряжением кольца, как, только в качестве примера, восьмичленные кольцевые структуры, или девятичленные, присоединяющие электроноакцепторные группы к таким алкиновым кольцам, или алкины могут быть активированы добавлением кислоты Льюиса, как, только в качестве примера, Au (I) или Au (III). Алкины, активируемые напряжением кольца, были описаны и получили название «не требующего меди» или [3+2] циклоприсоединения без меди. Например, циклооктины и дифторциклооктины, описанные Agard et al., J. Am. Chem. Soc, 126 (46): 15046-15047 (2004), дибензоциклооктины, описанные Boon et al., PCT International Publication No. WO 2009/067663 Al (2009), азадибензоциклооктины, описанные Debets et al., Chem. Comm., 46:97-99 (2010), и циклононины, описанные Dommerholt et al., Angew. Chem. 122:9612-9615 (2010)). Дополнительные описания реакции активированных алкинов с азидами без Cu можно найти в PCT/US2006/042287, PCT/IB2007/003472 и PCT/US2013/066765. В некоторых вариантах реализации способов, описанных в настоящем документе, краситель может содержать азидный фрагмент, вследствие чего биомолекула обладает активированным алкиновым фрагментом; в то время как в других вариантах реализации краситель может содержать активированный алкиновый фрагмент, и биомолекула содержит азидный фрагмент. В различных вариантах реализации циклооктин выбран из циклооктина (OCT), монофторированного циклооктина (MOFO), дифторциклооктина (DIFO), диметоксиазациклооктина (DIMAC), дибензоциклооктина (DIBO), дибензоазациклооктина (DIBАС), биарилазациклооктинона (BARAC), бициклононина (BCN), 2,3,6,7-тетраметокси-DIBO (TMDIBO), сульфонилированного DIBO (S-DIBO), карбоксиметилмонобензоциклооктина (COMBO) и пирролоциклооктина (PYRROC).
[123] Примеры полимерных конъюгатов нуклеиновой кислоты представляют собой меченые, одно-, двух- или многоцепочечные, природные или синтетические ДНК или РНК, ДНК или РНК-олигонуклеотиды, или гибриды ДНК/РНК, или включают необычный линкер, такой как дериватизированные морфолином фосфаты или пептидо-нуклеиновые кислоты, такие как звенья N-(2-аминоэтил) глицина. Когда нуклеиновая кислота представляет собой синтетический олигонуклеотид, она обычно содержит менее 50 нуклеотидов, чаще менее 25 нуклеотидов. Более крупные полимеры нуклеиновых кислот обычно получают из меченых нуклеотидов или олигонуклеотидов с применением полимеризации ДНК с олигонуклеотидным праймером, например, с применением полимеразной цепной реакции или путем удлинения праймера, или путем присоединения меченого нуклеотида, катализируемого концевой трансферазой, к 3′-концу полимера нуклеиновой кислоты. Обычно соединение присоединено через одно или более пуриновых или пиримидиновых оснований посредством амидной, сложноэфирной, простой эфирной или простой тиоэфирной связи; или присоединен к фосфату или углеводу связью, которая представляет собой сложноэфирную, сложнотиоэфирную, амидную, простую эфирную или простую тиоэфирную. В качестве альтернативы, соединение связывается с полимером нуклеиновой кислоты путем химической пост-модификации, например, с помощью платиновых реагентов, или с применением фотоактивируемой молекулы, такой как конъюгированный псорален. В одном варианте реализации гасящий фрагмент присоединен к нуклеотиду, олигонуклеотиду или полимеру нуклеиновой кислоты через группу, реакционноспособную по отношению к фосфорамидиту, что приводит к образованию фосфодиэфирной связи.
[124] Гасящие соединения могут принимать энергию от самых разных флуорофоров при условии, что гасящее соединения и флуорофор находятся достаточно близко друг к другу, чтобы произошло гашение, и что по меньшей мере некоторое спектральное наложение возникает между длинами волн излучения флуорофора и полосой поглощения гасящего соединения. Это наложение может возникать при излучении донора, происходящем при более низкой или даже более высокой длине волны максимума излучения, чем максимальная длина волны поглощения гасящего соединения, при условии, что существует достаточное спектральное наложение. В некоторых вариантах реализации гасящее соединение является только слабо флуоресцентным или по существу нефлуоресцентным, так что перенос энергии приводит к небольшому испусканию флуоресценции или ее отсутствию. В одном аспекте гасящее соединение является по существу нефлуоресцентным и имеет квантовый выход флуоресценции менее примерно 0,05. В другом аспекте гасящее соединение имеет квантовый выход флуоресценции менее примерно 0,01. В еще одном аспекте гасящее соединение имеет квантовый выход флуоресценции менее примерно 0,005.
[125] Обычно гашение происходит за счет FRET между донором и гасящим акцептором. Степень FRET, проявляемого донорно-акцепторной парой, может быть представлена уравнением Ферстера:
R
⋅n
⋅QY
J
o
D
23
2
−4
1/6
=(8,8×10⋅κ ⋅(λ)Å
o
где радиус Ферстера (R) представляет собой расстояние разделения, на котором передача энергии между донором и акцептором является на 50% эффективной (т.е. 50% возбужденных доноров дезактивируются FRET);
2
2
κ = фактор ориентации диполя (диапазон 0-4, κ = ⅔ для случайно ориентированных доноров и акцепторов);
D
QY = квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора;
n = показатель преломления; и
J(λ) = интеграл спектрального наложения.
[126] Поскольку степень передачи энергии зависит от интеграла спектрального наложения, легко понять, что спектральные свойства донорных и акцепторных красителей оказывают сильное влияние на наблюдаемую передачу энергии, как показано в следующем уравнении:
J
F
dλ
M
A
D
4
3
−1
(λ)=∫ε(λ)⋅(λ)⋅λcm
A
A.
D
D
где ε (λ) представляет собой спектр поглощения акцептора, выраженный через коэффициент молярной экстинкции ε F (λ) представляет собой спектр излучения флуоресценции донора, при этом интенсивность флуоресценции (F) выражается в виде доли от общей интегральной интенсивности.
[127] Следует понимать, что степень передачи энергии во время FRET и, следовательно, гашения, сильно зависит от расстояния разделения между флуорофором и гасящим соединением. В молекулярных системах изменение гашения флуоресценции обычно хорошо коррелирует с изменением расстояния разделения между молекулой флуорофора и молекулой гасящего соединения. Любой флуорофор с достаточным спектральным наложением с гасящим соединением является подходящим донором для применения. Чем больше степень наложения, тем больше наблюдается общее гашение.
[128] В одном варианте реализации разборку, расщепление или другое разрушение молекулярной структуры, содержащей описанные флуорофор и гаситель, обнаруживают при наблюдении частичного или полного восстановления флуоресценции флуорофора. В некоторых вариантах реализации первоначально погашенная флуоресценция флуорофора, связанного со структурой, ослабляется при удалении из непосредственной близости к гасящему соединению посредством разборки, расщепления или разрушения молекулярной структуры. Гасящее соединение необязательно связано с той же молекулярной структурой, что и флуорофор, или донор и акцептор связаны с соседними, но разными субъединицами структуры. Следующие системы, среди прочего, могут быть проанализированы с применением описанных пар передачи энергии для обнаружения и/или количественной оценки разборки структуры:
определение активности протеазы с применением флуорогенных субстратов (например, анализы протеазы ВИЧ); обнаружение ферментно-опосредованной модификации белка (например, расщепление углеводов/жирных кислот, фосфатов, простетических групп); иммуноанализы (с помощью анализа вытеснения/конкурентного анализа); обнаружение раскручивания дуплекса ДНК (например, анализы хеликазы/топоизомеразы/гиразы); смещение цепи нуклеиновой кислоты; плавление дц ДНК; нуклеазная активность; распределение и транспорт липидов; и анализы TaqMan.
[129] Разделение структуры обычно обнаруживают, наблюдая частичное или полное восстановление флуоресценции, поскольку конъюгированное вещество подвергается воздействию представляющих интерес условий разрушения в течение периода времени, достаточного для возникновения разрушения. Восстановление флуоресценции указывает на увеличение расстояния между флуорофором и гасящим соединением и, следовательно, на разрушение конъюгированного вещества.
[130] Зонд
m
[131] Различные производители предоставляют приборы для обнаружения мультиплексных анализов ПЦР. В качестве одного примера, Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс) предоставляет 4-плексные TaqMan-тесты для обнаружения в реальном времени целевых нуклеиновых кислот на приборах Thermo Fisher Scientific, таких как Vii7, Quant Studio и т.д. Большинство этих приборов для кПЦР в реальном времени имеют оптическую способность проведения анализа 6-плексного TaqMan. В некоторых вариантах реализации мультиплексные зонды TaqMan содержат репортерные красители FAM, VIC, ABY и JUN и гаситель QSY7. Гаситель QSY7 не может эффективно гасить репортерные красители с максимумами флуоресценции > 630 нм. Таким образом, в одном варианте реализации идеальный краситель для обнаружения в ПЦР с применением 5-го и 6-го фильтров имеет максимумы излучения при 665 нм и 700 нм соответственно. В одном варианте реализации 5-й и 6-й репортерные красители должны быть доступны в виде производного фосфорамидита, что упрощает синтез зондов TaqMan с высоким качеством и меньшей стоимостью. В одном варианте реализации описанный зонд(ы) включен в мультиплексный ПЦР-анализ как 5-й и/или 6-й зонд, при этом анализ также включает зонды, содержащие следующие комбинации краситель/гаситель: JUN/QSY, VIC/QSY, FAM/MGBNFQ и ABY/QSY. Красители этих зондов имеют максимальную эмиссию: FAM примерно 517 нм, VIC примерно 551 нм, ABY примерно 580 нм и JUN примерно 615 нм. В различных вариантах реализации описанные зонды также включают связующий фрагмент с малой бороздкой (MGB) на 3'-конце, который увеличивает температуру плавления (T) зонда и стабилизирует гибриды зонд-мишень. В некоторых вариантах реализации применение MGB позволяет применение более короткого зонда, чем традиционные зонды, что может обеспечить лучшее различение последовательностей и гибкость для размещения большего количества мишеней.
[132] Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что бензильное замещение индола цианинового красителя дает неожиданно большой сдвиг максимума эмиссии цианинового красителя в красную область. Например, следующий бензилзамещенный краситель был сдвинут на 8 нм в красную область по сравнению с красителем без бензильного производного, со сдвигом эмиссии от 697 до 705 нм.
Этот сдвиг длины волны излучения в красную область значительно упрощает отделение бензилового красителя от других красителей, излучающих с аналогичными длинами волн. Поскольку наблюдается уменьшение спектрального наложения, при использовании для мультиплексного (например, 6-плексного) применения в кПЦР бензильное производное цианин может привести к уменьшению перекрестных помех между красителями, излучающими на соседних длинах волн, и минимизировать шум, связанный с деконволюцией их сигналов. Сведение к минимуму шума также может способствовать большей чувствительности обнаружения, позволяя использовать большее окно обнаружения. В различных вариантах реализации этот описанный бензилзамещенный краситель включен в описанный зонд и позволяет применять мультиплексные кПЦР методы, включая 6-плексную кПЦР.
[133] В одном варианте реализации описанный зонд содержит один из флуорофорных/репортерных красителей, описанных выше, и один из гасителей, описанных выше, причем каждый флуорофор и гаситель ковалентно конъюгированы с олигонуклеотидом. Примеры зондов, подходящих для применений в мультиплексной ПЦР, могут включать карбоцианиновый репортерный краситель, как описано в настоящем документе, который излучает в красной области спектра при возбуждении соответствующей длиной волны. Типичные примеры карбоцианиновых красителей, излучающих в красной области спектра, включают, например, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 676, DyLight 647 или DyLight 677, доступные от Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA), и их производные. В одном варианте реализации флуорофор и гаситель ковалентно присоединены к концам олигонуклеотида. Типичный пример полностью собранного зонда:
[134] Описанный зонд можно синтезировать способами, известными в данной области техники. Например, в одном варианте реализации флуорофор и гаситель ковалентно конъюгированы с концами олигонуклеотида с применением химии конъюгации и реакционноспособных групп, описанных выше. В другом примере гаситель или зонд могут быть конъюгированы с твердой подложкой, и олигонуклеотид синтезирован из присоединенного гасителя или зонда с применением стандартных способов синтеза олигонуклеотидов, таких как синтезатор ДНК, а затем другой гаситель или зонд ковалентно присоединяется к концу синтезированного олигонуклеотида. Пример варианта реализации присоединения гасителя к твердой подложке представлен в примере.
[135] Способы и наборы
[136] В дополнительном аспекте предложены способы и наборы для осуществления одноплексной или мультиплексной ПЦР, такой как кПЦР, ПЦР по конечной точке или ОТ-ПЦР, с применением описанного зонда. ПЦР по конечной точке представляет собой анализ после завершения всех циклов ПЦР. В отличие от кПЦР, которая позволяет количественно определять удвоение матрицы (экспоненциальная фаза), анализ конечной точки основан на фазе плато амплификации. ОТ-ПЦР сочетает в себе обратную транскрипцию РНК в ДНК, называемую комплементарной ДНК или кДНК, и амплификацию конкретных мишеней кДНК с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). В различных вариантах реализации комбинацию ОТ-ПЦР и кПЦР обычно применяют для анализа нуклеиновых кислот, такого как определение экспрессии генов и количественное определение вирусной РНК в исследовательских и клинических условиях. Однако ОТ-ПЦР можно применять без кПЦР, например, для обеспечения молекулярного клонирования, секвенирования или простого обнаружения РНК, а кПЦР можно применять без ОТ-ПЦР, например, для количественного определения числа копий определенного фрагмента ДНК.
[137] В частности, способ амплификации и обнаружения множества целевых последовательностей ДНК включает обеспечение композиции или реакционной смеси, содержащей описанный зонд, осуществление протокола термоциклирования реакционной смеси, в результате чего может происходить амплификация указанного множества целевых последовательностей, и мониторинг амплификации путем обнаружения флуоресценции описанного зонда по меньшей мере один раз в течение множества циклов амплификации. В одном варианте реализации способ включает 5-плексный или 6-плексный мультиплексный ПЦР-анализ, в котором описанные зонды позволяют детектировать 5-ю и/или 6-ю целевую нуклеиновую кислоту.
[138] Обнаружение сигнала может быть осуществлено с применением любых реагентов или приборов, которые обнаруживают изменение флуоресценции от флуорофора. Например, обнаружение может быть выполнено с применением любого спектрофотометрического термоциклера. Примеры спектрофотометрических термоциклеров включают, но не ограничиваются ими, Applied Biosystems (AB) PRISM 7000, систему для ПЦР в реальном времени AB 7300, систему для ПЦР в реальном времени AB 7500, AB PRISM 7900HT, Bio-Rad ICycler IQ.TM., Cepheid SmartCycler II, Corbett Research Rotor-Gene 3000, Idaho Technologies R.A.P.I.D.™, MJ Research Chromo 4™, Roche Applied Science LightCycler, Roche Applied Science LightCycler2.0, Stratagene Mx3000P™ и Stratagene Mx4000™. Следует отметить, что новые приборы разрабатываются быстрыми темпами, и любые подобные приборы можно применять для данных способов. В одном варианте реализации и в качестве примера 6-плексного мультиплексного анализа можно применять следующие наборы фильтров: 1-й 520 ± 15, 2-й 558 ± 12, 3-й 587 ± 10, 4-й 623 ± 14, 5-й 682 ± 14 и 6-й 711 ± 12. Этот набор фильтров является стандартным для приборов для анализа в реальном времени Vii7, Quant Studio 5 и Quant Studio 7.
[139] Мишень(и) нуклеиновой кислоты описанного способа может представлять собой любую мишень нуклеиновой кислоты, известную специалисту в данной области техники. Кроме того, мишенями могут быть области с низкой мутацией или области с высокой мутацией. Например, одно особенно ценное применение раскрытых в настоящем документе способов включает нацеливание на сильно мутировавшие нуклеиновые кислоты, такие как вирусные гены РНК, или на участки с высокой генетической изменчивостью, такие как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP). В некоторых вариантах реализации мишени могут быть фрагментированы или разрушены, например, материал из судебно-медицинских образцов и/или фиксированных тканей. Мишени могут быть любого размера, поддающиеся амплификации. Одно особенно ценное применение способов и композиций, представленных в настоящем документе, включает идентификацию коротких фрагментов, таких как миРНК и микроРНК. Другим особенно ценным применением является применение для образцов, которые могут содержать фрагментированную и/или разрушенную нуклеиновую кислоту, например, фиксированные образцы или образцы, подвергшиеся воздействию окружающей среды. Таким образом, данные способы можно применять, например, для биопсии ткани и ДНК в судебной экспертизе. Мишени могут быть очищенными или неочищенными. Мишени могут быть получены in vitro (например, мишень кДНК) или могут быть обнаружены в биологических образцах (например, мишень РНК или геномной ДНК (гДНК)). Биологический образец можно применять без обработки, или биологические образцы можно обрабатывать для удаления веществ, которые могут мешать раскрытым в настоящем документе способам.
[140] Зонды, представленные в настоящем документе, можно применять в способах диагностики, например, обнаружении SNP, идентификации конкретных биомаркеров и т.д., при условии, что зонды комплементарны последовательности (например, геномной) возбудителя инфекционного заболевания, например, заболевания человека, включая, но не ограничиваясь, вирусы, бактерии, паразиты и грибы, тем самым диагностируя присутствие инфекционного агента в образце, содержащем нуклеиновую кислоту от пациента. Нуклеиновая кислота-мишень может быть геномной, кДНК, или мРНК, или синтетической, человека или животного, или микроорганизмов и т.д. В других вариантах реализации зонды можно применять для диагностики или прогнозирования заболевания или расстройства, которое не вызвано инфекционным агентом. Например, зонды можно применять для диагностики или прогнозирования рака, аутоиммунных заболеваний, психических заболеваний, генетических нарушений и т.д. путем определения наличия мутации, полиморфизма или аллеля в образце от человека или животного. В некоторых вариантах реализации зонд содержит мутацию или полиморфизм. Кроме того, зонды можно применять для оценки или отслеживания прогрессирования лечения заболевания или расстройства.
[141] Также предусмотрены композиции, такие как реакционная смесь или мастер-микс, содержащие описанный зонд. В одном варианте реализации композиция для ПЦР, такой как для ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР, ПЦР по конечной точке или ОТ-ПЦР содержит по меньшей мере один из описанных зондов. В одном варианте реализации композиция или реакционная смесь или мастер-микс для ПЦР (например, количественная ПЦР, ПЦР по конечной точке или ОТ-ПЦР) содержит зонды, позволяющие обнаруживать 4 целевые нуклеиновые кислоты, и описанный зонд(ы), позволяющий обнаруживать по меньшей мере одну из 5-й и/или 6-й целевой нуклеиновой кислоты, при этом каждый из описанных зондов состоит из донорного фрагмента FRET, т.е. флуорофора, и акцепторного фрагмента FRET, то есть гасителя, где флуорофор имеет максимум эмиссии между примерно 650 и 720 нм. Максимальное поглощение гасителя, как описано в настоящем документе, составляет при 660-668 нм. Описанный в настоящем документе диапазон поглощения гасителя составляет 530-730 нм. В альтернативном варианте реализации предусмотрены реагенты для мечения для конъюгирования описанных флуорофора и гасителя с выбранным олигонуклеотидом.
[142] Кроме того, такая композиция или реакционная смесь или мастер-микс может содержать одно или более соединений и реагентов, выбранных из следующего перечня: буфер, применимый для полимеразной цепной реакции, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), ДНК-полимераза с 5’-3’ экзонуклеазной активностью, по меньшей мере одна пара или несколько пар праймеров для амплификации и/или дополнительных зондов.
[143] В еще одном аспекте предложен набор, содержащий по меньшей мере один из описанных зондов. Кроме того, набор может содержать одно или более других соединений и реагентов, выбранных из следующего перечня: буфер, применимый для полимеразной цепной реакции, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), ДНК-полимераза с 5’-3’ экзонуклеазной активностью, по меньшей мере одна или множество пар праймеров для амплификации. Набор также может содержать ДНК или стандарт внутреннего контроля. Что касается ОТ-ПЦР, набор может дополнительно включать обратную транскриптазу. Каждый из описанных выше компонентов можно хранить в одной емкости для хранения и упаковывать отдельно или вместе. Однако также возможна любая комбинация компонентов для хранения в одной емкости.
[144] Примеры
[145] Соединение-гаситель может быть прикреплено к твердой подложке, например, грануле, для обеспечения субстрата для конструирования зонда с применением синтезатора олигонуклеотидов, в соответствии со следующей схемой реакции:
[146] Следующий пример процедура синтеза может быть легко распространен на любой из гасителей, описанных выше. Таким образом, приведенная выше схема реакции и нижеприведенная процедура не предназначены для ограничения объема заявленного предмета изобретения.
[147] В одном варианте реализации пример дериватизированного гасителя (2) может быть синтезирован согласно следующей процедуре.
2
4
2
2
1
+
+
Пример гасителя (1) сложный эфир NHS (100 мг, 0,123 ммоль) растворяли в 1 мл безводного ДХМ (англ. DCM). 1-O-DMT-2-(4-аминобутил)-1,3-пропандиол (61 мг, 0,14 ммоль), растворенный в 1213 мкл ДХМ (5% раствор), смешивали с диизопропилэтиламином (32 мкл, 0,19 ммоль). Его по каплям добавляли к гасителю (1) сложному эфиру NHS при комнатной температуре и перемешивали в течение 30 мин в атмосфере азота. Неочищенный пример гасителя (2) в растворе ДХМ разбавляли посредством ДХМ (50 мл) и промывали 1% лимонной кислотой, водой и затем солевым раствором. Органический слой сушили над NaSO и упаривали досуха. Посредством дальнейшей сушки в глубоком вакууме в течение ночи получали 125 мг (выход 88%) гасителя (2) в виде темно-синего твердого вещества. Продукт применяли на следующей стадии без дополнительной очистки. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,14 (1H, d), 7,83 (2H, m), 7,60 (2H, d), 7,50 – 7,10 (22H, m), 6,80 (4H, m) 4,40 (2H, m), 4,25 (2H, m), 3,75 (6H, s), 3,62 – 3,50 (4H, m), 3,30 (6H, m), 3,05 (2H, m), 2,51 (2H, t), 2,40 (1H, t), 1,72 (2H, d), 1,50 – 1,20 (7H, m). LC/HRMS (ESI): рассчитано для [M] 1113,48; обнаружено 1113,47. Элюирование проводили с применением линейного градиента от 40 до 100% ацетонитрила (против 0,1 М ацетата триэтиламмония) в течение 20 минут. Скорость потока 1,0 мл/мин. Обнаружение при 285 нм и 655 нм.
[148] В другом варианте реализации пример гасителя, включающего дигликолевый линкер (3), может быть синтезирован согласно следующей процедуре.
2
4
2
2
1
+
+
Пример гасителя (2) (125 мг, 0,109 ммоль) растворяли в 3 мл безводного ДХМ. Добавляли DIPEA (47 мкл, 0,27 ммоль), а затем дигликолевый ангидрид (25 мг, 0,22 ммоль). Раствор перемешивали в течение 30 мин в атмосфере азота. Реакционную смесь концентрировали, и остаток повторно растворяли в 1% TEA/ДХМ и очищали на хроматографической колонке с силикагелем (предварительно уравновешенной в 10% - 1% TEA/ДХМ) с применением элюента 5-15% MeOH/ДХМ/1% TEA. Очищенный объем смеси концентрировали, и затем промывали 1% лимонной кислотой, водой и солевым раствором. Органический слой сушили над безводным NaSO, упаривали досуха, и затем дополнительно сушили в глубоком вакууме с получением примера гасителя дигликолевого линкера (3) (96 мг, выход 69%) в форме темно-синего твердого вещества. H ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,14 (1H, d), 7,85 (2H, m), 7,60 (2H, d), 7,52 – 7,10 (22H, m), 6,79 (4H, d), 4,35 (2H, m), 4,25 (2H, m) 4,05 (3H, s/m), 3,80 (2H, s), 3,72 (6H, s), 3,28 (6H, m), 3,00 (2H, m), 2,90 (2H, m), 2,50 (2H, t), 2,32 (1H, t), 1,65 (2H, m), 1,50 – 1,10 (7H, m). LC/HRMS (ESI): рассчитано для [M] 1229,49; обнаружено 1229,49. Элюирование проводили с применением линейного градиента от 40 до 100% ацетонитрила (против 0,1 М ацетата триэтиламмония) в течение 20 минут. Скорость потока 1,0 мл/мин. Обнаружение при 285 нм и 655 нм.
[149] Пример гасителя (4) может быть связан с твердой подложкой, например, полистирольной гранулой, в соответствии со следующей процедурой.
-1
-1
Пример дигликолевый линкер гасителя (3) (357 мг, 0,20 ммоль) растворяли в 50 мл безводного ДМФА. К нему добавляли аминометилполистирол (6,77 г, 0,223 ммоль, 33 мкмоль/г амина), DIPEA (194 мкл, 1,12 моль) и COMU или 1-циано-2-этокси-2-оксоэтилиденаминоокси)диметиламиноморфолино карбения гексафторфосфат (287 мг, 0,669 ммоль). Смесь встряхивали в течение 3 часов. Растворитель удаляли, и смолу промывали 3 раза по 50 мл посредством ДМФА (англ. DMF), MeCN и ДХМ. Затем любые оставшиеся аминогруппы на смоле блокировали взаимодействием с 50 мл уксусного ангидрида/пиридина в ТГФ, смешанных с 50 мл 1-N-метилимидазола в ТГФ, и встряхивали в течение 1 часа. Растворитель удаляли, и смолу промывали 3 раза посредством ТГФ, MeCN и ДХМ. Затем смолу сушили в течение ночи в глубоком вакууме с получением 6,60 г светло-голубого порошка примера гасителя (4). Смолу-носитель тестировали на любые остаточные аминогруппы с применением нингидринового теста, и обнаружили 0,94 мкмоль/г амина (незначительно). Количество примера гасителя, связанного с носителем, определяли путем отщепления группы DMT от взвешенной аликвоты образца примера PS-гасителя с известным объемом 0,1 М толуолсульфоновой кислоты в MeCN. Получали поглощение при 498, и с применением коэффициента экстинкции (76 500Mсм), массы и объема установили, что загрузка примера гасителя на грамм полистирола составила 22 мкмоль/г. Типичный диапазон, обнаруженный для данного условия связывания, составлял 20-27 мкмоль/г.
[150] В качестве примера бензилзамещенный цианиновый краситель со сдвигом эмиссии от 697 до 705 нм от не замещенного бензилом цианинового красителя, как описано, может быть синтезирован следующим образом с применением способов синтеза, хорошо известных в данной области:
Гидролиз
1
2
2
2
3
3
4
5
5
6
3,
2
4.
2
4
2
2
2
[151] Смесь  и пара-бромметилметилбензоат нагревали с обратным холодильником при перемешивании в ацетонитриле в течение 48 часов. Реакционную смесь охлаждали до температуры окружающей среды, и нерастворимые твердые вещества удаляли вакуумной фильтрацией. Растворитель удаляли на роторном испарителе и  очищали колоночной хроматографией, элюируя этилацетатом и гексаном (5:1). Соединение  суспендировали в метаноле, и добавляли 5 эквивалентов 6 М гидроксида натрия. Смесь нагревали при 55 °C в течение 8 часов до тех пор, пока не израсходуется  по данным анализа ТСХ с применением EtOAc/гексанов/AcOH. (1 : 2 : 0,1). Метанол удаляли на роторном испарителе. Колбу охлаждали на бане с ледяной водой при 0-5 °C и при перемешивании по каплям добавляли концентрированную HCl до достижения pH 5. Водную смесь экстрагировали посредством CHCl органический слой отделяли и сушили над NaSO. NaSO удаляли фильтрованием, и растворитель удаляли роторным испарением. Маслянистый продукт  очищали колоночной хроматографией с применением EtOAc:гексаны:AcOH (2: 8: 0,1). Соединение  смешивали с 0,8 эквивалентами 6-гидразино-1,3-нафталиндисульфоновой кислоты  в уксусной кислоте и кипятили с обратным холодильником при перемешивании в течение 12 часов. Уксусную кислоту удаляли с применением роторного испарения, и  очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с применением CHCl: MeOH: HO: AcOH (6,5:3:0,2:0,1). Соединение  смешивали с 3 эквивалентами 1,3-пропансульфона и 2 эквивалентами ацетата натрия и нагревали при 110 °C в течение 1 часа. К остатку при кипячении с обратным холодильником добавляли ацетонитрил. Раствор охлаждали и декантировали AcCN с получением неочищенного  после вакуумной сушки.
6
8
8
9
9
10
9
11
[152] Соединение  суспендировали в 0,5 н. HCl в метаноле и кипятили с обратным холодильником при перемешивании в течение 1 часа. Растворитель удаляли на роторном испарителе. Остаток суспендировали в метаноле, и добавляли 1,1 эквивалента ацетата натрия при перемешивании в течение 10 минут. Метанол удаляли на роторном испарителе, и остаток сушили в вакууме. Остаток суспендировали в ДМФА с 0,1% диизопропилэтиламином и 5 эквивалентами метилиодида, и нагревали при перемешивании в течение 8 часов. Соединение  очищали колоночной хроматографией, элюируя смесью CH2Cl2: MeOH: AcOH (80: 20: 1). Соединение  и 1 эквивалент моногидрохлорида бис(фенилимина) малонового альдегида суспендировали в уксусной кислоте, и добавляли 0,1 эквивалента триэтиламина. Смесь нагревали при 110 °C в течение 1 часа. Реакционную смесь охлаждали, и добавляли EtOH (приблизительно 2 x объем AcOH), неочищенный  осаждали диэтиловым эфиром и собирали фильтрованием. Соединение  очищали колоночной хроматографией, элюируя смесью CH2Cl2: MeOH: AcOH (80: 20: 1). Соединение  (20 мг) суспендировали в ДМФА (2 мл). При перемешивании добавляли 1 эквивалент соединения . Добавляли уксусный ангидрид (3,5 эквивалента), и затем триэтиламин (6,4 эквивалента) при перемешивании, и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение двух часов. Раствор концентрировали на роторном испарителе. К концентрату добавляли EtOAc и перемешивали 4-12 часов. Сине-зеленое твердое вещество собирали фильтрованием под вакуумом. Твердое вещество суспендировали в 0,2 М LiOH в воде (15 мг/1 мл), перемешивали в течение 3 часов. Добавляли смолу Dowex H + 50W-X8, H +, 20-50 меш (0,5 г смолы/1 мл LiOH). Перемешивали 15 минут до нейтральной реакции, раствор красителя фильтровали. Краситель  очищали колоночной хроматографией, элюируя смесью CH2Cl2: MeOH: AcOH (80: 20: 1).
[153] Следует понимать, что, хотя вышеупомянутые варианты реализации были подробно описаны посредством иллюстрации и примера, возможны многочисленные модификации, замены и изменения без отступления от сущности и объема заявленного предмета изобретения. Каждая из процитированных в настоящем документе ссылок полностью включена посредством ссылки.
[154] Дополнительные аспекты настоящего изобретения изложены в следующих пронумерованных пунктах:
[155] Пункт 1. Зонд, содержащий продукт конъюгации:
а) красителя общей формулы Ia, формулы Ib, формулы Ic или формулы Id
Формула Ia
Формула Ib
Формула Ic
Формула Id
где
4
13
14
3,
3
каждый из R, R и R и R когда они присутствуют, являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, алифатической группы, гетероалифатической группы, сульфоалкила, гетероалифатической группы с концевой SO, бензила и замещенного бензила, где замещенный бензил содержит по меньшей мере одну карбоксигруппу, по меньшей мере одну сульфонатную группу, -F, -Cl, -Br или их комбинацию;
5
6
7
8
9
10
15
16
17
18
19
20
21
22
3
каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO;
2
12
3
каждый из R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO;
2
2
2
2
2
X выбран из группы, состоящей из -OH, -SH, -NH, -NH-NH, -F, -Cl, -Br, I, -O-NHS (гидроксисукцинимидил/сульфосукцинимидил), -O-TFP (2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-STP (4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-бензотриазола, -бензотриазола, -NR-L-OH, -NR-L-O-фосфорамидита, -NR-L-SH, -NR-L-NH, -NR-L-NH-NH, -NR-L-COH, -NR-L-CO-NHS, -NR-L-CO-STP, -NR-L-CO-TFP, -NR-L-CO-бензотриазола, -NR-L-CHO, -NR-L-малеимида,
2
2
z
2
2
3
2
3
-NH(CHCHO)CHCHN, -NR-L-NH-CO-CH-I, и азид (N)-содержащей группы, где R представляет собой -H или алифатическую или гетероалифатическую группу, z представляет собой целое число от 1 до 5 включительно, и L выбран из группы, состоящей из двухвалентной линейной, разветвленной или циклической алкильной группы, необязательно замещенной по меньшей мере одним атомом кислорода и/или атомом серы;
+
+
2+
Kat представляет собой количество Na, K, Ca, аммония или другого катиона(ов), необходимого для компенсации отрицательного заряда, переносимого цианином;
m представляет собой целое число от 0 до 5 включительно; n представляет собой целое число от 1 до 3 включительно; o представляет собой целое число от 0 до 12 включительно; и p представляет собой целое число от 0 до 5 включительно;
b) гасителя общей формулы II
Формула II
где
23
24
25
26
27
28
29
30
3
каждый из R, R, R, R, R, R,R и R являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из H или SO;
Z представляет собой OR, где R представляет собой H или алкил, или NH-L, где L представляет собой , и Y представляет собой или H, или связь с твердой подложкой;
и
c) олигонуклеотидного линкера, соединяющего краситель и гаситель.
[156] Пункт 2. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
5
6
9
10
3
R, R, R и R представляют собой SO;
7
8
R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
2
12
3
R и R представляют собой SO;
m, o и p составляют 3; и n составляет 2.
[157] Пункт 3. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
10
3
R представляет собой SO;
5
6
7
8
9
R, R, R, R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
12
R представляет собой H;
2
3
R представляет собой SO;
m и o составляют 3; и n и p составляют 2.
[158] Пункт 4. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
10
3
R представляет собой SO;
5
6
7
8
9
R, R, R, R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
2
12
3
R и R представляют собой SO;
m, o и p составляют 3; и n составляет 2.
[159] Пункт 5. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
9
10
3
R и R представляют собой SO;
5
6
7
8
R, R, R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
12
R представляет собой H;
2
3
R представляет собой SO;
m и o составляют 3; и n и p составляют 2.
[160] Пункт 6. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
9
10
3
R и R представляют собой SO;
5
6
7
8
R, R, R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
2
12
3
R и R представляют собой SO;
m, o и p составляют 3; и n составляет 2.
[161] Пункт 7. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
5
6
7
8
9
10
R, R, R, R, R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
2
12
R и R представляют собой H;
m и p составляют 1; n составляет 2; и o составляет 3.
[162] Пункт 8. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
15
16
17
18
19
20
21
22
R, R, R, R, R, R, R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
2
12
R и R представляют собой H;
m и p составляют 1; n составляет 2; и o составляет 3.
[163] Пункт 9. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
17
18
3
R и R представляют собой SO;
15
16
19
20
21
22
R, R, R, R, R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
2
12
3
R и R представляют собой SO;
m, o и p составляют 3; и n составляет 2.
[164] Пункт 10. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что:
5
6
9
10
3
R, R, R и R представляют собой SO;
7
8
R и R представляют собой H;
4
13
14
R, R и R представляют собой метил;
3
R представляет собой -C-бензоат;
2
3
12
R представляет собой SO, и R представляет собой H;
m составляет 3; p составляет 1; и n составляет 2.
23
25
26
27
29
30
24
28
3
[165] Пункт 11. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что каждый из R, R, R, R, R и R представляет собой H, и каждый из R и R представляет собой SO.
23
24
25
26
27
28
29
30
[166] Пункт 12. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что каждый из R, R, R, R, R, R, R и R представляет собой H.
2
[167] Пункт 13. Зонд по п. 1, отличающийся тем, что Z представляет собой COR, где R представляет собой NH-L, L представляет собой , и Y представляет собой связь с твердой подложкой.
[168] Пункт 14. Способ обнаружения или количественного определения молекулы целевой нуклеиновой кислоты в образце с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающий:
(i) приведение образца, содержащего одну или более молекул целевой нуклеиновой кислоты, в контакт с а) по меньшей мере одним зондом, содержащим последовательность, которая по меньшей мере частично комплементарна молекуле целевой нуклеиновой кислоты, где по меньшей мере один зонд демонстрирует обнаруживаемое изменение флуоресценции при амплификации одной или более молекул целевой нуклеиновой кислоты; и с b) по меньшей мере одной парой олигонуклеотидных праймеров;
(ii) инкубирование смеси со стадии (i) с ДНК-полимеразой в условиях, достаточных для амплификации одной или более молекул целевой нуклеиновой кислоты; и
(iii) обнаружение присутствия или отсутствия или количественное определение содержания амплифицированных молекул целевой нуклеиновой кислоты путем измерения флуоресценции зонда, при этом зонд содержит продукт конъюгации:
а) красителя общей формулы Ia, формулы Ib, формулы Ic или формулы Id
Формула Ia
Формула Ib
Формула Ic
Формула Id
где
4
13
14
3,
3
каждый из R, R и R и R когда они присутствуют, являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, алифатической группы, гетероалифатической группы, сульфоалкила, гетероалифатической группы с концевой SO, бензила и замещенного бензила, где замещенный бензил содержит по меньшей мере одну карбоксигруппу, по меньшей мере одну сульфонатную группу, -F, -Cl, -Br или их комбинацию;
5
6
7
8
9
10
15
16
17
18
19
20
21
22
3
каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO;
2
12
3
каждый из R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO;
2
2
2
2
2
2
2
z
2
2
3
2
3
X выбран из группы, состоящей из -OH, -SH, -NH, -NH-NH, -F, -Cl, -Br, I, -O-NHS (гидроксисукцинимидил/сульфосукцинимидил), -O-TFP (2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-STP (4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-бензотриазола, -бензотриазола, -NR-L-OH, -NR-L-O-фосфорамидита, -NR-L-SH, -NR-L-NH, -NR-L-NH-NH, -NR-L-COH, -NR-L-CO-NHS, -NR-L-CO-STP, -NR-L-CO-TFP, -NR-L-CO-бензотриазола, -NR-L-CHO, -NR-L-малеимида, NH(CHCHO)CHCHN, -NR-L-NH-CO-CH-I и азид (N)-содержащей группы, где R представляет собой -H или алифатическую или гетероалифатическую группу, z представляет собой целое число от 1 до 5 включительно, и L выбран из группы, состоящей из двухвалентной линейной, разветвленной или циклической алкильной группы, необязательно замещенной по меньшей мере одним атомом кислорода и/или атомом серы;
+
+
2+
Kat представляет собой количество Na, K, Ca, аммония или другого катиона(ов), необходимого для компенсации отрицательного заряда, переносимого цианином;
m представляет собой целое число от 0 до 5 включительно; n представляет собой целое число от 1 до 3 включительно; o представляет собой целое число от 0 до 12 включительно; и p представляет собой целое число от 0 до 5 включительно;
b) гасителя общей формулы II
Формула II
где
23
24
25
26
27
28
29
30
3
каждый из R, R, R, R, R, R,R и R являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из H или SO;
Z представляет собой OR, где R представляет собой H или алкил, или NH-L, где L представляет собой , и Y представляет собой или H, или связь с твердой подложкой;
и
c) по меньшей мере одного олигонуклеотидного линкера, соединяющего краситель и гаситель.
[169] Пункт 15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что ПЦР представляет собой ПЦР в реальном времени или количественную ПЦР (кПЦР).
[170] Пункт 16. Способ по пп. 14 или 15, отличающийся тем, что полимераза представляет собой полимеразу Taq.
[171] Пункт 17. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что зонд представляет собой гидролизуемый зонд.
[172] Пункт 18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что зонд представляет собой зонд TaqMan.
[173] Пункт 19. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что целевая нуклеиновая кислота содержит мутацию.
[174] Пункт 20. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что способ применяют для обнаружения редкого аллеля или SNP.
[175] Пункт 21. Набор для полимеразной цепной реакции (ПЦР), содержащий:
зонд, содержащий продукт конъюгации:
а) красителя общей формулы Ia, формулы Ib, формулы Ic или формулы Id
Формула Ia
Формула Ib
Формула Ic
Формула Id
где
4
13
14
3,
3
каждый из R, R и R и R когда они присутствуют, являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, алифатической группы, гетероалифатической группы, сульфоалкила, гетероалифатической группы с концевой SO, бензила и замещенного бензила, где замещенный бензил содержит по меньшей мере одну карбоксигруппу, по меньшей мере одну сульфонатную группу, -F, -Cl, -Br или их комбинацию;
5
6
7
8
9
10
15
16
17
18
19
20
21
22
3
каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO;
2
12
3
каждый из R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO;
2
2
2
2
2
2
2
z
2
2
3
2
3
X выбран из группы, состоящей из -OH, -SH, -NH, -NH-NH, -F, -Cl, -Br, I, -O-NHS (гидроксисукцинимидил/сульфосукцинимидил), -O-TFP (2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-STP (4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-бензотриазола, -бензотриазола, -NR-L-OH, -NR-L-O-фосфорамидита, -NR-L-SH, -NR-L-NH, -NR-L-NH-NH, -NR-L-COH, -NR-L-CO-NHS, -NR-L-CO-STP, -NR-L-CO-TFP, -NR-L-CO-бензотриазола, -NR-L-CHO, -NR-L-малеимида, NH(CHCHO)CHCHN, -NR-L-NH-CO-CH-I и азид (N)-содержащей группы, где R представляет собой -H или алифатическую или гетероалифатическую группу, z представляет собой целое число от 1 до 5 включительно, и L выбран из группы, состоящей из двухвалентной линейной, разветвленной или циклической алкильной группы, необязательно замещенной по меньшей мере одним атомом кислорода и/или атомом серы;
+
+
2+
Kat представляет собой количество Na, K, Ca, аммония или другого катиона(ов), необходимого для компенсации отрицательного заряда, переносимого цианином;
m представляет собой целое число от 0 до 5 включительно; n представляет собой целое число от 1 до 3 включительно; o представляет собой целое число от 0 до 12 включительно; и p представляет собой целое число от 0 до 5 включительно;
b) гасителя общей формулы II
Формула II
где
23
24
25
26
27
28
29
30
3
каждый из R, R, R, R, R, R,R и R являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из H или SO;
Z представляет собой OR, где R представляет собой H или алкил, или NH-L, где L представляет собой , и Y представляет собой либо H, либо связь с твердой подложкой;
и
c) по меньшей мере одного олигонуклеотидного линкера, соединяющего краситель и гаситель; и
одно или более из следующего: буферный агент, среда для очистки, мишень, органический растворитель, фермент и ингибитор фермента.
[176] Пункт 22. Набор по п. 21, отличающийся тем, что ПЦР представляет собой ПЦР в реальном времени или количественную ПЦР (кПЦР).
[177] Пункт 23. Набор по пп. 21 или 22, дополнительно содержащий инструкции по проведению ПЦР в реальном времени или количественной ПЦР (кПЦР).
[178] Пункт 24. Набор по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что компоненты упакованы в отдельные емкости.
[179] Пункт 25. Набор по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что два или более компонента упакованы вместе как мастер-микс.
[180] Пункт 26. Набор, содержащий по меньшей мере один краситель общей формулы Ia, формулы Ib, формулы Ic или формулы Id
Формула Ia
Формула Ib
Формула Ic
Формула Id
где
4
13
14
3,
3
каждый из R, R и R и R когда они присутствуют, являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, алифатической группы, гетероалифатической группы, сульфоалкила, гетероалифатической группы с концевой SO, бензила и замещенного бензила, где замещенный бензил содержит по меньшей мере одну карбоксигруппу, по меньшей мере одну сульфонатную группу, -F, -Cl, -Br или их комбинацию;
5
6
7
8
9
10
15
16
17
18
19
20
21
22
3
каждый из R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R, R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO;
2
12
3
каждый из R и R являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и SO;
2
2
2
2
2
2
2
z
2
2
3
2
3
X выбран из группы, состоящей из -OH, -SH, -NH, -NH-NH, -F, -Cl, -Br, I, -O-NHS (гидроксисукцинимидил/сульфосукцинимидил), -O-TFP (2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-STP (4-сульфо-2,3,5,6-тетрафторфенокси), -O-бензотриазола, -бензотриазола, -NR-L-OH, -NR-L-O-фосфорамидита, -NR-L-SH, -NR-L-NH, -NR-L-NH-NH, -NR-L-COH, -NR-L-CO-NHS, -NR-L-CO-STP, -NR-L-CO-TFP, -NR-L-CO-бензотриазола, -NR-L-CHO, -NR-L-малеимида, NH(CHCHO)CHCHN, -NR-L-NH-CO-CH-I и азид (N)-содержащей группы, где R представляет собой -H или алифатическую или гетероалифатическую группу, z представляет собой целое число от 1 до 5 включительно, и L выбран из группы, состоящей из двухвалентной линейной, разветвленной или циклической алкильной группы, необязательно замещенной по меньшей мере одним атомом кислорода и/или атомом серы;
+
+
2+
Kat представляет собой количество Na, K, Ca, аммония или другого катиона(ов), необходимого для компенсации отрицательного заряда, переносимого цианином;
m представляет собой целое число от 0 до 5 включительно; n представляет собой целое число от 1 до 3 включительно; o представляет собой целое число от 0 до 12 включительно; и p представляет собой целое число от 0 до 5 включительно; и
по меньшей мере один гаситель общей формулы II
Формула II
где
23
24
25
26
27
28
29
30
3
каждый из R, R, R, R, R, R,R и R являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из H или SO;
Z представляет собой OR, где R представляет собой H или алкил, или NH-L, где L представляет собой , и Y представляет собой или H, или связь с твердой подложкой.
[181] Пункт 27. Набор по п. 26, дополнительно содержащий дополнительные компоненты для конъюгирования по меньшей мере одного красителя и по меньшей мере одного гасителя с олигонуклеотидом.
[182] Пункт 28. Набор по пп. 26 или 27, дополнительно содержащий инструкции по конъюгированию по меньшей мере одного красителя и по меньшей мере одного гасителя с олигонуклеотидом.
[183] Пункт 29. Набор по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что компоненты упакованы в отдельные емкости.
[184] Пункт 30. Зонд по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что азидсодержащая группа содержит алифатический линкер с концевым азидом.
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
[185] Пункт 31. Зонд по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что алифатический линкер с концевым азидом выбран из NH-CH-CH-CH-N или NH-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-N.
[186] Пункт 32. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что азидсодержащая группа содержит алифатический линкер с концевым азидом.
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
[187] Пункт 33. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что алифатический линкер с концевым азидом выбран из NH-CH-CH-CH-N или NH-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-N.
[188] Пункт 34. Набор по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что азидсодержащая группа содержит алифатический линкер с концевым азидом.
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
[189] Пункт 35. Набор по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что алифатический линкер с концевым азидом выбран из NH-CH-CH-CH-N или NH-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-N.
[190] Пункт 36. Набор по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что азидсодержащая группа содержит алифатический линкер с концевым азидом.
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
[191] Пункт 37. Набор по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что алифатический линкер с концевым азидом выбран из NH-CH-CH-CH-N или NH-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-O-CH-CH-N.