НОВЫЕ СПОСОБЫ, ПОЛИПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Способ получения рекомбинантного полипептида, обладающего серинпротеазной активностью, включающий
(a) трансформацию микробной клетки-хозяина или ее популяции молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей зимогенный полипептид, содержащий активационный пептид, соединенный с N-концом полипептида, обладающего серинпротеазной активностью
отличающийся тем, что указанный зимогенный полипептид не содержит сигнальной последовательности;
(b) экспрессию указанного зимогенного полипептида в клетке-хозяине (клетках-хозяевах) в виде телец включения;
(c) очистку указанного зимогенного полипептида из клетки-хозяина (клеток-хозяев); и
(d) активацию указанного зимогенного полипептида путем воздействия протеазой, такой как трипсин
при этом этап (с) включает солюбилизацию указанного зимогенного полипептида из телец включения и повторную укладку указанного полипептида в биологически активную форму.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, проявляет трипсиновую активность.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из последовательности аминокислот, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичной указанной последовательности
16
⎪
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG
79
⎪
TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG
141
⎪
WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV
200
⎪
VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[SEQ ID NO: 1]
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, не содержит гистидина в положении 25.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3
16
⎪
IVGGYECTKSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG
79
⎪
TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG
141
⎪
WGNTMSSVADGDKLQCLSLPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV
200
⎪
VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[SEQ ID NO: 3]
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность.
6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, не содержит лизина в положении 160.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 4
16
⎪
IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHFCGGSLVSKDWVVSAAHCYKSVLRVRLGEHHIRVNEG
79
⎪
TEQYISSSSVIRHPNYSSYNINNDIMLIKLTKPATLNQYVHAVALPTECAADATMCTVSG
141
⎪
WGNTMSSVADGDKLQCLSPILSHADCANSYPGMITQSMFCAGYLEGGKDSCQGDSGGPV
200
⎪
VCNGVLQGVVSWGYGCAERDHPGVYAKVCVLSGWVRDTMANY
[SEQ ID NO: 4]
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность.
8. Способ по любому из пп. 3-7, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, представляет собой вариант последовательности SEQ ID NO: 1, содержащий одну или более мутированных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из следующих аминокислот в следующих положениях:
Е21, Н25, Н29, V47, K49, D50, L63, Н71, Н72, R74, N76, Т79, Y82, S85, S87, N98, I99, V121, М135, V138, М145, V148, D150, K154, L160, М175, S179, А183, L185, V212, Y217, Р225, А229, V233, L234, V238, М242, N244 и/или Y245,
или ее фрагмент, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, представляет собой вариант последовательности SEQ ID NO: 1, содержащий одну или более мутированных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
Е21Т, H25Y, H29(Y/N), V47I, K49E, D50Q, L63I, H71D, H72N, R74(K/E), N76(T/L), T79(S/N), Y82F, S85A, S87(K/R), S89R, N98T, I99L, V121I, M135Q, V138I, M145(T/L/V/E/K), V148G, D150S, K154(T/V), L160(I/A), M175(K/Q), S179N, A183V, L185G, V212I, Y217(D/H/S), P225Y, A229V, V233N, L234Y, V238I, M242I, N244S и/или Y245N,
или ее фрагмент, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
10. Способ по любому из пп. 3-7, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, представляет собой вариант последовательности SEQ ID NO: 2, содержащий одну или более мутированных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из следующих аминокислот в следующих положениях:
Е25, Н29, Н33, V49, K51, D52, L65, Н72, Н73, R75, N77, Т80, Y83, S86, S88, N99, I100, V122, М134, V137, М144, V147, D149, K152, L158, М173, S177, А181, L184, V208, Y213, Р221, А225, V229, L230, V234, М238, N240 и/или Y241.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, представляет собой вариант последовательности SEQ ID NO: 2, содержащий одну или более мутированных аминокислот выбранных из группы, состоящей из:
Е25Т, H29Y, H33(Y/N), V49I, K51E, D52Q, L65I, H72D, H73N, R75(K/E), N77(T/L), T80(S/N), Y83F, S86A, S88(K/R), N99T, I100L, V122I, M134Q, VI37I, M144(T/L/V/E/K),
V147G, D149S, K152(T/V), L158(I/A), M173(K/Q), S177N, A181V, L184G, V208I, Y213(D/H/S), P221Y, A225V, V229N, L230Y, V234I, M238I N240S и/или Y241N.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из последовательности аминокислот, приведенной в таблице 1 или 2.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(a) N244S, Y245N, S87K ("EZA-002");
(b) K154T ("EZA-003");
(c) K154L ("EZA-004");
(d) K154V ("EZA-005");
(e) K154E ("EZA-006");
(f) N98T ("EZA-007");
(g) I99L ("EZA-008");
(h) L185G, P225Y ("EZA-009");
(i) V212I ("EZA-0010");
(j) Y217D, M175K ("EZA-011");
(k) Y217H ("EZA-012");
(l) Y217S ("EZA-013");
(m) A229V ("EZA-014");
(n) H25Y ("EZA-015");
(o) H25N ("EZA-016");
(p) H29Y ("EZA-017");
(q) H71D ("EZA-018");
(r) H72N ("EZA-019");
(s) R74K ("EZA-020");
(t) R74E ("EZA-021");
(u) N76T ("EZA-022");
(v) N76L, Y82F ("EZA-023");
(w) T79S ("EZA-0024");
(x) T79N ("EZA-025");
(y) K49E, D50Q ("EZA-026");
(z) S87R ("EZA-027");
(aa) E21T, H71D, D150S, K154V ("EZA-028");
(bb) S179N, V233N ("EZA-029");
(cc) M135Q ("EZA-030");
(dd) M145K, V148G ("EZA-031");
(ее) M175Q ("EZA-032");
(ff) L63I, S85A ("EZA-033");
(gg) L160I ("EZA-034");
(hh) V138I, L160A, A183V ("EZA-035");
(ii) V121I ("EZA-036");
(jj) V47I, V238I, M242I ("EZA-037");
(kk) V238I ("EZA-038"); и
(ll) L234Y ("EZA-039")
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(a) H25N, N76T
(b) H25N, H29Y
(c) H25N, M135Q
(d) H29Y, T79N, M135Q
(e) I99L, V121I, L160I, Y217H
(f) V121I, L160I
(g) H72N, R74E, S87K
(h) H25N, M135Q, Y217H
(i) T79N,V121I, V212I
(j) H29Y, N76T, I99L, M135Q
(k) K49E, D50Q, N76L, Y82F, S179N, V233N
(l) M145K, V148G, N76L, Y82F, S179N, V233N
(m) H25N, N76T, S87K, K154T
(n) H25Q
(o) H25D
(p) H25S
(q) K24E, H25N
(r) Y97N
(s) N100D
(t) A120S, A122S
(u) M135E
(v) V204Q, A122S
(w) T79D
(x) R74D
(y) K49E
(z) K49S, D50Q
(aa) D50Q
(bb) Q178D
(cc) S87R
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из аминокислоты сериновой протеазы естественного происхождения.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что активационный пептид содержит или состоит из последовательности аминокислот, выбранной из следующей группы:
(a) MEEDK [SEQ ID NO: 5];
(b) MTEEDK [SEQ ID NO: 6];
(c) MFAEEDK [SEQ ID NO: 7];
(d) MVFAEEDK [SEQ ID NO: 8];
(e) MAFAEEDK [SEQ ID NO: 9]; и
(f) MGAVFAEEDK [SEQ ID NO: 10].
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на этапе (а) молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид трипсиногена, находится в экспрессионном векторе, подходящем для применения у Escherichia coli.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный экспрессионный вектор представляет собой Е3.
20. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что клетка-хозяин на этапе (а) представляет собой бактериальную клетку-хозяина (такую как Escherichia coli и Pseudoalteromonas haloplanktis).
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что клетка-хозяин на этапе (а) представляет собой клетку-хозяина Escherichia coli (такую как клетки BL21(E3), BL21(DE3), BL21 Star (DE3), ArcticExpress (DE3) и HMS174).
22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что клетка-хозяин на этапе (а) представляет собой клетку-хозяина Escherichia coli штамма ArcticExpress (DE3).
23. Способ по любому из пп. 1-17, отличающийся тем, что клетка-хозяин на этапе (а) представляет собой дрожжевую клетку-хозяина (такую как Pichia pastoris).
24. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на этапе (с) повторная укладка указанного полипептида в биологически активную форму включает приведение указанного полипептида в контакт с ФСБ/глицериновым буфером.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что ФСБ/глицериновый буфер представляет собой 1×ФСБ, 10% глицерина, рН 7,4.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на этапе (с) не присутствует ингибитор аутопротеолиза (такой как бензамидин).
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что на этапе (d) для активации указанного зимогенного полипептида применяют трипсин атлантической трески.
28. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что специфическая активность активированного полипептида, полученного на этапе (d) составляет по меньшей мере 20 ед/мг, например, по меньшей мере 30 ед/мг, 40 ед/мг, 50 ед/мг или по меньшей мере 60 ед/мг.
29. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что количество активированного полипептида, полученного на этапе (d) составляет по меньшей мере 0,1 мг, например, по меньшей мере 0,5 мг, 1 мг, 2 мг, 3 мг, 5 мг или 10 мг.
30. Выделенный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, который может быть получен способом по любому из предшествующих пунктов.
31. Выделенный полипептид по п. 30, отличающийся тем, что указанный полипептид проявляет трипсиновую активность.
32. Выделенный полипептид по п. 30 или 31, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит или состоит из последовательности аминокислот, по меньшей мере на 70% идентичной последовательности аминокислот SEQ ID NO: 1, например, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 95%, 97%, 98% или 99% идентичной указанной последовательности, или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность.
33. Выделенный полипептид по п. 32, отличающийся тем, что указанный полипептид не содержит гистидина в положении 25.
34. Выделенный полипептид по п. 33, содержащий или состоящий из последовательности аминокислот, представленной в последовательности SEQ ID NO: 2, или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность.
35. Выделенный полипептид по п. 32 отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, не содержит лизина в положении 160.
36. Выделенный полипептид по п. 35, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из последовательности аминокислот SEQ ID NO: 3, или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность.
37. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-36, отличающийся тем, что указанный полипептид представляет собой вариант последовательности SEQ ID NO: 1, содержащий одну или более мутированных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из следующих аминокислот в следующих положениях:
Е21, Н25, Н29, V47, K49, D50, L63, Н71, Н72, R74, N76, Т79, Y82, S85, S87, S89, N98, I99, V121, М135, V138, М145, V148, D150, K154, L160, М175, S179, А183, L185, V212, Y217, Р225, А229, V233, L234, V238, М242, N244 и/или Y245,
или ее фрагмент, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
38. Выделенный полипептид по п. 37, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, представляет собой вариант последовательности SEQ ID NO: 1, содержащий одну или более мутированных аминокислот выбранных из группы, состоящей из:
Е21Т, H25Y, H29(Y/N), V47I, K49E, D50Q, L63I, H71D, H72N, R74(K/E), N76(T/L),
T79(S/N), Y82F, S85A, S87(K/R), S89R, N98T, I99L, V121I, M135Q, V138I, M145(T/L/V/E/K), V148G, D150S, K154(T/V), L160(I/A), M175(K/Q), S179N, A183V, L185G, V212I, Y217(D/H/S), P225Y, A229V, V233N, L234Y, V238I, M242I, N244S и/или Y245N,
или ее фрагмент, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
39. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-37, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, представляет собой вариант последовательности SEQ ID NO: 2, содержащий одну или более мутированных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из следующих аминокислот в следующих положениях:
Е25, Н29, Н33, V49, K51, D52, L65, Н72, Н73, R75, N77, Т80, Y83, S86, S88, N99, I100, V122, М134, V137, М144, V147, D149, K152, L158, М173, S177, А181, L184, V208, Y213, Р221, А225, V229, L230, V234, М238, N240 и/или Y241.
40. Выделенный полипептид по п. 39, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, представляет собой вариант последовательности SEQ ID NO: 2, содержащий одну или более мутированных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из:
Е25Т, H29Y, H33(Y/N), V49I, K51E, D52Q, L65I, H72D, H73N, R75(K/E), N77(T/L), T80(S/N), Y83F, S86A, S88(K/R), N99T, I100L, V122I, M134Q, V137I, M144(T/L/V/E/K), V147G, D149S, K152(T/V), L158(I/A), M173(K/Q), S177N, A181V, L184G, V208I, Y213(D/H/S), P221Y, A225V, V229N, L230Y, V234I, M238I, N240S и/или Y241N.
41. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-40, отличающийся тем, что указанный полипептид, обладающий серинпротеазной активностью, содержит или состоит из последовательности аминокислот, приведенной в таблице 1 или 2.
42. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-41, содержащий или состоящий из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(а) N244S, Y245N, S87K ("EZA-002");
(b) K154T ("EZA-003");
(с) K154L ("EZA-004");
(d) K154V ("EZA-005");
(е) K154E ("EZA-006");
(f) N98T ("EZA-007");
(g) I99L ("EZA-008");
(h) L185G, P225Y ("EZA-009");
(i) V212I ("EZA-0010");
(j) Y217D, M175K ("EZA-011");
(k) Y217H ("EZA-012");
(l) Y217S ("EZA-013");
(m) A229V ("EZA-014");
(n) H25Y ("EZA-015");
(о) H25N ("EZA-016");
(p) H29Y ("EZA-017");
(q) H71D ("EZA-018");
(r) H72N ("EZA-019");
(s) R74K ("EZA-020");
(t) R74E ("EZA-021");
(u) N76T ("EZA-022");
(v) N76L, Y82F ("EZA-023");
(w) T79S ("EZA-0024");
(x) T79N ("EZA-025");
(y) K49E, D50Q ("EZA-026");
(z) S87R ("EZA-027");
(aa) E21T, H71D, D150S, K154V ("EZA-028");
(bb) S179N, V233N ("EZA-029");
(cc) M135Q ("EZA-030");
(dd) M145K, V148G ("EZA-031");
(ее) M175Q ("EZA-032");
(ff) L63I, S85A ("EZA-033");
(gg) L160I ("EZA-034");
(hh) V138I, L160A, A183V ("EZA-035");
(ii) V121I ("EZA-036");
(jj) V47I, V238I, M242I ("EZA-037");
(kk) V238I ("EZA-038"); и
(ll) L234Y ("EZA-039")
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
43. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-42, содержащий или состоящий из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(a) H25N, N76T
(b) H25N, H29Y
(c) H25N, M135Q
(d) H29Y, T79N, M135Q
(e) I99L, V121I, L160I, Y217H
(f) V121I, L160I
(g) H72N, R74E, S87K
(h) H25N, M135Q, Y217H
(i) T79N, V121I, V212I
(j) H29Y, N76T, I99L, M135Q
(k) K49E, D50Q, N76L, Y82F, S179N, V233N
(l) M145K, V148G, N76L, Y82F, S179N, V233N
(m) H25N, N76T, S87K, K154T
(n) H25Q
(o) H25D
(p) H25S
(q) K24E, H25N
(r) Y97N
(s) N100D
(t) A120S, A122S
(u) M135E
(v) V204Q, A122S
(w) T79D
(x) R74D
(y) K49E
(z) K49S, D50Q
(aa) D50Q
(bb) Q178D
(cc) S87R
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
44. Выделенный полипептид по п. 30, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит или состоит из аминокислоты сериновой протеазы естественного происхождения.
45. Выделенный полипептид по п. 44, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит или состоит из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1.
46. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-45, проявляющий улучшенную стабильность относительно трипсина I, выделенного из атлантической трески (Gadus morhua).
47. Выделенный полипептид по п. 46, отличающийся тем, что трипсин I, выделенный из атлантической трески, имеет последовательность аминокислот SEQ ID NO: 1.
48. Выделенный полипептид по п. 46 или 47, который проявляет улучшенную термостабильность относительно полипептида трипсина из трипсина I, выделенного из атлантической трески.
49. Выделенный полипептид по п. 48, содержащий или состоящий из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(a) K154E ("EZA-006");
(b) N98T ("EZA-007");
(c) I99L ("EZA-008");
(d) V212I ("EZA-0010");
(e) Y217D, M175K ("EZA-011");
(f) Y217H ("EZA-012");
(g) A229V ("EZA-014");
(h) H25Y ("EZA-015");
(i) H25N ("EZA-016");
(j) H72N ("EZA-019");
(k) R74E ("EZA-021");
(l) N76L, Y82F ("EZA-023");
(m) T79N ("EZA-025");
(n) K49E, D50Q ("EZA-026");
(o) S87R ("EZA-027");
(p) E21T, H71D, D150S, K154V ("EZA-028");
(q) S179N, V233N ("EZA-029");
(r) M135Q ("EZA-030");
(s) M145K, V148G ("EZA-031");
(t) L63I, S85A ("EZA-033");
(u) L160I ("EZA-034");
(v) V138I, L160A, A183V ("EZA-035");
(w) V121I ("EZA-036");
(x) V47I, V238I, M242I ("EZA-037"); и
(y) L234Y ("EZA-039")
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
50. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-49, который проявляет улучшенную устойчивость к аутопротеолизу относительно трипсина I, выделенного из атлантической трески.
51. Выделенный полипептид по п. 50, содержащий или состоящий из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(a) I99L ("EZA-008");
(b) V212I ("EZA-0010");
(c) Y217D, M175K ("EZA-011");
(d) Y217H ("EZA-012");
(e) A229V ("EZA-014");
(f) H25Y ("EZA-015");
(g) H25N ("EZA-016");
(h) H29Y ("EZA-017");
(i) H72N ("EZA-019");
(j) R74E ("EZA-021");
(k) N76T ("EZA-022");
(l) N76L, Y82F ("EZA-023");
(m) T79S ("EZA-0024");
(n) T79N ("EZA-025");
(о) K49E, D50Q ("EZA-026");
(р) S87R ("EZA-027");
(q) Е21Т, H71D, D150S, K154V ("EZA-028");
(r) S179N, V233N ("EZA-029");
(s) M135Q ("EZA-030");
(t) M145K, V148G ("EZA-031");
(u) L63I, S85A ("EZA-033");
(v) L160I ("EZA-034");
(w) V138I, L160A, A183V ("EZA-035");
(х) V121I ("EZA-036"); и
(y) V47I, V238I, M242I ("EZA-037").
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
52. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-51, который демонстрирует улучшенную Kcat относительно трипсина I, выделенного из атлантической трески.
53. Выделенный полипептид по п. 52, содержащий или состоящий из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(а) H25N ("EZA-016");
(b) H29Y ("EZA-017");
(с) H71D ("EZA-018");
(d) H72N ("EZA-019");
(е) N76T ("EZA-022");
(f) N76L, Y82F ("EZA-023");
(g) M145K, V148G ("EZA-031");
(h) M175Q ("EZA-032");
(i) L63I, S85A ("EZA-033");
(j) L160I ("EZA-034");
(k) V138I, L160A, A183V ("EZA-035");
(l) V47I, V238I, M242I ("EZA-037"); и
(m) V238I ("EZA-038"),
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
54. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-53, который демонстрирует улучшенную Km относительно трипсина I, выделенного из атлантической трески.
55. Выделенный полипептид по п. 54, содержащий или состоящий из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(а) K154T ("EZA-003");
(b) I99L ("EZA-008");
(с) V212I ("EZA-0010");
(d) Y217D, M175K ("EZA-011");
(е) Y217S ("EZA-013");
(f) A229V ("EZA-014");
(g) H25Y ("EZA-015");
(h) K49E, D50Q ("EZA-026");
(i) E21T, H71D, D150S, K154V ("EZA-028"); и
(j) M135Q ("EZA-030"),
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
56. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-55, который демонстрирует улучшенную константу специфичности (Kcat/Km) относительно трипсина I, выделенного из атлантической трески.
57. Выделенный полипептид по п. 56, содержащий или состоящий из аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 1 с одной из следующих заданных мутаций:
(a) K154T ("EZA-003");
(b) Y217D, M175K ("EZA-011");
(c) Y217S ("EZA-013");
(d) A229V ("EZA-014"); и
(e) M135Q ("EZA-030");
или ее фрагмента, который проявляет антимикробную активность,
при этом нумерация аминокислот соответствует Базе данных белковых структур [PDB], запись «2EEK!».
58. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-57, отличающийся тем, что он не гликозилирован.
59. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-58, содержащий или состоящий из L-аминокислот.
60. Выделенный полипептид по любому из пп. 30-59, содержащий одну или более аминокислот, которые модифицированы или дериватизированы.
61. Выделенный полипептид по п. 60, отличающийся тем, что указанная одна или более аминокислота модифицирована или дериватизирована путем пегилирования, амидирования, этерификации, ацилирования, ацетилирования и/или алкилирования.
62. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид по любому из пп. 30-61.
63. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 62.
64. Экспрессионный вектор по п. 63, подходящий для применения у Escherichia coli.
65. Микробная клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 62 или экспрессионный вектор по п. 63 или 64.
66. Клетка-хозяин по п. 65, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой бактериальную клетку-хозяина (такую как Escherichia coli и Pseudoalteromonas haloplanktis).
67. Клетка-хозяин по п. 59, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина Escherichia coli (например, клетки BL21(E3), BL21(DE3), BL21 Star (DE3), ArcticExpress (DE3) и HMS174).
68. Клетка-хозяин по п. 67, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин на этапе (а) представляет собой клетку-хозяина Escherichia coli штамма ArcticExpress (DE3).
69. Клетка-хозяин по п. 65, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку-хозяина (такую как Pichia pastoris).
70. Терапевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 30-61 совместно с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, разбавителем, носителем, буфером или адъювантом.
71. Терапевтическая композиция по п. 70, подходящая для введения способом, выбранным из группы, состоящей из перорального, назального, легочного, буккального, местного, введения в глаза, парентерального (внутривенного, подкожного, интратекального и внутримышечного), вагинального и ректального введения.
72. Терапевтическая композиция по п. 70 или 71, отличающаяся тем, что указанный полипептид представлен в форме, подходящей для доставки в слизистую оболочку ротовой полости и/или ротовой части глотки.
73. Терапевтическая композиция по п. 72, отличающаяся тем, что указанный полипептид входит в состав спрея для полости рта, таблетки для рассасывания, пастилки, жевательной резинки или жидкости.
74. Терапевтическая композиция по п. 73, отличающаяся тем, что указанный полипептид входит в состав спрея для полости рта.
75. Полипептид по любому из пп. 30-61 для применения в медицине.
76. Полипептид по любому из пп. 30-61 для применения при лечении или предотвращении у субъекта расстройства или состояния, выбранного из групп, состоящих из микробных инфекций, воспаления и ран.
77. Полипептид для применения по п. 76, отличающийся тем, что указанное расстройство или состояние представляет собой микробную инфекцию.
78. Полипептид для применения по п. 77, отличающийся тем, что указанная микробная инфекция выбрана из группы, состоящей из бактериальных инфекций, вирусных инфекций, грибковых инфекций, паразитических инфекций и дрожжевых инфекций.
79. Полипептид для применения по п. 78, отличающийся тем, что указанная микробная инфекция представляет собой бактериальную инфекцию.
80. Полипептид для применения по п. 79, отличающийся тем, что указанная микробная инфекция включает образование биопленки.
81. Полипептид для применения по п. 79 или 80, отличающийся тем, что указанная микробная инфекция представляет собой заболевание пародонта.
82. Полипептид для применения по п. 77, отличающийся тем, что указанная микробная инфекция представляет собой вирусную инфекцию.
83. Полипептид для применения по п. 82, отличающийся тем, что указанная вирусная инфекция выбрана из группы, состоящей из простуды и гриппа.
84. Полипептид для применения по п. 82, отличающийся тем, что указанная вирусная инфекция вызвана энтеровирусом (таким как риновирус человека или вирус Коксаки А).
85. Полипептид для применения по п. 82, отличающийся тем, что вирусная инфекция вызвана вирусом простого герпеса.
86. Полипептид для применения по п. 77, отличающийся тем, что указанная микробная инфекция представляет собой грибковую инфекцию.
87. Полипептид для применения по п. 86, отличающийся тем, что указанная грибковая инфекция выбрана из группы, состоящей из дерматофитии стоп (стопа атлета) и кандидоза (молочницы).
88. Полипептид для применения по любому из пп. 76-87, отличающийся тем, что у субъекта наблюдается иммунодефицит или он подвержен иммунодефициту.
89. Полипептид для применения по п. 88, отличающийся тем, что указанный иммунодефицит представляет собой вторичный или приобретенный иммунодефицит, например, указанный субъект получает лечение с применением иммуносупрессивной терапии.
90. Полипептид для применения по п. 89, отличающийся тем, что указанный иммунодефицит представляет собой естественный иммунодефицит, например, указанный иммунодефицит обусловлен первичным иммунодефицитом, раковым заболеванием (таким как лейкоз, лимфома, множественная миелома), хронической инфекцией (такой как синдром приобретенного иммунодефицита, или СПИД), нарушениями питания и/или старением.
91. Полипептид для применения по любому из пп. 76-90, отличающийся тем, что указанная микробная инфекция представляет собой инфекцию ротовой полости и/или ротовой части глотки.
92. Полипептид для применения по любому из пп. 76-87, отличающийся тем, что указанный субъект представляет собой спортсмена (например, бегуна на марафонские дистанции).
93. Полипептид для применения по п. 76, отличающийся тем, что расстройство или состояние представляет собой воспалительное расстройство или состояние.
94. Полипептид для применения по п. 93, отличающийся тем, что воспалительное расстройство или состояние выбрано из группы, состоящей из болевого синдрома, острого воспаления, хронического воспаления, артрита, воспаления суставов, бурсита, остеоартрита, ревматоидного артрита, юношеского ревматоидного артрита, септического артрита, фибромиалгии, системной красной волчанки, флебита, тендинита, сыпи, псориаза, акне, экземы, себорейной экземы лица и экземы рук, лица или шеи.
95. Полипептид для применения по п. 76, отличающийся тем, что указанное расстройство или состояние представляет собой рану.
96. Полипептид для применения по п. 95, отличающийся тем, что указанная рана выбрана из острой травмы (в том числе ожогов), локальных язв, рубцов, келоидов, фурункулов и бородавок.
97. Полипептид для применения по п. 95 или 96, отличающийся тем, что указанный полипептид предназначен для санации (т.е. отделения инфицированной, омертвевшей или отшелушивающейся кожи от здоровой кожи) и/или удаления фибриновых сгустков.
98. Полипептид для применения по любому из пп. 76-97, отличающийся тем, что указанный полипептид предназначен для применения в комбинации с одним или более дополнительным активным агентом.
99. Полипептид для применения по п. 98, отличающийся тем, что указанные дополнительные активные агенты выбраны из группы, состоящей из антимикробных агентов (в том числе антибиотиков, противовирусных агентов и антимикотических агентов), противовоспалительных агентов (в том числе стероидов и нестероидных противовоспалительных агентов) и антисептических агентов.
100. Применение полипептида по любому из пп. 30-61 для получения медикамента для лечения или предотвращения у субъекта расстройства или состояния, выбранного из групп, состоящих из микробных инфекций, воспаления и ран.
101. Способ лечения или предотвращения у субъекта расстройства или состояния, выбранного из групп, состоящих из микробных инфекций, воспаления и ран, включающий введение эффективного количества полипептида по любому из пп. 30-61 нуждающемуся в этом субъекту.
102. Применение полипептида по любому из пп. 30-61 в качестве косметической терапии у субъекта.
103. Применение по п. 102, отличающееся тем, что указанная косметическая терапия обеспечивает один или более следующих эффектов у субъекта:
(a) отшелушивание кожи (удаление клеток омертвевшей или отшелушивающейся кожи);
(b) защита от разрушения коллагена и эластина в коже;
(c) комедонолитический эффект;
(d) уменьшение или предотвращение глабеллярных (межбровных) морщин; и/или
(e) стимуляция роста волос.
104. Способ косметической терапии у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества полипептида по любому из пп. 30-61.
105. Способ по п. 104, отличающийся тем, что указанная косметическая терапия обеспечивает один или более следующих эффектов у субъекта:
(а) отшелушивание кожи (удаление клеток омертвевшей или отшелушивающейся кожи);
(b) защита от разрушения коллагена и эластина в коже;
(c) комедонолитический эффект;
(d) уменьшение или предотвращение глабеллярных (межбровных) морщин; и/или
(e) стимуляция роста волос.
106. Применение полипептида по любому из пп. 30-61 в качестве промышленного агента.
107. Применение по п. 106, отличающееся тем, что промышленный агент представляет собой:
(a) агент для обработки текстиля;
(b) биокатализатор (например, при органическом синтезе фармацевтических средств)
(c) очищающий/гигиенический агент (например, детергент);
(d) агент для биовосстановления среды (например, для уменьшения загрязнения);
(e) молекулярно-биологический агент; и
(f) агент для обработки пищевых продуктов (например, в производстве молочных продуктов).