СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОСТВАКЦИНАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА
METHOD FOR ASSESSING POSTVACCINAL IMMUNITY AGAINST BRUCELLOSIS

Изобретение относится к медицине, в частности к инфекционным болезням и эпидемиологии, может быть использовано при проведении обследования людей перед профилактической вакцинацией и ревакцинацией против бруцеллеза и для установления факта сенсибилизации к бруцеллезному антигену.
Согласно методическим указаниям МУК 3.1.7.3402-16 «Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза» при обследовании населения перед профилактической вакцинацией целесообразно использовать пластинчатую реакцию агглютинации (Хеддельсона), реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) или иммуноферментный анализ (ИФА) и аллерготесты (кожно-аллергическая проба Бюрне, реакция лизиса лейкоцитов, определение экспрессии на базофилах рецепторов CD63 методом проточной цитометрии). Однако, в реальных условиях, руководители животноводческих предприятий и мясокомбинатов чаще выбирают только серологический метод исследования, как более экономичный (реакции агглютинации Райта и/или Хеддельсона) и исключают проведение ИФА и аллергологических реакций.
Недостатком способов оценки поствакцинального иммунитета с использованием серологических реакций, включая ИФА, является возможность получения недостоверной информации из-за наличия блокирующих антител, а также наличия перекрестно реагирующих антител к микроорганизмам, имеющим общие антигенные детерминанты с бруцеллами, которые обусловливают ложноположительные серологические реакции на бруцеллез [Состояние и перспективы лабораторной диагностики бруцеллеза / Г.И. Лямкин [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2002. - №12. - с. 46-49].
Судить о напряженности поствакцинального иммунитета по результатам пробы Бюрне, также является невозможным, т.к. она имеет ряд недостатков. Во-первых, это инвазивная процедура, во-вторых, у лиц, высоко сенсибилизированных к бруцеллезному антигену, возможно развитие нежелательных реакций. Также известен риск возникновения ложноположительного результата при наличии аллергии и других иммунопатологических состояний. Учет реакции осуществляется через 24-48-72 часа, требуя наблюдение пациента в течение 72 часов [Инструкция по применению аллергена бруцеллезного жидкого (бруцеллина), раствор для внутрикожного введения: №01-11/198-06: утверждена Главным государственным санитарный врачом РФ Г.Г. Онищенко 22.11.06. - М, 2006].
Известен метод оценки аллергической перестройки организма in vitro реакция лейкоцитолиза, но она имеет ряд ограничений, включая низкую специфичность, в результате чего не получил широкого применения в практике.
Известен новый метод аллергодиагностики - определение экспрессии на базофилах рецепторов CD63 методом проточной цитофлуориметрии [Новый подход к аллергодиагностике бруцеллеза / Пономаренко Д.Г. [и др.]. // Инфекция и иммунитет 2013. - Т. 3. - №1. - С. 89-92]. Определение аллергической перестройки организма проводят в условиях in vitro с помощью наборов для постановки тестов активации базофилов, который может применяться для определения аллергической реакции немедленного типа и гиперчувствительности к предполагаемым антигенам.
Метод определения экспрессии на базофилах рецепторов CD63 методом проточной цитофлуориметрии является наиболее близким по технической сущности решением к заявленному изобретению по совокупности признаков. Способ включает инкубацию цельной гепаринизированной крови с бруцеллезным жидким аллергеном (бруцеллином) и моноклональными антителами против маркера дегрануляции базофилов - CD63. Далее определяют методом проточной цитофлуориометрии количество активированных базофилов, которое у вакцинированных против бруцеллеза находится в пределах от 5,1% до 19%. [Пат. 2574207, Российская Федерация, МПК. Способ дифференциации поствакцинного и инфекционного бруцеллезного процессов по степени повышенной чувствительности организма к бруцеллам в условиях in vitro [Электронный ресурс] / Пономаренко Д.Г. [и др.]; заявитель и патентообладатель: Федеральное казенное учреждение здравоохранения Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Режим доступа: https://findpatent.ru/patent/257/2574207.html].
К недостаткам прототипа относится:
- ограничение по клеточному составу лейкоцитов, для оценки сенсибилизации используют базофилы, они составляют всего 0,5-1,0% от всех лейкоцитов и принимают активное участие преимущественно в развитии аллергических реакций немедленного типа;
- в качестве специфического антигена применятся аллерген бруцеллезный жидкий - бруцеллин; содержащий белок от 3,8 до 5,4 мкг/мл в отличие от заявляемого способа, где в качестве специфического индуктора применяется инактивированный водорастворимый бруцеллезный антиген, полученный из вакцинного штамма Brucella abortus 19 ВА в конечном разведении по белку 50 мкг/мл, что позволяет получить более выраженный иммунный ответ в условиях in vitro;
- для учета активированных бруцеллином базофилов, требуется проточный цитофлуометр и дорогостоящие реактивы, включающие специфические моноклональные антитела против маркера дегрануляции базофилов - CD63, что ограничивает применение этого метода.
Задачей изобретения является создание способа оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза, основанного на модифицированной реакции бласттрансформации лимфоцитов (мРБТЛ) с бруцеллезным антигеном (Brucella abortus 19 ВА) и определении концентрации спонтанного и антиген индуцированного гамма-интерферона (ИФН-γ) в культуральном супернатанте с помощью ИФА с последующим расчетом индекса стимуляции.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в заявляемом способе оценивается клеточно-опосредованная реакция в ответ на специфический бруцеллезный антиген в условиях in vitro. Предусмотрены следующие отличия: проводится мРБТЛ с бруцеллезным антигеном Brucella abortus 19 ВА и определение концентрации спонтанного и антиген индуцированного ИФН-γ в культуральном супернатанте методом ИФА с последующим расчетом индекса стимуляции.
Кроме того предложенный способ отличается тем, что в качестве индуктора применяется инактивированный водорастворимый бруцеллезный антиген в конечном разведении по белку 50 мкг/мл, полученный из вакцинного штамма Brucella abortus 19 ВА, а определение концентрации спонтанного и антиген индуцированного ИФН-γ в культуральном супернатанте проводится спектрофотометрически при длине волны 450 нм, при этом уровень специфического клеточного ответа оценивается по индексу стимуляции с учетом концентрации антиген индуцированного ИФН-γ в культуральном супернатанте.
Техническое решение позволяет усовершенствовать оценку поствакцинального иммунитета против бруцеллеза in vitro при помощи доступных лабораторных методов, оборудования и реактивов, не требующих высоких финансовых и трудозатрат, в том числе за счет применения готовых наборов тест-систем для определения ИФН-γ в супернатанте.
Техническая сущность предлагаемого технического решения состоит в том, что с помощью мРБТЛ с бруцеллезным антигеном (Brucella abortus 19 ВА) и определения концентрации спонтанного и антиген-индуцированного ИФН-γ в культуральном супернатанте при помощи ИФА проводят оценку состояния специфического клеточного иммунного ответа in vitro по индексу стимуляции с учетом концентрации антиген индуцированного ИФН-γ.
2
Описанное выше техническое решение «Способ оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза» осуществляется следующим образом. Сначала забирают кровь обследуемого пациента в вакуумную пробирку с зеленой крышкой (Li-гепарин/Na-гепарин). Гепаринизированную таким образом кровь в качестве контрольного образца в количестве 0,025 мл инкубируют в течение 72 часов во влажной камере термостата или СО-инкубатора в стерильных условиях, в круглодонных иммунологических планшетах в 0,145 мл полной ростовой среды (ПРС).
Опытный образец крови в количестве 0,025 мл также культивируют в 0,145 мл ПРС, содержащей инактивированный водорастворимый специфический бруцеллезный антиген, полученный из вакцинного штамма Brucella abortus 19 ВА в конечном разведении 50 мкг/мл, в течение 72 часов.
Из полученных контрольного и опытного образцов крови отбирают культуральные супернатанты (надосадок) и используют их для определения концентрации ИФН-γ с помощью набора реагентов тест-системы ИФА «гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ» (АО «Вектор-Бест», Новосибирск) в соответствии с инструкцией производителя. Учет результатов проводят спектрофотометрически при длине волны 450 нм с настройкой прибора «по воздуху».
По значению индекса стимуляции (ИС) и концентрации антиген индуцированного ИФН-γ (пг/мл) судят о специфическом клеточном ответе на бруцеллезный антиген. Индекс стимуляции рассчитывается по формуле:
ИС=Оп/К, где
Оп - значение опытного образца в пг/мл (антиген индуцированная продукция ИФН-γ);
К - значение контроля в пг/мл (спонтанная продукции ИФН-γ).
Для реализации способа используют:
1. ПРС: среда 199, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки, L-глютамин (2 mM), HEPES (10 mM), гентамицина сульфат 50 мкг/мл.
2. Контрольный образец крови (0,025 мл).
3. Опытный образец крови (0,025 мл).
4. Инактивированный водорастворимый бруцеллезный антиген Brucella abortus 19 ВА.
5. Раствор хлорида натрия 0,9% для разведения антигена.
6. Набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации γ-интерферона в сыворотке, плазме крови, культуральном супернатанте (γ-Интерферон-ИФА-БЕСТ, Новосибирск).
7. Принцип анализа: «Sandwich» - вариант твердофазного трехстадийного ИФА на планшетах.
8. Учет результатов: спектрофотометрия на длине волны 450 нм.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel 2010. Для интервальной оценки медианы значений применяли статистическую программу «Довинт v. 1.0». Достоверность различий в двух независимых выборках оценивалась с помощью критерия Манна-Уитни (U), при сравнении более двух независимых выборок - критерия Краскела-Уоллиса (Н). Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05.
Техническим результатом изобретения является усовершенствование оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза за счет создания информативного, экономичного и широкодоступного способа для практического здравоохранения in vitro с помощью мРБТЛ с бруцеллезным антигеном (Brucella abortus 19 ВА) и ИФА для определения концентрации спонтанного и антиген индуцированного ИФН-γ в культуральном супернатанте с последующим расчетом индекса стимуляции.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Обследование лиц, ранее невакцинированных от бруцеллеза, заявленным способом (перед вакцинацией)
Нами было проведено изучение предложенного способа у 34 лиц в возрасте от 23 до 59 лет, не имевших в анамнезе вакцинации от бруцеллеза. Всем обследуемым были проведены реакции агглютинации Райта и Хеддельсона, а также ИФА с определением противобруцеллезных антител классов IgM, IgG, IgA.
Затем был оценен уровень спонтанной продукции ИФН-γ и уровень антиген индуцированной продукции ИФН-γ бруцеллезным антигеном (Brucella abortus 19 ВА) и рассчитан индекс стимуляции.
В группе людей, не имевших в анамнезе вакцинации от бруцеллеза, при серологическом исследовании в реакциях Хеддельсона, Райта и ИФА не регистрировалось противобруцеллезных антител. Результаты исследования по продукции спонтанного и антиген индуцированнного ИФН-γ представлены в таблице 1.
В результате эксперимента было установлено достоверно значимое увеличение уровня антиген индуцированной продукции ИФН-γ (Н=81,7; р<0,05) и значения индекса стимуляции в группе вакцинированных лиц от бруцеллеза по сравнению с невакцинированными (Н=63,2; р<0,05).
Уровень спонтанной продукции ИФН-γ в группах вакцинированных и невакцинированных от бруцеллеза лиц достоверно не различался (р>0,05).
Установлено, что у людей, не имевших в анамнезе вакцинации от бруцеллеза, медиана значений антиген индуцированного ИФН-γ равна 15,6 пг/мл, при этом с 99,9%-ной вероятностью находится в пределах 12,2-23,3 пг/мл. Медиана значений индекса стимуляции равна 1,0 и с 99,9%-ной вероятностью находится в пределах 1,0-1,3.
Результат считается отрицательным в пределах значений верхней границы доверительного интервала 99,9% антиген индуцированного ИФН-γ до 23,3 пг/мл (возможно округление до 23,0) и ИС - до 1,3. При таких значениях вышеуказанных показателей - показана вакцинация.
Пример 2. Способ оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза у ранее привитых лиц
Для изучения предложенного способа было обследовано 70 работников мясокомбината в возрасте от 23 до 59 лет, у которых документально был подтвержден факт вакцинации от бруцеллеза (13 месяцев назад) живой бруцеллезной вакциной Brucella abortus 19 ВА.
Значения концентрации антиген индуцированного ИФН-γ и индекса стимуляции, в группе лиц, ранее вакцинированных от бруцеллеза, были вариабельными (табл. 2). Подавляющее большинство (81,4%) обследуемых лиц имело высокие и очень высокие значения концентрации антиген индуцированного ИФН-γ и ИС, что свидетельствует о наличии выраженной сенсибилизации к бруцеллезному антигену.
За норму были приняты результаты исследования невакцинированных лиц: антиген индуцированный ИФН-γ Ме=15,6 пг/мл; ДИ 99,9% [12,2-23,3] пг/мл и ИС - Ме=1,0; ДИ 99,9% [1,0-1,3]. На основании этого, лица, имеющие сочетание значений антиген индуцированного ИФН-γ и ИС до 2-х норм Me [ДИ 99,9%] - допускаются к ревакцинации от бруцеллеза. При этом медиана значения антиген индуцированного ИФН-γ будет равна 31,2 пг/мл, верхняя граница доверительного интервала 99,9% - 46,6 пг/мл (возможно округление до 47,0 пг/мл), при этом медиана значения ИС равна 2,0 и с учетом верхней границы доверительного интервала 99,9% - 2,6. При таких значениях уровень антигенной индукции расценивается, как низкий, а поствакцинальный иммунитет - как недостаточно протективный. Таким образом, критериями допуска к ревакцинации является сочетание значений антиген индуцированного ИФН-γ до 47,0 пг/мл и ИС до 2,6.
Далее, в таблице 2 показано применение полученных критериев допуска к ревакцинации. Все рекомендованные к ревакцинации лица (согласно графику ревакцинации от бруцеллеза на мясокомбинате), были распределены по группам в зависимости от полученных значений концентрации антиген индуцированного ИФН-γ.
Не допускаются к ревакцинации от бруцеллеза лица, имеющие сочетание значений антиген-индуцированного ИФН-γ выше 47,0 пг/мл и ИС выше 2,6 в связи с риском развития осложнений. Таким образом, на основании результатов обследования и полученного распределения, только 13 из 70 человек рекомендуется ревакцинация от бруцеллеза.
Пример 3. Результаты серологического тестирования у лиц, ранее вакцинированных от бруцеллеза
Сыворотки обследуемых нами ранее 70 работников мясокомбината в возрасте от 23 до 59 лет, у которых документально был подтвержден факт вакцинации от бруцеллеза (13 месяцев назад) живой бруцеллезной вакциной Brucella abortus 19 ВА были поставлены в серологических реакциях агглютинации (Хеддельсона, Райта) и ИФА. В таблицах 3, 4, 5 представлены результаты.
В группе лиц, ранее вакцинированных от бруцеллеза, были получены как отрицательные, так и положительные результаты серологических тестов: в реакциях Хеддельсона, Райта и ИФА (таблицы 3, 4, 5).
В реакции Хеддельсона были получены следующие результаты: отрицательные - в 34 случаях (48,6%); сомнительные - в 9 случаях (12,8%); положительные/резко положительные - в 27 случаях (38,6%).
При отрицательном результате в реакции Хеддельсона с 95%-ной вероятностью уровень антиген индуцированного ИФН-γ находился в пределах 76,0-424,0 пг/мл и индекс стимуляции ИФН-γ - в пределах 5,6-34,5.
На фоне отрицательных и сомнительных результатов реакции Хеддельсона, что составило 61,4% (43 человека) от всех результатов данной реакции, отмечался выраженный антиген индуцированный клеточный иммунный ответ без статистически достоверной разницы в данных группах (U=1,7; р>0,05). При этом у 48,6% (34) пациентов при отрицательных результатах в реакции Хеддельсона был получен клеточный иммунный ответ. Достоверных различий в группах с отрицательным, сомнительным, положительным и резко положительными результатами по индуцированному ИФН-γ (Н=1,7; р>0,05) и по значению индекса стимуляции не было обнаружено (Н=0,7; р>0,05).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что для оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза серологическое исследование в пластинчатой реакции агглютинации Хеддельсона является недостаточным, и уровень специфического клеточного ответа достоверно не различается в группах с разными результатами реакции Хеддельсона.
В реакции агглютинации Райта были получены следующие результаты: отрицательные - в 41 случае (58,6%); сомнительные (титр антител 1/50)- в 10 случаях (14,3%); положительные (титр 1/100) - в 9 случаях (12,8%); положительные (титр 1/200-1/400) - в 10 случаях (14,3%). Достоверных различий по спонтанной, антиген индуцированной продукции ИФН-γ (Н=6,1; р>0,05) и индексам стимуляции в группах в зависимости от результатов реакции Райта не было получено (Н=1,6; р>0,05).
При отрицательном результате в реакции Райта с 95%-ной вероятностью значение концентрации антиген индуцированного ИФН-γ находилось в пределах 80,2-347,0 пг/мл и индекс стимуляции ИФН-γ - в пределах 6,4-20,6. Таким образом, у пациентов данной группы отмечался только клеточный иммунный ответ на бруцеллезный антиген с медианой значения ИС - 8,8 пг/мл. Это свидетельствует о том, что для оценки поствакцинального иммунитета против бруцеллеза серологическое исследование в реакции агглютинации Райта является недостаточным.
По результатам ИФА у ранее вакцинированных от бруцеллеза лиц (у 60 из 70 человек) выявлялись противобруцеллезные антитела (коэффициент позитивности более 1,0) либо одного класса, либо в сочетании. Антитела к бруцеллам всех трех классов (IgG+IgA+IgM) были выявлены у 5 человек. Антитела двух классов (IgG+IgA) - у 46 человек; только IgG - у 5; только IgA - у 4-х человек. При выявлении антител к бруцеллам в ИФА (особенно IgM) при наличии факторов риска заражения бруцеллезом необходима консультация инфекциониста для исключения инфицирования возбудителем бруцеллеза.
Независимо от результатов ИФА (положительный, отрицательный) были получены высокие значения индекса стимуляции (табл. 5). В случаях отсутствия антител к бруцеллезным антигенам в ИФА (Ig М, G, А) у лиц, ранее вакцинированных от бруцеллеза, были получены высокие значения ИС (Me ИС: 17,3; 9,3; 7,1 соответственно). Вышеизложенные данные свидетельствует о том, что применение ИФА с определением противобруцеллезных антител трех классов, также является недостаточным для оценки поствакцинального иммунитета.
В примерах демонстрируется, что величина антиген индуцированной продукции ИФН-γ используется как показатель напряженности специфического клеточного иммунного ответа в группах невакцинированных и вакцинированных ранее от бруцеллеза лиц.
Таким образом, разработанный способ позволяет усовершенствовать оценку поствакцинального иммунитета против бруцеллеза. По силе специфического клеточного ответа можно судить об уровне сенсибилизации организма к бруцеллезному антигену, предотвращая поствакцинальные осложнения. В связи с чем, способ может применяться перед вакцинацией и ревакцинацией от бруцеллеза и для установления факта сенсибилизации к бруцеллезному антигену в качестве аллерготеста in vitro.