Димер полипептида полифемузина I, полученного из L. Polyphemus
DIMER OF POLYPHEMUSIN I POLYPEPTIDE OBTAINED FROM L. POLYPHEMUS

Изобретение относится к области биохимии, а именно, к получению димера полипептида полифемузина I из организма L. Polyphemus. Может быть использовано в фармакологической промышленности с целью получения более активных форм антибиотических препаратов, применяемых в качестве антибиотиков.
В связи с появлением новых, устойчивых к традиционным антибиотикам, штаммов патогенных микроорганизмов, возрастает необходимость в более эффективных средствах для борьбы с ними.
На данный момент большое количество исследований посвящено пептидам с антимикробной активностью (АМП). Группа АМП в большинстве своем представлена короткими амфипатическими белками длиной от 12 до 50 аминокислот, молекулы которых обладают положительным зарядом для взаимодействия с отрицательно заряженной мембраной. Данные вещества чрезвычайно эффективны в качестве антимикробных препаратов, то есть, антибиотиков, поскольку способны взаимодействовать с грамположительными, грамотрицательными бактериями, а также с грибами, вирусами и простейшими. Кроме того, микроорганизмы гораздо медленнее и хуже вырабатывают механизмы устойчивости против АМП. Таким образом, поиск наиболее активных форм АМП и экономически выгодных методов их получения - два важных направления для исследований в современной науке.
Среди известных АМП одним из наиболее активных является полипептид полифемузин I, выделенный из гемоцитов краба вида L. polyphemus. Данный пептид длинной 18 аминокислот стабилен в виде структуры с двумя амфифильными антипаралельными β-структурами, соединенными дисульфидным мостиком (фиг. 1) Он обладает высоким сродством к липосахаридам, и его минимальная ингибирующая концентрация составляет 2 мкг/мл. Механизм действия данного пептида не до конца раскрыт, но он предполагает взаимодействие полифемузина с отрицательно заряженным слоем мембранных липидов бактерии [1].
Как правило, механизм действия АМП схож и заключается в создании пор в клеточной мембране микроорганизмов, что приводит к гибели клетки. Предполагается, что поры образуют различного рода олигомерные формы АМП. Поэтому в качестве одного из перспективных подходов для увеличения активности АМП применяется создание димерных форм таких пептидов. Исследования показывают, что димеризация АМП способствовала увеличению их активности и селективности, а также повышала устойчивость к протеазам по сравнению с мономерными формами [2].
Традиционным способом получения коротких пептидов является химический синтез. Данный метод, несмотря на некоторые недостатки, прост и относительно недорог для пептидов небольшой длины (до 40 аминокислот).
Задача изобретения состоит в том, чтобы получить новый димер полипептида полифемузина I, который был бы стабильным и не уступал по активности своей мономерной форме.
Технический результат изобретения достигается тем, что создается димер полипептида полифемузина из организма L. Polyphemus. Полипептид полифемузин имеет длину 18 аминокислот и представлен следующей последовательностью: Arg-Arg-Trp-Cys-Phe-Arg-Val-Cys-Tyr-Arg-Gly-Phe-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg. Для соединения мономеров между собой использовали линкер Gly-Ser-Gly. Конечная длина полученного димера составила 39 аминокислот. Трехмерная структура димера представлена на фиг. 2.
Полученный полипептид стабилен и не уступает по конечной активности своей мономерной форме.
Существенными признаками, характеризующими изобретение, в отличие от исходной версии полипептида, является использование димера полипептида полифемузина.
Предложенный способ поясняется следующими материалами: Химический синтез полипептида проводился методом твердофазного синтеза, разработанного Р. Б. Меррифилдом. Суть процесс состоит в последовательном добавлении аминокислот, модифицированных таким образом, чтобы обеспечить образование пептидной связи и предотвратить взаимодействие боковых реакционноспособных групп. Для этой цели боковые группы закрывают специальными защитными группировками, которые затем снимаются, давая на выходе итоговую полипептидную цепь.
6
Оценку активности проводили с использованием методики определения биологической активности антибиотиков методом серийных разведений. Для этого проводили наращивание жидкой культуры клеток E. coli неэкспрессионного штамма МС1061 в 10 мл питательной среды LB при 37°С до OD600 0,4. Рассчитывали количество клеток по оптической плотности, разводили до концентрации 1*10 клеток в 1 мл, разливали в пробирки по 1 мл полученной культуры.
6
Готовили последовательные двукратные разведения мономера и димера полифемузина со следующими конечными концентрациями (мкг на мл культуральной жидкости, содержащей 1*10 клеток): 40 мкг/мл, 20 мкг/мл, 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл, 1,25 мкг/мл, 0,6 мкг/мл, 0,3 мкг/мл.
Вносили в пробирки с культуральной жидкостью димер и мономер полифемузина в соответствующей концентрации (по три повтора на каждое разведение), для контроля реакции в три оставшиеся пробирки с культуральной жидкостью не вносили ничего. Растили полученные образцы в течение ночи при 37°. После проводили оценку наименьшей концентрации, при которой не наблюдался рост микроорганизмов (минимальная ингибирующая концентрация).
Для мономера полифемузина минимальная ингибирующая концентрация составила 2,5 мкг/мл; для димера - 5 мкг/мл. Полученный результат показывает, что полученный димер был стабилен, а его активность не уступала мономеру, так как полученная минимальная ингибирующая концентрация была в два раза выше, чем аналогичная для мономера, однако молекулярная масса димера в два раза превышала молекулярную массу мономера.
1. Zhang L. et al. Interaction of polyphemusin I and structural analogs with bacterial membranes, lipopolysaccharide, and lipid monolayers // Biochemistry. 2000. Vol. 39, №47. P. 14504-14514.
2. Lorenzon E.N. et al. Dimerization of Antimicrobial Peptides: A Promising Strategy to Enhance Antimicrobial Peptide Activity // Protein Pept. Lett. 2019. Vol. 26, №2. P. 98-107.