Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого "сэндвич"-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О N2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных
TEST SYSTEM BASED ON LIQUID PHASE BLOCKING INDIRECT "SANDWICH" ELISA FOR DETERMINATION OF ANTIBODY TITER AGAINST FMDV STRAIN O N2047/SAUDI ARABIA/2008 GENOTYPE O/ME-SA/PANASIA2 IN ANIMAL BLOOD SERA

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности созданию тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных.
Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое характеризуется высокой заболеваемостью, что влечет за собой ограничения на международную торговлю скотом и его продукцией. Основными клиническими признаками заболевания являются лихорадка, хромота, афты во рту, ступнях и сосках. Молодые животные имеют более высокую смертность из-за миокардита по сравнению со взрослыми особями. Вспышки ящура часто возникают в странах Ближнего Востока и Азии, Африки [1, 2].
1
2
3
4
1
Вирус ящура является представителем рода Aphthovirus семейства Picornaviridae и имеет 7 различных серотипов: О, А, Азия-1, С и SAT-1, SAT-2, SAT-3 [2]. Геном кодирует 4 структурных белка VP, VP, VP, VP. Петля G-H белка VP была идентифицирована как основной антигенный сайт. РНК вируса ящура также несет в себе информацию о 8 неструктурных белках (L-протеаза, 2А, 2В, 2С, 3А, 3В, 3С-протеаза и 3D-РНК-зависимая РНК-полимераза). Вирус ящура имеет очень высокую частоту мутаций из-за отсутствия механизма репарации вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы. Антигенные варианты вызваны различными аминокислотными мутациями, приводящими к трудностям в борьбе с ящуром [1, 2].
В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены мутациями и рекомбинацией. Рекомбинация - еще один важный процесс, определяющий биологию и эволюцию вирусов. Она представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Было показано, что генетическая рекомбинация происходит между вирусами одного и того же серотипа [3, 4]. Внутритипическая рекомбинация происходит часто и, по-видимому, события рекомбинации при ящуре происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации приводят к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые могут избежать иммунного давления и привести к изменениям тропизма клеток и диапазона хозяев [2, 5, 6]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус будет приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [6].
Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и клеток-хозяев [6, 7]. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [6].
1
1
Наиболее вариабельным является белок VP вируса ящура, поскольку на него приходится не менее 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [7]. Участок поверхностного белка VP в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [8, 9, 10]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому [9].
В 2008 г. широкое распространение на территории Саудовской Аравии получил вирус ящура, который принадлежит к генотипу O/ME-SA/PanAsia2. В марте 2008 г. в этой стране от теленка был выделен изолят O/SAU/5/2008. Проанализирован ID-ген нуклеиновой кислоты данного вируса с помощью двух систем праймеров O-1C244F/EUR-2B52R и O-1C272BF/EUR-2B52R. Выделен фрагмент кДНК полученного изолята размером 639 п.н. По результатам секвенирования определено, что полученный изолят на 99,53% схож с представителями генотипа O/ME-SA/PanAsia2. Последовательности нуклеотидов ID-гена и аминокислот белка VP1 для указанного изолята опубликованы в базе данных GenBank 14.06.2021 под номером МТ 443784.1. Следует отметить, что генетическая сублиния данному изоляту не присвоена. Более узкое разделение по генетике стали проводить для изолятов вируса ящура, выделенных, начиная с 2009 г.
В ФГБУ «ВНИИЗЖ» данный изолят был адаптирован к различным чувствительным клеточным линиям, в том числе, к монослойной и суспензионной перевиваемой клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21 и получен штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2. Данный штамм был депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» (справка №33 о депонировании штамма «О №2047/Саудовская Аравия/2008» серотипа О вируса ящура для целей патентной процедуры от 24.12.2021) под регистрационным номером: штамм ВЯ О №2047/Саудовская Аравия/2008. Филогенетическая принадлежность изолята O/SAU/5/2008 / штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2 представлена на фиг. 4.
Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с болезнью. В связи с появлением представителя нового генотипа вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген вируса ящура данного штамма, данного генотипа.
Возникла необходимость создания высокоспецифичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, которые позволили бы выявлять антитела против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2.
2
Защита от ящура после вакцинации определяется уровнем специфических антител в сыворотке крови животных [11, 12, 13, 14]. Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к капсиду или структурным белкам вируса ящура. В соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE) [2] для определения иммунного статуса животных применяют реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция нейтрализации считается чувствительным и специфичным методом, однако проведение анализа имеет ряд следующих ограничений: 1) большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 3 суток), 2) высокая стоимость процедуры, связанная с применением чувствительной клеточной линии, наличием СО-инкубатора, 3) предполагает использование живого вируса ящура, который является биологическим агентом II группы опасности.
В свою очередь ИФА обладают многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде углекислого газа [15, 16]. Исходя из этого ИФА целесообразно применять для определения титра антител у вакцинированных животных.
Выделяют прямой и непрямой варианты ИФА. Преимущества прямого варианта ИФА заключаются в быстроте анализа, поскольку используется только один вариант иммуноглобулинов G и устраняется перекрестная реактивность вторичных антител. При этом имеются и некоторые недостатки, а именно, снижение иммунной активности первичных антител в следствие отрицательного влияния ферментов или меток, отсутствие гибкости в выборе первичной метки антител в зависимости от задачи исследования, а также минимальное усиление сигнала.
Существует непрямой вариант ИФА, который имеет заметные преимущества по сравнению с прямым. К достоинствам этого варианта метода относится следующее: 1) наличие большого разнообразия меченых вторичных антител, 2) универсальность (многие первичные антитела могут быть получены у одного вида, и одно и то же меченое вторичное антитело может быть использовано для обнаружения), 3) максимальная иммунная активность основного антитела сохраняется, поскольку оно не маркировано, 4) повышение чувствительности, поскольку каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые могут быть связаны меченым вторичным антителом, что позволяет усиливать детектируемый сигнал. К ограничениям метода относится вероятность появления перекрестной активности со вторичным антителом, что может привести к появлению неспецифического сигнала, а также наличие дополнительного этапа реакции [4, 15, 17].
Большое значение в лабораторной деятельности имеет «сэндвич»-вариант ИФА, который обычно требует использования пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены они для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Указанный вариант ИФА имеет следующие преимущества:
- высокая специфичность анализа;
- подходит для исследования полевых образцов разной степени очистки;
- высокая чувствительность реакции.
ИФА также разделяют на твердофазные и жидкофазные варианты. В настоящее время твердофазный вариант широко распространен по причине удобства применения и быстроте проведения анализа. На первом этапе реакции для твердофазного варианта адсорбируют антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием. При добавлении конъюгата и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.
Жидкофазный блокирующий непрямой вариант ИФА имеет ряд следующих преимуществ: 1) анализ максимально из всех модификаций данного анализа приближен к классической реакции нейтрализации, поскольку частицы антигена не прикреплены к субстрату; 2) эпитопы антигена наиболее доступны в пространстве для специфичных антител, и это позволяет получать наиболее приближенные результаты к реакции нейтрализации в клеточной линии; 3) обладает высокими показателями аналитической и диагностической чувствительности, специфичности и общей точности.
Sharma G.K. и др. (2015) предложили способ определения антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [18]. Данная методика позволяла идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к вирусу ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2 не более 50%, а, следовательно, точное выявление иммуноглобулинов G не представляется возможным. Следует заметить, что данный способ предполагал применение в качестве блокирующего компонента не иммунную сыворотку лошади, которая содержит различные белковые соединения, в том числе, возможно, гомологичные участки аминокислотных последовательностей относительно антигенных детерминант. Авторы тест-системы применяли моноклональные антитела, использование которых увеличивает спектр выявления различных генетических линий вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижается специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности O/ME-SA/PanAsia2. В качестве красителя использовали тетраметилбензидин (ТМВ), являющийся агрессивным канцерогеном и нестабильным компонентом для проведения цветной реакции. Для остановки реакции применяли серную кислоту, являющуюся опасным соединением.
Указанные выше тест-системы не представлены на рынке в качестве набора для детекции противоящурных антител в сыворотках крови животных и остаются в качестве недоступных для широкого потребителя диагностикумов. В свою очередь на мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа О - IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды).
Тест-система в наборе IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА. Комплектующие набора IZSLER (Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna Brescia, Italy The Pirbright Institute) следующие:
1. Герметичные микропланшеты, сенсибилизированные инактивированным вирусом ящура типа О.
2. Конъюгат (моноклональные антитела против вируса ящура типа О, конъюгированные с пероксидазой).
3. Положительный контроль сыворотки против вируса ящура типа О.
4. Отрицательный контроль.
5. Буферный раствор для ИФА - фосфатно-солевой буфер с твином-20 (ФСБ-Tween).
6. Буфер для разведения сыворотки крови и конъюгата.
7. Субстрат - раствор хромогена ТМВ.
8. Раствор для остановки реакции - 0,6N раствор серной кислоты. Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены ранее 2008 года (период, когда появился штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008, с 2014 года он стал использоваться в качестве производственного штамма) и не могут с высокой достоверностью и точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность указанной тест-системы для выявления антител против вируса ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2 ниже 50%, что подтверждают данные реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Иными словами, применяемая тест-система не позволяет получать точных результатов именно в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа.
Наиболее близким прототипом для разработанной нами тест-системы является тест-система PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура типа О.
Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже:
Компонент 1 - Планшеты иммунологические.
Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят непосредственно перед применением.
Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).
Компонент 4 - Неиммунная сыворотка крови лошади.
Компонент 5 - Деминерализованная вода.
Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).
Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).
Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).
Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).
Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 - отрицательный контроль (жидкая).
Компонент 11 - Субстрат хромогена ТМВ.
Компонент 12 - Стоп-раствор - 1 N раствор серной кислоты. Данные о комплектации тест-системы отражены в инструкции производителя.
Диагностикум удобен в применении и позволяет за 5-6 ч получить результаты исследования. Данная тест-система включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа О, исходя из этого является типоспецифичной, но без более узкой дифференциации. Разработана прототипная тест-система в конце 90-гг XX в. и получены соответствующие антитела против антигенов вируса ящура различных генотипов, созданных с использованием антигенов вируса ящура различных генотипов, кроме активно циркулирующего с 2008 г. генотипа О/МЕ-SA/PanAsia2. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа О. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного пептида вируса ящура VP], ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Исходя из выше отраженного, прототипная тест-система не является высокочувствительной и специфичной по отношению к вирусу ящура генотипа O/ME-SA/PanAsia2. Данная тест-система выявляет антитела к данному штамму не более, чем на 60%. Исходя из этого требуется разработать высокочувствительную, специфичную тест-систему для детекции и количественного анализа антител против вируса ящура представленного генотипа.
Кроме того, прототипная тест-система основана на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА, однако эта форма хоть и является одним из вариантов серологических реакций, но при этом находится дальше от реакции нейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.
Прототипный вариант предполагает наличие в своем составе нативных контрольных сывороток крови животных, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и есть риск контаминации микроорганизмами.
Прототипный вариант имеет также некоторое ограничение в применении, а именно, рабочий раствор конъюгата не стабилен и быстро разрушается. В составе набора он представлен в виде 30-кратного концентрата. В таком состоянии в отличии от лиофилизированного компонента срок хранения заметно сокращается. Следует также отметить, что данная тест-система не предусматривает контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура.
В прототипной тест-системе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может негативно отражаться на конечных результатах количественного исследования сывороток крови животных.
В прототипной тест-системе для проявления цветной реакции используют краситель ТМВ, который обладает канцерогенными свойствами.
Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся тест-систем, в том числе прототипной, для проведения точного анализа гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный вирус ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2, актуальной является разработка серологической тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для выявления антител в сыворотках крови животных с учетом выше приведенных недостатков.
В настоящее время ветеринарная служба Российской Федерации не располагает современной отечественной тест-системой ИФА, которая позволила бы с высокой достоверностью определять титр антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках животных.
Целью изобретения является создание тест-системы на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2.
Поставленная цель достигается тем, что предлагаемая тест-система содержит следующие иммуноспецифические компоненты:
1) культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2;
2) сенсибилизирующие антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2;
3) детекторные антитела - лиофилизированные иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2;
4) контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2, с процентом ингибиции ≥75%;
5) контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови телят к антигену вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2, с процентом ингибиции от 50% до 75%;
6) контроль 3 - лиофилизированная сыворотка крови телят, не содержащая антитела к вирусу ящура - отрицательный контроль;
7) лиофилизированная фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета;
8) антивидовой конъюгат - лиофилизированные иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Предлагаемая тест-система содержит также неспецифические компоненты: карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6) для разведения антигена, 20-кратный концентрат буферного раствора, хромогенный субстрат ABTS (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота), «стоп»-раствор - 1%-ный раствор додецилсульфата натрия.
Цель достигается благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к классической реакции нейтрализации в естественных условиях, поскольку все антигенные сайты полных вирионов вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами кролика и морской свинки, соответственно. Реакция основана на взаимодействии исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в жидкой фазе в лунках круглодонного планшета с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета иммуноглобулинами G кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки блокируют с помощью фетальной сыворотки крови КРС, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят восстановленную суспензию детекторных антител. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против IgG морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата.
Технический результат от изобретения заключается в разработке современной, высокоспецифической и чувствительной тест-системы, предназначенной для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 методом жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, вследствие применения инактивированного вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 и при получении специфических компонентов реакции в жидкой фазе.
В состав разработанной тест-системы ИФА входят следующие иммуноспецифические компоненты:
3
1. культуральный инактивированный лиофилизированный вирус ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 - 1 флакон (0,5 см);
3
2. сенсибилизирующие лиофилизированные антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 - 1 флакон (0,5 см);
3
3. детекторные лиофилизированные антитела - иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 - 1 флакон (0,5 см);
3
4. контроль 1 - положительная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2, с процентом ингибиции ≥75% - 1 флакон (0,2 см);
3
5. контроль 2 - положительная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2, с процентом ингибиции от 50% до 75% - 1 флакон (0,2 см);
3
6. контроль 3 - нормальная лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антител к вирусу ящура - 1 флакон (0,2 см);
3
7. лиофилизированная фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета - 2 флакона (по 2,0 см);
8. антивидовой лиофилизированный конъюгат - иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена.
Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты:
9. карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (рН 9,5-9,6) для разведения антигена;
10. 20-кратный концентрат буферного раствора;
11. хромогенный субстрат - краситель ABTS (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота);
12. «стоп»-раствор - 0,5%-ный раствор додецилсульфата натрия.
В состав тест-системы также входят 4 иммунологических 96-луночных плоскодонных полистироловых планшета для проведения ИФА и 1 полимерный 96-луночный круглодонный планшет для связывания антигена и антител в жидкой фазе.
В отличии от прототипа в разработанной тест-системе применяется культуральный инактивированный вирус ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2, который представлен в виде лиофилизата. Данный факт дает возможность выявлять именно антитела против вируса ящура указанного штамма с высокими показателями чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 40% выше по сравнению с наиболее близким прототипом. Кроме того, лиофилизированный компонент остается стабильным не менее 3 лет по сравнению с антигеном в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 составляет 1:3500.
В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к антигену вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2, поскольку были получены с применением высокоочищенного антигена с высокой активностью. Указанные в тест-системе ИФА иммуноглобулины G кролика и морской свинки против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 представлены в виде лиофильного компонента, что позволяет антителам находится в стабильном состоянии не менее 3 лет с активностью не менее 1:10000 и 1:4500, соответственно.
В отличии от прототипа сыворотки крови КРС, контроль 1 и 2, получены против высокоочищенного инактивированного вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2, что позволяет достичь высокой специфичности и чувствительности при контроле работы тест-системы. Указанные компоненты представлены в виде лиофилизата, что позволяет хранить их не менее 3 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 активность составляет не менее 1:4000, для контроля 2 - не менее 1:4000. Данная активность высокая и удобна для получения большого количества контролей в рабочем нативном состоянии.
В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется очищенная фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в лиофильном виде, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 3 лет.
В отличии от прототипного варианта представленная тест-система предусматривает контроль антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать достоверные абсолютные данные по оптическим плотностям и значению титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2.
В отличии от прототипа в предложенной тест-системе применяется непрямой конъюгат, что позволяет снижать вероятность шумовых фоновых явлений и получать более достоверные результаты определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:3000.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Фиг. 2 - Спектральный профиль фракций антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2).
Фиг. 3 - Электрофореграмма для антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2) в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1-3: фракции с 50% сахарозы, 4-8: фракции с 40% сахарозы, 9-13: фракции с 30% сахарозы, 14-18: фракции с 20% сахарозы; целевой белок с молекулярным весом 25 кDa.
Фиг. 4 - Филогенетическая принадлежность изолята O/SAU/5/2008 / штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура генотип О/МЕ-SA/PanAsia2.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура (генотип О/МЕ-SA/PanAsia2);
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VP1 штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура генотип O/ME-SA/PanAsia2.
Разработанная тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА основана на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотип O/ME-SA/PanAsia2 антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами кролика против штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2. Наличие антител к вирусу ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в исследуемой пробе будет выражаться в формировании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами морской свинки, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против IgG морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата ABTS. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера. Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА представлена на фиг. 1.
Перед началом работы компоненты инкубируют 30 минут при температуре от 18 до 23°С.
Проводят подготовку лиофилизированных компонентов тест-системы. Перед началом работы лиофилизированные препараты (антиген вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2), конъюгат, положительные и отрицательный контроли, фетальную сыворотку крови телят) восстанавливают до необходимого объема дистиллированной водой.
Проводят приготовление рабочих растворов.
Раствор №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор - КББ). Готовят по стандартной методике 100 мл КББ раствора (рН 9,5-9,6) для сенсибилизации планшетов.
Раствор №2 (промывочный раствор). Раствор используется для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же как основа для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Готовят 2 л стандартного буферного раствора TBS с добавлением 0,05% твин-20 (рН 7,4-7,6).
3
3
3
Раствор №3 (буфер для восстановления антител и конъюгата). Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовится из раствора №2 с добавлением 10% фетальной сыворотки телят. Для этого к 36 см раствора №2 следует добавить 4,0 см фетальной сыворотки телят, восстановленной из лиофилизированного препарата путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.
Этапы проведения жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2) представлены ниже.
1. Сенсибилизация планшетов. Восстановленную суспензию сенсибилизирующих антител готовят в разведении 1:10000 в растворе №1 (карбонатно-бикарбонатный буферный раствор). Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета для ИФА вносят по 100 мкл суспензии сенсибилизирующих антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре (2-8)°С.
2. Промывание лунок планшета осуществляют с использованием Washer любой марки, либо вручную раствором №2. Процедуру повторяют два раза.
2
3
3
3
3. Серологическая реакция в жидкой фазе. Параллельно с сенсибилизацией планшета проводят иммунную реакцию связывания антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5 log (1:16-1:1448) в растворе №2. Для этого во все лунки полимерного планшета за исключением лунок H1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см (3 мкл) пробы. В лунки H1-6 вносят по 0,05 см (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1.
В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови свиней против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2) - процент ингибиции 75-100%, контроля 2 - положительную сыворотку крови свиней против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2) - процент ингибиции 50-74%, контроля 3 - нормальную сыворотку свиней - процент ингибиции меньше 50%.
3
Во все лунки планшета добавляют по 0,05 см рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:3500. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 18-20 часов при температуре (2-8)°С.
3
4. Улавливание антигена. В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносят по 0,05 см смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±1)°С.
5. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.
3
6. Внесение детекторных антител. Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см3 раствора №3, вносят по 0,05 см рабочего разведения детекторных антител (1:4500) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±1)°С.
7. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.
3
8. Внесение конъюгата. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см рабочего разведения конъюгата (1:3000) в растворе №3. Планшет накрывают крышкой и инкубируют в течение 60±5 мин при температуре (37±1)°С.
9. Промывание лунок планшета. Проводят, как представлено выше (п. 2). Процедуру повторяют 4 раза.
3
10. Проявление цветной реакции. Во все лунки планшета вносят по 0,05 см хромогенного субстрата ABTS, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (18-23)°С.
3
11. Остановка реакции. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см 0,5% раствора додецилсульфата натрия.
12. Учет результатов ИФА. Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность (D) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 410 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения D контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (PI, %) по формуле:
сыворотки
КК
КА
КК
PI (%)=(1-(D-D)/(D-D))×100,
сыворотки
где D - среднее значение оптической плотности смеси сыворотки с инактивированным вирусом ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2);
КА
D - среднее значение оптической плотности контроля антигена;
КК
D - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.
Результаты реакции достоверны в том случае, если данные удовлетворяют следующим критериям:
КА
КК
- разница между значениями D и D не менее 0,4 оптических единиц (о.е.);
- контроль 1 имеет значение PI>75%;
- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-74%;
- контроль 3 имеет значение PI<50%.
Пробы, демонстрирующие значение РI≥50%, считают положительными, а животные, от которых получены данные пробы сыворотки крови, иммунными к ящуру, вызванного вирусом штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2. Значение PI<50% в сыворотке крови обследуемых животных является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру, вызванного вирусом штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипо O/ME-SA/PanAsia2. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Это разведение считают титром антител против ящура, вызванного вирусом штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008.
В результате проведенных экспериментов были оптимизированы условия постановки реакции. Активность детекторных антител, определенная в непрямом варианте ИФА, составила 1:4500, антивидового конъюгата - 1:3000; сенсибилизирующих антител - 1:10000, антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2) - 1:3500, контроля 1 - 1:4000, контроля 2 - 1:4000, контроля 3 - 1:3000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением титра антител и проведен сравнительный анализ с результатами реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].
2
Разработанный вариант ИФА позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета 6 проб сывороток в следующих разведениях, выраженных в двоичном логарифме: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0; 8,5; 9,0: 9,5; 10,0; 10,5 log (1:16-1:1448). Срок годности предлагаемой тест-системы составляет не менее 24 месяцев со дня изготовления при температуре хранения 4-8°С.
В качестве рабочего применяли инактивированный вирус ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (генотип O/ME-SA/PanAsia2).
Контроль штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура на специфичность. Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура, был выделен от теленка в Саудовской Аравии. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VP1, отвечающему за изменчивость вируса ящура. По результатам исследования нуклеотидной последовательности (представлена в приложении) указанного гена была выявлена принадлежность штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 к генотипу O/ME-SA/PanAsia2. Данная последовательность наиболее близка к нуклеотидной последовательности, представленной в GenBank под номером МТ 443784.1 (изолят O/SAU/5/2008) [19]. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 составила 2,58 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 1,68 мкг/мл, 75S компонента - 0,77 мкг/мл, 12S - 0,13 мкг/мл.
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура типа О.
Морфологические признаки
Штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу О, генотипу O/ME-SA/PanAsia2 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции нейтрализации.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:3500.
Антигенное родство штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура с имеющимися производственными штаммами вируса ящура серотипа О исследовано серологическим методом в перекрестной реакции микронейтрализации (РМН). Штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008 антигенно отличается от производственных штаммов O1/Маниса/1993, О №1715/Тайвань/3/97, О №2147/Приморский/2012, О №2212/Приморский/2014, О №2311/Забайкальский/2016, О №2344/Монголия/2017.
1
1
1
Результаты исследований в РМН представлены в таблице 2. Антигенное родство (r) составило для O1/Маниса/1993 - 0,05; О №1715/Тайвань/3/97 - 0,09; О №2147/Приморский/2012 - 0,12; О №2212/Приморский/2014 - 0,09; О №2311/Забайкальский/2016 - 0,11; О №2344/Монголия/2017 - 0,11. При значении r≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического полевого вируса, при значении r<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического полевого вируса.
Биотехнологические характеристики.
50
3
Штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008 репродуцируется в перевиваемых монослойных клеточных линиях почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, и в течение 14-20 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,50 до 8,50 lg ТЦД/см.
Генотаксономическая характеристика.
Штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой с молекулярной массой 2,8×10 Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP, VP, VP и VP.
1
66a
Основным антигенным белком является VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов. Физические свойства.
2
6
-18
Для данного вируса при константе седиментации полных вирусных частиц 146 S, константе диффузии 1,41 см/с молекулярная масса составляет 8,08×10Д. Размер вириона 23-25 нм, масса составляет 8,4×10 г.
Устойчивость к внешним факторам.
Штамм О №2047/Саудовская Аравия/2008 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,5-7,8. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства.
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение инактивированного вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 морским свинкам, кроликам, свиньям, овцам, КРС индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при культивировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение инактивированного вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008.
50
3
Для получения инактивированного вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21 в течение 12-14 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД/см. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли за счет полигексаметиленгуанидина.
Инактивированную культуральную суспензию, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4°С на центрифуге типа Bekman J2-21 (Beckman Coulter, USA) или аналоге. Надосадочную жидкость отбирали и добавляли в нее полиэтиленгликоль с молекулярным весом 6000 Д (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 8% и хлорида натрия (сухой) до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М растворе ФСБ, концентрируя 200 раз (1/200 от первоначального объема).
К полученному преципитату добавляли 50% трихлорметана, интенсивно перемешивали и фракционировали с помощью центрифуги в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008. Отбирали 100 мкл образца для последующего электрофоретического анализа в 12% полиакриламидном геле.
На следующем этапе проводили получение 146S компонента вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 (данный компонент является иммуногенным и наиболее важным в иммунизации животных, поскольку представляет собой полные вирионы).
Перед помещением в градиент сахарозы антиген вируса ящура обрабатывали нонилфеноксиполиэтоксилэтанолом в концентрации 1,5%.
Для выделения 146S компонента готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Обработанный с помощью нонилфеноксиполиэтоксилэтанола антиген вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 наливали по 15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания центрифугировали при скорости 25000 об/мин и температуре 4±2°С в течение 4 часов. Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки. Начало и конец пика 146S компонента определяли по спектральному профилю, объединяя фракции, входящие в этот диапазон.
При использовании перистальтического насоса сначала оценивали визуально пробирку с градиентом сахарозы. Опалесцирующий слой, содержащий 146S компонент, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы. В этом случае отбирали последнюю верхнюю фракцию 50%-го слоя (1,0 мл), все фракции 30%-го слоя (5,0 мл) и нижнюю фракцию 20%-го слоя сахарозы (1,0 мл). Общий объем составляет приблизительно 7,0 мл. Затем 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 4±2°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М фосфатно-солевом буферном растворе.
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2. Анализ проводили для 20 фракций, пики наблюдали для 5-10 фракции с максимальными значениями в для 7 и 8 пиков. Проведен электрофорез полученных фракций в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях для 18 фракций, в которых возможно нахождение 146S компонента вируса ящура данного штамма (фиг. 3). На фиг. 3 отражено, что слоты №№1-3 - это фракции с 50% сахарозы, №№4-8 -фракции с 40% сахарозы, №№9-13 - фракции с 30% сахарозы, №№14-18 -фракции с 20% сахарозы.
Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела) против штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008.
Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.
Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный инактивированный вирус ящура штамма
3
О №2047/Саудовская Аравия/2008, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-70 VG (в соотношении адъювант/антиген = 70/30 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0,21 и 42 дни в объеме 0,5 см. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови - содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.
Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела) против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008.
Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного инактивированного вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.
Пример 4. Определение активности антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008, сенсибилизирующих и детекторных антител.
Индивидуальные пробы сывороток проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 3, 4, 5.
2
Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:8000, 1:9000, 1:10000, 1:12000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:3500, для детекторных антител - 1:4500, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 3 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:10000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log/мл). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.
2
Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:3000, 1:4000, 1:4500, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:3500, для сенсибилизирующих антител - 1:10000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 4 следует, что при разведении детекторных антител 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log/мл). При меньших разведений антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.
2
Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:2000, 1:3000, 1:3500, 1:4000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4500, для сенсибилизирующих антител - 1:10 000, конъюгата - 1:3000. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 5 следует, что при разведении антигена 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log/мл). При меньших разведениях наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных.
При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.
Таким образом, в ходе лабораторных исследований доказано, что рабочие разведения антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008, сенсибилизирующих и детекторных антител составили 1:3500, 1:10000, 1:4500, соответственно.
Пример 5. Применение тест-системы жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против антигена вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008.
Исследовали 12 сывороток крови животных, полученных после иммунизации инактивированными сорбированными вакцинами против ящура, содержащими антиген вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2. Определены значения титра антител с применением разработанной тест-системы ИФА, а также данные сыворотки были исследованы в реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2, рекомендованной OIE [2]. Полученные результаты отражены в таблице 6, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанной тест-системы ИФА (предлагаемое изобретение) и классического метода (РН) высокая (приближено к 100%).
Пример 6. Определение диагностических показателей разработанной тест-системы для определения титра антител в сыворотках крови животных против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 с применением жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Для исследования представленной тест-системы (предлагаемое изобретение) для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 625 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции нейтрализации в чувствительной перевиваемой монослойной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 1:32-1:1448. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. Разработанной тест-системой (предлагаемое изобретение) определили, что из 625 образцов сывороток крови 622 определены в качестве положительных, а 3 - в качестве отрицательных (титр 1:16-1:24). Для исследования специфичности метода тестировали 148 отрицательных сывороток крови животных. В результате исследования с помощью ИФА (предлагаемое изобретение) определили, что из 148 отрицательных проб - 148 определены в качестве отрицательных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,52% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,64-99,90%), диагностическая специфичность (DSp) - 100% (в 95%-ном доверительном интервале: 97,54-100,0%), k-критерий - 0,988; прогностичность положительного результата (PPV) - 100%, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,01%) (в 95%-ном доверительном интервале: 94,10-99,35%), общая точность (DAc) - 99,61% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,87-99,92%) (таблица 7).
Таким образом предлагаемая «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных» является специфичной и чувствительной, позволяющей быстро в течение 4-5 часов провести анализ сывороток крови животных с количественным определением значения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2 в сыворотках крови животных»:
1. Груздев, К.Н. Программа совместных действий по профилактике и борьбе с ящуром животных в странах СНГ / К.Н. Груздев, В.М. Захаров, A.M. Рахманов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. -Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 3-13.
2. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. - Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.
3. Гуленкин, В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С. 31-41.
4. Anon Global Strategy for control of foot-and-mouth disease. - In, Bangkok, Thailand, - 2012. - P. 27-29.
5. Динамика развития противоящурного гуморального иммунитета у крупного рогатого скота, иммунизированного трехвалентной сорбированной вакциной типов А, О, Азия-1 / Д.В. Михалишин, Т.Н. Лезова // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Т. 5. - С. 75-82.
6. Wong C.L., Yong C.Y., Ong Н.K., Но K.L., Tan W.S. Advances in the Diagnosis of Foot-and-Mouth Disease // Front Vet Sci. - 2020 Aug 21. - V.7. - P. 477.
7. Curry S., Abu-Ghazaleh R., Blakemore W., Fry E., Jackson Т., King A., Lea S., Logan D., Newman J., Stuart D. Crystallization and preliminary X-ray analysis of three serotypes of foot-and-mouth disease virus // J. Mol Biol. - 1992. - V. 228(4). - P. 1263-1268.
8. Fry E.E., Stuart D.I., Rowlands D.J. The structure of foot-and-mouth disease virus // Curr Top Microbiol Immunol - 2005. - V. 288. - P. 71-101.
9. Palmenberg A.C. Proteolytic processing of picornaviral polyprotein // Annu Rev Microbiol. - 1990. - V. 44. - P. 603-623.
0
10. Curry S., Fry E., Blakemore W., Abu-Ghazaleh R., Jackson Т., King A., Lea S., Newman J., Stuart D. Dissecting the roles of VP cleavage and RNA packaging in picornavirus capsid stabilization: the structure of empty capsids of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. - 1997. - V. 71(12). - P. 9743-9752.
11. Curry S.R. Zunszain P.A., Leatherbarrow R.J. Foot-and-mouth disease virus 3C protease: recent structural and functional insights into an antiviral target // Int J Biochem Cell Biol. - 2007. - V. 39(1). - P. 1-6.
12. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Kye S.J., Park J.Y., Song H.J. Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA // Vaccine. - 2007. - V. 25(20). - P. 4112-12.
13. Lewis S.A., Morgan D.O., Grubman M.J. Expression, processing, and assembly of foot-and-mouth disease virus capsid structures in heterologous systems: induction of a neutralizing antibody response in guinea pigs // J. Virol. - 1991. - V. 65(12). - P. 6572-6580.
14. Cao Y., Lu Z., Sun J., Bai X., Sun P., Bao H., Chen Y., Guo J., Li D., Liu X., Liu Z. Synthesis of empty capsid-like particles of Asia I foot-and-mouth disease virus in insect cells and their immunogenicity in guinea pigs // Vet. Microbiol. - 2009. - V. 137(1-2). - P. 10-17.
15. Hamblin C, Barnett I.T., Hedger R.S. A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA // J. Immunol. Methods. - 1986. - V. 93(1). - P. 115-121.
16. Grubman M.J., Moraes M.P., Diaz-San Segundo F., Pena L., de los Santos T. Evading the host immune response: how foot-and-mouth disease virus has become an effective pathogen // FEMS Immunol Med Microbiol. - 2008. - V. 53(1). - P. 8-17.
17. Ma L.N, Zhang J, Chen H.T, Zhou J.H, Ding Y.Z., Liu Y.S. An overview on ELISA techniques for FMD // Virol J. - 2011 Sep 4. - V. 8. - P. 419.
18. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K, Mahajan S, Matura R, Subramaniam S, Ranjan R, Biswal J, Rout M, Mohapatra J.K, Dash B.B, Sanyal A, Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India // World J Virology. - 2015. - V. 4(3). - P. 295-302.
19. GenBank. Foot-and-mouth disease virus - type О isolate SAU/5/2008 VPI gene, partial cds/ URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/2050239519 (Дата обращения: 05.01.2022).
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр
охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Federal Governmental Budgetary
Institution «Federal Centre for Animal Health» (FGBI «ARRIAH»)
<120> Тест-система на основе жидкофазного блокирующего непрямого
«сэндвич»-варианта ИФА для определения титра антител против вируса ящура
штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 генотипа O/ME-SA/PanAsia2
в сыворотках кровиживотных
<160>    2
<210>    1
<211>    636
<212>    РНК
<213>    вирус ящура
<400>    1
accaccgcca ccggggaatc agcagaccct gtcacaacca ccgttgagaa ctacggtggc  60
gagacacaag tacagcggcg ttaccacacc gacgtcggct tcttaatgga caggttcgtg 120
cagatcaagc ctgtgggccc cacacatgtc attgacctca tgcagacaca ccaacacggg 180
ctggtgggcg ccatgttgcg cgcggccacc tactactttt ctgatcttga gattgtggtg 240
aaccacacgg gtaacctaac gtgggtaccc aatggagcac ccgaggcagc actgcaaaac 300
acgagcaacc ccactgctta ccacaaagcg ccgttcacga ggcttgcgct cccctacacc 360
gcgccacacc gcgtgctggc aactgtgtac agtgggacga gcaagtactc cgcacctcaa 420
aaccggcgag gtgacttggg tcctctcgcg gcgagactcg ctgcacagct ccctgcctcc 480
ttcaacttcg gtgcaattcg ggccacggag atctgcgaac tccttgtgcg catgaagcgc 540
gccgagctct actgccccag gccactgttg gcggtggagg tgtcgtcgca agacagacac 600
aagcagaaaa tcattgcccc tgcaaaacaa ctcctg                           636
<210>    2
<211>    213
<212>    ПРТ
<213>    вирус ящура
<400>    2
1     Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val   15
16    Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr   30
31    Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys   45
46    Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr   60
61    Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp   75
76    Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro   90
91    Asn Gly Ala Pro Glu Thr Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr   105
106   Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr   120
121   Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Ser Cys Lys   135
136   Tyr Gly Glu Ser His Thr Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val   150
151   Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr   165
166   Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met   180
181   Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile His   195
196   Pro Asp Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys   210
211   Gln Leu Leu                                                   213
<---