СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПОРИСТОГО МАТРИКСА
METHOD OF OBTAINING POROUS MATRIX

Изобретение предназначено для использования в биомедицине, клеточных технологиях, заместительной и восстановительной хирургии, в частности для изготовления матриксов-носителей, имплантируемых вместе с клетками в организм человека для восстановления функционирования пораженного органа.
Известно, что после имплантации клеточного материала, введенного в организм без матрикса-носителя, почти все клетки гибнут из-за отсутствия условий для их созревания и размножения. По этой причине создание имплантатов на основе матриксов-носителей является одной из ключевых проблем в реализации технологий клеточной трансплантации.
Главными требованиями к матриксам-носителям должны быть их высокая биосовместимость и способность стимулировать собственные регенерационные процессы поврежденного органа. Конструирование матриксов-носителей на основе объемных пористых материалов из биодеградируемых полимеров, характеризующихся высокой биологической безопасностью, а также возможностью регулировать время биорезорбции имплантата, является одним из новейших направлений в биотехнологии. Разработка полимерных носителей для внедряемых лекарственных препаратов и клеточных культур в виде трехмерных (губки, пространственные сетки) тонкоструктурированных полимерных матриксов составляет ключевую проблему для имплантационных хирургических материалов. К ним можно отнести, например, «ЭластоПОБ, разработанный АНО «ИМБИИТ» (Марковцева М.Г., Немец Е.А., Севастьянов В.И. Пористые трехмерные носители для культивирования и трансплантации клеток на основе сополимера гидроксибутирата с гидроксивалератом. Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2006, №4, с.83-88; Потапов И.В., Ильинский И.М., Куренкова Л.Г., Севастьянов В.И., Егорова В.А., Зайденов В.А., Расулов М.Ф., Онищенко Н.А., Пленочные системы ЭластоПОБ с иммобилизованными стромальными клетками костного мозга оптимизируют условия регенерации поврежденных тканей. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2005, №3, с.151-15; Севастьянов В.И., Егорова В.А., Немец Е.А., Перова Н.В., Онищенко Н.А. Биодеградируемый материал ЭластоПОБ для клеточной трансплантации. Перспективные материалы. 2004, №3, с.35-41).
Матрикс - двумерная или трехмерная хаотическая сетка заданной структуры и размеров, состоящая из волокон полимерного биосовместимого материала. Базовые виды матриксов:
- двумерная хаотическая сетка, свободнонесущая или армированная нитями из биосовместимых полимеров. Размеры матрикса от 10 до 100 мм, толщина - от 50 до 500 мкм, размер микропор 0,5-5 мкм, диаметр перфораций - от 0,2 до 2 мм.
- трехмерная хаотическая сетка из биосовместимых полимеров с пористостью не менее 95%, размером макропор порядка 300±100 мкм, размером микропор 0,5-5 мкм; диаметр матриксов ~10 мм, толщина ~2-5 мм.
Конкретная область применения имплантата на основе трехмерных матриксов - тканевая и клеточная инженерия жизненно важных органов (печень, поджелудочная и щитовидная железа, почки), центральной и периферической нервной системы в качестве биодеградируемого имплантируемого носителя, временного каркаса и питательной среды для клеток различной природы. Медицинское применение разрабатываемых имплантатов: общая хирургия, сердечно-сосудистая хирургия, травматология и ортопедия, нейрохирургия, пластическая хирургия, клеточные технологии, имплантируемые системы доставки биологически активных веществ, лекарств. Известны различные подходы к созданию гетерогенных сред с высокой степенью пористости (80-90%) из биосовместимых полимеров, в том числе: лиофилизация, высаливание, газовое вспенивание, электроспиннинг. Они дают в результате разные структуры пористых сред (Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. «Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины», Новосибирск, Издательство СО РАН, 2003. - 330 с.; Matsusaki М., Yoshida H., Akashi M., The construction of 3D-engineered tissues composed of cells and extracellular matrices by hydrogel template approach. Biomaterials. 2007 Jun; 28(17):2729-37, Epub. 2007 Feb. 21).
В нашей разработке мы исходим из того, что для успешного функционирования имплантат, созданный на основе матрикса в виде трехмерной сетки, должен состоять из системы взаимосвязанных ячеек разного размера, то есть иметь бимодальную односвязную структуру. Ячейки с диаметром, многократно превышающим размеры имплантируемых клеток, необходимы для их инфильтрации в объем матрикса. Наличие системы ячеек меньшего, микро- и нанометрового размера необходимо для подвода питательных веществ и выведения продуктов жизнедеятельности клеток. С целью управления размерами ячеек, их количеством и распределением по объему матрикса нами разработан способ приготовления биомедицинских матриксов. Он является развитием метода лиофилизации.
Известен способ изготовления пористого матрикса (С.Ф.Медовщиков, С.Л.Недосеев. Способ изготовления лайнера для инерциального термоядерного синтеза. Патент РФ №2075115 от 10.03.1997), при котором полимерный материал, (поливиниловый спирт (ПВС) или агар-агар), растворяют в растворителе, воде, с получением геля, затем из него приготавливают заготовку заданных размеров путем намораживания геля на матрицу, предварительно охлажденную до - (35÷40)°C. Замороженные заготовки, снятые с формы-матрицы, подвергают сублимационной сушке без изменения формы заготовки (лиофилизация), при которой лед полностью удаляется. При этом тонкая сетчатая структура мицелл агар-агара в геле, зафиксированная при замораживании геля, сохраняется. Сушка проводится в вакуумной камере при комнатной температуре ее стенок. Вакуумирование осуществляется до остаточного давления ~0,01 Торр. При вакуумировании сублимация льда приводит к самоохлаждению заготовки до температуры ниже температуры плавления льда, так что заготовка остается твердой и не меняет форму и тонкую структуру в течение всего времени сушки.
-3
Структура данного полимерного матрикса представляла собой трехмерную хаотическую сетку, например, из агар-агаровых нитей с характерным размером ячейки 10-30 мкм при толщине нитей порядка 1-3 мкм, усредненная плотность среды от 1 мг/см и более. Пористость - до 99%. Изделия имели цилиндрическую форму с радиусом 0,5-11 мм при погонной массе от 50 мкг/см и более. Изделия предназначены для использования в термоядерных исследованиях, для чего в них вводились излучающие добавки. Данный полимерный матрикс не предназначен для использования в биомедицине.
Недостатком способа является использование агар-агара в качестве полимера, формирующего структуру матрикса. Агар-агар - полисахарид, растворимый в воде, и поэтому он не может служить материалом для матрикса, имплантируемого в живую среду.
За прототип выбран патент РФ №2301677 от 27.06.2007, в котором описан способ получения биотрансплантата для лечения дегенеративных и травматических заболеваний хрящевой ткани, заключающийся в том, что гели хитозана и добавки смешивают и в полученный носитель вносят суспензию клеточной культуры.
Материалом для нашего биоматрикса выбран полиоксибутират - полиоксивалерат, (ПОБ/ПОВ) - биорезорбируемый полимер, нерастворимый в воде. Он растворяется с образованием гелей в жидкостях, имеющих низкую температуру замерзания, например дихлорэтан (-36,6°С), хлороформ (-63,5°С) и т.д. Изготовление и сублимационная сушка изделий из таких гелей технологически сложны. Поддержание твердого состояния таких гелей самоохлаждением при вакуумной откачке невозможно. Для лиофильной сублимационной сушки изделий из них требуются специальные холодильные установки с отрицательной температурой ниже -40°С, что усложняет и удорожает технологию.
Техническим результатом, на который направлено изобретение, является изготовление полимерного матрикса с бимодальной структурой односвязных пор для биомедицины и клеточных технологий и упрощение и удешевление технологии за счет отказа от низкой температуры проведения вакуумной сублимационной сушки.
Для этого предложен способ изготовления полимерного матрикса для использования в биомедицине, заключающийся в том, что приготавливают раствор полимерного вещества - полиоксибутират - полиоксивалерата (ПОБ/ПОВ) в растворителе - дихлорэтане, после чего в раствор вводят ледяную уксусную кислоту при следующем соотношении компонентов, г: ПОБ/ПОВ - 1-2, дихлорэтан - 10-12, ледяная уксусная кислота - 10-15, замораживают полученный раствор и подвергают сублимационной сушке полученную заготовку матрикса в вакуумной камере.
При этом замораживание раствора производят при температуре минус (25-30)°С.
Замораживание раствора и сублимационную сушку заготовки матрикса проводят на подложке, выполненной из фторопластовой пленки и пластины из водяного льда.
Кроме того, толщина пластины из водяного льда выбрана из условия ее полной сублимации при сушке в вакуумной камере.
Сублимационную сушку заготовки матрикса на подложке проводят на сетке из пластиковых нитей.
При этом выбирают начальное давление в вакуумной камере не меньше 100 Торр.
После испарения дихлоэртана из заготовки матрикса давление в вакуумной камере снижают до ~0,01 Торр.
На фигуре 1 и 2 показаны структура заготовки после заморозки и в начале сублимационной вакуумной сушки соответственно, где 1 -форма из алюминиевой фольги, 2 - пластина из водяного льда, 3 - фторопластовая пленка, 4 - рабочий раствор из «ПОБ/ПОВ + дихлорэтан+уксусная кислота». 5 - сетка из пластиковых нитей.
На фигуре 3 показано готовое изделие - матрикс из ПОБ/ПОВ, полученный заявленным способом
На фигуре 4 показана микроструктура матрикса из ПОБ/ПОВ, показанного на фиг.3.
Технологическим решением проблемы является применение гелеобразующего растворителя с низкой температурой замерзания и дополнительной жидкости, которая имеет высокую температуру затвердевания. Например, возможна комбинация дихлорэтана и ледяной уксусной кислоты, температура затвердевания которой равна + 16,6°С.
Предлагаемый способ основан на применении этой комбинации жидкостей для растворения ПОБ/ПОВ, замораживания раствора в форме и его сублимационной сушки с самоохлаждением при комнатной температуре стенок вакуумной камеры. Дополнительно, в качестве охлаждающей подложки, при сублимационной сушке используется водяной лед. Способ осуществляется следующим образом.
пл
Навеска из биополимера ПОБ/ПОВ растворяется в дихлорэтане в соотношении 1-2 г биополимера ×10 г дихлорэтана. При этом образуется гелеобразный раствор. В полученный раствор добавляется ледяная уксусная кислота СН3СООН, в количестве 10-20 г. Добавление уксусной кислоты производится при температуре, превышающей температуру плавления ледяной уксусной кислоты (t=16,64°С). Вязкость раствора при этом существенно уменьшается. Приготовленный рабочий раствор хранится в герметичной посуде для предотвращения испарения дихлорэтана. Количество рабочего раствора определяется объемом будущего плоского матрикса при его толщине в диапазоне 3-6 мм. Толщина задается требованием потребителя.
Из дистиллированной воды замораживанием приготавливается пластина из водяного льда 2, у которой форма и площадь соответствуют форме и площади будущего матрикса. Толщина пластины 3-5 мм. Она определяется из условия удобства обращения с пластиной, не допускающего ее механического повреждения. Ледяная пластина приготавливается в заранее приготовленной заливочной форме из алюминиевой фольги 1. На ледяную пластину 2 в алюминиевой форме 1 укладывается фторопластовая пленка 3, закрывающей с перекрытием всю ее поверхность. Затем в форму 1, поверх фторопластовой пленки 3, заливается рабочий раствор 4 «ПОБ/ПОВ + дихлорэтан + уксусная кислота» для получения заготовки матрикса. Не допуская плавления пластины из водяного льда 2, заготовку помещают в холодную (морозильную) камеру с температурой в диапазоне -(25-30)°С, где ее выдерживают до затвердевания рабочего раствора. Рабочий раствор «ПОБ/ПОВ + дихлорэтан + уксусная кислота» не имеет строгой температуры замерзания. Жесткость замороженной заготовки определяется механическими свойствами ледяной пластины. По затвердевании рабочего раствора заготовку освобождают от формы из алюминиевой фольги и, не допуская плавления заготовки, помещают ее в вакуумную камеру на редкую сетку из тонких полимерных нитей 5. Сетка из тонких полимерных нитей не допускает притока тепла от внутрикамерных элементов и не препятствует сублимации льда. Схема размещения заготовки при сублимационной вакуумной сушке показана на фигуре 2.
Вакуумирование ведется при комнатной температуре стенок вакуумной камеры. Низкая температура затвердевшего рабочего раствора и водяного льда обеспечивается их самоохлаждением в процессе вакуумной сублимации.
Процесс вакуумирования камеры ведется по программе, определяющей соотношение количества крупноразмерных и микроразмерных пор в заготовке матрикса. Сначала регулированием скорости откачки устанавливается давление ~100 Торр, визуально контролируется процесс испарения дихлорэтана из заготовки по появлению мелких пузырьков на поверхности заготовки. По прекращении выделения пузырьков - прекращении испарения дихлорэтана - давление в вакуумной камере снижают до ~ 0,01 Торр.
Необходимость управления вакуумированием определяется следующими обстоятельствами. Прочность затвердевшего рабочего раствора определяется остовом из кристаллов ледяной уксусной кислоты, между которыми расположен гель «ПОБ/ПОВ + дихлорэтан». Кристаллы ледяной уксусной кислоты и мицеллы геля взаимодействуют друг с другом, определяя грубую и тонкую структуру пор будущего матрикса. При вакуумировании прежде всего начинает испаряться жидкая фаза, основу которой составляет дихлорэтан. С одной стороны, молекулы дихлорэтана могут напрямую диффундировать к поверхности заготовки и выходить в вакуум. С другой стороны, внутри каркаса из уксусной кислоты могут образовываться относительно крупные капли геля, определяющие, при их испарении в вакуум, образование крупных пор в матриксе. Сублимационное охлаждение ледяной подложки позволяет в некоторой степени снизить интенсивность этого процесса и обеспечить управление им путем подбора степени разрежения в вакуумной камере. В этот период сублимационной сушки разрежение в камере составляет от 100 до 10 Торр. Оно регулируется размером откачного отверстия вакуумного шибера.
По окончании испарения легколетучей фазы затвердевшего рабочего раствора, содержащей в основном дихлорэтан, начинает испаряться жесткий остов твердой ледяной уксусной кислоты, к которым теперь связаны мицеллы - нити ПОБ/ПОВ. Оба этих вещества имеют положительные температуры плавления, поэтому надобность в принудительном охлаждении заготовки сублимацией водяного льда отпадает. Исходя из этого условия определяется начальная толщина ледяной подложки. На этой фазе вакуум в камере достигает значения, предельного для механического форвакуумного насоса (~0,01 Торр). Длительность этой фазы 2-4 часа. Критерием завершения сушки является равенство массы полученного пористого продукта начальной массе ПОБ/ПОВ, введенного в раствор. В ходе второй фазы сублимационной сушки происходит некоторая усадка заготовки.
Дальнейшая работа над заготовкой сводится к ее механической обработке: резке на куски заданного размера и формы, обработке поверхностей для получения необходимой поверхностной структуры. Фотография одного из вариантов матрикса, полученного заявляемым способом, и микрофотографии его тонкой внутренней структуры показаны на фигурах 3 и 4.
Таким образом, данным способом возможно получать полимерные матриксы заданной структуры и формы, которые в силу их дешевой технологии изготовления найдут применение в медицине.