ПРИМЕНЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ 3,5-ВТОР-4-НОРХОЛЕСТАНА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА - ЦИТОПРОТЕКТОРА
APPLICATION OF 3,5 - SECO-4-NORCHOLESTAN DERIVATIVES FOR OBTAINING MEDICATION-CYTOPROTECTOR

Настоящее изобретение относится к применению производных 3,5-втор-4-норхолестана для получения лекарственного средства-цитопротектора, за исключением лекарственного средства-нейропротектора.
Клеточные дегенеративные процессы характеризуются дисфункцией клеток, часто вызывающей нежелательную клеточную активность и клеточную смерть.
Клетки развили адаптационные механизмы в ответ на стресс, которые продлевают их жизнь или замедляют или препятствуют клеточной смерти (цитопротекторные механизмы).
Однако эти цитопротекторные механизмы иногда бывают недостаточными, неадекватными или запускаются слишком поздно, чтобы быть эффективными, и клетки гибнут. Таким образом, существует потребность в новых лекарственных средствах-цитопротекторах, которые способствуют цитопротекторному действию. В этом заключается одна из целей настоящего изобретения.
Термин «цитопротектор» обозначает способность веществ, природных или нет, защищать клетку от клеточной смерти, в частности, от патологической клеточной смерти, и/или от клеточных дисфункций, ведущих к клеточной смерти. Эти клеточные дисфункции могут, например, иметь митохондриальное происхождение, такие как снижение способности генерировать АТР, неспособность захватывать и/или удерживать кальций или образование свободных радикалов.
Из основных механизмов клеточной смерти различают главным образом некроз, апоптоз и некроптоз.
Некроз - это клеточная смерть, называемая «случайной», которая происходит в процессе повреждения тканей. Больше всего затрагивается плазменная мембрана клетки, вызывая изменение гомеостаза клетки. Клетки наполняются водой настолько, что это вызывает лизис их плазменной мембраны. Этот клеточный лизис приводит к изливанию в окружающую среду цитоплазменного содержимого. Некроз лежит в основе воспалительного процесса.
Некроз может поражать группу клеток или ткань, тогда как другие соседние части остаются живыми. Происходящая в результате трансформация является умерщвлением клеток или тканей.
Иными словами, некроз определяется морфологическими изменениями, происходящими, когда жизнь клетки подходит к концу вследствие событий, таких как тяжелая травма, например, остановка или уменьшение кровообращения в органе, гипертермия (значительное повышение температуры), интоксикация химическим продуктом, физический стресс и т.д. Один из наиболее известных видов некроза - это некроз миокарда при инфаркте (прекращение кровоснабжения сердечной мышцы), связанный с облитерацией (закупоркой) коронарной артерии.
Апоптоз является неотъемлемой частью нормальной физиологии организма. Это физиологическая форма клеточной смерти с высокой регуляцией и она необходима для выживания многоклеточных организмов. Апоптоз - это процесс, который играет главную роль в эмбриогенезе.
Клетки в апоптозе или апоптотические клетки изолируются от других клеток. В апоптозе участвуют обычно индивидуальные клетки ткани и он не вызывает воспаления. Одной из характерных морфологических фаз апоптоза является значительное одновременное уплотнение ядра и цитоплазмы, что индуцирует существенное уменьшение клеточного объема. Далее, ядро распадается на фрагменты, каждый фрагмент окружен двойной оболочкой. Апоптотические тела (цитоплазменные и ядерные элементы) затем высвобождаются и абсорбируются фагоцитами соседних клеток.
Апоптоз может быть вызван разными причинами. Например, облучение, присутствие химического соединения или гормона являются стимулами, способными вызвать каскад апоптотических событий в клетке. Внутриклеточные сигналы, такие как неполный митоз или повреждение ДНК, могут также вызвать апоптоз.
Апоптоз происходит также при генотоксическом воздействии или во время болезни. Некоторые патологии характеризуются анормальным апоптозом, приводящим к потере некоторых клеточных популяций, как, например, гепатотоксичность, ретинопатия, кардиотоксичность.
Таким образом, различают физиологический апоптоз и патологический апоптоз. Изобретение относится главным образом к патологическому апоптозу.
Существуют другие механизмы клеточной смерти, например некроптоз, который имеет характеристики некроза и апоптоза. Гибнущая от некроптоза клетка имеет признаки, подобные признакам клетки, гибнущей от некроза, но биохимические фазы этого механизма больше подобны фазам апоптоза. Этот механизм клеточной смерти имеет место, например, при ишемии.
Таким образом, одной из целей настоящего изобретения являются новые лекарственные средства, которые позволили бы предупредить и/или лечить некроз, и/или патологический апоптоз, и/или некроптоз (противонекротические, и/или противоапоптотические, и/или противонекроптотические лекарственные средства).
Клеточные дегенеративные процессы могут, кроме того, являться следствием патологических ситуаций, которые охватывает термин болезни или дегенеративных нарушений, травм или воздействия различных факторов.
К этим травмам или факторам можно отнести воздействие излучения (УФ, гамма), гипоксию или отсутствие кислорода, недостаток питания, отсутствие факторов роста, яды, клеточные токсины, отходы, токсины, содержащиеся в окружающей среде, свободные радикалы, реактивный кислород или некоторые другие события и/или медицинские процедуры, например хирургические вмешательства, включающие в себя трансплантацию клеток, тканей или органов. Можно также назвать химические или биологические агенты, используемые в качестве терапевтических средств в контексте медицинского лечения, например цитостатические средства или противовоспалительные средства.
Целью изобретения является не устранение внеклеточных причин патологий или дегенеративных процессов, которые могут привести к клеточной смерти, а устранение последствий на клеточном уровне указанных патологических процессов или указанных патологий и, в частности, защита клетки от указанных последствий.
Из наиболее значительных патологических ситуаций, характеризующихся дегенеративным процессом, кроме неврологических или нейродегенеративных заболеваний, к которым настоящее изобретение не относится, можно назвать:
заболевания костей, суставов, соединительных тканей и хрящей, такие как остеопороз, остеомиелит, артриты, из которых можно назвать, например, остеоартрит, ревматоидный артрит и псориатический артрит, аваскулярный некроз, оссифицирующий прогрессирующий миозит, рахит, синдром Кушинга;
мышечные заболевания, такие как мышечная дистрофия, например мышечная дистрофия Дюшенна, миотоническая дистрофия, миопатии и миастении;
кожные заболевания, такие как дерматиты, экзема, псориаз, старение или ухудшение рубцевания;
сердечно-сосудистые заболевания, такие как сердечная и/или сосудистая ишемия, инфаркт миокарда, ишемическая кардиопатия, хроническая или острая сердечная недостаточность, сердечная аритмия, фибрилляция предсердий, фибрилляция желудочков сердца, пароксизмальная тахикардия, сердечная недостаточность, аноксия, гипоксия, побочное действие, связанное с проведением терапии противораковыми средствами, заболевания системы кровообращения, такие как атеросклероз, склероз артерий и заболевания периферических сосудов, нарушение мозгового кровообращения, аневризм;
гематологические и сосудистые заболевания, такие как анемия, сосудистый амилоидоз, кровотечения, дрепаноцитоз, синдром фрагментации эритроцитов, нейропения, лейкопения, аплазия костного мозга, панцитопения, тромбоцитопения, гемофилия;
заболевания легких, включая пневмонию, астму; обструктивные хронические заболевания легких, как, например, хронические бронхиты и эмфизема;
заболевания желудочно-кишечного тракта, такие как язва;
заболевания печени, как, например, гепатиты, в частности, гепатиты вирусного происхождения или имеющие в качестве причины другие инфекционные возбудители, аутоиммунные гепатиты, молниеносный гепатит, некоторые наследственные нарушения метаболизма, болезнь Вильсона, цирроз, неалкогольный гликогеноз, заболевания печени, вызванные токсинами и лекарственными средствами;
заболевания поджелудочной железы, как например, острые или хронические панкреатиты;
нарушения обмена веществ, такие как сахарный и несахарный диабет, тироидиты;
болезни почек, такие, например, как острые почечные нарушения или гломерулонефрит;
вирусные и бактериальные инфекции, такие как септицемия;
тяжелые интоксикации химическими веществами, токсинами или лекарственными средствами;
дегенеративные заболевания, связанные с синдромом приобретенного иммунодифицита (СПИД);
нарушения, связанные со старением, такие как синдром ускоренного старения;
воспалительные заболевания, такие как болезнь Крона, ревматоидный полиартрит;
аутоимунные заболевания, такие как красная волчанка;
стоматологические заболевания, такие как заболевания, вызывающие разрушение тканей, например, периодонтиты;
офтальмологические болезни или нарушения, включая диабетическую ретинопатию, глаукому, макулярную дегенерацию, ретинальную дегенерацию, пигментный ретинит, отверстия или разрыв сетчатки, отслоение сетчатки, ретинальную ишемию, острую травматическую ретинопатию, воспалительную дегенерацию, послеоперационные осложнения, медикаментозную ретинопатию, катаракту;
болезни органов слуха, такие как отосклероз и глухота, вызванная антибиотиками;
болезни, связанные с митохондриями (митохондриальные патологии), такие как спинальная атаксия Фридрейха, врожденная мышечная дистрофия со структурной митохондриальной аномалией, некоторые виды миопатии (синдром MELAS, синдром MERFF, синдром Пирсона), синдром MIDD (митохондриальный диабет и глухота), синдром Вольфрама, дистония.
Изобретение также относится к защите клеток тканей и/или трансплантированных органов как перед, так и во время (взятие, транспортировка и/или реимплантация) или после трансплантации.
Постоянно ведется поиск фармакологических активных соединений для борьбы с дегенеративными процессами, упомянутыми выше.
Настоящее изобретение отвечает этой потребности в цитопротекторных соединениях. Заявителем было обнаружено, что производные 3,5-втор-4-норхолестана, в частности 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола и один из его сложных эфиров, обладают замечательными цитопротекторными свойствами.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является применение по меньшей мере одного соединения формулы I
в которой
- Х и Y вместе обозначают кетогруппу (=О), оксимную группу (=NOH) или метилоксимную группу (=NНOМе) или Х обозначает гидроксил и Y обозначает атом водорода,
- В обозначает гидроксильный радикал и С и D, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал алкил, линейный или разветвленный, содержащий от 1 до 4 атомов углерода,
или В и С вместе обозначают кетогруппу и радикал D обозначает метил, гидроксил или метиламин,
или В и С обозначают атом водорода и радикал D обозначает метиламин,
или В и С вместе обозначают оксимную группу и радикал D обозначает метил,
и R обозначает радикал алкил, линейный или разветвленный, содержащий от 1 до 10 атомов углерода,
или одной из его солей присоединения фармацевтически приемлемой кислоты, или одного из его сложных эфиров или одной из солей присоединения фармацевтически приемлемой кислоты указанных сложных эфиров,
для получения лекарственного средства-цитопротектора, за исключением нейропротектора.
Согласно изобретению соли присоединений фармацевтически приемлемой кислоты могут, например, представлять собой соли, образованные с кислотами: соляной, бромистоводородной, азотной, серной, фосфорной, уксусной, муравьиной, пропионовой, бензойной, малеиновой, фумаровой, янтарной, винной, лимонной, щавелевой, глиоксалевой, аспарагиновой, алкансульфоновых, таких как кислоты метансульфоновые или этансульфоновые, арилсульфоновые, такие как бензолсульфоновые или пара-толуолсульфоновые, или карбоновые.
Согласно изобретению оксимная группа представляет собой син- и анти-изомеры, чистые или в смеси, связанные в направлении связи N-О по отношению к двойной связи С=N.
В соответствии с частной формой изобретения радикал R пригодных соединений формулы I предпочтительно является радикалом холестана формулы II
В соответствии с другими частными формами изобретения предпочтительно используются соединения формулы I, в которых Х и Y вместе обозначают кетогруппу или обозначают оксимную группу.
В соответствии с другими частными формами изобретения предпочтительно используются соединения формулы I, в которых В обозначает гидроксильный радикал и С и D, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал алкил, линейный или разветвленный, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или в которых В и С вместе обозначают кетогруппу и D обозначает радикал метил.
Особенно предпочтительно по изобретению используется по меньшей мере одно соединение формулы I, выбранное из
3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола,
3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-метилового спирта, или
3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-диметилового спирта,
или одной из его солей присоединения фармацевтически приемлемой кислоты, или одного из его сложных эфиров или одной из солей присоединений фармацевтически приемлемой кислоты указанных сложных эфиров.
Представляющие интерес цитопротекторные свойства соединений формулы I определяют их использование для получения лекарственного средства-цитопротектора, более конкретно предназначенного для лечения или предупреждения некроза, и/или апоптоза, и/или некроптоза (противонекротические, и/или противоапоптотические, и/или противонекроптотические лекарственные средства), или заболеваний, таких как:
заболевания костей, суставов, соединительных тканей и хрящей,
мышечные заболевания,
кожные заболевания,
сердечно-сосудистые заболевания,
заболевания системы кровообращения,
гематологические и сосудистые заболевания,
легочные заболевания,
заболевания желудочно-кишечного тракта,
болезни печени,
заболевания поджелудочной железы,
нарушения обмена веществ,
болезни почек,
вирусные и бактериальные инфекции,
тяжелые интоксикации,
дегенеративные заболевания, связанные с синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД);
нарушения, связанные со старением,
воспалительные заболевания,
аутоиммунные заболевания,
стоматологические заболевания,
офтальмологические болезни или нарушения,
болезни органов слуха,
болезни, связанные с митохондриями (митохондриальные патологии).
Изобретение также относится к защите клеток, тканей или трансплантированных органов как до, так и во время (взятие, транспортировка и/или реимплантация) или после трансплантации.
Преимущественно, соединения формулы I можно использовать для получения лекарственного средства, предназначенного для защиты клеток сердца (кардиопротектор), для защиты клеток печени (гепатопротектор) или лекарственного средства, предназначенного для лечения или предотвращения заболеваний, связанных с митохондриями.
В соответствии с изобретением, соединение формулы I предпочтительно присутствует в лекарственном средстве-цитопротекторе в физиологически эффективных дозах: указанные лекарственные средства содержат, в частности, эффективную цитопротекторную дозу по меньшей мере одного из соединений формулы I.
В качестве лекарственного средства соединения формулы I, их сложные эфиры, их соли присоединения фармацевтически приемлемых кислот, а также соли присоединения фармацевтически приемлемых кислот указанных сложных эфиров могут входить в состав лекарственных форм для введения через пищеварительный тракт или парентеральным путем.
Лекарственные средства по изобретению могут дополнительно содержать по меньшей мере один другой терапевтически активный ингредиент, независимо от того, обладает ли он активностью в отношении той же самой или другой патологии, для одновременного, раздельного или распределенного во времени применения, в частности, при лечении пациента с одной из указанных выше патологий.
В соответствии с изобретением, соединение формулы I можно использовать в лекарственном средстве в смеси с одним или несколькими инертными эксципиентами или наполнителями, т.е. фармацевтически неактивными и нетоксичными. В качестве примера можно назвать солевые, физиологические, изотонические, буферные растворы и т.д., пригодные для фармацевтического применения и известные специалисту. Композиции могут содержать один или несколько агентов или наполнителей, выбранных из диспергаторов, растворителей, стабилизаторов, консервантов и т.д. Агентами или наполнителями, пригодными для использования в составах (жидких, и/или для инъекций, и/или твердых), являются, в частности, метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, циклодекстрины, полисорбат 80, маннит, желатин, лактоза, растительные или животные масла, камедь и т.д. Композициям может быть придана форма суспензий для инъекций, гелей, масел, таблеток, суппозиториев, порошков, желатиновых капсул, капсул и т.д., возможно при помощи галеновых форм или устройств, обеспечивающих длительное и/или замедленное высвобождение. Для этого вида составов преимущественно используют такой агент, как целлюлозу, карбонаты или крахмалы.
Введение можно осуществлять любым известным специалисту способом, предпочтительно перорально или путем инъекции, обычно внутрибрюшным, интрацеребральным, межоболочечным, внутривенным, интраартериальным или внутримышечным путем. Предпочтительным является пероральное введение. При длительном лечении предпочтительным является сублингвальное, пероральное или чрескожное введение.
Для инъекций соединения обычно находятся в форме жидких суспензий, которые можно вводить при помощи шприцов или путем перфузий, например. Конечно, расход и/или инъецированная доза или вводимая доза могут подбираться специалистом в зависимости от пациента, патологии, способа введения и т.д. Разумеется, повторные введения могут проводиться в сочетании с другими активными ингредиентами и/или любым наполнителем, приемлемым в фармацевтическом плане (буферные растворы, растворы солевые, изотонические, в присутствии стабилизаторов и т.д.).
Изобретение пригодно для млекопитающих, более конкретно для человека.
Главным образом, суточная доза соединения является минимальной дозой для достижения требуемого терапевтического эффекта. Дозы соединений, описанных выше, и, например, 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола составляют главным образом от 0,001 до 100 мг на кг в день для человека.
В случае необходимости, суточная доза может вводиться в два, три, четыре, пять, шесть и более приемов в день или в виде нескольких полудоз, вводимых с соответствующими интервалами в течение дня.
Выбранное количество будет зависеть от многих факторов, в частности, от способа введения, продолжительности введения, момента введения, скорости вывода соединения, от одного или нескольких веществ, используемых в комбинации с соединением, от возраста, веса и физического состояния пациента, а также от его анамнеза и от любых других данных, известных в медицине.
Назначение лечащего врача может начинаться с доз, которые меньше, чем те, которые обычно применяются, затем эти дозы постепенно повышаются с тем, чтобы лучше контролировать появление возможных побочных эффектов.
Композиции по изобретению, в частности фармацевтические композиции или лекарственные средства, могут содержать по меньшей мере одно соединение формулы I, такое как описано выше, или одну из его солей присоединения фармацевтически приемлемой кислоты, или один из его сложных эфиров или одну из его солей присоединения фармацевтически приемлемой кислоты указанных сложных эфиров.
Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать дополнительно по меньшей мере один терапевтический активный ингредиент для одновременного, раздельного или распределенного во времени применения, более конкретно, при лечении пациентов, страдающих одной из указанных выше патологий.
Фармацевтические композиции по изобретению могут преимущественно содержать один или несколько эксципиентов или инертных наполнителей, т.е. фармацевтически неактивных и нетоксичных.
Соединения формулы I, используемые по изобретению, можно синтезировать путем взаимодействия соединения формулы III
в которой R имеет значения, указанные выше, которое подвергают взаимодействию
или
с метиламином, затем гидроксиламином для получения соединения формулы I, в которой R имеет значения, указанные выше, Х и Y обозначают вместе оксимную группу, В обозначает вместе с С кетогруппу и D обозначает метиламинную группу,
или
метилирования до получения соединения формулы IV
в которой R имеет значения, указанные выше, которое подвергают действию защитного агента кетонной группы в положении 5 для получения соединения формулы V
в которой R имеет значения, указанные выше, которое,
или
вводят во взаимодействие с метиллитием, затем подвергают действию агента для снятия защиты с кетонной группы в положении 5, затем вводят во взаимодействие с гидроксиламином для получения соединения формулы I, в которой R имеет значения, указанные выше, Х и Y обозначают вместе оксимную группу, В обозначает гидроксильную группу и С и D обозначают линейные или разветвленные алкильные радикалы с 1-4 атомами углерода,
или
3
3
омыляют, затем подвергают взаимодействию с соединением формулы HC-NH-OCH, затем проводят взаимодействие с метиллитием для получения соединения формулы VI
в котором восстанавливают кетонную группу, затем подвергают действию агента для снятия защиты с кетонной группы в положении 5, затем подвергают взаимодействию с гидроксиламином для получения соединения формулы I, в которой R имеет значения, указанные выше, Х и Y обозначают вместе оксимную группу, В обозначает гидроксильную группу и С обозначает линейный или разветвленный алкильный радикал с 1-4 атомами углерода, возможно замещенный, и D обозначает атом водорода,
или
восстанавливают до получения соединения формулы VII
в которой R имеет значения, указанные выше, В обозначает гидроксильную группу и С и D обозначают атом водорода, которое,
или
подвергают воздействию окислительного агента до получения соединения формулы VIII
в которой R имеет значения, указанные выше, из которого получают основание Шиффа, затем восстанавливают, после чего подвергают действию агента для снятия защиты с кетонной группы в положении 5, затем вводят во взаимодействие с гидроксиламином для получения соединения формулы I, в которой R имеет значения, указанные выше, Х и Y обозначают вместе оксимную группу, В обозначает метиламинную группу и С и D обозначают атом водорода,
или
подвергают действию агента для снятия защиты с кетонной группы в положении 5, затем вводят во взаимодействие с амином, выбранным из гидроксиламина, метилгидроксиламина и карбоксиметилгидроксиламина для получения соединения формулы I, в которой R имеет значения, указанные выше, Х и Y обозначают вместе соответственно оксимную, метилоксимную и карбоксиметилоксимную группу, В обозначает гидроксильную группу и С и D обозначают атом водорода,
и выделяют и, если требуется, превращают в соль соединения формулы I или этерифицируют их, выделяют их, затем, если требуется, превращают их в соль.
В предпочтительных условиях осуществления описанного выше способа
- взаимодействие соединения формулы III с метиламином проводят в присутствии связывающего вещества, активирующего кислотную группу, такую как ВОР (бензотриазол-1-илокси-три(диметиламин)фосфония гексафторфосфат) или TBTU (2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония тетрафторборат) преимущественно в присутствии основания, такого как N-метилморфолин, в частности, в пригодном растворителе, таком как дихлорметан или диметилформамид. Предпочтительно взаимодействие проводят в присутствии EDCI (1-этил-3(3'-диметиламинопропил)карбодиимид) в ассоциации с 4-диметиламинопиридином в дихлорметане, причем смесь взбалтывают при комнатной температуре в течение 24 часов. Далее продукт растворяют предпочтительно в пиридине, после чего добавляют от 5 до 7, в частности, 6 эквивалентов гидроксиламинхлоргидрата;
- метилирование соединения формулы III проводят путем взаимодействия с метанолом в присутствии тионилхлорида, предпочтительно растворяя кислоту формулы II в соответствующем объеме смеси, содержащей 70% метанола и 30% дихлорметана. Охлаждают до 0°С и вводят по каплям 3 эквивалента тионилхлорида. Перемешивают затем в течение 2 часов при комнатной температуре. В этом соединении защита кетонной группы осуществляется предпочтительно путем растворения продукта в избыточном количестве, например 10 эквивалентах триметилортоформата и достаточном объеме этиленгликоля с последующим добавлением безводной п-толуолсульфоновой кислоты;
- взаимодействие соединения формулы V с метиллитием предпочтительно проводят в безводном ТГФ, затем, после охлаждения примерно до -45°С, вводят по каплям избыточное количество метиллития. Снятие защиты с диоксолана, блокирующего кетонную группу в положении 5, проводят в ацетоне в присутствии серной кислоты. Предпочтительно, его проводят в диоксане в присутствии смеси вода/уксусная кислота 1/1. Оксим кетона преимущественно получают следующим образом:
3
3
- омыление соединения формулы V проводят при помощи едкого натра, предпочтительно в диоксане. Вводят, в частности, примерно 2 эквивалента водного раствора едкого натра. Этот продукт вводят во взаимодействие с соединением формулы HC-NH-OCH, например, в присутствии связующего вещества, активирующего кислотную группу, такую как ВОР или TBTU в присутствии основания, такого как N-метилморфолин в соответствующем растворителе, таком как дихлорметан или диметилформамид. Предпочтительно, его проводят в присутствии EDCI в ассоциации с гидроксибензотриазолом, добавляя по каплям триэтиламин в растворитель. Этот продукт вводят во взаимодействие с метиллитием в атмосфере аргона в соответствии с протоколом, описанным выше, затем кетонную группу в положении 3 восстанавливают борогидридом натрия. Полученный продукт затем подвергают снятию защиты с кетонной группы в положении 5 и вводят во взаимодействие с гидроксиламином в соответствии с протоколом, описанным выше;
- восстановление соединения формулы V для получения соединения формулы VII проводят предпочтительно при помощи гидрида алюминийлития, в частности, суспендируя его в тетрагидрофуране. Проводят гидролиз с осторожностью путем добавления раствора сульфата натрия;
- окисление соединения формулы VII проводят при помощи пиридиния хлорохромата. Из этого продукта получают основание Шиффа, которое мгновенно восстанавливается, в частности, путем растворения в атмосфере аргона, предпочтительно в этаноле в присутствии триэтиламина, метиламинхлоргидрата и тетраизопропоксида титана с последующим введением борогидрида натрия. Снятие защиты с кетонной группы в положении 5, а также взаимодействие с гидроксиламином проводят в описанных выше условиях.
Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящую заявку, не ограничивая ее.
ПРИМЕРЫ
Время удерживания выражено ниже в минутах и сотых минуты.
Метод жидкостной хроматографии, применяемый в отношении продуктов, в целом следующий:
Колонка: Macherey-Nagel-Nucleosil 300-6 C4 -150×4,6 мм
Градиент: вода (+0,05% трифторуксусная кислота)/ацетонитрил (+0,05% трифторуксусная кислота)
2
t=0 мин: 60% ацетонитрил, 40% НО
2
t=6 мин: 100% ацетонитрил, 0% НО
2
t=11 мин: 100% ацетонитрил, 0% НО
2
t=13 мин: 60% ацетонитрил, 40% НО
2
t=15 мин: 60% ацетонитрил, 40% НО.
Условия ионизации масс-спекрометрометра следующие:
температура источника: 250°С
напряжение конуса: 50 V
напряжение капиллярной трубки: 3kV
Rf lens: 0,3V
Пример 1: синтез 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиламида
2
2
Стадия А: сначала в колбу вводят 250 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-оевой кислоты, 38 мг метиламинхлоргидрата, 250 мг EDCl, 100 мг DMAP и 2,5 мл дихлорметана. Раствор перемешивают в течение 24 часов при комнатной температуре, затем реакционную среду разбавляют дихлорметаном и промывают 10%-ным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом магния, затем концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (СHCl/МеОH 95/5). Получают 176 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-метиламида с выходом 68%.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 4 мин 42 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=418; [2M+H]+=835
2
2
2
Стадия В: далее в колбу вводят 50 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-метиламида, 50 мг гидроксиламинхлоргидрата в 1 мл пиридина. Перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре, затем реакционную среду концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток обрабатывают смесью СHCl/НО; органическую фазу отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом магния, затем концентрируют при пониженном давлении. Получают 40,6 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиламида, выход 78%.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 3 мин 70 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=433; [2M+H]+=865
Пример 2: синтез 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-диметилового спирта
Стадия А: в колбе растворяют 10,5 г 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-оевой кислоты в 378 мл метанола и 146 мл дихлорметана. Охлаждают до 0°С и вводят по каплям 5,7 мл тионилхлорида. Затем перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Реакционную среду концентрируют при пониженном давлении, выпаривают совместно с толуолом, затем с дихлорметаном. Получают 10,3 г сложного 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-метилового эфира, выход 94%. Продукт используют как таковой без очистки.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 4 мин 69 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=419; [2M+H]+=785
Стадия В: в колбе растворяют 9,62 г сложного 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-метилового эфира в 25 мл триметилортоформата и 53 мл этиленгликоля. Затем вводят 400 г (2,3 моля) п-толуолсульфоновой кислоты, после чего перемешивают в течение 1 ночи при комнатной температуре. В реакционную среду вводят этилацетат; промывают 10% раствором гидрогенкарбоната натрия. Органическую фазу отделяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 9,95 г сложного 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-метилового эфира, выход 93%. Продукт используют как таковой без очистки.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 5 мин 76 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=463
Стадия С: в колбе растворяют 300 мг сложного 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-метилового эфира в 5 мл безводного ТГФ. Среду охлаждают до -45°С, затем вводят по каплям 1,36 мл раствора метиллития 1,6М в простом эфире. Перемешивают в течение 30 минут при -45°С. Вводят несколько капель метанола в реакционную среду и доводят до комнатной температуры. Обрабатывают в 20 мл простого диэтилового эфира и промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом магния, затем концентрируют при пониженном давлении. Получают 295 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-диметилового спирта (РМ=462), выход 98%.
Время удерживания: 5 мин 76 сотых
2
2
2
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M-(СНОН-СНОН+НО)+Н]+]=401
Стадия D: в колбу вводят 6 мл смеси вода/уксусная кислота 1/1 и 295 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-диметилового спирта, нагревают с обратным холодильником в течение 1 часа 30 мин. После охлаждения реакционную среду разбавляют этилацетатом, промывают насыщенным раствором натрия хлорида, затем насыщенным раствором бикарбоната натрия. Наконец, органическую фазу сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный неочищенный продукт очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат 8/2). Получают 180 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-диметилового спирта, выход 68%.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 5 мин 08 сотых
2
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=419; [M-НО+H]+=401, [2M+H]+=837
Пример 3: синтез 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-диметилового спирта
2
2
2
В колбу вводят 1 г соединения из примера 2, 1 г гидроксиламинхлоргидрата в 53 мл пиридина и несколько мл дихлорметана для растворения кетона. Перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре, затем реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток обрабатывают смесью СHCl/НО; органическую фазу отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 814 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-диметилового спирта, выход 78%.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 5 мин 09 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=434; [2M+H]+=867
Пример 4: синтез 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-метилового спирта
Стадия А: в колбу вводят 2 г 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-диметилового спирта в 26 мл диоксана. Добавляют 8,6 мл раствора едкого натра 1N. Реакционную среду нагревают с обратным холодильником в течение 1 часа 30 мин и диоксан выпаривают при пониженном давлении. Полученный раствор подкисляют путем введения раствора соляной кислоты 1N до получения рН 1 и экстрагируют 2 раза толуолом. Органические фазы объединяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 1,92 г 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-оевой кислоты с выходом 99%, которую используют без дополнительной обработки на следующей стадии.
2
2
2
2
2
Стадия В: в колбу 1,9 г 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-оевой кислоты вводят в 30 мл дихлорметана. В этот раствор вводят 1,06 г EDCI, 743 мг HOBT, 537 мг хлоргидрата N,O-диметилгидроксиламина, затем 1,37 мл триэтиламина по каплям. Перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. В реакционную среду вводят смесь СHCl/НО и экстрагируют 3 раза дихлорметаном. Органические фазы объединяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (СHCl/этилацетат 8/2). Получают 1,46 г 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3(N,N-метоксиметил)амида с выходом 70%.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 5 мин 31 сотая
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=492
Стадия С: в колбу в атмосфере аргона вводят 1,4 г 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3(N,N-метоксиметил)амида в 20 л безводного тетрагидрофурана и охлаждают до 0°С. Затем вводят по каплям 3,38 мл раствора метиллития 1,6М в простом эфире. Реакционную среду перемешивают в течение 3 часов 40 минут при 0°С, затем по каплям вводят раствор 0,72 мл концентрированной соляной кислоты в 7,28 мл воды. Тетрагидрофуран выпаривают при пониженном давлении; полученный водный раствор подщелачивают путем добавления едкого натра 1N до получения рН 10. Экстрагируют простым диэтиловым эфиром; органические фазы объединяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат 9/1). Получают 930 г 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-метилкетона с выходом 73%.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 5 мин 65 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=403
Стадия D: в колбу вводят 119 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-метилкетона со стадии С в 1,5 мл метанола. Охлаждают до 0°С и добавляют 10 мг натрия борогидрида. Реакционную среду перемешивают при 0°С в течение 1 часа, затем концентрируют при пониженном давлении. Остаток обрабатывают водой и экстрагируют дихлорметаном. Органическую фазу сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 94 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-метилового спирта с выходом 78%, этот продукт используют как таковой.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 5 мин 22 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=387
Стадия Е: методика опыта та же, что на стадии D примера 2 для снятия защиты с кетона в положении 5.
Стадия F: в колбу вводят 121 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-метилового спирта, 1,5 мл пиридина и 121 мг гидроксиламинхлоргидрата. Раствор перемешивают в течение 2 дней при комнатной температуре. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении, обрабатывают водой и экстрагируют дихлорметаном. Далее, органическую фазу промывают водой, затем сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный таким образом продукт очищают хроматографией (петролейный эфир/этилацетат 9/1). Получают 66 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-метилового спирта с выходом 53%.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 4 мин 91 сотая
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=420
Пример 5: синтез 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиламина
4
Стадия А: в колбе суспендируют 615 мг LiAlH в 57 мл ТГФ. Охлаждают до 0°С и вводят по каплям раствор 3,0 г сложного 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-метилового эфира в 57 мг тетрагидрофурана. Затем перемешивают при 0°С в течение 5 часов. Осторожно проводят гидролиз путем добавления раствора сульфата натрия; полученный раствор белого цвета перемешивают в течение 30 минут, затем фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении и обрабатывают водой, экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу сушат над сульфатом магния, затем концентрируют при пониженном давлении. Получают 2,55 г 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-ола с выходом 85%, этот продукт используют как таковой.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 4 мин 82 сотых
2
2
2
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M-(СНОН-СНОН+НО=H]+=373
Стадия В: в колбе в атмосфере аргона растворяют 476 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-ола в 7 мл дихлорметана, затем вводят 189 мг нейтрального оксида алюминия и 399 мг пиридиния хлорхромата; перемешивают при комнатной температуре в течение 3 часов 30 мин. Реакционную смесь фильтруют через Сélite; фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (толуол/этилацетат 9/1, 8/2). Получают 328 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-ала с выходом 69%.
Время удерживания: 5 мин 57 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=433
Стадия С: в колбе в атмосфере аргона растворяют 323 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-ала в 3 мл этанола, затем вводят 209 мкл триэтиламина, 100 мг метиламинхлоргидрата и 444 мкл тетраизопропоксида титана. Реакционную среду перемешивают в течение 6 часов при комнатной температуре, затем вводят 42,5 мг борогидрида натрия. Перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционную среду фильтруют и промывают дихлорметаном. Фильтрат сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (дихлорметан/метанол от 9/1 до 5/5). Получают 84 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)оксим-3-метиламина с выходом 25%.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 3 мин 93 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=448.
Стадия D: в колбу вводят 50 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-метиламина и 976 мкл смеси вода/уксусная кислота 1/1. Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 6 часов. После охлаждения реакционную среду разбавляют этилацетатом и промывают насыщенным раствором хлорида натрия, затем 5%-ным раствором бикарбоната натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный продукт очищают флэш-хроматографией (дихлорметан/метанол 95/5); получают 5 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-метиламина с выходом 11%.
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 3 мин 68 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=404.
Стадия Е: в колбу вводят 5 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-метиламина, 5 мг гидроксиламинхлоргидрата и 287 мкл пиридина. Смесь перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре. Затем обрабатывают в дихлорметане и промывают водой. Органическую фазу сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 5 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиламина с выходом 91%.
Время удерживания: 3 мин 66 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=419.
Пример 6: синтез 3,5-втор-4-норхолестан-5-онметилоксим-3-ола
2
2
2
В колбу вводят 20 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-ола, 20 мг О-метилгидроксиламина хлоргидрата в 1 мл пиридина. Перемешивают 36 часов при комнатной температуре и вводят еще 10 мг О-метилгидроксиламина хлоргидрата. Перемешивают снова в течение 16 часов при комнатной температуре, затем реакционную среду концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток обрабатывают смесью СHCl/НО; органическую фазу отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 18 мг желтого масла, которое очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат 9/1). Рекуперируют 5,8 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-онметилоксим-3-ола с выходом 27%.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 5 мин 50 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=420.
Пример 7: синтез 3,5-втор-4-норхолестан-5-онкарбоксиметилоксим-3-ола
2
2
2
В колбу вводят 52 мг кетона, 25 мг карбоксиметоксиламингемихлоргидрата в 0,5 мл пиридина. Перемешивают в течение 2 дней при комнатной температуре, затем реакционную среду концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток обрабатывают смесью СHCl/НО; органическую фазу отделяют, промывают водой, затем 2%-ным раствором соляной кислоты, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат 8/2). Получают 24 мг с выходом 39% карбоксиметилоксима.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 4 мин 40 сотых
+
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=464, [2M+H]=927.
Пример 8
Получают суспензию состава
3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол 20 мг на мл
Эксципиент: масляная эмульсия
Пример 9
Получают суспензию состава
хлоргидрат сложного 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-N,N-диметилглициновый эфир 250 мг
Эксципиент: количество, достаточное для получения конечной желатиновой капсулы, весом 750 мг
Пример 10: синтез сложного 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-N,N-диметилглицинового эфира: пролекарство 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола
В колбу вводят 509 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-он-3-ола, 182 мг N,N-диметилглицинхлоргидрата, 275 мг EDCI и 207 мг DMAP в 10-15 мл дихлорметана. Перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. В реакционную среду вводят 5%-ный раствор бикарбоната натрия и экстрагируют дихлорметаном. Органические фазы объединяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (толуол/этилацетат 8/2). Получают 488 мг с выходом 78%.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 3 мин 77 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=476
Затем продукт вводят в следующую реакцию:
2
2
2
в колбу вводят 488 мг полученного продукта и 488 мг гидроксиламинхлоргидрата в 23 мл пиридина. Перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре, затем реакционную среду обрабатывают смесью СHCl/НО; органическую фазу отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Рекуперируют 378 мг оксима с выходом 75%. Затем продукт превращают в соль в присутствии подкисленного раствора простого эфира с использованием раствора НСl для получения продукта в виде хлоргидрата.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 3 мин 43 сотых
Обнаруженные пики масс-спектрометрии: [M+H]+=491
Пример 11: синтез сложного эфира 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-(4-метил-1-пиперзин)пропионата: пролекарство 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола
В колбу вводят 264 мг 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола, 121 мг 4-метил-1-пиперазинпропановой кислоты в виде соли лития, 1425 мг EDCI и 106 мг DMAP в 2-3 мл дихлорметана. Перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ночи. В реакционную среду вводят воду и экстрагируют дихлорметаном. Органические фазы объединяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (толуол/этилацетат 98/2). Получают 54 мг целевого продукта с выходом 15%.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 3 мин 66 сотых
Обнаруженный пик масс-спектрометрии: [M+H]+=545
Затем продукт вводят в следующую реакцию:
2
2
2
в колбу вводят 30 мг полученного продукта и 30 мг гидроксиламинхлоргидрата в 1,2 мл пиридина. Перемешивают в течение 5 час 30 мин часов при комнатной температуре, затем реакционную среду обрабатывают смесью СHCl/НО; органическую фазу отделяют, промывают водой, сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 19 мг оксима с выходом 13%.
Анализ
3
ЯМР-1Н (СDCl): соответствует
Время удерживания: 3 мин 62 сотых
Обнаруженный пик масс-спектрометрии: [M+H]+=560
Затем продукт превращают в соль в присутствии раствора, подкисленного водным раствором соляной кислоты для получения продукта в виде дихлоргидрата.
Пример 12: антиапоптотическое действие 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола: сократимость и апоптоз желудочковых кардиомиоцитов кролика
Антиапоптотические свойства 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола (Azasteroidal alkaloids. Synthesis of A-nor-B-homo-5-azacholestane, Rodewald, W.J.; Wicha, J. Univ. Warsaw, Bulletin de l'Académie Polonaise des Sciences, Serie des Sciences Chimiques (1963), 11(8), 437-441) подвергались анализу на кардиомиоцитах при помощи теста на сократительную дисфункцию, вызванную доксорубицином.
Материалы и методы
Тестируемое соединение
Использовали сток-раствор 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола в концентрации 10 мМ в 100% ДМСО.
Конечная концентрация ДМСО была одинаковой для всех экспериментальных точек, независимо от используемых концентраций молекул.
2
4
2
2
3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол тестировали в концентрациях 0,1 и 0,3 мкм, разведенный раствором Tyrode (состав в ммоль/л: NaCl 135, KCl 5,4, NaHPO 0,33, CaCl 1,2, MgCl 1,0, Hepes 10; величина рН установлена 7,4 при помощи NaOH).
Получение изолированных клеток желудочковых кардиомиоцитов кролика
2
2
4
2
2
2
2
4
3
2
2
Индивидуальные желудочковые клетки получают из сердца самцов новозеландских кроликов, как описано у A.d'Anglemont de Tassigny et al., Fund Clin Pharmacol, 18: 531-38, 2004. Кроликам (2,0-2,5 кг) делали анестезию с использованием раствора пентобарбитала (50 мг/кг), затем вводили гепарин (200 IU/кг). Сердца иссекали и немедленно подвергали перфузии в течении 10-15 минут при помощи аппарата Langendorff без рециркуляции с использованием кислородосодержащего изотонического раствора Tyrode (без кальция) (95%, 2-5% СО)(в мМ: NaСl 135, KCl 5,4, NaPO 0,33, MgCl 1,0, HEPES 10, значение pH установлено 7,4 при помощи NaOH 1N при 37°С, 280-300 mOsмол/кг НО). Далее все сердца подвергали перфузии в течение 3 минут в режиме «рециркуляции» с использованием того же раствора Tyrode без кальция (коронарный кровоток, 10-15 мл/мин) с добавлением 1 мг/мл коллагеназы типа II и 0,28 мг/мл протеазы типа XIV. Наконец, все сердца подвергали перфузии в режиме без рециркуляции с использованием того же раствора Tyrode без кальция с добавлением 0,3 мМ СаCl в течение 10 минут. Левый желудочек извлекали и разрезали на кусочки, клеточную диссоциацию проводили путем слабого механического перемешивания. Каждые 15 минут вводили посредством инкремента внеклеточный кальций до получения физиологической концентрации 1,0 мМ. Выделенные миоциты выдерживали в бессывороточной среде, содержащей (в мМ) NaСl 110, KCl 5,4, NaPO 0,33, NaHCO 25, глюкозу 5, MgCl 0,8, CaCl 1, pH 7,4, за 1 час 30 мин до эксперимента. Все клетки имели форму палочки, имели перекрестные светлые полосы и не имели везикул на поверхности под оптическим микроскопом.
Введение меток аннексина V
Мечение аннексином V фосфатидилсерина использовали как количественный метод определения апоптоза с использованием набора MiniMacs cell isolation (Miltenyi Biotec, Bergisch, Gladbach, Germany). Коротко, на клетки с фосфатидилсерином, ставили магнитные метки при помощи микросфер аннексина V, затем помещали в колонну, находящуюся в магнитном поле. Меченные клетки (которые содержат фосфатидилсерин, имеющий магнитную метку) удерживались в колонне, а не меченные клетки (некротические и неапоптотические клетки) не удерживались. Колонну удаляли из магнитного поля, клетки с фосфатидилсерином, удерживаемые под действием намагничивания, элюировали, как положительную фракцию, и подсчитывали при помощи клетки Mallassez. Процентное содержание апоптотических клеток соотносили с первоначальным количеством клеток.
Измерение активности каспазы-3
Активность каспазы-3 используют для количественного метода определения апоптоза. Коротко, клетки лизируют и отстоявшуюся жидкость используют для измерения активности каспазы-3 при помощи набора АК-005 (Biomol Research Laboratories, Plymouth Meeting, РA, USA). Для измерения активности каспазы-3 (DEVD) флуорогенный субстрат метят флуорохром-7-амино-4-метилкумарином (АМС), который продуцирует желто-зеленую флуоресценцию, выявляемую УФ-излучением при 360/460 нм в течение 210 минут. АМС высвобождается из субстрата путем расщепления каспазой-3, экспрессию фермента выражают в fмол/мин.
Измерение сократительной способности
2
2
2
Миоциты перемещают в камеру при 37°С, подвергаемую непрерывной перфузии и установленную на предметном столике инвертированного микроскопа. Камеру перфузируют физиологичеким раствором, содержащим (в мМ): NaСl 140, KCl 5,4, CaCl 1, MgCl 0,8, HEPES 10 и глюкозу 5, (рН 7,4; 290 mOsмол/кг НО).
Сокращение миоцитов индуцируют один раз в секунду (1 Гц) при помощи платиновых полевых электродов, установленных в камере и соединенных со стимулятором. Съемку проводят непрерывно при помощи объектива ×20 и передают на камеру ССD их расчета 240 образцов/с. Камера ССD передает изображение на монитор.
2+
Отбор миоцитов для исследования проводили по следующему критерию: внешний вид в виде палочки с хорошо видимыми полосами и без межклеточной вакуоли, без спонтанного сокращения при стимуляции с использованием 1 мМ Са и с постоянными длиной в состоянии покоя и амплитудой. Длину саркомеров измеряли при помощи программы анализа видеоизображения и данные регистрировали со скоростью 240 образцов/с. Снятое на камеру изображение преобразовывали в измерения длины саркомера. Процент сокращений вычисляли, исходя из этих данных о длине саркомера.
Анализ данных
Все данные выражены средней величиной ± типовое отклонение. Сравнение данных по разным группам проводили при помощи ANOVA с последующим тестом STUDENT с разницей, значимой при р<0,05.
Протокол проведения опыта
2
4
3
2
2
Апоптоз индуцировался в изолированных кардиомиоцитах под воздействием в течение 3-8 часов 1 мкМ доксорубицина, введенного в изотонический раствор, содержащий (в мМ) NaCl 110, KCl 5,4, NaPO 0,33, NaHCO 25, глюкозу 5, MgCl 0,8, CaCl 1, рН 7,4. Мечение аннексином проводили через 3 часа после начала воздействия доксорубицина, т.к. это событие является очень ранним в апоптотическом каскаде. Измерения активности каспазы-3 проводили через 8 часов после воздействия доксорубицина, т.к. это событие является более поздним при апоптозе. Сократимость кардиомиоцитов измеряли каждый час в течение 8 часов воздействия доксорубицина. После всех обработок клетки сравнивали с контрольными кардиомиоцитами, не подвергшимися воздействию доксорубицина.
Кардиомиоциты предварительно обрабатывали соединением 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-олом в течение 15 минут перед началом воздействия доксорубицина. Во время этого исследования тестировали две концентрации этого соединения: 0,1 и 0,3 мкМ.
Результаты
Средняя длина саркомеров клеток, используемых в этом исследовании, не имеет существенного различия между группами.
- Воздействие доксорубицина на сократимость миоцитов и апоптоз.
Результат действия доксорубицина выражается в том, что со временем укорачивание саркомера уменьшается. Укорачивание пика под действием доксорубицина сходно с контрольным в течение первых трех часов, затем существенно сокращается после 4 часов воздействия (-53,20±7,70% по сравнению с 19,49±2,06% по отношению к основной линии доксорубицина и контроля соответственно, р<0,05, n=5).
Обработка при помощи 1 мкМ доксорубицина индуцирует апоптоз с существенным увеличением мечения аннексином V и активности каспазы-3.
- Воздействие 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола на дисфункцию сократительной способности, индуцированной доксорубицином, и на апоптоз.
Результатом обработки при помощи 1 мкМ доксорубицина является существенное сокращение укорачивания пика кардиомиоцитов желудочков, которое устраняется в присутствии 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола (0,1 и 0,3 мкМ). Действительно, после 4 часов воздействия укорачивание пика под действием доксирубицина (-53,20±7,70%) существенно уменьшается при помощи соединения в концентрации 0,1мкМ (-18,9±5,4%) и 0,3 мкМ (-8,1±9,6%) по отношению к основной линии.
Более того, увеличения мечения аннексином V и активности каспазы-3, связанные с доксорубицином, блокируются 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-олом в концентрации 0,1 и 0,3 мкМ.
Апоптоз, оцениваемый в % изменения мечения аннексином V через 3 часа после доксорубицина, дает следующие результаты: контроль: 100%; доксорубицин: 320%±48,7; доксорубицин+3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол 0,1 мкМ: 116,3%±15,1; доксорубицин+3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол 0,3 мкМ: 137,3%±19,3. Результаты измерений активности каспазы-3 следующие: контроль 19±9 fмол/мин; доксорубицин: 120±15 fмол/мин, доксорубицин+3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол 0,1 мкМ: 27±20 fмол/мин, доксорубицин+3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол 0,3 мкМ: 15±7 fмол/мин.
Комментарии и выводы
Соединение 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол показывает кардиопротекторное действие на дисфункцию сократительной способности, вызванной доксорубицином, и на апоптоз изолированных кардиомиоцитов кролика. При использовании в соответствующих дозах молекула может эффективно защищать от кардиотоксичности, индуцированной доксорубицином, которая известна как ограничивающий фактор в лечении онкологических больных этим антрациклином. Таким образом, 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол можно применять для ограничения кардиотоксичности доксорубицина у таких пациентов.
Пример 13: Действие соединений 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола и сложного эфира 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-N,N-диметилглицина на модели in vivo инфаркта миокарда у мыши
Цель этого эксперимента заключается в исследовании in vivo на модели коронарной окклюзии-реперфузии у мыши кардиопротекторных свойств соединений 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола и сложного эфира 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-N,N-диметилглицина.
Тестируемые соединения вводят мыши внутривенно за 5 минут до реперфузии миокарда, в котором предварительно вызвана ишемия. Контрольным животным введены наполнители соединений соответственно бета-циклодекстрин (ниже называемый βCD) и вода, в тех же условиях, что и соединения.
Для определения действия тестируемых соединений измеряют размер инфаркта после реперфузии, продолжавшейся 24 часа.
Хирургическая операция на животных
2
2
Самцам мыши C57BL6 в возрасте от 6 до 8 недель провели анестезию натриевым пентобарбиталом (50 мг/кг i.p.) и вентилировали после интубации смесью О/СО (95%/5%) в течение всего эксперимента. Снимали поверхностную электрокардиограмму (ЭКГ) и визуализировали на осциллоскопе в течение всего хирургического вмешательства. В жестких условиях стерильности в яремную вену вставляли катетер для внутривенного введения соединений. Провели левую боковую торакотамию и после перикардиотомии определяли большую ветвь левой коронарной артерии в задней боковой области левого желудочка. Проленовую нить номер 8 расположили вокруг этой артерии в виде подвижной петли для создания временной коронарной окклюзии.
Протоколы проведения эксперимента
Все мыши являлись объектом временной коронарной окклюзии в течение 30 минут. Ишемия области миокарда подтверждалась присутствием цианоза поверхности миокарда и отклонением сегмента ST на электрокардиограмме.
Каждое из соединений (обработанная группа, n=10) или его растворитель (контрольная группа, n=10) вводили в виде болюсов внутривенно за 5 минут до остановки тридцатиминутной коронарной окклюзии.
3,5-Втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол, предварительно растворенный в конечной концентрации 0,46 мг/мл в 30%-ном растворе βCD в фосфатном буфере, полученный путем насыщения с последующим центрифугированием, вводили в количестве 1 мг/кг.
Сложный эфир 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-N,N-диметилглицина, предварительно растворенный в конечной концентрации 1,56 мг/мл в стерильной воде путем перемешивания и разрушения ультразвуком, вводили в количестве 3,9 мг/кг.
Тот же объем наполнителя вводили соответствующим контрольным группам.
Реперфузия была обоснована характером сегмента QRS электрокардиограммы.
После поэтапного закрытия грудной клетки и удаления пневмоторакса аспирацией через дренаж, мышей постепенно будили и продолжали вспомогательную вентиляцию до восстановления спонтанной нормальной вентиляции. В случае необходимости вводили через брюшину бупренорфин (1 мг/кг) для обеспечения эффективного обезболивания.
Через сутки после окончания коронарной окклюзии мышам делали повторную анестезию натриевым пентобарбиталом (50 мг/кг i.p.) и внутривенно вводили гепарин (гепарин Choay 1000 UI/кг). Перевязку коронарной артерии проводили в том же месте, что и при первой окклюзии, осуществленной на сутки ранее. Далее мышей подвергали эвтаназии при помощи летальной насыщенной дозы калия хлорида и их сердце быстро иссекали, затем поднимали по аорте при помощи системы ретроградной перфузии типа Langendorf.
5%-ный раствор синего Эванса перфузировали ретроградным способом для окрашивания здорового миокарда в синий цвет; при этом область, в которой была вызвана ишемия путем коронарной окклюзии или «область риска AR», осталась неокрашенной из-за недостаточности.
Затем левый желудочек разрезали на 5 кусочков равной толщины (1 мм) при помощи резака, специально приспособленного для сердца мыши (Les Isolants de Paris, Palaiseau), которые затем взвешивали.
Эти кусочки инкубировали в 1%-ном растворе трифенилтетразолия хлорида (TTC, Sigma, Poole, UK) с рН 7,4 в течение 20 минут при 37°С, затем закрепляли в 4%-ном формалине. ТТС обладает свойством окрашивать в красный цвет, не подвергшийся инфаркту миокард и, таким образом, показывать белые участки, подвергшиеся инфаркту. Каждый кусочек сердца помещают под стереомикроскоп для цифрового фотографирования с высоким разрешением.
Количественный анализ инфаркта и области риска проводят с помощью планиметрии (Scion Image, Scion, Frederick MD, USA) и соотносят с весом каждой части.
Область риска (область, не окрашенная в синий цвет) выражена в процентном отношении к весу левого желудочка. Размеры инфаркта выражены в процентном отношении к весу левого желудочка.
Все величины размера инфаркта и области риска выражены средней величиной ± SEM. ANOVA с последующим Непарным тестом t Student в модификации Бонферрони применяется для сравнения областей риска и размеров инфаркта в экспериментальных группах, при этом установленный порог значения составляет р<0,05.
Результаты и выводы
Размеры инфаркта у мышей, получивших соединения, существенно отличаются от размеров инфаркта у мышей, получивших наполнитель.
Результаты, представленные в нижеследующей таблице, с одной стороны, выражены областью риска, а с другой стороны, размером инфаркта.
Обработанные мыши
Область риска
Размер инфаркта
3,5-Втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол
9+/-4%
21+/-7%
Наполнитель
14+/-4%
33+/-7%
P<0,01
P<0,0007
Уменьшение размера инфаркта
36,4%
Сложный эфир 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-N,N-диметилглицина
8+/-3%
23+/-9%
Наполнитель
16+/-8%
40+/-15%
P<0,07
P<0,006
Уменьшение размера инфаркта
42,5%
В использованной экспериментальной модели оба тестируемые соединения уменьшают размер инфаркта. К тому же результаты показывают, что соединения уменьшают размеры инфаркта независимо от размера зоны риска.
Эти результаты показывают, таким образом, что оба эти соединения обладают in vivo кардиопротекторным действием.
Пример 14: Действие соединения 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола на модели in vivo острой гепатотоксичности
В этом эксперименте тестируют способность 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола защищать гепатоциты.
Гепатоциты, так же, как многие другие клетки, несут на своей цитоплазматической мембране рецептор Fas/СD95. Стимуляция этого пути Fas индуцирует клеточную смерть путем активирования каспазного каскада.
Модель острого поражения печени можно индуцировать путем одной инъекции антител анти-Fas Jo2 (Ogasawara et al., Nature, август 1993), продуцирующих тяжелое поражение печени, подобное вирусному гепатиту, аутоиммунного или вызванного наркотиками.
Аланинаминотрансфераза (ALAT), называемая также сывороточной сериновой глютаминпируват-трансаминазой (SGPT), - это фермент, присутствующий в гепатоцитах. Его активноcть существенно повышаетcя в плазме после разрушения печени и, следовательно, является хорошим маркером для определения поражения печени.
Материалы и методы
Животные
Используют взрослых самцов мышей CD1, происходящих из «Elevage Janvier» (Le Genest-Saint-Isle, France). Животных идентифицировали индивидуально, они имели свободный доступ к воде и пище.
В установках поддерживали контролируемый световой цикл (7:00-19:00) и температуру 20±2°С и влажность 50±20%.
Подготовка антитела Jo2
Сток-раствор моноклональных антимышиных хомячьих антител CD95 (Fas), называемых Jo2, происходящий из Pharmingen (BD Bioscience, ref. 554254 batch 32699), готовят в концентрации 1 мг/мл в воде. Используют 0,9%-ное разведение хлорида натрия в воде.
Получение тестируемого соединения
Требуемое количество 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола взвешивают и измельчают до мелкого порошка, затем смешивают с Cremophore EL (Sigma C5135) и абсолютным этанолом (Carlo Erba RPE 41571)(соответственно 5% и 10% конечного объема). После полного растворения вводят приготовленный перед самым употреблением 0,9%-ный раствор хлорида натрия в воде (85% конечного объема).
Проводят эксперимент двух видов: интоксикация Jo2 с последующим введением ALAT и летальная интоксикация Jo2.
Интоксикация Jo2 и введение ALAT
Протокол
Предварительную обработку 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-олом проводят с использованием доз 10 и 30 мг/кг путем внутрибрюшного введения за 1 час до введения антител Jo2. Антитела Jo2 вводят путем внутрибрюшной инъекции в дозе 125 мкг/кг в объеме 5 мл/кг веса тела.
Контроль осуществляют на животных, предварительно обработанных путем внутрибрюшного введения за 1 час до введения антитела такого же объема раствора, использовавшегося для получения тестируемого соединения, не содержащего соединения.
Количественное определение ALAT
Через 24 часа после введения Jo2 проводят забор крови у мышей под анестезией. Количественное определение ALAT осуществляют при помощи набора (Roche Diagnostics) с использованием спектрофотометра (Hitachi Modular) по методу, стандартизованному МФКХ (Международная федерация клинической химии).
Результаты и выводы
Внутрибрюшное введение Jo2 в количестве 125 мкг/кг не приводит к смерти мышей через сутки после инъекции.
Активность ALAT существенно снижена соединением 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-олом в концентрации от 10 до 30 мг/кг.
Таблица 1Активность ALAT, измеренная через 24 часа после введения Jo2
Обработка
Активность ALAT (U/л)среднее значение±SEM (n)
Контроль
2860±382 (61)
3,5-Втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол (10 мг/кг)
511±140 (19)**
3,5-Втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол (30 мг/кг)
533±150 (20)**
**: р<0,01, ANOVA с последующим сравнительным тестом Dunnett, проведенным по сравнению с группой плацебо.
Введение 10 мг/кг и 30 мг/кг 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола за 1 час до введения антитела Jo2 позволило ограничить клеточную смерть, индуцируемую сублетальной дозой антител.
Активность ALAT, биомаркера печеночного цитолиза в плазме, значительно ниже у мышей, обработанных 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-олом, чем у контрольных необработанных мышей.
Летальная интоксикация антителом Jo2
В ходе этого эксперимента оценивают действие 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола на выживание животных после введения летальной дозы антитела Jo2.
Протокол
Антитело Jo2 вводят путем внутрибрюшной инъекции в дозе от 200 до 250 мкг/кг в объеме 5 мл/кг веса тела.
3,5-Втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол тестируют в дозировке 10 и 30 мг/кг при предварительной обработке за 1 час до введения Jo2 или при последующей обработке через 1 час после введения Jo2.
Контроль осуществляют на животных, предварительно обработанных путем внутрибрюшного введения за 1 час до или через 1 час после введения антитела такого же объема раствора, использовавшегося для получения тестируемого соединения, не содержащего соединения.
Результаты и выводы
Таблица 2Выживаемость животных через 24 часа
Доза Jo2
Группа
Смертность(24 ч)/общее количествоживотных
Выживаемость
Опыт 1
250 мкг/кг
Контроль
15/20
25
С пред.обработкой10 мг/кг
7/20
65
Опыт 2
250 мкг/кг
Контроль
18/20
10
С пред.обработкой30 мг/кг
2/20
90
Опыт 3
250 мкг/кг
Контроль
18/20
10
С послед. обработкой10 мг/кг
17/20
15
Опыт 4
250 мкг/кг
Контроль
19/20
5
С послед. обработкой30 мг/кг
13/20
35
Опыт 5
200 мкг/кг
Контроль
14/20
30
С послед. обработкой10 мг/кг
8/20
60
Опыт 6
200 мкг/кг
Контроль
16/20
20
С послед. обработкой30 мг/кг
8/20
60
Во введенных дозах антитело Jo2 индуцирует значительную смертность через 24 часа (70-100% животных) в контрольной группе.
Предварительная и/или последующая обработка 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-олом во введенных дозах повышает выживаемость животных.
Таким образом, если используется летальная доза антитела (200 или 250 мкг/кг), 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол, введенный в дозе 10 и 30 мг/кг за 1 час до или через 1 час после введения антитела, повышает выживаемость мышей в течение 24 часов.
Выводы
Модель острой гепатотоксичности у мыши, вызванной антителом анти Fas (Jo2), позволила выявить гепатопротекторные свойства 3,5-втор-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола.
Этот замечательный эффект позволяет считать, что соединения формулы I пригодны для получения лекарственного средства, являющегося цитопротектором в целом.