Прогностическая значимость полиморфизма генов-регуляторов лимфангиогенеза в оценке состояния здоровья человека

УДК 611.1:575

ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ-РЕГУЛЯТОРОВ ЛИМФАНГИОГЕНЕЗА В ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА

Владимир Иосифович КОНЕНКОВ, Виктор Федорович ПРОКОФЬЕВ, Алла Владимировна ШЕВЧЕНКО

ФГБУ НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Цель исследования - анализ частоты встречаемости генотипов VEGF (vascular endothelial growth factor) в двух полиморфных позициях регуляторной области гена в сочетании с генотипами других ангиогенных цитокинов и металлопротеаз в группах практически здоровых лиц различного возраста. Исследовался однонуклеотид-ный полиморфизм промоторного региона генов TNFA -863 C ^ A, TNFA -308 G ^ A , TNFA -238 G ^ A, ILlß -511 T ^ С, ILlß -31 С ^ T, IL-4 -590 С ^ T, IL-6 -174 G ^ C, IL-10 -1082 G ^ A и IL-10 -592 А ^ С, генов матричных металлопротеаз MMP2 -1306 C ^ T, MMP9 -1562 C ^ T и факторов роста сосудистого эндотелия VEGF-2578 А ^ С и VEGF +936 C ^ T. При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели, как частота встречаемости генов, генотипов и их комбинаций, специфичность, отношение шансов с расчетом 95%-го доверительного интервала. Внутри группы обследованных, в которую вошли 219 человек, сопоставили исследуемые признаки в подгруппах лиц молодого возраста (менее 35 лет - 103 человека) и лиц старшего возраста (55 лет и более - 116 человек). Установлено, что среди лиц старшего возраста полностью отсутствует целый ряд комбинированных генетических признаков, включающих генотипы VEGF и представленных гомозиготными вариантами полиморфных участков генов цитокинов, с высокой частотой встречающихся в группе молодых лиц. Частота других, более распространенных среди молодых лиц генетических комбинаций, значительно (в несколько раз) снижена. В этой группе комбинированных генетических признаков, частота которых уменьшается с возрастом, наиболее часто выявляются варианты АС и СС в полиморфных позициях гена VEGF -2578 и VEGF +936, ассоциированные с высокими уровнями продукции фактора роста сосудистого эндотелия. Можно предположить, что само наличие таких комбинаций генотипов в геноме молодого человека является неблагоприятным прогностическим признаком, указывающим на непродолжительный срок жизни данного индивида, что, вероятно, позволяет судить о низком уровне состояния его здоровья и служит основанием для включения его в группу высокого риска развития заболеваний.

Ключевые слова: однонуклеотидный полиморфизм промоторного региона гена, гены цитокинов, фактора роста сосудистого эндотелия, лимфангиогенез, генетика продолжительности жизни человека.

Нарушения функционирования лимфатической сосудистой системы, параллельной кровеносной, при заболеваниях различной природы до настоящего времени исследованы явно недостаточно. Столь же недостаточно исследовано функциональное значение межклеточных взаимодействий в тесно ассоциированных с лимфатической сосудистой и капиллярной сетью многочисленных лимфоидных органов и лимфоидных скоплений, непосредственно прилежащих к очагам патологических изменений в тканях. Вместе с тем нарушения нормального тканевого лимфотока лежат в основе всех патологических процессов, инициируя цепь событий, приводящих к локаль-

ному отеку, тканевой гипоксии, индуцирующей продукцию тканевыми макрофагами каскада ци-токинов, киназных и протеазных ферментов, рецепторов и ростовых факторов, внутриклеточных транспортеров, процессов фосфорилирования и т.п. Все эти каскадные события на тканевом уровне приводят к активации процессов воспаления, неоангиогенеза и лимфангиогенеза, определяющих в конечном итоге клиническую картину заболевания [1].

Имея конечной целью создание новых медицинских технологий адресной коррекции этих процессов, на первый план выходит исследование двух ключевых моментов: клеточных процес-

Коненков В.И. - д.м.н., академик РАМН, директор, e-mail: lymphology@soramn.ru ПрокофьевВ.Ф. - к.м.н., ведущий научный сотрудник

Шевченко А.В. - к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории клинической иммуногенетики, e-mail: shalla64@mail.ru

сов воспаления и ангиогенеза и их гуморальной регуляции. По первому направлению основное внимание сейчас справедливо уделяется процессам клеточной дифференцировки и передиффе-ренцировки клеток-предшественников, а по второму направлению - факторам роста сосудистого эндотелия и их рецепторам на клеточной мембране [2, 5, 31].

Ангиогенез представляет собой образование новых капилляров из ранее существующих путем миграции и пролиферации дифференцированных эндотелиальных клеток. Данный процесс протекает в несколько этапов и включает активацию эндотелиальных клеток, экспрессию в них проте-аз, растворение базальной мембраны, миграцию эндотелиоцитов из стенок сосудов через перива-скулярную ткань по направлению к ангиогенно-му стимулу, образование первичных высокопроницаемых сосудистых структур, последующую стабилизацию и «взросление» этих структур за счет привлечения перицитов и гладкомышечных клеток и организации их в сложную трехмерную сосудистую сеть. В процессе ангиогенеза взаимодействуют компоненты клеточного матрик-са, растворимые факторы и клетки. Основным стимулом к ангиогенезу при физиологических и патологических состояниях является недостаток кислорода (гипоксия или ишемия), который через индуцируемый гипоксией фактор-1 (HIF-1) индуцирует экспрессию многих ангиогенов, прежде всего фактора роста эндотелия сосудов (VEGF, vascular endothelial growth factor) и его рецепторов (VEGFR1 и VRGFR2). VEGF избирательно стимулирует пролиферацию и миграцию эндоте-лиальных клеток, их предшественников и моноцитов, увеличивает сосудистую проницаемость, способствует вазодилатации через усиление продукции оксида азота NO. В процессе стабилизации и «взросления» вновь образованной незрелой сосудистой сети участвуют тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста в (TGF-в), фактор роста фибробластов (FGF), ангиопоэтины и другие факторы [4].

Ремоделирование сосудов в физиологических и патологических условиях контролируется балансом между активаторами ангиогенеза и его ингибиторами. Недостаточный адаптивный ангиогенез, обусловленный снижением продукции активаторов либо увеличением синтеза ингибиторов, может способствовать нарастанию тяжести ишемических заболеваний сердечно-сосудистой системы: ИБС, ишемии нижних конечностей [3].

В настоящее время доказано, что новые сосуды в постнатальном периоде могут образовываться не только из ранее существующих сосудов, но и de novo из гемопоэтических клеток. Важнейшую

роль в васкулогенезе играют эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК). ЭПК представляют собой гетерогенную популяцию, характеризующуюся экспрессией различных маркеров клеток гематопоэтического (CD14, CD34, CD133) и эндотелиального (VEGFR2, CD31, CD144, фактор Виллебранда) ряда и могут быть идентифицированы в составе мононуклеарных клеток путем сортировки по набору поверхностных антигенов или при культивировании in vitro. Вопрос о том, какие маркеры в наибольшей степени выявляют истинные ЭПК, остается дискуссионным [20, 28, 35].

Источниками ЭПК служат костный мозг, ме-зенхимальные предшественники, тканевые резидентные клетки. При возникновении ишемии или повреждении эндотелия ЭПК могут быть мобилизованы в кровоток. Стимуляторами рекрутирования ЭПК из костного мозга выступают грану-лоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующие факторы (G-CSF и GM-CSF), VEGF, ангиопоэтин-1, эритропоэтин и другие регуляторы. Поступившие в кровоток ЭПК мигрируют в зону повреждения, накапливаются в ней и дифференцируются в эндотелио-циты. Сеть эндотелиальных клеток, создаваемая васкулогенезом, в дальнейшем служит каркасом для ангиогенеза. Показано, что под воздействием VEGF-А и VEGF-С мезенхимальные стволовые клетки при культивировании дифференцируются не только в остеоциты и адипоциты, но и в клетки эндотелия лимфатических сосудов, несущие специфический маркер лимфатического эндотелия LYVE-1 [39].

VEGF - семейство структурно близких между собой белков, которые совместно с рецепторами играют существенную роль в развитии и регуляции деятельности кровеносных и лимфатических сосудов. VEGF подразделяют на VEGF-A, B, C, D, Е, плацентарные факторы роста (PlGF 1 и PlGF 2). VEGFR-1, 2, 3 - трансмембранные тирозинкиназные рецепторы, которые связывает лиганд VEGF. VEGFR-1 (Flt-1) и VEGFR-2 (KDR/Flk-1) экспрессируются эндотелиальными клетками, в то время как VEGFR-3 (Flt-4) - клетками лимфатического и сосудистого эндотелия [6]. VEGFR-2, как полагают, преимущественно отвечает за ангиогенез и быстрый рост эндотелиальных клеток [18].

VEGF-А влияет на ангиогенез и выживание незрелых кровеносных сосудов (сосудистая поддержка), связываясь с двумя близкими по строению рецепторами VEGFR-1 и VEGFR-2 и активируя их. Кроме того, VEGFA - не только главный стимулятор ангиогенеза, но и лимфангиогенный фактор. VEGF-B регулирует деградацию внекле-

точного матрикса, клеточную адгезию и миграцию, принимает участие в ангиогенезе, но ответственен не за рост сосудов, а за их «выживание». VEGF-C и VEGF-D участвуют главным образом в лимфангеогенезе [38], специфическим рецептором для них служит белок VEGFR3. VEGF-E -единственный известный лиганд, активирующий VEGFR-2, но не VEGFR-1 или 3. Установлено, что VEGFR-2 и VEGFR-3 принимают участие в регуляции как ангиогенеза, так и лимфангио-генеза.

Экспрессия VEGF стимулируется множеством проангиогенных факторов, включая эпи-дермальный ростовой фактор, основной фибро-бластный ростовой фактор, тромбоцитарный ростовой фактор, интерлейкин-lß, и факторами внешней среды, такими как рН, давление и концентрация кислорода. Подобное влияние заключается в опосредованной через VEGF стимуляции важных для ангиогенеза и лимфангиогенеза факторов, включая антиапоптотические белки, молекулы клеточной адгезии и металлопротеи-назы. Продукция VEGF в ответ на стандартные стимулы у разных людей варьирует, причем в популяции встречаются стабильные низко- или вы-сокопродуцирующие фенотипы при неизменной структуре синтезируемого белка.

На сегодняшний день с особенностями функционального полиморфизма генов VEGF и VEGFR связывают развитие, характер и особенности течения многих патологий, так или иначе связанных с ангио- и лимфангиогенезом. Основной интерес направлен на онкопатологию, есть ограниченные данные о генетических особенностях пациентов с кардиопатологиями и диабетическими ретинопатиями, с аутоиммунными патологиями, вторичной и первичной лимфедемой.

Продемонстрировано влияние полиморфизмов С-2578А, G-1154A, T-460C, C+936T, картированных в регуляторных областях гена VEGF, на уровень его экспрессии и содержание медиатора в плазме крови здоровых доноров и больных раком молочной железы, лейомиомой, раком желудка и кишечника; показана их ассоциированность с агрессивностью роста опухоли, рецидивами, метастазированием и выживаемостью [22].

Ассоциированность продолжительности жизни с отдельными генами неоднократно была доказана при анализе различных генетических систем. Так, при сотрудничестве исследователей 11 европейских стран в рамках международного проекта Genetics of Healthy Aging (GEHA) при исследовании более 2000 тысяч неродственных европеоидов была доказана достоверная связь продолжительности жизни с генами rs4420638 [13]. Были предприняты попытки оценить зна-

чимость в процессах долголетия человека различных полиморфизмов VEGF и генов цитокинов (IL1, IL6, IL10, TNFA, TGFB и др.) [15, 17], которые или не дали однозначных результатов, или обладали низкой прогностической значимостью, на наш взгляд, ввиду того, что при анализе были использованы расчеты ассоциированности с отдельными аллелями и генотипами, а не с различными вариантами комплексных генетических признаков.

Целью настоящего исследования послужил анализ частоты встречаемости генотипов VEGF в двух полиморфных позициях регуляторной области гена в сочетании с генотипами других ангио-генных цитокинов и металлопротеаз у практически здоровых лиц различного возраста.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В исследовании участвовала группа из 219 практически здоровых лиц (по данным устных опросов), длительное время проживающих на территории Сибирского федерального округа, европеоидной внешности, идентифицирующих себя, своих родителей и предков как русских, языком общения которых является русский. Среди обследованных было 67 мужчин и 152 женщины молодого возраста (менее 35 лет - 103 человека) и старшего возраста (55 лет и более - 116 человек). Данные подгруппы были выделены с помощью квантильного подхода из общей группы обследованных, численность которой составляла 531 человек. Для наглядности мы исключили из сравнительного генетического анализа две средние возрастные декады (35-44 и 45-54 лет). Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности, получено разрешение локального Этического комитета.

Исследовался однонуклеотидный полиморфизм (SNP, single nucleotide polymorphism) промоторного региона генов TNFA -863 C ^ A, TNFA -308 G ^ A, TNFA -238 G ^ A, ILip -511 T ^ С, ILie -31 С ^ T, IL-4 -590 С ^ T, IL-6 -174 G ^ C, IL-10 -1082 G ^ A и IL-10 -592 A ^ С, генов матричных металлопротеаз MMP2 -1306 C ^ T, MMP9 -1562 C ^ T и факторов роста сосудистого эндотелия VEGF -2578 А ^ С и VEGF +936 C ^ T. Генотипирование осуществляли методом рестриктного анализа продуктов амплификации (RFLP, restriction fragment length polymorphism). Участки промоторного региона генов амплифицировали с использованием пары специфичных праймеров, затем продукты амплификации подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами рестрикции

(«СибЭнзим», Новосибирск). Электрофорез проводили в 2%-м агарозном геле [7-9, 33, 37].

При статистическом анализе результатов исследований использовали такие показатели, как частота встречаемости генов, генотипов и их комбинаций, специфичность (вероятность отрицательного результата диагностического теста в отсутствие изучаемого признака), отношение шансов (OR, odds ratio - отношение шансов события в одной группе к шансам этого же события в другой группе) с расчетом 95%-го доверительного интервала (CI 95%, 95% confidence interval). Частоту аллелей генов цитокинов вычисляли методом прямого подсчета по формуле: f = n/2N, где n - количество раз встречаемости аллеля (у гомозигот он учитывался дважды); 2N - удвоенная численность обследованных. Частоту встречаемости отдельных генотипов и их комбинаций определяли как процентное отношение индивидов, несущих генотип (комбинацию генотипов), к общему числу обследованных в группе по формуле: f = n/N, где n - количество раз встречаемости генотипа (комбинации); N - численность обследованных. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга. Достоверность различий частот распределения изучаемых признаков при сравнении в группах обследованных определяли по двустороннему варианту точного метода Фишера для четырехпольных таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенного сравнительного анализа частоты встречаемости всех комбинаций генотипов исследуемых генов в группах «молодых» и «пожилых» лиц нами получены данные (см. таблицу), из которых следует, что среди людей старшего возраста полностью отсутствует целый ряд комбинированных генетических признаков, включающих генотипы VEGF и представленных гомозиготными вариантами полиморфных участков генов цитокинов, которые встречаются с различной частотой в группе молодых лиц. Частота других, более распространенных среди молодых лиц генетических комбинаций, значительно (в несколько раз) снижена.

В группе комбинированных генетических признаков, частота которых уменьшается с возрастом, наиболее часто выявляются варианты АС и СС в полиморфных позициях гена VEGF -2578 и VEGF +936, ассоциированные с высокими уровнями продукции фактора роста сосудистого эндотелия [33, 37]. В одной, из близких к нашей, работе, исследовавшей особенности распределе-

в у

и

£ ¿3

и и с с о

«

е

еле

л

в

о оро

3 и

е р

с

«

е

т е с

g

к с е

4 и

т е н е г

X

з

в о н и к о

и

^

в о

нто

а

и р

а в

с о

мое

а ч

е р

т с в

с а ч

3

и

н и

ая

н т

ас зра

о

aq

0х

Р* О

(D

3

4

о

С

(D

ч о ч о

с

S

h О

и

(N (N «Ч

7

<N 00 <N

О ©0

о

О H

I

О о

I

< о

I

ü

<с

I

Ü

0

1

о о

«

о и

о «

о и

в «

о

S

!Г

Я &

а о S s ч о с о h <D

О

00 ©

О Н

I

О

о

I

<с о

I

Ü

<с

I

о

0

1

Ü о

оо ©

СП

и

Н

I

и и

I

< о

I

Ü

<с

I

ü

0

1

Ü

0

1

о о

J

00 ©

m

О О

I

< О

I

Ü

<с

I

о

0

1

Ü

0

1

Ü о

©

«э "о" (N

00

О Н

I

О о

I

< о

I

< о

I

Ü

0

1

Ü о

00 ©

m

О Н

I

О о

I

< о

I

< о

I

Ü

0

1

Ü

0

1

о о

©

©

m

m

О

00

ич

(N %

О

hJ

О Н

I

О О

I

< о

I

< о

I

о

0

1

Ü

0

1

о о

Рч

о

о

00

ич

(N %

О

00 m <N

00 ©

сп ю 00

СП

5 ь ь гп н гп

I сг

о о

5

со со

м о

ТКР-238:1Ь6-174:1Ь10-592:УЕСР2578:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СА-СА-СС-ТС-СС 25,00 0,00 51,95 2.49-1085.63

Т№-863:Т№-238:1Ы0-592:УЕСР2578:ММР2-13()6 СС-Св-СА-СА-ТС 23,08 0,00 51,00 2.46-1058.35

ТКР-308:ТКР-238:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306 СС-СС-СА-СА-ТС 23,08 0,00 51,00 2.46-1058.35

ТКР-238:1Ь6-174:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306 СС-СС-СА-СА-ТС 23,08 0,00 51,00 2.46-1058.35

ТКР-863:ТКР-308:ТКР-238:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306 СС-СС-СС-СА-СА-ТС 23,08 0,00 51,00 2.46-1058.35

тар-863:Т№-238:1Ь6-174:1и0-592:УЕСР2578:ММР2-1306 СС-СС-СС-СА-СА-ТС 23,08 0,00 51,00 2.46-1058.35

тар-308:Т№-238:1Ь6-174:1и0-592:УЕСР2578:ММР2-1306 СС-СС-СС-СА-СА-ТС 23,08 0,00 51,00 2.46-1058.35

ТКР-863:ТКР-308:ТКР-238:1Ь6-174:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306 СС-СС-СС-СС-СА-СА-ТС 23,08 0,00 51,00 2.46-1058.35

ТКР-863:ТКР-238:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СА-СА-ТС-СС 23,08 0,00 50,33 2.43-1044.63

ТКР-308:ТКР-238:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СА-СА-ТС-СС 23,08 0,00 50,33 2.43-1044.63

ТКР-238:1Ь6-174:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СА-СА-ТС-СС 23,08 0,00 50,33 2.43-1044.63

ТКР-863:ТКР-308:ТКР-238:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СС-СА-СА-ТС-СС 23,08 0,00 50,33 2.43-1044.63

ТКР-863:ТКР-238:1Ь6-174:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СС-СА-СА-ТС-СС 23,08 0,00 50,33 2.43-1044.63

ТКР-308:ТКР-238:1Ь6-174:1Ь10-592:УЕСР2578:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СС-СА-СА-ТС-СС 23,08 0,00 50,33 2.43-1044.63

1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-АС-СА-СС-ТС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-863:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-СС-АС-СА-СС-ТС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-308:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-СС-АС-СА-СС-ТС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-308:1Ь6-174:1Ь10-1082:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-АС-СС-ТС-СС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-238:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-СС-АС-СА-СС-ТС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-АС-СА-СС-ТС-СС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-863:ТКР-308:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ы0-592:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-СС-СС-АС-СА-СС-ТС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-863:ТКР-308:1Ь6-174:1Ь10-1082:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СС-АС-СС-ТС-СС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-863:ТКР-238:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ы0-592:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-СС-СС-АС-СА-СС-ТС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-863:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-АС-СА-СС-ТС-СС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-308:ТКР-238:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ы0-592:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-СС-СС-АС-СА-СС-ТС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-308:ТКР-238:1Ь6-174:1Ь10-1082:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-СС-АС-СС-ТС-СС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-308:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-АС-СА-СС-ТС-СС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

ТКР-238:1Ь6-174:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-СС-АС-СА-СС-ТС-СС 33,33 0,00 50,08 2.31-1083.95

1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР2578:УЕСР-936:ММР2-1306 АС-СА-СА-СС-ТС 33,33 0,00 47,92 2.21-1037.95

ТКР-863:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР2578:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-АС-СА-СА-СС-ТС 33,33 0,00 47,92 2.21-1037.95

ТКР-308:1Ь6-174:1Ь10-1082:УЕСР2578:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-СС-АС-СА-СС-ТС 33,33 0,00 47,92 2.21-1037.95

ТКР-308:1Ы0-1082:1Ь10-592:УЕСР2578:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-АС-СА-СА-СС-ТС 33,33 0,00 47,92 2.21-1037.95

ТКР-308:1Ь10-1082:УЕСР2578:УЕСР-936:ММР2-1306:ММР9-1562 СС-АС-СА-СС-ТС-СС 33,33 0,00 47,92 2.21-1037.95

ТКР-238:1Ы0-1082:1Ы0-592:УЕСР2578:УЕСР-936:ММР2-1306 СС-АС-СА-СА-СС-ТС 33,33 0,00 47,92 2.21-1037.95

£ а

а §

» Й5

Примечание. В столбцах «Молодые» и «Пожилые» представлены показатели частоты встречаемости данного признака в группе в процентах; в таблице приведены значения, сл уровень достоверности различий которых по двустороннему критерию точного метода Фишера р < 0,001.

ния 4 полиморфизмов гена VEGF у молодых и пожилых итальянцев [17], также выявлена связь различных генотипов с продолжительностью жизни. В частности, относительно полиморфизма VEGF -2578 авторами показано наличие статистически значимого изменения с возрастом частот гомозиготных генотипов (AA и CC), тогда как в нашей выборке с возрастом достоверно падает частота гетерозиготных генотипов AC (68,1 % у «молодых» и 50,0 % у «пожилых» лиц, р = 0,0129) и нарастает (статистически не значимо) число го-мозиготых генотипов AA (соответственно 12,1 и 21,6 %) и CC (соответственно 19,8 и 28,4 %). Во всех случаях значения специфичности по всем вариантам указанных генотипов не превышали 78 %, что свидетельствует об их низкой прогностической ценности в отличие от комбинированных генетических признаков, специфичность которых, по нашим данным, достигает 95-100 %.

В группе прогностически неблагоприятных комбинаций генотипов наиболее распространены гомозиготные генотипы ТТ гена IL1B в позиции полиморфизма T-31C и генотип СС гена IL10 в позиции полиморфизма A-592C. По некоторым данным, оба этих полиморфизма ассоциируются с повышенным синтезом клетками человека самих цитокинов интерлейкина-1 и интерлейки -на-10, обладающих соответственно провоспали-тельной, проангиогенной и антивоспалительной, противоангиогенной активностями [10, 14]. Такой относительный «регуляторный дисбаланс», при котором в геноме человека одновременно присутствуют генотипы, ассоциированные с гиперпродукцией цитокинов с противоположными свойствами, может служить одним из факторов редкого дожития носителей таких комбинаций генотипов VEGF до старшего возраста.

Можно с уверенностью предположить, что само наличие таких комбинаций генотипов в геноме молодого человека является неблагоприятным прогностическим признаком, указывающим на непродолжительный срок жизни данного индивида, что, вероятно, позволяет судить о низком уровне его здоровья и служить основанием для включения его в группу высокого риска развития заболеваний. Формирование групп повышенного риска по такого рода генетическим критериям позволит применять программы общеукрепляющих профилактических мероприятий не для всего населения, а лишь для лиц с низким потенциалом здоровья, что может существенно снизить масштаб потребности во всеобщей диспансеризации населения и персонализировать ее направленность. Проведение генетических обследований человека возможно на самых ранних этапах жизни, что позволяет отнести данного индиви-

да в группу для диспансерного наблюдения для углубленного обследования, ранней доклинической диагностики и выполнения направленных профилактических мероприятий. Подобные сведения могут быть занесены в индивидуальную электронную медицинскую карту человека, способствовать выбору рационального образа жизни и профессиональной ориентации.

Открытие роли нарушений ангиогенеза и ва-скулогенеза в развитии сосудистых осложнений поставило вопрос о возможностях их коррекции с помощью традиционных и новых методов терапии.

Установлено, что регулярные физические нагрузки способны увеличивать количество циркулирующих ЭПК и улучшать их ангиогенную функцию у больных с атеросклерозом нижних конечностей [36]. По предварительным данным, терапия аторвастатином повышает содержание ЭПК в крови больных сахарным диабетом 2-го типа [24]. Комплексное лечение таких больных с включением метформина, статинов, аспирина и антагонистов рецепторов ангиотензина II в наибольшей степени способствует увеличению количества циркулирующих ЭПК [32].

Анти-VEGF терапия рассматривается как перспективный метод при неоваскулярной глаукоме [26]. В пилотных исследованиях установлено, что бевацизумаб может уменьшать интенсивность новообразования сосудов сетчатки и радужной оболочки. Как показали гистологические исследования, введение бевацизумаба уменьшает фе-нестрацию и усиливает апоптоз эндотелия новообразованных сосудов [27].

Предполагают, что средства, блокирующие ангиогенез, смогут найти применение в лечении поражения почек. В экспериментах показана способность ингибиторов ангиогенеза эндостатина, тумстатина, ангиостатина, изокумарина (КМ-3) и вазогибина уменьшать альбуминурию и выраженность структурных почечных изменений [30]. В то же время чрезмерное подавление VEGF может оказывать неблагоприятное действие на почки. Описаны случаи развития тромботической микроангиопатии в почках у больных с злокачественными опухолями, получающими бевацизу-маб. Показано, что экспериментальная «нейтрализация» гена VEGF в подоцитах воспроизводит тромботическую микроангиопатию в клубочках [19]. Небольшая и обычно бессимптомная проте-инурия возникает на фоне лечения ингибиторами VEGF у 21-63 % пациентов с опухолями [23].

Цель терапевтического ангиогенеза - обеспечить реваскуляризацию ишемизированных тканей за счет стимуляции естественных процессов образования и роста сосудов. Ангиогенная

терапия включает в себя применение экзогенных факторов роста, стволовых или прогениторных клеток, а также сочетание этих воздействий. В экспериментальных исследованиях обосновано применение факторов роста (VEGF, ангиопоэ-тинов), мультипотентных стромальных клеток и ЭПК для ускорения заживления язв у животных с сахарным диабетом и ишемией конечностей [11, 12]. Установлена возможность введения ангио-генных факторов роста (VEGF165, FGF-1, НШ-1а) с помощью плазмид или аденовирусов (так называемая «генная терапия») для стимуляции новообразования сосудов в зоне ишемии у пациентов с облитерацией периферических артерий [21]. Показана эффективность стимуляции ангиогене-за у больных с ишемией нижних конечностей с помощью местных внутримышечных инъекций аутологичных мононуклеаров костно-мозгового происхождения или мононуклеаров, выделенных из периферической крови после стимуляции G-CSF [29].

Метаанализ 6 рандомизированных контролируемых исследований 2-й фазы, включавших в общей сложности 543 пациента с перемежающейся хромотой, язвой или критической ишемией, показал, что методы генной и клеточной терапии, стимулирующие ангиогенез, улучшают результаты лечения облитерирующих заболеваний нижних конечностей. Клинический эффект (комбинированная конечная точка) включал увеличение дистанции ходьбы, уменьшение болей в покое, заживление трофических язв или сохранение конечности (различия с плацебо: OR = 1,437, р = 0,033; при критической ишемии: OR = 2,2, р = 0,046). Побочные эффекты (отек, гипотония, протеинурия) несколько чаще встречались в группах активного лечения (OR = 1,81, р = 0,045) [16].

Опубликованы первые результаты применения клеточной терапии у больных с критической ишемией нижних конечностей. Показано, что местное внутримышечное введение аутологич-ных мононуклеарных клеток, выделенных из периферической крови после стимуляции G-CSF, повышает шансы на сохранение конечности. Внутриартериальное введение аутологичных мононуклеарных клеток костно-мозгового происхождения больным с поражением дистальных артерий ног способствовало уменьшению симптомов ишемии и ускорению заживления язв. Клиническая динамика коррелировала с выраженностью неоваскулогенеза [25, 34].

В «Стратегии развития медицинской науки РФ на период до 2025 года» при формировании платформы «профилактическая среда» указано, что «основными результатами научной платформы будет разработка информационных систем

прогнозирования влияния экологических факторов на здоровье человека». Результаты, представленные в настоящем сообщении, показывают, что использование технологий индивидуального анализа генных сетей регуляции ангиогенеза может помочь в создании таких информационных систем прогнозирования, основанных на персонализированных предикторах как общего уровня состояния здоровья и продолжительности срока жизни, так и предрасположенности/резистентности к развитию социально значимых заболеваний.

При хорошо развитой системе раннего генетического прогноза состояния здоровья человека в индивидуальную электронную медицинскую карту могут быть занесены данные о персональном прогнозе общего уровня состояния здоровья человека и его предрасположенности к развитию различных заболеваний, а также о персональной эффективности различных схем профилактических мероприятий, эффективности различных схем терапии развившихся болезней и предполагаемом характере их клинического течения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Коненков В.И., Бородин Ю.И., Любарский М.С. Лимфология. Новосибирск: Манускрипт, 2012. 1001 с.

2. Коненков В.И., Покушалов Е.А., Повещен-ко О.В. Характеристика фенотипа мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором клеток периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012. (1). 9-14.

3. Коненков В.И., Шевченко А.В., Прокофьев В.Ф., Воевода М.И. Полиморфизм генов белков - регуляторов воспаления, при атеросклерозе, осложненном развитием острого инфаркта миокарда // Атеросклероз. 2011. 7. (1). 5-18.

4. Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Механизмы и факторы ангиогенеза // Успехи физиол. наук. 2010. 41. (2). 68-89.

5. Повещенко О.В., Повещенко А.Ф., Коненков В.И. Физиологические и цитологические основы клеточной регуляции ангиогенеза // Успехи физиол. наук. 2012. 43. (3). 48-61.

6. Фильченков А.А. Лимфангиогенез и метастази-рование опухолей // Онкология. 2009. 11. (2). 94-102.

7. Шевченко А.В., Голованова О.В., Коненков В.И. Особенности полиморфизма промоторных регионов генов цитокинов IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и TNF-a европеоидного населения Западной Сибири // Иммунология. 2010. (4). 176-181.

8. Шевченко А.В., Голованова О.В., Коненков В.И. и др. Анализ полиморфизма генов матрикс-ных металлопротеиназ-2 и 9 у пациентов с ишеми-

ческой болезнью сердца // Терапевт. арх. 2010. 82. (1). 31-34.

9. Шевченко А.В., Коненков В.И., Голованова О.В. и др. Полиморфизм гена VEGFA (С-2578А, C+936T) у пациенток с раком молочной железы // Мед. иммунол. 2012. 14. (1-2). 87-94.

10. Ackerman H., Usen S., Mott R. Haplotypic analysis of the TNF locus by association efficiency and entropy // Genome Biol. 2003. 4. 24-27.

11. Amin A.H., Abd Elmageed Z.Y., Nair D. et al. Modified multipotent stromal cells with epidermal growth factor restore vasculogenesis and blood flow in ischemic hind-limb of type II diabetic mice // Lab. Invest. 2010. 90. (7). 985-996.

12. Barcelos L.S., Duplaa C., Krankel N. et al. Human CD133+ progenitor cells promote the healing of diabetic ischemic ulcers by paracrine stimulation of angiogenesis and activation of Wnt signaling // Circ. Res. 2009. 104. (9). 1095-1102.

13. Beekman M., Blanche H., Perola M. et al. GENA consortium. Genome-wide linkage analysis for human longevity: Genetics of Healthy Aging Study // Aging Cell. 2013. 12. (2). 184-193.

14. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing // J. R. Stat. Soc. Series B. Stat. Methodol. 1995. 57. 289-300.

15. Capri M., Salvioli S., Sevini F. et al. Understanding and modulating aging // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. 5. (1067). 252-263.

16. De Haro J., Acin F., Lopez-Quintana A. et al. Meta-analysis of randomized, controlled clinical trials in angiogenesis: gene and cell therapy in peripheral arterial disease // Heart Vessels. 2009. 24. (5). 321-328.

17. Del Bo R., Ghezzi S., Scarlato M. et al. Role of VEGF gene variability in longevity: a lesson from the Italian population // Neurobiol. Aging. 2008. 29. (12). 1917-1922.

18. Dvorac H.F. Vascular permeability factor // J. Clin. Oncol. 2002. 280. 6. 1358-1366.

19. Eremina V., Jefferson J.A., Kowalewska J. et al. VEGF inhibition and renal thrombotic microangio-pathy // N. Engl. J. Med. 2008. 358. (11). 1129-1136.

20. Goligorsky M.S., Kuo M.C., Patschan D., Verhaar M.C. Review article: endothelial progenitor cells in renal disease // Nephrology (Carlton). 2009. 14. (3). 291-297.

21. Gupta R., Tongers J., Losordo D.W. Human studies of angiogenic gene therapy // Circ. Res. 2009. 105. (8). 724-736.

22. Hsie Y., Chang C., Tsai F. T allele for VEGF gene polymorphism at 5-untranslated region is associated with higher susceptibility of leiomyoma // Biochem. Genet. 2008. 46. (5-6). 356-361.

23. Izzedine H., MassardC., Spano J.P. et al. VEGF signalling inhibition-induced proteinuria: Mechanisms, significance and management // Eur. J. Cancer. 2010. 46. (2). 439-448.

24. Jaumdally R.J., Goon P.K., Varma C. et al. Effects of atorvastatin on circulating CD34+/CD133+/ CD45- progenitor cells and indices of angiogenesis (vascular endothelial growth factor and the angiopoie-tins 1 and 2) in atherosclerotic vascular disease and diabetes mellitus // J. Intern. Med. 2010. 267. (4). 385393.

25. Kawamura A., Horie T., Tsuda I. et al. Clinical study of therapeutic angiogenesis by autologous peripheral blood stem cell (PBSC) transplantation in 92 patients with critically ischemic limbs // J. Artif. Organs. 2006. 9. (4). 226-233.

26. Kimoto K., Kubota T. Anti-VEGF agents for ocular angiogenesis and vascular permeability // J. Ophthalmol. 2012. 2012. 852183.

27. Kohno R., Hata Y., Mochizuki Y. et al. Plasma levels of vascular endothelial growth factor and pigment epithelium-derived factor before and after intravitreal injection of bevacizumab // Br. J. Ophthalmol. 2010. 94. (9). 1215-1218.

28. Li Calzi S, Neu M.B., Shaw L.C., Grant M.B. Endothelial progenitor dysfunction in the pathogenesis of diabetic retinopathy: treatment concept to correct diabetes-associated deficits // EPMA J. 2010. (1). 88100.

29. Moazzami K., Majdzadeh R., Nedjat S. Local intramuscular transplantation of autologous mononuclear cells for critical lower limb ischaemia // Cochrane Database Syst. Rev. 2011. 12. CD008347.

30. Nasu T., Maeshima Y., Kinomura M. et al. Vasohibin-1, a negative feedback regulator of angioge-nesis, ameliorates renal alterations in a mouse model of diabetic nephropathy // Diabetes. 2009. 58. (10). 2365-2375.

31. Poveshchenko O.V., Poveshchenko A.F., Ko-nenkov V.I. Endothelial progenitor cells and neovas-culogenesis // Biol. Bull. Rev. 2012. 2. (4). 333-339.

32. Reinhard H., Jacobsen P.K., Lajer M. Multifactorial treatment increases endothelial progenitor cells in patients with type 2 diabetes // Diabetologia. 2010. 53. (10). 2129-2133.

33. Renner W., Kotschan S., Hoffman C. et al. A common 936 C/T mutation in the gene for vascular endothelial growth factor is associated with vascular endothelial growth factor plasma level // J. Vasc. Rev. 2000. 37. 443-448.

34. Ruiz-Salmeron R., de la Cuesta-Diaz A., Constantino-Bermejo M. et al. Angiographic demonstration of neoangiogenesis after intra-arterial infusion of autologous bone marrow mononuclear cells in diabetic patients with critical limb ischemia // Cell. Transplant. 2011. 20. (10). 1629-1639.

35. Schatteman G.C., Dunnwald M., Jiao C. Biology of bone marrow-derived endothelial cell precursors // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2007. 292. (1). 1-18.

36. Schlager O., Giurgea A., Schuhfried O. et al. Exercise training increases endothelial progenitor

cells and decreases asymmetric dimethylarginine in peripheral arterial disease: a randomized controlled trial // Atherosclerosis. 2011. 217. (1). 240-248.

37. Shahbazi M., Fryer A.A., Pravika V et al. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms are associated with acute renal allograft rejection // J. Am. Soc. Nephrol. 2002. 13. 260-264.

38. Takahashi M., Yoshimoto T., Kubo H. Molecular mechanism of lymphoangiogenesis // Int. J. Hemat. 2004. 80. (1). 29-34

39. Wei L., Liu Y., Chen G. Differentiation of lymphatic endothelial cells from bone marrow mesenchymal stem cells with VEGF // Lymphology. 2012. 45. 177-187.

PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF LYMPHANGIOGENESIS GENE POLYMORPHISM IN LEVEL OF PERSON HEALTH VALUATION

Vladimir Iosifovich KONENKOV, Viktor Fedorovich PROKOF'EV, Аlla Vladimirovna Shevchenko

Institute of Clinical and Experimental Lymphology of SB RAMS 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2

Analysis of occurrence frequency of genotypes of VEGF (vascular endothelial growth factor) in two polymorphic gene regulatory region positions in combination with other genotypes of those angiogenic cytokines and metalloproteinases in groups of healthy people of different ages has been carried out. The SNP promoter of genes TNFA -863 C ^ A, TNFA -308 G ^ A, TNFA -238 G ^ A, IL1/3 -511 T ^ C, IL1/3 -31 C ^ T, IL-4 -590 C ^ T, IL-6 -174 G ^ C, IL-10 -1082 G ^ A and IL-10 -592 A ^ C, genes of matrix metalloproteinases MMP2-1306 C ^ T, MMP9 -1562 C ^ T, and gene of VEGF-vascular endothelial growth factor VEGF-2578 A ^ C and VEGF +936 C ^ Thave been investigated. The statistical analysis of the studies results included such indicators as the rate of occurrence of genes, genotypes and their combinations, specificity, odds ratio (or) with 95% confidence intervals (CI). The group surveyed ranked 219 people; the investigated signs were compared in the subgroup of young people (less than 35 years - 103) and senior citizens (55 years and over - 116 persons). It has been found that among older people the whole range of combined genetic traits, including VEGF and homozygous genotypes of polymorphic variants of genes of cytokines is fully absent, with the high frequency in the group of young people. The frequency of other genetic combinations, which are more frequent among young people, significantly reduced (by several times). This group combined genetic traits, which frequency decreases with age, most often detected in AC and CC options polymorphic gene VEGF-2578 positions and VEGF +936, associated with high levels of production growth factor of vascular endothelial function. It can be assumed that the presence of such combinations of genotypes in the young man's genome is an adverse prognostic sign, pointing to the short lifespan of a given individual that probably gives an indication of the low level of health state and his inclusion in the group of high risk diseases.

Key words: single nucleotide polymorphism of promoter gene region, genes of cytokines, growth factors, vascular endothelial function, lymphangiogenesis, genetics of human longevity.

Konenkov V.I. - doctor of medical sciences, academician of RAMS, director, e-mail: lymphology@soramn.ru Prokofiev V.F. - candidate of medical sciences, leading researcher

Shevchenko A.V. - candidate of biologic sciences, senior researcher of laboratory for clinical immunogenetics