УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

Область техники, к которой относится полезная модель.
Полезная модель относится к области измерительных устройств, а именно к устройствам для количественного измерения интенсивности свечения, возникающего в ходе протекания химических реакций (хемилюминесценции) или генерируемого биологическими объектами в процессе их жизнедеятельности (биолюминесценции).
В частности, полезная модель предназначена для измерения слабых свечений жидких сред, содержащих компоненты ферментных систем, тканевые гомогенаты или клеточные суспензии.
Задача определения интенсивности хемилюминесценции возникает при осуществлении исследований, ставящих своей целью количественную характеристику процессов перекисного окисления липидов, образования активных форм кислорода или реакций окиси азота. Отдельное направление подобных исследований составляет так называемая «активированная хемилюминесценция», предусматривающая добавление к реакционным смесям особых веществ, способных усиливать интенсивность свечения в сотни и тысячи раз.
Задача определения биолюминесценции возникает при проведении исследований биотоксичности различных природных сред, основанной на измерении тушения спонтанного свечения природных или рекомбинантных люминесцирующих бактерий.
Таким образом, предлагаемая полезная модель предназначена для использования в лабораториях биологического, медицинского и санитарно-гигиенического профиля, использующих в своей работе аналитические технологии, основанные на явлениях хемилюминесценции или биолюминесценции.
Уровень техники.
Типичный люминометр включает темновую камеру для размещения исследуемой пробы, сопряженный с ней фотоприемник (обычно высокочувствительный фотоэлектронный умножитель - ФЭУ), а также подключенную к нему систему регистрации импульсов, последняя из которых позволяет количественно выразить интенсивность свечения (SU 1343249, опубл. 07.10.1987).
В частности, известен анализатор жидких проб, содержащий реакционную камеру и систему регистрации, включающую ФЭУ, блок питания, блоки усиления и вывода данных на внешние регистрирующие устройства, в схеме которого блок питания подключен к элементам схемы регистрации, а сами названные элементы соединены последовательно (RU 2009466, опубл. 15.03.1994). При этом с целью повышения стабильности работы прибора он дополнительно содержит совокупность механических устройств, исключающих попадание внешнего света на ФЭУ во время смены анализируемых образцов.
Другим вариантом совершенствования отдельных узлов люминометра является устройство для измерения хемилюминесценции и биолюминесценции жидкости, в котором с целью повышения эффективности регистрации предусмотрено термостатирование кюветы с анализируемым образцом, а сама кювета снабжена приводом для обеспечения ее вращения вокруг оси во время измерения (SU 1400258, опубл. 10.01.2000).
Еще один известный подход заключается в том, что система регистрации люминесценции содержит средства для линеаризации характеристики выходного сигнала (RU 2200315, опубл. 10.03.2003). При этом выход ФЭУ подключен к компаратору, к другому выходу которого подключен блок задания порогового уровня, а также имеется несколько иных усовершенствований электронной системы регистрации импульсов.
В то же время изучение доступной литературы, в которой приводятся сведения об известных аналогах, позволяет констатировать, что основной причиной, препятствующей получению технического результата, который обеспечивается заявляемой полезной моделью, является отсутствие возможности проведения одновременной оценки интенсивности свечения более чем в одной анализируемой пробе. Однако, большинство измерительных технологий, использующих явления хемилюминесценции и биолюминесценции, предусматривает сравнительную оценку интенсивности свечения как минимум в двух - контрольной и опытной пробах. Указанная особенность обуславливает необходимость постоянной смены образцов в темновой камере, исключает возможность одновременного сравнительного (в том числе - кинетического) анализа интенсивности свечения в опытной и контрольных пробах и, в конечном счете, негативно сказывается на точности определения и длительности его проведения.
Альтернативные подходы, ведущие к устранению данного недостатка, в доступной нам литературе не описаны. Таким образом, в уровне техники не известно средство того же назначения, что и полезная модель, которому присущи все приведенные в независимом пункте формулы полезной модели существенные признаки.
Раскрытие полезной модели.
Основной задачей, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, является создание технических возможностей для одновременного определения интенсивности хемилюминесценции или биолюминесценции в двух (контрольной и опытной) пробах, что позволяет повысить точность их сравнения, а также примерно в два раза сократить время проведения анализа.
Дополнительной задачей, решаемой при использовании предлагаемой полезной модели, является возможность растянутого во времени (кинетического) сравнительного анализа опытной и контрольной проб, позволяющего оценивать не только конечный результат реакции хемилюминесценции или биолюминесценции по некоей «точке», удаленной по времени от начала реакции, но и отслеживать ход самих этих реакций в режиме реального времени.
Таким образом, обеспечиваемый заявляемой полезной моделью технический результат заключается в повышении точности исследования, сокращении времени его проведения, а также возможности сравнительного кинетического анализа хода ферментативных и биологических реакций, сопровождающихся генерацией свечения.
Сущностью заявляемой полезной модели как технического решения, выражающегося в совокупности существенных признаков, достаточных для достижения обеспечиваемого полезной моделью технического результата, является следующее:
- для одновременной оценки интенсивности хемилюминесценции или биолюминесценции в двух (контрольной и опытной) пробах, содержащих идентичные компоненты для реакции генерации свечения, но отличающихся по наличию определяемого (действующего) компонента, предлагается их помещение в единое кюветное отделение, обеспечивающее идентичный режим инкубирования, но содержащее две отдельные темновые камеры, каждая из которых сопряжена с отдельным регистратором свечения (ФЭУ), сигнал с каждого из которых через независимые усилители передается на единое сопрягающее устройство, позволяющее не только количественно оценить интенсивность свечения в каждой пробе, но и провести расчет абсолютной и относительной разницы между ними.
Принципиальная схема заявляемого устройства изображена на фиг.1 и включает кюветное отделение с двумя темновыми камерами (для контрольной и опытной проб), в оптической связи с которыми находятся два регистратора слабых свечении на основе ФЭУ, каждый из которых сопряжен с одной из темновых камер. Сигналы с ФЭУ поступают на входы независимых усилителей, соединенных с единым устройством сопряжения и далее с персональным компьютером.
Идентичность условий, создаваемой для каждой из сравниваемых проб, обеспечивается вращением содержащих их цилиндрических кювет вокруг своей оси единым устройством, состоящим из фиксирующего элемента (стакан с резиновыми кольцами, соединенный с валом с насаженным на него шкивом), электродвигателя и стабилизатора вращения, а также термостатированием кюветного отделения единым нагревателем. Электропитание всех устройств, входящих в структуру биохемилюминометра, также осуществляется от единого источника.
Среди перечисленных выше признаков наиболее существенным (влияющим на возможность получения технического результата и находящимся с ним в причинно-следственной связи) и отличительными от наиболее близких аналогов является кюветное отделение, имеющее не одну, а две светоизолированные камеры, что создает условия для одновременного анализа двух проб. Вторым существенным признаком, также отличающим заявляемую полезную модель от известных аналогов, является наличие не одного, но двух фотоэлектронных умножителей, каждый из которых регистрирует свечение в одной из проб, находящейся в соответствующей ему светоизолированной камере.
Среди прочих элементов заявляемого устройства, частично или полностью совпадающих с аналогами, но указанных в его формуле и значимых для получения технического результата, следует указать на совокупность устройств по перемешиванию контрольной и опытных проб путем их вращения вокруг собственной оси, что исключает возможность оседания клеточных суспензий под действием силы тяжести и также повышает точность измерения. В то же время при проведении исследований свечения растворимых ферментных систем или клеточных экстрактов использование данного узла заявляемой модели не является обязательным.
Термостатирование контрольной и опытной проб, указанное в формуле заявляемой полезной модели, также распространяется на частные формы его реализации, а именно на те случаи, когда для протекания реакций хемилюминесценции или биолюминесценции необходима некая оптимальная температура (наиболее часто 37°С).
Краткое описание чертежей.
На фиг.2 (вид сверху без крышки) и фиг.3 (вид сбоку в сечении А-А) изображена конструкция кюветного отделения, являющегося основным структурным элементом заявляемой полезной модели в определении взаимоположения ее прочих элементов и определенным образом ориентирующим вокруг себя регистрирующие, термостатирующие и вращательные устройства биохемилюминометра.
Конструкция кюветного отделения, представляет собой цельнометаллический корпус (1) с двумя цилиндрическими гнездами (2), каждое из которых имеет боковое окно (3) с сосной ему цилиндрической выточкой для крепления ФЭУ (4).
Для предотвращения засветки чувствительных элементов ФЭУ в структурной связи с боковыми окнами кюветного отделения между выточками и гнездами помещены два затвора (5), представляющие собой поджатые пружинами (6) пластинки, передвигающиеся внутри прямоугольных пазов и имеющие отверстия (7), совпадающие по размерам с боковыми окнами, но в нерабочем состоянии находящиеся с ними на разных уровнях. При закрытии же кюветного отделения штырьки крышки (8) утапливают затворы, совмещая прорезанные в них окна с окнами гнезд, создавая тем самым условия для регистрации свечения в пробах.
В нижней части кюветного отделения на дне гнезд находятся цилиндрические стаканы для фиксации кювет (9), каждый из которых через систему передачи вращения (10) сопряжен с низкоскоростным электродвигателем, обеспечивающим вращение кювет вокруг собственной оси со скоростью 60-120 об/мин.
Кроме того, в кюветное отделение вмонтирован резистивный нагревательный элемент, состоящий из нагреваемых пластин (11), закрепленных на боковых стенках кюветного отделения, а также имеется термоконтроллер, позволяющий оценивать текущую температуру и изменять ее в зависимости от целей исследования или при отклонении от заданного режима.
Описанная выше механическая связь между структурными элементами предлагаемой полезной модели дополняется передачей данных об интенсивности регистрируемого свечения с каждого из ФЭУ через систему независимых усилителей на единое электронное сопрягающее устройство и далее на ПК.
Осуществление полезной модели.
Полезная модель работает следующим образом:
1) после подключения устройства к электрической сети в первое гнездо кюветного отделения помещается пробирка с контрольной пробой, содержащей все компоненты для генерации свечения в результате реакции хемилюминесценции или биолюминесценции, но не содержащей анализируемое вещество (смесь веществ);
2) во второе гнездо кюветного отделения помещается пробирка с анализируемой пробой;
3) в зависимости от значений температурного оптимума свечения включается или остается выключенным блок термостатирования;
4) в зависимости от используемых компонентов (клеточные суспензии или растворимые ферментные системы) включается или остается выключенным блок перемешивания проб;
5) кюветное отделение закрывается крышкой, штырьки которой утапливают затворы, совмещая прорезанные в них окна с окнами гнезд, в которых находятся анализируемые пробы;
6) проводится измерение интенсивности свечения в каждой из сравниваемых проб с использованием двух независимых ФЭУ;
7) сигналы с ФЭУ, прошедшие через независимые усилители преобразуются на едином устройстве сопряжения и поступают на ПК, где происходит оценка абсолютного и относительного различия между ними;
8) анализируемая проба извлекается из второго гнезда кюветного отделения, после чего на ее место последовательно помещаются вторая, третья и др. анализируемые пробы, после чего весь цикл с п1 повторяется.
Таким образом, основным техническим результатом, формирующимся в результате использования полезной модели, является одновременная регистрация интенсивности свечения в опытной и контрольной пробах, что позволяет повысить точность измерения и сократить время проведения анализа.
Пример.
к
o
к
к
o
Полезная модель, в частности, может использоваться при осуществлении метода оценки биотоксичности различных природных сред и отдельных химических соединений, основанного на измерении их воздействия на уровень свечения микробных биотестов (природных или рекомбинантных люминесцирующих бактерий) по сравнению с контролем - теми же микроорганизмами, инкубируемыми в биологически инертной жидкой среде. Итоговый расчет биотоксичности проводится по формуле (I-I)/I*100%, где I - интенсивность свечения контрольной пробы, I - интенсивность свечения опытной пробы, содержащей те же люминесцирующие бактерии и инкубируемой в тех же температурных и иных условиях, но подвергнутой воздействию анализируемого вещества (смеси веществ).
Однако, при проведении значительных по объему определений, предусматривающих исследование целых серий анализируемых веществ или их смесей, уровень спонтанной (контрольной) люминесценции во времени имеет тенденцию к постоянному изменению (обычно, снижению), что объясняется исчерпанием субстратных ресурсов для поддержания свечения. В этих условиях для обеспечения достаточной точности
измерения приходится многократно измерять значения контроля, что требует целой серии последовательных замен контрольной и различных опытных проб в кюветном отделении обычного биохемилюминометра, отрицательно сказывается на точности определения и увеличивает его продолжительность.
Использование заявляемой полезной модели позволяет устранить эти недостатки, так как при ее осуществлении возможна одновременная оценка свечения в контрольной и опытной пробе, первая из которых остается в соответствующем гнезде кюветного отделения, а последовательной замене подлежат только опытные пробы. Указанная особенность позволяет игнорировать значимое для получения конечного результата постепенное снижение интенсивности свечения в контрольной пробе, т.к. в каждый конкретный цикл измерения сопоставляются образцы, одинаково отстоящие по времени от начала эксперимента и характеризующиеся сходным «ресурсом» субстратов для реакции биолюминесценции.
Среди прочих элементов заявляемого устройства, указанных в его формуле и значимых для получения технического результата в описываемом примере, следует указать на совокупность устройств по перемешиванию контрольной и опытных проб путем их вращения вокруг собственной оси, что исключает возможность оседания бактериальных суспензий под действием силы тяжести и также повышает точность измерения.
Термостатирование контрольной и опытной проб, также указанное в формуле заявляемой полезной модели, распространяется на частные формы его реализации описываемого примера, а именно на те случаи, когда для протекания реакций хемилюминесценции или биолюминесценции необходима оптимальная температура 37°С. В частности, использование данного элемента полезной модели при определении биотоксичности целесообразно в случае использования микробных биосенсоров с lux-оперонами почвенной люминесцирующей бактерии Photorhabdus luminescens с температурным оптимумом 37°С. В иных случаях, например при использовании в качестве микробных биосенсоров с lux-оперонами морских микроорганизмов Photobacterium leiognathi с температурным оптимумом 22-24°С использование данного узла при условии аналогичной температуры в лабораторном помещении также не является обязательным.