СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОКРИСТАЛЛИТОВ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА
METHOD FOR PRODUCING NANOCRYSTALLITES OF LOW-MOLECULAR CHYTOSAN

Изобретение относится к способам получения производных хитина, а именно к способу получения низкомолекулярного хитозана, и может быть использовано в химических производствах для создания новых лекарственных и косметических препаратов.
В России на протяжении последних лет природный полимер хитозан находит широкое использование в различных отраслях промышленности и медицины благодаря сочетанию его уникальных специальных свойств и широкой доступности.
Хитозан является физиологически активным соединением природного происхождения и представляет собой высокомолекулярные углеводы, построенные из остатков моносахаридов и не содержащие никаких компонентов неуглеводного характера. Хитозан представляет собой биополимер с высокой молекулярной массой 1000 кДа и выше, низкой биологической активностью, высокой вязкостью и низкой растворимостью в нейтральных средах.
В настоящее время актуальными являются исследования процессов деструкции высокомолекулярного хитозана (ВМХ) для получения низкомолекулярных препаратов, обладающих более высокой биологической активностью, чем природный полимер и разработка новых современных технологий для их производства.
Известны различные способы деструкции хитозана, например, достаточное распространение получил способ ферментативного гидролиза хитозана с использованием специфических ферментов; обработка хитозана в кислых средах; облучение ультразвуком; деструкция в токе плазмы.
Известен способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана путем ферментативного расщепления ВМХ, заключающийся в том, что ферментативное расщепление проводят с использованием иммобилизованного на инертном носителе хитиназного комплекса в две стадии: сначала при рН 4,5-5,0 и температуре 45-50°С в течение 16 часов при массовом соотношении хитозан: иммобилизованный на инертном носителе хитиназный комплекс 1:10, а затем при рН 6,0-6,5, температуре 37°С в течение 8-12 часов при том же их массовом соотношении.
Известный способ позволяет получать низкомолекулярный хитозан (НМХ) с молекулярной массой 1000-3000 дальтон, обладающий хорошей растворимостью и может быть использован в качестве носителя биологически активных соединений и как противовирусный препарат (RU 2073016, С08В 37/08, опубл. 10.02.1997).
Недостатками известного способа являются длительность процесса и его низкая производительность, к тому же процесс идет в кислой среде с образованием солей, которые в промышленных условиях трудно выводить.
Известен способ получения НМХ в бессолевой среде путем ферментативной деполимеризации, включающий переосаждение исходного ВМХ, отмывку переосажденного хитозана с помощью крупнопористого фильтра, растворение переосажденного хитозана в растворе кислоты до оптимального для ферментативной деполимеризации значения рН 5,5 с последующей ферментативной деполимеризацией хитозана с использованием ферментного препарата целловиридин Г20Х.
Полученный НМХ имеет молекулярную массу (мм) 2-20 кДа, высокую биологическую активность и способность растворяться в нейтральных растворах (RU 2425844, С08В 37/08, опубл. 10.08.2011).
Однако известно, что ферментные препараты работают в узких диапазонах рН, в связи с чем необходимо устанавливать и поддерживать в процессе реакции заданное значение рН, что технологически является достаточно сложным и дорогим.
Известен способ получения НМХ, включающий приготовление раствора ВМХ в 1% водной уксусной кислоте, прибавление к нему раствора пероксида водорода в количестве 0,5-1,5 мас. % к общей массе раствора в присутствии каталитических количеств оксида марганца, выдерживание при температуре 18-50°С в течение 30 мин, добавление по окончании времени реакции водного раствора аммиака, доводя рН реакционной смеси до 6,9-7,0, после выпадения осадка в реакционную массу прибавляют ацетон и выдерживают в течение 2 часов, осадок отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и ацетоном, сушат.
По известному способу получают НМХ с молекулярной массой 30 кДа; 9 кДа; 3 кДа (RU 2417088, С08В 37/08, опубл. 27.04.2011).
Недостатком известного способа является длительность технологического процесса, что удорожает производство.
Известен способ получения наночастиц сукцината хитозана, включающий взаимодействие хитозана и янтарной кислоты с последующим выделением целевого продукта, причем готовят 0,11-0,17% раствор янтарной кислоты при комнатной температуре, фильтруют нерастворившуюся янтарную кислоту и вносят в полученный раствор предварительно очищенный НМХ с молекулярной массой 3 кДа; 9 кДа; 30 кДа, выдерживают при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение 2 часов, по окончании реакции добавляют этанол и центрифугируют, твердый осадок фильтруют и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С.
Размер частиц НМХ составляет 165 Нм; 186 Нм; 205 Нм; 270 Нм (RU 2562721, С08В 37/08, опубл. 10.09.2015).
Известен способ получения наночастиц глутамата хитозана, включающий взаимодействие хитозана с водным раствором глутаминовой кислоты при комнатной температуре и перемешивании с последующим извлечением глутамата хитозана, отличающийся тем, что используют НМХ молекулярной массы 3 кДа; 9 кДа; 30 кДа, который обрабатывают в течение 2 часов 0,005-0,1375% раствором глутаминовой кислоты при соотношении хитозан: глутаминовая кислота 1:0,864 при перемешивании со скоростью 200 об/мин, по окончании реакции прибавляют этанол и центрифугируют, твердый осадок фильтруют и сушат в вакуумном сушильном шкафу при температуре 30°С. Получают глутамат хитозана с наночастицами от 40 до 100 Нм (RU 2562723, С08В 37/08, опубл. 10.09.2015)
В известных способах для получения наночастиц НМХ обрабатывают НМХ с молекулярной массой 3 кДа; 9 кДа; 30 кДа. Однако по известным технологиям невозможно получить НМХ с высокой степенью кристалличности.
Известен способ получения наночастиц НМХ, включающий приготовление раствора предварительно очищенного НМХ в фильтрованной 1-2 мас. % водной уксусной кислоте, прибавление растворов гидроксидов щелочных металлов или аммония в течение 2 часов, диспергирование системы с помощью механической мешалки со скоростью 200-300 об/мин при температуре 20°С до рН 6,9-7,0, по окончании процесса дисперсию центрифугируют со скоростью 10000 об/мин и полученный твердый осадок редиспергируют в бидистилляте при механическом перемешивании со скоростью 200-300 об/мин при 20°С.
Размер полученных наночастиц составляет 30 Нм; 50 Нм; 83 Нм (RU 2428432, С08В 37/08, опубл. 10.09.2011).
Однако следует отметить, что выше описанные известные способы не решают проблему получения нанокристаллитов НМХ.
Наиболее близким аналогом к заявленному техническому решению является способ получения микрокристаллического хитозана путем его осаждения из водного кислого раствора водным раствором щелочи, заключающийся в том, что водный кислый раствор 0,01-2,1 мас. хитозана (мм 600-700 кДа) и водный раствор щелочи с концентрацией 0,1-20,0 мас, одновременно вводят в реактор с получением смеси, имеющей рН, равной или выше 7, при скорости подачи раствора хитозана 1,2 5,3 об.ч./час и раствора щелочи 0,7 10 об.ч./час на 1 об.ч. реактора, а образующуюся дисперсию непрерывно выводят из реактора со скоростью, необходимой для поддержания постоянного объема дисперсии в реакторе, с последующей очисткой дисперсии, концентрированием и высушиванием. Размер полученных частиц составляет 0,1-10 мкм; 5-15 мкм; 15-20 мкм; 20-30 мкм; 40-50 мкм (RU 2046800, С08В 37/08, опубл. 27.10.1995).
Одним из основных недостатков известного способа является получение хитозана с высокой молекулярной массой (90-500 кДа) и с низкой биологической активностью.
Технический результат от использования изобретения заключается в создании высокоэффективной технологии получения низкомолекулярного хитозана с высокой степенью кристалличности, повышенной термостабильностью, высокой антимикробной активностью и с повышенной биологической совместимостью.
Данный технический результат достигается за счет предлагаемого способа получения нанокристаллитов низкомолекулярного хитозана при интенсивном перемешивании, включающего диспергирование в воде высокомолекулярного хитозана с молекулярной массой 190-250 кДа, последующую обработку в 9,0-17,0%-ном водном растворе серной кислоты при 100-120°С в течение 20-55 мин для проведения гомогенного гидролиза, высаживание продукта гидролиза из сернокислого раствора, путем введения в горячий раствор 10%-ного раствора гидроксида натрия при объемном соотношении гидроксида натрия и серной кислоты, равном соответственно 1:0,667, промывку и сушку полученного продукта при комнатной температуре.
Испытания проводили с использованием современных методов: ИК-спектроскопия; ядерно-магнитный резонанс; атомно-силовая микроскопия (АСМ); термогравиметрический анализ (ТГА); потенциометрия, УФ-фотокалориметрия, сорбционные, биохимические и другие. Обрабатывали полученные данные методами математической статистики.
По предлагаемому способу в процессе осаждения продукта гидролиза из сернокислого раствора при гомогенном гидролизе происходит формирование кристаллической структуры. Сопоставление уровней степени полимеризации и степени кристалличности полученного НМХ свидетельствуют о получении в предложенных условиях нанокристаллитов.
Исследования методом ТГА показали, что структура полученного НМХ более упорядочена и вследствие этого более термоустойчива по сравнению с исходным хитозаном, а именно полученный НМХ обладает повышенной термостабильностью.
НМХ в твердой фазе обладает высокой степенью кристалличности (90%), т.е. получен чистый продукт, не содержащий примесей, хорошо растворим в подкисленной воде, который может быть диспергирован в жидкой среде до наночастиц.
При исследовании морфологии полученных наночастиц НМХ методом АСМ определен их средний размер 100 Нм в диаметре и 20 Нм в высоту, что свидетельствует о получении в принятых условиях кристаллических структур. Наночастицы представляют собой агрегаты, состоящие из 12-25 кристаллитов.
Разработана высокоэффективная технология получения нанокристаллитов НМХ, а именно в едином технологическом процессе получен НМХ и нанокристаллиты, получен новый продукт - НМХ в виде нанокристаллитов с новыми свойствами.
Предложенный способ, по которому деструкцию ВМХ проводят сернокислотным гомогенным гидролизом, более эффективен в сравнении, например, с уксуснокислым гидролизом. Так продолжительность реакции до получения НМХ с молекулярной массой 5-30 кДа сокращается с 1500 до 20-55 мин.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Конкретные примеры осуществляют в лабораторном реакторе при постоянном интенсивном перемешивании со скоростью от 20 до 90 об/мин.
Пример 1
В сухой реактор при комнатной температуре загружают 5 г ВМХ мм 190 кДа, затем при перемешивании со скоростью 20-25 об/мин подают 90 мл дистиллированной воды и диспергируют 10 мин, полученную дисперсию нагревают до 100°С и вводят 10 мл 9%-ного водного раствора серной кислоты при скорости перемешивания 60-70 об/мин, проводят гомогенный гидролиз в течение 20 мин. По истечении времени гидролиза скорость перемешивания увеличивают до 80-90 об/мин и для высаживания продукта гидролиза в горячий раствор вводят 10%-ный раствор гидроксида натрия, при объемном соотношении гидроксида натрия и серной кислоты 1:0,667, а последующие промывки ведут дистиллированной водой до нейтральной среды и ацетоном, сушку осуществляют при комнатной температуре.
Полученный НМХ мм 30 кДа со степенью кристалличности 87%, со степенью полимеризации 185.
Пример 2
Обработку ведут по примеру 1, но берут ВМХ мм 250 кДа, вводят 10 мл 17%-ного водного раствора серной кислоты, проводят гомогенный гидролиз в течение 30 мин при 115°С.
Получают НМХ мм 25 кДа, степень кристалличности 90%, степень полимеризации 155.
Пример 3
Обработку ведут по примеру 1, но вводят 10 мл 17%-ного водного раствора серной кислоты, проводят гомогенный гидролиз в течение 55 мин при 120°С.
Получают НМХ мм 5 кДа, степень кристалличности 85%, степень полимеризации 30.
Предложена новая технология снижения молекулярной массы хитозана, получен новый НМХ с молекулярной массой 5-30 кДа с высокой степенью кристалличности, низкой степенью полимеризации с повышенными физико-механическими и функциональными свойствами, что дает возможность получать новые полимерные материалы с использованием низкомолекулярных нанокристаллитов хитозана и разрабатывать нановолокнистые полимерные пленки, гранулы, волокна для медицины, а также использовать полученный новый НМХ в качестве стабилизатора в косметологии, в пищевой промышленности и в сельском хозяйстве.
Полученный предлагаемым способом новый НМХ обладает ранозаживляющими, антимикробными свойствами. Нановолокнистый материал, изготовленный с его использованием, является перспективным для применения в качестве аппликативного покрытия для гнойных, ожоговых и послеоперационных ран.
Были проведены испытания по определению биологической активности нового НМХ по выживаемости клеток линии мышиных фибробластов L 929 после 24 часов инкубирования с экстрактами и контроль (100%) - клетки, культивируемые в среде без добавления экстрактов.
Согласно полученным данным по результатам МТТ теста установлено, что культивирование клеток в присутствии экстрактов материалов (нового НМХ) не снижает жизнеспособность клеток и не влияет на их морфологию, а следовательно, новый НМХ обладает высокой биологической совместимостью.
Антимикробную активность полученного нановолокнистого материала с использованием нового НМХ определяли по отношению к грамположительной микрофлоре Staphylococcus aureus и к грамотрицательной микрофлоре Escherichia coli.
Нановолокнистый материал с использованием нового НМХ обладает повышенной антимикробной активностью по сравнению с волокнистыми материалами с использованием исходного ВМХ, а по сравнению с нановолокнистым материалом, содержащим мирамистин, разница в размерах зон лизиса составляет 1-2 мм (см. таблицу).