СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБ ДЛЯ ЭКСТРАКЦИОННО-ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАТИОННЫХ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦ
METHOD TO PREPARE SAMPLES FOR EXTRACTION-PHOTOMETRIC METHOD OF DETECTING RESIDUAL QUANTITIES OF CATIONIC SURFACTANTS IN MUSCULAR TISSUE OF ANIMALS AND BIRDS

Изобретение относится к ветеринарной медицине, в частности к способам подготовки проб для экстракционно-фотометрического метода определения остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани животных и птиц.
В связи с широким распространением в ветеринарной практике препаратов из группы катионных поверхностно-активных веществ, для контроля пищевой безопасности продуктов животноводства необходимо точное определение их остаточных количеств в мышечной ткани животных и птиц и сроков выведения из организма.
Известен способ подготовки проб для экстракционно-фотометрического метода определения содержания остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани животных и птиц, включающий приготовление суспензии мышечной ткани, ее осветление путем коагуляции и осаждения белков трихлоруксусной кислотой и повышение рН до 6,8 раствором гидроксида натрия (Николаенко В.П. Токсичность бактерицида и его количественное определение./В.П.Николаенко, И.Н.Щедров. // Ветеринария. - 2005. - №4. - С.38-41).
Недостатком известного способа является невысокая чувствительность пробы, связанная с тем, что после подготовки проб в суспензии мышечной ткани остается значительное количество белков, пептидов, липидов и других органических веществ, затрудняющих фотометрическое определение искомого элемента.
Задача изобретения - повышение чувствительности пробы для экстракционно-фотометрического метода определения остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани животных и птиц.
Технический результат - повышение чувствительности пробы и достоверности прогноза сроков выведения катионных поверхностно-активных веществ из организма для экстракционно-фотометрического метода определения остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани животных и птиц.
Технический результат достигается тем, что в способе подготовки проб для экстракционно-фотометрического метода определения остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани животных и птиц, включающем приготовление суспензии мышечной ткани, ее осветление путем коагуляции и осаждения белков и повышение pH до 6,8 раствором гидроксида натрия, дополнительно удаляют липиды из суспензии мышечной ткани двойной обработкой диэтиловым эфиром, при этом коагуляцию и осаждение белков в последней осуществляют методом Карреза.
4
6
2
3
2
3
3
3
Способ осуществляют следующим образом: к суспензии мышечной ткани объемом 80 мл добавляют 10 мл раствора Карреза I (106 г железистосинеродистого калия KFe(CN)·3HО растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 1 дм), тщательно перемешивают, добавляют 10 мл раствора Карреза II (238 г уксуснокислого цинка Zn(CHCOO)2HО и 30 см ледяной уксусной кислоты растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 1 дм) и вновь тщательно перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 30 мин, надосадочную жидкость фильтруют через бумажный фильтр, полученный фильтрат обрабатывают двумя порциями по 10 мл диэтилового эфира, повторно процеживают через фильтровальную бумагу и добавляют 5%-ный раствор гидроксида натрия до pH 6,8.
Метод Карреза основан на адсорбционном осаждении белков цинком гексаноферратом (II) при обработке растворами Карреза I и Карреза II (цинк в составе реактивов нейтрализует отрицательный заряд на фосфатах миозина и ранее отрицательно заряженные взаимно отталкивающиеся молекулы начинают притягиваться), что позволяет более дифференцированно осуществить выделение и осаждение белков в мышечной суспензии по сравнению с известным способом, тем самым снизив в пробе содержание протеиновых структур, затрудняющих фотометрическое определение катионных поверхностно-активных веществ.
Пример 1.
При проверке полноты экстракции катионных поверхностно-активных веществ из мышечной ткани животных и птиц при подготовке проб для экстракционно-фотометрического метода определения остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ использовали мышечную ткань крупного рогатого скота, не подвергавшегося обработке катионными поверхностно-активными веществами. В навески тонкоизмельченного образца мышечной ткани вносили 50 мкг катионного поверхностно-активного вещества (мирамистина). Пробы готовили известным и описанным выше способами, затем определяли в них содержание мирамистина с помощью фотометрии. Значения степени извлечения мирамистина из образцов мышечной ткани крупного рогатого скота представлены в таблице 1. Из полученных данных видно, что предлагаемый способ определения катионных поверхностно-активных веществ характеризуется более высокой степенью экстракции аналита из мышечной ткани животных.
Таблица 1
№ п/п
Найдено, мкг
Степень извлечения, %
Известным способом подготовки проб
Согласно заявленному способу подготовки проб
Известным способом подготовки проб
Согласно заявленному способу подготовки проб
1.
35,5
41,1
71,0
82,2
2.
34,0
39,5
68,0
79,0
3.
37,9
43,5
75,8
87,0
4.
37,2
42,7
74,4
85,4
5.
36,7
41,6
73,4
83,2
Среднее
36,3±0,59
41,7±0,77
72,5±1,26
83,4±1,54
Пример 2.
Определение содержания остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани животных и сроков их выведения из организма проводили в опыте на 60 белых крысах (n=5) массой 280-300 г. Было сформировано 8 опытных и 4 контрольных группы. Крысам первой, четвертой, седьмой и десятой групп внутримышечно ввели катионное поверхностно-активное вещество (препарат мирамистин) в дозе 2,0 мл/гол., второй, пятой, восьмой и одиннадцатой - мирамистин в дозе 1,0 мл/гол. Образцы мышечной ткани крыс первой и второй групп исследовали на содержание остаточных количеств мирамистина через одни сутки после введения препарата, четвертой и пятой - через трое суток, седьмой и восьмой - через пять суток, десятой и одиннадцатой - через семь суток. Животные третьей, шестой, девятой и двенадцатой групп не обрабатывались препаратом и служили контролем соответственно через одни сутки, трое, пять и семь суток. Образцы мышечной ткани всех 60 белых крыс исследовались на содержание остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ экстракционно-фотометрическим методом, включающим подготовку проб предлагаемым способом и параллельно экстракционно-фотометрическим методом, включающим подготовку проб известным способом. Результаты сравнительного определения остаточных количеств мирамистина в мышечной ткани животных экстракционно-фотометрическим методом, включающим подготовку проб известным и предлагаемым способами, приведены в таблице 2.
Таблица 2
№ группы
Сроки отбора проб мяса
Содержание мирамистина, мг/кг, определенное
Известным способом подготовки проб
Согласно заявленному способу подготовки проб
1
2
3
4
1.
Через одни сутки после введения дозы 2,0 мл
3,255±0,355**
2,570±0,413**
2.
Через одни сутки после введения дозы 1,0 мл
2,258±0,286**
1,610±0,306**
3.
Контроль через одни сутки
0,025±0,004
0,007±0,002
4.
Через трое суток после введения дозы 2,0 мл
1,301±0,239**
0,809±0,256**
5.
Через трое суток после введения дозы 1,0 мл
0,780±0,217**
0,392±0,118**
6.
Контроль через трое суток
0,017±0,003
0,005±0,002
7.
Через пять суток после введения дозы 2,0 мл
0,032±0,007*
0,010±0,004
8.
Через пять суток после введения дозы 1,0 мл
0,027±0,008*
0,007±0,003
9.
Контроль через пять суток
0,018±0,004
0,008±0,002
10.
Через семь суток после введения дозы 2,0 мл
0,024±0,005
0,007±0,002
11.
Через семь суток после введения дозы 1,0 мл
0,021±0,005
0,008±0,002
12.
Контроль через семь суток
0,022±0,004
0,006±0,001
Примечание: достоверность различий к контролю *- Р<0,05; **- Р<0,01.
Из таблицы 2 видно, что пробы, приготовленные согласно заявленному способу, имеют более высокую чувствительность, что повлияло на определение сроков выведения препарата из организма животных. Так, содержание мирамистина в опытных группах при определении экстракционно-фотометрическим методом, включающим подготовку проб предлагаемым способом, не отличается от контрольных значений уже на 5-й день, в то время как при использовании известного способа содержание мирамистина снижается до фоновых показателей только к 7-му дню.
Пример 3.
Определение содержания остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани птиц и сроков их выведения из организма проводили в опыте на 30 курах (n=5). Было сформировано 4 опытных и 2 контрольных группы. Курам первой и четвертой групп интраназально ввели катионное поверхностно-активное вещество (препарат мирамистин) в дозе 0,3 мл/гол., второй и пятой - внутримышечно ввели мирамистин в дозе 0,5 мл/гол. Образцы мышечной ткани кур первой и второй групп исследовали на содержание остаточных количеств мирамистина через трое суток после введения препарата, четвертой и пятой - через пять суток. Птица третьей и шестой групп не обрабатывалась препаратом и служила контролем соответственно через трое и пять суток. Образцы мышечной ткани всех 30 кур исследовались на содержание остаточных количеств катионных поверхностно-активных веществ экстракционно-фотометрическим методом, включающим подготовку проб предлагаемым способом и параллельно экстракционно-фотометрическим методом, включающим подготовку проб известным способом. Результаты сравнительного определения остаточных количеств мирамистина в мышечной ткани птиц экстракционно-фотометрическим методом, включающим подготовку проб известным и предлагаемым способами, отражены в таблице 3.
Таблица 3
№ группы
Сроки отбора проб мяса
Содержание мирамистина, мг/кг
Известным способом подготовки проб
Согласно заявленному способу подготовки проб
1
2
3
4
1.
Через трое суток после интраназального введения дозы 0,3 мл
0,0207±0,0064**
0,0145±0,003**
2.
Через трое суток после внутримышечного введения дозы 0,5 мл
0,0239±0,0027**
0,0160±0,006**
3.
Контроль через трое суток
0,0056±0,0030
0,0044±0,010
4.
Через пять суток после интраназального введения дозы 0,3 мл
0,0061±0,0085
0,0048±0,003
5.
Через пять суток после внутримышечного введения дозы 0,5 мл
0,0082±0,0013*
0,0053±0,007
6.
Контроль через пять суток
0,0053±0,0042
0,0046±0,008
Примечание: достоверность различий к контролю * - Р<0,05; ** - Р<0,01.
Из таблицы 3 следует, что пробы мышечной ткани птицы, приготовленные согласно заявленному способу, имеют более высокую чувствительность, и содержание мирамистина в опытных группах практически не отличается от контрольных значений на 5-й день, в то время как в пробах, приготовленных известным способом, содержание мирамистина в эти сроки значительно превышает фоновые значения.
Таким образом, предлагаемый способ подготовки проб для экстракционно-фотометрического метода определения остаточных катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани животных и птиц характеризуется высокой чувствительностью проб и позволяет с большой точностью определить остаточные количества катионных поверхностно-активных веществ в мышечной ткани животных и птиц и сроки выведения их из организма.