Исследование процессов ферментации мышечно-хрящевого комплекса тканей гидробионтов

2011

Известия ТИНРО

Том 165

УДК 577.15:574.5

А.Н. Баштовой, Т.Н. Слуцкая*

Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ МЫШЕЧНО-ХРЯЩЕВОГО КОМПЛЕКСА ТКАНЕЙ ГИДРОБИОНТОВ

Обоснованы параметры гидролиза мышечно-хрящевого комплекса гидроби-онтов при температуре 40 °С ферментами целлолюкс для кальмара в течение 2,02,5 ч и протомегатерином для лососевых в течение 4,5-5,0 ч. Остановка ферментной реакции и гибель микрофлоры обеспечиваются прогревом при 75-80 °С в течение 15 мин и последующей инфракрасной сушкой при температуре 45 ± 5 °С. При этом содержание гексозаминов в гидролизате мышечно-хрящевого комплекса тканей голов кальмара составляет ~ 4,5 % (к массе навески), голов кеты — 0,4 %.

Ключевые слова: ферментация, мышечно-хрящевой комплекс, гидролиз, целлолюкс, гексозамины.

Bashtovoy A.N., Slutskaya T.N. Parameters of fermentation process for musculocartilaginous tissues of squid and salmon // Izv. TINRO. — 2011. — Vol. 165. — P. 320-327.

Parameters of hydrolysis are determined for muscular-cartilaginous tissue from squid (enzyme cellolux-f) and chum salmon (enzyme protomegaterin). The process of hydrolysis developed at the temperature 40 °С during 2.0-2.5 h for squid and 4.55.0 h for salmon and was stopped with microflora destruction by heating to 75-80 °С during 15 minutes and subsequent infrared drying at the temperature 45 ± 5 °С. After the processing, the hydrolyzate from squid heads contains « 4.5 % of hexosami^ and the hydrolyzate from chum salmon heads contains 0.4 % of hexosamine.

Key words: enzyme, muscular-cartilage complex, hydrolysis, cellolux-f, hexosaminе.

Введение

В рыбной промышленности большой интерес представляют недоиспользуемые, но массовые виды отходов от переработки рыбы и моллюсков. Количество отходов при обработке нерыбного сырья может достигать 50 % от массы сырья, поступившего на обработку (Артюхова и др., 2001). Для голов лососевых их количество составляет в среднем 50-60 тыс. т, для кальмара — в среднем до 45 тыс. т в год (Мокрин, 1986; Руководство ..., 1998; Дударев и др., 2004). Использование отходов переработки повышает рентабельность добычи и обработки гид-робионтов в 1,5-2,0 раза (Юрко, 2007).

Считается, что применение ферментных препаратов позволяет рационально перерабатывать сырье, не имеющее пищевого использования (рыбу и моллюски с механическими повреждениями либо нестандартных размеров), и отходы от разделки (Кузнецов, 2002).

* Баштовой Александр Николаевич, инженер, e-mail: gepard-83@bk.ru; Слуцкая Татьяна Ноевна, доктор технических наук, главный научный сотрудник, e-mail: slutskaya@tinro.ru.

Целью настоящей работы являлось исследование процессов ферментации мышечно-хрящевого комплекса тканей голов кальмара и лососевых и выявление наличия биологически активных веществ, которые могут обладать определенной функциональной направленностью.

Материалы и методы

Материалом для исследования служили отходы переработки дальневосточных гидробионтов: мышечно-хрящевой комплекс тканей голов головоногих моллюсков Todarodes pacificas (тихоокеанского кальмара) и Berryteuthis magister (командорского кальмара) и головы рыб семейства лососевых Oncorhynchus keta (кеты).

Установлено, что массовое соотношение (%) хрящевой ткани и мышечной ткани в головах кальмара составляет 22-24 : 76-78, а в головах кеты — соответственно 16-18 : 82-84.

На основе данных о химическом составе сырья, соотношении хрящевой и мышечной ткани и литературных данных (Зайцев, Кизеветтер, 1965; Калиничен-ко, Купина, 1987; Артюхова, Богданов, 2001; Кузнецов, 2002; Суховерхова, 2006; Сорокоумов, 2007; и др.) о строении, свойствах ферментов было принято решение использовать ферменты класса гидролазы: протеолитического, смешанного и амилолитического (целлолитического) действия.

Фермент целлолюкс-f (ТУ 9291-010-00479563-99), в основном проявляющий амилолитическое действие (www.sibbio.ru), использовали для ферментолиза мышечно-хрящевого комплекса тканей голов кальмара, так как головы кальмара содержат высокое количество хрящевой ткани.

Фермент протомегатерин (ТУ 00479942-002-94), который в основном проявляет протеолитический характер действия, использовали для ферментолиза мы-шечно-хрящевого комплекса тканей голов лососевых: головы лососевых содержат больше мышечной ткани, чем хрящевой.

Фермент амилопротооризин (ТУ 9291-078-00334586-2007) в основном проявляет протеолитический характер действия, но содержит и ферменты, способные расщеплять углеводы, поэтому его использовали для ферментолиза мышеч-но-хрящевого комплекса тканей голов кальмара и лососевых.

Исследование сырья и полученных продуктов проводили согласно стандартным методам анализа (ГОСТ 7636-85).

Для исследований использовали жидкую фракцию гидролизатов, получаемую после проведения ферментолиза и центрифугирования полученной суспензии при 4000 об./мин в течение 15-20 мин.

В образцах сырья и кормовых добавок определяли количество небелкового азота после осаждения белков трихлоруксусной кислотой (Лазаревский, 1955).

Содержание гексозаминов определяли спектрофотометрически, согласно методике фармакопейной статьи (ФС № 42-1286-99), и выражали в процентах:

Y = C • V • 10 • 100 = 2 • C • V • 100

А а • 0,5 • 5 а • 0,5 ,

где V — объем нейтрализованного гидролизата, мл; а — навеска исследуемого материала, мг; С — количество гексозаминов в 1 мл, найденное по калибровочному графику по галактозамину и глюкозамину, мг; 0,5 — объем нейтрализованного гидролизата, взятого для реакции, мл.

Содержание свободных сахаров по галактозе определяли спектрофотомет-рически, согласно методике фармакопейной статьи (ФС № 42-1286-99).

Количественное определение свободных сахаров проводили после кислотного гидролиза исследуемого образца 1 Н раствором соляной кислоты в течение 4 ч. Проведя реакцию, измеряли поглощение гидролизата и определяли количество сахара по калибровочной кривой, соответствующей поглощению галактозы.

Расчет содержания свободных Сахаров проводили по формуле:

%(Gal) = (С 100 • 10-3 • 100 %)/m = (С 10)/m,

где С — концентрация, определяемая по калибровочному графику, мкг; m — навеска образца, взятого для анализа, мг.

Результаты исследований обрабатывали статистическими методами (Урбах, 1963, 1975; Кенуй, 1979; Саут, Уиттик, 1990). Достоверность данных достигали планированием экспериментов, необходимых и достаточных для достижения точности результатов (Р = 0,90-0,95), при доверительном интервале А ± 3-10 %. Для изображения изменений различных показателей в работе использовали персональный компьютер с пакетами прикладных программ Office Pro-2003 (Excel), программы Statistica 6.0.

Результаты и их обсуждение

Исследование процессов ферментации мышечно-хрящевого комплекса тканей голов командорского кальмара

При исследовании концентрация амилопротооризина Г20х составляла 1764 и 3528 Пе/кг. Выбор концентрации фермента сделан на основе анализа источников литературы, в которых имелась информация о применении ферментных препаратов и их концентрациях, а именно 200-8000 Ед/кг (Калиниченко, Купина, 1987; Леваньков, Купина, 1999а, б; Кузнецов 2002; Суховерхова, 2006; Ильина, Галина, 2009). Концентрация целлолюкса-f составляла 630 ЦлА/кг, это соответствовало сопутствующей амилолитической активности фермента амилопротоо-ризин Г20х с концентрацией в 1764 Пе/кг. Рациональный гидромодуль выбран в соотношении сырье : вода 1,0 : 0,5. Температура ферментации 40 °С.

Контролем послужила система с соотношением сырье : вода 1,0 : 0,5 без добавления фермента. Гидролиз проводился при аналогичных условиях.

Каждый час отбиралась проба, в которой определяли содержание гексоза-минов, небелкового азота и свободных сахаров по галактозе.

На рис. 1 видно, что имеется существенное различие в количестве гексоза-минов в гидролизатах. Ферментолиз с целлолюксом-f через 2,0-2,5 ч приводит к увеличению содержания гексозаминов в 4 раза по сравнению с контролем.

«

0

1

S

§

эт о

о «

о и

Й = 0J

сг

S

ч &

---Без фермента -А- Целлолюкс-f

2 3 4

Время, ч

Рис. 1. Зависимость количества гексозаминов при гидролизе отходов голов кальмара с целлолюксом-f (630 ЦлА/кг) от времени

Fig. 1. Dependence of hex-оваште content in hydrolyzate from squid heads on time of hydrolysis with cellolux-f

При гидролизе с амилопротооризином количество гексозаминов, переходящих в растворимую часть, меньше, чем в эксперименте с целлолюксом. В образцах с амилопротооризином максимальный прирост содержания гексозаминов приходится на 4-й час гидролиза, после чего наблюдается снижение их количества.

На рис. 2 также хорошо видно, что увеличение концентрации амилопротоо-ризина в 2 раза незначительно влияет на концентрацию гексозаминов и применение амилопротооризина в концентрации 3528 Пе/кг нецелесообразно.

Рис. 2. Зависимость количества гексозаминов при гидролизе отходов голов кальмара с амило-протооризином от времени

Fig. 2. Dependence of hexo-samine content in hydrolyzate from squid heads on time of hydrolysis with amiloprotoorizin

«

0

1 s

о и so

OJ 3-

s &

В 2

3 2

OJ §

я * 1

Без фермента Амилопротооризин, 1764 Пе/кг Амилопротооризин, 3528 Пе/кг

Ж

> г- / N и-

> .---^ >—

12 3 4 Время, ч

Расчеты показали, что в случае применения целлолюкса наиболее значительный прирост содержания гексозаминов происходит в первые 2 ч гидролиза, после чего наблюдается замедление реакции (табл. 1); что же касается гидролиза с амилопротооризином, то максимальное накопление происходит на 4-й час реакции.

Таблица 1

Изменение величины прироста количества гексозаминов в гидролизатах с кальмаром по отношению к последующему часу, %

Table 1

Hexamine content growth by the hour in hydrolyzates from squid heads, %

Образец, количество единиц активности на 1 кг фарша 2 Время 3 гидролиза, 4 ч 5 6

Целлолюкс-f, 630 ЦлА/кг 27,71 3,58 2,81 6,10 4,16

Амилопротооризин, 1764 Пе/кг 7,80 7,23 62,70 -20,97

Амилопротооризин, 3528 Пе/кг 30,37 30,68 89,56 -39,22

Эти результаты согласуются с литературными данными, согласно которым, в первые 2 ч гидролиз коллагеновой составляющей хрящевой ткани идет наиболее интенсивно (Сорокоумов и др., 2007).

Также было установлено, что при воздействии целлолюкса-! на отходы голов кальмара наблюдается рост количества свободных сахаров с максимумом на 4-й час гидролиза (рис. 3). Таким образом, при использовании отходов голов кальмара гидролиз полисахари-

1,05

дов протекает интенсивнее при использовании целлолюкса-f.

Рис. 3. Зависимость количества свободных сахаров при гидролизе отходов голов кальмара с цел-лолюксом-f от времени

Fig. 3. Dependence of free sugars content in hydrolizate from squid heads on time of hydrolysis with cellolux-f

«т 1 SP

<И

2 Я

14

0,85

«

° 0,8

0,9

* Без фермента  Целлолюкс-f

/

Время,

Максимальная степень протеолиза отходов кальмара установлена для ами-лопротооризина с концентрацией 3528 ПЕ/кг (рис. 4). При концентрации ами-лопротооризина 1764 Пе/кг содержание небелкового азота на 4-й час гидролиза составляет ~ 800 мг%. В образцах с целлолюксом-1 (630 ЦлА/кг) и амилопротооризином с концентрацией 1764 Пе/кг разница в количестве небелкового азота

составляет 30-90 мг%, в образцах с целлолюксом-{ и в контроле — 30-40 мг%. В образце с целлолюксом^ замедление протеолиза наблюдается после 2 ч гидролиза. Количество небелкового азота в течение 2-3 ч реакции с использованием целлолюкса-1 и амилопротооризина с концентрацией 1764 Пе/кг практически совпадает.

950

о 850

750 650 550 450 350 250

н

о «

3 «

§ 0J

ю

Jc

г- —L

Без фермента A Целлолюкс-f, 630 ЦлА/кг Амилопротооризин, 1764 Пе/кг Амилопротооризин, 3528 Пе/кг

Рис. 4. Зависимость количества небелкового азота при гидролизе отходов голов кальмара от времени

Fig. 4. Dependence of nonprotein nitrogen content in hy-drolyzate from squid heads on time of hydrolysis

1 2 3 4 5 6

Время, ч

На основании полученных результатов можно сделать заключение, что для ферментного гидролиза отходов голов кальмара с целью максимального расщепления углеводов эффективнее применять ферментный препарат целлолюкс-f. Однако стоит отметить, что и амилопротооризин также способен достаточно хорошо катализировать расщепление белковых и углеводных компонентов мышечно-хрящевого комплекса тканей кальмаров.

Исследование процессов ферментации мышечно-хрящевого комплекса тканей голов лососевых

Гидролиз мышечно-хрящевого комплекса тканей голов кеты проводили с использованием 3 ферментов: амилопротооризина Г20х, целлолюкса-f и протоме-гатерина Г10х. Концентрация амилопротооризина Г20х и протомегатерина Г10х составляла по 1764 Пе/кг, целлолюкса-f — 630 ЦлА/кг, что соответствовало сопутствующей амилолитической активности фермента амилопротооризин Г20х.

Рациональный гидромодуль выбран в соотношении сырье : вода 1,0 : 0,5. Температура ферментолиза 40 °С. Каждый час отбиралась проба, в которой определяли содержание гексозаминов, небелкового азота и свободных сахаров по галактозе.

Наиболее высокое количество гексозаминов при гидролизе с протомегате-рином накапливается через 5 ч гидролиза (рис. 5, табл. 2). В это время количество гексозаминов в гидролизате на 20 % выше, чем при использовании амило-протооризина.

Таблица 2

Изменение величины прироста количества гексозаминов в гидролизатах с кетой по отношению к последующему часу, %

Table 2

Hexamine content growth by the hour in hydrolyzates from chum salmon heads, %

Образец, количество единиц активности на 1 кг фарша 2 Время 3 гидролиза 4 , ч 5 6

Целлолюкс-f, 630 ЦлА/кг 18,18 4,23 0,25 7,97 -3,97

Амилопротооризин, 1764 Пе/кг 25,40 9,70 6,15 15,22 -22,32

Протомегатерин, 1764 Пе/кг -4,50 33,96 13,38 21,74 -2,30

Рис. 5. Зависимость количества гексозаминов при гидролизе отходов (голов кеты) от времени

Fig. 5. Dependence of hexosaminе content in hy-drolyzate from chum salmon heads on time of hydrolysis

«

0

1

s

§

о

о «

о и f-

о

OJ 3-

s

ч

ä

0,4

0,35 -

0,3

OJ «

0

1 °'25

0,2

0,15

0,1

И Целлолюкс-f 630 ЦлА/кг Амилопротооризин, 1764 Пе/кг Протомегатерин, 1764 Пе/кг Без фермента

Время, ч

Степень гидролиза отходов голов кеты с использованием целлолюкса-! и без него мало различается.

На рис. 6 видно, что количественное изменение свободных Сахаров в образцах в процессе ферментолиза незначительное. Наибольшее количество свободных сахаров обнаружено при использовании амилопротооризина — 1764 Пе/кг, в образцах с протомегатерином и целлолюксом-1 содержание сахаров находится на одном уровне.

Рис. 6. Зависимость изменения содержания свободных сахаров (по галактозе) в гидролизатах из отходов (голов кеты) от времени

Fig. 6. Dependence of free sugars content (by galactose) in hydro-lyzates from chum salmon heads on time of hydrolysis

Время, ч

На рис. 7 видно, что наибольшее количество небелкового азота накапливается при использовании фермента амилопротооризин. Причем при использовании в качестве сырья отходов голов кеты содержание небелкового азота в гидро-лизате через 4 ч реакции в 2 раза больше, чем при использовании голов кальмара. В варианте с целлолюксом-f небелкового азота в среднем на 30 %, а с протомегатерином — на 150 мг% меньше, чем в образцах с амилопротооризи-ном 1764 Пе/кг. Такие результаты объясняются различной направленностью действия ферментов, взятых для экспериментов, и химическим составом сырья.

Проанализировав полученные данные, можно сделать вывод, что ферменты амилопротооризин и протомегатерин примерно в равной степени способствуют расщеплению белковой и углеводной составляющей сырья в гидролизате из голов кеты. При этом необходимо отметить, что амилопротооризин лучше других испытанных ферментов способствует увеличению количества свободных сахаров, которые, как известно (Poole, 1986; Tryggvason et al., 1987; Ruoslahti, 1989; Шитов, 1992; Timothy, Michael, 2000; AbdelFattah, Hammad, 2001; Данилевская, Николаев, 2002; Пат. РФ 2077328; Пат. WO 69444), обладают определенной функциональной направленностью.

га

900 850 800 750

^ 700 | 650 и 600

550 500

-с Я

14

I 450 «

U 400 350 300

^^Безфермента ^^^ Целлолюкс-f, 630 ЦлА/кг Амилопротооризин, 1764 Пе/кг Промегатерин, 1764 Пе/кг

1,5

2,5

3,5

4,5

о 1200

S

, g 1100 § 1000 g 900

ю 800

700

Без фермента

Амилопротоорезин, 1764 Пе/кг

Целлолюкс-f, 630 Ае/кг  Протомегатерин, 1764 Пе/кг

Рис. 7. Зависимость изменения содержания небелкового азота при гидролизе отходов голов кеты от времени

Fig. 7. Dependence of nonprotein nitrogen content in hydrolyzates from chum salmon heads on time of hydrolysis 630 ЦлА/кг

1 2 3 4 5

Время, ч

Заключение

Исследовав процессы ферментации мышечно-хрящевого комплекса тканей из голов кальмара и кеты, мы установили, что для голов кальмара наиболее рациональными параметрами гидролиза являются применение фермента целло-люкс-f в концентрации 630 ЦлА/кг, время гидролиза 2,0-2,5 ч. Для голов кеты наиболее эффективно применение протомегатерина или амилопротооризина в концентрации 1764 Пе/кг, время гидролиза 4,0-4,5 ч. В обоих вариантах температура ферментолиза 40 °С, гидромодуль 1,0 : 0,5. Данные режимы ферментации голов кальмара и кеты позволяют наиболее полно извлечь биологически активные вещества (гексозамины).

Список литературы

Артюхова С.А., Богданов В.Б., Дацун В.М. и др. Технология продуктов питания : учебник для вузов. — М. : Колос, 2001. — 496 с.

ГОСТ 7636-85 "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки". Методы анализа.

Данилевская Н.В., Николаев А.А. Хондропротекторы и их использование в ветеринарии // Ветеринар. — 2002. — № 3. — С. 45-49.

Дударев В.А., Байталюк А.А, Мокрин Н.М., Шелехов В.А. Современное состояние сырьевой базы рыболовства в северо-западной части Японского моря // Вопр. рыболовства. — 2004. — Т. 5, № 3. — С. 16-17.

Зайцев В.П., Кизеветтер И.В., Лагунов Л.Л. Технология рыбных продуктов : монография. — М. : Пищ. пром-сть, 1965. — 752 с.

Ильина Н.М., Галина Ю.Ф. Использование гидролизатов коллагена в технологии цельномышечных продуктов // Мат-лы 3-й Междунар. науч.-техн. конф. "Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)". Т. 1. — Воронеж : Воронеж. гос. технол. акад., 2009. — С. 250-253.

Калиниченко Т.П., Купина Н.М. Протеолиз мышечной ткани минтая под влиянием ферментных препаратов из внутренностей сельди иваси // Технология гидробион-тов : сб. науч. тр. — Владивосток : ТИНРО, 1987. — С. 85-91.

Кенуй М.Г. Быстрые статистические вычисления. — М. : Статистика, 1979. — 69 с.

Кузнецов Ю.Н. Обоснование биотехнологической модификации отходов от разделки минтая : дис. ... канд. техн. наук. — Владивосток, 2002. — 139 с.

Лазаревский А.А. Техно-химический контроль в рыбообрабатывающей промышленности : монография. — М. : Пищепромиздат, 1955. — 520 с.

Леваньков С.В., Купина Н.М. Использование протеиназ печени краба в технологии извлечения каратиноидных пигментов из панцирьсодержащих отходов переработки краба // Хран. и перераб. сельхозсырья. — 1999б. — № 12. — С. 32-35.

Леваньков С.В., Купина Н.М. Ферментативный гидролиз панцирьсодержащих отходов производства пищевой продукции из краба // Хран. и перераб. сельхозсырья. — 1999а. — № 11. — С. 34-37.

Мокрин Н.М. Оценка запасов тихоокеанского кальмара в Японском море в летне-осенний период 1985 г. // Ресурсы и перспективы использования кальмаров Мирового океана. — М. : ВНИРО, 1986. — С. 81-85.

Пат. WO 69444 Применение гликозаминогликанов для лечения старческого слабоумия / Cornelli U., DeAmbrosi L. Опубл. ИСМ 2001, № 22.

Пат. РФ 2077328 Вещество для стимуляции пролиферации эндотелия роговицы человека / Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза», Федоров С.Н., Ронкина Т.И., Золоторевский А.В. 1997. № 11.

Руководство по поиску и промыслу пелагических кальмаров в Японском море и Южно-Курильском районе / Н.М. Мокрин, Е.В. Слободской. — Владивосток : ТИНРО-центр, 1998. — 61 с.

Саут Р., Уиттик А. Основы альгологии : монография. — М. : Мир, 1990. — 597 с.

Сорокоумов И.М., Ежова Е.А., Быкова В.М. и др. Хондроитинсульфат из хрящей рыб // Рыбпром. — 2007. — № 3. — С. 18-20.

Суховерхова Г.Ю. Биохимическая характеристика хрящевой ткани гидробионтов и технология БАД к пище : автореф. дис. ... канд. техн. наук. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2006. — 24 с.

Урбах В.Ю. Математическая статистика для биологов и медиков : монография. — М. : АН СССР, 1963. — 323 с.

Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях : монография. — М. : Медицина, 1975. — 296 с.

Фармакопейная статья (ФС) № 42-1286-99. Методика определения аминоса-харов. "Хонсурид".

Шитов Г.Г. Новые подходы к созданию лекарственных средств с хондропротек-торными свойствами // Вестн. РАМН. — 1992. — № 5. — С. 26-30.

Юрко Н.И. Новые и традиционные технологии в рыбоперерабатывающем производстве // Рыбпром. — 2007. — № 3. — С. 30-33.

Abdel Fattah W., Hammad T. Chondroitin Sulfate and Glucosamine: a review of the Safety Profile // JANA. — 2001. — Vol. 3, № 4. — P. 16-23.

Роо1е A.R. Proteoglycans in health and disease: structure and function // Biochemistry Journ. — 1986. — Vol. 236. — P. 1-14.

Ruoslahti E. Proteoglycans in cell regulation // J. Biol. Chem. — 1989. — Vol. 264. — P. 13369-13372.

Timothy E., Michael P. Glucosamine and Chondroitin for Treatment of Osteoarthritis // JANA. — 2000. — Vol. 283, № 11. — P. 33-37.

Tryggvason K., Hoyhtya M., Salo T. Proteolytic degradation of extracellular matrix in tumor invasion // Biochem. Biophys. Acta. — 1987. — Vol. 907. — P. 191-217.

Поступила в редакцию 9.12.10 г.