КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
COMPOSITION AND METHOD FOR IMPROVEMENT OF PLANT DEVELOPMENT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к новым композициям штаммов инактивированных бактерий, способу их получения и их применению для улучшения развития растений.
ОПИСАНИЕ УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Поиск новых стратегий, направленных на поддержание или повышение продуктивности сельскохозяйственных систем при одновременном сокращении использования химических веществ, продемонстрировал решающее значение микроорганизмов в биологическом функционировании агросистем. Эти исследования привели к появлению концепции «биоудобрений» и «биостимуляторов», которые могут быть определены как продукты, содержащие, например, инактивированные живые микроорганизмы и/или экстракты микроорганизмов, которые при нанесении на почву или растения заселяют ризосферу, и даже колонизируют ткани растений, и стимулируют рост растений путем улучшения, например, усвоения питательных веществ и выработки фитогормонов.
Bacillus licheniformis
Fusarium
В патенте США 5,589,381 описано выделение агента биологического контроля, содержащего штамм , который контролирует фузариоз, вызываемый присутствием  в кукурузе.
В патенте США 5,503,652 описано выделение штаммов, которые могут способствовать удлинению корней растений.
Arthrobacter sp
Pseudomonas fluorescens
В патенте США 5,935,839 описано применение . и  для стимуляции роста сеянцев хвойных растений, при котором ризобактерии, стимулирующие рост растений (PGPR), выбирают по их способности расти в кислой почве и в условиях холода, характерных для хвойных растений.
В US 5,503,651 описано применение штаммов PGPR, которые способствуют росту злаков, масличных культур и кукурузы согласно способности к хемотаксису и благодаря штаммам, колонизирующим корни.
Pseudomonas
Rhizoctonia solani
В патенте США 5,496,547 описано выделение мутантов , которые являются эффективными биологическими агентами против .
Pseudomonas
В патенте США 4,849,008 описано нанесение  на корни, растения, семена и фрагменты клубней или почву для повышения урожайности корнеплодов.
Pseudomonas
В патенте США 4,584,274 описаны штаммы , устойчивые к бактериофагам, полезные для стимуляции роста корнеплодов.
Achromobacter piechaudii
Agrobacterium tumefaciens
Stenotrophomonas maltophilia
Delftia acidovorans
В международной заявке WO2003057861 описано выделение и идентификация некоторого количества ризобактерий, способствующих росту растений (PGPR), которые окисляют серу в сульфат, пригодный для стимуляции роста растений, таких как RAY12, идентифицированный как ; RAY28, идентифицированный как , RAY132, идентифицированный как ; и RAY209, идентифицированный как .
Bacillus
Paenibacillus
В патенте США 6,194,193 описано применение композиции для усиления роста растений, которая содержит смесь штаммов  и , продуцирующих фитогормоны.
Azospirillum spp
Другим примером известного гормонального эффекта является действие  (см., в частности, Kucey (1988), Plant growth-altering effects of Azospirillum brasilense and Bacillus C-11-25 on two wheat cultivars. Journal of Applied Microbiology, volume 64, Issue 3, pages 187-196).
Некоторые биоудобрения состоят из живых организмов; поэтому их необходимо производить, готовить из них составы и продавать, при этом сохраняя их жизнеспособность и биологическую активность. Кроме того, успешная инокуляция сельскохозяйственных растений микроорганизмами в значительной степени зависит от количества жизнеспособных клеток, внесенных в почву (Duquenne et al., 1999, FEMS Microbiology Ecology 29:331-339). Жизнеспособность инокулянта является важным фактором успеха и адекватной колонизации ризосферы для получения требуемого положительного эффекта на рост растений. Основным недостатком использования биоудобрений является то, что конкретные условия, такие как почва, температура и влажность, могут сильно изменяться от одного участка к другому, и эти изменения могут влиять на жизнеспособность микроорганизмов и, следовательно, на урожайность и рост растений.
Следовательно, существует потребность в композиции, стимулирующей развитие растений с улучшенной эффективностью без недостатков, связанных с поддержанием жизнеспособности такого типа биоудобрения/биостимулятора.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу повышения биостимулирующего действия штамма живых бактерий или композиции, содержащей его, отличающемуся тем, что он включает стадию инактивации штамма живых бактерий, причем указанный штамм инактивированных бактерий, полученный таким образом, оказывает более сильное биостимулирующее действие на развитие растений по сравнению с действием такого же штамма живых бактерий или содержащей его композицией.
Настоящее изобретение также относится к штамму инактивированных бактерий для улучшения развития растений или к содержащей его композиции, отличающемуся тем, что указанный штамм инактивированных бактерий позволяет улучшить развитие растений по сравнению с таким же штаммом живых бактерий или содержащей его композицией.
Настоящее изобретение также относится к штамму инактивированных бактерий для улучшения роста растений или к содержащей его композиции, отличающемуся тем, что указанный штамм инактивированных бактерий оказывает более сильное биостимулирующее действие на развитие растений по сравнению с действием такого же штамма живых бактерий или содержащей его композиции.
Настоящее изобретение также относится к способу применения или применению штамма инактивированных бактерий или содержащей его композиции для улучшения развития растений, отличающемуся тем, что штамм инактивированных бактерий позволяет улучшить развитие растений относительно того же штамма живых бактерий или содержащей его композиции.
Настоящее изобретение также относится к способу применения или применению штамма инактивированных бактерий или содержащей его композиции для улучшения развития растений, отличающемуся тем, что штамм инактивированных бактерий оказывает более сильное биостимулирующее действие на развитие растений по сравнению с таким же штаммом живых бактерий или содержащей его композицией.
Преимущественно штамм инактивированных бактерий или содержащая его композиция, полученные способом по настоящему изобретению, оказывают более сильное биостимулирующее действие на развитие растений по сравнению с таким же штаммом живых бактерий или содержащей его композицией.
Преимущественно композиция и способ по настоящему изобретению позволяют улучшить развитие растений без необходимости учитывать жизнеспособность бактериального инокулята.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Arabidopsis thaliana
Delftia acidovorans
Delftia acidovorans
Delftia acidovorans
Delftia Acidovorans
Bacillus amyloliquefaciens
Delftia acidovorans
На фиг. 1 показана оценка роста площади листьев , где: М означает культуральную среду, отделенную от  RAY209; Вода означает воду без активных или неактивных бактерий или культуральной среды; B+M означает  RAY209 в культуральной среде; Mp означает пастеризованную культуральную среду, отделенную от  RAY209; S означает суспензию серы; B+вода означает  RAY209 в воде; IT45 является положительным контролем ( IT45); (B+вода)p означает пастеризованный раствор  RAY209 в воде, согласно изобретению.
Brassica napus cultivar
На фиг. 2 показаны впитывающие корневые волоски растений канолы ( 5525CL) через 36 дней после обработки стерильной водой.
Brassica napus cultivar
Delftia acidovorans
На фиг. 3 показаны впитывающие корневые волоски растений канолы ( 5525CL) через 36 дней после обработки культуральной средой штамма  RAY209.
Brassica napus cultivar
Delftia acidovorans
На фиг.4 показаны впитывающие корневые волоски растений канолы ( 5525CL) через 36 дней после обработки штаммом  RAY209, инактивированным обработкой Френч-прессом (высокое давление с последующей быстрой декомпрессией).
Brassica napus cultivar
Lactobacillus rhamnosus
На фиг. 5 показаны впитывающие корневые волоски растений канолы ( 5525CL) через 36 дней после обработки штаммом , инактивированным обработкой Френч-прессом (высокое давление с последующей быстрой декомпрессией).
Brassica napus cultivar
Delftia acidovorans
На фиг. 6 показаны впитывающие корневые волоски растений канолы ( 5525CL) через 36 дней после обработки штаммом живых  RAY209.
Brassica napus cultivar
Lactobacillus rhamnosus
На фиг. 7 показаны впитывающие корневые волоски растений канолы ( 5525CL) через 36 дней после обработки штаммом живых .
Brassica napus cultivar
Delftia acidovorans
На фиг. 8 показаны впитывающие корневые волоски растений канолы ( 5525CL) через 36 дней после обработки штаммом  RAY209, инактивированным пастеризацией.
Brassica napus cultivar
Lactobacillus rhamnosus
На фиг. 9 показаны впитывающие корневые волоски растений канолы ( 5525CL) через 36 дней после обработки штаммом , инактивированным пастеризацией.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Термин «живые бактерии» или «штаммы живых бактерий» означает бактерии или препараты бактерий с жизнеспособностью более 70%.
Термин «инактивированные бактерии» или «штаммы инактивированных бактерий» означает бактерии или препараты бактерий, убитых физическими, биохимическими, химическими или физико-химическими процессами и имеющих жизнеспособность менее 50%.
Термин «биомасса» означает весь органический и минеральный материал, составляющий организм.
Термин «биостимулятор (биостимулирующий)» означает стимуляцию развития растений. Например, развитие растений может включать один из следующих параметров: укоренение, площадь листьев, цветение, плодоношение, высоту растения, биомассу, всхожесть и урожайность.
Термин «ризобактерии, способствующие росту растений» или «PGPR» означает ризосферные бактерии, способствующие росту и здоровью растений.
Термин «культуральная среда» означает среду, содержащую элементы, необходимые для роста бактерий, позволяющие культивировать бактерии по изобретению. В соответствии с одним из вариантов осуществления культуральная среда может содержать бактерии по изобретению во время их роста или представлять собой культуральную среду, свободную от бактерий по настоящему изобретению, если эти бактерии отделены от среды в результате процесса, в частности, но не исключительно, фильтрации или центрифугирования. Согласно одному из вариантов осуществления культуральная среда предпочтительно представляет собой жидкую среду. Все эти среды, а также обычные процессы ферментации хорошо известны специалисту в данной области техники.
Термин «среда для выращивания» означает совокупность продуктов, применяемых в качестве среды для выращивания определенных растений. Их применение позволяет получить среды с порозностью, занятой водой, и порозностью, занятой воздухом, которые обеспечивают как закрепление абсорбирующих органов растений, так и контактирование этих органов с растворами, необходимыми для роста растений. Они обычно состоят из органических материалов и/или неорганических материалов и обычно состоят из торфа, других органических материалов (в частности, кокосовых волокон, коры, древесных волокон, компостов) и неорганических материалов (в частности, почвы, песка, пуццолана, глин, минеральной ваты, перлита, вермикулита).
Настоящее изобретение относится к способу повышения биостимулирующего действия штамма живых бактерий или содержащей его композиции, отличающемуся тем, что он включает этап инактивации штамма живых бактерий, причем указанный штамм инактивированных бактерий, полученный таким образом, оказывает более сильное биостимулирующее действие на развитие растений по сравнению с действием такого же штамма живых бактерий или содержащей его композицией. В одном из предпочтительных вариантов осуществления этап инактивации, выполняемый в способе по изобретению, осуществляют при помощи физических, биохимических, химических или физико-химических процессов. В более предпочтительном варианте осуществления штамм живых бактерий инактивируют термической обработкой или обработкой высоким давлением. Преимущественно, штамм живых бактерий инактивируют пастеризацией. Более предпочтительно, штамм живых бактерий инактивируют без культуральной среды.
Delftia
Achromobacter
Agrobacterium
Stenotrophomonas
Delftia
Delftia acidovorans
Achromobacter piechaudii
Agrobacterium tumefaciens
Stenotrophomonas maltophilia
Delftia acidovorans
В одном из особенно предпочтительных вариантов осуществления штамм бактерий, используемый в способе по изобретению, относится к роду , ,  или . Преимущественно, штамм бактерий относится к роду . Более предпочтительно штамм бактерий представляет собой  RAY209, зарегистрированный в ATCC 25 апреля 2002 года под номером PTA-4249,  RAY12, зарегистрированный в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 16 апреля 2002 года под номером PTA-4231,  RAY28, зарегистрированный в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 16 апреля 2002 года под номером PTA-4232, или  RAY 132, зарегистрированный в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 16 апреля 2002 года под номером PTA-4233. В еще более предпочтительном варианте осуществления штамм инактивированных бактерий представляет собой штамм  RAY209, зарегистрированный в ATCC 25 апреля 2002 года под номером PTA-4249.
Настоящее изобретение относится к штамму инактивированных бактерий или композиции для улучшения развития растений, отличающейся тем, что она включает по меньшей мере один штамм инактивированных бактерий. Преимущественно, настоящее изобретение также относится к штамму инактивированных бактерий для улучшения развития растений, отличающемуся тем, что штамм инактивированных бактерий обеспечивает улучшенное развитие растений по сравнению с тем же штаммом живых бактерий.
Настоящее изобретение относится к штамму инактивированных бактерий или композиции для улучшения развития растений, отличающейся тем, что она включает по меньшей мере один штамм инактивированных бактерий. Преимущественно, настоящее изобретение относится к штамму инактивированных бактерий для улучшения развития растений, отличающемуся тем, что штамм инактивированных бактерий оказывает более сильное биостимулирующее действие на развитие растений по сравнению с действием такого же штамма живых бактерий или содержащей его композицией.
Delftia
Achromobacter
Agrobacterium
Stenotrophomonas
Delftia acidovorans
Achromobacter piechaudii
Agrobacterium tumefaciens
Stenotrophomonas maltophilia
Achromobacter piechaudii
Agrobacterium tumefaciens
Stenotrophomonas maltophilia
Delftia acidovorans
Штамм бактерий, используемый в соответствии с изобретением, может происходить из любых видов бактерий, в частности, бактерий рода , ,  и . Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления бактерии, используемые по изобретению, могут происходить из видов , ,  и . Более предпочтительно выбирать используемый штамм бактерий из группы, состоящей из штамма  RAY12, зарегистрированного в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 16 апреля 2002 года под номером PTA-4231,  RAY28, зарегистрированного в Американской коллекцию типовых культур (ATCC) 16 апреля 2002 года под номером PTA-4232,  RAY 132, зарегистрированного в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 16 апреля 2002 года под номером PTA-4233, и/или  RAY209, зарегистрированного в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 25 апреля 2002 года под номером PTA-4249, в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Delftia
Delftia acidovorans
Согласно одному из вариантов осуществления штамм бактерий, используемый в настоящем изобретении, представляет собой ризобактерии, способствующие росту растений, или «PGPR». Согласно другому предпочтительному варианту осуществления штамм инактивированных бактерий, используемый по изобретению, относится к роду . Более конкретно, штамм бактерий, используемый по изобретению, представляет собой штамм  RAY209, зарегистрированный в Американской коллекции типовых культур (ATCC) 25 апреля 2002 года под номером PTA-4249 в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления бактерии по изобретению инактивируют при помощи физических, химических, биохимических или физико-химических процессов. В соответствии с одним из вариантов осуществления бактерии по настоящему изобретению инактивируют обработкой высоким давлением (например, при помощи Френч-пресса или другими способами, известными в данной области техники). В другом варианте осуществления бактерии по настоящей заявке инактивируют термической обработкой. Более предпочтительно, бактерии по изобретению инактивируют пастеризацией. В соответствии с одним из особенно предпочтительных вариантов осуществления пастеризацию проводят путем нагревания живых бактерий до температуры от 60°С до 90°С, от 62°С до 88°С, от 65°С до 85°С, от 75°С до 85°С или от 80°С и 85°С. Согласно другому варианту осуществления бактерии по изобретению пастеризуют без культуральной среды. Согласно еще одному варианту осуществления бактерии по настоящему изобретению инактивируют с культуральной средой. Согласно другому варианту осуществления бактерии по настоящему изобретению инактивируют без культуральной среды.
Согласно одному из вариантов осуществления улучшение развития и/или роста и продуктивности растений и/или увеличение биостимулирующего действия на развитие растений, в частности, но не исключительно, включает улучшение одного из следующих параметров: укоренение, площадь листа, развитие корня, цветение, плодоношение, высота растения, биомасса, всхожесть, урожайность, особенно в терминах количества, качества или более раннего созревания. Согласно одному из вариантов осуществления усиление биостимулирующего действия на развитие растений включает площадь листа, количество впитывающих корневых волосков и/или высоту растения.
Согласно одному из вариантов осуществления настоящее изобретение применимо ко всем типам растений, в частности, без исключения, к зерновым культурам (пшеница, ячмень, овес, рожь, тритикале), корнеплодам (сахарная свекла, картофель, кукуруза), бобовым (люцерна, клевер, спаржа), кормовым культурам (райграс, овсяница, садовая трава, фестулолиум, люцерна, вика, рапс, кормовая редька), масличным культурам (соя, рапс, рапс, горох, фасоль, белый люпин, подсолнечник), овощам и огородным культурам, плодовым культурам, виноградарству и декоративным культурам (цветоводство, газоны, рассада питомников).
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции для улучшения развития растений, отличающейся тем, что она содержит по меньшей мере один штамм инактивированных бактерий, причем указанный штамм инактивированных бактерий оказывает более сильное биостимулирующее действие на развитие растений по сравнению с препаратом, полученным с тем же штаммом живых бактерий.
4
12
5
12
6
12
7
12
6
11
6
10
6
9
6
8
В соответствии с одним из предпочтительных вариантов осуществления композиция по изобретению содержит перед инактивацией от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл, от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл, от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл, от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл, от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл, от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл, от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл или от 10 КОЕ/мл до 10 КОЕ/мл бактерий.
В соответствии с одним из вариантов осуществления композиция по изобретению содержит, по меньшей мере, один штамм бактерий инактивированных на 100%, 99% (с 1% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 98% (с 2% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 97% (с 3% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 96% (с 4% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 95% (с 5% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 94% (с 6% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 93% (с 7% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 92% (с 8% по меньшей мере одного штамма активных бактерий) 91% (с 9% по крайней мере одного штамма активных бактерий), 90%-85% (с 10-15% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 85%-80% (с 15-20% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 80%-75% (с 20-25% по меньшей мере одного штамма бактерий), 75%-70% (с 25-30% по меньшей мере одного штамма бактерии), 70%-65% (с 30-35% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 65%-60% (с 35%-40% по меньшей мере одного штамма активных бактерий), 60%-55% (с 40-45% по меньшей мере от одного штамма активных бактерий) или 55%-50% (с 45%-50% по меньшей мере одного штамма активных бактерий).
Согласно одному из особенно предпочтительных вариантов осуществления композиция по изобретению содержит, по меньшей мере, один штамм инактивированных бактерий и носитель, подходящий для применения в сельском хозяйстве. Более конкретно, подходящий для применения в сельском хозяйстве носитель подходит для введения инактивированных бактерий в растение и/или почву. Согласно одному из вариантов осуществления носитель находится в твердой и/или жидкой форме. Согласно другому варианту осуществления носитель является водой. Согласно другому варианту осуществления носитель представляет собой водно-гербицидную смесь. В соответствии с другим вариантом осуществления носитель представляет собой смесь воды и удобрений. Согласно другому варианту осуществления носитель является культуральной средой.
Согласно одному из особенно предпочтительных вариантов осуществления композиция по изобретению содержит штамм инактивированных бактерий, отделенный от культуральной среды.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления композиция, содержащая, по меньшей мере один штамм инактивированных бактерий, может находиться в форме порошка, гранул, микрогранул, средств для обработки семян, жидких составов, капсулированных бактерий или жидких суспензий. Более конкретно, композиция по изобретению находится в жидкой форме.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления композиция по изобретению находится в комбинации с подходящим составом, содержащим порошки, в частности смачивающиеся порошки, гранулы, микрогранулы, средства для обработки семян, капсулированные бактерии, жидкие составы, включая, без ограничения, суспензии в воде, в растворителе или культуральной среде.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления композиция по изобретению находится в подходящей форме для обработки почвы, обработки корневой части растения, обработки листовой части растения, обработки цветущей части растения, обработки плодоносящие части растения и/или для обработки семян. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления композицию по изобретению вводят одновременно или последовательно, путем внесения в почву, замачивания корней, обработки семян или включения и/или покрытия средой для роста, пленочным покрытием с продуктами для защиты растений или удобрениями или любым другим носителем или любым способом, обеспечивающим непосредственный контакт или контакт в будущем композиции с предназначенными для инокуляции семенами или растениями. Более конкретно, нанесение на почву осуществляется, в частности, но не исключительно, путем распыления, разбрасывания, полива, обработки почвы, фертигации, капельным путем в борозды с рассадой или на открытый грунт.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления композиция по изобретению содержит штамм инактивированных бактерий в комбинации с другими живыми микроорганизмами, инактивированными или в экстрактах, такими как бактерии, грибы и/или дрожжи. Более конкретно, композиция по изобретению содержит штамм инактивированных бактерий в комбинации с другими штаммами инактивированных бактерий, причем указанные бактерии способствуют развитию растений, питанию и защите.
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления композиция по изобретению также содержит удобрения, гербициды, инсектициды, фунгициды, бактерициды, минеральные растворы и/или питательные среды. В соответствии с другим предпочтительным вариантом осуществления композиция по изобретению также содержит субстрат. Более конкретно, субстрат содержит органический материал, в частности, но не исключительно, торф, неорганические материалы, в частности, но не исключительно, почву и/или песок, и/или глину, и/или другие компоненты почвы и/или синтетические вещества. Более конкретно, синтетическое вещество может представлять собой абсорбирующий материал, такой как, например, гранулят.
Согласно одному из вариантов осуществления композиция, содержащая штамм инактивированных бактерий, или штамм инактивированных бактерий по настоящему изобретению обеспечивает более сильное улучшение развития растений по сравнению с улучшением, обеспечиваемым такой же композицией, содержащей такой же штамм живых бактерий, или таким же штаммом живых бактерий.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению штамма инактивированных бактерий или содержащей его композиции для улучшения развития растений. В соответствии с одним из вариантов осуществления применение композиции или штамма инактивированных бактерий по настоящему изобретению обеспечивает более сильное улучшение развития растений по сравнению с улучшением, получаемым при использовании такого же штамма живых бактерий или такой же содержащей его композиции.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу улучшения развития растения, включающему введение композиции инактивированных бактерий по изобретению или штамма инактивированных бактерий по изобретению. В соответствии с одним из вариантов осуществления способ, включающий введение композиции штамма инактивированных бактерий или штамма инактивированных бактерий по изобретению, обеспечивает более сильное улучшение развития растений по сравнению с улучшением, получаемым при использовании такой же композиции, содержащей такой же штамм живых бактерий, или такого же штамма живых бактерий.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к растению, полученному путем использования композиции по изобретению или штамма инактивированных бактерий по изобретению для улучшения развития растения.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к растению, полученному путем использования способа улучшения развития растения, включающего введение композиции инактивированных бактерий или штамма инактивированных бактерий по изобретению.
ПРИМЕРЫ
Приведенные ниже примеры позволят лучше понять настоящее изобретение, которые приведены для иллюстрации заявки, а не для ограничения ее объема.
Delftia acidovorans
Были проведены испытания для проверки влияния на развитие модельного растения некоторых штаммов, в основном живых или убитых , в комбинации или без культуральной среды.
Пример 1
1-1/Получение инокулята бактериального штамма:
Delftia acidovorans
11
3
3
8
Delftia acidovorans
Требуемую бактериальную концентрацию в каждом инокуляте оценивали в эквиваленте 4⋅10 КОЕ/м коммерческого штамма , относительно LPC8. Поскольку во время испытаний использовали емкости объемом 0,0003 м, было определено, что в каждую емкость необходимо вводить 1,2⋅10 КОЕ.
1-2/Метод подсчета бактериальных суспензий:
Delftia acidovorans
-1
-2
-4
-5
-4
-5
7
Штамм бактерий  RAY209 продается в виде жидкого состава, содержащего суспензию бактерий в культуральной среде (BioBoost Liquid или BBL). Чтобы узнать концентрацию бактерий в продукте BBL, был выполнен их подсчет. Из исходной бактериальной суспензии Bag-in-Box™ (BBL) отбирали 1 мл раствора, который помещали в пробирку. В пробирку, содержащую 1 мл бактериальной суспензии, добавляли пептонную воду (9 мл) для 10 разведения. 1 мл второго образца этого разведения помещали в пробирку и добавляли 9 мл пептонной воды для получения 10 разведения. Затем этот процесс повторяли до тех пор, пока не были получены 10 и 10 разведения. Из каждого из 10 и 10 разведений отбирали по 100 мкл для инокуляции поверхности чашки Петри (среда TSA: соевый агар с триптоказеином). В общей сложности для одного разведения инокулировали 6 чашек Петри, которые инкубировали в течение 48 часов при 30°С (ATCC, 2015; Larcher., 2015). Подсчитывали колонии на поверхности чашек, и оценивали концентрацию в BBL (коммерческом продукте) при 2⋅10 КОЕ/мл.
1-3/Метод подсчета бактериальных суспензий:
Delftia acidovorans
Штамм бактерий  RAY209 продается в виде жидкого состава, содержащего суспензию бактерий в культуральной среде. Приготовление бактериального инокулята в культуральной среде: «бактерии+супернатант» (B+M):
Для протокола «бактерии+супернатант» (B+M) использовали бактериальную суспензию BBL как таковую.
1-4/Приготовление инокулята: «бактерии+вода»:
7
1400 мл бактериальной суспензии BBL центрифугировали при 8500 об/мин (13000 g) в течение 15 минут. Бактериальный осадок растворяли в 700 мл воды и снова центрифугировали. Эту стадию повторяли 3 раза, чтобы удалить оставшийся культуральный супернатант. Затем осадок ресуспендировали в водопроводной воде (примерно 700 мл). Повторно измеряли концентрацию бактерий в этом растворе в соответствии с протоколом, описанным в Примере 1-2. После подсчета колоний на поверхности чашек оценивали концентрацию бактерий при 4⋅10 КОЕ/мл. Эта суспензия является протоколом «бактерии+вода».
1-5/Подготовка протокола «бактерии+вода, пастеризованные» ((B+вода)p):
Примерно 200 мл суспензии «бактерии+вода», описанной в Примере 1-2, нагревали на водяной бане в течение 20 минут при 80°C, чтобы получить суспензию «бактерии+вода, пастеризованные» ((B+вода)p).
1-6/Подготовка протокола «культуральный супернатант» (M):
Бактериальную суспензию BBL центрифугировали при 8500 об/мин (13000 g) в течение 15 минут, и отбирали примерно 600 мл супернатанта для инокуляции растений. Этот образец является протоколом «культуральная среда» (M).
1-7/Подготовка протокола «пастеризованный культуральный супернатант» (Mp):
Бактериальную суспензию BBL центрифугировали, и после центрифугирования извлекали 200 мл культурального супернатанта, который нагревали на водяной бане в течение 20 минут при 80°C. Полученный раствор представляет собой протокол «пастеризованный культуральный супернатант» (Mp).
1-8/Подготовка протокола «сера» (S):
1 г серы смешивали со 100 мл воды в контейнере для получения протокола «сера» (S).
1-9/Подготовка протокола для положительного контроля
IT45 (IT45):
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus amyloliquefaciens
10
7
Распыленный микробный препарат  IT45 в виде порошка, концентрированный до 2⋅10 КОЕ/г, ресуспендировали в воде с получением целевой концентрации 4⋅10 КОЕ/мл.
Пример 2
2-1/Подготовка растений (
)
Arabidopsis thaliana
Растения выращивали на твердой среде в нестерильных условиях, приближенных к естественным полевым условиям в следующих повторах:
Биологический повтор=8 протоколов х 3 повтора х 6 итераций=144 растения
2-2/Приготовление рассады
Семена хранили при 4°C для обеспечения правильного и синхронизированного прорастания (ABRC, 2015). Примерно 300-400 семян высевали с низкой плотностью в 3 чашках Петри (диаметром 14 см) на бумаге для проверки всхожести семян. Добавляли эквивалентное количество воды, 5 мл, для пропитки ею бумаги для проверки всхожести семян. Чашки Петри помещали в холодильник (4°С) на 3 дня для стратификации семян.
2-3/Приготовление микро-теплиц и горшков
Растения выращивали в горшках (6×6х7 см), помещенных в 6 микро-теплиц (22×16×18 см). Горшки заполняли 150 г песчано-грунтовой смеси для проращивания (2/3 питательный грунт и 1/3 песка, м/м).
Микро-теплицы с внутренней стороны покрывали ирригационным матом для поддержания влажной среды для растений.
Затем семена извлекали из чашек Петри и помещали при помощи щипцов в горшки с почвой (5-6 семян на горшок). После прорастания семян оставляли один проросток на горшок.
2-4/Инокуляция и рост растений
Каждый сеянец инокулировали во время посева растворами/суспензиями, описанными в Примере 1, следующим образом. Рассаду выращивали с циклом день/ночь, при 23°С в течение 16 дневных часов, а затем при 18°С в течение 8 ночных часов. Горшки поливали один или два раза в день в дневное время. Влажность не регулировалась и составляла примерно 70-80%. Каждый протокол инокулировали следующими дозами:
Delftia acidovorans
A)  RAY209 в культуральной среде (B+M): 6 мл/горшок (18 горшков)
B) «бактерии+вода» (B+вода): 3 мл/горшок (18 горшков)
C) «(бактерии+вода) пастеризованные» (B+вода)p: 3 мл/горшок (18 горшков)
D) «Пастеризованный супернатант культуры» (Mp): 6 мл/горшок (18 горшков)
E) вода: 3 мл/горшок (18 горшков)
F) «Супернатант культуры» (М): 6 мл/горшок (18 горшков)
Bacillus amyloliquefaciens
G) Суспензия  IT45: 1 мл/горшок (18 горшков)
H) Сера (S): 0,01 г/горшок (18 горшков) (1 мл на растение 1% (масс./об.) раствора).
Различные партии горшков рандомизировали таким образом, чтобы было получено равномерное распределении тестируемых образцов в используемой области, позволяющее устранить разброс переменных (температуры, яркости, аэрации, влажности и т.д.), имеющийся в теплице и помещении для культивирования. В комнате для выращивания устанавливали 3 блока из 8 периодически перемещаемых внутри блока мини-теплиц.
2-5/Измерения и анализы
Рост растений оценивали по развитию площади листьев с течением времени. Растения фотографировали сверху каждые 2 дня, и каждую фотографию анализировали при помощи программного обеспечения Фиджи для расчета площади листьев каждого растения в течение цикла.
Данные измерений записывали в файле Excel (площадь листа, сухая масса, свежая масса), и эти данные анализировали при помощи программного обеспечения XLSTAT. Для оценки различий между средними значениями протоколов использовали тест Тьюки (апостериорный тест множественного сравнения) (см. фиг. 1).
Таблица 1. Средние значения площади листовых пластин для каждого протокола и за день
День 7
День 9
День 11
День 14
День 16
День 20
День 24
(B+вода)p
0,742 ab
2,166 ab
IT45
0,126 ab
0,242 ab
B+вода
0,070 bc
0,149 abc
0,254 ab
0,498 abc
1,167 ab
2,917a
S
0,044 c
0,125 bc
0,226 ab
0,360 abc
0,964 ab
Mp
0,050 c
0,120 bc
0,164 ab
0,315 abc
0,859 ab
B+M
0,056 c
0,106 bc
0,158 ab
0,296 abc
0,890 ab
вода
0,053 c
0,101 bc
0,173 ab
0,252 bc
0,553 ab
M
0,018 c
0,033 c
0,050 b
0,098 c
0,218 b
Pr> F
0,000
0,001
0,010
0,004
0,025
0,033
0,036
значимое(>95%)
да
да
да
да
да
да
да
a, b и c - однородные группы обработанных растений, использованные для проведения статистического теста Тьюки.
Pr > F: пороговое значение для степени значимости
Bacillus amyloliquefaciens
Различия, наблюдаемые в измерениях площади листа для каждого протокола, являются значимыми (см. Таблицу 1). Значимое различие наблюдали между положительным контролем ( IT45) и отрицательным контролем (вода). Кроме того, протокол (B+вода)p показал наилучшие результаты для площади листьев растений (превышающие данные для положительного контроля) по сравнению с другими протоколами. Культуральный супернатант М показал наименьший рост листьев.
Пример 3
Delftia
Lactobacillus
Изучение влияния инактивации штаммов  и  на параметры роста проростков канолы
Delftia acidovorans
Lactobacillus rhamnosus
Brassica napus cultivar
Целью данного исследования является определение влияния обработки штаммов  и  пастеризацией на рост сеянцев канолы ( 5525CL). Более конкретно, данное исследование направлено на сравнение влияния пастеризованных и непастеризованных (т.е., живой бактериальной культуры) бактериальных штаммов на параметры роста проростков канолы.
3-1/Сорт канолы
Brassica napus
Рассаду канолы , принадлежащей к сорту 5525CL (Brett Young), дезинфицировали в соответствии с протоколом, описанным в Asaduzzaman et al. («Metabolomics Differentiation of Canola Genotypes: Toward an Understanding of Canola Allelochemicals». Frontiers in Plant Science, vol. 5, 2015.doi:10.3389/fpls.2014.00765). После сушки семена оставляли прорастать в чашках Петри, содержащих агар (15 г/л). Проросшие семена переносили в мешки для прорастания (Mega International) в количестве 2 семени/мешок, содержащие смесь питательный грунт, дополненный половиной дозы Hoagland № 2 (Sigma, H2395).
3-2/Протоколы исследования
Таблица 2. Описание различных протоколов, изученных в этом примере.
<b>№ протокола</b>
<b>Протоколы</b>
1
Суспензия живых <i>Delftia acidovorans</i> RAY 209 (клетки промывали в стерильной дистиллированной воде)
2
Суспензия <i>Delftia acidovorans</i> RAY 209 (клетки промывали в стерильной дистиллированной воде), инактивированная пастеризацией
3
Суспензия <i>Delftia acidovorans</i> RAY 209 (клетки промывали в стерильной дистиллированной воде), инактивированная обработкой Френч-прессом (высокое давление с последующей быстрой декомпрессией)
4
Суспензия живых <i>Lactobacillus rhamnosus</i> R0011 (клетки промывали в стерильной дистиллированной воде)
5
Суспензия <i>Lactobacillus rhamnosus</i> R0011 (клетки промывали в стерильной дистиллированной воде), инактивированная пастеризацией
6
Суспензия <i>Lactobacillus rhamnosus</i> R0011 (клетки промывали в стерильной дистиллированной воде), инактивированная обработкой Френч-прессом (высокое давление с последующей быстрой декомпрессией)
7
Культуральный супернатант <i>Delftia acidovorans</i> RAY 209 (обработка без бактерий)
8
Стерильная дистиллированная вода
3-3 Приготовление непастеризованных инокулянтов
Delftia acidovorans
Lactobacillus rhamnosus
Штаммы бактерий, используемые для инокуляции проростков канолы, представляли собой  RAY 209 (BBL) и  R0011 (Institut Rosell-Lallemand. Montréal, Qc, Canada). Концентрации маточных растворов бактерий составляли соответственно 3,71E+08 КОЕ/мл и 2,21E+11 КОЕ/мл.
Delftia acidovorans
Маточные растворы (1 мл) центрифугировали при 8500 об/мин в течение 15 минут. Осадок ресуспендировали в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Эту стадию промывки бактериальных клеток повторяли дважды. После первого центрифугирования исходного раствора  RAY 209 супернатант сохраняли для дальнейшей обработки проростков канолы (протокол 3). Бактериальные суспензии в стерильной дистиллированной воде хранили для инокуляции проросшей канолы (протоколы 1 и 4).
3-4/Приготовление инактивированных инокулянтов
Оценивали два метода инактивации: (1) пастеризацию или термическую обработку и (2) обработку на Френч-прессе (высокое давление с последующей быстрой декомпрессией).
(1) Термическая обработка
Для каждого из 2 изученных бактериальных штаммов 1 мл бактериальной суспензии с концентрацией 3,71E+08 КОЕ/мл в дистиллированной воде переносили в пробирку типа Эппендорф (1,5 мл) и инкубировали при 80°C на водяной бане в течение 20 минут. Пастеризованные бактериальные суспензии хранили для инокуляции проросших семян канолы (протоколы 2 и 5).
(2) Обработка на Френч-прессе (высокое давление с последующей быстрой декомпрессией)
Для каждого из 2 изученных бактериальных штаммов 5 мл бактериальной суспензии с концентрацией 2,21Е+11 КОЕ/мл в стерильной дистиллированной воде пропускали через Френч-пресс (American Instrument CO Inc.) под давлением 18000 фунтов на квадратный дюйм при 4°C с последующей мгновенной разгерметизации. Лизированные бактериальные клетки собирали для инокуляции проросших семян канолы (протоколы 3 и 6).
3-5/Бактериальная инокуляция рассады канолы
Проросшие семена канолы инокулировали при помощи пипетки, и 10 мкл полученных препаратов (см. протокол 8 в таблице 2 описания протоколов) наносили на каждое семя канолы. В таблице 3 приведены концентрации бактерий, нанесенных на семена канолы.
Обработанные семена выдерживали в контролируемой атмосфере в камере для выращивания при 22°С в течение 16 световых часов и при 18°С в темноте течение 8 часов.
Согласно схеме эксперимента, каждый протокол имел по 10 повторов для 2 проросших семян/мешок для прорастания. Таким образом, в общей сложности было обработано 20 проросших семян на каждый протокол.
Таблица 3. Расчеты бактериальных концентраций, применяемых для семян канолы
Инокулянт
Концентрация маточного раствора
Разведение маточного раствора до 10<sup>8</sup> КОЕ/мл
Требуемый титр (КОЕ/мл)
Внесенное количество/семя (мкл)
Конечный титр (КОЕ/семя (10 мкл))
Количество инокулянта в общем объеме (мкл)
Количество воды в общий объем (мкл)
<i>D.acidovorans</i> RAY209
3,71E+08
3,71E+08
1,00E+08
10
1,00E+06
2,694
7,31
<i>L.rhamnosus</i> R0011
2,21E+11
2,21E+08
1,00E+08
10
1,00E+06
4,525
5,48
3-6/Обсуждение результатов
Данные получали через 8, 22 и 36 дней после инокуляции семян канолы. Через 8 дней подсчитывали количество боковых корней. Через 22 дня инкубации собирали по 10 проростков на каждый протокол. По десять проростков на каждый протокол собирали через 36 дней инкубации. После сбора проростков канолы измеряли высоту побегов от корневой шейки до самого высокого листа. Корни отделяли от почвы и измеряли. Растительную биомассу и корневую биомассу (побеги и корни по отдельности) также измеряли при помощи точных весов. Массу сухих побегов и корней определяли после сушки при 35°С в течение 48 часов.
2
Кроме того, для каждого из протоколов под микроскопом оценивали наличие впитывающих корневых волосков на корнях проростка канолы. Для этого для каждого из протоколов 1 см первичного корня помещали в чашку Петри. Корень погружали в воду так, чтобы впитывающие корневые волоски находились во взвешенном состоянии. Наблюдения под микроскопом проводили при увеличении в 100 раз. Корневые волоски подсчитывали на площади 0,75 мм. На фиг. 2-9 показаны изображения впитывающих корневых волосков в соответствии с протоколом, наблюдаемых под микроскопом.
Выполняли односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) и тест Бартлетта для сравнения дисперсий для определения протоколов, которые отличались от других по высоте побегов (при помощи программного обеспечения KyPlot). Результат анализа высоты побега представлен в таблице 4.
Delftia acidovorans
Результаты показывают, что штамм  может стимулировать развитие корневой части растений за счет увеличения количества впитывающих корневых волосков. Среди прочего, он также способствует улучшению усвоения питательных веществ растениями.
Таблица 4. Сравнение высоты побегов канолы через 36 дней после обработки.
<b>Обработка</b>
<b>Терильная вода</b>
<b>Живые </b><b><i>Delftia</i></b>
Стерильная вода
X
X
Культуральная среда для <i>Delftia</i>
+
X
<i>Lactobacillus, </i>инактивированные под давлением
-
X
Пастеризованные <i>Lactobacillus </i>
+
X
Живые <i>Lactobacillus </i>
-
X
Живые <i>Delftia</i>
--
X
<i>Delftia, </i>инактивированные под давлением
+
++
Пастеризованные <i>Delftia</i>
+++
+++
Символы представляют значимость результатов сравнения видов обработки, указанных в столбце, с видами обработки, указанными в строке (дисперсионный анализ статистической значимости ANOVA).
Описание
Символ/значение
«+» значимое положительное различие отсутствует
«-» значимое отрицательное различие отсутствует
«=» различия отсутствуют
«++» значимое положительное различие при P=0.1
«--» значимое отрицательное различие при P=0,1
«+++»значимое положительное различие при P=0,05
«---» значимое отрицательное различие при P=0,05
Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления, понятно, что в указанные варианты осуществления могут быть добавлены несколько вариантов и модификаций, и настоящая заявка включает такие модификации, применения или адаптации настоящей заявки в целом, принципы изобретения, включая любое изменение настоящего описания, которое станет известным или общепринятым в области техники, к которой относится настоящая заявка, и которое может быть применено к существенным элементам, указанным выше, в соответствии с объемом формулы изобретения.