Нелинейная оптическая микроскопия в применении к биомедицинским исследованиям

2

Теория и практика биомединженерии

УДК 535.8, 616-07, 577.3

Ю. С. Крылова, А. О. Дробинцева, В. О. Полякова, И. М. Кветной, Л. Н. Пантелеев, С. Ф. Мусихин, В. Барзда

Нелинейная оптическая микроскопия в применении к биомедицинским исследованиям

Ключевые слова: нелинейная оптическая микроскопия, двухфотонная флюоресценция (ДФФ, TPF), генерации второй гармоники (SHG), генерация третьей гармоники (THG).

Keywords: nonlinear optical microscopy, two photon fluorescence (TPF), second harmonic generation (SHG), third harmonic generation (THG).

Достижения в развитии нелинейных оптических методов привело к разработке современных неинвазивных методов диагностики, позволяющих проводить исследования как ex vivo, так и in vivo. В данном обзоре рассмотрены основные принципы функционирования нелинейных оптических методов для микроскопической диагностики и их применение в медикобиологи-ческих исследованиях. Рассматриваются принципы и методы двухфотонной флюоресценции и генерации второй и третей гармоник.

В последние годы использование двухфотонной флюоресценции (ДФФ) и генерации второй (SHG) и третьей (THG) гармоники в микроскопии стало важным инструментом в области биомедицинских исследований. Способность ДФФ с минимальной инвазивностью получать оптические срезы является выгодной для использования в клинической диагностике. В данном обзоре рассмотрены основные принципы работы нелинейных методов в микроскопии и использование ДФФ, SHG и THG для диагностики кожной патологии, заболеваний роговицы и дифференцировки опухолевого процесса.

Принципы нелинейной микроскопии

Нелинейная оптическая микроскопия, несмотря на сходство с конфокальной микроскопией, открывает новые возможности исследования биологических тканей и структур и применения ее в интересах медицины. Оптический микроскоп в соединении с фемтосекундным лазером становится мощным средством получения изображения, с помощью которого удается выделить биологические структуры на основе нелинейного взаимодействия света с веществом. Нелинейный оптический отклик может быть использован для получения изображения, с помощью которого можно визуализиро-

вать структурную и функциональную информацию о биологическом объекте. При этом нет необходимости использовать флуорофоры.

Взаимодействие света с веществом можно описать, используя наведенную поляризацию, т. е. наведенный дипольный момент в расчете на единицу объема. Лазерное излучение с использованием сверхкоротких импульсов в лазерных сканирующих микроскопах имеет достаточно высокую интенсивность, чтобы вызвать нелинейную поляризацию в материале. Для описания нелинейного взаимодействия вектор поляризации P можно представить в виде [1]

Р^) = X(1E(t) + x(2E(t)E(t) + x(3E(t)E(t) E(t) + ...,

где первый член описывает линейный отклик материала на оптическое электрическое поле E, второй член описывает нелинейную восприимчивость второго порядка, в том числе и генерацию второй гармоники, а третий член представляет различные нелинейные процессы четырехволнового смешивания, такие как генерация третьей гармоники, когерентное рамановское рассеяние, двухфотонное поглощение и оптический эффект Керра.

Волны, которые генерируются при нелинейном взаимодействии, описываются неоднородным волновым уравнением, в которое входит нелинейная поляризация. Наличие этого члена уравнения вызывает появление электрического поля, которое ускоряет заряды и, как результат, генерирует электромагнитное излучение на частотах, отличных от частоты возбуждающего электромагнитного излучения. Нелинейный отклик, который чаще всего используют в нелинейной микроскопии, может быть представлен в виде энергетических переходов (рис. 1) [2]. Из представленных на рисунке оптических откликов только генерация второй гармоники (ГВГ — SHG) связана с нелинейностью поляризации второго порядка, в то время как двухфотонная флюоресценция (ДФФ — TPF) и генерация третьей гар-

ю <2ю

----"3

ю

1 г

ТРЕ

2ю

SHG

1 1

ю

ю 3ю

ю

г

ТИО

Рис. 1 I

моники (ГТГ — ТИО) являются эффектами третьего порядка. Сплошные горизонтальные линии на рисунке представляют электронные состояния молекул, а штриховые — виртуальные уровни, которые являются суперпозицией полей одного или более фотонов и собственных состояний молекул. Переходы на электронные состояния молекул связаны с поглощением одного или более фотонов, в то время как переходы на виртуальные состояния не приводят к поглощению фотонов. Энергия переходов, связанная с виртуальными состояниями, сразу когерентно переизлучается, не приводя к поглощению энергии в системе. Это означает, что для возбуждения второй и третьей гармоник можно использовать более высокие интенсивности света по сравнению с двухфотонным поглощением, которое может приводить к фотообесцвечиванию и тепловым эффектам разрушения.

Из рис. 1 следует, что лазерное излучение одной и той же частоты может вызывать различные нелинейные эффекты, в то время как частота двух-фотонного поглощения определяется электронными переходами в молекулах, а положение виртуальных уровней зависит только от частоты возбуждающего излучения. Поэтому тот же самый импульс лазера, который вызывает возбуждение флуоресценции, может приводить к генерации второй и третьей гармоник. Когерентные нелинейные эффекты усиливаются, когда частота возбуждения оказывается близка к резонансным переходам молекул. Такое резонансное усиление можно наблюдать при генерации второй и третьей гармоник, и оно часто используется в рамановской спектроскопии. При резонансном усилении генерируются более мощные сигналы, но при этом возрастает возможность фотообесцвечивания и проявления тепловых эффектов разрушения.

БНО — это случай вырождения генерации суммарной частоты, когда два взаимодействующих электрических поля имеют одну и ту же частоту. БНО генерируется в среде без центра симметрии, т. е. нелинейная восприимчивость второго поряд-

ка исчезает в системах с инверсионной симметрией. Поэтому ненулевые значения %(2) определяются асимметричными молекулами или структурами. Особый случай возникает, когда в среде находятся хиральные молекулы одного и того же энантиоме-ра. Хиральными являются, например, молекулы сахара и аминокислоты. Тогда генерация второй гармоники запрещена правилами по симметрии, и поэтому в оптически активных жидкостях, таких, например, как раствор сахара, вторая гармоника не генерируется. Инверсионная симметрия нарушается на границе раздела между двумя материалами, поэтому вторая гармоника хорошо генерируется монослоем молекул, адсорбированных на поверхность.

Эффективность генерации второй гармоники зависит от структурного устройства образца. Присутствие многослойных структур, макрохираль-ность и подходящая ориентация осей структуры по отношению к направлению распространения лазерного луча в значительной мере определяют микроскопическую эффективность генерации второй гармоники. Механизм контрастирования микроскопии БНО основан на нецентросимметричной организации образца. Микроскопически генерация БНО происходит из-за нарушения симметрии на границе раздела или из-за нецентросимметричной организации объемной структуры. Биологические мембраны являются хорошими кандидатами для генерации второй гармоники на границе раздела. Два листа липидного бислоя должны быть асимметрично расположены, чтобы вызвать генерацию БИО. Часто это бывает в случае биологических мембран, когда клеточные мембраны имеют различное содержание липидов и протеинов на разных сторонах мембраны. Можно наблюдать также сигнал БИО, когда нелинейные молекулы красителя аккумулируются только на одной стороне мембраны. Когда две такие асимметричные мембраны объединяются вместе, так что образуется симметричная структура, сигнал БИО исчезает. Иногда объемная генерация БИО в биологических образцах появляется из-за микрокристаллических структур, например в кальцитах или гранулах крахмала. Регулярно организованные биологические макроструктуры, которые обладают оптической активностью, тоже эффективно генерируют БИО. Значительная генерация БИО в объеме наблюдалась в миоцитах [3], коллагене [4], хлоропласте и других биологических объектах. Регистрация БИО при различной ориентации образца позволяет определить тензор элементов %(2), который описывает структурную организацию молекул в трехмерной системе. В большинстве случаев генерация БИО в объеме оказывается более существенной, чем генерация на поверхности, что связано с большим количеством когерентно фазированных молекул в фокальной области по сравнению с количеством молекул на границе раздела.

п

ю

т

ю

ё

Генерация третьей гармоники является нелинейным процессом третьего порядка. THG можно генерировать в однородной среде, и она не имеет запрета по симметрии в противоположность SHG. THG не наблюдается в дальнем поле, когда луч сфокусирован в однородном материале с нормальной дисперсией. Это обусловлено сдвигом Гюи, когда гауссов пучок света проходит через фокус. При этом пучок света приобретает фазовый сдвиг на п и в дальнем поле происходит аннигиляция сигнала как результат интерференции сигналов с противоположными фазами. THG можно наблюдать только если симметрия в фокальной области нарушена путем введения границы раздела двух материалов с различными показателями преломления или с нелинейными восприимчивостями третьего порядка. Хотя THG проявляется на границе раздела, но исходно это объемный эффект, поскольку THG генерируется в объеме среды по обе стороны от границы раздела. Многослойные структуры могут усилить интенсивность третьей гармоники в дальнем поле при условии правильно подобранной периодичности. Чувствительность THG к присутствию границ раздела используют в микроскопии THG. THG чувствительна к ориентации границы раздела по отношению к направлению распространения пучка света.

В случае биологических применений THG может быть использована для визуализации биологических мембран, стенок клеток и многослойных структур, таких как складки внутренних мембран в митохондриях [3]. THG также наблюдали для эритроцитов, культивируемых нейронов, дрожжевых клеток, глиальных клеток человека, мышечных клеток, зародышей дрозофилл и других биологических объектов.

Многофотонное поглощение света также является нелинейным процессом. Двухфотонное поглощение — это нелинейный эффект третьего порядка, а трехфотонное поглощение — это эффект пятого порядка. В результате нелинейного возбуждения молекулы появляется эмиссия флуоресценции либо поглощенная энергия релаксирует через безызлу-чательный процесс.

Многофотонное поглощение происходит, когда энергия молекулярного перехода из основного в возбужденное состояние соответствует энергии двух или трех фотонов. Переход также требует соблюдения правил симметрии волновой функции основного и возбужденного состояний. Однофотон-ное возбуждение может быть запрещено, а двух-фотонное — разрешено. Спектр двухфотонного поглощения может быть подобен спектру однофотон-ного поглощения. Однако некоторые зоны могут появиться, а иные зоны окажутся пропущенными в спектре двухфотонного поглощения по сравнению с линейным спектром поглощения. Применение многофотонного поглощения позволяет использовать длинноволновое инфракрасное возбуждение,

которое глубже проникает в биологические ткани благодаря слабому линейному поглощению и уменьшенному рассеянию.

Возможна одновременная регистрация сигналов второй, третьей гармоник и многофотонной флуоресценции. Такая мультимодальная микроскопия дает определенные преимущества и помогает выявлять различные функциональные структуры одного и того же биологического объекта. Однородные структуры не видны при регистрации SHG и THG, но могут быть видны в сигнале флуоресценции. Зато структурные особенности хорошо проявляются для SHG и THG. Регистрация этих изображений соместно с теоретическим расчетом позволяют выделить особенности строения объекта [5]. Такая специальная обработка изображений, как декон-волюция с учетом аппаратной функции и кросс-корреляционный анализ изображения, позволяет повысить его контраст.

Нелинейный мультимодальный микроскоп

Нелинейные микроскопы имеют много общих черт, которые роднят их с широко используемыми конфокальными микроскопами. Это позволяет, используя конфокальный микроскоп и присоединяя к нему фемтосекундный импульсный лазер, преобразовать его в нелинейный оптический микроскоп.

Пример нелинейного оптического микроскопа представлен на рис. 2 [2]. На этом рисунке М1, М2, М3 — зеркала; SM — сканирующие зеркала; L1, ..., L7 — линзы; F1, F2, F3 — оптические фильтры; DM1, DM2 — дихроические зеркала; OE — объектив возбуждения; OC — объектив с высокой числовой апертурой для сбора сигналов второй и третьей гармоник; PMT — фотоумножители; SF —

пространственный фильтр; PZ — пьезоподвижка. Поскольку нелинейное возбуждение происходит только в фокальной области объектива, то дополнительной конфокальной точечной диафрагмы здесь не требуется. Возбуждения нелинейных сигналов за пределами фокальной области не происходит, поскольку там недостаточна мощность лазерного луча.

Для появления нелинейных оптических эффектов требуется высокий уровень возбуждения, поэтому обычно используют пикосекундные или фемтосе-кундные лазеры. Сверхбыстрые лазеры обеспечивают высокую плотность потока во время длительности импульса, в то же время средняя мощность остается низкой, что вполне приемлемо для биологических объектов. Нелинейный отклик имеет квадратичную или кубическую зависимость от интенсивности возбуждения, поэтому для эффективного нелинейного возбуждения требуются как можно более короткие лазерные импульсы. Однако имеется ограничение пиковой мощности, которую можно приложить к биологическому образцу, ее превышение вызовет пробой диэлектрика. Импульсы длительностью несколько сотен фемтосекунд (фс) обеспечивают наилучшие результаты. Очень короткие импульсы лазера (менее 20 фс) испытывают значительное ушире-ние при прохождении через стеклянные компоненты микроскопа благодаря эффекту дисперсии групповой скорости. Поляризация лазерного луча также играет важную роль, поскольку циркулярно поляризованный свет не вызывает генерации третьей гармоники. Поэтому эллиптически поляризованный свет, который является комбинацией линейной и циркулярной поляризации, генерирует меньшую интенсивность третьей гармоники, чем линейно поляризованное возбуждение.

Растровое сканирование вдоль поверхности (оси xy) осуществляют обычно с помощью гальванометрических зеркал. Если требуется сканирование в режиме видео, то используют резонансные сканеры. Оптические срезы изображения получают с помощью пьезоподвижки, которая смещает образец по вертикали (ось z).

Использование в биомедицинских исследованиях

Как было отмечено ранее, прямое двухфотон-ное изображение характеризует ДФФ и интенсивность SHG и соответствует морфологии ткани [6—9]. Наличие и количество собственных флюорофоров, таких как NAD (P) H, кератин, эластин и ретинол, влияют на наблюдаемую на изображении автофлюоресценцию и могут быть использованы в качестве индикаторов или единиц измерения для па-тогистологической диагностики [10]. Исследования с использованием ДФФ показали, что интенсивность автофлюоресценции в измененных опухоле-

вым процессом тканях, например при гепатоцелю-лярной карциноме (ГЦК), ниже, чем в здоровой ткани [11]. В настоящее время в патоморфологи-ческом отделении степень дифференцировки при ГЦК оценивают от одного до четырех патологоанатомов [12]. Количественная оценка автофлюоресценции позволяет различать опухолевые клетки от здоровых путем анализа от одного до четырех морфологических параметров, в частности подсчитать количество клеточных ядер и соотношение их к цитоплазме. Автофлюоресценция имеет свои недостатки, такие как слабая собственная флюоресценция, которая составляет всего 0,1—1 %, по сравнению с эндогенно меченными аналогами [13], а также невозможность получить информацию от некоторых клеточных органелл из-за отсутствия у них собственных флюорофоров.

Другой метод количественного морфологического анализа с использованием 2Б-дискретного преобразователя Фурье (ДПФ), который преобразует интенсивность БИО из тканей, богатых БИО, в пространственную томографию ДПФ, отображает структурные особенности с точки зрения частотного распределения. Подобный анализ 2Б-ДПФ был продемонстрирован в работах Маттейни и соавторов, где они исследовали фототермически индуцированную коллагеновую дезорганизацию роговицы. В исследовании выявили, что в зоне интереса интенсивность изображения иллюстрировала прогрессию заболевания в коллагеновых структурах, что отражалось в частоте распределения [14]. Чувствительность к пространственной вариации делает ДПФ особенно подходящей для количественной оценки организованной фиброзной ткани, в частности коллагеновой стромы роговицы, коллагено-вого внеклеточного матрикса, путем определения направления анизотропии. Коллагеновая строма роговицы расположена упорядоченно в виде тонких слоев [15]. Эта структура несет ответственность и за прозрачность роговицы, что мешает эффективной визуализации с помощью методов конфокальной микроскопии [16], однако она создает сильные сигналы БИО и это делает ее особенно подходящей для исследования с использованием ДФФ-метода [17,18], который позволяет количественно оценить нарушение коллагеновых структур в зависимости от расстояния до роговицы [9]. Аналогичный метод используется для характеристики здоровой кожи и келоидных рубцов [19].

Ценными биологическими источниками БИО являются поперечно-полосатая мускулатура, богатая миозином, хрящи и сухожилия, богатые коллагеном, а также элементы растений, содержащие целлюлозу и хлоропласты [20]. Способность генерировать БИО тканями, структурно богатыми коллагеном и миозином, обусловила значительный прогресс в выявлении, дифференцировке и диагностике ассоциированных с их поражением заболеваний [21—23]. Как сильный генератор БИО

и наиболее распространенный структурный белок человеческого тела коллаген является особенно подходящей мишенью для анализа [24, 25]. Наиболее часто встречающийся тип I коллагена образует пучки в дерме, сухожилиях и роговице [26]. Структурные изменения, возникающие при различной патологии, происходят на масштабах, которые невозможно выявить при обычной томографии, но можно при использовании SHG, которая позволяет получать изображение за счет контраста между различными структурами [27, 28]. Это широко используется для отбора проб из дермы при различной патологии, связанной с неправильным ростом коллагена в коже, в частности при келоиде, очаговой склеродермии и эластолизе [22]. В современной восстановительной медицине методика применяется для различия типов коллагена при инженерии конструкции хряща, а также при культивировании ткани [29]. Отношение компонентов тензора восприимчивости по результатам измерения поляризации SHG оказалось различным для нормальных и опухолевых тканей легкого [30]. Изображение, построенное на основе SHG с учетом поляризации, позволяет визуализировать раковые области и помогает в патологической диагностике. Отношение компонентов восприимчивости может быть использовано как новый маркер для анализа гистологических образцов в раковой диагностике.

Различные комбинации двухфотонных нелинейных процессов, а именно ГТГ автофлюоресценции и SHG, вместе с количественными методами позволяют целенаправленно дифференцировать участки биологических организмов для более комплексного исследования по сравнению с обычной оптической микроскопией. Кроме изучения внутренних тканей ex vivo, распространение in vivo в клинических условиях двухфотонной микроскопии пока ограничено исследованиями глаза, кожи, полости рта, областей, которые легко доступны [31—33]. Включение миниатюрной сканирующей головки двухфотонной микроскопии улучшает in vivo клиническую диагностику внутренних органов, таких как кишечник и пищевод [34]. Применение дополнительно моделирования и количественного анализа совместно с двухфотонной микроскопией увеличивает достоверность экспериментальных исследований [35]. Количественное определение интенсивности, основанное на ДФФ, позволяет отделять ГЦК от нормальных тканей, а также определять нормальную и келлоидно измененную дерму кожи, количественно оценить неоднородность эластина и распределение коллагена в дерме кожи и дифференцировать ба-зально-клеточную карциному (БКК) от здоровой ткани. Кроме волокон, эндогенные люминесцентные частицы NADH и FAD могут быть использованы для мониторинга физиологических условий, а также для раннего обнаружения метаболических расстройств, вызванных онкологической патологией, например карциномой. SHG и ДФФ позволяют

отличать нормальную дерму кожи от измененной келоидом, эластолизом или очаговой склеродермией, кроме того, могут быть использованы для дифференцировки организованных коллагеновых волокон здоровой ткани яичников человека от измененных опухолевым процессом.

Таким образом, различные комбинации двухфо-тонной визуализации и SHG открыли новые возможности в клинической диагностике. Достоинства метода, такие как неинвазивность, отсутствие необходимости использования дополнительных красителей, дают возможность использовать их во время рутинных эндоскопических манипуляций на кишечнике и пищеводе, исследовании роговицы в офтальмологии и коллагеновых структур в дерматологии, интраоперационной диагностике измененных сосудов и дифференциальной диагностики онкологических процессов.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 14-15-00324).

I Литература I

1. Boyd R. W. Nonlinear optics. Amsterdam: Academic Press, 2003. 578 p.

2. Barzda V. Non-Linear Contrast Mechanisms for Optical Microscopy // In „Biophysical Techniques in Photosynthesis". Eds. T. J. Aartsma / / Jurn. Matysik. Springer Science +Business Media. 2008. Vol. II. Р. 35-54. 517 р.

3. Visualization of mitochondria in cardiomyocytes by simultaneous harmonic generation and fluorescence microscopy / V. Barzda, C. Greenhalgh, J. Aus der Au [et al.] // Opt. Express. 2005. Vol. 13. P. 8263-8276.

4. Second harmonic generation imaging microscopy studies of osteogenesis imperfect / O. Nadiarnykh, S. Plotnikov, W. A. Mohler [et al.] // Jour. of Biomedical Optics. 2007. Vol. 12, N 5. P. 051805

5. Numerical second- and third-harmonic generation microscopy / D. Sandkuijl, A. E. Tuer, D. Tokarz [et al.] // Jurn. Opt. Soc. Am. B. 2013. Vol. 30. N 2. P. 382-395.

6. Han X. X., Brown E. Measurement of the ratio of forward-propagating to backpropagating second harmonic signal using a single objective// Opt. Express. 2010. Vol. 18. P. 1053810550.

7. Deep in vivo twophoton imaging of blood vessels with a new dye encapsulated in pluronic nanomicelles / M. Maurin, O. Stephan, J. C. Vial [et al.]. Jurn. Biomed. Opt. 2011.

8. Label-free second-harmonic phase imaging of biological specimen by digital holographic microscopy // E. Shaffer, C. Moratal, P. Magistretti [et al.] // Opt. Lett. 2010. N 35. P. 4102-4104.

9. Nonlinear optical properties of type I collagen fibers studied by polarization dependent second harmonic generation microscopy / A. E. Tuer, S. Krouglov, N. Prent [et al.] // Jurn. Phys. Chem. B. 2011. N 115. P. 12759-12769.

10. Fast nonlinear spectral microscopy of in vivo human skin / A. N. Bader, A. M. Pena, C. Johan van Voskuilen [et al.] // Biomed. Opt. Express. 2011. N 2. P. 365-373.

11. Label-free diagnosis of human hepatocellular carcinoma by multiphoton autofluorescence microscopy / T. L. Sun, Y. Liu, M. C. Sung [et al.] // Appl. Phys. Lett. 2009. Vol. 95.

12. Angiography of small hepatocellular carcinomas—analysis of resected tumors / K. Takayasu, Y. Shima, Y. Muramatsu [et al.] // Am. Jurn. Roentgenol. 1986. N 147. P. 525-529.

13. Li D., Zheng W., Qu J. A. Y. Two-photon autofluorescence 25. microscopy of multicolor excitation // Opt. Lett. 2009.

Vol. 34. P. 202-204. 26.

14. Photothermally-induced disordered patterns of corneal collagen revealed by SHG imaging / P. Matteini, F. Ratto, F. Rossi [et al.] // Opt. Express. 2009. Vol. 17. P. 4868-4878.

15. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea / 27. F. Aptel, N. Olivier, A. Deniset-Besseau [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010. Vol. 51. P. 2459-2465.

16. In vivo confocal microscopic findings in lisch corneal 28. dystrophy / K. Kurbanyan, K. D. Sejpal, A. J. Aldave,

S. X. Deng // Cornea. 2012.

17. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo / 29. H. Y. Tan, Y. Sun, W. [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis.

Sci. 2006. Vol. 47. P. 5251-5259.

18. Evaluating corneal collagen organization using highresolution nonlinear optical macroscopy / J. V. Jester, 30. M. Winkler, B. E. Jester [et al.] // Eye Contact Lens. 2010.

Vol. 36. P. 260-264.

19. Scoring of collagen organization in healthy and diseased human dermis by multiphoton microscopy / R. Cicchi, D. 31. Kapsokalyvas, V. J. De Giorgi [et al.] // Jurn. Biophotonics. 2010. N 3. P. 34-43.

20. Label-free 3D visualization of cellular and tissue structures 32. in intact muscle with second and third harmonic generation microscopy / M. Rehberg, F. Krombach, U. Pohl [et al.] // PLoS ONE. 2011. N 6. P. e28237.

21. Selective imaging in second-harmonicgeneration microscopy 33. by polarization manipulation / S. W. Chu, S. P. Tai,

C. K. Sun, C. H. Lin. // Appl. Phys. Lett. 2007. P. 91.

22. Collagen and myosin characterization by orientation field second harmonic microscopy / C. Odin, T. Guilbert, A. Alkilani 34. [et al.] // Opt. Express. 2008. Vol. 16. P. 16151-16165.

23. Campagnola P. J., Dong C. Y. Second harmonic generation microscopy: principles and applications to disease diagnosis / / Laser Photonics. Rev. 2011. Vol. 5. P. 13-26. 35.

24. Han M., Giese G., Bille J. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera // Opt. Express. 2005. Vol. 13. P. 5791-5797.

Second-harmonic tomography of tissues / Y. Guo, P. P. Ho, H. Savage [et al.] // Opt. Lett. 1997. Vol. 22. P. 1323-1325. Discrimination of collagen in normal and pathological skin dermis through second-order susceptibility microscopy / P. J. Su, W. L. Chen, J. B. Hong [et al.] // Opt. Express. 2009. Vol. 17. P. 11161-11171.

Second harmonic generation chi tensor microscopy for tissue imaging / W. L. Chen, T. H. Li, P. J. [et al.] // Appl. Phys. Lett. 2009. P. 94.

Quantitative discrimination between endogenous SHG sources in mammalian tissue, based on their polarization response / S. Psilodimitrakopoulos, D. Artigas, G. Soria [et al.] // Opt. Express. 2009. Vol. 17. P. 10168-10176. The discrimination of type I and type II collagen and the label-free imaging of engineered cartilage tissue / P. J. Su, W. L. Chen, T. H. Li [et al.] // Biomaterials. 2010. Vol. 31. P. 9415-9421.

Characterization of collagen in non-small cell lung carcinoma with second harmonic polarization microscopy / A. Golaraei, R. Cisek, S. Krouglov [et al.] // Biomedical Optics Express. 2014. Vol. 5. N 10. P. 3567

Multiphoton microscopy for ophthalmic imaging / E. A. Gibson, O. Masihzadeh, T. C. Lei [et al.] // Jurn. Ophthalmol. 2011. P. 870-879.

Paoli J., Smedh M., Ericson M. B. Multiphoton laser scanning microscopy — a novel diagnostic method for superficial skin cancers // Sem. Cutan. Med. Surg. 2009. Vol. 28. P. 190195.

In vivo optical biopsy of hamster oral cavity with epi-third-harmonic-generation microscopy / S. P. Tai, W. J. Lee, D. B. Shieh [et al.] // Opt. Express. 2006. Vol. 14. P. 61786187.

Lin K., Zheng W., Huang Z. Integrated autofluorescence endoscopic imaging and point-wise spectroscopy for real-time in vivo tissue measurements // Jurn. Biomed. Opt. 2010. Vol. 15. P. 0405-0407.

Monte Carlo-based inverse model for calculating tissue optical properties. Part II: application to breast cancer diagnosis / G. M. Palmer, C. Zhu, T. M. Breslin [et al.] // Appl. Opt. 2006. P. 45.

(r \

Как оформить подписку?

• В любом отделении связи по каталогам «Роспечать» (по России) — индекс № 45886, через агентство «Урал-Пресс».

• Через редакцию (с любого номера текущего года), отправив по факсу (812) 312-53-90 или электронной почтой gfm@polytechnics.spb.ru заполненный запрос счета на подписку.

Запрос счета для редакционной подписки на журнал «Биотехносфера»

Полное название организации_

Юридический адрес_

Банковские реквизиты_

Адрес доставки_

Срок подписки Кол-во экз.

Тел. Факс e-mail

Ф.И.О. исполнителя

Стоимость одного номера журнала при подписке через редакцию — 550 руб. с добавлением стоимости доставки (простой бандеролью). К каждому номеру журнала будут приложены накладная и счет-фактура. Журнал выходит 6 раз в год. Отдельные номера можно заказать с получением наложенным платежом. Информация о журнале — www.polytechnics.ru.

Журнал «Биотехносфера» распространяется только по подписке в России и странах СНГ.