МЕМБРАННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ПЕПТИДОВ ТИМУСА ТЕЛЯТ
MEMBRANE METHOD OF OBTAINING THE MEDICINAL ON THE BASIS OF CALF THYMUS PEPTIDES

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к фармацевтической промышленности и биотехнологии и может быть использовано в медицине для получения лекарственного средства, обладающего иммунотропной, радиопротекторной и геропротекторной активностью, обеспечивающего усиление репарационных систем.
Уровень техники
В настоящее время существует ряд лекарственных средств, получаемых на основе вилочковых желез млекопитающих. К ним, в частности, относят тимозин, тимоптин, тималин, тимактивин, тимактид, вилозен, тимостимулин, тимусасин, олетим и другие. В состав подавляющего большинства из них входят пептиды тимуса, некоторые из них также содержат нуклеопротеиды.
Данные препараты обладают сходным действием. Так, в частности, показано, что тималин повышает устойчивость генома, активизирует работу иммунной и репарационной систем. Пептидные биорегуляторы тималина оказывают выраженное геропротекторное и противоопухолевое действие, а также способствуют устойчивости организма к стрессорным воздействиям [1, 2]. Тималин обладает антикоагулянтным действием и способствует торможению фибринолиза, способствует снижению уровня холестерина в крови, печени и аорте [1]. Также было показано, что данный препарат способствует минимизации территории мозга, вовлекаемой в процесс формирования энграмм памяти, способствует приросту памяти, снижает энергетическую цену формирования, консолидации и хранения информации, обладая, таким образом, психотропной активностью и свойствами неспецифических корректоров, что существенно для адаптации в критических состояниях [3, 4].
Известен способ, предложенный в патенте SU №1218521(1980), который предполагает гомогенизацию измельченной ткани железы тимуса, экстракцию разбавленной уксусной кислотой в присутствии хлорида цинка в течение 48-72 ч, добавление ацетона, центрифугирование и дополнительную обработку экстракта ацетоном [5]. Способ обеспечил относительно высокую экстракцию пептидов и позволил сократить количество этапов по сравнению с существовавшими на тот момент аналогами. Основными недостатками данной технологии являются применение летучего легковоспламеняющегося токсичного ацетона, низкий выход продукта, недостаточная степень очистки конечного продукта.
Известно техническое решение, описанное в патенте Франции №25702786 (1981). Согласно данному решению пептиды из тимусов различных животных получают биохимическими методами, которые включают гомогенизацию в растворе 9 г/л хлорида натрия, автолиз, центрифугирование, прогревание супернатанта при 80°C, осаждение ацетоном, трехкратное центрифугирование и насыщение раствором сульфата аммония, ультрафильтрацию, удаление солей, хроматографию и лиофилизацию [6]. Метод обеспечивает высокую степень очистки, обусловленную применением хроматографии, и предполагает получение лиофилизированной лекарственной формы, которая обладает большей стабильностью в процессе хранения по сравнению с растворами. К недостаткам данного способа можно отнести риск разрушения пептидов при нагревании до 80°C, применение летучего легковоспламеняющегося токсичного ацетона, применение дорогостоящей и сложной в исполнении хроматографии.
По способу, описанному в патенте RU №2205013(2003), изготовление препарата предполагает следующие стадии: измельчение и гомогенизация тимуса оленя, экстрагирование в растворе хлорида натрия, нагревание экстракта, удаление термолабильной фракции, получение целевого продукта путем ультрафильтрации в два этапа - на мембране, отсекающей вещества с массой 10 кДа, и мембране с порами, задерживающими вещества массой более 1 кДа, добавление D-маннита, стерилизующую фильтрацию и лиофилизацию [7]. Данный способ предполагает оптимальные параметры мембран, применяемых при ультрафильтрации, так как они отсекают вещества, обладающие молекулярной массой вне диапазона молекулярных масс биологически активных пептидов тимуса. Недостатками данного способа является недостаточно полная экстракция пептидов тимуса, обусловленная применением раствора хлорида натрия в качестве экстрагента, дополнительный этап нагревания до 80°С, который замедляет процесс и может привести к нарушению стабильности экстрагируемых пептидов, использование в качестве стабилизатора D-маннита, который может приводить к обострению заболеваний почек, нарушению кровообращения и обезвоживанию организма, а также использование труднодоступного сырья.
Описанный в патенте RU №2240817(2003) способ отличается от предыдущего аналога тем, что на втором этапе ультрафильтрации используются мембраны, задерживающие вещества с молекулярной массой 0,5 кДа; для экстракции применяется раствор, содержащий 5,5 г/л натрия хлорида и 0,42 г/л калия хлорида, в конечный продукт не добавляется стабилизатор, препарат не подвергается лиофилизации. Данный способ обеспечивает более полную экстракцию по сравнению с предыдущим аналогом [8]. Применение в ходе ультрафильтрации мембран с размером пор 0,5 кДа расширяет диапазон получаемых веществ, однако вещества фракции 0,5-1,0 кДа не являются целевыми в большинстве препаратов из тимуса. К недостаткам способа можно отнести использование в качестве экстрагента хлоридов, что приводит к недостаточно полной экстракции биологически активных пептидов, и наличие этапа нагревания до 80°C, который может привести к нарушению стабильности пептидов. Также препараты в жидком виде уступают по устойчивости в процессе хранения.
В качестве прототипов настоящего изобретения рассматриваются технические решения, описанные в патентах RU №2205013(2003) и RU №2240817(2003), так как в них предлагается использование ультрафильтрации при выделении целевого продукта. Однако в обоих случаях сырьем является тимус северного оленя, который труднодоступен в условиях средней полосы России [7, 8]. Предложенное решение также сравнивается со способом, изложенным в патенте SU №1218521(1980), так как он широко используется на производстве [5].
Сущность изобретения
Технический результат настоящего изобретения заключается в разработке способа получения лекарственного средства на основе тимуса телят без применения ацетона, причем заявляемый способ имеет более высокий выход конечного продукта и обеспечивает получение лекарственного средства с более высокой степенью чистоты.
Настоящее изобретение обеспечивает решение задачи по созданию способа производства лекарственных средств на основе тимуса телят, который обеспечивает более высокий выход конечного продукта, обладающего более высокой степенью чистоты, и не требует применения ацетона.
Решение задачи достигается за счет усовершенствования этапа экстракции пептидов из ткани тимуса телят, применения особой схемы осветляющей фильтрации, выделения и очистки целевого продукта путем ультрафильтрации и с использованием глицина для стабилизации раствора для лиофилизации в концентрации 40±10% мг на 1 мл.
Предлагаемый способ включает следующие этапы:
- Измельчение и гомогенизация ткани тимуса телят (в возрасте до 12 месяцев). Экстракция 3%-ным раствором уксусной кислоты в течение 24±2 часов при температуре +37±3°C (соотношение сырья и экстрагента 1:2) с добавлением хлорида цинка из расчета 5 г на 1 кг сырья.
- Отделение жмыха путем сепарирования полученного экстракта.
- Осветляющая фильтрация - фильтрация отсепарированного экстракта с применением вспомогательного вещества - 10% кизельгура, фильтрация на нутч-фильтре через фильтровальный картон.
- Ультрафильтрация в тангенциальном потоке на мембранах, отсекающих вещества, молекулярная масса которых более 10 кДа, применяемая для отделения высокомолекулярных примесей, сбор пермеата, содержащего пептиды. Очистка от низкомолекулярных примесей путем ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах, задерживающих вещества с молекулярной массой, равной 1 кДа (на этом этапе возможно концентрирование). Диафильтрация концентрата (при необходимости).
- Добавление глицина из расчета 40±10% мг на 1 мл раствора.
- Стерилизующая фильтрация, розлив препарата во флаконы и сублимационная сушка.
Исследования по подбору оптимальных условий экстракции пептидов из вилочковых желез телят включали подбор соотношения сырья и экстрагента (варианты от 1:2 до 1:5), температуры (+20±3 и +37±3°C) и времени (24±2 либо 48±2 часов) для данной стадии техпроцесса. Полученные данные свидетельствуют, что экстракцию следует проводить в течение 24±2 часов при температуре +37±3°C и отношении сырья к экстрагенту, равном 1 к 2. Экстракция при температуре +37±3°C и соотношении сырья к экстрагенту 1:2 обеспечивает статистически значимое (при p≤0,05) увеличение концентрации пептидов в экстракте по сравнению со всеми вариантами при температуре +20±3°C, при этом различия между вариантами соотношения сырья и экстрагента при температуре +37±3°C не значимы. Различия по содержанию пептидов в экстракте при одинаковой температуре, но различном времени экстракции не значимы. Повышение температуры экстракции обеспечивает повышение выхода целевого продукта, а сокращение времени процесса и уменьшение количества экстрагента на данный параметр не влияют. Предлагаемый режим позволяет получать большее количество пептидов при сокращении длительности техпроцесса, экономии экстрагента и уменьшении объема экстракта при том же объеме загрузки сырья.
Этап осветляющей фильтрации, необходимый для очистки отсепарированного экстракта, обеспечивает более высокое качество конечного продукта и более длительный срок эксплуатации мембранных фильтрационных установок, применяемых на последующих этапах техпроцесса. На данном этапе происходит фильтрация с 10% кизельгура, отделение последнего на нутч-фильтре через фильтровальный картон, что обеспечивает осветление раствора и практически полное удаление липидов.
В основе выделения и очистки пептидов тимуса по предлагаемому способу лежат процессы мембранной фильтрации. Ультрафильтрация осветленного экстракта в тангенциальном потоке через кассету с номинальной отсекаемой молекулярной массой, равной 10 кДа, обеспечивает отделение высокомолекулярных примесей. Затем выполняется очистка от низкомолекулярных примесей и, при необходимости, концентрирование полученного пермеата в тангенциальном потоке на мембранах, отсекающих вещества меньше 1 кДа. Данный этап обеспечивает отделение низкомолекулярных примесей, уменьшение объема раствора, возможность хранения малых объемов в замороженном виде. В случае необходимости возможна отмывка концентрата на мембране в 1 кДа. Молекулярная масса веществ, отсечение которых обеспечивается мембранами фильтров, используемых для ультрафильтрации, соответствует молекулярным массам биологически активных пептидов тимуса.
Краткое описание иллюстративных материалов
Фиг. 1. Содержание пептидов в экстракте в мг из расчета на 1 г сырья при различном соотношении «сырье: экстрагент» и различных температурах экстракции.
Фиг. 2. Содержание пептидов в экстракте (мг/мл) в зависимости от времени экстракции.
Фиг.3. Гель-хроматограммы восстановленного в физиологическом растворе лиофилизата лекарственного средства на основе пептидов тимуса, полученного по предложенному способу (а) и по ацетоновой технологии (б).
Возможность осуществления изобретения подтверждает следующий пример.
Вилочковые железы телят массой 1 кг измельчили до состояния фарша, экстрагировали при температуре +37±3°C в течение 24 часов 3%-ным раствором уксусной кислоты объемом 2 л с добавлением хлорида цинка массой 5 г спустя полчаса после начала экстракции.
По окончании экстракции от гомогенатов отделяли жмых путем центрифугирования, в супернатант добавили 10% кизельгура, профильтровали на нутч-фильтре через фильтровальный картон.
Провели ультрафильтрацию при комнатной температуре через мембрану, отсекающую вещества массой выше 10 кДа, получили пермеат, который очистили от низкомолекулярных примесей на мембране 1 кДа. Было получено 1885 мл полупродукта, содержание пептидов в котором составило около 50 мг в перерасчете на 1 г сырья (свыше 25 мг/мл). Добавили 76 г глицина, провели стерилизующую фильтрацию (диаметр пор 0,22 мкм), розлив во флаконы в асептических условиях и сублимационную сушку. Выход пептидов в конечном продукте по сравнению с ацетоновой технологией больше до 10 раз. Сравнение выхода биологически активных пептидов, полученных предлагаемым способом, с технологией производства препарата «Олетим» [8] показало увеличение более чем в 10 раз.
Источники информации
1. Хавинсон В.Х., Кузник Б.И. Пептидные биорегуляторы - новый класс геропротекторов. Сообщение 1. Результаты экспериментальных исследований // Успехи геронтологии, 2012, т. 25, №4. С. 696-708.
2. Демина Э.А. Аргументация профилактики радиогенного рака на основе цитогенетических исследований // Экологический вестник, 2011, №4 (18). С. 45-49.
3. Долженко А.Т., Мелехин В.Д. Пептиды тимуса как психотропные средства // Применение малых регуляторных пептидов в анестезиологии и интенсивной терапии. - М., 1991. С. 70-72.
4. Мелехин В.Д. Пептиды тимуса как стресспротекторы и антиноцицептивные средства // Применение малых регуляторных пептидов в анестезиологии и интенсивной терапии. - М., 1991. С. 96-98.
5. Патент SU №1218521, 1980.
6. Патент Франции №25702786, 1981.
7. Патент RU №2205013, 2003.
8. Патент RU №2240817, 2003.