УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

1. Бессывороточная среда культуры клеток, содержащая Часть А, Часть В и Часть С, где
а) Часть А состоит, по существу, из модифицированной базальной среды, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы;
b) Часть В состоит, по существу, из неорганического источника железа; и
с) Часть С содержит рекомбинантный фактор роста; буфер; регулятор осмолярности; источник энергии и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения.
2. Среда культуры клеток по п.1, где
Часть А дополнительно содержит ионы цветных металлов, витамины или их комбинацию, или
неорганическим источником железа Части В является цитрат трехвалентного железа, или
рекомбинантный фактор роста Части С выбран из группы, состоящей из инсулина или рекомбинантного аналога, IGF-1, и комбинации инсулина и IGF-1, или
буфером, который исключен из модифицированной базальной среды, является буфер HEPES, или
буфер Части С содержит фосфатный буфер, HEPES и бикарбонат натрия, или
Часть С дополнительно содержит аспарагин, глутамин или глутамин и аспарагин, или регулятором осмолярности Части С является NaCl, или
источником энергии Части С является моносахарид, или
по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения Части С являются гидролизатом продуктов растительного происхождения и гидролизатом продуктов не животного или не растительного происхождения.
3. Среда культуры клеток по п.2, где неорганическим источником железа Части В является цитрат трехвалентного железа, и указанная среда культуры клеток содержит приблизительно 122,5 мг/л или 0,5 мМ цитрата трехвалентного железа.
4. Среда культуры клеток по п.2, где рекомбинантный фактор роста Части С представляет собой инсулин или его рекомбинантный аналог, и указанная среда культуры клеток содержит приблизительно 4 - 13 мг/л инсулина или его рекомбинантного аналога.
5. Среда культуры клеток по п.2, где буфер Части С содержит фосфатный буфер, HEPES и бикарбонат натрия, и
указанная среда культуры клеток содержит приблизительно 1,6 г/л бикарбоната натрия, или
указанная среда культуры клеток содержит приблизительно 1,8 г/л HEPES, или
указанный фосфатный буфер содержит приблизительно 0,01-0,5 г/л одноосновного и двухосновного фосфата натрия.
6. Среда культуры клеток по п.2, где регулятором осмолярности Части С является NaCl, и указанная среда культуры клеток содержит приблизительно 1,0-6,5 г/л NaCl.
7. Среда культуры клеток по п.2, где источником энергии Части С является моносахарид, и моносахарид выбран из группы, состоящей из глюкозы, мальтозы, маннозы, галактозы и фруктозы.
8. Среда культуры клеток по п.7, где глюкоза является D-глюкозой, и среда содержит не более приблизительно 7,0 г/л глюкозы.
9. Среда культуры клеток по п.2, где по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения Части С являются гидролизатом продуктов растительного происхождения и гидролизатом продуктов не животного или не растительного происхождения, где гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.
10. Среда культуры клеток по любому из пп.1-9, дополнительно содержащая метотрексат или протектор клеток или поверхностно-активное вещество или L-глутамин.
11. Среда культуры клеток по п.10, дополнительно содержащая метотрексат в количестве приблизительно 100 - 5000 нМ.
12. Среда культуры клеток по п.10, дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество, где поверхностно-активным веществом является метилцеллюлоза или плюроник-полиол.
13. Среда культуры клеток по п.12, где плюроник-полиол представляет собой Плюроник F-68.
14. Среда культуры клеток по любому из пп.1-9, где рН находится в диапазоне 7,1-7,3 или осмолярность находится в диапазоне 320-450 мОсм/кг.
15. Способ получения белка, включающий культивирование клетки млекопитающего в среде культуры клеток по любому из пп.1-9.
16. Способ по п.15, где клеткой млекопитающего является клетка яичника китайского хомячка (СНО).
17. Способ по п.15, где белок представляет собой антитело.
18. Способ по п.17, где антитело выбрано из группы, состоящей из анти-TNFα-антитела, анти-IL-12-антитела, анти-IL-18-антитела и анти-EPO рецептор (EPO-R)-антитела.
19. Бессывороточная среда культуры клеток, содержащая
a) базальную среду;
b) приблизительно 8-12 мл/кг или 116-126 мг/л цитрата трехвалентного железа;
c) приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
d) приблизительно 2-5 г/кг безводной глюкозы;
e) приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина;
f) приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия;
2
4
2
g) приблизительно 0,01-0,05 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
h) приблизительно 0,4-0,5 г/кг NaHPO.7HO и
i) приблизительно 1,0-3,0 г/кг гидролизата дрожжей.
20. Среда культуры клеток по п.1, содержащая
a) приблизительно 8-l2 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа;
b) приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
c) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
d) приблизительно 0,5-0,7 г/кг L-глутамина;
e) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия;
f) приблизительно 1-2 г/кг HEPES;
g) приблизительно 2-3 г/кг NaCl;
h) приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68;
2
4
2
i) приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
j) приблизительно 0,4-0,5 г/кг NaHPO.7HO;
k) приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и
l) приблизительно 60-70 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.
21. Среда культуры клеток по п.1, содержащая
a) приблизительно 8-l2 мл/кг или 122,45 мг/л цитрата трехвалентного железа;
b) приблизительно 3-5 мл/кг или 6-8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
c) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
d) приблизительно 0,1-2 г/кг L-глутамина;
e) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия;
f) приблизительно 1-2 г/кг HEPES;
g) приблизительно 2-3 г/кг NaCl;
h) приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68;
2
4
2
i) приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
j) приблизительно 0,4-0,5 г/кг NaHPO.7HO;
k) приблизительно 0,4-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина;
l) приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и
m) приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.
22. Среда культуры клеток по любому из пп.19-21, дополнительно содержащая приблизительно 2,50 мл/кг метотрексата.
23. Способ получения белка, включающий культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в среде культуры клеток по п.20 или 21.
24. Способ по п.23, где клеткой млекопитающего является клетка СНО или белок представляет собой антитело.
25. Среда культуры клеток по п.1, содержащая
a) приблизительно 8-l0 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
b) приблизительно 3-5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
c) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
d) приблизительно 0,8-0,9 г/кг L-глутамина;
e) приблизительно 0,3-0,5 г/кг моногидрата L-аспарагина;
f) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия;
g) приблизительно 1-2 г/кг HEPES;
h) приблизительно 2-3 г/кг NaCl;
i) приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68;
2
4
2
j) приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
k) приблизительно 0,1-1,0 г/кг NaHPO.7HO;
l) приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей, и
m) приблизительно 2-4 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.
26. Бессывороточная среда культуры клеток, содержаща
a) базальную среду роста клеток;
b) приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
c) приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
d) приблизительно 150-250 г/кг безводной глюкозы;
e) приблизительно 0,1-0,5 г/кг L-глутамина;
f) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия и
g) приблизительно 5-15 г/кг гидролизата дрожжей.
27. Среда культуры клеток по п.25 или 26, дополнительно содержащая метотрексат.
28. Способ получения белка, включающий культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую этот белок, в среде культуры клеток по п.25 или 26.
29. Способ по п.28, где белок представляет собой антитело.
30. Способ по п.29, где клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО.
31. Бессывороточная среда культуры клеток, содержащая
a) базальную среду роста клеток;
b) приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
c) приблизительно 2-6 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
d) приблизительно 1-3 г/кг безводной глюкозы;
e) приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина;
f) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия и
g) приблизительно 1-4 г/кг гидролизата дрожжей.
32. Среда культуры клеток по п.31, дополнительно содержащая метотрексат или имеющая рН приблизительно 7,10-7,30 или имеющая осмолярность приблизительно 300-340 мОсм/кг или содержащая по меньшей мере 8 г/кг гидролизата дрожжей.
33. Способ получения белка, включающий культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в среде культуры клеток по п.31 или 32.
34. Среда культуры по п.1, содержащая
a) приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
b) приблизительно 2,5-4,5 мл/кг или 7,8 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
c) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
d) приблизительно 0,5-1 г/кг L-глутамина;
e) приблизительно 0,1-1 г/кг моногидрата L-аспарагина;
f) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия;
g) приблизительно 1-2 г/кг HEPES;
h) приблизительно 1-4 г/кг NaCl;
i) приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68;
2
4
2
j) приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
k) приблизительно 0,1-1 г/кг NaHPO.7H0;
l) приблизительно 2-6 г/кг гидролизата дрожжей и
m) приблизительно 2-6 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.
35. Среда культуры клеток по п.34, имеющая рН приблизительно 7,10-7,20 или имеющая осмолярность приблизительно 373-403 мОсм/кг.
36. Среда культуры по п.1, содержащая
a) приблизительно 8-12 мл/кг или 120-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
b) приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
c) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
d) приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина;
e) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия;
f) приблизительно 1-2 г/кг HEPES;
g) приблизительно 1-3 г/кг NaCl;
h) приблизительно 0,5-2 г/кг Плюроника F-68;
2
4
2
i) приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
.
j) приблизительно 0,1-1 г/кг NaHPO 7HO;
k) приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и
l) приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.
37. Продукционная среда культуры клеток по п.35 или 36, имеющая рН приблизительно 7,10-7,20 или имеющая осмолярность приблизительно 373-403 мОсм/кг.
38. Среда культуры по п.1, содержащая
a) приблизительно 8-12 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
b) приблизительно 4-8 мл/кг или 11-15 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
c) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
d) приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина;
e) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия,
f) приблизительно 1-2 г/кг HEPES;
g) приблизительно 1-3 г/кг NaCl;
h) приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68;
2
4
2
i) приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
.
j) приблизительно 0,1-1 г/кг NaHPO 7HO;
k) приблизительно 12-16 г/кг гидролизата дрожжей и
l) приблизительно 8-10 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.
39. Продукционная среда культуры клеток по п.36 или 38, дополнительно содержащая метотрексат.
40. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки млекопитающего, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток по п.36 или 38.
41. Среда культуры клеток по любому из пп.19, 20, 21, 25, 34, 36 или 38, где гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.
42. Клетка яичника китайского хомячка (СНО) в среде культуры клеток по любому из пп.1, 2, 19-21, 25, 26, 31, 32, 34, 36 и 38.
43. Способ получения белка с подпиткой, включающий
a) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и
b) подпитку этих клеток млекопитающего добавлением обогащенного гидролизатом раствора и обогащенного раствора базальной среды к культуре клеток в течение времени,
где обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения,
так что продуцируется этот белок.
44. Способ по п.43, где обогащенный раствор базальной среды содержит концентрированную базальную среду или обогащенный раствор базальной среды содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу.
45. Способ по п.44, где базальной средой является среда PF CHO.
46. Способ по любому из пп.43-45, в котором клеткой млекопитающего является клетка яичника китайского хомячка (СНО) или обогащенный гидролизатом раствор содержит первый гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, и второй гидролизат продуктов растительного происхождения.
47. Способ по п.46, в котором обогащенный гидролизатом раствор содержит первый гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, и второй гидролизат продуктов растительного происхождения и гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, и гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат дрожжей.
48. Способ по п.46, в котором гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.
49. Способ получения анти-TNFα-антитела с подпиткой, включающий
a) культивирование клеток яичника китайского хомячка (СНО), содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNFα-антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и
b) подпитку клеток СНО добавлением обогащенного гидролизатом раствора и базального обогащенного раствора к культуре клеток в течение времени,
где базальный обогащенный раствор содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и
где обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения,
так что продуцируется анти-TNFα-антитело.
50. Способ с подпиткой по п.49, в котором продукционная среда культуры клеток на стадии а) содержит по меньшей мере 2,0 г/л глюкозы, причем концентрация глюкозы на указанной стадии регулируется добавлением глюкозы к продукционной среде культуры клеток по мере необходимости для поддержания концентрации по меньшей мере 2,0 г/л глюкозы; и
51. Способ по п.49 или 50, дополнительно включающий извлечение анти-TNFα-антитела или в котором
культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°C;
продукционную среду культуры клеток поддерживают в диапазоне 20-65% растворенного кислорода;
осмолярность продукционной среды культуры клеток поддерживают на всем протяжении культивирования не выше 500 мОсм;
обогащенный гидролизатом раствор содержит первый гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, и второй гидролизат продуктов растительного происхождения;
обогащенный гидролизатом раствор состоит, по существу, из приблизительно 50-280 г/кг гидролизата сои и приблизительно 75-300 г/кг гидролизата дрожжей;
базальной средой является PF CHO; или
базальный обогащенный раствор имеет рН 9,0-10,5.
52. Способ по п.51, в котором культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°C и температура культивирования составляет приблизительно 35°C.
53. Способ по п.51, в котором продукционную среду культуры клеток поддерживают в диапазоне 20-65% растворенного кислорода и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне приблизительно 30%.
54. Способ по п.51, в котором обогащенный гидролизатом раствор содержит первый гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, и второй гидролизат продуктов растительного происхождения и гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, и гидролизат продуктов растительного происхождения является гидролизатом дрожжей.
55. Способ по п.54, в котором гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.
56. Способ по п.51, в котором
период времени находится в диапазоне 9-15 дней; или
базальный обогащенный раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток по меньшей мере в один из следующих дней этого периода времени: День 4, День 6, День 9 и День 11; или
обогащенный гидролизатом раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток в День 4, День 7 или День 4 и День 7 этого периода времени; или
указанный способ дополнительно включает коррекцию рН продукционной среды культуры клеток в соответствии с линейным уменьшением рН, где это линейное снижение рН включает начало от рН, равного приблизительно 7,1-7,2 и достижение конечного рН, равного приблизительно 6,9.
57. Способ по п.56, где указанный способ дополнительно включает коррекцию рН продукционной среды культуры клеток в соответствии с линейным уменьшением рН, где это линейное снижение рН включает начало от рН, равного приблизительно 7,1-7,2 и достижение конечного рН, равного приблизительно 6,9 и линейное снижение рН корректируют на протяжении периода, выбранного из группы состоящей из по меньшей мере приблизительно 24 ч, по меньшей мере приблизительно 48 ч и приблизительно 72 ч.
58. Способ по п.49 или 50, в котором продукционная среда культуры клеток содержит
a) приблизительно 8-10 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
b) приблизительно 4-8 мл/кг или 10-14 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
c) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
d) приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина;
e) приблизительно 1-3 г/кг бикарбоната натрия;
f) приблизительно 1-3 г/кг HEPES;
g) приблизительно 2-3 г/кг NaCl;
h) приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68;
2
4
2
i) приблизительно 0,01-0,1 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
j) приблизительно 0,1-0,1 г/кг NaHPO.7HO;
k) приблизительно 8-12 г/кг гидролизата дрожжей и
l) приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.
59. Способ по п.49 или 50, в котором клеткой млекопитающего является клетка СНО или культура клеток является крупномасштабной культурой клеток.
60. Способ по п.59, в котором культура клеток является крупномасштабной культурой клеток и крупномасштабная культура клеток является большей, чем приблизительно 10 л.
61. Способ получения анти-IL-12-антитела с подпиткой, включающий
a) культивирование клеток СНО, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в культуре клеток, содержащей продукционную среду культуры клеток; и
b) подпитку этих клеток СНО добавлением обогащенного гидролизатом раствора и базального обогащенного раствора к культуре клеток в течение периода времени,
где базальный обогащенный раствор содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и
где обогащенный гидролизатом раствор содержит по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения,
так что продуцируется анти-IL-12-антитело.
62. Способ по п.61, в котором
обогащенный гидролизатом раствор дополнительно содержит глюкозу; или
дополнительно включает извлечение анти-IL-12-антитела; или
культуру клеток культивируют при температуре в диапазоне приблизительно 32-38°C; или
температура культивирования равна приблизительно 33°C; или
продукционную среду культуры клеток поддерживают при 20-65% растворенного кислорода; или
продукционная среда культуры клеток имеет рН приблизительно 6,7-7,2; или
обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, и гидролизат продуктов растительного происхождения; или
обогащенный гидролизатом раствор состоит по существу из приблизительно 50-225 г/кг гидролизата сои, приблизительно 75-300 г/кг гидролизата дрожжей и приблизительно 2-3 г/л глюкозы; или
базальный обогащенный раствор содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу.
63. Способ по п.62, в котором продукционную среду культуры клеток поддерживают при 20-65% растворенного кислорода и концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне приблизительно 40%.
64. Способ по п.62, в котором обогащенный гидролизатом раствор содержит гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, и гидролизат продуктов растительного происхождения, и гидролизат, который получен из продуктов не растительного или не животного происхождения, является гидролизатом дрожжей.
65. Способ по п.64, в котором гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.
66. Способ по п.62, в котором базальный обогащенный раствор содержит базальную среду, аспарагин и глюкозу, и базальный обогащенный раствор
имеет рН 9,7 и осмолярность приблизительно 1400-1500 мОсм; или
базальной средой в базальном обогащенном растворе является PF CHO.
67. Способ по любому из пп.61-66, в котором
период времени находится в диапазоне 14-15 дней; или
базальный обогащенный раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток каждый день, начиная в день 6 этого периода времени; или
базальный обогащенный раствор и обогащенный гидролизатом раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток каждый день, начиная в день 5 этого периода времени.
68. Способ по любому из пп.61-66, в котором продукционная среда культуры клеток содержит
a) модифицированную базальную среду, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество и моносахарид глюкозы;
b) приблизительно 8-12 мл/кг или 110-130 мг/л цитрата трехвалентного железа;
с) приблизительно 5-8 мл/кг или 11-15 мг/кг рекомбинантного инсулина человека;
d) приблизительно 5-9 г/кг безводной глюкозы;
е) приблизительно 0,1-1 г/кг L-глутамина;
f) приблизительно 1-2 г/кг бикарбоната натрия;
g) приблизительно 1-2 г/кг HEPES;
h) приблизительно 2-3 г/кг NaCl;
i) приблизительно 0,1-2 г/кг Плюроника F-68;
2
4
2
j) приблизительно 0,01 - 0,1 г/кг NaHPO.HO;
2
4
2
k) приблизительно 0,1-1 г/кг NaHPO.7HO;
l) приблизительно 6-12 г/кг гидролизата дрожжей и
m) приблизительно 6-8 г/кг гидролизата продуктов растительного происхождения.
69. Способ по любому из пп.61-66, в котором культура клеток является крупномасштабной культурой клеток и крупномасштабная культура клеток является большей, чем приблизительно 10 л.
70. Комбинированный подпитывающий раствор, содержащий
a) глюкозу;
b) базальную среду;
c) аминокислоту, другую, чем глутамин, и
d) по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения;
где подпитывающий раствор имеет рН приблизительно 6,0-8,0.
71. Комбинированный подпитывающий раствор по п.70, в котором
содержание глюкозы составляет приблизительно 100-250 г/кг; или
аминокислота представляет собой аспарагин; или
по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения представляют собой гидролизат продуктов растительного происхождения и гидролизат, который не является гидролизатом продуктов животного или растительного происхождения; или
базальной средой является среда PF-CHO или DMEM/F12; или
базальная клеточная среда является модифицированной базальной средой, в которой исключены следующие компоненты: бикарбонат натрия, буфер, одноосновный фосфат натрия, двухосновный фосфат натрия, регулятор осмолярности, поверхностно-активное вещество, глутамин и глюкоза.
72. Комбинированный подпитывающий раствор по п.71, в котором аминокислотой является аспарагин, и указанный комбинированный подпитывающий раствор содержит приблизительно 1,0-15,0 г аспарагина.
73. Комбинированный подпитывающий раствор по п.71, в котором аминокислотой является аспарагин, и указанный комбинированный подпитывающий раствор содержит приблизительно 3,0-5,0 г/кг аспарагина.
74. Комбинированный подпитывающий раствор по п.71, в котором по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения представляют собой гидролизат продуктов растительного происхождения и гидролизат, который не является гидролизатом продуктов животного или растительного происхождения, и гидролизат, который не является гидролизатом продуктов продуктов животного или растительного происхождения, является гидролизатом дрожжей.
75. Комбинированный подпитывающий раствор по п.71, в котором по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения представляют собой гидролизат продуктов растительного происхождения, и гидролизат, который не является гидролизатом продуктов животного или растительного происхождения, является гидролизатом сои.
76. Комбинированный подпитывающий раствор по любому из пп.71-75, дополнительно имеющий мутность менее приблизительно 15 NTU.
77. Способ поддержания постоянного уровня глюкозы продукционной среды культуры клеток, включающий добавление комбинированного подпитывающего раствора по любому из пп.71-75.
78. Способ приготовления комбинированного подпитывающего раствора, содержащего базальную среду, глюкозу и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения, включающий
a) объединение глюкозы и базальной среды в раствор;
b) доведение рН раствора a) до приблизительно 9,5-10,5;
c) добавление по меньшей мере двух различных гидролизатов продуктов не животного происхождения к раствору b); и
d) доведение pH раствора c) таким образом, что комбинированный подпитывающий раствор имеет рН приблизительно 6,6-7,5.
79. Способ по п.78, в котором стадия c) включает добавление первого гидролизата, который является гидролизатом продуктов не животного или не растительного происхождения, и второго гидролизата продуктов растительного происхождения.
80. Способ по п.79, в котором гидролизат, который является гидролизатом продуктов не животного или не растительного происхождения, является гидролизатом дрожжей, или гидролизатом продуктов растительного происхождения является гидролизат сои.
81. Способ получения по меньшей мере приблизительно 1,5 г/л антитела из культуры клеток млекопитающего, включающий
а) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и
b) добавление комбинированного подпитывающего раствора, имеющего рН приблизительно 6,7-7,2, в продукционную среду культуры клеток, где комбинированный подпитывающий раствор содержит глюкозу; базальную клеточную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата из продуктов не животного происхождения,
так что продуцируется по меньшей мере приблизительно 1,5 г/л антитела.
82. Способ по п.81, в котором комбинированный подпитывающий раствор содержит приблизительно 100-250 г/кг глюкозы.
83. Способ по п.81, в котором антитело получают в концентрации, выбранной из группы, состоящей из по меньшей мере 2 г/л антитела, по меньшей мере 4 г/л антитела, по меньшей мере 5 г/л антитела и приблизительно 6 г/л антитела.
84. Способ увеличения титра антитела, полученного из культуры клеток млекопитающих, включающий
а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и
b) добавление комбинированного подпитывающего раствора, имеющего рН приблизительно 6,7-7,2, в продукционную среду культуры клеток, где комбинированный подпитывающий раствор содержит глюкозу; базальную клеточную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата из продуктов не животного происхождения,
так что титр полученного антитела является по меньшей мере на 50% большим, чем у контрольной культуры клеток млекопитающих, которую культивируют в соответствии со стадией а) и с исключением стадии b).
85. Способ по п.84, в котором титр получаемого антитела выбран из группы, состоящей из по меньшей мере на 100% большим, чем контроль и по меньшей мере на 150% большим, чем контроль.
6
6
86. Способ по любому из пп.82-85, где комбинированный подпитывающий раствор добавляют при достижении плотности клеток, выбранной из группы, состоящей из по меньшей мере 2,0·10 клеток/мл и приблизительно 3,5·10 клеток/мл.
87. Способ получения белка в культуре клеток млекопитающих, включающий
а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую этот белок, в продукционной среде культуры клеток; и
b) добавление комбинирование подпитывающего раствора в продукционную среду культуры клеток с использованием системы регуляции с обратной связью для мониторинга уровня метаболического индикатора в продукционной среде культуры клеток, причем комбинированный подпитывающий раствор добавляют к продукционной среде культуры клеток во временной точке, определенной системой регуляции с обратной связью,
так что продуцируется антитело.
88. Способ по п.87, в котором клеткой млекопитающего является клетка яичника китайского хомячка (СНО).
89. Способ по п.87 или 88, в котором метаболическим индикатором является глюкоза или глутамин.
90. Способ по п.87, в котором подпитывающий раствор является комбинированным подпитывающим раствором, содержащим глюкозу; базальную клеточную среду; аминокислоту, другую, чем глутамин; и по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения.
91. Способ по п.87 или 88, в котором белком является антитело.
92. Способ по п.91, в котором антитело получают при титре, выбранном из группы состоящей из по меньшей мере 1,5 г/л и по меньшей мере 2 г/л.
93. Способ по любому из пп.81-85 и 90, в котором
комбинированный подпитывающий раствор содержит приблизительно 3,0-12,5 г/кг аспарагина; или
по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения включают гидролизат продуктов растительного происхождения и гидролизат, который не является гидролизатом продуктов животного происхождения или растительного происхождения; или
комбинированный подпитывающий раствор содержит приблизительно 100-200 г/кг глюкозы; или
способ дополнительно включает регулирование уровня глюкозы в среде культуры клеток, так что уровень глюкозы поддерживается в диапазоне приблизительно 0,25-20,0 г/л.
94. Способ по п.93, в котором по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения включают гидролизат продуктов растительного происхождения и гидролизат, который не является гидролизатом продуктов животного или растительного происхождения, и гидролизат, который не является гидролизатом продуктов животного или растительного происхождения является гидролизатом дрожжей.
95. Способ по п.93, в котором по меньшей мере два различных гидролизата продуктов не животного происхождения включают гидролизат продуктов растительного происхождения и гидролизат, который не является гидролизатом продуктов животного или растительного происхождения, и гидролизат продуктов растительного происхождения является гидролизатом сои.
96. Способ по п.93, где способ дополнительно включает регулирование уровня глюкозы в среде культуры клеток, так что уровень глюкозы поддерживается в диапазоне приблизительно 0,25-20,0 г/л и контроль уровня глюкозы осуществляют с использованием автоматизированного устройства для взятия проб.
97. Способ определения профиля подпитки для получения белка в культуре клеток млекопитающего, включающий
а) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и
b) добавление комбинированного подпитывающего раствора в продукционную среду культуры клеток с использованием системы регуляции с обратной связью для контроля метаболического индикатора в продукционной среде культуры клеток, где комбинированный подпитывающий раствор добавляют в продукционную среду культуры клеток для соответствия заданному значению метаболического индикатора-мишени; и
с) определение количества комбинированного подпитывающего раствора, добавляемого в день в продукционную среду культуры клеток,
так что определяют профиль подпитки.
98. Способ по п.97, в котором метаболическим индикатором является глюкоза или глутамин.
99. Способ получения белка в культуре клеток млекопитающего с подпиткой, включающий добавление комбинированного подпитывающего раствора в культуру клеток млекопитающего в соответствии с профилем подпитки по п.97.
100. Способ получения антитела в культуре клеток млекопитающих, так что бы титр антитела составлял по меньшей мере 100 мг/л, где указанный способ включает
a) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и
b) добавление бутирата натрия, N-ацетилцистеина или их комбинации, в среду культуры клеток, причем бутират натрия добавляют до конечной концентрации приблизительно от 0,1 мМ до 10 мМ, а N-ацетилцистеин добавляют до конечной концентрации приблизительно 1 - 80 мМ,
так что антитело получают при титре по меньшей мере 100 мг/л.
101. Способ по п.100, в котором титр антитела выбран из группы состоящей из по меньшей мере 150 мг/л, по меньшей мере 2000 мг/л, по меньшей мере 250 мг/л, по меньшей мере 300 мг/л и по меньшей мере 400 мг/л.
102. Способ получения антитела в культуре клеток млекопитающих, так что бы титр антитела был по меньшей мере на 10% больше, чем в контрольной культуре клеток млекопитающего, включающий
a) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и
b) добавление бутирата натрия, N-ацетилцистеина или их комбинации, в среду культуры клеток, причем бутират натрия добавляют до конечной концентрации приблизительно от 0,1 мМ до 10 мМ, а N-ацетилцистеин добавляют до конечной концентрации приблизительно 1 - 80 мМ,
так что титр антитела является по меньшей мере на 10% выше, чем у контроля, где контрольная культура клеток млекопитающего предусматривает стадию a) и исключает стадию b).
103. Способ по п.102, в котором титр антитела культуры клеток млекопитающего улучшается на величину, выбранную из группы, состоящей из по меньшей мере на 29% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего, по меньшей мере на 40% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего и по меньшей мере на 70% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего.
104. Способ по любому из пп.100-103, в котором бутират натрия, N-ацетилцистеин, или их комбинацию, добавляют в культуру клеток млекопитающего во время фазы роста этой культуры клеток млекопитающего или между днями 4 и 7 времени культивирования культуры.
105. Способ по любому из пп.100-103, в котором конечная концентрация бутирата натрия равна приблизительно 0,1 - 10 мМ.
106. Способ по любому из пп.100-103, в котором конечная концентрация N-ацетилцистеина равна приблизительно 20 - 60 мМ.
107. Способ продления долговечности культуры клеток млекопитающего по меньшей мере на 35% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего, включающий
а) культивирование клеток млекопитающего, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, в продукционной среде культуры клеток; и
b) добавление приблизительно 1 - 80% мМ N-ацетилцистеина к этой клеточной среде;
так что долговечность этой культуры клеток млекопитающего удлиняется по меньшей мере на 35% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего, где культивирование контрольной культуры клеток млекопитающего включает стадию а) и исключает стадию b).
108. Способ по п.107, в котором долговечность культуры клеток млекопитающего удлиняется на величину, выбранную из группы, состоящей из по меньшей мере на приблизительно 45% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего и по меньшей мере на приблизительно 55% в сравнении с контрольной культурой клеток млекопитающего.
109. Способ по п.107 или 108, включающий добавление N-ацетилцистеина в продукционную среду культуры клеток до конечной концентрации приблизительно 8 мМ.