СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
METHODS OF TREATING CANCER

Родственные заявки
[01] Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущество согласно предварительным заявкам на патенты США № 61/714 045, поданной 15 октября 2012 года, 61/758 972, поданной 31 января 2013 года, 61/714 140, поданной 15 октября 2012 года, 61/714 145, поданной 15 октября 2012 года, 61/780 703, поданной 13 марта 2013 года, и 61/786 277, поданной 14 марта 2013 года. Полное содержание каждой из указанных предварительных заявок на патенты полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область техники
[02] Настоящее изобретение в целом относится к области лечения рака, и в частности, к области лечения рака, ассоциированного с комплексом SWI/SNF (т.е. SWI/SNF-опосредованного рака). Более конкретно, настоящее изобретение обеспечивает способы и композиции, обеспечивающие лечение, облегчение, предотвращение, уменьшение или облегчение другим образом симптоматики рака, ассоциированного с комплексом SWI/SNF.
Уровень техники
[03] Связанные с заболеванием модифицирующие хроматин ферменты (например, EZH2) вовлечены в развитие таких заболеваний, как пролиферативные расстройства, метаболические расстройства и заболевания крови. Таким образом, существует необходимость в разработке низкомолекулярных соединений, способных модулировать активность EZH2.
Краткое описание изобретения
[04] Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения SWI/SNF-ассоциированного рака или облегчения симптома SWI/SNF-ассоциированного рака у субъекта путем введения указанному субъекту, нуждающемуся в указанном введении, терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, при этом указанный субъект страдает раком, выбранным из группы, состоящей из рака мозга и центральной нервной системы, рака головы и шеи, рака почки, рака яичника, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака легкого, лимфомы, миеломы, саркомы, рака молочной железы и рака предстательной железы. Например, SWI/SNF-ассоциированный рак характеризуется пониженной экспрессией и/или потерей функции комплекса SWI/SNF или одного или более компонентов комплекса SWI/SNF.
[05] Например, указанный субъект страдает раком, выбранным из группы, состоящей из медуллобластомы, злокачественной рабдоидной опухоли и атипичной тератоидной/рабдоидной опухоли.
[06] Например, один или более компонентов выбраны из группы, состоящей из SNF5, ATRX и ARID1A.
[07] Например, потеря функции вызвана мутацией, которая приводит к потери функции, и  является результатом точечной мутации, делеции и/или инсерции.
[08] Например, указанный субъект имеет делецию SNF5.
[09] Например, указанный субъект имеет мутацию ATRX, выбранную из группы, состоящей из замещения аспарагином (N) остатка лизина (K), соответствующего дикому типу, в положении 688 аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 5 (K688N) и замещения изолейцином (I) остатка метионина (M), соответствующего дикому типу, в положении 366 аминокислоты последовательности SEQ ID NO: 5 (M366I).
[010] Например, указанный субъект имеет мутацию ARID1A, выбранную из группы, состоящей из нонсенс-мутации остатка цистеина (C) , соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 884 последовательности SEQ ID NO: 11 (C884*), замещения лизином (K) остатка глутаминовой кислоты (E), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 966 (E966K), нонсенс-мутации остатка глутамина (Q), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1411 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q1411*), мутации со сдвигом рамки на остатке фенилаланина (F), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 1720 последовательности SEQ ID NO: 11 (F1720fs), мутации со сдвигом рамки после остатка глицина (G), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1847 последовательности SEQ ID NO: 11 (G1847fs), мутации со сдвигом рамки на остатке цистеина (C), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 1874 последовательности SEQ ID NO: 11 (C1874fs), замещения глутаминовой кислотой (E) остатка аспарагиновой кислоты (D), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1957 (D1957E), нонсенс-мутации остатка глутамина (Q), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1430 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q1430*), мутации со сдвигом рамки на остатке аргинина (R), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 1721 последовательности SEQ ID NO: 11 (R1721fs), замещения глутаминовой кислотой (E) остатка глицина (G), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1255 (G1255E), мутации со сдвигом рамки на остатке глицина (G), соответствующем дикому типу, в положении аминокислоты 284 последовательности SEQ ID NO: 11 (G284fs), нонсенс-мутации остатка аргинина (R), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1722 последовательности SEQ ID NO: 11 (R1722*), мутации со сдвигом рамки на остатке метионина (M), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 274 последовательности SEQ ID NO: 11 (M274fs), мутации со сдвигом рамки на остатке глицина (G), соответствующем дикому типу, в положении аминокислоты 1847 последовательности SEQ ID NO: 11 (G1847fs), мутации со сдвигом рамки на остатке P, соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 559 последовательности SEQ ID NO: 11 (P559fs), нонсенс-мутации в остатке аргинина (R), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 1276 последовательности SEQ ID NO: 11 (R1276*), мутации со сдвигом рамки на остатке глутамина (Q), соответствующем дикому типу, в положении аминокислоты 2176 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q2176fs), мутации со сдвигом рамки на остатке гистидина (H), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 203 последовательности SEQ ID NO: 11 (H203fs), мутации со сдвигом рамки на остатке аланина (A), оответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 591 последовательности SEQ ID NO: 11 (A591fs), нонсенс-мутации в остатке глутамина (Q) , соответствующем дикому типу, в положении аминокислоты 1322 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q1322*), нонсенс-мутации в остатке серина (S) , соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 2264 последовательности SEQ ID NO: 11 (S2264*), нонсенс-мутации остатка глутамина (Q), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 586 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q586*), мутации со сдвигом рамки на остатке глутамина (Q), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 548 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q548fs) и мутации со сдвигом рамки на остатке аспарагина (N), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 756 последовательности SEQ ID NO: 11 (N756fs).
[011] Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения SWI/SNF-ассоциированного рака или облегчения симптома SWI/SNF-ассоциированного рака у нуждающегося в этом субъекта   путем (a) определения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов ингибирования клеточного цикла и генов опухолевой супрессии, в образце, полученном от субъекта; (b) выбора субъекта, имеющего уменьшенный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в этапе (a); и (c) введения субъекту, выбранному в этапе (b), эффективного количества ингибитора EZH2 с обеспечением, таким образом, лечения или облегчение симптома рака у субъекта.
[012] Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения SWI/SNF-ассоциированного рака или облегчения симптома SWI/SNF-ассоциированного рака у нуждающегося в этом субъекта  , путем (a) определения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов пути hedgehog, генов пути myc и генов метилтрансферазы гистонов, в образце, полученном от субъекта; (b) выбора субъекта, имеющего увеличенный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в этапе (a); и (c) введения субъекту, выбранному в этапе (b), эффективного количества ингибитора EZH2 с обеспечением, таким образом, лечения или облегчение симптома рака у субъекта.
[013] Например, рак может представлять собой медуллобластому, злокачественную рабдоидную опухоль или атипичную тератоидную рабдоидную опухоль.
[014] Например, ген нейрональной дифференцировки представляет собой CD133, DOCK4 или PTPRK.
[015] Например, ген, ингибирующий клеточный цикл, представляет собой CKDN1A или CDKN2A.
[016] Например, ген опухолевой супрессии представляет собой BIN1.
[017] Например, ген пути hedgehog представляет собой GLI1 или PTCH1.
[018] Например, ген пути myc представляет собой MYC.
[019] Например, ген метилтрансферазы гистонов представляет собой EZH2.
[020] Настоящее изобретение также обеспечивает способ индукции нейрональной дифференцировки, ингибирования клеточного цикла или опухолевой супрессии путем приведения клетки в контакт с ингибитором EZH2. Ингибитор EZH2 может присутствовать в количестве, достаточном для повышения экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из CD133, DOCK4, PTPRK, CKDN1A, CDKN2A и BIN1.
[021] Настоящее изобретение также обеспечивает способ ингибирования сигнального пути hedgehog путем приведения клетки в контакт с ингибитором EZH2. Ингибитор EZH2 может присутствовать в количестве, достаточном для уменьшения экспрессии GLI1 и/или PTCH1.
[022] Настоящее изобретение также обеспечивает способ индукции экспрессии гена путем приведения клетки в контакт с ингибитором EZH2. Ингибитор EZH2 может присутствовать в количестве, достаточном для индукции нейрональной дифференцировки, ингибирования клеточного цикла и/или опухолевой супрессии. Например, ген может представлять собой CD133, DOCK4, PTPRK, CKDN1A, CKDN2A или BIN1.
[023] Настоящее изобретение также обеспечивает способ ингибирования экспрессии гена путем приведения клетки в контакт с ингибитором EZH2. Ингибитор EZH2 присутствует в количестве, достаточном для ингибирования сигнального пути hedgehog. Например, ген может представлять собой GLI1 или PTCH1.
[024] Например, клетка может иметь утраченную функцию SNF5, ARID1A, ATRX и/или компонента комплекса SWI/SNF.
[025] Например, потеря функции вызвана делецией SNF5.
[026] Например, клетка представляет собой раковую клетку. Рак может представлять собой медуллобластому, злокачественную рабдоидную опухоль или атипичную тератоидную рабдоидную опухоль.
[027] Например, ингибитор EZH2 представляет собой соединение A, имеющее следующую формулу:
(A), стереоизомеры или фармацевтически приемлемые соли или сольваты указанного соединения.
[028] Например, ингибитор EZH2 представляет собой соединение B, имеющее следующую формулу:
(B),  стереоизомеры или фармацевтически приемлемые соли или сольваты указанного соединения.
[029] Например, ингибитор EZH2 представляет собой соединение C, имеющее следующую формулу:
(C), стереоизомеры или фармацевтически приемлемые соли или сольваты указанного соединения.
[030] Например, ингибитор EZH2 представляет собой соединение D, имеющее следующую формулу:
(D), стереоизомеры или его фармацевтически приемлемые соли или сольваты указанного соединения.
[031] Например, ингибитор EZH2 представляет собой соединение E, имеющее следующую формулу:
(E), стереоизомеры или фармацевтически приемлемые соли или сольваты указанного соединения.
[032] Если иное не указано, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют такое же значение, как общепринятое значение в области техники, к которой относится настоящее изобретение. В настоящей заявке употребление предмета в единственном числе также включает множественного число указанного предмета, если иное явно не следует из контекста. Несмотря на то что при осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, подобные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящей заявке, ниже описаны подходящие способы и материалы. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, перечисленные в настоящей заявке, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Ссылки, цитированные в настоящей заявке, не следует рассматривать как предшествующий уровень техники для заявленного изобретения. В случае несоответствий, включая определения, настоящее изобретение имеет преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры приведены исключительно в качестве иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение.
[033] Другие признаки и преимущества настоящего изобретения очевидны из следующего далее подробного описания и формулы изобретения.
Краткое описание фигур
[034] На Фигурах 1A и 1B представлены результаты анализа способом Вестерн-блоттинга для клеточных линий, имеющих SNF5 дикого типа (RD и SJCRH30) и мутантный SNF5.
[035] На Фигурах 2A-2E представлены графики, подтверждающие, что мутантные по гену SNF5 клеточные линии A204 (C), G401 (D) и G402 (E) селективно отвечают на соединение EZH2 (соединение E) по сравнению с клеточными линиями RD (A) и SJCRH30 (B), имеющими ген SNF5 дикого типа.
[036] На Фигурах 3A-3D представлен ряд гистограмм, показывающих, что мутантная по SNF клеточная линия G401 отвечает на соединение E через 7 дней культивирования в мягком агаре по сравнению с клетками RD дикого типа. A - клетки линии RD (5,000 клеток на лунку). B - клетки линии G401 (5,000 клеток на лунку). C клетки линии G401 в условиях 2D культивирования. D - клетки линии G401 (10,000 клеток на лунку).
in vitro
[037] На Фигурах 4A-4D представлены четыре графика, показывающих, что мутантная по SNF5 клеточная линия G401 чувствительна к соединению A . Клеточные линии SJCRH30 (A) и RD (C) дикого типа и мутантные по SNF5 клеточные линии G401 (B) и A204 (D) предварительно обрабатывали в течение 7 дней соединением А в указанной концентрации и заново высевали на 0 день. Выживаемость клеток определяли с помощью набора для люминесцентного анализа клеточной выживаемости CellTiter-Glo.
[038] На Фигурах 5A-5D представлены графики, показывающие продолжительную регрессию ксенотрансплантатов G401 (модель злокачественной рабдоидной опухоли) при лечении соединением A. (A) Регрессия опухолей, вызванная соединением A в указанных дозах. (B) Регрессия опухолей, вызванная введением соединения A в указанных дозах два раза в день. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n=8). Соединение прекращали вводить на 28 день. (C) Направленное ингибирование EZH2 в ткани опухоли ксенотрансплантата G401, собранного из параллельной когорты мышей на 21 день. Каждая точка показывает отношение H3K27Me3 к общему H3. Горизонтальные линии показывают средние значения для группы. BLLQ = ниже нижнего предела количественного определения. (D, E) Иммуногистохимическое окрашивание метилированных гистонов в образцах опухолей, полученных от мышей, получающих лечение носителем (D) и соединением A (E) (в дозе 125 мг/кг).
[039] На Фигуре 6 представлен график, показывающий расположение мутаций ATRX, которые были идентифицированы в клеточных линиях SCLC.
in vitro
[040] На Фигуре 7A представлен график, показывающий дозозависимое ингибирование клеточного роста на клетках рака предстательной железы LNCAP при лечении соединением E .
[041] На Фигуре 7B представлен график, показывающий значение IC50 соединения E нa 11 и 14 день для клеток WSU-DLCL2 и LNCAP.
[042] На Фигурах 8A-8C представлены три графика, подтверждающих, что мутантные по ATRX линии SCLC NCI-H446 (A), SW1271 (B) и NCI-H841 (C) отвечают на соединение E.
[043] На Фигурах 9A-9C представлены три изображения, полученных с помощью микроскопии, показывающих, что клетки линии SCLC NCI-H841 изменяют морфологию после лечения носителем (A) или соединением E в концентрации 4,1E-02 мкМ (B) или 3,3 мкМ (C).
SMARCB1
in vitro
[044] На Фигурах 10A-10C представлены графики, показывающие влияние соединения A на общий клеточный уровень метилирования гистонов и выживаемость клеток. (A) Химическая структура соединения A. (B) Зависимое от концентрации ингибирование клеточного уровня H3K27Me3 в клетках G401 и RD. (C) Селективное ингибирование пролиферации клеток G401 с делецией  соединением A  (измеренное по содержанию АТФ). Клетки G401 (панели a и b) и клетки RD (панели c и d) были заново посажены в исходной плотности посева на 7 день. Каждая точка представляет собой среднее для каждой концентрации (n=3).
50
[045] На Фигурах 11A и 11B представлены графики, показывающие биохимический механизм для исследований действия соединений. Значение IC соединения A повышается с повышением концентрации SAM (A); повышение олигонуклеосомной концентрации минимально влияет на указанное значение (B), что указывает на SAM-конкурентный и нуклеосома-неконкурентный механизм действия.
[046] На Фигурах 12A и 12B представлен ряд панелей, подтверждающих экспрессию SMARCB1 и EZH2 в клеточных линиях и специфичность ингибирования соединением A метилирования гистонов в клетках. (A) Клеточные лизаты анализировали с помощью иммуноблоттинга с использованием антител, специфичных к SMARCB1, EZH2 и актину (контроль нагрузки). (B) Селективное ингибирование клеточного метилирования H3K27 в клетках G401 и RD. Клетки инкубировали с соединением A в течение 4 дней и экстрагированные кислотой гистоны анализировали с помощью иммуноблоттинга.
1
1
SMARCB1
[047] На Фигурах 13A и 13B представлены гистограммы, демонстрирущие, что соединение A индуцирует остановку фазы G и апоптоз в клетках ЗРО с делецией . Анализ клеточного цикла (с помощью проточной цитометрии) и определение апоптоза (в помощью TUNEL-анализа) в клетках RD (панель A) или G401 (панель B) во время инкубации клеток с носителем или соединением A в концентрации 1 мкМ в течение времени до 14 дней. Остановку G наблюдали на 7 день, а индукцию апоптоза наблюдали на 11 день. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n=2). Показанные значения контроля ДМСО представляют собой среднее ± стандартная ошибка среднего для каждой временной точки. Клетки разбивали и заново сажали на 4, 7 и 11 день в плотности, соответствующей исходной плотности посева.
SMARCB1
[048] На Фигурах 14A-14B представлены графики, показывающие, что соединение A индуцирует изменения экспрессии SMARCB1-регулируемых генов и морфологии клеток. (A) Исходная экспрессия SMARCB1-регулируемых генов в клетках G401 с делецией  по сравнению с контрольными клетками RD (измерено с помощью количественной ПЦР, n=2). (B) Клетки G401 и RD инкубировали либо с ДМСО, либо с соединением A в концентрации 1 мкМ в течение 2, 4 и 7 дней. Экспрессию генов определяли с помощью количественной ПЦР (n=2) и выражали по сравнению с контролем ДМСО для каждой временной точки. Панели a-j соответствуют генам GLI1, PTCh1, DOCK4, CD133, PTPRK, BIN1, CDKN1A, CDKN2A, EZH2 и MYC, соответственно. (C) Клетки G402, которые инкубировали либо с ДМСО (левая панель), либо с соединением A в концентрации 1 мкМ (правая панель) в течение 14 дней. Клетки разбивали и снова сажали на 7 день в плотности, соответствующей исходной плотности посева.
[049] На Фигурах 15A-15D представлен ряд графиков, показывающих массу тела, регрессию опухоли и уровень в плазме крови у мышей, содержащих ксенотрансплантат G401, которых лечили соединением A. (A) Массу тела животных, получающих лечение соединением A два раза в день в течение 28 дней, определяли два раза в неделю. Данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (n=16 до 21 дня, n=8 с 22 дня по 60 день). (B) Регрессия опухолей, вызванная введением соединения A два раз в день (BID)  в течение 21 дня в указанных дозах (средние значения ± стандартная ошибка среднего, n=16). * p <0,05, ** p < 0,01, ANOVA повторных измерений, пост-критерий Даннетта, по сравнению с носителем. (C) Массы опухолей 8 мышей, усыпленных на 21 день. **** p < 0,0001, точный критерий Фишера. (D) Собирали плазму за 5 минут до и через 3 часа после введения дозы соединения A на 21 день и уровень соединения измеряли с помощью ЖХ-МС/МС. Животных усыпляли и собирали опухоли через 3 часа после введения дозы на 21 день. Получали гомогенаты опухолей, которые подвергали анализу с помощью  ЖХ-МС/МС для определения концентрации соединения A. Необходимо отметить, что уровень соединения в опухоли не мог быть определен у всех животных, особенно в группах, получающих высокую дозу, так как ксенотрансплантаты были слишком малы на 21 день. Точки представляют собой значения для отдельных животных; горизонтальные линии показывают средние значения для группы.
SMARCB1
3
[050] На Фигурах 16A-16C представлен ряд графиков, показывающих, что соединение A приводит к устранению ксенотрансплантата ЗРО с делецией  у мышей SCID. (A) Регрессия опухолей вызванная путем введения соединения A два раза в день (BID) в течение 28 дней в указанных дозах. Соединение прекращали вводить на 28 день и опухолям позволяли заново расти до тех пор, пока они не достигали размера 2000 мм (данные показаны как средние значения ± стандартная ошибка среднего, n=8). (B) Направленное ингибирование EZH2 в ткани опухоли ксенотрансплантата G401, собранной от мышей, усыпленных на 21 день. Каждая точка показывает отношение H3K27Me3 к общему H3, измеренному с помощью ИФА. Горизонтальные линии показывают средние значения для группы; серые символы представляют собой значения за пределами стандартной кривой ИФА. (C) Изменение экспрессии гена в ткани опухоли ксенотрансплантата G401, собранного от мышей, получающих лечение соединением A в течение 21 дня. Панели a-d соответствуют генам CD133, PTPRK, DOCK4 и GLI1, соответственно. Данные представляют кратность изменения по сравнению с носителем ± стандартная ошибка среднего (n=6, n=4 для группы, получающей 500 мг/кг). * p < 0,05, ** p < 0,01, **** p < 0,0001 по сравнению с носителем, точный критерий Фишера.
Подробное описание изобретения
[051] Настоящее изобретение отчасти основано на открытии того факта, что ингибиторы EZH2 могут обеспечивать эффективное лечение SWI/SNF-ассоциированных раковых заболеваний, которые характеризуются измененной экспрессией и/или потерей функции определенных биомаркеров или генов. В частности, опухоли или клетки опухоли с измененной экспрессией и/или потерей функции выбранных биомаркеров или генов чувствительны к ингибиторам EZH2 согласно настоящему изобретению. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения рака или облегчения симптомов рака у субъекта путем введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, в частности, способ лечения раковых заболеваний, ассоциированных с измененной экспрессией и/или потерей функции конкретных биомаркеров или генов. Например, биомаркер представляет собой один компонент комплекса SWI/SNF. Например, ген выбран из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов, подавляющих клеточной цикл, генов опухолевой супрессии, генов пути hedgehog, генов пути myc и генов метилтрансферазы гистонов.
[052] Комплекс SWI/SNF у человека включает по меньшей мере эволюционно консервативные основные субъединицы и вариабельные субъединицы. Эволюционно консервативные основные субъединицы включают SNF5 (также называемый SMARCB1, INI1 или BAF47), SMARCA4 (также известный как BRM/SWI2-связанный ген 1, BRG1), BAF155 и BAF170. Вариабельные субъединицы включают BAF53 (A или B), BAF60 (A, B или C), BAF 57, BAF45 (A, B, C или D). Другие субъединицы включают ARIDI1A (также известную как SMARCF1), ARID1B, SMARCA2 (также известную как гомолог brahma, BRM), ATRX, BAF200, BAF180 (также известную как PBRM1) и бромдомен-содержащий белок 7 (BRD7). По меньшей мере один компонент комплекса SWI/SNF может представлять собой любой компонент указанного комплекса, например, компонент/субъединицу, описанную в настоящей заявке или известную в данной области техники.
[053] В любых способах, описанных в настоящей заявке, ген нейрональной дифференцировки может представлять собой CD133 (также называемый PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64 или GFAP, но не ограничивается указанными.
[054] В любом способе, описанном в настоящей заявке, ген, ингибирующий клеточный цикл, может представлять собой CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, млF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FОКСО4, CDK6, ТФУP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4 или TRIM35, но не ограничивается указанными.
[055] В любых способах, описанных в настоящей заявке, ген опухолевой супрессии может представлять собой BIN1, но не ограничивается указанным. При использовании в настоящей заявке, термин «ген опухолевой супрессии» имеет общепринятое в данной области техники значение, т.е. представляет собой ген, экспрессия и нормальная функция которого направлена на ингибирование неопластического фенотипа или вызывает апоптоз или направлена на ингибирование неопластического фенотипа и вызывает апоптоз. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, гены опухолевой супрессии включают гены, подавляющие клеточный цикл. Примеры групп опухолевых супрессоров на основе их функции включают, но не ограничиваются указанными:
(1) гены, которые подавляют клеточный цикл;
(2) гены, связывающие клеточный цикл с повреждением ДНК. Когда в клетке имеется поврежденная ДНК, клетка не должна делиться. В случае устранения повреждения, клеточный цикл может продолжаться. Если повреждение не может быть исправлено, клетка инициирует апоптоз (запрограммированную гибель клеток);
(3) гены, которые предотвращают распространение клеток опухоли, блокируют потерю контактного ингибирования и подавляют метастазирование. Указанные гены и закодированные ими белки также называются супрессорами метастаза; и
(4) белки ДНК-репарации. Мутации в указаны генах повышают риск развития рака.
[056] В любых способах, описанных в настоящей заявке, ген сигнального пути hedgehog может представлять собой GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 или SMO, но не ограничивается указанными.
[057] В любых способах, описанных в настоящей заявке, ген пути myc может представлять собой MYC NMI, NFYC, NFYB, ген циклина T1, ген RuvB-подобного белка 1, GTF2I, BRCA1, ген индуцирующего инвазию и метастазирование T-клеточной лимфомы белка 1, ACTL6A, PCAF, MYCBP2, MAPK8, Bcl-2, гомолог гена белка инициации транскрипции SPT3, SAP130, DNMT3A, матери против декапентаплегического гомолога (mothers against decapentaplegic homolog) 3», MAX, матери против декапентаплегического гомолога (mothers against decapentaplegic homolog) 2, MYCBP, HTATIP, ZBTB17, ассоциированный с доменом трансформации/транскрипции белок, TADA2L, PFDN5, MAPK1, TFAP2A, P73, TAF9, YY1, SMARCB1, SMARCA4, MLH1, EP400 или let-7, но не ограничивается указанными.
[058] В любых способах, описанных в настоящей заявке, ген метилтрансферазы гистонов может представлять собой EZH2, но не ограничивается указанным.
[059] Соединения согласно настоящему изобретению ингибируют активность метилтрансферазы гистонов EZH2 или её мутантной формы, и соответственно, согласно одному аспекту изобретения, соединения, описанные в настоящей заявке, являются кандидатными соединениями для лечения или предотвращения конкретных состояний и заболеваний. Настоящее изобретение обеспечивает способы лечения, предотвращения или облегчения симптома рака или предракового состояния. Способ включает введение субъекту, нуждающемуся в указанном введении, терапевтически эффективного количества соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа, сольвата или стереоизомера. Примеры раковых заболеваний, которые можно лечить согласно изобретению, включают медуллобластому, олигодендроглиому, светлоклеточную аденокарциному яичника, эндометриоидную аденокарциному яичника, серозную аденокарциному яичника, аденокарциному протоков поджелудочной железы, эндокринную опухоль поджелудочной железы, злокачественную рабдоидную опухоль, астроцитому, атипичную тератоидную рабдоидную опухоль, карциному хороидного сплетения, папиллому хороидного сплетения, эпендимому, глиобластому, менингиому, нейроглиальную опухоль, олигоастроцитому, олигодендроглиому, пинеобластому, карциносаркому, хордому, экстрагонадную опухоль половых клеток, внепочечную рабдоидную опухоль, шванному, плоскоклеточную карциному кожи, хондросаркому, светлоклеточную саркому мягких тканей, саркому Юинга, желудочно-кишечную стромальную опухоль, остеосаркому, рабдомиосаркому, эпителиоидную саркому, почечную медуллокарциному, диффузную B-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому и саркому без уточнения гистогенеза (not otherwise specified, NOS). В качестве альтернативы, раковые заболевания, которые предполагается лечить соединениями согласно настоящему изобретению, представляют собой раковые заболевания, не относящиеся к неходжкинским лимфомам (не НХЛ-раковые заболевания).
[060] Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединения согласно настоящему изобретению или фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата указанного соединения для лечения рака или предракового состояния или для получения медикамента, применимого для лечения указанного рака или предракового состояния. Примеры раковых заболеваний, которые можно лечить согласно изобретению, включают медуллобластому, олигодендроглиому, светлоклеточную аденокарциному яичника, эндометриоидную аденокарциному яичника, серозную аденокарциному яичника, аденокарциному протоков поджелудочную железы, эндокринную опухоль поджелудочную железы, злокачественную рабдоидную опухоль, астроцитому, атипичную тератоидную рабдоидную опухоль, карциному хороидного сплетения, папиллому хороидного сплетения, эпендимому, глиобластому, менингиому, нейроглиальную опухоль, олигоастроцитому, олигодендроглиому, пинеобластому, карциносаркому, хордому, экстрагонадную опухоль половых клеток, внепочечную рабдоидную опухоль, шванному, плоскоклеточную карциному кожи, хондросаркому, светлоклеточную саркому мягких тканей, саркому Юинга, желудочно-кишечную стромальную опухоль, остеосаркому, рабдомиосаркому, эпителиоидную саркому, почечную медуллокарциному, диффузную B-крупноклеточную лимфому, фолликулярную лимфому и саркому без уточнения гистогенеза (NOS). В качестве альтернативы, соединение согласно настоящему изобретению можно применять для лечения не НХЛ-раковых заболеваний или для получения медикамента, применимого для лечения не НХЛ-раковых заболеваний.
in vivo
in vitro
[061] Соединения согласно настоящему изобретению можно применять для модуляции метилирования белка (например, гистона), например, для модуляции ферментативной активности метилтрансферазы гистонов или деметилазы гистонов. Соединения согласно изобретению можно применять  или  для модуляции метилирования белка. Благодаря неожиданному открытию того, что регуляция метилирования EZH2 принимает участие в образовании опухолей, в частности, опухолей, имеющих измененную экспрессию и/или потерю функции выбранных биомаркеров/генов, соединения, описанные в настоящей заявке, являются подходящими кандидатами соединений для лечения указанных заболеваний, т.е. для уменьшения метилирования или восстановления метилирования приблизительно до его уровня в аналогичных нормальных клетках.
[062] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, соединения согласно настоящему изобретению могут селективно ингибировать пролиферацию ассоциированной с комплексом SWI/SNF опухоли или клеток опухоли (как показано на Фигурах 1-9). Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает способы лечения, предотвращения или облегчения симптома, ассоциированного с комплексом SWI/SNF, рака или предракового состояния с помощью соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата. Настоящее изобретение также обеспечивает применение соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата для лечения ассоциированного с комплексом SWI/SNF рака или предракового состояния или для получения медикамента, применимого для лечения указанного рака или предракового состояния.
[063] Согласно настоящему изобретению, также предложены способы определения чувствительности субъекта, страдающего раком, к ингибитору EZH2. Указанный способ включает этапы получения образца (образца нуклеиновой кислоты или белка) от субъекта и выявления уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF, выявления экспрессии и/или функции указанного компонента, где наличие указанной уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции указывает на то, что субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2. Термин «образец» относится к любому биологическому образцу, полученному от субъекта, и включает, но не ограничивается указанными, клетки, образцы ткани, жидкости тела (включая, но не ограничиваясь указанными, слизь, кровь, плазму, сыворотку, мочу, слюну и сперму), клетки опухоли и ткани опухоли. Образцы могут быть предоставлены субъектом, который подвергается лечению или исследованию. В качестве альтернативы, образцы могут быть получены врачом в соответствии со стандартными практическими способами в данной области техники.
[064] Настоящее изобретение также обеспечивает способы определения предрасположенности субъекта к развитию рака или предракового состояния путем получения образца от указанного субъекта и выявления уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF, где наличие указанной уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции указывает на то, что указанный субъект имеет предрасположенность (т.е. увеличенный риск) развития рака или предракового состояния по сравнению с субъектом, не имеющим потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF.
[065] Предполагается, что термин «предрасположенность» при использовании в настоящей заявке в отношении рака или предракового состояния означает увеличенную вероятность (например, увеличенную по меньшей мере на 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% или более вероятность) того, что субъект с пониженной экспрессией, гаплонедостаточностью и/или потерей функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF будет страдать раком или предраковым состоянием, по сравнению с вероятностью того, что другой субъект, не имеющий уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF, будет страдать раком или предраковым состоянием, при условии что другие факторы риска развития рака или предракового состояния (например, химические факторы/окружающая среда, пища и курение и т.д.) не различаются у указанных субъектов.
[066] Термин «риск» в контексте настоящего изобретения относится к вероятности того, что событие произойдет в течение конкретного периода времени, и может означать «абсолютный риск» или «относительный» риск для субъекта. Абсолютный риск можно измерить на основании действительного наблюдения за когортой после измерения в течение соответствующего времени или на основании индексных значений, полученных от статистически значимых исторических когорт, за которыми наблюдали в течение соответствующего периода времени. Относительный риск относится к отношению абсолютных рисков субъекта либо к абсолютным рискам когорты, имеющей низкий риск, либо к среднему риску популяции; относительный риск может варьировать в зависимости от способа оценки клинических факторов риска. Также обычно используют отношение шансов, т.е. отношение положительных событий к отрицательным событиям по результатам данного исследования (шансы рассчитывают согласно формуле p/(1-p), где p представляет собой вероятность происшествия события, и (1- p) представляет собой вероятность того, что событие не произойдет).
[067] Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает индивидуализированный медицинский подход, лечение и/или контроль рака для субъекта путем генетического скрининга уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF у указанного субъекта. Например, настоящее изобретение обеспечивает способы для лечения, предотвращения или облегчения симптома рака или предракового состояния путем определения чувствительности субъекта к ингибитору EZH2 и в случае наличия указанной чувствительности к действию ингибитора EZH2 у субъекта введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2 или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата или стереоизомера. Чувствительность определяют путем получения образца от субъекта и выявления уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF (такого как SNF5, ARID1A или ATRX), где наличие такой потери функции указывает на то, что указанный субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2.
[068] Согласно другому примеру настоящее изобретение обеспечивает способ контроля рака у субъекта путем периодического определения предрасположенности указанного субъекта к развитию рака или предракового состояния. Способы включают этапы получения образца от субъекта и выявления уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF, где наличие указанной уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции указывает на то, что указанный субъект имеет предрасположенность к развитию рака или предракового состоянию по сравнению с субъектом, не имеющим указанной уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF.
[069] Согласно приведенным исключительно в качестве иллюстрации вариантам реализации изобретения, способ лечения, представленный в настоящей заявке, включает этапы (a) сбора образца нуклеиновой кислоты или белка из биологического образца, полученного от субъекта, (b) измерения уровня экспрессии или функционального уровня компонента комплекса SWI/SNF в указанном образце, (c) измерения уровня экспрессии или функционального уровня компонента SWI/SNF в контрольном образце; (d) сравнения уровня экспрессии или функционального уровня компонента в исследуемом образце, измеренного в этапе (b), с уровнем экспрессии или функциональным уровнем компонента в контрольном образце, измеренным в этапе (c) (или контрольным значением); (e) идентификации субъекта в качестве кандидата для проведения лечения, если уровень экспрессии или функциональный уровень компонента, измеренного в этапе (b), уменьшен или отсутствует (например, в случае гаплонедостаточности или потери функции) по сравнению с уровнем экспрессии или функциональным уровнем компонента, измеренным в этапе (c); и (f) введения терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2 субъекту, идентифицированному в этапе (e), или выбора схемы лечения для субъекта, идентифицированного в этапе (e). Уровень экспрессии или функциональный уровень компонента у субъекта в образце уменьшен, например, на 10%, 25%, 50% или в 1, 2, 5 или более раз по сравнению с уровнем экспрессии или функциональным уровнем компонента в контрольном образце. Для измерения уровня экспрессии или функционального уровня компонента комплекса SWI/SNF можно использовать любые подходящие способы, известные в данной области техники. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, субъект страдает от злокачественной рабдоидной опухоли, медуллобластомы или атипичной тератоидной рабдоидной опухоли. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, компонент представляет собой SNF5, ARID1A или ATRX.
[070] Например, идентифицированного субъекта можно лечить с помощью стандартного способа лечения, описанного в наиболее актуальном руководстве Национальной сети многопрофильных онкологических учреждений США (National Comprehensive Cancer Network, NCCN).
[071] Например, контрольный образец получают от здорового нормального субъекта. В качестве альтернативы, контрольный образец получают от субъекта, который не страдает раком, у которого не диагностирован рак или который не находится в группе риска развития рака, ассоциированного с комплексом SWI/SNF.
[072] Согласно одному предпочтительному аспекту, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения рака или облегчения симптома рака у субъекта путем определения чувствительности указанного субъекта к ингибитору EZH2 и введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, если указанный субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2, и указанный субъекта страдает раком, выбранным из группы, состоящей из рака мозга и ЦНС, рака почки, рака яичника, рака поджелудочной железы, лейкоза, лимфомы, миеломы и/или саркомы. Указанную чувствительность определяют путем получения образца от субъекта и выявления уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции SNF5, ARID1A и/или ATRX, где наличие уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции указывает на то, что субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2.
[073] Согласно другому предпочтительному аспекту, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения злокачественной рабдоидной опухоли или облегчения симптома злокачественной рабдоидной опухоли у субъекта путем определения чувствительности указанного субъекта к ингибитору EZH2 и введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, если указанный субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2. Такую чувствительность определяют путем получения образца от субъекта и выявления уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции SNF5, ARID1A и/или ATRX, где наличие уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции указывает на то, что субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2.
[074] Согласно другому предпочтительному аспекту, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения медуллобластомы или облегчения симптома медуллобластомы у субъекта путем определения чувствительности указанного субъекта к ингибитору EZH2 и введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, если указанный субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2. Такую чувствительность определяют путем получения образца от субъекта и выявления уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции SNF5, ARID1A и/или ATRX, где наличие уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции указывает на то, что субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2.
[075] Согласно другому предпочтительному аспекту, настоящее изобретение обеспечивает способ лечения атипичной тератоидной рабдоидной опухоли или облегчения симптома атипичной тератоидной рабдоидной опухоли у субъекта путем определения чувствительности указанного субъекта к ингибитору EZH2 и введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2, если субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2. Такую чувствительность определяют путем получения образца от субъекта и выявления уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции SNF5, ARID1A и/или ATRX, где наличие уменьшенной экспрессии, гаплонедостаточности и/или потери функции указывает на то, что указанный субъект является чувствительным к действию ингибитора EZH2.
SMARCB1
[076] Злокачественные рабдоидные опухоли (ЗРО) и атипичные тератоидные рабдоидные опухоли (АТРО) являются крайне агрессивными высоко злокачественными, локально инвазивными, часто метастазирующими и очень часто приводящими к летальному исходу  раковыми заболеваниями мозга, почек и мягких тканей у детей. Они, как правило, являются диплоидными и не включают геномных аберраций; однако они характеризуются утратой корового компонента хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF SMARCB1 (также называемого SNF5, INI1 или BAF47) практически с полной пенетрантностью. Биаллельная инактивация  является по существу единственным генетическим событием в клетках ЗРО и АТРО, что указывает на ведущую роль этой генетической аберрации.
in vitro
SMARCB1
SMARCB1
CD133, DOCK4
PTPRK
CDKN1A
CDKN2A
BIN1
MYC
EZH2
SMARCB1
50
[077] Без ограничения какой-либо теорией, соединение согласно настоящему изобретению специфично ингибирует клеточное метилирование H3K27, что приводит к селективной апоптотической гибели SMARCB1-мутантных клеток ЗРО. Например, обработка  клеточных линий ЗРО с делецией  соединением A вызывала сильный антипролиферативный эффект с наномолярными значениями IC; тогда как контрольные (дикого типа) клеточные линии подвергались минимальному влиянию (Фигура 10C и Таблица 6). Более того, соединение согласно настоящему изобретению индуцирует гены нейрональной дифференцировки, ингибирования клеточного цикла и опухолевой супрессии при ингибировании экспрессии генов пути hedgehog, MYC и EZH2. Например, лечение соединением A клеток G401 с делецией в течение периода времени до7 дней вызывало сильную индукцию экспрессии  и  и ингибирование ингибиторов клеточного цикла  и  и опухолевого супрессора  зависимым от времени образом (Фигура 14B). Одновременно уменьшалась экспрессия генов пути hedgehog,  и . Следует отметить, что клетки G402 с делецией , подверженные воздействиюсоединения A в течение 14 дней, принимали нейроно-подобную морфологию (Фигура 14C).
[078] Соответственно, настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения рака или облегчения симптома рака у нуждающегося в этом субъекта  путем (a) определения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов ингибирования клеточного цикла и генов опухолевой супрессии, в образце, полученном от субъекта; (b) выбора субъекта, имеющего уменьшенный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в этапе (a); и (c) введения субъекту, выбранному в этапе (b), эффективного количества соединения согласно изобретению, что таким образом обеспечивает лечение рака или облегчение симптома рака у субъекта.
[079] Настоящее изобретение также обеспечивает способ лечения рака или облегчения симптома рака у нуждающегося в этом субъекта   путем (a) определения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов пути hedgehog, генов пути myc и генов метилтрансферазы гистонов, в образце, полученном от субъекта; (b) выбора субъекта, имеющего увеличенный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в этапе (a); и (c) введения субъекту, выбранному в этапе (b), эффективного количества соединения согласно изобретению, что таким образом обеспечивает лечение рака или облегчение симптома рака у субъекта.
[080] Согласно настоящему изобретению также предложен способ выбора противораковой терапии для субъекта, нуждающегося в указанной терапии, путем (a) определения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов, подавляющих клеточный цикл, и генов опухолевой супрессии, в образце, полученном от указанного субъекта, и (b) выбора противораковой терапии, если субъект имеет уменьшенный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в этапе (a), где указанная противораковая терапия включает введение субъекту эффективного количества соединения согласно изобретению.
[081] Настоящее изобретение также обеспечивает способ выбора противораковой терапии для субъекта, нуждающегося в указанной терапии, путем (a) определения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов пути hedgehog, генов пути myc и генов метилтрансферазы гистонов, в образце, полученном от субъекта, и (b) выбора противораковой терапии, если у субъекта наблюдается увеличенный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в этапе (a), где указанная противораковая терапия включает введение субъекту эффективного количества соединения согласно изобретению.
[082] Согласно приведенным исключительно в качестве иллюстрации вариантам реализации изобретения, способы, представленные в настоящей заявке, могут включать этапы (a) сбора образца нуклеиновой кислоты или белка из биологического образца, полученного от субъекта, (b) измерения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов, подавляющих клеточный цикл, и генов опухолевой супрессии, в образце, (c) измерения уровня экспрессии того же гена (генов) в контрольном образце; (d) сравнения уровня экспрессии гена в исследуемом образце, измеренного в этапе (b), с уровнем экспрессии гена в контрольном образце, измеренным в этапе (c) (или с контрольным значением); (e) идентификации субъекта в качестве кандидата для проведения лечения, если уровень экспрессии компонента, измеренный в этапе (b), уменьшен по сравнению с уровнем экспрессии гена, измеренным в этапе (c); и (f) введения терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2 субъекту, идентифицированному в этапе (e), или выбора схемы лечения для субъекта, идентифицированного в этапе (e). Уровень экспрессии гена у исследуемого субъекта уменьшен, например, на 10%, 25%, 50% или в 1, 2, 5 или более раз по сравнению с уровнем экспрессии гена в контрольном образце.
[083] Согласно приведенным исключительно в качестве иллюстрации вариантам реализации изобретения, способы, представленные в настоящей заявке, могут включать этапы: (a) сбора образца нуклеиновой кислоты или белка из биологического образца, полученного от субъекта, (b) измерения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов пути hedgehog, генов пути myc и генов метилтрансферазы гистонов в образце, (c) измерения уровня экспрессии того же гена (генов) в контрольном образце; (d) сравнения уровня экспрессии гена в исследуемом образце, измеренного в этапе (b), с уровнем экспрессии гена в контрольном образце, измеренным в этапе (c) (или с контрольным значением); (e) идентификации субъекта как кандидата для проведения лечения, если уровень экспрессии компонента, измеренного в этапе (b), повышен по сравнению с уровнем экспрессии гена, измеренным в этапе (c); и (f) введения терапевтически эффективного количества ингибитора EZH2 субъекту, идентифицированному в этапе (e), или выбора схемы лечения для субъекта, идентифицированного в этапе (e). Уровень экспрессии гена у исследуемого субъекта повышен, например, на 10%, 25%, 50% или в 1, 2, 5 или более раз по сравнению с уровнем экспрессии гена в контрольном образце.
in situ
[084] Термин «уровень экспрессии» относится к уровню белка, РНК или мРНК конкретного интересующего гена. Любые способы, известные в данной области техники, можно использовать для определения уровня экспрессии конкретного интересующего гена. Примеры включают, но не ограничиваются указанными, анализ с помощью обратной транскрипции и амплификации (например, ПЦР, ПЦР в реальном времени с лигированием или количественная ПЦР в реальном времени), анализы способом гибридизации, Нозерн-блоттинг, дот-блоттинг,  гибридизация, электрофорез в геле, капиллярный электрофорез, колоночная хроматография, Вестерн-блоттинг, иммуногистохимия, иммуноокрашивание или масс-спектрометрия. Анализы можно проводить непосредственно на биологических образцах или на белках/нуклеиновых кислотах, выделенных из образцов. Проведение указанных анализов находится в пределах стандартных практических экспериментов в советующей области техники. Например, этап измерения в любом способе, описанном в настоящей заявке, включает приведение образца нуклеиновой кислоты из биологического образца, полученного от субъекта, во взаимодействие с одним или более праймерами, которые специфично гибридизуются с интересующим геном, описанным в настоящей заявке. В качестве альтернативы, этап измерения любого способа, описанного в настоящей заявке, включает приведение белкового образца из биологического образца, полученного от субъекта, во взаимодействие с одним или более антителами, которые связываются с интересующим биомаркером, описанным в настоящей заявке.
[085] Уменьшенный уровень экспрессии конкретного гена означает уменьшение его уровня экспрессии по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% или более по сравнению с контрольным значением или уровнем экспрессии указанного гена, измеренным в другом (или предыдущем) образце, полученном от того же субъекта.
[086] Увеличенный уровень экспрессии конкретного гена означает повышение его уровня экспрессии по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% или более по сравнению с контрольным значением или уровнем экспрессии указанного гена, измеренным в другом (или предыдущем) образце, полученном от того же субъекта.
[087] Термины «контрольный или исходный уровень/значение» могут использоваться в настоящей заявке взаимозаменяемо и относятся к числу или значению, полученному в результате исследований популяций, включая, но не ограничиваясь указанными, субъектов, имеющих одинаковый возрастной диапазон, статус заболевания (например, стадию), субъектов одной или подобных этнических групп, или по отношению к исходному образцу субъекта, подвергаемого лечению рака. Такие контрольные значения могут быть получены из данных статистического анализа и/или  данных прогнозирования риска для популяций, полученных на основе математических алгоритмов и рассчитанных показателей рака. Контрольные показатели также можно получать и использовать с помощью алгоритмов и других способов статистической и структурной обработки.
[088] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, контрольное или исходное значение представляет собой уровень экспрессии конкретного интересующего гена в контрольном образце, полученном от одного или более здорового субъекта или субъекта, у которого не было диагностировано какое-либо раковое заболевание.
[089] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, контрольное или исходное значение представляет собой уровень экспрессии конкретного интересующего гена в образце, полученном от того же субъекта до проведения какого-либо лечения рака. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения, контрольное или исходное значение представляет собой уровень экспрессии конкретного интересующего гена в образце, полученном от того же субъекта во время проведения лечения рака. В качестве альтернативы, контрольное или исходное значение представляет собой предыдущее измерение уровня экспрессии конкретного интересующего гена в ранее полученном образце от того же субъекта или от субъекта, находящегося в том же возрастном диапазоне и имеющего такой же статус заболевания (например, стадию), как и исследуемый субъект.
[090] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, эффективное количество означает количество, достаточное для повышения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, экспрессия которого уменьшена у субъекта до проведения лечения, или количество, достаточное для ослабления одного или более симптомов рака. Например, эффективное количество представляет собой количество, достаточное для повышения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов, подавляющих клеточный цикл, и генов опухолевой супрессии, по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% или более по сравнению с контрольным значением или уровнем экспрессии при отсутствии лечения каким-либо соединением.
[091] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, эффективное количество означает количество, достаточное для уменьшения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, который повышен у субъекта до начала лечения, или количество, достаточное для облегчения одного или более симптомов рака. Например, эффективное количество представляет собой количество, достаточное для уменьшения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов пути hedgehog, MYC и EZH2, по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% или более по сравнению с контрольным значением или уровнем экспрессии при отсутствии лечения каким-либо соединением.
[092] Точное эффективное количество для субъекта зависит от массы тела, роста и состояния здоровья указанного субъекта; природы и степени состояния; и терапевтического соединения, выбранного для введения. Эффективное количество для конкретного случая можно определить с помощью стандартных экспериментов, которые клиницист способен провести и оценить.
[093] Настоящее изобретение также обеспечивает способ определения эффективности лечения рака у субъекта, нуждающегося в указанном лечении, путем (a) измерения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов, подавляющих клеточный цикл, и генов опухолевой супрессии, в образце, полученном от субъекта, (b) сравнения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в этапе (a), с контрольным значением или значением до проведения измерения и (c) определения эффективности лечения рака на основе этапа сравнения. Пример лечения рака представляет собой введение соединения согласно изобретению исследуемому субъекту.
[094] Лечение является эффективным, когда исследуемый субъект имеет увеличенную экспрессию по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов, подавляющих клеточный цикл, и генов опухолевой супрессии, 1) по сравнению с контрольным значением или значением до измерения; или 2) в течение периода наблюдения, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 недель или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или более. Если текущее лечение не является эффективным, то для исследуемого субъекта подбирают новое лечение или увеличенную дозу текущего лечебного препарата (например, увеличенная доза соединения, вводимого субъекту).
[095] Настоящее изобретение также обеспечивает способ определения эффективности лечения рака у нуждающегося в этом субъекта   путем (a) измерения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов пути hedgehog, генов пути myc и генов метилтрансферазы гистонов, в образце, полученном от субъекта, (b) сравнения уровня экспрессии по меньшей мере одного гена, указанного в этапе (a), с контрольным значением или предыдущем измерением и (c) определения эффективности лечения рака на основе этапа сравнения. Пример лечения рака представляет собой введение ингибитора EZH2 согласно изобретению исследуемому субъекту.
[096] Например, лечение является эффективным, когда исследуемый субъект имеет уменьшенную экспрессию по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов пути hedgehog, генов пути myc и генов метилтрансферазы гистонов 1) по сравнению с контрольным значением или предыдущим измерением; или 2) в течение наблюдаемого периода времени, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 недель или 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 месяцев или дольше. Если текущее лечение не является эффективным, то для исследуемого субъекта подбирается новое лечение или увеличенная доза текущего лечебного препарата (например, увеличенная доза соединения, вводимого субъекту).
[097] В любых способах, описанных в настоящей заявке, рак выбран из группы, состоящей из рака мозга и центральной нервной системы (ЦНС), рака головы и шеи, рака почки, рака яичника, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака легкого, лимфомы, миеломы, саркомы, рака молочной железы и рака предстательной железы. Предпочтительно, рак выбран из группы, состоящей из медуллобластомы, олигодендроглиомы, светлоклеточной аденокарциномы яичника, эндометриоидной аденокарциномы яичника, серозной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, эндокринной опухоли поджелудочной железы, злокачественной рабдоидной опухоли, астроцитомы, атипичной тератоидной рабдоидной опухоли, карциномы хороидного сплетения, папилломы хороидного сплетения, эпендимомы, глиобластомы, менингиомы, нейроглиальной опухоли, олигоастроцитомы, олигодендроглиомы, пинеобластомы, карциносаркомы, хордомы, экстрагонадной опухоли половых клеток, внепочечной рабдоидной опухоли, шванномы, плоскоклеточной карциномы кожи, хондросаркомы, светлоклеточной саркомы мягких тканей, саркомы Юинга, желудочно-кишечной стромальной опухоли, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, эпителиоидной саркомы, почечной медуллокарциномы, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, и саркомы без уточнения гистогенеза (NOS). Более предпочтительно, рак представляет собой медуллобластому, злокачественную рабдоидную опухоль или атипичную тератоидную рабдоидную опухоль.
[098] При использовании в настоящей заявке термин «восприимчивость» используется взаимозаменяемо с терминами «отвечающий», «чувствительный» и «чувствительность» и означает, что субъект проявляет терапевтические ответы на введение ингибитора EZH, например, клетки опухоли или ткани опухоли указанного субъекта подвергаются апоптозу и/или некрозу и/или проявляют уменьшение роста, деления или пролиферации. Указанный термин также означает, что субъект будет иметь или имеет увеличенную вероятность возникновения терапевтического ответа на введение ингибитора EZH по сравнению с целой популяцией, например, вероятность того, что клетки опухоли или ткани опухоли субъекта будут подвергаться апоптозу и/или некрозу и/или проявлять уменьшение роста, деления или пролиферации.
[099] При использовании в настоящей заявке, термин «субъект» используется взаимозаменяемо с термином «субъект, нуждающийся в указанном введении», оба из которых относятся к субъекту, страдающему расстройством, в котором принимает участие EZH2-опосредованное метилирование белка, или субъекту, имеющему увеличенный риск развития такого расстройства по сравнению с целой популяцией. Указанный  нуждающийся в этом субъект может представлять собой субъекта, страдающего расстройством, ассоциированным с комплексом SWI/SNF. Указанный  нуждающийся в этом субъект может иметь предраковое состояние. Предпочтительно, указанный  нуждающийся в этом субъект страдает раком. Указанный  нуждающийся в этом субъект может страдать раком, ассоциированным с комплексом SWI/SNF. Указанный  нуждающийся в этом субъект может страдать раком, ассоциированным с потерей функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF. Согласно предпочтительному аспекту, указанный  нуждающийся в этом субъект страдает одним или более раковым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из рака мозга и центральной нервной системы (ЦНС), рака головы и шеи, рака почки, рака яичника, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака легкого, лимфомы, миеломы, саркомы, рака молочной железы и рака предстательной железы. Предпочтительно, указанный  нуждающийся в этом субъект страдает от медуллобластомы, олигодендроглиомы, светлоклеточной аденокарциномы яичника, эндометриоидной аденокарциномы яичника, серозной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, эндокринной опухоли поджелудочной железы, злокачественной рабдоидной опухоли, астроцитомы, атипичной тератоидной рабдоидной опухоли, карциномы хороидного сплетения, папилломы хороидного сплетения, эпендимомы, глиобластомы, менингиомы, нейроглиальной опухоли, олигоастроцитомы, олигодендроглиомы, пинеобластомы, карциносаркомы, хордомы, экстрагонадной опухоли половых клеток, внепочечной рабдоидной опухоли, шванномы, плоскоклеточной карциномы кожи, хондросаркомы, светлоклеточной саркомы мягкой ткани, саркомы Юинга, желудочно-кишечной стромальной опухоли, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, эпителиоидной саркомы, почечной медуллокарциномы, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы, и саркомы без уточнения гистогенеза (NOS). В качестве альтернативы, указанный  нуждающийся в этом субъект страдает не НХЛ-раковым заболеванием.
[0100] При использовании в настоящей заявке, термин «субъект» включает млекопитающее. Млекопитающее может представлять собой, например, человека или подходящее не представляющее собой человека млекопитающее, такое как примат, мышь, крыса, собака, кошка, корова, лошадь, коза, верблюд, овца или свинья. Субъект также может представлять собой птицу или домашнюю птицу. Согласно одному варианту реализации изобретения, млекопитающее представляет собой человека. Субъект может представлять собой мужчину или женщину.
[0101]  Указанный  нуждающийся в этом субъект может представлять собой субъекта, у которого ранее не был диагностирован рак или который не был идентифицирован как имеющий раковое или предраковое состояние. Указанный  нуждающийся в этом субъект может представлять собой субъекта, у которого ранее был диагностирован рак или который был идентифицирован как имеющий рак или предраковое состояние. Указанный  нуждающийся в этом субъект также может представлять собой субъекта, имеющего (страдающего от) рак или предраковое состояние. В качестве альтернативы, указанный  нуждающийся в этом субъект может представлять собой субъекта, имеющего риск развития такого расстройства по сравнению с целой популяцией (т.е. субъекта, который предрасположен к развитию такого расстройства по сравнению с целой популяцией).
[0102] Указанный субъект необязательно уже подвергался, подвергается или будет подвергаться по меньшей мере одному терапевтическому вмешательству в раковое или предраковое состояние.
[0103] Указанный субъект может иметь рефрактерную форму рака, устойчивую к наиболее современной терапии. «Рефрактерная форма рака» означает, что рак не отвечает на лечение. Рак может быть устойчивым в начале лечения или становиться устойчивым во время лечения. Рефрактерный рак также называется устойчивым раком. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанный  нуждающийся в этом субъект страдает рецидивом рака после ремиссии на фоне наиболее современной терапии. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанный  нуждающийся в этом субъект не получал благоприятного эффекта от всех известных вариантов эффективного терапевтического лечения рака. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанный  нуждающийся в этом субъект подвергался по меньшей мере одному предшествующую терапевтическому лечению.
[0104] Указанный  нуждающийся в этом субъект может представлять собой субъекта, который страдал, страдает раком или предраковым состоянием или имеет предрасположенность к развитию рака или предракового состояния, ассоциированного с комплексом SWI/SNF. Указанный  нуждающийся в этом субъект может представлять собой субъекта, который страдал или страдает раком или предраковым состоянием или имеет предрасположенность к развитию рака или предракового состояния, ассоциированного с потерей функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF. Согласно предпочтительному аспекту, указанный  нуждающийся в этом субъект представляет собой субъекта, который страдал или страдает одним или более раковых заболеваний или имеет предрасположенность к развитию одного или более раковых заболеваний, выбранных из группы, состоящей из рака мозга и центральной нервной системы (ЦНС), рака головы и шеи, рака почки, рака яичника, рака поджелудочной железы, лейкоза, рака легкого, лимфомы, миеломы, саркомы, рака молочной железы и рака предстательной железы. Предпочтительно, указанный  нуждающийся в этом субъект представляет собой субъекта, который страдал или страдает или имеет предрасположенность к развитию рака мозга и ЦНС, рака почки, рака яичника, рака поджелудочной железы, лейкоза, лимфомы, миеломы и/или саркомы. Примеры рака мозга и центральной нервной системы (ЦНС) включают медуллобластому, олигодендроглиому, атипичную тератоидную рабдоидную опухоль, карциному хороидного сплетения, папиллому хороидного сплетения, эпендимому, глиобластому, менингиому, нейроглиальную опухоль, олигоастроцитому, олигодендроглиому и пинеобластому. Примеры рака яичника включают светлоклеточную аденокарциному яичника, эндометриоидную аденокарциному яичника и серозную аденокарциному яичника. Примеры рака поджелудочной железы включают аденокарциному протоков поджелудочной железы и эндокринную опухоль поджелудочной железы. Примеры саркомы включают хондросаркому, светлоклеточную саркому мягких тканей, саркому Юинга, желудочно-кишечную стромальную опухоль, остеосаркому, рабдомиосаркому и саркому без уточнения гистогенеза (not otherwise specified, NOS). В качестве альтернативы, раковые заболевания, которые предполагается лечить с помощью соединений согласно настоящему изобретению, представляют собой не НХЛ-раковые заболевания.
[0105] В качестве альтернативы, указанный  нуждающийся в этом субъект представляет собой субъекта, который страдал или страдает одним или более раковых заболеваний или имеет предрасположенность к развитию одного или более раковых заболеваний, выбранных из группы, состоящей из медуллобластомы, олигодендроглиомы, светлоклеточной аденокарциномы яичника, эндометриоидной аденокарциномы яичника, серозной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, эндокринной опухоли поджелудочной железы, злокачественной рабдоидной опухоли, астроцитомы, атипичной тератоидной рабдоидной опухоли, карциномы хороидного сплетения, папилломы хороидного сплетения, эпендимомы, глиобластомы, менингиомы, нейроглиальной опухоли, олигоастроцитомы, олигодендроглиомы, пинеобластомы, карциносаркомы, хордомы, экстрагонадной опухоли половых клеток, внепочечной рабдоидной опухоли, шванномы, плоскоклеточной карциномы кожи, хондросаркомы, светлоклеточной саркомы мягких тканей, саркомы Юинга, желудочно-кишечной стромальной опухоли, остеосаркомы, рабдомиосаркомы и саркомы без уточнения гистогенеза (NOS). Предпочтительно, субъект представляет собой субъекта, который страдал или страдает или имеет предрасположенность к развитию медуллобластомы, светлоклеточной аденокарциномы яичника, эндометриоидной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, злокачественной рабдоидной опухоли, атипичной тератоидной рабдоидной опухоли, карциномы хороидного сплетения, папилломы хороидного сплетения, глиобластомы, менингиомы, пинеобластомы, карциносаркомы, внепочечной рабдоидной опухоли, шванномы, плоскоклеточной карциномы кожи, хондросаркомы, саркомы Юинга, эпителиоидной саркомы, почечной медуллокарциномы, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы и/или NOS-саркомы. Более предпочтительно, указанный  нуждающийся в этом субъект представляет собой субъекта, который страдал или страдает или имеет предрасположенность к развитию злокачественной рабдоидной опухоли, медуллобластомы и/или атипичной тератоидной рабдоидной опухоли.
[0106] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, указанный  нуждающийся в этом субъект имеет уменьшенный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов нейрональной дифференцировки, генов, подавляющих клеточный цикл, и генов опухолевой супрессии.
[0107] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанный  нуждающийся в этом субъект имеет увеличенный уровень экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из генов пути hedgehog, генов пути myc и генов метилтрансферазы гистонов.
[0108] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, указанный  нуждающийся в этом субъект имеет потерю функции по меньшей мере одного компонента/субъединицы комплекса SWI/SNF. В качестве альтернативы, указанный  нуждающийся в этом субъект имеет уменьшенную экспрессию или гаплонедостаточность по меньшей мере одного компонента/субъединицы комплекса SWI/SNF. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, указанный  нуждающийся в этом субъект имеет потерю функции субъединицы SNF5.
[0109] В любом способе согласно настоящему изобретению указанный  нуждающийся в этом субъект может иметь пониженную экспрессию, гаплонедостаточность или потерю функции по меньшей мере одного компонента сигнального пути, более позднего по отношению к комплексу SWI/SNF. Такой более поздний компонент включает, но не ограничивается указанными, комплекс polycomb (PcG) и его мишени.
[0110] При использовании в настоящей заявке термин «потеря функции» относится к уменьшенной функции или отсутствию функции продукта гена/белка по сравнению с диким типом. Потеря функции компонента комплекса SWI/SNF означает, что компонент/субъединица или целый комплекс SWI/SNF незначительно проявляет или не проявляет биологическую функцию по сравнению с компонентом/субъединицей или целым комплексом SWI/SNF дикого типа, соответственно. Потеря функции может быть вызвана транскрипционными, пост-транскрипционными или пост-трансляционными механизмами. Согласно одному аспекту настоящего изобретения, потеря функции вызвана мутацией, приводящей к потери функции, являющейся результатом точечной мутации (например, замены, миссенс-мутации или нонсенс-мутации), инсерции и/или делеции в полипептиде компонента комплекса SWI/SNF или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид компонента комплекса SWI/SNF. Мутации, на которые ссылаются в настоящей заявке, представляют собой соматические мутации. Термин «соматическая мутация» относится к неблагоприятному изменению по меньшей мере в одной аллели гена, которое не встречается в каждой клетке организма, а встречается только в выделенных клетках. Характеристикой соматических мутаций при использовании в настоящей заявке является то, что они ограничиваются конкретными тканями или даже частью ткани или клеток в ткани и не встречаются в целом организме, содержащем указанные ткани и клетки. Термин «дикий тип» относится к гену или продукту гена, который имеет характеристики указанного гена или продукта гена, выделенного из естественного источника. Ген дикого типа представляет собой ген, который наиболее часто встречается в популяции и, таким образом, случайным образом стал «нормальной» формой гена или формой «дикого типа».
[0111] Соответственно, мутацию, приводящую к потери функции или уменьшенной экспрессии, можно выявить с использованием любого подходящего способа, доступного в данной области техники. Например, мутацию, приводящую к потери функции, можно выявить путем измерения биологической функции продукта гена, такого как ATP-зависимая хроматин-ремоделирующая активность комплекса SWI/SNF. В качестве альтернативы, мутацию, приводящую к потери функции, можно определить путем выявления любого изменения в последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей компонент комплекса SWI/SNF. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую компонент комплекса SWI/SNF, имеющую мутацию, приводящую к потери функции, можно выявить путем полногеномного ресеквенирования или ресеквенирования области-мишени (последнее также известно как направленное ресеквенирование) с использованием подходящим образом выбранных источников ДНК и праймеров для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Способ, как правило, в целом включает этапы очистки геномной ДНК, ПЦР-амплификации для амплификации интересующей области, циклического секвенирования, очистки с помощью секвенирующей реакции, капиллярного электрофореза и/или анализа данных. В качестве альтернативы или дополнительно, способ может включать применение захвата меченой области геномной ДНК на основе микрочипов и/или секвенирования. Наборы, реагенты и способы для выбора подходящих праймеров для ПЦР-анализа и осуществления ресеквенирования являются коммерчески доступными, например, из компаний Applied Biosystems, Agilent и NimbleGen (Roche Diagnostics GmbH). В качестве альтернативы или дополнительно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид SWI/SNF, имеющий мутацию, приводящую к потери функции, может быть выявлена с помощью Саузерн-блоттинга в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Необязательно мутацию, приводящую к потери функции, можно выявить путем измерения отсутствия экспрессии компонента полипептида или путем измерения экспрессии полипептида мутантного компонента. Экспрессию (мутантного) полипептида можно выявить с помощью любого подходящего иммуноанализа, известного в данной области техники, такого как Вестерн-блоттинг.
[0112] Последовательность нуклеиновых кислот и аминокислот компонентов комплекса SWI/SNF человека была описана ранее. См., например, коды доступа в базе данных GenBank NP_003064,2, NM_003073,3, NP_001007469,1 и NM_001007468,1 для SNF5, коды доступа в базе данных GenBank NM_000489,3, NP_000480,2, NM_138270,2 и NP_612114,1 для ATRX, коды доступа в базе данных GenBank NP_006006,3, NM_006015,4, NP_624361,1 и NM_139135,2 для ARID1A, каждый из которых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.
et al.
[0113] Спектр соматических мутаций hSNF5 у человека также был описан в источнике Sevenet, Human Molecular Genetics, 8: 2359-2368, 1999, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[0114] Указанный  нуждающийся в этом субъект может иметь пониженную экспрессию, гаплонедостаточность и/или потерю функции SNF5. Например, субъект может иметь делецию SNF5 в полипептиде SNF5 или последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид SNF5.
Член подсемейства B SWI/SNF-связанного ассоциированного с матриксом актин-зависимого регулятора хроматина 1 (SMARCB1, также называемый SNF5), изоформа а [Homo sapiens] (SEQ ID NO: 1)
1   mmmmalsktf gqkpvkfqle ddgefymigs evgnylrmfr gslykrypsl wrrlatveer 61  kkivasshgk ktkpntkdhg yttlatsvtl lkaseveeil dgndekykav sistepptyl 121 reqkakrnsq wvptlpnssh hldavpcstt inrnrmgrdk krtfplcfdd hdpavihena 181 sqpevlvpir ldmeidgqkl rdaftwnmne klmtpemfse ilcddldlnp ltfvpaiasa 241 irqqiesypt dsiledqsdq rviiklnihv gnislvdqfe wdmsekensp ekfalklcse 301 lglggefvtt iaysirgqls whqktyafse nplptveiai rntgdadqwc plletltdae 361 mekkirdqdr ntrrmrrlan tapaw
Член подсемейства B SWI/SNF-связанного ассоциированного с матриксом актин-зависимого регулятора хроматина 1 (SMARCB1, также называемый SNF5), Homo sapiens,  вариант транскрипта 1, мРНК (SEQ ID NO: 2)
1    aacgccagcg cctgcgcact gagggcggcc tggtcgtcgt ctgcggcggc ggcggcggct 61   gaggagcccg gctgaggcgc cagtacccgg cccggtccgc atttcgcctt ccggcttcgg 121  tttccctcgg cccagcacgc cccggccccg ccccagccct cctgatccct cgcagcccgg 181  ctccggccgc ccgcctctgc cgccgcaatg atgatgatgg cgctgagcaa gaccttcggg 241  cagaagcccg tgaagttcca gctggaggac gacggcgagt tctacatgat cggctccgag 301  gtgggaaact acctccgtat gttccgaggt tctctgtaca agagataccc ctcactctgg 361  aggcgactag ccactgtgga agagaggaag aaaatagttg catcgtcaca tggtaaaaaa 421  acaaaaccta acactaagga tcacggatac acgactctag ccaccagtgt gaccctgtta 481  aaagcctcgg aagtggaaga gattctggat ggcaacgatg agaagtacaa ggctgtgtcc 541  atcagcacag agccccccac ctacctcagg gaacagaagg ccaagaggaa cagccagtgg 601  gtacccaccc tgcccaacag ctcccaccac ttagatgccg tgccatgctc cacaaccatc 661  aacaggaacc gcatgggccg agacaagaag agaaccttcc ccctttgctt tgatgaccat 721  gacccagctg tgatccatga gaacgcatct cagcccgagg tgctggtccc catccggctg 781  gacatggaga tcgatgggca gaagctgcga gacgccttca cctggaacat gaatgagaag 841  ttgatgacgc ctgagatgtt ttcagaaatc ctctgtgacg atctggattt gaacccgctg 901  acgtttgtgc cagccatcgc ctctgccatc agacagcaga tcgagtccta ccccacggac 961  agcatcctgg aggaccagtc agaccagcgc gtcatcatca agctgaacat ccatgtggga 1021 aacatttccc tggtggacca gtttgagtgg gacatgtcag agaaggagaa ctcaccagag 1081 aagtttgccc tgaagctgtg ctcggagctg gggttgggcg gggagtttgt caccaccatc 1141 gcatacagca tccggggaca gctgagctgg catcagaaga cctacgcctt cagcgagaac 1201 cctctgccca cagtggagat tgccatccgg aacacgggcg atgcggacca gtggtgccca 1261 ctgctggaga ctctgacaga cgctgagatg gagaagaaga tccgcgacca ggacaggaac 1321 acgaggcgga tgaggcgtct tgccaacacg gccccggcct ggtaaccagc ccatcagcac 1381 acggctccca cggagcatct cagaagattg ggccgcctct cctccatctt ctggcaagga 1441 cagaggcgag gggacagccc agcgccatcc tgaggatcgg gtgggggtgg agtgggggct 1501 tccaggtggc ccttcccggc acacattcca tttgttgagc cccagtcctg ccccccaccc 1561 caccctccct acccctcccc agtctctggg gtcaggaaga aaccttattt taggttgtgt 1621 tttgtttttg tataggagcc ccaggcaggg ctagtaacag tttttaaata aaaggcaaca 1681 ggtcatgttc aatttcttca acaaaaaaaa aaaaaaa
Член подсемейства B SWI/SNF-связанного ассоциированного с матриксом актин-зависимого регулятора хроматина 1 (SMARCB1, также называемый SNF5), изоформа b [Homo sapiens] (SEQ ID NO: 3)
1   mmmmalsktf gqkpvkfqle ddgefymigs evgnylrmfr gslykrypsl wrrlatveer 61  kkivasshdh gyttlatsvt llkaseveei ldgndekyka vsisteppty lreqkakrns 121 qwvptlpnss hhldavpcst tinrnrmgrd kkrtfplcfd dhdpavihen asqpevlvpi 181 rldmeidgqk lrdaftwnmn eklmtpemfs eilcddldln pltfvpaias airqqiesyp 241 tdsiledqsd qrviiklnih vgnislvdqf ewdmsekens pekfalklcs elglggefvt 301 tiaysirgql swhqktyafs enplptveia irntgdadqw cplletltda emekkirdqd 361 rntrrmrrla ntapaw
Член подсемейства B SWI/SNF-связанного ассоциированного с матриксом актин-зависимого регулятора хроматина 1 (SMARCB1, также называемый SNF5), Homo sapiens, вариант транскрипта 2, мРНК (SEQ ID NO: 4)
1    aacgccagcg cctgcgcact gagggcggcc tggtcgtcgt ctgcggcggc ggcggcggct 61   gaggagcccg gctgaggcgc cagtacccgg cccggtccgc atttcgcctt ccggcttcgg 121  tttccctcgg cccagcacgc cccggccccg ccccagccct cctgatccct cgcagcccgg 181  ctccggccgc ccgcctctgc cgccgcaatg atgatgatgg cgctgagcaa gaccttcggg 241  cagaagcccg tgaagttcca gctggaggac gacggcgagt tctacatgat cggctccgag 301  gtgggaaact acctccgtat gttccgaggt tctctgtaca agagataccc ctcactctgg 361  aggcgactag ccactgtgga agagaggaag aaaatagttg catcgtcaca tgatcacgga 421  tacacgactc tagccaccag tgtgaccctg ttaaaagcct cggaagtgga agagattctg 481  gatggcaacg atgagaagta caaggctgtg tccatcagca cagagccccc cacctacctc 541  agggaacaga aggccaagag gaacagccag tgggtaccca ccctgcccaa cagctcccac 601  cacttagatg ccgtgccatg ctccacaacc atcaacagga accgcatggg ccgagacaag 661  aagagaacct tccccctttg ctttgatgac catgacccag ctgtgatcca tgagaacgca 721  tctcagcccg aggtgctggt ccccatccgg ctggacatgg agatcgatgg gcagaagctg 781  cgagacgcct tcacctggaa catgaatgag aagttgatga cgcctgagat gttttcagaa 841  atcctctgtg acgatctgga tttgaacccg ctgacgtttg tgccagccat cgcctctgcc 901  atcagacagc agatcgagtc ctaccccacg gacagcatcc tggaggacca gtcagaccag 961  cgcgtcatca tcaagctgaa catccatgtg ggaaacattt ccctggtgga ccagtttgag 1021 tgggacatgt cagagaagga gaactcacca gagaagtttg ccctgaagct gtgctcggag 1081 ctggggttgg gcggggagtt tgtcaccacc atcgcataca gcatccgggg acagctgagc 1141 tggcatcaga agacctacgc cttcagcgag aaccctctgc ccacagtgga gattgccatc 1201 cggaacacgg gcgatgcgga ccagtggtgc ccactgctgg agactctgac agacgctgag 1261 atggagaaga agatccgcga ccaggacagg aacacgaggc ggatgaggcg tcttgccaac 1321 acggccccgg cctggtaacc agcccatcag cacacggctc ccacggagca tctcagaaga 1381 ttgggccgcc tctcctccat cttctggcaa ggacagaggc gaggggacag cccagcgcca 1441 tcctgaggat cgggtggggg tggagtgggg gcttccaggt ggcccttccc ggcacacatt 1501 ccatttgttg agccccagtc ctgcccccca ccccaccctc cctacccctc cccagtctct 1561 ggggtcagga agaaacctta ttttaggttg tgttttgttt ttgtatagga gccccaggca 1621 gggctagtaa cagtttttaa ataaaaggca acaggtcatg ttcaatttct tcaacaaaaa 1681 aaaaaaaaaa
[0115] Указанный  нуждающийся в этом субъект может иметь пониженную экспрессию, гаплонедостаточность и/или потерю функции ATRX. Например, субъект может иметь мутацию, выбранную из группы, состоящей из замещения аспарагином (N) остатка лизина (K), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 688 последовательности SEQ ID NO: 5 (K688N) и замещения изолейцином (I) остатка метионина (M), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 366 последовательности SEQ ID NO: 5 (M366I).
Белок синдрома сцепленной с X-хромосомой альфа-талассемии, сопровождающейся умственной отсталостью (ATRX), Homo sapiens, изоформа 1 (SEQ ID NO: 5)
1    mtaepmsesk lntlvqklhd flahsseese etsspprlam nqntdkisgs gsnsdmmens 61   keegtsssek skssgssrsk rkpsivtkyv esddekpldd etvnedasne nsenditmqs 121  lpkgtvivqp epvlnedkdd fkgpefrsrs kmktenlkkr gedglhgivs ctacgqqvnh 181  fqkdsiyrhp slqvlicknc fkyymsddis rdsdgmdeqc rwcaeggnli ccdfchnafc 241  kkcilrnlgr kelstimden nqwycyichp eplldlvtac nsvfenleql lqqnkkkikv 301  dseksnkvye htsrfspkkt ssncngeekk lddscsgsvt ysysalivpk emikkakkli 361  ettanmnssy vkflkqatdn seissatklr qlkafksvla dikkahlale edlnsefram 421  davnkekntk ehkvidakfe tkarkgekpc alekkdisks eaklsrkqvd sehmhqnvpt 481  eeqrtnkstg gehkksdrke epqyepants edldmdivsv pssvpedife nletamevqs 541  svdhqgdgss gteqevesss vklnisskdn rggiksktta kvtkelyvkl tpvslsnspi 601  kgadcqevpq dkdgykscgl npklekcglg qensdnehlv enevslllee sdlrrsprvk 661  ttplrrptet npvtsnsdee cnetvkekqk lsvpvrkkdk rnssdsaidn pkpnklpksk 721  qsetvdqnsd sdemlailke vsrmshssss dtdineihtn hktlydlktq agkddkgkrk 781  rksstsgsdf dtkkgksaks siiskkkrqt qsessnydse lekeiksmsk igaarttkkr 841  ipntkdfdss edekhskkgm dnqghknlkt sqegssddae rkqeretfss aegtvdkdtt 901  imelrdrlpk kqqasastdg vdklsgkeqs ftslevrkva etkekskhlk tktckkvqdg 961  lsdiaekflk kdqsdetsed dkkqskkgte ekkkpsdfkk kvikmeqqye sssdgteklp 1021 ereeichfpk gikqikngtt dgekkskkir dktskkkdel sdyaekstgk gdscdssedk 1081 kskngaygre kkrckllgks srkrqdcsss dtekysmked gcnssdkrlk rielrerrnl 1141 sskrntkeiq sgssssdaee ssednkkkkq rtsskkkavi vkekkrnslr tstkrkqadi 1201 tsssssdied ddqnsigegs sdeqkikpvt enlvlsshtg fcqssgdeal sksvpvtvdd 1261 ddddndpenr iakkmlleei kanlssdedg ssddepeegk krtgkqneen pgdeeaknqv 1321 nsesdsdsee skkpryrhrl lrhkltvsdg esgeekktkp kehkevkgrn rrkvssedse 1381 dsdfqesgvs eevsesedeq rprtrsakka eleenqrsyk qkkkrrrikv qedsssenks 1441 nseeeeeeke eeeeeeeeee eeeedendds kspgkgrkki rkilkddklr tetqnalkee 1501 eerrkriaer erereklrev ieiedasptk cpittklvld edeetkeplv qvhrnmvikl 1561 kphqvdgvqf mwdcccesvk ktkkspgsgc ilahcmglgk tlqvvsflht vllcdkldfs 1621 talvvcplnt alnwmnefek wqeglkddek levselatvk rpqersymlq rwqedggvmi 1681 igyemyrnla qgrnvksrkl keifnkalvd pgpdfvvcde ghilkneasa vskamnsirs 1741 rrriiltgtp lqnnlieyhc mvnfikenll gsikefrnrf inpiqngqca dstmvdvrvm 1801 kkrahilyem lagcvqrkdy taltkflppk heyvlavrmt siqcklyqyy ldhltgvgnn 1861 seggrgkaga klfqdfqmls riwthpwclq ldyiskenkg yfdedsmdef iasdsdetsm 1921 slssddytkk kkkgkkgkkd ssssgsgsdn dvevikvwns rsrgggegnv detgnnpsvs 1981 lkleeskats ssnpsspapd wykdfvtdad aevlehsgkm vllfeilrma eeigdkvlvf 2041 sqslisldli edflelasre ktedkdkpli ykgegkwlrn idyyrldgst taqsrkkwae 2101 efndetnvrg rlfiistkag slginlvaan rviifdaswn psydiqsifr vyrfgqtkpv 2161 yvyrflaqgt medkiydrqv tkqslsfrvv dqqqverhft mneltelytf epdllddpns 2221 ekkkkrdtpm lpkdtilael lqihkehivg yhehdslldh keeeelteee rkaawaeyea 2281 ekkgltmrfn iptgtnlppv sfnsqtpyip fnlgalsams nqqledlinq grekvveatn 2341 svtavriqpl ediisavwke nmnlseaqvq alalsrqasq eldvkrreai yndvltkqqm 2401 liscvqrilm nrrlqqqynq qqqqqmtyqq atlghlmmpk ppnlimnpsn yqqidmrgmy 2461 qpvaggmqpp plqrapppmr sknpgpsqgk sm
Синдром сцепленной с X-хромосомой альфа-талассемии, сопровождающейся умственной отсталостью, (ATRX), Homo sapiens, вариант транскрипта 1, мРНК (SEQ ID NO: 6)
1   aattctcctg cctgagcctc ggcccaacaa aatggcggcg gcagcggtgt cgctttgttt 61  ccgcggctcc tgcggcggtg gcagtggtag cggcctttga gctgtgggga ggttccagca 121 gcagctacag tgacgactaa gactccagtg catttctatc gtaaccgggc gcgggggagc 181 gcagatcggc gcccagcaat cacagaagcc gacaaggcgt tcaagcgaaa acatgaccgc 241 tgagcccatg agtgaaagca agttgaatac attggtgcag aagcttcatg acttccttgc 301 acactcatca gaagaatctg aagaaacaag ttctcctcca cgacttgcaa tgaatcaaaa 361 cacagataaa atcagtggtt ctggaagtaa ctctgatatg atggaaaaca gcaaggaaga 421 gggaactagc tcttcagaaa aatccaagtc ttcaggatcg tcacgatcaa agaggaaacc 481 ttcaattgta acaaagtatg tagaatcaga tgatgaaaaa cctttggatg atgaaactgt 541 aaatgaagat gcgtctaatg aaaattcaga aaatgatatt actatgcaga gcttgccaaa 601 aggtacagtg attgtacagc cagagccagt gctgaatgaa gacaaagatg attttaaagg 661 gcctgaattt agaagcagaa gtaaaatgaa aactgaaaat ctcaaaaaac gcggagaaga 721 tgggcttcat gggattgtga gctgcactgc ttgtggacaa caggtcaatc attttcaaaa 781 agattccatt tatagacacc cttcattgca agttcttatt tgtaagaatt gctttaagta 841 ttacatgagt gatgatatta gccgtgactc agatggaatg gatgaacaat gtaggtggtg 901 tgcggaaggt ggaaacttga tttgttgtga cttttgccat aatgctttct gcaagaaatg 961 cattctacgc aaccttggtc gaaaggagtt gtccacaata atggatgaaa acaaccaatg 1021 gtattgctac atttgtcacc cagagccttt gttggacttg gtcactgcat gtaacagcgt 1081 atttgagaat ttagaacagt tgttgcagca aaataagaag aagataaaag ttgacagtga 1141 aaagagtaat aaagtatatg aacatacatc cagattttct ccaaagaaga ctagttcaaa 1201 ttgtaatgga gaagaaaaga aattagatga ttcctgttct ggctctgtaa cctactctta 1261 ttccgcacta attgtgccca aagagatgat taagaaggca aaaaaactga ttgagaccac 1321 agccaacatg aactccagtt atgttaaatt tttaaagcag gcaacagata attcagaaat 1381 cagttctgct acaaaattac gtcagcttaa ggcttttaag tctgtgttgg ctgatattaa 1441 gaaggctcat cttgcattgg aagaagactt aaattccgag tttcgagcga tggatgctgt 1501 aaacaaagag aaaaatacca aagagcataa agtcatagat gctaagtttg aaacaaaagc 1561 acgaaaagga gaaaaacctt gtgctttgga aaagaaggat atttcaaagt cagaagctaa 1621 actttcaaga aaacaggtag atagtgagca catgcatcag aatgttccaa cagaggaaca 1681 aagaacaaat aaaagtaccg gtggtgaaca taagaaatct gatagaaaag aagaacctca 1741 atatgaacct gccaacactt ctgaagattt agacatggat attgtgtctg ttccttcctc 1801 agttccagaa gacatttttg agaatcttga gactgctatg gaagttcaga gttcagttga 1861 tcatcaaggg gatggcagca gtggaactga acaagaagtg gagagttcat ctgtaaaatt 1921 aaatatttct tcaaaagaca acagaggagg tattaaatca aaaactacag ctaaagtaac 1981 aaaagaatta tatgttaaac tcactcctgt ttccctttct aattccccaa ttaaaggtgc 2041 tgattgtcag gaagttccac aagataaaga tggctataaa agttgtggtc tgaaccccaa 2101 gttagagaaa tgtggacttg gacaggaaaa cagtgataat gagcatttgg ttgaaaatga 2161 agtttcatta cttttagagg aatctgatct tcgaagatcc ccacgtgtaa agactacacc 2221 cttgaggcga ccgacagaaa ctaaccctgt aacatctaat tcagatgaag aatgtaatga 2281 aacagttaag gagaaacaaa aactatcagt tccagtgaga aaaaaggata agcgtaattc 2341 ttctgacagt gctatagata atcctaagcc taataaattg ccaaaatcta agcaatcaga 2401 gactgtggat caaaattcag attctgatga aatgctagca atcctcaaag aggtgagcag 2461 gatgagtcac agttcttctt cagatactga tattaatgaa attcatacaa accataagac 2521 tttgtatgat ttaaagactc aggcggggaa agatgataaa ggaaaaagga aacgaaaaag 2581 ttctacatct ggctcagatt ttgatactaa aaagggcaaa tcagctaaga gctctataat 2641 ttctaaaaag aaacgacaaa cccagtctga gtcttctaat tatgactcag aattagaaaa 2701 agagataaag agcatgagta aaattggtgc tgccagaacc accaaaaaaa gaattccaaa 2761 tacaaaagat tttgactctt ctgaagatga gaaacacagc aaaaaaggaa tggataatca 2821 agggcacaaa aatttgaaga cctcacaaga aggatcatct gatgatgctg aaagaaaaca 2881 agagagagag actttctctt cagcagaagg cacagttgat aaagacacga ccatcatgga 2941 attaagagat cgacttccta agaagcagca agcaagtgct tccactgatg gtgtcgataa 3001 gctttctggg aaagagcaga gttttacttc tttggaagtt agaaaagttg ctgaaactaa 3061 agaaaagagc aagcatctca aaaccaaaac atgtaaaaaa gtacaggatg gcttatctga 3121 tattgcagag aaattcctaa agaaagacca gagcgatgaa acttctgaag atgataaaaa 3181 gcagagcaaa aagggaactg aagaaaaaaa gaaaccttca gactttaaga aaaaagtaat 3241 taaaatggaa caacagtatg aatcttcatc tgatggcact gaaaagttac ctgagcgaga 3301 agaaatttgt cattttccta agggcataaa acaaattaag aatggaacaa ctgatggaga 3361 aaagaaaagt aaaaaaataa gagataaaac ttctaaaaag aaggatgaat tatctgatta 3421 tgctgagaag tcaacaggga aaggagatag ttgtgactct tcagaggata aaaagagtaa 3481 gaatggagca tatggtagag agaagaaaag gtgcaagttg cttggaaaga gttcaaggaa 3541 gagacaagat tgttcatcat ctgatactga gaaatattcc atgaaagaag atggttgtaa 3601 ctcttctgat aagagactga aaagaataga attgagggaa agaagaaatt taagttcaaa 3661 gagaaatact aaggaaatac aaagtggctc atcatcatct gatgctgagg aaagttctga 3721 agataataaa aagaagaagc aaagaacttc atctaaaaag aaggcagtca ttgtcaagga 3781 gaaaaagaga aactccctaa gaacaagcac taaaaggaag caagctgaca ttacatcctc 3841 atcttcttct gatatagaag atgatgatca gaattctata ggtgagggaa gcagcgatga 3901 acagaaaatt aagcctgtga ctgaaaattt agtgctgtct tcacatactg gattttgcca 3961 atcttcagga gatgaagcct tatctaaatc agtgcctgtc acagtggatg atgatgatga 4021 cgacaatgat cctgagaata gaattgccaa gaagatgctt ttagaagaaa ttaaagccaa 4081 tctttcctct gatgaggatg gatcttcaga tgatgagcca gaagaaggga aaaaaagaac 4141 tggaaaacaa aatgaagaaa acccaggaga tgaggaagca aaaaatcaag tcaattctga 4201 atcagattca gattctgaag aatctaagaa gccaagatac agacataggc ttttgcggca 4261 caaattgact gtgagtgacg gagaatctgg agaagaaaaa aagacaaagc ctaaagagca 4321 taaagaagtc aaaggcagaa acagaagaaa ggtgagcagt gaagattcag aagattctga 4381 ttttcaggaa tcaggagtta gtgaagaagt tagtgaatcc gaagatgaac agcggcccag 4441 aacaaggtct gcaaagaaag cagagttgga agaaaatcag cggagctata aacagaaaaa 4501 gaaaaggcga cgtattaagg ttcaagaaga ttcatccagt gaaaacaaga gtaattctga 4561 ggaagaagag gaggaaaaag aagaggagga ggaagaggag gaggaggagg aagaggagga 4621 ggaagatgaa aatgatgatt ccaagtctcc tggaaaaggc agaaagaaaa ttcggaagat 4681 tcttaaagat gataaactga gaacagaaac acaaaatgct cttaaggaag aggaagagag 4741 acgaaaacgt attgctgaga gggagcgtga gcgagaaaaa ttgagagagg tgatagaaat 4801 tgaagatgct tcacccacca agtgtccaat aacaaccaag ttggttttag atgaagatga 4861 agaaaccaaa gaacctttag tgcaggttca tagaaatatg gttatcaaat tgaaacccca 4921 tcaagtagat ggtgttcagt ttatgtggga ttgctgctgt gagtctgtga aaaaaacaaa 4981 gaaatctcca ggttcaggat gcattcttgc ccactgtatg ggccttggta agactttaca 5041 ggtggtaagt tttcttcata cagttctttt gtgtgacaaa ctggatttca gcacggcgtt 5101 agtggtttgt cctcttaata ctgctttgaa ttggatgaat gaatttgaga agtggcaaga 5161 gggattaaaa gatgatgaga agcttgaggt ttctgaatta gcaactgtga aacgtcctca 5221 ggagagaagc tacatgctgc agaggtggca agaagatggt ggtgttatga tcataggcta 5281 tgagatgtat agaaatcttg ctcaaggaag gaatgtgaag agtcggaaac ttaaagaaat 5341 atttaacaaa gctttggttg atccaggccc tgattttgtt gtttgtgatg aaggccatat 5401 tctaaaaaat gaagcatctg ctgtttctaa agctatgaat tctatacgat caaggaggag 5461 gattatttta acaggaacac cacttcaaaa taacctaatt gagtatcatt gtatggttaa 5521 ttttatcaag gaaaatttac ttggatccat taaggagttc aggaatagat ttataaatcc 5581 aattcaaaat ggtcagtgtg cagattctac catggtagat gtcagagtga tgaaaaaacg 5641 tgctcacatt ctctatgaga tgttagctgg atgtgttcag aggaaagatt atacagcatt 5701 aacaaaattc ttgcctccaa aacacgaata tgtgttagct gtgagaatga cttctattca 5761 gtgcaagctc tatcagtact acttagatca cttaacaggt gtgggcaata atagtgaagg 5821 tggaagagga aaggcaggtg caaagctttt ccaagatttt cagatgttaa gtagaatatg 5881 gactcatcct tggtgtttgc agctagacta cattagcaaa gaaaataagg gttattttga 5941 tgaagacagt atggatgaat ttatagcctc agattctgat gaaacctcca tgagtttaag 6001 ctccgatgat tatacaaaaa agaagaaaaa agggaaaaag gggaaaaaag atagtagctc 6061 aagtggaagt ggcagtgaca atgatgttga agtgattaag gtctggaatt caagatctcg 6121 gggaggtggt gaaggaaatg tggatgaaac aggaaacaat ccttctgttt ctttaaaact 6181 ggaagaaagt aaagctactt cttcttctaa tccaagcagc ccagctccag actggtacaa 6241 agattttgtt acagatgctg atgctgaggt tttagagcat tctgggaaaa tggtacttct 6301 ctttgaaatt cttcgaatgg cagaggaaat tggggataaa gtccttgttt tcagccagtc 6361 cctcatatct ctggacttga ttgaagattt tcttgaatta gctagtaggg agaagacaga 6421 agataaagat aaacccctta tttataaagg tgaggggaag tggcttcgaa acattgacta 6481 ttaccgttta gatggttcca ctactgcaca gtcaaggaag aagtgggctg aagaatttaa 6541 tgatgaaact aatgtgagag gacgattatt tatcatttct actaaagcag gatctctagg 6601 aattaatctg gtagctgcta atcgagtaat tatattcgac gcttcttgga atccatctta 6661 tgacatccag agtatattca gagtttatcg ctttggacaa actaagcctg tttatgtata 6721 taggttctta gctcagggaa ccatggaaga taagatttat gatcggcaag taactaagca 6781 gtcactgtct tttcgagttg ttgatcagca gcaggtggag cgtcatttta ctatgaatga 6841 gcttactgaa ctttatactt ttgagccaga cttattagat gaccctaatt cagaaaagaa 6901 gaagaagagg gatactccca tgctgccaaa ggataccata cttgcagagc tccttcagat 6961 acataaagaa cacattgtag gataccatga acatgattct cttttggacc acaaagaaga 7021 agaagagttg actgaagaag aaagaaaagc agcttgggct gagtatgaag cagagaagaa 7081 gggactgacc atgcgtttca acataccaac tgggaccaat ttaccccctg tcagtttcaa 7141 ctctcaaact ccttatattc ctttcaattt gggagccctg tcagcaatga gtaatcaaca 7201 gctggaggac ctcattaatc aaggaagaga aaaagttgta gaagcaacaa acagtgtgac 7261 agcagtgagg attcaacctc ttgaggatat aatttcagct gtatggaagg agaacatgaa 7321 tctctcagag gcccaagtac aggcgttagc attaagtaga caagccagcc aggagcttga 7381 tgttaaacga agagaagcaa tctacaatga tgtattgaca aaacaacaga tgttaatcag 7441 ctgtgttcag cgaatactta tgaacagaag gctccagcag cagtacaatc agcagcaaca 7501 gcaacaaatg acttatcaac aagcaacact gggtcacctc atgatgccaa agcccccaaa 7561 tttgatcatg aatccttcta actaccagca gattgatatg agaggaatgt atcagccagt 7621 ggctggtggt atgcagccac caccattaca gcgtgcacca cccccaatga gaagcaaaaa 7681 tccaggacct tcccaaggga aatcaatgtg attttgcact aaaagcttaa tggattgtta 7741 aaatcataga aagatctttt atttttttag gaatcaatga cttaacagaa ctcaactgta 7801 taaatagttt ggtcccctta aatgccaatc ttccatatta gttttacttt tttttttttt 7861 aaatagggca taccatttct tcctgacatt tgtcagtgat gttgcctaga atcttcttac 7921 acacgctgag tacagaagat atttcaaatt gttttcagtg aaaacaagtc cttccataat 7981 agtaacaact ccacagattt cctctctaaa tttttatgcc tgcttttagc aaccataaaa 8041 ttgtcataaa attaataaat ttaggaaaga ataaagattt atatattcat tctttacata 8101 taaaaacaca cagctgagtt cttagagttg attcctcaag ttatgaaata cttttgtact 8161 taatccattt cttgattaaa gtgattgaaa tggttttaat gttcttttga ctgaagtctg 8221 aaactgggct cctgctttat tgtctctgtg actgaaagtt agaaactgag ggttatcttt 8281 gacacagaat tgtgtgcaat attcttaaat actactgctc taaaagttgg agaagtcttg 8341 cagttatctt agcattgtat aaacagcctt aagtatagcc taagaagaga attccttttt 8401 cttctttagt ccttctgcca ttttttattt tcagttatat gtgctgaaat aattactggt 8461 aaaatttcag ggttgtggat tatcttccac acatgaattt tctctctcct ggcacgaata 8521 taaagcacat ctcttaactg catggtgcca gtgctaatgc ttcatcctgt tgctggcagt 8581 gggatgtgga cttagaaaat caagttctag cattttagta ggttaacact gaagttgtgg 8641 ttgttaggtt cacaccctgt tttataaaca acatcaaaat ggcagaacca ttgctgactt 8701 taggttcaca tgaggaatgt acttttaaca attcccagta ctatcagtat tgtgaaataa 8761 ttcctctgaa agataagaat cactggcttc tatgcgcttc ttttctctca tcatcatgtt 8821 cttttacccc agtttcctta cattttttta aattgtttca gagtttgttt tttttttagt 8881 ttagattgtg aggcaattat taaatcaaaa ttaattcatc caatacccct ttactagaag 8941 ttttactaga aaatgtatta cattttattt tttcttaatc cagttctgca aaaatgacct 9001 ataaatttat tcatgtacaa ttttggttac ttgaattgtt aaagaaaaca ttgtttttga 9061 ctatgggagt caactcaaca tggcagaacc atttttgaga tgatgataca acaggtagtg 9121 aaacagctta agaattccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaaaac tgggtttggg 9181 ctttgcttta ggtatcactg gattagaatg agtttaacat tagctaaaac tgctttgagt 9241 tgtttggatg attaagagat tgccattttt atcttggaag aactagtggt aaaacatcca 9301 agagcactag gattgtgata cagaatttgt gaggtttggt ggatccacgc ccctctcccc 9361 cactttccca tgatgaaata tcactaataa atcctgtata tttagatatt atgctagcca 9421 tgtaatcaga tttatttaat tgggtggggc aggtgtgtat ttactttaga aaaaatgaaa 9481 aagacaagat ttatgagaaa tatttgaagg cagtacactc tggccaactg ttaccagttg 9541 gtatttctac aagttcagaa tattttaaac ctgatttact agacctggga attttcaaca 9601 tggtctaatt atttactcaa agacatagat gtgaaaattt taggcaacct tctaaatctt 9661 tttcaccatg gatgaaacta taacttaaag aataatactt agaagggtta attggaaatc 9721 agagtttgaa ataaaacttg gaccactttg tatacactct tctcacttga cattttagct 9781 atataatatg tactttgagt ataacatcaa gctttaacaa atatttaaag acaaaaaaat 9841 cacgtcagta aaatactaaa aggctcattt ttatatttgt tttagatgtt ttaaatagtt 9901 gcaatggatt aaaaatgatg atttaaaatg ttgcttgtaa tacagttttg cctgctaaat 9961 tctccacatt ttgtaacctg ttttatttct ttgggtgtaa agcgtttttg cttagtattg 10021 tgatattgta tatgttttgt cccagttgta tagtaatgtt tcagtccatc atccagcttt 10081 ggctgctgaa atcatacagc tgtgaagact tgcctttgtt tctgttagac tgcttttcag 10141 ttctgtattg agtatcttaa gtactgtaga aaagatgtca cttcttcctt taaggctgtt 10201 ttgtaatata tataaggact ggaattgtgt ttttaaagaa aagcattcaa gtatgacaat 10261 atactatctg tgttttcacc attcaaagtg ctgtttagta gttgaaactt aaactattta 10321 atgtcattta ataaagtgac caaaatgtgt tgtgctcttt attgtatttt cacagctttg 10381 aaaatctgtg cacatactgt ttcatagaaa atgtatagct tttgttgtcc tatataatgg 10441 tggttctttt gcacatttag ttatttaata ttgagaggtc acgaagtttg gttattgaat 10501 ctgttatata ctaaattctg taaagggaga tctctcatct caaaaagaat ttacatacca 10561 ggaagtccat gtgtgtttgt gttagttttg gatgtctttg tgtaatccag ccccatttcc 10621 tgtttcccaa cagctgtaac actcatttta agtcaagcag ggctaccaac ccacacttga 10681 tagaaaagct gcttaccatt cagaagcttc cttattacct ggcctccaaa tgagctgaat 10741 attttgtagc cttcccttag ctatgttcat tttccctcca ttatcataaa atcagatcga 10801 tatttatgtg ccccaaacaa aactttaaga gcagttacat tctgtcccag tagcccttgt 10861 ttcctttgag agtagcatgt tgtgaggcta tagagactta ttctaccagt aaaacaggtc 10921 aatcctttta catgtttatt atactaaaaa ttatgttcag ggtatttact actttatttc 10981 accagactca gtctcaagtg acttggctat ctccaaatca gatctaccct tagagaataa 11041 acatttttct accgttattt tttttcaagt ctataatctg agccagtccc aaaggagtga 11101 tcaagtttca gaaatgcttt catcttcaca acattttata tatactatta tatggggtga 11161 ataaagtttt aaatccgaaa tataaaaaaa aaaaaaaaaa aa
Белок синдрома сцепленной с X-хромосомой альфа-талассемии, сопровождающейся умственной отсталостью (ATRX), Homo sapiens, изоформа 2 (SEQ ID NO: 7)
1    mtaepmsesk lntlvqklhd flahsseese etsspprlam nqntdkisgs gsnsdmmens 61   keegtsssek skssgssrsk rkpsivtkyv esddekpldd etvnedasne nsenditmqs 121  lpkedglhgi vsctacgqqv nhfqkdsiyr hpslqvlick ncfkyymsdd isrdsdgmde 181  qcrwcaeggn liccdfchna fckkcilrnl grkelstimd ennqwycyic hpeplldlvt 241  acnsvfenle qllqqnkkki kvdseksnkv yehtsrfspk ktssncngee kklddscsgs 301  vtysysaliv pkemikkakk liettanmns syvkflkqat dnseissatk lrqlkafksv 361  ladikkahla leedlnsefr amdavnkekn tkehkvidak fetkarkgek pcalekkdis 421  kseaklsrkq vdsehmhqnv pteeqrtnks tggehkksdr keepqyepan tsedldmdiv 481  svpssvpedi fenletamev qssvdhqgdg ssgteqeves ssvklnissk dnrggikskt 541  takvtkelyv kltpvslsns pikgadcqev pqdkdgyksc glnpklekcg lgqensdneh 601  lvenevslll eesdlrrspr vkttplrrpt etnpvtsnsd eecnetvkek qklsvpvrkk 661  dkrnssdsai dnpkpnklpk skqsetvdqn sdsdemlail kevsrmshss ssdtdineih 721  tnhktlydlk tqagkddkgk rkrksstsgs dfdtkkgksa kssiiskkkr qtqsessnyd 781  selekeiksm skigaarttk kripntkdfd ssedekhskk gmdnqghknl ktsqegssdd 841  aerkqeretf ssaegtvdkd ttimelrdrl pkkqqasast dgvdklsgke qsftslevrk 901  vaetkekskh lktktckkvq dglsdiaekf lkkdqsdets eddkkqskkg teekkkpsdf 961  kkkvikmeqq yesssdgtek lpereeichf pkgikqikng ttdgekkskk irdktskkkd 1021 elsdyaekst gkgdscdsse dkkskngayg rekkrckllg kssrkrqdcs ssdtekysmk 1081 edgcnssdkr lkrielrerr nlsskrntke iqsgssssda eessednkkk kqrtsskkka 1141 vivkekkrns lrtstkrkqa ditsssssdi edddqnsige gssdeqkikp vtenlvlssh 1201 tgfcqssgde alsksvpvtv ddddddndpe nriakkmlle eikanlssde dgssddepee 1261 gkkrtgkqne enpgdeeakn qvnsesdsds eeskkpryrh rllrhkltvs dgesgeekkt 1321 kpkehkevkg rnrrkvssed sedsdfqesg vseevsesed eqrprtrsak kaeleenqrs 1381 ykqkkkrrri kvqedsssen ksnseeeeee keeeeeeeee eeeeeedend dskspgkgrk 1441 kirkilkddk lrtetqnalk eeeerrkria ererereklr evieiedasp tkcpittklv 1501 ldedeetkep lvqvhrnmvi klkphqvdgv qfmwdccces vkktkkspgs gcilahcmgl 1561 gktlqvvsfl htvllcdkld fstalvvcpl ntalnwmnef ekwqeglkdd eklevselat 1621 vkrpqersym lqrwqedggv miigyemyrn laqgrnvksr klkeifnkal vdpgpdfvvc 1681 deghilknea savskamnsi rsrrriiltg tplqnnliey hcmvnfiken llgsikefrn 1741 rfinpiqngq cadstmvdvr vmkkrahily emlagcvqrk dytaltkflp pkheyvlavr 1801 mtsiqcklyq yyldhltgvg nnseggrgka gaklfqdfqm lsriwthpwc lqldyisken 1861 kgyfdedsmd efiasdsdet smslssddyt kkkkkgkkgk kdssssgsgs dndvevikvw 1921 nsrsrgggeg nvdetgnnps vslkleeska tsssnpsspa pdwykdfvtd adaevlehsg 1981 kmvllfeilr maeeigdkvl vfsqslisld liedflelas rektedkdkp liykgegkwl 2041 rnidyyrldg sttaqsrkkw aeefndetnv rgrlfiistk agslginlva anrviifdas 2101 wnpsydiqsi frvyrfgqtk pvyvyrflaq gtmedkiydr qvtkqslsfr vvdqqqverh 2161 ftmneltely tfepdllddp nsekkkkrdt pmlpkdtila ellqihkehi vgyhehdsll 2221 dhkeeeelte eerkaawaey eaekkgltmr fniptgtnlp pvsfnsqtpy ipfnlgalsa 2281 msnqqledli nqgrekvvea tnsvtavriq plediisavw kenmnlseaq vqalalsrqa 2341 sqeldvkrre aiyndvltkq qmliscvqri lmnrrlqqqy nqqqqqqmty qqatlghlmm 2401 pkppnlimnp snyqqidmrg myqpvaggmq ppplqrappp mrsknpgpsq gksm
Синдром сцепленной с X-хромосомой альфа-талассемии, сопровождающейся умственной отсталостью (ATRX), Homo sapiens, вариант транскрипта 2, мРНК (SEQ ID NO: 8)
1   aattctcctg cctgagcctc ggcccaacaa aatggcggcg gcagcggtgt cgctttgttt 61  ccgcggctcc tgcggcggtg gcagtggtag cggcctttga gctgtgggga ggttccagca 121 gcagctacag tgacgactaa gactccagtg catttctatc gtaaccgggc gcgggggagc 181 gcagatcggc gcccagcaat cacagaagcc gacaaggcgt tcaagcgaaa acatgaccgc 241 tgagcccatg agtgaaagca agttgaatac attggtgcag aagcttcatg acttccttgc 301 acactcatca gaagaatctg aagaaacaag ttctcctcca cgacttgcaa tgaatcaaaa 361 cacagataaa atcagtggtt ctggaagtaa ctctgatatg atggaaaaca gcaaggaaga 421 gggaactagc tcttcagaaa aatccaagtc ttcaggatcg tcacgatcaa agaggaaacc 481 ttcaattgta acaaagtatg tagaatcaga tgatgaaaaa cctttggatg atgaaactgt 541 aaatgaagat gcgtctaatg aaaattcaga aaatgatatt actatgcaga gcttgccaaa 601 agaagatggg cttcatggga ttgtgagctg cactgcttgt ggacaacagg tcaatcattt 661 tcaaaaagat tccatttata gacacccttc attgcaagtt cttatttgta agaattgctt 721 taagtattac atgagtgatg atattagccg tgactcagat ggaatggatg aacaatgtag 781 gtggtgtgcg gaaggtggaa acttgatttg ttgtgacttt tgccataatg ctttctgcaa 841 gaaatgcatt ctacgcaacc ttggtcgaaa ggagttgtcc acaataatgg atgaaaacaa 901 ccaatggtat tgctacattt gtcacccaga gcctttgttg gacttggtca ctgcatgtaa 961 cagcgtattt gagaatttag aacagttgtt gcagcaaaat aagaagaaga taaaagttga 1021 cagtgaaaag agtaataaag tatatgaaca tacatccaga ttttctccaa agaagactag 1081 ttcaaattgt aatggagaag aaaagaaatt agatgattcc tgttctggct ctgtaaccta 1141 ctcttattcc gcactaattg tgcccaaaga gatgattaag aaggcaaaaa aactgattga 1201 gaccacagcc aacatgaact ccagttatgt taaattttta aagcaggcaa cagataattc 1261 agaaatcagt tctgctacaa aattacgtca gcttaaggct tttaagtctg tgttggctga 1321 tattaagaag gctcatcttg cattggaaga agacttaaat tccgagtttc gagcgatgga 1381 tgctgtaaac aaagagaaaa ataccaaaga gcataaagtc atagatgcta agtttgaaac 1441 aaaagcacga aaaggagaaa aaccttgtgc tttggaaaag aaggatattt caaagtcaga 1501 agctaaactt tcaagaaaac aggtagatag tgagcacatg catcagaatg ttccaacaga 1561 ggaacaaaga acaaataaaa gtaccggtgg tgaacataag aaatctgata gaaaagaaga 1621 acctcaatat gaacctgcca acacttctga agatttagac atggatattg tgtctgttcc 1681 ttcctcagtt ccagaagaca tttttgagaa tcttgagact gctatggaag ttcagagttc 1741 agttgatcat caaggggatg gcagcagtgg aactgaacaa gaagtggaga gttcatctgt 1801 aaaattaaat atttcttcaa aagacaacag aggaggtatt aaatcaaaaa ctacagctaa 1861 agtaacaaaa gaattatatg ttaaactcac tcctgtttcc ctttctaatt ccccaattaa 1921 aggtgctgat tgtcaggaag ttccacaaga taaagatggc tataaaagtt gtggtctgaa 1981 ccccaagtta gagaaatgtg gacttggaca ggaaaacagt gataatgagc atttggttga 2041 aaatgaagtt tcattacttt tagaggaatc tgatcttcga agatccccac gtgtaaagac 2101 tacacccttg aggcgaccga cagaaactaa ccctgtaaca tctaattcag atgaagaatg 2161 taatgaaaca gttaaggaga aacaaaaact atcagttcca gtgagaaaaa aggataagcg 2221 taattcttct gacagtgcta tagataatcc taagcctaat aaattgccaa aatctaagca 2281 atcagagact gtggatcaaa attcagattc tgatgaaatg ctagcaatcc tcaaagaggt 2341 gagcaggatg agtcacagtt cttcttcaga tactgatatt aatgaaattc atacaaacca 2401 taagactttg tatgatttaa agactcaggc ggggaaagat gataaaggaa aaaggaaacg 2461 aaaaagttct acatctggct cagattttga tactaaaaag ggcaaatcag ctaagagctc 2521 tataatttct aaaaagaaac gacaaaccca gtctgagtct tctaattatg actcagaatt 2581 agaaaaagag ataaagagca tgagtaaaat tggtgctgcc agaaccacca aaaaaagaat 2641 tccaaataca aaagattttg actcttctga agatgagaaa cacagcaaaa aaggaatgga 2701 taatcaaggg cacaaaaatt tgaagacctc acaagaagga tcatctgatg atgctgaaag 2761 aaaacaagag agagagactt tctcttcagc agaaggcaca gttgataaag acacgaccat 2821 catggaatta agagatcgac ttcctaagaa gcagcaagca agtgcttcca ctgatggtgt 2881 cgataagctt tctgggaaag agcagagttt tacttctttg gaagttagaa aagttgctga 2941 aactaaagaa aagagcaagc atctcaaaac caaaacatgt aaaaaagtac aggatggctt 3001 atctgatatt gcagagaaat tcctaaagaa agaccagagc gatgaaactt ctgaagatga 3061 taaaaagcag agcaaaaagg gaactgaaga aaaaaagaaa ccttcagact ttaagaaaaa 3121 agtaattaaa atggaacaac agtatgaatc ttcatctgat ggcactgaaa agttacctga 3181 gcgagaagaa atttgtcatt ttcctaaggg cataaaacaa attaagaatg gaacaactga 3241 tggagaaaag aaaagtaaaa aaataagaga taaaacttct aaaaagaagg atgaattatc 3301 tgattatgct gagaagtcaa cagggaaagg agatagttgt gactcttcag aggataaaaa 3361 gagtaagaat ggagcatatg gtagagagaa gaaaaggtgc aagttgcttg gaaagagttc 3421 aaggaagaga caagattgtt catcatctga tactgagaaa tattccatga aagaagatgg 3481 ttgtaactct tctgataaga gactgaaaag aatagaattg agggaaagaa gaaatttaag 3541 ttcaaagaga aatactaagg aaatacaaag tggctcatca tcatctgatg ctgaggaaag 3601 ttctgaagat aataaaaaga agaagcaaag aacttcatct aaaaagaagg cagtcattgt 3661 caaggagaaa aagagaaact ccctaagaac aagcactaaa aggaagcaag ctgacattac 3721 atcctcatct tcttctgata tagaagatga tgatcagaat tctataggtg agggaagcag 3781 cgatgaacag aaaattaagc ctgtgactga aaatttagtg ctgtcttcac atactggatt 3841 ttgccaatct tcaggagatg aagccttatc taaatcagtg cctgtcacag tggatgatga 3901 tgatgacgac aatgatcctg agaatagaat tgccaagaag atgcttttag aagaaattaa 3961 agccaatctt tcctctgatg aggatggatc ttcagatgat gagccagaag aagggaaaaa 4021 aagaactgga aaacaaaatg aagaaaaccc aggagatgag gaagcaaaaa atcaagtcaa 4081 ttctgaatca gattcagatt ctgaagaatc taagaagcca agatacagac ataggctttt 4141 gcggcacaaa ttgactgtga gtgacggaga atctggagaa gaaaaaaaga caaagcctaa 4201 agagcataaa gaagtcaaag gcagaaacag aagaaaggtg agcagtgaag attcagaaga 4261 ttctgatttt caggaatcag gagttagtga agaagttagt gaatccgaag atgaacagcg 4321 gcccagaaca aggtctgcaa agaaagcaga gttggaagaa aatcagcgga gctataaaca 4381 gaaaaagaaa aggcgacgta ttaaggttca agaagattca tccagtgaaa acaagagtaa 4441 ttctgaggaa gaagaggagg aaaaagaaga ggaggaggaa gaggaggagg aggaggaaga 4501 ggaggaggaa gatgaaaatg atgattccaa gtctcctgga aaaggcagaa agaaaattcg 4561 gaagattctt aaagatgata aactgagaac agaaacacaa aatgctctta aggaagagga 4621 agagagacga aaacgtattg ctgagaggga gcgtgagcga gaaaaattga gagaggtgat 4681 agaaattgaa gatgcttcac ccaccaagtg tccaataaca accaagttgg ttttagatga 4741 agatgaagaa accaaagaac ctttagtgca ggttcataga aatatggtta tcaaattgaa 4801 accccatcaa gtagatggtg ttcagtttat gtgggattgc tgctgtgagt ctgtgaaaaa 4861 aacaaagaaa tctccaggtt caggatgcat tcttgcccac tgtatgggcc ttggtaagac 4921 tttacaggtg gtaagttttc ttcatacagt tcttttgtgt gacaaactgg atttcagcac 4981 ggcgttagtg gtttgtcctc ttaatactgc tttgaattgg atgaatgaat ttgagaagtg 5041 gcaagaggga ttaaaagatg atgagaagct tgaggtttct gaattagcaa ctgtgaaacg 5101 tcctcaggag agaagctaca tgctgcagag gtggcaagaa gatggtggtg ttatgatcat 5161 aggctatgag atgtatagaa atcttgctca aggaaggaat gtgaagagtc ggaaacttaa 5221 agaaatattt aacaaagctt tggttgatcc aggccctgat tttgttgttt gtgatgaagg 5281 ccatattcta aaaaatgaag catctgctgt ttctaaagct atgaattcta tacgatcaag 5341 gaggaggatt attttaacag gaacaccact tcaaaataac ctaattgagt atcattgtat 5401 ggttaatttt atcaaggaaa atttacttgg atccattaag gagttcagga atagatttat 5461 aaatccaatt caaaatggtc agtgtgcaga ttctaccatg gtagatgtca gagtgatgaa 5521 aaaacgtgct cacattctct atgagatgtt agctggatgt gttcagagga aagattatac 5581 agcattaaca aaattcttgc ctccaaaaca cgaatatgtg ttagctgtga gaatgacttc 5641 tattcagtgc aagctctatc agtactactt agatcactta acaggtgtgg gcaataatag 5701 tgaaggtgga agaggaaagg caggtgcaaa gcttttccaa gattttcaga tgttaagtag 5761 aatatggact catccttggt gtttgcagct agactacatt agcaaagaaa ataagggtta 5821 ttttgatgaa gacagtatgg atgaatttat agcctcagat tctgatgaaa cctccatgag 5881 tttaagctcc gatgattata caaaaaagaa gaaaaaaggg aaaaagggga aaaaagatag 5941 tagctcaagt ggaagtggca gtgacaatga tgttgaagtg attaaggtct ggaattcaag 6001 atctcgggga ggtggtgaag gaaatgtgga tgaaacagga aacaatcctt ctgtttcttt 6061 aaaactggaa gaaagtaaag ctacttcttc ttctaatcca agcagcccag ctccagactg 6121 gtacaaagat tttgttacag atgctgatgc tgaggtttta gagcattctg ggaaaatggt 6181 acttctcttt gaaattcttc gaatggcaga ggaaattggg gataaagtcc ttgttttcag 6241 ccagtccctc atatctctgg acttgattga agattttctt gaattagcta gtagggagaa 6301 gacagaagat aaagataaac cccttattta taaaggtgag gggaagtggc ttcgaaacat 6361 tgactattac cgtttagatg gttccactac tgcacagtca aggaagaagt gggctgaaga 6421 atttaatgat gaaactaatg tgagaggacg attatttatc atttctacta aagcaggatc 6481 tctaggaatt aatctggtag ctgctaatcg agtaattata ttcgacgctt cttggaatcc 6541 atcttatgac atccagagta tattcagagt ttatcgcttt ggacaaacta agcctgttta 6601 tgtatatagg ttcttagctc agggaaccat ggaagataag atttatgatc ggcaagtaac 6661 taagcagtca ctgtcttttc gagttgttga tcagcagcag gtggagcgtc attttactat 6721 gaatgagctt actgaacttt atacttttga gccagactta ttagatgacc ctaattcaga 6781 aaagaagaag aagagggata ctcccatgct gccaaaggat accatacttg cagagctcct 6841 tcagatacat aaagaacaca ttgtaggata ccatgaacat gattctcttt tggaccacaa 6901 agaagaagaa gagttgactg aagaagaaag aaaagcagct tgggctgagt atgaagcaga 6961 gaagaaggga ctgaccatgc gtttcaacat accaactggg accaatttac cccctgtcag 7021 tttcaactct caaactcctt atattccttt caatttggga gccctgtcag caatgagtaa 7081 tcaacagctg gaggacctca ttaatcaagg aagagaaaaa gttgtagaag caacaaacag 7141 tgtgacagca gtgaggattc aacctcttga ggatataatt tcagctgtat ggaaggagaa 7201 catgaatctc tcagaggccc aagtacaggc gttagcatta agtagacaag ccagccagga 7261 gcttgatgtt aaacgaagag aagcaatcta caatgatgta ttgacaaaac aacagatgtt 7321 aatcagctgt gttcagcgaa tacttatgaa cagaaggctc cagcagcagt acaatcagca 7381 gcaacagcaa caaatgactt atcaacaagc aacactgggt cacctcatga tgccaaagcc 7441 cccaaatttg atcatgaatc cttctaacta ccagcagatt gatatgagag gaatgtatca 7501 gccagtggct ggtggtatgc agccaccacc attacagcgt gcaccacccc caatgagaag 7561 caaaaatcca ggaccttccc aagggaaatc aatgtgattt tgcactaaaa gcttaatgga 7621 ttgttaaaat catagaaaga tcttttattt ttttaggaat caatgactta acagaactca 7681 actgtataaa tagtttggtc cccttaaatg ccaatcttcc atattagttt tacttttttt 7741 ttttttaaat agggcatacc atttcttcct gacatttgtc agtgatgttg cctagaatct 7801 tcttacacac gctgagtaca gaagatattt caaattgttt tcagtgaaaa caagtccttc 7861 cataatagta acaactccac agatttcctc tctaaatttt tatgcctgct tttagcaacc 7921 ataaaattgt cataaaatta ataaatttag gaaagaataa agatttatat attcattctt 7981 tacatataaa aacacacagc tgagttctta gagttgattc ctcaagttat gaaatacttt 8041 tgtacttaat ccatttcttg attaaagtga ttgaaatggt tttaatgttc ttttgactga 8101 agtctgaaac tgggctcctg ctttattgtc tctgtgactg aaagttagaa actgagggtt 8161 atctttgaca cagaattgtg tgcaatattc ttaaatacta ctgctctaaa agttggagaa 8221 gtcttgcagt tatcttagca ttgtataaac agccttaagt atagcctaag aagagaattc 8281 ctttttcttc tttagtcctt ctgccatttt ttattttcag ttatatgtgc tgaaataatt 8341 actggtaaaa tttcagggtt gtggattatc ttccacacat gaattttctc tctcctggca 8401 cgaatataaa gcacatctct taactgcatg gtgccagtgc taatgcttca tcctgttgct 8461 ggcagtggga tgtggactta gaaaatcaag ttctagcatt ttagtaggtt aacactgaag 8521 ttgtggttgt taggttcaca ccctgtttta taaacaacat caaaatggca gaaccattgc 8581 tgactttagg ttcacatgag gaatgtactt ttaacaattc ccagtactat cagtattgtg 8641 aaataattcc tctgaaagat aagaatcact ggcttctatg cgcttctttt ctctcatcat 8701 catgttcttt taccccagtt tccttacatt tttttaaatt gtttcagagt ttgttttttt 8761 tttagtttag attgtgaggc aattattaaa tcaaaattaa ttcatccaat acccctttac 8821 tagaagtttt actagaaaat gtattacatt ttattttttc ttaatccagt tctgcaaaaa 8881 tgacctataa atttattcat gtacaatttt ggttacttga attgttaaag aaaacattgt 8941 ttttgactat gggagtcaac tcaacatggc agaaccattt ttgagatgat gatacaacag 9001 gtagtgaaac agcttaagaa ttccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaaaactggg 9061 tttgggcttt gctttaggta tcactggatt agaatgagtt taacattagc taaaactgct 9121 ttgagttgtt tggatgatta agagattgcc atttttatct tggaagaact agtggtaaaa 9181 catccaagag cactaggatt gtgatacaga atttgtgagg tttggtggat ccacgcccct 9241 ctcccccact ttcccatgat gaaatatcac taataaatcc tgtatattta gatattatgc 9301 tagccatgta atcagattta tttaattggg tggggcaggt gtgtatttac tttagaaaaa 9361 atgaaaaaga caagatttat gagaaatatt tgaaggcagt acactctggc caactgttac 9421 cagttggtat ttctacaagt tcagaatatt ttaaacctga tttactagac ctgggaattt 9481 tcaacatggt ctaattattt actcaaagac atagatgtga aaattttagg caaccttcta 9541 aatctttttc accatggatg aaactataac ttaaagaata atacttagaa gggttaattg 9601 gaaatcagag tttgaaataa aacttggacc actttgtata cactcttctc acttgacatt 9661 ttagctatat aatatgtact ttgagtataa catcaagctt taacaaatat ttaaagacaa 9721 aaaaatcacg tcagtaaaat actaaaaggc tcatttttat atttgtttta gatgttttaa 9781 atagttgcaa tggattaaaa atgatgattt aaaatgttgc ttgtaataca gttttgcctg 9841 ctaaattctc cacattttgt aacctgtttt atttctttgg gtgtaaagcg tttttgctta 9901 gtattgtgat attgtatatg ttttgtccca gttgtatagt aatgtttcag tccatcatcc 9961 agctttggct gctgaaatca tacagctgtg aagacttgcc tttgtttctg ttagactgct 10021 tttcagttct gtattgagta tcttaagtac tgtagaaaag atgtcacttc ttcctttaag 10081 gctgttttgt aatatatata aggactggaa ttgtgttttt aaagaaaagc attcaagtat 10141 gacaatatac tatctgtgtt ttcaccattc aaagtgctgt ttagtagttg aaacttaaac 10201 tatttaatgt catttaataa agtgaccaaa atgtgttgtg ctctttattg tattttcaca 10261 gctttgaaaa tctgtgcaca tactgtttca tagaaaatgt atagcttttg ttgtcctata 10321 taatggtggt tcttttgcac atttagttat ttaatattga gaggtcacga agtttggtta 10381 ttgaatctgt tatatactaa attctgtaaa gggagatctc tcatctcaaa aagaatttac 10441 ataccaggaa gtccatgtgt gtttgtgtta gttttggatg tctttgtgta atccagcccc 10501 atttcctgtt tcccaacagc tgtaacactc attttaagtc aagcagggct accaacccac 10561 acttgataga aaagctgctt accattcaga agcttcctta ttacctggcc tccaaatgag 10621 ctgaatattt tgtagccttc ccttagctat gttcattttc cctccattat cataaaatca 10681 gatcgatatt tatgtgcccc aaacaaaact ttaagagcag ttacattctg tcccagtagc 10741 ccttgtttcc tttgagagta gcatgttgtg aggctataga gacttattct accagtaaaa 10801 caggtcaatc cttttacatg tttattatac taaaaattat gttcagggta tttactactt 10861 tatttcacca gactcagtct caagtgactt ggctatctcc aaatcagatc tacccttaga 10921 gaataaacat ttttctaccg ttattttttt tcaagtctat aatctgagcc agtcccaaag 10981 gagtgatcaa gtttcagaaa tgctttcatc ttcacaacat tttatatata ctattatatg 11041 gggtgaataa agttttaaat ccgaaatata aaaaaaaaaa aaaaaaaa
[0116] Указанный  нуждающийся в этом субъект может иметь пониженную экспрессию, гаплонедостаточность и/или потерю функции ARID1A. Например, субъект может иметь мутацию, выбранную из группы, состоящей из нонсенс-мутации остатка цистеина (C), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 884 последовательности SEQ ID NO: 11 (C884*), замещения лизином (K) остатка глутаминовой кислоты (E), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 966 (E966K), нонсенс-мутации остатка глутамина (Q), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1411 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q1411*), мутации со сдвигом рамки на остатке фенилаланина (F), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 1720 последовательности SEQ ID NO: 11 (F1720fs), мутации со сдвигом рамки после остатка глицина (G), соответствующего дикому типу, в положении аминокислоты 1847 последовательности SEQ ID NO: 11 (G1847fs), мутации со сдвигом рамки на остатке цистеина (C), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 1874 последовательности SEQ ID NO: 11 (C1874fs), замещения глутаминовой кислотой (E) остатка аспарагиновой кислоты (D), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1957 (D1957E), нонсенс-мутации остатка глутамина (Q), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1430 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q1430*), мутации со сдвигом рамки на остатке аргинина (R), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 1721 последовательности SEQ ID NO: 11 (R1721fs), замещения глутаминовой кислотой (E) остатка глицина (G), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1255 (G1255E), мутации со сдвигом рамки на остатке глицина (G), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 284 последовательности SEQ ID NO: 11 (G284fs), нонсенс-мутации остатка аргинина (R), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1722 последовательности SEQ ID NO: 11 (R1722*), мутации со сдвигом рамки на остатке метионина (M), соответствующем дикому типу, в положении аминокислоты 274 последовательности SEQ ID NO: 11 (M274fs), мутации со сдвигом рамки на остатке глицина (G), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 1847 последовательности SEQ ID NO: 11 (G1847fs), мутации со сдвигом рамки на остатке P, соответствующем дикому типу, в положении аминокислоты 559 последовательности SEQ ID NO: 11 (P559fs), нонсенс-мутации остатка аргинина (R), соответствующего дикому типу, в положении аминокислоты 1276 последовательности SEQ ID NO: 11 (R1276*), мутации со сдвигом рамки на остатке глутамина (Q), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 2176 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q2176fs), мутации со сдвигом рамки на остатке гистидина (H), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 203 последовательности SEQ ID NO: 11 (H203fs), мутации со сдвигом рамки на остатке аланина (A), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 591 последовательности SEQ ID NO: 11 (A591fs), нонсенс-мутации остатка глутамина (Q), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 1322 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q1322*), нонсенс-мутации остатка серина (S), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 2264 последовательности SEQ ID NO: 11 (S2264*), нонсенс-мутации остатка глутамина (Q), соответствующего дикому типу,  в положении аминокислоты 586 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q586*), мутации со сдвигом рамки на остатке глутамина (Q), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 548 последовательности SEQ ID NO: 11 (Q548fs) и мутации со сдвигом рамки на остатке аспарагина (N), соответствующем дикому типу,  в положении аминокислоты 756 последовательности SEQ ID NO: 11 (N756fs). «*» при использовании в настоящей заявке относится к стоп-кодону. «fs» при использовании в настоящей заявке относится к сдвигу рамки.
Белок, содержащий AT-богатый интерактивный домен, 1A (ARID1A), изоформа а [Homo sapiens] (SEQ ID NO: 9)
1    maaqvapaaa sslgnppppp pselkkaeqq qreeaggeaa aaaaaergem kaaagqeseg 61   pavgppqplg kelqdgaesn gggggggags gggpgaepdl knsngnagpr palnnnltep 121  pggggggssd gvgapphsaa aalpppaygf gqpygrspsa vaaaaaavfh qqhggqqspg 181  laalqsgggg glepyagpqq nshdhgfpnh qynsyypnrs aypppapaya lssprggtpg 241  sgaaaaagsk pppsssasas sssssfaqqr fgamggggps aagggtpqpt atptlnqllt 301  spssargyqg ypggdysggp qdggagkgpa dmasqcwgaa aaaaaaaaas ggaqqrshha 361  pmspgssggg gqplartpqp sspmdqmgkm rpqpyggtnp ysqqqgppsg pqqghgypgq 421  pygsqtpqry pmtmqgraqs amgglsytqq ippygqqgps gygqqgqtpy ynqqsphpqq 481  qqppysqqpp sqtphaqpsy qqqpqsqppq lqssqppysq qpsqpphqqs papypsqqst 541  tqqhpqsqpp ysqpqaqspy qqqqpqqpap stlsqqaayp qpqsqqsqqt aysqqrfppp 601  qelsqdsfgs qassapsmts skggqedmnl slqsrpsslp dlsgsiddlp mgtegalspg 661  vstsgisssq geqsnpaqsp fsphtsphlp girgpspspv gspasvaqsr sgplspaavp 721  gnqmpprpps gqsdsimhps mnqssiaqdr gymqrnpqmp qysspqpgsa lsprqpsggq 781  ihtgmgsyqq nsmgsygpqg gqygpqggyp rqpnynalpn anypsagmag ginpmgaggq 841  mhgqpgippy gtlppgrmsh asmgnrpygp nmanmppqvg sgmcpppggm nrktqetava 901  mhvaansiqn rppgypnmnq ggmmgtgppy gqginsmagm inpqgppysm ggtmannsag 961  maaspemmgl gdvkltpatk mnnkadgtpk teskskksss stttnekitk lyelggeper 1021 kmwvdrylaf teekamgmtn lpavgrkpld lyrlyvsvke iggltqvnkn kkwrelatnl 1081 nvgtsssaas slkkqyiqcl yafeckierg edpppdifaa adskksqpki qppspagsgs 1141 mqgpqtpqst sssmaeggdl kpptpastph sqipplpgms rsnsvgiqda fndgsdstfq 1201 krnsmtpnpg yqpsmntsdm mgrmsyepnk dpygsmrkap gsdpfmssgq gpnggmgdpy 1261 sraagpglgn vamgprqhyp yggpydrvrt epgigpegnm stgapqpnlm psnpdsgmys 1321 psryppqqqq qqqqrhdsyg nqfstqgtps gspfpsqqtt myqqqqqnyk rpmdgtygpp 1381 akrhegemys vpystgqgqp qqqqlppaqp qpasqqqaaq pspqqdvynq ygnaypatat 1441 aaterrpagg pqnqfpfqfg rdrvsappgt naqqnmppqm mggpiqasae vaqqgtmwqg 1501 rndmtynyan rqstgsapqg payhgvnrtd emlhtdqran hegswpshgt rqppygpsap 1561 vppmtrppps nyqpppsmqn hipqvsspap lprpmenrts pskspflhsg mkmqkagppv 1621 pashiapapv qppmirrdit fppgsveatq pvlkqrrrlt mkdigtpeaw rvmmslksgl 1681 laestwaldt inillyddns imtfnlsqlp gllellveyf rrclieifgi lkeyevgdpg 1741 qrtlldpgrf skvsspapme ggeeeeellg pkleeeeeee vvendeeiaf sgkdkpasen 1801 seekliskfd klpvkivqkn dpfvvdcsdk lgrvqefdsg llhwrigggd ttehiqthfe 1861 sktellpsrp hapcppaprk hvttaegtpg ttdqegpppd gppekritat mddmlstrss 1921 tltedgakss eaikesskfp fgispaqshr nikiledeph skdetplctl ldwqdslakr 1981 cvcvsntirs lsfvpgndfe mskhpgllli lgklillhhk hperkqaplt yekeeeqdqg 2041 vscnkvewww dclemlrent lvtlanisgq ldlspypesi clpvldgllh wavcpsaeaq 2101 dpfstlgpna vlspqrlvle tlsklsiqdn nvdlilatpp fsrleklyst mvrflsdrkn 2161 pvcremavvl lanlaqgdsl aaraiavqkg signllgfle dslaatqfqq sqasllhmqn 2221 ppfeptsvdm mrraaralla lakvdenhse ftlyesrlld isvsplmnsl vsqvicdvlf 2281 ligqs
AT-богатый интерактивный домен 1A (SWI-подобный) (ARID1A), Homo sapiens, вариант транскрипта 1, мРНК (SEQ ID NO: 10)
1 cagaaagcgg agagtcacag cggggccagg ccctggggag cggagcctcc accgcccccc 61 tcattcccag gcaagggctt ggggggaatg agccgggaga gccgggtccc gagcctacag 121 agccgggagc agctgagccg ccggcgcctc ggccgccgcc gccgcctcct cctcctccgc 181 cgccgccagc ccggagcctg agccggcggg gcggggggga gaggagcgag cgcagcgcag 241 cagcggagcc ccgcgaggcc cgcccgggcg ggtggggagg gcagcccggg ggactgggcc 301 ccggggcggg gtgggagggg gggagaagac gaagacaggg ccgggtctct ccgcggacga 361 gacagcgggg atcatggccg cgcaggtcgc ccccgccgcc gccagcagcc tgggcaaccc 421 gccgccgccg ccgccctcgg agctgaagaa agccgagcag cagcagcggg aggaggcggg 481 gggcgaggcg gcggcggcgg cagcggccga gcgcggggaa atgaaggcag ccgccgggca 541 ggaaagcgag ggccccgccg tggggccgcc gcagccgctg ggaaaggagc tgcaggacgg 601 ggccgagagc aatgggggtg gcggcggcgg cggagccggc agcggcggcg ggcccggcgc 661 ggagccggac ctgaagaact cgaacgggaa cgcgggccct aggcccgccc tgaacaataa 721 cctcacggag ccgcccggcg gcggcggtgg cggcagcagc gatggggtgg gggcgcctcc 781 tcactcagcc gcggccgcct tgccgccccc agcctacggc ttcgggcaac cctacggccg 841 gagcccgtct gccgtcgccg ccgccgcggc cgccgtcttc caccaacaac atggcggaca 901 acaaagccct ggcctggcag cgctgcagag cggcggcggc gggggcctgg agccctacgc 961 ggggccccag cagaactctc acgaccacgg cttccccaac caccagtaca actcctacta 1021 ccccaaccgc agcgcctacc ccccgcccgc cccggcctac gcgctgagct ccccgagagg 1081 tggcactccg ggctccggcg cggcggcggc tgccggctcc aagccgcctc cctcctccag 1141 cgcctccgcc tcctcgtcgt cttcgtcctt cgctcagcag cgcttcgggg ccatgggggg 1201 aggcggcccc tccgcggccg gcgggggaac tccccagccc accgccaccc ccaccctcaa 1261 ccaactgctc acgtcgccca gctcggcccg gggctaccag ggctaccccg ggggcgacta 1321 cagtggcggg ccccaggacg ggggcgccgg caagggcccg gcggacatgg cctcgcagtg 1381 ttggggggct gcggcggcgg cagctgcggc ggcggccgcc tcgggagggg cccaacaaag 1441 gagccaccac gcgcccatga gccccgggag cagcggcggc ggggggcagc cgctcgcccg 1501 gacccctcag ccatccagtc caatggatca gatgggcaag atgagacctc agccatatgg 1561 cgggactaac ccatactcgc agcaacaggg acctccgtca ggaccgcagc aaggacatgg 1621 gtacccaggg cagccatacg ggtcccagac cccgcagcgg tacccgatga ccatgcaggg 1681 ccgggcgcag agtgccatgg gcggcctctc ttatacacag cagattcctc cttatggaca 1741 acaaggcccc agcgggtatg gtcaacaggg ccagactcca tattacaacc agcaaagtcc 1801 tcaccctcag cagcagcagc caccctactc ccagcaacca ccgtcccaga cccctcatgc 1861 ccaaccttcg tatcagcagc agccacagtc tcaaccacca cagctccagt cctctcagcc 1921 tccatactcc cagcagccat cccagcctcc acatcagcag tccccggctc catacccctc 1981 ccagcagtcg acgacacagc agcaccccca gagccagccc ccctactcac agccacaggc 2041 tcagtctcct taccagcagc agcaacctca gcagccagca ccctcgacgc tctcccagca 2101 ggctgcgtat cctcagcccc agtctcagca gtcccagcaa actgcctatt cccagcagcg 2161 cttccctcca ccgcaggagc tatctcaaga ttcatttggg tctcaggcat cctcagcccc 2221 ctcaatgacc tccagtaagg gagggcaaga agatatgaac ctgagccttc agtcaagacc 2281 ctccagcttg cctgatctat ctggttcaat agatgacctc cccatgggga cagaaggagc 2341 tctgagtcct ggagtgagca catcagggat ttccagcagc caaggagagc agagtaatcc 2401 agctcagtct cctttctctc ctcatacctc ccctcacctg cctggcatcc gaggcccttc 2461 cccgtcccct gttggctctc ccgccagtgt tgctcagtct cgctcaggac cactctcgcc 2521 tgctgcagtg ccaggcaacc agatgccacc tcggccaccc agtggccagt cggacagcat 2581 catgcatcct tccatgaacc aatcaagcat tgcccaagat cgaggttata tgcagaggaa 2641 cccccagatg ccccagtaca gttcccccca gcccggctca gccttatctc cgcgtcagcc 2701 ttccggagga cagatacaca caggcatggg ctcctaccag cagaactcca tggggagcta 2761 tggtccccag gggggtcagt atggcccaca aggtggctac cccaggcagc caaactataa 2821 tgccttgccc aatgccaact accccagtgc aggcatggct ggaggcataa accccatggg 2881 tgccggaggt caaatgcatg gacagcctgg catcccacct tatggcacac tccctccagg 2941 gaggatgagt cacgcctcca tgggcaaccg gccttatggc cctaacatgg ccaatatgcc 3001 acctcaggtt gggtcaggga tgtgtccccc accagggggc atgaaccgga aaacccaaga 3061 aactgctgtc gccatgcatg ttgctgccaa ctctatccaa aacaggccgc caggctaccc 3121 caatatgaat caagggggca tgatgggaac tggacctcct tatggacaag ggattaatag 3181 tatggctggc atgatcaacc ctcagggacc cccatattcc atgggtggaa ccatggccaa 3241 caattctgca gggatggcag ccagcccaga gatgatgggc cttggggatg taaagttaac 3301 tccagccacc aaaatgaaca acaaggcaga tgggacaccc aagacagaat ccaaatccaa 3361 gaaatccagt tcttctacta caaccaatga gaagatcacc aagttgtatg agctgggtgg 3421 tgagcctgag aggaagatgt gggtggaccg ttatctggcc ttcactgagg agaaggccat 3481 gggcatgaca aatctgcctg ctgtgggtag gaaacctctg gacctctatc gcctctatgt 3541 gtctgtgaag gagattggtg gattgactca ggtcaacaag aacaaaaaat ggcgggaact 3601 tgcaaccaac ctcaatgtgg gcacatcaag cagtgctgcc agctccttga aaaagcagta 3661 tatccagtgt ctctatgcct ttgaatgcaa gattgaacgg ggagaagacc ctcccccaga 3721 catctttgca gctgctgatt ccaagaagtc ccagcccaag atccagcctc cctctcctgc 3781 gggatcagga tctatgcagg ggccccagac tccccagtca accagcagtt ccatggcaga 3841 aggaggagac ttaaagccac caactccagc atccacacca cacagtcaga tccccccatt 3901 gccaggcatg agcaggagca attcagttgg gatccaggat gcctttaatg atggaagtga 3961 ctccacattc cagaagcgga attccatgac tccaaaccct gggtatcagc ccagtatgaa 4021 tacctctgac atgatggggc gcatgtccta tgagccaaat aaggatcctt atggcagcat 4081 gaggaaagct ccagggagtg atcccttcat gtcctcaggg cagggcccca acggcgggat 4141 gggtgacccc tacagtcgtg ctgccggccc tgggctagga aatgtggcga tgggaccacg 4201 acagcactat ccctatggag gtccttatga cagagtgagg acggagcctg gaatagggcc 4261 tgagggaaac atgagcactg gggccccaca gccgaatctc atgccttcca acccagactc 4321 ggggatgtat tctcctagcc gctacccccc gcagcagcag cagcagcagc agcaacgaca 4381 tgattcctat ggcaatcagt tctccaccca aggcacccct tctggcagcc ccttccccag 4441 ccagcagact acaatgtatc aacagcaaca gcagaattac aagcggccaa tggatggcac 4501 atatggccct cctgccaagc ggcacgaagg ggagatgtac agcgtgccat acagcactgg 4561 gcaggggcag cctcagcagc agcagttgcc cccagcccag ccccagcctg ccagccagca 4621 acaagctgcc cagccttccc ctcagcaaga tgtatacaac cagtatggca atgcctatcc 4681 tgccactgcc acagctgcta ctgagcgccg accagcaggc ggcccccaga accaatttcc 4741 attccagttt ggccgagacc gtgtctctgc accccctggc accaatgccc agcaaaacat 4801 gccaccacaa atgatgggcg gccccataca ggcatcagct gaggttgctc agcaaggcac 4861 catgtggcag gggcgtaatg acatgaccta taattatgcc aacaggcaga gcacgggctc 4921 tgccccccag ggccccgcct atcatggcgt gaaccgaaca gatgaaatgc tgcacacaga 4981 tcagagggcc aaccacgaag gctcgtggcc ttcccatggc acacgccagc ccccatatgg 5041 tccctctgcc cctgtgcccc ccatgacaag gccccctcca tctaactacc agcccccacc 5101 aagcatgcag aatcacattc ctcaggtatc cagccctgct cccctgcccc ggccaatgga 5161 gaaccgcacc tctcctagca agtctccatt cctgcactct gggatgaaaa tgcagaaggc 5221 aggtccccca gtacctgcct cgcacatagc acctgcccct gtgcagcccc ccatgattcg 5281 gcgggatatc accttcccac ctggctctgt tgaagccaca cagcctgtgt tgaagcagag 5341 gaggcggctc acaatgaaag acattggaac cccggaggca tggcgggtaa tgatgtccct 5401 caagtctggt ctcctggcag agagcacatg ggcattagat accatcaaca tcctgctgta 5461 tgatgacaac agcatcatga ccttcaacct cagtcagctc ccagggttgc tagagctcct 5521 tgtagaatat ttccgacgat gcctgattga gatctttggc attttaaagg agtatgaggt 5581 gggtgaccca ggacagagaa cgctactgga tcctgggagg ttcagcaagg tgtctagtcc 5641 agctcccatg gagggtgggg aagaagaaga agaacttcta ggtcctaaac tagaagagga 5701 agaagaagag gaagtagttg aaaatgatga ggagatagcc ttttcaggca aggacaagcc 5761 agcttcagag aatagtgagg agaagctgat cagtaagttt gacaagcttc cagtaaagat 5821 cgtacagaag aatgatccat ttgtggtgga ctgctcagat aagcttgggc gtgtgcagga 5881 gtttgacagt ggcctgctgc actggcggat tggtgggggg gacaccactg agcatatcca 5941 gacccacttc gagagcaaga cagagctgct gccttcccgg cctcacgcac cctgcccacc 6001 agcccctcgg aagcatgtga caacagcaga gggtacacca gggacaacag accaggaggg 6061 gcccccacct gatggacctc cagaaaaacg gatcacagcc actatggatg acatgttgtc 6121 tactcggtct agcaccttga ccgaggatgg agctaagagt tcagaggcca tcaaggagag 6181 cagcaagttt ccatttggca ttagcccagc acagagccac cggaacatca agatcctaga 6241 ggacgaaccc cacagtaagg atgagacccc actgtgtacc cttctggact ggcaggattc 6301 tcttgccaag cgctgcgtct gtgtgtccaa taccattcga agcctgtcat ttgtgccagg 6361 caatgacttt gagatgtcca aacacccagg gctgctgctc atcctgggca agctgatcct 6421 gctgcaccac aagcacccag aacggaagca ggcaccacta acttatgaaa aggaggagga 6481 acaggaccaa ggggtgagct gcaacaaagt ggagtggtgg tgggactgct tggagatgct 6541 ccgggaaaac accttggtta cactcgccaa catctcgggg cagttggacc tatctccata 6601 ccccgagagc atttgcctgc ctgtcctgga cggactccta cactgggcag tttgcccttc 6661 agctgaagcc caggacccct tttccaccct gggccccaat gccgtccttt ccccgcagag 6721 actggtcttg gaaaccctca gcaaactcag catccaggac aacaatgtgg acctgattct 6781 ggccacaccc cccttcagcc gcctggagaa gttgtatagc actatggtgc gcttcctcag 6841 tgaccgaaag aacccggtgt gccgggagat ggctgtggta ctgctggcca acctggctca 6901 gggggacagc ctggcagctc gtgccattgc agtgcagaag ggcagtatcg gcaacctcct 6961 gggcttccta gaggacagcc ttgccgccac acagttccag cagagccagg ccagcctcct 7021 ccacatgcag aacccaccct ttgagccaac tagtgtggac atgatgcggc gggctgcccg 7081 cgcgctgctt gccttggcca aggtggacga gaaccactca gagtttactc tgtacgaatc 7141 acggctgttg gacatctcgg tatcaccgtt gatgaactca ttggtttcac aagtcatttg 7201 tgatgtactg tttttgattg gccagtcatg acagccgtgg gacacctccc ccccccgtgt 7261 gtgtgtgcgt gtgtggagaa cttagaaact gactgttgcc ctttatttat gcaaaaccac 7321 ctcagaatcc agtttaccct gtgctgtcca gcttctccct tgggaaaaag tctctcctgt 7381 ttctctctcc tccttccacc tcccctccct ccatcacctc acgcctttct gttccttgtc 7441 ctcaccttac tcccctcagg accctacccc accctctttg aaaagacaaa gctctgccta 7501 catagaagac tttttttatt ttaaccaaag ttactgttgt ttacagtgag tttggggaaa 7561 aaaaataaaa taaaaatggc tttcccagtc cttgcatcaa cgggatgcca catttcataa 7621 ctgtttttaa tggtaaaaaa aaaaaaaaaa aatacaaaaa aaaattctga aggacaaaaa 7681 aggtgactgc tgaactgtgt gtggtttatt gttgtacatt cacaatcttg caggagccaa 7741 gaagttcgca gttgtgaaca gaccctgttc actggagagg cctgtgcagt agagtgtaga 7801 ccctttcatg tactgtactg tacacctgat actgtaaaca tactgtaata ataatgtctc 7861 acatggaaac agaaaacgct gggtcagcag caagctgtag tttttaaaaa tgtttttagt 7921 taaacgttga ggagaaaaaa aaaaaaggct tttcccccaa agtatcatgt gtgaacctac 7981 aacaccctga cctctttctc tcctccttga ttgtatgaat aaccctgaga tcacctctta 8041 gaactggttt taacctttag ctgcagcggc tacgctgcca cgtgtgtata tatatgacgt 8101 tgtacattgc acataccctt ggatccccac agtttggtcc tcctcccagc taccccttta 8161 tagtatgacg agttaacaag ttggtgacct gcacaaagcg agacacagct atttaatctc 8221 ttgccagata tcgcccctct tggtgcgatg ctgtacaggt ctctgtaaaa agtccttgct 8281 gtctcagcag ccaatcaact tatagtttat ttttttctgg gtttttgttt tgttttgttt 8341 tctttctaat cgaggtgtga aaaagttcta ggttcagttg aagttctgat gaagaaacac 8401 aattgagatt ttttcagtga taaaatctgc atatttgtat ttcaacaatg tagctaaaac 8461 ttgatgtaaa ttcctccttt ttttcctttt ttggcttaat gaatatcatt tattcagtat 8521 gaaatcttta tactatatgt tccacgtgtt aagaataaat gtacattaaa tcttggtaag 8581 acttt
Белок, содержащий AT-богатый интерактивный домен, 1A (ARID1A), изоформа b (SEQ ID NO: 11)
1    maaqvapaaa sslgnppppp pselkkaeqq qreeaggeaa aaaaaergem kaaagqeseg 61   pavgppqplg kelqdgaesn gggggggags gggpgaepdl knsngnagpr palnnnltep 121  pggggggssd gvgapphsaa aalpppaygf gqpygrspsa vaaaaaavfh qqhggqqspg 181  laalqsgggg glepyagpqq nshdhgfpnh qynsyypnrs aypppapaya lssprggtpg 241  sgaaaaagsk pppsssasas sssssfaqqr fgamggggps aagggtpqpt atptlnqllt 301  spssargyqg ypggdysggp qdggagkgpa dmasqcwgaa aaaaaaaaas ggaqqrshha 361  pmspgssggg gqplartpqp sspmdqmgkm rpqpyggtnp ysqqqgppsg pqqghgypgq 421  pygsqtpqry pmtmqgraqs amgglsytqq ippygqqgps gygqqgqtpy ynqqsphpqq 481  qqppysqqpp sqtphaqpsy qqqpqsqppq lqssqppysq qpsqpphqqs papypsqqst 541  tqqhpqsqpp ysqpqaqspy qqqqpqqpap stlsqqaayp qpqsqqsqqt aysqqrfppp 601  qelsqdsfgs qassapsmts skggqedmnl slqsrpsslp dlsgsiddlp mgtegalspg 661  vstsgisssq geqsnpaqsp fsphtsphlp girgpspspv gspasvaqsr sgplspaavp 721  gnqmpprpps gqsdsimhps mnqssiaqdr gymqrnpqmp qysspqpgsa lsprqpsggq 781  ihtgmgsyqq nsmgsygpqg gqygpqggyp rqpnynalpn anypsagmag ginpmgaggq 841  mhgqpgippy gtlppgrmsh asmgnrpygp nmanmppqvg sgmcpppggm nrktqetava 901  mhvaansiqn rppgypnmnq ggmmgtgppy gqginsmagm inpqgppysm ggtmannsag 961  maaspemmgl gdvkltpatk mnnkadgtpk teskskksss stttnekitk lyelggeper 1021 kmwvdrylaf teekamgmtn lpavgrkpld lyrlyvsvke iggltqvnkn kkwrelatnl 1081 nvgtsssaas slkkqyiqcl yafeckierg edpppdifaa adskksqpki qppspagsgs 1141 mqgpqtpqst sssmaeggdl kpptpastph sqipplpgms rsnsvgiqda fndgsdstfq 1201 krnsmtpnpg yqpsmntsdm mgrmsyepnk dpygsmrkap gsdpfmssgq gpnggmgdpy 1261 sraagpglgn vamgprqhyp yggpydrvrt epgigpegnm stgapqpnlm psnpdsgmys 1321 psryppqqqq qqqqrhdsyg nqfstqgtps gspfpsqqtt myqqqqqvss paplprpmen 1381 rtspskspfl hsgmkmqkag ppvpashiap apvqppmirr ditfppgsve atqpvlkqrr 1441 rltmkdigtp eawrvmmslk sgllaestwa ldtinillyd dnsimtfnls qlpgllellv 1501 eyfrrcliei fgilkeyevg dpgqrtlldp grfskvsspa pmeggeeeee llgpkleeee 1561 eeevvendee iafsgkdkpa senseeklis kfdklpvkiv qkndpfvvdc sdklgrvqef 1621 dsgllhwrig ggdttehiqt hfesktellp srphapcppa prkhvttaeg tpgttdqegp 1681 ppdgppekri tatmddmlst rsstltedga ksseaikess kfpfgispaq shrnikiled 1741 ephskdetpl ctlldwqdsl akrcvcvsnt irslsfvpgn dfemskhpgl llilgklill 1801 hhkhperkqa pltyekeeeq dqgvscnkve wwwdclemlr entlvtlani sgqldlspyp 1861 esiclpvldg llhwavcpsa eaqdpfstlg pnavlspqrl vletlsklsi qdnnvdlila 1921 tppfsrlekl ystmvrflsd rknpvcrema vvllanlaqg dslaaraiav qkgsignllg 1981 fledslaatq fqqsqasllh mqnppfepts vdmmrraara llalakvden hseftlyesr 2041 lldisvsplm nslvsqvicd vlfligqs
AT-богатый интерактивный домен 1A (SWI-подобный) (ARID1A), Homo sapiens, вариант транскрипта 2, мРНК (SEQ ID NO: 12)
1    cagaaagcgg agagtcacag cggggccagg ccctggggag cggagcctcc accgcccccc 61   tcattcccag gcaagggctt ggggggaatg agccgggaga gccgggtccc gagcctacag 121  agccgggagc agctgagccg ccggcgcctc ggccgccgcc gccgcctcct cctcctccgc 181  cgccgccagc ccggagcctg agccggcggg gcggggggga gaggagcgag cgcagcgcag 241  cagcggagcc ccgcgaggcc cgcccgggcg ggtggggagg gcagcccggg ggactgggcc 301  ccggggcggg gtgggagggg gggagaagac gaagacaggg ccgggtctct ccgcggacga 361  gacagcgggg atcatggccg cgcaggtcgc ccccgccgcc gccagcagcc tgggcaaccc 421  gccgccgccg ccgccctcgg agctgaagaa agccgagcag cagcagcggg aggaggcggg 481  gggcgaggcg gcggcggcgg cagcggccga gcgcggggaa atgaaggcag ccgccgggca 541  ggaaagcgag ggccccgccg tggggccgcc gcagccgctg ggaaaggagc tgcaggacgg 601  ggccgagagc aatgggggtg gcggcggcgg cggagccggc agcggcggcg ggcccggcgc 661  ggagccggac ctgaagaact cgaacgggaa cgcgggccct aggcccgccc tgaacaataa 721  cctcacggag ccgcccggcg gcggcggtgg cggcagcagc gatggggtgg gggcgcctcc 781  tcactcagcc gcggccgcct tgccgccccc agcctacggc ttcgggcaac cctacggccg 841  gagcccgtct gccgtcgccg ccgccgcggc cgccgtcttc caccaacaac atggcggaca 901  acaaagccct ggcctggcag cgctgcagag cggcggcggc gggggcctgg agccctacgc 961  ggggccccag cagaactctc acgaccacgg cttccccaac caccagtaca actcctacta 1021 ccccaaccgc agcgcctacc ccccgcccgc cccggcctac gcgctgagct ccccgagagg 1081 tggcactccg ggctccggcg cggcggcggc tgccggctcc aagccgcctc cctcctccag 1141 cgcctccgcc tcctcgtcgt cttcgtcctt cgctcagcag cgcttcgggg ccatgggggg 1201 aggcggcccc tccgcggccg gcgggggaac tccccagccc accgccaccc ccaccctcaa 1261 ccaactgctc acgtcgccca gctcggcccg gggctaccag ggctaccccg ggggcgacta 1321 cagtggcggg ccccaggacg ggggcgccgg caagggcccg gcggacatgg cctcgcagtg 1381 ttggggggct gcggcggcgg cagctgcggc ggcggccgcc tcgggagggg cccaacaaag 1441 gagccaccac gcgcccatga gccccgggag cagcggcggc ggggggcagc cgctcgcccg 1501 gacccctcag ccatccagtc caatggatca gatgggcaag atgagacctc agccatatgg 1561 cgggactaac ccatactcgc agcaacaggg acctccgtca ggaccgcagc aaggacatgg 1621 gtacccaggg cagccatacg ggtcccagac cccgcagcgg tacccgatga ccatgcaggg 1681 ccgggcgcag agtgccatgg gcggcctctc ttatacacag cagattcctc cttatggaca 1741 acaaggcccc agcgggtatg gtcaacaggg ccagactcca tattacaacc agcaaagtcc 1801 tcaccctcag cagcagcagc caccctactc ccagcaacca ccgtcccaga cccctcatgc 1861 ccaaccttcg tatcagcagc agccacagtc tcaaccacca cagctccagt cctctcagcc 1921 tccatactcc cagcagccat cccagcctcc acatcagcag tccccggctc catacccctc 1981 ccagcagtcg acgacacagc agcaccccca gagccagccc ccctactcac agccacaggc 2041 tcagtctcct taccagcagc agcaacctca gcagccagca ccctcgacgc tctcccagca 2101 ggctgcgtat cctcagcccc agtctcagca gtcccagcaa actgcctatt cccagcagcg 2161 cttccctcca ccgcaggagc tatctcaaga ttcatttggg tctcaggcat cctcagcccc 2221 ctcaatgacc tccagtaagg gagggcaaga agatatgaac ctgagccttc agtcaagacc 2281 ctccagcttg cctgatctat ctggttcaat agatgacctc cccatgggga cagaaggagc 2341 tctgagtcct ggagtgagca catcagggat ttccagcagc caaggagagc agagtaatcc 2401 agctcagtct cctttctctc ctcatacctc ccctcacctg cctggcatcc gaggcccttc 2461 cccgtcccct gttggctctc ccgccagtgt tgctcagtct cgctcaggac cactctcgcc 2521 tgctgcagtg ccaggcaacc agatgccacc tcggccaccc agtggccagt cggacagcat 2581 catgcatcct tccatgaacc aatcaagcat tgcccaagat cgaggttata tgcagaggaa 2641 cccccagatg ccccagtaca gttcccccca gcccggctca gccttatctc cgcgtcagcc 2701 ttccggagga cagatacaca caggcatggg ctcctaccag cagaactcca tggggagcta 2761 tggtccccag gggggtcagt atggcccaca aggtggctac cccaggcagc caaactataa 2821 tgccttgccc aatgccaact accccagtgc aggcatggct ggaggcataa accccatggg 2881 tgccggaggt caaatgcatg gacagcctgg catcccacct tatggcacac tccctccagg 2941 gaggatgagt cacgcctcca tgggcaaccg gccttatggc cctaacatgg ccaatatgcc 3001 acctcaggtt gggtcaggga tgtgtccccc accagggggc atgaaccgga aaacccaaga 3061 aactgctgtc gccatgcatg ttgctgccaa ctctatccaa aacaggccgc caggctaccc 3121 caatatgaat caagggggca tgatgggaac tggacctcct tatggacaag ggattaatag 3181 tatggctggc atgatcaacc ctcagggacc cccatattcc atgggtggaa ccatggccaa 3241 caattctgca gggatggcag ccagcccaga gatgatgggc cttggggatg taaagttaac 3301 tccagccacc aaaatgaaca acaaggcaga tgggacaccc aagacagaat ccaaatccaa 3361 gaaatccagt tcttctacta caaccaatga gaagatcacc aagttgtatg agctgggtgg 3421 tgagcctgag aggaagatgt gggtggaccg ttatctggcc ttcactgagg agaaggccat 3481 gggcatgaca aatctgcctg ctgtgggtag gaaacctctg gacctctatc gcctctatgt 3541 gtctgtgaag gagattggtg gattgactca ggtcaacaag aacaaaaaat ggcgggaact 3601 tgcaaccaac ctcaatgtgg gcacatcaag cagtgctgcc agctccttga aaaagcagta 3661 tatccagtgt ctctatgcct ttgaatgcaa gattgaacgg ggagaagacc ctcccccaga 3721 catctttgca gctgctgatt ccaagaagtc ccagcccaag atccagcctc cctctcctgc 3781 gggatcagga tctatgcagg ggccccagac tccccagtca accagcagtt ccatggcaga 3841 aggaggagac ttaaagccac caactccagc atccacacca cacagtcaga tccccccatt 3901 gccaggcatg agcaggagca attcagttgg gatccaggat gcctttaatg atggaagtga 3961 ctccacattc cagaagcgga attccatgac tccaaaccct gggtatcagc ccagtatgaa 4021 tacctctgac atgatggggc gcatgtccta tgagccaaat aaggatcctt atggcagcat 4081 gaggaaagct ccagggagtg atcccttcat gtcctcaggg cagggcccca acggcgggat 4141 gggtgacccc tacagtcgtg ctgccggccc tgggctagga aatgtggcga tgggaccacg 4201 acagcactat ccctatggag gtccttatga cagagtgagg acggagcctg gaatagggcc 4261 tgagggaaac atgagcactg gggccccaca gccgaatctc atgccttcca acccagactc 4321 ggggatgtat tctcctagcc gctacccccc gcagcagcag cagcagcagc agcaacgaca 4381 tgattcctat ggcaatcagt tctccaccca aggcacccct tctggcagcc ccttccccag 4441 ccagcagact acaatgtatc aacagcaaca gcaggtatcc agccctgctc ccctgccccg 4501 gccaatggag aaccgcacct ctcctagcaa gtctccattc ctgcactctg ggatgaaaat 4561 gcagaaggca ggtcccccag tacctgcctc gcacatagca cctgcccctg tgcagccccc 4621 catgattcgg cgggatatca ccttcccacc tggctctgtt gaagccacac agcctgtgtt 4681 gaagcagagg aggcggctca caatgaaaga cattggaacc ccggaggcat ggcgggtaat 4741 gatgtccctc aagtctggtc tcctggcaga gagcacatgg gcattagata ccatcaacat 4801 cctgctgtat gatgacaaca gcatcatgac cttcaacctc agtcagctcc cagggttgct 4861 agagctcctt gtagaatatt tccgacgatg cctgattgag atctttggca ttttaaagga 4921 gtatgaggtg ggtgacccag gacagagaac gctactggat cctgggaggt tcagcaaggt 4981 gtctagtcca gctcccatgg agggtgggga agaagaagaa gaacttctag gtcctaaact 5041 agaagaggaa gaagaagagg aagtagttga aaatgatgag gagatagcct tttcaggcaa 5101 ggacaagcca gcttcagaga atagtgagga gaagctgatc agtaagtttg acaagcttcc 5161 agtaaagatc gtacagaaga atgatccatt tgtggtggac tgctcagata agcttgggcg 5221 tgtgcaggag tttgacagtg gcctgctgca ctggcggatt ggtggggggg acaccactga 5281 gcatatccag acccacttcg agagcaagac agagctgctg ccttcccggc ctcacgcacc 5341 ctgcccacca gcccctcgga agcatgtgac aacagcagag ggtacaccag ggacaacaga 5401 ccaggagggg cccccacctg atggacctcc agaaaaacgg atcacagcca ctatggatga 5461 catgttgtct actcggtcta gcaccttgac cgaggatgga gctaagagtt cagaggccat 5521 caaggagagc agcaagtttc catttggcat tagcccagca cagagccacc ggaacatcaa 5581 gatcctagag gacgaacccc acagtaagga tgagacccca ctgtgtaccc ttctggactg 5641 gcaggattct cttgccaagc gctgcgtctg tgtgtccaat accattcgaa gcctgtcatt 5701 tgtgccaggc aatgactttg agatgtccaa acacccaggg ctgctgctca tcctgggcaa 5761 gctgatcctg ctgcaccaca agcacccaga acggaagcag gcaccactaa cttatgaaaa 5821 ggaggaggaa caggaccaag gggtgagctg caacaaagtg gagtggtggt gggactgctt 5881 ggagatgctc cgggaaaaca ccttggttac actcgccaac atctcggggc agttggacct 5941 atctccatac cccgagagca tttgcctgcc tgtcctggac ggactcctac actgggcagt 6001 ttgcccttca gctgaagccc aggacccctt ttccaccctg ggccccaatg ccgtcctttc 6061 cccgcagaga ctggtcttgg aaaccctcag caaactcagc atccaggaca acaatgtgga 6121 cctgattctg gccacacccc ccttcagccg cctggagaag ttgtatagca ctatggtgcg 6181 cttcctcagt gaccgaaaga acccggtgtg ccgggagatg gctgtggtac tgctggccaa 6241 cctggctcag ggggacagcc tggcagctcg tgccattgca gtgcagaagg gcagtatcgg 6301 caacctcctg ggcttcctag aggacagcct tgccgccaca cagttccagc agagccaggc 6361 cagcctcctc cacatgcaga acccaccctt tgagccaact agtgtggaca tgatgcggcg 6421 ggctgcccgc gcgctgcttg ccttggccaa ggtggacgag aaccactcag agtttactct 6481 gtacgaatca cggctgttgg acatctcggt atcaccgttg atgaactcat tggtttcaca 6541 agtcatttgt gatgtactgt ttttgattgg ccagtcatga cagccgtggg acacctcccc 6601 cccccgtgtg tgtgtgcgtg tgtggagaac ttagaaactg actgttgccc tttatttatg 6661 caaaaccacc tcagaatcca gtttaccctg tgctgtccag cttctccctt gggaaaaagt 6721 ctctcctgtt tctctctcct ccttccacct cccctccctc catcacctca cgcctttctg 6781 ttccttgtcc tcaccttact cccctcagga ccctacccca ccctctttga aaagacaaag 6841 ctctgcctac atagaagact ttttttattt taaccaaagt tactgttgtt tacagtgagt 6901 ttggggaaaa aaaataaaat aaaaatggct ttcccagtcc ttgcatcaac gggatgccac 6961 atttcataac tgtttttaat ggtaaaaaaa aaaaaaaaaa atacaaaaaa aaattctgaa 7021 ggacaaaaaa ggtgactgct gaactgtgtg tggtttattg ttgtacattc acaatcttgc 7081 aggagccaag aagttcgcag ttgtgaacag accctgttca ctggagaggc ctgtgcagta 7141 gagtgtagac cctttcatgt actgtactgt acacctgata ctgtaaacat actgtaataa 7201 taatgtctca catggaaaca gaaaacgctg ggtcagcagc aagctgtagt ttttaaaaat 7261 gtttttagtt aaacgttgag gagaaaaaaa aaaaaggctt ttcccccaaa gtatcatgtg 7321 tgaacctaca acaccctgac ctctttctct cctccttgat tgtatgaata accctgagat 7381 cacctcttag aactggtttt aacctttagc tgcagcggct acgctgccac gtgtgtatat 7441 atatgacgtt gtacattgca catacccttg gatccccaca gtttggtcct cctcccagct 7501 acccctttat agtatgacga gttaacaagt tggtgacctg cacaaagcga gacacagcta 7561 tttaatctct tgccagatat cgcccctctt ggtgcgatgc tgtacaggtc tctgtaaaaa 7621 gtccttgctg tctcagcagc caatcaactt atagtttatt tttttctggg tttttgtttt 7681 gttttgtttt ctttctaatc gaggtgtgaa aaagttctag gttcagttga agttctgatg 7741 aagaaacaca attgagattt tttcagtgat aaaatctgca tatttgtatt tcaacaatgt 7801 agctaaaact tgatgtaaat tcctcctttt tttccttttt tggcttaatg aatatcattt 7861 attcagtatg aaatctttat actatatgtt ccacgtgtta agaataaatg tacattaaat 7921 cttggtaaga cttt
[0117] Настоящее изобретение также обеспечивает способ индукции нейрональной дифференцировки путем приведения клетки в контакт с соединением (т.е. ингибитором EZH2) согласно изобретению. Предпочтительно, соединение присутствует в количестве, достаточном для повышения экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из CD133 (также называемого PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64 и GFAP.
[0118] Термин «индукция нейрональной дифференцировки» при использовании в настоящей заявке относится к стимуляции развития клетки в клетку нейрональной линии дифференцировки в результате непосредственного или преднамеренного воздействия на клетку.
[0119] Настоящее изобретение также обеспечивает способы индукции ингибирования клеточного цикла путем приведения клетки в контакт с соединением согласно изобретению. Предпочтительно, соединение присутствует в количестве, достаточном для повышения экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, млF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FОКСО4, CDK6, ТФУP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4 и TRIM35.
[0120] Термин «индукция ингибирования клеточного цикла» при использовании в настоящей заявке относится к стимуляции накопления клеток или остановке на любой фазе во время клеточного деления и/или удвоения.
[0121] Настоящее изобретение также обеспечивает способы индукции опухолевой супрессии путем приведения клетки в контакт с соединением согласно изобретению. Предпочтительно, соединение присутствует в количестве, достаточном для повышения экспрессии BIN1 или любых опухолевых супрессоров.
[0122] Термин «индукция опухолевой супрессии» может включать, но не ограничивается указанными, уменьшение размера опухоли, уменьшение объема опухоли, уменьшение количества опухолей, уменьшение количества метастатических повреждений в других тканях или органах, удаленных от первичного места возникновения опухоли, увеличение средней продолжительности жизни популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, получающих только носитель, увеличение средней продолжительности жизни в популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, не получающих лечение, увеличение средней продолжительности жизни в популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, получающих монотерапию лекарственным средством, которое не является соединением согласно настоящему изобретению, уменьшение смертности в популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, получающих только носитель, уменьшение скорости роста опухоли или уменьшение скорости возобновления роста опухоли.
[0123] Настоящее изобретение также обеспечивает способ ингибирования сигнального пути hedgehog путем приведения клетки в контакт с соединением согласно изобретению. Предпочтительно, соединение присутствует в количестве, достаточном для уменьшения экспрессии по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 и SMO.
[0124] Фраза «ингибирование сигнального пути hedgehog» означает, что сила (интенсивность) сигнального пути hedgehog при лечении соединением уменьшается по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% или более по сравнению с силой (интенсивностью) hedgehog-сигналинга в отсутствие лечения каким-либо соединением.
[0125] Настоящее изобретение также обеспечивает способ индукции экспрессии генов путем приведения клетки в контакт с соединением согласно изобретению. Предпочтительно, соединение присутствует в количестве, достаточном для индукции нейрональной дифференцировки, ингибирования клеточного цикла и/или опухолевой супрессии. Указанные гены выбраны из группы, состоящей из CD133 (также называемого PROM1), DOCK4, PTPRK, PROM2, LHX1, LHX6, LHX9, PAX6, PAX7, VEFGA, FZD3B, FYN, HIF1A, HTRA2, EVX1, CCDC64, GFAP, CKDN1A, CDKN2A, MEN1, CHEK1, IRF6, ALOX15B, CYP27B1, DBC1, NME6, GMNN, HEXIM1, LATS1, MYC, HRAS, TGFB1, IFNG, WNT1, TP53, THBS1, INHBA, IL8, IRF1, TPR, BMP2, BMP4, ETS1, HPGD, BMP7, GATA3, NR2F2, APC, PTPN3, CALR, IL12A, IL12B, PML, CDKN2B, CDKN2C, CDKN1B, SOX2, TAF6, DNA2, PLK1, TERF1, GAS1, CDKN2D, млF1, PTEN, TGFB2, SMAD3, FОКСО4, CDK6, ТФУP4, MAP2K1, NOTCH2, FOXC1, DLG1, MAD2L1, ATM, NAE1, DGKZ, FHL1, SCRIB, BTG3, PTPRK, RPS6KA2, STK11, CDKN3, TBRG1, CDC73, THAP5, CRLF3, DCUN1D3, MYOCD, PAF1, LILRB1, UHMK1, PNPT1, USP47, HEXIM2, CDK5RAP1, NKX3-1, TIPIN, PCBP4, USP44, RBM38, CDT1, RGCC, RNF167, CLSPN, CHMP1A, WDR6, TCF7L2, LATS2, RASSF1, MLTK, MAD2L2, FBXO5, ING4, TRIM35, BIN1 и любого опухолевого супрессора.
[0126] Фраза «индукция экспрессии генов» означает, что уровень экспрессии конкретного интересующего гена повышается по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% или более по сравнению с уровнем экспрессии указанного гена в отсутствие лечения каким-либо соединением.
[0127] Настоящее изобретение также обеспечивает способ ингибирования экспрессии гена, включающий приведение клетки в контакт с соединением согласно изобретению. Предпочтительно, соединение содержится в количестве, достаточном для ингибирования сигнального пути hedgehog. Такой ген представляет собой GLI1, PTCH1, SUFU, KIF7, GLI2, BMP4, MAP3K10, SHH, TCTN3, DYRK2, PTCHD1 или SMO.
[0128] Фраза «ингибирование экспрессии гена» означает, что уровень экспрессии конкретного интересующего гена уменьшается по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000%, 1500% или более по сравнению с уровнем экспрессии указанного гена в отсутствие лечения каким-либо соединением.
[0129] Нейрональную дифференцировку, ингибирование клеточного цикла, опухолевую супрессию и ингибирование сигнального пути hedgehog можно определять с помощью любых способов, известных в данной области техники.
[0130] При использовании в настоящей заявке, клетка относится к любой клетке, которую можно получить и использовать с помощью способа, описанного в настоящей заявке. Например, клетка может быть получена из клеточной культуры. В качестве альтернативы, клетка может быть выделена из субъекта. Клетка также может относиться к клетке субъекта.
[0131] Клетка может иметь потерю функции SNF5, ARID1A, ATRX и/или компонента комплекса SWI/SNF. Предпочтительно, клетка может иметь делецию SNF5.
[0132] Клетка может представлять собой раковую клетку, где рак выбран из группы, состоящей из медуллобластомы, олигодендроглиомы, светлоклеточной аденокарциномы яичника, эндометриоидной аденокарциномы яичника, серозной аденокарциномы яичника, аденокарциномы протоков поджелудочной железы, эндокринной опухоли поджелудочной железы, злокачественной рабдоидной опухоли, астроцитомы, атипичной тератоидной рабдоидной опухоли, карциномы хороидного сплетения, папилломы хороидного сплетения, эпендимомы, глиобластомы, менингиомы, нейроглиальной опухоли, олигоастроцитомы, олигодендроглиомы, пинеобластомы, карциносаркомы, хордомы, экстрагонадной опухоли половых клеток, внепочечной рабдоидной опухоли, шванномы, плоскоклеточной карциномы кожи, хондросаркомы, светлоклеточной саркомы мягких тканей, саркомы Юинга, желудочно-кишечной стромальной опухоли, остеосаркомы, рабдомиосаркомы, эпителиоидной саркомы, почечной медуллокарциномы, диффузной B-крупноклеточной лимфомы, фолликулярной лимфомы и саркомы без уточнения гистогенеза (NOS). Более предпочтительно клетка представляет собой раковую клетку медуллобластомы, злокачественной рабдоидной опухоли или атипичной тератоидной рабдоидной опухоли.
[0133] Стадия рака, который предполагается лечить, может быть установлена в соответствии с системой классификации TNM Американского объединенного онкологического комитета (American Joint Committee on Cancer, AJCC), согласно которой опухолям (T) присваивают стадию TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c или T4d; и регионарным лимфатическим узлам (N) присваивают стадию NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b или N3c; и отдаленным метастазам (M) присваивают стадию MX, M0 или M1. Стадия рака, который предполагается лечить, может быть определена в соответствии с классификацией Американского объединенного онкологического комитета (AJCC) как I стадия, IIA стадия, IIB стадия, IIIA стадия, IIIB стадия, IIIC стадия или IV стадия. Рак, который предполагается лечить, может быть определен в соответствии с классификацией AJCC как рак степени GX (например, степень не может быть определена), 1 степени, 2 степени, 3 степени или 4 степени. Стадия рака, который предполагается лечить, может быть определна в соответствии с патологической классификацией (pN) AJCC как pNX, pN0, PN0 (I-), PN0 (I+), PN0 (mol-), PN0 (mol+), PN1, PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b или pN3c.
[0134] Рак, который предполагается лечить, можно классифицировать с помощью ДНК-цитометрии, проточной цитометрии или отображающей цитометрии. Рак, который предполагается лечить, может быть классифицирован как рак, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% клеток которого находятся в ситнтетической стадии клеточного деления (например, в S фазе клеточного цикла). Рак, который предполагается лечить, может быть классифицирован как рак с низкой фракцией клеток в S-фазе или высокой фракцией клеток в S-фазе.
[0135] При использовании в настоящей заявке «нормальная клетка» представляет собой клетку, которая не может быть определена как часть «клеточного пролиферативного расстройства». Нормальная клетка не проявляет нерегулируемый или аномальный рост, или нерегулируемый и аномальный рост, который может приводить к развитию нежелательного состояния или заболевания. Предпочтительно, нормальная клетка обладает нормально функционирующими механизмами регуляции контрольных точек клеточного цикла.
[0136] При использовании в настоящей заявке «приведение клетки в контакт» относится к состоянию, при котором соединение или другая композиция веществ находится в непосредственном контакте с клеткой или на достаточно близком расстоянии для возможности индукции желаемого биологического ответа в указанной клетке.
[0137] При использовании в настоящей заявке, «монотерапия» относится к введению единственного активного или терапевтического соединения субъекту, нуждающемуся в указанном введении. Предпочтительно, монотерапия включает введение терапевтически эффективного количества активного соединения. Например, монотерапия рака одним соединением согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью, полиморфомом, сольватом, аналогом или производным, у субъекта, нуждающегося в лечении рака. Монотерапию можно противопоставить комбинированной терапии, при которой вводится комбинация множества активных соединений, где предпочтительно каждый компонент указанной комбинации присутствует в терапевтически эффективном количестве. Согласно одному аспекту, монотерапия соединением согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью, полиморфом или сольватом, является более эффективной по сравнению с комбинированной терапией с точки зрения индукции желаемого биологического эффекта.
in vitro
[0138] При использовании в настоящей заявке термин «лечение» или «лечить» описывает терапию и уход за пациентом в целях борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством, и включает введение соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата для облегчения одного или более симптомов или осложнений заболевания, состояния или расстройства или для устранения указанного заболевания, состояния или расстройства. Термин «лечение» также может включать лечение клетки  или на животной модели.
[0139] Соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую соль, полиморф или сольват также можно использовать для предотвращения заболевания, состояния или расстройства или для идентификации подходящих кандидатов для указанных целей. При использовании в настоящей заявке, термин «предотвращение» или «предотвращать» описывает уменьшение или устранение возникновения симптомов или осложнений заболевания, состояния или расстройства.
[0140] При использовании в настоящей заявке термин «облегчение» описывает процесс, с помощью которого уменьшается тяжесть признака или симптома расстройства. Необходимо отметить, что признак или симптом может быть уменьшен без его устранения. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения, введение фармацевтической композиции согласно изобретению приводит к устранению признака или симптома, однако устранение не является обязательным. Ожидается, что эффективные дозы приводят к уменьшению тяжести признака или симптома. Например, признак или симптом расстройства, такого как рак, который возникает в различных местоположениях, смягчается, если тяжесть рака уменьшена в пределах по меньшей мере одного из нескольких местоположений.
[0141] При использовании в настоящей заявке термин «тяжесть» описывает потенциальную способность рака трансформироваться из предракового или доброкачественного состояния в злокачественное состояние. В качестве альтернативы или дополнительно, тяжесть описывает стадию рака, например, в соответствии с системой TNM, принятой Международным союзом против рака (International Union Against Cancer, UICC) и Американским объединенным онкологическим комитетом (AJCC), или c помощью других признанных в данной области техники способов. Стадия рака относится к степени или тяжести рака, определенной на основе факторов, таких как местоположение первичной опухоли, размер опухоли, число опухолей и вовлечение лимфатических узлов (распространение рака на лимфатические узлы). В качестве альтернативы или дополнительно, предполагается, что тяжесть описывает степень опухоли, определенную с помощью признанных в данной области техники способов (см. Национальный институт рака, www.cancer.gov). Степени опухолей представляют собой систему, используемую для классификации раковых клеток с точки зрения выраженности их аномального фенотипа под микроскопом и скорости роста и распространения. При определении степени опухоли рассматриваются многие факторы, включая структуру и характеристики роста клеток. Конкретные факторы, используемые для определения степени опухоли, различаются в зависимости от типа рака. Тяжесть также описывается гистологической степенью, которая также называется дифференциацией и относится к тому, насколько  клетки опухоли напоминают нормальные клетки того же тканевого типа (см. Национальный институт рака, www.cancer.gov). Более того, тяжесть описывается ядерной степенью, которая относится к размеру и форме ядра в клетках опухоли и проценту делящихся клеток опухоли (см. Национальный институт рака, www.cancer.gov).
[0142] Согласно другому аспекту изобретения, тяжесть описывается степенью секреции опухолью ростовых факторов, деградации внеклеточного матрикса, васкуляризации, потери адгезии к соседним тканям или метастазирования. Более того, тяжесть описывает количество точек, к которым метастазировали первичные опухоли. Наконец, тяжесть включает трудность лечения опухолей различных типов и местоположений. Например, неоперабельные опухоли, такие раковые заболевания, которые имеют больший доступ ко множеству систем тела (гематологические и иммунологические опухоли) и те, которые являются наиболее устойчивыми к традиционных способам лечения, считаются наиболее тяжелыми. В указанных ситуациях продление ожидаемой продолжительности жизни субъекта и/или уменьшение боли, уменьшение отношения раковых клеток или ограничение клеток одной системой и улучшение стадии рака/степени опухоли/гистологической степени/ядерной степени считаются облегчением признака или симптома рака.
[0143] При использовании в настоящей заявке термин «симптом» указывает на наличие заболевания, болезни, повреждения или какого-либо нарушения в организме. Индивид, испытывающий указанный симптом, ощущает или замечает его, но другие люди могут не замечать указанный симптом. Другие люди представляют собой не профессиональных медработников.
[0144] При использовании в настоящей заявке термин «признак» также указывает на наличие какого-либо нарушения в организме. Но признаки могут быть заметны врачу, медсестре или другому профессиональному медработнику.
[0145] Рак представляет собой группу заболеваний, которые могут вызывать почти любой признак или симптом. Признаки и симптомы зависят от местоположения рака, размера рака и степени поражения близлежащих органов или структур. Если рак распространяется (метастазирует), то симптомы могут появляться в различных частях тела.
[0146] Лечение рака может приводить к уменьшению размера опухоли. Уменьшение размера опухоли также может называться «регрессией опухоли». Предпочтительно размер опухоли после лечения уменьшается на 5% или более по сравнению с ее размером до лечения; более предпочтительно, размер опухоли уменьшается на 10% или более; более предпочтительно, на 20% или более; более предпочтительно, на 30% или более; более предпочтительно, на 40% или более; более предпочтительно, на 50% или более; и наиболее предпочтительно, более чем на 75% или более. Размер опухоли можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Размер опухоли можно измерить как диаметр опухоли.
[0147] Лечение рака может приводить к уменьшению объема опухоли. Предпочтительно, объем опухоли после лечения уменьшается на 5% или более по сравнению с ее объемом до лечения; более предпочтительно, объем опухоли уменьшается на 10% или более; более предпочтительно, на 20% или более; более предпочтительно, на 30% или более; более предпочтительно, на 40% или более; более предпочтительно, на 50% или более; и наиболее предпочтительно, более чем на 75% или более. Объем опухоли можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения.
[0148] Лечение рака приводит к уменьшению количества опухолей. Предпочтительно, количество опухолей после лечения уменьшается на 5% или более по сравнению с количеством до лечения; более предпочтительно, количество опухолей уменьшается на 10% или более; более предпочтительно, на 20% или более; более предпочтительно, на 30% или более; более предпочтительно, на 40% или более; более предпочтительно, на 50% или более; и наиболее предпочтительно, более чем на 75%. Количество опухолей можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Количество опухолей можно измерить путем подсчета опухолей, видимых невооруженным глазом, или при специальном увеличении. Предпочтительно, специальное увеличение составляет 2x, 3x, 4x, 5x, 10x или 50x.
[0149] Лечение рака может приводить к уменьшению количества метастатических повреждений в других тканях или органах, отдаленных от первичного места расположения опухоли. Предпочтительно количество метастатических повреждений после лечения уменьшается на 5% или более по сравнению с количеством до лечения; более предпочтительно, количество метастатических повреждений уменьшается на 10% или более; более предпочтительно, на 20% или более; более предпочтительно, на 30% или более; более предпочтительно, на 40% или более; более предпочтительно, на 50% или более; и наиболее предпочтительно, более чем на 75%. Количество метастатических повреждений можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Количество метастатических повреждений можно измерить путем подсчета метастатических повреждений, видимых невооруженным глазом или при специальном увеличении. Предпочтительно, специальное увеличение составляет 2x, 3x, 4x, 5x, 10x или 50x.
[0150] Лечение рака может приводить к увеличению средней продолжительности жизни в популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, получающих только носитель. Предпочтительно, средняя продолжительность жизни повышается более чем на 30 дней; более предпочтительно, более чем на 60 дней; более предпочтительно, более чем на 90 дней; и наиболее предпочтительно, более чем на 120 дней. Увеличение средней продолжительности жизни популяции можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа. Увеличение средней продолжительности жизни популяции можно измерить, например, путем расчета средней продолжительности жизни для популяции после начала лечения активным соединением. Увеличение средней продолжительности жизни популяции также можно измерить, например, путем расчета средней продолжительности жизни для популяции после завершения первого курса лечения активным соединением.
[0151] Лечение рака может приводить к увеличению средней продолжительности жизни популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, не получающих лечение. Предпочтительно, средняя продолжительность жизни повышается более чем на 30 дней; более предпочтительно, более чем на 60 дней; более предпочтительно, более чем на 90 дней; и наиболее предпочтительно, более чем на 120 дней. Увеличение средней продолжительности жизни популяции можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа. Увеличение средней продолжительности жизни популяции можно измерить, например, путем расчета средней продолжительности жизни для популяции после начала лечения активным соединением. Увеличение средней продолжительности жизни популяции также можно измерить, например, путем расчета средней продолжительности жизни для популяции после завершения первого курса лечения активным соединением.
[0152] Лечение рака может приводить к повышению средней продолжительности жизни популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, получающих монотерапию лекарственным средством, которое не является соединением согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью, полиморфом, сольватом, аналогом или производным. Предпочтительно, средняя продолжительность жизни повышается более чем на 30 дней; более предпочтительно, более чем на 60 дней; более предпочтительно, более чем на 90 дней; и наиболее предпочтительно, более чем на 120 дней. Увеличение средней продолжительности жизни популяции можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа. Увеличение средней продолжительности жизни популяции можно измерить, например, путем расчета средней продолжительности жизни для популяции после начала лечения активным соединением. Увеличение средней продолжительности жизни популяции также можно измерить, например, путем расчета средней продолжительности жизни для популяции после завершения первого курса лечения активным соединением.
[0153] Лечение рака может приводить к уменьшению смертности в популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, получающих только носитель. Лечение рака может приводить к уменьшению смертности в популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, не получающих лечение. Лечение рака может приводить к уменьшению смертности в популяции субъектов, получающих лечение, по сравнению с популяцией субъектов, получающих монотерапию лекарственным средством, которое не является соединением согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемую солью, полиморфом, сольватом, аналогом или производным. Предпочтительно, смертность уменьшается более чем на 2%; более предпочтительно, более чем на 5%; более предпочтительно, более чем на 10%; и наиболее предпочтительно, более чем на 25%. Уменьшение смертности в популяции субъектов, получающих лечение, можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа. Уменьшение смертности в популяции можно измерить, например, путем расчета среднего количества связанных с заболеванием летальных исходов для популяции на единицу времени после начала лечения активным соединением. Уменьшение смертности популяции также можно измерить, например, путем расчета среднего числа связанных с заболеванием летальных исходов для популяции в единицу времени после завершения первого курса лечения активным соединением.
[0154] Лечение рака может приводить к уменьшению скорости роста опухоли. Предпочтительно скорость  роста опухоли после лечения уменьшается по меньшей мере на 5% по сравнению со скоростью до лечения; более предпочтительно, скорость  роста опухоли  уменьшается по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 75%. Скорость роста опухоли можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Скорость роста опухоли можно измерить на основе изменения диаметра опухоли в единицу времени.
[0155] Лечение рака может приводить к уменьшению возобновления роста опухоли. Предпочтительно возобновление роста опухоли после лечения уменьшается более чем на 5%; более предпочтительно, возобновление роста опухоли после лечения уменьшается более чем на 10%; более предпочтительно, более чем на 20%; более предпочтительно, более чем на 30%; более предпочтительно, более чем на 40%; более предпочтительно, более чем на 50%; еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, более чем на 75%. Возобновление роста опухоли можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Возобновление роста опухоли измеряют, например, путем измерения увеличения диаметра опухоли после предшествующего уменьшения опухоли после лечения. На уменьшение возобновления роста опухоли указывает отсутствие повторного возникновения опухолей после завершения лечения.
[0156] Лечение рака может приводить к уменьшению скорости клеточной пролиферации. Предпочтительно, после лечения скорость пролиферации клеток уменьшается по меньшей мере на 5%; более предпочтительно, по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 75%. Скорость пролиферации клеток можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Скорость пролиферации клеток измеряют, например, путем измерения количества делящихся клеток в образце ткани в единицу времени.
[0157] Лечение рака может приводить к уменьшению относительного содержания пролиферирующих клеток. Предпочтительно, после лечения относительное содержание пролиферирующих клеток уменьшается по меньшей мере на 5%; более предпочтительно, по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 75%. Относительное содержание пролиферирующих клеток можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Предпочтительно, относительное содержание пролиферирующих клеток измеряют, например, путем подсчета количества делящихся клеток по сравнению с количеством не делящихся клеток в образце ткани. Относительное содержание пролиферирующих клеток может являться эквивалентным митотическому индексу.
[0158] Лечение рака может приводить к уменьшению размера площади или зоны клеточной пролиферации. Предпочтительно, после лечения размер площади или зоны клеточной пролиферации уменьшается по меньшей мере на 5% по сравнению с ее размером до лечения; более предпочтительно, по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 75%. Размер площади или зоны клеточной пролиферации можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Размер площади или зоны клеточной пролиферации можно измерить как диаметр или ширину площади или зоны клеточной пролиферации.
[0159] Лечение рака может приводить к уменьшению количества или относительного содержания клеток, имеющих аномальный внешний вид или морфологию. Предпочтительно после лечения количество клеток, имеющих аномальную морфологию, уменьшается по меньшей мере на 5% по сравнению с их количеством до лечения; более предпочтительно, по меньшей мере на 10%; более предпочтительно, по меньшей мере на 20%; более предпочтительно, по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; еще более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; и наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 75%. Аномальный внешний вид или морфологию клеток можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа измерения. Аномальную морфологию клеток можно измерить с помощью микроскопии, например, с использованием инвертированного микроскопа для тканевых культур. Аномальная морфология клеток может принимать форму ядерного плейоморфизма.
et al
Proc Natl Acad Sci U S A.
[0160] Лечение рака может приводить к клеточной гибели, и предпочтительно указанная гибель клеток приводит к уменьшению по меньшей мере на 10% количества клеток в популяции. Более предпочтительно, гибель клеток приводит к уменьшению по меньшей мере на 20% количества клеток в популяции; более предпочтительно, по меньшей мере на 30%; более предпочтительно, по меньшей мере на 40%; более предпочтительно, по меньшей мере на 50%; наиболее предпочтительно, по меньшей мере на 75%. Количество клеток в популяции можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа. Количество клеток в популяции можно измерить с помощью сортировки клеток с актвированной флуоресценцией (FACS), иммунофлуоресцентной микроскопии и световой микроскопии. Способы измерения гибели клеток описаны в источнике Li .,  100(5): 2674-8, 2003. Согласно аспекту, гибель клеток происходит в результате апоптоза.
[0161] При использовании в настоящей заявке, термин «селективно» относится  к тенденции встречаться чаще в одной популяции по сравнению с другой. Сравниваемые популяции могут представлять собой клеточные популяции. Предпочтительно соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, полиморф или сольват действует селективно в отношении раковых или предраковых клеток, но не нормальных клеток. Предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, полиморф или сольват действует селективно с обеспечением модуляции одной молекулярной мишени (например, белка-мишени метилтрансферазы) без значительного модуляции другой молекулярной мишени (например, белка метилтрансферазы, не являющегося мишенью). Изобретение также обеспечивает способ селективного ингибирования активности фермента, такого как белок метилтрансфераза. Предпочтительно, событие происходит селективно в популяции A по сравнению с популяцией B, если оно происходит более чем в два раз чаще в популяции A по сравнению с популяцией B. Событие происходит селективно, если оно происходит более чем в пять раз чаще в популяции A. Событие происходит селективно, если оно происходит более чем в десять раз чаще в популяции A; более предпочтительно, более чем в пятьдесят раз; более предпочтительно, более чем в 100 раз; и наиболее предпочтительно, более чем 1000 раз чаще в популяции A по сравнению с популяцией B. Например, считается, что гибель клеток происходит селективно в раковых клетках, если она происходит более чем в два раза чаще в раковых клетках по сравнению с нормальными клетками.
in vitro
in vivo
in vitro
in vivo
[0162] Соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, полиморф или сольват может модулировать активность молекулярной мишени (например, белка-мишени метилтрансферазы). Модуляция относится к стимуляции или ингибированию активности молекулярной мишени. Предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, полиморф или сольват модулирует активность молекулярной мишени, если оно стимулирует или ингибирует активность молекулярной мишени по меньшей мере в 2 раза по сравнению с активностью указанной молекулярной мишени в тех же условиях, но только в отсутствие указанного соединения. Более предпочтительно, соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, полиморф или сольват модулирует активность молекулярной мишени, если оно стимулирует или ингибирует активность молекулярной мишени по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз по сравнению с активностью молекулярной мишени в тех же условиях, но только в отсутствие указанного соединения. Активность молекулярной мишени можно измерить с помощью любого воспроизводимого способа. Активность молекулярной мишени можно измерить  или . Например, активность молекулярной мишени можно измерить  с помощью анализа ферментативной активности или анализа ДНК-связывания, или активность молекулярной мишени можно измерить  путем оценки экспрессии репортерного гена.
[0163] Соединение согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль, полиморф или сольват существенно не модулирует активность молекулярной мишени, если добавление соединения не стимулирует или не ингибирует активность молекулярной мишени более чем на 10% по сравнению с активностью молекулярной мишени в тех же условиях, но только в отсутствие указанного соединения.
50
,
5
[0164] При использовании в настоящей заявке, термин «изозим-селективный» означает предпочтительное ингибирование или стимуляцию первой изоформы фермента по сравнению со второй изоформой фермента (например, предпочтительное ингибирование или стимуляция изозима альфа белка метилтрансферазы по сравнению с изозимом бета белка метилтрансферазы). Предпочтительно, доза соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата, необходимая для достижения биологического эффекта, различается как минимум в четыре раза, предпочтительно в десять раз, более предпочтительно, в пятьдесят раз. Предпочтительно, указанное различие дозы соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата наблюдается в диапазоне ингибирующих концентраций, и указанное различие показывают при ICт.е. 0% ингибировании в отношении интересующей молекулярной мишени.
[0165] Введение соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата в клетку или субъекту, нуждающемуся в указанном введении, может приводить к модуляции (т.е. стимуляции или ингибированию) активности интересующего белка метилтрансферазы.
[0166] Метилирование H3-K27, образование триметилированного H3-K27, превращение монометилированного H3-K27 в диметилированный H3-K27 или превращение диметилированного H3-K27 в триметилированный H3-K27 можно выявлять с использованием любого подходящего способа. Примеры способов можно найти в патенте США US20120071418, содержание которого включено в настоящую заявку посредством ссылки.
.
[0167] Введение соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата, в клетку или субъекту, нуждающемуся в указанном введении, приводит к модуляции (т.е стимуляции или ингибированию) активности внутриклеточной мишени (например, субстрата). Соединение согласно настоящему изобретению может модулировать несколько внутриклеточных мишеней, включая, но не ограничиваясь указанными, белок метилтрансферазу.
[0168] Предпочтительно, эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата не проявляет существенной цитотоксичности в отношении нормальных клеток. Терапевтически эффективное количество соединения не проявляет существенную цитотоксичность в отношении нормальных клеток, если введение указанного соединения в терапевтически эффективном количестве не вызывает гибель клеток в более чем 10% нормальных клеток. Терапевтически эффективное количество соединения существенно не влияет на выживаемость нормальных клеток, если введение соединения в терапевтически эффективном количестве не вызывает гибель клеток в более чем 10% нормальных клеток. Согласно аспекту изобретения, гибель клеток происходит в результате апоптоза.
[0169] Приведение клетки в контакт с соединением согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью, полиморфом или сольватом может селективно вызывать или активировать гибель раковых клеток. Введение субъекту, нуждающемуся в указанном введении, соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата может селективно вызывать или активировать  гибель  раковых клеток. Приведение клетки в контакт с соединением согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой солью, полиморфом или сольватом может селективно вызывать гибель одной или более клеток, пораженных пролиферативным расстройством клеток. Предпочтительно, введение субъекту, нуждающемуся в указанном введении, соединения согласно настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли, полиморфа или сольвата, селективно вызывает гибель одной или более клеткок, имеющих пролиферативное расстройство клеток.
et al., Current Protocols in Molecular Biology
et al.
Molecular Cloning, A Laboratory Manual
et al.
Current Protocols in Immunology
et al.
Current Protocols in Pharmacology
et al.
The Pharmacological Basis of Therapeutics
Remington's Pharmaceutical Sciences
rd
th
[0170] Специалист в данной области техники может найти подробное описание известных способов, обсуждаемых в настоящей заявке, или эквивалентных способов в текстах общих ссылок. Указанные тексты включают Ausubel , John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook,(3 edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan , , John Wiley & Sons, N.Y.; Enna , , John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl ,  (1975), , Mack Publishing Co., Easton, PA, 18 edition (1990). На указанные тексты, безусловно, можно также ссылаться при разработке или применении аспекта изобретения.
[0171] Соединение (т.е. ингибитор EZH2), которое можно использовать в любых способах, описанных в настоящей заявке, может иметь следующую формулу I:
(I) или представлять собой ее фармацевтически приемлемую соль; где
701
707
707
708
2
n7
3-8
3-8
1-3
1-6
1-6
1-3
3-8
1-6
1-6
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
1-3
R представляет собой H, F, OR, NHR, -(C≡C)-(CH)-R, фенил, 5- или 6-членный гетероарил, C циклоалкил или 4-7-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-3 гетероатома, где каждый из указанного фенила, 5- или 6-членного гетероарила, C циклоалкила или 4-7-членного гетероциклоалкила независимо необязательно содержит в качестве заместителя одну или более групп, выбранных из галогена, C алкила, OH, O-C алкила, NH-C алкила, и C алкил содержит в качестве заместителя C циклоалкил или 4-7-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-3 гетероатома, где каждый из указанного O-C алкила и NH-C алкила необязательно содержит в качестве заместителя гидроксил, O-C алкил или NH-C алкил, где каждый из O-C алкила и NH-C алкила необязательно также содержит в качестве заместителя O-C алкил или NH-C алкил;
702
703
1-4
1-6
6
10
каждый из RиR независимо представляет собой H, галоген, C алкил, C алкоксил или C-C арилокси, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя один или более атомов галогена;
704
705
1-4
каждый из R и R независимо представляет собой C алкил;
706
706
1-4
2
1-4
1-6
R представляет собой циклогексил, содержащий в качестве заместителя N(C алкил), где один или оба C алкила содержат в качестве заместителя C алкокси; или R представляет собой тетрагидропиранил;
707
1-4
1-4
1-4
3-8
3-8
1-3
R представляет собой C алкил, необязательно содержащий в качестве заместителя одну или более групп, выбранных из гидроксила, C алкокси, амино, моно- или ди-C алкиламино, C циклоалкила и 4-7-членного гетероциклоалкила, содержащего 1-3 гетероатома, где каждый из указанных C циклоалкила или 4-7-членного гетероциклоалкила независимо также необязательно содержит в качестве заместителя C алкил;
708
1-4
1-4
1-6
1-6
R представляет собой C алкил, необязательно содержащий в качестве заместителя одну или более групп, выбранных из OH, галогена и C алкокси, 4-7-членного гетероциклоалкила, содержащего 1-3 гетероатома или O-C алкил, где указанный 4-7-членный гетероциклоалкил может также необязательно содержать в качестве заместителя OH или C алкил; и
7
n равен 0, 1 или 2.
706
1-4
2
1-4
[0172] Например, R представляет собой циклогексил, содержащий в качестве заместителя N(C алкил),где один из C алкила является незамещенным, а другой содержит в качестве заместителя метокси.
706
[0173] Например, Rпредставляет собой .
[0174] Например, соединение представляет собой формулу II:
(II).
702
703
[0175] Например, R представляет собой метил или изопропил, и R представляет собой метил или метоксил.
704
[0176] Например, R представляет собой метил.
701
707
707
1-3
3
[0177] Например, R представляет собой OR, и R представляет собой Cалкил, необязательно содержащий в качестве заместителя OCH или морфолин.
701
[0178] Например, R представляет собой H или F.
701
2
2
3
[0179] Например, R представляет собой тетрагидропиранил, фенил, пиридил, пиримидил, пиразинил, имидазолил или пиразолил, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя метил, метокси, этил, содержащий в качестве заместителя морфолин или -OCHCHOCH.
708
1-6
[0180] Например, R представляет собой морфолин, пиперидин, пиперазин, пирролидин, диазепан или азетидин, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя OH или C алкил.
708
[0181] Например, R представляет собой морфолин.
708
1-6
[0182] Например, R представляет собой пиперазин, содержащий в качестве заместителя C алкил.
708
3
2
[0183] Например, R представляет собой метил, т-бутил или C(CH)OH.
[0184] Соединение (т.е. ингибитор EZH2), которое можно использовать в любом способе, описанном в настоящей заявке, может иметь следующую формулу III:
(III) или представлять собой ее фармацевтически приемлемую соль.
[0185] В указанной формуле:
801
801
801
1-6
2-6
2-6
3-8
1-6
x
1-6
x
x
1-3
1-3
x
1-3
1-3
x
2
2
2
1
3
1
6
2
R представляет собой C алкил, C алкенил, C алкинил, C циклоалкил, 4-7-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-3 гетероатома, фенил или 5- или 6-членный гетероарил, каждый из которых содержит в качестве заместителя O-C алкил-R или NH-C алкил-R, где R представляет собой гидроксил, O-C алкил или NH-C алкил, и R необязательно также содержит в качестве заместителя O-C алкил или NH-C алкил, за исключением тех случаев, когда R представляет собой гидроксил; или R представляет собой фенил, содержащий в качестве заместителя –Q-T, где Q представляет собой связь или C-C алкильный линкер, необязательно содержащий в качестве заместителя галоген, циано, гидроксил или C-C алкокси, и T представляет собой необязательно замещенный 4- 12-членный гетероциклоалкил; и R также является необязательно замещенным;
802
803
1-4
1-6
6
10
каждый из Rи R независимо представляет собой H, галоген, C алкил, C алкоксил или C-C арилокси, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя один или более галогенов;
804
805
1-4
каждый из R и R независимо представляет собой C алкил; и
806
x
x
x
1-4
x
1-4
3
8
R представляет собой –Q-T, где Q представляет собой связь или C алкильный линкер, T представляет собой H, необязательно замещенный C алкил, необязательно замещенный C-C циклоалкил или необязательно замещенный 4 - 14-членный гетероциклоалкил.
x
2
x
2
1-4
1-4
2
1-4
1-6
[0186] Например, каждый из Q и Qнезависимо представляет собой связь или метильный линкер, и каждый из T и Tнезависимо представляет собой тетрагидропиранил, пиперидинил, содержащий в качестве заместителя 1, 2 или 3 C алкильные группы, или циклогексил, содержащий в качестве заместителя N(C алкил), где один или оба C алкила необязательно содержат в качестве заместителя C алкокси;
806
806
1-4
2
[0187] Например, R представляет собой циклогексил, содержащий в качестве заместителя N(C алкил), или R представляет собой тетрагидропиранил.
806
[0188] Например, R представляет собой .
801
801
1-6
x
2
[0189] Например, R представляет собой фенил или 5- или 6-членный гетероарил, содержащий в качестве заместителя O-C алкил-R, или R представляет собой фенил, содержащий в качестве заместителя CH-тетрагидропиранил.
[0190] Например, соединение согласно настоящему изобретению представляет собой соединение формулы IVa или IVb:
807
2-3
x
(IVa) или (IVb), где Z’ представляет собой CH или N, и R представляет собой Cалкил-R.
807
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
[0191] Например, R представляет собой –CHCHOH, –CHCHOCH или–CHCHOCHCHOCH.
802
803
[0192] Например, R представляет собой метил или изопропил, и R представляет собой метил или метоксил.
804
[0193] Например, R представляет собой метил.
[0194] Соединение согласно настоящему изобретению может иметь следующую формулу (V):
(V) или представлять собой ее фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир.
[0195] В указанной формуле:
2
4
12
1-6
;
Каждый из R, R и R независимо представляет собой C алкил
6
6
10
2
2
2
1
3
1
6
2
a
a
b
a
b
c
a
a
a
b
b
a
b
a
2
a
2
a
b
S2
a
b
c
S3
S2
S3
1
6
3
8
6
10
a
b
S2
S3
a
b
3
3
3
1
3
1
6
3
1
6
3
8
6
10
d
d
2
d
d
e
d
e
d
e
1
6
3
3
2
2
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
+
–
–
R представляет собой C-C арил или 5- или 6-членный гетероарил, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь или C-C алкильный линкер, необязательно содержащий в качестве заместителя галоген, циано, гидроксил или C-C алкокси, и T представляет собой H, галоген, циано, -OR, -NRR, -(NRRR)A,-C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -S(O)R,-S(O)NRR или R, в котором каждый из R, R и R независимо представляет собой H или R, A представляет собой фармацевтически приемлемый анион, каждый из R и R независимо представляет собой C-C алкил, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 12-членный гетероциклоалкил или 5- или 6-членный гетероарил, или R и R вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 4 - 12-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее 0 или 1 дополнительный гетероатом, и каждый из R, R и 4 - 12-членного гетероциклоалкильного кольца, образованного R и R, необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь, или каждый C-C алкильный линкер необязательно содержит в качестве заместителя галоген, циано, гидроксил или C-C алкокси, и T выбран из группы, состоящей из галогена, циано, C-C алкила, C-C циклоалкила, C-C арила, 4 - 12-членного гетероциклоалкила, 5- или 6-членного гетероарила, OR, COOR, -S(O)R, -NRR, и -C(O)NRR, где каждый из R и R независимо представляет собой H или C-C алкил, или –Q-T представляет собой оксо; или любые два соседних кольца –Q-T вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членное кольцо, необязательно содержащее 1-4 гетероатома, выбранных из N, O и S, и необязательно содержат один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, гидроксила, COOH, C(O)O-C-C алкила, циано, C-C алкоксила, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкила, C-C арила, 4 - 12-членного гетероциклоалкила и 5- или 6-членного гетероарила;
7
4
4
4
1
4
2
4
1
6
4
f
g
f
f
f
f
g
f
g
f
g
2
f
S4
f
g
S5
S4
S5
1
6
2
6
2
6
3
8
6
10
S4
S5
5
5
5
k
k
2
1
3
k
1
6
5
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
q
q
q
1
6
2
6
2
6
3
8
6
10
5
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
5
5
5
R представляет собой –Q-T, в котором Q представляет собой связь, C-C алкильный линкер или C-C алкенильный линкер, где каждый линкер необязательно содержит в качестве заместителя галоген, циано, гидроксил или C-C алкокси, и T представляет собой H, галоген, циано, NRR, -OR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)NROR, -NRC(O)R, -S(O)R или R, в котором каждый из R и R, независимо представляет собой H или R, каждый из R и R, независимо представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 12-членный гетероциклоалкил или 5- или 6-членный гетероарил, и каждый из R и R необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь, C(O), C(O)NR, NRC(O), S(O) или C-C алкильный линкер, где R представляет собой H или C-C алкил, и T представляет собой H, галоген, C-C алкил, гидроксил, циано, C-C алкоксил, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 12-членный гетероциклоалкил, 5- или 6-членный гетероарил или S(O)R, в котором q равен 0, 1 или 2, и R представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 12-членный гетероциклоалкил или 5- или 6-членный гетероарил, и T необязательно содержит в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, C-C алкила, гидроксила, циано, C-C алкоксила, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкила, C-C арила, 4 - 12-членного гетероциклоалкила, и 5- или 6-членного гетероарила, за исключением тех случаев, когда T представляет собой H, галоген, гидроксил или циано; или –Q-T представляет собой оксо; и
8
S6
S6
S6
S6
1
6
2
6
2
6
3
8
1
6
1
6
S6
1
6
1
6
1
6
1
6
7
8
7
8
6
6
6
m
m
2
1
3
m
1
6
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
p
p
p
1
6
2
6
2
6
3
8
6
10
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
6
6
6
R представляет собой H, галоген, гидроксил, COOH, циано, R, OR или COOR, в котором R представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, C-C циклоалкил, 4 - 12-членнй гетероциклоалкил, амино, моно-C-C алкиламино или ди-C-C алкиламино, и R необязательно содержит в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, гидроксила, COOH, C(O)O-C-C алкила, циано, C-C алкоксила, амино, моно-C-C алкиламино и ди-C-C алкиламино; или R и R вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 4 - 11-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее от 0 до 2 дополнительных гетероатомов, и 4 - 11-членное гетероциклоалкильное кольцо, образованное R и R, необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь, C(O), C(O)NR, NRC(O), S(O) или C-C алкильный линкер, где R представляет собой H или C-C алкил, и T представляет собой H, галоген, C-C алкил, гидроксил, циано, C-C алкоксил, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 12-членный гетероциклоалкил, 5- или 6-членный гетероарил или S(O)R, в котором p равен 0, 1 или 2, и R представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 12-членный гетероциклоалкил или 5- или 6-членный гетероарил, и T необязательно содержит в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, C-C алкила, гидроксила, циано, C-C алкоксила, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкила, C-C арила, 4 - 12-членный гетероциклоалкил и 5- или 6-членный гетероарил, за исключением тех случаев, когда T представляет собой H, галоген, гидроксил или циано; или –Q-T представляет собой оксо.
6
6
10
2
2
2
1
3
2
a
a
b
a
b
c
a
b
b
a
2
a
S2
a
b
S3
S2
S3
1
6
a
b
S2
S3
a
b
3
3
3
1
3
3
1
6
d
2
d
d
e
d
e
1
6
3
3
2
2
+
–
[0196] Например, R представляет собой C-C арил или 5- или 6-членный гетероарил, каждый из которых необязательно независимо содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь или C-C алкильный линкер, и T представляет собой H, галоген, циано, -OR, -NRR,-(NRRR)A, -C(O)NRR, -NRC(O)R, -S(O)R или R, в котором каждый из R и R независимо представляет собой H или R, где каждый из R и R независимо представляет собой C-C алкил, или R и R вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 4-7-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее 0 или 1 дополнительный гетероатом, и каждый из R, R и 4-7-членного гетероциклоалкильного кольца, образованного R и R, необязательно независимо содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь или C-C алкильный линкер, и T выбран из группы, состоящей из галогена, C-C алкила, 4-7-членного гетероциклоалкила, OR, -S(O)R и -NRR, где каждый из R и R независимо представляет собой H или C-C алкил, или –Q-T представляет собой оксо; или любые два соседних кольца –Q-T вместе с атомом, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членное кольцо, необязательно содержащее 1-4 гетероатома, выбранных из N, O и S.
[0197] Например, соединение согласно настоящему изобретению представляет собой соединение формулы (VI):
2
2
a
a
b
a
b
c
2
a
b
7
5
5
8
+
–
(VI) или его фармацевтически приемлемую соль, где Q представляет собой связь или метильный линкер, T представляет собой H, галоген, -OR, -NRR, -(NRRR)A или -S(O)NRR, R представляет собой пиперидинил, тетрагидропиран, циклопентил или циклогексил, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя один –Q-T, и R представляет собой этил.
[0198] Соединение согласно настоящему изобретению может иметь следующую формулу (VIa):
(VIa), где
a
b
S3
S3
1
6
3
8
6
10
a
b
S3
a
b
3
3
3
1
3
1
6
3
1
6
3
8
6
10
d
d
2
d
d
e
d
e
d
e
1
6
3
3
каждый из R и R независимо представляет собой H или R, где R представляет собой C-C алкил, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 12-членный гетероциклоалкил или 5- или 6-членный гетероарил, или R и R вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 4 - 12-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее 0 или 1 дополнительный гетероатом, и каждый из R и 4 - 12-членного гетероциклоалкильного кольца, образованного R и R, необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь или C-C алкильный линкер, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя галоген, циано, гидроксил или C-C алкокси, и T выбран из группы, состоящей из галогена, циано, C-C алкила, C-C циклоалкила, C-C арила, 4 - 12-членного гетероциклоалкила 5- или 6-членного гетероарила, OR, COOR, -S(O)R, -NRR и -C(O)NRR, где каждый из R и R независимо представляет собой H или C-C алкил, или –Q-T представляет собой оксо;
7
4
4
4
1
4
2
4
1
6
4
f
g
f
f
f
f
g
f
g
f
g
2
f
S4
f
g
S5
S4
S5
1
6
2
6
2
6
3
8
6
10
S4
S5
5
5
5
k
k
2
1
3
k
1
6
5
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
q
q
q
1
6
2
6
2
6
3
8
6
10
5
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
5
5
5
7
R представляет собой –Q-T, в котором Q представляет собой связь, C-C алкильный линкер или C-C алкенильный линкер, где каждый линкер необязательно содержит в качестве заместителя галоген, циано, гидроксил или C-C алкокси, и T представляет собой H, галоген, циано, NRR, -OR, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)NROR, -NRC(O)R, -S(O)R или R, в котором каждый из R, и R независимо представляет собой H или R, каждый из R, и R, независимо представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 7-членный гетероциклоалкил или 5- или 6-членный гетероарил, и каждый из R, и R необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь, C(O), C(O)NR, NRC(O), S(O) или C-C алкильный линкер, где R представляет собой H или C-C алкил, и T представляет собой H, галоген, C-C алкил, гидроксил, циано, C-C алкоксил, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкил, C-C арил, 4 - 7-членный гетероциклоалкил, 5- или 6-членный гетероарил или S(O)R, в котором q равен 0, 1 или 2, и R представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, C-Cциклоалкил, C-C арил, 4-7-членный гетероциклоалкил или 5- или 6-членный гетероарил, и T необязательно содержит в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, C-C алкила, гидроксила, циано, C-C алкоксила, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкила, C-C арила, 4-7-членного гетероциклоалкила и 5- или 6-членного гетероарила, за исключением тех случае, когда T представляет собой H, галоген, гидроксил или циано; или –Q-T представляет собой оксо; при условии что R не является H; и
8
S6
S6
S6
S6
1
6
2
6
2
6
1
6
1
6
S6
1
6
1
6
1
6
1
6
7
8
6
6
6
m
m
2
1
3
m
1
6
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
p
p
p
1
6
2
6
2
6
3
8
6
10
6
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
6
10
6
6
6
R представляет собой H, галоген, гидроксил, COOH, циано, R, OR или COOR, в котором R представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, амино, моно-C-C алкиламино или ди-C-C алкиламино, и R необязательно содержит в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, гидроксила, COOH, C(O)O-C-C алкила, циано, C-C алкоксила, амино, моно-C-C алкиламино и ди-C-C алкиламино; или R и R вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 4 - 11-членное гетероциклоалкильное кольцо, которое содержит от 0 до 2 дополнительных гетероатомов и необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T, где Q представляет собой связь, C(O), C(O)NR, NRC(O), S(O) или C-C алкильный линкер, где R представляет собой H или C-C алкил, и T представляет собой H, галоген, C-C алкил, гидроксил, циано, C-C алкоксил, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкил, C-C арил, 4-7-членный гетероциклоалкил, 5- или 6-членный гетероарил или S(O)R, в котором p равен 0, 1 или 2, и R представляет собой C-C алкил, C-C алкенил, C-C алкинил, C-C циклоалкил, C-C арил, 4-7-членный гетероциклоалкил или 5- или 6-членный гетероарил, и T необязательно содержит в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, C-C алкила, гидроксила, циано, C-C алкоксила, амино, моно-C-C алкиламино, ди-C-C алкиламино, C-C циклоалкила, C-C арила, 4-7-членного гетероциклоалкила и 5- или 6-членного гетероарила, за исключением тех случаев, когда T представляет собой H, галоген, гидроксил или циано; или –Q-T представляет собой оксо.
a
b
3
3,
[0199] Например, R и R вместе с атомом N, к которому они присоединены, образуют 4-7-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее 0 или 1 дополнительный гетероатом, помимо атома N, и кольцо необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-Tгде гетероциклоалкил представляет собой азетидинил, пирролидинил, имидазолидинил, пиразолидинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, триазолидинил, пиперидинил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, пиперазинил или морфолинил.
7
3
8
5
5
[0200] Например, R представляет собой C-C циклоалкил или 4-7-членный гетероциклоалкил, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T.
7
5
5
[0201] Например, R представляет собой пиперидинил, тетрагидропиран, тетрагидро-2H-тиопиранил, циклопентил, циклогексил, пирролидинил или циклогептил, каждый из которых необязательно содержит в качестве заместителя один или более –Q-T.
8
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
[0202] Например, R представляет собой H или C-C алкил, который необязательно содержит в качестве заместителя один или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из галогена, гидроксила, COOH, C(O)O-C-C алкила, циано, C-C алкоксила, амино, моно-C-C алкиламино и ди-C-C алкиламино.
[0203] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, соединение, которое можно применять в любых способах, описанных в настоящей заявке, представляет собой:
(Соединение A), его стереоизомеры или фармацевтически приемлемые соли или сольваты.
[0204] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, соединение, которое можно применять в любых способах, описанных в настоящей заявке, представляет собой:
(B), (C), (D),
, его стереоизомеры или его фармацевтически приемлемые соли и сольваты.
[0205] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, соединение, которое можно применять в любых способах, описанных в настоящей заявке, представляет собой:
(E),
, его стереоизомеры или фармацевтически приемлемые соли и сольваты.
[0206] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, соединения, походящие для применения в способе согласно настоящему изобретению, включают соединения формулы (VII):
(VII),
где,
1
7
V представляет собой N или CR,
2
2
1
2
V представляет собой N или CR, при условии что когда V представляет собой N, V представляет собой N,
1
8
2
8
2
8
3
8
3
8
1
8
2
8
5
8
5
8
1
8
2
8
6
10
1
8
2
8
1
8
2
8
1
8
2
8
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
a
a
a
b
X и Z независимо выбраны из группы, состоящей из водорода, (C-C)алкила, (C-C)алкенила, (C-C)алкинила, незамещенного или замещенного (C-C)циклоалкила, незамещенного или замещенного (C-C)циклоалкил-(C-C)алкила или -(C-C)алкенила, незамещенного или замещенного (C-C)циклоалкенила, незамещенного или замещенного (C-C)циклоалкенил-(C-C)алкила или -(C-C)алкенила, (C-C)бициклоалкила, незамещенного или замещенного гетероциклоалкила, незамещенного или замещенного гетероциклоалкил-(C-C)алкила или -(C-C)алкенила, незамещенного или замещенного арила, незамещенного или замещенного арил-(C-C)алкила или -(C-C)алкенила, незамещенного или замещенного гетероарила, незамещенного или замещенного гетероарил-(C-C)алкила или -(C-C)алкенила, галогена, циано,-COR, - COR, -CONRR, -CONRNRR, -SR, -SOR, -SOR, -SONRR, нитро, -NRR,-NRC(O)R, -NRC(O)NRR, -NRC(O)OR, -NRSOR, -NRSONRR, -NRNRR,-NRNRC(O)R, -NRNRC(O)NRR, -NRNRC(O)ORa, -OR, -OC(O)R и -OC(O)NRR;
Y представляет собой H или галоген;
1
a
a
a
b
a
a
b
1
8
2
8
2
8
3
8
3
8
1
8
2
8
5
8
5
8
1
8
2
8
6
10
2
8
1
8
1
8
2
8
1
8
2
8
2
R представляет собой (C-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, незамещенный или замещенный (C-C)циклоалкил, незамещенный или замещенный (C-C)циклоалкил-(C-C)алкил или -(C-C)алкенил, незамещенный или замещенный (C-C)циклоалкенил, незамещенный или замещенный (C-C)циклоалкенил-(C-C)алкил или -(C-C)алкенил, незамещенный или замещенный (C-C)бициклоалкил, незамещенный или замещенный гетероциклоалкил или -(C-C)алкенил, незамещенный или замещенный гетероциклоалкил-(C-C)алкил, незамещенный или замещенный арил, незамещенный или замещенный арил-(C-C)алкил или -(C-C)алкенил, незамещенный или замещенный гетероарил, незамещенный или замещенный гетероарил-(C-C)алкил или -(C-C)алкенил, -COR, -COR, -CONRR, -CONRNRR;
2
1
8
1
8
1
3
R представляет собой водород, (C-C)алкил, трифторметил, алкокси или галоген, в котором указанный (C-C)алкил необязательно содержит в качестве заместителя от одной до двух групп, выбранных из амино и (C-C)алкиламино;
7
1
3
R представляет собой водород, (C-C)алкил или алкокси;
3
a
b
1
8
R представляет собой водород, (C-C)алкил, циано, трифторметил, -NRR или галоген;
6
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
a
a
a
a
b
1
8
2
8
2
8
3
8
3
8
1
8
5
8
5
8
1
8
6
10
1
8
1
8
1
8
2
2
2
2
2
R выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, (C-C)алкила, (C-C)алкенила, (C-C)алкинила, незамещенного или замещенного (C-C)циклоалкила, незамещенного или замещенного (C-C)циклоалкил-(C-C)алкила, незамещенного или замещенного (C-C)циклоалкенила, незамещенного или замещенного (C-C)циклоалкенил-(C-C)алкила, (C-C)бициклоалкила, незамещенного или замещенного гетероциклоалкила, незамещенного или замещенного гетероциклоалкил-(C-C)алкила, незамещенного или замещенного арила, незамещенного или замещенного арил-(C-C)алкила, незамещенного или замещенного гетероарила, незамещенного или замещенного гетероарил-(C-C)алкила, циано, -COR, -COR,-CONRR, -CONRNRR, -SR, -SOR, -SOR, -SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R,-NRC(O)NRR, -NRC(O)OR, -NRSOR, -NRSONRR, -NRNRR, -NRNRC(O)R,-NRNRC(O)NRR, -NRNRC(O)OR, -OR, -OC(O)R, -OC(O)NRR;
1
8
2
8
2
8
1
6
1-2
1
6
1-2
1
6
1-2
1
8
3
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
2
1
4
1
4
c
c
c
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
где любая указанная (C-C)алкильная, (C-C)алкенильная, (C-C)алкинильная, циклоалкильная, циклоалкенильная, бициклоалкильная, гетероциклоалкильная, арильная или гетероарильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из группы, состоящей из -O(C-C)алкила(R), -S(C-C)алкила(R), -(C-C)алкила(R), -(C-C)алкилгетероциклоалкила, (C-C)циклоалкилгетероциклоалкила, галогена, (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR,- CONRR, -SR, -SOR, -SOR, -SONRR, нитро, -NRR,-NRC(O)R, -NRC(O)NRR, -NRC(O)OR, -NRSOR, -NRSONRR, -OR, -OC(O)R, OC(O)NRR, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арил(C-C)алкила и гетероарил(C-C)алкила;
1
4
1
4
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
где любой арильный или гетероарильный фрагмент указанного арила, гетероарила, арил(C-C)алкила или гетероарил(C-C)алкила необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из группы, состоящей из галогена, (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR, -CONRR,-SR,-SOR., -SOR, -SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R,-NRC(O)NRR,-NRC(O)OR, -NRSO2R, -NRSONRR, -OR, -OC(O)R, и -OC(O)NRR;
a
b
1
8
2
8
2
8
3
8
5
8
6
10
1
8
2
8
2
8
1
4
1
4
1
4
1
4
2
2
1
4
2
1
4
1
4
1
4
2
1
4
2
2
2
1
4
2
1
4
1
4
каждый из R и Rнезависимо представляет собой водород, (C-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, (C-C)циклоалкил, (C-C)циклоалкенил, (C-C)бициклоалкил, гетероциклоалкил, арил или гетероарил, где указанная (C-C)алкильная, (C-C)алкенильная, (C-C)алкинильная, циклоалкильная, циклоалкенильная, бициклоалкильная, гетероциклоалкильная, арильная или гетероарильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из галогена, гидроксила, (C-C)алкокси, амино, (C-C)алкиламино, ((C-C)алкил)((C-C)алкил)амино, -COH, -CO(C-C)алкила, -CONH,-CONH(C-C)алкила,-CON((C-C)алкил)((C-C)алкила), -SO(C-C)алкила, -SONH,-SONH(C-C)алкила и SON((C-C)алкил)((C-C)алкила);
a
b
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
3
8
или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-8-членное насыщенное или ненасыщенное кольцо, необязательно содержащее дополнительный гетероатом, выбранный из кислорода, азота и серы, где указанное кольцо необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)галогеналкила, амино, (C-C)алкиламино, ((C-C)алкил)((C-C)алкил)амино, гидроксила, оксо, (C-C)алкокси и (C-C)алкокси(C-C)алкила, где указанное кольцо необязательно конденсировано с (C-C)циклоалкильным, гетероциклоалкильным, арильным или гетероарильным кольцом;
a
b
3
8
или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 6 - 10-членную мостиковую бициклическую кольцевую систему, необязательно конденсированную с (C-C)циклоалкильным, гетероциклоалкильным, арильным или гетероарильным кольцом;
c
a
b
a
a
a
a
a
b
a
1
4
2
2
каждый R представляет собой независимо (C-C)алкиламино, -NRSO2R, -SOR, -SOR,-NRC(O)OR, -NRR или -COR;
или их соли.
Подгруппы соединений, которые включены в общую структуру формулы (I), являются такими, как следует далее:
Подгруппа A формулы (VII)
1
8
3
8
a
b
a
X и Z выбраны из группы, состоящей из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, -NRR и -OR;
Y представляет собой H или F;
1
1
8
3
8
R выбран из группы, состоящей из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, гетероциклоалкила, арила и гетероарила;
2
1
8
1
8
1
3
R представляет собой водород, (C-C)алкил, трифторметил, алкокси или галоген, где указанный (C-C)алкил необязательно содержит в качестве заместителя от одной до двух групп, выбранных из амино и (C-C)алкиламино;
7
1
3
R представляет собой водород, (C-C)алкил или алкокси;
3
a
b
1
8
R выбран из группы, состоящей из водорода, (C-C)алкила, циано, трифторметила,-NRR и галогена;
6
a
a
b
a
b
1
8
3
8
2
8
2
2
2
R выбран из группы, состоящей из водорода, галогена, циано, трифторметила, амино, (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила; арила, гетероарила, ациламино; (C-C)алкинила, арилалкинила, гетероарилалкинила; -SOR; -SONRR, и -NRSOR ;
1
8
3
8
2
8
1
6
1-2
1
6
1-2
1
6
1-2
1
8
3
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
2
1
4
1
4
c
c
c
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
где любая (C-C)алкильная, (C-C)циклоалкильная, (C-C)алкинильная, арилалкинильная, гетероарилалкинильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из -O(C-C)алкила(R), -S(C-C)алкила(R), -(C-C)алкила(R), -(C-C)алкилгетероциклоалкила, (C-C)циклоалкилгетероциклоалкила, галогена, (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR, -CONRR, -SR, -SOR, -SOR,-SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)NRR, -NRC(O)OR,-NRSOR, - NRSONRR, -OR, -OC(O)R, -OC(O)NRR, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арил(C-C)алкила и гетероарил(C-C)алкила;
a
b
1
8
2
8
2
8
3
8
5
8
6
10
1
8
2
8
2
8
1
4
1
4
1
4
1
4
2
2
1
4
2
1
4
1
4
1
4
2
1
4
2
2
2
1
4
2
1
4
1
4
каждый из R и R независимо представляет собой водород, (C-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, (C-C)циклоалкил, (C-C)циклоалкенил, (C-C)бициклоалкил, гетероциклоалкил, арил или гетероарил, где указанная (C-C)алкильная, (C-C)алкенильная, (C-C)алкинильная, циклоалкильная, циклоалкенильная, бициклоалкильная, гетероциклоалкильная, арильная или гетероарильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из галогена, гидроксила, (C-C)алкокси, амино, (C-C)алкиламино, ((C-C)алкил)((C-C)алкил)амино, -COH, -CO(C-C)алкила, -CONH, -CONH(C-C)алкила, -CON((C-C)алкил)((C-C)алкила), -SO(C-C)алкила, -SONH,-SONH(C-C)алкила, и-SON((C-C)алкил)((C-C)алкила);
a
b
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
3
8
или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-8-членное насыщенное или ненасыщенное кольцо, необязательно содержащее дополнительный гетероатом, выбранный из атома кислорода, азота и серы, где указанное кольцо необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)галогеналкила, амино, (C-C)алкиламино, ((C-C)алкил)((C-C)алкил)амино, гидроксила, оксо, (C-C)алкокси и (C-C)алкокси(C-C)алкила, где указанное кольцо необязательно конденсировано с (C-C)циклоалкильным, гетероциклоалкильным, арильным или гетероарильным кольцом;
a
b
3
8
или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 6 - 10-членную мостиковую бициклическую кольцевую систему, необязательно конденсированную с (C-C)циклоалкильным, гетероциклоалкильным, арильным или гетероарильным кольцом. Арильная или гетероарильная группа в указанной конкретной подгруппе A независимо выбрана из группы, состоящей из фурана, тиофена, пиррола, оксазола, тиазола, имидазола, пиразола, оксадиазола, тиадиазола, триазола, тетразола, бензoфурана, бензoтиофена, бензоксазола, бензoтиазола, фенила, пиридина, пиридазина, пиримидина, пиразина, триазина, тетразина, хинолина, циннолина, хиназолина, хиноксалина и нафтиридина или другой арильной или гетероарильной группы, следующей далее:
,
где в формуле (1)
1
8
A представляет собой O, NH или S; B представляет собой CH или N, и C представляет собой водород или C-C алкил; или
,
где в формуле (2)
1
8
D представляет собой N или C, необязательно содержащий в качестве заместителя водород или C-C алкил; или
,
где в формуле (3)
2
2
E представляет собой NH или CH; F представляет собой O или CO; и G представляет собой NH или CH; или
,
где в формуле (4)
J представляет собой O, S или CO; или
,
где в формуле (5)
Q представляет собой CH или N;
M представляет собой CH или N; и
1
8
3
8
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
L/(5) представляет собой водород, галоген, амино, циано, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, -COR, -COR, -CONRR, -CONRNRR, -SOR, -SONRR, -NRR, -NRC(O)R,-NRSOR,-NRSONRR, -NRNRR, -NRNRC(O)R, -NRNRC(O)NRR или -OR,
1
8
3
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
b
где любая (C-C)алкильная или (C-C)циклоалкильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR, -CONRR, -SR, -SOR,-SOR, -SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)NRR, -NRC(O)OR,-NRSOR, -NRSONRR, -OR, -OC(O)R и -OC(O)NRR; где R и R являются такими, как определено выше; или
,
где в формуле (6)
2
L/(6) представляет собой NH или CH; или
,
где в формуле (7)
1
8
3
8
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
M/(7) представляет собой водород, галоген, амино, циано, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, гетероциклоалкил, -COR, -COR, -CONRR, -CONRNRR, -SOR, -SONRR,-NRR, -NRC(O)R,-NRSOR, -NRSONRR, -NRNRR, -NRNRC(O)R,-NRNRC(O)NRR или -OR,
1
8
3
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
b
где любая (C-C)алкильная, (C-C)циклоалкильная или гетероциклоалкильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR,-CONRR, -SR, -SOR, -SOR, -SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R,-NRC(O)NRR, -NRC(O)OR, -NRSOR, -NRSONRR, -OR, -OC(O)R и-OC(O)NRR; где R и R являются такими, как определено выше; или
,
где в формуле (8)
2
P представляет собой CH, NH, O или S; Q/(8) представляет собой CH или N; и n равен 0-2; или
,
где в формуле (9)
S/(9) и T/(9) представляют собой C, или S/(9) представляет собой C, и T/(9) представляет собой N, или S/(9) представляет собой N, и T/(9) представляет собой C;
R представляет собой водород, амино, метил, трифторметил или галоген;
1
8
3
8
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
b
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
U представляет собой водород, галоген, амино, циано, нитро, трифторметил, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, -COR, -COR, -CONRR, -SOR, -SONRR, -NRR, -NRC(O)R,-NRSOR,-NRSONRR, -NRNRR, -NRNRC(O)R, -OR или 4-(1H-пиразол-4-ил),
1
8
3
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
b
где любая (C-C)алкильная или (C-C)циклоалкильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR, -CONRR, -SR, SOR,-SOR, -SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)NRR, -NRC(O)OR,-NRSOR, -NRSONRR, -OR, - OC(O)R и -OC(O)NRR; где R и R являются такими, как определено выше.
Подгруппа B формулы (VII)
1
8
3
8
a
b
a
X и Z независимо выбраны из группы, состоящей из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, -NRR и -OR;
Y представляет собой H;
1
1
8
3
8
R представляет собой (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил или гетероциклоалкил;
2
1
3
1
3
1
3
R представляет собой водород, (C-C)алкил или галоген, где указанный (C-C)алкил необязательно содержит в качестве заместителя от одной до двух групп, выбранных из амино и (C-C)алкиламино;
7
1
3
R представляет собой водород, (C-C)алкил или алкокси;
3
1
8
R представляет собой водород, (C-C)алкил или галоген;
6
a
a
b
a
b
1
8
3
8
2
8
2
2
2
R представляет собой водород, галоген, циано, трифторметил, амино, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, арил, гетероарил, ациламино; (C-C)алкинил, арилалкинил, гетероарилалкинил, -SOR, -SONRR или -NRSOR;
1
8
3
8
2
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
2
1
4
1
4
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
где любая (C-C)алкильная, (C-C)циклоалкильная, (C-C)алкинильная, арилалкинильная или гетероарилалкинильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из галогена, (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR, -CONRR, -SR, -SOR, -SOR, - SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)NRR, -NRC(O)OR, -NRSOR,-NRSONRR, -OR, -OC(O)R, -OC(O)NRR, гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арил(C-C)алкила и гетероарил(C-C)алкила;
a
b
1
8
2
8
2
8
3
8
5
8
6
10
1
8
2
8
2
8
1
4
1
4
1
4
1
4
2
2
1
4
2
1
4
1
4
1
4
2
1
4
2
2
2
1
4
2
1
4
1
4
каждый из R иR независимо представляет собой водород, (C-C)алкил, (C-C)алкенил, (C-C)алкинил, (C-C)циклоалкил, (C-C)циклоалкенил, (C-C)бициклоалкил, гетероциклоалкил, арил или гетероарил, где указанная (C-C)алкильная, (C-C)алкенильная, (C-C)алкинильная, циклоалкильная, циклоалкенильная, бициклоалкильная, гетероциклоалкильная, арильная или гетероарильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из галогена, гидроксила, (C-C)алкокси, амино, (C-C)алкиламино, ((C-C)алкил)((C-C)алкил)амино, -COH, -CO(C-C)алкила, -CONH,-CONH(C-C)алкила,-CON((C-C)алкил)((C-C)алкила), -SO(C-C)алкила, -SONH, -SONH(C-C)алкила и-SON((C-C)алкил)((C-C)алкила);
a
b
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
3
8
или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 5-8-членное насыщенное или ненасыщенное кольцо, необязательно содержащее дополнительный гетероатом, выбранный из атома кислорода, азота и серы, где указанное кольцо необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)галогеналкила, амино, (C-C)алкиламино, ((C-C)алкил)((C-C)алкил)амино, гидроксила, оксо, (C-C)алкокси и (C-C)алкокси(C-C)алкила, где указанное кольцо необязательно конденсировано с (C-C)циклоалкильным, гетероциклоалкильным, арильным или гетероарильным кольцом;
a
b
3
8
или R и R вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 6-10-членную мостиковую бициклическую кольцевую систему, необязательно конденсированную с (C-C)циклоалкильным, гетероциклоалкильным, арильным или гетероарильным кольцом. Арил и гетероарил в указанном определении выбраны из группы, состоящей из фурана, тиофена, пиррола, оксазола, тиазола, имидазола, пиразола, оксадиазола, тиадиазола, триазола, тетразола, бензoфурана, бензoтиофена, бензоксазола, бензoтиазола, фенила, пиридина, пиридазина, пиримидина, пиразина, триазина, тетразина, хинолина, циннолина, хиназолина, хиноксалина и нафтиридина или соединения, представляющего собой другую арильную или гетероарильную группу, следующую далее:
,
где в формуле (1)
1
8
A представляет собой O, NH или S; B представляет собой CH или N, и C представляет собой водород или C-C алкил; или
,
где в формуле (2),
1
8
D представляет собой N или C, необязательно содержащий в качестве заместителя водород или C-Cалкил; или
,
где в формуле (3)
2
2
E представляет собой NH или CH; F представляет собой O или CO; и G представляет собой NH или CH; или
,
где в формуле (4)
J представляет собой O, S или CO; или
,
где в формуле (5)
Q представляет собой CH или N;
M представляет собой CH или N; и
1
8
3
8
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
L/(5) представляет собой водород, галоген, амино, циано, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, -COR, -COR,-CONRR, -CONRNRR, -SOR, -SONRR, -NRR, -NRC(O)R,-NRSOR,-NRSONRR, -NRNRR, -NRNRC(O)R, -NRNRC(O)NRR или -OR,
1
8
3
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
где любая указанная (C-C)алкильная, (C-C)циклоалкильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR, -CONRR, -SR, -SOR, -SOR, -SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)NRR, -NRC(O)OR, NRSOR, -NRSONRR, -OR, -OC(O)R и -OC(O)NRR,
a
b
где R и R являются такими, как определено выше; или
,
где в формуле (6)
2
L/(6) представляет собой NH или CH; или
,
где в формуле (7)
1
8
3
8
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
M/(7) представляет собой водород, галоген, амино, циано, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, гетероциклоалкил, -COR, -COR, -CONRR, -CONRNRR, -SOR, -SONRR,-NRR, -NRC(O)R, -NRSOR, -NRSONRR, -NRNRR, -NRNRC(O)R,-NRNRC(O)NRR или -OR,
1
8
3
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
b
где любая указанная (C-C)алкильная, (C-C)циклоалкильная, гетероциклоалкильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR, - CONRR, -SR, -SOR, -SOR, -SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R, NRC(O)NRR, -NRC(O)OR, -NRSOR, -NRSONRR, -OR, -OC(O)R, -OC(O)NRR; где R и R являются такими, как определено выше; или
,
где в формуле (8)
2
P представляет собой CH, NH, O или S; Q/(8) представляет собой CH или N; и n равен 0-2; или
,
где в формуле (9)
S/(9) и T/(9) представляют собой C, или S/(9) представляет собой C, и T/(9) представляет собой N, или S/(9) представляет собой N, и T/(9) представляет собой C;
R представляет собой водород, амино, метил, трифторметил, галоген;
1
8
3
8
2
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
b
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
a
a
b
a
U представляет собой водород, галоген, амино, циано, нитро, трифторметил, (C-C)алкил, (C-C)циклоалкил, -COR, -COR, -CONRR, -SOR, -SONRR, -NRR, -NRC(O)R,-NRSOR,-NRSONRR, -NRNRR, -NRNRC(O)R, -OR,or 4-(1H-пиразол-4-ил),
1
8
3
8
1
6
3
8
5
8
1
6
2
2
2
2
a
a
a
b
a
a
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
a
a
b
a
a
b
a
a
a
b
где любая указанная (C-C)алкильная или (C-C)циклоалкильная группа необязательно содержит в качестве заместителя 1, 2 или 3 группы, независимо выбранные из (C-C)алкила, (C-C)циклоалкила, (C-C)циклоалкенила, (C-C)галогеналкила, циано, -COR, -COR,-CONRR,-SOR,-SOR,-SONRR, нитро, -NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)NRR, -NRC(O)OR, -NRSOR,-NRSO2NRR, -OR, -OC(O)R и -OC(O)NRR, где Ra и Rb являются такими, как определено выше.
[0207] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, ингибитор EZH2 представляет собой:
(G), его стереоизомеры или фармацевтически приемлемую соль или сольват.
[0208] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, ингибитор EZH2 представляет собой
(H), его стереоизомеры или фармацевтически приемлемую соль или сольват.
[0209] Соединения, описанные в настоящей заявке, можно синтезировать в соответствии с любым способом, известным в данной области техники. Например, соединения, имеющие формулу (VII), можно синтезировать в соответствии со способами, описанными в международных публикациях WO 2011/140325; WO 2011/140324 и WO 2012/005805, каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.
1
2
3
4
5
6
1
6
1
2
3
4
5
6
3
4
5
6
[0210] Предполагается, что при использовании в настоящей заявке термин «алкил», «C, C, C, C, C или C алкил» или «C-C алкил» включает C, C, C, C, C или C насыщенную алифатическую углеводородную группу с прямой (линейной) цепью и C, C, C или C насыщенную алифатическую углеводородную группу с разветвленной цепью. Например, предполагается, что C1-C6 алкил включает C1, C2, C3, C4, C5 и C6 алкильные группы. Примеры алкила включают фрагменты, содержащие от одного до шести атомов углерода, включая, но не ограничиваясь указанными, метил, этил, н-пропил, изо-пропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил, втор-пентил или н-гексил.
1
6
3
6
[0211] Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, алкил с прямой или разветвленной углеводородной цепью содержит шесть, или меньше, атомов углерода (например, C-C в случае алкила с прямой углеводородной цепью, C-C в случае алкила с разветвленной углеводородной цепью). Согласно другому варианту реализации изобретения, алкил с прямой или разветвленной углеводородной цепью содержит четыре, или меньше, атомов углерода.
3
10
[0212] При использовании в настоящей заявке, термин «циклоалкил» относится к насыщенной или ненасыщенной неароматической углеводородной одно- или многокольцевой системе (например, конденсированным, мостиковым или спиро-кольцам), содержащей от 3 до 30 атомов углерода (например, C-C). Примеры циклоалкила включают, но не ограничиваются указанными, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклооктил, циклопентенил, циклогексенил, циклогептенил и адамантил. Термин «гетероциклоалкил» относится к насыщенной или ненасыщенной неароматической 3-8-членной моноциклической, 7-12-членной бициклической (конденсированным, мостиковым или спиро-кольцам) или 11-14-членной трициклической системе колец (конденсированным, мостиковым или спиро кольцам), содержащей один или более гетероатомов (таких как O, N, S или Se), если иное специально не указано. Примеры гетероциклоалкильных групп включают, но не ограничиваются указанными, пиперидинил, пиперазинил, пирролидинил, диоксанил, тетрагидрофуранил, изоиндолинил, индолинил, имидазолидинил, пиразолидинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, триазолидинил, тетрагидрофуранил, оксиранил, азетидинил, оксетанил, тиетанил, 1,2,3,6-тетрагидропиридинил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, пиранил, морфолинил, 1,4-диазепанил, 1,4-оксазепанил, 2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептанил, 2,5-диазабицикло[2.2.1]гептанил, 2-окса-6-азаспиро[3.3]гептанил, 2,6-диазаспиро[3.3]гептанил, 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]деканил и т.д.
[0213] Термин «необязательно замещенный алкил» относится к незамещенному алкилу или алкилу, содержащему обозначенные заместители, замещающие один или более атомов водорода на одном или более атомах углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонато, фосфинато, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент.
[0214] «Арилалкильный» или «аралкильный» фрагмент представляет собой алкил, содержащий в качестве заместителя арил (например, фенилметил (бензил)). «Алкиларильный» фрагмент представляет собой арил, содержащий в качестве заместителя алкил (например, метилфенил).
1
2
3
4
5
6
3
4
5
6
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
[0215] При использовании в настоящей заявке предполагается, что «алкильный линкер» включает C, C, C, C, C или C насыщенную бивалентную алифатическую углеводородную группу с прямой (линейной) углеводородной цепью и C, C, C или Cнасыщенную алифатическую углеводородную группу с разветвленной углеводородной цепью. Например, предполагается, что C1-C6 алкильный линкер включает C1, C2, C3, C4, C5 и C6 алкильные линкерные группы. Примеры алкильного линкера включает фрагменты, содержащие от одного до шести атомов углерода, включая, но не ограничиваясь указанными, метил (-CH-), этил (-CHCH-), н-пропил (-CHCHCH-), изо-пропил (-CHCHCH-), н-бутил (-CHCHCHCH-), втор-бутил (-CHCHCHCH-), и-бутил (-C(CH)CH-), н-пентил (-CHCHCHCHCH-), втор-пентил (-CHCHCHCHCH-) или н-гексил (-CHCHCHCHCHCH-).
2
6
3
6
2
6
3
6
[0216] «Алкенил» включает ненасыщенные алифатические группы, аналогичные описанным выше алкилам по длине и возможным заместителям, но содержащие по меньшей мере одну двойную связь. Например, термин «алкенил» включает алкенильные группы с прямой углеводородной цепью (например, этенил, пропенил, бутенил, пентенил, гексенил, гептенил, октенил, ноненил, деценил) и алкенильные группы с разветвленной углеводородной цепью. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, алкенильная группа с прямой или разветвленной углеводородной цепью содержит шесть или менее атомов углерода в углеводородном скелете (например, C-C в случае алкенила с прямой углеводородной цепью, C-Cв случае алкенила с разветвленной углеводородной цепью). Термин «C-C» включает алкенильные группы, содержащие от двух до шести атомов углерода. Термин «C-C» включает алкенильные группы, содержащие от трех до шести атомов углерода.
[0217] Термин «необязательно замещенный алкенил» относится к незамещенному алкенилу или алкенилу, содержащему обозначенные заместители, замещающие один или более атомов водорода на одном или более атомах углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонато, фосфинато, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент.
2
6
3
6
2
6
3
6
[0218] Термин «алкинил» включает ненасыщенные алифатические группы, аналогичные описанным выше алкилам по длине и возможным заместителям, но содержащие по меньшей мере одну тройную связь. Например, «алкинил» включает алкинильные группы с прямой углеводородной цепью (например, этинил, пропинил, бутинил, пентинил, гексинил, гептинил, октинил, нонинил, децинил) и алкинильные группы с разветвленной углеводородной цепью. Согласно некоторым вариантам реализации изобретения, алкинильная группа с прямой или разветвленной углеводородной цепью содержит шесть или менее атомов углерода в углеводородном скелете (например, C-C в случае алкинила с прямой углеводородной цепью, C-C в случае алкинила с разветвленной углеводородной цепью). Термин «C-C» включает алкинильные группы, содержащие от двух до шести атомов углерода. Термин «C-C» включает алкинильные группы, содержащие от трех до шести атомов углерода.
[0219] Термин «необязательно замещенный алкинил» относится к незамещенному алкинилу или алкинилу, содержащему обозначенные заместители, замещающие один или более атомов водорода на одном или более атомах углерода углеводородного скелета. Такие заместители могут включать, например, алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонато, фосфинато, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино, и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил, и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент.
[0220] Другие необязательно замещенные фрагменты (такие как необязательно замещенный циклоалкил, гетероциклоалкил, арил или гетероарил) включают как незамещенные фрагменты, так и фрагменты, содержащие один или более обозначенных заместителей. Например, замещенный гетероциклоалкил включает гетероциклоалкилы, содержащие в качестве заместителя одну или более алкильных групп, такие как 2,2,6,6-тетраметилпиперидинил и 2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,6-тетрагидропиридинил.
[0221] Термин «арил» включает ароматические группы, включая «конъюгированные» или мультициклические системы, которые содержат по меньшей мере одно ароматическое кольцо и не содержат какой-либо гетероатом в структуре кольца. Примеры включают фенил, бензил, 1,2,3,4-тетрагидронафталинил и т.д.
p
[0222] «Гетероарильные» группы представляют собой арильные группы, как определено выше, за исключением групп, содержащих от одного до четырех гетероатомов в структуре кольца, и также могут называться «арилгетероциклами» или «гетероароматическими группами». Предполагается, что при использовании в настоящей заявке, термин «гетероарил» включает стабильное 5-, 6- или 7-членное моноциклическое или 7-, 8-, 9-, 10-, 11- или 12-членное бициклическое ароматическое гетероциклическое кольцо, которое состоит из атомов углерода и одного или более гетероатомов, например, 1 или 1-2 или 1-3 или 1-4 или 1-5 или 1-6 гетероатомов, или, например¸1, 2, 3, 4, 5 или 6 гетероатомов, независимо выбранных из группы, состоящей из атомов азота, кислорода и серы. Атом азота может быть замещенным или незамещенным (т.е. представлять собой N или NR, где R представляет собой H или другие заместители, как определено в настоящей заявке). Гетероатом азота и серы может необязательно быть оксилен (т.е. представлять собой N→O и S(O), где p = 1 или 2). Следует отметить, что общее количество атомов S и O в ароматическом гетероцикле составляет не более 1.
[0223] Примеры гетероарильных групп включают пиррол, фуран, тиофен, тиазол, изотиазол, имидазол, триазол, тетразол, пиразол, оксазол, изоксазол, пиридин, пиразин, пиридазина, пиримидин и т.д.
[0224] Более того, термины «арил» и «гетероарил» включают мультициклические арильные и гетероарильные группы, например, трициклические, бициклические, например, нафталин, бензоксазол, бензoдиоксазол, бензoтиазол, бензoимидазол, бензoтиофен, метилендиоксифенил, хинолин, изохинолин, нафтиридин, индол, бензoфуран, пурин, бензoфуран, деазапурин, индолизин.
[0225] В случае мультициклических ароматических колец только одно из колец должно быть ароматическим (например, 2,3-дигидроиндол),  тем не менее, все кольца могут быть ароматическими (например, хинолин). Второе кольцо также может являться конденсированном или мостиковым.
[0226] Циклоалкильное, гетероциклоалкильное, арильное или гетероарильное кольцо может содержать в одном или более положениях кольца (например, на образующем кольцо атоме углерода или гетероатоме, таком как N) такие заместители, как описано выше, например, алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкокси, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, алкиламинокарбонил, аралкиламинокарбонил, алкениламинокарбонил, алкилкарбонил, арилкарбонил, аралкилкарбонил, алкенилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкилтиокарбонил, фосфат, фосфонато, фосфинато, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент. Арильные и гетероарильные группы также могут являться конденсированными или мостиковыми группами с алициклическими или гетероциклическими кольцами, которые не являются ароматическими и образуют мультициклическую систему (например, тетралин, метилендиоксифенил).
3
14
[0227] Предполагается, что при использовании в настоящей заявке, термин «карбоцикл» или «карбоциклическое кольцо» включает любое стабильное моноциклическое, бициклическое или трициклическое кольцо, содержащее определенное количество атомов углерода, любое из которых может быть насыщенным, ненасыщенным или ароматическим. Карбоцикл включает циклоалкил и арил. Например, предполагается, что C-C карбоцикл включает моноциклическое, бициклическое или трициклическое кольцо, содержащее 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 атомов углерода. Примеры карбоциклов включают, но не ограничиваются указанными, циклопропил, циклобутил, циклобутенил, циклопентил, циклопентенил, циклогексил, циклогептенил, циклогептил, циклогептенил, адамантил, циклооктил, циклооктенил, циклооктaдиенил, флуоренил, фенил, нафтил, инданил, адамантил и тетрагидронафтил. Определение карбоцикла также включает мостиковые кольца, включая, например, [3.3.0]бициклооктан, [4.3.0]бициклононан, [4.4.0]бициклодекан и [2.2.2]бициклооктан. Мостиковое кольцо образуется, когда один или более атомов углерода связывает два не соседних атома углерода. Согласно одному варианту реализации изобретения, мостик в кольце образует один или два атома углерода. Следует отметить, что мостик всегда превращает моноциклическое кольцо в трициклическое кольцо. Когда кольцо представляет собой мостиковое кольцо, заместители, перечисленные для указанного кольца, также могут присутствовать на мостике. Конденсированные кольца (например, нафтил, тетрагидронафтил) и спиро-кольца также включены.
[0228] При использовании в настоящей заявке, «гетероцикл» или «гетероциклическая группа» включает любую кольцевую структуру (насыщенную, ненасыщенную или ароматическую), которая содержит по меньшей мере один гетероатом в кольце (например, N, O или S). Гетероцикл включает гетероциклоалкил и гетероарил. Примеры гетероциклов включают, но не ограничиваются указанными, морфолин, пирролидин, тетрагидротиофен, пиперидин, пиперазин, оксетан, пиран, тетрагидропиран, азетидин и тетрагидрофуран.
H
H
H
b
H
H
H
[0229] Примеры гетероциклических групп включают, но не ограничиваются указанными, акридинил, азоцинил, бензимидазолил, бензoфуранил, бензoтиофуранил, бензoтиофенил, бензоксазолил, бензоксазолинил, бензотиазолил, бензотриазолил, бензотетразолил, бензизоксазолил, бензизотиазолил, бензимидазолинил, карбазолил, 4a-карбазолил, карболинил, хроманил, хроменил, циннолинил, декагидрохинолинил, 2,6-1,5,2-дитиазинил, дигидрофуро[2.3-]тетрагидрофуран, фуранил, фуразанил, имидазолидинил, имидазолинил, имидазолил, 1-индазолил, индолнил, индолинил, индолизинил, индолил, 3H-индолил, изатиноил, изобензoфуранил, изохроманил, изоиндазолил, изоиндолинил, изоиндолил, изохинолинил, изотиазолил, изоксазолил, метилендиоксифенил, морфолинил, нафтиридинил, октaгидроизохинолинил, оксадиазолил, 1,2,3-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазолил, 1,2,5-оксадиазолил, 1,3,4-оксадиазолил, 1,2,4-оксадиазол5(4H)-он, оксазолидинил, оксазолил, оксиндолил, пиримидинил, фенантридинил, фенантролинил, феназинил, фенотиазинил, феноксатинил, феноксазинил, фталазинил, пиперазинил, пиперидинил, пиперидонил, 4-пиперидонил, пиперонил, птеридинил, пуринил, пиранил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолинил, пиразолил, пиридазинил, пиридооксазол, пиридоимидазол, пиридотиазол, пиридинил, пиридил, пиримидинил, пирролидинил, пирролинил, 2H-пирролил, пирролил, хиназолинил, хинолинил, 4-хинолизинил, хиноксалинил, хинуклидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидрохинолинил, тетразолил, 6-1,2,5-тиадиазинил, 1,2,3-тиадиазолил, 1,2,4-тиадиазолил, 1,2,5-тиадиазолил, 1,3,4-тиадиазолил, тиантренил, тиазолил, тиенил, тиенотиазолил, тиенооксазолил, тиеноимидазолил, тиофенил, триазинил, 1,2,3-триазолил, 1,2,4-триазолил, 1,2,5-триазолил, 1,3,4-триазолил и ксантенил.
[0230] Термин «замещенный» при использовании в настоящей заявке обозначает, что любой один или более атомов водорода на обозначенном замещен на группу, выбранную из указанных групп, при условии, что нормальная валентность обозначенного атома не превышается, и что замещение приводит к получению стабильного соединения. Когда заместитель представляет собой оксо или кето (т.е. =O), тогда замещены 2 атома водорода на указанном атоме. Кето заместители не присутствуют на ароматических фрагментах. Межкольцевые двойные связи при использовании в настоящей заявке представляют собой двойные связи, которые образованы между двумя соседними атомами кольца (например, C=C, C=N или N=N). Предполагается, что «стабильное соединение» и «стабильная структура» относится к соединению, которое является достаточно прочным для возможности его выделения из реакционной смеси с достижением приемлемой степени чистоты и получения в виде эффективного терапевтического агента.
[0231] Когда показано, то связь с заместителем пересекает связь, связывающую два атома в кольце, указанный заместитель может быть связан с любым атомом в кольце. Когда заместитель перечисляется без указания атома, через который указанный заместитель связан с остальной частью соединения данной формулы, то такой заместитель может быть связан через любой атом в такой формуле. Комбинации заместителей и/или переменных допускаются, при условии, что такие комбинации приводят к получению стабильных соединений.
1
1
1
1
1
[0232] Когда любая переменная (например, R) встречается более одного раза в любом элементе или формуле соединения, ее определение в каждом случае является независимым от определений в каждом другом случае. Таким образом, например, если показано, что группа содержит в качестве заместителя 0-2 фрагментов R, то группа может необязательно содержать в качестве заместителя до двух фрагментов R, и R в каждом случае независимо выбран из определения указанного R. Также комбинации заместителей и/или переменных допустимы, при условии, что такие комбинации приводят к получению стабильных соединений.
-
[0233] Термин «гидрокси» или «гидроксил» включает группы, содержащие -OH или -O.
[0234] При использовании в настоящей заявке, «гало» или «галоген» относится к фтору, хлору, брому и йоду. Термин «пергалогенизированный» в целом относится к фрагменту, в котором все атомы водорода замещены на атом галогена. Термин «галогеналкил» или «галогеналкоксил» относится к алкилу или алкоксилу, содержащему в качестве заместителя один или более атомов галогена.
[0235] Термин «карбонил» включает соединения и фрагменты, которые содержат атом углерода, связанный двойной связью с атомом кислорода. Примеры фрагментов, содержащих карбонил, включают, но не ограничиваются указанными, альдегиды, кетоны, карбоновые кислоты, амиды, сложные эфиры, ангидриды и т.д.
1
6
[0236] Термин «карбоксил» относится к группе –COOH или ее сложному C-C алкилэфиру.
[0237] Термин «ацил» включает фрагменты, которые содержат ацильный радикал (R-C(O)-) или карбонильную группу. «Замещенный ацил» включает ацильные группы, где один или более атомов водорода замещены, например, на алкильные группы, алкинильные группы, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонато, фосфинато, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматический или гетероароматический фрагмент.
[0238] «Ароил» включает фрагменты, содержащие арильный или гетероароматический фрагмент, связанный с карбонильной группой. Примеры ароильных групп включают фенилкарбокси, нафтилкарбокси и т.д.
[0239] «Алкоксиалкил», «алкиламиноалкил» и «тиоалкоксиалкил» включают алкильные группы, как описано выше, в которых атом кислорода, азота или серы замещает один или более атомов углерода углеводородного скелета.
[0240] Термин «алкокси» или «алкоксил» включает замещенные и незамещенные алкильные, алкенильные и алкинильные группы, ковалентно связанные с атомом кислорода. Примеры алкокси групп или алкоксильных радикалов включают, но не ограничиваются указанными, метокси, этокси, изопропилокси, пропокси, бутокси и пентокси группы. Примеры замещенных алкокси групп включают галогенизированные алкокси группы. Алкокси группы могут содержать в качестве заместителя такие группы, как алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, фосфат, фосфонато, фосфинато, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматические или гетероароматические фрагменты. Примеры галоген-замещенной алкокси группы включают, но не ограничиваются указанными, фторметокси, дифторметокси, трифторметокси, хлорметокси, дихлорметокси и трихлорметокси.
[0241] Термин «эфир» или «алкокси» включает соединения или фрагменты, которые содержат атом кислорода, связанный с двумя атомами углерода или гетероатомами. Например, термин включает «алкоксиалкил», который относится к алкильной, алкенильной или алкинильной группе, ковалентно связанной с атомом кислорода, который ковалентно связан с алкильной группой.
[0242] Термин «сложный эфир» включает соединения или фрагменты, которые содержат атом углерода или гетероатом, связанный с атомом кислорода, который связан с атомом углерода карбонильной группы. Термин «сложный эфир» включает алкоксикарбокси группы, такие как метоксикарбонил, этоксикарбонил, пропоксикарбонил, бутоксикарбонил, пентоксикарбонил и т.д.
[0243] Термин «тиоалкил» включает соединения или фрагменты, которые содержат алкильную группу, связанную с атомом серы. Тиоалкильные группы могут содержать в качестве заместителя группы, такие как алкил, алкенил, алкинил, галоген, гидроксил, алкилкарбонилокси, арилкарбонилокси, алкоксикарбонилокси, арилоксикарбонилокси, карбоксилат, карбоновая кислота, алкилкарбонил, арилкарбонил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, диалкиламинокарбонил, алкилтиокарбонил, алкоксил, амино (включая алкиламино, диалкиламино, ариламино, диариламино и алкилариламино), ациламино (включая алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоил и уреидо), амидино, имино, сульфгидрил, алкилтио, арилтио, тиокарбоксилат, сульфаты, алкилсульфинил, сульфонато, сульфамоил, сульфонамидо, нитро, трифторметил, циано, азидо, гетероциклил, алкиларил или ароматические или гетероароматические фрагменты.
[0244] Термин «тиокарбонил» или «тиокарбокси» включает соединения и фрагменты, которые содержат атом углерода, связанный двойной связью с атомом серы.
[0245] Термин «тиоэфир» включает фрагменты, которые содержат атом серы, связанный с двумя атомами углерода или гетероатомами. Примеры тиоэфиров включают, но не ограничиваются указанными, алктиоалкилы, алктиоалкенилы и алктиоалкинилы. Термин «алктиоалкил» включает фрагменты, алкильная, алкенильная или алкинильная группа которых связана с атомом серы, который связан с алкильной группой. Подобным образом, термин «алктиоалкенил» относится к фрагментам, в которых алкильная, алкенильная или алкинильная группа связана с атомом серы, который ковалентно связан с алкенильной группой; и термин «алктиоалкинилы» относится к фрагментам, в которых алкильная, алкенильная или алкинильная группа связана с атомом серы, который ковалентно связан с алкинильной группой.
2
2
2
[0246] При использовании в настоящей заявке, термин «aмин» или «амино» относится к незамещенному или замещенному -NH. «Алкиламино» включает группы соединений, в которых атом азота группы -NH связан по меньшей мере с одной алкильной группой. Примеры алкиламино групп включает бензиламино, метиламино, этиламино, фенэтиламино и т.д. «Диалкиламино» включает группы, в которых атом азота группы -NH связан по меньшей мере с двумя дополнительными алкильными группами. Примеры диалкиламино групп включают, но не ограничиваются указанными, диметиламино и диэтиламино. «Ариламино» и «диариламино» включает группы, в которые атом азота связан по меньшей мере с одной или двумя арильными группами, соответственно. Термины «аминоарил» и «аминоарилокси» относятся к арилу и арилокси, содержащим в качестве заместителя амино. Термины «алкилариламино» «алкиламиноарил» или «ариламиноалкил» относятся к амино группе, которая связана по меньшей мере с одной алкильной группой и по меньшей мере с одной арильной группой. «Алкаминоалкил» относится к алкильной, алкенильной или алкинильной группе, связанной с атомом азота, который также связан с алкильной группой. «Ациламино» включает группы, в которых атом азота связан с ацильной группой. Примеры ациламино включают, но не ограничиваются указанными, алкилкарбониламино, арилкарбониламино, карбамоильные и уреидо группы.
[0247] Термин «амид» или «аминокарбокси» включает соединения или фрагменты, которые содержат атом азота, который связан с атомом углерода карбонильной или тиокарбонильной группы. Термин включает группы «алкаминокарбокси», которые включают алкильные, алкенильные или алкинильные группы, связанные с аминогруппой, которая связана с атомом углерода карбонильной или тиокарбонильной группы. Указанный термин также включает группы «ариламинокарбокси», которые включают арильные или гетероарильные фрагменты, связанные с аминогруппой, которая связана с атомом углерода на карбонильной или тиокарбонильной группе. Термины «алкиламинокарбокси», «алкениламинокарбокси», «алкиниламинокарбокси» и «ариламинокарбокси» включают фрагменты, в которых алкильные, алкенильные, алкинильные и арильные фрагменты, соответственно, связаны с атомом азота, который в свою очередь связан с атомом углерода карбонильной группы. Амиды могут содержать заместители, такие как алкил с прямой углеводородной цепью, алкил с разветвленной углеводородной цепью, циклоалкил, арил, гетероарил или гетероцикл. Заместители на амидных группах также могут быть замещенными.
in vivo
[0248] В некоторых случаях в настоящей заявке структурная формула соединения представляет собой конкретный изомер для удобства, но настоящее изобретение включает все изомеры, такие как геометрические изомеры, оптические изомеры, образующиеся на основе ассиметричного атома углерода, стереоизомеры, таутомеры и т.д. Необходимо понимать, что не все изомеры могут иметь одинаковый уровень активности. Кроме того, соединения, представленные формулой, могут обладать кристаллическим полиморфизмом. Необходимо отметить, что любая кристаллическая форма, смесь кристаллических форм или ее ангидрид или гидрат включены в объем настоящего изобретения. Более того, объем настоящего изобретения включает так называемые метаболиты, которые получают в результате деградации соединения согласно изобретению .
[0249] Термин «изомерия» относится к соединениям, которые имеют идентичную молекулярную формулу, но различаются по последовательности связывания их атомов или организации их атомов в пространстве. Изомеры, которые отличаются организацией их атомов в пространстве, называются «стереоизомеры». Стереоизомеры, которые не являются зеркальными отображениями друг друга, называются «диастереоизомерами», и стереоизомеры, которые не являются совпадающими при наложении зеркальными отображениями друг друга, называются «энантиомерами» или иногда оптическими изомерами. Смесь, содержащая равное количество отдельных энантиомерных форм противоположной хиральности называется «рацемической смесью».
[0250] Атом углерода, связанный с четырьмя не одинаковыми заместителями, называется «хиральным центром».
Sequence Rule
et al
Angew. Chem. Интер. Edit.
et al
Angew. Chem.
J. Chem. Soc.
et al
Experientia
J. Chem. Educ,1
[0251] Термин «хиральный изомер» означает соединение, содержащее по меньшей мере один хиральный центр. Соединения, содержащие более чем один хиральный центр, могут существовать в виде отдельного диастереомера или в виде смеси диастереомеров, которая называется «диастереомерной смесью». В случае наличия одного хирального центра стереоизомер может характеризоваться абсолютной конфигурацией (R или S) указанного хирального центра. Абсолютная конфигурация относится к пространственной организации заместителей, присоединенных к указанному хиральному центру. Заместители, присоединенные к интересующему хиральному центру, классифицируют  в соответствии с источником of Cahn, Ingold, и Prelog. (Cahn ., 1966, 5, 385; errata 511; Cahn ., 1966, 78, 413; Cahn, и Ingold, 1951 (London), 612; Cahn ., 1956, 12, 81; Cahn, 964, 41, 116).
[0252] Термин «геометрический изомер» относится к диастереомерам, образованным в результате затрудненного вращения относительно двойных связей или циклоалкильного линкера (например, 1,3-циклобутила). Названия указанных конфигураций различаются по префиксам цис- и транс- или Z и E, которые указывают на расположение групп на одной или противоположных сторонах относительно двойной связи в молекуле в соответствии с правилами Кана-Ингольда-Прелога.
[0253] Необходимо понимать, что соединения согласно настоящему изобретению могут быть изображены в виде различных хиральных изомеров или геометрических изомеров. Также необходимо понимать, что когда соединения имеют хиральные изомерные или геометрические изомерные формы, предполагается, что все изомерные формы включены в объем настоящего изобретения, и название соединений не исключает любые изомерные формы. Необходимо понимать, что не все изомеры могут иметь одинаковый уровень активности.
[0254] Более того, структуры и другие соединения, описанные согласно настоящему изобретению, включают все их атропные изомеры. Необходимо понимать, что не все атропные изомеры могут иметь одинаковый уровень активности. «Атропные изомеры» представляют собой тип стереоизомеров, в которых атомы двух изомеров по-разному организованы в пространстве. Атропные изомеры существуют благодаря ограниченному вращению, вызванному затрудненным вращением больших групп вокруг центральной связи. Такие атропные изомеры, как правило, существуют в виде смеси, однако благодаря недавним усовершенствованиям хроматографических способов стало возможным разделение смеси двух атропных изомеров в определенных случаях.
[0255] «Таутомер» представляет собой один из двух или более структурных изомеров, которые существуют в равновесии и легко превращаются из одной изомерной формы в другую. Это превращение приводит к формальной миграции атома водорода, которая сопровождается перемещением прилежащих сопряженных двойных связей. Таутомеры существуют в виде смеси ряда таутомеров в растворе. В растворах, где возможна таутомеризация, достигается химическое равновесие таутомеров. Точное соотношение таутомеров зависит от нескольких факторов, включая температуру, растворитель и pH. Явление взаимного превращения таутомеров в результате таутомеризации называется таутомерией.
[0256] Из различных возможных типов таутомерии обычно встречаются два типа. В случае кето-енольной таутомерии происходит одновременное перемещение электронов и атома водорода. Циклоцепная таутомерия возникает в результате реагирования альдегидной группы (-CHO) в цепи молекулы сахара с одной из гидроксигрупп (-OH) в той же молекуле с получением ее циклической (кольцевой) формы, что наблюадется в случае глюкозы.
[0257] Общие таутомерные пары представляют собой: кетон-енол, амид-нитрил, лактам-лактим, амид-имидокислота в гетероциклических кольцах (например, в основаниях нуклеиновых кислот, таких как гуанин, тимин и цитозин), имин-енамин и енамин-енамин. Пример кето-енольного равновесия представляет собой равновесие между пиридин-2(1H)-онами и соответствующими пиридин-2-олами, как показано ниже.
Н
пиридин-2(1)-он                            пиридин-2-ол
[0258] Необходимо понимать, что соединения согласно настоящему изобретению могут быть изображены как различные таутомеры. Также необходимо понимать, что когда соединения имеют таутомерные формы, все указанные таутомерные формы включены в объем настоящего изобретения, и название соединений не исключает любую таутомерную форму. Необходимо понимать, что конкретные таутомеры могут иметь более высокий уровень активности по сравнению с другими.
[0259] Термин «кристаллические полиморфы», «полиморфы» или «кристаллические формы» обозначает структуры, в которых соединение (или его соль или сольват) может кристаллизоваться с получением различных схем упаковки кристаллов, все из которых имеют одинаковый элементарный состав. Различные кристаллические формы обычно имеют различную рентгеновскую дифракционную картину, ИК-спектр, температуры плавления, плотность, жесткость, форму кристалла, оптические и электрические свойства, стабильность и растворимость. Растворитель для перекристаллизации, скорость кристаллизации, температура хранения и другие факторы могут приводить к доминированию одной кристаллической формы. Кристаллические полиморфы соединений можно получить путем кристаллизации в различных условиях.
[0260] Соединения любой формулы, описанной в настоящей заявке, включает сами соединения, а также, если применимо, их соли и сольваты. Соль, например, может образовываться между анионом и положительно заряженной группой (например, амино группой) на бензоловом соединении, содержащем в качестве заместителя арил или гетероарил. Подходящие анионы включает хлорид, бромид, йодид, сульфат, бисульфат, сульфамат, нитрат, фосфат, цитрат, метансульфонат, трифторацетат, глутамат, глюкуронат, глутарат, малат, малеат, сукцинат, фумарат, тартрат, тозилат, салицилат, лактат, нафталинсульфонат и ацетат (например, трифторацетат). Термин «фармацевтически приемлемый анион» относится к аниону, подходящему для образования фармацевтически приемлемой соли. Подобным образом, соль также может образовываться между катионом и отрицательно заряженной группой (например, карбоксилатом) на бензоловом соединении, содержащем в качестве заместителя арил или гетероарил. Подходящие катионы включают ион натрия, ион калия, ион магния, ион кальция и катион аммония, такой как ион тетраметиламмония. Бензоловые соединения, содержащие в качестве заместителя арил или гетероарил, также включают соли, содержащие четвертичный атом азота.
[0261] Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению, например, соли соединений, могут существовать в любой гидратированной или негидратированной (безводной) форме или в виде сольватов с молекулами другого растворителя. Неограничивающие примеры гидратов включает моногидраты, дигидраты и т.д. Неограничивающие примеры сольватов включает сольваты с этанолом, сольваты с ацетоном и т.д.
2
[0262] Термин «сольват» обозначает формы присоединения растворителя, которые содержат либо стехиометрические, либо не стехиометрические количества растворителя. Некоторые соединения имеют тенденцию в кристаллическом твердом состоянии захватывать молекулы растворителя в фиксированном молярном отношении с образованием, таким образом, сольвата. Если растворитель представляет собой воду, образованный сольват представляет собой гидрат; если растворитель представляет собой спирт, образованный сольват представляет собой алколят. Гидраты образованы комбинацией одной или более молекул воды с одной молекулой вещества, где вода удерживается в молекулярном состоянии в виде HO.
[0263] При использовании в настоящей заявке термин «аналог» относится к химическому соединению, которое структурно подобно другому соединению, но незначительно отличается по составу (например, в результате замещения одного атома атомом другого элемента или в результате присутствия конкретной функциональной группы или замещения одной функциональной группы другой функциональной группой). Таким образом, аналог представляет собой соединение, которое подобно или сравнимо по функции и внешнему виду с контрольным соединением, но отличается по структуре или природе.
[0264] Как определено в настоящей заявке, термин «производное» относится к соединениям, которые имеют общую основную структуру и содержат в качестве заместителя различные группы, как описано в настоящей заявке. Например, все из соединений, представленных формулой (I), представляют собой бензольные соединения, содержащие в качестве заместителя арил или гетероарил, и содержат формулу (I) в качестве общей основной структуры.
Chem. Rev.
[0265] Термин «биоизостер» относится к соединению, которое получается в результате замены атома или группы атомов на другой достаточно похожий атом или группу атомов. Целью биоизстреического замещения является создание новых соединений, обладающих сходными биологическими свойствами с исходным соединением. Биоизостерическое замещение может иметь физико-химическую или топологическую природу. Примеры биоизостеров карбоновой кислоты включают, но не ограничиваются указанными, ацилсульфонимидны, тетразолы, сульфонаты и фосфонаты. См., например, Patani and LaVoie,  96, 3147-3176, 1996.
[0266] Предполагается, что настоящее изобретение включает все изотопы атомов, встречающихся в соединениях согласно настоящему изобретению. Изотопы включают атомы, имеющие одинаковое атомное число, но разное массовое число. В качестве общего неограничивающего примера, изотопы водорода включают тритий и дейтерий, и изотопы углерода включают C-13 и C-14.
[0267] Настоящее изобретение обеспечивает способы синтеза соединений любой формулы, описанной в настоящей заявке. Настоящее изобретение также обеспечивает подробное описание способов синтеза различных описанных соединений согласно настоящему изобретению в соответствии со следующими схемами, показанными в Примерах.
[0268] Когда в настоящем описании указано, что композиции имеют, содержат или включают конкретные компоненты, предполагается, что указанные композиции также по существу состоят из перечисленных компонентов. Подобным образом, когда указано, что способы или процессы имеют, включают или содержат конкретные этапы процесса, такие процессы также по существу состоят из или состоят из перечисленных этапов процесса. Кроме того, следует понимать, что порядок этапов или порядок осуществления конкретных действий является несущественным, при условии что указанный процесс приводит к соответсвующему результату. Более того, два или более этапов или действий можно осуществлять одновременно.
[0269] Синтетические процессы согласно изобретению могут допускать большое разнообразие функциональных групп, таким образом, можно замещать исходные материалы различными другими материалами. Процессы в целом приводят к получению желаемых конечных соединений в конце или почти в конце указанного процесса, несмотря на то что в определенных примерах может являться желательным дополнительно превращать соединение в фармацевтически приемлемую соль, полиморф или сольват.
March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure
Protective Groups in Organic Synthesis
Comprehensive Organic Transformations
Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis
Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis
th
rd
[0270] Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены различными способами с использованием коммерчески доступных исходных материалов, соединений, известных в литературе, или из легко получаемых промежуточных веществ с использованием стандартных синтетических способов и процедур, известных специалистам в данной области техники или очевидных специалистам в данной области техники в свете изложенного в настоящей заявке изобретения. Стандартные синтетические способы и процедуры для получения органических молекул и превращения и перемещения функциональных групп можно найти в подходящей научной литературе или в стандартных учебных пособиях, известных в данной области техники. Несмотря на то что указанная литература не ограничивается каким-либо одним или несколькими источниками, можно использовать такие классические тексты, как Smith, M. B., March, J., , 5 edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; Greene, T.W., Wuts, P.G. M., , 3 edition, John Wiley & Sons: New York, 1999; R. Larock, , VCH Publishers (1989); L. Fieser and M. Fieser, , John Wiley and Sons (1994); L. Paquette, ed., , John Wiley and Sons (1995), включенные в настоящую заявку посредством ссылки, и общепринятые  справочники по органическому синтезу, известные специалистам в данной области техники. Следующие описания способов синтеза приведены в качестве неограничивающих примеров общих способов получения соединений согласно настоящему изобретению.
[0271] Соединения согласно настоящему изобретению можно легко получать с помощью различных способов, известных специалисту в данной области техники. Соединения согласно настоящему изобретению, имеющие любую формулу, описанную в настоящей заявке, могут быть получены в соответствии со способами, проиллюстрированными на схемах 1-10 ниже, из коммерчески доступных исходных материалов или исходных материалов, которые могут быть получены с помощью способов, описанных в литературе. Группы Z и R (такие как R
R
, R
, R
, R
, R
и R
) в схемах 1-10 являются такими, как определено в любой формуле, описанной в настоящей заявке, если иное специально не указано.
2,
3
4
6
7
8
12
[0272] Специалисту в данной области техники ясно, что порядок определенных этапов, таких как введение и удаление защитных групп, в ходе последовательностей реакций и схем синтеза, описанных в настоящей заявке, может быть изменен.
[0273] Специалисту в данной области техники очевидно, что может быть необходимо защищать определенные группы от условий реакции путем использования защитных групп. Защитные группы также можно использовать для того, чтобы дифференцировать одинаковые функциональные группы в молекулах. Перечень защитных групп и способы их введения и удаления можно найти в источнике Greene, T.W., Wuts, P.G. M.,
, 3
edition, John Wiley & Sons:
, 1999.
Protective Groups in Organic Synthesis
rd
New York
[0274] Предпочтительные защитные группы включают, но не ограничиваются указанными:
[0275] Для гидроксильного фрагмента: TBS, бензил, ТГП, Ac
[0276] Для карбоновых кислот: сложный бензиловый эфир, сложный метиловый эфир, сложный этиловый эфир, сложный аллилэфир
[0277] Для aминов: Cbz, BOC, DMB
[0278] Для диолов: Ac (x2), TBS (x2) или ацетониды (при совместном использовании групп)
[0279] Для тиолов: Ac
[0280] Для бензимидазолов: SEM, бензил, PMB, DMB
[0281] Для альдегидов: диалкилацетали, такие как диметоксиацеталь или диэтилацетил.
[0282] В соответствии со схемами реакций, описанными в настоящей заявке, может быть получено множество стереоизомеров. Необходимо понимать, что если конкретный стереоизомер не указан, то предполагаются все возможные стереоизомеры, которые могут быть получены в результате реакции. Специалисту в данной области техники очевидно, что реакции можно оптимизировать для получения преимущественно одного изомера, или можно разработать новые схемы для получения одного изомера. В случае получения смесей для разделения изомеров можно использовать такие способы, как препаративная тонкослойная хроматография, препаративная ВЭЖХ, препаративная хиральная ВЭЖХ или препаративная СФХ.
[0283] Ниже приведены определения следующих сокращений, которые используются в настоящей заявке:
[0284] Ac[0284] Ac
ацетил
[0285] AcOH[0285] AcOH
уксусная кислота
[0286] aq.[0286] aq.
водный
[0287] BID или b.i.d.[0287] BID или b.i.d.
два раза в день (bis in die, <i>лат.</i>)
[0288] BOC[0288] BOC
трет-бутоксикарбонил
[0289] Cbz[0289] Cbz
бензилоксикарбонил
[0290] CDCl[0290] CDCl<sub>3</sub>
дейтерированный хлороформ
[0291] CH[0291] CH<sub>2</sub>Cl<sub>2</sub>
дихлорметан
[0292] ДХМ[0292] ДХМ
дихлорметан
[0293] DMB[0293] DMB
2,4-диметоксибензил
[0294] ДМФА[0294] ДМФА
N,N-диметилформамид
[0295] ДМСО[0295] ДМСО
диметилсульфоксид
[0296] EA или EtOAc[0296] EA или EtOAc
этилацетат
[0297] EDC или EDCI[0297] EDC или EDCI
N-(3-диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимид
[0298] ИЭР-[0298] ИЭР-
электрораспыление в режиме отрицательных ионов
[0299] ИЭР+[0299] ИЭР+
электрораспыление в режиме положительных ионов
[0300] EtOH[0300] EtOH
этанол
[0301] ч[0301] ч
часы
[0302] H[0302] H<sub>2</sub>O
вода
[0303] HOBt[0303] HOBt
1-гидроксибензoтриазол
[0304] HCl[0304] HCl
хлорид водорода или соляная кислота
[0305] ВЭЖХ[0305] ВЭЖХ
высокоэффективная жидкостная хроматография
[0306] K[0306] K<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>
карбонат калия
[0307] ЖХ/МС или ЖХМС[0307] ЖХ/МС или ЖХМС
жидкостная хроматография и масс-спектрометрия
[0308] М[0308] М
молярный
[0309] MeCN[0309] MeCN
ацетонитрил
[0310] мин[0310] мин
минуты
[0311] Na[0311] Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>
карбонат натрия
[0312] Na[0312] Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
сульфат натрия
[0313] NaHCO[0313] NaHCO<sub>3</sub>
бикарбонат натрия
[0314] NaHMDs[0314] NaHMDs
гексaметилдисилазид натрия
[0315] NaOH[0315] NaOH
гидроксид натрия
[0316] NaHCO[0316] NaHCO<sub>3</sub>
бикарбоната натрия
[0317] Na[0317] Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
сульфат натрия
[0318] ЯМР[0318] ЯМР
ядерный магнитный резонанс
[0319] Pd(OH)[0319] Pd(OH)<sub>2</sub>
дигидроксид палладия
[0320] PMB[0320] PMB
пара-метоксибензил
[0321] ПО[0321] ПО
через рот (пероральное введение)
[0322] ppm[0322] ppm
миллионная доля
[0323] преп-ВЭЖХ[0323] преп-ВЭЖХ
препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография
[0324] PYBOP[0324] PYBOP
гексaфторфосфат (бензoтриазол-1-илокси)трипирролидинофосфония
[0325] Rt или RT[0325] Rt или RT
комнатная температура
[0326] TBME[0326] TBME
<i>трет</i>-бутилметиловый эфир
[0327] ТФУ[0327] ТФУ
трифторуксусная кислота
[0328] ТГФ[0328] ТГФ
тетрагидрофуран
[0329] ТГП[0329] ТГП
тетрагидропиран
[0330] Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие соединение любой формулы, описанной в настоящей заявке, в комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем.
[0331] «Фармацевтическая композиция» представляет собой лекарственную форму, содержащую соединения согласно настоящему изобретению в форме, подходящей для введения субъекту. Согласно одному варианту реализации изобретения, фармацевтическая композиция является нерасфасованной или представлена в виде единичной лекарственной формы. Единичная лекарственная форма представляет собой любую из различных форм, включая, например, капсулу, пакет для внутривенного вливания, таблетку, одну порцию в аэрозольном ингаляторе или ампулу. Количество активного ингредиента (например, лекарственной формы описанного соединения или его соли, гидрата, сольвата или изомера) в однократной дозе композиции представляет собой эффективное количество и различается в зависимости от конкретного используемого способа лечения. Специалисту в данной области техники очевидно, что в некоторых случаях необходимо вносить стандартные изменения дозировки в зависимости от возраста и состояния пациента. Доза также зависит от способа введения. Предполагаются различные способы введения, включая пероральный, легочный, ректальный, парентеральный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный, ингаляционный, буккальный, сублингвальный, интраплевральный, интратекальный, интраназальный и т.д. Формы дозирования для местного или трансдермального введения соединения согласно изобретению включают порошки, спреи, мази, пасты, крема, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингалянты. Согласно одному варианту реализации изобретения, активное соединение смешивают в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем и любыми необходимыми консервантами, буферами или пропеллентами.
[0332] При использовании в настоящей заявке, фраза «фармацевтически приемлемый» относится к таким соединениям, анионам, катионам, материалам, композициям, носителям и/или формам дозирования, которые по результатам тщательной медицинской проверки являются походящими для применения в контакте с тканями человека и животных и не проявляют избыточной токсичности, не вызывают раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, в соответствии с благоприятным соотношением польза/риск.
[0333] Термин «фармацевтически приемлемый наполнитель» означает наполнитель, применимый для получения фармацевтической композиции, который в целом является безопасным, нетоксичным и не оказывает биологического или другого нежелательного эффекта, и включает наполнители, которые являются приемлемыми для применения в ветеринарии, а также в качестве фармацевтического препарата для человека. «Фармацевтически приемлемый наполнитель» при использовании в настоящей заявке и формуле изощрения включает один и более чем один указанный наполнитель.
[0334] Фармацевтическая композиция согласно изобретению представлена в форме, совместимой с предполагаемым способом введения. Примеры способов введения включают парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, пероральное (например, путем ингаляции), трансдермальное (местное) и чрезслизистое введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут содержать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиaминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регуляции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Значение pH можно регулировать с помощью кислот или оснований, таких как соляная кислота или гидроксид натрия. Состав для парентарального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы из стекла или пластика.
[0335] Соединение или фармацевтические композиции согласно изобретению можно вводить субъекту с помощью различных хорошо известных способов, которые используются в настоящее время для химиотерапевтического лечения. Например, для лечения раковых заболеваний соединение согласно изобретению можно вводить непосредственно в опухоли, инъецировать в кровоток или полости тела или вводить перорально или через кожу с помощью пластыря. Выбранная доза должна быть достаточной для обеспечения эффективного лечения, но не настолько высокой, чтобы вызывать неприемлемые побочные эффекты. За состоянием заболевания (например, рака, предракового состояния и т.д) и здоровьем пациента предпочтительно следует внимательно наблюдать во время лечения и в течение подходящего периода времени после завершения лечения.
[0336] Термин «терапевтически эффективное количество» при использовании в настоящей заявке относится к количеству фармацевтического агента, достаточному для лечения, облегчения или предотвращения идентифицированного заболевания или состояния или для проявления поддающегося выявлению терапевтического или ингибиторного эффекта. Эффект можно выявить с помощью любого аналитического способа, известного в данной области техники. Точное эффективное количество для субъекта зависит от массы и размера тела субъекта и его состояния здоровья; природы и степени состояния и терапевтического препарата или комбинации терапевтических препаратов, выбранных для введения. Терапевтически эффективное количество для конкретного случая можно определить с помощью стандартных экспериментов, которые клиницист способен провести и оценить. Согласно предпочтительному аспекту, заболевание или состояние, которое предполагается лечить, представляет собой рак. Согласно другому аспекту, заболевание или состояние, которое предполагается лечить, представляет собой клеточное пролиферативное расстройство.
50
50
50
50
[0337] Для любого соединения терапевтически эффективное количество первоначально можно оценить с помощью анализов на клеточных культурах, например, культурах неопластичеких клеток, или на животных моделях, как правило, крысах, мышах, кроликах, собаках или свиньях. Животную модель также можно использовать для определения подходящего диапазона концентрации и способа введения. Полученные данные потом можно использовать для определения применимых доз и способов введения для человека. Терапевтическую/профилактическую эффективность и токсичность можно определить с помощью стандартных фармацевтических способов на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, ED (терапевтически эффективная доза для 50% популяции) и LD (летальная доза для 50% популяции). Отношение дозы, обладающей токсическим эффектом, к терапевтически эффективной дозе представляет собой терапевтический индекс, который может быть выражен как отношение LD/ED. Фармацевтические композиции с высоким терапевтическим индексом являются предпочтительными. Доза может варьировать в пределах указанного диапазона в зависимости от используемой формы дозирования, чувствительности пациента и способа введения.
[0338] Дозу и способ введения подбирают для обеспечения достаточного уровня активного агента (агентов) или для поддержания желаемого эффекта. Факторы, которые можно учитывать, включают тяжесть заболевания, общее состояние здоровья субъекта, возраст, массу тела и пол субъекта, диету, время и частоту введения, комбинацию (комбинации) лекарственных средств, чувствительность и переносимость/ответ на терапию. Фармацевтические композиции продолжительного действия можно вводить каждые 3 - 4 дня, каждую неделю или раз в две недели в зависимости от периода полувыведения и клиренса для конкретной лекарственной формы.
[0339] Фармацевтические композиции, содержащие активные соединения согласно настоящему изобретению, можно изготавливать с помощью в целом известного способа, например, путем стандартных процессов смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, отмучивания, эмульгирования, инкапсуливроания, захватывания или лиофилизирования. Фармацевтические композиции можно получать с помощью стандартных способов с использованием одного или более фармацевтически приемлемых носителей, включающих вспомогательные вещества и/или добавки, которые облегчают получение активного соединениям в виде фармацевтически применимого состава. Безусловно, подходящая лекарственная форма зависит от выбранного способа введения.
[0340] Фармацевтические композиции, подходящие для применения путем инъекций, включают стерильные водные растворы (в случае водорастворимого соединения) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов и дисперсий для инъекций непосредственно перед применением. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологические солевые растворы, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Парсипани, Нью-Джерси) или фосфатно-солевой буфер (ФСБ). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и текучей в такой степени, которая обеспечивает возможность ее введения через шприц. Она должна являться стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть защищена от контаминирующего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.д) и их подходящие смеси. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутaнола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимерозала и т.д. Во многих случаях в композицию предпочтительно включать изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит и сорбит, и хлорид натрия. Замеленную абсорбцию композиции для инъекций можно обеспечивать путем включения в указанную композицию агента, замедляющего абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
[0341] Стерильные растворы для инъекции можно получать путем включения активного соединение в требуемом количестве в подходящий растворитель, при необходимости вместе с одним или с комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизацией посредством фильтрования. В целом, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную среду для дисперсии и другие необходимые ингредиенты из вышеперечисленных. Способ получения стерильного порошка для получения стерильных растворов для инъекций представляет собой сушку в вакууме и лиофиизирование, приводящее к получению порошка активного ингредиента вместе с любым дополнительным желаемым ингредиентом из его предварительно стерилизованного посредством фильтрования раствора.
[0342] Пероральные композиции в целом содержат инертный разбавитель или съедобный фармацевтически приемлемый носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или прессованы в таблетки. Для перорального терапевтического введения активное соединение можно включать вместе с наполнителями и применять в виде таблеток, пастилок или капсул. Композиции для перорального введения также можно получать с использованием жидкого носителя для применения в качестве ополаскивателя для полости рта, где соединение в жидком носителе применяются перорально для полоскания ротовой полости и выплевывания или для проглатывания. Фармацевтически совместимые связывающие агенты и/или вспомогательные материалы могут быть включены как часть композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.д. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединения, имеющие сходную природу: связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагантовая камедь или желатин; наполнитель, такой как крахмал или лактоза, дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или агент Sterotes; регулятор сыпучести, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор.
[0343] Для введения путем ингаляции соединения доставляют в виде аэрозольного спрея из контейнера или дозирующего устройства под давлением, который содержит подходящий пропеллент, например, газ, такой как диоксид углерода, или с помощью небулайзера.
[0344] Системное введение также можно осуществлять путем чрезслизистого или трансдермального введения. Для чрезслизистого или трансдермального введения в лекарственной форме используют усилители проникновения, подходящие для преодоления предполагаемого барьера. Такие усилители проникновения в целом известны в данной области техники и включают, например, в случае чрезслизистого введения детергенты, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Чрезмукозальное введение можно осуществлять путем использования назальных спреев или суппозиториев. Для трансдермального введения активные соединения представлены в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, как в целом известно в данной области техники.
[0345] Активные соединения можно получать с фармацевтически приемлемыми носителями, которые предотвращают быстрое выведение соединения из организма, например, в виде лекарственной формы с контролируемым высвобождением, включая импланты и микроинкапсулированные системы доставки. Можно применять биодеградируемые биосовметимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких лекарственных форм очевидны специалистам в данной области техники. Материалы также могут быть получены коммерческим путем из компании Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. В качестве фармацевтически приемлемых носителей также можно использовать липосомные суспензии (включая направленные на инфицированные клетки липосомы, содержащие моноклональные антитела к вирусным антигенам). Указанные носители могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, например, описанными в патенте США № 4 522 811.
[0346] Особо предпочтительным является получение композиций для перорального или парентерального введения в виде единиц дозирования для облегчения введения и обеспечения однородности дозировки. Форма единиц дозирования при использовании в настоящей заявке относится к физически дискретным единицам, подходящих для применения в качестве однократной дозы для субъекта, которого предполагается лечить; каждая единица содержит предопределенное количество активного соединения, рассчитанное для обеспечения желаемого терапевтического эффекта, вместе с необходимым фармацевтическим носителем. Спецификация форм единиц дозирования согласно изобретению обусловлена и непосредственно зависит от уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который предполагается достигнуть.
2
[0347] При терапевтическом применении доза фармацевтических композиций, используемых в соответствии с изобретением, варьирует в зависимости от используемого агента, возраста, массы тела и клинического состояния пациента, являющего реципиентом указанной композиции, а также опыта и решения клинициста или практикующего врача, проводящего лечение, а также других факторов, влияющих на выбор дозы. В целом доза должна являться достаточной для обеспечения замедления и предпочтительно регрессии роста опухолей, а также предпочтительно полной регрессии рака. Доза может варьировать от приблизительно 0,01 мг/кг в день до приблизительно 5000 мг/кг в день. Согласно предпочтительным аспектам, дозы могут варьировать от приблизительно 1 мг/кг в день до приблизительно 1000 мг/кг в день. Согласно одному аспекту, доза варьирует в диапазоне от приблизительно 0,1 мг/день до приблизительно 50 г/день; от приблизительно 0,1 мг/день до приблизительно 25 г/день; от приблизительно 0,1 мг/день до приблизительно 10 г/день; от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 3 г/день или от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 1 г/день и представлена в виде одной дозы, дробной дозы или дозы непрерывного введения (где значение указанной дозы можно выражать относительно массы тела пациента, площади поверхности тела в м и возраста в годах). Эффективное количество фармацевтического агента представляет собой количество, которое обеспечивает объективно выявляемое улучшение, наблюдаемое клиницистом или другим квалифицированным наблюдателем. Например, регрессию опухоли у пациента можно измерить на основе диаметра опухоли. Уменьшение диаметра опухоли указывает на регрессию. На регрессию также указывает отсутствие повторного возникновения опухолей после завершения лечения. При использовании в настоящей заявке термин «дозозависимый эффект» относится к количеству активного соединения, обеспечивающему желаемый биологический эффект у субъекта или в клетке.
[0348] Фармацевтические композиции могут содержаться в контейнере, упаковке или дозирующем устройстве вместе с инструкциями по введению.
[0349] Соединения согласно настоящему изобретению способны также образовывать соли. Все их указанных формы также рассматриваются в пределах заявленного изобретения.
[0350] При использовании в настоящей заявке фраза «его фармацевтически приемлемые соли» относится к производным соединений согласно настоящему изобретению, где исходное соединение модифицировано путем получения его кислой или щелочной соли. Примеры фармацевтически приемлемых солей соединения включают, но не ограничиваются указанными, минеральные соли или соли органических кислот основных остатков, таких как aмины, щелочные или органические соли кислых остатков, таких как карбоновые кислоты т.д. Фармацевтически приемлемые соли соединения включают стандартные нетоксичные соли или соли четвертичного аммония исходного соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Например, такие стандартные нетоксичные соли включают, но не ограничиваются указанными, соли, полученные из неорганических и органических кислот, выбранных из 2-ацетоксибензойной, 2-гидроксиэтансульфоновой, уксусной, аскорбиновой, бензолсульфоновой, бензойной, бикарбоновой, карбоновой, лимонной, этилендиаминтетрауксусной, этандисульфоновой, 1,2-этансульфоновой, фумаровой, глюкогептоновой, глюконовой, глутамовой, гликолевой, гликоллиарсаниловой, гексилрезорциновая, гидрабаминовой, бромоводородной, соляной, йодоводородной, гидроксималеиновой, гидроксинафтоевой, изэтионовой, молочной, лактобионовой, лаурилсульфоновой, малеиновой, яблочной, миндальной, метансульфоновой, напсиловой, азотной, оксаловой, памовой, пантозатемовой, фенилуксусной, фосфорной, полигалактуроновой, пропионовой, салициловой, стеариновой, подуксусной (subacetic), сукциновой, сульфамовой, сульфаниловой, серной, танниновой, винной, толуолсульфоновой и часто встречающихся aминокислот, например, глицина, аланина, фенилаланина, аргинина и т.д.
[0351] Другие примеры фармацевтически приемлемых солей включают соли гексановой кислоты, циклопентановой кислоты, пропионовой кислоты, пировиноградной кислоты, малоновой кислоты, 3-(4-гидроксибензоил)бензойной кислоты, фенилакриловой кислоты, 4-хлорбензолсульфоновой кислоты, 2-нафталинсульфоновой кислоты, 4-толуолсульфоновой кислоты, камфорсульфоновой кислоты, 4-метилбицикло-[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоновой кислоты, 3-фенилпропионовой кислоты, триметилуксусной кислоты, третичной бутилуксусной кислоты, муконовой кислоты и т.д. Настоящее изобретение также включает соли, образованные при замещении протона кислоты, присутствующего в исходном соединении, ионом металла, например, ионом щелочного металла, ионом щелочно-земельного металла или ионом алюминия; или при взаимодействии с органическим основанием, таким как этанолaмин, диэтанолaмин, триэтанолaмин, трометамин, N-метилглюкамин и т.д. Необходимо понимать, что в форме соли отношение соединения к катиону или аниону соли может составлять 1:1 или принимать любое другое отношение, отличное от 1:1, например, 3:1, 2:1, 1:2 или 1:3.
[0352] Необходимо понимать, что все ссылки на фармацевтически приемлемые соли соединения включают формы присоединения растворителя (сольваты) или кристаллические формы (полиморфы) той же соли, как определено в настоящей заявке.
[0353] Соединения согласно настоящему изобретению также можно получать в виде сложных эфиров, например, фармацевтически приемлемых сложных эфиров. Например, функциональную группу карбоновой кислоты в соединении можно превращать в соответствующий сложный эфир, например, метиловый, этиловый или другой сложный эфир. Также спиртовую группу в соединении можно превращать в ее соответствующий сложный эфир, например, ацетатный, пропионатный или другой сложный эфир.
[0354] Соединения или их фармацевтически приемлемые соли или сольваты вводят перорально, назально, трансдермально, легочно, ингаляционно, буккально, сублингвально, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно, внутривенно, ректально, интраплеврально, интратекально и парентерально. Согласно одному варианту реализации изобретения, соединение вводят перорально. Специалисту в данной области техники очевидны преимущества конкретных способов введения.
[0355] Используемую схему введения доз соединений выбирают в зависимости от различных факторов, включая тип, вид, возраст, массу тела, пол и клиническое состояние пациента; тяжесть состояния, которое предполагается лечить; способ введения; почечная и печеночная функция пациента и конкретное используемое соединение или его соль. Специалист в области врачебного дела и ветеринарии легко определит и назначит эффективное количество лекарственного средства, необходимое для предотвращения, противодействия или остановки прогрессирования состояния.
Remington: the Science and Practice of Pharmacy
th
[0356] Способы получения лекарственных форм и введения описанных соединений согласно изобретению можно найти в источнике , 19 edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). Согласно варианту реализации изобретения, соединения, описанные в настоящей заявке, и их фармацевтически приемлемые соли используют в фармацевтических составах в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включает инертные твердые наполнители или разбавители и стерильные водные или органические растворы. Соединения присутствуют в таких фармацевтических композициях в количестве, достаточном для обеспечения желаемого размера дозы в диапазоне, описанном в настоящей заявке.
[0357] Все проценты и отношения при использовании в настоящей заявке, если иное не указано, приведены по массе. Другие признаки и преимущества настоящего изобретения очевидны из различных примеров. Предложенные примеры иллюстрируют разные компоненты и способы, применимые для осуществления на практике настоящего изобретения. Указанные примеры не ограничивают заявленное изобретение. На основе настоящего изобретения специалист в данной области техники может определить и использовать другие компоненты и способы, применимые для осуществления на практике настоящего изобретения.
[0358] В схемах синтеза, описанных в настоящей заявке, соединения для упрощения могут быть изображены в одной конкретной конфигурации. Такие конкретные конфигурации не ограничивают изобретение одним или другим изомером, таутомером, региоизомером или стереоизомером и не исключают смеси изомеров, таутомеров, региоизомеров или стереоизомеров; однако необходимо понимать что данный изомер, таутомер, региоизомер или стереоизомер может иметь более высокий уровень активности по сравнению с другим изомером, таутомером, региоизомером или стереоизомером.
[0359] Соединения, созданные, выбранные и/или оптимизированные с помощью способов, описанных выше, после их получения могут быть охарактеризованы с использованием различных анализов, известных специалистам в данной области техники, с точки зрения наличия биологической активности. Например, молекулы могут быть охарактеризованы с помощью стандартных анализов, включая, но не ограничиваясь указанными, анализы, описанные ниже, для определения наличия предсказанной активности, активности связывания и/или специфичности связывания.
[0360] Кроме того, для повышения скорости исследования, использующего указанные анализы, можно применять высокопроизводительный скрининг. Таким образом обеспечивается возможность быстрого скрининга молекул, описанных в настоящей заявке, на предмет активности с использованием способов, известных в данной области техники. Общие способы для осуществления высокопроизводительного скрининга описаны, например, в источнике Devlin (1998) High Throughput Screening, Marcel Dekker; и патенте США № 5 763 263. Высокопроизводительные анализы могут использовать один или более различных аналитических способов, включая, но не ограничиваясь указанными, способы, описанные ниже.
[0361] Ингибитор EZH2 согласно настоящему изобретению при желании может быть представлен в наборе (например, в упаковке или дозирующем устройстве), который может содержать одну или более единичных лекарственных форм, содержащих ингибитор EZH2. Упаковка, например, может содержать металлическую или пластиковую оболочку, например, блистерная упаковка. К упаковке или дозирующему устройству могут прилагаться инструкции по введению. Композиции, включающие ингибитор EZH2 согласно изобретению, также могут быть представлены вместе с совместимым фармацевтическим носителем, помещены в соответствующий контейнер и маркированы для лечения указанного состояния. Также могут быть предложены инструкции по применению.
[0362] В настоящей заявке также предложены наборы, содержащие множество реагентов для выявления метилирования, которые обеспечивают выявление метилированного H3-K27. Например, набор включает реагенты для выявления монометилированного H3-K27, диметилированного H3-K27 и триметилированного H3-K27. Реагент для выявления представляет собой например, антитела или их фрагменты, полипептиды или аптамеры.
[0363] Набор может также содержать реагенты для выявления потери функции по меньшей мере одного компонента комплекса SWI/SNF, например, нуклеиновые кислоты, которые специфично выявляют мутантный компонент последовательности нуклеиновых кислот благодаря наличию гомологичных последовательностей нуклеиновых кислот, таких как последовательности олигонуклеотидов, комплементарные части мутантного компонента последовательности нуклеиновых кислот, или антитела к белкам, закодированным компонентами последовательности нуклеиновых кислот дикого типа и/или мутантными компонентами последовательности нуклеиновых кислот, в виде набора. Олигонуклеотиды могут представлять собой фрагменты компонента гена. Например, олигонуклеотиды могут составлять 200, 150, 100, 50, 25, 10 или менее нуклеотидов в длину. Набор может содержать в раздельных контейнерах аптамер или антитело, контрольные составы (положительный и/или отрицательный контроль) и/или поддающуюся выявлению метку, такую как флуоресцеин, зеленый флуоресцентный белок, родамин, цианиновые красители, красители Alexa, люцифераза, радиоактивные метки и другие метки. Кроме того, реагенты для выявления биологической активности комплекса SWI/SNF (например, его хроматин-ремоделирующей активности) могут быть включены в набор.
[0364] Инструкции (например, напечатанные, записанные на магнитной ленте, VCR или CD-ROM и т.д.) для проведения анализа могут быть включены в набор. Анализ, например, может представлять собой анализ с помощью Вестерн-блоттинга, иммуногистохимического (IHC), иммунофлуоресцентного (IF) анализа, секвенирования и масс-спектрометрии (МС), как известно в данной области техники.
Пример 1:
Продолжительная регрессия опухоли в генетически измененных лимфомах и злокачественных рабдоидных опухолях при ингибировании EZH2
[0365] Соединение A представляет собой активный селективный ингибитор EZH2:
50
50
50
Бесклеточные биохимические анализы, включающие радиоактивно меченый SAM и олигонуклеосомы или пептиды эритроцитов курицы, соответствующие H3K27, в качестве субстратов, показали, что соединение A селективно ингибирует активность PRC2 человека, содержащего EZH2 дикого типа, при этом значение константы ингибирования (Ki) составляло 2,5 ± 0,5 нмоль/л, и значение IC составляло 11 ± 5 нМ (нуклосомный анализ) или 16 ± 12 нМ (пептидный анализ). Значения IC были сходными для ферментов EZH2 человека и крысы, а также для белков EZH2, содержащих все известные лимфомные мутации, приводящие к изменению функции. Значение IC соединения A повышалось с повышением концентрации SAM, но минимально изменялось при повышении количества олигонуклеосом, что соответствовало SAM-конкурентному и нуклеосома-неконкурентному механизму ингибирования. Для демонстрации селективности HMT оценивали ингибирующую активность соединения A в отношении панели HMT, отличных от EZH2, включающей как лизин, так и аргинин-специфичные HMT. Была показана 35-кратная селективность соединения А по сравнению с EZH1 и более чем 4500-кратная селективность по сравнению с 14 другими исследуемыми HMT.
[0366] Соединение A специфично ингибирует клеточное метилирование H3K27 в клетках:
50
При инкубированиимутантных клеток лимфомы WSU-DLCL2 EZH2 Y641F с соединением A в течение 4 дней наблюдали зависимое от концентрации уменьшение общего уровня H3K27Me3, при этом среднее значение IC составляло 0,26 мкМ (уровень H3K27Me3, определенный с помощью ИФА). При исследовании кинетики ингибирования метилирования период полувыведения H3K27Me3 составлял приблизительно 1 день, поскольку 90% ингибирования достигали только через 3 - 4 дня инкубации. При инкубировании клеток лимфомы OCI-LY19, содержащих EZH2 дикого типа, с соединением A в концентрации 2,7 мкМ в течение 4 дней, было показано воздействие только на метки метилирования H3K27Me1, H3K27Me2 и H3K27Me3 - три известных продукта катализа PRC2. Инкубация с соединением A приводила к увеличению ацетилирования H3K27. Способность соединения A уменьшать общий уровень триметилирования H3K27 также исследовали на нескольких других клеточных линиях лимфом человека, экспрессирующих EZH2 дикого типа или мутантный EZH2. Соединение A уменьшало H3K27Me3 со сходной активностью во всех клеточных линиях, независимо от статуса EZH2 (Таблица 1).
[0367] Соединение A приводит к селективному уничтожению клеток линий лимфомы, имеющих точечные мутации EZH2:
50
50
50
50
Инкубирование мутантных клеток EZH2 Y641F линии WSU-DLCL2 с соединением A приводило к антипролиферативному эффекту, при этом среднее значение IC составляло 0,28 ± 0,14 мкМ в 6-дневном анализе пролиферации. Кинетику влияния соединения A на количество живых клеток дополнительно исследовали в течение продолжительного периода, составляющего 11 дней. Антипролиферативный эффект соединения A был очевиден после того, как клетки WSU-DLCL2 подвергали воздействию соединения в течение более чем 4 дней, что согласовалось с кинетикой ингибирования клеточного метилирования H3K27, опосредованного соединением A. Значение IC соединения A для ингибирования пролиферации клеток WSU-DLCL2 в 11-дневном анализе (0,0086 мкМ, Таблица 1) было ниже по сравнению с результатами, полученными в 6-дневном анализе пролиферации, что указывает на увеличенную чувствительность при более длительных периодах инкубации. В отличие от клеток WSU-DLCL2, рост клеток лимфомы человека OCI-LY19 (EZH2 дикого типа для остатка Y641) в течение 11 дней существенно не изменялся, несмотря на сравнимые значения IC для ингибирования H3K27Me3 для обоих клеточных линий (Таблица 1). Для определения концентрации, при которой клетки заканчивают пролиферировать с учетом полного периода инкубации, составляющего 11 дней, рассчитывали минимальную цитотоксическую концентрацию (LCC) для конкретной клеточной линии. Значение LCC для мутантной лимфомы человека WSU-DLCL2 EZH2 Y641F было знчаиетльно ниже по сравнению с клетками OCI-LY19, которые имеют EZH2 дикого типа (Таблица 1). Это специфичное к клеточному содержимому уничтожение клеток также подтверждось результатами 11-дневного анализа пролиферации с расширенной панелью клеточных линий лимфом. Все клеточные линии, содержащие мутацию EZH2, за исключением клеточной линии RL (EZH2 Y641N), были более чувствительны к антипролиферативным эффектам соединения A по сравнению с клеточными линиями, содержащими EZH2 дикого типа (Таблица 1). Чувствительность клеточной линии Pfeiffer (EZH2 A677G) к соединению A была выше в 20 – 300 раз по результатам измерения с помощью значений IC и LCC, соответственно, по сравнению с мутантными клеточными линиями Y641. Затем исследовали минимальное время воздействия соединения, необходимое для устойчивого уничтожения клеток, с помощью экспериментов  по отмывке. Значения LCC на 11 день или 14 день для клеток WSU-DLCL2, которые инкубировали с соединением A в течение 7 дней (с последующей 7-дневной отмывкой от соединения), и для клеток, которые непрерывно обрабатывали соединением в течение 14 дней, были сходными (Таблица 2). Однако воздействия лекарственного средства в течение только 4 дней было недостаточным для получения значений LCC, сходных с продолжительной инкубацией.
[0368] Соединение A индуцирует остановку G
и апоптоз в мутантных по EZH2 клетках лимфомы:
1
1
2
1
Далее оценивали влияние инкубации с соединением A (1 мкМ) в течение 7 дней на прогрессирование клеточного цикла и апоптоз в клетках WSU-DLCL2. Увеличение процента клеток в G фазе и уменьшение процента клеток в S фазе и G/M фазе было очевидно через 2 дня инкубирования с соединением A. Максимальный эффект достигался через 4 дня. Не наблюдалось очевидного повышения фракции клеток в суб-G фазе, что указывало на отсутствие апоптоза, вызванного инкубированием с соединением A в течение 7 дней. Полученные данные соответствовали кривым роста клеток WSU-DLCL2 в присутствии соединения A, указывающим на то, что цитотоксические эффекты наблюдались только через 7 дней инкубирования. После инкубирования клеток WSU-DLCL2 с соединением A в течение до 14 дней фракция апоптотических клеток, определенная с помощью TUNEL-анализа, значительно увеличивалась на 14 день по сравнению с группой, получающей носитель, что указывает на опосредованную соединением A гибель клеток путем индукции апоптоза.
[0369] Пероральное введение соединения A ведет к направленному ингибированию EZH2 в моделях мутантных по EZH2 ксенотрансплантатов у мышей:
in vivo
Исследовали влияние перорального введения дозы соединения A на системное воздействие и  направленное ингибирование у мышей, содержащих мутантный ксенотрансплантат лимфомы EZH2. Сначала мышам SCID, которым имплантировали подкожно ксенотрансплантаты WSU-DLCL2, вводили перорально дозу соединения A в течение 4 или 7 дней. Результаты измерения уровня соединения A в плазме за 5 до или через 3 часа после введения последней дозы показали явное зависимое от дозы увеличение воздействия. Только у животных, которым вводили дозу 160 мг/кг TID или 213 мг/кг BID поддерживался средний уровень соединения в плазме выше LCC для клеток WSU-DLCL2 на протяжении курса введения дозы (1652 нг/мл, с учетом связывания с белками плазмы у мышей). Результаты определения соединения в гомогенатах из опухолей, собранных через 3 часа после введения последней дозы, показали, что только для групп с самыми высокими дозами уровень соединения в 2 компартментах был одинаковым. При анализе уровня H3K27Me3 в опухолях наблюдали дозозависимое направленное ингибирование EZH2. Ингибирование H3K27Me3 было ниже в опухолях, полученных от мышей, которым вводили дозу 213 мг/кг QD, что указывает на то, что для оптимального направленного ингибирования требуется поддержание концентрации в плазме выше LCC на протяжении всего курса введения дозы. Введение соединения в течение 4 дней в дозе 160 мг/кг TID приводило к немного более низкому направленному ингибированию по сравнению с введением дозы в течение 7 дней в той же дозе и режиме, что указывало на то, что продолжительное введение дозы повышало степень направленного ингибирования в опухолях WSU-DLCL2. Проводили подобное 7-дневное исследование в режимах BID и QD на голых мышах, которым имплантировали подкожно ксенотрансплантаты KARAPS-422. Соединение A вызывало дозозависимое уменьшение уровня H3K27Me3 опухоли при обоих режимах введения.
[0370] Соединение A индуцирует значительные противоопухолевые эффекты в нескольких мутантных ксенотрансплантатах лимфомы EZH2:
in vitro
При лечении мышей SCID, содержащих мутантные ксенотрансплантаты опухоли WSU-DLCL2 EZH2 Y641F, соединением A в течение 28 дней, наблюдали дозозависимое ингибирование роста опухолей на 58% при максимальной дозе, составляющей 150 мг/кг TID. Только у животных, которым вводили наиболее высокую дозу, поддерживался средний уровень соединения A в плазме выше LCC для клеток WSU-DLCL2 на протяжении курса введения дозы. Введение дозы соединения A в течение 28 дней приводило к относительному накоплению соединения в ткани опухоли по сравнению с плазмой в отличие от 7-дневного введения дозы. ИФА-анализ гистонов из опухолей, собранных на 28 день, показал дозозависимое направленное ингибирование. Уровень H3K27Me3 в ксенотрансплантатах WSU-DLCL2 был ниже у мышей, которым вводили дозу в течение 28 дней, по сравнению с животными, которым вводили дозу в течение 7 дней, что указывало на то, что продолжительного введение соединения A повышало степень направленного ингибирования. У мышей, содержащих мутантные ксенотрансплантаты, KARPAS-422 EZH2 Y461N при 28-дневном введении дозы соединения A в режиме BID приводило к намного более выраженному эффекту. Ингибирование роста опухоли наблюдали при таких низких дозах, как 80,5 мг/кг BID, при этом более высокие дозы приводили к устранению ксенотрансплантатов без возобновления роста в течение периода времени до 90 дней после прекращения введения дозы. При исследовании режимов непостоянного введения дозы у содержащих ксенотрансплантаты KARPAS-422 мышей был показан значительный дозозависимый противоопухолевый эффект соединения A при проведении двух циклов в режиме введение в течение 7 дней/отсутствие введения в течение 7 дней и введение в течение 21 дня/отсутствие введения в течение 7 дней. Для всех режимов введения дозы наблюдали ингибирование роста опухоли и полную регрессию при дозах 90 и 361 мг/кг BID, соответственно. Модель мутантного ксенотрансплантата Pfeiffer EZH2 A677G была наиболее чувствительной моделью опухоли, на что указывали сильные антипролиферативные эффекты соединения A на указанную клеточную линию . Во всех группах дозирования соединением A (режим QD), за исключением группы, получающей самую низкую дозу (30 мг/кг QD), была показана полная регрессия опухолей у всех животных. Возобновление роста опухоли не наблюдали до конца исследования (36 дней после завершения введения соединение A). Несмотря на то что возобновление роста опухоли наблюдали при введении дозы 30 мг/кг QD, указанная крайне низкая доза вызывала остановку роста опухоли во время периода введения. Из-за проблем с переносимостью введение дозы останавливали на 12 день у мышей, которым вводили дозу 1140 мг/кг QD; в указанной группе, которая подвергалась воздействию соединения A только в течение 12 дней, все же наблюдалась продолжительная полная регрессия опухолей.
[0371] Соединение A селективно уничтожает мутантные по SMARCB1 клетки
in vitro
и
in vivo
:
in vitro
50
Проводили исследование влияния ингибирования EZH2 на рост и выживаемость клеток ЗРО с делецией SMARCB1. Инкубирование клеточных линий ЗРО с делецией SMARCB1 G401 и A204 с соединением A в 14-дневном анализе пролиферации  вызывало сильные антипролиферативные эффекты со значениями IC в наномолярном диапазоне, тогда как на контрольные клеточные линии RD и SJCRH30, экспрессирующие SMARCB1, оказывалось минимальное влияние (Таблица 3). Введение соединения A мышам SCID, содержащим подкожные ксенотрансплантаты G401, в дозе 266 или 532 мг/кг BID в течение 28 дней приводило к устранению указанных крайне быстро растущих опухолей. Подобным образом, в модели KARPAS-422 и Pfeiffer EZH2 на момент окончания исследования через 32 дня после остановки введения дозы не наблюдали повторного роста мутантного ксенотрансплантата НХЛ. Введение соединения A в дозе 133 мг/кг вызывало остановку роста опухоли во время периода введения и значительную задержку роста опухоли по сравнению с носителем после прекращения введения дозы. Было показано сильное направленное ингибирование EZH2 в опухолях, которые собирали от подгрупп мышей из каждой группы на 21 день при всех дозах введения.
[0372] Соединение A ингибирует метилирование H3K27 в неопухолевых тканях дозозависимым образом:
Данные, описанныевыше, демонстрируют, что соединение A предоставляет собой новый способ лечения SWI/SNF-вызванных раковых заболеваний и ЗРО. На ранних фазах клинических исследований часто измеряют модуляцию фармакодинамического биомаркера после введения дозы для оценки уровня направленного ингибирования, предсказанного для получения ответа на основе данных доклинических моделей. Так как сбор биопсий опухолей после введения дозы часто невозможен, вместо них часто собирают легко доступные заменяющие ткани, такие как мононуклеары периферической крови (PBMC), кожа или костный мозг. Для исследования EZH2-направленного ингибирования в заменяющих тканях самцам и самкам крыс Sprague Dawley вводили перорально соединение A в концентрации 100, 300 или 1000 мг/кг в течение 28 дней и собирали образцы PBMC, костного мозга и кожи в конце исследования. Уровень соединения A в плазме повышался дозозависимым образом как у самцов, так и самок крыс, при этом уровень в плазме в целом был выше у самок по сравнению с самцами. Из-за проблем с переносимостью, самок в группе, получающей 1000 мг/кг, пришлось усыпить на 23 день. Дозозависимое направленное ингибирование наблюдали в PBMC и костном мозге крыс, которым вводили соединение A, по результатам измерения с помощью ИФА. Степень направленного ингибирования была менее выраженной для PBMC самок, которым вводили дозу в течение 22 дней, по сравнению с самцами, которым вводили дозу в течение 28 дней (одинаковая доза, составляющая 1000 мг/кг). Дозозависимое уменьшение количества H3K27Me3-положительных клеток наблюдали в эпидермисе кожи крыс, которым вводили соединение A, по результатам оценки с помощью иммуногистохического анализа. Максимальный эффект, который был очевиден уже через 22 дня введения соединения A, наблюдался при самой высокой дозе.
in vitro
in vitro
i
50
[0373] Соединение A проявляло сходные с другими ингибиторами EZH2 свойства , такие как очень высокая специфичность в отношении EZH2 в биохимических анализах по сравнению с другими HMT и специфическое ингибирование клеточного метилирования H3K27, приводящее к специфичному к клеточному содержимому уничтожению мутантных по EZH2 клеточных линий НХЛ. Однако активность указанного соединения была выше приблизительно в 10 раз, что отражалось в пониженных значениях K и IC, определенных в биохимических и клеточных функциональных анализах. Кроме того, была показана превосходная биодоступность соединения А при пероральном введении при его введении грызунам, приводящем к дозозависимому EZH2-направленному ингибированию в ксенотрансплантатах опухолевой и неопухолевой тканей. Необходимо отметить, что введение дозы соединения A вызвало значительные противоопухолевые эффекты у мышей, содержащих мутантные по EZH2 ксенотрансплантаты лимфомы. Ответы варьировали от устранения опухоли (отсутствия повторного роста после прекращения введение дозы) до дозозависимого ингибирования роста опухоли. Задержка начала противоопухолевого действия (начало через 4 - 7 дней) соответствовала кинетике ингибирования метилирования и антипролиферативной активности, вызванной инкубированием клеток с соединением A . Поддержание плазматического уровня соединения A выше LCC во время курса введения дозы было необходимо для модели ксенотрансплантата WSU-DLCL2 для индукции максимального направленного ингибирования и противоопухолевого ответа. Однако две другие модели ксенотрансплантата лимфомы (KARPAS-422 и Pfeiffer) были крайне чувствительными к введению соединения A, и поддержание уровня в плазме выше LCC не требовалось. Наблюдаюсь перманентное устранение мутантных ксенотрансплантатов опухолей Pfeiffer EZH2 A677G при очень низких дозах или коротких периодах введения доз, то дает основания предполагать, что пациенты с указанным типом генетически детерминированного НХЛ будут иметь значительный лечебный эффект от соединения A.
[0374] ЗРО представляют собой крайне агрессивные высоко злокачественные, локально инвазивные, часто метастазирующие и крайне часто приводящие к летальному исходу раковые заболевания мозга, почек и мягких тканей у детей. При этом они, как правило, являются диплоидными и не содержат геномных аберраций. Однако они характеризуются потерей экспрессии SMARCB1, корового компонента хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF, с практически полной пенетрантностью. Биаллельная инактивация SMARCB1, например, вызванная мутацией, является по существу единственным генетическим событием в ЗРО, что указывает на ведущую роль указанной генетической аберрации. По результатам генетических исследований предполагалось, что PRC2 и SWI/SNF антагонистически регулируют экспрессию генов путей RB, циклина D1 и MYC. Согласно настоящему изобретению были показаны вызванные фармакологическим ингибированием EZH2 антипролиферативные эффекты в клеточных линиях ЗРО с делецией SMARCB1 и перманентное устранение ксенотрансплантатов ЗРО у мышей. Эти данные подтверждают зависимость от активности PRC2 таких раковых заболеваний, в которых сам EZH2 не является генетически измененным.
[0375] Соединение A представляет собой новый способ лечения генетически детерминированных подгрупп НХЛ и ЗРО. Способность измерять дозозависимые изменения уровня H3K27Me3 в коже, PBMC и костном мозге дает возможность использовать данные от указанных замещающих тканей в качестве неинвазивного фармакодинамического биомаркера в клинических исследованиях на человеке.
[0376] Таблица 1: Значения IC
для метилирования и пролиферации, а также значения LCC соединения A в клеточных линиях лимфомы человека
50
<b>Клеточная линия</b>
<b>Статус EZH2</b>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> метилирования (нмоль/л)</b><sup><b>a</b></sup>
<b>Пролиферации IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (мкмоль/л)</b><sup><b>b</b></sup>
<b>LCC (мкмоль/л)</b><sup><b>b</b></sup>
DOHH-2
Дикий тип
ND
1,7
>10
Farage
Дикий тип
ND
0,099
>10
OCI-LY19
Дикий тип
8
6,2
10 – 25
Toledo
Дикий тип
ND
7,6
>10
Karpas-422
Y641N
90
0,0018
0,12
Pfeiffer
A677G
2
0,00049
0,0005
RL
Y641N
22
5,8
>25
SU-DHL-10
Y641F
ND
0,0058
0,14
SU-DHL-6
Y641N
20
0,0047
0,21
WSU-DLCL2
Y641F
9
0,0086
0,17
a: Значения получены с помощью иммуноблоттинга, после инкубации в течение 4 дней. Значения являются результатом одного эксперимента.b: Значения получены после инкубации в течение 11 дней. Инкубацию с соединением для каждого эксперимента осуществляли в трех повторениях, и значения представляют собой результат одного эксперимента для всех клеточных линий, за исключением OCI-LY19, Pfeiffer и WSU-DLCL2. Для оставшихся трех клеточных линий значения представляют собой среднее от следующего числа экспериментов: OCI-LY19: n=9; Pfeiffer: n=2 и WSU-DLCL2: n=15.
[0377] Таблица 2: Значения LCC соединения A для клеток лимфомы человека WSU-DLCL2 при непрерывном введении дозы или после отмывки от соединения
<b>Отмывка от соединения, WSU-DLCL2 </b>
<b>11 день</b>
<b>14 день</b>
<b>LCC (мкМ)</b>
<b>LCC (мкМ)</b>
<b>Нет отмывки</b>
<b>0,17</b>
<b>0,11</b>
<b>4-дневное лечение соединением A; 11-дневная отмывка</b>
<b>0,36</b>
<b>0,42</b>
<b>7- дневное лечение соединением A; 7-дневная отмывка</b>
<b>0,19</b>
<b>0,075</b>
Значения представляют собой среднее от двух экспериментов, каждый эксперимент проводили в трех повторениях для каждой концентрации инкубации.
[0378] Таблица 3: Значения IC
соединения A для SMARCB1-отрицательных клеточных линий ЗРО и SMARCB1-положительных контрольных клеточных линий
50
<b>Клеточная линия</b>
<b>Статус SMARCB1</b>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> пролиферации (мкМ), 7 день</b>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> пролиферации (мкМ), 14 день</b>
RD
Дикий тип
9,2
5,2
SJCRH30
Дикий тип
6,1
8,8
G401
Мутант
0,087
0,042
A204
Мутант
3,2
0,14
Значения представляют собой среднее от двух экспериментов с тремя повторностями для каждой концентрации инкубирования в пределах экспериментов.
Пример 2
: Продолжительная регрессия опухоли в генетически измененных злокачественных рабдоидных опухолях в результате ингибирования EZH2
[0379] Соединение A является активным и селективным ингибитором EZH2
:
Соединение A было создано с помощью итерационных способов медицинской химии (Фигура 10A). Соединение A ингибирует активность PRC2 человека, содержащих EZH2 дикого типа, со значением константы ингибирования (Ki), составляющим 2,5 ± 0,5 нМ. Наблюдали сходную активность в отношении белков EZH2, содержащих все известные лимфомные мутации с изменением функции (Таблица 5). С помощью исследования кинетики в состоянии покоя было обнаружено, что соединение действует SAM-конкурентным и нуклеосомно-неконкурентным образом (Фигура 11). Также оценивали ингибирование соединение A в отношении панели HMT, отличных от EZH2, включающих как лизин, так и аргинин-специфичные HMT. Была показана 35-кратная селективность соединения A по сравнению с EZH1 и > 4500-кратная селективность по сравнению с 14 другими исследованными HMT (Таблица 5).
[0380] Таблица 4: Ингибирование метилтрансферазы гистонов соединением A
<b>Ферментативный анализ</b>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (нМ)</b>
<b>% Ингибирование в концентрации 1 мкМ Соединение A</b><sup><b>a</b></sup>
<b>CARM1</b>
<b>>50,000</b><sup><b>b</b></sup>
<b> 5 ± 3</b>
<b>DOT1L</b>
<b>>50,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b> 2 ± 8</b>
<b>EHMT1</b>
<b>>50,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b> 6 ± 6</b>
<b>EHMT2</b>
<b>>50,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b> 7 ± 3</b>
<b>EZH1</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b>392 ± </b>72<sup>f</sup>
<b>98 ± 1</b>
<b>EZH2 пептидный анализ</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b>11 ± </b>5<sup>f</sup>
<b>ND</b>
<b>EZH2 нуклеосомный анализ</b><sup><b>d</b></sup>
<b>16 ± </b>12<sup>f</sup>
<b>100 ± 1</b>
<b>A677G EZH2</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b> 2</b><sup><b>b</b></sup>
<b>ND</b>
<b>A687V EZH2</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b> 2</b><sup><b>b</b></sup>
<b>ND</b>
Y641F EZH2<sup>d,e</sup>
14 ± 5<sup>f</sup>
ND
<b>Y641C EZH2</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b>16</b><sup><b>c</b></sup>
<b>ND</b>
<b>Y641H EZH2</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b> 6</b><sup><b>c</b></sup>
<b>ND</b>
<b>Y641N EZH2</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b>38</b><sup><b>b</b></sup>
<b>ND</b>
<b>Y641S EZH2</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b> 6</b><sup><b>c</b></sup>
<b>ND</b>
<b>rat EZH2</b><sup><b>d,e</b></sup>
<b> 4</b><sup><b>c</b></sup>
<b>ND</b>
<b>PRMT1</b>
<b>>50,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b>5 ± 4</b>
<b>PRMT3</b>
<b>ND</b>
<b>2 ± 2</b>
<b>PRMT5/MEP50</b>
<b>>50,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b>2 ± 6</b>
<b>PRMT6</b>
<b>ND</b>
<b>3 ± 3</b>
<b>PRMT8</b>
<b>>50,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b>7 ± 3</b>
<b>SETD7</b>
<b>ND</b>
<b>4 ± 3</b>
<b>SMYD2</b>
<b>>50,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b>1 ± 2</b>
<b>SMYD3</b>
<b>ND</b>
<b>0 ± 5</b>
<b>WHSC1</b>
<b>>100,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b>8 ± 3</b>
<b>WHSC1L1</b>
<b>>100,000</b><sup><b>c</b></sup>
<b>9 ± 8</b>
a: Значения представляют собой среднее и стандартное отклонение для двух экспериментов, определенное при концентрации соединения A 10 мкмоль/л.b: Значения представляют собой среднее от двух экспериментов, каждый эксперимент проводили в двух повторениях.c: Значения представляют собой значения одного эксперимента, каждый эксперимент проводили в двух повторениях.d: Все белки EZH1 и EZH2 анализировали в контексте компонентов 4 PRC2 (EZH1/2, SUZ12, RBAP48, EED).e: Анализировали с использованием пептидов H3K27 в качестве субстрата.
[0381] Соединение A специфично ингибирует клеточное метилирование H3K27, приводя к селективному уничтожению мутантных клеток ЗРО SMARCB1 путем апоптоза
SMARCB1
SMARCB1
In vitro
SMARCB1
SMARCB1
SMARCB1
SMARCB1
50
1
2
1
1
: Панель клеток ЗРО с отсутствием  и контрольных клеток, содержащих  дикого типа (что подтверждали с помощью иммуноблоттинга, Фигура 12A) обрабатывали соединением A в течение 4 дней, что приводило к зависимому от концентрации уменьшению общего уровня H3K27Me3 (Фигура 10B и Таблица 6). Обработка клеток дикого типа или мутантных клеток приводила к уменьшению только метильных меток на H3K27 без влияния на метильные метки других гистонов (Фигура 12B).  обработка клеточных линий ЗРО с делецией соединением A вызывает сильные антипролиферативные эффекты со значениями IC в нМ диапазоне; тогда как на контрольные клеточные линии (дикого типа) она оказывала минимальное влияние (Фигура 10C и таблица 6). Антипролиферативные эффекты были очевидны в клетках ЗРО с делецией через 7 дней воздействия соединения, но для максимальной активности требовалось 14 дней воздействия. Оценивали действие инкубирования с соединением A (1 мкМ) в течение 14 дней на прогрессирование клеточного цикла и апоптоз в клетках G401 и RD. Инкубирование с соединением A клеток RD, содержащих  дикого типа, не приводило к изменениям клеточного цикла или апоптоза по сравнению с контролем ДМСО (Фигура 13A). Напротив, для клеток G401 с делецией  было показано увеличение процента клеток в G фазе с сопутствующим уменьшением клеток в S фазе и G/M фазе через 7 дней (Фигура 13B). Чрез 7 дней не наблюдалось очевидного повышения фракции клеток в суб-G фазе, что указывает на отсутствие индукции апоптоза в указанное время. Полученные данные соответствуют кривыми роста клеток G401 в присутствии соединения A, которое проявляет цитотоксичность только через 7 дней инкубирования (Фигура 10C). После лечения клеток G401 соединением A в течение периода продолжительностью до 14 дней фракция клеток в суб-G фазе, а также фракция апоптотических клеток, определенная с помощью TUNEL-анализа, повышалась зависимым от времени образом с 11 по 14 день, что указывало на опосредованную соединением A гибель клеток путем индукции апоптоза (Фигура 13B).
Таблица 6
<b>Клеточная линия</b>
<b>Статус </b><b><i>SMARCB1</i></b>
<b>IC</b><sub><b>50 </b></sub><b>для метилирования (нМ)</b><sup><b>a</b></sup>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> для пролиферации на 14 день (нМ)</b><sup><b>b</b></sup>
G401
мутант
2,7
135
A204
мутант
1,4
590
G402
мутант
1,7
144
KYM-1
мутант
4,3
32
RD
дикий тип
5,6
6100, > 10000<sup>c</sup>
293
дикий тип
2,4
> 10000
SJCRH30
дикий тип
4,9
5100, >10000<sup>c</sup>
a: Данные получены после инкубации в течение 4 дней, экстракции гистонов, иммуноблоттинга и денситометрии. Значения представляют собой среднее от двух экспериментов.b: Инкубирование с соединениями для каждого эксперимента осуществляли в трех повторениях, значения представляют собой среднее от 2 экспериментов для всех клеточных линий.c: Расчет среднего для повторяющихся экспериментов не возможен.
[0382] Соединение A индуцирует гены нейрональной дифференцировки и ингибирования клеточного цикла при ингибировании экспрессии генов пути hedgehog, MYC и EZH2:
CD133, DOCK4, PTPRK
CDKN2A
BIN1
GLI1
SMARCB1
CD133, DOCK4
PTPRK
CDKN1A
CDKN2A
BIN1
MYC
EZH2
SMARCB1
Было предположено, что потеря SMARCB1 приводит к возникновению рака в результате одновременного эпигенетического изменения ключевых сигнальных путей рака. Данные, полученные согласно настоявшему изобретению, подтвердили ранее описанное уменьшение экспрессии генов, важных для нейрональной дифференцировки (), ингибирования клеточного цикла () и опухолевой супрессии (), а также повышение экспрессии гена пути hedgehog  в клетках G401 с делецией  по сравнению с контрольными клетками (Фигура 14A). Лечение соединением A клеток G401 в течение периода времени до 7 дней вызывало сильную индукцию экспрессии  и  и активацию ингибиторов клеточного цикла  и  и опухолевого супрессора  зависимым от времени образом (Фигура 14B). Одновременно уменьшалась экспрессия генов пути hedgehog,  и . Необходимо отметить, что клетки G402 с делецией , которые подвергали воздействию соединения A в течение 14 дней, принимали нейрон-подобную морфологию (Фигура 14C). Напротив, Инкубирование с соединением A контрольных клеток RD приводило к минимальному влиянию на экспрессию перечисленных выше генов.
[0383] Соединение A уничтожает мутантные по SMARCB1 ксенотрансплантаты ЗРО
in vivo
SMARCB1
CD133, PTPRK, DOCK4
GLI1
: Пероральное введение дозы соединения A приводило к системному воздействию соединения, направленному ингибированию  и противоопухолевой активности у мышей, содержащих ксенотрансплантаты ЗРО с делецией . Проводили исследование на мышах SCID, содержащих подкожные ксенотрансплантаты G401, в ходе которого животным вводили дозу соединения A в течение 21 дня. Половину мышей из каждой группы усыпляли на 21 день для сбора крови и образцов тканей, тогда как оставшихся животных лечили в течение дополнительных 7 дней и затем в течение дополнительных 32 дней дозу не вводили. Соединение A хорошо мыши переносили во всех дозах с минимальным воздействием на массу тела (Фигура 15A). Введение дозы 250 мг/кг или 500 мг/кг два раза в день (BID) в течение периода времени от 21 до 28 дней приводило к фактическому устранению быстро растущих опухолей G401 (Фигуры 15B, 14C и 16A). Возобновление роста не наблюдали в течение 32 дней после прекращения введения дозы. Введение соединения A в дозе 125 мг/кг вызывало остановку роста опухоли во время периода введения и значительную задержку роста опухоли по сравнению с носителем после периода введения дозы. Результаты измерения плазматического уровня соединения A либо за 5 мин до, либо через 3 часа после введение дозы на 21 день показали явное дозозависимое повышение системного воздействия (Фигура 15D). В опухолях, собранных от подгрупп мышей из каждой группы на 21 день наблюдали сильное ингибирование H3K27me3, коррелирующее с противоопухолевой активностью (максимальный эффект достигался при дозе 250 мг/кг, Фигура 16B). Кроме того, в ксенотрансплантатах опухолей G401 выявлялись дозозависимые изменения экспрессии  и (Фигура 16C).
SMARCB1
SMARCB1
GLI1
PTCH1
MYC
EZH2
[0384] Данные, полученные согласно настоящему изобретению, демонстрируют, что фармакологическое ингибирование EZH2 вызывало специфичный антипролиферативный эффект в клеточных линиях ЗРО с делецией  и перманентно устраняло ксенотрансплантаты ЗРО у мышей. Полученные данные подтверждают зависимость таких раковых заболеваний от активности PRC2, независимо от того, что сам EZH2 не является генетически измененным в данном случае. Данные, представленные в настоящей заявке, показывают, что в случае клеток ЗРО с делецией  ингибирование EZH2 заменяет действие SMARCB1 и приводит к устранению репрессии генов нейрональной дифференцировки, ингибиторов клеточного цикла и опухолевых супрессоров при уменьшении , ,  и . Суммарный эффект опосредованного соединением A ингибирования EZH2 на несколько сигнальных раковых путей является причиной мощной и перманентной противоопухолевой активности, наблюдаемой в моделях ЗРО. Таким образом, соединение A представляет собой новый способ лечения указанных летальных опухолей детей.
EZH2
[0385] Более того, поскольку несколько членов комплекса SWI/SNF генетически изменены в других типах рака помимо ЗРО, вероятно, что EZH2 также принимает участие в поддержании опухолей и выживании в различных типах рака. Наряду с недавно описанными данными, демонстрирующими эффективность ингибиторов EZH2 в селективном уничтожении неходжкинских лимфом, содержащих мутантный , данные, полученные согласно настоящему изобретению, демонстрируют, что ингибирование EZH2 с помощью низкомолекулярных соединений представляет собой эффективный способ терапевтического вмешательства для лечения различных гематологических и солидных опухолей, для которых генетические изменения, направленные или не направленные на мишень, подтверждают зависимость пролиферации от ферментативной активности EZH2.
Пример 3
: Материалы и способы
[0386] Клеточные культуры
: Клеточные линии 293T, RD, SJCRH30, A204, G401, G402, и KYM-1. 293T (CRL-11268), RD (CRL-136), SJCRH30 (CRL-2061), A204 (HTB-82), G401 (CRL-1441) и G402 (CRL-1440) были получены из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, ATCC). Линия KYM-1 (JCRB0627) была получена из Японского ресурсного банка (Japanese Collection of Research Bioresources, JCRB). Клетки 293T и RD культивировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки SJCRH30 культивировали в среде RPMI, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки A204, G401 и G402 культивировали в среде McCoys 5a, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Клетки KYM-1 культивировали в среде DMEM/Ham’s F12, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки.
[0387] Анализ с помощью Вестерн-блоттинга
: Гистоны экстрагировали с помощью кислоты, как описано ранее (Daigle et al., Blood. 2013 Aug 8;122(6):1017-25). Вестерн-блоттинг экстрагированных кислотой гистонов проводили, как описано ранее (Knutson et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 May 7;110(19):7922-7). Тотальные клеточные лизаты (WCL) получали с использованием модифицированного RIPA-буфера (10x лизирующий буфер RIPA (Millipore #20-188), 0,1% ДСН (Invitrogen AM9823), мини-таблетка ингибиторов протеаз (Roche #1836153)). Клетки осаждали, промывали ледяным ФСБ, ресуспендировали в ледяном буфере RIPA и инкубировали на льду в течение 5 минут. Лизаты обрабатывали ультразвуком 3 раза в течение 10 сек при 50% интенсивности, затем инкубировали на льду в течение 10 минут. Затем лизаты центрифугировали при максимальной скорости в течение 15 минут при 4 градусах в настольной центрифуге. Аликвоты очищенных лизатов переносили в чистую пробирку и определяли концентрацию белка для WCL с помощью BCA-анализа (Pierce). Десять микрограмм каждого лизата фракционировали в 10-20% трис-глициновом геле (Biorad), переносили с помощью прибора iBlot (7 минут по программе 3 с использованием нитроцеллюлозных мембран для переноса) и метили следующими антителами в блокирующем буфере Odyssey: SNF5 (CST #8745), EZH2 (CST #5246) и бета-актин (CST #3700).
[0388] Клеточные анализы
in vitro
6
: В анализах пролиферации адгезионных клеточных линий (всех клеточных линий, за исключением KYM-1, которую анализировали, как описано ранее для суспензионных клеточных линий (Daigle et al., Blood. 2013 Aug 8;122(6):1017-25) для каждой клеточной линии определяли плотность посева на основании кривых роста (измеряли с помощью АТФ-выживаемости) и плотность в течение периода времени 7 дней. За день до лечения соединением клетки помещали в либо 96-луночные планшеты в трех повторениях (на период времени от 0 до 7 дней), либо в 6-луночные планшеты (для повторного рассева на 7 день на оставшийся период времени). На 0 день клетки либо не обрабатывали, либо обрабатывали ДМСО или соединением A с начальной концентрацией 10 мкМ, которую уменьшали путем 3- либо 4-кратных разведений. Планшеты анализировали на 0, 4 и 7 день с использованием реагента CellTiter-Glo (Promega), где объем соединения/среды восполняли на 4 день. На 7 день 6-луночные планшеты обрабатывали трипсином, центрифугировали и ресуспендировали в свежей среде для подсчета клеток с помощью Vi-Cell. Клетки из каждой группы лечения заново помещали в 96-луночные планшеты в трех повторениях в плотности, соответствующей исходной плотности посева. Клеткам позволяли прикрепляться к поверхности планшета в течение ночи, затем клетки обрабатывали таким же образом, как на 0 день. На 7, 11 и 14 день планшеты анализировали с использованием реагента CellTiter-Glo, где объем соединения/среды восполняли на 11 день. Средние значения от трех повторностей использовали для нанесения на график пролиферации в зависимости от времени и рассчитывали значения IC50. Для анализа клеточного цикла и апоптоза клетки G401 и RD помещали в чашки диаметром 15 см в двух повторениях в плотности 1x10 клеток на чашку. Клетки инкубировали с соединением A в концентрации 1 мкМ в общем объеме 25 мл в течение 14 дней, при этом на 4, 7 и 11 день клетки повторно рассевали в плотности, соответствующей исходной плотности посева. Анализ клеточного цикла и TUNEL-анализ проводили с использованием проточного цитометра Guava в соответствии с протоколом изготовителя.
[0389] Анализ экспрессии генов
TM
in vivo
: Клетки G401 и RD помещали во флаконы T-75 в концентрации 175,000 клеток/флакон и 117,000 клеток/флакон, соответственно, и позволяли им прикрепляться в течение ночи. На 0 день клетки обрабатывали в двух повторениях ДМСО или 1 мкМ соединения A. Клетки собирали и осаждали на 2, 4 и 7 день в среде, где объем соединения восполняли на 4 день. Ткань опухоли, полученной от животных, содержащих ксенотрансплантат G401, которым вводили дозу в течение 21 дня (группа, получающая носитель, группы, получающие соединения A в дозе 125 мг/кг и 250 мг/кг (по 6 животных на каждую группу) и 500 мг/кг (4 животных)) использовали для анализа экспрессии гена. Тотальную мРНК экстрагировали из клеточных осадков и ткани опухоли с использованием набора RNeasy Mini (Qiagen #74106) и осуществляли обратную транскрипцию с помощью высокоэффективного набора для обратной транскрипции кДНК (Applied Biosystems (AB) #4368813). ПЦР в реальном времени проводили с помощью систем для ПЦР в реальном времени ViiA 7 (AB) с использованием смеси TaqMan Fast Advanced Master (AB #4444964) и наборов праймер/проба TaqMan, указанных в таблице ниже. Экспрессию гена нормализовали по отношению к экспрессии 18S (AB #Hs99999901_s1) и кратность изменения рассчитывали с использованием способа ΔΔCt. Для образцов  определяли среднее значение Ct +/- SD для каждой группы дозирования и кратность изменения по сравнению с группой, получающей дозу носителя, рассчитывали с помощью способа ΔΔCt.
<u>Ген</u>
<u>AB#</u>
MYC
Hs00153408_m1
EZH2
Hs00172783_m1
PTCH1
Hs00181117_m1
PROM1 (CD133)
Hs01009250_m1
GLI1
Hs01110766_m1
DOCK4
Hs00206807_m1
PTPRK
Hs00267788_m1
BIN1
Hs00184913_m1
[0390] ИФА
2
4
: Гистоны выделяли из опухолей, как описано ранее (Daigle et al), и готовили в эквивалентной концентрации (0,5 нг/мкл для H3 и 4 нг/мкл для H3K27Me3) в буфере для покрытия (ФСБ с 0,05% БСА). Образец или стандарт (100 мкл) добавляли в двух повторениях в два 96-луночных планшета для ИФА (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Гистоны, выделенные из клеток G401, обработанные ДМСО или соединением A в концентрации 10 мкмоль/л в течение 4 дней, добавляли в контрольные лунки с той же концентрацией гистонов, как и образцы гистонов опухоли. Планшеты запечатывали и инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующий день планшеты промывали 3 раза ФСБT в объеме 300 мкл/лунку (ФСБ с 0,05% Tween 20; 10x ФСБT, KPL #51-14-02) на устройстве для промывки планшетов Bio Tek. Планшеты блокировали разбавителем в объеме 300 мкл/лунку (ФСБ + 2% БСА + 0,05% Tween 20), инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов и промывали 3 раза ФСБT. Все антитела разводили в разбавителе. В каждый планшет добавляли по 100 мкл/лунку антител против H3K27Me3 (CST #9733, 50% исходный глицериновый раствор 1:1000) или общего H3 (Abcam #ab1791, 50% исходный глицериновый раствор 1:10,000). Планшеты инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре и промывали 3 раза ФСБT. Антитела анти-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) в концентрации 100 мкл/лунку добавляли в разведении 1:2000 в планшет для анализа H3K27Me3 и в разведении 1:6000 в планшет для анализа H3 и инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре. Планшеты промывали 4 раза ФСБT. Для выявления добавляли 100 мкл/лунку субстрата TMB (BioFx Laboratories, #TMBS) и планшеты инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 5 минут. Реакцию останавливали 1 н раствором HSOв концентрации 100 мкл/лунку. Абсорбцию при 450 нм считывали на ридере для микропланшетов SpectraMax M5.
[0391] Исследование ксенотрансплантатов
in vivo
6
3
3
3
: Все процедуры, связанные с содержанием, уходом и лечением животных в настоящем исследовании проводили в соответствии с руководством компании Shanghai Chemparner, принятым Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC), в соответствии с руководством Международной ассоциации по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, AAALAC). Для исследований  мышам инокулировали подкожно в правый бок клетки опухоли G-401 (5x10 /мышь) в 0,2 мл смеси основной среды и матригеля (McCoy’s 5A : матригель=1:1) для развития опухоли. Лечение начинали, когда достигали размера приблизительно 157 мм, для исследования эффективности лечения опухолей (n=16 мышей на группу). Соединение A или носитель (0,5% NaCMC+0,1% Tween-80в воде) вводили перорально BID в объеме дозы 10мкл/г в течение либо 21, либо 28 дней. Массу тела животных измеряли каждый день в течение первой недели, затем два раз в неделю в течение оставшегося времени исследования. Размер опухоли измеряли два раза в неделю в двух направлениях с использованием кронциркуля и объем выражали в мм. Для анализа PK/PD 8 мышей с самыми большими опухолями усыпляли для сбора опухоли и крови через 21 день введения дозы. Оставшимся мышам продолжали вводить дозу в течение еще одной недели и с 29 дня лечение прекращали и мышей включали в исследование задержки роста опухоли. За мышами наблюдали по отдельности до тех пор, пока масса опухоли не достигала конечной точки (2000 мм), или до 60 дня (в зависимости от того, что наступало раньше).
[0392] Фармакокинетические анализы
: Дексаметазон использовали в качестве внутреннего стандарта. Аликвоту образца плазмы 30 мкл добавляли с 30 мкл внутреннего стандарта (Дексаметазон, 1000 нг/мл) и 150 мкл ACN. Смесь перемешивали на вортексе в течение 5 мин и центрифугировали при скорости 14000 об/мин в течение 5 мин. Аликвоту 2 мкл супернатанта вводили для ЖХ-МС/МС анализа (Q-trap 3200). Для достижения 10-кратного разведения образцов плазмы аликвоту, содержащую 3 мкл образца плазмы, добавляли вместе 27 мкл контрольной плазмы, при этом коэффициент разбавления составлял 10. Затем добавляли 30 мкл внутреннего стандарта (дексаметазон, 1000 нг/мл) и 150 мкл ACN. Смесь перемешивали на вортексе в течение 5 мин и центрифугировали при скорости 14000 об/мин в течение 5 мин. Аликвоту объемом 2 мкл супернатанта вводили для ЖХ-МС/МС-анализа. Образцы опухоли гомогенизировали на гомогенизаторе Beadbeater в течение 30 секунд в присутствии 3 x ФСБ (масса к объему) с получением гомогената опухоли. Аликвоту, содержащую 30 мкл образца гомогената опухоли, добавляли вместе с 30 мкл внутреннего стандарта (дексаметазон, 1000 мг/мл) и 150 мкл ACN. Смесь перемешивали на вортексе в течение 5 мин и центрифугировали при скорости 14000 об/мин в течение 5 мин. Аликвоту, содержащую 2 мкл супернатанта, вводили для ЖХ-МС/МС-анализа.
Пример 4: Общие экспериментальные процедуры
ЯМР
[0393] 1
3
H-ЯМР-спектры получали с использованием CDCl, если иное не указано, и регистрировали при 400 или 500 МГц с использованием магнитных приборов Varian или Oxford instruments (500 МГц). Указанные мультиплетности представляют собой следующие: s=синглет, d = дублет, t = триплет, q = квадруплет, quint = квинтет, sxt = секстет, m = мультиплет, dd =двойной дублет, dt = двойной триплет; br указывает на уширенную полосу сигнала.
ЖХМС и ВЭЖХ
[0394] Ультраэффективная жидкостная хроматография на приборах Shimadzu LC-Q, Shimadzu ЖХМС-2010EV или Waters Acquity. ВЭЖХ: Продукты анализировали с помощью прибора Shimadzu SPD-20A с использованием колонки YMC ODS-M80 размером 150 x 4,5 мм или колонки YMC-Pack Pro C18 размером 150 x 4,6 мм при скорости 1,0 мл/мин.
3
4
[0395] Подвижная фаза представляла собой MeCN:H2O=3:2 (с содержанием 0,3% ДСН и 0,05% HPO),
[0396] 0,05% ТФУ в воде, 0,05% ТФУ в ацетонитриле (градиент: исходно 20 %, затем 0,05%ТФУ/MeCN до  концентрации 95 %, 3 мин., удерживание в течение 0,5 мин., при 3,51 - 4,50 мин., затем 0,05%ТФУ/MeCN, концентрация 20 % ).
[0397] В качестве альтернативы ЖХМС использовали 2 различных способа; один из способов, который в основном использовался, подходил для соединений с высоким значением pH (METCR1600), а другой использовали для более стандартных соединений (METCR1416).
[0398] 0,1% муравьиная кислота в воде – Подвижная фаза «A» 0,1% Муравьиная кислота в ацетонитриле – Подвижная фаза «B», колонка Waters Atlantis dC18, 2,1 мм x 100 мм, 3 мкм, скорость потока = 0,6 мл/мин, температура колонки = 40ºC; время (мин) %B 0,00 мин 5% B. 5,0 мин 100% B, 5,4 мин 100% B и .42 мин 5%B
[0399] 3,5-минутный способ относится к колонке Atlantis dC18, 2,1 мм x 50 мм, 3 мкм, скорость потока 1 мл/мин, при 40C. Подвижная фаза A Муравьиная кислота (водный раствор) 0,1% подвижная фаза B муравьиная кислота (MeCN) 0,1%, объем вводимой пробы 3 мкл, градиент 0 мин (5% органический растворитель), 2,5 мин (100 % органический растворитель), 2,7 мин (100 % органический растворитель), 2,71 мин (5% органический растворитель х), 3,5 мин (5% органический растворитель)
[0400] 7,0-минутный способ относится к колонке Atlantis dC18, 2,1 мм x 100 мм, 3 мкм, скорость потока 0,6 мл/мин при 40C. Подвижная фаза A - Муравьиная кислота (водный раствор) 0,1%, подвижная фаза B - муравьиная кислота (MeCN) 0,1%, объем вводимой пробы 3 мкл, градиент 0 мин (5% органический растворитель), 5 мин (100 % органический растворитель), 5,4 мин (100 % органический растворитель), 5,42 мин (5% органический растворитель), 7 мин (5% органический растворитель)
[0401] Оба способа (3. 5 и 7 минут) осуществляли на системе MS18 Shimadzu LCMS-2010EV или MS19 Shimadzu LCMS-2010EV с использованием насосов LC-20AB и детекторов SPD-M20A PDA.
[0402] Продукты очищали с помощью ВЭЖХ/МС с использованием водной системы Waters AutoPurification с масс-детектором 3100.
[0403] ВЭЖХ-анализ можно также осуществлять на приборе Shimdazu LC-2010CHT с иcпользованием колонки YMC ODS-A, C18, (150x4,6 x5 мкм) при комнатной температуре со скоростью потока 1,4 мл/мин. Использовали объем вводимой пробы 10 мкл и выявление осуществляли через UV/PDA. Подвижная фаза A представляла собой 0,05 % ТФУ в воде, и подвижная фаза B представляла собой 0,05 % ТФУ в ацетонитриле с программой градиента: исходно 5 % B - 95 % B за 8 мин, удержание в течение 1,5 мин, при 9,51 - 12 мин B. конц. 0,5 %. Разбавитель представлял собой подвижную фазу.
Другое
[0404] Автоматизированную колоночную флэш-хроматографию осуществляли на приборе Biotage Isolera version 4. Элюировали через 10 г картриджа SNAP при скорости 12 мл/мин или через 25 г картриджа SNAP при скорости 25 мл/мин, выявление осуществляли при 254 нм и 280 нм.
[0405] Селективное восстановление нитриловых групп можно осуществлять на приборе ThalesNano H-Cube в соответствии с условиями, описанными в процедуре эксперимента.
[0406] Другие связанные общие способы также можно найти в заявке PCT № WO12/118812, заявке PCT № PCT/US2012/033648 и заявке PCT № PCT/US2012/033662, каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки.
Пример 5:
Синтез N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил (тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксамида
Соединение A
[0407] Этап 1: Синтез 5-бром-2-метил-3-нитробензойной кислоты
2
4
6
1
d
[0408] К перемешанному раствору 2-метил-3-нитробензойной кислоты (100 г, 552 ммоль) в концентрированной HSO (400 мл) порциями добавляли 1,3-дибром-5,5-диметил-2,4-имидазолидиндион (88 г, 308 ммоль) при комнатной температуре и реакционную смесь затем перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Реакционную смесь выливали в ледяную воду, осажденное твердое вещество отфильтровывали, промывали водой и сушили в вакууме с получением желаемого соединения в виде твердого вещества (140 г, 98%). Выделенное соединение отбирали для использования непосредственно в следующем этапе.H ЯМР (ДМСО-, 400 МГц) δ 8,31 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 2,43 (s, 3H).
[0409] Этап 2: Синтез метил-5-бром-2-метил-3-нитробензоата
1
3
[0410] К перемешанному раствору 5-бром-2-метил-3-нитробензойной кислоты (285 г, 1105 ммоль) в ДМФА (2,8 л) при комнатной температуре добавляли карбонат натрия (468 г, 4415 ммоль) с последующим добавлением метилйодида (626,6 г, 4415 ммоль). Полученную реакционную смесь нагревали при температуре 60 °C в течение 8 часов. После завершения (по результатам ТСХ) реакционную смесь фильтровали (для удаления карбоната натрия) и промывали этилацетатом (1 л X 3). Объединенный фильтрат промывали водой (3 л X 5) и водную фазу заново экстрагировали этилацетатом (1 л X 3). Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества (290 г, выход 97%). Выделенное соединение отбирали для использования непосредственно в следующем этапе. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 8,17 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,59 (s, 3H).
[0411] Этап 3: Синтез метил-3-амино-5-бром-2-метилбензоата
1
3
[0412] К перемешанному раствору метил-5-бром-2-метил-3-нитробензоата (290 г,1058 ммоль) в этаноле (1,5 л) добавляли водный раствор хлорид аммония (283 г, 5290 ммоль, растворенный в 1,5 л воды). Полученную смесь перемешивали при температуре 80ºC и добавляли к ней порциями железный порошок (472 г, 8451 ммоль). Полученную реакционную смесь нагревали при температуре 80 °C в течение 12 часов. По завершении реакции (по результатам ТСХ) реакционную смесь фильтровали в горячем виде через фильтр Celite, и пластину, содержащую Celite, промывали метанолом (5 л) с последующей промывкой 30% MeOH в ДХМ (5 л). Объединенный фильтрат концентрировали в вакууме, полученный осадок разбавляли водным раствором бикарбоната натрия (2 л) и экстрагировали этилацетатом (5 л X 3). Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества (220 г, 85%). Соединение отбирали для использования непосредственно в следующем этапе. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 7,37 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,80 (bs, 2H), 2,31 (s, 3H).
[0413] Этап 4: Синтез метил-5-бром-2-метил-3-((тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино) бензоата
1
d
6
[0414] К перемешанному раствору метил-3-амино-5-бром-2-метилбензоата (15 г, 61,5 ммоль) и дигидро-2H-пиран-4(3)-она (9,2 г, 92 ммоль) в дихлорэтане (300 мл) добавляли уксусную кислоту (22 г, 369 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут, затем реакционную смесь охлаждали до температуры 0°C и добавляли триацетоксиборгидрид натрия (39 г, 184 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. После завершения реакции (по результатам ТСХ) к реакционной смеси добавляли водный раствор бикарбоната натрия до достижения значения pH, равного 7-8. Органическую фазу отделяли и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное соединение очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 100-200 меш) при элюировании смесью этилацетат:гексан с получением желаемого соединения в виде твердого вещества (14 г, 69%). H ЯМР (ДМСО-, 400 МГц) δ 7,01 (s, 1H), 6,98 (s, 1H), 5,00 (d, 1H, J=7,6 Гц), 3,84-3,87 (m, 2H), 3,79 (s, 3H), 3,54-3,56 (m, 1H), 3,43 (t, 2H, J=12 Гц), 2,14 (s, 3H), 1,81-1,84 (m, 2H), 1,47-1,55 (m, 2H).
[0415] Этап 5: Синтез метил-5-бром-3-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-2-метилбензоата
[0416] К перемешанному раствору метил-5-бром-2-метил-3-((тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)бензоата (
, 42,7 ммоль) в дихлорэтане (150 мл) добавляли ацетальдегид (
, 85,2 ммоль) и уксусную кислоту (
, 256 ммоль). Полученную реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Смесь охлаждали до температуры
и добавляли триацетоксиборгидрид натрия (
, 128 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. После завершения реакции (по результатам ТСХ) к реакционной смеси добавляли водный раствор бикарбоната натрия до достижения значения pH 7-8, органическую фазу отделяли и водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное соединение очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 100-200 меш) при элюировании смесью этилацетат/гексан с получением желаемого соединения в виде вязкой жидкости (
, 93%).
H ЯМР (ДМСО-
d
, 400 МГц) δ 7,62 (s, 1H), 7,52 (s, 1H), 3,80 (bs, 5H), 3,31 (t, 2H), 2,97-3,05 (m, 2H), 2,87-2,96 (m, 1H), 2,38 (s, 3H), 1,52-1,61 (m, 2H), 1,37-1,50 (m, 2H), 0,87 (t, 3H, J=6,8 Гц).
1
6
14 г3,75 г15,3 г0 °C27 г14 г
[0417] Этап 6: Синтез 5-бром-N-((4, 6-диметил-2-оксо-1, 2-дигидропиридин-3-ил) метил)-3-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-2-метилбензамида
[0418] К перемешанному раствору 5-бром-3-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-2-метилбензоата (
, 39,4 ммоль) в этаноле (100 мл) добавляли водный раствор NaOH (
, 59,2 ммоль в 25 мл воды) и полученную смесь перемешивали при температуре 60
C в течение 1 часа. После завершения реакции (по результатам ТСХ) растворитель удаляли при пониженном давлении и полученный осадок окисляли с помощью 1н раствора HCl до достижения значения pH, равного 7, затем добавляли водный раствор лимонной кислоты до достижения значения pH, равного 5-6. Водный слой экстрагировали 10% MeOH в ДХМ (200 мл X 3), объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением соответствующей кислоты (
, 100%).
o
14 г2,36 г14 г
1
d
6
[0419] Указанную выше кислоту (14 г, 40,9 ммоль) затем растворяли в ДМСО (70 мл) и добавляли 3-(аминометил)-4, 6-диметилпиридин-2(1H)-он (12,4 г, 81,9 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут, затем добавляли PYBOP (31,9 г, 61,4 ммоль) и продолжали перемешивать в течение ночи при комнатной температуре. После завершения реакции (по результатам ТСХ) реакционную смесь выливали в ледяную воду (700 мл), перемешивали в течение 30 минут и осажденное твердое вещество собирали посредством фильтрования, промывали водой (500 мл) и сушили на воздухе. Полученное твердое вещество перемешивали с ацетонитрилом (75 мл X 2), фильтровали и сушили на воздухе. Полученное твердое вещество снова перемешивали с 5% MeOH в ДХМ (100 мл), фильтровали и полностью высушивали в вакууме с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества (14 г, 74 %). H ЯМР (ДМСО-, 400 МГц) δ 11,47 (s, 1H), 8,23 (t, 1H), 7,30 (s, 1H), 7,08 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,23 (d, 2H, J=4,4 Гц), 3,81 (d, 2H, J=10,4 Гц), 3,20-3,26 (m, 2H), 3,00-3,07 (m, 1H), 2,91-2,96 (m, 2H), 2,18 (s, 3H), 2,14 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,58-1,60 (m, 2H), 1,45-1,50 (m, 2H), 0,78 (t, 3H, J=6,8 Гц).
[0420] Этап 7: Синтез N-((4, 6-диметил-2-оксо-1, 2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1, 1’-бифенил]-3-карбоксамида
[0421] К перемешанному раствору 5-бром-N-((4, 6-диметил-2-оксо-1, 2-дигидропиридин-3-ил)метил)-3-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-2-метилбензамида (
, 29,5 ммоль) в смеси диоксан/вода (70 мл/14 мл) добавляли 4-(4-(4, 4, 5, 5-тетраметил-1, 3, 2-диоксаборолан-2-ил)бензил)морфолин (
, 44,2 ммоль) с последующим добавлением Na
CO
(
, 106,1 ммоль). Через раствор пропускали аргон в течение 15 минут и затем добавляли Pd (PPh
)
(
, 2,94 ммоль) и через полученный раствор снова пропускали аргон в течение дополнительных 10 мин. Реакционную смесь нагревали при температуре
в течение 4 часов. После завершения реакции (по результатам ТСХ) реакционную смесь разбавляли водой и экстрагировали 10% MeOH/ДХМ. Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Неочищенное соединение очищали с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 100-200 меш) при элюировании смесью метанол:ДХМ с получением указанного в заголовке соединения в виде твердого вещества (
, 71 %). Аналитические данные: ЖХМС: 573,35 (M + 1)
; ВЭЖХ: 99,5% (@ 254 нм) (R
;3,999; Способ: Колонка: YMC ODS-A,
x
x 5 мкм; подвижная фаза: A: 0,05% ТФУ в воде/ B: 0,05% ТФУ в ацетонитриле; объем вводимой пробы: 10 мкл, температура колонки: 30
C; скорость потока: 1,4 мл/мин.; градиент: от 5% B до 95% B, 8 мин, удерживание в течение 1,5 мин, 9,51-12 мин 5% B);
H ЯМР (ДМСО-
d
, 400 МГц) δ 11,46 (s, 1H), 8,19 (t, 1H), 7,57 (d, 2H, J=7,2 Гц), 7,36-7,39 (m, 3H), 7,21 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,28 (d, 2H, J=2,8 Гц), 3,82 (d, 2H, J=9,6 Гц), 3,57 (bs, 4H), 3,48 (s, 2H), 3,24 (t, 2H, J=10,8Гц), 3,07-3,09 (m, 2H), 3,01 (m, 1H), 2,36 (m, 4H), 2,24 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,64-1,67 (m, 2H), 1,51-1,53 (m, 2H), 0,83 (t, 3H, J=6,4 Гц).
2
3
3
4
t
6
+
o
1
14 г13,4 г11,2 г3,40 г100°C12 г150 мм4,6 мм
[0422] Этап 8: Синтез тригидрохлорида N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил(тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1.1'-бифенил]-3-карбоксамида
Аналитические данные соли три-HCl: ЖХМС
Способ:
+
o
1
t
2
[0423] N-((4, 6-диметил-2-оксо-1, 2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(этил (тетрагидро-2H-пиран-4-ил)амино)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1.1’-бифенил]-3-карбоксамид (12 г, 21,0 ммоль) растворяли в метанольном растворе HCl (200 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. После перемешивания в течение трех часов реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Полученное твердое вещество перемешивали с эфиром (100 мл X 2) с получением желаемой соли в виде твердого вещества (11 г, 77 %). : 573,40 (M + 1); ВЭЖХ: 99,1% (@ 254 нм) (R;3,961;  Колонка: YMC ODS-A, 150 мм x 4,6 мм x 5 мкм; подвижная фаза: A: 0,05% ТФУ в воде/ B: 0,05% ТФУ в ацетонитриле; объем вводимой пробы: 10 мкл, температура колонки: 30 C; скорость потока: 1,4 мл/мин.; градиент: от 5% B до 95% B, 8 мин, удерживание в течение 1,5 мин, 9,51-12 мин 5% B); H ЯМР (DO 400 МГц) δ 7,92 (bs, 1H,) 7,80 (s, 1H), 7,77 (d, 2H, J=8 Гц), 7,63 (s, 1H), 7,61 (s, 1H), 6,30 (s, 1H), 4,48 (s, 2H), 4,42 (s, 2H), 4,09-4,11 (m, 4H), 3,95-3,97 (m, 2H), 3,77 (t, 3H, J=10,4 Гц), 3,44-3,47 (m, 3H), 3,24-3,32 (m, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,35 (s, 3H), 2,26 (s, 3H), 2,01 (m, 2H), 1,76 (m, 2H), 1,04 (t, 3H, J=6,8 Гц).
Пример 6:
N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(((1r,4r)-4-(диметиламино)циклогексил)(этил)амино)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксамид
Соединение E
[0424] Этап 1: 5-бром-2-метил-3-нитробензойная кислота
2
4
6
1
d
[0425] К перемешанному раствору 2-метил-3-нитробензойной кислоты (100 г, 552,48 ммоль) в концентрированной HSO (400 мл) порциями добавляли 1,3-дибром-5,5-диметил-2,4-имидазолидиндион (87,98 г, 307,70 ммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь затем перемешивали при комнатной температуре в течение 5 ч. Реакционную смесь выливали в ледяную воду, осажденное твердое вещество собирали посредством фильтрования, промывали водой и сушили в вакууме с получением желаемой 5-бром-2-метил-3-нитробензойной кислоты в виде твердого вещества не совсем белого цвета (140 г, выход 97,90%). H ЯМР (ДМСО-, 400 МГц) δ 8,31 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 2,43 (s, 3H).
[0426] Этап 2: метил-5-бром-2-метил-3-нитробензоат
1
3
[0427] К перемешанному раствору 5-бром-2-метил-3-нитробензойной кислоты (285 г, 1104,65 ммоль) в ДМФА (2,8 л) добавляли карбонат натрия (468 г, 4415,09 ммоль) с последующим добавлением метилйодида (626,63 г, 4415 ммоль) при комнатной температуре. Полученную реакционную смесь перемешивали при температуре 60 °C в течение 8 часов. Реакционную смесь затем фильтровали для удаления суспендированного твердого вещества, которое тщательно промывали этилацетатом (3 x 1 л). Объединенные фильтраты тщательно промывали водой (5 x 3 л) и водную фазу заново экстрагировали этилацетатом (3 x 1 л). Объединенные органические экстракты сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением метил-5-бром-2-метил-3-нитробензоата в виде твердого вещества не совсем белого цвета (290 г, выход 97%). H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 8,17 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 3,96 (s, 3H), 2,59 (s, 3H).
[0428] Этап 3: метил-3-амино-5-бром-2-метилбензоат
[0429] К перемешанному раствору метил-5-бром-2-метил-3-нитробензоата (290 г, 1058,39 ммоль) в этаноле (1,5 л) добавляли водный раствор хлорида аммония (283 г, 5290 ммоль, растворенный в 1,5 л воды). Полученную смесь перемешивали и нагревали при 80 °C с последующим добавлением железного порошка (472 г, 8451 ммоль) порциями при 80 °C. Полученную реакционную смесь нагревали при температуре 80 °C в течение 12 ч. Реакционную смесь затем фильтровали в горячем виде через фильтр Celite и пластину, содержащую Celite, тщательно промывали метанолом (5 л) и затем 30% MeOH в ДХМ (5 л). Объединенные фильтраты концентрировали в вакууме и полученный осадок разбавляли водным раствором бикарбоната (2 л) и экстрагировали этилацетатом (3 x 5 л). Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении с получением метил-3-амино-5-бром-2-метилбензоата в виде твердого вещества коричневого цвета (220 г, выход 89,41%).
1
3
[0430] Порцию продукта (5 г) растворяли в горячем этаноле (20 мл), нерастворимый осадок отфильтровывали и маточный раствор концентрировали с получением метил-3-амино-5-бром-2-метилбензоата (3,5 г, выход 70%) со степенью чистоты 93,81% (ВЭЖХ ) в виде твердого вещества светло-коричневого цвета. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 7,37 (s, 1H), 6,92 (s, 1H), 3,94 (s, 3H), 3,80 (bs, 2H), 2,31 (s, 3H).
[0431] Этап 4: метил 5-бром-3-(((1r,4r)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)циклогексил)амино)-2-метилбензоат
o
1
3
[0432] К перемешанному раствору метил-3-амино-5-бром-2-метилбензоата (5 г, 20,5 ммоль) и трет-бутил(4-оксоциклогексил)карбамата (5,69 г, 26,7 ммоль) в дихлорэтане (50 мл) добавляли уксусную кислоту (7,4 г, 123 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли триацетоксиборгидрид натрия (13,1 г, 61,7 ммоль) при температуре 0 C и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакцию гасили водным раствором бикарбоната натрия, отделяли органическую фазу и водную фазу экстрагировали дихлорметаном. Объединенные органические слои сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (размер пор 100-200 меш) при элюировании 10% этилацетатом в гексане с получением 3,5 г более полярного (транс) изомера метил-5-бром-3-(((1r,4r)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)циклогексил)амино)-2-метилбензоата в виде твердого вещества (38,46%). H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ 7,21 (s, 1H), 6,80 (s, 1H), 4,41 (bs, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,60 (m, 1H), 3,45 (m, 1H), 3,20 (m, 1H), 2,22 (s, 3H), 2,15 (bs, 2H), 2,05 (bs, 2H), 1,45 (s, 9H), 1,30 (m, 4H).
[0433] Этап 5: метил-5-бром-3-(((1r,4r)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)циклогексил)-(этил)амино)-2-метилбензоат
o
1
[0434] К перемешанному раствору метил-5-бром-3-(((1r,4r)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)-циклогексил)(этил)амино)-2-метилбензоата (55 г, 0,124 моль) и ацетальдегида (11 г, 0,25 моль) в дихлорэтане (550 мл) добавляли уксусную кислоту (44,64 г, 0,744 моль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем добавляли триацетоксиборгидрид натрия (79 г, 0,372 моль) при 0 C и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Реакцию гасили водным раствором бикарбоната натрия, органическую фазу отделяли и водную фазу экстрагировали дихлорметаном. Объединенные экстракты сушили над безводным сульфатом натрия и концентрировали в вакууме. Неочищенное соединение очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (размер пор 100-200 меш) при элюировании 10% этилацетатом в гексане с получением 44 г метил-5-бром-3-(((1r,4r)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)циклогексил)-(этил)амино)-2-метилбензоата (75,2%) в виде твердого вещества. H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 7,55 (s, 1H), 7,45 (s, 1H), 6,65 (d, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,15 (bs, 1H), 3,05 (q, 2H), 2,60 (m, 1H), 2,30 (s, 3H), 1,75 (m, 4H), 1,40 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,80 (t, 3H).
[0435] Этап 6: трет-бутил((1r,4r)-4-((5-бром-3-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)карбамоил)-2-метилфенил)(этил)амино)циклогексил)карбамат
2
o
1
[0436] К раствору метил-5-бром-3-(((1r,4r)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)циклогексил)-(этил)амино)-2-метилбензоата (25 г, 0,053 моль) в EtOH (100 мл) добавляли водный раствор NaOH (3,5 г, 0,08 моль в 10 мл HO) и перемешивали при 60 C в течение 1 ч. Затем этанол удаляли при пониженном давлении и реакционную смесь окисляли до достижения pH, равного 8, с помощью разбавленной HCl и до достижения pH, равного 6, с помощью лимонной кислоты. Смесь экстрагировали 10% метанолом в ДХМ (3 x 200 мл). Объединенные органические слои сушили и концентрировали с получением соответствующей кислоты (24,2 г, 99,0 %). H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 13,13 (s, 1H), 7,54 (s, 1H), 7,43 (s, 1H), 6,68 (d, 1H), 3,14 (bs, 1H), 3,03 (q, 2H), 2,56 (m, 1H), 2,33 (s, 3H), 1,80-1,65 (m, 4H), 1,40 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,77 (t, 3H).
1
[0437] Кислоту (24 г, 0,053 моль) растворяли в ДМСО (100 мл) и добавляли 3-(аминометил)-4,6-диметилпиридин-2(1H)-он (16 г, 0,106 моль) и триэтилaмин (5,3 г, 0,053 моль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем добавляли PyBop (41 г, 0,079 ммоль) и продолжали перемешивать в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь выливали в ледяную воду (1л). Полученный осадок собирали посредством фильтрования, тщательно промывали водой (2 x 1 л) и сушили. Полученный продукт затем очищали путем промывания ацетонитрилом (3 x 200 мл) и ДХМ (100 мл) с получением трет-бутил-((1r,4r)-4-((5-бром-3-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)карбамоил)-2-метилфенил)(этил)амино)циклогексил)-карбамата (24 г, 77 %). H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 11,47 (s, 1H), 8,24 (t, 1H), 7,25 (s, 1H), 7,04 (s, 1H), 6,67 (d, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,24 (d, 2H), 3,13 (bs, 1H), 3,01 (q, 2H), 2,53 (m, 1H), 2,18 (s, 3H), 2,10 (s, 6H), 1,80-1,65 (m, 4H), 1,40 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,77 (t, 3H).
[0438] Этап 7: трет-Бутил((1r,4r)-4-((5-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)карбамоил)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-ил)(этил)амино)циклогексил)карбамат
2
3
3
4
2
4
1
[0439] К перемешанному раствору трет-бутил((1r,4r)-4-((5-бром-3-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)карбамоил)-2-метилфенил)(этил)амино)циклогексил)-карбамата (24 г, 0,041 моль) и 4-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)бензил)морфолина (18 г, 0,061 моль) в смеси диоксан/вода (160 мл + 40 мл) добавляли NaCO (15 г, 0,15 моль) и через раствор пропускали аргон в течение 15 мин. Затем добавляли Pd(PPh) (4,7 г, 0,041 моль) и через реакционную смесь снова пропускали аргон в течение 10 мин. Реакционную смесь нагревали при температуре 100 °C в течение 4 ч. Реакционную смесь затем разбавляли смесью 10% MeOH/ДХМ (500 мл) и фильтровали. Фильтрат концентрировали, разбавляли водой (500 мл) и экстрагировали 10% MeOH в ДХМ (3 x 500 мл). Объединенные органические слои сушили над NaSO и растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (100-200 меш) при элюировании 7% MeOH в ДХМ с получением трет-бутил((1r,4r)-4-((5-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)карбамоил)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1.1'-бифенил]-3-ил)(этил)амино)циклогексил)карбамата (20 г, 71,43 %). H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 11,46 (s, 1H), 8,20 (t, 1H), 7,56 (d, 2H), 7,36 (m, 3H), 7,17 (s, 1H), 6,66 (d, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,28 (d, 2H), 3,57 (bs, 4H), 3,48 (s, 2H), 3,20-3,05 (m, 3H), 2,62 (m, 1H), 2,36 (bs, 4H), 2,20 (s, 6H), 2,10 (s, 3H), 1,75 (m, 4H), 1,42 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 1,10 (m, 2H), 0,82 (t, 3H).
[0440] Этап 8: 5-(((1r,4r)-4-аминоциклогексил)(этил)амино)-N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксамид
o
1
2
4
[0441] К перемешанному раствору трет-бутил ((1r,4r)-4-((5-(((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)карбамоил)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1.1'-бифенил]-3-ил)(этил)амино)циклогексил)карбамата (20 г, 0,03 моль) в ДХМ (200 мл) при температуре 0 C добавляли ТФУ (75 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь затем концентрировали до высыхания и осадок защелачивали водным насыщенным раствором бикарбоната (300 мл) до достижения значения pH, равного 8. Смесь экстрагировали 20% метанолом в ДХМ (4 x 200 м). Объединенные экстракты сушили над NaSO и растворитель удаляли при пониженном давлении с получением 5-(((1r,4r)-4-аминоциклогексил)(этил)амино)-N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксамида (15,5 г, 91%), который использовали в неизменном виде в следующей реакции. H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 8,18 (bs, 1H), 7,57 (d, 2H), 7,38 (m, 3H), 7,20 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,29 (d, 2H), 3,57 (bs, 4H), 3,48 (s, 2H), 3,31 (bs, 2H), 3,10 (m, 2H), 2,91 (m, 1H), 2,67 (m, 1H), 2,36 (bs, 4H), 2,21 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 1,90 (m, 2H), 1,83 (m, 2H), 1,45 (m, 2H), 1,23 (m, 2H), 0,83 (t, 3H).
[0442] Этап 9: N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-5-(((1r,4r)-4-(диметиламино)циклогексил)(этил)амино)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксамид
3
2
4
t
+
o
1
[0443] К перемешанному раствору 5-(((1r,4r)-4-аминоциклогексил)(этил)амино)-N-((4,6-диметил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-3-ил)метил)-4-метил-4'-(морфолинометил)-[1,1'-бифенил]-3-карбоксамида (14 г, 0,023 моль) в дихлорметане (150 мл) добавляли водный 35% раствор формальдегида (2,4 г, 0,080 моль) при температуре 0° C. После перемешивания в течение 20 мин добавляли Na(OAc)BH (12,2 г, 0,057 моль) и продолжали перемешивать в течение 2 часов при температуре 0° C. Затем к реакционной смеси добавляли воду (100 мл) и полученную смесь экстрагировали 20% метанолом в ДХМ (3 x 200 мл). Объединенные экстракты сушили над NaSO и растворитель удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на щелочном оксиде алюминия при элюировании 6-7% MeOH в ДХМ с получением указанного в заголовке соединения (10 г, 63,6%). ЖХМС: 614,65 (M + 1); ВЭЖХ: 98,88% (@ 210-370 нм) (R;3,724; Способ: колонка: YMC ODS-A 150 мм x 4,6 мм x 5 мкм; подвижная фаза: A: 0,05% ТФУ в воде/B: 0,05% ТФУ в ацетонитриле; объем вводимой пробы: 10 мкл, температура колонки: 30 C; скорость потока: 1,4 мл/мин.; градиент: 5% B - 95% B, 8 мин, удерживание в течение 1,5 мин, 9,51-12 мин 5% B); H ЯМР (ДМСО-d6, 400 МГц) δ 11,45 (s, 1H), 8,17 (t, 1H), 7,56 (d, 2H, J=8 Гц), 7,36 (m, 3H), 7,17 (s, 1H), 5,85 (s, 1H), 4,29 (d, 2H, J=4,4 Гц), 3,57 (bs, 4H), 3,48 (s, 2H), 3,09 (q, 2H), 2,66 (m, 1H), 2,36 (bs, 4H), 2,21 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,11 (s, 9H), 1,79 (m, 4H), 1,36 (m, 2H), 1,11 (m, 2H), 0,82 (t, 3H, J=6,4&6,8 Гц).
[0444] Пример 7:
Протокол биоанализа и общие способы
Протокол ферментативных анализов PRC2 дикого типа и мутантного PRC2
[0445] Общие материалы.
S
S
3
-аденозилметионин (SAM), -аденозилгомоцистеин (SAH), бицин, KCl, Tween20, диметилсульфоксид (ДМСО) и бычий желатин кожи (БЖК) получали из компании Sigma-Aldrich с максимальной возможной степенью чистоты. Дитиотреитол (DTT) получали из компании EMD. H-SAM со специфической активностью 80 Ки/ммоль получали из компании American Radiolabeled Chemicals. 384-луночные планшеты Flashplate со стрептавидиновым покрытием получали из компании PerkinElmer.
[0446] Субстраты.
st
Синтезировали пептиды, характерные для остатков 21 – 44 гистона H3 человека, содержащие либо немодифицированный лизин 27 (H3K27me0), либо диметилированный лизин 27 (H3K27me2) с C-концевым мотивом G(K-биoтиновый) линкер-аффинная метка и C-концевым амидным кэпом от компании 21 Century Biochemicals. Пептиды очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) до достижения чистоты более 95% и чистоту подтверждали с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Последовательности перечислены ниже.
H3K27me0: ATKAARKSAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotin)-амид (SEQ ID NO: 7)
H3K27me2: ATKAARK(me2)SAPATGGVKKPHRYRPGGK(biotin)-амид (SEQ ID NO: 8)
[0447] Олигонуклеосомы эритроцитов курицы очищали из крови курицы в соответствии с общепринятыми способами.
[0448] Комплексы рекомбинантного PRC2.
Spodoptera frugiperda
Комплексы PRC2 человека очищали в виде 4-компонентных ферментативных комплексов, ко-экспрессируемых в клетках  (sf9) с использованием бакуловирусной системы экспрессии. Экспрессируемые субъединицы представляли собой EZH2 дикого типа (NM_004456) или мутанты EZH2 Y641F, N, H, S или C, образованные из конструкта EZH2 дикого типа, EED (NM_003797), Suz12 (NM_015355) и RbAp48 (NM_005610). Субъединица EED содержала N-концевую метку FLAG, которую использовали для очистки целого 4-компонентного комплекса из лизатов клеток sf9. Чистота комплексов соответствовала или превышала 95% по результатам ДСН-ПААГ и анализа с помощью биоанализатора Agilent. Исходные концентрации фермента (в целом 0,3 – 1,0 мг/мл) определяли с помощью анализа по методике Брэдфорд с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина (БСА).
[0449] Общий способ для проведения ферментативных анализов PRC2 на пептидных субстратах.
3
3
3
Анализы проводили в буфере, состоящем из 20 мМ бицина (pH = 7,6), 0,5 мМ DTT, 0,005% БЖК и 0,002% Tween 20, приготовленном в день применения. Соединения в 100% ДМСО (1 мкл) раскапывали в полипропиленовые 384-луночные планшеты с V-образным дном (Greiner) с использованием прибора Platemate 2 X 3, оснащенного 384-канальной пипеточной головкой (Thermo). ДМСО (1 мкл) добавляли в колонки 11, 12, 23, 24 рядов A – H для контроля максимального сигнала и SAH, известный продукт, и ингибитор PRC2 (1 мкл) добавляли в колонки 11,12, 23, 24 рядов I – P для контроля минимального сигнала. Смесь (40 мкл), содержащую фермент PRC2 дикого типа и пептид H3K27me0 или любой из мутантных ферментов Y641 и пептид H3K27me2 добавляли с помощью прибора Multidrop Combi (Thermo). Соединения инкубировали с PRC2 в течение 30 мин при 25 °C, затем добавляли суспензию (10 мкл), содержащую смесь нерадиоактивного SAM и H-SAM, для инициации реакции (конечный объем = 51 мкл). Во всех случаях конечные концентрации были следующими: концентрация фермента PRC2 дикого типа или мутантного PRC2 составляла 4 нМ, концентрация SAH в лунках контроля минимального сигнала составляла 1 мМ, и концентрация ДМСО составляла 1%. Конечные концентрации остальных компонентов указаны в Таблице 7, ниже. Анализы останавливали путем добавления нерадиоактивного SAM (10 мкл) к конечной концентрации 600 мкМ, которая обеспечивала разведение H-SAM до того уровня, когда его включение в пептидный субстрат уже не поддается выявлению. 50 мкл реакционной смеси из 384-луночного полипропиленового планшета затем переносили в 384-луночный планшет Flashplate и биотинилированным пептидам позволяли связываться со стрептавииновой поверхностью в течение по меньшей мере 1 ч до трехкратной промывки 0,1% Tween20 в устройстве для отмывки планшетов Biotek ELx405. Планшеты затем анализировали на планшетном ридере PerkinElmer TopCount для определения количества H-меченного пептида, связанного с поверхностью планшета Flashplate, которое измеряли как число распадов в минуту (dpm), альтернативно называемое числом импульсов в минуту (cpm).
[0450] Таблица 7: Конечные концентрации компонентов для каждого варианта анализа на основе идентификации EZH2 (EZH2 дикого типа или мутанта Y641)
Фермент PRC2(обозначенный по статусу EZH2)
Пептид (нМ)
Нерадиоактивный SAM (нМ)
<sup>3</sup>H-SAM (нМ)
Дикого типа
185
1800
150
Y641F
200
850
150
Y641N
200
850
150
Y641H
200
1750
250
Y641S
200
1300
200
Y641C
200
3750
250
[0451] Общий способ анализа фермента PRC2 дикого типа на олигонуклеосомном субстрате.
3
3
3
3
Анализы проводили в буфере, состоящем из 20 мМ бицина (pH = 7,6), 0,5 мМ DTT, 0,005% БЖК, 100 мМ KCl и 0,002% Tween20, приготовленном в день применения. Соединения в 100% ДМСО (1 мкл) раскапывали в полипропиленовые 384-луночные планшеты с V-образным дном (Greiner) с использованием прибора Platemate 2 X 3, снабженного 384-канальной пипеточной головкой (Thermo). ДМСО (1 мкл) добавляли в колонки 11, 12, 23, 24 рядов A – H для контроля максимального сигнала и SAH, известный продукт и ингибитор PRC2 (1 мкл) добавляли в колонки 11,12, 23, 24 рядов I – P для контроля минимального сигнала. Коктейль (40 мкл), содержащий фермент PRC2 дикого типа и олигонуклеосомы  эритроцитов курицы добавляли с помощью прибора Multidrop Combi (Thermo). Соединения инкубировали с PRC2 в течение 30 мин при 25 °C, затем коктейль (10 мкл), содержащий смесь нерадиоактивного SAM и H-SAM добавляли для инициации реакции (конечный объем = 51 мкл). Конечные концентрации были следующими: концентрация фермента PRC2 дикого типа составляла 4 нМ, концентрация нерадиоактивного SAM составляла 430 нМ, концентрация H-SAM составляла 120 нМ, концентрация олигонуклеосом эритроцитов курицы составляла 120 нМ, концентрация SAH в лунках контроля минимального сигнала составляла 1 мМ, и концентрация ДМСО составляла 1%. Анализ останавливали путем добавления нерадиоактивного SAM (10 мкл) к конечной концентрации 600 мкМ, которая обеспечивала разведение H-SAM до того уровня, когда его включение в олигонуклеосомный субстрат эритроцитов курицы больше не поддавался выявлению. 50 мкл реакционной смеси из 384-луночного полипропиленового планшета затем переносили в 384-луночный планшет Flashplate и нуклеосомы эритроцитов курицы иммобилизовали к поверхности планшета, который затем промывали три раза 0,1% Tween20 в устройстве для отмывки планшетов Biotek ELx405. Планшеты затем анализировали на планшетном ридере PerkinElmer TopCount для определения количества H-меченных олигонуклеосом  эритроцитов курицы, связанных с поверхностью планшета Flashplate, которое измеряли как число распадов в минуту (dpm), альтернативно называемое числом счетов в минуту (cpm).
[0452] Расчет % ингибирования
[0453] Где dpm = число распадов в минуту, cmpd = сигнал а аналитической лунке, и мин и max, соответственно, представляют собой контроли минимального и максимального сигнала.
[0454] Четырехпараметрическая подгонка IC
50
Top - верхняя граница
Bottom – нижняя граница
Hill Coefficient – коэффициент Хилла
[0455] где верхняя и нижняя граница в норме не фиксированы, но могут быть фиксированы при 100 или 0, соответственно, в 3-параметрической подгонке. Коэффициент Хилла в норме не фиксирован, но также может быть иметь фиксированное значение 1 в 3-параметрической подгонке. Y представляет собой % ингибирование, и X представляет собой концентрацию соединения.
50
[0456] Значения IC для анализов ферментов PRC2 на пептидных субстратах (например, EZH2 дикого типа и Y641F) представлены в Таблице 8 ниже.
[0457] Анализ метилирования WSU-DLCL2
[0458] Суспензионные клетки WSU-DLCL2 получали из DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг, Германия). Среду RPMI/Glutamax, пенициллин-стрептомицин, термоинактивированную бычью эмбриональную сыворотку и D-ФСБ получали из компании Life Technologies, Гранд-Айленд и Нью-Йорк, США. Экстракционный буфер и нейтрализующий буфер (5X) получали из компании Active Motif, Карлсбад, Калифорния, США. Антитела кролика против гистона H3 получали из компании Abcam, Кэмбридж, Массачусетс, США. Антитела кролика против H3K27me3 и HRP-конъюгированные IgG против антител кролика получали из компании Cell Signaling Technology, Данверс, Массачусетс, США. «Суперчувствительный» субстрат TMB получли из компании BioFX Laboratories, Оуингс-Миллз, Мэриленд, США. Бычий сывороточный альбумин, свободный от IgG, получали из компании Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания, США. ФСБ, содержащий Tween (10X ФСБ-T) получали из компании KPL, Гайтерсберг, Мэриленд, США. Серную кислоту получали из компании Ricca Chemical, Арлингтон, Техас, США. Планшеты для ИФА Immulon получали из компании Thermo, Рочестер, Нью-Йорк, США. Планшеты для клеточных культур с V-образным дном получали из компании Corning Inc., Корнинг, Нью-Йорк, США. Полипропиленовые планшеты с V-образным дном получали из компании Greiner Bio-one, Монро, Северная Каролина, США.
2.
2
[0459] Суспензионные клетки WSU-DLCL2 поддерживали в ростовой среде (RPMI 1640 с добавлением 10% (по объему) термоинактивированной бычьей эмбриональной сыворотки и 100 ед/мл пенициллина-стрептомицина) и культивировали при 37 °C в присутствии 5% CO В условиях анализа клетки инкубировали в аналитической среде (RPMI 1640 с добавлением 20% (по объему) термоинактивированной бычьей эмбриональной сыворотки и 100 ед/мл пенициллина-стрептомицина) при 37 °C в присутствии 5% CO на планшетном шейкере.
[0460] Клетки WSU-DLCL2 высевали в аналитической среде в концентрации 50,000 клеток на мл в 96-луночный планшет для клеточных культур с V-образным дном в объеме 200 мкл на лунку. Соединение (1 мкл) из 96-луночных донорных планшетов добавляли непосредственно в клеточный планшет с V-образным дном. Планшеты инкубировали на шейкере для титровальных планшетов при 37°C, 5% CO2 в течение 96 часов. Через четыре дня инкубации планшеты центрифугировали при 241 x g в течение пяти минут и среду осторожно отбирали из каждой лунки планшета для клеточных культур, не задевая клеточный осадок. Осадок ресуспендировали в 200 мкл D-ФСБ и планшеты снова центрифугировали при 241 x g в течение пяти минут. Супернатант отбирали и добавляли холодный (4°C) буфер для экстракции (100 мкл на лунку). Планшеты инкубировали при 4°C на орбитальном шейкере в течение двух часов. Планшеты центрифугировали при скорости 3427 x g x 10 минут. Супернатант (80 мкл на лунку) переносили в соответствующую лунку 96-луночного полипропиленового планшета с V-образным дном. Нейтрализующий буфер 5X (20 мкл на лунку) добавляли в полипропиленовый планшет с V-образным дном, содержащий супернатант. Полипропиленовые планшеты с V-образным дном, содержащие неочищенный препарат гистона (CHP) инкубировали на орбитальном шейкере в течение пяти минут. Неочищенные препараты гистонов добавляли (по 2 мкл на лунку) в каждую соответствующую лунку в дублирующие 96-луночные планшеты для ИФА, содержащие 100 мкл покрывающего буфера (1X ФСБ + 0,05%, БСА, масса к объему). Планшеты запечатывали и инкубировали в течение ночи при 4°C. На следующий день планшеты промывали три раза 1X ФСБ-T (по 300 мкл на лунку). Лунки блокировали в течение двух часов разбавителем для ИФА в объеме 300 мкл на лунку (ФСБ (1X) БСА, 2% (масса к объему) и Tween 20, 0,05% по объему). Планшеты промывали три раза 1X ФСБ-T. В  планшеты для выявления гистона H3 добавляли по 100 мкл на лунку антител против гистона H3 (Abcam, ab1791) в разведении 1:10,000 в разбавителе для ИФА. В планшеты для выявления триметилирования H3K27 добавляли по 100 мкл на лунку антител против H3K27me3 в разведении 1:2000 в разбавителе для ИФА. Планшеты инкубировали в течение 90 минут при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза по 300 мкл 1X ФСБT на лунку. Для выявления гистона H3 добавляли по 100 мкл на лунку HRP-конъюгированных IgG антител против антител кролика в разведении 1:6000 в разбавителе для ИФА. Для выявления H3K27me3 добавляли по 100 мкл на лунку HRP-конъюгированных антител IgG против антител кролика в разведении 1:4000 в разбавителе для ИФА. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 90 минут. Планшеты промывали четыре раза 1X ФСБT по 300 мкл на лунку. Добавляли по 100 мкл субстрата TMB на лунку. Планшеты с гистоном H3 инкубировали в течение пяти минут при комнатной температуре. Планшеты с H3K27me3 инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Реакцию останавливали 1 н серной кислотой (100 мкл на лунку). Абсорбцию для каждого планшета считывали при 450 нм.
[0461] Сначала определяли отношение для каждой лунки с помощью формулы:
[0462] Каждый планшет содержал восемь контрольных лунок, обработанных только ДМСО (минимальное ингибирование), а также восемь контрольных лунок для контроля максимального ингибирования (фоновые лунки).
50
50
[0463] Рассчитывали среднее значение отношения для каждого контроля и использовали для определения процентного ингибирования для каждой исследуемой лунки в планшете. Получали серийные трехкратные разведения исследуемого соединения в ДМСО с получением в общем 10 исследуемых концентраций, начиная с концентрации 25 мкМ. Определяли процентное ингибирование и строили IC с использованием дублирующих лунок для каждой концентрации соединения. Значения IC для указанного анализа представлены в Таблице 8, ниже.
[0464] Процентное ингибирование = 100-
[0465] Анализ клеточной пролиферации
[0466] Суспензионные клетки WSU-DLCL2 получали из DSMZ (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур, Брауншвейг, Германия). Среду RPMI/Glutamax, пенициллин-стрептомицин, термоинактивированную бычью эмбриональную сыворотку получали из компании Life Technologies, Гранд-Айленд и Нью-Йорк, США. 384-луночные полипропиленовые планшеты с V-образным дном получали из компании Greiner Bio-one, Монро, Северная Каролина, США. Непрозрачные 384-луночные белые планшеты для клеточных культур получали из компании Perkin Elmer, Уолтем, Массачусетс, США. Реагент Cell-Titer Glo получали из компании Promega Corporation, Мэдисон, Висконсин, США. Планшетный ридер SpectraMax M5 получали из компании Molecular Devices LLC, Саннивейл, Калифорния, США.
2
2
[0467] Суспензионные клетки WSU-DLCL2 поддерживали в ростовой среде (RPMI 1640 с добавлением 10% (по объему) термоинактивированной бычьей эмбриональной сыворотки и культивировали при 37 °C с 5% содержанием CO. В условиях анализа клетки инкубировали в аналитической среде (RPMI 1640 с добавлением 20% (по объему) термоинактивированной бычьей эмбриональной сыворотки и 100 ед/мл пенициллина-стрептомицина) при 37 °C в присутствии 5% CO.
Для оценки влияния соединений на пролиферацию клеток линии WSU-DLCL2 указанные клетки на стадии экспоненциального роста помещали в 384-луночные белые непрозрачные планшеты в плотности 1250 клеток/мл в конечном объеме аналитической среды, составляющем 50 мкл. В донорном планшете, содержащем соединение, готовили 9 точек 3-кратных серийных разведений соединения в ДМСО в трех повторениях, начиная с концентрации
(конечная верхняя концентрация соединения в анализе составляла 20 мкМ, и концентрация ДМСО составляла 0,2%). Аликвоту объемом 100 нл из донорного планшета, содержащего соединение, добавляли в соответствующую лунку в планшете для клеток. Контроль 100% ингибирования представлял собой клетки, обработанные стауроспорином в конечной концентрации 200 нМ, и контроль 0% ингибирования представлял собой клетки, обработанные ДМСО. После добавления соединений аналитические планшеты инкубировали в течение 6 дней при 37ºC, 5% CO
, относительной влажности > 90% в течение 6 дней. Выживаемость клеток измеряли путем квантования АТФ, присутствующего в клеточных культурах, путем добавления 35 мкл реагента CellTiter-Glo в клеточные планшеты. Люминесцентный сигнал считывали на приборе SpectraMax M5. Концентрацию, ингибирующую клеточную выживаемость на 50%, определяли с использованием 4-параметрической подгонки нормированных кривых зависимости эффекта от дозы.
2
10 мМ
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[0468] Общее описание каждого из патентных документов и научных статей, на которые ссылаются в настоящей заявке, включено посредством ссылки во всех отношениях.
[0469] Все публикации и патентные документы, цитированные в настоящей заявке, включены в настоящую заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая такая публикация или документ был конкретно и индивидуально включен в настоящую заявку посредством ссылки. Не следует считать, что цитированные публикации и патентные документы, как и даты их публикации и содержимое, относятся к предшествующему уровню техники. Изобретение описано в настоящей завке с помощью описания, однако специалистам в данной области техники очевидно, что можно осуществить на практике различные варианты реализации настоящего изобретения, и что предшествующее описание и примеры приведены в целях иллюстрации и не ограничивают следующую далее формулу изобретения.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
[0470] Изобретение может быть реализовано в других конкретных формах в пределах его сущности или его существенных характеристик. Таким образом, вышеизложенные варианты реализации изобретения следует считать иллюстративными во всех отношениях и не ограничивающими изобретение, описанное в настоящей заявке. Таким образом, объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием. Предполагается, что формула изобретения включает все изменения, включенные в значения и диапазон эквивалентности формулы изобретения.