УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ СОПОЛИМЕР-1 В СОПОЛИМЕРНЫХ КОМПОЗИЦИЯХ
IMPROVED COPOLYMER-1 IN COPOLYMER COMPOSITION

Уровень техники Cополимер-1 - это синтетический полипептидный аналог основного белка миелина (ОБМ) - природного компонента миелиновой оболочки. Его предлагали примен ть в качестве потенциального терапевтического средства против рассе нного склероза (Eur. J.lmmunol. [1971] 1:242; и J.Neurol. Sci. [1977] 31: 433). Все приведенные здесь ссылки полностью включены в эту за вку. Интерес к сополимеру-1 как иммунотерапевтическому средству от рассе нного склероза возник в 1950-х годах, когда обнаружили, что такие компоненты миелина, как ОБМ, предотвращают или задерживают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАИ). ЭАИ - болезнь, сходна  с рассе нным склерозом, который может быть вызван у подверженных этому заболеванию животных.
Cополимер-1 был исследован в институте Вейсмана (Реховот, Израиль) докторами Cела, Арноном с сотрудниками, которые вы вили, что он подавл ет ЭАИ (Eur. J.lmmunol. [1971] 1:242: патент США 3849550). В последнее врем  стало известно, что сополимер-1 оказывает благопри тное действие на пациентов с обостр ющейс  и ослабевающей формой рассе нного склероза (N. Engl. J.Med. [1987] 317:408). У пациентов, которым ежедневно вводили сополимер-1, отмечено меньше случаев обострени  и небольшое развитие нетрудоспособности в сравнении с контрольными пациентами.
Cополимер-1 - это смесь полипептидов, состо щих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина в мол рном соотношении соответственно около 6:2: 5: 2. Его синтезируют, полимеризу  эти четыре аминокислоты с образованием продуктов со средней молекул рной массой 23000 Да (Патент США 3849550).
Цель изобретени  - получение усовершенствованной композиции сополимера-1.
Сущность изобретени  Изобретение относитс  к составу сополимера-1, по существу свободному от сополимера-1 с молекул рной массой более 40 кДа.
Кроме того, изобретение относитс  к сополимеру-1, в котором мол рна  дол  с молекул рной массой примерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%.
Дополнительно, изобретение относитс  к сополимеру-1 со средней молекул рной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа.
Изобретение также относитс  к фармацевтической композиции и к способу лечени  рассе нного склероза с применением описанного сополимера-1.
Краткое описание чертежей На фиг.1 показаны распределение молекул рной массы трех доз сополимера-1 и пропорци  видов с молекул рной массой выше 40 кДа. На фиг. 2 показаны те же данные, относ щиес  к мол рной доле.
Подробное описание изобретени  Насто щее изобретение относитс  к составу сополимера-1, по существу свободному от видов сополимера-1 с молекул рной массой более 40 кДа. Этот состав предпочтительно содержит менее 5%, а более предпочтительно менее 2,5% видов сополимера-1 с молекул рной массой 40 кДа или более.
Изобретение также относитс  к сополимеру-1, в котором мол рна  дол  с молекул рной массой примерно от 2 кДа до примерно 20 кДа превышает 75%.
Дополнительно, изобретение относитс  к сополимеру-1 со средней молекул рной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа. В частности, изобретение относитс  к сополимеру-1 со средней молекул рной массой примерно от 4 до примерно 8,6 кДа и к сополимеру-1 со средней молекул рной массой примерно от 6,25 до примерно 8,4 кДа.
o
Cополимер-1 согласно изобретению может быть получен известными способами, например, способом по патенту США N 3849550, согласно которому N-карбоксиангидриды тирозина, аланина, γ-бензилглутамата и E-N-трифторацетиллизина полимеризуют при температуре окружающей среды в безводном диоксане с диэтиламином как инициатором. Далее γ-карбоксильную группу глутаминовой кислоты деблокируют бромистым водородом в лед ной уксусной кислоте с последующим удалением трифторацетильных групп из остатков лизина 1М пиперидином. В за вке термины "температура окружающей среды" и "комнатна  температура" следует понимать как температуру примерно от 20 до примерно 26C.
Cополимер-1 с требуемым профилем молекул рной массы может быть получен по существу любым известным способом. Такие способы включают хроматографию сополимера-1, содержащего высокомолекул рные виды, и сбор фракций без нежелательных видов или частичный кислотный или ферментативный гидролиз дл  удалени  высокомолекул рных видов с последующей очисткой диализом или ультрафильтрацией. Другой способ получени  сополимера-1 с желаемым профилем молекул рной массы заключаетс  в получении желаемого вида с защищенными аминокислотами и последующем получении необходимого вида непосредственно после сн ти  защиты. Рецептуры композиций согласно изобретению можно составить общеизвестными способами. Предпочтительно состав лиофилизируют или превращают в водный раствор, пригодный дл  подкожных инъекций. Cополимеру-1 можно также придать любую из известных форм, удобную дл  приготовлени  пептидных лекарств дл  перорального, носового, защечного или ректального введени .
Обычно пациентам, страдающим рассе нным склерозом, сополимер-1 ввод т ежедневно в дозах 20 мг.
Изобретение описано в примерах, не ограничивающих его объем.
Пример 1 Хроматографический способ получени  низкотоксичного сополимера-1 Две дозы сополимера-1 получили известным способом, например по патенту США N 3849550.
Затем одну дозу подвергли хроматографическому разделению, как описано ниже.
Колонку дл  гельфильтрации FRACTOGEL TSK HWSS (600 х 26 мм) собрали в патроне Superformance 26 Merck согласно инструкции изготовител . Колонку эквилибрировали водой и впрыснули раствор ацетона дл  определени  общего объема. Колонку эквилибрировали 0,2 М буфером ацетата аммони  с pH 5,0, загрузили в нее 30 мл проб сополимера-1 (20 мг/мл в 0,2 М буфере ацетата аммони  с pH 5,0) и каждые 10 мин отбирали фракции. Фракцию со средней молекул рной массой 7-8 кДа, выдел ли между 120-130 минутами (Доза А).
Анализ молекул рной массы Поглощение ультрафиолетового света (ПУС) при 275 нм определ ли спектрофотометром UVIKON 810. Пробы разбавл ли дл  достижени  уровн  ПУС ниже 1 единицы поглощени . Молекул рное распределение двух доз определ ли на калиброванной гельфильтрационной колонке (Superose 12).
Было обнаружено, что доза А сополимера-1 имела среднюю молекул рную массу 7-8 кДа. В этой дозе из всех видов сополимера-1 2,5% имели молекул рную массу выше 42 кДа, а 5% - более 40 кДа.
Средн   молекул рна  масса другой, не подвергнутой хроматографическому разделению, дозы сополимера-1 составила 12 кДа. В этой дозе из всех видов сополимера-1 2,5% также имели молекул рную массу выше 42 кДа, а 5% - более 40 кДа.
Пример 2 Анализ на токсичность A: In Vivo Три дозы сополимера-1 со средней молекул рной массой 7,3 кДа, 8,4 кДа (менее 2,5% сополимера-1 имеет молекул рную массу более 40 кДа) и 22 кДа (более 5% сополимера-1 имеет молекул рную массу более 40 кДа) испытали на токсичность, как описано ниже. В каждом случае в каждой экспериментальной группе использовали по 5 мышей.
Методика Cополимер-1 растворили в дистиллированной воде дл  получени  раствора с концентрацией активного ингредиента 2 мг/мл. Каждой мыши ввели 0,5 мл испытуемого раствора в вену хвоста. Дл  определени  смертности и соответствующих клинических признаков мышей наблюдали более 48 часов. Результаты наблюдений записывали через 10 мин, 24 часа и 48 часов после инъекции. Если к исходу 48 часов все животные были живы и никакие неблагопри тные признаки не были обнаружены, то така  доза считалась "Нетоксичной". Если же одна или более мышей погибли или про вл ли неблагопри тные признаки, то така  доза считалась "токсичной".
Дозы со средней молекул рной массой 7,3. и 8,4 кДа были отнесены к "нетоксичным", а в опытах с дозой со средней молекул рной массой 22 кДа 3 из 5 мышей погибли к исходу 48 часов и поэтому ее признали "токсичной".
В: In Vitro Тест на БЛК-дегранул цию 1. Введение. Выделенный из базофильных клеток гистамин (или серотонин) служит in vitro моделью аллергической реакции немедленного типа.
3
Была получена лини  базофильных лейкозных клеток крыс (БЛК-2H), котора  представл ла собой воспроизводимую однородную легко сохран емую систему с высокой чувствительностью (E.L. Basumian, C. lsersky, M.G. Petrino and R.P. Siraganian. Eur. J. lmmunol. 11, 317, 1981). Физиологический стимул дл  выделени  гистамина предполагает св зывание антигена с мембранно-св занными молекулами IgE, в результате чего происходит сшивка молекул и последующий запуск сложного биохимического каскада. Кроме этих физиологических иммуноглобулин-опосредованных механизмов запуска, дегранул ци  может быть вызвана различными He-IgE-опосредованными стимулами. Среди них - различные пептиды и синтетические полимеры, например полилизин (R.P. Siraganian. Trends in Pharmacological Sciences, October 432, 1983). Поэтому испытание на БЛК-дегранул цию используют дл  отбора тех доз сополимера-1, которые вызывают существенную дегранул цию и, таким образом, могут вы вить нежелательные локальные и/или системные побочные эффекты.
3
3
3
II. Основы методики испытаний. К базофильным лейкозным клеткам крыс (БЛК-2H) добавл ли [H]-серотонин и смесь инкубировали со 100 мкг сополимера-1. Дозы сополимера-1, вызывающие неспецифическую дегранул цию, высвобождали [H] -серотонин в среду. Ее радиоактивность определ ли сцинтилл ционным счетчиком, а общее количество проникшего в клетки серотонина определ ли в центрифугированных клетках. Степень деградации вычисл ли в процентах выделенного из клеток серотонина от его общего количества.
III. Результаты. Четыре дозы сополимера-1 со средней молекул рной массой в интервале 6250-14500 исследовали дл  определени  в процентах доли видов с молекул рной массой более 40 кДа и на БЛК-дегранул цию. Результаты обобщены в таблице.
Как видно из таблицы, при малой (<2,5%) доле сополимера-1 с высокой молекул рной массой низкий (<2,5), процент выделенного как индикатор токсичности серотонина низок и наоборот.
Пример 3. Получение трифторацетилсополимеоа-1 Защищенный сополимер-1 получали, как описано Тейтельбаумом и др. (Eur. J. lmmun. Vol. 1 Р. 242, 1971), из растворенных в 3,5 л диоксана 18 г N-карбоксиангидридов тирозина, 50 г аланина, 35 г γ-бензилглутамата и 83 г трифторацетиллизина.
Полимеризацию инициировали добавлением 0,01-0,02 % диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, затем вливали в 10 л воды. Продукт (защищенный сополимер-1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали. Блокирующие γ-бензильные группы удал ли из остатков глутамата, обрабатыва  33% бромистоводородной кислотой при комнатной температуре в течение 6-12 часов при перемешивании. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, промывали и высушивали, получа  на выходе трифторацетилсополимер-1.
Пример 4.
Получение трифторацетилсополимера-1 Защищенный сополимер-1 получали, как описано Тейтельбаумом и др. (Eur. J. lmmun. Vol. 1 р. 242, 1971), из растворенных в 3,5 л диоксана 18 г N-карбоксиангидридов тирозина, 50 г аланина, 35 г τ-бензилглутамата и 83 г трифторацетиллизина.
Полимеризацию инициировали добавлением 0,01-0,02% диэтиламина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, затем вливали в 10 л воды. Продукт (защищенный сополимер-1) отфильтровывали, промывали водой и высушивали.
o
Защищенный сополимер-1 обрабатывали 33 % HBr в уксусной кислоте, удал   защищающую омега-бензилгруппу из 5-карбоксилатного остатка глутамата, и расщепл ли полимер на более короткие полипептиды. Врем , необходимое дл  получени  сополимера-1 с молекул рной массой 7000 ± 2000 Да, зависит от температуры реакции и размера защищенного сополимера-1. Каждую дозу вводили в тест-реакцию при температуре 20-28C и в течение разного времени, например от 10 до 50 часов.
o
Результаты относительно молекул рных масс в этих маломасштабных реакци х подсчитывали и строили график зависимости молекул рной массы от времени. Врем , необходимое дл  получени  молекул рной массы 7000 ± 2000 Да, рассчитывали по графику и этот показатель использовали при крупномасштабных реакци х. В среднем при 26C врем  составл ет 17 часов. Продукт вливали в избыточное количество воды, отфильтровывали, промывали и высушивали, получа  на выходе трифторацетилсополимер-1.
o
Получение низкотоксичного сополимера-1 20 г трифторацетилсополимера-1 диспергировали в 1 л воды и добавл ли 100 г пиперидина. Смесь перемешивали в течение 24 часов при комнатной температуре и фильтровали. Раствор сырого сополимера-1 распределли по камерам дл  диализа и диализировали при 10 - 20C против воды до достижени  pH=8. Затем проводили диализ против 0,3% уксусной кислоты и снова против воды до pH = 5,5 - 6,0. Затем раствор концентрировали и подвергли лиофильной сушке.