Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент янтарной кислоты (варианты)
YARROWIA LIPOLYTICA YEAST STRAIN - PRODUCER OF AMBER ACID (VERSIONS)

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается новых штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica, используемых для получения чистой янтарной кислоты (ЯК).
Традиционно для получения ЯК используют микробиологические способы получения, основанные на культивировании бактериальных штаммов. Недостатком бактериальных штаммов-продуцентов янтарной кислоты является их чувствительность к низким значениям pH, что приводит к необходимости добавления щелочи в процессе культивирования. В результате образуются соли янтарной кислоты. Для дальнейшего выделения и очистки янтарной кислоты необходимо использовать сильную минеральную кислоту, что негативно сказывается на экологичности процесса, ведет к образованию дополнительных отходов и, как следствие, к повышению стоимости производства янтарной кислоты.
В связи с этим особый интерес для создания продуцентов янтарной кислоты представляет конструирование штаммов микроорганизмов, в меньшей степени чувствительных к низким значениям pH.
Перспективным объектом для производства янтарной кислоты являются, в частности, дрожжи, многие из которых способны расти и осуществлять брожение в условиях повышенной кислотности.
Среди дрожжей известны различные продуценты янтарной кислоты, отличающиеся как по уровню накопления продукта, так и по условиям культивирования и по видам используемого сырья.
Штамм дрожжей Issatchenkia orientalis 257 [WO 2014018757] выращивают на минеральной среде с использованием в качестве источника углерода глюкозы (12,0 об. %). Культивирование осуществляют в колбах в течение 96 часов с добавлением мела. При этом янтарная кислота накапливалась до 89 г/л при средней скорости биосинтеза 0,93 г/л*ч и конверсии около 78% (г/г). Недостатком данного процесса является необходимость культивирования на среде с мелом.
3
Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae SUC-297 [WO 2011064151] при культивировании в ферментере объемом 1,0 м с минеральной средой и глюкозой в качестве источника углерода накапливает за 95 часов 43 г/л янтарной кислоты, при этом образуются вторичные продукты: 16,4 г/л этанола и 14,9 г/л глицерина. Недостатком данного процесса является низкая конверсия за счет образования вторичных продуктов.
Известен штамм дрожжей Yarrowia lipolytica PGC01003 [Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 179], который при культивировании в ферментере на минеральной среде в периодическом режиме с подпиткой и при поддержании pH на уровне 6,0, используя в качестве источника углерода глицерин, производит 160,2 г/л янтарной кислоты, при конверсии 40% (г/г). Недостатком данного штамма является необходимость поддерживать значение рН=6,0 на протяжении всего процесса ферментации.
В работе (RU 2487931) для получения янтарной кислоты предложено использовать штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3753. При культивировании штамма в лабораторном ферментере в периодическом режиме с подпиткой на минеральной среде без использования титрующих агентов он за 54 часа накапливает 42 г/л янтарной кислоты с конверсией 39%, конечное pH равно 2,9 [Biotechnology and Bioengineering, 2016, 113 (11), 2425-2432]. Штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-3753 является ауксотрофом по лейцину.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала микроорганизмов, продуцирующих янтарную кислоту без использования веществ, стабилизирующих pH.
Задача решена путем создания штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 продуцента янтарной кислоты.
Заявляемый штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 получен из коллекционного штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ У-3753 путем автоселекции. Штамм ВКПМ У-3753 культивировали в ферментере в хемостатном режиме в течение 840 часов, несколько раз дискретно увеличивая скорость протока и снижая pH. Отбор нового штамма производился в конце ферментации по размеру колоний после высева образца культуральной жидкости на агаризованную среду.
Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Y-4215.
Полученный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 также как штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ У-3753 является ауксотрофом по лейцину, но имеет более высокие показатели по продукции и конверсии.
Задача решена также путем создания штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 продуцента янтарной кислоты.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 получен из штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ У-4215 путем восстановления прототрофности по лейцину.
Для этого штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 трансформировали линейным фрагментом ДНК с геном LEU2, комплементирующим делению размером 681 п.о. в мутантной аллели leu2-270.
Полученный штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 способен расти и продуцировать янтарную кислоту на минеральной среде с глюкозой без добавления лейцина и применения титрующих агентов.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки.
На модифицированной полной среде YPD (мас. %: глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, агар - 1,8, вода - остальное) после четырех дней выращивания штамм образует колонии диаметром 1-1,5 мм, с кремовым оттенком. Край колоний неровный, поверхность ровная, образует подобие воронки, выражен вертикальный рост колоний.
В аналогичной жидкой среде трехдневная культура имеет клетки гетерогенные по размеру: от округлых до сильно удлиненных (2-4,5)×(4-22) мкм, образует истинный и псевдомицелий.
На агаризованной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2%), карбоната кальция (1%), фосфатного буфера (50 мМ, pH 6,8) и лейцина (0,002%) после шести дней выращивания культура образует колонии почти белого цвета, диаметром 1-1,5 мм. Через 3-5 дней поверхность культуры приобретает складчатость, а диаметр отдельно стоящих колоний может достигать 3 мм.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный аэроб. Брожение отсутствует. Утилизирует глюкозу, глицерин. Не растет на этаноле, янтарной и уксусной кислотах, в качестве единственного источника углерода. Ауксотроф по тиамину, лейцину. Не патогенен. Температура роста 28-30°C.
Штамм хранится в 10% глицерине при - 70°C в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297 характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические признаки.
На модифицированной полной среде YPD (мас. %: глюкоза - 2, дрожжевой экстракт - 1; пептон - 1, агар - 1,8, вода - остальное) после четырех дней выращивания штамм образует колонии диаметром 1-1,5 мм, с кремовым оттенком. Край колоний неровный, поверхность ровная, образует подобие воронки, выражен вертикальный рост колоний.
В аналогичной жидкой среде трехдневная культура имеет клетки гетерогенные по размеру: от округлых до сильно удлиненных (2-4,5)×(4-22) мкм, образует истинный и псевдомицелий.
На агаризованной среде YNB (Himedia) с добавлением глюкозы (2%), карбоната кальция (1%) и фосфатного буфера (50 мМ, pH 6,8) после шести дней выращивания культура образует колонии почти белого цвета, диаметром 1-1,5 мм. Через 3-5 дней поверхность культуры приобретает складчатость, а диаметр отдельно стоящих колоний может достигать 3 мм.
Физиолого-биохимические признаки.
Облигатный аэроб. Брожение отсутствует. Утилизирует глюкозу, глицерин. Не растет на этаноле, янтарной и уксусной кислотах, в качестве единственного источника углерода. Ауксотроф по тиамину. Не патогенен. Температура роста 28-30°C. Оптимальное pH 5,5, способен к росту в кислой среде (до pH 3).
Штамм хранится в 10% глицерине при - 70°C в кельвинаторе или парах жидкого азота без потери жизнеспособности в течение 10 лет.
Изобретение подтверждено следующими примерами.
Пример 1. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4215.
Посевной материал получают, высевая культуру, хранящуюся в 10% глицерине при -70°C, на среду, содержащую (мас. %): глицерин - 2,0; дрожжевой экстракт - 1,0; пептон - 1,0; карбонат кальция - 1,0; агар - 2,0; вода - остальное. Выращивают в течение 2 суток и для засева одной пробирки используют полную петлю посевного материала.
2
4
2
2
4
4
4
2
4
4
2
2
4
2
4
2
3
4
3
2
4
2
4
2
2
4конц.
4
Культивируют штамм в пробирках при температуре 30°C при 250 об/мин в 10 мл минеральной питательной среды следующего состава (мас. %): глюкоза - 2,5; NaHPO⋅12HO - 0,6; KHРО - 0,071; NHCl - 1,177; (NH)SO - 0,065; MgSO⋅7HO - 0,065; CaCl -0,0011; Лимонная кислота - 0,18; Биотин (витамин B7) - 0,00002; Тиамин (витамин B1) - 0,0001; L-Лейцин - 0,5; раствор микроэлементов - 0,46 (состав в мас. %: CuSO⋅5HO - 0,6; KJ - 0,0088; MnSO⋅5HO - 0,3; HВO - 0,02; CoCl⋅6HO - 0,0955; ZnSO⋅7HO - 4,2; FeSO⋅7HO - 6,5; HSO - 0,5), вода - остальное. Значение pH среды доводят до уровня 7,1 путем внесения 25%-ного раствора NHOH. Время выращивания - 48 часов, для засева одной колбы используют 10 мл культуральной жидкости.
Культивирование в колбах осуществляют в среде и условиях, описанных выше. Рабочий объем 100 мл. Время выращивания - 24 часа. Для засева в посевной ферментер используют 100 мл культуральной жидкости.
4
В посевном ферментере штамм культивируют в периодическом режиме с рабочим объемом 1000 мл, в среде такого же состава, но с концентрацией глюкозы 100 г/л при температуре 30°C и скорости вращения мешалки 700 об/мин. Аэрацию осуществляют воздухом с расходом 1 л/мин. Значение pH поддерживают в течение всего процесса культивирования на уровне 5,5 добавлением 25%-го раствора NHOH. Время выращивания - 56 часов. Для засева в основной ферментер используют 100 мл культуральной жидкости.
В основном ферментере культивирование штамма осуществляют как в посевном ферментере, но в периодическом режиме с подпиткой. Начальная концентрация глюкозы в среде - 50 г/л. Подпитка осуществляется на 12, 18, 24, 30 и 36-й час культивирования по 40 мл раствора глюкозы, концентрацией 700 г/л. Процесс культивирования проходит без использования титрующих агентов. Время культивирования - 60 часов.
Концентрацию янтарной кислоты в культуральной жидкости определяют методом ВЭЖХ с использованием системы Waters HPLC (Waters, США), колонки с обратной фазой ReproSil-Pur C18-AQ (4 mm×250 mm, 5 mm, Dr. Maisch, Германия) по методу, описанному в (Biotechnology and Bioengineering, 2010, Nov. 107 (4): 673-682). Остаточную концентрацию глюкозы определяют спектрофотометрически глюкозооксидазным методом с помощью набора реагентов «Диаком Глюкоза» (Диаком-ВНЦМДЛ, Россия) согласно инструкции производителя.
По окончании культивирования содержание янтарной кислоты в культуральной жидкости составляет 50 г/л, конверсия по глюкозе 40%, конечное значение pH 2,8.
Пример 2. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-4297.
Культивирование штамма Y-4297 осуществляют по примеру 1, но в среду не добавляют лейцин, культивирование в посевном ферментере первые 16 часов проходит без аэрации, далее аэрацию осуществляют воздухом с расходом 0,25 л/мин.
Время культивирования в основном ферментере - 53 часа.
По окончании культивирования содержание янтарной кислоты в культуральной жидкости составляет 49 г/л, конверсия по глюкозе 43%, конечное значение pH 2,4.
Полученный штамм Y. lipolytica ВКПМ Y-4297 способен расти на среде без L-лейцина, что имеет преимущество с экономической точки зрения.
Таким образом, получены перспективные для использования в промышленности, высокопродуктивные штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica, позволяющие производить янтарную кислоту без добавления титрующих агентов.