Определение аддуктов отравляющих веществ с биомолекулами как биомаркеров экспозиции/эффекта

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018

Савельева Е.И., Корягина Н.Л., Орлова О.И.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АДДУКТОВ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ С БИОМОЛЕКУЛАМИ КАК БИОМАРКЁРОВ ЭКСПОЗИЦИИ/ЭФФЕКТА

ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России,

188663, Санкт-Петербург

В статье представлены результаты исследования кинетических профилей зарина и зомана, реактивированных из аддуктов бутирилхолинэстеразы плазмы крови и эритроцитов крыс после внутримышечного введения зарина и зомана в эквитоксических дозах (0,5 ЛД50) и депури-низированных аддуктов сернистого иприта с ДНК (Ы7-гидроксиэтилтиоэтил гуанина) в моче крыс после подкожного введения сернистого иприта в дозе 0,25 ЛД50. Обоснована концепция рассмотрения биомолекулярных аддуктов ксенобиотиков как биомаркёров экспозиции или биомаркёров экспозиции/эффекта при отнесении таргетных биомолекул к немым или активным рецепторам, соответственно.

Ключевые слова: биомаркёры; экспозиция; эффект; чувствительность; биомолекулярные аддукты; фосфорорганические отравляющие вещества; сернистый иприт.

Для цитирования: Савельева Е.И., Корягина Н.Л., Орлова О.И. Определение аддуктов отравляющих веществ с биомолекулами как биомаркёров экспозиции/эффекта. Медицина экстремальных ситуаций. 2018; 20(3): 451-463.

Для корреспонденции: Савельева Елена Игоревна, доктор хим. наук, зав. лабораторией аналитической токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России, 188663, Санкт-Петербург. E-mail: esavelieva59@mail.ru

Savelyeva E.I., Koryagina N.L., Orlova O.I.

DETERMINATION OF TOXIC SUBSTANCES ADDUCTS WITH BIOMOLECULES AS BIOMARKERS OF THE EXPOSURE/EFFECT

Research Institute of Human Hygiene, Occupational Pathology, and Ecology, Saint Petersburg, 188663, Russian Federation

The article presents the results of a study of the kinetic profiles of sarin and soman, reactivated from adducts of plasma blood butyrylcholinesterase and erythrocytes of rats after intramuscular administration of sarin and soman in equitoxic doses (0.5 LD50) and depurinated adducts of sulfur mustard with DNA (N7-hydrotherapy) in rat urine after the subcutaneous administration of sulfur mustard at a dose of 0.25 LD50. There is substantiated concept of considering bio-molecular adducts of xenobiotics as biomarkers of exposure or biomarkers of exposure/effect when classifying targeted biomolecules to silent or active receptors, respectively.

Keywords: biomarkers; exposure; Effect; sensitivity; biomolecular adducts; organophosphate poisonous substances; sulfur mustard.

For citation: Savelyeva E.I., Koryagina N.L., Orlova O.I. Determination of toxic substances adducts with biomolecules as biomarkers of the exposure/effect. Meditsina ekstremal'nykh situatsiy (Medicine of Extreme Situations) 2018; 20(3): 451-463. (In Russ.).

For correspondence: Elena I. Savelieva, MD, Ph.D., DSci., Head of the Laboratory of Analytical Toxicology of the Research Institute of Human Hygiene, Occupational Pathology, and Ecology of the Federal Medical And Biological Agency of Russia, St. Petersburg, 188663, Russian Federation. E-mail: esavelieva59@mail.ru

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest Acknowledgments. The study had no sponsorship. Received 01 June 2018 Accepted 19 September 2018

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Известно, что возможности обнаружения ксенобиотиков в организме определяются их существованием в цикле абсорбция-распределение-метаболизм-экскреция. Совокупность ксенобиотиков и продуктов их биотрансформации, присутствующих в организме, составляет так называемый ксенометаболом [1]. Подробное исследование биотрансформации ксенобиотика реализуется как его токсикологический профиль. Токсикологические профили изучены далеко не для всех соединений. Поскольку в ближайшей перспективе трудно ожидать исчерпывающих сведений о метаболизме неуклонно возрастающего количества химических веществ, рядом исследователей предлагаются алгоритмы оценки экспозиции на основе рассмотрения пула неидентифицированных метаболитов, по существу представляющих собой набор хромато-спектральных характеристик в отсутствие попыток отнесения этих характеристик к определённым структурам [2]. Так, в качестве биомаркёров экспозиции к диизоно-нилфталату предложено рассматривать 13 аналитических сигналов, относящихся (предположительно) к метаболитам диизононилфталата. После адаптации такой системы применительно к человеку, по мнению авторов, можно будет оценивать экспозицию к этому широко распространённому химическому загрязнителю путём интерпретации абсолютных и относительных сигналов предполагаемых метаболитов в исследуемой биоматрице (моче) с помощью предложенных авторами [3] алгоритмов. Пока трудно судить о перспективности оценки экспозиции на основе измерения концентраций общего пула неидентифицированных метаболитов ксенобиотика. До настоящего времени преобладает стратегия, основанная на исследовании динамических профилей определённых показателей, а в русле традиционных биоаналитических подходов в качестве таких показателей всё чаще выступают кинетические профили таргетных молекул.

Биоиндикаторы, визуализирующие то или иное биологическое событие, традиционно характеризуют как биомаркёры экспозиции/ эффекта/чувствительности [4]. Установление биомаркёров для оценки уровня экспозиции (внутренней дозы), произведённого эффекта и

ответной чувствительности организма к воздействию токсичных ксенобиотиков проводятся в экспериментах на лабораторных животных. К сожалению, некоторые отравляющие вещества (ОВ) - зарин, иприт - имели сравнительно недавнюю историю поражения людей в террористических актах, локальных военных конфликтах и других инцидентах. Биопробы пострадавших были законсервированы и до настоящего времени исследуются на присутствие в них биомаркёров ОВ. В целом, эти исследования подтверждают сведения о распределении и периодах возможного обнаружения биомаркёров ОВ, полученных ранее в экспериментах на лабораторных животных [5-10]. Свободные метаболиты ксенобиотиков, как правило, рассматриваются в качестве биомаркёров экспозиции. Их недостатком является относительно короткое время жизни в организме, что не обеспечивает возможностей ретроспективного анализа, в наибольшей степени востребованного практикой. Конъюгаты ксенобиотиков или продуктов их трансформации с биомолекулами являются более ретроспективными биомаркёрами экспозиции в сравнении со свободными метаболитами. Авторы объёмного исследования [11] установили, что аддукты с ДНК обнаруживаются в моче на протяжении 30 дней после воздействия сернистого иприта (СИ), а ад-дукты СИ с гемоглобином по ^-терминальному валину могут быть обнаружены на 90-й день после поражения.

С 2002 г. в ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России проводится разработка процедур определения биомаркёров ОВ в биопробах. К настоящему времени авторскими аналитическими методиками обеспечено определение в моче и крови большинства известных метаболитов люизита, СИ, зарина, зомана и российского вещества УХ (УК) [12, 13]. Разработанные методики были апробированы в анализе биообразцов, полученных от лабораторных животных, экспонированных ОВ. В этих экспериментах были оценены возможности методик в части чувствительности и ретроспективности. Свободные и био-конъюгированные метаболиты ОВ оценивались нами как целевые аналиты для достоверного подтверждения факта воздействия определённого ОВ на организм, т. е. как биомаркёры экс-

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

позиции. Было установлено, что применение антидотной терапии в различной степени влияет на кинетические профили разных биомаркёров [14, 15].

Анализируя эти различия, мы пришли к выводу, что чувствительность кинетического профиля биомаркёра к антидотной терапии определяется степенью вовлечённости того или иного биомаркёра в реализацию биологического эффекта, лежащего в основе антидотной терапии. Таким образом, биомаркёры, образующиеся на активных биологических рецепторах, могут отражать не только экспозицию к определённому ксенобиотику, но и биологический эффект, обусловленный как экспозицией, так и антидотной терапией.

Целью настоящей работы являлось исследование кинетических профилей зарина и зомана, реактивированных из аддуктов с бутирилхоли-нэстеразой (БХЭ) крови, а также профилей экскреции с мочой депуринизированных аддуктов ДНК с СИ и интерпретацией полученных результатов в связи с известными биологическими эффектами фосфорорганических ОВ (ФОВ) и СИ. В качестве аналитических методов использованы газовая (зарин, зоман) и жидкостная ^7-гидроксиэтилтиоэтил гуанин) хроматография с тандемным масс-спектрометрическим детектированием.

Материал и методы

Определение реактивированных зарина и зомана

Реактивы и материалы: зоман (ГСО 82472003), зарин (ГСО 8246-2003), пеликсим, АЛ-85 (ФГУП Московский эндокринный завод), аце-тонитрил (ТУ 6-09-5497-91), муравьиная кислота (Fluka, кат. № 56302), калий фтористый 2-водный (CAS 7789-23-3, ГОСТ 20848-75), ацетат натрия (ГОСТ 199-78), уксусная кислота (ГОСТ 19814-74), дихлорметан (Supelco, кат. № 1.06044.2500), этилацетат (ГОСТ 22300-76), 10 мМ натрий-калиевый фосфатный буферный раствор (137 мМ NaCl и 2,7 мМ KCl), рН 7.4 (ФБ); 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота (Merck, 103291). Картриджи для твёрдофазной экстракции (ТФЭ) - OASIS HLB, 60 мг (Waters, кат. № WAT094226); фильтры Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units (10k, Millipore); много-

канальный вакуумный коллектор для ТФЭ (Supelco, кат. № 57030-U), вортекс (SkyLine, ELMI), ультразвуковая ванна (Elmasonic S30H, ELMA), термостатируемый шейкер (SkyLine ST-3L, ELMI).

Образцы плазмы крови получены в эксперименте in vivo от лабораторных животных (крысы). Условия содержания экспериментальных животных соответствовали «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)» (утв. Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19.06.2003).

В эксперименте были использованы 3 группы белых беспородных крыс-самцов со средней массой тела 270 ± 24 г по 12 особей в каждой: животным 1-й группы вводили зарин однократно подкожно в дозе 90 мкг/кг (0,5 ЛД50), 2-й - зоман в дозе 45 мкг/кг (0,5 ЛД50), 3-й - воду (контроль). Сразу после введения ФОВ половине животных каждой группы был введён антидот пеликсим однократно внутримышечно в физрастворе из расчёта 100 мкл/100 г массы тела животного (соответствует ~5-кратной дозе для человека). Отбор проб крови производили через 3 ч, 1, 3, 7 и 30 сут, отбор мочи -1, 3 и 7 сут после начала токсикологического эксперимента.

Определение в плазме крови зарина и зомана, регенерированных из аддуктов с помощью фторид-иона, проводили методом газовой тан-демной хроматомасс-спектрометрии

453

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Agilent модели 7000 с программным обеспечением Masshunter. Условия ГХ-МС/МС-анализа: капиллярная кварцевая колонка HP-5MS (60 м х 0,25 мм х 0,25 мкм) с привитой неподвижной фазой 5% фенил, 95% диметилполисилоксан (Supelco). Температура испарителя 250°С; ввод пробы без деления потока (1 мин); температурная программа: 40°C (1 мин) - 10 град/мин -250°C (2 мин), 280°C (5 мин); газ-носитель -гелий; расход газа-носителя 1 мл/мин; температура интерфейса 280°С; температура источника ионов 150°С; температура масс-фильтра 150°С; расходы азота и гелия 1,5 и 2,25 мл/мин соответственно; время задержки растворителя 3 мин; детектирование осуществлялось в режиме мониторинга множественных реакций: 99 ^ 81 (16 эB); 125 ^ 99 (5 эB); 126 ^ 82 (5 эB).

Определение аддуктов ДНК-СИ

Реактивы и материалы: сернистый иприт (ГШ 8248-2003), ацетонитрил (ТУ 6-09-549791), муравьиная кислота ^СЧ, CAS 64-186), картриджи для твёрдофазной экстракции (ТФЭ) OASIS HLB, 60 мг фирмы Waters, кат. № WAT094226.

Стандартный образец ^-гидроксиэтил-тиоэтил гуанина с содержанием основного вещества не менее 95% был синтезирован кандидатом хим. наук B.B. Абзианидзе.

B эксперименте, проводившемся согласно «Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (GLP)», были использованы 6 белых беспородных крыс-самцов со средней массой тела 270 ± 24 г. Животным контрольной группы (n = 3) подкожно вводили 20% ДMСO в физиологическом растворе, опытной группе (n = 3) - эту же смесь с добавлением СИ в дозе 0,25 ЛД50. Гибели животных отмечено не было. Oбразцы мочи отбирали индивидуально с использованием метаболической камеры.

Разработанная методика анализа включала внесение внутреннего стандарта, извлечение и очистку определяемых соединений из пробы мочи методом ТФЭ на патронах Oasis HLB 60 mg, упаривание полученного экстракта досуха, последующее перерастворение в 100 мкл подвижной фазы и анализ методом BЭЖХ-MС/MС.

Для определения аддукта ДНК-СИ (^-гидроксиэтилтиоэтил гуанина) использо-

вали тандемный масс-спектрометр высокого разрешения LTQ Orbitrap Velos с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении и программным обеспечением для управления и обработки данных «Xcalibur». Регистрацию аналита проводили по ионам m/z 256,08627 (ион-предшественник) и m/z 105,03690 (продукт-ион); разрешение по массам 70 000 массовых единиц. В качестве внутреннего стандарта использован синтезированный канд..хим. наук В.А. Кузнецовым 8-(1-гидроксибутан-2-иламино)-1,3,7-триметил-1-пурин-2,6(3Н,7Н).

Хроматографическое разделение проводили на колонке Agilent SB-C8 (150 мм х 4,6 мм х 1,8 мкм) в режиме градиентного элюирования. Состав подвижной фазы: элюент A - H2O + 0,1% HCOOH, элюент Б - CH3CN + 0,1% HCOOH, скорость потока 400 мкл/мин, температура термостата колонки 35оС. Установлен следующий режим элюирования: 0 мин - 90% А, 2 мин -90% А, 7 мин - 10% А, 9 мин - 10% А, 9,1 мин -90% А, 12 мин - 90% А. Время удерживания N7-HETEG 6,0 ± 0,1 мин.

Результаты и обсуждение

Неизмененные ксенобиотики, их метаболиты или продукты взаимодействия ксенобиотиков с биомолекулами могут быть биомаркёрами экспозиции в том случае, если имеют в молекуле элементы структуры, однозначно указывающие на факт воздействия на организм именно этого, а не другого ксенобиотика. Если биомаркёр имеет биогенную природу или может быть обнаружен в организме при воздействии других веществ, то специфичность, а, следовательно, и доказательность такого биомаркёра экспозиции ограничены. Так, тиоди-гликоль (ТДГ) - наиболее обильный метаболит СИ, образующийся по гидролитическому пути, присутствует в организме на биогенном уровне и является распространённым химикатом широкого применения. По этой причине доказательное установление факта воздействия СИ на организм не может быть основано только на определении содержания ТДГ в биопробах, каким бы высоким это содержание ни было. При этом, если биогенный ТДГ, идентифицированный в моче или плазме крови, не доказывает факт экспозиции к СИ, то выделенный из со-

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

става аддуктов - доказывает [16, 17]. Таким образом, важнейшими характеристиками биомаркёров экспозиции являются доказательность и ретроспективность или временное окно детектирования. На момент отбора биопробы биомаркёр должен ещё присутствовать в организме. Если свободные метаболиты преимущественно покидают организм в быстрой фазе экскреции, не продолжающейся, как правило, дольше двух суток, то время жизни биомолекулярного аддукта в организме определяется временем жизни таргетной биомолекулы. Ад-дукты формируются между электрофильными сайтами ОВ и нуклеофильными сайтами биомакромолекул - ДНК, сывороточного альбумина, глобина, ферментов [18, 19]. Как правило, ковалентная связь электрофильного фрагмента ОВ или его метаболита осуществляется через атом кислорода, азота или серы. Рассматривая аддукт в качестве биомаркёра, принимают во внимание эффективность его образования, стабильность и время жизни в организме. Эти свойства биомолекулярного аддукта определяются природой химической реакции между активными сайтами биомолекулы и ОВ (или метаболита), её обратимостью, возможностями репарации (для ДНК), реактивирования (для ферментов), жизненным циклом биомолекулы. Алгоритмы оценки внутренней дозы ксенобиотика (сильного электрофила) на основе кинетического профиля его биомолекулярного аддукта были предложены более полувека тому назад [20, 21]. Позднее эти исследования были положены в основу оценки экспозиции населения мутагенными ксенобиотиками на популя-ционном уровне посредством биомониторинга биомолекулярных аддуктов в качестве биомаркёров мутагенного эффекта [22]. Таким образом, эффективность подходов, основанных на корреляции экспозиции/биологического эффекта и результатов определения биомаркёров экспозиции/эффекта в определённых биологических средах, в настоящее время уже не вызывает сомнений, но в разных направлениях биоаналитических исследований (лекарственный мониторинг, популяционная токсикология, экстремальная токсикология и др.) эти подходы развиваются по-разному, и общая концепция до настоящего времени не сложилась.

Аддукты ксенобиотиков с биомолекулами выступают в роли биомаркёров эффекта, если образуются в результате воздействия ксенобиотика на вовлечённую в манифестацию биологического эффекта мишень. По этой причине исследование профилей биомаркёров экспозиции/ эффекта перспективно для оценки эффективности антидотной терапии и при поиске новых антидотов [23]. Отнесение биомолекулярного ад-дукта к биомаркёрам экспозиции/эффекта или к биомаркёрам только экспозиции в полной мере, как нам кажется, согласуется с концепцией «немых» и активных рецепторов, предложенной С. А. Куценко [24]. Согласно этой концепции, «немой» рецептор - структурный компонент биологической системы, взаимодействие которого с веществом не приводит к формированию ответной реакции. К «немым» рецепторам, по-видимому, можно отнести нуклеофильные сайты молекул альбумина, не оспаривая при этом защитные функции альбумина, реализуемые преимущественно за счёт связывания молекул высокотоксичных электрофилов. Наличие эсте-разной активности альбумина по отношению к ФОВ также исследуется и активно обсуждается [25, 26]. Таким образом, связывание ксенобиотика на рецепторе активного типа является избирательным лишь в определённой степени. Тем не менее, применительно к ФОВ в качестве активных рецепторов, т. е., по определению С.А. Куценко, - структурных компонентов биологической системы, взаимодействие которых с токсикантом инициирует токсический процесс, следует рассматривать холинэстеразы. Если так, то аддукты ФОВ с альбумином можно отнести к биомаркёрам экспозиции, а аддукты ФОВ с бутирилхолинэстеразой (БХЭ) - к биомаркёрам экспозиции/эффекта. При исследовании на молекулярном уровне эффективности антидотной терапии карбоксимом при отравлениях ФОВ в качестве биомаркёров экспозиции/ эффекта мы использовали аддукты бутирилхо-линэстеразы с ФОВ, а в качестве аналитического метода - реактивирование ФОВ из состава этих аддуктов фторид-ионом. В токсикологии ФОВ основным биохимическим критерием интоксикации остаётся ингибирование холи-нэстераз. Методами биохимического анализа в качестве биологического ответа на воздействие

455

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Рис. 1. Схема реакции регенерации ФОВ (R — алкильный радикал соответствующего ФОВ).

Рис. 2. Результаты определения зарина, регенерированного из состава аддуктов с БХЭ плазмы крови, после отравления зарином в дозе 0,5 LD50, без применения и с применением антидотной терапии пеликсимом (п = 6; р < 0,05).

ФОВ регистрируют снижение каталитической активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) крови [27, 28]. Масс-спектрометрические методы позволяют исследовать эстеразный статус на молекулярном уровне и получать дополнительные сведения о механизме антидотной терапии.

Известно, что действие ФОВ сопровождается быстрым образованием ковалентной связи между атомом фосфора молекулы ФОВ и ги-дроксильной группой серина в активном центре холинэстераз. При этом, в случае интоксикации ФОВ G-типа, выделяется фторид-ион, табуном -циано-группа, ФОВ У-типа - тиольная группа. Образующийся аддукт с аминокислотным остатком - специфический биомаркёр для данного типа ФОВ, стабильный до нескольких недель в организме [29]. Супертоксичность ФОВ связана с ингибированием АХЭ. Бутирилхоли-нэстераза также образует аддукты ФОВ с сери-ном активного центра фермента, которые могут быть обнаружены в высоких концентрациях (в среднем 80 нМ) в сыворотке и плазме крови человека, в то время как аддукты с АХЭ - гораздо в меньшем количестве в эритроцитах и в нейрональной ткани [30]. Таким образом, среди ферментов биомаркёром выбора для ретроспективного определения является фосфонилиро-ванная БХЭ в плазме крови. Для установления факта экспозиции проводят регенерацию БХЭ, ингибированной ФОВ, с помощью фторид-иона (рис. 1).

Продуктами регенерации являются сами ФОВ (зарин, зоман) или фторангидриды соответствующих алкил-метилфосфоновых кислот (табун, ФОВ У-типа) [31, 32]. Опубликован ряд работ [33, 34], в которых продемонстрировано успешное определение фрагментов БХЭ - но-напептидов, содержащих остатки ФОВ, методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Аддукты ФОВ с БХЭ подвержены

старению и спонтанному реактивированию. В результате старения фосфонилированной БХЭ происходит деалкилирование фосфониль-ной группы, при котором образуется одинаковый для всех ФОВ (зарин, зоман, VR, VX) аддукт - БХЭ, фосфонилированная по Ser198 остатком метилфосфоновой кислоты (МФК). Известно, что аддукты БХЭ с зоманом стареют наиболее быстро [35], в то время как старение аддукта БХЭ с веществами группы VX в среднем продолжается более 72 ч [36]. Важно отметить, что состаренные аддукты не подвержены реактивированию.

В качестве реактиваторов ХЭ, в случае поражения ФОВ, применяют дипироксим, ток-согонин, обидоксим и др. Принцип реактивации заключается в разрушении химической связи между ФОВ и ХЭ, в результате чего восстанавливается структура ХЭ и их функции. Кроме того, реактиваторы ХЭ обладают Н-холинолитическими свойствами, что обосновывает их применение в сочетании с атропином (М-холинолитиком). В России в качестве антидота само- и взаимопомощи и для экстренного лечения используется препарат Пе-ликсим (АЛ-85). В состав препарата входят центральные М-, Н-холинолитики, холинолитик пролонгированного действия, реактиваторы ХЭ, нейролептик. Препарат оказывает выраженное центральное и периферическое холиноблокиру-

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

350-,

а л

н а 1_ 300-

м н

о со ó 250-

е .0

и н Œ к 200-

а е

* Œ м со 150-

е а

оп 100-

О CQ 50-

3 ч 1 день 3 дня 7 дней 30 дней

Время после интоксикации зоманом дозой 0,045 мг/кг

Зоман

Зоман + пеликсим

Рис. 3. Результаты определения зомана, регенерированного из состава аддуктов с БХЭ плазмы крови после отравления зоманом в дозе 0,5 LD50 без применения и с применением антидотной терапии пеликсимом (п = 6; р < 0,05).

0

ющее действие, обладает многими свойствами, характерными для реактиваторов ХЭ [37, 38]. Антидотная терапия может изменить показатели токсикокинетики ФОВ и повлиять на результаты определения их метаболитов в биопробах. В рамках проведённого исследования была оценена информативность маркёров ФОВ G-типа при моделировании острого отравления животных (крысы) с применением антидотной терапии путём введения препарата Пеликсим (РеНхт). На рис. 2 и 3 представлены результаты определения зарина и зомана, регенерированных из состава белковых аддуктов плазмы крови, после отравления дозой 0,5 LD50 без применения и с применением антидотной терапии пеликсимом (р < 0,05).

Через 1-7 сут после отравления содержание реактивированного зомана в образцах плазмы крови животных, получивших антидот, примерно в 3 раза ниже, чем у животных без анти-дотной терапии. В случае отравления зарином значимое влияние антидотной терапии на реактивацию отмечено только через 3 ч после отравления. Содержание зарина в исследованных образцах плазмы крови через 1 сутки после отравления снижается на порядок и остаётся на этом уровне до 3 сут, в то время как содержание зомана даже через 3 сут всё ещё остаётся на достаточно высоком уровне. Через 7 сут после

отравления зоман идентифицирован в плазме крови в условиях антидотной терапии и без нее на уровне 0,3 нг/мл и 1 нг/мл соответственно. Зарин определяется максимум через 3 сут после отравления.

Ранее было показано, что зоман аккумулируется в тканях лёгких, а из клеток крови - эритроциты являются основным «депо» зомана [39].

Наряду с ХЭ, мишенью ковалентного присоединения ФОВ является сывороточный альбумин. Альбумин является более долгоживущим белком, чем БХЭ, время его полужизни составляет 20-25 дней. Аддукты с ФОВ возможно выявить через 49 сут после отравления [40]. Ад-дукты с альбумином стабильны при хранении, время полужизни аддукта альбумина с зоманом составляет 20 дней при температуре 22оС и при рН 7,4 [41]. Основным сайтом присоединения ОВ G-типа является тирозин-411, в то время как для У-газов преимущественным участком связывания оказывается тирозин 148/150. В отличие от аддуктов с БХЭ, тирозиновые аддукты с ФОВ не подвергаются «старению». Таким образом, альбуминовые аддукты с ФОВ (особенно с зоманом, который стареет на БХЭ за несколько минут) являются более ретроспективными маркёрами экспозиции к ФОВ, в сравнении с ад-дуктами с БХЭ. В нашем эксперименте влияние антидотной терапии на кинетические профили тирозиновых аддуктов ФОВ исследовано не было, но, согласно литературным данным [42, 43], антидотная терапия оксимами не влияет на возможность определения тирозиновых аддук-тов ФОВ в плазме.

Отсутствие чувствительности кинетических профилей аддуктов ФОВ с альбумином к действию реактиваторов ХЭ характеризует рецепторы альбумина как «немые» по отношению к ФОВ.

Известно, что антидотов к СИ не существует. Косвенным подтверждением того, что альбумин является «немой» биологической мишенью в отношении СИ, явилось отсутствие вовлечённости альбумина в механизм действия ацетилцистеина (АЦЦ) как скавенджера СИ [44]. В ферментном переваре плазмы крови, экспонированной СИ, были идентифицированы ди- и трипептид, модифицированные гидрок-

457

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

сиэтилтиоэтильной группой (HETE) - HETE-CysPro и HETE-CysProPhe. Авторами [44] был идентифицирован аддукт альбумина с АЦЦ, но в экспериментах in vitro установлено отсутствие влияния концентрации АЦЦ на скорость деградации СИ и образование аддуктов СИ с альбумином. При этом вывод авторов о том, что ковалентное связывание СИ с АЦЦ не вносит существенного вклада в терапию поражений СИ с помощью АЦЦ, представляется не вполне обоснованным, поскольку нет пока данных о влиянии терапии АЦЦ на токсикокинетические показатели биомаркёров чувствительности к СИ (аддуктов с гемоглобином и ДНК). Заранее можно предположить, что терапия поражений СИ АЦЦ будет способствовать более активной экскреции СИ с мочой в виде его аддукта с АЦЦ. Тем не менее исследования аддуктов с белками крови, сфокусированные на самом легкодоступном и обильном белке крови - сывороточном альбумине, не смогли пролить свет на механизм действия АЦЦ как скавенджера СИ.

В отличие от белков, ДНК подвергаются репарационным процессам, поэтому кинетика выведения аддуктов с ДНК априори трудно предсказуема. С другой стороны, кинетические профили аддуктов с ДНК отражают процессы повреждения и репарации ДНК при действии цитостатиков и, таким образом, рассматриваются как биомаркёры эффекта.

Если при определении биомаркёров экспозиции методы хроматомасс-спектрометрии играют главенствующую роль как при сборе доказательств воздействия известного ксенобиотика на организм, так и при идентификации неизвестного химического фактора, то поддающиеся количественной оценке биохимические или другие физиологические ответы организма (т .е. биомаркёры эффекта) методами хро-матомасс-спектрометрии определяются пока лишь в незначительной степени. Исследование кинетических профилей молекул, характеризующих биологический эффект, наступающий при воздействии на организм определённого ксенобиотика, получило название «химической дозиметрии». Данная терминология, как и сама технология, в большей степени получили распространение в онкологии при исследовании процессов повреждения и репарации ДНК при

химиотерапии. В этой области предметом химической дозиметрии является исследование концентрационных профилей аддуктов ДНК с цитостатиками в моче, лейкоцитах крови и других биообъектах. Известно, что толчком к применению химиотерапии для лечения онкологических заболеваний послужили последствия применения СИ в I Мировой войне. Аналитической платформой для развития методов молекулярной дозиметрии в химиотерапии онкологических заболеваний также послужили исследования образования и возможностей определения аддуктов СИ с ДНК. Суммарное количество аддуктов ксенобиотика с ДНК является мерой дозы, достигнувшей молекул-мишеней, но только определённые аддукты с ДНК позволяют охарактеризовать генотоксический процесс.

В связи с тем, что действие СИ определяется, главным образом, его способностью образовывать эписульфониевый ион, являющийся сильным электрофилом, который активно реагирует с нуклеофильными центрами составляющих клетки (белки, липиды, РНК и ДНК), его биомаркёрами являются 4 группы соединений: продукты окисления/гидролиза [45, 46], Р-лиазные метаболиты [47, 48], продукты алкилирования белков [49] и ДНК [50]. Именно способностью образовывать аддукты с ДНК объясняют гено-токсическое и канцерогенное действие СИ [5053]. Ещё в 60-х годах ХХ века авторы [54-56] в опытах с меченым 3^-СИ установили, что главной мишенью для воздействия СИ на ДНК является N7 положение гуанина. Последующая потеря атома хлора приводит к образованию N7-гидроксиэтилтиоэтил-20-деоксигуанозина (HETE-N7dGuo), который, в свою очередь, вследствие депуринизации, превращается в свободный ^-гидроксиэтилтиоэтил гуанин (N7-HETEG) [11]. Структура образующегося соединения N7-HETEG приведена на рис. 4.

На настоящий момент установлено, что ал-килирование ДНК протекает по трём основным сайтам: N7, 06 положения в гуанине и N3 положение в аденине. В качестве биомаркёров воздействия СИ обычно рассматривают 4 типа аддуктов: ^-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2'-гуанин (N7-HETEG), бис(2-этил-Ы7-гуанин) тиоэфир (Bis-G), образующийся в результате

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

Рис. 4. Структурная формула N7-гидроксиэтилтиоэтил гуанина.

Рис. 5. Изменение содержания N7-HETEG в моче крыс во времени после экспозиции СИ в дозе 2 мг/кг.

реакции по каждому положению N7 двух остатков гуанина в двухцепочечной ДНК, N3-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2'-аденин(ЖЗ-НЕТЕА) и 06-(2-гидроксиэтилтиоэтил)-2'-гуанин (O6 - HETEG). По данным работы [57], образование аддуктов протекает в соответствии со следующим процентным соотношением: по положению N7 гуанина (61%), по положению N3 аденина (16%), по двум положениям N7 гуанина как межнитевая, так и внутрицепочечная сшивка (около 17%), по положению O6 гуанина (0,1%). Именно по причине максимального выхода в качестве биомаркёра исследовали N7-гидроксиэтилтиоэтил гуанин.

При исследовании кинетического профиля N7-HETEG - биомаркёра генотоксического действия СИ, при анализе образцов мочи, полученных от экспонированных СИ крыс в эксперименте in vivo, было установлено, что максимум выведения приходится на вторые сутки после экспонирования, в то время, как уверенная идентификация аддуктов возможна до 7 дней после подкожного введения СИ [18].

В моче аддукты находятся уже в депурини-зированном виде за счёт внутренних процессов репарации ДНК организмом, поэтому стадии выделения ДНК и последующего её гидролиза можно избежать. Тем не менее, для надёжной регистрации малых доз требуется проведение пробоподготовки, связанной с концентрированием и очисткой.

Мочу контрольных и экспонированных СИ крыс отбирали с использованием метаболиче-

ских камер через 2, 3, 7, 14 и 21-е сутки после воздействия СИ. Полученные пробы анализировали согласно разработанной методике. Матричный фактор, нормализованный на внутренний стандарт, определяемый отношением матричного фактора аналита к матричному фактору внутреннего стандарта, составляет 12%. Нижний предел определения аналита в моче -1 нг/мл. Относительная ошибка определения (п = 2) менее 30%.

Результаты количественного определения N7-HETEG в моче крыс, экспонированных СИ дозой У LD5o, представлены на рис. 5.

Профиль экскреции N7-HETEG после одномоментного подкожного введения СИ лабораторным животным отличается от профиля, полученного при накожной аппликации [11, 18, 58]. В наших экспериментах при подкожном введении СИ скорость выведения N7-HETEG с мочой более высокая в сравнении с накожной аппликацией. Максимальная концентрация N7-HETEG в моче приходится на 2-е (а не 3-и, как при накожной аппликации) сутки после введения СИ и полное выведение N7-HETEG достигается раньше. Инъекционный путь введения более адекватно моделирует введение цитостатиков при химиотерапии, чем накожная аппликация. В дальнейшей работе мы планируем исследовать влияние терапии АЦЦ на профили экскреции аддуктов СИ с АЦЦ и ДНК в экспериментах на лабораторных животных.

Развитие аналитических технологий количественного определения аддуктов алкили-

459

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

рующих агентов с ДНК в моче чрезвычайно важно в целях терапевтического мониторинга лекарственных средств, используемых при химиотерапии. Чтобы данные таких исследований на животных можно было экстраполировать с целью прогнозирования риска для здоровья человека, необходимо определить, связана ли концентрация аддуктов установленного в экспериментах на животных типа с развитием новообразований в пробах ткани человека. Ключевым моментом оценки риска при воздействии высокотоксичных веществ является оценка уровней внутренней (экспозиция) и эффективной (эффект) доз. Связь между экспозицией и эффектом может быть установлена путём измерения концентраций биомаркёров экспозиции/ эффекта в определенных биологических средах.

Заключение

Внутренняя доза экспозиции определяется количеством абсорбированного ксенобиотика. Далее в процессе метаболизма, распределения и экскреции формируется токсикологический профиль. Продукты биотрансформации, сохранившие в молекуле элементы структуры, характерные исключительно для определённого ксенобиотика, могут рассматриваться как биомаркёры экспозиции. Измерение содержания биомаркёров в тканях, клетках, органеллах характеризует распределение биомаркёров в организме. Вещества или их метаболиты, достигшие специфических (активных) биологических мишеней и вступившие во взаимодействие с биомолекулами-мишенями, являются биомаркёрами экспозиции/эффекта. В качестве биомаркёров экспозиции/эффекта ФОВ предложено рассматривать аддукты с бутирилхоли-нэстеразой, для сернистого иприта биомаркёрами экспозиции/эффекта являются аддукты с ДНК. Биомониторинг аддуктов цитостатиков с ДНК в моче может способствовать визуализации процессов повреждения/репарации ДНК при химиотерапии и является перспективной технологией как для терапевтического лекарственного мониторинга при химиотерапии, так и при разработке новых лекарственных средств. Аддуктам высокотоксичных соединений с сывороточным альбумином, по-видимому, следу-

ет отвести роль селективных (доказательных) и

ретроспективных маркёров экспозиции.

Благодарности. Авторы выражают благодарность проф. В.Р. Рембовскому, проф. А.С. Радилову, доктору биол. наук Н.В. Гончарову, канд. хим. наук Н.С Хлебниковой, канд. биол. наук Г.В. Каракашеву, канд. хим. наук А.И. Уколову, инженеру В.Ю. Коневой и всем сотрудникам лаборатории аналитической токсикологии ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России за ценные консультации и помощь в проведении исследований.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

ЛИТЕРАТУРА

12. Методические рекомендации «Установление факта воздействия отравляющих веществ на организм по результатам анализа биологических проб при участии Российской Федерации в расследованиях Технического секретариата Организации по запрещению химического оружия возможных случаев применения химического оружия». Федеральное медико-биологическое агентство, МР ФМБА России № 1.2.060 - 2012 от 12.12.2012 г. - Москва, 2012.

13. Методические рекомендации «Подтверждение факта воздействия фосфорорганических отравляющих веществ на организм по результатам анализа биопроб». Федеральное медико-биологическое агентство, МР ФМБА России № 1.2.038-2016 от 31.05.16- Москва, 2016.

14. Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Уколова Е.С., Уколов А.И., Хлебникова Н.С., Войтенко Н.Г., Радилов А.С. Хромато-масс-спектрометрическое исследование токсикологических профилей отравляющих веществ кожно-нарывного действия. Токсикол. вест. 2013; 3: 21-9.

16. Орлова О.И., Савельева Е.И., Хлебникова Н.С. Методы обнаружения метаболитов сернистого иприта в объектах биологического происхождения. Аналитический обзор. Ж. анал. химии. 2013; 68(1): 4-14.

17. Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Хлебникова Н.С., Радилов А.С. Определение тиодигликоля и его оксида в биообразцах методом газовой хроматомасс-спектро-метрии. Масс-спектрометрия. 2017; 14(2): 124-32.

18. Орлова О.И., Каракашев Г.В., Шмурак В.И., Аб-зианидзе В.В., Савельева Е.И. Определение n7-[2-[(2-гидроксиэтил)-тио]-этил]-гуанина в моче крыс как маркёра воздействия сернистого иприта. Вест. СПбГУ. Физика и химия. 2017; 4(62): 3: 313-25.

19. Орлова О.И., Савельева Е.И., Каракашев Г.В. Методы определения аддуктов сернистого иприта с ДНК. Ж. анал. химии. 2017; 72(3): 17-25.

24. Куценко С.А. Основы токсикологии: учебное пособие. СПб.: Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, 2002.

25. Белинская Д.А., Шмурак В.И., Прокофьева Д.С., Гончаров Н.В. Сывороточный альбумин: поиск но-

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

вых сайтов взаимодействия с фосфорорганическими соединениями на примере зомана. Биоорг. химия. 2014; 40(5): 541.

27. Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Уколов А.И., Прокофьева Д.С., Хлебникова Н.С., Орлова Т.И., Уколова Е.С., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Возможности химико-токсикологического анализа при моделировании острого отравления веществом VR и антидотной терапии карбоксимом. Токсикол. вест. 2016; 2(137): 8-18.

33. Корягина Н.Л., Савельева Е.И., Каракашев Г.В., Бабаков В.Н., Дубровский Я.А., Уколова Е.С., Хлебникова Н.С., Мурашко Е.А., Конева В.Ю., Уколов А.И., Копейкин В.А., Радилов А.С. Определение конъюги-рованных с белками метаболитов фосфорорганиче-ских отравляющих веществ в плазме крови. Ж. анал. химии. 2016; 71(8): 1-11.

37. Куценко С.А. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита. СПб: ООО «Изд-во ФОЛИАНТ», 2004.

38. Петренко Э.П. Военная токсикология, радиобиология и медицинская защита. Учебное пособие. (http:// www.studfiles.ru/preview/2361721, дата обращения 10.05.2018).

REFERENCES

1. Holmes E., Loo R.L., Cloarec O., Coen M, Tang H, Maibaum E, Bruce S, Chan Q, Elliott P, Stamler J, Wilson ID, Lindon JC, Nicholson JK. Detection of urinary drug metabolite (xenometabolome) signatures in molecular epidemiology studies via statistical total correlation (NMR) spectroscopy. Anal. Chem. 2007; 79(7): 2629-40.

2. Hsu J.F., Peng L.W., Li Y.J, Lin L.C., Liao P.C. Identification of di-isononyl phthalate metabolites for exposure marker discovery using in vitro/in vivo metabolism and signal mining strategy with LC-MS data. Anal. Chem. 2011; 83(9): 8725-31.

3. Hsu J.Y., Hsu J.F., Chen Y.R. Shih C.L, Hsu Y.S., Chen Y.J., Tsai S.H., Liao P.C. Urinary exposure marker discovery for toxicants using ultra-high pressure liquid chromatography coupled with Orbitrap high resolution mass spectrometry and three untargeted metabolomics approaches. Anal. Chim. Acta. 2016; 939: 73-83.

4. WHO. Environmental Health Criteria 237. Principles for evaluating health risks in children associated with exposure to chemicals. Training Package for the Health Sector, World Health Organization, 2011.

5. Balali-Mood M., Hefazi M. Long-term complications of sulphur mustard poisoning in severely intoxicated Iranian veterans. Fund. Clin. Pharmacol. 2005; 19: 297-315.

6. Davis K.G., Aspera G. Exposure to liquid sulfur mustard. Ann. Emerg. Med. 2001; 37 (6): 653-6.

7. Kehe K., Szinicz L. Medical aspects of sulphur mustard poisoning. Toxicology. 2005; 214(3): 198-209.

8. Newmark J., Langer J.M., Capacio B. et al. Liquid sulfur mustard exposure. Mil. Med. 2007; 172(2): 196-8.

9. Wattana M., Bey T. Mustard gas or sulfur mustard: an old chemical agent as a new terrorist threat. Prehosp. Disast. Med. 2009; 24(1): 19-29.

10. Xu H., Nie Z., Zhang Y., Li C., Yue L., Yang W., Chen J., Dong Y., Liu Q., Lin Y., Wu B., Feng J., Li H., Guo L., Xie J. Sulfur mustard exposure cases: Overall analysis of four types of biomarkers in clinical samples provides positive implication for early diagnosis and treatment monitoring. Toxicol. Rep. 2014; 1: 533-43.

11. Zhang Y., Yue L., Nie Z., Chen J., Guo L., Wu B., Feng J., Liu Q., Xie J.. Simultaneous determination of four sulfur mustard-DNA adducts in rabbit urine after dermal exposure by isotope-dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2014; 961: 29-35.

12. Methodological Guidelines № 1.2.060-2012 of 12.12.2012 «Establishment of Exposure to Toxic Substances by the Results of Analysis of Biomedical Samples in the Case of Involvement of the Russian Federation in Investigations of the Technical Secretariat of the Organization for the Prohibition of Chemical Weapons of the Suspected Use of Chemical Weapons».

13. Methodological Guidelines № 1.2.038-2016 of 31.05.2016 «Confirmation of Exposure to Organo-phophorus Nerve Agents by the Results of Analysis of Biomedical Samples».

14. Koryagina N.L., Savel'eva E.I., Ukolova E.S., Ukolov A.I., Khlebnikova N.S, Voitenko N.G., Radilov A.S. Gas Chromatography-Mass Spectrometry Study of TOC Profiles of Blister Agents. . Toksikologicheskiy vestnik 2013; 3: 21-9.

15. Koryagina N.L., Ukolova E.S., Savel'Eva E.I., Voitenko N.G., Orlova O.I., Jenkins R.O., Goncharov N.V Spectroscopy: high-sensitivity determination of 2-chlorovi-nylarsonous acid in biomedical samples for retrospective detection of exposure to lewisite upon antidotal therapy. Int. J. 2011; 26(1): 1-10.

16. Orlova O.I., Savel'eva E.I., Khlebnikova N.S. Methods for the detection of sulfur mustard metabolites in biological materials: An analytical review. Zh. Anal. Khim. 2013; 68

17. Koryagina N.L., Savel'eva E.I., Khlebnikova N.S, Radilov A.S. Determination of Thiodiglycol and Its oxide in Biomedical Samples By Gas Chromatography-Mass Spectrometry. Mass-spektrometriya. 2017; 14

18. Orlova O.I., Karakashev G.V., Shmurak V.I., Abzianidze V.V., Savelieva E.I. Determination ofN7-[2-[(2-hydroxy-ethyl)thio]-ethyl]guanine in rat's urine as biomarker of exposure of sulfur mustard. Vestn. S.-Peterb. Gos. Univ.: Phis. Khim. 2017; 4(62), 3: 313-25. (in Russian).

19. Orlova O.I., Savel'eva E.I., Karakashev G.V Methods of the determination of sulfur mustard- DNA adducts. Zh. Analiticheskoy Khimii. 2017; 72(3): 17-25. (in Russian).

20. Ehrenberg L., Hiesche K.D., Osterman-Golkar S., and Wennberg, I. Evaluation of genetic risks of alkylating

МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

agents. Tissue doses in the mouse from air contaminated with ethylene oxide. Mutat. Res. 1974; 242: 83-103.

21. Ehrenberg L., Moustacchi E. and Osterman-Golkar S. International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens. Dosimetry of genotoxic agents and dose-response relationships of their effects. Mutat Res. 1984; 1232: 121-82.

22. Ehrenberg L., Granath F. and Tornqvist M. Macromole-cule adducts as biomarkers of exposure to environmental mutagens in human populations. Environ. Health Per-spect. Suppl. 1996; 3: 423-8.

23. Nath A.K., Roberts L.D., Liu Y., Mahon S.B., Kim S., Ryu J.H., Werdich A., Januzzi J.L., Boss G.R., Rockwood G.A., MacRae C.A., Brenner M., Gerszten R.E., Peterson R.T. Chemical and metabolomic screens identify novel biomarkers and antidotes for cyanide exposure. FASEB J. 2013; 27(5): 1928-38.

24. Kuthenko S.A. Basics of Toxicology [Osnovy toksikolo-gii].. A Textbook. Sankt Petersburg: Military Medical S.M. Kirova Academy. 2002.

25. Belinskaia D.A., Shmurak V.I., Prokofieva D.S., Gon-charov N.V. Serum Albumin: Search for New Sites of Interaction with Organophosphorus Compounds by the Example of Soman. Russ. J. Bioorganicheskay Chimiay. 2014; 40(5): 499-519.

26. Goncharov N.V., Belinskaia D.A., Shmurak VI. et al. Serum Albumin Binding and Esterase Activity: Mechanistic Interactions with Organophosphates. Molecules. 2017; 22(7): 1201.

27. Koryagina N.L., Savelieva E.I., Ukolov A.I., Prokofieva D.S., Khlebnikova N.S., Orlova T.I., Ukolova E.S., Radilov A.S., Goncharov N.V Possibilities of chemical toxicological analysis for modeling acute poisoning with VR and antidotal therapy with Carboxim. Toksikol. vest. 2016; 2

28. Prokofieva D.S., Voitenko N.G., Gustyleva L.K., Baba-kov V.N., Savelieva E.I., Jenkins R.O., Goncharov N.V. Microplate spectroscopic methods for determination of the organophosphate soman. J. Environ. Monit. 2010; 12(6): 1349-54.

29. Degenhardt C.E.A.M., Pleijsier K., van der Schans M.J., Langenberg J.P., Preston K.E., Solano M.I., Maggio V.L, Barr J.R. Improvements of the fluoride reactivation method for the verification of nerve agent exposure. J. Anal. Toxicol. 2004; 28: 364-71.

30. Kuca K., Patocka J.R. Reactivation of cyclosarin-inhib-ited rat brain acetylcholinesterase by pyridinium—ox-imes. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2004; 19(1): 39-43.

31. Koryagina N., Savelieva E., Babakov V., Dubrovskiy Ya., Karakashev G., Murashko E., Ukolova E., Kopey-kin V., Koneva V, Khlebnikova N., Radilov A. Improved Methodology of Determination of Protein Adducts of Nerve Agents in Blood Plasma. The Toxicologist: Supplement to Toxicological Sciences. Society of Toxicology. 2015; 144(1): 447.

32. Noort D., Fidder A. Sample collection, preparation and analytical methods. Chemical weapons convention

chemicals analysis. Ed. M. Mesilaakso. New York: John Wiley & Sons, Ltd., 2005: 433-51.

33. Koryagina NL, Savel'eva EI, Khlebnikova NS, Ukolov AI, Ukolova ES, Karakashev GV, Radilov AS. Chro-matography-mass spectrometry determination of al-kyl methylphosphonic acids in urine. J. Analiticheskoy Chimii. 2016; 71 (8): 1-11.

34. Aryal U.K., Lin C.T., Kim J.S., Heibeck T.H., Wang J., Qian W.J., Lin Y. Identification of phosphorylated butyr-ylcholinesterase in human plasma using immunoaffinity purification and mass spectrometry. Anal. Chim. Acta. 2012; 723: 68-75.

35. Worek F., Thiermann H., Szinicz L., Eyer P. Kinetic analysis of interactions between human acetylcholinesterase, structurally different organophosphorus compounds and oximes. Biochem. Pharmacol. 2004; 68: 2237.

36. Aurbek N., Thiermann H., Szinicz L. Worek F. Analysis of Inhibition, Reactivation and Aging Kinetics of Highly Toxic Organophosphorus Compounds with Human and Pig Acetylcholinesterase. Toxicol. 2006; 224(1-2): 91-9.

37. Kuthenko S.A. Military toxicology, radiation biology, and medical protection [Voennaya toksikologiya, radi-atsionnaya biologiya I meditsinskaya zashchita].. Sankt Petersburg: FOLIANT, 2004: 526.

38. Petrenko E.P. Military toxicology, radiation biology, and medical protection A Textbook. [Voennaya toksikologiya, radiatsionnaya biologiya I meditsinskaya zashchita]. Available at: http://www.studfiles.ru/preview/2361721

39. Shih M.L., McMonagle J.D., Dolzine T.W., Gresham V.C. Metabolite pharmacokinetics of soman, sarin and GF in rats and biological monitoring of exposure to toxic organophosphorus agents. J. Appl. Toxicol. 1994; 14(3): 195-9.

40. Van der Schans M.J., Hulst A.G., van der Riet-van Oeveren D. Noort D, Benschop H.P., Dishovsky Ch. New tools in diagnosis and biomonitoring of intoxications with organophosphorothioates: case studies with chlorpyrifos and diazinon. Chem. Biol. Interact. 2013; 203(1): 96-102.

41. Li B., Nachon F., Froment M.T., Verdier L, Debouzy JC, Brasme B, Gillon E, Schopfer LM, Lockridge O, Mas-son P. Binding and hydrolysis of soman by human serum albumin. Chem. Res. Toxicol. 2008; 21(2): 421-31.

42. Read R.W., Riches J.R., Stevens J.A. Stubbs S.J., Black R.M. Biomarkers of organophosphorus nerve agent exposure: comparison of phosphylated butyrylcholinester-ase and phosphylated albumin after oxime therapy. Arch. Toxicol. 2010; 84(1): 25-36.

43. Williams N.H., Harrison J.M., Read R.W, Black R.M. Phosphylated tyrosine in albumin as biomarker of exposure to organophosphorous nerve agents. Arch. Toxicol. 2007; 81: 627-39.

44. Siegert M., Kranawetvogl A., Thiermann H., John H. N-Acetylcysteine as a chemical scavenger for sulfur mustard: New insights by mass spectrometry. Drug Test Anal. 2017 Sep 6. doi: 10.1002/dta.2299.

MEDICAL AND BIOLOGICAL ASSURANCE OF THE CHEMICAL SAFETY OF THE RUSSIAN FEDERATION

45. Li C., Chen J., Zhong Y. Li H. Simultaneous quantification of thioglycol and thioglycol sulfoxide in rat plasma by isotope dilution-liquid chromatography tandem mass spectrometry. Chin. J. Anal. Chem. 2012; 40(10): 1567-72.

46. Riches J., Read R.W., Black R.M. Analysis of the sulphur mustard metabolites thiodiglycol and thiodiglycol sulphoxide in urine using isotope-dilution gas chroma-tography-ion trap tandem mass spectrometry. J. Chro-matogr. B. 2007; 845: 114.

47. Barr J.R., Pierce C.L., Smith J.R. Capacio B.R., Woolfitt A.R., Solano M.I., Wooten J.V, Lemire S.W., Thomas J.D., Ash D.H., Ashley D.L. Analysis of urinary metabolites of sulfur mustard in two individuals after accidental exposure. J. Anal. Toxicol. 2008; 32(1): 10-6.

48. Li C., Chen J., Liu Q., Xie J., Li H. Simultaneous quantification of seven plasma metabolites of sulfur mustard by ultra high performance liquid chromatography-tan-dem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. 2013; 917: 917-8.

49. Noort D., Fidder A., Benschop H.P., De Jong L.P., Smith J.R. Procedure for monitoring exposure to sulfur mustard based on modified edman degradation of globin. J. Anal. Toxicol. 2004; 28(5): 311-5.

50. Lakshmana-Rao P.V, Vijayaraghavan R., Bhaskar A.S.B. Sulphur mustard induced DNA damage in mice after dermal and inhalation exposure. Toxicol. 1999; 139: 39.

51. Jowsey P. A., Williams F.M., Blain P.G. DNA damage, signalling and repair after exposure of cells to the sul-

phur mustard analogue 2-chloroethyl ethyl sulphide. Toxicology. 2009; 257: 105-12.

52. Lodhi I.J., Sweeney J.F., Clift R.E., Hinshaw D.B. Nuclear dependence of sulfur mustard-mediated cell death. Toxicol. Appl. Pharm. 2001; 170: 69-77.

53. Papirmeister B., Gross C. L., Meier H. L. et al. Molecular basis for mustard-induced vesication. Fundam. Appl. Toxicol. 1985; 5: 134.

54. Brookes P., Lawley P. D. Reaction of Mustard Gas With Nucleic Acids in vitro and in vivo. Analysis of urinary metabolites of sulfur mustard in two individuals after accidental exposure. Biochem. J. 1960; 77: 478-84.

55. Brookes P., Lawley P. D. Effects of Alkylating Agents on T2 and T4 Bacteriophages. Biochem. J. 1963; 89: 138-44.

56. Lawley P. D., Brookes P. Further Studies on Alkylation of Nucleic Acids and Their Constituent Nucleotides. Biochem. J. 1963; 89: 127-38.

57. Kehe K., Balszuweit F., Steinritz D., Thiermann H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 2009; 263: 12-9.

58. O.I. Orlova, E.I. Savelieva, G.V. Karakashev, V.I. Shmurak, T. I. Orlova, N. S. Khlebnikova, A.S. Radilov. New in vivo Data on the Excretion Kinetics of a DNA Adduct of Sulfur Mustard. Abstract Book "International workshop on analysis of chemical warfare agents to mark the 20th anniversary of the CWC". 11 -13 December. 2017: 71.

Поступила 01 июня 2018 Принята в печать 19 сентября 2018