Способ прогнозирования неблагоприятного течения увеальной меланомы, связанного с опухолевым микроокружением
METHOD FOR PREDICTING THE UNFAVORABLE COURSE OF UVEAL MELANOMA ASSOCIATED WITH A MALIGNANT MICROENVIRONMENT

Изобретение относится к медицине, а именно, к офтальмологии и предназначено для прогнозирования неблагоприятного течения увеальной меланомы, связанного с опухолевым микроокружением.
Злокачественные опухоли - заболевания, ведущие к метастазированию и высокой смертности в мире [Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. (ред.). Состояние онкологической помощи населению России в 2015 г. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ НМИРЦ Минздрава России; 2016.]. Канцерогенез - это многоэтапный процесс возникновения новообразования, вызывающий появление микроокружения (МО), состоящего из измененных клеток хозяина, перепрограммированных для роста опухоли. В последнее время появилось значительное количество работ, указывающих, что МО влияет на прогрессию опухоли, ее ангиогенез и метастазирование [Зибиров Р.Ф., Мозеров С.А. Характеристика клеточного микроокружения опухоли. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена, 2018; 2:67-72. DOI:https://doi.org/10.17116/onkolog20187267-72; Roma-Rodrigues С, Mendes R., Baptista P.V., Fernandes A.R. Targeting Tumor Microenvironment for Cancer Therapy. Int. J. Mol. Sci. 2019; 20(4): 840. DOI:https://doi.org/10.3390/ijms20040840]
К клеткам МО с доказанным влиянием на поддержание злокачественного процесса относят клетки, названные в литературе «воспалительное микроокружение». К ним относят макрофаги, супрессорные клетки миелоидного происхождения, эозинофилы, тучные клетки, фибробласты, плазмоциты, лимфоциты, нейтрофилы [Coussens L.M., Werb Z. Inflammation and cancer. Nature. 2002; 420 (6917): 860-7; Ribatti D., Crivellato E., Roccaro A.M., Ria R., Vacca A. Mast cell contribution to angiogenesis related to tumour progression. Clin Exp Allergy. 2004; 34 (11): 1660-4. DOI: https://doi.org/ 10.1111/j.1365-2222.2004.02104.x].
В ряде работ показано, что присутствующие в опухоли фибробласты приобретают иммуносупрессивные свойства, макрофаги получают туморогенные свойства и накапливаются тучные клетки. Это приводит к усилению пролиферации опухолевых клеток, гипоксии, аномальным очагам воспаления и ангиогенеза [Diaz-Montero С.М., Finke J., Montero A.J. Myeloid-derived suppressor cells in cancer: therapeutic, predictive, and prognostic. Semin Oncol. 2014; 41 (2): 174-84. DOI: 10.1053/j.seminoncol.2014.02.003; Yang J., Li X., Liu X., Liu Y. The role of tumor-associated macrophages in breast carcinoma invasion and metastasis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015; 8 (6): 6656-6664].
В литературе имеются работы по изучению влияния супрессорных клеток миелоидного происхождения (myeloid-derived suppressor cells - MDSC) на прогрессию злокачественных опухолей, в которых указано, что их увеличение коррелирует с развитием метастазирования и снижением общей выживаемости [Gabrilovich D.I., Nagaraj S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2009; 9(3): 162-174. DOI: 10.1038/nri2506; Diaz-Montero С.M., Finke J., Montero A.J. Myeloid-derived suppressor cells in cancer: therapeutic, predictive, and prognostic. Semin Oncol. 2014; 41 (2): 174-84. DOI: 10.1053/j.seminoncol.2014.02.003].
Увеальная меланома (УМ) - злокачественное новообразование нейроэктодермального происхождения, заболеваемость которым достигает 13 случаев на 1 млн. взрослого населения в Российской Федерации [Бровкина А.Ф., Панова И.Е., Саакян С.В. Офтальмоонкология: новое за последние два десятилетия. Вестник офтальмологии. 2014; 130(6): 13-19.] и 5,1 случаев на 1 млн. в мире [Singh A.D., Turell М.Е., Topham А.K. Uveal melanoma: trends in incidence, treatment, and survival. Ophthalmology. 2011; 118: 1881-1885. DOI:https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2011.01.040]. У половины пациентов с далекозашедшими формами УМ развивается метастатическая болезнь [Schmittel A., Bechrakis N.E., Martus P., Mutlu D., Scheibenbogen C., Bornfeld N., Foerster M.H. Thiel E., Keilholz U. Independent prognostic factors for distant metastases and survival in patients with primary uveal melanoma. Eur. J. Cancer. 2004; 40: 2389-2395. DOI:https://doi.org/10.1016/j.ejca.2004.06.028]. Патогенез развития меланомы сосудистой оболочки глаза включает молекулярно-генетические, иммунологические и другие аспекты [Саакян С.В., Мякошина Е.Б., Кричевская Г.И., Слепова О.С., Пантелеева О.Г., Андрюшин А.С., Хорошилова-Маслова И.П., Захарова Г.П. Обследование больных увеальной меланомой на наличие герпес-вирусных инфекций. Вопросы вирусологии. 2016; 61(6):284-287. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2016-61-6-284-287; Саакян С.В., Амирян А.Г., Цыганков А.Ю., Склярова Н.В., Залетаев Д.В. Клинические, патоморфологические и молекулярно-генетические особенности увеальной меланомы с высоким риском метастазирования. Российский офтальмологический журнал. 2015; 8(2): 47-52.].
В настоящее время существуют немногочисленные работы по изучению влияния клеток МО на УМ [Bronkhorst I.H.G., Jager M.J. Uveal Melanoma: The Inflammatory Microenvironment. J. Innate Immun 2012; 4:454-462. DOI: 10.1159/000334576]. Так, ряд авторов отмечали инфильтрацию ткани меланомы лимфоцитами, выявленную в 134 из 1078 опухолей [Lagouros Е., Salomao D., Thorland Е., Hodge D.O., Vile R., Pulido J.S: Infiltrative T regulatory cells in enucleated uveal melanomas. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 2009; 107: 223-228.]. Кроме того, обнаружены также опухолеассоциированные макрофаги при УМ преимущественно эпителиодноклеточного гистологического типа, встречающиеся при большой плотности опухолевых сосудов [Bronkhorst I.H.G., Jager M.J. Uveal Melanoma: The Inflammatory Microenvironment. J. Innate Immun 2012; 4:454-462. DOI: 10.1159/000334576]. Также доказано, что наличие высокого числа макрофагов ассоциируется с плохим прогнозом УМ [Bronkhorst I.H.G., Jager M.J. Uveal Melanoma: The Inflammatory Microenvironment. J. Innate Immun 2012; 4:454-462. DOI: 10.1159/000334576].
В настоящее время определены клинико-морфологические критерии прогноза УМ: размеры, локализация, гистологический тип, степень склеральной инвазии, наличие или отсутствие эпибульбарного роста, факт соприкосновения края опухоли с ДЗН, присутствие субретинальной жидкости, характер ангиогенеза, показатели клеточной пролиферации, возраст пациента, присутствие генетических аберраций, характер и спектр экспрессии меланома-ассоциированных антигенов, уровень экспрессии активаторов и ингибиторов плазминогена и др. [Schmittel A., Bechrakis N.E., Martus P., Mutlu D., Scheibenbogen C, Bornfeld N., Foerster M.H. Thiel E., Keilholz U. Independent prognostic factors for distant metastases and survival in patients with primary uveal melanoma. Eur. J. Cancer. 2004; 40: 2389-2395. DOI:https://doi.org/10.1016/j.ejca.2004.06.028].
Однако клинико-морфологические корреляции клеточного МО с выявлением предикторов неблагоприятного прогноза при УМ до настоящего времени не проводили.
Известны способы прогнозирования течения увеальной меланомы по уровню показателей сыворотки крови и слезной жидкости: интерферона-гамма (RU 2157998, 20.10.2000); фактора некроза опухоли альфа (RU 2193200, 20.11.2002); по иммуногистохимическому анализу клеток удаленной опухоли с определением процента иммунопозитивных клеток, экспрессирующих рецептор Flt в ядре (RU 2193200, 20.11.2002). Однако эти способы являются довольно трудоемкими и дорогостоящими.
Известен способ прогнозирования течения увеальной меланомы на основе данных ультразвукового исследования в В-режиме с биометрическим определением элевации опухоли, в режиме цветового картирования или энергетической допплерографии - степени васкуляризации меланомы, в режиме спектральной допплерографии - средней величины периферического сосудистого сопротивления в новообразованном русле с вычислением суммарной кодовой величины по определенной формуле (RU 2280410, 27.07.2006). Данный способ принят за ближайший аналог. Однако этот способ не дает возможности выявить морфологические критерии неблагоприятного течения опухолевого процесса, позволяющие обнаружить первые признаки распространения единичных опухолевых клеток в просвет эмиссария склеры в сочетании с наличием клеток микроокружения, ведущие в конечном счете к метастазированию.
Задачей настоящего изобретения является разработка прогнозирования неблагоприятного течения УМ на основе патоморфологических исследований.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности определения тяжести течения увеальной меланомы для выбора дальнейшей адекватной тактики ведения и лечения.
Технический результат достигается за счет проведения патоморфологического исследования и выявления наличия тучных клеток, фибробластов, супрессорных клеток миелоидного происхождения в микроокружении УМ в сочетании с наличием опухолевых клеток в просвете эмиссариев склеры.
Нами были изучены 43 энуклеированных глаза с УМ (260 гистологических препаратов). Возраст пациентов составил от 35 до 65 (в среднем 54±2,7) лет. Определен патоморфологический тип УМ: эпителиоидноклеточная (n=9), веретеноклеточная тип АВ (n=15), смешанноклеточная (n=19). Проминенция опухоли составила от 1,5 до 7,1 мм (в среднем 4,7±1,3), диаметр основания от 1,5 до 16,5 мм (в среднем 13,5±3,3). При этом опухоли T1N0M0 локализовались в 6 глазах юкстапапиллярно с вовлечением диска зрительного нерва, что потребовало энуклеации. По локализации опухолевого узла значительно преобладали опухоли хориоидеи (n=40), опухоли иридоцилиохориоидальной зоны наблюдались только у трех пациентов. По степени пигментации выделяли слабо пигментированные (n=16), умеренно пигментированные (n=7), с выраженной пигментацией (n=20) опухоли. Все 43 пациента, глаза которых исследовали после энуклеации, до операции лечения не получали.
Анализировали наличие и локализацию клеток, участвующих в «хроническом воспалении», сопровождающим опухолевый рост (макрофагов, тучных клеток, плазмоцитов, супрессорных клеток миелоидного происхождения, эозинофилов фибробластов, лимфоцитов, нейтрофилов) в МО и степень выраженности их инфильтрации ткани УМ.
Тучные клетки происходят из костномозговых предшественников - стволовых клеток CD34, которые мигрируют из крови в ткани под влиянием фактора роста стволовых клеток при участии адгезивных молекул. Тучные клетки стимулируют рост опухолей за счет медиаторов, выделяемых при их дегрануляции [Ribatti D., Crivellato Е., Roccaro A.M., Ria R., Vacca A. Mast cell contribution to angiogenesis related to tumour progression. Clin Exp Allergy. 2004; 34 (11): 1660-4. DOI: https://doi.org/ 10.1111/j.l365-2222.2004.02104.x]. Нами тучные клетки в УМ выявлены в 18 (41,9%) из 43 случаев с их локализацией вокруг опухоли. Морфологически они представляли собой полиморфные клетки округлой и овальной формы, с округлым гиперхромным ядром, с наличием цитоплазматических гранул, окрашивающихся эозином в розовый цвет.
Супрессорные клетки миелоидного происхождения (myeloid-derived suppressor cells (MDSC)) - гетерогенная популяция незрелых миелоидных клеток, обладающих супрессорной активностью в отношении иммунных клеток, и у здоровых лиц они расположены преимущественно в костном мозге без распределения в тканях организма [Gabrilovich D.I., Nagaraj S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 2009; 9(3): 162-174. DOI: 10.1038/nri2506.]. Повышение уровня факторов роста, хемокинов и цитокинов при опухолях ускоряет выход MDSC из костного мозга и приводит к накоплению этих клеток в органах и тканях [Diaz-Montero С.М., Finke J., Montero A.J. Myeloid-derived suppressor cells in cancer: therapeutic, predictive, and prognostic. Semin Oncol. 2014; 41 (2): 174-84. DOI: 10.1053/j.seminoncol.2014.02.003]. В нашей группе пациентов в опухолевом МО УМ выявлены MDSC в 7 (16,3%) из 43 глаз. Морфологически они представляли собой клетки неправильной формы со светлой цитоплазмой, большим неравномерно окрашенным округлым ядром и мелким ядрышком.
Фибробласты - клетки соединительной ткани, продуцирующие компоненты межклеточного вещества. Фибробласты, ассоциированные с опухолью, обладают активированным фенотипом и характеризуются экспрессией виментина, десмина, факторов роста, что способствует усилению пролиферации и выживаемости опухолевых клеток. Они более генетически гомогенны и представляют собой одну из мишеней для противоопухолевой терапии [Мнихович М.В. Экстрацеллюлярный матрикс, ангиогенез и клеточное микроокружение при дисгормональных гиперплазиях, фиброаденомах и раке молочной железы (световое и электронно-микроскопическое исследование). Российский медико-биологический вестник им. акад. И.П. Павлова. 2010; 1: 30-37.]. В гистопрепаратах с УМ фибробласты выявлялись в 18,6% случаях и локализовались вокруг опухоли. Они представляли собой клетки веретенообразной формы с отростками. Их ядра содержат 1-2 или даже несколько ядрышек. Хроматин в виде пылевидных частиц равномерно распределен по ядру. В цитоплазме содержатся мелкие вакуоли, гранулы и органеллы.
В зависимости от числа клеток в МО УМ мы выделили две степени их накопления: 1-я степень - 1-5 клеток, 2-я степень - 6 и более клеток.
s
s
s
Фактор роста опухолевых клеток по эмиссариям склеры является неблагоприятным прогностическим признаком, объективно свидетельствующим о склонности к метастазированию. При 2-й степени накопления клеток микроокружения и наличия опухолевых клеток в просвете хотя бы одного эмиссария склеры отмечали склонность к метастазированию, то есть неблагоприятное течение УМ. При этом показателе отмечали корреляционные связи средней силы с тучными клетками (r=0.469), супрессорными клетками миелоидного происхождения (r=0.469), фибробластами (r=0.571).
2
Патоморфологическое исследование проводили следующим образом. Энуклеированные глаза фиксировали в 10% забуференном формалине в течение суток. После вскрытия глазного яблока центральную колодку и кусочек опухоли из боковой колодки пускали в проводку в автоматический тканевой процессор для проведения обезвоживания и затем заключали в парафин с использованием современной станции для заливки в парафин с микропроцессорным управлением (фирма Leica, Germany). После микротомии парафиновые срезы (5-6 мкм) окрашивали гематоксилин-эозином и пикрофуксином по методу Ван-Гизона. Кроме того, проводили специальное окрашивание срезов специфическим красителем для выявления ТК - толлуидиновым синим Гистологические исследования проводили с помощью микроскопической системы фирма Leica, Germany с увеличением от 50 до 630 раз. Количественный подсчет проводился в 8 полях зрения, что соответствует площади 1 мм.
Способ осуществляют следующим образом.
Проводят патоморфологическое исследование микроокружения опухоли энуклеированного глаза у пациента с УМ. При выявлении в нем тучных клеток, фибробластов, супрессорных клеток миелоидного происхождения в количестве не менее 6 каждого вида клеток и наличии опухолевых клеток в просвете хотя бы одного эмиссария склеры прогнозируют неблагоприятное течение увеальной меланомы.
Пример 1. Пациент Д., 46 лет обратился с жалобами на появление искажения формы предметов перед правым глазом.
Проведенные офтальмологические исследования:
Визометрия: Visus OD - 0,4 н.к.,
Visus OS - 1,0.
Тонометрия: ВГД OD - 16 мм.рт.ст., OS - 16 мм.рт.ст.
Биомикроскопия: OD - спокоен, среды прозрачны.
Прямая офтальмоскопия:
OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. Юкстапапиллярно с распространением на ДЗН по меридианам с 12 до 14 часов определяется проминирующее образование аспидного цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью. На поверхности притуморальная отслойка сетчатки.
OS - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
Эхография:
OD - «+» ткань с проминенцией 2,8 мм, диаметром основания 9,8 мм,
OS - «+» ткань не определяется.
В связи с папиллярной локализацией опухоли независимо от ее размеров по данным УЗИ, проведена энуклеация правого глаза.
Проведены патоморфологические исследования. Выявлен смешанноклеточный тип УМ, в микроокружении опухоли диагностированы тучные клетки, фибробласты, супрессорные клетки миелоидного происхождения в количестве 6 клеток каждого вида с выявлением опухолевых клеток в просвете эмиссария склеры, что свидетельствовало о дальнейшем неблагоприятном течении УМ, связанным с опухолевым микроокружением.
Несмотря на небольшие размеры опухоли, полное удаление меланомы из организма, наблюдение за больным показало, что через 3 года после энуклеации появились метастазы в печени, что свидетельствовало о неблагоприятном течении опухолевого процесса.
Пример 2. Пациент К., 54 лет обратился с жалобами на появление искажения формы предметов перед правым глазом.
Проведенные офтальмологические исследования:
Визометрия: Visus OD - 0,1 н.к.,
Visus OS - 1,0.
Тонометрия: ВГД OD - 18 мм.рт.ст., OS - 18 мм.рт.ст.
Биомикроскопия: OD - спокоен, среды прозрачны.
Прямая офтальмоскопия:
OD - На глазном дне - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. Юкстапапиллярно с распространением на ДЗН по меридианам с 13 до 16 часов определяется проминирующее образование аспидного цвета, с нечеткими, неровными границами, гладкой поверхностью. На поверхности притуморальная отслойка сетчатки. Вторичная отслойка сетчатки в нижних отделах глазного дна.
OS - ДЗН бледно-розовый, границы четкие. В макулярной зоне - рефлекс четкий. На периферии очаговой патологии не выявлено.
Эхография:
OD - «+» ткань с проминенцией 4,9 мм, диаметром основания 15,6 мм,
OS - «+» ткань не определяется.
В связи с папиллярной локализацией опухоли независимо от ее размеров по данным УЗИ, проведена энуклеация правого глаза.
При патоморфологическом исследовании выявлен смешанноклеточный тип УМ, в микроокружении опухоли диагностирована 1 тучная клетка, 2 фибробласта, 2 супрессорных клетки миелоидного происхождения с выявлением опухолевых клеток в просвете эмиссария склеры.
Наблюдение за больным в течение 3 лет показало, что метастазы в печени отсутствовали, что указывает на адекватность прогнозирования тяжести течения УМ, связанного с опухолевым микроокружением, предложенным способом.
Полученные данные указывают на необходимость проведения прогнозирования неблагоприятного течения УМ для выбора соответствующей тактики ведения пациента. Необходимы более частые обследования внутренних органов и консультации специалистов: осмотр онкологом и офтальмологом 3 раза в год, проведение МРТ органов брюшной полости с контрастированием 3 раза в год, рентгенография органов грудной клетки 1 раз в год, компьютерная томография орбит 1 раз в год в течение первых 5 лет.
Таким образом, способ позволяет более точно оценить течение УМ после энуклеации, связанное с опухолевым микроокружением, с целью прогнозирования заболевания и соответствующим выбором тактики послеоперационного ведения пациентов.