СПОСОБ ОЦЕНКИ АТЕРОГЕННОСТИ АПОЛИПОПРОТЕИН В-СОДЕРЖАЩИХ ЛИПОПРОТЕИНОВ
METHOD FOR ASSESSING ATHEROGENICITY OF APOLIPOPROTEIN B-CONTAINING LIPOPROTEINS

В основе большинства сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) лежит атеросклероз, который протекает бессимптомно в течение многих лет и, как правило, к моменту проявления клинических симптомов достаточно выражен.
Надежным методом диагностики атеросклеротического поражения коронарных артерий в настоящее время считается коронароангиография (КАГ). Метод КАГ позволяет точно верифицировать наличие поражения коронарного русла, однако сложен и инвазивен, не является общедоступным и применяется, как правило, уже на достаточно выраженной стадии заболевания. Проведение КАГ сопряжено с определенным риском для пациента; по разным данным, он составляет от 0,1 до 2% и четко коррелирует с опытом оператора, отбором пациентов для исследования и используемой техникой. [Национальные рекомендации 2008].
В ходе многочисленных эпидемиологических исследований было показано, что важную роль в развитии атеросклероза играет повышенный в крови уровень холестерина (ХС) липопротеинов низкой плотности (ЛНП), а медикаментозные воздействия, направленные на коррекцию высокого уровня ХС ЛНП, дают наибольший эффект по снижению риска развития ССЗ и их клинических осложнений. Однако в настоящее время половина сердечно-сосудистых событий происходит среди пациентов с умеренным или низким уровнем общего ХС, а остаточный риск их развития сохраняется почти у 70% пациентов [Dallmeier D., Koenig W., 2014], несмотря на хорошо разработанные стратегии, включающие применение высоких доз статинов.
Липопротеины плазмы крови гетерогенны и различаются по плотности, заряду, размеру липидному и белковому составу и функциональной активности. Так, в спектре аполипопротеин (апо) В-содержащих липопротеинов выделяют подфракции липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП), промежуточной плотности (ЛПП С, В, А) и низкой плотности (ЛНП), включающие основные подфракции крупных (ЛНП1) и средних (ЛНП2) частиц и минорные подфракции более плотных мелких частиц (наиболее часто встречаются частицы ЛНПЗ, реже еще более мелкие и плотные (ЛНП4-7) [Carmena, 2004].
Проведенный анализ субфракционного спектра липопротеинов низких плотностей при выраженных поражениях коронарных артерий в зависимости от уровня триглицеридов (ТГ) плазмы крови позволил обнаружить ассоциирующиеся с гипертриглицеридемией сдвиги в сторону снижения доли крупных ЛНП1 и накопления высокоатерогенных мелких плотных частиц ЛНП3-7 [Озерова ИН и др., 2013]. Этот способ принят нами за прототип заявленного способа.
Вместе с тем, данный способ не позволяет выявить критериальные значения, свидетельствующие о критическом накоплении субфракций мелких плотных частиц ЛНП и не позволяет диагностировать наличие коронарного атеросклероза, в том числе, и на более ранних, доклинических стадиях.
Техническим результатом заявленного способа является возможность неинвазивного выявления поражения коронарных артерий путем проведения биохимического анализа крови и расчета коэффициента, отражающего соотношение между относительным содержанием (в %) атерогенных субфракций липопротеинов, включая ЛОНП, средние ЛНП2 и мелкие плотные частицы ЛНП3+ЛНП4+ЛНП5+ЛНП6+ЛНП7 (ЛНП3-7), и крупных физиологически активных частиц ЛНП1, причем даже при нормальном уровне липидов крови. Технический результат заявляемого способа достигается путем проведения биохимического анализа крови с определением уровня липидов и анализом субфракционного спектра липопротеинов низких плотностей с последующим вычислением коэффициента К по формуле
где ЛОНП - относительное содержание липопротеинов очень низкой плотности, %
ЛНП1 - относительное содержание подфракции крупных физиологически активных частиц липопротеинов низкой плотности, %
ЛНП2 - относительное содержание подфракции средних частиц липопротеинов низкой плотности, %
ЛНП3-7 - относительное содержание подфракций мелких плотных частиц липопротеинов низкой плотности, %
При величине К>1,7 диагностируют наличие коронарного атеросклероза.
Предлагаемый метод неинвазивен, достаточно прост и относительно дешев.
Изобретение осуществляется следующим образом.
1. Проводят сбор анамнеза пациента, выявляют факторы риска коронарного атеросклероза.
2. Проводят биохимический анализ крови с определением липидного профиля: уровень общего ХС, ХС ЛНП, ХС липопротеинов высокой плотности (ЛВП), триглицеридов (ТГ). Для анализа субфракционного спектра аполипопротеин В-содержащих липопротеинов используют Липопринт ЛНП систему (Quantimetrix, США). Комплекс Липопринт ЛНП система включает камеру для проведения электрофореза, источник питания (120/220 V), сканер, цветной принтер, компьютер (встроенная программа Lipoware Analysis Program), специальный штатив для трубочек с гелем и лампу для фотополимеризации, наборы реагентов. В каждый набор входят готовые стеклянные трубочки с 3% полиакриламидным гелем, загрузочный гель с красителем, флаконы с реагентами для приготовления буфера, контрольный образец. Для определения субфракционного спектра липопротеинов используют сыворотку крови или плазму, которые можно хранить 5-7 дней при +2-8°С, либо замороженные образцы, хранящиеся при -70°С. При проведении эксперимента, согласно инструкции, на поверхность готовой трубочки с 3% полиакриламидным гелем наслаивают 25 мкл сыворотки (плазмы) крови, затем вносят 200 мкл жидкого загрузочного геля, содержащего липидный краситель Судан черный, трубочку несколько раз переворачивают для создания однородной смеси на поверхности геля. После фотополимеризации (30 минут при комнатной температуре) проводят электрофорез в течение 1 часа, после чего трубочки с гелем сканируют. Анализ результатов проводят с помощью компьютерной программы. Для каждой липопротеиновой субфракции определяют соответствующую ей площадь под кривой и на основании концентрации ХС в исследуемом образце крови рассчитывают относительное содержание каждой субфракции липопротеинов низких плотностей (%), а именно ЛОНП, крупных частиц ЛНП1, средних ЛНП2 и мелких плотных частиц ЛНП3-7.
3. По оригинальной математической формуле вычисляют коэффициент К, отражающий соотношение между атерогенными субфракциями липопротеинов, включая ЛОНП, средние ЛНП2 и мелкие плотные частицы ЛНП3+ЛНП4+ЛНП5+ЛНП6+ЛНП7 (ЛНП3-7), и крупными физиологически активными частицами ЛНП1
При величине К>1,7 показатель свидетельствует о повышенной атерогенности апо В-содержащих липопротеинов низких плотностей и указывает на наличие атеросклеротического поражения коронарных артерий (вероятность поражения коронарных артерий увеличивается в 2,18 раза по сравнению с лицами, имеющими К≤1,7; отношение шансов=2,18; 95% доверительный интервал 1,2-3,8, р=0,006).
Коэффициент К, вычисленный как отношение [(ЛОНП+ЛНП2+ЛНП3-7)/ЛНП1]>1,7 в определении наличия коронарного атеросклероза, обладает специфичностью 65,5%, чувствительностью 55,1% (двусторонний критерий Фишера 0,007).
Способ апробирован на выборке из 310 человек: М/Ж 203/107, средний возраст 62,5±9,3 лет.
Для верификации заявленного способа использовали КАГ с определением наличия поражения коронарных артерий по шкале Gensini (GS) [Gensini G. 1983]. Отсутствие коронарного атеросклероза соответствует GS=0. Наличием коронарного атеросклероза считали GS>0 или поражение коронарных артерий более 20%.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
1. Пациент Г, 68 лет. По данным обследования: уровень общего ХС 4,8 ммоль/л, ХС ЛОНП 0,6 ммоль/л, ХС ЛНП 3,3 ммоль/л, ХС липопротеинов высокой плотности (ЛВП) 0,9 ммоль/л, триглицеридов (ТГ) 1,3 ммоль/л.
Согласно способу-прототипу в спектре липопротеинов выявлены мелкие плотные частицы ЛНП3-7 - 3,5%. Пациент направлен на коронароангиографию, по данным обследования: GS=27.
2. Пациентка Б., 66 лет. По данным обследования: уровень общего ХС 4,5 ммоль/л, ХС ЛОНП 0,6 ммоль/л, ХС ЛНП 3,0 ммоль/л, ХС ЛВП 0,8 ммоль/л, ТГ 1,4 ммоль/л.
Согласно способу-прототипу в спектре липопротеинов выявлены мелкие плотные частицы ЛНП3-7 - 1,3%. Пациентка направлена на коронароангиографию, по данным обследования: GS=0.
3. Пациентка О., 61 года. По данным обследования: уровень общего ХС 5,7 ммоль/л, ХС ЛОНП 0,7 ммоль/л, ХС ЛНП 4,0 ммоль/л, ХС ЛВП 1,1 ммоль/л, ТГ 1,5 ммоль/л.
Согласно способу-прототипу в спектре липопротеинов выявлены мелкие плотные частицы ЛНП3-7 - 0,5%. Пациент направлен на коронароангиографию, по данным обследования: GS=0.
4. Пациент О., 51 года. По данным обследования: уровень общего ХС 3,4 ммоль/л, ХС ЛОНП 1,5 ммоль/л, ХС ЛНП 1,0 ммоль/л, ХС ЛВП 0,9 ммоль/л, ТГ 3,3 ммоль/л.
Согласно способу-прототипу в спектре липопротеинов мелкие плотные частицы ЛНП3-7 не выявлены - 0,0%. Пациент направлен на коронароангиографию, по данным обследования: GS=68.
Предлагаемый способ позволяет выявить наличие коронарного атеросклероза даже при нормальном уровне липидов крови, позволяет в отличие от способа-прототипа исключить ложно-положительные (пример 2) и ложно-отрицательные (пример 4) результаты и дает основание назначить дополнительное обследование и рациональную терапию до развития явных клинических проявлений коронарной болезни сердца.
Литература
1. Национальные рекомендации по диагностике и лечению стабильной стенокардии. Кардиоваскулярная терапия и профилактика 2008; 7(6): Приложение 4.
2. Dallmeier D, Koenig W. Strategies for vascular disease prevention: the role of lipids and related markers including apolipoproteins, low-density lipoproteins (LDL)-particle size, high sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) and lipoprotein(a) (Lp(a)). Best Pract Res Clin Endicrinol Metab 2014; 28(3):281-94.
3. Carmena R, Duriez P, Fruchart JC Atherogenic lipoprotein particles in atherosclerosis Circulation 2004: 109: 2-7.
4. Koba S, Yokota Y, Hirano T, Ito Y, Ban Y, Tsunoda F, Sato T, Shoji M, Suzuki H, Geshi E, Kobayasanulshi Y, Katagirl T. Small LDL-cholesterol is superior to LDL-cholesterol for determining severe coronary atherosclerosis. J Atheroscler Thromb, 2008;15(5):250-6.
5. Gensini G. A more meaningful scoring system for determining the severity of coronary artery disease. Am J Cardiol, 1983; 51: 606.
6. Субфракционный спектр липопротеинов низких плотностей при разной степени стенозов коронарных артерий Озерова И.Н., Перова Н.В., Метельская В.А., Чернушевич О.И., Гаврилова Н.Е. Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2013; 12 (4): 16-20.
7. Banuls С, Bellod L, Jover A, Martinez-Triguero ML, Victor VM, Rocha M, Hernandez-Mijares A. Comparability two different polyacrylamide gel electrophoresis methods for the classification of LDL pattern type. Clin Chim Acta, 2012; 413(1-2):251-7.
8. Hoefner DM, Hodel SD, O′Brein JF, Braun EL, Sun D, Meissner I, McConnell JP. Development of a rapid, quantitative method for LDL subfractionation with use of the Quantimetrix Lipoprint LDL System. Clin Chem, 2001; 47(2): 266-74.