Способ профилактики нарушений микроциркуляции в почках асиалированным эритропоэтином в эксперименте
METHOD FOR PREVENTING MICROCIRCULATION DISORDERS IN KIDNEYS WITH ASIALISED ERYTHROPOIETIN IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной фармакологии и урологии.
В течение последних 25 лет частота возникновения острого почечного повреждения возросла в 20 раз и составляет в среднем 13-20% всех госпитализаций [Заморский И.И. Щудрова Т.С. Линькова Н.С.  и др. Нефропротективное действие пептида EDL при остром повреждении почек различного генеза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2017. – №3. – С. 376-381]. Ухудшении почечной перфузии и микроциркуляции признано ключевым фактором в инициировании и развитии острого почечного повреждения [The role of the microcirculation in acute kidney injury. / Le Dorze M, Legrand M, Payen D, Ince C. // Curr Opin Crit Care. 2009. 15(6). P. 503-8. doi: 10.1097/MCC.0b013e328332f6cf; Munshi R, Hsu C, Himmelfarb J. Advances in understanding ischemic acute kidney injury. // BMC Medicine. 2011. 9:11. doi:10.1186/1741-7015-9-11.] Комплексное взаимодействие между микрососудистыми изменениями и воспалительным ответом, повреждением почек и дисфункцией эндотелия сформировало концепцию о профилактике микроциркуляторных нарушений в качестве эффективной стратегии в предотвращении и/или лечении острого почечного повреждения.
Известен способ профилактики ишемически-реперфузионной травмы почек в эксперименте (Okada T, Sawada T, Kubota K. Asialoerythropoietin has strong renoprotective effects against ischemia-reperfusion injury in a murine model. // Transplantation. 2007 Aug 27;84(4):504-10.), включающий моделирование патологии путем удаления левой почки и наложения атравматичного зажима на правую почечную ножку лабораторных мышей-самок на 60 минут. Для профилактики ишемически-реперфузионной травмы использовали однократное подкожное введение асиалированного эритропоэтина в дозе 500 МЕ/кг за 30 минут до ишемического стимула. Способ обеспечивает снижение концентрации креатинина и мочевины через 24 часа, уменьшение количества клеток в стадии апоптоза и улучшает выживаемость животных на 7 сутки эксперимента.
Основным недостатком способа является то, что используемая модель позволяет оценить изменения лишь при наличии одной почки, тогда как в условиях клинической практики ишемически-реперфузионные повреждения чаще встречаются у лиц с двумя почками, кроме того, отсутствие мониторинга микроциркуляторных изменений, которые предшествуют развитию канальцевой и клубочковой дисфункции. С другой стороны, использование в качестве лабораторных животных самок, не позволяет исключить усиление протективных свойств эстрогенов.
Другой способ профилактики микроциркуляторных нарушений в почках в эксперименте (Noha I. Hussien, Hanan T. Emam, The potential protective effects of erythropoietin and estrogen on renal ischemia reperfusion injury in ovariectomized rats. // Alexandria Journal of Medicine. 2016. Vol. 52, Is. 4. P. 325-335) включает моделирование патологии путем предварительной овариоэктомии с последующим наложением атравматичных зажимов на обе почечные ножки лабораторных крыс-самок на 50 минут. Для профилактики микроциркуляторных нарушений использовали однократное внутрибрюшинное введение эритропоэтина в дозе 5000 МЕ/кг за 20 минут до ишемического стимула. Способ обеспечивает снижение концентрации креатинина и мочевины через 2 часа реперфузии, увеличение показателей микроциркуляции, нормализацию количества оксида азота, эндотелина-1 и провоспалительных маркеров в ткани почек, улучшение морфологической картины.
Основным недостатком способа является то, что используемая модель является трудновоспроизводимой (включает два последовательных этапа), а используемая доза эритропоэтина является эритропоэтической, что может осложнить течение послеоперационного течения у пациентов (повышенный риск тромбозов, нарушений функции сердечно-сосудистой системы). С другой стороны, измерение показателей гемодинамики в крупной почечной артерии может не соответствовать уровню микроциркуляции в самой почке. Кроме того, отсутствует наблюдение за животными в динамике и срок реперфузии является недостаточным, так как через 2 часа имеются лишь начальные изменения почечной ткани.
Наиболее близким к заявленному является способ профилактики микроциркуляторных нарушений после ишемии-реперфузии в почках в условиях эксперимента (Rho kinase regulates renal blood flow by modulating eNOS activity in ischemia-reperfusion of the rat kidney / Amanda M. G. Versteilen, Iolente J. M. Korstjens, René J. P. Musters, A. B. Johan Groeneveld, and Pieter Sipkema // American Journal of Physiology-Renal Physiology 2006 291:3, F606-F611), включающий воспроизведение модели патологии и введение лабораторному животному ингибитора Rho-киназы Y27632 в дозе 1 мг/кг однократно до моделирования ишемии, продолжительность ишемического стимула составляет 60 минут, Y27632 вводят внутривенно за 60 минут до моделирования патологии и выраженность микроциркуляторных нарушений производят однократно через 1 час реперфузии.
Основным недостатком способа является то, что оценка микроциркуляторных изменений производится с использованием флуоресцентных микросфер, что является технически сложной методикой, не позволяет оценить состояние микроциркуляции в ткани почки, в том числе в динамике. С другой стороны, оценка изменений через 1 час реперфузии не может служить достоверным показателем эффективности вмешательства, так как максимум патологических изменений в почках при ишемии-реперфузии приходится на 1 и 3 сутки реперфузии. Кроме того, ингибирование Rho-киназы и блокада кальциевых каналов указанным препаратом может привести к системной гипотензии, которая негативно сказывается на течении и исходах острого почечного повреждения.
Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного способа профилактики нарушений микроциркуляции в почках с использованием асиалированного эритропоэтина в эксперименте.
Поставленная задача решается с помощью предложенного способа профилактики нарушений микроциркуляции в почках с использованием асиалированного эритропоэтина в эксперименте, включающего профилактику лекарственным средством путем однократного введения его раствора крысам-самцам линии Wistar с последующим моделированием патологии путем наложения атравматичных зажимов на почечные ножки с последующей реперфузией кровотока в почках, причем продолжительность ишемического стимула составляет 40 минут, в качестве лекарственного средства используют асиалированный эритропоэтин, вводимый в дозе 2,4 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 минут до моделирования патологии, а оценку микроциркуляции проводят через 24 и 72 часа реперфузии.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является эффективный способ профилактики микроциркуляторных нарушений в почках с использованием асиалированного эритропоэтина в эксперименте, подтверждаемый результатами измерения уровня микроциркуляции в почках методом лазерной допплеровской флоуметрии. Основным преимуществом предлагаемого способа является то, что введение асиалированного эритропоэтина в дозе 2,4 мкг/кг однократно за 30 минут до индукции ишемии приводит к выраженной профилактике нарушений микроциркуляции в почках в эксперименте.
Эритропоэтин и его производные относят к стимуляторам эритропоэза и цитопротекторным средствам. Асиалированный эритропоэтин является лишенной сиаловых кислот формой эритропоэтина, которая не имеет гематопоэтических свойств, но сохраняет цитопротекторные свойства [Mennini T, De Paolo M, Bigini P, et al. Nonhematopoietic erythropoietin derivatives prevent motoneuron degeneration in vitro and in vivo. Mol Med 2006; 12: 153; Wang X, Zhu C, Wang X, et al. The nonerythropoietic asialoerythropoietin protects against neonatal hypoxia-ischemia as potently as erythropoietin. J Neurochem 2004; 91: 900.].
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ
Эксперименты проведены на 80 крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г. Для исследования взяты крысы без внешних признаков заболевания, прошедшие карантинный режим.
Выбор крыс-самцов в эксперименте связан с наличием циклических гормональных изменений у самок и ренопротективных эффектов у эстрогенов, что может повлиять на чистоту эксперимента.
Каждая группа включала 10 крыс. Первая группа – группа ложнооперированных животных (24 часа реперфузии), вторая группа – группа ложнооперированных животных (72 часа реперфузии); третья группа – с моделированием ишемически-реперфузионных повреждений почек (контроль, 24 часа), четвертая группа – с моделированием ишемически-реперфузионных повреждений почек (контроль, 72 часа), пятая группа – с коррекцией патологии асиалированным эритропоэтином (24 часа реперфузии), шестая группа – с коррекцией патологии асиалированным эритропоэтином (72 часа реперфузии), седьмая группа – с коррекцией патологии эритропоэтином (препарат сравнения, 24 часа реперфузии), восьмая группа – с коррекцией патологии эритропоэтином (препарат сравнения, 72 часа реперфузии).
Моделирование ишемически-реперфузионного повреждения почек производили следующим образом: под общей анестезией (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) производили срединную лапаротомию, выделяли почечные ножки и последовательно накладывали атравматичные сосудистые зажимы на обе ножки с ишемическим периодом 40 минут под контролем микроциркуляции. Далее производили снятие зажимов, промывали брюшную полость 0,9% раствором натрия хлорида и послойно ушивали рану.
Асиалированный эритропоэтин (ООО «Протеиновый Контур») вводили в дозе 2,4 мкг/кг однократно внутрибрюшинно за 30 мин до наложения сосудистых зажимов. Эритропоэтин вводили в дозе 50 МЕ/кг однократно внутрибрюшинно за 30 мин до наложения сосудистых зажимов.
О выраженности протективного эффекта судили по результатам измерения уровня микроциркуляции, определяемого с помощью аппаратно-программного комплекса MP100 (Biopac System, Inc., США) с модулем лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) LDF100C и поверхностного датчика TSD143, который накладывался на среднюю часть почки, не затрагивая область ворот. Уровень микроциркуляции измеряли через 24 или 72 часа реперфузии в зависимости от экспериментальной группы. Регистрация и обработка результатов производилась с помощью программного обеспечения AcqKnowledge версии 3.8.1. Значения показателей выражались в перфузионных единицах (ПЕ).
Достоверность изменений абсолютных параметров определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов, средней арифметической и вероятности возможной ошибки (р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные при p<0,05. Для расчётов использовали программу статистического анализа Microsoft Excel.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ
В группе ложнооперированных животных уровень микроциркуляции составлял 870±96,48 ПЕ и 859±67,98 ПЕ через 24 часа и 72 часа после начала эксперимента соответственно. Моделирование острого почечного повреждения приводило к статистически значимому снижению уровня микроциркуляции до 418,1±46,02 ПЕ и 315,5±13,67 ПЕ через 24 и 72 часа реперфузии соответственно.
Профилактическое применение асиалированного эритропоэтина приводило к росту показателей микроциркуляции до 725,6±47,41 ПЕ и 689,3±46,52 ПЕ через 24 и 72 часа реперфузии соответственно, что достоверно превосходило показатели групп с моделированием ишемии-реперфузии и групп с профилактическим введением эритропоэтина (662,9±22,71ПЕ и 490,5±21,81 ПЕ соответственно). Динамика показателей  микроциркуляции представлена в таблице 1.
Таблица 1
Динамика показателей микроциркуляции в экспериментальных группах (ПЕ, M±m, n=10)
x
y
Примечание:  – р<0,05 в сравнении с группой ложнооперированных животных;  – р<0,05 в сравнении с группой ишемии-реперфузии.
Таким образом, в предлагаемом способе внутрибрюшинное введение асиалированного эритропоэтина в дозе 2,4 мкг/кг однократно за 30 минут до индукции ишемии приводит к более выраженной профилактике ишемически-реперфузионных повреждений почек, чем введение эритропоэтина в дозе 50 МЕ/кг, что подтверждается результатами измерения уровня микроциркуляции в почках методом лазерной допплеровской флоуметрии через 24 и 72 часа реперфузионного периода.