Избирательность влияния дизоцилпина на пространственное обучение у низко- и высокотревожных мышей

УДК 612.821.6 : 615.78

Р.А. Томиленко, Н.И. Дубровина

ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ ВЛИЯНИЯ ДИЗОЦИЛПИНА НА ПРОСТРАНСТВЕННОЕ ОБУЧЕНИЕ У НИЗКО- И ВЫСОКОТРЕВОЖНЫХ МЫШЕЙ

ГУ НИИ физиологии СО РАМН, Новосибирск

Изучали зависимость выработки пространственного навыка от уровня исходной тревожности мышей и влияние блокады М-метил-О-аспартатных (NMDA) рецепторов. По времени нахождения на открытых рукавах и центре приподнятого крестообразного лабиринта мыши были классифицированы как высоко- и низкотревожные. Низкотревожные мыши оказались не способными к обучению навигационному рефлексу в отличие от высокотревожных, у которых пространственная память сохранялась 2 суток. Антагонист NMDA рецепторов дизо-цилпин в дозе 0,15 мг/кг улучшал формирование пространственного навыка у низкотревожных мышей и ухудшал у высокотревожных.

Ключевые слова: пространственная память, тревожность, NMDA рецепторы, мыши

Для приспособления организма к окружающей среде важной является способность ориентироваться в пространстве, в значительной степени зависимая от адекватных соотношений пространственной памяти и тревожности. Тревожность как эмоциональное предчувствие опасности может быть защитной реакцией или причиной стрессо-бусловленных нарушений психоэмоционального состояния. При анализе пространственной памяти мышей наиболее часто используемым когнитивным тестом является водный лабиринт [2, 5, 7, 11]. Пространственное обучение в водном лабиринте — это ассоциативный процесс, заключающийся в приобретении связей между маркерами обстановки и местом локализации платформы [12]. Выработка пространственного навыка сочетает формирование активной реакции избавления от водной среды и умение ориентироваться в пространстве и позволяет раздельно исследовать процессы обучения и памяти.

Многочисленными экспериментами показана значимая роль возраста, особенностей поведения мышей различных линий в пространственной памяти [5, 6, 7, 11]. Исследования зависимости пространственной памяти от уровня тревожности фрагментарны и противоречивы. В частности, у мышей линии SAMP8 (модель болезни Альцгеймера) с повышенной тревожностью плохо вырабатывался навык нахождения спасательной платформы [6]. В то же время есть данные, полученные в экспериментах на мышах разных линий, что лишь у низкотревожных особей нарушено обучение пространственному навыку в водном лабиринте [5, 18]. Достаточно доказательств с ис-

пользованием разных экспериментальных подходов (мыши с генетическим нокаутом, многократные болевые воздействия в детстве, социальная изоляция) независимости когнитивной способности к пространственному обучению от уровня тревожности [8, 13]. Важной характеристикой памяти является сохранность ее воспроизведения в течение времени, и для ее оценки широко используется подход с угашением выработанного навыка. Нами в модели условной реакции пассивного избегания показана избирательность угаше-ния у мышей с разным уровнем тревожности [1]. Угашению пространственной памяти посвящено лишь несколько исследований [9, 12], а о связи его с индивидуальными особенностями поведения работ нет.

В регуляции тревожности и пространственной памяти важная роль отводится глютаматовым рецепторам М-метил-О-аспартатного (NMDA) типа. Существуют экспериментальные свидетельства выраженной анксиолитической активности [17, 18] и дефицита пространственной памяти [4, 7, 16] при блокаде NMDA рецепторов.

Однако остается невыясненным существенный вопрос — избирательны ли эффекты блокады NMDA рецепторов у мышей с разным уровнем тревожности на процессы обучения и угашения пространственной памяти, что и стало целью данной работы.

Методика

Эксперименты проводили на 47 мышах — самцах линии C57BL/6J в возрасте 3-3,5 мес., массой 22-27 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к пище и

воде. Опыты проводили с соблюдением принципов гуманности в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755), одобренных комитетом по биомедицинской этике ГУ НИИ физиологии СО РАМН.

Уровень тревожности определялся в тесте приподнятого крестообразного лабиринта, состоящего из двух закрытых и двух открытых рукавов. Мышь помещали в центр лабиринта носом к закрытому рукаву. Анализировали следующие показатели: время нахождения на открытых рукавах и в центре, число выходов на открытые рукава и свешиваний с них, количество выглядываний из закрытых рукавов, переходов из одного закрытого рукава в другой, вертикальных стоек и уровень дефекации в течение 5 мин теста.

Для анализа пространственной памяти использовали прямоугольный бассейн длиной 60 см, шириной 30 см и высотой 45 см, заполненный водой до 22 см [2]. Площадь бассейна условно делилась на три равных сектора. Спасательная платформа была диаметром 5 см. Температура воды в бассейне составляла 21-23 °С. Использовали пространственную версию, когда от мыши требовалось локализовать скрытую платформу в бассейне, вода которого забелялась молоком. Во время эксперимента каждая мышь видела стимулы окружающей обстановки, которые служили маркерами для пространственного ориентирования в бассейне при нахождении скрытой платформы. Экспериментатор также был в поле зрения мыши,

находясь в одной и той же позиции в течение пробы. Обучение включало 8 одноминутных сеансов по 4 в день с интервалом между сеансами 30-40 мин и затем следовало угашение из 4 ежедневных тестов без платформы. Анализировали латентный период нахождения платформы и время «пассивного дрейфа».

Оценивали влияние блокады NMDA рецепторов на обучение и угашение пространственного навыка у высоко- и низкотревожных мышей. Использовали дизоцилпин (МК-801, «Sigma», США) — блокатор ионных каналов NMDA рецепторов в дозе 0,15 мг/кг. Препарат растворяли в физиологическом растворе и вводили внутри-брюшинно в объеме 0,2 мл на мышь за 1 час до 1-го и 5-го сеансов выработки навигационного рефлекса. Контрольным мышам вводили физиологический раствор. Были выделены 2 группы низкотревожных (n=9 — контроль и n=15 — с препаратом) и 2 группы высокотревожных (n=11 — контроль и n=12 — с препаратом) мышей.

Результаты обработаны статистически с применением однофакторного и двухфакторного ANOVA с последующими плановыми множественными сравнениями.

Результаты и обсуждение

По результатам тестирования в приподнятом крестообразном лабиринте мыши были разделены на высокотревожных, находившихся на открытых рукавах и центре от 0 до 60 с (n=23) и низкотревожных (n=24) — с временем > 60 с (Рис. 1). Высокотревожные мыши с малым временем пребывания на открытых рукавах и в цен-

14

80

12

10

1

2

3

4

5

6

70

60

50

к

S

а> 40

а

ш

30

20

10

7

8

Рис. 1. Характеристики поведения низкотревожных (светлые столбцы) и высокотревожных (темные столбцы) мышей в приподнятом крестообразном лабиринте

1 — выходы на открытые рукава; 2 — свешивания с открытых рукавов; 3 — вертикальные стойки; 4 — переходы из одного темного рукава в другой; 5 — выглядывания из закрытых рукавов; 6 — уровень дефекации; 7 — время на открытых рукавах; 8 — время в центре. * — р<0,05; ** — р<0,001 достоверность межгрупповых отличий

8

6

*

4

2

0

0

Таблица

Процент мышей с эпизодами «пассивного дрейфа»

Группы Сеансы обучения Тесты

1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4

1 33 65 33 22 22 22 22 22 33 22 44 66

2 18 36 55 73 36 55 55 45 64 73 73 82

3 20 7 13 13 13 13 20 20 13 33 20 40

4 8 8 17 8 23 17 17 8 42 58 42 50

тре характеризовались значимо меньшим числом посещений открытых рукавов, свешиваний с них, выглядываний из закрытых рукавов, но более высоким уровнем дефекаций (р<0,05). Показатели вертикальной (число вертикальных стоек) и горизонтальной (число переходов) активности были сходны у особей обеих групп.

Данные по динамике времени нахождения скрытой платформы и «пассивному дрейфу» контрольными низко- и высокотревожными мышами представлены на рисунке 2. Отчетливо видно, что низкотревожные мыши были не способны к выработке навигационного рефлекса, что отразилось в высоких значениях времени поиска скрытой платформы. При этом 40% таких особей не могли идентифицировать местоположение спасательной платформы в течение всей обучающей процедуры, несмотря на принудительную высадку на нее. В отличие от низкотревожных мышей, у высокотревожных время выполнения задачи

А

сеансы обучения тесты

Рис. 2. Динамика пространственного обучения и угашения низкотревожных (квадраты) и высокотревожных (треугольники) мышей. А — латентный период нахождения скрытой платформы; Б — «пассивный дрейф».

*- р<0,05; ** — р<0,001 достоверность межгрупповых отличий; # — р<0,05; ## — р<0,001 достоверность различий по сравнению с 1-м сеансом; + — р<0,05; ++ — р<0,001 достоверность различий по сравнению с 1-м тестом

существенно снижалось в процессе обучения и, начиная с 5-го сеанса, достоверно отличалось от значения в 1-ом сеансе (Рис. 2А). Выработанный пространственный навык сохранялся 2 суток, затем наступало угашение рефлекса, отразившееся в достоверном росте времени посещения «целевого» отсека (местоположение платформы при обучении). Анализ показателя «пассивного дрейфа» при всей вариативности его динамики показал преобладание его в поведении высокотревожных мышей (Рис. 2Б). Этот факт доказан значимостью факторов группы ^ =7,15, р<0,02), сеансов ^ 198=4,25, р<0,001) и взаимодействия этих факторов ^ =2,22, р<0,02). И еще более отчетли-

во он выражен при анализе процентного соотношения мышей с эпизодами «пассивного дрейфа» (Таблица).

Полученные нами данные о плохой выработке навигационного рефлекса мышами с исходной низкой тревожностью подтверждают таковые, полученные на мышах селективных линий — с повышенной экспрессией 5-НТ1А серотониновых рецепторов [18] и линии С3Н/Не [5]. Такой дефект может быть обусловлен сочетанием использования низкотревожными мышами неэффективной пространственной стратегии поиска спасательной платформы и нарушения реагирования в ситуации водного стресса. Они могли воспринимать ситуацию как неизбегаемую и легко отвлекаться незначимыми для целенаправленного поведения стимулами. Способность же приобретения навыка высокотревожными мышами связана, по-видимому, с их лучшей ориентацией в пространстве, основанной на формировании более четких связей между внешними маркерами и местом положения спасательной платформы. Не исключено также, что у них сильнее мотивация избегания негативной ситуации водного пространства.

При этом не совсем ясно, почему именно у обучающихся высокотревожных мышей мы регистрировали преобладание эпизодов «пассивного дрейфа» во время сеансов обучения, так как этот показатель коррелировал с нарушением пространственной памяти у крыс Крушинского-Молодкиной [3] и крыс с высоким уровнем неподвижности в тесте принудительного плавания [15]. Объяснение этому, вероятно, кроется в ви-

довых особенностях выработки адекватной стратегии поиска мышей и крыс [11] или отмечаемой независимости пространственной памяти от повышенной тревожности и появления эпизодов «пассивного дрейфа» у нокаутных по аденозино-вым А1 рецепторам мышей [8].

При угашении пространственного навыка повторное тестирование без платформы приводило у высокотревожных мышей к закономерному росту латентного периода нахождения «целевого» места, где была локализована платформа при обучении, и «пассивного дрейфа» (Рис. 2А, Б). Угашение поведения избавления в водном лабиринте, обусловленное удалением платформы, по мнению некоторых исследователей [9], заключается в возникновении негативного состояния и включает развитие неподвижности как отражение беспомощности или «поведенческого отчаяния». Однако угашение можно рассматривать и как процесс нового обучения, формирования новых ассоциаций, когда внешние маркеры уже не указывают на местоположение спасательной платформы [12], и тогда «пассивный дрейф» служит защитным механизмом сохранения энергии. Неизменность обоих показателей при выработке и угашении навигационного рефлекса у низкотревожных мышей свидетельствует о дефиците ассоциативных процессов и случайной стратегии поиска выхода из аверсивной ситуации водного бассейна.

На рисунке 3 представлены результаты анализа влияния антагониста NMDA рецепторов

А

сеансы обучения тесты

Рис. 3. Влияние блокады NMDA рецепторов на формирование пространственного навыка низкотревожных мышей.

Сплошная линия — контроль; пунктирная — дизоцилпин в дозе 0,15 мг/кг. Остальные обозначения как на рис. 2

дизоцилпина в дозе 0,15 мг/кг на формирование и угашение пространственной памяти низкотревожных мышей. Под воздействием дизоцилпина низкотревожные мыши к концу периода обучения (8-й сеанс) находили платформу с латентным периодом 20±3 с в отличие от контроля. Влияние препарата на угашение сохранялось при 1-ом и 2-ом тестированиях. Изменений показателя «пассивного дрейфа» при введении дизоцилпина не регистрировалось.

У высокотревожных мышей дизоцилпин тормозил формирование пространственного навыка, что видно по задержке снижения латентного периода нахождения спасательной платформы во время обучения — в контроле достоверные отличия от значений 1-го сеанса выявлены уже при 5-ом сеансе, а у дизоцилпининъецированных — только при 7-ом (Рис. 4А). Более того, дизоцилпин снижал эффективность обучения, как показано общим ANOVA (достоверность факторов группы — F121=8,69, р<0,008 и сеансов — F11231=20,18, р<0,001) и плановыми сравнениями. Угашение навыка у дизоцилпин-инъецированных высокотревожных мышей по характеру было сходно с контрольными особями. Что касается показателя «пассивного дрейфа», то дизоцилпин блокировал появление этих эпизодов при обучении, хотя при угашении навыка они отчетливо регистрировались (Рис. 4Б).

Принципиальным результатом нейрофарма-кологического анализа была обнаруженная из-

А

сеансы обучения тесты

Рис. 4. Влияние блокады NMDA рецепторов на формирование пространственного навыка высокотревожных мышей.

Сплошная линия — контроль; пунктирная — дизоцилпин в дозе 0,15 мг/кг. Остальные обозначения как на рис. 2

бирательность влияний антагониста NMDA рецепторов на обучение пространственному навыку у мышей с разным уровнем тревожности. В мировой литературе отмечалось преимущественно угнетающее пространственную память влияние дизоцилпина [4, 7, 16] и лишь в одной работе регистрировалось улучшение при использовании антагонистов NMDA рецепторов в низких дозах [14]. Однако ни в одном исследовании не акцентировалось внимание на зависимость эффектов от тревожности.

Мы в одинаковых экспериментальных условиях зарегистрировали значимое ухудшение пространственного обучения у высокотревожных и облегчение — у низкотревожных мышей. Некоторые авторы [7] предполагают, что дефицит выработки навигационного рефлекса под действием дизоцилпина обусловлен вызванной препаратом гиперактивностью скорее, чем нарушением пространственного обучения. Действительно, мы обнаружили снижение эпизодов «пассивного дрейфа» при обучении у высокотревожных мышей, однако корреляций с латентным периодом нахождения платформы не было. Этот факт скорее свидетельствует лишь о стимуляции двигательной активности, не связанной с изменениями процесса обучения. Подтверждением независимости пространственного обучения от моторного компонента служит улучшение выработки навигационного рефлекса у дизоцилпининъеци-рованных низкотревожных мышей, который не сопровождается модификациями «пассивного дрейфа».

Избирательность влияния блокады NMDA рецепторов у мышей с исходно разным тревожным поведением может быть следствием дифференцированных изменений ситуативной тревожности при выработке навигационного рефлекса под действием дизоцилпина. При анализе такой возможности приходится констатировать, что это маловероятно, так как у дизоцилпина доминирует анксиолитический эффект [17, 18], а изменения обучения были различны. Известно также дизоцилпинвызванное нарушение внимания к окружающим стимулам и сенсомоторного сопряжения, что послужило основой разработки фармакологической модели шизофрении при блокаде NMDA рецепторов [10]. Однако выявленное в данной работе разнонаправленное влияние этого препарата на пространственное обучение высоко- и низкотревожных особей не позволяет рассматривать такие эффекты, как причину избирательности. Исходя из этого нам представляется, что дифференцированное влияние дизоцилпина у низко- и высокотревожных мышей связано с изменением ассоциативных процессов во время

обучения, то есть непосредственно с формированием следа пространственной памяти.

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать выводы о зависимости формирования навигационного рефлекса от исходного уровня тревожности и избирательности влияния блокады NMDA рецепторов у высоко- и низкотревожных мышей.

SELECTIVITY OF DIZOCILPINE EFFECTS ON SPATIAL MEMORY IN LOW-ANXIOUS AND HIGH-ANXIOUS MICE

R. A. Tomilenko, N. I. Dubrovina

Dependence of spatial memory on a level of mice initial anxiety and influence of blockade of the N-methyl-D-aspartate (NDMA) receptors were investigated. Mice were classified as high- and low-anxious by time spent in the open area of the elevated plus-maze. The low-anxious mice have appeared not to be capable of learning to navigational reflex in difference from high-anxious ones in which spatial memory was evident for 2 days. Antagonist of NMDA receptors dizocilpine in the of dose 0,15 mg/ kg improved spatial learning in low-anxious mice and impaired — in high-anxious mice.

Литература

1. Дубровина Н.И. Особенности угашения условной реакции пассивного избегания мышей с разным уровнем тревожности / Н.И. Дубровина, Р.А. Томиленко // Рос. физиол. журн. — 2005. — Т. 52. — № 9. — С. 10131020.

2. Нарушение пространственной памяти у мышей под влиянием агроклавина / Н.В. Бобкова, Н.И. Медвинская, И.В. Нестерова, М.У. Аринбасаров // Журн. высш. нервн. деят. — 2002. — Т. 52. — № 2. — С. 183-188.

3. Поведение в водном тесте Мориса крыс линии Крушинского-Молодкиной, селектированных на повышенную судорожную готовность / М.Г. Плескачева, З.А. Зорина, Д.Л. Николенко и др. // Журн. высш. нерв. деят. — 2002. — Т. 52. — № 3. — С. 356-365.

4. A behavioral analysis of the spatial learning deficit induced by the NMDA receptor antagonist MK-801 (dizocilpine) in the rat / M. Ahlander, I. Misane, P.A. Schott, S.O. Ogren // Neuropsychopharmacology. — 1999.

— Vol. 21. — № 3. — P. 414-426.

5. Behavioural profiles of inbred mouse strains used as transgenic backgrounds. II: cognitive tests / S.P. Brooks, T. Pask, L. Jones, S.B. Dunnett // Genes Brain Behav.

— 2005. — Vol. 4. — № 5 — P. 307-317.

6. BrandewiedeJ. Ethological analysis of the senescence-accelerated P/8 mouse / J. Brandewiede, M. Schachner, F.Morellini // Behav. Brain Res. — 2005. — Vol. 158. — №

1. — P. 109-121.

7. D’Hooge R. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory / R. D’Hooge, P.P. De Deyn // Brain Res. Brain Res. Rev. — 2001. — Vol. 36.

— № 1. — P. 60-90.

8. Emotional instability but intact spatial cognition in adenosine receptor 1 knock out mice / U.E. Lang, F. Lang, K. Richter et al. // Behav. Brain Res. — 2003. — Vol. 145.

— № 1-2. — P. 179-188.

9. Extinction-induced immobility in the water maze and its neurochemical concomitants in aged and adult rats: a possible model for depression? / D. Schulz, B. Topic, M.A. De Souza Silva, J.P. Huston // Neurobiol. Learn. Mem. — 2004. — Vol. 82. — № 2. — P. 128-141.

10. Farber N.B. The NMDA receptor hypofunction model of psychosis / N.B. Farber //Ann. N.Y. Acad Sci.

— 2003. — Vol. 1003. — P. 119-130.

11. Jonasson Z. Meta-analysis of sex differences in rodent models of learning and memory: a review of behavioral and biological data / Z. Jonasson // Neurosci. Biobehav. Rev. — 2005. — Vol. 28. — № 8. — P. 811-825.

12. Lattal K.M. Extinction, renewal, and spontaneous recovery of a spatial preference in the water maze / K.M Lattal, M.T. Mullen, T. Abel // Behav. Neurosci. — 2003.

— Vol. 117. — № 5. — P. 1017-1028.

13. Long-term individual housing in C57BL/6J and DBA/2 mice: assessment of behavioral consequences / V. Voikar, A. Polus, E. Vasar, H. Rauvala // Genes Brain Be-hav. — 2005. — Vol. 4. — № 4. — P. 240-252.

14. Mondadori C. NMDA — receptor blockers facilitate and impair learning via different mechanisms / C. Mondadori, L. Weiskrantz // Behav. Neural. Biol. — 1993. — Vol. 60. — P. 205-210.

15. Naudon L. Opposite behaviours in the forced swimming test are linked to differences in spatial working memory performance in the rat / L. Naudon, T.M. Jay // Neuroscience. — 2005. — Vol. 130. — № 2. — P. 285-293.

16. Parallel recovery of MK-801-induced spatial learning impairment and neuronal injury in male mice / G. Brosnan-Walters, D.F. Wazniak, A. Nardi, J.W. Olney // Pharmacol. Biochem. Behav. — 1999. — Vol. 62. — P. 111-117.

17. Rorick-Kehn L.M. Pharmacological characterization of stress-induced hyperthermia in DBA/2 mice using metabotropic and ionotropic glutamate receptor ligands / L.M. Rorick-Kehn, J.C. Hart, D.L. McKinzie // Psychopharmacology. — 2005. — Vol. 183. — № 2. — P. 226-240.

18. Transient overexpression of the 5-HT1A receptor impairs water-maze but not hole-board performance / B. Bert, E. Dere, N. Wilhelmi et al. // Neurobiol. Learn. Mem.

— 2005. — Vol. 84. — № 1. — P. 57-68.