СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕХМЕРНЫХ СТРУКТУР, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ, ВЫДЕЛЕНИЯ ИЛИ ПОДСЧЕТА МИКРООРГАНИЗМОВ
METHOD FOR OBTAINING OF THREE-DIMENSIONAL STRUCTURES USED FOR THE DETECTION, ISOLATION OR COUNTING OF MICROORGANISMS

Настоящее изобретение относится к области микробиологии, в частности к детекции и идентификации микроорганизмов в различных средах и образцах.
Известно значительное число обычных культуральных сред и способов детекции и идентификации микроорганизмов, основные недостатки которых заключаются в длительном периоде инкубации образца (в течение по меньшей мере 18-24 часов) наряду с громоздкой манипуляцией, поскольку в ее ходе прибегают к различным средам для выделения, обогащения и идентификации бактерий и дрожжей.
Были предложены некоторые решения для уменьшения времени идентификации, такие как использование сред с хромогенными и флуорогенными субстратами, которые являются точно так же слишком медленными для нужд идентификации на основании доступности.
Использование керамических материалов, включая наноструктурированные материалы, было в основном нацелено на концентрирование микроорганизмов в образцах для их дальнейшей идентификации и для их детекции или идентификации с моноклональными антителами или фрагментами генетических структур, связавшихся с наноструктурами (Integration of hydroxyapatite concentration of bacteria and seminested PCR to enhance detection of Salmonella typhimurium from ground beef and bovine carcass sponge samples. Elaine D. Berry and Gregory R. Siragusa. United States Department of Agriculture Agricultural Research Service 2. Roman L. Hruska U.S. Meat Animal Research CenterClay Center, NE 689330166. Принята к публикации 15 февраля 1999), (Method of manufacturing hydroxyapatite and uses therefore in delivery of nucleic acid. Публикация заявки на патент США US 20080095820).
С другой стороны, взамен использовали силикатные наночастицы для ингибирования роста микроорганизмов. (Composition comprising aluminum silicates and silver nanoparticles as bactericides. Заявка на патент WIPO WO/2011/128488).
В патенте США US 6596505 В2 от 2003 Ceri и др. предложено устройство и способы для проверки эффекта материалов и поверхностей на образование биопленок. Способ включает использование гидроксиапатита и сред для культивирования для образования биопленок и дальнейшее определение характеристик этих микроорганизмов. В способе не рассматривается одноступенчатая идентификация и в его случае необходимы присоединения для образования биопленок, таким образом он неполностью подходит для целей идентификации, поскольку хорошо известно, что метаболические характеристики микроорганизмов и их устойчивость к противомикробным средствам меняются при образовании биопленок.
В изобретении Hatzmann M.J. и др. (WO 2009/067012 А2) заявлен способ детекции микроорганизмов в различных жидких материалах и в нем предусматривается концентрирование микроорганизмов в устройстве вроде фильтра, которое соединено с другими устройствами и фильтр которого формируют гидроксиапатитная структура, среда для культивирования и хромогенные и флуорогенные субстраты. Основными недостатками этого способа является то, что для детекции загрязнения требуется фаза концентрирования образца, что он применим только к жидким образцам, что для него необходимо добавочное оборудование и что ответ в виде идентификации не является ни быстрым, ни точным для многих микроорганизмов, поскольку он основан на детекции глюкуронидазной или галактозидазной активности.
Вкратце, недостатки способов, описанных выше в научной литературе и патентных документах, заключаются в том, что:
- Не все микроорганизмы (такие, как E. coli O157: Н7) присоединяются к наночастицам и не все микроорганизмы, которые присоединяются, можно выделить в пределах приемлемого периода времени для их дальнейшей идентификации.
- Адгезия микроорганизмов зависит от их концентрации в образце; чем ниже концентрация, тем меньше адгезия.
- В большинстве способов необходимо отделение микроорганизмов от структур для их дальнейшей идентификации, для которой требуются дополнительные стадии, такие как центрифугирование, для которого в свою очередь требуется использование дополнительного оборудования и которое подвергает выделенные микроорганизмы внешнему загрязнению или использованию центрифуг в асептических условиях.
- В случае тех изобретений, в которых предусматривается эта дополнительная фаза, требуются среды для культивирования, чтобы выделить микроорганизмы для их дальнейшей идентификации при помощи различных иммуноферментных способов или других молекулярных методов.
- В способах, охраняемых изобретениями, описанными до сих пор здесь, идентификация основывается на механизмах идентификации, которые прибегают к моноклональным антителам, которые являются очень чувствительными к температурам и имеют очень короткий срок эксплуатации или в которых используются методы обнаружения фрагментов ДНК или РНК, для которых требуется дополнительное оборудование, которое может быть недоступным по цене для небольших лабораторий или лабораторий, имеющих ограниченные средства.
- По этой причине ускоренный рост микроорганизмов в низких концентрациях очень трудно идентифицировать и может быть даже недетектируемым, или большие объемы образца должны быть подвергнуты фильтрованию для детекции этих низких концентраций.
- В случае некоторых изобретений, в которых предусматривается контактирование микроорганизмов с нано- или микроструктурами и со средами для культивирования, последние не являются выбранными, в частности, из-за их способности к стимулированию быстрого роста, и микроорганизмы в низких концентрациях не детектируются или их детекция происходит слишком поздно, что касается диагностических нужд.
- Те питательные основы, существующие на международных рынках, которые были выбраны для использования в средах для культивирования, не способны к стимулированию образования ферментов, чтобы увеличить биомассу в пределах сокращенного периода времени, поскольку они не способны сократить латентную фазу роста микроорганизмов.
- На схожих структурах, основанных на нанопористых материалах или сформированных агрегированными наночастицами, широкий ряд микроорганизмов, таких как дрожжи, грибы, грамположительные и грамотрицательные бактерии, микробактерии нанобактерии, не детектируется за один раз.
- В случае большинства запатентованных способов необходимо применение образца в жидком состоянии и, кроме того, необходимо концентрирование с помощью фильтрации и они не включают выделение микроорганизмов, суспендированных в воздухе, других газах или в твердых образцах.
- Некоторые природные глины, такие как цеолит, белая фарфоровая глина/каолит и другие, за счет своего собственного минерального соединения становятся ингибиторами большинства микроорганизмов, по этой причине их не используют для стимулирования роста, а скорее используют для его ингибирования.
- Никакой способ, описанный до сих пор, не гарантирует простое, быстрое выделение, детекцию и подсчет множества микроорганизмов, которые могут встречаться в концентрациях всего лишь 1 КОЕ/объем образца и в пределах сокращенного периода времени.
Цель этого изобретения заключается в выдвижении способа детекции, выделения и подсчета множества микроорганизмов в различных образцах.
Новизна этого изобретения заключается в следующем:
- В способе предусматривается интенсивное и ускоренное развитие и образование клеточных и ферментных структур благодаря комбинации эффектов, никогда не описываемых ранее - ни в научной литературе, ни в патентной документации. Эти эффекты в основном достигаются: а) благодаря использованию питательных веществ, специально полученных при помощи оригинальных способов, которые сокращают скрытую фазу роста и активируют фазу ускорения роста; b) ускорению ферментативных процессов, которые деградируют субстраты-индикаторы, посредством предоставления ионов, которые могут содержать трехмерные структуры глин или керамических материалов; с) механическому эффекту адгезии глиняных или керамических структур, которые включают комбинации или полости различных размеров, которые захватывают, удерживают или вмещают микроорганизмы самых различных размеров, колеблющихся от нанометров до колоний длиной несколько сантиметров, и нитчатые структуры грибов, гиф или спор и/или других стадий, служащих для размножения; d) эффекту увеличения уже увеличенной поверхности контакта, которая обеспечивается нано- и микроструктурами, которые значительно увеличивают скорость ферментативного расщепления маркеров на твердой фазе; е) эффекту загрузок, который могут вносить ионы на поверхности трехмерных структур, включая глиняные структуры, или от ингредиентов питательных веществ, которые могут увеличить адгезию клеток; и в общем в отличие от всех предшествующих решений это изобретение не основано на выделении, детекции и идентификации микроорганизмов только согласно адгезии к структурам (концентрировании).
- Это - первый раз, когда глины или керамические материалы, такие как цеолит, бентонит и каолинит, среди прочего, могут использоваться в природном виде для демонстрации бактерицидной, фунгицидной или бактериостатической активности без необходимости химической модификации для стимулирования роста микроорганизмов, поскольку их ингибиторный эффект, вызванный естественным присутствием на них «токсичных» для микроорганизмов ионов, устраняется благодаря абсорбции или адсорбции питательных смесей, специально разработанных для каждого вида образца и трехмерной структуры. Предшествующие применения этих глин были нацелены на устранение бактерий.
- Нет предшествующих решений комбинирования стимуляции роста на природных или искусственных глинах с субстратами, поскольку в предшествующих решениях, в которых используются хромогенные и флуорогенные субстраты, детекцию или идентификацию выполняют исключительно на основе действия указанных субстратов в присутствии повышенных концентраций клеток наряду с тем, что, с другой стороны, предшествующие решения, использованные для стимуляции роста грибов или бактерий на глинах или керамических материалах, не предназначены для идентификации или подсчета, а вместо этого для увеличения концентрации клеток.
- Это - первый раз, когда в одном и том же способе анализа или в отдельном или составном устройстве используют множество природных или искусственных глин или керамических материалов, при этом каждые из них вносят различные виды ионов, которые работают избирательно в качестве катализаторов ферментативных реакций, специфических для вида, рода или группы микроорганизмов, которые, вместе с питательными веществами и факторами роста, привносимыми питательными формулами, выбраны специально для поддержки короткого периода скрытой фазы и для ускорения роста микроорганизмов и которые неожиданно позволили детектировать, выделить и/или подсчитать множество микроорганизмов по отдельности или внутри одного и того же образца за такой короткий период, как 60-90 минут, который никогда не достигался с помощью хромогенных и флуорогенных способов идентификации микроорганизмов.
- Неожиданно, некоторые микроорганизмы, такие как конкретные виды Pseudomonas, продемонстрировали характеристики, которые обычно не проявляются на определенных средах; например, при использовании обожженной и очищенной кремнистой земли с питательным веществом Pseudomonas проявляла флуоресценцию спустя всего лишь 120 минут, тогда как на оставшихся без изменения средах для культивирования, которые содержат это вещество, флуоресценция появляется только спустя 18 часов.
- Впервые неожиданно обнаружено, что при уменьшении размера полостей, в частности размера пор трехмерных структур тестируемых устройств, и, таким образом, при увеличении поверхности контакта и доступности загрузок на поверхность ускорялась ферментативная реакция расщепления субстратов и бактерии можно было детектировать на по меньшей мере 60 минут раньше, чем в случае схожих структур, содержащих то же питательное вещество и для того же микроорганизма, но с большими размерами полостей.
- В вариантах способа, в которых предусматривается использование трехмерных структур с питательными формулами, специфическими субстратами-индикаторами и противомикробными средствами в различных параллельных комбинациях в качестве части вышеупомянутых устройств было возможным определение их чувствительности к противомикробным средствам наряду с детекцией микроорганизмов одношагово.
- Впервые были объединены ферментативные гидролизаты водорослей Spirulina platensis, Saccharomyces cerevisiae и Torula, экстракт из сладкого картофеля, экстракт из помидоров, полученный с использованием папаина гидролизат ткани бычьего сердца и бычьей крови, ферментативные гидролизаты лактоальбумина из сычужной сыворотки, ферментативные гидролизаты или продукты кислотного гидролиза казеина пахты и гидролизат или автолизат Eudrillus eugeniae с природными или искусственными трехмерными структурами, что неожиданно сократило период скрытой фазы роста микроорганизмов.
- Загрязнения образцов, такие как суспендированные твердые частицы в воде, которые мешают детекции и количественному определению микроорганизмов, можно было исключить на той же фазе детекции способа.
9
- Смогли получить очень универсальный способ, который с одной или множеством объединенных единиц позволяет осуществлять детекцию, рекуперацию и/или подсчет самых разнообразных микроорганизмов в различных типах образцов из газа, жидкости, твердых тел, гелей и зон жизни с уровнями загрязнения, составляющими менее чем 1 КОЕ/единицу образца; вплоть до 10 КОЕ/единицу образца без мешающего действия загрязнения образцов.
Преимущества этого способа заключаются в том, что:
- Все жизнеспособные микроорганизмы можно детектировать, выделить и/или пересчитать за один раз, поскольку принципы способа обеспечивают все условия, необходимые для этой цели.
- Предложенный способ способен детектировать и/или выделить все микроорганизмы независимо от того, присоединены ли они к структуре или нет, в отличие от предшествующих этому изобретению решений, которые не гарантируют, что все микроорганизмы (такие, как Е. coli O157: Н7) будут присоединены к наноструктурам, а также не гарантируют то, что присоединенные микроорганизмы могут быть выделены в пределах приемлемого периода времени для их дальнейшей идентификации.
- Поскольку этот способ не основан только на адгезии жизнеспособных микроорганизмов к структурам устройства, детектируют все микроорганизмы-мишени, присутствующие в образце, даже в низких концентрациях, или исходя из их спор, гиф или других стадий, служащих для размножения, и это достигается в отличие от предшествующих способов, в которых адгезия микроорганизмов зависит от их концентрации в образце (чем ниже концентрации, тем меньше адгезия).
- Способ, предусматриваемый в этом изобретении, позволяет детектировать, выделить и/или пересчитать микроорганизмы независимо от первоначальных характеристик структур, их ионов или их рН в отличие от некоторых из вышеотмеченных патентов, в которых адгезия микроорганизмов к их структурам с целью их концентрирования и последующей идентификации осуществляется благодаря ионной активности на поверхности тех структур, которые взаимодействуют с клетками микроорганизмов, так что, если образец, содержащий микроорганизмы, содержит вещества, которые могут мешать этим ионам или захватывать их, или если их рН оказывает влияние на них, правильные и своевременные детекция, идентификация или количественное определение могут не достигаться.
- В случае предложенного изобретения не требуются какие-либо дополнительные стадии детекции, концентрирования образцов, особые асептические условия или обязательное оборудование, а значит оно само отличается от предшествующих описаний, поскольку в случае большинства из них необходимо отделение микроорганизмов от структур для их дальнейшей идентификации, которая включает дополнительные стадии, такие как центрифугирование, для которого требуется дополнительное оборудование (центрифуги) и которое подвергает выделенные микроорганизмы внешнему загрязнению или использованию центрифуг в асептических условиях.
- Новый способ является простым, дешевым, детекция не занимает много времени и не требует дополнительных технологических методов в отличие от других описанных изобретений, в которых предусматривается одна или более дополнительных фаз, требуется отделение сред для культивирования от структур, чтобы выделить микроорганизмы для их последующей идентификации при помощи различных способов, в том числе иммуноферментных способов или других молекулярных методов идентификации, и это делает их более дорогими и технически сложными.
- Способ, описанный в этой заявке на патент, осуществляют без риска и в различных лабораторных условиях и условиях окружающей среды, и он является очень стабильным, поскольку реагенты, препараты и питательные вещества, как только они внедрены в трехмерные структуры, являются очень стабильными при температуре окружающей среды и влажности в лаборатории, что представляет значимое отличие от способов, ранее упоминаемых в научной и патентной литературе, поскольку, как правило, детекция основывается на механизмах с использованием моноклональных антител, которые являются очень чувствительными к температурам, или для нее используются методы обнаружения фрагментов ДНК или РНК, для которых требуется дополнительное оборудование, которое может быть слишком дорогим для небольших лабораторий или лабораторий, имеющих ограниченные средства.
- Выполнение способа является очень стабильным, а значит оно позволяет выполнять каждую стадию с удлиненными периодами между ними в необходимых случаях, поскольку, как было ранее отмечено, после абсорбции питательных формул трехмерными структурами с нано- и микрополостями и после удаления растворителя устройства являются очень стабильными до изменений температуры и влажности и, следовательно, могут использоваться безопасно на протяжении длительных периодов. Этот эффект обусловлен тем, что твердые вещества питательных формул имеют очень низкую степень влажности, и остаточная влажность подвергается силам адсорбции поверхностей полостей, которые формируют устройство, и, таким образом, является недоступной для биологических или биохимических реакций распада до добавления второго растворителя или образца.
- В этом изобретении описывается способ с очень низким пределом детекции на единицу образца используемых питательных веществ (ниже чем 1 КОЕ), что означает, что можно детектировать и выделить вид микроорганизма в очень низких концентрациях, таким образом способствуя их идентификации и/или подсчету, и в отличие от других описанных процедур уровня техники в нем не требуются большие объемы образцов или высокие концентрации засева.
- С помощью этого способа детектируют за один раз низкие концентрации (ниже чем 1 КОЕ/единицу образца) микроорганизмов различных видов, родов, групп и размеров благодаря контакту с теми питательными веществами и рыночными субстратами, которые специально отобраны для различных трехмерных структур с различными характеристиками; это осуществляется с тем отличием от концепций других авторов, что эти питательные вещества не являются специально выбранными по их способности к быстрой стимуляции роста в случае конкретных свойств структур и характеристик микроорганизмов, подвергаемых детекции, и, соответственно, в низких концентрациях некоторые из них не детектируются или их детекция занимает слишком много времени, что касается диагностических нужд.
- В одной и той же структуре в одно и то же время детектируется широкий ряд микроорганизмов, таких как дрожжи, мицелиальные грибы, грамположительные и грамотрицательные бактерии, микробактерии и нанобактерии; этот эффект не достигался ранее с помощью других процедур.
- Изобретение, описанное в этой заявке, позволяет на фоне одной и той же комбинации структура-питательное вещество-маркеры ферментативной активности детектировать, выделить и/или подсчитать те микроорганизмы, которые суспендированы в газах, например в воздухе, жидкостях или твердых образцах, что круто отличается от традиционных процедур, в которых используются средства, опоры, соединения и различные среды для культивирования в зависимости от типа образца, подвергаемого обработке, как в случае жидких образцов для анализа, при котором используют специальные среды и фильтрационные мембраны, изготовленные из ацетата или нитрата целлюлозы; однако в случае твердых образцов эти мембраны не используют, поскольку формулы этих сред имеют вариации, или даже размер пластины отличается.
- В соответствии с этим изобретением все виды природных глин, керамических материалов и фосфатов кальция могут селективно использоваться без ограничений, поскольку они объединены с питательными веществами и другими компонентами, которые нейтрализуют ингибиторный эффект, который может быть вызван некоторыми из ионов, которые они содержат, такие как цеолит, каолинит или бентонит, лишь упоминая три примера; это является основным отличием при использовании этих глин, предусмотренных в предшествующих решениях, в которых планируется их использование в качестве антибактериальных средств.
- Для целей этого способа (детекции, выделения и/или подсчета), для осуществления способа природные глины, которые первоначально проявляли бактерицидную, фунгицидную или бактериостатическую активности, могут использоваться с обходом без дополнительных затрат на очистку или химическую модификацию для стимуляции роста микроорганизмов благодаря их объединению с другими компонентами, описанными в предыдущем параграфе.
- Способ позволяет ингибировать некоторые нецелевые микроорганизмы или определить чувствительность или устойчивость к противомикробным средствам наряду с детекцией микроорганизмов в пределах очень короткого периода времени в случае любого вида, рода или группы микроорганизма, который присутствует в образце, благодаря объединению различных трехмерных структур с различными питательными веществами, маркерами ферментативной активности с отобранными противомикробными средствами.
- Новый способ является простым, дешевым и его можно легко приготовить в случае его производства.
Ниже приведено подробное описание настоящего изобретения.
8
В качестве предварительной стадии питательные вещества согласно изобретению выбирают из ряда смесей белков, углеводов, витаминов и минеральных веществ, которые подвергаются деградации посредством химических или ферментативных способов. Одну или более из этих питательных смесей, которые стимулируют рост микроорганизмов, готовят в водных растворах или растворах солей с концентрациями, составляющими 0,1-3 г/л, в которые засевают 0,1 мл микроорганизмов, которые предназначены для детекции, выделения или подсчета, в концентрации, составляющей 3×10 КОЕ/мл, и которые инкубируют при желаемой температуре и давлении кислорода, измеряя кинетику роста микроорганизмов при помощи любого известного способа, предпочтительно определяя увеличение оптической плотности в динамике по времени. Выбирают те вещества, которые обеспечивают сокращение скрытой фазы роста, которая не превышает 60-120 минут в случае бактерий и 16 часов в случае дрожжей и мицелиальных грибов.
Некоторыми примерами питательных веществ, упомянутых выше, являются ферментативные гидролизаты водорослей Spirulina platensis, описанные в авторском свидетельстве на изобретение Кубы с №22310; экстракт из Saccharomyces cerevisiae, полученный при помощи ферментативного гидролиза, как описано в авторском свидетельстве на изобретение Кубы с №22221, и ферментативные гидролизаты кормовых дрожжей Torula (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22280), экстракт из сладкого картофеля, описанный в патенте Кубы с №23507; экстракт из помидоров (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22308); ферментативные гидролизаты ткани бычьего сердца (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22442), бычьей крови (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22208) и бычьей печени (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22220); ферментативные гидролизаты лактоальбумина из сычужной сыворотки (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22219), ферментативные гидролизаты или продукты кислотного гидролиза казеина пахты (авторские свидетельства на изобретение Кубы с №№22166 и 22089 соответственно) и гидролизат и автолизат Eudrillus eugeniae (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22381). Выбранные вещества растворяют или суспендируют в первом растворителе в количествах, находящихся в пределах от 1 до 50 г/л.
После выбора питательных веществ можно начинать осуществление способа, предложенного в этой заявке на патент (вторая фаза).
Ко всем из вышеуказанных веществ могут быть также добавлены другие коммерческие ферментативные гидролизаты или экстракты из растений или животных тканей, такие как пептоны и триптоны, или имеющиеся в продаже белковые экстракты из водорослей, микроорганизмов, овощей, ткани высших животных и их комбинации, такие как те, которые получены из говядины, мозгов и картофеля, среди прочего, в количествах, находящихся в пределах от 1 до 10 г/л.
Как только вещество приготовлено, может быть добавлено одно или более хромогенных, флуорогенных или биолюминесцентных соединений - маркеров ферментативной активности, специфических для одного или более видов, родов или групп микроорганизмов в количествах, составляющих от 0,01 до 2 г/л.
Некоторыми примерами этих маркеров для одного или более видов микроорганизмов могут быть: соединения, являющиеся производными фенола, паранитроанилина, индолила, метилумбеллиферила (MUG) для детекции активности галактозидазы, глюкуронидазы, декарбоксилазы, гликозидазы и фосфатазы, которые включают: 2-нитрофенил-β-D-галактопиранозид, 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид, 4-метилумбеллиферил фосфат и 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкозид.
Примером этих маркеров для одного или более видов дрожжей и грибков в целом являются соединения, являющиеся производными метилумбеллиферила (MU) для активности фосфатазы Candida parapsilosis и Candida glabrata, которые включают 4-метилумбеллиферил фосфат (всегда в комбинации с трехмерными наноструктурами гидроксиапатитов или карбонатов из природных апатитов, к которым эти маркеры будут добавлены позднее), и производными метилкумарина для L-пролин-амидазы Candida albicans и Candida prapsilosis, которые включают L-пролин-метилкумарин (всегда в комбинации с трехмерными наноструктурами гидроксиапатитов или карбонатов из природных апатитов или обожженной и очищенной кремнистой землей, к которым эти маркеры будут добавлены позднее).
К смеси питательных веществ и маркеров ферментативной активности могут быть добавлены другие вещества, такие как активаторы или ингибиторы микроорганизмов, относящихся к определенным родам, видам или группам. Некоторые примеры этих веществ включают витамины, минеральные соли, альбумин, антибиотики, красители, краски, соли желчных кислот, бычью желчь, сахара и аминокислоты, такие как лактоза, сорбит, декстроза, триптофан, гистидин, метионин, D-L-фенилаланин, одноосновные фосфаты, двухосновные фосфаты. Также другие вещества, которые увеличивают растворимость маркеров ферментативной активности или проницаемость клеток микроорганизмов, могут быть добавлены в количествах, находящихся в пределах от 0,01 вплоть до 40 г/л.
Если запланировано ингибирование некоторых микроорганизмов или определение чувствительности к противомикробным и противогрибковым средствам или к чистящим или дезинфицирующим растворам или для подтверждения конкретного бактерицидного или бактериостатического эффекта какого-либо вещества или продукта, соли, полимеры, натуральные растительные экстракты, жирные кислоты, сложные эфиры, бактерициды, бактериостатические средства, спирты, вещества с поверхностной активностью или их смеси в количествах, находящихся в пределах от 0,01 до 2 г/л, и/или антибиотики или противогрибковые средства в количествах, находящихся в пределах от 10 до 100 мкг/л, могут быть также добавлены к выбранному питательному веществу.
Выбранное питательное вещество вместе со специфическим маркером ферментативной активности и другими компонентами растворяют или суспендируют в первом растворителе в количествах, находящихся в пределах от 1 до 150 г/л.
Растворителем может быть дистиллированная или деионизированная вода, водные растворы солей (NaCl, фосфатные растворы, среди прочего), спирты и спиртовые растворы (например, 10% (часть/объем) раствор основного красителя - фуксина в этиловом спирте), растворы веществ, которые увеличивают растворимость маркеров ферментативной активности [например, диметилсульфоксид (DMSO)] или проницаемость клеток микроорганизмов.
После образования питательной смеси и ее растворения или суспендирования в первом растворителе вместе со специфическими маркерами ферментативной активности и другими компонентами их можно подвергнуть стерилизации при помощи любого известного способа за исключением тех соединений, которые содержат термолабильные вещества, которые нельзя стерилизовать нагреванием.
После образования питательной смеси и ее растворения или суспендирования в первом растворителе вместе со специфическими маркерами ферментативной активности и другими компонентами их можно привести в контакт с одной или более трехмерными структурами природных или искусственных глин или керамических материалов.
Эти трехмерные структуры могут быть предварительно подвергнуты стерилизации посредством любого известного способа.
Время контакта питательного вещества и других соединений, растворенных или суспендированных в первом растворителе, и трехмерной структуры глины или керамического материала находится, как правило, в пределах от 10 минут в случае нанометрических или субмикрометрических (<1000 нм) размеров вплоть до 60 минут в случае больших структур.
3
8
2
3
Эти структуры должны иметь удельную поверхность, равную 2×10-6×10 м/м, и сформированы множеством нано-, микро- и макрополостей или их комбинациями.
Эти глины и/или природные или искусственные керамические материалы выбирают из каолинита, галлоизита, диккита, накрита, хризолита, антигорита, лизардита, вермикулита, слюды, гекторита, сапонита, гидроталцита, мусковита, хлорита, диатомовой земли, бентонитов (монтмориллонита, сауконита, бейделлита, нонтронита), клиноптилотитов, гидроксиапатитов, цеолитов и фосфатов кальция или их комбинаций.
3
2
2
4
2
2
4
2
6
20
7
5
16
2
2
2
7
2
2
7
2
4
4
2
2
4
2
3
4
2
8
2
4
6
2
10
4
4
6
2
10
4
6
2
40
4
2
10
4
6
2
5
4
3
3
Кальций-фосфатные структуры, упомянутые в вышеприведенном параграфе, должны выбираться между метафосфатом [Са(РО)], моногидратом дигидрофостата кальция [Са(HPO)НО], тетракальцием дигидрогенфосфатом (CaHPO), гептакальцием фосфатом [Са(РО)], пирофосфатом кальция (CaPO и CaPO2HO), дикальцием фосфатом [CaHPO, CaHPO⋅2HO и Са(HPO)], трикальцием фосфатом [Са(PO)], октакальцием фосфатом [СаН(PO)⋅5HO], лишенным кальция гидроксиапатитом [Ca-x(HPO)х(PO)-х(ОН)-х], гидроксиапатитом [Са(PO)(ОН)], тетракальцием фосфатом [Са(PO)], апатитом [Са(PO)(ОН,F,Cl,Br)], карбонатапатитом [Са(PO,CO)(ОН,F)] или их смесью.
Глины и/или природные или искусственные керамические материалы и фосфаты кальция могут иметь изоморфные замещения ионов катионами или быть предварительно функционализированы с помощью различных ионов, предпочтительно одновалентных, двухвалентных, трехвалентных или четырехвалентных, действующих в качестве катализаторов ферментов, таких как Na, K, Са, Mg, Р, Fe и Zn, образующих поверхностные слои или распределенных по всей их структуре.
Трехмерные структуры, упомянутые выше, выбирают из числа тех, размеры полостей которых соответствуют:
- нанополостям или частицам, предпочтительно со сморщенной поверхностью, с диаметрами или просветами вплоть до 200 нм для нано- и микробактерий;
- нано- и субмикрополостям с диаметрами или просветами от 5 нм до 1000 нм для бактерий с различными размерами;
- микрополостям с диаметрами или просветами от 1 мкм до 1000 мкм для дрожжевых бактерий и клеток;
- микро- и макрополостям с диаметрами или просветами, составляющими более чем 1 мкм и вплоть до 2 мм, для бактерий, дрожжей и мицелиальных грибов;
- комбинациям всех диаметров полостей и просветов от нано- вплоть до макро = 2 мм для ассортимента микроорганизмов.
Полости в структуре могут иметь вид пор, каналов, трубок, регулярных или нерегулярных мешков различных геометрических форм или их комбинаций или, если возможно, слоев или листов.
Трехмерные структуры могут формировать слой или пленку толщиной до 3 мм, в особенности при использовании для детекции, идентификации или подсчета микроорганизмов, используя метод мембранной фильтрации, или для детекции поверхностных микроорганизмов; или столб высотой вплоть до 10 см, в особенности, когда требуется подвергнуть фильтрации большие количества жидких суспензий микроорганизмов, которые могут встречаться в низких концентрациях, или когда различные зоны структур используются с различными маркерами ферментативной активности или с различными питательными смесями.
Могут также использоваться структуры в виде сфер или гранул диаметром до 10 мм; шестигранников или кубов, образующих набор тестовых сценариев с различными соединениями, или их можно добавить к образцу жидкости или суспензии, содержащему микроорганизмы.
Другим структурам придана форма цилиндров или трубок с очень маленьким диаметром (5 нм) для небольших аликвот, которые соединяют многие из этих трубок с образованием набора диаметром вплоть до 10 см, сходного с диметром чашки Петри, для тех тестов, в случае которых предусмотрен пересчет стандартов, для которых необходима такая поверхность.
Высота этих структур варьирует в зависимости от формы представления, используемой в способе, находясь в пределах от 5 нм для наноаликвот или микроаликвот, или в случае соединения многих из этих структур в подобный сэндвичу набор слоев, который может достигать высоты вплоть до 10 см.
Трехмерные структуры могут иметь вид волокон или сетей, которые удерживают микроорганизмы, делая возможным их детекцию.
Всякий раз, когда желательно, чтобы структуры детектировали и идентифицировали микроорганизмы во всем объеме образца, используют глины, которые способны к значительному разбуханию по своей природе или при добавлении желирующих веществ, которые заставляют их принимать форму емкости, вмещающей их.
Трехмерные структуры в соответствии с этим изобретением могут демонстрировать множество зон с различными пористостями, диаметрами или просветами нано-, микро- и макрополостей по всему их объему, длине или диаметру при распределении этих зон в виде градиента или в виде дифференцированных зон. Различные питательные вещества и маркеры ферментативной активности могут быть добавлены в каждую зону, по всей их структуре, длине или диаметру, таким образом распределяя по концентрическим зонам. Распределение соединений или сосредоточение одного или более из их компонентов можно обеспечить при помощи непрерывных или ступенчатых градиентов.
К этим структурам можно добавить вещества, которые вносят вклад в закрепление питательного вещества и выбранных маркеров ферментативной активности и других соединений в тех случаях, когда полагают, что жидкость образца может перетащить указанное питательное вещество. Некоторые из этих веществ могут включать альгинаты, такие как альгинат натрия; природные полисахариды, такие как пектин и хинин; аравийскую камедь и другие камеди; крахмалы, такие как кукурузный крахмал или крахмал сладкого картофеля, или пептизированные крахмалы; декстран и карбоксиметилцеллюлозу и другие полимерные производные; каррагенин или каррегенат натрия; агар, агарозу и искусственные полимерные производные; производные винилового спирта, а также полибутилен, полипропилен и поливинилпирролидон с различными молекулярными массами в количествах, находящихся в пределах от 0,01 до 0,5 г/г трехмерной структуры.
2
В том случае, когда удельная поверхность трехмерной структуры составляет менее 500 м/г, можно добавить вещества, которые увеличивают ее адсорбционную способность, такие как активированный уголь и целлюлоза, в количествах, находящихся в пределах от 2 до 4 мг/г, например, в виде слоев.
После завершения абсорбции первый растворитель удаляют. Наиболее рекомендуемой процедурой является процедура, осуществляемая при температуре окружающей среды и атмосферном давлении с принудительной циркуляцией воздуха для сохранения питательных веществ и предотвращения их распада, как и в случае термолабильных витаминов.
Первый растворитель можно удалить с помощью сушки трехмерной структуры при температуре от 25 до 100°С при атмосферном давлении или при давлении ниже атмосферного, например в вакуумной печи в течение 30 минут - 3 часов, или удаляя его посредством сублимационной или распылительной сушки при температуре от 90 до 180°С.
После удаления первого растворителя структуру можно сохранять вплоть до момента проведения анализов в течение периодов вплоть до пяти (5) лет. Рекомендуется стерилизация этих структур с внедренными соединениями, предпочтительно, но не исключительно, посредством другого способа облучения. Могут использоваться другие способы, такие как автоклавирование, в случае тех структур, которые не содержат какие-либо термолабильные компоненты.
3
9
9
3
3
Возможность выделения целевых микроорганизмов установлена при отборе тех структур, которые имеют предел детекции, составляющий менее чем 1 КОЕ/10 л в случае жидких образцов, менее чем 1 КОЕ/250 г в случае твердых образцов или менее чем 1 КОЕ/10 м воздуха, и максимальный предел вплоть до 10 КОЕ/мл или 10 КОЕ/г или 10 КОЕ/м.
До начала анализа трехмерную структуру можно разместить на опорах, которым придана форма пластин, слоев или цилиндров, которые являются проницаемыми для газов или жидкостей или непроницаемы для них или окружены непроницаемыми материалами на по меньшей мере 90% своей поверхности.
Позже те микробные клетки, которые может образовать множество микроорганизмов, могут быть приведены в контакт, чтобы детектировать, выделить, идентифицировать и/или подсчитать в числе вид, род, группу или их комбинации, включая нанобактерии, бактерии, плесенные грибки и дрожжи, а также споры, гифы или другие стадии, служащие для размножения, с трехмерными структурами в присутствии второго растворителя.
Этим вторым растворителем может быть вода, гипотонический, изотонический или гипертонический раствор солей, таких как хлорид натрия, или сам образец в зависимости от природы тех микроорганизмов, которые должны быть идентифицированы.
Некоторые примеры могут включать биологические образцы, такие как кровь или пищевой продукт вроде молока, или суспензии образцов.
Другой вариант способа заключается в приведение суспензии микроорганизмов в контакт с газообразными носителями, такими как воздух или аэрозоли.
3
Образец применяют к структуре в следующих соотношениях: 0,05-13 мл/г или от 0,1 до 10 м/г трехмерной структуры.
Для детекции, выделения, идентификации или количественного определения многообразия клеток второй растворитель или образцы, вмещающие его, можно привести в контакт с поверхностью трехмерной структуры, или вынуждая его проходить через нее вниз на определенную глубину; если клетки или образцы, которые вмещают их, находятся в форме суспензии в газовой или жидкой фазе, в виде геля или с полутвердой или твердой консистенцией, наносят его непосредственно на структуру или при помощи устройства для нанесения, такого как, например, щетка, держатель или игла, среди прочего.
Образцы, вмещающие микроорганизмы, или второй растворитель, содержащий микроорганизмы, можно наносить на различные структуры в одно и то же время.
Трехмерную структуру затем подвергают температурам от 20 до 50°С на протяжении периода, превышающего большую продолжительность скрытой фазы или конечной фазы ускорения роста микроорганизма с самым медленным развитием при переменном напряжении кислорода, колеблющемся от аэробных условий до полного отсутствия этого элемента, в зависимости от целевых микроорганизмов, которые должны быть детектированы.
Рост будет отмечаться с 30 минут вплоть до 240 минут в случае бактерий, и наряду с детекцией различные виды, роды или группы могут быть идентифицированы. С этой целью структуры сохраняют в вышеупомянутых условиях для стимуляции роста микроорганизмов и внутри полостей, и на поверхности.
В случае микроорганизмов с очень медленным ростом, таких как дрожжи и мицелиальные грибы, рост отмечается через всего лишь 16 часов вместо 36-72 часов, отмечаемых в традиционных способах.
Рост отмечают на наночастицах или в полостях по нанобактериальной активности, а рост других бактерий отмечают опосредовано по продуктам распада маркеров ферментативной активности, которые под действием микробных ферментов могут накапливаться в них. Бактерии с меньшими размерами растут в микрополостях, в то время как более большие бактерии, дрожжи и мицелиальные грибы растут в макрополостях, а все другие микроорганизмы разрастаются по поверхности.
Детекцию множества клеток осуществляют в основном, но не исключительно, посредством визуальной или автоматической детекции флуоресценции или биолюминесценции.
Могут использоваться добавочные методы детекции, например, по изменению трехмерной структуры или ее цвета, консистенции, текстуры, блеска, мутности, тона, однородности или прозрачности; или по изменениям цвета, блеска, тона, прозрачности или флуоресценции второго растворителя или образца; или по появлению биолюминесценции и внутри полостей и на поверхности структуры; или при наблюдении других морфологических структур; или по метаболическим реакциям в трехмерных структурах, во втором растворителе или в образце, или по комбинации некоторых или всех способов идентификации.
Концентрацию клеток в образце определяют на поверхности структурных слоев или покровов посредством визуального подсчета, посредством автоматических способов определения на поверхности или посредством измерения интенсивности флуорогенного, колориметрического или биолюминесцентного сигнала под ультрафиолетовым, видимым или инфракрасным светом, электрических, тепловых или магнитных сигналов, по изменениям рН или посредством количественного определения выделения или потребления газов, образуемых в результате активности микроорганизмов во время скрытой фазы роста или периода ускорения роста, таких как углекислый газ, кислород, сероводород, аммиак или водород. Наряду с идентификацией множества микроорганизмов можно определить устойчивость или чувствительность к противомикробным средствам, таким как бактерициды, бактериостатические средства, фунгициды, дезинфицирующие растворы, добавляемым к смеси питательного вещества и маркеров ферментативной активности, наблюдая полное или частичное ингибирование роста, его замедление, удлинение скрытой фазы, или по отсутствию реакции распада субстрата.
Эти пропитанные трехмерные структуры содержат одно или более питательных веществ, компоненты которых выбирают из смесей белков, углеводов, витаминов и минеральных веществ, подвергаемых распаду с помощью химических или ферментативных способов, в количествах, находящихся в пределах от 0,33 до 20 мг/г трехмерной структуры, что обеспечивает быстрый рост микроорганизмов.
Трехмерные структуры также содержат один или множество хромогенных, флуорогенных или биолюминесцентных маркеров ферментативной активности внутри полостей или на поверхности структур в количествах, находящихся в пределах от 0,0033 до 0,66 мг/г трехмерной структуры. Помимо этих субстратов, устройства могут содержать индикаторы рН и окислительно-восстановительного потенциала.
Кроме того, питательное вещество внутри устройства может включать добавочные имеющиеся в продаже продукты, такие как ферментативные гидролизаты, химические гидролизаты или белковые экстракты из: водорослей, микроорганизмов, компонентов овощей, ткани высших животных и их комбинаций, в количествах, находящихся в пределах от 0,33 до 4 мг/г трехмерной структуры. Некоторые примеры этих веществ включают бактериологический пептон, триптон, мясные экстракты, экстракты, которые получены из мозгов и сердца, экстракты из картофеля, кукурузы, риса, сои и дрожжевые экстракты.
Трехмерные структуры могут включать другие вещества, такие как активаторы роста, его ингибиторы, соли, буферы, углеводы и другие соединения, применимые для стимулирования роста этих микроорганизмов, относящихся к определенным родам, видам или группам, в количествах, находящихся в пределах от 0,003 вплоть до 14 мг/г. В целом, эти соединения, находящиеся внутри полостей или на поверхности устройств (смесь питательного вещества с маркерами ферментативной активности и другими компонентами), встречаются в количествах, находящихся в пределах от 0,33 до 60 мг/г трехмерной структуры.
3
9
9
3
3
Трехмерные структуры в соответствии с этим изобретением имеют пределы детекции, составляющие менее чем 1 КОЕ/10 л в случае жидких образцов, менее чем 1 КОЕ/250 г в случае твердых образцов или менее чем 1 КОЕ/10 м воздуха и максимальный предел вплоть до 10 КОЕ/мл или 10 КОЕ/г или 10 КОЕ/м.
Те трехмерные структуры, которые используют для выборочной детекции, выделения или подсчета определенных микроорганизмов внутри образца, содержат выборочные средства для роста микроорганизмов, выбираемые из солей (например, солей желчных кислот, дезоксихолата натрия), другие вещества, такие как полимеры, натуральные растительные экстракты, жирные кислоты, сложные эфиры, бактерициды, бактериостатические средства, спирты, вещества с поверхностной активностью или их смеси, в количествах, находящихся в пределах от 0,0033 до 0,8 мг/л трехмерных структур глин или керамических материалов, и антибиотики (например, ванкомицин, налидиксовую кислоту), противогрибковые средства (например, нистатин, кетоконазол, амфотерицин В) в количествах, находящихся в пределах от 0,033 до 0,33 мг/г.
Те трехмерные структуры, которые используют для пропускания образцов на водной основе через их трехмерную структуру и которые имеют компоненты, которые являются очень растворимыми в воде, могут содержать вещества, которые вносят вклад в закрепление питательного вещества и маркеров ферментативной активности на трехмерных структурах, такие как альгинаты (например, альгинат натрия или кальция), природные полисахариды, пектин, хитин, аравийская камедь и другие камеди, крахмалы, такие как пептизированный кукурузный крахмал, декстран и карбоксиметилцеллюлоза и другие их полимерые производные, каррагенин, агар, агароза и искусственные полимерные производные, производные винилового спирта, полибутилен; полиэтилен и полипропилен, поливинилпирролидон, в количествах, находящихся в пределах от 0,01 до 0,5 г/г трехмерной структуры.
2
3
Частью устройств могут быть другие соединения, такие как вещества, которые увеличивают их адсорбционную способность, вроде активированного угля и целлюлозы в количестве от 2 до 4 мг/г, что используется для формирования устройств, структуры которых имеют удельные поверхности, составляющие менее 3×10 м/м.
Ниже приведены некоторые примеры выполнения.
Пример 1
Выбор питательных основ для получения пропитанных структур, разработанных для выделения или детекции Е. coli
Предварительная фаза: Для анализа стимуляции роста бактерий (Е. coli) был взят образец питательных основ, такой как подвергнутая гидролизу под действием папаина ткань сердца, в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22442, в количестве = 0,2 г/л деионизированной воды, экстракты из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22221, в количестве = 0,2 г/л, ферментативные гидролизаты казеина (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22166) в количестве = 0,2 г/л и 0,2 г/л панкреатического гидролизата сердца.
Также была образована смесь всех из них в следующих количествах: подвергнутая гидролизу под действием папаина ткань сердца в количестве = 1 г/л деионизированной воды, экстракт из дрожжей Saccharomyces cerevisiae в количестве = 1 г/л, ферментативные гидролизаты казеина в количестве = 2 г/л и 1 г/л панкреатического гидролизата сердца.
8
В продукты, подвергаемые проверке, засевали 0,1 мл суспензии целевых микроорганизмов с концентрацией, составляющей 3×10 КОЕ/мл.
Основы и смесь инкубировали по отдельности в течение 8 часов при 37°С в аэробной атмосфере, в случае которых за увеличением оптической плотности следили с помощью спектрофотометра при 680 нм.
Из всех вариантов эта питательная смесь продемонстрировала сокращение скрытой фазы роста Е. coli до 30 минут, в то время как отдельные основы продемонстрировали изменчивую продолжительность этой фазы: подвергнутая гидролизу под действием папаина ткань сердца - 45 минут, экстракт из дрожжей Saccharomyces cerevisiae - 80 минут, ферментативные гидролизаты казеина - 60 минут и панкреатический гидролизат сердца - 50 минут.
По этой причине была выбрана смесь питательных компонентов, которая в дальнейшем будет именоваться CCL, и ее растворяли в 1 л деионизированной воды в качестве первого растворителя в количестве = 5 г/л (вариант 1) и в количестве = 10 г/л (вариант 2).
Исходя из выбора спицифических питательных композиций, можно начинать осуществление способов, заявленных в настоящем изобретении (вторая фаза = заявленный способ).
В эту питательную смесь уже был добавлен панкреатический гидролизат ткани сердца в количестве = 1 г/л (вариант 1) и 2 г/л (вариант 2), что приводит к уже отмеченным концентрациям питательной смеси, составляющим 5 г/л и 10 г/л соответственно.
12
15
6
16
16
9
2
После приготовления вещества были добавлены два маркера ферментативной активности: хромогенный маркер [2-нитрофенил-β-D-галактопиранозид (CHNO)] в количествах, находящихся в пределах от 0,5 г/л (вариант 1) до 1 г/л (вариант 2), и другой флуорогенный маркер [4-метилумбеллиферил-β-D-глюкоронид (CHO⋅2НО)] в количествах, находящихся в пределах от 0,075 г/л (вариант 1) до 0,15 г/л (вариант 2).
К смесям питательных веществ и маркерам ферментативной активности были добавлены другие вещества, такие как активаторы роста, в частности лактоза (5 и 10 г/л), сорбит (0,5 и 1 г/л), L-триптофан (1 и 2 г/л), неорганические соли, в частности дигидроортокалия фосфат (2,75 и 5,5 г/л), гидроортофосфат калия (2,75 и 5,5 г/л) и хлорид натрия (5 и 10 г/л), наконец, соли желчной кислоты были добавлены в концентрации, составляющей 1,3-2,6 г/л.
Выбранное питательное вещество вместе с маркерами ферментативной активности и другими компонентами растворяли в первом растворителе в количествах, находящихся в пределах от 23,9 г/л в случае варианта 1 до 47,8 г/л в случае варианта 2.
После образования питательной смеси и растворения маркеров ферментативной активности и других компонентов в первом растворителе их подвергали стерилизации фильтрованием.
Питательные смеси вместе с маркерами ферментативной активности и другими компонентами, растворенными в первом растворителе, приводили в контакт с двумя трехмерными структурами керамических материалов, в частности гидроксиапатита, которые были предварительно подвергнуты стерилизации при 180°С в течение 60 минут.
Время контакта между соединениями варианта 1 (V1) и варианта 2 (V2) составляло 60 минут.
2
3
Эти структуры имели удельную поверхность, равную 7500 м/м.
Размеры упомянутых выше трехмерных структур имели в составе сочетания всех диаметров или просветов, соответствующих нано- и микрополостям с диаметрами или просветами в диапазоне от 5 нм до 600 мкм в форме пор. Эти структуры демонстрировали цилиндрические формы диаметром 0,5 см и высотой 0,5 см.
После завершения стадии абсорбции первый растворитель удаляли посредством сушки трехмерных структур при температуре, равной 60°С, в вакуумной печи в течение 3 часов.
Подтверждали возможность выделения целевого микроорганизма (Е. coli), убеждаясь в том, что структуры имеют пределы детекции, составляющие менее чем 1 КОЕ/100 мл в случае обоих вариантов.
6
Суспензию Е. coli в солевом изотоническом растворе с концентрацией, составляющей 3×10 КОЕ/мл, приводили в контакт с 0,1 г трехмерных структур в количествах = 0,2 мл (в соотношении 2 мл/г).
Впоследствии трехмерные структуры держали при температуре, составляющей 35±2°С, в аэробных условиях на всем протяжении 2-часового периода, что соответствует продолжительности скрытой фазы роста Е. coli.
После завершения 2-часового периода инкубации присутствие целевого микроорганизма определяли визуально в обоих вариантах по его флуоресценции под ультрафиолетовым светом при 366 нм через супернатантную жидкость, причем Е. coli можно было идентифицировать на основании его позитивной глюкуронидазной ответной реакции (флуоресценции).
Пример 2
Такой же, как вариант 1 примера 1, хотя со следующими отличиями:
3
2
3
V3 - гранулы гидроксиапатита с суммарным весом 0,2 г и удельной поверхностью = 2×10 м/м с внедренным питательным веществом в соответствии с V2 примера 1.
2
3
V4 - гранулы гидроксиапатита с суммарным весом 0,2 г, удельной поверхностью = 3000 м/м с внедренным питательным веществом в соответствии с V2 примера 1.
Структурам позволяли абсорбировать питательные вещества в течение 2 часов и подвергали вакуумной сушке в течение 2 часов при 60°С.
Впоследствии в них засевали 2 КОЕ/мл Е. coli в объеме 0,2 мл (1 мл/г). Флуоресценцию Е. coli отмечали спустя 120 минут.
Пример 3
V5 - гранулы гидроксиапатита с суммарным весом 0,2 г и удельной поверхностью с внедренным питательным веществом в соответствии с V2 примера 1.
3
2
3
V6 - гранулы гидроксиапатита с суммарным весом 0,2 г и удельной поверхностью = 1,5×10 м/м с внедренным питательным веществом в соответствии с V2 примера 1.
2
V7 - целлюлозные диски без глины диаметром 6 мм, с площадью поверхности 0,94 см и весом 0,014 г с внедренным питательным веществом в соответствии с V1 примера 1.
V8 - питательное вещество в соответствии с V1 примера 1 в объеме 0,25 мл.
В керамические материалы внедряли питательное вещество в течение 3 часов и первый растворитель удаляли при температуре, равной 70°С.
Впоследствии в них засевали 0,1 мл сконцентрированной суспензии (1 колония в 5 мл солевого раствора) Е. coli.
В результате флуоресценцию отмечали спустя 90 минут в V6, спустя 105 минут в V5 и ее не отмечали ни в V7, или в V8, что подтверждает, что комбинирование использования трехмерных систем вместе с выбранными питательными смесями, которые сокращают скрытую фазу роста, ускоряет детекцию и идентификацию микроорганизмов по сравнению с использованием лишь соединения или его с любым другим видом структуры.
Пример 4
В общем, этот способ выполняли в соответствии с примером 1 со следующими отличиями.
Первая фаза (не заявленная в настоящем изобретении): Анализ стимуляции роста бактерий выполняли с использованием подвергнутой гидролизу под действием папаина ткани сердца, в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22442, в количестве = 0,2 г/л деионизированной воды.
Эту основу инкубировали в течение 8 часов при 37°С в аэробной атмосфере и за увеличением оптической плотности следили с помощью спектрофотометра при 680 нм.
Питательная основа продемонстрировала сокращение скрытой фазы роста Enterococcus через 120 минут.
Вторая фаза (в соответствии с настоящей заявкой): Этот гидролизат был выбран для комбинирования с трехмерной структурой (варианта 9) для выполнения этого способа, и его растворяли в 1 л деионизированной воды в качестве первого растворителя в количестве (10 г/л), эквивалентном 10 мг/г структуры, и добавляли соли для регулирования возможного изменения рН, вызываемого трехмерной структурой, в частности дикалийфосфат (3,5 г/л, эквивалент 8,75 мг/г структуры), фосфат калия (1,5 г/л, эквивалент 3,75 мг/г структуры) и хлорид натрия (5 г/л, эквивалент 12,5 мг/г структуры), что обеспечивает суммарное количество питательной смеси = 50 мг/г. К структуре добавляли метилумбеллиферил-β-глюкозид в количестве = 0, 075 г/л в качестве флуорогенного маркера, эквивалентном 0,1875 мг/г трехмерной структуры глины.
Все компоненты были предварительно подвергнуты стерилизации в автоклаве при 121°С в течение 15 минут.
Присутствие Enterococcus отмечали на основе голубоватой флуоресценции, которая появлялась спустя 120 минут.
Пример 5
В общем, этот способ выполняли в соответствии с примером 4 со следующими отличиями.
Первая предварительная фаза: Для проверки стимуляции роста бактерий (Enterococcus faecalis АТСС 29212, Enterococcus faecium АТСС 19434, Enterococcus avium АТСС 14025) использовали подвергнутую гидролизу под действием папаина ткань сердца, в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22442, в количестве = 0,2 г/л деионизированной воды.
Основы инкубировали в течение 8 часов при 37°С в аэробной атмосфере и за увеличением оптической плотности следили с помощью спектрофотометра при 680 нм.
Питательные основы продемонстрировала сокращение скрытой фазы роста, составляющей 2 часа.
Вторая фаза (по изобретению):Устройства для выполнения способа получали, дублируя концентрации каждого компонента, который внедряли в структуры.
Спустя 90 минут отмечали изменение цвета второго растворителя, который становился слегка голубоватым относительно исходного, который был зеленоватым в обоих устройствах с трехмерными глиняными структурами для Е. avium.
3
2
3
3
2
3
Спустя 150 минут отмечали появление флуоресценции во втором растворителе в случае устройства с удельной поверхностью = 7,5×10 м/м (вариант 10) и слабую флуоресценцию в случае устройства с удельной поверхностью = 2×10 м/м (вариант 11) для Е. avium.
Спустя 210 минут Е. faecalis детектировали в устройстве варианта 11 на основе появления флуоресценции.
Спустя 240 минут все микроорганизмы продемонстрировали флуоресценцию во всех трехмерных структурах.
Пример 6
Выполняли в соответствии с примером 1 со следующими отличиями.
3
2
3
3
2
3
3
2
3
Были приготовлены три устройства: одно, описанное в варианте 11 (V11) с удельной поверхностью = 2×10 м/м, одно, описанное в варианте 12 (V12) с удельной поверхностью = 3,3×10 м/м, и одно, описанное в варианте 13 (V13) с удельной поверхностью = 1,5×10 м/м.
Время контакта соединений этих вариантов составляло 180 минут.
По завершении абсорбции первый растворитель удаляли посредством сушки трехмерных структур при температуре, составляющей 60°С, в вакуумной печи на протяжении 60-минутного периода.
Приводили в контакт суспензию Е. coli в солевом изотоническом растворе с концентрацией, составляющей 1 колония в 5 мл, из которых 0,1 мл отбирали и наносили на поверхность устройства.
Спустя 90 минут флуоресценцию отмечали в устройстве со структурой варианта 11 (V11).
3
2
3
3
2
3
Спустя 210 минут флуоресценцию отмечали в двух других устройствах (V12 и V13) со структурами с удельной поверхностью = 1,5×10 м/м-3,3×10 м/м.
Пример 7
Такой же, как вариант 1 примера 1, с отличием, что были созданы следующие варианты:
V14 - каолинит, уплотненный в агломераты, с суммарным весом = 0,2 г с внедренным питательным веществом в соответствии с V2 примера 1.
Расстояния между частицами каолинита формируют полости различных форм с размерами, соответствующими микро- и макрополостям.
V15 - порошковый бентонит, измельченный в грануляторе и позже уплотненный, с суммарным весом = 0,2 г с внедренным питательным веществом в соответствии с V2 примера 1. Расстояния между частицами каолинита формируют полости различных форм с размерами, соответствующими макрополостям.
Структурам позволяют абсорбировать питательные вещества на протяжении 4 часов и подвергают вакуумной сушке в течение 3 часов при 60°С.
6
Суспензию Е. coli в изотоническом натрий-фосфатном растворе с концентрацией, составляющей 10 КОЕ/мл, приводят в контакт с 0,1 г трехмерных структур в количествах = 0,2 мл (в соотношении 2 мл/г).
Флуоресценцию Е. coli отмечают через 280 минут.
Пример 8
Штамм Е. coli АТСС 25922 проверяют, как описано в примере 1, и он создан в соответствии с V2 этого примера наряду с питательным веществом, приготовленным, как описано в указанном варианте 2 примера 1, с отличием, что добавляют лишь флуорогенный субстрат 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкоронид (MUG) в количестве = 0,2 г/л.
Питательную смесь вместе с маркерами ферментативной активности и другими компонентами, растворенными в первом растворителе, приводят в контакт с 3 трехмерными структурами.
6
2
3
Первую структуру искусственной керамической природы формирует нанослой гидроксиапатита с нанопористостью, удельной поверхностью = 50×10 м/м и нанопостями высотой 20 нм, опирающийся на нижний слой агаропектина в количестве = 0,5 г/г. Эта структура также опирается на всю поверхность диска диметром 6 см, который является непроницаемым для производных целлюлозы, в частности нитрата целлюлозы, с использованием которого сформировано исходное устройство (вариант 16).
5
2
3
6
2
3
Вторая структура изготовлена из кремнистой земли с удельной поверхностью = 3×10 м/м-1×10 м/м и пористостью в виде нано- и микрополостей, в которой питательное вещество смешано с агаром (0,3 г/г), растворенным в первом растворителе. Второе устройство готовят, помещая описанную структуру из обожженной и очищенной кремнистой земли в цилиндр высотой 3 мм, диаметром 90 мм (вариант 17).
3
2
3
3
2
3
Третью трехмерную структуру формирует гидроксиапатит с минимальной удельной поверхностью = 1,25×10 м/м с нерегулярными макро- и микрополостями, за которой следует трехмерная структура цеолита с удельной поверхностью, превышающей 5×10 м/м. Питательные вещества примера 1, варианта 2 и флуорогенный субстрат, описанный в указанном варианте, абсорбируют на первой и второй структурах. Общая высота этих трехмерных структур достигает 10 см с диаметром 4 см при формировании устройства, в случае которого этот трехмерный столб помещен в трубку, изготовленную их непроницаемого материала с отверстиями на верхней и нижней частях, так что трубка из непроницаемого материала (PVC) окружает 90% внешней поверхности структуры (вариант 18).
2
Суспензию Е. coli в солевом изотоническом растворе с концентрацией, составляющей 10 КОЕ/мл, приводят в контакт по всей поверхности первого устройства (V16) с помощью щетки, пропитанной альгинатом натрия. Затем трехмерную структуру держат при температуре, составляющей 35±2°С, и в аэробных условиях на протяжении 120-минутного периода, тогда как рост детектируют по испусканию флуоресценции под светом при 366 нм с помощью сенсора и с определением по глюкуронидазной активности.
Суспензию Е. coli в солевом изотоническом растворе с концентрацией, составляющей 10 КОЕ/мл, приводят в контакт по всей поверхности второго устройства (V17) с помощью автоматической пипетки и с распределением с помощью шпателя Дригальского. Затем трехмерную структуру держат при температуре, составляющей 35±2°С, в аэробных условиях на протяжении 240-минутного периода, тогда как рост детектируют по испусканию флуоресценции под светом при 366 нм с помощью сенсора и с определением по глюкуронидазной активности.
Образец объемом 10 л деионизированной воды, искусственно зараженный Е. coli в концентрации, составляющей 8 КОЕ/10 л, пропускают через весь объем устройства и допускают инкубацию в условиях, описанных в предыдущих экспериментах. Через 210 минут отмечали флуоресценцию внутри устройства.
Пример 9
Четыре трехмерные структуры природных глин или керамических материалов оценивали с использованием двух питательных веществ для идентификации грамотрицательных бактерий.
Питательные компоненты были выбраны в соответствии с примером 1.
Различные устройства были приготовлены с использованием этого соединения для осуществления способа.
3
2
3
5
2
3
4
2
3
Выбранными опорами были керамические материалы HAP-S (наноструктура природного гидроксиапатита с удельной поверхностью = 7,5×10 м/м) и НАР-56 (наноструктура искусственно полученного гидроксиапатита с удельной поверхностью = 3×10 м/м), а также очищенная и обожженная кремнистая земля (TSC) (удельная поверхность = 5,3×10 м/м).
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
Питательная смесь была приготовлена с флуорогенными и хромогенными маркерами и другими компонентами в соответствии с V1 примера 1 (композиция, также называемая CCL). Параллельно была приготовлена другая смесь флуорогенного соединения с солями и другими компонентами в соответствии со следующим соединением (композиция, также называемая MCS): сульфат аммония [(NH)SO] 5,0 г/л первого растворителя; гидроортофосфат калия [KHPO] 0,45 г/л; дигидроортофосфат калия [KHPO] 0,31 г/л; гидроортофосфат натрия [NaHPO] 0,92 г/л; хлорид натрия [NaCl] 0,1 г/л; хлорид кальция [CaCl] 0,05 г/л; гептагидрат сульфата магния [MgSO⋅7HO] 0,2 г/л; L-гистидина моногидрохлорид 0,005 г/л; L-триптофан 0,02 г/л; L-метионин 0,02 г/л; декстроза 10,0 г/л и MUG в количестве 0,2 г/л.
рН обоих соединений доводили до 6,8 и их стерилизовали фильтрацией через фильтры одноразового употребления (размер пор = 0,2 мкм) (Nalge Co., Rochester, NY).
Трехмерные структуры были приготовлены с использованием смесей, используя следующую методологию:
- 1 г каждой структурированной опоры отвешивали в устойчивые к сухому жару емкости.
- Их подвергали стерилизации при 180°С в течение 1 часа, затем добавляли 2 мл питательного вещества или смеси маркеров ферментативной активности с солями и другими компонентами (MCS), подвергнутого(й) стерилизации фильтрованием, под вертикальным приграничным потоком воздуха и ему позволяли внедряться в структуру в течение 1 часа; крышку удаляли и их оставляли под вертикальным приграничным потоком воздуха на 3 часа до удаления первого растворителя. Часть, равную 0,1 г, устройства затем хранили в асептических условиях, так что его высота и диаметр достигали 0,5 см, таким образом получая стеклянную емкость с гидролитическим свойством 1, прозрачную, с крышкой и максимальной емкостью 2 мл.
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
Конечные устройства содержали: сульфат аммония [(NE)SO] 10 мг/г трехмерной структуры; гидроортофосфат калия [KHPO] 0,9 мг/г; дигидроортофосфат калия [KHPO] 0,62 мг/г; гидроортофосфат натрия [NaHPO] 1,84 мг/г; хлорид натрия [NaCl] 0,2 мг/г; хлорид кальция [CaCl] 0,1 мг/г; гептагидрат сульфата магния [MgSO⋅7НО] 0,4 мг/г; L-гистидина моногидрохлорид 0,001 мг/г; L-триптофан 0,04 мг/г; L-метионин 0,04 мг/г и декстрозу 20,0 мг/г и MUG в количестве 0,4 мг/г, всего 34,55 мг/г.
План эксперимента охватывал следующие варианты анализа:
8
7
Для засева во все варианты исследования готовили суспензии микроорганизмов с концентрацией, составляющей приблизительно 10 КОЕ/мл, в 9 мл стерильного 0,85% (часть/часть) раствора двух солей из чистой культуры Escherichia coli АТСС 25922, подвергнутой инкубации в течение вплоть до 24 часов. Объем посевного материала составлял 0,2 мл для каждого варианта анализа, обеспечивая концентрацию посевного материала = 2×10. Устройства после засева инкубировали при 35±2°С в аэробных условиях.
Считывания осуществляли визуально, используя ультрафиолетовую лампу при 366 нм каждые 30 минут.
Полученные результаты представлены в следующей таблице с указанием периода в часах и минутах позитивной флуоресцентной ответной реакции.
Этот индикатор показывает, что вид микроорганизма обладает ферментативной активностью, которая соответствует маркеру ферментативной активности, использованному в соединениях.
Также доказано, что не является очевидным то, что при объединении каждого питательного вещества с трехмерной структурой глины ответная реакция происходит через более короткий период времени или микроорганизмы детектируются или идентифицируются через более короткий период.
Также доказано, что объединение глиняных или керамических структур с питательными смесями, маркерами ферментативной активности и другими ингредиентами ускоряет идентификацию, что касается вариантов V21-V23, которые не содержали питательные компоненты на основе белкового гидролизата и экстрактов, права на которые авторов этого изобретения были ранее подтверждены свидетельствами, таким образом доказывая, что чрезвычайно важно использовать соединения, которые позволяют укоротить скрытую фазу роста бактерий, сокращая время детекции и идентификации.
Этот эксперимент также доказал, что, как ни удивительно, разработанные питательные вещества способны ослабить или исключить ингибиторный эффект или антибактериальное применение этой структуры, описанные различными авторами для некоторых биотехнологических процессов, в частности таковой цеолита (V21), при добавлении питательного вещества, специально предназначенного для исключения этого антибактериального эффекта.
Пример 10
Четыре трехмерные структуры природных глин или керамических материалов оценивали с использованием двух питательных веществ для идентификации грамотрицательных бактерий, описанных в предшествующем примере (примере 9).
Выбор питательных компонентов был так же осуществлен в соответствии с методологией примера 1, но с использованием штамма Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853).
Предварительная первая фаза: Были оценены отдельные и смешанные ферментативные гидролизаты, среди них подвергнутая гидролизу под действием папаина ткань бычьего сердца в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22442 и панкреатический гидролизат ткани сердца и их смеси. Результаты показали, что в этих 3 случаях скрытая фаза роста имела максимальную продолжительность, равную 120 минутам; по этой причине оба были выбраны для приготовления питательного вещества.
Вторая фаза (по изобретению): Различные варианты для способа были приготовлены с использованием этого вещества для осуществления способа.
Питательная смесь была приготовлена с флуорогенными и хромогенными маркерами и другими компонентами в соответствии с V1 примера 1. Параллельно была приготовлена другая смесь флуорогенного соединения с солями и другими компонентами в соответствии с описанием предшествующего примера (MCS).
Все другие устройства и посевные материалы были приготовлены в соответствии с описаниями примера 9 с отличием, что посевные материалы Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853 и Enterococcus faecalis АТСС 29212 в устройствах были добавлены к эксперименту.
План эксперимента охватывал следующие варианты анализа:
Полученные результаты представлены в следующей таблице с указанием периода в часах и минутах позитивной флуоресцентной ответной реакции.
Неожиданное появление зеленоватой флуоресценции Pseudomonas отмечали в трехмерных керамических структурах спустя всего лишь 3 часа в случае варианта V18; этот эффект никогда не достигался при использовании какого-либо другого известного диагностического средства. Необходимо отметить, что предложенный ферментативный маркер в этих вариантах (MUG) не предназначался для детекции Pseudomonas, которые не показывают глюкуронидазной активности, поскольку он является специфическим для Е. Coli, которая имеет эту активность. Тем не менее, зеленоватая флуоресценция Pseudomonas не приводит к путанице с синеватой флуоресценцией Е. coli. В этом эксперименте была продемонстрирована специфичность заявленного способа, поскольку в отсутствие Е. coli она не детектировалась. В качестве дополнительного полезного эффекта, пусть он и не заявлен как таковой, было возможным детектировать Pseudomonas в отсутствие специфического флуорогенного маркера для этих видов.
Во-вторых, было подтверждено, что для детекции и идентификации определенных микроорганизмов как можно быстрее важна удельная поверхность и размер полостей (3 часа в случае V18 и 24 часа в случае V19), а также зависимость от этого конкретного типа глины, объединенного со смесью для исключения ингибиторного эффекта этих глин или керамических материалов (обнаруживаемого в случае V18 и не обнаруживаемого в случае V20 или V21).
7
Был подтвержден избирательный характер этого устройства, в то время как оно ингибировано Е. faecalis, поскольку композиция CCL содержит ингибиторы для Е. faecalis (композиция CCL включает вещества, являющиеся производными желчных солей). Эта композиция, внедренная в структуру глины, вместе с ней была способна ингибировать Е. faecalis - даже при использовании концентраций до 10 КОЕ/мл.
Пример 11
Оценка трех видов трехмерных структур природных глин или керамических материалов (HAP-S, НАР-56 и TSC) с использованием питательных веществ для идентификации грамположительных бактерий
Предварительная фаза для выбора питательной смеси: Для проверки стимуляции роста бактерий [Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes) были использованы различные смеси питательных основ, среди них экстракт из Saccharomyces cerevisiae, полученный при помощи ферментативного гидролиза, как описано в авторском свидетельстве на изобретение Кубы с №22221, ферментативные гидролизаты бычьей крови (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22208), ферментативные гидролизаты казеина (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22089), ферментативные гидролизаты имеющейся в продаже сои и имеющийся в продаже мясной экстракт.
Первая смесь (M1) содержала: экстракт из Saccharomyces cerevisiae - 3,24 г/л; ферментативные гидролизаты бычьей крови - 6,37 г/л; ферментативные гидролизаты казеина - 9,97 г/л; имеющийся в продаже соевой пептон - 3,24 г/л и имеющийся в продаже мясной экстракт - 2,43 г/л.
Вторая смесь (М2) содержала: экстракт из Saccharomyces cerevisiae - 5,0 г/л; ферментативные гидролизаты бычьей крови - 5,0 г/л; ферментативные гидролизаты казеина - 5,0 г/л; имеющийся в продаже соевый пептон - 6,0 г/л и имеющийся в продаже мясной экстракт - 3,0 г/л.
Третья смесь (М3) содержала: экстракт из Saccharomyces cerevisiae - 6,0 г/л; ферментативные гидролизаты бычьей крови - 6,0 г/л; ферментативные гидролизаты казеина - 3,0 г/л; имеющийся в продаже соевый пептон - 6,0 г/л и имеющийся в продаже мясной экстракт - 4,0 г/л.
8
В продукты, подвергаемые проверке, засевали 0,1 мл суспензии целевых микроорганизмов с концентрацией, составляющей 3×10 КОЕ/мл.
Смесь и основы инкубировали по отдельности в течение 8 часов при 37°С в аэробной атмосфере и за увеличением оптической плотности следили с помощью спектрофотометра при 680 нм.
Все варианты укорачивали скрытую фазу до всего лишь 1 часа в случае S. pyogenes, и продолжительность этой фазы в случае S. aureus составляла всего лишь 2 часа. Из них была выбрана М3, поскольку рост S. pyogenes был немного более интенсивным в ней.
Вторая фаза (согласно изобретению)
Были проверены следующие питательные вещества:
- Питательное вещество (STR-STAP), в состав которого входили: ферментативные гидролизаты казеина, в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22166 (3,0 г/л); экстракт из дрожжей Saccharomyces cerevisiae в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22221 (6,0 г/л) и ферментативные гидролизаты крови в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22208 (6,0 г/л). Кроме того, были добавлены имеющийся в продаже мясной экстракт (4,0 г/л), расщепленные под действием папаина соевые белки (6,0 г/л) наряду с другими компонентами, такими как ацетат таллия (0,014 г/л), натриевая соль налидиксовой кислоты (0,008 г/л), DL-фенилаланин (1,0 г/л), цитрат железа - аммоний (0,5 г/л), хлорид натрия (0,2 г/л), декстроза (0,1 г/л) и 0,2 г/л MU-фосфат в качестве флуорогенного маркера.
- Дополнительное синтетическое соединение без гидролизатов или экстрактов (MCS в соответствии с предыдущим примером) с добавлением 4-метилумбеллиферилфосфата (MU-фосфата) в количестве 0,2 г.
Соединения растворяли прямо пропорционально первому растворителю (деионизированной воде), рН которого доводили до 7,3. Их подвергали стерилизации фильтрованием, используя 0,2 мкм фильтры одноразового употребления.
Устройства были приготовлены, следуя методологии, описанной в примере 10, и план эксперимента охватывал следующие варианты анализа:
Для этого эксперимента были выбраны целевые виды Staphylococcus aureus АТСС 25923 и Streptococcus pyogenes АТСС 19615. Приготовление их разведений, засев и инкубацию выполняли, как описано в примере 10.
В следующих таблицах представлен период до проявления флуоресценции (в час : мин) для каждого вида микроорганизмов, оцениваемого против каждого маркера ферментативной активности, используя только соединения из вариантов 24-27, т.е. только те, которые содержат питательную смесь.
Оценка, выполненная с использованием этого флуорогенного субстрата, подтвердила, что самыми удовлетворительными вариантами - по показателю скорости ответной реакции - были комбинации STR-STAP с НАР-S (вариант 24), которые через всего лишь 3-5 часов инкубации позволяли детектировать S. aureus и S. pyogenes.
Вариант 25 позволял детектировать микроорганизмы с очень высокими требованиями к питательным веществам, такие как S. aureus, спустя всего лишь 5 часов, и S. pyogenes, спустя всего лишь 24 часа.
Еще раз было подтверждено, что лишь комбинирование питательных смесей с маркерами ферментативной активности и трехмерными керамическими структурами (V24-V25) способно ускорить детекцию микроорганизмов по сравнению с только соединением (V26) или даже достигать их детекции (S. pyogenes-негативный V26).
Были приготовлены другие комбинации для создания составных устройств с двумя структурами и двумя различными соединениями: одного, содержащего гидролизаты и экстракты, и другого синтетического:
V24+V27=V29
V25+V28=V30
V24+V28=V31
V25+V27=V32.
Комбинирование структур исследованных вариантов дало лучшие результаты по показателю времени детекции для одного из сочетаемых устройств, а значит не потребовалось комбинирование всех других, как описано ниже:
- комбинирование HAP-S с первоначальным питательным веществом и той же трехмерной структурой, хотя и с синтетическим соединением (V32), сократило время детекции S. aureus с 5 часов до 3 часов, a S. pyogenes с 24 часов до 4, 30 часов.
Пример 12
Исследование ответной реакции различных устройств и способ в присутствии образца мочи. Устройства были сформированы, используя четыре различных вида трехмерных структур природных и искусственных глин и керамических материалов (HAP-S, НАР-56), каждая из которых была объединена с соединением, описанным в варианте 1 примера 1, и выполняя способ, описанный в примере 9.
Объем используемого посевного материала составлял 0,2 мл образца для каждого варианта.
Параллельно образец оценивали, используя традиционную процедуру, используя агаризованные среды, такие как CromoCen СС и лактозный агар с бромтимоловым синим (ABL).
В случае обеих схем тестирования (нового способа с использованием устройства из глины и традиционного способа) засеянные образцы инкубировали при 35°С. Считывания тестирований осуществляли каждые 30 минут после применения устройства, используя ультрафиолетовую лампу при 3 66 нм.
В следующей таблице представлен период (в час : мин), после которого детектировали флуоресценцию, которая подтверждала присутствие инфекции в клиническом образце, связанной с позитивным видом, по используемому маркеру ферментативной активности.
Комбинация CCL с НАР-56 представляла собой вариант, который реагировал быстрее, через 2 часа и 30 минут, за которой следовала комбинация со структурой HAP-S, которая реагировала через 3 часа. Этот результат означает, что Е. coli является бактерией, которая вызывала инфекцию, принимая во внимание избирательность питательного вещества и устройства, и что в большинстве зафиксированных случаев этот вид образца реагирует на этот вид.
Только Е. coli была детектирована в обеих средах (CromoCen СС и ABL) через 24 часа, используя традиционные процедуры.
Это служит доказательством, насколько точными являются способ и устройство, и что они ускоряли процедуру в по меньшей мере 8 раз.
Пример 13
Исследование взаимосвязи между питательными свойствами соединений и проявлением микробной ферментативной активности в отношении маркера ферментативной активности.
С этой целью было выбрано наносоединение CCL с HAP-S, приготовленное, как описано в примере 9. С другой стороны, был приготовлен вариант, используя HAP-S в качестве опоры, в который был добавлен водный раствор MUG с концентрацией, составляющей 0,2 г/л (часть/объем), а затем подвергнут дегидратации, следуя той же методологии, что и методология, описанная в примере 9.
8
7
Использовали чистую культуру Е. coli в качестве микроорганизма анализа, на основе которой была приготовлена суспензия с концентрацией 10 КОЕ/мл. Для исследования использовали объемы, равные 0,2 и 0,4 мл, получая посевные материалы, которые вносили в структуры, вплоть до 10, и затем оба устройства засевали параллельно: CCL с HAP-S (V35) и MUG с НАР-S (V36).
Варианты инкубировали при 35°С, наблюдая их флуоресцентную ответную реакцию каждые 30 минут, используя ультрафиолетовую лампу при 366 нм.
В следующей таблице представлены полученные результаты, в которых на первый план выдвинуто время в час : мин, через которое наблюдали позитивную флуоресцентную ответную реакцию.
Этот эксперимент подтвердил значительное влияние комбинации гидролизатов или экстрактов, полученных из питательных веществ белковой природы, присутствующей в используемом питательном веществе. Она позволяла виду микроорганизма быстрее адаптироваться к условиям устройства и проявляла ферментативную активность во время его роста в скрытой фазе (2 ч), что делало в этом случае возможным его идентификацию в присутствии используемого маркера ферментативной активности за минимальный период времени, составляющий 1 час и 30 минут. Тем не менее, в случае структуры, которая содержала только флуорогенный субстрат, его ответную реакцию детектировали 2 часами позже, поскольку детекция не основана на активации ферментативного механизма, а основана на их детекции в намного более высоких концентрациях, что является способом, используемым в вышеупомянутых решениях уровня техники.
Пример 14
Исследование влияния рН соединения на действие флуорогенного субстрата для обнаружения микробной ферментативной активности.
Используя соединение CCL, описанное в примере 9, были приготовлены четыре экспериментальных варианта с различными значениями рН (6,6-6,8-7,0-7,2). Каждый вариант был подвергнут стерилизации фильтрованием, независимо внедрен в керамический материал HAP-S (вариант 37) и засеян и подвергнут инкубации, следуя процедуре, упомянутой в примере 9.
В следующей таблице представлены полученные результаты с указанием периода (час : мин) позитивной флуоресцентной ответной реакции в качестве индикатора микробной ферментативной активности в отношении используемого маркера.
Результаты показывают, что нет значительного влияния рН соединения на детекцию ферментативной активности микроорганизма (Е. coli) в случае использованного маркера ферментативной активности (MUG).
Позитивную ответную реакцию детектировали через период от 1,5 часов до 2 часов культивирования.
Пример 15
Оценка четырех трехмерных структур природных глин или керамических материалов (HAP-S, НАР-56 и TSC), используя два питательных вещества и два маркера ферментативной активности для независимых тестирований, нацеленных на идентификацию вида рода Candida.
С целью отбора питательных веществ(а) исследовали сокращение продолжительности скрытой фазы с помощью растительных экстрактов из сладкого картофеля, которые были ранее разработаны авторами этого изобретения, а именно ферментативных гидролизатов казеина, соевого пептона, смеси дрожжевых пептонов и ферментативных гидролизатов, все в количествах в диапазоне от 0,2 г/л. Оптическую плотность контролировали каждый 1 час с помощью спектрофотометра при 380 нм. Результаты показали, что экстракты из сладкого картофеля укорачивают скрытую фазу роста С. albicans на по меньшей мере 1 час по сравнению со всеми другими соединениями, требуя всего лишь 16 часов.
Были приготовлены первые экспериментальные варианты, используя флуорогенный субстрат MU-фосфат в качестве первого маркера ферментативной активности. Субстрат добавляли к соединению CND в количестве 0,2 г, в состав которого входили: экстракт из сладкого картофеля 20,0 г; экстракт из дрожжей Saccharomyces cerevisiae 10,0 г; фосфат калия 1,0 г; сульфат магния 0,5 г; дезоксихолат натрия 0,5 г и налидиксовая кислота 0,03 г, на один литр деионизированной воды.
Другим используемым соединением была среда MCS, в которую добавляли то же количество MU-фосфата (0,2 г/л).
Параллельно были приготовлены схожие варианты, используя L-пролин-метилкумарин (L-Pro) в качестве субстрата - маркера ферментативной активности, 0,2 г которого добавляли к соединениям CND и MCS соответственно.
Питательные вещества, приготовленные с маркерами ферментативной активности и другими ингредиентами, которые готовили для каждого экспериментального варианта, растворяли пропорционально с использованием одного литра деионизированной воды в качестве первого растворителя и их рН доводили до 6,6. Их подвергали стерилизации фильтрованием, используя 0,2 мкм фильтр одноразового употребления.
Структуры были приготовлены, следуя методологии, описанной в примере 9, и план эксперимента охватывал следующие варианты анализа:
8
Микробиологическое определение проводили с использованием контрольных штаммов: Candida albicans АТСС 10231, Candida parapsilosis АТСС 22019 и Candida glabrata АТСС 15126, только что собранных с агара Сабуро с декстрозой в течение 36 часов. Суспензии этих культур были приготовлены в 9 мл пробирках с использованием стерильного 0,85% (часть/часть) раствора двух солей до достижения плотности микроорганизмов = 10 КОЕ/мл.
В каждый вариант устройств в соответствии со способом засевали объем 0,2 мл и осуществляли инкубацию при 35°С. Флуоресцентную ответную реакцию регистрировали каждые 30 минут, используя ультрафиолетовую лампу при 366 нм.
В следующих таблицах, в которых представлен период (час : мин), через который позитивная флуоресцентная ответная реакция отмечалась, полученные результаты представлены независимо для каждого маркера ферментативной активности.
Прежде всего следует отметить, что три оцененных вида Candida продемонстрировали фосфатазную активность; по этой причине во всех случаях варианты проверяли с целью детекции позитивной флуоресцентной ответной реакции в присутствии субстрата MU-фосфата.
С другой стороны, оценка этого флуорогенного субстрата (MU-фосфата) еще раз подтвердила его распад в присутствии керамического материала НАР-56, поскольку наносоединение было гидратированным, было выявлено появление позитивной флуоресцентной ответной реакции, которая не связана с ферментативным действием вида микроорганизма. Это аннулирует считывание сначала, затем оно было зарегистрировано как «не применимо».
С другой стороны, глина TSC как-то блокирует ответную реакцию, или исходя из ферментативной активности тестируемых микроорганизмов, или конкретного флуорогенного субстрата, поскольку биологическая функциональность наносоединения не отмечается на всем протяжении периода культивирования.
Что касается керамического материала HAP-S, схожая ответная реакция была детектирована в случае каждого проверенного соединения, хотя она была различной для каждого вида Candida.
В случае С. albicans было выявлено, что этот вид не был способен проявлять свою активность в присутствии субстрата MU-фосфата, в то время как в случае видов С. parapsilosis и С. glabrata флуоресценция появлялась спустя 15 часов культивирования, хотя с очень низкой интенсивностью, наряду с появлением индикатора, который не увеличивал свою интенсивность во время более длинного периода инкубации.
Как правило, ответная реакция, получаемая в результате использования этого маркера ферментативной активности (MU-фосфата) в качестве части питательных веществ, тесно связана со структурой, используемой в качестве наноструктурированной опоры; по этой причине при этом ответная реакция в результате окончания Z является самой подходящей реакцией.
В следующей таблице представлены результаты, установленные при использовании флуорогенного субстрата L-Pro.
В соответствии с другими исследованиями, проведенными авторами этого изобретения для детекции ферментативной активности нескольких видов Candida, хорошо известно, что виды С. albicans и С. parapsilosis имеют фермент L-пролин-амидазу. С другой стороны, С. glabrata не характеризуется активностью указанного фермента, поэтому для этих дрожжей не было зафиксировано никакого сигнала.
На основе этих предшествующих сведений осуществляли считывание, ожидая позитивную флуоресцентную ответную реакцию для видов С. albicans и С. parapsilosis.
Было отмечено, что варианты, полученные с использованием структур HAP-S, НАР-56 и TSC, в случае обеих сред для культивирования (CND и MCS) демонстрируют удовлетворительные результаты, делая возможным детекцию С. albicans и С. parapsilosis спустя всего лишь 15 часов. Тем не менее, большая интенсивность флуоресцентной ответной реакции, используя керамический материал НАР-56, отмечена в исходном случае.
Что касается использования цеолита в качестве опоры с этим флуорогенным субстратом, была установлена несовместимость, поскольку не отражалась микробная активность, а также не блокировался каким-либо образом распад субстрата L-Pro, что делает микробиологическую функциональность наносоединения неидеальной.
На основании результатов этого эксперимента авторы изобретения подтверждают необходимость использования специфических маркеров для специфических видов Candida таким образом, чтобы некоторые маркеры использовались только с некоторыми структурами для некоторых видов Candida для того, чтобы гарантировать, что маркер не будет подвергнут расщеплению или разрушению.
Пример 16
Такой же, как вариант 1 примера 1, с отличием следующих вариантов:
5
2
3
V50 - совокупность природных цеолитовых глин, спрессованных в виде таблетки, с суммарным весом 0,2 г и удельной поверхностью = 3×10 м/м с внедренным питательным веществом в соответствии с V1 примера 1.
5
4
3
3
3
2
3
V51 - порошкообразный карбонатапатит [Са(PO,CO)(ОН)], помещенный в резервуар высотой 1 см, весом 0,5 г и с удельной поверхностью = 4×10 м/м и размером полостей = 700 мкм с внедренным питательным веществом в соответствии с V2 примера 1.
3
2
3
V52 - кубики цеолита с суммарным весом 0,2 г и с удельной поверхностью = 7,0×10 м/м с внедренным питательным веществом в соответствии с V44 примера 15.
Структурам позволяли абсорбировать питательные вещества в течение 1 часа и подвергали вакуумной сушке в течение 3 часов при 60°С.
6
Впоследствии в них вносили посевной материал 10 КОЕ/мл Е. coli (V50 и V51) и объем = 0,2 мл (1 мл/г) С. albicans (V52).
Флуоресценцию Е. coli отмечают спустя 180 минут в случае V50 и спустя 210 минут в случае V51, а флуоресценцию С. albicans отмечают спустя 18 часов в случае V52.
Пример 17
Такие бактерии, как Е. coli, Е. coli O157 : Н7, Aeromonas hydrophila, Enterococcus avium, и мицелиальные грибы Aspergillus niger были отобраны для проверки роста бактерий.
Каждый из этих микроорганизмов проверяют с использованием различных питательных основ, таких как подвергнутая гидролизу под действием папаина ткань сердца, в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22442, в количестве = 0,2 г/л деионизированной воды, экстракты из дрожжей Saccharomyces cerevisiae в соответствии с авторским свидетельством на изобретение Кубы с №22221, в количестве = 0,2 г/л, ферментативные гидролизаты казеина (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22166), 0,2 г/л экстракта из сладкого картофеля, описанного в патенте Кубы с №23507; экстракт из помидоров в количестве = 0,2 г/л (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22308) и ферментативные гидролизаты бычьей крови (авторское свидетельство на изобретение Кубы с №22208) в количестве = 0,2 г/л. Также смесь всех их была создана в количествах в диапазоне от 0,2 г/л каждого из них.
Основы и смесь инкубировали по отдельности в течение 8 часов при 37°С в аэробной атмосфере и за увеличением оптической плотности следили с помощью спектрофотометра при 680 нм.
Из всех вариантов эта питательная смесь продемонстрировала сокращение скрытой фазы роста всех микроорганизмов за исключением Aspergillus по истечении 90 минут, в то время как отдельные основы продемонстрировали изменчивую продолжительность этой фазы, и в некоторых случаях больше 2 часов; по этой причине эта смесь была выбрана для экспериментов.
Эту смесь растворяют в солевом растворе (NaCl с концентрацией 9,5 г/л) в количестве 10 г/л.
12
15
6
Сразу после приготовления питательного вещества в нее добавляли различные маркеры ферментативной активности, один хромогенный маркер [2-нитрофенил-β-D-галактопиранозид (CHNO)] в количествах, находящихся в пределах от 1 г/л, и три флуорогенных маркера [4-метилумбеллиферил-β-D-глюкоронид, 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид и 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкозид] в количествах, находящихся в пределах от 0,2 г/л каждого.
К смесям питательных веществ и маркерам ферментативной активности были добавлены другие вещества, такие как активаторы роста, в частности глюкоза (10 г/л), неорганические соли, в частности гидроортофосфат калия (5,5 г/л) и дигидроортофосфат калия (5,5 г/л). Выбранное питательное вещество вместе с маркерами ферментативной активности и другими компонентами обеспечивается растворенным в первом растворителе в количествах, находящихся в пределах от 32,6 г/л.
После образования питательной смеси и вместе с растворением маркеров ферментативной активности и других компонентов в первом растворителе их подвергают стерилизации фильтрованием. Питательные смеси вместе с маркерами ферментативной активности и другими компонентами, растворенными в первом растворителе, приводят в контакт с одной или множеством трехмерных структур искусственных керамических материалов, в частности жженого гидроксиапатита, которые были предварительно подвергнуты стерилизации при 180°С в течение 60 минут.
Время контакта соединения составляет 30 минут.
3
2
3
Эта структура имеет удельную поверхность, равную 5×10 м/м, и ее формирует множество нано-, микро- и макрополостей.
Трехмерная структура имеет размеры полостей, которые соответствуют различным комбинациям всех диаметров полостей или просветов, соответствующих нано-, полумикро- и микрополостям с диаметрами или просветами в диапазоне от 5 нм до 10 мкм в форме пор. Эти структуры имеют цилиндрическую форму диаметром 100 см и высотой 2 см.
После завершения абсорбции первый растворитель удаляли посредством сушки трехмерных структур при температуре, равной 60°С, в вакуумной печи в течение 3 часового периода.
Подтверждают возможность выделения целевых микроорганизмов, убеждаясь в том, что структуры имеют пределы детекции, составляющие менее чем 1 КОЕ/100 мл, посредством фильтрации 1 л суспензии, искусственно зараженной Е. coli с концентрацией вплоть до 6 КОЕ, что означает, что 0,6 КОЕ находится в каждых 100 миллилитрах, принимая во внимание, что их можно детектировать по флуоресценции и по желтоватому цвету структуры.
6
В случае этого анализа суспензии целевых микроорганизмов в солевом изотоническом растворе с концентрацией, составляющей 3×10 КОЕ/мл, приводят в контакт с трехмерными структурами в количествах, находящихся в пределах от 1 мл, и распределяют по всей поверхности.
Затем трехмерные структуры держат при температурах, составляющих 35±2°С, в аэробных условиях на протяжении периода вплоть до 4 часов, что соответствует продолжительности скрытой фазы роста Е. coli.
После завершения инкубации в течение самое большее 4 часов присутствие целевых микроорганизмов детектируют во всех вариантах, в одном случае с засевом по отдельности каждого микроорганизма, а в другом случае с использованием смеси всех их. В случае Е. coli отмечали флуоресценцию и изменение цвета структуры на желтоватый цвет; в случае Е. coli O157 : Н7 и Aeromonas hydrophila отмечали лишь изменение цвета структуры. Во всех случаях детекция имела место спустя 2 часа.
В случае Enterococcus avium голубая флуоресценция без изменения цвета отмечалась в структуре спустя 3 часа, а мицелиальные грибы росли вроде черной структуры на поверхности устройства, хотя желтоватый цвет отмечался сначала в зоне роста. В случае, когда в образец засевают смесь микроорганизмов, можно наблюдать все реакции.
Пример 18
3
5
3
Штамм S. aureus проверяют, как описано в примере 11, и питательное вещество и устройство готовят в соответствии с V26 этого примера с отличием, что трехмерная структура имеет форму дисков высотой 0,1 мм и с диаметром 60 см. Объем воздуха = 3 м пропускают через весь объем с помощью устройства для фильтрации воздуха, которое засасывает его благодаря отрицательному давлению. Загрязнение имитируют с использованием штамма анализа с концентрацией, составляющей 10 КОЕ/м, перед фильтрацией воздуха для проверки, оказывает ли его поток какое-либо влияние на обезвоживание структуры или ее работу. В случае подвергания устройства воздействию воздуха его увлажняют с помощью второго растворителя, состоящего из дистиллированной воды, и допускают его инкубацию при температуре и в условиях, описанных в примере 11. S. aureus можно идентифицировать спустя 240 минут.
Пример 19
8
Такой же, как пример 1, с отличием, что готовят два устройства в соответствии с V1 примера 1, тогда как к одному устройству добавляют ципрофлоксацин в количестве, равном 0,003 мкг, а к другому - гентамицин в количестве, равном 0,2 мкг. Засевают 0,2 мл суспензии микроорганизмов с использованием штамма Е. coli, выделенного из мочи, с концентрацией, составляющей 3×10 КОЕ/мл, и осуществляют инкубацию в течение 4 часов. Не отмечают рост Е. coli спустя 4 часа в устройстве, содержащем ципрофлоксацин, или флуоресценцию в устройстве, содержащем гентамицин.