Спектрофотометрическое определение 5-аминосалициловой кислоты в моче для оценки ее экскреции из организма человека

С. Ю. Гармонов, З. Ч. Нгуен, И. Ф. Мингазетдинов, Л. М. Юсупова,

Н. С. Шитова, Р. Н. Исмаилова, В. Ф. Сопин

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ 5-АМИНОСАЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЕЕ ЭКСКРЕЦИИ ИЗ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

Ключевые слова: 5-аминосалициловая кислота, моча, спектрофотометрия.

Установлены условия спектрофотометрического определения месала-зина в моче при использовании 5,7-дихлор-4,6-динитробензофураксана и 7-хлор-

4,6-динитробензофуроксана как аналитических реагентов. Оптимальные результаты определений достигаются при длине волны 500 нм и pH 6-8. Предел обнаружения месалазина составляет 0,31 мкг/мл. Показана возможность использования разработанных методик для оценки индивидуальных фенотипов метаболизма процессов ацетилирования месалазина у человека.

Keywords: 5-aminosalicilic acid, urine, spectrophotometry.

The condition of spectrophotometric determination of mesalazine in the urine are established with 5,7-dichlorine-4,6-dinitrobenzofuroxan and 7-chlorine-4,6-dinitrobenzofuroxan application as analytical reagent. The optimal result of the determination are observed at the wavelength of 500 nm and pH 6-8. The detection limit of mesalazine is 0,31 mcg/ml. The possibility of the applicated the developed methodology was demonstrated for the diagnostic of individual phenotypes of acety-lation processes mesalazine in humans.

Одной из важных проблем фармацевтической химии, которая возникает при обеспечении безопасного и эффективного применения лекарственных средств (ЛС), является подбор индивидуальных терапевтических доз для каждого больного. В связи с этим весьма актуальной является оценка активности ферментативных систем организма человека, отвечающих за процессы биотрансформации лекарственных веществ (ЛВ).

Метаболизм лекарственных средств (ЛС) осуществляется путем реакций химической модификации (фаза I - окисление, восстановление, гидролиз) и конъюгации с эндогенными соединениями (фаза II - ацетилирование, сульфатация, глюкоронизация) при участии различных ферментов. Для фармакокинетических исследований генетически детерминированных процессов биотрансформации ЛВ в организме человека путем N-ацетилирования нашли применение вещества, содержащие аминные функциональные группы (гидразиды кислот, производные изоникотиновой и п-аминобензойной кислот, сульфаниламиды и др.), для которых показано бимодальное распределение у населения и сформированы фенотипы быстрого и медленного метаболизма, различающиеся генетически детерминированной индивидуальной активностью N-ацетилтрансферазы гепатоцитов [1,2].

Месалазин (месаламин, 5-аминосалициловая кислота) находит применение для лечения воспалительных заболеваний кишечника, особенно неспецифического язвенного колита и болезни Крона [3,4]. Для этого часто используются препараты как на основе суб-

станции месалазина, так и его пролекарств (сульфасалазин, олсалазин, балсалазид) (рис. 1). Однако применение пролекарств месалазина весьма ограничено из-за большого количества побочных эффектов при их применении (лекарственные гепатиты, синдром Стивена-Джонсона, гемолитическая анемия, интерстициальный нефрит и др.), в формирование которых вносят вклад и особенности генетического статуса пациента [3,4].

В организме под действием ацетилирующих ферментов месалазин метаболизирует-ся, образуя N-ацетилмесалазин (Ы-ацетил-5-аминосалициловую кислоту). При этом биотрансформация месалазина в организме человека контролируется ферментами N-ацетилтрансферазы 1-го типа (NAT1) и 2-го типа (NAT2). Тем не менее, неизвестно какой именно из этих ферментов играет ключевую роль в N-ацетилировании месалазина [5]. В тоже время для оптимизации режимов дозирования, предотвращения побочных эффектов необходимы способы оценки фенотипов ацетилирования при использовании месалазина как фармакогенетического маркера. При этом выбор надлежащего аналитического метода для количественного определения месалазина в биологических образцах играет важную роль в оценке и интерпретации его биодоступности, биоэквивалентности и индивидуальных различий в фармакокинетических данных.

Для количественного определения месалазин и его метаболита в различных биологических матрицах описаны спектрофотометрические [6] и хроматографические методы анализа [7-13]. Однако в настоящее время в литературе не представлены спектрофотометрические способы оценки интенсивности процессов ацетилирования месалазина при его экскреции с мочой.

В связи с этим проведение исследований по разработке простых, избирательных, экспрессных и точных методик спектрофотометрического определения месалазина в биологических объектах являются весьма актуальными. Цель работы состояла в изучении возможности оценки фенотипа ацетилирования при выведении месалазина с мочой человека спектрофотометрическим методом анализа при использовании 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (хлорБФО) и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана как реагентов (дихлорБФО).

Экспериментальная часть

Спектрофотометрические измерения проведены на спектрофотометре СФ-26, оптическую плотность исследуемых растворов в видимой области измеряли в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см. Синтез хлорБФО и дихлорБФО проведен Л.М. Юсуповой [14, 15]. Использованы субстанция месалазина (Alfa Aesar, Германия) и его лекарственная форма - таблетки месакола, покрытые кишечнорастворимой оболочкой по 400 мг (SUN Pharmaceutical Industries Ltd, Индия).

Методика определения. Для определения содержания месалазина в мерную колбу объемом 10 мл отбирают 0,5 мл образца анализируемой мочи, добавляют 0,5 мл диметилсульфоксида, 0,15 мл 0,02 М раствора хлорБФО (дихлорБФО), 2 мл фосфатного буферного раствора (0,2 М) и доводят дистиллированной водой до метки. Для приготовления раствора сравнения используется образец мочи до приема тест-препарата и все компоненты, кроме реагента, добавляются так же, как и в исследуемый раствор. Через 5 мин после приготовления растворов измеряется их оптическая плотность при длине волны 500 нм и толщине кюветы 1 см. Количество выведенного месалазина определяют по градуировочному графику.

Результаты и их обсуждение

Наиболее распространенным в клинической практике методом детектирования содержания тест-препаратов ацетилирования и их метаболитов благодаря универсальности и невысокой стоимости является спектрофотометрия. Однако, в этих случаях для достижения избирательности аналитических определений ЛВ в биологических матрицах важным условием является проведение реакций, протекающих с образованием окрашенных соединений.

Взаимодействие месалазина с 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксаном и 7-хлор-

4,6-динитробензофуроксаном в полярных средах приводит к образованию интенсивно окрашенных в красный цвет устойчивых продуктов реакции:

02N Q2n

На рис. 2 представлены спектрально-аналитические характеристики растворов 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана, 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана, а также продуктов их взаимодействия с месалазином. Полосы поглощения продуктов реакции месалазина с реагентами имеют сдвиг в сторону больших длин волн, чем для самих аналитических реагентов соответственно. Кроме того, в случае продукта реакции месалазина с 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном достигаются более высокие значения интенсивности поглощения. На рис. 3 представлены спектры поглощения растворов 7-хлор-4,6-

динитробензофуроксана, смеси 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с мочой и продукта реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с месалазином. Из представленных спектрально-

аналитических данных видно, что в условиях анализа при ^=500 нм, влияние реагента и мочи на полосы поглощения продукта аналитической реакции весьма незначительно. Как показали проведенные эксперименты, его можно полностью исключить, включив эти компоненты в состав раствора сравнения при спектрофотометрическом детектировании.

Рис. 2 - Спектры поглощения: 1 - 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10"4М) в ацетонитриле, 2 - 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4 М) в ацетонитриле, 3 - производного месалазина (3*10-5М) и 5,7-дихлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4М), 4 -производного месалазина (3*10-5М) и 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4 М) в смеси диметилсульфоксид - вода (5:95 % об.), рН=6,8. /=1 см

A

Рис. 3 - Спектры поглощения: 1 - 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4 М) в ацетонитриле, 2 - производных компонентов мочи и 7-хлор-4,6-

динитробензофуроксана (1,5*10-4М), 3 - 4,6-динитробензофуроксанового производного месалазина (3*10-5 М) в смеси диметилсульфоксид - вода (5:95 % об.), pH=6,8. /=1 см

Было установлено, что используемые добавки органических растворителей при проведении аналитической реакции существенно влияют на устойчивость 4,6-динитропроизводного месалазина и интенсивность его полосы поглощения (рис. 4). Как видно, максимальное светопоглощение наблюдается при использовании смеси димети-сульфоксид - вода (5:95 % об.), что может быть связано с обеспечением оптимальной растворимости продукта реакции. Ранее было установлено, что в зависимости от pH среды

4,6-динитобензофуроксановые ароматических аминов в водных растворах могут существовать в виде различных форм, обусловленных проявлением ЫН-кислотности соединений [15]. В связи с этим было исследовано влияние рН на интенсивность полосы поглощения продукта реакции (рис. 5). Как видно, наиболее полное образование производного и максимальная интенсивность светопоглощения наблюдается в интервале pH 6-8, причем в этом интервале максимум поглощения соответствует аналитической длине волны 500 нм.

Рис. 4 - Спектры поглощения 4,6-динитробензофуроксановых производных месалазина (3*10"5 М): 1 - в воде; 2 - в смеси этанол-вода (30:70, об. %), 3 - в смеси ацетонитрил-вода (30:70, об.%), 4 - в смеси диметилсульфоксид-вода (30:70, об. %), 5 - в смеси диметилсульфоксид-вода (5:95, об. %), рН=6,8, /=1 см

Рис. 5 - Зависимость оптической плотности от рН при проведении реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана (1,5*10-4 М) и месалазина (3*10-5 М) в смеси диметилсуль-фоксид-вода (5:95 об. %), Х=500 нм, /=1 см

Оптимальную концентрацию реагента при проведении реакции 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана с месалазином определяли экспериментально. Как видно из дан-

ных, представленных на рис. 6, при двукратном и более избытке реагента достигается полное количественное завершение аналитической реакции.

А

С

Рис. 6 - Влияние концентрации реагента 7-хлор-4,6-динитробензофуроксана на аналитический сигнал при проведении реакции с месалазином (3*10- М) в смеси диме-тилсульфоксид-вода (5:95 об. %), А=500 нм, /=1 см

При этом хорошо воспроизводимые зависимости оптической плотности от концентрации месалазина линейны и подчиняются закону Бугера-Ламберта-Бера для области концентраций 0,32 - 4,6 мкг/мл:

А = 0,1594Сх (мкг/мл)+0,0012 (Н2 = 0,9994; П=12).

Предел обнаружения месалазина, опредленный по 3Э критерию, при указанных условиях спектрофотометрического определения достигает 0,3 мкг/мл, что ниже интервала фармакокинетических концентраций лекарственного вещества.

Правильность определения месалазина в моче была оценена методом введено - найдено. Полученные данные свидетельствовали, что при выбранных условиях детектирования 4,6-динитробензофуроксанового производного месалазина компоненты мочи не оказывают мешающего влияния на спектрофотометрические определения аналита.

С помощью разработанной методики избирательного спектрофотометрического определения месалазина в моче была проведена оценка его количества при выведении с мочой из организма человека. Кинетические кривые экскреции лекарственного вещества с мочой приведены на рис. 7. За 10 часов исследования было выведено 1,6 % (12,89±1,12 мг) свободного месалазина у пациентов с медленным фенотипом ацетилирования, а у лиц с быстрым фенотипом ацетилирования 0,8 % (6,43±0,51 мг) соответственно. Эти результаты согласуются с литературными данными, где количество месалазина, выведенное с мочой составляет около 3-6 % за 72 часа [4]. Установление количества выводимого месалазина в процентах от вводимой дозы (фракции дозы) позволяет судить о фенотипе ацетилирования обследуемых. При этом уровень выводимого неизменным месалазина для быстрых и медленных ацетиляторов различается в два раза.

Таким образом, разработанные методики в дальнейшем можно использовать в клинической практике для определения фенотипа ацетилирования пациентов при использовании месалазина в качестве тест-препарата процессов ацетилирования.

1,8 -,

0,6 -

0,4 -0,2 -oi

1,6 -

1,4 -

1,2 -1 -

0,8 -

f, час

О

2

4

6

8

10

12

Рис. 7 - Кинетические кривые выведения свободного месалазина с мочой. Медленый фенотип ацетилирования (1), быстрый фенотип ацетилирования (2). Прием месалазина в разовой дозе 800 мг в виде лекарственной формы месакола

1. Кукес В.Г., Грачев С.В., Сычев Д.А., Раменская Г.В.. Метаболизм лекарственных средств. Научные основы персонализированной медицины. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. - 293 с.

2. Гармонов С.Ю., Евгеньев М.И., Зыкова И.Е., Аналитические методы исследования генетического полиморфизма организма человека, в кн. «Проблемы аналитической химии. Т.11. Химический анализ в медицинской диагностике». - М.: Наука, 2010.- С. 21-65.

3. Javier P.G., Fernando G., JoséM., JoséM.P. Digestive //Diseases and Sciences. - 2002. - V. 47. - № 3. - Р. 471 - 488.

4. Sandborn W.J., Hanauer S.B. // Aliment Pharmacol Ther .- 2003. - V. 17. - Р. 29- 42.

5. HendirkL., Martina K, Alexander J., Uwe F., Fritz S. // Eur J Clin Pharmacol.- 2009. - V. 65. - Р. 47- 54.

6. PieniaszekHJ.Jr., Bates TR.//Res Commun Chem Pathol Pharmacol. - 1975. - V. 12. - № 3. - Р. 571 - 581.

7. Jette T,. Steen H.H. // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. - 1991. - V. 570. -№ 1. - Р.109 -117.

8. Palumbo G., Carlucci G., Mazzeo P., Frieri G., Pimpo MT., Fanini D. // J Pharm Biomed Anal. - 1995. - V. 14. - № 1-2. - Р.175 -180.

9. Hussain F. N., Ajjan R. A., Moustafa M., Anderson J. C., Riley S. A. // Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. - 1998. - V. 716. - № 1-2. - Р.257 -266.

10. Beata B., Jolanta N., Jerzy B. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2000. - V. 22. - № 2. -Р.341 -347.

11. Giancarlo P,et al. // Biomed. Chromatogr. - 2005. - V. 19. - Р.350 -354.

12. Nobilis M. et al. // Journal of Chromatography A. - 2006. - V. 1119. - Р.299 -308.

13. Elisabetta P., Marcello L., Patrizia S., Giulia R., Enrico R., Aldo R. // Journal of Chromatography B. - 2008. -V. 872. - № 1-2. - Р.99 -106.

14. BaileyA.S., Case J.R, Tetrahedron. - 1958. - V. 3. - Р.113 -131.

15. Шарнин Г.П., Левинсон Ф.С., Акимова С.А. А.С. 657025 (СССР). - 1979. - V. 14.

16. ЕвгеньевМ.И., Гармонов СЮ., ШакироваЛ.Ш., БрысаевА.С. // Хим.-фарм. журн. . - 1999. - V. 33. - № 5. - Р.50 -53.

© С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ, serggar@mail.ru; З. Ч. Нгуен - асп. той же кафедры; И. Ф. Мингазетдинов -студ. КГТУ; Л. М. Юсупова - д-р хим. наук, проф. каф. химии и технологии органических соединений азота КГТУ; Н. С. Шитова - канд. хим. наук, доцент ОПП ЦМД КГТУ; Р. Н. Исмаилова -канд. хим. наук, доц. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ; В. Ф. Сопин - д-р хим. наук, проф. зав. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ.

Литература