Оценка роли бактерий рода Campylobacter в возникновении пищевых токсикоинфекций и современные методы обнаружения возбудителя

ОБЗОРЫ

Для корреспонденции

Ефимочкина Наталья Рамазановна - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБНУ «НИИ питания» Адрес: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д. 2/14 Телефон: (495) 698-53-83 E-mail: karlikanova@ion.ru

Н.Р. Ефимочкина

Оценка роли бактерий рода Campylobacter в возникновении пищевых токсикоинфекций и современные методы обнаружения возбудителя

Evaluation of the role of Campylobacter spp. in the occurrence of foodborne diseases and modern methods to detect the pathogen

N.R. Efimochkina

ФГБНУ «НИИ питания», Москва Institute of Nutrition, Moscow

Гастроэнтероколиты, вызванные термофильными бактериями рода Campylobacter, являются наиболее распространенными острыми инфекционными зоонозными заболеваниями с пищевым путем передачи. Наибольшую эпидемиологическую значимость представляют Campylobacter jejuni, которые обусловливают до 90% подтвержденных лабораторных случаев пищевого кампилобактериоза. Частота обнаружения кампилобактеров у клинически здоровых сельскохозяйственных животных и домашней птицы, а также в полученном от них сырье свидетельствует о значительном распространении этих зооноз-ных патогенов и о высоких рисках контаминации ими пищевых продуктов и воды. Основными факторами передачи при кампилобактериозах являются птицепродукты (до 70% от общего числа случаев), питьевая вода (8%), сырое молоко (5%). Важным фактором риска распространения этого эмерджентного патогена является его способность персис-тировать в водных экосистемах. Интенсификация сельского хозяйства, расширение спектра применяемых дезинфектантов и антисептиков, неконтролируемое использование антибиотиков в животноводстве все чаще приводит к селективному отбору наиболее устойчивых форм Campylobacter spp., обладающих антибиотикорезистентостью и множественными факторами патогенности. Дан обзор современных методов детекции Campylobacter spp., подробно изложены культуральные методы детекции C. jejuni, основанные на применении селективных питательных сред и диагностических наборов для характеристики фенотипических профилей штаммов. Подчеркивается, что основой микробиологического контроля должны стать молекулярные методы на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени, позволяющие проводить оценку присутствующих в пищевых продуктах термотолерантных кампилобактеров, включая C. jejuni.

Ключевые слова: Campylobacter jejuni, пищевой кампилобактериоз, факторы патогенности, пищевые продукты, методы детекции

5

Infections caused by Campylobacter spp. are now considered to be one of the most important foodborne diseases worldwide, this organism is one of the most epidemiologically significant zoonotic pathogens. Among these pathogens Campylobacter jejuni have the greatest epidemiological importance, they are responsible for 90% of laboratory confirmed cases of food campylobacteriosis. The frequency of detection of campylobacters in the environmental and on many raw foods, of both plant and animal origin, in normal intestine biota of domestic and wild animal and birds, indicates the prevalence of these bacteria and the high risk of contamination of food and water. The main factors of transmission in sporadic campylobacteriosis are the poultry and poultry products (up to 70% of the total number of cases), water (8%), raw milk (5%). One of the risk factors for the spread of emergent pathogen is its ability to persist in aquatic ecosystems. Continuing changes in landscape and agricultural intensification can cause further enhance microbial contamination of freshwater bodies and groundwater, and the associated increase in the number of cases of waterborne campylobacteriosis. Intensification of agriculture, expanding the range of applied disinfectants and antiseptics, uncontrolled use of antibiotics in livestock often leads to the selection of the sustainable strains of Campylobacter spp., which have antibiotic resistance and multiple virulence determinants. This paper presents an overview of modern methods for the detection of Campylobacter spp., detailed culture and biochemical methods for the isolation of C. jejuni based on the use of selective culture media and diagnostic kits for the characterization of the phenotypic profiles of the strains. These methods are the starting point in selecting the most effective schemes of food control and surveillance. It is emphasized that the basis of microbiological analysis should be molecular methods based on real-time PCR, which allows to quantify present in foods of thermotolerant Campylobacter, including C. jejuni. Keywords: Сampylobacter jejuni, food campylobacteriosis , pathogenicity factors, foods, detection methods

# ' #

Современные системы обеспечения безопасности пищевых продуктов требуют детального знания и исследования особенностей новых патогенов, биохимических и генетических механизмов формирования их вирулентности, адаптации к неблагоприятным условиям внешней среды и трансформации бактериальных геномов. Установление эпидемической значимости тех или иных пищевых патогенов предполагает комплексный анализ фено- и генотипических признаков, определяющих таксономическую принадлежность и наличие факторов патогенности микроорганизмов, профиль резистентности к антимикробным препаратам, а также их идентификацию как факторов риска в пищевой цепочке.

Изменение свойств микроорганизмов в условиях антропогенной трансформации внешней среды сопровождается появлением новых или эволюционно измененных возбудителей заболеваний с пищевым путем передачи (эмерджентных пищевых патогенов), обладающих множественными факторами патогенности и устойчивостью к антимикробным средствам. Жизнедеятельность микроорганизмов в той или иной экологической нише непосредственно связана с генетически закрепленной способностью включать регуляторные

6

системы изменчивости на разных стадиях развития микробной клетки. В свете современных концепций перестройка популяционных структур патогенов по факторам патогенности в условиях окружающей среды существенно отличается от характера персистенции возбудителя в клеточных системах макроорганизма при различных типах пищевых инфекций, что требует углубленного изучения биохимических и генетических аспектов этой проблемы.

Обширная группа условно-патогенных и патогенных бактерий включает значительное число микроорганизмов, из которых наиболее опасными в эпидемиологическом отношении являются отдельные представители родов Salmonella, Escherichia, Enterobacter, Listeria и Campylobacter и другие микроорганизмы, способные в определенных условиях вызывать заболевания с пищевым путем передачи.

Оценивая рейтинг вышеназванных микроорганизмов по частоте возникновения вспышек, числу пострадавших и тяжести заболевания, международные организации относят к числу наиболее важных эмерджентных патогенов следующие виды: бактерии рода Salmonella, энтерогеморра-гические E. coli (ЕНЕС), Listeria monocytogenes,

Н.Р. Ефимочкина

Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica. Доминирующее влияние этих микроорганизмов в возникновении пищевых инфекций было установлено в результате анализа массовых вспышек заболеваний в разных странах мира с 1970-1980-х гг. [1]. В подавляющем большинстве они относились к зоонозам и возникали как вследствие потребления продуктов, полученных от больных животных, так и в результате вторичной контаминации при заготовке и переработке животноводческого сырья, в процессе приготовления и хранения пищи [2].

Гастроэнтероколиты, вызванные бактериями рода Campylobacter, являются наиболее распространенными острыми инфекционными зооноз-ными заболеваниями с пищевым путем передачи. Микроорганизмы Campylobacter spp. известны более 80 лет как возбудители заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц, в 1957 г. они впервые были выделены от больных людей с клиническими признаками гастроэнтерита. В результате установленной взаимосвязи между кишечными инфекциями, обусловленными термофильными кампилобактериями, в животноводческих хозяйствах и заболеваниями человека экспертный комитет ВОЗ в 1982 г. включил этот микроорганизм в официальный перечень возбудителей пищевых токсикоинфекций [3]. В настоящее время общепризнано, что заболевание людей кампило-бактериозом вызывают бактерии Campylobacter jejuni (ранее известные как Campylobacter fetus ssp. jejuni).

В некоторых странах, таких как США и Великобритания, отмечается резкий рост случаев заболеваемости кампилобактериозом, число которых превалирует над другими распространенными пищевыми инфекциями - сальмонел-лезом и шигеллезом. Широкое распространение кампилобактериозного энтерита в различных странах мира и большой социально-экономический ущерб от этого заболевания объясняют его включение ВОЗ в список эмерджентных пищевых инфекций [4].

Рассматривая таксономию возбудителей кам-пилобактериоза, следует отметить, что семейство Campylobacteriaceae включает 3 рода - Campylobacter, Arcobacter и Sulfurospirillum [5], каждый из которых включает несколько видов: Campylobacter spp. - 16 видов, Arcobacter spp. - 4 вида, Sulfurospirillum spp. - 5 видов.

Род Campylobacter, впервые описанный M. Veron и R. Chatelain в 1973 г., представлен грамотрицатель-ными неспорообразующими палочками изогнутой или спиральной формы, с полярным расположением жгутиков на одном или двух концах, которое обусловливает специфическую штопорообразную подвижность бактериальной клетки. Эти бактерии являются каталазо- и оксидазоположительными микроаэрофилами; оптимальная атмосфера для

роста: 3-15% кислорода, 2-10% углекислого газа и 85-87% азота. Шесть таксонов: Campylobacter jejuni subsp. jejuni, Campylobacter jejuni subsp. doylei, Campylobacter coli, Campylobacter lari, Campylobacter upsaliensis и Campylobacter helveticus образуют генетически родственную группу термофильных кампилобактеров с оптимальной температурой роста +42 °С, обладающих способностью инфицировать человека и теплокровных животных.

Большинство видов семейства Campylobacte-riaceae характеризуется широкой распространенностью и разнообразием источников выделения (табл. 1), наибольшее значение в возникновении пищевых инфекций имеют C. jejuni и C. coli. В развивающихся странах эпидемически значимым считают также вид C. upsaliensis.

Видовая идентификация Campylobacter spp. основана на определении фенотипических характеристик, включающих биохимические тесты, профили антибиотикорезистентности и температурные значения роста. Специфические свойства вида Campylobacter jejuni включают анаэробные/ микроаэрофильные условия роста, температурный оптимум 42-43 °С, неспособность расти при температуре ниже 30 °С, что ассоциируется с отсутствием генов, ответственных за синтез белков холодового шока, играющих ведущую роль в адаптации многих бактерий к низким температурам [6]. Другие фенотипические характеристики C. jejuni приведены в табл. 2.

Эпидемиология кампилобактериоза в настоящее время является объектом пристального внимания и детального изучения в большинстве развитых стран мира, поскольку бактерии рода Campylobacter все чаще регистрируются в качестве этиологического агента при пищевых вспышках, а также в спорадических случаях бактериальных гастроэнтеритов и диарейных заболеваний. ВОЗ признает, что около 1% населения Западной Европы ежегодно инфицируется кампилобакте-рами [7], поэтому Campylobacter считается одним из наиболее значимых «новых» зоонозных патогенов, способных вызывать заболевания человека и животных.

Кампилобактериоз в большинстве случаев протекает с симптомами энтероколита и гастроэнтерита, продолжительность заболевания составляет от 2-3 дней до 2 нед и более, человек также может быть бессимптомным носителем в течение длительного времени.

Экстраинтестинальные кампилобактериозные инфекции преимущественно включают бактериемию, гемолитический уринарный синдром, перитониты, очаговые инфекции. У иммунокомпромис-сных групп населения персистирующие диарейные заболевания и бактериемия с трудом поддаются лечению. Кампилобактериозы редко имеют летальный исход, однако уровень смертности при

7

Таблица 1. Виды семейства Campylobacteriaceae

#

Вид Резервуар Заболевания

C. coli Свинья, птица, крупный рогатый скот, овца Гастроэнтериты, септицемия

C. concisus Человек Периодонтальные заболевания, гастроэнтериты

C. curvus Человек Периодонтальные заболевания, гастроэнтериты

C. fetus subsp. fetus Крупный рогатый скот, овца Септицемия, гастроэнтериты, самопроизвольные аборты, менингиты

C. fetus subsp. venerealis Крупный рогатый скот Септицемия

C. gracilis Человек Периодонтальные заболевания, абсцессы

С. helveticus Кошка, собака Нет данных

C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis Свинья, крупный рогатый скот, олень, хомяк Гастроэнтериты

C. hyointestinalis subsp. lawsonii Свинья Нет данных

C. hyoilei Свинья Нет данных

С. jejuni subsp. doylei Человек Гастроэнтериты, гастриты, септицемия

С. jejuni subsp. jejuni Птица, свинья, крупный рогатый скот, Гастроэнтериты, септицемия, менин-

овца, собака, кошка, вода, кролик, норка, гиты, самопроизвольные аборты, про-

насекомые ктиты, GBS

С. lari Птицы, вода, собака, кошка, обезьяна, лошадь Гастроэнтериты, септицемия

С. mucosalis Свинья Нет данных

С. rectus Человек Периодонтальные заболевания

C. showae Человек Периодонтальные заболевания

С. sputorum bv. sputorum Человек, крупный рогатый скот, птицы Абсцессы, гастроэнтериты

С. sputorum bv. faecalis Овца, буйвол Нет данных

C. upsaliensis Собака, кошка Гастроэнтериты, септицемия, абсцессы

C. insulaenigrae Тюлень, дельфин Нет данных

С. lanienae Крупный рогатый скот, свинья, человек Нет данных

С. hominis Человек Гастроэнтериты у иммунокомпромисс-ных групп

Ф

Таблица 2. Фенотипические характеристики C. jejuni

Тест Характеристика Тест Характеристика

Продукция каталазы + Редукция нитритов -

Продукция уреазы - Продукция ДНКазы +/-

Утилизация гиппурата + Наличие цитохромоксидазы +

Утилизация углеводов - Рост в присутствии 3,5% ЫаС! -

Продукция щелочной фосфатазы + Редукция трифенилтетразолий хлорида +

Утилизация цитрата + Продукция индола +

Утилизация сукцината + Чувствительность к налидиксовой кислоте +

Продукция ^ - Устойчивость к цефалотину +

Редукция нитратов до нитритов + Рост на угольно-дрожжевом агаре +/-

этой инфекции может недооцениваться, поскольку ассоциируется с другими этиологическими факторами.

Достаточно хорошо изучены такие осложнения кампилобактериоза, как синдром Гийена-Барре (вВБ), синдром Миллера-Фишера (МРБ) и реактивные артриты, которые являются иммунным ответом на гастроинтестинальную инфекцию [8].

8

GBS - это обратимый паралич, поражающий периферическую нервную систему. C. jejuni способен к ганглиозидоподобной мимикрии в липополи-сахаридном слое, вызывая иммунный ответ этих структур, что приводит к повреждению периферических нервных тканей, богатых ганглиозидами. Основными серотипами при GBS являются HS:19 и HS:41. Реактивные артриты возникают после

Н.Р. Ефимочкина

кампилобактериозной инфекции, по данным разных авторов, в 2,6-45% случаев, и ассоциируются с обнаружением C. jejuni [7].

Учитывая значительную распространенность и циркуляцию кампилобактеров в природе, исследователи уделяют большое внимание частоте обнаружения этих микроорганизмов в различных объектах. Они присутствуют в окружающей среде как комменсалы или патогены в организме домашней птицы или животных, и могут персистировать длительное время при неблагоприятных условиях. В первую очередь C. jejuni рассматривается как нормальный обитатель кишечника птиц. Степень бактерионосительства у домашней птицы очень высока и достигает 90% [9]. В содержимом кишечника кур количество C. jejuni может достигать 106 кОЕ/г.

Однако частота обнаружения бактерий рода Campylobacter у других видов сельскохозяйственных животных и птицы, а также в полученном от них сырье свидетельствует о значительном распространении этих микроорганизмов и о возможной контаминации вырабатываемых пищевых продуктов. Данные о частоте выделения кам-пилобактеров обобщены Т. Humphrey и соавт. в 2007 г. [7] и приведены в табл. 3.

Представленный анализ сделан по результатам исследований, опубликованных в различных странах мира (более 20 стран). Показано, что при сравнительно высокой частоте обнаружения этих бактерий в разных видах мясного сырья наибольший риск для здоровья человека связан с употреблением куриного мяса, поскольку его удельный вес в структуре питания населения очень велик.

Основными источниками спорадических кампи-лобактерных токсикоинфекций являются домашняя птица (до 70% от общего числа случаев), кон-

такты с домашними животными (6-30%), питьевая вода (8%), сырое молоко (5%).

Вспышки инфекций, связанных с заражением питьевой воды возбудителем Campylobacter jejuni, в последние годы стали довольно частым явле-ним в Скандинавских странах (Швеции, Норвегии и Финляндии), Новой Зеландии, США. Это связано с тем, что в районах с редким населением пресноводные экосистемы подвержены микробному загрязнению со стороны сельскохозяйственных предприятий. Выявлены сезонные колебания уровней зараженности Campylobacter водоемов: более высокие средние значения установлены летом, в сезон с максимальным использованием воды в рекреационных целях. Вспышки кампилобакте-риоза, связанные с водой и молочными продуктами, преимущественно регистрируются весной и осенью, в то время как спорадические заболевания наиболее часто наблюдаются в летний период.

Особенности возникновения этих заболеваний связаны в значительной мере с физиологическими свойствами возбудителя: C. jejuni являются термофильными микроорганизмами и не развиваются при температурах ниже 30 °С; они погибают при высушивании, в присутствии высоких концентраций кислорода и при низких значениях рН среды. Обычные дезинфицирующие средства весьма эффективны против бактерий рода Campylobacter, солнечная радиация также губительно действует на эти микроорганизмы. Вместе с тем персистен-ция возбудителя в водных экосистемах является одним из основных факторов риска и обусловливает особенности экологии этого эмерджентного патогена.

Продолжающиеся изменения в структуре землепользования и интенсификация сельского хозяйства в ряде стран могут стать причиной даль-

Таблица 3. Выделение кампилобактеров из животноводческой продукции

Объект исследования Доля положительных проб, % Пределы колебаний, %

Молочные животные 30,0 6-64

Мясной скот 62,1 42-83

Овцы 31,1 18-44

Свиньи 61,0 50-69

Тушки кур 58,7 2,9-100

Тушки индеек 78,0 20-100

Тушки уток 38,0 0-88

Сырое молоко 3,2 0-9,2

Мясо кур в розничной торговле 57,4 23-100

Мясо индейки в розничной торговле 47,8 14-94

Мясо утки в розничной торговле 30,2 19-46

Свинина в розничной торговле 2,0 0-5,1

Говядина в розничной торговле 2,7 0-9,8

Баранина в розничной торговле 6,0 0-12,2

2000

1000

0

Заболеваемость кампилобактериозом в Российской Федерации в 2000-2012 гг.

/—71

2000 г.

2001 г.

2003 г.

2004 г.

2005 г.

2006 г.

2007 г.

2008 г.

2009 г.

2010 г.

2011 г.

2012 г.

256

292

300

364

394

398

395

485

515

803

1153

1446

нейшего усиления микробного заражения пресных водоемов и грунтовых вод и связанного с этим увеличения количества случаев кишечных заболеваний с водным путем передачи, в том числе таких, как кампилобактериоз.

Заболеваемость кампилобактериозом в европейских странах в 1993-2000 гг. показана в табл. 4, которая включает данные 7-го и 8-го докладов Программы ВОЗ по надзору и контролю за пищевыми инфекциями и интоксикациями в Европе.

Во всех европейских странах на протяжении описанного периода отмечена четкая тенденция увеличения числа заболеваний, вызванных бактериями рода Campylobacter. Наибольший уровень заболеваемости зарегистрирован в Англии и Уэльсе.

Сведений о вспышках или спорадической заболеваемости, связанных с Campylobacter, в Российской Федерации на сегодняшний день недостаточно, поскольку эта нозологическая форма включается в общий перечень заболеваний без указания источников инфекции. При этом учитывается только заболеваемость детей в возрасте до 14 лет (см. рисунок), и диагноз устанавливается на основании клинической картины или косвенных им-

мунологических тестов. Лабораторное подтверждение роли пищевых продуктов как факторов передачи этих инфекций и квалификация последних как пищевых в настоящий момент практически не проводятся [10].

Следует отметить, что причины подъема заболеваемости кампилобактериозом остаются неизвестными. Имеются предположения о его взаимосвязи с повышением доли в питании населения продуктов из птицы, обычным обитателем кишечника которой являются бактерии рода Campylobacter, и распространением новых технологий упаковки пищевых продуктов в пленки и модифицированную газовую атмосферу, способствующих сохранности и проявлению биологических свойств возбудителя. Высказываются гипотезы о роли в инфицировании некультивируемых форм возбудителя при контактно-бытовом и пищевом пути передачи и перекрестном заражении готовых продуктов от сырой птицы.

Микроорганизмы Campylobacter jejuni обладают несколькими факторами вирулентности, которые определяются такими свойствами возбудителя, как хемотаксис и подвижность, адгезия и инвазия, гликозилирующие системы, продукция ци-

Таблица 4. Кампилобактериозы в некоторых европейских странах

Страна 1993 г. 1997 г. 1998 г. 1999 г. 2000 г.

Финляндия 1600/31 2404/46 2851/46 3303/64 3527/68

Исландия 59/21 93/4 220/80 435/156 245/87

Норвегия 877/20 1178/27 1700/39 2032/46 2331/51

Швеция 4485/21 5306/21 6543/29 7137/81 7646/86

Бельгия 4394/44 5417/54 6610/65 6514/64 7473/73

Нидерланды Нет данных 3646/23 3398/22 3160/Нет данных 3362/Нет данных

Англия и Уэльс 39477/74 51360/95 56852/110 54987/104 55887/106

Шотландия 4011/78 5533/108 6381/125 5865/115 6482/127

Швейцария 5058/71 5955/84 5455/77 6709/94 7568/105

Н.Р. Ефимочкина

толетального токсина CDT, капсулообразование, образование липоолигосахаридов (LOS) и др.

Способность колонизации интестинального тракта Campylobacter связана с хемотаксисом, который на уровне генома кодируется системами, близкими к таковым у E. coli, воздействуя на муцин, L-серин и L-фукозу слизистой кишечника. Ряд других компонентов системы хемотаксиса C. jejuni идентифицированы как специфичные для данного возбудителя - CheY, CheV, Cet A, CetB [11, 12]. Ведущим фактором, определяющим колонизацию кишечника, является образование полярных флагелл (жгутиков), обеспечивающих подвижность и способность к клеточной инвазии кампилобактеров. При этом флагеллы могут вызывать аутоагглютинацию бактериальных клеток, формируя микроколонии как in vitro, так и in vivo, адаптированные к существованию на эпителиальных поверхностях. Функционирование флагелл в качестве секреторных органелл является одним из факторов инвазии, определяющих патогенность C. jejuni [13, 14].

Одним из важных факторов вирулентности C. jejuni является способность к образованию цитолетального токсина СDT, который поражает эукариотические клетки в определенных стадиях деления [15]. Это связывающийся с мембраной клетки токсин, состоящий из трех субъединиц CdrA, CdrB и CdrC. Проникающая в клеточное ядро субъединица CdrB повреждает хромосомную ДНК. Наличие СDT характерно для всех представителей C. jejuni, этот токсин может обнаруживаться также у Shigella dysenteriae, Helicobacter hepaticus и некоторых E. coli.

Выявление причин пищевого кампилобактери-оза весьма важно для разработки профилактических мероприятий и снижения уровней заболеваемости. Ведущую роль в выявлении источников инфекции призваны сыграть современные методы эпидемиологических исследований и лабораторного анализа, позволяющие определить природу заболевания.

Методы выделения и детекции

Традиционные микробиологические методы позволяют определить наличие Campylobacter в пищевых продуктах, они основаны на применении селективных питательных сред и специальных условий культивирования бактерий. Процедура выделения Campylobacter из образцов пищевых продуктов включает: - предобогащение в селективном бульоне (например, бульон Престона, среда Парка и Сандерса) при 37 °С в течение 4 ч в микроаэрофильных условиях (5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота);

- обогащение в селективном бульоне Престона в микроаэрофильных условиях при 42 °С в течение 18 ч;

- пересев на 2 агаровые среды для выделения изолированных колоний (агар Кармали, агар Престона и др.), инкубирование в мик-роаэрофильных условиях при 42 °С в течение 24-72 ч.

Для повышения селективных свойств жидких и плотных питательных сред применяют антибиотики (полимиксин В, рифампицин, ванкомицин, триметоприм лактат, циклогексимид, нистатин и другие в различных комбинациях). Для обеспечения ростовых свойств, нейтрализации токсического действия кислорода и света в состав большинства сред вводят стерильную дефиб-ринированную баранью или лошадиную кровь. Поскольку использование крови в лабораториях, контролирующих пищевые продукты, вызывает затруднения, в настоящее время взамен этого компонента рекомендуют применять добавки на основе активированного угля, гематина, а также комбинации из сульфата железа, ме-табисульфита натрия и пирувата натрия. Для создания микроаэрофильных условий используют различные микроаэробно-генерирующие системы: газ-пакеты, СО2-инкубаторы. Перечень наиболее часто используемых селективных сред для выделения Campylobacter приведен в табл. 5.

Выросшие типичные или подозрительные колонии исследуют по основным морфологическим и биохимическим признакам, в том числе: окраска по Граму, подвижность, оксидазный и ката-лазный тесты, нитрат/нитрит редукция, гидролиз гиппурата, ферментация углеводов, чувствительность к антибиотикам, температура роста и др. (табл. 6).

Биохимическая дифференциация различных видов Campylobacter вызывает определенные затруднения в связи с общностью большинства признаков и возможным присутствием атипичных вариантов, например гиппуратнегативных или ка-талазоотрицательных штаммов C. jejuni [16].

Открытые в 1986 г. некультивируемые формы Campylobacter [17] являются фактором риска ввиду возможного присутствия их в пищевых продуктах и воде; тем самым возникают дополнительные затруднения в выявлении возбудителя и оценке безопасности зараженных объектов. Поскольку эти формы (VBNC) не способны расти на культу-ральных средах, они не могут быть обнаружены традиционными бактериологическими методами, в связи с чем возникает необходмость применения более точных методов, основанных на принципах молекулярной детекции.

Наиболее часто для детекции и типирования термотолерантных Campylobacter используют ме-

11

Таблица 5. Селективные среды для выявления бактерий рода Campylobacter

#

Среда Основные ингредиенты среды

Селективные бульоны

Бульон Парка Бульон для бруцелл, ванкомицин, триметоприм, полимиксин В

Модифицированный обогатительный бульон Парка Бульон для бруцелл, железа сульфат, натрия метабисульфит, натрия пируват, ванкомицин, триметоприм, полимиксин В

Обогатительный бульон Мартина Бульон для бруцелл, 5-флуороурацил, цефоперазон, триметоприм

Селективная обогатительная среда Дойла и Романа Триптон, пептон, глюкоза, дрожжевой экстракт, натрия хлорид, натрия бисульфит, дефибринированная кровь, натрия сукцинат, цистин, ванкомицин, триметоприм, полимиксин В, циклогексимид

Обогатительный бульон Болтона Мясной пептон, гидролизат лактальбумина, дрожжевой экстракт, гемин, натрия хлорид, натрия пируват, а-кетоглютаминовая кислота, натрия метабисульфит, натрий углекислый, дефибринированная кровь, натрия цефоперазон, триметоприм лактат, ванкомицин, циклогексимид

Бульон Престона Пептон, мясной экстракт, натрия хлорид, дефибринированная кровь, полимиксина В сульфат, рифампицин, триметоприма лактат, амфотерицин

Селективные агаровые среды

Агар Престона Пептон, мясной экстракт, натрия хлорид, агар, дефибринированная кровь, полимиксина В сульфат, рифампицин, триметоприма лактат, амфотерицин

Угольный агар Гидролизат казеина, пептический перевар мяса, мясной экстракт, натрия хлорид, железа сульфат, натрия пируват, уголь древесный бактериологический, агар, цефоперазон, тейкопланин, амфотерицин

Агар Кармали Колумбийский агар, активированный уголь, гемин, натрия пируват, ванкомицин, цефоперазон, циклогексимид

Агар Бутцлера Тиогликолевая среда, дефибринированная кровь, бацитрацин, новобиоцин, актидион, цефалотин, колистин, агар

SK-агар Основа кровяного агара Охо1с1, дефибринированная кровь, ванкомицин, полимиксин В, триметоприм

Ф

Таблица 6. Дифференцирующие признаки термотолерантных видов Campylobacter

Признак C. jejuni C. coli C. upsaliensis C. lari

Морфология Мелкие изогнутые или спиралевидные палочки

Окраска по Граму - - - -

Подвижность + + + +

Культуральные признаки на селективных агаровых средах Серовато-коричневые колонии, влажные, плоские, имеющие тенденцию «ползучего роста»

Рост при +25 °С - - - -

Наличие оксидазы + + + +

Наличие каталазы + + - +

Сбраживание глюкозы, лактозы и сахарозы - - - -

Образование газа из глюкозы - - - -

Образование Н^ на TSI-агаре - + - -

Гидролиз гиппурата + - - -

Чувствительность к налидиксовой кислоте + + + -

Чувствительность к цефалотину - - + -

тоды на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленные на выявление специфичных поверхностно экспрессируемых маркеров (липо-полисахаридов, антигенных детерминант, флагел-лярных генов), консервативных последовательностей 16SPHK, а также генетических детерминант факторов вирулентности и токсинообразования C. jejuni (табл. 7).

12

Существует большое количество модификаций ПЦР-методов, предназначенных для детекции и идентификации C. jejuni, основная часть которых была разработана для исследования чистых культур кампилобактеров или клинических образцов (в том числе фекалий). Значительно меньше вариантов постановки ПЦР предназначено и используется для прямого об-

Н.Р. Ефимочкина

Таблица 7. Гены-мишени в ПЦР-анализе термотолерантных Campylobacter

Ген Характеристика

16srRNA Консервативная последовательность генома термотолерантных видов Campylobacter

сadF Кодирует 37-KDa поверхностный мембранный белок, который связывает фибронектин клеток INT407 у млекопитающих, обусловливает адгезию и колонизацию C. jejuni

ceuE Кодирует 35-Ша липопротеиновый компонент протеин-зависимой транспортной системы сидерофоров, продуцируемых С. coli

pVirb11 35-bp плазмида вирулентности, включенная в процессы адгезии и инвазии C. jejuni

pVir 37,5-bp плазмида вирулентности, кодирующая белки, участвующии в инвазии C. jejuni в 11\1Т407-клетки

cdtA, cdtB, cdtC сdt-кластер, состоящий из трех генов, кодирующих 3 субъединицы цитолетального токсина CDT

flaA и flaB Кодируют флагеллярные белки, участвующие в адгезии C. jejuni

hipO Кодирует синтез фермента гиппуриказы C. jejuni, гидролизующего гиппурат

Asp Кодирует синтез фермента аспартокиназы C. coli

VS1 Кодирует протеин, специфичный для C. jejuni

peb1A Кодирует CBF-1 протеин (28-Ша), расположенный на внешней мембране C. jejuni и C. coli и участвующий в прикреплении возбудителей к эпителиальным клеткам

наружения C. jejuni в пищевых продуктах, которые обычно содержат малые количества возбудителя и характеризуются высоким уровнем сопутствующей микрофлоры [18]. Перечень опубликованных молекулярных методов детекции термотолерантных видов Campylobacter приведен в табл. 8.

При исследовании пищевых продуктов наиболее часто применяются методы, основанные на ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) или изотермаль-ной амплификации нуклеиновых кислот NASBA, которые обладают наибольшей чувствительностью и позволяют выявлять ДНК преимущественно жизнеспособных Campylobacter spp. Проведение

ПЦР-РВ требует тщательного подбора способов пробоподготовки, включая селективное обогащение образцов в питательных бульонах, иммуномаг-нитную сепарацию и др.

В зависимости от выбранного целевого гена или нуклеотидной последовательности можно проводить межвидовую дифференциацию термотолерантных представителей рода Campylobacter с достаточной степенью достоверности. Наиболее специфичным для идентификации C. jejuni считают последовательность ceuE, амплификация которой позволяет обнаружить видоспецифические фрагменты ДНК у близкородственных микроорганизмов C. jejuni и С. coli.

Таблица 8. Молекулярные методы детекции Campylobacter

Метод и способ детекции продуктов ПЦР Возбудитель Целевой ген Объект исследования (способ пробоподготовки) Литература

ПЦР-РВ, анализ пиков плавления Campylobacter jejuni cadF Смывы с тушек кур (селективное обогащение в бульоне Мюллера-Хинтона с цефо-перазоном и ростовыми добавками) [19]

ПЦР-РВ, TaqMan-зонды C. jejuni ORF-C Сырое мясо, субпродукты, морепродукты, молоко (селективное обогащение в бульоне Болтона) [20]

ПЦР-РВ, TaqMan-зонды Термотолерантные Campylobacter 16srRNA Тушки кур - смывы (селективное обогащение в бульоне Болтона) [21]

ПЦР-РВ, анализ пиков плавления Campylobacter jejuni cadF Кожа кур (селективное обогащение в бульоне Болтона) [22]

ПЦР-РВ в системе ЫдМсус!ег, анализ пиков плавления C. jejuni, C. coli, С. lari, C. jejuni 16srRNA hipO Куры (селективное обогащение в бульоне Престона) [23]

ПЦР-РВ, анализ пиков плавления C. jejuni cadF Кожа кур, свинина, молоко (селективное обогащение в бульоне Болтона) [24]

ПЦР-РВ в системе ЫдМсус!ег Campylobacter spp. 16srRNA Смывы кур (иммуномагнитная сепарация) [25]

ПЦР-РВ, TaqMan-зонды Campylobacter spp. 16srRNA Кожа кур (селективное обогащение в бульоне Болтона) [26]

13

Окончание табл. 8

#

Метод и способ детекции продуктов ПЦР Возбудитель Целевой ген Объект исследования (способ пробоподготовки) Литература

ПЦР-РВ, TaqMan-зонды C. jejuni VS1 Тушки кур - смывы (прямая детекция) [27]

ПЦР-РВ, анализ пиков плавления C. jejuni gyrA Куры (сепарация) [28]

ПЦР-РВ в системе Lightcycler Термотолерантные Campylobacter 16srRNA Тушки кур - смывы (иммуномагнитная сепарация) [29]

ПЦР-РВ, TaqMan-зонды C. jejuni C. coli hipO ceuE Тушки кур (прямая детекция) [30]

ПЦР (традиционная), гель-электрофорез C. jejuni C. coli сadF Тушки кур (прямая детекция) [31]

ПЦР, гель-электрофорез C. jejuni C. coli flaA-flaB Мясной фарш (селективное обогащение в бульоне Розефа) [32]

ПЦР, биотин-авидин-захват C. jejuni, C. coli, С. lari 16srRNA Кожа кур, молоко (иммуномагнитная сепарация) [33]

ПЦР, гель-электрофорез Campylobacter spp. 16srRNA Брокколи, грибы, мясо краба, устрицы, сырое молоко (селективное обогащение) [34]

ПЦР, гель-электрофорез Campylobacter spp. C. jejuni C. coli 16srRNA mapA ceuE Куры (селективное обогащение в бульоне Престона) [35]

ПЦР, гель-электрофорез Campylobacter spp. 16srRNA Куры (селективное обогащение в бульоне Престона) [36]

ПЦР, ELISA DIG C. jejuni, C. coli ccoN Сырое мясо и субпродукты, молоко, морепродукты (селективное обогащение) [37]

ПЦР, ELISA DIG C. jejuni, C. coli ceuE Смывы с тушек кур (прямая детекция) [38]

ПЦР, гель-электрофорез Термотолерантные Campylobacter 16srRNA Тушки кур (селективное обогащение в бульоне Болтона) [39]

ПЦР, гель-электрофорез Термофильные Campylobacter C. jejuni 23srRNA ceuE Окорочка кур, сырая говядина, сырокопченые колбасы, готовые мясопродукты (селективное обогащение в бульоне Болтона) [40]

ПЦР, гель-электрофорез Campylobacter spp. C. jejuni C. coli 16srRNA mapA ceuE Птица (прямая детекция и селективное обогащение в бульоне Престона) [41]

ПЦР, гель-электрофорез C. jejuni, C. coli lpxA Тушки кур - смывы (селективное обогащение в анаэробном бульоне Охо1с1) [42]

ДНК-гибридизация, олигонуклеотидные пробы (70 mer) C. jejuni, C. coli Тушки кур - смывы (селективное обогащение в анаэробном бульоне Охо1с1) [42]

Флюоресцентная ДНК-гибридизация insitu (FISH) Campylobacter spp. 16srRNA Продукты из кур (селективное обогащение в бульоне Престона) [36]

Флюоресцентная ДНК-гибридизация insitu (FISH) Campylobacter spp. Термофильные Campylobacter 16srRNA 23srRNA Куры (селективное обогащение в бульоне Престона) [43]

NASBA, фермент-связанный гель-форез C. jejuni, C. coli, С. lari 16srRNA Птицепродукты, молочные продукты, мясо, овощи (селективное обогащение в бульоне Престона) [44]

NASBA,фермент-свя-занный гель-форез C. jejuni, C. coli, С. lari 16srRNA Кожа кур (прямая детекция и селективное обогащение в бульоне Престона) [45]

NASBA,фермент-свя-занный гель-форез C. jejuni 16srRNA Птицепродукты, молочные продукты, вода (иммуномагнитная сепарация) [46]

NASBA, флюоресцентные зонды C. jejuni, С. coli 16srRNA Куриные грудки (прямая детекция) [47]

Ф

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени.

Н.Р. Ефимочкина

Ниже приведено краткое описание постановки мультиплексной ПЦР и дуплексной ПЦР-РВ. Оли-гонуклеотидные праймеры и размеры ампликонов представлены в табл. 9.

При проведении мультиплексной ПЦР [48] используют 3 пары праймеров для детекции последовательности 16s rRNA (Campylobacter spp.), генов mapA (C. Jejuni) и ceuE (С. coli). В состав ПЦР-смеси (30 мкл) входят 1хПЦР буфер, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTPS, 0,6 е.а./мкл Taq-полимеразы, 0,5мкМ MD16S1 и MD16S1 праймеров, 0,42мкМ праймеров MDmapA1, MDmapA2, COL3 и MDCOL2, 100 нг пробы исследуемой ДНК. Амплификацию проводят в следующем режиме: 1 цикл при 95 °С -10 мин, 35 циклов: при 95 °С - 30 с, при 59 °С -90 с, при 72 °С - 1 мин и один цикл при 72 °С -10 мин. Продукты амплификации (10 мкл) анализируют методом электрофореза в 2% TBE-агарозном геле.

Дуплексная ПЦР-РВ направлена на одновременную детекцию двух генов mapA (C. jejuni) и ceuE (C.coli) с использованием TaqMan-зондов для получения флюоресцентного сигнала [49]. Смесь для ПЦР (20 мкл) включает TaqMan универсальную смесь, по 0,3 мкМ каждого праймера, 0,1 мкМ mapA-зондов, 0,05мкМ ceuE-зондов и 100 нг исследуемой пробы ДНК. Амплификацию проводят в термоциклере ABI PRISM при следующих параметрах: 95 °С - 10 мин, 40 двухэтапных циклов 95 °С - 15 с, 60 °С - 60 с. Как и в традиционной ПЦР, включают позитивные и негативные кон-троли для каждой пары используемых праймеров. Оценку результатов ПЦР проводят по нарастанию флюоресцентного сигнала в определенном диапазоне циклов амплификации.

В Российской Федерации разработана, стандартизована и внедрена в практику лабораторий методика детекции Campylobacter jejuni с использованием ПЦР-РВ, подробное описание

которой приведено в Методических указаниях МУ 4.2.2872-2011 «Методы выявления и идентификации патогенных бактерий - возбудителей инфекционных заболеваний с пищевым путем передачи в продуктах питания на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией».

Основные этапы метода включают:

1. Посев пищевых продуктов для накопления бактерий рода Campylobacter в среде селективного обогащения. Для этого к необходимому количеству подготовленной пробы добавляют 9-кратный объем селективного бульона Престона или селективного бульона Дойла. Полученную взвесь инкубируют в течение 4 ч при 37 °С и в течение 18-24 ч при (42±1) °С. Инкубация осуществляется в микроаэрофильных условиях.

2. Экстракция ДНК. Применяются коммерчески доступные комплекты реагентов на основе методов преципитации или сорбции ДНК на силикагеле.

3. ПЦР для выявления ДНК Campylobacter spp. осуществляется с использованием наборов реагентов, обеспечивающих гибридизационно-флу-оресцентную детекцию продуктов амплификации по конечной точке (вариант FEP) и в режиме реального времени (вариант FRT). Для подтверждения жизнеспособности бактериальных клеток Campylobacter методом ПЦР-FRT одновременно тестируют инокуляты пищевых продуктов, подвергавшиеся и не подвергавшиеся инкубации в селективной среде обогащения.

4. Заключение о присутствии Campylobacter spp. в исследованной массе продукта выдают при получении положительного результата ПЦР (выявлении ДНК) и подтверждения их жизнеспособности. Отставание сигнала по каналу JOE/HEX на 3 и более пороговых цикла (Ct) для образца, не подвергавшегося инкубации (Ct^ инк-С^нк>3), свидетельствует о наличии в продукте жизнеспособных клеток Campylobacter.

Таблица 9. ПЦР-праймеры для видоспецифической детекции Campylobacter

Целевой ген Праймер Последовательность (5'-3') Размер, bp

Мультиплексная ПЦР

16s rRNA MD16S1 ATCTAATGGCTTAACCATTAAAC 857

MD16S2 GGAGGGTAACTAGTTTAGTATT

mapA MD mapA1 CTATTTTATTTTTGAGTGCTTGTG 589

MD mapA2 GCTTTATTTGCCATTTGTTTTATT

ceuE COL3 AATTGAAAATTGCTCCAACTATG 462

MDCOL2 TGATTTTATTATTTGTAGCAGCG

Дуплексная ПЦР-РВ

mapA mapA-F CTGGTGGTTTTGAAGCAAAGA 95

mapA-R CAATACCAGTGTCTAAAGTGCGTTTAT

mapA-зонд fam-TGAATTCCAACATCGCTAA-TGTATAAAAGCCCCTTT-tamra

ceuE ceuE-F AAGCTCTTATTGTTCTAACCAATTCTAACA 102

ceuE-R TCATCCACAGCATTGATTCCTAA

ceuE-зонд vic-TTGGACCTCAATCTCGCTTTGGAAT CATT-tamra

В целом, учитывая большую значимость проблемы, представляется необходимым проведение углубленного изучения природных источников распространения Campylobacter jejuni, факторов вирулентности, патогенеза и механизмов возникновения инфекций, обусловленных этими эмерд-жентными патогенами. Наиболее перспективные исследования в изучении возбудителей пищевого кампилобактериоза будут основаны на применении инновационных геномных технологий, включающих методы ДНК-типирования патогенов на основе «т1огоаггау»-технологий, мультиплекс-

ных форматов ПЦР и секвенирования геномов Campylobacter spp. Это позволит сформировать расширенную базу данных о генетических регу-ляторных механизмах экспрессии вирулентных свойств этих микроорганизмов для разработки новых критериев безопасности и анализа степени микробиологического риска возникновения пищевого кампилобактериоза.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 15-16-00015).

Литература

#

1. Ефимочкина Н.Р. Некоторые закономерности появления эмер-джентных пищевых патогенов // Вопр. питания. 2006. № 4.

С. 9-15. 18.

2. Шевелева С.А., Шурышева Ж.Н. Изучение загрязненности пищевых продуктов бактериями рода Campylobacter // Вопр. питания.

2006. № 6. С. 38-43.

3. John T., Prescott M., Munroe L. Campylobacter jejuni enteritis in 19. man and domestic animals // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1982. Vol. 181,

N 12. P. 1524-1530.

4. Schmidt K. WHO Surveillance Programme for control of foodborne infections and intoxications in Europe. 6th Report - FAO/WHO 20. Collaborating Centre for Research and Training in Food Hygiene and Zoonosis. Berlin, 1995.

5. Nachamkin I., Guerry P. Campylobacter infections // Foodborne 21. Pathogens: Microbiology and Molecular Biology. Wymondham, 2005. P. 285-293.

6. Levin R.E. Rapid Detection and Characterization of Foodborne Pathogens by Molecular techniques. USA : CRC Press, 2010. 592 p. 22.

7. Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective // Int. J. Food Microbiol.

2007. Vol. 117, N 03. P. 237-257.

8. Nachamkin I. Chronic effects of Campylobacter infections // Microbes 23. Infect. 2002. Vol. 4, N 4. P. 399-403.

9. Куликовский А.В. Эмерджентные пищевые зоонозы. М., 2004. 174 с.

10. Шевелева С.А., Ефимочкина Н.Р. Иванов А.А. и др. Пищевые 24. отравления и инфекции в Российской Федерации за период 1992-2001 гг.: состояние проблемы и тенденции // Гиг. и сан. 2003. № 3. С. 38-45. 25.

11. Marchant J., Wren B., Ketley J. Exploiting genome sequence: predictions for mechanisms of Campylobacter chemotaxis // Trends Microbiol. 2002. Vol. 10, N 4. P. 155-159.

12. Young K.T., Davis L.M., Dirita V.J. Campylobacterjejuni: molecular 26. biology and pathogenesis // Nat. Rev. Microbiol. 2007. Vol. 5, N 9.

P. 665-679.

13. Kopecko D.J., Hu L., Zaal K.J. Campylobacterjejuni - microtubule-dependent invasion // Trends Microbiol. 2001. Vol. 9, N 8. P. 389- 27. 396.

14. Pei Z., Burucoa C., Grignon B. et al. Mutation in the peb1A locus of Campylobacterjejuni reduces interactions with epithelial cells and intestinal colonization of mice // Infect. Immun. 1998. Vol. 66, N 3. 28. P. 938-943.

15. Lara-Tajero M., Galan J.E. Cytolethal distending toxin: limited damage as a strategy to modulate cellular functions // Trends Microbiol. 2002. Vol. 10. P. 147. 29.

16. Paulsen P., Kanzler P., Hilbert F. et al. Comparison of three methods for detecting Campylobacter spp. in chilled or frozen meat // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 103, Issue 2. P. 229-233.

17. Rollins D.M., Colwell R.R. Viable but nonculturable stage 30. of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural

aquatic environment // Appl. Environ. Microbiol. 1986. Vol. 52, N 3. P. 531-538.

Булахов А.В., Ефимочкина Н.Р., Шевелева С.А. Обнаружение бактерий рода Campylobacter в птицепродуктах с помощью метода полимеразной цепной реакции // Вопр. питания. 2010. Т. 79, № 3. С. 24-29.

Cheng Z., Griffiths M.W. Rapid Detection of Campylobacter jejuni in Chicken Rinse Water by Melting-Peak Analysis of Amplicons in RealTime Polymerase Chain Reaction // J. Food Protection. 2003. Vol. 66, N 8. P. 1343-1352.

Sails A.D., Fox A.J., Bolton F.J. et al. A Real-Time PCR Assay for the Detection of Campylobacter jejuni in Foods after Enrichment Culture // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, N 3. P. 1383-1390. Josefsen M.H., Cook N., D'Agostino M. et al. Validation of a PCR-based method for detection of food-borne thermotolerant Campylobacters in a multicenter collaborative trial // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 7. P. 4379-4383. Oliveira T.C.R.M., Barbut S., Griffiths M.W. Detection of Campylobacter jejuni in naturally contaminated chicken skin by melting peak analysis of amplicons in real-time PCR // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 104, Issue 1. P. 105-111.

Abu-Halaweh M., Bates J., Patel B.K.C. Rapid detection and differentiation of pathogenic Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by real-time PCR // Res. Microbiol. 2005. Vol. 156, N 1. P. 107114.

Oliveira T.C.R.M., Barbut S., Griffiths M.W. A Robotic DNA purification protocol and real-time PCR for the detection of Campylobacter jejuni in foods // J. Food Protection. 2005. Vol. 68, N 10. P. 2131-2135. Wolffs P., Norling B., Hoorfar J. et al. Quantification of Campylobacter spp. in Chicken Rinse Samples by Using Flotation prior to Real-Time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2005. Vol. 71, N 10. P. 57595764.

Krause M., Josefsen M. H., Lund M. et al. Comparative, collaborative, and on-site validation of a TaqMan PCR method as a tool for certified production of fresh, Campylobacter-free chickens // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72, N 8. P. 5463-5468. Debretsion A., Habtemariam N., Wilson S. et al. Real-time PCR assay for rapid detection and quantification of Campylobacter jejuni on chicken rinses from poultry processing plant // Mol. Cell. Probes. 2007. Vol. 21, Issue 3. P. 177-181.

Fukushima H., Katsube K., HataY. et al. Rapid separation and concentration of food-borne pathogens in food samples prior to quantification by viable-cell counting and real-time PCR // Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73, N 1. P. 92-100. Wolffs P.F.G., Glencross K., Norling B., Griffiths M.W. Simultaneous quantification of pathogenic Campylobacter and Salmonella in chicken rinse fluid by a flotation and real-time multiplex PCR procedure // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, Issue 1. P. 50-54. Hong J., Jung W.K., Kim J.M. et al. Quantification and differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in raw chicken

16

H.P. E^MMOHKMHa

meats using a real-time PCR Method // J. Food Protection. 2007. 40. Vol. 70, N 9. P. 2015-2022.

31. Konkel M.E., Gray S.A., Kim B.J. et al. Identification of the enteropathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on the cadF virulence gene and its product // J. Clin. Microbiol. 41. 1999. Vol. 37, N 3. P. 510-517.

32. Waage A.S., Vardund T., Lund V., Kapperud G. Detection of Small Numbers of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli cells

in environmental water, sewage, and food samples by a seminested 42. PCR assay // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65, N 4. P. 1636-1643.

33. Waller D.F., Ogata S.A., Quantitative immunocapture PCR assay

for detection of Campylobacter jejuni in foods // Appl. Environ. 43. Microbiol. 2000. Vol. 66, N 9. P. 4115-4118.

34. Thunberg R. L., Tran T.T., Walderhaug M.O. Detection of thermophilic Campylobacter spp. in blood-free enriched samples of inoculated foods by the polymerase chain reaction // J. Food Protection. 2000. 44. Vol. 63, N 3. P. 299-303.

35. Denis M., Refregier-Petton J., Laisney M.J. et al. Campylobacter contamination in French chicken production from farm to consumers.

Use of a PCR assay for detection and identification of Campylobacter 45. jejuni and Camp. coli // J. Appl. Microbiol. 2001. Vol. 91, N 2. P. 255-267.

36. Moreno Y., Hernandez M., Ferrus M. A. et al. Direct detection of thermotolerant campylobacters in chicken products by PCR and 46. in situ hybridization // Res. Microbiol. 2001. Vol. 152, N 6. P. 577582.

37. Bolton F.J., Sails A.D., Fox A.J. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in foods by enrichment culture and 47. polymerase chain reaction enzyme-linked immunosorbent assay //

J. Food Protection. 2002. Vol. 65, N 5. P. 760-767.

38. Hong Y., Berrang M.E., Liu T. et al. Rapid detection of Campylobacter

coli, C. jejuni, and Salmonella enterica on poultry carcasses by 48. using PCR-enzyme-linked immunosorbent assay // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, N 6. P. 3492-3499.

39. Josefsen M.H., Jacobsen N.R., Hoorfar J. Enrichment followed by 49. quantitative PCR both for rapid detection and as a tool for quantitative

risk assessment of food-borne thermotolerant Campylobacters // Appl. Environ. Microbiol. 2004. Vol. 70, N 3. P. 3588-3592.

Bohaychuk V.M., Gensler G.E., King R.K. et al. Evaluation of detection methods for screening meat and poultry products for the presence of foodborne pathogens // J. Food Protection. 2005. Vol. 68, N 12. P. 2637-2647.

Mateo E., Carcamo J., Urquijo M. et al. Evaluation of a PCR assay for the detection and identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in retail poultry products // Res. Microbiol. 2005. Vol. 156, N 4. P. 568-574.

Quinones B., Parker C.T., Janda J.M. Jr. et al., Detection and genotyping of Arcobacter and Campylobacter isolates from retail chicken samples by use of DNA oligonucleotide arrays // Appl. Environ. Microbiol. 2007. Vol. 73, N 11. P. 3645-3655. Schmid M.W., Lehner A., Stephan R. et al. Development and application of oligonucleotide probes for in situ detection of thermotolerant Campylobacter in chicken faecal and liver samples // Int. J. Food Microbiol. 2005. Vol. 105, Issue 2. P. 245-255. Uyttendaele M., Schukkink R., van Gemen B., Debevere J. Detection of Campylobacter jejuni added to foods by using a combined selective enrichment and nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) // Appl. Environ. Microbiol. 1995. Vol. 61, N 4. P. 1341-1347. Uyttendaele M., Bastiaansen A., Debevere J. Evaluation of the NASBA nucleic acid amplification system for assessment of the viability of Campylobacter jejuni // Int. J. Food Microbiol. 1997. Vol. 37, Issue 1. P. 13-20.

Uyttendaele M., Debevere J., Lindqvist R. Evaluation of buoyant density centrifugation as a sample preparation method for NASBA-ELGA detection of Campylobacter jejuni in foods // Food Microbiol. 1999. Vol. 16, N 6. P. 575-582.

Churruca E., Girbau C., Martinez I. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in chicken meat samples by realtime nucleic acid sequence-based amplification with molecular beacons // Int. J. Food Microbiol. 2007. Vol. 117, Is. 1. P. 85-90. Denis M., Soumet C., Rivoal K. et al. Development of a m-PCR assay for simultaneous identification of Campylobacter jejuni and C. coli. // Lett. Appl. Microbiol. 1999. Vol. 29, Is. 6. P. 406-410. Best E.L., Powell E.J., Swift C. et al. Applicability of a rapid duplex real-time PCR assay for speciation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli directly from culture plates // FEMS Microbiol. Lett. 2003. Vol. 229, N 2. P. 237-241.

References

Efimochkina N.R. Some trends in occurrence of emergent foodborne 10. pathogens. Vopr. Pitan. [Problems of Nutrition]. 2006; Vol. 4: 9-15.

Sheveleva S.A., Shyrisheva J.N.The study of contamination of food by Campylobacter spp. Vopr. Pitan. [Problems of Nutrition]. 2006; 11. Vol. 6: 38-43.

John T., Prescott M., Munroe L. Campylobacter jejuni enteritis in man and domestic animals. J Am Vet Med Assoc. 1982; Vol. 181 12. (12): 1524-30.

Schmidt K. WHO Surveillance Programme for control of foodborne infections and intoxications in Europe. 6th Report - FAO/WHO Col- 13. laborating Centre for Research and Training in Food Hygiene and Zoonosis. Berlin, 1995. 14.

Nachamkin I., Guerry P. Campylobacter infections. In: Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology. Wymondham, 2005: 285-93.

Levin R.E. Rapid Detection and Characterization of Foodborne Patho- 15. gens by Molecular techniques. USA : CRC Press, 2010: 592 p. Humphrey T., O'Brien S., Madsen M. Campylobacters as zoonotic pathogens: a food production perspective. Int J Food Microbiol. 16. 2007; Vol. 117 (03): 237-57.

Nachamkin I. Chronic effects of Campylobacter infections. Microbes Infect. 2002; Vol. 4 (4): 399-403. 17.

Kulikovskiy A.V. Emergent food zoonoses. Moscow, 2004: 174 p.

Sheveleva S.A., Efimochkina N.R., Ivanov A.A. et al. Food poisoning and infections in the Russian Federation for the period 1992-2001: Issues and Trends. Gigiena i sanitariya [Hygiene and Sanitation]. 2003; Vol. 3: 38-45.

Marchant J., Wren B., Ketley J. Exploiting genome sequence: predictions for mechanisms of Campylobacter chemotaxis. Trends Micro-biol. 2002; Vol. 10 (4): 155-9.

Young K.T., Davis L.M., Dirita V.J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat Rev Microbiol. 2007; Vol. 5 (9): 665-79.

Kopecko D.J., Hu L., Zaal K.J. Campylobacter jejuni - microtubule-dependent invasion. Trends Microbiol. 2001; Vol. 9 (8): 389-96. Pei Z., Burucoa C., Grignon B. et al. Mutation in the peb1A locus of Campylobacterjejuni reduces interactions with epithelial cells and intestinal colonization of mice. Infect Immun. 1998; Vol. 66 (3): 938-43.

Lara-Tajero M., Galan J.E. Cytolethal distending toxin: limited damage as a strategy to modulate cellular functions. Trends Microbiol. 2002; Vol. 10: 147.

Paulsen P., Kanzler P., Hilbert F. et al. Comparison of three methods for detecting Campylobacter spp. in chilled or frozen meat. Int J Food Microbiol. 2005; Vol. 103 (2): 229-33.

Rollins D.M., Colwell R.R. Viable but nonculturable stage of Campy-lobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment. Appl Environ Microbiol. 1986; Vol. 52 (3): 531-8.

17

2

5

6.

7

8.

9.

I  и^Ш I I I

Ф

18. Bulakhov A.V., Efimochkina N.R., Sheveleva S.A. Detection of bacteria genus Campylobacter in poultry products by PCR method. Vopr. Pitan. [Problems of Nutrition]. 2010; Vol. 79

19. Cheng Z., Griffiths M.W. Rapid Detection of Campylobacter jejuni in Chicken Rinse Water by Melting-Peak Analysis of Amplicons in Real-Time Polymerase Chain Reaction. J. Food Protection. 2003; Vol. 66 (8): 1343-52.

20. Sails A.D., Fox A.J., Bolton F.J. et al. A Real-Time PCR Assay for the Detection of Campylobacter jejuni in Foods after Enrichment Culture. Appl Environ Microbiol. 2003; Vol. 69 (3): 1383-90.

21. Josefsen M.H., Cook N., D'Agostino M. et al. Validation of a PCR-Based method for detection of food-borne thermotolerant Campy-lobacters in a multicenter collaborative trial. Appl Environ Microbiol. 2004; Vol. 70 (7): 4379-83.

22. Oliveira T.C.R.M., Barbut S., Griffiths M.W. Detection of Campylo-bacter jejuni in naturally contaminated chicken skin by melting peak analysis of amplicons in real-time PCR. Int J Food Microbiol. 2005; Vol. 104 (1): 105-11.

23. Abu-Halaweh M., Bates J., Patel B.K.C. Rapid detection and differentiation of pathogenic Campylobacter jejuni and Campylobacter coli by real-time PCR. Res Microbiol. 2005; Vol. 156 (1): 107-14.

24. Oliveira T.C.R.M., Barbut S., Griffiths M.W. A Robotic DNA purification protocol and real-time PCR for the detection of Campylobacter jejuni in foods. J Food Protection. 2005; Vol. 68 (10): 2131-35.

25. Wolffs P., Norling B., Hoorfar J. et al. Quantification of Campylobacter spp. in Chicken Rinse Samples by Using Flotation prior to Real-Time PCR. Appl Environ Microbiol. 2005; Vol. 71 (10): 5759-64.

26. Krause M., Josefsen M. H., Lund M. et al. Comparative, collaborative, and on-site validation of a TaqMan PCR method as a tool for certified production of fresh, Campylobacter-free chickens. Appl Environ Microbiol. 2006; Vol. 72 (8): 5463-68.

27. Debretsion A., Habtemariam N., Wilson S. et al. Real-time PCR assay for rapid detection and quantification of Campylobacter jejuni on chicken rinses from poultry processing plant. Mol Cell Probes. 2007; Vol. 21 (3): 177-81.

28. Fukushima H., Katsube K., HataY. et al. Rapid separation and concentration of food-borne pathogens in food samples prior to quantification by viable-cell counting and real-time PCR. Appl Environ Microbiol. 2007; Vol. 73 (1): 92-100.

29. Wolffs P.F.G., Glencross K., Norling B., Griffiths M.W. Simultaneous quantification of pathogenic Campylobacter and Salmonella in chicken rinse fluid by a flotation and real-time multiplex PCR procedure. Int J Food Microbiol. 2007; Vol. 117 (1): 50-4.

30. Hong J., Jung W.K., Kim J.M. et al. Quantification and Differentiation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in raw chicken meats using a real-time PCR method. J Food Protection. 2007; Vol. 70 (9): 2015-22.

31. Konkel M.E., Gray S.A., Kim B.J. et al. Identification of the entero-pathogens Campylobacter jejuni and Campylobacter coli based on the cadF virulence gene and its product. J Clin Microbiol. 1999; Vol. 37 (3): 510-17.

32. Waage A.S., Vardund T., Lund V., Kapperud G. Detection of small numbers of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli cells in environmental water, sewage, and food samples by a seminested PCR assay. Appl Environ Microbiol. 1999; Vol. 65 (4): 1636-43.

33. Waller D.F., Ogata S.A., Quantitative Immunocapture PCR Assay for detection of Campylobacter jejuni in foods. Appl Environ Microbiol. 2000; Vol. 66 (9): 4115-18.

34. Thunberg R.L., Tran T.T., Walderhaug M.O. Detection of thermophilic Campylobacter spp. in blood-free enriched samples of inoculated

foods by the polymerase chain reaction. J Food Protection. 2000; Vol. 63 (3): 299-303.

35. Denis M., Refregier-Petton J., Laisney M.J. et al. Campylobacter contamination in French chicken production from farm to consumers. Use of a PCR assay for detection and identification of Campylobacter jejuni and Camp. coli. J Appl Microbiol. 2001; Vol. 91 (2): 255-67.

36. Moreno Y., Hernandez M., Ferrus M. A. et al. Direct detection of thermotolerant campylobacters in chicken products by PCR and in situ hybridization. Res Microbiol. 2001; Vol. 152 (6): 577-82.

37. Bolton F.J., Sails A.D., Fox A.J. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in foods by enrichment culture and polymerase chain reaction enzyme-linked immunosorbent assay. J Food Protection. 2002; Vol. 65 (5): 760-7.

38. Hong Y., Berrang M.E., Liu T. et al. Rapid Detection of Campylobacter coli, C. jejuni, and Salmonella enterica on poultry carcasses by using PCR-enzyme-linked immunosorbent assay. Appl Environ Microbiol. 2003; Vol. 69 (6) : 3492-99.

39. Josefsen M.H., Jacobsen N.R., Hoorfar J. Enrichment followed by quantitative PCR both for rapid detection and as a tool for quantitative risk assessment of food-borne thermotolerant Campylobacters. Appl Environ Microbiol. 2004; Vol. 70 (3): 3588-92.

40. Bohaychuk V.M., Gensler G.E., King R.K. et al. Evaluation of detection methods for screening meat and poultry products for the presence of foodborne pathogens. J Food Protection. 2005; Vol. 68 (12): 2637-47.

41. Mateo E., Carcamo J., Urquijo M. et al. Evaluation of a PCR assay for the detection and identification of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in retail poultry products. Res Microbiol. 2005; Vol. 156 (4): 568-74.

42. Quinones B., Parker C.T., Janda J.M. Jr. et al., Detection and geno-typing of Arcobacter and Campylobacter isolates from retail chicken samples by use of DNA oligonucleotide arrays. Appl Environ Microbiol. 2007; Vol. 73 (11): 3645-55.

43. Schmid M.W., Lehner A., Stephan R. et al. Development and application of oligonucleotide probes for in situ detection of thermotolerant Campylobacter in chicken faecal and liver samples. Int J Food Microbiol. 2005; Vol. 105 (2): 245-55.

44. Uyttendaele M., Schukkink R., van Gemen B., Debevere J. Detection of Campylobacter jejuni added to foods by using a combined selective enrichment and nucleic acid sequence-based amplification (NASBA). Appl Environ Microbiol. 1995; Vol. 61 (4): 1341-47.

45. Uyttendaele M., Bastiaansen A., Debevere J. Evaluation of the NASBA nucleic acid amplification system for assessment of the viability of Campylobacter jejuni. Int J Food Microbiol. 1997; Vol. 37 (1): 13-20.

46. Uyttendaele M., Debevere J., Lindqvist R. Evaluation of buoyant density centrifugation as a sample preparation method for NASBA-ELGA detection of Campylobacter jejuni in foods. Food Microbiol. 1999; Vol. 16 (6): 575-82.

47. Churruca E., Girbau C., Martinez I. et al. Detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in chicken meat samples by real-time nucleic acid sequence-based amplification with molecular beacons. Int J Food Microbiol. 2007; Vol. 117 (1): 85-90.

48. Denis M., Soumet C., Rivoal K. et al. Development of a m-PCR assay for simultaneous identification of Campylobacter jejuni and C. coli. Lett Appl Microbiol. 1999; Vol. 29 (6): 406-10.

49. Best E.L., Powell E.J., Swift C. et al. Applicability of a rapid duplex real-time PCR assay for speciation of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli directly from culture plates. FEMS Microbiol Lett. 2003; Vol. 229 (2): 237-41.

18