Оценка фиброгенной активности одностенных и многостенных углеродных нанотрубок у крыс в условиях подострого ингаляционного эксперимента

A.B. Воробьев, В.И. Сигаев, А.Д. Толчинский, С.Н. Успенская, Ю.В. Иванова, Е.В. Звя гина, С.П. Рыбалкин, Л.В. Михина, С.Г. Бесаева, A.A. Мазанова, Н.Р. Дядищев

Оценка фиброгенной активности одностенных и многостенных углеродных нанотрубок у крыс в условиях подострого ингаляционного эксперимента

НИЦ ТБП — филиал ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России,

г. Серпухов, Московская область

A.V. Vorobyev, V.I. Sigaev, A.D. Tolchinsky, C.N. Uspenskaya, Yu.V. Ivanova, E.V. Zvyagina, S.P.Rybalkin, L.V. Mikhina, S.G. Besaeva, A.A. Mazanova, N.R. Dyadishchev

Assessment of fibrogen activity of single-wall and multi-walled carbon nanotubes in rats in subacute inhalation experiment

RCT&HRB AT NRC "Institute of Immunology" of FMBA of Russia Serpukhov,

Moscow Region, Russia

Ключевые слова: одностенные углеродные нано-трубки, многостенные углеродные нанотрубки, белые крысы, фиброгенная активность, подо-стрый ингаляционный эксперимент.

Исследования по ингаляционному введению в течение 4—6 недель аэрозоля исследуемых материалов (кварцевая пыль, одностенные углеродные нанотрубки ТиЬа11, многостенные углеродные нанотрубки Таунит-М) в условиях подострого эксперимента с последующим наблюдением животных в течение 3 месяцев показали, что во всех случаях отмечено цитотоксическое действие исследуемых материалов, проявляющееся в разной степени в цитологических и биохимических показателях бронхоальвеолярной жидкости. Развитие активного фибропластического процесса, подтвержденного патоморфологическими исследованиями, отмечено только при ингаляционном введении многостенных углеродных нанотрубок Таунит-М.

Keywords: single-wall carbon nanotubes, multi-walled carbon nanotubes, rats, fibrogen activity, subacute inhalation experiment.

The studies on inhalation exposure to aerosol of the test materials (quartz dust, single-wall carbon nanotubes Tuball, multi-wall carbon nanotubes Taunit-M) during 4—6weeks in subacute experiment followed by a 3-month period of observation of animals demonstrated cytotoxicity of test materials reflected in different degrees in cytological and biochemical parameters of bronchoalveolar fluid. Development of active fibroplastic process confirmed by pathomorphological studies was observed only when using multi-wall carbon nanotubes Taunit-M.

Анализ состояния и тенденций развития объектов наноиндустрии в настоящее время позволяет сделать вывод о том, что одной из наиболее перспективных областей нанотех-нологий является производство углеродных нанотрубок (УНТ), которые при диаметре 1...50 нм и длине до нескольких микрометров образуют новый класс квазиодномерных на-

нообъектов. УНТ обладают рядом уникальных свойств, обусловленных упорядоченной структурой их нанофрагментов: хорошей электропроводностью и адсорбционными свойствами, способностью к холодной эмиссии электронов и аккумулированию газов, диамагнитными характеристиками, химической и термической стабильностью, большой прочностью

в сочетании с высокими значениями упругой деформации. Материалы, созданные на основе УНТ, могут успешно использоваться в качестве структурных модификаторов конструкционных материалов, аккумуляторов водорода, элементов радиоэлектроники, добавок в смазочные материалы, лаки и краски, высокоэффективных адсорбентов, газораспределительных слоев топливных элементов. В последние годы широко используются углеродные наноструктуры в тонком химическом синтезе, биологии и медицине [5; 9].

По своим структурным особенностям УНТ могут относиться к двум основным группам: одностенные углеродные нанотруб-ки (ОУНТ), состоящие из одного слоя гра-феновой цилиндрической стенки; многостенные углеродные нанотрубки (МУНТ) имеющие несколько соосных цилиндров графена, наличие которых определяет большую толщину стенок таких трубок. Типичный диаметр ОУНТ составляет несколько нанометров, в то время как диаметр МУНТ имеет размер 10 нм и более в зависимости от количества слоев. Длина УНТ может достигать нескольких микрометров для обоих типов на-нотрубок.

ОУНТ и МУНТ представляют собой порошок черного цвета из гранул спутанных пучков с выраженной волокнистой структурой. Наличие сходства в структурной организации микрочастиц УНТ и асбеста, связанное с их волокнистой структурой, вызывает особую озабоченность, так как в ряде исследований было установлено, что УНТ могут проявлять токсические свойства, близкие к установленным для асбестовых волокон [10; 12].

Производство ОУНТ и МУНТ в России налажено на ряде предприятий.

Основные российские фирмы-производители ОУНТ — ООО «Центр угольных технологий и новых углеродных материалов», Кемерово (www.107377.ru.all. biz), ООО «Углерод ЧГ», Черноголовка (www.caronchg.ru), ООО «ОКСиАл.ру», Новосибирск (www.ocsial.com). В полупромышленных масштабах ОУНТ выпускает ООО «ОКСиАл.ру».

МУНТ производят ООО «Сорбенты Кузбасса», Новокузнецк (www.corbkuz.ru), Институт катализа Сибирского отделения

РАН, Новосибирск (www.catalisis.ru), ООО «НаноТехЦентр», Тамбов (www.nanotc.ru). В полупромышленных масштабах МУНТ выпускает ООО «НаноТехЦентр».

Несмотря на то что объем производства УНТ в России еще не достиг реальных промышленных масштабов, активное использование этого вида материалов в таких отраслях, как автомобильная промышленность, строительство, здравоохранение, экология, электроника, в которых существуют контакты персонала с УНТ на разных стадиях технологических процессов, стимулирует необходимость проведения санитарно-гигиенических исследований для исключения вредного влияния этого малоизученного класса материалов на здоровье людей, занятых в производстве и соприкасающихся с ними в селитебной зоне.

Особое внимание следует уделять оценке возможных проявлений фиброгенных свойств новых волокнистых углеродных материалов, к которым относятся ОУНТ и МУНТ.

При проведении исследований по оценке возможного проявления фиброгенных свойств новых углеродных волокнистых материалов, таких как УНТ, в качестве контроля целесообразно использовать материал, введение которого в легкие лабораторных животных приводило бы к развитию в них типичного фиброзного процесса.

В Методических рекомендациях МР 2673-83 «Обоснование предельно допустимых концентраций (ПДК) аэрозолей в рабочей зоне» есть прямая рекомендация использовать в качестве стандартного образца фи-брогенной пыли высокодисперсный кварцевый порошок [4]. Кварцевый порошок с такими характеристиками производится многими предприятиями по ГОСТ 9077-82 «Кварц молотый пылевидный». Кварц молотый пылевидный производится путем помола химически чистого природного жильного кварца до тонкодисперсного состояния. Кварц пылевидный имеет степень помола 60 мкм.

Материалы и методы

Кварц молотый пылевидный, ГОСТ 9077-82, марка Б

Кварц молотый пылевидный производится путем помола химически чисто-

A.B. Воробьев, В.И. Сигаев, А.Д. Толчинский, С.Н. Успенская, Ю.В. Иванова, Е.В. Звягина, С.П. Рыбалкин, Л.В. Михина, С.Г. Бесаева, A.A. Мазанова, Н.Р. Дядищев

го природного жильного кварца до тонкодисперсного состояния. Кварцевая пыль представляет собой твердый природный материал серовато-белого цвета. Массовая дола двуокиси кремния в продукте составляет не менее 98%. Кварцевая пыль имеет степень помола 60 мкм, остаток на сите № 0,063 (т.е. частицы крупнее 63 мкм) составляет не более 10%. В исследованиях был использован кварц молотый пылевидный по ГОСТ 9077-82, марки Б, производства компании «Батолит», Москва, Россия (www.batolit.ru).

Одностенные углеродные нано-трубки

ОУНТ получают каталитическим пиролизом углеводородов при газофазном осаждении на поверхности катализаторов (CVD). Продукт пиролиза представляет собой порошок черного цвета из гранул спутанных пучков. Количество слоев — 1, диаметр волокна — 1,8 нм, длина волокна — >5 мкм, содержание примесей — до 12%, удельная геометрическая поверхность — 465 м2/г.

В исследованиях были использованы одностенные углеродные нанотрубки Tuball производства компании ООО «ОКСиАл.ру», Новосибирск.

Многостенные углеродные нанотрубки

МУНТ также получают катал итиче-ским пиролизом углеводородов при газофазном осаждении на поверхности катализаторов (CVD). Продукт пиролиза представляет собой порошок черного цвета из гранул спутанных пучков. Количество слоев — 6—10, диаметр волокна — 8—15 нм, длина волокна — >2 мкм, содержание примесей — менее 5%, удельная геометрическая поверхность — 300—320 м2/г. В исследованиях были использованы МУНТ Таунит-М производства компании ООО «НаноТехЦентр», Тамбов.

Экспериментальные животные

В качестве лабораторных животных при проведении исследований использовали белых беспородных крыс-самцов, поставщик — Научный центр биомедицинских технологий РАМН, филиал «Андреевка».

Схемы экспериментов

Оценку возможного фиброгенно-го действия ОУНТ и МУНТ, а также референс-материала кварцевой пыли проводили в условиях подострого ингаляционного эксперимента. Продолжительность подострого эксперимента и уровень концентрации кварцевой пыли в динамических каналах экспозиционной аэрозольной камерной установки были выбраны таким образом, чтобы суммарная расчетная доза кварцевой пыли, осевшей в легких крыс, по окончании эксперимента составила не менее 50 мг, т.е. была сопоставима с дозой, вводимой эндо-трахеально, в модельных экспериментах по оценке фиброгенного действия пылевидных материалов [4].

Исследуемый материал вводили инга-ляционно в течение 4 часов пять дней в неделю 4—6 недель. Контрольные животные экспонировались в атмосфере чистого воздуха. В каждом эксперименте были использованы 90 самцов беспородных белых крыс, по 20 особей в каждой из трех экспериментальных групп и по 10 особей в каждой контрольной группе. После завершения курса ингаляций наблюдения за животными проводили в течение 3 месяцев.

Создание и мониторинг аэрозоля исследуемых материалов в экспозиционной аэрозольной камерной установке

Экспонирование животных по системе «голова-нос» осуществляли в разработанной в Научно-исследовательском центре токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов (НИЦ ТБП) экспозиционной аэрозольной камерной установке (ЭАКУ) (патент РФ № 2552945) с использованием оригинального генератора сухих аэрозолей конструкции НИЦ ТБП (патент РФ № 2614706), работа которого основана на принципах помола и «кипящего слоя». Характеристики устройств и методология работы с использованием этого оборудования были описаны нами ранее [6; 7]. Экспонирование лабораторных животных в динамических каналах ЭАКУ проводили в атмосфере концентрации аэрозоля исследуемого материала в диапазоне 40-90 мг/м3.

Концентрацию аэрозоля исследуемых материалов определяли прямым гравиметрическим и альтернативным фотометрическим методами с использованием в качестве пробоотборников аналитических фильтров АФА-РМП-3. Фильтры АФА-РМП-3 растворяли в 5 мл этил ацетата, полученную суспензию материалов анализировали фотометрически (анализатор Флюорат-02-Панорама Люмекс, Россия). Объемная скорость отбора пробы составляла 2 л/мин. Данные, полученные гравиметрическим методом, служили эталоном при калибровке альтернативного фотометрического метода определения концентрации аэрозолей в ЭАКУ.

Для определения фракционно-дис-персного состава (ФДС) аэрозоля исследуемого материала использовали 8-каскадный физический импактор Андерсена, ThermoAndersen Inc., США. Объемная скорость отбора пробы составляла 28,3 л/мин. Время отбора пробы — 1—2 минуты. Смыв частиц МУНТ с осадительных пластин каждой ступени проводили 5 мл этилацетата. Оптическую плотность полученных суспензий определяли фотометрическим методом. Процентное содержание частиц различных фракций в аэрозоле рассчитывали, используя данные фотометрического анализа.

Оценку массовой концентрации и ФДС аэрозоля исследуемого материала в динамических каналах ЭАКУ осуществляли периодически в течение каждой недели проведения эксперимента.

Методы

Клинические наблюдения за состоянием животных, потреблением корма и воды проводили ежедневно, взвешивание — еженедельно в течение эксперимента.

Исследование проб, полученных от животных, проводили сразу после завершения курса ингаляций, через 1 и 3 месяца наблюдений.

Исследовали бронхоальвеолярный ла-важ (БАЛ) для оценки количества макрофагов в 1 мл лаважной жидкости и определяли процентное содержание в ней эозинофилов, сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и макрофагов (световой микроскоп Axioskop 40 Zeiss, Германия).

Для проведения биохимического анализа использовали надосадочную жидкость, полученную после центрифугирования брон-хоальвеолярного лаважа, в которой оценивали активность ферментов лактатдегидроге-назы (ЛДГ) и щелочной фосфатазы (ЩФ) (биохимический анализатор STATFAX 4500, США).

Пробы крови для гематологического и биохимического анализов отбирали из бедренной вены после ночи голодания. Определяли лейкоцитарную формулу крови и биохимические показатели сыворотки крови (общий белок, глюкозу, общий холестерин, мочевину, креатинин, общий билирубин, активность ЩФ и ЛДГ) (световой микроскоп Axioskop 40 Zeiss, Германия, автоматический гематологический ветеринарный анализатор B^2800Vet, КНР).

Пробы мочи анализировали на полуавтоматическом анализаторе мочи Urisys1100, США.

Некропсию всех животных проводили с подробным исследованием и описанием внешнего состояния тела, кожи, шерстного покрова, видимых слизистых оболочек, а также исследованием грудной, брюшной и тазовой полостей с находящимися в них органами. У всех животных определяли массу следующих органов: сердце, легкие, печень, почки, селезенка. Парные органы взвешивали вместе. Определяли массовые коэффициенты органов путем расчета отношения массы органа (г) к массе тела (кг), определенной перед некропсией после ночи голодания. Значимость различий определяли с использованием U-критерия Манна—Уитни. Для гистологического анализа отбирали образцы следующих органов и тканей: легкое, сердце, печень, почка, селезенка. Срезы толщиной 5—6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Дополнительно окрашивали серию препаратов легких по Ван Гизону.

Результаты исследования и их обсуждение

Концентрация и ФДС аэрозоля исследуемых материалов в динамических каналах ЭАКУ

Текущая концентрация каждого из исследуемых материалов в аэрозоле в разные

А.В. Воробьев, В.И. Сигаев, А.Д. Толчинский, С.Н. Успенская, Ю.В. Иванова, Е.В. .Звягина, С.П. Рыбалкин, Л.В. Михина, С.Г. Бесаева, A.A. Мазанова, Н.Р. Дядищев

Таблица 1 Средняя концентрация аэрозоля исследуемого материала в динамических каналах ЭАКУ в течение многодневной ингаляции крыс

Материал Средняя концентрация аэрозоля материала в ЭАКУ, мг/м3

1-я неделя 2-я неделя 3-я неделя 4-я неделя 5-я неделя 6-я неделя Среднее

Кварцевая пыль 71±20 62±6 61±5 83±6 — — 70±9

ОУНТ 41±2 42±1 40±2 42±2 41±1 45±8 42±3

МУНТ 74±9 89±7 87±8 87±3 — — 84±7

периоды ингаляций имела близкие значения. Это послужило основанием для того, чтобы использовать среднее значение концентрации конкретного исследуемого материала за весь период ингаляционного введения при дальнейших расчетах суммарной дозы материала, поглощенной крысами (табл. 1).

ФДС аэрозоля исследуемых материалов в течение подострого эксперимента был представлен частицами размером не более 5 мкм (кварцевая пыль — Д50=1,6 мкм, ОУНТ — Д50=3,0 мкм, МУНТ - Д50=2,1 мкм). Аэрозольные частицы такого размера проникают в глубокие отделы дыхательного тракта (бронхиолы, альвеолы) и практически полностью задерживаются в них.

Для расчета суммарной поглощенной дозы использовали модифицированную формулу Флюри, связывающую концентрацию токсиканта в воздухе, вес и параметры дыхания экспериментальных животных, время экспонирования и дозу [2; 8]. Используемые показатели и результаты расчета приведены в таблице 2.

Таким образом, в результате проведенных подострых ингаляционных экспериментов выполнено основное условие — обеспечено поступление в легкие крыс дозы исследуемых материалов не менее 50 мг, сопоставимой с дозой, вводимой эндотрахеально в мо-

дельных экспериментах по оценке фиброген-ной активности пылевых материалов.

Учитывая обилие цифровых данных, полученных по различным видам анализа для 3 материалов и 3 сроков исследований в ходе экспериментов, которые трудно поместить в формат статьи, целесообразно представить итоговые результаты в виде совокупности диагностических параметров, указывая только наименование параметра и достоверное уменьшение ( —) или увеличение ( + ) его значения для экспериментальных животных по сравнению с контрольными (табл. 3).

Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных, экспонированных в атмосфере заданной концентрации исследуемых материалов в аэрозоле от начала и до завершения курса ингаляций, соответствовали показателям физиологической нормы. Достоверно показано, что поступление кварцевой пыли приводило к уменьшению прироста массы тела крыс со 2-й недели наблюдения по сравнению с контрольной группой животных. При поступлении ОУНТ также отмечена достоверная разница в весе экспериментальных и контрольных животных с 3-й недели наблюдения. В случае МУНТ достоверных различий в весе животных отмечено не было в течение всего

Таблица 2 Используемые показатели и результаты расчета суммарной ингаляционной дозы для крыс в подострых ингаляционных экспериментах

Материал Средняя концентрация материала в ЭАКУ, мг/м3 Средний вес крыс в период ингаляций, г Легочная вентиляция крысы, см3/г мин Общее время ингаляций, мин Суммарная расчетная ингаляционная доза на крысу, мг

Кварцевая пыль 70±11 «=18 270±19 п=60 0,65 4320 (4 недели) 55

ОУНТ 42±1 «=19 272±15 п=60 0,65 6720 (6 недель) 50

МУНТ 84±5 «=12 213±20 п=60 0,65 4320 (4 недели) 50

о

Ел

Ьо о е о

с

л

04

!» = «

. я с а

II I ^ I ^

ев ^

н § = 5

Л

Ьа

л

Г4

а

л

04

а

: (я

£

04

а я о

04

а

еч ^ Ел

Ь Ог

9а 04

!а

Таблица 3 Динамика диагностических показателей у крыс на разных стадиях ингаляционных экспериментов

Материал и срок исследований Диагностические показатели

Клинические наблюдения БАЛ Кровь Моча Патоморфология Все-

Цитология Биохимия Гематология Биохимия го

После завершения ингаляций Масса тела( —) 1 Макрофаги ( —) 1 Нейтрофилы ( + ) 1 ЩФ ( + ) 1 Лейкоциты ( —) 1 0 0 Макроскопия внутренних органов — 0 Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Небольшое количество макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 7

Кварцевая пыль Через 1 месяц наблюдений 0 Нейтрофилы ( + ) 1 0 0 0 0 Макроскопия внутренних органов — 0 Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Множественные скопления макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 Мелкие узелковые клеточные образования — 1 4

Через 3 месяца наблюдений 0 Макрофаги ( —) 1 Нейтрофилы ( + ) 1 Лимфоциты ( —) 1 Эозинофилы (+) 1 ЛДГ ( + ) 1 ЩФ ( + ) 1 0 Глюкоза ( —) 1 Креатинин ( —) 1 0 Макроскопия внутренних органов — 0 Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Множественные скопления макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 Мелкие узелковые клеточные образования — 1 11

После завершения ингаляций Масса тела( —) 1 Нейтрофилы ( + ) 1 Лимфоциты ( —) 1 ЛДГ ( + ) 1 ЩФ ( + ) 1 0 Мочевина ( + ) 1 Креатинин ( —) 1 0 Макроскопия внутренних органов — 1 (многочисленные очаги темно-серого цвета на легких) Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Множественные скопления макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 10

ОУНТ Через 1 месяц наблюдений 0 Макрофаги ( —) 1 Нейтрофилы ( + ) 1 0 Гемоглобин ( + ) 1 Нейтрофилы (") 1 0 0 Макроскопия внутренних органов — 1 (отдельные очаги темно-серого цвета на легких) Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Множественные скопления макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 7

Через 3 месяца наблюдений 0 Макрофаги ( —) 1 Нейтрофилы ( + ) 1 ЛДГ ( + ) 1 ЩФ ( + ) 1 0 0 0 Макроскопия внутренних органов — 0 Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Множественные скопления макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 6

«= С>

* £

е 3

С Я

5 *

я а

я о

X I»

я я о

Яг

«я -

0 а

1

я о ^ а

2 « я

(в К.

Я

8

I

л я

о

я о

я

я с

I» : я

г

Ч «я

й

е

о

я с

а

«я

К.

Таблица 3. Продолжение

Материал и срок исследований Диагностические показатели

Клинические наблюдения БАЛ Кровь Моча Патоморфология Всего

Цитология Биохимия Гематология Биохимия

После завершения ингаляций 0 0 ЛДГ ( + ) 1 0 Глюкоза ( + ) 1 Холестерин ( + ) 1 0 Макроскопия внутренних органов — 1 (многочисленные очаги темно-серого цвета на легких) Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Множественные скопления макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 6

МУНТ Через 1 месяц наблюдений 0 Макрофаги ( + ) 1 Нейтрофилы (+) 1 Лимфоциты ( —) 1 ЛДГ ( + ) 1 ЩФ ( + ) 1 0 Общий белок (—) 1 Билирубин ( + ) 1 АлАТ (+) 1 0 Макроскопия внутренних органов — 1 (многочисленные очаги темно-серого цвета на легких) Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Множественные скопления макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 Очаговые скопления лимфоцитов и макрофагов в паренхиме — 1 12

Через 3 месяца наблюдений 0 0 ЛДГ ( + ) 1 ЩФ ( + ) 1 0 0 0 Макроскопия внутренних органов — 1 (многочисленные очаги темно-серого цвета на легких) Массовые коэффициенты внутренних органов — 0 Утолщение межальвеолярных перегородок — 1 Множественные скопления макрофагов в альвеолах и межальвеолярных перегородках — 1 Очаговые скопления лимфоцитов и макрофагов в паренхиме — 1 Формирование единичных мелких гранулем вокруг скопления частиц МУНТ — 1 7

периода ингаляционного введения препарата. Наблюдение за животными после завершения ингаляций (в течение 3 месяцев) не выявило достоверных различий в приросте массы тела крыс во всех экспериментальных группах.

Цитологические исследования показали, что соотношение различных видов лейкоцитов в БАЛ животных после ингаляционного введения исследуемых материалов изменялось в разные периоды наблюдений. Так, непосредственно после завершения ингаляций кварцевой пыли отмечали уменьшение доли макрофагов и увеличение доли сег-ментоядерных нейтрофилов. Остальные показатели (доли лимфоцитов и эозинофилов) не отличались от показателей контрольной группы животных. В этот период наблюдения в эксперименте с ОУНТ отмечали увеличение доли сегментоядерных нейтрофилов и уменьшение доли лимфоцитов. В эксперименте с МУНТ достоверных изменений в соотношении различных видов лейкоцитов отмечено не было. Через 1 месяц наблюдений у животных, ингалированных кварцевой пылью, было зафиксировано только увеличение доли сегментоядерных нейтрофилов, а через 3 месяца все исследуемые показатели ( доли макрофагов, сегментоядерных нейтрофилов, лимфоцитов и эозинофилов) достоверно отличались от показателей животных контрольной группы.

В эксперименте с ОУНТ через 1 и 3 месяца наблюдений отмечали стойкое уменьшение доли макрофагов и увеличение доли сег-ментоядерных нейтрофилов. В эксперименте с МУНТ наибольшие изменения в соотношении различных видов лейкоцитов наблюдали через 1 месяц после окончания ингаля-

ций (увеличение доли макрофагов и сегмен-тоядерных нейтрофилов, а также уменьшение доли лимфоцитов) . Через 3 месяца все показатели экспериментальной и контрольной групп животных не имели существенных различий.

Наиболее характерной и, главное, ранней реакцией на отложение цитотоксичных пылевых частиц является изменение в брон-хоальвеолярной жидкости числа альвеолярных макрофагов и сегментоядерных нейтрофилов. Возрастание соотношения нейтрофилов и макрофагов может служить информативным показателем цитотоксического действия, прогнозирующим степень его фибро-генности [1; 3; 11].

С использованием результатов цитологических исследований БАЛ экспериментальных и контрольных животных, полученных нами в ингаляционных экспериментах с исследуемыми материалами, был проведен расчет соотношения нейтрофилов и макрофагов на разных этапах экспериментов (табл. 4).

Значения показателя нейтрофилы/ макрофаги возрастало по мере увеличения срока наблюдения в эксперименте с ингаляционным введением кварцевой пыли животным, что может указывать на развитие процесса цитотоксического действия. В случае с ингаляционным введением ОУНТ этот показатель имел повышенные значения относительно контроля непосредственно после завершения курса ингаляций и оставался на прежнем уровне по мере увеличения срока наблюдений за животными. В данном случае цитотоксический процесс не получил активного развития. Непосредственно после завершения курса ингаляций МУНТ у экспериментальных животных отмечен уровень

Таблица 4 Соотношение нейтрофилов и макрофагов в бронхоальвеолярной жидкости на разных этапах эксперимента

Этапы эксперимента и материалы Соотношение СН/М

После завершения ингаляций Через 1 месяц наблюдений Через 3 месяца наблюдений

Кварцевая пыль Э 1,5 2,1 3,7

К 0,2 0,5 0,4

ОУНТ Э 4,1 4,7 4,8

К 1,7 1,2 1,2

МУНТ Э 4,9 9,5 8,3

К 0,7 1,4 1,2

Примечания: Э — эксперимент, К — контроль.

А.В. Воробьев, В.И. Сигаев, А.Д. Толчинский, С.Н. Успенская, Ю.В. Иванова, Е.В. Звягина, С.П. Рыбалкин, Л.В. Михина, С.Г. Бесаева, А.А. Мазанова, Н.Р. Дядищев

показателя нейтрофилы/макрофаги, сопоставимый с установленным в экспериментах с кварцевой пылью и ОУНТ. Через 1 месяц наблюдения за животными отмечено увеличение значения показателя нейтрофилы/ма-крофаги. Высокие значения показателя сохранялись и в отдаленные сроки наблюдений (3 месяца). Значения показателя и его динамика отражают протекание активного цитотоксического процесса.

Биохимические исследования БАЛ в ингаляционных экспериментах проводили по показателям активности ЛДГ и ЩФ. После завершения ингаляций кварцевой пыли и МУНТ активность ЛДГ в экспериментальной группе животных не отличалась от установленной в контрольной группе. При этом активность ЩФ в этот период достоверно отличалась для всех исследуемых материалов — кварцевой пыли, ОУНТ и МУНТ. Через 1 месяц наблюдений повышенные значения активности ЛДГ и ЩФ наблюдались только в эксперименте с МУНТ. Биохимические показатели БАЛ в экспериментах с кварцевой пылью и ОУНТ были на уровне контроля. Через 3 месяца наблюдений в экспериментах со всеми исследуемыми материалами (кварцевая пыль, ОУНТ и МУНТ) в экспериментальных группах животных была отмечена повышенная активность как ЛДГ, так и ЩФ.

Гематологический анализ проб крови экспериментальных животных в экспериментах с кварцевой пылью и ОУНТ выявил отдельные отклонения в исследуемых показателях в разные сроки наблюдения, однако диагностической ценности эти данные практически не имели. В эксперименте с МУНТ все гематологические показатели независимо от срока проведения исследований в экспериментальной и контрольной группах не имели существенных различий.

Биохимический анализ проб сыворотки крови экспериментальных животных, ингалированных кварцевой пылью, показал, что только в отдаленный период наблюдения, через 3 месяца, наблюдалось достоверное снижение концентрации глюкозы и креатинина. У животных, ингалиро-ванных ОУНТ, достоверное изменение некоторых биохимических показателей (уве-

личение концентрации мочевины и снижение концентрации креатинина) наблюдали непосредственно после завершения курса ингаляций. В последующие сроки наблюдения (1 и 3 месяца) все биохимические показатели в экспериментальной и контрольной группах животных не имели существенных различий. Наибольшие отклонения в биохимических показателях от контроля отмечались в эксперименте с МУНТ. Так, непосредственно после завершения курса ингаляций наблюдали увеличение концентрации глюкозы и холестерина, а через 1 месяц наблюдений — понижение концентрации общего белка, повышение концентрации билирубина и аланинаминотрансферазы. Однако через 3 месяца наблюдений все биохимические показатели в экспериментальной группе животных не отличались от таковых в контрольной группе.

Анализ проб мочи не выявил существенных различий в показателях у экспериментальных и контрольных групп животных независимо от исследуемого материала и сроков наблюдения.

Результаты патоморфологических исследований легких как наиболее показательного органа в подостром ингаляционном эксперименте по ингаляционному введению кварцевой пыли выражались в развитии макрофагальной реакции, наличии широкоплазменных макрофагов в просветах альвеол, утолщении межальвеолярных перегородок и наличии мелких плотных узелковых образований в легких. Очагов формирования соединительной ткани в легких в условиях подострого эксперимента выявлено не было. В эксперименте с ингаляционным введением ОУНТ в результате макроскопических исследований были выявлены многочисленные очаги темно-серого цвета, но общее их количество существенно уменьшилось через 1 месяц и исчезло полностью через 3 месяца наблюдений за животными. Микроскопические исследования легких крыс экспериментальной группы дали отчетливую картину макрофагальной реакции на ингаляционное введение ОУНТ. Однако по мере увеличения срока наблюдений выявлено наличие процесса элиминации макрофагов с частицами ОУНТ. При

этом какой-либо специфической или общего характера реакции в тканях легких крыс после окончания срока наблюдения установлено не было. Ингаляционное введение МУНТ крысам по плану подострого эксперимента приводило к появлению у экспериментальных животных типичных признаков цитотоксического действия с яркими проявлениями макрофагальной реакции, сохраняющейся весь период наблюдений и сопровождающейся активизацией биохимических процессов в бронхоальвеолярной жидкости. На поверхности легких отмечены многочисленные очаги темно-серого цвета, наличие которых сохранялось и в отдаленные сроки наблюдения за животными.

Микроскопические исследования показали утолщение межальвеолярных перегородок, множественные скопления макрофагов в альвеолах и формирование единичных гранулем вокруг скопления частиц МУНТ (рисунок).

Заключение

Результаты ингаляционного введения в течение 4—6 недель аэрозоля исследуемых материалов (кварцевая пыль, одностенные углеродные нанотрубки ТиЬа11, многостенные углеродные нанотрубки Таунит-М) в условиях подострого эксперимента с последующим наблюдением животных в течение 3 месяцев показали, что во всех случаях отмечено цитотоксическое действие иссле-

Легкое крысы через 3 месяца наблюдений. Формирование гранулемы в легком крысы после ингаляционного введения МУНТ

дуемых материалов, проявляющееся в разной степени в цитологических и биохимических показателях бронхоальвеолярной жидкости.

Развитие активного фибропластическо-го процесса, подтвержденного патоморфоло-гическими исследованиями, отмечено только при ингаляционном введении многостенных углеродных нанотрубок Таунит-М.

Полученные результаты позволяют считать, что дальнейшие исследования ингаляционной токсичности различных волокнистых углеродных наноматериалов являются актуальной задачей в связи с существенными различиями в клинической картине их воздействия на экспериментальных животных.

Литература

1. Кацнельсон Б. А., Алексеева О. Г., Привалова Л.И., Ползик Е.В. Пневмокониозы: патогенез и биологическая практика. Екатеринбург, 1995.

2. Лазарев Н.В. Общие основы промышленной токсикологии. М.; Л.: Гос. изд-во мед. лит-ры, 1938. Лекция 6.

3. Луценко Л. А., Пыльцев Ю.П., Якубов Б.И. и др. Экспериментальное изучение фиброгенного и токсического действия минеральных пыл ей сложного химического состава // Вопросы гигиенической оценки органических и минеральных пылей сложного химического состава. М.: Медицина, 1976. С. 9—19.

4. Методические рекомендации МР 2673-83 «Обоснование предельно допустимых концентраций (ПДК) аэрозолей в рабочей зоне». М., 1983.

5. Мищенко С.В., Ткачев А.Т. Углеродные наноматериалы. Производство, свойства, применение. М.: Машиностроение, 2008.

6. Сигаев В.И., Толчинский А.Д., Воробьев А.В., Звягина Е.В. Технические и методологические аспекты перевода волокнистых углеродных материалов в аэрозольное состояние при проведении ингаляционных токсикологических экспериментов // Прикладная токсикология. 2015. № 1. С. 44—54.

А.В. Воробьев, В.И. Сигаев, А.Д. Толчинский, С.Н. Успенская, Ю.В. Иванова, Е.В. Звягина, С.П. Рыбалкин, Л.В. Михина, С.Г. Бесаева, А.А. Мазанова, Н.Р. Дядищев

7. Толчинский А.Д., Сигаев В.И., Воробьев А. В., Мажинский А. А. Разработка и испытания экспозиционной аэрозольной камерной установки для нормирования вредных веществ в воздухе рабочей зоны // Прикладная токсикология. 2014. № 1. C. 10-17.

8. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шеф-тель В.О. и др. Проблемы нормы в токсикологии. М.: Медицина, 1991.

9. Харрис П. Углеродные нанотрубки и родственные структуры. Новые материалы XXI века. М.: Техносфера, 2003.

10. Jaurand M.C.F., Renier A., Daubriac J. Mesothelioma: Do asbestos and carbon nanotubes pose the same health risk? // Particle and Fibre Toxicology. 2009. No. 6. P. 16-29.

11. Katsnelson B.A., Privalova L.I. Correlation between cytotoxisity and fibrogenisity of

silicosis inducing dusts // Med. Lavoro. 1984. No. 6. P. 450-462. 12. Poland C.A., Duffin R., Kinloch I. et al. Carbon nanotubes introduced into the abdominal cavity of mice show asbestos-like pathogenicity in a pilot study // Nature Nanotechnology. 2008. No. 3 (7). P. 423428.

Контакты:

Сигаев Владимир Иванович, ведущий научный сотрудник,

отдел аэрозольной токсикометрии НИЦ ТБП — филиала

ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России,

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник.

Тел. раб. (4967) 399738.

E-mail: vsigaev@list.ru

_информация

Подписание соглашения о сотрудничестве

7 сентября 2017 г. в г. Хиросиме (Япония) состоялось торжественное подписание соглашения о сотрудничестве между Федеральным государственным бюджетным учреждением «Государственный научный центр Российской Федерации - Федеральный медицинский биофизический центр имени А.И. Бурназяна» и Научно-исследовательским институтом радиационной биологии и медицины Хиросимского университета.

Генеральный директор ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России д.м.н. А.С. Самойлов и директор НИИ радиационной биологии и медицины профессор Shinya Matsuura поставили свои подписи на договоре, над которым организации работали более года. В связи с высокой значимостью события подписание транслировалось в прямом эфире на национальных телеканалах Японии. Стороны договорились о тесном взаимодействии в области радиационной медицины, производства радиофармацевтических препаратов, а также радиационной биологии.

6 сентября 2017 г. японские коллеги познакомили российских ученых с работой Центра радиационной медицины. Его опыт особенно актуален для сотрудников ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России в связи с возложенным на них запуском Центра протонной терапии в Димитровграде.

Перед официальной церемонией подписания принимающая сторона провела для российских коллег экскурсию по экспозиции музея университета. Также состоялась научная конференция, в которой участвовали и представители ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России. Руководитель научной делегации А.С. Самойлов поделился с японским научным сообществом российским опытом в области радиационной медицины.