Создание генетических паспортов подвойных форм яблони на основе анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей ДНК

й01: 10.24411/0235-2451-2019-10203 УДК 634.11:575.2

Создание генетических паспортов подвойных форм яблони на основе анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей ДНК*

А. С. ЛЫЖИН, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник

Федеральный научный центр им. И. В. Мичурина, ул. Мичурина, 30, Мичуринск, Тамбовская обл., 393774, Российская Федерация

Резюме. Анализировали полиморфизм микросателлитных локусов для генетической идентификации подвойных форм яблони M9, B9, 54-118, 62-396. Для этого сформировали диагностический набор из 10 микросателлитных маркеров (SSR-маркеров): CH01c06, CH01f03b, CH02c02b, CH02g04, CH03a04, CH03d12, CH04c07, CH04h02, CH05e04, CH05g08. Предложенный набор позволяет проводить надёжную идентификацию изученных подвойных форм яблони. Работу проводили в 2017-2018 гг. Повторность опытов 3-х кратная. Растительный материал подвоев B9, 62-396, 54-118 был взят в генетической коллекции Федерального научного центра им. И. В. Мичурина, подвоя M9 - в плодообъединении «Сады Ставрополья». Фрагментный анализ ПЦР-продуктов осущесвляли на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer, позволяющем определять размер SSR-аллелей с точностью до одного нуклеотида. Полученныехроматограммы обрабатывали в программной среде GeneMarker V2.6.3. У изучаемых подвоев яблони анализируемый набор микросателлитов представлен 39 аллелями, размер которых лежит в диапазоне 94...202 п.н. Из 39 аллелей 37 - полиморфные, то есть позволяют выявить различия между образцами. Количество аллелей на маркер варьировало от 2 (маркер CH05e04) до 5 (маркеры CH02g04, CH04c07). Средний уровень полиморфизма изучаемых SSR-локусов составил 94,8 %, гетерозиготности - 82,0 %. Для подвоя M9 доля уникальных аллелей была равна 41,2 % при среднем уровне гетерозиготности 82,3 %; у B9 - 10,5 и 94,7 %; у 54118 - 22,2 и 88,9 %; у 62-396 - 15,8 и 94,7 % соответственно. Невысокая доля уникальных SSR-аллелей у подвоев B9, 54-118 и 62-396объясняется тем, что формы 54-118 и 62-396получены с использованием в качестве родительской формы подвоя B9. На основании полученных данных сформированы генетические паспорта подвойных форм яблони.

Ключевые слова: яблоня, подвой, молекулярные маркеры, полиморфизм, генетический паспорт.

Для цитирования: Лыжин А. С., Соловченко А. Е. Создание генетических паспортов подвойных форм яблони на основе анализа полиморфизма микросателлитных последовательностей ДНК //Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 2. С. 11-13. DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10203.

Вопрос идентификации генотипов плодовых растений в современном садоводстве очень актуален. Чистосорт-ность - необходимое условие при закладке промышленных насаждений, обеспечении охраны интеллектуальной собственности на селекционные достижения. В качестве апробационныхмаркеров до сих пор чаще всего используют морфологические признаки. Но они имеют ряд недостатков: чётко проявляются только на поздних стадиях онтогенеза, при этом сильно варьируют, подвержены влиянию условий окружающей среды и технологий возделывания, на их основе сложно различить близкородственные генотипы и вести контроль сортовой чистоты посадочного материала.

Отмеченных недостатков лишены молекулярные маркеры, позволяющие детектировать различия между

генотипами на основе полиморфизма ДНК. Среди них наибольший интерес для генетической паспортизации представляют ДНК-маркеры, которые, в отличие от биохимических (белковых), анализирующих полиморфизм только белок-кодирующих последовательностей, позволяют выявлять сортовые различия генома. ДНК-маркеры можно использовать на любой стадии развития растения, в том числе на самых ранних этапах онтогенеза, они не требуют фенотипического проявления признака.

Однако общепринятые универсальные методы ДНК-идентификации плодовых культур остутствуют. Нет и единого мнения относительно выбора типа молекулярных маркеров, их необходимом количестве и уровне информативности. Поэтому нужны углубленные исследования в сфере генетической паспортизации видов, сортов и форм растений. Сейчас наиболее широко используют маркеры на основе простых повторяющихся последовательностей ДНК (микросателлитов). Микросателлитные маркеры (ББЯ-маркеры) характеризуются кодоминантностью, высокой поли-морфностью и надежной воспроизводимостью. Они удобны для построения генетических карт и анализа генетического разнообразия [1, 2, 3]. В связи с тем, что различия между ББЯ-локусами, как правило, обусловлены межвидовым и межсортовым полиморфизмом, ББЯ-маркеры широко используют для анализа генетического разнообразия сортов и видов яблони [4, 5, 6].

Вместе с тем молекулярно-генетические исследования подвойных форм яблони, особенно отечественной селекции, проводят в недостаточном объёме: отсутствуют данные о полиморфности микросателлитных локусов, пригодности отдельных ББЯ-маркеров для анализа и выявления различий между генотипами. Поэтому изучение генетического разнообразия подвойных форм яблони и разработка методов их ДНК-идентификации - актуальные и важные задачи.

Цель исследований - анализ полиморфизма микросателлитных локусов ДНК для создания генетических паспортов подвойных форм яблони.

Условия, материалы и методы. Работу проводили в 2017-2018 гг. Повторность опытов 3-х кратная. Объектами исследования служили подвойные формы яблони:

М9 - карликовый подвой неизвестного происхождения, получен на Ист-Моллингской опытной станции, Англия. Образцы предоставлены ООО «Плодообъединение «Сады Ставрополья», Ставропольский край, с. Сунжа;

В9 - карликовый подвой. Происхождение - М8 х Красный штандарт. Оригинатор - Мичуринский ГАУ, Россия;

62-396 - карликовый подвой. Происхождение - гибридная форма 13-14 х В9. Оригинатор - Мичуринский ГАУ, Россия.

54-118 - полукарликовый подвой. Происхождение -В9 х гибридная форма 13-14. Оригинатор - Мичуринский ГАУ, Россия.

Автор признателен доктору биологических наук Соловченко А.Е. (ФГБОУ ВО «МГУ имени М.В. Ломоносова») за плодотворное обсуждение и поддержку при проведении экспериментов.

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности использованных в работе праймеров[8]

SSR-локус I Праймер | 5'-3' последовательность

CH03d12 CH03d12 F GCCCAGAAGCAATAAGTAAACC

CH03d12 R ATTGCTCCATGCATAAAGGG

CH02c02b CH02c02b F TGCATGCATGGAAACGAC

CH02c02b R TGGAAAAAGTCACACTGCTCC

CH01f03b CH01f03b F GAGAAGCAAATGCAAAACCC

CH01f03b R CTCCCCGGCTCCTATTCTAC

CH05g08 CH05g08 F CCAAGACCAAGGCAACATTT

CH05g08 R CCCTTCACCTCATTCTCACC

CH02g04 CH02g04 F TTTTACCTTTTTACGTACTTGAGCG

CH02g04 R AGGCAAAACTCTGCAAGTCC

CH04c07 CH04c07 F GGCCTTCCATGTCTCAGAAG

CH04c07 R CCTCATGCCCTCCACTAACA

CH03a04 CH03a04 F GACGCATAACTTCTCTTCCACC

CH03a04 R TCAAGGTGTGCTAGACAAGGAG

CH01c06 CH01c06 F TTCCCCATCATCGATCTCTC

CH01c06 R AAACTGAAGCCATGAGGGC

CH04h02 CH04h02 F GGAAGCTGCATGATGAGACC

CH04h02 R CTCAAGGATTTCATGCCCAC

CH05e04 CH05e04 F AAGGAGAAGACCGTGTGAAATC

CH05e04 R CATGGATAAGGCATAGTCAGGA

Растительный материал подвоев B9, 62-396, 54-118 для экстракции геномной ДНК взят в генетической коллекции ФГБНУ «ФНЦ им. И. В. Мичурина».

Анализ генетического полиморфизма проводили с использованием набора из 10 SSR-маркеров: CH01c06, CH01f03b, CH02c02b, CH02g04, CH03a04, CH03d12, CH04c07, CH04h02, CH05e04, CH05g08 (табл. 1), которые подбирали на основе методики [7], данных электронных баз (National Center for Biotechnology Information) и литературных источников [2, 8, 9].

Маркеры CH01c06, CH01f03b, CH02c02b, CH02g04, CH03a04, CH03d12, CH04c07, CH05g08 - монолокусные, то есть представлены одним или двумя фрагментами в зависимости от гомо- или гетерозиготности генотипа. Маркеры CH04h02 и CH05e04 - мультилокусные [8]. Для фрагментного анализа на автоматическом секвенаторе прямой праймер каждого SSR маркера с 5' конца был модифицирован красителем Rox.

Геномную ДНК выделяли из молодых листьев по методу Diversity Arrays Technology P/L (DArT) [10] с модификациями, позволяющими согласно результатам проведённых ранее исследований [11, 12] получать экстракт геномной ДНК дикорастущих видов и сортов яблони, необходимой для постановки ПЦР концентрации и чистоты. Реакционная смесь для ПЦР объемом 15 мкл содержала 20 нг ДНК, 1,5 мМ dNTPs, 2,5 мМ MgCI2, 10 пМ каждого праймера, 1 ед. Taq-полимеразы и 1,5 мМ 10х стандартного ПЦР-буфера.

Амплификацию проводили в термоциклере T100 (BIO-RAD) по следующей программе: начальная денатурация 94 °C - 2 мин. 30 с; 4 цикла: 94 °C - 30 с, 65 °C - 1 мин. (при понижении температуры отжига праймеров с каждым циклом на 1 °C), 72 °C - 1 мин.; 30 циклов: 94 °C -30 с, 60 °C - 1 мин., 72 °C - 1 мин; финальная элонгация 72 °C - 5 мин. [13].

Для подтверждения успешности протекания процесса амплификации ПЦР-продукты предварительно визуализировали на агарозном геле: концентрация ага-розы - 2 %, буферная система - 1 х ТВЕ (трис-боратный буфер) при напряженности электрического поля 3,9... 4,5 В/см. Фрагментный анализ ПЦР-продуктов проводили в ЦКП «Геном» (Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта, Москва) на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Для обработки хроматограмм использовали программу GeneMarker V2.6.3. Полученные в результате анализа

хроматограмм расчетные данные по количеству аллелей и их размеру для каждого маркера использовали для составления генетических паспортов.

Результаты и обсуждение. Использованные для анализа маркеры характеризовались высоким уровнем полиморфизма. В общей сложности с использованием 10 ББЯ-маркеров у изучаемых генотипов выявили 39 аллелей, размер которых находился в диапазоне от 94 до 202 п.н. (табл. 2).

Проведенный молекуляр-но-генетический анализ подтвердил происхождение подвоев 54-118 и 62-396 от формы В9. Аллельное сходство между подвоями 54-118 и В9 составляло 57,9 %, между 62-396 и В9 - 68,4 %.

Таблица 2. Аллельное разнообразие подвойных форм яблони по 10 микросателлитным локусам, п.н.

SSR-локус Генотип

M9 62-396 I 54-118 I B9

CH03d12 100/151 123/133 133 123/133

CH02c02b 113/117 112/116 112/116 112/116

CH01f03b 162/173 155/162 153/173 162/173

CH05g08 170 170/176 176 176/183

CH02g04 189/196 191/198 196/202 198/202

CH04c07 110/117 108/112 101/112 101/108

CH03a04 94 94 175/200 94/114

CH01c06 164/189 153/164 159/164 164

CH04h02 175/200 175/187 171/187 171/175

CH05e04 161 161/171 161/171 161/171

Из 39 аллелей 37 - полиморфные, то есть позволяют выявлять различия между образцами. Количество аллелей на маркер варьировало от 2 (маркер СН05е04) до 5 (маркеры СН02д04, СН04с07), средний уровень полиморфизма - 94,8 %, гетерозиготности - 82,0 %. Для подвоя М9 доля уникальных аллелей была равна 41,2 % при среднем уровне гетерозиготности 82,3 %; В9 - 10,5 и 94,7 %; 54-118 - 22,2 и 88,9 %; 62-396 -15,8 и 94,7 % соответственно. Невысокая доля уникальных ББЯ-аллелей у подвоев В9, 54-118 и 62-396

Генетический паспорт подвоя яблони 62-396

ФГБНУ «ФНЦ им. И.В. Мичурина» Тамбовская область, Мичуринский р-н, г. Мичуринск

Оригинатор Мичуринский ГАУ

Происхождение Гибридная форма 13-14 х В9

Генотип Маркер Linkage group Размер аллеля, п.н.

62-396 СН01с06 8 153/164

СНО1Ш3Ь 9 155/162

СН02С02Ь 4 112/116

CH02g04 17 191/198

СН03а04 5 94

CH03d12 6 123/133

СН04с07 14 108/112

CH04h02 11 175/187

СН05е04 16 161/171

CH05g08 1 170/176

Рисунок. Генетический паспорт подвойной формы яблони 62-396.

объясняется тем, что формы 54-118 и 62-396 созданы с использованием в качестве родительской формы подвоя В9.

Высокий уровень полиморфизма микросателлит-ных локусов генома дикорастущих видов и сортов яблони отмечали и другие исследователи. Так, для локусов СН05е03 и СН04И02 при анализе коллекции сортов и дикорастущих видов яблони уровень полиморфизма составлял 88,0 и 94,0 % соответственно [14], в другом исследовании при анализе 66 сортов яблони для локуса СН05е03 коэффициент полиморф-ности был равен 87,0 % [15].

С помощью предложенного набора из 10 ББЯ-маркеров были получены уникальные молекулярно-генетические профили и сформированы генетические

паспорта подвойных форм яблони, в которых отражено место получения растительного материала, использованные в анализе микросателлитные маркеры и характерные для каждого генотипа фрагменты (см. рисунок).

Выводы. У изучаемых подвоев яблони М9, В9, 62396, 54-118 анализируемый набор микросателлитов представлен 39 аллелями, длинной от 94 до 202 п.н. Из 39 аллелей 37 - полиморфные, что позволяет выявлять различия между образцами. Количество аллелей на маркер варьировало от 2 (маркер СН05е04) до 5 (маркеры СН02д04, СН04с07). С помощью предложенного набора из 10 ББЯ-маркеров получены уникальные молекулярно-генетические профили и сформированы генетические паспорта подвойных форм яблони М9, В9, 54-118, 62-396.

Литература.

1. Pina A., Urrestarazu J., Errea P. Analysis of the genetic diversity of local apple cultivars from mountainous areas from Aragon (Northeastern Spain)//Scientia Horticulturae. 2014. Vol. 174. Pp. 1-9. DOI: 10.1016/j.scienta.2014.04.037.

2. Microsatellite markers spanning the apple (Malus x domestica Borkh.) genome /E. Silfverberg-Dilworth, C. L. Matasci, W. E. Van de Weg, etc. // Tree Genetics & Genomes. 2006. Vol. 2. Pp. 202-224. DOI: 10.1007/s11295-006-0045-1.

3. Construction of a dense genetic linkage map for apple rootstocks using SSRs developed from Malus ESTs and Pyrus genomic sequences / J.-M. Celton, D. S. Tustin, D. Chagné, etc.// Tree Genetics & Genomes. 2009. Vol. 5. Pp. 93-107. DOI: 10.1007/s11295-008-0171-z.

4. Microsatellite genotyping of apple (Malus x domestica Borkh.) genetic resources in the Netherlands: application in collection management and variety identification / R. Van Treuren, H. Kemp, G. Ernsting, etc. // Genetic Resources and Crop Evolution. 2010. Vol. 57(6). Pp. 853-865. DOI: 10.1007/s10722-009-9525-0.

5. Current trends in microsatellite genotyping / E. Guichoux, L. Lagache, S. Wagner, etc. // Molecular ecology resources. 2011. Vol. 11(4). Pp. 591-611. DOI: 10.1111/j.1755-0998.2011.03014.x.

6. Genetic diversity of Czech apple cultivars inferred from microsatellite markers analysis/ J. Patzak, F. Paprstein, A. Henychovâ, etc. // Horticultural Sci. (Prague). 2012. Vol. 39 (4). Pp. 149-157.

7. Шамшин И. Н., Кудрявцев А. М., Савельев Н. И. Создание генетических паспортов сортов яблони на основе анализа полиморфизма микросателлитныхлокусов генома: методика. Мичуринск: МГАУ, 2013. 44 с.

8. Development and characterisation of 140 new microsatellites in apple (Malus x domestica Borkh.)/R. Liebhard, L. Gianfranceschi, B. Koller, etc.// Molecular Breeding. 2002. Vol. 10. Pp. 217-241.

9. Genetic diversity, population structure, parentage analysis, and construction of core collections in the French apple germplasm based on SSR markers / L. Lassois, C. Denancé, E. Ravon, etc. // Plant molecular biology reporter. 2016. Vol. 34 (4). Pp. 827-844. DOI: 10.1007/s11105-015-0966-7.

10. DArT, 2014 // Diversity Array Technology [Электронный ресурс]. URL: http://www.diversityarrays.com/sites/default/files/ resources/DArT DNA isolation.pdf (дата обращения: 10.07.2018).

11. Savel'ev N. I., Lyzhin A. S., Savel'eva N. N. Genetic diversity of genus Malus Mill. for scab resistance genes//Russian Agricultural Sciences. 2016. Vol. 42. No. 5. Pp. 310-313. DOI: 10.3103/S1068367416050189.

12. Лыжин А. С., Савельева Н. Н. Идентификация генов устойчивости к парше у сортов и гибридных форм яблони с использованием молекулярных маркеров//Плодоводство и виноградарство Юга России. 2018. № 53 (5). С. 1-14. DOI: 10.30679/22195335-2018-5-53-1-14.

13. Simple sequence repeats for the genetic analysis of apple / L .Gianfranceschi, N.Seglias, R.Tarchini, etc.// Theoretical and Applied Genetics. 1998. Vol. 96 (8). Pp. 1069-1076.

14. Анализ полиморфизма SSR локусов видов Malus / О. Ю. Урбанович, З. А. Козловская, А. А. Хацкевич и др. // Известия национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук. 2010. № 1. С. 12-17.

15. Microsatellite (SSR) variation in a collection of Malus (apple) species and hybrids / S. C. Hokanson, W. F. Lamboy, A. K. Szewc-McFadden, etc. //Euphytica. 2001. V0l. 118. Pp. 281-294.

Creation of Genetic Passports of Apple Rootstock Forms on the Basis of Microsatellite DNA Polymorphism

A. S. Lyzhin

I. V. Michurin Federal Scientific Center, ul. Michurina, 30, Michurinsk, Tambovskaya obl., 393774, Russian Federation Abstract. Polymorphism of microsatellite loci for the genetic identification of apple rootstock forms M9, B9, 54-118, 62-396 was analyzed. A diagnostic set from 10 SSR markers (CH01c06, CH01f03b, CH02c02b, CH02g04, CH03a04, CH03d12, CH04c07, CH04h02, CH05e04, and CH05g08) was formed. The proposed set allowed reliable identification of apple rootstock forms. The work was carried out in 2017-2018. The replication of the experiments was 3-fold. Plant material of apple rootstocks B9, 62-396, 54-118 was taken in the genetic collection of the I.V. Michurin Federal Scientific Center, M9 apple rootstock was received from Sady Stavropolia. Fragment analysis of the obtained PCR products was performed using Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer automated sequencer, which allows determining the size of SSR alleles with an accuracy of one nucleotide. The obtained chro-matograms were processed in the GeneMarker V2.6.3 software environment. In the studied apple rootstocks, the analyzed set of microsatellites was represented by 39 alleles, the size of which was in the range of 94-202 bp. Among the 39 alleles, 37 were polymorphic, i.e. could detect differences between samples. The number of alleles per marker ranged from 2 (marker CH05e04) to 5 (markers CH02g04, CH04c07). The average level of polymorphism of the studied SSR loci was 94.8%, the level of heterozygosity was 82.0%. For the M9 stock, the share of unique alleles was 41.2% with an average heterozygosity level of 82.3%; for B9 the values of these parameters were 10.5% and 94.7%; for 54-118 - 22.2% and 88.9%; for 62-396 - 15.8% and 94.7%, respectively. The low fraction of unique SSR alleles in B9, 54-118 and 62-396 rootstocks was due to the fact that forms 54-118 and 62-396 were obtained using the B9 stock as the parent form. Based on the data obtained, genetic passports of apple rootstock forms were formed.

Keywords: apple; rootstock; molecular markers; polymorphism; genetic passport.

Author Details: A. S. Lyzhin, Cand. Sc. (Agr.), leading research fellow (e-mail: Ranenburzhetc@yandex.ru).

For citation: Lyzhin A. S. Creation of Genetic Passports of Apple Rootstock Forms on the Basis of Microsatellite DNA Polymorphism. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2019. Vol. 33. No. 2. Pp. 11-13 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10203.