АНТИ-ICOS АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ, СВЯЗАННЫХ С ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ И АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ANTI-ICOS ANTIBODIES AND THEIR APPLICATION IN TREATMENT OF ONCOLOGICAL, TRANSPLANTATION-ASSOCIATED AND AUTOIMMUNE DISEASES

Введение
Настоящее изобретение относится к анти-ICOS антителам с повышенной эффекторной функцией. Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, которая может опосредовать один или несколько из следующих признаков: комплементзависимую клеточно опосредованную цитотоксичность (КЗЦ), антигензависимую клеточно опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ) и антителозависимый фагоцитоз (опсонизацию). Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим анти-ICOS антитела изотипа IgG1 и/или IgG3 человека, а также к композициям, включающим анти-ICOS антитела изотипа IgG2 и/или IgG4 человека, которые могут опосредовать АЗКЦ, КЗЦ и/или антителозависимый фагоцитоз.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения и предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств. Например, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний и расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативного расстройства Т-клеток, но не только их, используя терапевтические анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, в которых используют терапевтические анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией.
Предпосылки создания изобретения
+
ICOS является трансмембранным белком I типа, включающим внеклеточный (Ig)V-подобный домен. ICOS служит рецептором для ко-стимулирующей молекулы B7h. Экспрессия ICOS происходит на низком уровне в не подвергнутых какому-либо воздействию Т-клетках, но регуляция экспрессии повышается в течение нескольких часов после контакта с Т-клеточным рецептором. Экспрессия ICOS сохраняется в субпопуляциях активированных Т-клеток, например, клеток Th1, Th2, и Th17 CD4.
Поскольку экспрессия ICOS концентрируется в популяциях активированных клеток Т-хелперов, терапевтическое применение анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией способствует улучшению эффективности лечения и предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, например, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний и расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативного расстройства Т-клеток, но не только их, используя терапевтические анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение также относится к анти-ICOS антителам с повышенной эффекторной функцией, которые связываются с молекулой ICOS человека, а также к композициям, включающим эти антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают JMab-136 анти-ICOS антитела (см. US 6803039), которые могут опосредовать эффекторную функцию антитела более эффективно, чем исходное антитело JMab-136. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти- ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело настоящего изобретения включает гликозилирование, отличное от гликозилирования исходного антитела.
Настоящее изобретение также предусматривают фармацевтические композиции, включающие анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения или предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, например, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний и расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативного расстройства Т-клеток, используя терапевтические анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией.
Определения
2
В контексте настоящего изобретения понятия «антитело» и «антитела» (иммуноглобулины) охватывают моноклональные антитела (включая моноклональные антитела полной длины), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), формируемые по меньшей мере из двух интактных антител, антитела человека, гуманизированные антитела, камелизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, антитела с одним доменом, доменные антитела, фрагменты Fab, фрагменты F(ab'), фрагменты антител, которые проявляют желаемую биологическую активность, область Fv с дисульфидными связями (sdFv) и анти-идиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id антитела к антителам по настоящему изобретению), внутриклеточные антитела и эпитоп-связывающие фрагменты каких-либо из указанных выше антител. В частности, к антителам относятся молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулина, т.е. молекулы, содержащие сайт связывания антигена. Молекулы иммуноглобулина могут быть какого-либо типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.
Нативные антитела обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами массой примерно 150000 Дн, состоящими из двух идентичных легких цепей (light - L) и двух идентичных тяжелых цепей (heavy - Н). Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, хотя число дисульфидных связей варьирует у тяжелых цепей разных иммуноглобулиновых изотипов. Каждая тяжелая и легкая цепь также содержит регулярно расположенные дисульфидные мостики между цепями. Каждая тяжелая цепь с одного конца содержит вариабельный домен (VH) за которым, следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен с одного конца (VL) и константный домен с другого конца; константный домен легкой цепи выравнивают с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выравнивают с вариабельным доменом тяжелой цепи. Легкие цепи классифицируют в качестве лямбда и каппа цепей, основываясь на аминокислотной последовательности константной области легкой цепи. Вариабельный домен легкой цепи каппа также может обозначаться в настоящем изобретении «VK». Понятие «вариабельная область» также может применяться для описания вариабельного домена тяжелой цепи и легкой цепи. Полагают, что определенные аминокислотные остатки формируют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей. Такие антитела могут быть получены из организмов каких-либо млекопитающих, например, людей, обезьян, свиней, лошадей, кроликов, собак, кошек, мышей, а также из других видов млекопитающих.
Понятие «вариабельный» применимо с учетом того обстоятельства, что определенные части вариабельных доменов существенно отличаются по последовательности от других частей антител и ответственны за специфичность связывания каждого конкретного антитела с его соответствующим антигеном. Однако вариабельность распределена неравномерно по вариабельным доменам антител. Она сосредоточена в сегментах, называемых комплементарно детерминируемыми областями (Complementarity Determining Regions - CDR) вариабельных доменов и в легкой цепи, и в тяжелой цепи. Более высоко консервативные части вариабельных доменов называются каркасными участками (framework regions - FW). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелой и легкой цепей включают четыре участка FW, в значительной степени адаптируя β-складчатую конфигурацию, соединенную тремя областями CDR, которые формируют петли, соединяющие и, в некоторых случаях, формирующие часть β-складчатой структуры. В каждой цепи CDR локализованы вместе в тесной близости к участкам FW и с областями CDR из другой цепи, тем самым, участвуя в формировании сайта связывания антигена у антител (см. кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., Национальный институт здоровья, общественное здравоохранение, Бетесда, Мэриленд). Константные домены обычно не участвуют непосредственно в связывании антигена, но могут влиять на связывающее сродство с антигеном и могут проявлять различные эффекторные функции, например, участие антитела в АЗКЦ, КЗЦ, антитело-зависимом фагоцитозе и/или апоптозе.
Понятие «гипервариабельная область» в контексте настоящего изобретения относится к остаткам аминокислот в антителе, которые ассоциированы со связыванием с антигеном. Гипервариабельные области охватывают аминокислотные остатки «комплементарно детерминируемых областей» или «CDR» (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) вариабельного домена легкой цепи и остатки 31-35 (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) вариабельного домена тяжелой цепи, кн.: Kabat и др. «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 1991, 5-е изд., Национальный институт здоровья, общественное здравоохранение, Bethesda, MD) и/или указанные остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в вариабельном домене тяжелой цепи, Chothia и Lesk, J. Mol. Biol., 196, 1987, cc.901-917). Остатками «каркасного участка» или «FW» являются остатки вариабельного домена, фланкирующие области CDR. Остатки FW содержатся в химерных, гуманизированных, человеческих, доменных антителах, двойных антителах, антителах vaccibodies, линейных антителах и биспецифических антителах.
В контексте настоящего изобретения понятие «область Fc» включает полипептиды, содержащие константную область антитела, исключающую первый домен константной области иммуноглобулина. Таким образом, Fc относится к двум последним доменам константной области иммуноглобулинов IgA, IgD и IgG, и трем последним доменам константной области иммуноглобулинов IgE и IgM, и гибкому шарнирному N-концу к этим доменам. Область Fc в IgA и IgM может включать цепь J. У иммуноглобулина IgG область Fc включает домены иммуноглобулина Сгамма2 и Сгамма3 (Сγ2 и Сγ3) и шарнирную область между Сгамма1 (Сγ1) и Сгамма2 (Сγ2). Хотя границы области Fc могут варьировать, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяют по включению остатков С226 или Р230 с С-концов, причем нумерация соответствует индексу EU по Kabat и др. (1991, NIH Publication 91-3242, Служба национальной технической информации, Спрингфилд, Виржиния). Понятие «индекс EU, установленный по Kabat» относится к нумерации EU остатков IgG1 антитела человека по описанию в работе Kabat и др., приведенной выше. Fc может относиться отдельно к определенной области, или этой области в составе антитела, фрагмента антитела или гибридного белка Fc. Вариант белка Fc может быть антителом, Fc гибридом или каким-либо белком или белковым доменом, включающим область Fc. Особенно предпочтительными являются белки, включающие варианты области Fc, которые являются неприродными вариантами области Fc. Аминокислотная последовательность неприродной области Fc (также обозначаемой в настоящем изобретении «вариантом области Fc») включает замещение, инсерцию и/или делецию, по меньшей мере одного аминокислотного остатка по сравнению с аминокислотной последовательностью дикого типа. Какой-либо новый аминокислотный остаток, появляющийся в последовательности варианта области Fc в результате инсерции или замещения, может рассматриваться в качестве неприродного аминокислотного остатка. Примечание: полиморфизмы были установлены в ряде положений в Fc, включая, но ими не ограничиваясь, положения 270, 272, 312, 315, 356 и 358 по Kabat, и поэтому небольшие отличия между представленной последовательностью и последовательностями в предшествующем уровне техники могут существовать.
Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, полученному из популяции в существенной степени гомогенных антител, т.е. индивидуальных антител, составляющих популяцию, являются идентичными за исключением возможных естественно встречающихся мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направленными против единственного антигенного участка. Кроме того, в противоположность препаратам поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. Дополнительно к их специфичности моноклональные антитела полезны тем, что их можно синтезировать гибридомными клетками без примесей иных клеток, вырабатывающих иммуноглобулин. Другие способы получения известны специалистам в данной области, например, моноклональное антитело может быть получено клетками, которые временно или постоянно трансфецированы генами тяжелых или легких цепей, кодирующими моноклональное антитело.
Понятие модифицирующее «моноклональное» указывает на характер антитела, получаемого из популяции антител, которая в существенной степени гомогенна, и не следует считать, что антитела получают каким-то особым способом. Понятие «моноклональное» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, которое формируется в популяции клеток клона, в том числе эукариотического, прокариотического или фагового клона, но не к способу, с помощью которого указанное антитело конструируют. Например, моноклональные антитела, применяемые по настоящему изобретению, можно получить на основе гибридомной технологии, впервые описанной Kohler и др., Nature, 256, 1975, cc.495, или их можно получить посредством методов рекомбинантных ДНК (см., например, US 4816567), включая, например, выделение из библиотек фаговых антител методами, описанными Clackson и др., Nature, 352, 1991, cc.624-628, и Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, cc.581-597. Эти методы могут применяться для получения моноклональных антител млекопитающих, химерных антител, гуманизированных антител, антител человека, доменных антител, двухвалентных антител, антител vaccibodies, линейных антител и биспецифических антител.
«Антитело человека» может быть антителом, полученным от человека, или антителом, полученным из трансгенного организма, который был «сконструирован» для выработки специфических антител человека в ответ на введение антигена, и который может быть получен каким-либо методом, известным в данной области. В некоторых методах элементы локусов тяжелой и легкой цепей человека внедряют в штаммы организма, полученные из линий эмбриональных стволовых клеток, которые содержат целевые разрывы эндогенных локусов тяжелой и легкой цепей. Трансгенный организм может синтезировать антитела человека, специфичные в отношении антигенов человека, и такой организм может применяться для получения гибридом, секретирующих антитела человека. Антитело человека также может быть антителом, в котором тяжелая и легкая цепи кодируются нуклеотидной последовательностью, полученной из одного или нескольких источников ДНК человека. Антитело, являющееся полностью антителом человека, может быть получено также при конструировании методами генетической или хромосомальной трансфекции, а также методом фагового дисплея или активированной in vitro экспрессии ICOS Т-клетками, известными в данной области.
Понятие «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКЦ)» относится к опосредуемой клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки (например, природные клетки-киллеры (NK - natural killer), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и затем вызывают лизис клетки-мишени. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такие клетки являются клетками человека. Не стремясь ограничиться каким-либо определенным механизмом действия, следует отметить, что такие цитотоксические клетки, которые опосредуют АЗКЦ, обычно экспрессируют рецепторы Fc (FcR). Основные клетки для опосредования АЗКЦ, NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, а моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII, FcγRIII и/или FcγRIV. Экспрессия FcR в гемопоэтических клетках представлена в обобщенном виде Ravetch и Kinet в Annu. Rev. Immunol., 9, 1991, cc.457-492. Для оценки АЗКЦ-активности молекулы можно провести АЗКЦ-анализ in vitro, например, описанный в патентах US 5500362 или 5821337. Соответствующие эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). В другом варианте или дополнительно АЗКЦ-активность интересующей молекулы можно оценить in vivo, например, в экспериментальной модели на животных, например, описанной Clynes и др. в PNAS (США), 95, 1998, cc.652-656.
«Комплемент-зависимая цитотоксичность (КЗЦ») относится к способности молекулы инициировать активацию комплемента и лизировать мишень в присутствии комплемента. Путь активации комплемента начинается со связывания первого компонента комплементарной системы (C1q) с молекулой (например, антителом), образующей комплекс с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента можно провести КЗЦ-анализ, например, по описанию Gazzano-Santoro и др. в J. Immunol. Методы, 202, 1996, с.163.
Понятие «антителозависимый фагоцитоз» или «опсонизация» в контексте настоящего изобретения относится к опосредуемой клетками реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют рецепторы FcγR, распознают связанное антитело на клетке-мишени и в результате вызывают фагоцитоз клеток-мишеней.
«Эффекторными клетками» являются лейкоциты, которые экспрессируют один или несколько FcR и проявляют эффекторные функции. Клетки экспрессируют, по меньшей мере FcγRI, FCγRII, FcγRIII и/или FcγRIV и проявляют АЗКЦ эффекторную функцию. К примерам лейкоцитов человека, которые опосредуют АЗКЦ, относятся мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы.
Понятия «Fc рецептор» или «FcR» используют для описания рецептора, который связывается с областью Fc антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения FcR является естественной последовательностью FcR человека. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рецептор FcR является тем рецептором, который связывает IgG антитело (гамма рецептор) и представляет рецепторы FcγRI, FcγRII, FcγRIII и FcγRIV подклассов, включая аллельные варианты и иным образом сплайсированные формы указанных рецепторов. Рецепторы FcγRII включают FcγRIIA («активирующий рецептор») и FcγRIIB («ингибирующий рецептор»), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, отличающиеся в основном по их цитоплазматическим доменам. Активирующий FcγRIIA-рецептор в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный активаторный мотив, основанный на тирозине (ITAM - immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Ингибирующий FcγRIIB-рецептор в своем цитоплазматическом домене содержит иммунорецепторный ингибиторный мотив, основанный на тирозине (ITIM - immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif). (См. обзор М. Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15, 1997, cc.203-234). Обзор по FcR представлен Ravetch и Kiner в Annu. Rev. Immunol., 9, 1991, cc.457-492, Capel и др., Immunomethods, 4, 1994, cc.25-34 и de Haas и др., J. Lab. Clin. Med., 126, 1995, cc.330-341. Понятием «FcR» объединяют в настоящем описании и другие FcR, включая те, которые будут идентифицированы в будущем. Это понятие также включает неонатальный рецептор FcRn, который ответственен за передачу материнских IgG плоду (Guyer и др., J. Immunol., 117, 1976, с.587, Kim и др., Eur. J. Immunol., 24, 1994, с.249).
Понятие «сродства» антитела с эпитопом по отношению к эпитопу, применяемому в лечении (лечениях) и описанному в настоящем изобретении, является термином, хорошо известным в данной области, и означает протяженность или прочность связывания антитела с эпитопом. Сродство может быть измерено и/или выражено разными способами, известными в данной области, включая, но, не ограничиваясь ими, константу равновесной диссоциации (KD или Kd), очевидную константу равновесной диссоциации (KD' или Kd') и IC50 (количество, требуемое для 50% подавления в конкурентном анализе). Очевидно, что для целей настоящего изобретения сродство означает среднее сродство для данной популяции антител, связывающихся с эпитопом. Величина KD' в настоящем изобретении выражена в мг IgG на мл (или мг/мл) и означает количество Ig, выраженное в мг/мл сыворотки, хотя также может быть в мг/мл плазмы. Если сродство с антителом используют в качестве основы для применения способов лечения, описанных в настоящем изобретении, или выбора способов лечения, описанных в настоящем изобретении, сродство с антителом может быть измерено до и/или во время лечения, и полученные значения могут быть использованы врачом при оценке, является ли больной человек соответствующим кандидатом для применения указанного лечения.
В контексте настоящего изобретения понятие «авидность антител» означает измерение общей связывающей силы (т.е., обеих частей антитела), с которой антитело связывается с антигеном. Авидность антител может быть измерена по определению диссоциации связи антигена-антитела при избытке антигена, используя какие-либо средства, известные в данной области, например, модификацию непрямой флуоресценции антитела, описанную Gray и др., J. Virol. Meth., 44, 1993, cc.11-24, а также другие методы.
Понятие «эпитоп» широко применяется в данной области и означает какую-либо часть молекулы, которая проявляет специфическое связывание с антителом. Понятие «антиген» означает часть молекулы или молекулу, которая содержит эпитоп и, таким образом, также специфически связывается с антителом.
Понятие «период полураспада антитела» в контексте настоящего изобретения означает фармакокинетическое свойство антитела, которое является показателем среднего времени сохранения молекул антитела после их введения. Период полураспада антитела может быть выражен в виде периода, необходимого для элиминации 50% известного количества иммуноглобулина из организма человека или его специфического компартмента, например, измеренного в сыворотке или плазме, т.е., период полураспада циркулирующего антитела, или в других тканях. Полураспад может варьировать в зависимости от вида и класса иммуноглобулина. Обычно повышение периода полураспада антитела приводит к повышению среднего времени удержания в организме (СВУ) при циркуляции введенного антитела.
Понятие «изотип» относится к классификации константной области тяжелой и легкой цепей антитела. Константные домены антител не участвуют в связывании с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи данное антитело человека или иммуноглобулин может быть отнесено к одному из пяти крупных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из этих классов могут быть дополнительно поделены на подклассы (изотипы), например, IgG1 (гамма 1), IgG2 (гамма 2), IgG3 (гамма 3) и IgG4 (гамма 4), а также IgA1 и IgA2. Константные области тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и µ, соответственно. Структуры и трехмерные конфигурации разных классов иммуноглобулинов хорошо известны. Известно, что из разных классов иммуноглобулинов человека только IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и IgM человека активируют комплемент. Известно, что IgG1 и IgG3 человека опосредуют АЗКЦ у людей. Константные области легкой цепи человека могут быть классифицированы на два крупных класса - каппа и лямбда.
В контексте настоящего изобретения понятие «иммуногенность» означает, что соединение способно возбуждать иммунный ответ (стимулируя выработку специфических антител и/или пролиферацию специфических Т-клеток).
В контексте настоящего изобретения понятие «антигенность» означает, что соединение распознается антителом или может связываться с антителом и индуцировать иммунный ответ.
Понятия «лечить» или «лечение» (или их грамматические эквиваленты) подразумевают, что тяжесть состояния субъекта снижается или по меньшей мере частично улучшается или облегчается, и/или что достигается некоторое облегчение, смягчение или снижение, по меньшей мере одного клинического признака, и/или подавление или отсрочка прогрессирования состояния, и/или предупреждение или отсрочка начала заболевания или болезненного состояния. Таким образом, понятия «лечить» или «лечение» (или их грамматические эквиваленты) относятся и к профилактическим, и к терапевтическим режимам лечения.
В контексте настоящего изобретения понятия «достаточное количество» или «количество, достаточное для» достижения определенных результатов, относится к количеству антитела или композиции по настоящему изобретению, которое достаточно для получения желаемого результата, который является необязательно терапевтическим эффектом (т.е. путем введения терапевтически эффективного количества). Например, понятия «достаточное количество» или «количество, достаточное для» может относиться к количеству, которое эффективно для истощения Т-клеток, экспрессирующих белок ICOS.
Понятие «терапевтически эффективное количество» в контексте настоящего изобретения означает количество, которое предусматривает некоторое улучшение состояние субъекта или приносит пользу субъекта. Иначе говоря, «терапевтически эффективное» количество является количеством, которое предусматривает некоторое смягчение, уменьшение и/или снижение, по меньшей мере одного клинического симптома. Клинические симптомы, связанные с расстройствами, могут быть вылечены способами настоящего изобретения, хорошо известными специалистам в данной области. Кроме того, специалисты в данной области могут оценить, что терапевтические эффекты не обязательно должны быть полными или целебными, до тех пор, пока некоторая польза проявляется в отношении субъекта.
Краткое описание фигур
Фиг.1. Аминокислотная последовательность доменов VH (А) и VL (Б) JMab-136 анти-ICOS антитела. Остатки CDR, определенные по Kabat, помещены в рамки и выделены жирным шрифтом. Потенциальные сайты O-гликозилирования (Т или S остатки) и сайты деамидирования (DS или DG остатки) отмечены серым цветом.
Фиг.2. Повышенное связывающее сродство IC9G1-aFuc с FcgRIIIa человека и макаки крабоеда. Связывающее сродство (нМ) IC9G1-aFuc с рекомбинантными FcγR человека и макаки крабоеда измеряют, сравнивая с контрольными антителами (IC009 и IC9G1), и суммируют на настоящей фигуре.
Фиг.3. IC9G1-aFuc ингибирует CD3/ICOSL индуцированную пролиферацию Т-клеток человека. Т-клетки человека инкубируют в течение 72 ч в планшете, покрытом B7h-Fc (50 мкл при концентрации 4 мкг/мл) и анти-CD3 антителом (50 мкл при концентрации 0,2 мкг/мл) в присутствии повышенных количеств IC9G1-aFuc антитела. Показана пролиферация Т-клеток в качестве функции концентрации IC9G1-aFuc антитела. Данные, полученные из контрольных экспериментов, используя антитела IC009 и IC9G1, также показаны.
Фиг.4. IC9G1-aFuc не ингибирует пролиферацию Т-клеток миндалин человека, опосредованную анти-CD3/анти-CD28 антителом. Выделенные Т-клетки миндалин человека инкубируют в течение 72 ч в планшете с покрытием из анти-CD3 и/или анти-CD28 антител. Показывают клеточную пролиферацию, выявляемую в присутствии 10 мкг/мл IC9G1.
Фиг.5. Активность АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc выше активности антител IC9G1 или IC009. Активность АЗКЦ измеряют, используя стабильно трансфецированные клетки (A) HPB-ALL клетки (HPB-ALL h-ICOS) и (Б) Jurkat клетки (Jurkat h-ICOS), экспрессирующие ICOS человека, в качестве клеток-мишеней. Величина активности ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 на клетки HPB-ALL h-ICOS составляет 138 пМ и 648 пМ, соответственно. Активность ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 на трансгенные клетки Jurkat h-ICOS составляет 5,7 пМ и 61 пМ, соответственно.
FH
FH
Фиг.6. Экспрессия ICOS в миндалинах человека ограничивается CD4+ T клетками памяти. Показывают анти-ICOS-окрашенный вариант CD4+CD45RO-CXCR5- исходных Т-клеток и CD4+CD45RO+CXCR5+ T клеток памяти.
Фиг.7. АЗКЦ действие антитела IC9G1-aFuc выше соответствующего действия антител IC9G1 или IC009. АЗКЦ действие измеряют, используя выделенные Т-клетки миндалин человека в качестве клеток-мишеней. Величина ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляет 8,2 пМ и 60,4 пМ, соответственно, в данном исследовании.
Фиг.8. Антитело IC9G1-aFuc опосредует действие АЗКЦ на свежевыделенные Т-клетки-мишени селезенки макаки крабоеда. (А) Профиль экспрессии ICOS выделенных CD4+CD45RA+ исходных Т-клеток и CD4+CD45RA- Т-клеток памяти селезенки макаки крабоеда определяют, используя жидкостную цитометрию. Показано по точкам окрашивание методом жидкостной цитометрии. Уровень экспрессии ICOS CD4+CD45RA- Т-клеток памяти существенно выше по сравнению с CD4+CD45RA+ исходными Т-клетками. (Б) Показаны кривые цитотоксичности АЗКЦ антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc, измеренные по выделенным Т-клеткам селезенки макаки крабоеда. Действие АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc выше, чем у антител IC009 или IC9G1. В настоящем исследовании величина ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляет 14,6 пМ и 236 пМ, соответственно.
Фиг.9. Антитело IC9G1-aFuc опосредует действие АЗКЦ в отношении свежевыделенных Т-клеток-мишеней из брыжеечного лимфоузла (mesenteric lymph node - БЛУ) макаки крабоеда. (А) Профиль экспрессии ICOS в выделенных из макаки крабоеда БЛУ CD4+CD45RA+неподвергнутых какому-либо воздействию Т-клеток определяют с помощью жидкостной цитометрии. Показаны результаты жидкостной цитометрии окрашенных клеток. Уровень экспрессии ICOS в CD4+CD45RA-активированных Т-клетках существенно выше, чем в CD4+CD45RA+ неподвергнутых какому-либо воздействию Т-клетках. (Б) Показаны кривые АЗКЦ цитотоксичности антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc, измеренные с применением выделенных из макаки крабоеда БЛУ Т-клеток. Действие АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc выше по сравнению с соответствующим показателем антител IC009 или IC9G1. Величина ЕС50 действия антител IC9G1-aFuc и IC9G1 в данном исследовании составляет 17,1 пМ и 198 пМ, соответственно.
Фиг.10. Фармакокинетический профиль IC9G1-aFuc у макак крабоедов. Одна доза 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc вводится внутривенно макакам крабоедам. Концентрацию антитела IC9G1-aFuc измеряют в течение 4 недель после введения. Показана концентрация в сыворотке IC9G1-aFuc в виде функции времени.
Фиг.11. Одна внутривенная доза IC9G1-aFuc существенно истощает уровень CD3+CD4+CD45RA_ICOS+ Т-клеток памяти in vivo у макак крабоедов. Одну дозу 0,01 мг/кг, 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc вводят внутривенно макакам крабоедам. Уровень CD3+CD4+CD45RA-ICOS+ Т-клеток памяти подвергают мониторингу. Уровни нормализованных Т-клеток памяти показаны в виде функции времени после введения IC9G1-aFuc. Введение одной дозы 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc приводит практически к полной элиминации CD3+CD4+CD45RA_ICOS+ Т-клеток памяти на 4 сутки. Выделение ICOS+ Т-клеток памяти является доза-зависимым.
Фиг.12. Описание по данным жидкостной цитометрии В-клеток зародышевого центра. В-клетки зародышевого центра макаки крабоеда идентифицируют в виде или CD3-CD20+IgM-CD95+ клеток, или CD3-CD20+IgM-CD27+ клеток.
Фиг.13. Одна внутривенная доза антитела IC9G1-aFuc существенно снижает уровень ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти брыжеечного лимоузла (БЛУ) и В-клеток зародышевого центра БЛУ in vivo у макак крабоедов. Одну дозу 0,1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc вводят внутривенно макакам крабоедам. Контрольных животных лечат дозой 10 мг/кг IC009 или ФСБ. Проводили мониторинг уровней ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти брыжеечного лимоузла (БЛУ) и В-клеток зародышевого центра БЛУ. Идентифицируют Т-хэлперные клетки памяти БЛУ в качестве CD3+CD4+CD45RA-ICOS+ клеток. В-клетки зародышевого центра БЛУ идентифицируют в качестве CD20+CD95+IgM- клеток. (А) Показано общее число БЛУ Т-клеток и БЛУ В-клеток зародышевого центра на 8 сутки после лечения. (Б) Показан процент истощения ICOS+ Т-клеток и процент разрушения В-клеток зародышевого центра на 8 сутки после лечения. Введение антитела IC9G1-aFuc приводит к доза-зависимому истощению ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти и В-клеток зародышевого центра из брыжеечного лимфоузла (БЛУ).
Фиг.14. Одна внутривенная доза антитела IC9G1-aFuc существенно снижает уровень ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти селезенки и В-клеток зародышевого центра у макак крабоедов in vivo. Одну дозу 0,1 мг/кг или 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc вводят внутривенно макакам крабоедам. Контрольных животных лечат 10 мг/кг IC009 или ФСБ. Проводят мониторинг уровня ICOS+ Т-клеток памяти и В-клеток зародышевого центра селезенки на протяжении исследования. Идентифицируют Т-хэлперные клетки памяти селезенки в качестве CD3+CD4+CD45RA-ICOS+ клеток, В-клетки зародышевого центра в качестве CD3-CD20+CD95+IgM- клеток. (А) Показаны общее число Т-хэлперных клеток памяти селезенки и В-клеток зародышевого центра на 8 и 30 сутки после лечения. (Б) Показаны проценты истощения Т-клеток и распад В-клеток зародышевого центра на 8 и 29 сутки после лечения. Введение IC9G1-aFuc приводит к существенному истощению Т-хэлперных клеток памяти и В-клеток зародышевого центра из селезенки. Уровни истощения существенно выше у животных, получающих антитело IC9G1-aFuc, по сравнению с контрольными животными, получающими антитело IC009. Максимальное истощение Т-клеток достигается на 8 сутки после введения IC9G1-aFuc. Максимальный уровень истощения В-клеток зародышевого центра наблюдают на 29 сутки после введения IC9G1-aFuc.
Фиг.15. Зародышевые центры селезенки атрофируются на 29 сутки после введения одной дозы антитела IC9G1-aFuc макакам крабоедам. Морфологию белой пульпы селезенки исследуют после введения одной дозы антитела IC9G1-aFuc. Показывают гистологические срезы селезенки, выделенной на 8 сутки (А) и 29 сутки (Б) после введения антитела IC9G1-aFuc. Введение IC9G1-aFuc приводит к тяжелой атрофии фолликул селезенки на 29 сутки.
Фиг.16. Выравнивание длинной и короткой изоформ аминокислотной последовательности ICOS человека (SEQ ID NO:32 и 33, соответственно).
Фиг.17. Комплементарность нуклеотидной последовательности иРНК ICOS (SEQ ID NO:34) и выбранных микромолекул РНК.
Фиг.18. Уровень относительной экспрессии miR-101 в образцах мышц больных спонгиоформным миозитом с включениями (СМВ), полимиозитом (ПМ) и дерматомиозитом (ДМ) по сравнению со здоровыми нормальными контролями по данным измерений методом TaqMan КРВ-ПЦР.
Фиг.19. Относительные уровни иРНК (A) ICOS и ICOS-L, (Б) CD4 и (В) CD3ε в образцах мышечной ткани больных спонгиоформным миозитом с включениями (СМВ), полимиозитом (ПМ) и дерматомиозитом (ДМ) по сравнению со здоровыми нормальными контролями по данным измерений методом Affymetrix выстраивания целого генома. (Г) Уровни экспрессии ICOS и ICOS-L иРНК в образцах цельной крови, выделенных из больных спонгиоформным миозитом с включениями (СМВ), полимиозитом (ПМ) и дерматомиозитом (ДМ) по сравнению со здоровыми нормальными контролями по данным измерений методом TaqMan количественной реального времени ПЦР.
Фиг.20. Относительные уровни экспрессии иРНК (А) ICOS и ICOSL, (Б) CD4 и (В) CD3ε в очагах кожных повреждений больных СКВ, сравниваемые с нормальными контролями, по результатам ПЦР реального времени TaqMan.
Фиг.21. Относительные уровни экспрессии иРНК (A) CD28, CTLA4, ICOS, ICOS-L, (Б) CD4 и (В) CD3ε в цельной крови больных СКВ, сравниваемые с нормальными контролями, по результатам ПЦР реального времени TaqMan.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к способам выработки анти-ICOS антител с повышенной эффекторной функцией. С помощью способов настоящего изобретения исходное анти-ICOS антитело модифицируют для получения анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, например, повышенной АЗКЦ, повышенной КЗЦ и повышенным антителозависимым фагоцитозом, а также с другими функциями. Какое-либо анти-ICOS антитело, которое специфически связывается с антигеном ICOS человека, может служить в качестве исходного антитела для осуществления на практике способа настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела, описанные в US 6803039, действуют в качестве исходного антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения JMAb-136 (IgG2) анти-ICOS антитело действует в качестве исходного антитела.
Настоящее изобретение предусматривает анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую эффекторную функцию более эффективно по сравнению с исходным анти-ICOS антителом. В одном из специфических вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую эффекторную функцию более эффективно, чем JMAb-136 (см. US 6803039).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, опосредует антителозависимую эффекторную функцию более эффективно, чем исходное анти-ICOS антитело, причем указанную эффекторную функцию выбирают из группы, состоящей из антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), антителозависимого фагоцитоза. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело настоящего изобретения опосредует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ) более эффективно, чем исходное анти-ICOS антитело. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ) более эффективно, чем исходное анти-ICOS антитело. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антитело-зависимый фагоцитоз более эффективно, чем исходное анти-ICOS антитело.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую клеточно-зависимую цитотоксичность более эффективно, чем исходное анти-ICOS антитело, причем активность АЗКЦ определяют, используя анализ цитотоксичности in vitro. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% более высокую максимальную цитотоксичность в анализе АЗКЦ in vitro по сравнению с исходным анти-ICOS антителом. В другом определенном варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует повышенную максимальную цитотоксичность, которая больше, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, в исследовании АЗКЦ in vitro по сравнению с максимальной цитотоксичностью исходного анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую клеточнозависимую цитотоксичность (АЗКЦ) более эффективно, чем JMab-136 анти-ICOS антитело, причем активность АЗКЦ определяют, используя анализ in vitro на цитотоксичность. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует повышенную максимальную цитотоксичность в анализе АЗКЦ in vitro, которая, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% больше по сравнению с соответствующей величиной JMab-136 анти-ICOS антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует максимальную цитотоксичность в анализе АЗКЦ in vitro, которая, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз превышает данные, полученные для JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению в анализе in vitro АЗКЦ ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз соответствующей величины исходного анти-ICOS антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению в анализе АЗКЦ in vitro ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз соответствующей величины JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ) более эффективно, чем исходное анти-ICOS антитело, причем активность АЗКЦ определяют, используя анализ цитотоксичности in vivo. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению по данным анализа АЗКЦ in vivo опосредует максимальную цитотоксичность, которая, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше максимальной цитотоксичности анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ) более эффективно, чем JMab-136 анти-ICOS антитело, причем активность АЗКЦ определяют, используя анализ на цитотоксичность in vivo. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению по данным анализа АЗКЦ in vivo опосредует максимальную цитотоксичность, которая, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше максимальной цитотоксичности JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ) более эффективно, чем исходное анти-ICOS антитело, причем активность КЗЦ определяют, используя анализ цитотоксичности in vitro. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует максимальную цитотоксичность, которая при анализе КЗЦ in vitro превышает, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100%, цитотоксичность исходного анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ) эффективнее по сравнению с JMab-136 анти-ICOS антителом, причем действие КЗЦ определяют, используя исследование цитотоксичности in vitro. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению по данным исследования КЗЦ in vitro опосредует максимальную цитотоксичность, которая по сравнению с JMab-136 анти-ICOS антителом выше, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению по данным исследования КЗЦ in vitro по сравнению с исходным анти-ICOS антителом ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз или по меньшей мере примерно в 100 раз. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению по данным исследования in vitro КЗЦ по сравнению с JMab-136 анти-ICOS антителом ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз или по меньшей мере примерно в 100 раз.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимый фагоцитоз более эффективно по сравнению с анти-ICOS антителом, что следует из результатов анализа цитотоксичности in vitro. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению по данным исследования in vitro антителозависимого фагоцитоза опосредует максимальную цитотоксичность, которая по сравнению с исходным анти-ICOS антителом выше, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимый фагоцитоз более эффективно по сравнению с JMab-136 анти-ICOS антителом, что следует из результатов анализа цитотоксичности in vitro. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует повышенную максимальную цитотоксичность при исследовании in vitro антитело-зависимого фагоцитоза, которая, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению в исследовании in vitro антитело-зависимого фагоцитоза ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с исходным анти-ICOS антителом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению в исследовании in vitro антитело-засисимого фагоцитоза ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, который имеет измененное сродство в отношении белка лиганда Fc. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, который имеет измененное сродство в отношении лиганда Fc, выбранного из группы, состоящей из FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcγRIV и C1q. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, который имеет измененное сродство с белком FcγRIIIA. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, который имеет измененное сродство с белком C1q. В другом варианте осуществления настоящего изобретения белок лиганд Fc может быть белком лигандом Fc мыши, человека или примата (например, макаки крабоеда).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, который имеет повышенное сродство с белком лигандом Fc. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, который имеет повышенное сродство с лигандом Fc, выбранным из группы, состоящей из FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcγRIV и C1q. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, который имеет повышенное сродство в отношении белка FcγRIIIA. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc с повышенным сродством в отношении белка C1q. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок лиганд Fc может быть белком лигандом Fc мыши, человека или примата (например, макаки крабоеда).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, причем указанный вариант области Fc включает, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, инсерцию или делению. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, содержащий, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, инсерцию или делецию, причем указанное, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, инсерция или делеция приводит к повышенному сродству с лигандом Fc, выбранным из группы, состоящей из: FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcγRIV и C1q. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, включающей, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, инсерцию или делецию, причем указанное, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, инсерция или делеция приводит к повышенному сродству с белком FcγRIIIA. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, включающий, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, инсерцию или делецию, причем указанное, по меньшей мере одно замещение аминокислотного остатка, инсерция или делеция приводит к повышенному сродству с белком C1q. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок лиганда Fc может быть белком лигандом Fc мыши, человека или примата (например, макаки крабоеда).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, содержащий, по меньшей мере одну аминокислотную замену, инсерцию или делецию, причем указанный, по меньшей мере один аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из остатков 239, 330 и 332, и аминокислотные остатки пронумерованы согласно индексу EU. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, включающий, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, инсерцию или делецию, причем указанный, по меньшей мере один замещенный, инсертированный или делегированный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из остатков 239, 330 и 332, и аминокислотные остатки пронумерованы согласно индексу EU. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, включает вариант области Fc, содержащей, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, причем указанный, по меньшей мере один замещенный остаток аминокислоты выбран из группы, состоящей из остатков 239, 330 и 332, и аминокислотные остатки пронумерованы согласно индексу EU. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, включает вариант области Fc, содержащий, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, причем указанное, по меньшей мере одно аминокислотное замещение выбрано из группы, состоящей из S239D, A330L, A330Y и I332E, в которой аминокислотные остатки пронумерованы согласно индексу EU. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, включающий аминокислотные замещения S239D, A330L и I332E, причем аминокислотные остатки пронумерованы по индексу EU.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, включающий, по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из: D в положении 239, Е в положении 239, L в положении 330, Y в положении 330, Е в положении 332 и D в положении 332, причем аминокислотные остатки пронумерованы по индексу EU. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, включающий D в положении 239, L в положении 330 и Е в положении 332, причем аминокислотные остатки пронумерованы по индексу EU.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает область Fc, причем сконструированная область Fc включает посттрансляционную модификацию, которая отличается от модификации исходного анти-ICOS антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, причем указанная сконструированная область Fc включает сложные N-гликозид-связанные цепочки Сахаров, в которых фукоза не связана с N-ацептилглюкозамином в уменьшающемся конце цепочки сахара.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, обладающую измененным сродством в отношении лигандного белка Fc. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, которая имеет измененное сродство в отношении лиганда Fc, выбранного из группы, состоящей из FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcγRIV и C1q. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, которая имеет измененное сродство в отношении белка FcγRIIIA. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, которая имеет измененное сродство в отношении белка C1q.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, которая имеет повышенное сродство в отношении белка лиганда Fc. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, которая имеет повышенное сродство в отношении лиганда Fc, выбранного из группы, состоящей из FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcγRIV и C1q. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, которая имеет повышенное сродство в отношении белка FcγRIIIA. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, которая имеет повышенное сродство в отношении белка C1q.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, an анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, причем указанная сконструированная область Fc включает пониженный уровень фукозы по сравнению с нативным антителом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, включающую пониженный уровень фукозы, причем указанное понижение уровня фукозы приводит к повышенному сродству с лигандом Fc, выбранным из группы, состоящей из FcγRIA, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA, FcγRIIIB, FcγRIV и C1q. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, включающую пониженный уровень фукозы, причем указанное понижение уровня фукозы приводит к повышенному сродству с белком FcγRIIIA. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, включающую пониженный уровень фукозы, причем указанное понижение уровня фукозы приводит к повышенному сродству с белком C1q.
a
on
off
d
off
on
3
-1
3
-1
4
-1
4
-1
5
-1
5
-1
6
-1
6
-1
7
-1
7
-1
8
-1
8
-1
-1
9
-1
10
-1
10
-1
11
-1
11
-1
12
-1
12
-1
-3
-3
-4
-4
-5
-5
-6
-6
-7
-7
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
-11
-12
-12
Анти-ICOS антитела, описанные в настоящем изобретении, включают области Fc с высоким связывающим сродством в отношении белка человека FcγRIIIA. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает область Fc, которая имеет константу сродства или K (k/k), равную, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М=, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М или по меньшей мере 5×10 М. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает область Fc с константой диссоциации или K (k/k) менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М или менее 10 М.
d
d
d
Антитело, применяемое в соответствии со способом настоящего изобретения, может включать область Fc, которая связывается с FcγRIIIA человека с константой диссоциацией (K) менее 3000 нМ, менее 2500 нМ, менее 2000 нМ, менее 1500 нМ, менее 1000 нМ, менее 750 нМ, менее 500 нМ, менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ, менее 75 нМ, менее 50 нМ, менее 25 нМ, менее 10 нМ, менее 5 нМ, менее 1 нМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA) (фирма Biacore International AB, Уппсала, Швеция). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, применяемое в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, может включать область Fc, которая связывается с FcγRIIIA человека с константой диссоциации (K) 1-3000 нМ, 1-3000 нМ, 1-2000 нМ, 1-1500 нМ, 1-1000 нМ, 1-750 нМ, 1-500 нМ, 1-250 нМ, 1-100 нМ, 1-50 нМ, 1-25 нМ, 1-10 нМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA). В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, которое используют в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, может включать область Fc, которая связывается с FcγRIIIA человека с константой диссоциации (K) 500 нМ, 250 нМ, 100 нМ, 75 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 10 нМ или 1 нМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA).
a
on
off
d
off
on
3
-1
3
-1
4
-1
4
-1
5
-1
5
-1
6
-1
6
-1
7
-1
7
-1
8
-1
8
-1
9
-1
9
-1
10
-1
10
-1
11
-1
11
-1
12
-1
12
-1
-3
-3
-4
-4
-5
-5
-6
-6
-7
-7
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
-11
-12
-12
Анти-ICOS антитела, описанные в настоящем изобретении, включают области Fc, обладающие высоким сродством в отношении белка FcγRIIIA не из организма обезьяны (например, не от макаки крабоеда). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает область Fc, имеющую константу сродства или K (k/k), составляющую, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 Мили по меньшей мере 5×10 М. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает область Fc, которая имеет константу диссоциации или K (k/k) менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М или менее 10 М.
d
d
d
Антитело, используемое в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, может включать область Fc, которая связывается с FcγRIIIA обезьяны (например, макаки крабоеда) с константой диссоциации (K) менее 3000 нМ, менее 2500 нМ, менее 2000 нМ, менее 1500 нМ, менее 1000 нМ, менее 750 нМ, менее 500 нМ, менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ, менее 75 нМ, менее 50 нМ, менее 25 нМ, менее 10 нМ, менее 5 нМ, менее 1 нМ, которая рассчитана по способу, описанному в настоящем изобретении или известному специалистам в данной области (например, анализ BIAcore, ELISA) (фирма Biacore International AB, Уппсала, Швеция). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, используемое в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, может включать область Fc, которая связывается FcγRIIIA обезьяны (например, макаки крабоеда) с константой диссоциации (K) 1-3000 нМ, 1-3000 нМ, 1-2000 нМ, 1-1500 нМ, 1-1000 нМ, 1-750 нМ, 1-500 нМ, 1-250 нМ. 1-100 нМ, 1-50 нМ, 1-25 нМ, 1-10 нМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA). В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, используемое в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, может включать область Fc, которая связывается с FcγRIIIA обезьяны (например, макаки крабоеда) с константой диссоциации (K) 500 нМ, 250 нМ, 100 нМ, 75 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 10 нМ или 1 нМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA).
a
on
off
d
off
on
3
-1
3
-1
4
-1
4
-1
5
-1
5
-1
6
-1
6
-1
7
-1
7
-1
8
-1
8
-1
9
-1
9
-1
10
-1
10
-1
11
-1
11
-1
12
-1
12
-1
-3
-3
-4
-4
-5
-5
-6
-6
-7
-7
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
-11
-12
-12
Анти-ICOS антитела, описанные в настоящем изобретении, включают области Fc, имеющие высокое связывающее сродство с белком FcγRIIIA мыши. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает Fc область с константой сродства или K (k/k), составляющей, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М или по меньшей мере 5×10 М. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает Fc область, которая имеет константу диссоциации или K (k/k) менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, или менее 10М.
d
d
d
Антитело, используемое в соответствии со способом, который описан в настоящем изобретении, может включать Fc область, которая связывается с FcγRIIIA мыши с константой диссоциации (K) менее 3000 нМ, менее 2500 нМ, менее 2000 нМ, менее 1500 нМ, менее 1000 нМ, менее 750 нМ, менее 500 нМ, менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ, менее 75 нМ, менее 50 нМ, менее 25 нМ, менее 10 нМ, менее 5 нМ, менее 1 нМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA) (фирма Biacore International AB, Уппсала, Швеция). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, используемое в соответствии со способом, который описан в настоящем изобретении, может включать Fc область, которая связывается с FcγRIIIA мыши с константой диссоциации (K) 1-3000 нМ, 1-3000 нМ, 1-2000 нМ, 1-1500 нМ, 1-1000 нМ, 1-750 нМ, 1-500 нМ, 1-250 нМ, 1-100 нМ, 1-50 нМ, 1-25 нМ, 1-10 нМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA). В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, применяемое в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, могут включать область Fc, которая связывается с FcγRIIIA мыши с константой диссоциации (K) of 500 нМ, 250 нМ, 100 нМ, 75 нМ, 50 нМ, 25 нМ, 10 нМ или 1 нМ по оценке с применением способа, описанного в настоящем изобретении или известного специалистам в данной области (например, анализ BIAcore, ELISA).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела по настоящему изобретению включают одну, две, три, четыре, пять или все шесть областей CDR антитела JMAb-136 (см. US 6803039).
Аминокислотные последовательности областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела JMAb-136, обозначенные по нумерации Kabat, определяют в виде SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, соответственно. Аминокислотные последовательности областей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела JMAb-136, обозначенные по нумерации Kabat, определяют в виде SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5, соответственно.
Нумерация Kabat основана на принципиально важной работе Kabat и др., опубликованной в 1991 году, публикации №91-3242 в трех томах, изданных Национальным институтом здоровья. Национальной службой технической информации (нумерация называется в настоящем изобретении «Kabat»). Kabat представляет выравнивания множества последовательностей цепей иммуноглобулина из изотипов антител разных видов. Выровненные последовательности нумеруют по единой системе нумерации - системе нумерации Kabat. Последовательности Kabat были обновлены после публикации 1991 года и доступны в качестве электронной базы данных последовательностей (версия 1997 года может быть перекопирована на другой компьютер). Какая-либо последовательность иммуноглобулина может быть пронумерована по системе Kabat путем выравнивания по референсной последовательности Kabat. Таким образом, система нумерации Kabat представляет единую систему для нумерации цепей иммуноглобулинов. Если не указано иначе, все аминокислотные последовательности иммуноглобулина, описанные в настоящем изобретении, пронумерованы по системе нумерации Kabat. Сходным образом все отдельные положения аминокислот, приводимые в настоящем изобретении, пронумерованы по системе нумерации Kabat.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, может включать вариабельную область, VH, содержащую, по меньшей мере одну область CDR, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению может включать домен VH с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, может включать вариабельную область легкой цепи, VK, содержащую, по меньшей мере одну область CDR, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению может включать VK домен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает VK домен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, и дополнительно включает VH домен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.
Настоящее изобретение предусматривает антитела, которые связываются с белком ICOS человека, включающим производные VH домена, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VK домена, VK CDR1, VK CDR2 или VK CDR3, описанные в настоящем изобретении, которые могут связываться с ICOS человека. Стандартные методики, известные специалистам в данной области, могут быть использованы для внедрения мутаций (например, вставок, делеций и/или замещений) в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, включая, например, сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез, которые обычно используют для выработки аминокислотных замещений. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения VH и/или VK CDR производные могут включать менее 25 аминокислотных замещений, менее 20 аминокислотных замещений, менее 15 аминокислотных замещений, менее 10 аминокислотных замещений, менее 5 аминокислотных замещений, менее 4 аминокислотных замещений, менее 3 аминокислотных замещений, менее 2 аминокислотных замещений, или 1 аминокислотное замещение по сравнению с исходными VH и/или VK областями CDR антитела JMab-136 анти-ICOS. В другом варианте осуществления настоящего изобретения производные VH и/или VK области CDR могут содержать консервативные аминокислотные замещения (например, указанные выше), произведенные по положениям одного или нескольких рассчитанных не имеющих принципиального значения остатков аминокислот (т.е., аминокислотных остатков, которые не имеют принципиально важного значения для антитела при специфическом связывании с ICOS человека). Мутации также могут быть внедрены случайным образом по всей длине или по части кодирующих последовательностей VH и/или VK CDR, например, методом насыщающего мутагенеза, и получаемые мутанты могут быть подвергнуты скринингу для выявления биологической активности для идентификации мутантов, сохранивших активность. После мутагенеза кодируемое антитело может быть экспрессировано, а действие антитела может быть определено.
Настоящее изобретение также предусматривает антитела, которые связываются с ICOS человека, причем указанные антитела или фрагменты антител, включающих одну или несколько областей CDR, причем указанные области CDR включают аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере а 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности одной или нескольких областей CDR антитела JMab-136 анти-ICOS. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен каким-либо из методов, известных специалистам в данной области, включая, но, не ограничиваясь им, метод поиска белков BLAST.
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые связываются с ICOS человека, причем указанные антитела или фрагменты антител включают VH и/или VK домен, и указанные VH и/или VK домены содержат аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности VH и VK доменов антитела JMab-136 анти-ICOS. Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей может быть определен специалистами в данной области каким-либо методом, в том числе с помощью исследований белков методом BLAST, но не только им.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению может связываться с ICOS человека со сродством, сопоставимым со сродством JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению специфически связывается с тем же эпитопом ICOS, что и JMab-136 анти-ICOS антитело.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело специфически конкурирует с JMab-136 анти-ICOS антителом за связывание с ICOS. Исследование конкуренции может быть выполнено, используя какой-либо метод анализ связывания, известный в данной области, например, метод ELISA, радиоиммуноанализ, жидкостную цитометрию, а также другие методы.
Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, включая полинуклеотидные последовательности, которые кодируют анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией. Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, которые гибридизируются в жестких условиях гибридизации или в условиях пониженной жесткости, описанных в настоящем изобретении, с полинуклеотидами, которые кодируют анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению, кодирующий анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией, описанное в настоящем изобретении, включает оптимизированную полинуклеотидную последовательность. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению, кодирующий VH домен антитела, описанного в настоящем изобретении, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:28. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению, кодирующий VK домен антитела, описанного в настоящем изобретении, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:29. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению, кодирующий тяжелую цепь антитела, описанного в настоящем изобретении, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:30. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению, кодирующий легкую цепь антитела, описанного в настоящем изобретении, включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:31.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является вектор, включающий одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией, причем нуклеотидная последовательность является оптимизированной нуклеотидной последовательностью. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:28. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:29. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:30. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:31. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией, причем нуклеотидная последовательность выбрана из группы, включающей последовательности SEQ ID NO:28-31. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вектор по настоящему изобретению включает одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией, причем нуклеотидная последовательность выбрана из группы, включающей последовательности SEQ ID NO:28-31.
Настоящее изобретение также относится к выделенным клеткам, включающим вектор, причем указанный вектор содержит одну или несколько нуклеотидных последовательностей, кодирующих анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, выделенные клетки по настоящему изобретению включают полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:28-31. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, выделенные клетки по настоящему изобретению включают полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:28-31.
К анти-ICOS антителам по настоящему изобретению относятся IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 изотипы человека.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией.
Еще один объект настоящего изобретения относится к способам лечения и предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, например, но ими перечень не ограничивается, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний или расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативного расстройства Т-клеток, включающим введение человеку, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией.
Настоящее изобретение относится к анти-ICOS антителам с повышенной эффекторной функцией, а также к композициям, включающим указанные антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению может опосредовать антигензависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ). В других вариантах осуществления настоящее изобретение направлено на композиции, включающие анти-ICOS антитело IgG1 и/или IgG3 изотипа человека, а также на анти-ICOS антитело IgG2 и/или IgG4 изотипа человека, которые способны опосредовать АЗКЦ, КЗЦ человека и/или антителозависимый фагоцитоз.
on
k-on
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
7
-1
-1
8
-1
-1
Анти-ICOS антитела, описанные в настоящем изобретении, могут обладать повышенным связывающим сродством с антигеном ICOS человека. Например, антитело, описанное в настоящем изобретении, может иметь константу скорости ассоциации или k (антитело (Ab) + антиген (Ag) → Ab-Ag), равную, по меньшей мере 2×10 М·с, по меньшей мере 5×10 М·с, по меньшей мере 10 М·с, по меньшей мере 5×10 М·с, по меньшей мере 10 М·с, по меньшей мере 5×10 М·с, или по меньшей мере 10 М·с.
off
off
k-off
-1
-1
-1
-1
-2
-1
-2
-1
-3
-1
-3
-1
-4
-1
-4
-1
-5
-1
-5
-1
-6
-1
-6
-1
-7
-1
-7
-1
-8
-1
-8
-1
-9
-1
-9
-1
-10
-1
В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело может иметь степень k ((Ab-Ag) → антитело (Ab) + антиген (Ag)) менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с или менее 10 с. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело по настоящему изобретению имеет величину k менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, менее 5×10 с, менее 10 с, или менее 10 с.
a
on
off
d
off
on
2
-1
2
-1
3
-1
3
-1
4
-1
4
-1
5
-1
5
-1
6
-1
6
-1
7
-1
7
-1
8
-1
8
-1
9
-1
9
-1
10
-1
10
-1
11
-1
11
-1
12
-1
12
-1
13
-1
13
-1
14
-1
14
-1
15
-1
15
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
-5
-5
-6
-6
-1
-7
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
-11
-12
-12
-13
-13
-14
-14
-15
-15
В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело может иметь константу сродства или K (k/k), равную, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10 М, по меньшей мере 10 М, по меньшей мере 5×10М, по меньшей мере 10 М, или по меньшей мере 5×10 М. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело может иметь константу диссоциации или K (k/k), составляющую менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М, менее 10 М, менее 5×10 М или менее 10 М.
d
d
d
Антитело, применяемое в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, может иммуноспецифически связываться с ICOS и может обладать константой диссоциации (K), составляющей менее 3000 пМ, менее 2500 пМ, менее 2000 пМ, менее 1500 пМ, менее 1000 пМ, менее 750 пМ, менее 500 пМ, менее 250 пМ, менее 200 пМ, менее 150 пМ, менее 100 пМ, менее 75 пМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA) (фирма Biacore International AB, Уппсала, Швеция). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело, используемое в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, может иммуноспецифически связываться с антигеном ICOS человека и может иметь константу диссоциации (K), составляющую 25-3400 пМ, 25-3000 пМ, 25-2500 пМ, 25-2000 пМ, 25-1500 пМ, 25-1000 пМ, 25-750 пМ, 25-500 пМ, 25-250 пМ, 25-100 пМ, 25-75 пМ, 25-50 пМ, что следует из результатов анализа с применением способа, описанного в настоящем изобретении, или способа, известного в данной области (например, анализа BIAcore, ELISA). В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, используемое в соответствии со способом, описанным в настоящем изобретении, может иммуноспецифически связываться с ICOS и может обладать константой диссоциации (K) 500 пМ, 100 пМ, 75 пМ или 50 пМ, которая была определена способом, описанным в настоящем изобретении, или известным специалистам в данной области (например, анализ BIAcore, ELISA).
Настоящее изобретение также представляет полинуклеотиды, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией. Настоящее изобретение также представляет полинуклеотиды, которые гибридизируются в жестких условиях и в условиях пониженной жесткости, например, описанных в настоящем изобретении, с полинуклеотидами, которые кодируют анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией.
К условиям жесткой гибридизации относятся, но ими не ограничиваются, гибридизация с ДНК, связанной на фильтре, в 6Х хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при температуре примерно 45°C с последующими одной или несколькими промывками в 0,2Х SSC/0,1% SDS при температуре примерно 50-65°C, причем условия высокой жесткости, например, гибридизация с ДНК, связанной на фильтре, в 6Х SSC при температуре примерно 45°C с последующими одной или несколькими промывками в 0,1X SSC/0,2% SDS при температуре примерно 60°C, или какие-либо другие условия жесткой гибридизации, известные специалистам в данной области (см., например, кн.: «Current Protocols in Molecular Biology» под ред. Ausubel P.M. и др., 1989, т.1, изд-ва Green Publishing Associates, Inc. и John Wiley и Sons, Inc., Нью-Йорк, cc.6.3.1-6.3.6 и 2.10.3).
Полинуклеотиды могут быть получены, и нуклеотидная последовательность может быть определена каким-либо методом, известным в данной области. Например, если известна нуклеотидная последовательность антитела, полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть собран из химически синтезированных олигонуклеотидов (например, согласно описанию Kutmeier и др., BioTechniques 17, 1994, с.242), который, вкратце, включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих части последовательности, кодирующей антитело, отжиг и лигирование этих олигонуклеотидов, и затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов методом ПЦР.
Полинуклеотид, кодирующий антитело, также может быть получен из нуклеиновой кислоты из соответствующего источника. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую определенное антитело, недоступен, но последовательность молекулы антитела известна, нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин, могут быть химически синтезирована или получена из соответствующего источника (например, из библиотеки кДНК антител, или выделенной библиотеки кДНК, или нуклеиновой кислоты, предпочтительно полиА+РНК, выделенной из какой-либо ткани или клеток, экспрессирующих антитело, например, клеток гибридомы, выбранных для экспрессии антитела) путем ПЦР амплификации, используя гибридизируемые синтетические праймеры к 3' и 5' концам последовательности или клонируя, используя олигонуклеотидный зонд, специфичный в отношении определенной генной последовательности для идентификации, например, клона кДНК из библиотеки кДНК, которая кодирует антитело. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, полученные методом ПЦР, затем могут быть клонированы в соответствующих реплицируемых векторах клонирования, используя какой-либо способ, известный в данной области.
Настоящее изобретение также представляет антитела, которые эффективно истощают клетки, экспрессирующие ICOS, в системе модели мыши с трансплантатом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может составить, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере примерно 100% истощения ICOS-экспрессирующих клеток в системе модели мыши с трансплантатом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие клетки в модели мыши с трансплантатом более эффективно по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную доменную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие клетки в модели мыши с трансплантатом более эффективно, чем фукозилированное JMab-136 анти-ICOS антитело.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих клеток в модели мыши с трансплантатом, которое превышает, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз, истощение ICOS-экспрессирующих клеток, вызванное исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную доменную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощение ICOS-экспрессирующих клеток в модели мыши с трансплантатом, которое превышает, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз, истощение ICOS-экспрессирующих клеток, вызванное исходным анти-ICOS антителом более эффективно, чем фукозилированное JMab-136 анти-ICOS антитело.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих клеток в модели мыши с трансплантатом ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз аналогичной величины исходного анти-ICOS антитела (например, антителом, включающим ту же вариабельную доменную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения of ICOS-экспрессирующих клеток в модели мыши с трансплантатом ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз аналогичной величины исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность домена, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих клеток в модели мыши с трансплантатом, которое превышает, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% аналогичный показатель исходного анти-ICOS антитела (например, антителом, включающим ту же вариабельную доменную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток в модели мыши с трансплантатом, которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток в модели мыши с трансплантатом, которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную доменную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток в модели мыши с трансплантатом, которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз больше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также описывает антитела, которые эффективно истощают ICOS-экспрессирующие клетки в системе трансгенной модели мыши. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере примерно 100% истощения ICOS-экспрессирующих клеток в системе трансгенной модели мыши.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие клетки в трансгенной модели мыши более эффективно по сравнению с анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную доменную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие клетки в трансгенной модели мыши более эффективно по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих клеток в трансгенной модели мыши, которое выше, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз, чем при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную доменную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих клеток в трансгенной модели мыши, которое выше, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих клеток в трансгенной модели мышей ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз аналогичной величины исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих клеток в трансгенной модели мыши ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с аналогичной величиной анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экепрессирующих клеток в трансгенной модели мыши больше, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100%, по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих клеток в трансгенной модели мыши больше, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100%, по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышения истощения ICOS-экспрессирующих клеток в трансгенной модели мыши, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению приводит к повышенному истощению ICOS-экспрессирующих клеток в трансгенной модели мыши, которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также представляет антитела, которые эффективно истощают клетки, экспрессирующие ICOS, у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может привести к истощению клеток, экспрессирующих ICOS, у приматов (обезьяны или человека) по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 99%, или по меньшей мере примерно на 100%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих клеток у примата (обезьяны или человека), которое превышает, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз, указанное истощение, вызываемое исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток у примата (обезьяны или человека), по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих клеток у примата (обезьяны или человека) составляет, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз меньшую величину, чем соответствующая величина исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих клеток у примата (обезьяны или человека) составляет, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз меньшую величину по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% больше, чем достигается исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% большего истощения ICOS-экспрессирующих клеток у примата (обезьяны или человека) по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 разх, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше истощения, достигаемого исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз большего истощения ICOS-экспрессирующих клеток у примата (обезьяны или человека) по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые эффективно истощают ICOS-экспрессирующие Т-клетки у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека), по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 99%, или по меньшей мере примерно на 100%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Т-клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Т-клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз больше по сравнению с истощением, вызываемым исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в два раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз больше по сравнению с истощением, вызываемым фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с аналогичной величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше истощения при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека), по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые эффективно истощают ICOS-экспрессирующие Т-хэлперные клетки у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере примерно 100% истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Т-хэлперные клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно, чем введение исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Т-хэлперные клетки у примата более эффективно по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает аналогичный показатель при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнению с истощением исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает большего истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также предусматривает антитела, которые эффективно истощают ICOS-экспрессирующие клетки Th1 у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может истощить ICOS-экспрессирующие Th1 клетки у примата (обезьяны или человека), по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 99%, или по меньшей мере примерно на 100%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Th1 клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Th1 клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Th1 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает истощение, вызываемое анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз большее истощение ICOS-экспрессирующих Th1 клеток у примата (обезьяны или человека) по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ЕС50 величина анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Th1 клеток у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения ЕС50 величина анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Th1 клеток у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает большего истощения ICOS-экспрессирующих Th1 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнению с истощением при введении анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает большего истощения ICOS-экспрессирующих Th1 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз большего истощения ICOS-экспрессирующих Th1 клеток у примата (обезьяны или человека) по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антител по настоящему изобретению достигает, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз большего истощения ICOS экспрессирующих Th1 клеток у примата (обезьяны или человека) по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые эффективно истощают ICOS-экспрессирующие Th2 клетки у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере примерно 100% истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Th2 клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Th2 клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз выше по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека) меньше, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнением с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше истощения при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз превышает истощение при введении анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Th2 клеток у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также описывает антитела, которые эффективно истощают ICOS-экспрессирующие Th1 7 клетки у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере примерно 100% истощения ICOS-экспрессирующих Th1 7 клеток у примата (обезьяны или человека).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Th1 7 клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Th1 7 клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток Th1 7 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз, больше истощения при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток Th1 7 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих клеток Th1 7 у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз, по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих клеток Th1 7 у примата (обезьяны или человека) ниже по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз, по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитело по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток Th1 7 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток-Th17 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100%, превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток Thl7 у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз, превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих клеток Th1 7 у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз, превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также представляет антитела, которые эффективно истощают ICOS-экспрессирующие Т-хэлперные клетки памяти у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере примерно 100% истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующих Т-хэлперные клетки памяти у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ICOS-экспрессирующие Т-хэлперные клетки памяти у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз, превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз соответствующей величины при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз, соответствующей величины при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% больше истощения при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ICOS-экспрессирующих Т-хэлперных клеток памяти у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Истощение клеток определенного типа может привести к истощению указанными клетками секретируемого продукта. Например, истощение клеток Th1 7, используя повышенную эффекторную функцию анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может привести к истощению ИЛ-17. Настоящее изобретение также представляет антитела, которые эффективно истощают ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека) по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 99%, или по меньшей мере примерно на 100%.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека) ниже по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека) ниже по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз соответствующей величины исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнением с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% больше истощения при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитело (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-17 у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также описывает антитела, которые эффективно истощают ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере примерно 100% истощения ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека) ниже по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения of ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека) ниже, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека), которое составляет по меньшей мере примерно 5%, по меньшей мере примерно 10%, по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 75%, по меньшей мере примерно 100% от истощения при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения ИЛ-2 у примата (обезьяны или человека), которое, по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз превышает истощение ИЛ-2 при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
ICOS-экспрессирующие Т-клетки вовлечены в формирование зародышевого центра в модельных системах мышей. Данные, описанные в настоящем изобретении, показывают, что ICOS-экспрессирующие клетки также участвуют в поддержании структурной целостности компартмента В-клеток уже сформированных зародышевых центров. Без привязки к определенной модели, истощение ICOS-экспрессирующих Т-клеток у примата (обезьяны или человека) введением одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может предупредить формирование зародышевых центров, может разрушить архитектуру уже сформировавшихся зародышевых центров, может истощить В-клетки зародышевых центров из вторичных лимфоидных органов и/или может истощить циркулирующие переключенные В-клетки. Формирование зародышевых центров может подвергаться мониторингу каким-либо методом, известным в данной области, например, но ими перечень не ограничивается, гистологическим исследованием вторичных лимфоидных органов или анализом лимфоидных клеток, выделенных из вторичных лимфоидных тканей методом жидкостной цитометрии. Распределение структуры зародышевого центра может подвергаться мониторингу каким-либо методом, известным в данной области, например, но не только им, гистологическим исследованием вторичных лимфоидных органов. Истощение В клеток зародышевых центров из вторичных лимфоидных органов может подвергаться мониторингу каким-либо методом, известным в данной области, например, но ими перечень не ограничивается, гистологическим исследованием вторичных лимфоидных органов или анализом лимфоидных клеток, выделенных из вторичных лимфоидных тканей методом жидкостной цитометрии. Истощение класса циркулирующих переключенных В-клеток может подвергаться мониторингу каким-либо методом, известным в данной области, например, но не только им, анализом циркулирующих лимфоидных клеток методом жидкостной цитометрии. Класс переключенных В-клеток может быть идентифицирован на основании специфической экспрессии в этих клетках поверхностных маркеров или на основании утраты такой экспрессии, например, класс переключенных циркулирующих В-клеток может быть определен в качестве CD27+IgM-IgD- В-клеток.
Настоящее изобретение предусматривает антитела, которые эффективно предупреждают формирование зародышевых центров во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является лимфатический узел. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом являются миндалины. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является брыжеечный лимфатический узел.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению предупреждает формирование зародышевых центров во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) в течение по меньшей мере 1 суток, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является миндалина.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению предупреждает формирование зародышевых центров во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) на протяжении более длительного срока по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению предупреждает формирование зародышевых центров во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) на протяжении более длительного срока по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом являются миндалины.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению предупреждает формирование зародышевых центров во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению предупреждает формирование зародышевых центров во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с фукозилированным JMab-136 анти-ICOS антителом.
Настоящее изобретение также представляет антитела, которые эффективно разрушают структуру зародышевого центра во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является лимфатический узел. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом являются миндалины. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является брыжеечный лимфатический узел.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению разрушает структуру зародышевого центра во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) в течение по меньшей мере 1 суток, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом являются миндалины.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению разрушает структуру зародышевого центра во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) в течение более длительного периода по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению разрушает структуру зародышевого центра во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) в течение более длительного периода по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом являются миндалины.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению разрушает структуру зародышевого центра во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению разрушает структуру зародышевого центра во вторичном лимфоидном органе примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также описывает антитела, которые эффективно истощают зародышевые центры В-клеток из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является лимфатический узел. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом являются миндалины. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является брыжеечный лимфатический узел.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает зародышевые центры В-клеток из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека) в течение по меньшей мере 1 суток, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом являются миндалины. Истощение В-клеток зародышевого центра оценивают в качестве «в существенной степени сохраняемого» на протяжении периода после введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела, если число В-клеток зародышевых центров ниже, по меньшей мере на 10%, в образце, обработанном антителом, по сравнению с числом В-клеток зародышевых центров в необработанном контрольном образце.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает В-клетки зародышевых центров из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека) в течение более длительного периода по сравнению с исходным анти-ICOS антителом (например, антителом, включающим ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает В-клетки зародышевых центров из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека) в течение более длительного периода по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом является селезенка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторичным лимфоидным органом являются миндалины.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению могут достичь по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 30%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 50%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 70%, по меньшей мере примерно 80%, по меньшей мере примерно 90%, по меньшей мере примерно 95%, по меньшей мере примерно 97%, по меньшей мере примерно 99%, или по меньшей мере примерно 100% истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает В-клетки зародышевых центров из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает В-клетки зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека), которое выше по меньшей мере примерно 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз выше истощения при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения В-клеток зародышевого центра вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека) ниже по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 по сравнению с аналогичной величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека) ниже по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз аналогичной величины исходного анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека) по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела по сравнению с истощением при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющую 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз выше истощения при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые эффективно истощают циркулирующие переключенные В-клетки у примата (обезьяны или человека). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает циркулирующие переключенные В-клетки у примата (обезьяны или человека) в течение по меньшей мере 1 суток, по меньшей мере 2 суток, по меньшей мере 5 суток, по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 9 месяцев. Истощение циркулирующих переключенных В-клеток оценивают в качестве «в существенной степени устойчивого» на протяжении периода после введения одной или нескольких доз анти-ICOS антитела, если число циркулирующих переключенных В-клеток ниже, по меньшей мере на 10% в образце, обработанным антителом, по сравнению с циркулирующими переключенными В-клетками в необработанном контрольном образце.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает циркулирующие переключенные В-клетки у примата (обезьяны или человека) в течение более длительного времени по сравнению с истощением при ведении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющего 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает циркулирующие переключенные В-клетки у примата (обезьяны или человека) в течение более длительного периода по сравнению с истощением при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может достичь истощения циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека) по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 90%, по меньшей мере примерно на 95%, по меньшей мере примерно на 97%, по меньшей мере примерно на 99% или по меньшей мере примерно на 100%,
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может истощить циркулирующие переключенные В-клетки до менее чем 2%, менее чем 1,5%, менее чем 1%, менее чем 0,9%, менее чем 0,8%, менее чем 0,7%, менее чем 0,6%, менее чем 0,5%, менее чем 0,4%, менее чем 0,3% или менее чем 0,1% от числа лимфоцитов периферической крови (ЛПК) у примата (обезьяны или человека).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает циркулирующие переключенные В-клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющего 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению истощает циркулирующие переключенные В-клетки у примата (обезьяны или человека) более эффективно по сравнению с введением фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз или по меньшей мере примерно в 10 раз выше истощения при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющего 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 3 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, или по меньшей мере примерно в 10 раз превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека) ниже по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз или по меньшей мере примерно в 100 раз соответствующей величины исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющего 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения величина ЕС50 анти-ICOS антитела по настоящему изобретению для истощения циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека) ниже по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз или по меньшей мере примерно в 100 раз по сравнению с соответствующей величиной исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющего 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющего 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 75%, по меньшей мере примерно на 100% выше истощения при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз, или по меньшей мере примерно в 100 раз превышает истощение при введении исходного анти-ICOS антитела (например, антитела, включающего ту же вариабельную аминокислотную последовательность, но имеющего 1) фукозилированный домен Fc или 2) аминокислотную последовательность домена Fc, которая не была модифицирована для повышения АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения введение одной или нескольких терапевтических доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению достигает повышенного истощения категории циркулирующих переключенных В-клеток у примата (обезьяны или человека), которое по меньшей мере примерно в 2 раза, по меньшей мере примерно в 5 раз, по меньшей мере примерно в 10 раз, по меньшей мере примерно в 15 раз, по меньшей мере примерно в 20 раз, по меньшей мере примерно в 25 раз, по меньшей мере примерно в 50 раз или по меньшей мере примерно в 100 раз превышает истощение при введении фукозилированного JMab-136 анти-ICOS антитела.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ), комплементзависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (КЗЦ) и/или антителозависимый фагоцитоз. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению опосредует антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) и/или антителозависимый фагоцитоз. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению имеет повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, который опосредует повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ). В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, содержащей по меньшей мере одно замещение аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из остатков 239, 330 и 332, причем положения аминокислотных остатков определяют по конвенции EU. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, содержащий по меньшей мере аминокислотное замещение, выбранное из группы, состоящей из S239D, A330L и I332E, причем положения аминокислотных остатков определяют по конвенции EU. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D в положении 239, L в положении 330 и Е в положении 332, причем положения аминокислотных остатков определяют по конвенции EU.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную Fc область, содержащую по меньшей мере одну сконструированную гликоформу, причем указанная сконструированная область Fc опосредует повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, утратившую гликозилирование. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную область Fc, имеющую сложные N-гликозид-связанные цепочки Сахаров, связанные с остатком Asn297, в которых фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином в редуцированном конце.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, которая имеет повышенное сродство с Fc-связывающим белком, например, но не только с ним, Fc рецептором, C1q по сравнению с областью Fc дикого типа. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, которая имеет повышенное сродство с рецепторным белком FcλRIIIA по сравнению с областью Fc дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную Fc область, включающую по меньшей мере одну сконструированную гликоформу, причем указанная сконструированная область Fc имеет повышенное сродство с Fc-связывающим белком, например, но ими перечень не ограничивается, с рецептором Fc, C1q по сравнению с диким типом области Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает сконструированную Fc область, включающую по меньшей мере одну сконструированную гликоформу, в которой указанная сконструированная область Fc имеет повышенное сродство в отношении рецепторного белка FcγRIIIA по сравнению с областью Fc дикого типа.
Настоящее изобретение также относится к способам лечения и предупреждения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, например, но ими перечень не ограничивается, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний или расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативных расстройств Т-клеток у человека, включающих введение человеку, нуждающемуся в этом, анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией (например, антителозависимой клеточной цитотоксичностью (АЗКЦ), комплементзависимой клеточно-опосредованной цитотоксичностью (КЗЦ) и/или антителозависимым фагоцитозом) в количестве, достаточном для истощения циркулирующих ICOS-экспрессирующих клеток. В одном из объектов настоящее изобретение также относится к способам лечения и предупреждения заболеваний и расстройств, опосредованных Т-клетками, например, но ими перечень не ограничивается, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний или расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и Т-клеточных пролиферативных расстройств у человека, включающих применение терапевтически эффективного анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, которое является изотипом IgG1 или IgG3 человека.
Настоящее изобретение охватывает способы идентификации, диагностики, лечения и мониторинга прогрессирования заболевания у пациентов. У пациента может быть заболевание, расстройство или состояние, представляющие результат экспериментального исследования, например, это может быть экспериментальная модель, разработанная для заболевания, расстройства или состояния. В другом варианте у пациента может быть заболевание, расстройство или состояние в отсутствии экспериментальных манипуляций. К пациентам относятся люди, мыши, крысы, свиньи, кошки, собаки и какие-либо животные, применяемые для исследования.
Пациент может включать по-разному регулируемые уровни ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101. По-разному регулируемые уровни ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 могут быть такими, что в образце ткани пациента проявляется повышенная экспрессия ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 относительно контрольного образца ткани пациента или относительно образца от здорового контрольного индивидуума. По-разному регулируемые уровни ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 могут быть такими, что в образце ткани пациента проявляется пониженная экспрессия ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 относительно контрольного образца пациента или относительно образца от здорового контрольного индивидуума. По-разному проявляемое повышение или понижение экспрессии может примерно составлять 10% - 500% от контрольного образца, примерно 10% - 400% от контрольного образца, примерно 10% - 300% от контрольного образца, примерно 10% - 250% от контрольного образца, примерно 10% - 200% от контрольного образца, примерно 10% - 150% от контрольного образца, примерно 10% - 100% от контрольного образца, примерно 10% - 50% от контрольного образца, примерно 100% - 500% от контрольного образца, примерно 200% - 500% от контрольного образца, примерно 300% - 500% от контрольного образца, примерно 400% - 500% от контрольного образца, примерно 50% - 100% от контрольного образца, примерно 100% - 200% от контрольного образца, примерно 100% - 400% от контрольного образца, примерно 200% - 400% от контрольного образца, примерно 10% - 50% от контрольного образца, примерно 20% - 100% от контрольного образца, примерно 25% - 75% от контрольного образца, или примерно 50% - 100% от контрольного образца. Экспрессия может составлять 10, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400 или 500% контрольного образца.
Введение анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может привести к нейтрализации по-разному регулируемых уровней ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101. Нейтрализация по-разному регулируемого уровня ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101, может представлять снижение по меньшей мере на 2%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 4%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 7%, по меньшей мере на 8%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90% от уровня ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101. В другом варианте нейтрализация уровня по-разному регулируемых ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 относится к уменьшению экспрессии ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101, регуляция которых повышена, и составляет самое большее до 50%, до 45%, до 40%, до 35%, до 30%, до 25%, до 20%, до 15%, до 10%, до 5%, до 4%, до 3%, до 2% или до 1% от уровней экспрессии ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 в контрольном образце.
Повышенная или пониженная регуляция ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 у пациента может быть выражена в виде какой-либо степени относительно регуляции в контрольном образце (который может быть взят из образца, не являющегося больной тканью пациента (например, неповрежденная кожа больных системной красной волчанкой) или от здорового индивидуума, у которого нет заболевания или расстройства). Степень повышенной регуляции или пониженной регуляции может составлять, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 125%, по меньшей мере 150%, или по меньшей мере 200%, или по меньшей мере 300%, или по меньшей мере 400%, или по меньшей мере 500% от регуляции контроля или контрольного образца.
В способах мониторинга или прогнозирования прогрессирования заболевания у пациента образцы от пациента могут быть получены до или после введения агента.
К образцам относятся какие-либо биологические жидкости или ткани, например, цельная кровь, сыворотка, мышцы, слюна, моча, синовиальная жидкость, костный мозг, цереброспинальная жидкость, выделения из носа, мокрота, амниотическая жидкость, промывная бронхоальвеолярная жидкость, мононуклеарные клетки периферической крови, лейкоциты, клетки лимфоузлов, клетки селезенки, клетки миндалин или кожи. Образцы могут быть получены каким-либо известным в данной области способом.
ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 уровни устанавливают в образцах (до или после введения агента). Сличают уровни ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 в образцах.
Образец, полученный от пациента, может быть получен до первого введения агента т.е., пациент не подвергался ранее воздействию этого агента. В другом варианте образец, полученный от пациента, может быть взят после введения агента на протяжении курса лечения. Например, агент может быть введен до начала осуществления протокола мониторинга. После введения агента от пациента могут быть получены дополнительные образцы. Образцы могут быть того же или другого типа, например, каждый полученный образец может быть образцом крови, или каждый полученный образец может быть образцом сыворотки. Уровни ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101, выявленные в каждом образце, могут быть теми же, могут существенно перекрываться или могут быть схожими.
Образцы могут быть получены в какое-либо время до или после введения терапевтического агента. Образец, полученный после введения терапевтического агента, может быть отобран через по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, или по меньшей мере 14 суток после введения терапевтического агента. Образец, полученный после введения терапевтического агента, может быть отобран через по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или по меньшей мере 8 недель после введения терапевтического агента. Образец, полученный после введения терапевтического агента, может быть отобран через по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 6 месяцев после введения терапевтического агента.
Дополнительные образцы могут быть получены о пациента после введения терапевтического агента. По меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25 образцов может быть получено от пациента для мониторинга прогрессирования или регрессирования заболевания или расстройства на протяжении определенного времени. Прогрессирование заболевания может подвергаться мониторингу на протяжении по меньшей мере 1 недели, по меньшей мере 2 недель, по меньшей мере 3 недель, по меньшей мере 4 недель, по меньшей мере 5 недель, по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере 7 недель, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 1 года, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 3 лет, по меньшей мере 4 лет, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 10 лет или на протяжении периода жизни человека. Дополнительные образцы могут отбираться у пациента с регулярными интервалами, например, ежемесячными, двухмесячными, ежеквартальными, полугодичными или годичными. Дополнительные образцы могут быть взяты у пациента с регулярными интервалами после введения агента. Например, образцы могут быть получены от пациента через неделю после каждого введения агента, или через две недели после каждого введения агента, или через три недели после каждого введения агента, или через месяц после каждого введения агента, или через два месяца после введения агента. В другом варианте большое количество образцов может быть получено от пациента после каждого введения агента.
Настоящее изобретение также представляет способы применения уровней ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 для лечения, диагностики, прогнозирования и мониторинга миозита. Уровни ICOS иРНК, или ICOSL иРНК, или miR-101 также могут применяться для выбора доз и лечения больных миозитом.
Моноклональные анти-ICOS антитела
Моноклональное анти-ICOS антитело проявляет специфичность связывания с антигеном ICOS человека и может опосредовать АЗКЦ, КЗЦ и/или антителозависимый фагоцитоз у человека. Такое антитело может быть выработано, используя разнообразные методики, известные в данной области, в том числе с применением гибридом, рекомбинации и фагового дисплея или их комбинации. Антитела высокоспецифичны и направлены против единственного антигенного сайта. Сконструированное анти-ICOS антитело может быть получено какими-либо средствами, известными в данной области, включая, но ими не ограничиваясь, те способы, которые описаны ниже, и усовершенствованные варианты этих способов. Крупномасштабное с высоким уровнем выхода получение обычно включает культивирование клеток-хозяев, которые вырабатывают сконструированное анти-ICOS антитело, и выделение анти-ICOS антитела из культуры клеток-хозяев.
Метод с применением гибридом
Моноклональные антитела могут быть наработаны методами с применением гибридом, в том числе известными в данной области и описанными, например, в кн.: Harlow и др. «Antibodies: A Laboratory Manual», 1988, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, в работе Hammerling и др. в кн.: «Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas», 1981, изд-во Elsevier, Нью-Йорк, cc.563-681 (эти работы включены в настоящее изобретение в виде ссылок на их сущность). Например, в методе с применением гибридом мышей или других соответствующих животных-хозяев, например, хомяков или макак, иммунизируют для индукции лимфоцитов, которые продуцируют или могут продуцировать антитела, способные специфически связываться с белком, применявшимся для иммунизации. Лимфоциты также могут быть иммунизированными in vitro. Лимфоциты затем гибридизируют с клетками миеломы, используя соответствующий гибридизирующий агент, например, полиэтиленгликоль, для формирования клеток гибридом (в кн.: Coding «Monoclonal Antibodies: Principles и Practice», 1986, изд-во Academic Press, cc.59-103).
Полученные таким образом гибридомные клетки высевают и выращивают в соответствующей культуральной среде, которая содержит одно или несколько веществ, подавляющих рост или выживание негибридных исходных миеломных клеток. Например, если исходные миеломные клетки утратили фермент гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (hypoxanthine guanine phosphoribosyi transferase - HGPRT или HPRT), культуральная среда для гибридом обычно может включать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (hypoxanthine, aminopterin и thymidine - среда HAT), причем указанные вещества предупреждают рост HGPRT-недостаточных клеток.
В специфических вариантах осуществления настоящего изобретения используют клетки миеломы, которые эффективно гибридизируются, поддерживают стабильный высокий уровень продуктивности антитела выбранными вырабатывающими антитело клетками и чувствительны к среде, например, среде HAT. Среди этих линий миеломных клеток содержатся линии миелом мышей, например, полученные из опухолей мышей МОРС-21 и МРС-11, которые содержатся и могут быть получены в Центре распределения клеток Института Солка, Сан-Диего, Калифорния, США, и SP-2 или X63-Ag8.653 клетки, которые могут быть получены из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection - ATCC), Роквилл, Мэриленд, США. Линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека также были описаны для выработки моноклональных антител человека (Kozbor J. Immunol., 133, 1984, с.3001, Brodeur и др. в кн.: «Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications», 1987, изд-во Marcel Dekker, Нью-Йорк, Inc., cc.51-63.
Культуральную среду, в которой гибридомные клетки выращивают, исследуют на предмет выработки антител, направленных против антигена ICOS человека. Связывающая специфичность моноклональных антител, вырабатываемых гибридомными клетками, может быть определена иммунопреципитацией или исследованием связывания in vitro, например, радиоиммуноанализом (РИА) или ферментсвязанным иммуносорбентным анализом (enzyme-linked immunoabsorbent assay - ELISA).
После выявления клеток гибридом, продуцирующих антитела с требуемыми специфичностью, сродством и/или действием, клоны могут быть субклонированы методом серийных разведении, и выращены стандартными методами (см. кн.: Goding «Monoclonal Antibodies: Principles and Practice», 1986, изд-во Academic Press, cc.59-103). К соответствующим средам для указанной цели относятся, например, среды D-MEM или RPMI 1640. Кроме того, гибридомные клетки могут выращиваться in vivo в виде асцитных опухолей животных.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, могут быть отделены от культуральной среды, асцитной жидкости или сыворотки с помощью обычных методов очистки иммуноглобулина, например, на белок А-сефарозе, хроматографии на гидроксиаппатите, гель-электрофорезом, диализом или аффинной хроматографией.
Методика рекомбинантной ДНК
ДНК, кодирующая анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, легко выделяют и секвенируют, используя обычные методики (например, используя олигонуклеотидные зонды, способные специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкие цепи анти-ICOS антител). Гибридомные клетки являются источником такой ДНК. После выделения ДНК может быть помещена в векторы экспрессии, которые затем переносят в клетки-хозяева, например, клетки Е.coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые не вырабатывают белок иммуноглобулина, для получения синтеза анти-ICOS антител в рекомбинантных клетках-хозяевах.
H
L
H
L
H
L
В методах фагового дисплея домены функционального антитела расположены на поверхностях фаговых частиц, несущих кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В частности, последовательности ДНК, кодирующие домены V и V, амплифицируют с библиотек кДНК животных (например, библиотек кДНК человека и мышей из пораженных тканей). ДНК, кодирующую домены V и V, рекомбинируют вместе с линкером scFv методом ПЦР и клонируют в фагмидном векторе. Вектор электропорируют в Е.coli и затем Е.coli инфицируют хэлперным фагом. Фагами, используемыми в этих методах, обычно являются нитчатые фаги, включая fd и М13, и V и V домены, которые обычно рекомбинантно гибридизируют с фаговым геном III или VIII. Фаги, экспрессирующие антигенсвязывающий домен, который связывается с определенным антигеном, могут быть выбраны или идентифицированы с помощью антигена, например, используя меченый антиген или антиген, связанный или заключенный в твердую поверхность или в гранулы. Примерами методов фагового дисплея, которые могут быть применены для получения антитела по настоящему изобретению, являются методы, описанные в работах Brinkman и др., J. Immunol. Методы, 182, 1995, cc.41-50, Ames и др., J. Immunol. Methods, 184, 1995, cc.177-186, Kettleborough и др., Eur. J. Immunol., 24, 1994, cc.952-958, Persic и др., Gene, 187, 1997, cc.9-18, Burton и др., Advances in Immunology, 57, 1994, cc.191-280, PCT/GB91/01 134, WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/11236, WO 95/15982, WO 95/20401, и W097/13844, и US Patent Nos. 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108, сущность каждой из которых включена в настоящее изобретение в виде ссылки.
2
В приведенных выше работах после отбора фагов антитело, кодирующее области от фага, может быть выделено и использовано для выработки целых антител, включая антитела человека, или какой-либо другой требуемый антигенсвязывающий фрагмент, и экспрессировано в каком-либо требуемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий, например, описанные ниже. Методы рекомбинантного получения фрагментов Fab, Fab' и F(ab') также могут быть применены, используя методики, известные в данной области, например, описанные в РСТ WO 92/22324, Mullinax и др., BioTechniques, 12(6), 1992, cc.864-869, Sawai и др., AJRI, 34, 1995, cc.26-34, Better и др., Science, 240, 1988, cc.1041-1043 (указанные работы включены в настоящее изобретение в виде ссылок на их сущность).
Антитела могут быть выделены из библиотек фаговых антител, полученных по методикам, описанным McCafferty и др., Nature, 348, 1990, cc.552-554. Clackson и др., Nature, 352, 1991, cc.624-628. Marks и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, cc.581-597, описывают выделение антител мыши и человека, соответственно, используя фаговые библиотеки. Комбинирование по цепи можно использовать для получения высокого сродства (в диапазоне нМ) антител человека (Marks и др., Bio/Technology, 10, 1992, cc.779-783), а также комбинаторного инфицирования и рекомбинации in vivo в качестве стратегии для конструирования очень больших фаговых библиотек (Waterhouse и др., Nuc. Acids. Res., 21, 1993, cc.2265-2266). Таким образом, эти методики представляют жизнеспособные варианты, которые могут заменить традиционные методики применения гибридом моноклональных антител для выделения анти-ICOS антител.
Для получения целых антител ПЦР праймеры, включающие нуклеотидные последовательности VH или VL, сайт рестрикции и фланкирующую последовательность для защиты сайта рестрикции, могут применяться для амплификации VH или VL последовательностей в клонах scFv. Используя методы клонирования, известные специалистам в данной области, ПЦР амплифицированные домены VH могут быть клонированы в векторы, экспрессирующие константную область тяжелой цепи, например, гамма 4 константную область человека, и ПЦР амплифицированные домены VL могут быть клонированы в векторы, экспрессирующие константную область легкой цепи, например, константные области каппа и лямбда человека. Векторы для экспрессии доменов VH или VL могут включать промотор EF-1α, сигнал секреции, сайт клонирования для вариабельного домена, константных доменов и селективный маркер, например, неомицин. Домены VH и VL также могут быть клонированы в вектор, экспрессирующий необходимые константные области. Векторы конверсии тяжелой цепи и векторы конверсии легкой цепи затем совместно трансфецируют в линии клеток для выработки стабильных или временных клеточных линий, которые экспрессируют антитела полной длины, например, IgG, используя методы, известные специалистам в данной области.
ДНК также может быть модифицирована, например, замещением кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепи человека по положению гомологичной последовательности мыши (US 4816567, Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, с.6851) или путем ковалентного соединения с иммуноглобулин-кодирующей последовательностью всей или части кодирующей последовательности для полипептида, не относящегося к иммуноглобулинам.
Химерные антитела
Анти-ICOS антитела в настоящем изобретении в особенности включают химерные антитела (иммуноглобулины), у которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, производных от определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, а другая часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, производных от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, до тех пор, пока они проявляют желаемую биологическую активность (US 4816567, Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, cc.6851-6855). К исследуемым химерным антителам в настоящем изобретении относятся «приматизированные» антитела, включающие вариабельный домен антиген-связывающей последовательности, производные от обезьяны (например, от узконосой обезьяны, например, павиана, макаки резус или макаки крабоеда) и последовательности константной области человека(US 5693780).
Измененные/мутантные антитела
Анти-ICOS антитела в композициях и способах, описанных в настоящем изобретении, могут быть мутантными антителами. В контексте настоящего изобретения понятие «мутантное антитело» или «измененное антитело» относится к варианту аминокислотной последовательности анти-ICOS антитела, в котором один или несколько аминокислотных остатков анти-ICOS антитела могут быть модифицированы. К модификациям аминокислотной последовательности анти-ICOS антитела относятся модификации последовательности, которые могут улучшить сродство или авидность антитела по отношению к его антигену, и/или модификации части Fc антитела, которые могут улучшить эффекторную функцию.
ON
OFF
D
D
-6
-7
-8
-9
Настоящее изобретение также относится к анти-ICOS антителам с повышенной эффекторной функцией, описанной в настоящем изобретении, а также к ее измененным/мутантным производным, включая, но ими не ограничиваясь, антитела с измененными свойствами по связыванию ICOS человека, например, измененные константы k, константы диссоциации k и/или константы равновесия или связывающего сродства, K. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения величина K анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, или его измененного/мутантного производного, для ICOS человека может составлять не более примерно 10 М, 10 М, 10 М или 10 М. Способы и реагенты, применимые для определения таких связывающих способностей у антитела по настоящему изобретению или его измененного/мутантного производного, известны в данной области и коммерчески доступны (см. ссылки выше, а также, например, US 6849425, US 6632926, US 6294391 и US 6143574, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок). Кроме того, оборудование и программное обеспечение, разработанные для такого кинетического анализа, являются коммерчески доступными (например, приборы Biacore А 100 и Biacore 2000, фирма Biacore International АВ, Уппсала, Швеция).
Модификации могут быть произведены в каких-либо известных анти-ICOS антителах или анти-ICOS антителах, описанных в настоящем изобретении. Такие измененные антитела обязательно обладают степенью идентичности или сходства с известным анти-ICOS антителом, составляющей менее 100%. Примером является измененное антитело, которое может иметь аминокислотную последовательность, которая примерно на 25-95% идентична или схожа с аминокислотной последовательностью вариабельного домена или тяжелой, или легкой цепи анти-ICOS антитела согласно описанному в настоящем изобретении. Измененное антитело может иметь аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере на 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, или 95% идентичностью или сходством с аминокислотной последовательностью вариабельного домена либо тяжелой, либо легкой цепи анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении. В другом варианте осуществления настоящего изобретения измененное антитело может иметь аминокислотную последовательность, обладающую, по меньшей мере на 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, или 95% идентичностью или сходством с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи CDR1, CDR2 или CDR3 анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения измененное антитело может поддерживать способность связывания ICOS человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, описанное в настоящем изобретении, может включать последовательность VH, которая по меньшей мере или примерно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:7.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения измененное антитело может иметь аминокислотную последовательность, идентичную или сходную по меньшей мере на 25%, 35%, 45%, 55%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% с аминокислотной последовательностью CDR1, CDR2 или CDR3 легкой цепи анти-ICOS антитела согласно описанию настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению может включать последовательность VL, которая по меньшей мере или примерно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
Идентичность или сходство с последовательностью выражают в настоящем изобретении в качестве процента аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны (т.е., те же остатки) или сходны (т.е., аминокислотные остатки из той же группы, исходя из общих свойств боковой цепи, см. ниже) с остатками анти-ICOS антитела после выравнивания последовательностей и внедрения гэпов, при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательности. Ни одна из N-концевой, C-концевой или внутренних протяженных последовательностей, делеций или инсерций в последовательности антитела за пределами вариабельного домена не может быть сконструирована в качестве последовательности, воздействующей на идентичность или сходство.
Понятие «% идентичности», известное в данной области, означает измерение взаимосвязи между двумя полинуклеотидами или двумя полипептидами, которую определяют путем сравнения их последовательностей. В общем две сравниваемые последовательности выравнивают для получения максимальной корреляции между последовательностями. Выравнивание двух последовательностей оценивают и определяют число положений, дающих точное соответствие между двумя последовательностями, делят на общую длину группировки и умножают на 100 для получения величины процента идентичности. Такая величина процента идентичности может быть определена по всей длине сравниваемых последовательностей, что особенно применимо для последовательностей той же или очень близкой длины, которые также в высокой степени гомологичны, или для более коротких последовательностей, которые более применимы для последовательностей неравной длины или которые обладают пониженным уровнем гомологии.
Например, последовательность может выравниваться по программному обеспечению Clustalw под Unix, которое вырабатывает файл с протяжением «.aln», этот файл затем может импортироваться в программу Bioedit (Hall T.A. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41, 1999, cc.95-98), которая открывает файл .aln. В окне программы Bioedit можно выбрать отдельные последовательности (две одновременно) и сравнить их. Этот метод позволяет сравнивать целую последовательность.
Методы сравнения идентичности двух или нескольких последовательностей известны в данной области. Например, программы могут быть получены в виде Wisconsin Sequence Апализис Package, версия 9.1 (Devereux J. и др., Nucleic Acids Res., 12, 1984, cc.387-395, могут быть получены от Genetics Computer Group, Мэдисон, Висконсин, США). Определение процента идентичности последовательностей может быть произведено, используя математический алгоритм. Например, программы BESTFIT и GAP могут быть использованы для определения процента идентичности между двумя полинуклеотидами и процента идентичности между двумя полипептидными последовательностями. Программа BESTFIT использует алгоритм «локальной гомологии» Smith и Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2, 1981, cc.482-489) и устанавливает одну наилучшую область сходства между двумя последовательностями. Программа BESTFIT больше приспособлена для сравнения последовательностей двух полинуклеотидов или двух полипептидов, отличающихся по длине, при условии, что более короткая последовательность представляет часть более длинной. Программа GAP сравнивает две последовательности, выявляя «максимальную схожесть» по алгоритму Neddleman и Wunsch (J. Mol. Biol., 48, 1970, cc.443-354). Программа GAP более применима для сравнения последовательностей, которые примерно одной и той же длины, и выравнивание предполагается по всей длине. Предпочтительно параметры «Gap Weight» и «Length Weight», используемые в каждой программе, равны 50 и 3 для полинуклеотидов и 12 и 4 для полипептидов, соответственно. Предпочтительно процент идентичности и сходства определяют, если две сравниваемые последовательности оптимально выравнивают.
Другие программы для определения идентичности и/или сходства между последовательностями также известны в данной области, например, семейство программ BLAST (публикация Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1990, cc.2264-2268, и ее модификация Karlin и Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, cc.5873-5877, могут быть получены в Национальном центре информации по биотехнологии (National Center for Biotechnology Information - NCB), Вифезда, Мэриленд, США, со страницы NCBI на сайте www.ncbi.nlm.nih.gov). Эти программы не являются единственными примерами математических алгоритмов, используемых для сравнения двух последовательностей. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST по работе Altschul и др., J. Mol. Biol., 215, 1990, cc.403-410. Исследование нуклеотидов BLAST может быть выполнено по программе NBLAST, оценка = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидной последовательности, гомологичной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей все или часть анти-ICOS антитела по настоящему изобретению. Анализ BLAST применительно к белковым последовательностям может быть выполнен с применением программы XBLAST, оценка = 50, длина слова = 3, для получения гомологичных аминокислотных последовательностей к молекуле белка по настоящему изобретению. Для получения отрезков с пробелами для целей сравнения может быть использована программа Gapped BLAST согласно описанию Altschul и др., Nucleic Acids Res., 25, 1997, cc.3389-3402. Программа PSI-Blast также может быть использована для проведения повторного исследования, выявляющего отдаленные взаимосвязи между молекулами (см. ссылку выше). При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Другой, но не единственной, известной в данной области программой по определению идентичности и/или сходства между последовательностями, является программа FASTA (Pearson W.R. и Lipman D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1988, cc.2444-2448, доступная в виде части пакета программ Wisconsin Sequence Апализис Package). Предпочтительно аминокислотная BLOSUM62 подстановочная матрица (Henikoff S., Henikoff J.G., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1992, cc.10915-10919) используется при сравнении полипептидных последовательностей, включая нуклеотидные последовательности, которые сначала переводятся в аминокислотные последовательности перед сравнением.
Еще одним, но не единственным, примером программы, известной в данной области для определения идентичности и/или сходства между аминокислотными последовательностями, является программа SeqWeb (интерфейс на основе сети для пакета программ GCG Wisconsin: Gap program), которую используют с алгоритмом по умолчанию и набором параметров программ blosum 62, размер гэпа 8, размер длины 2.
Процент идентичности между двумя последовательностями может быть определен, используя методики, близкие описанным выше, с допустимыми гэпами или без них. При подсчете процента идентичности обычно учитываются только точные совпадения.
Предпочтительно программу BESTFIT используют для определения процента идентичности последовательности исследуемого полинуклеотида или полипептида по отношению к последовательности полинуклеотида или полипептида по настоящему изобретению, исследуемую и контрольную последовательность выравнивают оптимально и параметры программы устанавливают на величину по умолчанию.
L
H
Для выработки измененного антитела вносят одно или несколько аминокислотных изменений (например, замещений) в одну или несколько гипервариабельных областей видоспецифичного антитела. Одно или несколько изменений (например, замещений) в остатках каркасного участка также может быть произведено в анти-ICOS антителе, если они приводят к улучшению связывающего сродства мутантного антитела в отношении антигена от млекопитающего второго вида. К примерам остатков каркасного участка для модификации относятся те остатки, которые непосредственно связывают антиген (Amit и др., Science, 233, 1986, cc.747-753), взаимодействуют/влияют на конформацию CDR (Chothia и др., J. Mol. Biol., 196, 1987, cc.901-917) и/или участвуют в соединении V-V (ЕР 239400 В1). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модификация одного или нескольких таких остатков в каркасном участке приводит к повышению связывающего сродства антитела с антигеном от млекопитающего второго вида. Например, примерно от одного до примерно пяти остатков каркасного участка может быть изменено в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения. Иногда может быть достаточным получение мутантного антитела, которое может быть использовано в доклинических исследованиях, даже если ни один из остатков гипервариабельной области не был изменен. Однако в норме измененное антитело может включать дополнительное изменение (изменения) гипервариабельной области.
Измененные остатки гипервариабельной области, которые могут быть изменены случайным образом, особенно если начальное связывающее сродство анти-ICOS антитела в отношении антигена из млекопитающего второго вида таково, что такое случайным образом полученное антитело может быть легко отобрано.
Один из соответствующих методов по выработке такого измененного антитела называют «аланин-сканирующим мутагенезом» (Cunningham, Wells, Science, 244, 1989, cc.1081-1085). При этом один или несколько остатков гипервариабельной области замещают остатком (остатками) аланина или полиаланина для влияния на взаимодействие аминокислот с антигеном от второго вида млекопитающего. Такой остаток (остатки) гипервариабельной области, проявляющий функциональную чувствительность к замещениям, затем уточняют путем внедрения дополнительных или других мутаций по сайтам замещения. Таким образом, хотя сайт для внедрения вариации аминокислотной последовательности определяют заранее, природа мутации сама по себе не нуждается в предварительной установке. Ala-мутанты, получаемые таким образом, подвергают скринингу на выявление биологической активности по описанию настоящего изобретения.
Другой способ получения таких измененных антител включает формирование сродства, используя метод фагового дисплея (Hawkins и др., J. Mol. Biol., 254, 1992, cc.889-896, и Lowman и др., Biochemistry, 30(45), 1991, cc.10832-10837). Вкратце, несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) мутируют для выработки всех возможных аминокислотных замещений в каждом сайте. Мутанты антител, полученные таким образом, проявляют в моновалентном виде из частиц нитчатых фагов в виде гибридов с продуктом гена III фага М13, упакованного в каждой частице. Мутанты, проявленные фаговым дисплеем, затем подвергают скринингу на биологическую активность (например, связывающее сродство) способом, описанным в настоящем изобретении.
Мутации в последовательности антитела могут включать замещения, делеции, в том числе внутренние делеции, добавления, в том числе добавления, в результате которых формируются гибридные белки, или консервативные замещения аминокислотных остатков внутри и/или рядом с аминокислотной последовательностью, в результате которых происходят «молчащие» изменения, заключающиеся в том, что изменение приводит к получению функционального эквивалента анти-ICOS антитела. Консервативные аминокислотные замещения могут быть получены на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы включенных остатков. Например, к неполярным (гидрофобным) аминокислотам относятся аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин, к полярным нейтральным аминокислотам относятся глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин, к положительно заряженным (основным) аминокислотам относятся аргинин, лизин и гистидин, а к отрицательно заряженным (кислотным) аминокислотам относятся аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота. Кроме того, глицин и пролин являются остатками, которые могут повлиять на ориентацию цепи. Неконсервативные замещения могут вызвать замещение представителя одного из этих классов на представителя другого класса. Кроме того, при необходимости неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот могут быть интродуцированы в качестве замещений или дополнений к последовательности антитела. К неклассическим аминокислотам в основном относятся, но ими не ограничиваются, D-изомеры обычных аминокислот, α-аминоизомасляная кислота, 4-аминомасляная кислота, аминомасляная кислота (Abu), 2-аминомасляная кислота, γ-Abu, ε-Ahx, 6-аминокапроевая кислота, аминоизомасляная кислота (Aib), 2-аминоизомасляная кислота, 3-аминопропионовая кислота, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, цистеиновая кислота, t-бутилглицин, t-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтор-аминокислоты, сконструированные аминокислоты, например, β-метиламинокислоты, Сα-метиламинокислоты, Nα-метиламинокислоты и аминокислотные аналоги.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения у сайтов, выбранных для модификации, было сформировано сродство методом фагового дисплея (см. выше).
Какие-либо методы мутагенеза, известные в данной области, могут быть применены для модификации отдельных нуклеотидов в последовательности ДНК для получения аминокислотной последовательности (последовательностей) в последовательности антитела или создания/удаления сайтов рестрикции для облегчения дальнейших манипуляций. Такие методы включают, но ими не ограничиваются, химический мутагенез, сайт-направленный мутагенез in vitro (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1985, с.488, Hutchinson С. и др., J. Biol. Chem., 253, 1978, с.6551), олигонуклеотид-направленный мутагенез (Smith, Ann. Rev. Genet., 19, 1985, cc.423-463), Hill и др., Methods Enzymol., 155, 1987, cc.558-568), перекрывающееся удлинение на основе ПЦР (Но и др., Gene, 77, 1989, cc.51-59), мегапраймерный мутагенез на основе ПЦР (Sarkar и др., Biotechniques, 8, 1990, cc.404-407) и др. Модификации могут быть подтверждены секвенированием двухнитевой дидезоксиДНК.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело может быть модифицировано для получения гибридных белков, т.е. антитела или его фрагмента, гибридизированных с гетерологичным белком, полипептидом или пептидом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения белком, гибридизированным с частью анти-ICOS антитела, является фермент - компонент направляемой антителами ферментной пролекарственной терапии (Antibody-directed enzyme prodrug therapy - ADEPT). К примерам других белков или полипептидов, которые могут быть сконструированы в качестве гибридного белка с анти-ICOS антителом, относятся, но ими не ограничиваются, токсины, например, рицин, абрин, рибонуклеаза, ДНКаза I, стафилококковый энтеротоксин-А, противовирусный белок фитолакки американской, гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas. См., например, Pastan и др., Cell, 47, 1986, с.641, Goldenberg и др., Cancer Journal for Clinicians, 44, 1994, с.43. Могут быть применены ферментативно активные токсины и их фрагменты, в том числе цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь экзотоксина А (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модексина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки из Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232.
Дополнительные гибридные белки могут быть получены по методам перетасовки генов, перетасовки мотивов, перетасовки экзонов и/или перетасовки кодонов (все эти методы называются «перетасовкой ДНК»), Перетасовка ДНК может применяться для изменения активности анти-ICOS антитела или его фрагментов (например, антитела или его фрагментов с повышенным сродством и пониженной степенью диссоциации). См. US 5605793, 5811238, 5830721, 5834252 и 5837458, Patten и др., Curr. Opinion Biotechnol., 8, 1997, cc.724-733, Harayama, Trends Biotechnol. 16(2), 1998, cc.76-82, Hansson и др., J. Mol. Biol., 287, 1999, cc.265-276, Lorenzo и Blasco, Biotechniques 24(2), 1998, cc.308-313 (сущность каждого патента и каждой публикации включена в настоящее изобретение в виде ссылки). Антитело также может быть домен-связывающим гибридным иммуноглобулиновым белком согласно описанию в публикацях US 20030118592, US 200330133939 и РСТ WO 02/056910, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок.
Доменные антитела
H
L
Анти-ICOS антитела композиций и методов по настоящему изобретению могут быть доменными антителами, например, антителами, которые содержат малые функциональные связывающие составляющие антител, соответствующие вариабельным областям тяжелой (V) или легкой цепей (V) антител человека. К примерам доменных антител относятся, но ими не ограничиваются, соответствующие антитела, которые можно получить от фирмы Domantis Limited (Кэмбридж, Великобритания) и от фирмы Domantis Inc. (Кэмбридж, Массачусетс, США), которые специфичны в отношении терапевтических мишеней (см., например, WO04/058821, WO04/003019, US 6291158, 6582915, 6696245 и 6593081). Коммерчески доступные библиотеки доменных антител могут применяться для идентификации анти-ICOS доменных антител. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела включают функциональную единицу связывания ICOS и функциональную единицу связывания Fc гамма рецептора.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS доменное антитело может включать какую-либо одну область CDR или какую-либо комбинацию областей CDR тяжелой или легкой цепи JMab-136 моноклонального антитела.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS доменное антитело может включать VH CDR3 антитела JMab-136 вместе с какой-либо комбинацией областей CDR, составленной вариабельными областями тяжелой или легкой цепей моноклонального антитела JMab-136. Анти-ICOS доменное антитело также может включать VK CDR3 антитела JMab-136 вместе с какой-либо комбинацией областей CDR, составленной вариабельными областями тяжелой или легкой цепей моноклонального антитела JMab-136.
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS доменное антитело может включать CDR3 VH антитела JMab-136. Анти-ICOS доменное антитело может также включать CDR3 VK антитела JMab-136.
Двухвалентные антитела
H
L
H
L
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела являются двухвалентными антителами. Понятие «двухвалентные антитела» относится к малым фрагментам антител с двумя сайтами связывания антигена, фрагменты которых включают вариабельный домен тяжелой цепи (V), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V) в той же полипептидной цепи (V-V). С помощью линкера, который слишком короток, чтобы соединить два домена в одной цепи, домены усиливают для спаривания с комплементарными доменами другой цепи и создания двух сайтов связывания антигена. Двухвалентные антитела описаны более полно, например, в работах ЕР 404097, WO 93/11161 и Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90. 1993, cc.6444-6448.
Вакцинные антитела (Vaccibody)
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела являются вакцинными антителами (Vaccibody). Вакцинные антитела являются димерными полипептидами. Каждый мономер вакцинного антитела состоит из scFv со специфичностью в отношении поверхностной молекулы на антигенпрезентирующей клетке (АПК), соединенной через шарнирную область и Сγ3 домен со вторым фрагментом scFv. В других вариантах осуществления настоящего изобретения вакцинные антитела, содержащие в качестве одного из фрагментов scFv фрагмент анти-ICOS антитела, могут быть применены для сопоставления тех ICOS-экспрессирующих клеток, которые должны быть разрушены, и эффекторных клеток, которые опосредуют АЗКЦ. Например, см. публикацию патентной заявки US 20040253238.
Линейные антитела
H
H1
H
H1
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела являются линейными антителами. Линейные антитела включают пару тандемных сегментов Fd (V-C-V-C), которые формируют пару антиген-связывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими и моноспецифическими. См. Zapata и др., Protein Eng., 8(10), 1995, cc.1057-1062.
Исходное антитело
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело является исходным антителом. Понятие «исходное антитело» означает антитело, включающее аминокислотную последовательность, которая может утратить или может быть недостаточной по одному или нескольким аминокислотным остаткам, или может быть присоединена к одной или нескольким ее гипервариабельным областям по сравнению с измененным/мутантным антителом согласно описанию настоящего изобретения. Таким образом, исходное антитело может иметь укороченную гипервариабельную область по сравнению с соответствующей гипервариабельной областью мутантного антитела, описанного в настоящем изобретении. Исходный полипептид может включать последовательность нативного антитела (т.е., природного, включая природный аллельный вариант) или последовательность антитела с имеющимися модификациями аминокислотной последовательности (например, другие инсерции, делении и/или замещения) природной последовательности. Исходное антитело может быть гуманизированным антителом или антителом человека.
Фрагменты антител
2
«Фрагменты антитела» включают часть антитела полной длины, обычно его антиген-связывающую часть или его вариабельную область. Примерами фрагментов антител являются Fab, Fab', F(ab') и Fv фрагменты, двойные антитела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител и полиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител.
2
2
Традиционно эти фрагменты получают протеолитическим расщеплением интактных антител (см., например, Morimoto и др., Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24, 1992, cc.107-117, Brennan и др., Science, 229, 1985, с.81). Однако эти фрагменты теперь могут быть получены непосредственно в рекомбинантных клетках. Например, фрагменты антител могут быть выделены из фаговых библиотек антител, рассмотренных выше. Фрагменты Fab'-SH также могут быть непосредственно выделены из Е.coli и химически соединены для формирования фрагментов F(ab') (Carter и др., Bio/Technology, 10, 1992, cc.163-167). Следуя другому подходу, фрагменты F(ab') могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток-хозяев. Другие методики получения фрагментов антител известны практикующим специалистам в этой области. В других вариантах осуществления настоящего изобретения антителом выбора является одноцепочечный фрагмент Fv (scFv). См., например, WO 93/16185. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело не является фрагментом Fab.
Биспецифические антитела
Биспецифические антитела являются антителами, которые обладают связывающей специфичностью в отношении по меньшей мере двух разных эпитопов. Варианты биспецифических антител могут связываться с двумя разными эпитопами поверхностного маркера ICOS-экспрессирующих Т-клеток. Другие такие антитела могут связывать первый маркер ICOS-экспрессирующих Т-клеток и дополнительно связывать второй маркер с поверхности ICOS- экспрессирующих Т-клеток. Плечо, связывающее маркер анти-ICOS-экспрессирующих Т-клеток, также может комбинироваться с плечом, которое связывается с инициирующей молекулой лейкоцита, например, рецепторной молекулой Т-клеток (например, CD2 или CD3), или Fc рецепторы для IgG (FcγR), таким образом, чтобы сфокусировать механизмы клеточного разрушения на ICOS-экспрессирующих Т-клетках. Биспецифичные антитела также могут использоваться для локализации цитотоксических агентов на ICOS-экспрессирующих Т-клетках. Эти антитела обладают плечом, связывающим маркер ICOS-экспрессирующих Т-клеток, и плечом, которое связывает цитотоксический агент (например, сапорин, анти-интерферон-α, алкалоиды борвинка, цепь А рицина, метол-exate или гаптен радиоактивного изотопа). Биспецифические антитела могут быть приготовлены в качестве антител полной длины или фрагментов антител (например, F(ab'): биспецифические антитела).
Способы получения двухвалентных антител известны в данной области (см., например, Millstein и др., Nature, 305, 1983, cc.537-539, Traunecker и др., EMBO J., 10, 1991, cc.3655-3659, Suresh и др., Methods in Enzymology, 121, 1986, с.210, Kostelny и др., J. Immunol., 148(5), 1992, cc.1547-1553, Hollinger и др., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90, 1993, cc.6444-6448, Gruber и др., J. Immunol., 152, 1994, с.5368, US 4474893, 4714681, 4925648, 5573920, 560181, 95731168, 4676980 и 4676980, WO 94/04690, WO 91/00360, WO 92/200373, WO 93/17715, WO 92/08802 и ЕР 03089).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, в котором анти-ICOS антитело по композициям и способам настоящего изобретения является биспецифичным, анти-ICOS антитело может быть антителом человека или гуманизированным антителом и может обладать специфичностью в отношении ICOS человека и эпитопа на поверхности Т-клеток или может связывать эффекторные клетки человека, например, моноциты/макрофаги и/или природные клетки киллеры для индукции гибели клеток.
Области вариантов Fc
Настоящее изобретение предусматривает составы белков, включающих область варианта Fc. Примером является область Fc, например область Fc, включающая один или несколько неприродных аминокислотных остатков. Также соответствующими вариантами области Fc по настоящему изобретению являются области Fc, которые включают делеции аминокислот, добавления и/или модификации.
Следует учитывать, что область Fc в контексте настоящего изобретения включает полипептиды, содержащие константную область антитела, исключая первый домен константной области иммуноглобулина. Таким образом, Fc относится к двум последним доменам константной области иммуноглобулинов IgA, IgD и IgG, к последним трем доменам константной области иммуноглобулинов IgE и IgM и к гибкому шарнирному N-концу к таким доменам. В области Fc IgA и IgM может быть цепь J. Для IgG область Fc включает домены иммуноглобулина Сгамма2 и Сгамма3 (Сγ2 и Сγ3) и шарнирную область Сгамма1 (Сγ1) и Сгамма2 (Сγ2). Хотя связывания области Fc могут варьировать, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяют для включения остатков С226 или Р230 к его карбокси-концу, в котором нумерация соответствует индексу EU по Kabat и др. (1991, NIH Publication 91-3242, Служба национальной технической информации, Спрингфилд, Вирджиния). Понятие «индекса EU, указанного выше в публикации Kabat» относится к нумерации EU остатков в антителе IgG1 человека по описанию Kabat и др., см. выше. Область Fc может относиться к такой области в выделенном антителе, или это область в составе антитела, фрагмента антитела или гибридного белка Fc. Вариант белка Fc может быть антителом, гибридом Fc или каким-либо белком или белковым доменом, который включает область Fc, включая, но ими не ограничиваясь, варианты области Fc, которые не являются природными вариантами Fc. Примечание: полиморфизмы отмечают в ряде положений в Fc, включая, но ими не ограничиваясь, положения 270, 272, 312, 315, 356 и 358 по Kabat, и таким образом, могут быть небольшие отличия настоящей последовательности от последовательностей, известных в предшествующем уровне техники.
D
off
on
D
D
on
off
D
Настоящее изобретение также относится к белкам варианта Fc, которые имеют измененные связывающие свойства в отношении лиганда Fc (например, рецептор Fc, C1q) относительно сопоставляемой молекулы (например, белка, имеющего тот же аминокислотный состав за исключением области Fc дикого типа). К примерам связывающих свойств относятся, но ими не ограничиваются, специфичность связывания, константа уравнения диссоциации (K), степени диссоциации и ассоциации (k и k соответственно), связывающее сродство и/или авидитет. Обычно связывающая молекула (например, белок варианта Fc, например, антитело) с низкой величиной K может быть предпочтительнее связывающей молекулы с высокой величиной K. Однако в некоторых случаях величина k или k может быть более важной, чем величина K. Специалист в данной области может определить, какой кинетический параметр наиболее важный для применения данного антитела.
Сродство и связывание домена Fc с его лигандом могут быть определены различными методами анализа in vitro (основанными преимущественно на биохимических и иммунологических показателях), известными в данной области для определения взаимодействий Fc-FcγR, т.е. специфического связывания области Fc с FcγR, включающими, но ими не ограничивающимися, методы равновесия (например, фермент-связанного иммуносорбентного анализа (ELISA), или ридиоиммуноанализа (РИА)), или кинетики (например, анализ BIACORE), а также другие методы, например, методы непрямого связывания, методы конкурентного ингибирования, переноса энергии флуоресцентного резонанса (fluorescence resonance energy transfer - FRET), гельэлектрофореза и хроматографии (например, гельфильтрации). Эти и другие методы могут использовать метку на одном или нескольких компонентах, исследующих и/или применяющих различные методы обнаружения, включая, но ими не ограничиваясь, хромогенные, флуоресцентные, люминесцентные или изотопные метки. Подробное описание связывающего сродства и кинетики приведено в кн.: «Fundamental Immunology», 1999, 4-е изд., под ред. Paul W.E., изд-во Lippincott-Raven, Филадельфия, в которой сосредотачиваются на взаимодействиях антитело-иммуноген.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок варианта Fc имеет повышенное связывание с одним или несколькими лигандами Fc по сравнению с сопоставляемой молекулой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc имеет сродство с лигандом Fc, которое по меньшей мере в 2 раза, или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 7 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 20 раз, или по меньшей мере в 30 раз, или по меньшей мере в 40 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 60 раз, или по меньшей мере в 70 раз, или по меньшей мере в 80 раз, или по меньшей мере в 90 раз, или по меньшей мере в 100 раз, или по меньшей мере в 200 раз больше по сравнению с сопоставляемой молекулой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения белок варианта Fc обладает повышенным связыванием с рецептором Fc. В другом варианте осуществления настоящего изобретения белок варианта Fc обладает повышенным связыванием с Fc рецептором FcγRIIIA. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок варианта Fc обладает повышенным связыванием с Fc рецептором FcRn. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок варианта Fc обладает повышенным связыванием с C1q относительно сопоставляемой молекулы.
Периоды полураспада в сыворотке белков, включающих области Fc, могут быть повышены за счет повышения связывающего сродства Fc области с FcRn. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения белок варианта Fc имеет повышенный период полураспада в сыворотке относительно сопоставимой молекулы.
Понятие «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (АЗКЦ)» относится к форме цитотоксичности, при которой секретируемый Ig, связанный с рецепторами Fc (FcR), находящимися на определенных цитотоксических клетках (например, природных клетках-киллерах (NK), нейтрофилах и макрофагах), способен такие цитотоксические эффекторные клетки связывать специфически с антиген-несущей клеткой-мишенью и в результате уничтожать клетки-мишени с цитотоксинами. Специфические с высоким сродством IgG антитела, направленные к поверхности клеток-мишеней, «схватывают» цитотоксические клетки и являются абсолютно необходимыми для такого уничтожения. Лизис клетки-мишени является внеклеточным, требует непосредственного контакта между клетками и происходит без комплемента. Предполагают, что помимо антител, другие белки, включающие область Fc, специфические Fc гибридные белки, обладающие способностью специфически связываться с антиген-несущими клетками-мишенями, могут влиять на опосредованную клетками цитотоксичность. Для упрощения, опосредованная клетками цитотоксичность, возникающая из действия гибридного белка Fc, также в контексте настоящего изобретения обозначается активностью АЗКЦ.
Может быть исследована способность какого-либо определенного варианта белка Fc опосредовать лизис клеток-мишеней за счет АЗКЦ. Для оценки действия АЗКЦ исследуемый вариант белка Fc вносят к клеткам-мишеням в комбинации с иммунными эффекторными клетками, которые могут быть активированы комплексами антиген-антител, что приводит к цитолизу клеток-мишеней. Клеточный лизис обычно выявляют по высвобождению метки (например, радиоактивных субстратов, флуоресцентных красителей или природных внутриклеточных белков) из лизированных клеток. Применимыми эффекторными клетками, например, могут быть мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). Конкретные примеры исследований АЗКЦ in vitro описаны в работах Wisecarver и др., 79, 1985, cc.277-282, Bruggemann и др., J Exp Med 166, 1987, cc.1351-1361, Wilkinson и др., J Immunol methods 258, 2001, cc.183-191, Patel и др., J Immunol methods 184, 1995, cc.29-38. Действие АЗКЦ исследуемого варианта белка Fc также может быть оценено in vivo, например, в животной модели, например, в работе Clynes и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, cc.652-656.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc обладает повышенным действием АЗКЦ относительно сравниваемой молекулы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc обладает действием АЗКЦ, которое по меньшей мере в 2 раза, или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 100 раз, больше, по сравнению с действием сравниваемой молекулы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc обладает повышенным связыванием с Fc рецептором FcγRIIIA и имеет повышенное действие АЗКЦ по сравнению с действием сравниваемой молекулы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc обладает и повышенным действием АЗКЦ, и повышенным периодом полураспада в сыворотке по сравнению с действием сравниваемой молекулы.
Понятие «комплементзависимая цитотоксичность (КЗЦ)» относится к лизису клеток-мишеней в присутствии комплемента. Метаболический путь активирования комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой антитела, например, объединенного с родственным антигеном. Для оценки активирования комплемента может быть выполнено исследование КЗЦ, например, описанное в работе Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. methods, 202, 1996, с.163. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc обладает повышенным действием КЗЦ по сравнению с сопоставляемой молекулой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc обладает действием КЗЦ, которое по меньшей мере в 2 раза, или по меньшей мере в 3 раза, или по меньшей мере в 5 раз, или по меньшей мере в 10 раз, или по меньшей мере в 50 раз, или по меньшей мере в 100 раз выше действия сопоставляемой молекулы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc обладает повышенным действием КЗЦ и повышенным периодом полураспада в сыворотке относительно сопоставляемой молекулы.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают композиции, в которых область Fc включает неприродные аминокислотные остатки по одному или нескольким положениям, выбранным из группы, состоящей из положений 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 и 443, нумерация которых соответствует индексу EU, основанному по Kabat. Необязательно область Fc может включать неприродный аминокислотный остаток по дополнительным и/или измененным положениям, известным специалистам в данной области (см., например, US 5624821, 6277375, 6737056, PCT WO 01/58957, WO 02/06919, WO 04/016750, WO 04/029207, WO 04/035752, WO 04/074455, WO 04/099249, WO 04/063351, WO 05/070963, WO 05/040217, WO 05/092925 и WO 06/020114).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают композицию варианта белка Fc, в котором Fc область включает по меньшей мере один неприродный остаток аминокислоты, выбранный из группы, состоящей из 234D, 234Е, 234N, 234Q, 234Т, 234Н, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235А, 235D, 235R, 235W, 235Р, 235S, 235N, 235Q, 235Т, 235Н, 235Y, 235I, 235V, 235F, 236Е, 239D, 239Е, 239N, 239Q, 239F, 239Т, 239Н, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244Н, 245А, 247L, 247V, 247G, 251F, 252Y, 254T, 255L, 256E, 256M, 2621, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 269G, 297S, 297D, 297E, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 313F, 316D, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330Т, 330С, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 440Y и 434W, пронумерованных по индексу EU, установленному ниже по Kabat. Необязательно область Fc может включать дополнительно и/или в другом варианте неприродные остатки аминокислот, известных специалисту в данной области (см., например, US 5624821, 6277375, 6737056, PCT WO 01/58957, WO 02/06919, WO 04/016750, WO 04/029207, WO 04/035752 и WO 05/040217).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривается композиция варианта белка Fc, в которой область Fc включает по меньшей мере неприродную аминокислоту по одному или нескольким положениям, выбранным из группы, состоящей из 239, 330 и 332 по нумерации по индексу EU, установленному в работе Kabat. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения настоящее изобретение предусматривает состав варианта белка Fc, в котором область Fc включает по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 239D, 330L и 332E по нумерации по индексу EU, установленному в работе Kabat. Необязательно область Fc может дополнительно включать неприродную аминокислоту по одному или нескольким положениям, выбранным из группы, состоящей из 252, 254 и 256 по нумерации по индексу EU, установленному в работе Kabat. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают состав варианта белка Fc, в котором область Fc включает по меньшей мере одну неприродную аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из 239D, 330L и 332E, по нумерации по индексу EU, установленному в работе Kabat и по меньшей мере одну неприродную аминокислоту по одному или по нескольким положениям, выбранным из группы, состоящей из 252Y, 254Т и 256Е по нумерации по индексу EU, установленному в работе Kabat.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения варианты Fc по настоящему изобретению могут комбинироваться с другими известными вариантами Fc, например, описанными в публикациях Ghetie и др., Nat Biotech. 15, 1997, cc.637-640, Duncan и др., Nature 332, 1988, cc.563-564, Lund и др., J. Immunol 147, 1991, cc.2657-2662, Lund и др, Mol Immunol 29, 1992, cc.53-59, Alegre и др., Transplantation 57, 1994, cc.1537-1543, Hutchins и др., Proc Natl. Acad Sci USA 92, 1995, cc.11980-11984, Jefferis и др., Immunol Lett. 44, 1995, cc.111-117, Lund и др., Faseb J 9, 1995, cc.115-119, Jefferis и др, Immunol Lett 54, 1996, cc.101-104, Lund и др., J Immunol 157, 1996, cc.4963-4969, Armour и др., Eur J Immunol 29, 1999, cc.2613-2624, Idusogie и др, J Immunol 164, 2000, cc.4178-4184, Reddy и др., J Immunol 164, 2000, cc.1925-1933, Xu и др., Cell Immunol 200, 2000, cc.16-26, Idusogie и др., J Immunol 166, 2001, cc.2571-2575, Shields и др., J Biol Chem 276, 2001, cc.6591-6604, Jefferis и др., Immunol Lett 82, 2002, cc.57-65, Presta и др., Biochem Soc Trans 30, 2002, cc.487-490, US 5624821, 5885573, 5677425, 6165745, 6277375, 5869046, 6121022, 5624821, 5648260, 6528624, 6194551, 6737056, 6821505, 6277375, US Patent Publication Nos. 2004/0002587 и WO 94/29351, WO 99/58572, WO 00/42072, WO 02/060919, WO 04/029207, WO 04/099249, WO 04/063351. Настоящее изобретение также относится к областям Fc, которые включают делеции, вставки и/или модификации. Другие модификации/замещения/дополнения/делеции домена Fc домен очевидны специалистам в данной области.
Способы получения неприродных областей Fc известны в данной области. Например, аминокислотные замещения и/или делеции могут быть получены методами мутагенеза, включая, но ими не ограничиваясь, сайт-направленный мутагенез (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985, cc.488-492), ПЦР мутагенез (Higuchi в кн.: «PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications», 1990, изд-во Academic Press, Сан-Диего, cc.177-183) и кассетный мутагенез (Wells и др., Gene 34, 1985, cc.315-323). Предпочтительно сайт-направленный мутагенез проводят методом перекрывающегося удлинения на основе ПЦР (Higuchi в кн.: «PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification», 1989, изд-во Stockton Press, Нью-Йорк, cc.61-70). Методика перекрывающегося удлинения на основе ПЦР (Higuchi, см. выше) также может применяться для внедрения какой-либо желаемой мутации (мутаций) в последовательность-мишень (стартовую ДНК). Например, первый цикл ПЦР в методе перекрывающегося удлинения включает амплификацию последовательности-мишени с внешним праймером (праймером 1) и внутренним праймером мутагенеза (праймером 3) и отдельно со вторым внешним праймером (праймером 4) и внутренним праймером (праймером 2), получая два сегмента ПЦР (сегмента А и Б). Внутренний праймер мутагенеза (праймер 3) конструируют таким образом, чтобы были ошибочные спаривания с последовательностью-мишенью, точно определяя соответствующую мутацию (мутации). Во втором цикле ПЦР продукты первого цикла ПЦР (сегменты А и Б) амплифицируют методом ПЦР, используя два внешних праймера (праймеры 1 и 4). Образуемый ПЦР сегмент полной длины (сегмент В) разрушают ферментами рестрикции и получаемый фрагмент рестрикции клонируют в соответствующем векторе. На первой стадии мутагенеза начальная ДНК (например, кодирующая гибридный белок Fc, антитело или просто область Fc) оперативно клонирована в вектор для мутагенеза. Праймеры конструируют для отражения требуемых аминокислотных замещений. Другие методы, применимые для получения вариантов областей Fc, известны в данной области (см., например, US 5624821, 5885573, 5677425, 6165745, 6277375, 569046, 6121022, 5624821, 5648260, 6528624, 6194551, 6737056, 6821505, 6277375, патентные публикации US 2004/0002587 и РСТ публикации WO 94/29351, WO 99/58572, WO 00/42072, WO 02/060919, WO 04/029207, WO 04/099249, WO 04/063351).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вариант белка Fc включает одну или несколько сконструированных гликоформ, т.е. углеводных композиций, которые ковалентно присоединены к молекуле, включающей область Fc. Сконструированные гликоформы могут быть применимы для разных целей, включая, но ими не ограничиваясь, повышение или понижение эффекторной функции. Сконструированные гликоформы могут быть выработаны каким-либо способом, известным специалистам в данной области, например, с применением штаммов со сконструированной или измененной экспрессией, путем совместной экспрессии с одним или несколькими ферментами, например DI N-ацетилглюкозаминилтрансферазой III (GnTI11), путем экспрессии молекулы, включающей область Fc в разных организмах и линиях клеток от разных организмов, или путем модификации углевода (углеводов) после экспрессии молекулы, включающей область Fc. Методы выработки сконструированных гликоформ известны специалистам в данной области и включают, но ими не ограничиваются, методы, описанные в следующих работах: Umana и др, Nat. Biotechnol 17, 1999, cc.176-180, Davies и др., Biotechnol Bioeng 74, 2007, cc.288-294, Shields и др, J Biol Chem 277, 2002, cc.26733-26740, Shinkawa и др., J Biol Chem 278, 2003, cc.3466-3473, US 6602684, US 10/277370, US 10/113929, PCT WO 00/61739A1, PCT WO 01/292246A1, PCT WO 02/311140A1, PCT WO 02/30954A1, а также технологию Potillegent™ (фирма Biowa, Inc. Princeton, Нью-Джерси), технологию GlycoMAb™ конструирования гликозилирования (фирма GLYCART biotechnology AG, Цюрих, Швейцария). См., например, WO 00061739, ЕА01229125, US 20030115614, Okazaki и др., JMB, 336, 2004, cc.1239-1249.
Гликозилирование антител
В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения гликозилирование антител, используемых в соответствии с настоящим изобретением, является модифицированным. Например, может быть получено антитело без гликозилирования (т.е. антитело, утратившее гликозилирование). Гликозилирование может быть изменено, например, таким образом, чтобы повысить сродство антитела с антигеном-мишенью. Такие углеводные модификации могут достигаться, например, путем изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в последовательности антитела, например, изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в последовательности антитела. Например, может быть произведено одно или несколько аминокислотных замещений, которые приводят к элиминации одного или нескольких сайтов гликозилирования вариабельной области каркасного участка, тем самым, удаляя гликозилирование по данному сайту. Такое гликозилирование может повысить сродство антитела с антигеном. Такой подход подробно описан в US 5714350 и 6350861. Также может быть произведено одно или несколько аминокислотных замещений, которые приводят к элиминации сайта гликозилирования, имеющегося в области Fc (например, аспарагин 297 в IgG). Кроме того, негликозилированные антитела могут быть получены в бактериальных клетках, утративших необходимый механизм гликозилирования.
Также может быть получено антитело, имеющее измененный тип гликозилирования, например, гипофукозилированное антитело, обладающее пониженным количеством остатков фукозила, или антитело, имеющее разветвленные структуры GlcNAc. Такие измененные варианты гликозилирования показаны для повышения способности антител к АЗКЦ. Такие углеводные модификации могут сопровождаться, например, экспрессирующие антитело в клетках-хозяевах с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования описаны в данной области и могут применяться в качестве клеток-хозяев, в которых для экспрессии рекомбинантных антител по настоящему изобретению получат антитело с измененным гликозилированием. См., например, работы Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 277, 2002, cc.26733-26740, Umana и др., Nat. Biotech. 17, 1999, cc.176-181, US 6946292, EP 1176195, PCT WO 03/035835, WO 99/54342, сущность каждой из которых включена в настоящее изобретение в виде ссылки.
Антитела с измененным типом гликозилирования также могут быть выработаны, используя клетки-хозяева низших эукариот, включающие модифицированный механизм гликозилирования согласно описаниям в US 7029872, US 20060148035A1, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок.
Конструирование эффекторной функции
Может потребоваться проведение модификации анти-ICOS антитела по настоящему изобретению, касающейся эффекторной функции, например, таким образом, что повышается эффективность антитела в лечении опосредованных Т-клетками заболеваний. Например, остатки цистеина могут быть внедрены в область Fc, тем самым допуская формирование межцепочечной дисульфидной связи в данной области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать повышенной способностью к интернализации, и/или к комплемент-опосредованному уничтожению клеток, и/или к антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и/или антитело-зависимому фагоцитозу. См. Caron и др., J. Exp Med., 176, 1992, cc.1191-1195 и Shopes B., J. Immunol., 148, 1992, cc.2918-2922. Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также могут быть приготовлены, используя гетеробифункциональные кросс-линкеры согласно описанию Wolff и др., Cancer Research, 53, 1993, cc.2560-2565. Также может быть сконструировано антитело, которое имеет сдвоенные области Fc и за счет этого обладает усиленным комплемент-зависимым лизисом, антитело-зависимым фагоцитозом и/или АЗКЦ способностями. См., Stevenson и др., Anti-cancer Drug Design, 3, 1989, cc.219-230.
Другие методы конструирования областей Fc антител, позволяющие изменять эффекторные функции, известны в данной области (например, патентные публикации US 20040185045 и РСТ WO 2004/016750, в которых описаны изменения в области Fc для повышения связывающего сродства с FcγRIIB по сравнению со связывающим сродством с FCyRIIA, см. также WO 99/58572, WO 99/51642 и US 6395272, сущность которых в целостности включена в настоящее изобретение). Методы модификации области Fc для снижения связывающего сродства с FcγRIIB хорошо известны в данной области (например, патентные публикации US 20010036459 и РСТ WO 01/79299, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок). Модифицированные антитела, обладающие вариантами области Fc с повышенным связывающим сродством в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA по сравнению с областью Fc дикого типа, также были описаны (например, патентная публикация РСТ WO 2004/063351, сущность которой включена в настоящее изобретение в виде ссылки).
Известные в данной области методы in vitro могут быть применены чтобы определить, являются ли анти-ICOS антитела в композициях и способах по настоящему изобретению способными опосредовать АЗКЦ, КЗЦ и/или антитело-зависимый фагоцитоз, например, описанные в настоящем изобретении.
Получение/выработка анти-ICOS антител
Если сконструировано требуемое анти-ICOS антитело, анти-ICOS антитело может быть получено в коммерческом масштабе, используя методы, хорошо известные в данной области для масштабного получения антител. Например, этого можно достичь, используя рекомбинантные системы экспрессии, например, но ими перечень не ограничивается, описанные ниже.
Системы рекомбинантной экспрессии
Рекомбинантная экспрессия антитела или его варианта обычно требует конструкции вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, который кодирует антитело. Если был получен полинуклеотид, кодирующий молекулу антитела, или тяжелую или легкую цепь антитела, или их часть, вектор для получения молекул антител может быть получен рекомбинацией ДНК, используя методики, известные в данной области. См., например, патент US 6331415, сущность которого включена в настоящее изобретение в виде ссылки. Таким образом, в настоящем изобретении описаны способы получения белка путем экспрессии полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело. Методы, известные в данной области, могут применяться для конструирования векторов экспрессии, содержащих последовательности, кодирующие антитело, и соответствующие сигналы контроля транскрипции и трансляции. К указанным методам относятся, например, методы рекомбинации ДНК in vitro, методы синтеза и генетическая рекомбинация in vivo. Настоящее изобретение, таким образом, представляет реплицируемые векторы, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую молекулу антитела, тяжелую и легкую цепь антитела, вариабельный домен тяжелой и легкой цепей антитела или их части, или области CDR тяжелой и легкой цепей, оперативно связанные с промотором. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, WO 86/05807, WO 89/01036 и US 5122464), и вариабельный домен антитела может быть клонирован в таком векторе для экспрессии целой тяжелой цепи, целой легкой цепи или и тяжелой, и легкой цепей.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела могут быть получены, используя целевую гомологичную рекомбинацию для получения целых анти-ICOS антител или их частей (см., US 6063630, 6187305 и 6692737). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела могут быть получены, используя методы случайной рекомбинации для получения целых анти-ICOS антител или их частей (см., US 6361972, 6524818, 6541221 и 6623958). Анти-ICOS антитела также могут быть получены в клетках, экспрессирующих антитело из геномной последовательности клетки, включающей локус модифицированного иммуноглобулина, используя Cre-опосредованную сайт-специфическую гомологическую рекомбинацию (см. US 6091001). Линия клеток-хозяев может быть получена от человека или от представителя другого вида, включая, но ими не ограничиваясь, мышей и китайских хомячков. Если требуется антитело человека или гуманизированное антитело, линия клеток-хозяев должна быть линией клеток человека. Эти методы преимущественно могут применяться для конструирования стабильных клеточных линий, которые постоянно экспрессируют молекулы антитела.
Если вектор экспрессии трансфецируют в клетки-хозяева с помощью традиционных методов, затем трансфецированные клетки культивируют традиционными способами, предназначенными для получения антитела. Таким образом, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотид, кодирующий антитело по настоящему изобретению, или его фрагменты, или его тяжелую или легкую цепь, или ее часть, или одноцепочечное антитело по настоящему изобретению, оперативно связанное с гетерологичным промотором. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для экспрессии двухцепочечных антител векторы, кодирующие и тяжелую, и легкую цепь, могут совместно экспрессироваться в клетках-хозяевах для экспрессии целой молекулы иммуноглобулина, что подробно описано ниже.
Различные векторные системы экспрессии в хозяине могут применяться для экспрессии анти-ICOS антитела или его частей, которые могут применяться в конструировании и выработке анти-ICOS антител (см., например, US 5807715). Например, клетки млекопитающих, например, клетки яичника китайского хомячка (Chinese hamster ovary cells - CHO), совместно с вектором, например, элемент большого промежуточного раннего генного промотора из цитомегаловируса человека, являются эффективной системой экспрессии для антител (Foecking и др., Gene, 45, 1986, с.101, и Cockett и др., Bio/Technology, 8, 1990, с.2). Кроме того, могут быть выбраны клетки штамма-хозяина, которые модулируют экспрессию инсертированных последовательностей антитела, или модифицируют и процессируют продукт гена антитела желаемым специфическим образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важны для функции белка. Разные клетки-хозяева имеют специфичные механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Соответствующие линии клеток или системы хозяев могут быть выбраны, чтобы убедиться в точности модификации и процессинга экспрессированного антитела или его части. С этой целью могут применяться эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным механизмом для соответствующего процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. К таким клеткам-хозяевам млекопитающих относятся, но ими не ограничиваются, клетки СНО, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, ВТ483, Hs578T, HTB2, BT20 и T47D, NS0 (линия клеток миеломы мыши, которая эндогенно не вырабатывает какие-либо функциональные цепи иммуноглобулина), CRL7030 и HsS78Bst.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линии клеток человека, созданные путем иммортализации лимфоцитов человека, могут применяться для рекомбинантного получения моноклональных человеческих анти-ICOS антител. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения может применяться линия клеток человека PER.С6. (фирма Crucell, Нидерланды) для рекомбинантного получения моноклональных человеческих анти-ICOS антител.
В бактериальных системах ряд экспрессирующих векторов может быть преимущественно выбран в зависимости от применения, предназначенного для экспрессируемой молекулы антитела. Например, может быть желательно при получении большого количества такого антитела для получения фармацевтических композиций, включающих анти-ICOS антитело, получать векторы, которые направляют экспрессию высоких уровней продуктов гибридных белков, которые можно легко очистить. К таким векторам относится, но им перечень не ограничивается, вектор экспрессии pUR278 E.coli (Ruther и др., ЕМВО, 12, 1983, с.1791), в котором последовательность, кодирующая антитело, может быть отдельно лигирована в вектор в рамку с lac Z кодирующей областью таким образом, что вырабатывается гибридный белок, pIN векторы (Inouye и Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13, 1985, cc.3101-3109, Van Heeke и Schuster, J. Biol. Chem., 24, 1989, cc.5503-5509) и др. Векторы pGEX также могут применяться для экспрессии чужеродных полипептидов в качестве гибридных белков с глутатион S-трансферазой (glutathione-S-transferase - GST). Обычно такие гибридные белки растворимы и могут быть легко очищены из лизированных клеток путем адсорбции и связывания с глютатион-агарозным матриксом с последующей элюцией в присутствии свободного глютатиона. Векторы pGEX конструируют для внедрения сайтов расщепления тромбина и/или протеазы фактора Ха в экспрессируемый полипептид таким образом, что клонируемый целевой генный продукт может быть высвобожден из части молекулы GST.
В системе насекомых вирус ядерного полиэдроза (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus - AcNPV) используют в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус размножается в клетках Spodoptera frugiperda. Последовательность, кодирующая антитела, может быть клонирована отдельно в несущественных областях (например, в гене полигедрина) вируса и помещают под контроль промотора AcNPV (например, промотора полигедрина).
В клетках-хозяевах млекопитающих может быть применен ряд экспрессирующих систем на основе вирусов. В случаях, когда аденовирус используют в качестве вектора экспрессии, кодирующая последовательность исследуемого антитела может быть лигирована с аденовирусным комплексом контроля транскрипции/трансляции, например, с поздним промотором и трехраздельной лидерной последовательностью. Затем химерный ген может быть инсертирован в геном аденовируса путем рекомбинации in vitro или in vivo. Инсерция в несущественную область вирусного генома (например, область Е1 или Е3) может привести к получению рекомбинантного вируса, который жизнеспособен и может экспрессировать молекулу антитела в инфицированных хозяевах (см., например, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:355-359 (1984)). Сигналы специфической инициации могут также потребоваться для эффективной трансляции инсертированной последовательности, кодирующей антитело. К таким сигналам относится кодон инициации ATG и присоединенная последовательность. Кроме того, кодон инициации обычно бывает в рамке с рамкой считывания требуемой кодирующей последовательности для подтверждения трансляции всего инсерта. Такие экзогенные сигналы контроля трансляции и кодоны инициации могут иметь разное происхождение, и природное, и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть повышена путем включения соответствующих элементов усиления транскрипции, терминаторов транскрипции и др. (см., например, Bittner и др., Methods in Enzymol., 153, 1987, cc.51-544).
Стабильную экспрессию можно использовать для длительной на высоком уровне выработке рекомбинантных белков. Например, могут быть получены клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Клетки-хозяева могут быть трансформированы соответствующим сконструированным вектором, включающим элементы контроля экспрессии (например, промотор, энхансер, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и др.) и селективный маркерный ген. После внедрения чужеродной ДНК клетки выращивают в течение 1-2 суток на обогащенных средах и затем переносят на селективные среды. Селективный маркер в рекомбинантной плазмиде обеспечивает устойчивость к отбору и позволяет клеткам, у которых стабильно интегрирована в хромосому плазмида, расти и формировать колонии, которые в свою очередь могут быть клонированы и размножены в линии клеток. Плазмиды, которые кодируют анти-ICOS антитело, могут применяться для внедрения гена/кДНК в какую-либо клеточную линию для выработки в культуре.
-
-
-
Может быть применен ряд селективных систем, включая, но ими не ограничиваясь, гены тимидинкиназы вируса герпес симплекс (Wigler и др., Cell, 11, 1977, с.223), гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы (Szybalska, Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48, 1992, с.202) и аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy и др., Cell, 22, 1980, cc.8-17) в tk, hgprt или aprT клетках, соответственно. Также антиметаболиты могут использоваться в качестве основы для отбора следующих генов: dhfr, который обеспечивает устойчивость к метотрексату (Wigler и др., Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с.357, O'Hare и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, с.1527), gpt, который обеспечивает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan, Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1981, с.2072), neo, который обеспечивает устойчивость к аминогликозидному антибиотику G-418 (Wu и Wu, Biotherapy 3, 1991, cc.87-95, Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32, 1993, 573-596, Mulligan, Science 260, 1993, cc.926-932, Morgan, Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62, 1993, cc.191-217, May, TIB TECH 11(5), 1993, cc.155-215), hygro, который обеспечивает устойчивость к гигромицину (Santerre и др., Gene, 30, 1984, с.147). Методы, хорошо известные в данной области рекомбинации ДНК, могут обычным образом применяться для выбора требуемого рекомбинантного клона, и такие способы описаны, например, в кн.: «Current Protocols in Molecular Biology », 1993, под ред. Ausubel и др., изд-во John Wiley & Sons, Нью-Йорк; в кн.: Kriegler «Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual», 1990, изд-во Stockton Press; в кн.: «Current Protocols in Human Genetics», 1994, под ред. Dracopoli и др., изд-во John Wiley & Sons, Нью-Йорк, главы 12 и 13; Colberre-Garapin и др., J. Mol. Biol., 150, 1981, с.1, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок.
Уровни экспрессии молекулы антитела могут быть повышены амплификацией вектора (см. обзор по этой теме в кн.: Bebbington, Hentschel «The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning», 1987, изд-во Academic Press, Нью-Йорк, т.3). Если маркер антитела, экспрессируемого в векторной системе, способен к амплификации, повышение уровня ингибитора, имеющегося в культуре клеток-хозяев, может повысить число копий гена-маркера. Поскольку амплифицированная область ассоциирована с геном антитела, выработка антитела также может повыситься (Crouse и др., Mol. Cell. Biol., 3, 1983, с.257). Уровни экспрессии антитела могут быть амплифицированы через применение методов рекомбинации и инструменты, известные специалистам в области получения рекомбинантных белков, включая технологии, которые изменяют окружающий хроматин, и повышенную трансгенную экспрессию в форме активного искусственного домена транскрипции.
Клетки-хозяева могут быть совместно трансфецированы двумя векторами экспрессии: первым вектором, кодирующим полипептид, производный первой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, производный второй цепи. Два вектора могут содержать идентичные или разные селективные маркеры. Один вектор, который кодирует и способен к экспрессии полипептидов и тяжелой, и легкой цепи, также может применяться. В таких случаях легкая цепь может быть помещена в положение 5' к тяжелой цепи чтобы избежать избытка токсичной свободной тяжелой цепи (Proudfoot, Nature 322, 1986, cc.562-565, и Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с.2197). Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепей могут включать кДНК или геномную ДНК.
Если молекула антитела получена методом рекомбинантной экспрессии, она может быть очищена каким-либо методом, известным в области очистки молекулы иммуноглобулина, например, хроматографией (например, ион-обменной, аффинной, особенно имеющей сродство к специфическим антигенам белок А или белок G, и эксклюзионной хроматографией), центрифугированием, дифференцирующим растворением или каким-либо другим стандартным методом очистки белков. Кроме того, антитела по настоящему изобретению или их фрагменты могут быть гибридизированы с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в настоящем изобретении или иными известными в данной области методами для облегчения очистки.
Очистка и выделение антител
При использовании рекомбинантных методик антитело может быть получено внутриклеточно, в периплазматическом пространстве или прямой секрецией в среду. Если антитело получают внутриклеточно, в качестве первой стадии, обрывки клеток, или клетки-хозяева, или лизированные фрагменты удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Carter и др., Bio/Technology, 10, 1992, cc.163-167, описывают процедуру выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство Е.coli. Вкратце, массу клеток оттаивают в присутствии натрия ацетата (рН 3.5), EDTA и фенилметилсульфонилфторида (phenylmethylsulfonylfluoride - PMSF) в течение примерно 30 мин. Обрывки клеток могут быть удалены центрифугированием. Если мутантное антитело выделяется в среду, супернатанты таких экспрессирующих систем обычно сначала концентрируют, используя коммерчески доступный фильтр для концентрации белка, например, блок ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеазы, например, PMSF, может быть применен на какой-либо из последующих стадий для подавления протеолиза, а антибиотики могут быть включены для предупреждения роста ненужных контаминантов.
3
Композицию антитела, приготовленного из клеток, можно очистить, используя, например, хроматографию на гидроксиаппатите, хроматографию гидрофобного взаимодействия, ионообменную хроматографию, гель- электрофорез, диализ и/или аффинную хроматографию, отдельно или в комбинации с другими стадиями очистки. Стабильность белка А в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа домена Fc иммуноглобулина, имеющегося в мутанте антитела. Белок А может применяться для очистки антител, которые основаны на тяжелых цепях γ1, γ2 или γ4 человека (Lindmark и др., J. Immunol. Методы, 62, 1983, cc.1-13). Белок G рекомендован для всех изотипов мыши и для γ3 человека (Guss и др., ЕМВО J., 5, 1986, cc.1567-1575). Матриксом, к которому присоединен лиганд, является в большинстве случаев агароза, но также возможно применение других матриксов. Механически стабильные матриксы, например, определенное пористое стекло или поли(стиролдивинил)бензол позволяют увеличить скорости тока и сократить время процессирования, по сравнению с соответствующими показателями при использовании агарозы. Если антитело включает домен СН, для очистки применима смола Bakerbond ABX (фирма J.T. Baker, Phillipsburg, Нью-Джерси). Другие методы очистки белка, например, фракционирование на ион-обменной смоле, осаждение этанолом, ВЭЖХ обратной фазы, хроматография на кремнии, хроматография на кремнии, хроматография на гепарине, хроматография на SEPHAROSE, хроматография на анион- и катионобменной смоле (например, в колонке с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE, и осаждение сульфатом аммония, также могут быть применены и зависят от выделяемого антитела.
После каких-либо предварительных стадий (стадии) очистки смесь, включающая исследуемое антитело и контаминанты, может быть подвергнута хроматографированию с гидрофобным взаимодействием при низкой величине рН, используя буфер для элюции с величиной рН примерно 2,5-4,5, и может выполняться при низких концентрациях солей (например, примерно 0-0,25 молях солей).
Терапевтические анти-ICOS антитела
Анти-ICOS антитело, используемое в композициях и способах по настоящему изобретению, может быть антителом человека или гуманизированным антителом, которое может опосредовать АЗКЦ линии Т-клеток, антитело-зависимый фагоцитоз и/или КЗЦ, или может быть выбрано из известных анти-ICOS антител, которые могут опосредовать АЗКЦ линии Т- клеток, антитело-зависимый фагоцитоз и/или КЗЦ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела могут быть химерными антителами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело может быть моноклональным антителом, антителом человека, гуманизированным или химерным анти-ICOS антителом. Анти-ICOS антитело, используемое в композициях и способах по настоящему изобретению, может быть антителом человека или гуманизированным антителом изотипа IgG1 или IgG3 человека, или каким-либо аллелем IgG1 или IgG3, обнаруженным в популяции человека. В других вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело, используемое в композиция и способах по настоящему изобретению, может быть антителом человека или гуманизированным антителом изотипа IgG2 или IgG4 человека или каким-либо IgG2 или аллелем IgG4, обнаруженным в популяции человека.
Хотя такие антитела могут быть получены, используя описанные выше методы, в других вариантах осуществления по настоящему изобретению, JMab-136 анти-ICOS антитело человека (см., US 6803039) может быть модифицировано для получения анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, например, но ими перечень не ограничивается, АЗКЦ, антителозависимый фагоцитоз и/или КЗЦ. Например, известными анти-ICOS антителами, которые могут использоваться, являются, но ими не ограничиваются, моноклональные антитела против ICOS человека, описанные в US 6803039, и клон ISA-3 (фирма eBioscience, US).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело является переключенным вариантом изотипа известного антитела (например, изотипа IgG1 или IgG3 человека), например, описанного выше.
Анти-ICOS антитела, используемые в композициях и способах по настоящему изобретению, могут быть «голыми» антителами, иммуноконъюгатами или гибридными белками. Анти-ICOS антитела, описанные выше для применения в композициях и способах по настоящему изобретению, могут быть способны к уменьшению или истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток и циркулирующего иммуноглобулина у человека, подвергнутого лечению ими. Истощение Т-клеток может происходит у циркулирующих Т-клетках, или в определенных тканях, например, но ими перечень не ограничивается, в костном мозге, селезенке, лимфатической ткани, связанной с кишечником, и/или в лимфатических узлах. Такое истощение может быть достигнуто по разным механизмам, например, через антителозависимую клеточно опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ), и/или антителозависимый фагоцитоз, и/или путем блокирования взаимодействия ICOS с его намеченным лигандом, и/или через комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ). Понятие «истощение» Т-клеток означает снижение количества циркулирующих ICOS-экспрессирующих Т-клеток и/или ICOS-экспрессирующих Т-клеток в определенной ткани (тканях) по меньшей мере примерно на 25%, 40%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более. В определенных вариантах осуществления практически все выявляемые ICOS-экспрессирующие Т-клетки истощены в кровяном русле и/или в определенных тканях (ткани). «Истощение» циркулирующего иммуноглобулина (Ig) означает снижение, по меньшей мере примерно на 25%, 40%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения практически весь выявляемый Ig истощается из кровообращения.
Скрининг антител для связывания белка ICOS человека
Анализ связывания можно использовать для идентификации антител, которые связывают антиген ICOS человека. Анализ связывания можно проводить либо в виде прямого связывания, либо в виде анализа конкурентного связывания. Связывание может быть обнаружено, используя стандарт ELISA или стандарт анализа методом жидкостной цитометрии. В анализе прямого связывания антитело-кандидат тестируют на связывание с антигеном белка человека ICOS. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения исследования по скринингу включают на второй стадии определение способности антитела индуцировать расположенные ниже сигнальные события в Т-клетках, экспрессирующих ICOS человека. С другой стороны, исследование конкурентного связывания позволяет оценивать способность антитела-кандидата конкурировать с известным анти-ICOS антителом или другим соединением, которое связывает ICOS человека.
При исследовании прямого связывания ICOS антиген человека контактирует с антителом-кандидатом в условиях, которые позволяют связывать антитело-кандидат с ICOS антигеном человека. Связывание может происходить и в растворе, и на твердой поверхности. На антитело-кандидат может быть предварительно нанесена метка для выявления. Какое-либо выявляемое соединение может применяться для нанесения метки, например, но ими перечень не ограничивается, люминесцентной метки, флуоресцентной метки или радиоактивного изотопа или содержащей его группы, или неизотопной метки, например, фермента или красителя. После периода инкубирования, достаточного для формирования связывания, реакцию подвергают воздействию условий и манипуляций, которые удаляют избыток антитела или неспецифически связанное антитело. Обычно к ним относится промывка соответствующим буфером. В итоге выявляют наличие комплекса ICOS-антитела.
При исследовании конкурентного связывания антитело-кандидат оценивают по способности ингибировать или смещать связывание известного анти-ICOS антитела (или другого соединения) с ICOS антигеном человека. Меченое известное связующее ICOS может быть смешано с антителом-кандидатом и помещено в условия, при которых взаимодействие между ними в норме может произойти, с/без добавления антитела-кандидата. Количество меченого известного связующего ICOS, которое связывает ICOS человека, может быть сопоставлено с количеством, связанным в присутствии или отсутствии антитела-кандидата.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анализ связывания проводят с одним или несколькими компонентами, иммобилизованными на плотной поверхности для облегчения формирования и выявления комплекса антитело-антиген. В различных вариантах осуществления плотной основой может быть, но ими перечень не ограничивается, поливинилиденфторид, поликарбонат, полистерол, полипропилен, полиэтилен, стекло, нитроцеллюлоза, декстран, нейлон, полиакриламид и агароза. По конфигурации подложка может быть в виде гранул, мембран, микрочастиц, внутренней поверхности сосуда для проведения реакции, например, планшет для микротитрований, пробирка или другой сосуд для проведения реакции. Иммобилизация ICOS человека или другого компонента может быть достигнута через ковалентное или нековалентное присоединение. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения присоединение может быть непрямым, т.е. через присоединенное антитело. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ICOS антиген человека и отрицательные контроли захвачены эпитопом, например, глютатион-3-трансферазой (GST), таким образом, что присоединение к твердой подложке может быть опосредовано коммерчески доступным антителом, например, анти-GST (фирма Santa Cruz Biotechnology).
Например, такой анализ связывающего сродства может быть проведен, используя ICOS антиген человека, иммобилизованный на плотной основе. Обычно на неиммобилизованный компонент реакции связывания, в данной случае это анти-ICOS антитело-кандидат, наносят метку для обеспечения выявления. Известны и могут быть нанесены разные метки, например, люминесцентная, хромофорная, флуоресцентная или радиоактивный изотоп или содержащей его группы, и неизотопные метки, например, ферменты или красители. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело-кандидат метят флюорофором, например, флюоресцеинизотиоцианатом (FITC, фирмы Sigma Chemicals, Сэнт-Льюис). Такое исследование связывающего сродства может быть выполнено, используя ICOS антиген человека, иммобилизованный на плотной поверхности. Анти-ICOS антитела затем инкубируют с антигеном и специфическое связывание антитела выявляют методами, известными в данной области, но не только ими, включая BiaCore Analyses, ELISA, FMET и РИА методы.
В итоге сохраняющаяся на плотной основе метка может быть выявлена каким-либо способом обнаружения, известным в данной области. Например, если анти-ICOS антитело мечено флуорофором, флюориметр может применяться для выявления комплексов.
ICOS антиген человека может быть добавлен при исследовании связывания в форме интактных клеток, которые экспрессируют ICOS антиген человека, или выделенных мембран, содержащих ICOS антиген человека. Таким образом, прямое связывание с ICOS антигеном человека может быть исследовано в интактных клетках в культуре или в моделях животных в присутствии или отсутствии анти-ICOS антитела-кандидата. Меченое анти-ICOS антитело-кандидат может быть смешано с клетками, которые экспрессируют ICOS антиген человека, или с грубыми экстрактами, полученными из таких клеток, и анти-ICOS антитело-кандидат может быть добавлено. Выделенные мембраны могут применяться для идентификации анти-ICOS антитела-кандидата, который взаимодействует с ICOS человека. Например, в типичном эксперименте используют выделенные мембраны, клетки могут быть генетически сконструированы для экспрессии ICOS антигена человека. Мембраны могут быть собраны стандартными методами и использованы в анализе связывания in vitro. Меченое анти-ICOS антитело-кандидат (например, флюоресцентно-меченое антитело) связывают с мембранами и исследуют на специфическое действие, специфическое связывание определяют путем сравнения с анализами связывания, выполненными в присутствии избытка немеченого (холодного) анти-ICOS антитела-кандидата. Растворимый ICOS антиген человека может рекомбинантно экспрессироваться и используется в исследованиях, проводящихся не на основе связывания с клетками для идентификации антитела, которое связывается с ICOS антигеном человека. Рекомбинантно экспрессируемые ICOS полипептиды человека могут применяться в скрининговых исследованиях, не основанных на клетках. Пептиды, соответствующие одной или нескольким частям связывания ICOS антигена человека, или гибридные белки, содержащие одну или несколько связывающих частей ICOS антигена человека, также могут применяться в системах анализа, не основанных на клетках, для идентификации антитела, которое связывается с частями ICOS антигена человека. В исследованиях, не основанных на клетках, рекомбинантно экспрессируемый белок ICOS человека присоединяют к плотному субстрату, например, пробирке, лунке микропланшета или колонке, средствами, известными в данной области (см. выше Ausubel и др.). Исследуемые антитела затем исследуют на способность связывать ICOS антиген человека.
Реакция связывания также может проводиться в растворе. В настоящем исследовании проводят связывание меченого компонента с его связывающим партнером (партнерами) в растворе. Если различия в размере между меченым компонентом и его связывающим партнером (партнерами) допускает такое разделение, это разделение может быть достигнуто пропусканием продуктов реакции связывания через ультрафильтр, поры которого допускают пропуск несвязанного меченого компонента, но не его связывающего партнера (партнеров) или меченого компонента, связанного с его партнером (партнерами). Разделение также может быть достигнуто с помощью какого-либо реагента, способного захватывать связывающего партнера меченого компонента из раствора, например, антитела против связывающего раствора, и так далее.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения твердая подложка является мембраной, содержащей ICOS антиген человека, присоединенной к чашке для микротитрований. Антитела-кандидаты, например, могут связывать клетки, которые экспрессируют библиотеку антител, культивированные в условиях, которые допускают экспрессию представителей библиотеки в чашках для микротитрований. Собирают представителей библиотеки, которые связываются с ICOS человека. Такие методы в основном описаны в виде примеров в работах Parmley и Smith, Gene, 73, 1988, cc.305-318, Fowlkes и др., BioTechniques, 13, 1992, cc.422-427, PCT WO94/18318, и в ссылках, приводящихся в этих перечисленных работах. Антитела, идентифицированные в качестве связывающихся с ICOS антигеном человека, могут быть какого-либо типа или модификации антител, описанных выше.
Скрининг антител к эффекторной функции АЗКЦ человека
Антитела класса IgG человека с определенными функциональными свойствами, например, длинным периодом полураспада в сыворотке и способностью опосредовать различные эффекторные функции, используют в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения (кн.: «Monoclonal Антитела: Principles and Applications», 1995, фирма Wiley-Liss, Inc., глава 1). Антитело класса IgG дополнительно классифицируют на следующие 4 подкласса: IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Большое количество работ было выполнено до настоящего времени по АЗКЦ и КЗЦ в качестве эффекторных функций антитела класса IgG, и было установлено, что среди антител класса IgG человека подкласс IgG1 имеет наивысшую активность АЗКЦ и КЗЦ у людей (Chemical Immunology, 65, 1997, с.88).
Экспрессия действия АЗКЦ и действия КЗЦ антител подкласса IgG1 человека обычно включает связывание области Fc антитела с рецептором антитела (называемого в настоящем изобретении «FcγR»), находящимся на поверхности эффекторных клеток, например, клеток-киллеров, природных клеток-киллеров или активированных макрофагов. Различные компоненты комплемента могут быть связанными. По поводу связывания также было установлено, что имеет важное значение связывание нескольких аминокислотных остатков в шарнирной области и втором домене области С (обозначаемом в настоящем изобретении «Сγ2 доменом») антитела (Eur. J. Immunol., 23, 1993, с.1098, Immunology, 86, 1995, с.319, Chemical Immunology, 65, 1997, с.88) и что цепочка сахара в домене Сγ2 (Chemical Immunology, 65, 1997, с.88) также важна.
Анти-ICOS антитела могут быть модифицированы по эффекторной функции, например, таким образом, чтобы повысить АЗКЦ и/или комплемент зависимую цитотоксичность (КЗЦ) антитела. Этого можно достичь внедрением одного или нескольких аминокислотных замещений в области Fc антитела. Остаток (остатки) цистеина также могут быть внедрены в область Fc, допуская формирование межцепочечных дисульфидных связей в данной области. Таким способом может быть получено гомодимерное антитело, которое может обладать важной способностью к интернализации и/или повышенной комплемент-опосредованной гибели клеток и АЗКЦ (Caron и др., J. Exp. Med., 176, 1992, cc.1191-1195, Shopes, J. Immunol., 148, 1992, cc.2918-2922). Гетеробифункциональные перекрестные связки также могут применяться для получения гомодимерных антител с повышенной противоопухолевой активностью (Wolff и др., Cancer Research, 53, 1993, cc.2560-2565). Антитела также могут быть сконструированы таким образом, чтобы в их составе было две или несколько областей Fc, что приводит к повышенному лизису комплемента и способности к АЗКЦ (Stevenson и др., Анти-Cancer Drug Design, 3, 1989, cc.219-230).
Другие методы конструирования областей Fc, в результате которых изменяются эффекторные функции, известные в данной области (например, US 20040185045 и РСТ WO 2004/016750, которые описывают изменение области Fc для повышения связывающего сродства с FcγRIIB относительно связывающего сродства с FCγRIIA, см. также РСТ WO 99/58572, WO 99/51642, US 6395272, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок). Методы модификации области Fc для снижения связывающего сродства с FcγRIIB также известны в данной области (например, US 20010036459 и РСТ WO 01/79299, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок). Модифицированные антитела, имеющие варианты области Fc с повышенным связывающим сродством в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA относительно связывающего сродства с областью Fc дикого типа, также были описаны (например, РСТ WO 2004/063351, сущность которого включена в настоящее изобретение в виде ссылки).
Было обнаружено по меньшей мере четыре разных типа FcγR, которые соответственно называются FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16) и FcγRIV. У людей типы FcγRII и FcγRIII дополнительно классифицируют на FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa и FcγRIIIb, соответственно. FcγR является мембранным белком, принадлежащим к надсемейству иммуноглобулинов, причем FcγRII, FcγRIII и FcγRIV имеют цепь а, содержащую два иммуноглобулин-подобных домена, FcγRI имеет цепь а, содержащую внеклеточную область, включающую три иммуноглобулин-подобных домена, в качестве составляющего компонента, и цепь а участвует в связывающей способности IgG. Кроме того, FcγRI и FcγRIII содержат цепь у или цепь С, в качестве составляющего компонента, который обладает функцией передачи сигнала в ассоциации с цепью a (Annu. Rev. Immunol., 18, 2000, с.709, Annu. Rev. Immunol., 19, 2001, с.275). FcγRIV был описан Bruhns и др., Clin. Invest. Med., Canada) 27, 2004, с.3D.
Для оценки действия АЗКЦ исследуемого анти-ICOS антитела может применяться анализ АЗКЦ in vitro, например, описанный в US 5500362 или 5821337. Этот анализ также может быть выполнен, используя коммерческий набор, например, продукт CytoTox 96  (фирма Promega). К полезным эффекторным клеткам для таких исследований, например, относятся, но ими не ограничиваются, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), природные клетки-киллеры (NK) и линии клеток NK. Линии NK клеток, экспрессирующие трансгенный рецептор Fc (например, CD16) и ассоциированный сигнальный полипептид (например, FCεRI-γ), могут также служить эффекторными клетками (см., например, WO 2006/023148 А2). Например, также может исследоваться способность какого-либо определенного антитела опосредовать лизис клеток-мишеней путем активирования комплемента и/или АЗКЦ. Исследуемые клетки выращивают и наносят метку in vitro, антитело добавляют к культуре клеток в комбинации с иммунными клетками, которые могут быть активированы комплексами антиген-антитело, т.е., эффекторными клетками, участвующими в АЗКЦ ответе. Антитело может также исследоваться на активирование комплемента. В каждом случае цитолиз клеток-мишеней выявляют по выделению метки из лизированных клеток. Степень лизиса клеток-мишеней может также определяться по выявлению высвобождения цитоплазматических белков (например, ЛДГ) в супернатант. В самом деле, антитела могут подвергаться скринингу, используя собственную сыворотку пациента в качестве источника комплемента и/или иммунных клеток. Антитела, способные опосредовать АЗКЦ человека в тесте in vitro, затем могут использоваться терапевтически для данного определенного пациента. Действие АЗКЦ исследуемой молекулы также может быть оценено in vivo, например, в модели животного, например, модели, описанной Clynes и др., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95, 1998, cc.652-656. Кроме того, методы модулирования (т.е. повышения или понижения) уровня АЗКЦ, и необязательно действия КЗЦ антитела, известны в данной области. См., например, US 6194551. Антитела по настоящему изобретению могут иметь способность индуцировать АЗКЦ и/или КЗЦ, или могут быть модифицированы для приобретения этой способности. Исследования для определения функции АЗКЦ могут быть осуществлены, используя эффекторные клетки человека для оценки функции АЗКЦ человека. К таким исследованиям также могут относиться исследования, предназначенные для скрининга антител, которые индуцируют, опосредуют, повышают, блокируют гибель клеток в результате механизмов некроза и/или апоптоза. Такие методы, включающие использование прижизненных красителей, методы выявления и анализа каспаз и методы измерения разрывов ДНК, могут применяться для оценки активности апоптоза культивируемых клеток in vitro с исследуемым анти-ICOS антителом.
Например, исследования с окрашиванием аннексином V или по методу TUNEL (TdT-mediated dUTP nick-end labeling) могут выполняться по описанию Decker и др., Blood (USA) 103, 2004, cc.2718-2725 для выявления апоптической активности. Анализ TUNEL включает культивирование исследуемых клеток с меченым флуоресцеином dUTP для включения в разрывы цепей ДНК. Затем клетки процессируют для анализа жидкостной цитометрией. Исследование с применением аннексина V выявляет появление фосфатидилсерина (ФС) на внешней стороне плазматической мембраны апоптических клеток, используя конъюгированный с флуоресцеином аннексии V, который специфически распознает открытые молекулы ФС. Одновременно жизнеспособный краситель, например, пропидий иодит, может применяться для исключения поздних апоптических клеток. Клетки окрашивают меченым аннексином V и анализируют жидкостной цитометрией.
Иммуноконъюгаты и гибридные белки
Согласно определенным объектам настоящего изобретения терапевтические агенты или токсины могут быть конъюгированы с анти-ICOS антителами для применения в композициях и способах по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения такие конъюгаты могут быть выработаны в качестве гибридных белков. К примерам терапевтических агентов и токсинов относятся, но ими не ограничиваются, представители семейства молекул энедина, например, калихимицина и эсперамицина. Химические токсины также могут быть взяты из группы, включающей дуокармицин (см., например, US 5703080 и US 4923990), метотрексат, доксорубицин, мелфалан, хлорамбуцил, ARA-C, виндезин, митомицин С, цис-платину, этопозид, блеомицин и 5-фторурацил. К примерам химиотерапевтических агентов также относятся адриамицин, доксорубицин, 5-фторурацил, цитозин арабинозид (Ara-С), циклофосфамид, тиотепа, таксотер (доцетаксел), бусульфан, цитоксин, таксол, метотрексат, цисплатин, мелфалан, винбластин, блеомицин, этопозид, ифосфамид, митомицин С, митоксантрон, винкристин, винорелбин, карбоплатин, тенипозид, дауномицин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, митомицины, эсперамицины (см., US 4675187), мелфалан и соединения, близкие к горчичному газу (иприту).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела конъюгированы с цитостатическим, цитотоксическим или иммуносупрессивным агентом, причем цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из энедиина, лекситропсина, дуокармицина, таксана, пуромицина, доластатина, майтансиноида и алкалоидов барвинка. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения цитотоксическим агентом является паклитаксел, доцетаксел, СС-1065, SN-38, топотекан, морфолино-доксорубицин, ризоксин, цианоморфолино-доксорубицин, доластатин-10, эхиномицин, комбретастатин, калихимицин, майтанзин, DM-1, ауристатин Е, АЕВ, AEVB, AEFP, ММАЕ (см., US 10/983340) или нетропсин.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения цитотоксическим агентом конъюгата анти-ICOS антитела-цитотоксического агента по настоящему изобретению является анти-тубулиновый агент. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цитотоксический агент выбран из группы, включающей алкалоиды барвинка, подофиллотоксин, таксан, производное баккатин, криптофизин, майтанзиноид, комбретастатин и доластатин. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цитотоксическим агентом является винкристин, винбластин, виндезин, винорелбин, VP-16, камптотецин, паклитаксел, доцетаксел, эпитилон А, эпитилон В, нокодазол, колхицин, колцимид, эстрамустин, цемадотин, дисккодермолид, майтанзин, DM-1, AEFP, ауристатин Е, АЕВ, AEVB, AEFP, ММАЕ или элеутеробин.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело конъюгировано с цитотоксически агентом через линкер, причем линкер является пептидным линкером. В других вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело конъюгировано с цитотоксически агентом через линкер, причем линкер является линкером val-cit, линкером phe-lys, гидразонным линкером или дисульфидным линкером.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело конъюгата анти-ICOS антитела-цитотоксического агента конъюгировано с цитотоксическим агентом через линкер, причем линкер может быть подвержен гидролизу при рН менее 5,5. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения линкер может быть подвержен гидролизу при величине рН менее 5,0.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело конъюгата анти-ICOS антитела-цитотоксического агента конъюгировано с цитотоксическим агентом через линкер, причем линкер может расщепляться протеазой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения протеаза является лизосомальной протеазой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения протеаза наряду с другими является мембрано-ассоциированной протеазой, внутриклеточной протеазой или эндосомальной протеазой.
К другим токсинам, которые могут быть применимы в композициях и способах по настоящему изобретению, относятся ядовитые лектины, растительные токсины, например, рицин, абрин, модексин, ботулинический и дифтерийный токсины. Безусловно, комбинации различных токсинов также могут быть соединены с одной молекулой антитела, тем самым, подбирая различную цитотоксичность. Примерами токсинов, пригодных для использования в комбинированных лечениях по настоящему изобретению, являются рицин, абрин, рибонуклеаза, ДНКаза I, стафилококковый энтеротоксин-А, противовирусный белок фитолакки американской (Phytolacca ameriможета), гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas. См., например, публикации Pastan и др., Cell 47, 1986, с.641, Goldenberg и др., Можетcer Journal for Clinicians, 44, 1994, с.43. Могут быть применены ферментативно активные токсины и их фрагменты, в том числе цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модексина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки из Phytolaca ameriможета (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232.
Применимые токсины и химиотерапевтические агенты описаны в кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences, 1995, 19-е изд., изд-во Mack Publishing Co., и в кн.: Goodman, Oilman's «The Pharmacological Basis of therapeutics», 1985, 7-е изд., изд-во MacMillan Publishing Co. Другие применимые токсины и/или химиотерапевтические агенты известны специалистам в данной области.
121
123
125
131
14
35
3
111
112
113m
115m
99
99m
201
68
67
103
99
135
18
153
177
159
149
140
175
166
90
47
186
188
142
105
97
Настоящее изобретение также относится к антителам (включая фрагменты антител или их варианты), включающие или конъюгированные с радиоактивным агентом, применимым для диагностических целей. Примерами соответствующих радиоактивных материалов являются, но ими не ограничиваются, йод (I, I, I, I), углерод (С), сера (S), тритий (H), индий (In, In, In, In), технеций (Tc, Tc), таллий (Ti), галлий (Ga, Ga), палладий (Pd), молибден (Мо), ксенон (Хе), фтор (F), Sm, Lu, Gd, Pm, La, Yb, Но, Y, Sc, Re, Re, Pr, Rh и Ru.
213
103
135
131
68
57
65
85
32
35
90
153
153
169
51
54
75
113
90
117
186
188
166
177
90
166
153
Кроме того, анти-ICOS антитело по настоящему изобретению (включая scFv или другую молекулу, включающую, или в другом варианте состоящую из фрагментов антитела или его вариантов) может быть объединено или конъюгировано с ионом радиоактивного металла, используемого для терапевтических целей. К примерам соответствующих радиоактивных ионов относятся, но ими не ограничиваются, альфа-эмиттеры, например, Bi, или другие радиоизотопы, например, Pd, Хе, I, Ge, Со, Zn, Sr, Р, S, Y, Sm, Gd, Yb, Cr, Mn, Se, Sn, Y, Tin, Re, Re и Но. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или его фрагмент присоединен к макроциклическим хелаторам, которые захватывают и присоединяют к полипептидам ионы радиоактивных металлов, включая, но ими не ограничиваясь, Lu, Y, Но и Sm. В других вариантах осуществления настоящего изобретения макроциклическим хелатором является 1,4,7,10-тетрациклододекан-N,N',N'',N'"-тетрауксусная кислота (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N,N',N'',N'"-tetraacetic acid - DOTA). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения соединение DOTA присоединено к антителу по настоящему изобретению или его фрагменту через линкерную молекулу. Примеры линкерных молекул, применимых для конъюгирования DOTA с полипептидом, хорошо известны в данной области (см., например, DeNardo и др., Clin Cancer Res 4(10), 1998, cc.2483-2490, Peterson и др., Bioconjug Chem 10(4), 1999, cc.553-557, Zimmerman и др., Nucl Med Biol 26(8), 1999, cc.943-950, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок).
Анти-ICOS антитело по настоящему изобретению также может применяться в терапии ADEPT путем конъюгирования антитела с ферментом, активирующим пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент, см., WO81/01145) в противоопухолевое лекарство. См., например, WO 88/07378 и US 4975278. Ферментный компонент в иммуноконъюгате, применимый для ADEPT, представляет какой-либо фермент, способный воздействовать на пролекарство таким образом, что конвертирует его в более действующую цитотоксическую форму.
К ферментам, применимым в способе по настоящему изобретению, относятся, но ими не ограничиваются, щелочная фосфатаза, применимая для конверсии фосфат-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства, цитозиндеаминаза, применимая для конверсии нетоксического 5-фторцитозина в противораковое лекарственное средство 5-фторурацил, протеазы, например, протеаза Serratia, термолизин, субтилизин, карбоксипептидазы и катепсины (например, катепсины В и L), которые применимы для конверсии пептид-содержащих пролекарств в свободные лекарственные средства, D-аланилкарбоксипептидазы, применимые для конверсии пролекарств, которые содержат D-аминокислотные заместители, ферменты, расщепляющие углеводы, например, β-галактозидаза и нейраминидаза, применимые для конверсии гликозилированных пролекарств в свободные лекарственные средства, β-лактамаза, применимая для конверсии лекарственных средств, модифицированных α-лактамами, в свободные лекарственные средства, и пенициллин амидазы, например, пенициллин V амидаза или пенициллин G амидаза, применимые для конверсии лекарственных средств, производных по их аминному азоту с феноксиацетильными или фенилацетильными группами, соответственно, в свободные лекарственные средства. Антитела с ферментативной активностью, также называемые в данной области «абзимами», могут также применяться для конверсии пролекарств в свободные активные лекарственные средства (см., например, Massey, Nature 328, 1987, cc.457-458). Конъюгаты антитело-абзим могут быть приготовлены по описанию в настоящем изобретении для высвобождения абзима при необходимости порциями у человека со злокачественным заболеванием, связанным с Т-клетками, экспрессирующими ICOS.
Антитела по настоящему изобретению могут быть ковалентно связаны с ферментами методами, известными в настоящей области, например, методом с применением гетеробифункциональных перекрестно сшивающих реагентов, описанных выше. Гибридные белки, включающие по меньшей мере антиген-связывающую область анти-ICOS антитела, связанного по меньшей мере с функционально активной частью фермента, также могут быть сконструированы, используя методы рекомбинантной ДНК, известные в данной области (см., например, Neuberger и др., Nature, 312, 1984, cc.604-608).
Ковалентные модификации анти-ICOS антитела включены в область охвата настоящего изобретения. Они могут быть получены химическим синтезом, или ферментативным, или химическим расщеплением антитела, если это допустимо. Другие типы ковалентных модификаций анти-ICOS антитела внедряют в молекулу путем взаимодействия целевых аминокислотных остатков антитела с органическим дериватизирующим агентом, способным реагировать с выбранными боковыми цепями или N- или C-концевыми остатками.
Цистеинильные остатки в большинстве случаев взаимодействуют с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), например, хлоруксусной кислотой или хлорацетамидом, для получения карбоксиметильных или карбоксиамидометильных производных. Сходным образом также могут применяться йодсодержащие реагенты. Из цистеинильных остатков также получают производные реакцией с бромтрифторацетоном, α-бром-β-(5-имидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, р-хлормеркурбензоатом, 2-хлормеркур-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.
Из гистидильных остатков также получают производные реакцией с диэтилпирокарбонатом при величине рН 5,5-7,0, поскольку этот агент относительно специфичен в отношении боковой цепи гистидила. Также применим пара-бромфенацил бромид, реакция может быть выполнена в 0,1 М натрие какодилате при рН 6,0.
Лизильные и амино-концевые остатки реагируют с ангидридами янтарной или другой карбоновой кислотой. Дериватизация указанных агентов приводит к восстановлению заряда остатков лизинила. К другим соответствующим реагентам для получения производных α-амино-содержащих остатков и/или α-амино-содержащих остатков относятся имидоэфиры, например, метил пиколинимидат, пиридоксал фосфат, пиридоксал, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, 0-метилизомочевина, 2,4-пентанедион и катализируемая трансаминазой реакция с глиоксилатом.
Аргинильные остатки модифицируют с помощью реакции с одним или несколькими обычными реагентами, среди которых фенилглиоксал, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Получение производных аргинильных остатков обычно требует проведения реакции в щелочных условиях из-за высокой величины функциональной гуанидиновой группы. Кроме того, эти реагенты могут взаимодействовать с ε-амино-группами лизина, а также с аргинин-эпсилон-аминогруппой.
125
131
Специфическая модификация остатков тирозила может быть произведена при конкретной потребности во внедрении спектральных меток в остатки тирозила реакцией с соединениями ароматического диазония или тетранитрометана. В большинстве случаев используют N-ацетилимидизол и тетран итрометан для формирования O-ацетилтирозильных видов и 3-нитро производных, соответственно. Тирозильные остатки иодинируют, используя I или I для получения меченых белков для использования в радиоиммуноанализе.
Карбоксильные боковые группы (аспартильная или глютамильная) избирательно модифицируют реакцией с карбодиимидами (R--N=C=N--R'), где R и R' означают разные алкильные группы, например, 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил) карбодиимид или 1-этил-3-(4-азоний-4,4-диметилпентил) карбодиимид. Кроме того, остатки аспартила и глютамила преобразуют в остатки аспарагинила и глютаминила в реакции с ионами аммония.
Остатки глютаминила и аспарагинила часто деамидируют в соответствующие остатки глютамила и аспартила, соответственно. Эти остатки деамидируют в нейтральных или основных условиях. Деамидированная форма таких остатков относится к области охвата настоящего изобретения.
К другим модификациям относятся гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование α-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина (см. кн.: Т.Е. Creighton «Proteins: Structure и Molecular Properties», 1983, изд-во W.H. Freeman & Co., Сан-Франциско, cc.79-86), ацетилирование N-концевого амина и амидирование C-концевой карбокси-группы.
Другим типом ковалентной модификации является химическое или ферментативное соединение гликозидов с антителом. Такие методы имеют преимущество, заключающееся в том, что они не нуждаются в выработке антитела в клетке-хозяине, которая обладает способностью к гликозилированию для N- или O-связанного гликозилирования. В зависимости от применяемого способа соединения сахар (сахара) могут быть присоединены к (а) аргинину и гистидину, (б) свободным карбоксильным группам, (в) свободным сульфгидрильным группам, например, у цистеина, (г) свободным гидроксильным группам, например, у серина, треонина или гидроксипролина, (д) ароматическим остаткам, например, у фенилаланина, тирозина или триптофана, или (е) амидной группе глутамина. Эти методы описаны в WO 87/05330 и в работе Aplin и Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 1981, cc.259-306.
Химиотерапевтические комбинации
По настоящему изобретению рак или один или несколько его симптомов могут быть предупреждены, вылечены, изменены или облегчены путем введения анти-ICOS моноклонального антитела в комбинации с применением одного или нескольких способов лечения, например, но ими перечень не ограничивается, химиотерапии, радиационной терапии, гормональной терапии и/или биологической терапии/иммунотерапии.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способы по настоящему изобретению включают введение одного или нескольких антагонистов ангиогенеза, к которым, например, относятся, но ими перечень не ограничивается, ангиостатин (фрагмент плазминогена), антиангиогенный антитромбин III, ангиозим, АВТ-627, Bay 12-9566, бенефин, бевацизумаб, BMS-275291, производный от хрящей ингибитор (cartilage-derived inhibitor - CDI), CAI, фрагмент комплемента CD59, СЕР-7055, Col 3, комбретастатин А-4, эндостатин (фрагмент коллагена XVIII), фрагмент фибронектина, Gro-бета, галофугинон, гепариназы, гексасахаридный фрагмент гепарина, HMV833, хорионический гонадотропин человека (hCG), IM-862, интерферон альфа/бета/гамма, интерферон-индуцируемый белок (IP-10), интерлейкин-12, домен Kringle 5 (фрагмент плазминогена), маримастат, ингибиторы металлопротеиназы (TIMP), 2-метоксиэстрадиол, MMI 270 (CGS 27023A), моноклональное антитело IMC-1C11, неовастат, НМ-3, панзем, PI-88, ингибитор плацентарной рибонуклеазы, ингибитор активатора плазминогена, фактор тромбоцитов-4 (PF4), приномастат, фрагмент пролактина 16 кДа, пролиферин-родственный белок (PRP), PTK 787/ZK 222594, ретиноиды, солимастат, скваламин, SS 3304, SU 5416, SU6668, SU11248, тетрагидрокортизол-S, тетратиомолибдат, талидомид, тромбоспондин-1 (TSP-1), TNP-470, трансформирующий фактор роста бета (Transforming growth factor-beta - TGF-b), васкулостатин, вазостатин (фрагмент калретикулина), ZD6126, ZD 6474, ингибиторы фарнезил трансферазы (FTI) и бисфосфонаты (например, алендронат, клодронат, этидронат, ибандронат, памидронат, ризедронат, тилудронат и золедронат, но ими перечень не ограничивается).
В определенном варианте осуществления настоящего изобретения способы включают введение одного или нескольких иммуномодулирующих агентов, например, химиотерапевтических и нехимиотерапевтических агентов, которыми перечень не ограничивается. К примерам, которыми перечень не ограничивается, относятся метотрексат, циклоспорин А, лефлюномид, цисплатин, ифосфамид, таксаны, например, таксол и паклитаксол, ингибиторы топоизомеразы I (например, СРТ-11, топотекан, 9-АС и GG-211), гемцитабин, винорелбин, оксалиплатин, 5-фторурацил (5-ФУ), лейковорин, винорелбин, темодал, цитохалазин В, грамицидин D, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхитин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, гомологи пуромицина и цитоксан. К примерам нехимиотерапевтических иммуномодулирующих агентов относятся, но ими не ограничиваются, антитела против рецептора Т-клеток (например, анти-С04 антитела (например, сМ-Т412 (фирма Boeringer), IDEC-CE9.1 (IDEC и SKB), моноклональное антитело 4162W94, Orthoclone и OKTcdr4a (фирма Janssen-Cilag)), анти-CD3 антитела (например, Nuvion (фирма Product Design Labs), OKT3 (фирма Johnson & Johnson) или Rituxan (фирма IDEC)), анти-CD5 антитела (например, анти-CD5 рицин-связанный иммуноконъюгат), анти-CD7 антитела (например, СНН-380 (фирма Novartis)), анти-CD8 антитела, анти-CD40 лиганд моноклонального антитела (например, IDEC-131 (фирма IDEC)), анти-CD52 антитела (например, CAMPATH 1H (Ilex)), анти-CD2 антитела (например, MEDI-507 (MedImmune, Inc., International Publication Nos. WO 02/098370 и WO 02/069904), анти-CD11a антитела (например, Xanelim (фирма Genentech)) и анти-В7 антитела (например, IDEC-114) (фирма IDEC)), антитела против рецептора цитокина (например, анти-IFN рецептор антитела, анти-ИЛ-2 рецептор антитела (например, Zenapax (фирма Protein Design Labs)), анти-ИЛ-4 рецептор антитела, анти-ИЛ-6 рецептор антитела, анти-ИЛ-10 рецептор антитела, и анти-ИЛ-12 рецептор антитела), антитела против цитокинов (например, анти-ИФН антитела, анти-ФНО-α антитела, анти-ИЛ-1β антитела, анти-ИЛ-6 антитела, анти-ИЛ-8 антитела (например, АВХ-ИЛ-8 (фирма Abgenix)), анти-ИЛ-12 антитела и анти-ИЛ-23 антитела)), CTLA4-иммуноглобулин, LFA-3TIP (фирма Biogen, международная публикация WO 93/08656 и US 6162432), растворимые рецепторы цитокинов (например, внеклеточный домен ФНО-α рецептора или его фрагмента, внеклеточный домен ИЛ-1β рецептора или его фрагмента и внеклеточный домен ИЛ-6 рецептора или его фрагмента), цитокины или их фрагменты (например, интерлейкин (ИЛ)-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-23, ФНО-α, ФНО-β, интерферон (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, и GM-CSF) и анти-цитокин антитела (например, анти-ИЛ-2 антитела, анти-ИЛ-4 антитела, анти-ИЛ-6 антитела, анти-ИЛ-10 антитела, анти-ИЛ-12 антитела, анти-ИЛ-15 антитела, анти-ФНО-α антитела, и анти-IFN-γ антитела), и антитела, которые иммуноспецифически связываются с опухоль-ассоциированными антигенами (например, герцептин В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующий агент является иммуномодулирующим агентом, отличным от химиотерапевтического агента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующий агент является иммуномодилирующим агентом, отличным от цитокина или кроветворного фактора, например, ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, M-CSF, G-CSF, ИЛ-3 или эритропоэтин. В других вариантах осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующий агент является агентом, отличным от химиотерапевтического агента и цитокина или кроветворного фактора.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способы по настоящему изобретению охватывают введение одного или нескольких противовоспалительных агентов, к которым, например, относятся, но ими перечень не ограничивается, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НСПВЛС), стеоидные противовоспалительные средства (СПВЛС), бета-агонисты, антихолинергические агенты и метилксантины. К примерам НСПВЛС относятся, но ими перечень не ограничивается, аспирин, ибупрофен, целекоксиб (продукт CELEBREX™), диклофенак (продукт VOLTAREN™), этодолак (продукт LODINE™), фенопрофен (продукт NALFON™), индометацин (продукт INDOCIN™), кеторалак (продукт TORADOL™), оксапрозин (продукт DAYPRO™), набументон (продукт RELAFEN™), зулиндак (продукт CLINORIL™), толментин (продукт TOLECTIN™), рофекоксиб (продукт VIOXX™), напроксен (продукт ALEVE™, продукт NAPROSYN™), кетопрофен (продукт ACTRON™) и набуметон (продукт RELAFEN™). Такие НСПВЛС функционируют путем ингибирования фермента циклооксигеназы (например, СОХ-1 и/или СОХ-2). К примерам стериодных противовоспалительных средств относятся, но ими не ограничиваются, глюкокортикоиды, дексаметазон (продукт DECADRON™), кортизон, гидрокортизон, преднизон (продукт DELTASONE™), преднизолон, триамцинолон, азулфидин и эйкозаноиды, например, простагландины, тромбоксаны и лейкотриены.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения способы по настоящему изобретению включают введение одного или нескольких противовирусных агентов (к которым, например, относятся амантадин, рибавирин, римантадин, ацикловир, фамцикловир, фоскарнет, ганцикловир, трифлуридин, видарабин, диданозин, ставудин, залцитабин, зидовудин, интерферон), антибиотиков (к которым, например, относятся дактиномицин (ранее называвшийся актиномицином), блеомицин, митрамицин и антрамицин (АМС)), средств против рвоты (к которым, например, относятся алпразолам, дексаметазон, домперидон, дронабинол, дроперидол, гранисетрон, галоперидол, лоразепам, метилпреднизолон, метоклопрамид, набилон, ондансетрон, прохлорперазин), противогрибковых агентов (к которым, например, относятся амфотерицин, клотримазол, эконазол, флуконазол, флуцитозин, гризеофульвин, итраконазол, кетоконазол, миконазол и нистатин), противопаразитарных агентов (к которым, например, относятся дегидроэметин, дилоксанид фуроат, эметин, мефлохин, меларсопрол, метронидазол, нифуртимокс, паромомицин, пентабидин, пентамидин изетионат, примахин, хинакрин, хинидин) или их комбинаций.
К конкретным примерам противораковых агентов, которые могут быть применены в различных вариантах осуществления по настоящему изобретению, относятся фармацевтические композиции, лекарственные формы и наборы, которые включают, но ими не ограничиваются, ацивицин, акларубицин, акодазол гидрохлорид, акронин, адоцелезин, алдеслейкин, алтретамин, амбомицин, аметатрон ацетат, аминоглютетимид, амсарцин, анастрозол, антрамицин, аспарагиназа, асперлин, азацитидин, азетепа, азотомицин, батимастат, бензодепа, бикалютамид, бизантрен гидрохлорид, биснафид димезилат, бицелизин, блеомицин сульфат, бреквинар натрий, бропиримин, бусульфан, кактиномицин, калустерон, карацемид, карбетимер, карбоплатин, кармустин, карубицин гидрохлорид, карцелезин, цедефингол, хлорамбуцил, циролемицин, цисплатин, кладрибин, криснатол мезилат, циклофосфамид, цитарабин, дакарбазин, дактиномицин, даунорубицин гидрохлорид, децитабин, дексормаплатин, дезагуанин, дезагуанин мезилат, диазиквин, доцетаксел, доксорубицин, доксорубицин гидрохлорид, дролоксифен, дролоксифен цитрат, дромостанолон пропионат, дуазомицин, эдатрексат, эфлорнитин гидрохлорид, элзамитруцин, энлоплатин, энпромат, эпипропидин, эпирубицин гидрохлорид, эрбулозол, эзорубицин гидрохлорид, эстрамустин, эстрамустин фосфат натрия, этанидозол, этопозид, этопозид фосфат, этоприн, фадрозол гидрохлорид, фазарабин, фенретинид, флоксуридин, флударабин фосфат, фторурацил, флуроцитабин, фосквидон, фостриецин натрия, гемцитабин, гемцитабин гидрохлорид, гидроксимочевина, идарубицин гидрохлорид, ифосфамид, илмофозин, интерлейкин II (включая рекомбинантный интерлейкин II или гИЛ2), интерферон альфа-2а, интерферон альфа-2b, интерферон альфа-n1, интерферон альфа-n3, интерферон бета-I а, интерферон гамма-I b, ипроплатин, иринотекан гидрохлорид, ланреотид ацетат, летрозол, лейпролид ацетат, лиарозол гидрохлорид, натриевая соль лометрексола, ломустин, лозоксантрон гидрохлорид, мазопрокол, майтанзин, меклоретамин гидрохлорид, мегестрол ацетат, меленгестрол ацетат, мелфалан, меногарил, меркаптопурин, метотрексат, натриевая соль метотрексата, метоприн, метуредепа, митиндомид, митокарцин, митокромин, митогиллин, митомалцин, митомицин, митоспер, митотан, митоксантрон гидрохлорид, микофеноловая кислота, нокодазол, ногаламицин, ормаплатин, оксизуран, паклитаксел, ПЭГаспаргаза, пелиомицин, пентамустин, пепломицин сульфат, перфосфамид, пипоброман, пипосульфан, пироксантрон гидрохлорид, пликамицин, пломестан, натриевая соль порфимера, порфиромицин, преднимустин, прокарбазин гидрохлорид, пуромицин, пуромицин гидрохлорид, пиразофурин, рибоприн, роглетимид, сафингол, сафингол гидрохлорид, семустин, симтрацен, спарфосат натрия, спарзомицин, спирогерманий гидрохлорид, спиромустин, спироплатин, стрептонигрин, стрептозоцин, сулофенур, тализомицин, натриевая соль текогалана, тегафур, телоксантрон гидрохлорид, темопорфин, тенипозид, тероксирон, тестолактон, тиамиприн, тиогуанин, тиотепа, тиазофурин, тирапазамин, торемифен цитрат, трестолон ацетат, трицирибин фосфат, триметрексат, триметрексат глюкуронат, трипторелин, тубулозол гидрохлорид, азотистый иприт, уредепа, вапреотид, вертепорфин, винбластин сульфат, винкристин сульфат, виндезит, виндезит сульфат, винепидин сульфат, винглицинат сульфат, винлейрозин сульфат, винорелбин тартрат, винрозидин сульфат, винзолидин сульфат, ворозол, зениплатин, зиностатин, зорубицин гидрохлорид. К другим противораковым средствам относятся, но ими не ограничиваются, 20-эпи-1,25 дигидроксивитамин D3, 5-этинилурацил, абиратерон, акларубицин, ацилфульвен, адеципенол, адоцелезин, алдеслейкин, ALL-TK антагонисты, алтретамин, амбамустин, амидокс, амифостин, аминолевулиновая кислота, амрубицин, амсакрин, анагрелид, анастрозол, андрографолид, ингибиторы антиогенеза, антагонист D, антагонист G, антареликс,анти-нейральный морфогенетический белок-1, антиандроген (карцинома простаты), антиэстроген, антинеопластон, антисмысловые олигонуклеотиды, афидиколин глицинат, модуляторы гена апоптоза, регуляторы апоптоза, апуриновая кислота, ara-CDP-DL-PTBA, аргининдеаминаза, асулакрин, атаместан, атримустин, аксинастатин 1, аксинастатин 2, аксинастатин 3, азасетрон, азатоксин, азатирозин, производные баккатина III, баланол, батимастат, BCR/ABL антагонисты, бензохлорины, бензоилстауроспорин, производные бета-лактамов, бета-алетин, бетакламицин В, бетулиновая кислота, ингибитор bFGF, бикалутамид, бизантрен, бисазиридинилспермин, биснафид, бистратен А, бизелезин, брефлат, бропиримин, будотитан, бутионин сульфоксимид, кальципотриол, калфостин С, производные камптотецина, канарипокс ИЛ-2, капецитабин, карбоксамид-амино-триазол, карбоксиамидотриазол, CaRest М3, CARN 700, ингибитор из хряща, карцелезин, ингибиторы казеинкиназы (ICOS), кастаноспермин, цекропин В, цетрореликс, хлорины, хлорхиноксалин сульфонамид, цикапрост, цис-порфирин, кладрибин, аналоги кломифена, клотримазол, коллисмицин А, коллисмицин В, комбретастатин А4, аналог комбретастатина, конагенин, крамбесцидин 816, криснатол, криптофицин 8, производные криптофицина А, курацин А, циклопентрахиноны, циклоплатам, ципемицин, цитарабин окфосфат, цитолитический фактор, цитостатин, дакликсимаб, децитабин, дегидродидемнин В, дезлорелин, дексаметазон, дексифосфамид, дексразоксан, дексверапамил, диазиквин, дидемнин В, дидокс, диэтилнорспермин, дигидро-5-азацитидин, дигидротаксол, 9-диоксамицин, дифенил спиромустин, доцетаксел, докозанол, доласетрон, доксифлуридин, дролоксифен, дронабинол, дуокармицин SA, эбселен, экомустин, эделфозин, эдреколомаб, эфлорнитин, элемен, эмитефур, эпирубицин, эпристерид, аналог эстрамустина, агонисты эстрогена, антагонисты эстрогенов, этанидазол, этопозид фосфат, эксеместан, фадрозол, фазарабин, фенретинид, филграстим, финастерид, флавопиридол, флецеластин, флуастерон, флударабин, фтордаунорубицин гидрохлорид, форфенимекс, форместан, фостриэцин, фотемустин, гадолиний тексафирин, галлий нитрат, галоцитабин, ганиреликс, ингибиторы желатиназы, гемцитабин, ингибиторы глютатиона, гепсульфам, герегулин, гексаметилен бисацетамид, гиперицин, ибандроновая кислота, идарубицин, идоксифен, идрамантон, илмофозин, иломастат, имидазоакридоны, имиквимод, пептиды-иммуностимуляторы, ингибитор рецептора инсулиноподобного ростового фактора-1, агонисты интерферона, интерфероны, интерлейкины, йобенгуан, йоддоксорубицин, ипомеанол, 4-, ироплакт, ирзогладин, изобенгазол, изогомогаликондрин В, итасетрон, ждасплакинолид, кахалалид F, ламелларин-N триацетат, ланреотид, лейнамицин, ленограстим, лентинан сульфат, лептолстатин, летрозол, фактор подавления лейкоза, лейкоцитарный альфа интерферон, лейпролид + эстроген + прогестерон, лейпрорелин, девамизол, лиарозол, аналог линейного полиамина, липофильный пептид с дисахаридом, липофильные соединения платины, лисоклинамид 7, лобаплатин, ломбрицин, лометрексол, лонидамин, лозоксантрон, ингибитор HMG-CoA редуктазы (например, но ими перечень не ограничивается, ловастатин, правастатин, флувастатин, статин, симвастатин и аторвастатин), локсорибин, луртотекан, лютеций тексафирин, лизофиллин, литические пептиды, майтанзин, манностатин А, маримастат, мазопрокол, маспин, ингибиторы матрилизина, ингибиторы матричной металлопротеиназы, меногарил, мербарон, метерелин, метиониназа, метоклопрамид, ингибитор MIF, мифепристон, милтефозин, миримостим, ошибочно спаренная двунитевая РНК, митогуазон, митолактол, аналоги митомицина, митонафид, митотоксин, фактор роста фибробластов сапорин, митоксантрон, мофаротен, молграмостим, моноклональное антитело, хорионический гонадотропин человека, монофосфорильный липид А + сфингозинкиназа (sk) клеточной стенки микобактерий, мопидамол, ингибитор гена множественной лекарственной устойчивости, терапия на основе множественного опухолевого супрессора 1, ипритный противораковый агент, микапероксид В, экстракт клеточной стенки бактерий, мириапорон, N-ацетилдиналин, N-замещенные бензамиды, нафарелин, нагрестип, налоксон + пентазоцин, напавин, нафтерпин, нартограстим, недаплатин, неморубицин, неридроновая кислота, нейтральная эндопептидаза, нилутамид, низамицин, модуляторы окиси азота, нитроксидантиоксидант, нитруллин, O6-бензилгуанин, октреотид, окиценое, олигонуклеотиды, онапристон, ондансетрон, ондансетрон, орацин,индуктор орального цитокина, ормаплатин, озатерон, оксалиплатин, оксауномицин, паклитаксел, аналоги паклитаксела, производные паклитаксела, палауамин, пальмитоилризоксин, памидроновая кислота, панакситриол, паномифен, парабактин, пацеллиптин, ПЭГаспаргаза, пелдезин, пентозан полисульфан натрия, пентостатин, пентрозол, перфлуброн, перфосфамид, перилловый спирт, феназиномицин, фенилацетат, ингибиторы фосфатазы, пицибанил, пилокарпин гидрохлорид, пирарубицин, пиритрексим, плацетин А, плацетин В, ингибитор активатора плазминогена, комплекс платины, соединения платины, комплекс платины-триамина, порфимер натрия, порфиромицин, преднизон, пропил-бис-акридон, простагландин 32, ингибиторы протеасом, иммунный модулятор на основе белка А, ингибитор протеинкиназы С, ингибиторы протеинкиназы С, микроалгал, ингибиторы протеинтирозинфосфатазы, ингибиторы пуриннуклеозидфосфорилазы, пурпурины, пиразолакридин, конъюгат пиридоксилированного гемоглобина и полиоксиэтилена, антагонисты raf, ралтитрексед, рамосетрон, ингибиторы ras фарнезилпротеинтрансферазы, ингибиторы ras, ингибитор ras-GAP, ретеллиптин деметилированный, рений Re 186 этидронат, ризоксин, рибозимы, RII ретинамид, роглетимид, рохитукин, ромуртид, роквинимекс, рубигинон В1, рубоксил, сафингол, саинтопин, SarCNU, саркофитол А, сарграмостим, Sdi 1 миметики, семустин, производное ингибитора старения 1, смысловые олигонуклеотиды, ингибиторы сигнальной трансдукции, модуляторы сигнальной трансдукции, одноцепочечный антигенсвязывающий белок, сизофиран, собузоксан, натрий борокаптат, натрий фенилацетат, сольверол, соматомедин-связывающий белок, сонермин, спарфозиновая кислота, спикамицин D, спиромустин, спленопентин, спонгистатин 1, скваламин, ингибитор стволовых клеток, ингибиторы деления стволовых клеток, стипиамид, ингибиторы стромелизина, сульфинозин, сверхактивный вазоактивный антагонист кишечного пептида, сурадиста, сурамин, свейнсонин, синтетические гликозаминогликаны, таллимустин, тамоксифен метиодид, тауромустин, тазаротен, натриевая соль текогалана, тегафур, теллурапирилий, ингибиторы теломеразы, темопорфин, темозоломид, тенипозид, тетрахлодекаоксид, тетразомин, талибластин, тиокоралин, тромбопоэтин, миметик тромбопоэтина, тималфазин, агонист рецептора тимопоэтина, тимотринан, тироидстимулирующий гормон, этилэтиопурпурин олова, тирапазамин, титаносен бихлорид, топсентин, торемифен, тотипотентный фактор стволовых клеток, ингибиторы трансляции, третиноин, триацетиоуридин, трицирибин, триметрексат, трипторелин, тропизетрон, туростерид, ингибиторы тирозинкиназы, тирфостины, ингибиторы UBC, убенимекс, производный от урогенитального синуса фактор ингибирования роста, антагонисты рецептора урокиназы, вапреотид, вариолин В, векторная система, эритроцитная генная терапия, веларезол, верамин, вердины, вертепорфин, винорелбин, винксадтин, продукт Vitaxin, ворозол, занотерон, зениплатин, циласкорб и зиностатин стималамер. Дополнительными противораковыми средствами являются 5-фторурацил и лейковорин. Эти два агента могут быть полезны в способах, в которых применяют талидомид и ингибитор топоизомеразы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения противораковый агент не является химиотерапевтическим агентом.
В более конкретных вариантах осуществления настоящее изобретение также включает введение анти-ICOS моноклонального антитела в комбинации с введением одного или нескольких лекарственных средств, например, противораковых агентов, но ими перечень не ограничивается, например, описанных в табл.1, для лечения груди, яичника, меланомы, простаты, толстой кишки и легких, согласно описанному выше. При применении комбинированной терапии дозы и/или частота введения, приведенные в табл.1, могут быть понижены.
Таблица 1
Противоопухолевые агенты
Терапевтический агент
Доза/введение/состав
Доксорубицин гидрохлорид (продукт адриамицин RDF и продукт адриамицин PFS
Внутривенно
60-75 мг/м<sup>2</sup> на 1 сутки
Интервалы длительностью 21 сутки
Эпирубицин гидрохлорид (продукт Ellence™)
Внутривенно
100-120 мг/м<sup>2</sup> на 1 сутки каждого цикла или дозу равно делят и принимают на 1-8 сутки цикла
Длительность циклов 3-4 недели
Фторурацил
Внутривенно
В зависимости от упаковки: ампулы на 5 мл и на 10 мл (содержащих 250 и 500 мг фторурацила, соответственно)
Доцетаксел (продукт Taxotere)
Внутривенно
60-100 мг/м<sup>2 </sup>введение в течение 1 ч
Раз в три недели
Паклитаксел (продукт Taxol)
Внутривенно
175 мг/м<sup>2</sup> в течение 3 ч
Каждые три недели на протяжении 4 курсов (вводят последовательно после комбинаторной химиотерапии, содержащей доксорубицин)
Тамоксифен цитрат (продукт Nolvadex)
Перорально (таблетки)
20-40 мг Дозы, выше 20 мг, могут быть даны в виде поделенных доз (прием утром и вечером)
Ежедневно
Лейковорин кальциевая соль для инъекций
Внутривенная или внутримышечная инъекция
В зависимости от упаковки: 350 мг в ампуле
Из текста доза неясна. PDR 3610
Терапевтический агент
Доза/введение/состав
Лупролид ацетат (продукт Lupron)
Одна подкожная инъекция
1 мг (0,2 мл или 20 единиц маркировки)
Раз в сутки
Флутамид (продукт Eulexin)
Перорально (капсулы)
50 мг (каждая капсула содержит 125 мг флутамида)
3 раза в сутки с интервалами 8 ч (суммарная суточная доза 750 мг)
Нилутамид (продукт Nilandron)
Перорально (таблетки)
300 мг или 150 мг (таблетки содержат 50 или 150 мг нулитамида каждая)
300 мг один раз в сутки в течение 30 суток, затем по 150 мг раз в сутки
Бикалутамид (продукт Casodex)
Перорально (таблетки)
50 мг (каждая таблетка содержит 50 мг бикалутамида)
Раз в сутки
Прогестерон
Инъекция
USP в кунжутном масле 50 мг/мл
Кетоконазол (продукт Nizoral)
Мазь
2% мазь применяют 1-2 раза в сутки в зависимости от симптомов.
Преднизон
Перорально (таблетки)
Начальная доза может варьировать от 5 мг до 60 мг в сутки в зависимости от конкретного заболевания, подвергаемого лечению.
Эстрамустин фосфат натриевая соль (продукт Emcyt)
Перорально (капсулы)
14 мг/кг массы тела (т.е. одна капсула со 140 мг на каждые 10 кг или 22 фунта массы тела)
Суточная доза поделена на 3 или 4 дозы
Этопозид или VP-16
Внутривенно
5 мл раствора 20 мг/ мл (100 мг)
Дакарбазин (продукт DTIC-Dome)
Внутривенно
2-4,5 мг/кг
Раз в сутки на протяжении 10 суток. Повторение возможно с интервалами 4 недели.
Терапевтический агент
Доза/введение/состав
Полифепрозан 20 с имплантом кармустина (BCNU) (нитрозомочевина) (продукт Gliadel)
Пластину помещают в рассеченную полость
8 пластинок, каждая содержащая 7,7 мг кармустина, в целом 61,6 мг, если размер и форма рассеченной полости позволяют
Цисплатин
Инъекция
[не применим в PDR 861] Лекарственные формы: раствор 1 мг/мл в многодозовых флаконах, содержащих 50 мл и 100 мл
Митомицин
Инъекция
Ампулы содержат по 5 мг и 20 мг митомицина
Гемцитабин гидрохлорид (продукт Gemzar)
Внутривенно
Для NSCLC-2 схемы были исследованы и оптимальная схема не была определена Четырехнедельная схема - внутривенное введение 1000 мг/м<sup>2 </sup>на протяжении 30 мин По трехнедельной схеме - продукт Gemzar вводят внутривенно в дозе 1250 мг/м<sup>2</sup> в течение 30 мин.
Схема длительностью 4 недели. Сутки 1, 8 и 15 в каждом цикле, длительностью 28-суток. Цисплатин внутривенно в количестве 100 мг/м<sup>2</sup> в 1 сутки после инфузии продукта Gemzar. Схема длительностью 3 недели. Сутки 1 и 8 в каждом цикле, длительностью 21 сутки. Цисплатин в дозе 100 мг/м<sup>2 </sup>вводят внутривенно после введения продукта Gemzar в 1 сутки.
Терапевтический агент
Доза/введение/состав
Карбоплатин (продукт Paraplatin)
Внутривенно
Лечение одним агентом: 360 мг/м<sup>2 </sup>внутривенно в 1 сутки (инфузия в течение 15 мин или более) Другие подсчеты доз: комбинированное лечение с циклофосфамидом, Рекомендации по корректировки доз, формула дозирования и др.
Раз в 4 недели
Ифозамид (продукт Ifex)
Внутривенно
Ежедневно 1,2 г/м
5 последовательных суток. Повторяют раз в 3 недели или после восстановления от гематологической токсичности.
Топотекан гидрохлорид (продукт Hycamtin)
Внутривенно
1,5 мг/м<sup>2</sup> вводят внутривенно инфузией в течение 30 мин ежедневно.
5 суток подряд, начиная с 1 суток курса длительностью 21 сутки.
Бисфосфанаты: памидронат алендронат ризедронат
Внутривенно или перорально вместе с 6-8 унциями воды
60 мг или 90 мг одна инфузия на протяжении 4-24 ч для коррекции гиперкальциемии у больных раком 5 мг/сутки ежедневно на протяжении 2 лет и затем 10 мг/сутки на протяжении 9 месяцев для предупреждения или контроля костной резорпции. 5,0 мг для предупреждения или контроля костной резорпции.
Терапевтический агент
Доза/введение/состав
Ловастатин (продукт Mevacor™)
Перорально
10-80 мг/сутки в виде одной дозы или указанное количество делят на две дозы
Настоящее изобретение также охватывает введение анти-ICOS моноклонального антитела в комбинации с лучевой терапией, включающее применение рентгеновских лучей, гамма лучей и других источников радиации для разрушения раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения радиационное лечение проводят в виде внутреннего пучка радиации или радиотерапии (дистанционной лучевой терапии), при которой радиация возникает из удаляемого источника. В других вариантах осуществления настоящего изобретения лечение радиацией проводят в виде внутренней терапии или брахитерапии (близкофокусной лучевой терапии), при которой радиоактивный источник помещают внутрь организма близко к раковым клеткам или массе опухоли.
е
Противораковая терапия и дозирование, способы введения и рекомендации по применению известны в данной области и были описаны, например, в кн.: «Physician's Desk Reference» 2002, 56 изд.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение также относится к иммунотерапевтическим композициям и способам лечения у людей заболеваний и расстройств, опосредованных Т-клетками, например, но ими перечень не ограничивается, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний или расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжение трансплантата и Т-клеточных пролиферативных расстройств у людей, используя терапевтические антитела, которые связываются с антигеном ICOS и опосредуют АЗКЦ человека.
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, включающим анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией IgG1 или IgG3 изотипа человека. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим анти-ICOS антитела человека или гуманизированные анти-ICOS антитела IgG2 или IgG4 изотипа человека, которые опосредуют АЗКЦ человека. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим моноклональные анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией, которые могут быть получены методами, известными в данной области.
Терапевтические составы и режимы описаны для лечения людей, у которых были диагностированы аутоиммунные заболевания, например, но ими перечень не ограничивается, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, иммунная тромботическая пурпура (ИТП), диабет, псориаз и реакции гиперчувствительности (например, аллергия, сенная лихорадка, астма и острый отек, вызванный реакциями гиперчувствительности типа I). Настоящее изобретение также относится к составам и режимам лечения людей, у которых диагностированы хронические воспалительные заболевания, например, но ими перечень не ограничивается, воспалительная болезнь кишечника (болезнь Крона и язвенный колит), базедова болезнь, тиреоидит Хашимото и сахарный диабет.
Терапевтические составы и режимы описаны для лечения людей, у которых диагностированы Т-клеточные злокачественные заболевания, которые производны от ICOS-экспрессирующих Т-клеток и их предшественников.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела могут опосредовать АЗКЦ, комплементзависимую клеточную цитотоксичность или антителозависимый фагоцитоз. Композиции и способы настоящего изобретения также обладают преимуществом, заключающимся в нацеливании на узкую популяцию Т-клеток, в отличие от других иммунотерапии, направленных на Т-клетки. Например, анти-ICOS антитела по настоящему изобретению могут быть эффективны в отношении специфически нацеленных активированных Т-клеток, например, но ими перечень не ограничивается, активированных Т-клеток. Соответственно, способы и композиции по настоящему изобретению могут быть эффективны для снижения или истощения циркулирующих активированных CD4+ Т-клеток, а также активированных CD8+ Т-клеток.
Соответственно, в одном из объектов настоящего изобретения представлены композиции и способы лечения и предупреждения БТПХ и отторжения трансплантата, которые ассоциированы с меньшими и/или менее тяжелыми осложнениями по сравнению с менее нацеленными терапевтическими агентами и режимами. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в композициях и способах по настоящему изобретению используют пониженные дозы традиционных терапевтических агентов, которые были бы возможны при отсутствии способов и композиций по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления настоящего изобретения композиции и способы по настоящему изобретению избавлены от необходимости более тяжелой формы терапии, например, радиационной терапии, высокодозовой химиотерапии или спленэктомии.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела и композиции могут вводиться пациенту-реципиенту трансплантата до или после трансплантации, отдельно или в комбинации с другими терапевтическими агентами или режимами для лечения или предупреждения БТПХ и отторжения трансплантата. Например, анти-ICOS антитела и композиции могут применяться для истощения активированных Т-клеток от реципиента трансплантата до или после трансплантации аллогенного трансплантата. Анти-ICOS антитела и композиции также могут применяться для истощения активированных Т-клеток из трансплантата ex vivo, до трансплантации, или в организме донора, или в качестве профилактики БТПХ и отторжения трансплантата.
Фармацевтические формулы, введение и дозирование
Фармацевтическая составы по настоящему изобретению содержат в качестве действующего ингредиента анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией. Составы содержат «голое» антитело, иммуноконъюгат или гибридный белок в количестве, эффективном для получения требуемого ответа в единицах массы или объема, пригодных для введения больному человеку, и предпочтительно являются стерильными. Ответ может, например, измеряться путем определения физиологических эффектов композиции анти-ICOS антитела, например, но ими перечень не ограничивается, истощения Т-клеток, истощения ИЛ-17, регрессии Т-клеточной злокачественности или снижения проявления симптомов заболевания. Другие исследования могут быть известны специалистам в данной области и могут быть применены для измерения уровня ответа.
Фармацевтические составы
Композиция, включающая анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией, может быть переработано с фармацевтически приемлемым носителем. Понятие «фармацевтически приемлемый» означает один или несколько нетоксических материалов, которые не влияют на эффективность биологического действия действующих ингредиентов. Такие препараты обычно могут содержать соли, буферные агенты, консерванты, совместимые носители и необязательно другие терапевтические агенты. Такие фармацевтически приемлемые препараты также обычно могут содержать совместимые твердые и жидкие наполнители, разбавители или инкапсулированные вещества, которые применимы для введения человеку. При использовании в медицине соли могут быть фармацевтически приемлемыми, но соли, не являющиеся фармацевтически приемлемыми, могут также применяться для приготовления их фармацевтически приемлемых солей и входят в рамки охвата настоящего изобретения. Такие фармакологически и фармацевтически приемлемые соли включают, но ими не ограничиваются, соли, приготовленные из следующих кислот: хлористоводородной, бромистоводородной, серной, азотной, фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, лимонной, борной, муравьиной, малоновой, янтарной и других. Фармацевтически приемлемые соли также могут быть приготовлены в виде солей щелочных металлов или солей щелочноземельных металлов, например, натрия, калия или кальция. Понятие «носитель» относится к органическим или неорганическим ингредиентам, природным или синтетическим, с которыми действующий ингредиент объединяют для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также способны смешиваться с антителами по настоящему изобретению и друг с другом таким образом, что не возникает взаимодействия, которое могло бы существенно ослабить требуемую фармацевтическую эффективность.
Согласно некоторым объектам настоящего изобретения композиции анти-ICOS антител могут быть приготовлены для хранения путем смешивания антитела или иммуноконъюгата, обладающего требуемой степенью чистоты, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1999, под ред. A. Osol, 16-е изд.) в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Соответствующие носители, эксципиенты или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферы, например, гистидиновый, фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот, к антиоксидантам относятся аскорбиновая кислота и метионин, консерванты (например, октадецилдиметилбензил аммоний хлорид, гексаметоний хлорид, бензалконий хлорид, бензетоний хлорид, фенол, бутил или бензиловый спирт, алкилпарабены, например, метиловый или пропиловый парабен, катехин, резорцин, циклогексанол, 3-пентанол, и m-крезол), низкомолекулярные полипептиды (примерно состоящие менее чем из 10 остатков), белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, например, поливинилпиролидон, аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая трегалозу, глюкозу, маннозу или декстрины, хелатирующие агенты, например, EDTA, сахара, например, сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит, формирующие соль противоионы, например, натрий, комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, например, твин, полисорбат 80, продукт PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Композиции анти-ICOS антител также могут необязательно включать соответствующие консерванты, например, бензалконий хлорид, хлорбутанол, парабены и тимерозол.
Композиции анти-ICOS антител обычно могут быть представлены в отдельной лекарственной форме и могут быть приготовлены с помощью какого-либо метода, известного в области фармацевтики. Все методы включают стадию привнесения действующего агента и сопряжение с носителем, который представляет один или несколько вспомогательных ингредиентов. В общем композиции анти-ICOS антител приготовляют путем однородного и непосредственного приведения действующего соединения в соприкосновение с жидким носителем, тонко измельченным твердым носителем и затем, при необходимости, приданием формы продукту.
Композиции, пригодные для парентерального введения, обычно включают стерильный водный или неводный препарат анти-ICOS антитела, который может быть изотоническим по отношению к крови реципиента. Такой препарат может быть переработан по известным методам, используя соответствующие диспергирующие или увлажняющие агенты и суспендирующие агенты. Стерильный инъекционный препарат также может быть стерильным инъекционным раствором или суспензией в нетоксическом разбавителе или растворителе, пригодном для парентерального введения, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Среди соответствующих растворителей может быть использована вода, раствор Рингера и изотонический раствор натрия хлорида. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно применяют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может применяться какое-либо обычное нелетучее масло в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели может применяться какое-либо обычное нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, например, олеиновая кислота, могут применяться в инъекционных составах. С составом носителя, пригодным для перорального, подкожного, внутривенного, внутримышечного и др. введения, можно ознакомиться в кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», изд-во Mack Publishing Co., Истон, Пенсильвания. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения состав носителя, пригодного для разных путей введения, может быть таким же или похожим на состав носителя, описанный для продукта RITUXAN™. См. кн.: «Physicians' Desk Reference», 2005, изд-во Medical Economics Company, Inc., Montvale, Нью-Джерси, cc.958-960 и 1354-1357, сущность которой включена в настоящее изобретение в виде ссылки. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции анти-ICOS антитела переработаны для внутривенного введения с натрием хлоридом, натрием цитратом дигидратом, полисорбатом 80 и стерильной водой, в которых рН композиции доведены до величины примерно 6,5. Специалистам в данной области известно, что внутривенная инъекция представляет полезную модель введения из-за быстрого распределения антител за счет кровообращения. Внутривенное введение, однако, имеет ограничения из-за сосудистого барьера, включающего эндотелиальные клетки сосудистой сети и субэндотелиального матрикса. Кроме того, сосудистый барьер является более важной проблемой для потребления терапевтических антител твердыми опухолями. Лимфомы имеют относительно высокие скорости тока крови, способствуя эффективной доставке антител. Внутрилимфатические пути введения, например, подкожной или внутримышечной инъекцией, или путем катетеризации лимфатических сосудов, также предусматривают полезные средства лечения заболеваний и расстройств, опосредованных Т-клетками. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции анти-ICOS антител и способы по настоящему изобретению представляют подкожное само введение. В таких вариантах осуществления композиции перерабатывают в виде лиофилизированного лекарственного средства или жидкого буфера (например, гистидинового буфера, ФСБ, цитрата) в концентрации примерно 50 мг/мл.
Состав по настоящему изобретению также может включать более одного действующего соединения, что требуется для определенного показания к лечению, предпочтительно такие соединения обладают сочетающимися действиями и не влияют отрицательно друг на друга. Например, может потребоваться дополнительно ввести иммуносупрессирующий агент. Такие молекулы соответствующим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для назначенной цели.
Действующие ингредиенты также могут быть заключены в приготовленные микрокапсулы, например, методами коацервации или полимеризации на разделе сред, например, гидроксиметилцеллюлозы или желатиновых микрокапсул и поли(метакрилатных) микрокапсул, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросфер, микроэмульсий, нано-частиц и нанокапсул) или в макроэмульсиях. Такие методы описаны в кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1980, под ред. A. Osol, 16-е изд.
Используемые составы для введения in vivo обычно стерильны. Это легко достигается фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны.
Могут быть приготовлены препараты устойчивого высвобождения. К соответствующим примерам препаратов устойчивого высвобождения относятся полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих анти-ICOS антитело, причем матрицы имеют определенную форму частиц, например, форму пленок или микрокапсул. К примерам матриц устойчивого высвобождения относятся полиэфиры, гидрогели, (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый спирт), полилактиды (US 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, нераспадающийся этиленвинилацетат, распадающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, например, продукт LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролидацетат) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляная кислота. Если полимеры, например, этиленвинилацетат и сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты способны высвобождать молекулы на протяжении более 100 суток, некоторые гидрогели высвобождают белки за более короткое время. Если инкапсулированные антитела остаются в организме длительное время, они могут денатурироваться или агрегировать в результате воздействия влажности при 37°C, приводя к потере биологической активности и возможному изменению иммуногенности. Рациональные стратегии могут быть созданы для стабилизации в зависимости от вовлеченного механизма. Например, если установлено, что механизм агрегирования представляет формирование межмолекулярных связей S-S через тио-дисульфидное перемещение, стабилизация может быть достигнута путем модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контроля содержания влажности, используя соответствующие добавки и создавая специфические полимерные матричные композиции. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтически приемлемые носители, используемые в композициях по настоящему изобретению, не влияют на АЗКЦ или КЗЦ человека.
Композиции анти-ICOS антител, описанные в настоящем изобретении, могут также быть переработаны в виде иммунолипосом. Понятие «липосома» означает маленьких шарик, состоящий из разных типов липидов, фосфолипидов и/или поверхностно-активного вещества, применимых для доставки лекарственного средства (например, описанных выше анти-ICOS антител) в организме человека. Компоненты липосом обычно собраны в двухслойную структуру, схожую с липидной сборкой биологических мембран. Липосомы, содержащие антитела по настоящему изобретению, получают способами, известными в данной области, например, описанными в работах Epstein и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1985, с.3688, Hwang и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с.4030, US 4485045 и 4544545. Липосомы с повышенным временем циркулирования описаны в US 5013556. Особенно полезные липосомы могут быть получены методом упаривания с обратной фазой с липидной композицией, включающей фосфатидилхолин, холестерин и ПЭГ-производное фосфатидилэтаноламина (ПЭГ-ФЭ). Липосомы пропускают через фильтры с определенным размером пор для получения липосом требуемого диаметра. Антитело по настоящему изобретению может быть соединено с липосомами, согласно описанию в работе Martin и др., J. Biol. Chem., 257, 1982, cc.286-288, через реакцию взаимодействия через дисульфидную связь. Терапевтический агент также может быть помещен в липосомы. См. Gabizon и др., J. National Можетcer Inst., 19, 1989, с.1484.
Некоторые из фармацевтических составов включают, но ими не ограничиваются:
(а) стерильный без консервантов жидкий концентрат для внутривенного введения анти-ICOS антитела, поставляемого в концентрации 10 мг/мл или в 100 мг (10 мл), или в 500 мг (50 мл) одноразовых ампулах. Продукт может быть переработан для внутривенного введения, используя натрий хлорид, натрий цитрат дигидрат, полисорбат и стерильную воду для инъекций. Например, продукт может быть переработан в 9,0 мг/мл натрий хлориде, 7,35 мг/мл натрий цитрат дигидрате, 0,7 мг/мл полисорбате 80 и стерильной воде для инъекций. Величину рН доводят до 6,5.
(б) Стерильный лиофилизированный порошок в одноразовых стеклянных ампулах для подкожной инъекции. Продукт может быть переработан с сахарозой, L-гистидин гидрохлорид моногидратом, L-гистидином и полисорбатом 20. Например, каждая одноразовая ампула может содержать 150 мг анти-ICOS антитела, 123,2 мг сахарозы, 6,8 мг L-гистидин гидрохлорид моногидрата, 4,3 мг L-гистидина и 3 мг полисорбата 20. Восстановление одноразовых ампул стерильной водой для инъекций в количестве 1,3 мл образует примерно 1,5 мл раствора для доставки 125 мг в 1,25 мл (100 мг/мл) антитела.
(в) Стерильный без консерванта лиофилизированный порошок для внутривенного введения. Продукт может быть переработан с α-трегалозой дигидратом, L-гистидином хлоридом, гистидином и полисорбатом 20 USP. Например, каждая ампула может содержать 440 мг анти-ICOS антитела, 400 мг α,α-трегалозы дигидрата, 9,9 мг L-гистидина гидрохлорида, 6,4 мг L-гистидина и 1,8 мг полисорбата 20, USP. Восстановление проводят с помощью 20 мл бактериостатической воды для инъекций (БВДИ), USP, содержащей 1,1% бензилового спирта в качестве консерванта, с получением многодозового раствора, содержащего 21 мг/мл антитела при примерной величине рН 6.
(г) Стерильный лиофилизированный порошок для внутривенной инфузии, в котором анти-ICOS антитело перерабатывают с сахарозой, полисорбатом, моноосновным натрием фосфатом моногидратом и двухосновным натрием фостатом дигидратом. Например, каждая одноразовая ампула может содержать 100 мг антитела, 500 мг сахарозы, 0,5 мг полисорбата 80, 2,2 мг моноосновного натрия фосфата моногидрата и 6,1 мг двухосновного натрия фосфата дигидрата. Консерванты отсутствуют. Последующее восстановление с помощью 10 мл стерильной воды для инъекций, USP, приводит к величине рН, которая составляет величину примерно 7,2.
(д) Стерильный без консервантов раствор для подкожного введения, помещенный в одноразовый объемом 1 мл, заранее наполненный фильтр. Продукт может быть переработан с натрием хлоридом, моноосновным натрием фосфатом дигидратом, двухосновным натрием фосфатом дигидратом, натрием цитратом, лимонной кислотой моногидратом, маннитом, полисорбатом 80 и водой для инъекций, USP. Натрий гидроксид может быть добавлен для доведения рН примерно до величины 5,2.
Например, каждый шприц может быть переработан для высвобождения 0,8 мл (40 мг) лекарственного продукта. В каждой дозе объемом 0,8 мл содержится 40 мг анти-ICOS антитела, 4,93 мг натрия хлорида, 0,69 мг моноосновного натрия фосфата дигидрата, 1,22 мг двухосновного натрия фосфата дигидрата, 0,24 мг натрия цитрата, 1,04 лимонной кислоты моногидрата, 9,6 мг маннита, 0,8 мг полисорбата 80 и воду для инъекций, USP.
(е) Стерильный без консервантов лиофилизированный порошок, содержащейся в одноразовой ампуле, который восстанавливают стерильной водой для инъекций, USP, и вводят в виде подкожной инъекции. Продукт может быть переработан с сахарозой, гистидином гидрохлоридом моногидратом, L-гистидином и полисорбатом. Например, ампула на 75 мг может содержать 129,6 мг или 112,5 мг анти-ICOS антитела, 93,1 мг сахарозы, 1,8 мг L-гистидина гидрохлорида моногидрата, 1,2 мг L-гистидина и 0,3 мг полисорбата 20, и рассчитана для высвобождения 75 мг антитела в 0,6 мл после восстановления 0,9 мл стерильной воды для инъекций, USP. Ампула на 150 мг может содержать 202,5 мг или 175 мг анти-ICOS антитела, 145,5 мг сахарозы, 2,8 мг L-гистидина гидрохлорида моногидрата, 1,8 мг L-гистидина и 0,5 мг полисорбата 20, и рассчитана для высвобождения 150 мг антитела в 1,2 мл после восстановления 1,4 мл стерильной воды для инъекций, USP.
(ж) Стерильный лиофилизированный продукт для восстановления стерильной водой для инъекций. Продукт может быть переработан в ампулы одноразового применения для внутримышечной инъекции, используя маннит, гистидин и глицин. Например, каждая одноразовая ампула может содержать 100 мг анти-ICOS антитела, 67,5 мг маннита, 8,7 мг гистидина и 0,3 мг глицина, и рассчитана для высвобождения 100 мг антитела в 1,0 мл после восстановления 1,0 мл стерильной воды для инъекций. В другом примере каждая одноразовая ампула может включать 50 мг анти-ICOS антитела, 40,5 мг маннита, 5,2 мг гистидина и 0,2 мг глицина и рассчитана для высвобождения 50 мг антитела после восстановления 0,6 мл стерильной воды для инъекций.
(з) Стерильный без консервантов раствор для внутримышечной инъекции, приготовленный в концентрации 100 мг/мл. Продукт может быть переработан в одноразовой ампуле с гистидином, глицином и стерильной водой для инъекций. Например, каждая одноразовая ампула может быть переработана со 100 мг антитела, 4,7 мг гистидина и 0,1 мг глицина в объеме 1,2 мл из расчета высвобождения 100 мг антитела в 1 мл. В качестве другого примера каждая одноразовая ампула может быть переработана с 50 мг антитела, 2,7 мг гистидина и 0,08 мг глицина в объеме 0,7 мл или 0,5 мл и рассчитана для высвобождения 50 мг антитела в 0,5 мл.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению стабильна при 4°C. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению стабильна при комнатной температуре.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения жидкий состав по настоящему изобретению является водным составом. В другом варианте осуществления настоящего изобретения жидкий состав по настоящему изобретению является водным составом, причем водным носителем является дистиллированная вода.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению является стерильным. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению является гомогенным. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению является изотоническим.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 1 мг/мл, по меньшей мере примерно 5 мг/мл, по меньшей мере примерно 10 мг/мл, по меньшей мере примерно 20 мг/мл, по меньшей мере примерно 30 мг/мл, по меньшей мере примерно 40 мг/мл, по меньшей мере примерно 50 мг/мл, по меньшей мере примерно 60 мг/мл, по меньшей мере примерно 70 мг/мл, по меньшей мере примерно 80 мг/мл, по меньшей мере примерно 90 мг/мл, по меньшей мере примерно 100 мг/мл, по меньшей мере примерно 110 мг/мл, по меньшей мере примерно 120 мг/мл, по меньшей мере примерно 130 мг/мл, по меньшей мере примерно 140 мг/мл, по меньшей мере примерно 150 мг/мл, по меньшей мере примерно 160 мг/мл, по меньшей мере примерно 170 мг/мл, по меньшей мере примерно 180 мг/мл, по меньшей мере примерно 190 мг/мл, по меньшей мере примерно 200 мг/мл, или по меньшей мере примерно 300 мг/мл анти-ICOS антитела или его фрагмента.
Необязательно составы по настоящему изобретению могут включать обычные эксципиенты и/или добавки, например, буферные агенты, сахариды, соли и поверхностно активные агенты. Дополнительно или в другом варианте составы по настоящему изобретению могут дополнительно включать обычные эксципиенты и/или добавки, например, разбавители, растворители, связующие агенты, стабилизирующие агенты, соли, липофильные растворители, аминокислоты, хелатирующие агенты, консерванты или др.
2
2
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения буферный агент выбран из группы, состоящей из гистидина, цитрата, фосфата, глицина и ацетата. В другом варианте осуществления настоящего изобретения эксципиент сахарид выбран из группы, состоящей из трегалозы, сахарозы, маннита, мальтозы и раффинозы. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения поверхностно активный агент выбран из группы, состоящей из полисорбата 20, полисорбата 40, полисорбата 80 и плюроник F68. В другом варианте осуществления настоящего изобретения соль выбрана из группы, состоящей из NaCl, KCl, MgCl и CaCl.
Необязательно составы по настоящему изобретению могут дополнительно включать другие известные вспомогательные компоненты, например, но ими перечень не ограничивается, соответствующие эксципиенты, полиолы, растворители, разбавители, связующие агенты, стабилизирующие агенты, липофильные растворители, хелаторы, консерванты или др.
Составы по настоящему изобретению включают буферный или рН регулирующий агент для обеспечения улучшенного контроля рН. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению имеет величину рН примерно от 3,0 и примерно до 9,0, примерно от 4,0 и примерно до 8,0, примерно от 5,0 и примерно до 8,0, примерно от 5,0 и примерно до 7,0, примерно от 5,0 и примерно до 6,5, примерно от 5,5 и примерно до 8,0, примерно от 5,5 и примерно до 7,0 или примерно от 5,5 и примерно до 6,5. В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению имеет рН примерно 3,0, примерно 3,5, примерно 4,0, примерно 4,5, примерно 5,0, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, примерно 5,5, примерно 5,6, примерно 5,7, примерно 5,8, примерно 5,9, примерно 6,0, примерно 6,1, примерно 6,2, примерно 6,3, примерно 6,4, примерно 6,5, примерно 6,6, примерно 6,7, примерно 6,8, примерно 6,9, примерно 7,0, примерно 7,5, примерно 8,0, примерно 8,5 или примерно 9,0. В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению имеет рН примерно 6,0.
Величина рН состава обычно не может быть равна изоэлектрической точке определенного антитела (включая фрагмент антитела), применяемого в составе (например, но ими перечень не ограничивается, изоэлектрические точки 13Н5, 13Н7 или 7Н9), и может варьировать примерно от 4,0 до примерно 8,0, или может варьировать примерно от 5,5 до примерно 6,5.
е
Обычно буферным агентом является соль, приготовленная из органической или неорганической кислоты или основания. К представителям буферных агентов относятся, но ими не ограничиваются, соли органических кислот, например, соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, угольной кислоты, винной кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; трис, трометамин гидрохлорид или фосфатные буферы. Кроме того, аминокислотные компоненты также могут влиять на буферную емкость. К примерам аминокислотных компонентов, которые могут применяться в составах по настоящему изобретению в качестве буферных агентов, относятся, но ими не ограничиваются, глицин и гистидин. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения буферный агент выбран из группы, состоящей из гистидина, цитрата, фосфата, глицина и ацетата. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения буферным агентом является гистидин. В другом варианте осуществления настоящего изобретения буферным агентом является цитрат. Чистота буферного агента должна составлять по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5%. В контексте настоящего изобретения, понятие «чистота» применительно к гистидину относится к химически чистому гистидину и используется в настоящей области, например, согласно описанию в кн.: «The Merck Index», 2001, под ред. O'Neil и др., фирма Merck & Co., 13 изд.
Буферные агенты обычно используют в концентрациях примерно от 1 мМ и примерно до 200 мМ или в каких-либо диапазонах и величинах, в зависимости от требуемой ионной силы и буферной емкости. С обычными концентрациями традиционных буферных агентов, применяемых в составах для парентерального введения, можно ознакомиться в кн.: «Pharmaceuticals Dosage Form: Parenteral Medications», 2-е изд., т.1, глава 5, с.194, таблица 5: «Commonly used additives in Parenteral Products (Обычно используемые добавки в продуктах для парентерального введения)». В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает буферный агент. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный буферный агент выбирают из группы, состоящей из гистидина, цитрата, фосфата, глицина и ацетата. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает гистидин в качестве буферного агента. В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает нитратный буфер.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 1 мМ, по меньшей мере примерно 5 мМ, по меньшей мере примерно 10 мМ, по меньшей мере примерно 20 мМ, по меньшей мере примерно 30 мМ, по меньшей мере примерно 40 мМ, по меньшей мере примерно 50 мМ, по меньшей мере примерно 75 мМ, по меньшей мере примерно 100 мМ, по меньшей мере примерно 150 мМ или по меньшей мере примерно 200 мМ буферного агента.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения составы по настоящему изобретению включают углеводный эксципиент. Углеводные эксципиенты могут действовать, например, в качестве агентов повышения вязкости, стабилизаторов, агентов, создающих объем, агентов для растворения и/или др. Углеводородные эксципиенты обычно составляют примерно от 1% до примерно 99% по массе или объему. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения углеводный эксципиент содержится в концентрации примерно от 0,1% до примерно 20%. В другом варианте осуществления настоящего изобретения углеводный эксципиент содержится в концентрации примерно от 0,1% до примерно 15%. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения углеводный эксципиент содержится в концентрации примерно от 0,1% до примерно 5%, или примерно от 1% до примерно 20%, или примерно от 5% до примерно 15%, или примерно от 8% до примерно 10%, или примерно от 10% и примерно до 15%, или примерно от 15% и примерно до 20%. В другом варианте осуществления настоящего изобретения углеводный эксципиент содержится в концентрации примерно от 0,1% до 20%, или от 5% до 15%, или от 8% до 10%, или от 10% и до 15%, или от 15% и до 20%. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения углеводный эксципиент составляет примерно от 0,1% до примерно 5%. В другом варианте осуществления настоящего изобретения углеводный эксципиент составляет примерно от 5% до примерно 10%. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения углеводный эксципиент составляет примерно от 15% до примерно 20%. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения углеводный эксципиент составляет до 1%, или до 1,5%, или до 2%, или до 2,5%, или до 3%, или до 4%, или до 5%, или до 10%, или до 15%, или до 20%.
Углеводные эксципиенты, применимые для составов по настоящему изобретению, включают, например, моносахариды, например, фруктозу, мальтозу, галактозу, глюкозу, D-маннозу, сорбозу и другие, дисахариды, например, лактозу, сахарозу, трегалозу, целлобиозу и др., полисахариды, например, раффинозу, мелезитозу, мальтдекстрины, декстраны, крахмалы и др., и альдиты, например, маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит) и др. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения углеводные эксципиенты для применения в настоящем изобретении выбраны из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, лактозы, маннита и раффинозы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения углеводным эксципиентом является трегалоза. В другом варианте осуществления настоящего изобретения углеводным эксципиентом является маннит. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения углеводным эксципиентом является сахароза. В другом варианте осуществления настоящего изобретения углеводным эксципиентом является раффиноза. Чистота углеводного эксципиента должна составлять по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, или по меньшей мере 99,5%.
2
2
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает эксципиент. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает по меньшей мере один эксципиент, выбранный из группы, состоящей из: сахара, соли, поверхностно активного вещества, аминокислоты, полиола, хелатирующего агента, эмульсификатора и консерванта. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает а соль. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает соль, выбранную из группы, состоящей из: NaCl, KCl, CaCl и MgCl. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает NaCl.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 10 мМ, по меньшей мере примерно 25 мМ, по меньшей мере примерно 50 мМ, по меньшей мере примерно 75 мМ, по меньшей мере примерно 100 мМ, по меньшей мере примерно 125 мМ, по меньшей мере примерно 150 мМ, по меньшей мере примерно 175 мМ, по меньшей мере примерно 200 мМ, или по меньшей мере примерно 300 мМ натрия хлорида.
Составы по настоящему изобретению могут дополнительно включать поверхностно активное вещество. Понятие «поверхностно активное вещество» в контексте настоящего изобретения относится к органическим веществам с амфипатическими структурами, а именно, они состоят из групп с противоположными тенденциями к растворимости, обычно из растворимой в масле углеводородной цепи и водорастворимой ионной группы. Поверхностно активные вещества могут быть классифицированы в зависимости от заряда поверхностно активной части молекулы в анионных, катионных и неионных поверхностно активных веществах. Поверхностно активные вещества часто используют в качестве увлажняющих, эмульгирующих, растворяющих и диспергирующих агентов для различных фармацевтических композиций и препаратов из биологических материалов. Фармацевтически приемлемые поверхностно активные вещества, например, полисорбаты (например, полисорбаты 20 или 80), полиоксамеры (например, полоксамер 188), тритон, натрий октилгликозид, лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-сульфобетаин, лаурил-, миристил-, линолеил- или стеарил-саркозин, лаурил-, миристил- или цетил-бетаин, лауроамидопропил-, кокамидопропил-, линолеамидопропил-, миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-бетаин (например, лауроамидопропил), миристамидопропил-, пальмидопропил- или изостеарамидопропил-диметиламин, натрий метилкокоил- или динатрий метилолеилтаурат и серии продукта MONAQUA.TM. (фирма Mona Industries, Inc., Паттерсон, Нью-Джерси), полиэтилгликоль, полипропилгликоль и сополимеры этилен- и пропиленгликоля (например, плюроники, PF68 и др.), могут необязательно добавляться в составы по настоящему изобретению для снижения агрегирования. Поверхностно активные вещества особенно применимы, если используют для введения состава насос или пластиковый контейнер. Наличие фармацевтически приемлемого поверхностно активного вещества смягчает склонность белка к агрегированию. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения составы по настоящему изобретению включают полисорбат, который содержится в концентрации, варьирующей примерно от 0,001% до примерно 1%, или примерно от 0,001% до примерно 0,1%, или примерно от 0,01% до примерно 0,1%. В других специфических вариантах осуществления настоящего изобретения составы по настоящему изобретению включают полисорбат в концентрации 0,001%, или 0,002%, или 0,003%, или 0,004%, или 0,005%, или 0,006%, или 0,007%, или 0,008%, или 0,009%, или 0,01%, или 0,015%, или 0,02%. В другом варианте осуществления настоящего изобретения полисорбатом является полисорбат-80.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает поверхностно активное вещество. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 или полисорбат 80. В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает полисорбат 80.
Необязательно составы по настоящему изобретению могут дополнительно включать другие распространенные эксципиенты и/или добавки, включая, но ими не ограничиваясь, разбавители, связующие, стабилизаторы, липофильные растворители, консерванты, адъюванты и др. Фармацевтически приемлемые эксципиенты и/или добавки могут применяться в составах по настоящему изобретению. Обычно используемые эксципиенты/добавки, например, фармацевтически приемлемые хелаторы (например, ими перечень не ограничивается, EDTA, DTPA или EGTA), необязательно могут быть добавлены в составы по настоящему изобретению для понижения агрегирования. Такие добавки предпочтительно используют, если для введения состава используют насос или пластиковый контейнер.
Консерванты, например, фенол, m-крезол, p-крезол, o-крезол, хлоркрезол, бензиловый спирт, фенилмеркурнитрит, феноксиэтанол, формальдегид, хлорбутанол, магний хлорид (например, гексагидрат, но не только), алкилпарабен (метил, этил, пропил, бутил и др.), бензалконий хлорид, бензетоний хлорид, натрий дегидроацетат и тимерозол или их смеси необязательно могут быть добавлены в составы по настоящему изобретению в какой-либо соответствующей концентрации, например, примерно от 0,001% до примерно 5%, или в каком-либо их диапазоне или величине. Концентрация консерванта, используемого в составах по настоящему изобретению, является концентрацией, достаточной для получения микробиологического эффекта. Такие концентрации зависят от консерванта, выбранного и легко определяемого специалистом.
Другие рассматриваемые эксципиенты/добавки, которые могут применяться в составах по настоящему изобретению, включают, например, ароматизирующие агенты, антимикробные агенты, подсластители, антиоксиданты, антистатические агенты, липиды, например, фосфолипиды или жирные кислоты, стериоды, например, холестерин, белковые эксципиенты, например, сывороточный альбумин (сывороточный альбумин человека (human serum albumin - HAS), рекомбинантный альбумин человека (recombinant human albumin - rHA)), желатин, казеин, формирующие соли противоионы, например, натрий и др. Эти и дополнительные известные фармацевтические эксципиенты и/или добавки, применимые для использования в составах по настоящему изобретению, известны в данной области, например, перечислены в кн.: «Remington: The Science & Practice of Pharmacy», 2005, 21-е изд., изд-во Lippincott Williams & Wilkins, и в кн.: «Physician's Desk Reference», 2005, 60-е изд., изд-во Medical Economics, Montvale, Нью-Джерси. Фармацевтически приемлемые носители могут быть обычным образом выбраны так, чтобы они были пригодны для способа введения, растворимости и/или стабильности варианта белка Fc, что известно в данной области или описано в настоящем изобретении.
Специалисты в данной области должны учитывать, что составы по настоящему изобретению могут быть изотоническими по отношению к крови человека, и что составы по настоящему изобретению имеют в значительной степени такое же осмотическое давление, что и кровь человека. Такие изотонические составы обычно могут иметь осмотическое давление примерно от 250 мОсмол до примерно 350 мОсмол. Изотоничность может быть измерена, например, используя типы осмометров, основанные на давлении пара или замораживания льда. Тоничность состава доводят путем применения модификаторов тоничности. Понятие «модификаторы тоничности» относится к тем фармацевтически приемлемым инертным веществам, которые могут быть добавлены в состав для обеспечения изотоничности состава. Модификаторы тоничности, применимые в настоящем изобретении, включают, но ими не ограничиваются, сахариды, соли и аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения составы настоящего изобретения имеют осмотическое давление примерно от 100 мОсмол до примерно 1200 мОсмол, или примерно от 200 мОсмол до примерно 1000 мОсмол, или примерно от 200 мОсмол до примерно 800 мОсмол, или примерно от 200 мОсмол до примерно 600 мОсмол, или примерно от 250 мОсмол до примерно 500 мОсмол, или примерно от 250 мОсмол до примерно 400 мОсмол, или примерно от 250 мОсмол до примерно 350 мОсмол.
Концентрация какого-либо компонента или какой-либо комбинации различных компонентов составов по настоящему изобретению подобрана таким образом, чтобы достичь желаемой тоничности конечного состава. Например, соотношение углеводного эксципиента и антитела может быть изменено, исходя из способов, известных в данной области (например, US 6685940). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения молярное соотношение углеводного эксципиента и антитела может быть примерно от 100 молей до примерно 1000 молей углеводного эксципиента примерно к 1 молю антитела, или примерно от 200 молей до примерно 6000 молей углеводного эксципиента к примерно 1 молю антитела, или примерно от 100 молей до примерно 510 молей углеводного эксципиента к примерно 1 молю антитела, или примерно от 100 молей до примерно 600 молей углеводного эксципиента к примерно 1 молю антитела.
2
2
2
Требуемая изотоничность конечного раствора также может быть достигнута подбором концентрации соли в растворе. Соли, которые фармацевтически приемлемы и применимы в настоящем изобретении в качестве модификаторов тоничности, включают, но ими не ограничиваются, натрий хлорид, натрий сукцинат, натрий сульфат, калий хлорид, магний хлорид, магний сульфат и кальций хлорид. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения составы по настоящему изобретению включают NaCl, MgCl и/или CaCl. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения концентрация NaCl составляет примерно от 75 мМ и примерно до 150 мМ. В другом варианте осуществления настоящего изобретения концентрация MgCl составляет примерно от 1 мМ и примерно до 100 мМ. К аминокислотам, которые фармацевтически приемлемы и применимы в настоящем изобретении в качестве модификаторов тоничности, относятся, но ими не ограничиваются, пролин, аланин, L-аргинин, аспарагин, L-аспарагиновая кислота, глицин, серии, лизин и гистидин.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения составы по настоящему изобретению не содержат пирогенов, которые в значительной степени свободны от эндотоксинов и/или родственных пирогенных веществ. К эндотоксинам относятся токсины, которые замкнуты внутри микроорганизма и высвобождаются, только когда микроорганизмы разрушаются или погибают. К пирогенным веществам также относятся вызывающие лихорадку термостабильные вещества (гликопротеины) с внешней мембраны бактерий и других микроорганизмов. Все эти вещества могут вызвать лихорадку, гипотонию и шок при введении людям. Из-за возможных вредных воздействий даже небольшие количества эндотоксинов должны быть удалены из вводимых внутривенно растворов фармацевтических лекарственных средств. Управление по контролю за продуктами и лекарствами США (Food and Drug Administration - FDA) установило верхний предел в 5 единиц эндотоксина (endotoxin units - EU) на дозу на кг массы тела на протяжении 1 ч для внутривенных введений лекарственных средств (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1), 2000, с.223). Если терапевтические белки вводят в количестве нескольких сотен или тысяч миллиграмм на 1 кг массы тела, что может быть в случае введения антитела, даже следовые количества вредных и опасных элементов должны быть удалены. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения уровни эндотоксина и пирогенна в композиции менее 10 EU/мг, или менее 5 EU/мг, или менее 1 EU/мг, или менее 0,1 EU/мг, или менее 0,01 EU/мг, или менее 0,001 EU/мг.
е
Для введения in vivo составы по настоящему изобретению должны быть стерильными. Составы по настоящему изобретению могут быть стерилизованы разными методами стерилизации, включая стерилизующую фильтрацию, радиацию и др. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав с антителом стерилизуют фильтрацией через заранее простерилизованный фильтр с порами размером 0,22 мкм. Стерильные композиции для инъекций могут быть переработаны в соответствии с традиционной фармацевтической практикой согласно описанию в кн.: «Remington: The Science & Practice of Pharmacy», 2005, 21 изд., изд-во Lippincott Williams & Wilkins. Составы, включающие антитела, например, описанные в настоящем изобретении, обычно хранят в лиофилизированной форме или в растворе. Рассчитывают таким образом, чтобы стерильные композиции, включающие антитела, помещать в контейнер, имеющий стерильный порт для входа, например, в емкость или ампулу для внутривенного раствора с адаптером, который позволяет извлекать содержимое, например, ограничитель, проницаемый для подкожной инъекционной иглы.
Понятия «стабильность» и «стабильный» в контексте настоящего изобретения относятся к составу, включающему анти-ICOS антитело по настоящему изобретению, который обеспечивает устойчивость антитела в составе к агрегации, разрушению или фрагментации в условиях конкретного производства, приготовления, транспортировки и хранения. «Стабильные» составы по настоящему изобретению сохраняют биологическое действие в условиях конкретного производства, приготовления, транспортировки и хранения. Стабильность указанного антитела может быть оценена по степени агрегации, разрушения или фрагментации, которые измеряют с помощью HPSEC, статического светового рассеяния (static light scattering - SLS), инфракрасной спектроскопия на основе преобразования Фурье, циркулярного дихроизма, методами развертывания с применением мочевины, по свойственной триптофану флуоресценции, дифференциальной сканирующей калориметрии и/или методов, соответствующих Американскому национальному стандарту (American National Standard - ANS), при сравнении к контрольным составом. Например, контрольный состав может быть стандартом, замороженным при -70°C, включающим 10 мг/мл анти-ICOS антитела по настоящему изобретению в ФСБ. Общая стабильность состава, включающего анти-ICOS антитело по настоящему изобретению, может быть оценена различными методами, включая, например, метод ELISA, радиоиммунный анализ и анализ АЗКЦ. Общая стабильность состава, включающего анти-ICOS антитело по настоящему изобретению, может быть оценена методами in vivo, включая, например, методы истощения in vivo.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает анти-ICOS антитело. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению понижает агрегирование анти-ICOS антитела или его фрагмента. В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению понижает фрагментацию анти-ICOS антитела или его фрагмента. В другом варианте осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению понижает деамидирование анти-ICOS антитела или его фрагмента.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает анти-ICOS антитело по настоящему изобретению и стабилен при хранении примерно при 40°C в течение, по меньшей мере примерно 1 недели, по меньшей мере примерно 2 недель, по меньшей мере примерно 3 недель или по меньшей мере примерно 4 недель. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению стабилен при хранении примерно при 40°C в течение по меньшей мере примерно 1 месяца, по меньшей мере примерно 2 месяцев, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 4 месяцев, по меньшей мере примерно 5 месяцев или по меньшей мере примерно 6 месяцев.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает анти-ICOS антитело по настоящему изобретению и является стабильным при хранении примерно при 5°C в течение, по меньшей мере примерно 1 месяца, по меньшей мере примерно 2 месяцев, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 4 месяцев, по меньшей мере примерно 5 месяцев, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 7 месяцев, по меньшей мере примерно 8 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 10 месяцев, по меньшей мере примерно 11 месяцев или по меньшей мере примерно 12 месяцев. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению стабилен при хранении примерно при 5°C в течение по меньшей мере примерно 1 года, по меньшей мере примерно 2 лет, по меньшей мере примерно 3 лет, по меньшей мере примерно 4 лет, по меньшей мере примерно 5 лет, по меньшей мере примерно 6 лет, по меньшей мере примерно 7 лет, по меньшей мере примерно 8 лет, по меньшей мере примерно 9 лет, по меньшей мере примерно 10 лет, по меньшей мере примерно 11 лет или по меньшей мере примерно 12 лет.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает, по меньшей мере примерно 50 мг/мл анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, причем состав стабилен при хранении примерно при 40°C в течение, по меньшей мере примерно 1 недели, по меньшей мере примерно 2 недель, по меньшей мере примерно 3 недель, по меньшей мере примерно 4 недель, по меньшей мере примерно 2 месяцев, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 4 месяцев, по меньшей мере примерно 5 месяцев или по меньшей мере примерно 6 месяцев.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 50 мг/мл анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, причем состав стабилен при хранении примерно при 5°C в течение по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 7 месяцев, по меньшей мере примерно 8 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 1 года, по меньшей мере примерно 2 лет или по меньшей мере примерно 3 лет.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 100 мг/мл анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, причем состав стабилен при хранении примерно при 40°C в течение, по меньшей мере примерно 1 недели, по меньшей мере примерно 2 недель, по меньшей мере примерно 3 недель, по меньшей мере примерно 4 недель, по меньшей мере примерно 2 месяцев, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 4 месяцев, по меньшей мере примерно 5 месяцев, или по меньшей мере примерно 6 месяцев.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает, по меньшей мере примерно 100 мг/мл анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, причем состав стабилен при хранении примерно при 5°C в течение, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 7 месяцев, по меньшей мере примерно 8 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 1 года, по меньшей мере примерно 2 лет, или по меньшей мере примерно 3 лет.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает, по меньшей мере примерно 110 мг/мл анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, причем состав стабилен при хранении примерно при 40°C в течение, по меньшей мере примерно 1 недели, по меньшей мере примерно 2 недель, по меньшей мере примерно 3 недель, по меньшей мере примерно 4 недель, по меньшей мере примерно 2 месяцев, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 4 месяцев, по меньшей мере примерно 5 месяцев, или по меньшей мере примерно 6 месяцев.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает, по меньшей мере примерно 110 мг/мл анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, причем состав стабилен при хранении примерно при 5°C в течение, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 7 месяцев, по меньшей мере примерно 8 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 1 года, по меньшей мере примерно 2 лет или по меньшей мере примерно 3 лет.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 150 мг/мл анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, причем состав стабилен при хранении примерно при 40°C в течение, по меньшей мере примерно 1 недели, по меньшей мере примерно 2 недель, по меньшей мере примерно 3 недель, по меньшей мере примерно 4 недель, по меньшей мере примерно 2 месяцев, по меньшей мере примерно 3 месяцев, по меньшей мере примерно 4 месяцев, по меньшей мере примерно 5 месяцев или по меньшей мере примерно 6 месяцев.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения состав по настоящему изобретению включает по меньшей мере примерно 150 мг/мл анти-ICOS антитела, описанного в настоящем изобретении, причем состав стабилен при хранении примерно при 5°C в течение, по меньшей мере примерно 6 месяцев, по меньшей мере примерно 7 месяцев, по меньшей мере примерно 8 месяцев, по меньшей мере примерно 9 месяцев, по меньшей мере примерно 1 года, по меньшей мере примерно 2 лет или по меньшей мере примерно 3 лет.
Период полураспада антител
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения период полураспада анти-ICOS антитела в композициях и способах по настоящему изобретению составляет, по меньшей мере примерно 4-7 суток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения средний период полураспада анти-ICOS антитела в композициях и способах по настоящему изобретению составляет, по меньшей мере примерно 2-5 суток, 3-6 суток, 4-7 суток, 5-8 суток, 6-9 суток, 7-10 суток, 8-11 суток, 8-12, 9-13, 10-14, 11-15, 12-16, 13-17, 14-18, 15-19 или 16-20 суток. В других вариантах осуществления настоящего изобретения средний период полураспада анти-ICOS антитела в композициях и способах по настоящему изобретению составляет, по меньшей мере примерно 17-21 суток, 18-22 суток, 19-23 суток, 20-24 суток, 21-25, суток, 22-26 суток, 23-27 суток, 24-28 суток, 25-29 суток или 26-30 суток. В других вариантах осуществления настоящего изобретения период полураспада анти-ICOS антитела в композициях и способах по настоящему изобретению может составлять примерно до 50 суток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения период полураспада антител в композициях и способах по настоящему изобретению может быть пролонгирован методами, известными в данной области. Такое пролонгирование в свою очередь может понизить количество и/или частоту дизирования композиций с антителами. Антитела с улучшенными in vivo периодами полураспада и способы их получения описаны в US 6277375, WO 98/23289 и WO 97/3461.
Циркулирование в сыворотке анти-ICOS антител in vivo также может быть пролонгировано путем присоединения инертных полимерных молекул, например, высокомолекулярного полиэтиленгликоля (ПЭГ), к антителам с мультифункциональным линкером или без него, или через сайт-специфичную конъюгацию ПЭГ с N- или С-концом антитела или через эпсилон-аминогруппы, имеющиеся на остатках лизила. Может быть применено линейное или разветвленное производное, которое приводит к минимизации потери биологической активности. Степень конъюгирования может подвергаться тщательному мониторингу методами SDS-PAGE и масс-спектрометрии для подтверждения конъюгации молекул ПЭГ с антителами. Не вступивший в реакцию ПЭГ может быть отделен от конъюгатов антитело-ПЭГ с помощью эксклюзионной или ион-обменной хроматографии. ПЭГ-производные антител могут быть исследованы на способность связываться, а также на действие in vivo, используя методы, известные специалистам в данной области, например, иммуноанализ, описанный в настоящем изобретении.
Кроме того, антитела в композициях и способах по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с альбумином для получения более стабильного антитела in vivo или для продленного периода полураспада in vivo. Соответствующие методы известны в данной области, см., например, WO 93/15199, WO 93/15200, WO 01/77137 и 413 622, которые включены в настоящее изобретение в виде ссылок.
Кроме того, были описаны варианты области Fc, которые обеспечивают повышенный in vivo период полураспада антител (см. US US2003/0190311 A1). Рассматривают применение вариантов Fc с протяженным in vivo периодом полураспада в комбинации с композициями и способами настоящего изобретения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc с повышенным in vivo периодом полураспада. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области tfc, включающей по меньшей мере одно замещение аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из остатков 252, 254 и 256, причем положения аминокислотных остатков определяют по конвенции EU. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, включающей, по меньшей мере одно аминокислотное замещение, выбранное из группы, включающей M252Y, S254T и Т256Е, причем положения аминокислотных остатков определяют по конвенции EU. В другом варианте осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению включает вариант области Fc, включающей, по меньшей мере один аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из Y в положении 252, Т в положении 254 и Е в положении 256, причем положения аминокислотных остатков определяют по конвенции EU.
Введение и дозирование
Введение композиций по настоящему изобретению больному человеку может быть проведено каким-либо способом, включая, но ими не ограничиваясь, введение внутривенное, внутрикожное, чрескожное, подкожное, внутримышечное, ингаляционное (например, при применении аэрозоля), внутриротовое (например, помещение лекарства под язык), местное (т.е., через кожу и слизистые, в том числе через слизистую дыхательных путей), подоболочечное, внутрисуставное, множественное, внутримозговое, внутриартериальное, внутрибрюшинное, пероральное, внутрилимфатическое, внутриносовое, прямокишечное или вагинальное, введение перфузией через региональный катетер или прямой инъекцией в рану. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению вводят внутривенным впрыскиванием или внутривенной инфузией на протяжении определенного периода (например, 0,5-2 ч). Композиции по настоящему изобретению могут быть высвобождены средствами под давлением или в форме депо, хотя специалистам в данной области известно, что наиболее применимый способ введения в каждом конкретном случае может зависеть от ряда факторов, например, от возраста, пола и общего состояния субъекта, природы и тяжести состояния, подвергаемого лечению, и/или от природы определенной вводимой композиции (т.е., от дозы и состава). В одном из вариантов осуществления способ введения заключается в болюсной или непрерывной инфузии на протяжении определенного периода времени, один или два раза в неделю.
2
В других определенных вариантах осуществления настоящего изобретения способ введения заключается в подкожных инъекциях, необязательно один или два раза в неделю. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции и/или способы по настоящему изобретению вводят амбулаторно. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дозу композиции, включающей анти-ICOS антитело, выражают в мг/кг массы тела пациента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения дозу композиции, включающей анти-ICOS антитело, выражают в мг/кг массы тела пациента без учета массы жирового компонента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения дозу композиции, включающей анти-ICOS антитело, выражают в мг/м площади поверхности тела пациента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения дозу композиции, включающую анти-ICOS антитело, измеряют в мг на дозу, введенную пациенту. Какое-либо измерение дозы может применяться в сочетании с композициями и способами по настоящему изобретению и дозовые единицы могут быть преобразованы средствами, стандартными в данной области.
Специалистам в данной области очевидно, что дозы могут быть выбраны, основываясь на ряде факторов, включая возраст, пол, вид и состояние субъекта (например, стадию заболевания), требуемую степень клеточного истощения, болезнь, подвергаемую лечению, и/или используемое определенное антитело или антиген-связывающий фрагмент, и могут быть определены специалистами в данной области. Например, эффективные количества композиций по настоящему изобретению могут быть экстраполированы по кривым доза-ответ, полученным в тест-системах in vitro или по тест-системам животных моделей (например, с использованием хлопкового хомяка или обезьяны). Модели и способы оценки воздействий антитела известны в данной области (см. публикацию Wooldridge и др., Blood, 89(8), 1997, cc.2994-2998), сущность которой включена в настоящее изобретение в виде ссылки). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения для определенных форм злокачественных заболеваний, связанных с Т-клетками, экспрессирующими ICOS, стандартные терапевтические режимы в данной области, касающиеся лечения антителами, могут применяться с композициями и способами по настоящему изобретению.
К примерам режимов дозирования, которые могут использоваться в способах по настоящему изобретению, относятся, но ими перечень не ограничивается, ежедневное введение, введение три раза в неделю (прерывистое), раз в неделю или каждые 14 суток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения к режимам дозирования относятся, но ими не ограничиваются, дозирования раз в месяц или каждые 6-8 недель.
Для специалистов в данной области очевидно, что дозировки обычно выше и/или частота введения больше вначале лечения по сравнению с поддерживающими режимами лечения.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитела связываются с ICOS-экспрессирующими Т-клетками и могут привести к эффективному (т.е., при низкой дозе) истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток (по описанному в настоящем изобретении). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дозировки антитела (необязательно в фармацевтически приемлемом носителе в качестве части фармацевтической композиции) составляют по меньшей мере примерно 0,0005, 0,001, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25, 0,375, 0,5, 1, 2,5, 5, 10, 20, 37,5 или 50 мг/м и/или менее примерно 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 37,5, 20, 15, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,375, 0,1, 0,075 или 0,01 мг/м. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дозировка составляет примерно от 0,0005 до примерно 200 мг/м, примерно 0,001-150 мг/м, примерно 0,075-125 мг/м, примерно 0,375-100 мг/м, примерно 2,5-75 мг/м, примерно 10-75 мг/м и примерно 20-50 мг/м. В близких вариантах осуществления настоящего изобретения используемая доза анти-ICOS антитела составляет, по меньшей мере примерно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза используемого «голого» анти-ICOS антитела составляет по меньшей мере примерно 1-10, 5-15, 10-20 или 15-25 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения применяемая доза анти-ICOS антитела составляет, по меньшей мере примерно 1-20, 3-15 или 5-10 мг/кг мг/кг массы тела пациента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения доза применяемого анти-ICOS антитела составляет, по меньшей мере примерно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения единичная доза антитела (необязательно в фармацевтически приемлемом носителе в виде составляющей фармацевтической композиции) может быть равна по меньшей мере примерно 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248 или 250 мкг/м. В других вариантах осуществления настоящего изобретения дозу повышают до 1 г в расчете на разовую дозу.
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы настоящего изобретения антитела и/или композиции по настоящему изобретению могут вводиться в дозе, которая ниже примерно 375 мг/м, ниже примерно 37,5 мг/м, ниже примерно 0,375 мг/м, и/или в дозе примерно от 0,075 мг/м и примерно до 125 мг/м. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения способы по настоящему изобретению, режимы дозирования включают низкие дозы, вводимые с повторяемыми интервалами. Например, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению могут вводиться в дозе, которая ниже примерно 375 мг/м с интервалами примерно каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175 или 200 суток.
Указанное дозирование может привести к истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток у человека после лечения композициями и способами по настоящему изобретению на протяжении периода, составляющего по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14, 20, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 или 180 суток или более. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в способах по настоящему изобретению истощают ICOS-экспрессирующие Т-клетки по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% по сравнению с уровнями ICOS-экспрессирующих Т-клеток у пациента, подвергавшегося лечению до применения композиций и способов по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления настоящего изобретения в способах по настоящему изобретению истощают ICOS-экспрессирующие Т-клетки по меньшей мере на 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, или 100% по сравнению со стандартными уровнями ICOS-экспрессирующих Т-клеток у людей. В близких вариантах осуществления настоящего изобретения стандартные уровни ICOS-экспрессирующих Т-клеток у людей определяют, используя пациентов, сопоставимых с подвергаемыми лечению пациентами по возрасту, полу, массе и другим параметрам.
2
2
2
2
2
2
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза, составляющая примерно 125 мг/м или менее антитела или антиген-связывающего фрагмента, приводит к истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток на период, составляющий по меньшей мере примерно 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150 или 200 суток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения доза, составляющая примерно 37,5 мг/мили менее, истощает ICOS-экспрессирующие Т-клетки на период, составляющий по меньшей мере примерно 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150 или 200 суток. В других вариантах осуществления настоящего изобретения доза, составляющая примерно 0,375 мг/м или менее, приводит к истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток в течение по меньшей мере примерно 7, 14, 21, 30, 45 или 60 суток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения доза, составляющая примерно 0,075 мг/м или менее, приводит к истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток на период, составляющий по меньшей мере примерно 7, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150 или 200 суток. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доза, составляющая примерно 0,01 мг/м, 0,005 мг/мили даже 0,001 мг/м или приводит к истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток в течение по меньшей мере примерно 3, 5, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 90, 120, 150 или 200 суток. В соответствии с указанными вариантами осуществления настоящего изобретения дозу можно вводить каким-либо приемлемым способом, но необязательно можно вводить подкожно.
2
2
2
2
2
2
В другом объекте настоящего изобретения установлено, что истощение ICOS-экспрессирующих Т-клеток и/или лечение расстройств, опосредованных Т-клетками, может быть достигнуто при пониженных дозах антитела или фрагментов антитела, используемых в современных методах. Таким образом, в другом варианте осуществления настоящего изобретения представляют способ истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток и/или лечения опосредованных Т-клетками расстройств, включающий введение человеку эффективного количества антитела, которое специфически связывается с ICOS, в котором дозирование примерно 500, 475, 450, 425, 400, 375, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 175, 150, 125, 100, 75, 60, 50, 37,5, 20, 10, 5, 2,5, 1, 0,5, 0,375, 0,25, 0,1, 0,075, 0,05, 0,001, 0,0005 мг/м или менее приводит к истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток (циркулирующих и/или тканевых ICOS-экспрессирующих Т-клеток) на 25%, 35%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или более на протяжении по меньшей мере примерно 3, 5, 7, 10, 14, 21, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180 или 200 суток или дольше. В типичных вариантах осуществления настоящего изобретения доза, примерно составляющая 125 мг/м, или 75 мг/м, или менее, приводит по меньшей мере примерно к 50%, 75%, 85% или 90% истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток в течение по меньшей мере примерно 7, 14, 21, 30, 60, 75, 90, 120, 150 или 180 суток. В других вариантах осуществления настоящего изобретения дозирование примерно 50, 37,5 или 10 мг/м приводит по меньшей мере примерно к 50%, 75%, 85% или 90% истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток в течение по меньшей мере примерно 7, 14, 21, 30, 60, 75, 90, 120 или 180 суток. В еще одном из вариантов осуществления дозирование примерно 0,375 или 0,1 мг/м приводит по меньшей мере примерно к 50%, 75%, 85% или 90% истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток в течение по меньшей мере примерно 7, 14, 21, 30, 60, 75 или 90 суток. В других вариантах осуществления доза, составляющая примерно 0,075, 0,01, 0,001, или 0,0005 мг/м приводит по меньшей мере примерно к 50%, 75%, 85% или 90% истощению ICOS-экспрессирующих Т-клеток в течение по меньшей мере примерно 7, 14, 21, 30 или 60 суток.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза может быть увеличена или уменьшена для поддержания константной дозы в крови или в ткани, например, в костном мозге, но не только в нем. В близких вариантах осуществления настоящего изобретения дозу увеличивают или уменьшают примерно на 2%, 5%, 8%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% и 95% чтобы поддержать требуемый уровень антитела в композициях и способах по настоящему изобретению.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дозировка может изменена и/или скорость инфузии может быть уменьшена в зависимости от иммуногенного ответа пациента на композиции и способы по настоящему изобретению.
Тестирование токсичности
Устойчивость, токсичность и/или эффективность композиций и/или режимов лечения по настоящему изобретению могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами в культурах клеток или в экспериментальных животных, например, для определения величин LD50 (дозы летальности, приводящей к гибели 50% популяции), ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции) и IC50 (дозы, эффективной для достижения 50% подавления). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доза означает дозу, эффективную для достижения истощения циркулирующих ICOS-экспрессирующих Т-клеток, по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99%. Соотношение доз, вызывающих токсичность и терапевтические эффекты, представляет терапевтический индекс и может выражаться в виде соотношения LD50/ED50. Способы лечения, которые проявляют значимые терапевтические результаты, могут быть предпочтительными. Хотя могут применяться способы лечения, которые проявляют токсический эффект, следует сосредоточиться на системе доставки, которая нацеливает такие агенты на ICOS-экспрессирующие клетки, чтобы минимизировать сильное разрушение ICOS-отрицательных клеток и там самым понизить побочные эффекты.
Данные, полученные при исследовании культур клеток и животных, могут быть использованы при переработке диапазона доз композиций и/или режимов лечения для применения людьми. Дозы таких агентов могут лежать в диапазоне циркулирующих концентраций, которые охватывают величину ED50 без токсичности или с малой токсичностью. Доза может варьировать в этом диапазоне, завися от используемой лекарственной формы и способа введения. Для какого-либо лечения в способах по настоящему изобретению терапевтически эффективная доза может устанавливаться с помощью соответствующих моделей животных. В зависимости от вида животного доза может масштабироваться для людей по формулам, принятым в настоящей области, например, разработанным Freireich и др., Cancer Chemotherapy Reports, NCI40, 1966, cc.219-244. Данные, полученные при исследовании культур клеток, могут быть использованы для прогноза возможной токсичности. Исследования животных могут использоваться для определения специфической дозы для достижения диапазона концентрации в циркулирующей плазме, к которому относится величина IC50 (т.е., концентрация исследуемого соединения, которая достигает подавления наполовину максимально проявляемых симптомов) согласно определению в культуре клеток. Такая информация может применяться для более точного определения полезных для людей доз. Уровни лекарственных средств в плазме могут быть измерены, например, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ELISA или методами на основе исследования клеток.
Терапевтическое применение
Композиции, включающие анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией, могут применяться для лечения аутоиммунных заболеваний, например, системной красной волчанки, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, диабета, иммунной тромбоцитопенической пурпуры (immune thrombocytopenic purpura - ITP) и псориаза, хронических воспалительных заболеваний, например, болезни воспаленной кишки (болезни Крона и язвенного колита), болезни Грэйвса, тиреоидита Хашимото и сахарного диабета. Анти-ICOS композиции, описанные в настоящем изобретении, также могут применяться для смягчения синдрома токсического шока, болезни воспаленной кишки, аллосенсибилизации из-за трансфузии крови, Т-клетки-зависимых В-клетки-опосредованных заболеваний и лечения болезни трансплантат-против-хозяина. Кроме того, композиции и способы по настоящему изобретению могут применяться в показаниях к терапевтическому применению, которые требуются для подавления или повышения выработки антитела.
Композиции, включающие анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией, также могут применяться в качестве иммуносупрессивных агентов при трансплатнации костного мозга и органов и могут применяться для продления функционирования трансплантата. Такие композиции могут обеспечить существенное преимущество по сравнению с имеющимся лечением. Трансплантационная терапия костного мозга и органов должна противостоять опосредованному Т-клетками отторжению чужеродных клеток или ткани хозяином. Настоящие терапевтические режимы по подавлению опосредованного Т-клетками отторжения включают лечение лекарственными средствами циклоспорином или FK506. Хотя лекарственные средства эффективны, пациенты страдают от тяжелых побочных эффектов, включая гепатотоксичность, нефротоксичность и нейротоксичность. Мишенью для класса лекарственных средств циклоспорина/РК50б является кальциневрин, фосфатаза, экспрессируемая в организме повсеместно. Поскольку экспрессия ICOS ограничивается Т-клетками, истощение of ICOS-экспрессирующих Т-клеток может привести к утрате тяжелых побочные эффектов, наблюдаемых при использовании настоящих иммунотерапевтических агентов.
Гиперчувствительность является в норме полезным иммунным ответом, который чрезмерен или недостаточен и приводит к воспалительным реакциям и повреждению ткани. Реакции гиперчувствительности, опосредованные антителом, могут быть особенно чувствительными к антагонизму по истощению ICOS-экспрессирующих клеток. Аллергии, сенная лихорадка, астма и острый отек вызывают реакции гиперчувствительности I типа, и эти реакции могут быть подавлены истощением ICOS-экспрессирующих клеток.
Заболевания, которые вызывают реакции опосредованной антителом гиперчувствительности, включают системную красную волчанку, артриты (ревматоидный артрит, реактивный артрит, псориатический артрит), нефропатии (гломерулонефрит, мембранную, мезангиокапиллярную, фокальную сегментную, фокальную некротизирующую, серповидную, пролиферативную тубулопатии), кожные расстройства (пемфигус и пемфигоид, узловатую эритему), эндокринопатии (тиреоидит - болезнь Грэйвса, болезнь Хашимото - инсулинзависимый сахарный диабет), различные пневмопатии (особенно внешние альвеолитические), различные васкулопатии, глютеновая болезнь, с нарушенной выработкой IgA, многие анемии и тромбоцитопении, синдром Гийена-Барре и бульбоспинальный паралич можно лечить, используя композиции, включающие анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией.
Кроме того, лимфопролиферативные расстройства, например, множественная миелома, макроглобулинемия (болезнь Вальденстрема) и криоглобулинэмия, могут подавляться введением композиции, включающей анти-ICOS антитело с повышенной эффекторной функцией. Кроме того, при болезни трансплантат-против-хозяина «искусственное» иммунное расстройство истощение ICOS-экспрессирующих клеток может быть полезным.
ICOS-зависимый метаболический путь совместной стимуляции участвует в регуляции выработки IgE. Иммуноглобулин IgE является тем изотипом, который участвует в опосредовании аллергических ответов, например, астмы, пищевой аллергии, сенной лихорадки, гиперчувствительности первого типа и воспалении полостей. При воздействии аллергена процесс, включающий взаимодействие Т- клеток и В-клеток, приводит к выработке В-клетками IgE, специфичного в отношении аллергена. Аллерген-специфичный IgE высвобождается в кровяное русло В-клетками, связанными с тучными клетками и базофилами через рецептор IgE с высокой степенью сродства (FceRI). Тучные клетки и базофилы, с которыми связан IgE, становятся сенсибилизированными и последующая экспозиция аллергеном приводит к перекрестному связыванию поверхностных рецепторов и высвобождению гистаминов.
Настоящее изобретение представляет применение анти-ICOS антитела для регуляции выработки IgE и предупреждения или лечения IgE-опосредованного расстройства. К примерам таких расстройств относятся аллергические ответы, например, астма, пищевая аллергия, сенная лихорадка, гиперчувствительность и воспаление пазух. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-ICOS антитело по настоящему изобретению используют для частичного или полного подавления выработки IgE. Анти-ICOS антитело по настоящему изобретению может использоваться отдельно или в комбинации в режимах лечения для снижения уровней IgE.
Настоящее изобретение также представляет использование анти-ICOS антитела в комбинации с антагонистом IgE для частичного или полного подавления выработки IgE и для предупреждения и/или лечения расстройств, отличающихся избыточной или несоответствующей выработкой IgE. В контексте настоящего изобретения понятие «антагонист IgE» относится к соединению, способному к разрушению или блокированию взаимодействия IgE с его рецептором FceRI, обладающим высоким сродством, на клетках таким образом, что ответ на стимул аллергена ослабляется или уничтожается. Антагонисты включают анти-IgE антитело и его фрагменты, растворимый рецептор FceRI и его фрагменты, анти-FceRI антитело и его фрагменты, варианты IgE и их фрагменты, IgE связывающие пептиды, FceRI рецептор связывающие пептиды и малые молекулы, способные связываться с IgE или конкурировать с IgE за связывание с рецептором FceRI. Анти-ICOS антитело по настоящему изобретению также может использоваться в комбинации с антигистаминами, десенсибилизацией аллергена, понижением экспозиции аллергеном и др. для лечения аллергических расстройств.
Настоящее изобретение также относится к предупреждению и/или лечению астмы, включающему введение анти-ICOS антитела по настоящему изобретению, одного или вместе с одним или несколькими агентами для лечения астмы. К примерам таких агентов относятся бронходилаторы (антихолинэргические агенты, агонисты бета-2 адренэргического рецептора, антагонисты ленкотриена D-4, антагонисты нейрокинина, открыватели калиевых каналов, антагонисты вещества Р, антагонисты тромбоксана А-2 и ксантины), противовоспалительные (ингибиторы 5-липоксигеназы, ингибиторы белка, активирующего 5-липоксигеназы, ингибиторы фосфодиэстеразы IV, антагонисты фактора активации тромбоцитов, респираторные НСПВЛС, стероиды и ингибиторы тирозинкиназы), ингибиторы цитокинов (CD4, ИЛ-4 и ИЛ-5 ингибиторы) и IgE антагонисты, указанные выше.
Композиции и способы по настоящему изобретению могут контролировать (подавлять или стимулировать) пролиферацию ICOS-экспрессирующих клеток или выработку цитокина (например, ИЛ-17) ICOS-экспрессирующими клетками, тем самым, делая возможным подавление различных патологических состояний и лечение или предупреждение различных расстройств, вызванных различными физиологическими явлениями, связанными с сигнальной трансдукцией, опосредованной ICOS.
Композиции, включающие анти-ICOS антитело по настоящему изобретению, позволяют подавлять, предупреждать и/или лечить, например, приводимые ниже заболевания, но ими перечень не ограничивается: ревматоидный артрит, рассеянный склероз, аутоиммунный тиреоидит, аллергический контактный дерматит, хронический воспалительный дерматоз (например, красный плоский лишай), системную красную волчанку, инсулинзависимый сахарный диабет, псориаз, аутоиммунные или аллергические расстройства, аутоиммунные заболевания и аллергические реакции замедленного типа, вызываемые клеточно-опосредованным иммунитетеом, артропатию (например, но ими перечень не ограничивается, ревматоидный артрит (РА) и остеоартрит (ОА)), воспаление (например, гепатит), реакцию трансплантат-против-хозяина (реакция ТПХ), болезнь трансплантат-против-хозяина (БТПХ), иммунное отторжение, связанное с трансплантацией ткани (например, кожи, роговицы, кости) или органа (например, печени, сердца, легкого, почки, поджелудочной железы), иммунного ответа, индуцируемого чужеродным антигеном или аутоантигеном (например, выработку антитела против антигена, пролиферацию клеток, выработку цитокинов) и расстройств, вызванных нарушенным кишечным иммунитетом (например, синдром раздраженной кишки, болезнь Крона, язвенный колит, пищевая аллергия).
Кроме того, композиции и способы, описанные в настоящем изобретении, могут применяться для супрессии/лечения отторжения трансплантата или БТПХ в комбинации с известными иммуносупрессирующими агентами, например, ингибиторами транскрипции цитокина (например, циклоспорином А, такролимусом), синтеза нуклеотидов (например, азатиопурином, микофенолятом мофетилом), сигнальной трансдукции фактора роста (например, сиролимуса, рапамицина) и рецептора интерлейкина 2 Т-клеток (например, даклизумаба, базиликсимаба). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуносупрессирующим агентом, используемым в комбинации с композициями и способами по настоящему изобретению, является один или несколько из следующих агентов: адриамицин, азатиопурин, бусульфан, циклофосфамид, циклоспорин А («СуА»), цитоксин, флударабин, 5-фторурацил, метотрексат, микофенолят мофетил (MOFETIL), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НСПВЛС), рапамицин и такролимус (FK506).
Композиции и способы по настоящему изобретению могут быть применены в отношении воспалительных заболеваний, например, сопутствующих воспалениям различных артритов (например, ревматоидного артрита, остеоартрита), воспаления легких, гепатита (включая вирусный гепатит), сопутствующих воспалениям инфекционных заболеваний, воспалительных кишечных заболеваний, кишечных энтеритов, нефрита (например, клубочкового нефрита, нефрофиброза), гастрита, ангиита, панкреатита, перитонита, бронхита, миокардита, энцефалита, воспаления при постишемическом реперфузионном повреждении (миокардиальном ишемическом реперфузионном повреждении), воспаления, связанного с иммунным отторжением после трансплантации ткани и органа, с ожогом, различных кожных воспалений (псориаза, аллергического контактного дерматита, красного плоского лишая), воспаления при полиорганной недостаточности, воспаления после чрескожной транслуминальной коронарной ангиопатии (РТСА) или чрескожной транслуминальной коронарной реканализации (PTCR), сопутствующего артериосклерозу воспалению и аутоиммунного тиреоидита.
Композиции по настоящему изобретению, включающие анти-ICOS антитело с повышенной эффекторнной функцией в качестве действующего ингредиента, могут применяться для подавления, лечения и/или предупреждения различных заболеваний, например, но ими перечень не ограничивается, ревматоидного артрита, рассеянного склероза, аутоиммунного тиреоидита, аллергического контактного дерматита, красного плоского лишая, системной красной волчанки, инсулин-зависимого сахарного диабета, псориаза, аутоиммунных заболеваний или аллергических заболеваний, аллергических реакций замедленного типа, вызываемых клеточно-опосредованным иммунитетом, артропатии (например, ревматоидного артрита (РА), остеоартрита (ОА)), воспаления (например, гепатита), реакции трансплантат-против-хозяина (реакции ТПХ), болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), иммунного отторжения, связанного с трансплантацией тканей (например, кожи, роговицы, кости) или органов (например, печени, сердца, легкого, почки, поджелудочной железы), синдрома раздраженной кишки, болезни Крона, язвенного колита и пищевой аллергии.
Композиции в соответствии с настоящим изобретением позволяют лечить или предупреждать некоторые воспаления, для которых используют различные стероидные средства в качестве противовоспалительных лекарственных средств, например, воспаления, связанные с различными артритами (например, ревматоидным артритом, остеоартритом), воспаление легких, гепатит (включая вирусный гепатит), воспаление, связанное с инфекционными заболеваниями, синдром воспаленной кишки, энтерит, нефрит, гломерулонефрит, воспаление, связанное с фиброзом почки, гастрит, васкулит, панкреатит, перитонит, бронхит, миокардит, энцефалит, воспаление, связанное с ишемическим реперфузионным повреждением, миокардиальным ишемическим реперфузионным повреждением, воспалением, связанным с иммунным отторжением после трансплантации тканей или органов, псориаз, аллергический контактный дерматит, красный плоский лишай, воспаление при полиорганной недостаточности, воспаления после чрескожной транслуминальной коронарной ангиопатии (РТСА) или чрескожной транслуминальной коронарной реканализации (PTCR)воспаление, сопутствующее артериосклерозу, и аутоиммунный тиреоидит.
Трансляция
В некоторых объектах по настоящему изобретению применяемые режимы лечения и дозы с композициями и способами по настоящему изобретению выбраны, основываясь на ряде факторов, включая, например, клиническое проявление, которое имеется у пациента с риском развития отторжения трансплантата, или клиническое подтверждение того, что такое отторжение происходит.
Настоящее изобретение предусматривает композиции, терапевтические составы, способы и режимы, эффективные в случае частоты возникновения, тяжести или длительности БТПХ, в случаях отторжения или посттрансляционных лимфопролиферативных расстройств. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции и способы по настоящему изобретению эффективны для ослабления ответа хозяина на ишемическое реперфузионное повреждение трансплантата плотной ткани или органа. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции и способы по настоящему изобретению эффективны для пролонгированного выживания трансплантата у реципиента трансплантата.
Настоящее изобретение включает трансплантаты, являющиеся аутогенными, аллогенными или ксеногенными для реципиента. К типам трансплантатов, рассматриваемых в настоящем изобретении, относятся трансплантаты тканей и органов, включая, но ими не ограничиваясь, трансплантаты костного мозга, трансплантаты периферических стволовых клеток, трансплантаты кожи, трансплантаты артерий и вен, трансплантаты островковых клеток поджелудочной железы и трансплантаты почек, печени, поджелудочной железы, щитовидки и сердца. Понятия «имплантат» и «трансплантат» в настоящем изобретении взаимозаменяемые. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аутологичный трансплантат является трансплантатом костного мозга, трансплантатом артерии, трансплантатом вены или трансплантатом кожи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аллотрансплантат является пересаженным костным мозгом, трансплантатом роговицы, трансплантатом почки, трансплантатом клеток островка Лангерганса или комбинированным трансплантатом почки и поджелудочной железы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения трансплантат является ксенотрансплантатом, в котором возможными животными-донорами являются, но ими не ограничиваются, свиньи. Композиции и способы по настоящему изобретению также могут применяться для подавления вредного иммунного ответа на небиологический трансплантат или имплант, включая, но ими не ограничиваясь, искусственный сустав, стент или водитель ритма.
Анти-ICOS антитела, композиции и способы по настоящему изобретению могут быть применены для лечения или предупреждения БТПХ, отторжения или посттрансляционных лимфопролиферативных расстройств, безотносительно к определенным показателям, изначально вызвавшим потребность в трансплантате или определенном типе трансплантированной ткани.
Терапевтические составы и режимы по настоящему изобретению описаны для лечения людей, у которых диагностированы аутоиммунные заболевания или расстройства, включая, но ими не ограничиваясь, ревматоидный артрит, СКВ, иммунную тромбоцитопеническую пурпуру (immune thrombocytopenic purpura - ITP), расстройства, связанные с пемфигусом, диабет и склеродерму.
Соответствующие режимы лечения могут быть определены специалистом в данной области для определенного пациента или группы пациентов. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения режим лечения представляет дотрансплантационный определенный режим, посттрансплантационный поддерживающий режим или посттрансплантационный лечащий режим для случаев острого и хронического отторжения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения определенный режим варьирует для пациента, которого оценивают в качестве обладающего высоким или умеренным риском развития ответа по отторжению, по сравнению с режимом для пациента, у которого низкая степень риска отторжения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения определенный режим варьирует в зависимости от стадии отторжения, с более агрессивной терапией, назначаемой для пациентов на более поздних стадиях отторжения. Стадии гуморального отторжения могут быть классифицированы, исходя из знаний и опыта, накопленных в данной области. Например, стадии гуморального отторжения могут быть классифицированы на стадии с I по IV исходя из следующих критериев: стадия I (латентный ответ), отличающаяся циркулирующими алло-антителами против донора, особенно анти-HLA антитела, стадия II (скрытая реакция), отличающаяся циркулирующими алло-антителами против донора, особенно анти-HLA антителами, и C4d депонированием, но без гистологических изменений или дисфункции трансплантата, стадия III (субклиническое отторжение), отличающаяся циркулирующими алло-антителами против донора, особенно анти-HLA антителами, C4d депонированием и тканевой патологией, но без дисфункции трансплантата, стадия IV (гуморальное отторжение), отличающаяся циркулирующими алло-антителами против донора, особенно анти-HLA антителами, C4d депонированием, тканевой патологией и дисфункцией трансплантата.
Анти-ICOS антитела, композиции и способы по настоящему изобретению могут использоваться для лечения или предупреждения БТПХ, отторжения или пост-трансляционных лимфопролиферативных расстройств, или отдельно, или в комбинации с другими терапевтическими агентами или режимами лечения. К другим терапевтическим режимам лечения или предупреждения БТПХ, отторжения или пост-трансляционных лимфопролиферативных расстройств могут относиться, например, один или несколько вариантов антилимфоцитарной терапии, стероидной терапии, терапии, направленной на истощение антитела, иммуносупрессивной терапии и плазмофорез.
Антилимфоцитарная терапия может включать введение реципиенту трансплантата анти-тимоцитных глобулинов, также называемых тимоглобулинами. Анти-лимфоцитарная терапия может также включать введение одного или нескольких моноклональных антител, направленных против антигенов на поверхности Т-клеток. Примерами таких антител являются, но ими не ограничиваются, продукт OKT3™ (муромонаб-CD3), продукт САМРАТН™-1Н (алемтузумаб), продукт CAMPATH™-1G, продукт САМРАТН™-1М, продукт SIMULECT™ (базиликсимаб) и продукт ZENAPAX™ (даклизумаб). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антилимфоцитарная терапия включает одно или несколько антител, направленных против В-клеток, включая, но им не ограничиваясь, продукт RITUXAN™ (ритуксимаб).
Стероидная терапия может включать введение реципиенту трансплантата одного или нескольких стероидов, выбранных из группы, состоящей из кортизола, преднизона, метилпреднизолона, дексаметазона и индометацина. Из стериодов один или несколько могут быть кортикостероидами, включая, но ими не ограничиваясь, кортизол, преднизон и метилпреднизолон.
Терапия, направленная на истощение антител, может включать, например, внутривенное введение реципиенту трансплантата иммуноглобулина. Терапия, направленная на истощение антител, может также включать иммуноадсорбционную терапию, примененную к трансплантату ex vivo до трансплантации. Иммуноадсорбция может быть выполнена, используя какую-либо соответствующую методику, например, сродство с белком А или аффинные методы на основе антитела, используя антитела, направленные против маркеров на поверхности Т-клеток или В-клеток, например, анти-CD3 антитела, анти-CD19 антитела, анти-CD20 антитела и анти-CD22 антитела.
Иммуносупрессирующая терапия может включать введение одного или нескольких иммуносупрессирующих агентов, например, ингибиторов транскрипции цитокинов (например, циклоспорина А, такролимуса), синтеза нуклеотидов (например, азатиопурином, микофенолятом мофетилом), сигнальной трансдукции фактора роста (например, сиролимуса, рапамицина) и рецептора интерлейкина 2 Т-клеток (например, даклизумаба, базиликсимаба). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуносупрессирующим агентом, используемым в комбинации с композициями и способами по настоящему изобретению, является один или несколько из следующих агентов: адриамицин, азатиопурин, бусульфан, циклофосфамид, циклоспорин А («СуА»), цитоксин, флударабин, 5-фторурацил, метотрексат, микофенолят мофетил (MOFETIL), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НСПВЛС), рапамицин и такролимус (FK506). Иммуносупрессирующие агенты также могут включать ингибиторы комплемента, например, растворимый рецептор-1 комплемента, анти-С5 антитело или низкомолекулярный ингибитор С1, например, описанный в работе Buerke и др. (J. Immunol., 167, 2001, cc.5375-5380.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции и способы по настоящему изобретению используют в комбинации с одним или несколькими терапевтическими режимами для подавления отторжения, включая, но ими не ограничиваясь, лечение такролимусом и микофенолятом мофетилом, иммуноадсорбцию, внутривенную терапию иммуноглобином и плазмофорез.
Воспалительные расстройства
Анти-ICOS антитела по настоящему изобретению могут вводиться субъекту, нуждающемуся в этом, для предупреждения, контроля, лечения или облегчения воспалительных расстройств (например, астмы) или одного или нескольких ее симптомов. Композиции по настоящему изобретению могут также вводиться в комбинации с одной или несколькими другими терапиями, предпочтительно применяемыми для предупреждения, контроля, лечения или облегчения воспалительных расстройств (включая, но ими не ограничиваясь, перечисленные в настоящем изображении профилактические или терапевтические агенты), субъекту, нуждающемуся, для предупреждения, контроля, лечения или облегчения воспалительных расстройств или одного или нескольких его симптомов. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение представляет способ предупреждения, контроля, лечения или облегчения воспалительных расстройств или одного или нескольких их симптомов, указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, дозу профилактически или терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитела по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают способ предупреждения, контроля, лечения или облегчения воспалительных расстройств или одного или нескольких их симптомов, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, дозы профилактически или терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией по настоящему изобретению и дозу профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких лекарственных средств (например, профилактических или терапевтических агентов), не являющихся антителами (а также фрагментами антител), которые иммуноспецифически связываются с полипептидом ICOS.
Настоящее изобретение представляет способы контроля, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов воспалительных расстройств у субъекта, не поддающегося лечению традиционными методами (например, метотрексатом и антагонистом ФНО-альфа (например, продуктами REMICADE™ или ENBREL™)) для таких воспалительных расстройств, указанные способы включают введение указанному субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитело по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией. Настоящее изобретение также представляет способы контроля, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов воспалительных расстройств у субъекта, не поддающегося лечению на основе имеющихся единичных терапевтических агентов, предназначенных для таких воспалительных расстройств, причем указанные способы включают введение указанному субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией и дозы профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких лекарственных средств (например, профилактического или терапевтического агента), не являющихся антителом (в том числе фрагментами антител), которые иммуноспецифически связываются с ICOS полипептидом. Настоящее изобретение также представляет способы контроля или лечения воспалительных расстройств путем введения анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в комбинации с каким-либо другим лечением пациентов, у которых установлена неэффективность лечения другими лекарственными средствами, причем лечение этими лекарственными средствами прекращено. Настоящее изобретение также представляет измененные способы лечения воспалительных расстройств, если установлено или может быть установлено, что другое лечение слишком токсично, т.е., приводит к неприемлемым или невыносимым побочным эффектам для подвергаемого лечению субъекта. Например, композиция по настоящему изобретению может быть введена субъекту, причем субъект невосприимчив к антагонисту ФНО или метотрексату. Кроме того, настоящее изобретение представляет способы для предупреждения рецидива воспалительных расстройств у пациентов, которых лечили и у которых не было проявления болезни после введения анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией.
К воспалительным расстройствам, которые можно лечить способами, описанными в настоящем изобретении, относятся, но ими не ограничиваются, астма, энцефалит, воспалительная болезнь кишечника, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), аллергическое расстройств, септический шок, фиброз легких, недифференцированная губчатая артропатия, недифференцированная артропатия, артрит, остеоартрит, губчатые артропатии (например, псориатический артрит, анкилозирующий спондилоартрит, синдром Рейтера (реактивный артрит), воспалительный остеолизис, болезнь Вильсона и хроническое воспаление, возникающее из-за хронических вирусных или бактериальных инфекций. Согласно описанному в настоящем изобретении некоторые аутоиммунные расстройства связаны с состоянием воспаления.
Противовоспалительное лечение, дозировки, пути введения и рекомендованное применение известны в данной области и описаны в литературе, например, в кн.: «Physician's Desk Reference», 2007, 61-е изд.
Противовоспалительная терапия
Настоящее изобретение предусматривает способы предупреждения, контроля, лечения или облегчения воспалительных расстройств или одного или нескольких симптомов таких расстройств, причем указанные способы, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, анти-ICOS антител по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией и одного или нескольких лекарственных средств (например, профилактических или терапевтических агентов, не являющихся антителами или фрагментами антител), которые иммуноспецифически связываются с полипептидом ICOS. Какой либо агент или какое-либо лечение, эффективность которых известна, или которые использовали или в настоящее время используют для предупреждения, контроля, лечения или облегчения воспалительных расстройств или одного или нескольких симптомов таких расстройств, можно использовать в комбинации с анти-ICOS антителом по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в соответствии с изобретением, описанным в настоящем изобретении.
Какой-либо противовоспалительный агент, в том числе агенты, применимые в лечении воспалительных расстройств, известны специалистам в данной области и могут применяться в композициях и способах по настоящему изобретению. К примерам противовоспалительных агентов относятся, но ими не ограничиваются, противовоспалительные агенты, в том числе нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НСПВЛС), стероидные противовоспалительные средства (СПВЛС), антихолинэргетические агенты (например, атропин сульфат, атропин метилнитрат и ипратропий бромид (продукт ATROVENT™)), бета2-агонисты (например, абутерол (продукты VENTOLIN™ и PROVENTIL™), битолтерол (продукт TORNALATE™), левалбутерол (продукт XOPONEX™), метапротеренол (продукт ALUPENT™), пирбутерол (продукт MAXAIR™), тербутлаин (продукты BRETHAIRE™ и BRETHINE™), альбутерол (продукты PROVENTIL™, REPETABS™ и VOLMAX™), формотерол (продукт FORADIL AEROLIZER™) и салметерол (продукты SEREVEN™ и SEREVENT DISKUS™)) и метилксантины (например, теофиллин (продукты UNIPHYL™, THEO-DUR™, SLO-BID™ и ТЕНО-42™)). К примерам НСПВЛС относятся, но ими не ограничиваются, аспирин, ибупрофен, целекоксиб (CELEBREX™), диклофенак (продукт VOLTAREN™), этодолак (продукт LODINE™), фенопрофен (продукт NALFON™), индометацин (продукт INDOCIN™), кеторалак (продукт TORADOL™), оксапроцин (продукт DAYPRO™), набументон (продукт RELAFEN™), зулиндак (продукт CLINORIL™), толментин (продукт TOLECTIN™), рофекоксиб (продукт VIOXX™), напроксен (продукты ALEVE™, NAPROSYN™), кетопрофен (продукт ACTRON™) и набуметон (продукт RELAFEN™). Такие НСПВЛС функционируют путем ингибирования фермента циклооксигеназы (например, СОХ-1 и/или СОХ-2). К примерам стероидных противовоспалительных лекарственных средств относятся, но ими не ограничиваются, глюкокортикоиды, дексаметазон (продукт DECADRON™), кортикостероиды (например, метилпреднизолон (продукт MEDROL™)), кортизон, гидрокортизон, преднизон (продукты PREDNISONE™ и DELTASONE™), преднизолон (продукты PRELONE™ и PEDIAPRED™), триамцинолон, азульфидин и ингибиторы эйкозаноидов (например, простагландины, тромбоксаны и лейкотриены).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффективное количество одной или нескольких композиций по настоящему изобретению вводят в комбинации с ингибитором протеазы тучных клеток субъекту при риске возникновения воспалительного расстройства или при воспалительном расстройстве. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитором протеазы тучных клеток является ингибитор триптазкиназы, например, но ими перечень не ограничивается, GW-45, GW-58 и генистин. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибитором протеазы тучных клеток является ингибитор фосфатидилинозитид-3' (PI3)-киназы, например, кальфостин С, но им перечень не ограничивается. В другом варианте осуществления настоящего изобретения ингибитором протеазы тучных клеток является ингибитор протеинкиназы, например, стауроспорин, но им перечень не ограничивается. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения ингибитор протеазы тучных клеток вводят локально в поврежденную область.
К специфическим примерам иммуномодулирующих агентов, которые могут вводиться в комбинации с анти-ICOS антителом по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией субъекту с воспалительным расстройством, относятся, но ими не ограничиваются, метотрексат, лефлюнамид, циклофосфамид, цитоксан, иммуран, циклоспорин А, миноциклин, азатиоприн, антибиотики (например, FK506 (такролимус)), метилпреднизолон (МП), кортикостероиды, стероиды, микофенолят мофетил, рапамицин (сиролимус), мизорибин, дезоксиспергуалин, бреквинар, малононитрилоаминды (например, лефлюнамид), антитела против рецептора Т-клеток (например, анти-CD4 антитела (например, сМ-Т412 (фирма Boeringer), IDEC-CE9.1.RTM. (IDEC и SKB), моноклональное антитело 4162W94, ортоклон и OKTcdr4a (фирма Janssen-Cilag)), анти-CD3 антитела (например, нувион (фирма Product Design Labs), OKT3 (фирма Johnson & Johnson) или ритуксан (IDEC)), анти-CD5 антитела (например, анти-CD5 рицин-связанный иммуноконъюгат), анти-CD7 антитела (например, CHH-380 (фирма Novartis)), анти-CD8 антитела, анти-CD40 лиганд моноклональное антитела (например, IDEC-131 (IDEC)), анти-CD52 антитела (например, продукт CAMPATH 1H (илекс)), анти-CD2 антитела (например,, MEDI-507 (MedImmune, Inc., WO 02/098370 и WO 02/069904), анти-CD11a антитела (например, ксанелим (фирма Genentech)), и анти-В7 антитела (например, IDEC-114) (IDEC)), антитела против рецептора цитокина (например, антитела к рецептору IFN, антитела к рецептору ИЛ-2 (например, ценапакс (фирма Protein Design Labs)), антитела к рецептору ИЛ-4, антитела к рецептору ИЛ-6, антитела к рецептору ИЛ-10 и антитела к рецептору ИЛ-12), антитела к цитокину (например, анти-IFN антитела, анти-ФНО-альфа антитела, анти-ИЛ-1бета антитела, анти-ИЛ-6 антитела, анти-ИЛ-8 антитела (например, АВХ-ИЛ-8 (фирма Abgenix)) и анти-ИЛ-12 антитела)), CTLA4-иммуноглобулин, LFA-3TIP (фирма Biogen, WO 93/08656 и US 6162432), растворимые рецепторы цитокинов (например, внеклеточный домен рецептора ФНО-альфа или его фрагмента, внеклеточный домен рецептора ИЛ-1бета или его фрагмент и внеклеточный домен рецептора ИЛ-6 или его фрагмента), цитокины или их фрагменты (например, интерлейкин (ИЛ)-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-112, ИЛ-15, ФНО-альфа, ФНО-бета, интерферон (ИФН)-альфа, ИФН-бета, ИФН-гамма и GM-CSF) и антитело к цитокину (например, анти-ИЛ-2 антитела, анти-ИЛ-4 антитела, анти-ИЛ-6 антитела, анти-ИЛ-9 антитела, анти-ИЛ-10 антитела, анти-ИЛ-12 антитела, анти-ИЛ-15 антитела, анти-ИЛ17 антитела, анти-ФНО-альфа антитела, и анти-ИФН-гамма антитела).
Какой-либо антагонист ФНО-альфа, известный специалистам в данной области, может применяться в композициях и способах по настоящему изобретению. Примерами антагонистов ФНО-альфа, которыми перечень не ограничивается, и которые могут вводиться в комбинации с анти-ICOS антителом по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией субъекту с воспалительным расстройством, являются белки, полипептиды, пептиды, гибридные белки, антитела (например, человека, гуманизированные, химерные, моноклональные, поликлональные, Fvs, ScFvs, Fab фрагменты, F(ab)2 фрагменты и их антиген-связывающие фрагменты), например, антитела, которые иммуноспецифически связываются с ФОН-альфа, молекулами нуклеиновой кислоты (например, антисмысловыми молекулами или тройными спиралями), органическими молекулами, неорганическими молекулами и низкомолекулярными соединениями, которые блокируют, редуцируют, ингибируют или нейтрализуют функцию, действие и/или экспрессию ФНО-альфа. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антагонист ФНО-альфа снижает функцию, действие и/или экспрессию ФНО-альфа по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% относительно контроля, например, фосфатно-солевого буфера (ФСБ). К примерам антител, которые иммуноспецифически связываются с ФИО-альфа, относятся, но ими не ограничиваются, инфликсимаб (продукт REMICADE™, фирма Centacor), D2E7 (фирма Abbott Laboratories/Knoll Pharmaceuticals Co., Mt. Olive, Нью-Джерси), CDP571, который также называют продуктом HUMICADE™, и CDP-870 (оба от фирмы Celltech/Pharmacia, Slough, Великобритания), и TN3-19.12 (Williams и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1994, cc.2762-2766, Thorbecke и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc.7375-7379). Настоящее изобретение также предусматривает применение антитела, которое иммуноспецифически связывается с ФИО-альфа и описано в следующих патентах US в композициях и способах по настоящему изобретению: 5136021, 5147638, 5223395, 5231024, 5334380, 5360716, 5426181, 5436154, 5610279, 5644034, 5656272, 5658746, 5698195, 5736138, 5741488, 5808029, 5919452, 5958412, 5959087, 5968741, 5994510, 6036978, 6114517 и 6171787, сущность каждого из которых включена в настоящее изобретение в виде ссылки. Примерами растворимых рецепторов ФНО-альфа являются, но ими не ограничиваются, sTNF-R1 (фирма Amgen), этанерсепт (продукт ENBREL™, фирма Immunex) и его гомолог из крысы продукт RENBREL™, растворимые ингибиторы ФНО-альфа, производные от TNFrI, TNFrII (Kohno и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, cc.8331-8335) и ФНО-альфа Inh (Seckinger и др, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1990, cc.5188-5192).
К другим антагонистам ФНО-альфа в настоящем изобретении относятся, но ими не ограничиваются, ИЛ-10, о котором известно, что он блокирует выработку ФНО-альфа через интерферон гамма-активированные макрофаги (Oswald и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc.8676-8680), TNFR-IgG (Ashkenazi и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 1991, cc.10535-10539), продукт ТВР-1 из грызунов (фирма Serono/Yeda), вакцина CytoTAb (фирма Prдругихics), антисмысловая молекула 104838 (фирма ISIS), пептид RDP-58 (фирма SangStat), талидомид (фирма Celgene), КЗЦ-801 (фирма Celgene), DPC-333 (фирма Dupont), VX-745 (фирма Vertex), AGIX-4207 (фирма AtheroGenics), ITF-2357 (фирма Italfarmaco), NPI-13021-31 (фирма Nereus), SCIO-469 (фирма Scios), TACE нацеливатель (фирма Immunix/AHP), CLX-120500 (фирма Calyx), тиазолопирим (фирма Dynavax), ауранофин (ридаура) (фирма SmithKline Beecham Pharmaceuticals), квинакрин (меракрин дихлоргидрат), тенидап (энаблекс), меланин (фирма Large Scale Biological) и анти-р38 МАРК агенты фирмы Uriach.
Неограничительными примерами противовоспалительных агентов, которые могут быть введены в комбинации с анти-ICOS антителом по настоящему изобретению с эффекторной функцией субъекту с воспалительным расстройством, являются нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (НСПВЛС), стероидные противовоспалительные лекарственные средства, бета-агонисты, антихолинэргетические агенты и метилксантины. К примерам НСПВЛС относятся, но ими не ограничиваются, аспирин, ибупрофен, целекоксиб (продукт CELEBREX™), диклофенак (продукт VOLTAREN™), этодолак (продукт LODINE™), фенопрофен (продукт NALFON™), индометацин (продукт INDOCIN™), кеторалак (продукт TORADOL™), оксапрозин (продукт DAYPRO™), набументон (продукт RELAFEN™), зулиндак (продукт CLINORIL™), толментин (продукт TOLECTIN™), рофекоксиб (продукт VIOXX™), напроксен (продукт ALEVE™, продукт NAPROSYN™), кетопрофен (продукт ACTRON™) и набуметон (продукт RELAFEN™). Такие НСПВЛС функционируют путем ингибирования фермента циклооксигеназы (например, СОХ-1 и/или СОХ-2). К примерам стероидных противовоспалительных средств относятся, но ими не ограничиваются, глюкокортикоиды, дексаметазон (продукт DECADRON™), кортизон, гидрокортизон, преднизон (продукт DELTASONE™), преднизолон, триамцинолон, азулфидин и эйкозаноиды, например, простагландины, тромбоксаны и лейкотриены.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациентам с остеоартритом вводят профилактически или терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в комбинации с другими агентами или терапиями, применимыми для предупреждения, лечения, контроля или облегчения остеоартрита, включая, но ими не ограничиваясь: анальгетики (неограничительными примерами являются, но ими не ограничиваются, ацетаминофен в дозе до 4000 мг/сутки, фенацитин и трамадол в суточной дозе в диапазоне 200-300 мг), НСПВЛС (неограничительными примерами являются, но ими не ограничиваются, аспирин, дифлунизол, диклофенак, этодолак, фенаматы, фенопрофен, флюрбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, метилсалицилат, небуметон, напроксин, оксапразин, фенилбутазон, пироксикам, зулиндак и толметин). Предпочтительными являются низкие дозы НСПВЛС, например, ибупрофен в дозе 1200 мг/сутки, напроксен в дозе 500 мг/сутки. Агент защиты желудка, например, мизопростол, фамотидин или омепразол, предпочтителен для применения одновременно с НСПВЛС, неацетилированными салицилатами, включая, но не ограничиваясь им, сальсалат, (Сох)-2-специфическими ингибиторами (CSI) циклооксигеназы, включая, но не ограничиваясь ими, целекоксиб и рофекоксиб, внутри- или вокруг суставной инъекцией препарата депо глюкокортикоида, внутрисуставной инъекцией гиалуроновой кислоты, капсаициновой мазью, обширным орошением остеоартритного колена для промывания струей фибрина, кусочков хряща и других остатков, и реконструктивной хирургией по замещению суставов. Композиции и способы по настоящему изобретению также могут применяться в комбинации с другими нефармакологическими средствами для предупреждения, лечения, контроля и облегчения остеоартрита, включая, но не ограничиваясь ими: снижение нагрузки на сустав (неограничительными примерами являются исправление неправильной осанки, поддержка при избыточном поясничном лордозе, ограничение чрезмерной нагрузки на поврежденный сустав, отказ от длительного пребывания в положении стоя, стоя на коленях и в положении приседания), прогревание поврежденного сустава, дыхательные упражнения и физиотерапию.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациентам с ревматоидным артритом вводят профилактически или терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в комбинации с другими агентами или терапиями, полезными для предупреждения, лечения, контроля и облегчения ревматоидного артрита, включая, но ими не ограничиваясь: НСПВЛС (неограничивающие примеры включают, но ими не ограничиваются, аспирин, дифлунизол, диклофенак, этодолак, фенаматы, фенопрофен, флюрбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, метилсалицилат, небуметон, напроксин, оксапразин, фенилбутазон, пироксикам, зулиндак и толметин), анальгетики (неограничительными примерами являются ацетаминофен, фенацетин и трамадол), CSI, включая, но ими не ограничиваясь, целекоксиб и рофекоксиб, глюкокортикоиды (предпочтительно низкодозовые перорального применения глюкокортикоиды, например, <7,5 мг/сутки преднизона, или ежемесячные введения высоких пульсовых доз глюкокортикоидов, или внутрисуставные введения глюкокортикоидов), модифицирующие болезнь противоревматические лекарственные средства (МБПРЛС), включая, но ими не ограничиваясь, метотрексат (предпочтительно вводимый прерывистыми низкими дозами, например, 7,5-30 мг один раз в неделю), соединения золота (например, соли золота), D-пенициллинамин, противомалярийные средства (например, хлорохин) и сульфасалазин, ФНО-альфа нейтрализующие агенты, включая, но ими не ограничиваясь, этанерсепт и инфликсимаб, иммуносупрессирующие и цитотоксические агенты (к примерам относятся, но ими не ограничиваются, азатиоприн, лефлуномид, циклоспорин и циклофосфамид) и хирургическое вмешательство (к примерам относятся, но ими не ограничиваются, артропластика, полная замена суставов, восстановительная хирургия руки, открытая или артроскопическая синовэктомия и раннее иссечение синовиального влагалища сухожилия запястья). Композиции и способы по настоящему изобретению могут также применяться в комбинации с другими средствами для предупреждения, лечения, контроля и облегчения ревматоидного артрита, включая, но ими не ограничиваясь: покой, наложение шины для снижения нежелательной подвижности воспаленного сустава, упражнения, применение различных ортопедических и вспомогательных устройств и других методов физиотерапии. Композиции и способы по настоящему изобретению могут также применяться в комбинации с некоторыми нетрадиционными подходами к предупреждению, лечению, контролю и облегчению ревматоидного артрита, включая, но ими не ограничиваясь, диеты (например, с использованием омега-3 жирных кислот, например, эйкозапентаеновой кислоты, обнаруженной в определенных сортах рыбьего жира, для диетических омега-6 насыщенных жирных кислот, обнаруженных в мясе), вакцины, гормоны и анастезирующие препараты.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациентам с хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ) вводят профилактически или терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в комбинации с другими агентами и терапиями, применимыми для предупреждения, лечения, контроля и облегчения ХОЗЛ, включая, но ими не ограничиваясь: бронхолитические средства, включая, но ими не ограничиваясь, краткого и длительного действия бета2-адренергические агонисты (к примерам краткого действия бета2-адренгергических агонистов относятся, но ими не ограничиваются, альбутерол, пирбутерол, тербуталин и метапротеренол; к примерам длительного действия бета2-адренгергических агонистов относятся, но ими не ограничиваются, перорального применения устойчивого высвобождения альбутерол и сальметерол ингаляционного применения), антихолинэргетики (к их примерам относятся, но ими не ограничиваются, ипратропий бромид) и теофиллин и его производные (терапевтический диапазон для теофиллина предпочтительно составляет 10-20 мкг/мл), глюкокортикоиды, экзогенный альфа1AT (например, альфа1AT, производный от введенной внутривенно объединенной плазмы человека в суточной дозе 60 мг/кг), кислород, трансплантация легких, хирургическое удаление части легкого, эндотрахеальная интубация, искусственная вентиляция легких, ежегодная вакцина от гриппа и вакцинирование от пневмококка с 23-валентным полисахаридом, физическая нагрузка и прекращение курения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациентам с астмой вводят профилактически или терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в комбинации с эффективным количеством одного или нескольких других агентов, используемых для лечения астмы. К неограничивающие примерам таких агентов относятся адренэргические стимуляторы (например, катехоламины (например, эпинефрин, изоэтарин), резорцины (например, метапротеренол, тербуталин и фенотерол) и салигенины (например, сальмутам)), адренокортикоиды, блюкокортикоиды, кортикостероиды (например, беклометадонз, будезонид, флунизолид, флутиказон, триамцинолон, метилпреднизолон, преднизолон и преднизон), другие стероиды, бета2-агонисты (например, альбтуерол, битолтерол, фенотерол, изоэтарин, метапротеренол, пирбутерол, салбутамол, тербуталин, формотерол, сальметерол и альбутамол тербуталин), анти-холинергетики (например, ипратропий бромид окситропий бромид), антагонисты ИЛ-4 (включая антитела), антагонисты ИЛ-5 (включая антитела), антагонисты ИЛ-9 (включая антитела), антагонисты ИЛ-13 (включая антитела), антагонисты ИЛ-17 (включая антитела), РОЕ4-ингибитор, NF-Каппа-бета ингибитор, VLA-4 ингибитор, CpG, анти-СD23, антагонисты селектина (ТВС 1269), ингибиторы протеазы тучных клеток (например, ингибиторы триптазкиназы (например, GW-45, GW-58 и генистин), ингибиторы фосфатидилинозитид-3' (РI3)-киназы (например, кальфостин С) и другие ингибиторы киназы (например, стауроспорин) (см. Temkin и др., J Immunol, 169(5), 2002, cc.2662-2669, Vosseller и др., Mol. Biol. Cell 8(5), 1997, cc.909-922, Nagai и др., Biochem Biophys Res Commun 208(2), 1995, cc.576-581)), антагонисты СЗ рецептора (включая антитела), иммуносупрессирующие агенты (например, метотрексат и соли золота), модуляторы тучных клеток (например, кромолин натрия (продукт INTAL™) и недокромил натрия (продукт TILADE™)) и муколитические агенты (например, ацетилцистеин). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения противовоспалительным агентом является ингибитор лейкотриена (например, монтелукаст (продукт SINGULAIR™), зафирлукаст (продукт ACCOLATE™), пранлукаст (продукт ONON™) или зилейтон (продукт ZYFLO™)).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациентам с аллергией водят профилактически или терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела с повышенной функцией по настоящему изобретению в комбинации с эффективным количеством одного или нескольких других агентов, применяемых для лечения аллергии. К неограничивающими примерам таких агентов относятся антимедиаторные лекарственные средства (например, антигистамины), кортикостероиды, противоотечные средства, симпатомиметики (например, альфа-адренергические и бета-адрегергические лекарственные средства), TNX901 (Leung и др., N Engl J Med 348(11), 2003, cc.986-993), антагонисты IgE (например, антитело rhuMAb-E25 омализумаб (см. Finn и др., J Allergy Clin Immuno 111(2), 2003, cc.278-284, Corren и др., J Allergy Clin Immuno 111(1), 2003, cc.87-90, Busse и Neaville, Curr Opin Allergy Clin Immuno 1(1), 2001, cc.105-108, Tang и Powell, Eur J Pediatr 160(12), 2001, cc.696-704), HMK-12 и 6HD5 (см. Miyajima и др., Int Arch Allergy Immuno 128(1), 2002, cc.24-32) и моноклональное антитело Hu-901 (см. van Neerven и др., Int Arch Allergy Immuno 124(1-3), 2001, с.400), теофиллин и его производные, глюкокортикоиды и иммунотерапии (например, неоднократное длительное введение инъекциями аллергена, краткий курс десенсибилизации и иммунотерапия ядом).
Аутоиммунные заболевания
По некоторым объектам настоящего изобретения режим лечения и доза применительно к композициям и способам по настоящему изобретению выбраны, основываясь на ряде факторов, включая, но ими не ограничиваясь, стадию аутоиммунного заболевания или расстройства, подвергаемого лечению. Соответствующие режимы лечения могут быть определены специалистом в данной области для определенных стадий аутоиммунного заболевания или расстройства у пациента или группы пациентов. Кривые зависимости от дозы могут быть получены, используя стандартные протоколы, известные в данной области, для определения эффективных количеств композиций по настоящему изобретению для лечения пациентов с разными стадиями аутоиммунных заболеваний или расстройств. Обычно пациентам с более активной формой аутоиммунных заболеваний или расстройств могут понадобиться повышенные дозы и/или дозы более частого введения, которые могут вводиться на протяжении более длительных периодов времени по сравнению с пациентами, у которых менее активная форма аутоиммунных заболеваний или расстройств.
Анти-ICOS антитела, композиции и способы могут применяться для лечения аутоиммунных заболеваний или расстройств. Понятие «аутоиммунные заболевания или расстройства» относится к состоянию субъекта, характеризующегося повреждением клеток, тканей и/или органов, вызванным иммунологической реакцией субъекта в отношении собственных клеток, тканей и/или органов. Понятие «воспалительное заболевание» используют взаимозаменяемо с понятием «воспалительное расстройство» применительно к состоянию субъекта, отличающемуся воспалением, включая, но им не ограничиваясь, хроническое воспаление. Аутоиммунные расстройства могут быть связаны или не связаны с воспалением. Кроме того, воспаление может быть вызвано или не вызвано аутоиммунным расстройство. Таким образом, определенные расстройства могут быть охарактеризованы и в качестве и аутоиммунных, и воспалительных расстройств. Примерами аутоиммунных заболеваний или расстройств являются, но ими не ограничиваются: гнездная плешивость, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, аутоиммунная тромбоцитопения, болезни Бехчета, пемфигоид буллезный, кардиомиопатия, целиакический спру-дерматит, синдром хронической усталости и дисфункции иммунной системы, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (ХВДП), синдром Чарджа-Стросса, рубцовый пемфигоид, CREST синдром, холодовая агглютининовая болезнь, болезнь Крона, дискоидная красная волчанка, смешанная криоглобулинемия, диабет, эозинофильный фасцит, фибромиалгия-фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хасимото, пурпура Henoch-Schonlein, идиопатический фиброз легких, идиопатическая/аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), IgA нейропатия, ювенильный артрит, плоский лишай, красная волчанка, болезнь Меньера, смешанная соединительно-тканная болезнь, рассеянный склероз, первого типа или опосредованный иммунной системой сахарный диабет, миастения тяжелая псевдопаралитическая, расстройство типа пузырчатки (например, вульгарная пузырчатка), пернициозная анемия, узелковый полиартериит, полихондрит, многожелезистый синдром, полимиалгия ревматическая, полимиозит и дерматомиозитом, первичная агаммаглобулинэмия, первичный билиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейнольд, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродерма, синдром Шенгрена, синдром мышечной скованности, системная красная волчанка (СКВ), синдром Свита, болезнь Стилла, красная волчанка, артериит Такаясу, преходящий артрит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, васкулит, например, дерматит герпетиформный васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера. К примерам воспалительных расстройств относятся, но ими не ограничиваются, астма, энцефалит, воспалительная болезнь кишечника, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ), аллергические расстройства, септический шок, фиброз легких, недифференцированная спондилоартропатия, недифференцированная артропатия, артрит, воспалительный остеолизис, болезнь трансплантат-против-хозяина, крапивница, синдром Фогта-Коянаги-Харада и хроническое воспаление из-за хронической вирусной или бактериальной инфекции.
Лечение аутоиммунного заболевания
Анти-ICOS антитело по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией может вводиться субъекту, нуждающемуся в этом, для предупреждения, контроля, лечения или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких их симптомов. Композиции по настоящему изобретению могут также вводиться в комбинации с одной или несколькими другими терапиями, предпочтительно терапиями, применимыми для предупреждения, контроля или лечения аутоиммунных расстройств (включая, но ими не ограничиваясь, профилактические или терапевтические агенты), субъекту, нуждающемуся в них, для предупреждения, контроля, лечения или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких их симптомов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ предупреждения, контроля, лечения или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких их симптомов, который включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, дозы профилактически или терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ предупреждения, контроля, лечения или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких их симптомов, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, дозы профилактически или терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией и дозы профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких лекарственных средств (например, профилактических или терапевтических агентов), не являющихся антителами (или фрагментами антител), которые иммуноспецифически связываются с полипептидом ICOS.
В настоящем изобретении предусмотрены способы контроля, лечения или облегчения состояния при аутоиммунных расстройствах или одном или нескольких их симптомах у субъекта, неподдающегося лечению обычными способами, предназначенными для таких аутоиммунных расстройств, указанные способы включают введение указанному субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией. Настоящее изобретение также предусматривает способы контроля, лечения или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких их симптомов у субъекта, неподдающегося лечению единственным лечебным агентом, предназначенным для таких аутоиммунных расстройств, указанные способы, включающие введение указанному субъекту дозы профилактически или терапевтически эффективного количества анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией и дозы профилактически или терапевтически эффективного количества одного или нескольких лекарственных средств (например, профилактических или терапевтических агентов), не являющихся антителами (или фрагментами антител), которые иммуноспецифически связываются с полипептидом ICOS. Настоящее изобретение также представляет способы контроля, лечения или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких их симптомов путем введения анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в комбинации с каким-либо другим лечением пациентов, у которых была подтверждена неэффективность другого лечения и оно более не продолжается. Настоящее изобретение также представляет другие способы контроля или лечения аутоиммунных расстройств, если было установлено, что другие терапии слишком токсичны или могут оказаться слишком токсичными, т.е., приводят к неприемлемым или непереносимым побочным эффектам у субъекта, подвергаемого лечению. В частности настоящее изобретение представляет другие способы для контроля или лечения аутоиммунных расстройств, при которых пациент отвергает другие терапии. Кроме того, настоящее изобретение представляет способы предупреждения рецидива аутоиммунных расстройств у пациентов, которых лечили и у которых не было проявления болезни после введения анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией.
К примерам аутоиммунных расстройств, которые можно лечить способами по настоящему изобретению, относятся, но ими не ограничиваются, гнездная плешивость, анкилозирующий спондилоартрит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, аутоиммунная тромбоцитопения, болезни Бехчета, пемфигоид буллезный, кардиомиопатия, целиакический спру-дерматит, синдром хронической усталости и дисфункции иммунной системы, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (ХВДП), синдром Чарджа-Стросса, рубцовый пемфигоид, CREST синдром, холодовая агглютининовая болезнь, болезнь Крона, дискоидная красная волчанка, смешанная криоглобулинемия, диабет, эозинофильный фасцит, фибромиалгия-фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена-Барре, тиреоидит Хасимото, пурпура Henoch-Schonlein, идиопатический фиброз легких, идиопатическая/аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), IgA нейропатия, ювенильный артрит, плоский лишай, красная волчанка, болезнь Меньера, смешанная соединительно-тканная болезнь, рассеянный склероз, первого типа или опосредованный иммунной системой сахарный диабет, миастения тяжелая псевдопаралитическая, вульгарная пузырчатка, пернициозная анемия, узелковый полиартериит, полихондрит, многожелезистый синдром, полимиалгия ревматическая, полимиозит и дерматомиозитом, первичная агаммаглобулинэмия, первичный билиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, феномен Рейнольд, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродерма, синдром Шенгрена, синдром мышечной скованности, системная красная волчанка, красная волчанка, синдром Свита, болезнь Стилла, красная волчанка, артериит Такаясу, преходящий артрит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, васкулит, например, дерматитный герпетиформный васкулит, витилиго и гранулематоз Вегенера.
Аутоиммунные терапии и дозировки, способы введения и рекомендации по применению известны в данной области и описаны, например, в кн.: «Physician's Desk Reference», 2007, 61-е изд.
Лечение аутоиммунного расстройства
В настоящем изобретении предусмотрены способы предупреждения, контроля, лечения или облегчения состояния при аутоиммунных расстройствах или одном или нескольких их симптомах, указанные способы включают введение субъекту, нуждающемуся в этом, анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией и одного или нескольких лекарственных средств (например, профилактических или терапевтических агентов), не являющихся антителами (или фрагментами антител), которые иммуноспецифически связываются с полипетидом ICOS. Какой-либо агент или терапия, полезность применения которых известна и которые применялись или в настоящее время применяются для предупреждения, контроля, лечения или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких их симптомов, могут применяться в комбинации с анти-ICOS антителом по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в соответствии с настоящим изобретением. К примерам таких агентов относятся, но ими не ограничиваются, иммуномодулирующие агенты, противовоспалительные агенты и антагонисты ФНО-альфа. Характерные примеры иммуномодулирующих агентов, противовоспалительных агентов и антагонистов ФНО-альфа, которые могут применяться в комбинации с анти-ICOS антителом по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией для предупреждения, контроля, лечения или облегчения аутоиммунных расстройств, описаны в настоящем изобретении.
2
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациентам с рассеянным склерозом вводят профилактически или терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в комбинации с другими агентами или терапиями, применимыми для предупреждения, контроля, лечения или облегчения состояния при рассеянном склерозе, включая, но ими не ограничиваясь: ИФН-бета1 (бетасерон) (например, 8,0 миллионов международных единиц (ММЕ) вводят подкожной инъекцией через день), ИФН-бета1а (авонекс) (например, 6,0 ММЕ вводят внутримышечной инъекцией раз в неделю), глатирамер ацетат (копаксон) (например, 20 мг вводят подкожной инъекцией ежедневно), митоксантрон (например, 12 мг/м вводят внутривенной инфузией раз в три месяца), азатиоприн (например, 2-3 мг/кг массы тела вводят перорально ежедневно), метотрексат (например, 7,5 мг вводят перорально еженедельно), циклофосфамид, внутривенный иммуноглобулин (например, 0,15-0,2 г/кг массы тела вводят ежемесячно до двух лет), глюкокортикоиды, метилпреднизолон (например, вводимый раз в два месяца в высоких дозах), 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин), баклофен (например, 15-80 мг/сутки в виде нескольких доз, или перорально в повышенных дозах до 240 мг/сутки, или интратекально через постоянный катетер), циклобензаприн гидрохлорид (например, 5-10 мг дважды в сутки или три раза в сутки), клоназепам (например, 0,5-1,0 мг три раза в сутки, включая дозу на ночь), клонидин гидрохлорид (например, 0,1-0,2 мг три раза в сутки, включая дозу перед сном), карбамазепин (например, 100-1200 мг/сутки в виде нескольких возрастающих доз), габапентин (например, 300-3600 мг/сутки), дилантин (например, 300-400 мг/сутки), амитриптилин (например, 25-150 мг/сутки), баклофен (например, 10-80 мг/сутки), примидон (например, 125-250 мг дважды в сутки или три раза в сутки), ондансетрон (например, 4-8 мг дважды в сутки или три раза в сутки), изониазид (например, до 1200 мг в виде нескольких доз), оксибутинин (например, 5 мг дважды в сутки или три раза в сутки), толтеродин (например, 1-2 мг дважды в сутки), пропантелин (например, 7,5-15 мг четыре раза в сутки), бетанекол (например, 10-50 мг три раза в сутки или четыре раза в сутки), теразозин гидрохлорид (например, 1-5 мг на ночь), силденафил цитрат (например, 50-100 мг перорально по необходимости), амантадинг (например, 100 мг дважды в сутки), пемолин (например, 37,5 мг дважды в сутки), высокие дозы витаминов, оротат кальция, ганцикловир, антибиотик и обменное переливание плазмы.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения больным псориазом вводят профилактически или терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией по настоящему изобретению в комбинации с другими агентами или типами лечения, применимыми для предупреждения, лечения, контроля или облегчения псориаза, включая, но ими не ограничиваясь, крем или мазь со стероидами для местного применения, тар (примерами являются, но ими не ограничиваются, эстар, псоригель, мазь фототар и LCD 10% в лосьоне нутрадерм или непосредственно в смеси с мазью триамцинолон 0,1%), окклюзия, местный аналог витамина D (неограничивающим примером является мазь с кальцитоприеном), ультрафиолет, PUVA (psoralen plus ultraviolet A - фотосенсибилизирующее средство псорален плюс облучение длинноволновыми УФ-лучами), метотрексат (например, до 25 мг раз в неделю, или 25 мг в виде нескольких доз каждые 12 ч для трех доз раз в неделю), синтетический ретиноид (неограничивающим примером является этретинат, например, в дозах 0,5-1 мг/кг/сутки), иммуномодулирующая терапия (циклоспорин, но не только он), сульфасалазин (например, в дозах 1 г трижды в сутки).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациентам с болезнью Крона вводят профилактически и терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией по настоящему изобретению в комбинации с другими агентами или типами лечения, применимыми для предупреждения, лечения, контроля и облегчения состояния при болезни Крона, включая, но, не ограничиваясь ими, противодиаретические средства (например, лоперамид 2-4 мг до 4 раз в сутки, дифеноксилат с атропином по 1 таблетке до 4 раз в сутки, настойка опиума в количестве 8-15 капель до 4 раз в сутки, холестирамин в количестве 2-4 г или колестипол в количестве 5 г 1 или 2 раза в сутки), противосудорожные агенты (например, пропантелин в количестве 15 мг, дицикломин в количестве 10-20 мг или гиосциамин в количестве 0,125 мг перед едой), агенты 5-аминосалициловой кислоты (например, сульфасалазин в количестве 1,5-2 г дважды в сутки, мезаламин (продукт ASACOL™) и его медленно высвобождаемая форма (продукт PENTASA™), особенно в высоких дозах, например, продукт PENTASA™ 1 г четыре раза в сутки и продукт ASACOL™ 0,8-1,2 г четыре раза в сутки), кортикостероиды, иммуномодулирующие лекарственные средства (например, азатиоприн (1-2 мг/кг), меркаптопурин (50-100 мг), циклоспорин и метотрексат), антибиотики, ингибиторы ФНО (например, инфликсмаб (продукт REMICADE™)), иммуносупрессивные агенты (например, такролимус, микофенолят мофетил и талидомид), противовоспалительные цитокины (например, ИЛ-10 и ИЛ-11), лечебное питание, энтеральная терапия с элементными диетами (например, вивонекс в течение 4 недель) и полное парентеральное питание.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациентам с красной волчанкой вводят профилактически или терапевтически эффективное количество анти-ICOS антитела по настоящему изобретению с повышенной эффекторной функцией в комбинации с другими агентами или терапиями, применимыми для предупреждения, лечения, контроля и облегчения состояния при красной волчанке, включая, но ими не ограничиваясь: противомалярийные средства (включая, но им не ограничиваясь, гидроксихлорохин), глюкокортикоиды (например, могут применяться низкая доза, высокая доза или внутривенная пульс-терапия высоких доз), иммуносупрессивные агенты (включая, но ими не ограничиваясь, циклофосфамид, хлорамбуцил и азатиоприн), цитотоксические агенты (включая, но ими не ограничиваясь, метотрексат и микофенолят мофетил), андрогенные стероиды (включая, но им не ограничиваясь, даназол) и антикоагулянты (включая, но им не ограничиваясь, варфарин).
Составы антител по настоящему изобретению или комбинированные терапии по настоящему изобретению могут применяться в качестве первой, второй, третьей, четвертой или пятой терапии для предупреждения, контроля, лечения и/или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких его симптомов. Настоящее изобретение также включает способы предупреждения, лечения, контроля и/или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких его симптомов у пациентов, подвергаемых лечению других заболеваний или расстройств. Настоящее изобретение также относится к разработке способов предупреждения, коррекции, лечения и/или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких их симптомов у пациента до каких-либо побочных эффектов или устойчивости к лечению, отличному от лечения антителами по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, коррекции, лечения и/или облегчения аутоиммунных расстройств или их симптомов у пациентов, для которых другое лечение неэффективно. Настоящее изобретение также относится к способам предупреждения, коррекции, лечения и/или облегчения пролиферативных расстройств или их симптомов у пациентов, у которых установлено, что неэффективны другие способы лечения, отличные от антител, композиций или комбинированного лечения по настоящему изобретению. Определение невосприимчивости пациента к лечению может быть произведено или in vivo, или in vitro, каким-либо способом, известным в данной области для оценки эффективности лечения аутоиммунных расстройств, используя принятое в настоящей области понятие «невосприимчивости к лечению», употребляемое в указанном контексте. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пациент с аутоиммунным расстройством невосприимчив к лечению, если один или несколько симптомов аутоиммунных расстройств не оказался предупрежденным, скорректированным и/или облегченным. Настоящее изобретение также охватывает способы предупреждения, коррекции, лечения и/или облегчения аутоиммунных расстройств или их симптомов у пациентов, чувствительных к побочным реакциям, связанным с традиционными способами лечения.
Настоящее изобретение охватывает способы предупреждения, лечения, коррекции и/или облегчения аутоиммунных расстройств или одного или нескольких симптомов присущих им симптомов в качестве иного варианта традиционных способов лечения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения проводят коррекцию или лечение в соответствии со способами настоящего изобретения при устойчивости к другим способам лечения или при чувствительности к побочным реакциям, возникающим в результате такого лечения. Пациенты, которые могут иметь подавленную иммунную систему (например, после операции, химиотерапии, или при бронхолегочной дисплазии, врожденном пороке сердца, муковисцидозе, пациенты с приобретенным или врожденным заболеванием сердца или у инфицированных больных), а также пациенты с нарушенной функцией печени или почек, пожилые люди, дети, новорожденные, недоношенные дети, пациенты с нервно-психиатрическими расстройствами или пациенты, принимающие психотропные средства, пациенты с эпилептическим припадком в анамнезе, или пациенты, находящиеся на лечении, которое может отрицательно взаимодействовать с традиционными лекарственными средствами, используют для предупреждения, коррекции, лечения или облегчения аутоиммунных заболеваний или расстройств.
Способы лечения аутоиммунных заболеваний и дозировки, способы введения и рекомендации по применению известны в данной области и могут быть описаны в литературе в данной области, например, в кн.: «Physician's Desk Reference», 2007, 61-е изд.
Диагностика аутоиммунных заболеваний или расстройств
Диагностика аутоиммунных заболеваний или расстройств осложнена тем, что каждый тип аутоиммунного заболевания или расстройства по-разному проявляется у разных пациентов. Такая гетерогенность симптомов связана с тем, что при установке клинического диагноза обычно используют множество факторов. Обычно врачи используют определенные признаки, например, наличие аутоантител, повышенные уровни цитокинов, специфическую дисфункцию органов, кожную сыпь, опухание суставов, боль, деформацию костей и/или утрату подвижности, в качестве первичных показателей аутоиммунного заболевания или расстройства. В данной области для определенных аутоиммунных заболеваний или расстройств, например, для ревматоидного артрита и системной красной волчанки, стандарты диагностики установлены. Для некоторых аутоиммунных заболеваний или расстройств стадии заболевания описаны и хорошо известны. В данной области способы диагностики аутоиммунных заболеваний или расстройств, а также стадий заболевания и масштаба действия и/или тяжести заболевания, известны в данной области и могут применяться для идентификации больных и групп больных, нуждающихся в лечении аутоиммунных заболеваний или расстройств, используя композиции и методы по настоящему изобретению.
Клинические критерии для диагностики аутоиммунных заболеваний или расстройств
Диагностические критерии для разных аутоиммунных заболеваний или расстройств известны в данной области. Исторически диагноз обычно основывается на комбинации физических симптомов. В последнее время молекулярные методы, например, профилирование генной экспрессии, применялись для разработки молекулярных критериев аутоиммунных заболеваний или расстройств. Примеры методов клинической диагностики определенных аутоиммунных заболеваний или расстройств приводятся ниже. Другие применимые методы могут быть известны специалистам в данной области.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения больные с низкими уровнями активности аутоиммунного заболевания или больные на ранней стадии аутоиммунного заболевания (это касается заболеваний, стадии которого установлены) могут быть идентифицированы для лечения, используя композиции анти-ICOS антитела и способы. Ранняя диагностика аутоиммунного заболевания затруднена из-за того, что симптомы являются общими с симптомами других заболеваний. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при лечении больного на ранней стадии или при наличии низких уровней проявления аутоиммунного заболевания симптомы включают, по меньшей мере один симптом аутоиммунного заболевания или расстройства. В других близких вариантах осуществления настоящего изобретения подвергаемый лечению больной на ранней стадии или при низких уровнях аутоиммунного заболевания имеет симптомы, среди которых имеется, по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 симптомов аутоиммунного заболевания или расстройства. Симптомы могут принадлежать какому-либо аутоиммунному заболеванию или расстройству или их комбинациям. Примеры аутоиммунных заболеваний и расстройств описаны ниже.
Иммунотерапевтические протоколы
Композиции анти-ICOS антител, используемые в терапевтических режимах/протоколах, относятся в контексте настоящего изобретения к «анти-ICOS иммунотерапии» и могут быть «голыми» антителами, иммуноконъюгатами и/или гибридными белками. Композиции по настоящему изобретению могут быть применены в виде единичного лечебного агента или в комбинации с другими терапевтическими агентами или режимами. Анти-ICOS антитела или иммуноконъюгаты могут вводиться до, одновременно или после введения одного или нескольких терапевтических агентов. Терапевтические агенты, которые могут применяться в комбинированных терапевтических режимах с композициями по настоящему изобретению, включают какое-либо вещество, которое ингибирует или предупреждает функцию клеток и/или причины деструкции клеток. К примерам относятся, но ими не ограничиваются, радиоактивные изотопы, химиотерапевтические агенты и токсины, например, токсины с ферментативным действием из бактерий, грибов, растений или животных, или их фрагменты.
Терапевтические режимы, описанные в настоящем изобретении, или какие-либо желаемые схемы лечения могут быть исследованы на эффективность, используя модель трансгенного животного, которая экспрессирует ICOS антиген человека вместо нативного ICOS антигена. Таким образом, режим лечения анти-ICOS антителом может быть исследован в модели животного для определения эффективности до введения человеку.
Анти-ICOS иммунотерапия
В настоящем изобретении понятие «анти-ICOS иммунотерапия» охватывает введение какого-либо из анти-ICOS антител по настоящему изобретению по какому-либо из режимов лечения, описанных в настоящем изобретении. Анти-ICOS антитела могут быть введены в качестве «голых» антител, или иммуноконъюгатов, или гибридных белков. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пациента с заболеванием или расстройством, опосредованным Т-клетками, можно лечить введением анти-ICOS антитела, способного опосредовать АЗКЦ человека.
Антитела изотипов IgG1 или IgG3 человека в некоторых случаях предпочтительны для лечения. Однако изотипы IgG2 или IgG4 человека также могут применяться в том случае, если они обладают соответствующей эффекторной функцией, например, АЗКЦ человека. Такая эффекторная функция может быть оценена по измерению способности исследуемого антитела опосредовать лизис клеток-мишеней эффекторными клетками in vitro или in vivo.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения доза применяемого антитела должна быть достаточной для истощения циркулирующих ICOS-экспрессирующих Т-клеток. Успешность лечения больного может подвергаться мониторингу по анализу образцов крови. Другие признаки улучшения клинического состояния могут учитываться при мониторинге течения.
Методы измерения истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток, которые могут быть применены в композициях и способах по настоящему изобретению, хорошо известны в данной области, но приведенными в указанных ниже вариантах осуществления их перечень не ограничивается. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения истощение циркулирующих ICOS-экспрессирующих Т-клеток может быть измерено методом жидкостной цитометрии, используя реагент, отличный от анти-ICOS антитела, который связывается с ICOS-экспрессирующими Т-клетками, для определения количества ICOS-экспрессирующих Т-клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения истощение ICOS-экспрессирующих Т-клеток может быть измерено иммунохимическим окрашиванием для идентификации ICOS-экспрессирующих Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ICOS-экспрессирующие Т-клетки, или ткани, или сыворотка, включающие ICOS-экспрессирующих Т-клетки, выделенные от пациента, могут быть помещены на предметные стекла для микроскопии, на них наносится метка и проводится исследование на наличие или отсутствие. В других вариантах осуществления настоящего изобретения сравнивают ICOS-экспрессирующие Т-клетки, выделенные до и после лечения, для определения различий в наличии ICOS-экспрессирующих Т-клеток.
В вариантах осуществления настоящего изобретения, если анти-ICOS антитело вводят в виде одного лечебного агента, представляют разные режимы лечения.
В некоторых объектах по настоящему изобретению анти-ICOS антитело, используемое в композициях и способах по настоящему изобретению, является «голым» антителом. В близких вариантах осуществления настоящего изобретения используемая доза «голого» анти-ICOS антитела составляет по меньшей мере примерно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 15, 15,5, 16, 16,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 19,5, 20, 20,5 мг/кг массы тела больного. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения используемая доза «голого» анти-ICOS антитела составляет, по меньшей мере примерно 1-10, 5-15, 10-20 или 15-25 мг/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза используемого «голого» анти-ICOS антитела составляет, по меньшей мере примерно 1-20, 3-15 или 5-10 мг/кг массы тела пациента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения доза используемого «голого» анти-ICOS антитела составляет, по меньшей мере примерно 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг массы тела пациента.
2
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза включает примерно 375 мг/м анти-ICOS антитела, вводимого еженедельно на протяжении примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 последовательных недель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения доза составляет по меньшей мере примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, или 15 мг/кг массы тела пациента и вводится еженедельно на протяжении примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 последовательных недель.
Примеры доз анти-ICOS антитела, описанные выше, могут вводиться согласно описанному выше. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанные выше дозы представляют разовые инъекции. В других вариантах осуществления настоящего изобретения дозы вводят на протяжении некоторого времени. В других вариантах осуществления настоящего изобретения дозы вводят много раз на протяжении некоторого времени. Период времени может исчисляться днями, неделями или месяцами. Многократные дозы анти-ICOS антитела могут вводиться с интервалами, пригодными для достижения полезного терапевтического результата и уравновешивающими токсические побочные эффекты. Например, при использовании многократных доз может быть предпочтительным синхронизировать интервалы для достижения восстановления количества моноцитов у пациентов до повторного лечения антителом. Такой режим дозирования может оптимизировать эффективность лечения, поскольку популяция моноцитов отражает функцию АЗКЦ у больного.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению вводят больному человеку до тех пор, пока пациент отвечает на терапию. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению вводят больному человеку до тех пор, пока болезнь не начинает прогрессировать. В близких вариантах осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению вводят больному человеку до тех пор, пока болезнь не начинает прогрессировать или не прогрессирует определенный период времени, после чего пациенту композиции по настоящему изобретению не вводят до тех пор, пока болезнь не возникнет снова или не начнет опять прогрессировать. Если прогрессирование заболевания прекращается или ревертирует, пациенту не следует вводить композиции по настоящему изобретению до тех пор, пока у пациента не возникнет рецидива, т.е. пока подвергавшееся лечению заболевание не возникло вновь или не стало прогрессировать. Если заболевание возникло вновь или стало прогрессировать, пациента можно опять лечить в том же режиме дозирования, который использовался первоначально, или используя другие дозы, описанные выше.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения композиции по настоящему изобретению могут быть введены в виде ударных доз после многократных более низких доз (поддерживающих доз) на протяжении определенного периода времени. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения дозы могут быть спланированы по времени, а количество подобрано для поддержания истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ударная доза составляет примерно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 мг/кг массы тела пациента, а поддерживающая доза составляет, по меньшей мере примерно 5-10 мг/кг массы тела пациента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения поддерживающую дозу вводят один раз каждые 7, 10, 14 или 21 сутки.
Комбинация с химиотерапевтическими агентами
Анти-ICOS иммунотерапия (используя «голое» антитело, иммуноконъюгаты или гибридные белки) может применяться вместе с другими терапиями, включая, но, не ограничиваясь ими, химиотерапию, радиоиммунотерапию (РИТ), химиотерапию и радиоиммунотерапию внешним пучком радиации (combined modality therapy, CMT) или комбинированную воздействующую радиоиммунотерапию одной или в комбинации и др. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапия анти-ICOS антителом по настоящему изобретению может быть проведена вместе с применением циклофосфамида-гидроксидоксорубицина-онковина (винкристина)-преднизолона. В контексте настоящего изобретения понятие «введенное вместе с» означает, что анти-ICOS иммунотерапия может быть осуществлена до, во время или после другой применяемой терапии.
225
224
211
212
213
212
224
223
186
188
90
131
67
177
153
166
64
125
123
77
198
32
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммунотерапия анти-ICOS применяют вместе с цитотоксическим радионуклидом или радиотерапевтическим изотопом. Например, альфа-излучающий изотоп, например, Ас, Ac, At, Bi, Bi, Pb, Ra или Ra. Цитотоксический радионуклид также может быть бета-излучающим изотопом, например, Re, Re, Y, I, Cu, Lu, Sm, Ho или Cu. Кроме того, цитотоксические радионуклиды могут испускать и низкоэнергетические электроны и включают изотопы I, I или Br. В других вариантах осуществления настоящего изобретения изотопом могут быть Au, P и др. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения количество введенного субъекту радионуклида составляет примерно от 0,001 мКюри/кг и примерно до 10 мКюри/кг.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения количество введенного субъекту радионуклида составляет примерно от 0,1 мКюри/кг и примерно до 1,0 мКюри/кг. В других вариантах осуществления настоящего изобретения количество введенного субъекту радионуклида составляет примерно от 0,005 мКюри/кг до 0,1 мКюри/кг.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS иммунотерапию проводят в сочетании с химическим токсином или химиотерапевтическим агентом. Химический токсин или химиотерапевтический агент могут быть выбраны из группы, состоящей из энедиина, например, калихимицина и эсперамицина, дуокармицина, метотрексата, доксорубицина, мелфалана, хлорамбуцила, ARA-C, виндезина, митомицина С, цисплатина, этопозида, блеомицина и 5-фторурацила.
Соответствующие химические токсины или химиотерапевтические агенты, которые могут применяться в комбинированной терапии с анти-ICOS иммунотерапией, включают представителей семейства молекул энедиина, например, калихимицин и эсперамицин. Химические токсины также могут быть взяты из группы, состоящей из дуокармицин (см., например, US 5703080 и US 4923990), метотрексата, доксорубицина, мелфалана, хлорамбуцина, ARA-C, виндезина, митомицина С, цис-платина, этопозида, блеомицина и 5-фторурацила. К примерам химиотерапевтических агентов также относятся адриамицин, доксорубицин, 5-фторурацил, цитозинарабинозин («Ara-С»), циклофосфамид, тиотепа, таксотер (доцетаксел), бусульфан, цитоксин, таксол, метотрексат, цисплатин, мелфалан, винбластин, блеомицин, этопозид, ифосфамид, митомицин С, митоксантрон, винкрестин, винорелбин, карбоплатин, тенипозид, дауномицин, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, итомицины, эсперамицины (см. US 4675187), мелфалан и другие агенты, родственные азотистому иприту.
2
2
2
В других вариантах осуществления настоящего изобретения, например, "CVB" (1,5 г/м циклофосфамида, 200-400 мг/м этопозида и 150-200 мг/мкармустина) может применяться в способах комбинированной терапии по настоящему изобретению. CVB является режимом, применяемым для лечения неходжкинской лимфомы. Patti и др., Eur. J. Haematol. 51, 1993, с.18. Другие соответствующие режимы комбинированной химиотерапии известны специалистам в данной области. См., например, работу Freedman и др., «Non-Hodgkin's Lymphomas» в кн.: «МОЖЕТCER MEDICINE», 1993, под ред. Holland и др., изд-во Lea & Febiger, 3-е изд., т.2, cc.2028-2068. Примером являются химиотерапевтические режимы первого поколения для лечения стадии средней тяжести неходжскинской лимфомы, которые включают С-МОРР (циклофосфамид, винкристин, прокарбазин и преднизон) и CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон). Применимым химиотерапевтическим режимом второго поколения является режим m-BACOD (метотрексат, блеомицин, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, дексаметазон и лейковорин), а применимым режимом третьего поколения является режим МАСОР-В (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, преднизон, блеомицин и лейковорин). Дополнительными соответствующими лекарственными средствами являются фенилбутират и бростатин-1. При комбинированной терапии оба химиотерапевтических лекарственных агента и цитокины вводят совместно с антителом, иммуноконъюгатом или гибридным белком в соответствии с настоящим изобретением. Цитокины, химиотерапевтические лекарственные средства и антитело, иммуноконъюгат или гибридный белок могут вводиться каким-либо порядком или совместно.
К другим токсинам, которые могут быть применимы в композициях и способах по настоящему изобретению, относятся ядовитые лектины, растительные токсины, например, рицин, абрин, модексин, ботулинический и дифтерийный токсины. Безусловно, комбинации различных токсинов также могут быть соединены с одной молекулой антитела, тем самым, подбирая различную цитотоксичность. Примерами токсинов, пригодных для использования в комбинированных лечениях по настоящему изобретению, являются рицин, абрин, рибонуклеаза, ДНКаза I, стафилококковый энтеротоксин-А, противовирусный белок фитолакки американской (Phytolacca americana), гелонин, дифтерийный токсин, экзотоксин Pseudomonas и эндотоксин Pseudomonas. См., например, публикации Pastan и др., Cell 47, 1986, с.641, Goldenberg и др., Cancer Journal for Clinicians, 44, 1994, с.43. Могут быть применены ферментативно активные токсины и их фрагменты, в том числе цепь А дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модексина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки из Phytolaca americana (PAPI, PAPII, и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. См., например, WO 93/21232.
Соответствующие токсины и химиотерапевтические агенты описаны в кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1995, 19-е изд., изд-во Mack Publishing Co., и в кн.: «GOODMAN and GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХS», 7-е изд., изд-во MacMillan Publishing Co. Другие соответствующие токсины и/или химиотерапевтические агенты известны специалистам в данной области.
Анти-ICOS иммунотерапия по настоящему изобретению также может производиться с пролекарство-активирующим ферментом, который конвертирует пролекарство (например, пептидильный химиотерапевтический агент, см., WO81/01145) в активное противораковое лекарственное средство. См., например, WO 88/07378 и US 4975278. Ферментный компонент таких комбинаций включает какой-либо фермент, способный воздействовать на пролекарство таким образом, чтобы конвертировать его в более действенную цитотоксическую форму. Понятие «пролекарство» в контексте настоящего изобретения относится к предшественнику или производной форме фармацевтически активного вещества, которое менее цитотоксично по отношению к опухолевым клеткам по сравнению с исходным пролекарством и является ферментативно активированным или конвертированным в более активную исходную форму. См., например, Wilman в кн.: «Prodrugs in Cancer Chemotherapy. Biochemical Society Transactions», 1986, т.14, cc.375-382, 615-е Заседание в Белфасте, и Stella и др. В кн. «Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery. Directed Drug Delivery», 1985, под ред. Borchardt и др., изд-во Humana Press, cc.247-267. К пролекарствам, которые могут применяться в комбинации с анти-ICOS антителами, относятся, но ими не ограничиваются, фосфат-содержащие пролекарства, тиофосфат-содержащие пролекарства, сульфат-содержащие пролекарства, пептид-содержащие пролекарства, пролекарства, модифицированные по D-аминокислотам, гликозилированные пролекарства, a-лактам-содержащие пролекарства, необязательно замещенные феноксиацетамид-содержащими пролекарствами или необязательно замещенные фенилацетамид-содержащими пролекарствами, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридин пролекарства, которые могут быть конвертированы в более активные цитотоксические свободные лекарства. Примерами цитотоксических лекарств, которые могут быть преобразованы в форму пролекарства для применения в настоящем изобретении, являются, но ими не ограничиваются, химиотерапевтические агенты, описанные выше.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения введение композиций и применение способов по настоящему изобретению могут помочь избежать нежелательных побочных эффектов и рисков осложнений, связанных с химиотерапией, и отсрочить развитие устойчивости к химиотерапии. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лечение токсическими агентами и/или устойчивость к лечению токсическими агентами отсрочены у пациентов, которым вводят композиции и в отношении которых применяют способы по настоящему изобретению, примерно до 6 месяцев, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет.
Комбинация с терапевтическими антителами
Агенты анти-ICOS иммунотерапии, описанные в настоящем изобретении, могут вводиться в комбинации с другими антителами, включая, но, не ограничиваясь ими, анти-CD19 моноклональное антитело, анти-CD52 моноклональное антитело, анти-CD22 антитело и анти-CD20 антитела, например, продукт RITUXAN™ (C2B8, продукт RITUXIMAB™, фирма IDEC Pharmaceuticals). К другим примерам терапевтических антител, которые могут применяться в комбинации с антителами по настоящему изобретению или в композициях по настоящему изобретению, относятся, но ими не ограничиваются, продукт HERCEPTIN™ (трастузумаб, фирма Genentech), продукт MYLOTARG™ (гемтузумаб озогамицин, фирма Wyeth Pharmaceuticals), продукт САМРАТН™ (алемтузумаб, фирма Berlex), продукт ZEVALIN™ (ипритумомаб тиуксетан, фирма Biogen Idec), продукт BEXXAR™ (тоситумомаб, фирма GlaxoSmithK-line Corixa), продукт ERBITUX™ (цетуксимаб, фирма Imclone) и продукт AVASTIN™ (бетацизумаб, фирма Genentech).
Комбинируемые соединения, которые повышают функцию моноцитов или макрофагов
В некоторых вариантах осуществления способов по настоящему изобретению соединение, которое усиливает функцию моноцитов или макрофагов (например, по меньшей мере примерно на 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% или более), может быть использовано вместе с анти-ICOS иммунотерапией. Такие соединения известны в данной области, и к ним относятся, но ими не ограничиваются, цитокины, например, интерлейкины (например, ИЛ-12) и интерфероны (например, альфа или гамма интерферон).
9
9
9
9
9
9
9
Соединение, которое усиливает функцию моноцитов или макрофагов, может быть переработано в ту же фармацевтическую композицию, что и антитело, иммуноконъюгат или антигенсвязывающий фрагмент. При раздельном введении антитело/фрагмент и соединение могут быть введены последовательно (с интервалом несколько часов), во время общего курса терапии или может быть введено последовательно (т.е., сначала пациент получает курс лечения антителом/фрагментом и затем курс лечения соединением, которое повышает функцию макрофагов/моноцитов, или наоборот). В таких вариантов осуществления настоящего изобретения соединение, которое повышает функцию моноцитов или макрофагов, вводят человеку до, одновременно или после лечения другими терапевтическими режимами и/или композициями по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения у больного человека содержание в крови лейкоцитов, моноцитов, нейтрофилов, лимфоцитов и/или базофилов находится в диапазоне нормы для людей. Нормальные диапазоны содержания в крови человека лейкоцитов (общее) составляют примерно 3,5-10,5 (10/л). Нормальные диапазоны содержания в крови человека нейтрофилов составляют примерно 1,7-7,0 (10/л), моноцитов - примерно 0,3-0,9 (10/л), лимфоцитов - примерно 0,9-2,9 (10/л), базофилов - примерно 0-0,3 (10/л) и эозинофилов - примерно 0,05-0,5 (10/л). В других вариантах осуществления настоящего изобретения в крови человека содержится лейкоцитов менее диапазона нормы для людей, например по меньшей мере примерно 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 или 0,8 (10/л) лейкоцитов.
Комбинация с иммунорегулирующими агентами
2
Анти-ICOS иммунотерапия по настоящему изобретению может также быть в сочетании с иммунорегулирующим агентом. Понятие «иммунорегулирующий агент» в контексте настоящего изобретения применительно к комбинированному лечению относится к веществам, которые действуют, супрессируя, маскируя или повышая иммунную систему хозяина. К примерам иммуномодулирующих агентов относятся, но ими не ограничиваются, белковые агенты, например, цитокины, пептидные миметики и антитела (например, человека, гуманизированные, химерные, моноклональные, поликлональные, Fvs, ScFvs, Fab или F(ab) фрагменты или эпитоп-связывающие фрагменты), молекулы нуклеиновых кислот (например, молекулы антисмысловых нуклеиновых кислот, РНКи и трехцепочечные спирали), низкомолекулярные агенты, органические соединения и неогранические соединения. В частности, к иммуномодулирующим агентам относятся, но ими не ограничиваются, метотрексат, лефлуномид, циклофосфамид, цитоксан, иммуран, циклоспорин А, миноциклин, азатиоприн, антибиотики (например, FK506 (такролимус)), метилпреднизалон (МП), кортикостероиды, стероиды, микофенолят мофетил, рапамицин (сиролимус), мизорибин, дезоксиспергуалин, бреквинар, малононитриламиды (например, лефлунамид), модуляторы рецептора Т-клеток и модуляторы рецептора цитокина. К примерам иммуносупрессантов относятся, но ими не ограничиваются, микофенолят мофетил (продукт CELLCEPT™), D-пенициламин (продукты CUPRIMINE™, DEPEN™), метотрексат (продукты RHEUMATREX™, TREXALL™) и гидроксихлорохин сульфат (продукт PLAQUENIL™).
К иммуномодулирующим агентам также могут относиться вещества, которые подавляют выработку цитокинов, понижают или подавляют экспрессию аутоантигена или маскируют антигены главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). К примерам таких агентов относятся 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см. US 4665077), азатиоприн (или циклофосфамид, если есть побочная реакция на азатиоприн), бромкриптин, глутаральдегид (который маскирует антигены ГКГ согласно описанию в US 4120649), анти-идиотипические антитела в отношении антигенов ГКГ и фрагменты ГКГ, циклоспорин А, стероиды, например, глюкокортикостероиды, например, преднизон, метилпреднизолон и дексаметазон, антагонисты цитокина или рецептора цитокина, включая анти-интерферон-гамма, -бета или -альфа антитела, анти-фактор некроза опухолей-альфа антитела, анти-фактор некроза опухолей-бета антитела, анти-интерлейкин-2 антитела и антитела к рецептору анти-ИЛ-2, анти-L3T4 антитела, гетерологичный анти-лимфоцитарный глобулин, pan-Т антитела, предпочтительно анти-CD3 или анти-CD4/CD4a антитела, растворимый пептид, содержащий LFA-3 связывающий домен (WO 90/08187), стрептокиназа, TGF-.beta., стрептодомаза, РНК или ДНК из организма хозяина, FK506, RS-61443, дезоксиспергуалин, рапамицин, рецептор Т-клеток (US 5114721), фрагменты рецептора Т-клеток (Offner и др., Science 251, 1991, cc.430-432, WO 90/11294, WO 91/01133), антитела к рецептору Т-клеток (ЕР 340109), например, Т10В9.
К примерам цитокинов относятся, но ими не ограничиваются, лимфокины монокины и обычные полипептидные гормоны. Среди цитокинов имеются гормон роста, например, гормон роста человека, N-метионил гормона роста человека и гормон роста быка, паращитовидный гормон, тироксин, инсулин, проинсулин, релаксин, прорелаксин, гликопротеиновые гормоны, например, фолликуло-стимулирующий гормон (ФСГ), гормон стимуляции щитовидки и лютеинизирующий гормон (ЛГ), фактор роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген, фактор некроза опухолей альфа, ингибирующее вещество Мюллера, гонадотропин-ассоциированный пептид мыши, ингибин, активин, сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor - VEGF), интегрин, тромбопоэтин (ТПО), фактор роста нервов (nerve growth factor - NGF), например, NGF-альфа, фактор роста тромбоцитов (platelet-growth factor - PGF), трансформирующие факторы роста (transforming growth factor - TGF), например, TGF-альфа и TGF-альфа, инсулиноподобный фактор роста-I и -II, эритропоэтин (ЭПО), остеогенные факторы, интерфероны, колониестимулирующие факторы (colony stimulating factor - CSF), например, колониестимулирующий фактор макрофагов (macrophage-CSF - M-CSF), колониестимулирующий фактор роста гранулоцитов-макрофагов (granulocyte-macrophage-CgP - GM-CSP) и колониестимулирующий фактор роста гранулоцитов (granulocyte-CSF - G-CSF), интерлейкины (ИЛ), например, ИЛ-1, ИЛ-1а, ИЛ-2, 1L-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-15, фактор некроза опухолей, например, ФНО-альфа или ФИО-бета, и другие полипептидные факторы, включая LIF и kit ligand (KL). В контексте настоящего изобретения понятие «цитокин» относится к белкам из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активных эквивалентов последовательностей природных цитокинов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения к способам также относится введение субъекту одного или нескольких иммуномодулирующих агентов, предпочтительно цитокинов. Предпочтительные цитокины выбраны из группы, состоящей из интерлейкина-1 (ИЛ-1), ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, G-CSF, GM-CSF, тромбопоэтина и интерферона гамма.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующим агентом является модулятор рецептора цитокина. К примерам модуляторов рецептора цитокина относятся, но ими не ограничиваются, растворимые рецепторы цитокина (например, внеклеточный домен рецептора ФНО-альфа или его фрагмента, внеклеточный домен рецептора ИЛ-1 бета или его фрагмента и внеклеточный домен рецептора ИЛ-6 или его фрагмента), цитокины или их фрагменты (например, интерлейкин ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-15, ФНО-альфа, ФНО-бета, интерферон (1РМ)-альфа, IFN-бета, IFN-гамма и GM-CSF), анти-цитокин рецептор антитела (например, анти-ИЛ-2 рецептор антитела, анти-ИЛ-4 рецептор антитела, анти-ИЛ-6 рецептор антитела, анти-ИЛ-10 рецептор антитела, и анти-ИЛ-12 рецептор антитела), анти-цитокин антитела (например, анти-IFN рецептор антитела, анти-ФНО-альфа антитела, анти-ИЛ-1бета антитела, анти-ИЛ-6 антитела, анти-ИЛ-9, анти-ИЛ-17 антитела, антитела, и анти-ИЛ-12 антитела). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модулятором рецептора является ИЛ-4, ИЛ-10 или их фрагмент. В другом варианте осуществления настоящего изобретения модулятором рецептора цитокина является анти-ИЛ-1бета антитело, анти-ИЛ-6 антитело, антитело к рецептору ИЛ-12, анти-ФНО-альфа антитело. В другом варианте осуществления настоящего изобретения модулятором рецептора цитокина является внеклеточный домен рецептора ФИО-альфа или его фрагмента. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модулятором рецептора цитокина не является антагонистом ФНО-альфа.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующим агентом является модулятор рецепторов Т-клеток. К примерам модуляторов рецепторов Т-клеток относятся, но ими не ограничиваются, антитела к рецепторам Т-клеток (например, анти-С04 антитела (например, сМ-Т412 (фирма Boeringer), IDEC-CE9.1 (IDEC и 8KB), моноклональное антитело 4162W94, ортоклон и OKTcdr4a (фирма Janssen-Cilag)), анти-CD3 антитела, анти-CD5 антитела (например, анти-CD5 рицин-связанный иммуноконъюгат), анти-CD7 антитела (например, СНН-380 (фирма Novartis)), анти-CD8 антитела, моноклональные антитела к лиганду CD40, анти-CD52 антитела (например, CAMPATH 1H (фирма Ilex)), анти-CD2 моноклональные антитела) и CTLA4-иммуноглобулин.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения иммуномодулирующим агентом является антагонист ФНО-альфа. К примерам антагонистов ФНО-альфа относятся, но ими не ограничиваются, антитела (например, инфликсимаб (продукт REMICADE™, фирма Centocor), D2E7 (фирма Abbott Laboratories/Knoll Pharmaceuticals Co., Mt. Olive, Нью-Джерси), антитело CDP571, также называемое HUMIRA™, и CDP-870 (оба антитела от фирмы Celltech/Pharmacia, Slough, Великобритания), и TN3-19.12 (Williams и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1994, cc.2762-2766, Thorbecke и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc.7375-7379)), растворимые ФНО-альфа рецепторы (например, sTNF-R1 (фирма Amgen), этанерцепт (продукт ENBREL™, фирма Immunex) и его гомолог из крысы продукт RENBREL™, растворимые ингибиторы ФНО-альфа, производного от TNFrI, TNFrII (Kohno и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1990, cc.8331-8335) и ФНО-альфа Inh (Seckinger и др, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 1990, cc.5188-5192)), ИЛ-10, TNFR-IgG (Ashkenazi и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1991, cc.10535-10539), продукт из грызунов ТВР-1 (фирма Serono/Yeda), вакцина CytoTAb (фирма Prдругихics), антисмысловая молекула 104838 (фирма ISIS), пептид RDP-58 (фирма SangStat), талидомид (фирма Celgene), КЗЦ-801 (фирма Celgene), DPC-333 (фирма Dupont), VX-745 (фирма Vertex), AGIX-4207 (фирма AtheroGenics), ITF-2357 (фирма Italfarmaco), NPI-13021-31 (фирма Nereus), SCIO-469 (фирма Scios), TACE targeter (фирма Immunix/AHP), CLX-120500 (фирма Calyx), Thiazolopyrim (фирма Dynavax), ауранофин (продукт Ridaura) (фирма SmithKline Beecham Pharmaceuticals), хинакрин (мепакрин дихлоргидрат), тенидап (фирма Enablex), меланин (фирма Large Scale Biological) и анти-p38 МАРК агенты фирмы Uriach.
Анти-ICOS иммунотерапия может также применяться вместе с иммунорегулирующим агентом. При таком подходе может применяться химерное, гуманизированное анти-ICOS антитело или анти-ICOS антитело человека. Понятие «иммунорегулирующий агент» в контексте настоящего изобретения применительно к комбинированной терапии относится к веществам, которые действуют, подавляя, маскируя или усиливая иммунную систему хозяина. К ним могут относиться вещества, которые подавляют выработку цитокина, снижают регуляцию или подавляют экспрессию аутоантигена, или маскируют антигены ГСГ. К примерам таких агентов относятся 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины (см. US 4665077), азатиоприн (или циклофосфамид, если на азатиоприн проявляется побочная реакция), бромкриптин, глютаральдегид (который маскирует антигены ГКГ согласно описанию в US 4120649), анти-идиотипические антитела к антигенам ГКГ и фрагментам ГКГ, циклоспорин А, стероиды, например, глюкокортикостероиды, например, преднизон, метилпреднизолон и дексаметазон, антагонисты цитокина или рецептора цитокина, включая анти-интерферон-γ, -β или -α антитела, антитела к фактору некроза опухолей-α, антитела к фактору некроза опухолей-β, анти-интерлейкин-2 антитела и анти-ИЛ-2 рецептор антитела, анти-L3T4 антитела, гетерологичный анти-лимфоцитарный глобулин, pan-Т антитела, например анти-CD3 или анти-CD4/CD4a антитела, растворимый пептид, включающий LFA-3-связывающий домен (WO 90/08187), стрептокиназа, TGF-β, стрептодорназа, РНК или ДНК хозяина, FK506, RS-61443, дезоксиспергуалин, рапамицин, рецептор Т-клеток (US 5114721), фрагменты рецептора Т-клеток (Offner и др., Science 251, 1991, cc.430-432, WO 90/11294 и WO 91/01133) и T-cell рецептор антитела (ЕР 340109), например, Т10В9. Примерами цитокинов являются, но ими не ограничиваются, лимфокины, монокины и традиционные полипептидные гормоны. Среди цитокинов есть гормон роста, например, гормон роста человека, N-метионил гормона роста человека и гормон роста быка, паращитовидный гормон, тироксин, инсулин, проинсулин, релаксин, прорелаксин, гликопротеиновые гормоны, например, фолликуло-стимулирующий гормон (ФСГ), гормон стимуляции щитовидки и лютеинизирующий гормон (ЛГ), фактор роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов, пролактин, плацентарный лактоген, фактор некроза опухолей альфа, ингибирующее вещество Мюллера, гонадотропин-ассоциированный пептид мыши, ингибин, активин, сосудистый эндотелиальный фактор роста (vascular endothelial growth factor - VEGF), интегрин, тромбопоэтин (ТПО), фактор роста нервов (nerve growth factor - NGF), например, NGF-альфа, фактор роста тромбоцитов (platelet-growth factor - PGF), трансформирующие факторы роста (transforming growth factor - TGF), например, TGF-альфа и TGF-альфа, инсулиноподобный фактор роста-I и -II, эритропоэтин (ЭПО), остеогенные факторы, интерфероны, колониестимулирующие факторы (colony stimulating factor - CSF), например, колониестимулирующий фактор макрофагов (macrophage-CSF - M-CSF), колониестимулирующий фактор роста гранулоцитов-макрофагов (granulocyte-macrophage-CgP - GM-CSP) и колониестимулирующий фактор роста гранулоцитов (granulocyte-CSF - G-CSF), интерлейкины (ИЛ), например, ИЛ-1, ИЛ-1а, ИЛ-2, 1L-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-12, ИЛ-15, фактор некроза опухолей, например, ФНО-альфа или ФНО-бета, и другие полипептидные факторы, включая LIF и kit ligand (KL). В контексте настоящего изобретения понятие «цитокин» относится к белкам из природных источников или из культуры рекомбинантных клеток и биологически активных эквивалентов последовательностей природных цитокинов. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения к способам также относится введение субъекту одного или нескольких иммуномодулирующих агентов, предпочтительно цитокинов. Соответствующие цитокины могут быть выбраны из группы, состоящей из интерлейкина-1 (ИЛ-1), ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-12, ИЛ-15, ИЛ-18, G-CSF, GM-CSF, тромбопоэтина и интерферона гамма.
Такие иммунорегулирующие агенты вводят одновременно с анти-ICOS антителом или в другое время. Предпочтительный иммунорегулирующий агент может зависеть от многих факторов, включая тип расстройства, подвергаемого лечению, а также истории болезни пациента, но чаще агент может быть выбран из циклоспорина А, глюкокортикостероида (например преднизона или метилпреднизолона), азатиоприна, бромкриптина, гетерологического анти-лимфоцитарного глобулина или их смеси.
Комбинация с другими терапевтическими агентами
Агенты, которые действуют на новую сформированную сосудистую сеть опухоли, также могут применяться вместе с анти-ICOS иммунотерапией и включают тубулин-связывающие агенты, например, комбрестатин А4 (Griggs и др., Lancet Oncol. 2, 2001, с.82) и ангиостатин и эндостатин (обзор Rosen, Oncologist 5, 2000, с.20). Иммуномодуляторы, применимые для использования в комбинации с анти-ICOS антителом, включают, но ими не ограничиваются, α-интерферон, γ-интерферон и фактор некроза опухоли альфа (ФНОα). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтические агенты, используемые в комбинированном лечении, использующем композиции и способы по настоящему изобретению, являются пептидами.
I
I
I
I
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS иммунотерапия объединена с одной или несколькими молекулами калихимицина. Антибиотики семейства калихимицина способны вырабатывать двухцепочечные разрывы ДНК в субпикомолярных концентрациях. Структурные аналоги калихимицина, которые могут быть применены, включают, но ими не ограничиваются, γ1, γ2, γ3, N-ацетил-γ1, PSAG и 011 (Hiнman и др., MCancer Research 53, 1993, cc.3336-3342, Lode и др., Cancer Research 58, 1998, cc.2925-2928).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения режим лечения включает соединения, которые смягчают цитотоксические эффекты композиций с анти-ICOS антителом. Такие соединения включают анальгетики (например, ацетаминофен), бисфосфанаты, антигистамины (например, хлорфенирамин малеат) и стероиды (например, дексаметазон, ретиноиды, дельтоиды, бетаметазон, кортизол, кортизон, преднизон, дегидротестостерон, глюкокортикоиды, минералокортикоиды, эстроген, тестостерон, прогестины).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтический агент, применяемый в комбинации с анти-ICOS иммунотерапией, является низкомолекулярной молекулой (т.е., неорганическими или органическими соединениями с молекулярной массой менее примерно 2500 Дн). Например, библиотеки низкомолекулярных соединений могут быть приобретены на коммерческой основе на фирмах Specs and BioSpecs B.V. (Rijswijk, Нидерланды), Chembridge Corporation (Сан-Диего, Калифорния), Comgenex USA Inc. (Принстон, Нью-Джерси) и Maybridge Chemicals Ltd. (Cornwall PL34 OHW, Великобритания).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS иммунотерапия может быть проведена в комбинации с антибактериальным агентом. Примерами антибактериальных агентов могут быть белки, полипептиды, пептиды, гибридые белки, антитела, молекулы нуклеиновых кислот, органические молекулы, неорганические молекулы и низкомолекулярные молекулы, которые ингибируют и/или уменьшают бактериальную инфекцию, ингибируют и/или уменьшают репликацию бактерий, или ингибируют и/или уменьшают распространение бактерий на другие клетки или субъекты. Специфическими примерами антибактериальных агентов являются, но ими не ограничиваются, антибиотики, например, пенициллин, цефалоспорин, имипенем, акстреонам, ванкомицин, циклосерин, бацитрацин, хлорамфеникол, эритромицин, клиндамицин, тетрациклин, стрептомицин, тобрамицин, гентамицин, амикацин, канамицин, неомицин, спектиномицин, триметоприм, норфлоксацин, рифампин, полимиксин, амфотерицин В, нистатин, кетоканазол, изониазид, метронидазол и пентамидин.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS иммунотерапия может проводиться в комбинации с противогрибковым агентом. К специфическим примерам противогрибковых агентов относятся, но ими не ограничиваются, лекарственные средства группы азолов (например, миконазол, кетоконазол (продукт NIZORAL), каспофунгин ацетат (продукт CANCIDAS), имидазол, триазолы (например, флюконазол (продукт DIFLUCAN)) и итраконазол (продукт SPORANOX)), полиен (например, нистатин, амфотерицин В (продукт FUNGIZONE), липидный комплекс амфотерицина В («ABLC») (продукт ABELCET), коллоидная дисперсия амфотерицина В («ABCD») (продукт АМРНОТЕС), липосомальный амфотерицин В (продукт AMBISONE)), калий иодит (KI), пиримидин (например, флуцитозин (продукт ANCOBON), и вориконазол (продукт VFEND)). Введение антибактериальных или противогрибковых агентов, которые могут быть предусмотрены в способах по настоящему изобретению, может смягчить воздействие инфекции или усиление инфекционного заболевания, при которых у пациента ICOS-экспрессирующие Т-клетки существенно истощены.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS иммунотерапия может осуществляться введением в комбинации с одним или несколькими агентами, описанными выше, для смягчения токсических побочных эффектов, которые могут сопровождать введение композиций по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления настоящего изобретения анти-ICOS иммунотерапия может вводиться в комбинации с одним или несколькими агентами, которые известны в данной области для применения с целью смягчения побочных эффектов от введения антитела, химиотерапии, токсинов или лекарственных средств.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения при иммунотерапии анти-ICOS антитело также вводят в комбинации с другим антителом, или антителами, и/или агентом, причем дополнительное антитело, или антитела, и/или агенты могут вводиться в какой-либо последовательности относительно введения антитела по настоящему изобретению. Например, дополнительное антитело или антитела могут вводиться до, одновременно и/или после введения анти-ICOS антитела или иммуноконъюгата человеку. Дополнительное антитело или антитела могут содержаться в той же фармацевтической композиции, что и антитело по настоящему изобретению, и/или содержаться в другой фармацевтической композиции. Доза и способ введения антитела по настоящему изобретению и доза дополнительного антитела или антител могут быть равными или различными в соответствии с какой-либо из рекомендаций по числу дозирований и способам введения в качестве предусмотренных в настоящем применении и в качестве известных в настоящей области.
Применение анти-ICOS антител для диагностики злокачественных поражений Т-клеток
131
125
123
121
14
35
3
115
113
112
111
99
201
68
67
103
99
133
18
153
177
159
149
140
175
166
90
47
186
188
142
105
97
68
57
65
85
32
153
169
51
54
75
113
117
Настоящее изобретение также предусматривает анти-ICOS антитела и их композиции, которые иммуноспецифически связаны с ICOS антигеном человека, причем анти-ICOS антитела конъюгированы с диагностическим или выявляемым агентом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела являются анти-ICOS антителами с повышенной эффекторной функцией. Такие анти-ICOS антитела могут применяться для мониторинга или прогнозирования развития или прогрессирования злокачественных заболеваний, связанных с Т-клетками, в качестве части методики клинического тестирования, например, определения эффективности определенной терапии. Такая диагностика и такое обнаружение могут быть связаны с анти-ICOS антителом, которое иммуноспецифически связывает ICOS антиген человека с выявляемым веществом, примерами которого являются, но которыми перечень не ограничивается, различные ферменты, например, но ими перечень не ограничивается, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза, простерические группы, например, но ими перечень не ограничивается, стрептавидин/биотин и авидин/биотин, флуоресцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоционат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин, люминесцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, люминол, биолюминесцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, люцифераза, люциферин и экворин, радиоактивные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, иод (I, I, I, I,), углерод (С), сера (S), тритий (H), индий (In, In, In, In,) и технеций (Tc), таллий (Ti), галлий (Ga, Ga), палладий (Pd), молибден (Мо), ксенон (Хе), фтор (F), Sm, Lu, Gd, Pm, La, Yb, Ho, Y, Sc, Re, Re, Pr, Rh, Ru, Ge, Co, Zn, Sr, P, Gd, Yb, Cr, Mn, Se, Sn и Sn, испускающие позитроны металлы, используя различные томографии позитронной эмиссии, ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов и молекулы, меченые радиоактивно или конъюгированные со специфическими радиоизотопами. Какие-либо выявляемые метки, которые могут быть легко измерены, могут быть объединены с анти-ICOS антителом и могут применяться для диагностики злокачественных Т-клеток. Выявляемое вещество может быть объединено или непосредственно с антителом, или косвенным образом через посредника (например, линкера, известного в данной области), используя методики, известные в данной области. См., например, US 4741900 по ионам металлов, которые могут быть объединены с антителами для применения в качестве диагностикумов по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения диагностические наборы включают анти-ICOS антитело, конъюгированное с диагностическим или выявляемым агентом.
Применение анти-ICOS антител для мониторинга восстановления иммунного состояния
131
125
123
121
14
35
3
115
113
112
111
99
201
68
67
103
99
133
18
153
177
159
149
140
175
166
90
47
186
188
142
105
97
68
57
65
85
32
153
169
51
54
75
113
117
Настоящее изобретение также предусматривает анти-ICOS антитела и их композиции, которые иммуноспецифически связывают ICOS антиген человека, причем анти-ICOS антитела объединены с диагностическим или выявляемым агентом. Такие анти-ICOSантитела могут применяться для мониторинга восстановления иммунной системы после иммуносупрессивной терапии или трансплантации костного мозга. Такой мониторинг может сопровождаться соединением анти-ICOS антитела, которое иммуноспецифически связывает ICOS антиген человека с выявляемым веществом, примером которого являются, но ими не ограничиваясь, различные ферменты, например, но ими перечень не ограничивается, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза, простерические группы, например, но ими перечень не ограничивается, стрептавидин/биотин и авидин/биотин, флуоресцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоционат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин, люминесцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, люминол, биолюминесцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, люцифераза, люциферин и экворин, радиоактивные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, иод (I, I, I, I,), углерод (C), сера (S), тритий (H), индий (In, In, In, In,) и технеций (Tc), таллий (Ti), галлий (Ga, Ga), палладий (Pd), молибден (Mo), ксенон (Хе), фтор (F), Sm, Lu, Gd, Pm, La, Yb, Ho, Y, Sc, Re, Re, Pr, Rh, Ru, Ge, Co, Zn, Sr, P, Gd, Yb, Cr, Mn, Se, Sn и Sn, испускающие позитроны металлы, используя различные томографии позитронной эмиссии, ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов и молекулы, меченые радиоактивно или конъюгированные со специфическими радиоизотопами. Какие-либо выявляемые метки, которые могут быть легко измерены, могут быть объединены с анти-ICOS антителом и могут применяться для диагностики аутоиммунных заболеваний или расстройств. Выявляемое вещество может быть объединено или непосредственно с антителом, или косвенным образом через посредника (например, линкера, известного в данной области), используя методики, известные в данной области. См., например, US 4741900 по ионам металлов, которые могут быть объединены с антителами для применения в качестве диагностикумов по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены диагностические наборы, которые включают анти-ICOS антитело, конъюгированное с диагностическим или выявляемым агентом.
Применение анти-ICOS антител для диагностики аутоиммунных заболеваний или расстройств
131
125
123
121
14
35
3
115
113
112
111
99
201
68
67
103
99
133
18
153
177
159
149
140
175
166
90
47
186
188
142
105
97
68
57
65
85
32
153
169
51
54
75
113
117
Настоящее изобретение также предусматривают анти-ICOS антитела и их композиции, которые иммуноспецифически связываются с ICOS антигеном человека, причем анти-ICOS антитела соединены с диагностическим или выявляемым агентом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антителами являются анти-ICOS антитела с повышенной эффекторной функцией. Такие анти-ICOS антитела могут применяться для мониторинга или прогнозирования развития или прогрессирования аутоиммунных заболеваний или расстройств в качестве части методики клинического тестирования, например, определения эффективности определенной терапии. Такая диагностика и такое обнаружение могут быть связаны с анти-ICOS антителом, которое иммуноспецифически связывает ICOS антиген человека с выявляемым веществом, примерами которого являются, но которыми перечень не ограничивается, различные ферменты, например, но ими перечень не ограничивается, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или ацетилхолинэстераза, простерические группы, например, но ими перечень не ограничивается, стрептавидин/биотин и авидин/биотин, флуоресцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоционат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин, люминесцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, люминол, биолюминесцентные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, люцифераза, люциферин и экворин, радиоактивные материалы, например, но ими перечень не ограничивается, иод (I, I, I, I,), углерод (С), сера (S), тритий (Н), индий (In, In, In, In,) и технеций (Tc), таллий (Ti), галлий (Ga, Ga), палладий (Pd), молибден (Мо), ксенон (Хе), фтор (F), Sm, Lu, Gd, Pm, La, Yb, Ho, Y, Sc, Re, Re, Pr, Rh, Ru, Ge, Co, Zn, Sr, P, Gd, Yb, Cr, Mn, Se, Sn и Sn, испускающие позитроны металлы, используя различные томографии позитронной эмиссии, ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов и молекулы, меченые радиоактивно или конъюгированные со специфическими радиоизотопами. Какие-либо выявляемые метки, которые могут быть легко измерены, могут быть объединены с анти-ICOS антителом и могут применяться для диагностики аутоиммунных заболеваний или расстройств. Выявляемое вещество может быть объединено или непосредственно с антителом, или косвенным образом через посредника (например, линкера, известного в данной области), используя методики, известные в данной области. См., например, US 4741900 по ионам металлов, которые могут быть объединены с антителами для применения в качестве диагностикумов по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения диагностические наборы включают анти-ICOS антитело, конъюгированное с диагностическим или выявляемым агентом.
Наборы
Настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую упаковку или набор, включающий один или несколько контейнеров, наполненных композициями по настоящему изобретению для предупреждения, лечения, контроля или облегчения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, например, но ими перечень не ограничивается, хронических инфекций, аутоиммунных заболеваний или расстройств, воспалительных заболеваний или расстройств, болезни трансплантат-против-хозяина (БТПХ), отторжения трансплантата и пролиферативного расстройства Т-клеток, или одного или нескольких их симптомов, усиливающих заболевание или расстройство, опосредованное Т-клетками.
Настоящее изобретение предусматривает наборы, которые могут применяться в указанных выше способах. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения набор включает композиции по настоящему изобретению в одном или нескольких контейнерах. В другом варианте осуществления настоящего изобретения набор включает композиции по настоящему изобретению в одном или нескольких контейнерах и один или несколько других профилактических или терапевтических агентов, применимых для предупреждения, контроля или лечения опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств или одного или нескольких их симптомов, усиливающих заболевание или расстройство, опосредованное Т-клетками, в одном или нескольких контейнерах. Набор может дополнительно включать инструкции по предупреждению, лечению, контролю или облегчению опосредованных Т-клетками заболеваний и расстройств, а также информацию о побочных эффектах и дозировках для способа введения. Необязательно связанным с таким контейнером (контейнерами) может быть информация в форме, установленной государственным агентством, регулирующим получение, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, причем эта информация отражает одобрение указанным агентством получения, применения или продажи для введения людям.
Определенные варианты осуществления настоящего изобретения
1. Выделенное анти-ICOS антитело, включающее домен VH, домен VK и вариант области Fc, причем указанное антитело опосредует повышенное действие антигензависимой клеточно опосредованной цитотоксичности (АЗКЦ) по сравнению с уровнем действия АЗКЦ, опосредованной исходным антителом, включающим домены VH и VK и область Fc дикого типа.
2. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 1, в котором величина ЕС50 антитела, измеренная в анализе АЗКЦ in vitro, no меньшей мере примерно в семь раз ниже величины ЕС50 исходного антитела.
3. Антитело по вариантам осуществления настоящего изобретения 1 или 2, в котором вариант области Fc обладает повышенным сродством с рецептором Fc по сравнению с областью Fc дикого типа.
4. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 3, в котором рецептором Fc является рецептор человека FcгаммаRIIIA.
5. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 1, в котором вариант области Fc включает по меньшей мере одно замещение аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из: остатков 239, 330 и 332, причем положения аминокислотных остатков определяют в соответствии с Европейской конвенцией.
6. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 1, в котором вариант области Fc включает по меньшей мере одно замещение аминокислотного остатка, выбранного из группы, состоящей из: остатков S239D, A330L и I332E, причем положения аминокислотных остатков определяют в соответствии с Европейской конвенцией.
7. Выделенное анти-ICOS антитело, включающее домен VH, домен VK и сконструированную область Fc, причем антитело обладает сложными N-гликозид-связанными цепочками Сахаров, связанными с областью Fc, в которых фукоза не связана с N-ацилглюкозамином в редуцируемом конце в цепи сахара.
8. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 7, причем антитело опосредует повышенное действие АЗКЦ по сравнению с уровнем действия АЗКЦ, опосредованного исходным антителом, включающим домены VH и VK и несконструированную область Fc.
9. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 8, причем величина ЕС50, измеренная в анализе АЗКЦ in vitro, по меньшей мере примерно в семь раз ниже величины ЕС50 исходного антитела.
10. Антитело по одному из вариантов осуществления настоящего изобретения 1-7, в котором домен VH включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, а домен VK включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
11. Нуклеиновая кислота, кодирующая последовательность аминокислоты антитела, подобно какому-либо одному из вариантов осуществления настоящего изобретения 1-10.
12. Нуклеиновая кислота по варианту осуществления настоящего изобретения 11, включающая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящую из последовательностей SEQ ID NO:28-31.
13. Вектор, включающий нуклеиновую кислоту по варианту осуществления настоящего изобретения 11.
14. Вектор по варианту осуществления настоящего изобретения 13, который включает нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:28-31.
15. Выделенные клетки, включающие вектор по варианту осуществления настоящего изобретения 13.
16. Выделенные клетки по варианту осуществления настоящего изобретения 15, причем указанные клетки утратили активность фермента гликозилирования.
17. Гликозилирующий фермент по варианту осуществления настоящего изобретения 16, который выбран из группы, состоящей из FUT8 или GnTIII.
18. Выделенные клетки по варианту осуществления настоящего изобретения 16, в котором фермент выбран из группы, состоящей из FUT8 или GnTIII, и в котором клетки включают вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO:28-31.
19. Выделенные клетки, экспрессирующие антитело подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
20. Способ получения антитела, включающий культивирование выделенных клеток по варианту осуществления настоящего изобретения 19 в условиях, достаточных для получения антитела и выделения антитела из культуры.
21. Фармацевтическая композиция, включающая антитело, подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10, в фармацевтически-приемлемом носителе.
22. Фармацевтическая композиция по варианту осуществления настоящего изобретения 21, в котором антитело относится к the IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 изотипу человека.
23. Способ лечения аутоиммунных заболеваний или расстройств у человека, включающий введение человеку, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
24. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 23, в котором аутоиммунным заболеванием или расстройством является системная красная волчанка или склеродерма.
25. Способ лечения или предупреждения отторжения у трансплантированного пациента, включающий введение человеку, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела, подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
26. Способ лечения злокачественности Т-клеток у человека, включающий введение человеку, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела, подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
27. Способ лечения воспалительного заболевания или расстройств у человека, включающий введение человеку, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
28. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 27, в котором воспалительное заболевание или расстройство является миозитом.
29. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 28, в котором миозит является миозитом с включенными тельцами (МВТ), полимиозитом (ПМ) или дерматомиозитом (ДМ).
30. Способ истощения ICOS-экспрессирующих Т-клеток у больного человека, включающий введение человеку, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества антитела подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
31. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 30, в котором истощение существенно сохраняется в течение, по меньшей мере примерно 1, по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 3 или по меньшей мере примерно 4 недель после введения антитела.
32. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 30, в котором по меньшей мере примерно 95% Т-клеток истощено.
33. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 30, в котором ICOS-экспрессирующие Т-клетки являются Т-клетками памяти.
34. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 30, в котором ICOS-экспрессирующие Т-клетки являются циркулирующими Т-клетками.
35. Способ разрушения структуры зародышевого центра во вторичном лимфоидном органе примата, включающий введение эффективного количества антитела подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
36. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 35, в котором приматом является обезьяна.
37. Способ истощения В-клеток зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа примата, включающий введение эффективного количества антитела подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
38. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 37, в котором приматом является обезьяна.
39. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 37, в котором приматом является человек.
40. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 37, в котором истощение существенно сохраняется в течение по меньшей мере примерно 1, по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 3 или по меньшей мере примерно 4 недель после введения антитела.
41. Способ истощения класса циркулирующих переключенных В-клеток у примата, включающий введение эффективного количества антитела подобно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-10.
42. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 41, в котором приматом является обезьяна.
43. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 41, в котором приматом является человек.
44. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 41, в котором истощение существенно сохраняется в течение по меньшей мере примерно 1, по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 3 или по меньшей мере примерно 4 недель после введения антитела.
45. Способ по варианту осуществления настоящего изобретения 41, в котором по меньшей мере примерно 95% клеток из класса циркулирующих переключенных В-клеток истощено.
46. Выделенное анти-ICOS антитело, включающее домен VH, домен VK и вариант области Fc, которое опосредует повышенное действие АЗКЦ по сравнению с уровнем действия АЗКЦ, опосредованным исходным антителом, включающим домены VH и VK и область Fc дикого типа, причем указанное антитело способно истощать В-клетки зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа примата.
47. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 46, в котором приматом является обезьяна.
48. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 46, в котором приматом является человек.
49. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 46, в котором истощение существенно сохраняется в течение по меньшей мере примерно 1, по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 3 или по меньшей мере примерно 4 недель после введения антитела.
50. Выделенное анти-ICOS антитело, включающее домен VH, домен VK и вариант области Fc, которое опосредует повышенное действие АЗКЦ по сравнению с уровнем действия АЗКЦ, опосредованным исходным антителом, включающим домены VH и VK и область Fc дикого типа, причем указанное антитело способно истощать класс циркулирующих переключенных В-клеток у примата.
51. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 50, в котором приматом является обезьяна.
52. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 50, в котором приматом является человек.
53. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 50, в котором истощение существенно сохраняется в течение по меньшей мере примерно 1, по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 3 или по меньшей мере примерно 4 недель после введения антитела.
54. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 50, в котором истощено по меньшей мере примерно 95% клеток класса циркулирующих переключенных В-клеток.
55. Выделенное анти-ICOS антитело, включающее домен VH, домен VK и сконструированную Fc область, причем антитело имеет сложные N-гликозид-связанные цепи Сахаров, связанные со сконструированной областью Fc, в которых фукоза не связана со сложным N-ацилглюкозамином в редуцируемом конце цепи сахара, причем антитело опосредует повышенное действие АЗКЦ по сравнению с уровнем действия АЗКЦ, опосредованным исходным антителом, включающим домены VH и VK и область Fc, не являющуюся результатом конструирования, причем указанное антитело способно истощать В-клетки зародышевого центра из вторичного лимфоидного органа примата.
56. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 55, в котором приматом является обезьяна.
57. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 55, в котором приматом является человек.
58. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 55, в котором истощение существенно сохраняется в течение по меньшей мере примерно 1, по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 3 или по меньшей мере примерно 4 недель после введения антитела.
59. Выделенное анти-ICOS антитело, включающее домен VH, домен VK и сконструированную область Fc, причем антитело имеет сложные N-гликозид-связанные цепи Сахаров, связанные со сконструированной областью Fc, в которых фукоза не связана с N-ацилглюкозамином в редуцируемом конце цепи сахара, причем антитело опосредует повышенное действие АЗКЦ по сравнению с уровнем действия АЗКЦ, опосредованным исходным антителом, включающим домены VH и VK и область Fc, не являющуюся результатом конструирования, причем указанное антитело способно истощать клетки класса переключенных В-клеток у примата.
60. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 59, в котором приматом не является человек.
61. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 59, в котором приматом является человек.
62. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 59, в котором истощение существенно сохраняется в течение по меньшей мере примерно 1, по меньшей мере примерно 2, по меньшей мере примерно 3 или по меньшей мере примерно 4 недель после введения антитела.
63. Антитело по варианту осуществления настоящего изобретения 59, в котором истощено по меньшей мере примерно 95% клеток класса циркулирующих переключенных В-клеток.
Примеры
Конструирование анти-ICOS антител с повышенной величиной АЗКЦ
В последующих разделах описывают анти-ICOS антитело с повышенной величиной АЗКЦ, включающее константную область IgHγ1 человека. Анти-ICOS антитело с повышенной величиной АЗКЦ может включать варианты области Fc с повышенной эффекторной функцией (см. US 2007-0003546 A1, US 20060160996A9, US 2005-0054832 A1, US 2004-0132101 A1 и US 2004-0110226 A1). Анти-ICOS антитело с повышенной величиной АЗКЦ может включать сложные N-гликозид-связанные цепочки сахаров, связанные с Asn297 области Fc, в которых фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином в редуцируемом конце (см. US 6946292, US 2006-0223147 A1, US 2006-0021071 A1, US 2005-0272916 A1, US 2004-0259150 A1, US 2004-0132140 A1, US 2004-0110704 A1 и US 2004-0110282 A1). Анти-ICOS антитела с повышенной величиной АЗКЦ, описанные в примерах, включают вариабельные домены тяжелой и легкой цепей JMab-136 анти-ICOS антитела, описанного в US 6803039. Аминокислотная последовательность VH и VK доменов JMab анти-ICOS антитела описана в настоящем изобретении в виде последовательностей SEQ ID NO:7 и 2, соответственно. Анти-ICOS антитело, включающее VH и VL домены антитела JMab-136 и дополнительно включающее константную область IgHγ2, обозначается в настоящем изобретении «IC009». Анти-ICOS антитело, включающее домены JMab-136 VH и VL и дополнительно включающее константную область IgHγ1, обозначается в настоящем изобретении «IC9G1». Специалистам в данной области очевидно, что экспериментальные способы, описанные в настоящем изобретении, также могут быть применены к каким-либо другим антителам помимо анти-ICOS антитела, например, описанными в US 6803039, но ими перечень не ограничивается.
Оптимизация последовательности
Аминокислотная последовательность: аминокислотная последовательность домена VK (SEQ ID NO:1) включает следующие мотивы: потенциальный сайт o-гликозилирования по положению аминокислоты 5 и потенциальный мотив деамидирования по положению аминокислоты 92 в VK CDR3. Аминокислотная последовательность домена VH (SEQ ID NO:6) включает следующие домены: потенциальный сайт o-гликозилирования по положению аминокислоты 17 и потенциальный мотив формирования изоаспартата по положению аминокислоты 99 в VH CDR3. Положения аминокислот определены по системе Kabat. Аминокислотная последовательность домена VH или VK может быть изменена для элиминации каких-либо указанных мотивов последовательности и таким образом элиминирует возможность пост-трансляционной модификации по измененным мотивам последовательности. Например, мотив NG потенциального деаминирования может быть элиминирован путем замещения остатка N на остаток Y, D или G. Ниже описывают способы интродукции замещения в аминокислотной последовательности анти-ICOS антитела. Антиген-связывающие свойства аминокислотного замещения, включающие анти-ICOS антитело, могут быть установлены, используя методы, описанные в настоящем изобретении.
Последовательность нуклеиновой кислоты: у полинуклеотидов, кодирующих тяжелую и легкую цепи анти-ICOS антитела, могут быть оптимизированы последовательности нуклеиновой кислоты. Конечной целью процесса оптимизации является создание кодирующей области, которая транскрибируется и транслируется с наибольшей возможной эффективностью. Оптимизации последовательности достигают комбинированием: (i) оптимизации использования кодона, (ii) адаптации содержания G/C, (iii) элиминации сайтов внутреннего сплайсинга и сайтов раннего полиаденилирования, (iv) разрыва стабильных вторичных структур РНК, (v) элиминации последовательностей прямых повторов, (vi) элиминации последовательности, которая может формировать стабильные дцРНК с транскриптами клеток-хозяев, (vii) элиминации последовательностей, нацеливаемых микро РНК клеток-хозяев, и (viii) внедрения стабилизирующей РНК и сигналов транслокации РНК. Методы детальной оптимизации последовательности описаны в WO2004059556A2, WO2006015789A2, Bradel-Tretheway и др., J. Virol. Методы 111, 2003, cc.145-156, Valencik, McDonald, Transgenic Res. 3, 2001, cc.269-275. В другом варианте последовательность может быть оптимизирована коммерческим провайдером (например, фирмой GENEART Inc.).
Нуклеотидные последовательности, кодирующие VH, VK, тяжелую и легкую цепь IC9G1, оптимизируют методами, описанными в настоящем изобретении. Оптимизированные нуклеотидные последовательности, кодирующие VH, VK, тяжелую и легкую цепь IC9G1, описывают в виде последовательностей SEQ ID NO:28-31, соответственно.
Генная сборка и клонирование экспрессии
Конструкции могут быть выработаны методом генной сборки на основе ПЦР, впервые описанным Stemmer (Stemmer W. Р. и др., Gene, 164, 1995, cc.49-53). Этот метод включает следующие четыре стадии: синтеза олигонуклеотидов, генной сборки, генной амплификации и клонирования. Восемь специфичных для гена VH праймеров и шесть специфичных для гена VK праймеров, которые можно использовать для ПЦР-опосредованной генной сборки, приведены в табл.2. Наборы праймеров для вариантов областей VH и VK, включающих специфичные аминокислотные замещения, могут быть получены модификацией последовательности нуклеиновой кислоты праймера, кодирующего данный аминокислотный остаток. Праймеры сконструированы таким образом, что они перекрываются 15-20 нуклеотидами и лигируются в полную вариабельную область за счет термического циклирования. В случае VH дополнительный специфичный в отношении вектора праймер (Universal VH FW в табл.2.) включают в процесс опосредованной ПЦР генной сборки. Внешние 5' и 3' праймеры для области VH включают уникальный сайт распознавания для эндонуклеаз рестрикции XbaI и ApaI, соответственно, чтобы способствовать последующим стадиям клонирования. Внешние 5' и 3' праймеры для VK включают уникальный сайт распознавания для эндонуклеаз рестрикции XmaI и BsiWI, соответственно, что способствует последующим стадиям клонирования. Продукты реакции ПЦР определенного размера получают расщеплением рестриктазой и лигируют в рамку в вектор экспрессии, в котором области VH расщепляют рестриктазами XbaI и ApaI, а области VK расщепляют рестриктазами XmaI и BsiWI по рекомендациям производителя. Вектор сборки тяжелой цепи включает элементы контроля эукариотической транскрипции, оперативно связанные с полинуклеотидом, кодирующим лидерную последовательность MGDNDIHFAFLSTGVHS VH (SEQ ID NO:26) и константную область IgHγ1 человека, причем указанные элементы контроля транскрипции включают ранний промотор цитомегаловируса (CMV) и поли-А дополнительный сигнал вируса SV40. Применение соответствующим образом сконструированных праймеров для сборки VH гарантирует, что полинуклеотид последовательности, кодирующей лидерную последовательность VH, VH область и константную область IgHγ1 объединены в рамку с итоговым вектором экспрессии тяжелой цепи. Вектор сборки легкой цепи включает эукариотические элементы контроля транскрипции, оперативно связанные с полинуклеотидом, кодирующим лидерную последовательность человека VKI-L12 (аминокислотной последовательностью MDMRVPAQLLGLLLLWLPGAKC (SEQ ID NO:27), Bentley, D. L. & Rabbitts, T. H., Nature 288, 1980, cc.730-733) и константной областью IgLK человека, причем указанные элементы контроля транскрипции включают ранний промотор цитомегаловируса (CMV) и поли-А дополнительный сигнал вируса SV40. Применение соответствующим образом сконструированных праймеров для сборки VK гарантирует, что полинуклеотид последовательности, кодирующей лидер VKI-L12, VK область и константную область IgLK объединены в рамку с итоговым вектором экспрессии легкой цепи. Продукт лигирования используют для трансформации DH10B компетентных клеток Е.coli по протоколам производителя. Колонии, содержащие плазмиду и инсерт определенного размера, могут быть идентифицированы, используя различные методы, известные в данной области (например, рестрикционное расщепление препарата векторной ДНК, ПЦР амплификацию векторной последовательности). Плазмидные клоны с инсертами определенного размера могут быть секвенированы, используя реакцию дидезоксисеквенирования (например, продукт BigDye Terminator v3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, ABI). Плазмидную ДНК приготовляют из выбранных клонов, используя мини и макси наборы реактивов QIAGEN, по протоколам производителя.
Препараты ДНК плазмидного вектора экспрессии, кодирующего полипептиды анти-ICOS тяжелой цепи и легкой цепи, используют для совместной трансфекции клеток HEK293. Совместно трансфецированные клетки HEK293 культивируют в стандартных условиях. Антитело-содержащую кондиционную среду собирают через 72 и 144 ч после трансфекции. Секретированный растворимый IgG человека очищают от кондиционных сред, непосредственно используя колонки объемом 1 мл HiTrap с белком А по рекомендациям производителя (фирма APBiotech, Inc., Piscataway, Нью-Джерси). Очищенный IgG человека (обычно чистота >95% судя по результатам SDS-PAGE) диализируют против фосфатно-солевого буфера (ФСБ), сверхбыстро замораживают и хранят при -70°C.
Концентрацию IgG в очищенном препарате определяют количественно, используя анализ рецептора-ловушки ELISA. Вкратце, молекулы IgG захватываются в лунках 96-луночного планшета через иммобилизованное козье анти-человеческого IgG H+L специфическое антитело, и определяют с HRP конъюгированным антителом к легкой цепи каппа человека. Анализ калибруют, используя контрольное IgG1 моноклональное антитело с иной специфичностью.
Таблица 2
Характерные наборы праймеров для сборки областей VH и VK. Специфичные для генов нуклеотиды обозначены прописными буквами, специфичные для вектора нуклеотиды обозначены строчными буквами. Сайты распознавания для эндонуклеаз рестрикции, применяемых для клонирования фрагментов VH и VK, подчеркнуты
Univ VH FW
tatatatatctagacatatatatgggtgacaatgacatccactttgcctttctctcc (SEQ ID NO:11)
VH FW1
tccactttgcctttctctccacaggtgtccactccCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG GGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTG (SEQ ID NO:12)
VH RE2
CATATAGTAGCCGGTGAAGGTGTATCCAGAAGCCTTGCAGGAGA CCTTCACTGAGGCCCCAGGCTTC (SEQ ID NO:13)
VH FW3
CACCGGCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAG GGCTTGAGTGGATGGGATGGATC (SEQ ID NO:14)
VH RE4
CTGCCCTGAAACTTCTGTGCATAGTTTGTGCCACCACTGTGAGGG TTGATCCATCCCATCCAC (SEQ ID NO:15)
VH FW5
CAGAAGTTTCAGGGCAGGGTCACCATGACCAGGGACACGTCCAT CAGCACAGCCTACATGGAGCTGAG (SEQ ID NO:16)
VH RE6
GTCCTCGCACAGTAATACACGGCCGTGTCGTCGGATCTCAGCCTG CTCAGCTCCATGTAGGCTG (SEQ ID NO:17)
VH FW7
GTATTACTGTGCGAGGACGTATTACTATGATAGTAGTGGTTATTA CCATGATGCTTTTGATATCTG (SEQ ID NO:18)
VH RE8
tatatatagggcccttggtggaggcCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCCTTGGCCCCAGATATCAAAAGCATC (SEO ID NO:19)
VK FW1
tatatataccccggggccaaatgtGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCC GTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAG (SEQ ID NO:20)
VK RE2
GATACCAGGCTAACAACCTGCTAATACCCTGACTCGCCCGACAA GTGATGGTGACTCTGTCTCCTACAGA (SEQ ID NO:21)
VK FW3
GTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAACTCC TGATCTATGTTGCATCCAGTTTGCAAAGTG (SEQ ID NO:22)
VK RE4
GTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCGCTGAACCTTGATGGGAC CCCACTTTGCAAACTGGATG (SEQ ID NO:23)
VK FW5
CTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAA GATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAG (SEQ ID NO:24)
VK RE6
tatatatacgtacgTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTCCAC GGGAAACTGTTAGCCTGTTGACAATAGTAAG (SEQ ID NO:25)
Анти-ICOS антитело с повышенной АЗКЦ, включающее вариант домена Fc
Вектор экспрессии антитела, кодирующий анти-ICOS антитело с повышенной АЗКЦ, имеющий вариант домена Fc, включающий аминокислотные замещения S239D, A330L и I332E (который в настоящем изобретении обозначается «IC9G1-3M»), может быть выработан, используя методы, описанные в US 2004/0132101 и 2005/0054832. Вкратце, описанный выше вектор экспрессии, кодирующий домены JMab136 VH и VL, модифицируют, используя набор для сайт-направленного мутагенеза (например, QuickChange (фирма Promega)) для внедрения необходимых замещений нуклеотидов в последовательности полинуклеотида, кодирующего константную область тяжелой цепи, чтобы получить вектор экспрессии антитела IC9G1-3M. Очищенное антитело IC9G1-3M получают путем трансфекции клеток HEK239F вектором экспрессии антитела IC9G1-3M. Трансфецированные клетки подпитывают на 3 и 6 сутки, а содержащую антитело кондиционную среду собирают на 9 сутки. Антитело очищают от кондиционной среды, используя колонку с белком А заводского изготовления (фирма GE Healthcare). Антитело элюируют с колонки буфером с низкой величиной рН, нейтрализуют и диализируют против ФСБ. Концентрацию очищенного антитела подсчитывают в растворе по оптической плотности при 280 нм.
Анти-ICOS антитело с нулевой АЗКЦ, содержащее вариант области Fc
Вектор экспрессии антитела, кодирующий анти-ICOS антитело со сниженным действием АЗКЦ, имеющее область Fc, включающую аминокислотные замещения L234F, L235E и P331S (называемое в настоящем изобретении «IC9G1-TM»), получают, используя методы, описанные в US 2004/0132101 и US 2005/0054832. Вкратце, вектор экспрессии описанного выше антитела, кодирующий JMab136 VH и VL домены, модифицируют, используя мутагенный набор сайт-направленного действия (например, QuickChange (фирма Promega)) для внедрения необходимых замещений нуклеотидных остатков в полинуклеотидную последовательность, кодирующую константную область тяжелой цепи для выработки вектора экспрессии антитела IC9G1-TM. Очищенное антитело IC9G1-TM вырабатывают путем трансфекции клеток HEK239F вектором, экспрессирующим антитело IC9G1-TM. Трансфецированные клетки подпитывают на 3 и 6 сутки и антитело-содержащую стандартную среду собирают на 9 сутки. Антитело очищают от стандартной среды, используя колонку с белком А заводского изготовления (фирма GE Healthcare). Антитело элюируют с колонки буфером с низкой величиной рН, нейтрализуют и диализируют против ФСБ. Концентрацию очищенного антитела подсчитывают в растворах по оптической плотности при 280 нм.
Афукозилированное анти-ICOS антитело с повышенной АЗКЦ
Композицию антитела IC9G1 (обозначаемого в настоящем изобретении «IC9G1-aFuc»), включающую множество антител, имеющих сложные N-гликозид-связанные цепочки сахаров, связанные с Asn297 области Fc, в которой фукоза не связана с N-ацетилглюкозамином в редуцируемом конце, приготовляют методами, изложенными в US 6946292. Вкратце, модифицированные по фукозилтрансферазе клетки СНО трансфецируют препаратом ДНК плазмидного вектора экспрессии, кодирующего тяжелую и легкую цепи антитела JMab136. Трансфецированные клетки подпитывают на 3 и 6 сутки и антитело-содержащую стандартную среду собирают на 9 сутки. Антитело очищают от стандартной среды, используя колонку с белком А заводского изготовления (фирма GE Healthcare). Антитело элюируют с колонки буфером с низкой величиной рН, нейтрализуют и диализируют против ФСБ. Концентрацию очищенного антитела подсчитывают в растворах по оптической плотности при 280 нм.
Описание профиля связывания анти-ICOS антитела с повышенной АЗКЦ
Профиль связывания анти-ICOS антитела с повышенной АЗКЦ может быть описан с помощью ряда методов, известных специалистам в данной области. Антитела могут быть описаны, используя, например, но не ограничиваясь ими, анализы ELISA на основе клеток, анализы ELISA, используя рекомбинантную молекулу ICOS в качестве реагента-ловушки, жидкостную цитометрию, анализ Biacore.
5
Способность анти-ICOS антитела с повышенной АЗКЦ может быть оценена анализом связывания ICOS на основе клеток, используя стабильно трансфецированные клетки, экспрессирующие рекомбинантный белок ICOS на поверхности клеток в качестве реагента-ловушки. В US 6803039 описывают линию ICOS трансгенных клеток СНО и линию ICOS трансгенных клеток НРВ-ALL, каждая из которых может применяться в методе ELISA на основе клеток. Метод ELISA на основе клеток может быть выполнен, используя какую-либо из методик, известных специалистам в данной области. Например, HPB-ALL h-ICOS+ клетки культивируют по стандартным протоколам в среде RPMI 1640, содержащей L-глютамин и обогащенной 10% фетальной сывороткой теленка. Отдельные лунки с круглым дном 96-луночного планшета засевают стабильно трансфецированными клетками HPB-ALL hICOS в количестве 1×10 и инкубируют в течение ночи. Клетки однократно промывают буфером ELISA до инкубирования на льду с разными количествами анти-ICOS антитела. Реакции связывания проводят в трех повторах для каждой исследуемой концентрации антитела. В исследование следует включить лунки отрицательного контроля, для которого используют изотипически подобранное антитело с иной специфичностью. Дополнительные лунки отрицательного контроля, засеянные нетрансфецированными HPB-ALL клетками, могут использоваться для дополнительной демонстрации связывающей специфичности анти-ICOS антитела. После инкубирования с антителом клетки HPB-ALL hICOS промывают трижды 200 мкл буфера ELISA. Количество анти-ICOS антител, связанных с клетками HPB-ALL hICOS, может быть определено, используя козье анти-kappa человека антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена, по стандартным протоколам. ICOS-специфичное антитело должно дать доза-зависимый сигнал ELISA с клетками HPB-ALL hICOS, но не с исходными клетками HPB-ALL. Ожидают, что сигнал ELISA достигает максимума при концентрации антитела, при которой доступные эпитопы на поверхности клетки оказываются связанными.
2
4
Анти-ICOS антитела также могут быть охарактеризованы методом ELISA, в котором используют ICOS-Fc гибридный белок (фирма R&D Systems) в качестве реагента-ловушки. Анализы методом ELISA могут быть выполнены по какому-либо одному из установленных протоколов, известных специалистам в данной области. Например, планшеты для микротитрований покрывают гибридным белком ICOS-Fc (например, 100 мкл 0,25 мкг/мл ICOS-Fc белка) и инкубируют при 4°C в течение ночи. Какие-либо остающиеся сайты связывания блокируют 4% снятым молоком в буфере ФСБ (блокирующий буфер) в течение 1 ч при 37°C. Примерно 25-50 мкл раствора анти-ICOS антитела разной концентрации добавляют в каждую лунку и инкубируют в течение 1 ч при 37°C.После промывки лунок козье анти-каппа человека антитело, объединенное с пероксидазой хрена, используют для обнаружения гибридного белка ICOS-Fc, связанного анти-ICOS антителом, по рекомендациям производителя. Обнаружение проводят добавлением 30 мкл субстрата тетраметилбензидина (ТМБ) (фирма Pierce) с последующей нейтрализацией 30 мкл 0,2 М HSO. Поглощение считывают при 450 нм. В данное исследование следует включить в качестве отрицательного контроля в лунки сочетающееся по изотипу антитело несоответствующей специфичности. Кроме того, лунки отрицательного контроля без ICOS-Fc белка также могут быть включены в исследование. ICOS-специфическое антитело может дать доза-зависимый сигнал ELISA в лунках, покрытых ICOS-Fc, но не в лунках без нанесения, являющихся отрицательным контролем. Ожидают, что сигнал ELISA достигает максимума при концентрации антитела, когда все доступные эпитопы оказываются занятыми.
Специфичность по антигену анти-ICOS антитела с повышенной АЗКЦ также может быть охарактеризована методами жидкостной цитометрии. Выделенные клетки, экспрессирующие ICOS человека на клеточной поверхности (например, стабильные трансфектанты клетки СНО hICOS, активированные Т-лимфоциты), инкубируют с флуоресцентно конъюгированным анти-ICOS антителом по стандартным протоколам. Клетки отрицательного контроля, которые не проявляют ICOS на своей поверхности, окрашивают по тому же протоколу. Иммуно-окрашенные клетки анализируют на жидкостном цитометре. Клетки, инкубированные с антителом отрицательного контроля неродственной специфичности, могут также включаться в настоящее исследование. ICOS- экспрессирующие клетки, окрашенные флуоресцентно конъюгированным анти-ICOS антителом, должны иметь среднюю интенсивность флуоресценции выше, чем у клеток, не экспрессирующих ICOS, которые окрашивались тем же антителом, или чем у ICOS-экспрессирующих клеток, окрашенных антителом отрицательного контроля, обладающим неродственной специфичностью.
Связывающее сродство анти-ICOS антитела с повышенной АЗКЦ также может быть установлено, используя систему Biacore (см. US 6803039).
Антиген-связывающее сродство деамидированного анти-ICOS антитела
Деамидирование аспарагиновых остатков может существенно повлиять на химическое разрушение фармацевтических антител (см. Chelius и др., Anal. Chem. 77, 2005, cc.6004-6011). Деамидирование может иметь особое значение, если сайт потенциального деамидирования расположен в областях CDR антитела. CDR3 вариабельного домена легкой цепи антитела JMAM36 включает NS сайт потенциального деамидирования по положению 92 по нумерации Kabat. Влияние деамидирования на антиген-связывающее сродство анти-ICOS антитела можно определить, используя известные специалистам в данной области методы. Вкратце, анти-ICOS антитело хранят в условиях, используемых для повышения химического процесса деамидирования. Например, анти-ICOS антитело можно хранить в течение двух недель при 40°C в буфере с величиной рН 8,5 или 9,5 для увеличения процесса деамидирования. Поскольку Деамидирование остатка аспарагина меняет общий заряд белка, степень деамидирования у данного очищенного образца антитела может быть оценена с помощью ряда аналитических методов, например, но ими перечень не ограничивается, ионообменной хроматографии, изоэлектрофокусирования, жидкостной хроматографии/массспектрометрии. Влияние деамидирования на ICOS-связывающее сродство может быть установлено путем сравнения связывающих свойств препаратов антитела IC9G1 с высокими и низкими уровнями деамидирования. Связывающее сродство различных препаратов антител можно проанализировать, например, исследованием клеток на основе метода ELISA, методом ELISA, используя рекомбинантную молекулу ICOS в качестве реагента-ловушки, методом жидкостной цитометрии, методом Biacore. Существенное снижение ICOS-связывающего сродства препаратов IC9G1 анти-ICOS антитела в связи с деамидированием играет важную роль в химическом разрушении антитела. В другом варианте ICOS-связывающее действие препаратов недеамидированного и деамидированного IC9G1 антитела может быть весьма сходным, следовательно, деамидирование не является важным показателем при оценке метаболических путей разрушения антитела. Если деамидирование представляет проблему для долгосрочной стабильности IC9G1 анти-ICOS антитела, тогда сайт деамидирования может быть элиминирован из аминокислотной последовательности путем получения вариантов с единичными аминокислотными заменами, используя описанные выше методы. ICOS-связывающее сродство какого-либо несущественного по деамидированию варианта анти-ICOS антитела может быть охарактеризовано с помощью способов, описанных в настоящем изобретении.
Действие АЗКЦ in vitro анти-ICOS антитела с повышенной АЗКЦ
5l
Действие АЗКЦ разных анти-ICOS антител может быть определено исследованием АЗКЦ in vitro, например, по описанию в US 5500362 или 5821337. Анализ АЗКЦ может быть выполнен, используя коммерчески доступный набор, например, набор CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (фирма Promega), а также другие. Продукт CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (фирма Promega) является колориметрической альтернативой методам определения цитотоксичности по высвобождению Cr. Метод CytoTox 96 количественно измеряет лактатдегидрогеназу (ЛДГ), стабильный цитозольный фермент, который высвобождается при лизисе клеток. Высвободившийся ЛДГ в культуральных супернатантах измеряют в 30-минутном исследовании со спаренным ферментом, в результате которого происходит конверсия соли тетразолия в продукт красного формазана. Количественно определяемая интенсивность цвета формируется пропорционально числу лизировавшихся клеток.
6
6
2
Исследования проводят по указаниям производителя. Вкратце, клетки-мишени промывают буфером ФСБ, ресуспендируют в среде RPMI-5 без фенола до плотности клеток 0,4×10/мл. Эффекторные клетки NK однократно промывают в ФСБ и ресуспендируют в среде RPMI-5 без фенола до плотности клеток 1×10 /мл. Исследования проводят в 96-луночных планшетах с круглодонными лунками. В каждом планшете присутствуют и экспериментальные, и контрольные лунки. Экспериментальные лунки заполняют путем объединения 50 мкл раствора соответствующего антитела, 50 мкл суспензии эффекторных клеток. Описанные выше плотности клеток приводят к соотношению клеток-мишеней к клеткам-эффекторам 1:2,5, исходный раствор эффекторных клеток может дополнительно разводиться или концентрироваться, если требуются разные соотношения клеток-мишеней к клеткам-эффекторам. Несколько разных типов контрольных лунок используют для подсчета: (i) спонтанного высвобождения ЛДГ из клеток-мишеней (самопроизвольные мишени), (ii) спонтанного высвобождения ЛДГ из клеток-эффекторов (самопроизвольные эффекторы), (iii) максимального высвобождения ЛДГ из клеток-мишеней (максимальные мишени), и (iv) наличия контаминантов в культуральной среде (фон). Все лунки при использовании 96-луночного планшета содержат равный конечный объем. Реакции проводят в трех повторах. После установки планшеты центрифугируют в режиме 120 g в течение 3 мин для осаждения клеток. Инкубируют планшеты при 37°C в атмосфере 5% CO в течение 4 ч. За 45 мин до завершения инкубирования 15 мкл поставляемого производителям лизирующего буфера вносят в контрольные лунки максимального высвобождения клеток-мишеней. После инкубирования чашки центрифугируют в режиме 120 g в течение 4 мин. По 50 мкл супернатанта из каждой лунки переносят в новый 96-луночный планшет с плоскодонными лунками. По 50 мкл субстратной смеси (созданной производителем, поставляющим компоненты) вносят в лунки планшета и инкубируют при комнатной температуре 10-20 мин без доступа света. Вносят по 50 мкл стоп-буфера от производителя и измеряют поглощение при длине волны 490 или 492 нм с помощью ридера для планшетов. Проценты цитотоксичности равны (экспериментальных - эффекторных спонтанных - целевых спонтанных) / (целевой максимум - целевой спонтанный). Перед подсчетом процент цитотоксичности всех других величин снижают до уровня фона.
Потенциальные клетки-мишени для анти-ICOS антитело-зависимой цитотоксичности включают, но ими не ограничиваются, стабильные трансфектант hICOS экспрессирующие линии клеток (например, ICOS человека экспрессирующие клетки линии СНО и ICOS человека экспрессирующие клетки линии HPB-ALL, описанные в US 6803039). В другом варианте свежевыделенные клетки, проявляющие ICOS человека на поверхности (например, активированных Т-клеток), могут также применяться в качестве клеток-мишеней. К соответствующим клеткам-эффекторам относятся, но ими не ограничиваются, свежевыделенные природные клетки-киллеры (клетки NK) и мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК). Линии клеток NK, экспрессирующие трансгенный рецептор Fc (например, CD 16) и ассоциированный сигнальный полипептид (например, FCεRI-γ), могут также выступать в качестве клеток-эффекторов (см., например, WO 2006/023148).
Исследования АЗКЦ проводят, параллельно используя немодифицированное анти-ICOS антитело (например, IC9G1), анти-ICOS антитело с повышенной АЗКЦ (например, IC9G1-aFuc, IC9G1-3М). Ожидают, что антитела с повышенной АЗКЦ опосредуют лизис большего процента клеток-мишеней по сравнению с соответствующим показателем, опосредуемым немодифицированным антителом. Анти-ICOS антитело с пониженным действием АЗКЦ (например, IC9G1-ТМ) может также включаться в исследование в качестве отрицательного контроля. Специфичность по отношению к мишени исследования анти-ICOS опосредованной АЗКЦ может быть показана, используя клетки-мишени, не экспрессирующие hICOS. Ожидают, что фоновая цитотоксичность в исследованиях АЗКЦ, которые проводят, используя клетки-мишени, не экспрессирующие hICOS, сходна у реакций, в которых используют анти-ICOS антитела с повышенной АЗКЦ и немодифицированные анти-ICOS антитела.
Экспрессия белка ICOS человека в трансгенных мышах
Трансгенные мыши с геном ICOS человека, которые могут быть получены, используя методы, известные специалистам в данной области, или другие трансгенные животные, экспрессирующие ICOS человека, могут применяться для оценки разных терапевтических режимов, включающих анти-ICOS антитела, например, вариаций концентраций дозирования, количества и хронометража. Эффективность для людей разных терапевтических режимов может прогнозироваться, например, по двум показателям, описанным ниже, т.е. по истощению Т-клеток в определенных жидкостях тела и/или тканях и по способности анти-ICOS антитела связывать Т-клетки. Определенные варианты осуществления настоящего изобретения, эффективные в трансгенных мышах с геном ICOS человека, могут применяться в композициях и способах по настоящему изобретению для лечения расстройств и заболеваний Т-клеток, включая, но ими не ограничиваясь, аутоиммунные заболевания или расстройства, воспалительные заболевания или расстройства и злокачественные поражения Т-клеток.
Чтобы определить, возможна ли экспрессия ICOS человека в субпопуляциях Т-клеток из трансгенных мышей (линии hICOStg), включающих трансген ICOS человека, Т-клетки могут быть экстрагированы из тимуса, периферической крови, селезенки, лимфоузлов и промывных вод брюшной полости этих мышей. Экспрессия ICOS человека и экспрессия ICOS мыши могут быть определены в этих клетках путем их контакта с анти-ICOS антителами, которые специфически связывают ICOS человека (например, IC9G1) или ICOS мыши (mICOS) (например, клон 15F9, фирма BioLegend, Калифорния). Связывание антитела с линиями субпопуляций Т-клеток может быть обнаружено, используя четырехцветное флуоресцентное окрашивание при анализе жидкостной цитометрии. Уровни относительной экспрессии mICOS и hICOS затем могут быть оценены по измерению средней интенсивности флуоресценции (анти-hICOS для hICOS и анти-mICOS для mICOS), соответственно.
Анти-ICOS антитело опосредует истощение Т-клеток in vivo
2
Анти-ICOS антитела по настоящему изобретению, которые связываются с белком ICOS человека, могут быть оценены по способности истощать субпопуляции Т-клеток в тимусе, периферической крови, селезенке и лимфоузлах у мышей линии hICOStg in vivo. Например, каждое антитело может быть введено мышам в количестве или 250, или 50 мкг/мышь, единичная доза примерно в 10-50 раз ниже дозы 375 мг/м, которую вводят людям. Истощение Т-клеток из тимуса, крови, селезенки и лимфоузлов у мышей линии hICOStg может быть определено по иммунофлуоресцентному окрашиванию методом жидкостной цитометрии. Результаты применения анти-ICOS антител, выявленных в виде истощения Т-клеток, могут коррелировать с применением людьми, и антитела со свойствами выявленных антител могут применяться в композициях и способах по настоящему изобретению для лечения расстройств и заболеваний человека, связанных с Т-клетками, включая, но ими не ограничиваясь, аутоиммунные заболевания или расстройства, воспалительные заболевания или расстройства и злокачественные поражения Т-клеток.
Определение возможной зависимости истощения тканевых Т-клеток от FCγR
Чтобы установить, может ли введение анти-ICOS моноклонального антитела по настоящему изобретению привести к истощению Т-клеток, могут быть произведены следующие исследования, чтобы показать зависимость от экспрессии FcγR. Путем интербридинга мышей hICOStg с мышами, утратившими экспрессию определенного рецептора FcγR, могут быть получены мыши, которые экспрессируют hICOS и утратили экспрессию определенного рецептора FcγR. Такие мыши могут применяться в исследованиях по оценке способности анти-ICOS антител к истощению Т-клеток через метаболические пути, которые включают экспрессию FcγR, например, АЗКЦ. Таким образом, анти-ICOS антитела, выявленные в результате таких исследований, могут применяться для конструирования анти-ICOS антител с повышенной эффекторной функцией, используя описанные выше методы. Такие антитела в свою очередь могут применяться в композициях и способах по настоящему изобретению для лечения расстройств и заболеваний человека, связанных с Т-клетками, включая, но ими не ограничиваясь, аутоиммунные заболевания или расстройства, воспалительные заболевания или расстройства и злокачественные поражения Т-клеток.
-/-
-/-
Эффекторные клетки мыши экспрессируют четыре разных класса FcγR для IgG, FcγRI (CD64) высокого сродства и FcγRII (CD32), FcγRIII (CD 16) и молекулы FcγRIV с низким сродством. FcγRI, FcγRIII и FcγRIV являются гетероолигомерными комплексами, в которых соответствующие лиганд связанные а цепи ассоциированы с общей цепью γ (FcRγ). Экспрессия цепи FcRγ необходима для сборки FcγR и для инициации эффекторных функций FcγR, включая фагоцитоз макрофагами. Поскольку мыши FcRγ утратили молекулы высокого сродства FcγRI (CD64) и низкого сродства FcγRIII (CD16) и FcγRIV, мыши FcRγ, экспрессирующие hICOS, могут применяться для оценки роли FcγR в истощении Т-клеток в ткани после лечения анти-ICOS антителом.
Длительность истощения Т-клеток, индуцированных анти-ICOS антителом
Для оценки эффективности и длительности истощения Т-клеток, мышам hICOStg может быть введена инъекцией одна низкая доза (например, 250 мкг) анти-ICOS антитела, и длительность и доза-ответ Т-клеток проявляются в качестве функции времени. Предполагают, что результаты покажут истощение на протяжении значительного периода времени (например, от одной недели и до шести месяцев) ICOS-экспрессирующих Т-клеток с их последующим постепенным восстановлением.
Терапевтическая эффективность подкожного введения анти-ICOS антитела по настоящему изобретению
Исследование, описанное в настоящем изобретении, может быть использовано для определения, может ли подкожное введение анти-ICOS антитела по настоящему изобретению эффективно истощать субпопуляцию Т-клеток. Результаты эффективности различных способов доставки лекарственного средства на животных моделях могут быть соответствующим образом пересчитана для людей способами, известными в данной области.
Например, мышей hICOStg можно лечить анти-ICOS антителом по настоящему изобретению в количестве 250 мкг подкожным, внутрибрюшинным или внутривенным введением. Величины определяют по среднему числу (± среднее отклонение) в мл ICOS-положительных Т-клеток в крови, тимусе, селезенке, лимфатических узлах и брюшной полости на седьмые сутки по данным жидкостной цитометрии. Ожидают, что подкожное, внутрибрюшинное и внутривенное введение анти-ICOS антитела по настоящему изобретению может эффективно истощать ICOS-экспрессирующие циркулирующие и тканевые Т-клетки in vivo.
Применение анти-ICOS антител для снижения роста опухоли на модели лимфомы in vivo
Анти-ICOS антитела по настоящему изобретению, которые связываются с ICOS человека, могут быть оценены по присущей им способности понижать рост опухоли в животных моделях in vivo. Например, SCID мышам могут быть введены инъекцией линии ICOS-экспрессирующих клеток для получения трансплантата опухоли (например, стабильно трансфецированных HBP-ALL hICOS клеток). Затем мышам могут вводить несколько доз анти-ICOS антитела по настоящему изобретению (например, 100 мкг антитела/мышь 5 раз). Рост опухоли можно контролировать, используя стандартные методы (например, объем опухоли, массу тела животного, паралич). Воздействие обработки анти-ICOS антителом на рост опухоли может быть определено сравнением животных, получающих лечение анти-ICOS антителом или контрольный антителом. Результаты, полученные с применением анти-ICOS антител, оценивают в качестве способных снижать рост опухоли, могут коррелировать с применением у людей, и антитела, способные снижать рост опухоли, могут применяться в композициях и способах по настоящему изобретению для лечения расстройств и болезней человека, связанных с Т-клетками, включая, но, не ограничиваясь ими, аутоиммунные заболевания или расстройства, воспалительные заболевания или расстройства и злокачественные поражения Т-клеток.
Чтобы определить, зависит ли способность анти-ICOS антитела понижать рост опухоли от плотности ICOS, линии опухолевых клеток с разными профилями экспрессии ICOS могут анализироваться описанными выше способами оценки роста опухоли in vivo. Полученные результаты могут показать, может ли плотность ICOS на поверхности опухолевых клеток влиять на рост опухоли, понижая действие анти-ICOS антитела. Результаты могут коррелировать с лечением людей с варьирующими уровнями экспрессии ICOS. Таким образом, методы исследования наличия и плотности ICOS, описанные в настоящем изобретении, могут применяться для выявления пациентов или групп пациентов, для которых определенные анти-ICOS антитела могут понизить рост злокачественных Т-клеток и/или для определения соответствующих доз.
-/-
-/-
Чтобы определить, зависит ли способность анти-ICOS антитела понижать рост опухоли от FcγR, описанное выше исследование роста опухоли in vivo может быть выполнено, используя SCID мышей с компромисной активностью Fcγ рецептора (например, FcRγ). С помощью процесса интербридинга SCID мышей с мышами, утратившими экспрессию определенного FcγR, могут быть получены мыши SCID, которые также утратили экспрессию определенного FcγR (например, SCID, FcRγ мыши). Такие мыши могут использоваться в исследованиях по оценке способности анти-ICOS антител понижать рост опухоли через метаболические пути, в которые включена экспрессия FcγR, например, АЗКЦ. Исходя из указанных результатов анти-ICOS антитела с повышенной АЗКЦ, могут быть сконструированы, используя описанные выше методы. Такие антитела в свою очередь могут применяться в композициях и способах по настоящему изобретению для лечения Т-клеточных расстройств и заболеваний человека, включая, но, не ограничиваясь ими, аутоиммунные заболевания или расстройства, воспалительные заболевания или расстройства и злокачественные поражения Т-клеток.
Связывание IC9G1-aFuc с рецепторами Fcгамма
D
D
Константы уравнения связывания IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc с FcγRIIIA-V158, FcγRIIIA-F158, FcγRIIA и FcγRIIB человека и макаки крабоеда измеряют на приборе BIAcore 3000 (Упсала, Швеция). Измерения проводят по стандартным протоколам. Вкратце, все IgG иммобилизованы на отдельных проточных кюветах двух СМ5 сенсорных чипов, используя стандартную химическую методику соединения аминокислот по рекомендации производителя. Уровни иммобилизованного IgG варьируют от 8194 до 8725 RU. Исходные растворы рекомбинантно экспрессированных внеклеточных доменов всех FcγR при 4000 или при 16000 нм приготовляют и затем серийно разводят до требуемых концентраций, используя рабочий буфер (50 мМ буфер BBS, содержащий 0,01 М HEPES, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% Р-20). Двойные инъекции каждой концентрации FcγR затем закалывают поверх поверхностей всех IgG при скорости тока 5 мкл/мин. Данные по связыванию собирают примерно через 50 мин, после чего на 30 с впрыскивают 5 мМ HCl между инъекциями для регенерации IgG поверхностей. Несколько буферных инъекций также рассеивают через серии инъекций. Одну из таких инъекций буфера используют отдельно наряду с данными контрольных клеток для корректировки наборов полученных данных. После сбора всех данных по связыванию определяют отдельно средние данные для каждой у концентрации, затем сопоставляют с 1:1 изотермой связывания, по которой определяют константы (K) уравнения связывания. Анализ проводят, используя программное обеспечение BIAevaluation. Величины K (нМ) показаны на фиг.2.
IC9G1-aFuc ингибирует анти-CD3/ICOSL индуцированную пролиферацию Т-клеток человека
96-луночные планшеты для культуры ткани покрывают 25 мкл белка B7h-Fc в концентрации 2 мкг/мл и 25 мкл анти-CD3 антитела (OKT3) в концентрации 0,2 мкг/мл. Выделенные Т-клетки помещают на планшеты с предварительно нанесенным покрытием в присутствии различных концентраций (0,1-20 мкг/мл) IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc антитела. Пролиферацию Т-клеток подтверждают измерением после 72 ч инкубации числа жизнеспособных клеток в каждой лунке, используя метод люминесценции. Пролиферацию Т-клеток в непокрытых лунках и лунках, покрытых либо анти-CD3 антителом, либо только одним белком B7h-Fc, определяют в качестве контроля.
Пример полученных результатов показан на фиг.3. Т-клетки без стимуляции или Т-клетки после стимуляции анти-CD3 антителом или B7h-Fc отдельно проявляют весьма ограниченный исходный уровень пролиферации. Индукция Т-клеток связанными с поверхностью анти-CD3 и B7h-Fc в присутствии 0,01 мг/мл антитела приводит к пролиферации клеток, которая существенно выше исходного уровня. Анти-CD3/B7h-Fc индуцированная пролиферация Т-клеток подавляется всеми тремя исследованными анти-ICOS антителами (IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc) доза-зависимым образом. В настоящем исследовании ингибирующее действие IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc антител в существенной степени идентично.
IC9G1-aFuc не ингибирует анти-CD3/анти-CD28 индуцированной пролиферации Т-клеток
96-луночные планшеты для культуры ткани покрывают анти-CD3 (OKT3) и анти-CD28 антителами. Выделенные из миндалин Т-клетки помещают на планшеты с предварительно нанесенным покрытием в присутствии 10 мкг/мл антитела IC9G1-aFuc. Пролиферацию Т-клеток подтверждают измерением после 72 ч инкубации числа жизнеспособных клеток в каждой лунке, используя метод люминесценции. Пролиферацию Т-клеток в непокрытых лунках и лунках, покрытых либо анти-CD3 антителом, либо только одним анти-CD28 антителом, определяют в качестве контроля.
Пример полученных результатов показан на фиг.4. Т-клетки без стимуляции или Т-клетки после стимуляции анти-CD3 антителом или анти-CD28 антителом отдельно проявляют весьма ограниченный исходный уровень пролиферации. Индукция Т-клеток связанными с поверхностью анти-CD3 и анти-CD28 антителами приводит к пролиферации клеток, существенно выше исходного уровня (αCd3+αCD28). Антитело IC9G1-aFuc (10 мкг/мл) не ингибирует анти-CD3/ анти-CD28 индуцированной Т-клеточной пролиферации (αCd3+αCD28+IC9G1-aFuc).
IC9G1-aFuc обладает повышенным АЗКЦ действием
Действие АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc устанавливают методом АЗКЦ in vitro, используя различные ICOS экспрессирующих первичные клетки и клеточные линии. Исследования АЗКЦ проводят по стандартным протоколам. Вкратце, клетки-мишени и эффекторные клетки (например, трансгенные клетки NK, экспрессирующие CD16 и ассоциированный сигнальный полипептид FCεRI-γ) высевают в определенном соотношении (например, в соотношении 2,5:1 эффекторных клеток к клеткам-мишеням) в присутствии антитела IC9G1-aFuc. Планшеты инкубируют на протяжении заранее определенного времени (например, 4 ч). Гибель клеток устанавливают по измерению высвобождения ЛДГ в супернатант, используя коммерчески доступный набор для выявления ЛДГ. Опосредованную антителом цитотоксичность подсчитывают путем вычитания от уровней ЛДГ в лунках с антителом исходные фоновые уровни ЛДГ из контрольных уровней без антитела. Опосредованную антителом цитотоксичность выражают в виде процента достигаемой максимальной цитотоксичности. Максимальная величина цитотоксичности производив от уровней ЛДГ, измеренных в лунках, содержащих химически дозированные клетки (например, в лунках, обработанных Triton-X 100). Активность АЗКЦ выражают путем построения кривой цитотоксичности, опосредованной антителом, в качестве функции концентрации антитела. Величины ЕС50 соответствуют концентрации антитела, приводящей к 50% максимальной опосредованной антителом цитотоксичности в конкретном исследовании.
Фиг.5А показывает пример измерений активности АЗКЦ, выполненный с применением стабильно трансфецированных клеток HPB-ALL hICOS в качестве клеток-мишеней. Получение ICOS трансгенной линии клеток человека HPB-ALL описано в US 6803039. Анализ АЗКЦ проводят, используя CD16/FCεRI-γ трансгенные NK клетки в качестве эффекторных клеток при соотношении эффектора к мишени. Реакцию АЗКЦ проводят в течение 4 ч. Устанавливают действие АЗКЦ антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc. Действие АЗКЦ, опосредованное антителом IC009, ниже уровня обнаружения указанным методом. Действие АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc существенно выше по сравнению с действием антитела IC9G1. В настоящем исследовании величины ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляют 138 пМ и 648 пМ, соответственно.
Фиг.5Б показывает пример измерений действия АЗКЦ, выполненных с использованием линии ICOS трансгенных клеток человека Jurkat в качестве клеток-мишеней. Анализ АЗКЦ проводят, используя CD16/FCεRI-γ трансгенные NK клетки в качестве эффекторных клеток при соотношении эффектора к мишени 2,5:1. Реакцию АЗКЦ проводят в течение 4 ч. Устанавливают действие АЗКЦ антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc. Все три антитела проявляют измеримое действие АЗКЦ. Максимальный процент действия АЗКЦ антител IC9G1-aFuc и IC9G1 выше, чем у антитела IC009. Максимальные проценты действия АЗКЦ антител IC9G1-aFuc и IC9G1 практически идентичны. В настоящем исследовании величины ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляют 5,7 пМ и 61 пМ, соответственно.
FH
Фиг.7 показывает пример измерений действия АЗКЦ, выполненных с использованием выделенных Т-клеток из миндалин человека в качестве клеток-мишеней. Экспрессию ICOS в Т-клетках миндалин человека ограничивают до популяции CD4+CD45RO+CD45RA-CXCR5+ T-клеток памяти (фиг.6). Т-клетки миндалин человека выделяют с помощью коммерчески доступного набора (Miltenyi MACS human PanT cell isolation kit). Исследование АЗКЦ проводят, используя выделенные NK клетки человека в качестве эффекторных клеток при соотношении эффектора к мишени 2:1, реакцию инкубируют в течение ночи. Устанавливают действие АЗКЦ антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc. Действие АЗКЦ, опосредованное IC009, ниже уровня обнаружения. В настоящем исследовании антитела IC9G1-aFuc и IC9G1 проявляют доза-зависимое действие АЗКЦ. Действие АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc существенно выше по сравнению с действием антитела IC9G1. В настоящем исследовании величины ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляют 8,2 пМ и 60,4 пМ, соответственно.
Фиг.8 показывает пример измерений действия АЗКЦ, выполненных с использованием выделенных Т-клеток из селезенки макаки крабоеда в качестве клеток-мишеней. Экспрессия ICOS существенным образом ограничивается популяцией CD4+CD45RA- Т-клеток памяти в селезенке (фиг.8А). Т-клетки-мишени макаки крабоеда выделяют, используя набор фирмы Miltenyi для выделения Т-клеток из приматов (но не из человека). Исследование АЗКЦ проводят, используя выделенные NK клетки человека в качестве эффекторных клеток при соотношении эффектора к мишени 2:1, реакцию инкубируют в течение ночи. Устанавливают действие АЗКЦ антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc. Действие АЗКЦ, опосредованное IC009, ниже уровня обнаружения. В настоящем исследовании антитела IC9G1-aFuc и IC9G1 проявляют доза-зависимое действие АЗКЦ. Действие АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc существенно выше по сравнению с действием антитела IC9G1. В настоящем исследовании величины ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляют 14,6 пМ и 236 пМ, соответственно.
Фиг.8 показывает пример измерений действия АЗКЦ, выполненных с использованием выделенных Т-клеток из брыжеечных лимфоузлов (БЛУ) макаки крабоеда в качестве клеток-мишеней. Экспрессия ICOS существенным образом ограничивается популяцией CD4+CD45RA-активированных Т-клеток в БЛУ (фиг.9А). Выделяют Т-клетки-мишени из селезенки макаки крабоеда, используя набор фирмы Miltenyi для выделения Т-клеток из приматов (но не из человека). Исследование АЗКЦ проводят, используя выделенные NK клетки человека в качестве эффекторных клеток при соотношении эффектора к мишени 2:1, реакцию инкубируют в течение ночи. Устанавливают активность АЗКЦ антител IC009, IC9G1 и IC9G1-aFuc. Действие АЗКЦ, опосредованное антителом IC009, проявляется на уровне обнаружения указанным методом. В данном исследовании антитела IC9G1-aFuc и IC9G1 проявляют доза-зависимую активность АЗКЦ. Активность АЗКЦ антитела IC9G1-aFuc существенно выше активности АЗКЦ антитела IC9G1. В данном исследовании величины ЕС50 антител IC9G1-aFuc и IC9G1 составляют 17,1 пМ и 198 пМ, соответственно.
Фармакокинетический профиль IC9G1-aFuc у макак крабоедов
Макакам крабоедам вводят внутривенно одну дозу IC9G1-aFuc антитела на 0 сутки эксперимента. Схема эксперимента показана в табл.3.
Таблица 3
Экспериментальное конструирование исследований in vivo IG9G1-aFuc в макаках крабоедах.
Группа
Агент
Доза (мг/кг)
Число
1
Только носитель
0
5 самцов
2
IC9G1-aFuc
0,01
5 самцов
3
IC9G1-aFuc
0,1
5 самцов
Группа
Агент
Доза (мг/кг)
Число
4
IC9G1-aFuc
1
5 самцов
5
IC9G1-aFuc
10
5 самцов
6
IC009
10
5 самцов
LAST
Фармакокинетический профиль IC9G1-aFuc анализируют путем введения одной дозы антитела и мониторинга концентрации в сыворотке на протяжении времени. Концентрацию антитела IC9G1-aFuc в сыворотке измеряют методом ELISA по стандартным протоколам. Концентрация антитела IC9G1-aFuc в сыворотке в виде функции времени представлена на фиг.10. Системная экспозиция, основанная на оценках AUC для IC9G1-aFuc и Cmax, возрастала пропорционально дозе с повышением дозы, отражая линейность фармакокинетических свойств антитела. Средние итоговые величины периода полураспада (t½ lz), составляющие 4,36±1,52 суток, 6,34±1,44 суток и 7,87±1,09 суток, наблюдают после болюсных инфузий 0,1 мг/кг, 1 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно.
In vivo истощение Т-клеток после введения одной дозы антитела IC9G1-aFuc
Макакам крабоедам вводят внутривенно одну дозу антитела IC9G1-aFuc. Доза антитела, введенная разным животным, представлена в табл.3. По двое животных из каждой группы умерщвляют на 8 сутки после дозирования. По трое животных из каждой группы умерщвляют на 29 сутки после дозирования. Уровень циркулирующих ICOS+ Т-клеток из селезенки и брыжеечного лимфоузла (БЛУ) подвергают мониторингу в течение четырех недель после введения одной дозы антитела. ICOS+ Т-клетки подвергают мониторингу методом жидкостной цитометрии.
Фиг.11 показывает изменения в уровне циркулирующих ICOS+ Т-клеток памяти после введения одной дозы IC9G1-aFuc антитела. Циркулирующие Т-клетки памяти обозначают CD3+CD4+CD45RA-ICOS+ клетками для целей настоящего исследования. Абсолютное выявленное число циркулирующих Т-клеток памяти нормализуют до числа циркулирующих Т-клеток памяти, выявленных на 0 сутки перед введением антитела. Введение одной дозы 0,01 мг/кг IC9G1-aFuc антитела приводит к существенному снижению числа циркулирующих Т-клеток памяти к 4-м суткам. Введение одной дозы 0,1 мг/кг, 1 мг/кг или 10 мг/кг IC9G1-aFuc антитела приводит к полной элиминации циркулирующих Т-клеток памяти к 4-м суткам эксперимента. Восстановление составляющей циркулирующих Т-клеток памяти по прошествии времени является доза-зависимым.
Фиг.13 представляет пример результатов истощения, наблюдаемого в компартменте Т-клеток брыжеечного лимфоузла (БЛУ). Т-клетки БЛУ выделяют из животных, умерщвленных на 8 и 29 сутки эксперимента. Абсолютное число ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти, выделенных из БЛУ, определяют методом жидкостной цитометрии. Хэлперные Т-клетки памяти обозначают «CD3+CD4+CD45RA-» для целей настоящего эксперимента. Абсолютное число ICOS+ Т-клеток памяти, выделенных из БЛУ на 8 сутки, отображают на фиг.13А. Введение одной дозы 0,1 мг/кг и 10 мг/кг IC9G1-aFuc антитела приводит к существенному доза-зависимому истощению ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти из брыжеечного лимфоузла (БЛУ). Сходное истощение ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти выявляют в лимфоузле миндалин и в подчелюстном лимфоузле. Фиг.13Б представляет процент истощения ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти в брыжеечном лимфоузле на 8 сутки. Процент истощения подсчитывают путем нормализации абсолютного числа ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти, обнаруженных у IC9G1-aFuc обработанных животных, относительно числа клеток, выявленных у контрольных животных, которых обрабатывали только носителем. Введение одной дозы 0,1 мг/кг и 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc приводит к истощению более чем 60% и 90%, соответственно, ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти из брыжеечного лимфоузла на 8 сутки.
Фиг.14 представляет пример результатов истощения, наблюдаемого в компартменте Т-клеток селезенки. Т-клетки селезенки выделяют из животных, умерщвленных на 8 и 29 сутки эксперимента. Абсолютное число ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти из селезенки определяют методом жидкостной цитометрии. Хэлперные Т-клетки памяти обозначают «CD3+CD4+CD45RA-» для целей настоящего эксперимента. Абсолютное число ICOS+Т-клеток памяти, выделенных из БЛУ на 8 и 29 сутки, отображают на фиг.14А. Введение одной дозы 0,1 мг/кг и 10 мг/кг IC9G1-aFuc антитела приводит к существенному доза-зависимому истощению ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти из селезенки на 8 сутки. Восстановление ICOS+ Т-клеток памяти селезенки является доза- зависимым, восстановление ICOS+ Т-клеток на 28 сутки более выражено у животных, которым вводили 0,1 мг/кг IC9G1-aFuc, по сравнению с животными, которым вводили 10 мг/кг IC9G1-aFuc. Фиг.14Б представляет процент истощения ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти селезенки в брыжеечном лимфоузле на 8 и 29 сутки. Процент истощения подсчитывают путем нормализации абсолютного числа ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти, обнаруженных у IC9G1-aFuc обработанных животных, относительно числа клеток, выявленных у контрольных животных, которых обрабатывали только носителем. Введение одной дозы 0,1 мг/кг и 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc приводит к истощению более чем 60% ICOS+ хэлперных Т-клеток памяти селезенки на 8 сутки. На 29 сутки ICOS+хэлперных Т-клеток памяти компартмента селезенки животных, которым вводили дозу 0,1 мг/кг IC9G1-aFuc, начинают восстанавливаться. ICOS+ хэлперные Т-клетки памяти компартмента селезенки животных, которым вводили дозу 10 мг/кг IC9G1-aFuc, больше истощены на 29 сутки по сравнению с 8 сутками.
In vivo введение одной дозы IC9G1-aFuc приводит к распаду уже сформированных зародышевых центров
Макакам крабоедам вводят внутривенно одну дозу IC9G1-aFuc антитела. Доза антитела, введенного разным животным, описывают в табл.3. Двух животных из каждой группы умерщвляют на 8 сутки после дозирования. По трое животных из каждой группы умерщвляют на 29 сутки после введения дозы. Конфигурацию белой пульпы селезенки исследуют на 8 и 29 сутки используя стандартные гистологические протоколы. Число В-клеток брыжеечного лимфоузла и зародышевого центра лимфоузла селезенки измеряют на 8 и 29 сутки методом жидкостной цитометрии.
Фиг.15 представляет пример структурных изменений в белой пульпе селезенки, вызванных внутривенным введением одной дозы IC9G1-aFuc. Показано низкое (в 10 раз) и высокое (в 20 раз) увеличение гистологических срезов белой пульпы, выделенной от контрольных и дозированных IC9G1-aFuc животных на 8 сутки (фиг.15А) и на 29 сутки эксперимента (фиг.15Б). Фолликулы селезенки атрофируются на 29 сутки после введения одной дозы антитела IC9G1-aFuc макакам крабоедам. Морфологию белой пульпы селезенки исследуют после введения одной дозы IC9G1-aFuc антитела. Показаны гистологические срезы селезенки, выделенные на 8 (А) и 29 сутки (Б) после введения IC9G1-aFuc антитела. Введение IC9G1-aFuc приводит к тяжелой атрофии фолликул селезенки на 29 сутки.
Фиг.12 показывает протокол жидкостной цитометрии, который используют для идентификации зародышевого центра В-клеток. Лимфоциты выделяют из лимфатических органов умерщвленных животных по стандартным протоколам. Выделенные лимфоциты окрашивают иммунокрасителями с анти-CD3, анти-CD20, анти-IgM и анти CD95 или анти-С027 антителами. Мертвые клетки исключают из анализа с помощью окрашивания 7AAD. Зародышевый центр N-клеток определяют в качестве или CD3-CD20+IgM-CD95+, или CD3-CD20+IgM-CD27+ клеток.
Фиг.13 представляет пример воздействия на компартмент зародышевого центра В-клеток брыжеечного лимфоузла, вызванного введением одной дозы IC9G1-aFuc. Лимфоциты БЛУ выделяют из животных, умерщвленных на 8 и 29 сутки эксперимента. Определяют абсолютное число В-клеток зародышевого центра методом жидкостной цитометрии. В-клетки зародышевого центра определяют в виде CD20+IgM- CD95+ клеток для целей настоящего эксперимента. Абсолютное число В-клеток зародышевого центра, выделенных из БЛУ на 8 сутки, представлены на фиг.13А. Введение одной дозы 0,1 мг/кг и 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc приводит к существенному доза-зависимому снижению В-клеток зародышевого центра из брыжеечного лимфоузла. Введение одной дозы антитела IC009 приводит к соизмеримой утрате В-клеток зародышевого центра из БЛУ на 8 сутки. Фиг.13Б представляет процент распада зародышевых центров в брыжеечном лимфоузле на 8 сутки. Процент распада подсчитывают путем нормализации абсолютного числа В-клеток зародышевого центра, выявленного у животных, обработанных IC9G1-aFuc, к числу клеток, выявленных у контрольных животных, обработанных только носителем. Введение одной дозы 0,1 мг/кг и 10 мг/кг IC9G1-aFuc антитела приводит к распаду более чем 75% и 90%, соответственно, зародышевых центров в брыжеечном лимфоузле на 8 сутки. Введение одной дозы 10 мг/кг of IC009 антитела приводит к распаду более чем 80% зародышевых центров в брыжеечном лимфоузле на 8 сутки. В-клетки зародышевого центра в этой модельной системе присутствуют в БЛУ до введения IC9G1-aFuc антитела. Утрата В-клеток зародышевого центра из БЛУ, следовательно, является показателем того, что истощение ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти приводит к распаду ранее сформированных зародышевых центров.
Фиг.14 представляет пример воздействий на компартмент В-клеток зародышевых центров селезенки, вызванных введением одной дозы антитела IC9G1-aFuc. Лимфоциты селезенки выделяют из животных, умерщвленных на 8 и 29 сутки эксперимента. Абсолютное число В-клеток зародышевых центров определяют жидкостной цитометрией. В-клетки зародышевого центра определяют в качестве CD20+IgM- CD95+ клеток для целей настоящего эксперимента. Абсолютное число В-клеток зародышевого центра, выделенных из селезенки на 8 и 29 сутки, показано на фиг.14А. Введение одной дозы 0,1 мг/кг и 10 мг/кг антитела IC9G1-aFuc не повлияло существенным образом на число В-клеток в зародышевых центрах селезенки на 8 сутки. К 29 суткам, однако, число В-клеток в зародышевых центрах селезенки было существенно снижено у животных, которым вводили антитело IC9G1-aFuc, и напротив, существенного изменения числа В-клеток в зародышевых центрах селезенки не обнаружено у животных, которым вводили антитело IC009. Фиг.14Б представляет процент распада зародышевых центров селезенки на 8 и 29 сутки. Процент распада подсчитывают путем соотношения абсолютного числа В-клеток зародышевых центров, выявленных у животных, которым вводили антитело IC9G1-aFuc, с числом клеток у животных, которым вводили только контроль. Введение одной дозы антитела IC9G1-aFuc не приводит к существенному распаду зародышевых центров в селезенке к 8 суткам. К 29 суткам, однако, примерно 80% зародышевых центров в селезенке было разрушено у животных, которым вводили антитело IC9G1-aFuc. Не установлено существенного разрушения зародышевых центров в селезенке ни на 8, ни на 29 сутки после введения 10 мг/кг антитела IC009. В-клетки зародышевых центров в селезенке этой модельной системы присутствуют до введения антитела IC9G1-aFuc. Отсутствие В-клеток в зародышевых центрах селезенки свидетельствует о том, что истощение ICOS+ Т-хэлперных клеток памяти приводит к разрушению ранее сформированных зародышевых центров.
Экспрессия ICOS и ICOSL иРНК возрастает у пациентов с воспалительными и аутоиммунными заболеваниями.
ICOS является мишенью для лечения системной красной волчанки
Индуцируемый костимулятор (Inducible costimulator - ICOS) участвует в регуляции аутоиммунных и провоспалительных ответов и может играть важную роль в патогенезе системной красной волчанки (СКВ). Был использован геномный подход к оценке уровней экспрессии иРНК панели цитокинов и иммунных регуляторов в поврежденной коже пациентов с активной формой СКВ, затрагивающей кожу.
Профилируют кожные повреждения и цельную кровь (ЦК) из большой панели пациентов с СКВ с повреждениями кожи, используя платформу Affymetrix для анализа полного генома человека (whole genome array - WGA). Используют метод TaqMan QRT-PCR с динамическим рядом BioMarkTM 48.48 фирмы Fluidigm для измерения уровней иРНК и длинных, и коротких альтернативных сплайсинговых форм ICOS наряду с большой панелью цитокинов.
Происходит сверхэкспрессия ICOS иРНК в поврежденной коже примерно у 50-60% больных СКВ, исследованных в настоящей работе (фиг.20). Наблюдают положительные корреляции между ICOS и сверхэкспрессией иРНК лиганда ICOS, и между ICOS и ИЛ-10 иРНК сверхэкспрессией. Сильную сверхэкспрессию таких иРНК не наблюдают в периферических незатронутых тканях больных СКВ. Кроме того, используют метод TaqMan QRT-PCR для определения, может ли короткая или длинная иным образом сплайсированная форма ICOS сверхэкспрессироваться у больных СКВ, а также оценивают экспрессию miR-101 в ICOS+ Т-клетках памяти, очищенных от цельной крови больных СКВ.
Две белковые изоформы ICOS были идентифицированы из базы данных кДНК (см. фиг.16). Полная длина ICOS (SEQ ID NO:32) включает 199 аминокислот. Эта последовательность содержит сигнальный пептид, внеклеточный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. В цитоплазматическом домене содержится YMFM (остатки 180-183 последовательности SEQ ID NO:32) консервативный мотив для связывания PI3K. Короткая форма ICOS (SEQ ID NO:33) содержит 168 аминокислот. Короткая форма имеет рамочное усечение в цитоплазматическом домене, вызванное пропуском экзона 4. Усечение дает намного более короткий цитоплазматический домен и утрачивает сайт связывания PI3K, что может оказать функциональные воздействия на функцию ICOS.
In silico анализируют ICOS 3' UTR (остатки 238-2284 последовательности SEQ ID NO:34), используя выявленные MiRanda несколько предполагаемых сайтов-мишеней микро-РНК (фиг.17). Целевая область микроРНК один (MTR1), область из 47 п.о., содержащая целевую последовательность для miR-101, 103/107 и 338, и микро-РНК целевая область два (MTR2), область из 47 п.о., содержащая целевую последовательность для miR-149. Комплементарность ICOS кДНК и идентифицированных молекул микро-РНК показана на фиг.17. (Di Yu, & Carola G. Vinuesa и др., Nature, 450, 2007, cc.299-303).
Affymetrix GeneChip и qRT-PCR профилирование - СКВ: профилируют кожные повреждения и цельную кровь (ЦК) из большой панели пациентов с СКВ с повреждениями кожи, используя платформу Affymetrix для анализа полного генома человека (whole genome array - WGA). Используют метод TaqMan QRT-PCR с динамическим рядом BioMarkTM 48.48 фирмы Fluidigm для измерения уровней иРНК ICOS по большой панели цитокинов.
Фиг.20А показывает относительную экспрессию ICOS и ICOSL иРНК (по шкале log2) в образцах поврежденной кожи больных СКВ (системной красной волчанкой). Величины кратного изменения определяют относительно контрольного образца нормальной кожи. Данные получают по динамическому ряду BioMarkTM 48.48 фирмы Fluidigm. Штрихами отмечена относительная экспрессия (кратное изменение) для каждого исследованного транскрипта (ICOS или ICOSL).
Необработанные величины интенсивности сигнала (по шкале log2) для CD4 (фиг.20Б) и CD3ε иРНК (фиг.20В) в образцах нормальной кожи и кожи больных СКВ (системной красной волчанкой). Данные (GC-RMA нормализиванные) получают на матрице Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0. Штрихами отмечена средняя величина интенсивности необработанного сигнала для образцов нормальной кожи и кожи больных СКВ.
Фиг.21А: относительная экспрессия CD28, CTLA4, ICOS и ICOSL иРНК (по шкале log2) у больных СКВ (системной красной волчанкой) в образцах цельной крови. Величины индивидуальных кратных изменений определяют относительно контрольного образца объединенной нормальной цельной крови. Данные получают по динамическому ряду BioMarkTM 48.48 фирмы Fluidigm. Штрихами отмечена средняя величина относительной экспрессии (кратность изменения) для каждого анализируемого транскрипта (CD28, CTLA4, ICOS или ICOSL).
Необработанные величины интенсивности сигнала (по шкале log2) для CD4 (фиг.21Б) и CD3ε иРНК (фиг.21В) в образцах нормальной кожи и кожи больных СКВ (системной красной волчанкой). Данные (GC-RMA нормализиванные) получают на матрице Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0. Штрихами отмечена средняя величина интенсивности необработанного сигнала для образцов нормальной кожи и кожи больных СКВ.
Экспрессия ICOS при миозите с включенными тельцами (МВТ) и дерматомиозите (ДМ)
Индуцируемый костимулятор (Inducible costimulator - ICOS), рецептор активированных Т-клеток, играет центральную роль в гуморальном иммунитете. Повышенные уровни ICOS присутствуют у пациентов с аутоиммунными заболеваниями (например, с ревматоидным артритом и системной волчанкой), а также установлено, что эффекторные цитокины коррелируют с повышенными уровнями этого белка. В настоящем изобретении используют геномные методики для исследования сверхэкспрессии ICOS и лиганда ICOS (ICOSL) в мышечной ткани, взятой от пациентов с миозитом с включенными тельцами (МВТ), дерматомиозитом (ДМ) и полимиозит (ПМ) и представляют результаты, согласующиеся с регуляторным механизмом ICOS за счет экспрессируемой Т-клетками микро-РНК, miR-101.
В настоящем изобретении образцы мышц больных миозитом, используя метод TaqMan QRT-PCR (BioMarkTM 48.48 динамическая матрица фирмы Fluidigm). Молекулы микро-РНК (некодирующие молекулы РНК, экспрессированные Т-лимфоцитами и регулирующие генную экспрессию), которые потенциально регулируют ICOS, идентифицируют по двум критериям: (1) их последовательности комплементарны 3' UTR области ICOS и (2) они существенно по-другому экспрессируются в противоположном направлении ICOS иРНК в мышцах больных МВТ, ПМ и ДМ по сравнению с контрольными нормальными образцами мышц.
Регуляция ICOS иРНК в образцах мышц больных МВТ повышена в среднем в 40 раз, при регуляции молекул иРНК ICOSL, повышенной в среднем в 3,5 раза, по сравнению с нормальными контролями. В образцах мышц больных ДМ повышена регуляция иРНК ICOS в среднем в 5 раз, иРНК ICOSL не показывает существенного повышения регуляции по сравнению с нормальными контролями. Регуляция ICOS иРНК в образцах мышц больных МВТ повышена значительно (более чем в 70 раз), при регуляция молекул иРНК ICOSL в ~2 раза по сравнению с нормальными контролями. Сверхэкспрессию иРНК ICOS и ICOSL иРНК не наблюдают в цельной крови из мышц больных МВТ или ДМ. CD4 и CD3ε иРНК выражено сверхэкспрессируются в образцах мышц больных МВТ, и только CD4 иРНК сверхэкспрессируется в образцах мышц больных ДМ. Наличие сайтов ARE (AU обогащенная область для связывания белка) и комплементарность последовательностей между 3' UTR доменом в ICOS и miR-101 означает, что miR-101 является мощным регулятором ICOS. В настоящем изобретении впоследствии оценивают уровень экспрессии miR-101, а также возможность такой микро-РНК регулировать данный транскрипт. Регуляция экспрессии miR-101 была существенно понижена в среднем в 4 и 2,5 раза, соответственно, в мышцах больных МВТ и ДМ по сравнению с нормальными контрольными мышцами.
ICOS иРНК сверхэкспрессируется в тканях мышц больных МВТ, ДМ и ПМ. Сильная сверхэкспрессия молекул иРНК CD4 и CD3ε означает повышение инфильтрации CD4+ Т-клеток в пораженном месте больных МВТ, согласно ранее описанному. Существенное снижение экспрессии miR-101 в мышцах больных МВТ и ДМ подтверждает наблюдение, сделанное ранее на мышах Sanroque.
Affymetrix GeneChip, qRT-PCR и microRNA профилирование - миозит: профилируют биопсию мышц и цельную кровь (ЦК) из панели пациентов с миозитом, используя платформу матрицы целого генома человека(WGA) Affymetrix. Кроме того, профилируют образцы мышц от пациентов с миозитом, используя платформы и TaqMan qRT-PCR (с динамическим рядом BioMarkTM 48.48 фирмы Fluidigm), и Applied Biosystem MicroRNA TaqMan Human MicroRNA Array v1.0. Молекулы Микро-РНК (некодирующие молекулы РНК, экспрессируемые Т-лимфоцитами и регулирующие генную экспрессию), которые потенциально регулируют ICOS, идентифицируют по двум критериям: (1) их последовательности комплементарны области 3' UTR в ICOS, и (2) они существенным образом по-разному экспрессируются в разных направлениях ICOS иРНК в мышцах больных МВТ, ПМ и ДМ, по сравнению с нормальными контрольными образцами мышц.
Фиг.18 показывает miR-101 относительную экспрессию в образцах мышц больных миозитом (МВТ = миозит с включенными тельцами, ПМ = полимиозит, ДМ = дерматомиозит). Индивидуальные величины экспрессии определяют относительно нормального контрольного образца мышцы. Данные получают на платформе ABI's Human MicroRNA Array v1.0. Штрихи представляют среднюю относительную экспрессию для каждого подтипа заболевания.
Фиг.19А показывает относительную экспрессию ICOS и ICOSL иРНК (по шкале log2) в образцах мышц больных миозитом (МВТ = миозит с включенными тельцами, ПМ = полимиозит, ДМ = дерматомиозит). Индивидуальные кратные величины экспрессии определяют относительно нормального контрольного образца мышцы. Данные получают по динамической матрице BioMarkTM 48.48 фирмы Fluidigm. Штрихи представляют среднюю относительную экспрессию (кратное изменение) для каждого подтипа заболевания и комбинации транскрипта (ICOS или ICOSL).
Величины интенсивности необработанных сигналов (по шкале log2) для CD4 (фиг.19Б) и CD3ε (фиг.19В) иРНК в образцах мышц нормальной ткани и при наличии миозита (МВТ = миозит с включенными тельцами, ПМ =полимиозит, ДМ = дерматомиозит). Данные (нормализованные GC-RMA) получают на матрице Human Genome U133 Plus 2.0 Array. Штрихи представляют среднюю величину интенсивности необработанного сигнала для нормы и каждого подтипа заболевания.
Фиг.19Г показывает относительную экспрессию ICOS и ICOSL иРНК (по шкале log2) в образцах цельной крови при миозите (МВТ = миозит с включенными тельцами, ПМ = полимиозит, ДМ = дерматомиозит). Отдельные кратного изменения величины определяют относительно контрольного образца нормальной мышцы. Данные были получены на устройстве Fluidigm's BioMarkTM 48.48 dynamic array. Чертами обозначены средние уровни относительной экспрессии (кратное изменение) для подтипа заболевания и комбинации транскриптов (ICOS или ICOSL).
Специалисты в данной области могут выяснить или способны обнаружить, используя только обычные эксперименты, большое количество эквивалентов по отношению к определенным вариантам осуществления настоящего изобретения. Такие эквиваленты также относятся к области охвата формулы настоящего изобретения.
В настоящем изобретении цитируются различные публикации, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылок на их целостность. Кроме того, временные заявки US 60/916400 и 61/049131 включены в настоящее изобретение в виде ссылок на их сущность.
Хотя приведенное выше описание настоящего изобретения подробно изложено с помощью иллюстраций и примеров для ясности его понимания, очевидно, что определенные изменения и модификации могут производиться в рамках охвата приводимой ниже формулы изобретения.