Способ амплификации нуклеиновых кислот тяжелой и легкой цепи человеческих иммуноглобулинов для создания рекомбинантных антител, композиции праймеров (варианты)

1. Способ амплификации нуклеиновых кислот тяжелой и легкой цепи человеческих иммуноглобулинов, который включает
(а) изоляцию человеческих единичных иммуноглобулинпродуцирующих клеток, полученных из биологического материала доноров с помощью проточной цитофлюориметрии, совмещенной с флюоресцентным сортингом по признаку взаимодеймодействия с флюороформеченным антигеном, притом клетки сортируют непосредственно в емкость с лизирующим буфером для выхода мРНК из клетки в раствор;
(б) синтез двух целевых одноцепочечных кДНК на матрице мРНК транскриптов легкой и тяжелой цепи, отличающийся тем, что выполняется по технологии SMART в присутствии композиции из пяти генспецифичных праймеров как представлено в группе последовательностей SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, несущих на 3′-конце генспецифичные последовательности к цепям иммуноглобулина типа γ, ε, α, μ, κ, λ и адапторную последовательность на 5′-конце, а также TSO-олигонуклеотида с такой же адапторной последовательностью на 5′-конце, предназначенного для активации механизма переключения образца MMLV-ревертазой, а затем синтез второй цепи двух целевых кДНК и последующую амплификацию кДНК в присутствии ПЦР-праймера, гибридизующегося с адапторными последовательностями;
H
H
(в) три последующие независимые амплификации одной пробы кДНК, полученной по технологии SMART, которые отличаются использованием трех различных композиций олигонуклеотидных праймеров для осуществления амплификации нуклеиновых кислот, кодирующих вариабельные домены V, Vκ и Vλ начиная с первой аминокислоты региона FR1, и имеющих последовательности нуклеотидов как представленно в группах (SEQ ID NO: 11 – 19, 32 – 35), (SEQ ID NO: 20 – 23, 36) и (SEQ ID NO: 24 – 31, 37), причем результатом трех ПЦР является два продукта: один полинуклеотид домена V длиной 360-390 пар оснований с сайтом рестрикции XhoI или SalI на 3′-конце, и один полинуклеотид либо домена Vκ длиной 470-490 пар оснований с сайтом рестрикции SalI на 3′-конце, либо домена Vλ длиной 360-380 пар оснований с сайтом рестрикции XhoI на 3′-конце, которые предназначаются для клонирования в подходящие плазмидные вектора по «тупому» и «липкому» концу между полинуклеотидом сигнального пептида и недостающей (неамплифицированной) части константного домена для экспрессии полноразмерной цепи человеческого иммуноглобулина в клетках млекопитающих.
2. Композиция праймеров по п.1, характеризующаяся последовательностями нуклеотидов как представлено в SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, или любая композиция праймеров, где содержится хотя бы 2 идентичных праймера из перечисленной группы последовательностей, для затравки синтеза первой цепи кДНК на матрице мРНК цепей иммуноглобулина человека типа γ, ε, α, μ, κ и λ, причем 2 праймера гибридизуются с двумя целевыми мРНК единичной клетки в консервативной области: один с транскриптом тяжелой и второй с транскриптом легкой цепи, а 3 оставшихся в гибридизации не участвуют.
H
3. Композиция праймеров по п.1, характеризующаяся температурой отжига 50°C и последовательностями нуклеотидов как представлено в SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 32, 33, 34, 35, или любая композиция праймеров, где содержится хотя бы 6 идентичных праймеров из перечисленной группы последовательностей, для амплификации полинуклеотида домена V тяжелой цепи любого из типов α, γ, ε, μ.
4. Композиция праймеров по п.1, характеризующаяся температурой отжига 55°C и последовательностями нуклеотидов как представлено в SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 36, или любая композиция праймеров, где содержится хотя бы 2 идентичных праймера из перечисленной группы последовательностей, для амплификации полинуклеотида домена Vκ легкой цепи.
5. Композиция праймеров по п.1, характеризующаяся температурой отжига 55°C и последовательностями нуклеотидов как представлено в SEQ ID NO: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 37, или любая композиция праймеров, где содержится хотя бы 3 идентичных праймера из перечисленной группы последовательностей, для амплификации полинуклеотида домена Vλ легкой цепи.
6. Праймер длиной 24 нуклеотида, частично комплементарный смысловой цепи кДНК в районе соединения вариабельного и константного домена тяжелых цепей типов γ и ε человеческого иммуноглобулина и привносящий в нуклеиновую кислоту после амплификации сайт рестрикции XhoI как «тихую» мутацию без изменения аминокислотной последовательности данного константного домена, причем праймер выбирают из группы, включающей SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 33.
7. Праймер длиной 25 нуклеотидов, частично комплементарный последовательности смысловой цепи кДНК в  районе соединения вариабельного и константного домена тяжелой цепи типа α человеческого иммуноглобулина и привносящий сайт рестрикции SalI как «тихую» мутацию без изменения аминокислотной последовательности данного константного домена, с последовательностью нуклеотидов как представлено в SEQ ID NO: 34.
8. Праймер длиной 24 нуклеотида, частично комплементарный последовательности смысловой цепи кДНК, кодирующей участок соединения вариабельного и константного домена тяжелой цепи типа μ человеческого иммуноглобулина и привносящий в нуклеиновую кислоту после амплификации сайт рестрикции SalI как «тихую» мутацию без изменения аминокислотной последовательности данного константного домена, с последовательностью нуклеотидов как представлено в SEQ ID NO: 35.
9. Праймер длиной 22 нуклеотида, частично комплементарный последовательности смысловой цепи кДНК, кодирующей участок константного домена легкой цепи типа κ человеческого иммуноглобулина и привносящий в нуклеиновую кислоту после амплификации сайт рестрикции SalI как «тихую» мутацию без изменения аминокислотной последовательности данного константного домена, с последовательностью нуклеотидов как представлено в SEQ ID NO: 36.
10. Праймер длиной 21 нуклеотид, комплементарный последоваельности смысловой цепи кДНК, кодирующей участок константного домена легкой цепи типа λ человеческого иммуноглобулина и привносящий в нуклеиновую кислоту после амплификации сайт рестрикции XhoI как «тихую» мутацию без изменения аминокислотной последовательности данного константного домена, с последовательностью нуклеотидов как представлено в SEQ ID NO: 37.