ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS VALLISMORTIS - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ
STRAIN OF BACTERIA BACILLUS VALLISMORTIS - DESTRUCTOR OF OIL AND OIL PRODUCTS

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат). Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +8 до +37°C.
Уровень техники
Известны штаммы: Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus luteus, Micrococcus flavus (1. Клюшникова T.M., Смирнова Г.Ф., Куберская С.Л., Слабоспицкая А.Т., Залевский B.C., Касаткина Т.П., Елисеева Г.С. А.с. SU 1493666-А1. Способ очистки подсланцевых сточных вод от нефтепродуктов. Заявка 4280617, 09.07.1987. Опубл. 15.07.1989); Flavobacterium tirrennicum (2. Новожилова М.И., Попова Л.Е., Недоводиева Т.П., Каламкарова Л.И. А.с. SU 1409594. Штамм бактерий Flavobacterium tirrennicum, используемый для очистки подсланевых и промышленных сточных вод от нефти и нефтепродуктов. Заявка 4066152, 24.03.1986. Опубл. 15.07.1988), которые могут разлагать углеводороды нефти.
Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию нефтепродуктов только в воде и не способны осуществлять очистку почвы от нефти.
Известны штаммы: Pseudomonas putida 36 (3. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н. Штамм @ @ 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. А.с. СССР 1076446. Заявка 3474745, 22.07.1982. Опубл. 28.02.1984); Acinetronacter sp.НВ-1 (4. Жиркова Н.А., Холоденко В.П. Штамм бактерий ACINETOBACTER SPECIES, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2077579. Заявка 9404331, 06.12.1994. Опубл. 20.04.1997); Acinetronacter sp.JN-2 (5. Ушков С.Б., Ильинская Н.В. Штамм ACINETOBACTER SPECIES, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2064017. Заявка 93009595, 23.02.1993. Опубл. 20.07.1996); Pseudomonas alcaligenes Е7 (6. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. Штамм бактерий PSEUDOMONAS ALCALIGENES Е7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2134723. Заявка 98105707, 25.03.1998. Опубл. 20.08.1999) и Pseudomonas alcaligenes B-1 (7. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А., Кобелев B.C., Акимова Н.А. Штамм бактерий PSEUDOMONAS ALCALIGENES В-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Патент РФ 2133770. Заявка 98105709, 25.03.1998. Опубл. 27.07.1999).
Недостатком штаммов является то, что они утилизируют нефть при сравнительно высоких температурах.
Большую эффективность в условиях низких положительных температур показал штамм Rhodococcus erythroplis Е-15 (8. Коронелли Т.В., Аракелян Э.И., Комарова Т.Н., Ильинский В.В. Способ очистки почв от нефтяных загрязнений. Патент РФ 2019527. Заявка 93017464, 3.04.1993. Опубл. 15.09.1994), но процесс биодеградация нефти протекает медленно и только при добавлении нитроаммофоски или нитроаммофоски и натриевой селитры.
В качестве прототипа служит штамм бактерий «Bacillus subtilis Колыма 7/2» (9. Неустроев М.П., Тарабукина Н.П., Неустроев М.М., Сазонов Н.Н., Парникова С.И., Степанова A.M. Способ очистки мерзлотных почв от нефти спорообразующими бактериями BACILLUS SUBTILIS. Патент РФ 2446900. Заявка 2010129158, 13.07.1010. Опубл. 13.07.2010), обладающий способностью снижать концентрацию нефти до 0,48%, то есть уровень нефти от 135143 мг/кг снижается до 645 мг/кг в течение 3 месяцев летнего периода. Однако штамм осуществляет деградацию только нефти и только в почве в условиях модельного эксперимента и не способен осуществлять очистку воды от нефти и утилизировать нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат), в том числе в условиях широкого диапазона температур от +4 до +37°C.
Задачей изобретения является получение штамма бактерий, обладающего высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам в относительно короткие сроки, в широком диапазоне температур от +8 до +37°C, который может быть использован для очистки почв и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат).
Осуществление изобретения
Предлагаемый штамм бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 выделен из нефтезагрязненной почвы трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан», 1338,5 км, Ленский район, Республика Саха (Якутия), 19 мая 2010 года. Штамм депонирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов в ФГУП ГосНИИГенетика - ВКПМ, 117545, г.Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. Коллекционный номер ВКПМ В-11017.
Штамм Bacillus vallismortis ВКПМ B-11017 утилизирует нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат) в качестве единственного источника углерода. Процесс идет в широком диапазоне температур (от +8 до +37°C).
Использование штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 в естественных условиях, для очистки мерзлотной почвы от нефти, при средней температуре почвы от +8 до +14°C, позволяет достичь 78,3% деструкции нефти за 60 суток.
Деструкция нефти и нефтепродуктов в воде при температуре воды +20°C составляет 50,8%, за 2 месяца.
Деструкция нефти и нефтепродуктов в водной среде с добавлением минеральных компонентов через 7 суток при температуре +8°C составляет 18,5 - 56,4%, при температуре +20°C - 31,7 - 67,8%, при температуре +30°C - 44,7 - 74,0%, при температуре +37°C - 50,0 - 84,7% в зависимости от типа загрязнителя.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Морфологокультуральные признаки.
Грамположительные споровые палочки в мазках расположены одиночно и короткими цепочками.
На мясопептонном агаре (масс.%: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, pH 7,0-7,2) с добавлением 1% глюкозы растет в виде сморщенных суховатых бежевых колоний, через 1-3 суток колонии окрашиваются в коричневый цвет, субстрат не пигментирует.
На поверхности скошенного мясопептонного агара без добавления 1% глюкозы растет в виде сухой морщинистой пленки бежевого цвета.
На среде Сабуро (масс.%: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; pH 6,0±3) образует крупные колонии от грязно-коричневого до болотно-коричневого оттенка  диаметром до 1 см и более.
В мясопептонном бульоне (масс.%: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; pH 7,0-7,2) растет в виде морщинистой пленки бежевого цвета поверх бульона.
3
4
2
2
4
2
4
На минеральной среде Мюнца (10. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С.1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат) следующего состава, масс.%: KNO - 0,4; MgSO·7HO - 0,08; NaCl - 0,1; KHPO - 0,14; KHPO - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0; вода дистиллированная - остальное, pH - 7,2, в виде непрозрачных матовых серо-бежевых колоний диаметром 0,1-0,2 см.
Физиолого-биохимические признаки.
Штамм хорошо растет при температуре от +8 до +37°C, в аэробных условиях. При температуре ниже +8°C и в анаэробных условиях штамм сразу не погибает, но развивается медленнее. Оптимум роста +30°C. Растет при pH 6,0 - 8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.
Штамм каталазоположителен, оксидазоотрицателен. Метаболизм окислительного типа. Биохимическая активность выражена слабо. Не усваивает лизин и орнитин. Не потребляет цитрат и малонат натрия. Желатин не гидролизует. Крахмал не разлагает. Индолоотрицателен. Не образует сероводород. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Ферментирует бета-галактозидазу.
Штамм не вирулентный, не токсичный, не токсигенный, не фитотоксичен (проверка проведена на белых мышах и семенах высших растений (овес сорт «Скакун» и пшеница сорт «Приленская-19»).
Условия хранения:
1. В лиофилизированном виде в ампулах при +4°C.
2. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на скошенном МПА.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Культивирование штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
Предлагаемый штамм Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 был выделен из нефтезагрязненной почвы трассы магистрального нефтепровода «Восточная Сибирь - Тихий Океан», 1338,5 км, Ленский район, Республика Саха (Якутия), 19 мая 2010 года.
3
3
3
3
4
2
2
4
2
4
Культивирование штамма проводили в минеральной среде Мюнца следующего состава (г/дм): KNO - 4,0; MgSO·7НO - 0,8; NaCl - 1,0; KHPO - 1,4; KHPO - 0,6; агар - 20,0; вода дистиллированная 1,0 дм; pH среды - 7,2. Для чего 1,0 г нефтезагрязненной почвы с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали нефть, которую вносили в среду Мюнца в количестве 1000 мг на 1,0 дм среды. Инкубация проводилась в термостатируемых качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин и температуре +29±1°C. Рост бактерий наблюдали уже через 7-10 дней инкубации по образованию мутной беловатой эмульсии и исчезновению маслянистых пятен нефти. Чистая культура бактерий была получена путем культивирования при вышеперечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с агаром из гидролизата рыбной муки (ГРМ-агар) с добавлением 1% глюкозы. Далее посевы инкубировали в стационарных условиях в термостате при +30°C. Через 48 часов на поверхности ГРМ-агара появились суховатые бежевого оттенка колонии, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (11. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact.; July 1985, p.408), идентифицированы как штамм Bacillus vallismortis.
Изолированные колонии пересевали на скошенный мясопептонный агар. Через 48 часов инкубации при температуре +30°C клетки штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 со скошенного агара использовали для определения активности в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.
Пример 2. Исследование нефтеокисляюшей активности штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
3
3
Клетки штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 со скошенного мясопептонного агара смывают 0,9% раствором NaCl, готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см, с концентрацией 1×109 микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.
Полученный бактериальный изолят штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 культивируют в водной среде с минеральным составом, близким по составу к среде Мюнца, состав которой описан в примере 1.
3
3
9
3
В колбочки объемом 200,0 см вносят по 100,0 см готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1·10 клеток/ см. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторностях. Колбы культивируют в качалочных условиях на установке «УВМТ-12-250» при 200 об/мин, при температурах +8°C; +20°C; +30°C и +37°C в течение 7 суток.
Биодеградацию нефти и нефтепродуктов определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (12. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117 Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).
Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм уже на 7-е сутки при температуре +8+37°C утилизирует 18,59-52,82% - нефти; 25,46-82,26% - дизельного топлива; 28,19-50,04% - масла моторного; 56,40-84,73% - газового конденсата (таблица 1).
Таблица 1
Степень утилизации нефти и нефтепродуктов штаммом Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 через 7 суток культивирования
Вариант опыта
t°C
Ксенобиотик, мг/дм<sup>3</sup>
Срок
+8
+20
+30
+37
Нефть
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
814,1
425,0
393,0
471,8
% деструкции
18,59
57,5
60,7
52,82
Дизельное топливо
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
745,4
393,7
171,0
177,4
% деструкции
25,46
60,63
82,9
82,26
Масло моторное
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
718,1
682,8
553,0
499,6
%
28,19
31,72
44,7
50,04
деструкции
Газовый конденсат
до опыта
1000,0
1000,0
1000,0
1000,0
после опыта
436,0
321,2
259,4
152,7
% деструкции
56,4
67,88
74,06
84,73
Пример 3. Приготовление препарата на основе клеток штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
3
3
4
2
4
6
7
24
2
Бактериальный изолят, полученный способом, описанным в примере 2, переносят в колбы с жидкой стерильной средой, по составу близкой к среде Степина и др. (13. Степин А.А., Самыгин В.М., Кухтин В.П., Владимцева И.В., Жога Л.К., Каплиев В.И. Способ получения биомассы бацилл. Патент РФ 2053293. Заявка 5036470, 09.01.1992. опубл. 27.01.1996), г/дм: солянокислый гидролизат казеина - 14,0; экстракт кормовых дрожжей 3,0; MgSO·7HO - 0,2; NaCl - 4,0; (NH)MoO·4HO - 0,5; дистиллированная вода до 1,0 дм; pH 7,3-7,4. Среду стерилизуют при 0,5 атм в течение 20 мин.
3
3
3
3
В стерильных условиях, в 100,0 см готовой среды вносят 2,0 см эмульсии «Перфторана» (ОАО НПФ «Перфторан», Россия) и 10,0 см суспензии бактериального изолята. Культивируют в колбах на качалке в течение 48 часов, при температуре 29±1°C. Получают жидкую мутноватую культуру, с титром не менее 1 млрд клеток/см, которую используют как препарат для обработки почвы или воды от загрязнений нефтью.
Пример 4. Очистка воды от нефти с помощью препарата на основе клеток штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
3
3
3
3
В эксикатор объемом 5,0 дм вносили 3,0 дм воды и 30,0 см препарата на основе штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017, полученной вышеописанным способом (пример 3). Для создания нефтяной пленки в емкости добавляли 30000 мг сырой неочищенной нефти. В качестве контроля использовали воду в количестве 3,0 дм с добавлением 30 000 мг нефти и без внесения микроорганизмов.
Эксперименты проводились в течение 2-х месяцев при температуре воды +20±1°C.
Биодеградацию нефти определяют спектрометрическим методом, с использованием концентратомера «ИКН-025» (12. ФР. 1.31.2007.03234 МВИ 01.02.117. Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера «ИКН-025»).
Установлено, что деструкция нефти в воде за 2 месяца составила 50,8%. Деструкция в контрольной емкости за 2 месяца существенно не изменилась (таблица 2).
Таблица 2
Динамика деструкции нефти в воде после внесения препарата на основе штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
Вариант опыта
Количество нефти до внесения клеток штамма, мг
Количество нефти через 2 месяца после внесения клеток штамма, мг
Степень утилизации нефти, %
Вода+нефть+клетки штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
30 000
14 736,2
50,80
Контроль
30 000
29 334,6
2,21
Пример 5. Очистка почвы от нефти с помощью клеток штамма бактерий Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
Проведен эксперимент по очищению мерзлотной почвы, загрязненной нефтью, с помощью клеток штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017. Опыт выполнен в естественных условиях. Средняя температура почвы, в течение всего периода постановки эксперимента, на горизонте 20 см составляла +8°C; на горизонте 10 см - +14°C.
9
3
Для опыта клетки штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 со скошенного мясопептонного агара, полученные способом, описанным в примере 1, смывают 0,9% раствором NaCl, готовят микробную суспензию бактериального изолята, с концентрацией 1×10 микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.
Полученную суспензию клеток штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017 вносят в почву, загрязненную нефтью в количестве 1 литр суспензии на 1 куб. м нефтезагрязненной почвы. Почву тщательно перемешивают и экспонируют в течение 60 суток.
Для анализа образцы почвы отбирают до начала эксперимента и через 60 суток после его окончания. Эффективность биодеградации нефти предлагаемым штаммом оценивают гравиметрическим методом (14. РД 39-0147098-90. Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтегазпрома. - 1990). Результаты исследований показывают, что предлагаемый штамм в течение 60-ти суток, при средней температуре почвы +8+14°C, осуществляет деградацию нефти на 78,3%, в то время как естественные потери нефти при тех же условиях окружающей среды в почве, не обработанной препаратом, составила 7,32% (таблица 3).
Таблица 3
Динамика деструкции нефти в мерзлотных почвах, обработанных суспензией на основе клеток штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
Вариант опыта
Содержание нефти до внесения штамма, мг/кг
Содержание нефти через 60 суток после внесения штамма, мг/кг
Деструкция нефти за 60 суток, %
Почва+нефть+препарат на основе штамма Bacillus vallismortis ВКПМ В-11017
3886
843
78,3
Контроль
13771
12762
7,32
Технико-экономическая эффективность
Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма бактерий BACILLUS VALLISMORTIS ВКПМ В-11017 является то, что он обладает высокой утилизирующей способностью по отношению как к нефти, так и к нефтепродуктам и в относительно короткие сроки (от 7 до 60 суток), в широком диапазоне температур от +8 до +37°C осуществляет деградацию нефти на 78,3%, в то время как естественные потери нефти при тех же условиях окружающей среды в почве, не обработанной препаратом, составляют 7,32%. Штамм может быть использован, как для очистки почв, так и для очистки воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, газовый конденсат).