ХЛАДООГРАЖДАЮЩИЙ РАСТВОР ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ЯДЕРНЫХ КЛЕТОК КРОВИ
FROST PROTECTION SOLUTION FOR NUCLEAR BLOOD CELL FREEZING

Изобретение относится к физиологии, криобиологии и медицине, а именно к созданию раствора для консервирования лейкоцитов, в частности, человека.
В качестве прототипа нами использована работа Н.Н.Абезгауза и В.А.Леонтовича «Замораживание белых клеток периферической крови для их длительного хранения при ультранизких температурах» (ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1966. - №9. - С.24-29). Существенным недостатком прототипа является то, что предложенный его авторами ограждающий раствор содержит глицерин в 15% концентрации и после отогрева требует отмывания, что дополнительно травмирует высокочувствительные к разного рода повреждающим факторам ядерные клетки крови. Кроме того, взамен используемого в прототипе дисахарида сахарозы нами применен полисахарид комаруман, обладающий рядом положительных эффектов в отношении лейкоцитов: экзоцеллюлярным, иммуномодулирующим и противовоспалительным.
С целью консервирования лейкоцитов при субумеренно низкой температуре в учреждениях криобиологического и медицинского профиля, обеспеченных электроморозильниками на -20°С, в предложенный протекторный раствор включены следующие ингредиенты: растительный полисахарид - комаруман, 1) обладающий как полисахарид (пектин) экзоцеллюлярным криопротекторным действием, что гармонично дополняет эндоцеллюлярное хладоограждающее влияние глицерина на клетки и делает комбинированный криоконсервант более полноценным, дающим при охлаждении лейкоцитов до -20°С выраженный криобиологический (технический) эффект и 2) оказывающий иммуномодулирующие и противовоспалительное действие на лейкоциты (Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G., Ovodov Yu.S. Antiinflammatory acrivity of the pectic polysaccharide from Comarum palustre L. // Fitoterapia. 2005. Vol.76, №3-4. P.281-287; Попов С.В. Иммуномодулирующее действие пектиновых полисахаридов: Автореф. дис. док. биол. наук; Сыктывкар, 2010. - 37 с.), поэтому включение комарумана в криоконсервант усиливает и активизирует их фагоцитарную способность и способствует 70% их морфологической сохранности; глицерин высшего сорта - криопротектор эндоцеллюлярного действия (Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы: Киев - Наукова думка, 1978. - с.5-64), используется в нетоксичной для клеток концентрации, поэтому не требует отмывания перед применением; антикоагулянт - трилон Б (динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты), имеющий широкое применение в производстве медицинских препаратов и при консервировании.
Криоконсервант имеет рН среды 7,0-7,4, самый благоприятный для клеток крови. Его ингредиенты тропны лейкоцитарным клеткам и производятся в Российской Федерации.
Пример использования средства
Консервирующий раствор, содержащий глицерин в концентрации 6%, комаруман - 0,25%, трилон Б - 0,1%, воду для инъекций до 100 мл и имеющий рН 7,0-7,4, смешивают в отношении 1:1 с концентратом лейкоцитов в полимерном контейнере «Компопласт». Смесь, выдержав 20 мин при комнатной температуре, охлаждают по экспоненциальной программе в электрическом морозильнике в 4-литровой ванне с этиловым 96% спиртом до -20°С в течение 9-14 минут. Затем замороженный лейкоконцентрат переносят в камеру электроморозильника, имеющую температуру -20°С. Термограмму записывают по термопаре, введенной в контейнер «Компопласт» с хладоограждающим раствором, в конечной концентрации. Размораживание проводят в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 35-50 секунд при покачивании контейнера 3-4 раза в сек. Температура оттаянного лейкоконцентрата в контейнере должна быть в пределах +2÷+4°С. Затем определяют морфологическую сохранность размороженных лейкоцитарных клеток, их жизнеспособность по витальному красителю (с 1% раствором эозина) и фагоцитарную активность нейтрофилов в пробе с латексом (по Потаповой С.Г. и соавт., ж. Проблемы гематологии и переливания крови. - 1977. - №9. - С.58-59). Расчет выражают в процентах в сравнении с аналогичными показателями клеток до замораживания.
Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови Института физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России».
Изучены три варианта консерванта для лейкоконцентрата, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов. Состав вариантов консерванта представлен в таблице 1.
Таблица 1
Номер варианта криоконсерванта
Состав хладоограждающего раствора
Комаруман в %
Глицерин в %
Трилон Б в %
Вода для инъекций в мл
1
0,35
6,0
0,1
До 100
2
0,25
6,0
0,1
До 100
3
0,15
6,0
0,1
До 100
Конечная концентрация веществ, входящих в состав вариантов криоконсерванта №1, №2 и №3, после смешивания 1:1 с лейкоконцентратом оказывалась в 2 раза ниже исходной (таблица 2), рН среды не изменялась, оставаясь в пределах 7,0-7,4.
Таблица 2
Номер варианта криоконсерванта
Конечная концентрация ингредиентов в различных вариантах криоконсерванта после смешивания с лейковзвесью
Комаруман в %
Глицерин в %
Трилон Б в %
Вода для инъекций в мл
1
0,175
3,0
0,05
До 200
2
0,125
3,0
0,05
До 200
3
0,075
3,0
0,05
До 200
Исследования лейкоцитов производили на морфологическую сохранность и функциональную активность (таблица 3).
Таблица 3
Вариант консервирующего раствора
Показатели в % к исходному уровню
Жизнеспособность лейкоцитов
Морфологическая сохранность гранулоцитов
Фагоцитарная активность нейтрофилов
Верхний предел дозировок ингредиентов раствора
76,8±4,9 (n=5)
67,0±7,4 (n=5)
61,2±4,6*(n=5)
Оптимальное соотношение ингредиентов раствора
75,5±2,9 (n=6)
70,0±6,9 (n=6)
82,8±7,7 (n=6)
Нижний предел дозировок ингредиентов раствора
36,0±4,1*(n=5)
34,4±3,5*(n=5)
19,2±2,3*(n=5)
* - различие достоверное (р<0,05)
Основным критерием оценки биологической полноценности лейкоцитов, прежде всего нейтрофилов, является определение их фагоцитарной активности. Этот тест, наиболее надежно характеризующий физиологические свойства клеток, был лучшим после охлаждения-отогрева при использовании криоконсерванта с оптимальным соотношением ингредиентов.
Готовый оптимальный вариант криоконсерванта прозрачен, с желтоватым оттенком, без запаха, рН=7,0-7,4, хорошо смешивается во всех соотношениях с лейкоцитным концентратом, не вызывает конгломерацию клеток и обеспечивает функциональную и морфологическую сохранность при положительной температуре до замораживания. Криоконсервант проявляет выраженное хладоограждающее свойство при замораживании лейкоцитов до -20°С.
Таким образом, разработанный криоконсервант при замораживании лейкоконцентрата до -20°С обеспечил сохранность высокого процента физиологически активных ядерных клеток крови. Он может быть применен в учреждениях медицинского и биологического профиля.