ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО "ФУЗОБАКВЕЛТ" НА ОСНОВЕ НАНОСОМНОЙ СУБСТАНЦИИ
TERAPEUTIC MEDICATION "FUZOBAKVELT" BASED ON NANOSOMAL SUBSTANCE

Изобретение относится к области ветеринарии, медицины, санитарии и касается биоцидных средств.
Важнейшей особенностью инфекционных болезней является то, что непосредственной причиной их возникновения служит внедрение в организм человека вредоносного (патогенного) микроорганизма. Как правило, каждая инфекционная болезнь имеет своего специфического возбудителя. Однако в ряде случаев, в частности при гнойно-некротических процессах, безусловная этиологическая роль принадлежит аэробно-анаэробной ассоциативной микрофлоре, в том числе антибиотикорезистентной. В связи с этим все больший интерес для клинической практики представляет группа биоцидов, которые широко используются для уничтожения микроорганизмов как в живых тканях (антисептики), так и вне живого организма (дезинфектанты) и которые имеют сходные с антибиотиками мишени воздействия.
Значительную роль в развитии гнойно-некротических процессов играют фузобактерии (fusobacterium) - род палочковидных аспорогенных бескапсульных грамхемоорганотрофных анаэробных бактерий из сем. Bacteroidaceae.
Данные микроорганизмы - нормальные обитатели дыхательных путей, кишечника, гениталий человека, грызунов и др. животных. Некоторые их виды условно-патогенны для человека, вызывая у него, как правило, вторичные гангренозные или гнойно-гангренозные процессы. Типовой вид - F. nucleatum (fusiformis) продуцирует индол, пропионат из треонина, некоторые штаммы - сероводород. Часто встречающийся у человека вид, возбудитель фузоспирохетоза - F. necrophorum близок по свойствам к F. nucleatum.
Заболевания человека, обусловленные Fusobacterium necrophorum, могут протекать в виде артритов, стоматитов, пневмонии, абсцессов, некротизированных язв на коже. У разных видов животных наблюдаются гнойно-некротические поражения нижних частей конечности, вымени, половых органов, печени, легких, кожи, слизистых.
Возбудитель образует ряд сильных токсинов (гемолизин, лейкоцитидин, цитоплазмотический токсин) и ферментов (лецитиназа, гиалуроназа), которые угнетают иммунную систему организма млекопитающего.
В этой связи остро встает вопрос о разработке новых биоцидных средств, проявляющих эффективное противофузобактериальное действие.
Известно средство, применяемое в качестве стерилизующего и дезинфицирующего средства для дезинфекции поверхностей и изделий медицинского назначения, включающее определенное соотношение клатрат карбамид дидецилдиметиламмония бромида, спирта, альдегидов, диальдегидов, отдушки, органического красителя и воды. Средство действует на грамположительные и грамотрицательные бактерии, вирусы, споры, зеленые водоросли (патент РФ 2158141, опубл. 2000.10.27). Данное средство не применяется как терапевтическое.
Известно использование четвертичных солей аммония в способе лечения грибковых инфекций ногтей (онихомикозов), в котором применяют лечебные ванны с 0,1-0,25% раствором дидецилдиметиламмоний бромида (ДДАБ) (патент РФ 2186565, опубл. 2002.08.10).
Известно использование дидецилдиметиламмония бромида, обладающего фунгицидным и бактерицидным действием в санитарии, ветеринарии, медицине, а также в косметологии в качестве вещества, обладающего тонизирующим и регенеративным действием (патент РФ 2229284, опубл. 2004.05.27).
Известные решения описывают различные области воздействия солей дидецилдиметиламмония, но не касаются биоцидов, имеющих эффективное противофузобактериальное действие.
В качестве ближайшего аналога может быть указана биоцидная водная композиция на основе соли меди, содержащая четвертичное соединение аммония и пероксид при следующем соотношении компонентов, мас.%: соль меди 2-20; четвертичное соединение аммония 0,5-2; пероксид 0,5-5; вода остальное. Предпочитаемым четвертичным соединением аммония в описываемой данным изобретением композиции является смесь хлорида N-алкил(С12-18)-N,N-диметилбензиламмония и хлорида N-алкил (С12-18)-N,N-диметилэтилбензиламмония, реализуемая под торговым названием ВТС 2125 М, предлагаемая компанией Stepan (Northfield, Illinois). Другим предпочитаемым четвертичным соединением аммония в описываемой данным изобретением композиции является смесь хлорида N-алкил(С12-18)-N,N-диметил-N-бензиламмония, хлорида N-додецил-N,N-диметил-N-этилбензиламмония и хлорида N-тетрадецил-N,N-диметил-N-бензиламмония, реализуемая под торговым названием Barquat 4280-2 компанией Lonza (Fair Lawn, New Jersey) (патент РФ 2235546, опубл. 2004.09.10).
Известная композиция предназначена для использования в узкой области.
Задачей изобретения является разработка более эффективного стабильного при хранении биоцидного средства, которое оказывает избирательное действие на пораженные участки и может быть использовано в терапии.
Задача решается с помощью терапевтического средства нового поколения, представляющего собой наноструктурированную композицию в форме суспензии со средним размером частиц, составляющим от 10 до 100 нм, содержащую клатрат дидецилдиметиламмония галагенида с карбамидом, медный купорос, деготь, фармацевтически приемлемый одноатомный спирт и воду при следующем содержании компонентов, мас.%:
Клатрат дидецилдиметиламмония галагенида
с карбамидом
2-10
Медный купорос
1-10
Деготь
2-10
Одноатомный спирт
2-10
Вода
остальное
Входящий в состав клатрат дидецилдиметиламмония галагенида с карбамидом является известным дезинфицирующим средством, проявляет тонизирующее, очищающее, противоспалительное, антисептическое, антибактериальное, антивирусное, антигрибковое действие. Клатраты дидецилдиметиламмония галогенида с карбамидом (КДГК) могут быть представлены в виде хлоридов, бромидов и иодидов.
Деготь березовый (Pix Betulae, Oleum Rusci) - препарат, получаемый путем сухой перегонки наружной части коры березы (отборной бересты). Содержит бензол, ксилол, крезол, крезот, толуол, гваякол, фенол, смолы и другие вещества, обладает сильными антисептическими, местнораздражающими, кератопластическими (3-5%), кератолитическими (30-50%), противовоспалительными, инсектицидными, противопаразитарными и дезинфицирующими свойствами, улучшает кровоснабжение тканей, умеренно раздражает чувствительные нервные окончания, стимулирует регенерацию эпидермиса поврежденных тканей, усиливает процесс ороговения, подсушивает раны и ускоряет их заживление. После кратковременного воздействия убивает многие бактерии и, в частности, туберкулезную палочку и споры сибирской язвы. Кроме того, в составе предложенного средства он используется для закрепления состава на обрабатываемых участках.
Медный купорос проявляет антисептическое действие.
В качестве одноатомного спирта предпочтительно использование спиртов типа изопропилового или этилового спирта.
Наносомальная форма субстанции обеспечивает избирательное накапливание в очагах инфекционного поражения. За счет этого средство практически не поступает в системный кровоток, обеспечивая отсутствие токсичности, при этом продолжительность действия препарата возрастает, создавая депо в очаге патологического процесса. За счет указанных размеров наносомы (липосомы нового поколения) легче взаимодействуют с клетками и воспринимаются ими как родственные компоненты. Благодаря нанокомплексам кожа запускает естественные процессы регенерации, восстанавливает собственную структуру, при этом образуется структурированная «решетка», что приводит к повышению эластичности кожи, связыванию свободных радикалов и защите кожи.
Эффективный терапевтический препарат «Фузобаквелт» для наружного применения представляет собой уникальную наноструктурированную композицию, которая может быть использована в виде биоцидного средства. Средство обладает высокой проникающей способностью в пораженные ткани организма, не повреждает здоровые клетки, проявляет высокую активность в отношении широкого спектра микроорганизмов как in vitro, так и in vivo.
В частности, средство обладает антимикробной активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий (в том числе возбудителей внутрибольничных инфекций, сибирской язвы, бруцеллеза, сальмонеллеза, туберкулеза и др.), грибов рода Кандида и Трихофитон, вирусов (гепатита В, ВИЧ, гриппа, в том числе вируса гриппа А птиц, включая подтип H5N1, парагриппа), дерматофитов. Особый интерес вызывает активность в отношении неспорообразующих микроорганизмов из рода Fusobacterium.
Средство может применяться для лечения различных гнойно-некротических поражений на коже, артритов, стоматитов, абсцессов и др. Средство может быть использовано, например, для обработки рук хирургов, операционных медицинских сестер, акушерок и других лиц, участвующих в проведении операций, приеме родов и др.; обработки кожи операционного поля, в том числе перед введением катетеров и пункцией суставов; обработки локтевых сгибов доноров и инъекционного поля; работников лабораторий (в том числе бактериологических, вирусологических, микологических, иммунологических, клинических и других), обеззараживания ступней ног с целью профилактики грибковых заболеваний; частичной санитарной обработки кожных покровов представителей силовых ведомств системы РСЧС, в т.ч. спасателей МЧС, личного состава войск и формирований ГО; пациентов лечебно-профилактических учреждений, включая лежачих больных в отделениях гериартрического, онкологического профиля, хосписах; лиц, поступающих в приемные отделения стационаров (после травм, аварий, автомобильных катастроф) и социальных приютов (лиц без определенного места жительства с подозрением на инфекционные и кожно-венерологические заболевания); профилактики пролежней; борьбы с педикулезом и др.
Способ получения средства заключается в смешении спиртового раствора клатрата дидецилдиметиламмония галагенида с карбамидом и медного купороса, добавлении полученной смеси к дегтю березовому с последующим интенсивным перемешиванием смеси.
Для получения наноструктурной композиции с указанным размером частиц могут быть использованы известные в области нанотехнологий методы, например ультразвуковая обработка, гомогенизация при высоком давлении и т.п.
Определение размеров осуществляли методом автокорреляционной спектроскопии на субмикронном лазерном спектрометре Coulter N4MD фирмы Coulter Electronics (Франция-США).
Возможность осуществления изобретения продемонстрирована ниже представленными примерами.
Пример 1
Клатрат дидецилдиметиламмония хлорида
с карбамидом
10
Медный купорос
2,5
Деготь
5
Изопропиловый спирт
10
Вода
72,5
Пример 2
Клатрат дидецилдиметиламмония бромида
с карбамидом
4
Медный купорос
1
Деготь
5
Изопропиловый спирт
4
Вода
86
Пример 3
Клатрат дидецилдиметиламмония бромида
с карбамидом
2
Медный купорос
10
Деготь
10
Этиловый спирт
2
Вода
76
Пример 4
Клатрат дидецилдиметиламмония бромида
с карбамидом
10
Медный купорос
5
Деготь
5
Изопропиловый спирт
10
Вода
70
Пример 5
Клатрат дидецилдиметиламмония бромида
с карбамидом
5
Медный купорос
0,5
Деготь
2
Изопропиловый спирт
5
Вода
87,5
Пример 6
Определение активности в отношении Fusobacterium necrophorum
Для определения бактерицидной активности препарата кровяной агар засевали сплошным газоном Fusobacterium necrophorum, выделенным из некротизированных тканей и ран коров, накладывали на поверхность агара бумажный диски, пропитанные составами по примерам 1-5, а также суспензией, содержащей только клатрат дидецилдиметиламмония бромида с карбамидом, изопропиловый спирт и воду, культивирование проводили в анаэростате в течение 24 часов при температуре 37°С. После инкубации поверхность среды и выросшей культуры просматривали в косо проходящем свете и измеряли зону отсутствия роста изучаемого микроорганизма. Было установлено, что зона отсутствия роста при использовании составов по примерам 1-5 составила 3,4-3,8 см, что свидетельствует о высокой активности заявленного средства в отношении возбудителя. Зона роста при использовании контрольного состава составила 2,6 см.
Пример 7
Исследование биоцидной активности
Было приготовлено 10 разведений средства в концентрациях от 0,025 до 1%.
Тест-штаммы микроорганизмов:
- Escherichia coli K-99;
- Staphylococcus aureus 209;
- Streptococcus faecalis 685;
- Salmoneilla typhimurium 11;
- Candida albicans 690;
- Mycobacterium B5;
- Bacillus subtilis ТПИ 13;
- Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ;
- Bacillus cereus 96;
- Trichophyton verrucosum 480;
- Microsporum gypseum 37;
- плесневые грибы Cladosporium spp., Mucor spp.
Штаммы микроорганизмов были получены нами из Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ), из музея штаммов ГНУ ВИЭВ, коллекции штаммов Центра военно-технических проблем биологической защиты НИИ микробиологии МО РФ, из музея штаммов кафедры микробиологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ. Все штаммы микроорганизмов имели типичные морфологические, биохимические и культуральные свойства. Для поддержания и культивирования тест-штаммов микроорганизмов в процессе исследований использовали мясо-пептонный агар (МПА), мясо-пептонный бульон (МПБ), среду Гаузе №2, среду Петраньяни, агар Сабуро, желточно-солевой агар, среду КОДА, среду Китта-Тароцци. Посевы инкубировали в термостате при 37°С. Результаты учитывали через 24 часа и 7 суток (при культивировании микобактерий и дерматофитов). При наличии роста на МПБ делали подтверждающий посев на МПА (кроме микобактерий и дерматофитов). Эффективным считали такой режим дезинфекции тест-объектов, который обеспечивал по результатам 3-х опытов полное подавление роста всех использованных в эксперименте тест-объектов при наличии роста в посевах с контрольных тест-объектов. Результаты испытаний показали наличие 100% бактерицидной активности в отношении всех культур в минимальной испытуемой концентрации.
При испытании средства на вирулицидную активность использовали тесты непрямого определения инактивации вируса:
1. Демонстрация деструкции антигенности ВГВ (поверхностного антигена вируса гепатита В и HBeAg);
2. Деструкция ДНК вируса гепатита В.
В качестве субстрата применяли охарактеризованную сливную сыворотку с высокой протеиновой нагрузкой (52% по альбумину за счет добавления к сыворотке альбумина человеческого сухого) и высоким содержанием вирусных частиц. Субстрат имел следующие параметры:
1. HBsAg - положительная реакция, концентрация 180 нг/мл;
2. HBeAg - положительная реакция;
3. Концентрация частиц вируса гепатита В - 2,5•106 Geq/ml.
Определение исходных параметров субстрата для испытания проводили с использованием диагностических наборов фирмы «Хоффман - ля Рош» (Швейцария) на автоматических анализаторах «CobasCore II» для ИФА и «CobasAmplicore» (Швейцария) для ПЦР-анализа.
Критерий оценки эффективности средством - не менее 100%.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии вирулицидной активности средства в отношении вируса гепатита В в концентрациях от 0,1 до 0,5%.
Пример 8
Испытания терапевтической активности средства
При производственных испытаниях были использованы больные некробактериозом коровы в количестве 20 голов.
Животные были разделены на опытные и контрольные группы. Животных опытных групп обрабатывали заявляемым составом по примеру 2 ежедневно 1 раз в сутки аппликационно в течение 10 суток. Перед нанесением препарата копытца очищали от загрязнений и при необходимости срезали копытный рог копытным ножом. Животных контрольных групп лечили известным коммерческим противобактериальным средством Террамицин.
На третьи сутки лечения коров опытной группы отечность кожи и подкожной клетчатки заметно уменьшалась, изъязвленные участки кожи подсыхали, уменьшалось истечение из ран. На 4-5 сутки исчезли признаки воспаления, ранки затягивались и образовывался плотный струп. На 7 сутки уменьшилась хромота опирающихся конечностей и полностью исчезли признаки некробиоза. У коров контрольной группы процесс заживления проходил в 2 раза медленнее.
Были проведены также испытания на 48 овцах, пораженных копытной гнилью.
Средства, имеющие составы по примеру 1 и 4, применяли в виде ножных ванн 1 раз в день в течение 7 суток. Овец ставили на 15 минут в металлическую емкость, наполненную средством. Уровень верхнего мениска составлял 5 см. Ежедневно овец осматривали и учитывали физиологическое состояние организма.
На 4-5 сутки у овец уменьшалась отечность. Подсыхали изъязвления и раны затягивались. На 7 сутки исчезала хромота опирающихся конечностей. Признаки копытной гнили полностью исчезли. Все овцы независимо от течения болезни выздоравливали.
Пример 9
Изучение стабильности средства при хранении
Стабильность свойств средства при хранении определяли методом «ускоренного старения», основанным на увеличении скорости протекания химических процессов при повышенной температуре, превышающей максимально допустимую при хранении средства в нормальных условиях.
3
С этой целью 3 серии экспериментальных образцов в объеме 300 см помещали в термостат с температурой 50°С. Качество серий оценивали по изменению массовой доли клатрата аммонийного соединения с карбамидом, плотности и коэффициенту преломления в соответствии с СТО 719544720-0003-2008.
Эксперимент проводили 12 месяцев. Каждые 2 месяца отбирали пробы и определяли массовую долю активного вещества методом двухфазного титрования с помощью анионного стандартного раствора (додецилсульфат натрия) в щелочной среде в присутствии индикатора бромфенолового голубого, плотность - с помощью ареометра, коэффициент преломления - рефрактометрическим методом.
Результаты исследования представлены в таблице.
Продолжительность хранения, месяц
Соответствующий сроку хранения год
Массовая доля активной субстанции, %
Плотность, г/см<sup>3</sup>
Коэффициент преломления
СТО
Стабильность свойств
2
1
10
1,055
1,353
Соотв.
Стаб.
4
2
10
1,055
1,353
Соотв.
Стаб.
6
3
10
1,055
1,353
Соотв.
Стаб.
8
4
10
1,055
1,353
Соотв.
Стаб.
10
5
10
1,055
1,353
Соотв.
Стаб.
12
6
10
1,055
1,353
Соотв.
Стаб.