Рекомбинантные альгинат-лиазы морских бактерий: субстратная специфичность и потенциал использования для разрушения биоплёнок

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine»

at low temperatures. J. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70:2912-2918.

6. Бердасова А.С., Бузолева Л.С., Богатыренко Е.А. Образование биоплёнки Listeria monocytogenes в консорциуме с сапротрофными бактериями: В кн.: Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Матер. все-рос. симп. с межд. участ. - М.: 2012. 34 с.

7. Leriche, V., Carpentier B. Limitation of adhesion and growth of Listeria monocytogenes on stainless steel surfaces by Staphylococcus sciuribiofilms. J. Appl. Microbiol. 2000; 4: 594-605.

8. Zhao, T., Doyle M.P., Zhao P. Control of Listeria monocytogenes in a biofilm by competitive-exclusion microorganisms. J. Appl. Environ. Microbiol. 2004; 70: 3996-4003.

9. Christensen G. D., Simpson W.A., Younger J.J., Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical devices. J Clin Microbiology. 1985; 22(6): 996-1006.

10. Корягин В.В. Аддитивные и неаддитивные оформления совершенства и их эмерджентные определения // Наука и современность. 2011; 13(3): 58-66.

11. Пономарева А.Л. Исследование интенсивности образования биопленок Listeria monocytogenes при различных температурах // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2016; 2 (65): 38-39.

12. Цветкова Н.Б. Изменчивость биологических свойств Listeria monocytogenes под влиянием абиотических факторов // Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2012; 47-48(1-2): 253-257.

Сведения об авторе

Бузолева Любовь Степановна - д.б.н., главный научный сотрудник экологии патогенных бактерий, доктор биологических наук; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г.П. Сомова», 690087, Владивосток, ул. Сельская, дом 1, тел. (423)244-18-88; e-mail: buzoleva@mail.ru

© Белик А.А., Сильченко А.С., 2017 г. doi: 10.5281/zenodo.817768

Удк 577.152.321

А.А. Белик, А.С. Сильченко

рекомбинантные альгинат-лиазы морских бактерий: субстратная специфичность и потенциал использования для разрушения биоплёнок

Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова, Владивосток

Были получены рекомбинантные формы пяти альгинат-лиаз морской бактерии Formosa algae KMM 3553 и трех альгинат-лиаз морской бактерии Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549(T). Было показано, что данные ферменты активны в отношении полиманнуроновой, полигулуроновой кислот, а также альгиновой кислоты смешанного типа. Принимая во внимание тот факт, что альгинаты играют существенную роль в образовании биоплёнок патогенных бактерий, данные ферменты потенциально могут быть использованы в составе средств для обеззараживания поверхностей.

Ключевые слова: альгинат-лиазы, альгиназы, Formosa algae, Pseudoalteromonas issachenkonii, маннуро-нат-специфичная альгинат-лиаза, гулуронат-специфичная альгинат-лиаза, биоплёнки

A.A. Belik, A.S. Silchenko

recombinant ALGINATE LYASES of MARINE BACTERIA:

SUBSTRATE SPECIFICITY AND PoTENTIAL of USAGE IN BioFILM DEGRADATioN

G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Vladivostok, Russia

There were expressed recombinant forms of five alginate lyases of marine bacterium Formosa algae KMM 3553 and three alginate lyases of marine bacterium Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549(T). By using the method of assaying of reducing sugars it was shown that these enzymes are active against polymannuronic, polyguluronic and mixed type of alginic acids. Taking in account the fact, that alginates play essential role in formation of biofilms of pathogenic bacteria, these enzymes potentially can be used in compositions for disinfection of surfaces.

Keywords: alginate lyases, alginases, Formosa algae, Pseudoalteromonas issachenkonii, mannuronate-specific alginate lyase, guluronate-specific alginate lyase, biofilms

HEALTH. MEDICAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 33

• Материалы Научно-практической конференции «Фундаментальная дальневосточная наука - медицине»

Введение

Альгиновые кислоты и их соли (альгина-ты) представляют собой группу промышленно важных биополимеров, составленных из C-5-эпимеров ß-D-маннуроновой кислоты (M) и a-L-гулуроновой кислоты (G). Альгинат-лиазы - ферменты, гидролизирующие связи между звеньями альгиновых кислот, продуцируются всеми аль-гинат-производящими бактериями для удаления ошибочно высвободившихся в периплазму молекул альгинатов, а также теми организмами, которые используют альгинаты в качестве источников углерода [1]. Данные ферменты могут быть разделены по функциональному признаку на три типа: 4.2.2.3 - маннуронат-специфичные альгинат-лиазы, 4.2.2.11 - гулуронат-специфичные альгинат-лиазы, а также 4.2.2.26 - олиго альгинат-лиазы.

Продукты действия альгинат-лиаз имеют фамако-логическое значение. В частности, было показано, что альгинат-лиаза S бактерии Sphingobacterium sp. расщепляет альгинат FD170 с образованием оли-госахаридов, способных полностью ингибировать окисление липидов в эмульсиях [2]. Также было показано, что продукты ферментирования альгина-та из Laminaria hyperborea бакериальной культурой Bacillus subtilis KCTC 11872BP (альгинат-олигоса-хариды) повышают экспрессию рецептора липо-поротеина низкой плотности и внутриклеточное поглощение данного липопротеина в гепатоцитах дозо- и время-зависимым образом. Лечение мышей данным альгинат-олигосахаридом в течение двух недель приводило к снижению уровня холестерина в плазме крови [3].

Наибольший интерес представляет использование альгинат-лиаз для разрушения биоплёнок. Известно, что матрикс биоплёнок может быть частью защитного механизма бактерий. Например, субминимальные ингибирующие концентрации бета-лактамных антибиотиков индуцируют повышенный синтез альгината биоплёнками Pseudomonas aeruginosa. Применение же ДНКазы и альгинат-лиазы позволило расщепить матрикс биоплёнки и повысить активность тобрамицина против данного штамма [4, 5].

Поскольку P. aeruginosa и другие альгинат-продуцирующие псевдомонады не синтезируют альгинаты с G-блоками, только маннуронат-специфичные и универсальные альгинат-лиазы представляют интерес в данном аспекте [6, 7]. Модификация поликарбонатных поверхностей альги-нат-лиазой Sphingobacterium multivorium уменьшает адгезию мукоидных и немукоидных штаммов P. aeruginosa даже когда фермент наносится в инактивированной форме [8]. Применение альги-нат-лиазы Flavobacterium sp. в сочетании с клари-томицином позволило снизить концентрацию анти-

биотика, необходимую для ингибирования роста Helicobacter pylori [9]. Путём направленного мутагенеза была получена рекомбинантная форма собственной альгинат-лиазы P. aeruginosa со значительно повышенными значениями каталитической константы и константы Михаэлиса, эффективная против биоплёнок ципрофлоксацин-резистентной P. aeruginosa [10]. Таким образом, изучение аль-гинат-лиаз из новых источников как деструкторов биоплёнок различных патогенных штаммов микроорганизмов является перспективной, с практической точки зрения, задачей.

Целью исследования было получить рекомби-нантные формы ранее неизученных ферментов из морских бактерий Formosa algae KMM 3553 и Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549(T), которые по данным полного геномного секвени-рования были охаратеризованы как потенциально обладающие альгинат-лиазной активностью. Экспериментальная характеристика наличия активности и субстратной специфичности позволит рекомендовать те или иные ферменты в качестве потенциально пригодных для практического применения.

Материалы и методы

Полные генетические последовательности морских бактерий Formosa algae KMM 3553 и P. issachenkonii KMM 3549(T) были взяты в базе данных GenBank (NCBI). Анализ последовательностей производился с помощью программ Artemis 16.0.0 (Sanger Institute), GeneRunner (Hastings Software), онлайн сервисов BLAST, Clustal Omega, InterPro, Phobius, SignallP. Получение генетических конструкций проводилось с помощью метода безре-стрикционного клонирования, дизайн праймеров проводился с помощью онлайн сервиса Restriction Free Cloning (www.rf-cloning.org/).

В качестве вектора использовалась плазмида pColdll (Clontech), в качестве полимеразы использовалась Phusion© HF DNA Polymerase (New England Biolabs). Компетентные клетки приготовляли химическим методом, транформацию производили методом теплового шока. Молекулярное клонирование конструкций осуществлялось в клетках E. coli XL10 Gold, экспрессия - в E. coli Arctic Express. Экспрессию проводили при 16°C в течение 16 ч. Клетки собирали центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин, осадки ресуспендировали в 40 мМ фосфатном буфере (pH 7,0) из расчёта 10 мл буфера на осадок из 20 мл культуральной среды и подвергали ультразвуковой дезинтеграции, контролируя, чтобы температура суспензии не превышала 5°C. Супер-натант отделяли центрифугированием при 6000 g в течение 30 мин, очищали с помощью металоаффин-ной хроматографии на сорбенте Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences) согласно рекомендациям производителя.

34 ЗДОРОВЬЕ. МЕДИЦИНСКАЯ ЭКОЛОГИЯ. НАУКА 3 (70) - 2017

Materials of the Scientific and Practical Conference «Fundamental Far Eastern science for medicine» •

Активность ферментов определяли путём измерения количества восстанавливающих Сахаров в смеси по методу Нельсона. В качестве субстратов использовали растворы полиманнуроновой кислоты из Fucus evanescens (получена в лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН), полигулуроновой кислоты (Laboratory BDH) и альгината натрия смешанного типа (Sigma) в 40 мМ фосфатном буфере (pH 7,0) в концентрациях 2 мг/мл.

Результаты и обсуждение

Путём анализа полных геномных последовательностей в геноме Formosa algae KMM 3553 было выделено пять альгинат-лиаз (ALFA1 - ALFA5). А в Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549(T) - две (ALPI1 и ALPI2). Полная последовательность ALPI1 была обозначена как ALPI1E1, а укороченная -содержащая только альгинат-лиазный домен -как ALPI1E2.

Более значительная дистанция между двумя аль-гинат-лиазами ALPI1 и ALPI2 Pseudoalteromonas issachenkonii по сравнению с дистанцией между ALPI2 и любыми аналогичными ферментами из Formosa algae может указывать на горизонтальный перенос генов в ходе эволюции данного штамма.

Ближайшими гомологами данных ферментов оказались альгинат-лиазы бактерий Formosa agariphila, Flavobacterium sp., Streptomyces leeuwenhoekii, Formosa haliotis и Pseudoalteromonas haloplanktis.

Интересно, что при более низких концентрациях ALPI1 проявляет активность только в отношении по-лиманнуроновой кислоты, а ALPI2 - только в отношении полигулуроновой. Данные позволяют предположить, что ALFA4, ALFA5, ALPI1E1 и ALPI1E2 расщепляют преимущественно гликозидные связи между остатками маннуроновой кислоты, ALFA2 и ALPI2 - преимущественно между остатками гулуро-новой. Альгинат-лиаза ALFA3 является ферментом смешанного типа действия и катализирует расщепление полисахаридов, являющихся сополимерами гулуроновой и маннуроновой кислот.

Для ALFA3 был определён оптимум pH для всех упомянутых субстратов. Во всех случаях он оказался равным 6,0. По-видимому, полиспецифичность фермента обеспечивает сохранение относительно высокого уровня активности при действии на смешанный субстрат даже при неоптимальных условиях, в то время как эффективность взаимодействия с гомогенными субстратами падает.

Выводы

Нами были получены восемь новых рекомбинантных альгинат-лиаз морских бактерий Formosa algae KMM 3553 и Pseudoalteromonas issachenkonii KMM 3549(T). Они были охарактеризованы по типу действия. Исходя из литературных данных по структуре альгинатов в биоплёнках патогенных бактерий, они имеют потенциал применения в составе обеззараживающих агентов.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 15-04-01004_а.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ertesvag H., Frontiers in Microbiology. 2015; 6: doi:10.3389/fmicb.2015.00523.

2. Falkeborg M., Cheong L.Z., Gianfico C., Sztukiel K.M., Kristensen K., Glasius M., Xu X. and Guo Z., Food Chemistry. 2014; 164: 185-194. doi:10.1016/j. foodchem.2014.05.053.

3. Yang J.H., Bang M.A., Jang C.H., Jo G.H., Jung S.K. and Ki S.H., Journal of Nutritional Biochemistry. 2015; 26: 1393-1400. doi:10.1016/j.jnut-bio.2015.07.009.

4. Alipour M., Suntres Z.E. Omri A., Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2009; 64: 317-325. doi:10.1093/jac/dkp165.

5. Hoiby N., Bjarnsholt T., Givskov M., Molin S., Cio-fu O., International Journal of Antimicrobial Agents. 2010; 35: 322-332. doi:10.1016/j.ijantimicag.2009.12.011.

6. Skjakbraek G., Grasdalen H. and Larsen B., Carbohydrate Research. 1986; 154: 239-250. doi:10.1016/ S0008-6215(00)90036-3.

7. Wong T.Y., Preston L.A., Schiller N.L., Annual Review of Microbiology. 2000; 54: 289-340. doi:10.1146/annurev.micro.54.1.289.

8. Alves D., Sileika T., Messersmith P.B., Pereira M.O. Macromolecular Bioscience. 2016; 16: 13011310. doi:10.1002/mabi.201600077.

9. Bugli F., Palmieri V., Torelli R., Papi M., De Spirito M., Cacaci M., Galgano S., Masucci L., Sterbini F.P., Vella A., Graffeo R., Posteraro B. Sanguinetti M., Biotechnology Progress. 2016; 32: 1584-1591. doi:10.1002/btpr.2339.

10. Cho H., Huang X.Q., Piao Y.L., Kim D.E., Lee S.Y., Yoon E.J., Park S.H., Lee K., Jang C.H., Zhan C.G., Proteins-Structure Function and Bioinformatics. 2016; 84: 1875-1887. doi:10.1002/prot.25171.

Сведения об авторах

Белик Алексей Анатольевич, м.н.с. ТИБОХ ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: 89146640272, e mail: belik_a_a@ mail.ru;

Сильченко Артём Сергеевич, к.х.н., н.с. ТИБОХ ДВО РАН, г. Владивосток, тел.: (423) 231-07-05; e mail: artem.silchencko@yandex.ru.

HEALTH. MEDiCAL ECOLOGY. SCiENCE 3 (70) - 2017 35