Способ профилактики ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза
METHOD FOR PREVENTION OF LARVAL STAGE OF ECHINOCOCCOSIS ALVEOLARIS

Изобретение относится к ветеринарной и медицинской гельминтологии и может быть использовано для иммунопрофилактики ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза.
Echinococcus multilocularis - возбудитель альвеолярной формы эхинококкоза (гидатидоза) относится к числу наиболее патогенных социально опасных гельминтов. Вызываемое этим паразитом заболевание имеет большое распространение в различных зонах земного шара, представляет серьезную угрозу для здоровья человека и является актуальной проблемой для ветеринарной медицины. Большое влияние эхинококкозов на экономику и здоровье населения признаны Комитетом Экспертов ВОЗ. Зоны высокого риска болезни альвеолярной формой эхинококкоза (гидатидоза) давно известны во Франции, Швейцарии, Германии (1); Японии (2, 3, 4); Словакии (5). За последние годы отмечено широкое распространение цистного и альвеолярного гидатидоза также в России, что связано с возросшей миграцией населения, развалом устоявшихся экономических отношений, а также в связи с ухудшением социальной жизни и снижения санитарно-эпидемиологического контроля (6, 7, 8).
По мнению исследователей с каждым годом отмечается увеличение числа случаев заболевания людей и альвеолярный эхинококкоз (гидатидоз) становится важной проблемой ветеринарии и здравоохранения в этих странах и требует немедленной организации методов борьбы и профилактики. Степень отрицательного влияния этой инвазии на здоровье зараженных людей трудно оценить. В запущенных случаях болезнь, как правило, неизлечима, поскольку в этот период уже значительно поражена печень, а метастазы подобно раковой опухоли уже имеются и в других органах и тканях. В этом случае даже пересадка печени может оказаться малоэффективной.
Такая ситуация выдвигает проблему разработки мер профилактики и лечения этого опасного гельминтозооноза в качестве одной из приоритетных направлений гельминтологической науки и практики.
В борьбе с ларвальной стадией альвеолярного эхинококкоза наиболее приемлемым и осуществимым являются три пути: химиотерапия, вакцинопрофилактика, иммунотерапия.
Проведение химиотерапии всегда сопровождается большими дозами химических препаратов и длительным их применением. Но даже в этом случае этот способ недостаточно эффективен, поскольку помимо развития резистентности паразита к лечебному химиопрепарату, в процессе лечения происходит только приостановка его развития, а не окончательная гибель, что впоследствии приводит к возобновлению заболевания и возникновению метастазов.
К способам профилактики ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза относится использование специфических и неспецифических стимуляторов иммунной системы, позволяющих повысить резистентность животных и человека к заражению, подавлять рост метацестод Е. multilocularis и вызывать гибель популяции паразита.
6
Неспецифическая резистентность хлопковых крыс к заражению Е. multilocularis с полным подавлением роста метацестод паразита достигалась введением им внутрибрюшинно 26,4x10 единиц БЦЖ. Эта доза хорошо переносилась и на 100% убивала ларвоцисты паразита у экспериментально зараженных монгольских песчанок (9).
3
7
5
7
Аналогичный достаточно сильный эффект защиты достигался у мышей относительно низкими дозами вакцины БЦЖ (10 - 10 колониеобразующих единиц), который выражался значительно меньшими размерами паразитарных узлов по сравнению с контрольными (10). Однако по данным Reuben et al. (11) при дозе 10 - 10 единиц БЦЖ у мышей развивались туберкулезные гранулемы.
Защита от альвеолярного гидатидоза достигалась также стимулированием хлопковых крыс клеточным перитонеальным экссудатом, полученным через 3 дня после внутрибрюшинного введения фитогемагглютинина. Такая процедура в значительной мере предохраняла животных от развития ларвоцист Echinococcus multilocularis в брюшной полости и во внутренних органах (12).
Известен случай профилактики вторичного альвеолярного гидатидоза, предусматривающий использование специфического компонента - антигена культивируемых клеток протосколексов Е. multilocularis и иммуномодулятора - риботана, повышающего иммунореактивность специфического антигена (13).
Профилактическим действием, защищающим хлопковых крыс от инвазии Echinococcus multilocularis, обладали клеточные мембраны Micobacterium bovis штамма BCG (BCG - CW), которые вводили экспериментальным животным в дозе 150 мкг за две недели до внутрибрюшинной инокуляции им выводковых капсул Е. multilocularis в эмульсии вазелинового масла в солевом растворе Твин-80. Этот способ предлагается авторами для профилактики метастаз у больных альвеококкозом (14). Однако ранее было установлено, что при повышенных дозах БЦЖ у экспериментальных животных развиваются туберкулезные гранулемы, что требует более тщательной отработки дозы этой вакцины и разработки лечения туберкулом (15).
Наиболее близким к заявляемому техническим решением является использование специфического компонента - антигена культивируемых клеток протосколексов Е. multilocularis и иммуномодулятора риботана, повышающего иммунореактивность специфического антигена. Однако этот способ не обеспечивает 100%-ный эффект защиты.
Учитывая серьезную опасность ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза для людей и перспективность развития вакцинопрофилактики этой инвазии была проведена работа по разработке способа профилактики ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза на модели мышь - Е. multilocularis; кролик - Е. multilocularis с использованием специфического антигена Е. multilocularis и неспецифического биопрепарата, представляющего собой мембранную фракцию клеток эпимастигот (МФКЭ) Т. cruzi, полученную в ступенчатом градиенте сахарозы, распологающуюся на границе слоев 30-60%. Способность продуцировать противоопухолевое начало является видовым свойством Т. cruzi и доказано многими исследователями как у нас в стране, так и за рубежом (16).
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа иммунизации, обеспечивающего развитие защитной иммунной реакции, предохраняющей от последующего заражения.
Поставленная задача решается тем, что одновременно с клеточным антигеном из протосколексов Е. multilocularis животным вводят подкожно МФКЭ - причем дозу вводимого МФКЭ через каждые 10 дней увеличивают в 2-3 раза. Количественный расчет клеточного антигена из протосколексов Е. multilocularis проводят по содержанию белка, а МФКЭ в единицах действия (ЕД). Одна ЕД содержит 1 млн клеток в 1 мл. Белок в клеточном антигене определяли спектрофотометрически по Layne (17). Клеточный антиген - антигеноактивные метаболиты клеток протосколексов Е. multilocularis, получают из приготовленной первичной клеточной культуры протосколексов E. multilocularis, последующего культивирования клеток в искусственных питательных средах с добавлением необходимых факторов роста, получения перевиваемой клеточной культуры и отбора антигеноактивных серий метаболитов клеток с использованием иммуноферментной реакции. Клеточный антиген вызывает иммунный ответ у кроликов и реагирует с гомологичной антисывороткой, образуя в реакции иммунодиффузии в агаровом геле не менее 5-6 комплексов антиген - антитело в виде проявленных полос преципитации.
Непосредственно перед проведением экспериментов на животных - моделях определяли необходимое количество иммунизирующей дозы клеточного антигена Е. multilocularis (по белку) в объемном выражении и смешивали с рассчитанной увеличивающейся дозой МФКЭ по ЕД. Полученный иммунопрепарат использовали для профилактики ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза на животных - моделях при 3-кратном подкожном введении с интервалом 10 дней и последующем проверочном заражении иммунизированных и контрольных животных инвазивным материалом Echinococcus multilocularis через 20 дней после последней иммунизации.
Первая иммунизирующая доза иммунопрепарата для мышей составила 0,2 мл (60 мкг белка) клеточного антигена и 5 ЕД МФКЭ; вторая - 0,2 мл (60 мкг белка) клеточного антигена и 10 ЕД МФКЭ; третья - 0,2 мл (60 мкг белка) клеточного антигена и 20 ЕД МФКЭ; для кроликов - первая доза - 0,5 мл (4,5 мг белка) клеточного антигена и 5 ЕД МФКЭ; вторая - 0,5 мл (4,5 мг белка) клеточного антигена и 15 ЕД МФКЭ и третья - 0,5 мл (4,5 мг белка) клеточного антигена и 45 ЕД МФКЭ.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа, обладающего высоким защитным эффектом против ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза.
Примеры конкретного исполнения
Пример 1. Протективные свойства заявленного способа оценивали при экспериментальной ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза на мышах.
Исследования провели на 48 белых беспородных мышах, массой 20,0 г, распределенных на 4 равноценные группы (табл. 1).
Первая группа мышей была иммунизирована подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней иммунопрепаратом из расчета: первая иммунизация - 0,2 мл (60 мкг белка) клеточного антигена с 5 ЕД МФКЭ; вторая - 0,2 мл (60 мкг белка) клеточного антигена с 10 ЕД МФКЭ; третья - 0,2 (60 мкг белка) клеточного антигена с 20 ЕД МФКЭ.
Вторая группа мышей была иммунизирована подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней МФКЭ в дозе 5 ЕД, 10 ЕД и 20 ЕД соответственно, каждую дозу вводили в 0,2 мл стерильного физиологического раствора.
Третья группа мышей получала подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней по 0,2 мл (60 мкг белка) клеточного антигена.
Четвертая контрольная группа мышей получала 3-кратно подкожно с интервалом 10 дней по 0,2 мл стерильного физиологического раствора.
По истечении 20 дней мышей всех 4-х групп заразили протосколексами и ацефалоцистами Е. multilocularis в дозе 750±50 экз/мышь. Убой подопытных мышей провели через 90 дней после заражения. Результаты эксперимента, представленные в табл. 1, показали, что все мыши первой группы, иммунизированные иммунопрепаратом (клеточный антиген + МФКЭ), оставались незараженными, у них в органах и в брюшной полости ларвоцисты паразита не были обнаружены. Таким образом, эффективность защиты составила 100%.
У мышей второй группы, иммунизированных только МФКЭ без клеточного антигена ,защитный эффект составил 75,0%, у трех мышей из этой группы были обнаружены единичные ларвоцисты в брюшной полости без зародышевых элементов.
Мыши третьей группы, которые были иммунизированы только клеточным антигеном без МФКЭ, оказались защищенными от инвазии на 66,7%. У четырех мышей из этой группы были обнаружены ларвоцисты в брюшной полости и на паренхиме печени.
Мыши четвертой контрольной группы были все заражены, у них обнаружены многочисленные ларвоцисты во всех внутренних органах и в брюшной полости размером до 1,2 см в диаметре, массой 0,105-1086 г с протосколексами.
Пример 2. Протективные свойства заявленного способа при экспериментальной ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза на кроликах (табл. 2).
Исследования провели на 6 кроликах массой 1,5 кг, распределенных на 2 группы по 3 кролика в каждой.
Кролики первой группы были иммунизированы иммунопрепаратом (клеточный антиген + МФКЭ) подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней: первая доза - 0,5 мл (4,5 мг белка) клеточного антигена с 5 ЕД МФКЭ; вторая - 0,5 мл (4,5 мг белка) клеточного антигена с 15 ЕД МФКЭ и третья - 0,5 мл (4,5 мг белка) клеточного антигена с 45 ЕД МФКЭ.
Вторая контрольная группа кроликов получала подкожно 3-кратно с интервалом 10 дней по 0,5 мл стерильного физраствора.
По истечении 20 дней, со дня последней иммунизации, все подопытные кролики были заражены протосколексами и ацефалоцистами в количестве 750±50 экз/животное. Убой кроликов провели на 90-й день после заражения. Результаты эксперимента, представленные в табл. 2, показали, что все кролики первой группы оставались свободными от инвазии. Таким образом, эффективность защиты составила 100%. Кролики контрольной группы все были заражены, в брюшной полости и во внутренних органах были обнаружены многочисленные ларвоцисты паразита 2,5-3,0 см в диаметре со сформировавшимися протосколексами.
Источники информации
1. Berke О., Keyserlingk М. Von, Broil S., Kreienbrock L. // Berk Miinch. Tierarztl. Wschr. - 2002. - V. 115, №11-12. - S. 428-434.
2. Giman A.E., Nonaka M., Oku V., Kamiya MM Jap. J. Vet. Res., 2002. - V. 49, №4. - P. 287-296.
3. Gnoue T. // Jap. J. Vet. Res., 2003. - V. 51, №1. - P. 39.
4. Liu Ch. // Jap J. Vet. Res. - 2004. - V. 52, №1, P. 39.
5. Miterpakova M., Reiterova K., Turcekova L., Dubinsky P. // Helmintologia. - 2003. - V. 40, №3. - P. 180.
6. Маркин А.В. // Теория и практика борьбы с паразитарными болезями. - 1999. - c. 152-154.
7. Мусаев Г.X.// Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. - 1999. - с. 170-171.
8. Kovalenko F.P. et al. // Acta Parasitologica, 8 Europ Microcolloquium of Parasitol. - 2002. - V. 45, №3. - p. 241-242.
9. Rau M.E., Tanner C.E. // Nature, London. - 1975. - V. 256, №5515. - P. 318-319.
10. Reuben J.M., Tanner C. EM Short. Commun., Warszawa. - 1978. - sec. E. - P. 51-52.
11. Reuben J.M., Tanner С.E, Rau M. EM Infect, and Immun. - 1978. - V. 21, №1. - P. 135-139.
12. Reuben J.M., Tanner C.E. // Parasite immunol. - 1983. - v. 5., №1. - 61-66.
13. Бережко и др. Патент №221921 А. 11 окт. 2004 г. Бюл. №19.
14. Reuben J.М., Tanner С.Е, Portelance V. // Infect, and Immun. - 1979. - V. 23, № З..Р. 582-585.
15. Tompson R.C. // Z. Parasitenk. - 1976. - V. 21, № L-P. 31-36.
16. Каллиникова В.Д. Противоопухолевые свойства жгутикового простейшего Tripanosoma cruzi. - М., МГУ. 2004 г. 280 с.
17. Layne Е. // Methods Enzymol. - 1957. - V. З.-Р. 447-454.
Таблица 1
Протективные свойства клеточного антигена (КлАг) протосколексов E. multilocularis в комплексе с биопрепаратом МФКЭ при ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза мышей
№ групп
Кол-во мышей в группе
Иммунизирующее средство, доза
Кратность иммунизации
Интервал между иммунизациями
Доза заражения<sup>1</sup>, экз.
Кол-во заразившихся мышей
Эффективность защиты, %
1
12
Препарат МФКЭ (5, 10, 20 ЕД) + КлАг (60 мкг белка)
3
10
750±50
0
100
2
12
Препарат МФКЭ (5, 10, 20 ЕД)
3
10
750±50
3
75,0
3
12
КлАг (60 мкг белка)
3
10
750±50
4
66,7
4Контроль
12
Физиологический р-р
3
10
750±50
12
0
<sup>1</sup> – заражение через 20 дней после последней иммунизации
Таблица 2
Протективные свойства клеточного антигена (КлАг) протосколексов E. multilocularis в комплексе с биопрепаратом МФКЭ при ларвальной стадии альвеолярного эхинококкоза кроликов
№ групп
Кол-во кроликов в группе
Иммунизирующее средство, доза
Кратность иммунизации
Интервал между иммунизациями
Доза заражения<sup>*</sup>
Кол-во заразившихся кроликов
Эффективность защиты, %
1
3
МФКЭ (5 ЕД, 15 ЕД, 45 ЕД) + КлАг (4,5 мг белка) в 0,5 мл физраствора
3
10
750±50
-
100
2Контроль
3
Физиологический раствор 0,5 мл
3
10
750±50
3
0
<sup>*</sup> – заражение через 20 дней после последней иммунизации