Получение стерильной активно пролиферирующей культуры ириса в условиях in vitro

70.. .80 %. При посеве в теплице лучшие результаты обеспечила обработка альбитом - всхожесть семян повысилась на 18 %, а в открытом грунте - экогелем - на 20% .

Погодные условия вегетациио 2007-2009 гг были благоприятными для серой гнили, особенно в 2009 г. Ранняя и продолжительная весна, обильное выпадение осадков (180 мм) в первой-второй декаде июня и резкие перепады температуры воздуха способствовали интенсивному развитию болезни.

В контрольных вариантах на сорте Снежана серой гнилью были поражены 21,8 % растений, на сорте Утренняя Звезда - 15,3 %, на сорте - Лионелла - 11,3 %. После обработки изученными препаратами отмечено снижение величины этого показателя. Лучшие результаты по биологической эффективности получены в вариантах с применением эмистима и циркона, где по-раженность болезнью снизилась до 5,4...9,9 % и 6,1.10,7 % соответственно, а биологическая эффективность составила 48,4.55,5 % и 41,4.49,6 %. Биологическая эффективность использования эпина и иммуноцитофита была ниже на 2,0.24,2%.

Кроме того, на фоне обработок изучаемыми препаратами наблюдалось значительное увеличение высоты растений и размера луковиц: у сорта Лионелла - на 3,1.11,5 см и 0,3.0,9 см (11.28 %), Утренняя Звезда -на 7,3.18,9 см и 0,6.0,9 см (20.30 %) и Снежана - на

6,2.13,9 см и 0,5.1,5 см (18.37 %) соответственно в среднем по вариантам.

Наилучшее влияние на всхожесть детки гладиолусов оказали препараты экогель и проросток. На сортах Лаура, Снежная Фантазия и Татьянин День при использовании проростка всхожесть повысилась, по сравнению с контролем, на 20, 33 и 12 %, экогеля - на 18, 18 и 9 %. На сорте Нью-Голд и линии 400-98 положительное влияние оказал проросток (всхожесть увеличилась на 51 и 11 %), на сорте Тайфун - экогель (18 %).

Выводы. Таким образом, мы установили положительный ростостимулирующий эффект биологически активных веществ, который выразился:

в повышении всхожести семян лилий в полевых условиях (экогель, 25 мл/кг) - на 20 %, в условиях теплицы (альбит, ТПС, 2 г/кг) - 18 %, луковичек лилий (ново-сил, 2 мл/кг) - на 27,4 %, детки гладиолусов (проросток, 2 мл/кг) - на 25,4 %;

в увеличении показателей биометрии при обработке вегетирующих растений лилий в условиях теплицы лариксином (90 мл/га), в полевых условиях эмистимом (1 мл/га) и цирконом (30 мл/га);

в повышении устойчивости к возбудителям ботрити-оза при обработки эмистимом в дозе 1 мл/га (биологическая эффективность в среднем по сортам - 52 %) и цирконом в дозе 30 мл/га (45,5 %).

Литература.

1. Вакуленко В.В. Регуляторы роста // Защита и карантин растений. - 2004. - №1. - С. 22-23.

2. Краткие методические указания по проведению государственных испытаний регуляторов роста растений. - Москва, 1984. - 43 с.

3. Полевой В.В. Фитогормоны. - Л.: Изд-во Ленинградского университета, 1982. - 249с.

4. Регуляторы роста растений с антистрессовыми и иммунопротекторными свойствами / Л.Д. Прусакова, Н.Н. Малеванная, С.Л. Белопухов, В.В. Вакуленко // Агрохимия. - 2005. - №11. - С. 76-86.

5. Седова Е.А. Прорастание семян лилий: эволюция представлений о температурной реакции надземно и подземно прорастающих видов /Седова, Е.А.//Вестник Московского университета. Серия 16. Биология. - 2003. - №4. - С. 43-48.

6. Турецкая Р.Х. Инструкция по применению стимуляторов роста при вегетативном размножении растений. -М.: Издательство Академии Наук СССР, 1963. - 72с.

7. ГОСТ 12038-66. Семена сельскохозяйственных культур: Методы определения качества. М.: Издательство стандартов, 1966. - 171 с.

THE EFFICIENCY OF GROWTH REGULATOR USE IN FLOWER CROP PRODUCTION G.M. Pugachyova, M.A. Sokolova, S.Yu. Yachmenyova, O.V. Yudina

Summary. The results of studies on lily and gladiolus growth regulator treatments have been presented. They result in plant growth and development stimulation and gray mold incidence decrease.

Key words: lily, gladiolus, growth regulators, diseases, circone, novosil, albit, immunocytophyte, emistim.

УДК 575:635.92

ПОЛУЧЕНИЕ СТЕРИЛЬНОЙ АКТИВНО ПРОЛИФЕРИРУЮЩЕЙ КУЛЬТУРЫ ИРИСА В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Л.И. ТИХОМИРОВА, научный сотрудник НИИС им. М.А. Лисавенко E-mail: L-tichomirova@yandex.ru

Резюме. Использование вегетативных почек в качестве эксплантов, для введения в культуру in vitro ириса может быть эффективно при дополнении питательных сред антибиотиками. Предварительно необходимо методом дисков определить чувствительность микроорганизмов-контаминантов к про-тивомикробным лекарственным средствам. Достижения науки и техники АПК, №08-2010 _

Ключевые слова: ирис, бактериальная и грибная инфекция, микроклональное размножение, эксп-лант, растение-регенерант, культура in vitro, жизнеспособность, инфицированность, стерилизация, чувствительность к антибиотикам, питательная среда.

Ирисы - перспективные многолетние растения с высокими декоративными качествами и большим разнообразием форм и окраски цветков. Сорта ириса, как и многих других многолетников, размножают только вегетативно. В лесостепной зоне Алтайско-

го края реальный коэффициент вегетативного размножения БЗ высоких сортов I. hybrida hort. равен в среднем 18 с изменчивостью от З до 27 [1]. Это усложняет или делает невозможным производство посадочного материала в промышленных масштабах. В таком случае необходимо увеличивать площади под маточные насаждения, что экономически не выгодно, или искать альтернативные способы размножения [2].

Ирисы подвержены бактериальной и грибной инфекции. Бактериоз (возбудитель Erwinia ceratovora) или мягкая гниль корневищ - опасное заболевание I. hybrida. В неблагоприятные годы в условиях Санкт-Петербурга потери коллекции бородатых ирисов достигали 9Q % [З]. При традиционных способах размножения трудно получить здоровый посадочный материал, так как существует возможность накопления и передачи инфекции.

Для получения качественного посадочного материала многих многолетников в короткие сроки сегодня применяют метод микроклонального размножения.

Успех этой технологии во многом зависит от первого ее этапа - введения в культуру in vitro. На эффективность микроклонального размножения влияет множество факторов различной природы.

Большое значение при введении в культуру ткани имеет эффективность стерилизации. Выбор стерилизующего агента определяется особенностями экспланта. Для нежных тканей его концентрация должна быть снижена, чтобы сохранить жизнеспособность экспланта. Часто внутреннее заражение исходных тканей бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций.

В России корневищные почки ириса, в том числе I. hybrida и I. sibirica L., впервые в качестве эксплан-тов использовала Л.С. Лунева. В ходе опытов она изучила условия культуры, благоприятствующие образованию каллусной ткани и последующему органогенезу [4].

Позднее был предложен способ получения рас-тений-регенерантов ириса, согласно которому в качестве эксплантов выступали верхушечные и боковые почки, изолированные с корневищ многолетних генеративных растений во время вегетации (июнь -июль) и после её окончания (сентябрь - октябрь). Стерильность и жизнеспособность эксплантов при введении в культуру in vitro составляла 49.68 % [Б].

Недостаток такого способа - сложность проведения стерилизации растительного материала.

Условия, материалы и методы. Объект исследований - перспективные сорта отечественной и зарубежной селекции, а также новые элитные гибриды трех видов ириса: I. hybrida, I.ensata, I. sibirica из коллекции НИИСС им. Лисавенко.

В качестве эксплантов использовали верхушечные и боковые почки, изолированные с корневищ многолетних генеративных растений.

Для изучения влияния способа стерилизации на жизнеспособность и инфицированность почек вегетативных побегов трех видов ириса были использованы следующие варианты стерилизующих средств: раствор хлоргексидина (0,5 мг/л), 0,2 %-ный раствор сулемы, раствор 70 %-ного этанола и 3 %-ной перекиси водорода (1:1), раствор 96 %-ного этанол и 3 %-ной перекиси водорода (1:1), 6 %-ный раствор сульфохлорантина. В качестве фунгицида приминя-ли фундазол (0,3 %-ный раствор).

Определение чувствительности к антибиотикам проводили методом дисков. Для этого использовали готовую питательную среду для микробиологических целей типа АГВ. Ее варили по прописи на этикетке и разливали в чашки Петри. Выделенную чистую культуру бактерий наносили штрихами на поверхность чашки и сверху раскладывали готовые стандартные диски, пропитанные антибиотиками. Через двое суток учитывали результаты. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяли по величине зоны отсутствия роста вокруг диска. Если ее радиус превышает 5 мм, считали, что микрофлора проявляет чувствительность к антибиотику.

Питательные среды готовили по прописи Мура-сиге и Скуга с дабавлением 30 г/л сахарозы. Работу проводили в асептических условиях, приготовление и стерилизацию питательных сред осуществляли по общепринятым методикам [6].

Растения выращивали в лабораторных условиях при искусственном освещении (2000.4000 лк) в условиях 16 часов свет, 8 часов темнота при температуре 24.26 0С.

Результаты и обсуждение. Жизнеспособность эксплантов в наших исследованиях была высокой при всех испытанных способах стерилизации (табл. 1). Исключением были вегетативные почки I. hybrida при использовании хлоргексидина и 70 %-ного раствора этанола в сочетании с 3 %-ной перекисью водорода. В этих вариантах гибель эксплантов наступала очень быстро из-за мягкой гнили. Инфицированность эксплантов I. ensata, I. sibirica в течение первых 7.10 дней была не высокой, что свидетельствует о качественной поверхностной сте-

Ирисы - геофиты, поэтому Таблица 1. Влияние способа стерилизации на жизнеспособность и инфициро-получение стерильного и ванность почек вегетативного побега трех видов ириса (экспозиция 20 минут), %

жизнеспособного материала при введении in vitro представляет большую трудность. Цель исследования -разработать способ введе- Стерилизующ ий агент Вид

I. hybrida I.ensata I. sibirica

инфи- цирован ван- ность жизне- способ- ность инфи- цирован ван- ность жизне- способ- ность инфи- цирован ван- ность жизне- способ- ность

ния в культуру in vitro почек Хлоргексидин 100 0 80 100 100 80

вегетативного побега трех Сулема 80 50 60 100 70 100

видов ириса (I. hybrida, этанол (70 %) + пере-

I.ensata Thunb., I. sibirica) кись водорода (3 %) 100 0 70 100 80 80

для получения стерильной этанол (96 %) + пере-

активно пролиферирующей кись водорода (3 %) 90 40 80 100 80 80

культуры in vitro. Сульфохл орантин 80 70 70 100 70 80

З8 ------------------------------------------- Достижения науки и техники АПК, №08-2010

Таблица 2. Определение чувствительности к противомикробным лекарственным средствам

*ЛС - лекарственное средство, Я - устойчив, Б - чувствителен, прочерк - чувствительность не определялась. рилизации. В дальнейшем она достигала больших величин, вероятно из-за внутренней инфекции. Предстерилизационная обработка 0,3 %-ным раствором фундазола в течение 16 часов положительных результатов не дала. Увеличение времени стерилизации больше 20 минут приводило к массовой гибели эксплантов.

Бактериальное загрязнение может снижать темп роста, коэффициент размножения и даже вызывать гибель растения. Наиболее трудная инфекция для контроля - эндогенные бактерии, которые не вызывают каких-либо видимых симптомов в загрязненной культуре [7].

После изучения состава микрофлоры, выделенной из инфицированных эксплантов изучаемых видов ириса, мы определили чуствительность наиболее часто встречавшихся микроарганизмов из рода

Ervinia и Pseudomonas к антибиотикам. Оказалось, что они обладают чувствительностью к широкому спектру антибиотиков (табл. 2). Это позволило выбрать лекарственные средства менее токсичные для эксплантов ириса.

При введении в культуру in vitro в питательные среды был добавлен левомицетин в количестве 100 мг/л, контролем служила среда без антибиотиков. Для эксплантов I.ensata, I. sibirica процент инфици-рованности на среде с левомецитином оказался на уровне контроля, что говорит о преобладании инфекции грибной этиологии. Для I. hybrida на средах с антибиотиком доля инфицированных эксплантов снизилась до 20 %. Вероятно, для этого вида более характерно наличие бактериальной микрофлоры (см. рисунок).

Рисунок. Влияние левомицетина в составе питательной среды на развитие микрофлоры эксплантов I. ЬуЬпбв (слева - среда без антибиотика, справа - с антибиотиком).

Выводы. При введении в культуру in vitro почек вегетативного побега ириса (I. hybrida, I. ensata, I. sibirica) внутренняя инфекция проявляет себя не зависимо от качества стерилизации.

Необходимо проведение микробиологического контроля эксплантов введённых в культуру и определения чувствительности к антибиотикам выделенных микроорганизмов.

Для выделенных бактерий из рода Ervinia и Pseudomonas определён широкий спектр антибактериальных средств, к которым они проявляют чувствительность.

Введение антибиотиков в агаризованную питательную среду для культивирования растений-реге-нерантов ириса (I. hybrida), позволяет сохранить стерильными и жизнеспособными до 80 % эксплантов.

Наименование ЛС* Содержание Лс в диске, мкг, ед. Анализируемые микроорганизмы

Ervinia spp. Pseudomonas spр.

Амикацин 30 S S

Ампициллин 10 R -

Гентамицин 10 S S

Доксициклин 10 S R

Левомицетин 30 S S

Офлоксацин б S S

Полимиксин 300 S S

Тетрациклин 30 S R

Фурадонин 300 S -

Цефазолин 30 S -

Цефалотин 30 S -

Цефаперазон 75 S S

Цефотаксим 30 S R

Ципрофлоксацин б - S

Левофлоксацин б - S

Цефтазидим 30 S S

Цефтриаксон 30 S R

Имипенем 10 S S

Меропенем 10 S S

Цефепим 30 S S

Амоксицил-

лин/клавуланат 20/10 S -

Литература.

1. Долганова З.В. Биология и интродукция цветочно-декоративных корневищных многолетников в Западной Сибири. РАСХН. Сиб. отд-ние. НИИСС им. М.А. Лисавенко. - Новосибирск, 2002. - 232 с.

2. Yabuya t, Ikeda Y., Adachi T. (1991) In-vitro propagation of Japanese garden iris iris-ensata thunb. Euphytica 57. - Р. 77-82.

3. Родионенко Г.И. Ирисы. - Санкт-Петербург. - 2002. - 60 с.

4. Лунева Л.С. Размножение ирисов (Iridaceae) методом культуры апикальных меристем in vitro. Ботанический журнал. Т. 62. 3. Наука. 1977. - С. 416-421.

5. Ишмуратова М.М. . Особенности культивирования in vitro растений различных экологических групп на примере видов рода Iris L. Растительные ресурсы. № 4. - Москва. - 1999. - С. 67-74.

6. Калинин Ф.А., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. -Киев, 1980. - 488 с.

7. Wojtania A., Puiawska J., Gabryszewska E. Identification and elimination bacterial contaminantes from Pelargonium tissue cultures. Journal of Fruit and Ornamental Plant Research. Vol. 13, 2005. - P.101-108.

OBTAINING OF STERILE ACTIVELY PROLIFEROUS IRIS CULRURE IN VITRO

Summary. Application of vegetative buds as explants for iris introduction in vitro can be effective at addition of antibiotics to nutrient media. Preliminarily, microorganism sensitivity - contaminants to antimicrobial medicinal means - is defined by disc method.

Key words: iris, bacterial, fungous, infection, microclonal propagation, explant, plant-regenerant, culture in vitro, viability, infectionness, sterilization, sensitiveness to antibiotics, nutrient media.

Достижения науки и техники АПК, №08-2010 ______________________________________________________ 39