Углеводородокисляющая активность микромицетов, выделенных из нефтезагрязненных почв Башкортостана

УДК 631.466.1

УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРОМИЦЕТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ БАШКОРТОСТАНА

Киреева Н.А., Мифтахова А.М., Бакаева М.Д.*

Из нефтезагрязненных почв Башкортостана выделено 168 штаммов микромицетов, обладающих уг-леводородокияляющей активностью. Показана способность роста этих грибов на средах с различными углеводородами.

Мицелиальные грибы (микромицеты) играют важную роль в процессах разложения нефтепродуктов, которые содержатся в сточных водах, почве и т.д. [1]. С другой стороны, как считают Э.З. Коваль, Л.П. Сидоренко [2], нефтепродукты можно рассматривать как своеобразную экологическую нишу, в которой развитие микроорганизмов подчиняется определенным закономерностям, подобно любому биоценозу. На пропитанных нефтепродуктами участках почвы создаются специфические условия, влияние которых на рост грибов проявляется в изменении некоторых морфологических признаков и увеличении плотности популяций независимо от сезона исследования [3].

Первоначально, для определения углеводород-разрушающей способности мицелиальных грибов нами использован метод, предложенный В.И.Билай, Э.З.Коваль [1]. В чашки Петри разливали агаризован-ную минеральную среду, содержащую нефть или нефтепродукты. Затем туда добавляли краситель - бром-фено ловый спиртовой индикатор. После инокуляции грибы ставили в термостат при 22°С. Растущие культуры окрашивали среду за счет выделения продуктов метаболизма (в основном кислоты). Окраска индикатора в среде служила оценкой активности культуры. Кроме того, способность грибов утилизировать углеводороды была проверена на среде Бушнелла-Хааса [3]. Сырую нефть или нефтепродукты добавляли в среду в качестве единственного источника углерода по

0,5 мл в пробирки, содержащие по 20 мл минеральносолевой среды. Пробирки инокулировали конидиями и мицелием грибов, выращенных на скошенной среде, культуры инкубировали месяц при 25°С (3). Дополнительно, в ряде случаев, было проведено определение оксидазной активности культур микромицетов. Известно, что ответственной за процесс деструкции углеводородов является группа ферментов, относящихся к классу оксидаз (4). Общую оксидазную активность оценивали качественно на агаризованной среде Чапека с 1% сахарозы и 0,1% таннина. Согласно, данным Л.К. Михайловой с соавт. [4], слабо- и умеренноактивные грибы характеризуются высокой оксидазной активностью на 3-4-е сутки. У видов грибов, активно растущих на топливах, внеклеточная оксидазная активность незначительна и проявляется только на 7-е сутки роста или же активность не обнаруживается совсем. По мнению авторов, процесс усвоения углеводородов грибами, активными в отношении топлив, происходит внутри клеток.

Способность роста на средах, содержащих нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода, проверяли в основном для доминирующих и типичных комплексов микромицетов различных видов почв [5]. Углеводородусваивающую активность случайных и редких видов не рассматривали. Активность штаммов оценивали визуально, применяя при этом пятибалльную систему, по рекомендации В.И. Билай, Э.З. Коваль [1]. Полученные данные приведены в таблицах 1-3. Как видно из полученных результатов, основное количество штаммов углеводородус-ваивающих грибов относится к родам АврегккШив, РешсПИит, Бивагшт. Согласно данным, полученным В.И. Билай, Э.З. Коваль [1], представители этих трех родов могут в естественных условиях обитания выдерживать конкуренцию при помощи образования ими антибиотиков и токсических веществ. Способность дейтеромицетов усваивать углеводороды была установлена раньше. Чем у остальных мицелиальных грибов [6]. За последнее время количество исследуемых видов значительно увеличивалось и достигает до 400 [1]. Более 50 различных штаммов аспергиллов обладают способностью усваивать нефть или нефтепродукты (табл.1). Наибольшее количество активных штаммов, усваивающих углеводороды, характерны для видов А.шкег и АЛеггеив. Малоактивными являются штаммы, относящиеся к А.гевМсШт, А^епШ, А.герепв.

Из рассмотренных штаммов рода РешсП1шт53 обладают углеводородусваивающей активностью (табл.2). Среди пенициллиев были обнаружены более активные по отношению к различным нефтепродуктам штаммы, чем у аспергиллов. Эти штаммы (Р/ЬгеуюотрасШт, Р.йкиеЮгй, Р.уайаЫе, Реп.вр.) способны усваивать как нефть, так и ее фракции (бензин, дизельное топливо, моторное масло, гудрон).

Известно, что способность усваивать один и более углеводородов является характеристикой штаммов, но не видов [1]. В то же время для штаммов, выделенных из опытно участка, характерно усвоение более широкого набора различных нефтяных фракций, в том числе ароматических.

Виды и штаммы рода Ривагшт, выделенные из нефтезагрязненных почв, обладают способностью к усвоению широкого спектра углеводородов (табл.3). Среди представителей кл.ВеШеготусев, кроме трех вышеназванных родов, углеводородусваивающей активностью в разной степени обладают штаммы и виды р.р. Асгетопшт, СИосМшт, ТйсЬо_егта, вМоврогшт, АНегпайа, 8сори1агюр515, вгарЫит. Представители р. вгарЫит не являются специфическими почвенными грибами (цит.по [1]), но они были выделены в значительном количестве из нефтезагряз-

* Кир е ева Наиля Ахняфовна - доктор биологиче ских наук, проф е ссор каф. биохимии и биот е хнологии. Мифтахова Айсылу Мансафовна - к.б.н. каф. биохимии и биот е хнологии.

Бакаева Маргарита Дмитриевна - аспирант каф. биохимии и биот е хнологии БашГУ

ненной серой лесной почвы (табл.З). В комплексе микромицетов типичными видами кл. Zygomycetes явились р.р. Mortierella, Mucor, Actinomucor, Rhizopus, отдельные штаммы которых обладают средней углеводородусваивающей активностью (табл.З). Они растут, в основном на средах, содержащих нефть или дизельное топливо. Среди сумчатых грибов (кл.Ascomycetes) способностью усваивать как нефть, так и нефтепродукты, обладают штаммы р. Chaetomium и Paecilomyces, причем все штаммы р.Chaetomium, усваивали нефть и дизельное топливо. Как видно, большинство штаммов мицелиальных грибов обладает избирательной способностью в отношении углеводородов, но могут расти на средах с нефтью и нефтепродуктами.

Известно, что свойство расти на углеводородах присуще не всем грибам в одинаковой степени и проявление его зависит от ряда факторов, например, строения углеводородов, способа выделения, культивирования и т.д. [1].

Все рассмотренные штаммы и виды микромицетов, являющиеся доминирующими и типичными представителями комплекса, в той или иной степени способны расти на углеводородах. Кроме того, как было показано в [5], они обладают определенной цел-люлозолитической активностью, которая в ряде случаев, у отдельных штаммов усиливается при загрязнении почвы нефтью. По мнению В.И. Билай, Э.З. Коваль [1], способностью усваивать углеводороды обладают те виды, которые в естественных условиях обитания разлагают и ассимилируют различные

сложные углеводы. Способностью усваивать углеводороды не являются исключительной для отдельных родов и видов мицелиальных грибов, а свойственна им как ассимиляция других источников углерода.

Подтверждением тому, что усвоение углеводородов является физиологической особенностью многих мицелиальных грибов, может служить тот факт, что у некоторых исследуемых штаммов это свойство закреплено филогенетически и проявляется не только в ко-нидиальной стадии, но и в сумчатой (многие штаммы сумчатых аспергиллов, фузариев и т.п.) [1].

Доля углеводородокисляющих микромицетов от общего числа выделенных колоний растет с увеличением срока инкубации. Наиболее резкие изменения этого показателя зафиксированы через год после внесения в почву нефти. Интересно, что наличие такого активного деструктора углеводородов как АЯит1ка1и5 уаг. А1Ьив зафиксировано лишь спустя 6 месяцев после загрязнения почвы нефтью, а к концу 12 месяца эксперимента он становится доминирующим видом. Известно, что через 6 месяцев после внесения нефти в почву разлагается около 50% ее количества [7]. Дальнейшее разложение нефти происходит гораздо медленнее, и связано с развитием микробиоты, способной утилизировать трудноразлагаемые углеводороды. Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что способность микромицетов усваивать углеводороды является важным фактором сукцессии микроскопических грибов в нефтезагрязненной почве.

Таблица 1

Рост видов и штаммов рода Aspergillus на среде с нефтью и нефтепродуктами (через флеш приведены номера

штаммов и их рост в баллах)

Виды Штаммы Нефть Бензин Дизельное топливо Моторное масло Гудрон

A.caespitosus З 2 2 1 -

A.clavatus 1/2/З 4/З/2 1/З/2 2/4/2 5/З/2 5/З/4

A.flavus 1/2/З 4/4/З 1/5/З 2/5/4 5/З/4 5/З/4

A.fumigatus 1/2/З 5/4/4 З/-/5 З/2/5 1/5/- -/5/-

4/5 З/2 2/- 2/- 2/З -/З

A.niger 1/2/З 5/4/4 -/-/5 -/1/5 5/5/2 5/5/-

4/5/6 4/5/З 5/4/4 4/4/4 1/5/З 1/-/-

7/8/9 З/З/З 4/4/2 5/4/2 5/2/1 З/1/1

10/1/12 2/2/2 1/1/2 1/2/1 1/2/1 2/З/1

A.nidulans 1/2/З 4/4/5 З/-/- З/З/- З/З/4 -/З/4

A.oryzae 1/2 4/5 5/4 4/4 2/З 1/З

З/4 4/4 -/2 S 5/З 5/1

A. repens 1/2/З З/2/1 -/-/- З/З/2 1/1/2 -/-/-

A.restrictum 1/2 2/2 -/- 2/2 -/1 -/-

A.sydowii 1/2/З З/4/З 5/-/- 4/-/- -/-/2 -/З/2

A.terreus 1/2/З 4/4/5 З/2/- 4/5/З -/2/5 -/-/5

4/5 5/4 -/2 2/2 4/2 5/2

6/7 З/4 -/- -/- З/4 4/З

A.ustus 4 З 4 2

A.versicolor 1/2 4/4 4/- З/- -/4 -/5

A.wentii З 1 4 1

Таблица 2

Рост видов и штаммов рода Penicillium на среде с нефтью и нефтепродуктами

Виды Штаммы Іаоои Бензин Дизельное топливо Моторное масло Гудрон

Р.Ьіґогте 1/2 4/3 -/- 4/3 3/- -/-

Р.Ьгєуі- 1/2/3 3/2/3 -/-/- 5/4/4 5/3/2 3/2/1

сотрасШт

Р.сапевсепв 1/2/3 5/3/2 -/-/- 5/4/3 4/4/3 4/2/-

4/5 3/3 -/1 3/2 3/1 1/-

Р.савеі 1/2 3/4 -/- 2/1 3/5 4/4

Р.сусіоріит 1/2 4/3 -/- 5/4 4/3 1/-

3/4 3/3 -/- 5/4 3/3 1/1

Р.іипісиїовит 1/2/3 3/2/2 -/2/1 -/1/3 4/4/4 5/4/4

4/5 2/2 -./- 2/- 5/3 4/3

Р.ІапШіпеїїит 1/2 4/4 4/3 4/4 4/3 1/-

Р.їаповит 1/2/3 5/4/4 4/3/2 5/5/5 4/4/3 -/-/-

4/5/6 3/3/2 1/-/- 5/4/4 3/3/2 -/2/1

Р.таПепвіі 1/2 4/3 -/- 4/3 4/4 3/2

Р.рісеит 4 2 4 3

Р.гевМсШт 4 4 4 3

Р.годиеґоПі 5 3 5 4

РЛаМит 4 5 4

Р.уагіаЬїе 1/2 4/4 -/- 5/4 4/3 4/4

3/4 3/3 -/2 4/4 3/3 3/-

Репісіїїіит 1/2 4/4 -/- 2/3 4/5 5/5

уегтісиїаШт

Репісіїїіит ер. 1/2/3 5/5/5 5/5/5 5/4/3 4/3/2 3/2/-

4/5/6 5/5/5 4/3/3 4/5/4 4/5/4 3/4/-

7/8/9 5/4/4 2/-/- 3/4/2 3/4/3 4/5/5

10/11/12 4/4/4 -/1/- 1/1/2 3/4/5 4/4/5

Таблица 3

Рост микромицетов на среде с нефтью и нефтепродуктами

Виды Штам- мы Нефть Бензин Дизельное топливо Моторное масло Гудрон

Асіїпотисог ер. 1 4 4 3

Асіїпотисог 1/2 4/4 -/- 2/1 4/3 4/4

АНепагіа еїеяапв 3 1 2

СЬаеІотіит ер. 1/2/3 3/2/2 4/4/3 5/4/4 -/-/- -/-/-

4/5/6 2/1/1 2/3/3 4/4/3 -/-/- -/-/-

7/8/9 1/1/1 2/1/1 3/3/3 -/1/- -/-/-

10/11 -/- 1/1 2/2 1/- -/-

12/13 -/- -/- 2/1 -/- -/-

СМоврогіит сїа_о5рогіоі_е5 2 3

Сїа_о5рогіит ер. 1/2/3 4/5 3/3/2 2/2 5/4/4 3/3 3/4/2 3/1 -/-/- -/- -/-/- -/-

Бивагіит 1/2/3 4/4/4 1/-/- 4/4/4 3/3/3 -/-/1

топіїіґогте

4/5/6 3/3/3 -/1/1 4/4/4 3/2/1 -/-/-

Бивагіит 1/2/3 4/3/3 4/4/4 5/4/4 -/3/3 -/3/3

охуврогит 4/5 3/2 2/1 4/4 2/1 3/1

Бивагіит ер. 1/2/3 4/4/3 -/-/1 4/4/4 3/3/2 -/-/-

4/5/6 3/3/3 -/-/1 3/3/3 3/2/2 -/1/-

7/8 2/2 -/- 3/3 2/1 -/-

Мисог ер. 1/2 2/2 3/3 -/1 -/- -/-

3/4 3/3 4/5 2/3 -/- -/-

Раесіїотусев ер. 1/2 2/2 1/- 4/3 1/1 -/-

Rhizopus nigricans 1/2/3 2/2/2 -/-/- 2/2/1 2/1/2 -/-/-

Rhizopus sp. 1/2/3 3/3/2 -/-/- 3/2/3 1/-/- -/-/-

4/5/6 2/2/2 -/-/- 2/1/1 -/-/- -/-/-

Scopulariopsis 3 2 3 1

communis

Trichoderma sp. 1/2/3 5/5/4 4/5/4 3/4/4 -/-/- -/-/-

4/5/6 4/4/3 4/3/3 3/3/3 -/-/- -/-/-

T.viride 1/2/3 4/4/3 5/4/4 4/4/4 -/-/- -/-/-

4/5 3/3 4/3 3/3 -/- -/-

ЛИТЕРАТУРА

1.Билай В.И., Коваль Э.З. Рост грибов на углеводородах нефти. Киев:Наукова думка. 1980.254с.

2.Коваль Э.З., Сидоренко Л.П. Микродеструкторы промышленных материалов. Киев:Наукова думка.1989.192с.

3.Llanos С., Kjoller A., Changens in the flora of soil fungi following oil waste application //Oikos. 1976.N27. P.377-382.

4.Михайлова Л.К., Лаптева E.A., Скрибачилин В.Б., Прохоров В.П. Микромицеты нефтяных топлив//Микология и фитапатология.1986. Т.20.№6. С.461-466.

5.Киреева Н.А., Водопьянов В.В., Мифтахова А.М. Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Уфа:Гилем.2001.376с.

6.Бирштехер Э. Нефтяная микробиология. Л. :Гостоптехиздат. 1957.314с.

7.Киреева Н.А., Галимзянова Н.Ф., Мифтахова А.М. Микромицеты почв, загрязненных нефтью, и их фитотоксичность //Микология и фитопатология. 2000. №1. С.36-41.

Поступила в редакцию 26.01.04 г.