СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ КОМПЛЕКСА MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
METHOD AND KIT FOR IMMUNOLOGICAL DETECTION OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX

Область техники
[0001]
Настоящее изобретение относится к высокобезопасным способу и набору для иммунологической детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, которую можно удобно и быстро осуществлять непосредственно для биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, без операции культивирования, посредством термической обработки биологического образца при предопределенной температуре и иммунологической детекции специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка, таким образом секретированного во внеклеточное пространство.
Уровень техники
[0002]
Туберкулез в настоящее время является инфекционным заболеванием высокой важности, которое, по сообщениям, приводит к смерти тысяч человек в Японии и миллионов человек по всему миру ежегодно. В Японии лицо, у которого подозревают наличие туберкулезной инфекции, должно быть госпитализировано в соответствии с Законодательством об Инфекционных заболеваниях. Терапевт должен немедленно сообщать уполномоченному органу при постановке пациенту диагноза туберкулез, и, таким образом, необходимы безотлагательные ответные действия.
[0003]
Mycobacterium tuberculosis (человеческий тип туберкулезной бактерии), Mycobacterium bovis (бычий тип туберкулезной бактерии), Mycobacterium microti (мышиный тип туберкулезной бактерии) и Mycobacterium africanum (африканский тип туберкулезной бактерии), принадлежащие к комплексу Mycobacterium tuberculosis, известны как кислотоустойчивые бактерии, патогенные для человека. Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium marinum и подобные известны как нетуберкулезные микобактерии.
[0004]
Инфекция человека комплексом Mycobacterium tuberculosis в основном вызвана Mycobacterium tuberculosis и, в некоторых редких случаях, Mycobacterium bovis. Число случаев инфекции Mycobacterium avium, среди нетуберкулезных микобактерий, увеличилось в последние годы. Поскольку обе эти инфекции проявляют сходные клинические симптомы, идентификация микроорганизма-возбудителя также является важной для определения курсов лечения.
[0005]
Таким образом, дифференциальная детекция туберкулезной инфекции или нетуберкулезной микобактериальной инфекции является также важной для снижения нагрузки на пациентов и соответствующего проведения раннего лечения. В другом аспекте дифференциальная детекция является также важной для цели предотвращения получения третьим лицом вторичной инфекции с точки зрения общественного здравоохранения.
[0006]
До настоящего времени способы детекции на основе культивирования осуществляли на практике в качестве способов детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis. Такие способы культивации осуществляют посредством инокуляции биологического образца, подлежащего тестированию, либо в жидкую среду, либо на твердую среду и детекции выросших бактериальных клеток. Способ с использованием жидкой среды обладает высоким риском вторичной инфекции в ходе манипуляций и, таким образом, требует высокобезопасных отделения и аппаратуры, хотя этот способ может сокращать период культивирования биологического образца, подлежащего тестированию. Способ с использованием твердой среды требует периода, настолько длительного, как приблизительно 2 месяца, для получения результатов детекции. Комплекс Mycobacterium tuberculosis необходимо культивировать с использованием высокобезопасной аппаратуры в высокобезопасном окружении с большими предосторожностями, предпринятыми для предотвращения вторичной инфекции.
[0007]
В качестве способа идентификации комплекса Mycobacterium tuberculosis из культуры вышеупомянутого культивированного биологического образца известен удобный способ детекции, включающий в себя иммунологический анализ специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка, секретированного в среду.
[0008]
В находящемся в открытом доступе патенте Японии №11-108931 описан способ детекции присутствия комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающий в себя: инокуляцию биологического образца, полученного от пациента с туберкулезом, в твердую среду или в жидкую среду; культивирование комплекса Mycobacterium tuberculosis в течение от нескольких суток до нескольких недель; и затем иммунологическую детекцию специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64, секретированного в среду. В соответствии с этой ссылкой, этот способ позволяет идентификацию и детекцию комплекса Mycobacterium tuberculosis немедленно после культивирования и снижает риск вторичной инфекции в ходе манипуляции по сравнению с общепринятыми способами.
[0009]
Этот способ, однако, включает культивирование комплекса Mycobacterium tuberculosis, содержащегося в биологическом образце, и использование полученных культур в качестве образца. Таким образом, способ требует почти того же количества времени, как период культивирования, до детекции и идентификации комплекса Mycobacterium tuberculosis и, таким образом, является необычайно трудоемким и дорогостоящим.
[0010]
Как описано в находящемся в открытом доступе патенте Японии №11-108931, MPB64 представляет собой специфический для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторный белок, продуцируемый Mycobacterium bovis BCG (M. bovis BCG) и секретируемый во внеклеточное пространство. MPT64 представляет собой специфический для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторный белок, продуцируемый Mycobacterium tuberculosis и секретируемый во внеклеточное пространство. MPB64 и MPT64 известны как идентичные вещества.
[0011]
В находящемся в открытом доступе патенте Японии №2002-62299 описано, что специфический для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторный белок MPT64 можно детектировать посредством иммунологического анализа без культивирования комплекса Mycobacterium tuberculosis, содержащегося в биологическом образце. Этот способ включает в себя обработку биологического образца, такого как мокрота, и детекцию MPT64, содержащегося в биологическом образце, так что детектируют присутствие комплекса Mycobacterium tuberculosis.
[0012]
Однако, даже если комплекс Mycobacterium tuberculosis присутствует в биологическом образце, этот способ неспособен детектировать комплекс Mycobacterium tuberculosis, пока MPB64 не секретируется во внеклеточное пространство комплексом Mycobacterium tuberculosis и не будет содержаться в биологическом образце. Кроме того, небольшое количество MPT64, хотя и секретируется, требует большого количества биологического образца и затрудняет манипуляции. Это налагает увеличенную нагрузку на тестируемых субъектов и лиц, ответственных за тесты. В то же самое время, инфекция комплексом Mycobacterium tuberculosis может быть пропущена, что приводит к проблемам общественного здравоохранения.
[0013]
В международной публикации № WO 2009/084481 описан способ более быстрой и более безопасной, чем когда-либо, диагностики туберкулезной инфекции с более высокой точностью, включающий специфическую детекцию MPB64 в биологическом образце с использованием антитела против конкретного эпитопа в MPB64. По этому способу, подходящий образец может представлять собой культуры, полученные культивированием биологического образца с использованием небольшого количества жидкой среды только в течение времени до того, как бактериальные клетки комплекса Mycobacterium tuberculosis по существу начинают расти.
[0014]
Этот способ, однако, все еще требует способа стимуляции секреции MPB64 из бактериальных клеток до роста, так что большее количество MPB64 накапливается в среде.
Общепринятые технические документы
Патентные документы
[0015]
Патентный документ 1: находящийся в открытом доступе патент Японии №11-108931
Патентный документ 2: находящийся в открытом доступе патент Японии №2002-62299
Патентный документ 3: Международная публикация № WO 2009/084481
Краткое изложение сущности изобретения
Проблемы, подлежащие решению посредством изобретения
[0016]
Как описано выше, обычные способы требуют длительного времени для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, а также являются необычайно трудоемкими и дорогостоящими. По этим причинам окончательный диагноз и раннее начало лечения невозможно осуществлять для туберкулеза. Таким образом, существовала необходимость более быстрого способа. Также, непосредственную детекцию в биологическом образце невозможно осуществлять, если биологический образец не содержит MPT64 или содержит очень малое количество MPT64. В результате инфекция комплексом Mycobacterium tuberculosis может быть пропущена. Таким образом, существовала необходимость более надежного способа детекции. Целью настоящего изобретения является решение этих проблем посредством предоставления удобного, быстрого и более надежного способа детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis.
Средства для решения проблем
[0017]
Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования для решения вышеуказанных проблем и вследствие этого обнаружили, что проблемы можно решить термической обработкой биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, так, чтобы секретировать во внеклеточное пространство специфический для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторный белок, такой как MPB64, и детектировать таким образом секретированный белок, и в результате настоящее изобретение завершено.
[0018]
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение относится к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающему в себя подвергание специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка иммунологическому анализу, где внеклеточную секрецию указанного белка осуществляют посредством подвергания биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, термической обработке. В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение также относится к набору для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, содержащему по меньшей мере контейнер для обработки, в котором биологический образец, содержащий комплекс Mycobacterium tuberculosis, подвергают термической обработке, и устройство для иммунологического анализа для детекции специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка, секретированного посредством термической обработки, в качестве набора для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis для цели осуществления вышеуказанного способа. Набор может дополнительно содержать средство для обработки образца и/или растворитель. Способ и набор для детекции по настоящему изобретению являются способными быстро и удобно детектировать комплекс Mycobacterium tuberculosis. В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение также относится к способу внеклеточной секреции специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка, включающему в себя подвергание биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, термической обработке.
Краткое описание фигур
[0019]
Фиг. 1 представляет собой график, показывающий связь между температурой термической обработки и эффектом стимуляции внеклеточной секреции MPB64 при использовании бактериальных клеток M. bovis BCG штамма Токио.
Фиг. 2 представляет собой график, показывающий связь между временем термической обработки и эффектом стимуляции внеклеточной секреции MPB64 при использовании бактериальных клеток M. bovis BCG штамма Токио.
Описание вариантов осуществления
[0020]
Биологический образец, используемый по настоящему изобретению, не является конкретно ограниченным при условии, что биологический образец может содержать комплекс Mycobacterium tuberculosis. Примеры биологического образца включают в себя мокроту, плевральный выпот, секрет бронхов, желудочный сок, кровь, спинномозговую жидкость, мочу и фекалии. Предпочтительно, используют мокроту из-за высокой концентрации бактерий в ней. Альтернативно, бронхиальные смывы, собранные при проведении исследования органов дыхания, ткань, собранную из бронхов или легкого, или т.п. можно использовать в качестве биологического образца. Каждый из этих биологических образцов можно использовать отдельно или их можно использовать в форме смеси двух или более из них.
[0021]
Термическую обработку биологического образца предпочтительно проводят посредством помещения биологического образца в контейнер, который можно закрывать герметично, и затем подвергания контейнера в целом термической обработке, поскольку биологический образец, подлежащий обработке, содержит высокоинфекционный комплекс Mycobacterium tuberculosis. Операцию термической обработки предпочтительно проводят внутри ламинарного бокса для обеспечения безопасности оператора. Контейнер для использования для термической обработки не является конкретно ограниченным при условии, что контейнер может сохранять свое герметично закрытое состояние и может выдерживать предопределенную температуру нагревания. Контейнер можно подходящим образом выбирать в соответствии с биологическим образцом, подлежащим обработке. Контейнер может быть оборудован, при его открывании, наконечником-капельницей с фильтром так, чтобы облегчать отбор обработанного таким образом биологического образца из контейнера для иммунологического анализа. Использование наконечника-капельницы с фильтром является предпочтительным, поскольку наконечник-капельница с фильтром может удалять твердые вещества, такие как денатурированные компоненты, содержащиеся в обработанном биологическом образце, и, кроме того, может удобным образом помещать капли полученного биологического образца в устройство для иммунологического анализа.
[0022]
Биологический образец можно подвергать обработке, такой как лизис, с помощью средства для обработки образцов, в соответствии с его свойствами, до термической обработки. Например, когда мокроту используют в качестве образца, ее можно лизировать с помощью щелочного вещества, восстанавливающего вещества, протеазы, сахара, поверхностно-активного вещества, денатурирующего белок вещества или т.п., которые снижают вязкость мокроты, чтобы улучшать эффективность термической обработки. В частности, обработка с использованием гидроксида натрия в качестве щелочного вещества и N-ацетил-L-цистеина в качестве восстанавливающего вещества в комбинации является удобной, и ее предпочтительно используют.
[0023]
В соответствии с другим вариантом осуществления биологический образец можно диспергировать или растворять в растворителе и затем подвергать термической обработке. Растворитель может представлять собой, например, любой растворитель, который может сохранять комплекс Mycobacterium tuberculosis, содержащийся в биологическом образце, живым. Можно использовать буферный раствор, такой как фосфатно-солевой буфер, или жидкую среду для использования в выделенной культуре кислотоустойчивых бактерий, такую как среда Миддлбрука 7H9. Особенно предпочтительно использовать жидкую среду, поскольку необходимо осуществлять внеклеточную секрецию белка посредством термической обработки без нарушения активности комплекса Mycobacterium tuberculosis и поскольку обработанный таким образом образец можно непосредственно подвергать иммунологическому анализу. Альтернативно, биологический образец, лизированный с помощью средства для обработки образцов, можно повторно диспергировать в растворителе.
[0024]
Температура нагревания для биологического образца может представлять собой любую температуру, при которой можно осуществлять внеклеточную секрецию белка в биологический образец или растворитель посредством комплекса Mycobacterium tuberculosis, и она предпочтительно лежит в диапазоне 40-60°C, более предпочтительно в диапазоне 40-55°C. В частности, температура, которая эффективно стимулирует секрецию, лежит в диапазоне 45-50°C.
[0025]
Время обработки для биологического образца может представлять собой время, которое является достаточным для внеклеточной секреции поддающегося детекции количества специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка, в то время как температуру обработки поддерживают в пределах вышеуказанного диапазона. Время обработки составляет предпочтительно 15 минут или дольше, более предпочтительно 15 минут или дольше и 2,5 часа или короче, более предпочтительно 15 минут или дольше и 1,5 часа или короче, наиболее предпочтительно 30 минут или дольше и 1 час или короче.
[0026]
Образец, таким образом подвергнутый термической обработке, можно подвергать обработке для инактивации комплекса Mycobacterium tuberculosis просто посредством повышения температуры нагревания. Температура обработки для инактивации комплекса Mycobacterium tuberculosis не является конкретно ограниченной, но она составляет предпочтительно 100°C. Инактивация комплекса Mycobacterium tuberculosis, содержащегося в образце, позволяет безопасное проведение иммунологического анализа без риска вторичной инфекции.
[0027]
Нагревательное устройство для использования для термической обработки не является конкретно ограниченным при условии, что устройство является способным поддерживать постоянную температуру. Можно использовать термостатирующую баню, нагревательный блок, инкубатор или т.п. Небольшое нагревательное устройство является особенно предпочтительным, поскольку все процедуры для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis можно выполнять внутри ламинарного бокса.
[0028]
В соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять внеклеточную секрецию специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis белка посредством термической обработки биологического образца. Присутствие комплекса Mycobacterium tuberculosis можно таким образом легко детектировать посредством иммунологического анализа или т.п. с использованием обработанного таким образом биологического образца.
[0029]
По настоящему изобретению специфический для комплекса Mycobacterium tuberculosis белок, подлежащий внеклеточной секреции, не является конкретно ограниченным при условии, что происходит внеклеточная секреция белка. Примеры белка, секретируемого во внеклеточное пространство комплексом Mycobacterium tuberculosis, включают в себя множество белков, таких как MPT64, MPB64, MPB70, ESAT-6 и CFP-10. Из этих белков белок, секретируемый во внеклеточное пространство в большом количестве за короткое время, является предпочтительным в качестве белка, используемого как показатель для указания на присутствие комплекса Mycobacterium tuberculosis в иммунологическом анализе, используемом по настоящему изобретению. Например, MPB64, т.е. MPT64, секретируют или высвобождают во внеклеточное пространство в большом количестве посредством термической обработки биологического образца в соответствии с настоящим изобретением без культивирования, т.е. до того, как бактериальные клетки начинают расти. С такой точки зрения MPB64, т.е. MPT64, предпочтительно используют в качестве мишени для детекции присутствия комплекса Mycobacterium tuberculosis. Секретируемый во внеклеточное пространство MPB64, т.е. MPT64, можно подвергать иммунологическому анализу так, чтобы определять присутствие или отсутствие комплекса Mycobacterium tuberculosis.
[0030]
В способе детекции по настоящему изобретению иммунологический анализ не является конкретно ограниченным и предпочтительно представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием первого антитела и второго антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка, в частности, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) или иммунохроматографический анализ. Первое антитело и второе антитело могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга при условии, что они позволяют детекцию специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка.
[0031]
Этот иммунологический анализ может представлять собой любой способ, способный к иммунологической детекции MPB64, секретированного во внеклеточное пространство посредством термической обработки биологического образца, и предпочтительно представляет собой иммунохроматографический анализ, особенно предпочтительно, иммунохроматографический анализ с использованием моноклонального антитела против MPB64. Иммунохроматографический анализ для детекции MPB64 можно легко осуществлять в соответствии со способом, описанным в находящемся в открытом доступе патенте Японии №11-108931. Кроме того, можно использовать Capilia ТВ (изготовленный TAUNS Laboratories, Inc.), коммерчески доступное устройство для иммунохроматографического анализа для детекции MPB64, т.е. MPT64.
Примеры
[0032]
Настоящее изобретение более конкретно описано посредством примеров ниже. Однако эти примеры не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
[0033]
Эталонный пример 1 (Получение раствора бактерий для тестирования)
4,7 г основной среды Миддлбрука 7H9 (изготовленной Difco Laboratories Inc.) растворяли в 900 мл дистиллированной воды, содержащей 0,5 г Твин 80. Раствор стерилизовали в автоклаве при высоком давлении при 121°C в течение 10 минут. После охлаждения к этому в стерильных условиях добавляли 100 мл добавки ADC (альбумин-декстроза-каталаза) для получения жидкой среды Миддлбрука 7H9.
M. bovis BCG штамм Токио (далее в настоящем документе обозначаемый как штамм BCG) инокулировали в вышеописанную жидкую среду и культивировали в соответствии со стандартным способом. Культивирование продолжали до получения мутности, соответствующей №1 по стандарту Макфарланда. Полученный раствор бактерий центрифугировали для выделения бактериальных клеток. Выделенные бактериальные клетки ресуспендировали посредством добавления вышеупомянутой жидкой среды Миддлбрука 7H9 и затем дополнительно центрифугировали для выделения бактериальных клеток. Эту операцию повторяли три раза. Бактериальные клетки промывали для удаления секреторных белков комплекса Mycobacterium tuberculosis, прикрепленных к бактериальным клеткам. 100 мкл супернатанта после операции промывки наносили в Capilia ТВ (изготовленный TAUNS Laboratories, Inc.), устройство для иммунохроматографического анализа для детекции MPB64. В результате показана отрицательность для этого продукта, чтобы подтвердить, что секретированный MPB64 отсутствовал в супернатанте.
[0034]
Пример 1 (Исследование оптимальных условий для температуры термической обработки)
7
6
5
Оптическую плотность раствора бактерий, обладающего мутностью, соответствующей №1 по стандарту Макфарланда, полученного в эталонном примере 1, доводили до O.D. 0,1 при поглощении при 530 нм для получения раствора бактерий для тестирования (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ). Раствор бактерий для тестирования далее разводили жидкой средой для получения разведенного в 10 раз раствора бактерий (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ) и разведенного в 100 раз раствора бактерий (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ). По 200 мкл каждого полученного раствора бактерий распределяли в каждую пластиковую пробирку (пробирку для амплификации нуклеиновой кислоты) и подвергали термической обработке с использованием термоблока с контролируемой температурой для устройства для амплификации нуклеиновой кислоты. Температуру нагревания устанавливали на температуры, различающиеся на 5°C, от 35°C до 75°C. Термическую обработку проводили в течение 30 минут. Образцы, подвергнутые термической обработке при обычной температуре культивирования 35°C, использовали в качестве контроля. Аликвоту 100 мкл отбирали из каждого образца, обработанного таким образом, и наносили в Capilia ТВ (изготовленный TAUNS Laboratories, Inc.) таким же образом, как в эталонном примере 1, для детекции присутствия MPB64. Оптическую плотность в области считывания измеряли с использованием иммунохроматографического считывателя (изготовленного Otsuka Electronics Co., Ltd.).
[0035]
7
6
5
Результаты показаны на фиг. 1. На фиг. 1 ордината представляет собой значение измерения интенсивности окраски (оптической плотности) в Capilia ТВ (изготовленном в TAUNS Laboratories, Inc.), и абсцисса представляет собой температуру нагревания. Связь между оптической плотностью и температурой обработки показана сплошной линией для результатов для раствора бактерий для тестирования (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ), пунктирной линией для результатов для разведенного в 10 раз раствора бактерий (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ) и удлиненной пунктирной линией для результатов для разведенного в 100 раз раствора бактерий (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ).
Как видно из результатов, для всех из тестированных образцов показано повышение оптической плотности при 40-60°C, в частности, заметное повышение при 45-50°C. Это показывает, что термическая обработка бактериальных клеток стимулирует их секрецию MPB64 во внеклеточное пространство. Для контроля, обработанного в обычных условиях культивирования при 35°C, не показано повышения оптической плотности, что показывает, что только поддержание образца при комнатной температуре или в эквивалентных ей условиях не вызывает внеклеточной секреции MPB64. С другой стороны, не подтверждено повышения оптической плотности в диапазоне температур выше, чем диапазон температур от 40°C до 60°C, в котором подтверждена секреция MPB64. Это показало, что MPB64 не секретируется в диапазоне температур, равных или превышающих 60°C.
Соответственно, по этим результатам подтверждено, что термическая обработка образца бактерий при 40-60°C, в частности, при 45-50°C, заметно стимулирует внеклеточную секрецию MPB64 и заметно увеличивает частоту детекции иммунологического анализа.
[0036]
Пример 2 (Исследование оптимальных условий для температуры термической обработки)
7
Оптическую плотность раствора бактерий, обладающего мутностью, соответствующей №1 по стандарту Макфарланда, полученного в эталонном примере 1, доводили до O.D. 0,1 при поглощении при 530 нм для получения раствора бактерий для тестирования (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ). По 200 мкл полученного раствора бактерий распределяли в каждую пластиковую пробирку (пробирку для амплификации нуклеиновой кислоты) и подвергали термической обработке с использованием термоблока с контролируемой температурой для устройства для амплификации нуклеиновой кислоты. Температуру нагревания устанавливали на 35°C, 13 температур, различающихся на 2°C от 40°C до 64°C, и 2 температуры 70°C и 80°C в качестве диапазона высоких температур. Термическую обработку проводили в течение 60 минут. Образцы, подвергнутые термической обработке при обычной температуре культивирования 35°C, использовали в качестве контроля. Аликвоту 100 мкл отбирали из каждого образца, обработанного таким образом, и наносили в Capilia ТВ (изготовленный TAUNS Laboratories, Inc.) таким же образом, как в эталонном примере 1, для детекции присутствия MPB64. Оценку осуществляли посредством визуального наблюдения интенсивности окраски метящего вещества, накопленной в области считывания. Интенсивность окраски оценивали визуально как степень пурпурной окраски на основании 5 степеней: - (отсутствие окрашивания), ± (слабое окрашивание), + (явное окрашивание), ++ (более явное окрашивание) и +++ (значительное окрашивание). Результаты оценки показаны в таблице 1.
[0037]
Таблица 1
Температура обработки
Оценка
35°C (контроль)
-
40°C
±
42°C
+
44°C
+
46°C
++
48°C
+++
50°C
+++
52°C
++
54°C
+
56°C
+
58°C
+
60°C
±
62°C
-
64°C
-
70°C
-
80°C
-
[0038]
Как видно из результатов таблицы 1, повышение интенсивности окраски показано при 40-60°C, и особенно заметное повышение подтверждено при 44-52°C. Это показывает, что термическая обработка бактериальных клеток стимулирует их секрецию MPB64 во внеклеточное пространство, как в примере 1. Для контроля, обработанного в обычных условиях культивирования при 35°C, не показано повышения оптической плотности, что показывает, что только поддержание образца при комнатной температуре или в эквивалентных ей условиях не вызывает внеклеточной секреции MPB64. С другой стороны, не подтверждено повышения оптической плотности при температурах, равных или превышающих 62°C, или в диапазоне высоких температур 70°C и 80°C. Это показало, что MPB64 не секретируется в диапазоне температур, равных или превышающих 60°C.
Соответственно, по этим результатам подтверждено, что термическая обработка образца бактерий при 40-60°C, в частности, при 45-50°C, заметно стимулирует внеклеточную секрецию MPB64 и заметно увеличивает частоту детекции иммунологического анализа.
[0039]
Пример 3 (Исследование оптимальных условий для времени термической обработки)
7
Оптическую плотность раствора бактерий, обладающего мутностью, соответствующей №1 по стандарту Макфарланда, полученного в эталонном примере 1, доводили до O.D. 0,1 при поглощении при 530 нм для получения раствора бактерий для тестирования (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ). По 200 мкл полученного раствора бактерий распределяли в каждую пластиковую пробирку и подвергали термической обработке с использованием термоблока с контролируемой температурой для устройства для амплификации нуклеиновой кислоты. Операцию нагревания проводили при температуре нагревания, установленной на температуры, различающиеся на 5°C, от 35°C до 75°C. Время обработки устанавливали на 0 минут, 15 минут, 30 минут и 60 минут. Аликвоту 100 мкл отбирали из каждого образца, обработанного таким образом, и наносили в Capilia ТВ (изготовленный TAUNS Laboratories, Inc.) таким же образом, как в примере 1. Оптическую плотность в области считывания измеряли с использованием иммунохроматографического считывателя (изготовленного Otsuka Electronics Co., Ltd.).
[0040]
Результаты показаны на фиг. 2. На фиг. 2 ордината представляет собой значение измерения интенсивности окраски (оптической плотности) в Capilia ТВ (изготовленном в TAUNS Laboratories, Inc.), и абсцисса представляет собой температуру нагревания. Связь между оптической плотностью и температурой обработки показана пунктирной линией для результатов для образцов, обработанных в течение времени обработки 15 минут, сплошной линией для результатов для образцов, обработанных в течение времени обработки 30 минут, и удлиненной пунктирной линией для результатов для образцов, обработанных в течение времени обработки 60 минут.
Как видно из результатов, для всех из образцов, обработанных в течение времени обработки 15 минут, 30 минут и 60 минут, показано заметное повышение оптической плотности при температуре 45-50°C. Не обнаружено различий между периодами времени обработки. Даже для образцов, обработанных в течение времени обработки 60 минут, не подтверждено больших отличий от других образцов. Соответственно, подтверждено, что время термической обработки по меньшей мере 15 минут оказывает эффект стимуляции внеклеточной секреции MPB64.
[0041]
Пример 4 (Исследование оптимальных условий для времени термической обработки)
6
Оптическую плотность раствора бактерий, обладающего мутностью, соответствующей №1 по стандарту Макфарланда, полученного в эталонном примере 1, доводили до O.D. 0,01 при поглощении при 530 нм для получения раствора бактерий для тестирования (количество бактерий: соответствующее 10 КОЕ). По 200 мкл полученного раствора бактерий распределяли в каждую пластиковую пробирку и подвергали термической обработке при 50°C с использованием термоблока с контролируемой температурой для устройства для амплификации нуклеиновой кислоты. Термическую обработку проводили с временем обработки, установленным на 0 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 60 минут, 75 минут, 120 минут и 150 минут. В качестве контроля такой же раствор бактерий, подлежащий тестированию, как выше, оставляли при комнатной температуре без термической обработки. Аликвоту 100 мкл отбирали из каждого образца, обработанного таким образом, и наносили в Capilia ТВ (изготовленный TAUNS Laboratories, Inc.) таким же образом, как в примере 1. Интенсивность окраски накопленного метящего вещества наблюдали визуально. Интенсивность окраски оценивали визуально как степень пурпурной окраски на основании 5 степеней: - (отсутствие окрашивания), ± (слабое окрашивание), + (явное окрашивание), ++ (более явное окрашивание) и +++ (значительное окрашивание). Результаты оценки показаны в таблице 2.
[0042]
Таблица 2
Термическая обработка при 50°C
Контроль (без термической обработки)
Оценка
Оценка
0 мин
-
-
15 мин
+
-
30 мин
+
-
45 мин
++
-
60 мин
+++
-
75 мин
+++
-
120 мин
+++
-
150 мин
+++
-
[0043]
Как видно из результатов таблицы 2, для не подвергнутого термической обработке контрольного образца и образца, обработанного в течение времени нагревания 0 минут, подтверждено отсутствие развития окраски в области считывания. Подтверждено, что термическая обработка в течение 15 минут приводит к окрашиванию, полученному от внеклеточной секреции MPB64. Для образца, подвергнутого термической обработке в течение 60 минут, подтвердили заметное развитие окраски. Для образцов, подвергнутых термической обработке в течение вплоть до 150 минут, не показано дальнейшего повышения интенсивности окраски и подтверждено заметное развитие окраски на том же уровне, что и в образце, подвергнутом термической обработке в течение 60 минут. По этим результатам подтверждено, что термическая обработка в течение по меньшей мере 15 минут оказывает эффект на стимуляцию внеклеточной секреции MPB64, которая достигает максимума за 60 минут.
[0044]
Пример 5 (Исследование растворителя)
7
6
5
Из раствора бактерий, обладающего мутностью, соответствующей №1 по стандарту Макфарланда, полученного в эталонном примере 1, получали растворы бактерий, обладающие количеством бактерий, соответствующим 10 КОЕ, 10 КОЕ или 10 КОЕ, с использованием содержащего Твин 80 фосфатного буферного раствора или жидкой среды Миддлбрука 7H9 в качестве растворителя для обработки биологических образцов для получения тестируемых образцов. По 200 мкл каждого тестируемого образца распределяли в каждую пластиковую пробирку. Затем образец подвергали термической обработке при 50°C в течение 30 минут в термоблоке. Затем аликвоту 100 мкл отбирали из образца, обработанного таким образом, и наносили в Capilia ТВ (изготовленный TAUNS Laboratories, Inc.) таким же образом, как в примере 1, с последующей оценкой. Оценку проводили посредством визуального наблюдения интенсивности окраски метящего вещества, накопленного в области считывания. Интенсивность окраски оценивали визуально как степень пурпурной окраски на основании 5 степеней: - (отсутствие окрашивания), ± (слабое окрашивание), + (явное окрашивание), ++ (более явное окрашивание) и +++ (значительное окрашивание). Результаты оценки показаны в таблице 3.
[0045]
Таблица 3
Растворитель
Содержащий Твин 80 фосфатный буферный раствор
Жидкая среда Миддлбрука 7H9
Тестируемый образец (концентрация бактерий)
Соответствующая 10<sup>5</sup> КОЕ
+
++
Соответствующая 10<sup>6</sup> КОЕ
++
+++
Соответствующая 10<sup>7</sup> КОЕ
+++
+++
[0046]
Как очевидно из результатов в таблице 3, секретированный во внеклеточное пространство MPB64 можно детектировать в обоих случаях, когда содержащий Твин 80 фосфатный буферный раствор используют в качестве растворителя и когда жидкую среду Миддлбрука 7H9 используют в качестве растворителя. Таким образом, не подтверждено различий в иммунологическом анализе для вариантов состава растворителя.
[0047]
Пример 6 (Детекция в образце мокроты)
7
Раствор бактерий, обладающий мутностью, соответствующей №1 по стандарту Макфарланда, полученный в эталонном примере 1, добавляли к мокроте, как подтверждено, являющейся отрицательной по туберкулезной инфекции, для получения псевдоположительного образца мокроты, соответствующего 10 КОЕ. Этот образец распределяли в пластиковые пробирки. К каждому из этих образцов мокроты N-ацетил-L-цистеин и водный раствор гидроксида натрия добавляли в равных количествах, и смесь оставляли стоять при комнатной температуре в течение 15 минут для лизиса образца. Затем образец подвергали термической обработке при 50°C в течение 30 минут с использованием термоблока. Затем аликвоту 100 мкл отбирали из образца, обработанного таким образом, и наносили в Capilia ТВ (изготовленный TAUNS Laboratories, Inc.) таким же образом, как в примере 1, с последующей оценкой. Контрольные образцы мокроты обрабатывали таким же образом, как выше, за исключением того, что их оставляли стоять при комнатной температуре в течение 30 минут без термической обработки, с последующей оценкой. Оценку проводили посредством визуального наблюдения интенсивности окраски метящего вещества, накопленного в области считывания. Интенсивность окраски оценивали визуально как степень пурпурной окраски на основании 5 степеней: - (отсутствие окрашивания), ± (слабое окрашивание), + (явное окрашивание), ++ (более явное окрашивание) и +++ (значительное окрашивание). Результаты оценки показаны в таблице 4.
[0048]
Таблица 4
Без термической обработки
Термическая обработка при 50°C
Образец <1>
-
+
Образец <2>
-
+
Образец <3>
от - до ±
++
Образец <4>
-
+
[0049]
В результате, для подвергнутых термической обработке образцов подтвердили развитие явного окрашивания в области считывания, показывающего присутствие MPB64 в образцах. В отличие от этого, контрольные образцы явно отличались от подвергнутых термической обработке образцов, хотя для некоторых образцов показано слабое окрашивание в области считывания. Соответственно, подтверждено, что термическая обработка стимулирует секрецию MPB64 даже в образце мокроты, что показывает, что комплекс Mycobacterium tuberculosis можно детектировать быстро и удобно в биологическом образце.
Промышленная применимость
[0050]
Настоящее изобретение относится к способу детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, который можно удобно и быстро осуществлять непосредственно для биологического образца, содержащего комплекс Mycobacterium tuberculosis, без операции культивирования, посредством термической обработки биологического образца при предопределенной температуре и иммунологического анализа специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка, таким образом секретированного во внеклеточное пространство, и также относится к предназначенному для этого набору. Настоящее изобретение является пригодным не только для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, но также для соответствующей диагностики и лечения туберкулеза.