ПРОИЗВОДНОЕ АЛЬГИНОВОЙ КИСЛОТЫ
ALGINIC ACID DERIVATIVE

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в фармакологии, фармации и биотехнологии.
Альгиновая кислота, полученна из морской водоросли Laminaria Saccharina, произрастающей в Белом море. Альгинаты представляют собой семейство неразветвленных двойных сополимеров-остатков D-маннуроновой кислоты (М) и L-глюкуроновой кислоты (G), соединенных 1-4 гликозидной связью которая представлена на фигуре 1. Относительное количество двух мономеров уроновой и маннуроновой кислот, последовательность их расположения в полимерной цепи широко варьирует в зависимости от природы альгината. Молекулярная масса природной альгиновой кислоты варьируются от 35-500 кДа.
В настоящее время существует несколько направлений использования солей альгиновой кислоты в медицине. Основное из них - это репаранты на основе солей альгиновой кислоты (альгипор, альгимаф, гевискон, альгинатол).
Альгипор (рег. № Р N 003535/01) 1 г лиофилизированного геля содержит альгината натрия 0,7276 г, глюконата кальция 0,2374 г и фурацилина 0,035 г; в пористых листах толщиной 5-10 мм размером 135×250, 150×160, 60×100 и 40×50 мм. Каждый лист стерилен и герметически упакован в пакет из полимерной пленки.
Альгимаф (рег. № Р N 003173/01) 1 г препарата содержит альгината натрия 0,72 г, глюконата кальция 0,234 г, мафенида ацетата 0,036 г и фенозановой кислоты 0,01 г; в пористых листах толщиной 10 мм и размером 50×50, 60×100, 150×150 и 135×250 мм. Каждый лист стерилен и герметически упакован в пакет из полимерной пленки.
Гевискон (рег. № ЛС-002445) - круглые, плоские со скошенными краями таблетки, от почти белого до кремового цвета с небольшими вкраплениями, с лимонным или мятным запахом. На одной стороне таблетки изображение круга и шпаги, на другой - G 250.
Альгинатол (рег. P №001060/01) - в одном суппозитории содержится в качестве активного компонента натрия альгинат - 250 мг и основа для суппозиториев (Витепсол) - достаточное количество до получения суппозитория массой 1,28 г.
Второе направление - это использование солей альгиновой кислоты в качестве сорбентов.
Способ получения альгината кальция патент RU 2395525. Сухой порошок альгиновой кислоты или ее водорастворимой соли смешивают с водным раствором соли кальция концентрацией не менее 0,6 моль/л, смесь тщательно перемешивают, выдерживают не менее 10 минут, затем полученный альгинат кальция отделяют от водной фазы (если таковая образуется) декантацией, центрифугированием или фильтрацией и сушат.
Так же в литературе описываются сорбционные свойства альгинатов как сорбентов различных ионов (цезия, стронция, кадмия, свинца и др.). Известно, что альгинаты полученные с использованием химического гидролиза обладают способностью прочно и эффективно связывать ионы свинца и кадмия, при этом, чем ниже молекуляная масса, тем более эффективно увеличивается сорбционная емкость альгинатов [1]. При данном способе используются химические вещества для гидролиза альгинатов и длительное нагревание, что ведет к разрушению и частичному декарбоксилированию уроновых кислот [2].
Задачей настоящего изобретения является создание биотехнологически модифицированного производного альгиновой кислоты в виде натриевой соли. Использование данного метода позволяет белее эффективно получить снижение молекулярной массы альгиновой кислоты (природная альгиновая кислота имеет молекулярную массу 35-500 кДа) и, заменяя химический гидролиз при высокой температуре на битехнологический процесс, получить более нативную структуру альгиновой кислоты без декарбоксилирования уроновых кислот. В результате получатся высокобиологически активное соединение, обладающее высокими противовоспалительными и регенирирующими свойствами.
Получение производного альгината натрия основывается на методике биотехнологической модификации природной альгиновой кислоты для медицинских целей, полученной в соответствии с ФС 42-3383-97. Полученное производное альгината натрия сравнивали с альгинатом натрия для медицинских целей по физико-химическим показателям подлинности в соответствии с требованиям ФС 42-3383-97 (табл. 1).
Спектроскопия ядерно-магнитного резонанса (ЯМР)
Анализ образца производного Альгината натрия проведен с использованием спектрометра ЯМР Bruker Avance III с рабочей частотой для протонов 600 МГц.
2
13
Для этого проба растворялась в DO, раствор объемом 0,6 мл помещался в ампулу диаметром 5 мм. Тяжелая вода применялась для регистрации опорного сигнала ядер дейтерия с целью настройки однородности магнитного поля спектрометра. Спектры ЯМР регистрировались на ядрах C.
13
Спектр C-ЯМР регистрировали с развязкой от протонов для подавления нежелательных спин-спиновых взаимодействий С-Н и улучшения отношения «сигнал/шум», представлен на фигуре 2. Длительность импульса составляла 12 мкс, время задержки между импульсами - 16 с. Число накоплений - 4096.
Сигналы с химическими сдвигами ~175 м.д. в обоих спектрах отвечают атомам углерода, входящим в состав групп СООН (положение I на фигуре 1). Для более точного отнесения остальных сигналов был дополнительно зарегистрирован спектр 13C-ЯМР раствора глюкозы в D2O фигура 3.
Сопоставление спектров производного альгината со спектром глюкозы и природной альгиновой кислотой (фигура 4) позволяет определить, что в спектре исследуемого образца в области ~100 м.д. наблюдаются сигналы, соответствующие, вероятно, атомам углерода углеводного кольца, связанным с двумя атомами кислорода (положение II на фигуре 1). Группы сигналов в области 70-80 м.д. соответствуют остальным атомам углерода углеводного кольца (положения III-VI на фигуре 1).
На основании проведенного исследования спектров ЯМР установлено, что в отличие от природного альгината натрия, производное альгината полученное методом биотехнологии в водных растворах, отсутствует группа сигналов соответсвующее области 60-70 м.д. Это свидетельствует об отсутствии внутримолекулярных связей, способствующих образованию природным альгинатом натрия гелей.
Результаты исследований производного альгиновой кислоты методом эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии:
Анализ проведен с использованием ВЭЖХ системы LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония), состоящей из автосамплера SIL-20A, двухплунжерного нacoca LC-20AD, вакуумного дегазатора DGU-A3, термостата колонок STO-20А и рефрактометрического детектора RID-10A. Разделение проводилось при температуре 50°C на колонках для анализа водорастворимых полимеров МСХ 300×8 мм с размером пор 1000-1000000 A (PSS, Германия). В качестве элюента использовался водный раствор нитрата калия (0,2 моль/л) и дигидрофосфата натрия (0,01 моль/л) с рН8. Градуировка системы проводилась по монодисперсным стандартным образцам полистиролсульфонатов натрия (PSS, Германия) с известной молекулярной массой в диапазоне от 891 до 976000 Да. Сбор и обработка данных осуществлялись с помощью ПО WinGPC (PSS, Германия).
Полученные результаты расчета среднечисловой (Мn), среднемассовой (Mw) и z-средней (Mz) масс, а также полидисперсности исследованных образцов (Mw/Mn) приведены в таблице 2.
Таким образам, производное альгиновой кислоты отличается от природного соединения:
1. не образует геля при растворении в воде 10% производного альгината натрия. Природный альгинат натрия образует стойкие не текучие гели при концентрации 5%.
2. на основании ЯМР-спектроскопии установлено отсутствие группы сигналов, соответствующих 60-70 м.д., это доказывает отсутствие внутримолекуляных связей, отвечающих за адсорбцию воды молекулой альгината и образования гелевой структуры.
3. молекулярная масса производного альгината значительно снижена по сравнению с природной альгиновой кислоты (Табл. 2). Молекулярная масса природной альгиновой кислоты составляет 35000-500000 Да.
Определение биологической (фармакологической) активности производного альгиновой кислоты
Эксперимент выполнен на беспородных крысах обоего пола массой 200+/-40 грамм. На модели раневого процесса - плоскостной асептической ране, полученная по методике [3]: у животных, в условиях эфирной наркотизации, на предварительно дэпиллированной коже спины, после обработки операционного поля йодопироном и 70% спиртом в межлопаточной области по трафарету диаметром 2 см, скальпелем была сформирована стандартная плоскостная рана глубиной 2 мм.
Пример 1. Подбор средней эффективной дозы препарата (Табл. 3). Для этой цели были подготовлены растворы, содержащие производное альгината натрия в следующих концентрациях на 1 дозу: 0,05 мг, 0,1 мг, 0,2 мг, 0,4 мг. Данные препараты наносили 1 раз в день на 3 сутки готовили гистопепараты, окрашенные гематоксилин-эозином. Подсчет клеток (лимфоцитов, нейтрофилов) проводили под микроскопом «МИКМЕД 5» (Россия) под увеличением ×100 в сетке академика Г.Г. Автандилова. Для эксперимента было взято 50 лабораторных животных.
Было установлено, что разовая доза в 0,1 мг на 1 применение в течение 3 дней обладает выраженным противовоспалительным действием на рану. Для дальнейших исследований разовая доза составила 0,1 мг на 1 применение.
Медицинские препараты, зарегистрированные как лекарственные средства, имеющие в своем составе природную соль альгиновой кислоты (альгипор, альгимаф, гевискон, альгинатол), содержат данную соль на 1 дозу в концентрации: альгипорт и альгимаф - 700 мг, гевискон и альгинатол - 250 мг.
Таким образом, биотехнологическая модификация альгиновой кислоты с получением производного альгината натрия позволяет значительно повысить противовоспалительный эффект при более низких концентрациях действующего вещества 0,1 мг производного альгиновой кислоты и 250 мг природного альгината натрия.
Пример 2. Регенерирующая способность производного альгината натрия (Табл. 4).
Для данного опыта было взято 60 лабораторных крыс с поверхностной асептической раной. Они были разделены на контроль (30 особей), которые ничем не обрабатывались и 30 особей, которым на рану 1 раз в день наносили производное альгината натрия в дозе 0,1 мг на 1 прием (опыт). Гистологические препараты готовились на 3, 7 и 14 сутки и окрашивались гематоксилин-эозином. Подсчет клеток-эффекторов (лимфоцитов, нейтрофилов, фибробластов) проводили под микроскопом «МИКМЕД 5» (Россия) под увеличением ×100. Количество сосудов подсчитывали в большом квадрате сетки академика Г.Г. Автандилова при увеличении ×40.
На основании полученных данных установлено значительное снижение воспалительной реакции в зоне раны при использовании производного натриевой соли альгиновой кислоты на 3-й сутки эсксперимента (Табл. 4). В то же время установлено повышение количества фибробластов и сосудов в зоне раны, что характеризует развитие восстановительных регенеративных процессов. В ране происходит интенсивный рост новых кровеносных и лимфатических сосудов, улучшается кровообращение, уменьшается гипоксия, и стихает воспалительная реакция. В ране образуются новые сосуды, созревает молодая грануляционная ткань, которая способствует ликвидации раневого дефекта тканей.
Пример 3. Гастропротективная активность производного альгиновой кислоты в виде натриевой соли.
Брали 20 беспородных белых крыс-самцов весом 200±40 г, которые в течение 24 часов не получали ни пищи, ни воды и содержались в клетках с ячеистым дном во избежание копрофагии. 10-ти крысам перорально вводили 0,5 мл/200 г массы тела физиологического раствора (контрольные животные), а 10-ти другим животным вводят 1 мл/200 г исследуемого препарата (опыт). Через 1 час после введения и опытным, и контрольным животным вводили этанол 96% (1 мл/200 г массы тела). Через 1 час осуществляли эвтаназию лабораторных животных путем передозировки медицинского эфира, извлекали желудки, разрезали по малой кривизне. Затем готовили гистологические препараты, окрашенные гематоксилин-эозином. Подсчет клеток (лимфоцитов, нейтрофилов) проводили под микроскопом «МИКМЕД 5» (Россия) под увеличением ×100 в сетке академика Г.Г. Автандилова.
Анализ полученных данных подтверждает эффективное снижение воспалительной реакции в зоне язвенного дефекта слизистой оболочки желудка на фоне применения производного альгиновой кислоты (Табл. 5)
Литература:
1. Макарова К.Е., Хожаенко Е.В., Ковалев В.В., Подкорытова Е.А., Хотимченко Р.Ю. Альгинаты с различными молекулярными массами как сорбенты ионов кадмия и свинца. Материалы докладов на XVIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека», 8-10.10.2013.
2. Усов А.И. Альгиновые кислоты и альгинаты: методы анализа, определение состава и установления строения. Успехи химии - 68 (11) 1999.