Сравнительная оценка влияния загрязняющих веществ на дегидрогеназную активность аборигенной микрофлоры серой лесной почвы и культуры Bacillus pumilus

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ЗАГРЯЗНЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ НА ДЕГИДРОГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ СЕРОЙ ЛЕСНОЙ ПОЧВЫ И КУЛЬТУРЫ BACILLUS PUMILUS

С.Ю. Селивановская, П.Ю. Галицкая

Казанский государственный университет ул. Кремлевская, 18, Казань, Россия, 420008

Изучено влияние металлов (С^ Pb, Ni, Cr, Cd) и фунгицида альто-супер на дегидрогеназную активность аборигенной микрофлоры серой лесной почвы и лабораторной культуры Bacillus pu-milus КМ-21. Установлено, что внесение в почву металлов вызывает дозо-зависимое ингибирование дегидрогеназной активности аборигенной микрофлоры и Bacillus pumilus КМ-21, оцененной в контактном и элюатном тестах. Сравнение концентраций металлов, вызывающих 50% ингибирование дегидрогеназной активности, выявило, что контактный тест оказался более чувствительным по сравнению с элюатным. Отмечена тесная корреляция между изменениями в чистой культуре (контактный тест) и аборигенной микрофлоры, что позволяет рекомендовать контактный тест для оценки загрязнения почв экзогенными токсичными веществами.

Ключевые слова: токсиканты, почва, биотестирование, дегидрогеназная активность, серые лесные почвы.

Поступление в почву экзогенных органических и неорганических веществ приводит к увеличению ее токсичности в отношении микроорганизмов. Для оценки ответной реакции почвенных микробных сообществ на воздействие токсичных соединений применяется широкий спектр показателей, основанных на анализе активности аборигенной микрофлоры, например, базального и субстрат-индуциро-ванного дыхания, дегидрогеназной, протеазной, фосфатазной, липазной активностей или ее биомассы [1; 2]. В дополнение к указанным методам, основанным на оценке состояния аборигенной микрофлоры, для оценки токсичности почвы предлагаются методы биотестирования, суть которых заключается в определении воздействия анализируемого почвенного образца на лабораторную культуру микроорганизмов, называемую тест-объектом [3; 4]. Наиболее известными микробными тест-объектами являются Vibrio fischery и Pseudomonas putida, в качестве функций, изменение которых подвергается регистрации при оценке влияния токсикантов, чаще всего применяются изменение роста культуры или активности ферментов [4; 5]. Методы биотестирования подразделяются на две группы — элюатные и контактные. В элюатных тестах предварительно из почвы получают водный экстракт и затем определяют эффект его воздействия на лабораторную культуру микроорганизмов. В контактных тестах оценивают эффект воздействия на культуру микроорганизмов непосредственно почвенного образца. Первая группа методов биотестирования получила большее распространение [4], тогда как контактные микробные тесты в настоящее время находятся в стадии разработки [5].

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка токсичности серой лесной почвы, загрязненной рядом металлов (Cu, Pb, Cd, Cr, Ni) и фунгицидом альто-супер, в отношении дегидрогеназной активности аборигенной микрофлоры почвы и лабораторной культуры Bacillus pumilus.

Материалы и методы исследования. В работе использовали серую лесную супесчаную почву с содержанием органического вещества по Сорг 0,76%. В образцы почвы вносили отдельно соли индивидуальных металлов (CuSO45H2O — 5—360; PbCl2 — 15—1500; Cd(N03)2-4H20 — 0,25—232; NiSO4 — 10—500; K2Cr2O7 — 0,312—3971 мг элемента/кг почвы) и фунгицид альто-супер (0,35— 67,8 мг/кг). Токсиканты вносили в почву в виде водных растворов, инкубировали в течение 7 сут при комнатной температуре (22 °С). Образцы делили на две части. В первой части определяли дегидрогеназную активность аборигенной микрофлоры почвы, вторую часть стерилизовали в автоклаве (1 атм, 20 мин.).

Дегидрогеназную активность аборигенной микрофлоры почвы определяли по скорости восстановления резазурина [6]. Навеску почвы (3 г) помещали в пробирки с завинчивающимися пробками, приливали 3 мл дистиллированной воды и помещали на ротатор (60 об/мин., 2 ч). Через 2 ч добавляли 4 мл резазурина (20 мг/л), растворенного в калиево-фосфатном буфере. Пробирки вновь помещали на ротатор (50 мин.), центрифугировали (10 мин., 3,5 тыс. об./мин.). Невосстановленный резазурин определяли в надосадочной жидкости спектрофотометрически при длине волны (X) 600 нм.

Для оценки воздействия загрязнителей на дегидрогеназную активность аборигенной почвенной микрофлоры рассчитывали относительную дегидрогеназную активность (Аотн):

P

А = зп

отн р ’ нп

где Рзп — экстинкция пробы почвы с токсикантом, опт. ед.; Рнп — экстинкция пробы контрольной почвы (без токсиканта), опт. ед.

При биотестировании почвенных образцов использовали грамположительную бактерию Bacillus pumilus КМ-21 (тест-объект). Тест-функцией служила актуальная дегидрогеназная активность культуры.

Контактный тест осуществляли в соответствии со следующей процедурой. Навеску стерильной почвы (3 г), помещали в пробирки с завинчивающимися пробками, приливали 1 мл бактериальной суспензии (B. pumilus), 3 мл дистиллированной воды и помещали на ротатор (60 об./мин., 2 ч). Затем добавляли 4 мл резазурина (20 мг/л), растворенного в калиево-фосфатном буфере. Пробирки снова помещали на ротатор на 50 мин., а затем пробы центрифугировали (10 мин. при 3,5 тыс. об./мин.). Невосстановленный резазурин определяли в надосадочной жидкости спектрофотометрически при X = 600 нм. Контролем служила дегидро-геназная активность культуры B. pumilus в присутствии дистиллированной воды (контроль активность культуры — КА).

Для того, чтобы избежать влияния окрашенных компонентов ростовой среды или почвы, предусматривали так называемую слепую пробу, где 1 мл бактериальной суспензии был заменен на 1 мл дистиллированной воды.

Рассчитывали относительную дегидрогеназную активность культуры микроорганизмов (Аотн):

рсл _ р

< _ проба проба

отн _ р сл _ р ’

1 Ка 1 Ка

где РКа экстинкция пробы при оценке активности культуры; Р^ — экстинкция сле-

Ка-- ал^11шлцш1 прииы при ицсплс алшьпи^ш ± ка

пой пробы при оценке активности культуры; Рпроба — экстинкция пробы образца; Р™оба — экстинкция слепой пробы образца.

Элюатный тест проводили в соответствии с процедурой, описанной для контактного теста, заменяя 3 г стерильной почвы на 3 мл водного экстракта почвы (навеску почвы 1 г разбавляли дехлорированной водой в соотношении 1 : 10, встряхивали на ротаторе (1 ч, 60 об./мин. и затем фильтровали). Контролем служила дегидрогеназная активность культуры В. ритйш в присутствии дистиллированной воды (контроль активность культуры — КА).

Для расчета концентраций, вызывающих 50%-ное ингибирование (ЕС50) использовали кинетическую модель [6]. Все измерения проводили в пятикратной повторности.

Результаты и их обсуждение. Было установлено, что незагрязненная (контрольная) почва оказывает стимулирующий эффект на дегидрогеназную активность В. ритйш, (увеличение в 1,7—2 раза по сравнению с активностью В. ритйш в присутствии дистиллированной воды), что, скорее всего, связано с действием органического вещества почвы. Достоверный ингибирующий эффект на дегидрогеназную активность В. ритйш (контактный тест) оказывала почва, содержащая 30 мг/кг Си (рис. 1а). Мерой токсичности вещества в почве служит его концентрация, вызывающая 50%-ное ингибирование (ЕС50) тест-функции (дегидрогеназной активности): чем выше значение ЕС50, тем вещество менее токсично. Поскольку в эксперименте с В. ритйш не была установлена ЕС50 для меди, то она была рассчитана. На основе модели было определено значение ЕС50, которое составило для меди 65,1 мг элемента/кг (табл. 1). В элюатном тесте рассчитанное значение ЕС500 меди оказалось в 1,6 раз больше по сравнению со значением ЕС50, контактного теста.

Таблица 1

Интервалы значений концентраций различных токсикантов в почве, вызывающих 50% ингибирование дегидрогеназной активности В. ритПиэ (ЕС50), определенные в контактном (а) и элюатном (б) тестах

Токсикант Интервалы значений ЕС50 мг (металла/фунгицида)/кг

а б

60,3—74,1 96,1 — 121,5

Cd 7,2—10,4 321,3—374,3

М 94,1—107,1 157—189,9

Pb 106,8—131,3 234,0—280,2

а (VI) 10,1—14,5 17,4—22,3

Фунгицид альто-супер 14,4—23,5 81,0—87,0

Аот>

Аотн

Содержание, мг металла/кг почвы

АотН

Содержание, мг метапла/кг почвы

Аотн

Содержание, мг метапла/кг почвы

Содержание, мг метапла/кг почвы

контактный тест элюатный тест -а- аборигенная микрофлора

Содержание, мг металла/кг почвы

Рис. 1. Влияние солей металлов ^ (а), Pb (б), № (в), ^ (г), Cd (д) на относительную (контактный и элюатный тесты) дегидрогеназную активность (Аотн) В. ритііив и аборигенной микрофлоры серой лесной почвы

Значения ЕС50 свинца, рассчитанные по результатам контактного и элюат-ного тестов, составили 119,1 и 257,3 мг/кг соответственно (см. табл. 1). Полученные данные свидетельствуют о том, что токсичность свинца для дегидрогеназной активности В. ритіїш, оказалась ниже, чем меди.

Токсичность почвы, содержащей никель для B. pumilus показана на рис. 1 в. Выявлено, что значение ЕС50 для никеля в почве составило 99,6 и 174,1 мг элемента/кг почвы в контактном и элюатном тестах соответственно (табл. 1).

Изменение дегидрогеназной активности B. pumilus при воздействии на нее почвенных образцов, загрязненных солями хрома и кадмия представлены на рис. 1 г, д. Можно отметить, что при контактном биотестировании эти металлы оказались более токсичными для тест-объекта. Значения ЕС50 (контактный и элюатный тесты) для кадмия составили 8,6 и 227,4, а для хрома 12,1 и 18,3 мг элемента/кг соответственно.

Установлено, что токсичность металлов для B. pumilus (контактный тест) снижалась в ряду Cd > & > Си № > Pb, а в элюатном тесте — & > Си > № > Cd > Pb.

Оценка реакции тестового организма на органический токсикант (фунгицид альто-супер) представлена на рис. 2. Этот фунгицид широко используется в сельском и лесном хозяйстве. Значения ЕС50 для фунгицида (контактный и элюатный тесты) существенно различались и составили 18,8 и 85 мг вещества/кг соответственно.

Содержание, мг/кг

Рис. 2. Влияние фунгицида альто-супер на относительную дегидрогеназную активность (Аотн) B. pumilus (контактный и элюатный тесты) и аборигенной микрофлоры серой лесной почвы

Полученные результаты свидетельствуют о большей чувствительности контактного теста по сравнению с элюатным. Можно заключить также, что ингибирующий эффект на дегидрогеназную активность бактерий рода Bacillus, могут оказывать водорастворимые и связанные с почвенной матрицей фракции токсикантов. Полученные выводы согласуются с данными Ivask с соавторами [8], демонстрирующими, что токсичность почвы, загрязненной кадмием, для генетически измененного штамма B. subtilis BR151-(pTOO24) в контактном тесте в 90 раз выше, чем в элюатном тесте, а ртути и свинца — в 30 и 20 раз соответственно. Важными факторами, определяющими токсичность вещества в почве, являются ее тип, содержание в ней органического вещества, кислотность и механический состав [8].

В этих же почвенных образцах была определена дегидрогеназная активность аборигенной микрофлоры (см. рис. 1, 2). Внесение металлов приводило к снижению дегидрогеназной активности почвы. Наибольший негативный эффект выявлен при загрязнении хромом (см. рис. 1г). Значение ЕС50 для хрома составило 0,9 мг/кг почвы. Наименьшее влияние на дегидрогеназную активность аборигенной микрофлоры оказывал никель (ЕС50 41 мг/кг) (см. рис. 1в). Установлены значения ЕС50 для кадмия, меди и свинца, которые составили 3,6, 19,7 и 23,6 мг элемента/кг почвы соответственно. На основании значений ЕС50 (аборигенная микрофлора), металлы составили ряд: Сг > Cd > Си > РЬ > №.

Концентрации кадмия в почве, вызывающие 50% ингибирование дегидрогеназной активности аборигенной микрофлоры, составили 1082—1111, 323—483 и 1484—1429 мг Сd/кг (через 3 ч, 20 и 60 сут после внесения токсиканта соответственно) [9]. Менее токсичным оказался никель, значение ЕС50 которого составило 2885,1 и 9127,5 мг/кг (через 3 ч и 40 сут после внесения токсиканта соответственно) [10]. Установленные нами значения ЕС50 для изученных металлов оказались существенно ниже. Это, возможно, связано с тем, что упомянутые авторы изучали почву с более высоким содержанием органического вещества. В литературе представлены данные и о более высокой чувствительности дегидроге-назной активности аборигенной микрофлоры к металлам. Так, дегидрогеназная активность почвы, содержащая Си, РЬ, Cd и Zn в концентрациях 22,1; 15,3; 2,2 и 60,6 мг элемента/кг, составляет лишь 4% от таковой в незагрязненной [11]. Эти значения сопоставимы с данными нашего исследования.

Дегидрогеназная активности аборигенной микрофлоры почв, при низком содержании фунгицида (менее 1 мг/кг), увеличивалась на 25—35% (см. рис. 2). При возрастании содержания фунгицида в почве наблюдали дозо-зависимое снижение активности.

Значения ЕС50, установленные в контактном тесте, оказались выше значений, установленных при анализе аборигенной микрофлоры в 3; 5; 2,5; 2,4 и 13 раз для Си, РЬ, №, Cd и Сг, для элюатного теста были значительно больше и составили 5,3; 11; 4,2; 6,3 и 20 раз соответственно. Это позволяет считать контактный тест более чувствительным по сравнению с элюатным. К тому же выявлена тесная корреляция между величинами ингибирования дегидрогеназной активности контактного теста с B. pumilus и аборигенной микрофлоры (г = 0,96). При сопоставлении результатов элюатного теста и аборигенной микрофлоры коэффициент корреляции оказался ниже (г = 0,62). Это позволяет заключить, что контактный тест более адекватно отражает воздействие исследованных токсикантов на почвенную микрофлору.

Таким образом, загрязнение серой лесной почвы неорганическими токсикантами (Cd, №, Си, РЬ, Сг) вызывало дозо-зависимое ингибирование дегидрогеназной активности аборигенного микробного сообщества почвы и штамма B. pumilus. Определение токсичности почвы в контактном и элюатном тестах с B. pumilus выявили большую чувствительность контактного, который может быть рекомендован для оценки загрязнения почв экзогенными токсичными веществами.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Ананьева Н.Д., Благодатская Е.В., Демкина Т.С. Оценка устойчивости почвенных микробных комплексов к природным и антропогенным воздействиям // Почвоведение. —

2002. — № 5.

[2] Giller K.E., Witter E., McGrath S.P. Toxicity of heavy metals to microorganisms and microbial processes in agricultural soils: a review // Soil Biol. Biochem. — 1998. — V. 10/11.

[3] Kapanen A., Itavaara M. Ecotoxicity Tests Compost Applications // Ecotoxicol. Environ. Safety. — 2001. — V. 49.

[4] Ronnpagel K., Janssen E., Ahlf W. Asking for indicator function of bioassays evaluating soil contamination: are bioassays results reasonable surrogates of effects on soil microflora? // Chemosphere. — 1998. — V. 36. — No 6.

[5] Селивановская С.Ю., Галицкая П.Ю. Оценка токсичности плотных многокомпонентных сред с использованием контактного метода биотестирования // Токсикологический вестник. — 2006. — № 4.

[6] Ronnpagel K., Liss W., Ahlf W. Microbial bioassays to assess the toxicity of solid-associated contaminants // Ecotoxicol. Environ. Saf. — 1995. — V. 31. — P. 99—103.

[7] Speir T.W., Kettles H.A., Parshotam A., Searle P.L., Vlaar L.N.C. A simple kinetic approach to derive the ecological dose value, ED50, for the assessment of Cr(VI) toxicity to soil biological properties // Soil Biol. Biochem. — 1995. — V. 27.

[8] Ivask A., Fracois M., Kahru A., Dobourguier H.-C., Virta M., Douay F. Recombinant luminescent bacterial sensors for the measurement of bioavailability of cadmium and lead in soils polluted by metal smelters // Chemosphere. — 2004. — V. 55.

[9] Moreno J.L., Sanchez-Marin A., Hernandez T., Garsia C. Effect of cadmium on microbial activity and a ryegrass crop in two semiarid soils // Environ. Manag. — 2006. — V. 37.

[10] Moreno J.L., Perez A., Aliaga A., Hernandez T. The ecological dose of nickel in semiarid soil amended with sewage sludge related to unamended soil // Water, Air and Soil Pollution. —

2003. — V. 143.

[11] Hinojosa M.B., Carreira J.A., Garzia-Ruiz R., Dick R.P. Soil moisture pre-treatment effects on enzyme activities as indicators of heavy metal-contaminated and reclaimed soils // Soil Biol. Biochem. — 2004. — V. 36.

COMPARATIVE EVALUATION OF THE EFFECTS OF CONTAMINANTS ON DEHYDROGENASE ACTIVITIES OF INDIGENOUS MICROFLORA OF GRAY FOREST SOIL AND BACTERIA BACILLUS PUMILUS

S.Yu. Selivanovskaya, P.Yu. Galitskaya

Kazan State University

Kremlyevskaya str., 18, Kazan, Russia, 420008

The effects of metals (Cu, Pb, Ni, Cr, Cd) and fungicide alto-super on dehydrogenase activities of indigenous microflora of grey forest soil and laboratory culture Bacillus pumilus KM-21 were studied. It was determined that the putting of the metals into soil caused the dose-effect inhibition of dehydrogenase activities of indigenous microflora of soil and dehydrogenase activities Bacillus pumilus KM-21 estimated in eluate and contact tests. On the base of the established metal concentration causing the 50% inhibition on dehydrogenase activity, it was revealed that the contact test was more sensitive in comparison with eluate test. Cose relation between the alteration in activities of microbial culture (contact test) and indigenous microflora was shown. It allowed to recommend the contact test for estimation of the soil contamination with toxic compounds.

Key words: toxicants, soil, biotesting, dehydrogenase activity, grey forest soil.