Способ прогнозирования угрозы прерывания беременности ранних сроков при обострении цитомегаловирусной инфекции путем определения в сыворотке крови α-токоферола и ω-3 полиненасыщенных жирных кислот
METHOD FOR PREDICTING THREAT OF EARLY TERMINATION OF PREGNANCY DURING EXACERBATION OF CYTOMEGALOVIRUS INFECTION BY DETERMINING Α-TOCOPHEROL AND W-3 POLYUNSATURATED FATTY ACIDS IN BLOOD SERUM

Область применения:
предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к акушерству, а также к области научных исследований - патологической физиологии, и может быть использовано в целях прогнозирования угрозы прерывания беременности ранних сроков при обострении цитомегаловирусной инфекции.
Уровень техники
К числу наиболее актуальных и важных как в научно-теоретическом, так и в медицинско-социальном аспектах проблем относится угроза невынашивания беременности, частота которого составляет 18-20% и не имеет тенденции к снижению, несмотря на многочисленные и высокоэффективные методы диагностики и лечения, разработанные в последнее время.
У 78-85% пациенток с угрозой невынашивания беременности персистируют цитомегаловирусы, что объясняется высокой их тератогенностью и способностью нарушать формирование плаценты и эмбриональных тканей [10, 11].
Инфицирование цитомегаловирусом в ранние сроки беременности приводит к самопроизвольному прерыванию беременности (9,7%), угроза прерывания наблюдается у 36%, преждевременные роды у 30%, перинатальная заболеваемость 5,4% [6]. Механизмом данных патологий может являться патогенное действие вируса на фетоплацентарную систему. При этом наблюдается нарушение инвазии синцитиотрофобласта [27], гестационной трансформации трофобласта и ворсин хориона [8, 9], происходят деструктивные процессы вследствие активации процессов перекисного окисления липидов и медиаторов воспаления [3], нарушения гормонального баланса [4].
Таким образом, за счет оказания патогенного действия вируса на уровне микроскопических структур, обмена веществ при цитомегаловирусной инфекции намного чаще встречается неразвивающаяся беременность.
Крайне малоизученной областью исследований является изучение конкретных липидов, необходимых для развития. Ооциты представляют собой богатую липидами среду, обеспечивающую запасы энергии и прекурсоры для роста и биосинтеза мембран. Однако новые литературные данные свидетельствуют о том, что различные жирные кислоты способствуют развитию и росту эмбрионов за счет средств, выходящих за рамки удовлетворения потребностей в энергии. Так зарубежные исследователи установили непосредственную роль полиненасыщенных жирных кислот в процессе оплодотворения [14], регуляции раннего эмбриогенеза [20, 28], ангиогенезе [25].
Докозагексаеновая кислота может оказывать влияние на процесс плацентации посредством проангиогенного действия, а также стимулирует формирование нервной трубки в первом триместре гестации [17].
Помимо этого показано, что эйкозапентаеновая кислота обладает антиапоптическим эффектом и подавляет окислительный стресс путем уменьшения уровня активных форм кислорода, малонового диальдегида и усиления продукции фермента глутатионпероксидазы в условиях гипоксии. В комбинации с докозагексаеновой кислотой, метморфином и γ-аминомасляной кислотой поддерживают жизнеспособность клеток при гипоксии посредствам повышения уровня экспрессии гипоксией индуцированного фактора и снижения активности каспазы 3 [13].
Есть свидетельства того, что наряду с полиненасыщенными жирными кислотами решающее значение для эмбрионального развития человека имеет α-токоферол [29], который обладает иммуномодулирующим эффектом, участвует в развитии плаценты [19], способствует ангиогенезу [18, 30]. Помимо этого, α-токоферол необходим для нормального развития нервной системы, тогда как его дефицит вызывает продолжительные нейрокогнитивные нарушения. Также отмечается, что эмбриональный дефицит α-токоферола вызывает стойкие нарушения липидного, антиоксидантного и энергетического метаболизма, несмотря на потребление адекватной диеты с добавлением данного витамина [24].
Получены  новые научные данные, описывающие взаимодействие между α-токоферолом, полиненасыщенными жирными кислотами и липооксигеназами во время эмбриогенеза. При этом показано, что во время эмбрионального развития α-токоферол специально требуется для защиты ω-3 докозагексаеновой кислоты или опосредования продукции и/или действия биоактивных липидных медиаторов, синтезируемых из данной кислоты [22]. Предполагается, что α-токоферол локализуется совместно в фосфолипидными доменами, обогащенными полиненасыщенными жирными кислотами клеточной мембраны [12]. Более того, пероксидный радикал, образующийся из полиненасыщенных жирных кислот, будет локализоваться на границе раздела воздух-вода, где гидроксильная группа α-токоферола перехватывает радикал и восстанавливает его [23].
Исследователи полагают, что эмбриональное развитие зависит от достаточного количества докозагексаеновой, арахидоновой, эйкозапентаеновой кислот и специфических продуктов их окисления, а также от уровня α-токоферола, который защищает эмбрион от окислительного повреждения. Подчеркивается, что в условиях дефицита α-токоферола истощаются запасы полиненасыщенных жирных кислот, повышается синтез их гидроксипроизводных [21]. В конечном итоге развивается окислительный стресс, который может быть причиной возникновения апоптоза в различных тканях. Клетки, имеющие дефекты антиоксидантной защиты, наиболее чувствительны к воздействиям, вызывающим их запрограммированную гибель [16, 26].Установлено, что апоптоз может изменять функциональную активность плаценты, регулируя процесс дифференцировки цитотрофобласта в синцитиотрофобласт. Более того, формирование новых сосудов путем ангиогенеза происходит при одновременном участии процессов апоптоза. Таким образом, в физиологических условиях апоптоз является ключевым механизмом, осуществляющим комплексный контроль фетоплацентарного роста и развития [5]. Нарушение регуляции апоптоза, наблюдаемое при обострении цитомегаловирусной инфекции, приводит к снижению числа клеток синцитиотрофобласта, нарушению инвазии трофобласта в маточно-плацентарные артерии [8, 9], способствующее морфофункциональной несостоятельности развивающейся плаценты.
Таким образом, недостаточная  выработка α-токоферола и кислот ω-3 семейства может являться одной из причин  самопроизвольного прерывания беременности, так как данные соединения являются важными факторами эмбрионального развития.
На основании вышеописанных известных сведений, нами предложен способ прогнозирования угрозы прерывания беременности ранних сроков при обострении цитомегаловирусной инфекции.
Проведя анализ отечественной и зарубежной литературы мы установили, что диагностике и прогнозированию угрожающих состояний беременности ранних сроков по уровню липидов (в том числе полиненасыщенных жирных кислот), липидных медиаторов и тем более совместного применения жирных кислот ω-3 семейства, α-токоферола  посвящено незначительное количество работ.
Известен способ раннего прогнозирования невынашивания беременности, основанный на определении экспрессии липолитического фермента, регулирующего синтез липидных медиаторов - циклооксигеназы-2 и энзима, индуцирующего апоптоз - каспазы-3 [7].
Основным недостатком метода является его трудоемкость. Необходимо выделить РНК из эпителиальных клеток цервикального канала у женщин на ранних сроках беременности; провести обратную транскрипцию с получением ДНК; определить экспрессию циклооксигеназы-2 и каспазы-3 с помощью количественной полимеразной цепной реакции и провести расчет по уравнениям линейной дискриминантной функции.
Известен способ, предложенный нами ранее, оценки нарушения имплантации эмбриона при беременности, осложненной цитомегаловирусной инфекцией путем определения циклооксигеназы-2 в гомогенате ворсинчатого хориона [1].
Основным недостатком данного метода является то, что он позволяет определить причину развития угрозы раннего выкидыша после самопроизвольного прерывания беременности, ассоциированной с обострением цитомегаловирусной инфекцией.
Наиболее близким по техническому решению является способ, предложенный нами ранее [2], который позволяет диагностировать угрозу прерывания беременности по определению в сыворотке крови содержание докозагексеновой кислоты и сосудисто-эндотелиального фактора роста при цитомегаловирусной инфекции. Указанный способ выбран нами в качестве ближайшего аналога (прототипа).
Недостатком способа-прототипа является то, что он не раскрывает причины нарушения инвазивных процессов в ранние периоды гестации, а лишь нарушения формирования процессов ангиогенеза при обострении цитомегаловирусной инфекции.
Указанные факторы могут быть устранены в заявленном способе.
Техническим результатом
, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является повышение точности прогнозирования угрозы прерывания беременности при обострении цитомегаловирусной инфекции ранних сроков.
Заявляемый технический результат достигается тем, что у беременных женщин с выявленной цитомегаловирусной инфекцией, определяют в мкг/мл α-токоферол (αТФ) флюорометрическим методом по прописи L.G. Hansen et Warwich W.I. (1966) [15], в (%) содержание эйкозапентаеновой (ЭПК) и докозагексаеновой (ДГК) кислот методом капиллярной газожидкостной хроматографии в сыворотке крови.
Полученные значения используют для вычисления прогностического индекса (ПИ), по формуле, разработанной с использованием метода дискриминантного анализа:
ПИ= -151,975-23,532×αТФ-13,563×ЭПК+26,946×ДГК,
где ПИ - дискриминантная функция, граничное значение которой (-32,709).
При ПИ равном или меньше граничного значения, прогнозируют риск угрозы прерывания беременности при обострении цитомегаловирусной инфекции в ранние сроки. При ПИ больше граничного значения прогнозируют отсутствие риска угрозы прерывания беременности при обострении цитомегаловирусной инфекции в ранние сроки.
Новизна заявляемого способа
заключается в определении с учетом значений α-токоферола, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой  кислот в сыворотке крови у беременных женщин с выявленной цитомегаловирусной инфекцией, прогностического индекса ПИ, по отношению которого к граничному значению дискриминантной функции прогнозируют угрозу прерывания беременности ранних сроков при обострении цитомегаловирусной инфекции.
Ранее совокупность указанных признаков в прогнозировании угрозы прерывания беременности ранних сроков при обострении цитомегаловирусной инфекции не использовалась.
Способ содержит следующие приемы:
- у беременных женщин с выявленной цитомегаловирусной инфекцией в сыворотке крови, взятой из локтевой вены в утренние часы, натощак, определяют (мкг/мл) содержание α-токоферола флюорометрическим методом L.G. Hansen et W.I Warwich (1966);
- измеряют в (%) содержание эйкозапентаеновой и докозагексаеновой полиненасыщенных жирных кислот методом капиллярной газожидкостной хроматографии с помощью программно-аппаратного комплекса Хроматэк Аналитик 2,5 (Россия) по времени удерживания с использованием стандартов жирных кислот фирмы «Supelco» (США) в сыворотке крови;
- с помощью дискриминантного уравнения определяют прогностический индекс ПИ=-151,975+26,946×ДГК-23,532×αТФ-13,563×ЭПК,
где ПИ - прогностический индекс дискриминантной функции, граничное значение которого (-32,709);
- определяют прогноз развития угрозы прерывания беременности ранних сроков при обострении цитомегаловирусной инфекции: при ПИ равной или меньше граничного значения, прогнозируют угрозу прерывания беременности ранних сроков, при ПИ больше граничного значения - прогнозируют отсутствие угрозы прерывания беременности ранних сроков.
Вероятность правильного прогноза составляет 86%.
Примеры конкретной реализации способа
Пример 1. Беременная Д., 21 г., находилась на стационарном лечении в гинекологическом отделении ГАУЗ АО «Благовещенская городская клиническая больница».  Поступила с болями внизу живота и кровянистыми выделениями из половых путей. Гинекологический анамнез осложнен: 1 медицинский аборт без осложнений. Проведен анализ крови на TORCH-инфекции, содержание α-токоферола, эйкозапентаеновой и докозогексаеновой кислот, УЗИ органов малого таза. По ИФА выявлены антитела IgM к цитомегаловирусу, титр антител IgG составил 1600, индекс авидности - 94%.
По данным УЗИ-исследования - в полости матки имеется эмбрион, соответствующий 7-недельной беременности, сердцебиение определяется. Гипертонус по задней стенке матки. Внутренний зев сомкнут. Ниже плодного яйца гематома небольших размеров (отслойка ворсинчатого хориона).
Диагноз: беременность 7-8 недель. Угрожающий самопроизвольный выкидыш. Хроническая цитомегаловирусная инфекция, стадия обострения.
По заявленному способу при лабораторном исследовании сыворотки крови получены следующие показатели: содержание α-токоферола - 1,32 мкг/мл, эйкозапентаеновой кислоты - 1,10%, докозогексаеновой кислоты - 6,10%. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, составил (-33,585), что свидетельствовало о высоком риске прерывания беременности, в связи с чем пациентка отнесена в группу риска по реализации невынашивания в ранние сроки.
На третий день стационарного лечения усилились боли внизу живота и кровянистые выделения из половых путей. Выставлен диагноз самопроизвольный выкидыш в ходу при сроке 7 недель беременности.
Прогноз по заявленному способу подтвердился.
Пример 2. Беременная Е., 23 л., находилась на стационарном лечении в гинекологическом отделении ГАУЗ АО «Благовещенская городская клиническая больница». Гинекологический анамнез: 1 медицинский аборт без осложнений. Проведен анализ сыворотки крови на TORCH-инфекции, содержание α-токоферола, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот, УЗИ органов малого таза.
По ИФА титр антител IgG - 800, индекс авидности - 95%. Диагноз: Беременность 7 недель. Хроническая цитомегаловирусная инфекция, латентная стадия.
По данным УЗИ-исследования - в полости матки имеется эмбрион, соответствующий 7-недельной беременности. Внутренний зев сомкнут.
Диагноз: Беременность 7-8 недель. Хроническая цитомегаловирусная инфекция, латентная стадия.
По заявленному способу при лабораторном исследовании сыворотки крови получены следующие показатели: содержание α-токоферола - 1,46 мкг/мл, эйкозапентановой кислоты - 1,26%, докозогексаеновой кислоты  - 8,72%. Прогностический индекс, рассчитанный по формуле, составил - (31,545). Отсутствие риска угрозы прерывания беременности ранних сроков.
Прогноз по заявленному способу подтвердился.
Предложенное изобретение позволяет эффективно прогнозировать угрозу прерывания беременности в 86% случаев.
Применение данного способа позволяет своевременно реализовать необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению невынашивания беременности ранних сроков у женщин с обострением цитомегаловирусной инфекции.
Используемые источники
1. Способ оценки нарушения имплантации эмбриона при беременности, осложненной цитомегаловирусной инфекцией путем определения циклооксигеназы-2 в гомогенате ворсинчатого хориона: пат. №2685554 / авторы и заявители: И.А. Андриевская, Н.А. Ишутина; патентообладатель Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания»; заяв. 07.05.2018; опубл. 22.04.2019. Бюл. №12.
2. Способ прогнозирования угрозы прерывания беременности при обострении цитомегаловирусной инфекции путем определения  сосудистого эндотелиального фактора роста и докозагексаеновой кислоты в сыворотке крови: пат. №. 2736689 / авторы и заявители: И.А. Андриевская, Н.А. Ишутина; патентообладатель Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания»; заяв. 21.02.2020; опубл. 19.11.2020. Бюл. № 32.
3. Ишутина Н.А., Дорофиенко Н.Н., Андриевская И.А. Малоновый диальдегид и фактор некроза опухолей α в периферической крови беременных с цитомегаловирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2015. Вып. 55. С. 78-81.
4. Ишутина Н.А., Луценко М.Т., Андриевская И.А. Роль холестерола и эстрадиола в развитии плацентарной недостаточности при цитомегаловирусной инфекции в III триместре гестации // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2017. Вып. 65. С. 54-58.
5. Колобов А.В., Соколов Д.И., Корооева Л.И., Евсюкова И.И., Сельков С.А., Кветной И.М. Роль нарушений ангиогенеза в формировании плацентарной недостаточности при герпесвирусной инфекции // Вестник Санкт-Петербургского университета. 2008. Вып. 2(11). С 157-167.
6. Кытикова О.Ю., Новгородцева Т.П., Петрова К.К. Патофизиологические механизмы повреждающего действия цитомегаловирусной инфекции при беременности //Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2017. Вып. 66. С. 98-107.
7. Способ раннего прогнозирования невынашивания беременности: пат. № 2592204 С1 RU /авторы и заявители: О.П. Лебедева, О.Н. Яковлева, С.П. Пахомов, Ю.М. Цуверкалова, М.И. Чурносов, Р.Ю. Старцев; патентообладатель Федеральное государственное автономное учреждение высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский институт»; заяв. 29.12.2014; опубл. 20.07.2016. Бюл. №20.
8. Луценко М.Т. Цитомегаловирусная инфекция // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2012. Вып. 44. С. 131-136.
9. Милованов А.П. Патология системы мать-плацента-плод. М.: Медицина, 1999. 446 с.
10. Петров Ю.А., Блесманович А.Е., Алехина А.Г. Риски для беременной и плода при цитомегаловирусной инфекции // Главный врач Юга России. 2019. Т.36, №1. С. 91-96.
11. Петрова К.К. Клинико-функциональные и гормональные причины раннего невынашивания беременности при цитомегаловирусной инфекции //Здоровье. Медицинская экология. Наука. 2017. №4(71). С. 111-113.
12. Atkinson J., Harroun T., Wassall S.R., Stillwell W., Katsaras J. The location and behavior of alpha-tocopherol in membranes // Mol. Nutr. Food. Res. 2010 Vol. 5. P. 641-651. doi: 10.1002/mnfr.200900439.
13. Chandravanshi B., Bhonde R. Small molecules exert anti-apoptotic effect and reduce oxidative stress augmenting insulin secretion in stem cell engineered islets against hypoxia // Eur. J. Pharmacol. 2016. № 791. P. 424-432.
14. Edmonds J.W., Prasain J.K., Dorand D., Yang Y., Hoang H.D., Vibbert J., Kubagawa H.M., Miller M.A. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction // Dev Cell. 2010. Vol.19, №6. P. 858-871. doi: 10.1016/j.devcel.2010.11.005.
15. Hansen L.G., Warwich W.I. Flurometric micromethod for serum tocoferol // Am. J. Chen Pathology. 1966. Vol. 46. №1 P.137-138.
16. Iskusnykh I.Y., Popova T.N., Agarkov A.A. et al. Expression of glutathione peroxidase and glutathione reductase and level of free radikal processes under toxoc hepatitis in rats // J. Toxicol. 2013. 2013: 870628. doi: 10.1155/2013/870628.
17. Johnsen G.M., Basak S., Weedon-Fekjcer M.S. Docosahexaenoic acid stimulates tube formation in first trimester trophoblast cell, HTR8/SVneo // Placenta. 2011. Vol. 32. № 9. P. 626-632.
18. Kasimanickam R.K., Kasimanickam V.R., Rodriguez J.S., Pelzer K.D., Sponenberg P.D., Thatcher C.D. Tocopherol induced angiogenesis in placental vascular network in late pregnant ewes // Reprod Biol Endocrinol. 2010; 8: 86. doi:10.1186/1477-7827-8-86.
19. Kasimanickam R.K., Kasimanickam V.R., Haldorson G.J., Tibary A. Effect of tocopherol supplementation during last trimester of pregnancy on mRNA abundances of interleukins and angiogenesis in ovine placenta and uturus // Reprod. Biol. Endocrinol. 2012. №10. P. 4.
20. Kniazeva M., Shen H., Euler T., Wang C., Han M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans // Genes Dev. 2012. Vol. 26, №6. P. 554-566. doi: 10.1101/gad.187054.112.
21. Lebold K.M., Kirkwood J.S., Taylor A.W., Choi J., Barton C.L., Miller G.W., La Du J., Jump D.B., Stevens J.F., Tanguay R.L., Traber M.G. Novel liquid chromatography-mass spectrometry method shows that vitamin E deficiency depletes arachidonic and docosahexaenoic acids in zebrafish (Danio rerio) embryos // Redox Biol. 2013. Vol. 2. P. 105-113. doi: 10.1016/j.redox.2013.12.007.
22. Lebold K.M., Traber M.G. Interactions between α-tocopherol, polyunsaturated fatty acids, and lipoxygenases during embryogenesis // Free Radic Biol Med. 2014. № 66. P.13-9. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2013.07.039.
23. Marquardt D., Williams J.A., Kučerka N., Atkinson J., Wassall S.R., Katsaras J., Harroun T.A. Tocopherol activity correlates with its location in a membrane: a new perspective on the antioxidant vitamin E // J. Am. Chem. Soc. 2013. Vol. 135(20). P.7523-7533. doi: 10.1021/ja312665 r.
24. McDougall M., Choi J., Truong L., Tanguay R., Traber M.G. Vitamin E deficiency during embryogenesis in zebrafish causes lasting metabolic and cognitive impairments despite refeeding adequate diets // Free Radic Biol Med. 2017. Vol. 110. P. 250-260. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2017.06.012.
25. Pandya A.D., Das M.K., Sarkar A., Vilasagaram S., Basak S., Duttaroy A.K. Tube formation in the first trimester placental trophoblast cells: Differential effects of angiogenic growth factors and fatty acid // Cell. Biol. Int. 2016; 40(6): 652-661.
26. Stehbens W.E. Oxidative stress in viral hepatitis and AIDS // Exp. Mol. Pathol. 2004. Vol. 77, № 2. P. 121-131.
27. Tao L., Suhua C., Juanjuan C., Zongzhi Y., Juan X., Dandan Z. In vitro study on human cytomegalovirus affecting early pregnancy villous EVT's invasion function // Virol. J. 2011, №8. P. 114. doi: 10.1186/1743-422X-8-114.
28. Vrablik T.L., Watts J.L. Emerging roles for specific fatty acids in developmental processes // Genes Dev. 2012. Vol. 26(7). P. 631-7. doi: 10.1101/gad.190777.112.
29. Wilcox A.J., Baird D.D., Weinberg C.R. Time of implantation of the conceptus and loss of pregnancy // N. Engl. J. Med. 1999. Vol.340, № 23. P. 1796-1799. doi: 10.1056/NEJM199906103402304.
30. Wu Z., Zheng X., Meng L. et al. α-Tocopherol, especially α-tocopherol phosphate, exerts antiapoptotic and angiogenic effects on rat bone marrow-derived endothelial progenitor cells under high-glucose and hypoxia conditions // J. Vasc. Surg. 2018; 67(4):1263-1273.e1. doi:10.1016/j.jvs.2017.02.051.