СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПРОКАНЦЕРОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ФУЛВЕСТРАНТА НА ЯИЧНИКИ ПОТОМСТВА ЖЕНСКОГО ПОЛА У ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ
METHOD FOR SIMULATING THE PROCARCINOGENIC ACTION OF FULVESTRANT ON FEMALE DESCENDANTS OVARY IN LABORATORY MICE

Изобретение относится к экспериментальной медицине и онкологии и онкогинекологии, может быть использовано для контролируемого моделирования пренатального проканцерогенного воздействия на яичники потомства лабораторных животных.
Известно, что антиэстрогены блокируют эстроген рецепторы, образуя комплекс антиэстроген-рецептор, который не способен к транскрипции [Zhu X, Leav I, Leung YK, et al. Dynamic regulation of estrogen receptor-beta expression by DNA methylation during prostate cancer development and metastasis // American Journal of Pathology. 2001. №159. P. 94-97.].
С 1970 x годов нестероидное производное трифенилэтилена - тамоксифен со свойствами агониста рассматривали как один из лучших препаратов для лечении рака молочной железы (РМЖ). Однако, обладая эстрогеноподобными эффектами, он повышает риск развития рака эндометрия, гиперкоагуляционнного синдрома, тромбоэмболитических осложнений и т.п. [Heuderson I.C. A rose is no longer a rose. J Clin Oncol 2002;20:3365-68.; Howell A., Osborn C.K., Morris C. et al. Fazlodex:Development of a novel, «pure» antistrogen. Cancer 2000;89:817-25.; Fisher В., Constantino J.P., Redmond C.K. et al. Endometrial cancer in tamoxifen-treated breast cancer patients: findings from the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) B-14. J Natl Cancer Inst 1994;86:527-37.].
В отличие от тамоксифена, препарат ICI 182,78 фулвестрант, имеет стероидную структуру и обладает более высоким сродством к эстрогеновым рецепторам (ЭР), чем тамоксифен, полностью блокируя трофическое действие эстрадиола на матку [Howell A. Preliminary experience with pure antiestrogens. Clin Cancer Res 2001;7(Suppl 12):4369s-75s.]. Исследования у животных показали также, что фулвестрант блокирует активность тамоксифена в отношении эндометрия, не проникая через гематоэнцефалический барьер [Эндокринотерапия рака молочной железы: преодоление резистентности/ В.Ф. Семиглазов, Г.А. Дашян, В.В. Семиглазов/ "Эффективная фармакотерапия. Онкология, гематология и радиология." №1 (10) | 2015].
Благодаря своему механизму действия и хорошей переносимости фулвестрант рекомендуется использовать для лечения в комбинации с другими препаратами [Зикиряходжаев А.Д, Клинические преимущества новых антиэстрогенов, 2007]. По результатам исследования, риск прогрессирования РМЖ или смерти при использовании 500 мг фулвестранта оказался ниже на 20% по сравнению с дозой 250 мг [Di Leo A., Jerusalem G., Petruzelka L. et al. Final overall survival: fulvestrant 500 mg vs 250 mg in the randomized CONFIRM trial // J. Natl. Cancer Inst. 2014. Vol. 106. №1].
В лечении рака молочной железы особое внимание уделяют фитотерапии после обнаружения селективного воздействия растительных препаратов (фитоэстрогенов) на ЭР. Такими препаратами являются индол-3-карбинол, секоизолариципезинол и др. За эффективностью индол-3-кабинода наблюдала группа ученых (Рожкова И.И., Меских Е.В., 2007), которая продемонстрировала, что применение индол-3-карбинола в дозе по 200 мг 2 раза в день на протяжении 6 мес.оказывало положительный маммопротекторный эффект. Другая группа российских ученых исследовали влияние фитоэстрогена секоизоларицирезинола на аденокарциному молочной железы СА755. В результате 10-дневного курса перрорального введения СЕКО в разовой дозе 250-500 мг/кг было выявлено ингибирующее действие, при этом отрицательная динамика в состоянии мышей не наблюдалась, а также отсутствовали патологические изменения их желудочно-кишечного канала [Результаты скрининга фитоантиэстрогена секоизолариципезинола на эстрогензависимой аденокарциноме молочной железы СА755./ Юлия Александровна Борисова, Галина Борисовна Смирнова, Натан Танфелевич Райхлин, Елена Михайловна Трещалина, Зоя Сергеевна Шпрах / Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, т. 25. - 2014. - №1-2. - С. 26-30.].
На действие антиэстрогенов оказывают влияние следующие факторы: состояние репродуктивной системы, доза (концентрация) и способ введения (однократно, дробно, длительно) [Kitts W.D., Newsome F.E., Runeckles V.C. The tstrogenic and antiestrogenic effects of coumestrol and zerananol on the immature rat uterus. Can. J. Anim. Sci. 1983; 63: 823-4].
Однако механизмы этого провоцирующего воздействия не представляется возможным изучить вследствие отсутствия однотипных по используемым дозам препаратов, воспроизводимых лабораторных моделей.
В доступной научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности способа моделирования проканцерогенного действия фулвестранта на ткани яичника у потомства не обнаружено.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа моделирования проканцерогенного (провоцирующего развитие злокачественных новообразований) действия повышенного уровня гормонов на яичники потомства женского пола у лабораторных животных путем введения в материнский организм эффективной субтоксической дозы фулвестранта в критический день закладки этих органов.
Технический результат при использовании изобретения - получение предельно допустимой дозы фулвестранта, оказывающей морфологически и иммуногистохимически контролируемый проканцерогенный эффект на ткани яичника у потомства женского пола лабораторных мышей.
Предлагаемый способ моделирования проканцерогенного действия пренатального уровня фулвестранта на ткани яичника потомства у лабораторных мышей в постнатальном периоде выполняется следующим образом. Беременным самкам лабораторных мышей внутримышечно вводят фулвестрант в дозе 100 мкг/кг массы животного в виде 0,4 мл 0,0005% масляного раствора на 11 сутки пренатального периода. В качестве растворителя используют касторовое масло.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами: на фиг. 1,5 представлены микрофото гистологического препарата яичника потомства беременных мышей контрольной группы, не получавших препарат; на фиг. 2,6 - микрофото гистологического препарата яичника потомства после введения фулвестранта в дозе 20 мкг/кг массы беременной мыши на 11 сутки пренатального периода; на фиг. 3,7 - микрофото гистологического препарата яичника потомства после введения фулвестранта в дозе 100 мкг/кг массы беременной мыши на 11 сутки пренатального периода; на фиг. 4,8 - микрофото гистологического препарата яичника потомства после введения фулвестранта в дозе 200 мкг/кг массы беременной мыши на 11 сутки пренатального периода.
Модель может быть рекомендована:
1) в фармакологии: для разработки и испытания новых и существующих лекарственных препаратов, предупреждающих развитие злокачественных новообразований яичников у потомства с неблагоприятным воздействием стероидных гормонов в период их внутриутробного развития;
2) в акушерстве: для разработки профилактических мер при вынужденном использовании антагонистов эстрогеновых рецепторов для поддержки беременности при привычном невынашивании с целью нивелирования их проканцерогенного воздействия на яичники потомства;
3) в гинекологии и онкогинекологии: для исследования молекулярно-клеточных механизмов пренатального программирования развития рака и других заболеваний репродуктивных органов и его гормональных факторов;
4) в персонализированной медицине: в исследованиях клеточной и молекулярно-генетической предрасположенности к раку и предраковым заболеваниям репродуктивных органов, измененных уровней гормонов отягчающих это состояние.
Расчеты эффективности доз препарата производили в соответствии с коэффициентами для перерасчета доз веществ в мкг/кг для мышей [Арзамасцев Е.В. Методологические указания по изучению общетоксического действия фармакологических веществ. // Москва. - 1997.; Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному изучению новых фармакологических веществ. // - 2005. - с. 49-51.; Гуськова Т.А. Доклиническое токсикологическое изучение лекарственных средств как гарантия безопасности проведения их клинических исследований. // -2010]. В качестве экспериментальных животных использовали белых лабораторных мышей, которые были получены и содержались в питомнике ГУП ДП ПСХ «Питомник лабораторных животных», расположенном по адресу Республика Башкортостан, Чишминский район, п. Горный. Условия вивария и содержания животных соответствует РД-АПК 3.10.07.02-09 «Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений», другим необходимым санитарным нормам и требованиям ветеринарного контроля и надзора работ с лабораторными и экспериментальными животными, лицензия №99-04-000097 от 25.01.2005 г. Федеральная служба по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (Справка представлена от филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Уфа «Иммунопрепарат» от 11.03.2014 г.).
Исследуемые мыши были разделены на 4 группы, в каждой по 5 животных:
Контрольная группа №1 - экспозиция 0,8 мл касторового масла на беременную мышь внутримышечно.
Опытная группе №2 - экспозиция фулвестранта 0,08 мл 0,0005% масляного раствора в дозировке 20 мкг/кг массы беременной мыши внутримышечно.
Опытная группа №3 - экспозиция фулвестранта 0,4 мл 0,0005% масляного раствора в дозировке 100 мкг/кг массы беременной мыши внутримышечно.
Опытная группа №4 - экспозиция фулвестранта 0,8 мл 0,0005% масляного раствора в дозировке 200 мкг/кг массы беременной мыши внутримышечно.
Животных выводили из опыта по окончании сроков на 90-е сутки и усыпляли в соответствии с Директивой 2010/63 / ЕС Европейского парламента и Совета 22 / о9 / 2010 о защите животных в научных целях и рекомендациями других международных российских и институциональных правил в области биоэтики. Для исследования извлекали яичник потомства лабораторной мыши. Органы фиксировали в 10%-ном нейтральном забуференном формалине в течение 24 часов, подвергали стандартной гистологической обработке. Готовили срезы 5-6 мкм, после соответствующей гистологической проводки следующим этапом проводилось окрашивание срезов гематоксилин-эозином и иммуногистохимическим (ИГХ) методом. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond™ (Германия). В работе были использованы в качестве первых антител поликлональные антитела для мыши (Santa Cruz Biotechnology, США): к рецепторам ki-67 (клон MIB-1), bcl 2 (клон N-19), р 53 (клон fl-393-G). Все антитела были в разведении 1:300. Для демаскировки использовали непрямую стрептавидин-биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия). Докраску проводили раствором гематоксилина. Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первых антител. Исследование и визуализацию препаратов проводили с использованием светового микроскопа Leica DMD 108 (Германия) со специализированным программным обеспечением управления настройками и захвата изображения. Всего приготовлено 110 микропрепаратов.
На гистологической картине яичника потомства мыши контрольной группы видны следующие структуры: корковое вещество (1) яичника представлено фолликулами на разных стадиях развития: примордиальный фолликул (2), первичный (униламинарный) фолликул (3), вторичный (мультиламинарный) фолликул (4), третичный фолликул (5). Мозговое вещество (6) яичника невелико по сравнению с корковым. Оно хорошо васкуляризировано, сосуды в нем расширены и умеренно кровенаполнены. В строме - умеренный отек и полнокровные сосуды (Фиг. 1). Во вторичных фолликулах наблюдается примерно 1% ядерной экспресии, в третичных фолликулах - 5-6% умеренной ядерной экспрессии. В строме наблюдается 1% ядерной экспрессии (Фиг. 5).
В результате внутримышечного введения фулвестранта в дозе 20 мкг/кг массы беременной мыши установлено, что гистологическая картина яичника потомства представлена корковым и мозговым веществом. В корковом веществе яичника наблюдается большое количество фолликулов на разных стадиях развития. Отмечается увеличение первичных фолликулов (3), внутренняя поверхность которых выстлана высоким цилиндрическим эпителием с зернистой цитоплазмой. Значительно преобладают вторичные (4), третичные фолликулы (5). Слой теки, окружающий фолликулы, утолщен. В строме коркового вещества определяется очаговая пролиферация (7). Определяется резко выраженное паретическое расширение сосудов и полнокровие, как сосудов коркового вещества, так и мозгового (6). Желтые тела (8) представлены гиперплазированным фолликулярным эпителием с признаками белковой зернистой дистрофии. (Фиг. 2). В фолликулах определяется экспрессия р53 до 2-3%. В строме наблюдается до 1-2% ядерной экспрессии р53 (Фиг. 6).
В результате внутримышечного введения фулвестранта в дозе 100 мкг/кг массы беременной мыши установлено, что гистологическая картина яичника потомства представлена следующими структурами. В корковом веществе наблюдаются фолликулы на разных стадиях развития: первичные (3), вторичные (4), третичные (5). Отмечается увеличение первичных фолликулов и смещение их вглубь органа к мозговому веществу. Так же определяется выраженное преобладание вторичных фолликулов, с признаками кистозного расширения, фолликулярный эпителий в них утолщен. Наблюдается единичное желтое тело (8) с признаками выраженной дистрофии и атрофии фолликулярного эпителия. Слой теки желтого тела уплощен. В строме отмечается очаговая лютеинизация - это фолликулярный эпителий без слоя теки с признаками секреторной активности. В мозговом слое отмечается обеднение кровотока сосудов (9) (Фиг. 3). В фолликулах экспрессия белка-онкосупрессора р53 составляет 0%. Уровень ядерной экспрессии р53 в строме до 1%. В желтом теле яркая экспрессия р53 составляет 3-4% (Фиг. 7).
В результате внутримышечного введения фулвестранта в дозе 200 мкг/кг массы беременной мыши установлено, что яичник значительно увеличен в размерах. Корковое и мозговое вещество плохо дифференцируются. Значительное уменьшение примордиальных фолликулов, сохраненные фолликулы с признаками атрофии и дистрофии. Присутствуют кистозные изменения во вторичных фолликулах (4). Структуры третичных фолликулов и желтых тел не определяются. Диффузная инфильтрация яичника, процесс распространяется на прилежащую жировую ткань (10). Площадь яичника представлена большим количеством полостей, выстланных однослойным, резко уплощенным эпителием с признаками выраженной белковой дистрофии (11) и фокальными некрозами клеток (12). Умеренное полнокровие сосудов мозгового вещества с очаговым фибриноидным некрозом сосудов (13). Слой теки расширен за счет выраженного фиброза и отека (Фиг. 4).
В фолликулах определяется яркая экспрессия р53 до 40-50%. В желтых телах - ядерная экспрессия р53 до 6-7%). (Фиг. 8)
Полученные данные выявляют наличие положительной корреляции между повышенным уровнем антагонистов половых гормонов (антиэстрогенов) в период пренатального развития и структурно-функциональными изменениями в яичниках потомства женского пола в позднем постнатальном онтогенезе.
Таким образом, фулвестрант в дозировке 20 мкг/кг вызывает выраженный стимулирующий эффект за счет блокады эстрогеновых рецепторов и активации обратной связи в гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системе. Субтоксическая дозировка фулвестранта в дозе 100 мкг/кг массы мыши на 11 сутки пренатального периода занимает промежуточное положение, так как сочетаются признаки атрофии и умеренной активности.
При этом введение фулвестранта в дозе 200 мкг/кг массы мыши на 11 сутки пренатального периода является токсической дозировкой и помимо атрофических процессов вызывает некробиотические процессы (кистозное расширение фолликулов, очаговые некрозы в тканях яичников).
Таким образом, введение фулвестранта в дозе 100 мкг/кг массы мыши на 11 сутки пренатального периода оказывает проканцерогенный с точки зрения морфологических и иммуногистохимических изменений эффект на репродуктивную систему потомства лабораторных мышей, с одной стороны не вызывая необратимые изменения в тканях яичников, такие как большое количество желтых тел, расположенных по всему периметру яичника, уменьшение или отсутствие первичных, вторичных и третичных фолликул, отсутствие которых приводит к бесплодию на основе патоморфологических критериев, определяемых на светооптическом уровне, как при введении в дозе 200 мкг/кг, но в то же время резко повышая иммуногистохимические показатели, свидетельствующие о проканцерогенных изменениях на молекулярно-генетическом уровне, наиболее отчетливо проявляющихся в выраженном повышении активности белка-онкосупрессора Р53.