Возрастные особенности влияния утф на сократительную активность миокарда крыс в раннем постнатальном онтогенезе

ВЕСТНИК ТГГПУ. 2010. №3

УДК 612.17

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ УТФ НА СОКРАТИТЕЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МИОКАРДА КРЫС В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ

© Ф.Г.Ситдиков, Т. А. Аникина, И.Н.Трофимова

В статье исследуется влияние УТФ в концентрациях 10"10-10"6М на сократительную активность миокарда крыс 7-100-суточного возраста. При анализе изометрического сокращения полосок миокарда установлено, что УТФ вызывает отрицательный инотропный эффект. Физиологические концентрации внеклеточной УТФ вызывают больший ингибирующий эффект в сократительной активности миокарда у 21- и 100-суточных крыс по сравнению с 7-суточными животными.

Ключевые слова: пуринорецепторы, Р2У-рецепторы, миокард УТФ, сердце, онтогенез.

Кроме хорошо известной роли аденозинтри-фосфорной кислоты (АТФ) как внутриклеточного энергетического субстрата известно, что внеклеточная АТФ может регулировать многие внутриклеточные процессы через специфические Р2-пуриноцепторы. По результатам, ранее полученным в лаборатории "Возрастная физиология сердца" ТГГПУ, стойкий аналог АТФ - 2-метилтиоАТФ вызывает дозозависимое увеличение сократительной активности миокарда предсердий и желудочков у крыс в постнатальном онтогенезе. Концентрации агониста, вызывающие положительную инотропию от 7- к 100-суточному возрасту, повышаются, что указывает на более высокую чувствительность миокарда к агонистам Р2Х - пуринорецепторов на ранних этапах постнатального онтогенеза - 7-, 14- и 21-суточные животные [1].

Известно, что уридин-5‘-трифосфат (УТФ) -пиримидиновый нуклеотид - так же, как и АТФ, находится в клетке и выполняет роль источника энергии, обеспечивая жизнедеятельность клетки. В настоящее время доказано, что УТФ, как и АТФ, выполняет функцию сигнальной молекулы и находится в везикулах вместе с основным медиатором, участвует в передаче нервных импульсов, выполняя функции котрансмиттера [2].

Метаболизм пиримидиновых нуклеотидов в сердце на сегодняшний день изучен очень мало. Концентрация этих нуклеотидов в миокарде очень низка [3]. Известно, что содержание ура-циловых нуклеотидов в миокарде ниже по сравнению с адениновыми нуклеотидами, т.е. с АТФ. Соотношение АТФ и УТФ в сердце соответствует 1 к 10 [4]. По мнению других авторов, содержание УТФ в миокарде составляет 1,7 ммоль на грамм белка, что примерно в 16 раз меньше содержания АТФ в кардиомиоцитах [5]. Во внеклеточную среду УТФ выделяется при разрушении эпителиальных и гладкомышечных клеток сосу-

дов [3]. Показано, что УТФ выделяется в большей степени из кардиомиоцитов при гибели клеток, т.е. при различных патофизиологических условиях, например, ишемии, гипоксии, инфаркте миокарда и аритмии сердца [6; 7].

Присутствие внеклеточной УТФ считается доказанным, и несколько подтипов Р2У-рецепто-ров активируются урациловыми нуклеотидами [5]. Р2У-рецепторы - это метаботропные рецепторы, которые состоят из 7 трансмембранных белков, пронизывающих клеточную мембрану (рис. 1). В настоящее время известно 8 подтипов Р2У-рецепторов, которые чувствительны к пуриновым и пиримидиновым нуклеотидам [8]. Это Р2У 1,2,4,6,11,12,13,14 подтипы.

Все Р2У-рецепторы фармакологически разделены на 3 группы по чувствительности к агонистам. Первая группа (Р2УЬ Р2Уц, Р2У!2 и Р2У13) активируется адениннуклеотидами, т.е. АТФ и АДФ. Вторая группа (Р2У6) стимулируется урацилнуклеотидами УТФ и УДФ и третья группа (Р2У2 и Р2У4) отвечает на оба нуклеотида: урациловый и адениновый [5; 9; 10].

Л п

Снаружи клетки

аиц/

Клеточная мембрана

Влуїри метки

СОО]!

Рис.1. Молекулярная структура Р2У- рецепторов [15]

В целом в тканях сердца, в сердечных мио-фибробластах [5; 9; 10; 11], отдельных кардиомиоцитах [5; 10; 12], эндотелиальных и гладкомышечных клетках сосудов [13] показано присутствие Р2Уі,2,4,6,ц,і2,із подтипов рецепторов.

Р2У2-, Р2У4- и Р2У6 подтипы рецепторов активируются уридин-5’-трифосфат (УТФ).

Методом иммуногистохимии показано, что локализация Р2У-рецепторов в целом сердце имеет возрастные особенности. Так, в целом в тканях сердца неонатальных крыс наиболее распространены Р2У6 рецепторы [5; 12]. На отдельных кардиомиоцитах и сердечных миофибробла-стах неонатальных животных были найдены P2Yi-, P2Y2-, P2Y4-, Р2Уб- и Р2У„-подтипы рецепторов [10, 12]. В то время как у взрослых животных Р2У4-подтипа рецепторов обнаружено не было [12, 14]. Следует отметить, что онтогенетический аспект функционирования Р2У-рецепто-ров практически не изучен и затрагивает только неонатальный период развития.

Целью нашего исследования явилось изучение влияния УТФ разных концентраций на сократительную активность миокарда крыс в раннем постнатальном онтогенезе.

Методика исследования

Сократительную активность миокарда в эксперименте in vitro изучали на полосках миокарда белых крыс 7-, 21- и 100-суточного возраста. В своих экспериментах мы придерживались общепринятой в настоящее время классификации по-стнатального развития белых лабораторных крыс: 7-суточные крысята считаются новорожденными, это ранний молочный период. 21-суточные относятся к позднему молочному периоду. По полученным в нашей лаборатории результатам, в этом возрасте происходит становление симпатической регуляции сердца, зафиксированы максимальные значения частоты сердечных сокращений [16; 17]. 100-суточные - это половозрелые животные.

Определение реакции сократительной функции миокарда на УТФ проводили в трех последовательно возрастающих концентрациях на установке "PowerLab" ("ADInstruments") с датчиком силы "MLT 050/D" ("ADInstruments").

Все эксперименты на изолированных полосках миокарда проводились с соблюдением био-этических правил. У наркотизированных животных сердце быстро извлекали и помещали в чашку Петри с оксигенированным рабочим раствором при подключенном стимуляторе "ЭСЛ-2". Далее препарировали полоски миокарда. Препарат фиксировали вертикально одним концом к датчику силы, другим - к точке опоры, затем каждый препарат погружали в отдельный резервуар, в который подавался рабочий раствор (мкмоль/л: NaCl - 119.8, КС1 - 5.4, СаС12 - 1.8, MgCl2 - 1.05, NaHPO4 - 0.42, глюкоза - 5.05) с кислородом (95% О2 и 5% СО2). Для поддержания рН в пределах 7.3-7.4 в раствор добавляли

основной и кислотный буферы Trizma ("Sigma"). Полоски стимулировались через платиновые электроды с частотой 6 и 10 стимулов для 7- и 21-, 100-суточных животных соответственно,

длительностью 5 мс.

Запись кривой регистрировали на персональном компьютере при помощи программного обеспечения "Chart 5.0". После погружения препаратов в резервуары следовал "период приработки" в течение 40-60 мин. По окончании приработки 10 мин регистрировали исходные параметры сокращения, затем в течение 30 мин с добавлением в рабочий раствор УТФ одной из концентраций. Агонист Р2У-рецепторов УТФ ("Sigma") добавляли в различных концентрациях и оценивали изменения сокращений полосок миокарда крыс. По окончании стимуляции УТФ препараты трехкратно отмывали рабочим раствором в течение 10 мин и регистрировали исходные показатели для каждой последующей дозы. Рассчитывали реакцию силы сокращения в ответ на УТФ в процентах от исходной, которые принимали за 100%. Достоверность различий рассчитывали по параметрическому парному и непарному t критерию Стьюдента, достоверными считались результаты при р<0,05.

Результаты исследования

В последние годы был найден высокочувствительный метод, позволяющий определить концентрацию внеклеточной УТФ, содержание которой соответствует субнаномолярной концентрации [4, 18, 19]. Поэтому для изучения дозозависимого эффекта мы выбрали диапазон концентраций от 10-6 до 10-10 М.

Экзогенная УТФ в концентрации 10-10-10-6 М привела к возникновению отрицательного ино-тропного эффекта у 7-, 21- и 100-суточных животных в предсердиях и в желудочках.

У 7-суточных крыс УТФ в концентрации 10-6 М уменьшает силу сокращения миокарда на 5,9±1,39% в предсердиях и на 8,4±2,44% в желудочках, что является достоверным по отношению к контролю. В концентрации 10-7 М при действии агониста сила сокращения миокарда уменьшается на 7,6±2,33% в предсердиях и на 6,9±1,31% в желудочках

У 21-суточных крысят концентрации агониста от 10-6 М до 10-10 М также уменьшает сократительную активность миокарда. УТФ в концентрации 10-10 М уменьшает силу сокращения пре-

парата на 19,4±2,32% в предсердиях и на 22±3,41% в желудочках (р<0,05). Агонист в концентрации 10-8 М, 10-7 М и 10-6 М в предсердиях снижает силу сокращения миокарда на 17,3±2,21%, 20±1,74% и 15±2,7% соответственно (р<0,05). УТФ в концентрации 10-8 и 10-7 М в желудочках уменьшает сократительную активность миокарда на 17,7±2,70% и 13,4±2,09% соответственно (р<0,05), а в концентрации 10-6 М наблюдаются незначительные изменения (рис.3.).

У взрослых крыс УТФ выше названных концентраций также приводит к развитию отрицательной инотропии. Максимальный сократительный эффект УТФ у взрослых крыс вызывает в концентрациях 10-10 и 10-6 в предсердиях на 20,6±5,4% и 19,3±4,5% соответственно (р<0,05). Агонист в концентрации 10-8 М снижает силу сокращения в предсердиях на 13±1,45%, а в желудочках на 12,8±1,93% (р<0,05). УТФ в концентрации 10-7 М уменьшает сократительную активность миокарда предсердий на 11±2,9%, а в желудочках на 15,4±1,51% (р<0,05) (рис.4).

- -*

-4-

-10 -8 '9 1УТФ’ М -7 -6

- ♦ -предсердия И желудочки

контроль -10 -8 -7 -6

предсердия д [УТФ, М] Щ желудочки

Рис.2. Влияние УТФ на сократительную активность миокарда предсердий и желудочков крыс 7-суточного возраста

-10 -8 'д [УТФ, М] -7

предсердия ижелудочки

Рис.3. Влияние УТФ на сократительную активность миокарда предсердий и желудочков крыс 21-суточного возраста

10 -8 9 [УТФ, М] -7

предсердия ижелудочки

Рис.4. Влияние УТФ на сократительную активность миокарда предсердий и желудочков взрослых крыс

Следует отметить, что физиологические концентрации внеклеточной УТФ (10-8 и 10-7 М) вызывают больший эффект в сократительной активности миокарда у 21- и 100-суточных животных по сравнению с 7-суточными (р<0.05).

В литературе показано разнонаправленное влияние УТФ на деятельность сердца. Так, УТФ

%

%

100

95

90

85

80

75

70

100

%

95

*

*

90

85

80

75

70

%

100

95

90

85

95

80

90

75

85

70

80

75

70

в концентрации 10"6-10"3 М вызывает снижение силы сокращения миокарда ушка правого предсердия на 7-10% [20]. Увеличение сократимости миокарда крыс при действии УТФ описывают [5; 9; 10; 21]. Двойной эффект при добавлении УТФ на сократимость миокарда предсердий и желудочков крыс описывает Froldi [22]. В последние годы появились исследования, которые посвящены изучению защитного (протекторного) влияния УТФ, где показано увеличение диастолического давления, скорости кровотока при добавлении УТФ на фоне развития ишемии сердца [6; 23; 24; 26]. Следует отметить, что эти результаты получены при использовании агониста в концентрации на 2 порядка больше, чем необходимо для активации Р2У2-рецепторов [7], и используемая концентрация УТФ больше соответствует патофизиологической, чем физиологической [7]. Увеличение внеклеточной УТФ наблюдается при ишемии, коронарной окклюзии, гипоксии, то есть состояниях, сопровождающихся гибелью клеток и выходом внеклеточных АТФ и УТФ и последующей активацией Р2-пуринорецепторов.

Большая часть Р2У-рецепторов (Р2У1,2,4,6,и) связана с Gq/n-белком, который активирует фос-фолипазу С, образованием инозитолфосфата и увеличением Са2+ в клетке и последующим увеличением силы сокращения миокарда [10]. Отрицательный инотропный эффект может наблюдаться в ряде случаев при возбуждении и Р2У2-, и Р2У4-подтипа рецепторов, которые активируются АТФ и УТФ и связаны с Gi/o белком. УТФ через активацию Gi/о белка ингибирует аденилат циклазу, снижает образование цАМФ и уменьшает поступление Са2+ в клетку, вызывая уменьшение сократимости миокарда [10]. Положительный инотропный эффект при использовании высоких концентраций УТФ (3-100 цм) возможно активирует не только Р2У2,46-рецепторы, но и Р2У1- и Р2У11-рецепторы, для которых УТФ является слабым, но агонистом [24; 25].

1. Аникина Т.А. Пуринергическая регуляция сердца крыс в постнатальном онтогенезе: Автореф. дис. ... д-ра биолог. наук: 03.00.13. - Казань. - 2009. -35 с.

2. Abbracchio M.P., Burnctock G., Boeynaems J-M. Update and subclassification of the Р2У G-protein-coupled nucleotide receptors; From moleclular mechanisms and pathophysiolody to therapy // Pharmacological Reviews. - 2006. - V.58. - P.281-341.

3. Rossi A. and Olivares J. Basis of pyrimidine nucleotide metabolism in the myocardium // Cardiovascular Druds and Therapy. - 1998. - Vol.12. - Р.171-177.

4. Lazarowski ER and Harder TK. Quantitation of extracellular UTP using a sensitive enzymatic assay // Biochem Pharmacol. - 1999. - Vol. 127. - P. 12721278.

5. Vassort G. Adenosine 5'-Triphosphate: a P2-Purinergic Agonist in the Myocardium // Physiol. Rev. - 2001. - Vol.81. - No.2. - P.767-806.

6. Yitzhaki S., Shneyvays V., Jacobson KA. and Shain-berg A. Involvement of uracil nucleotides in protection of cardiomyocytes from hypoxic stress // Bio-chem Pharmacol. - 2005. - Vol.69. - P.1215-1223.

7. Yitzhaki S., Shainberg A., Cheporko Y., Vidne BA., Sagie A., Jacobson KA. Uridine-5-triphosphate (UTP) reduces infarct size and improves rat heart function after myocardial infarct // Biochem Pharmacol. - 2006. - Vol.72. - P.949-955.

8. Burnstock G. Purines and Purinoceptors: Molecular Biology Overview. In: Squire LR (ed.) // Encyclopedia of Neuroscience. - 2009. - Vol.7. - Р.1253-1262.

9. Von Кьgelgen I. Pharmacological profiles of cloned mammalian P2Y-receptor subtypes // Pharmacol Ther. - 2006. - Vol.110. - P.415-432.

10. Talasila A., Germack R. and Dickenson J. Characterization of P2Y receptor subtypes functionally expressed on neonatal rat cardiac myofibroblasts // Dritish jornal of pharmacology. - 2009. - Vol.158. -P.339-353.

11. Zheng JS., O'Neill L., Long X., Webb TE., Barnard EA., Lakatta EG. Stimulation of P2Y receptors activates c-fos gene expression and inhibits DNA synthesis in cultured cardiac fibroblasts // Cardiovasc Res. -1998. - Vol.37. - P.718-728.

12. Webb T.E., BoluytM.O., BarnardE.A. Molecular biology of P2Y purinoceptors: Expression in heart // J. Auton. Pharmacol. - 1996. -Vol.16. - P.303-307.

13. Wang LW., Karlsson L., Moses S., Hultgardh-Nilsson A., Andersson M., Borna C., Gudbjartsson T., Jern S. and Erlinge D. P2 receptor expression profiles in human vascular smooth muscle and endothelial cells // J. Cardiovasc Pharmacol. - 2002. - Vol.40. -P.841-853.

14. Shacher J.B., Sromek S.M., Nicholas A.A. Human embryonic kidney cells endogenously expess the P2Y1 and P2Y2 receptoss // Europharmacology. -1997. - Vol.36. - P.1181-1187.

15. Зиганшин А.У. Роль рецепторов АТФ (Р2-рецепторов) в нервной системе // Неврологический вестник. - 2005. - Т.ХХХУП. - Вып.1-2. -С.45-53.

16. Зефиров Т.Л. Нервная регуляция сердечного ритма крыс в постнатальном онтогенезе: Дис. ... д-ра мед. наук: 14.00.17. - Казань. - 1998. - 535 с.

17. Ситдиков Ф.Г., Аникина Т.А., Гильмутдинова Р.И. Адренергические и холинергические факторы регуляции сердца в онтогенезе у крыс // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1998. - №9. - С.318-320.

18. Huang C.E., Cruz-Reyes J., Zhelonkina A.G., O’Hean S., Wirtz E., Sollner-Webb B. Roles for ligases in the RNA editing complex of Trypanosoma brucei: band IV is needed for U-deletion and RNA repair // EMBO. - 2001. - Vol.20. - Р.4694-4703.

volved? // Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol. - 1995. - Vol.349. - P.381-386.

23. Ninomiya H., Otani H., Lu K., Uchiyama T., Kido M. and Imamura H. Enhanced IPC by activation of pertussis toxin-sensitive and -insensitive G-protein-coupled purinoreceptors // Am J. Physiol. - 2002. -Vol.282. - P.1933-1943.

24. Von ^gelgen I. Pharmacology of mammalian P2X-and P2Y-receptors // Review. - 2008. - No.3/9.

25. Jacobson K.A., Jarvis M.F. And Williams M. Purine and pyrimidine (P2) receptors as drug targets // J Med Chem. - 2002. - Vol.45. - P.4057-4093.

26. Wee S., Peart J.N., Headrick J.P. P2 purinoceptor-mediated cardioprotection in ischemic-reperfused mouse heart // J Pharmacol Exp Ther. - 2007. -Vol.323(3). - P.861-867.

THE INFLUENCE OF UTP ON CONTRACTILE ACTIVITY OF MYOCARDIUM OF RATS IN ONTOGENY

T.A.Anikina, F.G.Sitdikov, I.N.Trofimova

The effect of UTP in concentration 10-10-10-6 М on contractile activity of a myocardium was studied in 7100-day-old rats. The analysis of isometric contraction of myocardial strips demonstrated negative inotropic effect of UTP. Physiological concentration of extracellular UTP causes the most inhibition effect on contractile activity of myocardium of 21- and 100-day rats, in comparison with 7-day animals.

Key words: purinoreceptors, P2Y-receptors, UTP myocardial, heart, ontogeny.

Ситдиков Фарит Габдулхакович - доктор биологических наук, профессор кафедры анатомии и физиологии Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.

E-mail: fgsitdikov@mail.ru

Аникина Татьяна Андреевна - доктор биологических наук, доцент кафедры анатомии и физиологии Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.

E-mail: Tania57vg1@rambler.ru

Трофимова Ирина Николаевна - аспирант кафедры анатомии и физиологии Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета.

19. Lazarowski E.R., Shea D.A., Boucher R.C., Harden T.K. Release of cellular UDP-glucose as a potential extracellular signaling molecule // Mol. Pharmacol. -2003. - Vol.63. - Р.1190-1197.

20. Рычков А.В. Влияние температуры на пуриноре-цептор-опосредуемые сократительные ответы гладкой и сердечной мышц: Автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.25. - Казань, 2007. - 21 с.

21. Froldi G., Ragazzi E., Caparrotta L. Do ATP and UTP involve cGMP in positive onotropism on rat atria? // Comp biochem physiol c toxicol pharmacol. - 2001. - Vol.128. - P.265-274.

22. Froldi G., Pandolfo L., Chinellato A., Ragazzi E., Caparrotta L., and Fassina G. Dual effect of ATP and UTP on rat atria: which types of receptors are in-

E-mail: irina171185@rambler.ru