Влияние тиолов на пероксидазную реакцию окисления о-дианизидина

УДК 577.152.18

Е. А. Флюрик, ассистент (БГТУ); В. Н. Леонтьев, доцент (БГТУ);

О. Г. Буткевич, студентка

ВЛИЯНИЕ ТИОЛОВ НА ПЕРОКСИДАЗНУЮ РЕАКЦИЮ ОКИСЛЕНИЯ

О-ДИАНИЗИДИНА

Статья посвящена изучению кинетики реакции пероксидазного окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии тиолов (Р-меркаптоэтанола и дитиоэритритола). Приведены результаты кинетических исследований. Установлено, что реакция пероксидазного окисления о-дианизидина ингибируется на 50% при концентрациях ингибиторов 250,0 мкМ (Р-меркапто-этанол) и 7,0 мкМ (дитиоэритритол). Установлен сложный характер ингибирования реакции пе-роксидазного окисления о-дианизидина тиолами разного строения.

The article covers the studying of the kinetic of the reaction of peroxidase oxidation of

o-dianisidine by hydrogen peroxide in the presence of thiols (P-mercaptoethanol and ditioeritritola). The results of the kinetic studies is shown. It was found that the rate of the reaction of peroxidase oxidation of o-dianisidine was inhibited by 50% at the concentration of inhibitor (P-mercaptoethanol) equal to 250,0 mkM, and at the concentration of inhibitor (ditioeritritola) equal to 7,0 mkM. In addition, the studies enabled to confirm the assumption about the complex nature of the inhibition by thiols of the different structure of the reaction of peroxidase oxidation of o-dianisidine.

Введение. Пероксидаза - один из весьма распространенных ферментов, интерес к изучению которого с годами не ослабевает. Повсеместное присутствие этого фермента в растительных и животных тканях, а также в составе первичных метаболитов грибов и бактерий дает основание считать его жизненно важным белком высших и низших организмов. Он является индуцибельным, реагирует на самые разнообразные воздействия, изменяя при этом набор своих изоэнзимов либо повышая активность уже присутствующих молекулярных форм.

Корневище хрена издавна используется в народной медицине как противовоспалительное, мочегонное, раздражающее, витаминное, отхаркивающее, фитонцидное, противоцинготное, противомикробное и противогрибкое средство.

Пероксидаза хрена (КФ 1.11.1.7) (рис. 1) является одним из наиболее изученных ферментов своего класса [1].

Пероксидаза хрена - самый популярный биоаналитический фермент, который позволяет детектировать перекись водорода и ферменты, ее производящие [3], кроме того, широко применяется в аналитической биохимии и биотехнологии в качестве маркера антител и различных антигенов [4, 5].

Хотя пероксидазы обнаруживаются в тканях практически всех растений, в настоящее время основным источником коммерчески доступной пероксидазы являются корни хрена (Агтогааа гшНеапа) [6].

В свойствах и действии различных перокси-даз много общего, хотя и имеются некоторые специфические особенности в отдельных стадиях катализируемых ими процессов. Пероксидаза окисляет полифенолы и некоторые ароматические амины. Многие органические соединения,

реагируя с кислородом воздуха, образуют пероксиды. Например, хинон, образующийся при окислении полифенола кислородом воздуха, может существовать как в хиноидной, так и в перекисной форме. Особенно легко пероксиды образуются при окислении кислородом воздуха соединений, имеющих непредельные связи между двумя атомами углерода: терпенов, ненасыщенных жирных кислот, каротиноидов. Пероксиды этих соединений под действием перок-сидазы окисляют полифенолы. Многочисленные фенолы, аминофенолы и некоторые аминокислоты подвергаются дегидрированию.

Рис 1. Общий вид молекулы пероксидазы хрена со стороны входа в активный центр, формируемого четырьмя остатками фенилаланина [2]

Многообразие субстратов позволяет предположить, что в реакциях пероксидазного окис-

ления могут реализовываться различные механизмы действия фермента [7, 8].

Ингибиторами фермента является целый комплекс соединений: натрий азид, цианин, L-цис-теин, бихромат, этилентиомочевина, гидроксил-амин, сульфиды, ванадат, n-аминобензойная кислота, Cd+2, Co+2, Cu+2, Fe+3, Mn+2, Ni+2, Pb+2 [9, 10].

Целью настоящей работы явилось изучение кинетики реакции пероксидазного окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии тиолов.

Основная часть. В работе использовали о-дианизидин марки «ч» («Реахим», Россия), пе-роксидазу хрена со спектральным показателем чистоты Е403 / Е278 = RZ = 0,45.

Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при X = 403 нм (в = = 10,2 • 10 М-1 • см-1). Известно, что концентрированные растворы пероксидазы окрашены в коричневый цвет и имеют характерные полосы поглощения при 403, 498, 548, 583 и б40 нм. Наиболее интенсивная полоса наблюдается при 403 нм (полоса Соре) [3].

Концентрацию перекиси водорода («Реа-хим», Россия) определяли спектрофотометрически при X = 230 нм (в = 72,7 М-1 • см-1) [11].

Физиологический раствор (0,1 мМ) - 0,18 г NaCl растворяли в 20,0 cм3 воды.

Растворы о-дианизидина необходимых концентраций готовили в этаноле по навеске.

Для приготовления растворов использовали бидистиллированную воду.

Конечные концентрации реагентов в разных сериях экспериментов указаны в подписях к рис. 2-4.

Реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода проводили при 20°С в физиологическом растворе.

В кварцевую кювету (l = 1,0 см) последовательно вносили 2,0 см3 физиологического раствора, 0,1 см3 спиртового раствора о-дианизидина и 0,3 см3 раствора пероксидазы. Реакцию инициировали добавлением 0,1 см3 перекиси водорода. Кинетические кривые регистрировали при непрерывном перемешивании на спектрофотометре SPECORD М40 (Carl Zeiss, ГДР) по изменению экстинкции при 4б0 нм (в = 3,0 • 104 М-1 • см-1) [11].

0,0

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

Концентрация о-дианизидина, мкМ

1/V, мин/мкМ 1

y = 0,0117x + 0,2897

-25,0

15,0

35 01^s, мкМ-1

а б

Рис. 2. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина от его начальной концентрации (а); б - то же в координатах Лайнуивера-Берка. Условия: 20°С; рН б,1; 0,05 мМ перекись водорода; 0,0б мкМ активных центров пероксидазы

Концентрация меркаптоэтанола, мМ

Рис. 3. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина от концентрации р-меркаптоэтанола. Условия: 20°С; рН б,1; 0,15 мМ перекись водорода; 0,09 мкМ активных центров пероксидазы; 0,09 мкМ о-дианизидин

Концентрация о-дианизидина, мкМ

Рис. 4. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина от концентрации ДЭТ.

Условия: 20°С; рН б,1; 0,003 мМ перекись водорода; 0,07 мкМ активных центров пероксидазы; 0,12 мМ о-дианизидин

При изучении влияния тиолов на скорость протекания реакции в кварцевую кювету вносили 0,1 см3 раствора Р-меркаптоэтанола или дитио-эритритола (ДЭТ) определенной концентрации.

Начальные скорости реакции определяли как тангенс угла наклона касательной к началу кинетической кривой. Расчет проводили с помощью пакета программ «Kinetiks» спектрофотометра SPECORD М40 (Carl Zeiss, ГДР).

Зависимость начальной скорости перокси-дазного окисления о-дианизидина от его начальной концентрации представлена на рис. 2, а.

Лианеризация кривой в координатах Лай-нуивера-Берка (рис. 2, б) позволяет сделать вывод о том, что пероксидазное окисление о-дианизидина пероксидазой подчиняется

уравнению Михаэлиса-Ментен. Установлено, что константа Михаэлиса (Km) этой реакции составляет 0,04 мкМ, а максимальная скорость реакции (Vmax) - 3,3 мкМ/мин. Полученные значения согласуются с литературными данными [8].

Дальнейшая работа была направлена на изучение влияния тиолов на скорость протекания ферментативной реакции окисления о-дианизидина пероксидазой хрена (рис. 3).

Установили, что скорость реакции ингибируется на 50% (I50) при концентрации ингибитора (Р-меркаптоэтанола), равной 250,0 мкМ [12], и концентрации ДЭТ - 7,0 мкМ (рис. 4).

Заключение. Выполнены кинетические исследования окисления о-дианизидина перекисью водорода, катализируемого пероксидазой хрена с показателем оптической чистоты Rz = 0,45. Установлено, что Кт = 0,04 мкМ и Vmax = 3,3 мкМ/мин.

Изучено влияние Р-меркаптоэтанола и ДЭТ на ферментативное окисление о-дианизидина. Реакция пероксидазного окисления о-дианизи-дина ингибируется на 50% при концентрациях ингибиторов 250,0 мкМ (Р-меркаптоэтанол) и 7,0 мкМ (ДЭТ).

Исследования позволили подтвердить возможность использования пероксидаз для окисления тиолов.

Литература

1. Александрова, Е. Ю. Изучение перокси-дазной активности в экстрактах из корневища и корней хрена и ее стабильность к различным воздействиям / Е. Ю. Александрова, М. А. Орлова, П. Л. Нейман // Вестн. моск. ун-та. - 2006. -Т. 47, № 5. - С. 350-352.

2. Газарян, И. Г. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений / И. Г. Газарян, Д. М. Хушпульян, В. И. Тишков // Успехи биол. химии. - 2006. - Т. 46. - С. 303-322.

3. Иванова, Т. М. О природе фенолоксидаз-ного действия пероксидазы / Т. М. Иванова,

Б. А. Рубин // Биохимия. - 1962. - Т. 27, № 4. -С. 622-630.

4. Карамышев, А. В. Колориметрическое определение пероксидазной активности в присутствии полианиона / А. В. Карамышев, Т. В. Ступ-никова, И. Ю. Сахаров // Журн. аналит. химии. -2008. - Т. 63, № 1. - С. 36-39.

5. Григоренко, В. Г. Получение, свойства и применение рекомбинантной пероксидазы хрена: автореф. дис. ... канд. хим. наук: 03.00.23 / В. Г. Григоренко; Моск. госуд. ун-т им. М. В. Ломоносова. - М., 2001. - 26 с.

6. Алпеева, И. С. Анионные пероксидазы и их применение в биоанализе: автореф. дис. . канд. хим. наук: 02.00.15, 03.00.23 / И. С. Алпее-ва; Моск. госуд. ун-т им. М. В. Ломоносова. -М., 2007. - 27 с.

7. Рогожина, Т. В. Исследование активного центра и механизма действия пероксидазы с помощью функционально активных веществ: автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.04 / Т. В. Рогожина; Якут. госуд. сельскохоз. акад. -Саратов, 2005. - 21 с.

8. Лебедева, О. В. Влияние никотинамида-дениндинуклеотида на кинетику реакции пе-роксидазного окисления ферроцианида калия / О. В. Лебедева // Вестн. моск. ун-та. - 2000. -Т. 41, № 3. - С. 195-198.

9. Карасева, Е. И. Пероксидазное окисление

3, 3', 5, 5'-тетраметилбензидина в присутствии

2, 4-динитрозорезорцина и полисульфанов резорцина и 2, 4-динитрозорезорцина / Е. И. Карасева, Ю. П. Лосев, Д. И. Метелица // Биоорган. химия. - 2002. - Т. 28, № 2. - С. 147-155.

10. Ферментативное определение ингибито-

ров пероксидаз и алкогольдегидрогеназ различного происхождения / Т. Н. Шеховцова [и др.] // Химия и компьют. моделирование. [Электронный ресурс]. - 2002. - Режим доступа: http://chem.kstu.ru/but1erov_comm/vo13/cd-

а5Ма1а/)сЬет&с8/ги881ап/п9/арр19/апаП12001^£/ 1ach2.pdf. - Дата доступа: 15.01.2010.

11. Лебедева, О. В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидна перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена / О. В. Лебедева, Н. Н. Угарова, И. В. Березин // Биохимия. - 1977. - Т. 42, № 8. - С. 1372-1379.

12. Буткевич, О. Г. Кинетика пероксидазной реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии Р-меркаптоэтанола / О. Г. Буткевич, Е. А. Флюрик // Наука - шаг в будущее [Электронный ресурс] : материалы 3-й науч. конф. студентов, магистрантов и аспирантов факультета «Технология органических веществ». - Минск, 3-4 дек. 2009 г. / Белорус. гос. технол. ун-т. - Минск, 2009. - С. 19-20. -Электрон. дан. (17 Мб). - Минск, 2009 г. -

1 электрон. опт. диск (СБ-ЯОМ).

Поступила 26.03.2010