Исследование экспрессии и анализ функции гена Sip1 в развитии коры головного мозга

Оригинальные исследования

Исследование экспрессии и анализ функции гена 5/р7 в развитии коры головного мозга

АС. Поляков, Л.И. Корочкин , Г.В. Павлова

Лаборатория нейрогенетики и генетики развития Институт биологии гена РАН, Москва

Investigation of expression and analysis of function of Sip 1 gene in cerebral cortex development

AS. Polyakov, \ L.l. Korochkin |, G.V. Pavlova Laboratory of neurogenetics and genetics of development Institute of Gene Biology, RAS, Moscow

Недавно описанный ген Sip1 относится к транскрипционным факторам семейства ZFHX1 позвоночных. Используя методы in situ гибридизации и иммуноокрашивания, мы изучили экспрессию гена Sip1 в эмбриогенезе. Начиная с 12-го дня эмбрионального развития мыши, транскрипты Sip1 присутствуют в ряде структур центральной нервной системы: кортикальная пластинка головного мозга, вентрикулярная зона базального ганглия, таламус, варолиев мост, средний мозг, специфические ядра ствола мозга и дорзальная часть спинного мозга. Во взрослой ткани мозга экспрессия Sip1 обнаруживается в гиппокампе, зубчатой извилине и белом веществе. В коре головного мозга экспрессия гена Sip1 обнаруживает региональную специфичность. Мыши с инактивированным геном Sip1 в неокортексе характеризуются отсутствием медиальной части коры. Посредством анализа экспрессии генов и морфологии мозга установлено, что при отсутствии Sip1 зоны гиппокампа нормально специфицируются в ходе развития. Анализ пролиферации клеток гиппокампа мутантов Sip1 не выявил изменений в активности. Посредством окрашивания по протоколу TUNEL был выявлен высокий уровень клеточной смерти в ткани гиппокампа у мышей, мутированных по гену Sip1.

Данные результаты доказывают важность выполняемой геном Sip1 функции для нормального развития гиппокампа и зубчатой извилины.

Ключевые слова: Sip1, эмбриогенез, кортикальная пластинка, головной мозг.

Expression of SMAD interacting protein 1 [Sip1} during mouse CNS development was studied by in situ hybridization and immunohistochemistry. Starting at E12.5, Sip1 transcripts are present in a regionalized fashion and persist throughout development. Sip1 is expressed in the cortical plate, ventricular zone of the basal ganglia, thalamus, pons and midbrain, specific nuclei of the brain stem and in the dorsal part of the spinal cord. In the developing cerebral cortex, Sip1 expression shows regional specificity. In the brain of the adult mice, SIP1 expression is detected mostly in the hippocampus, dentate gyrus and white matter of the neocortex.

We investigated the expression of the Sip1 gene in the brains of newborn reeler mutants. At this stage in the wild type piriform cortex Sip1 expression is found in the most outer part. In the piriform cortex of reeler mutants Sip1 expressing cells were not located in the superficial part but diffused.

Using a Cre/loxP-based approach, we studied the effect of conditional inactivation ofSipl gene. The results provide new evidence for the important role of Sip1 in hippocampal neurogenesis.

Key words: Sip1, embryogenesis, cortical plate, brain.

Введение

В последние годы обнаружена существенная генетичес кая обусловленность поведенческих реакций млекопитающих и человека. Роль наследственности в формировании лично сти оказалась значительно большей, чем это было принято считать. Изучению этой роли способствовало вторжение в неврологию современной молекулярно биологической и моле кулярно генетической техники. Понятно, что при этом особое внимание уделяется тем отделам головного мозга, кото рые играют определяющую роль в детерминации поведения, в первую очередь конечный мозг (теленцефалон).

Основными компонентами теленцефалона являются паллиум (кора головного мозга у млекопитающих) и субпал лиум (базальный ганглий). Функционирование теленцефалона зависит от интегрального взаимодействия с рядом нейро нальных структур, таких как таламус, гипоталамус, «обонятель ный эпителий» и ствол мозга. Данные структуры ответственны как за обработку сенсорной информации, так и за ее интег рацию с ранее установленной памятью (приобретенной и инстинктивной) и последующее формирование поведенчес ких реакций.

Теленцефалон человека это область, где сосредото чены нейральные элементы, ответственные за языковые функции, за контроль двигательной деятельности, сознание и эмоции. Различного рода повреждения данной структуры

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 2, 2007

приводят к специфическим сенсорным, моторным и эмоци ональным расстройствам, к существенным изменениям личности. Теленцефалон контролирует сходные функции в ряду позвоночных. Исследования развития теленцефалона способны ответить на вопросы, касающиеся закономерно стей функционирования и эволюции мозга. Они установят топологическую взаимосвязь регионов теленцефалона и определят гомологию между производными теленцефалона различных животных, раскроют механизмы, обусловливаю щие у человека ряд поведенческих особенностей и заболе ваний, таких как ментальная ретардация, аутизм, эпилепсия и др. Знание о том, как формируется теленцефалон, откроет новые пути в разработке лекарств против некоторых ней рологических и психических расстройств.

До последнего времени исследования развития телен цефалона ограничивались изучением его морфологии. В этой области накоплен значительный фактический мате риал. Однако молекулярно биологические основы развития и функционирования теленцефалона остаются в значитель ной степени непознанными. Некоторый прорыв в опреде лении генов, вовлеченных в развитие теленцефалона, был сделан благодаря применению методов молекулярной ге нетики. Выстраиваются генетические сети, контролирующие особенности создания паттерна и организации обуслов ленных ими поведенческих реакций.

А

И I II II

тп

Оригинальные исследования

Ранее, с помощью метода вычитающей гибридизации нам удалось клонировать ряд транскриптов, дифференци ально экспрессирующихся в коре головного мозга [1, 2].

В данной работе с помощью методов гибридизации in situ и иммуноокрашивания проведен детальный анализ паттер на экспрессии одного из генов [Sip1). Было установлено, что ген Sip1 начинает экспрессироваться рано и имеет диффе ренциальный характер распределения мРНК внутри коры головного мозга.

Белок Sip1 был обнаружен в двугибридной системе как белок, реагирующий с факторами транскрипции Smad [3]. Smad белки являются внутриклеточными медиаторами путей передачи сигнала, запускаемого BMP и TGF Ь. Последние регулируют процессы пролиферации, миграции, дифферен цировки и запрограммированной клеточной гибели в раз витии [4]. Ранее было показано, что инактивация гена ВМР4 приводит к дефектам спецификации клеток медиального региона коры головного мозга [5].

SIP1 является транскрипционным репрессором [6, 7]. Также известно, что Sip1 у пациентов, страдающих недавно описанным синдромом Моуат-Вильсона мутировал. Паци енты обнаруживают такие дефекты как умственная отста лость, микроцефалия, гипертелоризм, задержки в разви тии моторных навыков и эпилептические припадки [8]. Из вышеизложенного следует, что Sip1 играет важную роль в развитии коры головного мозга.

Транскрипты гена SIP1 выявляются во многих тканях очень рано в эмбриональном развитии. Гомозиготы, несу щие мутацию по гену SIP1, обнаруживают ряд дефектов производных нервного гребня уже на Е8.5 и погибают на де сятый день эмбрионального развития (персональное сооб щение D. Huylebroeck).

Вследствие ранней гибели эмбрионов проведение фун кционального анализа гена SIP1 в развитии конечного моз га является невозможным. Для установления роли SIP1 в регуляции развития коры головного мозга была выбрана стратегия тканеспецифической инактивации белкового про дукта гена.

Было показано, что функция данного гена необходима для нормального развития медиального компонента коры голов ного мозга.

Материал и методы

Лабораторные животные

Основная работа проводилась на лабораторной линии мышей NMRA. Функциональный анализ гена Sip1 проводился на мышах со смешанным генетическим фоном C57BL6/ J и CD1. Линия, несущая флоксированный аллель экзона 7 гена Sip1, была представлена в генетическом фоне CD1. Данная линия несет пару 1охР сайтов, фланкирующих экзон 7 гена Sip1. Две тысячи пар нуклеотидов экзона 7 содержат прибли зительно половину от общей последовательности, кодирую щей белок Sip1, включая 4 N концевых домена типа цинко вые пальцы, гомео домен и Smad и CtBP связывающие домены. Индуцируемая Сге рекомбиназой делеция приво дит к сдвигу рамки считывания в последующем экзоне 8 и полной инактивации активной формы белкового продукта гена. Трансгенные линии, несущие Сге рекомбиназу (EmxCre, Six3Cre) поддерживались в генетическом фоне C57BL6/J (F7). Операции по выделению эмбриональной ткани определенной области мозга производили микрохи рургическими пинцетами под бинокулярным микроскопом.

Гибридизация in situ

Подготовку ткани, гибридизацию in situ, а также эмуль сионную авторадиографию проводили по методике, опи санной в [9].

Иммуногистохимический анализ Парафиновые срезы гидратировали, как описано в [9], и постфиксировали в 4% растворе параформальдегида в PBS 5 мин. Преблокировали в растворе 1 % BSA lg free (Sigma)/ 0,1% Tween 20 на PBS 1 час. После преблокировки инкуби ровали 12 часов с первичными антителами (1:500), разве денными в растворе 1 % BSA lg free (Sigma)/0,1 % Tween 20 на PBS. Несвязавшиеся первичные антитела отмывали тре мя сменами PBS. Далее инкубировали со вторичными анти телами (1:500), конъюгированными с HRP (DAKO). Окраска DAB/перекись водорода осуществлялась по стандартному протоколу.

Анализ морфологии посредством окрашивания срезов ткани мозга мыши по протоколу Nissi

Анализ морфологии проводился на парафиновых сре зах. Препараты инкубировали 20 мин. в толуоле для удале ния парафина, гидратировали последовательной сменой растворов 100%; 96%; 90; 80; 70%; 50%; 30% этанола по 2 мин., промывали водой два раза по 5 мин., далее инкубиро вали в течение 20 мин. в 30% растворе сульфида калия. Пос ле промывания водой срезы окрашивали в течение 20 мин. раствором cresyl violet, дважды промывали раствором, со держащим 1 мМ ацетата натрия, 5мМ уксусной кислоты, ин кубировали полминуты в растворе ЮмМ уксусной кислоты и после промывания водой осуществляли дегидратацию тка ни последовательной сменой растворов (30%; 50%; 70%; 80; 90; 96%; 100%) этанола.

Анализ уровня запрограммированной клеточной гибели

Фиксированные ткани, подготовленные, как описано в [9], постепенно переводили в среду для замораживания (Sakura). После отмывки в буфере PBS выделенные ткани переносились в 15% раствор сахарозы, приготовленный на PBS, и инкубировались 12 часов при качании при 4°С, Далее раствор 15% сахарозы меняли на 30% раствор и инкубировали при тех же условиях. Образцы помещали в специальные пластиковые кюветы и замораживали при температуре 80°С.

Срезы толщиной 5 7 мкм помещали на предметные стекла SuperFrost и высушивали на воздухе при 37°С в течение 1 часа. Детекция апоптоза проводилась в соответ ствии со стандартным протоколом Apoptag plus fluorescein in situ apoptosis detection kit (Serologicals Corporation), l/lc пользовались замороженные срезы стадии Е17 толщиной 10 мкм, приготовленные по описанной выше методике.

Результаты и обсуждение

Анализ паттерна экспрессии Sip1 в теленцефалоне

Анализ распределения мРНК гена Sip1 в коре головного мозга мыши показал, что Sip1 начинает экспрессироваться с 12 го дня эмбрионального развития. Транскрипты обна руживаются, главным образом, в зоне кортикальной пластин ки. Позднее, на стадии Е15, помимо кортикальной пластинки продукты гена Sip1 были найдены также в зоне клеточной пролиферации (вентрикулярной зоне) коры головного моз га (ГМ) (рис. 1 А, Б). На 18 й день эмбриогенеза транскрипты гена Sip1 определяются только в кортикальной пластинке (рис. 1В 1 И). В результате анализа распределения мРНК Sip1 на стадии Е18.5 был установлен интересный факт региональная специфичность экспрессии гена Sip1 внутри кортикальной пластинки. В передней части коры большин ство клеток Sip1 позитивны, а в каудальных ее зонах Sip1 экспрессируется только в клетках слоя VI (см. рис. 1 В, Г, К, Л).

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 2, 2007

L_

Оригинальные исследования

Дифференциальный характер экспрессии в коре головного мозга воспроизводится также при иммуноокрашивании ан тителами против белка Sip1 (рис. 10).

В области вентрального теленцефалона экспрессия гена Sip1 также показывает дифференциальный характер. Начи ная с 12 го дня эмбрионального развития экспрессия гена Sip1 обнаруживается, главным образом, в пролиферативной зоне (вентрикулярная и субвентрикулярная зоны базального ганглия), в отличие от дорзальной части теленцефалона, где транскрипты Sip1 были найдены только в зоне дифференци ровки (кортикальная пластинка). Также было установлено, что во взрослой ткани мозга основными регионами Sip1 эксп рессии являются гиппокамп, зубчатая извилина и белое ве щество коры головного мозга (рис. 1П).

Экспрессия Sip1 в Reeler-мутанте

Reeler это мутация, которая характеризуется инвер тированной стратификацией коры головного мозга. Ранее было показано, что данный дефект связан с мутацией гена реелин. Продукт гена реелин, белок внеклеточного матрик са, необходимый для нормального формирования коры в радиальном направлении. С мутациями гена реелин ассо циированы такие заболевания человека, как аутосомная рецессивная лизенцефалия и гипоплазия мозжечка. Мы исследовали экспрессию гена Sip 1 в ткани мозга у ново рожденных Reeler мутантов мыши. В результате анализа

было установлено, что у дикого типа экспрессия гена Sip1 выявляется исключительно в верхних слоях пириформной коры, тогда как у мутанта экспрессия гена Sip 1 в этой об ласти имеет диффузный характер (см. рис. 1М, Н, Р, С).

Тканеспецифическая инактивация

гена Sip1

Линия, несущая аллель Sip1flax, была предоставлена кол легами D. Huylebroeck и Т. Van de Putte из Фландерского института биотехнологии.

Нами было показано, что основными доменами экспрес сии гена Sip1 в конечном мозге являются кортикальная пла стинка и зона клеточной пролиферации (вентрикулярная зона) базального ганглия. Для установления функции гена Sip1 in vivo была создана линия мышей, несущих делецию экзона 7 в клетках коры головного мозга. Для этого была взята линия, несущая knock in гена Сге в локус гена Емх1. Сге рекомбиназа Емх1-Сге линии экспрессируется во всех клетках коры головного мозга, включая клетки предше ственники. Линия была создана К. Jones из университета Колорадо.

Первой стадией получения мутантов является совме щение трансгенов Sip1flax и Сге в одном генотипе. Далее животных с генотипом Sip1flax/+: Сге/+ (двойные трансген ные гетерозиготы) скрещивали между собой для получения мутанта Sip1flox / Sip1flox; Сге/+.

Рис. 1. Распределение мРНК гена Sip1 и белка Sip1 в головном мозге мыши в период эмбрионального и постнатального развития. Гибридизация in situ рибопробы гена Sip1 с сагиттальными и фронтальными срезами мозга мыши стадий Е15 [А, Б, Д, Ж] и Е18 [В, Г, 3, И, Т, У]. К, Л - увеличенные виды В и Г, слои коры обозначены латинскими цифрами, региональная специфичность показана стрелками. М, Н, Р, С - распределение мРНК гена Sip1 в ткани мозга мыши, несущей мутацию Reeler. О -распределение белка Sip1 в коре на стадии Е18; П - гибридизация in situ рибопробы гена Sip1 с фронтальными срезами ткани взрослого мозга мыши; 1 - неокортекс; 2 - гиппокамп; 3 - базальный ганглий; 4 - таламус; 5 - средний мозг; 6 - пириформная кора; 7 - обонятельная луковица

4-

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 2, 2007

И I II II

тп

Оригинальные исследования

Фенотипический анализ мутантов, полученных при инактивации гена Sip1 в коре головного мозга Анализ морфологии ткани мозга на ранних стадиях корти когенеза (Е12 Е18) не выявил существенных фенотипичес ких различий между мутантом и диким типом. Проведенные исследования морфологии коры Sip1 мутантов (рис. 2) и анализ экспрессии генов показали, что зоны гиппокампа СА1 САЗ и зубчатая извилина нормально специфицируются в ходе эмбриогенеза.

В норме СА1 САЗ зоны гиппокампа на 17 й день эмб рионального развития уже заложены, зубчатая извилина на данной стадии представлена четко выраженной структурой (см. рис. 2).

При морфологическом анализе поздних стадий нейроге неза было обнаружено, что у взрослых животных полностью отсутствуют гиппокамп и зубчатая извилина (рис. 3). Меди альный район коры головного мозга представлен пре и па расубикулярным комплексом. Зона subiculum выглядит зна чительно тоньше (см. рис. ЗБ). Также интересным фактом является отсутствие corpus callosum у мышей, мутантных по гену Sip1 (см. рис. ЗВ, Г).

Как было показано раньше, зоны, отсутствующие у взрослых животных, нормально специфицируются в эмбри огенезе (см. рис. 2). Поэтому дальнейшим предположением было то, что дефект образуется вследствие низкого уровня пролиферативной активности клеток предшественников каудо медиального района коры. Анализ клеточной проли ферации изучался с использованием метода иммуноокра

шивания парафиновых срезов эмбриональной ткани мозга мыши антителами против бромдеоксиуридина. Разницы в уровне пролиферации между мутантом и диким типом на ста дии Е16.5, т. е. в период, когда клетки каудо медиального района кортекса отличаются максимальной пролифератив ной активностью, выявлено не было.

Далее мы решили проверить уровень клеточной гибели в медиальном паллиуме. Окрашивание ткани мозга мыши стадии Е17.5 по протоколу TUNEL показало высокий уровень апоптоза у мутантов в медиальном районе коры. В остальной части коры уровень апоптоза остается одинаковым при сравнении мутанта и дикого типа (рис. 4).

Недавно стало известно, что мутация гена Sip1 у чело века приводит к изменениям в развитии медиального пал лиума. Интересно также, что у пациентов с мутированным геном Sip1 наблюдается агенез мозолистого тела. В резуль тате анализа морфологии мозга мышей, мутантных по Sip1, были обнаружены подобные дефекты (см. рис. ЗВ, Г).

Ранее в литературе был описан ряд направленных ген ных мутаций, приводящих к дефектам развития медиального паллиума. Было показано, что Wnt3A локально регулирует рост каудо медиальной части коры, из которой формирует ся гиппокамп [10]. При инактивации Wnt3a, медиатора Wnt сигнального пути Lef1 [11], также как и фактора транскрип ции Етх2 [12], спецификация клеток предшественников каудо медиальной зоны кортекса проходит нормально, однако гиппокамп не формируется вследствие дефекта про лиферации.

Рис. 2.

Анализ морфологии мозга мыши, несущей мутацию гена 3р1 в коре головного мозга с помощью окрашивания по протоколу Мбб/. Корональные срезы ткани мозга мыши 17-го дня эмбрионального развития:

А, В- дикий тип;

Б, Г- мутант;

к- кора головного мозга;

с - БиЫси1ит;

з - зубчатая извилина.

Район зубчатой извилины отмечен стрелками

Рис. 3.

Анализ морфологии ткани мозга мыши, полученной при инактивации гена 3р1 в коре головного мозга. Окрашивание по протоколу Ы/бб! корональных срезов ткани мозга мыши стадии РЗО:

А, В - дикий тип;

Б, Г- мутант;

1 - кора головного мозга;

2 - гиппокамп;

3 - зубчатая извилина;

4 - мозолистое тело

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 2, 2007

Оригинальные исследования

Рис, 4,

Анализ уровня клеточной гибели в ткани мозга эмбриона мыши, полученной при инактивации гена Э!р1 в коре головного мозга.

Окрашивание по протоколу ТиЫЕЬ фронтальных срезов ткани мозга мыши стадии Е17:

A, В - дикий тип;

Б, Г- мутант;

B, Г - увеличенные виды, выделенные прямоугольниками на А и Б.

Стрелками обозначены клетки, показывающие окраску

Недавно было показано, что Етх2 является прямой транс крипционной мишенью Writ и Втр [13]. Для экспрессии Етх2 в дорзальной части теленцефалона также необходима актив ность медиаторов Wnt и Bmp сигнального пути, факторов транскрипции Smad и Tcf. Ранее было показано, что Smad белки, медиаторы Bmp сигнального пути напрямую реагируют с Sip1. Также известно, что один из членов генного семейства Tcf Tcf8/ZEB-1 выполняет функцию, обратную функции Sip1 /ZEB-2 в регуляции TGF р/ВМР сигнального пути.

Мутации генов И/лСЗэ, 1-еИ, Етх2 и &р1 приводят к схожим фенотипическим проявлениям.

Для более точного установления роли Б1р1 в развитии медиальной коры и о месте 5/р"! в генной иерархии \ЛЛК;- и Tgfp сигнального пути требуются дальнейшие исследования. На основании выше приведенных данных можно сделать вывод о том, что активность гена Б1р1 необходима для нор мального развития таких компонентов медиальной коры, как гиппокамп и зубчатая извилина.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Поляков А.С., Британова О.В., Усман Н.Ю. и др. Новые нейрогены млекопитающих. Докл. АН 2003; 392(3): 467 70.

2. Поляков А.С., Шпеер Н., Британова ОБ. и др. Клонирование и анализ нового нейрогена мыши. Генетика 2004; 40(6): 853 7.

3. Verschueren К., Remade J.E., Collart С. et at., SIP1, a novel zinc finger/ homeodomain repressor, interacts with Smad proteins and binds to 5' CACCT sequences in candidate target genes. J. Biol. Chem. 1999; 274(29): 20489 98.

4. Miyazono, K., Kusanagi K., Inoue H. Divergence and Convergence of TGFb/ BMP Signaling. J. Cell. Physiol. 2002; 187: 265 76.

5. Ragsdale C.W., Grove E.A. Patterning the mammalian cerebral cortex. Current Opinion in Neurobiol. 2001; 11: 50 8.

6. Tylzanowski P., Verschueren K., Huylebroeck D., Luyten F.P. Smad interacting protein 1 is a repressor of liver/bone/kidney alkaline phosphatase Transcription in BMP induced osteogenic differentiation of C2C12 cells. J. Biol. Chemistry 2001; 276: 40001 7.

7. Meersseman G., Verschueren K., Nelles L. et al. The С terminal domain of Mad like signal transducers is sufficient for biological activity in the Xenopus

embryo and transcriptional activation. Mech. Dev. 1997; 61: 127 40.

8. Wilson M., Mowat D., Dastot Le Moal F. et al., Further delineation of the phenotype associated with heterozygous mutations in ZFHX1B. Am. J. Med. Gen. 2003; 119A: 257 65.

9. Stoykova A., Gruss P. Roles of Pax genes in developing and adult brain as suggested by expression patterns. J. Neurosci. 1994; 14: 1395 412.

10. Lee S.M., Tole S., Grove E., McMahon A.P. A local Wnt 3a signal is required for development of the mammalian hippocampus. Dev. 2000; 127: 457 67.

11. Galceran J., Miyashita Lin E.M., Devaney E. et al., Hippocampus development and generation of dentate gyrus granule cells is regulated by LEF1. Dev. 2000; 127(3): 469 82.

12. Tole S., Goudreau G., Assimacopoulos S., Grove E.A. Emx2 is required for growth of the hippocampus but not for hippocampal field specification. J. Neurosci. 2000; 20: 2618 25.

13. Theil T., Aydin S., Koch S. et al., Wnt and Bmp signalling cooperatively regulate graded Emx2 expression in the dorsal telencephalon. Dev. 2002; 129(13): 3045 54.

Поступила в редакцию 10,05,2007

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 2, 2007

А