Ген металлопротеиназы Morganella morganii

УДК 579.222

Л. Ф. Миннуллина, Н. М. Замалютдинова, Е. О. Михайлова, М. Р. Шарипова, А. М. Марданова

ГЕН МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ MORGANELLA MORGANII

Ключевые слова: Morganella morganii, протеиназа, биоинформационный анализ, промотор.

Биоинформационный анализ генома Morganella morganii subsp. morganii KT позволил идентифицировать в нем гомолог гена гримелизина Serratia grimesii. Ортологи гена гипотетической металлопротеиназы M. morganii обнаружены в геномах разных видов Enterobacteriaceae и представителей других семейств. В промоторной области гена металлопротеиназы M. morganii идентифицированы сайты -10 и -35, а также последовательность Шайна-Дальгарно. С помощью праймеров, сконструированных к гену M. morganii subsp. morganii KT, был амплифицирован ген металлопротеиназы из генома клинического изолята M. morganii ZM. Секвенирование ПЦР-амплификата и BLAST-анализ выявил 83% гомологию нуклеотидных последовательностей генов.

Keywords: Morganella morganii, proteinase, bioinformatic analysis, promoter.

Using bioinformatic analysis of Morganella morganii subsp. genome we identified gene homologous of grimelyzin gene of Serratia grimesii. We identified genes orthologous to the gene of M. morganii hypothetical metalloprotease in the genomes of several species of Enterobacteriaceae and representatives of other families. In the promoter region of metalloprotease M. morganii -10 and -35 sites and also Shine-Dalgarno sequence were identified. Using primers designed for M. morganii subsp. KT gene metalloprotease gene from M. morganii ZM clinical isolate was amplified. PCR-amplificate sequencing and BLAST processing revealed 83% gomology of the genes.

Введение

Morganella morganii - условно-патогенная бактерия, относящаяся к семейству Enterobacteriaceae. Является возбудителем оппортунистических госпитальных инфекций, включая инфекции мочеполового тракта, ран и кожи. Эти бактерии продуцируют различные факторы вирулентности, например, уреазу, гемолизины, липополисахариды, адгезины, а также ферменты, гидролизующие и модифицирующие антибиотики [1]. В 2012 году описан случай смертельной инфекции среди кур, вызванной M. morganii [2]. Показана роль M. morganii в формировании фронтального абсцесса мозга у женщины [3], в редких случаях является возбудителем перитонита [4]. Ранее нами показано, что в клетках M. morganii содержатся протеиназы, расщепляющие азоказеин, желатин и скелетно-мышечный актин [5]. Однако внутриклеточная протеиназа M. morganii в настоящее время не выделена и не изучена. Геном M. morganii subsp. morganii KT секвенирован [7], что позволяет провести биоинформационный поиск генов-гомологов известных ферментов. Ранее в клетках Serratia grimesii была описана внутриклеточная металлопротеиназа гримелизин [8]. Было показано, что гримелизин может участвовать в инвазии патогенов в эукариотические клетки [9].

Настоящая работа посвящена поиску гена металлопротеиназы в геноме M. morganii, аминокислотная последовательность которого гомологична гримелизину S. grimesii, анализу геномного локу-са, в котором локализован ген, и промоторной области гена. Кроме того, проведена идентификация гена металлопротеиназы в клиническом изоляте M. morganii штамм ZM.

Материалы и методы исследования

Штамм бактерий M. morganii ZM был предоставлен профессором Томасом Адамом (Charite,

Берлин). Идентификация штамма осуществлена на основании анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и микробиологических тестов [5].

Бактерии культивировали при 37°С с интенсивностью качания 200 об/мин (вибростенд, B. Braun, Германия), как описано в работе [6]. В качестве инокулята использовали 12-часовую культуру, выращенную на среде LB (%) [10]: триптон - 1.0, дрожжевой экстракт - 0.5, NaCl - 0.5, pH 8.5. Среда LBА содержала 2% агар.

Биоинформационный поиск гена-гомолога гримелизина S. grimesii был проведен с использованием следующих ресурсов: анализ нуклеотидных последовательностей проводился с использованием программ Blast, которые представлены на сервере Национального Центра Биотехнологической информации (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih), для анализа степени консервативности геномных локусов использовали программы и базы данных сайта ASAP

(https://asap.ahabs.wisc.edu/asap/sim_search_query.php ?), а также базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), Sanger

(http://www.sanger.ac.uk), xBASE

(http://www.xbase.ac.uk/colibase).

Анализ промоторной области проводили с помощью программы BPROM

(http://linux 1.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom& group=programs&subgroup=gfindb).

Для амплификации исследуемой последовательности применяли классическую ПЦР. Использованные праймеры представлены в таблице 2.

Разделение продуктов амплификации проводили с помощью горизонтального ДНК-электрофореза в 1.5% агарозном геле.

Секвенирование ДНК-амплификатов было проведено фирмой Syntol (http://www.syntol.ru/).

Для выравнивания сиквенсов использовали программу MEGA 4. Поиск открытых рамок считывания (ОРС) проводили при помощи программ

Clone Manager 7 и «Трансляция нуклеотидной последовательности» на сайте molbiol.ru (http://molbiol.ru/scripts/01_13.html).

Результаты исследований и их обсуждение

Используя последовательность белка гри-мелизина S. grimesii strain DSMZ 30063 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABY40626.1), с помощью программ Blast и БД ASAP в аннотированном геноме штамма M. morganii subsp. morganii KT был найден ген гипотетической металлопротеа-зы размером в 1101 нуклеотидных пар (н.п.). Идентифицированная последовательность гена M. morganii subsp. morganii KT (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/4554187167repo rt=genbank&from=1950949&to=1952049) была использована для биоинформационного поиска генов-ортологов с помощью программы Blastn. Показано, что в геномах различных видов семейства Enterobacteriaceae присутствуют гомологичные последовательности. Однако их протяженность невелика и не превышает 204 н.о. у Enterobacter sakazakii, Cronobacter sakazakii SP291 (гомология 68%), 191 н.о. у Klebsiella oxytoca E718 (68% гомологии) и 167 н.о. у Pantoea sp. At-9b (70% гомологии) при длине ОРС 1101 н.о. Гомология гена гримелизина с геном гипотетической металлопро-теиназы M. morganii subsp. morganii KT на коротком участке (114/166 н.о.) равна 69%.

Аминокислотная последовательность гена металлопротеазы M. morganii KT состоит из 366 аминокислотных остатков (а.о.). Blastp-анализ гипотетической аминокислотной последовательности белка выявил наличие большого числа его гомологов среди белков бактерий сем. Enterobacteriaceae (табл. 1), а также у различных представителей других семейств. Наибольшей степенью гомологии с металлопротеазой M. morganii KT обладают эластаза S. marcescens FGI94 (39% идентичности и 54% сходства) и термолизиновая металлопептидаза Achromobacter xylosoxidans A8 (38% идентичности, 51% сходства). Металлопротеиназа M. morganii обладает 37% гомологией с аминокислотными последовательностями гримелизина S. grimesii и протеализина S. proteamaculans. Важно отметить, что в геноме Bacillus subtilis также обнаружен орто-лог с 36% гомологией, кодирующий фибринолити-ческий фермент BK II (Fbk2).

Идентификация генов-ортологов металло-протеиназы в геномах энтеробактерий позволяет предположить, что фермент выполняет в клетках важную функцию.

Был проведен сравнительный анализ геномных локусов S. proteamaculans и M. morganii, в которых расположены гены металлопротеаз. Как видно из рисунка 1, эти локусы сильно различаются. В геноме S. proteamaculans ген протеализина находится в опероне с гипотетическим белком, а в геноме M. morganii - организован как индивидуальный ген. Значительно различаются и соседние гены. В геноме S. proteamaculans после гена протеализина следует ген гипотетического белка, а на комплементарной цепи - гены uf и auef, кодирующие соответственно

белок с неизвестной функцией и белок насоса ауксина. В геноме M. morganii после гена металлопро-теиназы находятся гены engA и yfgL, расположенные на комплементарной цепи и кодирующие ГТФ-связывающий белок и белок внешней мембраны

Таблица 1 - Гомологи гипотетической металло-протеазы Morganella morganii subsp. morganii KT по аминокислотной последовательности

Организм Длина выравни- Длина вырав-

ваемых участ- ниваемых уча-

ков, а.о. Иден- стков, а.о.

тичность,

Morganella mor- 366/ 366* 366/ 366

ganii subsp. mor-

ganii KT

M. morganii 352/366 360/ 366

SC01

Serratia 141/360 195/360

marcescens

FGI94

Pantoea ananatis 132/360 192/360

LMG 20103

Serratia 133/360 193/360

proteamaculans

Dickeya dadantii 139/361 191/361

3937

Serratia 133/361 192/361

plymuthica

4Rx13

Dickeya zeae 139/362 190/362

Enterobacter sp. 134/361 190/361

SST3

Serratia grimesii 132/360 190/360

Pectobacterium 137/366 192/366

wasabiae

Erwinia 132/360 187/ 360

pyrifoliae Ep1/96

Enterobacter 133/361 189/ 361

cloacae subsp.

cloacae ATCC

13047

Citrobacter 133/361 188/ 361

rodentium

ICC168

Photorhabdus 122/356 188/ 356

luminescens

subsp. laumondii

TTO1

Salmonella 127/ 361 188/ 361

enterica

Klebsiella 131/ 369 192/369

oxytoca

* Длина выравниваемых последовательностей

соответственно. Перед геном протеализина находятся гены reg и mft, кодирующие регуляторный белок семейства LacI и MFS-транспортер. Перед геном металлопротеиназы M. morganii находятся гены hemN и ypeA, кодирующие аэробную копропорфи-риноген оксидазу III и ацетилтрансферазу соответственно. Таким образом, сравнение геномных локусов двух металлопротеаз показало, что они значительно различаются в геномах энтеробактерий разных родов. Более того, гены гомологичных метал-

лопротеиназ могут, как входить в состав оперонов (р. Serratia), так и быть индивидуальными генами (р.

Morganella).

Рис. 1 - Сравнение локусов, несущих ген металлопротеазы, в геномах S. proteamaculans и M. morganii: auef - ген насоса ауксина, uf - ген белка с неизвестной функцией, hp - ген гипотетического белка, prt - ген металлопротеазы, reg - ген регулятора семейства LacI, mft - ген MFS-транспортера, a-glu - ген a-глюкозидазы; yfgL -ген белка внешней мембраны, engA - ген ГТФ-связывающего белка, hmp - ген гипотетической металлопротеазы, hemN - ген аэробной копро-порфириноген оксидазы III, ypeA - ген ацетил-трансферазы

Направление стрелки указывает, на какой цепи ДНК локализован ген: стрелка вправо - ген расположен на плюс-цепи, стрелка влево - ген расположен на минус-цепи

Был проведен анализ промоторной области гена гипотетической металлопротеиназы M. morganii KT. Протяженность межгенного участка составляет 102 н.п. (рис. 2). С помощью программы BPROM были идентифицированы консервативные последовательности -10 и -35, а также последовательность Шайна-Дальгарно (SD). Сайтов связывания регуляторных белков данной программой не выявлено.

GG GTC TG А С А АС С СТТС А С AGTGTG|CTG АСТ]С A A A A GC A G G CfTC AT ACTCljC C'TC C'G С T A A AT ATTTTTCTCCGT A A АС A T CGTCATTCCA A CCA CjACG"À;G A A CCGCCTATQTC'AG С'A G AT G

Рис. 2 - Строение промоторной области гена гипотетической металлопротеазы M. morganii subsp. morganii KT. Отмечены участки -10 и -35, TGA - стоп-кодон предыдущего гена, SD - последовательность Шайна-Дальгарно, ATG - точка начала трансляции

Основываясь на данных биоинформационного анализа гена M. morganii subsp. morganii KT, были сконструированы праймеры для амплификации гомологичного гена в геноме изолята M. morganii ZM (табл. 2).

Полученные с помощью праймеров Morggluz_d и Morggluz_r продукты ПЦР-амплификации (рис.3) были секвенированы, сиквен-сы выравнены с помощью программы MEGA 4, что позволило обнаружить протяженный участок гомологии (85%) в центральной части последовательности с геном M. morganii subsp. morganii KT. Однако концевые участки сиквенсов сильно различались,

что препятствовало нахождению старт- и стоп-кодонов. Для решения этой проблемы были сконструированы новые праймеры (Morg.L-Morg.RX включающие участки нуклеотидной последовательности, расположенные за пределами гена. После выравнивания секвенированных ПЦР-продуктов, амплифицированных с помощью этих праймеров, была выявлена ОРС длиной в 1104 н.п. ЫаБ^анализ генов М. шерсти КТ и М. шерсти 2М выявил 83% идентичность по нуклеотидной последовательности, гомология по аминокислотной последовательности составила 86% (при сходстве 92%).

Таблица 2 - Использованные праймеры

Название Напр авле ние Последовательность (5'-3') Температура отжига, °С

Morggluz d For TTACGGCTCCAGCCC GACGG 60

Morggluz r Rev TGTCAGCA-CATGCCCCGCGC 60

Morg.L f. 2 For GCGGCCGTTATGTGG AGTTT 61.30

Morg.L r. 2 Rev TGATGGCTGTAAGTC AGCGG 60.11

Morg.R f. 1 For TGAGTGAATCCCCGC TGTTC 60.04

Morg.R r. 1 Rev TGAAAGTGATGGGA ACGCCT 59.60

Morg.R f. 2 For TGGATATCGCCACAC ACGAG 59.90

Morg.R r. 2 Rev CTGAAAGTGATGGG AACGCC 59.20

Рис. 3 - Результат ПЦР-амплификации гена гипотетической металлопротеазы в геноме М. тог^апи ZM. М - ДНК-маркер, 1,2 - ПЦР-продукты

Таким образом, в геноме референтного штамма М. шерсти БиЬБр. шерсти КТ идентифицирован гомолог гена гримелизина S.griшesii, кодирующий гипотетическую металлопротеиназу с гомологией по аминокислотной последовательности 37%. С помощью праймеров, сконструированных к последовательности гена М. шерсти КТ, был идентифицирован ген металлопротеиназы в геноме изо-лята М. шерсти 2М, гомологичный гену М. шерсти КТ на 83%.

Работа поддержана грантом РФФИ-рег № 13-04-97130.

Литература

1. P. Zalas-Wiecek, E. Gospodarek, J. Wroblewska, Przegl. Epidemiol., 66, 1, 13-18 (2012).

2. C. Zhao, N. Tang, Y. Wu, Y. Zhang, Z. Wu, W. Li, X. Qin, J. Zhao, G. Zhang, Vet. Microbiol., 156, 452-455 (2012).

3. J. Abdalla, M. Saad, I. Samnani, P. Lee, J. Moorman, Am. J. Med. Sci., 331, 1, 44-47 (2006).

4. H. Atalay, I. Guney, Y. Solak, E. Almaz, Petit. Dial. Int., 30, 1, 119-121 (2010).

5. Н.М. Замалютдинова, И.Р. Галиева, А.О. Арапова, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова, А.М. Марданова,

Вестник Казанского технологического университета, 16, 10, 191-194 (2013).

6. А.М. Марданова, Э.Х. Низамутдинова, Т.В. Ширшикова, Л.Х. Камалетдинова, Е.О. Михайлова, М.Р. Шарипова, Л.М. Богомольная, Вестник Казанского технологического университета, 19, 215-218 (2013).

7. Y.T. Chen, H.L. Peng, W.C. Shia, F.R. Hsu, C.F. Ken, Y.M.Tsao, C.H. Chen, C.E. Liu, M.F. Hsieh, H.C. Chen, C.Y. Tang, T.H. Ku, BMC Genomics, 13, (2012).

8. E.S. Bozhokina, S.Yu. Khaitlina, T. Adam, Biochem. Biophys. Res. Commun, 367, 888-892 (2008).

9. E.S. Bozhokina, O.A. Tsaplina, T.N. Efremova, L.V. Kever, I.V. Demidyuk, S.V. Kostrov, T. Adam, Y.Y. Komissarchik, S.Y. Khaitlina, Cell. Biol. Int., 35, 2, 111-118 (2011).

10. J. Sambrook, E.F. Fritsch, S.T. Maniatis, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989, 2344 p.

© Л. Ф. Миннуллина - студ. каф. генетики К(П)ФУ, masaco@mail.ru; Н. М. Замалютдинова - асп. каф. микробиологии К(П)ФУ, nelya-zamalutdinova@rambler.ru; Е. О. Михайлов - канд. биол. наук, доц. каф. БСМЭ КНИТУ, katyushka.glukhova@gmail.com; М. Р. Шарипова - д.б.н., проф. каф. микробиологии К(П)ФУ, marsharipova@gmail.com; А. М. Марданова - канд. биол. наук, доц. той же кафедры.