Фенотипическое проявление талассемической мутации IVS1.6 в Азербайджане

Фенотипическое проявление талассемической мутации IVS1.6 в Азербайджане

Ч.Д.Асадов, Э.Р.Адулалимов, Т.А.Мамедова, С.Н.Кафарова, Е.Д.Кулиева

НИИ гематологии и трансфузиологии им. Б.А.Эйвазова, г.Баку

Введение. Среди моногенных наследственных заболеваний наибольшую распространенность получили наследственные гемоглобинопатиии. В среднем частота носительства этих заболеваний составляет около 7%. Ежегодно в мире рождается около полумиллиона человек с тяжелыми формами талассемии. Как предполагается, причиной столь широкой распространенности талассемии является малярия, так как носители гена талассемии более устойчивы к малярийному плазмодию, чем лица без этого генетического дефекта [10, 12].

Наибольшую долю среди гемоглобинопатий занимают талассемии. Являясь аутосомно-рецес-сивными заболеваниями, талассемии в гетерозиготных формах проявляются практически бессимптомно, тогда как в гомозиготной форме преобладает тяжелое течение болезни. Талассемические синдромы развиваются в результате мутаций в бета-подобных и альфа-подобных глобиновых генах (НВВ, НВА1, НВА2, HBD, HBG), что приводит к уменьшению скорости или отсутствие синтеза гло-биновых цепей. В связи с этим различают альфа (НВА1 и НВА2), бета (НВВ), гамма (HBG) и дельта (HBD) талассемии. При бета-талассемии происходит угнетение синтеза бета цепей, что приводит к избыточному накоплению альфа-цепей в эритро-идных клетках, что, в свою очередь, приводит к их преждевременному разрушению, за счет преципитации избыточных альфа-цепей, в результате чего развивается неэффективный эритропоэз и анемия.

На сегодняшний день уже известно о более 200 бета-талассемических мутаций, частота встречаемости которых в той или иной популяции очень разнообразна [7, 11].

По данным эпидемиологических исследований, проведенных ранее в Азербайджане с учетом неоднородной частоты встречаемости носителей генов талассемии по регионам, в среднем частота встречаемости генов талассемии составляет около 8,7% [2]. Наряду с талассемическими синдромами в Азербайджане выявлены структурные гемоглобинопатии HbS, HbD, НЬС и НЬЕ, которые могут наследоваться вместе с талассемией [1, 3, 4].

Прогресс, происходящий в последнее время в молекулярной биологии и широкие возможности методов ДНК-анализа, позволяют определить генные дефекты при талассемических синдромах и понимать механизмы регуляции и экспрессии гло-биновых генов и частично освещают взаимосвязи между генотипом и фенотипом. Бета-талассемия имеет чрезвычайно разнообразное клиническое проявление от легких форм, которые не требуют особого лечения, до тяжелых форм, проходящих с глубокой анемией, гепатоспленомегалией, значительными изменениями в костях, которые в случае не проведения надлежащего лечения, оканчиваются летально в детском возрасте. Выяснение факторов, лежащих в основе такого клинического разнообразия, имеет большое научное и прикладное значение. Особое значение имеет изучение фенотипи-ческого проявления различных мутаций р-глоби-нового гена [11].

Предыдущими исследованиями в Азербайджане были выявлены 22 талассемические мутации и было установлено, что одной из наиболее часто встречающейся мутацией бета-глобинового гена в Азербайджане является ГVS1.6 [5, 6, 8]. Целью настоящего исследования явилось изучение фено-типического проявления этой мутации в гетерозиготном, гомозиготном и компаундном состоянии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Всего было обследовано 137 человек как с гомозиготной, так и гетерозиготной ¡5-талассемией и дрепаноталассемией (5/¡5-талас-семией). У обследованных лиц были выявлены 146 мута-нтных аллелей ¡5-глобинового гена 19 видов. Среди них мутация 1У51.6 встречалась 16раз. Эта мутация отмечалась в гетерозиготном состоянии у 4, в гомозиготном состоянии у 11, в сочетании с мутацией Codon 8 (-АА) у 2 лиц.

Образцы крови обследуемых лиц собирались в пробирки, содержащие ЭДТА. Диагноз талассемии ставился на основании показателей красной крови и фракций гемоглобина. Проводилось определение количества эритроцитов, содержания гемоглобина, показателей гематокрита и эритроцитарных индексов - средний объем эритроцитов (МСУ), среднее содержание гемоглобина (МСН) и средняя концентрация гемоглобина (МСНС) - на гематологическом анализаторе 5утех

Таблица 1. Гематологические показатели при генотипе IVS1.6 / Normal

Шифры больных п=4 Во> раст Пол Эритроциты

1520-12 31 M 5,09 10,6 36,6 71,9 20,8 29 3,2 0,72

1607-12 23 M 5,28 13,2 44,2 70,4 21 29,9 3,4 0,69

1609-12 21 Ж 5,22 10,6 36,7 70,3 20,3 28,9 4,3 1,20

2507-11 20 Ж 3,37 7,7 27,4 81,3 22,8 28,1 4,2 1,80

M 24 4,60 10,5 36,1 74,3 21,3 29,0 3,8 0,93

m 5 0,92 2,2 6,9 5,3 1,1 0,7 0,6 0,26

XT2000i (Япония). Кроме того, во всех случаях проводили исследования фракций гемоглобина методами электрофореза на ацетат-целлюлозных пленках и высокоразрешающей жидкостной хромотографии (HPLC) на аппарате VARIANT II Haemoglobin Testing System компании BIO-RAD (США). Содержание фетального гемоглобина определяли методом щелочной денатурации по методу Betke. Для выявления мутаций бета-глобиново-го гена ДНК экстрагировали из белых кровяных клеток по методу Poncz et al. [9]. Для амплификации ДНК использовали термоциклер C-1000 компании BIO-RAD (США), гельдокументацию проводили на аппарате Biometra Gel Documentation System (США).

Для выявления бета-талассемических мутаций использовали два метода: АРМС и обратной гибридизации (ОГ).

АРМС. В основе метода АРМС лежит проведение 2-х ПЦР реакций. В обоих реакцияx используется прай-меры с одинаковой олигонуклеотидной последовательностью для проведения амплификации участков ДНК с одинаковой протяженностью. Для каждой из реакций используются аллельспецифические праймеры с комплементарной исследуемому участку ДНК олигонуклео-тидной последовательностью, где для одной реакции используется мутантная, а для другой нативная. Следовательно, если в исследуемом участке ДНК имеется мутация, то амплификат образуется в том образце, где есть аллельспецифические праймеры с мутантной олигонуклеотидной последовательностью.

ОГ. Исследование методом ОГ проводили с использованием коммерческих тест-систем для выявления мутаций (ß-Globin StripAssay Kit, ViennaLab Cat. No. 4-130, ViennaLab Diagnostics, Vienna, Austria), основанной на обратной дот-блот гибридизации) согласно инструкции к тест-системам. Тест-стрип содержит 22 олиго-нуклеотидных зонда, параллельно расположенных на мембране: - 101 (C>T); - 87 (C>G); - 30 (T>A); Codon 5 (-CT); Codon 6 (G>A) HbC; Codon 6 (A>T) HbS; Codon 6 (-A); Codon 8 (-AA); Codon 8/9 (+G); Codon 15 (TGG>TGA); Codon 27 (G>T); IVS1-1 (G>A); IVS1-5 (G>C); IVS1-6 (T>C); IVS1-110 (G>A); IVS1-116 (T>G); IVS1-130 (G>C); Codon 39 (C>T); Codon 44 (-C); IVS2-1 (G>A); IVS2-745(C>G); IVS2-848 (C>A).

Статистическую обработку полученных цифровых данных провели с использованием методов вариационной статистики с помощью программы Microsoft

Office Excel 2007. Наличие или отсутствие взаимосвязи между изучаемыми показателями определяли путем вычисления коэффициента корреляции (r).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. С целью выявления особенностей фенотипического проявления талассемической мутации IVS1.6 мы отдельно проанализировали гематологические показатели у гетерозигот, гомозигот и компаундов по этому патологическому гену. Гематологические показатели носителей талассемического гена IVS1.6 приведены в таблице 1.

Как следует из указанной таблицы, всего было обследовано 4 лиц, 2 из которых мужского и, соответственно 2 женского пола в возрасте от 20 лет до 31 года. Количество эритроцитов у 3 из 4 обследованных было выше нормы, а уровень гемоглобина был понижен у 3 обследованных. В двух случаях анемия носила умеренный, а в одном случае выраженный характер (Нв=7,7 г/л). Такое значительное уменьшение содержания гемоглобина в последнем случае можно объяснить наличием у больной сопутствующего дефицита железа. Во всех случаях отмечалось снижение показателей эритроцитар-ных индексов (MCV, MCH, MCHC). Содержание HbA2 в двух случаях было выше нормы. Уровень фетального гемоглобина во всех случаях был в пределах нормы (до 2%).

Гематологические показатели гомозигот по та-лассемическому гену IVS1.6 приведены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, всего было обследовано 7 лиц мужского и 4 лица женского пола в возрасте от 12 до 52 лет. Количество эритроцитов было в норме в 5 случаях, в то время как в остальных случаях этот показатель был понижен. Уровень гемоглобина, показатель гематокрита и эритроцитар-ные индексы (MCV, MCH, MCHC) у всех больных были значительно понижены. Содержание HbA2 и HbF было повышено у всех обследованных в различной степени. Мы провели сравнительный анализ уровня гемоглобина у больных с содержанием фетального гемоглобина ниже и выше 10%. Сравнительный анализ уровня гемоглобина в указан-

Таблица 2. Гематологические показатели при генотипе IVS1.6 / IVS1.6

Шифры Больных п=11 Возраст Пол Эритроциты

355-12 41 Ж 5,27 7,9 27,9 52,9 15,0 28,3 7,3 5,4

356-12 46 М 4,91 7,5 27,3 55,6 15,3 27,5 8,4 6,5

1624-12 19 М 5,58 8,3 28,8 51,6 14,9 28,8 4,4 9,9

2589-12 12 М 4,46 7,8 25,2 56,5 17,5 31,0 6,0 5,2

2025-11 49 Ж 2,90 4,4 19,0 65,5 15,2 23,2 5,4 5,3

2401-11 50 М 3,19 6,3 25,2 79,0 19,7 25,0 5,0 12,6

2450-11 20 Ж 4,05 7,2 25,5 63,0 17,8 28,2 3,8 14,7

2552-11 36 Ж 1,73 3,4 13,2 76,3 19,7 25,8 5,1 13,5

2911-11 30 М 3,47 6,3 22,1 63,7 18,2 28,5 3,2 16,3

3316-11 50 М 2,34 4,2 15,8 67,5 17,9 26,6 5,6 15,3

899-11 52 М 3,30 5,1 17,9 54,2 15,5 28,5 5,0 24,0

М 36 3,73 6,2 22,3 62,8 17,0 27,4 5,4 11,7

m 15 1,22 1,7 53 9,3 1,9 2,1 1,5 5,9

Таблица 3. Коэффициенты корреляции (г) между уровнем гемоглобина и содержанием фракций гемоглобина при мутации IVS1.6 в гетерозиготном и гомозиготном состоянии

Показатели IVS1.6/Normal IVS1.6/IVS1.6

Hb-HbF НЬ-НЬАг r= -0,88 r= -0,58 г = -0,42 г = 0,20

ных группах показал, что в группе с показателями HbF ниже 10% средний уровень гемоглобина выше, и эта разница составляет 1,76 г/дл (разница статистически достоверна).

Мутация IVS 1.6 относится к мутациям в консенсус сайтах, приводящих к нарушению процес-синга РНК. Так как эта мутация относиться к ß+-мутациям, то есть при этой мутации синтез бета-цепей глобина не отсутствует полностью, а только уменьшена скорость синтеза указанный цепей, у всех больных наблюдалась клиника промежуточной талассемии и большинство больных обходились без трансфузии крови. Только 2 больных получали гемотрансфузии эпизодически.

Также мы выявили 1 компаунда IVS 1.6 / Codon 8 (-AA). Эта была девочка в возрасте 1 года с клиникой большой талассемии, со следующими гематологическими показателями: эритроциты -3,70х1012/л; Нв - 6,8 г/дл; НСТ - 23,5%, MCV - 63,5 фл; MCH - 18,4 пг; MCHC - 28,9 г/дл; HbA2 - 1,6%; HbF - 27,7%. Известно, что сдвиг рамки считывания при талассемической мутации Codon 8 (-AA) происходит в результате терминации трансляции в кодоне 21 (TGA) и приводит к ß0-талассемии

Данные по исследованию взаимосвязи некоторых гематологических показателей при различных генетических формах ß-талассемии представлены в таблице 3.

Как следует из таблицы 3, при гетерозиготной талассемии (IVS1.6/Normal) отмечается тесная отрицательная связь между показателями уровня гемоглобина содержанием фетального гемоглобина и гемоглобина НЬА2. Однако из за малого числа наблюдений эта зависимость оказалась статистически недостоверной. При гомозиготной талассе-мии была выявлена статистически достоверная отрицательная связь между уровнем гемоглобина и содержанием фетального гемоглобина, а также прямая связь между уровнем гемоглобина и содержанием НЬА2, однако эта связь статистически недостоверна. Наши данные не согласуются с результатами исследований D. WeatheraП, J. Qegg [13], которые установили хорошую отрицательную корреляцию между уровнем гемоглобина и содержанием НЬА2 при талассемии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Таким образом, проведенные нами исследование позволили определить феноти-пические проявления одной из наиболее часто встречающейся в Азербайджане талассемической мутации IVS1.6 в гетерозиготном, гомозиготном и компаундном состоянии.

Данная работа выполнена при финансовой поддержке Фонда Развития науки при Президенте Азербайджанской республики - Грант № - EIF-2011-1(3)82/46/3.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гаджиев Э.Г., Рустамов Р.Ш., Асадов Ч.Д. и др. Гетерозиготное носительство гемоглобина S в Азербайджане. Гематология и трансфузиология, 1991, № 7, с. 15-18.

2. Рустамов Р.Ш., Гаибов Н.Т., Ахмедова А.Ю., Кулиева Н.М. Распространение наследственных гемоглобинопатий в Азербайджане. Проблемы гематологии и переливания крови, 1981, № 9, с. 12- 16.

3. Рустамов Р.Ш., Мамедова Т.А., Ширинова Э.А., Гаджиев Э.Г. Гетерозиготное носительство аномальных гемоглобинов (S, C, E, D) в азербайджанской популяции тезисы докладов II всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов, Москва, 1985, с. 360.

4. Ширинова Э.А., Ахундова А.М., Токарев Ю.Н. и др. Гемоглобин Е в азербайджанской популяции. Проблемы гематологии и переливания крови, 1981, № 9, с. 51-53.

5. Asadov C.D., Abdulalimov E.R., Mammadova T.A. et al. Identification of Two Rare ?-Globin Gene Mutations in a Patient with ?-Thalassemia Intermedia from Azerbaijan. Hemoglobin, 2013, vol. 37, p. 291-296.

6. Curuk M.A., Yuregir G.T., Asadov C.D. et al. Molecular characferization of в-thalassemia in Azerbaijan. Human Genetics, 1992, v. 90, p. 417-419.

7. Hardison R.C., Chui D.H.K., Giardine B. et al. HbVar: a relational database of human hemoglobin variants and thalassemia mutations at the globin gen server. Hum Mutat. 2002, v. 19, p. 225-233 (http://globin.cse.psu.edu).

8. Kuliev A.M., Rasulov I.M., Dadasheva T. et al. Thalassaemia in Azerbaijan. J. Med. Genet., 1994, v. 31, p. 209-12.

9. Poncz M., Solowiejczyk D., Harpel B. et al. Construction of human gene libraries from small amounts of peripheral blood: analysis of beta-like globin genes. Hemoglobin, 1982, v. 6, p. 27-36.

10. Sankaran VG., Lettre G., Orkin S.H. et al. Modifier genes in Mendelian disorders: the example of hemoglobin disorders. Ann. N.Y Acad. Sci., 2010, v. 1214, p. 47-56.

11. Weatherall D.J. Phenotype-genotype relationships in monogenic disease: lessons from the thalassaemias. Nat. Rev. Genet., 2001, v. 2,

p. 245-255.

12. Weatherall D.J. The inherited diseases of hemoglobin are an emerging global health burden. 2010, Blood, v. 115, p. 4331-4336.

13. Weatherall D., Clegg J. The Thalassemia Syndromes. 3rd Ed. Oxford, 1981.

SUMMARY

Phenotypical manifestation of IVS1.6 talassemic mutation in Azerbaijan Ch.Asadov, E.Adulalimov, T.Mamedova, S.Kafarova, E.Kuliyeva

B.Eyvazov's Scientific Research Institute of Hematology and Trnsfusiology, Baku

P-thalassemia is extremely varied clinical manifestations of mild forms that do not require special treatment to severe forms that came from deep anemia, hepatosplenomegaly, significant changes in the bones, which, if not carrying out proper treatment, terminate lethal in children. Elucidation of the factors underlying this clinical diversity, is of great scientific and practical importance. Of particular importance is the study of phenotypic expression of different mutations in p-globin gene. Previous studies in Azerbaijan, it was found that one of the most common mutation of P-globin gene in Azerbaijan is the IVS1.6. As a result of these studies was defined phenotypic manifestations of this mutation in the heterozygous, homozygous and compound state's.

Поступила 08.05.2015