Роль цитохром Р-450-зависимых монооксигеназных ферментных систем бактерий рода Pseudomonas в биотрансформации и биодеградации ксенобиотиков

УДК 579.861

В. Н. Леонтьев, доцент; О. С. Игнатовец, ассистент;

Т. И. Ахрамович, ст. преподаватель

РОЛЬ ЦИТОХРОМ Р-450-ЗАВИСИМЫХ МОНООКСИГЕНАЗНЫХ ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS В БИОТРАНСФОРМАЦИИ И БИОДЕГРАДАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ

In the article the results of researches of microbial transformation and degradation xenobiotics by monooxygenases fermental system of bacteria genus Pseudomonas are presented. Activity of oxydore-ductases and content of cytochromes P-450 and b5 were determined. Monooxygenase fermental system of bacteria genus Pseudomonas content of four component: NADPHH+-cytochrome P-450 reductase, NADHH+-cytochrome b5 reductase, cytochrome P-450 and cytochrome b5. The results of investigation are demonstrate main role P-450-depended monooxygenase fermental system of bacteria genus Pseudomonas in transformation and degradation process of various xenobiotics.

Введение. В окружающей среде в результате хозяйственной деятельности постоянно накапливаются ксенобиотики, которые представляют реальную и потенциальную опасность для человека и для биосферы в целом. Это различные пестициды, растворители и мономеры органического синтеза, красители и др. Биологические методы, основанные на применении деградационной активности микроорганизмов, чрезвычайно актуальны для очистки почв и водных сред, загрязненных различными ксенобиотиками. Бактерии рода Pseudomonas в течение ряда лет привлекают внимание исследователей реальными перспективами использования в биотехнологических целях. Они обладают уникальной способностью осуществлять биотрансформацию различных природных и синтезированных соединений, а также выступать в качестве деструкторов ароматических ксенобиотиков.

Часто в состав ферментных систем бактерий, ответственных за аэробные процессы разложения ксенобиотиков, входит уникальный гемо-протеин - цитохром Р-450 [1]. В присутствии доноров электронов (НАД(Ф)Н Н+) цитохром Р-450 способен активировать молекулярный кислород, один атом которого восстанавливается до воды, а другой внедряется в молекулу окисляемого субстрата в виде гидроксильной группы. Такая модификация ксенобиотиков, многие из которых являются труднодоступными для клеток микроорганизмов в силу своей гидро-фобности, увеличивает их растворимость и обусловливает ключевую роль цитохрома Р-450 в метаболизме ароматических соединений.

В электрон-транспортных цепях бактерий существует еще один гемопротеин - цитохром b5. В последнее время накапливается все больше данных о том, что он функционирует как в НАДНН-, так и НАДФНН+-зависимых электрон-транспортных цепях цитохром Р-450-содержащей ферментной системы. Поэтому содержание цитохрома b5 является показателем степени вовлеченности последней в процесс окисления субстрата. Кроме того, от содержания цитохрома b5 может зависеть монооксиге-назная активность цитохрома Р-450.

В большинстве случаев цитохром Р-450 является индуцибельным ферментом, причем в качестве индукторов биосинтеза могут выступать различные органические соединения, в том числе и субстраты [2-4].

Что касается клеточной локализации бактериального цитохрома P-450, то он может быть как мембранно-связанным, так и цитоплазма-тическим, иногда это определяется химической природой (структурой) индуктора [5].

Целью настоящей работы являлось изучение роли монооксигеназной ферментной системы бактерий рода Pseudomonas в биотрансформации и биодеградации алифатических и ароматических соединений.

Основная часть. В работе использовали следующие реактивы: гексан, нонан, гексен-1 («Реахим», РФ), нонен-4, глюкоза (Fluka, Швейцария). Симазин (2-хлор-4,6-бис(этиламино)-сим-триазин) и прометрин (2-метилтио-4,6-бис-(изопропиламино)-1,3,5-триазин) были выделены из технического препарата экстракцией горячим ацетоном. Полученные таким образом прометрин и симазин представляли собой белые мелкокристаллические порошки с температурой плавления 120 и 225°С соответственно.

Объектами исследований являлись штаммы бактерий Pseudomonas fluorescens B-22, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Pseudomonas aurantica В-162, Pseudomonas aeruginosa В-7 из коллекции кафедры биотехнологии и биоэкологии БГТУ. Ранее нами была установлена способность штаммов P. aurantica В-162 и P. aeruginosa В-7 осуществлять полную деградацию симазина и прометрина соответственно [6, 7]. Штаммы P. fluorescens B-22 и P. aeruginosa PAO1 способны эпоксидировать алкены с двойной связью в конце углеводородной цепи, причем бактерии P. fluorescens В-22 более эффективно эпоксидируют гексен-1 и нонен-4, чем бактерии P. aeruginosa РАО1 [8].

Для определения активностей оксидоредук-таз (АО) и содержания цитохромов b5 и Р-450 в клетках P. aeruginosa B-7 суточную культуру бактерий разводили средой ММ9 с глюкозой (0,2%) или ксенобиотиком (0,05%) в качестве

единственного источника углерода и энергии и инкубировали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл (объем среды 50 мл) на установке Environmental Shaker-incubator ES-20 «BioSan» в условиях аэрации (200 мин1) при 30°С. Время выращивания варьировали в зависимости от субстрата и в соответствии с кривыми роста бактерий. Для измерения АО с добавленными акцепторами электронов и анализа содержания цитохромов b5 и Р-450 использовали культуру бактерий в экспоненциальной фазе роста. Клетки осаждали центрифугированием (6000 мин-1, 15 мин) и ресус-пендировали в 100 мМ трис-HCl буферном растворе (рН 7,4) или дистиллированной воде в зависимости от цели эксперимента.

АО определяли по модифицированному нами методу [9, 10]. Разрушение клеток бактерий осуществляли с помощью ультразвукового дезинтегратора УЗДН-2Н при частоте 44 кГц в течение 90 с. Содержание цитохромов b5 и Р-450 определяли на спектрофотометре Specord M-40 по методу [11]. Образцы ресуспендировали в физиологическом растворе с добавлением 0,004% SDS и 0,004% Твина 20. Концентрацию белка устанавливали по методу Варбурга - Христиана [12].

Функционирование цитохром Р-450-содер-жащей монооксигеназной ферментной системы требует участия оксидоредуктаз НАДФНН+- и НАДН-Независимых электрон-транспортных цепей, цитохромов b5 и Р-450. С целью изучения роли НАДФНН - и НАДН-Независимых электрон-транспортных цепей бактерий рода Pseudomonas в окислении различных по структуре субстратов были измерены АО с помощью добавленных акцепторов электронов, редокс-потенциал которых позволяет им взаимодействовать со строго определенными переносчиками. Для этого была адаптирована методика измерения активностей оксидоре-дуктаз в микросомах печени животных с добавленными акцепторами электронов. Принцип метода основан на определении изменения поглощения акцепторов электронов при переходе их из окисленной формы в восстановленную. Участки редокс-цепей, с которых снимаются электроны, указаны на схеме ре-докс-цепей переноса электронов, функционирующих при окислении органических субстратов, штриховыми стрелками (см. рисунок).

АО или скорость переноса электронов в ре-докс-цепях может быть измерена по скорости окисления НАДНН+ или НАДФНН+.

Определение АО осуществляли в дезинтегрированных ультразвуком клетках бактерий, выращенных на синтетической среде с различными источниками углерода до середины логарифмической фазы роста как наиболее метаболически активной. Предварительно был оптимизирован режим дезинтеграции клеток данных бактерий ультразвуком, при котором НАДНН+- и

НАДФНН+^Ре^М^-редуктазные активности имеют максимальные значения. В связи с этим дезинтеграцию осуществляли при частоте 44 кГц, время дезинтеграции составило 1,5 мин (3 раза по 30 с - обработка с 30-секундными перерывами).

НАДН  Н+

K3Fe(CN)6«" 50% ДХФИФ

ФП2

НАДФНН+

ФП-1

\быстро

цитохром с, ДХФИФ, K3Fe(CN)6

цитохром с, «-------цитохром b5---------1

50% ДХФИФ '

НТ

цитохром Р-450------

Рисунок. Схема редокс-цепей переноса электронов, функционирующих при окислении органических субстратов:

ФП} - НАДФН • Н+-цитохром Р-450-редуктаза;

ФП2 - НАДНН+-цитохром Ь5-редуктаза;

ДХФИФ - 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия;

НТ - неотетразолий синий

Для получения воспроизводимых результатов представлялось целесообразным выбрать оптимальную концентрацию белка, при которой значения оксидоредуктазных активностей практически не изменялись бы. Оптимальной концентрацией белка для обоих штаммов являются значения в пределах от 1 до 5 мг/мл, расположенные на начальных участках кривых зависимости НАДНН+- и НАДФНН+:КзРе(СК)б-редуктазных активностей от концентрации белка, где указанные редуктазные активности мало зависят от концентрации белка [8]. Что касается концентрации белка в пробе при измерении остальных ре-дуктазных активностей, эта величина также соответствовала значениям 1-5 мг/мл, которые были определены пропорционально количествам вносимого белка микросом печени крыс при измерении оксидоредуктазных активностей по стандартной методике. Значения активностей оксидо-редуктаз представлены в табл. 1, 2.

Результаты измерения содержания цитохромов b5 и Р-450 в клетках бактерий рода Pseudomonas, осуществляющих деградацию алифатических и гетероциклических ксенобиотиков, представлены в табл. 3. В качестве биотрансформационных были выбраны процессы эпоксиди-рования алкенов бактериями рода Pseudomonas. Стереохимия образовавшихся эпоксидов описана в работе [8]. В качестве ростовых субстратов использовали глюкозу, гексан или нонан, а в качестве трансформационных - гексен-1 и нонен-4. В качестве субстратов деградации были выбраны пестициды триазинового ряда - симазин и про-метрин. Регистрацию интермедиатов и продуктов биодеградации ксенобиотиков осуществляли с помощью методов ГЖХ и ВЭЖХ.

Таблица 3

Содержание цитохромов и Р-450 в клетках бактерий, окисляющих ксенобиотики

Таблица 1

Активности оксидоредуктаз в клетках бактерий, осуществляющих трансформацию алкенов в эпоксиалканы

Донор/акцептор электронов Активность оксидоредуктаз, нмоль/

P. aeruginosa PAO1 P. fluorescens B-22

глюкоза гексан гексен-1 нонен-4 глюкоза гексан гексен-1 нонен-4

НАДН:2,6-ДХФИФ НАДФН:2,6-ДХФИФ 1,71 2,21 2,30 2,94 2,70 3,07 3,51 1,68 4,11 1,65 4,94 1,67 7,44 2,83 3,77 2,09

НАДН: цитохром с НАДФН: цитохром с 1,81 0,52 1,98 0,39 3,15 1,43 0,97 0,40 1,66 0,51 2,78 0,86 4,17 0,84 0,37 0,43

HA£H:K3Fe(CN)6 НАДФН:К^е(С№)6 21,47 14,24 79,90 43,07 83,24 26,22 35,48 20,54 50,26 27,78 60,46 31,30 82,48 56,10 28,57 13,76

НАДН:НТ НАДФН :НТ 0,35 0,14 0,35 0,27 0,06 0,21 0,11 0,03 0,10 0,23 0,17 0,21 0,14 0,12 0,14 0,07

Таблица 2

Активности оксидоредуктаз в клетках бактерий, осуществляющих деградацию сим-триазиновых ксенобиотиков

Донор/акцептор электронов Активность оксидоредуктаз, нмоль/

P. aeruginosa B-7 P. aurantica B-162

глюкоза прометрин глюкоза симазин

НАДН:2,6-ДХФИФ НАДФН:2,6-ДХФИФ 1,81 2,33 3,76 2,45 1,62 1,13 3,32 0,54

НАДН: цитохром с НАДФН: цитохром с 1,87 0,61 3,69 1,92 1,74 0,72 3,35 1,28

НАДН:^е(С№)6 НАДФН:^е(С№)6 21,54 15,12 39,52 22,41 20,19 14,62 36,87 16,04

НАДН:НТ 0,33 0,32 0,23 0,37

НАДФН:НТ 0,15 0,27 0,18 0,08

Субстрат Содержание цитохромов b5 и Р-450, нмоль/мг белка

P. aeruginosa PAO1 P. fluorescens B-22 P. aeruginosa B-7 P. aurantica B-162

b5 Р-450 b5 Р-450 b5 Р-450 b5 Р-450

Глюкоза 0,01 0,03 0,04 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01

Гексан 0,02 0,05 0,12 0,10 — — — —

Гексен-1 0,04 0,02 0,18 0,21 — — — —

Нонен-4 0,06 0,09 0,05 0,18 — — — —

Прометрин — — — — 0,02 0,04 — —

Симазин - — — — — — 0,03 0,09

Как видно из представленных данных, замена углеводного субстрата на углеводородные приводит к увеличению содержания цитохромов b5 и Р-450 в клетках бактерий P. aeruginosa PAO1 и P. fluorescens B-22, причем это увеличение особенно заметно у P. fluorescens B-22 при эпок-сидировании гексена-1, а у P. aeruginosa PAO1 -при эпоксидировании нонена-4. Кроме этого, в клетках бактерий, осуществляющих деградацию ксенобиотиков, увеличение содержания ци-тохромов b5 и Р-450 не такое значительное, как при трансформации алкенов в их эпоксипроиз-водные. Причем при деградации симазина клетками P. aurantica B-162 отмечается наиболее существенный прирост содержания цитохромов Р-450 и b5. В клетках бактерий рода Pseudomonas независимо от того, осуществляют ли они транс-

формацию или деградацию, наблюдаются в значительной степени близкие значения активностей оксидоредуктаз. Причем отмечаются случаи более существенных изменений активностей оксидоредуктаз в пределах одного штамма, выращенного на разных субстратах, например для P. fluorescens B-22 НАДФН:К3Ре(С1Ч)6-редуктаз-ная активность при переходе от гексена-1 к но-нену-4 уменьшается примерно в 4 раза.

Подобные исследования проведены авторами [5] с целью изучения субклеточной локализации ферментов начальных этапов окисления н-алканов дрожжами Candida maltosa. В результате показано, что компоненты алканмоно-оксигеназы - цитохром Р-450, НАДФНН-цитохром с-редуктаза и НАДНН+-цитохром с-редуктаза локализованы во фракциях легких

мембран (микросомах), но отсутствуют в мембранах митохондрий и пероксисом.

Полученные нами результаты хорошо согласуются с литературными данными. Так, у алка-нокисляющих дрожжей Candida guilliermondii, Candida lipolytica, Candida tropicalis и Torulopsis candida при их росте как на гексадекане, так и на интермедиатах его окисления - гексадеканоле и пальмитате - индуцируется синтез цитохрома Р-450, но при росте на гексадеканоле и пальми-тате его максимальное содержание в клетках в 3-4 раза меньше, чем при росте на гексадекане. Вместе с тем в экспоненциальной фазе роста культур для всех перечисленных субстратов имела место индукция синтеза цитохрома Р-450, содержание которого уменьшалось при переходе культур в стационарную фазу [2-4].

Заключение. Таким образом, нами установлено, что в трансформации алкенов и деградации сим-триазиновых гербицидов бактериями рода Pseudomonas участвует цитохром Р-450-содержа-щая монооксигеназная ферментная система, которая состоит из четырех компонентов, функционирующих как в НАДФНН+-, так и в НАДНН+-зави-симых электрон-транспортных цепях, сопряженных с реакцией окисления органических субстратов: нАдФНН+-цитохром Р-450-редуктазы, НАДНН+-цитохром Ь5-редуктазы, цитохромов b5 и Р-450.

Полученные результаты свидетельствуют о ключевой роли цитохром Р-450-зависимой мо-нооксигеназной ферментной системы бактерий рода Pseudomonas в окислении ксенобиотиков.

Литература

1. Munro, A. W. Bacterial cytochromes P-450 / A. W. Munro, Y. C. Lindsay // Mol. Microbiol. -1996. - Vol. 20, № 6. - P. 1115-1125.

2. Gallo, M. Participation of cytochrome P-450 in the oxidation of alkanes in Candida tropicalis / M. Gallo, J. C. Bertrand, E. Azoulay // FEBS Lett. -1971. - Vol. 19, № 1. - P. 45-51.

3. Lebeault, J. M. Fatty acid hydrogen hy-droxylation in yeast: role of cytochrome P-450 in Candida tropicalis / J. M. Lebeault, E. T. Lode,

M. J. Coon // Biochim. Biophys. Acta. - 1971. -Vol. 42, № 3. - P. 413-418.

4. Индукция и активация цитохрома Р-450 в дрожжах Candida при их выращивании на н-алканах / В. И. Козлов [и др.] // Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека: тез. докл. Всесоюз. конф., Москва, 12-18 авг. 1985 г. / Акад. наук СССР. - Москва, 1985. - С. 89-90.

5. Краузова, В. И. Исследование субклеточного распределения ферментов начальных этапов окисления н-алканов в клетках дрожжей Candida maltosa / В. И. Краузова, А. А. Шарышев // Биохимия. - 1987. - Т. 52, № 4.- С. 599-606.

6. Механизм деградации симазина бактериями рода Pseudomonas / О. С. Игнатовец [и др.] // Докл. НАН Беларуси. - 2006. - Т. 51, № 2. -С.61-64.

7. Игнатовец, О. С. Механизм деградации симазина бактериями рода Pseudomonas / О. С. Игнатовец, В. Н. Леонтьев // Докл. НАН Беларуси. - 2008. - Т. 52, № 3. - С. 81-85.

8. Ахрамович, Т. И. Получение оптически активных эпоксидных соединений с применением ферментных систем микроорганизмов: автореф. дис. ...канд. биол. наук: 03.00.23; 03.00.07 / Т. И. Ахрамович; Белорус. гос. тех-нол. ун-т. - Минск, 2002. - 22 с.

9. Dallner, G. Studies on the structural and en-zymic organisation of the membraneous elements of liver microsomes / G. Dallner // Acta Pathol. Microbiol. Scand. - 1963. - Vol. 166. - P. 94.

10. Roering, D. L. Microsomal electron transport: tetrazolium reduction by rat liver microsomal NADPH-cytochrome c reductase / D. L. Roering, L. Mascaro, S. D. Aust // Arch. Biochem. - 1972. -Vol. 153. - P. 475-479.

11. Omura, T. The carbon monooxide binding pigment of liver microsomes. II. Solubilization, purification and properties / T. Omura, R. Sato // J. Biol. Chem. - 1964. - Vol. 239, № 7. - P. 2379-2385.

12. Warburg, O. Isolation and crystallization of enolase / O. Warburg, W. Christian // Biochem. Z. -1942. - Vol. 310. - P. 384-421.