ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ С ПРОБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ФЕКАЛИЙ ДЕТЕЙ, ВСКАРМЛИВАЕМЫХ ИСКЛЮЧИТЕЛЬНО МАТЕРИНСКИМ МОЛОКОМ
RECOVERING, IDENTIFYING AND DESCRIBING STRAINS WITH PROBIOTIC ACTIVITY RECOVERED FROM FAECES OF EXCLUSIVELY BREAST-FED CHILDREN

Область изобретения
Основная задача данного исследования заключается в выделении пробиотических микроорганизмов для последующего применения в пищевой и фармацевтической промышленности, в частности для их применения в молочных смесях для детского питания. Указанные микроорганизмы имеют высокие показатели устойчивости к рН, солям желчных кислот и адгезии на клетках кишечника, поэтому они являются особенно подходящими для применения в указанных выше отраслях промышленности.
Предшествующий уровень техники
Питание прошло весьма существенное развитие, которое изменило его концепцию в последние десятилетия. Ранее считалось, что пища играет роль источника питательных веществ, необходимых для поддержания состояния здоровья, однако в настоящее время из этой концепции развилась идея о том, что пищевой рацион может включать продукты питания, которые, в дополнение к обеспечению питания, будут способствовать здоровью. На этом основании в пищевой промышленности начались разработки большого количества продуктов, способствующих здоровью и хорошему самочувствию. В этой области произошло весьма существенное развитие линии функциональных продуктов питания, в которой ежедневно увеличивается употребление населением пробиотиков. Серьезной проблемой является расширение знаний об этих продуктах питания, среди которых особый интерес представляют продукты, содержащие пробиотики.
Имеются очень давние сведения относительно полезных эффектов употребления продуктов питания с высоким содержанием бактерий, таких как в варианте древнего лечения, где сказано, что Авраам связывает свою долгую жизнь с употреблением молока, или у римского историка Плиния, который в 76 году до нашей эры рекомендовал применение кисломолочных продуктов для лечения гастроэнтерита (Senmier and De Vrese 2001).
В начале прошлого века русский микробиолог Илья Мечников (1845-1916) подтвердил, что употребление кисломолочных продуктов модулирует кишечную микробиоту, оказывая положительное воздействие на здоровье человека (Metchnikoff 1908). Он сконцентрировал свое внимание на том факте, что в Болгарии было удивительно много долгожителей, несмотря на то, что она была одной из беднейших стран Европы. Он обратил внимание на то, что болгары употребляли большие количества йогурта. Мечников успешно выделил бактерии, обеспечивающие получение йогурта, и использовал их в своих исследованиях. Это послужило началом исследований пробиотиков. Мечников стал убежденным защитником концепции, согласно которой пища может защищать организм от инвазии патогенов и, следовательно, продлевает жизнь и улучшает ее качество. Он также первым разработал препарат с использованием лактобацилл в форме капсулы для перорального приема, названный лактобациллином.
В то же самое время французский микробиолог Тиссье обратил внимание на то, что микробиота фекалий новорожденных, вскармливаемых материнским молоком, содержит больше бактерий из рода Bifidobacterium, чем микробиота фекалий детей, получавших искусственное молоко, и подтвердил полезную роль этого микроорганизма.
Позднее, в 1940 году, появилось бифидомолоко (Bifidus Milk) для облегчения недостаточности питания у детей во время Первой мировой войны. В 1950 году фабрика Degusta произвела Biogur и Bio-garde. В 1989 году увеличилось потребление и производство кисломолочных продуктов в Швейцарии. В 1993 году два исследователя, Модлер (Modler) и Вила-Гарсия (Vila-Garcia), разработали первый низкокислотный биойогурт.
В 1965 году Лилли (Lilly) и Стиллвелл (Stillwell) впервые использовали термин «пробиотик» для обозначения продуктов желудочной ферментации. Однако более обоснованным и широко используемым определением пробиотков стало определение, сформулированное значительно позже Фуллером (Fuller 1992, Fuller 1989). Пробиотики определяют следующим образом: «добавки из живых микроорганизмов, которые при добавлении к продуктам питания оказывают полезные воздействия на здоровье того, кто их употребляет, поскольку они обуславливают улучшение микробного баланса в его/ее кишечнике». Для взрослого человека это включает как продукты, получаемые из кисломолочных продуктов, так и препараты, лиофилизированные с этими бактериями.
В 1998 году Международный институт медико-биологических наук (International Life Science Institute. (ILSI)) в Брюсселе определил пробиотики как живые микроорганизмы, которые при их приеме в достаточных количествах оказывают полезные воздействия на здоровье, значительно превышающие воздействия от обычной пищи. Они оказывают полезное воздействие на одну или несколько функций организма. Они обеспечивают лучшее состояние здоровья и хорошее самочувствие и/или снижают риск заболевания. Они могут быть функциональными для населения в целом или для его определенных групп.
В настоящее время существуют следующие критерии определения пробиотических микроорганизмов:
1) они имеют происхождение от человека;
2) они непатогенны по своей природе;
3) они устойчивы к разрушению техническими способами;
4) они устойчивы к разрушению кислотой желудочного сока и желчью;
5) они способны к адгезии на кишечном эпителии;
6) они способны колонизировать желудочно-кишечный тракт;
7) они продуцируют антимикробные вещества;
8) они модулируют иммунный ответ;
9) они влияют на метаболические процессы человека (ассимиляция холестерина, образование витаминов и так далее).
Пробиотические бактерии могут влиять на все клетки кишечника и механизмы функционирования этих клеток, включая воздействия на микробиоту (Backhed and Ley 2005), модуляцию функции иммунной системы (Picard et al. 2004; Kalliomaki 2004) и усиление барьерной функции эпителия (Madsen etal. 2001; Isolauri & Salminen 2005).
Среди бактерий с пробиотической активностью в кишечнике наиболее многочисленны бактерии рода Bifidobacterium, и они составляют 25% бактерий в толстой кишке взрослого и 95% у новорожденного, питающегося материнским молоком. Сегодня существует множество продуктов питания (йогурт и молоко), дополненных бактериями этого типа. Другие штаммы, также обладающие пробиотической активностью, представляют собой штаммы рода Lactobacillus, которые, согласно исследованиям in vitro, ингибируют адгезию других анаэробных бактерий, таких как Clostridium, Bacteroides, Bifidobacterium, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus и Enterobacteriacea (Silva et al., 1987).
Применение пробиотиков в качестве медицинского инструмента при некоторых патологиях воспринято очень хорошо, и доказательства их эффективности убедительны, главным образом в результате клинических исследований и мета-анализа относительно нарушения всасывания лактозы (Adolfsson et al. 2004; Piaia et al. 2003), желудочно-кишечных инфекций (Brownlee et al. 2003) и диареи, ассоциированной с применением антибиотиков (D'Souza et al. 2002). Кроме того, показаны положительные эффекты применения пробиотических бактерий Bifidobacterium, Lactobacillus и/или их смеси при некоторых заболеваниях пищеварительной системы. В литературе существует множество доказательств этих положительных эффектов.
Понимание взаимоотношений, существующих между компонентами кишечной микробиоты, а также ее взаимодействия с организмом хозяина, является очень сложным. Геном облегчает анализ ответа выделенных бактерий на условия в кишечнике, отчасти показывая метаболическую способность штаммов, однако, условия, при которых возможно проявление этих способностей, а также условия, позволяющие выделить большинство штаммов, формирующих кишечную микробиоту, все еще в значительной степени неизвестны, при этом идентифицировать их можно только молекулярными способами с частичной или полной идентификацией их генома. По этой причине разработки в области пробиотиков и функциональных продуктов питания активно развиваются.
Таким образом, принимая во внимание, что имеют место различные эффекты между пробиотическими штаммами и что разновидности бактерий, принадлежащих к одному виду, могут проявлять разные физиологические характеристики, что придает им отличные или улучшенные пробиотические свойства по сравнению с другими бактериями, идентификация и описание эффектов новых пробиотических штаммов очень важны в свете их медицинского и промышленного значения.
Основная задача данного исследования заключается в том, чтобы выделить пробиотические микроорганизмы с улучшенными пробиотическими свойствами устойчивости к кислому рН, устойчивости к солям желчных кислот и адгезии на клетках кишечника для последующего применения в пищевой и фармацевтической промышленности, в частности для их применения в молочных смесях для детского питания.
Согласно настоящему изобретению предложены и охарактеризованы пробиотические микроорганизмы, выделенные из фекалий детей, вскармливаемых исключительно материнским молоком.
Повышенная устойчивость штаммов по изобретению к рН и солям желчных кислот придает пробиотическим микроорганизмам повышенную выживаемость при их прохождении через желудок и кишечник и тем самым увеличивает их колонизующий эффект и, следовательно, их антагонистические эффекты против других потенциально патогенных бактерий. С другой стороны, повышенная способность пробиотических штаммов по изобретению к адгезии на клетках кишечника человека обеспечивает более сильное воздействие на модуляцию всей иммунной системы.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены пробиотические микроорганизмы, выделенные из фекалий детей, вскармливаемых исключительно материнским молоком. Указанные микроорганизмы используют в пищевой или фармацевтической промышленности, в частности для применения в молочных смесях для детского питания, благодаря их пробиотическим свойствам, оказывающим полезные воздействия на здоровье тех, кто их принимает.
Для выделения указанных пробиотических микроорганизмов согласно настоящему изобретению поставлены следующие конкретные задачи: а) выделение штаммов молочнокислых бактерий, полученных из фекалий детей, вскармливаемых исключительно материнским молоком; б) оценка устойчивости к рН и солям желчных кислот; и в) оценка способности к адгезии на клетках кишечного эпителия.
Пробиотические бактерии часто обнаруживают в фекалиях детей. Кроме того, существует определенный подход, согласно которому пробиотики должны иметь происхождение от человека, предположительно в виду их лучшего внедрения в кишечник человека. Однако, многие выделенные штаммы не соответствуют определению пробиотика, поскольку они редко обладают или не обладают устойчивостью к пищеварительным сокам, и многие из них не способны к адгезии на кишечном эпителии. В настоящем изобретении выбраны дети, вскармливаемые исключительно материнским молоком, для обеспечения того, что выделенные бактерии не являются коммерческими бактериями. Кроме того, показано, что кишечная микробиота детей, вскармливаемых материнским молоком, очень богата бифидобактериями и лактобациллами.
Относительно пробиотиков, эффективный пробиотик должен обладать следующими свойствами:
1) способность оказывать полезное воздействие на организм хозяина, например, обеспечивать невосприимчивость к заболеваниям;
2) не вызывает патогенности или токсичности;
3) способность к выживанию при прохождении через кишечный тракт; например, устойчивость к кислоте желудочного сока и желчным кислотам;
4) сохранение способности к адгезии на клетках кишечной стенки;
5) короткое постоянное время генерации и способность оставаться жизнеспособным на протяжении длительных периодов в условиях хранения;
6) имеет происхождение от человека;
7) продуцирование антимикробных веществ против патогенов; противоопухолевые свойства;
8) способность влиять на метаболическую активность.
Польза для здоровья, связанная с приемом пробиотиков, включает следующее:
1) облегчение симптомов, возникающих при нарушении всасывания лактозы;
2) повышение естественной невосприимчивости к инфекционным заболеваниям кишечного тракта;
3) снижение концентрации холестерина в сыворотке;
4) улучшение пищеварения;
5) стимуляция иммунитета в желудочно-кишечном тракте;
6) развитие иммунологической толерантности к пищевым антигенам и снижение риска возникновения аллергий.
Таким образом, настоящее изобретение относится к новым пробиотическим микроорганизмам, выделенным из фекалий детей. Изобретение, в частности, относится к микроорганизмам Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM 1-4036), Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM I-4034) и Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM 1-4035). Указанные микроорганизмы имеют улучшенные пробиотические свойства по сравнению с микроорганизмами тех же видов.
«Композиция» относится к композициям или группе из одного или нескольких ингредиентов, то есть класса и числа элементов, присутствующих в сложном веществе (продукте питания или лекарственной форме, среди прочего), и соотношению, в котором они находятся.
Под «носителем» понимают вещество любого типа, обеспечивающее возможность выращивания, переноса и/или введения штаммов по настоящему изобретению. В зависимости от назначения и/или применения, для которого предназначены указанные штаммы, «носители» могут иметь различную природу. Настоящее изобретение относится к фармацевтически приемлемым «носителям», таким как «носители», обычно используемые в капсулах, таблетках или порошках, а также «носители», образованные ингредиентами или продуктами питания.
Продукты питания, предназначенные для специального питания, представляют собой продукты питания, которые в виду их особого состава или особого способа их изготовления несомненно отличаются от массовых продуктов питания, которые подходят для указанной цели питания и которые представлены на рынке с указанием, что они удовлетворяют указанной цели (Директива Совета 89/398/ЕЕС от 3 мая 1989 года, относящаяся к сближению законодательств стран-участниц о продуктах питания, предназначенных для специального питания (DO, серия L, №186 от 30 июня).
Под специальным питанием понимают питание, которое должно удовлетворять специфические питательные потребности:
1) определенных классов людей, имеющих расстройство процесса ассимиляции или метаболизма; или
2) определенных классов людей, имеющих определенные физиологические состояния и получающих, вследствие этого, особую пользу от контролируемого приема определенных питательных веществ; или
3) здоровых младенцев или детей младшего возраста.
Пищевая добавка относится к тем продуктам питания, назначение которых заключается в дополнении нормального питания и которые состоят из концентрированных источников питательных или других веществ, оказывающих питательный или физиологический эффект сами по себе или в комбинации, и имеются в продаже в дозированной форме, то есть в форме капсул, пилюль, таблеток, пастилок и других подобных формах, в форме саше из порошков, ампул с жидкостями, флаконов с каплями и других подобных формах жидкостей и порошков, которые следует принимать в небольших единичных количествах (директива 2002/46/ЕС Европейского парламента и совета от 10 июня 2002 года, относящаяся к сближению законодательств стран-участниц в отношении пищевых добавок).
Пробиотик относится к препаратам микробных клеток, или микробным клеткам, или компонентам микробных клеток, оказывающим полезное воздействие на здоровье и хорошее самочувствие хозяина.
Под пребиотиком понимают «неперевариваемый ингредиент из пищевого рациона, оказывающий полезный эффект и стимулирующий рост кишечных бактерий, улучшая баланс в кишечнике организма хозяина». Используемые пребиотики включают инулин, фруктоолигосахариды, галактоолигосахариды и олигосахариды, полученные гидролизом пектинов и других смол и растительных клеев, и резистентные крахмалы и мальтодекстрины, а также нуклеотиды.
Задача настоящего изобретения относится к штамму пробиотического микроорганизма, выделенному из фекалий детей, вскармливаемых исключительно материнским молоком, характеризующемуся тем, что он состоит из Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM 1-4036), или Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 1-4034), или Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM 1-4035).
В конкретном воплощении указанный штамм представляет собой Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM 1-4036).
В другом конкретном воплощении указанный штамм представляет собой Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM 1-4034).
В еще одном конкретном воплощении указанный штамм представляет собой Bifidobacterium breve HERO 15 В (CNCM 1-4035).
В одном воплощении описанный выше штамм представлен в форме чистой биологической культуры. В другом воплощении штамм является выделенным.
В одном воплощении описанный выше штамм микроорганизма представлен в форме жизнеспособных клеток; в другом воплощении штамм представлен в форме нежизнеспособных клеток.
Другая задача изобретения относится к композиции, содержащей штамм микроорганизма, как он описан выше. В конкретном воплощении указанная композиция содержит другой пробиотический материал; в другом воплощении она дополнительно содержит пребиотический материал.
В другом конкретном воплощении описанная композиция содержит носитель, подходящий для приема внутрь. Указанный носитель представляет собой фармацевтически приемлемый носитель, такой как носители, обычно используемые в капсулах, таблетках или порошках.
В еще одном конкретном воплощении указанный носитель представляет собой продукт питания. Указанный продукт питания выбран из группы, состоящей из молока и продуктов, полученных из молока, в частности кисломолочных продуктов и сыров; зерновых и их производных, включая тесто для выпечки хлеба; супов и других подобных продуктов в дегидратированной форме; ферментированных мясных продуктов; продуктов переработки фруктов, соков и безалкогольных напитков; продуктов питания для применения в специальном питании.
Еще одна задача изобретения относится к штамму пробиотического микроорганизма или композиции, описанным выше, для применения в питании. В одном воплощении указанное питание относятся к детскому и/или взрослому и/или специальному питанию.
В другом воплощении штамм пробиотического микроорганизма или композицию, описанные выше, применяют для изготовления молочной смеси для детского питания. В конкретном воплощении указанные смеси состоят из готового к употреблению молока для детского питания и/или зерновых продуктов для детского питания и/или продуктов для детского питания.
В еще одном воплощении штамм пробиотического микроорганизма или композицию, описанные выше, применяют для изготовления пищевых добавок.
В еще одном воплощении штамм пробиотического микроорганизма или композицию, описанные выше, применяют для изготовления специальных смесей для перорального и/или энтерального питания.
В еще одном воплощении штамм пробиотического микроорганизма или композицию, описанные выше, применяют для изготовления продукта для фармацевтического применения, или продукта, применимого в качестве лекарственного средства, или для использования в изготовлении фармацевтического продукта.
В еще одном воплощении штамм пробиотического микроорганизма или композиция, описанные выше, пригодны для стимуляции иммунной системы, и/или предотвращения/лечения астмы, и/или предотвращения/лечения желудочно-кишечных расстройств, и/или устранения/модуляции основных патогенов, поражающих пищеварительную систему, и/или предотвращения/лечения ожирения и сопутствующих ему заболеваний, включая метаболический синдром и диабет, и/или при заболеваниях, ассоциированных со старением.
Указанные желудочно-кишечные расстройства включают изменения прохождения содержимого через кишечник, такие как запор, и изменения биодоступности минералов, инфекции и синдромы мальабсорбции.
Указанные синдромы мальабсорбции включают расстройства, затрагивающие анатомию кишечника, такие как синдром укороченной тонкой кишки, и расстройства, затрагивающие физиологию кишечника, такие как муковисцидоз поджелудочной железы, нарушения всасывания Сахаров, в частности лактозы, изменения всасывания липидов, пищевые аллергии и воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона и неспецифический язвенный колит.
Описание графических материалов
На Фиг.1 в форме таблицы показано влияние рН на выживание штаммов Lactobacillus rhamnosus CNCM 1-4036 и Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 no изобретению по сравнению с двумя штаммами, введенными в производство. Конкретно, в указанной таблице представлены значения жизнеспособности (в % колониеобразующих единиц) из исследований устойчивости выделенных штаммов Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036), Lactobacillus paracasei 7 (CNCM I-4034) и их соответствующих производственных контролей к рН. Указанные значения выражены в виде % выживания, полученного сравнением числа бактерий, присутствующих в контроле, с числом бактерий, присутствующих при различных исследованных рН. Результаты представлены в процентных единицах в колонке «%». Видно, что при рН 3 штаммы 7 и 22A имеют такую же или несколько более высокую устойчивость, чем исследованные производственные штаммы. Тем не менее при рН 2 штамм 22A имеет очень высокую жизнеспособность по сравнению с остальными штаммами, не выживающими при этом рН.
На Фиг.2 в форме таблицы показано влияние солей желчных кислот (Oxgall) на выживание штаммов Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 и Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 по изобретению по сравнению с двумя производственными штаммами. Таким образом, в указанной таблице представлены значения жизнеспособности из исследований устойчивости выделенных штаммов Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036), Lactobacillus paracasei 7 (CNCM I-4034) и их соответствующих производственных контролей к солям желчных кислот. Указанные значения выражены в виде % выживания при сравнении числа бактерий, присутствующих в контроле, с числом бактерий, присутствующих при различных исследованных концентрациях солей желчных кислот. Результаты представлены в процентных единицах в колонке «%». На основании этих результатов можно сделать вывод, что и штамм 7, и штамм 22A демонстрируют значительно более высокий процент выживания, который приблизительно в два раза выше процента выживания исследованных производственных штаммов, как при концентрации солей желчных кислот 0,3%, так и при концентрации солей желчных кислот 0,7%. Оба штамма имеют показатель выживания более 100%, указывая на то, что они могут даже размножаться в присутствии этих солей. Вместе с их высокой устойчивостью к рН, это указывает на высокий колонизирующий потенциал этих штаммов.
На Фиг.3 в форме таблицы показана адгезия штаммов Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 и Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 по изобретению на клетках кишечника человека НТ-29 по сравнению с двумя производственными штаммами. Указанная способность выражена через значения жизнеспособности из исследований адгезии выделенных штаммов Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036), Lactobacillus paracasei 7 (CNCM I-4034) и их соответствующих производственных контролей на клетках кишечного эпителия. Указанные значения выражены в виде % прикрепившихся бактерий по сравнению с числом бактерий, присутствующих в контроле. Оба штамма демонстрируют проценты адгезии на клетках кишечника человека НТ-29, значительно превышающие проценты адгезии исследованных производственных штаммов, что указывает на их потенциальное действие при модуляции активности клеток кишечника, включая иммуномодуляцию.
На Фиг.4 в форме таблицы показано влияние рН на выживание штамма Bifidobacterium breve CNCM I-4035 по изобретению по сравнению с двумя производственными штаммами. Указанное влияние выражено через значения жизнеспособности из исследований устойчивости указанного штамма к рН по сравнению с его соответствующими производственными контролями. Указанные значения выражены в виде % выживания, полученного сравнением числа бактерий, присутствующих в контроле, с числом бактерий, присутствующих при различных исследованных рН. Результаты выражены в процентных единицах в колонке «%». Видно, что при рН 3 штамм 15В демонстрирует значительно более высокую устойчивость, чем два других исследованных штамма бифидобактерий, при этом его жизнеспособность превышает 100%, указывая на то, что бактерии могут даже размножаться при этом значении рН.
На Фиг.5 в форме таблицы показано влияние солей желчных кислот (Oxgall) на выживание штамма Bifidobacterium breve CNCM I-4035 по изобретению по сравнению с двумя производственными штаммами. Это влияние продемонстрировано исследованиями устойчивости выделенного штамма Bifidobacterium breve 15B (CNCM I-4035) и его соответствующих производственных контролей к солям желчных кислот.Указанные значения выражены в виде % выживания, полученного сравнением числа бактерий, присутствующих в контроле, с числом бактерий, присутствующих при различных исследованных концентрациях солей желчных кислот. Результаты выражены в процентных единицах в колонке «%». Показатели выживания в присутствии солей желчных кислот в низких концентрациях сходны с показателями двух других бифидобактерий. Тем не менее, штамм 15В демонстрирует лучшее выживание при высоких концентрациях.
На Фиг.6 в форме таблицы показана адгезия штамма Bifidobacterium breve CNCM I-4035 по изобретению на клетках кишечника человека по сравнению с двумя производственными штаммами. Указанная способность выражена через значения жизнеспособности из исследований адгезии выделенного штамма Bifidobacterium breve 15B (CNCM I-4035) и его соответствующих производственных контролей на клетках кишечного эпителия. Указанные значения выражены в виде % прикрепившихся бактерий по сравнению с числом бактерий, присутствующих в контроле. Штамм по изобретению имеет процент адгезии на клетках кишечника человека НТ-29, значительно превышающий процент адгезии исследованных производственных штаммов, что указывает на их потенциальное действие при модуляции активности клеток кишечника, включая иммуномодуляцию.
На Фиг.7 показаны ферментативные активности (в единицах на мл культуральной среды, Ед/мл) штамма Bifidobacterium breve CNCM I-4035 (Bifidobacterium breve 15B) по изобретению по сравнению с двумя производственными штаммами (его контролями). Результаты представлены как описано в Примере 11. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что ферментативная активность CNCM I-4035 совпадает с ферментативной активностью вида из рода Bifidobacterium, давая возможность классифицировать CNCM I-4035 как принадлежащий указанному роду.
На Фиг.8 показаны ферментативные активности штаммов Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 (Lactobacillus rhamnosus HERO 22A) и Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 (Lactobacillus paracasei HERO 7) по изобретению по сравнению с двумя производственными штаммами (контролями). Результаты представлены как описано в Примере 11. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что ферментативная активность HERO 7 и HERO 22A совпадает с ферментативной активностью видов из рода Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus, давая возможность классифицировать CNCM I-4036 и CNCM I-4034 как принадлежащие указанным видам и роду.
Фиг.9 - на Фиг.9А и 9Б показаны результаты по ферментативным активностям выбранных штаммов CNCM I-4034 (Lactobacillus paracasei HERO 7) и CNCM I-4036 (Lactobacillus rhamnosus HERO 22A) и их контролей в отношении углеводов и других субстратов (API 50 CHL). Результаты представлены как описано в Примере 11. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что ферментативная активность HERO 7 (CNCM I-4034) и HERO 22A (CNCM I-4036) совпадает с ферментативной активностью видов из рода Lactobacillus paracasei и Lactobacillus rhamnosus, давая возможность классифицировать CNCM I-4036 и CNCM I-4034 как принадлежащие указанному роду.
Фиг.10 - на Фиг.10А, 10Б и 10В показаны результаты в отношении эффекта, оказываемого пробиотическими бактериями по настоящему изобретению на L. monocytogenes CECT 4031 и S. sonnei CECT 457. (А) Эффект, оказываемый на L. monocytogenes CECT 4031 10x-концентрированной надосадочной жидкостью, полученной через 17 часов роста L. paracasei CNCM I-4034. (Б) Эффект, оказываемый на L. monocytogenes CECT 4031 10x-концентрированной надосадочной жидкостью, полученной через 24 часа роста В. breve CNCM I-4035. (В) Эффект, оказываемый на S. sonnei CECT 457 10x-концентрированной надосадочной жидкостью, полученной через 24 часа роста L. rhamnosus CNCM I-4036.
На Фиг.11 показаны результаты по ингибирующим эффектам 1% и 4% нейтрализованной и не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 при времени культивирования 17 и 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725, Salmonella typhimurium CECT 443 и Salmonella typhimurium CECT 4594. (А) Ингибирующий эффект не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 при времени культивирования 17 часов в отношении бактерий Salmonella typhimurium CECT 443. (Б) Ингибирующий эффект не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhimurium CECT 4594. (В) Ингибирующий эффект не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725. (Г) Ингибирующий эффект нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725. (Д) Ингибирующий эффект не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus paracasei CNCM I-4034 при времени культивирования 17 часов в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725.
На Фиг.12 показаны ингибирующие эффекты 1% и 4% нейтрализованной и не нейтрализованной надосадочной жидкости Bifidobactehum breve CNCM I-4035 при времени культивирования 17 и 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725. (А) Ингибирующие эффекты 1% и 4% не нейтрализованной надосадочной жидкости Bifidobactenum breve CNCM I-4035 при времени культивирования 17 часов в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725. (Б) Ингибирующие эффекты 1% и 4% нейтрализованной надосадочной жидкости Bifidobactenum breve CNCM I-4035 при времени культивирования 17 часов в отношении бактерий Salmonella typhi CECJ 725. (В) Ингибирующие эффекты 1% и 4% не нейтрализованной надосадочной жидкости Bifidobactenum breve CNCM I-4035 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725. (Г) Ингибирующие эффекты 1% и 4% нейтрализованной надосадочной жидкости Bifidobactenum breve CNCM I-4035 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725.
На Фиг.13 показаны ингибирующие эффекты 1% и 4% нейтрализованной и не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 17 и 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725, Salmonella typhimurium CECT 4594, Escherichia coli ETEC CECT 501, Escherichia coil ETEC CECT 515, Escherichia coli EPEC CECT 729 и Escherichia coli EPEC CECT 742. (А) Ингибирующие эффекты 1% и 4% не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 17 часов в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725. (Б) Ингибирующие эффекты 1% и 4% не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhi CECT 725. (В) Ингибирующие эффекты 1% и 4% нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Salmonella typhimurium CECT 4594. (Г) Ингибирующие эффекты 1% и 4% не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 17 часов в отношении бактерий Escherichia coli ЕТЕС CECT 501. (Д) Ингибирующие эффекты 1% и 4% не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Escherichia coli ЕТЕС CECT 501. (Е) Ингибирующие эффекты 1% и 4% не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 17 часов в отношении бактерий Escherichia coli ЕТЕС CECT 515. (Ж) Ингибирующие эффекты 1% и 4% не нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 17 часов в отношении бактерий Escherichia coli EPEC CECT 729. (3) Ингибирующие эффекты 1% и 4% нейтрализованной надосадочной жидкости Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036 при времени культивирования 24 часа в отношении бактерий Escherichia coli EPEC CECT 742.
На Фиг.14 показано снижение образования инфекционных очагов 1х-концентрированными надосадочными жидкостями штаммов по настоящему изобретению после (А) 17 часов роста и (Б) 24 часов роста при инфицировании линии НТ-29 вирусами Ito, Wa и VA70.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены пробиотические микроорганизмы с улучшенными пробиотическими свойствами устойчивости к рН, солям желчных кислот и адгезии. Конкретно, согласно настоящему изобретению выделены и охарактеризованы бактерии Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM I-4036), Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM I-4034) и Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM I-4035), выделенные из фекалий детей.
8
11
12
Известно, что поверхности слизистых оболочек заселены большим количеством разнообразных микроорганизмов. У взрослых число прокариотических клеток превышает число эукариотических клеток, действительно, по некоторым оценкам 90% клеток в организме человека являются микробными клетками, в то время как только 10% соответствуют эукариотическим клеткам (Savage 1977). Влияние этого микробного сообщества на физиологию человека вероятно более очевидно в кишечнике, в виду того факта, что этот орган содержит большую часть этих организмов. Их плотность в проксимальных и средних отделах тонкой кишки относительно мала, но в дистальных отделах тонкой кишки она существенно увеличивается и может достигать 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на мл кишечного содержимого, а в толстой кишке вплоть до 10-10/г.
В течение первых нескольких дней жизни состав кишечной микробиоты существенно изменяется. При рождении кишечник стерилен и в первые несколько часов жизни в испражнениях начинают появляться бактерии. Сначала происходит колонизация желудочно-кишечного тракта материнской вагинальной и фекальной бактериальной флорой. Первыми микроорганизмами, колонизирующими кишечник, являются микроорганизмы с высокой восстанавливающей способностью, включая такие разновидности, как энтеробактерии, стрептококки и стафилококки. Потребление кислорода этими бактериями постепенно изменяет среду в кишечнике, что делает возможным рост анаэробных бактерий, включая лактобациллы и бифидобактерии. Эти бактерии, заселяющие организм новорожденного, имеют происхождение, главным образом, от матери и из внешней среды, при этом тип родоразрешения является одним из основных определяющих факторов для кишечной микробиоты (Bezirtzoglou 1997).
Экосистема кишечника формируется при взаимодействии микробиоты, кишечного эпителия, иммунной системы слизистой оболочки и нервной системы кишечника (Gordon et al. 1997). Сравнение нормальных крыс и крыс со стерильным кишечником выявило ряд анатомических, биохимических и физиологических различий. Например, присутствие микробиоты повышает эпителиальный обмен, она также обеспечивает конъюгацию и удаление гидроксильной группы из желчных кислот, метаболизирует билирубин и восстанавливает холестерин до копростерина.
Таким образом, взаимоотношения кишечника и микробиоты являются очень тесными, и их можно рассматривать как симбиотические взаимоотношения, поскольку, например, микробиота может расщеплять углеводы, расщепление которых в кишечнике невозможно из-за отсутствия ферментативного механизма. Продукты, полученные при таком расщеплении, используются, главным образом, в качестве питательных веществ для кишечного эпителия, как это происходит с короткоцепочечными жирными кислотами. Кроме того, присутствие этой микробиоты оказывает иммуномодулирующий эффект, поскольку основной физиологической характеристикой кишечного эпителия является способность к запуску сильного ответа против инвазивных патогенов, которые могут колонизировать кишечный эпителий, и одновременно отсутствие ответа на бактерии, входящие в состав продуктов питания или на резидентную микробиоту. Это отсутствие ответа представляет собой активный процесс, включающий несколько механизмов, известный как оральная толерантность. Этот процесс необходим для того, чтобы в организме хозяина не развивался воспалительный ответ на присутствие какого-либо микроорганизма и, следовательно, чтобы на разные микроорганизмы в организме хозяина развивались разные ответы, способствуя тем самым стабильности кишечной флоры. По этой причине наличие микробиоты нормального состава может способствовать физиологическому, иммунному и метаболическому развитию организма хозяина. Эта экосистема сохраняет равновесие, и любая причина, нарушающая это равновесие, может привести к развитию патологии (диарей, воспалительных заболеваний).
Важно понять значимость этой экосистемы, функционирование непатогенных штаммов или «хороших бактерий». На основании этой идеи была разработана концепция о пробиотиках как медиаторах здоровья человека. Из различных исследованных областей влияние пробиотиков на модуляцию экспрессии генов в различных ситуациях представляется наиболее интересным.
Как указано выше, согласно настоящему изобретению выделены молочнокислые бактерии и бифидобактерии с улучшенными пробиотическими свойствами из фекалий детей, вскармливаемых исключительно материнским молоком. Для этого у выделенных бактерий оценивали устойчивость к рН, устойчивость к солям желчных кислот и их способность к адгезии на клетках кишечного эпителия. Основные результаты настоящего изобретения указывают на то, что в фекалиях этих детей присутствуют бактерии, обладающие высокой устойчивостью к желудочному рН, к солям желчных кислот и способностью к адгезии на клетках кишечного эпителия, которые могут быть использованы в качестве пробиотиков.
Для проверки пробиотической активности бактерий сначала их необходимо подвергнуть серии анализов in vitro с имитацией условий, которые будут воздействовать на указанные бактерии в организме, они должны оставаться жизнеспособными в указанных условиях и, следовательно, сохранять свои полезные для здоровья свойства. В настоящем изобретении использованные контрольные бактерии (Пример 12), в сравнении с которыми бактерии по изобретению демонстрируют свои улучшенные пробиотические свойства, представляют собой, для бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum, поставляемые Него Espana S.A.; и для лактобацилл используют 2 производственные лактобациллы: Lactobacillus casei (Danone) и Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) (VALIO).
Принимая во внимание полезность бактерий, составляющих данное изобретение, при стимуляции иммунной системы и при их воздействии на основные патогены, поражающие пищеварительную систему, эти контрольные бактерии были выбраны, поскольку в настоящее время они имеются в продаже на международном уровне в форме кисломолочных продуктов и в других дозированных формах, и имеется ряд публикаций об их пробиотических эффектах, особенно при предотвращении острой диареи у детей и модуляции иммунной системы, как у животных, так и у людей.
Таким образом, указанные анализы in vitro относятся к следующим.
Устойчивость к кислотности желудочного сока
Перед тем, как достичь кишечного тракта, пробиотические бактерии должны выжить при их прохождении через желудок (Henriksson et al. 1999). Секреция кислоты желудочного сока в желудке формирует первый защитный механизм против большей части микробной нагрузки, поступающей пероральным путем. По этой причине, выживание бактериальных штаммов в кислоте желудочного сока является наиболее точным показателем их способности проходить через желудок. Исследовательская группа по пробиотикам Университетского колледжа в Корке (University College of Corkbased Probiotic Research Group) успешно выделила и идентифицировала молочнокислые бактерии, продемонстрировавшие идеальные пробиотические свойства (Dunne et al. 1999). Были проведены предварительные эксперименты для определения степени начальной устойчивости штаммов лактобацилл и бифидобактерий, выделенных из подвздошной кишки человека. Человеческий желудочный сок получали от здоровых индивидуумов аспирацией через назогастральный зонд. Поскольку рН в желудке изменяется (он может достигать 1,5), его измеряли перед применением. Эту кислоту добавляли в среду RSM (среду Рогозы-Шарпа). Начальное выживание штаммов было оценено как 108% и 106% для лактобацилл и бифидобактерий, соответственно, в среде RSM (De Man et al 1960) с изменением значения рН от 2,0 до 3,4 посредством HCl. Результаты продемонстрировали значительную чувствительность бифидобактерий к кислотности (Thornton 1996). Таким образом, штаммы, составляющие настоящее изобретение, имеют показатели устойчивости, превышающие показатели штаммов, исследованных в указанных экспериментах, то есть, они обладают большей устойчивостью к кислотности (Фиг.1 и 4).
Устойчивость к солям желчных кислот
Как объяснено выше, для характеристики пробиотического потенциала необходимо, чтобы штамм обладал устойчивостью к солям желчных кислот (Lee and Salminen 1995). Желчные кислоты синтезируются из холестерина в печени и секретируются в двенадцатиперстную кишку из желчного пузыря в форме конъюгатов (500-700 мл/сутки), эти кислоты проходят дальнейшие химические модификации (деконъюгацию, дегидратацию, дегидрирование и деконъюгацию глюкуроновой кислоты) в толстой кишке, в основном лишь в результате микробной активности. Как конъюгированные, так и деконъюгированные кислоты обладают антибактериальной активностью, ингибируя рост штаммов Escherichia coli, Klebsiella sp., и Enterococcus sp. in vitro (Lewis et al 1972; Stewart et al 1986). Деконъюгированные формы обладают большей ингибирующей активностью, и грамположительные микроорганизмы более чувствительны, чем грамотрицательные (Floch et al. 1972; Percy-Robb 1972). Группа Dunne (Dunne et al. 1999) выбрала для использования в первом анализе твердую питательную среду с добавлением бычьих, свиных и человеческих желчных кислот до конечной концентрации 0,3% и 7,5% для оценки устойчивости штаммов к солям желчных кислот. После обеспечения роста лактобацилл и бифидобактерий результат состоял в том, что они продемонстрировали устойчивость к бычьей желчной кислоте, и что результатом использования свиной желчной кислоты являлось значительно более сильное ингибирование в отношении обеих групп бактерий (Thornton 1996). Таким образом, относительно поиска возможного пробиотика для использования у людей, наиболее значимым результатом является их способность расти в человеческой желчи. Принимая во внимание, что человеческая желчь не имеет стандартного состава, и что содержание желчных кислот подвержено значительным индивидуальным колебаниям, применение бычьей желчи со стандартным содержанием желчных кислот (OXGALL) в качестве замены человеческой желчи является общепринятой практикой в данной области техники и позволяет протоколировать воспроизводимые анализы. Этот способ использовали в настоящем изобретении для определения устойчивости бактерий по настоящему изобретению к солям желчных кислот. Полученные результаты демонстрируют, что указанные бактерии имеют более высокую устойчивость к солям желчных кислот, чем их производственные контроли (Фиг.2 и 5).
Способность пробиотических штаммов к адгезии на кишечном эпителии При селекции также необходимо оценивать адгезию штаммов, прикрепившихся к эпителиальной ткани кишечника, и способность колонизировать желудочно-кишечный тракт. Важность этого действия основана на том факте, что после проведения селекции многие пробиотики больше не способны колонизировать их целевого хозяина. Действительно, из доступных на сегодняшний день пробиотиков, по-видимому, только L rhamnosus GG остается в желудочно-кишечном тракте на протяжении значительного периода времени (Berg et al. 1998; Goldin et al. 1992). L. rhamnosus GG способен к адгезии на клетках Сасо-2, клетках НТ-29 и клетках Сасо-2, принадлежащих линиям клеток кишечника человека, они проявляют морфологические и физиологические свойства нормального колоноцита человека, и их используют для исследования механизмов, опосредующих адгезию энтеропатогенов (Bernet 1994). В недавних исследованиях они были использованы для проводимой селекции и, таким образом, для оценки способности возможных молочнокислых бактерий или бифидобактерий к адгезии (Coconnier et al 1992; Bernet et al. 1993; Greene & Klaenhammer 1994; Crociani et al 1995; Sarem et al. 1996; Tuomola & Salminen 1998).
На основании исследований, проведенных с использованием этих клеточных линий, сделан вывод о том, что способность штаммов лактобацилл по настоящему изобретению к адгезии, составляющая порядка 9% на клетках Сасо-2 и порядка 5% на клетках НТ-29 (Tuomola et al, 1998; Dunne et al, 2001; Botes et al, 2008), очень высока (7,5% для L. rhamnosus CNCM I-4036 и 15,5% для L. paracasei CNCM I-4034 (Фиг.3)) по сравнению с хорошо описанным штаммом Lactobacillus rhamnosus GG. В данной области техники подразумевается, что адгезия бифидобактерий мала по сравнению с лактобациллами, независимо от их вида (Dunne et al, 2001). Тем не менее, для штаммов Bifidobacterium bifidum и В. longum, использованных компанией HERO Espana, рассматриваемых в настоящем изобретении в качестве контролей, показатели адгезии на клетках НТ-29 близки к 9%. Аналогично, для бифидобактерий по настоящему изобретению значения адгезии на указанных клетках значительно выше и составляют 16,7% (Фиг.6).
Селекция бактерий
Таким образом, в настоящем изобретении проводили селекцию бактерий с использованием специальных культуральных сред (Пример 4), как для бифидобактерий, так и для лактобацилл. При выделении использовали три новые культуральные среды, которые были описаны как специфичные для бифидобактерий, они представляют собой: среду BFM (Nebra and Blanch 1999), модифицированную колумбийскую среду (Modified Columbia) и среду Биренса (Beerens) (Beerens 1991; Примеры 4.1, 4.2 и 4.3), посредством чего при получении колоний бифидобактерий был получен лучший результат.Для селекции лактобацилл использованная культуральная среда представляла собой агаровую среду Рогозы (Пример 4.4).
В настоящем изобретении инкубировали 4680 колоний бактерий от разных детей и подвергали эти колонии селекционным тестам. После первого анализа на устойчивость к рН 3,0 и к солям желчных кислот осталось 758 колоний с жизнеспособностью 90%, после исследований адгезии на клетках кишечного эпителия осталось только 90 колоний (Примеры 5, 6 и 7).
Эти колонии разделяли на лактобациллы и бифидобактерии на основании культуральной среды, с использованием которой они были получены. Проводили их непосредственную молекулярную идентификацию (Пример 10) амплификацией гена 16S рибосомальной РНК (рРНК) каждой колонии для последующего секвенирования и поиска гомологов в базе данных BLAST Национального центра биотехнологической информации (NCBI).
В итоге осталось 29 бактериальных штаммов, выделенных из среды Биренса, 13 штаммов, выделенных из среды Рогозы, и 10 штаммов, выделенных из модифицированной колумбийской среды, которые успешно прошли селекцию. Принимая во внимание число выбранных колоний, как было объяснено, проводили их непосредственную молекулярную идентификацию амплификацией гена 16S рРНК каждой колонии для последующего секвенирования и поиска гомологов в базе данных NCBI (BLAST).
Штаммы, классифицированные как лактобациллы, секвенировали, и эти последовательности выравнивали относительно друг друга для определения присутствия бактерий с одинаковым геном 16S рДНК, и была обнаружена 41 бактерия, которые можно разделить на следующие 2 группы.
Группа с 99% гомологией фрагмента гена 16S рДНК длиной 1474 пар оснований (п.о.):
Lactobacillus rhamnosus, штамм R-11;
Lactobacillus rhamnosus, штамм La;
Lactobacillus rhamnosus, штамм MNFLM01;
Lactobacillus rhamnosus, штамм IDCC 3201;
Lactobacillus rhamnosus, штамм YIT 0105 (соответствует АТСС 7469);
Lactobacillus rhamnosus, штамм Lcr35 16S.
С учетом этих результатов из данной группы были выбраны бактерии с наилучшими показателями в тестах устойчивости (Примеры 7 и 9), и они были названы Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (которым впоследствии в Институте Пастера (CNCM, Национальная коллекция культур микроорганизмов (National Collection of Microorganism Culture); PASTEUR INSTITUTE; 25, Rue du Docteur Roux F-75724 Paris) был присвоен номер Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036, где они были депонированы 2 июля 2008 года).
Другая группа с 100% гомологией фрагмента гена 16S рДНК длиной 1276 п.о.:
Lactobacillus paracasei, штамм Т11-9;
Lactobacillus paracasei, штамм Т7-10;
Lactobacillus casei, штамм KLDS 1.0720;
Lactobacillus casei, штамм L5;
Lactobacillus casei, штамм YIT 0209 (соответствует NCDO 151);
Lactobacillus casei, штамм YIT 0180 (соответствует АТСС 334);
Lactobacillus paracasei, штамм IMPC 2.1;
Lactobacillus paracasei, штамм NRIC 1944;
Lactobacillus paracasei, штамм NRIC 1942;
Lactobacillus paracasei, штамм NRIC 1938;
Lactobacillus paracasei, штамм NRIC 1934;
Lactobacillus paracasei, штамм NRIC 0638;
Lactobacillus casei АТСС 334;
Lactobacillus paracasei, штамм DJ1;
Lactobacillus casei, штамм Ru2-2i;
Lactobacillus paracasei, изолят 3С;
Lactobacillus paracasei, изолят 2С;
Lactobacillus paracasei;
Lactobacillus casei, штамм MCRF-284;
Lactobacillus sp. L02;
Lactobacillus paracasei;
Lactobacillus paracasei, штамм SM20;
Lactobacillus casei, штамм BL23;
Lactobacillus paracasei, подвид paracasei;
Lactobacillus paracasei, подвид paracasei;
Lactobacillus casei;
Lactobacillus paracasei, подвид tolerans.
С учетом этих результатов из этой второй группы были выбраны бактерии с наилучшими показателями в тестах устойчивости (Примеры 7 и 9), и изначально они были названы Lactobacillus paracasei HERO 7 (которым впоследствии в институте Пастера (CNCM, Национальная коллекция культур микроорганизмов; PASTEUR INSTITUTE; 25, Rue du Docteur Roux F-75724 Paris) был присвоен номер Lactobacillus paracasei CNCM I-4034, где они были депонированы 2 июля 2008 года).
Впоследствии та же самая методика была проведена с группой бифидобактерий, при этом была обнаружена только одна группа с 100% гомологией фрагмента гена 16S рДНК длиной 1136 п.о.:
некультивируемый бактериальный клон rRNA235;
Bifidobacterium breve, штамм АТСС 15700.
С учетом этих результатов из группы бифидобактерий были выбраны бактерии с наилучшими результатами по устойчивости (139,6% при рН 2,5) (Примеры 7 и 9), и изначально они были названы Bifidobacterium breve HERO 15 В (которым впоследствии было присвоено другое название Bifidobacterium breve CNCM I-4035 в институте Пастера (CNCM, Национальная коллекция культур микроорганизмов; PASTEUR INSTITUTE 25, Rue du Docteur Roux F-75724 Paris), где они были депонированы 2 июля 2008 года).
Таким образом, эти бактерии, классифицированные как:
Lactobacillus rhamnosus HERO 22A;
Lactobacillus paracasei HERO 7;
Bifidobacterium breve HERO 15B;
были направлены в институт Пастера для их депонирования, где они были признаны уникальными, и им было присвоено следующее окончательное обозначение.
Начальное обозначение
Окончательное обозначение
Lactobacillus paracasei HERO 7
CNCM I-4034
Bifidobacterium breve HERO 15B
CNCM I-4035
Lactobacillus rhamnosus HERO 22A
CNCM I-4036
Результаты по устойчивости к рН. солям желчных кислот и адгезии на клетках
Как указано выше, для того, чтобы пробиотические штаммы оказывали полезное воздействие на кишечник, они должны выживать при прохождении через желудок, проявляя устойчивость к его кислотности (рН 2,5-3,5) (Holzapfel et al. 1998), и, с другой стороны, они должны быть устойчивыми к солям желчных кислот, присутствующим в тонкой кишке, для того чтобы достичь толстой кишки (Oties et al. 2003).
В настоящем исследовании бактерии инкубировали при рН 3,0 в течение 3 часов, хотя было описано, что 90 минут должно быть достаточно для воспроизведения времени от поступления в желудок до выхода из желудка (Jin et al. 1998). В данном случае выделенные штаммы и контроли продемонстрировали жизнеспособность, близкую к 100% (Пример 12/Фиг.1 и 4), но воздействие рН 2,5 показало, что оно было очень избирательным, поскольку ни один контроль не продемонстрировал жизнеспособность, и только штамм Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036) оказался жизнеспособным. Иными словами, штамм Lactobacillus rhamnosus 22A по изобретению значительно более устойчив к кислоте, чем контрольные бактерии, что, следовательно, способствует его прохождению в желудочно-кишечный тракт и последующей колонизации. С другой стороны, штамм L. rhamnosus 7A по изобретению демонстрирует более высокую жизнеспособность при рН 3,0, чем штаммы, использованные в качестве контролей (Пример 12, Фиг.1, 4), что означает более эффективное прохождение в тонкую кишку.
Жизнеспособность пробиотических культур при рН 3,0 в течение 2 часов и в среде, содержащей 500-1000 мг (0,05-0,1%) солей желчных кислот на литр, рассматривают как стандартные тесты переносимости кислоты и солей желчных кислот (Snelling 2005), хотя подходящие концентрации солей желчных кислот для селекции пробиотиков составляют 0,3%. В тестах на устойчивость к солям желчных кислот, проводимых при различных концентрациях (0,3% и 0,7%), для бактерий по изобретению во всех случаях были получены показатели выше 100%, превышая показатели производственных контрольных бактерий (Пример 12, Фиг.2 и 5). В заключение, штаммы лактобацилл по изобретению более устойчивы к рН и солям желчных кислот, чем другие бактерии, применяемые в настоящее время в качестве пробиотиков.
Было описано, что лактобациллы в целом демонстрируют большую устойчивость к условиям желудочно-кишечного тракта, особенно в отношении кислотности и солей желчных кислот (Ross et al. 2005). Полученные результаты согласуются с этим описанием, поскольку показатели устойчивости к условиям желудочно-кишечного тракта у лактобацилл несколько выше, чем у бифидобактерий.
Как также упомянуто выше, другим очень важным аспектом для внедрения пробиотиков в кишечную микробиоту является способность к адгезии на клетках кишечного эпителия, поскольку они предотвращают элиминацию пробиотических штаммов вследствие перистальтических движений и других бактерий, составляющих кишечную микробиоту. Кроме того, адгезия является первой стадией колонизации и, вероятно, предпосылкой конкурентного вытеснения энтеропатогенов (Forestier et al. 2001; Lee et al. 2003) и иммуномодуляции организма хозяина (Ouwehand et al. 1999; Plant and Conway 2002).
В настоящем изобретении свойства адгезии различных штаммов изучали с использованием клеток НТ-29 в качестве модели кишечного эпителия in vitro (Пример 12, Фиг.3 и 6). Картина адгезии продемонстрировала специфичность для каждого штамма, поскольку для них были получены очень разные показатели, несмотря на то, что они принадлежат одному виду. Это можно понять, сравнивая способность различных описанных пробиотиков к адгезии, например, для Lactobacillus casei (Fyos) показатель адгезии составляет 14,4%, в то время как для Lactobacillus casei (Lactophilus) он составляет 2,6% (Morata De Ambrosini et al., 1999). Как указано выше, показатели адгезии штаммов лактобацилл по настоящему изобретению значительно выше (7,5% для L. rhamnosus CNCM I-4036 и 15,5% для L. paracasei CNCM I-4034), чем у других бактерий, таких как Lactobacillus rhamnosus GG, у которой они составляют порядка 5% на клетках НТ-29 (Dunne et al., 2001) (Таблица 3). Сходным образом, бифидобактерия по изобретению В. breve CNCM I-4035 также демонстрирует адгезию на указанных клетках с показателем, значительно превышающим 16,7% (Фиг.5), по сравнению с 9% у бактерий, использованных в качестве контролей.
Эти данные подтверждают результаты настоящего изобретения, демонстрирующие жизнеспособность различных пробиотических штаммов. В данном конкретном случае контроли лактобацилл демонстрируют адгезию (4%), соответствующую половине показателей адгезии контролей бифидобактерий (8%), однако, выделенные штаммы по настоящему изобретению демонстрируют более высокую адгезию, чем их контроли, поскольку при выравнивании 16S рРНК различных групп были выбраны штаммы с наилучшими показателями адгезии на эпителиальных клетках.
Таким образом, в случае лактобацилл были выбраны штаммы, демонстрирующие адгезию порядка 7,48 и 11,55% относительно 4,80 и 4,09% у их контролей (Фиг.3), и в случае бифидобактерий были выбраны штаммы, демонстрирующие адгезию порядка 16,7% относительно 8,8 и 9,1% у их контролей (Фиг.6). Иными словами, бактерии, являющиеся разными объектами настоящего изобретения, имеют более высокую способность к колонизации и задержке в кишечнике и, следовательно, будут оказывать лучший пробиотический эффект.
Результаты определения характеристик выделенных бактерий
Исследование 16S РНК
Были разработаны различные молекулярные методики идентификации, определения состава и количества всего бактериального сообщества кишечника, большая часть которых основана на исследовании гена 16S рибосомальной РНК (рРНК), поскольку за последние десять лет ген 16S рРНК произвел революцию в способах, которыми специалисты по систематике классифицируют и идентифицируют бактерии. Ген 16S рРНК содержит как высоковариабельные, так и высококонсервативные области, и различия последовательностей используют для определения филогенетических взаимосвязей и для разделения бактерий на виды и штаммы. Доступны базы данных с более чем 200000 генов 16S рРНК, такие как, например, NCBI/BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), проект базы данных рибосомальной РНК (ribosomal database project, RPD; http://rpd.cme.msu.edu/htlm) и EMBL (http://www.embl-heidelberg.de/); в этих базах данных сравнивают существующие последовательности гена 16S рРНК с полученными новыми последовательностями. Как показано в Примере 2, выделенные штаммы по настоящему изобретению демонстрируют высокую гомологию с Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus paracasei и Bifidobacterium breve, что согласуется с документами из предшествующего уровня техники, в которых определено, что у ребенка, питающегося материнским молоком, высоки уровни бифидобактерий в кале, составляя 40-60% всей микробиоты, причем Bifidobacterium breve обнаруживают в большом проценте случаев (Harmsen et al. 2000). Также высок процент лактобацилл, главным образом, L. casei, L paracasei, L. acidophilus среди прочих (Heiling et al. 2002, Satokari et al. 2002).
Процент гомологии гена 16S рРНК выделенных штаммов был очень высоким (99-100%) согласно базе данных NCBI/BLAST (Пример 2). Фрагменты гена 16S рРНК имеют длину приблизительно 1400 п.о., и вторичные фрагменты имеют длину 1474 п.о. для Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036), 1274 п.о. для (CNCM I-4034) 7 HERO и 1118 п.о. для Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM I-4035). Точнее, последний демонстрирует 100% гомологию Bifidobacterium breve ATCC 15700 и некультивируемому клону Bifidobacterium, по этой причине амплификация секвенированного фрагмента гена 16S рРНК была бы интересной, но в данном случае получение большего фрагмента было невозможным, поскольку олигонуклеотиды 27F (SEQ ID NO: 1) и 1492R (SEQ ID NO: 2), использованные для амплификации фрагмента длиной приблизительно 1400 п.о., не были пригодны для амплификации гена 16S рРНК штамма Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM I-4035). Поэтому использовали другие универсальные олигонуклеотиды, такие как 39F (SEQ ID NO: 3) и 1391 R (SEQ ID NO: 4), с помощью которых амплифицируют меньшие фрагменты.
Секвенированные фрагменты гена 16S рРНК выделенных штаммов лактобацилл демонстрируют 99% гомологию группе Lactobacillus rhamnosus, и другие штаммы демонстрируют 100% гомологию целому ряду Lactobacillus paracasei и небольшому числу Lactobacillus casei. Проводили выравнивание фрагментов 16S рРНК контролей, штаммов Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036) и Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM I-4034) и фрагмента L. paracasei, имевшего высокую гомологию выделенному штамму. Из этого видно, что контрольные штаммы, L. rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036) и L. paracasei 7 HERO (CNCM I-4034) отличаются 4 основаниями. Контроли LGG и L. casei также отличаются 4 основаниями. Штамм Lactobacillus rhamnosus 22A, HERO (CNCM I-4036) демонстрирует отличие от обоих контролей на 1 основание, отличие от контроля LGG на 1 основание и отличие от L. casei на 3 основания.
8 данном случае различия между выравниваемыми штаммами немногочисленны, что указывает на значительную консервативность гена 16S рРНК у этих штаммов.
Для расширения информации о геноме изученных бактериальных штаммов амплифицировали межгенное пространство, присутствующее между генами 16S и 23S рРНК, размер которого, как известно, существенно варьирует (Barry et al. 1991 и Navarro et al. 1992), и которое также использовали для различения видов прокариот (Barry et al. 1991). У выделенных штаммов длина фрагментов межгенного пространства варьирует следующим образом: Lactobacillus rhamnosus 22А HERO (CNCM I-4036) - 579 п.о.; Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM I-4034) - 512 п.о.; и Bifidobacterium breve 15B HERO (CNCM I-4035) - 182 п.o. Межгенные фрагменты 16S-23S сравнивали с такими же фрагментами в базе данных NCBI/BLAST, и результаты демонстрируют 100% гомологию штамма Lactobacillus rhamnosus 22А HERO (CNCM I-4036) выделенным Lactobacillus rhamnosus TS1 и Lactobacillus rhamnosus PS1 16S. При сравнении результатов гомологии, показанных для 16S рРНК, результаты полностью отличаются, следовательно, этот штамм, возможно, отсутствует в базе данных, или в базе данных NCBI/BLAST больше информации о 16S рРНК, а не о межгенном пространстве 16S-23S. Эти результаты показывают, что выделенные бактерии по изобретению уникальны, что было подтверждено институтом Пастера, а именно когда им было дано название Lactobacillus rhamnosus CNCM I-4036.
В случае штамма Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM I-4034) результаты исследования межгенного пространства 16S-23S демонстрируют 100% гомологию Lactobacillus casei ATCC 334. База данных NCBI/BLAST содержит полный геном, и он представлен в перечне L. casei, демонстрируя 100% гомологию 16S рРНК, следовательно, весьма вероятно, что выделенный штамм представляет собой L. casei ATCC 334; в любом случае, при секвенировании других фрагментов генома, таких как гены 23S или 5S или другие, можно подтвердить или опровергнуть идею о том, что он соответствует именно этому штамму. В этой связи, после подходящих анализов в институте Пастера данный штамм был признан уникальным.
В случае штамма бифидобактерий фрагмент довольно мал, таким образом, межгенное пространство контролей амплифицировали с получением фрагмента длиной 165 п.о. для Bifidobacterium longum и 298 п.о. для Bifidobacterium bifidum, что подтверждает наличие большого разнообразия размеров фрагмента. Проводили выравнивание контрольных штаммов, выделенного штамма, Bifidobacterium breve 15 В HERO (CNCM I-4035) и штамма, продемонстрировавшего 99% гомологию (NCBI/BLAST) штамму по изобретению, при этом наблюдали существенные различия между контролями и штаммами Bifidobacterium breve; тем не менее, штамм по изобретению и штамм, демонстрирующий 99% гомологию (Bifidobacterium breve, внутренний транскрибируемый спейсер (ITS) 16S-23S, штамм Y8) отличаются лишь одним основанием. Этот штамм полностью отличается от штамма со 100% гомологией 16S рРНК, следовательно, он может представлять собой штамм, не введенный в эту базу данных.
Все эти результаты демонстрируют, что три выделенных штамма по настоящему изобретению являются новыми, поскольку они не были до этого описаны в уровне техники.
Фенотипическая идентификация
Как показано в Примере 11, в настоящем изобретении использован набор для оценки ферментации углеводов (API 50CH) (Фиг.8) и набор для определения ферментативной активности (API Zym) (Фиг.9) для анализа биохимических способностей выделенных видов. Они составляют быстрый и теоретически воспроизводимый способ фенотипической идентификации чистых бактериальных культур. Эти тесты были использованы для описания и идентификации лактобацилл в молоке (Medina et al. 2001), йогурте и других кисломолочных продуктах (Andrighetto ef al. 1998) и сырах (Andrighetto et al. 1998, Bouton et al. 1998 и De Angelis et al. 2001). Однако, возникли сомнения в надежности этих тестов, особенно API 50CH, поскольку он был изначально разработан для идентификации штаммов лактобацилл для клинического применения, и поскольку база данных изготовителя не была обновлена для некоторых видов лактобацилл, что приводит к сомнительным результатам идентификации (Andrighetto et al. 1998 и Collins et al. 1993), тем не менее, предложенная информация имеет ценность для получения фенотипических характеристик выделенных штаммов.
Как видно из Фиг.8, выделенные штаммы, а также контроли демонстрируют низкую протеолитическую активность, функционируя как трипсин и α-химотрипсин, хотя они демонстрировали активность, отличную от лейцина, для валина они демонстрируют минимальную активность у бифидобактерий и очень высокую активность у лактобацилл.
Бифидобактерии также демонстрируют высокую активность в отношении α- и β-галактозидазы и α-гликозидазы. α-Галактозидазная и α-гликозидазная активность других молочнокислых бактерий может отличаться от активности бифидобактерий, как описано Desjardins et al. (1990).
Видно, что у бифидобактерий и у выделенного штамма Lactobacillus rhamnosus 22A HERO (CNCM I-4036) высокая α-галактозидазная активность. Иными словами, эта активность важна, поскольку гидролиз определенных Сахаров, таких как α-D-галактозил-олигосахарид, делает возможной селективную пролиферацию бифидобактерий в кишечном тракте (Gopal et al. 2001; Gulewicz et al. 2002), так как бифидобактерий могут использовать галактоолигосахариды. Оценка фенотипических свойств бифидобактерий позволила подтвердить их предшествующую классификацию генетическими способами и определить, что их ферментативные активности делают возможным образование молочной кислоты с использованием ряда углеводородных субстратов, предпочтительно полимеров глюкозы с α-связями.
Было описано, что небольшое количество штаммов из других источников и родов, включая лактобацилл, демонстрируют β-глюкуронидазную активность (Gopa et al. 2001; Hopkins et al. 1998). Так, штаммы лактобацилл и бифидобактерий по настоящему изобретению, а также их контроли, не демонстрируют уровни β-глюкуронидазной активности, что рассматривают как благоприятное свойство. Отсутствие р-глюкуронидазной активности является свойством, которым должны обладать все пробиотики, рассматриваемые как хорошие, поскольку этот фермент образуется ферментами кала (нитроредуктазой, азоредуктазой) микробного происхождения, которые являются причиной превращения проканцерогенов в канцерогены (Kurman 1988). Nanno et al. (1986) продемонстрировали, что экстракты β-глюкуронидаза-положительных бактерий усиливают мутагенную активацию желчных метаболитов бензопирена, в то время как экстракты β-глюкуронидаза-отрицательных бактерий не демонстрируют такой активности. В заключение, можно отметить, что поскольку эти бактерии демонстрируют низкую активность в отношении других источников углерода, таких как манноза, фукоза и глюкурониды, они предпочитают лактозу и глюкозу в качестве источников углерода для метаболизма, хотя выделенный штамм Lactobacillus rhamnosus 22А HERO (CNCM I-4036) демонстрирует ферментативную активность в отношении а-фукозы, что влечет за собой благоприятный эффект на ферментацию фукозил-лактозных производных, таких как присутствующие в материнском молоке, оказывая известный благоприятный эффект на рост бифидобактерий. Это свойство означает, что пробиотики по настоящему изобретению особенно применимы в детском питании, хотя они также могут быть использованы в рационах питания взрослых и специальном питании.
Другим аспектом, который следует упомянуть, является результат API 50СН (Фиг.9Б), где штамм Lactobacillus paracasei 7 HERO (CNCM I-4034) ферментирует инулин, то есть, обладает способностью, которая отсутствует у его контролей. Способность ферментировать инулин не является распространенным свойством лактобацилл (Cebeci and Gurakan 2003; Makras et al. 2005). Это указывает на то, что штамм по изобретению обладает способностью ферментировать фруктоолигосахариды (FOS), широко используемые в качестве пребиотиков в детском питании, стимулируя развитие кишечной микробиоты, в которой преобладают лактобациллы и бифидобактерий. Это свойство бифидобактерий по изобретению подтверждает тот факт, что пробиотики по настоящему изобретению особенно применимы в детском питании, хотя они также могут быть использованы в рационах питания взрослых и специальном питании. Была показана способность инулина и FOS увеличивать число бифидобактерий в толстой кишке (Roberfroid et al. 1998; Van Loo et al. 1999).
Пробиотическая активность
При соответствии вышеупомянутым требованиям относительно устойчивости к рН, устойчивости к солям желчных кислот, способности к адгезии на клетках кишечного эпителия и секвенирования 16S получают выделенный и определенный пробиотический микроорганизм. Следующая стадия заключается в получении характеристик его пробиотических активностей, более конкретно, необходимо описать пробиотические свойства Lactobacillus rhamnosus HERO 22А (CNCM I-4036), и/или Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM I-4034), и/или Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM I-4035).
Принимая во внимание, что бактерии по изобретению соответствуют требованиям, предъявляемым к пробиотикам, относительно устойчивости к рН, солям желчных кислот и способности к адгезии, указанные бактерии могут быть применены в различных областях, в которых использование пробиотиков является известной частью современного уровня техники, среди прочего, в лечении и предотвращении различных патологий, таких как нарушение всасывания лактозы, снижение уровней холестерина в плазме, различные типы диарей, воспалительные заболевания кишечника, рак, расстройства, вызванные патогенными бактериями, и так далее. Таким образом, указанные пробиотики будут применимы в различных областях, как например, среди прочего, в борьбе с основными патогенами, поражающими пищеварительную систему, и в стимуляции иммунной системы.
Патогенные бактерии
Из различных типов исследований, проведенных с использованием пробиотиков, особый интерес представляют исследования, включающие патогенные бактерии, поражающие пищеварительную систему. При выборе патогенных бактерий необходимо принимать во внимание механизм их патогенности, который варьирует у разных бактерий. Бактерией, представляющей интерес, является энтеротоксигенная Escherichia coli, поскольку образование ее энтеротоксина является важной причиной диареи у людей. В недавних исследованиях описано, что определенные молочнокислые бактерии обладают антагонистическим эффектом в отношении энтеротоксигенной Escherichia coli (Gopal et al. 2001; Todoriki et al. 2001; Chu et al. 2005; Tsai et al. 2007) и в отношении других патогенных бактерий, таких как Salmonella typhimorium и Shigella flexneri (Tien et al. 2006; Jankowska et al. 2008).
Другим интересным аспектом пробиотических штаммов является возможное образование веществ, называемых бактериоцинами, которые секретируют некоторые бактерии для конкуренции с другими микроорганизмами, растущими в той же нише. Эти вещества могут ингибировать рост или адгезию патогенных бактерий на клетках кишечного эпителия, и их могут продуцировать некоторые молочнокислые бактерии (Klaenhamer 1993; Jack et al. 1995; Sablon et al. 2000).
Важным аспектом является знание взаимодействия пробиотических или патогенных бактерий с клетками кишечного эпителия, поскольку все бактерии, присутствующие в микробиоте человека, взаимодействуют с ними.
Было описано, что присутствие патогенных бактерий в клетках кишечного эпителия стимулирует профиль провоспалительного ответа (Th1) с высвобождением таких цитокинов, как фактор некроза опухоли-а (TNF-α) и интерлейкин-8 (IL-8), активацией NF-кВ (Tien et al. 2006; О Нага et al. 2006) и повышением их экспрессии. Этот ответ в большинстве случаев частично снижен в присутствии пробиотических бактерий, что указывает на полезный эффект (Servin 2004).
Так, некоторые пробиотики могут модулировать свойства дендритных клеток (DC), включая их способность активировать специфический иммунный ответ (Kelsall et al. 2002). Равновесие стимуляции и толерантности после контакта с пробиотическими бактериями в кишечнике может быть важным для поддержания их гомеостаза и способности выполнять их полезные защитные функции в отношении патогенных бактерий в пищеварительной системе хозяина.
Показано, что пробиотические штаммы по настоящему изобретению оказывают ингибирующее действие в отношении роста кишечных патогенных микроорганизмов, таких как патогенные бактерии, среди прочих, Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes, Shigella sonnei, энтеротоксигенная Escherichia coli, энтеропатогенная Escherichia coli, кишечная Salmonella, а также кишечные вирусы, такие как Rotavirus.
Нарушение всасывания лактозы
Млекопитающие рождаются с достаточной лактазной активностью для использования лактозы материнского молока. После прекращения грудного вскармливания эта активность постепенно снижается с возрастом, и употребление пищи, содержащей лактозу, приводит к признакам и симптомам, связанным с непереносимостью лактозы (аномальному повышению газообразования, боли в животе, диарее и тому подобному). Известно, что применение пробиотиков, высвобождающих лактазу, способствует усвоению лактозы в просвете кишечника, устраняя симптомы непереносимости лактозы.
Снижение уровней холестерина
Следствием высоких уровней липидов, таких как холестерин и триглицериды, в крови является высокий риск для здоровья человека, так как они ассоциированы с заболеванием сердца. Поскольку употребление продуктов питания с низким содержанием жиров или с микроорганизмами, участвующими в метаболизме липидов, очень полезно для предотвращения этих состояний, были описаны штаммы лактобацилл, регулирующие уровни липидов в сыворотке. Этот пробиотический эффект тесно связан с гидролизом солей желчных кислот.
В различных исследованиях у животных (Akalin et al. 1997; Fukushina and Nakano 1996) и у людей (Lin et al. 1989) наблюдали, что введение пробиотиков может снижать концентрацию холестерина в сыворотке.
Диарея
Действительно, лучше всего подтверждено документальными доказательствами клинического применения пробиотиков лечение острой диареи. Клинические исследования продемонстрировали эффективность применения пробиотиков в лечении для предотвращения и/или лечения некоторых кишечных расстройств, включая диарею, вызванную применением антибиотиков (McFarland et al. 1995), диарею у взрослых (Hocter et al. 1990), диарею у детей (Cetina-Sauri and Sierra 1994) и диарею путешественников (Kollaritsch et al. 1993).
В этих случаях пробиотик, используемый в качестве биотерапевтического агента, влияет на экспрессию и активность большого числа ферментов и белков, регулирующих кишечный эпителий и, возможно, микробиоту.
В отношении диареи, ассоциированной с применением антибиотиков, прием пробиотиков при назначении антибиотиков может ослаблять проявление и/или уменьшать продолжительность диареи. Наиболее широко используемыми микроорганизмами являются: Enterococcus faecium SF6 (Wunderlich et al. 1989), Lactobacillus GG (Siitonen et al. 1990; Vanderhoof et al. 1999), Lactobacillus acidophilus, L. bulgaiicus и Saccharomyces boulardii. Эти агенты способствуют уменьшению изменений в микробиоте кишечника, изменений консистенции и частоты стула.
Диарея, вызванная Clostridium difficile, являющейся оппортунистическим патогеном, использующим изменения в кишечной микробиоте вследствие приема антибиотиков, приводит к широкому спектру клинических симптомов, варьирующих от умеренной неосложненной диареи до тяжелого колита с развитием токсического мегаколона, внутрибрюшных и системных осложнений, которые могут привести к смерти пациента. Диарея обычно начинается через несколько недель после начала антибиотикотерапии. Патогенетическая цепочка начинается с изменений кишечной бактериальной микробиоты, вызванных антибиотиками, что делает возможной колонизацию С. difficile, если этот агент попадает в организм человека. Затем бактерии высвобождают токсины, вызывая повреждение тканей. Патогенные штаммы С. difficile продуцируют токсины, называемые А и В. S. boulardii ингибирует токсины А и В путем высвобождения протеазы 54 кДа, которая расщепляет эти токсины и их мембранные рецепторы (Castagliuolo et al. 1999).
Наблюдали, что пероральное введение Lactobacillus rhamnosus GG и Saccharomyces boulardii эффективно в восстановлении нормальной микробиоты у пациентов.
Диарея путешественников возникает вследствие бактериальной, вирусной или паразитарной инфекции. Ее вызывают многие микроорганизмы, и они, вероятно, отличаются в разных странах. По частоте они включают: Е coli, Shigela, Salmonella, Campylobacter, Rotavirus и Giardia lamblia. Диарея путешественников поражает половину путешественников, направляющихся в области высокого риска. Бактерии, используемые в качестве пробиотиков в различных исследованиях, представляют собой: лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки и энтерококки. Относительно диареи путешественников наиболее эффективным пробиотиком является Lactobacillus GG.
Воспалительные заболевания кишечника
Одним из основных показаний для применения пробиотиков является дисбаланс микробиоты и иммунной системы. Следуя этой практической заинтересованности, исследование воспалительных заболеваний кишечника является одним из наиболее интересующих основных вопросов для возможного применения пробиотиков в качестве клинических терапевтических средств.
Исследования, проведенные в этой области, обеспечили важную информацию о клиническом применении пробиотиков и экспрессии генов различных посредников, вовлеченных в эти заболевания.
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) являются хроническими воспалительными расстройствами кишечника неизвестного происхождения (неспецифический язвенный колит, болезнь Крона), их патогенез сложен и включает по меньшей мере 3 важных элемента: факторы генетической предрасположенности, кишечную микрофлору и иммуноопосредованное повреждение. Была выдвинута гипотеза, что ВЗК возникают в результате аномального ответа Т-клеток на микробиоту, также обсуждали, что к этим заболеваниям может приводить присутствие патогенных организмов.
В биоптатах толстой кишки пациентов с ВЗК снижен уровень лактобацилл и бифидобактерий (Fabia et al. 1993; Favier et al. 1997). Традиционные способы лечения ВЗК сосредоточены на подавлении или модуляции иммунитета хозяина, и среди этих способов лечения применение антибиотиков является эффективным способом лечения болезни Крона. Это указывает на то, что применение пробиотиков для изменения микрофлоры может быть важным при лечении ВЗК.
В предшествующем уровне техники есть недавнее исследование, в котором было обнаружено, что в фекалиях пациентов с болезнью Крона во время активных периодов заболевания снижено количество β-галактозидаз. Это снижение коррелирует со снижением содержания бифидобактерий, являющихся источником β-галактозидазы (Favier et al. 1997).
Рак
Колоректальный рак является одним из наиболее тяжелых осложнений ВЗК, включая неспецифический язвенный колит и болезнь Крона (Eaden et al. 2001). Точный механизм, посредством которого ВЗК может приводить к процессу канцерогенеза, не вполне понятен. Предполагают, что он может быть причиной хронического воспалительного процесса (Weitzman & Gordon 1990), который в некоторых экспериментальных моделях может действовать как стимулятор развития опухолей.
Кишечная микробиота и иммунная система играют важную роль в регуляции канцерогенеза. Пробиотики могут влиять и на то, и на другое, поэтому для борьбы с колоректальным раком в этой области были предприняты значительные усилия. Было обнаружено, что пробиотики могут снижать концентрации ферментов, мутагенов, вторичных солей желчных кислот, которые, возможно, вовлечены в процесс канцерогенеза в толстой кишке (Wollowski et al. 2001). Эпидемиологические данные подтверждают, что ежедневное употребление ферментированных продуктов оказывает защитный эффект против аденомы или рака толстой кишки (Rafter and Glinghammar 1995).
Симбиотическую комбинацию, представляющую собой смесь пробиотика и пребиотика, использовали для исследования предотвращения рака. Эта комбинация повышала уровни короткоцепочечных жирных кислот, являющихся основными продуктами бактериальной ферментации, основное значение которых состоит в том, что они играют роль источника питательных веществ для кишечного эпителия. Они ассоциированы с индукцией дифференцировки, подавлением пролиферации и усилением апоптоза in vitro (Heerdt et al. 1997; Medina et al. 1997), и они могут играть роль в предотвращении некоторых заболеваний, таких как желудочно-кишечные расстройства и рак (Julia et al. 2006).
Настоящее изобретение не только демонстрирует способность выбранных штаммов ингибировать рост патогенных бактерий и кишечных энтеровирусов, но оно также демонстрирует превосходные характеристики, определяющие пробиотические свойства микроорганизмов, такие как устойчивость к рН, солям желчных кислот и способность к адгезии в кишечнике, по сравнению с контрольными пробиотическими бактериями, известными в данной области техники.
Во всех случаях результаты продемонстрировали, что пробиотические свойства бактерий по изобретению лучше, чем у указанных контрольных бактерий. Так, известно, что активность бактерий, использованных в качестве контролей, сосредоточена в следующих областях:
L. casei inmunitas от Danone
Полезные эффекты, ассоциированные с пробиотическими композициями, содержащими L. casei inmunitas (Actimel), включают лучший иммунный ответ на различные инфекционные агенты, повышение уровня активации цитокинов иммунной системы, улучшение пролиферативного ответа Т-клеток и модуляцию экспрессии NK-клеток. Согласно наблюдениям, употребление Actimel улучшает прогноз при диареях у детей, связанных с инфекциями, уменьшая их тяжесть и продолжительность.
Композиции, содержащие L. casei inmunitas, в свою очередь, оказывают положительные противовоспалительные воздействия на слизистую оболочку толстой кишки человека, поскольку они усиливают иммунный ответ в организме хозяина, что полезно для индивидуумов с воспалительными заболеваниями кишечника и для предотвращения рака толстой кишки.
В свете изложенного выше и различных проведенных сравнительных экспериментов, показавших лучшие пробиотические свойства Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM I-4034) по сравнению с L. casei inmunitas, Lactobacillus paracasei HERO 7 (CNCM I-4034) особенно применим, среди прочего, в предотвращении различных патологий, таких как нарушение всасывания лактозы, снижение уровней холестерина в плазме, различные типы диарей, воспалительные заболевания кишечника, рак и так далее, в улучшении иммунного ответа на различные инфекционные агенты, в улучшении при диареях у детей, в качестве противовоспалительного средства для слизистой оболочки толстой кишки человека (и, соответственно, в предотвращении рака толстой кишки).
LGG
Lactobacillus GG способна к адгезии на клетках кишечника, стимулируя иммунный ответ и предотвращая диарею, вызванную патогенами. Различные исследования продемонстрировали, что употребление композиций, содержащих LGG, таких как Bioactif от Kaiku, ингибирует конкурентную колонизацию кишечника патогенными микроорганизмами. Эти микроорганизмы, в свою очередь, продуцируют антимикробные соединения, ингибирующие рост патогенных штаммов, результатом чего является ингибирование роста патогенных штаммов. Таким образом, употребление композиций с LGG поддерживает или восстанавливает равновесие кишечной микрофлоры, оптимизируя процессы всасывания как функции слизистой оболочки кишечника.
В свете изложенного выше и различных проведенных сравнительных экспериментов, показавших лучшие пробиотические свойства Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM I-4036) по сравнению с Lactobacillus GG, Lactobacillus rhamnosus HERO 22A (CNCM I-4036) особенно применим, среди прочего, в стимуляции иммунного ответа и предотвращении диареи, вызванной патогенами, а также поддержании или восстановлении равновесия кишечной микрофлоры.
Bifidobacterium longum и Bifidobacterium bifidum
Из уровня техники известно, что Bifidobacterium longum устойчивы к антибиотикам, по этой причине их употребление в те периоды, когда индивидуумы получают лечение антибиотиками, предотвращает у пациентов диарею, к которой иногда приводит лечение антибиотиками. Другие применения этих микроорганизмов направлены на снижение уровней холестерина, облегчение симптомов непереносимости лактозы, стимуляцию иммунной системы и предотвращение рака.
Употребление композиций с В. bifidum облегчает симптомы, связанные с диареей. В свою очередь, они являются микроорганизмами, усиливающими иммунологический ответ индивидуума посредством повышения фагоцитарной активности в периферической крови.
В свете изложенного выше и различных проведенных сравнительных экспериментов, показавших лучшие пробиотические свойства Bifidobacterium breve HERO 15В (CNCM I-4035) по сравнению с Bifidobacterium longum и В. bifdum, Bifidobacterium breve HERO 15B (CNCM I-4035) особенно применим, среди прочего, в стимуляции иммунного ответа и предотвращении диареи, вызванной антибиотиками, в снижении уровней холестерина, улучшении симптомов непереносимости лактозы, в предотвращении рака и так далее.
Пробиотики в продуктах питания, напитках, лекарственных средствах и тому подобном
Практика включения жизнеспособных микроорганизмов в продукты питания существует давно. Йогурт и другие кисломолочные продукты являются продуктами питания, традиционно включающими живые микроорганизмы. Развитие функциональных продуктов питания в последние годы привело к разработке новых подходов, основанных на применении микроорганизмов, способных оказывать полезные воздействия на организм.
Область детского питания не была исключением в области функциональных продуктов питания, и в последние годы ингредиенты этого типа стали включать в различные типы продуктов для детского питания. Пробиотики являются одной из основных линий развития, и их применяют, главным образом, в области молочных смесей, в первую очередь в смесях для продолжительного вскармливания и стимуляции роста. Целью включения пробиотиков в продукты питания является их внедрение в толстую кишку организма хозяина и получение ряда полезных эффектов (уменьшения патогенной флоры, образования витаминов и других питательных веществ, снижения рН среды и так далее).
Все пробиотические бактерии по настоящему изобретению рассматривают как виды, входящие в группу молочнокислых бактерий, и они известны в течение некоторого времени на международном уровне в виду отсутствия у них патогенных свойств. Таким образом, они подходят для применения в ферментации молочных продуктов, среди прочего, сами по себе или в сочетании с другими молочнокислыми бактериями, например, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Streptococcus lactis и так далее. Подобным образом, их применение в молоке для детского питания, как и применение любых других молочнокислых бактерий, не связано ни с какими потенциальными проблемами безопасности продуктов питания.
Включение этих пробиотиков в продукты питания и напитки с использованием подходящего способа смешивания (или ферментации, где это подходит) должно обеспечить определенное число живых бактерий в конечном продукте по истечении максимального срока хранения продукта.
Пробиотики по настоящему изобретению могут быть использованы в детском питании, а также в рационах питания взрослых и специальном питании. Указанные Пробиотики могут быть использованы в форме порошка, сами по себе или в смеси с другими эксципиентами, известными в данной области техники, такими как сахар, белки, сухое молоко и так далее, или в качестве активных ингредиентов при ферментации, предпочтительно продуктов на основе молока. Таким образом, указанные Пробиотики могут быть включены, в форме порошка или в жидкой форме, в продукты питания, используемые населением в целом, особенно молоко и продукты, полученные из молока, в частности кисломолочные продукты и сыры; зерновые и их производные, включая тесто для выпечки хлеба; супы и другие подобные продукты в дегидратированной форме; ферментированные мясные продукты; продукты переработки фруктов, соки и безалкогольные напитки; продукты питания для применения в специальном питании, включая молоко для детского питания, зерновые для детского питания, готовые к употреблению продукты для детского питания и так далее. Они могут также быть обнаружены в пищевых добавках и специальных смесях для перорального и энтерального питания для клинического применения.
Если они входят в порошковый продукт (молоко для детского питания, зерновые и так далее), пробиотики будут включены путем их смешивания в сухом виде с конечным продуктом. Таким образом, пробиотики по настоящему изобретению могут быть включены в порошковые продукты питания, предназначенные для разведения водой или другой жидкостью, такой как молоко (сухое молоко для детского питания, зерновые и так далее).
При их применении для ферментации молока или молочных продуктов и изготовления кисломолочных продуктов пробиотики добавляют к жидкой молочной основе на промежуточной стадии способа, проводя ферментацию при контролируемой температуре в течение контролируемого времени с получением кисломолочного продукта.
Пробиотики по изобретению могут также быть использованы в пищевых добавках и даже в фармацевтических продуктах, которые могут быть представлены в форме порошковых препаратов, таблеток, покрытых сахарной оболочкой, и так далее. Областью применения этих продуктов является лечение воспалительных заболеваний кишечника, язв желудка, острой диареи и других заболеваний желудочно-кишечного тракта.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Амплификация межгенных фрагментов 16S-23S
Амплифицировали и секвенировали межгенные сегменты выбранных штаммов, и поиск гомологов проводили в базе данных NCBI (BLAST), что привело к следующим результатам.
- Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036) имеет 100% гомологию фрагмента длиной 579 п.о.:
- Lactobacillus rhamnosus, изоляту TS1;
- Lactobacillus rhamnosus, изоляту PS1 16S.
- Lactobacillus paracasei 7 (CNCM I-4034) имеет 100% гомологию фрагмента длиной 512 п.о.:
- Lactobacillus casei, штамму АТСС 334.
- Bifidobacterium breve 15 В (CNCM I-4035) имеет 99% гомологию фрагмента межгенного пространства 16S-23S длиной 182 п.о.:
- Bifidobacterium breve (ITS), штамму Y8;
- Bifidobacterium longum (ITS), штамму Y10.
Пример 2. Выравнивание секвенированных отрезков
Для выравнивания секвенированных отрезков выбранных штаммов и контролей использовали программное средство онлайн Clustalw (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/).
Общее выравнивание последовательностей гена 16S рДНК штаммов и контролей продемонстрировало присутствие различий последовательностей контролей и образцов L. rhamnosus 22A и L. paracasei 7, и видна полная гомология образца 7 и выбранной последовательности L. paracasei.
Относительно выбранного образца В. breve 15B, видно различие последовательностей контролей и образца В. breve 15B и 100% гомология В. breve 15B и выбранной последовательности В. breve.
Общее выравнивание последовательностей межгенного пространства 16S-23S штамма 15B и контролей позволило увидеть значительное различие последовательности контролей и образца В. breve 15B.
Действительно, секвенирование межгенного пространства 16S-23S уникально и не совпадает с предшествующими описаниями для бифидобактерий, показывая уникальность штамма по изобретению, что было признано институтом Пастера, где ему также было присвоено уникальное обозначение.
Пример 3. Получение и обработка образцов Получение образцов
Фекалии детей в возрасте от 2 до 4 месяцев, вскармливаемых исключительно материнским молоком, получали в анаэробных условиях в педиатрической клинике JM, являющейся разработчиком данного изобретения. Родителей просили принести их детей в клинику рано утром, после стимуляции ждали, когда у детей будет дефекация, и после дефекации кал собирали в стерильный контейнер с помощью пластиковой ложки, прикрепленной к крышке контейнера. По окончании сбора контейнер с образцом помещали в анаэростат (Anaerojan, Oxoid, Hampshire, United Kingdom) с пакетом-саше, обеспечивающим анаэробную атмосферу (Anaerogen, Oxoid, Hampshire, United Kingdom), и емкость герметично закрывали и транспортировали в лабораторию, где образцы обрабатывали не позднее чем через 2 часа.
Обработка и высев образцов
После сбора или до охлаждения при -80°С образцы можно держать в обозначенных соответствующим образом пробирках типа «Эппендорф».
1
7
2
2
Таким образом, получают 10% суспензию фекалий в PBS (забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS, Sigma-Aldrich, Madrid, Spain)) и гидрохлориде L-цистеина (Scharlau CEIME, Barcelona, Spain) (0,05%). Из этого препарата получают 7 разведении, от 10 до 10, наконец, 50 мкл каждого разведения высевают в две выбранные культуральные среды и инкубируют в анаэробных условиях для культивирования бифидобактерий (Anaerogen) и богатой CO среде для лактобацилл (COGen) в течение 72 часов при 37°С.
Пример 4. Приготовление культуральной среды
Ниже описаны 3 специфичные культуральные среды для бифидобактерий и культуральная среда, специфичная для лактобацилл.
1. Среда Биренса (Beerens 1990). Эту среду используют для определения бифидобактерий.
Для ее приготовления в колбе Эрленмейера объемом один литр смешивают 47 г агара с сердечно-мозговой вытяжкой, 5 г D-(+)-глюкозы, 0,5 г цитрата железа(III), 0,5 г L-цистеина и один литр дистиллированной воды. Эту смесь нагревают при постоянном перемешивании на мешалке с подогревом в течение нескольких минут до кипения, затем ее оставляют охлаждаться при комнатной температуре. При достижении 55°С в нее добавляют 5 мл пропионовой кислоты и 2,2 мл 2 экв/л гидроксида натрия, затем рН доводят до 5,0.
2. Среда BFM (Nebra & Blanch 1999). Эта среда специфична для бифидобактерий. Указанная среда включает следующие компоненты в указанных соотношениях на литр раствора:
- 2 г мясного экстракта;
- 7 г дрожжевого экстракта;
- 2 г крахмала;
- 0,5 г гидрохлорида L-цистеина;
- 5 г хлорида натрия;
- 5 г пептона;
- 2 г триптона;
- 5 г лактулозы;
- 1 мг рибофлавина*;
- 1 мгтиамина*;
- 16 мг метиленового синего;
- 2 г хлорида лития;
- 5 мл пропионовой кислоты;
- 15 гагара.
Соответствующие количества используют для приготовления 500 мл этой селективной среды для бифидобактерий. Эту смесь нагревают при постоянном перемешивании на мешалке с подогревом в течение нескольких минут до кипения, затем раствор автоклавируют.В завершение, приготавливают концентрированные растворы витаминов (*) (исходный раствор, 1 мг/мл), затем их фильтруют и добавляют вместе с пропионовой кислотой в культуральную среду, когда раствор остынет до приблизительно 55°С.
3. Модифицированная колумбийская среда (рН 5,0). Эта среда специфична для бифидобактерий. Указанная среда включает следующие компоненты в указанных соотношениях на литр раствора:
- колумбийскую агаровую среду (Oxoid, Hampshire, United Kingdom);
- глюкозу (5 г/л);
- цистеин (0,5 г/л);
- агар (до 15 г/л).
Указанные выше количества используют для приготовления 1000 мл этой селективной среды для бифидобактерий. Смесь нагревают при постоянном перемешивании на мешалке с подогревом в течение нескольких минут до ее расплавления, затем раствор автоклавируют.В завершение, в культуральную среду добавляют пропионовую кислоту, когда раствор остынет до приблизительно 55°С, и рН доводят до 5,0, используя 1 н. раствор NaOH.
4. Агаровая среда Рогозы. Эту среду используют для определения лактобацилл. Для ее приготовления следуют описаниям, предоставленным торговой фирмой.
Ее готовят согласно описаниям, предоставленным торговой фирмой.
Пример 5. Высев образцов
После получения разведении каждое из них высевают в трех экземплярах с использованием бактериологической петли. Все планшеты с различными культуральными средами затем инкубируют в инкубаторе с контролируемой температурой при 37°С.
2
2
Планшеты с культуральной средой для бифидобактерий заранее помещают в анаэростат с пакетом-саше Anaerogen (система, обеспечивающая анаэробную атмосферу), а планшеты с культуральной средой для лактобацилл помещают в емкости с пакетом-саше COGen (система, обеспечивающая атмосферу с СО), в завершение, их инкубируют в течение 72 часов при 37°С.
Пример 6. Определение числа колониеобразующих единиц
После инкубации отбирают разведения с более чем 10 колониеобразующими единицами (КОЕ) и значения КОЕ в каждой из сред подсчитывают с использованием электронного счетчика колоний (Colony counter model 608702, Bio Co, Kobe, Japan). В завершение, вычисляют общее число КОЕ посредством следующей формулы:
КОЕ = число колоний × коэффициент разведения × разведение.
После получения культур оставшиеся образцы фекалий хранили при -80°С до проведения молекулярно-биологических исследований.
Пример 7. Определение устойчивости к рН и солям желчных кислот
Через 72 часа инкубации отбирали по 100 колоний из каждой культуральной среды на ребенка, принимая во внимание морфологию, видную невооруженным глазом. Указанные колонии, как лактобацилл, так и бифидобактерий, инкубируют в жидкой среде Манна-Рогозы-Шарпа (Man Rogosa Sharpe (RSM)) и в анаэробных условиях в течение 48 часов. Затем из каждой культуры незамедлительно получали исходные глицериновые растворы (RSM+10% глицерин).
Одновременно с получением исходных глицериновых растворов из различных колоний оценивают их жизнеспособность при рН 3,0 и 3% концентрации солей желчных кислот (Oxgall, Sigma-Aldrich, Spain). Для этого проводят следующие действия:
1) колонии центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 минут;
2) надосадочную жидкость удаляют и осадок ресуспендируют в стерильном PBS;
3) снова проводят центрифугирование в условиях, аналогичных описанным выше;
4) стадии 1-3 повторяют три раза;
5) в завершение, ресуспендирование в 1 мл стерильного PBS;
6) внесение 100 мл описанной выше суспензии в 900 мл PBS при рН 7,0 и при рН 3,0 и 0,3% Oxgall, растворенного в PBS;
7) инкубация в анаэробных условиях в течение 3 часов при 37°С;
1
5
8) получают различные разведения (от 10 до 10) для каждого из условий, в которых проводили инкубацию;
9) высев 50 мкл каждого разведения;
10) инкубация в течение 72 часов при 37°С в анаэробных условиях;
11) определение посредством подсчета числа колоний, присутствующих в контроле и при данных рН и Oxgall;
12) определение жизнеспособности каждой колонии с помощью показателя:
жизнеспособность = ((число колоний при данных pH/Oxgall)/(число колоний в контроле))×100.
Все колонии, демонстрирующие жизнеспособность при рН 3,0 и 0,3% Oxgall выше 90%, рассматривают как положительные и сохраняют для проведения остальных исследований. Остальные колонии исключают.
Пример 8. Контрольные бактерии
Колонии, использованные в качестве положительных контролей, представляли собой следующие.
Для бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium longum, поставляемые Hero Spain S.A.
Для лактобацилл использовали 2 производственные лакгобациллы, Lactobacillus casei (Danone) и Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) (KAI KU).
По завершении начального скрининга выбранных колоний проводили второй скрининг.В этом случае проверяли жизнеспособность при рН 2,5 и 2,0 и при 0,5% и 0,7% Oxgall. Следовали протоколу, подобному использованному в первом анализе. После определения жизнеспособности определяли диапазоны жизнеспособности. В этом втором скрининге производственные бактериальные контроли продемонстрировали показатели ниже нуля, поэтому контроль с процентами жизнеспособности более 4% был определен как изначально оптимальный диапазон для селекции положительных колоний. Колонии разделяли на 3 группы:
группа 1 - колонии с жизнеспособностью более 66%;
группа 2 - колонии с жизнеспособностью от 33 до 66%;
группа 3 - колонии с жизнеспособностью более 4%.
На Фиг.1 и 4 показаны результаты устойчивости и выживания штаммов по изобретению при различных рН. Для штаммов Lactobacillus rhamnosus 22A (CNCM I-4036), а также Lactobacillus paracasei 7 (CNCM I-4034), результаты показаны на Фиг.1, и они демонстрируют, что при рН 3,0 данные штаммы имеют устойчивость, подобную или несколько превышающую устойчивость исследованных производственных штаммов. Тем не менее, при рН 2,0 штамм 22A имеет очень высокую жизнеспособность по сравнению с остальными штаммами, которые не выживают при этом рН. Для штамма Bifidobacterium breve CNCM I-4035 результаты показаны на Фиг.4, где видно, что при рН 3,0 штамм 15 В демонстрирует устойчивость, значительно превышающую устойчивость двух других исследованных бифидобактерий, при этом его жизнеспособность превышает 100%, указывая на способность этих бактерий размножаться при этом рН.
На Фиг.2 и 5 показаны результаты влияния солей желчных кислот на выживание штаммов по настоящему изобретению. На Фиг.2 представлены результаты для штаммов CNCM I-4036 и CNCM I-4034. Видно, что оба штамма демонстрируют процент выживания, значительно превышающий процент выживания исследованных производственных штаммов, при этом он составляет более 100%, указывая на то, что они могут даже размножаться в присутствии этих солей. На Фиг.5 представлены результаты для штамма CNCM I-4035. Как показано на данном графическом материале, при более высоких концентрациях этот штамм демонстрирует большее выживание по сравнению с контрольными бифидобактериями из уровня техники.
Пример 9. Исследование адгезии на клетках кишечного эпителия
Анализ адгезии на клетках проводят с использованием колоний, предварительно отобранных по устойчивости к рН и солям желчных кислот.Указанный анализ проводили с использованием клеток кишечного эпителия НТ29. Сначала предпринимали ряд попыток определения адгезии на клетках посредством различного окрашивания: окрашивания по Граму, окрашивания метиленовым синим, окрашиванием по Гимзе и так далее. При этом наблюдали, что определение процента адгезии на клетках НТ29 с использованием этих способов весьма затруднительно.
Возник вопрос о том, какой способ будет наилучшим для определения процента адгезии, при этом был сделан вывод, что наилучшим способом, вероятно, будет способ, позволяющий охватить все прикрепившиеся бактерии. По этой причине был выбран способ трипсинизации, и с этой целью его проводили следующим образом:
2
1) инкубация клеток НТ29 при 37°С и 5% СО до конфлюэнтности в 24-луночных планшетах;
2) инкубация различных колоний для анализа в анаэробных условиях;
3) приведение бактерий в контакт с клетками согласно стадиям, описанным ниже:
а) центрифугирование бактерий при 5000 об/мин в течение 5 минут;
б) удаление надосадочной жидкости и ресуспендирование бактерий в 1 мл стерильного PBS;
в) повторение стадий (а) и (б) еще два раза;
г) определение оптической плотности (OD) для каждого образца бактерий при 600 нм;
6
д) разведение бактериальной культуры до OD 0,8 в приготовленной ранее среде для культивирования клеток без FBS (фетальной телячьей сыворотки) и антибиотиков (от 1 до 5×10 КОЕ/мл);
е) отделение клеток от культуральной среды;
ж) многократная отмывка стерильным PBS для удаления остатков FBS и антибиотиков;
з) добавление 250 мл бактериальной суспензии в каждую лунку; эксперимент проводили трижды;
2
и) инкубация при 37°С и 5% CO в течение 90 минут;
4) после инкубации бактерий с клетками проводят следующее:
а) удаление среды путем аспирации пипеткой Пастера;
б) отмывка 4 или 5 раз 1х PBS (рН 7,0);
в) добавление 100 мкл трипсина и инкубация в течение 10-15 минут при 37°С;
г) отбор всего содержимого лунки и его перенос в пробирку Эппендорфа;
д) отмывка лунки 150 мкл PBS и внесение в ту же пробирку Эппендорфа;
е) приготовление нескольких разведении каждого образца (4 или 5);
ж) высев 50 мкл каждого разведения;
з) инкубация в анаэробных условиях при 37°С в течение 72 часов;
и) подсчет числа колоний.
5) определение % адгезии:
% адгезии = ((число прикрепившихся колоний)/(число инокулированных колоний))×100.
На Фиг.3 показаны результаты по адгезии для штаммов CNCM I-4036 (штамм 22А) и CNCM I-4034 (штамм 7) по изобретению. Оба штамма имеют проценты адгезии, значительно превышающие проценты, продемонстрированные контрольными штаммами (в случае штамма 22А более чем в два раза), что указывает на их потенциальное действие при модуляции активности клеток кишечника, включая иммуномодуляцию.
На Фиг.6 показаны результаты по адгезии для штамма CNCM I-4035 (штамм 15В), который также демонстрирует процент адгезии на клетках, значительно превышающий процент адгезии контрольных штаммов.
Пример 10. Идентификация молочнокислых бактерий
Выделение ДНК, амплификация и секвенирование фрагмента 16S рРНК
С учетом числа колоний, отобранных в исследовании адгезии, проводят их непосредственную идентификацию посредством амплификации фрагмента 16S рРНК каждой колонии, секвенирования и поиска гомологов в базе данных Национального центра биотехнологической информации (National Center of Biotechnology Information (NCBI)).
Сначала выбранные колонии инкубируют в среде RSM в течение 48 часов при 37°С в анаэробных условиях. Затем их отмывают PBS. Для этого проводят следующее:
1) колонии центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 минут;
2) надосадочную жидкость удаляют и бактериальный осадок ресуспендируют в 1 мл стерильного PBS;
3) трехкратное повторение стадий (1) и (2);
4) в завершение, ресуспендирование осадка в 1 мл стерильного PBS.
Затем выделяют геномную ДНК бактерий, что проводят следующим образом:
1) центрифугирование полученной ранее суспензии при 5000 об/мин в течение 5 минут и удаление надосадочной жидкости;
2) бактериальный осадок ресуспендируют в 567 мл буфера с гидроксиметиламинометаном (трис) и этилендиаминтетрауксусной кислотой (EDTA) (ТЕ-буфера);
3) добавление 30 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS) и 3 мл протеиназы К (20 мг/мл);
4) инкубация смеси при 37°С в течение 1 часа;
5) добавление 100 мл 5 М NaCl и 80 мл бромида цетилтриметиламмония (CTAB)/NaCl;
6) перемешивание и инкубация при 65°С в течение 10 минут;
7) добавление равного объема (780 мл) смеси хлороформа и изоамилового спирта (24:1);
8) перемешивание и центрифугирование в течение 5 минут при 10000 об/мин;
9) извлечение верхней водной фазы и ее перенос в новую пробирку Эппендорф;
10) добавление равного объема смеси фенола, хлороформа и изоамилового спирта (25:24:1);
11) перемешивание и центрифугирование в течение 5 минут при 10000 об/мин;
12) извлечение верхней водной фазы и ее перенос в новую пробирку Эппендорф;
13) добавление 0,6 объема изопропанола;
14) центрифугирование в течение 13 минут при 13000 об/мин при 4°С;
15) удаление надосадочной жидкости и добавление 1 мл 70% этанола к осажденной ДНК;
16) центрифугирование в течение 5 минут при 13000 об/мин при 4°С;
17) удаление надосадочной жидкости и осажденной ДНК, затем ее сушка при комнатной температуре;
18) ресуспендирование в 20-50 мкл воды;
19) измерение концентрации спектрофотометром при 260 нм и получение соотношения 260/280 для проверки ее чистоты.
Амплификация гена 16S рДНК и межгенного пространства 16S-23S полимеразной цепной реакцией (ПЦР)
- Использованные олигонуклеотиды
Для амплификации гена 16S рДНК использовали следующие наборы универсальных олигонуклеотидов:
27F 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' (M=A+C) (SEQ ID NO: 1).
1492R 5-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3' (Y=C+T) (SEQ ID NO: 2).
Фрагмент длиной приблизительно 1450 п.о. амплифицируют при температуре гибридизации 55°С, времени амплификации 90 секунд и числе циклов 35.
39F 5'-TGGCTCAGRWYGAACGCTRG-3' (R=A+G, W=A+T, Y=C+T) (SEQ ID NO: 3).
1391 R 5'-GACGGGCGGTGWGTRCA-3' (SEQ ID NO: 4).
Фрагмент длиной приблизительно 1350 п.о. амплифицируют при температуре гибридизации 52°С, времени амплификации 90 секунд и числе циклов 35.
Кроме того, были сконструированы олигонуклеотиды, специфичные в отношении бифидобактерий, которые представляют собой следующее:
Bif, 250 п.о., F 5'-CTCGTAGGCGGTTCGTCG-3' (SEQ ID NO: 5);
Bif, 250 п.о., R 5'-AACGGGCCCCACATCCAG-3' (SEQ ID NO: 6).
Фрагмент длиной приблизительно 250 п.о. амплифицируют при температуре гибридизации 65°С, времени амплификации 20 секунд и числе циклов 30.
Для амплификации межгенных областей 16S-23S лактобацилл и бифидобактерий использовали следующие наборы олигонуклеотидов:
LactoF 5-ACACCGCCCGTCACACCATG-3' (SEQ ID NO: 7).
LactoR 5'-CCHSTTCGCTCGCCGCTACT-3' (H=A+T, S=G+C) (SEQ ID NO: 8).
Олигонуклеотиды, специфичные в отношении лактобацилл. Фрагмент длиной приблизительно 600 п.о. амплифицируют при температуре гибридизации 65°С, времени амплификации 30 секунд и числе циклов 30.
ISBif F 5'-GGGATGCTGGTGTGGAAGAGA-3' (SEQ ID NO: 9).
ISBif R 5-TGCTCGCGTCCACTATCCAGT-3' (SEQ ID NO: 10).
Олигонуклеотиды, специфичные в отношении бифидобактерий. Фрагмент длиной приблизительно 240 п.о. амплифицируют при температуре гибридизации 60°С, времени амплификации 30 секунд и числе циклов 30.
Для амплификации гена 16S рДНК и межгенного пространства 16S-23S на одну ПЦР использовали 50-100 нг ДНК при конечном объеме 50 мкл, в каждом цикле использовали температуру денатурации 94°С в течение 30 секунд. Затем составляли программу в соответствии с условиями для каждого набора олигонуклеотидов, указанного выше.
Результат амплификации контролировали в 1,3% агарозном геле, образцы окрашивали бромидом этидия и визуализировали в трансиллюминаторе с ультрафиолетовым излучением.
Амплификации с отрицательным результатом повторяли, при положительном результате проводили амплификацию с использованием набора от GE Healthcare «Ilustra™ GFX™ PCR DNA and gel Band Purification Kit», следуя инструкциям изготовителя. После очистки образцы ресуспендировали в 25 мл воды и очистку контролировали визуализацией в новом 1,3% агарозном геле.
Затем образцы передавали службе секвенирования ДНК (DNA Sequencing Service) Института паразитологии и биомедицины (Institute of Parasitology and Biomedicine) «Lopez-Neyra» (CSIC).
Пример 11. Идентификация с использованием ферментационных тестов
Использовали системы API ZYM и API 50 CHL (bioMerieux's). Система API ZYM представляет полуколичественный способ измерения ферментативных активностей. Эта система включает 20 лунок, 19 из которых содержат дегидратированный субстрат для выявления активности 19 ферментов (Фиг.7 и 8), получают результат колориметрии, указывающий на степень ферментативной активности, что было измерено по шкале 0-5 в сравнении с контролем. Также использовали тест-полоски API 50 СН и среду API CHL (bioMerieuxs), представляющие способ получения ферментационного профиля в отношении 49 углеводов (Фиг.9 и 10). Получают результаты колориметрии, но в этом случае их классифицируют только как положительные (+), отрицательные (-) и промежуточные (V) в сравнении с контролем. Во всех тестах использовали контрольные бактерии.
Пример 12. Оценка антимикробной активности штаммов L. paracasei CNCM I-4034, S. breve CNCM I-4035 и L rhamnosus CNCM I-4036
Исследованные штаммы и условия культивирования и хранения
В настоящем исследовании были проанализированы в общей сложности 3 штамма, принадлежащие родам Lactobacillus и Bidifobaterium (Таблица 1).
Таблица 1
Штаммы, использованные в данном исследовании, и условия культивирования
Вид
Штамм
Культуральная среда
Температура
Аэрация
L. paracasei
CNCM I-4034
RSM
37°С
Анаэробные условия
В. breve
CNCM I-4035
0,05% RSM-цистеин
37°С
Анаэробные условия
L. rhamnosus
CNCM I-4036
RSM
37°C
Анаэробные условия
Оценивали антимикробную активность этих штаммов в отношении бактериальных патогенных агентов, поражающих пищеварительную систему {Helicobacter pylori, Listeria monocytogenes, Shigella sonnei, энтеротоксигенная Escherichia coli, энтеропатогенная Escherichia coli и Salmonella enterica), и вирусов (вирус Ito, Wa и Va70), показанных в Таблицах 2 и 3.
Таблица 2
Использованные штаммы патогенных микроорганизмов
Виды
Helicobacter pylori
Listeria monocytogenes
Shigella sonnei
Rotavirus
Штаммы
LMG 8775
CECT4031
CECT 457
Wa
LMG 18041
CECT 935
CECT 4887
Va70
LMG 19449
CECT911
CECT 413
Ito
Таблица 3
Использованные штаммы патогенных микроорганизмов
Виды
Энтеротоксигенная Escherichia coli
Энтеротопатогенная Escherichia coli
Salmonella enterica
Штаммы
CECT 434
CECT 443
CECT 443
CECT 501
CECT 729
CECT 725
CECT515
CECT 742
CECT 4594
В случае бактерий, их хранили в растворе RSM с добавлением 20% (масс./об.) глицерина с замораживанием при -80°С. Вирусы хранили замороженными в среде MEM при -190°С. Получение свободной от клеток надосадочной жидкости для исследования
Для получения концентрированной надосадочной жидкости для различных анализов штаммы культивировали в жидкой среде в течение 17 часов и 24 часов в среде RSM (CNCM I-4034 и CNCM I-4036) или RSM с добавлением 0,05% цистеина (CNCM I-4035) при 37°С. Надосадочную жидкость каждого из штаммов отбирали центрифугированием и лиофилизировали. Полученный концентрат растворяли с получением раствора с десятикратной концентрацией, рН нейтрализовали до значения 6,0 и полученный раствор стерилизовали фильтрацией через поры размером 0,22 мкм. Аликвоты нейтрализованной и стерилизованной надосадочной жидкости хранили замороженными при -20°С до их использования.
Анализы активности в отношении бактериальных патогенов, поражающих пищеварительную систему, в жидкой среде
Для проведения анализов ингибирования в жидкой среде использовали модификацию протокола Spinier et al. (2008). Кратко, в многолуночные планшеты по отдельности вносили объемы полученных надосадочных жидкостей 250 мкл в возрастающих процентных отношениях (от 0,2% до 4%) (об./об.) к культуральной среде, инокулированной каждым из патогенов при 5%, которых выращивали в течение ночи. Кривые роста получали мониторингом посредством измерения OD при 595 нм с использованием планшет-ридера Multiskan 5 Ascent. На основании результатов, полученных для различных образцов, проявленное ингибирование оценивали количественно в виде процента ингибирования роста в отношении контроля без добавления надосадочной жидкости ингибирующего штамма.
Анализ активности в отношении вирусных патогенов. поражающих пищеварительную систему, в жидкой среде
Анализы подавления вирусной инфекции надосадочными жидкостями исследованных штаммов проводили согласно протоколу, опубликованному Botic et al. (2007), с модификациями для его адаптации к работе, проводимой в данном проекте. В данном случае для проведения этих анализов использовали линию клеток кишечника человека НТ-29.
Результаты анализов активности в жидкой среде в отношении бактериальных патогенов. поражающих пищеварительную систему: Listeria monocvtoaenes, Shiaella sonnei u Helicobacter pylori
Для оценки эффекта надосадочных жидкостей, полученных при выращивании штаммов L paracasei, L rhamnosus и В. breve, использовали нейтрализованные и концентрированные в 10 раз надосадочные жидкости, полученные при выращивании штаммов в течение 17 и 24 часов, соответственно.
Результаты значительно варьировали в зависимости как от пробиотика, так и от патогенного штамма. В случае L. monocytogenes добавление надосадочной жидкости, полученной после выращивания L. paracasei в течение 17 часов, оказывало ингибирующий эффект (Фиг.10А). В случае L. rhamnosus наилучшие результаты были получены при добавлении надосадочной жидкости 24-часовой культуры. В случае В. breve ингибирование L. monocytogenes CECT 4031 Т (Фиг.10Б) было очевидным. Результаты, полученные для S. sonnei, были сходными с полученными для L. monocytogenes, поскольку для L. paracasei наилучшие результаты были получены при добавлении надосадочной жидкости, полученной после выращивания в течение 17 часов, и для L. rhamnosus наилучшие результаты были получены при добавлении надосадочной жидкости 24-часовой культуры (Фиг.10В). В случае Н. pylori, значительное уменьшение роста патогена было получено с использованием надосадочных жидкостей L. paracasei и В. breve, полученных через 17 часов и 24 часа инкубации, при этом наибольшее ингибирование оказывали надосадочные жидкости 24-часовых культур. Полученные проценты ингибирования приведены в следующей таблице (Таблица 4).
L. paracasei
L. rhamnosus
В. breve
0,4% (об./об.)
2% (об./об.)
4% (об./об.)
0,4% (об./об.)
2% (об./об.)
4% (об./об.)
0,4% (об./об.)
2% (об./об.)
4% (об./об.)
17 ч
24 ч
17 ч
24 ч
17 ч
24 ч
17 ч
24 ч
17 ч
24 ч
17 ч
24 ч
174
24 ч
17 ч
244
17 ч
24 ч
L. monocytogenes CECT 935
0,00
0,00
33,09
6,64
ОД)
1,89
1,51
3,21
8,43
13,86
2,45
30,31
0,69
0,00
1,24
0,00
0,03
0,00
L. monocytogenes CECT 4031
0,00
0,00
0,00
0,00
9,48
0,00
0,00
0,00
1,24
10,67
8,21
15,29
3,32
16,63
1,06
9,88
4,54
28,05
L. monocytogenes CECT 911
2,60
5,73
7,31
9,92
25,64
16,81
8,46
5.18
11,99
18,36
15,53
28,13
4,22
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
S. sonnei CECT 457
0,00
0,00
2,63
9,95
9,25
20,53
1,78
0,41
0,00
16,04
6,79
33,80
0,00
12,94
0,00
25,75
2,44
19,36
S. sonnei CECT 413
28,72
0,00
32,51
3,88
80,99
82,10
0,00
5,17
5,49
16,32
80,95
82,06
8,05
0,00
7,19
0,00
14,83
0,00
S. sonnei CECT 4887
0,00
0,00
2,63
9,95
9,25
20,53
0,00
0,00
0.00
10,05
3,80
29,07
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
H. pylori LMG 4081<sup>T</sup>
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
9,24
0,00
9,70
2,06
4,19
0,00
0,00
0,00
0,00
14,97
0,00
6,33
0,00
H. pylori LMG 19499
21,15
13,24
51,70
41,05
75,80
70,89
17,36
36,67
54,84
61,13
83,48
85,28
12,56
37,80
37,79
71,92
57,33
77,56
H. pylori IMS 8775
13,84
31,34
34,61
74,04
33,65
95,66
0,00
0,00
0,00
22,50
70,77
44,22
25,77
20,38
35,38
58,55
38,50
85,00
Результаты анализов активности в жидкой среде в отношении бактериальных патогенов, поражающих пищеварительную систему: Salmonella typhi, Salmonella thvohimurium u Eschehchia coli
Для надосадочной жидкости бактерий L. paracasei наблюдается значительное ингибирование роста в отношении исследованной группы Salmonella (Фиг.11). Этот эффект особенно выражен при использовании не нейтрализованной надосадочной жидкости, подтверждая, что он обусловлен образованием при ферментации кислоты, ограничивающей рост патогена. В случае Salmonella typhi CECT 725 ингибирующий эффект при 1% и 4% надосадочной жидкости наблюдают независимо от того, нейтрализована она или нет, подтверждая, что ингибирование обусловлено бактериоцином некоторого типа или другим фактором неизвестной природы, оказывающим этот эффект в отношении патогена.
Надосадочная жидкость бактерий В. breve ингибирует рост бактерий Salmonella typhi (CECT 725). Этот эффект наблюдают с использованием надосадочной жидкости при любых условиях (17 и 24 часа; нейтрализованная и не нейтрализованная; 1% и 4%), образование бактериоцина какого-либо типа или другого фактора отличной природы (Фиг.12) и в этом случае не исключено.
Для надосадочной жидкости бактерий L. rhamnosus видно значительное ингибирование роста во всех трех группах (E coli ЕТЕС, Е. coli EPEC и Salmonella enteiica), главным образом при 4% (Фиг.13). Этот эффект наблюдают, в основном, при использовании не нейтрализованной надосадочной жидкости, вновь подтверждая, что он обусловлен кислыми продуктами ферментации, ограничивающими рост патогена.
Хотя в случае Е. coli EPEC (CECT 742) и Salmonella typhimuhum (CECT 4594) ингибирование наблюдают при использовании нейтрализованной 24-часовой надосадочной жидкости, этот эффект можно объяснить, как и в предыдущих случаях, присутствием фактора или бактериоцина любого типа из питательной среды пробиотических бактерий (Фиг.13).
Результаты анализов активности в жидкой среде в отношении вирусных патогенов, поражающих пищеварительную систему: ротавирусов человека Ito, Wa и Va70
Оптимизировали протоколы инфицирования, выявления инфекционных очагов и количественной оценки защитного эффекта в отношении ротавирусов человека Ito, Wa и Va70. Для получения по возможности максимально репрезентативных результатов анализы инфицирования и защиты проводили на человеческой клеточной линии НТ-29.
6
4
5
После амплификации вирусов в клетках МА-104 проводили их титрование на линии НТ-29. Полученные титры в бляшкообразующих единицах (БОЕ) составляли 2,02х10 БОЕ/мл для вируса Ito, 6,80×10 БОЕ/мл для вируса Wa и 2,33×10 БОЕ/мл для вируса Va70. На основании полученных результатов титрования концентрации вирусов корректировали, чтобы они были подходящими для инфицирования. Для обеспечения правильности анализов анализы инфицирования проводили с использованием трех последовательных серийных десятичных разведении и повторяли эти анализы трижды. На Фиг.14 показаны результаты уменьшения образования инфекционных очагов, полученные с использованием надосадочных жидкостей без предварительного концентрирования нейтрализованных надосадочных жидкостей от 24-часовых культур. Эти результаты показывают, что штаммы по настоящему изобретению уменьшают образование инфекционных очагов всех исследованных вирусов (Wa, Ito и Va70).
ЛИТЕРАТУРА
- Adolfsson О, Meydani SN, Russell RM. Yogurt and gut function. Am J Clin Nutr 2004; 80:245-256.
- Agarwal BB, Shishodia S, Ashikawa K, Bharti AC. The role of TNF and its family members in inflammation and cancer: lessons from gene deletion. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 202; 1:327-41.
- Akalin AS, Gone S, Duzel S, Influence of yogurt and acidophilus yogurt on serum cholesterol leveis in micej Dairy Sci1997; 80:272I-25.
- Andrighetto C, De Dea P, Lombardi A, Neviani E, Rossetti L. Giraffa G. Molecular identification and cluster analysis of homofermentative thermophiliclactobacilli isolated from dairy products. Res Microbiol 1998; 149:631-643.
- Archer SY, Meng S, Shei A, et al. P21 (WAFI) is required for butyrate-mediated growth inhibition of human colon cancer cells. Proc Nati Acad Sci USA 1998; 95:679I-96.
- Arhne S, Molin G, Stahl S. Plasmids in Lactobacillus strain isolated from meat and meat products. Sysl Appl Microbiol 1989; 11:320-325.
- Backhed F, Ley RE, Sonnenburg JL, et al. Host-bacterial mutualism in the human intestine. Science. 2005; 307:1915-1920.
- Bai AP, Ouyang Q, Xiao X, Li SF. Probiotics modulate inflammatory cytokine secretion from inflammed mucosa in active ulcerative colitis. Int j Clin Pract 2006; 60:284-88.
- Barry Т, Colleran G, Glenon M, Dunican L, Gannon F. The 16S/23S ribosomal spacer as a target for DNA probes to identify eubacteria. PCR Methods App11991; 1:5I-56.
- Beerens. Deteccion of bifidobacteria by using propionic acid as a selective agent. AppI Env Microbio 1991; 57:2418-19.
- Berg RD. Probiotics, prebiotics or «conbiotics.» Trends Microbiol 1998; 6:89-92.
- Bernet MF, Brassart D, Neeser JR, Servin AL. Lactobacillus acidophilus LA-1 binds to cultured human intestinal cell-lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria. Gut 1994; 35:483-9.
- Bezirtzoglou E. The intestinal microflora during the first weeks of life. Anaerobe 1997; 3:173-177.
- Biller JA, Katz AJ, Flores AF, Buie TM, Gorbach SL. Treatment of recurrent Clostridium difficile colitis with Lactobacillus GG. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1995; 21:224-6.
- Black FT, Andersen PL, Orskov J, et al. Prophylactic efficacy of lactobacilli on travelers diarrhea. Travel Med 1989; 7: 333-5.
- Botes M, Loos B, van Reenen CA. Adhesion of the probiotics strains Enterococcus mundtii ST4SA and Lactobacillus plantarum 423 to Caco-2 cells under conditions simulating the intestinal tract, and in the presence of antibiotics and anti-inflammatory medicaments. Arch Microbiol 2008; 190: 573-584.
- Botic, Т., Klingberg, T.D., Weingart I.H., Cencic, A. (2007) A novel eukaryotic cell culture model to study antiviral activity of potential probiotic bacteria. International Journal of Food Microbiology. 115 (2): 227-234.
- Bouton Y, Guyot P, Grappin R. Preliminary characterization of microflora of comte cheese. J AppI Microbiol 1998; 85:123-131.
- Brownlee IA, Havler ME, Dettmar PW, Alien A, Pearson JP. Colonic mucus: secretion and turnover in relation to dietary fibre intake. Proc Nutr Soc 2003; 62:245-249.
- Butler M, Ng С, van Heel D, Lombarda G, Lechler R, Playford R, Ghosh S. Modulation of dendritic cell phenotype and function in an in vitro model of the intestinal epithelium. Eurj Immunol 2006; 36:864-74.
- Buts JP, De Keyser N. Effects of Saccharomyces boulardU on intestinal mucosa. Dig Dis Sci 2006; 51:1485-92.
- Buts JP, DeKeyser N, Marandi S, Hermans D, Chae YHE, Lambotte L, Chanteux H, Tulkens PM. Saccharomyces boulardii up-grades cellular adaptation after proximal eftterectomy in rats. Gut 1999; 45:89-96.
- Castagliuolo I, Riegler MF, Valenick L, LaMont JT, Pothoulakis C. Saccharomyces boulardii protease inhibits the effects of Clostridium difficile toxins A and В in human colonic mucosa. Infect Immu 1999; 67:302-7.
- Cebeci A, Gurakan C. Properties of potential probiotic Lactobacillus plantarum strains. Food Microbiol 2003; 20:51I-518.
- Cetina-Sauri G, Sierra Basto G. Evaluation therapeutique de Saccharomyces boulardii chez des enfants souffrant de diarrhee aigue. Ann Pediatr 1994; 41:397-400.
- Chai F, Evdokiou A, Young GP, et al. Involvement ofp21 (Waf1/Cip1) and its cleavage by DEVD-caspase during apoptosis of colorectal cancer ccells induced by butyrate. Carcinogenesis 2000; 21:7-14.
- Chu H, Kang S,Ha S.Cho K, Park SM, Han KH, er al. Lactobacillus acidophilus expressing recombinant K99 adhesive fimbriae has an inhibitory effect on adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli. Microbiol Immunol 2005; 49:941-8.
- Clements ML, Levine MM, Black RE, Robins-Browne RM, Cisneros LA, Drusano GL, Lanata CF, Saah AJ. Lactobacillus prophylaxis for diarrhea due to enterotoxigenic Escherichia coli. Antimicrob Agents Chemother. 1981; 20:104-8.
- Coconnier M, Lievin V, Bernet-Camard MF, Hudault S, Sen/in A. Antibacterial effect of the adhering human Lactobacillus acidophilus strain LB. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41:1046-52.
- Collins M, Samelis J, Metaxopoulos J, Wallbanks S. Taxonomic studies on some leuconostoc-Iike organims from fermented sausages: description of a new genus Weissella for the Leuconostoc paramesenteroides group of species. J Appl Bacteriol 1993; 75:595-603.
- Coronen R, Korpela R, Moilanen E. Signalling mechanisms involved in the induction of inducible nitric oxide synthase by Lactobacillus rhamnosus GG, endotoxin, and lipoteichoic acid. Inflammation 2002; 26:207-14.
- Cui H, Chen CL, Wang JD, Yang UJ, Cun Y, Wu JB, Liu YH, Dan HL, Jian YT, Chen XQ. Effects of probiotic on intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis. World j Gastroenterol 2004; 10:1521-25.
- DSouza AL, Rajkumar C, Cooke J, Bulpitt CJ. Probiotics in prevention of antibiotic associated diarrhoea: meta-analysis. BMJ 2002; 324:1361.
- Danielson AD, Peo ER Jr, Shahani KM, Lewis AJ, Whalen PJ, Amer MA. Anticholesteremic property of Lactobacillus acidophilus yogurt fed to mature boars. J AnimScL1989;67: 966-74.
- De Angelis M, Corsetti A, Tosti N, Rossi J, Corbo M, Gobbetti M. Characterization of non-starter lactic acid bacteria from Italian ewe cheese based on phenotypic, genotypic, and cell wall protein analyses. AppI Environ Microbiol 2001; 67:2010-20.
- De Man JC, Rogosa M, Sharpe MT. A medium for the cultivation of lactobacilli. J AppI Bacteriol 1960; 23:130-5.
- De Vrese M, Stegelmann A, Richter B, Fenselau S, Laue C, Schrezenmeir J. Probiotics-compensation for lactase insufficiency. Am J Clin Nutr. 2001; 73:421 S-429S.
- Desjardins ML and Roy D. Growth of bifidobacteria and their enzyme profiles. J Dairy Sci 1990; 73:299-307.
- Di Саrо S, Tao H, Grillo A, EHa C, Gasbarrini G, Sepulveda AR, Gasbarrini A. Effects of Lactobacillus GG on genes expression pattern in small bowel mucosa. Dig Liver Dis 2005; 37:320-29.
- Di Sabatino A, Ciccocioppo R, Luinetti O, et al. Increased enterocyte apoptosis in inflamed areas of Crohns disease. Dis Colon Rectum 2003; 46:1498-1507.
- Dunne С, Murphy L, Flynn S, O'Mahony L, O'Halloran S, Feeney M, Morrissey D, Thornton G, Fitzgerald G, Daly C, Kiely B, Quigley EM, O'Sullivan GC, Shanahan F, Collins JK. Probiotics: from myth to reality. Demonstration of functionality in animal models of disease and in human clinical trials. Antonie Van Leeuwenhoek. 1999; 76:279-92.
- Dunne С, O'Mahony L, Murphy L, Thornton G, Morrissey D, O'Halloran S, Feeney M, Flynn S, Fitzgerald G, Daly C, Kiely B, O'Sullivan GC, Shanahan F, Collins JK. In vitro selection criteria for probiotico bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. Am J din Nutr 2001; 73 (suppi) 386S-92S.
- Eaden JA, Abrams KR, Matberry JF. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut 2001; 48:526-535.
- Fabia R, Ar'Rajab A, Johansson M, Andersson R, Willen R, Jeppsson B, Molin G, Bengmark S. Impairment of bacterial flora in human ulcerative colitis and experimental colitis in the rat Digestion 1993; 54:248-255.
- FAO/WHO (2002). Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food.
- Favier C, Neut C, Mizon C, Cortot A, Colombel J, Mizon j. Fecal beta-D-galactosidase production and Bifidobacteria are decreased in Crohn's disease. Dig Dis Sci 1997; 42:817-822.
- Floch MH, Binder HJ, Filburn B, Gershengoren W. The effect of bile acids on intestinal micromicrobiota. Am J Clin Nutr 1972; 25:1418-26.
- Forestier C, de Champs C, Valtoux C, Joly B. Probiotic activities of Lactobacillus casei rhamnosus: in vitro adherence to intestinal cells and antimicrobial properties. Res microbiol 2001; 152:167-173.
- Fukushima M, Nakano M. Effect of a mixture of organisms, Lactobacillus acidophilus or Streptococcus faecalis on cholesterol metabolism in rats fed on a fat-and cholesterol-enriched diet. Brj Nutr 1996; 76:857-67.
- Fuller R. Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol. 1989; 66:365-78.
- Fuller R., ed. Probiotics: the scientific basis. London: Chapman & Hall, 1992.
- Gilliland SE, Nelson CR, Maxwell C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol. 1985; 49:377-81.
- Goldin BR, Gorbach SL. Probiotics for humans. In: Fuller R, ed. Probiotics, the scientific basis. London: Chapman and Hall, 1992; 355-76.
- Gopal P, Sullivan P, Smart J. Utilisation of galacto-oligosaccharides as selective substrate for growth by lactic acid bacteria including Bifidobacterium lactis DR 10 and Lactobacillus acidophilus DR 20. Int Dairy J 2001; 11: 19-25.
- Gopal PK, Prasad J, Smart J, Gill HS. In vitro adherence properties of Lactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 strain and their antagonistic activity against an eterotoxigenic Escherichia coli. Int J Food Microbiol 2001; 67:207-16.
- Gorbach SL, Chang TW, Goldin B. Successful treatment of relapsing Clostridium difficile colitis with Lactobacillus GG. Lancet. 1987; 2:1519.
- Gordon Jl, Hooper LV, McNevin MS, Wong M, Bry L. Epithelial cell growth and differentiation.III. promoting diversity in the intestine; conversations between the microflora, epithelium, and diffuse GALT. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 1997;273:G565-G70.
- Gotz V, Romankiewicz JA, Moss J, Murray HW. Prophylaxis against ampicillin-associated diarrhea with a lactobacillus preparation. Am J Hosp Pharm. 1979; 36:754-7.
- Grupa P, Andrew H, Kirschner BS, et al. Is Lactobacillus GG helpful in children with Crohn's disease? Results of preliminary, open-label study. J Pediatr Gastroenterol Nutr2000; 31:453-457.
- Gulewicz P, Szymaniec S, Bubak B, Frias J, Vidal-Valverde C, Trajanowska K, Gulewicz K. Biological activity of a-galactoside preparations from Lupinus angustifolius L and Pisum sativum L seeds. J Agr food chem 2002; 50:384-389.
- Harms HK, BerteIe-Harms RM, Bruer-KIeis D. Enzyme-substitution therapy with the yeast Saccharomyces cerevisiae in congenital sucrase-isomaltase deficiency. N EngI J Med. 1987; 316:1306-9.
- Harmsen HJ, Wildeboer-Veloo AC, Raangs GC, Wagendorp AA, Klijn N, Bindels JG, Welling GW. Analysis of intestinal flora development in breast-fed and formula-fed infants by using molecular identification and detection methods. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2000; 30:6I-67.
- Heerdt BG, Houston MA, Augenlicht LH. Short-chain fatty acid-initiated cell cycle arrest and apoptosis of colonic epithelial cells is linked to mitochondrial function. Cell Growth Differ 1997; 8:523-532.
- Heiling HG, Zoetendal EG, Vaughan ЕЕ, Marteu P, Akkermans AD, and de Vos WM. Molecular diversity of Lactobacillus spp.and other lactic acid bacteria in the human intestine as determined by specific amplification of 16S ribosomal DNA. Appl Environ Microbiol 2002; 68:114-123.
- Henriksson A, Khaled AKD, PL Conway. Lactobacillus colonization of the gastrointestinal tract of mice after removal of the non secreting stomach region. Microb Ecol Health Dis 1999; 11:96-9.
- Hilton E, Kolakowski P, Singer C, Smith M. Efficacy of Lactobacillus GG as a Diarrheal Preventive in Travelers. J Travel Med. 1997; 4:4I-43.
- Hóchter W, Chase D, Hegenhoff G. Saccharomyces boulardii in treatment of acute adult diarrhea. Efficacy and tolerance of treatment. Munch Med Wochen 1990; 132:188-92.
- Holzapfel W.H., Haberer P., Snel J., Schillinger U., Huisin'tVeld, J.H.J. Overview of gut flora and probiotics. International Journal of Food Microbiology 1998; 41,85-101.
- Hopkins M, Cummings H, McFarlane G. Interspecies differences in maximum specific growth rates and cell yields of bifidobacteria cultured on oligosaccharides and other simple carbohydrate source. J Appl Microbiol 1998; 85:38I-386.
- Isolauri E, Salminen S,. Probiotics, gut inflammation and barrier function. Gastroentero Clin North Am 2005; 34:437-450.
- Iwamoto M, Koji T, Makiyama K, et al. Apoptosis of crypt epithelial cells in ulcerative colitis. J Pathol 1996; 180:152-159.
- Jack RW, Tagg JR, Ray B. Bacteriocins of gram positive bacteria. Microbiol Rev 1995; 59:17I-200.
- Jankowska A, Laubitz D, Antushevich H, Zabielski R, Grzesiuk E. Competition of Lactobacillus paracasei with Salmonella enterica for adhesion to Caco-2 cells. J Biomed Biotechnol 2008; 2008:357964.
- Jin LZ, Ho WY, Abdullah N, Jalaludin S. Acid and bile tolerance of Lactobacillus isolated from chicken intestine. Lett. Appl. Microbiol. 1998; 27:183-185.
- Jobin С, sartor RB,. The IkB/NF-kB system: a key determinat of mucosal inflammation and protection. Am J Physiol Cell Physiol 2000; 278:045I-C462.
- Julia M, Wong RD, Russell de Souza RD, Cyril W, et al. Colonia health: fermtntation and short chain fatty acids. J Clin Gastroenterol 2006; 40:235-243.
- Kalliomaki MA, Isolauri E. Probiotics and down-regulation of the allergic response. Immunol Allergy Clin North Am 2004; 24:739-752.
- Kelsall В, Biron С, Sharma О, Кауе Р. Dendritic cells at the host-pathogen interface. Nat immunol 2002; 3:699-702.
- Klaenhammer TR. Genetics of bacteriocins produced by acid lactic bacteria. FEMS Microbiol Rev 1993; 12:39-85.
- Ко JS, Yang HR, Chang JY, Seo JK. Lactobacillus plantarum inhibits epithelial barrier dysfunction and interleukin-8 secretion induced by tumor necrosis factor-a. World J Gastroenterol 2007; 13:1962-65.
- Kollaritsch H, Hoist H, Grobara P, et al. Prophylaxe der reisediarrhoe mith Saccharomyces boulardii. ForstChrMed 1993; 111. - 152-56.
- Koshiji M, Adachi Y, Sogo S. Apoptosis of colorectal adenocarcinoma (COL0201) by tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) and/or interferon-gamma (IFN-gamma), resulting from down-regulation of Bcl-2 expression. Clin Exp Immunol 1998; 1 11:21I-218.
- Kulkami N, Zang E, Kelloff G. Effect of the chemopreventive agents piroxicam and D.L-alpha-difluoromethylomithine on intermediate biomarkers of colon carcinogenesis. Carcinogenesis 1992; 13:995-1000.
- Kurmann J, Started for fermented milk: Started with selected intestinal bacteria. Bull Int Dairy Fed 1988; 227:4I-45.
- Lee Y-K, Salminen S. The coming age of probiotics. Trends Food Sci Technol 1995; 6:24I-5.
- Lee Y.K., Puong K.Y., Ouwehand A.C, Salminen S. Displacement of bacterial pathogens from mucus and Caco-2 cell surface by lactobacilli J Med Microbio 2003; 52:925-930.
- Lewis R, Gorbach S. Modificaron of bile acids by intestinal bacteria. Arch Intern Med 1972; 130:545-9.
- Lin MY, Yen CL, Chen SH. Management of lactose maldigestion by consuming milk containing lactobacilli. Dig Dis Sci. 1998; 43:133-7.
- Lin SY, Ayres JW, Winkler W, Sandine WE. Lactobacillus effects on cholesterol: in vitro and in vivo results. J Dairy Res 1989; 72:885-9.
- Madsen К, Cornish A, Soper P, et al. Probiotic bacteria enhance murine and human intestinal epithelial barrier function. Gatroenterology 2001; 121:580-591.
- Mahe S, Marteau P, Huneau JF, Thuillier F, Tome D. Intestinal nitrogen and electrolyte movements following fermented milk ingestion in man. BrJ Nutr. 1994; 71: 169-80.
- Makras L, Van Acker G, De Vuyst L. Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei 8700:2 degrades inulin-type fructans exhibiting different degrees of polymerization. Appl Enviro Microbiol 2005; 71:6531-6537.
- Marini M, Bamias G, Rivera-Nieves J. TNF-D neutralization ameliorates the severity of murine Crohn's-like ileitis by abrogation of intestinal epithelial cell apoptosis. Proc Nati Acad Sci USA 2003; 100:8366-8371.
- Marteau P, Flourie B, Pochart P, Chastang C, Desjeux JF, Rambaud JC. Effect of the microbial lactase (EC 3.2.1.23) activity in yoghurt on the intestinal absorption of lactose: an in vivo study in lactase-deficient humans. Br J Nutr. 1990; 64:71-9.
- McFarland LV, Surawicz CM, Greenberg RN, et al. Prevention de β-lactam associated diarrhea by Saccharomyces boulardii compared with placebo. Am J Gastroenterol 1995; 90:439-48.
- Medina R, Katz M, Gonzalez S, Oliver G. Characterization of the lactic acid bacteria in ewes milk and cheese from northwest Argentina. J Food Prot 2001; 64:559-563.
- Medina V, Edmonds B, Young G, James R, Appleton S, Zaiewski P. Induction of caspase-3 protease activity and apoptosis by butyrate and trichostatin A (inhibitors of histone deacetylase): Dependence on protein synthesis and synergy with a mitochondrial/cytochrome c-dependent patway. 1997; 57:3697-3707.
- Metchnikoff E. Etudes sur la flore intestinale. Ann. Inst. Pasteur Paris 1908; 22:929-55.
- Morata De Ambrosini, Ganzalez S.N., Oliver G. Study of adhesion of Lactobacillus casei CRL431 to ileal intestinal cells of mice. J. FoodProt. 1999; 1430-1434.
- Nanno M, Morotomi M, Takayama H, Kuroshima Т, Tanaka R, Mutai M. Mutagenic activation of biliary metabolites of benzo(a)pyrene by b-glucoronidase-positive bacteria in human faeces. J Med Microbiol 1986; 22:351.
- Navarro E, Simonet P, Normard P, Bardin R. Characterization of natural populations of Nitrobacter spp. using PCR/RFLP analyses of the ribosomal intergenic spacer. Arch Microbiol 1992; 157:107-115.
- Nebra Y, Blanch AR. A new selective medium for Bifidobacterium spp.AppI Environ Microbiol. 1999; 65:5173-6.
- Niedergang F, Kweon M. New trends in antigen uptake in the gut mucosa. Trends Microbiol 2005; 13:485-90.
- O'Hara A, O'Regan P, Fanning A, OMahony C, MacSharry J, Lyons A, Bienenstock J, Omahony L, Sanan F. Functional modulation of human intestinal epithelial cell responses by Bifidobacterium infantis and Lactobacillus salivarius. Immunology 2006; 118:202-15.
- Oties S, Cagindi 0 & Akcicek E Probiotics and health. Asian Рас J Cancer Prev 2003; 4:369-372.
- Ouwehand A. C., Kirjavainen P.V., Shortt C., Salminen S. Probiotics: mechanisms and establishe deffects. Intern Dairy J 1999; 9:43-52.
- Percy-Robb IW, Collee JG. Bile acids: a pH dependent antibacterial system in the gut? Br Med J 1972; 3:813-5.
- Piaia M, Antoine JM, Mateos-Guardia JA, Lepligard A, Lenoir-Wijnkoop I. Assessment of the benefits of live yogurt methods and markers for in vivo studies of the physiological effects of yogurt cultures. Microb Ecol Health Dis 2003; 15:79-87.
- Pickard KM, Bremner AR, Gordon JN, et al. Microbial-gut interactions in health and disease. Immune responses. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 2004; 18:27I-285.
- Plant, LJ., Conway, P.L, 2002. Adjuvant properties and colonization potential of adhering and non-adhering Lactobacillus spp. Following oral administration to mice. FEMS Immunol Med Microbio 2002; 34:105-111.
- Ratajczak C, Duez C, Grangette C, Pochard P, Tonnel AB, Pestel J. Impact of lactic acid bacteria on dendritic cells from allergic patients in an experimental model of intestinal epithelium. J Biomed Biotechnol 2007; 1:719-21.
- Riedel С, Foata F, Philippe D, Adolfsson O, Eikmanns B, Blum S. Anti-inflammatory effects of bifidobacteria by inhibition of LPS-induced NF-kB activation. World J Gastroenterol 2006; 12:3729-35.
- Rimoldi M, Chieppa M, Salucci V, Avogadri F, Sonzogni A, Sampietro G, NespoliA, Viale G, Allavena P, Rescigno M. Intestinal immune homeostasis is regulated by the crosstalk between epithelial cells and dendritic cells. Nat immunol 2005; 6:507-14.
- Rioux KP, Fedorak RN. Probiotics in the treatment of inflammatory bowel disease. J Clin Gastroenterol 2006; 40:260-263.
- Roberfroid M, Van Loo E, Gibson R. The bifidogenic nature of chicory inulin and its hydrolysis products, J Nutr 1998; 128:1I-19.
- Ross RP, Desmond C, Fitzgerald GF, Staton C. Overcoming the technological hurdles in the development of probiotic food. J. Appl. Microbiol. 2005; 98:1410-17.
- Sablon E, Contreras B, Vandamme E. Antimicrobial peptide of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis. Adv Biochem Eng Biotechnol 2000; 68:21-60.
- Satokari RM, Vaughan ЕЕ, Favier C, Dore J, Edwards C, and de Vos WM. Diversity of Bifidobacterium and Lactobacillus spp. in breast-fed and formula-fed infants as assessed by 16S rDNA sequence differences. Microbiol Ecol Health Dis 2002; 14:97-105.
- Savage DC. Microbial ecology of the gastrointestinal tract. Annu Rev Microbiol 1977 31; 31:107-33.
- Senmeir J, deVrese M. Probiotics, prebiotics, and Synbiotics, approaching a definition. Am J Clin Nutr 2001; 73:361 S-648.
- Servin A. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens. FEMS Microbiol Rev 2004; 28:405-440.
- Siitonen S, Vapaatalo H, Salminen S, Gordin A, Saxelin M, Wikberg R, Kirkkola AL. Effect of Lactobacillus GG yoghurt in prevention of antibiotic associated diarrhea. Ann Med. 1990; 22:57-9.
- Silva M, Jacobs NV, Deneke C, Gorbach SL. Antimicrobial substance fro a human Lactobacillus strain: Antimicrob Agents Chemother. 1987; 31:123I-33.
- Sing J, Rvenson A, Tomita M, Shimamura S, Ishibashi N, Reddy B. Bifidobacterium longum, a lactic acid-producing intestinal bacterium inhibits colon cancer and modulates the intermediate biomarkers of colon carcinogenesis. Carcinogenesis 1997; 18:833-41.
- Sinocrope FA, Roddey G, Me Donnell TJ. Increased apoptosis accompanies neoplastic development in the human colorectum. Clin Cancer Res 1996; 2:1999-2006.
- Snelling AM Effects of probiotics on the gastrointestinal tract. Curr Opin InfeciDis 2005; 18:420-426.
- Spinier, J.K., Taweechotipatr, M., Rognerud, C.L, Oub, C.N., Tumwasorn, S., Versalovic, J. (2008) Human-derived probiotic Lactobacillus reuteri dem6nstrate antimicrobial activities targeting diverse enteric bacterial pathogens. Anaerobe 14: 166-171.
- Steiner TS, Nataro JP, Poteet-Smith CE, Smith JA, Guerrant RL. Enteroaggregative Escherichia coli expresses a novel flagellin that causes IL-8 release from intestinal epithelial cells. J Clin Invest 2000; 105:1769-77.
- Stewart L, Pellegrini CA, Way LW. Antibacterial activity of bile acids against common biliary tract organisms. Surg Forum 1986; 37:157-9.
- Surawicz CM, Elmer GW, Speelman P, McFarIand LV, Chinn J, Van Belle G. Prevention of antibiotic associated diarrhoea by Saccharomyces boulardii: Aprospective study. Gastroenterology 1989; 96:981-88.
- Taranto MP, Medici M, Perdigon G, Ruiz Holgado AP, Valdez GF. Evidence for hypocholesterolemic effect of Lactobacillus reuteri in hypercholesterolemic mice. J Dairy Sci. 1998:81:2336-40.
- Thornton GM. Probiotic bacteria. Selection of Lactobacillus and Bifidobacterium strains from the healthy human gastrointestinal tract; characterization of a novel Lactobacillus-derived antibacterial protein. PhD thesis. National University of Ireland, Cork, Ireland, 1996.
- Tien MT, Girardin S, Regnault B, Le Bourhis L, Dillies M, Coppee JY, Bourdet-Sicard R, Sansonetti P, Pedron T. Anti-Inflammatory effect of Lactobacillus casei on Shigella-lnfected Human Intestinal Epithelial Cells. J Immunol 2006; 176:1228-37.
- Todoriki К, Mukai Т, Sato S, Toba Т. Inhibition of adhesion of food-borne pathogens to Caco-2 cells by Lactobacillus strains. J Appl Microbiol 2001; 91:154-9.
- Tsai С, Lin P, Hsieh Y. Three Lactobacillus strains from healthy infant stool inhibit enterotoxigenic Escherichia coli grown in vitro. Anaerobe 2008; 14:61-7.
- Tuomola ЕМ, Salminen SJ. Adhesion of some probiotic and dairy Lactobacillus strains to Caco-2 cell cultures, Int J Food Microbiol 1998; 41: 45-51
- Van Loo J, Cummings J, Delzenne N, Englyst H, Franck A, Hopkins M, Kok N, Macfarlane G, Newton D, Quigley M, Roberfroid M. Functional food properties of nondigestibles oligosaccharides a consensus report from the ENDO project (DGXII Al - RII-CT94-1095) BrJ Nutr 1999; 81:121-132.
- Vanderhoof JA, Whitney DB, Antonson DL, Hanner TL, Lupo JV, Young RJ. Lactobacillus GG in the prevention of antibiotic-associated diarrhea in children. J Pediatr. 1999; 135:564-8.
- Wallace Т, Bradley S, Buckley N, Green-Johnson JM. Interactions of lactic acid bacteria with human intestinal epithelial cells: effects on cytokine production. J food Protect 2003; 66:466-72.
- Wang S, Ng L, Chow WL, Lee YK. Infant intestinal enterococcus faecalis down-regulates inflammatory responses in human intestinal cell lines. World J Gastroenterol 2008; 14:1067-76.
- Weitzman SA, Gordon LI. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood 1990; 76:655-66.
- Wunderlich PF, Braun L, Fumagalli I, D'Apuzzo V, Heim F, Karly M, Lodi R, Politta G, Vonbank F, Zeitner L. Double-blind report on the efficacy of lactic acid-producing Enterococcus SF68 in the prevention of antibiotic-associated diarrhoea and in the treatment of acute diarrhoea. J Int Med Res. 1989; 17:333-8.
- Yan F, Polk D. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells. J Biolog Chem 2002; 277:50959-50965.
- Zhang L, Li N, Caicedo R, Neu J. Alive and dead Lactobacillus rhamnosus GG decrease tumor necrosis factor-a-induced interleukin-8 production in Caco-2 cells. J Nutr 2005; 135:1752-56.