СПОСОБ ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА НИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА
METHOD FOR ASSESSING HYDROGEN PEROXIDE CONTENT IN TUMOUR CELLS AFTER EFFECT OF ANTICANCER PREPARATION

2
2
Предлагаемый способ относится к медицине, в частности к онкологии, и может быть применен для определения содержания активных форм кислорода, а именно пероксида водорода (HO), в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата, в частности цисплатина.
2
2
Химиотерапия является одним из основных методов лечения злокачественных новообразований. Известно, что химиотерапевтические методы, по крайней мере, частично, основаны на чувствительности раковых клеток к окислительному стрессу (1), а активные формы кислорода (АФК), в том числе и HO, играют важнейшую роль в реализации цитотоксического действия противоопухолевых препаратов (1, 2).
Известно, что окислительный стресс, вызываемый в тканях цитотоксическими препаратами в ходе химиотерапии, инициирует перекисное окисление липидов и, соответственно, продукцию множества электрофильных альдегидов, атакующих внутриклеточные мишени (3). Другой проблемой современной химиотерапии являются серьезные токсические эффекты в отношении нормальных тканей, в том числе и в отношении жизненно важных органов (4). Понимание механизмов, регулирующих генерацию и метаболизм АФК, является исключительно важным для разработки патогенетически обоснованных методов лечения злокачественных новообразований, в том числе, путем создания более активных и менее токсичных лекарственных средств.
2
2
2
2
2
2
С этой точки зрения особенно актуальны исследования, посвященные изучению природы окислительного стресса, особенностям его развития в злокачественных новообразованиях, возможностям воздействия на оксидантный статус опухоли с целью повышения эффективности терапии. До настоящего времени остается неясным, в каких именно клеточных структурах происходит генерация АФК, и какие именно формы АФК принимают участие в развитии клеточного повреждения, вызванного лекарственным препаратом. Нерешенными остаются вопросы участия конкретных форм АФК (сайт генерации, основные мишени, пути утилизации) в развитии ответа злокачественных новообразований на различные виды противоопухолевых воздействий. Особый интерес для понимания механизмов реализации противоопухолевых эффектов лекарственных препаратов представляет такая форма АФК, как пероксид водорода (HO), который является сигнальной молекулой, регулирующей пролиферацию и миграцию как нормальных, так и раковых клеток (5). Несмотря на важную роль, которую играет HO в развитии клеточного повреждения при воздействии противоопухолевых препаратов токсических агентов, места образования накопления и деградации HO, остаются недостаточно разъясненными.
2
2
Исследования функции HO в клетках осложняются рядом серьезных ограничений вследствие высокой его реактивности, короткого времени жизни и низкой концентрации данной биологической молекулы. Для оценки участия АФК и, в частности, пероксида водорода, в развитии клеточного повреждения предложены различные биохимические и оптические методы:
Так известен способ выявления участия АФК в процессах цисплатин-индуцированного клеточного повреждения на основе ингибирования развития окислительного стресса ловушками АФК (6). Указанный способ является косвенным и не дает возможности прямой оценки количества АФК в клетках, а также не позволяет селективно определить уровень пероксида водорода.
Известны также способы определения продукции АФК в клетках методом выявления хемилюминесценции люминола или люциногена (7, 8).
Основным недостатком данных способов является отсутствие специфичности по отношению к отдельным формам АФК, в частности, к пероксиду водорода. Кроме того, люцигенин способен вызывать дополнительную продукцию супероксид-анион радикала (9).
Наиболее близким по совокупности существенных признаков и техническому результату к предлагаемому способу является способ оценки в динамике содержания пероксида водорода в опухолевых клетках простаты при воздействии на них противоопухолевого препарата цисплатина, который выбран авторами в качестве прототипа.
2
2
2
2
2
2
Данный способ осуществляют путем воздействия противоопухолевого препарата цисплатина на клетки человеческого рака простаты, представляющие собой гормонорезистентные и гормоночувствительные клеточные линии, и измерения внутриклеточного содержания HO, при этом измерения внутриклеточного содержания HO осуществляют с использованием специфических флуоресцентных зондов (сенсоров), представляющих собой экзогенно введенные флуорофоры, изменяющие свои свойства при взаимодействии с HO (10).
2
2
Способ позволяет определить содержание HO в клетках человеческого рака простаты при воздействии цисплатина в динамике.
Однако данный способ не позволяет выявить клеточные структуры, в которых происходит изменение содержания пероксида водорода и, как следствие, отсутствует возможность судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне. Кроме того, недостатком способа является возможная погрешность оценки содержания пероксида водорода, обусловленная неспецифическим накоплением сенсора (11-14).
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа оценки содержания пероксида водорода в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата, позволяющего выявить место образования пероксида водорода в клетке, и на основе этого судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне, а также позволяет исключить возможную погрешность оценки содержания пероксида водорода, обусловленную неспецифическим накоплением сенсора.
2
2
2
2
Поставленная задача решается предлагаемым способом оценки содержания пероксида водорода в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата, включающем воздействие препарата цисплатина на опухолевые клетки человека и последующее измерение внутриклеточного содержания HO флуоресцентным сенсором, согласно изобретения, что в качестве опухолевых клеток человека берут клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, в качестве флуоресцентного сенсора пероксида водорода используют генетически-кодируемый белок HyPer-cyto, измерение внутриклеточного содержания HO осуществляют методом лазерной сканирующей микроскопии, определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, затем рассчитывают величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода.
Предпочтительно воздействие на опухолевые клетки человека - клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto осуществляют при концентрации цисплатина 1,85-3,85 мкг/мл.
Предпочтительно для оценки содержания пероксида водорода в динамике осуществляют определение интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, и расчет величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, каждые 60 секунд в течение 30 минут.
2
2
Техническим результатом предлагаемого способа является выявление места образования HO в клетке, что позволяет судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне и исключение возможной погрешности оценки содержания пероксида водорода, обусловленной неспецифическим накоплением сенсора.
2
2
Данный технический результат достигается тем, что в качестве опухолевых клеток человека берут клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, в качестве флуоресцентного сенсора пероксида водорода используют генетически-кодируемый белок HyPer-cyto, измерение внутриклеточного содержания HO осуществляют методом лазерной сканирующей микроскопии, определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, затем рассчитывают величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, при этом воздействие на опухолевые клетки осуществляют при концентрации цисплатина 1,85-3,85 мкг/мл, а для оценки пероксида водорода в динамике осуществляют определение интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, и расчет величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, каждые 60 секунд в течение 30 минут.
2
2
2
2
Данный технический результат обусловлен тем, что в качестве опухолевых клеток человека используют клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующую генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода белок HyPer-cyto, локализованный в цитоплазме клетки. Генетически кодируемый клетками аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto сенсор HyPer-cyto для детекции внутриклеточного HO представляет собой химерный белок, состоящий из двух доменов: чувствительного к HO (регуляторный домен транскрипционного фактора OxyR из Escherichia coli) и флуоресцентного (т.н. круговой пермутант желтого флуоресцентного белка - cpYFP) (15),
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом
2
2
488
458
На опухолевые клетки, которые представляют собой клеточную линию аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующую генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer-cyto, воздействуют противоопухолевым препаратом - цисплатином при его концентрации 1,85-3,85 мкг/мл и измеряют внутриклеточное содержания HO методом лазерной сканирующей микроскопии, определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, после чего рассчитывают величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм (F/F), по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода.
Для оценки содержания пероксида водорода в динамике осуществляют определение интенсивности сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, и расчет величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, по которой и судят о внутриклеточном содержании пероксида водорода, каждые 60 секунд в течение 30 минут.
2
2
При возрастании уровня HO в клетках происходит пропорциональное уменьшение интенсивности флуоресценции при возбуждении в диапазоне 400-460 нм и увеличение интенсивности флуоресценции при возбуждении в диапазоне 450-510 нм (15).
2
2
Предлагаемым способом была осуществлена оценка содержания HO в опухолевых клетках аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующих генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer-cyto при воздействии на них препарата цисплатина при его концентрации 1,85-3,85 мкг/мл в 8 экспериментах.
2
2
Введение цисплатина в указанных концентрациях вызывает повышение содержания HO в клетках линии HeLa Kyoto, экспрессирующих HyPer-cyto непосредственно после добавления препарата в среду инкубации клеток.
Примеры конкретного использования предлагаемого способа
2
2
Пример 1. На опухолевые клетки аденокарциномы шейки матки человека HeLa Kyoto, стабильно экспрессирующие генетически-кодируемый сенсор пероксида водорода HyPer-cyto, и находящиеся в среде инкубации, воздействовали противоопухолевым препаратом - цисплатином при его концентрации 3,85 мкг/мл, при этом измерение внутриклеточного содержания HO осуществляли каждые 60 секунд в течение 30 минут методом лазерной сканирующей микроскопии с помощью системы лазерной сканирующей микроскопии LSM 510 на базе инвертированного микроскопа Axiovert 200 М (Carl Zeiss GmbH, Jena, Germany), определяя интенсивность сигнала флуоресценции при возбуждении сенсора на длинах волн 458 нм и 488 нм, после чего рассчитали величину отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм, для каждого измерения.
Зависимость величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм от времени измерения приведена на графике 1 (фиг.1).
488
458
При этом график зависимости величины отношения (F/F) усреднен по данным об уровне флуоресценции 8 клеток после воздействия цисплатина. Данные представлены в виде средних вычислений. Вычисления проводились с использованием программы формирования изображений LSM 5 (Carl Zeiss) и лицензионного программного обеспечения Excel 5.0.
Динамику содержания пероксида водорода в опухолевых клетках оценивали по изменению величины отношения.
488
458
2
2
488
458
Контакт клеток с цисплатином в данной концентрации вызывает быстрое и относительно кратковременное повышение уровня генерации пероксида водорода в цитоплазме клеток линии HeLa-Kyoto-HyPer-cyto. При этом непосредственно после введения препарата в среду инкубации клеток отмечалось повышение величины отношения F/F, которое продолжалось в течение 5 минут.В дальнейшем, через 10 минут после введения цисплатина, концентрация HO вновь падала, о чем свидетельствовало снижение величины отношения F/F до исходных значений.
Пример 2.
Пример 2 осуществляли как пример 1, только воздействовали противоопухолевым препаратом - цисплатином при его концентрации 1,85 мкг/мл.
Зависимость величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм от времени измерения приведена на графике 2 (фиг.1).
488
458
При этом график зависимости величины отношения (F/F) усреднен по данным об уровне флуоресценции 8 клеток после воздействия цисплатина данной концентрации.
Содержание пероксида водорода в опухолевых клетках оценивали по изменению величины отношения во времени.
При этом наблюдается быстрое повышение содержания перексида водорода в цитоплазме, а затем постепенное снижение в течение 10 минут.
Пример 3.
Пример 3 осуществляли как пример 1, только воздействие противоопухолевым препаратом - цисплатином отсутствовало.
Зависимость величины отношения между интенсивностью сигнала флуоресценции на длине волны 488 нм к интенсивности сигнала флуоресценции на длине волны 458 нм от времени измерения приведена на графике 3 (фиг.1).
488
458
При этом график зависимости величины отношения F/F усреднен по данным об уровне флуоресценции 9 клеток в контроле.
Содержание пероксида водорода в опухолевых клетках оценивали по изменению величины отношения во времени. В данном случае подъема уровня пероксида не наблюдалось.
Как видно из полученных результатов, предлагаемый способ позволяет оценивать содержание пероксида водорода в опухолевых клетках при воздействии на них противоопухолевого препарата цисплатина, выявляя место образования пероксида водорода в клетке, и на основе этого судить о механизмах токсического действия цисплатина на молекулярном уровне, а также позволяет исключить возможную погрешность оценки содержания пероксида водорода, обусловленную неспецифическим накоплением сенсора.
Понимание механизмов, регулирующих генерацию и метаболизм, является исключительно важным для разработки патогенетически обоснованных методов лечения злокачественных новообразований, в том числе, и для разработки более активных и менее токсичных лекарственных средств. С этой точки зрения особенно актуальны исследования, посвященные изучению природы окислительного стресса, особенностям его развития в злокачественных новообразованиях, возможностям воздействия на оксидантный статус опухоли с целью повышения эффективности терапии.
Источники информации