АНТИТЕЛА

1. Антитело, включающее, по меньшей мере, одну антигенсвязывающую область, способную связываться с 5T4 (гликопротеин трофобластов), при этом антитело способно блокировать связывание с 5T4 антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 9 [059].
2. Антитело по п. 1, отличающееся тем, что указанное антитело блокирует связывание с 5T4 антитела, выбранного из группы, состоящей из
a) антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 44 [207],
b) антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 51 [226]; и
c) антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 9 [059].
3. Антитело по п. 1 или 2, отличающееся тем, что указанное антитело блокирует связывание с 5T4 антитела, выбранного из группы, состоящей из
a) антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 44 [207]; и
b) антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 51 [226].
4. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что 5T4 представляет собой 5T4 человека (Homo sapiens), например, последовательность зрелого полипептида SEQ ID NO: 1.
5. Антитело по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что 5T4 представляет собой 5T4 яванского макака (Macaca fascicularis), такую как последовательность зрелого полипептида SEQ ID NO: 2.
6. Антитело по любому из пп. 1-3, отличающееся тем, что 5T4 представляет собой 5T4 курицы (Gallus gallus), такой как последовательность зрелого полипептида SEQ ID NO: 3.
7. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что 5T4 представляет собой 5T4 человека, такой как зрелый полипептид SEQ ID NO: 1, и 5T4 яванского макака, такой как зрелый полипептид SEQ ID NO: 2.
8. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что 5T4 представляет собой 5T4 человека, такой как последовательность зрелого полипептида SEQ ID NO: 1, 5T4 яванского макака, такая как последовательность зрелого полипептида SEQ ID NO: 2 и 5T4 курицы, такой как последовательность зрелого полипептида SEQ ID NO: 3.
9. Антитело по любому из предшествующих пунктов, где указанное антитело способно связывать 5T4 человека, 5T4 яванского макакв и/или 5T4 курицы, с аффинностью связывания, которая соответствует значению KD 1E-7 M или меньше, например, 5E-8. M или меньше, 1E-8 M или меньше, 5E-9 M или меньше, или такое как 1E-9 M или меньше, например, с аффинностью связывания, соответствующим значению KD, которое находится в диапазоне от 1E-7 до 5E-10 M, например, в диапазоне от 1E-7 до 1E-9 M, например, от 5E-8 до 5E-10 M, от 5E-8 до 1E-9 M, например, от 1E-8 до 5E-10 M, 1E- От 8 до 1E-9 M или от 1E-8 до 5E-9 M.
10. Антитело по п. 9, отличающееся тем, что аффинность связывания определяется биослойной интерферометрией, необязательно, как указано в примере 2 в данном документе.
11. Антитело по любому из пп. 9 и 10, отличающееся тем, что аффинность связывания определяют с использованием биослойной интерферометрии, включающей стадии:
I) иммобилизации антитела в количестве 1 мкг/мл в течение 600 секунд на биосенсоре, основанном на принципе захвата антителами к Fc-фрагменту IgG человека;
II) определения ассоциации в течение периода времени 200 секунд и диссоциации в течение периода времени 1000 секунд 5T4ECDHis (зрелый белок SEQ ID NO: 99) или 5T4 яванского макака (зрелый белок SEQ ID NO: 2 или рекомбинантный белок 5T4 яванского макака (Cusabio; кат. № CSB-MP024093MOV), используя серии 2-кратных разведений в диапазоне от 100 нМ до 1,56 нМ;
III) сравнение проводили с данными, полученными в контрольном буфере (0 нМ).
12. Антитело по любому из пп. 9-11, отличающееся тем, что аффинность связывания определяют с использованием антитела, определенного в любом из предшествующих пп., которое представляет собой моноспецифическое двухвалентное антитело, такое как антитело, которое представляет собой полноразмерный IgG1.
13. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело распознает эпитоп, или область связывания антитела, или сайт связывания на 5T4, где указанная область связывания антитела, сайт связывания или эпитоп распознается любым из антител, выбранных из группы, состоящей из
a) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 9 [059];
b) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 16 [076];
c) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 23 [085];
d) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30 [106];
e) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37 [127];
f) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 40, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 44 [207]; и
g) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 47, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 51 [226].
14. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с областью связывания антитела, участком связывания или эпитопом на 5T4, которые не являются областью связывания антитела, участком связывания или эпитопом, связанным с ним, или отличаются от области связывания антитела, участка связывания или эпитопа, связанного антителом, выбранным из группы, состоящей из:
a) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 87, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 88 [H8];
b) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 83, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 84 [A1]; и
c) антитела, включающего область VH, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 85, и область VL, содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 86 [A3].
15. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что связывание указанного антитела с 5T4 блокируется связыванием с 5T4 антитела, включающего вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 85 и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 86 [A3].
16. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело демонстрирует вытеснение антитела, связанного с 5T4ECDHis (зрелый белок SEQ ID NO: 99), где указанное антитело, связанное с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 85, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 86 [A3].
17. Антитело по п. 14 или 15, отличающееся тем, что перекрестное блокирование или способность антитела, определенного в любом из предшествующих пунктов, блокировать связывание другого антитела с 5T4 определяется анализом сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), например, в анализе, проведенном, как описано в Примере 5.
18. Антитело по любому из пп. 14-16, отличающееся тем, что перекрестное блокирование или способность антитела, определенного в любом из предшествующих пунктов, блокировать связывание другого антитела с 5T4, определяется как способность неконъюгированного антитела блокировать связывание конъюгированного антитела и, необязательно, определяется с помощью процедуры, включающей стадии:
i) предоставление набора образцов, где каждый образец включает смесь клеток аденокарциномы яичника человека SK-OV-3, антитело, которое связывается с 5T4 и конъюгировано с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), и избыток неконъюгированного антитела, нацеленного на 5T4;
ii) инкубирование образцов в течение 30 минут при 4°C, а затем центрифугирования образцов;
iii) удаление надосадочной жидкости из каждого образца и ресуспендирование клеток в буфере и определение средней интенсивности флуоресценции (MFI) FITC с использованием проточного цитометра; и
iv) расчет процента связывания следующим образом:
разница в MFI между клетками, инкубированными со смесью FITC-конъюгированных антител и неконъюгированных антител, и клетками, инкубированными без FITC-конъюгированных или неконъюгированных антител, умноженная на 100 и затем разделенная на разницу в MFI между клетками, инкубированными со смесью FITC- конъюгированного антитела и антитела IgG-b12 и клетками, инкубированными без FITC-конъюгированных или неконъюгированных антител.
19. Антитело по любому из пп. 14-17, отличающееся тем, что способность указанного антитела блокировать связывание другого антитела с 5T4 или замещать другое антитело, связанное с 5T4ECDHis (зрелый белок SEQ ID NO: 99), определяется с помощью биослойной интерферометрии, как, например, в анализе, описанном в Примере 3.
20. Антитело по любому из пп. 14-18, отличающееся тем, что способность антитела блокировать связывание другого антитела с 5T4 или замещать другое антитело, связанное с 5T4, определяется с помощью биослойной интерферометрии в процедуре, включающей стадии:
i) иммобилизация антитела по любому из предшествующих пп. в количестве 20 мкг/мл в 10 мМ натрий-ацетатном буфере на активированном аминореактивном биосенсоре 2-го поколения;
ii) гашение биосенсора иммобилизованным антителом в этаноламине pH 8,5;
iii) погружение биосенсора с иммобилизованным антителом в композицию, содержащую 3,6 мкг/мл (100 нМ) человеческого 5T4ECDHis (зрелый белок SEQ ID NO: 99), на период времени 500 секунд, и затем
iv) погружение биосенсора с иммобилизованным антителом и 5T4ECDHis в композицию, содержащую 10 мкг/мл другого антитела, нацеленного на 5T4, и определение ответа ассоциации в течение периода времени 500 секунд;
при этом стадии i) -iv) выполняются при температуре 30 °C и встряхивании со скоростью 1000 об/мин.
21. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с эпитопом или областью связывания антитела на человеческом 5T4, содержащей аминокислотные остатки R73, Y92 и R94; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
22. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с эпитопом или областью связывания антитела на человеческом 5T4, содержащей аминокислотные остатки S69, R73, Y92 и R94; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
23. Антитело по любому из пп. 1-21, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с эпитопом или областью связывания антитела на человеческом 5T4, содержащей аминокислотные остатки R73, T74, Y92, R94 и N95; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
24. Антитело по любому из пп. 21 - 23, отличающееся тем, что указанные аминокислотные остатки непосредственно участвуют в связывании антитела.
25. Антитело по любому из пп. 21-24, отличающееся тем, что один или несколько из следующих дополнительных аминокислотных остатков участвуют в связывании антитела, например, косвенно участвуют в связывании, например, воздействуя на сворачивание белка и/или позиционируя один или несколько аминокислотных остатков, непосредственно участвующих в связывании антитела: L89, F111, L117, F138, L144, D148, N152; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
26. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с эпитопом или областью связывания антитела на 5T4 человека, в котором аминокислотные остатки R73, Y92 и R94 непосредственно участвуют в связывании антитела, и где один или несколько аминокислотных остатков F111, F138, L144 и D148 косвенно участвуют в указанном связывании; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
27. Антитело по любому из пп. 1-25, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с эпитопом или областью связывания антитела на человеческом 5T4, в котором аминокислотные остатки S69, R73, Y92 и R94 непосредственно участвуют в связывании антитела, и где один или большее количество аминокислотных остатков F111, F138 и D148 косвенно участвует в указанном связывании; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
28. Антитело по любому из пп. 1-25, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с эпитопом или областью связывания антитела на человеческом 5T4, в котором аминокислотные остатки R73, T74, Y92, R94 и N95 непосредственно участвуют в связывании антитела, и где аминокислотный остаток F138 косвенно участвует в указанном связывании; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
29. Антитело по любому из пп. 21-28, отличающееся тем, что аминокислотные остатки, содержащиеся в указанном эпитопе или связывающей области антитела, и, возможно, один или несколько дополнительных аминокислотных остатков идентифицируются путем аланинового сканирования 5T4 человека, имеющего указанную аминокислотную последовательность. в SEQ ID NO: 1 или последовательности зрелого полипептида SEQ ID NO: 1.
30. Антитело по п. 29, отличающееся тем, что аланиновое сканирование выполняется, как изложено или по существу, как изложено в примере 16 в данном документе.
31. Антитело по пп. 29-30, отличающееся тем, что аланиновое сканирование выполняется с помощью процедуры, включающей стадии:
i) экспрессия мутантных полипептидов 5T4 человека, в которых все аминокислотные остатки во внеклеточном домене 5T4 человека (соответствующие аминокислотным остаткам 32-355 SEQ ID NO: 1), за исключением цистеинов и аланинов, индивидуально замещены аланином, и полипептидов 5T4 дикого типа (аминокислотные остатки 32-355 SEQ ID NO: 1) индивидуально в клетках эмбриональной почки человека, например, клетках HEK 293, так что для каждого мутанта или 5T4 дикого типа предоставляется образец, содержащий 70-90 000 клеток, например, 80 000 клеток;
ii) инкубация клеток в каждом образце с 20 мкл указанного антитела, конъюгированного с антителом, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (3 мкг/мл; в буфере FACS), в течение 40 мин при комнатной температуре, с последующей промывкой каждого образца дважды в 150-180 мкл буфера FACS (фосфатно-солевой буферный раствор + 0,1 мас./об.% BSA + 0,02 мас./об.% азида натрия) и ресуспендирование клеток в каждом образце в 30 мкл буфера FACS;
iii) определение для каждого образца среднего количества связанного антитела на клетку, как среднего геометрического интенсивности флуоресценции (gMFI) для жизнеспособной популяции единичных клеток в указанном образце и нормализации данных для каждого тестируемого антитела против интенсивности связывания неперекрестно-блокирующего 5T4-специфического контрольного антитела с использованием уравнения
,
где «положение ак» относится к положению, в котором произошла мутация на аланин,
где Z-балл рассчитывается для выражения потери или усиления связывания антитела в соответствии с расчетом
,
где μ и σ - среднее и стандартное отклонение, соответственно, нормализованного gMFI, рассчитанного для всех мутантов,
где данные исключаются из анализа, если gMFI контрольного антитела для конкретного мутанта 5T4 ниже, чем среднее gMFIControl Ab - 2,5 x SD среднего gMFIControl Ab (от всех мутантов); и необязательно
где данные исключаются из анализа, если остаток связывается с Z-баллом чуть ниже -1,5 (например, между -1,5 и -1,8, например, между -1,5 и -1,7 или например, между -1,5 и -1,6) и прогнозируется, что этот остаток будет погружен и пространственно отделен от большинства остатков, которые, как предполагается, будут экспонироваться на поверхности и для которых определяется потеря связывания или снижение связывания.
32. Антитело по п. 31, отличающееся тем, что неперекрестное блокирующее 5T4-специфическое контрольное антитело на стадии iv) представляет собой биспецифическое антитело, включающее антигенсвязывающую область, которая содержит последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 83, и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 84 [A1]; и антигенсвязывающую область, которая содержит последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 97, и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 98 [B12].
33. Антитело по любому из пп. 1-20, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с 5T4 таким образом, что происходит потеря связывания или связывание снижается, если любой один или несколько аминокислотных остатков R73, Y92 и R94 заменен/заменены аланином; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
34. Антитело по любому из пп. 1-20 и 33, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с 5T4 таким образом, что происходит потеря связывания или связывание снижается, если один или несколько аминокислотных остатков S69, R73, Y92 и R94 замещен/замещены аланином; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
35. Антитело по любому из пп. 1-20 и 33, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с 5T4 таким образом, что происходит потеря связывания или связывание снижается, если любой один или несколько аминокислотных остатков R73, T74, Y92, R94 и N95 замещен/замещены аланином; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
36. Антитело по любому из пп. 1-20 и 33-35, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с 5T4 так, что происходит потеря связывания или связывание уменьшается, если любой один или несколько аминокислотных остатков: L89, F111, L117, F138, L144, D148, N152 замещен/замещены аланином; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
37. Антитело по любому из пп. 1-20 и 33-36, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с 5T4 таким образом, что происходит потеря связывания или связывание уменьшается, если любой один или несколько аминокислотных остатков R73, Y92, R94, F111., F138, L144 и D148 замещен/замещены аланином; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
38. Антитело по любому из пп. 1-20 и 33-36, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с 5T4 таким образом, что происходит потеря связывания или связывание уменьшается, если любой один или несколько аминокислотных остатков S69, R73, Y92, R94, F111, F138 и D148 замещен/замещены аланином; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
39. Антитело по любому из пп. 1-20 и 33-36, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с 5T4 таким образом, что происходит потеря связывания или связывание уменьшается, если любой один или несколько аминокислотных остатков R73, T74, Y92, R94, N95 и F138 замещен/замещены аланином; нумерация каждого аминокислотного остатка приводится относительно его положения в SEQ ID NO: 1.
40. Антитело по любому из пп. 33-39, отличающееся тем, что эффект замены аланина определяют путем аланинового сканирования полипептида, содержащего аминокислотные остатки 32-355 SEQ ID NO: 1.
41. Антитело по любому из пп. 33-39, отличающееся тем, что эффект замены аланина определяется с помощью процедуры, изложенной или по существу такой, как изложено в примере 16 в данном документе.
42. Антитело по любому из пп. 33-39, отличающееся тем, что потерю связывания определяют как Z-балл связывания ниже 1,5; Z-балл, необязательно, рассчитывается, как изложено или по существу как указано в Примере 16 в данном документе.
43. Антитело по п. 42, отличающееся тем, что эффект замены аланина определяют с помощью процедуры, включающей стадии:
i) экспрессия мутантных полипептидов 5T4 человека, в которых все аминокислотные остатки во внеклеточном домене 5T4 человека (соответствующие аминокислотным остаткам 32-355 SEQ ID NO: 1), за исключением цистеинов и аланинов, индивидуально замещены аланином, и полипептидов 5T4 дикого типа индивидуально в эмбриональных клетках почки человека, например, клетках HEK 293, так что для каждого мутанта или 5T4 дикого типа предоставляется образец, содержащий 70-90 000 клеток, например, 80 000 клеток;
ii) инкубация клеток в каждом образце с 20 мкл указанного антитела, конъюгированного с антителом, конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) (3 мкг/мл; в буфере FACS) в течение 40 минут при комнатной температуре, с последующей промывкой каждого образца дважды в 150-180 мкл Буфер FACS (фосфатно-солевой буферный раствор + 0,1% мас./об.% BSA + 0,02 мас./об.% азида натрия) и ресуспендирование клеток в каждом образце в 30 мкл буфера FACS;
iii) определение для каждого образца среднего количества связанного антитела на клетку, как среднего геометрического интенсивности флуоресценции (gMFI) для жизнеспособной популяции единичных клеток в указанном образце и нормализации данных для каждого тестируемого антитела против интенсивности связывания неперекрестно-блокирующего 5T4-специфического контрольного антитела с использованием уравнения
,
где «положение аа» относится к положению, в котором произошла мутация на аланин,
где Z-балл рассчитывается для выражения потери или усиления связывания антитела в соответствии с расчетом
,
где μ и σ - среднее и стандартное отклонение, соответственно, нормализованного gMFI, рассчитанного для всех мутантов,
где данные исключаются из анализа, если gMFI контрольного антитела для конкретного мутанта 5T4 ниже, чем среднее gMFIControl Ab - 2,5 x SD среднего gMFIControl Ab (от всех мутантов); и необязательно
где данные исключаются из анализа, если остаток связывается с Z-баллом чуть ниже -1,5 (например, между -1,5 и -1,8, например, между -1,5 и -1,7 или например, между -1,5 и -1,6) и прогнозируется, что этот остаток будет погружен и пространственно отделен от большинства остатков, которые, как предполагается, будут экспонироваться на поверхности и для которых определяется потеря связывания или снижение связывания.
44. Антитело по п. 43, отличающееся тем, что неперекрестное блокирующее 5T4-специфическое контрольное антитело на стадии iii) представляет собой биспецифическое антитело, включающее антигенсвязывающую область, которая содержит последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 83, и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 84 [A1]; и антигенсвязывающую область, которая содержит последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 97, и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 98 [B12].
45. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело обладает пониженной способностью к интернализации, о чем свидетельствует пониженная цитотоксичность при конъюгировании с цитотоксическим фрагментом по сравнению с антителом, включающим вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID. NO: 87 и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность, указанную в SEQ ID NO: 88 [H8].
46. Антитело по п. 45, отличающееся тем, что цитотоксичность определяют с использованием процедуры, изложенной в примере 7, например, процедуры, включающей стадии:
i) обеспечение моновалентного антитела, содержащего первое плечо Fab антитела, как определено в любом из предшествующих пп., и второе плечо Fab, которое способно связываться с gp120, вирусным белком HIV (HIV-1 gp120) и конъюгировано с дуостатином-3;
ii) Контакта клеток рака молочной железы MDA-MB-468 (клон ATCC HTB-132) или HCC1954 (клон ATCC CRL-1338) с указанным моновалентным антителом в течение 5 дней при 37°C; и
iii) определения жизнеспособности клеток.
47. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, состоящей из
a) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 6, 7 и 8 [059];
b) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 13, 14 и 15 [076];
c) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 20, 21 и 22 [085];
d) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 27, 28 и 29 [106];
e) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 34, 35 и 36 [127];
f) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 41, 42 и 43 [207];
g) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 48, 49 и 50 [226]; и
h) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем указанные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 содержат в общей сложности не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или большинство 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3, определенными в любом из пунктов от а) до g).
48. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, состоящей из
a) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 6, 7 и 8 [059];
b) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 41, 42 и 43 [207];
c) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 48, 49 и 50 [226]; и
d) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем указанные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 содержат в общей сложности не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или большинство 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3, определенными в любом из пунктов от а) до с).
49. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 6, 7 и 8. [059].
50. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, состоящей из: вариабельной области тяжелой цепи (VH), содержащей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 41, 42 и 43 [207].
51. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, состоящей из: вариабельной области тяжелой цепи (VH), содержащей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 48, 49 и 50 [226].
52. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), выбранные из группы, включающей
a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 10, AAS и SEQ ID NO: 11, соответственно [059];
b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 13, 14 и 15, соответственно; и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 17, DAS и SEQ ID NO: 18, соответственно [076];
c) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 20, 21 и 22, соответственно; и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 24, DAS и SEQ ID NO: 25, соответственно [085];
d) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 27, 28 и 29, соответственно; и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 31, DVS и SEQ ID NO: 32, соответственно [106];
e) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 34, 35 и 36, соответственно; и вариабельной области легкой цепи (VL), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 38, DAS и SEQ ID NO: 39, соответственно [127];
f) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 41, 42 и 43, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 45, DAS и SEQ ID NO: 46, соответственно [207];
g) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 48, 49 и 50, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 52, DAS и SEQ ID NO: 53, соответственно [226]; и
h) область вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL), каждая область содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем указанные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 содержат в общей сложности не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или самое большее 10 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3, определенными в любом из пунктов от а) до g).
53. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что шесть определяющих комплементарность областей (CDR) антигенсвязывающей области (областей), способных связываться с 5T4, содержат в целом не более 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или самое большее 10 аминокислотных замен по сравнению с
iv) последовательностями CDR SEQ ID NO: 6, 7, 8, 10, AAS и SEQ ID NO: 11 [059];
v) последовательностями CDR SEQ ID NO: 41, 42, 43, 45, DAS и SEQ ID NO: 46 [207]; или
vi) последовательностями CDR SEQ ID NO: 48, 49, 50, 52, DAS и SEQ ID NO: 53 [226].
54. Антитело по любому из пп. 22-29, отличающееся тем, что 1, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 из указанных аминокислотных замен является/являются консервативными аминокислотными заменами.
55. Антитело по любому из предшествующих пунктов, в котором антитело содержит одну или две вариабельные области тяжелой цепи, в которых определяющая комплементарность область 3 (CDR3) содержит шесть последовательных аминокислотных остатков последовательности, представленной в SEQ ID NO: 102 (YYGMDV) [059, 207, 226].
56. Антитело по п. 55, отличающееся тем, что указанные шесть последовательных аминокислотных остатков представляют собой наибольшее количество С-концевых аминокислотных остатков в CDR3.
57. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает одну или две вариабельные области (VH) тяжелой цепи, содержащие последовательность CDR1 SEQ ID NO: 41 (GGSFSGYY), последовательность CDR2 SEQ ID NO: 103 (IDHSX1ST) и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 104 (AX2WFGELX3X4YYYGMDV) и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность CDR1 SEQ ID NO: 105 (QSVSSX5), последовательность CDR2 DAS и последовательность CDR3 SEQ ID NO: 46 (QQRSNWPLT), и где X1 представляет собой G или E, X2 представляет собой A или G, X3 представляет собой W или Y, X4 представляет собой D или H и X5 представляет собой Y или F [207, 226].
58. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 6, 7, и 8, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 10, AAS и SEQ ID NO: 11, соответственно [059].
59. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 41, 42 и 43, соответственно, и вариабельной области легкой цепи (VL), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 45, DAS и SEQ ID NO: 46, соответственно [207].
60. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 48, 49 и 50, соответственно, и вариабельной области легкой цепи (VL), включающей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 52, DAS и 53, соответственно [226].
61. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), выбранную из группы, состоящей из
a) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 5 [059];
b) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 12 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 12 [076];
c) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 19 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 19 [085];
d) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 26 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 26 [106];
e) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 33 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 33 [127];
f) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 40 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 40 [207]; и
g) вариабельной области тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 47 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 47 [226].
62. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, при, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 5 [059].
63. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 40 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, при, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 40 [207].
64. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 47 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, при, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 47 [226].
65. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), выбранные из группы, включающей
a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающей последовательность SEQ ID NO: 9 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 9 [059];
b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 12 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающей последовательность SEQ ID NO: 16 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 16 [076];
c) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 19 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающей последовательность SEQ ID NO: 23 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 23 [085];
d) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 26 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающей последовательность SEQ ID NO: 30 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 30 [106];
e) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 33 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 33, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающей последовательность SEQ ID NO: 37 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 37 [127];
f) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 40 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающей последовательность SEQ ID NO: 44 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 44 [207];
g) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающей последовательность SEQ ID NO: 47 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающей последовательность SEQ ID NO: 51 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 51 [226].
66. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), выбранные из группы, включающей
a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 [059];
b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 12, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 [076];
c) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 19, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность SEQ ID NO: 23 [085];
d) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность SEQ ID NO: 30 [106];
e) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 33, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность SEQ ID NO: 37 [127];
f) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 40, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность SEQ ID NO: 44 [207]; и
g) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 47, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательность SEQ ID NO: 51 [226].
67. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой полноразмерное антитело, такое как полноразмерное антитело IgG1.
68. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое представляет собой моновалентное антитело.
69. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое представляет собой бивалентное антитело.
70. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является моноспецифическим антителом.
71. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является биспецифическим антителом.
72. Антитело по любому из предшествующих пунктов, содержащее антигенсвязывающую область антитела, которое связывается с CD3, например, CD3ε человека (эпсилон), например, CD3ε человека (эпсилон), как указано в SEQ ID NO: 4.
73. Антитело по п. 72, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, которая связывается с CD3, включает
вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 54, 55 и 56, соответственно; [анти-CD3 дикого типа (SP34/гуманизированный SP34, WO2015001085 (Genmab)) - последовательности VH CDR];
и, необязательно вариабельную область легкой цепи (VL), включающую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 58, GTN и 59, соответственно [анти-CD3 дикого типа, последовательности CDR VL].
74. Антитело по п. 72 или 73, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, которая связывается с CD3, включает
вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую последовательность SEQ ID NO: 57, или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 57 [полноразмерная последовательность анти-CD3 - VH дикого типа];
и, необязательно вариабельную область легкой цепи (VL), включающую последовательность SEQ ID NO: 60 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 60, [полноразмерная последовательность анти-CD3 - VL дикого типа].
75. Антитело по любому из пп. 72-74, отличающееся тем, что указанное антитело имеет более низкую аффинность связывания CD3ε человека, чем антитело, имеющее антигенсвязывающую область, содержащую последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 57, и последовательность VL, как приведена в SEQ ID NO: 60 [последовательности VH и VL анти-CD3 дикого типа (гуманизированные SP34, WO2015001085 (Genmab))], предпочтительно, где указанная аффинность, по меньшей мере, в 5 раз ниже, например, по меньшей мере, в 10 раз ниже, например, по меньшей мере, в 20 раз ниже, по меньшей мере, в 30 раз ниже, по меньшей мере, в 40 раз ниже, по меньшей мере, в 45 раз ниже или, например, по меньшей мере, в 50 раз ниже.
76. Антитело по любому из пп. 72-74, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, которая связывается с CD3, с константой равновесной диссоциации KD в диапазоне 200-1000 нМ, например, в диапазоне 300-1000 нМ, в диапазоне 400-1000 нМ, в диапазоне 500-1000 нМ, в диапазоне 300-900 нМ, в диапазоне 400-900 нМ, в диапазоне 400 700 нМ, в диапазоне 500-900 нМ, в диапазоне 500-800 нМ, в диапазоне 500-700 нМ, в диапазоне 600-1000 нМ, в диапазоне 600-900 нМ, в диапазоне 600-800 нМ или в пределах диапазон 600-700 нМ.
77. Антитело по п. 72 или 75, отличающееся тем, что указанная антигенсвязывающая область, которая связывается с CD3, с константой равновесной диссоциации KD в диапазоне 1-100 нМ, например, в диапазоне 5-100 нМ, в диапазоне 10-100 нМ, в диапазоне от 1 до 80 нМ, в диапазоне от 1 до 60 нМ, в диапазоне от 1 до 40 нМ, в диапазоне от 1 до 20 нМ, в диапазоне от 5 до 80 нМ, в диапазоне от 5 до 60 нМ, в диапазоне от 5 до 40 нМ, в диапазоне от 5 до 20 нМ, в диапазоне от 10 до 80 нМ, в диапазоне от 10 до 60 нМ, в диапазоне от 10 до 40 нМ или в диапазоне от 10 до 20 нМ.
78. Антитело по любому из пп. 72-77, отличающееся тем, что
область связывания антигена, которая связывается с CD3, включает область вариабельной области тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность CDR1, последовательность CDR2 и последовательность CDR3;
вариабельная область тяжелой цепи (VH) по сравнению с областью вариабельной области тяжелой цепи (VH), содержащей последовательность, указанную в SEQ ID NO: 57, имеет аминокислотную замену в одной из последовательностей CDR, причем замена находится в положении выбранные из группы, состоящей из: T31, N57, H101, G105, S110 и Y114, положения пронумерованы в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 57 [VH_huCD3-H1L1]; и
вариабельная область легкой цепи (VL) дикого типа содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, указанные в SEQ ID NO: 58, GTN и SEQ ID NO: 59, соответственно.
79. Антитело по п. 72, отличающееся тем, что CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) антигенсвязывающей области, которая связывается с CD3, содержат в общей сложности не более 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен по сравнению с CDR1, CDR2 и CDR3 последовательности, указанной в SEQ ID NO: 57.
80. Антитело по п. 72 или 73, отличающееся тем, что аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) антигенсвязывающей области, которая связывается с CD3, имеют идентичность последовательностей, по меньшей мере, на 95%, например, по меньшей мере, 96% идентичности последовательностей, по меньшей мере, 97% идентичности последовательностей, по меньшей мере, 98% идентичности последовательностей или, по меньшей мере, 99% идентичности последовательностей с аминокислотными последовательностями CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) дикого типа, где идентичность последовательностей вычисляется на основе выравнивания аминокислотной последовательности, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) антигенсвязывающей области, которая связывается с CD, с аминокислотной последовательностью, содержащей последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области тяжелой цепи (VH) дикого типа.
81. Антитело по пп. 72-74, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, которая связывается с CD3, содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из T31M, T31P, N57E, H101G, H101N, G105P, S110A, S110G, Y114M, Y114R, Y114V.
82. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что когда указанное антитело представляет собой биспецифическое антитело, которое лишено или имеет пониженную Fc-опосредованную эффекторную функцию («инертное» антитело), и включает антигенсвязывающую область антитела, которое связывает к CD3, и антитело:
a) способно опосредовать зависящую от концентрации цитотоксичность клеток SK-OV-3 при использовании очищенных PBMC или Т-клеток в качестве эффекторных клеток, например, при анализе, как описано в Примере 14 в данном документе;
b) способно опосредовать зависящую от концентрации цитотоксичность клеток MDA-MB-231 при использовании очищенных Т-клеток в качестве эффекторных клеток, например, при анализе, как описано в Примере 13 в данном документе;
c) способно активировать Т-клетки in vitro в присутствии опухолевых клеток MDA-MB-231; например, при анализе, как описано в Примере 13 в данном документе;
d) способно активировать Т-клетки in vitro в присутствии опухолевых клеток BxPC-3, PANC-1, Ca Ski и/или SiHa; например, при анализе, как описано в Примере 17 в данном документе;
e) способно вызывать цитотоксичность опухолевых клеток BxPC-3, PANC-1, Ca Ski и/или SiHa при использовании очищенных Т-клеток в качестве эффекторных клеток, например, при анализе, как описано в примере 17 в данном документе; и/или
scid
tm1Wjl
f) демонстрирует противоопухолевую активность, такую как замедленное разрастание опухоли, в модели мышиного ксенотрансплантата с восстановлением гуманизированных иммунных гемопоэтических стволовых клеток, такой как NOD.Cg-Prkdc Il2rg/SzJ, инокулированная опухолевыми клетками человека MDA-MB-231; например, при определении, как описано в примере 15.
83. Антитело по п. 82, отличающееся тем, что способность антитела опосредовать зависящую от концентрации цитотоксичность клеток SK-OV-3 определяют в анализе цитотоксичности in vitro, включающем стадии:
i) выделение мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) или Т-клеток из лейкоцитов здоровых доноров;
ii) предоставление первого набора образцов, где каждый образец содержит PBMC и клетки аденокарциномы яичника человека SK-OV-3, и где отношения PBMC: клетки SK-OV-3 в указанных образцах составляют 1: 2, 1: 1, 2: 1, 4: 1, 8: 1 и 12: 1; и
второго набора образцов, где каждый образец содержит Т-клетки и клетки аденокарциномы яичника человека SK-OV-3, и где соотношения Т-клетки: клетки SK-OV-3 в указанных образцах составляют 1: 2, 1: 1, 2: 1, 4: 1 и 8: 1;
iii) добавление антитела к каждому набору образцов в концентрациях от 0,0128 нг/мл до 1000 нг/мл и инкубация образцов в течение 72 ч при 37 °C; и затем
iv) оценку жизнеспособности клеток SK-OV-3 с использованием резазурина (7-гидрокси-3H-феноксазин-3-он 10-оксид).
84. Антитело по п. 82, отличающееся тем, что способность активировать Т-клетки in vitro в присутствии опухолевых клеток MDA-MB-231 определяют с помощью анализа, включающего стадии:
i) выделение Т-клеток из лейкоцитов здоровых доноров человека;
ii) предоставления набора образцов, каждый из которых содержит Т-клетки и клетки аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231, и где соотношение Т-клетки: клетки MDA-MB-231 в указанных образцах составляет 8:1;
iii) добавление антитела к набору образцов в концентрациях от 0,0128 нг/мл до 1000 нг/мл и инкубация образцов в течение 72 ч при 37 °C;
iv) окрашивание Т-клеток флуоресцентно меченными антителами против маркеров активации Т-клеток, таких как антитела CD69-APC, CD25-PE-Cy7 и CD279/PD1-BV604, путем инкубации с указанными антителами в течение 30 мин при 4°C; и
v) анализ образцов методом проточной цитометрии.
85. Антитело по п. 82, отличающееся тем, что активацию Т-клеток in vitro в присутствии опухолевых клеток BxPC-3, PANC-1, Ca Ski и/или SiHa определяют с помощью процедуры, включающей стадии:
i) предоставление Т-клеток, выделенных из лейкоцитов здоровых доноров человека;
ii) предоставления набора образцов, где каждый образец содержит указанные Т-клетки и опухолевые клетки BxPC-3, PANC-1, Ca Ski или SiHa, и где соотношение Т-клетки: опухолевые клетки в указанных образцах составляет 4: 1;
iii) добавление антитела к набору образцов в концентрациях от 0,0128 нг/мл до 5000 нг/мл (например, 5-кратные разведения) и инкубация образцов в течение 72 ч при 37°C;
iv) сбор из каждого образца 110 мкл надосадочной жидкости, содержащего Т-клетки, и окрашивание Т-клеток флуоресцентно меченными антителами против Т-клеточных маркеров, таких как CD3-eFluor450, CD4-APC-eFluor780, DC8-AF700, и антителами против маркеров Т-клеток, такие как антитела 69-APC, CD25-PE-Cy7 и CD279/PD1-BV604, путем инкубации с указанными антителами в течение 30 минут при 4°C; и
v) анализ образцов методом проточной цитометрии.
86. Антитело по п. 82, отличающееся тем, что способность индуцировать цитотоксичность опухолевых клеток BxPC-3, PANC-1, Ca Ski и/или SiHa определяют с помощью процедуры, включающей стадии:
i) предоставление Т-клеток, выделенных из лейкоцитов здоровых доноров человека;
ii) предоставление набора тестовых образцов и контрольных образцов, каждый из которых содержит указанные Т-клетки и опухолевые клетки BxPC-3, PANC-1, Ca Ski или SiHa, которым дали прикрепиться к дну 96-луночного культурального планшета и где соотношение Т-клетки: опухолевые клетки в указанных образцах составляет 4: 1;
iii) добавление антитела к набору тестируемых образцов в концентрациях от 0,0128 нг/мл до 5000 нг/мл (например, 5-кратные разведения), в то время как контрольные образцы остаются необработанными или инкубируются с 5 мкМ стауроспорином, и инкубации всех образцов в течение 72 ч при 37°C;
iv) инкубация прикрепленных клеток в 10 мас./мас.% 7-гидрокси-3H-феноксазин-3-он 10-оксиде (резазурин) в среде RPMI-1640 с добавлением 10мас./мас.% донорской бычьей сыворотки с железом и пенициллином/стрептомицином при 37°C в течение 4 ч;
v) измерение оптической плотности клеток; принятия поглощения клеток, инкубированных со стауроспорином, за 0% жизнеспособности, а необработанных клеток за 100% жизнеспособности и расчета процента жизнеспособных клеток как
87. Антитело по любому из пп. 72 и 78-84, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3, включает
a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 61, 55 и 56 [VH CDR1-T31P + VH CDR 2,3] дикого типа, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа]; или
b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 63, 55 и 56 [VH CDR1-T31M + VH CDR 2,3], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно; или
c) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 65 и 56 [VH CDR-N57E + VH CDR 1,3 дикого типа], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно; или
d) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 67 [CDR 1,2 VH дикого типа + VH CDR3-H101G], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно;
e) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 69 [CDR 1, 2 VH дикого типа + VH CDR3-H101N], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно;
f) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 71 [CDR 1,2 VH дикого типа + VH CDR3-G105P], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно;
g) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 73 [CDR 1, 2 VH дикого типа + VH CDR3-S110A], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно; или
h) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 75 [CDR 1,2 VH дикого типа + VH CDR3-S110G], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно;
i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 77 [CDR 1,2 VH дикого типа + VH CDR3-Y114V], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно; или
j) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 79 [CDR 1,2 VH дикого типа + VH CDR3-Y114M], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно; или
k) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 81 [CDR 1,2 VH дикого типа + VH CDR3-Y114R], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно.
88. Антитело по любому из пп. 72 и 78-85, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID. NO: 54, 55 и 67 [CDR 1,2 VH дикого типа + VH CDR3-H101G], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1, 2, 3 VL дикого типа], соответственно.
89. Антитело по любому из пп. 72 и 78-85, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 6, 7 и 8, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL) содержащие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 10, AAS и SEQ ID NO: 11, соответственно [059]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 67 [CDR 1, 2 VH дикого типа + VH CDR3-H101G], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно.
90. Антитело по любому из пп. 72 и 78-85, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 41, 42 и 43, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 45, DAS и 46, соответственно [207]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 67 [CDR 1, 2 VH дикого типа + VH CDR3-H101G], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно.
91. Антитело по любому из пп. 47 и 51-59, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 48, 49 и 50, соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 из SEQ ID NO: 52, DAS и 53, соответственно [226]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 54, 55 и 67 [CDR 1, 2 VH дикого типа + VH CDR3-H101G], соответственно, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 58, последовательность GTN и последовательность, указанную в SEQ ID NO: 59, соответственно [CDR 1,2,3 VL дикого типа], соответственно.
92. Антитело по любому из пп. 72 и 78-91, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3 человека, включает последовательность VH и последовательность VL, выбранные из группы, состоящей из
a) последовательности VH, указанной в SEQ ID NO: 62 [полноразмерная последовательность VH T31P], и последовательности VL, указанной в SEQ ID NO: 60 [полноразмерная последовательность дикого типа];
b) последовательности VH, указанной в SEQ ID NO: 64 [полноразмерная последовательность VH T31M], и последовательности VL, указанная в SEQ ID NO: 60;
c) последовательности VH, указанная в SEQ ID NO: 66 [полноразмерная последовательность VH N57E], и последовательности VL, указанная в SEQ ID NO: 60;
d) последовательности VH, указанная в SEQ ID NO: 68 [полноразмерная последовательность VH H101G], и последовательности VL, указанная в SEQ ID NO: 60;
e) последовательности VH, указанная в SEQ ID NO: 70 [полноразмерная последовательность VH H101N], и последовательности VL, указанная в SEQ ID NO: 60;
f) последовательности VH, указанной в SEQ ID NO: 72 [полноразмерная последовательность VH G105P], и последовательности VL, указанной в SEQ ID NO: 60;
g) последовательности VH, указанная в SEQ ID NO: 74 [полноразмерная последовательность VH S110A], и последовательности VL, указанная в SEQ ID NO: 60;
h) последовательности VH, указанная в SEQ ID NO: 76 [полноразмерная последовательность VH S110G], и последовательности VL, указанная в SEQ ID NO: 60;
i) последовательности VH, указанной в SEQ ID NO: 78 [полноразмерная последовательность VH Y114V], и последовательности VL, указанной в SEQ ID NO: 60;
j) последовательности VH, указанная в SEQ ID NO: 80 [полноразмерная последовательность VH Y114M], и последовательности VL, указанная в SEQ ID NO: 60; и
k) последовательности VH, указанная в SEQ ID NO: 82 [полноразмерная последовательность VH Y114R], и последовательности VL, указанная в SEQ ID NO: 60.
93. Антитело по любому из пп. 72 и 78-92, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3 человека, содержит последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 68 [полноразмерная последовательность VH H101G], и последовательность VL. как указано в SEQ ID NO: 60.
94. Антитело по любому из пп. 78-93, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 5 [059 - полноразмерная последовательность VH]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3 человека, включает последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 68 [полноразмерная последовательность VH H101G], и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 60.
95. Антитело по любому из пп. 72 и 78-93, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 40 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 40 [207 - полноразмерная последовательность VH]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3 человека, включает последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 68 [полноразмерная последовательность VH H101G], и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 60.
96. Антитело по любому из пп. 47 и 51-64, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 47 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 47 [226 - полноразмерная последовательность VH]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3 человека, включает последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 68 [полноразмерная последовательность VH H101G], и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 60.
97. Антитело по любому из пп. 72 и 78-94, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 5 и легкой области тяжелой цепи (VL), содержащей последовательность SEQ ID NO: 9 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% аминокислотной последовательности идентичности последовательности SEQ ID NO: 9 [059]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3 человека, включает последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 68 [полноразмерная последовательность VH H101G], и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 60.
98. Антитело по любому из пп. 72, 78-93 и 95, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 40 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 40, и легкой области тяжелой цепи (VL), содержащей последовательность SEQ ID NO: 44 или последовательность, имеющую не менее 90%, не менее 95%, не менее 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 44 [207 - полноразмерные последовательности VH + VL]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3 человека, включает последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 68 [полноразмерная последовательность VH H101G], и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 60.
99. Антитело по любому из пп. 72, 78-93 и 96, отличающееся тем, что антигенсвязывающая область, способная связываться с 5T4, включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую последовательность SEQ ID NO: 47 или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 47, и легкой области тяжелой цепи (VL), содержащей последовательность SEQ ID NO: 51 или последовательность, имеющую не менее 90%, не менее 95%, не менее 97% или, по меньшей мере, 99% идентичности по аминокислотной последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 51 [226 - полноразмерные последовательности VH + VL]; и антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3 человека, включает последовательность VH, указанную в SEQ ID NO: 68 [полноразмерная последовательность VH H101G], и последовательность VL, указанную в SEQ ID NO: 60.
100. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что каждая антигенсвязывающая область включает вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), и каждая из указанных вариабельных областей содержит три последовательности CDR, CDR1, CDR2. и CDR3, соответственно, и четыре каркасные последовательности, FR1, FR2, FR3 и FR4, соответственно.
101. Антитело по п. 100, отличающееся тем, что антитело включает две константные области тяжелой цепи (СН) и две константные области легкой цепи (CL).
102. Антитело по п. 100 или 101, отличающееся тем, что указанное антитело включает первую и вторую тяжелую цепь, каждая из указанных первой и второй тяжелых цепей включает, по меньшей мере, шарнирную область, область CH2 и CH3, причем в указанной первой тяжелой цепи, по меньшей мере, заменена одна из аминокислот в положениях, соответствующих положениям, выбранным из группы, состоящей из T366, L368, K370, D399, F405, Y407 и K409 в тяжелой цепи IgG1 человека, и в указанной второй тяжелой цепи, по меньшей мере, одна из аминокислот в положениях, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из T366, L368, K370, D399, F405, Y407 и K409 в тяжелой цепи IgG1 человека, были заменены, причем указанные замены указанной первой и указанной второй тяжелой цепи цепи находятся в разных положениях, и положения аминокислот пронумерованы согласно нумерации EU.
103. Антитело по любому из пп. 100-102, отличающееся тем, что аминокислота в положении, соответствующем K409 в тяжелой цепи IgG1 человека, представляет собой R в указанной первой тяжелой цепи, а аминокислота в положении, соответствующем F405 в тяжелой цепи IgG человека представляет собой L в указанной второй тяжелой цепи, или наоборот.
104. Антитело по любому из предшествующих пунктов., отличающееся тем, что антитело содержит первую и вторую тяжелую цепь, и где как в первой, так и во второй тяжелой цепи аминокислотные остатки в положениях, соответствующих положениям L234 и L235 в тяжелая цепь IgG1 человека согласно нумерации EU представляет собой F и E, соответственно.
105. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что антитело содержит первую и вторую тяжелую цепь, и где как в первой, так и во второй тяжелой цепи аминокислотный остаток в положении, соответствующем положению D265 в тяжелой цепи IgG1 человека согласно нумерации EU, представляет собой A.
106. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что a) антигенсвязывающая(ие) область(и), способная связываться с 5T4, является гуманизированной; и/или b) антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3, если присутствует, гуманизирована.
107. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что
a) антигенсвязывающая(ие) область(и), способная связываться с 5T4, является/являются человеческими; и/или
b) антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3, если присутствует, является человеческой.
108. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что
a) антигенсвязывающая(ие) область(и), способная связываться с 5T4, является/являются химерными; и/или
b) антигенсвязывающая область, способная связываться с CD3, если присутствует, является химерной.
109. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело содержит первую и, необязательно, вторую тяжелую цепь, и где первая тяжелая цепь и вторая тяжелая цепь, если она присутствует, модифицированы/модифицированы таким образом, что антитело индуцирует Fc-опосредованную эффекторную функцию в меньшей степени по сравнению с идентичным немодифицированным антителом.
110. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело содержит легкую цепь каппа (κ).
111. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело содержит легкую цепь лямбда (λ).
112. Антитело по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное антитело содержит легкую цепь лямбда (λ) и легкую цепь каппа (κ); например, антитело с тяжелой цепью и легкой лямбда-цепью, которые содержат связывающую область, способную связываться с CD3, и тяжелую цепь и легкую каппа-цепь, которые содержат связывающую область, способную связываться с 5T4.
113. Иммуноконъюгат или конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), содержащий антитело по любому из предшествующих пунктов и терапевтическую составляющую, такую как цитотоксический агент, химиотерапевтическое лекарственное средство, цитокин, иммунодепрессант, антибиотик или радиоизотоп.
114. Нуклеотидная конструкция, содержащая a) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с 5T4, как определено в любом из пп. 1-113; и/или b) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность легкой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с 5T4, как определено в любом из пп. 72-113.
115. Нуклеотидная конструкция по п. 114, дополнительно включающая a) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с CD3, как определено в любом из пп. 72-113; и/или b) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность легкой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с CD3, как определено в любом из пп. 72-113.
116. Экспрессирующий вектор, включающий a) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с 5T4, как определено в любом из пп. 1-112, и/или b) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность легкой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с 5T4, как определено в любом из пп. 1-112.
117. Экспрессирующий вектор по п. 116, дополнительно включающий a) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с CD3, как определено в любом из пп. 72-112; и/или b) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность легкой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с CD3, как определено в любом из пп. 72-112.
118. Клетка, содержащая нуклеотидную конструкцию, как определено в любом из пп. 114-115, или экспрессирующий вектор, как определено в пп. 116 или 117, такая как клетка, которая была получена путем трансфекции клетки-хозяина указанной нуклеотидной конструкцией или экспрессирующим вектором, такая как рекомбинантная клетка-хозяин.
119. Клетка по п. 118, отличающаяся тем, что указанная клетка-хозяин имеет человеческое происхождение, например, клетка эмбриональной почки человека (HEK), такая как клетка HEK/Expi, или имеет происхождение от грызунов, например, клетка яичника китайского хомячка, например, клетка CHO/N50.
120. Композиция, содержащая антитело по любому из пп. 1-112.
121. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, как определено в любом из пп. 1-112, и фармацевтически приемлемый носитель.
122. Антитело по любому из пп. 1-112 для применения в качестве лекарственного средства.
123. Антитело по любому из пп. 1-112, предназначенное для лечения заболевания.
124. Антитело для применения по п. 122 или 123, отличающееся тем, что заболевание представляет собой онкологическое заболевание.
125. Антитело для применения по п. 124, отличающееся тем, что онкологическое заболевание характеризуется экспрессией 5T4, по меньшей мере, в некоторых опухолевых клетках.
126. Антитело для применения по любому из пп. 122-125, отличающееся тем, что онкологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из рака почки/почек, рака молочной железы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака матки/эндометрия/шейки матки, рака легкого, рака желудочно-кишечного тракта, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака головы и шеи, лимфомы, острого миелоидного лейкоза.
127. Способ лечения заболевания, включающий введение антитела, определенного в любом из пп. 1-112, композиции по п.120 или фармацевтической композиции по п.121 нуждающемуся в этом объекту.
128. Способ по п. 127, при этом указанный способ предназначен для лечения онкологического заболевания.
129. Способ по п. 128, отличающийся тем, что онкологическое заболевание выбрано из группы, состоящей из рака почки/почек, рака молочной железы, колоректального рака, рака предстательной железы, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака матки/эндометрия/шейки матки, рака легкого, рака желудочно-кишечного тракта, рака желудка, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака головы и шеи, лимфомы, острого миелоидного лейкоза.
130. Способ получения антитела по любому из пп. 1-112, включающий стадии: a) культивирования клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, как определено в п. 114 или 117; и b) и очистки указанного антитела из культуральной среды.
131. Способ получения антитела по любому из пп. 1-112, включающий стадии:
a) обеспечение антитела, способного связываться с 5T4, путем культивирования клетки-хозяина, содержащей экспрессирующий вектор, как определено в п. 116 или 117, в условиях, позволяющих экспрессию антитела, способного связываться с 5T4, и очистки антитела, способного связываться с 5T4, из культуральной среды;
b) обеспечение антитела, способного связываться с CD3, путем культивирования клетки-хозяина, включающей экспрессирующий вектор, содержащий
I) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность тяжелой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с CD3, как определено в любом из пп. 72-112; и
II) нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность легкой цепи антитела, включающую антигенсвязывающую область, способную связываться с CD3, как определено в любом из пп. 72-112;
в условиях, позволяющих экспрессию антитела, способного связываться с CD3, и очистки антитела, способного связываться с CD3, из культуральной среды;
c) инкубирование указанного антитела, способного связываться с 5T4, вместе с указанным антителом, способным связываться с CD3, в восстанавливающих условиях, достаточных для того, чтобы позволить цистеинам в шарнирной области подвергнуться изомеризации дисульфидной связи, и
d) получение указанного антитела.
132. Набор, такой как набор для применения в качестве сопутствующей диагностики/для выявления среди группы пациентов тех пациентов, которые имеют склонность к ответу на лечение антителом, определенное в любом из пп. 1-112, или иммуноконъюгатом или конъюгатом антитело-лекарственное средство (ADC), как определено в п. 113, или для прогнозирования эффективности указанного антитела, или иммуноконъюгата, или ADC, при примененении для лечения пациента, включающий антитело, определенное в любом из пп. 1-112; и инструкции по применению указанного набора.
133. Антиидиотипическое антитело, которое связывается с антигенсвязывающей областью, способной связываться с 5T4, определенное в любом из пп. 1-112.