КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА Т-КЛЕТОК

1. Фармацевтическая композиция, содержащая: (a) популяцию иммунных клеток из биологического образца, содержащую по меньшей мере одну стимулированную антигенпрезентирующими клетками (APC) T-клетку, содержащую T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, где:
(i) количество иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в популяции пропорционально меньше количества иммунных клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце; или
(ii) APC является стимулированной лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) APC; и
(b) фармацевтически приемлемый эксципиент.
2. Фармацевтическая композиция по п.1, где биологический образец получают из человека со злокачественным новообразованием.
D
50
3. Фармацевтическая композиция по п.1 или 2, где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена связывается с белком, кодируемым аллелем HLA, экспрессируемым индивидуумом, с K или IC менее 500 нМ.
4. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-3, где каждая из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена кодируется экспрессируемым геном злокачественных клеток индивидуума и содержит мутацию, отсутствующую в незлокачественных клетках индивидуума.
5. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-4, где одна или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена имеет длину от 8 до 50 природных аминокислот.
6. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-5, где по меньшей мере одна пептидная последовательность антигена содержит по меньшей мере 2 пептидные последовательности антигена.
+
+
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-6, где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8 T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 1% всех CD8 T-клеток в композиции.
+
+
8. Фармацевтическая композиция по п.7, где процентная доля по меньшей мере одной антигенспецифической CD8 T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 5% всех CD8 T-клеток в композиции.
+
6
6
6
7
7
7
8
8
8
+
9. Фармацевтическая композиция по любому из пп.1-8, где количество по меньшей мере одной антигенспецифической CD8 T-клетки в композиции составляет по меньшей мере приблизительно 1×10, 2×10, 5×10, 1×10, 2×10, 5×10, 1×10, 2×10 или 5×10 антигенспецифических CD8 T-клеток.
10. Способ лечения, включающий введение фармацевтической композиции по любому из пп.1-9 индивидууму с заболеванием или нарушением.
11. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.1-9 для производства лекарственного средства для применения в терапии.
12. Способ получения по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки, содержащей T-клеточный рецептор (TCR), специфический в отношении по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена, включающий
(a) инкубацию одного или более препаратов антигенпрезентирующих клеток (APC) с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в течение одного или более отдельных периодов времени;
(b) инкубацию одного или более препаратов APC с популяцией иммунных клеток из биологического образца в течение одного или более отдельных периодов времени, где одна или более APC включают одну или более стимулированных лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) APC; или
(c) инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с популяцией иммунных клеток из биологического образца, где FLT3L инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода времени и где по меньшей мере один пептид инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток, где популяция иммунных клеток содержит по меньшей мере одну T-клетку и по меньшей мере одну APC;
где выращивают по меньшей мере одну антигенспецифическую T-клетку памяти или индуцируют по меньшей мере одну антигенспецифическую наивную T-клетку.
13. Способ по п.12, где способ включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с одним или более препаратами APC в течение одного или более отдельных периодов времени менее 28 дней после инкубации популяции иммунных клеток с первым препаратом APC из одного или более препаратов APC.
14. Способ по п.12 или 13, где способ включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с 3 или менее препаратами APC в течение 3 или менее отдельных периодов времени.
15. Способ по любому из пп.12-14, где по меньшей мере два из одного или более препаратов APC содержат FLT3L-стимулированные APC.
16. Способ по п.15, где по меньшей мере три из одного или более препаратов APC содержат FLT3L-стимулированные APC.
17. Способ по любому из пп.12-16, где инкубация включает инкубацию первого препарата APC из препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7 дней.
18. Способ по любому из пп.12-17, где APC из препаратов APC включает APC, нагруженную одним или более антигенными пептидами, содержащими одну или более из по меньшей мере одной пептидной последовательности антигена.
19. Способ по любому из пп.12-18, где APC из препаратов APC является аутологичной APC или аллогенной APC.
20. Способ по любому из пп.12-19, где APC из препаратов APC включает дендритную клетку (DC).
+
21. Способ по п.20, где DC является CD141 DC.
22. Способ по любому из пп.12-21, где способ включает истощение клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце и, таким образом, получение популяции иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14 и CD25.
23. Способ по любому из пп.12-22, где способ дополнительно включает истощение клеток, экспрессирующих CD19.
24. Способ по любому из пп.12-23, где истощение клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, включает связывание CD14- или CD25-связывающего средства с APC из одного или более препаратов APC.
25. Способ по любому из пп.12-24, где способ дополнительно включает введение индивидууму одной или более из по меньшей мере одной антигенспецифической T-клетки.
26. Способ по любому из пп.12-25, где инкубация включает инкубацию первого препарата APC из одного или более препаратов APC с T-клетками в течение более чем 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 дней.
27. Способ по любому из пп.12-26, где способ включает инкубацию по меньшей мере одного из одного или более препаратов APC с первой средой, содержащей по меньшей мере один цитокин или фактор роста, в течение первого периода времени.
28. Способ по п.27, где способ включает инкубацию по меньшей мере одного из одного или более препаратов APC со второй средой, содержащей один или более цитокинов или факторов роста, в течение третьего периода времени и, таким образом, получение зрелых APC.
29. Способ по п.28, где способ дополнительно включает удаление одного или более цитокинов или факторов роста из второй среды после третьего периода времени.
30. Способ по любому из пп.12-29, где APC из препаратов APC стимулируют одним или более цитокинами или факторами роста.
31. Способ по п.30, где один или более цитокинов или факторов роста включают ГМ-КСФ, ИЛ-4, FLT3L, ФНОα, ИЛ-1β, PGE1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИФНα, R848, LPS, ss-rna40, поли-I:C или их комбинацию.
32. Способ по любому из пп.12-31, где антиген является неоантигеном, опухолеассоциированным антигеном, вирусным антигеном, минорным антигеном гистосовместимости или их комбинацией.
ex vivo
33. Способ по любому из пп.12-32, где способ осуществляют .
34. Способ по любому из пп.12-33, где способ включает инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, с FLT3L в течение первого периода времени.
35. Способ по любому из пп.12-34, где способ включает инкубацию по меньшей мере одного пептида с популяцией иммунных клеток из биологического образца, истощенного в отношении клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом.
36. Способ по любому из пп.12-35, где способ включает инкубацию первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток.
37. Способ по любому из пп.12-36, где способ включает инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с (i) FLT3L-стимулированной APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени, (ii) FLT3L и вторым образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени или (iii) FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток.
38. Способ по любому из пп.12-37, где способ включает инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с (i) FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени, (ii) FLT3L и третьим образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение пятого периода времени или (iii) FLT3L и третьего образца APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток.
39. Способ по любому из пп.12-38, где один или более отдельных периодов времени, 3 или менее отдельных периодов времени, первый период времени, второй период времени, третий период времени, четвертый период времени или пятый период времени составляет по меньшей мере 1 час, по меньшей мере 2 часа, по меньшей мере 3 часа, по меньшей мере 4 часа, по меньшей мере 5 часов, по меньшей мере 6 часов, по меньшей мере 7 часов, по меньшей мере 8 часов, по меньшей мере 9 часов, по меньшей мере 10 часов, по меньшей мере 11 часов, по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере 13 часов, по меньшей мере 14 часов, по меньшей мере 15 часов, по меньшей мере 16 часов, по меньшей мере 17 часов, по меньшей мере 18 часов, по меньшей мере,19 часов, по меньшей мере 20 часов, по меньшей мере 21 час, по меньшей мере 22 часа, по меньшей мере 23 часа, по меньшей мере 24 часа, по меньшей мере 25 часов, по меньшей мере 26 часов, по меньшей мере 27 часов, по меньшей мере 28 часов, по меньшей мере 29 часов, по меньшей мере 30 часов, по меньшей мере 31 час, по меньшей мере 32 часа, по меньшей мере 33 часа, по меньшей мере 34 часа, по меньшей мере 35 часов, по меньшей мере 36 часов, по меньшей мере 37 часов, по меньшей мере 38 часов, по меньшей мере 39 часов или по меньшей мере 40 часов.
40. Способ по любому из пп.12-39, где один или более отдельных периодов времени, 3 или менее отдельных периодов времени, первый период времени, второй период времени, третий период времени, четвертый период времени или пятый период времени составляет от 1 до 4 часов, от 1 до 3 часов, от 1 до 2 часов, от 4 до 40 часов, от 7 до 40 часов, от 4 до 35 часов, от 4 до 32 часов, от 7 до 35 часов или от 7 до 32 часов.
41. Способ по любому из пп.12-40, где популяция иммунных клеток содержит APC или по меньшей мере один из одного или более препаратов APC.
42. Способ по любому из пп.12-41, где популяция иммунных клеток не содержит APC, популяция иммунных клеток не содержит один из одного или более препаратов APC.
43. Способ по любому из пп.12-42, где способ включает инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с популяцией иммунных клеток из биологического образца, где FLT3L инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода времени и где по меньшей мере один пептид инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток, где популяция иммунных клеток содержит по меньшей мере одну T-клетку и по меньшей мере одну APC.
44. Способ по п.43, где способ включает инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с по меньшей мере одной APC, где FLT3L инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение второго периода времени и где по меньшей мере один пептид инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение второго периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом; и инкубацию первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом, с первым образцом стимулированных T-клеток и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток.
45. Способ по п.44, где способ включает инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с по меньшей мере одной APC, где FLT3L инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение третьего периода времени и где по меньшей мере один пептид инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение третьего периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение второго образца зрелых APC, нагруженных пептидом; и инкубацию второго образца зрелых APC, нагруженных пептидом, со вторым образцом стимулированных T-клеток и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток.
46. Способ по любому из пп.12-40, где способ включает введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, или второго, или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.
47. Способ, включающий:
(a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну антигенпрезентирующую клетку (APC), из индивидуума;
+
(b) обогащение клеток, экспрессирующих CD14, из биологического образца и, таким образом, получение обогащенного CD14 клетками образца;
+
(c) инкубацию обогащенного CD14 клетками образца с по меньшей мере одним цитокином или фактором роста в течение первого периода времени;
+
(d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с обогащенным CD14 клетками образцом (c) в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом;
(e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с одним или более цитокинов или факторов роста в течение третьего периода времени и, таким образом, получение образца зрелых APC;
(f) инкубацию APC из образца зрелых APC с CD14- и CD25-истощенным образцом, содержащим T-клетки, в течение четвертого периода времени;
(g) инкубацию T-клеток с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени;
(h) инкубацию T-клеток с APC из образца зрелых APC в течение шестого периода времени; и
(i) введение по меньшей мере одной T-клетки из T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.
48. Способ, включающий:
(a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну T-клетку, из индивидуума;
+
+
(b) истощение клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14 и CD25 клеток;
+
+
(c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14 и CD25 клеток, с FLT3L в течение первого периода времени;
+
+
(d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14 и CD25 клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом;
(e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток;
(f) инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток;
(g) необязательно, инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток;
(h) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.
49. Способ, включающий:
(a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну T-клетку, из индивидуума;
+
+
(b) истощение клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14 и CD25 клеток;
+
+
(c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14 и CD25 клеток, с FLT3L в течение первого периода времени;
+
+
(d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14 и CD25 клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение образца APC, нагруженных пептидом;
(e) инкубацию образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток;
(f) необязательно, инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток;
(g) необязательно, инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток;
(h) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.
50. Способ, включающий:
(a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну T-клетку, из индивидуума;
+
+
(b) истощение клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14 и CD25 клеток;
+
+
(c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14 и CD25 клеток, с FLT3L в течение первого периода времени;
+
+
(d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14 и CD25 клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца APC, нагруженных пептидом;
(e) инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток;
(f) необязательно, инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L и вторым образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток;
(g) необязательно, инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L и третьим образцом APC, нагруженных пептидом, из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток;
(h) введение по меньшей мере оной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.
51. Способ, включающий:
(a) получение биологического образца, содержащего по меньшей мере одну APC и по меньшей мере одну T-клетку, из индивидуума;
+
+
(b) истощение клеток, экспрессирующих CD14 и CD25, в биологическом образце и, таким образом, получение образца, истощенного в отношении CD14 и CD25 клеток;
+
+
(c) инкубацию образца, истощенного в отношении CD14 и CD25 клеток, с FLT3L в течение первого периода времени;
+
+
(d) инкубацию по меньшей мере одного пептида с образцом, истощенным в отношении CD14 и CD25 клеток (c), в течение второго периода времени и, таким образом, получение первого образца APC, нагруженных пептидом;
(e) инкубацию первого образца APC, нагруженных пептидом, с по меньшей мере одной T-клеткой в течение третьего периода времени и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток;
(f) необязательно, инкубацию T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение четвертого периода времени и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток;
(g) необязательно, инкубацию T-клетки из второго образца стимулированных T-клеток с FLT3L и FLT3L-стимулированными APC из образца зрелых APC в течение пятого периода времени и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток;
(h) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого, второго или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.
52. Способ, включающий
(a) инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с популяцией иммунных клеток из биологического образца, где FLT3L инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода времени и где по меньшей мере один пептид инкубируют с популяцией иммунных клеток в течение первого периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение первого образца стимулированных T-клеток, где популяция иммунных клеток содержит по меньшей мере одну T-клетку и по меньшей мере одну APC;
(b) необязательно, инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с по меньшей мере одной APC, где FLT3L инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение второго периода времени и где по меньшей мере один пептид инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение второго периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом; и инкубацию первого образца зрелых APC, нагруженных пептидом, с первым образцом стимулированных T-клеток и, таким образом, получение второго образца стимулированных T-клеток;
(c) необязательно, инкубацию FLT3L и по меньшей мере одного пептида с по меньшей мере одной APC, где FLT3L инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение третьего периода времени и где по меньшей мере один пептид инкубируют с по меньшей мере одной APC в течение третьего периода стимуляции пептидом, и, таким образом, получение второго образца зрелых APC, нагруженных пептидом; и инкубацию второго образца зрелых APC, нагруженных пептидом, со вторым образцом стимулированных T-клеток и, таким образом, получение третьего образца стимулированных T-клеток; и
(d) введение по меньшей мере одной T-клетки из первого образца стимулированных T-клеток, второго образца стимулированных T-клеток или третьего образца стимулированных T-клеток нуждающемуся в этом индивидууму.
53. Способ, включающий
(a) определение экспрессии одного или более клеточных маркеров по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток, и
(b) определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC;
где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно.
54. Способ, включающий:
(a) инкубацию популяции иммунных клеток из биологического образца с APC, содержащими комплекс пептид-MHC, и, таким образом, получение образца стимулированных иммунных клеток;
(b) определение экспрессии одного или более клеточных маркеров по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток; и
(c) определение связывания по меньшей мере одной иммунной клетки из образца стимулированных иммунных клеток с комплексом пептид-MHC;
где определение экспрессии и определение связывания осуществляют одновременно.