ЛЕЧЕНИЕ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКА АНЕМИИ У БЕРЕМЕННЫХ НЕЧЕЛОВЕКООБРАЗНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
TREATING OR PREVENTING ANAEMIA IN PREGNANT NON-HUMAN MAMMALS

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к лечению анемии у беременных нечеловекообразных млекопитающих железо-углеводными комплексами. Изобретение в целом улучшает уровень гемоглобина у нечеловекообразного млекопитающего и/или параметры, которые оценивают у потомства, такие как частота мертворождения, частота смертности в подсосном периоде, увеличение уровня гемоглобина и скорость роста в подсосном периоде.
Предшествующая область техники
Несколько исследований предполагают, что анемия крайне распространена у свиней, хотя редко диагностируется в ветеринарной практике. Недавнее Датское исследование продемонстрировало, что 59% свиней в крупном коммерческом Датском стаде имели концентрации гемоглобина крови (Hb) ниже 110 г/л (Jensen et al, 2014), что расценивается как нижний предел референсного значения для беременных свиней (Thorn, 2010).
Наиболее частой причиной анемии является дефицит железа. Железо участвует в транспорте кислорода, в синтезе ДНК и во множестве других процессов, поддерживающих нормальную структуру и функцию клеток (Morris et al., 1995), низкий уровень железа оказывает несколько известных и неизвестных эффектов на состояние здоровья и продуктивность свиней и их потомства.
Недавно было показано, что высокий уровень гемоглобина у свиней во время беременности ассоциирован со сниженной частотой мертворождения поросят (Jensen et al 2014). Взаимоотношение между уровнем гемоглобина у свиней и частотой мертворождений ранее исследовали у свиней, которые были менее продуктивными, чем настоящее потомство (Archibald and Hancock, 1939, Moore et al., 1965, Zaleski and Hacker, 1993).
Также было показано, что мертворожденные поросята имеют более низкие значения гемоглобина, чем живые новорожденные поросята (Svetina et al., 2006; Zaleski and Hacker, 1993), и что 75% мертворожденных поросят умирают во время родов (Glastonbury, 1977; Leenhouwers et al., 1999). Более того, уровень гемоглобина у свиньи ассоциирован с уровнем гемоглобина у потомков поросят (Jensen and Nielsen, 2013). Наиболее очевидным объяснением наблюдаемого эффекта высокого уровня гемоглобина на частоту мертворождения является снижение риска гипоксии у свиней и поросят и большая выживаемость поросят во время родов. Следовательно, повышение уровня гемоглобина у свиней может открывать эффективные средства для уменьшения мертворождений.
В Дании из-за мертворождения теряют в среднем 1,7 поросят на приплод (Vinther, 2013), что является серьезной экономической и социально значимой проблемой в свиноводстве. Групповые вмешательства с целью уменьшения количества мертворождений часто трудно предпринимать, и только немного можно влиять на инфекционные факторы или факторы содержания.
Стандартной процедурой дополнения железа в подсосном периоде и промышленным стандартом является инъекция 200 мг элементарного железа в течение первых дней жизни. До того, как достигается требуемая продукция гемоглобина, поросенок зависит исключительно от железа, полученного в течение беременности из плаценты в матке свиньи.
Попытки увеличения уровня гемоглобина у свиней путем инъекции Глептосила в количестве 2 г в течение 7 недель и 4 недель до ожидаемого опороса оказались безуспешными (Auvigne, 2009). Для свиней, имеющих от 107,7 до 117,3 г/л гемоглобина в крови, парентеральное введение железо-углеводного комплекса не приводит к увеличению концентрации гемоглобина в крови.
Поросята, рожденные с высокими уровнями гемоглобина, имеют повышенную вероятность выживаемости до доращивания, и целью настоящего изобретения является обеспечение добавок железа для беременных свиней, которые могут повысить уровень гемоглобина у свиней и/или улучшать параметры, оцениваемые у потомков.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к железо-углеводному комплексу для применения в способе увеличения концентрации гемоглобина крови у беременного нечеловекообразного млекопитающего, где беременному нечеловекообразному млекопитающему, имеющему уровень гемоглобина крови 105 г/л или менее, вводят одну или более доз железо-углеводного комплекса, включающего количество элементарного железа 1800 мг или более на дозу.
В другом аспекте изобретение относится к железо-углеводному комплексу для применения в уменьшении частоты мертворожденного потомства от беременного нечеловекообразного млекопитающего, где беременному нечеловекообразному млекопитающему, имеющему уровень гемоглобина крови 105 г/л или менее, вводят одну или более доз железо-углеводного комплекса, включающего количество элементарного железа 1800 мг или более на дозу.
В еще одном аспекте изобретение относится к железо-углеводному комплексу для применения в способе увеличения концентрации гемоглобина в крови потомства в течение 3 дней после рождения и/или при доращивании, где беременному нечеловекообразному млекопитающему, имеющему уровень гемоглобина крови 105 г/л или менее, вводят одну или более доз железо-углеводного комплекса, включающего количество элементарного железа 1800 мг или более на дозу.
В еще одном аспекте изобретение относится к железо-углеводному комплексу для применения в способе увеличения размера приплода в последующем потомстве нечеловекообразного млекопитающего, где беременному нечеловекообразному млекопитающему, имеющему уровень гемоглобина крови 105 г/л или менее, вводят одну или более доз железо-углеводного комплекса, включающего количество элементарного железа 1800 мг или более на дозу.
Понимают, что железодефицитная анемия является частой проблемой для большинства млекопитающих из-за потери объема крови и изменений метаболизма, ассоцированных с ростом плода. Это подробно изучено и обычно лечат у людей. У нечеловекообразных млекопитающих железодефицитная анемия наиболее изучена у свиней, большее количество работ сфокусировано на железодефицитной анемии у поросят на полностью молочной диете, где такое состояние является эндемичным. В отличие от большинства других нечеловекообразных млекопитающих, железодефицитную анемию и ее лечение также исследовали у беременных свиней и, следовательно, настоящее изобретение относится к свиньям, как примеру беременных нечеловекообразных млекопитающих. Тогда как настоящее изобретение здесь преимущественно описано с использованием свиней в качестве примерного нечеловекообразного млекопитающего, для специалиста в области техники очевидно, что изобретение может быть осуществлено для любого нечеловекообразного млекопитающего. В определенном аспекте изобретения нечеловекообразным млекопитающим является свинья, лошадь, верблюд, овца, коза или корова.
Ранним предвестником снижения уровня гемоглобина крови до 105 г/л или менее является сниженный уровень ферритина, так как уровень ферритина отражает запас железа в организме. Следовательно, настоящее изобретение также охватывает профилактическое лечение беременных нечеловекообразных млекопитающих, имеющих низкий уровень ферритина, который предсказывает снижение уровня гемоглобина крови до 105 г/л или менее, если беременное нечеловекообразное млекопитающее не лечат в соответствии со способом по настоящему изобретению.
Дозой в контексте настоящего изобретения может быть разовое введение или два или более введений, проводимых в один день. Альтернативно, два или более введений можно осуществлять нечеловекообразному млекопитающему в течение временного периода 5 дней или менее, например, 4, 3, или 2 дня. Каждое введение может осуществляться посредством или энтерального или парентерального пути. В предпочтительном аспекте изобретения дозу вводят парентерально. Предпочтительно парентеральное введение осуществляют посредством инъекции или инфузии. В определенном варианте осуществления изобретения две инъекции или инфузии вводят в каждую сторону шеи нечеловекообразного млекопитающего в один и тот же день.
В соответствии с настоящим изобретением нечеловекообразному млекопитающему вводят одну или более доз, например, две, три, четыре, пять, шесть или более доз во время беременности. Кроме того, когда вводят две или более доз, разрыв во времени между каждой дозой составляет 1 неделю или более, например, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, или более. Когда вводят две дозы, первую дозу вводят за 15-3 недели до ожидаемого опороса и вторую дозу вводят за 8-1 неделю до ожидаемого опороса.
Считают, что железо-углеводный комплекс по изобретению увеличивает уровень гемоглобина крови у нечеловекообразных млекопитающих с анемией, таких как свиньи. Это само по себе является важным, так как улучает состояние здоровья и общее самочувствие свиней. Более того, в определенных вариантах осуществления изобретения авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение железо-углеводного комплекса по изобретению беременным свиньям с анемией также оказывало эффект на потомство свиней. Следовательно, железо-углеводный комплекс вводят беременным свиньям с анемией, один или более раз до опороса свиньи, введение также увеличивает уровень гемоглобина крови потомков поросят.
В качестве первого эффекта введение матери свинье снижает частоту мертворожденных поросят. Под мертворождением обозначают, что легкие раздуты. В другом варианте осуществления изобретения частота мумифицированных поросят снижается. Мумифицированного поросенка определяют, как поросенка, у которого легкие не раздуты. Следовательно, более высокий процент приплода будет живорожденным. Когда используется термин размер приплода, его понимают, как общий размер или количество мертворожденных и живорожденных поросят. Кроме того, введение матери свинье может увеличивать концентрацию гемоглобина в крови, выживаемость, состояние здоровья и/или рост потомства приплода до доращивания. В предпочтительном аспекте изобретения средняя частота мертворожденного потомства составляет 12% или менее, например, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или менее. В другом аспекте изобретения средняя частота выживаемости до доращивания составляет 80% или более, например, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Среднюю выживаемость рассчитывают на основании живорожденных поросят, т.е. общего количества поросят, за вычетом мертворожденных или мумифицированных поросят, и поросят, живых при доращивании.
Следовательно, от опороса до доращивания выживет больше потомства из приплода при сравнении с ситуацией, когда железо-углеводный комплекс не вводят беременным свиньям с анемией. Более того, потомство будет иметь лучшее состояние здоровья при доращивании, например, выражаемое параметрами состояния здоровья, такими как большая масса тела или более высокая концентрация гемоглобина крови. Когда железо-углеводный комплекс вводят беременной свинье с анемией, потомство будет лучше набирать массу и/или будет иметь более высокую концентрацию гемоглобина крови до доращивания, чем если железо-углеводный комплекс не вводят беременной свинье с анемией. В определенном варианте осуществления изобретения авторы изобретения наблюдали, что, когда углеводный комплекс железа вводят беременной свинье с анемией в соответствии с изобретением, существует меньшая необходимость во введении поросятам в подсосном периоде дополнительного железа, энтерально или парентерально. Следовательно, изобретение упрощает задачи свиновода и улучшает общее состояние и матери свиньи и потомства.
Посредством лечения по настоящему изобретению средний размер приплода может быть увеличен в последующем потомстве до уровня, в котором средний размер потомства составляет 13 или более, например, 14, 15, 16, 17, или более. Кроме того, средняя концентрация гемоглобина у беременных свиней увеличивается на 1% или более, например, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более. Более того, в предпочтительном аспекте настоящего изобретения средняя частота мертворожденного потомства снижается на 1% или более, например, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более. В определенном варианте осуществления изобретения средняя концентрация гемоглобина в крови потомства до доращивания увеличивается на 1% или более, например, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более. В одном аспекте изобретения средний размер приплода беременной свиньи в последующей партии увеличивается на 1% или более, например, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или более.
Свинья, получающая лечение в соответствии с настоящим изобретением, может иметь различное состояние здоровья, что отражается толщиной хребтового жира. В предпочтительном аспекте свинья имеет толщину хребтового жира 17 мм, 16 мм, 15 мм, 14 мм, 13 мм, 12 мм, 11 мм, 10 мм, или менее. Аналогично, свинья может иметь одни или несколько родов; предпочтительно, для свиньи, получающей лечение, количество родов свиньи в анамнезе составляет 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, или более.
3+
2+
В контексте изобретения железо-углеводным комплексом является любой комплекс ионов железа или частиц железа, включающий Fe и/или Fe и углевод, подходящий для введения свиньям. В определенном аспекте изобретения предпочтительно, чтобы железо-углеводный комплекс мог проникать через плаценту свиньи, посредством этого проникая к плоду. Железо-углеводные комплексы хорошо известны специалисту и специфический выбор подходящего железо-углеводного комплекса находится в рамках знаний специалиста. В предпочтительном варианте осуществления изобретения железо-углеводный комплекс рецептируют в виде инъекционной ветеринарной композиции, имеющей содержание элементарного железа в интервале 5-25%(масс/об), например, 50-250 г/л, в комплексе с углеводом. Ветеринарная композиция может включать добавки, обычно применяемые в этой области. Более того, ветеринарная композиция, включающая железо-углеводный комплекс, может содержать или не содержать консервант, такой как фенол, в количестве 1-10 г/л. В определенном варианте осуществления изобретения количество фенола составляет менее чем 1 г/л. Если необходимо, стерилизацию осуществляли альтернативным образом.
Железо-углеводный комплекс может быть выбран из множества различных веществ. Предпочтительно железо-углеводный комплекс выбирают из группы, состоящей из карбоксимальтозы железа, комплекса карбоксиметилового эфира полиглюкозы сорбита железа, комплекса маннита железа, декстрана железа, гидрированного декстрана железа, карбоксиалкилированных восстановленных олиго- и полисахаридов, сахарозы железа, глюконата железа, декстрина железа, гидрогенизированного декстрина железа, полимальтозы железа, гидрогенизированной полимальтозы железа, полиизомальтозы железа, гидрогенизированной полиизомальтозы железа, сахаридного комплекса железа, пирофосфата железа, сорбита железа, соли железа гликогептановой кислоты, окисленного декстрина, окисленного декстрана, окисленных олиго и полисахаридов или их смесей. В определенном варианте осуществления изобретения железо комплексовано с декстран глюкогептоновой кислотой. Такой железо-углеводный комплекс также известен как Глептоферрон и получают как, например, Глептосил (Alstoe Limited Animal Health, York, GB), Ursoferran (Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, D). В другом варианте осуществления изобретения железо образует комплекс с гидрогенизированным декстраном. Коммерческие комплексы гидрогенизированного декстрана железа представляют собой Униферон, КосмоФер, МоноФер и ДиаФер, получаемые от Pharmacosmos A/S, Holbaek, Denmark.
Углеводный компонент углеводного комплекса железа по настоящему изобретению может иметь любую подходящую молекулярную массу. Обычно предпочтительно использовать углеводный компонент с молекулярной массой, в котором массовая средняя молекулярная масса (ММ) углеводного компонента железо-углеводного комплекса составляет от 800 до 80000 Дальтон, предпочтительно от 800 до 10000 Дальтон. Массовая средняя молекулярная масса в указанном диапазоне может легче переноситься от беременной свиньи плоду. В предпочтительном аспекте, средняя молекулярная масса железо-углеводного комплекса составляет 500000 Дальтон или менее, например, средняя молекулярная масса 400000 Дальтон или менее.
Дозу железо-углеводного комплекса обычно рассчитывают на основании элементарного железа и обычно находится в диапазоне от 1800 мг до 10000 мг. В определенном варианте осуществления изобретения доза составляет 1900 мг, 2000 мг, 2100 мг, 2200 мг, 2300 мг, 2400 мг, 2500 мг, 2600 мг, 2700 мг, 2800 мг, 2900 мг, 3000 мг, 3100 мг, 3200 мг, 3300 мг, 3400 мг, 3500 мг, 3600 мг, 3700 мг, 3800 мг, 3900 мг, 4000 мг 4100 мг, 4200 мг, 4300 мг, 4400 мг, 4500 мг, 4600 мг, 4700 мг, 4800 мг, 4900 мг, 5000 мг, 5100 мг, 5200 мг, 5300 мг, 5400 мг, 5500 мг, 5600 мг, 5700 мг, 5800 мг, 5900 мг, 6000 мг, 6100 мг, 6200 мг, 6300 мг, 6400 мг, 6500 мг, 6600 мг, 6700 мг, 6800 мг, 6900 мг, 7000 мг, 7100 мг, 7200 мг, 7300 мг, 7400 мг, 7500 мг, 7600 мг, 7700 мг, 7800 мг, 7900 мг, 8000 мг, 8100 мг, 8200 мг, 8300 мг, 8400 мг, 8500 мг, 8600 мг, 8700 мг, 8800 мг, 8900 мг, 9000 мг, 9100 мг, 9200 мг, 9300 мг, 9400 мг, 9500 мг, 9600 мг, 9700 мг, 9800 мг, 9900 мг, 10000 мг, или более. В определенных обстоятельствах может быть подходящим вводить дозу 1650 мг, например, 1700мг, например, 1750 мг или более элементарного железа.
Доза в указанном диапазоне будет применимой к свинье типичного размера, например, с массой тела (МТ) около 250 кг. Так как масса свиньи варьируется от расы и питания, доза в некоторых вариантах осуществления изобретения лучше быть рассчитывается на массу тела свиньи. Следовательно, доза железа, т.е. элементарного железа, может находится в диапазоне 6 мг/кг МТ до 30 мг/кг МТ, например, 7 мг/кг МТ, 8 мг/кг МТ, 9 мг/кг МТ, 10 мг/кг МТ, 11 мг/кг МТ, 12 мг/кг МТ, 13 мг/кг МТ, 14 мг/кг МТ, 15 мг/кг МТ, 16 мг/кг МТ, 17 мг/кг МТ, 18 мг/кг МТ, 19 мг/кг МТ, 20 мг/кг МТ, 21 мг/кг МТ, 22 мг/кг МТ, 23 мг/кг МТ, 24 мг/кг МТ, 25 мг/кг МТ, 26 мг/кг МТ, 27 мг/кг МТ, 28 мг/кг МТ, 29 мг/кг МТ, 30 мг/кг МТ, или более.
Железо-углеводные комплексы по настоящему изобретению адаптированы для применения в способах, где железо-углеводный комплекс вводят свинье, имеющей уровень гемоглобина крови 105 г/л или менее. Однако, предполагают, что железо-углеводный комплекс будет оказывать желаемый эффект на всех свиней, вне зависимости от уровня гемоглобина крови. Следовательно, предусматривается, что железо-углеводный комплекс может также быть эффективным, если свинья имеет уровень гемоглобина крови около 110 г/л или менее, например, 109 г/л, 108 г/л, 107 г/л, 106 г/л или менее. В общем, свинья, получающая лечение, имеет уровень гемоглобина крови 105 г/л или менее, например, 104 г/л, 103 г/л, 102 г/л, 101 г/л, 100 г/л, 95 г/л, 90 г/л, 85 г/л, 80 г/л, 75 г/л, 70 г/л, 65 г/л, 60 г/л, 55 г/л, 50 г/л, 45 г/л, 40 г/л или менее. Свиней с указанным уровнем гемоглобина обычно называют как ʺанемичныеʺ.
Свинья, получающая лечение железо-углеводным комплексом, обычно имеет вторые роды или более. Обычно считается, что уровень гемоглобина крови свиньи будет снижаться с последующими родами (Normand et al., 2012), и авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что углеводный комплекс железа по изобретению является особенно эффективным при введении свиньям при вторых или последующих родах, таких как третьи роды, четвертые роды, пятые роды, шестые роды, седьмые роды, восьмые роды, девятые роды или более. Однако, предполагают, что железо-углеводный комплекс также будет эффективным, если вводится анемичным свиньям при первых родах.
В предпочтительном аспекте изобретения железо-углеводный комплекс по изобретению предназначен для парентерального введения посредством инъекции, например, внутримышечной (в/м), подкожной (п/к), или внутривенной (в/в) инъекции. В/м инъекция является предпочтительной, необязательно в виде болюсной инъекции. Ожидаемое время опороса хорошо известно специалисту и может быть рассчитано из даты инсеминации или зачатия. Определение времени введения, следовательно, рассчитывают от даты инсеминации или зачатия.
Для получения наилучшего эффекта у поросят, обычно считают, что введение последней дозы должно проводиться в последнюю 1 неделю, предпочтительно за 2-4 недели до опороса. Ожидается, что в течение последних 20 дней беременности плод удвоит свою массу. Первая доза обычно должна быть введена за 15 недель до опороса. Однако, вышеуказанные показания являются только ориентировочными и железо-углеводный комплекс, вводимый вне предпочтительного периода от 15 недель до 2 недель до опороса, может обеспечивать значимый эффект.
Дозу железо-углеводного комплекса вводят беременной свинье с анемией в одной или более временных точках, например, в виде двух, трех, четырех, пяти, шести или более доз в течение беременности, и предпочтительно в течение периода от 15 недель до 2 недель до опороса свиньи. Следовательно, при каждом введении от 1800 мг до 10000 мг элементарного железа, рецептированного в виде железо-углеводного комплекса, вводят, например, в/м, п/к или в/в, беременной свинье с анемией. Доза при каждом введении может быть одинаковой или дозы могут различаться. Например, первая инъекция может быть больше, чем вторая инъекция, например, на 500 мг, 1000 мг, 1500 мг, 2000 мг больше или наоборот. Обычно, достаточно вводить две дозы в течение периода от 9 недель до 3 недель до опороса. Период времени между дозами может составлять 1 неделю или более, например, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель или более.
Железо-углеводный комплекс можно вводить вместе с другими ветеринарными медикаментами. Примеры других типов ветеринарных медикаментов включают вакцины, такие как вакцина PRRS. Также антибиотики можно вводить вместе с железо-углеводным комплексом. Примеры антибиотиков включают амикацин, аминопенициллин, амоксициллин, азитромицин, цефалоспорины, ципрофлоксацин, клинамицин, доксициклин, энрофлоксацин, эритромицин, пенициллин, гентамицин, канамицин, линкомицин, марбофлоксацин,метронидазол, новобиоцин, орбифлоксацин, пенициллин G, пенициллиназа-резистентные пенициллины, сульфадиметоксин, тетрациклин, тиабендазол, неомицин, дексаметазон, триметоприм и тилозин. В определенном аспекте железо-углеводный комплекс вводят вместе с эритропоэтином для стимуляции продукции клеток крови.
Общее количество железо-углеводного комплекса, рассчитанного на элементарное железо, составляет по меньшей мере 1800 мг или более элементарного железа. В предпочтительном варианте осуществления изобретения общее количество элементарного железа составляет 2000 мг, 2500 мг, 3000 мг, 3500 мг, 4000 мг, 4500 мг, 5000 мг, 6000 мг, 7000 мг, 8000 мг, 9000 мг, 10000 мг элементарного железа или более. Также предусматривается, что общее количество железа может быть разделено на несколько введений, в которых некоторые могут содержать менее чем 1800 мг/л.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к железо-углеводному комплексу для применения в способе повышения концентрации гемоглобина крови, для применения в способе повышения концентрации гемоглобина крови, для применения в способе снижения частоты мертворождений поросят, для применения в способе повышения выживаемости, состояния здоровья и/или роста приплода до доращивания, или для применения в способе увеличения размера помета.
Далее описан экспериментальный протокол, поддерживающий изобретение.
1 Материалы и методы
1.1 Цель и популяция исследования
Исследование проводили на коммерческой свиноферме, которая является характерной для крупных свиноферм в Дании. Популяция исследования состоит из беременных свиней с низкими значениями гемоглобина и их потомства до доращивания. Беременных свиней отбирали для исследования между 60-80 днями гестации.
1.2 Дизайн исследования
Исследование представляет собой рандомизированное клиническое исследование. Одобрение от Danish Animal Experiments Inspectorate и от The Danish Medical Agency получено до начала исследования. Исследование проводили в соответствии с протоколом.
1.3 Объект исследования
Объектом исследования являются свиньи и их новорожденное потомство.
1.4 Выбор стада
Исследование частоты анемии у Датских свиней проводили в 5 стадах, выбранных в сочетании со специализированной ветеринарной практикой у свиней. Для исследования выбирали стадо с высокой частотой анемии.
1.4.1 Критерии выбора стада
1. Размер стада по меньшей мере 1000 свиноматок
2. Хорошее хранение записей данных стада
3. Мотивированный владелец стада
4. Добавки железа поросятам путем инъекции 200 мг декстрана железа только на 4 день
1.4.2 Критерии исключения стада
1. Обеспечение избытка железа свиньям или перорально или инъекционно (за исключением пищевых композиций)
2. Разведение или размножение стада
3. Индукция родов, например, простагландинами
4. Явные инфекционные заболевания или проблемы ведения, которые могут повлиять на мертворождение
1.5 Размер выборки
Размер выборки, необходимой для оценки частоты, рассчитывали по уравнению:
(1-α/2)
2
2
2
N=(Z)σ)/L (J.P.T.M et al., 2001)
N=количество получаемых образцов
(1-0,05/2)
0,975
α=0,05 (95% доверительный интервал) => Z=Z=1,96
σ=стандартное отклонение
В стаде с 50% свиноматок, страдающих от анемии (<100 г Hb на литр) размер выборки 50 животных был достаточным для определения частоты с допустимой погрешностью +/- 13%.
1.6 Идентификация свиней для клинического исследования
Все повторнородящие свиньи от достаточного количества еженедельных партий, соответствующих 200 животным, определяли на 60-80 день гестации. Первородящих свиней исключали.
Начальное измерение гемоглобина у 200 свиней проводили посредством измерения HaemoCue. Здоровых свиней с гемоглобином ниже, чем 100 г/л включали в исследование.
1.7 Забор образцов крови
Свиней обездвиживали и получали образцы 5 мл крови в ЭДТА и обычные вакутайнерные пробирки из яремной вены в начале исследования (одиннадцатая неделя исследования) и за одну неделю до ожидаемого опороса. В образцах исследовали полный клинический анализ крови, железо сыворотки TIBC и ферритин сыворотки, как описано в разделах 4.6.3 и 4.8. Насыщение трансферрина также рассчитывали, как описано в разделе 4.9.
1.8 Гематология свиней
Все 200 стабилизированных ЭДТА образцов крови тестировали исходно на концентрацию гемоглобина посредством HaemoCue. Оборудование, необходимое для такого исследование, обеспечивали Pharmacosmos. Выбор 100 свиней с анемией основывали на этом исследовании.
Образцы от 100 выбранных свиней подвергали полному клиническому анализу крови (исходное измерение) в Университете Копенгагена.
Образцы крови анализировали в отношении количества эритроцитов (RBC), количества лейкоцитов (общее количество лейкоцитов и лейкоцитарная формула), тромбоцитов, среднего объема тромбоцитов (MPV), ширины распределения эритроцитов (RDW), концентрации гемоглобина (Hb), ширины распределения гемоглобина (HDW), гематокрита (HCT), среднего объема клеток (MCV), среднего содержания гемоглобина в эритроцитах (MCH) и средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (MCHC). Также анализировали индексы ретикулоцитов, которые включают количество ретикулоцитов (абсолютное и относительное), содержание гемоглобина в ретикулоцитах (Chr), среднее содержание гемоглобина в ретикулоцитах (CHCMr), клеточный объем ретикулоцитов (MCVr), ширину распределения красных ретикулоцитов (RDWr) и ширину распределения гемоглобина ретикулоцитов (HDWr).
Образцы сыворотки хранили до идентификации включенных в клиническое исследование свиней.
1.9 Запись данных свиней
Для каждой свиньи делали следующие записи: возраст свиньи, возраст первой инсеминации, количество мертворожденных и живорожденных поросят в предыдущем помете, дата инсеминации, дата опороса и роды свиньи.
2 Расчет выборки образца для клинического исследования
Размер образца в каждой группе, необходимый для оценки различий между группами животных, рассчитывали по уравнению (Graat et al., 2001)
α
β
2
2
N=2×(Z+Z)2*SD/Δ
в котором
N=количество свиней, требуемое в каждой группе
α
β
Z, Z=значения стандартного нормального распределения на установленном уровне доверительном и эффективности
SD=стандартное отклонение
Δ=оценка разности
Константа 2 показывает, что SD равно в обеих группах.
0.20
Авторы применяли двухсторонний тест с α 0,05, Z 0,05=1,96 и силой 80%, Z=0,84.
Различия гемоглобина между двумя группами (Δ) приняли как 10 г/л и SD установили на 15 г/л на основании предшествующего исследования.
Предполагая разницу в концентрации гемоглобина 9 г/л между группой лечения и контрольной группой, на группу требовалось 50 свиней.
2.1 Лабораторный анализ замороженных образцов
Образцы сыворотки, полученные от выбранных 100 свиней (50 в группе лечения и 50 в контрольной группе) анализировали в отношении сывороточного железа, общей железосвязывающей способности сыворотки (TIBC) и ферритина сыворотки, если возможно. Сывороточное железо и железосвязывающую способность сыворотки анализировали в центральной лаборатории, University of Copenhagen, тогда как измерение ферритина сыворотки проводили в лаборатории профессора Ritzmanns, Tierärztliche Fakultät, Ludwig-Maximilians-Universität, München.
2.2 Расчет насыщения трансферрина (TfS)
Насыщение трансферрина рассчитывали для всех образцов крови с использованием формулы: TfS (%)=железо сыворотки/TIBC×100.
2.3 Измерение толщины хребтового жира на спине
Исходное измерение хребтового жира свиней проводили с использованием ультразвукового устройства. Измерение получали на уровне последнего подвижного ребра, в 7 см на каждой стороне от середины спины в соответствии с руководством производителя. Измерение хребтового жира проводили в начале исследования, при опоросе и непосредственно перед доращиванием.
2.4 Рандомизация свиней
Выбранных свиней случайным образом распределяли на две группы:
1. Контрольная группа
2. Группа лечения
Рандомизацию проводили с использованием лотереи с ушными бирками свиней.
2.5 Лечение свиней
Препараты тестируемого и контрольного вещества и оборудование для инъекций обеспечены Pharmacosmos.
Первая доза
-
Свиньи в группе лечения получают 12,5 мл (2500 мг) инъекции железа (Uniferon) внутримышечно в область шеи в день 70 гестации (6 недель до опороса). Контрольная группа получает 12,5 мл изотонического солевого раствора внутримышечно в область шеи в тот же день. Любые реакции на инъекцию железа отмечают и лечат соответственно.
- Вторая доза
Через две недели после первой дозы железа в день 84 (4 недели до опороса), свиньи получают вторую дозу 12,5 мл (2500 мг) инъекции железа (Uniferon) внутримышечно в область шеи. Также, контрольные свиньи получают вторую дозу изотонического солевого раствора.
2.6 Ведение свиней и поросят
Всех свиней ведут в соответствии со стандартными методиками на ферме в течение всего периода исследования.
2.7 Запись и классификация мертворожденных поросят
Всех полностью развитых мертвых поросят в приплоде собирали при опоросе. Мертвых поросят вскрывали и тестировали легкие. Если легкие тонули в воде, поросят расценивали как мертворожденных. Мертворожденных поросят классифицировали как указано далее:
1. Раннее мертворождение: демонстрирующие признаки дегенерации, коричневый цвет кожи - такие поросята вероятно умерли более чем за неделю до начала опороса (Randall and Penny 1967)
2. Предродовое мертворождение: Не проявляющие внешних признаков разложения, но с тем же самым кирпично красным цветом всех органов брюшной полости из-за гемолиза и аутолиза - такие поросята умерли в матке в дни, непосредственно предшествующие опоросу (Bille et al., 1974)
3. Мертворождение в родах: Нормальный цвет органов брюшной полости, но присутствие слизи и/или мекония в трахее, показывающие что поросята умерли во время опороса
Мумифицированных плодов записывали, но не включали в исследование. Для каждого мертворожденного и живорожденного поросенка, записывали пол и оценивали индивидуальную массу тела, если практически возможно.
2.8 Гематология поросят
Кровь получали из передней полой вены от подгруппы из двух живорожденных поросят на опорос. Таких поросят выбирали случайно среди всех поросят в определенном опоросе. Кровь от двух мертвых поросят на опорос собирали в соответствии с руководством Rootwelt et al., 2012.
Кровь подвергали полному клиническому анализу, включая железо сыворотки, TIBC и ферритин сыворотки, как описано в разделах 1.8 и 2.1. Также измеряли лактат у каждого поросенка.
2.9 Нежелательные реакции у свиней
Ожидали, что в течение исследования 20% свиней будут отбракованы при доращивании. Среди этих свиней 10 животных выбирали по удобству для исследований на реакции в месте инъекции. Место инъекции оценивали макроскопически для определения степени выраженности повреждения тканей, вызванного инъекцией. Образцы для гистологического исследования фиксировали в формалине.
Количество всех рожденных поросят у леченных животных сравнивали с таковым контроля. Записывали толщину хребтового жира близко к доращиванию.
3 Статистический анализ
SAS 9.3 использовали для анализа данных. Гематологию свиней до и после инъекции железа сравнивали с применением общей линейной модели с использованием методики PROC GLM в SAS. Различия в гематологии у свиней между контрольными свиньями и свиньями, получавшими лечение, рассчитывали с использованием общей линейной модели с помощью методики PROC GLM. Объясняющие факторы включают исходные значения Hb, количество всех рожденных поросят и роды свиньи. Вероятность мертворождения поросят у каждой контрольной свиньи и свиньи, получающей лечение, рассчитывали с использованием генерализованных линейных моделей с использованием методики PROC LOGISTIC. В указанной методике Hb при исходном измерении, количество всех рожденных поросят, роды свиньи, пол поросят являются независимыми переменными, которые рассматриваются для анализа.
Различия в гематологии между живыми и мертворожденными поросятами проводят с использованием линейной смешанной модели с методикой PROC MIXED со свиньей в качестве случайного фактора. Другие независимые переменные включают размер помета, роды свиньи и гемоглобин свиньи.
Пример 1
100 свиней выбирали из стада, демонстрирующего высокую частоту анемии. По практическим причинам исследование проводили в двух партиях. Все данные собирали.
5 мл крови собирали в EDTA из яремной вены в начале исследования, т.е. 8 неделе гестации, около одной недели до ожидаемого опороса и через 4 недели после опороса. Образцы крови маркировали Hb_S1, Hb_S2, и Hb_S3, соответственно. Образцы анализировали и определяли концентрацию гемоглобина крови (Hb).
Выбранных свиней случайно распределяли в две группы:
1. Контрольная группа (C)
2. Группа лечения (T)
Рандомизацию осуществляли с использованием лотереи с ушными бирками свиней. Каждая группа включала 50 свиней.
Свиньям в группе лечения вводили первую дозу 12,5 мл декстрана железа (Uniferon, 20%), соответствующую 2500 мг железа, внутримышечно в область шеи в день 70 гестации (6 недель до опороса). Контрольная группа получала 12,5 мл изотонического солевого раствора внутримышечно в область шеи в тот же самый день. Все реакции из-за инъекции железа отмечали и лечили соответственно.
Через две недели после первой дозы железа в день 84 (4 недели до опороса), свиньи получали вторую дозу 12,5 мл (2500 мг) инъекцию железа (Uniferon) внутримышечно в область шеи. Также, контрольные свиньи получали вторую дозу изотонического солевого раствора.
Таблица 1: Hb у свиней
Исходный Hb (г/л)
Группа
Количество свиней
Средний Hb_S1
Средний Hb_S2
Средний Hb_S3
Δ(Hb_S1, Hb_S2)
Δ(Hb_S1, Hb_S3)
<105
С
29
99,33
99,60
99,55
0,28
0,22
Т
31
99,10
100,51
100,77
1,40
1,66
>105
С
19
111,16
103,36
103,19
-7,80
-7,97
Т
19
111,07
102,26
101,66
-8,82
-9,41
Всех полностью развитых мертвых поросят в помете собирали при опоросе. Мертвых поросят вскрывали и тестировали легкие. Если легкие тонули в воде, поросенка расценивали как мертворожденного.
Мумифицированных плодов записывали, но не включали в исследование. Для каждого мертворожденного и живорожденного поросенка записывали пол и индивидуальную массу тела, если практически допустимо.
Таблица 2: Всего мертворожденных поросят
Исходный Hb (г/л)
Группа
Количество свиней
Количество мертворожденных
Сумма живорожденных
Частота мертворождений
<105
C
28
44
477
7,9%
T
27
32
451
6,6%
>105
C
16
20
276
6,6%
T
16
18
255
6,4%
Отмечено, что концентрация гемоглобина у свиней, представленная в таблице 1, увеличивалась для свиней, имеющих исходный уровень Hb ниже 105 г/л. Специфически, свиньи с анемией, имеющие низкий исходный Hb <105 г/л, продемонстрировали увеличение на 1,40 г/л, по сравнению с 0,28 г/л для контрольной группы, с начала исследования до одной недели до ожидаемого опороса, и увеличение на 1,66 г/л, по сравнению с 0,22 для контрольной группы, с начала до 4 недель после опороса. Результаты показывают, что анемичные беременные свиньи получают преимущество от введения железо-углеводного комплекса. Δ(Hb_S1, Hb_S2) и Δ(Hb_S1, Hb_S3) для свиней, имеющих исходный Hb выше 105 г/л, были отрицательными, подтверждая, что такие животные не получали преимущества от лечения.
Частота мертворождения в таблице 2 снизилась с 7,9% в контрольной группе до 6,6% в группе лечения, когда свиней, имеющих исходный <105 г/л, лечили железо-углеводным комплексом. Результат показывает, что частота мертворожденного потомства снижается путем введения железо-углеводного комплекса. Наоборот, частота мертворождения снижается с 6,6% в контрольной группе до 6,4% в группе лечения, когда исходный Hb выше 105 г/л, показывая, что снижения частоты мертворождения для этой группы свиней не получают.
Ссылки
Archibald, R., Hancock, E.E.I., 1939. Iron Deficiency-Stillbirth of Swine. Canadian Journal of Comparative Medicine 3, 134.
Bille, N., Nielsen, N.C., Larsen, J.L., Svendsen, J., 1974. Preweaning mortality in pigs. 2. The perinatal period. Nordisk veterinaermedicin, 26, 294-313.
Graat, E.A.M., Frankena, K., Bos, H., 2001. Principles and methods of sampling in animal disease surveys, In: Noordhuizen, J.P.T.M., Frankena, K., Thrusfield, M.V., Graat, E.A.M. (Eds.) Application of quantitative methods in veterinary epidemiology. Wageningen Pers, Wageningen, The Netherlands, pp. 45-46.
Jensen, A.K., Pedersen, K.S., Nielsen, J.P.,2013. Association between blood haemoglobin concentration in sows and neonatal piglets. In Proceedings of the 5th ESPHM, Edinburgh, UK.
Jensen, A.K., Nielsen, J.P., 2014. Association between stillborn piglets and haemoglobin concentration in sows at farrowing. In Proceedings of the 6th ESPHM, Sorrento, Italy.
Moore, R., Redmond, H., Livingston Jr, C., 1965. Iron deficiency anemia as a cause of stillbirths in swine. Journal of the American Veterinary Medical Association 147, 746.
Morris, C.J., Earl, J.R., Trenam, C.W., Blake, D.R., 1995. Reactive oxygen species and iron-a dangerous partnership in inflammation. The international journal of biochemistry and cell biology 27, 109-122.
Randall, G.C.B., Penny, R.H.C., 1967. Still birth in pigs: the possible role of anoxia. Veterinary Record 81, 359-361.
Rootwelt, V., Reksen, O., Farstad, W., Framstad, T., 2012. Associations between intrapartum death and piglet, placental, and umbilical characteristics. Journal of Animal Science 90, 4289-4296.
Svetina, A., Vrabac, L., Belić, M., Turk, R., 2006. Relation between erythrocyte parameters and stillbirth in piglets. Veterinarski arhiv 76, 297-303.
Thorn, C. 2010. Hematology of the pig. In Schalm's Veterinary Hematology 6th Edition, Wiley-Blackwell, Ames, Iowa, Weiss, D., Wardrop, K., eds. (Iowa, Wiley-Blackwell), p. 848.
Vinther J., 2013. National average productivity in pig production in 2012 (Landsgennemsnit for productivitet i svineproduktionen 2012). Videncenter for svineproduktion
Zaleski, H.M., Hacker, R.R., 1993. Variables related to the progress of parturition and probability of stillbirth in swine. The Canadian Veterinary Journal 34, 109.
Auvigne, V., et al., 2010. Anaemia in the hyperprolific sow: Effect of injectable iron administration and relation with fattering score.