ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
VACCINE COMPOSITION FOR TREATMENT OF CANCER

Настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере четыре разных опухолеспецифических неоантигена, слитых по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью Т-клеточного усилителя, последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей такой полипептид, вектору, содержащему такую последовательность нуклеиновой кислоты, и коллекции векторов, включающей такие векторы. Также предусмотрены композиции, содержащие, в смеси или отдельно, вакцину, содержащую полипептид, последовательность нуклеиновой кислоты, вектор или коллекцию векторов по настоящему изобретению и по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или иммуномодулятор другого типа для применения в лечении рака.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Совсем недавно были разработаны новые методы лечения рака. Исследования в отношении взаимодействия иммунной системы и опухоли позволили идентифицировать ключевые пути уклонения от иммунных ответов хозяина, обеспечивая возможность разработки антител в качестве ингибиторов контрольных точек иммунного ответа (CPI) для возможности реализации потенциала противоопухолевой активности Т-клеток. Несмотря на их успех, ингибиторы контрольных точек являются эффективными у незначительного числа получающих лечение пациентов. С помощью анализа паттернов Т-клеточного иммунного ответа в ходе лечения CPI было показано, что для крайне ограниченного числа видов специфичности Т-клеток в отношении опухолевых клеток может быть возобновлена активность в ходе лечения CPI (Alsaab, Н.О., et al. (2017) Front Pharmacol, 8: p.561).
Несколько опухолевых антигенов было идентифицировано и отнесено к разным категориям: наблюдающиеся при раке вследствие мутаций клеток зародышевой линии, антигены, образующиеся вследствие процессов тканевой дифференциации, и неоантигены, происходящие из мутированных собственных белков Fritsch, E.F., et al. (2014) Cancer Immunol Res. 2(6): 522-9. Вклад иммунных ответов в отношении аутоантигенов в ходе лечения с помощью CPI до сих пор остается предметом дискуссий (рассмотрено в Fritsch, E.F., et al. (2014) выше). Конкретной и предпочтительной категорией раковых антигенов, которые, как было показано, возобновляют активность в ходе лечения CPI, являются неоантигены. В последнее время убедительные свидетельства подтверждают концепцию о том, что неоантигены, образующиеся в опухоли как следствие мутаций в кодирующих последовательностях экспрессированных генов, являются перспективной мишенью для вакцинации против рака (Kandoth, С, et al. (2013) Nature 502(7471): 333). В мутированных белках, образующихся в результате генетических изменений в кодирующих областях генома, могут образовываться специфические в отношении типа рака неоантигены. Раковые неоантигены представляют собой антигены, присутствующие исключительно на поверхности опухолевых клеток, но не на поверхности нормальных клеток. Неоантигены образуются в результате мутаций ДНК в опухолевых клетках, и было показано, что они играют значимую роль в распознавании и уничтожении опухолевых клеток путем опосредованного Т-клетками иммунного ответа.
Появление секвенирования нового поколения (NGS), которое позволяет в краткие сроки и недорого определить полную последовательность ракового генома, обеспечило возможность выявления мутационных характеристик опухолей человека (Ott, P.A., et al. (2017) Nature 547(7662): 217). Наиболее часто встречающимся типом мутации является несинонимичная однонуклеотидная вариация (SNV), и среднее число однонуклеотидных вариаций, обнаруженных в опухолях, значительно варьируется в зависимости от их гистологии. Некоторые опухоли, такие как NSCLC и меланома, характеризуются высокой мутационной нагрузкой и медианным числом мутаций более 200, а некоторые выделяющиеся из общей статистики опухоли имеют более 1000 мутаций.
Недавно в клинических исследованиях I фазы были оценены два разных подхода к персонализированной вакцинации, основанных на применении либо РНК, либо пептидов. Из полученных данных видно, что вакцинация может обеспечить как увеличение ограниченного числа уже существующих неоантигенспецифических Т-клеток, так и индукцию более широкого репертуара новой специфичности Т-клеток у больных раком пациентов (Ott, Р.А., et al. (2017) выше и Sahin, U., et al. (2017) Nature 547(7662): 222). Основным ограничением обоих подходов является максимальное число неоантигенов, на которые направлены такие подходы к вакцинации. Верхний предел для подхода на основе применения пептидов, исходя из опубликованных данных, составляет двадцать пептидов, и при этом он не достигался у всех пациентов, поскольку в некоторых случаях пептиды не могли быть синтезированы. Описанный верхний предел для подхода на основе применения РНК даже ниже, поскольку в каждую вакцину были включены только 10 мутаций. Клинические данные, демонстрирующие эффективность этих подходов к вакцинации, пока отсутствуют. При противораковой вакцинации важно избегать уклонения опухоли за счет появления опухолевых вариантов, не распознаваемых индуцируемыми вакциной Т-клетками. Задача противораковой вакцины при излечивании рака заключается в том, чтобы индуцировать видимо разнообразную популяцию иммунных Т-клеток, способных распознавать и устранять наибольшее число раковых клеток одновременно, поэтому желательно, чтобы вакцина кодировала довольно большое число опухолевых антигенов.
Кроме того, в WO 2017/118702 А1 раскрыт пример конструкции только с 10 неоантигенами, соединенными линкерами, демонстрирующий при этом иммуногенность только нескольких неоантигенов и неэффективность. Более того, ни в одном из ранее проведенных исследований не была показана эффективность в моделях с высокой опухолевой массой.
При противораковой вакцинации важно избегать уклонения опухоли за счет появления антигенов, не распознаваемых индуцируемыми вакциной Т-клетками. Задача противораковой вакцины при излечивании рака заключается в том, чтобы индуцировать видимо разнообразную популяцию иммунных Т-клеток, способных распознавать и устранять наибольшее число раковых клеток одновременно, поэтому желательно, чтобы вакцина кодировала довольно большое число опухолевых антигенов.
Авторы настоящего изобретения ожидали, на основе полученных ими доклинических данных, что вакцина на основе ограниченного числа неоантигенов идеально подходит в качестве самостоятельного лечения для предупреждения рака или лечения минимального остаточного заболевания, то есть рака, диагностированного с помощью молекулярных методов, таких как на основе обнаружения циркулирующей внеклеточной опухолевой ДНК. Показатели при минимальном остаточном заболевании зачастую находятся ниже предела обнаружения с применением способов визуализации, например, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонансной томографии (MRI), радио изотопной диагностики с использованием меченых атомов, которые обнаруживают с помощью сцинтиграфии в рамках позитронной эмиссионной томографии (PET). В клинических испытания в области радиоизотопной медицины было показано, что минимальная обнаруживаемость очага поражения составляет приблизительно 1,5 см в диаметре. Более того, авторы настоящего изобретения ожидали, на основе полученных ими доклинических данных, что только вакцина, удовлетворяющая обоим из следующих условий: а) на основе множества неоантигенов (т.е. >25) и b) в комбинации с иммуномодулятором, таким как ингибитор молекулы, являющейся контрольной точкой, может обеспечить эффективный контроль развившихся опухолей, причем под развившимися опухолями подразумевается опухолевая масса, которая может быть диагностирована с помощью средств визуализации.
Для преодоления этих и других недостатков вакцин предшествующего уровня техники, нацеленных на ограниченное число неоантигенов, настоящее изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, кодирующей множество разных опухолевых неоантигенов, соединенных по принципу «голова к хвосту» (т.е. 31) и слитых по меньшей мере с одной аминокислотной последовательностью Т-клеточного усилителя, такого как лидерная последовательность тканевого активатора плазминогена (TPА) или инвариантная цепь, и векторам, содержащим такие нуклеиновые кислоты. Если направленную вакцину, содержащую такую нуклеиновую кислоту, вводят в комбинации с модулятором молекулы, являющейся контрольной точкой, достигается высокая эффективность лечения.
Настоящее изобретение основывается на обнаружении того, что для активации иммунной системы в отношении очень слабых иммуногенов, подобных тем, которые присутствующих в опухоли, включая большинство неоантигенов, требуется эффективная платформа иммунизации, и она должна сочетаться со специфической структурой кодируемых антигенов.
Многие неоантигены образуются вследствие точечных мутаций, несинонимичной SNV, которые являются наиболее часто встречающимся типом мутаций в опухолях. Изменение по одной аминокислоте в белковой последовательности очень редко приводит к образованию нового эпитопа, способного индуцировать сильный иммунный ответ, при этом в большинстве случаев это небольшое изменение либо не приводит к образованию нового эпитопа вовсе, либо может приводить к образованию «слабого» эпитопа. Было показано, что платформа для генной вакцинации на основе аденовируса, в частности, вирусного вектора на основе аденовируса, полученного от представителей гоминид (GAd), является очень эффективной для индукции Т-клеточных ответов, и она является подходящей для кодирования крупных антигенов в формате искусственных генов, состоящих из полинуклеотидов, кодирующих фрагменты из разных белков, связанные один за другим.
Неожиданно, когда авторы настоящего изобретения применяли эту платформу в контексте неоантигенов, авторы настоящего изобретения не смогли вызвать какой-либо иммунный ответ. Авторы настоящего изобретения идентифицировали способные восстанавливать иммуногенность специфические последовательности, которые в настоящей заявке называются «аминокислотной последовательностью Т-клеточного усилителя», при слиянии с цепочками раковых неоантигенов. Такая аминокислотная последовательность Т-клеточного усилителя была пригодна для преодоления сложностей, состоящих в отсутствии или слабой иммуногенности неоантигенов. Предпочтительно эти последовательности сливают выше последовательности, кодирующей неоантигены. Среди аминокислотных последовательностей Т-клеточных усилителей авторы настоящего изобретения идентифицировали лидерную последовательность тканевого активатора плазминогена (ТРА) и инвариантную цепь (INV), их варианты и фрагменты, демонстрирующие способность восстанавливать иммуногенность. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что неоантигены для восстановления иммуногенности не обязательно должны быть соединены посредством линкеров.
Соответствующий дополнительный аспект настоящего изобретения относится к числу иммуногенных неоантигенов, необходимых для эффективной противораковой вакцинации. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что генная вакцина на основе вектора на основе аденовируса, полученного от представителя гоминид, кодирующего небольшое число неоантигенов, хотя и очень эффективна в качестве самостоятельного лечения в условиях профилактики, в случае применения в условиях терапии в присутствии крупных развившихся опухолей является неэффективной и не действует синергически с иммуномодулирующей молекулой, способной обращать истощение Т-клеток, например, антителом к PD-1. В отличие от этого, в случае более крупной конструкции вакцины, кодирующей более тридцати неоантигенов, соединенных по принципу «голова к хвосту» без линкеров, и слитых с Т-клеточным усилителем, была показана сильная синергическая противоопухолевая активность при введении в сочетании с антителом к PD-1.
Обозначения на фигурах
8
Фиг. 1. Иммуногенность векторов GAd, кодирующих полноразмерную TNV человека (CT26-5-INV) или последовательность ТРА (СТ26-5 ТРА), связанные с пентатопом антигенов СТ26 (СТ26-5). Представленные значения были получены с помощью анализа ELISpot с использованием клеток селезенки иммунизированных животных. Спленоциты стимулировали ex vivo через три недели после вакцинации (доза 5×10 vp) с использованием пула из пяти синтетических пептидов, соответствующих последовательностям пяти содержащих мутации неоантигенов. Ответы выражены в виде числа продуцирующих IFNγ Т-клеток на миллион спленоцитов.
8
Фиг. 2. Иммуногенность векторов GAd-CT26-31 ТРА и GAd-CT26-5 ТРА. Векторы GAd путем внутримышечной инъекции вводили в дозе 5×10 vp, и Т-клеточные ответы измеряли с помощью по IFN-γ через три недели после иммунизации, и в данном случае они выражены в виде числа продуцирующих IFNγ Т-клеток на миллион спленоцитов. Показаны ответы в отношении мутантных раковых антигенов, которые оказались иммуногенными. Неоантигены №5, №18, №28 являются общими для двух векторов. Пунктирная линия представляет собой порог положительного ответа.
Фиг. 3. Профилактическая вакцинация с использованием векторов GAd-CT26-5 и GAd-CT26-31, кодирующих неоантигены СТ26, обеспечивает эффективный контроль развития опухоли. Мышей (n=8-10/группа) вакцинировали с использованием GAd-CT26-5 или GAd-CT26-31, и через 2 недели после иммунизации им путем инъекции вводили s.c. клетки СТ26. Рост опухоли отслеживали в динамике. Показан объем опухоли, измеренный через 28 дней после инокуляции GAd, в сравнении с таковым у не подвергавшихся лечению (имитационный контроль) мышей.
8
Фиг. 4. Ранняя вакцинация с использованием векторов GAd-CT26-5 и GAd-CT26-31 обеспечивает эффективный контроль роста опухоли. Мышам (n=8-10/группа) инокулировали i.v. клетки СТ26 (день 0) и оставляли без лечения (контроль) или путем инъекции вводили 5×10 vp GAd-CT26-5 или GAd-CT26-31 в день 3. Показано число узлов в легком, подсчитанное в день 16.
3
Фиг. 5. Для эффективности вакцин GAd у животных с высокой опухолевой массой требуется нацеливание на множество неоантигенов и комбинация с антителом к PD1. Мышам s.c. инокулировали клетки СТ26. Через одну неделю мышей рандомизировали в соответствии с объемом опухоли (среднее 70-100 мм). Лечение с использованием вакцины GAd начинали в день 0. А) Рост опухоли у отдельных мышей с течением времени показан у мышей, вакцинированных GAd-CT26-31, в сравнении с таковым у контрольных (не подвергавшихся лечению) мышей. В) Эффективность антитела к PD1 и комбинации антитела к PD1 с GAd-CT26-5 или GAd-CT26-31. Вакцину вводили в день 0 (im), тогда как антитело к PD1 давали два раза в неделю до наступления дня 16 (ip). Показан рост опухолей у отдельных мышей с течением времени. Статистические данные рассчитаны с помощью критерия хи-квадрат, с помощью которого оценивали число излеченных мышей (ответивших на лечение) в сравнении с числом не ответивших на лечение мышей.
Фиг. 6. Специфические в отношении неоантигенов Т-клеточные ответы измеряли с помощью ELISpot по IFN-γ у мышей с опухолями, получающих GAd-CT26-31 и лечение антителом к PD1 (день 30). Ответы измеряли в отношении спленоцитов, стимулированных в присутствии синтетических пептидов, соответствующих иммуногенным неоантигенам, и выражали в виде числа продуцирующих IFN-γ Т-клеток на миллион спленоцитов.
Фиг. 7. Рост опухоли у мышей с опухолями, подвергнутых лечению с использованием GAd-CT26-31 и антитела к PD1 в присутствии антитела, обеспечивающего истощение по CD4+ Т-клеткам (с истощением по CD4) или CD8+ Т-клеткам (с истощением по CD8), или в не подвергнутой истощению по Т-клеткам контрольной группе. Данные представлены по меньшей мере для 2 независимых экспериментов. Статистическая значимость обозначена как *(Р<0,05 по точному критерию Фишера) или как NS (значимость отсутствует).
Фиг. 8. Значимое различие (односторонний критерий Вилкоксона) внутриопухолевого разнообразия TCR (число клонотипов) между мышами, получающими комбинированное лечение (слева), и мышами, получающими лечение только антителом к PD1 (справа). Ответившие на комбинированное лечение мыши (слева, закрашенные круги), не ответившие на комбинированное лечение мыши (слева, закрашенные квадраты), ответившие на лечение только антителом к PD1 мыши (справа, направленные вверх треугольники), не ответившие на лечение только антителом к PD1 мыши (справа, направленные вниз треугольники).
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере 25 разных опухолеспецифических неоантигенов и по меньшей мере одну аминокислотную последовательность Т-клеточного усилителя.
Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид согласно первому аспекту настоящего изобретения.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, функционально связанную с последовательностью контроля экспрессии.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к коллекции одного или нескольких векторов экспрессии, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, причем каждый вектор экспрессии выбран из группы, состоящей из плазмиды; космиды; РНК; РНК, составленной с адъювантом; РНК, составленной в липосомальные частицы; самоамплифицирующейся РНК (SAM); SAM, составленной с адъювантом; SAM, составленной в липосомальные частицы; вирусного вектора; предпочтительно вектора на основе альфавируса, вектора на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вектора на основе вируса Синдбис (SIN), вирусного вектора на основе вируса леса Семлики (SFV), вектора на основе цитомегаловируса (CMV) обезьяны или человека, вектора на основе вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вектора на основе ретровируса или лентивируса, предпочтительно компетентного или некомпетентного по репликации вектора на основе аденовируса, полученного от представителей гоминид, предпочтительно полученного от шимпанзе, или бонобо, или гориллы, вектора на основе поксвируса, вектора на основе вируса осповакцины или вектора на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA).
Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей вакцину, содержащую полипептид согласно первому аспекту, нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, вектор согласно третьему аспекту настоящего изобретения или коллекцию векторов в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения и по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта.
Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к набору для вакцинации, содержащему в отдельной упаковке:
(i) вакцину, содержащую полипептид согласно первому аспекту настоящего изобретения, нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, вектор согласно третьему аспекту настоящего изобретения или коллекции векторов в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения; и
(ii) по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Прежде чем настоящее изобретение будет подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено описанными в настоящем документе конкретными методиками, протоколами и реагентами, поскольку они могут различаться. Также следует понимать, что применяемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все применяемые в настоящем документе технические и научные термины имеют те же значения, которые обычно понятны рядовому специалисту в данной области.
Предпочтительно применяемые в настоящем документе термины определены, как описано в "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland), и как описано в "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" Axel Kleemann and Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", под редакцией Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, и фармакопее Соединенных Штатов-25/Национальном формуляре-20, опубликованных United States Pharmcopeial Convention, Inc., Rockville Md., 2001.
В настоящем описании и нижеследующей формуле изобретения, если контекст не требует иного, слово «содержать» и варианты, такие как «содержит» и «содержащий», будут подразумевать включение заявленного признака, целого числа или стадии или группы признаков, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого признака, целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий. В следующих параграфах различные аспекты настоящего изобретения определены более подробно. Каждый определенный таким образом аспект может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если явно не указано иное. В частности, любой признак, указанный как предпочтительный или преимущественный, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или преимущественные.
В тексте настоящего описания приведены несколько документов. Каждый из документов, приведенных в настоящем документе (в том числе все патенты, патентные заявки, научные публикации, спецификации производителя, инструкции и т.д.), независимо от того, приведены они выше или ниже, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Ничто в настоящем документе не должно толковаться как признание того, что настоящее изобретение не имеет права претендовать на первенство в подаче настоящего раскрытия в силу предшествующего изобретения.
Определения
Ниже приведены некоторые определения терминов, часто применяемых в настоящем описании. Такие термины, в каждом случае их применения, в остальной части описания будут иметь соответственно определенное значение и предпочтительные значения.
Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» в настоящем документе применяют взаимозаменяемо, и они понимаются как полимерная или олигомерная макромолекула, состоящая из мономеров в виде нуклеотидов. Мономеры в виде нуклеотидов состоят из азотистого основания, пятиуглеродного сахара (такого как без ограничения рибоза или 2'-дезоксирибоза) и от одной до трех фосфатных групп. Как правило, нуклеиновая кислота образуется посредством фосфодиэфирных связей между отдельными мономерами в виде нуклеотидов. В контексте настоящего изобретения предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот включают без ограничения рибонуклеиновую кислоту (РНК), модифицированную РНК, дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и их смеси, такие как, например, гибриды РНК-ДНК. Нуклеиновые кислоты, например, могут быть химически синтезированы, например, в соответствии с фосфотриэфирным методом (см., например, Uhlmann, Е. & Peyman, А. (1990) Chemical Reviews, 90, 543-584).
В контексте настоящего документа термин «белок», «пептид», «полипептид», «пептиды» и «полипептиды» по всему тексту применяют взаимозаменяемо. Эти термины в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения как встречающихся в природе пептидов, например, встречающихся в природе белков, так и синтезированных пептидов, которые могут включать встречающиеся или не встречающиеся в природе аминокислоты.
Термин «неоантиген» применяют в контексте настоящего изобретения для обозначения антигена, отсутствующего в нормальных/зародышевых клетках, но который встречается в трансформированных, в частности, в раковых клетках. Неоантиген может содержать один или несколько, например, 2, 3, 4, 5 или более неоэпитопов. Предпочтительно, чтобы длина каждого неоантигена, включенного в полипептид по настоящему изобретению, была выбрана таким образом, чтобы обеспечивалась низкая вероятность того, что они будут содержать эпитопы, которые встречаются в нормальных/зародышевых клетках. Как правило, это может обеспечиваться за счет того, что неоантиген содержит 12 или менее аминокислот в сторону С-конца и/или N-конца от аминокислотного(-ых) изменения(-й), которое(-ые) привело(-и) к образованию неоэпитопа.
Мутированный онкобелок образуется в результате мутации, возникающей на уровне ДНК, и при этом мутированный белок может предусматривать
a) одно или несколько единичных аа изменений, обусловленных несинонимичной SNV вследствие точечной мутации; и/или
b) аминокислотную последовательность, отличную от таковой дикого типа, образующуюся вследствие вставок/делеций, обуславливающих пептид, образующийся в результате сдвига рамки считывания; и/или
c) аминокислотную последовательность, отличную от таковой дикого типа, образующуюся вследствие изменения границ экзонов или мутаций, приводящих к сохранению интронов; и/или
d) мутированный онкобелок, образующийся в результате события слияния генов. Неоантиген, который является результатом одного или нескольких изменений по
одной аминокислоте, обусловленных несинонимичной SNV вследствие точечной мутации в геноме, в контексте настоящего изобретения называется мутантным по одной аминокислоте пептидом.
Термин «пептид, образующийся в результате сдвига рамки считывания» в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения полного не относящегося к дикому типу продукта трансляция белок-кодирующего сегмента нуклеиновой кислоты, предусматривающей мутации со вставкой или делецией, обуславливающие сдвиг открытой рамки считывания (ORF).
Термин «открытая рамка считывания», сокращенно «ORF», в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения последовательности нуклеотидов, которая может транслироваться в последовательную цепочку аминокислот. Как правило, ORF содержит старт-кодон, последующий регион, обычно имеющий длину, кратную 3 нуклеотидам, но не содержит стоп-кодон (TAG, ТАА, TGA, UAG, UAA или UGA) в данной рамке считывания. ORF кодирует белок, где аминокислоты, в которые она может транслироваться, образуют цепь посредством пептидных связей.
Неоантиген, который происходит из аминокислотной последовательности, отличной от таковой дикого типа, образующейся вследствие изменения границ экзонов или мутаций, приводящих к сохранению интронов, в контексте настоящего изобретения называется мутантным по сайту сплайсинга пептидом.
Неоантиген, который происходит из мутированного онкобелка, образующегося в результате события слияния генов, в контексте настоящего изобретения называется пептидом, образующимся в результате мутации сквозного прочитывания.
Термин «кассета экспрессии» в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит по меньшей мере одну подлежащую экспрессии последовательность нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты, кодирующей цепочку неоантигенов, слитую с инвариантной цепью по настоящему изобретению, или ее часть, функционально связанную с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. Предпочтительно кассета экспрессии включает цис-регуляторные элементы для эффективной экспрессии данного гена, такие как промотор, сайт инициации и/или сайт полиаденилирования. Предпочтительно кассета экспрессии содержит все дополнительные элементы, требуемые для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке пациента. Типичная кассета экспрессии, таким образом, содержит промотор, функционально связанный с подлежащей экспрессии последовательностью нуклеиновой кислоты, и сигналы, требуемые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайты связывания рибосом и последовательность терминации транскрипции. Дополнительные элементы кассеты могут включать, например, энхансеры. Кассета экспрессии предпочтительно также содержит область терминации транскрипции ниже структурного гена для обеспечения эффективной терминации. Область терминации может быть получена из того же гена, что и промоторная последовательность, или может быть получена из другого гена.
Термин «функционально связанный», применяемый в контексте настоящего изобретения, относится к расположению элементов, при котором описанные таким образом компоненты сконфигурированы так, чтобы выполнять свою обычную функцию. Нуклеиновая кислота «функционально связана», если она находится в функциональном отношении с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с одним или несколькими трансгенами, если он влияет на транскрипцию одного или нескольких трансгенов. Кроме того, элементы контроля, функционально связанные с кодирующей последовательностью, способны влиять на экспрессию кодирующей последовательности. Элементы контроля не обязательно должны быть расположены смежно с кодирующей последовательностью, если они выполняют функцию управления ее экспрессией. Таким образом, например, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут присутствовать промежуточные нетранслируемые, но транскрибированные последовательности, и промоторная последовательность при этом все еще считается «функционально связанной» с кодирующей последовательностью.
Термины «вектор» или «вектор экспрессии» применяют взаимозаменяемо, и они относятся к полинуклеотиду или смеси полинуклеотида и белков, которые можно вводить, или которые способны вводить коллекцию нуклеиновых кислот по настоящему изобретению или одну нуклеиновую кислоту, которая является частью коллекции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, в клетку, предпочтительно клетку млекопитающего. Примеры векторов включают без ограничения плазмиды, космиды, фаги, вирусы или искусственные хромосомы. В частности, вектор применяют для переноса промотора и коллекции нуклеиновых кислот или одной нуклеиновой кислоты, которая является частью коллекции нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, в подходящую клетку-хозяина. Векторы экспрессии могут содержать полинуклеотидные последовательности «репликона», которые содействуют автономной репликации вектора экспрессии в клетке-хозяине. Попав в клетку-хозяина, вектор экспрессии может реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, или одновременно с ней, и могут образовываться несколько копий вектора и вставленной в него ДНК. В случае применения компетентных по репликации векторов экспрессии - что часто имеет место по соображениям безопасности - вектор может не реплицироваться, а просто управлять экспрессией нуклеиновой кислоты. В зависимости от типа вектора экспрессии, вектор экспрессии может утрачиваться в ходе деления клетки, т.е. он только транзиентно экспрессирует неоантигены, кодируемые нуклеиновой кислотой, или может находиться в клетке стабильно. Векторы экспрессии, как правило, содержат кассеты экспрессии, т.е. необходимые элементы, которые обеспечивают возможность транскрипции нуклеиновой кислоты в молекулу мРНК.
Термин «последовательность контроля экспрессии» относится к метке, подходящей для определения или измерения экспрессии. Подходящие метки известны в данной области. В контексте настоящего изобретения подходящие метки могут представлять собой белковые метки, пептидные последовательности которых связаны с полипептидом по настоящему изобретению. Белковые метки могут охватывать, например, аффинные метки, обеспечивающие растворимость метки, метки для хроматографии, эпитопные метки или флуоресцентные метки. Аффинные метки присоединяют к белкам, за счет чего они могут быть очищены из их биологического источника с применением методики аффинной очистки. Они включают хитинсвязывающий белок (СВР), мальтозосвязывающий белок (МВР) и глутатион-S-трансферазу (GST). Поли(His)-метка является широко используемой меткой для белков, которая связывается с металлсодержащими матрицами. Обеспечивающие растворимость метки применяют, в частности, для рекомбинантных белков, экспрессированных у дефицитных по шаперонам видов, для содействия надлежащему сворачивания белков и предотвращения их осаждения. Они включают тиоредоксин (TRX) и поли(NANP). Некоторые аффинные метки играют двойную роль в качестве солюбилизирующего средства, такие как МВР и GST. Метки для хроматографии применяют для изменения хроматографических свойств белка с целью обеспечения различного разрешения в зависимости от конкретной методики разделения. Зачастую такие метки состоят из полианионных аминокислот, как, например, FLAG-метка. Эпитопные метки представляют собой короткие пептидные последовательности, выбираемые ввиду того, что у множества разных видов могут стабильно продуцироваться высокоаффинные антитела. Они обычно происходят из вирусных генов, что объясняет их высокую иммунореактивность. Эпитопные метки включают V5-метку, Myc-метку и HA-метку. Такие метки являются особенно пригодными для вестерн-блоттинга, экспериментов на основе иммунофлуоресценции и иммунопреципитации, хотя они также находят применение при очистке антител. Флуоресцентные метки применяют для получения визуального считывания показаний для белка. GFP и его варианты являются наиболее часто применяемыми флуоресцентными метками. Более современные применения GFP включают применение его в качестве репортера сворачивания (флуоресцентный при сворачивании, бесцветный в случае отсутствия сворачивания). Дополнительные примеры флуорофоров включают флуоресцеин, родамин и сульфоиндоцианиновый краситель Су5.
Примеры такой метки включают без ограничения AviTag, кальмодулиновую метку, полиглутаматную метку, Е-метку, FLAG-метку, НА-метку, His-метку, Мус-метку, S-метку, SBP-метку, Softag 1, Softag 3, Strep-метку, ТС-метку, У5-метку, VSV-метку, Xpress-метку, Isopeptag, SpyTag, ВССР-метку, метку, представляющую собой глутатион-S-трансферазу, метку, представляющую собой зеленый флуоресцентный белок, метку, представляющую собой мальтозосвязывающий белок, Nus-метку, тиоредоксиновую метку, Fc-метку и Ту-метку. Наиболее предпочтительной является НА-метка (последовательность пептида НА в соответствии с SEQ ID NO: 41).
Термин «антиген» в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения любой структуры, распознаваемой молекулами иммунного ответа, например, антителами, Т-клеточными рецепторами (TCR) и т.п. Предпочтительными антигенами являются клеточные белки, которые ассоциированы с конкретным заболеванием. Антигены распознаются высоковариабельными антигенными рецепторами (В-клеточным рецептором или Т-клеточным рецептором) адаптивной иммунной системы, и могут вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ. Антигены, которые вызывают такой ответ, также называют иммуногенами. Доля белков внутри клеток, независимо от того, являются ли они чужеродными или клеточными, процессируются с образованием пептидов меньшего размера, и презентируются главным комплексом гистосовместимости (МНС).
5
6
7
8
Термин «эпитоп», также известный как антигенная детерминанта, в контексте настоящего изобретения применяют для обозначения сегмента антигена, предпочтительно пептида, который связывается молекулами иммунной системы, например, В-клеточными рецепторами, Т-клеточными рецепторами или антителами. Эпитопы, связываемые антителами или В-клетками, называют «В-клеточными эпитопами», а эпитопы, связываемые Т-клетками, называют «Т-клеточными эпитопами». В этом контексте термин «связывание» предпочтительно относится к специфическому связыванию, которое определяется как связывание антитела или Т-клеточного рецептора (TCR) и соответствующего эпитопа с константой ассоциации 1×10 М-1 или выше, предпочтительно 1×10 М-1, 1×10 М-1, 1×10 М-1 или выше. Специалисту в данной области хорошо известно, как определить константу ассоциации (см., например, Caoili, S.E. (2012) Advances in Bioinformatics Vol.2012). Предпочтительно специфическое связывание антител с эпитопом опосредовано Fab-(антигенсвязывающий фрагмент)-областью антитела, специфическое связывание В-клетки опосредовано Fab-областью антитела в составе В-клеточного рецептора и специфическое связывание Т-клетки опосредовано вариабельной (V) областью Т-клеточного рецептора. Т-клеточные эпитопы презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки, где они связываются с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС). Существует по меньшей мере два разных класса молекул МНС, называемых МНС класса I, II соответственно. Эпитопы, презентируемые посредством MHC-I-пути, вызывают ответ посредством цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+ клеток), тогда как эпитопы, презентируемые посредством МНС-II-пути, вызывают ответ посредством Т-хелперов (CD4+ клеток). Т-клеточные эпитопы, презентируемые молекулами МНС класса I, как правило, представляют собой пептиды длиной 8-11 аминокислот, и Т-клеточные эпитопы, презентируемые молекулами МНС класса II, как правило, представляют собой пептиды длиной 13-17 аминокислот. Молекулы МНС класса III также презентируют непептидные эпитопы, такие как гликолипиды. Соответственно, термин «Т-клеточный эпитоп» предпочтительно относится к пептидам длиной 8-11 или 13-17 аминокислот, которые могут быть презентированы молекулами либо МНС класса I, либо МНС класса II. Эпитопы обычно состоят из химически активных групп на поверхности аминокислот, которые могут нести или могут не нести боковые цепи из сахаров, и обычно обладают специфическими характеристиками трехмерной структуры, а также специфическими характеристиками заряда. Конформационный и неконформационный эпитоп отличаются тем, что связывание с первым, но не с последним, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей.
Термин «аминокислотная последовательность Т-клеточного усилителя» относится к полипептидной последовательности, которая при слиянии с антигенной последовательностью обеспечивает повышение индукции Т-клеток в отношении неоантигенов в контексте генной вакцинации. Примерами Т-клеточных усилителей являются последовательность инвариантной цепи или ее фрагмент; лидерная последовательность тканевого активатора плазминогена, необязательно включающая шесть дополнительных нижерасположенных аминокислотных остатков; последовательность PEST; бокс деструкции циклина; сигнал убиквитинирования; сигнал сумоилирования.
Подразумевается, что термины «препарат» и «композиция», применяемые в контексте настоящего изобретения, включают состав на основе активного соединения, например, вектора на основе аденовируса представителей гоминид по настоящему изобретению, с носителем и/или вспомогательным веществом.
Термин «фармацевтически приемлемый», применяемый в контексте настоящего изобретения, означает одобренный регулирующим органом федерального или регионального правительства или внесенный в список фармакопеи США или другой общепризнанной фармакопеи для применения у животных и, в частности, у людей.
Термин «носитель» в контексте настоящего документа относится к фармакологически неактивному веществу, такому как без ограничения разбавитель, вспомогательное вещество, поверхностно-активные вещества, стабилизаторы, физиологические буферные растворы или инертные вещества, с которыми вводят терапевтически активный ингредиент. Такие фармацевтические носители могут быть жидкими или твердыми. Жидкие носители включают без ограничения стерильные жидкости, такие как солевые растворы в воде и маслах, включая без ограничения таковые петролейного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъецируемых растворов. Если фармацевтическую композицию вводят внутривенно, предпочтительным носителем является солевой раствор. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" под авторством Е.W. Martin.
Подходящие фармацевтические «вспомогательные вещества» включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п.
«Поверхностно-активные вещества» включают анионные, катионные и неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как без ограничения дезоксихолат натрия, додецилсульфат натрия, Triton Х-100 и полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60, полисорбат 65 и полисорбат 80.
«Стабилизаторы» включают без ограничения маннит, сахарозу, трегалозу, альбумин, а также антагонисты протеаз и/или нуклеаз.
«Физиологический буферный раствор», который можно применять в контексте настоящего изобретения, включает без ограничения раствор хлорида натрия, деминерализованную воду, а также подходящие органические или неорганические буферные растворы, такие как без ограничения фосфатный буфер, цитратный буфер, трис-буфер (трис(гидроксиметил)аминометан), буфер HEPES ([4-(2-гидроксиэтил)пиперазино]этансульфоновая кислота) или буфер MOPS (3-морфолино-1-пропансульфоновая кислота). Выбор соответствующего буфера в целом зависит от молярности буфера. Фосфатный буфер подходит, например, для инъекционных и инфузионных растворов.
«Эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» представляет собой количество терапевтического средства, достаточное для достижения предполагаемой цели. Эффективное количество данного терапевтического средства будет варьироваться в зависимости от таких факторов, как природа средства, путь введения, размер и вид животного, которое будет получать терапевтическое средства, и цели введения. Эффективное количество в каждом отдельном случае может быть определено эмпирически специалистом в данной области в соответствии с устоявшимися в данной области способами.
В контексте настоящего документа «лечить», «осуществление лечения», «лечение» или «терапия» заболевания или нарушения означает осуществление одного или нескольких из следующего: (а) уменьшение тяжести нарушения; (b) ограничение или предупреждение развития симптомов, характерных для подлежащего(-их) лечению нарушения(-й); (с) ингибирование ухудшения симптомов, характерных для подлежащего(-их) лечению нарушения(-й); (d) ограничение или предупреждение рецидива нарушения(-й) у индивидуума, у которого ранее наблюдалось(-ись) нарушение(-я); и (е) ограничение или предупреждение рецидива симптомов у индивидуумов, у которых ранее наблюдались симптомы нарушения(-й).
Аспекты настоящего изобретения и предпочтительные варианты осуществления
Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к полипептиду, содержащему по меньшей мере четыре разных опухолеспецифических неоантигена и по меньшей мере одну аминокислотную последовательность Т-клеточного усилителя.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что эффективность лечения в рамках терапевтического плана с крупными развившимися опухолями зависит от числа иммуногенных неоантигенов, вызывающих Т-клеточные ответы. Это является особенно очевидным в контексте совместного введения с модулятором молекулы, являющейся контрольной точкой. Если число иммуногенных неоантигенов превышает 3, результат лечения значительно улучшается. «Иммуногенный» в этом контексте означает способность вызывать Т-клеточный ответ у пациента. Следовательно, в целом предпочтительно, чтобы по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 из неоантигенов были иммуногенными (вызывали Т-клеточный ответ у пациента). Специалисту в данной области хорошо известно, как измерять Т-клеточный ответ у пациента. Один из возможных способов описан ниже в разделе Примеры.
Для последовательного достижения такого минимального числа иммуногенных неоантигенов, особенно предпочтительно, чтобы полипептид согласно первому аспекту содержал по меньшей мере 25 опухолеспецифических неоантигенов, предпочтительно по меньшей мере 26, 27, 28, 29 или 30 опухолеспецифических неоантигенов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 31. Хотя в разделе Примеры в настоящем документе представлено применение 31 опухолеспецифического неоантигена, разумеется, возможным является, и в пределах объема настоящего изобретения, увеличение числа дополнительно, например, до по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45 или по меньшей мере 50 опухолеспецифических неоантигенов. Предпочтительно полипептид содержит от (и включительно) 25 до 200, более предпочтительно от 25 до 150, даже более предпочтительно от 25 до 100 или наиболее предпочтительно от 25 до 80 опухолеспецифических неоантигенов. Более предпочтительно полипептид содержит от (и включительно) 31 до 200, более предпочтительно от 31 до 150, даже более предпочтительно от 31 до 100 или наиболее предпочтительно от 31 до 80 опухолеспецифических неоантигенов. В целом в отношении любого упоминаемого в настоящем документе минимального числа предпочтительно, чтобы верхний предел опухолеспецифических неоантигенов составлял 80. Это обусловлено не тем, что невозможно включить более 80, а с целью более быстрого получения вакцины.
Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 25 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 26 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 27 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 28 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 29 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 30 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 31 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 35 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 40 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 45 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы по меньшей мере 50 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Кроме того, предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 25 до 200 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 25 до 150 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 25 до 100 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 25 до 80 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 31 до 200 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 31 до 150 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 31 до 100 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными. Предпочтительно, чтобы от по меньшей мере 31 до 80 опухолеспецифических неоантигенов, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 (с возрастающим предпочтением) неоантигенов были иммуногенными.
Также в целом предпочтительно, чтобы опухоль была по меньшей мере на стадии Tis или Т1 (исключая Тх и Т0), предпочтительно по меньшей мере на стадии Т2, Т3 или Т4. Опухоль может находиться одновременно на всех стадиях N (например, Nx или N0) и М (например, М0), и согласно предпочтительному варианту осуществления по меньшей мере на стадии N1, N2 или N3 и/или M1. Указанное относится к классификации TNM, согласно которой стадии опухоли определены следующим образом:
Т: размер или непосредственное распространение первичной опухоли
Тх: опухоль не может быть оценена
Tis: карцинома in situ
Т0: данные об опухоли отсутствуют
T1, Т2, Т3, Т4: данные о первичной опухоли, размер и/или степень распространенности, возрастающие со стадией
N: степень распространенности в регионарные лимфатические узлы
Nx: лимфатические узлы не могут быть оценены
N0: метастазы в регионарных лимфатических узлах отсутствуют
N1: наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах; в некоторых участках опухоль распространяется в небольшое число регионарных лимфатических узлов, или ближайшие из них.
N2: опухоль распространяется в пределах от N1 до N3 (N2 не применяют для всех участков)
N3: опухоль распространяется в более отдаленные или численные регионарные лимфатические узлы (N3 не применяют для всех участков)
М: наличие отдаленных метастазов
М0: отдаленные метастазы отсутствуют
M1: метастазирование отдаленных органов (за пределами регионарных лимфатических узлов).
Иллюстративными стадиями, в отношении которых предусматривается польза, в частности, от настоящего изобретения, являются Tis и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3) и любая из М (предпочтительно M1), Т1 и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3) и любая из М (предпочтительно M1), Т2 и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3) и любая из М (предпочтительно M1), Т3 и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3) и любая из М (предпочтительно M1), и Т4 и любая из N (предпочтительно N1, или N2, или N3), и любая из М (предпочтительно M1). Наличие опухоли и ее распространение у пациента может быть обнаружено с применением способов визуализации, например, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонанс ной томографии (MRI), радиоизотопной диагностики с использованием меченых атомов, которые обнаруживают с помощью сцинтиграфии в рамках позитронной эмиссионной томографии (PET), или их комбинации. Способы визуализации также можно сочетать с другими способами, такими как, например, ультразвуковое исследование, эндоскопическое исследование, маммография, обнаружение биомаркеров в крови, тонкоигольная биопсия или их комбинация. Размер опухолей, который может быть обнаружен с помощью способов визуализации, зависит от применяемого способа и составляет приблизительно 1,5 см в диаметре для визуализации с использованием изотопов, приблизительно 3 мм в диаметре для СТ и MRI и приблизительно 7 мм в диаметре для способов на основе PET (Erdi. (2012) Molecular Imaging and Radionuclide Therapy 21(1): 23).
Предпочтительно наличие опухоли («подтвержденный случай») определяют с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из обнаружения циркулирующей внеклеточной опухолевой ДНК, компьютерной томографии (СТ), магнитно-резонансной томографии (MRI), радиоизотопной диагностики с использованием меченых атомов, которые обнаруживают с помощью сцинтиграфии в рамках позитронной эмиссионной томографии (PET), и любой комбинации вышеперечисленного. Согласно одному варианту осуществления один или несколько из вышеперечисленных способов, или их комбинацию, сочетают со способом из группы, состоящей из ультразвукового исследования, эндоскопического исследования, маммографии, обнаружения биомаркеров в крови, тонкоигольной биопсии и любой комбинации вышеперечисленного.
Согласно предпочтительному варианту осуществления опухоль характеризуется наличием очага по меньшей мере приблизительно 3 мм в диаметре, предпочтительно по меньшей мере 7 мм в диаметре и более предпочтительно по меньшей мере 1,5 см в диаметре.
Предпочтительно опухолеспецифический неоантиген независимо выбран из группы, состоящей из мутантного по одной аминокислоте пептида, пептида, образующегося в результате сдвига рамки считывания, пептида, образующегося в результате мутации сквозного прочитывания, и мутантного по сайту сплайсинга пептида.
Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом полипептид содержит по меньшей мере пять белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Предпочтительно, чтобы полипептид содержал по меньшей мере десять белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Также предпочтительно, чтобы полипептид содержал по меньшей мере пятнадцать белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Также предпочтительно, чтобы полипептид содержал по меньшей мере двадцать белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Также предпочтительно, чтобы полипептид содержал по меньшей мере двадцать пять белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены. Более предпочтительно полипептид содержит по меньшей мере тридцать белковых фрагментов, содержащих опухолеспецифические неоантигены.
Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения полипептид содержит по меньшей мере пять, по меньшей мере десять, по меньшей мере пятнадцать, по меньшей мере двадцать и предпочтительно по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более опухолеспецифических неоантигенов. Предпочтительно полипептид содержит от 5 до 200, более предпочтительно от 15 до 150, даже более предпочтительно от 25 до 100 или более предпочтительно от 30 до 50 опухолеспецифических неоантигенов.
Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имеют длину от 8 до 50 аминокислот. Предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 9 до 45 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 10 до 40 аминокислот. Также предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 15 до 35 аминокислот. Также предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 12 до 30 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 13 до 28 аминокислот. Более предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 14 до 45 аминокислот. Даже более предпочтительно, чтобы опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имели длину от 15 до 35 аминокислот. Наиболее предпочтительно опухолеспецифические неоантигены независимо друг от друга имеют длину 25 аминокислот.
Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения каждый из опухолеспецифических неоантигенов независимо друг от друга имеет длину от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длину от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот.
Предпочтительно полипептид содержит от 5 до 200 опухолеспецифических неоантигенов длиной от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длиной от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот; более предпочтительно от 15 до 150 опухолеспецифических неоантигенов длиной от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длиной от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот; даже более предпочтительно от 25 до 100 опухолеспецифических неоантигенов длиной от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длиной от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот; или более предпочтительно от 30 до 50 опухолеспецифических неоантигенов длиной от 8 до 50 аминокислот, предпочтительно длиной от 15 до 35, более предпочтительно 25 аминокислот.
Общая длина неоантигенов в пределах пептида предпочтительно находится в диапазоне от 100 до 2000 аминокислот. Более предпочтительно от 500 до 1000 аминокислот.
Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения каждый опухолеспецифический неоантиген независимо выбран из группы, состоящей из мутантного по одной аминокислоте пептида, пептида, образующегося в результате сдвига рамки считывания, пептида, образующегося в результате мутации сквозного прочитывания, и мутантного по сайту сплайсинга пептида. Предпочтительно по меньшей мере 80% опухолеспецифических неоантигенов являются мутантным по одной аминокислоте пептидом, более предпочтительно по меньшей мере 85% опухолеспецифических неоантигенов являются мутантным по одной аминокислоте пептидом, более предпочтительно по меньшей мере 90% опухолеспецифических неоантигенов являются мутантным по одной аминокислоте пептидом и более предпочтительно по меньшей мере 95% опухолеспецифических неоантигенов являются мутантным по одной аминокислоте пептидом.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения опухолеспецифические неоантигены непосредственно связаны друг с другом.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения между каждым неоантигеном или между группами неоантигенов включены аминокислотные линкерные последовательности. Подходящие линкерные последовательности хорошо известны в данной области, и предпочтительно содержат от 1 до 10 аминокислот, или состоят из них. Линкер предпочтительно содержит небольшие аминокислоты, такие как Ser и Gly, или состоит из них.
Согласно другому варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения между каждым неоантигеном или между группами неоантигенов включены аминокислотные линкерные последовательности. Предпочтительно линкеры могут происходить из встречающихся в природе мультидоменных белков или могут быть получены путем конструирования. Линкеры включают гибкие линкеры и/или расщепляемые in vivo линкеры, которые могут быть обработаны клеточными протеазами.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения аминокислотная последовательность Т-клеточного усилителя выбрана из группы, состоящей из инвариантной цепи; лидерной последовательности тканевого активатора плазминогена (ТРА); последовательности PEST; бокса деструкции циклина; сигнала убиквитинирования; сигнала сумоилирования.
Предпочтительно, чтобы аминокислотная последовательность Т-клеточного усилителя была помещена со стороны N-конца в пределах полипептида, более предпочтительно на N-конце полипептида по настоящему изобретению.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения ТРА представляет собой удлиненную лидерную последовательность ТРА, предусматривающую лидерную последовательность ТРА и от двух до десяти, предпочтительно от четырех до восьми и более, предпочтительно шесть остатков ТРА непосредственно вблизи лидерной последовательности ТРА со стороны ее С-конца. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что наличие этих дополнительных остатков повышает надежность правильного расщепления лидерной последовательности («правильное» означает, что лидерная последовательность отщепляется именно по тому остатку, что и в ТРА дикого типа). Они обнаружили, что введение только лидерной последовательности может привести к расщеплению в пределах части неоантигена, и это привело бы к отщеплению участка цепочки неоантигенов. Предпочтительно, чтобы ТРА присутствовал на N-конце полипептида в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения. Предпочтительно ТРА, который может быть включен в полипептид по настоящему изобретению, имеет аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 42.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения инвариантная цепь выбрана из группы, состоящей из:
(a) инвариантной цепи человека в соответствии с SEQ ID NO: 36, инвариантной цепи мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37 и инвариантной цепи рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38;
(b) иммуностимулирующего фрагмента инвариантной цепи в соответствии с (а); и/или
(c) иммуностимулирующего варианта (а) или (b), причем вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей с инвариантной цепью в соответствии с (а) или ее фрагментом в соответствии с (b).
Предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой инвариантную цепь человека в соответствии с SEQ ID NO: 36. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой инвариантную цепь мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой инвариантную цепь рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38. Такие инвариантные цепи описаны в уровне техники, например, в WO 2007/062656.
Предпочтительно инвариантная цепь представляет собой иммуностимулирующий фрагмент инвариантной цепи человека в соответствии с SEQ ID NO: 36. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой иммуностимулирующий фрагмент инвариантной цепи мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой инвариантную цепь рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38. Такие фрагменты были описаны в уровне техники, например, WO 2010/057501 и WO 2015/082922. Особенно предпочтительные фрагменты содержат фрагмент SEQ ID NO: 38, или состоят из него, в частности, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39 или 40, или состоящего из нее.
Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой иммуностимулирующий вариант инвариантной цепи человека в соответствии с SEQ ID NO: 36, причем вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей и даже более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с инвариантной цепью в соответствии с SEQ ID NO: 36. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой иммуностимулирующий вариант инвариантной цепи мыши в соответствии с SEQ ID NO: 37, причем вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей и даже более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с инвариантной цепью в соответствии с SEQ ID NO: 37. Также предпочтительно, чтобы инвариантная цепь представляла собой иммуностимулирующий вариант инвариантной цепи рыбы-мандаринки в соответствии с SEQ ID NO: 38, причем вариант характеризуется по меньшей мере 70% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 75% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей и даже более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичностью последовательностей с инвариантной цепью в соответствии с SEQ ID NO: 38.
Термин «иммуностимулирующий вариант» иммуностимулирующего фрагмента инвариантной цепи в контексте настоящего изобретения означает, что активность в анализе, с помощью которого оценивают иммуностимулирующую активность неоантигена (см., например, примеры ниже), составляет по меньшей мере 50% активности, измеренной для неизмененной инвариантной цепи или ее фрагмента. Предпочтительно указанный вариант обладает по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, наиболее предпочтительно такой же или более высокой иммуностимулирующей активностью.
Также предпочтительно, чтобы полипептид не содержал MITD (сигнал транспортировки МНС класса I), поскольку это бы привело к направлению полипептида в мембрану эндоплазматического ретикулума после экспрессии, что является нежелательным. Даже более предпочтительно, соответственно, чтобы полипептид в целом не содержал элемент, направляющий его в мембрану эндоплазматического ретикулума после экспрессии. Согласно конкретному варианту осуществления полипептид связан на С-конце с меткой (последовательностью контроля экспрессии), как определено в настоящем документе. Согласно такому варианту осуществления предпочтительно, чтобы метка находилась на С-конце полипептида (т.е. чтобы не было дополнительного элемента). Если полипептид не содержит метку, предпочтительно, чтобы С-конец полипептида представлял собой неоантиген (т.е. чтобы не было дополнительного элемента, не являющегося неоантигеном).
Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид согласно первому аспекту настоящего изобретения.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к вектору, содержащему нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, функционально связанную с последовательностью контроля экспрессии.
Согласно предпочтительному варианту осуществления коллекции векторов экспрессии согласно седьмому аспекту, каждый вектор экспрессии из коллекции независимо выбран из группы, состоящей из плазмиды; космиды; РНК; РНК, составленной с адъювантом; РНК, составленной в липосомальные частицы; самоамплифицирующейся РНК (SAM); SAM, составленной с адъювантом; SAM, составленной в липосомальные частицы; вирусного вектора; предпочтительно вектора на основе альфавируса, вектора на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вектора на основе вируса Синдбис (SIN), вирусного вектора на основе вируса леса Семлики (SFV), также предпочтительно компетентного или некомпетентного по репликации вектора на основе аденовируса, предпочтительно полученного от шимпанзе, или бонобо, или гориллы, вектора на основе поксвируса, вектора на основе вируса осповакцины или вектора на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA), вектора на основе цитомегаловируса (CMV) обезьяны или человека, вектора на основе вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вектора на основе ретровируса или лентивируса. Предпочтительно, чтобы все векторы экспрессии, применяемые для одной коллекции, были одного типа, например, представляли собой некомпетентные по репликации векторы на основе аденовируса.
Наиболее предпочтительными векторами экспрессии являются векторы на основе аденовируса, в частности, векторы на основе аденовируса, полученного от человека или представителей гоминид, отличных от человека. Предпочтительными представителями гоминид, от которых получают аденовирусы, являются шимпанзе (Pan), горилла (Gorilla) и орангутаны (Pongo), предпочтительно бонобо (Pan paniscus) и обыкновенный шимпанзе (Pan troglodytes). Как правило, встречающиеся в природе аденовирусы представителя гоминид, отличного от человека, выделяют из образцов кала соответствующего представителя гоминид. Наиболее предпочтительными векторами являются нереплицирующиеся векторы на основе аденовируса на основе векторов hAd5, hAd11, hAd26, hAd35, hAd49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd55, ChAd63, ChAd73, ChAd82, ChAd83, ChAdl46, ChAdl47, PanAd1, PanAd2 и PanAd3 или компетентных по репликации векторов Ad4 и Ad7. Аденовирусы человека hAd4, hAd5, hAd7, hAd11, hAd26, hAd35 и hAd49 хорошо известны в данной области. Векторы на основе встречающихся в природе ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd6, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, ChAd44, ChAd63 и ChAd82 подробно описаны в WO 2005/071093. Векторы на основе встречающихся в природе PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAdl46 и ChAdl47 подробно описаны в WO 2010/086189.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к коллекции одного или нескольких векторов экспрессии, каждый из которых содержит нуклеиновую кислоту согласно пункту 11, причем каждый вектор экспрессии выбран из группы, состоящей из плазмиды; космиды; РНК; РНК, составленной с адъювантом; РНК, составленной в липосомальные частицы; самоамплифицирующейся РНК (SAM); SAM, составленной с адъювантом; SAM, составленной в липосомальные частицы; вирусного вектора; предпочтительно вектора на основе альфавируса, вектора на основе вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вектора на основе вируса Синдбис (SIN), вирусного вектора на основе вируса леса Семлики (SFV), вектора на основе цитомегаловируса (CMV) обезьяны или человека, вектора на основе вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), вектора на основе ретровируса или лентивируса, предпочтительно компетентного или некомпетентного по репликации вектора на основе аденовируса, полученного от представителя гоминид, предпочтительно полученного от шимпанзе, или бонобо, или гориллы, вектора на основе поксвируса, вектора на основе вируса осповакцины или вектора на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA).
Согласно пятому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей вакцину, содержащую полипептид согласно первому аспекту, нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, вектор согласно третьему аспекту настоящего изобретения или коллекцию векторов в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения и по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, для применения в предупреждении или лечении пролиферативного заболевания у субъекта.
Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с пятым аспектом модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, выбран из группы, состоящей из:
(a) агониста члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF), предпочтительно CD27 (например, варлилумаба), CD40 (например, СР-870,893), ОХ40 (например, INCAGN01949 или MEDI0562), GITR (например, MEDI1873) или CD137 (например, утомилумаба);
(b) антагониста PD-1 (например, антитела, такого как пембролизумаб или ниволумаб), PD-L1 (например, антитела, такого как атезолизумаб), CD274 (атезолизумаб или дурвалумаб), A2AR (например, преладенант), В7-Н3 (например, MGA271), В7-Н4, BTLA, CTLA-4 (например, тремелимумаб или AGEN1884), IDO, KIR, LAG3, TIM-3 (например, СА-327 или RMT3-23) или VISTA (например, СА-170) или антагониста члена суперсемейства B7-CD28, предпочтительно CD28 или ICOS, или антагониста их лиганда.
Предпочтительными иммуномодуляторами являются факторы роста Т-клеток, такие как IL-2, IL-12 или IL-15.
Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения введение модулятора молекулы, являющейся контрольной точкой, начинается до начала введения вакцины, или введение ингибитора контрольной точки начинается после начала введения вакцины, или введение ингибитора контрольной точки начинается одновременно с началом введения вакцины.
Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения схема вакцинации представляет собой гетер о логичную схему прайм-буст с использованием двух разных вирусных векторов. Предпочтительными комбинациями являются вектор на основе аденовируса, полученного от представителей гоминид, для примирования, и вектор на основе поксвируса, вектор на основе вируса осповакцины или вектор на основе модифицированного вируса осповакцины Анкара (MVA) для стимуляции. Предпочтительно их вводят последовательно с интервалом по меньшей мере 1 неделя, предпочтительно 6 недель.
Согласно предпочтительному варианту осуществления в соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения субъект подвержен риску развития или страдает от:
(a) злокачественных новообразований губы, ротовой полости и глотки; и/или
(b) злокачественных новообразований органов пищеварения; и/или
(c) злокачественных новообразований респираторных органов и органов грудной полости; и/или
(d) злокачественных новообразований кости и суставного хряща; и/или
(e) меланомы и других злокачественных новообразований кожи; и/или
(f) злокачественных новообразований мезотелиальной и мягкой ткани; и/или
(g) злокачественного новообразования молочной железы; и/или
(h) злокачественных новообразований женских половых органов; и/или
(i) злокачественных новообразований мужских половых органов; и/или
(j) злокачественных новообразований мочевыводящих путей; и/или
(k) злокачественных новообразований глаза, головного мозга и других частей центральной нервной системы; и/или
(l) злокачественных новообразований щитовидной железы и других желез внутренней секреции; и/или
(m) злокачественных новообразований лимфоидной, кроветворной и связанных с ними тканей.
В целом предпочтительно, чтобы у субъекта наблюдалась опухоль на стадии TNM, как описано выше.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления опухоль характеризуется наличием очага по меньшей мере приблизительно 3 мм в диаметре, предпочтительно по меньшей мере 7 мм в диаметре и более предпочтительно по меньшей мере 1,5 см в диаметре.
Согласно шестому аспекту настоящее изобретение относится к набору для вакцинации, содержащему в отдельной упаковке:
(i) вакцину, содержащую полипептид согласно первому аспекту настоящего изобретения, нуклеиновую кислоту согласно второму аспекту настоящего изобретения, вектор согласно третьему аспекту настоящего изобретения или коллекции векторов в соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения; и
(ii) по меньшей мере один модулятор молекулы, являющейся контрольной точкой, или нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор, или вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую модулятор.
Примеры
Пример 1. Слияние неоантигенов либо с инвариантной цепью, либо с последовательностью ТРА обеспечивает восстановление иммуногенности в контексте вакцинации GAd.
Вектор на основе аденовируса представителя гоминид, кодирующий пентатоп, содержащий 5 неоантигенов, которому предшествует инициирующий метионин (СТ26-5; SEQ ID NO: 32), полученный из опухоли СТ26 мыши, неспособен индуцировать иммунный ответ в отношении раковых антигенов, если не поместить последовательность INV на N-конце неоантигенов (СТ26-5 INV; SEQ ID NO: 33). Способность к восстановлению иммуногенности достигалась также при слиянии последовательности ТРА со стороны N-конца с цепочкой, кодирующей 5 неоантигенов (СТ26-5 ТРА; SEQ ID NO: 3).
Выбранные неоантигены образовывались в результате 5 несинонимичных однонуклеотидных вариаций (SNV), наиболее распространенного типа мутаций, обнаруживаемых в опухолях. Аминокислотная последовательность каждого неоантигена содержала расположенную в его центре мутированную аминокислоту, фланкированную как выше, так и ниже по последовательности 12 аминокислотами дикого типа (wt), при этом общая длина составляла 25аа (таблица 1). Последовательности неоантигенов соединены по принципу «голова к хвосту» с образованием искусственного антигена, слитого ниже по последовательности с последовательностью пептида НА с целью отслеживания его экспрессии (SEQ ID NO: 41).
8
Иммуногенность оценивали у инбредных мышей BalBC после единичной внутримышечной иммунизации в дозе 5×10 вирусных частиц GAd (vp) для каждой из 3 вакцин. Спленоциты собирали через три недели после иммунизации и тестировали с помощью ELISpot по IFN-γ путем стимулирования клеток в присутствии пула синтетических пептидов, соответствующих каждому из 5 неоантигенов. Иммунные ответы (число продуцирующих IFN-γ Т-клеток на миллион спленоцитов) показаны на фиг. 1. Ответы считали положительными, если (i) среднее по лункам с антигенами составляло более 20 пятнообразующих колоний SFC/106 РВМС, и (ii) в 3 раза превышало фоновое значение для лунок, инкубированных с DMSO в качестве разбавителя для пептидов. Как показано на фиг. 1, добавление либо INV, либо ТРА обеспечивало превращение неиммуногенного антигена СТ26-5 в иммуногенный антиген со 100% частотой ответа у вакцинированных животных.
Пример 2. Для получения синергической активности вакцины и антитела к PD-1 в условиях агрессивной терапии требуется большое число неоантигенов.
Был сконструирован второй вектор на основе аденовируса представителя гоминид (GAd-CT26-31 ТРА), соответствующий более длинной конструкции, кодирующей 31 неоантиген с последовательностью ТРА на N-конце (СТ26-31 ТРА, SEQ ID 35). Предпочтительная применяемая последовательность ТРА характеризовалась аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 42. Выбранные мутации, обуславливающие образование неоантигенов, представляли собой 31 несинонимичную SNV (таблица 2), 3 из которых также присутствовали в векторе GAd-CT26-5 ТРА, кодирующем более короткую конструкцию СТ26-5 ТРА (таблица 1). Аминокислотная последовательность каждого из 31 неоантигена содержала расположенную в его центре мутированную аминокислоту, фланкированную как выше, так и ниже по последовательности 12 аминокислотами wt, при этом общая длина составляла 25аа (таблица 1). Исключением являлся неоантиген ID 6 (таблица 2), в котором выше по последовательности присутствовали только 6 аминокислот wt, соответствующие N-концу мутированного белка и неоантигену SEQ ID: 16 (таблица 2), где дополнительная мутация, возникающая в результате дополнительной SNV, присутствовала в вышерасположенном сегменте из аминокислот (таблица 2). Аминокислотные последовательности неоантигенов были соединены по принципу «голова к хвосту» в порядке, показанном в таблице 2, и с целью отслеживания экспрессии на С-конце подвергнутых сборке неоантигенов добавляли последовательность пептида НА (SEQ ID NO: 41).
8
Иммуногенность GAd-CT26-5 ТРА (короткая конструкция) и GAd-CT26-31 ТРА (длинная конструкция) определяли in vivo путем иммунизации интактных мышей BalbC внутримышечно однократно в дозе 5×10 вирусных частиц (vp). Т-клеточные ответы измеряли через 3 недели после иммунизации с помощью ELISpot по iNFγ на предмет распознавания отдельных пептидов, соответствующих мутированным 25-мерным последовательностям, кодируемым конструкциями вакцины. Конструкция меньшего размера (СТ26-5 ТРА) индуцировала Т-клеточный ответ только в отношении 3 неоантигенов. При этом вакцинация СТ26-31 ТРА обеспечивала индукцию Т-клеточных ответов в отношении 8 из 31 неоантигена (фиг. 2), включая 3 неоантигена, общих для конструкции СТ26-5.
8
6
Чтобы определить, является ли общее количество присутствующих в вакцине иммуногенных неоантигенов критическим фактором, авторы настоящего изобретения оценили эффективность вакцинации для двух конструкций, как в условиях профилактики, так и в условиях агрессивной терапии. В случае условий профилактики, авторы настоящего изобретения сперва провели вакцинацию один раз с помощью GAd-CT26-31 ТРА или GAd-СТ26-5 ТРА (5×10 vp/мышь) внутримышечно, а затем через 15 дней после вакцинации инокулировали опухолевые клетки (2×10 клеток на мышь). Все вакцинированные мыши (100%), независимо от типа применяемой конструкции, были без опухоли, тогда как все контрольные мыши, вакцинированные имитирующей вакциной, погибали спустя 4 недели из-за наличия очень крупных опухолей.
6
3
8
Для имитации условий терапии мышам BALB/c прививали опухолевые клетки СТ26 (2×10 клеток на мышь). Показатели опухолевой массы измеряли с течением времени, и лечение начинали в том случае, когда опухолевая масса становилась заметной, и средний объем достигал 70 мм. Терапевтическую эффективность лечения с использованием GAd-СТ26-31 ТРА и GAd-CT26-5 ТРА по отдельности или в комбинации с антителом к PD1 (клон RMP1-14, Bioxcell) затем оценивали путем начального лечения развившихся опухолей с помощью внутримышечной инъекции одной дозы вакцины GAd-CT26-31 ТРА или GAd-CT26-5 ТРА (5×10 vp) и внутрибрюшинной инъекции антитела к PD1. Лечение с помощью антитела к PD-1 продолжали в течение 2 недель (дни 3, 6,9, 13 или 16).
Их результатов видно, что вакцинация с помощью GAd-CT26-31 ТРА и GAd-CT26-5 ТРА без лечения антителом к PD1 не была эффективной в этих условиях, и все мыши погибали спустя 4 недели из-за наличия очень крупных опухолей, как и в случае не подвергавшихся лечению мышей. Следовательно, при применении обоих вакцин в качестве самостоятельного лечения излечивание животных не представлялось возможным, в отличие от тех результатов, которые наблюдались в условиях профилактики. Монотерапия антителом к PD-1 или комбинация терапии антителом к PD-1 с вакцинацией GAd-CT26-5 ТРА обуславливали сокращение размеров опухоли лишь у 15% подвергнутых лечению мышей. В отличие от этого, комбинация лечения антителом к PD-1 с вакцинацией с использованием GAd-CT26-31 ТРА, кодирующей длинную конструкцию, обеспечивала заметную противораковую активность с сокращением размеров опухоли и полным излечением у 48% подвергнутых лечению животных. Данные обобщены в таблице 3, из которых видно, что различие между монотерапией PD-1 или комбинацией PD-1/GAd-CT26-5 ТРА по сравнению с комбинацией PD-1/GAd-CT26-31 ТРА является статистически значимым. Из этих результатов видно, что генная вакцина способна обеспечивать устранение развившихся опухолей в том случае, если она кодирует большое число неоантигенов, и в случае комбинации ее с лечением с помощью иммуномодулирующих молекул.
Пример 3. Сравнение эффективности вакцинации в трех разных условиях.
Чтобы определить, является ли общее количество присутствующих в вакцине неоантигенов критическим для определения эффективности подхода к вакцинации, авторы настоящего изобретения оценивали эффективность вакцинации в трех разных условиях: 1) условия профилактики, 2) раннее вмешательство в модели метастазирования при раке легкого и 3) условия передовой терапии крупных развившихся подкожных опухолей.
8
При профилактическом вмешательстве мышей сперва иммунизировали GAd-CT26-31 или GAd-CT26-5 в дозе 5×10 vp, и через две недели вводили опухолевые клетки СТ26 для оценки профилактической ценности вакцинации. Вакцинация обеспечивала защиту от приживления опухоли у 100% вакцинированных мышей независимо от типа применяемой конструкции, тогда как у всех не подвергавшихся лечению мышей развивались крупные опухоли (фиг. 3).
8
Подобным образом, GAd-CT26-31 и GAd-CT26-5 были в равной степени эффективными в устранении происходящих из клеток СТ26 метастазов в легком, измеряемом по числу узлов в легком, в условиях ранней терапии, имитирующих минимальное остаточное заболевание, поскольку опухолевые массы еще не сформировались на момент доставки вакцины. Вакцинацию (доза 5×10 vp) проводили через 3 дня после внутривенной инъекции опухолевых клеток (фиг. 4).
В случае, когда мышей с крупными развившимися подкожными опухолями вакцинировали GAd-CT26-31 ТРА, никакой противоопухолевой активности не наблюдалось (фиг. 5А). Частичный ответ наблюдали в случае монотерапии антителом к PD-1 или комбинации терапии антителом к PD-1 с GAd-CT26-5 ТРА (фиг. 5b). В отличие от этого, комбинация блокирования PD1 с крупной конструкцией GAd-CT26-31 ТРА обеспечивала заметную противораковую активность, что приводило к сокращению размеров опухоли и полному излечению у 48% подвергнутых лечению животных (фиг. 5В). Совместное лечение GAd-CT26-31 ТРА и антителом к PD1 индуцировало Т-клеточные ответы в отношении тех же 8 из 31 неоантигена (фиг. 6) в сравнении с вакцинацией GAd-СТ26-31 ТРА в отдельности в условиях профилактики (фиг. 2).
Пример 4. Эффективность персонализированной вакцины зависит от CD8+ Т-клеточного ответа.
Для оценки вклада CD4+ Т-клеток и CD8+ Т-клеток в терапевтический противоопухолевый эффект GAd-CT26-31 ТРА осуществляли истощение по CD4+ или CD8+ Т-клеткам с помощью специфических антител (α-mCD8, BioXcell клон YTS 169.4; α-mCD4, BioXcell клон YTS 191), введенных путем инъекции (200 мкг) через одну неделю после начала терапии. Истощение по CD8+ Т-клеткам полностью отменяет противоопухолевый эффект (фиг. 8), подчеркивая основной вклад CD8+ Т-клеток. Напротив, истощение по CD4+ Т-клеткам не влияет на эффективность лечения (фиг. 7). Идентификация CD8+ Т-клеточного ответа как посредника эффективности также согласуется с известным свойством векторов на основе аденовируса стимулировать сильный CD8+ Т-клеточный ответ.
Пример 5. Эффективность комбинированного применения персонализированной вакцины и лечения антителом к PD1 коррелирует с повышением клональности TCR в опухоли.
РНК из опухолей СТ26 от мышей, подвергнутых лечению только антителом к PD1, или подвергнутых лечению комбинацией терапии антителом к PD-1 с GAd-CT26-31 ТРА, экстрагировали и подвергали RNASeq-анализу. Клональность Т-клеточного рецептора (TCR) бета оценивали на основе данных RNASeq с применением инструмента MIXCR с использованием стандартных параметров, описанных в рабочем руководстве для RNA-seq (https://mixcr.readthedocs.io/en/master/maseq.html). Полученные с помощью MLXCR первичные данные (последовательности и экспрессия обнаруженных клонотипов TCR) дополнительно анализировали с помощью пакета программного обеспечения tcR R (https://cran.r-project.org/web/packages/tcR/vignettes/tcrvignette.html) для получения реконструированных последовательностей CDR3 и получения сводной статистики. Как показано на фиг.8, совместное лечение антителом к PD-1 и GAd-CT26-5 ТРА обеспечивает наличие значимо большего числа отдельных клонов TCR (клонотипов) в опухолях, в сравнении с лечением антителом к PD1 отдельно.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  НОУСКОМ АГ
<120>  ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
<130>  854-20 PCT
<150>  17181026.0
<151>  2017-07-12
<150>  17200036.6
<151>  2017-11-03
<160>  44
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Pro Gly Pro Gln Asn Phe Pro Pro Gln Asn Met Phe Glu Phe Pro Pro
1               5                   10                  15
His Leu Ser Pro Pro Leu Leu Pro Pro
20                  25
<210>  2
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Gly Ala Gln Glu Glu Pro Gln Val Glu Pro Leu Asp Phe Ser Leu Pro
1               5                   10                  15
Lys Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Arg
20                  25
<210>  3
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Ala Val Phe Ala Gly Ser Asp Asp Pro Phe Ala Thr Pro Leu Ser Met
1               5                   10                  15
Ser Glu Met Asp Arg Arg Asn Asp Ala
20                  25
<210>  4
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys Glu Met Ala Ile Ser Val Leu Glu
1               5                   10                  15
Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly Gln
20                  25
<210>  5
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln
1               5                   10                  15
Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro
20                  25
<210>  6
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Met Ser Tyr Ala Glu Lys Ser Asp Glu Ile Thr Lys Asp Glu Trp Met
1               5                   10                  15
Glu Lys Leu
<210>  7
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Gly Ala Gly Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Asn Phe Ser Met Arg Asp
1               5                   10                  15
Gly Ile Asp Asp Glu Ser Tyr Gly Gln
20                  25
<210>  8
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  8
Tyr Arg Gly Ala Asp Lys Leu Cys Arg Lys Ala Ser Ser Val Lys Leu
1               5                   10                  15
Val Lys Thr Ser Pro Glu Leu Ser Glu
20                  25
<210>  9
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Asp Ser Asn Leu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Tyr Glu Thr Leu Lys Lys
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Lys Ile Arg Glu Glu Ser
20                  25
<210>  10
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  10
His Ser Phe Ile His Ala Ala Met Gly Met Ala Val Thr Trp Cys Ala
1               5                   10                  15
Ala Ile Met Thr Lys Gly Gln Tyr Ser
20                  25
<210>  11
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  11
Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val
1               5                   10                  15
Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr
20                  25
<210>  12
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Phe Glu Gly Ser Leu Ala Lys Asn Leu Ser Leu Asn Phe Gln Ala Val
1               5                   10                  15
Lys Glu Asn Leu Tyr Tyr Glu Val Gly
20                  25
<210>  13
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Asp Pro Arg Ala Ala Tyr Phe Arg Gln Ala Glu Asn Asp Met Tyr Ile
1               5                   10                  15
Arg Met Ala Leu Leu Ala Thr Val Leu
20                  25
<210>  14
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Leu Arg Ser Gln Met Val Met Lys Met Arg Glu Tyr Phe Cys Asn Leu
1               5                   10                  15
His Gly Phe Val Asp Ile Glu Thr Pro
20                  25
<210>  15
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Asp Leu Leu Ala Phe Glu Arg Lys Leu Asp Gln Thr Val Met Arg Lys
1               5                   10                  15
Arg Leu Asp Ile Gln Glu Ala Leu Lys
20                  25
<210>  16
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Ile Lys Arg Glu Lys Cys Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Pro Glu Ser Phe
1               5                   10                  15
His Thr Leu Glu Ser Val Pro Ala Thr
20                  25
<210>  17
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Gly Arg Ser Ser Gln Val Tyr Phe Thr Ile Asn Val Asn Leu Asp Leu
1               5                   10                  15
Ser Glu Ala Ala Val Val Thr Phe Ser
20                  25
<210>  18
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile
1               5                   10                  15
Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg
20                  25
<210>  19
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Thr Thr Cys Leu Ala Val Gly Gly Leu Asp Val Lys Phe Gln Glu Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Arg Ala Ala Pro Asp Ile Leu
20                  25
<210>  20
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Ile Tyr Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Ile Thr Met Ile
1               5                   10                  15
Met Thr Ser Val Ser Gly His Leu Leu
20                  25
<210>  21
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Pro Asp Ser Phe Ser Ile Pro Tyr Leu Thr Ala Leu Asp Asp Leu Leu
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Leu Ala Leu Ser Phe
20                  25
<210>  22
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Tyr Ala Thr Ile Leu Glu Met Gln Ala Met Met Thr Leu Asp Pro Gln
1               5                   10                  15
Asp Ile Leu Leu Ala Gly Asn Met Met
20                  25
<210>  23
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Ser Trp Ile His Cys Trp Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu Phe
1               5                   10                  15
Arg Gly Ser Ser Leu Leu Phe Arg Arg
20                  25
<210>  24
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Phe Asp Leu Tyr Tyr Glu Ser
1               5                   10                  15
Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala Arg
20                  25
<210>  25
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  25
Ala Gln Ala Ala Lys Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Phe Gln Ala Gly Lys
1               5                   10                  15
Tyr Glu Gln Ala Ile Gln Cys Tyr Thr
20                  25
<210>  26
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Gln Pro Met Leu Pro Ile Gly Leu Ser Asp Ile Pro Asp Glu Ala Met
1               5                   10                  15
Val Lys Leu Tyr Cys Pro Lys Cys Met
20                  25
<210>  27
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  27
His Arg Gly Ala Ile Tyr Gly Ser Ser Trp Lys Tyr Phe Thr Phe Ser
1               5                   10                  15
Gly Tyr Leu Leu Tyr Gln Asp
20
<210>  28
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  28
Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu
1               5                   10                  15
Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro
20                  25
<210>  29
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  29
Pro Arg Gly Val Asp Leu Tyr Leu Arg Ile Leu Met Pro Ile Asp Ser
1               5                   10                  15
Glu Leu Val Asp Arg Asp Val Val His
20                  25
<210>  30
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Gln Ile Glu Gln Asp Ala Leu Cys Pro Gln Asp Thr Tyr Cys Asp Leu
1               5                   10                  15
Lys Ser Arg Ala Glu Val Asn Gly Ala
20                  25
<210>  31
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  31
Ala Leu Ala Ser Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Ser Tyr Ile Lys Lys
1               5                   10                  15
Leu Lys Glu Leu Arg Ser Met Leu Met
20                  25
<210>  32
<211>  137
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Met Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu
1               5                   10                  15
Glu Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro
20                  25                  30
Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met
35                  40                  45
Leu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile
50                  55                  60
Met Ala Ile Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr
65                  70                  75                  80
Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu
85                  90                  95
Leu Glu Leu Ala Pro His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala
100                 105                 110
Asp Ala Ile Gln Val Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr
115                 120                 125
Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
130                 135
<210>  33
<211>  368
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1               5                   10                  15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20                  25                  30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35                  40                  45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50                  55                  60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65                  70                  75                  80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85                  90                  95
Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro
100                 105                 110
Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met
115                 120                 125
Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His
130                 135                 140
Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile
165                 170                 175
Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu
180                 185                 190
Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys
195                 200                 205
Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys
210                 215                 220
Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp
225                 230                 235                 240
Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro
245                 250                 255
Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu
260                 265                 270
Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Lys Pro Leu Arg Arg Asn
275                 280                 285
Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Cys Gly Met Pro Leu Asp
290                 295                 300
Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr Met Arg Asp Val Ile
305                 310                 315                 320
Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala Pro His Ile His Arg
325                 330                 335
Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln Val Gly Phe Gly Arg
340                 345                 350
Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
355                 360                 365
<210>  34
<211>  165
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  34
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                   10                  15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Leu Leu Pro
20                  25                  30
Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu Leu Asn Ser
35                  40                  45
Ser Ala Leu Pro Pro Thr Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser
50                  55                  60
Tyr Ala Thr Tyr Leu Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Lys
65                  70                  75                  80
Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile Cys
85                  90                  95
Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr
100                 105                 110
Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala
115                 120                 125
Pro His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln
130                 135                 140
Val Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe Gly Tyr Pro Tyr Asp Val
145                 150                 155                 160
Pro Asp Tyr Ala Ser
165
<210>  35
<211>  807
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  35
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                   10                  15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg Pro Gly Pro
20                  25                  30
Gln Asn Phe Pro Pro Gln Asn Met Phe Glu Phe Pro Pro His Leu Ser
35                  40                  45
Pro Pro Leu Leu Pro Pro Gly Ala Gln Glu Glu Pro Gln Val Glu Pro
50                  55                  60
Leu Asp Phe Ser Leu Pro Lys Gln Gln Gly Glu Leu Leu Glu Arg Ala
65                  70                  75                  80
Val Phe Ala Gly Ser Asp Asp Pro Phe Ala Thr Pro Leu Ser Met Ser
85                  90                  95
Glu Met Asp Arg Arg Asn Asp Ala His Ser Gly Gln Asn His Leu Lys
100                 105                 110
Glu Met Ala Ile Ser Val Leu Glu Ala Arg Ala Cys Ala Ala Ala Gly
115                 120                 125
Gln Ile Leu Pro Gln Ala Pro Ser Gly Pro Ser Tyr Ala Thr Tyr Leu
130                 135                 140
Gln Pro Ala Gln Ala Gln Met Leu Thr Pro Met Ser Tyr Ala Glu Lys
145                 150                 155                 160
Ser Asp Glu Ile Thr Lys Asp Glu Trp Met Glu Lys Leu Gly Ala Gly
165                 170                 175
Lys Gly Lys Tyr Tyr Ala Val Asn Phe Ser Met Arg Asp Gly Ile Asp
180                 185                 190
Asp Glu Ser Tyr Gly Gln Tyr Arg Gly Ala Asp Lys Leu Cys Arg Lys
195                 200                 205
Ala Ser Ser Val Lys Leu Val Lys Thr Ser Pro Glu Leu Ser Glu Asp
210                 215                 220
Ser Asn Leu Gln Ala Arg Leu Thr Ser Tyr Glu Thr Leu Lys Lys Ser
225                 230                 235                 240
Leu Ser Lys Ile Arg Glu Glu Ser His Ser Phe Ile His Ala Ala Met
245                 250                 255
Gly Met Ala Val Thr Trp Cys Ala Ala Ile Met Thr Lys Gly Gln Tyr
260                 265                 270
Ser Leu Arg Thr Ala Ala Tyr Val Asn Ala Ile Glu Lys Ile Phe Lys
275                 280                 285
Val Tyr Asn Glu Ala Gly Val Thr Phe Thr Phe Glu Gly Ser Leu Ala
290                 295                 300
Lys Asn Leu Ser Leu Asn Phe Gln Ala Val Lys Glu Asn Leu Tyr Tyr
305                 310                 315                 320
Glu Val Gly Asp Pro Arg Ala Ala Tyr Phe Arg Gln Ala Glu Asn Asp
325                 330                 335
Met Tyr Ile Arg Met Ala Leu Leu Ala Thr Val Leu Leu Arg Ser Gln
340                 345                 350
Met Val Met Lys Met Arg Glu Tyr Phe Cys Asn Leu His Gly Phe Val
355                 360                 365
Asp Ile Glu Thr Pro Asp Leu Leu Ala Phe Glu Arg Lys Leu Asp Gln
370                 375                 380
Thr Val Met Arg Lys Arg Leu Asp Ile Gln Glu Ala Leu Lys Ile Lys
385                 390                 395                 400
Arg Glu Lys Cys Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Pro Glu Ser Phe His Thr
405                 410                 415
Leu Glu Ser Val Pro Ala Thr Gly Arg Ser Ser Gln Val Tyr Phe Thr
420                 425                 430
Ile Asn Val Asn Leu Asp Leu Ser Glu Ala Ala Val Val Thr Phe Ser
435                 440                 445
Lys Pro Leu Arg Arg Asn Asn Ser Tyr Thr Ser Tyr Ile Met Ala Ile
450                 455                 460
Cys Gly Met Pro Leu Asp Ser Phe Arg Thr Thr Cys Leu Ala Val Gly
465                 470                 475                 480
Gly Leu Asp Val Lys Phe Gln Glu Ala Ala Leu Arg Ala Ala Pro Asp
485                 490                 495
Ile Leu Ile Tyr Glu Phe Asp Tyr His Leu Tyr Gly Gln Asn Ile Thr
500                 505                 510
Met Ile Met Thr Ser Val Ser Gly His Leu Leu Pro Asp Ser Phe Ser
515                 520                 525
Ile Pro Tyr Leu Thr Ala Leu Asp Asp Leu Leu Gly Thr Ala Leu Leu
530                 535                 540
Ala Leu Ser Phe Tyr Ala Thr Ile Leu Glu Met Gln Ala Met Met Thr
545                 550                 555                 560
Leu Asp Pro Gln Asp Ile Leu Leu Ala Gly Asn Met Met Ser Trp Ile
565                 570                 575
His Cys Trp Lys Tyr Leu Ser Val Gln Ser Gln Leu Phe Arg Gly Ser
580                 585                 590
Ser Leu Leu Phe Arg Arg Tyr Asp Asn Lys Gly Ile Thr Tyr Leu Phe
595                 600                 605
Asp Leu Tyr Tyr Glu Ser Asp Glu Phe Thr Val Asp Ala Ala Arg Ala
610                 615                 620
Gln Ala Ala Lys Asn Lys Gly Asn Lys Tyr Phe Gln Ala Gly Lys Tyr
625                 630                 635                 640
Glu Gln Ala Ile Gln Cys Tyr Thr Gln Pro Met Leu Pro Ile Gly Leu
645                 650                 655
Ser Asp Ile Pro Asp Glu Ala Met Val Lys Leu Tyr Cys Pro Lys Cys
660                 665                 670
Met His Arg Gly Ala Ile Tyr Gly Ser Ser Trp Lys Tyr Phe Thr Phe
675                 680                 685
Ser Gly Tyr Leu Leu Tyr Gln Asp Val Ile Gln Thr Ser Lys Tyr Tyr
690                 695                 700
Met Arg Asp Val Ile Ala Ile Glu Ser Ala Trp Leu Leu Glu Leu Ala
705                 710                 715                 720
Pro Pro Arg Gly Val Asp Leu Tyr Leu Arg Ile Leu Met Pro Ile Asp
725                 730                 735
Ser Glu Leu Val Asp Arg Asp Val Val His Gln Ile Glu Gln Asp Ala
740                 745                 750
Leu Cys Pro Gln Asp Thr Tyr Cys Asp Leu Lys Ser Arg Ala Glu Val
755                 760                 765
Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser Ala Ile Leu Ser Asp Pro Glu Ser Tyr
770                 775                 780
Ile Lys Lys Leu Lys Glu Leu Arg Ser Met Leu Met Gly Tyr Pro Tyr
785                 790                 795                 800
Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
805
<210>  36
<211>  232
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  36
Met His Arg Arg Arg Ser Arg Ser Cys Arg Glu Asp Gln Lys Pro Val
1               5                   10                  15
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn Asn Glu Gln Leu Pro Met
20                  25                  30
Leu Gly Arg Arg Pro Gly Ala Pro Glu Ser Lys Cys Ser Arg Gly Ala
35                  40                  45
Leu Tyr Thr Gly Phe Ser Ile Leu Val Thr Leu Leu Leu Ala Gly Gln
50                  55                  60
Ala Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys
65                  70                  75                  80
Leu Thr Val Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Asn Leu Arg Met Lys
85                  90                  95
Leu Pro Lys Pro Pro Lys Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro
100                 105                 110
Leu Leu Met Gln Ala Leu Pro Met Gly Ala Leu Pro Gln Gly Pro Met
115                 120                 125
Gln Asn Ala Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Glu Asp His Val Met His
130                 135                 140
Leu Leu Gln Asn Ala Asp Pro Leu Lys Val Tyr Pro Pro Leu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Ser Phe Pro Glu Asn Leu Arg His Leu Lys Asn Thr Met Glu Thr Ile
165                 170                 175
Asp Trp Lys Val Phe Glu Ser Trp Met His His Trp Leu Leu Phe Glu
180                 185                 190
Met Ser Arg His Ser Leu Glu Gln Lys Pro Thr Asp Ala Pro Pro Lys
195                 200                 205
Glu Ser Leu Glu Leu Glu Asp Pro Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Lys
210                 215                 220
Gln Asp Leu Gly Pro Val Pro Met
225                 230
<210>  37
<211>  215
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  37
Met Asp Asp Gln Arg Asp Leu Ile Ser Asn His Glu Gln Leu Pro Ile
1               5                   10                  15
Leu Gly Asn Arg Pro Arg Glu Pro Glu Arg Cys Ser Arg Gly Ala Leu
20                  25                  30
Tyr Thr Gly Val Ser Val Leu Val Ala Leu Leu Leu Ala Gly Gln Ala
35                  40                  45
Thr Thr Ala Tyr Phe Leu Tyr Gln Gln Gln Gly Arg Leu Asp Lys Leu
50                  55                  60
Thr Ile Thr Ser Gln Asn Leu Gln Leu Glu Ser Leu Arg Met Lys Leu
65                  70                  75                  80
Pro Lys Ser Ala Lys Pro Val Ser Gln Met Arg Met Ala Thr Pro Leu
85                  90                  95
Leu Met Arg Pro Met Ser Met Asp Asn Met Leu Leu Gly Pro Val Lys
100                 105                 110
Asn Val Thr Lys Tyr Gly Asn Met Thr Gln Asp His Val Met His Leu
115                 120                 125
Leu Thr Arg Ser Gly Pro Leu Glu Tyr Pro Gln Leu Lys Gly Thr Phe
130                 135                 140
Pro Glu Asn Leu Lys His Leu Lys Asn Ser Met Asp Gly Val Asn Trp
145                 150                 155                 160
Lys Ile Phe Glu Ser Trp Met Lys Gln Trp Leu Leu Phe Glu Met Ser
165                 170                 175
Lys Asn Ser Leu Glu Glu Lys Lys Pro Thr Glu Ala Pro Pro Lys Glu
180                 185                 190
Pro Leu Asp Met Glu Asp Leu Ser Ser Gly Leu Gly Val Thr Arg Gln
195                 200                 205
Glu Leu Gly Gln Val Thr Leu
210                 215
<210>  38
<211>  281
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Met Ala Asp Ser Ala Glu Asp Ala Pro Met Ala Arg Gly Ser Leu Ala
1               5                   10                  15
Gly Ser Asp Glu Ala Leu Ile Leu Pro Ala Gly Pro Thr Gly Gly Ser
20                  25                  30
Asn Ser Arg Ala Leu Lys Val Ala Gly Leu Thr Thr Leu Thr Cys Leu
35                  40                  45
Leu Leu Ala Ser Gln Val Phe Thr Ala Tyr Met Val Phe Gly Gln Lys
50                  55                  60
Glu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met Ser Lys Gln
65                  70                  75                  80
Leu Thr Arg Ser Ser Gln Ala Val Ala Pro Met Lys Met His Met Pro
85                  90                  95
Met Asn Ser Leu Pro Leu Leu Met Asp Phe Thr Pro Asn Glu Asp Ser
100                 105                 110
Lys Thr Pro Leu Thr Lys Leu Gln Asp Thr Ala Val Val Ser Val Glu
115                 120                 125
Lys Gln Leu Lys Asp Leu Met Gln Asp Ser Gln Leu Pro Gln Phe Asn
130                 135                 140
Glu Thr Phe Leu Ala Asn Leu Gln Gly Leu Lys Gln Gln Met Asn Glu
145                 150                 155                 160
Ser Glu Trp Lys Ser Phe Glu Ser Trp Met Arg Tyr Trp Leu Ile Phe
165                 170                 175
Gln Met Ala Gln Gln Lys Pro Val Pro Pro Thr Ala Asp Pro Ala Ser
180                 185                 190
Leu Ile Lys Thr Lys Cys Gln Met Glu Ser Ala Pro Gly Val Ser Lys
195                 200                 205
Ile Gly Ser Tyr Lys Pro Gln Cys Asp Glu Gln Gly Arg Tyr Lys Pro
210                 215                 220
Met Gln Cys Trp His Ala Thr Gly Phe Cys Trp Cys Val Asp Glu Thr
225                 230                 235                 240
Gly Ala Val Ile Glu Gly Thr Thr Met Arg Gly Arg Pro Asp Cys Gln
245                 250                 255
Arg Arg Ala Leu Ala Pro Arg Arg Met Ala Phe Ala Pro Ser Leu Met
260                 265                 270
Gln Lys Thr Ile Ser Ile Asp Asp Gln
275                 280
<210>  39
<211>  27
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Gly Gln Lys Glu Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met
1               5                   10                  15
Ser Lys Gln Leu Thr Arg Ser Ser Gln Ala Val
20                  25
<210>  40
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  40
Gln Ile His Thr Leu Gln Lys Asn Ser Glu Arg Met Ser Lys Gln Leu
1               5                   10                  15
<210>  41
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Influenza virus
<400>  41
Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
1               5                   10
<210>  42
<211>  29
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  42
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1               5                   10                  15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Glu Ile His Ala Arg
20                  25
<210>  43
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Leu Leu Pro Phe Tyr Pro Pro Asp Glu Ala Leu Glu Ile Gly Leu Glu
1               5                   10                  15
Leu Asn Ser Ser Ala Leu Pro Pro Thr
20                  25
<210>  44
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  44
His Ile His Arg Ala Gly Gly Leu Phe Val Ala Asp Ala Ile Gln Val
1               5                   10                  15
Gly Phe Gly Arg Ile Gly Lys His Phe
20                  25
<---