Способ определения относительного количества этотически трансформированных фагоцитов
METHOD FOR DETERMINING THE RELATIVE AMOUNT OF ETHOTICALLY TRANSFORMED PHAGOCYTES

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для количественной оценки уровня трансформации фагоцитов крови в процессе этоза.
Известно приготовление обычного нестандартизованного тонкого мазка крови по общепринятой методике нанесения крови на предметное стекло для подсчета нейтрофильных внеклеточных ловушек, образующихся в результате этоза одного из вида фагоцитов, с целью диагностики малярии (J Infect Dis. 2018 Nov 19. doi: 10.1093/infdis/jiy661. Circulating neutrophil extracellular traps and neutrophil activation are increased in proportion to disease severity in human malaria. Kho S et al, p. 9).
Недостатком такого подхода является то, что изготовление обычного нестандартизованного тонкого мазка крови не обеспечивает необходимую точность получаемых результатов. Кроме того, количество выявленных трансформированных фагоцитов, образовавших нейтрофильные внеклеточные ловушки, нормируется на 1 мкл крови, а не на количество подсчитанных нативных фагоцитов в мазке, вследствие чего результат зависит от абсолютного содержания фагоцитов в крови, что также влияет на точность способа.
Известно приготовление мазков цельной крови путем нанесения капли крови на предметное стекло и размазывание ее шпателем или другим стеклом, для исследования содержания нейтрофильных внеклеточных ловушек, образованных этотически трансформированными нейтрофилами, у здоровых доноров и у больных сепсисом (Нейтрофильные Внеклеточные Ловушки: механизмы образования, методы обнаружения, биологическая роль. Диссер. на соиск. уч. ст. д.м.н. Савочкина Альбина Юрьевна, Челябинск, 2012, с. 152).
Недостатком такого подхода является то, что обычные мазки крови, приготовляемые в клинико-диагностических лабораториях, имеют неоднородную толщину, сильно варьируются при приготовлении различными операторами, и не позволяют точно подсчитать количество внеклеточных ловушек, образованных трансформированными фагоцитами. Кроме того, при микроскопической обработке мазка учитывали только нейтрофильные внеклеточные ловушки и целые нейтрофилы, хотя известно, что внеклеточные ловушки образуют все фагоциты крови в результате этотической трансформации, а не только нейтрофилы.
Наиболее близким к заявляемому является способ приготовления мазков крови при помощи размазывающей пластины (Патент РФ №2121297, МПК G01N 33/48, публ. 1998), заключающийся в проведении концом размазывающей пластины по рабочей поверхности предметного стекла, на которое наносится мазок, таким образом, что плоскость размазывающей пластины перемещается параллельно самой себе, а ее конец находится в контакте с рабочей поверхностью, при этом размазывающую пластину устанавливают в расположенном сбоку держателе под фиксированным углом к рабочей поверхности предметного стекла и осуществляют размазывание капли крови с опорой на ребро размазывающей пластины и держатель.
Недостатком способа является то, что подготавливают мазки из цельной крови необходимой равномерной толщины, но не определена оптимальная толщина мазка, при которой можно проводить точный подсчет трансформированных фагоцитов. Кроме того, мазки изготавливают без дополнительного регулируемого разрушающего воздействия (лизирующего фактора) и поэтому не обеспечивают возможность точно дифференцировать слабо, средне и сильно этотически трансформированные фагоциты.
Задачей предлагаемого изобретения является устранение указанных недостатков, повышение точности получаемых данных за счет создания стандартизованных равномерных мазков крови заданной толщины с добавлением стабилизирующих и ослабляющих модификаторов.
2
Для решения поставленной задачи в способе определения относительного количества этотически трансформированных фагоцитов, включающем проведение концом размазывающей поверхности пластины по рабочей поверхности рабочего стекла, на которое наносится мазок, предложено мазок крови изготавливать равномерным по толщине в один слой эритроцитов с плотностью эритроцитов в нем в пределах от 4 до 15 тысяч на мм. При этом для определения количества сильно трансформированных фагоцитов при приготовлении мазка в кровь добавляют альбумин в концентрации 1-5%. Для определения количества всех трансформированных фагоцитов образец крови для мазка смешивают с изотоническим солевым раствором при доле крови в смеси 25%-75%. Для определения общего количества средне и сильно трансформированных фагоцитов исследуют цельную кровь. Сушку мазков осуществляют в течение 5-30 с. Рабочие стекла для приготовления мазков предварительно калибруют, для этого изготавливают контрольные мазки цельной крови, по меньшей мере, 10 здоровых доноров, определяют общее количество этотически средне и сильно трансформированных фагоцитов в каждом мазке, и при определении их значений в пределах 1-11% не менее чем в 95% результатов и их среднеарифметическом значении в пределах 4-6%, такие стекла используют для приготовления мазков.
При этом в исследуемом мазке определяют количество трансформированных фагоцитов, которые визуализируются в мазке как внеклеточные ловушки, и нативных фагоцитов, и по отношению соответствующих трансформированных фагоцитов к сумме трансформированных и нативных фагоцитов определяют относительное количество соответствующих этотически трансформированных фагоцитов.
Кроме того, предложено при приготовлении мазка для определения количества сильно трансформированных фагоцитов, на поверхность рабочего стекла сначала наносить альбумин, а затем поверх наносить мазок из цельной крови.
Исследования показали, что этотически трансформированные фагоциты разрушаются и образуют внеклеточные ловушки непосредственно в мазке во время его изготовления, а в циркулирующей крови и в образцах крови, получаемых для анализа, свободные внеклеточные ловушки отсутствуют. Внешняя мембрана фагоцитов в процессе их трансформации при этозе ослабевает, взаимодействие фагоцитов со стеклом при высыхании мазка крови выступает в роли так называемого лизирующего фактора, оказывающего разрушающее воздействие на фагоциты. При этом этотически трансформированные фагоциты разрушаются с образованием внеклеточных ловушек, а нативные фагоциты и лимфоциты практически не разрушаются при высыхании мазка. Величина лизирующего фактора зависит от многих параметров, таких как толщина слоя крови в мазке в месте подсчета, состава плазмы, добавок к крови, скорости высыхания мазка, материала и качества поверхности стекла.
Оказалось, что при подсчете трансформированных фагоцитов в различных частях обычных мазков крови их доля по отношению к нативным фагоцитам сильно зависит от толщины той части мазка, в которой производился подсчет. Например, в более толстой части обычного мазка, где клетки крови лежат не в один слой, лизирующий фактор слабее и количество выявляемых трансформированных фагоцитов значительно меньше. Поэтому по предлагаемому способу мазки получаются близкими по величине лизирующего фактора, что необходимо для точного подсчета этотически трансформированных фагоцитов.
2
Для достижения воспроизводимых результатов при подсчете процентного содержания трансформированных фагоцитов необходимо стандартизовать метод приготовления мазка крови. Для этого необходимо изготовлять мазки при одних и тех же условиях: они должны быть определенной равномерной толщины, эритроциты должны лежать в один слой, условия высыхания должны быть одинаковыми. Трансформированные фагоциты удобнее всего подсчитывать при микроскопировании мазка, когда эритроциты лежат в один слой, не перекрываясь, поскольку при более плотно лежащих эритроцитах внеклеточные ловушки, образованных трансформированными фагоцитами, могут деформироваться и маскироваться, в результате чего возникают ошибки при их подсчете. С другой стороны, эритроциты в мазке не должны лежать слишком редко, поскольку в этом случае подсчет нативных и разрушенных фагоцитов сильно замедляется и производительность метода падает. Эти два условия ограничивают диапазон допустимой плотности эритроцитов от 4 до 15 тысяч на мм, достаточный для создания так называемого «плотного монослоя».
Введение в кровь различных добавок влияет на величину лизирующего фактора, который определяет какая часть трансформированных фагоцитов разрушится при изготовлении мазка. Естественным стабилизатором фагоцитов в крови является сывороточный альбумин; он является ключевым компонентом, определяющим величину лизирующего фактора.
Исследования показали, что можно варьировать величину лизирующего фактора, внося различные добавки в кровь. Наиболее простым способом является изменение количества альбумина при помощи добавления в кровь дополнительного альбумина или разбавления крови изотоническим солевым раствором перед изготовлением мазка. При этом анализ мазка из крови с добавлением альбумина позволяет оценить количество сильно трансформированных фагоцитов, поскольку средне и слабо трансформированные фагоциты не разрушаются в мазке благодаря протективному действию альбумина. Мазок из цельной крови позволяет оценить количество сильно и средне трансформированных фагоцитов. Мазок из крови с добавлением изотонического солевого раствора позволяет оценить общее количество слабо, средне и сильно трансформированных фагоцитов.
Материал и качество поверхности рабочего стекла, на котором изготавливают мазок, также могут влиять на величину лизирующего фактора, который определяет, какая часть трансформированных фагоцитов разрушится с образованием внеклеточных ловушек при приготовлении мазка. По этой причине для получения воспроизводимых результатов необходимо использовать заранее охарактеризованные стекла.
При практическом использовании изобретения в зависимости от поставленной задачи исследования можно изготавливать несколько мазков с добавлением альбумина и изотонического солевого раствора в двух или более концентрациях.
На фиг. 1 представлены фотографии нативных фагоцитов.
На фиг. 2 представлены фотографии трансформированных фагоцитов, разрушившихся с образованием внеклеточных ловушек.
На фиг. 3 показано количество выявленных трансформированных фагоцитов в мазках, выполненных из крови без добавок (столбец 4), с добавлением физиологического раствора (столбцы 1-3) или с добавлением бычьего сывороточного альбумина (столбцы 5-7) в различных концентрациях, где столбец 1 - смесь крови с физ. раствором, доля крови 25%, 2 - смесь крови с физ. раствором, доля крови 50%, 3 - смесь крови с физ. раствором, доля крови 75%, 4 - кровь без добавок, 5 - кровь с добавлением 1% альбумина, 6 - кровь с добавлением 3% альбумина, 7 - кровь с добавлением 5% альбумина.
На фиг. 4 показано количество выявленных трансформированных фагоцитов в мазках, выполненных из цельной крови одного донора, и высушенных при различных условиях, где столбец 1 - быстрое высыхание мазка в условиях обдува за время менее 2 с, 2 - самопроизвольное высыхание мазка при нормальных условиях в лабораторном помещении за время в пределах 5-30 с, 3 - медленное высыхание мазка в условиях влажности, близкой к 100%, за время более 60 с.
Способ осуществляется следующим образом.
2
2
12
2
Для обеспечения плотного монослоя подходит любое механическое устройство для стандартизации изготовления мазков, в которых регулируется время изготовления мазка и угол наклона шпателя, например, устройство в соответствии с патентом RU 2121297. Такое устройство позволяет изготовлять стандартизованные мазки с необходимыми параметрами, в том числе плотный монослой практически одинаковой толщины на всем протяжении мазка. Для приготовления мазка с плотностью эритроцитов в нем в пределах от 4 до 15 тысяч на мм на рабочую поверхность предметного стекла стандартного размера (26×76 мм) наносят, как правило, 2 мкл крови. Приготавливают мазок, проводя концом размазывающей поверхности пластины по рабочей поверхности рабочего стекла. Площадь мазка выбирается, исходя из содержания эритроцитов в крови, так чтобы обеспечить плотный монослой (поскольку ширина мазка определяется шириной шпателя, на практике подбирается длина мазка, которая определяется наклоном шпателя и скоростью его движения относительно стекла). Например, у здорового человека при нормальном количестве эритроцитов в крови (3,5-5,5×10/л) оптимальная плотность эритроцитов достигается при площади мазка примерно 400±100 мм на 1 мкл крови. Из образца крови приготавливают мазок; если плотность эритроцитов в нем не попадает в указанный интервал, приготавливают еще один мазок толще/тоньше предыдущего. Процедуру повторяют, пока не будет получен мазок необходимой толщины с плотностью эритроцитов в заданном интервале, пригодный для исследования по заявляемому способу.
Для производства мазков используют откалиброванные предметные стекла. Для этого случайным образом отбирают несколько стекол из одной партии, с их использованием изготавливают контрольные мазки цельной крови, как минимум, 10 здоровых доноров и определяют общее количество этотически средне и сильно трансформированных фагоцитов в каждом мазке. Если не менее 95% полученных значений лежат в пределах 1-11%, а среднеарифметическое полученных значений лежит в пределах 4-6%, данную партию стекол считают пригодной для применения в медицинской практике.
Стандартизация условий высыхания мазка, обеспечивающих время высыхания в интервале 5-30 с, может быть обеспечена различными способами, при этом самым простым является обеспечение самопроизвольного высыхания мазка при нормальных условиях в рабочем помещении (влажность 30-70%, температура 21-28°С), без дополнительного обдува или подогрева. Для этого сразу после нанесения цельной крови или крови с добавлением альбумина/изотонического солевого раствора на стекло, мазок помещают на горизонтальную поверхность и дают самопроизвольно высохнуть.
Фиксацию мазков осуществляют любым принятым способом, например, с использованием 96% этанола. Окрашивать мазок можно любым принятым способом, например, по Романовскому-Гимзе или с использованием флуоресцентных красителей и специфических антител.
Обычно в лабораторной практике в мазках вручную подсчитывают 100 лейкоцитов для ускорения проведения анализа. Для достижения хорошей точности подсчета трансформированных фагоцитов в маках крови необходимо учитывать большее количество морфологических структур. В силу трудоемкости ручного микроскопического метода, оптимальным вариантом для клинической лабораторной практики является подсчет 200-300 нативных фагоцитов и разрушенных трансформированных фагоцитов в мазке.
Стандартизацию подсчета трансформированных фагоцитов в мазках крови осуществляют путем создания библиотеки изображений (атласа), на которую ориентируются операторы или автоматические компьютерные системы при обучении и в работе (фиг. 1, 2).
Исследование мазков крови проводят при помощи стандартной иммерсионной микроскопии при удобном оператору увеличении, например, 400 или 1000. Для повышения скорости исследования и облегчения обучения новых операторов, эффективно использовать сканирующие микроскопические системы, которые позволяют быстро получить набор изображений клеток и разрушенных трансформированных фагоцитов в мазке и оценить их соотношение.
нат
paзр
Во всех изготовленных мазках подсчитывают количество нативных фагоцитов N и разрушенных трансформированных фагоцитов N, визуализируемых на мазке как внеклеточные ловушки, долю этозно трансформированных фагоцитов (ТФ) вычисляют по формуле
При необходимости подсчета сильно, средне и слабо трансформированных фагоцитов (при необходимости оценить распределение фагоцитов по степени трансформации), следует изготовить и проанализировать три или более мазка из цельной крови, крови с добавлением альбумина в одной или более концентрации в диапазоне 1-5%, и одной или более смеси крови и изотонического солевого раствора, причем доля крови в смеси составляет от 25% до 75%, и рассчитать искомое.
При практическом использовании предлагаемого способа, когда в крови больного человека количество фагоцитов значительно снижено, в том числе за счет разрушения в результате этотической трансформации, их уменьшение может искажать лейкоцитарную форму при ее подсчете при помощи мазков крови. В этом случае добавление альбумина в концентрации 1-5% в цельную кровь позволит стабилизировать кровь в смысле предотвращения лизиса лейкоцитов при производстве мазка и более точно определить количество фагоцитов.
Исследования показали, что, если покрыть предметное стекло альбумином, а затем нанести мазок из цельной крови, будет получен тот же результат, что и при добавлении альбумина в кровь заранее и изготовлению мазка из крови с добавочным альбумином на стекле без покрытия.
Пример 1.
Были проведены фундаментальные исследования крови. Для этого при приготовлении серии мазков по предлагаемому способу, с добавлением изотонического солевого буфера и альбумина в различных концентрациях определяли распределение фагоцитов крови по степени трансформации.
Используемые для этого предметные стекла были откалиброваны, для этого были отобраны 10 стекол, которые использовали для приготовления мазков из цельной крови 10 здоровых доноров. Относительное количество ТФ в полученных мазках был в среднем - 5,1%, причем все 10 полученных результатов (100%) лежали в пределах от 2% до 9,8%.
2
Приготовляли мазки крови с плотностью эритроцитов в них в пределах от 4 до 15 тысяч на мм.
Приготовленные мазки оставляли самопроизвольно высыхать на столе в течение 8-18 с.
Полученные мазки исследовали с использованием световой иммерсионной микроскопии при увеличении 1000, подсчитывая количество нативных и разрушенных трансформированных фагоцитов, и вычисляя относительную долю трансформированных фагоцитов ТФ.
Были приготовлены мазки из цельной крови, а также из крови с добавлением 3% альбумина и из смеси крови с физ. раствором в равных долях.
В мазках с добавлением альбумина количество сильно трансформированных фагоцитов составило 2,7% (фиг. 3).
В мазках из цельной крови - 8,9% (сумма сильно и средне трансформированных фагоцитов).
В мазках из крови с добавлением физ. раствора - 17,9% (слабо, средне и сильно трансформированные фагоциты).
Таким образом, количество сильно трансформированных фагоцитов равно 2,7%. Количество средне трансформированных фагоцитов равно 8,9% - 2,7%=6,2%. Количество слабо трансформированных фагоцитов равно 17,9% - 8,9%=9%.
Информация о распределении фагоцитов крови по степени трансформации дало дополнительные сведения и позволило более полно судить о состоянии фагоцитов.
Пример 2.
Также можно изготавливать большее количества мазков, с добавлением альбумина и физ. раствора в нескольких концентрациях. Для установления влияния концентрации добавок были приготовлены мазки из цельной крови, а также с добавлением альбумина и физ. раствора в трех концентрациях.
Используемые для работы предметные стекла были откалиброваны, для этого были отобраны 20 стекол, которые использовали для приготовления мазков из цельной крови 20 здоровых доноров. Относительное количество ТФ в полученных мазках был в среднем - 5,6%, причем 19 полученных результатов (95%) лежали в пределах от 2,1% до 9,4%.
2
Приготовляли мазки крови с плотностью эритроцитов в них в пределах от 4 до 15 тысяч на мм
Приготовленные мазки оставляли самопроизвольно высыхать на столе в течение 10-25 с.
Полученные мазки фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимзе и исследовали с использованием световой иммерсионной микроскопии при увеличении 500, подсчитывая количество нативных и разрушенных трансформированных фагоцитов, и вычисляя относительную долю трансформированных фагоцитов ТФ.
На фиг. 3 представлена диаграмма, показывающая количество ТФ в мазках из крови с добавлением 1%, 3%, 5% альбумина, в цельной крови, также в смеси крови и физ. раствора смесь крови с физ. раствором, в которой доля крови составляет 25%, 50%, 75%. Диаграмма показывает, что имеет смысл добавлять альбумин в концентрации не более 5%, поскольку при этой концентрации выявляют только самые сильно трансформированные фагоциты (1 шт. на 300 подсчитанных фагоцитов). Добавление альбумина в концентрации менее 1% даст результат, близкий к получаемому при использовании цельной крови. По указанным причинам следует добавлять альбумин в диапазоне концентраций от 1% до 5%. При изготовлении мазков из смеси крови и изотонического солевого раствора следует добавлять не более 75% соленого раствора на 25% крови, поскольку при большем разведении крови затруднительно изготовить мазок с заданной плотностью эритроцитов. Изготовление мазков из смеси менее 25% солевого раствора на 75% крови даст результат, близкий к получаемому при использовании цельной крови. По указанным причинам наиболее целесообразным является изготовление мазков из смеси крови и солевого раствора при доле крови в смеси от 25% до 75%.
Пример 3.
Пациент А., пол женский, возраст 38 лет. Поступила в отделение реанимации в связи с послеродовым повреждением мочеточников, развилась пневмония, подозрение на сепсис. Провела в реанимационном отделении 15 дней, переведена в хирургическое отделение в связи с улучшением.
По предлагаемому способу исследовали ТФ в мазках, приготовленных из цельной крови, крови с добавлением 3% альбумина и смеси крови с физ. раствором в равных долях. Мазки приготавливали и исследовали аналогично примеру 2.
За все время наблюдения ТФ в мазках из крови с добавлением альбумина не превышал 7%, в мазках из цельной крови не превышал 10,2%, в мазках из смеси крови и физ. раствора не превышал 20,7%.
Низкий уровень трансформированных фагоцитов крови коррелируют с благоприятным течением заболевания.
Пример 4.
Пациент Б, пол мужской, возраст 21 год. Поступил с отделение реанимации с гнойно-септическими осложнениями после трансплантоэктомии почки, развилась пневмония, полиорганная недостаточность. Провел в отделении реанимации 40 дней, исход заболевания - летальный.
По предлагаемому способу исследовали ТФ в мазках, приготовленных из цельной крови, крови с добавлением 3% альбумина и смеси крови с физ. раствором в равных долях. Мазки приготавливали и исследовали аналогично примеру 2.
За все время наблюдения относительное количество ТФ в мазках из крови с добавлением альбумина возрастало до 21,7%, в мазках из цельной крови - до 72%, в мазках из смеси крови и физ. раствора - до 96%. Высокий уровень трансформированных фагоцитов крови коррелируют с летальным исходом заболевания.
Для подтверждения значимости и полезности предлагаемого способа в клинической практике были проведены исследование количества ТФ в мазках, приготовленных из цельной крови 55 здоровых доноров и 60 пациентов реанимационного отделения с верифицированным сепсисом в динамике.
Из 60 обследованных пациентов с сепсисом 24 погибли, а 36 пациентов выжили. Анализировали максимальное содержание ТФ в мазках крови за все время наблюдения (maxТФ). У здоровых доноров maxТФ составил в среднем 5,7% (σ=2,5%, Min-Max: 1,8% - 11,9%); группе пациентов с неблагоприятным исходом заболевания - 27,1% (σ=19,7%, Min-Max: 5,6% -72%), в группе выживших пациентов - 9% (σ=5,3%, Min-Max: 1% - 23,1%). Различия между исследованными группами были статистически значимы по критерию Манна-Уитни: доноры vs пациенты с сепсисом - р<0,00001; выжившие пациенты vs погибшие пациенты - р=0,0025.
Результаты свидетельствует о клинической полезности определения количества трансформированных фагоцитов указанным способом в крови пациентов с сепсисом. Превышение уровня ТФ в мазках из цельной крови более 17%, в мазках из крови с добавлением 3% альбумина - более 8%, а в мазках из смеси крови и физ. раствора в равных долях - более 30%, свидетельствует об ухудшении течения заболевания и повышении риска летального исхода. Причем у пациента в примере 4 уровень ТФ в мазках с добавлением альбумина превышает критический на 2 дня раньше, чем в мазках из цельной крови. Данный способ позволяет более точно диагностировать развитие неадекватного иммунного ответа при сепсисе, корректировать тактику лечения и прогнозировать исход заболевания.
Предлагаемый способ дает возможность проводить фундаментальные исследования фагоцитов крови путем регистрации этотической трансформации клеток непосредственно в образце крови без выделения фагоцитов под воздействием разнообразных факторов, таких как патогенные микроорганизмы и лекарственные средства.
Предлагаемый способ позволяет оценить количество этотически трансформированных фагоцитов в крови пациентов с различными воспалительными, аутоиммунными заболеваниями и тромбозами, что является актуальным, поскольку установлена связь ряда заболевания с этотической трансформацией фагоцитов.