СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ, СОДЕРЖАЩИХСЯ НА ПОВЕРХНОСТИ ИЛИ ВНУТРИ ЖЕВАТЕЛЬНОЙ РЕЗИНКИ
METHOD FOR DETECTING AND QUANTIFYING BACTERIA CONTAINED ON OR WITHIN CHEWING GUM

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] Настоящее изобретение предусматривает способы извлечения и количественного определения количества бактерий, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Упоминание о первом использовании жевательных резинок относится ко времени древних греков, когда люди применяли древесные смолы мастикового дерева для утоления жажды и для освежения дыхания. Первые жевательные резинки не появлялись в широкой продаже до конца 19 века, когда древесный сок каучукового дерева Sapodilla стал составлять основу жевательной резинки. Сообщалось, что в последние годы 20 века жевательная резинка не только превратилась в символ стиля жизни, но также стала влиять на познавательное (когнитивное) поведение, настроение, состояние поддержания пристального внимания и контроль аппетита. Более того, жевательные резинки стали играть большую роль при уходе за ротовой полостью и при контроле функциональных пищевых продуктов ("нутрицевтиков"), так как они обеспечивают легко применимую доставку носителя для лекарств с потенциальной выгодой для здоровья ротовой полости. Большое потребление, до 2.5 кг на человека в год, привело к тому, что производство жевательных резинок стало приносить доход, исчисляемый миллиардами долларов.
[0003] Обычно жевательные резинки состоят из нерастворимой в воде смеси синтетических эластомеров, типа поливинилацетата или полиизобутилена, называемой основой жевательной резинки. Важными требованиями, предъявляемыми к материалам, используемым для получения основы жевательной резинки, являются их нерастворимость во рту и способность жеваться в течение продолжительного периода времени без изменений в составе этой основы. Во всех коммерчески доступных жевательных резинках основа жевательной резинки содержит структурирующие, смягчающие и вкусоароматические агенты, в настоящее время сахар часто заменяется искусственными подсластителями, такими как сорбит, ксилит или маннит.
[0004] Описано введение ксилита и других искусственных подсластителей для уменьшения образования оральных биопленок на зубах. Оральные биопленки являются причиной наиболее распространенных в мире инфекционных заболеваний, а именно кариеса зубов и периодонтоза. Кариес появляется вследствие нарушения равновесия между природной де- и реминерализацией зубной эмали. Деминерализация происходит, когда величина рН оральной биопленки становится меньше 5.5 из-за ферментации Сахаров под действием некоторых составляющих оральной биопленки на зубах. Большинство искусственных Сахаров не подвергается или почти не подвергается ферментации под действием оральных бактерий и при этом не происходит снижения величины рН. Более того, жевательная резинка способствует улучшенному пережевыванию, которое стимулирует образование слюны, увеличивая при этом концентрации кальция и фосфатов в полости рта, что требуется для реминерализации. Для предотвращения деминерализации эмали и стимулирования реминерализации в коммерческие жевательные резинки добавляли фториды. Можно рассматривать жевание резинки как дополнение к ежедневной процедуре гигиены полости рта, особенно потому, что большинство людей годами неспособны регулировать содержание оральной биопленки, что требуется для предотвращения заболеваний. Это привело к введению в состав жевательных резинок антимикробных веществ типа хлоргексидина и травяных экстрактов, и такие жевательные резинки действительно продемонстрировали успех в предотвращении повторного роста оральной биопленки. Хотя известно, что жевание жевательной резинки способствует удалению междентального осадка (Kakodkar et al. Dental Research Journal 7: 64-69, 2011) и в состав жевательных резинок для увеличения их чистящей способности добавлялись детергенты типа полифосфатов, до сих пор неясно, действительно ли способствует жевание жевательной резинки удалению бактерий из ротовой полости. Предпочтительное удаление организмов, вызывающих появление заболеваний, например, продуцирующих кислоту Streptococcus mutans или видов, которые рассматриваются как первоначальные инвазивные организмы для зубной эмали, при помощи жевательной резинки будет особенно способствовать превращению жевательной резинки в ценное дополнение к ежедневной процедуре гигиены ротовой полости.
[0005] Ротовая полость человека содержит меняющееся и обширное количество флоры (бактериальных и других микроскопических форм жизни), и в ротовой полости могут возникать многие заболевания желудочно-кишечного тракта и респираторной системы. Существуют также многие болезни, которые являются специфическими для ротовой полости. В дополнение к бактериальным организмам оральные микроорганизмы могут включать грибы, простейшие и вирусы, и многие из этих микроорганизмов могут прикрепляться к зубам, к поверхности зубодесневых карманов, к языку и к слизистой оболочке щек. Каждый такой участок характеризуется своим уникальным путем размещения бактерий. Каждый такой участок обладает своим уникальным путем размещения микроорганизмов. Многие из этих микроорганизмов могут прикрепляться к полимерам и захватываться этими полимерами, с которыми они контактируют, находясь в ротовой полости, и эти полимеры входят в состав дентальных и околозубных (периодонтальных) приспособлений и композиций в дополнение к составу жевательных резинок, описанному выше.
[0006] Следовательно, существует необходимость в разработке новых способов обнаружения, идентификации и количественного определения количества микроорганизмов, которые прикрепились к полимерам в ротовой полости, таких как бактерии, которые содержатся на поверхности или внутри жевательной резинки после ее использования.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Известно, что жевательная резинка способствует поддержанию здоровья полости рта; однако неясно, действительно ли жевательная резинка может способствовать удалению бактерий и других микроорганизмов из ротовой полости. Настоящее изобретение предусматривает способ обнаружения и определения количества микроорганизмов, которые содержатся на поверхности и внутри жевательной резинки после ее использования (например, после in vivo жевания, разминания при помощи пальцев или роботизированного или искусственного имитированного жевания). Исследования, проведенные в данной заявке, привели к созданию способа, при помощи которого количество микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки после жевания, может быть количественно определено и охарактеризовано.
[0008] Настоящее изобретение предусматривает способы обнаружения и количественного определения микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Термин "содержащихся" относится к микроорганизмам, которые прикрепились или прилипли к жевательной резинке, включая микроорганизмы, которые находятся внутри или захвачены в складках прожеванной или размятой пальцами жевательной резинки.
[0009] Согласно одному аспекту данного изобретения это изобретение предусматривает способы обнаружения микроорганизма, содержащегося на поверхности или внутри жевательной резинки, включающие а) обработку ультразвуком жевательной резинки в условиях, которые приводят к удалению микроорганизма из жевательной резинки и осаждения микроорганизма в суспензии, b) контактирование по меньшей мере части суспензии с твердой подложкой в условиях, которые ускоряют образование колоний, при этом образование колонии на твердой подложке свидетельствует о наличии микроорганизма на поверхности или внутри жевательной резинки. Согласно этому способу жевательная резинка может контактировать с полостью рта млекопитающего до обработки ультразвуком, например, после того, как млекопитающее жевало резинку, или с микроорганизмом, прикрепившимся к жевательной резинке вне полости рта млекопитающего, например, при разминании пальцами, как описано в Примере 1, или во время роботизированного или механического жевания при помощи имитаторов жевания. "Твердая подложка" представляет собой матрицу, в которой микроорганизм, такой как бактерия, гриб, простейшее или вирус, может расти в такой среде, как среда, содержащая агар или другой инертный отверждающийся агент, такой как желатин.
[0010] Воздействие ультразвуком относится к применению звуковой энергии, такой как ультразвук, для возбуждения частиц в образцах, например, к воздействию ультразвуком на жевательную резинку для удаления микроорганизмов, такого как бактерии, прикрепившиеся к жевательной резинке. Некоторые ультразвуковые аппараты (соникаторы) содержат зонд, который непосредственно контактирует с образцом. Ультразвуковые аппараты с применением водяной бани имеют элементы, генерирующие ультразвук, расположенные ниже емкости, в которой опосредованно перемешивается образец. Воздействие ультразвуком может быть осуществлено с применением стандартных размеров, например, как у жевательной резинки, обрабатываемой ультразвуком, которая была сформована с получением определенного изделия с использованием формующего устройства. Такое формующее устройство может быть любой формы со стандартными размерами, и оно может быть изготовлено из любого материала, к которому только слегка прилипает или вообще не прилипает жевательная резинка, такого как, например, политетрафторэтилен (TEFLON).
[0011] Способы обнаружения микроорганизма, содержащегося на поверхности или внутри жевательной резинки, дополнительно могут включать стадию количественного определения микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри прожеванной жевательной резинки, при этом количество колоний микроорганизмов является показателем количества микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Количественное определение может включать построение стандартной кривой для определения количества микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Комбинация обработки ультразвуком и построения стандартной кривой позволяет обнаруживать ряд микроорганизмов на поверхности жевательной резинки для экстраполяции общего числа микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки.
[0012] Согласно другому аспекту настоящего изобретения данное изобретение предусматривает способы обнаружения наличия микроорганизма в полости рта у млекопитающего, включающие а) обработку ультразвуком жевательной резинки, которая была в контакте с полостью рта млекопитающего в условиях, которые приводят к удалению микроорганизма из жевательной резинки и к осаждению микроорганизма в суспензии, b) контактирование по меньшей мере части суспензии с твердой подложкой в условиях, которые ускоряют образование колоний, при этом образование колонии микроорганизма на твердой подложке показывает на наличие микроорганизма в полости рта млекопитающего. Воздействие ультразвуком может быть осуществлено с применением стандартных размеров, например, как у жевательной резинки, обрабатываемой ультразвуком, которая была сформована с получением определенной формы с использованием формующего устройства.
[0013] Способы обнаружения наличия микроорганизма в полости рта млекопитающего могут также включать стадию количественного определения микроорганизма, содержащегося в полости рта млекопитающего, при этом количество колоний является показателем количества микроорганизмов в ротовой полости млекопитающего. Количественное определение может включать построение стандартной кривой для определения количества микроорганизмов, содержащихся в ротовой полости млекопитающего.
[0014] Согласно другому аспекту настоящее изобретение предусматривает способы количественного определения микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки, включающие а) обработку ультразвуком жевательной резинки в условиях, которые приводят к удалению микроорганизмов из жевательной резинки и к осаждению микроорганизмов в суспензии, b) контактирование по меньшей мере части суспензии с твердой подложкой в условиях, которые ускоряют образование колоний, и с) количественное определение колоний, образовавшихся на твердой подложке, при этом количество колоний на твердой подложке является показателем количества микроорганизмов, содержавшихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Количественное определение микроорганизмов, присоединившихся к жевательной резинке, может включать построение стандартной кривой для определения количества микроорганизмов, присоединившихся к жевательной резинке. Воздействие ультразвуком может быть осуществлено с применением стандартных размеров, таких как у жевательной резинки, обрабатываемой ультразвуком, которая была сформована с получением определенной формы с использованием формующего устройства.
[0015] Любой из описанных выше способов может включать также стадию идентификации микроорганизма. Такие микроорганизмы включают бактерии, вирусы, грибы и простейшие. Например, бактерии, которые обнаруживаются и определяются количественно способами согласно настоящему изобретению, включают патогенные или симбиотические бактерии полости рта, такие как Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Actinomyces naeslundii, Streptococcus sanguinis, Porphyromomas gingivalis, Porphymomas intermedia, Bacteroides forsythus, Tanneraella forsythia, Campylobacter rectus, Eubacerium nodatum, Peptostreptococcus micros, Streptococcus intermedius, Aggregetibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Lactobacillus salivarius, Streptococcus salivarius и Streptoococus sobrinus.
[0016] Кроме того, любой из способов, описанных выше, может включать также стадию диагностирования микробной инфекции у млекопитающего, когда жевательная резинка была в контакте с ротовой полостью субъекта и когда наличие микроорганизма, содержавшегося на поверхности или внутри жевательной резинки, является показателем микробной инфекции у субъекта.
[0017] Другой аспект настоящего изобретения предусматривает способы получения профиля микроорганизмов ротовой полости млекопитающего, включающие а) контактирование жевательной резинки с ротовой полостью субъекта, b) обнаружение наличия и отсутствия по меньшей мере одного микроорганизма, содержащегося на поверхности или внутри прожеванного полимера после контакта с ротовой полостью субъекта, при этом наличие или отсутствие по меньшей мере одного вида микроорганизма определяет профиль микроорганизмов ротовой полости субъекта. Когда прожеванный полимер входит в состав жевательной резинки, микроорганизм может содержаться на поверхности жевательной резинки или содержаться в складках прожеванной или размятой пальцами жевательной резинки. Термин "вид микроорганизма" относится к одному семейству, роду, виду, штамму, серотипу или серогруппе микроорганизма в зависимости от способа идентификации. Этот микроорганизм может представлять собой бактерию, вирус, гриб или простейшее. Профиль микроорганизмов может содержать информацию о по меньшей мере одном виде микроорганизмов, по меньшей мере двух видах микроорганизмов, по меньшей мере пяти видах микроорганизмов, по меньшей мере десяти видах микроорганизмов, по меньшей мере 20 видах микроорганизмов, по меньшей мере 50 видах микроорганизмов, по меньшей мере 100 видах микроорганизмов или по меньшей мере 500 видах микроорганизмов. Такой профиль может включать только один вид микроорганизмов или многие различные виды микроорганизмов.
[0018] В частности, настоящее изобретение предусматривает "бактериальные профили", которые содержат информацию о по меньшей мере одном виде бактерий, о по меньшей мере двух видах бактерий, по меньшей мере пяти видах бактерий, по меньшей мере 10 видах бактерий, по меньшей мере 20 видах бактерий, по меньшей мере 50 видах бактерий, по меньшей мере 100 видах бактерий или по меньшей мере 500 видах бактерий.
[0019] Данное изобретение предусматривает также вирусный профиль, который содержит информацию о по меньшей мере одном виде вирусов, по меньшей мере двух видах вирусов, по меньшей мере пяти видах вирусов, по меньшей мере 10 видах вирусов, по меньшей мере 20 видах вирусов, по меньшей мере 50 видах вирусов, по меньшей мере 100 видах вирусов и по меньшей мере 500 видах вирусов.
[0020] Кроме того, настоящее изобретение предусматривает также профили микроорганизмов, которые содержат информацию о по меньшей мере одном виде грибов (профиль грибов), по меньшей мере двух видах грибов, по меньшей мере пяти видах грибов, по меньшей мере 10 видах грибов, по меньшей мере 20 видах грибов, по меньшей мере 50 видах грибов, по меньшей мере 100 видах грибов или по меньшей мере 500 видах грибов.
[0021] Кроме того, настоящее изобретение предусматривает также профили микроорганизмов, которые содержат информацию о по меньшей мере одном виде простейших (профиль простейших), по меньшей мере двух видах простейших, по меньшей мере пяти видах простейших, по меньшей мере 10 видах простейших, по меньшей мере 20 видах простейших, по меньшей мере 50 видах простейших, по меньшей мере 100 видах простейших или по меньшей мере 500 видах простейших.
[0022] Эти способы могут необязательно включать также стадии сравнения профиля микроорганизмов млекопитающего с референсным профилем микроорганизмов, при этом референсный профиль является показателем повышенной восприимчивости к заболеванию, расстройству или патологическому состоянию, и оценки профиля микроорганизмов для определения наличия у субъекта повышенной восприимчивости к заболеванию или нарушению в полости рта. Кроме того, эти способы могут необязательно включать стадию количественного определения микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки.
[0023] Термин "профиль микроорганизмов" относится к наличию или отсутствию по меньшей мере одного вида микроорганизмов, который по меньшей мере частично идентифицирован или охарактеризован таким образом, что можно осуществлять контроль за наличием или отсутствием микроорганизма в любом конкретном образце. Термин "профиль микроорганизмов" включает бактериальные профили, вирусные профили, профили простейших и профили грибов и их комбинации. Термин "референсный профиль микроорганизмов" относится к профилю микроорганизмов, полученному для известного контрольного или стандартного образца, такому как референсный профиль для субъекта, о котором известно, что он имеет повышенную чувствительность к заболеванию, расстройству или патологическому состоянию полости рта. Например, профиль микроорганизмов может содержать информацию об одном или более видах бактерий, одном или более видах грибов, одном или более видах простейших или об одном или более видах вирусов. Кроме того, профиль микроорганизмов может характеризовать комбинацию микроорганизмов, такую как один или более видов бактерий, вирусов, грибов и/или простейших.
[0024] Профиль микроорганизмов субъекта ассоциируется с референсным бактериальным профилем, когда один или более видов микроорганизмов в референсном профиле имеются в профиле микроорганизмов субъекта. Для определения ассоциации профиля микроорганизмов субъекта с референсным профилем микроорганизмов указанные профили оцениваются для сравнения профиля микроорганизмов субъекта с референсным профилем.
[0025] Термин "бактериальный профиль" относится к наличию или отсутствию по меньшей мере одного вида бактерий, который по меньшей мере частично идентифицирован или охарактеризован таким образом, что можно контролировать наличие или отсутствие таких бактерий в любом конкретном образце. Термин "референсный бактериальный профиль" относится к бактериальному профилю, полученному для известного контрольного или стандартного образца, такому как референсный профиль для субъекта, о котором известно, что он имеет повышенную восприимчивость к заболеванию, расстройству или патологическому состоянию полости рта.
[0026] Бактериальный профиль субъекта ассоциируется с референсным бактериальным профилем, когда один или более видов бактерий в референсном профиле имеются в бактериальном профиле данного субъекта. Для определения ассоциации бактериального профиля субъекта с референсным бактериальным профилем указанные профили оцениваются для сравнения бактериального профиля субъекта с референсным профилем.
[0027] Методы получения бактериального профиля могут выявлять один или более видов бактерий. Например, некоторые бактерии, детектируемые для получения бактериального профиля, включают Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Actinomyces naeslundii, Streptococcus sanguinis, Porphyromomas gingivalis, Porphymomas intermedia, Bacteroides forsythus, Tanneraella forsythia, Campylobacter rectus, Eubacerium nodatum, Peptostreptococcus micros, Streptococcus intermedius, Aggregetibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Lactobacillus, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, и Streptoococus sobrinus, to name a few.
[0028] Кроме того, любой из профилей микроорганизмов согласно данному изобретению может быть использован для определения восприимчивости данного субъекта к возникновению заболевания, патологического состояния или нарушения, таких как хронический периодонтит, острый периодонтит у взрослых, гингивит, такой как острый некротизирующий язвенный гингивит, ангина Винсента ("вскопанный рот"), кариес зубов, наличие вирусов герпеса, первичный герпетический гингивостоматит или оральный герпес (герпетическая лихорадка и язвенный стоматит), генитальный герпес, наличие вируса ветряной оспы, например, ветрянки или опоясывающего герпеса, наличие гриппа, обычная простуда, наличие венерического заболевания, мононуклеоз, наличие вирусов Коксаки, например, синдром рука-нога-рот, герпетическая ангина, острый лимфонодулярный фарингит, инфекционный паротит, корь (краснуха), коревая краснуха (германская корь), африканская лимфома Беркитта, носоглоточная карцинома, волосистая лейкоплакия полости рта, младенческая розеола, саркома Капоши, кандидоз, острый псевдомембранозный кандидоз (микоз ротовой полости), острый атрофический (эритематозный) кандидоз, хронический гиперплазический кандидоз, хронический атрофический (эритематозный) кандидоз, аспергиллез, криптококкоз, гистоплазмоз, бластомикоз, паракокцидиоидомикоз и зигомикоз (мукормикоз).
[0029] Согласно другому аспекту настоящее изобретение предусматривает наборы для осуществления любого из способов, описанных в данной заявке. В частности, данное изобретение предусматривает наборы для обнаружения или количественного определения микроорганизмов на поверхности или внутри пережеванной жевательной резинки, или для получения бактериального профиля млекопитающего.
ОПИСАНИЕ РИСУНКА
[0030] На Фигуре 1 приведена калибровочная кривая для жевательной резинки, размятой пальцами, описанной в Примере 1. Кривая показывает количество бактерий, извлеченных после разминания пальцами в зависимости от первоначального количества бактерий в результате пережевывания.
[0031] Фигура 2 показывает количество бактерий, попавших в жевательную резинку в зависимости от времени, выраженное в колониеобразующих единицах (KOE; логарифмические единицы), определенных с использованием калибровочной кривой.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0032] Настоящее изобретение предусматривает способ обнаружения и количественного определения микроорганизмов, таких как бактерии, содержащихся и попавших внутрь пережеванной жевательной резинки с использованием обработки ультразвуком для удаления микроорганизма из жевательной резинки. Термин "содержащихся" относится к микроорганизмам, которые прикрепились или прилипли к жевательной резинке, включая микроорганизмы, которые находятся внутри или попали в складки пережеванной или размятой пальцами жевательной резинки. В частности, данное изобретение предусматривает способы обнаружения и количественного определения бактерий, содержащихся на поверхности или внутри пережеванной жевательной резинки с использованием обработки ультразвуком для удаления бактерий из жевательной резинки и осаждения бактерий на твердой подложке в условиях, которые ускоряют рост колоний, при этом образование колоний на твердой подложке показывает наличие бактерий, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Определение количества образовавшихся бактерий позволяет построить стандартную калибровочную кривую, как описано в Примере 1. Этот способ позволяет постоянно определять количество бактерий, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки независимо от вида бактерий или вида испытуемой резинки. Поскольку обработка ультразвуком может привести только к удалению бактерий, прикрепившихся к поверхности жевательной резинки, количество извлеченных бактерий примерно на 1 логарифмическую единицу меньше, чем количество бактерий, попавших внутрь.
[0033] Использование калибровочной кривой позволяет определить количество бактерий, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Комбинация обработки жевательной резинки ультразвуком и построение стандартной кривой позволяет использовать величину количества микроорганизмов на поверхности жевательной резинки для экстраполяции общего количества микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Один способ получения калибровочной кривой состоит в обработке жевательной резинки ультразвуком, когда резинка имеет стандартизованные размеры, например, жевательная резинка, которая имеет конкретную форму, полученную при формовании. Это формование обеспечивает фиксированную площадь поверхности для данного веса жевательной резинки, поэтому количество микроорганизмов, прикрепившихся к поверхности жевательной резинки будет служить средством для определения количества микроорганизмов внутри объема жевательной резинки.
3
[0034] Используемая формующее устройство может иметь любую форму, стандартизованные размеры, например, это может быть прямоугольная форма с размерами 15×15×4 мм или кубическая форма с объемом 12 мм. Форма может быть изготовлена из любого материала, такого как политетрафторэтилен (PTFE), известный также как TEFLON или DYNEON, поливинилиденфторид (PVDF), известный также как KYNAR, HYLAR и SOLEF; полиоксиметилен (РОМ), известный также как DELRIN, CELCON, DURACON и HOSTAFORM; сополимер этилена с тетрафторэтиленом (ETFE), известный также как TEFZEL, полиамидимиды, известные также как TORLON; перфторалкоксилированный (PFA) или фторированный сополимер этилена и пропилена (FEP).
[0035] Постоянство калибровочного способа было неожиданным, и оно позволяет осуществлять точное измерение независимо от вида бактерий, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Например, эксперименты, описанные в Примере 1, проводили с использованием in vitro способа разминания пальцами. Настоящее изобретение охватывает также способ осуществления изобретения с использованием искусственных или роботизированных имитаторов жевания, которые воспроизводят движения нижней челюсти, происходящие во время жевания жвачки. Опыты с разминанием жвачки пальцами объяснили то, что количество извлеченных бактерий примерно на одну логарифмическую единицу бактерий меньше, чем количество бактерий, которые попали при жевании. Хотя извлечение было довольно небольшим, то же самое объясняет наличие количества бактерий, которые были потеряны в процессе разминания пальцами, большинство бактерий все еще остаются в остатке от жевательной резинки. Калибровочная кривая объясняет эти потери и делает более точным подсчет количества бактерий, которые были захвачены. Кроме того, способ согласно данному изобретению позволяет подсчитать только живые организмы, которые способны к росту. Постоянство извлечения бактерий является очень высоким, например, 10%-ное извлечение бактерий из жевательной резинки наблюдалось постоянно в широком интервале концентраций. В экспериментах, описанных в данной заявке, палочковидные бактерии А. naeslundii, были потеряны в большей степени, чем кокковые штаммы, что может быть объяснено различием в способности к сцеплению (прикреплению), так как известно, что бактерии A. naeslundii характеризуются сильным прилипанием к поверхностям. Когда жевательная резинка контактирует с полостью рта млекопитающего, микроорганизмы, такие как бактерии, прикрепляются к жевательной резинке. Следовательно, способы согласно настоящему изобретению, могут быть использованы для выявления наличия микроорганизмов в ротовой полости млекопитающего. Информация о наличии некоторых микроорганизмов, таких как бактерии, в ротовой полости может быть использовано для диагностики инфекции или других заболеваний, или расстройств ротовой полости. Кроме того, наличие некоторых микроорганизмов, таких как некоторые бактерии, в ротовой полости может позволить определить риск или восприимчивость млекопитающего к развитию инфекционного заболевания или патологического состояния ротовой полости.
Жевательная резинка
[0036] Жевательная резинка обычно состоит из не растворимой в воде основы резинки, растворимой в воде части и вкусоароматического вещества. Со временем водорастворимая часть рассредоточивается вместе с частью ароматизирующего вещества во время жевания. Основа жевательной резинки удерживается во рту в процессе жевания.
[0037] Не растворимая в воде основа жевательной резинки обычно включает эластомеры, смолы, жиры и масла, мягчители и неорганические наполнители. Основа жевательной резинки может содержать или не содержать воск. Не растворимая в воде основа жевательной резинки может составлять примерно от 5% до примерно 95% от веса жевательной резинки, обычно основа жевательной резинки составляет от 10% до примерно 50% от веса жевательной резинки и согласно некоторым предпочтительным вариантам, от примерно 25% до примерно 35% от веса жевательной резинки.
[0038] Основа жевательной резинки может, например, содержать от примерно 20% до примерно 60% по весу синтетического эластомера, от примерно 0% до примерно 30% по весу природного эластомера, от примерно 5% до примерно 55% по весу пластификатора для эластомеров, от примерно 4% до примерно 35% по весу наполнителя, от примерно 5% до примерно 35% по весу мягчителя и необязательно незначительные количества (примерно 1% или менее по весу) вспомогательных ингредиентов, таких как красители, антиоксиданты и т.д.
[0039] Синтетические эластомеры могут включать, но без ограничения, полиизобутилен со средневесовой молекулярной массой, определенной методом гель-проникающей хроматографии (GPC) равной от примерно 10,000 до примерно 95,000, сополимер изобутилена и изопрена (бутилкаучук), сополимеры стирола с бутадиеном, имеющие отношение стирол: бутадиен, составляющее от примерно 1:3 до примерно 3:1, поливинилацетат со средневесовой молекулярной массой (метод GPC) от примерно 2,000 до примерно 90,000, полиизопрен, полиэтилен, сополимер винилацетата с виниллауратом, имеющий содержание виниллаурата, составляющее от примерно 5% до примерно 50% от веса сополимера, и их комбинации.
[0040] Предпочтительно использовать полиизобутилен со средневесовой молекулярной массой, определенной методом гель-проникающей хроматографии (GPC) равной от примерно 50,000 до 80,000 и сополимеры стирол-бутадиен с отношением стирола к бутадиену от 1:1 до 1:3, поливинилацетат со средневесовой молекулярной массой (метод GPC) от примерно 10,000 до 65,000, поливинилацетаты с высокой молекулярной массой обычно используются в основе надувной жевательной резинки, предпочтительно также применять сополимеры винилацетата с виниллауратом с содержанием виниллаурата, составляющим 10-45%.
[0041] Природные эластомеры могут включать натуральный каучук, такой как копченый или жидкий латекс и гваюла, а также природные смолы, такие как йелутонг, лечи каспи, перилло, сорва, смола балата массарандуба, массарандубы шоколадной, нисперо, розиндинья, чикле, гутта ханг канг и их комбинации. Предпочтительные концентрации синтетического эластомера и природного эластомера меняются в зависимости от того, является ли жевательная резинка, для которой используют эту основу, адгезивной или обычной, надувной жевательной резинкой или обычной резинкой, как это будет обсуждаться ниже. Предпочтительные природные эластомеры включают йелутонг, чикле, сорву и балату массарандубу.
[0042] Пластификаторы для эластомеров могут включать, но без ограничения, эфиры природной канифоли, такие как глицериновые эфиры или частично гидрированная канифоль, глицериновые эфиры полимеризованной канифоли, эфиры частично димеризованной канифоли, глицериновые эфиры канифоли, пентаэритритные эфиры частично гидрированной канифоли и частично гидрированные метиловые эфиры канифоли, пентаэритритные эфиры канифоли; синтетические соединения, такие как терпеновые смолы, полученные из альфа-пинена, бета-пинена и/или d-лимонена; и любые подходящие комбинации перечисленных пластификаторов. Вид предпочтительных пластификаторов для эластомеров зависит от конкретного назначения и от вида эластомера, который используется.
[0043] Наполнители/текстуризаторы могут включать карбонаты магния и кальция, известковую муку, силикаты, такие как силикаты магния и кальция и силикат алюминия, глину, оксид алюминия, тальк, оксид титана, моно-, ди- и трикальцийфосфат, различные целлюлозы, такие как древесная целлюлоза, и их комбинации.
[0044] Мягчители/эмульгаторы могут включать талловое масло, гидрированное талловое масло, гидрированные и частично гидрированные растительные масла, масло какао, моностеарат глицерина, триацетат глицерина, лецитин, моно-, ди- и триглицериды, ацетилированные моноглицериды, жирные кислоты (например, стеариновая, пальмитиновая, олеиновая и линолевая кислоты); и их комбинации. Красители и отбеливатели могут включать красители типа FD&C и лаки, фруктовые и овощные экстракты, оксид титана и их комбинации. Основа жевательной резинки может содержать или не содержать воск.
[0045] В дополнение к не растворимой в воде основе жевательной резинки типичная жевательная резинка включает растворимую в воде объемообразующую часть и один или более вкусоароматических веществ (ароматизаторов). Водорастворимая часть может включать объемообразующие подсластители, высокоинтенсивные подсластители, ароматизирующие агенты, мягчители, эмульгаторы, красители, подкислители, наполнители, антиоксиданты и другие компоненты, которые придают желательные свойства.
[0046] Мягчители добавляются в жевательную резинку для того, чтобы оптимизировать жевательные свойства и ощущение резинки во рту. Мягчители, которые также известны как пластификаторы и пластифицирующие агенты, обычно составляют от примерно 0.5% до примерно 15% от веса жевательной резинки. Мягчители могут включать глицерин, лецитин и их комбинации. В качестве мягчителей и связующих в жевательной резинке могут быть использованы водные растворы подсластителей, такие как растворы, содержащие сорбит, гидрогенизированные гидролизаты крахмала, кукурузный сироп и их комбинации.
[0047] Объемообразующие подсластители могут содержать сахар и не содержать сахар. Объемообразующие подсластители обычно могут составлять от примерно 5% до примерно 95% от веса жевательной резинки, чаще от примерно 20% до примерно 80% по весу, и более предпочтительно, от примерно 30% до примерно 60% от веса жевательной резинки. Содержащие сахар подсластители обычно включают компоненты, содержащие сахариды, известные в области получения жевательных резинок, включая, но без ограничения, сахарозу, декстрозу, мальтозу, декстрин, высушенный инвертный сахар, фруктозу, левулозу, галактозу, твердые вещества кукурузного сиропа и т.п. в отдельности или в комбинации друг с другом. Бессахарные подсластители включают, но без ограничения, сахарные спирты, такие как сорбит, маннит, ксилит, гидрогенизированные гидролизаты крахмала, мальтит и т.п. в отдельности или в комбинации друг с другом.
[0048] Могут быть также использованы высокоинтенсивные подсластители, в отдельности или в комбинации с перечисленными выше компонентами. Предпочтительные подсластители включают, но без ограничения, сукралозу, аспартам, соли ацесульфама, алитам, сахарин и его соли, цикламовую кислоту и ее соли, глицирризинат, дигидрохальконы, тауматин, ло хан го, монеллин, стевию и ее гликозиды и т.п., в отдельности или в комбинации друг с другом. Для обеспечения длительной сладости и восприятия вкуса может быть желательно проводить инкапсулирование подсластителей или регулировать другим образом высвобождение по меньшей мере части искусственного подсластителя. Для достижения желательных характеристик высвобождения могут быть использованы такие методы, как влажное гранулирование, сушка при распылении, охлаждение при распылении, покрытие в псевдоожиженном слое, коацервация и вытягивание волокна.
[0049] В жевательной резинке могут применяться комбинации подсластителей, содержащих и/или не содержащих сахар. Кроме того, дополнительную сладость могут придавать мягчители, такие как водные растворы сахара или альдита.
[0050] Настоящее изобретение включает способы обнаружения микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри полимеров, пластичных в живом организме. В изобретении также предусматриваются способы определения микробного профиля образца слюны живого организма. Микробный профиль образца слюны можно применять для определения чувствительности организма или повышенного риска развития у него кариеса или пародонтоза независимо от того, действительно ли микроорганизмы вызывают инфекцию в настоящее время. Кроме того, способы по изобретению можно использовать применительно к методам контроля качества с целью определения, является ли полимер восприимчивым или устойчивым к прикреплению или захвату микроорганизмов.
Микроорганизмы
[0051] Согласно настоящему изобретению предусматриваются способы обнаружения, идентификации и количественного определения микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Термин "тип микроорганизма" относится к одному семейству, роду, виду, штамму, серотипу (серологическому типу) или к одной серологической группе конкретного микроорганизма в зависимости от способа идентификации.
[0052] Термин "микроорганизмы", или "микробы", относится к микроскопическим организмам, которые могут представлять собой одноклеточные или многоклеточные организмы и могут быть патогенными или условно-патогенными по отношению к организму-хозяину. Согласно настоящему изобретению предусматриваются способы обнаружения и количественного определения микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри полимера, пластичного в живом организме, и эти микроорганизмы включают бактерии, вирусы, грибы и простейшие.
[0053] Например, в данном изобретении предусматриваются способы обнаружения, идентификации и количественного определения бактерий, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки. Термин "тип бактерии" относится к одному семейству, роду, виду, штамму, серотипу или к одной серологической группе бактерии в зависимости от способа идентификации.
[0054] Бактерии могут представлять собой грамотрицательные или грамположительные бактерии и анаэробные или аэробные бактерии. Бактерии могут представлять собой кокки (сферические бактерии) или бациллы (палочковидные бактерии). В частности, в изобретении рассматриваются способы обнаружения бактерий ротовой полости, например, таких как условно-патогенные бактерии ротовой полости и патогенные бактерии ротовой полости, такие как streptococci (стрептококки), lactobacilli (молочнокислые бактерии, лактобактерии), staphylococci (стафилококки), corynebacteria (коринебактерии), actinomyces sp.(актиномицеты, лучистые грибки), fusobacterium sp.(фузобактерии, веретенообразные бактерии) и различные anaerobes (анаэробы), в частности, bacteroides (бактероиды, бактерии-сапрофиты). Примеры бактерий ротовой полости включают Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius, Actinomyces naeslundii, Streptococcus sanguinis, Porphyromomas gingivalis, Porphymomas intermedia, Bacteroides forsythus, Tanneraella.
[0055] Настоящее изобретение также предусматривает способы обнаружения, идентификации и количественного определения вирусов, прикрепленных к жевательной резинке (попавших в жевательную резинку). Термин "тип вируса" относится к одному семейству, роду, виду, штамму, серотипу или к одной серологической группе вируса в зависимости от способа идентификации.
[0056] Вирус может являться членом семейства герпесвирусов, например, таким как герпесвирус человека (HHV), включая HHV-1 (также известный как вирус простого герпеса (HSV)-1), HHV-2 (HSV-2), HHV-3 (также известный как вирус ветряной оспы), HHV-4 (вирус Эпштейна-Барр), HHV-5 (цитомегаловирус), HHV-6, HHV-7 и HHV-8.
[0057] Вирус может являться членом семейства пикорнавирусов (Picornaviridae) (род энтеровирусов, Enterovirus genus), например, таким как вирус полиомиелита (полиовирус), вирус Коксаки группы А, вирус Коксаки группы В, эховирус (ECHO). В частности, вирус, который может вызывать энтеровирусный везикулярный стоматит (синдром "рука-нога-рот"), например, такой как вирус Коксаки А16, А5, А7, А10, В2 и В5, вирус, который вызывает герпетическую ангину (афтозный (везикулярный) фарингит), например, такой как вирус Коксаки А1-6, А8, А10 и А22, и Энтеровирус 71 (EV-71).
[0058] Вирус может являться членом семейства паповавирусов (Papovaviridae), например, такого как семейство вирусов папилломы человека (HPV), включая HPV-16, HPV-18, HPV-33 и HPV-35. Вирус может являться членом семейства парамиксовирусов (Paramyxovirus) (рода Rubulavirus), таким как вирус эпидемического паротита, вирус болезни Ньюкасла, вирус парагриппа 2, 4а и 4b. Вирус может являться членом семейства парамиксовирусов (Paramyxovirus) (рода Morbillivirus). Также вирус может являться членом семейства тогавирусов (рода рубивирусов, Rubivirus genus). Вирус может также представлять собой вирус папилломы ротовой полости лошадей, кошачий калицивирус и вирус кошачьего герпеса.
[0059] Вирус может также представлять собой вирус гриппа, например, вирус гриппа человека типа А, такой как H1N1 и H3N3, вирус гриппа человека типа В и вирус гриппа человека типа С. Вирус может представлять собой такой вирус, который вызывает обычную простуду, например, риновирус.
[0060] Известно, что некоторые вирусы герпеса (вирус простого герпеса и вирус ветряной оспы, вызывающий ветряную оспу и опоясывающий лишай) являются причиной воспаления десен. Другие герпесвирусы (цитомегаловирус и вирус Эпштейна-Барр) также могут играть некоторую роль в возникновении или в прогрессировании некоторых типов пародонтоза, включая агрессивное и тяжелое хроническое заболевание пародонта. Все герпесвирусы проходят через активные фазы, за которыми следует латентная (скрытая) фаза и, возможно, реактивация. Эти вирусы могут вызывать болезнь пародонта различными путями, включая высвобождение разрушающих ткани цитокинов, избыточный рост бактерий пародонта, факторы, подавляющие иммунную систему, и инициирование других патологических процессов, которые приводят к гибели клеток.
[0061] В изобретении предусматриваются способы обнаружения, идентификации и количественного определения грибов, прикрепленных к жевательной резинке. Термин "тип гриба" относится к одному семейству, роду, виду, штамму, серотипу или к одной серологической группе гриба в зависимости от способа идентификации.
[0062] Способы по изобретению позволяют обнаруживать такие грибы, как Candida, например, Candida albicans, Aspergillus, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidiodes immites и Zygomycota.
[0063] В изобретении предусматриваются способы обнаружения, идентификации и количественного определения простейших, прилипающих к жевательной резинке. Термин "тип простейшего" относится к одному семейству, роду, виду, штамму, серотипу или к одной серологической группе простейшего в зависимости от способа идентификации.
[0064] Способы по изобретению позволяют обнаруживать простейшие, например, такие как Entamoeba gingivalis и Trichomonas tenax.
[0065] Согласно настоящему изобретению рассматривается обнаружение микроорганизмов, которые вызывают заболевания или патологии ротовой полости или связаны с заболеваниями или патологиями ротовой полости, например, такими как заболевание пародонта (воспаление или инфекция десневой ткани), такое как хронический периодонтит и острый периодонтит взрослых, гингивит, например, острый некротизирующий язвенный гингивит, ангина Венсана (ангина язвенно-пленчатая, "вскопанный рот"), кариес, инфекция, вызванная вирусом герпеса, первичный герпетический гингивостоматит, или герпес ротовой полости (герпес губы и язвенный стоматит), герпес гениталий, инфекция, вызванная вирусом ветряной оспы, например, ветрянка или опоясывающий лишай, грипп, обычная простуда, венерическое заболевание, мононуклеоз, инфекция, вызванная вирусами Коксаки, например, такая как энтеровирусный везикулярный стоматит (синдром "рука-нога-рот"), афтозный стоматит (везикулярный) (герпетическая ангина, герпангина), острый фарингит неуточненный, свинка, корь (корь, краснуха), коревая краснуха (немецкая корь), африканская лимфома Беркитта, рак носоглотки, волосистая (волосатая) лейкоплакия ротовой полости, детская розеола, саркома Капоши, кандидоз (стоматомикоз), острый псевдомембранозный кандидоз (острый кандидозный стоматит, микоз ротовой полости), острый атрофический (эритематозный) кандидоз, хронический гиперпластический кандидоз, аспергиллез, криптококкоз (торулез), гистоплазмоз (также известный как пещерная болезнь, болезнь Дарлинга, болезнь долины Огайо, ретикулоэндотелиоз и болезнь спелеологов), бластомикоз (также известный как североамериканский бластомикоз, кожный бластомикоз и болезнь Гилкриста), паракокцидиоидоз (паракокцидиоидомикоз) (также известный как бразильский бластомикоз, южноамериканский бластомикоз, болезнь Лутца-Сплендоре-де Альмейды и паракокцидиоидная гранулема), мукоромикоз (от слова "мукоровые" (плесневые) грибы), фикомикоз (от слова "фикомицеты" (низшие грибы)) и базидиоболомикоз (от слова Basidiobolus, базидиоболус) и зигомикоз (мукоромикоз). В изобретении также предусматриваются способы диагностики любого состояния, заболевания или расстройства, которые вызваны или обусловлены присутствием микроорганизма, содержащегося на поверхности или внутри жевательной резинки.
Колонии микроорганизмов
[0066] Согласно одному варианту изобретения способы включат осаждение суспензии микроорганизма, такого как бактерии, вирус, простейшие или грибы, на твердой подложке, такой как среда, содержащая агар-агар или другой инертный отвердитель, например, желатин. Степень отверждения также может меняться, причем для ингибирования роста бактерий на твердой среде ("скопления") предпочтительным является твердый агар, а полутвердый, или "полужидкий" агар применяется для изучения других характеристик. Предпочтительно, перед применением такую среду сделать стерильной.
[0067] Твердая подложка может представлять собой скошенный агар, камеру или чашку Петри, содержащие твердую среду. Твердая среда имеет физическую структуру, которая обеспечивает физически наглядный или успешный рост бактерий, например, в виде колоний или штриховых культур. Термин "колония" относится к множеству (скоплению) или к массе клеток или организмов, растущих на или в твердой среде. В изобретении предполагается, что твердая среда может содержать колориметрический индикатор (индикаторная среда), может представлять собой селективную среду или дифференциальную среду.
[0068] Питательные среды, используемые в данном изобретении, представляют собой любой жидкий или твердый препарат, пригодный для роста, поддержания, хранения, дифференцировки и/или идентификации бактерий. Они включают такие среды, которые применяются для стимуляции культуры (или субкультуры) (стимуляции культивирования или субкультивирования), для обогащения или для диагностических (идентификационных) тестов с использованием различных организмов. Эти тесты представляют собой такие испытания, в которых идентичность данного организма можно установить на основании особенностей его роста в или на конкретной среде.
[0069] Термин "селективная среда" относится к среде, предназначенной для подавления роста некоторых микроорганизмов, но в то же время способствующей росту других микроорганизмов. Например, агар МакКонки позволяет проводить отбор против грамположительных бактерий, на агаре с эозином и метиленовым синим проводят отбор против грамположительных бактерий, а фенилэтиловый спирт позволяет проводить отбор против грамотрицательных бактерий. Дифференциальная среда способствует росту одного или более микроорганизмов, представляющих интерес, но с морфологически отличными колониями. Например, маннит-солевой агар (ферментация маннита = желтое окрашивание), кровяной агар (различные типы гемолиза), агар МакКонки (ферментация лактозы = желтое окрашивание) и агар с эозином и метиленовым синим (различные типы дифференцировки).
2
[0070] При использовании культуры для анаэробных бактерий необходимо, чтобы газ (воздух) над поверхностью среды не содержал кислорода и чтобы в среде отсутствовал растворенный кислород. Даже в этих условиях некоторые анаэробы могут не размножаться (расти), если среда предварительно не будет восстановлена, т.е. уравновешена при величине или ниже величины конкретного редокс-потенциала. Соответственно, в состав среды могут быть включены также восстанавливающие агенты, такие как восстановители, содержащие сульфгидрильные группы (например, HS, цистеин, тиогликолят). Примеры общедоступных сред, пригодных для селективного роста анаэробов, применяемые в настоящем изобретении, включают, но без ограничения (как в виде бульона, так и в виде агара): бульон с сердечно-мозговым экстрактом, агар/бульон для бруцелл (Brucella), CDC Anaerobe, агар/бульон с питательными веществами, агар/бульон Шедлера, тиогликолятный или триптиказо-соевый агар/бульон.
[0071] Кроме того, можно создавать анаэробную среду в анаэростате, анаэробной камере или в анаэробном контейнере. Анаэростат представляет собой контейнер, применяемый для инкубации материалов (например, для засевания материалов на среды) в отсутствие кислорода или, в общем, в воздушной среде, отличной от атмосферного воздуха. Анаэростаты более известны под названиями "Brewer Jar", "Gaspak", "Mcintosh and Filde's Anaerobic Jar", и т.д.
[0072] Культуральную среду засевают образцом суспензии бактерий, извлеченных из жевательной резинки. Суспензию можно разбавлять перед засеванием на культуральную среду или нанесением на твердую подложку. Согласно некоторым вариантам образец можно серийно разводить и серийные разведения применять для засевания совокупности культуральных сред, чтобы более точно подсчитать число бактерий в исходном образце.
[0073] Согласно другому варианту данного изобретения способы включают выращивание бактерий, извлеченных из жевательной резинки, и разведенную суспензию бактерий, извлеченных из жевательной резинки, можно засевать на бульонную питательную среду. Бульонная (питательная) среда означает среду, не содержащую загустевающей (затвердевающей) матрицы. Инокулированную культуральную среду инкубируют в условиях, которые способствуют росту растений. Бульонная среда позволяет предусматривать детекцию типа среды. Например, среда содержит колориметрический индикатор (индикаторная среда), представляет собой селективную среду или дифференциальную среду.
[0074] Согласно некоторым вариантам способа по настоящему изобретению число микроорганизмов в образце может быть подсчитано. Например, можно подсчитать число бактерий в образце, выбирая такую форму культуральной среды, которая обеспечивает образование колоний. После инокуляции культуральной среды и инкубации в условиях, которые допускают образование колоний бактерий, колонии можно подсчитать. Колонии можно подсчитывать, считая детектируемый сигнал, возникающий при реакции индикатора и фосфатазы, которую продуцируют бактерии. Согласно тем вариантам изобретения, в которых в качестве индикаторов для субстрата фосфатазы используют 5-бром-6-хлор-3-индолилфосфат или 6-хлор-3-индолилфосфат, детектируемым сигналом может служить окрашивание колоний от красного до красно-фиолетового цвета. При этом согласно некоторым вариантам подсчет микроорганизмов заключается в простом подсчете колоний с конкретной окраской, например, колоний, которые в фосфатном буфере имеют окраску от красной до красно-фиолетовой. Подходящие детектируемые сигналы включают, но без ограничения, хемилюминесцентный сигнал, флуоресцентный сигнал или изменение электрической проводимости. Согласно некоторым вариантам обнаружение детектируемого сигнала можно осуществлять вручную, тогда как согласно другим вариантам для обнаружения детектируемого сигнала могут потребоваться специальные измерительные приборы, известные среднему специалисту в данной области техники. Способ, применяемый для подсчета микроорганизмов в конкретном образце, может зависеть, например, от типа детектируемого сигнала, используемого в способе по настоящему изобретению.
[0075] Помимо количественного определения микроорганизмов, извлеченных из жевательной резинки, способ по изобретению можно применять также для идентификации микроорганизма, извлеченного из жевательной резинки. Идентификацию можно проводить на основе принципов таксономии (микроорганизмов) с учетом морфологических и метаболических характеристик. Для идентификации типа бактерий, извлеченных из жевательной резинки, можно анализировать морфологию колоний. Термин "морфология колоний" относится к визуальным характеристикам колонии. Колонии, которые отличаются по внешнему виду, как правило, относятся к разным семействам, родам, видам, штаммам, серотипам и серологическим группам бактерий. Морфологию колоний определяют, например, на основании формы, края (границ), цвета, характерных особенностей поверхности, высоты, прозрачности или пигментации колонии бактерий.
[0076] Существует много различных тестов, известных в уровне техники, которые позволяют различать микроорганизмы. Методы молекулярной биологии, применяемые для идентификации специфических генов или генных сегментов известных бактерий, включают PCR (ПЦР), нозерн-блоттинг, традиционный Саузерн-блоттинг и Саузерн-блоттинг в импульсном магнитном поле, денатурирующий градиентный гель-электрофорез, микрочипы, слот-блоттинг или дот-блоттинг с использованием полинуклеотидных последовательностей, специфических для конкретного семейства, рода, вида, штамма, серотипа или конкретной серологической группы.
[0077] Например, для определения типа бактерий можно использовать определение последовательности гена 16S рибосомной РНК и других областей в геноме бактерий. Методы аналитической химии, например, такие, как анализ жирнокислотного профиля, углеводного профиля и содержания различных форм убихинона, определение характеристик секретируемых продуктов метаболизма, например, таких как летучие спирты и короткоцепные жирные кислоты, также применяются для идентификации бактерий по типу.
[0078] Согласно другому варианту изобретения предусматриваются способы, включающие осаждение вируса из суспензии на конфлуэнтном монослое клеток, прикрепленном к твердой подложке, такой, как среда, содержащая агар, карбоксиметилцеллюлозу или другой отвердитель, например, желатин, как описано выше. Колонии вирусов также известны как "вирусные бляшки". Вирусная бляшка образуется, когда вирус инфицирует клетку в фиксированном монослое. Вирус разрушает клетку, и инфекция распространяется на другие клетки. Инфицированные клетки образуют бляшки, которые можно увидеть под микроскопом. Анализы для определения количества вируса хорошо известны в уровне техники, как например, анализы, в которых используются иммунофлуоресценция, колориметрические измерения, анализы белков и гемагглютинация вирусов, см., например, Kaufman & Kabelitz, Methods of Microbiology Vol. 32 Immunology of Infection, Academic Press, 2002.
[0079] Помимо количественного определения вирусов, извлеченных из жевательной резинки, способы по изобретению можно применять для идентификации вируса, извлеченного из жевательной резинки. Идентификацию можно проводить методами молекулярной биологии, применяемыми для идентификации специфических генов или генных сегментов известных вирусов, которые включают PCR (ПЦР), нозерн- блоттинг, традиционный Саузерн-блоттинг и Саузерн-блоттинг в импульсном магнитном поле, денатурирующий градиентный гель-электрофорез, микрочипы, слот-блоттинг или дот-блоттинг с использованием полинуклеотидных последовательностей, специфических для конкретного семейства, рода, вида, штамма, серотипа или конкретной серологической группы. Для идентификации морфологических характеристик вируса могут применяться также методы микроскопии, например, для определения размера, формы или других отдельных морфологических признаков вируса.
Наборы
[0080] Данное изобретение также предусматривает наборы для осуществления способов по изобретению. В частности, в изобретении предусматривается набор, содержащий компоненты для обнаружения и/или количественного определения бактерий, извлеченных из жевательной резинки, согласно любому способу по изобретению.
[0081] Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут понятны после рассмотрения нижеприведенных иллюстративных примеров.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Количественное определение бактерий, попавших на поверхность и внутрь размятой пальцами жевательной резинки
[0082] Для определения количества бактерий, попавших (прикрепленных) на поверхность или внутрь жевательной резинки, было проведено in vitro исследование размятой пальцами жевательной резинки. В этом эксперименте использовали две продажные таблетки мятной жевательной резинки.
[0083] Жевательная резинка А: Продажная жевательная резинка 1 (таблетки 1.5 г). Композиция в порядке убывания веса: сорбит, гуммиоснова (основа жевательной резинки), глицерин. Натуральные и искусственные вкусоароматические вещества; содержание менее 2%: гидрогенизированный гидролизат крахмала, аспартам, маннит, ацесульфам K, соевый лецитин, ксилит, бета-каротин, лак Синий 1 и бутилированный гидрокситолуол.
[0084] Жевательная резинка В: Продажная жевательная резинка 2 (таблетки 1.5 г). Композиция в порядке убывания веса: сорбит, гуммиоснова (основа жевательной резинки), глицерин, маннит, ксилит. Натуральные и искусственные вкусоароматические вещества; менее 2%: ацесульфам K, аспартам, бутилированный гидрокситолуол, лак Синий №1, соевый лецитин и лак Желтый №5. Все изделия жевательной резинки имели стандартный вес 1.5 г.
4
5
7
9
[0085] В данном исследовании использовали три различных штамма бактерий, S. oralis J22, S. mutans АТСС 25175 и A. naeslundii T14V-J1. Считается, что S. oralis и А. naeslundii образуют первичные колонии на поверхности зубов in vivo, в то время как S. mutans являются причиной кариеса. Streptococci выращивали аэробно в бульоне Тодда Хьюитта (Todd Hewitt Broth) при 37°С, a Actinomyces выращивали анаэробно в бульоне с сердечно-мозговым экстрактом. Бактерии выращивали на плашках с соответствующим агаром с использованием замороженного исходного препарата в течение 24 часов, после чего 5 мл соответствующей культуральной среды инокулировали в течение 24 часов. Основную культуру готовили с использованием разведения 1:10 в свежей среде в течение 16 час. Основные культуры обрабатывали ультразвуком с целью суспендировать бактериальные агрегаты. Концентрацию бактерий определяли, используя счетную камеру Бюркера-Тюрка (Burker-Turk), и концентрацию доводили до 10, 10, 10 и 10 бактерий в мл.
[0086] Бактерии каждого штамма разминали пальцами вместе с таблетками жевательной резинки после добавления 1.5 г жевательной резинки вместе с 200 мкл бактериальной суспензии в палец стерильной латексной перчатки (Powder-Free Latex Examination Gloves, VWR international, Radnor, USA). Затем бактерии разминали пальцами с жевательной резинкой ("вминали" в жевательную резинку) при 30°С в течение 5 минут. После разминания пальцами жевательную резинку вынимали из пальца перчатки, погружали один раз в стерильную воду и помещали в тефлоновую форму (15×15×1 мм), чтобы создать фиксированную (воспроизводимую) площадь поверхности жевательной резинки (±15×15×4 мм), используя стерильный пинцет. После этого бактерии извлекали из жевательной резинки с помощью ультразвука в стерильных чашках из полистирола, заполненных 5 мл восстановленной среды-носителя (RTF), стерилизованной фильтрованием через мелкопористый фильтр (Millipore, Millex GS 0,22 мкм), как описано в публикации Syed et al. (Appl. Microbiology 24: 638-644), в течение 60 секунд на ультразвуковой водяной бане (ELMA Transsonic ТР690, Elma GmbH & Со, Germany). Наконец, готовили серийные разведения полученной суспензии, и эти серийные разведения помещали в плашки с агаром Тодда-Хьюитта (ТНВ) или кровяным агаром (основа кровяного агара по. 2, 40 г/л, гемин 5 мг/л, менадион 1 мг/л, овечья кровь 50 мл/л). Колониеобразующие единицы (CFU, KOE): выдерживали при 37°С в течение 48 час, после чего считали число колониеобразующих единиц и переводили их в число бактерий, попавших (захваченных) в одну таблетку жевательной резинки. Эксперименты проводили в трех параллельных анализах.
[0087] Для подсчета предположительной потери бактерий вследствие прилипания (прикрепления) к внутренней поверхности перчаток, палец перчатки выворачивали наизнанку, подвергали действию ультразвука в 10 мл стерилизованной фильтрованием RTF в течение 60 секунд и серийные разведения засевали на агар, как описано выше, после чего определяли число предположительно потерянных KOE (CFUs). Аналогичным образом анализировали бактерии, предположительно потерянные в воде, в которую погружали размятую пальцами жевательную резинку (см. выше). В процессе разминания пальцами были потеряны примерно 0.05 логарифмических единиц кокков (S. oralis и & mutans) вследствие прилипания (прикрепления) к поверхности перчаток. К поверхности перчаток прилипало немного большее количество бактерий A. naeslundii. Потери бактерий вследствие погружения разминаемых пальцами таблеток жевательной резинки в воду составляли в среднем 0.004 логарифмических единиц. Потери вследствие разминания пальцами не зависели от вида участвующей в эксперименте жевательной резинки, однако немного уменьшались при повышении концентрации.
[0088] Ввиду того, что с образцами жевательной резинки разминали различные количества бактерий, можно было построить калибровочную кривую для различных бактериальных штаммов, показывающую число бактерий, извлеченных из каждого образца жевательной резинки, в зависимости от фактического числа бактерий, прикрепленных к размятой пальцами жевательной резинке. Использование калибровочной кривой позволяет рассчитать количество бактерий, прикрепленных к размятой пальцами или пережеванной жевательной резинке или захваченных этой жевательной резинкой, которое отражает общее количество микроорганизмов, содержащихся на поверхности или внутри жевательной резинки.
[0089] С учетом этих потерь были получены линейные соотношения между числом бактерий, извлеченных из жевательной резинки, и числом бактерий в размятой пальцами жевательной резинке (Фигура 1), которые не зависят от типа бактериального штамма или вида испытуемой жевательной резинки. Поскольку обработка ультразвуком может привести только к удалению бактерий, попавших в жевательную резинку с внешней поверхности, количество извлеченных бактерий примерно на 1.5 логарифмических единицы меньше, чем количество бактерий, попавших внутрь.
[0090] Данное исследование также доказывает, что способы по изобретению дают возможность детектировать и количественно определять бактерии ротовой полости, которые содержатся на поверхности и внутри жевательной резинки.
Пример 2
Количественное определение бактерий, прикрепленных к пережеванной жевательной резинке In Vivo
[0091] Было проведено in vivo исследование с целью продемонстрировать, что жевательная резинка может удалять бактерии из ротовой полости. Здоровые добровольцы дали свое письменное информированное согласие на участие в данном исследовании. Критерии включения в данное исследование: каждый доброволец должен быть здоров и иметь по меньшей мере 16 собственных постоянных зубов. Критерии исключения: применение антибиотиков или ополаскивателя для полости рта в течение месяца перед исследованием. Добровольцы также не должны были применять антибиотики, ополаскиватели для полости рта и жевательную резинку других типов во время исследования. Все эксперименты проводили в двух повторностях.
[0092] Затем добровольцев просили жевать резинку двух различных видов в течение разного времени вплоть до 10 минут, и число бактерий, захваченных резинкой при разжевывании, определяли в CFU (KOE) после разрушения стандартных таблеток разжеванной жевательной резинки с помощью ультразвука. Определение числа бактерий дало начальный пик количества захваченных (прикрепленных) бактерий вскоре после (начала) жевания. По мере увеличения времени жевания вплоть до 10 минут число прикрепленных бактерий снижалось.
[0093] Предполагается, что при практическом использовании изобретения специалисты в данной области техники, после рассмотрения предпочтительных в настоящее время вариантов этого изобретения, смогут осуществить его многочисленные модификации и варианты. Соответственно, объем изобретения ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения.