КОМПОНЕНТ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
COMPONENT OF NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF CELL

Изобретение относится к биотехнологии, клеточной биологии и ветеринарии и может быть использовано при культивировании клеток млекопитающих для производства вакцинных и диагностических биопрепаратов, а также при проведении научных исследований.
Необходимым компонентом питательных сред является сыворотка крови, без которой большинство культур клеток человека и животных не растет in vitro. Сыворотка способствует размножению клеток, обуславливает их длительное прикрепление к субстрату, а также выполняет целый ряд регуляторных функций. Однако при применении сыворотки возможная контаминация клеток посторонними вирусами, прионами и микоплазмами. Сыворотки могут содержать различные ингибиторы, задерживающие рост клеток и репродукцию вирусов. Наличие в сыворотке антител ко многим возбудителям вирусных инфекций и, в первую очередь, таким, как парагрипп-3, инфекционный ринотрахеит, аденовирусная инфекция, вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек, рота- и коронавирусные энтериты крупного рогатого скота снижает результативность исследований в направлении адаптации штамма, выделения цитопатогенного вируса из патологического материала с целью постановки диагноза и, наконец, делает малоэффективным путь промышленного изготовления диагностических и вакцинных препаратов.
Для клеточной биотехнологии предложены сыворотки крови северных оленей, плодов крупного рогатого скота [3, 4, 5, 6].
В настоящее время одним из основных требований к питательной среде, используемой при выращивании клеток in vitro, является уменьшение или по возможности полное исключение содержания в ней сыворотки крови животных, так как сыворотка крови животных, являясь дорогостоящим компонентом питательной среды, нестабильна по своему составу и кроме этого содержит различные гетерогенные факторы, например липолипиды, присутствие которых в питательных средах может вызвать нежелательные осложнения при изучении биохимических процессов культивирования клеток. В связи с этим целесообразно применение бессывороточных питательных сред [1].
Известна сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих [9], содержащая ферментативный гидролизат белков мышц, L-глутамин, неорганические соли, глюкозу, феноловый красный, натрий углекислый кислый, ростовые протеины из сыворотки крови. Недостатком питательной среды является получение многокомпонентной сухой рецептуры среды.
Известна среда для культивирования клеток без белков и без сыворотки [8], включающая в себя синтетическую среду, от 0,1 до 100 г/л гидролизата сои. Однако такие растительные гидролизаты в жидкой форме получены путем температурного на них воздействия, что по данной технологии не позволяет обеспечить глубокое расщепление субстрата, поэтому обуславливает низкий выход аминокислот и витаминов.
Известна также питательная среда для культивирования клеток млекопитающих MDCK и Vero, используемых в производстве противогриппозных вакцин млекопитающих [10], для приготовления которой используется сбалансированный солевой раствор, ферментативный гидролизат рисовой и/или соевой муки, аминокислоты и витамины. Недостатком данной питательной среды является то, что при ее использовании дополнительно вводится до 2% сыворотки.
Медицинская пиявка Hirudo Medicinal is Officinalis - единственный представитель фауны, внесенный в фармакопею и приравненный к лекарственным средствам [7]. В слюне пиявки содержится более 80 биологически активных веществ, в том числе ингибиторы протеиназ: трипсина, альфа-химотрипсина, которые в комплексе положительно действуют на организм человека. Поэтому сегодня медицинскую пиявку заслуженно называют «фармацевтической мини-фабрикой».
Известен Способ получения препарата из медицинских пиявок [11], заключающийся в том, что пиявок промывают, лиофильно высушивают, измельчают в порошок, из которого изготавливают лекарственные формы.
Современной формой переработки пиявки медицинской является сублимационная сушка, позволяющая сохранить активность биологически активных веществ. Препарат представляет собой порошок серовато-коричневого с красным оттенком цвета и специфическим запахом, с содержанием азота не менее 6-8%.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является применение компонента питательной среды для культивирования клеток млекопитающих, улучшающего ростовые и адгезивные свойства, пролиферативную активность клеток, а также снижающего риск контаминации патогенами.
Указанная задача достигается тем, что при приготовлении ростовых питательных сред для культивирования клеток животных на основе коммерческих питательных сред, вместо сыворотки крови крупного рогатого скота в качестве компонента питательной среды применяют экстракт лиофильно высушенной медицинской пиявки в концентрации 20 мг/мл, который позволяет поддерживать жизнеспособность и рост клеток также эффективно, как и сыворотка крови крупного рогатого скота. Экстракт лиофильно высушенной медицинской пиявки обладает дополнительной способностью инактивировать трипсин, химотрипсин, которые используются для снятия клеток со стекла.
Сущность изобретения. Приготовление экстракта из медицинской пиявки. Лиофильно высушенную медицинскую пиявку в количестве 100 г растворяют в 1000 мл раствора Хенкса, в течение 2 часов при температуре 37°С для получения раствора концентрацией 100 мг/мл, центрифугируют в течение 15 мин при 30000 об/мин. Надосадочную жидкость пропускают через фильтрующие (0,45 мкм) и стерилизующие (0,22 мкм) фильтры (например, фирмы «Миллипор») и асептически упаковывают.
Компонент питательной среды применяется следующим образом. Питательную среду готовят на основе известных коммерческих питательных сред: Игла, Игла МЭМ, среды 199, ДМЭМ, 0,5% гидролизата лактальбумина с включением экстракта медицинской пиявки, в количестве 20 мг экстракта на 1 мл питательной среды.
Пример 1. Применение компонента питательной среды для культивирования клеток ПТ-80.
В качестве объекта исследования используется культура перевиваемой линии ПТ-80. Клетки снимают со стекла смесью, состоящей из равных объемов 0,25% раствора трипсина и 0,02% версена, предварительно подогретой на водяной бане до 35°С. После снятия с поверхности стекла трипсином (или химотрипсином) клетки делят на две части и ресуспендируют в питательной среде для выращивания клеток до концентрации 300 тысяч клеток в 1,0 мл. В качестве среды для выращивания используют среду с 0,5% гидролизатом лактальбумина на растворе Хенкса, или среду 199, или МЭМ, или двойную МЭМ, антибиотики из расчета 25 единиц пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100 мл среды. В одну часть клеток вносят экстракт медицинской пиявки на растворе Хэнкса до конечной концентрации 20 мг на мл среды (например, на 400 мл питательной среды с клетками добавляют 100 мл экстракта медицинской пиявки). В другую часть клеток вносят сыворотку крупного рогатого скота в конечной концентрации 5-10% (например, на 400 мл питательной среды с клетками добавляют 40 мл сыворотки крупного рогатого скота). Проводят культивирование по стандартной методике выращивания клеток. Через 48-72 часа монослой в обоих случаях образовывался ровный и плотный.
Для контроля индекса пролиферации проводили подсчет клеток в камере Горяева по стандартной методике.
Клетки ПТ-80, выращенные с использованием заявляемого компонента, полностью формировали монослой на 2-3 сутки роста, имели форму, характерную для данного вида клеток, с четко выраженными границами, без признаков дегенерации и морфологически не отличались от клеток, выращенных в контрольной среде (табл. 1).
Отмечено удлинение продолжительности жизни клеток в пределах одного пассажа. Пролиферативная активность клеток представлена в табл. 2. Индекс пролиферации достигал показателей выше контроля.
Применение в качестве компонента питательной среды экстракта лиофильно высушенной медицинской пиявки позволяет существенно уменьшить риск контаминации биопрепарата патогенами при поддержании необходимых для роста клеток физико-химических условий и обеспечения их питательными веществами, необходимыми для получения клеточной  биомассы. Компонент питательной среды опробован в производственных условиях и его использование показало хорошие результаты.
Пример 2. Применение компонента питательной среды для культивирования клеток MDBK.
В качестве среды для выращивания используют среду двойную МЭМ, антибиотики из расчета 25 единиц пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100 мл среды. Вносят экстракт медицинской пиявки на растворе Хэнкса до конечной концентрации 20 мг на мл среды (например, на 400 мл питательной среды с клетками добавляют 100 мл экстракта медицинской пиявки).
После снятия с поверхности стекла трипсином (или химотрипсином) клетки MDBK ресуспендируют в питательной среде для выращивания клеток до концентрации 300 тысяч клеток в 1,0 мл. Проводят культивирование по стандартной методике выращивания клеток. Через 48-72 часа образовывался ровный и плотный монослой.
Индекс пролиферации клеток на питательной среде с использованием в качестве компонента экстракта лиофильно высушенной медицинской пиявки достигал значения 4,7±0,09, что превосходило пролиферативную активность клеток MDBK на питательной среде с 10% сыворотки крови крупного рогатого скота -4,0±0,1.
Пример 3. Применение компонента питательной среды для культивирования клеток ВНК-21.
В качестве среды для выращивания используют среду, известную из уровня техники - ДМЭМ, антибиотики из расчета 25 единиц пенициллина и 25,0 мг стрептомицина на 100 мл среды. Вносят экстракт медицинской пиявки на растворе Хэнкса до конечной концентрации 20 мг на мл среды (например, на 400 мл питательной среды с клетками добавляют 100 мл экстракта медицинской пиявки).
После снятия с поверхности стекла трипсином (или химотрипсином) клетки ВНК-21 ресуспендируют в питательной среде для выращивания клеток до концентрации 300 тысяч клеток в 1,0 мл. Проводят культивирование по стандартной методике выращивания клеток. Через 48-72 часа образовывался ровный и плотный монослой.
Индекс пролиферации клеток на питательной среде ДМЭМ с использованием в качестве компонента экстракта лиофильно высушенной медицинской пиявки достигал значения 4,7±0,09, что превосходило пролиферативную активность клеток ВНК-21 на питательной среде ДМЭМ с 10% сывороткой крови крупного рогатого скота (4,2±0,1 - контроль).
Источники информации
1. Общая и частная вирусология / Под редакцией В.М. Жданова. М. - 1982. - Том 1. - С. 479-484.
2. Животная клетка в культуре / Под редакцией Л.П. Дьяконова и В.И. Ситькова. М. «Компания Спутник». - 2000. - С. 67-88.
3. Подчерняева Р.Я., Хижникова Т.М., Ткаченко А.В., Поликарпова С.С. Использование отечественных сывороток различных видов животных для культивирования клеточных культур. Вирусы и вирусные заболевания. 1990. - 18. - С. 89-91.
4. Гуненков В.В., Сухарев О.И., Сирота В.Ф. Свойства сыворотки крови северных оленей и результаты применения ее в вирусологии и биотехнологии. Вопросы вирусологии. - 2003. - №6. - С. 37-41.
5. Баландин И.Г., Извекова А.В., Шторм Г.Г., Пугачева М.И. Методы получения, стерилизации и контроля сыворотки крови плодов крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ. 1983. - Вып. 49. - С. 42-45.
6. Хаертынов К.С., Дьяконов Л.П., Винтер В.Г., Белова М.М. Фетальная сыворотка крови крупного рогатого скота. Ветеринария. 1990. - №3. - С. 62-63.
7. Госфармакопея XI, изменение №3, вып. 2, с. 187, категория 4,2.
8. Патент РФ №2266325 C12N 5/00, C12N 5/02, С12Р 21/00 от 27.09.2000.
9. Патент RU 2201958 C12N 5/02 от 08.05.2001.
10. Патент RU 2377295 C12N 5/00, C12N 5/02, C12N 7/00 от 11.06.2008.
11. Патент RU 2271821 A61K 35/62, А61Р 7/00 от 07.10.2003.