СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДОМ ИЗ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА (ВАРИАНТЫ)
METHOD OF ISOLATING PLAGUE MICROBE BY BACTERIOLOGICAL METHOD FROM INVESTIGATED MATERIAL (VERSIONS)

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к разработке способа выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала, включая объекты внешней среды, и может быть использовано для лабораторной диагностики чумы.
Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний занимает важное место в системе противоэпидемических мероприятий, направленных на поддержание эпидемиологического благополучия населения, а повышение ее эффективности и качества остается актуальной задачей. Чума является опасной острой инфекционной болезнью, относящейся к группе зоонозов с природной очаговостью, а возбудитель чумы Y. pestis - биологическим агентом бактериальной природы I группы патогенности, который может быть применен в качестве биологического средства массового поражения (Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. академика РАМН, профессора Г.Г.Онищенко. - М.:ЗАО «МП Гигиена», 2006. - 288 с.).
Бактериологическое исследование интегрировано в схему лабораторной диагностики чумы, является одним из методов биологического накопления возбудителя чумы в схеме специфической индикации и предполагает выделение культуры чумного микроба из исследуемого материала с последующим определением чувствительности к антибиотикам. Стандартный бактериологический метод исследования на чуму предусматривает посев исследуемого материала на плотные питательные среды с возможным использованием в качестве стимуляторов роста чумного микроба лизированной крови или сульфита натрия. Для подавления роста посторонней микрофлоры к среде добавляют раствор генцианвиолета в конечной концентрации 1:100-1:800 тыс. (Руководство по профилактике чумы / Под ред. Н.И.Николаева. - Саратов, 1972. - 200 с.).
Недостатком является низкая эффективность при исследовании контаминированного сопутствующей микрофлорой материала, включая объекты внешней среды, особенно при малом содержании в нем чумного микроба, поздняя визуализация в этом случае колоний Y. pestis (через 48-96 ч). Также не всегда удается выделить культуру возбудителя чумы из материала от больного с клиническим диагнозом чумы при наличии положительных результатов экспрессной диагностики с применением полимеразной цепной реакции, метода флуоресцирующих антител.
В настоящее время появились сведения о возможном использовании патогенными микроорганизмами биологически активных веществ организма хозяина (биогенных аминов - нейрогормонов) для ускорения своего собственного развития. (O'Donnel P.M., Aviles H., Lyte M. and Sonnenfeld G. Enhancement of In Vitro Growth Pathogenic Bacteria by Norepinephrine: Importance of Inoculum Density and Role of Transferrin. - Applied and Environmental Microbiology. - 2006. - V.72. - N 7. - P.5097-5099).
Серотонин (5-окситриптамин) принадлежит к группе биогенных аминов: азотистых оснований, возникающих в организме при декарбоксилировании аминокислот и обладающих чрезвычайно сильной активностью благодаря высокой способности их к конформационным изменениям, к соединению с макромолекулами, к переносу электронов и протонов. Серотонин является нейромедиатором, медиатором воспаления и аллергических реакций, обладает выраженным иммуномодулирующим действием, является одним из компонентов сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, способен комплексировать с ДНК про- и эукариот, с нуклеозидами и нуклеотидами (Курский М.Д., Бакшеев Н.С.Биохимические основы механизма действия серотонина. - Киев: Наукова думка, 1974. - 296 с.; Девойно Л.В., Ильюченок Р.Ю. Монаминергические системы в регуляции иммунных реакций (серотонин, дофамин). - Новосибирск: Наука, 1983. - 234 с.).
Серотонин-креатинин сульфат ("Merck", Germany; "ICN", USA) имеет формулу
14
21
5
6
2
СНNОS·HО, молекулярную массу 405.43 г/моль и представляет собой белый порошок, легко растворимый в воде, устойчивый при хранении в сухом состоянии при температуре 0-5°С, используется в качестве стандартного раствора в биохимических исследованиях при определении концентрации серотонина в биологических жидкостях и тканях, а также в патофизиологических исследованиях, направленных на изучение биологического действия серотонина на функции нервной, сердечно-сосудистой, эндокринной, иммунной, мочеполовой систем, органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, печени, селезенки, системы гемостаза. (Симоненков А.П., Федоров В.Д. Серотонин и его рецепторы в генезе стресса и адаптации // Вестник РАМН. - 2002. - №8. - С.9-13). Серотонин-креатинин сульфат применяется в виде свежеприготовленного водного раствора, стерилизованного путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0.2 µm.
-6
-5
Известно использование серотонина для выращивания дрожжей, где повышение выхода биомассы дрожжей Candida guilliermondii осуществляли путем дробного добавления в жидкую культуральную среду серотонин-креатинин сульфата в количествах от 4×10 до 2×10 мас.% через каждые 2-4 ч роста культуры (Фрайкин Г.Я., Страховская М.Г., Беленикина Н.С., Рубин А.Б. А.с. 1544796 СССР // БИ №7. 1990.- С.154). Однако данный способ применим для масштабируемого культивирования в микробиологической промышленности с использованием жидких питательных сред и не может быть использован в бактериологической схеме лабораторной диагностики чумы.
Известно стимулирующее действие серотонин-креатинин сульфата (СКС) на накопление биомассы чумного микроба в жидких питательных средах (Korsukov V.N., Schukovskaya T.N., Klueva S.N., Kravtsov A.L., Polunina T.A., Popov Yu.A. The application of flow cytometry for the determination of the action of serotonin on the antigenic composition and amount of DNA of plague microbe, cultured at 37°C // Proc. SPIE. - 2003. - Vol.5068. - P.61-67). Однако в схеме лабораторной диагностики на чуму контаминированного сопутствующей микрофлорой материала, включая объекты внешней среды, жидкие среды для биологического накопления возбудителя чумы из нативного материала не используются (Самойлова Л.В., Донская Т.Н., Вейнблат В.И., Коровкин С.А., Плотникова Е.А., Пионтковский С.А., Куличенко А.Н. Чума // Лабораторная диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Под ред. Онищенко Г.Г., Кутырева В.В. - Саратов, 1998. - С.3-49).
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации, показал, что сведений по применению серотонина (серотонин основания, серотонин-креатинин сульфата) для выделения чумного микроба бактериологическим методом из исследуемого материала на твердых питательных средах в литературе не обнаружено.
Технический результат от использования изобретения заключается в сокращении времени и повышении эффективности выделения возбудителя чумы из исследуемого материала, как контаминированного, так и не контаминированного сопутствующей микрофлорой.
-4
Указанный технический результат достигается тем, что в бактериологическом способе выделения чумного микроба исследуемый материал обрабатывают при комнатной температуре в течение 30 мин раствором серотонин-креатинин сульфата концентрацией 3.5×10 М с последующим посевом на плотные питательные среды для культивирования чумного микроба (агар Хоттингера или Мартена, рН 7.2), содержащие лизированную кровь (1%) и генцианвиолет (1:100000-1:200000) и дальнейшей инкубацией посевов при 28°С в течение 24-48 часов.
-4
Указанный технический результат достигается также тем, что перед посевом исследуемого материала поверхность агаровых пластин питательной среды для культивирования чумного микроба (агар Хоттингера или Мартена, рН 7.2), содержащей лизированную кровь (1%) и генцианвиолет (1:100000-1:200000) предварительно обрабатывают в течение 15 мин раствором серотонин-креатинин сульфата концентрацией 3.5×10 М с последующей инкубацией посевов при 28°С в течение 24-48 часов.
При общепринятом способе приготовления плотных питательных сред со стимуляторами роста чумного микроба и ингибиторами посторонней микрофлоры ингредиенты вносятся согласно существующим требованиям либо непосредственно в рецептуру агаровой среды в процессе ее изготовления с последующим автоклавированием, либо в расплавленную агаровую основу перед приготовлением агаровых пластинок (МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры …» // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. - 2006. - Вып.4 (26). - С.119-144). В результате многочисленных экспериментов нами установлено, что при внесении СКС непосредственно в расплавленный агар под воздействием высокой температуры (46°С) происходит резкое снижение стимулирующих свойств серотонин-креатинин сульфата в отношении чумного микроба.
В этой связи нами разработан режим обработки СКС как непосредственно самого исследуемого материала перед посевом, так и готовых агаровых пластин. Нами установлено, что в сочетании со стандартным стимулятором роста чумного микроба гемолизированной кровью обработка СКС перед посевом либо исследуемого материала, либо агаровых пластин позволяет значительно сократить (до 24 часов) сроки биологического накопления возбудителя чумы и увеличить число колониеобразующих единиц (КОЕ) чумного микроба.
Способ осуществляется следующим образом.
3
-4
-5
По первому варианту. Для приготовления рабочего раствора СКС 2.4 мг серотонин-креатинин сульфата растворяют в 10 мл 0.9% раствора натрия хлорида. Затем приготовленным ex tempore раствором СКС заполняют цилиндр шприца объемом 20 мл, канюля которого предварительно соединена с фильтродержателем многократного применения полипропиленовым «Свинекс» диаметром 25 мм, куда помещен стерильный мембранный фильтр диаметром пор 0.2 µm. Возможно использование одноразового комплекта мембранного фильтра с фильтродержателем различных фирм изготовителей. Стерилизация раствора СКС осуществляют путем продавливания через мембранный фильтр с помощью поршня шприца. 3 мл стерильного раствора СКС вносят в пробирку с 2 мл стерильного 0.9% раствора натрия хлорида. Конечное разведение серотонин-креатинин сульфата соответствует 3.5×10 М или 1.0×10 M в пересчете на серотонин основание.
-4
Для предварительной обработки посевного материала 100 мкл свежеприготовленного стерильного раствора СКС концентрацией 3.5×10 М вносят в пробирку с 1 мл исследуемого материала, перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее производят посев исследуемого материала, обработанного СКС, стандартным методом на питательные среды для культивирования чумного микроба (рН 7.2), содержащих лизированную кровь (1%) и генцианвиолет (1:100000-1:200000) и дальнейшей инкубацией посевов при 28°С в течение 24-48 часов.
-4
По второму варианту. Для обработки агаровых пластин 100 мкл свежеприготовленного по вышеописанной методике раствора СКС концентрацией 3.5×10 М наносят на поверхность агаровой пластины питательной среды для культивирования чумного микроба (рН 7.2), содержащей лизированную кровь (1%) и генцианвиолет (1:100000-1:200000), равномерно распределяют стерильным шпателем по всей поверхности и оставляют на 15 минут при комнатной температуре до полного впитывания. Затем производят посев исследуемого материала стандартным методом и дальнейшей инкубацией посевов при 28°С в течение 24-48 часов.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами, где в качестве исследуемого материала были использованы монокультуры, смешанные культуры и объекты внешней среды.
Пример 1.
9
Штамм Y. pestis EV НИИЭГ выращивали на пластинках агара Хоттингера рН 7.2 при температуре 28°С в течение 48 ч. Из полученной культуры готовили взвесь в стерильном 0.9% растворе натрия хлорида рН 7.2 по стандартному образцу мутности ОСО-42-28-85П 10 единиц, эквивалентному 10 клеток чумного микроба. Методом последовательных 10-кратных серийных разведений в стерильном 0.9% растворе натрия хлорида рН 7.2 доводили концентрацию клеток Y. pestis EV НИИЭГ до 10 м.к. в 1 мл.
2
-4
Полученную взвесь делили на две части. Из одной части проводили высев 10 м.к. Y. pestis EV НИИЭГ в объеме 100 мкл на предварительно обработанные (по 2 варианту) 100 мкл 3.5×10 М СКС пластинки агара Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100 000). Контролем служил высев
2
10 м.к. Y. pestis EV НИИЭГ в объеме 100 мкл на не обработанные СКС пластинки агара Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000).
-4
2
Во вторую часть вносили СКС из расчета 100 мкл 3.5×10 М СКС на 1 мл полученной взвеси, перемешивали встряхиванием и оставляли при комнатной температуре в течение 30 мин (по 1 варианту). Далее производили высев 100 мкл обработанной СКС взвеси, содержащей 10 м.к. Y. pestis EV НИИЭГ, на пластинки агара Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000). Все посевы инкубировали при 28°С в течение 48 часов. Результаты наблюдений представлены в таблице 1.
Обработка агаровых пластин СКС и непосредственная обработка СКС исследуемого материала (взвеси Y. pestis EV НИИЭГ) приводила к увеличению числа КОЕ (колониеобразующих единиц) в 2.0 и 2.2 раза соответственно.
-4
Свидетельством влияния СКС на чумной микроб является увеличение доли клеток с повышенным содержанием ДНК после обработки 3.5×10 М СКС взвеси Y. pestis EV НИИЭГ, регистрируемой методом проточной цитометрии (цитофлуориметр ICP-22 PHYWE (Германия), окраска ДНК митрамицином и этидиум бромидом по методу Steen Н.В., Воуе Е. (1981) и показанной на чертеже.
Представленные гистограммы свидетельствуют о том, что обработка взвеси Y. pestis EV СКС в течение 30 минут при комнатной температуре увеличивает долю клеток с повышенным содержанием ДНК в 2,0 раза относительно взвеси Y. pestis EV без обработки СКС.
Пример 2. Выделение чумного микроба из смешанной культуры, состоящей из взвеси клеток Yersinia pestis EV, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.
9
3
Штамм Y. pestis EV НИИЭГ выращивали на пластинках агара Хоттингера рН 7.2 при температуре 28°С в течение 48 ч, штамм St. aureus 209-П - на пластинках агара Хоттингера рН 7.4 при температуре 37°С в течение 24 ч, штамм Е. coli 25922 АТСС - на пластинках агара Хоттингера рН 7.2 при температуре 37°С в течение 24 ч. Из каждой полученной культуры готовили взвесь в стерильном 0.9% растворе натрия хлорида рН 7.2 по стандартному образцу мутности ОСО-42-28-85П 10 единиц, эквивалентному 10микробных клеток. Методом последовательных 10-кратных серийных разведений в стерильном 0.9% растворе натрия хлорида рН 7.2 доводили концентрацию клеток каждого штамма до 10 м.к. в 1 мл. Затем 500 мкл взвеси каждого штамма смешивали в одной пробирке. В результате получали смешанную культуру, состоящую из взвеси клеток Y. pestis EV, St. aureus, Е. coli объемом 1500 мкл и содержащую по 500 м.к. каждого вида микроорганизма.
-4
2
Полученную взвесь делили на две части. В одну часть вносили СКС из расчета 100 мкл 3.5×10М СКС на 1 мл полученной взвеси, перемешивали встряхиванием и оставляли при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее производили высев 100 мкл обработанной СКС взвеси, содержащей 0,33×10 м.к. Y. pestis EV НИИЭГ,
2
2
0.33×10 м.к. St. aureus 209-П, 0,33×10 м.к. Е.coli 25922 АТСС на пластинки агара Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000).
2
2
2
Вторая часть не подвергалась обработке СКС и служила в качестве контроля. Высев из нее в объеме 100 мкл, содержащих 0,33×10 м.к. Y. pestis EV НИИЭГ, 0,33×10 м.к. St. aureus 209-П, 0,33×10 м.к. Е. coli 25922 АТСС, производился на пластинки агара Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000).
3
2
Параллельно аналогичным образом проводили обработку СКС взвесей монокультур Y. pestis EV НИИЭГ, Е. coli 25922 АТСС, St. aureus 209-П, содержащих 10м.к. в 1 мл. Высев из обработанных и не обработанных СКС взвесей монокультур Y. pestis EV НИИЭГ, Е. coli 25922 АТСС, St. aureus 209-П производили в объеме 100 мкл (10 м.к.) на пластинки агара Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000). Все посевы инкубировали при 28°С в течение 48 часов. Результаты наблюдений представлены в таблице 2.
Обработка СКС исследуемого материала (смешанной культуры, состоящей из взвеси клеток Y. pestis EV, St. aureus, Е. coli) с последующей инкубацией приводила к увеличению числа КОЕ Y. pestis EV в 1.5 раза.
Отсутствие роста St. aureus 209-П связано с ингибирующим действием генцианвиолета на грамположительные бактерии.
Пример 3. Выделение чумного микроба из инфицированной Y. pestis пробы почвы (объект внешней среды).
9
5
4
Штамм Y. pestis EV НИИЭГ выращивали на пластинках агара Хоттингера рН 7.2 при температуре 28°С в течение 48 ч. Из полученной культуры готовили взвесь в стерильном 0.9% растворе натрия хлорида рН 7.2 по стандартному образцу мутности ОСО-42-28-85П 10 единиц, эквивалентному 10 клеток чумного микроба. Методом последовательных 10-кратных серийных разведений в стерильном 0.9% растворе натрия хлорида рН 7.2 доводили концентрацию клеток Y. pestis EV НИИЭГ до 1,0×10 м.к. в 1 мл и 1,0×10м.к. в 1 мл.
6
5
5
4
Навески природной почвы массой 1 г вносили в два стерильных флакона. В одну пробу почвы вносили 100 мкл взвеси Y. pestis EV НИИЭГ, концентрацией 1,0×10 м.к. в 1 мл (инфицирующая доза составляет 10 м.к.), в другую - 100 мкл взвеси Y. pestis EV НИИЭГ, концентрацией 1,0×10 м.к. в 1 мл (инфицирующая доза составляет 10 м.к.). Затем в каждый флакон вносили по 10 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида для приготовления почвенной суспензии. Для освобождения от грубых механических примесей полученную взвесь отстаивали в течение 3-5 минут, затем забирали верхний слой почвенной суспензии и переносили в две бактериологические пробирки по 2.5 мл в каждую.
-4
В одну пробирку вносили СКС из расчета 100 мкл 3.5×10М СКС на 1 мл верхнего слоя почвенной суспензии, перемешивали встряхиванием и оставляли при комнатной температуре в течение 30 мин. Далее 100 мкл обработанной СКС взвеси наносили на поверхность пластинки агара Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000) и рассеивали шпателем. Шпатель без обжигания переносили во вторую чашку с этой же средой и распределяли в ней остатки материала.
Верхний слой почвенной суспензии, находящийся во второй пробирке, не подвергался обработке СКС и служил в качестве контроля. Высев из него в объеме 100 мкл производился на пластинки агара Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000) аналогичным способом. Параллельно проводили высев материала из этой же пробы на пластинки агара Хоттингера рН 7.2, содержащие лизированную кровь (1%), генцианвиолет (1:100000) и обработанные СКС в течение 15 мин. Все посевы инкубировали при 28°С в течение 48 часов. Результаты наблюдений представлены в таблице 3.
Обработка агаровых пластин СКС и непосредственная обработка СКС исследуемого материала (инфицированная Y. pestis проба почвы) с последующей инкубацией приводила к увеличению числа КОЕ Y. pestis в 3.0-3.7 раза и 3.3-4.5 раза соответственно.
Таким образом, совокупность существенных признаков заявляемого способа позволяет увеличить количество колониеобразующих единиц (КОЕ) Y. pestis в 1.5-5.5 раза, несмотря на присутствие других видов микроорганизмов, и сократить сроки биологического накопления возбудителя чумы из нативного материала. Окончательные результаты получают через 24-48 часов, что соответствует требованиям специфической индикации для бактериальных форм и представляет необходимую информацию для оперативных решений по проведению противоэпидемических мероприятий. Предлагаемый способ не требует больших материальных затрат и дорогостоящего оборудования, легко воспроизводим и может быть реализован как в стационарных, так и полевых условиях.
Использование серотонин-креатинин сульфата не ухудшает физических свойств среды, не затрудняет учет результатов посева и их просмотр при малом увеличении оптического микроскопа, не влияет на культурально-морфологические критерии отбора колоний возбудителя чумы. Серотонин-креатинин сульфат ("Merck", Germany; "ICN" USA) доступный препарат, выпускаемый в сухом виде.
Таблица 1
Влияние серотонина-креатинина сульфата на количество колониеобразующих единиц (КОЕ) Y. pestis EV через 48 ч инкубации при 28°С
Способ обработки СКС
Кол-во экспериментов
Питательная среда
КОЕ
Индекс увеличения
n
M±m
Внесение СКС во взвесь
20
Агар Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100 000)
85±1.8
2.2
Нанесение СКС на поверхность агаровых пластин
20
-"-
77±2.1
2.0
Контроль (без СКС)
20
-"-
38±1.0
Таблица 2
Влияние обработки серотонин-креатинин сульфатом смешанной культуры, состоящей из взвеси клеток Y. pestis EV, St. aureus, E.coli, на количество колониеобразующих единиц (КОЕ) через 24 и 48 ч инкубации при 28°С на агаре Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000)
Исследуемый материал
Способ обработки СКС
КОЕ
Вид микроорганизмов
через 24 ч
через 48 ч
n
M±m
n
M±m
Смешанная культура
Внесение СКС во взвесь
Y. pestis EV НИИЭГ
10
12±2.4
10
32±3.6
St. aureus 209-П
10
нет роста
10
нет роста
E.coli 25922 АТСС
10
16±2.7
10
29±3.1
Смешанная культура
Контроль (без СКС)
Y. pestis EV НИИЭГ
10
6±1.5
10
15±1.9
St. aureus 209-П
10
нет роста
10
нет роста
E.coli 25922 АТСС
10
13±2.3
10
22±2.8
Монокультура
Внесение СКС во взвесь
Y. pestis EV НИИЭГ
10
44±1.8
10
85±1.8
Контроль (без СКС)
У pestis EV НИИЭГ
10
20±1.2
10
38±1.0
Монокультура
Внесение СКС во взвесь
St. aureus 209-П
10
нет роста
10
нет роста
Контроль (без СКС)
St. aureus 209-П
10
нет роста
10
нет роста
Монокультура
Внесение СКС во взвесь
E.coli 25922 АТСС
10
62±2.5
10
88±4.9
Контроль (без СКС)
E.coli 25922 АТСС
10
49±2.0
10
83±4.3
Таблица 3
Влияние обработки серотонин-креатинин сульфатом почвенной суспензии, содержащей чумной микроб, на количество колониеобразующих единиц (КОЕ) Y. pestis через 24 и 48 ч инкубации при 28°С на агаре Хоттингера рН 7.2 с лизированной кровью (1%) и генцианвиолетом (1:100000)
Исследуемый материал
Инфицирующая доза
Способ обработки СКС
КОЕ
через 24 ч
через 48 ч
n
M±m
n
M±m
Почва
10<sup>5</sup> м.к. Y. pestis EV на 1 г почвы
Внесение СКС в почвенную суспензию
5
6±0.5
5
55±6.1
Нанесение СКС на поверхность агаровых пластин
5
7±0.8
5
37±2.1
Контроль (без СКС)
5
нет роста
5
10±1.2
10<sup>4</sup> м.к. Y. pestis EV на 1 г почвы
Внесение СКС в почвенную суспензию
5
2±0.8
5
20±1.5
Нанесение СКС на поверхность агаровых пластин
5
3±0.6
5
18±2.3
Контроль (без СКС)
5
нет роста
5
6±0.8