БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ КОМПЛЕКС НА ОСНОВЕ БЕСКЛЕТОЧНОГО ПРОБИОТИКА, КОРМОВАЯ КОМПОЗИЦИЯ ЕГО СОДЕРЖАЩАЯ, И СПОСОБ КОРМЛЕНИЯ МОЛОДНЯКА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ
ACELLULAR PROBIOTIC BASED BIOLOGICALLY ACTIVE COMPLEX, FODDER COMPOSITION CONTAINING SUCH COMPLEX, METHOD FOR FARM ANIMALS AND POULTRY FEEDING

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к изготовлению биологически активных добавок для сельскохозяйственных животных и птицы, и может быть использовано при их выращивании для повышения продуктивности, естественной резистентности, а также профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний.
Современное промышленное животноводство и птицеводство основано на применении высокоинтенсивных технологий содержания высокопродуктивных пород животных и кроссов птицы, что приводит к повышенной чувствительности к стрессам и нарушениям в режимах кормления и содержания, низкой иммунокомпетентности, значительному усилению техногенной и микробиологической нагрузки на организм животного и является основной причиной отхода молодняка и потери продуктивности взрослых животных от дисбактериоза, вирусных болезней и микст-инфекций.
В сложившейся ситуации необходимо качественное изменение характера кормовой базы за счет создания и применения экологически безопасных и эффективных биологически активных кормовых добавок, обладающих питательной ценностью и защитным действием на организм животных и птицы, что обусловило интенсивное развитие такого направления экобиотехнологии, как разработка и использование в ветеринарии пробиотиков, пребиотиков и синбиотиков.
Пробиотики - это живые микроорганизмы и микробные метаболиты, оказывающие при естественном способе введения позитивные эффекты на физиологические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина путем стабилизации и оптимизации функции его нормальной микрофлоры.
Пребиотики - это препараты немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или усиление метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника.
Синбиотики - это препараты, полученные в результате рациональной комбинации пробиотиков и пребиотиков. Как правило, это биологически активные добавки, обогащенные одним или несколькими штаммами представителей бактерий-пробиотиков.
Синбиотики - это научно обоснованный комплекс про- и пребиотиков. Номенклатура синбиотиков для промышленного животноводства и птицеводства представлена как комплексными препаратами (сочетанием в одном препарате пробиотика и пребиотика), так и комплексами, состоящими из отдельных препаратов пробиотиков и пребиотиков, в которых синбиотические свойства обеспечиваются как составом комплекса, так и способом его применения.
Известен кисломолочный продукт, полученный культивированием в молоке штамма Bifidumbacterium sieccum №791, в который дополнительно вводят культуру Lactobacterium sieccum (plantarum). Данный способ предусматривает скармливание цыплятам вместе с кормом этого кисломолочного продукта с 4-го дня жизни по 4-6 мл на голову в начале кормления (Патент RU №2156062, А01К 67/02, опубл. 20.09.2000).
Недостатком известного аналога является нестабильность кисломолочного продукта и недостаточная его эффективность, т.к. бифидобактерии быстро теряют жизнеспособность.
Известен пробиотик для птиц «Авилакт-1К», который содержит высушенную сублимационным методом культуру штамма Lactobacillus acidophilum 1-К, выделенного из организма птицы. Способ выращивания птицы, предусматривающий добавление в корм пробиотика «Авилакт-1К» в количестве двух процентов от суточной нормы корма, начиная с суточного возраста птицы двумя курсами - с первого по десятый и с двадцатого по тридцатый дни (С.В.Калугин и др. Отработка технологических процессов изготовления и контроля пробиотика «Авилакт-1К» //Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов. ВНИИТИБП, Сборник докладов Международной конференции молодых ученых, 5-6 июня 2001 г., Щелково, 2001, с.88-91).
Известная кормовая добавка содержит только молочнокислые бактерии, что ограничивает спектр пробиотического действия, и не обогащена биологически активными веществами.
Известен пробиотический препарат для жвачных животных и способ его получения (Патент RU №2260043, C12N 1/20, А61К 35/74, опубл. 10.09.2005). Препарат представляет собой консорциум штаммов Clostridium cellobioparum КЭ-157, Ruminoccocus flavefaciens К-339, Lactobacillus acidophilus 1082 и Propionibacterium acnes-83, полученный при совместном культивировании, высушенный в защитной среде и смешанный с наполнителем.
Недостатком такого препарата является его относительно невысокая биологическая активность, связанная с процессом дезактивации живых микроорганизмов при их прохождении через верхние отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а также отсутствие стабильности их биологических свойств при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности его применения.
Известен пробиотический препарат, предназначенный для повышения прироста живой массы поросят-отъемышей, и способ их кормления (Патент RU №2399661, C12N 1/20, А23К 1/16, опубл. 20.09.2010). Препарат представляет собой смесь культуральных жидкостей (КЖ) бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis (в соотношении 1:1), высушенную после внесения в них равного по массе количества смеси отрубей и гороховой муки (в соотношении 1:1).
Недостатком такого препарата является чувствительность входящих в его состав штаммов бактерий к антибиотикам, что снижает эффективность его применения одновременно с антибиотикотерапией.
Известен штамм гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F -867), используемый в качестве продуцента белка пищевого и кормового назначения и физиологически активных веществ (Патент РФ №2259209, А61К 35/84, A23L 1/054, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R 1/77, опубл. 27.08.2005). На основе культуральной жидкости гриба разработан пребиотик АВИСТИМ (Неминущая Л.А. и др. Новый штамм гриба Fusarium sambucinum - продуцента биологически активных добавок // Научн. основы производства вет. биол. препаратов: мат. Междун. конф.- Щелково, 2005.- С.517-521).
Недостатком такого препарата является отсутствие пробиотической (антагонистической) активности и низкая питательная ценность в случае использования его в качестве кормовой добавки.
Известна кормовая добавка «Селебен», (Патент RU №2432774, А23К 1/00, опубл. 10.11.2010). Препарат включает диацетофенонилселенид и бентонит в различных сочетаниях.
Недостатком такого препарата является химическая природа одного из его компонентов (диацетофенонилселенида), а также неэффективность в отношении лечения и профилактики болезней ЖКТ, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, за счет отсутствия пробиотических бактерий.
Наиболее близким из аналогов по технической сущности и заявляемому эффекту является кормовая добавка для птицеводства (Патент RU №2286066, А23К 1/16, А23К 1/165, опубл. 27.10.2006), содержащая комплекс биологически активных веществ, продуцируемый грибами рода Fusarium, отличающаяся тем, что в качестве комплекса биологически активных веществ она содержит биомассу и/или культуральную жидкость, полученную при культивировании гриба Fusarium sambucinum штамма MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F-867), или биомассу и/или культуральную жидкость, полученную при культивировании гриба Fusarium sambucinum штамма MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F-867), в смеси с пробиотиком Авилакт-1К. Данное изобретение принято за прототип.
Недостатком прототипа является использование в его составе живых микроорганизмов, что не обеспечивает высокую биологическую активность за счет дезактивации при их прохождении через верхние отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных с многокамерным строением желудка (например, крупный рогатый скот), а также затрудняет или исключает его использование совместно с антибиотиками за счет чувствительности штамма лактобактерий к антибиотикам. Недостатком является также низкая питательная ценность культуральной жидкости, полученной при культивировании гриба Fusarium sambucinum штамма MKF 2001 - 3 (ВКПМ №F-867), в случае использования ее в качестве кормовой добавки.
Задачей, решаемой авторами, является создание эффективной и экономичной кормовой добавки на основе синбиотического комплекса, включающего биомассу и/или автолизат гриба и бесклеточный пробиотик для повышения питательной ценности корма и обеспечения защитного действия предлагаемой добавки на организм животных и птицы.
Указанная задача решалась путем создания биологически активного комплекса, содержащего бесклеточный пробиотик (смесь стерильных культуральных жидкостей бактерий Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ и Bacillus subtilis штамм М-8), пребиотик (жидкий стерильный автолизат мицелия гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3) и/или сухую биологически активную добавку (сухая биомасса гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3), а также создания на их основе кормовых композиций: сочетание пробиотика и пребиотика, сочетание пробиотика и биологически активной добавки, которые применяли молодняку сельскохозяйственных животных и птице без предварительного смешивания полученных препаратов, а способом непосредственного внесения каждого препарата в корм или питьевую воду в дозах, зависящих от вида и возраста животных.
Технический результат изобретения заключается в повышении продуктивности, физиологического и иммунного статуса организма животных и птицы, компенсации в рационе кормления дефицита аминокислот, витаминов и микроэлементов, повышении эффективности профилактики и лечения заболеваний ЖКТ, в том числе одновременно с применением антибиотиков, за счет применения молодняку крупного рогатого скота, свиней и птице кормовых композиций на основе разработанного биологически активного (синбиотического) комплекса, включающего бесклеточный пробиотик (смесь стерильных культуральных жидкостей бактерий Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ и Bacillus subtilis штамм М-8), пребиотик (жидкий стерильный автолизат мицелия гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3) и/или сухую биологически активную добавку (сухая биомасса гриба Fusarium sambucinum штамм MKF-2001-3). Данный результат достигается усилением полезных свойств препаратов (пробиотик и пребиотик, пробиотик и биологически активная добавка), при их совместном применении молодняку сельскохозяйственных животных и птице без предварительного смешивания препаратов, а способом непосредственного внесения каждого препарата в корм или питьевую воду в дозах, зависящих от вида и возраста животных.
Характеристика, получение и свойства препарата-пробиотика. Бесклеточный пробиотический препарат представляет собой смесь культуральных жидкостей (КЖ) лактобактерий Lactobacillus plantarum, штамм 8 РАЗ (ВКПМ №В-11007) и бактерий Bacillus, штамм М-8 (ВКПМ №В-1948), взятых в объемном соотношении 1:1. Культуральные жидкости включают метаболиты, накопленные методом раздельного глубинного культивирования бактерий на питательных средах, с последующим отделением микроорганизмов путем двухстадийной фильтрации на пористом многослойном керамическом фильтре для осветления и фильтровальной установке типа «Миллипор» (мембрана с размером пор 0,2 мкм) для стерилизации препарата (Пример 1). Качество полученного препарата характеризуют по показателям, приведенным в таблице 1.
В механизме действия пробиотических микроорганизмов большое значение имеет подавление роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры. При введении бесклеточных пробиотических препаратов в ЖКТ также происходит торможение патогенной микрофлоры.
Таблица  1
Биологические, органолептические и физико-химические свойства бесклеточного пробиотического препарата
Внешний вид
Прозрачная или опалесцирующая жидкость желто-коричневого цвета. Допускается образование при хранении осадка из компонентов среды
Запах
Специфический, уксусной и молочной кислот
Посторонние включения
Не допускаются
Количество жизнеспособных клеток в 1 см<sup>3</sup>, не более
1×10<sup>5</sup>
Наличие посторонних микроорганизмов в 1 см<sup>3</sup>
Не допускается
рН
5,0-6,0
Биологическая (антагонистическая) активность, мм
Не менее 16
Безвредность
Введение белым мышам препарата в тест-дозе 0,25 мл внутрь не должно вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней
Культуральные жидкости отобранных штаммов бактерий эффективно ингибируют рост патогенных бактерий родов Salmonella, Streptococcus, Staphylococcus, Proteus, Klebsiella, Pasterella и патогенных серотипов E.coli. Сочетание в одном препарате метаболитов кислотообразующих бактерий нормальной микрофлоры (Lactobacillus plantarum) и спорообразующих бактерий (Bacillus subtilis) позволяет сочетать механизмы действия и тех, и других.
В опытах in vitro определена биологическая (антагонистическая) активность (АА) препарата в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ (табл.а 2).
Таблица 2
Результаты определения антагонистической активности бесклеточного пробиотического препарата (n=10)
Патогенные микроорганизмы
зона задержки роста, мм
экспериментальные данные
среднее
S. typhimurium
21; 24; 21; 24; 25; 22; 23; 25; 24; 22
23,1
S. dublin
19; 18; 19; 17; 19; 18; 19; 20; 17; 19
18,5
S. gallinarum
21; 24; 25; 25; 23; 24; 22; 24; 25; 21
23,4
E.coli: K-88
18; 19; 20; 19; 18; 21; 22; 19; 18; 20
19,4
E.coli: K-99
18; 20; 19; 18; 17; 19; 20; 18; 17; 20
18,6
E.coli: A-20
16; 14;15; 16; 14; 16; 17; 17; 16; 17
15,8
Показано, что препарат обладает выраженным антагонизмом в отношении патогенных микроорганизмов ЖКТ.
Исследована антагонистическая активность бесклеточного пробиотика в отношении микроорганизмов, выделенных от больных послеродовыми эндометритами коров (таблица 3).
Таблица 3
Антагонистическая активность бесклеточного пробиотического препарата в отношении микроорганизмов, выделенных от больных послеродовыми эндометритами коров
Серия препарата
Диаметр зоны задержки роста (мм)
Staph, epidermidis
Proteus vulgaris
E.coli
Staph, pyogenes
Staph, aureus
Ps. auroginosa
№1
25
18
16
11
28
17
№2
21
22
15
19
21
22
№3
19
20
20
17
25
28
№4
22
26
22
22
20
11
№5
23
29
18
21
28
19
№6
19
31
19
18
30
29
№7
29
25
26
28
32
31
М±m
21,8
24,4
17,7
19,5
26,3
22,5
Полученные результаты свидетельствуют, что большинство штаммов микроорганизмов, выделенных от больных послеродовыми эндометритами коров, чувствительны к бесклеточному пробиотическому препарату.
Характеристика, получение и свойства пребиотика и биологически активной добавки на основе гриба Fusarium sambucinum, шт.MKF 2001 - 3 (ВКПМШ-867).
Для разработки пребиотика и биологически активной добавки в качестве продуцента БАВ использован штамм гриба Fusarium sambucinum MKF-2001-3 (патент РФ №2259209 «Штамм гриба Fusarium sambucinum - продуцент биологически активных веществ», опубл. 27.08.2005, Бюл. №24).
Пребиотик представляет собой стерильный жидкий автолизат мицелия гриба (AM), полученного при культивировании данного штамма в питательной среде на основе молочной сыворотки, последующего водного автолиза ее в культуральной жидкости, отделения биомассы на нутч-фильтрах и стерилизации фильтрата ультрафильтрацией на полых волокнах (Пример 2).
Биологически активная добавка представляет собой сухую биомассу гриба (БМ), полученную после отделения автолизата и высушенную распылительным способом (Пример 3).
Проведено сравнительное исследование химического состава биомассы (БМ), автолизата мицелия (AM) и культуральной жидкости (КЖ) по показателям: общий анализ (сухие вещества, общий белок, жиры, углеводы), макро- и микроэлементы, аминокислоты, витамины (табл.4).
Таблица 4
Химический состав культуральной жидкости (КЖ), автолизата мицелия (AM) и биомассы (БМ) гриба
Показатели
КЖ
AM
БМ
1
2
3
4
Общий анализ (масс %)
Сухие вещества
1,5
76,8
93,1
Общий белок
2,5
46,3
47,5
Жиры
0,02
4,8
7,1
Углеводы
13,0
18,7
22,0
Макро- и микроэлементы (мг/г)
Калий
13,35
45,0
19,35
Натрий
1,25
5,88
17,5
Кальций
1,935
12,5
29,95
Магний
1,225
1,75
2,95
Железо
0,005
0,922
0,65
Медь
0,003
0,028
0,015
Цинк
0,03
0,062
0,043
Марганец
0,012
0,043
0,244
Азот
10
23,6
34,9
Фосфор
23
11,8
17,45
Никель
0,001
0,006
0,01
Кобальт
0,001
0,002
Свинец
н/обн
н/обн
н/обн
Ртуть
н/обн
н/обн
н/обн
Мышьяк
н/обн
н/обн
н/обн
Аминокислоты (% АСВ)
Лизин
0,18
1,98
2,8
Гистидин
0,26
1,05
1,57
Аргинин
0,27
2,01
2,2
Аспарагиновая к-та
0,41
3,17
3,25
Треонин
0,18
1,33
2,00
Серин
0,15
1,23
1,70
Пролин
0,36
1,15
1,59
Глицин
0,24
1,35
1,75
Аланин
0,25
1,94
3,00
Цистин
0,10
0,18
0,45
Валин
0,21
1,70
1,90
Метионин
0,08
0,42
0,80
Изолейцин
0,16
1,25
1,37
1
2
3
4
Лейцин
0,18
2,10
2,25
Тирозин
0,01
1,1
1,40
Фенилаланин
0,11
1,25
1,81
Глютаминовая к-та
0,72
3,67
4,60
Сумма аминокислот
3,87
26,89
34,44
Витамины (мг/г)
Bi (тиамина хлорид)
0,001
0,009
11,2
В<sub>2</sub> (рибофлавин)
0,088
0,11
60,0
Вз (пантотеновая к-та)
0,06
0,145
305,0
В<sub>4</sub>(холин)
н/обн
н/обн
следы
В<sub>5</sub> (никотиновая к-та)
0,087
9,60
49,5
В<sub>6</sub> (пиридоксин)
0,008
0,05
15,0
В<sub>9</sub>(фолиевая к-та)
0,017
0,025
12,5
В<sub>12</sub>(цианокобаламин)
0,0002
0,020
7,5
Н(биотин)
следы
0,001
1,5
А (ретинол)
н/обн
н/обн
н/обн
Е (токоферол)
0,031
0,032
0,1
Результаты исследования состава КЖ, AM и БМ показали, что автолизат мицелия и биомасса гриба более богаты по своему химическому составу, чем культуральная жидкость.
Белковые компоненты обоих продуктов (AM и БМ) содержат большой спектр аминокислот, в том числе и все незаменимые аминокислоты; в состав углеводов входит хитиновая клетчатка, адсорбирующая токсины и шлаки, а также биологически активные полисахариды (глюканы и галактоманнаны), регулирующие работу иммунной системы; в липидную фракцию входят такие физиологически активные вещества, как фосфолипиды, стерины, жирные кислоты (более 50% из них приходится на долю эссенциальных - линолевой и линоленовой, которые не синтезируются в организме человека и животных и должны поступать туда с пищей).
Следует отметить присутствие органических кислот (оксалиновой, яблочной, лимонной и др.), полного набора микро- и макроэлементов в легкоусвояемой форме (в виде органических соединений и их комплексов), а также комплекса витаминов, в том числе - группы В, которые играют важную роль в процессах белкового, липидного и углеводного обменов, а их недостаток вызывает нарушение функций нервной системы, кожи, слизистых оболочек кишечника, сосудистой системы и органов кровообращения.
Таким образом, биомасса и автолизат мицелия гриба являются по составу весьма ценным продуктом и обладают как высокой питательной ценностью, так и возможностью благотворного физиологического действия на организм животного.
Качество полученных на основе гриба препаратов характеризуют по показателям, приведенным в табл. 5, 6.
Таблица 5
Основные показатели качества пребиотика
Показатель
Значение
Концентрация водородных ионов (рН)
6,6-7,0
Массовая доля сухих веществ, %, не менее
5,8
Контаминация бактериальной и грибковой микрофлорой
Не допускается
Безвредность
Введение белым мышам препарата в тест-дозе 0,25 мл внутрь не должно вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней
Таблица 6
Основные показатели качества биологически активной добавки
Наименование показателя
Характеристика и нормы
1
2
Массовая доля сырого протеина в пересчете на АСВ, %, не менее
38
Массовая доля белка по Барнштейну в пересчете на АСВ, %, не менее
28
Массовая доля липидов в пересчете на АСВ, %, не более
10
Массовая доля углеводов в пересчете на АСВ, %, не более
28
Массовая доля золы в пересчете на АСВ, %, не более
12
Контаминация посторонней бактериальной и грибковой микрофлорой
Не допускается
Токсичность
Не допускается
Безвредность
Однократное скармливание дозы 3% от суточной нормы корма не должно вызывать изменений общего состояния животных в течение 10 дней
Указанный технический результат данного изобретения обеспечивается также способами применения синбиотического комплекса молодняку крупного рогатого скота, свиней и птице в виде кормовых композиций, действие которых базируется на усилении полезных свойств препаратов при их совместном применении.
Первый способ связан с применением жидких препаратов пробиотика и пребиотика выпаиванием при их смешивании с питьевой водой и/или другими жидкостями (примеры 3, 4, 5). Синбиотический комплекс применяют для профилактики заболеваний ЖКТ:
3
- цыплятам-бройлерам и курам-несушкам препараты задают в дозе по 0,1 см каждого препарата на голову с питьевой водой, начиная с суточного возраста, ежедневно, двумя циклами с 1 по 7 и с 21 по 28 дни выращивания (пример 3);
3
- телятам препараты задают в первый, третий дни жизни и в день отъема по 10,0 см каждого препарата на голову с молоком или молозивом, один раз в день (пример 4);
3
3
- поросятам препараты задают в первый и третий дни жизни по 1,0 см, в день отъема - по 1,5 см каждого препарата на голову с питьевой водой (пример 5).
Второй способ связан с применением жидкого пробиотического препарата одновременно с сухой биологически активной добавкой и включает выпаивание пробиотика и введение сухой добавки при смешивании ее с кормом (примеры 6, 7, 8). Синбиотический комплекс применяют для повышения физиологического статуса животных при стрессовых ситуациях (вакцинация, переход на другой вид корма и др.):
3
- цыплятам-бройлерам препараты задают, начиная с суточного возраста ежедневно в с 1 по 7 и с 21 по 28 дни выращивания, в следующих дозах - пробиотик по 0,1 см на голову в сутки с питьевой водой, биологически активная добавка - 1,5% (по массе) от суточного рациона корма (пример 6);
3
- телятам месячного возраста препараты задают, смешивая пробиотик с молоком в дозах - по 5,0 см на голову и биологически активную добавку с комбикормом - 1,5% (по массе) от суточного количества комбикорма в течение трех дней (пример 7);
3
- поросятам-отъемышам препараты задают, смешивая пробиотик по 1,5 см пробиотика на голову с питьевой водой и биологически активную добавку с комбикормом - 1,5% (по массе) от суточного количества комбикорма в течение пяти дней (пример 8).
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Получение бесклеточного пробиотика
Штаммы микроорганизмов, используемые для получения препарата, депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика: лактобактерии Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ (ВКПМ №В-11007) и бактерии Bacillus subtilis штамм М-8 (ВКПМ №В-1948). В дополнение к паспортным данным их характеризовали по величине антагонистической активности (АнтА).
При определении АнтА в опытах in vitro установлен выраженный антагонизм штамма лактобактерии в отношении патогенных микроорганизмов (табл.7).
Таблица 7
Результаты определения антагонистической активности штамма лактобактерии, (n=10)
Патогенные микроорганизмы
зона задержки роста, мм
экспериментальные данные
среднее
S. typhimurium
10; 11; 12; 10; 11; 10; 12; 11; 10; 12
10,9
S. dublin
12; 11; 10; 11; 10; 10; 12; 11; 11; 12
11,0
S. gallinarum
11; 12; 10; 10; 11; 12; 11; 10; 12; 11
11,0
E.coli: K-88
15; 14; 13; 15; 14; 15; 13; 14; 13;14
14,0
E.coli: K-99
16; 15; 14; 15; 15; 16; 14; 15; 16; 16
15,2
E.coli: A-20
15; 14; 16; 15; 16; 16; 16; 15; 16; 15
15,4
При исследовании антагонистической активности штамма Bacillus subtilis, штамм М-8 (ВКПМ №В-1948), in vitro (п=10) установлено, что штамм обладает выраженным антагонизмом в отношении патогенных микроорганизмов, превышающим по величине аналогичные значения для лактобактерии (табл.8).
Таблица 8
Результаты определения антагонистической активности штамма Bacillus subtilis штамм М-8, (n=10)
Патогенные микроорганизмы
Зона задержки роста, мм
Экспериментальные данные
среднее
S. typhimurium
21; 24; 21;24; 25; 22; 23; 25; 24; 22
23,1
S. dublin
19; 18; 19; 17; 19; 18; 19; 20; 17; 19
18,5
S. gallinarum
21; 24; 25; 25; 23; 24; 22; 24; 25; 21
23,4
E.coli: K-88
18; 19; 20; 19; 18; 21; 22; 19; 18; 20
19,4
E.coli: K-99
18; 20; 19; 18; 17; 19; 20; 18; 17; 20
18,6
E.coli: A-20
16; 14;15; 16; 14; 16; 17; 17; 16; 17
15,8
Получение препаратов включает три этапа: раздельное культивирование бактерий, отделение культуральной жидкости от бактериальной массы, смешивание культуральных жидкостей.
Культивирование Lactobacillus plantarum штамм 8 РАЗ (ВКПМ №В-11007).
Посевной материал для культивирования бактерий в биореакторе получали выращиванием культуры в термостате в колбах. Культивирование бактерий в колбах и биореакторе проводили с питательной средой на основе молочной сыворотки (МС).
4
2
4
2
4
3
3
Состав среды МС: сухая молочная сыворотка - 30 г; (NH)SO - 5,0 г; КНРО - 3,0 г; дрожжевой автолизат - 0,01 дм; вода водопроводная - 1,0 дм.
4
2
5
3
3
Характеристика среды после стерилизации (0,5 атм 30 мин): редуцирующих веществ (РВ) - 1,6%; NH - 0,9 г/дм; РO - 0,5 г/дм. Режимы культивирования приведены в табл.9.
Таблица 9
Режимы культивирования L. plantarum в колбах и биореакторе
Параметры культивирования
Колбы (V=1 дм<sup>3</sup>)
Реактор (V=30 дм<sup>3</sup>)
1
2
3
Посевная доза, % от объема питательной среды
10
10
Температура, °С
31
31
Время, ч
71
23
Перемешивание
каждые 12 ч
в течение первых двух часов (по 15 мин/ч, g=180 об/мин)
рН
начальное значение рН - 7,0-7,2
начальное значение рН - 7,0-7,2; при культивировании поддерживали рН на уровне 6,5-7,0 (6%-ной аммиачной водой)
1
2
3
Конечная концентрация сахаров в среде, %
не определялась
0,2
Конечная концентрация сухих веществ в биомассе, г/дм
не определялась
11
Накопление бактерий, КОЕ/см<sup>3</sup>
5×10<sup>9</sup>
3,5×10<sup>9</sup>
Культивирование В. subtilis, штамм М-8 (ВКПМ №В-1948). Посевной материал для культивирования бактерий в биореакторе получали выращиванием культуры на качалке в колбах. Культивирование бактерий в колбах и биореакторе проводили с питательной средой на основе молочной сыворотки (МС).
Режимы культивирования приведены в табл.10.
Таблица 10
Режимы культивирования В. subtilis в колбах и биореакторе
Параметры культивирования
Колбы (V=1 дм<sup>3</sup>)
Реактор (V=30 дм<sup>3</sup>)
Посевная доза, % от объема питательной среды
5
5
Температура, °С
37
37
Время, ч
44
42
Перемешивание
на качалке (200 об/мин)
мешалкой (300 об/мин)
Аэрация
не проводилась
1 дм<sup>3</sup> воздуха/1 дм<sup>3 </sup>среды/мин
рН
начальное значение рН - 7,0-7,2
начальное значение рН 7,0-7,2, в процессе культивирования величина рН не регулировалась
Конечная концентрация сухих веществ в биомассе, г/дм<sup>3</sup>
не определялась
15
Накопление бактерий, КОЕ/см<sup>3</sup>
1,5×10<sup>10</sup>
6,5×10<sup>10</sup>
Получение готовой формы препарата. По окончании процесса культивирования клетки микроорганизмов удаляют из культуральных сред путем двухстадийной фильтрации на пористом многослойном керамическом фильтре для осветления и фильтровальной установке типа «Миллипор» с мембраной с размером пор 0,2 мкм для стерилизации препарата. Затем в асептических условиях культуральные жидкости (КЖ) бактерий L. plantarum и В. subtilis смешивают в объемном соотношении 1:1 и расфасовывают в стеклянные или полиэтиленовые флаконы.
Пример 2. Получение пребиотика (жидкого автолизата мицелия гриба F. sambucinum, шт.MKF 2001-3)
Для разработки пребиотика и биологически активной добавки в качестве продуцента БАВ использован штамм гриба Fusarium sambucinum MKF-2001-3 (патент РФ №2259209 «Штамм гриба Fusarium sambucinum -продуцент биологически активных веществ», опубликовано: 27.08.2005 Бюл. №24). Штамм депонирован в ВКПМ (№F - 867).
Пребиотик представляет собой стерильный автолизат мицелия гриба (AM), полученной при культивировании Fusarium sambucinum MKF-2001-3 в питательной среде на основе молочной сыворотки, с последующим водным автолизом биомассы, отделением автолизата центрифугированием и стерилизации фильтрата ультрафильтрацией на полых волокнах.
Культивирование гриба F. sambucinum MKF-2001-3.
Посевной материал для культивирования гриба в биореакторе получали выращиванием культуры на качалке в колбах. Культивирование гриба в колбах и биореакторе проводили с питательной средой на основе молочной сыворотки (МС). Режимы культивирования приведены в табл.11.
Таблица 11
Режимы культивирования F. sambucinum в колбах и биореакторе
Параметры культивирования
Колбы (V=1 дм<sup>3</sup>)
Реактор (V=30 дм<sup>3</sup>)
1
2
3
Посевная доза, % от объема питательной среды
3
3
Температура, °С
26
27
1 пассаж - 96
Время, час
2 пассаж - 48
32
3 пассаж - 24
Перемешивание
на качалке (160 об/мин)
перемешивание постоянное (120 об/мин)
Аэрация
не проводилась
барботаж воздухом (при 1,1 атм); остаточное давление 0,25 атм
рн
начальное значение рН - 5,5-6,0
процесс заканчивали при снижении рН до 4,1±0,5; после окончания процесса среду подкисляли до рН 3,0-3,5 и выдерживали в течение 1-3 ч
Конечная концентрация сухих веществ в биомассе, г/дм<sup>3</sup>
5,5
11
Содержание белка, %
не определялось
49
Автолиз проводили при смешивании биомассы с водопроводной водой в соотношении 1:1, периодическом перемешивании и выдерживании смеси при температуре 35°С в течение 24 часов.
Получение готовой формы препарата. Автолизат отделяли от биомассы фильтрацией на нутч-фильтрах (фильтрующая ткань типа лавсана, разрежение 0,05-0,07 МПа, скорость 90-110 л/м/мин), подвергали стерилизующей фильтрации на полых волокнах и расфасовывали в стеклянные или полиэтиленовые флаконы.
Определяли химический состав пребиотика (табл.12).
Таблица 12
Химический состав биологически активной добавки
Показатель
Значение
Сухие вещества, масс. %
72,5
Углеводы, масс. %
17,4
Липиды, масс. %
5,8
Общий белок, масс. %
45,1
Пример 3. Получение биологически активной добавки (биомассы гриба F. sambucinum, шт. MKF 2001-3).
Биологически активная добавка представляет собой биомассу гриба (БМ), полученную после отделения автолизата и высушенную распылительным способом.
Способ культивирования F. sambucinum MKF-2001-3 приведен в примере 2.
Получение готовой формы препарата. Биомассу F. sambucinum, после отделения автолизата, сушили на распылительной сушилке Niro Atomizer (температура на входе 130°С, на выходе 95°С) и расфасовывали в полиэтиленовые мешки. Определяли химический состав биологически активной добавки (табл.13).
Таблица 13
Химический состав биологически активной добавки
Показатель
Значение
Общий белок, %, от асв*
49,2
Углеводы, %, от асв
24,9
Липиды, %, от асв
8,1
Нуклеиновые кислоты,(%, от асв
3,9
Зола, %, от асв
8,0
Влажность, %
7,8
*асв - абсолютно сухое вещество
3
Пример 4. Цыплятам-бройлерам бесклеточный пробиотик и пребиотик задают в дозе по 0,1 см каждого препарата на голову с питьевой водой, начиная с суточного возраста, ежедневно, двумя циклами в 1-7 и 21-28 дни жизни, что обеспечивает эффективное увеличение сохранности поголовья, прирост живой массы, уменьшение затрат корма.
Эффективность применения синбиотического комплекса определяли при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Кобб-500».
В производственных испытаниях (по 105 голов в группе) определяли эффективность двух схем применения комплекса: однократно в 1-7 дни жизни (1 вариант) и двукратно в 1-7 и 21-28 дни жизни (2 вариант).
3
Дозировка препаратов одинакова для двух вариантов: по 0,1 см каждого препарата на голову с питьевой водой (табл.14).
Таблица 14
Результаты производственных испытаний эффективности применения синбиотического комплекса при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Кобб-500»
Показатель
Вариант
1
2
Контроль
Сохранность, %
98,1
98,1
94,3
Живая масса 1 гол., г (1-37 дни жизни)
2054,1±33,6
2060,4±37,9
2049,3±35,1
Затраты корма на 1 кг прироста, кг
1,782
1,744
1,813
ЕИП
306
313
288
Лучший результат получен для варианта 2.
По сравнению с контролем сохранность цыплят выше на 3,8%, затраты корма ниже на 3,8%, европейский индекс продуктивности (ЕИП) выше на 25 единиц.
Бесклеточная форма пробиотика позволяет применять его на фоне курса лечебных антибиотиков без снижения его пробиотической активности, а жидкая форма про- и пребиотика обеспечивает возможность их выпаивания, которое является более технологичным способом по сравнению со скармливанием.
3
Пример 5. Исследования эффективности синбиотического комплекса (пробиотика и пребиотика) проводили на телятах. Новорожденным телятам в первый, третий дни жизни и при переводе с молочного питания на растительные корма выпаивают по 10,0 см каждого препарата на голову с молоком или молозивом, что обеспечивает эффективное увеличение прироста живой массы.
3
Для подтверждения результатов были сформированы 2 группы телят по принципу аналогов по 50 голов в группе. Здоровым телятам опытной группы жидкие пробиотик и пребиотик выпаивают по 10,0 см каждого препарата на голову с молоком или молозивом. Данные, полученные в результате опыта, представлены в табл. 15.
Таблица 15
Эффективность комплексного использования пробиотического и пребиотического препаратов на телятах
Показатели
Контрольная группа
Опытная группа
Количество животных в группе, гол.
50
75
Продолжительность опыта, дн
60
60
Средняя живая масса теленка в начале опыта, кг
27,3±4,3
28,1±3,9
Средняя живая масса теленка в конце опыта, кг
58,3±8,5
68,9±7,2
Среднесуточный прирост живой массы, г
520±8,82
680±14,32**
Заболело телят, голов
29
10
Бактерицидная активность, %
48,33±1,0
66,2±1,47**
Лизоцимная активность, мкг/мл
2,9±0,11
3,6±0,13***
Примечание- ** -Р<0,05; *** - Р<0,001
Из представленных в таблице данных видно, что использование комплекса препаратов по определенной нами схеме позволяет дополнительно получить среднесуточный прирост живой массы 160 г и увеличить среднюю живую массу теленка в конце опыта на 10,6 кг.
Таким образом, из результатов проведенных исследований следует, что применение пробиотика и пребиотика является действенным средством повышения продуктивности телят.
Бесклеточная форма пробиотика позволяет избежать снижения пробиотической активности за счет процесса дезактивации живых микроорганизмов при их прохождении через верхние отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), а жидкая форма препаратов позволяет применять их выпаиванием.
3
3
Пример 6. Для применения новорожденным поросятам - с 1 по 3 дни жизни по 1,0 см каждого препарата на голову с питьевой водой, в день отъема - по 1,5 см каждого препарата на голову, что обеспечивает эффективное увеличение сохранности, прироста живой массы. Результаты представлены в табл.16.
Таблица 16
Эффективность использования комплекса при выпаивании поросятам-сосункам
Показатели
Группа
опытная
контрольная
Количество животных в группе, гол.
30
25
Продолжительность опыта, дней
30
30
Прирост живой массы, кг
12,5
10,4
Заболело поросят, %
10
25
При использовании комплекса для откармливания поросят опытной группы (с применением пробиотика и пребиотика) получен дополнительный прирост живой массы в 2-месячном возрасте, в среднем, 2,1 кг на голову по сравнению с данными по контрольной группе, в которой препараты не применялись.
Таким образом, сохранность и прирост живой массы поросят значительно повышается при использовании синбиотического комплекса. Жидкая форма препаратов позволяет применять их поросятам-сосунам.
Пример 7. Применение цыплятам-бройлерам жидкого пробиотического препарата одновременно с сухой биологически активной добавкой включает выпаивание пробиотика с питьевой водой и введение сухой добавки при смешивании ее с кормом, что обеспечивает повышение физиологического статуса животных при стрессовых ситуациях, таких как вакцинация.
Влияние синбиотического комплекса (бесклеточный пробиотик и биологически активная добавка) на эффективность вакцинации птицы против ньюкаслской болезни (НБ) исследовали при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Смена».
3
Определяли влияние комплекса на динамику роста живой массы птицы (2000 голов) после плановой вакцинации против НБ (в возрасте 14 дней). Цыплятам-бройлерам препараты задавали, начиная с суточного возраста ежедневно двумя циклами (в 1-7 и 21-28 дни жизни), в следующих дозах - пробиотик по 0,1 см на голову в сутки с питьевой водой, биологически активная добавка - 1,5% (по массе) от суточного рациона корма (табл. 17).
Применение синбиотического комплекса улучшало (Р≤0,05) динамику увеличения живой массы вакцинированной птицы.
Таким образом, использование синбиотического комплекса значительно повышает физиологический статус птицы при таких стрессовых ситуациях, как вакцинация.
3
Пример 8. Применение жидкого пробиотического препарата одновременно с сухой биологически активной добавкой телятам в первый - третий дни и при переводе с молочного питания на растительные корма, с молоком в дозах - по 5,0 см пробиотика на голову и биологически активной добавки - 1,5% (по массе) от суточного рациона корма обеспечивает повышение физиологического статуса животных при стрессовых ситуациях, таких как переход на другой вид корма.
3
Эффективность применения комплекса пробиотика и биологически активной добавки исследовали на телятах. По принципу аналогов были сформированы 2 группы телят в возрасте 30 суток по 20-50 голов в группе. Телятам опытной группы препараты комплекса применяли по схеме: в первый - третий дни пробиотика - по 5,0 см на голову с молоком, биологически активной добавки - 1,5% (по массе) от суточного рациона комбикорма.
Продолжительность исследований - 60 дней.
Данные, полученные в результате опыта, представлены в таблице 18.
Из представленных в таблице данных видно, что использование комплекса позволяет дополнительно получить среднесуточный прирост живой массы от 90 до 134 г, повысить бактерицидную активность сыворотки крови на 9,3-12,8%, лизоцимную активность на 1,1-1,7 мкг/мл.
Таким образом, использование синбиотического комплекса значительно увеличивает прирост живой массы телят при переходе на другой тип кормления.
Пример 9. Применение жидкого пробиотического препарата одновременно с сухой биологически активной добавкой поросятам-отъемышам включает выпаивание пробиотика с питьевой водой и введение сухой добавки при смешивании ее с кормом, что обеспечивает повышение физиологического статуса животных при стрессовых ситуациях, таких как переход на другой вид корма.
3
Для подтверждения результатов поросятам-отъемышам в возрасте 2 месяцев в течение 5 дней применяли препараты комплекса в дозах: пробиотика - по 1,5 см на голову с питьевой водой и биологически активной добавки - 1,5% (по массе) от суточного рациона комбикорма (табл. 19).
Используя синбиотический комплекс при кормлении поросят опытной группы получен дополнительный прирост живой массы (по сравнению с контрольной группой)  в среднем  2,2 кг на голову и снижение расхода кормов  в среднем  на 1,6 кормовых единиц.
Полученные данные позволяют говорить о том, что использование синбиотического комплекса значительно повышает эффективность использования комбикормов и интенсивность откорма поросят-отъемышей.
Таким образом, применение синбиотического комплекса молодняку крупного рогатого скота, свиней и птице в виде кормовых композиций (пробиотик и пребиотик, пробиотик и биологически активная добавка) обеспечивает повышение физиологического статуса животных при стрессовых ситуациях (вакцинация, переход на другой вид корма и др.) и способствует профилактике заболеваний желудочно-кишечного тракта.