РЕКОМБИНАНТНОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ПЕПТИДОВ

1. Белок-предшественник, содержащий расщепляемую повторяющуюся последовательность целевых пептидных элементов (Pep) и вспомогательных пептидных элементов (Aux) общей формулы:
x
(Pep-Aux) или
x
(Aux-Pep),
где x>1, причем
элементы Aux являются идентичными или различными и содержат элементы аминокислотной последовательности, которые обеспечивают свойства самосборки указанного белка-предшественника, причем по меньшей мере один элемент Aux содержит самособирающийся пептидный элемент (SA), который содержит по меньшей мере одну последовательность из по меньшей мере 8 аминокислот, которые содержат по меньшей мере 50% остатков аланина, по меньшей мере 50% остатков валина или по меньшей мере 50% остатков глутамина, или по меньшей мере 80% которых составляет по меньшей мере один из этих остатков, и
элементы Pep являются идентичными или различными и содержат аминокислотную последовательность идентичных или различных пептидных молекул, и на концах элементов Pep находятся расщепляемые последовательности, которые обеспечивают возможность высвобождения Pep элементов из белка-предшественника посредством специфического расщепления.
2. Белок-предшественник по п.1, где элементы Pep и Aux пептидно связаны друг с другом, и пептидная связь специфически расщепляется химическим или ферментативным путем.
3. Белок-предшественник по п.1, который образует стабильные ассоциаты, которые являются нерастворимыми при комнатной температуре в 0,2 М NaOH в течение одного часа, или в 2 М мочевине или 1 М гидрохлориде гуанидина в течение 10 мин.
4. Белок-предшественник по п.3, где элемент SA содержит по меньшей мере один из следующих мотивов последовательности:
A<sub>n</sub>
(мотив 1)
(GA)<sub>m</sub>
(мотив 2)
V<sub>n</sub>
(мотив 3)
(VA)<sub>m</sub>
(мотив 4)
(VVAA)<sub>o</sub>
(мотив 5)
где A представляет собой аланин, G представляет собой глицин, V представляет собой валин, n представляет собой целое число от 2 до 12, m представляет собой целое число от 2 до 10, и о представляет собой целое число от 1 до 6.
5. Белок-предшественник по п.1 или 4, где элемент SA содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 5 или SED ID NO: 73.
6. Белок-предшественник по п.1, где по меньшей мере один пептид Aux, кроме того, содержит защитный пептидный элемент (SU).
7. Белок-предшественник по п.6, где элемент SU содержит повышенную долю отрицательно заряженных аминокислотных остатков.
8. Белок-предшественник по п.7, где элемент SU в белке-предшественнике способен образовывать амфифильную спиральную структуру.
9. Белок-предшественник по п.8, где элемент SU представляет собой амфифильный пептид, содержащий сегмент последовательности из по меньшей мере семи пептидно связанных аминокислот, способных образовывать амфифильную альфа-спираль, причем указанная спираль в ее вертикальной проекции показывает разделение аминокислотных остатков на гидрофобную половину и гидрофильную половину спирали, причем гидрофобная половина спирали (в ее вертикальной проекции) имеет по меньшей мере 3 идентичных или различных смежных гидрофобных аминокислотных остатка, и гидрофильная половина спирали (в ее вертикальной проекции) имеет по меньшей мере 3 идентичных или различных смежных гидрофильных аминокислотных остатка.
10. Белок-предшественник по п.7, 8 или 9, где доля заряженных аминокислотных остатков элемента SU выбирается таким образом, что общий суммарный заряд белка-предшественника при pH=7 больше -10 и меньше +10.
11. Белок-предшественник по п.7, где элемент SU содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 68.
12. Белок-предшественник по п.1, где элемент Pep содержит катионную противомикробную пептидную последовательность.
13. Белок-предшественник по п.12, где элемент Pep содержит аминокислотную последовательность, выбранную из катионных аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 6 - SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 69-SEQ ID NO: 72.
14. Белок-предшественник по п.1, где элемент Pep содержит аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 20 или SEQ ID NO: 29-67.
15. Белок-предшественник по п.1, где элементы Aux независимо друг от друга имеют одно из следующих значений:
SA,
SA-SU,
SU-SA,
SA-SU-SA,
SU-SA-SU,
где элементы SA и SU пептидно связаны друг с другом, и элементы Aux терминально пептидно связан с по меньшей мере одним элементом Pep, и эта пептидная связь с элементами Pep специфически расщепляется химическим или ферментативным путем.
16. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере один белок-предшественник по пп.1-15.
17. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.16, содержащая по меньшей мере одну кодирующую последовательность согласно SEQ ID NO:21, 24, 27, 74 и 76.
18. Экспрессионная кассета, содержащая по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты по п.16 или 17, оперативно связанную с по меньшей мере одной регуляторной последовательностью нуклеиновой кислоты.
19. Рекомбинантный вектор для трансформации эукариотического или прокариотического хозяина, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты по одному из пп.16 или 17, или экспрессионную кассету по п.18.
20. Способ получения целевого пептида (Pep), который содержит:
а) получения белка-предшественника по одному из пп.1-15, и
b) удаление пептидов Pep из белка-предшественника посредством расщепления.
21. Способ по п.20, где белок-предшественник продуцируется в рекомбинантном микроорганизме, несущем по меньшей мере один вектор по п.19.
22. Способ по п.21, где белок-предшественник продуцируется в рекомбинантном штамме E.coli.
23. Способ по одному из пп.20-22, где экспрессированный белок-предшественник, при необходимости после того как был превращен в стабильную ассоциированную форму, подвергается очистке и химическому или ферментативному расщеплению с высвобождением целевого пептида (Pep).
24. Белок-предшественник, содержащий расщепляемую последовательность целевых пептидных элементов (Pep) и вспомогательных пептидных элементов (Aux') общей формулы:
x
(Pep-Aux') или
x
(Aux'-Pep),
где x>1, причем
элементы Aux' являются идентичными или различными и содержат амфифильный пептид, образующий альфа-спираль, причем указанный амфифильный пептид содержит сегмент последовательности из по меньшей мере семи пептидно связанных аминокислот, способных образовывать амфифильную альфа-спираль, причем указанная спираль в ее вертикальной проекции показывает разделение аминокислотных остатков на гидрофобную половину и гидрофильную половину спирали, причем гидрофобная половина спирали (в ее вертикальной проекции) имеет по меньшей мере 3 смежных идентичных или различных гидрофобных аминокислотных остатка, и гидрофильная половина спирали (в ее вертикальной проекции имеет) по меньшей мере 3 смежных идентичных или различных гидрофильных аминокислотных остатка; и
элементы Pep являются идентичными или различными и содержат аминокислотную последовательность идентичных или различных пептидных молекул, и на концах элементов Pep находятся расщепляемые последовательности, которые обеспечивают возможность высвобождения Pep элементов из белка-предшественника посредством специфического расщепления.
25. Белок-предшественник по п.24, где элементы Aux' содержат по меньшей мере один самособирающийся пептидный элемент (SA), как определено в любом из пп.4 или 5.
26. Белок-предшественник по п.24 или 25, где целевым пептидом (Pep) является катионный противомикробный пептид, и элементом Aux' является анионный пептид, формирующий амфифильную альфа-спираль.
27. Применение амфифильного пептида в качестве защитного пептида для рекомбинантного получения противомикробного целевого пептида, отличного от него, где указанный амфифильный пептид содержит участок последовательности из по меньшей мере семи пептидно связанных аминокислот, способных образовывать амфифильную альфа-спираль, причем указанная спираль в ее вертикальной проекции показывает разделение аминокислотных остатков на гидрофобную половину и гидрофильную половину спирали, причем гидрофобная половина спирали (в ее вертикальной проекции) имеет по меньшей мере 3 смежных идентичных или различных гидрофобных аминокислотных остатка, и гидрофильная половина спирали (в ее вертикальной проекции) имеет по меньшей мере 3 смежных идентичных или различных гидрофильных аминокислотных остатка.
28. Применение по п.27, где целевой пептид (Pep) представляет собой катионный противомикробный пептид, и элемент Aux' представляет собой анионный пептид, формирующий амфифильную альфа-спираль.