Влияние селективного лазерного спекания на активность трипсина, инкапсулированного в полилактид

ВЛИЯНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО ЛАЗЕРНОГО СПЕКАНИЯ НА АКТИВНОСТЬ ТРИПСИНА, ИНКАПСУЛИРОВАННОГО В ПОЛИЛАКТИД

Е.Н.Антонов1, В.Н.Баграташвили1, Т.Н. Бородина2, С.А.Бочкова1,

Е.А. Марквичева2, В.К.Попов1, А.В. Попова1, Л.Д.Румш2, Б.М.Фельдман3

1Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН,

Троицк, Московской обл., Россия.

2Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва, Россия. 3ФГУП «Государственный научный центр «НИОПИК», Москва, Россия.

Включение биологически активного вещества, трипсина в частицы полилактида осуществлялось путем обработки смеси порошков в сверхкритическом СО2. Полученный композит затем спекался методом поверхностно селективного лазерного спекания. Проведено исследование зависимости активности трипсина от параметров лазерного спекания. Показано, что при энергиях лазерного излучения, используемых для формирования твердых трехмерных структур на базе биорезорбируемых полимеров, трипсин сохраняет более 80% своей первоначальной активности. Таким образом, метод поверхностно селективного лазерного спекания может быть эффективно использован для обеспечения управляемого пролонгированного выхода биологически активных веществ в тканевой инженерии.

ВВЕДЕНИЕ.

Биодеградируемые полимеры используются для формирования матричной каркасной структуры в тканевой инженерии. В процессе резорбции матрицы постепенно замещаются естественной тканью. Для стимулирования формирования ткани в материал матрицы включаются биологически активные вещества (БАВ). Таким образом, матрицы могут использоваться не только как временная опора для формирования новой ткани, но и как резервуар для пролонгированного выхода биологически активных веществ. В последнее время для изготовления матриц активно развиваются технологии быстрого прототипирования (послойного изготовления трёхмерных объектов, основанного на компьютерной модели) [1]. Наиболее универсальный из этих методов, метод поверхностно селективного лазерного спекания (ПСЛС), позволяет формировать структуры любой архитектуры из широкого класса материалов, включая биорезорбируемые полимеры. Принципиальная возможность сохранения активности (БАВ), включенных в полилактид и подвергнутых термическому воздействию в процессе ПСЛС, была ранее продемонстрирована на примере рибонуклеазы [2]. В данной работе матричные структуры были сформированы методом ПСЛС из порошка полилактида (ПЛА) с, включенным в него ферментом, трипсином. Исследовалась активность трипсина в зависимости от параметров лазерного воздействия.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Приготовление порошка полилактида с трипсином.

Для включения трипсина в полимерные частицы использовалось явление пластификации аморфных алифатических полиэфиров в сверхкритическом СО2 [3]. 10 весовых % кристаллического трипсина (Самсон-Мед, Санкт-Петербург) смешивались с порошком ПЛА, ^^)-полилактида (Alkermes Medisorb, Mw = 84 kDa). В камеру подавался СО2, и система выдерживалась в течение 1 часа при давлении 100 бар и температуре 40оС. После сброса давления был сформирован композит ПЛА с трипсином в виде монолита, который затем размалывался до получения порошка с размером частиц порядка 200 мкм.

Процесс ПСЛС.

Полученный порошок ПЛА с трипсином спекался методом ПСЛС, аналогично, описанному в [2]. Спекание осуществлялось на установке СЛС-100 (ИПЛИТ РАН, Шатура, Россия) при превышении мощности лазерного излучения над пороговой

мощностью спекания в 1,5, 3 и 6 раз. В СЛС-100 использовался одномодовый волоконный лазер с длинной волны 1.06 мкм и мощностью до10 Вт.

Измерение активности трипсина.

Активность трипсина до и после лазерного спекания тестировалась с помощью хромогенного субстрата р-нитроанилида бензоиларгинина (Bz-Arg-pNA) в Трис*НС1 буфере. Проводилась инкубация 2,3 мл 0.05М Т^*НС1 буфера (pH 8.1), содержащего 0.0115М хлорида кальция, и 30 мкл Bz-Arg-pNA (исходная концентрация 5 мг/мл в DMSO) при 25°С в течение 3-4 минут. Затем к смеси добавлялся 1 мг образца, содержащего капсулированный трипсин. Смесь перемешивалась в течение 3-4 минут, и после центрифугирования проводилось измерение оптической плотности супернатанта при длине волны 410 нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Результаты измерений активности трипсина представлены на рисунке 1.

Активность исходного трипсина принималась за 100%.

100

80

Й 60

и

©

X

а 40

н

<

20

0

Рис. 1. Активность трипсина в ПЛА до и после лазерного спекания при различном превышении пороговой мощности спекания.

Очевидно, что активность фермента уменьшается с ростом мощности лазерного излучения. В то же время, трипсин сохраняет существенную активность при всех интенсивностях лазерного излучения. В частности, при 3-х кратном превышении над порогом спекания активность трипсина оставалась на уровне 56% от исходной. Данные результаты коррелируют с данными работы [2], в которой при аналогичных условиях измеренная активность рибонуклеазы составляла 69,1%. Следует отметить, что при 2-х - 3-х кратном превышении порога спекания, на базе порошков ПЛА формируются структуры, механическая прочность которых может удовлетворять требованиям, предъявляемым к имплантатом твердых тканей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Исследована зависимость активности трипсина от параметров лазерного спекания. Показано, что при энергиях лазерного излучения, используемых для формирования твердых трехмерных структур на базе биорезорбируемых полимеров, трипсин сохраняет основную часть своей активности. Таким образом,

Исходный 1,5 3 6

Превышение над порогом

метод ПСЛС может быть эффективно использован для обеспечения пролонгированного выхода БАВ в тканевой инженерии.

Данная работа выполнялась при поддержке РФФИ, а также Научнотехнической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2007-2009 г, финансируемой правительством г. Москвы.

1. C. K. Chua, K. F. Leong, C. M. Cheah and S. W. Chua, Development of a tissue engineering scaffold structure library for rapid prototyping. Part 1: Investigation and classification, Int. J. Adv. Manuf. Technol., 2003, v.21, pp. 291-301.

2. E. N. Antonov, V. N. Bagratashvili, at al., Three-Dimensional Bioactive and Biodegradable Scaffolds Fabricated by Surface-Selective Laser Sintering, Advanced Materials, 2005, v.17, pp. 327-330.

3. В.К.Попов, А.П.Краснов, А.И.Воложин, С.М.Хоудл, Новые биоактивные композиты для регенерации костных тканей, Перспективные Материалы, 2004, № 4, стр.49-57.

EFFECT OF SELECTIVE LASER SINTERING PROCESSING ON THE ACTIVITY OF TRYPSIN ENCAPSULATED INTO POLYLACTIC ACID.

E.N.Antonov1, V.N.Bagratashvili1, S.A.Bochkova1, S.E.Bogorodski, B.M. Feldman3, E.A.Markvicheva2, V.K.Popov1, A.V.Popova1, L.D.Rumsh2

1 Institute on Laser and Information Technologies, Rus. Acad. Sci., Troitsk, Moscow Reg., Russia.

2 Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry Rus. Acad. Sci., Moscow, Russia.

3 FSUE "State Scientific Center" Organic Intermediates and Dyes Institute, Moscow, Russia.

Trypsin was encapsulated into polylactic acid by supercritical carbon dioxide technique. The activity of trypsin after surface selective laser sintering of PLA /trypsin composite has been studied. The enzyme activity was decreased with laser power. At the same time, trypsin retained substantial activity, higher than 80 % after laser sintering. This process can be used for fabrication of matrixes for controlled drug release.