Создание env псевдовирусов на основе штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в Новосибирской области

References

1. Gagushkina O. M., Mitroshenkova A. E. Jekologo-biologicheskaja harakteristika lugovoj flory levoberezhnoj chasti reki Derkul (Respublika Kazahstan) // VI Obshherossijskaja studencheskaja jelektronnaja nauchnaja konferencija «Studencheskij nauchnyj forum 2014» [Jelektronnyj resurs] - Rezhim dostupa: http://www.scienceforum.ru/2014. svobodnyj. - Data obrashhenija : 15.02.2015 g.

2. Il'ina V. N., Mitroshenkova A. E., Ustinova A. A. Organizacija i monitoring osobo ohranjaemyh prirodnyh territory v Samarskoj oblasti // Samarskij nauchnyj vestnik. № 3 (4). Samara : Izd-vo PGSGA. - 2013. - S. 41-44.

3. Il'ina V. N., Mitroshenkova A. E. Sohranenie fitoraznoobrazija na osobo ohranjaemyh prirodnyh territorijah Samarskoj oblasti // Problemy sovremennoj biologii. - 2014. № XII. - S. 20-26.

4. Mitroshenkova A. E. Osobo ohranjaemye prirodnye territorii kak potencial'nye ob#ekty dlja nauchno-issledovatel'skoj i uchebnoj dejatel'nosti studentov // Samarskij nauchnyj vestnik. - 2014. № 2 (7). - S. 68-71.

5. Mitroshenkova A. E., Il'ina V. N. Botanicheskoe kraevedenie Samarskoj oblasti: aktual'nye problemy i perspektivy razvitija // Samarskij nauchnyj vestnik. - 2014. № 2 (7). - S. 71-74.

6. Mitroshenkova A. E. Pedagogicheskij proekt «Jekspedicija uchashhihsja v ramkah geobotanicheskoj nauchnoj shkoly Povolzhskoj gosudarstvennoj social'no-gumanitarnoj akademii» // Nauchno-metodicheskij jelektronnyj zhurnal «Koncept». - 2014. № 5. - S. 106-110.

7. Ustinova A. A., Mitroshenkova A. E., Il'ina V. N. Voprosy botanicheskogo obrazovanija v Pedagogicheskom vuze // Sibirskij pedagogicheskij zhurnal. № 4. Novosibirsk . - 2013. - S. 169-172.

Рудометов А.П.1, Щербакова Н.С.2

'Аспирант, Г осударственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Работа выполнена при поддержке гранта Минобрнауки России «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014 - 2020 годы» ФЦП № 303 СОЗДАНИЕ ENV ПСЕВДОВИРУСОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ ВИЧ-1, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В НОВОСИБИРСКОЙ

ОБЛАСТИ

Аннотация

В статье рассмотрено - создание Env псевдовирусов на основе штаммов ВИЧ-1, выделенных из сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов Новосибирской области. Получено 3 функционально активных псевдовируса, относящихся к циркулирующей рекомбинантной форме CRF63 02A1.

Ключевые слова: ВИЧ-1, псевдовирусы, вируснейтрализация.

Rudometov A.P.1, Shcherbakova N.S.2 *Ph.D. student, State Research Center of Virology and Biotechnology “Vector”

PRODUCTION OF ENV PSEUDOVIRUSES BASED ON HIV-1 STRAINS CIRCULATING IN THE NOVOSIBIRSK

REGION

Abstract

In the article we describe the production of Env pseudoviruses based on HIV-1 strains isolated from HIV-positive patients in Novosibirsk region. We assembled 3 functionally active pseudoviruses expressing HIV-1 envelope from circulating recombinant form

CRF63 02А1.

Keywords: HIV-1, pseudoviruses, virus neutralization.

ВИЧ-инфекция в России стала национальной угрозой. На 1 января 2014 года в России выявлено 798122 ВИЧ-инфицированных, в том числе 7256 детей. В Сибирском Федеральном округе выявлено 127 635 ВИЧ-положительных пациентов, данный регион занимает 3-е место в стране по количеству инфицированных ВИЧ-1 [1]. В 2008 г. в Новосибирской области выявлен новый генетический вариант CRF02_AG ВИЧ-1, который продолжает стремительно распространяться в Сибирском регионе.

Разработка безопасной и эффективной вакцины против ВИЧ-1 является одной из важнейших задач в борьбе с эпидемией СПИДа. Клинические испытания RV-144 в Тайланде показали, что создание вакцины против ВИЧ-1 возможно [2]. Одним из основных показателей эффективности вакцины является способность индуцировать антитела, нейтрализующие большое количество первичных изолятов ВИЧ-1 разных субтипов. В связи с этим изучение вируснейтрализующих свойств антител, индуцированных ВИЧ-1 иммуногенами, является важной процедурой при создании вакцины.

На смену трудоемкому и дорогостоящему методу анализа нейтрализации ВИЧ с помощью лимфоцитов периферической крови и не клонированных вирусных изолятов, пришла новая технология псевдотипированных вирусов, с использованием генноинженерных линий клеток [3]. Сегодня данный метод анализа нейтрализующей активности антител, оценки антиретровирусной активности препаратов и вакцин является одним из основных в странах Европы и США [4].

Псевдовирусы представляют собой рекомбинантные вирусные частицы, которые иммунологически практически идентичны природным изолятам ВИЧ-1, но биологически безопасны. Псевдовирусы получают ко-трансфекцией плазмид, одна из которых несет ген Env, кодирующий белки оболочки ВИЧ-1 определенного штамма, другая - геном ВИЧ-1, за исключением гена Env. Только Env-минус-плазмида способна реплицироваться в клетках 293Т/17, ее участие необходимо для упаковки псевдовириона и доставки tat-гена в клетки TZM-bl. Таким образом, ко-трансфекция клеток 293Т/17 вышеуказанными плазмидами формирует потомство инфекционных псевдовирусных частиц [3]. Благодаря наличию комплекса поверхностных гликопротеинов gp120-gp41 псевдовирусы способны однократно инфицировать клетки, несущие рецепторы CD4+ и CCR5/X4, но из-за дефектного генома не способны к дальнейшему размножению, соответственно работа с ними безопаснее для исследователя [5].

Клетки-мишени TZM-bl, созданные методами генной инженерии, содержат рецептор CD4 и корецепторы CCR5 и CXCR4, а также репортерный tat-зависимый ген люциферазы, который активируется в результате инфицирования этих клеток псевдовирусной частицей. Экспрессия активированного гена люциферазы в инфицированных клетках детектируется с помощью люминометра, при этом интенсивность люминесценции пропорциональна уровню инфекции, а подавление люминесценции соответствует нейтрализации вируса [6].

Целью нашего исследования было получить псевдовирусы на основе штаммов ВИЧ-1, циркулирующих на территории Новосибирской области.

Результаты и обсуждения

Для проведения работы были получены 10 сывороток ВИЧ-инфицированных больных из Областного центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями по Новосибирской области. Из полученных образцов сывороток крови была выделена мРНК ВИЧ-1. Для амплификации гена env, кодирующего оболочечные белки ВИЧ-1, с полученной мРНК была проведена полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (таб.1 праймеры 1 и 2) с последующим проведением гнездовой ПЦР (таб. 1 праймеры 2 и 3).

19

Таблица 1 - Праймеры, используемые при проведении ПЦР

№ п/п Нуклеотидная последовательность (5’ ^ 3’) Орие нтаци я Положение относительно HXB2

1 TACAGT GCAGGGGAAAGAAT AAT AGACAT AAT A S 4809-4834

2 AGACCCAGTACAGGCRARAAGC A 9523-9548

3 TTAGGCATCTCCTATGGCAGGAAGAAG S 5957-5983

4 TCCAGTCCCCCCTTTTCTTTTAAAAAG A 9063-9089

Были получены 8 амплифицированных фрагментов полноразмерного гена env длинной 3132 п.н. (Рис. 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

mi iM) Jto w t»/ to wt ы

Рис. 1 - Электрофореграмма продуктов ПЦР-реакции в 1% агарозном геле. 1-10 - исследуемые образцы сывороток крови; 11 -отрицательный контроль; 12 - положительный контроль ОТ-ПЦР; 13 - положительный контроль гнездовой ПЦР

Для построения филогенетического дерева и определения субтипа полученных изолятов было проведено определение их нуклеотидных последовательностей в районе гена env (ЦКП «Геномика», Новосибирск). Филогенетические деревья строили методом максимального правдоподобия при помощи программы RAxML версия 7.2.7. Рекомбинацию изучали, используя программу SimPlot версия 3.5. Достоверность филогенетических отношений определяли методом бутстреп-анализа.

В качестве референсных использовали ранее охарактеризованные последовательности субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, полученные из коллекции HIV Sequence Database [7].

Филогенетический анализ показал, что все 8 проанализированных последовательностей гена env относятся к рекомбинантной форме CRF63_02A1, распространенной на территории Новосибирской области [8].

Амплифицированные фрагменты полноразмерного гена env были клонированы в составе векторной плазмиды pcDNA™3.1/V5-His TOPO TA (Invitogen). Полученными рекомбинантными плазмидами pEnv были трансформированы компетентные клетки E.coli Stbl3. Отбор клонов, содержащих вставку, проводили методом ПЦР с праймерами 3 и 4 (табл. 1).

Псевдовирусы получали магнитной ко-трансфекцией (MATra, PromoKine) эукаратиотических клеток 293Т двумя видами плазмид в эквимолярных концентрациях: полученной нами pEnv, кодирующей оболочечные белки ВИЧ-1, и pSG3Aenv (backbone-плазмида), кодирующей остальные белки ВИЧ-1, за исключением Env.

Функциональную активность псевдовирусов определяли в клетках TZM-bl по методике Montefiori [4]. Было показано, что 3 из 8 полученных псевдовирусов обладают функциональной активностью.

Таким образом, были получены 3 функционально активных псевдовируса рекомбинантной формы CRF63_02A1, распространенной в Новосибирской области.

Полученные псевдовирусы будут использованы для анализа нейтрализующей активности антител, индуцированных ВИЧ-1 иммуногенами, и могут применятся при тестировании антиретровирусных препаратов.

Литература

1. Федеральный научно-методический Центр по профилактике и борьбе со СПИДом [Электронный ресурс] URL: http://www.hivrussia.ru/ (дата обращения 20.02.2015).

2. Rerks-Ngarm S., Pitisuttithum, P., Nitayaphan, S. et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand // New England Journal of Medicine. - 2009 - 361(23) - С. 2209-2220.

3. Рыжиков А.Б., Саркисян К.А., Л.И. Карпенко и др. Апробация в доклинических испытаниях метода определения вируснейтрализующей активности вакцины-кандидата против ВИЧ-инфекции КомбиВИЧвак с использованием технологии псевдовирусов ВИЧ-1 // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. - 2014. - 2 (63) - С. 70-76.

4. Montefiori D. C. Measuring HIV neutralization in a luciferase reporter gene assay // HIV protocols. - Humana Press, 2009. - С. 395405.

5. Li M., Gao F., Mascola J. R. et al. Human immunodeficiency virus type 1 env clones from acute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies // Journal of virology. - 2005. - 79(16) - С. 10108-10125.

6. Mascola J. R., D'Souza P., Gilbert P. et al. Recommendations for the design and use of standard virus panels to assess neutralizing antibody responses elicited by candidate human immunodeficiency virus type 1 vaccines // Journal of virology. - 2005. - 79(16) - С. 1010310107.

7. HIV Sequence Database [Электронный ресурс] URL: http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html/ (20.02.2015).

8. Shcherbakova N.S., Shalamova L.A., Delgado E. et al. Molecular Epidemiology, Philogeny, and Phylodynamics of CRF63_02A1, a Recently Originated HIV-1 Circulating Recombinant Form Spreading in Siberia // AIDS Research and Human Retroviruses. - 2014. - V. 30. - N. 9. - P. 912-919.

References

1. Federal'nyj nauchno-metodicheskij Centr po profilaktike i bor'be so SPIDom [Jelektronnyj resurs] URL: http://www.hivrussia.ru/ (data obrashhenija 20.02.2015).

2. Rerks-Ngarm S., Pitisuttithum, P., Nitayaphan, S. et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand // New England Journal of Medicine. - 2009 - 361(23) - S. 2209-2220.

3. Ryzhikov A.B., Sarkisjan K.A., L.I. Karpenko i dr. Aprobacija v doklinicheskih ispytanijah metoda opredelenija virusnejtralizujushhej aktivnosti vakciny-kandidata protiv VICh-infekcii KombiVIChvak s ispol'zovaniem tehnologii psevdovirusov VICh-1 // Jepidemiologija i Vakcinoprofilaktika. - 2014. - 2 (63) - S. 70-76.

4. Montefiori D. C. Measuring HIV neutralization in a luciferase reporter gene assay // HIV protocols. - Humana Press, 2009. - S. 395405.

20

5. Li M., Gao F., Mascola J. R. et al. Human immunodeficiency virus type 1 env clones from acute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies // Journal of virology. - 2005. - 79(16) - S. 10108-10125.

6. Mascola J. R., D'Souza P., Gilbert P. et al. Recommendations for the design and use of standard virus panels to assess neutralizing antibody responses elicited by candidate human immunodeficiency virus type 1 vaccines // Journal of virology. - 2005. - 79(16) - S. 1010310107.

7. HIV Sequence Database [Jelektronnyj resurs] URL: http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html/ (20.02.2015).

8. Shcherbakova N.S., Shalamova L.A., Delgado E. et al. Molecular Epidemiology, Philogeny, and Phylodynamics of CRF63_02A1, a Recently Originated HIV-1 Circulating Recombinant Form Spreading in Siberia // AIDS Research and Human Retroviruses. - 2014. - V. 30. - N. 9. - P. 912-919.

Тагиев А.А.

Кандидат биологических наук, Азербайджанский Научно-Исследовательский Институт Хлопководства ХИМИЧЕСКИЙ МУТАГЕНЕЗ - ЭФФЕКТИВНЫЙ МЕТОД СОЗДАНИЯ ВЫСОКОПОТЕНЦИАЛЬНОГО

ИСХОДНОГО МАТЕРИАЛА ХЛОПЧАТНИКА

Аннотация

Использование индуцированных мутантов, одновременно несущих несколько измененных признаков в различных комбинациях скрещиваний, показали высокую эффективность этого метода, ускоряющего селекционный процесс и повышающего результативность мутационной селекции за счет расширения спектров изменчивости, увеличения числа форм, комплексно сочетающих 5-7 ценных признаков, а также появление растений с 8 хозяйственно-важными показателями, с усилением степени выраженности ценных мутантных признаков у различных рекомбинантов.

Ключевые слова: хлопок, гибрид, мутант, сорт, выход волокна.

Tagiyev A.A

Candidate of biological sciences, Azerbaijan Cotton-Planting Research Institute CHEMICAL MUTAGENESIS - AN EFFECTIVE METHOD OF CREATION HIGH POTENTIAL INITIAL MATERIAL OF

COTTON PLANT

Abstract

Application of the induced mutants carrying some changed characters at a time in different cross-breeding combinations showed high efficiency of this method, which quickens the breeding process and rises the result of mutation breeding due the widening of the changing specters, increasing the number offorms with complex of 5-7 valuable characters, appearance of plants with 8 economically important characters and fastening the express of valuable mutant characters of different recombinants.

Keywords: cotton, hybrid, mutant, variety, fiber output.

The chemical mutagenesis became one of the actual methods of cultivated plants selection. There have been created nearly 2 thousands mutant varieties in the world agricultural production. 40 of them are cotton varieties by direct increasing of the best induced mutants or improvement at cross-breeding with other forms and varieties [1-4].

The importance of chemical mutagenesis for selection is determined not only by quantity of varieties, created with this method, but also by possibility of solving some practical tasks, which are inaccessible or solved with difficulty by the other methods of selection.

At the present time the place of chemical mutagenesis has been determined as a method of increasing the genetic changeability, improving some signs of varieties and also solving some specific tasks of selection successfully. Some ways of using the induced mutants [56] have been worked out and checked during experiments. Dry seeds of cotton varieties 3038, AzNIKhI-33, Mugan-395, AzNIKhI-104, AzNIKhI-170 and 3273 are thought to be certificated varieties, but besides the positive characters they also have negative characters. These seeds were treated by chemical mutagens DAB, NDMM, DMS and EI in different concentrations during 18 hours; afterwards they were washed and dried out. Untreated seeds were used as a control in the experiment.

Each variant of experiment had been conducted at four repeated plantations (single row plots in 10 meter of length) on the experimental field of AzCRI (Azerbaijan Cotton-Planting Research Institute). There had been sown 320 seeds on each variant.

During the vegetation period there had been conducted the following observations and calculation over the height and development of plants in 50% sprouts and accordingly the time of first flowers and ripening, there had been noted 100% sprouts, had been studied the lifetime of plants within comparison by the control. For getting the correct characterization of height, the plants were sized up no later than two weeks before flowering.

The notes of height and development are taken every month for determining from the period of budding till ripening start, over the present leaves, height of plants, and quantity of monopodial and sympodial branches, number of fruit organs, including buds, flowers, bolls and height of the place of the first sympodial branch.

Phenotypic description of the plants in M! and M2 mutant families in M3 and the next generations had been conducted at the end of vegetation. It had been noted that the range of family equality, fur-trimmed of stems, color of stems and branches, form and size of the leaf superficial, types of fruit branches, color of corolla petals, presence of antocian spot at the base of flower, color and shape of bract, calyx and the size of the boll. There had been chosen approximately 150-200 plants on each variant.

Plants with dominating macro mutations among the plants of M! for phenotypic description had been chosen. Valuable samples by quantity characters (yielding, quality of fiber, soon ripening and etc.) of economical significance were checked as well. The collected seeds were sown separately for the next year.

A great importance was attached to volume of M2 generation, which undoubtedly needs to be the maximum. During the vegetation period, the bushes of M2 were carefully studied and were noted all samples which had declinations from control. If the suspicion of given mutation plants row appeared then the seeds of these plants were sown in separate rows for getting next generation (M3).

Studying of mutant families in respect of 10 studying economically valuable characters were lasted in M4 generation. The seeds got from M4 plants were sown for further studying of mutants in M4 on valuable quantity and quality characters.

The arising economically valuable mutations may be combined both useful and deleterious morphological mutation of the experiment there were obtained mutant lines characterized by comparatively wide specter of mutations with 4-8 positive characters.

We have obtained 626 positive mutant lines of cotton plant by chemical mutagenesis. But the most of mutants obtained by experimental way don’t correspond with the modern type of variety, though they carry valuable and sometimes specific character and property. That’s why selectionist wants to obtain such selection material and new varieties on its base. Mutant lines which surpass the initial variety on some characters couldn’t be a direct ancestor of new varieties due the absence of all characters complex, determining the modern type of variety. That’s why we decided to study possibility of improvement of induced mutants by conducting different cross-breeding. For this purpose there had been chosen some more valuable mutants which had 3-5 positively changed characters at a time.

Application of induced mutants at cross-breeding looks forward their hybridization both with the initial varieties, and between themselves.

During the cross-breeding of mutants with different varieties there may be possible recombination or combination of the variety and mutant, changing the influence of mutant’s gene in the new genotypic environment which will bring to the exposition of transgressive forms. Intermutant cross-breeding had been conducted on different agricultural plant with the main purpose of determining the alikeness of mutants

21