КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
COMBINED THERAPY FOR CANCER TREATMENT

Перекрестная ссылка на родственные заявки:
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент США №62/239020 (поданной 8 октября 2015 г., заявка на стадии рассмотрения), содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Ссылка на перечень последовательностей:
[0002] Настоящая заявка включает один или более перечней последовательностей в соответствии с параграфом 1.821 раздела 37 Свода федеральных правил США и далее, которые раскрыты на машиночитаемых носителях (файл озаглавлен: 1301_129PCT_ST25.txt, создан 24 сентября 2016 года и имеет размер 89867 байт), причем указанный файл полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки.
Область техники:
[0003] Настоящее изобретение относится к комбинированной терапии, включающей введение субъекту первой молекулы, которая специфично связывается с B7-H3 человека, и второй молекулы, которая специфично связывается с PD-1 человека, для лечения рака и/или воспаления. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат первую молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 человека, и вторую молекулу, которая специфично связывается с PD-1 человека, которые способны опосредовать, и, более предпочтительно, усиливать активацию иммунной системы против раковых клеток, которые связаны с любым из различных видов рака человека. Настоящее изобретение также относится к применению указанных фармацевтических композиций для лечения рака и других заболеваний у субъектов, получающих лечение.
Уровень техники:
[0004] Рост и метастазирование опухолей во многом зависят от их способности уклоняться от иммунного надзора хозяина и преодолевать механизмы защиты хозяина. Большинство опухолей экспрессируют антигены, которые могут быть распознаны в разной степени иммунной системой хозяина, однако во многих случаях возникает ненадлежащий иммунный ответ, обусловленный неэффективной активацией эффекторных Т-клеток (Khawli, L.A. et al. (2008) «Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors», Exper. Pharmacol. 181:291-328).
A. Суперсемейство B7 и B7-H3
[0005] Члены семейства В7 являются членами суперсемейства иммуноглобулинов, которые содержат домены, сходные с вариабельными (V) доменами иммуноглобулинов и константными доменами (С) иммуноглобулинов (например, IgV-IgC) (Sharpe, А.Н. et al. (2002) «The B7-CD28 Superfamily», Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Домены IgV и IgC членов семейства B7 кодируются отдельными экзонами, и при этом дополнительные экзоны кодируют лидерные последовательности, трансмембранные и цитоплазматические домены. Цитоплазматические домены являются короткими, содержат от 19 до 62 остатков аминокислот в длину и могут кодироваться несколькими экзонами (Collins, М. et al. (2005) «The В7 Family Of Immune-Regulatory Ligands», Genome Biol. 6:223.1-223.7). Предполагают, что члены семейства В7 образуют тандемные, нековалентные гомодимеры на поверхности клетки, и такие димеры были обнаружены для В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86). В7-1 (CD80) и В7-2 (CD86) проявляют двойную специфичность в отношении стимулирующего рецептора CD28 и ингибирующего рецептора CTLA-4 (CD 152) (Sharpe, А.Н. et al. (2002) «The B7-CD28 Superfamily», Nature Rev. Immunol. 2:116-126).
[0006] Уникальность B7-H3 заключается в том, что основная форма у человека содержит два внеклеточных тандемных домена IgV-IgC (т.е. IgV-IgC-IgV-IgC) (Collins, М. et al. (2005) «The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands», Genome Biol. 6:223.1-223.7). Был выявлен вариант с четырьмя внеклеточными доменами иммуноглобулина («4Ig-B7-H3»), несмотря на то, что первоначально предполагали, что он содержит только 2 домена Ig (IgV-IgC) (Chapoval, A. et al. (2001) «B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production», Nature Immunol. 2:269-274; Sun, M. et al. (2002) «Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes», J. Immunol. 168:6294-6297), также обнаружено, что он является более распространенной формой белка у человека (Sharpe, А.Н. et al. (2002) «The B7-CD28 Superfamify», Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Однако природная форма (2Ig) мыши и форма 4Ig человека имеют сходную функцию (Hofmeyer, K. et al. (2008) «The Contrasting Role Of B7-H3», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). Молекула 4Ig-B7-H3 ингибирует лизис раковых клеток, опосредованный природными клетками-киллерами (NK-клетками) (Castriconi, R. et al. «Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34): 12640-12645). Было установлено, что B7-H3 человека (форма 2Ig) стимулирует активацию Т-клеток и выработку ИФН-γ путем связывания с предполагаемым рецептором на активированных Т-клетках (Chapoval, A. et al. (2001) «B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production», Nature Immunol. 2:269-274; Xu, H. et al. (2009) «MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors», Cancer Res. 69(15):5275-6281). B7-H4 и B7-H1 являются эффективными ингибиторами иммунной функции при их экспрессии на опухолевых клетках (Flies, D.B. et al. (2007) «The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity», J. Immunother. 30(3):251-260).
[0007] Способ действия B7-H3 является сложным, поскольку белок выступает посредником костимуляции и коингибирования Т-клеток (Hofmeyer, K. et al. (2008) «The Contrasting Role Of B7-H3», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278; Martin-Orozco, N. et al. (2007) «Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity», Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298; Subudhi, S.K. et al. (2005) «The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition», J. Mol. Med. 83:193-202). B7-H3 связывается с TREM-подобным транскриптом 2 (TLT-2) и костимулирует активацию Т-клеток, а также связывается с еще неидентифицированным рецептором (рецепторами), для опосредования коингибирования Т-клеток. Помимо этого, B7-H3 путем взаимодействия с неизвестным рецептором (рецепторами) ингибирует природные клетки-киллеры и остеобласты (Hofmeyer, K. et al. (2008) «The Contrasting Role Of B7-H3», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). Ингибирование может быть опосредовано взаимодействиями с членами основных путей передачи сигналов, через которые рецептор Т-клеток (TCR) регулирует транскрипцию гена (например, факторами NFTA, NF-κB или АР-1).
+
+
+
[0008] B7-H3 костимулирует пролиферацию CD4 и CD8 Т-клеток. B7-H3 также стимулирует выработку ИФН-γ и литическую активность CD8 (Chapoval, A. et al. (2001) «B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production», Nature Immunol. 2:269-274; Sharpe, A.H. et al. (2002) «The B7-CD28 Superfamily», Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Однако белок также может действовать через NFAT (ядерный фактор для активированных Т-клеток), NF-κB (ядерный фактор каппа-В) и АР-1 (белок-активатор 1) для ингибирования активации Т-клеток (Yi. K.H. et al. (2009) «Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And В7-Н4», Immunol. Rev. 229:145-151). Полагают, что B7-H3 ингибирует Th1, Th2 или Th17 в условиях in vivo (Prasad, D.V. et al. (2004) «Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells», J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) «B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunctivitis In Mice», Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) «Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And В7-Н4», Immunol. Rev. 229:145-151). Результаты нескольких независимых исследований показали, что злокачественные опухолевые клетки человека проявляют заметное увеличение экспрессии белка B7-H3 и что указанная повышенная экспрессия связана с повышенной степенью тяжести заболевания (Zang, X. et al. (2007) «The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition», Clin. Cancer Res. 13:5271-5279), это свидетельствует о том, что опухоли используют B7-H3 в качестве пути уклонения от иммунного надзора (Hofmeyer, K. et al. (2008) «The Contrasting Role Of B7-H3», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
[0009] Молекулы, которые блокируют способность молекулы В7 связываться с рецептором Т-клеток (например, CD28), ингибируют иммунную систему и были предложены в качестве средств лечения аутоиммунного заболевания (Linsley, P.S. et al. (2009) «The Clinical Utility Of Inhibiting CD28-Mediated Co-Stimulation», Immunolog. Rev. 229:307-321). Клетки нейробластомы, экспрессирующие 4Ig-B7-H3, обработанные антителами к 4Ig-B7-H3, были более восприимчивы к NK-клеткам. Однако неясно, можно ли объяснить такую активность только антителами к форме 4Ig-B7-H3, поскольку все описанные антитела, которые вырабатывались к 4Ig-B7-H3, также связывались с формой B7-H3, сходной с 2Ig (Steinberger, P. et al. (2004) «Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains», J. Immunol. 172(4): 2352-2359 и Castriconi et al. (2004) «Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645).
+
[00010] B7-H3 не экспрессируется на покоящихся В-клетках или Т-клетках, моноцитах или дендритных клетках, однако экспрессия B7-H3 индуцируется на дендритных клетках под действием ИФН-γ и на моноцитах под действием ГМ-КСФ (Sharpe, А.Н. et al. (2002) «The B7-CD28 Superfamily», Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Рецептор(ы), который связывается с B7-H3, не был полностью охарактеризован. Результаты предшествующей работы свидетельствовали о том, что один такой рецептор должен быть быстро и кратковременно активирован на Т-клетках после активации (Loke, P. et al. (2004) «Emerging Mechanisms Of Immune Regulation: The Extended B7 Family And Regulatory T Cells." Arthritis Res. Ther. 6:208-214). Недавно было показано, что рецептор TREM-подобного транскрипта 2 (TLT-2 или TREML2) (King, R.G. et al. (2006) «Trem-Like Transcript 2 Is Expressed On Cells Of The Myeloid/Granuloid And В Lymphoid Lineage And Is Up-Regulated In Response To Inflammation», J. Immunol. 176:6012-6021; Klesney-Tait, J. et al. (2006) «The TREM Receptor Family And Signal Integration», Nat. Immunol. 7:1266-1273; Yi. K.H. et al. (2009) «Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4», Immunol. Rev. 229:145-151), который экспрессируется на миелоидных клетках, способен связываться с B7-H3 и тем самым, в частности, костимулировать активацию CD8 Т-клеток (Zang, X. et al. (2003) «В7х: A Widely Expressed В7 Family Member That Inhibits T Cell Activation», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 100:10388-10392; Hashiguchi, M. et al. (2008) «Triggering Receptor Expressed On Myeloid Cell-Like Transcript 2 (TLT-2) Is A Counter-Receptor For B7-H3 And Enhances T Cell Responses», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10495-10500; Hofmeyer, K. et al. (2008) «The Contrasting Role Of B7-H3», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
[00011] Помимо экспрессии на клетках нейробластомы B7-H3 человека гиперэкспрессируется в широком спектре видов рака и культивируемых раковых клетках, сходных со стволовыми клетками. В частности, B7-H3 широко гиперэкспрессируется на многих злокачественных новообразованиях, включая: SCCHN, где уровень прямо пропорционален развитию дистальных метастазов и снижению выживаемости (Katayama, A., et al. (2011) «Expression of B7-H3 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma as a predictive indicator for tumor metastasis and prognosis», Int J Oncol 38:1219-26); рак мочевого пузыря (Boorjian, S.A., et al. (2008) «T Cell Coregulatory Molecule Expression in Urothelial Cell Carcinoma: Clinicopathologic Correlations and Association with Survival», Clin Cancer Res 14:4800-7); рак предстательной железы, при котором экспрессия B7-H3 связана с метастатическим поведением и неблагоприятным исходом (Chavin, G., et al. (2009) «Expression of immunosuppresive B7-H3 ligand by hormone-treated prostate cancer tumors and metastases'», Clin Cancer Res 15:2174-80; Zang, X., et al. (2007) «B7-H3 and B7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with disease spread and poor outcome», Proc Natl Acad Sci USA 104:19458-63); карциному почек, при которой B7-H3 широко экспрессируется в сосудистой сети опухоли (Crispen, P.L., et al. (2008) «Tumor cell and tumor vasculature expression of B7-H3 predict survival in clear cell renal cell Carcinoma», Clin Cancer Res 14:5150-7); рак яичников (Zang, X., et al. (2010) «Tumor associated endothelial expression of B7-H3 predicts survival in ovarian carcinomas», Mod Pathol 2010 May 21); колоректальный рак (Sun, J., et al. (2010) «Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H3 in human colorectal carcinoma», Cancer Immunol Immunother, Mar 24); рак желудка (Wu, С.Р., et al. (2006) «Relationship between costimulatory molecule B7-H3 expression and gastric carcinoma histology and prognosis», World J Gastroenterol 12:457-9); немелкоклеточный рак легкого, при котором более высокие уровни на первичной опухоли связаны с более высокой вероятностью метастатического заболевания (Sun, Y., et al. (2006) «B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer», Lung Cancer 53:143-51); глиобластому (Modak, S., et al. (2001) «Monoclonal antibody 8H9 targets a novel cell surface antigen expressed by a wide spectrum of human solid tumors», Cancer Res 61:4048-54); меланому, при которой более высокие уровни связаны с более высокой стадией опухоли и более короткой продолжительностью выживания (Tekle, С., et al. (2012) «B7-H3 contributes to the metastatic capacity of melanoma cells by modulation of known metastasis-associated genes», Int J Cancer 130:2282-90; Wang, L., et al. (2013) «B7-H3 mediated tumor immunology: Friend or foe?», Int J Cancer Sep 7); и некоторые детские опухоли из мелких круглых синих клеток, включая нейробластому и рабдомиосаркому (Gregorio, A., et al. (2008) «Small round blue cell tumours: diagnostic and prognostic usefulness of the expression of B7-H3 surface molecules, Histopathology 53:73-80).
B. PD-1
[00012] Белок программируемой смерти-1 («PD-1») представляет собой мембранный белок типа I с массой 31 кДа, являющийся членом расширенного семейства CD28/CTLA4 регуляторов Т-клеток, который в целом отрицательно регулирует иммунные ответы (Ishida, Y. et al. (1992) «Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death», EMBO J. 11:3887-3895; публикации заявок на патент США 2007/0202100; 2008/0311117; 2009/00110667, патенты США №№6808710, 7015050, 7488802, 7635757, 7722868, РСТ публикация WO 01/14557).
[00013] PD-1 экспрессируется на активированных Т-клетках, В-клетках и моноцитах (Agata, Y. et al. (1996) «Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And В Lymphocytes», Int. Immunol. 8(5):765-772; Yamazaki, T. et al. (2002) «Expression Of Programmed Death 1 Ligands By Murine T-Cells And АРС», J. Immunol. 169:5538-5545) и с низкими уровнями на природных киллерных Т-клетках (NK-клетках) (Nishimura, Н. et al. (2000) «Facilitation Of Beta Selection And Modification Of Positive Selection In The Thymus Of PD-1-Deficient Mice», J. Exp. Med. 191:891-898; Martin-Orozco, N. et al. (2007) «Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity», Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298).
[00014] Внеклеточная область PD-1 состоит из одного вариабельного домена (V) иммуноглобулина (Ig), который на 23% идентичен эквивалентному домену в CTLA-4 (Martin-Orozco, N. et al. (2007) «Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity», Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). После внеклеточного вариабельного домена Ig расположена трансмембранная область и внутриклеточный хвост. Внутриклеточный хвост содержит два сайта фосфорилирования, расположенных в иммунорецепторном тирозиновом ингибирующем мотиве и иммунорецепторном тирозиновом переключающем мотиве, это свидетельствует о том, что PD-1 отрицательно регулирует сигналы TCR (Ishida, Y. et al. (1992) «Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death), EMBO J. 11:3887-3895; Blank, C. et al. (2006) «Contribution Of The PD-L1/PD-1 Pathway To T-Cell Exhaustion: An Update On Implications For Chronic Infections And Tumor Evasion Cancer», Immunol. Immunother. 56(5):739-745).
[00015] PD-1 опосредует ингибирование иммунной системы путем связывания с PD-L1 и PD-L2 (Flies, D.B. et al. (2007) «The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity», J. Immunother. 30(3):251-260; патенты США №№6803192, 7794710, публикации заявок на патент США 2005/0059051, 2009/0055944, 2009/0274666, 2009/0313687, РСТ публикации WO 01/39722, WO 02/086083).
[00016] PD-L1 и PD-L2 широко экспрессируются на поверхностях тканей человека и мыши, таких как сердце, плацента, мышцы, фетальная печень, селезенка, лимфатические узлы и тимус, а также печень, легкие, почки, клетки островков поджелудочной железы и тонкого кишечника мыши (Martin-Orozco, N. et al. (2007) «Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity», Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298). У человека экспрессия белка PD-L1 была обнаружена в клетках эндотелия человека (Chen, Y. et al. (2005) «Expression of B7-H1 in Inflammatory Renal Tubular Epithelial Cells», Nephron. Exp. Nephrol. 102:e81-e92; de Haij, S. et al. (2005) «Renal Tubular Epithelial Cells Modulate T-Cell Responses Via ICOS-L And В7-Н1'' Kidney Int. 68:2091-2102; Mazanet, M.M. et al. (2002) «B7-H1 Is Expressed By Human Endothelial Cells And Suppresses T-Cell Cytokine Synthesis», J. Immunol. 169:3581-3588), миокарде (Brown, J.A. et al. (2003) «Blockade Of Programmed Death-1 Ligands On Dendritic Cells Enhances T-Cell Activation And Cytokine Production», J. Immunol. 170:1257-1266), синцитиотрофобластах (Petroff, M.G. et al. (2002) «57 Family Molecules: Novel Immunomodulators At The Maternal-Fetal Interface», Placenta 23:S95-S101). Молекулы также экспрессируются резидентными макрофагами некоторых тканей, макрофагами, которые были активированы интерфероном (ИФН)-γ или фактором некроза опухоли (ФНО)-α (Latchman, Y. et al. (2001) «PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation», Nat. Immunol 2:261-268), и в опухолях (Dong, H. (2003) «В7-Н1 Pathway And Its Role In The Evasion Of Tumor Immunity», J. Mol. Med. 81:281-287).
+
[00017] Было обнаружено, что взаимодействие PD-L1 и PD-1 посылает существенный отрицательный костимулирующий сигнал Т- и В-клеткам (Martin-Orozco, N. et al. (2007) «Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity», Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298) и выполняет функцию индуктора гибели клеток (Ishida, Y. et al. (1992) «Induced Expression Of PD-1, A Novel Member Of The Immunoglobulin Gene Superfamily, Upon Programmed Cell Death», EMBO J. 11:3887-3895; Subudhi, S.K. et al. (2005) «The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition», J. Molec. Med. 83:193-202). Более конкретно, было обнаружено, что взаимодействие рецептора PD-1 и лиганда PD-L1 в низких концентрациях приводит к передаче ингибирующего сигнала, который сильно ингибирует пролиферацию антигенспецифичных CD8 Т-клеток; при более высоких концентрациях взаимодействия с PD-1 не ингибируют пролиферацию Т-клеток, но значительно снижают выработку многих цитокинов (Sharpe, А.Н. et al. (2002) «The В7-CD28 Superfamily», Nature Rev. Immunol. 2:116-126). Было обнаружено, что пролиферация Т-клеток и выработка цитокинов покоящимися и ранее активированными CD4 и CD8 Т-клетками и даже наивными Т-клетками из пуповинной крови ингибируется растворимыми гибридными белками PD-L1-Fc (Freeman, G.J. et al. (2000) «Engagement Of The PD-1 Immunoinhibitory Receptor By A Novel B7 Family Member Leads To Negative Regulation Of Lymphocyte Activation», J. Exp. Med. 192:1-9; Latchman, Y. et al. (2001) «PD-L2 Is A Second Ligand For PD-1 And Inhibits T-Cell Activation», Nature Immunol. 2:261-268; Carter, L. et al. (2002) «PD-1:PD-L Inhibitory Pathway Affects Both CD4(+) and CD8(+) T-cells And Is Overcome By IL-2», Eur. J. Immunol. 32(3):634-643; Sharpe, A.H. et al. (2002) «The B7-CD28 Superfamily», Nature Rev. Immunol. 2:116-126).
[00018] Роль PD-L1 и PD-1 в ингибировании активации и пролиферации Т-клеток позволяет предположить, что указанные биологические молекулы могут служить терапевтическими мишенями для лечения воспаления и рака. В этой связи было предложено применение антител к PD-1 для лечения инфекций и опухолей, а также активирующей модуляции адаптивного иммунного ответа (см. публикации заявок на патент США 2010/0040614; 2010/0028330; 2004/0241745; 2008/0311117; 2009/0217401, патенты США №№7521051, 7563869, 7595048, РСТ публикации WO 2004/056875, WO 2008/083174). Антитела, способные специфично связываться с PD-1, были описаны Agata, Т. et al. (1996) «Expression Of The PD-1 Antigen On The Surface Of Stimulated Mouse T And В Lymphocytes», Int. Immunol. 8(5):765-772; и Berger, R. et al. (2008) «Phase I Safety And Pharmacokinetic Study Of CT-011, A Humanized Antibody Interacting With PD-1, In Patients With Advanced Hematologic Malignancies», Clin. Cancer Res. 14(10):3044-3051 (см. также патенты США №№8008449 и 8552154, публикации патентов США 2007/0166281, 2012/0114648, 2012/0114649, 2013/0017199, 2013/0230514 и 2014/0044738; и РСТ публикации WO 2003/099196; WO 2004/004771; WO 2004/056875; WO 2004/072286; WO 2006/121168; WO 2007/005874; WO 2008/083174; WO 2009/014708; WO 2009/073533; WO 2012/135408, WO 2012/145549; и WO 2013/014668).
С. В7-Н3-экспрессирующие виды рака
0th
[00019] B7-H3 гиперэкспрессируется в широком спектре видов рака и культивируемых раковых клетках, сходных со стволовыми. Как указано выше, гиперэкспрессия B7-H3 тесно связана с увеличением частоты рецидивов заболевания и неблагоприятным прогнозом. Однако B7-H3 является потенциальной мишенью для лекарственных препаратов, нацеленных к B7-H3, включая моноклональные антитела, которые нацелены к внеклеточному домену рецептора. Были описаны антитела и другие молекулы, которые специфично связываются с B7-H3 (см. патенты США №№8802901, 7527969, 7368554, 7358354 и 7279567, публикации заявок на патент США US 20090087416, US 20090022747, US 20090018315, US 2008116219 US20080081346, US 20050202536, US 20030103963, US 20020168762, РСТ публикации WO 2011/109400, WO 2008/116219, WO 2006/016276, WO 2004/093894, WO 04/001381, WO 2002/32375, WO 2002/10187 и WO 2001/094413; ЕР 1292619 B; Modak, S. et al. (March 1999) «Disialoganglioside GD2 And Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) And Rhabdomyosarcoma (RMS)», Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting, Vol. 40:474 (9 Annual Meeting Of The American Association For Cancer Research; Philadelphia, Pennsylvania, US; April 10-14, 1999; Modak, S. et al. (March 2000) «Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8Н9», Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 41:724; Modak, S. et al. (2001) «Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors», Cancer Res. 61(10):4048-4054; Steinberger, P. et al. (2004) «Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains», J. Immunol. 172(4):2352-2359; Xu, H. et al. (2009) «MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors», Cancer Res. 69(15):5275-6281).
[00020] Несмотря на эти достижения, остается необходимость в разработке улучшенных способов лечения видов рака, экспрессирующих B7-H3, и облегчения или индукции иммунного ответа на указанные виды рака. Несмотря на то, что адаптивная иммунная система может быть мощным защитным механизмом против рака и заболевания, зачастую ей препятствуют механизмы подавления иммунитета в микроокружении опухоли, такие как экспрессия коингибирующих молекул. Кроме того, коингибирующие молекулы, экспрессируемые опухолевыми клетками, иммунными клетками и стромальными клетками в опухолевой среде, могут преимущественно ослаблять ответы Т-клеток на раковые клетки. Следовательно, также существует потребность в новых комбинациях и схемах лечения, которые специфично распознают мишени на поверхности раковых клеток и которые могут тем самым опосредовать активацию Т-клеток, имитацию иммунного ответа и гибель раковых клеток, которые экспрессируют B7-H3. Целью настоящего изобретения является выявление указанных композиций и схем лечения.
Краткое описание изобретения:
[00021] Настоящее изобретение относится к комбинированной терапии, включающей введение субъекту первой молекулы, которая специфично связывается с В7-Н3 человека (т.е., В7-Н3-связывающей молекулы), и второй молекулы, которая специфично связывается с PD-1 человека (т.е., PD-1-связывающей молекулы), для лечения рака и воспаления. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат первую молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 человека, и вторую молекулу, которая специфично связывается с PD-1 человека, которые способны опосредовать, и более предпочтительно усиливать, активацию иммунной системы против раковых клеток, которые связаны с различными видами рака человека. Настоящее изобретение также относится к применению указанных фармацевтических композиций для лечения рака и других заболеваний.
[00022] В частности, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, молекулы, которая специфично связывается с B7-H3, и молекулы, которая специфично связывается с PD-1.
[00023] Настоящее изобретение, в частности, относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекула, которая специфично связывается с B7-H3, представляет собой антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающий фрагмент, и молекула, которая специфично связывается с PD-1, представляет собой антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[00024] Настоящее изобретение, в частности, относится к варианту реализации указанных способов, в которых антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающий фрагмент:
(a) конкурирует за связывание с B7-H3 с BRCA84D, BRCA69D, PRCA157 или с антителом к B7-H3, выбранным из таблицы 5; или
(b) содержит три определяющих комплементарность участка (CDR) тяжелой цепи и три CDR легкой цепи BRCA84D, H.BRCA84D (1.1), hBRCA84D (2.2), hBRCA84D-2, hBRCA69D (1.1), hBRCA (2.2) или три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела к B7-H3, выбранного из таблицы 5; или
(c) содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL) BRCA84D, hBRCA84D (1.1), hBRCA84D (2.2), hBRCA84D-2, hBRCA69D (1.1), hBRCA (2.2) или вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антитела к B7-H3, выбранного из таблицы 5.
[00025] Настоящее изобретение, в частности, относится к варианту реализации указанных способов, причем указанное антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент:
(а) конкурирует за связывание с PD-1 с ниволюмабом, пембролизумабом, пидилизумабом, мАТ к PD-1 3, мАТ к PD-1 5, мАТ к PD-1 6, мАТ к PD-1 7, мАТ к PD-1 8 или с антителом к PD-1, выбранным из таблицы 6; или
(b) содержит три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи ниволюмаба, пембролизумаба, пидилизумаба, мАТ к PD-1 3, мАТ к PD-1 5, мАТ к PD-1 6, мАТ к PD-1 7, мАТ к PD-1 8 или три CDR тяжелой цепи и три CDR легкой цепи антитела к PD-1, выбранного из таблицы 6; или
(c) содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи ниволюмаба, пембролизумаба, пидилизумаба, мАТ к PD-1 3, мАТ к PD-1 5, мАТ к PD-1 6, мАТ к PD-1 7, мАТ к PD-1 8 или вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи антитела к PD-1, выбранного из таблицы 6.
[00026] Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен Fc и/или антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит домен Fc. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариант домена Fc, содержащий одну, две, три, четыре, пять или более модификаций в домене Fc, которые усиливают ADCC. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых модификации домена Fc, которые усиливают ADCC, содержат любую одну, любые две, любые три, любые четыре или все пять замен L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (а) вариант домена Fc, содержащий по меньшей мере одну модификацию в домене Fc, которая снижает или устраняет активность ADCC; или (b) домен Fc IgG4. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых модификации домена Fc, которые снижают или устраняют ADCC, содержат замену L234A; L235A; или L234A и L235A, предпочтительно домена Fc IgG1.
[00027] Настоящее изобретение также относится к вариантам указанных способов, в которых антитело к B7-H3 представляет собой hBRCA84D-2 и антитело к PD-1 представляет собой ниволюмаб, пембролизумаб, пидилизумаб или мАТ к PD-1 6-ISQ. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых антитело к B7-H3 представляет собой hBRCA84D-2 и антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH и VL ниволюмаба, пембролизумаба, пидилизумаба, мАТ к PD-1 3, мАТ к PD-1 5, мАТ к PD-1 6, мАТ к PD-1 7, мАТ к PD-1 8 или антитела к PD-1, выбранного из таблицы 6.
[00028] Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 (в частности, антитело к B7-H3), вводят в дозе 1-15 мг/кг массы тела каждую неделю, и молекулу, которая специфично связывается с PD-1 (в частности, антитело к PD-1), вводят в фиксированной дозе 200 мг один раз каждые три недели. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 (в частности, антитело к B7-H3), вводят в дозе 1-15 мг/кг массы тела каждую неделю, и молекулу, которая специфично связывается с PD-1 (в частности, антитело к PD-1), вводят в дозе 1-10 мг/кг массы тела каждые две или три недели. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 (в частности, антитело к B7-H3), вводят в дозе, выбранной из 1 мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг массы тела каждую неделю, и молекулу, которая специфично связывается с PD-1 (в частности, антитело к PD-1), вводят в фиксированной дозе 200 мг каждые три недели. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 (в частности, антитело к B7-H3), вводят в дозе, выбранной из 1 мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг массы тела каждую неделю, и молекулу, которая специфично связывается с PD-1 (в частности, антитело к PD-1), вводят в дозке 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг массы тела каждые два или три недели. Настоящее изобретение, в частности, относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 (в частности, антитело к B7-H3), вводят в дозе 3 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг массы тела каждую неделю, и молекулу, которая специфично связывается с PD-1 (в частности, антитело к PD-1), вводят в дозе 2 мг/кг массы тела каждые три недели. Настоящее изобретение, в частности, относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 (в частности, антитело к B7-H3), вводят в дозе, выбранной из 3 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг массы тела каждую неделю, и молекулу, которая специфично связывается с PD-1 (в частности, антитело к PD-1), вводят в дозе 3 мг/кг массы тела каждые две недели. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 (в частности, антитело к B7-H3), и молекулу, которая специфично связывается с PD-1 (в частности, антитело к PD-1), вводят путем внутривенной (в/в) инфузии. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 (в частности, антитело к B7-H3), и молекулу, которая специфично связывается с PD-1 (в частности, антитело к PD-1), вводят с 48-часовым интервалом каждые две или три недели.
[00029] Настоящее изобретение, в частности, относится к вариантам реализации указанных способов, в которых рак представляет собой рак, экспрессирующий B7-H3. Настоящее изобретение также относится к вариантам реализации указанных способов, в которых рак представляет собой плоскоклеточный рак головы и шеи (SCCHN), рак мочевого пузыря, рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, глиобластому, рак почек, рак легких, меланому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак глотки, рак предстательной железы, почечноклеточную карциному, опухоль из мелких круглых синих клеток, нейробластому или рабдомиосаркому, в которых экспрессируется B7-H3.
[00030] Настоящее изобретение дополнительно относится к вариантам реализации указанных способов, дополнительно включающих этап введения третьего терапевтического агента, в частности, в которых третий терапевтический агент представляет собой антиангиогенный агент, противоопухолевый агент, химиотерапевтический агент или цитотоксический агент.
Подробное описание изобретения:
[00031] Настоящее изобретение относится к комбинированной терапии, включающей введение субъекту первой молекулы, которая специфично связывается с B7-H3 человека, и второй молекулы, которая специфично связывается с PD-1 человека, для лечения рака и/или воспаления. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат первую молекулу, которая специфично связывается с B7-H3 человека, и вторую молекулу, которая специфично связывается с PD-1 человека, которые способны опосредовать, и более предпочтительно усиливать, активацию иммунной системы против раковых клеток, которые связаны с любым из различных видов рака человека. Настоящее изобретение также относится к применению указанных фармацевтических композиций для лечения рака и других заболеваний у субъектов, получающих лечение.
А. Антитела
1. Антитела
2
[00032] «Антитела» представляют собой молекулы иммуноглобулинов, способные иммуноспецифично связываться с мишенью, такой как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д. («антиген»), при помощи по меньшей мере одного сайта распознавания эпитопов, расположенного в вариабельном домене молекулы иммуноглобулина. Следовательно, в то время как молекула-мишень представляет собой «антиген», часть антигена, которая распознается антителом и с которой связывается антитело, представляет собой «эпитоп». В настоящей заявке термин «антитело» включает не только интактные поликлональные или моноклональные антитела, антитела, содержащие фрагменты антител верблюдовых, одноцепочечные антитела и антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, анти-Id и анти-анти-Id антитела к антителам согласно настоящему изобретению), а также их мутированные варианты, природные варианты, гибридные белки, содержащие эпитопсвязывающий сайт требуемой иммунной специфичности, гуманизированные антитела и химерные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена требуемой иммунной специфичности. В настоящей заявке термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела представляет собой иммуноглобулин, аминокислотная последовательность которого содержит по меньшей мере один эпитопсвязывающий сайт антитела, специфичный в отношении указанного антигена. В настоящей заявке термин включает фрагменты (например, Fab, Fab', F(ab'), Fv), дисульфидсвязанные биспецифичные Fvs (sdFv), внутриклеточные антитела и одноцепочечные молекулы (например, scFv). В частности, антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные фрагменты молекул иммуноглобулинов, т.е., молекулы, которые содержат эпитопсвязывающий сайт. Молекулы иммуноглобулинов могут быть любого типа (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса.
[00033] Природные антитела (такие как антитела IgG) состоят из двух легких цепей, соединенных с двумя тяжелыми цепями. Каждая легкая цепь содержит вариабельный домен легкой цепи (VL) и константный домен легкой цепи (CL). Каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), три константных домена тяжелой цепи (CH1, СН2 и СН3), а также шарнирный домен, который расположен между доменами СН1 и СН2. Основной структурной единицей природных иммуноглобулинов (например, IgG), следовательно, является тетрамер, содержащий две легкие цепи и две тяжелые цепи, обычно экспрессированные в виде гликопротеина массой приблизительно 150000 Да. Амино-концевая часть каждой полипептидной цепи содержит вариабельный домен («V»), который содержит примерно от 100 до 110 или более аминокислот, и главным образом отвечает за распознавание антигена. Карбокси-концевая последовательность каждой полипептидной цепи определяет константную область цепи («С»). Следовательно, структура легких цепей молекулы IgG (в направлении от N-конца к С-концу) является следующей: VL-CL, и структура тяжелых цепей IgG (в направлении от N-конца к С-концу) является следующей: VH-CH1-шарнирная область-СН2-CH3.
L
L
L
L
L
L
L
H
H
H
H
H
H
H
L
L
L
H
H
H
L
L
L
H
H
H
[00034] Способность интактного немодифицированного антитела (например, антитела IgG) связываться с эпитопом антигена зависит от наличия вариабельных доменах в легких и тяжелых цепях иммуноглобулина (т.е. области VL и области VH, соответственно). Взаимодействие легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела и, в частности, взаимодействие их областей VL и VH образует один из эпитопсвязывающих сайтов антитела. Вариабельные домены молекулы IgG состоят из определяющих комплементарность участков (CDR), которые содержат остатки, вступающие в контакт с эпитопом, и сегменты, не относящиеся к CDR, называемые каркасными сегментами (FR), которые в целом поддерживают структуру и определяют расположение петель CDR, чтобы обеспечить такой контакт (хотя некоторые остатки каркасных участков также могут вступать в контакт с антигеном). Следовательно, области VL имеют структуру (в направлении от N-конца к С-концу): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, и области VH имеют структуру (в направлении от N-конца к С-концу): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Полипептиды, которые представляют собой (или могут выполнять их функции) первый, второй и третий CDR легкой цепи антитела обозначены, соответственно, домен CDR1, домен CDR2 и домен CDR3. Аналогичным образом, полипептиды, которые представляют собой (или могут выполнять их функции) первый, второй и третий CDR тяжелой цепи антитела, обозначены, соответственно, домен CDR1, домен CDR2 и домен CDR3. Следовательно, термины домен CDR1, домен CDR2, домен CDR3, домен CDR1, домен CDR2 и домен CDR3 относятся к полипептидам, которые при включении в белок, придают указанному белку способность связываться с определенным эпитопом независимо от того, является ли такой белок антителом, содержащим легкие и тяжелые цепи, или одноцепочечной связывающей молекулой (например, scFv, BiTe и т.д.), или представляет собой другой тип белка. В отличие от указанных антител конструкция scFv содержит области VL и VH антитела, которые являются частью одной полипептидной цепи, причем указанные области разделены гибким линкером достаточной длины, чтобы обеспечить самосборку двух областей в функциональный эпитопсвязывающий сайт. Если самосборка областей VL и VH становится невозможной из-за линкера, имеющего недостаточную длину (менее 12 остатков аминокислот), две конструкции scFv могут взаимодействовать друг с другом с образованием двухвалентной молекулы, в которой VL одной цепи связывается с VH другой цепи (рассматривается в Marvin et al. (2005) «Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies», Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).
[00035] Было показано, что, помимо известных способов применения в диагностике, антитела можно использовать в качестве терапевтических агентов. В последние несколько десятилетий наблюдается возрождение интереса к терапевтическому потенциалу антител, и антитела стали одним из ведущих классов биотехнологических препаратов (Chan, С.Е. et al. (2009) «The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases», Singapore Med. J. 50(7):663-666). Почти 200 лекарственных препаратов на основе антител были одобрены для применения или находятся на этапе разработки.
2
[00036] Термин «моноклональное антитело» относится к гомогенной популяции антител, причем моноклональное антитело состоит из аминокислот (природных и неприродных), которые участвуют в селективном связывании антигена. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены к одному эпитопу (или антигенному сайту). Термин «моноклональное антитело» включает не только интактное моноклональное антитело и полноразмерное моноклональное антитело, а также их фрагмент (такой как Fab, Fab', F(ab') Fv), одноцепочечный фрагмент (scFv), их мутированный вариант, гибридный белок, содержащий часть антитела, гуманизированное моноклональное антитело, химерное моноклональное антитело и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена, обладающий требуемой иммунной специфичностью и способностью связываться с эпитопом. Термин не являются ограничивающим в отношении источника антитела или способа его получения (например, с помощью гибридомы, отбора фага, рекомбинантной экспрессии, трансгенных животных и т.д.). Термин включает полноразмерные иммуноглобулины, а также фрагменты и т.д., описанные выше под определением «антитело». Способы получения моноклональных антител известны в данной области техники. Одним из способов, которые могут быть использованы, является способ, описанный Kohler, G. et al. (1975) «Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity», Nature 256:495-497, или его модификация. Как правило, моноклональные антитела вырабатываются у мышей, крыс или кроликов. Антитела получают путем иммунизации животного иммуногенным количеством клеток, клеточных экстрактов или белковых препаратов, которые содержат желательный эпитоп. Иммуноген может представлять собой, но не ограничивается ими, первичные клетки, культивируемые линии клеток, раковые клетки, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или ткань. Клетки, используемые для иммунизации, можно культивировать в течение определенного периода времени (например, по меньшей мере 24 часов) до их использования в качестве иммуногена. Клетки могут быть использованы в качестве иммуногенов сами по себе или в комбинации с неденатурирующим адъювантом, таким как Ribi (см., например, Jennings, V.M. (1995) «Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production», ILAR J. 37(3): 119-125).
[00037] В целом клетки должны поддерживаться в интактном состоянии и предпочтительно жизнеспособном состоянии при использовании в качестве иммуногенов. Интактные клетки могут обеспечить более эффективное детектирование антигенов, чем поврежденные клетки, иммунизированным животным. Использование денатурации или жестких адъювантов, например, адъюванта Фрейда, может привести к повреждению клеток и, следовательно, не рекомендуется. Иммуноген можно вводить несколько раз с периодическими интервалами, такими как один раз в две недели или еженедельно, или можно вводить так, чтобы поддерживать жизнеспособность животного (например, в тканевом рекомбинанте). В другом варианте, существующие моноклональные антитела и любые другие эквивалентные антитела, которые являются иммуноспецифичными для желательного патогенного эпитопа, могут быть секвенированы и получены с использованием любых рекомбинантных способов, известных в данной области техники. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения подходящее антитело секвенируют, и полинуклеотидную последовательность затем клонируют в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующую представляющее интерес антитело, можно поддерживать в векторе в клетке-хозяине, и затем клетка-хозяин может быть размножена и заморожена для последующего использования. Полинуклеотидную последовательность указанных антител можно использовать для генетической манипуляции, чтобы получить химерное антитело, гуманизированное антитело или антитело, содержащее фрагменты антител собачьих, или для улучшения аффинности или других характеристик антитела. Термин «гуманизированное» антитело относится к химерной молекуле, обычно полученной с использованием рекомбинантных методик, содержащей антигенсвязывающий сайт, полученный из иммуноглобулина из вида, отличного от человека, и оставшуюся структуру молекулы иммуноглобулина, основанную на структуре и/или последовательности иммуноглобулина человека. Полинуклеотидная последовательность вариабельных доменов указанных антител может быть использована для генетической манипуляции, чтобы получить указанные производные и улучшить аффинность или другие характеристики указанных антител. Общий принцип гуманизации антитела включает сохранение основной последовательности антигенсвязывающей части антитела и замену оставшейся части антитела из вида, отличного от человека, последовательностями антител человека. Существуют четыре общих этапа гуманизации моноклонального антитела. Указанные этапы включают: (1) определение нуклеотидной и предсказанной аминокислотной последовательности исходных вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антитела, (2) дизайн гуманизированного антитела или антитела, содержащего фрагменты антител собачьих, т.е. принимается решение о том, какой каркасный участок антитела будет использован во время процесса гуманизации или включения фрагментов антител собачьих, (3) фактические методологии/методики гуманизации или включения фрагментов антител собачьих, и (4) трансфекцию и экспрессию гуманизированного антитела. См., например, патенты США №№4816567; 5807715; 5866692; и 6331415.
[00038] Эпитопсвязывающий сайт указанных антител может содержать полные вариабельные домены, гибридизованные с константными доменами, или только определяющие комплементарность участки (CDR), привитые на соответствующие каркасные участки в вариабельных доменах. Антигенсвязывающие сайты могут быть дикого типа или могут быть модифицированы одной или более заменами аминокислот. Это исключает константную область в качестве иммуногена у человека, однако сохраняется возможность иммунного ответа на чужеродную вариабельную область (LoBuglio, A.F. et al. (1989) «Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224). Другой подход сосредоточен не только на обеспечении константных областей человеческого происхождения, но и на модификации вариабельных областей, чтобы как можно более точно изменить их на форму у человека. Известно, что вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат три определяющих комплементарность участка (CDR), которые изменяются в зависимости от рассматриваемых антигенов и определяют способность к связыванию, фланкированных четырьмя каркасными участками (FR), которые являются относительно консервативными у данного вида и которые предположительно обеспечивают каркас для CDR. При получении антител из вида, отличного от человека, по отношению к определенному антигену, вариабельные области могут быть «преобразованы» или «гуманизированы» путем прививки CDR, полученных из антител из видов, отличных от человека, на FR, присутствующие в антителе человека, подлежащем модификации. Применение упомянутого подхода к различным антителам было описано в Sato, K. et al. (1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies for Therapy», Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity», Science 239:1534-1536; Kettleborough, C.A. et al. (1991) «Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation», Protein Engineering 4:773-3783; Maeda, H. et al. (1991) «Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity», Human Antibodies Hybridoma 2:124-134; Gorman, S. D. et al. (1991) «Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest, P.R. et al. (1991) «Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo», Bio/Technology 9:266-271; Co, M. S. et al. (1991) «Humanized Antibodies For Antiviral Therapy», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter, P. et al. (1992) «Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy», Proc.
Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; и Co, M.S. et al. (1992) «Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen», J. Immunol. 148:1149-1154. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гуманизированные антитела сохраняют все последовательности CDR (например, гуманизированное мышиное антитело, которое содержит все шесть CDR из мышиных антител). Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гуманизированные антитела содержат один или более CDR (один, два, три, четыре, пять или шесть), последовательности которых отличаются в сравнении с исходным антителом.
[00039] Был описан ряд молекул «гуманизированных» антител, содержащих антигенсвязывающий сайт, полученный из иммуноглобулина из вида, отличного от человека, включая химерные антитела, содержащие вариабельную область грызуна или модифицированную вариабельную область грызуна, и связанные с ними опрееляющие комплементарность участки (CDR), гибридизованные с константными доменами человека (см., например, Winter et al. (1991) «Man-made Antibodies», Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) «Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. (1987) «Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen», J. Immunol. 138:4534-4538, и Brown et al. (1987) «Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody», Cancer Res. 47:3577-3583). В других ссылках описаны CDR грызунов, привитые в поддерживающий каркасный участок человека (FR) перед гибридизацией с соответствующим константным доменом человека (см., например, Riechmann, L. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies for Therapy», Nature 332:323-327; Verhoeyen, M. et al. (1988) «Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity», Science 239:1534-1536; и Jones et al. (1986) «Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse», Nature 321:522-525). В другой ссылке описаны CDR грызунов, поддерживаемые каркасными участками грызунов после рекомбинации поверхностных остатков. См., например, публикацию европейского патента №519596. Указанные «гуманизированные» молекулы предназначены для минимизации нежелательного иммунологического ответа на молекулы антител грызунов к белкам человека, что ограничивает продолжительность и эффективность терапевтического применения указанных фрагментов у людей, получающих лечение. Другие способы гуманизации антител, которые также могут быть использованы, раскрыты в Daugherty et al. (1991) «Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins», Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 и в патентах США №№6180377; 6054297; 5997867; и 5866692.
2. Биспецифичные антитела
[00040] Природные антитела способны связываться только с одним видом эпитопов (т.е. они являются «моноспецифичными»), хотя они могут связываться с несколькими копиями указанного вида эпитопа (т.е. могут проявлять бивалентность или поливалентность). Функциональность антител может быть повышена путем получения полиспецифичных молекул на основе антител, которые могут одновременно связываться с двумя отдельными и разными антигенами (или различными эпитопами одного и того же антигена) и/или путем получения молекулы на основе антитела, имеющей более высокую валентность (т.е. более двух сайтов связывания) в отношении одного и того же эпитопа и/или антигена.
[00041] Был разработан широкий спектр форматов рекомбинантных биспецифичных и триспецифичных антител (см., например, патенты США №№8277806, 6994853, 6551592 и 6171586; публикации патентов США 2010-0291112 и 2008-0057054; РСТ публикации WO 2013/070565, WO 2012/156430, WO 2012/009544, WO 2009/132876, WO 2009/018386, WO 2008/003116, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2006/072152, WO 2002/020039, WO 2000/018806, WO 1999/042597, WO 1998/003670), в большинстве из которых используют линкерные пептиды, чтобы гибридизовать дополнительный эпитопсвязывающий сайт (например, scFv, VL, VH и т.д.) с центральной частью антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) или в ее пределах, или гибридизовать несколько эпитопсвязывающих фрагментов (например, два фрагмента Fab или scFv) друг с другом. В альтернативных форматах используют линкерные пептиды для гибридизации эпитопсвязывающего сайта (например, scFv, VL, VH и т.д.) с доменом димеризации, таким как домен СН2-CH3, или альтернативными полипептидами (WO 2005/070966, WO 2006/107786А WO 2006/107617А, WO 2007/046893). В РСТ публикациях WO 2013/174873, WO 2011/133886 и WO 2010/136172 описаны триспецифичные антитела, в которых домены CL и СН1 передвинуты с их соответствующих природных положений, и домены VL и VH были диверсифицированы (WO 2008/027236, WO 2010/108127) для придания им способности связываться более чем с одним антигеном. В РСТ публикациях WO 2013/163427 и WO 2013/119903 раскрыты модификации домена СН2 для включения аддукта гибридного белка, содержащего связывающий домен. В РСТ публикациях WO 2010/028797, WO 2010028796 и WO 2010/028795 раскрыты рекомбинантные антитела, домены Fc которых были заменены дополнительными доменами VL и VH так, чтобы получить трехвалентные связывающие молекулы. В РСТ публикации WO 2013/006544 раскрыты поливалентные молекулы Fab, которые синтезируют как одну полипептидную цепь и затем подвергают протеолизу с образованием гетеродимерных структур. В РСТ публикациях WO 2014/022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 и WO 1991/003493 раскрыты способы добавления дополнительных связывающих доменов или функциональных групп к антителу или части антитела (например, добавление дополнительных доменов VL и VH к легким и тяжелым цепям антитела, или добавление гетерологичного гибридного белка, или обмен нескольких доменов Fab друг на друга). В патенте США №7695936 и публикации патента США 2007/0196363 описаны биспецифичные антитела, которые образованы из тяжелых цепей двух антител, одно из которых имеет выступ, введенный в его тяжелую цепь, и второе из которых содержит комплементарную впадину, введенную в его тяжелую цепь. Присутствие таких комплементарных «выступов» и «впадин», как полагают, преимущественно приводит к образованию биспецифичных гетероантител (содержащих одну тяжелую цепь из каждого такого антитела), в сравнении с моноспецифичными гомоантителами, которые содержат две тяжелые цепи из одного и того же антитела.
3. Предпочтительные домены Fc
[00042] Домены СН2 и CH3 двух тяжелых цепей взаимодействуют с образованием домена Fc, которая представляет собой домен, распознаваемый клеточными рецепторами Fc (FcγR). В настоящей заявке термин «домен Fc» используется для определения C-концевой области тяжелой цепи IgG. Аминокислотная последовательность домена СН2-CH3 примерного IgG1 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 1):
пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в работе Кабат, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.
[00043] Аминокислотная последовательность домена СН2-CH3 примерного IgG2 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 2):
пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в работе Кабат, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.
[00044] Аминокислотная последовательность домена СН2-CH3 примерного IgG3 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 3):
пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в работе Кабат, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.
[00045] Аминокислотная последовательность домена СН2-CH3 примерного IgG4 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 4):
пронумерованную с использованием индекса ЕС, как изложено в работе Кабат, где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.
th
[00046] В настоящем описании нумерация остатков в константной области тяжелой цепи IgG соответствует индексу ЕС, как изложено в работе Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) («Кабат»), включенной в явной форме в настоящую заявку посредством ссылки. Термин «индекс ЕС, как изложено в работе Кабат» относится к нумерации в соответствии с системой ЕС антитела IgG1 человека. Аминокислоты из вариабельных областей зрелых тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов обозначены в соответствии с положением аминокислоты в цепи. В работе Kabat et al. описаны многочисленные аминокислотные последовательности для антител, идентифицирована аминокислотная консенсусная последовательность для каждой подгруппы и каждой аминокислоте присвоен номер остатка. Схема нумерации Кабат может быть расширена на антитела, не включенные в его сборник, путем сопоставления рассматриваемого антитела с одной из консенсусных последовательностей в Кабат по отношению к консервативным аминокислотам. Этот способ присвоения номеров остатков стал стандартным в данной области техники и позволяет легко идентифицировать аминокислоты в эквивалентных положениях в разных антителах, включая химерные или гуманизированные варианты. Например, аминокислота в положении 50 легкой цепи антитела человека занимает положение, эквивалентное таковому для аминокислоты в положении 50 легкой цепи мышиного антитела.
[00047] Несмотря на то, что границы могут незначительно отличаться, домен СН2 домена Fc из IgG человека обычно располагается от аминокислоты 231 до аминокислоты 341 IgG человека в соответствии с системой нумерации ЕС, описанной Кабат. Домен CH3 IgG человека обычно располагается от аминокислоты 342 до аминокислоты 447 в соответствии с системой нумерации ЕС, описанной в Кабат. «Шарнирная область» или «шарнирный домен» обычно определяется как участок от Glu216 до Pro230 IgG1 человека.
[00048] Полиморфизмы наблюдали в ряде различных положений в константных областях антитела (например, в положениях Fc, включая, но не ограничиваясь ими, положения 270, 272, 312, 315, 356 и 358, в соответствии с системой нумерации ЕС, изложенной в Кабат), и, соответственно, могут существовать небольшие различия между представленной последовательностью и последовательностями, известными из предшествующего уровня техники. Хорошо известны полиморфные формы иммуноглобулинов человека. В настоящее время известно 18 GM-аллотипов: G1m (1, 2, 3, 17) или G1m (а, х, f, z), G2m (23) или G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) или G3m (b1, с3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., «The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, Function And Regulation». Pergamon, Oxford, pp. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). В настоящем изобретении конкретно предусмотрено, что антитела, которые можно применять в способах согласно настоящему изобретению, могут включать любой аллотип, изоаллотип или гаплотип любого гена иммуноглобулина и не ограничены аллотипом, изоаллотипом или гаплотипом последовательностей согласно настоящему изобретению. Помимо этого в некоторых системах экспрессии C-концевой остаток аминокислоты (выделенный жирным шрифтом) домена CH3 может быть удален после трансляции. Соответственно, C-концевой остаток домена CH3 является необязательным аминокислотным остатком в В7-Н3-связывающих молекулах и PD-1-связывающих молекулах согласно настоящему изобретению. В область настоящего изобретения конкретно включены связывающие молекулы, лишенные C-концевого остатка домена CH3. В область настоящего изобретения также конкретно включены связывающие молекулы, содержащие C-концевой остаток лизина домена CH3.
[00049] В случае их присутствия, домен СН1 и/или шарнирная область могут быть любого изотипа (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), но предпочтительно их изотип аналогичен таковому желательного домена Fc.
[00050] Аминокислотная последовательность примерного домена CH1 IgG1 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 8):
[00051] Аминокислотная последовательность примерного домена CH1 IgG2 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 60):
[00052] Аминокислотная последовательность примерного домена CH1 IgG4 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 61):
[00053] Аминокислотная последовательность домена CH1 IgG4 и стабилизированной шарнирной области представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 16).
[00054] Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области IgG1 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 10):
[00055] Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области IgG2 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 62):
[00056] Аминокислотная последовательность примерной шарнирной области IgG4 человека представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 11):
3
2+
[00057] Активирующие и ингибирующие сигналы передаются через рецепторы Fc-гамма (FcγR) после их лигирования с доменом Fc. Упомянутые диаметрально противоположные функции обусловлены структурными различиями между различными изоформами рецептора. Два различных домена в цитоплазматических сигнальных доменах рецептора, называемые иммунорецепторными тирозиновыми активирующими мотивами (ITAM) и иммунорецепторными тирозиновыми ингибирующими мотивами (ITIM), являются причиной различных ответов. Привлечение различных цитоплазматических ферментов к этим структурам обуславливает результат опосредованных FcγR клеточных ответов. ITAM-содержащие комплексы FcγR включают FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, тогда как ITIM-содержащие комплексы включают только FcγRIIB. Нейтрофилы человека экспрессируют ген FcγRIIA. Кластеризация FcγRIIA посредством иммунных комплексов или специфичной сшивки антител служит для агрегации ITAM вместе с рецептор-ассоциированными киназами, которые способствуют фосфорилированию ITAM. Фосфорилирование ITAM служит местом стыковки для Syk-киназы, активация которой приводит к активации последующих субстратов (например, PIK). Клеточная активация приводит к высвобождению провоспалительных медиаторов. Ген FcγRIIB экспрессируется в В-лимфоцитах; внеклеточный домен FcγRIIB на 96% идентичен FcγRIIA и связывается с комплексами IgG аналогичным образом. Присутствие ITIM в цитоплазматическом домене FcγRIIB определяет данный ингибирующий подкласс FcγR. Недавно была установлена молекулярная основа такого ингибирования. При совместном лигировании с активирующим FcγR ITIM в FcγRIIB становится фосфорилированным и притягивает домен SH2 инозитолполифосфат-5'-фосфатазы (SHIP), который гидролизует фосфоинозитные мессинджеры, которые высвобождаются в результате активации тирозинкиназы, опосредованной ITAM-содержащим FcγR, что впоследствии ведет к предотвращению притока внутриклеточного Са. Соответственно, сшивка FcγRIIB ослабляет активирующий ответ на лигирование FcγR и ингибирует клеточную восприимчивость. Как следствие, предотвращается активация В-клеток, пролиферация В-клеток и секреция антител. Помимо этого взаимодействие с неонатальным рецептором Fc (FcRn) опосредует рециклирование молекул IgG из эндосомы к поверхности клетки и высвобождение в кровь.
[00058] Модификация домена Fc обычно приводит к измененному фенотипу, например, измененному периоду полувыведения из сыворотки крови, измененной стабильности, измененной восприимчивости к клеточным ферментам или измененной эффекторной функции. Желательной может быть модификация домена Fc В7-Н3-связывающих молекул и/или PD-1-связывающих молекул (например, антител к B7-H3 и антител к PD-1) для применения в способах согласно настоящему изобретению в отношении эффекторной функции, чтобы повысить эффективность антитела, например, в лечении рака. Снижение или устранение эффекторной функции является желательным в некоторых случаях, например, в случае антител, механизм действия которых включает блокирование или антагонистическое действие, но не уничтожение клеток, несущих антиген-мишень. Увеличение эффекторной функции, как правило, является желательным, если она направлена на нежелательные клетки, такие как клетки опухоли и чужеродные клетки, в которых FcγR экспрессируются с низкими уровнями, например, опухолеспецифичные В-клетки с низким уровнем FcγRIIB (например, неходжкинская лимфома, ХЛЛ и лимфома Беркитта).
[00059] Домен Fc В7-Н3-связывающих молекул и/или PD-1-связывающих молекул (например, антител к B7-H3 и антител к PD-1) для применения в способах согласно настоящему изобретению может представлять собой полный домен Fc (например, полный домен Fc IgG) или только фрагмент полного домена Fc. Следовательно, домен Fc молекул, которые можно применять в способах согласно настоящему изобретению, которые содержат указанную область, может содержать некоторые или все домены СН2 и/или некоторые или все домены CH3 полного домена Fc, или может содержать вариант последовательности СН2 и/или вариант последовательности CH3 (который может содержать, например, одну или более вставок и/или одну или более делеций по отношению к доменам СН2 или CH3 полного домена Fc). Указанные домены Fc могут содержать участки полипептида, отличные от домена Fc, или могут содержать части доменов Fc, которые в природных условиях не являются полными, или могут содержать неприродные ориентации доменов СН2 и/или CH3 (такие как, например, два домена СН2 или два домена CH3, или, в направлении от N-конца к С-концу, домен CH3, соединенный с доменом СН2, и т.д.). Несмотря на то, что домен Fc В7-Н3-связывающих молекул и/или PD-1-связывающих молекул может обладать способностью связываться с одним или более рецепторами Fc (например, FcγR), более предпочтительно указанный домен Fc вызовет изменение параметров связывания с FcγRIA (CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB (CD32B), FcγRIIIA (CD16a) или FcγRIIIB (CD16b) (относительно связывания, проявляемого областью Fc дикого типа) или существенно устраняет способность указанного домена Fc связываться с одним или более FcγR (например, ингибирующим рецептором (рецепторами».
[00060] Согласно некоторым вариантам реализации молекулы для применения в способах согласно настоящему изобретению могут содержать вариант домена Fc, имеющий измененную аффинность в отношении активирующего и/или ингибирующего рецептора Fcγ. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения молекулы содержат вариант домена Fc, который имеет повышенную аффинность в отношении FcγRIIB и уменьшенную аффинность в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей домен Fc дикого типа. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения молекулы для применения в способах согласно настоящему изобретению содержат вариант домена Fc, который имеет уменьшенную аффинность в отношении FcγRIIB и повышенную аффинность в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей домен Fc дикого типа. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения молекулы для применения в способах согласно настоящему изобретению содержат вариант домена Fc, который имеет уменьшенную аффинность в отношении FcγRIIB и уменьшенную аффинность в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей домен Fc дикого типа. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения молекулы для применения в способах согласно настоящему изобретению содержат вариант домена Fc, который имеет неизмененную аффинность в отношении FcγRIIB и уменьшенную (или увеличенную) аффинность в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA по сравнению с сопоставимой молекулой, содержащей домен Fc дикого типа.
[00061] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения молекулы для применения в способах согласно настоящему изобретению содержат вариант домена Fc, имеющий измененную аффинность в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA так, что иммуноглобулин обладает повышенной эффекторной функцией. Неограничивающие примеры функций эффекторных клеток включают антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность, антитело-зависимый фагоцитоз, фагоцитоз, опсонизацию, опсонофагоцитоз, связывание клеток, образование розеток из клеток, связывание C1q и комплемент-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность.
[00062] Варианты домена Fc хорошо известны в данной области техники, и любой известный вариант домена Fc может быть использован в настоящем изобретении для придания или модификации эффекторной функции, проявляемой молекулой согласно настоящему изобретению, содержащей домен Fc (или его часть), в соответствии с данными функциональных исследований, например, в NK-зависимом или зависимом от макрофагов количественном исследований. Например, варианты домена Fc, идентифицированные как варианты, изменяющие эффекторную функцию, раскрыты в РСТ публикациях WO 04/063351; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 06/113665; WO 07/021841; WO 07/106707; и WO 2008/140603, и любой подходящий вариант, раскрытый в указанных публикациях, можно применять в молекулах согласно настоящему изобретению.
[00063] В таблице 4 приведены примеры одиночных, двойных, тройных, четырехкратных и пятикратных мутаций домена Fc.
[00064] Особенно предпочтительные варианты содержат одну или более модификаций, выбранных из групп A-AI:
[00065] Еще более предпочтительные варианты содержат одну или более модификаций, выбранных из групп 1-105:
[00066] Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации в область настоящего изобретения включены молекулы, связывающие B7-H3, которые содержат вариант домена Fc, причем указанный вариант придает или имеет повышенную активность ADCC и/или повышенное связывание с FcγRIIIA (CD16A), а также может иметь сниженное связывание с FcγRIIB (CD32B). Примерные варианты доменов Fc IgG1 человека с повышенным связыванием с CD16A, которые дополнительно могут иметь сниженное связывание с CD32B, содержат замены L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I или P296L. Предпочтительные В7-Н3-связывающие молекулы содержат варианты доменов Fc IgG1, которые содержат любую 1, 2, 3, 4, 5 или 6 из замен: L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L. Указанные замены аминокислот могут присутствовать в домене Fc IgG1 человека в любой комбинации.
[00067] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающая молекула будет содержать вариант домена Fc, содержащий по меньшей мере одну модификацию в домене Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант домена Fc содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L235V, F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L.
[00068] Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения вариант домена Fc содержит:
(A) по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L;
(B) по меньшей мере две замены, выбранные из группы, состоящей из:
(1) F243L и P396L;
(2) F243L и R292P; и
(3) R292P и V305I;
(C) по меньшей мере три замены, выбранные из группы, состоящей из:
(1) F243L, R292P и Y300L;
(2) F243L, R292P и V305I;
(3) F243L, R292P и P396L; и
(4) R292P, V305I и P396L;
(D) по меньшей мере четыре замены, выбранные из группы, состоящей из:
(1) F243L, R292P, Y300L и P396L; и
(2) F243L, R292P, V305I и P396L; или
(E) по меньшей мере пять замен, выбранных из группы, состоящей из:
(1) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L; и
(2) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L.
[00069] Согласно другому конкретному варианту реализации настоящего изобретения вариант домена Fc содержит замены:
(A) F243L, R292P и Y300L;
(B) L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L; или
(C) F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L.
[00070] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула содержит вариант домена Fc, причем указанный вариант придает или имеет уменьшенное (или по существу отсутствующее) связывание с FcγRIIIA (CD 16а), по отношению к связыванию, которое проявляет домен Fc дикого типа (SEQ ID NO: 1)).
[00071] Примерные варианты доменов Fc IgG1 человека со сниженным связыванием с FcγR содержат замены L234A, L235A, D265A, N297A или N297Q. Предпочтительные PD-1-связывающие молекулы содержат варианты доменов Fc IgG1, которые содержат любую 1, 2, 3, 4 или все 5 из замен: L234A, L235A, D265A, N297A и N297Q. Указанные замены аминокислот могут присутствовать в домене Fc IgG1 человека в любой комбинации.
[00072] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула будет содержать вариант домена Fc, содержащий по меньшей мере одну модификацию в домене Fc. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вариант домена Fc содержит по меньшей мере одну замену, выбранную из группы, состоящей из L234A, L235A, D265A и N297Q. Поскольку замены L234A, L235A, D265A, N297A и N297Q устраняют эффекторную функцию, в тех случаях, когда эффекторная функция является желательной, указанные замены предпочтительно не будут применяться.
[00073] Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения вариант домена Fc содержит замены:
(A) L234A, L235A;
(B) D265A;
(D) N297A; или
(C) N297Q.
[00074] Предпочтительная последовательность IgG1 для доменов СН2 и CH3 PD-1-связывающих молекул для применения в способах согласно настоящему изобретению будет содержать замены L234A/L235A (SEQ ID NO: 5):
где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.
[00075] Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации домен СН2-CH3 PD-1-связывающей молекулы, содержащей домен Fc, для применения в способах согласно настоящему изобретению, может представлять собой домен, который исходно проявляет уменьшенное (или по существу отсутствующее) связывание с FcγRIIIA (CD 16а) и/или сниженную эффекторную функцию (относительно связывания, проявляемого доменом Fc IgG1 дикого типа (SEQ ID NO: 1)). Например, домен СН2-CH3 PD-1-связывающей молекулы, содержащей домен Fc, для применения в способах согласно настоящему изобретению, может представлять собой домен Fc IgG2 или домен Fc IgG4.
[00076] Согласно предпочтительному варианту реализации PD-1-связывающая молекула для применения в способах согласно настоящему изобретению содержит домен Fc IgG4. В случае применения домена Fc IgG4, в область настоящего изобретения также включено введение стабилизирующей мутации шарнирной области, такой как S228P (например,  (SEQ ID NO: 12)), согласно нумерации с использованием индекса ЕС, как изложено в Кабат (Lu et al., (2008) «The Effect Of A Point Mutation On The Stability Of Igg4 As Monitored By Analytical Ultracentrifugation», J. Pharm. Sci. 97:960-969), чтобы снизить частоту обмена нитей. В домен Fc IgG4 могут быть введены другие стабилизирующие мутации, известные в данной области техники (Peters, Р et al., (2012) «Engineering an Improved IgG4 Molecule with Reduced Disulfide Bond Heterogeneity and Increased Fab Domain Thermal Stability», J. Biol. Chem., 287:24525-24533; РСТ публикация патента WO 2008/145142). Помимо этого, как отмечено выше, домен СН1 и/или шарнирная область, в случае их присутствия, предпочтительно имеют тот же изотип, что и желательный домен Fc. Соответственно, в указанных вариантах реализации PD-1-связывающая молекула (например, антитело) будет содержать CH1 IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 9), стабилизированную шарнирный домен IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 12) и домены CH2-CH3 IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 4).
[00077] Период полувыведения из сыворотки крови белков, содержащих домены Fc, может быть увеличен за счет увеличения аффинности связывания домена Fc в отношении FcRn. В настоящей заявке термин «период полувыведения» означает фармакокинетическое свойство молекулы, которое является мерой среднего времени существования молекул после их введения. Период полувыведения может быть выражен как время, необходимое для выведения пятидесяти процентов (50%) известного количества молекулы из организма субъекта (например, пациента-человека или другого млекопитающего) или конкретного компартмента его организма, например, при измерении в сыворотке крови, т.е., период полувыведения из кровотока, или в других тканях. В целом, увеличение периода полувыведения приводит к увеличению среднего времени удержания (MRT) в кровотоке для введенной молекулы.
[00078] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающие молекулы и/или PD-1-связывающие молекулы для применения в способах согласно настоящему изобретению содержат вариант домена Fc, причем указанный вариант домена Fc содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты, по сравнению с доменом Fc дикого типа, так, что указанная молекула имеет увеличенный период полувыведения (по сравнению с доменом Fc дикого типа).
[00079] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающие молекулы и/или PD-1-связывающие молекулы для применения в способах согласно настоящему изобретению содержат вариант домена Fc, причем указанный вариант домена Fc содержит замену аминокислоты, которая увеличивает период полувыведения, в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435 и 436. Многочисленные специфичные мутации, способные увеличивать период полувыведения молекулы, содержащей домен Fc, известны в данной области техники и включают, например, M252Y, S254T, Т256Е и их комбинации. Например, см. мутации, описанные в патентах США №№6277375, 7083784; 7217797, 8088376; публикациях заявок на патент США 2002/0147311; 2007/0148164; и международных публикациях WO 98/23289; WO 2009/058492; и WO 2010/033279, которые полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. Молекулы, содержащие домен Fc, с увеличенным периодом полувыведения также включают те, которые содержат замены в двух или более остатках домена Fc 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 и 436. В частности, указанные молекулы содержат две или более замен, выбранных из: T250Q, M252Y, S254T, Т256Е, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, Н435К, Y436I.
[00080] Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения вариант домена Fc содержит замены:
(A) M252Y, S254T и Т256Е;
(B) M252Y и S254T;
(C) M252Y и Т256Е;
(D) T250Q и M428L;
(E) T307Q и N434A;
(F) A378V и N434A;
(G) N434A и Y436I;
(H) V308P и N434A; или
(I) K288D и H435K.
[00081] В область настоящего изобретения также включены варианты домена Fc, содержащие:
(A) одну или более мутаций, которые изменяют эффекторную функцию и/или FcγR; и
(B) одну или более мутаций, которые увеличивают период полувыведения из сыворотки.
[00082] Два домена СН2 и/или два домена CH3 из доменов СН2-CH3 двух взаимодействующих полипептидных цепей, содержащих домен Fc, из В7-Н3-связывающих молекул и/или PD-1-связывающей молекулы для применения в способах согласно настоящему изобретению не обязательно должны иметь одинаковые последовательности, и преимущественно модифицированы, чтобы стимулировать комплексообразование между двумя полипептидными цепями (см., например, WO 98/50431; WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867). Например, замена аминокислоты (предпочтительно замена аминокислотой, содержащей объемную боковую группу, образующую «выступ», например, триптофаном), может быть введена в домен СН2 или CH3 так, что стерическое влияние предотвратит взаимодействие с доменом, мутированным аналогичным образом, и приведет к спариванию мутированного домена с доменом, в который была введена комплементарная или содействующая мутация, т.е. «впадина» (например, замена глицином). Такие наборы мутаций могут быть введены в любой из полипептидов В7-Н3-связывающих молекул и/или PD-1-связывающих молекул, содержащих домены Fc, согласно настоящему изобретению. Способы модификации белков, способствующие гетеродимеризации по сравнению с гомодимеризацией, хорошо известны в данной области техники, в частности, в отношении модификации молекул, подобных иммуноглобулинам, и включены в область настоящего изобретения (см., например, Ridgway et al. (1996) «’Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization», Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) «Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library», J. Mol. Biol. 270: 26-35, и Xie et al. (2005) «A New Format Of Bi-specific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis», J. Immunol. Methods 296:95-101; каждая из которых полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки). Предпочтительно «выступ» вводят в домены СН2-CH3 первой полипептидной цепи, и «впадину» вводят в домены СН2-CH3 другой полипептидной цепи, содержащей СН2-CH3. Соответственно, «выступ» предотвратит гомодимеризацию первой полипептидной цепи с помощью ее доменов СН2 и/или CH3. Полипептидная цепь СН2-CH3, несущая «впадину», будет гетеродимеризоваться с полипептидной цепью СН2-CH3, несущей «выступ», а также будет гомодимеризоваться сама с собой. Предпочтительный «выступ» создают путем модификации нативного домена Fc IgG для включения модификации T366W. Предпочтительную впадину создают путем модификации домена Fc IgG для включения модификации T366S, L368A и Y407V. Чтобы облегчить очистку гомодимера полипептидной цепи, несущей впадину, от предпочтительной гетеродимерной молекулы, сайт связывания белка А доменов СН2 и CH3 домена Fc, несущего впадину, предпочтительно мутируют путем замены аминокислоты в положении 435 (H435R). Следовательно, гомодимер домена Fc, несущей «впадину», не будет связываться с белком А, тогда как В7-Н3-связывающая молекула, содержащая домен Fc, и/или PD-1-связывающая молекула, содержащая домен Fc, для применения в способах согласно настоящему изобретению будет сохранять свою способность связываться с белком А с помощью сайта связывания белка А на первой полипептидной цепи.
[00083] Предпочтительная последовательность, несущая «выступ», для В7-Н3-связывающей молекулы, содержащей домен Fc, и/или PD-1-связывающей молекулы, содержащей домен Fc, содержит последовательность, представленную ниже (SEQ ID NO: 6):
где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.
[00084] Предпочтительная последовательность, несущая «впадину», для В7-Н3-связывающей молекулы, содержащей домен Fc, и/или PD-1-связывающей молекулы, содержащей домен Fc, содержит последовательность, представленную ниже (SEQ ID NO: 7):
где X представляет собой лизин (K) или отсутствует.
[00085] В область настоящего изобретения также включены домены СН2-CH3, которые содержат дополнительные замены, которые изменяют эффекторную функцию и/или активность связывания домена Fc с FcγR, как описано выше. В область настоящего изобретения также включены домены СН2-CH3, которые дополнительно содержат одну или более замен аминокислот, увеличивающих период полувыведения. В частности, в область настоящего изобретения также включены несущие выступ или впадину домены СН2-CH3, которые дополнительно содержат замены M252Y/S254T/T256E.
В. В7-Н3-связывающие молекулы
[00086] Молекулы, которые специфично связываются с B7-H3, включенные в область настоящего изобретения, включают антитела к B7-H3, способные связываться с непрерывной или прерывистой (например, конформационной) частью (эпитопом) B7-H3 человека, и молекулы, содержащие эпитопсвязывающий сайт указанных антител. В7-Н3-связывающие молекулы, применяемые в способах и композициях согласно настоящему изобретению, предпочтительно также способны связываться с молекулами B7-H3 одного или более видов, отличных от человека, в частности, мышей, грызунов, собак и приматов. Известны антитела, специфичные в отношении B7-H3 (см., например, патенты США №№7527969, 7666424, 7718774, 7737258, 7740845, 8148154, 8216570; 8414892; 8501471; 8779098; 8802091; 9062110; публикации патентов США 2013/0078234; 2010/0143245; и РСТ публикации WO 2004/001381; WO 2008/066691; WO 2008/116219; WO 2011/109400; WO 2012/147713 и таблицу 5). Дополнительные желательные антитела могут быть получены путем выделения гибридом, секретирующих антитела, с использованием В7-Н3-экспрессирующих клеток; B7-H3 или его пептидного фрагмента.
[00087] B7-H3 человека существует в виде формы «2Ig» и формы «4Ig». Аминокислотная последовательность формы «2Ig» B7-H3 человека (включая сигнальную последовательность, содержащую 29 остатков аминокислот, выделенную подчеркиванием) представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 17):
[00088] Аминокислотная последовательность формы «2Ig» B7-H3 человека (SEQ ID NO: 17) полностью входит в состав формы «4Ig» B7-H3 человека (SEQ ID NO: 18, сигнальная последовательность, содержащая 29 остатков аминокислот, выделена подчеркиванием):
L
H
[00089] Предпочтительные В7-Н3-связывающие молекулы содержат домены VL и/или VH моноклонального антитела к B7-H3 человека, «BRCA84D», «BRCA69D», «PRCA1» или любого из антител к B7-H3, приведенных в таблице 5; и более предпочтительно содержат 1, 2 или все 3 из CDR области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR домена VH указанных моноклональных антител к B7-H3. Особенно предпочтительными являются В7-Н3-связывающие молекулы, которые содержат гуманизированный домен VH и/или VL. Указанные предпочтительные В7-Н3-связывающие молекулы включают антитела, содержащие варианты домена Fc, биспецифичные (или полиспецифичные) антитела, химерные или гуманизированные антитела и т.д.
1. BRCA84D
L
[00090] Аминокислотная последовательность домена VL BRCA84D (SEQ ID NO: 19) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
H
[00091] Аминокислотная последовательность домена VH BRCA84D (SEQ ID NO: 20) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
a. hBRCA84D
[00092] Шесть примерных гуманизированных доменов VL BRCA84D, обозначенных в настоящем документе «hBRCA84D VL1», «hBRCA84D VL2», «hBRCA84D VL3», «hBRCA84D VL4», «hBRCA84D VL5», «hBRCA84D VL6», и четыре примерные гуманизированные домены VH BRCA84D, обозначенные в настоящем документе «hBRCA84D VH1», «hBRCA84D VH2», «hBRCA84D VH3» и «hBRCA84D VH4», приведены ниже. Любая из гуманизированных доменов VL может быть спарена с любой из гуманизированных доменов VH с получением В7-Н3-связывающего домена. Соответственно, любое антитело, содержащее одну из гуманизированных доменов VL, спаренных с гуманизированным доменом VH, в общем называется «hBRCA84D», и конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL упоминаются посредством ссылки на определенные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее hBRCA84D VH1 и hBRCA84D VL2, в частности, называется «hBRCA84D (1.2)».
L
[00093] Аминокислотная последовательность домена VL из hBRCA84D VL1 (SEQ ID NO: 21) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[00094] Аминокислотная последовательность домена VL из hBRCA84D VL2 (SEQ ID NO: 22) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[00095] Аминокислотная последовательность домена VL из hBRCA84D VL3 (SEQ ID NO: 23) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[00096] Аминокислотная последовательность домена VL из hBRCA84D VL4 (SEQ ID NO: 24) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[00097] Аминокислотная последовательность домена VL из hBRCA84D VL5 (SEQ ID NO: 25) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[00098] Аминокислотная последовательность домена VL из hBRCA84D VL6 (SEQ ID NO: 26) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
H
[00099] Аминокислотная последовательность домена VH из hBRCA84D VH1 (SEQ ID NO: 27) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
H
[000100] Аминокислотная последовательность домена VH из hBRCA84D VH2 (SEQ ID NO: 28) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
H
[000101] Аминокислотная последовательность домена VH из hBRCA84D VH3 (SEQ ID NO: 29) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
H
[000102] Аминокислотная последовательность домена VH из hBRCA84D VH4 (SEQ ID NO: 30) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
2. BRCA69D
L
[000103] Аминокислотная последовательность домена VL из BRCA69D (SEQ ID NO: 31) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
H
[000104] Аминокислотная последовательность домена VH из BRCA69D (SEQ ID NO: 32) приведена ниже (CDR остатки выделены подчеркиванием).
a. hBRCA69D
L
L
L
[000105] Два примерных гуманизированных домена VL BRCA69D, обозначенные в настоящем документе «hBRCA69D VL1» и «hBRCA69D VL2», и два примерных гуманизированных домена VH BRCA69D, обозначенные в настоящем документе «hBRCA69D VH1» и «hBRCA69D VH2», приведены ниже. Следует отметить, что hBRCA69D VL2 содержит замены аминокислот в CDR1 и CDR2 и что hBRCA69D VH2 содержит замены аминокислот в CDR2. Любой из гуманизированных доменов VL может быть спарена с любым из гуманизированных доменов VH с получением В7-Н3-связывающего домена. Соответственно, любое антитело, содержащее один из гуманизированных доменов VL, спаренных с гуманизированным доменом VH, в общем называется «hBRCA69D», и конкретные комбинации гуманизированных доменов VH/VL упоминаются посредством ссылки на определенные домены VH/VL, например, гуманизированное антитело, содержащее hBRCA69D VH1 и hBRCA69D VL2, в частности, называется «hBRCA69D (1.2)».
L
[000106] Аминокислотная последовательность домена VL из hBRCA69D VL1 (SEQ ID NO: 33) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[000107] Аминокислотная последовательность домена VL из hBRCA69D VL2 (SEQ ID NO: 34) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
H
[000108] Аминокислотная последовательность домена VH из hBRCA69D VH1 представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 35) (остатки CDR выделены подчеркиванием):
H
[000109] Аминокислотная последовательность домена VH из hBRCA69D VH2 представляет собой последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 36) (остатки CDR выделены подчеркиванием):
3. PRCA157
H
[000110] Аминокислотная последовательность домена VL PRCA157 (SEQ ID NO: 37) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
H
[000111] Аминокислотная последовательность домена VH PRCA157 (SEQ ID NO: 38) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
4. Дополнительные антитела к B7-H3
[000112] Дополнительные антитела к B7-H3, которые можно применять в способах и композициях согласно настоящему изобретению, приведены в таблице 5.
5. Примерное антитело к B7-H3
[000113] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела B7-H3, применяемые в способах и композициях согласно настоящему изобретению, содержат домены VL и VH любого из антител, приведенных выше (например, hBRCA84D, hBRCA69D, PRCA157 или домены VL и VH любого из антител к B7-H3, приведенных в таблице 5), домен CL легкой каппа-цепи и вариант домена Fc IgG1 с повышенной ADCC (по сравнению с доменом Fc дикого типа). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения домены СН2-CH3 содержат замены L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L (нумерация которых соответствует индексу ЕС, как изложено в Кабат). Указанные антитела предпочтительно будут содержать домен СН1 IgG1 и шарнирную область.
[000114] Аминокислотная последовательность домена CL легкой каппа-цепи приведена ниже (SEQ ID NO: 13).
[000115] Аминокислотная последовательность домена СН1 и шарнирной области IgG1 приведена ниже (SEQ ID NO: 14).
[000116] Аминокислотная последовательность доменов СН2-CH3 IgG1, содержащая замены L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L, приведена ниже (SEQ ID NO: 15).
[000117] Примерное антитело к B7-H3, обозначенное «hBRCA84D-2», содержит: легкую цепь, содержащую домен VL из BRCA84D VL2 (SEQ ID NO: 22), и домен CL легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 13); и тяжелую цепь, содержащую домен VH из BRCA84D VH2 (SEQ ID NO: 28), домен CH1 и шарнирную область IgG1 (SEQ ID NO: 14) и варианты доменов СН2-CH3 IgG, содержащие замены L235V, F243L, R292P, Y300L и P396L (SEQ ID NO: 15).
[000118] Аминокислотная последовательность полной легкой цепи hBRCA84D-2 приведена ниже (SEQ ID NO: 39).
[000119] Аминокислотная последовательность полной тяжелой цепи hBRCA84D-2 приведена ниже (SEQ ID NO: 40).
С. PD-1-связывающие молекулы
[000120] Молекулы, которые специфично связываются с PD-1, включенные в область настоящего изобретения, включают антитела к PD-1, способные связываться с непрерывной или прерывистой (например, конформационной) частью (эпитопом) PD-1 человека, и молекулы, содержащие эпитопсвязывающий сайт указанных антител. PD-1-связывающие молекулы (например, антитела), применяемые в способах и композициях согласно настоящему изобретению, предпочтительно также способны связываться с молекулами PD-1 одного или более видов, отличных от человека, в частности, мышей, грызунов, собак и приматов. Антитела, специфичные в отношении PD-1, известны (см., например, заявку на патент США 62/198867; патенты США №№5952136; 7488802; 7521051; 8008449; 8088905; 8354509; 8552154; 8779105; 8900587; 9084776; РСТ публикации WO 2004/056875; WO 2006/121168; WO 2008/156712; WO 2012/135408; WO 2012/145493; WO 2013/014668; WO 2014/179664; WO 2014/194302; и WO 2015/112800, и таблицу 6). Дополнительные желательные антитела могут быть получены путем выделения гибридом, секретирующих антитела, индуцированных с использованием PD-1 или его пептидного фрагмента.
[000121] PD-1 человека (включая сигнальную последовательность, содержащую 20 остатков аминокислот (выделенную подчеркиванием), и зрелый белок, содержащий 268 остатков аминокислот) содержит аминокислотную последовательность, приведенную ниже (SEQ ID NO: 41):

L
H
L
H
[000122] Предпочтительные PD-1-связывающие молекулы (например, антитела), которые можно применять в способах и композициях согласно настоящему изобретению, содержат домены VL и/или VH из моноклонального антитела к PD-1 человека «МАТ к PD-1 1» (ниволюмаб, CAS №946414-94-4, также известное как 5С4, BMS-936558, ONO-4538, MDX-1106 и выпущенное на рынок под наименованием OPDIVO компанией Bristol-Myers Squibb); «МАТ к PD-1 2» (пембролизумаб (ранее известное как ламбролизумаб), CAS №1374853-91-4, также известное как MK-3475, SCH-900475 и выпущенное на рынок под наименованием KEYTRUDA компанией Merck); «МАТ к PD-1 3» (ЕН12.2Н7; Dana Farber), «МАТ к PD-1 4» (пидилизумаб, CAS №1036730-42-3, также известное как СТ-011, CureTech) или любого из антител к PD-1 в таблице 6; и более предпочтительно содержат 1, 2 или все 3 из CDR области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR домена VH указанных моноклональных антител к PD-1. Недавно были идентифицированы дополнительные антитела к PD-1, обладающие уникальными характеристиками связывания, которые можно применять в способах и композициях согласно настоящему изобретению (см. заявку на патент США 62/198867). В частности, предпочтительными являются PD-1-связывающие молекулы, которые содержат гуманизированный домен VH и/или VL антитела к PD-1 «МАТ к PD-1 5» (МАТ к чPD-1 2, MacroGenics); «МАТ к PD-1 6» (МАТ к чPD-1 7, MacroGenics); «МАТ к PD-1 7» (МАТ к чPD-1 9, MacroGenics); или «МАТ к PD-1 8» (МАТ к чPD-1 15, MacroGenics); и более предпочтительно содержат 1, 2 или все 3 из CDR области VL и/или 1, 2 или все 3 из CDR домена VH указанных гуманизированных моноклональных антител к PD-1. Указанные предпочтительные PD-1-связывающие молекулы включают антитела, содержащие варианты доменов Fc, биспецифичные (или полиспецифичные) антитела, химерные или гуманизированные антитела и т.д.
1. МАТ к PD-1 1
H
[000123] Аминокислотная последовательность домена VH мАТ к PD-1 1 (SEQ ID NO: 42) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[000124] Аминокислотная последовательность домена VL мАТ к PD-1 1 приведена ниже (SEQ ID NO: 43) (остатки CDR выделены подчеркиванием).
2. МАТ к PD-1 2
H
[000125] Аминокислотная последовательность домена VH мАТ к PD-1 2 (SEQ ID NO: 44) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[000126] Аминокислотная последовательность домена VL мАТ к PD-1 2 (SEQ ID NO: 45) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
3. МАТ к PD-1 3
H
[000127] Аминокислотная последовательность домена VH мАТ к PD-1 3 (SEQ ID NO: 46) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[000128] Аминокислотная последовательность домена VL мАТ к PD-1 3 (SEQ ID NO: 47) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
4. МАТ к PD-1 4
H
[000129] Аминокислотная последовательность домена VH мАТ к PD-1 4 (SEQ ID NO: 48) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[000130] Аминокислотная последовательность домена VL мАТ к PD-1 4 (SEQ ID NO: 49) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
5. МАТ к PD-1 5
H
[000131] Аминокислотная последовательность домена VH мАТ к PD-1 5 (SEQ ID NO: 50) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[000132] Аминокислотная последовательность домена VL мАТ к PD-1 5 (SEQ ID NO: 51) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
6. МАТ к PD-1 6
H
[000133] Аминокислотная последовательность домена VH мАТ к PD-1 6 (SEQ ID NO: 52) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
где X представляет собой I или А.
L
[000134] Аминокислотная последовательность домена VL мАТ к PD-1 6 (SEQ ID NO: 53) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
1
2
1
2
1
2
1
2
где X представляет собой N или S и Х представляет собой Q или R; или X представляет собой N и Х представляет собой Q; или X представляет собой S и Х представляет Q; или X представляет собой S и Х представляет собой R.
[000135] Согласно конкретным вариантам реализации мАТ к PD-1 6 содержит:
1
2
(a) SEQ ID NO: 52, в которой X представляет собой I; и SEQ ID NO: 53, в которой X представляет собой N и Х представляет собой Q; или
1
2
(b) SEQ ID NO: 52, в которой X представляет собой I; и SEQ ID NO: 53, в которой X представляет собой S и Х представляет Q.
7. МАТ к PD-1 7
H
[000136] Аминокислотная последовательность домена VH мАТ к PD-1 7 (SEQ ID NO: 54) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
где X представляет собой V или А; Х представляет собой S или G; Х представляет собой V или Т; Х представляет собой L или A; X представляет собой V, Х представляет собой S, Х представляет собой V и Х представляет собой L; или X представляет собой А, X представляет собой G, X представляет собой Т и X представляет собой А.
L
[000137] Аминокислотная последовательность домена VL мАТ к PD-1 7 (SEQ ID NO: 55) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
1
2
1
2
1
2
где X представляет собой S или N и X представляет собой N или D; или X представляет собой S и X представляет собой N; или X представляет собой N и X представляет собой D.
[000138] Согласно конкретным вариантам реализации мАТ к PD-1 7 содержит:
1
2
3
4
1
2
(a) SEQ ID NO: 54, в которой X представляет собой V, X представляет собой S, X представляет собой V и Х представляет собой L; и SEQ ID NO: 55, в которой X представляет собой S и X представляет собой N; или
1
2
3
4
1
2
(b) SEQ ID NO: 54, в которой X представляет собой А, X представляет собой G, X представляет собой Т и Х представляет собой А; и SEQ ID NO: 55, в которой X представляет собой N и X представляет собой D.
8. МАТ к PD-1 8
H
[000139] Аминокислотная последовательность домена VH мАТ к PD-1 8 (SEQ ID NO: 56) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
L
[000140] Аминокислотная последовательность домена VL мАТ к PD-1 8 (SEQ ID NO: 57) приведена ниже (остатки CDR выделены подчеркиванием).
9. Дополнительные антитела к PD-1
[000141] Дополнительные антитела к PD-1, которые можно применять в способах и композициях согласно настоящему изобретению, представлены в таблице 6.
10. Примерные антитела к PD-1
[000142] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения антитела PD-1, которые можно применять в способах и композициях согласно настоящему изобретению, содержат домены VL и VH любого из вышеперечисленных антител (например, мАТ к PD-1 1, мАТ к PD-1 2, мАТ к PD-1 3, мАТ к PD-1 4, мАТ к PD-1 5, мАТ к PD-1 6, мАТ к PD-1 7, мАТ к PD-1 8 или любого из антител к PD-1, приведенных в таблице 6), домен CL легкой каппа-цепи и домен Fc IgG4, необязательно не содержащий C-концевого остатка лизина. Указанные антитела предпочтительно содержат домен СН1 и шарнирную область IgG4, и более предпочтительно содержат стабилизированную шарнирную область IgG4, содержащую замену S228P (где нумерация соответствует индексу ЕС, как изложено в Кабат).
[000143] Аминокислотная последовательность домена CL легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 13) была представлена выше.
[000144] Аминокислотная последовательность домена СН1 и стабилизированной шарнирной области IgG4 была представлена выше (SEQ ID NO: 16).
[000145] Аминокислотная последовательность доменов СН2-CH3 IgG4 (SEQ ID NO: 4) была представлена выше.
1
2
1
[000146] Примерное антитело к PD-1, обозначенное «МАТ к PD-1 6-ISQ», содержит: легкую цепь, содержащую домен VL мАТ к PD-1 6 (SEQ ID NO: 53), в которой X представляет собой S и X представляет Q, и домен CL легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 13); и тяжелую цепь, содержащую домен VH мАТ к PD-1 6 (SEQ ID NO: 52), в которой X представляет собой I, домен CH1 IgG4, стабилизированную шарнирную область IgG4 (SEQ ID NO: 16) и домены СН2-CH3 IgG4 (SEQ ID NO: 4).
[000147] Аминокислотная последовательность полной легкой цепи мАТ к PD-1 6-ISQ (SEQ ID NO: 58) приведена ниже.
[000148] Аминокислотная последовательность полной тяжелой цепи мАТ к PD-1 6-ISQ (SEQ ID NO: 59) приведена ниже.
[000149] Другое примерное антитело к PD-1 представляет собой мАТ к PD-1 1 (ниволюмаб), который представляет собой антитело человека, содержащее легкую цепь, содержащую домен VL (SEQ ID NO: 43) и домен CL легкой каппа-цепи (см., например, SEQ ID NO: 13); и тяжелую цепь, содержащую домен VH (SEQ ID NO: 42), домен CH1 IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 9), стабилизированную шарнирную область IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 12) и домены СН2-CH3 IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 4).
[000150] Другое примерное антитело к PD-1 представляет собой мАТ к PD-1 2 (пембролизумаб), который представляет собой гуманизированное антитело, содержащее легкую цепь, содержащую домен VL (SEQ ID NO: 45) и домен CL легкой каппа-цепи (см., например, SEQ ID NO: 13); и тяжелую цепь, содержащую домен VH (SEQ ID NO: 44), домен CH1 IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 9), стабилизированную шарнирную область IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 12) и домены СН2-CH3 IgG4 (см., например, SEQ ID NO: 4).
D. Способы получения
[000151] В7-Н3-связывающие молекулы и PD-1-связывающие молекулы, включенные в область настоящего изобретения, могут быть получены способами, известными в данной области техники, например, с помощью синтетических или рекомбинантных способов (см, например, Kelley, R.F. et al. (1990) в: Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. Ed., Plenum Press, N.Y., vol. 12, pp 1-19; Stewart, J.M et al. (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, см. также патенты США №№4105603, 3972859, 3842067 и 3862925, Merrifield, В. (1986) «Solid Phase Synthesis», Science 232(4748):341-347; Houghten, R.A. (1985) «General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids», Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) «Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century», Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).

[000152] В другом варианте подходящие В7-Н3-связывающие молекулы и/или PD-1-связывающие молекулы, содержащие один или более CDR из желательного антитела к B7-H3 и/или антитела к PD-1, могут быть получены с использованием коммерчески доступных линий мышей, которые были сконструированы для экспрессии специфичных белков иммуноглобулинов человека. Трансгенные животные, которые предназначены для получения более желательного (например, полностью человеческих антител) или более устойчивого иммунного ответа, также могут быть использованы для получения гуманизированных антител или антител человека. Примеры подходящей технологии включают Xenomouse™ (Abgenix, Inc., Фримонт, Калифорния, США), HuMAb-Mouse и ТС Mouse™ (обе технологии от Medarex, Inc., Принстон, Нью-Джерси, США).
[000153] Согласно дополнительному альтернативному способу указанные связывающие молекулы могут быть получены рекомбинантными способами и экспрессированы с использованием любого способа, известного в данной области техники. Антитела могут быть получены рекомбинантным способом, путем сначала выделения антител, полученных от животных-хозяев, получения последовательности гена и затем использования последовательности гена для рекомбинантной экспрессии антитела в клетках-хозяевах (например, клетках линии СНО). Другой способ, который можно применять, представляет собой экспрессию последовательности антитела в растениях (например, табаке) или трансгенном молоке. Были раскрыты подходящие способы рекомбинантной экспрессии антител в растениях или молоке (см., например, Peeters et al. (2001) «Production Of Antibodies And Antibody Fragments In Plants», Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) «Human Antibodies From Transgenic Mice», Int. Rev. Immunol 13:65-93; и Pollock et al. (1999) «Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies», J. Immunol Methods 231:147-157). Подходящие способы получения производных антител, например, гуманизированных, биспецифичных антител, одноцепочечных и т.д, известны в данной области техники. В другом варианте антитела могут быть получены рекомбинантными способами с помощью технологии фагового дисплея (см., например, патенты США №№5565332, 5580717, 5733743, 6265150 и Winter, G. et al. (1994) «Making Antibodies By Phage Display Technology», Annu. Rev. Immunol. 12.433-455).
[000154] Векторы, содержащие полинуклеотиды, представляющие интерес, могут быть введены в клетку-хозяина любым из ряда подходящих способов, включая электропорацию, трансфекцию с использованием хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, DEAE-декстрана или других веществ; бомбардировку микрочастицами; липофекцию; и инфицирование (например, если вектор представляет собой инфекционный агент, такой как вирус коровьей оспы). Выбор векторов или полинуклеотидов для введения часто будет зависеть от особенностей клетки-хозяина.
[000155] Любая клетка-хозяин, способная к гиперэкспрессии гетерологичных ДНК, может быть использована для выделения генов, кодирующих антитело, полипептид или белок, представляющий интерес. Неограничивающие примеры подходящих клеток-хозяев млекопитающих включают, но не ограничиваются ими, клетки линии COS, HeLa и СНО. Предпочтительно клетки-хозяева экспрессируют кДНК на уровне примерно в 5 раз выше, более предпочтительно в 10 раз выше, еще более предпочтительно в 20 раз выше, чем уровень соответствующего эндогенного антитела или белка, представляющего интерес, если он присутствует, в клетке-хозяине. Скрининг клеток-хозяев для определения иммуноспецифичного связывания с мишенью, экспрессируемой кДНК (например, B7-H3 или PD-1), осуществляют с помощью иммунологического количественного исследования или флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS). Клетка, гиперэкспрессирующая антитело или белок, представляющий интерес, может быть идентифицирована.
[000156] В область настоящего изобретения включены полипептиды, содержащие аминокислотную последовательность (предпочтительно эпитопсвязывающий домен) антитела к B7-H3 и/или антитела к PD-1 согласно настоящему изобретению. Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены способами, известными в данной области техники. Полипептиды могут быть получены путем протеолитического или другого типа расщепления антител, рекомбинантными способами (т.е. одиночные или гибридные полипептиды), как описано выше, или с помощью химического синтеза. Полипептиды, особенно более короткие полипептиды, содержащие не более приблизительно 50 аминокислот, обычно получают путем химического синтеза.
[000157] В область настоящего изобретения включены модификации полипептидов любых указанных В7-Н3-связывающих молекул и/или PD-1-связывающих молекул, которые не оказывают существенного влияния на свойства указанных молекул, а также варианты, которые имеют повышенную или пониженную активность. Модификация полипептидов является стандартным способом в данной области техники и не нуждается в подробном описании в настоящем документе. Примеры модифицированных полипептидов включают полипептиды с консервативными заменами остатков аминокислот, одной или более делениями или добавлениями аминокислот, которые не оказывают значительного вредного влияния на функциональную активность, или использование химических аналогов. Остатки аминокислот, которые могут быть консервативно заменены друг другом, включают, но не ограничиваются ими: глицин/аланин; серин/треонин; валин/изолейцин/лейцин; аспарагин/глутамин; аспарагиновую кислоту/глутаминовую кислоту; лизин/аргинин; и фенилаланин/тирозин. Подходящие полипептиды также включают гликозилированные и негликозилированные полипептиды, а также полипептиды с другими посттрансляционными модификациями, такими как, например, гликозилирование различными сахарами, ацетилирование и фосфорилирование. Предпочтительно замены аминокислот будут консервативными, т.е. замененная аминокислота будет обладать химическими свойствами, сходными с таковыми исходной аминокислоты. Подходящие консервативные замены известны в данной области техники, и примеры были приведены выше. Модификации аминокислот могут варьироваться от изменения или модификации одной или более аминокислот до полной реорганизации области, такой как вариабельный домен. Изменения в вариабельном домене могут изменять аффинность связывания и/или иммунную специфичность. Другие способы модификации включают использование методик соединения, известных в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, ферментативные способы, окислительную замену и хелатирование. Модификации могут быть использованы, например, для прикрепления меток для иммунологического количественного исследования, таких как прикрепление радиоактивных фрагментов для радиоиммунологического количественного исследования. Модифицированные полипептиды получают с использованием процедур, стандартных в данной области техники, и могут быть подвергнуты скринингу с использованием стандартных количественных исследований, известных в данной области техники.
[000158] В область настоящего изобретения включены гибридные белки, содержащие одно или более антител согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения обеспечен гибридный полипептид, который содержит легкую цепь, тяжелую цепь или обе легкую и тяжелую цепи. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный полипептид содержит константную область гетерологичного иммуноглобулина. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный полипептид содержит домен VL и домен VH антитела согласно настоящему изобретения или полученного из гибридомы, депонированной в общедоступных базах. Для целей настоящего изобретения гибридный белок антитела содержит один или более эпитопсвязывающих сайтов, которые иммуноспецифично связываются с B7-H3 и/или PD-1, и один или более полипептидных доменов, которые иммуноспецифично связываются с другой аминокислотной последовательностью, к которой он не присоединен в нативной молекуле, например, с гетерологичной последовательностью или гомологичной последовательностью из другой области.
Е. Фармацевтические композиции
[000159] В область настоящего изобретения включены композиции, содержащие В7-Н3-связывающую молекулу, PD-1-связывающую молекулу или комбинацию указанных молекул. Композиции согласно настоящему изобретению содержат нерасфасованные лекарственные композиции, пригодные для изготовления фармацевтических композиций (например, неочищенных или нестерильных композиций) и фармацевтических композиций (т.е., композиций, которые подходят для введения субъекту или пациенту), которые могут быть использованы в приготовлении стандартных лекарственных форм. Подходящие композиции содержат В7-Н3-связывающую молекулу, PD-1-связывающую молекулу или комбинацию указанных молекул и фармацевтически приемлемый носитель. Предпочтительно композиции согласно настоящему изобретению содержат В7-Н3-связывающую молекулу, PD-1-связывающую молекулу или комбинацию указанных молекул и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно предпочтительному аспекту указанные композиции по существу очищены (т.е. по существу не содержат вещества, которые ограничивают их действие или вызывают нежелательные побочные эффекты).
[000160] В тех случаях, когда необходимо ввести более одного терапевтического агента, агенты могут быть смешаны и изготовлены в виде одной композиции или могут быть изготовлены в виде отдельных композиций. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающую молекулу и PD-1-связывающую молекулу смешивают и изготавливают в виде одной фармацевтической композиции. В других вариантах реализации молекулы изготавливают в виде отдельных фармацевтических композиций.
[000161] Для введения можно использовать различные составы В7-Н3-связывающей молекулы, PD-1-связывающей молекулы или комбинации указанных молекул. Помимо фармакологически активного агента (агентов) композиции согласно настоящему изобретению могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включающие вспомогательные вещества и вспомогательные ингредиенты, которые хорошо известны в данной области техники и являются относительно инертными веществами, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества или которые облегчают обработку активных соединений с получением препаратов, которые могут быть использованы фармацевтически для доставки в место действия. Например, вспомогательное вещество может придать форму или консистенцию или действовать как разбавитель. Подходящие вспомогательные вещества включают, но не ограничиваются ими, стабилизирующие агенты, смачивающие и эмульгирующие агенты, соли для изменения осмолярности, инкапсулирующие агенты, буферы и усилители проникновения в кожу.
[000162] Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для использования у животных и, более конкретно, у человека. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), вспомогательному веществу или носителю, с которым вводят лекарственное соединение. Подходящими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтепродуктов, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Водные носители, такие как физиологические солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, являются предпочтительными при внутривенном введении фармацевтической композиции. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п. Композиция, если необходимо, также может содержать незначительное количество смачивающего или эмульгирующего агента или буферного агента для поддержания pH. Подходящие композиции могут быть в форме растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, композиций с замедленным высвобождением и т.п.
[000163] Обычно ингредиенты композиций согласно настоящему изобретению поставляют по отдельности или смешивают с получением стандартной дозированной формы, например, в виде сухого лиофилизованного порошка или концентрата, не содержащего воды, в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. В том случае, если композиция должна быть введена путем инфузии, она может быть распределена с инфузионной бутылкой, содержащей стерильную воду фармацевтической степени чистоты или физиологический раствор. В том случае, если композицию вводят путем инъекции, может быть обеспечена ампула стерильной воды для инъекций или физиологического раствора так, что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.
[000164] Композиции согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают, но не ограничиваются ими, соли, образованные с анионами, такими как анионы, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и те, которые образованы катионами, такими как катионы, полученные из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
[000165] Предпочтительно терапевтический агент (т.е., В7-Н3-связывающая молекула, PD-1-связывающая молекула или комбинация указанных молекул) поставляется в виде сухого стерильного лиофилизованного порошка в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием Количества молекулы (молекул). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения терапевтический агент поставляется в виде сухого стерилизованного лиофилизованного порошка или концентрата, не содержащего воды, в герметично закрытом контейнере и может быть восстановлен, например, с использованием воды или физиологического раствора до соответствующей концентрации для введения субъекту. В другом варианте реализации терапевтический агент поставляется в жидкой форме в герметично закрытом контейнере с указанием количества и концентрации терапевтического агента.
[000166] Лиофилизованный терапевтический агент (т.е., В7-Н3-связывающую молекулу, PD-1-связывающую молекулу или комбинацию указных молекул) следует хранить при температуре от 2°C до 8°C в исходном контейнере, и агент должен быть введен в течение 12 часов, предпочтительно в течение 6 часов, в течение 5 часов, в течение 3 часов или в течение 1 часа после восстановления. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения терапевтический агент поставляется в жидкой форме в герметично закрытом контейнере с указанием количества и концентрации молекулы (молекул), гибридного белка или конъюгированной молекулы. Предпочтительно указанный терапевтический агент, если он обеспечен в жидкой форме, поставляется в герметично закрытом контейнере.
[000167] Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая упаковка или набор, содержащий один или более контейнеров, содержащих В7-Н3-связывающую молекулу, PD-1-связывающую молекулу или комбинацию указанных молекул по отдельности или совместно с другими агентами, предпочтительно с фармацевтически приемлемым носителем. Помимо этого один или более других профилактических или терапевтических агентов, которые можно применять для лечения заболевания, также могут быть включены в фармацевтическую упаковку или набор. Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая упаковка или набор, содержащий один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Уведомление в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов, которое отражает одобрение указанным агентством производства, применения или продажи для введения человеку, может быть необязательно прикреплено к указанному контейнеру (контейнерам).
[000168] Набор может содержать В7-Н3-связывающую молекулу, PD-1-связывающую молекулу или комбинацию указанных молекул. Набор также может содержать один или более других профилактических и/или терапевтических агентов, которые можно применять для лечения рака, в одном или более контейнерах; и/или набор также может содержать одно или более цитотоксических антител, которые связываются с одним или более раковыми антигенами. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения другой профилактический или терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент. Согласно другим вариантам реализации профилактический или терапевтический агент представляет собой биологический или гормональный терапевтический агент.
F. Способы применения
[000169] Как обсуждалось выше, молекулы, которые специфично связываются с B7-H3, и молекулы, которые специфично связываются с PD-1, могут быть использованы для терапевтических целей у пациентов, страдающих раком или другими заболеваниями. Соответственно, согласно настоящему изобретению обеспечены способы лечения рака, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, В7-Н3-связывающей молекулы и PD-1-связывающей молекулы. В частности, в область настоящего изобретения включены способы, в которых В7-Н3-связывающая молекула содержит эпитопсвязывающий сайт антитела к B7-H3 согласно настоящему изобретению и в которых PD-1 -связывающая молекула содержит эпитопсвязывающий сайт антитела к PD-1 согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающая молекула представляет собой антитело. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения PD-1-связывающая молекула представляет собой антитело. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающая молекула и PD-1-связывающая молекула представляют собой антитела.
[000170] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающую молекулу и PD-1-связывающую молекулу вводят одновременно. В настоящей заявке «одновременное» введение предназначено для обозначения:
(A) введения отдельной фармацевтической композиции, которая содержит В7-Н3-связывающую молекулу и PD-1-связывающую молекулу. Указанные молекулы могут представлять собой одну и ту же молекулу (например, биспецифичное антитело) или могут представлять собой различные молекулы (например, антитело к B7-H3 или его антигенсвязывающий фрагмент и антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент); или
(B) раздельного введения двух или более фармацевтических композиций, одна композиция из которых содержит молекулу, которая специфично связывается с B7-H3, и другая композиция из которых содержит молекулу, которая специфично связывается с PD-1, причем указанные композиции вводят в течение 48-часового периода.
[000171] Согласно второму варианту реализации применяют две различные молекулы, при этом указанные молекулы вводят «последовательно» (например, вводят антитело к B7-H3 и позднее вводят антитело к PD-1 или наоборот). При упомянутом последовательном введении вторую вводимую композицию вводят по меньшей мере через 48 часов или более после введения первой вводимой композиции.
[000172] Обеспечение терапии или «лечения» относится к любым признакам благоприятных или желательных результатов, включая, но не ограничиваясь ими, клинические результаты, такие как уменьшение размера опухоли (в случае рака, например, опухоли молочной железы, рака желудка или рака предстательной железы), замедление размножения раковых клеток, замедление развития метастазов, уменьшение симптомов, возникающих в результате заболевания, повышение качества жизни индивидуумов, страдающих указанным заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, повышение эффекта другого лекарственного средства, например, путем нацеленного воздействия и/или интернализации, замедление прогрессирования заболевания и/или увеличение продолжительности выживания индивидуума.
[000173] Субъекты, подходящие для лечения, включают животных, наиболее предпочтительно виды млекопитающих, такие как виды, отличные от приматов (например, бычьих, лошадиных, кошачьих, собачьих, грызунов и т.д.), или приматов (например, обезьяну, такую как яванская макака, человека и т.д.). Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения субъект представляет собой человека.
[000174] Примерные расстройства, которые можно лечить в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, пролиферативные расстройства, клеточные пролиферативные расстройства и рак (в частности, рак, экспрессирующий B7-H3). Согласно различным вариантам реализации настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения, предотвращения или контроля заболевания или расстройства у субъекта, включающим введение субъекту терапевтически эффективного количества молекулы, которая специфично связывается с B7-H3, и молекулы, которая специфично связывается с PD-1. Например, В7-Н3-связывающая молекула и PD-1-связывающая молекула являются особенно подходящими для предотвращения, ингибирования, уменьшения роста или регрессии первичных опухолей и метастазов раковых клеток. Безотносительно к определенному механизму действия, полагают, что указанные связывающие молекулы могут опосредовать эффекторную функцию, направленную на раковые клетки, способствовать активации иммунной системы против раковых клеток, сшивать поверхностные клеточные антигены и/или рецепторы на раковых клетках и усиливать апоптоз или передачу регуляторных сигналов, подавляющих рост, или их комбинацию, что приводит к удалению опухоли и/или к уменьшению опухоли.
[000175] В настоящей заявке термин «эффективное количество» фармацевтической композиции, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения, представляет собой количество, достаточное для получения благоприятных или желательных результатов, включая, но не ограничиваясь ими, клинические результаты, такие как уменьшение симптомов, вызванных заболеванием, ослабление симптома инфекции (например, вирусной нагрузки, лихорадки, боли, сепсиса и т.д.) или симптома рака (например, пролиферации раковых клеток, присутствия опухоли, метастазов опухоли и т.д.), повышая тем самым качество жизни индивидуумов, страдающих указанным заболеванием, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения заболевания, усиление действия другого лекарственного средства, например, путем нацеленного воздействия и/или интернализации, замедление прогрессирования заболевания и/или увеличение продолжительности выживания индивидуумов. Применительно к отдельному активному ингредиенту, вводимому по отдельности, указанный термин относится только к указанному ингредиенту. Применительно к комбинации указанный термин относится к комбинированным количествам активных ингредиентов, которые приводят к терапевтическому действию, независимо от их введения в комбинации, последовательно или одновременно. Конкретные дозы описаны ниже.
[000176] Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающую молекулу (например, антитело) и PD-1-связывающую молекулу (например, антитело) можно применять для лечения любого заболевания или состояния, связанного или характеризующегося экспрессией B7-H3. Следовательно, способы и композиции согласно настоящему изобретению могут быть использованы, но не ограничиваются этим, для иммунотерапии, направленной на рак, включая виды рака, характеризующиеся присутствием раковой клетки, включая, но не ограничиваясь ими, клетку острого миелобластного лейкоза, опухоли надпочечников, ассоциированного со СПИДом рака, альвеолярной саркомы мягких тканей, астроцитарной опухоли, рака мочевого пузыря, рака костей, рака головного и спинного мозга, метастатической опухоли головного мозга, рака молочной железы, опухолей сонной артерии, рака шейки матки, хондросаркомы, хордомы, хромофобной карциномы клеток почек, светлоклеточной карциномы, рака толстой кишки, колоректального рака, кожной доброкачественной фиброзной гистиоцитомы, десмопластической мелкокруглоклеточной опухоли, эпендимомы, опухоли Юинга, экстраскелетной миксоидной хондросаркомы, несовершенного костного фиброгенеза, фиброзной дисплазии кости, рака желчного пузыря или желчного протока, рака желудка, гестационного трофобластного заболевания, герминогенной опухоли, рака головы и шеи, гепатоцеллюлярной карциномы, глиобластомы, опухоли островковых клеток, саркомы Капоши, рака почек, лейкоза, липомы/доброкачественной липоматозной опухоли, липосаркомы/злокачественной липоматозной опухоли, рака печени, лимфомы, рака легких, медуллобластомы, меланомы, менингиомы, злокачественной мезотелиомы, множественной эндокринной неоплазии, множественной миеломы, миелодиспластического синдрома, нейробластомы, нейроэндокринных опухолей, немелкоклеточного рака легких, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака глотки, папиллярной карциномы щитовидной железы, опухоли паращитовидной железы, педиатрического рака, опухоли оболочек периферических нервов, феохромоцитомы, опухоли гипофиза, рака предстательной железы, постериальной увеальной меланомы, редкого гематологического расстройства, почечноклеточной карциномы, метастатического рака почек, рабдоидной опухоли, рабдомиосаркомы, саркомы, рака кожи, саркомы мягких тканей, плоскоклеточного рака, рака желудка, синовиальной саркомы, рака яичка, карциномы тимуса, тимомы, метастатического рака щитовидной железы и рака матки. Указанная иммунотерапия может быть достаточной, например, чтобы уменьшить деление раковых клеток, замедлить развитие (например, начало и степень) метастазов и/или стимулировать активность иммунной системы на раковых клетках.
[000177] В частности, комбинация В7-Н3-связывающей молекулы и PD-1-связывающей молекулы особенно подходит для лечения разных видов плоскоклеточного рака головы и шеи (SCCHN), разных видов рака мочевого пузыря, разных видов рака молочной железы, разных видов колоректального рака, разных видов рака желудка, глиобластом, разных видов рака почек, разных видов рака легких, включая виды немелкоклеточного рака легких (НМРЛ), меланом, разных видов рака яичников, разных видов рака поджелудочной железы, разных видов рака глотки, разных видов рака предстательной железы, почечноклеточных карцином и детских опухолей из мелких круглых синих клеток, включая нейробластомы и рабдомиосаркомы, которые все активно экспрессируют B7-H3.
[000178] Следует понимать, что В7-Н3-связывающие молекулы и PD-1-связывающие молекулы вводят в концентрации, которая способствует связыванию при физиологических (например, в условиях in vivo) условиях. В7-Н3-связывающие молекулы и PD-1-связывающие молекулы (например, антитела к B7-H3 и антитела к PD-1) можно вводить с дополнительными агентами, которые усиливают или направляют собственный иммунный ответ индивидуума, например, с агентом, который усиливает ADCC или стимулирует Т-клетки.
[000179] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающая молекула и/или PD-1-связывающая молекула может быть конъюгирована или связана с радиоактивной молекулой, токсином (например, калихеамицином), химиотерапевтической молекулой, липосомами или другими везикулами, содержащими химиотерапевтические соединения, и введена индивидууму, нуждающемуся в таком лечении, для нацеливания указанных соединений к раковой клетке, содержащей антиген, распознаваемый В7-Н3-связывающей молекулой, и устранения тем самым рака или пораженных клеток. Не желая быть связанными соответствием какой-либо конкретной теории, авторы настоящего изобретения полагают, что В7-Н3-связывающая молекула (например, антитело к B7-H3) подвергается интернализации клетками, несущими B7-H3 на своей поверхности, доставляя тем самым конъюгированный фрагмент в клетку для индукции терапевтического действия, при этом PD-1-связывающая молекула, способствует активации иммунной системы.
[000180] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающую молекулу и PD-1-связывающую молекулу (например, антитела к B7-H3 и антитела к PD-1) можно применять в качестве адъювантной терапии во время хирургического удаления опухоли, чтобы замедлить, подавить или предотвратить развитие метастазов. Молекулы также могут быть введены до хирургического вмешательства (неоадъювантная терапия), чтобы уменьшить размер опухоли и тем самым обеспечить возможность проведения или упростить хирургическое вмешательство, сберечь ткань во время хирургического вмешательства и/или уменьшить любой дефект, возникший в результате вмешательства.
[000181] Молекулы, содержащие домен Fc с увеличенной аффинностью в отношении FcγRIIIA и/или FcγRIIA и необязательно уменьшенной аффинностью в отношении FcγRIIB, могут приводить к усиленному активирующему ответу при связывании с FcγR и, следовательно, повышают терапевтическую эффективность лечения и/или предотвращения рака. Соответственно, В7-Н3-связывающие молекулы, содержащие вариант домена Fc, являются особенно подходящими для лечения и/или предотвращения заболевания или расстройства (например, рака), при котором желательной является функция эффекторных клеток (т.е., ADCC), опосредованная FcγR. Например, В7-Н3-связывающая молекула с усиленным связыванием с FcγRIIIA может связываться с поверхностным антигеном клетки и FcγRIIIA на иммунной эффекторной клетке (например, NK-клетке), стимулируя эффекторную функцию (например, ADCC, CDC, фагоцитоз, опсонизацию и т.д.), направленную на клетку. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения В7-Н3-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению являются особенно подходящими для лечения разных видов рака. Эффективность стандартной терапии моноклональными антителами зависит от полиморфизма FcγR субъекта. Cartron, G. et al. (2002) «Therapeutic Activity Of Humanized Anti - CD20 Monoclonal Antibody And Polymorphism In IgG Fc Receptor FcgammaRIIIa Gene», Blood 99:754-758; Weng, W.K. et al. (2003) «Two Immunoglobulin G Fragment С Receptor Polymorphisms Independently Predict Response To Rituximab In Patients With Follicular Lymphoma», J Clin Oncol. 21(21):3940-3947. Указанные рецепторы экспрессируются на поверхности эффекторных клеток и опосредуют ADCC. Высокоаффинные аллели улучшают способность эффекторных клеток выступать посредниками ADCC. В частности, В7-Н3-связывающие молекулы согласно настоящему изобретению, содержащие вариант домена Fc, который проявляет повышенную аффинность в отношении FcγRIIIA (по сравнению с доменом Fc дикого типа) на эффекторных клетках, являются лучшими иммунотерапевтическими реагентами для пациентов, независимо от полиморфизма FcγR у пациента.
G. Введение и доза
[000182] Комбинация В7-Н3-связывающей молекулы и PD-1-связывающей молекулы может быть обеспечена для лечения, профилактики и улучшения одного или более симптомов, связанных с раком или другим заболеванием, или расстройства путем введения субъекту эффективного количества указанной комбинации или фармацевтической композиции (композиций), содержащей указанную комбинацию. Согласно любому из вариантов реализации, представленных ниже, рак предпочтительно представляет собой рак, экспрессирующий B7-H3.
[000183] В настоящей заявке термин «комбинация» относится к использованию более чем одного терапевтического агента (например, В7-Н3-связывающей молекулы и PD-1-связывающей молекулы). Использование термина «комбинация» не ограничивает порядок, в котором терапевтические агенты вводят субъекту с расстройством, а также не означает, что агенты вводят точно в одно и то же время, однако указанный термин означает, что агенты вводят субъекту в последовательности и в течение промежутка времени так, что агенты могут действовать, чтобы обеспечить большую пользу, чем в случае введения агентов иным образом. Например, каждый терапевтический агент (т.е., В7-Н3-связывающую молекулу и PD-1-связывающую молекулу) можно вводить в одно и то же время или последовательно в любом порядке и/или в разные моменты времени так, чтобы обеспечить желательное терапевтическое или профилактическое действие. Помимо этого каждый агент не нужно вводить на протяжении всего курса лечения. Например, оба агента могут быть введены в течение определенного периода времени, после которого введение одного агента прекращают. Каждый терапевтический агент можно вводить по отдельности, в любой подходящей форме и любым подходящим путем, например, один агент может быть введен пероральным путем и другой агент может быть введен парентеральным путем.
[000184] Доступны различные системы доставки и пути введения для обеспечения комбинации В7-Н3-связывающей молекулы и PD-1-связывающей молекулы. Системы доставки, которые могут быть использованы для введения В7-Н3-связывающей молекулы и PD-1-связывающей молекулы, включают, но не ограничиваются ими, инкапсулирование в липосомах, микрочастицах, микрокапсулах, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или гибридный белок, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987) «Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System», J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения В7-Н3-связывающей молекулы и PD-1-связывающей молекулы включают, но не ограничиваются ими, парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и через слизистую оболочку (например, интраназальный и пероральный пути). Согласно конкретному варианту реализации настоящего изобретения молекулы вводят внутримышечным, внутривенным или подкожным путем. Композиции могут быть введены любым удобным путем, например, с помощью инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или кожнослизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.) и могут быть введены совместно с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным. Помимо этого можно применять легочное введение, например, с использованием ингалятора или распылителя и состава с аэрозольным агентом. См., например, патенты США №№6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540; и 4880078; и РСТ публикации WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; и WO 99/66903, которые все полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.
[000185] Лечение субъекта с использованием терапевтически или профилактически эффективного количества В7-Н3-связывающей молекулы и/или PD-1-связывающей молекулы может включать однократное введение или предпочтительно может включать несколько введений. Например, субъект может получать лечение с применением В7-Н3-связывающей молекулы и/или PD-1-связывающей молекулы один раз в неделю, два раза в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз каждые шесть недель, один раз каждые два месяца в течение от 2 до 52 недель. Следует понимать, что эффективная доза молекул, используемых для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в течение курса конкретного лечения. Согласно настоящему изобретению В7-Н3-связывающую молекулу и PD-1-связывающую молекулу не требуется вводить одновременно или с одинаковыми интервалами или с использованием одинакового количества введений.
[000186] Предпочтительно В7-Н3-связывающую молекулу и PD-1-связывающую молекулу вводят с использованием схемы лечения, включающей одну или более доз, которые вводят в течение 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 6 недель, 8 недель или более 8 недель. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения схема лечения включает прерывистое введение доз эффективного количества указанных молекул (например, введение дозы на первой неделе и четвертой неделе и перерыв во введении доз молекулы на второй неделе или третьей неделе). Как правило, применяют 1, 2, 3, 4, 5 или более 5 курсов лечения. Каждый курс может представлять собой одну схему лечения или включать различные схемы лечения.
[000187] Доза В7-Н3-связывающей молекулы, PD-1-связывающей молекулы или комбинации указанных молекул, вводимая пациенту, как правило, составляет по меньшей мере приблизительно 1,0 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 3 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 5 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 15 мг/кг массы тела или по меньшей мере приблизительно 20 мг/кг. Для антител, включенных в область настоящего изобретения, вводимая пациенту доза, как правило, составляет от 1,0 мг/кг до 20 мг/кг массы тела пациента. Предпочтительно вводимая пациенту доза составляет от 1,0 мг/кг до 20 мг/кг, от 1,0 мг/кг до 10 мг/кг, от 1,0 мг/кг до 5 мг/кг, от 2,0 мг/кг до 20 мг/кг или от 5 мг/кг до 20 мг/кг массы тела пациента. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения вводимая пациенту доза составляет от 1 мг/кг до 15 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту вводимая пациенту доза составляет 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, 6 мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг или 15 мг/кг, 16 мг/кг, 17 мг/кг, 18 мг/кг, 19 мг/кг, или 20 мг/кг массы тела. Рассчитанная доза будет введена на основании массы тела пациента в начале исследования. При значительном (≥10%) изменении массы тела относительно начальных условий или установленного плато массы тела доза должна быть пересчитана.
[000188] В другом варианте фиксированную дозу В7-Н3-связывающей молекулы, PD-1-связывающей молекулы или комбинации указанных молекул вводят пациенту независимо от массы тела. Для антител, включенных в область настоящего изобретения, фиксированная доза, вводимая пациенту, как правило, составляет от 50 до 500 мг. Предпочтительно фиксированная доза, вводимая пациенту, составляет от 50 до 300 мг, от 100 мг до 300 мг или от 100 мг до 200 мг. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения фиксированная доза, вводимая пациенту, составляет 100 мг, 200 мг или 300 мг.
[000189] Согласно различным вариантам реализации настоящего изобретения первый терапевтический агент (например, антитело к B7-H3 или антитело к PD-1) можно вводить субъекту, имеющему расстройство, до (например, за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), одновременно или после (например, через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) введения второго (или последующего) терапевтического агента (например, антитела к B7-H3 или антитела к PD-1). Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения два или более агентов вводят пациенту во время одного и того же визита.
[000190] Согласно настоящему изобретению В7-Н3-связывающую молекулу и PD-1-связывающую молекулу можно вводить в разных дозах, в разных концентрациях, в разное время и/или в соответствии с разными схемами лечения.
[000191] Несмотря на то, что, как обсуждалось выше, различные схемы дозирования и пути введения можно применять для обеспечения комбинации молекулы, которая специфично связывается с B7-H3, и молекулы, которая специфично связывается с PD-1, субъектам, получающим лечение, нуждающимся в этом, в соответствии с настоящим изобретением некоторые комбинации, схемы дозирования и пути введения являются особенно предпочтительными для использования в указанном лечении. Особенно предпочтительным является использование антитела к B7-H3 (например, hBRCA84D-2) по отдельности и в комбинации с антителом к PD-1 (например, пембролизумабом) в соответствии с указанной схемой дозирования и путем введения.
[000192] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дозу антитела к B7-H3 вводят еженедельно в комбинации с дозой антитела к PD-1, которое вводят каждые две или три недели (причем каждое введение указанной комбинированной схемы лечения называется в настоящем документе «цикл»). Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 вводят еженедельно в дозе от 1 до 15 мг/кг массы тела пациента, предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 мг/кг массы тела. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело к PD-1 вводят в дозе от 1 до 10 мг/кг массы тела пациента, предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг массы тела или фиксированную дозу 100, 200 или 300 мг антитела к PD-1 вводят один раз каждые две или три недели до момента развития ремиссии заболевания или неконтролируемой токсичности.
[000193] Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 еженедельно вводят субъекту путем внутривенной инфузии, и антитело к PD-1 вводят субъекту путем внутривенной инфузии каждые две или три недели в течение по меньшей мере 1 месяца или более, по меньшей мере 3 месяцев или более или по меньшей мере 6 месяцев или более, или по меньшей мере 12 месяцев или более. Особенно предпочтительной является продолжительность лечения по меньшей мере 6 месяцев или более, или по меньшей мере 12 месяцев или более, или до момента развития ремиссии заболевания или неконтролируемой токсичности. В случае внутривенного введения один раз каждые две или три недели антитело к B7-H3 и антитело к PD-1 можно вводить совместно или последовательно. Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 и антитело к PD-1 вводят субъекту последовательно путем внутривенной инфузии с интервалом между введениями не более 48 часов. При указанном последовательном введении антитело к B7-H3 может быть введено до, или после, введения антитела к PD-1.
[000194] Особенно предпочтительным является введение субъекту нескольких доз комбинированной терапии с применением антитела к B7-H3 и антитела к PD-1. Соответственно, схема лечения может включать 1 цикл, по меньшей мере 2 цикла или более 2 циклов, по меньшей мере 3 цикла или более 3 циклов, по меньшей мере 4 цикла или более 4 циклов, по меньшей мере 5 циклов или более 5 циклов или по меньшей мере 6 циклов или более 6 циклов. Доза каждого антитела в каждом указанном цикле может быть одинаковой или может отличаться от введенной ранее дозы.
[000195] Предпочтительно введение антител осуществляют способом, отличным от внутривенной быстрой струйной или болюсной инфузии, в частности, указанное введение осуществляют путем внутривенной инфузии. Соответственно, антитела предпочтительно разбавляют в инфузионном мешке, содержащем подходящий разбавитель, например, 0,9% хлорид натрия. Поскольку может развиться реакция на инфузию или аллергическая реакция, рекомендуется проведение премедикации для предотвращения таких реакций на инфузию, и при введении антител следует соблюдать меры предосторожности, чтобы предотвратить развитие анафилаксии. Особенно предпочтительным является осуществление внутривенной инфузии субъекту в течение периода от 30 минут до 24 часов. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения внутривенную инфузию предпочтительно осуществляют в течение периода 30-180 минут или 30-120 минут, или 30-90 минут, или в течение 60 минут или в течение меньшего периода, если субъект не проявляет признаков или симптомов нежелательной реакции на инфузию.
[000196] Соответственно, согласно настоящему изобретению обеспечен предпочтительный способ лечения рака, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, комбинации антитела к B7-H3 и антитела к PD-1, при этом указанное антитело к B7-H3 вводят в дозе от 1 до 15 мг/кг массы тела еженедельно, и антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозе 200 мг каждые три недели. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 вводят в дозе 1, 3, 10 или 15 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 вводят в дозе 1 мг/кг еженедельно, и антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозе 200 мг каждые три недели. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 вводят в дозе 3 мг/кг массы тела еженедельно, и антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозе 200 мг каждые три недели. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 вводят в дозе 10 мг/кг массы тела еженедельно, и антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозе 200 мг каждые три недели. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 вводят в дозе 15 мг/кг массы тела еженедельно, и антитело к PD-1 вводят в фиксированной дозе 200 мг каждые три недели. Согласно любому из вышеприведенных вариантов реализации антитело к B7-H3 и антитело к PD-1 вводят путем внутривенной инфузии, и при введении в течение одной и той же недели оба антитела могут быть введены в течение 48 часов, предпочтительно в течение 24-часового периода.
[000197] Согласно настоящему изобретению обеспечен другой предпочтительный способ лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, комбинации антитела к B7-H3 и антитела к PD-1, причем доза антитела к В7-Н3-составляет от 1 до 15 мг/кг массы тела еженедельно, и доза антитела к PD-1 составляет от 1 до 10 мг/кг массы тела каждые две или три недели. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 1, 3, 10 или 15 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к PD-1 составляет 1, 2, 3 или 10 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 1 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 1 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 1 мг/кг, и доза антитела к PD-1 составляет 2 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 1 мг/кг масса тела, и доза антитела к PD-1 составляет 3 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 1 мг/кг, и доза антитела к PD-1 составляет 10 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 3 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 1 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 3 мг/кг масса тела, и доза антитела к PD-1 составляет 2 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 3 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 3 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 3 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 10 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 10 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 1 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 10 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 2 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 10 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 3 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 10 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 10 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 15 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 1 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 15 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 2 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 15 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 3 мг/кг массы тела. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения доза антитела к B7-H3 составляет 15 мг/кг массы тела, и доза антитела к PD-1 составляет 10 мг/кг массы тела. Согласно любому из вышеприведенных вариантов реализации антитело к B7-H3 и антитело к PD-1 вводят путем внутривенной инфузии, и при введении один раз каждые две или три недели оба антитела могут быть введены в течение 48 часов, предпочтительно в течение 24-часового периода.
L
L
L
H
H
H
L
L
L
H
H
H
L
L
L
H
H
H
L
L
L
H
H
H
[000198] Согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 содержит домены CDR1, CDR2, CDR3, CDR1, CDR2 и CDR3 из hBRCA84D, hBRCA69D, PRCA157 или домены CDR1, CDR2, CDR3, CDR1, CDR2 и CDR3 любого из антител к B7-H3, представленных в таблице 5, и антитело к PD-1 содержит домены CDR1, CDR2, CDR3, CDR1, CDR2 и CDR3 из мАТ к PD-1 1, мАТ к PD-1 2, мАТ к PD-1 3, мАТ к PD-1 4, мАТ к PD-1 5, мАТ к PD-1 6, мАТ к PD-1 7, мАТ к PD-1 8 или домены CDR1, CDR2, CDR3, CDR1, CDR2 и CDR3 любого из антител к PD-1, представленных в таблице 6. Согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 представляет собой hBRCA84D-2, и антитело к PD-1 выбрано из антител, представленных в таблице 6. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 представляет собой hBRCA84D-2, и антитело к PD-1 представляет собой пембролизумаб. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 представляет собой hBRCA84D-2, и антитело к PD-1 представляет собой ниволюмаб. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 представляет собой hBRCA84D-2, и антитело к PD-1 представляет собой пидилизумаб. Согласно другому предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 представляет собой hBRCA84D-2, и антитело к PD-1 представляет собой мАТ к PD-1 6-ISQ.
[000199] Согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации настоящего изобретения терапевтические агенты предпочтительно вводят субъекту циклически. Циклическая терапия может уменьшить риск развития резистентности к одному или более терапевтическим средствам, может помочь избегнуть или уменьшить побочные эффекты одного из терапевтических средств и/или повысить эффективность лечения. Примерные циклы включают приблизительно один раз в неделю, приблизительно один раз каждые 10 дней, приблизительно один раз каждые две недели и приблизительно один раз каждые три недели. Каждый цикл может включать по меньшей мере 1 неделю перерыва во введении, по меньшей мере 2 недели перерыва во введении, по меньшей мере 3 недели перерыва во введении и т.д. Количество введенных циклов составляет от приблизительно 1 до приблизительно 12 циклов, более типично от приблизительно 2 до приблизительно 10 циклов и более типично от приблизительно 2 до приблизительно 8 циклов.
[000200] Предпочтительная схема дозирования для терапевтического введения, обеспеченная в любом из вышеупомянутых вариантов реализации настоящего изобретения, включает введение указанной комбинации антитела к B7-H3 и антитела к PD-1 субъекту, получающему лечение, в начальном цикле, и в одном или более последующих циклах. В любом из вышеупомянутых вариантов реализации настоящего изобретения антитело к B7-H3 и антитело к PD-1 вводят в течение одного и того же цикла. Согласно указанным вариантам реализации каждый цикл включает две или три недели, причем антитело к B7-H3 вводят субъекту еженедельно, и антитело к PD-1 вводят субъекту в первую неделю каждого 2 или 3-недельного периода. В другом варианте антитело к B7-H3 и антитело к PD-1 вводят в разных циклах. Согласно указанным вариантам реализации настоящего изобретения каждый цикл для антитела к PD-1 включает две или три недели, причем антитело к PD-1 вводят субъекту в первую неделю каждого 2 или 3-недельного периода. Согласно указанному варианту реализации настоящего изобретения начальный цикл для антитела к B7-H3 предпочтительно составит 8 недель, причем антитело к B7-H3 вводят субъекту еженедельно в течение первых четырех недель указанного 8-недельного начального периода, затем введение антитела субъекту прекращают в течение периода с 5 по 8 неделю указанного начального 8-недельного периода. Каждый последующий цикл предпочтительно включает 4-недельный период, при этом антитело к B7-H3 вводят субъекту еженедельно в течение первых трех недель указанного последующего 4-недельного периода, затем в течение 4 недели указанного последующего 4-недельного периода следует перерыв во введении антитела субъекту. Например, субъект будет получать антитело B7-H3 еженедельно на 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 13, 14, 15 неделе и т.д., причем 1-8 недели представляют собой начальный цикл схемы дозирования, 9-12 недели представляют собой первый последующий цикл, 13-16 недели представляют собой второй последующий цикл и т.д.
I. Способы комбинированной терапии
[000201] В область настоящего изобретения включено введение субъекту комбинации молекулы, которая специфично связывается с B7-H3, и молекулы, которая специфично связывается с PD-1, в виде дополнительной комбинации с другими способами терапии, известными специалистам в данной области техники, для лечения или предотвращения рака, аутоиммунного заболевания, воспаления или инфекционного заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, современные стандартные и экспериментальные способы химиотерапии, способы гормональной терапии, способы биологической терапии, способы иммунотерапии, способы лучевой терапии или хирургическое вмешательство. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения комбинацию В7-Н3-связывающей молекулы и PD-1-связывающий молекулы (например, антитела к B7-H3 и антитела к PD-1) вводят в комбинации с терапевтически или профилактически эффективным количеством одного или более дополнительных терапевтических агентов, известных специалистам в данной области техники для лечения и/или профилактики рака, в частности, рака, экспрессирующего B7-H3.

[000202] Согласно одному варианту реализации способа лечения клеточного пролиферативного расстройства В7-Н3-связывающую молекулу и/или PD-1-связывающую молекулу (например, антитело к B7-H3, антитело к PD-1) конъюгируют или вводят в виде дополнительной комбинации с другим терапевтическим агентом, таким как, но не ограничиваясь ими, алкилирующий агент (например, мехлорэтамин или цисплатин), ингибитор ангиогенеза, антрациклин (например, даунорубицин/дауномицин или доксорубицин), антибиотик (например, дактиномицин, блеомицин или антрамицин), антитело (например, антитело к VEGF, такое как бевацизумаб (продается как AVASTIN Genentech, Inc.), антитело к EGFR, такое как панитумумаб (продается как VECTIBIX™ Amgen, Inc.) или антитело к интегрину, такое как натализумаб (продается как TYSABRI Biogen Idec and Elan Pharmaceuticals, Inc.)), антиметаболит (например, метотрексат или 5-фторурацил), антимитотический агент (например, винкристин или паклитаксел), цитотоксин (например, цитостатический или цитоцидный агент), агент для гормональной терапии (например, селективный модулятор рецептора эстрогена (например, тамоксифен или ралоксифен), ингибитор ароматазы, аналог рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, прогестагенный агент, адренокортикостероид, эстроген, андроген, антиэстрогенный агент, агент, блокирующий рецептор андрогена, ингибитор 5-альфа-редуктазы, ингибитор выработки гормонов надпочечников и т.д.), ингибитор матриксной металлопротеиназы, радиоактивный элемент (например, альфа-источники, гамма-источники и т.д.) или любой другой химиотерапевтический агент.
[000203] Неограничивающие примеры подходящих ингибиторов ангиогенеза включают АВТ-627; ангиостатин (фрагмент плазминогена); ангиозим; антиангиогенный антитромбин III; Bay 12-9566; бенефин; бевацизумаб; BMS-275291; бисфосфонаты; ингибитор, полученный из хряща (CDI); CAI; фрагмент комплемента CD59; СЕР-7055; Col 3; комбретастатин А-4; эндостатин (фрагмент коллагена XVIII); ингибиторы фарнезилтрансферазы (FTI); фрагмент фибронектина; GRO-бета; галофугинон; гепариназы; гексасахаридный фрагмент гепарина; HMV833; хорионический гонадотропин человека (ХГЧ); IM-862; интерферон альфа/бета/гамма; индуцируемый интерфероном белок (IP-10); интерлейкин-12; kringle 5 (фрагмент плазминогена); маримастат; ингибиторы металлопротеиназы (TIMP); 2-метоксиэстрадиол; MMI 270 (CGS 27023А); MoAb IMC-1C11; неовастат; NM-3; панзем; PI-88; ингибитор плацентарной рибонуклеазы; ингибитор активатора плазминогена; тромбоцитарный фактор-4 (PF4); приномастат; фрагмент пролактина массой 16 кДа; родственный пролиферину белок (PRP); PTK 787/ZK 222594; ретиноиды; солимастат; скваламин; SS3304; SU5416; SU6668; SU11248; тетрагидрокортизол-S; тетратиомолибдат; талидомид; тромбоспондин-1 (TSP-1); TNP-470; трансформирующий фактор роста-бета (TGF-b); васкулостатин; вазостатин (фрагмент калретикулина); ZD6126; и ZD 6474.
3
[000204] Неограничивающие примеры дополнительных антител для лечения клеточного пролиферативного расстройства включают антитела к 17-1 A, αvβ, AFP, CD3, CD18, CD20, CD22, CD33, CD44, CD52, CEA, CTLA-4, ДНК-ассоциированным белкам, рецептору ЭФР, Ер-САМ, ганглиозиду GD2, gp IIIb/IIIa, gp72, HLA-DR 10 бета, антигену HLA-DR, IgE, ганглиозиду GD3, MUC-1, nuC242, антигену РЕМ, антигену SK-1, опухолевому антигену СА125, опухолевому антигену MUC1, VEGF и рецептору VEGF.
Примеры
[000205] Настоящее изобретение было описано в общих чертах выше, настоящее изобретение будет более подробно описано при помощи ссылки на следующие примеры, которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения, если не указано иное.
Пример 1
Исследование с повышением дозы комбинации антитела к B7-H3 и антитела к PD-1
[000206] Несмотря на то, что в представленном ниже протоколе исследования с повышением дозы подробно описано использование примерного антитела к B7-H3 «hBRCA84D-2» в комбинации с антителом к PD-1 «пембролизумабом», следует понимать в свете принципов, изложенных в настоящем документе, что аналогичные комбинированные протоколы могут быть разработаны с использованием любых антител к B7-H3 и антител к PD-1, описанных в настоящем документе.
[000207] Исследование с повышением дозы проводили для определения максимальной переносимой дозы (MTD) или максимальной введенной дозы (MAD) (если MTD не определена) для увеличивающихся доз hBRCA84D-2, которые вводили еженедельно в комбинации с пембролизумабом в дозе 2 мг/кг, который вводили каждые три недели. После данного исследования может быть проведена фаза расширения когорты, чтобы дополнительно определить безопасность и начальную эффективность комбинации с дозой hBRCA84D-2, установленной в исследовании с повышением дозы. hBRCA84D-2 вводили еженедельно, и пембролизумаб вводили один раз каждые 3 недели. Один раз каждые три недели агенты вводили в один и тот же день, при этом в первую очередь вводили пембролизумаб и затем hBRCA84D-2. Однако в тех случаях, когда комбинированная доза превышала 2500 мг, антитела следовало вводить в течение последовательных дней. При введении антител в течение последовательных дней пембролизумаб может быть введен в первый день, и антитело hBRCA84D-2 может быть введено на следующий календарный день. Каждый цикл терапии определен как 3 недели, в течение которых hBRCA84D-2 вводили в 1, 8 и 15 день, и пембролизумаб вводили в 1 день. Оценки опухоли можно осуществлять в ходе исследования, предпочтительно в конце первых двух циклов, и в конце каждых последующих трех циклов лечения (т.е., через 6 недель [конец цикла 2] и через 15 недель, 24 недели, 33 недели и т.д. [конец цикла 5, 8, 11, и т.д.]).
[000208] hBRCA84D-2 может быть оценено в трех последовательных возрастающих дозах, 3 мг/кг массы тела, 10 мг/кг и 15 мг/кг массы тела в комбинации с 2 мг/кг пембролизумаба у пациентов когорты. Если определено, что MTD превышена в когорте, получавшей первую дозу, может быть использована когорта для снижения дозы, чтобы оценить более низкую дозу hBRCA84D-2 (1 мг/кг) в комбинации с 2 мг/кг пембролизумаба.
[000209] Для фазы расширения когорты зачисляли дополнительных пациентов, которым вводили hBRCA84D-2 в MTD (или MAD), установленной на этапе исследования с повышением дозы, в комбинации с 2 мг/кг пембролизумаба.
[000210] Пациенты, которые оставались клинически стабильными и не испытывали неприемлемой токсичности, которая требовала окончательного прекращения приема исследуемых препаратов, по завершении первых двух трехнедельных циклов могли получить дополнительное лечение с применением hBRCA84D-2 и пембролизумаба. Пациенты, которые оставались клинически стабильными, статус заболевания которых поддерживался на стабильном или более благоприятном уровне, и которые не имели неприемлемой токсичности, которая требовала окончательного прекращения приема исследуемых препаратов, могли получить дополнительные циклы лечения с применением hBRAC84D-2 и пембролизумаба. Указанное дополнительное лечение может длиться приблизительно один год так, что пациенты могут получить 51 дозу hBRCA84D-2 и 17 доз пембролизумаба.
[000211] Все публикации и патенты, упомянутые в настоящем документе, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или заявка на патент была конкретно и индивидуально указана для полного включения посредством ссылки. Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано применительно к конкретными вариантами реализации, следует понимать, что оно может быть дополнительно модифицировано, и подразумевается, что настоящая заявка включает любые изменения, способы применения или адаптации настоящего изобретения, следуя в целом принципам настоящего изобретения и включая такие отклонения от сущности настоящего изобретения, которые входят в известную или стандартную практику в области, к которой относится настоящее изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, изложенным выше.