СМЯГЧАЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕВЕНТИВНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ
EMOLLIENT COMPOSITION FOR PREVENTIVE EFFECT IN ATOPIC DERMATITIS

Настоящее изобретение относится к области атопии и лечения поражений, ассоциированных с ней.
Атопия определяется как наследственная предрасположенность к реакциям на симптоматическом уровне (как заболевание) на различные аллергены, такие как домашняя пыль, клещи, пыльца, шерсть животных и т.д. Поражения, считающиеся атопическими, включают атопический дерматит (AD), аллергическую бронхиальную астму и аллергический ринит или "поллиноз".
Атопический дерматит (или атопическая экзема) является часто встречающимся дерматологическим заболеванием, поражающим 10-15% детей младшего возраста во Франции, и это количество увеличивалось за последние десятилетия.
Атопический дерматит представляет собой хроническое заболевание, развитие которого сопровождается высыпаниями, прерываемыми периодами ремиссии, в течение которых всегда присутствуют, но в минимальной степени, участки поражения, главным образом проявляющиеся в виде ксероза (сухости кожи) и зуда.
Воспаление кожи характеризуется высыпаниями, проявляющимися в виде воспалительных признаков и симптомов, включающих красные пятна (эритему), пузырьки, корки, экссудацию и чесотку.
Как правило, данное заболевание возникает в возрасте от 3 месяцев до 2 лет, но может начаться даже раньше, в возрасте от 1 месяца. Его развитие протекает по благоприятному сценарию с полной ремиссией, в большинстве случаев наблюдаемой в возрасте от 5 до 8 лет. Возможно возобновление заболевания в подростковом или молодежном возрасте. В 15-20% случаев заболевание может сохраняться в зрелом возрасте.
Также возможно развитие в сторону другого атопического поражения. Наличие AD в детском возрасте увеличивает риск развития астмы, и существует четкая корреляция между частотой возникновения AD и частотой возникновения астмы. Риск возникновения астмы у ребенка, страдающего AD, предположительно составляет 30-40%.
Риск возникновения пищевой аллергии, наиболее часто начинающейся в возрасте до 3 лет, или аллергического ринита, возникающего позже, в разных исследованиях оценен по-разному.
Что касается атопического дерматита, то существует выраженная генетическая предрасположенность с риском развития заболевания 30-50%, если заболеванием поражен один из родителей, и с риском, близким 80%, если поражены оба родителя. Генетическая предрасположенность обусловлена большим числом генов, кодирующих либо детерминанты, связанные с защитной функцией эпидермиса, либо факторы, отвечающие за врожденный или приобретенный иммунитет. С учетом многочисленных последних исследований можно принять как аксиому, что AD (или другие сходные атопические заболевания) связаны с первичным нарушением защитной функции эпидермиса, отвечающим за повышение проницаемости в отношении агентов окружающей среды (аллергенов и микроорганизмов), отвечающим за иммунологическую активацию и аллергические симптомы.
Нарушение проницаемости эпидермиса проявляется в виде ксероза кожи и в увеличении неощущаемой потери воды и является подтверждением полиморфизма генов, кодирующих эпидермальные белки, такие как филагрин (FLG), принимающие участие в защитной функции эпидермиса (Palmer, 2006). Недавнее исследование во Франции подтверждает связь полиморфизма гена FLG c AD, с относительным риском, превышающим 3 (Hubiche, 2007).
Атопию можно рассматривать как запаздывающую реакцию гиперчувствительности при контакте с аллергенами окружающей среды. Как правило, она проявляется в двух фазах. Во время первой клинически бессимптомной фазы сенсибилизации образуются специфические для кожи Т-лимфоциты. Эта сенсибилизация происходит вследствие облегченного ксерозом проникновения аллергенов из окружающей среды в кожу. Вторая фаза активации специфических Т-лимфоцитов вызывает продуцирование провоспалительных цитокинов.
В целом, внешние признаки атопического дерматита являются результатом сложных взаимодействий между факторами окружающей среды, фармакологических нарушений, дисфункций или изменений защитных функций кожи, иммунологических процессов и генетической предрасположенности.
По-видимому, среди многочисленных факторов в хроническом характере патологии играют роль кожная гиперреактивность, ненадлежащий иммунный ответ на различные микроорганизмы, а также вторичные инфекции.
Становится все более известной роль кожной флоры в возникновении и/или поддержании активации иммунной системы, способствующей развитию экзематозных поражений. Изменение защитной функции кожи связано с некоторым иммунодефицитом у пациентов, пораженных атопическим дерматитом, обусловленным колонизацией штаммом Staphylococcus aureus, который колонизирует кожу 90% пациентов с AD, даже без прогрессирующих высыпаний при данном заболевании (Current Opinion in Allergy and Clinical Immunol. 2007, 7, 413).
Существует корреляция между тяжестью заболевания и плотностью колонизации стафилококками, с одной стороны, и положительной пробой на специфические IgE (иммуноглобулины Е) против токсинов стафилококков, с другой стороны (J. Allergy Clin. Immunol. 2006, 117, 1141; Am. J. Clin. Dermatol., 2006, 7, 273; Clin. Rev. Allergy Immunol., 2007, 33, 167; Current Opinion Allergy and Clinical Immunol. 2004, 4, 373).
Эти факты позволяют предположить, что золотистый стафилококк играет роль в развитии местной активации иммунной системы, ответственной за проявление внешних признаков атопического дерматита на коже и возможно аллергической сенсибилизации.
Помимо расчесывания существует много факторов, стимулирующих колонизацию Staphylococcus aureus посредством изменения системы первичной защиты кожи и прежде всего посредством изменения липидного состава рогового слоя. Таким образом, данное изменение защитной функции кожи ответственно за колонизацию стафилококками и также за увеличение потери кожей воды, что вызывает ксероз, раздражение, чесотку, создавая тем самым разновидность психопатологического порочного круга.
Терапевтическое лечение атопического дерматита может быть рассмотрено на различных уровнях, главным образом на симптоматическом уровне, но также и на профилактическом уровне. На сегодняшний день не имеется никакого куративного лечения данного заболевания.
Помимо устранения идентифицированных аллергенов, что по возможности желательно, дополнением к симптоматическому лечению высыпаний с применением местной кортикотерапии, которая считается стандартной терапией этого заболевания, является увлажнение кожи как средства для восстановления или поддержания ее защитной роли. Для лечения высыпаний также можно использовать другие местные нестероидные противовоспалительные агенты (в частности ингибиторы кальциневрина). И наконец, в случае тяжелых форм заболевания резервными являются фототерапия, пероральные иммуносупрессоры или другие экстенсивные системные терапии.
Однако применение кортикоидов, противовоспалительных средств и/или иммуносупрессоров, даже путем местного введения, в частности, детям младшего или ясельного возраста, не является тривиальным, вызывает нежелательные эффекты и представляет собой только лишь симптоматическое лечение.
С другой стороны, существует боязнь применения кортикоидов, что не облегчает лечения этого заболевания и не способствует соблюдению режима терапии пациентами, который часто не выдерживается.
И наконец, Staphylococcus aureus могут вызывать резистентность к кортикоидам (Clin. Rev. Allergy Immunol. 2007, 33, 167).
Таким образом, существует необходимость и огромная потребность в терапевтических альтернативах и, более конкретно, в превентивных лечениях. Эти лечения имеют целью снижение частоты возникновения и/или интенсивности экзематозных высыпаний, которые наблюдаются у пациентов, пораженных атопическим дерматитом. Согласно определению ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) этот подход является третичным превентивным актом, поскольку он направлен на то, чтобы избежать осложнений (воспалительных сыпей) заболевания (атопического дерматита), которое уже имеется.
В заявке WO 2008048076 описано применение глюкозамина или одного из его производных для лечения атопического дерматита.
В заявке WO 2007023226 описано применение пробиотика, объединенного с пребиотиком, для лечения атопического дерматита у детей.

В ходе данной работы было замечено, что довольно удивительно и неожиданно комбинация глицерина, вазелина и вазелинового масла в форме эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле делает возможным предупреждение атопического дерматита.
Авторы изобретения продемонстрировали ингибирующий эффект этой комбинации на адгезию Staphylococcus aureus к кератиноцитам в культуре. Таким образом, комбинация глицерина, вазелина и вазелинового масла делает возможным предупреждение инфицирущего действия Staphylococcus aureus у пациентов с атопией, а также их действия в поддержании воспалительной реакции, за счет образования специфических IgE, ингибирующих колонизацию кожи микроорганизмами Staphylococcus aureus.
Кроме того, авторы изобретения продемонстрировали, что эта комбинация восстанавливает защитную и функциональную изолирующую роль кожи. Для этого авторы изобретения использовали модель индуцированного обезвоживания кожи ex vivo. Кроме того, они контролировали экспрессию эпидермальных маркеров и активность сериновых протеаз.
Следовательно, задачей настоящего изобретения является композиция для местного применения, содержащая, в качестве активного ингредиента, комбинацию глицерина, вазелина и вазелинового масла в виде эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле, с целью ее применения для предупреждения атопического дерматита.
Предпочтительно, чтобы данное предупреждение представляло собой предупреждение первичного типа.
В рамках настоящего изобретения термины "предупреждают", "предупреждение" или "превентивное лечение" означают предотвращение возникновения заболевания, расстройства или одного или нескольких признаков и/или симптомов.
В рамках настоящего изобретения термин "первичное предупреждение" или "первичное превентивное лечение" означает предупреждение возникновения атопических заболеваний (атопического дерматита, и/или аллергической бронхиальной астмы, и/или аллергического ринита, обычно называемого "поллинозом") и/или аллергической сенсибилизации посредством оказания действия до проявления первых клинических признаков атопии, то есть до начала заболевания.
В рамках настоящего изобретения комбинация глицерина, вазелина и вазелинового масла в виде эмульсии типа масло-в-воде или вода-в-масле будет называться "активной комбинацией".
Предпочтительно, глицерин, вазелин и вазелиновое масло удовлетворяют критериям, которые описываются и контролируются в соответствии с "Европейской фармакопеей" 6-го издания.
Предпочтительно, вазелин активной комбинации имеет температуру каплепадения, составляющую от 35 до 70°С, предпочтительно составляющую от 51 до 57°С, более предпочтительно примерно 54°С. Температуру каплепадения измеряют в соответствии с методом 2.2.17, описанным в "Европейской фармакопее" 6-го издания.
Предпочтительно, вазелин активной комбинации имеет консистенцию, составляющую от 175 до 195 1/10 мм, предпочтительно примерно 185 1/10 мм (конусная пенетрация при 25°С).
Предпочтительно, вазелин активной комбинации имеет вязкость, составляющую от 4 до 5 сСт (сантистокс) при 100°С, предпочтительно примерно 4,8 сСт при 100°С.
В композициях по изобретению доля активной комбинации составляет от 10 до 50% и предпочтительно от 20 до 30% по массе из расчета на общую массу композиции; концентрация глицерина составляет от 5 до 30%, предпочтительно от 10 до 20% и более предпочтительно составляет примерно 15% по массе из расчета на общую массу композиции; концентрация вазелина составляет от 3 до 20%, предпочтительно от 5 до 10% и более предпочтительно составляет примерно 8% по массе из расчета на общую массу композиции, а концентрация вазелинового масла составляет от 0,5 до 5%, предпочтительно от 1 до 3% и более предпочтительно составляет примерно 2% по массе из расчета на общую массу композиции.
В водной фазе вода составляет от 30 до 80% по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, композиция по изобретению содержит примерно 15% глицерина, примерно 8% вазелина и примерно 2% вазелинового масла по массе из расчета на общую массу композиции.
Дерматологическая композиция по изобретению дополнительно содержит стандартные дерматологически совместимые эксципиенты.
Дерматологическая композиция по настоящему изобретению может быть приготовлена в виде эмульсии типа масло-в-воде (W/O) или вода-в-масле (O/W), в виде множественной эмульсии, такой как, например, эмульсия типа вода/масло/вода (W/O/W) или эмульсия типа масло/вода/масло (O/W/O), или также в виде гидродисперсии или липодисперсии, геля или аэрозоля.
Дерматологически совместимыми эксципиентами может быть любой эксципиент среди эксципиентов, известных специалисту в данной области техники для приготовления композиции для местного применения в виде крема, лосьона, геля, мази, эмульсии, микроэмульсии, спрея и т.д.
В частности, композиция по изобретению может содержать добавки и вспомогательные вещества к композициям, такие как эмульгаторы, загустители, гелеобразующие агенты, влагоудерживающие агенты, усиливающие растекание агенты, стабилизаторы, красители, отдушки и консерванты.
Подходящие эмульгаторы включают стеариновую кислоту, троламин, ПЭГ-40-стеарат.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется примерно 5% эмульгаторов по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется от 1 до 5% стеариновой кислоты, предпочтительно примерно 3% по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется от 0 до 2% троламина, предпочтительно примерно 0,5% по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется от 0 до 2% ПЭГ-40-стеарата, предпочтительно примерно 0,5% по массе из расчета на общую массу композиции.
Подходящие загустители включают глицерина моностеарат, ПЭГ.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется примерно 5% загустителей по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется от 2 до 10% глицерина моностеарата, предпочтительно примерно 5% по массе из расчета на общую массу композиции.
Подходящие консерванты включают пропил-парагидроксибензоат, хлоркрезол.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется примерно 0,1% консервантов по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется от 0,05 до 1% пропил-парагидроксибензоата, предпочтительно примерно 0,1% из расчета на общую массу композиции.
Подходящие усиливающие растекание агенты включают диметикон, полидиметилциклосилоксан.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется примерно 2% усиливающих растекание агентов по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется от 0,2 до 2% диметикона, предпочтительно примерно 0,5% по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется от 1 до 3% полидиметилциклосилоксана, предпочтительно примерно 2,5% по массе из расчета на общую массу композиции.
Подходящие влагоудерживающие агенты включают полиэтиленгликоль, предпочтительно полиэтиленгликоль 600.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется примерно 8% влагоудерживающих агентов по массе из расчета на общую массу композиции.
Предпочтительно, в композиции по изобретению имеется от 2 до 10% полиэтиленгликоля, предпочтительно примерно 5% по массе из расчета на общую массу композиции.
Водой, используемой для водной фазы эмульсии, может быть дистиллированная вода или термальная вода, обладающая дермато-косметическими свойствами.
Предпочтительно, композиция по изобретению содержит:
- примерно 15% глицерина,
- примерно 8% вазелина,
- примерно 2% вазелинового масла, и в качестве эксципиентов:
- примерно 1-5% стеариновой кислоты,
- примерно 2-10% глицерина моностеарата,
- примерно 1-3% полидиметилциклосилоксана,
- примерно от 0,2% до 2% диметикона,
- примерно 2-10% полиэтиленгликоля 600,
- примерно 0-2% троламина,
- примерно 0,05-1% пропил-парагидроксибензоата,
- воду до 100%.
Кроме того, настоящим изобретением решается задача применения композиции по изобретению для изготовления лекарственного средства, предназначенного для предупреждения атопического дерматита.
Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими далее примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Композиции
Композиция A
- 15 г глицерина,
- 8 г вазелина,
- 2 г вазелинового масла,
- 0,5 гтроламина,
- и в качестве эксципиентов: стеариновая кислота, глицерина моностеарат, полидиметилциклосилоксан, диметикон, полиэтиленгликоль (ПЭГ) 600, пропил-парагидроксибензоат,
- вода до 100 г.
Композиция A'
- 15 г глицерина,
- 8 г вазелина,
- 2 г вазелинового масла,
- 1,5 г стеариновой кислоты,
- 5 г глицерина моностеарата,
- 1,5 г полидиметилциклосилоксана,
- 0,5 г диметикона,
- 5 г полиэтиленгликоля 600,
- 0,15 г троламина,
- 0,1 г пропилпарагидроксилбензоата,
- вода до 100 г.
Композиция B
- 15 г глицерина,
- 8 г вазелина,
- 2 г вазелинового масла,
- 0,5 г ПЭГ-40-стеарата,
- и в качестве эксципиентов: стеариновая кислота, глицерина моностеарат, полидиметилциклосилоксан, диметикон, полиэтиленгликоль (ПЭГ) 600, хлоркрезол,
- вода до 100 г.
Композиция B'
- 15 г глицерина,
- 8 г вазелина,
- 2 г вазелинового масла,
- 3 г стеариновой кислоты,
5 г глицерина моностеарата,
- 2 г полидиметилциклосилоксана,
- 0,5 г диметикона,
- 0,1 г троламина,
- 3 г полиэтиленгликоля 600,
- 0,5 г ПЭГ-40-стеарата,
- 0,075 г хлоркрезола,
- вода до 100 г.
Пример 2: тест на цитотоксичность
Принцип
Принцип теста основан на ферментативном превращении соли тетразолия, "натриевой соли 3,3-[1-[(фениламино)карбонил]-3,4-тетразолий-бис(4-метокси-6-нитро)]бензол-сульфоновой кислоты гидрата", то есть ХТТ, в окрашенный продукт формазан.
ХТТ восстанавливается под действием митохондриальной дегидрогеназы живых клеток в присутствии донора электронов, кофермента Q, до водорастворимого соединения формазана желто-оранжевой окраски, что можно измерить количественно спектрофотометрически на 450 нм.
Обработка продуктом
5
96-луночные микропланшеты засевают клетками в количестве 10/мл, через 24 часа инкубации культуральную среду удаляют и микропланшеты промывают PBS (забуференным фосфатом физиологическим раствором). В каждую лунку микропланшетов добавляют по 100 мкл тестируемого продукта в разных разведениях. В тех же условиях готовят контроли без какого-либо продукта.
2
Микропланшеты помещают для проведения инкубации в течение 2 часов при 37°C в атмосфере 5% CO.
Выявление цитотоксичности
После инкубации микропланшеты дважды промывают PBS. Затем в каждую лунку 96-луночного планшета добавляют по 100 мкл смеси ХТТ (1 мг/мл)/кофермента Q (0,2 мг/мл).
Через 3 часа инкубации в каждую лунку добавляют по 100 мкл 10%-го раствора SDS (додецилсульфата натрия).
Незамедлительное считывание оптической плотности (OD) при 450 нм осуществляют с использованием спектрофотометра POLARstar (BMG, France).
Представление результатов
Измеренная оптическая плотность пропорциональна количеству жизнеспособных клеток.
Таким образом, с помощью этого теста авторы изобретения получили возможность анализировать на основании сравнения с оптической плотностью, соответствующей контролю, клеточную цитотоксичность, когда оптическая плотность меньше таковой в контрольной пробе:
% жизнеспособности = (OD после обработки - OD контроля)/OD контроля × 100.
Продукт считается токсичным, если процент жизнеспособности составляет ≤30%.
Внутренние базовые тесты проводят 8 раз.
Результаты
В зависимости от степени не-цитотоксичности продуктов для теста на адгезию выбраны следующие концентрации:
- композиция A: 6%, 3%, 1,5%, 0,8% и 0,4%;
- Atopiclair: 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1% и 0,05%;
- Physiogel: 6%, 3%, 1,5%, 0,8% и 0,4%;
- композиция B: 3%, 1,5%, 0,8%, 0,4% и 0,2%.
Пример 3. Тест на адгезию
Принцип
Введение метки в бактерии с использованием меченного тритием аденина (Sigma) и определение доли бактерий, прикрепившихся в результате адгезии к поверхности кератиноцитов, посредством оценки уровня радиоактивности.
Введение метки в бактерии с использованием меченного тритием аденина
Введение метки в бактерии осуществляют в присутствии 30 мкКи меченного тритием аденина в соответствующей культуральной среде. После инкубации в течение 18 часов при 37°C микроорганизмы промывают три раза в PBS для удаления не включившейся радиоактивной метки.
8
Суспензии подводят до 2×10 микроорганизмов/мл в поддерживающей среде.
Эффект ингибирования адгезии
На поверхность клеточного слоя наносят по 500 мкл суспензии меченых бактерий в присутствии каждого тестируемого разведения продукта.
2
Через 2 часа инкубации (37°C, 5% CO) выполняют 3 промывки, используя PBS.
Лизис клеток
Бактерии, прикрепившиеся в результате адгезии к кератиноцитам, лизируют с помощью 500 мкл 0,5 н. раствора гидроксида натрия с 0,1% додецилсульфата натрия в течение 18 часов при 37°C.
Из каждой лунки отбирают лизат и помещают в сцинтилляционные флаконы. В каждый флакон добавляют по 2 мл жидкого сцинтиллятора.
Представление результатов
Снятие показаний осуществляют, используя счетчик β-излучения, и результаты выражают в виде уровня радиоактивности в cpm (число импульсов в минуту).
Процент ингибирования адгезии рассчитывают в соответствии с формулой:
% ингибирования = ((cpm в тесте - cpm в контроле)/cpm в контроле × 100.
Процент ингибирования адгезии является существенным, если его величина составляет ≤ -30%.
Эти тесты выполняют в четырех повторах.
Заключение
- Композиция A значительно ингибирует адгезию S. aureus к кератиноцитам через 2 часа инкубации при концентрации 6% и 3%.
- Продукт Physiogel значительно ингибирует адгезию S. aureus к кератиноцитам через 2 часа инкубации при концентрации 6%, но не при 3%.
- Продукт Atopiclair не оказывает никакого эффекта на адгезию S. aureus к кератиноцитам.
- В присутствии композиции B адгезия S. aureus к кератиноцитам аномально повышена.
Пример 4: анализ регуляции индуцированного обезвоживания кожи
Здесь авторы изобретения оценивают увлажняющую активность композиции A и последующее улучшение защитной функции кожи, используя модель индуцированного обезвоживания кожи ex vivo.
Авторы изобретения наблюдают за экспрессией различных молекулярных эпидермальных маркеров с помощью количественной ПЦР (полимеразной цепной реакции) и иммуногистохимического анализа.
Кроме этого авторы изобретения отслеживают активность ферментов -сериновых протеаз, используя зимографию in situ, и деградацию десмосомальных белков роговой оболочки, используя вестерн-блоттинг.
Функциональность кожного барьера анализируют, используя флуоресцентные зонды.
Оборудование и методы
I. Модели ткани
1. Подготовка эксплантатов кожи
Лаборатория получает образцы кожи из отходов после операций пластической хирургии (по уменьшению молочной железы). Использование этих образцов подпадает под "Декларацию о деятельности по консервации и препарированию элементов человеческого тела для нужд научной программы группы Пьера Фабра" ("the declaration of an activity for preserving and preparing elements of the human body for the needs of a research program of the Pierre Fabre group"), утвержденной министерством высшего образования и научных исследований Франции.
Эти образцы промывают в 10 промывках PBS и затем с помощью штампа высекают диски диаметром 2 см. Эксплантанты кожи расстилают на сетке в чашке Петри и, чтобы ограничить площадь обработки, на кожу герметично накладывают кольцо диаметром 1 см.
2. Кинетики моделей
Для индуцирования модели обезвоживания кожу сушат в течение 2 часов в вытяжном шкафу для клеточных культур в чашке без крышки и затем помещают в сушильный шкаф на 2 часа для местной обработки в присутствии или в отсутствии какой-либо активной комбинации. Отрицательный контроль обезвоживающего стресса подвергается той же самой кинетике в закрытой чашке Петри.
3. Образцы для анализа
После обработки отбирают 2 образца биоптата диаметром 6 мм для анализа экспрессии РНК, а биоптат диаметром 4 мм помещают в полимерный блок Tissue Tek (Sakura Finetek) для гистологического исследования. Для анализа белка кожу подвергают воздействию теплового шока в водяной бане при 60°C в течение 5 минут и затем при 4°C в течение 2 минут, чтобы отделить эпидермис от дермы.
Биоптаты и образцы эпидермиса замораживают в жидком азоте и хранят при -80°C до проведения анализа.
II. Анализ транскриптома посредством количественной ПЦР
Кожные биоптаты измельчают в ступке, заранее охлажденной жидким азотом, и РНК экстрагируют, используя набор RNeasy (QIAGEN) в соответствии с рекомендациями поставщика. Затем РНК анализируют с использованием Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) на РНК-чипах 6000 Nano LabChip. кДНК получают из 1 мкг РНК посредством ферментативной реакции ретротранскрипции, проводимой с использованием набора Access RT-PCR Core Reagents (Promega) с олиго-dT-праймерами. Уровни экспрессии генов анализируют посредством количественной ПЦР в флуоресцентном термоциклере iCycler iQ (Biorad), используя наборы для ПЦР iQ™ с красителем супермикс зеленым SYBR (Biorad) в соответствии с процедурой из 40 циклов, включающих в себя денатурацию при 95°C (15 с) и элонгацию при 60°С (1 мин). Накопление продукта ПЦР, пропорциональное эмиссии флуоресценции (интеркалирующий краситель SYBRGreen), наблюдают цикл за циклом, используя программное обеспечение iCycler.
т
т
т
т
Аналитическое программное обеспечение iCycler, версия 3.1, выдает приближенные величины С (порогового цикла): цикла, с которого начинается регистрация амплификации кДНК. Параллельно выполняют анализ экспрессии нескольких генов сравнения, используя программу Genorm, версию 3.4, что позволяет отобрать наиболее стабильный ген сравнения для каждого образца. Затем этот ген используют в качестве сравнения для нормирования результатов, рассчитывая ΔС=С представляющего интерес гена - С гена сравнения.
<mrow><mi>I</mi><mi>F</mi><mo>=</mo><msup><mn>2</mn><mrow><mo>−</mo><mi>Δ</mi><mi>Δ</mi><msub><mi>C</mi><mi>T</mi></msub></mrow></msup><mo>,</mo><mtext> </mtext></mrow>
T
T
Затем рассчитывают фактор индукции (IF) для каждой обработки по отношению к соответствующему контрольному состоянию.
где ΔΔC=ΔСт после обработки - ΔC контроля. Экспрессию мРНК оценивают в двух повторах для пяти экспериментов для 5 различных индивидуумов. Если фактор индукции относительно контроля больше 2, считается, что экспрессия гена индуцирована, а если меньше 0,5, считается, что экспрессия репрессирована. Влияние активного начала на ответ на стресс, вызываемый в модели, оценивают как процент ингибирования, рассчитанный по следующей формуле:
% ингибирования ответа на стресс = 100×[((IF после стресса) - (IF контроля в отсутствие стресса)) - ((IF после обработки) - (IF контроля в отсутствие стресса))]/[(IP после стресса) - (IF контроля в отсутствие стресса)]
В рамках исследуемой модели состояние "контроль в отсутствие стресса" соответствует контролю в отсутствии сушки; состояние "после стресса" соответствует кожному биоптату, который сушили в течение 2 часов и который находился 2 дополнительных часа в условиях контроля (то есть без какой-либо местной обработки); и наконец, состояние "после обработки" относится к коже, которую в течение 2 часов подвергали сушке, затем в течение 2 часов местной обработке смягчающим средством.
III. Анализ белковой экспрессии вестерн-блоттингом
+
Подвергнутые обработке образцы эпидермиса измельчают в ступке, охлажденной жидким азотом, и белки экстрагируют в лизирующем буфере RIPA (Трис HCl, pH 8, 50 мМ; NaCl, 150 мМ; Тритон Х 100 IX; дезоксихолат Na, 1%; SDS, 0,1%; EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 5 мМ; DTT (дитиотриит), 100 мМ; коктейль ингибиторов протеаз (ссылочный номер P8340, SIGMA).
Затем белки анализируют, используя метод анализа белков в присутствии восстанавливающих агентов и детергентов (RC-DC Protein Assay) (Biorad), и анализируют вестерн-блоттингом. Для каждого состояния на гели, приготовленные в трис-глициновом буфере и содержащие 7,5% полиакриламида, наносят по 25-40 мкг общего белка. Смесь белков разделяют электрофорезом, используя систему Mini Protean II (Biorad), и белки переносят на мембрану PVDF (поливинилиденфторид) (Hybond-P, Amersham). Представляющий интерес белок выявляют, используя специфичное к нему антитело и набор ECL + (Amersham). Количество белков и долю деградированной формы рассчитывают, используя программное обеспечение Image Master TotalLab, версию 1.11 (Amersham) после нормирования на β-актин (белок сравнения).
IV. Гистологические методики
Кожные биоптаты разрезают, используя криотом (Leica CM 3050s), на срезы толщиной 5 мкм и помещают на предметные стекла для изучения (Starfrost).
1. Иммуногистохимический анализ
Криосрезы фиксируют в течение 10 минут ацетоном при 20°C и затем регидрируют PBS перед проведением анализа посредством иммуногистохимического мечения. После фиксации и регидрирования проводят насыщение кожных срезов 3%-ным раствором BSA (бычьего сывороточного альбумина) и инкубируют в течение 1 часа с первичным антителом к представляющему интерес белку. Во второй фазе их инкубируют в течение 1 часа со вторичным антителом, конъюгированным с флуорохромом Alexa-488 или Alexa-555, и окончательно закрепляют в мовиоле, содержащем DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) для мечения ядер.
2. Зимография in situ
После фиксации в течение 10 минут в ацетоне при -20°C срезы промывают в промывающем растворе (1%-ном Твине 20 в воде) и инкубируют в течение 2 часов при 37°C с раствором, содержащим специфический субстрат представляющих интерес ферментов, конъюгированный с флуорофором (вспомогательным веществом). Когда фермент активируется, флуорофор отщепляется, испуская сигнал флуоресценции, который можно наблюдать под микроскопом. Затем меченые предметные стекла разглядывают под микроскопом с эпифлуоресценцией (Nikon Eclipse 50i) или под инвертированным конфокальным микроскопом Zeiss Axiovert 100.
3. Флуоресцентный зонд
После обезвоживающей обработки эксплантаты кожи дополнительно инкубируют в течение одного часа в сушильном шкафу при 37°C с флуоресцентным зондом дилитиевой солью карбокси-гидрозида люциферового желтого красителя (Invitrogen) в концентрации 1 мМ в буфере HBSS (Hank's Buffered Salt Solution, сбалансированный солевой раствор Хенка). После этого кожу промывают в ванночке с HBSS в течение 1 минуты и затем отбирают образцы биоптатов диаметром 4 мм и помещают в полимеризующуюся массу Tissue TekR (Sakura Finetek) (Matsuki et al., 1998). Затем кожу разрезают, ядра маркируют с помощью DAPI и предметные стекла разглядывают под флуоресцентным микроскопом с длиной волны 450 нм, как описано выше.
Результаты
I. Модель нарушения защитной функции индуцированным высушиванием
1. Измерение проницаемости кожи с использованием флуоресцентного зонда
Первый анализ заключался в изучении фундаментального функционального параметра защитной функции кожи: проницаемости верхних слоев эпидермиса. Инкубация кожи с флуоресцентным зондом (люциферовым желтым) после эксперимента с высушиванием позволила охарактеризовать изменение проницаемости кожи. Для контрольных состояний включение метки является очень низким и поверхностным, зонд не проникает очень сильно через роговой слой и удаляется в процессе промывки. После двух часов высушивания включение метки наблюдается в более глубоких пластах рогового слоя. Высушивание делает кожу более проницаемой, ее защитная функция ухудшается. Местная обработка композицией A после двух часов высушивания восстанавливает непроницаемость SC (рогового слоя) для зонда, включение метки опять очень низкое и поверхностное, такое же, как для контрольных состояний. Ввиду этого можно сделать заключение, что увлажняющая обработка оказывает восстанавливающий эффект на высушенную кожу и на защитную функцию кожи, поддающуюся экспериментальной оценке в данной модели ткани.
2. Влияние на регуляцию транскриптома и протеома
Экспрессию различных генов, потенциально вовлеченных в гомеостаз эпидермальной защитной функции, измеряли с использованием количественной ПЦР в различных стрессовых состояниях и при различной обработке в модели сушки. Иммуногистохимический анализ дал возможность показать перестройку экспрессии некоторых белков в плане локализации, например, белков межклеточных контактов. Анализ деградации десмосомальных белков роговой оболочки проводили, используя вестерн-блоттинг.
Мишени, исследованные с использованием этих разных подходов, объединяли в группы в соответствии с их физиологической ролью (см. Таблицу 1). Цель данного исследования заключается в обнаружении поддающегося измерению ответа на стресс и коррекции данного эффекта стресса посредством местного применения композиции А.
В выполненной работе также оказалось возможным показать различные уровни регуляции определенных мишеней. Таким образом, авторы изобретения в состоянии заметить, что ферменты, обуславливающие десквамацию, не регулируются на уровне транскрипции, а более конкретно, регулируются на уровне их активности (сравн. результаты 3).
Таблица 1.
Краткое описание мишеней и фармакологического ответа, исследованного в модели с высушиванием
Y = мишень дает ответ в модели Y = да,
Х = мишень не дает ответа в модели Х = нет
Мишень
Ответ на стресс
Ингибирование композицией A ответа на стресс
Проницаемость кожи
Y
Y
Десмоглеин 1
Y
Y
Cdsn (корнеодесмозин)
Х
Х
Десмоколлин
Y
Y
Плакоглобин
Y
Х
KLK5 (калликреин 5)
Y
Х
KLK7
Х
Х
KLK8
Х
Х
Сериновые протеазы
Y
Y
Катепсин D
Х
Х
АВСА12 (АТФ-связывающая кассета, член 12 подсемейства A)
Y
Y
ABCG1 (АТФ-связывающая кассета, член 1 подсемейства G)
Х
Х
B-GC
Х
Х
DES2
X
X
Филагрин
Y
Y
Инволюкрин
X
X
TG1
X
X
TG3
X
X
Каспаза 14
X
X
Elox-3 (эпидермальная липоксигеназа 3)
Y
X
12R-LOX (12R-липоксигеназа)
X
X
HAS 2
Y
X
CD44 (фактор дифференцировки 44)
X
X
AQP3 (аквапорин 3)
Y
Y
NHE1 (Na+/H+ обменник типа 1)
Y
Y
IL-1a (интерлейкин-1a)
Y
Y
Окклудин
Y
Y
Клаудин 1
Y
Y
Клаудин 4
Y
Y
ZO-1 (zonula occludence-1)
X
X
E-кадгерин
X
X
β-Катенин
X
X
3. Измерение ферментативной активности, имеющей отношение к десквамации
Активность сериновых протеаз оценивали с использованием зимографии in situ на модели обезвоживания и наблюдали с использованием конфокального микроскопа в контрольных состояниях после двух часов высушивания и после двух часов высушивания с последующей инкубацией с композицией A в течение двух часов. Включение метки более интенсивно в контрольных состояниях, оно соответствует нормальной сильной активности. Это включение метки уменьшается и становится неравномерным вдоль по роговому слою после двух часов высушивания, в то время как его интенсивность усиливается и локализация активности преобразуется после двух часов инкубации с композицией A. Высушивание оказывает влияние на уменьшение и нарушение ферментативной активности. Эти результаты согласуются с уменьшением деградации десмосомальных белков роговой оболочки, которую авторы изобретения наблюдают при высушивании, и подтверждают влияние высушивания на уменьшение десквамации, наблюдаемое в разработанной модели. Композиция A способна восстанавливать ферментативную активность обезвоженной кожи, что подтверждает влияние этой композиции на восстановление гомеостаза десквамации.
Эти результаты показывают, что применение композиции A позволяет восстановить уровень экспрессии молекулярных мишеней, экспрессия которых повышается под действием стресс-индуцированного обезвоживания кожи. С помощью композиции A также возможно восстановление активности сериновой протеазы. Кроме того, местное применение композиции A позволяет осуществить супрессию стресс-индуцированного воспаления.
В целом эти результаты позволяют предположить, что композиция A при местном применении позволяет восстановить защитную функцию кожи, ограничить или даже предупредить колонизацию золотистым стафилококком и таким образом представляет собой "первичное превентивное лечение", предупреждающее возникновение атопических заболеваний (атопического дерматита, и/или аллергической бронхиальной астмы, и/или аллергического ринита, обычно называемого "поллинозом ") и/или аллергических сенсибилизаций.