Смеси химозинов с улучшенными молокосвертывающими свойствами
MIXTURE OF CHEMOSINES WITH IMPROVED MILK-CLOTTING PROPERTIES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к смесям коагулянтов и/или их смесям с улучшенными свойствами для сыроделия.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Ферментативная коагуляция молока молокосвертывающими ферментами, такими как химозин и пепсин, представляет собой один из наиболее важных процессов в изготовлении сыров. Ферментативная коагуляция молока представляет собой двухфазный процесс: первую фазу, когда протеолитический фермент, химозин или пепсин, воздействует на κ-казеин, что приводит к метастабильному состоянию структуры мицелл казеина, и вторую фазу, когда молоко в дальнейшем коагулирует и образует сгусток.
Химозин (ЕС 3.4.23.4) и пепсин (ЕС 3.4.23.1), молокосвертывающие ферменты желудка млекопитающих, представляют собой аспарагиновые протеазы, принадлежащие к широкому классу пептидаз.
Будучи продуцированными в клетках слизистой оболочки желудка, химозин и пепсин возникают в виде ферментативно неактивного препрохимозина и препепсиногена, соответственно. Когда химозин выделяется, N-концевой пептидный фрагмент, префрагмент (сигнальный пептид), отщепляется, давая прохимозин, включающий профрагмент. Прохимозин является по существу неактивной формой фермента, которая, однако, становится активированной в кислой среде до активного химозина посредством автокаталитического удаления профрагмента. Эта активация имеет место in vivo в просвете желудка при соответствующих условиях рН или in vitro в кислой среде.
Структурные и функциональные характеристики бычьего, то есть Bos taurus, препрохимозина, прохимозина и химозина были всесторонне изучены. Пре-часть молекулы бычьего препрохимозина содержит 16 аминокислотных остатков и про-часть соответствующего прохимозина имеет длину 42 аминокислотных остатков. Активный бычий химозин содержит 323 аминокислоты и представляет собой смесь двух форм, А и В, обе из которых являются активными.
Химозин продуцируется естественным образом у видов млекопитающих, таких как быки, верблюды, козлы, буйволы, овцы, свиньи, люди, обезьяны и крысы.
Бычий химозин в течение ряда лет имелся в продаже в молочной промышленности.
В WO 02/36752 А2 (Chr. Hansen) описано рекомбинантное получение верблюжьего химозина.
В WO 2013/174840 А1 (Chr. Hansen) описаны мутанты/варианты бычьего и верблюжьего химозина.
В WO 2013/164479 А2 (DSM) описаны мутанты бычьего химозина.
Ссылки, непосредственно перечисленные ниже, могут рассматриваться в настоящем контексте в качестве ссылок, описывающих мутанты химозина:
- Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71;
- Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569;
- van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310;
- Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83;
- M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997;
- Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871;
- Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin В which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139;
- Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
Ссылки на известный уровень техники, упомянутые выше, уделяют основное внимание молекулярной структуре и ее влиянию на специфичность или результативность химозинов.
Ни в одной из ссылок не раскрыты комбинированные эффекты разных химозинов с разными свойствами и различного происхождения.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что конкретные коагулянты и/или их смеси можно использовать в регулировании степени бактериального подкисления и конечной точки подкисления во время формирования сыра.
Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что настоящее изобретение делает возможным реальный контроль образования структуры мягкого сыра во время созревания и хранения посредством обеспечения специфическими смесями химозинов.
Как обсуждается в рабочих Примерах в данном описании - авторами настоящего изобретения также был идентифицирован ряд смесей коагулянтов, показывающих коммерчески привлекательные свойства, в том числе, например, ускоренное развитие твердости сгустка, которое превосходит ожидаемую результативность.
На основе сравнительного анализа смесей коагулянтов авторы настоящего изобретения идентифицировали ряд смесей, которые являются важными в этом описании в том смысле, что путем изготовления смеси можно добиться улучшенной и исключительной результативности коагулянта.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Все определения релевантных терминов в этом описании соответствуют тем, которые будут понятны специалисту во взаимосвязи с релевантным техническим контекстом в этом описании.
Термин «коагулянт» относится к ферменту, используемому для коагуляции молока в процессе сыроварения. Для полноты картины, химозин следует рассматривать в качестве коагулянта.
Термин «коагулянт с высоким С/Р (удельная свертывающая активность/протеолитическая активность)» или «коагулянт с высоким соотношением С/Р» относится к коагулянту, в том числе, например, к химозину, имеющему С/Р более 4,5, в том числе, например, С/Р более 5, в том числе, например, С/Р более 6, в том числе, например, С/Р более 7 или С/Р от 6 до 12. Имеющиеся в продаже примеры коагулянтов с высоким С/Р включают ChyMax М или ChyMax М1000 (Chr. Hansen A/S) и Maxiren XDS (DSM).
Термин «коагулянт с низким С/Р» или «коагулянт с низким соотношением С/Р» относится к коагулянту, в том числе, например, к химозину, имеющему С/Р менее 4,5, в том числе, например, С/Р менее 4, в том числе, например, С/Р менее 3, в том числе, например, С/Р менее 2, в том числе, например, С/Р менее 1,5, в том числе, например, С/Р менее 1, в том числе, например, С/Р менее 0,5 или С/Р менее 0,1. Имеющиеся в продаже примеры коагулянтов с низким С/Р включают Hannilase L, Hannilase ХР, Thermolase и Naturen, все доступны от Chr. Hansen A/S.
Термин "смесь коагулянтов" относится к смесям ферментов, используемых для коагуляции молока, например в процессе сыроделия.
Термин «химозин» относится к ферменту класса ЕС 3.4.23.4. Химозин имеет высокую специфичность, и он свертывает молоко путем расщепления одинарной связи 105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108 в каппа-цепи казеина. Альтернативное название, используемое в данной области техники, представляет собой реннин.
Термин «активность химозина» относится к химозиновой активности фермента химозина, что понятно специалисту в настоящем контексте. Специалист знает, как определять в данном описании релевантную активность химозина.
В рабочем Примере 2 в данном описании представлен Пример стандартного способа определения удельной активности химозина - альтернативно называемой свертывающей активностью или молокосвертывающей активностью. В качестве примера, свертывающая активность может быть определена с использованием способа REMCAT, который является стандартным способом, разработанным международной молочной федерацией (способ IDF).
Термин «выделенный вариант» обозначает вариант, который человек модифицируют вручную.
Термин «зрелый полипептид» обозначает пептид в своей конечной форме после трансляции и любых посттрансляционных модификаций, таких как процессинг N-концевой части, С-концевое усечение, гликозилирование, фосфорилирование и так далее. В настоящем контексте в данном описании релевантный зрелый полипептид химозина можно рассматривать как полипептидную последовательность активного химозина, то есть без последовательностей пре-части и/или про-части.
Термин «родительский» или «родительский полипептид, имеющий химозиновую активность» обозначает полипептид, в котором осуществляют изменение для получения вариантов фермента по настоящему изобретению. Родительский может представлять собой встречающийся в природе (дикий тип) полипептид или его вариант.
Термин «идентичность последовательности» относится к сходству между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями и может быть вычислена согласно способам, доступным специалисту в данной области техники.
Термин «вариант» обозначает пептид, имеющий химозиновую активность, содержащий изменение, а именно замену, вставку и/или делецию, в одном или более (нескольких) положениях. Замена означает замену аминокислоты, занимающей положение, другой аминокислотой; делеция означает удаление аминокислоты, занимающей положение; и вставка означает добавление 1-3 аминокислот, расположенных рядом с аминокислотой, занимающей положение.
Термин пептид химозина «дикого типа» обозначает химозин, экспрессируемый встречающимся в природе организмом, в том числе, например, млекопитающим (например верблюдом или быком), встречающимся в природе.
Термин «коагулянты различного происхождения» относится к коагулянтам, полученным из разных организмов или, альтернативно, посредством генетической модификации. Таким образом, бычий химозин дикого типа и генетически модифицированный бычий химозин в контексте настоящего изобретения следует рассматривать как коагулянты разного происхождения.
ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
Фиг. 1: Выравнивание релевантных различных последовательностей химозина в данном описании. Показанный «Бычий химозин В» представляет собой бычий химозин SEQ ID NO: 1 в данном описании и показанный «Одногорбый верблюд» представляет собой верблюжий химозин SEQ ID NO: 2 в данном описании. Используя бычий химозин SEQ ID NO: 1 в качестве контрольной последовательности, как описано в данном описании, можно, например, видеть, что бычий химозин имеет «V» в положении 10, и верблюжий химозин имеет «А» в том же самом положении 10. Можно, например, также видеть, что бычий/крысиный имеет «Q» в положении 352, и верблюжий/Двугорбый верблюд имеет «Е» в том же самом положении 352.
По отношению к последовательностям химозина, показанным на Фиг. 1, овечий имеет идентичность последовательности с бычьим SEQ ID NO: 1 94,5%; "Двугорбый верблюд" имеет идентичность последовательности с бычьим SEQ ID NO: 1 83,2%; "Одногорбый верблюд" (верблюжий химозин SEQ ID NO: 2) имеет идентичность последовательности с бычьим SEQ ID NO: 1 84%; свиной имеет идентичность последовательности с бычьим SEQ ID NO: 1 80,3% и крысиный имеет идентичность последовательности с бычьим SEQ ID NO: 1 71,9%.
Как понятно специалисту в настоящем контексте - в данном описании релевантные проценты идентичности последовательностей зрелых полипептидных последовательностей, например, овечьего химозина, химозина двугорбого верблюда, верблюжьего, свиного или крысиного химозина со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычий химозин, то есть положения аминокислот с 59 до 381 SEQ ID NO: 1) являются относительно подобными упомянутым выше процентам идентичности последовательности.
Фиг. 2: Твердость сыров типа бри, изготовленных с разными смесями коагулянтов.
Фиг. 3: Липкость сыров типа бри, изготовленных с разными смесями коагулянтов.
Фиг. 4: рН на стадии расформовки для сыров типа бри, изготовленных с разными смесями коагулянтов.
Фиг. 5: Сухое вещество (СВ) на стадии расформовки для сыров типа бри, изготовленных с разными смесями коагулянтов.
Фиг. 6: Относительная специфичность протеолиза группы коагулянтов, представляющих особый интерес в настоящем изобретении.
Фиг. 7: Скорость коагуляции и нарастание твердости трех различных растворов коагулянтов: верблюжьего химозина (Chymax М1000), отмеченного темно-серой сплошной линией, бычьего химозина (Chymax +), отмеченного светло-серыми пунктирными линиями, и смеси верблюжьего/бычьего химозина в соотношении 80/20 (Chymax soft), отмеченного темно-серой пунктирной линией.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Как подробно подтверждается примером в данном описании, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим два или более различных коагулянтов.
В родственном аспекте настоящее изобретение относится к композициям для свертывания молока, содержащим смесь двух или более коагулянтов, имеющих разное происхождение.
В родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где два или более коагулянтов имеют различные соотношения С/Р и/или свертывающие активности, в том числе, например, с разницей по меньшей мере в три раза.
В родственном аспекте молокосвертывающую активность определяют по времени, которое требуется для видимой флокуляции стандартного молочного субстрата, полученного из сухого молока пониженной жирности, низкотемпературного сгущения и распылительной сушки, с использованием раствора хлорида кальция 0,5 г на литр (рН приблизительно 6,5). Время свертывания образца сычужным ферментом сравнивают со временем свертывания стандартного образца, имеющего известную молокосвертывающую активность и имеющего такой же состав ферментов, согласно IDF Standard 110 В, как образец. Образцы и стандартные образцы измеряют в идентичных химических и физических условиях. Образцы варианта доводят до приблизительно 3 IMCU/мл, используя буфер рН 5,5 на основе 84 мМ уксусной кислоты. Затем добавляют 200 мкл фермента в 10 мл предварительно нагретого молока (32°С) в стеклянной пробирке, помещенной в водяную баню, способную поддерживать постоянную температуру 32°С плюс/минус 1°С при постоянном перемешивании.
Суммарную молокосвертывающую активность (концентрацию) сычужного фермента вычисляют в международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на мл относительно стандарта, имеющего такой же состав ферментов, как образец, согласно формуле:
S стандарта: Молокосвертывающая активность международного стандартного образца для сычужного фермента
Т стандарта: Время свертывания в секундах, полученное для разбавления стандарта
D образца: Коэффициент разбавления для образца
D стандарта: Коэффициент разбавления для стандарта
Т образца: Время свертывания в секундах, полученное для разбавленного образца сычужного фермента, от добавления фермента до времени флокуляции
Определение содержания общего белка
Содержание общего белка определяли, используя набор для анализа белка Pierce ВСА от Thermo Scientific, следуя инструкциям поставщиков.
Вычисление удельной свертывающей активности
Удельную свертывающую активность (IMCU/мг общего белка) определяли путем деления свертывающей активности (IMCU/мл) на содержание общего белка (мг общего белка на мл).
В рабочем Примере 3 в данном описании представлен Пример стандартного способа определения протеолитической активности.
В качестве примера, общую протеолитическую активность можно измерять, используя флуоресцентно меченный Bodipy-FL казеин в качестве субстрата (EnzChek; Molecular Bioprobes, Е6638). Производные казеина, интенсивно меченные не чувствительным к рН зеленым флуоресцентным Bodipy-FL, вызывают почти полное гашение флуоресценции конъюгата. Катализируемый протеазой гидролиз высвобождает флуоресцентный Bodipy-FL. Этот способ является очень чувствительным, что является необходимым для этого эксперимента, поскольку коагулянты с высоким С/Р часто имеют низкую общую протеолитическую активность по сравнению с коагулянтами с низким С/Р.
Анализ проводили в 0,2 М фосфатном буфере, отрегулированном до желательного рН, с конечной концентрацией субстрата 0,04 мг/мл. Перед смешиванием 1 части субстрата с 1 частью фермента, обе из которых приготовлены в фосфатном буфере, все варианты фермента нормализовали к 50 IMCU/мл (согласно примеру 2). Субстрат и фермент перемешивали в 96-луночных микротитрационных планшетах Nunc Fluoro, плотно закрывали и инкубировали при 32°С в течение 60 мин. После инкубирования удаляли изоляцию и флуоресценцию регистрировали на флуориметре.
Как известно в данной области техники, в данном описании релевантное так называемое соотношение С/Р определяют путем деления удельной свертывающей активности (С)(IMCU/мл) на протеолитическую активность (Р)(mU/мл).
Как известно в данной области техники, более высокое соотношение С/Р означает, как правило, что потеря белка во время, например, производства сыра вследствие неспецифической деградации белка снижается, то есть выход сыра увеличивается, и что формирование горького вкуса у сыра во время созревания снижается.
Другой аспект изобретения относится к композициям, содержащим два или более различных химозинов, которые придают полезные свойства в отношении твердости сгустка и скорости коагуляции.
Один способ измерения этого предполагает использование CHYMOgraph. CHYMOgraph предусматривает оценивание времени флокуляции молока, а также изменение твердости сгустка в процессе получения сыра.
Компьютерная программа измеряет скорость формирования белкового каркаса в сгустке. Варьирование плотности молока и вязкоэластичности сгустка преобразовывают в удобные для пользователя графические данные, которые можно использовать для характеристики коагулянта или для определения оптимального времени разрезания сгустка.
CHYMOgraph измеряет время флокуляции молока, твердость сгустка и ее изменение и скорость формирования белкового каркаса.
Для приготовления молока готовили контейнер с 500 г молока согласно целевому назначению молочной композиции и нагревали до температуры сычужного свертывания при 38°С на водяной бане 1 час перед добавлением сычужного фермента. Перед использованием молока регулировали и регистрировали рН. Пример предпочтительной молочной композиции представляет собой:
Обогащенное молоко с 3,8% белка, высокотемпературная обработка при 90°С в течение 30 секунд,
рН при сычужном свертывании: 6,18 при 38°С и 6,28 при (4°С).
Температура сычужного свертывания: 38°С. Этот тип молока соответствует типу молока молочной композиции, используемой при производстве мягкого сыра.
Предпочтительный коагулянт получают так: испытывали 3 раствора коагулянтов: верблюжьего химозина (ChyMax М1000), бычьего химозина (ChyMax+) и ChyMaxM soft (смесь 80% верблюжьего химозина (ChyMax М1000) и 20% бычьего химозина (ChyMax +)). Каждый раствор коагулянта можно получать с концентрацией 20 IMCU/мл путем разбавления теплой водой. Такое разбавление предназначено для внесения достаточного количества коагулянта в образец молока для облегчения его диспергирования.
Каждый раствор коагулянта можно добавлять в молоко (1 мл для 500 г молока, то есть 40 IMCU/1 л). После добавления коагулянта образец перемешивали 30 секунд путем вращения. После вращения 10 мл каждого раствора коагулянта добавляли в Chymograph.
Как известно в данной области техники, различные природные полипептидные последовательности химозина дикого типа, полученные от разных видов млекопитающих (в том числе, например, быков, верблюдов, овец, свиней или крыс), имеют относительно высокое(ую) сходство/идентичность последовательности.
На Фиг. 1 в данном описании это проиллюстрировано путем выравнивания релевантных в данном описании последовательностей разных химозинов.
В настоящем контексте, естественным образом полученный химозин дикого типа (такой как бычий химозин или верблюжий химозин), как показано на Фиг. 1, может в данном описании представлять собой пример родительского полипептида, то есть родительский полипептид, в котором осуществляют изменение для создания варианта полипептида химозина по настоящему изобретению.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где два или более коагулянтов образуют αS1 и/или β-казеин с разными скоростями.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где два или более коагулянтов имеют различную общую протеолитическую активность, в том числе, например, с разницей по меньшей мере в три раза.
Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения предложены композиции, которые описаны выше, где композиция содержит по меньшей мере один коагулянт, имеющий соотношение С/Р более 5 IMCU/mU, и по меньшей мере второй коагулянт, имеющий соотношение С/Р в диапазоне от 0,05 до 1,5 IMCU/mU.
Например, композиция может содержать по меньшей мере 50% масс./масс. одного коагулянта, имеющего соотношение С/Р более 5 IMCU/mU, и по меньшей мере 15% масс./масс. второго коагулянта, имеющего соотношение С/Р в диапазоне от 0,05 до 1,5 IMCU/mU, где % масс./масс. показывает концентрацию одного коагулянта относительно суммарного количества коагулянтов. В еще одном аспекте в изобретении предложена композиция, содержащая по меньшей мере 70% масс./масс. одного коагулянта, имеющего соотношение С/Р более 5 IMCU/mU, и от 15 до 30% масс./масс. второго коагулянта, имеющего соотношение С/Р в диапазоне от 0,05 до 1,5 IMCU/mU, где % масс./масс. показывает концентрацию одного коагулянта относительно суммарного количества коагулянтов.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где композиция содержит смесь двух или более коагулянтов, полученных из двух или более различных животных или видов или родов микроорганизмов.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где композиция содержит смесь двух или более коагулянтов, которые представляют собой варианты одного и того же родительского коагулянта.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где два или более различных родов или видов выбраны из перечня, состоящего из: коровы, буйвола, верблюда, свиньи, крысы, овцы или мукора.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где по меньшей мере один из двух или более различных коагулянтов получают из коагулянта, имеющего происхождение из коровы, буйвола, верблюда, свиньи, крысы, овцы и/или мукора.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где композиция содержит молоко, в том числе, например, соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, молоко буйвола, молоко яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко; и
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где композиция представляет собой смесь бычьего коагулянта и небычьего коагулянта или представляет собой смесь верблюжьего коагулянта и неверблюжьего коагулянта.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где композиция содержит от 10-50%, в том числе, например, 20% небычьего или неверблюжьего коагулянта, относительно суммарного количества коагулянтов.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где композиция содержит коагулянт с высоким соотношением С/Р и коагулянт с низким соотношением С/Р. В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где композиция содержит от 10-50%, в том числе, например, 20% коагулянта с низким соотношением С/Р относительно суммарного количества коагулянтов.
В еще одном воплощении настоящего изобретение предложена пищевая или кормовая композиция, содержащая смесь двух или более коагулянтов, которые описаны выше. Пищевая или кормовая композиция может представлять собой мягкий сыр, в том числе, например, бри или камамбер.
В еще одном родственном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, которая раскрыта в данном описании, где композиция предназначена для изготовления мягкого сыра, в том числе, например, бри или камамбера, возможно, мягкий сыр представляет собой созревающий с поверхности мягкий сыр.
Кроме того, изобретение относится к применению композиции по любому из аспектов в данном описании, в способе изготовления мягкого сыра. Композиция, как описано в аспектах в данном описании, может быть добавлена не позже чем через 20 минут, в том числе, например, не позже чем через 15 минут, в том числе, например, не позже чем через 10 минут, в том числе, например, не позже чем через 5 минут после добавления одной или более заквасочных культур.
Если это применимо, добавляют любые дополнительные стадии производства для получения продукта на основе молока.
Например, в настоящем изобретении предложен способ изготовления ферментированного молочного продукта, включающий следующие стадии:
а) добавление заквасочной культуры в молоко и инкубирование культуры при температуре от 28 до 42°С в течение по меньшей мере пяти минут;
б) добавление композиции, содержащей два или более различных коагулянтов в суммарной концентрации от 2000 IMCU/100 л до 3500 IMCU/100 л;
в) дополнительное инкубирование культуры при температуре от 28 до 42°С в течение по меньшей мере трех часов;
г) отделение сыворотки с получением сыра.
Способ можно преимущественно использовать для изготовления мягкого сыра, в том числе, например, бри или камамбера.
Также, композиция, как описано в любом из аспектов в данном описании, может, в качестве родственного воплощения, быть добавлена не позже чем через 20 минут, в том числе, например, не позже чем через 15 минут, в том числе, например, не позже чем через 10 минут, в том числе, например, не позже чем через 5 минут после добавления одной или более заквасочных культур.
Определение положения аминокислот химозина, представляющего интерес
Как обсуждалось выше - в качестве контрольной последовательности для определения положения аминокислот релевантного в данном описании полипептида химозина, представляющего интерес (например верблюжьего, овечьего, бычьего и так далее) в данном описании используют общедоступную известную последовательность бычьего химозина, раскрытую как SEQ ID NO: 1 в данном описании.
В результате использования хорошо известных компьютерных программ, как указано выше, для специалиста является обычной работой определение положения аминокислот релевантного в данном описании полипептида химозина, представляющего интерес (например верблюжьего, овечьего, бычьего и так далее), в соответствующем химозине.
Способ получения выделенного варианта полипептида химозина
Как обсуждалось выше, как известно в данной области техники, специалист может, на основе его обычных общих знаний, в плановом порядке получить и очистить химозин и варианты химозина. Иначе говоря, когда специалист владеет релевантным в данном описании родительским полипептидом, имеющим активность химозина, представляющего интерес (например от коров, верблюдов, овец, свиней или крыс), для специалиста является обычной работой создание варианта такого родительского химозина, представляющего интерес.
Пример подходящего способа получения и выделения химозина (варианта или родительского) может быть осуществлен хорошо известной технологией, например, на основе экспрессии/продуцирования грибкового рекомбинанта, как, например, описано в WO 02/36752 А2 (Chr. Hansen).
Как известно в данной области техники, химозиновую активность можно определять по так называемому соотношению С/Р, которое определяют путем деления удельной свертывающей активности (С) на протеолитическую активность (Р).
В рабочем Примере 2 в данном описании описан подходящий способ определения удельной свертывающей активности (С) и в рабочем Примере 3 в данном описании описан подходящий способ определения протеолитической активности (Р).
Как обсуждалось выше, в качестве контрольной последовательности для определения положения аминокислот релевантного в данном описании полипептида химозина, представляющего интерес (например верблюжьего, овечьего, бычьего и так далее), в данном описании используют общедоступную известную последовательность бычьего химозина, раскрытую как SEQ ID NO: 1 в данном описании.
Как обсуждалось выше, на основе, например, компьютерных программ выравнивания последовательностей, обсуждаемых в данном описании, для специалиста является обычной работой определение релевантного в данном описании положения аминокислот релевантного в данном описании полипептида химозина, представляющего интерес (например верблюжьего, овечьего, бычьего и так далее).
Как понятно специалисту в настоящем контексте, в данном описании релевантный родительский полипептид, имеющий химозиновую активность, уже может, например, представлять собой вариант, например, соответствующего химозина дикого типа. Например, вариант верблюжьего химозина, например, с 5-10 изменениями (например заменами) по сравнению с полипептидом верблюжьего химозина дикого типа SEQ ID NO: 2 по-прежнему будет представлять собой родительский полипептид, который имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычьим) по меньшей мере 65%, как требуется, например, в первом аспекте в данном описании.
Иначе говоря, в данном описании релевантный выделенный полипептидный вариант химозина может содержать изменения (например замены) в другом положении, по сравнению с положениями, например, первого аспекта в данном описании.
Одно воплощение относится к выделенному полипептидному варианту химозина, где изменение включает замену, делецию или вставку по меньшей мере в одном положении аминокислоты, соответствующем любому из положений, например, первого аспекта в данном описании.
Может быть предпочтительно, чтобы несовпадение в химозинах, существующее по меньшей мере в одном изменении пептида, представляло собой замену, то есть в данном описании релевантный коагулянт относится к выделенному полипептидному варианту бычьего химозина, в том числе, например, вариант, где изменение включает замену по меньшей мере в одном положении аминокислот, соответствующем любому из положений 51 и/или 221, предпочтительно A51V и К221М в зрелой родительской последовательности бычьего химозина.
Предпочтительно, родительский полипептид имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычий химозин) по меньшей мере 70%, более предпочтительно родительский полипептид имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычий химозин) по меньшей мере 75%.
В качестве примера, в данном описании подходящий релевантный родительский полипептид может, например, представлять собой бычий химозин А, как известно в данной области техники, бычий химозин А может иметь только одно несовпадение аминокислот по сравнению с бычьим химозином В SEQ ID NO: 1 в данном описании.
Как обсуждалось выше, в рабочих примерах в данном описании созданы варианты с использованием полипептида SEQ ID NO: 1 (бычьего) в качестве родительского полипептида, такой вариант может в данном описании называться вариантом бычьего химозина.
Таким образом, в предпочтительном воплощении, родительский полипептид имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычий химозин) по меньшей мере 90%, более предпочтительно родительский полипептид имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычий химозин) по меньшей мере 95% и еще более предпочтительно родительский полипептид имеет идентичность последовательности со зрелым полипептидом SEQ ID NO: 1 (бычий химозин) по меньшей мере 97%. Может быть предпочтительно, чтобы родительский полипептид представлял собой зрелый полипептид SEQ ID NO: 1 (бычий химозин).
Как понятно специалисту в настоящем контексте, в данном описании релевантный родительский полипептид, имеющий химозиновую активность, уже может, например, представлять собой вариант, например, соответствующего химозина дикого типа.
Способ изготовления продукта на основе молока
Как обсуждалось выше, композицию, содержащую два или более разных коагулянтов, которые описаны в данном описании, можно использовать согласно данной области техники, например, для изготовления представляющего интерес продукта на основе молока (в том числе, например, сырного продукта).
Как обсуждалось выше, один аспект изобретения относится к способу изготовления пищевого или кормового продукта, включающему добавление эффективного количества смесей коагулянтов, которые описаны в данном описании, к пищевому(ым) или кормовому(ым) ингредиенту(ам) и выполнение дополнительных стадий производства для получения пищевого или кормового продукта.
Предпочтительно, пищевой или кормовой продукт представляет собой продукт на основе молока, и где способ включает добавление эффективного количества смеси коагулянтов, которые описаны в данном описании, в молоко и выполнение дополнительных стадий производства для получения продукта на основе молока.
Молоко может, например, представлять собой соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, молоко буйвола, молоко яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко.
Продукт на основе молока может, например, представлять собой ферментированный молочный продукт, творог или сыр.
Изобретение дополнительно относится к следующим родственным кратко изложенным аспектам:
Аспект 1. Композиция для свертывания молока, содержащая смесь двух или более коагулянтов с разными соотношениями С/Р.
Аспект 2. Композиция для свертывания молока, содержащая смесь двух или более коагулянтов разного происхождения, в том числе, например, верблюжьего химозина и бычьего химозина.
Аспект 3. Композиция согласно аспекту 1 или 2, где два или более коагулянтов имеют разную общую протеолитическую активность, в том числе, например, с разницей по меньшей мере в три раза.
Аспект 4. Композиция согласно любому из предшествующих аспектов, содержащая по меньшей мере один коагулянт, имеющий соотношение С/Р более 5 IMCU/mU, и по меньшей мере второй коагулянт, имеющий соотношение С/Р от 0,05 до 1,5 IMCU/mU.
Аспект 5. Композиция согласно любому из предшествующих аспектов, содержащая по меньшей мере 50% масс./масс. одного коагулянта, имеющего соотношение С/Р более 5 IMCU/mU, и по меньшей мере 15% масс./масс. второго коагулянта, имеющего соотношение С/Р в диапазоне от 0,05 до 1,5 IMCU/mU, где % масс./масс. показывает концентрацию одного коагулянта относительно суммарного количества коагулянтов.
Аспект 6. Композиция согласно любому из предшествующих аспектов, содержащая смесь двух или более коагулянтов, имеющих происхождение из двух или более различных животных или видов или родов микроорганизмов.
Аспект 7. Композиция согласно любому из предшествующих аспектов, содержащая по меньшей мере 70% масс./масс. одного коагулянта, имеющего соотношение С/Р более 5 IMCU/mU, и от 15 до 30% масс./масс. второго коагулянта, имеющего соотношение С/Р в диапазоне от 0,05 до 1,5 IMCU/mU, где % масс./масс. показывает концентрацию одного коагулянта относительно суммарного количества коагулянтов.
Аспект 8. Композиция согласно любому из аспектов 1-7, где по меньшей мере один из двух или более различных коагулянтов получен из коагулянта, имеющего происхождение из коровы, буйвола, верблюда, свиньи, крысы, овцы и/или мукора.
Аспект 9. Композиция согласно любому из предшествующих аспектов, содержащая молоко, в том числе, например, соевое молоко, овечье молоко, козье молоко, молоко буйвола, молоко яка, молоко ламы, верблюжье молоко или коровье молоко.
Аспект 10. Композиция согласно аспекту 9, где молоко представляет собой коровье молоко.
Аспект 11. Композиция согласно аспекту 9 или 10, где молоко содержит от примерно 3% до примерно 5% белка, например от 3,5% до 4,5% белка, например 3,8% белка.
Аспект 12. Композиция согласно любому из аспектов 9-11, где молоко содержит от примерно 1,5% до 5% жира, например от 2,5% до 4% жира, например 3,5% жира.
Аспект 13. Композиция согласно любому из аспектов 1-12, представляющая собой смесь бычьего коагулянта и небычьего коагулянта или представляющая собой смесь верблюжьего коагулянта и неверблюжьего коагулянта, в том числе, например, смесь верблюжьего и бычьего химозина.
Аспект 14. Пищевая или кормовая композиция, содержащая смесь двух или более коагулянтов согласно любому из предшествующих аспектов.
Аспект 15. Пищевая или кормовая композиция согласно аспекту 14, представляющая собой мягкий сыр, в том числе, например, бри или камамбер.
Аспект 16. Пищевая или кормовая композиция согласно аспекту 15, где мягкий сыр представляет собой созревающий с поверхности мягкий сыр.
Аспект 17. Применение композиции согласно любому из аспектов 1-13 в процессе изготовления мягкого сыра.
Аспект 18. Применение согласно аспекту 17, где композицию согласно любому из аспектов 1-13 добавляют в молоко не позже чем через 20 минут, в том числе, например, не позже чем через 15 минут, в том числе, например, не позже чем через 10 минут, в том числе, например, не позже чем через 5 минут после добавления одной или более заквасочных культур.
Аспект 19. Способ изготовления продукта на основе молока, включающий добавление эффективного количества композиции согласно любому из аспектов 1-13 и выполнение дополнительных стадий производства для получения продукта на основе молока.
Аспект 20. Способ изготовления ферментированного молочного продукта, включающий следующие стадии:
а) добавление заквасочной культуры в молоко и инкубирование культуры при температуре от 28 до 42°С в течение по меньшей мере пяти минут;
б) добавление композиции согласно любому из аспектов 1-13 в суммарной концентрации от 2000 IMCU/100 л до 3500 IMCU/100 л;
в) дополнительное инкубирование культуры при температуре от 28 до 42°С в течение по меньшей мере трех часов;
г) отделение сыворотки с получением сыра.
Аспект 21. Способ согласно аспекту 20, где композицию согласно любому из аспектов 1-13 добавляют не позже чем через 20 минут, в том числе, например, не позже чем через 15 минут, в том числе, например, не позже чем через 10 минут после добавления одной или более заквасочных культур.
Аспект 22. Способ согласно аспекту 20 или 21, используемый для изготовления мягкого сыра, в том числе, например, бри или камамбер.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: выравнивание и нумерация белковых последовательностей химозина и последовательностей вариантов
Белковые последовательности химозина выравнивали с использованием алгоритма ClustalW, который предложен EBI (Европейским институтом биоинформатики) (EBI, инструментальные программные средства, множественное выравнивание последовательностей, CLUSTALW", http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) и который описан в Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA, McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ, Higgins DG (2007). Bioinformatics 23(21), 2947-2948.
Параметры настройки ClustalW2 для множественных выравниваний последовательностей представляли собой: Protein weight Matrix = BLOSUM, GAP open = 10, GAP EXTENSION 0,05, GAP DISTANCES = 8, No End Gaps, ITERATION = none, NUMITER = 1, CLUSTERING = NJ.
В качестве контрольной последовательности использовали препрохимозин бычьего химозина В (учетный номер Genbank Р00794 - раскрыт в данном описании как SEQ ID NO: 1), где N-концевой метионин имеет номер 1 (MRCL …) и С-концевой изолейцин (в белковой последовательности … LAKAI) имеет номер 381. Варианты выравнивали с бычьим препрохимозином В и остатки нумеровали по соответствующему остатку бычьего химозина.
ПРИМЕР 2: Определение удельной активности химозина
2.1 Определение свертывающей активности
Молокосвертывающую активность определяли, используя способ REMCAT, который является стандартным способом, разработанным Международной молочной федерацией (способ IDF).
Молокосвертывающую активность определяют по времени, которое требуется для видимой флокуляции стандартного молочного субстрата, полученного из сухого молока пониженной жирности, низкотемпературного сгущения и распылительной сушки, с использованием раствора хлорида кальция 0,5 г на литр (рН приблизительно 6,5). Время свертывания образца сычужным ферментом сравнивают со временем свертывания стандартного образца, имеющего известную молокосвертывающую активность и имеющего такой же состав ферментов, согласно IDF Standard 110 В, как образец. Образцы и стандартные образцы измеряли в идентичных химических и физических условиях. Образцы вариантов доводили до приблизительно 3 IMCU/мл, используя буфер рН 5,5 на основе 84 мМ уксусной кислоты. Затем добавляли 200 мкл фермента к 10 мл предварительно нагретого молока (32°С) в стеклянной пробирке, помещенной в водяную баню, способную поддерживать постоянную температуру 32°С плюс/минус 1°С, при постоянном перемешивании.
Суммарную молокосвертывающую активность (концентрацию) сычужного фермента вычисляли в международных молокосвертывающих единицах (IMCU) на мл относительно стандарта, имеющего такой же состав ферментов, как образец, по формуле:
S стандарта: Молокосвертывающая активность международного стандартного образца для сычужного фермента.
Т стандарта: Время свертывания в секундах, полученное для разбавления стандарта
D образца: Коэффициент разбавления для образца
D стандарта: Коэффициент разбавления для стандарта
Т образца: Время свертывания в секундах, полученное для разбавленного образца сычужного фермента, от добавления фермента до времени флокуляции
2.2 Определение содержания общего белка
Содержание общего белка определяли, используя набор для анализа белка Pierce ВСА от Thermo Scientific, следуя инструкциям поставщиков.
2.3 Вычисление удельной свертывающей активности
Удельную свертывающую активность (IMCU/мг общего белка) определяли путем деления свертывающей активности (IMCU/мл) на содержание общего белка (мг общего белка на мл).
ПРИМЕР 3: Определение протеолитической активности
Общую протеолитическую активность измеряли, используя флуоресцентно меченный Bodipy-FL казеин в качестве субстрата (EnzChek; Molecular Bioprobes, Е6638). Производные казеина, интенсивно меченные не чувствительным к рН зеленым флуоресцентным Bodipy-FL, вызывают почти полное гашение флуоресценции конъюгата. Катализируемый протеазой гидролиз высвобождает флуоресцентный Bodipy-FL. Этот способ является очень чувствительным, что было необходимо для этого эксперимента, поскольку CHYMAX М имеет самую низкую общую протеолитическую активность всех коагулянтов, известных на сегодняшний день.
Анализ проводили в 0,2 М фосфатном буфере, отрегулированном до желательного рН, с конечной концентрацией субстрата 0,04 мг/мл. Перед смешиванием 1 части субстрата с 1 частью фермента, обе из которых приготовлены в фосфатном буфере, все варианты фермента нормализовали к 50 IMCU/мл (согласно примеру 2). Субстрат и фермент перемешивали в 96-луночных микротитрационных планшетах Nunc Fluoro, плотно закрывали и инкубировали при 32°С в течение 60 мин. После инкубирования удаляли изоляцию и регистрировали флуоресценцию на флуориметре.
ПРИМЕР 4: Оценка двух типов смесей коагулянтов: смеси верблюжий - бычий химозин и верблюжий - коагулянт Mucor miehei
В технологии мягкого сыра применение коагулянта с высоким соотношением С/Р, такого как ChyMaxM, имеет несколько преимуществ. Некоторые из более важных представляют собой: увеличенный срок хранения, уменьшенную горечь, повышенное извлечение жира благодаря повышенной твердости при разрезании, уменьшенные последствия подкисления, особенно в случае использования быстрых штаммов (fast strain).
Однако обычная модификация, которая представляет собой повышенную твердость сыра, в отдельном случае может рассматриваться как недостаток.
Для того, чтобы сохранить преимущество высокого соотношения С/Р, такого как у ChyMaxM, и понизить твердость сыра, была определена смесь СпуМахМ и других коагулянтов с более низким соотношением С/Р.
Были изготовлены стабилизированные мягкие сыры типа бри с использованием разных соотношений коагулянтов. Сыры анализировали при расформовке и в течение срока хранения.
- Молоко: (одно и то же для всех испытаний)
- Белки: 36,2 г/л (без белка сыворотки в случае, когда добавлена)
- Жир: 61,7 г/л
- Соотношение жир/белок: 1,7
- Пастеризация: 72°С/20 секунд
- Суммарный объем/испытание: 500 л (5 ванн по 100 л)
2
- Добавленный CaCl: 15 г/100 л
- Температура при добавлении коагулянта: 40°С
- рН при добавлении коагулянта: 6,3
- Доза коагулянта: 3000 IMCU/100 л молока (соответствует 8287 IMCU/г белков).
Смеси коагулянтов:
- Тестировали первый тип смесей: ChyMaxM с 20%, 30% или 50% ChyMax (бычий коагулянт с низким С/Р), показаны линиями с квадратными метками на Фиг. 2-5.
- Тестировали второй тип смесей: ChyMaxM с 20% или 30% Hannilase (коагулянт Mucor miehei с низким соотношением С/Р), показаны линиями с метками в виде ромбов на Фиг. 2-5.
- В качестве контроля был выполнен тест с чистым ChyMaxM с такими же дозами и параметрами. Этот контроль используют для обоих типов смесей, причем контроль является смесью, содержащей 0% отличного от ChyMaxM компонента, и показывают в первой колонке таблиц, включенных в Фиг. 2-5.
Результаты:
(Значения представляют собой среднее от 5 ванн)
- рН при расформовке (Фиг. 4): для обоих типов используемых коагулянтов с низким соотношением С/Р наблюдают незначительную тенденцию получать при расформовке более низкий рН при прибавлении компонента с низким соотношением С/Р: от рН 5,06 для теста с чистым ChyMaxM, рН равнялся 5,03 для смеси с 20% Hannilase и по-прежнему 5,06 с 20% ChyMax. Будучи близкой к точности рН-метра, такая изменчивость все же является значительной, поскольку представляет собой среднее от 5 ванн. Далее, при 30% рН равняется 5,03 для смесей с Hannilase, аналогично 20% смеси, и 5,02 для смесей с ChyMax, аналогично результатам с Hannilase 20% и 30% смесями. Далее, с 50% ChyMax смесью рН является аналогичным 30% смеси. Это показывает, что использование смеси коагулянтов с высоким соотношением С/Р, таких как ChyMaxM, и с более низким соотношением С/Р, таких как ChyMax или Hannilase, имеет тенденцию снижать значение рН при расформовке в мягком сыре типа бри. Эта тенденция является эффективной уже с 20% Hannilase, тогда как для ChyMax эта тенденция наблюдается только выше 30%.
- Структура: Измерения структуры были выполнены на сырах после 25 суток хранения с использованием пенетрометра ТАХТ2 с гильотинным устройством.
- Твердость (Фиг. 2): Твердость четко снижалась при повышении процента коагулянта с низким С/Р в смесях и затем стабилизировалась при более высоких процентах. Для смесей ChyMax, твердость снижается от 1325 г для теста с чистым ChyMaxM до 1180 г для 20% смеси, далее до 1022 г для 30% смеси. Для смесей Hannilase твердость снижается уже до 1050 у 20% смеси и далее сохраняет приблизительно то же самое значение, 1053 г, у 30% смеси.
- Липкость (Фиг. 3): Липкость четко повышается при смешивании ChyMaxM с коагулянтом с более низким соотношением С/Р. Для 20% обоих типов коагулянтов с низким соотношением С/Р, где незначительное повышение липкости: от значения 50 g/s для чистого ChyMaxM в тесте с 20% ChyMax достигала 72 g/s и в тесте с 20% смесью Hannilase достигала 59 g/s. Эти значения соответствовали все же приемлемой липкости сыров. Далее, оба типа 30% смесей достигают значений, близких к 95 (96 для ChyMax и 92 для Hannilase). Эти значения четко связаны с неприемлемыми сырами в плане липкости сыров.
- Оптимум структуры: Цель данного эксперимента заключалась в уменьшении твердости; однако липкость не является желательной характеристикой. Таким образом, оптимальные смеси для улучшения структуры для обоих типов коагулянтов с низким соотношением С/Р составляли 20%.
- Сухое вещество (DM) при расформовке (Фиг. 5): Сухое вещество увеличивается в смесях по сравнению с тестом с чистым ChyMaxM. Для обоих типов смесей сухое вещество при расформовке увеличивается при 20% и при 30%, от 48,2% для теста с чистым ChyMaxM, у 20% смесей сухое вещество составило 49% для смеси ChyMax и 50,5% для смеси Hannilase, и для теста 30% сухое вещество составило 52% для смеси ChyMax и 52,5% для смеси Hannilase.
- Сухое вещество в зависимости от твердости: Сравнивая эти результаты для сухого вещества с измерением структуры, можно видеть, что даже если сыры являются более сухими при расформовке, в смесях по сравнению с тестами с чистым ChyMaxM структура по-прежнему более мягкая. Это показывает, что смешивание ChyMaxM с коагулянтами с более низким С/Р является в высокой степени эффективным для снижения твердости даже с повышенным сухим веществом.
- Оптимальные результаты: Используя эти разные результаты, можно видеть, что для смеси ChyMaxМ и ChyMax, а также для смеси ChyMaxM и Hannilase оптимальное соотношение, близкое к 20%, сохраняет преимущества коагулянта с высоким соотношением С/Р и снижает твердость, когда она не требуется.
ПРИМЕР 5: Определение параметров коагуляции бычьего, верблюжьего и смешанных химозинов
Для наблюдения за параметрами коагуляции авторы изобретения использовали CHYMOgraph (запатентованный Chr. Hansen прибор). CHYMOgraph предусматривает оценивание времени флокуляции молока, а также изменение твердости сгустка при производстве сыра.
Компьютерная программа измеряет скорость формирования белкового каркаса в сгустке. Варьирование плотности молока и вязкоэластичности сгустка преобразовывают в удобные для пользователя графические данные, которые можно использовать для характеристики коагулянта или для определения оптимального времени разрезания сгустка.
CHYMOgraph измеряет время флокуляции молока, твердость сгустка и ее изменение и скорость формирования белкового каркаса.
Приготовление молока
Готовили контейнер с 500 г молока согласно целевому назначению молочной композиции и нагревали до температуры сычужного свертывания при 38°С на водяной бане 1 час перед добавлением сычужного фермента. Перед использованием молока регулировали и регистрировали рН.
Молочная композиция
Обогащенное молоко с 3,8% белка, высокотемпературная обработка: 90°С в течение 30 секунд,
рН при сычужном свертывании: 6,18 при 38°С и 6,28 при (4°С).
Температура сычужного свертывания: 38°С. Этот тип, молока соответствует типу молока молочной композиции, используемой при производстве мягкого сыра.
Приготовление коагулянта
Испытывали 3 раствора коагулянтов: верблюжьего химозина (ChyMax М1000), бычьего химозина (ChyMax+) и ChyMaxM soft (смесь 80% верблюжьего химозина (ChyMax М1000) и 20% бычьего химозина (ChyMax+)). Каждый раствор коагулянта получали с концентрацией 20 IMCU/мл разбавлением теплой водой. Такое разбавление предназначено для внесения достаточного количества коагулянта в образец молока для облегчения его диспергирования.
Каждый раствор коагулянта добавляли в молоко (1 мл на 500 г молока, то есть 40 IMCU/1 л). После добавления коагулянта образец перемешивали 30 секунд путем вращения. После вращения 10 мл каждого раствора коагулянта добавляли в Chymograph.
Результаты
Как изображено на Фиг. 7, скорость коагуляции при использовании смеси бычьего и верблюжьего химозина (ChyMax soft) превышает скорость коагуляции при использовании только верблюжьего химозина (ChyMax М1000) или бычьего химозина (ChyMax+). Это весьма неожиданно, поскольку квалифицированный научный работник ожидал бы результативность смеси, соответствующую среднему взвешенному двух компонентов, включенных в смесь.
ССЫЛКИ
1: WO 02/36752 А2 (Chr. Hansen).
2: Suzuki et al: Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218, Lys220 and Asp304 in chymosin, Protein Engineering, vol. 4, January 1990, pages 69-71.
3: Suzuki et al: Alteration of catalytic properties of chymosin by site-directed mutagenesis, Protein Engineering, vol. 2, May 1989, pages 563-569.
4: van den Brink et al: Increased production of chymosin by glycosylation, Journal of biotechnology, vol. 125, September 2006, pages 304-310.
5: Pitts et al: Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderma reesei, Journal of biotechnology, vol. 28, March 1993, pages 69-83.
6: M.G. Williams et al: Mutagenesis, biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin, Protein engineering design and selection, vol. 10, September 1997, pages 991-997.
7: Strop et al: Engineering enzyme subsite specificity: preparation, kinetic characterization, and x-ray analysis at 2.0 ANG resolution of Val111phe site mutated calf chymosin, Biochemistry, vol. 29, October 1990, pages 9863-9871.
8: Supannee et al: Site-specific mutations of calf chymosin В which influence milk-clotting activity, Food Chemistry, vol. 62, June 1998, pages 133-139.
9: Zhang et al: Functional implications of disulfide bond, Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin, Biochimica et biophysica acta, vol. 1343, December 1997, pages 278-286.
10: WO 2013/174840 A1 (Chr. Hansen).
11: WO 2013/164479 A2 (DSM).