ОБЪЕДИНЕННАЯ ОЧИСТКА И ИЗМЕРЕНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК С СОВМЕСТНЫМ ИЗМЕРЕНИЕМ МУТАЦИЙ И/ИЛИ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ мРНК В АВТОМАТИЧЕСКОМ РЕАКЦИОННОМ КАРТРИДЖЕ
COMBINED PURIFICATION AND MEASUREMENT OF DNA METHYLATION WITH COMBINED MEASUREMENT OF MUTATIONS AND/OR LEVELS OF mRNA EXPRESSION IN AUTOMATED REACTION CARTRIDGE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предшествующей предварительной заявки на патент США №62/433165, поданной 12 декабря 2016 г., полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Геном высших эукариот содержит модифицированный нуклеозид 5-метилцитозин (5-meC). Данная модификация обычно присутствует в виде части динуклеотида CpG, в котором цитозин преобразован в 5-метилцитозин в результате реакции, которая включает «выталкивание» (flipping out) цитозина-мишени из нативной двойной спирали и перенос ферментом метилтрансферазой метальной группы из S-аденозилметионина (см., например, Klimasauskas et al. (1994) Cell 76: 357-369). Ферментативное преобразование является первичной эпигенетической модификацией ДНК, про которую известно, что она происходит у позвоночных и крайне важна для нормального эмбрионального развития (см., например, Bird (1992) Cell 70: 5-8; Laird and Jaenisch (1994) Human Mol. Genet. 3: 1487-1495; и Li et al. (1992) Cell 69: 915-926).
[0003] У эукариот метилирование ДНК регулирует нормальное течение клеточных процессов, таких как геномный импринтинг, хромосомая нестабильность и инактивация Х-хромосомы. Обычно метилирование ДНК происходит по положению пятого атома углерода цитозина в участках динуклеотида 5'-CpG-3' или рядом с промоторами генов, называемых CpG-островками или берегами. Метилирование контролирует экспрессию генов путем понижающей регуляции транскрипции либо путем прямого ингибирования транскрипционного аппарата, либо опосредованно через вовлечение белков ремоделирования хроматина. Паттерны метилирования хромосом динамично изменяются в ходе эмбрионального развития, и надлежащие паттерны метилирования должны поддерживаться на протяжении всей жизни индивидуума. Изменения паттернов метилирования связаны со старением, и ошибки в метилировании ДНК входят в число самых ранних изменений, которые происходят в течение онкогенеза. Таким образом, выявление (детектирование) метилирования промоторов генов, помимо прочего, важно для диагностики и/или наблюдения пациентов с раковыми заболеваниями.
[0004] Эпигенетические изменения, включая метилирование ДНК, нарушают порядок ДНК-РНК-белок, согласно которому генетическая информация преобразуется в матричную РНК (мРНК) путем транскрипции. Взаимосвязь между геномными изменениями в ДНК, числом копий мРНК и уровнями белка может быть описана уровнем метилирования ДНК. Таким образом, совместное измерение уровней метилирования ДНК и соответствующих последующих уровней мРНК может быть важно для понимания механизма эпигенетической регуляции клетки.
[0005] Было разработано несколько способов эффективного и точного выявления (детектирования) и количественного анализа метилирования. Наиболее распространенным методом является метод бисульфитной конверсии, в котором неметилированный цитозин преобразуется в урацил. После конверсии профиль метилирования ДНК может быть определен стандартным методом ПЦР, секвенированием и т.п.
[0006] Существует несколько наборов для метилирования ДНК, подходящих для бисульфитной конверсии и очистки ДНК (например, наборы EZ DNA METHYLATION™ от Zymo Research). В большинстве наборов используется несколько стадий несколько реагентов, несколько периодов инкубации и часто требуется выделение ДНК перед проведением конверсии, хотя в некоторых наборах в качестве исходного материала могут быть использованы ткани или плазма/сыворотка.
[0007] В целом процесс бисульфитной конверсии требует проведения по меньшей мере четырех стадий: 1) денатурация ДНК; 2) инкубация с бисульфитом; 3) очистка ДНК и 4) десульфирование. Конечная стадия десульфирования может быть выполнена на колонке или в растворе с последующим осаждением этанолом. В настоящее время не существует наборов метилирования, которые позволяют пользователю провести в один этап весь процесс: очистку ДНК, инкубацию с бисульфитом, десульфирование, вторую очистку ДНК и метилспецифическую ПЦР.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[0008] Различные варианты реализации, предусмотренные в настоящем описании, могут включать, но не должны ограничиваться ими, одно или более из следующего:
[0009] Различные варианты реализации, предусмотренные в настоящем описании, могут включать, но не должны ограничиваться ими, одно или более из следующего:
[0010] Вариант реализации 1: Способ определения статуса метилирования нуклеиновой кислоты, включающий:
[0011] i) приведение биологического образца, содержащего нуклеиновую кислоту, в контакт с первым матричным материалом, содержащим первую колонку или фильтр, где указанный матричный материал связывает и/или фильтрует нуклеиновые кислоты в указанном образце и, таким образом, очищает ДНК;
[0012] ii) элюирование связанной ДНК из первого матричного материала и денатурирование ДНК с получением элюированной денатурированной ДНК;
[0013] iii) нагревание элюированной ДНК в присутствии бисульфитного реагента с получением дезаминированной нуклеиновой кислоты;
[0014] iv) приведение указанной дезаминированной нуклеиновой кислоты в контакт со вторым матричным материалом, содержащим вторую колонку, для связывания указанной дезаминированной нуклеиновой кислоты с указанным вторым матричным материалом;
[0015] v) десульфирование связанной дезаминированной нуклеиновой кислоты и/или одновременное элюирование и десульфирование указанной нуклеиновой кислоты путем приведения дезаминированной нуклеиновой кислоты в контакт со щелочным раствором с получением конвертированной (например, конвертированной бисульфитом) нуклеиновой кислоты;
[0016] vi) элюирование конвертированной бисульфитом нуклеиновой кислоты из второго матричного материала; и
[0017] vii) выполнение специфической в отношении метилирования полимеразной цепной реакции (ПЦР), и/или секвенирования нуклеиновой кислоты, и/или высокоточного анализа кривых плавления (HRM) указанной конвертированной нуклеиновой кислоты для определения метилирования указанной нуклеиновой кислоты, и при этом по меньшей мере стадии с iv) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0018] Вариант реализации 2: Способ согласно варианту реализации 1, в котором по меньшей мере стадии с iv) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0019] Вариант реализации 3: Способ согласно варианту реализации 1, в котором по меньшей мере стадии с iii) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0020] Вариант реализации 4: Способ согласно варианту реализации 1, в котором по меньшей мере стадии с ii) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0021] Вариант реализации 5: Способ согласно варианту реализации 1, в котором по меньшей мере стадии с i) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0022] Вариант реализации 6: Способ по любому из вариантов реализации 1-5, в котором стадию vii проводят в одном реакционном картридже.
[0023] Вариант реализации 7: Способ по любому из вариантов реализации 1-6, в котором указанный первый матричный материал и указанный второй матричный материал представляют собой одинаковый материал, образующий одну и ту же колонку.
[0024] Вариант реализации 8: Способ по любому из вариантов реализации 1-7, в котором указанный первый матричный материал и указанный второй матричный материал образуют разные колонки.
[0025] Вариант реализации 9: Способ по любому из вариантов реализации 1-8, в котором указанную специфическую в отношении метилирования ПЦР, при ее проведении, проводят в указанном картридже.
[0026] Вариант реализации 10: Способ по любому из вариантов реализации 1-9, в котором секвенирование указанной нуклеиновой кислоты, при его проведении, проводят в указанном картридже или в устройстве, совмещенном с указанным картриджем.
[0027] Вариант реализации 11: Способ по любому из вариантов реализации 1-10, в котором указанный картридж включает колонку, содержащую указанный первый матричный материал, камеру приема образца, канал или камеру с контролем температуры, множество камер, содержащих реагенты и/или буферы, и в процессе применения (эксплуатации) по меньшей мере одна из указанных камер содержит буфер для десульфирования/элюирования, при этом указанный картридж необязательно содержит вторую колонку, содержащую указанный второй матричный материал.
[0028] Вариант реализации 12: Способ согласно варианту реализации 11, в котором в процессе применения по меньшей мере одна из указанных камер содержит реагент, который обеспечивает бисульфит-ионы.
[0029] Вариант реализации 13: Способ по любому из вариантов реализации 11-12, в котором указанная вторая колонка отсутствует.
[0030] Вариант реализации 14: Способ по любому из вариантов реализации 11-13, в котором указанная вторая колонка присутствует.
[0031] Вариант реализации 15: Способ по любому из вариантов реализации 11-14, в котором указанный картридж помимо указанного канала или камеры с контролем температуры содержит канал или камеру термоциклирования.
[0032] Вариант реализации 16: Способ по любому из вариантов реализации 11-14, в котором указанный канал или камера с контролем температуры представляет собой канал или камеру термоциклирования.
[0033] Вариант реализации 17: Способ по любому из вариантов реализации 11-16, в котором указанный картридж включает одну или более камер, содержащих один или более реагентов, выбранных из группы, состоящей из специфических в отношении метилирования праймеров для ПЦР, специфических в отношении метилирования зондов для ПЦР, фермента(ов) для ПЦР и реакционного буфера для ПЦР.
[0034] Вариант реализации 18: Способ согласно варианту реализации 17, в котором указанный картридж включает одну или более камер, содержащих один или более праймеров и зондов для определения метилирования прямой цепи конвертированной бисульфитом ДНК.
[0035] Вариант реализации 19: Способ по любому из вариантов реализации 17-18, в котором указанный картридж включает одну или более камер, содержащих один или более праймеров и зондов для определения метилирования обратной цепи конвертированной бисульфитом ДНК.
[0036] Вариант реализации 20: Способ по любому из вариантов реализации 11-19, в котором указанная камера приема образца, указанная(ые) колонка(и), множество камер и, в случае наличия, указанный канал или камера с контролем температуры и/или канал или камера термоциклирования имеют избирательное соединение по текучей среде.
[0037] Вариант реализации 21: Способ согласно варианту реализации 20, в котором указанная камера приема образца, указанная(ые) колонка(и), указанное множество камер и, в случае наличия, указанный канал или камера термоциклирования имеют избирательное соединение по текучей среде посредством микрофлюидных каналов и клапанов.
[0038] Вариант реализации 22: Способ согласно варианту реализации 20, в котором указанная камера приема образца, указанная(ые) колонка(и), указанное множество камер, и, в случае наличия, указанный канал или камера термоциклирования или порт в указанный канал или камеру термоциклирования расположены вокруг центрального клапана и имеют избирательное соединение по текучей среде с каналом в указанном центральном клапане, причем указанный центральный клапан выполнен с возможностью размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном.
[0039] Вариант реализации 23: Способ по любому из вариантов реализации 11-22, в котором указанный картридж, в процессе применения содержит:
[0040] первую камеру, содержащую образец;
[0041] вторую камеру, содержащую раствор гуанидина тиоцианат-этанол (GTC-EtOH);
[0042] третью камеру, содержащую бисульфитный реагент;
[0043] четвертую камеру, содержащую буфер;
[0044] пятую камеру, содержащую промывочный раствор; и
[0045] шестую камеру, содержащую реагент для элюирования/десульфирования.
[0046] Вариант реализации 24: Способ согласно варианту реализации 23, в котором первая камера содержит указанный образец в реагенте для экстрагирования/осаждения GTC-EtOH-Твин.
[0047] Вариант реализации 25: Способ по любому из вариантов реализации 23-24, в котором буфер GTC-EtOH-Твин добавляют во время или близко ко времени помещения образца в картридж.
[0048] Вариант реализации 26: Способ по любому из вариантов реализации 23-25, в котором указанный бисульфитный реагент добавляют во время или близко ко времени помещения образца в картридж.
[0049] Вариант реализации 27: Способ согласно варианту реализации 23, в котором буфер GTC-EtOH-Твин представлен в виде компонента данного картриджа.
[0050] Вариант реализации 28: Способ по любому из вариантов реализации 23-25, в котором бисульфитный реагент представлен в виде компонента данного картриджа.
[0051] Вариант реализации 29: Способ по любому из вариантов реализации 11-28, в котором указанный картридж включает седьмую камеру, содержащую праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты для ПЦР.
[0052] Вариант реализации 30: Способ по любому из вариантов реализации 11-29, в котором указанный картридж включает восьмую камеру, также содержащую праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты для ПЦР.
[0053] Вариант реализации 31: Способ согласно вариантам реализации 29-30, в котором указанные праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты представлены на шариках (beads).
[0054] Вариант реализации 32: Способ по любому из вариантов реализации 1-31, в котором указанный биологический образец включает один или более образцов, выбранных из группы, состоящей из клетки, ткани и биологической жидкости, содержащей нуклеиновую кислоту.
[0055] Вариант реализации 33: Способ согласно варианту реализации 32, в котором указанный биологический образец содержит биологическую жидкость, выбранную из группы, состоящей из цельной крови, плазмы, сыворотки, слюны, слизи, мочи, мокроты, поджелудочного сока и спинномозговой жидкости.
[0056] Вариант реализации 34: Способ согласно варианту реализации 32, в котором указанный биологический образец содержит образец, выбранный из группы, состоящей из образца ткани, фиксированного формалином и залитого парафином образца ткани (FFPE), свежезамороженной ткани, тонкоигольного аспирационного биоптата (ТАБ) и толстоигольного биоптата.
[0057] Вариант реализации 35: Способ по любому из вариантов реализации 1-34, в котором указанный способ включает приведение в контакт указанного биологического образца с лизирующим раствором.
[0058] Вариант реализации 36: Способ согласно варианту реализации 35, в котором указанный способ включает расположение указанного образца в указанной камере приема образца и приведение в контакт указанного образца с раствором для экстрагирования/осаждения.
[0059] Вариант реализации 37: Способ по любому из вариантов реализации 1-36, в котором указанный матричный материал содержит материал колонки, выбранный из группы, состоящей из стекла или оксида кремния, ионообменной смолы, целлюлозы и гидроксиапатита.
[0060] Вариант реализации 38: Способ согласно варианту реализации 37, в котором указанный матричный материал содержит стекло.
[0061] Вариант реализации 39: Способ по любому из вариантов реализации 1-38, в котором указанный бисульфит-ион представлен в виде соединения, выбранного из группы, состоящей из бисульфита аммония, метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO).
[0062] Вариант реализации 40: Способ согласно варианту реализации 39, в котором указанный бисульфит-ион представлен бисульфитом аммония.
[0063] Вариант реализации 41: Способ по любому из вариантов реализации 1-40, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей поглотители (scavengers) для предотвращения окисления сульфитов и/или катализаторов.
[0064] Вариант реализации 42: Способ согласно варианту реализации 41, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей поглотители, выбранные из группы, состоящей из Тролокса и гидрохинона.
[0065] Вариант реализации 43: Способ по любому из вариантов реализации 41-42, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей полиамины в качестве катализаторов.
[0066] Вариант реализации 44: Способ по любому из вариантов реализации 1-43, в котором указанное элюирование связанной ДНК включает элюирование и денатурирование указанной ДНК с использованием низкой концентрации гидроксида калия или другого основания.
[0067] Вариант реализации 45: Способ согласно варианту реализации 44, в котором указанное элюирование связанной ДНК включает элюирование и денатурирование указанной ДНК с щелочным раствором с рН выше, чем примерно рН 10,5.
[0068] Вариант реализации 46: Способ согласно варианту реализации 44, в котором указанное элюирование связанной ДНК включает элюирование и денатурирование указанной ДНК с щелочным раствором с рН выше, чем примерно рН 12.
[0069] Вариант реализации 47: Способ вариантов реализации 45-46, в котором указанный щелочной раствор является раствором KOH 10-15 мМ.
[0070] Вариант реализации 48: Способ по любому из вариантов реализации 1-47, в котором указанная инкубация элюированной ДНК с бисульфит-ионами с получением дезаминированной нуклеиновой кислоты включает инкубацию данной ДНК в растворе бисульфита аммония, который имеет концентрации в диапазоне примерно от 6 М до примерно 7 М.
[0071] Вариант реализации 49: Способ согласно варианту реализации 48, в котором указанная инкубация элюированной ДНК с бисульфит-ионами с получением дезаминированной нуклеиновой кислоты включает инкубацию данной ДНК в растворе бисульфита аммония, который имеет концентрацию примерно 6,5 М.
[0072] Вариант реализации 50: Способ согласно варианту реализации 49, в котором указанная инкубация включает перенос ДНК в концентрированном растворе бисульфита внутрь канала или камеры с контролем температуры в указанном картридже и нагревание указанной смеси.
[0073] Вариант реализации 51: Способ согласно варианту реализации 50, в котором указанная инкубация включает термоциклирование концентрированного раствора бисульфита с температурой примерно в 60°С до примерно 95°С.
[0074] Вариант реализации 52: Способ по любому из вариантов реализации 1-51, в котором указанное приведение в контакт указанной дезаминированной нуклеиновой кислоты со вторым матричным материалом включает перемешивание раствора ДНК-бисульфит со свежеприготовленным GTC-EtOH и распределение данного раствора по указанному второму матричному материалу.
[0075] Вариант реализации 53: Способ согласно варианту реализации 52, в котором указанный способ включает промывание ДНК в указанном втором матричном материале свежеприготовленным GTC-EtOH и затем промывочным раствором.
[0076] Вариант реализации 54: Способ согласно варианту реализации 53, в котором указанный промывочный раствор содержит ПЭГ200.
[0077] Вариант реализации 55: Способ по любому из вариантов реализации 1-54, в котором указанное десульфирование связанной дезаминированной нуклеиновой кислоты включает элюирование ДНК из указанной второй колонки буфером для десульфирования с высоким рН и инкубацию указанного раствора.
[0078] Вариант реализации 56: Способ согласно варианту реализации 55, в котором указанная инкубация длится в течение периода времени в диапазоне примерно от 1 минуты до примерно 1 часа, или примерно от 5 минут до примерно 30 минут, или примерно от 10 минут до примерно 20 минут, или в течение примерно 15 минут.
[0079] Вариант реализации 57: Способ вариантов реализации 55-56, в котором указанный буфер для десульфирования/элюирования с высоким рН содержит KOH.
[0080] Вариант реализации 58: Способ по любому из вариантов реализации 55-57, в котором указанная инкубация происходит в камере, в которой предварительно содержался указанный буфер для десульфирования с высоким рН (например, камера 10).
[0081] Вариант реализации 59: Способ по любому из вариантов реализации 1-58, в котором после инкубации с бисульфит-ионами канал или камеру с контролем температуры отмывают буфером для удаления остатка бисульфита и нейтрализации рН.
[0082] Вариант реализации 60: Способ по любому из вариантов реализации 1-59, в котором проводят высокоточный анализ кривых плавления (HRM) указанной конвертированной бисульфитом нуклеиновой кислоты с целью определения метилирования указанной нуклеиновой кислоты.
[0083] Вариант реализации 61: Способ по любому из вариантов реализации 1-60, в котором проводят секвенирование указанной конвертированной бисульфитом нуклеиновой кислоты с целью определения метилирования указанной нуклеиновой кислоты.
[0084] Вариант реализации 62: Способ по любому из вариантов реализации 1-60, в котором проводят специфичную в отношении метилирования ПЦР с целью определения метилирования исследуемых последовательностей нуклеиновой кислоты.
[0085] Вариант реализации 63: Способ согласно варианту реализации 62, в котором проводят указанную специфическую в отношении метилирования ПЦР (MSP) с использованием праймеров, специфических для метилированных последовательностей, и/или праймеров, специфических для не метилированных последовательностей.
[0086] Вариант реализации 64: Способ согласно варианту реализации 62, в котором указанная специфическая в отношении метилирования ПЦР включает протокол MetyLight.
[0087] Вариант реализации 65: Способ согласно варианту реализации 62, в котором проводят ПЦР TaqMan с использованием праймеров, специфических для конвертированных бисульфитом метилированных и/или не метилированных последовательностей.
[0088] Вариант реализации 66: Способ по любому из вариантов реализации 62-65, в котором для указанной MSP применяют один или более флуоресцентных зондов, являющихся маркерами для амплифицированных метилированных последовательностей, и/или один или более флуоресцентных зондов, являющихся маркерами для амплифицированных неметилированных последовательностей.
[0089] Вариант реализации 67: Способ согласно варианту реализации 66, в котором указанные флуоресцентные зонды содержат флуоресцентный репортерный краситель и гасящий краситель, при этом зонд формирует сигнал о расщеплении посредством 5'-3' нуклеазной активности ДНК-полимеразы Taq.
[0090] Вариант реализации 68: Способ по любому из вариантов реализации 66-67, в котором сигнал метилирования определяют по объединенному сигналу (combined signal) от множества зондов, каждый из которых специфичен в отношении разных метилированных участков в исследуемой амплифицированной области.
[0091] Вариант реализации 69: Способ по любому из вариантов реализации 66-67, в котором сигнал метилирования определяют с помощью множества зондов, специфичных в отношении одних и тех же метилированных участков в исследуемой амплифицированной области.
[0092] Вариант реализации 70: Способ по любому из вариантов реализации 66-67, в котором указанное множество зондов содержит 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более зондов.
[0093] Вариант реализации 71: Способ по любому из вариантов реализации 66-67, в котором сигнал о метилировании определяют одним зондом в исследуемой амплифицированной области.
[0094] Вариант реализации 72: Способ по любому из вариантов реализации 66-71, в котором указанные зонды используют в простом (simplex) или мультиплексном формате.
[0095] Вариант реализации 73: Способ по любому из вариантов реализации 66-71, в котором указанные зонды используют в мультиплексном формате.
[0096] Вариант реализации 74: Способ по любому из вариантов реализации 66-73, в котором указанные зонды используют для вложенной (nested) ПЦР.
[0097] Вариант реализации 75: Способ по любому из вариантов реализации 66-74, в котором указанная реакционная смесь для ПЦР содержит контрольный образец контаминации бисульфитом, в котором, в случае присутствия в реакционной смеси бисульфита, во время ПЦР происходит запускаемое бисульфитом расщепление.
[0098] Вариант реализации 76: Способ по любому из вариантов реализации 1-75, в котором ПЦР проводят в отношении одного или более мутировавших генов.
[0099] Вариант реализации 77: Способ по любому из вариантов реализации 1-76, в котором ПЦР проводят для неконвертированной ДНК в качестве контроля.
[0100] Вариант реализации 78: Способ по любому из вариантов реализации 1-77, в котором ПЦР проводят для конвертированной ДНК в качестве контроля.
[0101] Вариант реализации 79: Способ согласно варианту реализации 77, в котором ПЦР проводят для неконвертированной ДНК, и при этом неконвертированная ДНК является мишенью в указанном способе.
[0102] Вариант реализации 80: Способ по любому из вариантов реализации 1-79, в котором реакцию с бисульфитом и ПЦР, или реакцию десульфирования и ПЦР, или реакцию с бисульфитом, реакцию десульфирования и ПЦР проводят вместе в одной и той же реакционной пробирке или камере.
[0103] Вариант реализации 81: Способ по любому из вариантов реализации 1-80, в котором указанное приведение биологического образца, содержащего нуклеиновую кислоту, в контакт с первым матричным материалом включает приведение в контакт образца, содержащего РНК, с указанным первым матричным материалом, причем указанный матричный материал связывает указанную РНК и, таким образом, приводит к очистке РНК.
[0104] Вариант реализации 82: Способ согласно варианту реализации 81, в котором указанный способ включает элюирование указанной РНК из указанного матричного материала по существу независимо от ДНК.
[0105] Вариант реализации 83: Способ согласно варианту реализации 82, в котором указанную РНК элюируют из указанного первого матричного материала с применением Трис-буферного элюирования.
[0106] Вариант реализации 84: Способ по любому из вариантов реализации 81-83, в котором указанную РНК элюируют и хранят в камере.
[0107] Вариант реализации 85: Способ по любому из вариантов реализации 81-84, в котором на указанной РНК проводят обратную транскрипцию (ОТ) и ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) для определения уровней экспрессии последовательностей-мишеней РНК.
[0108] Вариант реализации 86: Способ по любому из вариантов реализации 82-85, в котором для элюирования конвертированной бисульфитом нуклеиновой кислоты из указанного второго матричного материала и для смешения с конвертированной бисульфитом ДНК используют фракцию РНК или смешивают ее с элюированной конвертированной бисульфитом ДНК.
[0109] Вариант реализации 87: Способ согласно варианту реализации 86, в котором ОТ выполняют на указанной РНК до или после объединения с конвертированной бисульфитом ДНК.
[0110] Вариант реализации 88: Способ по любому из вариантов реализации 86-87, в котором qRT-PCR выполняют для ОТ РНК в смеси с целью определения уровней экспрессии последовательностей-мишеней РНК, а также в данной смеси выполняют специфическую в отношении метилирования ПЦР с целью определения метилирования последовательностей-мишеней ДНК.
[0111] Вариант реализации 89: Способ по любому из вариантов реализации 1-88, в котором определяют метилирование промоторной области гена, выбранного из группы, состоящей из MGMT. RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, НОХВ4, RASGRF2, TM6SF1 и AKR1B1.
[0112] Вариант реализации 90: Способ по любому из вариантов реализации 81-89, в котором указанный уровень экспрессии РНК определяют для метилтрансферазы.
[0113] Вариант реализации 91: Способ согласно варианту реализации 90, в котором указанный уровень экспрессии РНК определяют для метилтрансферазы, выбранной из группы, состоящей из DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B и TNMT3L.
[0114] Вариант реализации 92: картридж для определения статуса метилирования нуклеиновой кислоты, содержащий: колонку, включающую первый матричный материал, камеру приема образца, канал или камеру с контролем температуры, множество камер, содержащих реагенты и/или буферы, и в процессе применения по меньшей мере одна из указанных камер содержит бисульфитный реагент, и по меньшей мере одна из указанных камер содержит буфер для десульфирования/элюирования, и при этом указанный картридж необязательно включает вторую колонку, которая содержит указанный второй матричный материал.
[0115] Вариант реализации 93: картридж согласно варианту реализации 92, в котором указанный картридж в процессе применения включает камеру, которая содержит реагент, содержащий гуанидина тиоцианат - этанол (GTC-EtOH).
[0116] Вариант реализации 94: картридж по любому из вариантов реализации 92-93, в котором отсутствует указанная вторая колонка.
[0117] Вариант реализации 95: картридж по любому из вариантов реализации 92-93, в котором присутствует указанная вторая колонка.
[0118] Вариант реализации 96: картридж по любому из вариантов реализации 92-95, в котором указанный канал или камера с контролем температуры представляет собой канал или камеру термоциклирования.
[0119] Вариант реализации 97: картридж по любому из вариантов реализации 92-96, в котором указанный картридж дополнительно содержит второй канал или камеру нагрева.
[0120] Вариант реализации 98: картридж по любому из вариантов реализации 92-97, в котором указанный бисульфитный реагент содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из бисульфита аммония, метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO).
[0121] Вариант реализации 99: картридж согласно варианту реализации 98, в котором указанный бисульфитный реагент содержит бисульфит аммония.
[0122] Вариант реализации 100: картридж по любому из вариантов реализации 92-99, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей поглотители для предотвращения окисления сульфитов и/или катализаторы.
[0123] Вариант реализации 101: картридж согласно варианту реализации 100, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей поглотители, выбранные из группы, состоящей из Тролокса и гидрохинона.
[0124] Вариант реализации 102: картридж по любому из вариантов реализации 100-101, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей полиамины в качестве катализаторов.
[0125] Вариант реализации 103: картридж по любому из вариантов реализации 92-102, в котором указанный первый матричный материал и/или указанный второй матричный материал, при наличии, содержит материал, выбранный из группы, состоящей из стекла или кремния диоксида, ионно-обменной смолы и гидроксиапатита.
[0126] Вариант реализации 104: картридж по любому из вариантов реализации 92-103, в котором указанный картридж включает одну или более камер, содержащих один или более реагентов, выбранных из группы, состоящей из специфических для метилирования праймеров для ПЦР, специфических для метилирования зондов для ПЦР, фермента(-ов) для ПЦР и реакционного буфера для ПЦР.
[0127] Вариант реализации 105: картридж согласно варианту реализации 104, в котором указанный картридж включает по меньшей мере две камеры, содержащие один или более реагентов, выбранных из группы, состоящей из специфических для метилирования праймеров для ПЦР, специфических для метилирования зондов для ПЦР, фермента(-ов) для ПЦР и реакционного буфера для ПЦР.
[0128] Вариант реализации 106: картридж по любому из вариантов реализации 92-105, в котором указанный картридж включает по меньшей мере одну камеру, содержащую праймеры и зонды для определения метилирования прямой цепи конвертированной ДНК.
[0129] Вариант реализации 107: картридж по любому из вариантов реализации 92-106, в котором указанный картридж включает по меньшей мере одну камеру, содержащую праймеры и зонды для определения метилирования обратной цепи конвертированной ДНК.
[0130] Вариант реализации 108: картридж по любому из вариантов реализации 104-107, в котором указанные праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты представлены на шариках (beads).
[0131] Вариант реализации 109: картридж по любому из вариантов реализации 92-108, в котором указанная камера приема образца, указанная колонка(и), указанное множество камер и указанный канал или камера нагревания с контролем температуры имеют избирательное соединение по текучей среде.
[0132] Вариант реализации 110: картридж согласно варианту реализации 109, в котором указанная камера приема образца, указанная колонка(и), указанное множество камер и указанный канал или камера с контролем температуры имеют избирательное соединение по текучей среде посредством микрофлюидных каналов и клапанов.
[0133] Вариант реализации 111: картридж согласно варианту реализации 109, в котором указанная камера приема образца, указанная колонка(и), указанное множество камер и указанный канал или камера с контролем температуры или порт в указанном канале или камере с контролем температуры расположены вокруг центрального клапана и имеют избирательное соединение по текучей среде с каналом в указанном центральном клапане, причем указанный центральный клапан выполнен с возможностью для размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном.
[0134] Вариант реализации 112: картридж по любому из вариантов реализации 92-111, в котором указанный картридж выполнен с возможностью того, чтобы в процессе применения указанный картридж включал:
[0135] первую камеру, содержащую образец;
[0136] вторую камеру, содержащую раствор гуанидина тиоцианат-этанол (GTC-EtOH);
[0137] третью камеру, содержащую бисульфитный реагент;
[0138] четвертую камеру, содержащую буфер;
[0139] пятую камеру, содержащую промывочный раствор; и
[0140] шестую камеру, содержащую реагент для элюирования/десульфирования.
[0141] Вариант реализации 113: картридж согласно варианту реализации 112, в котором указанная первая камера содержит указанный образец в реагент для экстрагирования/осаждения GTC-EtOH-Твин.
[0142] Вариант реализации 114: картридж по любому из вариантов реализации 92-113, в котором указанный картридж выполнен с возможностью добавления бисульфитного реагента в данный картридж во время или близко ко времени помещения образца в картридж.
[0143] Вариант реализации 115: картридж по любому из вариантов реализации 92-113, в котором указанный бисульфитный реагент представлен в виде компонента картриджа.
[0144] Вариант реализации 116: картридж по любому из вариантов реализации 92-115, в котором указанный картридж выполнен с возможностью добавления буфера GTC-ETOH-Твин во время или близко ко времени помещения образца в картридж.
[0145] Вариант реализации 117: картридж по любому из вариантов реализации 92-115, в котором указанный буфер GTC-ETOH-Твин представлен в виде компонента картриджа.
[0146] Вариант реализации 118: картридж по любому из вариантов реализации 92-117, в котором указанный картридж включает седьмую камеру, содержащую праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты для ПЦР.
[0147] Вариант реализации 119: картридж по любому из вариантов реализации 92-118, в котором указанный картридж включает восьмую камеру, также содержащую праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты для ПЦР.
[0148] Вариант реализации 120: картридж по любому из вариантов реализации 92-119, в котором указанный картридж включает одну или более камер, содержащих праймеры, специфичные для конвертированных бисульфитом метилированных и/или неметилированных последовательностей.
[0149] Вариант реализации 121: картридж по любому из вариантов реализации 92-120, в котором указанный картридж включает одну или более камер, содержащих реагенты для ПЦР TaqMan.
[0150] Вариант реализации 122: картридж по любому из вариантов реализации 92-121, в котором указанный картридж включает одну или более камер, содержащих один или более флуоресцентных зондов, которые являющихся маркерами для амплифицированных метилированных последовательностей, и/или один или более флуоресцентных зондов, являющихся маркерами для амплифицированных неметилированных последовательностей.
[0151] Вариант реализации 123: картридж согласно варианту реализации 122, в котором указанные зонды содержат флуоресцентный репортерный краситель и гасящий краситель, при этом зонд формирует сигнал о расщеплении посредством 5'-3' нуклеазной активности Taq ДНК-полимеразы.
[0152] Вариант реализации 124: картридж по любому из вариантов реализации 122-123, в котором указанный картридж содержит множество зондов, каждый из которых специфичен в отношении разных метилированных участков в исследуемой амплифицированной области.
[0153] Вариант реализации 125: картридж по любому из вариантов реализации 122-123, в котором указанный картридж содержит один зонд, специфичный в отношении одного метилированного участка в исследуемой амплифицированной области.
[0154] Вариант реализации 126: картридж по любому из вариантов реализации 122-123, в котором указанный картридж содержит множество зондов, каждый из которых специфичен в отношении одного и того же метилированного участка в исследуемой амплифицированной области.
[0155] Вариант реализации 127: картридж по любому из вариантов реализации 92-126, в котором указанный картридж содержит праймеры и/или зонды для определения метилирования промоторной области гена, выбранной из группы, состоящей из MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, НОХВ4, RASGRF2, TM6SF1 и AKR1B1.
[0156] Вариант реализации 128: картридж по любому из вариантов реализации 92-126, в котором указанный картридж содержит один или более праймеров, приведенных в таблицах 5, 9 или 10, и/или один или более зондов, приведенных в таблицах 5, 9 или 10.
[0157] Вариант реализации 129: картридж согласно варианту реализации 128, в котором указанный картридж содержит следующие зонды и праймеры для определения метилирования MGMT с использованием вложенной ПЦР:
[0158] внешний прямой праймер (248b), содержащий последовательность нуклеотидов GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO: 263);
[0159] внешний обратный праймер (249b), содержащий последовательность нуклеотидов: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO: 265);
[0160] внутренний прямой праймер (250), содержащий последовательность нуклеотидов TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 266);
[0161] внутренний обратный праймер (251), содержащий последовательность нуклеотидов GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO: 267); и
[0162] зонд (252а), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАААСАС(Т*)САССАААТС(N*)САААС-блокатор (SEQ ID NO: 268).
[0163] Вариант реализации 130: картридж по любому из вариантов реализации 128-129, в котором указанный картридж содержит следующий зонды и праймеры для определения метилирования АСТВ (например, в качестве контроля) с использованием вложенной ПЦР:
[0164] внешний прямой праймер (102), содержащий последовательность нуклеотидов: GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO: 103);
[0165] внешний обратный праймер (103), содержащий последовательность нуклеотидов: ССААТААААССТАСТССТСССТТАА (SEQ ID NO: 104);
[0166] внутренний прямой праймер (148), содержащий последовательность нуклеотидов: GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO: 149);
[0167] внутренний обратный праймер (149), содержащий последовательность нуклеотидов: CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO: 150); и
[0168] зонд (178), содержащий последовательность нуклеотидов: флуорофор-ССАССАСССААСАСА(N*)САА(Т*)ААСАААСАС-блокатор (SEQ ID NO: 179).
[0169] Вариант реализации 131: картридж по любому из вариантов реализации 92-130, в котором указанный картридж выполнен с возможностью для определения уровня экспрессии РНК для метилтрансферазы.
[0170] Вариант реализации 132: картридж согласно варианту реализации 131, в котором указанная метилтрансфераза выбрана из группы, состоящей из DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B и TNMT3L.
[0171] Вариант реализации 133: Система для определения метилирования нуклеиновой кислоты в биологическом образце, включающая: корпус, выполненный с возможностью размещения одного или более модулей обработки образца, где каждый модуль обработки образца выполнен с возможностью крепления съемного картриджа по любому из вариантов реализации 92-132; при этом указанная система выполнена с возможностью управления модулями обработки образца с обеспечением выполнения обработки образца с целью определения метилирования одной или более нуклеиновых кислот-мишеней и необязательно для определения уровня одной или более последовательностей ДНК-мишени внутри соответствующего съемного картриджа с образцом, при этом указанная обработка образца внутри соответствующего съемного картриджа проводится способом по любому из вариантов реализации 1-91.
[0172] Вариант реализации 134: система согласно варианту реализации 133, где указанная система выполнена с возможностью размещения одного модуля обработки образца.
[0173] Вариант реализации 135: система согласно варианту реализации 133, где указанная система выполнена с возможностью размещения по меньшей мере двух модулей обработки образца, или по меньшей мере 4 модулей обработки образца, или по меньшей мере 8 модулей обработки образца, или по меньшей мере 12 модулей обработки образца, или по меньшей мере 16 модулей обработки образца, или по меньшей мере 20 модулей обработки образца, или по меньшей мере 24 модулей обработки образца, или по меньшей мере 28 модулей обработки образца, или по меньшей мере 32 модулей обработки образца, или по меньшей мере 64 модулей обработки образца, или по меньшей мере 128 модулей обработки образца.
[0174] Вариант реализации 136: система по любому из вариантов реализации 133-135, в которой указанные модули включают одну или более нагревательных пластин для нагревания камеры или канала с контролем температуры в указанном картридже.
[0175] Вариант реализации 137: система по любому из вариантов реализации 133-136, в которой указанные модули включают вентилятор, выполненный с возможностью охлаждения канала или камеры с контролем температуры в указанном картридже.
[0176] Вариант реализации 138: система по любому из вариантов реализации 133-137, в которой указанные модули включают электронную плату для передачи информации (например, оптической информации) в компьютер с целью ее анализа.
[0177] Вариант реализации 139: система по любому из вариантов реализации 133-138, в которой указанные модули включают оптические блоки, обеспечивая возбуждение и/или детектирование одного или более оптических сигналов, генерируемых за счет реакций в указанном картридже.
[0178] Вариант реализации 140: система по любому из вариантов реализации 133-139, где указанная система выполнена с возможностью управления указанным картриджем с обеспечением выполнения способа по любому из вариантов реализации 1-91.
[0179] Вариант реализации 141: система по любому из вариантов реализации 133-139, в которой указанная система выполнена с возможностью управления указанным картриджем для: связывания образца на колонке; элюирования ДНК из колонки и объединения указанной ДНК с реагентом для конверсии; нагревания раствора ДНК/реагент для конверсии в реакционной камере или пробирке с получением конвертированной ДНК; связывания конвертированной ДНК на колонке; десульфирования и элюирования ДНК из колонки; и проведения ПЦР с элюированной десульфированной ДНК в реакционной камере или пробирке.
[0180] Вариант реализации 142: система согласно варианту реализации 141, в которой указанную ПЦР выполняют в одной и той же реакционной камере или пробирке, и при этом раствор ДНК/реагент для конверсии предварительно нагревается.
[0181] Вариант реализации 143: картридж подготовки образца, включающий: канал или камеру, содержащую аффинную матрицу, которая связывает ДНК, множество камер, расположенных вокруг узла центрального клапана и имеющих избирательное соединение по текучей среде с указанным узлом центрального клапана, при этом указанный узел центрального клапана выполнен с возможностью для размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном; причем указанное множество камер включает: камеру, выполненную с возможностью приема раствора образца примерно до 5 мл включительно или примерно до 4 мл включительно; камеру, содержащую ПЭГ; камеру, содержащую GTC-EtOH; камеру, содержащую щелочной раствор; и камеру, содержащую буфер.
[0182] Вариант реализации 144: картридж согласно варианту реализации 143, в котором указанное множество камер дополнительно включает камеру, содержащую бисульфитный реагент.
[0183] Вариант реализации 145: картридж по любому из вариантов реализации 143-144, в котором указанное множество камер включает камеру, содержащую отмывочный раствор GTC-этанол.
[0184] Вариант реализации 146: картридж согласно варианту реализации 145, в котором указанный отмывочный раствор GTC-этанол содержит гуанидина тиоцианат 1,25М, Трис 25 мМ с рН 7,0 и 50% этанол.
[0185] Вариант реализации 147: картридж по любому из вариантов реализации 143-146, в котором указанный ПЭГ содержит ПЭГ200.
[0186] Вариант реализации 148: картридж по любому из вариантов реализации 143-147, в котором указанный щелочной раствор содержит KOH.
[0187] Вариант реализации 149: картридж по любому из вариантов реализации 143-148, в котором указанный буфер содержит Трис.
[0188] Вариант реализации 150: картридж по любому из вариантов реализации 143-149, в котором указанное множество камер включает камеру, содержащую шарики, содержащие один или более праймеров для ПЦР и/или зонды.
[0189] Вариант реализации 151: картридж по любому из вариантов реализации 143-150, в котором указанная камера, содержащая ПЭГ, содержит примерно 1 мл ПЭГ.
[0190] Вариант реализации 152. картридж по любому из вариантов реализации 143-151, в котором указанная камера, содержащая щелочной раствор, содержит примерно 500 мкл раствора.
[0191] Вариант реализации 153: картридж по любому из вариантов реализации 143-152, в котором указанная камера, содержащая GTC-EtOH, содержит примерно 2 мл GTC-EtOH.
[0192] Вариант реализации 154: картридж по любому из вариантов реализации 143-153, в котором указанная камера, содержащая буфер, содержит примерно 2 мл буфера.
[0193] Вариант реализации 155: при высокообъемной пробоподготовке (HVSP) указанный картридж включает: канал или камеру, содержащую аффинную матрицу, которая связывает ДНК, множество камер, расположенных вокруг узла центрального клапана и имеющих избирательное соединение по текучей среде с указанным узлом центрального клапана, при этом указанный узел центрального клапана выполнен с возможностью для размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном, причем указанное множество камер включает: по меньшей мере две отличающихся камеры, выполненных с возможностью приема примерно 4,5 мл раствора образца; камеру, содержащую ПЭГ; камеру, содержащую щелочной раствор; и камеру, содержащую буфер.
[0194] Вариант реализации 156: картридж согласно варианту реализации 155, в котором указанное множество камер включает по меньшей мере три различных камеры, каждая из которых выполнена с возможностью размещения вплоть до 4 мл раствора образца.
[0195] Вариант реализации 157: картридж по любому из вариантов реализации 155-156, в котором указанный ПЭГ содержит ПЭГ200.
[0196] Вариант реализации 158: картридж по любому из вариантов реализации 155-157, в котором указанный раствор основания содержит KOH.
[0197] Вариант реализации 159: картридж по любому из вариантов реализации 155-158, в котором указанный буфер содержит Трис.
[0198] Вариант реализации 160: картридж по любому из вариантов реализации 155-159, в котором указанное множество камер включает камеру, содержащую отмывочный раствор.
[0199] Вариант реализации 161: картридж согласно варианту реализации 160, в котором указанный отмывочный раствор содержит гуанидина тиоцианат 1,25М, Трис 25 мМ с рН 7,0 и 50% этанол.
[0200] Вариант реализации 162: картридж по любому из вариантов реализации 155-161, в котором указанный картридж включает камеру, выполненную с возможностью изъятия обработанного образца.
[0201] Вариант реализации 163: картридж по любому из вариантов реализации 155-162, в котором указанные камеры для образца в процессе применения содержат раствор образца, GTC и изопропанол.
[0202] Вариант реализации 164: картридж согласно варианту реализации 163, в котором указанные камеры для образца в процессе применения содержат раствор образца, GTC и изопропанол в равных по существу объемах.
[0203] Вариант реализации 165: картридж по любому из вариантов реализации 155-164, в котором указанный картридж в процессе применения содержит 4 мл раствора образца, размещаемого в каждой из указанных камер, выполненных с возможностью приема образца.
[0204] Вариант реализации 166: картридж по любому из вариантов реализации 155-165, в котором указанный картридж обеспечивает выделение ДНК или РНК, которое по существу имеет линейную зависимость от объема образца, от 0,5 мл до примерно 4 мл.
[0205] Вариант реализации 167: картридж по любому из вариантов реализации 155-166, в котором указанный картридж содержит или выполнен с возможностью для размещения реагента для конверсии.
[0206] Вариант реализации 168: картридж согласно варианту реализации 167, в котором в процессе применения в указанном картридже проводят бисульфитную конверсию ДНК.
[0207] Вариант реализации 169: лизирующий раствор для получения образца ДНК из сыворотки или плазмы, содержащий: GTC, буфер, детергент и, необязательно, антивспенивающий агент.
[0208] Вариант реализации 170: лизирующий раствор согласно варианту реализации 169, в котором указанный лизирующий раствор для сыворотки или плазмы содержит GTC, Трис с рН 7,0, Твин 20 и пеногаситель SE15.
[0209] Вариант реализации 171: лизирующий раствор согласно варианту реализации 170, в котором указанный лизирующий раствор для сыворотки или плазмы содержит GTC примерно 4,5 М, Трис примерно 45 мМ с рН 7,0, Твин20 примерно 1% и пеногаситель SE15 примерно 0,01%.
[0210] Вариант реализации 172: лизирующий раствор для получения образца ДНК из образца FFPE.
2
[0211] Вариант реализации 173: лизирующий раствор согласно варианту реализации 172, в котором указанный лизирующий раствор для образцов FFPE содержит буфер, детергент, NaCl, MgCl, комплексообразующий агент, пеногаситель SE15 и азид натрия.
2
[0212] Вариант реализации 174: лизирующий раствор согласно варианту реализации 173, в котором указанный лизирующий раствор для образцов FFPE содержит примерно 1% Твина 20, примерно 400 мМ NaCl, примерно 25 мМ ЭДТА, примерно 10 мМ MgCl, примерно 50 мМ ГЭПЭС с рН 7,2, примерно 0,01% пеногасителя SE15 и примерно 0,01% азида натрия.
[0213] Вариант реализации 175: набор для определения метилирования ДНК, включающий: контейнер, содержащий картридж для определения статуса метилирования нуклеиновой кислоты по любому из вариантов реализации 92-136.
[0214] Вариант реализации 176: набор согласно варианту реализации 175, в котором указанный набор дополнительно включает контейнер, содержащий лизирующий раствор.
[0215] Вариант реализации 177: набор согласно варианту реализации 176, в котором указанный лизирующий раствор представляет собой лизирующий раствор для сыворотки или плазмы по любому из вариантов реализации 169-171.
[0216] Вариант реализации 178: набор согласно варианту реализации 176, в котором указанный лизирующий раствор представляет собой лизирующий раствор для образца FFPE по любому из вариантов реализации 172-174.
[0217] Вариант реализации 179: набор по любому из вариантов реализации 175-178, в котором указанный набор включает контейнер, содержащий протеиназу K.
[0218] Вариант реализации 180: набор по любому из вариантов реализации 175-179, в котором указанный набор содержит реагент для конверсии в указанном картридже или в обособленном от картриджа контейнере.
[0219] Вариант реализации 181: набор согласно варианту реализации 180, в котором указанный набор содержит указанный реагент для конверсии в обособленном от картриджа контейнере.
[0220] Вариант реализации 182: набор согласно варианту реализации 180, в котором указанный набор содержит указанный реагент для конверсии, который размещен в камере картриджа.
[0221] Вариант реализации 183: набор по любому из вариантов реализации 180-182, в котором указанный реагент для конверсии содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия, бисульфита аммония и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO).
[0222] Вариант реализации 184: набор согласно варианту реализации 183, в котором указанный реагент для конверсии содержит бисульфит аммония.
[0223] Вариант реализации 185: набор по любому из вариантов реализации 175-184, в котором указанный набор включает контейнер, содержащий реагент для обработки образца.
[0224] Вариант реализации 186: набор согласно варианту реализации 185, в котором указанный реагент для обработки образца содержит гуанидина тиоцианат.
[0225] Вариант реализации 187: набор по любому из вариантов реализации 185-186, в котором указанный реагент для обработки образца содержит этанол.
[0226] Вариант реализации 188: набор по любому из вариантов реализации 175-187, в котором указанный набор включает контейнер, содержащий картридж подготовки образца по любому из вариантов реализации 155-166.
[0227] Вариант реализации 189: набор по любому из вариантов реализации 175-188, в котором указанный набор содержит инструктирующие материалы для обучения по применению указанного картриджа для определения метилирования ДНК.
[0228] Вариант реализации 190: картридж для определения метилирования маркеров рака, который включает: множество камер и канал или камеру термоциклирования, при этом указанное множество камер и порт в указанный канал или камеру термоциклирования расположены вокруг узла центрального клапана и имеют избирательное соединение по текучей среде с указанным узлом центрального клапана, при этом указанный узел центрального клапана выполнен с возможностью для размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь или из камеры или порта при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном, причем указанное множество камер включает: камеру приема образца; камеру, содержащую или выполненную с возможностью приема бисульфитного реагента; камеру, содержащую отмывочный раствор; камеру, содержащую буфер Трис; камеру, содержащую щелочной раствор, содержащий KOH; камеру, содержащую шарики, на которых размещен мастер-микс для ПЦР; и камеру, содержащую шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака.
[0229] Вариант реализации 191: картридж согласно варианту реализации 190, в котором указанное множество камер включает камеру, предусмотренную для приема отработанных растворов.
[0230] Вариант реализации 192: картридж по любому из вариантов реализации 190-191, в котором указанный бисульфитный реагент содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия, бисульфита аммония и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO).
[0231] Вариант реализации 193: картридж согласно варианту реализации 192, в котором указанный бисульфитный реагент содержит бисульфит аммония.
[0232] Вариант реализации 194: картридж по любому из вариантов реализации 190-193, в котором указанный отмывочный раствор содержит GTC 1,25 М, Трис 25 мМ с рН 7,0 и 50% этанол.
[0233] Вариант реализации 195: картридж по любому из вариантов реализации 190-194, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мозга и рака легкого.
[0234] Вариант реализации 196: картридж согласно варианту реализации 195, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые обеспечивают праймеры для ПЦР и зонды для вложенной ПЦР.
[0235] Вариант реализации 197: картридж согласно варианту реализации 196, в котором указанная вложенная ПЦР включает первую реакционную смесь для ПЦР, специфичную в отношении конвертированной ДНК, и вторую реакционную смесь для ПЦР, специфичную в отношении метилированных CpG.
[0236] Вариант реализации 198: картридж по любому из вариантов реализации 190-197, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования прямой цепи конвертированной ДНК.
[0237] Вариант реализации 199: картридж по любому из вариантов реализации 190-198, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования обратной цепи конвертированной ДНК.
[0238] Вариант реализации 200: картридж по любому из вариантов реализации 190-199, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, BRCA1, BNC1, ADAMTS1, CDO1, SOX17, ТАС1, НОХА7 и MGMT.
[0239] Вариант реализации 201: картридж по любому из вариантов реализации 190-200, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером для рака поджелудочной железы.
[0240] Вариант реализации 202: картридж согласно варианту реализации 201, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов ADAMTS1 и/или BNC1.
[0241] Вариант реализации 203: картридж согласно варианту реализации 202, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора ADAMTS1.
[0242] Вариант реализации 204: картридж по любому из вариантов реализации 202-203, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора BNC1.
[0243] Вариант реализации 205: картридж согласно варианту реализации 202, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают один или более праймеров для ПЦР и/или зондов для ADAMTS1 и/или BNC, представленных в таблицах 5 или 10.
[0244] Вариант реализации 206: картридж по любому из вариантов реализации 190-200, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака молочной железы.
[0245] Вариант реализации 207: картридж согласно варианту реализации 206, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов одного, двух, трех, четырех, пяти или всех генов, выбранных из группы, состоящей из BRCA1, RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2 и TM6SF1.
[0246] Вариант реализации 208: картридж согласно варианту реализации 207, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора BRCA1.
[0247] Вариант реализации 209: картридж по любому из вариантов реализации 207-208, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора RASSF1A.
[0248] Вариант реализации 210: картридж по любому из вариантов реализации 207-209, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора AKR1B1.
[0249] Вариант реализации 211: картридж по любому из вариантов реализации 207-210, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора НОХВ4.
[0250] Вариант реализации 212: картридж по любому из вариантов реализации 207-211, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора HIST1H3C.
[0251] Вариант реализации 213: картридж по любому из вариантов реализации 207-212, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора RASGRF2.
[0252] Вариант реализации 214: картридж по любому из вариантов реализации 207-213, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора TM6SF1.
[0253] Вариант реализации 215: картридж по любому из вариантов реализации 207-214, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают один или более праймеров для ПЦР и/или один или более зондов для ПЦР, представленных в таблицах 5 или 9.
[0254] Вариант реализации 216: картридж согласно варианту реализации 206, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов BRCA1.
[0255] Вариант реализации 217: картридж по любому из вариантов реализации 190-200, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака легкого.
[0256] Вариант реализации 218: картридж согласно варианту реализации 217, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов одного, двух, трех или всех генов выбранный из группы, состоящей из CDO1, SOX17, ТАС1 и НОХА7.
[0257] Вариант реализации 219: картридж согласно варианту реализации 218, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора CDO1.
[0258] Вариант реализации 220: картридж по любому из вариантов реализации 218-219, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора SOX17.
[0259] Вариант реализации 221: картридж по любому из вариантов реализации 218-220, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора ТАС1.
[0260] Вариант реализации 222: картридж по любому из вариантов реализации 218-221, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора НОХА7.
[0261] Вариант реализации 223: картридж по любому из вариантов реализации 190-200, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака мозга.
[0262] Вариант реализации 224: картридж согласно варианту реализации 223, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора MGMT.
[0263] Вариант реализации 225: картридж согласно варианту реализации 224, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают один или более праймеров для ПЦР и/или зондов для MGMT, представленных в таблицах 5 или 10.
[0264] Вариант реализации 226: картридж согласно варианту реализации 225, в котором указанный картридж содержит следующий зонды и праймеры для определения метилирования MGMT с использованием вложенной ПЦР:
[0265] внешний прямой праймер (248b), содержащий последовательность нуклеотидов GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO: 263);
[0266] внешний обратный праймер (249b), содержащий последовательность нуклеотидов ААААААС(Т*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO: 265);
[0267] внутренний прямой праймер (250), содержащий последовательность нуклеотидов TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 266);
[0268] внутренний обратный праймер (251), содержащий последовательность нуклеотидов GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO: 267); и
[0269] зонд (252а), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАААСАС(Т*)САССАААТС(N*)САААС-блокатор (SEQ ID NO: 268).
[0270] Вариант реализации 227: картридж по любому из вариантов реализации 225-226, в котором указанный картридж содержит следующие зонды и праймеры для определения метилирования АСТВ (например, в качестве контроля) с использованием вложенной ПЦР:
[0271] внешний прямой праймер (102), содержащий последовательность нуклеотидов GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO: 103);
[0272] внешний обратный праймер (103), содержащий последовательность нуклеотидов ССААТААААССТАСТССТСССТТАА (SEQ ID NO: 104);
[0273] внутренний прямой праймер (148), содержащий последовательность нуклеотидов GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO: 149);
[0274] внутренний обратный праймер (149), содержащий последовательность нуклеотидов CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO: 150); и
[0275] зонд (178), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАССАСССААСАСА(N*)САА(Т*)ААСАААСАС-блокатор (SEQ ID NO: 179).
[0276] Вариант реализации 228: Способ подготовки образца ДНК из сыворотки или плазмы, который включает:
[0277] смешивание образца сыворотки или плазмы, обработанного протеиназой K, с лизирующим раствором по любому из вариантов реализации 169-171 и со спиртом для образования раствора образца;
[0278] загрузку указанного раствора образца внутрь камеры приема образца в картридже по любому из вариантов реализации 143-154 или внутрь камеры приема образца в картридже по любому из вариантов реализации 155-168; и
[0279] управление указанным картриджем для связывания ДНК в указанном образце с указанной аффинной матрицей и последующей отмывки и выделения указанной ДНК из указанной матрицы.
[0280] Вариант реализации 229: способ согласно варианту реализации 228, в котором указанное объединение обработанного протеиназой K образца сыворотки или плазмы включает объединение указанного образца, лизирующего раствора и спирта в соотношениях, соответствующих примерно до 1,3 мл сыворотки или плазмы, обработанной протеиназой K, 2,2 мл лизирующего раствора и примерно 1,5 мл спирта.
[0281] Вариант реализации 230: Способ по любому из вариантов реализации 228-229, в котором указанный спирт включает изопропанол.
[0282] Вариант реализации 231: Способ по любому из вариантов реализации 228-230, в котором указанный образец содержит сыворотку.
[0283] Вариант реализации 232: Способ по любому из вариантов реализации 228-231, в котором указанный образец содержит плазму.
[0284] Вариант реализации 233: Способ по любому из вариантов реализации 228-232, в котором указанный образец содержит сыворотку.
[0285] Вариант реализации 234: Способ по любому из вариантов реализации 228-233, в котором управление указанным картриджем включает установку указанного картриджа внутрь модуля обработки образца в системе по любому из вариантов реализации 133-139.
[0286] Вариант реализации 235: Способ по любому из вариантов реализации 228-234, в котором указанный способ дополнительно включает управление указанным картриджем для конверсии указанной ДНК с целью определения метилирования.
[0287] Вариант реализации 236: Способ по любому из вариантов реализации 228-235, в котором указанный способ дополнительно включает управление указанным картриджем с обеспечением выполнения одной или более ПЦР с использованием указанной ДНК или конвертированной ДНК в качестве матрицы (template).
[0288] Вариант реализации 237: Способ по любому из вариантов реализации 228-234, в котором указанная загрузка включает загрузку указанного раствора образца внутрь одной или более камер приема образца в картридже по любому из вариантов реализации 155-165.
[0289] Вариант реализации 238: Способ согласно варианту реализации 237, в котором указанный способ дополнительно включает перенос выделенной ДНК во второй картридж для определения метилирования и/или ПЦР.
[0290] Вариант реализации 239: Способ согласно варианту реализации 238, в котором указанный второй картридж представляет собой картридж по любому из вариантов реализации 92-132.
[0291] Вариант реализации 240: Способ по любому из вариантов реализации 238-239, в котором указанный способ дополнительно включает управление указанным вторым картриджем с целью конверсии указанной ДНК для определения метилирования.
[0292] Вариант реализации 241: Способ по любому из вариантов реализации 238-240, в котором указанный способ дополнительно включает управление указанным вторым картриджем с обеспечением выполнения одной или более ПЦР с использованием указанной ДНК или конвертированной ДНК в качестве матрицы (template).
[0293] Вариант реализации 242: Способ по любому из вариантов реализации 238-241, в котором указанное управление вторым картриджем включает установку указанного второго картриджа внутрь модуля подготовки образца в системе по любому из вариантов реализации 133-139.
[0294] Вариант реализации 243: Способ получения ДНК из образца FFPE, включающий:
[0295] объединение фиксированного формалином и залитого парафином образца с лизирующим раствором по любому из вариантов реализации 172-174;
[0296] нагревание указанного лизирующего раствора, содержащего указанный образец; добавление спирта к указанному образцу для образования раствора образца; загрузку указанного раствора образца внутрь камеры приема образца в картридже по любому из вариантов реализации 143-154, или внутрь камеры приема образца в картридже по любому из вариантов реализации 155-168; и
[0297] управление указанным картриджем для связывания ДНК в указанном образце с указанной аффинной матрицей и последующей отмывкой и выделением указанной ДНК из указанной матрицы.
[0298] Вариант реализации 244: Способ согласно варианту реализации 243, в котором указанное нагревание включает добавление протеиназы K к указанному образцу и нагревание указанного образца.
[0299] Вариант реализации 245: Способ согласно варианту реализации 244, в котором указанное нагревание включает добавление примерно 50 мкл протеиназы K к примерно 1,2 мл лизирующего раствора FFPE, содержащего образец FFPE.
[0300] Вариант реализации 246: Способ по любому из вариантов реализации 243-245, в котором указанное нагревание включает нагревание указанного лизирующего раствора до температуры в диапазоне от примерно 50°С до примерно 60°С.
[0301] Вариант реализации 247: Способ согласно варианту реализации 246, в котором указанное нагревание включает нагревание указанного лизирующего раствора до температуры примерно 56°С.
[0302] Вариант реализации 248: Способ по любому из вариантов реализации 243-247, в котором указанное нагревание проводят в течение периода времени в диапазоне вплоть до примерно 4 часов, или вплоть до примерно 5 часов, или вплоть до примерно 6 часов.
[0303] Вариант реализации 249: Способ согласно варианту реализации 248, в котором указанное нагревание проводят в течение примерно 4 часов.
[0304] Вариант реализации 250: Способ по любому из вариантов реализации 243-249, в котором указанный спирт включает этанол.
[0305] Вариант реализации 251: Способ по любому из вариантов реализации 243-250, в котором указанный способ включает добавление спирта к указанному лизирующему раствору в объемном соотношении лизирующий раствор : спирт примерно 1:1.
[0306] Вариант реализации 252: Способ по любому из вариантов реализации 243-251, в котором управление указанным картриджем включает установку указанного картриджа внутрь модуля обработки образца в системе по любому из вариантов реализации 133-139.
[0307] Вариант реализации 253: Способ по любому из вариантов реализации 243-252, в котором указанный способ дополнительно включает управление указанным картриджем для конверсии указанной ДНК с целью определения метилирования.
[0308] Вариант реализации 254: Способ по любому из вариантов реализации 243-253, в котором указанный способ дополнительно включает управление указанным картриджем с обеспечением выполнения одной или более ПЦР с использованием указанной ДНК или конвертированной ДНК в качестве матрицы.
[0309] Вариант реализации 255: Способ по любому из вариантов реализации 243-251, в котором указанная загрузка включает загрузку указанного раствора образца внутрь одной или более камер приема образца в картридже по любому из вариантов реализации 155-165.
[0310] Вариант реализации 256: Способ согласно варианту реализации 255, в котором указанный способ дополнительно включает перенос выделенной ДНК во второй картридж для определения метилирования и/или ПЦР.
[0311] Вариант реализации 257: Способ согласно варианту реализации 256, в котором указанный второй картридж представляет собой картридж по любому из вариантов реализации 92-132.
[0312] Вариант реализации 258: Способ по любому из вариантов реализации 256-257, в котором указанный способ дополнительно включает управление указанным вторым картриджем для конверсии указанной ДНК с целью определения метилирования.
[0313] Вариант реализации 259: Способ по любому из вариантов реализации 256-258, в котором указанный способ дополнительно включает управление указанным вторым картриджем с обеспечением выполнения одной или более ПЦР с использованием указанной ДНК или конвертированной ДНК в качестве матрицы.
[0314] Вариант реализации 260: Способ по любому из вариантов реализации 256-259, в котором указанное управление вторым картриджем включает установку указанного второго картриджа внутрь модуля обработки образца в системе по любому из вариантов реализации 133-139.
[0315] Вариант реализации 261: Способ выявления (детектирования) рака и/или определения степени рака, и/или выявления предрасположенности к раку у субъекта, который включает:
[0316] получение биологического образца от указанного субъекта, причем указанный биологический образец содержит ДНК;
[0317] применение картриджа по любому из пп. 190-225 для определения метилирования одного или более промоторов гена в указанной ДНК, статус метилирования которых является маркером рака, при этом увеличение метилирования указанного одного или более промоторов гена является показателем наличия рака, или предрасположенности к раку, или на стадии рака или предракового состояния.
[0318] Вариант реализации 262: Способ согласно варианту реализации 261, в котором указанный субъект является человеком.
[0319] Вариант реализации 263: Способ по любому из вариантов реализации 261-262, в котором указанный рак представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мозга, рака легкого, В-клеточной лимфомы, рака бронхов, колоректального рака, рака желудка, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака мозга или центральной нервной системы, рака периферической нервной системы, рака пищевода, рака шейки матки, меланомы, рака матки или эндометрия, рака ротовой полости или глотки, рака печени, рака почки, рак желчевыводящих протоков, рак тонкого кишечника или аппендикса, рака слюнной железы, рака щитовидной железы, рака надпочечника, остеосаркомы, хондросаркомы, липосаркомы, рака яичка и злокачественной фиброзной гистиоцитомы.
[0320] Вариант реализации 264: Способ по любому из вариантов реализации 261-262, в котором указанный рак представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мозга, рака легкого.
[0321] Вариант реализации 265: Способ по любому из вариантов реализации 261-264, в котором указанный образец включает образец из сыворотки или плазмы.
[0322] Вариант реализации 266: Способ по любому из вариантов реализации 261-264, в котором указанный образец включает образец FFPE.
[0323] Вариант реализации 267: Способ по любому из вариантов реализации 261-266, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, BRCA1, BNC1, ADAMTS1, CDO1, SOX17, ТАС1, НОХА7 и MGMT.
[0324] Вариант реализации 268: Способ по любому из вариантов реализации 261-266, в котором указанный рак представляет собой рак поджелудочной железы, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы одного, двух, трех или четырех генов, выбранных из группы, состоящей из ADAMTS1 и BNC1.
[0325] Вариант реализации 269: Способ согласно варианту реализации 268, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы ADAMTS1.
[0326] Вариант реализации 270: Способ по любому из вариантов реализации 268-269, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы BNC1.
[0327] Вариант реализации 271: Способ по любому из вариантов реализации 261-266, в котором указанный рак представляет собой рак молочной железы, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы одного, двух, трех, четырех, пяти или всех генов, выбранных из группы, состоящей из BRCA1, RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2 и TM6SF1.
[0328] Вариант реализации 272: Способ согласно варианту реализации 271, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы BRCA1.
[0329] Вариант реализации 273: Способ по любому из вариантов реализации 271-272, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы RASSF1A.
[0330] Вариант реализации 274: Способ по любому из вариантов реализации 271-273, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы AKR1B1.
[0331] Вариант реализации 275: Способ по любому из вариантов реализации 271-274, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы НОХВ4.
[0332] Вариант реализации 276: Способ по любому из вариантов реализации 271-275, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы HIST1H3C.
[0333] Вариант реализации 277: Способ по любому из вариантов реализации 271-276, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы RASGRF2.
[0334] Вариант реализации 278: Способ по любому из вариантов реализации 271-277, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы TM6SF1.
[0335] Вариант реализации 279: Способ по любому из вариантов реализации 261-266, в котором указанный рак представляет собой рак молочной железы, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы BRCA1.
[0336] Вариант реализации 280: Способ по любому из вариантов реализации 261-266, в котором указанный рак представляет собой рак легкого, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы одного, двух, трех или всех генов, выбранных из группы, состоящей из CDO1, SOX17, ТАС1 и НОХА7.
[0337] Вариант реализации 281: Способ согласно варианту реализации 280, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы CDO1.
[0338] Вариант реализации 282: Способ по любому из вариантов реализации 280-281, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы SOX17.
[0339] Вариант реализации 283: Способ по любому из вариантов реализации 280-282, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы ТАС1.
[0340] Вариант реализации 284: Способ по любому из вариантов реализации 280-283, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы НОХА7.
[0341] Вариант реализации 285: Способ по любому из вариантов реализации 261-266, в котором указанный рак представляет собой рак мозга, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы MGMT.
[0342] Вариант реализации 286: Способ конверсии в ДНК остатков цитозина на урацил, при этом остатки 5-метилцитозина по существу остаются не затронутыми; указанный способ включает:
[0343] приведение в контакт образца, содержащего ДНК, с 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октаном (DABSO) для конверсии указанной ДНК;
[0344] десульфирование конвертированной ДНК с получением ДНК, в которой остатки цитозина модифицированы в урацил, но остатки 5-метилцитозина по существу не затронуты.
[0345] Вариант реализации 287: Способ согласно варианту реализации 286, в котором указанное приведение в контакт включает приведение указанной ДНК в контакт с DABSO при концентрации в диапазоне от примерно 2 М до примерно 5 М включительно.
[0346] Вариант реализации 288: Способ согласно варианту реализации 286, в котором указанное приведение в контакт включает приведение указанной ДНК в контакт с DABSO при концентрации примерно 2,5 М.
[0347] Вариант реализации 289: Способ по любому из вариантов реализации 286-288, в котором указанный DABSO растворяют в водном щелочном растворе.
[0348] Вариант реализации 290: Способ согласно варианту реализации 289, в котором указанный DABSO растворяют в растворе, содержащем KOH.
[0349] Вариант реализации 291: Способ по любому из вариантов реализации 286-290, в котором указанное приведение в контакт включает нагревание раствора DABSO/ДНК до температуры в диапазоне от примерно 55°С до примерно 90°С.
[0350] Вариант реализации 292: Способ по любому из вариантов реализации 286-291, в котором указанный DABSO подвергают взаимодействию с ДНК в течение периода времени в диапазоне примерно от 15 минут до примерно 90 минут включительно.
[0351] Вариант реализации 293: Способ по любому из вариантов реализации 286-292, в котором указанное десульфирование включает приведение в контакт указанной конвертированной ДНК с щелочным реагентом.
[0352] Вариант реализации 294: Способ согласно варианту реализации 293, в котором указанный щелочной реагент содержит KOH.
[0353] Вариант реализации 295: Способ по любому из вариантов реализации 286-294, в котором указанную конверсию и/или десульфирование проводят с ДНК, связанной на колонке.
[0354] Вариант реализации 296: Способ по любому из вариантов реализации 286-294, где указанную конверсию и/или десульфирование проводят с ДНК в растворе.
[0355] Вариант реализации 297: Способ анализа метилирования ДНК, включающий:
[0356] обеспечение образца ДНК;
[0357] конверсию ДНК в указанном образце согласно любому из вариантов реализации 286-296; и
[0358] выполнение специфической в отношении метилирования ПЦР и/или секвенирование нуклеиновой кислоты, и/или высокоточного анализа кривых плавления (HRM) на конвертированной нуклеиновой кислоте с целью определения метилирования указанной нуклеиновой кислоты.
[0359] Вариант реализации 298: Способ согласно варианту реализации 297, в котором указанное получение образца ДНК включает подготовку образца по любому из вариантов реализации 228-234 или по любому из вариантов реализации 243-252.
[0360] Вариант реализации 299: Набор для определения статуса метилирования ДНК, включающий:
[0361] контейнер, содержащий реагент для конверсии, содержащий 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октан (DABSO); и
[0362] контейнер, содержащий реагент для десульфирования.
[0363] Вариант реализации 300: набор согласно варианту реализации 299, где указанный набор содержит колонку, содержащую аффинную матрицу.
[0364] Вариант реализации 301: набор по любому из вариантов реализации 299-300, где указанный набор включает контейнер, содержащий связывающий буфер.
[0365] Вариант реализации 302: набор по любому из вариантов реализации 299-301, где указанный набор включает контейнер, содержащий буфер для элюирования.
[0366] Вариант реализации 303: набор по любому из вариантов реализации 299-302, где указанный набор включает контейнер, содержащий отмывочный буфер.
[0367] Вариант реализации 304: набор по любому из вариантов реализации 299-303, где указанный набор включает контейнер, содержащий лизирующий раствор по любому из вариантов реализации 169-171 и/или контейнер, содержащий лизирующий раствор по любому из вариантов реализации 172-174.
[0368] Вариант реализации 305: набор по любому из вариантов реализации 299-304, где указанный набор содержит картридж по любому из вариантов реализации 143-155 и/или картридж по любому из вариантов реализации 155-166.
[0369] Вариант реализации 306: набор по любому из вариантов реализации 299-305, включающий инструктирующие материалы для обучения использованию указанного набора для конверсии нуклеиновой кислоты с целью определения статуса метилирования указанной нуклеиновой кислоты.
[0370] Вариант реализации 307: комплект праймеров и зондов для определения метилирования MGMT с использованием вложенной ПЦР, в котором указанный комплект содержит следующие праймеры и зонды:
[0371] внешний прямой праймер, содержащий последовательность нуклеотидов GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO: 263);
[0372] внешний обратный праймер, содержащий последовательность нуклеотидов ААААААС(Т*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO: 265);
[0373] внутренний прямой праймер, содержащий последовательность нуклеотидов TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 266);
[0374] внутренний обратный праймер, содержащий последовательность нуклеотидов GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO: 267); и
[0375] зонд, содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАААСАС(Т*)САССАААТС(N*)САААС-блокатор (SEQ ID NO: 268).
[0376] Вариант реализации 308: комплект праймеров и зондов для определения метилирования АСТВ (например, в качестве контроля) с использованием вложенной ПЦР, в котором указанный комплект содержит следующие праймеры и зонды:
[0377] внешний прямой праймер (102), содержащий последовательность нуклеотидов GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO: 103);
[0378] внешний обратный праймер (103), содержащий последовательность нуклеотидов ССААТААААССТАСТССТСССТТАА (SEQ ID NO: 104);
[0379] внутренний прямой праймер (148), содержащий последовательность нуклеотидов GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO: 149);
[0380] внутренний обратный праймер (149), содержащий последовательность нуклеотидов CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO: 150); и
[0381] зонд (178), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАССАСССААСАСА(N*)САА(Т*)ААСАААСАС-блокатор (SEQ ID NO: 179).
[0382] Вариант реализации 309: комплект праймеров и зондов для определения метилирования MGMT с использованием вложенной ПЦР с определением метилирования АСТВ в качестве контроля, содержащий праймеры и зонды согласно варианту реализации 307 и праймеры и зонды согласно варианту реализации 308.
[0383] Вариант реализации 310: Способ определения метилирования MGMT с применением специфической в отношении метилирования ПЦР, который включает:
[0384] получение конвертированной (например, конвертированной бисульфитом) ДНК, содержащей промоторную область гена MGMT;
[0385] выполнение специфической в отношении метилирования ПЦР для MGMT метилирования с использованием вложенной ПЦР, содержащей следующие праймеры и зонды:
[0386] внешний прямой праймер, содержащий последовательность нуклеотидов GTTTT(Т*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO: 263);
[0387] внешний обратный праймер, содержащий последовательность нуклеотидов ААААААС(Т*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO: 265);
[0388] внутренний прямой праймер, содержащий последовательность нуклеотидов TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 266);
[0389] внутренний обратный праймер, содержащий последовательность нуклеотидов GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO: 267); и
[0390] зонд, содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАААСАС(Т*)САССАААТС(N*)САААС-блокатор (SEQ ID NO: 268); и
[0391] детектирование и/или количественное измерение продукта амплификации при ПЦР с целью осуществления определения метилирования указанного гена MGMT.
[0392] Вариант реализации 311: Способ согласно варианту реализации 310, где указанный способ дополнительно включает:
[0393] получение конвертированной (например, конвертированную бисульфитом) ДНК, содержащей промоторную область гена АСТВ (например, в качестве контроля);
[0394] проведение специфической в отношении метилирования ПЦР для АСТВ метилирования с использованием вложенной ПЦР, содержащей следующие праймеры и зонды:
[0395] внешний прямой праймер, содержащий последовательность нуклеотидов GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO: 103);
[0396] внешний обратный праймер, содержащий последовательность нуклеотидов ССААТААААССТАСТССТСССТТАА (SEQ ID NO: 104);
[0397] внутренний прямой праймер, содержащий последовательность нуклеотидов GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO: 149);
[0398] внутренний обратный праймер, содержащий последовательность нуклеотидов CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO: 150); и
[0399] зонд, содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАССАСССААСАСА(N*)САА(Т*)ААСАААСАС-блокатор (SEQ ID NO: 179); и
[0400] детектирование и/или количественное измерение продукта амплификации при ПЦР с целью осуществления определения метилирования указанного гена АСТВ.
[0401] Вариант реализации 312: Способ по любому из вариантов реализации 310-311, в котором указанную специфическую в отношении метилирования ПЦР для метилирования MGMT и указанную специфическую в отношении метилирования ПЦР для метилирования АСТВ проводят как одиночную мультиплексную ПЦР.
[0402] Вариант реализации 313: Способ по любому из вариантов реализации 310-312, в котором указанную специфическую в отношении метилирования ПЦР проводят с использованием картриджа по любому из вариантов реализации 92-132.
[0403] Вариант реализации 314: Способ согласно варианту реализации 313, в котором указанное получение конвертированной ДНК, содержащей промоторные области гена MGMT, включает в себя введение неконвертированной ДНК, содержащей промоторные области гена MGMT, в указанный картридж и управление указанным картриджем для конверсии указанной ДНК в указанном картридже с использованием реагента для конверсии; и/или указанное получение конвертированной ДНК, содержащей промоторные области гена АСТВ, включает в себя введение неконвертированной ДНК, содержащей промоторные области гена АСТВ, в указанный картридж и управление указанным картриджем для конверсии указанной ДНК в указанном картридже с использованием реагента для конверсии.
[0404] Вариант реализации 315: Способ согласно варианту реализации 314, в котором указанный реагент для конверсии содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из бисульфита аммония, метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октан (DABSO).
[0405] Вариант реализации 316: Способ по любому из вариантов реализации 313-315, в котором указанное управление указанным картриджем включает нагревание указанной ДНК и указанного реагента для конверсии в канале или камере термоциклирования, которую далее используют для проведения указанной вложенной ПЦР.
[0406] Вариант реализации 317: комплект картриджей для определения статуса метилирования нуклеиновой кислоты, включающий:
[0407] камеру приема образца;
[0408] колонку, содержащую первый матричный материал;
[0409] канал или камеру с контролем температуры;
[0410] камеру изъятия образца; и
[0411] множество камер, содержащих реагенты и/или буферы, где в процессе применения по меньшей мере одна из указанных камер содержит бисульфитный реагент; и
[0412] второй картридж, содержащий:
[0413] камеру приема образца;
[0414] колонку, содержащую второй матричный материал;
[0415] канал или камеру с контролем температуры; и
[0416] множество камер, содержащих реагенты и/или буферы, где в процессе применения по меньшей мере одна из указанных камер содержит реагент для десульфирования и/или элюирования.
[0417] Вариант реализации 318: комплект картриджей согласно варианту реализации 317, причем указанный канал или камера с контролем температуры в указанном первом картридже представляет собой канал или камеру термоциклирования.
[0418] Вариант реализации 319: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-318, в котором указанный канал или камера с контролем температуры в указанном втором картридже представляет собой канал или камеру термоциклирования.
[0419] Вариант реализации 320: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-319, в котором указанный бисульфитный реагент содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из бисульфита аммония, метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октан (DABSO).
[0420] Вариант реализации 321: комплект картриджей согласно варианту реализации 320, в котором указанный бисульфитный реагент содержит бисульфит аммония.
[0421] Вариант реализации 322: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-321, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей поглотители для предотвращения окисления сульфитов и/или катализаторы.
[0422] Вариант реализации 323: комплект картриджей согласно варианту реализации 322, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей поглотители, выбранные из группы, состоящей из Тролокса и гидрохинона.
[0423] Вариант реализации 324: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 322-323, в котором указанный бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей полиамины в качестве катализаторов.
[0424] Вариант реализации 325: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-324, в котором указанный первый картридж выполнен с возможностью для добавления в картридж бисульфитного реагента во время или близко ко времени помещения образца в картридж.
[0425] Вариант реализации 326: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-325, в котором указанный бисульфитный реагент представлен в виде компонента в одной из указанного множества камер в указанном первом картридже.
[0426] Вариант реализации 327: комплект картриджей по любому из пп. 317-326, в котором указанный первый матричный материал и/или указанный второй матричный материал, независимо содержат материал, выбранный из группы, состоящей из стекла или кремния диоксида, ионно-обменной смолы и гидроксиапатита.
[0427] Вариант реализации 328: комплект картриджей согласно варианту реализации 327, в котором указанный первый матричный материал содержит стекловолокно.
[0428] Вариант реализации 329: комплект картриджей по любому из пп. 327-328, в котором указанный второй матричный материал содержит стекловолокно.
[0429] Вариант реализации 330: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-329, в котором указанный первый картридж включает две камеры приема образца.
[0430] Вариант реализации 331: комплект картриджей по любому из пп. 317-330, в котором по меньшей мере одна камера, содержащая множество камер в указанном втором картридже, содержит праймеры для ПЦР, и/или зонды для ПЦР, и/или мастер-микс для ПЦР.
[0431] Вариант реализации 332: комплект картриджей по любому из пп. 317-331, при этом, если указанный картридж находится в процессе применения, то камера, содержащая множество камер в указанном первом картридже, содержит GTC-EtOH в буфере.
[0432] Вариант реализации 333: комплект картриджей по любому из пп. 317-332, при этом, если указанный картридж находится в процессе применения, то камера, содержащая множество камер в указанном втором картридже, содержит GTC-EtOH в буфере.
[0433] Вариант реализации 334: комплект картриджей по любому из пп. 332-333, в котором указанный первый картридж выполнен с возможностью добавления в буфер GTC-ETOH во время или близко ко времени помещения образца в картридж.
[0434] Вариант реализации 335: комплект картриджей по любому из пп. 332-333, в котором указанный GTC-ETOH в буфере представлен в качестве компонента в камере, содержащей множество камер первого картриджа.
[0435] Вариант реализации 336: комплект картриджей по любому из пп. 332-335, в котором указанный второй картридж выполнен с возможностью для добавления GTC-ETOH в буфер во время или близко ко времени помещения образца в картридж.
[0436] Вариант реализации 337: комплект картриджей по любому из пп. 332-336, в котором указанный GTC-ETOH в буфере представлен в качестве компонента в камере, содержащей множество камер второго картриджа.
[0437] Вариант реализации 338: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-337, в котором указанный второй картридж включает одну или более камер, содержащих один или более реагентов, выбранных из группы, состоящей из специфических для метилирования праймеров для ПЦР, специфических для метилирования зондов для ПЦР, фермента (-ов) для ПЦР и реакционного буфера для ПЦР.
[0438] Вариант реализации 339: комплект картриджей согласно варианту реализации 338, в котором указанный второй картридж включает по меньшей мере две камеры, содержащие один или более реагентов, выбранных из группы, состоящей из специфических для метилирования праймеров для ПЦР, специфических для метилирования зондов для ПЦР, фермента (-ов) для ПЦР и реакционного буфера для ПЦР.
[0439] Вариант реализации 340: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-339, в котором указанный второй картридж включает по меньшей мере одну камеру, содержащую праймеры и зонды для определения метилирования прямой цепи конвертированной ДНК.
[0440] Вариант реализации 341: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-340, в котором указанный второй картридж содержит по меньшей мере одну камеру, содержащую праймеры и зонды для определения метилирования обратной цепи конвертированной ДНК.
[0441] Вариант реализации 342: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 338-341, в котором указанные праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты представлены на шариках (beads).
[0442] Вариант реализации 343: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-342, в котором:
[0443] в указанном первом картридже указанная камера приема образца, указанная колонка, указанное множество камер, указанная камера изъятия образца и указанный канал или камера нагревания с контролем температуры имеют избирательное соединение по текучей среде; и/или
[0444] в указанном втором картридже указанная камера приема образца, указанная колонка, указанное множество камер и указанный канал или камера нагревания с контролем температуры имеют избирательное соединение по текучей среде.
[0445] Вариант реализации 344: комплект картриджей согласно варианту реализации 343, в котором
[0446] в указанном первом картридже указанная камера приема образца, указанная колонка, указанное множество камер, указанная камера изъятия образца и указанный канал или камера с контролем температуры имеют избирательное соединение по текучей среде посредством микрофлюидных каналов и клапанов; и/или
[0447] в указанном втором картридже, указанная камера приема образца, указанная колонка, указанное множество камер и указанный канал или камера нагревания с контролем температуры имеют избирательное соединение по текучей среде посредством микрофлюидных каналов и клапанов.
[0448] Вариант реализации 345: комплект картриджей согласно варианту реализации 343, в котором
[0449] в указанном первом картридже указанная камера приема образца, указанная колонка, указанное множество камер, указанная камера изъятия образца и указанный канал или камера с контролем температуры или порт в указанном канале или камере с контролем температуры расположены вокруг центрального клапана и имеют избирательное соединение по текучей среде с каналом в указанном центральном клапане, при этом указанный центральный клапан выполнен с возможностью для размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном; и/или
[0450] в указанном втором картридже, указанная камера приема образца, указанная колонка, указанное множество камер и указанный канал или камера нагревания с контролем температуры или порт в указанном канале или камере с контролем температуры расположены вокруг центрального клапана и имеют избирательное соединение по текучей среде с каналом в указанном центральном клапане, при этом указанный центральный клапан выполнен с возможностью для размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном.
[0451] Вариант реализации 346: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-345, в котором указанный первый картридж выполнен с возможностью того, чтобы в процессе применения он включал:
[0452] первую камеру, содержащую образец;
[0453] вторую камеру, содержащую раствор гуанидина тиоцианат-этанол (GTC-EtOH);
[0454] третью камеру, содержащую бисульфитный реагент;
[0455] четвертую камеру, содержащую Трис-буфер;
[0456] пятую камеру, содержащую полиэтиленгликоль (ПЭГ); и
[0457] шестую камеру, содержащую KOH.
[0458] Вариант реализации 347: комплект картриджей согласно варианту реализации 346, в котором указанная первая камера в указанном первом картридже содержит указанный образец в реагенте для экстрагирования/осаждения GTC-EtOH-Твин.
[0459] Вариант реализации 348: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 346-347, в котором указанная вторая камера, содержащая раствор гуанидина тиоцианат-этанол (GTC-EtOH), содержит GTC-Трис (рН 7), этанол.
[0460] Вариант реализации 349: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-336, в котором указанный второй картридж выполнен с возможностью для того, чтобы в процессе применения он включал:
[0461] первую камеру, содержащую образец;
[0462] вторую камеру, содержащую раствор гуанидина тиоцианат-этанол (GTC-EtOH);
[0463] третью камеру, содержащую бисульфитный реагент;
[0464] четвертую камеру, содержащую полиэтиленгликоль (ПЭГ);
[0465] пятую камеру, содержащую KOH; и
[0466] шестую камеру, содержащую шарик с ферментом для ПЦР.
[0467] Вариант реализации 350: комплект картриджей согласно варианту реализации 349, где указанный второй картридж содержит седьмую камеру, содержащую шарик с Трис и шарик с ферментом.
[0468] Вариант реализации 351: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 349-350, в котором указанная вторая камера, содержащая раствор гуанидина тиоцианат-этанол (GTC-EtOH), содержит GTC-Трис (рН 7), этанол.
[0469] Вариант реализации 352: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-351, в котором указанный второй картридж включает камеру, содержащую праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты для ПЦР.
[0470] Вариант реализации 353: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-352, в котором указанный второй картридж содержит восьмую камеру, также содержащую праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты для ПЦР.
[0471] Вариант реализации 354: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-353, в котором указанный второй картридж включает одну или более камер, содержащих праймеры, специфичные для конвертированных бисульфитом метилированных и/или неметилированных последовательностей.
[0472] Вариант реализации 355: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-354, в котором указанный второй картридж включает одну или более камер, содержащих реагенты для TaqMan ПЦР.
[0473] Вариант реализации 356: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-355, в котором указанный второй картридж включает одну или более камер, содержащих один или более флуоресцентных зондов, которые являются маркерами для амплифицированных метилированных последовательностей и/или один или более флуоресцентных зондов, которые являются маркерами для амплифицированных неметилированных последовательностей.
[0474] Вариант реализации 357: комплект картриджей согласно варианту реализации 356, в котором указанные зонды содержат флуоресцентный репортерный краситель и гасящий краситель, при этом зонд формирует сигнал о расщеплении посредством 5'-3'-нуклеазной активности Taq ДНК-полимеразы.
[0475] Вариант реализации 358: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 356-357, в котором указанный второй картридж содержит множество зондов, каждый из которых специфичен в отношении различных метилированных участков в исследуемой амплифицированной области.
[0476] Вариант реализации 359: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 356-357, в котором указанный второй картридж содержит один зонд, специфичный в отношении одного метилированного участка в исследуемой амплифицированной области.
[0477] Вариант реализации 360: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 356-357, в котором указанный второй картридж содержит множество зондов, каждый из которых специфичен в отношении одного и того же метилированного участка в исследуемой амплифицированной области.
[0478] Вариант реализации 361: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-360, в котором указанный второй картридж содержит праймеры и/или зонды для определения метилирования промоторной области гена, выбранного из группы, состоящей из MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, НОХВ4, RASGRF2, TM6SF1 и AKR1B1.
[0479] Вариант реализации 362: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-360, в котором указанный второй картридж содержит один или более праймеров, приведенных в таблицах 5, 9 или 10, и/или один или более зондов, приведенных в таблицах 5, 9 или 10.
[0480] Вариант реализации 363: комплект картриджей согласно варианту реализации 362, в котором указанный второй картридж содержит следующие зонды и праймеры для определения метилирования MGMT с использованием вложенной ПЦР:
[0481] внешний прямой праймер (248b), содержащий последовательность нуклеотидов GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO: 263);
[0482] внешний обратный праймер (249b), содержащий последовательность нуклеотидов: AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO: 265);
[0483] внутренний прямой праймер (250), содержащий последовательность нуклеотидов TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 266);
[0484] внутренний обратный праймер (251), содержащий последовательность нуклеотидов GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO: 267); и
[0485] зонд (252а), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-CCAAACAC(T*)CACCAAATC(N*)CAAAC-блокатор (SEQ ID NO: 268).
[0486] Вариант реализации 364: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 362-363, в котором указанный второй картридж содержит следующие зонды и праймеры для определения метилирования АСТВ (например, в качестве контроля) с использованием вложенной ПЦР:
[0487] внешний прямой праймер (102), содержащий последовательность нуклеотидов GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO: 103);
[0488] внешний обратный праймер (103), содержащий последовательность нуклеотидов ССААТААААССТАСТССТСССТТАА (SEQ ID NO: 104);
[0489] внутренний прямой праймер (148), содержащий последовательность нуклеотидов GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO: 149);
[0490] внутренний обратный праймер (149), содержащий последовательность нуклеотидов CCTTAAAAATTACAAAAACCACAAC (SEQ ID NO: 150); и
[0491] зонд (178), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-CCACCACCCAACACA(N*)CAA(T*)AACAAACAC-блокатор (SEQ ID NO: 179).
[0492] Вариант реализации 365: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 317-360, в котором указанный второй картридж включает одну или более камер, содержащих шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов.
[0493] Вариант реализации 366: комплект картриджей согласно варианту реализации 365, в котором указанный второй картридж включает одну или более камер, содержащих шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мозга и рака легкого.
[0494] Вариант реализации 367: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 365-366, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мозга и рака легкого.
[0495] Вариант реализации 368: комплект картриджей согласно варианту реализации 367, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для вложенной ПЦР.
[0496] Вариант реализации 369: комплект картриджей согласно варианту реализации 368, в котором указанная вложенная ПЦР включает первую ПЦР, специфическую в отношении конвертированной ДНК, и вторую ПЦР, специфическую в отношении метилированных CpG.
[0497] Вариант реализации 370: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 349-369, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования прямой цепи конвертированной ДНК.
[0498] Вариант реализации 371: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 349-370, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды, содержит шарики, которые несут праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования обратной цепи конвертированной ДНК.
[0499] Вариант реализации 372: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 349-371, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, BRCA1, BNC1, ADAMTS1, CDO1, SOX17, ТАС1, НОХА7 и MGMT.
[0500] Вариант реализации 373: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 349-372, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака поджелудочной железы.
[0501] Вариант реализации 374: комплект картриджей согласно варианту реализации 373, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов ADAMTS1 и/или BNC1.
[0502] Вариант реализации 375: комплект картриджей согласно варианту реализации 374, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора ADAMTS1.
[0503] Вариант реализации 376: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 374-375, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора BNC1.
[0504] Вариант реализации 377: комплект картриджей согласно варианту реализации 374, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают один или более праймеров для ПЦР и/или зондов для ADAMTS1 и/или BNC1, которые представлены в таблицах 5 или 10.
[0505] Вариант реализации 378: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 349-372, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака молочной железы.
[0506] Вариант реализации 379: комплект картриджей согласно варианту реализации 378, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов одного, двух, трех, четырех, пяти или всех генов, выбранных из группы, состоящей из BRCA1, RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2 и TM6SF1.
[0507] Вариант реализации 380: комплект картриджей согласно варианту реализации 379, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора BRCA1.
[0508] Вариант реализации 381: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 379-380, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора RASSF1A.
[0509] Вариант реализации 382: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 379-381, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора AKR1B1.
[0510] Вариант реализации 383: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 379-382, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора НОХВ4.
[0511] Вариант реализации 384: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 379-383, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора HIST1H3C.
[0512] Вариант реализации 385: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 379-384, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора RASGRF2.
[0513] Вариант реализации 386: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 379-385, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора TM6SF1.
[0514] Вариант реализации 387: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 379-386, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают один или более праймеров для ПЦР и/или один или более зондов для ПЦР, которые представлены в таблицах 5 или 9.
[0515] Вариант реализации 388: комплект картриджей согласно варианту реализации 378, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов BRCA1.
[0516] Вариант реализации 389: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 349-372, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака легкого.
[0517] Вариант реализации 390: комплект картриджей согласно варианту реализации 389, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промоторов одного, двух, трех или всех генов, выбранных из группы, состоящей из CDO1, SOX17, ТАС1 и НОХА7.
[0518] Вариант реализации 391: комплект картриджей согласно варианту реализации 390, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора CDO1.
[0519] Вариант реализации 392: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 390-391, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора SOX17.
[0520] Вариант реализации 393: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 390-392, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора ТАС1.
[0521] Вариант реализации 394: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 390-393, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора НОХА7.
[0522] Вариант реализации 395: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 349-372, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, статус метилирования которых является маркером рака мозга.
[0523] Вариант реализации 396: комплект картриджей согласно варианту реализации 395, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования промотора MGMT.
[0524] Вариант реализации 397: комплект картриджей согласно варианту реализации 396, в котором указанная камера, содержащая шарики, которые размещают праймеры для ПЦР и зонды для определения метилирования одного или более промоторов генов, содержит шарики, которые размещают один или более праймеров для ПЦР и/или зондов MGMT, представленых в таблицах 5 или 10.
[0525] Вариант реализации 398: комплект картриджей согласно варианту реализации 397, в котором указанный картридж содержит следующий зонды и праймеры для определения метилирования MGMT с использованием вложенной ПЦР:
[0526] внешний прямой праймер (248b), содержащий последовательность нуклеотидов GTTTT(T*)AGAAYG(T*)TTTGYGTTT (SEQ ID NO: 263);
[0527] внешний обратный праймер (249b), содержащий последовательность нуклеотидов AAAAAAC(T*)CCRCACTCTTCC (SEQ ID NO: 265);
[0528] внутренний прямой праймер (250), содержащий последовательность нуклеотидов TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC (SEQ ID NO: 266);
[0529] внутренний обратный праймер (251), содержащий последовательность нуклеотидов GCACTCTTCCGAAAACGAAACG (SEQ ID NO: 267); и
[0530] зонд (252а), содержащий последовательность нуклеотидов флуорофор-ССАААСАС(Т*)САССАААТС(N*)САААС-блокатор (SEQ ID NO: 268).
[0531] Вариант реализации 399: комплект картриджей по любому из вариантов реализации 397-398, в котором указанный картридж содержит следующий зонды и праймеры для определения метилирования АСТВ (например, в качестве контроля) с использованием вложенной ПЦР:
[0532] внешний прямой праймер (102), содержащий последовательность нуклеотидов:
[0533] GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGTT (SEQ ID NO: 103);
[0534] внешний обратный праймер (103), содержащий последовательность нуклеотидов:
[0535] ССААТААААССТАСТССТСССТТАА (SEQ ID NO: 104);
[0536] внутренний прямой праймер (148), содержащий последовательность нуклеотидов:
[0537] GGTTTAGTAAGTTTTTTGGATTGTG (SEQ ID NO: 149);
[0538] внутренний обратный праймер (149), содержащий последовательность нуклеотидов:
[0539] ССТТАААААТТАСАААААССАСААС (SEQ ID NO: 150); и
[0540] зонд (178), содержащий последовательность нуклеотидов:
[0541] флуорофор-ССАССАСССААСАСА(N*)САА(Т*)ААСАААСАС-блокатор (SEQ ID NO: 179).
[0542] Вариант реализации 400: система для определения метилирования нуклеиновой кислоты в биологическом образце, которая включает:
[0543] корпус, выполненный с возможностью для размещения одного или более модулей обработки образца, где каждый модуль обработки образца выполнен с возможностью крепления съемного первого картриджа и/или второго картриджа указанного комплекта картриджей по любому из вариантов реализации 317-399;
[0544] при этом указанная система выполнена с возможностью:
[0545] управления модулями обработки образца с обеспечением выполнения обработки образца для управления первым картриджем из указанного комплекта картриджей с обеспечением выполнения бисульфитной конверсии нуклеиновой кислоты в образце, который введен в указанный первый картридж и/или
[0546] выполнения десульфирования и определения метилирования одной или более нуклеиновых кислот-мишеней внутри соответствующего съемного картриджа для образца.
[0547] Вариант реализации 401: система согласно варианту реализации 400, где указанная система выполнена с возможностью размещения одного модуля обработки образца.
[0548] Вариант реализации 402: система согласно варианту реализации 400, где указанная система выполнена с возможностью размещения одного или более модулей обработки образца или по меньшей мере 4 модуля подготовки образца, или по меньшей мере 8 модулей обработки образца, или по меньшей мере 12 модулей обработки образца, или по меньшей мере 16 модулей обработки образца, или по меньшей мере 20 модулей обработки образца, или по меньшей мере 24 модуля подготовки образца, или по меньшей мере 28 модулей обработки образца, или по меньшей мере 32 модуля подготовки образца, или по меньшей мере 64 модуля подготовки образца, или по меньшей мере 128 модулей обработки образца.
[0549] Вариант реализации 403: система по любому из вариантов реализации 400-402, в которой указанные модули включают одну или более нагревательных пластин для нагревания камеры или канала с контролем температуры в указанном картридже.
[0550] Вариант реализации 404: система по любому из вариантов реализации 400-403, в которой указанные модули включают вентилятор, выполненный с возможностью охлаждения канала или камеры с контролем температуры в указанном картридже.
[0551] Вариант реализации 405: система по любому из вариантов реализации 400-404, в которой указанные модули включают электронную плату для передачи информации (например, оптической информации) в компьютер с целью ее анализа.
[0552] Вариант реализации 406: система по любому из вариантов реализации 400-405, в которой указанные модули включают оптические блоки, обеспечивая возбуждение и/или детектирование одного или более оптических сигналов, генерируемых посредством реакций в указанном картридже.
[0553] Вариант реализации 407: система по любому из вариантов реализации 400-406, где указанная система выполнена с возможностью для управления указанным первым картриджем указанного комплекта картриджей для:
[0554] связывания образца на колонке;
[0555] элюирования ДНК из колонки и объединения указанной ДНК с реагентом для конверсии;
[0556] нагревания раствора ДНК/реагент для конверсии раствора в реакционной камере или пробирке с получением конвертированной ДНК; и
[0557] переноса конвертированной ДНК в камеру изъятия образца в первом картридже.
[0558] Вариант реализации 408: система по любому из вариантов реализации 400-407, где указанная система выполнена с возможностью управления указанным вторым картриджем в указанном комплекте картриджей для:
[0559] связывания конвертированной ДНК на колонке;
[0560] отмывки, промывания и элюирования конвертированной ДНК;
[0561] элюирования ДНК из колонки; и
[0562] десульфирования конвертированной ДНК.
[0563] Вариант реализации 409: система согласно варианту реализации 408, где указанная система выполнена с возможностью для управления указанным вторым картриджем в указанном комплекте картриджей с обеспечением выполнения ПЦР на элюированной десульфированной ДНК в реакционной камере или пробирке.
[0564] Вариант реализации 410: Способ определения статуса метилирования нуклеиновой кислоты, который включает: размещение биологического образца в камере для образца первого картриджа в указанном комплекте картриджей по любому из вариантов реализации 317-399; и управление указанным первым картриджем для:
[0565] связывания ДНК в указанном образце с указанным первым матричным материалом;
[0566] отмывки связанной ДНК; элюирования связанной ДНК из матричного материала; объединения элюированной ДНК с указанным бисульфитным реагентом;
[0567] нагревания смеси ДНК и бисульфитного реагента в указанном канале или камере с контролем температуры для выполнения бисульфитной конверсии указанной ДНК; и
[0568] переноса конвертированной бисульфитом ДНК внутрь камеры изъятия образца указанного первого картриджа.
[0569] Вариант реализации 411: Способ согласно варианту реализации 410, где указанный способ дополнительно включает:
[0570] размещение конвертированной бисульфитом ДНК в камере для образца второго картриджа в комплекте картриджей по любому из вариантов реализации 317-399; и
[0571] управление указанным вторым картриджем для:
[0572] связывания указанной конвертированной бисульфитом ДНК с указанным вторым матричным материалом;
[0573] отмывки связанной конвертированной бисульфитом ДНК;
[0574] элюирования отмытой конвертированной бисульфитом ДНК из указанного второго матричного материала; и
[0575] десульфирования конвертированной бисульфитом ДНК.
[0576] Вариант реализации 412: Способ согласно варианту реализации 411, в котором указанным вторым картриджем управляют с целью элюирования конвертированной бисульфитом ДНК из указанного второго матричного материала перед десульфированием.
[0577] Вариант реализации 413: Способ согласно варианту реализации 411, в котором указанным вторым картриджем управляют с целью элюирования конвертированной бисульфитом ДНК из указанного второго матричного материала после или в ходе десульфирования.
[0578] Вариант реализации 414: Способ по любому из вариантов реализации 411-413, где указанный способ включает управление указанным вторым картриджем с обеспечением выполнения специфической для метилирования ПЦР, и/или секвенирования нуклеиновой кислоты, и/или высокоточного анализа кривых плавления (HRM) указанной нуклеиновой кислоты с целью определения метилирования указанной нуклеиновой кислоты.
[0579] Вариант реализации 415: Способ по любому из вариантов реализации 410-414, в котором указанный образец включает один или более образцов, выбранных из группы, состоящей из клетки, ткани и биологической жидкости, содержащих нуклеиновую кислоту.
[0580] Вариант реализации 416: Способ согласно варианту реализации 415, в котором указанный биологический образец содержит биологическую жидкость, выбранную из группы, состоящей из цельной крови, плазмы, сыворотки, слюны, слизи, мочи, мокроты, поджелудочного сока и спинномозговой жидкости.
[0581] Вариант реализации 417: Способ согласно варианту реализации 415, в котором указанный биологический образец содержит образец, выбранный из группы, состоящей из образца ткани, фиксированного формалином и залитого парафином (FFPE), свежезамороженной ткани, тонкоигольного аспирационного биоптата (ТАБ) и толстоигольного биоптата.
[0582] Вариант реализации 418: Способ по любому из вариантов реализации 410-417, где указанный способ включает приведение указанного биологического образца в контакт с лизирующим раствором.
[0583] Вариант реализации 419: Способ по любому из вариантов реализации 410-418, в котором управление указанным первым картриджем включает установку указанного первого картриджа внутрь модуля обработки образца в системе по любому из вариантов реализации 400-409.
[0584] Вариант реализации 420: Способ по любому из вариантов реализации 410-419, в котором управление указанным вторым картриджем включает установку указанного второго картриджа внутрь модуля обработки образца в системе по любому из вариантов реализации 400-409.
[0585] Вариант реализации 421: Способ по любому из вариантов реализации 410-420, в котором указанное размещение биологического образца в камере для образца первого картриджа включает загрузку образца внутрь одной или более камер приема образца в указанном первом картридже.
[0586] Вариант реализации 422: Способ по любому из вариантов реализации 410-421, в котором указанное размещение конвертированной бисульфитом ДНК в камере для образца второго картриджа включает перенос конвертированной бисульфитом ДНК из камеры изъятия образца указанного первого картриджа внутрь камеры приема образца указанного второй картридж.
[0587] Вариант реализации 423: Способ по любому из вариантов реализации 410-422, в котором указанное элюирование связанной ДНК в указанном первом картридже включает элюирование и денатурацию указанной ДНК с использованием низкой концентрации калия гидроксида или другого основания.
[0588] Вариант реализации 424: Способ согласно варианту реализации 423, в котором указанное элюирование связанной ДНК в указанном первом картридже включает элюирование и денатурацию указанной ДНК щелочным раствором с рН выше, чем примерно рН 10,5.
[0589] Вариант реализации 425: Способ согласно варианту реализации 423, в котором указанное элюирование связанной ДНК в указанном первом картридже включает элюирование и денатурацию указанной ДНК щелочным раствором с рН выше, чем примерно рН 12.
[0590] Вариант реализации 426: Способ согласно варианту реализации 424-425, в котором указанный щелочной раствор представляет собой раствор KOH 10-15 мМ.
[0591] Вариант реализации 427: Способ по любому из вариантов реализации 410-426, в котором указанное объединение элюированной ДНК с бисульфитным реагентом в указанном первом картридже включает инкубацию ДНК в растворе бисульфита аммония, концентрация которого составляет примерно от 6 М до примерно 7 М.
[0592] Вариант реализации 428: Способ согласно варианту реализации 427, в котором указанное объединение элюированной ДНК с бисульфитным реагентом в указанном первом картридже включает инкубацию ДНК в растворе бисульфита аммония, имеющего концентрацию примерно 6,5 М.
[0593] Вариант реализации 429: Способ согласно варианту реализации 428, в котором указанное объединение элюированной ДНК с бисульфитным реагентом в указанном первом картридже включает перенос ДНК в концентрированном бисульфитном растворе внутрь канала или камеры с контролем температуры в указанном первом картридже и нагревание указанной смеси.
[0594] Вариант реализации 430: Способ согласно варианту реализации 429, в котором указанная инкубация включает термоциклирование концентрированного бисульфитного растворе при температуре примерно от 60°С до примерно 95°С.
[0595] Вариант реализации 431: Способ по любому из вариантов реализации 411-430, в котором указанное связывание конвертированной бисульфитом ДНК со вторым матричным материалом включает смешивание раствора ДНК-бисульфит со свежеприготовленным GTC-EtOH в указанной второй колонке, и распределение раствор в указанном втором матричном материале.
[0596] Вариант реализации 432: Способ согласно варианту реализации 431, где указанный способ включает отмывку ДНК в указанном втором матричном материале свежеприготовленным GTC-EtOH и затем промывочным раствором.
[0597] Вариант реализации 433: Способ согласно варианту реализации 432, в котором указанный промывочный раствор содержит ПЭГ200.
[0598] Вариант реализации 434: Способ по любому из вариантов реализации 411-433, в котором указанное десульфирование конвертированной ДНК включает элюирование ДНК из указанного второго матричного материала вместе с буфером для десульфирования с высоким рН и инкубацию указанного раствора.
[0599] Вариант реализации 435: Способ согласно варианту реализации 434, в котором указанная инкубация длится в течение периода времени в диапазоне примерно от 1 минуты до примерно 1 часа, или примерно от 5 минут до примерно 30 минут, или примерно от 10 минут до примерно 20 минут, или в течение примерно 15 минут.
[0600] Вариант реализации 436: Способ вариантов реализации 434-435, в котором указанный буфер для десульфирования/элюирования с высоким рН содержит KOH.
[0601] Вариант реализации 437: Способ по любому из вариантов реализации 411-436, в котором указанный способ включает управление указанным вторым картриджем с обеспечением выполнения одной или более ПЦР с использованием указанной конвертированной ДНК в качестве матрицы.
[0602] Вариант реализации 438: Способ согласно варианту реализации 437, в котором специфическую в отношении метилирования ПЦР проводят для определения метилирования последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
[0603] Вариант реализации 439: Способ согласно варианту реализации 438, в котором указанную специфическую в отношении метилирования ПЦР (MSP) проводят с использованием праймеров, специфических для метилированных последовательностей, и/или праймеров, специфических для неметилированных последовательностей.
[0604] Вариант реализации 440: Способ согласно варианту реализации 438, в котором указанная специфическая в отношении метилирования ПЦР включают протокол MethyLight.
[0605] Вариант реализации 441: Способ согласно варианту реализации 438, в котором TaqMan ПЦР выполняют с использованием праймеров, специфических для конвертированных бисульфитом метилированных и/или неметилированных последовательностей.
[0606] Вариант реализации 442: Способ по любому из вариантов реализации 438-441, в котором в указанной специфической в отношении метилирования ПЦР (MSP) применяют один или более флуоресцентных зондов, которые являются маркерами для амплифицированных метилированных последовательностей, и/или один или более флуоресцентных зондов, которые являются маркерами для амплифицированных неметилированных последовательностей.
[0607] Вариант реализации 443: Способ согласно варианту реализации 442, в котором указанные флуоресцентные зонды содержат флуоресцентный репортерный краситель и гасящий краситель, при этом зонд формирует сигнал о расщеплении посредством 5'-3' нуклеазной активности Taq ДНК-полимеразы.
[0608] Вариант реализации 444: Способ по любому из вариантов реализации 442-443, в котором сигнал о метилировании определяют по комбинированному сигналу для множества зондов, каждый из которых специфичен в отношении различных метилированных участков в исследуемой амплифицированной области.
[0609] Вариант реализации 445: Способ по любому из вариантов реализации 442-443, в котором сигнал о метилировании определяют с помощью множества зондов, специфичных в отношении одних и тех же метилированных участков в исследуемой амплифицированной области.
[0610] Вариант реализации 446: Способ по любому из вариантов реализации 442-443, в котором указанное множество зондов включает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более зондов.
[0611] Вариант реализации 447: Способ по любому из вариантов реализации 442-443, в котором сигнал о метилировании измеряют с помощью одного зонда в исследуемой амплифицированной области.
[0612] Вариант реализации 448: Способ по любому из вариантов реализации 442-447, в котором указанные зонды используют в обычном или мультиплексном формате.
[0613] Вариант реализации 449: Способ по любому из вариантов реализации 442-447, в котором указанные зонды используют в мультиплексном формате.
[0614] Вариант реализации 450: Способ по любому из вариантов реализации 442-449, в котором указанные зонды используют для вложенной ПЦР.
[0615] Вариант реализации 451: Способ по любому из вариантов реализации 442-450, в котором указанная реакционная смесь для ПЦР содержит контрольный образец контаминации бисульфитом, в котором, в случае присутствия в реакционной смеси бисульфита, во время ПЦР происходит запускаемое бисульфитом расщепление.
[0616] Вариант реализации 452: Способ по любому из вариантов реализации 411-451, в котором ПЦР проводят в отношении одного или более мутировавших генов.
[0617] Вариант реализации 453: Способ по любому из вариантов реализации 411-452, в котором ПЦР проводят для неконвертированной ДНК в качестве контроля.
[0618] Вариант реализации 454: Способ по любому из вариантов реализации 411-453, в котором ПЦР проводят для конвертированной ДНК в качестве контроля.
[0619] Вариант реализации 455: Способ согласно варианту реализации 453, в котором ПЦР проводят для неконвертированной ДНК, и при этом неконвертированная ДНК является мишенью в указанном способе.
[0620] Вариант реализации 456: Способ по любому из вариантов реализации 410-455, в котором метилирование определяют для промоторной области гена, выбранного из группы, состоящей из MGMT. RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, НОХВ4, RASGRF2, TM6SF1 и AKR1B1.
[0621] Вариант реализации 457: Способ выявления рака или предрасположенности к раку у субъекта, который включает:
[0622] получение биологического образца от указанного субъекта, при этом указанный биологический образец содержит ДНК;
[0623] применение комплекта картриджей по любому из вариантов реализации 317-399, в котором указанный первый картридж указанного комплекта картриджей применяют для выполнения бисульфитной конверсии указанной ДНК; и указанный второй картридж указанного комплекта картриджей применяют для десульфирования конвертированной ДНК и определения метилирования одного или более промоторов гена в указанной ДНК, статус метилирования которых является маркером рака, при этом увеличение метилирования указанного одного или более промоторов гена является показателем наличия рака, или предрасположенности к раку, или стадии рака или предракового состояния.
[0624] Вариант реализации 458: Способ согласно варианту реализации 457, в котором указанный субъект является человеком.
[0625] Вариант реализации 459: Способ по любому из вариантов реализации 457-458, в котором указанный рак представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мозга, рака легкого, В-клеточной лимфомы, рака бронхов, колоректального рака, рака желудка, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака мозга или центральной нервной системы, рака периферической нервной системы, рака пищевода, рака шейки матки, меланомы, рака матки или эндометрия, рака ротовой полости или глотки, рака печени, рака почки, рак желчевыводящих протоков, рак тонкого кишечника или аппендикса, рака слюнной железы, рака щитовидной железы, рака надпочечника, остеосаркомы, хондросаркомы, липосаркомы, рака яичка и злокачественной фиброзной гистиоцитомы.
[0626] Вариант реализации 460: Способ по любому из вариантов реализации 457-458, в котором указанный рак представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака мозга, рака легкого.
[0627] Вариант реализации 461: Способ по любому из вариантов реализации 457-460, в котором указанный образец включает образец из сыворотки или плазмы.
[0628] Вариант реализации 462: Способ по любому из вариантов реализации 457-460, в котором указанный образец включает образец FFPE.
[0629] Вариант реализации 463: Способ по любому из вариантов реализации 457-462, в котором указанный один или более промоторов гена включают промоторы одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, BRCA1, BNC1, ADAMTS1, CDO1, SOX17, ТАС1, НОХА7 и MGMT.
[0630] Вариант реализации 464: Способ по любому из вариантов реализации 457-462, в котором указанный рак представляет собой рак поджелудочной железы, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы одного, двух, трех или четырех генов, выбранных из группы, состоящей из ADAMTS1 и BNC1.
[0631] Вариант реализации 465: Способ согласно варианту реализации 464, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы ADAMTS1.
[0632] Вариант реализации 466: Способ по любому из вариантов реализации 464-465, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы BNC1.
[0633] Вариант реализации 467: Способ по любому из вариантов реализации 457-462, в котором указанный рак представляет собой рак молочной железы, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы одного, двух, трех, четырех, пяти или всех генов, выбранных из группы, состоящей из BRCA1, RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2 и TM6SF1.
[0634] Вариант реализации 468: Способ согласно варианту реализации 467, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы BRCA1.
[0635] Вариант реализации 469: Способ по любому из вариантов реализации 467-468, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы RASSF1A.
[0636] Вариант реализации 470: Способ по любому из вариантов реализации 467-469, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы AKR1B1.
[0637] Вариант реализации 471: Способ по любому из вариантов реализации 467-470, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы НОХВ4.
[0638] Вариант реализации 472: Способ по любому из вариантов реализации 467-471, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы HIST1H3C.
[0639] Вариант реализации 473: Способ по любому из вариантов реализации 467-472, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы RASGRF2.
[0640] Вариант реализации 474: Способ по любому из вариантов реализации 467-473, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы TM6SF1.
[0641] Вариант реализации 475: Способ по любому из вариантов реализации 457-462, в котором указанный рак представляет собой рак молочной железы, и указанные один или более промоторов гена включает промоторы BRCA1.
[0642] Вариант реализации 476: Способ по любому из вариантов реализации 457-462, в котором указанный рак представляет собой рак легкого, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы одного, двух, трех или всех генов, выбранных из группы, состоящей из CDO1, SOX17, ТАС1 и НОХА7.
[0643] Вариант реализации 477: Способ согласно варианту реализации 476, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы CDO1.
[0644] Вариант реализации 478: Способ по любому из вариантов реализации 476-477, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы SOX17.
[0645] Вариант реализации 479: Способ по любому из вариантов реализации 476-478, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы ТАС1.
[0646] Вариант реализации 480: Способ по любому из вариантов реализации 476-479, в котором указанные один или более промоторов гена включают промоторы НОХА7.
[0647] Вариант реализации 481: Способ по любому из вариантов реализации 457-462, в котором указанный рак представляет собой рак мозга, и указанные один или более промоторов гена включают промоторы MGMT.
[0648] Вариант реализации 482: набор для определения метилирования ДНК, содержащий: контейнер, содержащий первый картридж и/или второй картридж комплекта картриджей по любому из вариантов реализации 317-399.
[0649] Вариант реализации 483: набор согласно варианту реализации 482, в котором указанный первый картридж и указанный второй картридж расположены в одном и том же контейнере.
[0650] Вариант реализации 484: набор согласно варианту реализации 482, в котором указанный первый картридж и указанный второй картридж расположены в отдельных контейнерах.
[0651] Вариант реализации 485: набор согласно варианту реализации 482, где указанный набор дополнительно включает контейнер, содержащий лизирующий раствор.
[0652] Вариант реализации 486: набор согласно варианту реализации 485, в котором указанный лизирующий раствор представляет собой лизирующий раствор для сыворотки или плазмы.
[0653] Вариант реализации 487: набор согласно варианту реализации 485, в котором указанный лизирующий раствор представляет собой лизирующий раствор для образца FFPE.
[0654] Вариант реализации 488: набор по любому из вариантов реализации 482-487, где указанный набор включает контейнер, содержащий протеиназу K.
[0655] Вариант реализации 489: набор по любому из вариантов реализации 482-488, в котором указанный набор содержит реагент для конверсии в указанном картридже или в обособленном от картриджа контейнере.
[0656] Вариант реализации 490: набор согласно варианту реализации 489, в котором указанный набор содержит указанный реагент для конверсии в обособленном от картриджа контейнере.
[0657] Вариант реализации 491: набор согласно варианту реализации 489, в котором указанный набор, содержащий указанный реагент для конверсии, размещен в камере картриджа.
[0658] Вариант реализации 492: набор по любому из вариантов реализации 489-491, в котором указанный реагент для конверсии содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия, бисульфита аммония и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октан (DABSO).
[0659] Вариант реализации 493: набор согласно варианту реализации 492, в котором указанный реагент для конверсии содержит бисульфит аммония.
[0660] Вариант реализации 494: набор по любому из вариантов реализации 482-493, в котором указанный набор включает контейнер, содержащий реагент для обработки образца.
[0661] Вариант реализации 495: набор согласно варианту реализации 494, в котором указанный реагент для обработки образца содержит гуанидина тиоцианат.
[0662] Вариант реализации 496: набор по любому из вариантов реализации 494-495, в котором указанный реагент для обработки образца содержит этанол.
[0663] Вариант реализации 497: набор по любому из вариантов реализации 482-496, где указанный набор содержит инструктирующий материал для обучения применению указанного картриджа для определения метилирования ДНК.
[0664] В некоторых вариантах реализации способы и/или картриджи явно исключают магнитные материалы, включая магнитные шарики, магнитный гидроксиапатит и магнитный матричный материал. В некоторых вариантах реализации способы и/или картриджи явно исключают магнитные материалы для изолирования ДНК.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0665] На фигуре 1А показаны основные компоненты картриджа (например, картридж GENEXPERT), подходящего для применения согласно способам, приведенным в настоящем описании. На фиг. 1В показан вид картриджа сверху с изображением камер, расположенных вокруг центрального клапана. На фиг. 1C изображена пояснительная схема определения метилирования ДНК с применением реакционного картриджа.
[0666] На фигуре 2, панели А-С, изображен один из вариантов реализации картриджа GENEXPERT, подходящего для определения метилирования ДНК в соответствии с описанием в настоящем документе.
[0667] На фигурах 3А-3С изображены иллюстративные, но неограничивающие их, варианты реализации модулей и систем (например, устройства) для определения метилирования ДНК. На фиг. 3А изображен модуль для управления картриджем GENEXPERT. На фиг. 3В изображены некоторые компоненты одного из вариантов реализации модуля управления картриджем для анализа метилирования ДНК. На фиг. 3С изображена система (например, устройство), включающая множество модулей.
[0668] На фигурах 4A-4D показаны различные стратегии применения протоколов MethyLight для выявления/количественного измерения фосфорилирования ДНК. На фиг. 4А схематически изображтена технология MethyLight, модифицированная из Eads et al. 92000) Nucleic acids. Res., 28(8): e32). ДНК модифицируют бисульфитом натрия, что приводит к образованию различий в метил-зависимых последовательностях, например, в динуклеотидах CpG - путем конверсии неметилированных остатков цитозина (положения обозначены белыми кругами) на урацил, в то время как метилированные остатки цитозина (положения обозначены черными кругами) сохраняются в виде цитозина. Затем проводят ПЦР на основе флуоресценции с помощью праймеров, которые либо перекрывают сайты метилирования или не перекрывают ни одного сайта метилирования. Дискриминация последовательности (sequence discrimination) может происходить либо на уровне процесса амплификации ПЦР (панель D), либо на уровне процесса гибридизации зонда (панель В), либо на обоих (панель D). Для дискриминации последовательности на уровне процесса амплификации ПЦР используют праймеры и зонды (панель D), или только праймеры (панель С) для перекрывания потенциальных сайтов метилирования (например, в динуклеотидах CpG). Показаны только два типа (полностью метилированные (М) и полностью неметилированные (U)) из многих теоретических пермутаций при метилировании. Метод MethyLight может быть также разработан, таким образом, что при амплификации ПЦР дискриминации последовательности не происходит. В случае если ни праймеры ни зонды не перекрывают сайты метилирования (например, в динуклеотидах CpG) (панель А), то на уровне амплификации ПЦР или гибридизации зонда не происходит дискриминации в зависящей от метилирования последовательности. Данная реакция представляет собой амплификацию конвертированной геномной ДНК без системного сдвига (without bias) к статусу метилирования, что может служить в качестве контроля количества вносимой ДНК. Если только зонд перекрывает сайты метилирования (панель В), то дискриминация последовательности может происходить в ходе гибридизации зонда. На фиг. 4В изображен метод MethyLight с использованием одного, например, специфичного для метилирования, зонда (PR3) совместно со специфичными для метилирования прямыми (FW) и обратными (RV) праймерами. На фиг. 4С изображен метод MethyLight с использованием множества зондов (PR1…PR5), каждый из которых нацелен на различные области. На фиг. 4D изображен метод MethyLight с использованием множества зондов (PR1…PR5), каждый из которых нацелен на одну и ту же область, но формирует сигнал на различные паттерны метилирования.
[0669] На фигуре 5 приведены результаты репрезентативного эксперимента GeneXpert для 300 нг геномной ДНК человека с изображением кривой кПЦР для АСТВ и кривой кПЦР для HMBS.
[0670] На фигурах 6А и 6В изображены результаты титрования для конвертированной бисульфитом АСТВ с использованием геномной ДНК человека (hgDNA) во вложенной кПЦР с 15 циклами (фиг. 6А) и во вложенной кПЦР с 20 циклами (фиг. 6В).
[0671] На фигурах 7А-7С изображены результаты 20 циклов вложенной кПЦР (внутри картриджа) для шести метилированных мишеней (AKR1B1, НОХВ4, TM6SF1, RAASGRF2 и RASSF1A). На фиг. 7А изображены результаты для 25 нг HS DNA или 5000 клеток без бисульфитной конверсии. На фиг. 7В изображены результаты для 20 циклов вложенной кПЦР для конвертированных бисульфитом метилированных мишеней с использованием ДНК из клеток МВА-453. На фиг. 7С изображены результаты 20 циклов вложенной кПЦР для конвертированных бисульфитом метилированных мишеней с использованием ДНК из клеток МВА-453 в носителе (1 мкг SS и 10 нг HSDNA). Скачки флуоресценции (fallouts) происходят примерно при уровне 25-50 копий или примерно 100 клеток.
[0672] На фигуре 8 изображены результаты определения эффективности конверсии. Эффективность конверсии составляет примерно 66% (~1 Ct) разницы между неконвертированным HMBS и конвертированным АСТВ.
[0673] На фигуре 9 показано увеличение специфичности для конвертированной ДНК, полученной при вложенной кПЦР.
[0674] На фигуре 10 показана специфичность картриджа метилирования. Отсутствует операция «priming off» неконвертированной ДНК (панель сверху) или неметилированной ДНК (панель снизу) за исключением HIST1H3C.
[0675] На фигурах 11 изображены иллюстративные, но неограничивающие их, схемы проведения анализа метилирования с использованием картриджа (например, картриджа GENEXPERT). На фигуре сверху изображена одна из схем проведения анализа метилирования ДНК в образце из сыворотки или плазмы. На фигуре снизу изображена одна из схем проведения анализа метилирования ДНК в тканевом срезе (например, в замороженном или фиксированном формалином и залитом парафином (FFPE) срезе).
[0676] На фигуре 12 изображены результаты для сгустка клеток FFPE для конвертированного ALU (кривая крайняя слева) и метилированного RASSF1A (кривая крайняя справа).
[0677] На фигуре 13А показана принципиальная схема картриджа, на фигуре 13В показана схема проведения протокола, применяемого в примере 4.
[0678] На фигуре 14 показан эксперимент, в котором некоторые образцы имели контаминацию бисульфитом.
[0679] На фигуре 15А изображены результаты для 1000 клеток МВА-453 с бисульфитной конверсией (с НОХВ4, дающего самый мощный сигнал). На фигуре 15В изображены результаты для контрольного образца 25 нг HS DNA (при этом только HIST1H3C дает детектируемый сигнал).
[0680] На фигуре 16 показана структура DABSO (1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1,4-дисульфината).
[0681] На фигуре 17 показан один из вариантов реализации с картриджем подготовки образца cf-ДНК. Картридж эффективен для выделения как ДНК, так и РНК. В картридже реализовано три отмывки с GTC-этанолом (отмывочный раствор с GTC-этанолом обычно представляет собой 1,25 М гуанидина тиоцианат, 25 мМ Трис с рН 7,0, этанол 50%), промывание ПЭГ200 и элюирование 15 мМ KOH.
[0682] На фигуре 18 показаны контроли для экстрации cf-ДНК.
[0683] На фигуре 19А показано сравнение получения cf-ДНК с применением картриджа для получения образца в соответствии с описанием в настоящем документе по сравнению с получением согласно стандартному протоколу «tubefill» (то есть с применением набора на базе пробирок) (крайняя кривая слева). Выход при получении с использованием картриджа крайне близок к получаемому при применении способа «tubefill» (крайняя кривая справа). На фигуре 19В показано сравнение количества детектированной экстрагированной ДНК с применением очистки ДНК на основе картриджа по отношению к стандартному протоколу «tubefill» в зависимости от количества ДНК. Способ на основе картриджа надежно входит в рамки 1 Ct способа «tubefill» и, предположительно, будет еще более сходен при высокой концентрации ДНК.
[0684] На фигуре 20А изображен один из вариантов реализации картриджа для подготовки образца большого объема (например, до 12 мл включительно) (HVSP), который может быть применен вместе с кПЦР-картриджем и/или вместе с картриджем для определения метилирования. На фигуре 20В схематично изображен один из вариантов диаграммы процесса в HVSP-картридже при использовании в комбинации с кПЦР-картриджем для проведения анализа метилирования.
[0685] На фигуре 21 изображена детекция HBMS или β-глобина с проведением очистки в двух картриджах при применении картриджа для подготовки образца большого объема (см., например, фиг. 20), при этом образец переводят из картриджа большого объема в картридж анализа ПЦР, в сравнении с детекцией при использовании образца, помещенного в единичный картридж ПНР-анализа, имея в итоге меньший объем образца.
[0686] На фигуре 22 изображены результаты бисульфитной конверсии с применением многократных циклов нагревания (панель снизу) в сравнении с одним циклом нагревания (панель сверху).
[0687] На фигуре 23А изображены циклы и затраты времени на проведение анализа метилирования с использованием стандартного набора очистки ДНК Qiagen совместно с набором определения метилирования ДНК Zymo (справа) в сравнении с проведением анализа метилирования с использованием кадриджа для анализа метилирования, приведенного в настоящем описании. На фигуре 23В показано сравнение результатов, полученных с применением двух отличающихся методик.
[0688] На фигуре 24 показано сравнение конверсии ДНК с использованием 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO) в качестве реагента для конверсии по отношению к конверсии ДНК с использованием бисульфитного реагента для конверсии Zymo.
[0689] На фигуре 25, панели А и В, показана чувствительность детектирования метилированной ДНК. На панели А изображена серия разведении метилированной ДНК (MGMT) (кривые идут от наиболее высоких концентраций слева к более низким концентрациям справа). На панели В показана чувствительность детектирования метилированных маркеров поджелудочной железы.
[0690] На фигуре 26 изображены результаты для мультиплексного анализа с обратным комплементом для обеих цепей (кривые от наиболее высокой флуоресценции к низкой: панель сверху - BNC1_2, BNC1_2, BG, ADAMTS1_1/ADAMTS1_2; панель снизу - BNC1_2, BNC1_2, ADAMTS1_1/ADAMTS1_2, BG, ADAMTS1_1/ADAMTS1_2).
[0691] На фигуре 27А изображено детектирование в одном и том же картридже как метилированной ДНК, так и мутаций. На панели сверху изображено детектирование в одном картридже метилированной ДНК и мутации Kras G12D, а на панели снизу изображено детектирование в одном картридже метилированной ДНК и Kras дикого типа. На фигуре 27В изображено детектирование в одном и том же картридже метилированной ДНК и мутаций I для двух клеточных линий рака поджелудочной железы: клетки PANC-1 (панель сверху) и клетки MIA-PaCa (панель снизу).
[0692] На фигуре 28 показана оптимизация температуры при мультиплексном анализе метилирования ADAMTS1 и BNC1 в прямой цепи (сверху) и обратной цепи (снизу) конвертированной бисульфитом ДНК.
[0693] На фигуре 29 показана способность мультиплексного анализа с MSP-комплектом прамеров и зондов для BNC1, ADAMTS1 и контрольного гена АСТВ. Зонды были объединены в два комплекта на основании предпочтительных условий.
[0694] На фигуре 30 изображен один набор праймеров и зондов, который применяют для определения метилирования MGMT: внутренний прямой 22150 (SEQ ID NO: 266); внешний прямой 22422 (SEQ ID NO: 263); зонд 22419 (SEQ ID NO: 268), внутренний обратный 22151 (SEQ ID NO: 267); внешний обратный 22423 (SEQ ID NO: 265); матрица (SEQ ID NO: 1).
[0695] На фигуре 31 изображены результаты сравнения между бисульфитным пиросеквенированием и картриджем метилирования MGMT для экстрагированной ДНК (сверху) и для образца FFPE (снизу).
[0696] На фигуре 32 показана оптимизация ΔCt между метилированной и неметилированной конвертированной ДНК для комплекта праймеров и зондов BRCA1.
4
[0697] На фигуре 33 представлен анализ метилирования BRCA1 с одной мишенью при исследовании вместе с АСТВ в качестве контрольного гена. В соответствии с приведенным изображением исследовали восемь различных клеточных линий и сравнивали эффект добавления NH.
[0698] На фигуре 34 представлены результаты анализа метилирования генов с тремя мишенями, метилирование которых связано с раком легкого (SOX17, CDO1, ТАС1), на фоне плазмы здорового субъекта и в клеточных линиях с тремя различными типами рака легкого.
[0699] На фигуре 35 изображены результаты анализа метилирования с двумя картриджами для BNC1 и АСТВ.
[0700] На фигуре 36 изображены результаты анализа бисульфитной конверсии для образцов мочи здорового субъекта.
[0701] На фигуре 37 изображены результаты анализа метилирования для образцов мокроты здорового субъекта и мокроты при раке.
Определения
[0702] Для облегчения понимания настоящего изобретения ниже приведено определение для ряда терминов и фраз:
[0703] В контексте настоящего описания термины «детектировать» («определять»), «детектирование» («выявление») или «детекция» («выявление») могут описывать либо общее действие по обнаружению или определению, либо специфическое выявление композиции с детектируемой меткой.
[0704] В контексте настоящего описания термин «детектируемо отличающийся» или «спектрально различимый» относится к набору меток (таких как красители/флуорофоры), которые могут быть детектированы и различены одновременно.
3
[0705] Метилирование ДНК относится к ковалентному добавлению метильной группы (СН) к основанию цитозина (С), как правило, в динуклеотиде 5'-CpG-3'. Термин CpG относится к основанию цитозина (С), соединенному фосфатной связью с основанием гуанина (G) в последовательности нуклеотидов ДНК.
[0706] Термин «реагент для конверсии» относится к реагенту, который дезаминирует цитозин до урацила в одноцепочечной ДНК, при этом оставляя 5-МеС по существу не затронутым. Приведенные в качестве примера реагенты для конверсии включают бисульфиты (например, метабисульфит натрия, бисульфит калия, бисульфит цезия, бисульфит аммония и т.д.) и/или соединения, из которых можно получить бисульфит при надлежащих условиях реакции (например, 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октан (DABSO)).
[0707] Фраза «определение метилирования гена» в целом относится к определению метилирования цитозина, главным образом в CpG-островках, в промоторной области гена.
[0708] В контексте настоящего описания термины «пациент» и «субъект» в целом используют взаимозаменяемо в отношении человека. В некоторых вариантах реализации способы, представленные в настоящем описании, могут быть применены к образцам от не являющихся человеком животных, например, нечеловекообразных приматов, собачих, лошадиных, кошачих, свиных, бычьих, зайцеобразных и тому подобных.
[0709] В контексте настоящего описания термины «олигонуклеотид», «полинуклеотид», «молекула нуклеиновой кислоты» и тому подобные относятся к содержащим нуклеиновую кислоту молекулам, включая, но не ограничиваясь ими, ДНК. Данные термины охватывают последовательности, которые включают любые известные аналоги оснований ДНК и РНК, включая, но не ограничиваясь ими, 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N6-метиладенозин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изопентениладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметил-гуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиамино-метил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеуозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, сложный метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, сложный метиловый эфир N-урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту, псевдоурацил, квеуозин, 2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин.
[0710] В контексте настоящего описания термин «олигонуклеотид» относится к одноцепочечным полинуклеотидам, в основном содержащих менее чем 500 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид составляет в длину от 8 до 200, от 8 до 100, от 12 до 200, от 12 до 100, от 12 до 75 или от 12 до 50 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут иметь обозначение, исходя из их длины, например, олигонуклеотид с 24 остатками может быть обозначен как «24-mer».
[0711] В контексте настоящего описания термин «комплементарный» к гену-мишени (или его области-мишени) и процент «комплементраности» последовательности зонда к последовательности гена-мишени представляет собой процентное выражение «идентичности» по отношению к последовательности гена-мишени или к комплементу последовательности гена-мишени. При установлении степени «комплементарности» между зондами, используемыми в композициях, приведенных в настоящем описании (или их участками) и генами-мишенями, такими как те, которые раскрыты в настоящем описании, степень «комплементарности» выражают как процентную идентичность между последовательностью зонда (или его участка) и последовательностью гена-мишени или комплементарной последовательностью гена-мишени, которая выравнивается с ней в наибольшей степени. Процент вычисляют подсчетом числа соответствующих оснований, которые идентичны у указанных 2 последовательностей, которое делят на общее число последовательных нуклеотидов в зонде и умножают на 100. При использовании термина «комплементарный» рассматриваемый олигонуклеотид по меньшей мере на 90% комплементарен молекуле-мишени, за исключением случаев, где указано иначе. В некоторых вариантах реализации рассматриваемый олигонуклеотид по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% комплементарен молекуле-мишени.
[0712] Термины «праймер» или «зонд» в контексте настоящего описания относятся к олигонуклеотиду, который содержит участок, комплементарный к последовательности из по меньшей мере 8 непрерывных нуклеотидов целевой молекулы нуклеиновой кислоты, такой как ген-мишень. В некоторых вариантах реализации праймер или зонд содержат участок, комплементарный к последовательности по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29, по меньшей мере 29, по меньшей мере 30, по меньшей мере 319, по меньшей мере 32, по меньшей мере 33, по меньшей мере 34, по меньшей мере 35, по меньшей мере 36, по меньшей мере 37, по меньшей мере 38, по меньшей мере 39 или по меньшей мере 40 непрерывных нуклеотидов целевой молекулы. Если праймер или зонд содержит участок, «комплементарный к по меньшей мере х непрерывных нуклеотидов целевой молекулы», то данный праймер или зонд является по меньшей мере на 95% комплементарным к по меньшей мере х непрерывных нуклеотидов данной целевой молекулы. В некоторых вариантах реализации данный праймер или зонд является по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или 100% комплементарным к данной молекуле-мишени.
[0713] Термин «амплификация нуклеиновой кислоты» охватывает любые способы, которыми может быть воспроизведена по меньшей мере часть по меньшей мере одной целевой нуклеиновой кислоты, как правило, в зависимости от матрицы, включая, без ограничений, широкий круг методов амплификации последовательностей нуклеиновых кислот как линейно, так и экспоненциально. Приводимые в качестве примера способы выполнения стадии амплификации включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР), лигазную цепную реакцию (ЛЦР), реакцию лигазной детекции (LDR), мультиплексную лигазно-зависимую амплификацию зондов (MLPA), лигирование с последующей амплификацией Q-репликазой, достройку праймера, амплификацию с вытеснением цепи (SDA), амплификацию с вытеснением гиперразветвленной цепи, амплификацию с множественным вытеснением цепи (MDA), амплификацию, основанную на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), двухстадийные мультиплексные амплификации, амплификацию по типу катящегося кольца (RCA) и тому подобные, включая их мультиплексные версии и комбинации, например, но не ограничиваясь ими, OLA/PCR, PCR/OLA, LDR/PCR, PCR/PCR/LDR, PCR/LDR, LCR/PCR, PCR/LCR (также известная как комбинированная цепная реакция --CCR), цифровую амплификацию и тому подобные. Описание таких методов можно найти, помимо прочих источников, в Ausbel et al.; PCR Primer: A Laboratory Manual, Diffenbach, Ed., Cold Spring Harbor Press (1995); The Electronic Protocol Book, Chang Bioscience (2002); Msuih et al., J. Clin. Micro. 34: 501-07 (1996); The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley, ed., Humana Press, Totowa, N.J. (2002); Abramson et al., Curr Opin Biotechnol. 1993 February; 4(1): 41-7, патент США №6027998; патент США №6605451, Barany et al., PCT публикация № WO 97/31256; Wenz et al., PCT публикация № WO 01/92579; Day et al., Genomics, 29(1): 152-162 (1995), Ehrlich et al., Science 252: 1643-50 (1991); Innis et al., PCR Protocols: A Guide toMethods and Applications, Academic Press (1990); Favis et al., Nature Biotechnology 18: 561-64 (2000); and Rabenau et al., Infection 28: 97-102 (2000); Belgrader, Barany, and Lubin, Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay, Sixth International Symposium on Human Identification, 1995 (доступная во всемирной сети Интернет на: promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html); LCR Kit Instruction Manual, Cat. #200520, Rev. #050002, Stratagene, 2002; Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 188-93 (1991); Bi and Sambrook, Nucl. Acids Res. 25: 2924-2951 (1997); Zirvi et al., Nucl. Acid Res. 27: e40i-viii (1999); Dean et al., Proc Natl Acad Sci USA 99: 5261-66 (2002); Barany and Gelfand, Gene 109: 1-11 (1991); Walker et al., Nucl. Acid Res. 20: 1691-96 (1992); Polstra et al., BMC Inf. Dis. 2: 18-(2002); Lage et al., Genome Res. 2003 February; 13(2): 294-307, and Landegren et al., Science 241: 1077-80 (1988), Demidov, V., Expert Rev Mol Diagn. 2002 November; 2(6): 542-8., Cook et al., J Microbiol Methods. 2003 May; 53(2): 165-74, Schweitzer et al., Curr Opin Biotechnol. 2001 February; 12(1): 21-7, патент США №5,830,711, патент США №6,027,889, патент США №5,686,243, РСТ публикация № W00056927 A3 и РСТ публикация № W09803673 A1.
[0714] В некоторых вариантах реализации амплификация включает по меньшей мере один цикл последовательных процедур: отжиг по меньшей мере одного праймера с комплементарными или по существу комплементарными последовательностями по меньшей мере в одной нуклеиновой кислоте-мишени; синтез по меньшей мере одной цепи нуклеотидов в зависимости от матрицы (in a template-dependent manner) с использованием полимеразы; и денатурацию вновь образованного дуплекса нуклеиновых кислот для разделения цепей. Цикл может быть повторен или может быть не повторен. Амплификация может содержать термоциклирование или, в некоторых вариантах реализации, может быть выполнена изотермически.
m
m
m
[0715] Термин «гибридизация» в контексте настоящего описания главным образом относится к «специфической гибридизации», которая представляет собой связывание, образование дуплекса (duplexing) или гибридизацию молекулы нуклеиновой кислоты преимущественно к определенной последовательности нуклеотидов, в некоторых вариантах реализации, при жестких условиях. Термин «жесткие условия» относится к условиям, при которых зонд гибридизуется преимущественно к последовательности-мишени, и в меньшей степени или совсем не гибридизуется к другим последовательностям. «Жесткая гибридизация» и «жесткие условия гибридизационной отмывки» в контексте гибридизации нуклеиновой кислоты являются зависящими от последовательности и отличаются при различных параметрах внешней среды. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновой кислоты находится, например, в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, Ch. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, N.Y. ("Tijssen"). В целом крайне жесткие условия гибридизации и отмывки для гибридизации на фильтре выбраны, так чтобы быть примерно на 5°С ниже, чем температурная точка плавления (T) для специфической последовательности при заданной ионной силе и рН. T представляет собой температуру (при определенной ионной силе и рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизуется с полностью соответствующим зондом. В некоторых вариантах реализации крайне жесткие условия выбраны так, чтобы быть равными T для конкретного зонда. Зависимость жесткости гибридизации от композиции буфера, температуры и длины зонда широко известна специалистам в данной области техники (см., например, Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY).
[0716] «Образец» в контексте настоящего описания в общем относится к биологическому образцу, включая биологические жидкости (например, кровь или фракции крови, сыворотка, плазма, поджелудочный сок, спинномозговая жидкость, пероральная жидкость, лимфа, внутриглазная жидкость и тому подобное) и/или образцы ткани, включая, но не ограничиваясь ими, биоптаты, замороженные образцы ткани, фиксированный формалином и залитый парафином (FFPE) образец из различных тканей, включая, но не ограничиваясь ими, ткани молочной железы, ткани цервикального канала, вагинальную ткань, ткани толстой кишки/прямой кишки, ткани горла и другие типы тканей человеческих образцов, такие как кровь, стул и биоптаты. Термин «образец» также включает разбавленные и/или содержащие буферный раствор формы вышеуказанных образцов, например, буфер, в который поместили образец при взятии мазка, образец мочи, к которому добавили буфер, и тому подобное.
[0717] В контексте настоящего описания фраза «указывающий на наличие рака или предрасположенность к раку» означает, что конкретный результат в основном указывает на то, что присутствует или вероятно, что присутствует рак и/или присутствует предраковое состояние. Данная фраза не заключает в себе однозначного установления того, что данное состояние присутствует. Однозначное установление может быть выполнено на основании дополнительного обследования или исследования, которое практикующий врач посчитается надлежащим. Кроме того, данная фраза не предполагает, чтобы данное установление было выполнено в отношении того состояния, которое может присутствовать, только на основании данного конкретного результата. Скорее, под собой она подразумевает, что положительный результат будет оценен в свете другого обследования или будут получены дополнительные результаты при дифференциальной диагностике.
[0718] Термин «процедура tubefill» относится к процедуре, которую проводят с использованием стандартного лабораторного оборудования преимущественно на кассете (например, преимущественно с GENEXPERT или с модифицированным картриджем GENEXPERT, представленным в настоящем описании).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0719] В различных вариантах реализации устройства и способы представлены таким образом, чтобы способствовать скорейшему детектированию и/или характеризации метилирования в образцах ДНК. В некоторых вариантах реализации автоматические реакционные картриджи представлены вместе со способами, в которых используют автоматический реакционный картридж(и) с целью обеспечения проведения анализа метилирования образца ДНК и, необязательно, для измерения уровней мРНК совместно с определением метилирования ДНК. В различных вариантах реализации метилирование ДНК определяют посредством бисульфитной конверсии и анализа конвертированной бисульфитом ДНК (например, посредством специфической в отношении метилирования ПЦР, секвенирования нуклеиновой кислоты, анализа точки плавления и тому подобным образом). В некоторых вариантах реализации в картридже происходит выполнение всей или части бисульфитной конверсии ДНК и всего или части анализа конвертированной бисульфитом ДНК. В некоторых вариантах реализации в картридже происходит выполнение всех этапов, присущих бисульфитной конверсии, и всего или части анализа конвертированной бисульфитом ДНК. В некоторых вариантах реализации в картридже происходит выполнение всех этапов, присущих бисульфитной конверсии, и всего или части анализа конвертированной бисульфитом ДНК. В некоторых вариантах реализации в картридже дополнительно происходит проведение выделения и очистки ДНК, предназначенной для анализа.
[0720] Автоматизация анализа метилирования имеет несколько преимуществ, включая, например, сокращение времени обработки, улучшение эффективности, снижение ошибок пользователя и вариабельности, минимизацию потерь от стадии к стадии и повышение возможности использования меньшего количества образца. Применение процесса на основе картриджа в соответствии с настоящим описанием позволяет быстро и легко проводить анализ не только множества типов образцов, но также оценивать изменения в метилировании, наблюдаемые в нескольких различных типах раковых заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, рак молочной железы, колоректальный рак, рак предстательной железы и рак легкого.
[0721] Основанные на картридже способы, приведенные в настоящем описании, дополнительно позволяют проводить измерение мРНК, полученной из того же образца. Измерение соответствующих мРНК против хода и/или по ходу транскрипции (upstream и/или downstream), задействованных в метилировании ДНК, может быть важно для понимания механизма и действия эпигенетической модификации. Например, измерение мРНК ДНК-метилтрансфераз (DNMT) изучали совместно с метилированием ДНК для нескольких типов раковых заболеваний (см. таблицу 1).
[0722] Зачастую для изучения и измерения генов и транскриптов проводят отдельные независимые экстракции ДНК или РНК. Совместное детектирование при подготовке из одного и того же образца идеально для минимизации подготовки образца, а также вариабельности между проведениями анализа, между образцами и между клетками.
Бисульфитная конверсия ДНК с помощью картриджа
[0723] В некоторых вариантах реализации эктракцию ДНК, бисульфитную конверсию и специфическую в отношении метилирования ПЦР полностью проводят в картридже. В одном из примеров варианта реализации, пользователь добавляет образец к лизирующему/связывающему реагенту, далее реагент непродолжительно встряхивают/перемешивают вихревым способом, и затем добавляют образец в порт или камеру для образца в картридже. Иллюстративный, но не ограничивающий его, пример лизирующего реагента (включая реагенты в особенности подходящие для срезов FFPE) описан в патентной публикации РСТ №: WO/2014/052551 (PCT/US2013/061863), которая включена в настоящее описание посредством ссылки для реагентов, приведенных в настоящем документе.
[0724] Дополнительные примеры лизирующих реагентов для сыворотки или плазмы и для фиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE) образцов представлены в примере (таблицы 13 и 14, соответственно).
[0725] В некоторых вариантах реализации картридж размещен внутри рабочего модуля, и инициация анализа происходит посредством выполнения в программном обеспечении, управляющем модулем обработки, серии нажатий с необходимым выбором (см., например, фиг. 11А и 11В). Далее в картридже проходит процесс бисульфитной конверсии и анализ конвертированной бисульфитом ДНК. В некоторых вариантах реализации также определяют мРНК. Хотя в некоторых вариантах реализации все операции осуществляются в картридже, в других вариантах реализации лишь часть различных операций осуществляется в картридже согласно описанию ниже.
[0726] Образец может включать любой биологический образец, который содержит ДНК, статус метилирования которой подвергается оценке. Примеры образцов включают, но не ограничиваются ими, выделенную ДНК и/или выделенные все нуклеиновые кислоты, клетку, ткань, биологическую жидкость, содержащую нуклеиновую кислоту и тому подобное. В некоторых вариантах реализации биологический образец содержит биологическую жидкость, выбранную из группы, состоящей из плазмы, сыворотки, околоплодной жидкости, слюны, слизи, мочи, поджелудочного сока и цереброспинальной жидкости. В некоторых вариантах реализации образец содержит образец ткани из здоровой ткани или образец ткани из пораженной ткани. В некоторых вариантах реализации образец ткани получен от плода, новорожденного, ребенка; подростка или взрослого. В некоторых вариантах реализации образец ткани содержит клетку опухоли и/или получен при биопсии опухоли (например, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака мозга, рака шейки матки, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака толстой кишки, рака желудка, гепатоцеллюлярного рака и тому подобное). В некоторых вариантах реализации образец содержит фиксированную ткань, например, фиксированный в формалине образец ткани. В некоторых вариантах реализации образец содержит погруженный образец ткани (например, фиксированный в формалине и погруженный в парафин (FFPE) образец ткани).
[0727] Бисульфитная конверсия ДНК, как правило, включает следующие четыре стадии:
[0728] 1) очистка ДНК;
[0729] 2) денатурация ДНК;
[0730] 3) конверсия ДНК (например, бисульфитное дезаминирование) и
[0731] 4) щелочное десульфирование.
[0732] Как правило, конверсия ДНК (например, с использованием реагента для конверсии такого как бисульфит) включает: 1) сульфирование: добавление бисульфита к 5-6 двойной связи в цитозине; и 2) гидролитическое дезаминирование: гидролитическое дезаминирование полученного производного цитозин-бисульфит с получением производного урацил-бисульфит. Далее следует щелочное десульфирование: Удаление сульфогруппы посредством обработки щелочью позволяет получить урацил, как указано выше.
[0733] Как отмечено выше, в некоторых вариантах реализации очистка ДНК может быть выполнена перед помещением образца в картридж, или в качестве альтернативы, может быть выполнена в самом картридже. Соответственно, в некоторых вариантах реализации образец добавляют непосредственно в реакционный картридж, при этом в других вариантах реализации образец смешивают с одним или более реагентами. В некоторых вариантах реализации, как правило, подготовка ДНК включает получение по существу выделенной ДНК. Это может включать лизинг клеток для высвобождения ДНК, удаление частиц и остатков разрушенных клеток и/или удаление белковых компонентов, получая образец, содержащий по существу чистые нуклеиновые кислоты (например, по существу чистую ДНК и/или по существу комбинацию чистых ДНК и РНК). В одном иллюстративном, но неограничивающем варианте реализации образец (например, образец ткани) добавляют к лизирующему реагенту, перемешивают и затем помещают внутрь картриджа для дополнительной обработки.
[0734] В некоторых вариантах реализации все реагенты, необходимые для проведения бисульфитной конверсии ДНК, представлены в картридже. В некоторых вариантах реализации для предотвращения деградации реагентов в картридже с течением времени определенные реагенты могут быть добавлены в картридж непосредственно перед использованием. Таким образом, например, в некоторых вариантах реализации это подразумевает, что реагент для конверсии может быть загружен в картридж (например, бисульфитный реагент) и/или реагент гуанидина тиоционата (например, GTC-EtOH-Твин) во время или близко ко времени, когда происходит загрузка образца в картридж. В некоторых вариантах реализации реагент гуанидина тиоционат (например, GTC-EtOH-Твин) объединяют с образцом и добавляют в картридж в камеру приема образца (например, камера 2 в картридже GENEXPE RT).
[0735] В некоторых вариантах реализации при выполнении бисульфитной конверсии ДНК с использованием реакционного картриджа (например, картриджа GENEXPERT) способ включает:
[0736] i) приведение биологического образца, содержащего нуклеиновую кислоту, в контакт с первым матричным материалом, входящим в первую колонку или фильтр, где указанный матричный материал связывает и/или фильтрует нуклеиновую кислоту в указанном образце и, таким образом, очищает ДНК;
[0737] ii) элюирование связанной ДНК из первого матричного материала (например, с использованием щелочного раствора) и денатурацию ДНК с получением элюированной денатурированной ДНК;
[0738] iii) нагревание элюированной ДНК в присутствии реагента для конверсии (например, реагента, предоставляющего бисульфит-ионы) с получением конвертированной (например, дезаминированной) нуклеиновой кислоты;
[0739] iv) приведение в контакт конвертированной нуклеиновой кислоты с вторым матричным материалом, входящим во вторую колонку, для связывания указанной дезаминированной нуклеиновой кислоты с указанным вторым матричным материалом (следует отметить, что в некоторых вариантах реализации вторая колонка может представлять собой колонку, отличающуюся от первой колонки, или в других вариантах реализации ту же самую колонку используют второй раз);
[0740] v) десульфирование связанной дезаминированной нуклеиновой кислоты и/или одновременной элюирование и десульфирование нуклеиновой кислоты посредством приведения в контакт дезаминированной нуклеиновой кислоты с щелочным раствором с получением конвертированной (например, конвертированной бисульфитом) нуклеиновой кислоты; и
[0741] vi) элюирование конвертированной нуклеиновой кислоты из указанного второго матричного материала, где по меньшей мере стадии с iv) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0742] В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает анализ конвертированной ДНК. Соответственно, в некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает:
[0743] vii) выполнение специфической в отношении метилирования ПЦР и/или секвенирование нуклеиновой кислоты, и/или высокоточный анализ кривых плавления (HRM) указанной конвертированной нуклеиновой кислоты для определения метилирования нуклеиновой кислоты, при этом по меньшей мере стадии с iv) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0744] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере стадии с iii) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0745] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере стадии с ii) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0746] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере стадии с i) по vi) проводят в одном реакционном картридже.
[0747] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере стадии с i) по vii) проводят в одном реакционном картридже.
[0748] Следует отметить, что первая колонка и, при наличии, вторая колонка могут означать раздельные колонки. Однако, в особенности при интегрировании в реакционный картридж, «колонка» может всего лишь представлять собой матричный материал, размещенный в камере или канале в картридже. В различных вариантах реализации «колонки» выполняют функцию фильтров и/или аффинной колонки, которая связывает нуклеиновые кислоты. Соответственно, в некоторых вариантах реализации колонка содержит матричный материал, который связывает нуклеиновые кислоты (например, ДНК и/или РНК). Примеры матричных материалов включают, но не ограничиваются ими, стекло (диоксид кремния), ионно-обменную смолу, гидроксиапатит и тому подобное. Следует понимать, что матричные материалы могут иметь несколько форм. Таким образом, в некоторых вариантах реализации матричный материал содержит волокнистый материал, материал в виде частиц (например, микрошарики, наношарики и т.д.), структурированный материал (например, рифленая «baffle» система, канал в форме змеевика и тому подобное). В некоторых вариантах реализации первая колонка и вторая колонка представляют собой различные колонки (камеры или каналы). В других вариантах реализации первая колонка и вторая колонка представляют собой одну и ту же колонку (канал или камеру), которую используют дважды (например, первый раз и второй раз).
[0749] В некоторых вариантах реализации подразумевается использование одного или более дополнительных фильтров, например, очистки начального образца до приведения в контакт с первым матричным материалом. Таким образом, например, в некоторых вариантах реализации фильтрующая матрица (например, поликарбонатный фильтр, нейлоновый фильтр, полипропиленовый фильтр, сложнополиэфирный фильтр, нейлоновый фильтр, керамический фильтр, политетрафторэтиленовый фильтр и тому подобное) размещают в камере приема образца или «в последующих камера» от камеры приема образца и перед первой «колонкой». Также следует понимать, что в некоторых вариантах реализации образец может быть лизирован и/или отфильтрован перед размещением внутри камеры приема образца.
[0750] В определенных иллюстративных, но неограничивающих вариантах реализации способы, приведенные в настоящем описании, могут быть выполнены с использованием картриджа GENEXPERT (Cepheid, Inc., Sunnyvale, СА) или его вариантов. В различных вариантах реализации экстрагирование образца и/или амплификация, и/или конверсия ДНК, и/или детекция могут все быть проведены внутри данной автономной «лаборатории в картридже» (см., например, патенты США №№5958349, 6403037, 6440725, 6783736 и 6818185, содержание которых полностью включено в настоящее описание посредством ссылки). В различных вариантах реализации компоненты картриджа могут включать, но не быть ими ограничены, рабочие камеры, содержащие реагенты, фильтры и средства сбора информации, пригодные для применения с целью экстракции, очистки и амплификации целевых нуклеиновых кислот. Клапан обеспечивает перенос жидкости из одной камеры в другую и содержит компоненты для лизиса нуклеиновых кислот и фильтрации. Оптическое окно позволяет проводить оптическую детекцию в реальном времени (например, продуктов амплификации ПЦР). Может быть размещена реакционная пробирка, которая обеспечивает очень быстрое нагревание и/или термоциклирование.
[0751] В некоторых вариантах реализации пример картриджа GENEXPERT содержит множество камер, расположенных вокруг узла центрального клапана и имеющих избирательное соединение по текучей среде с узлом центрального клапана, при этом узел центрального клапана выполнен с возможностью размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с центральным клапаном. Поворот клапанного узла определяет, какая камера будет иметь соединение по текучей среде с центральным клапаном. Один из примеров картриджа GENEXPERT представлен на фигуре 1А, изображающей картридж, рабочие камеры/камеры с реагентами, реакционную пробирку (например, пробирка для нагревания и/или термоциклирования), необязательные оптические окна и клапан, который обеспечивает перенос жидкости из одной камеры в другую.
[0752] На фигуре 1В показан пример компоновки картриджа, который содержит вид картриджа сверху с нумерацией отдельных камер. В одном иллюстративном, но не неограничивающем варианте реализации компоненты камер, входящих в картридж, представлены в таблице 2. Следует понимать, что расположение реагентов и камер является иллюстративным и не ограничивающим. С использованием представленного в настоящем описании руководства для специалистов в данной области техники могут быть доступны другие расположения реагентов и/или другие конфигурации камеры.
[0753] Один из вариантов реализации с пошаговой диаграммой процесса определения метилирования ДНК при применении такого картриджа изображен на фигуре 1С. В данной конфигурации картриджа присутствует пять камер, которые в процессе применения (например, при функционировании картриджа с целью определения метилирования ДНК) содержат реагенты и буферы (например, камеры 3, 4, 5, 8 и 10), одна камера, которая содержит добавляемый пользователем образец (например, камера 2) и одна или две (или более) камер, которые содержат реагенты для проведения анализа (например, MSP-реагенты, такие как смесь ферментов, матрица- специфическая реакционная смесь (template specific reaction) и/или 200 мМ Трис с рН 7,0, например, в виде шариков) (например, камеры 9 и 11). В некоторых вариантах реализации реагенты (например, полимераза, обратная транскриптаза, праймер, зонд) представлены в виде раствора. В некоторых вариантах реализации реагенты представлены в виде лиофилизированного порошка. В некоторых вариантах реализации реагенты представлены в виде шариков лиофилизатами. Шарики могут дополнительно содержать агенты, которые повышают стабильность реагентов и/или их активность (см., например, патент США публикация №: 2006/0068399, который включен в настоящее описание посредством ссылки в отношении шариков, изготовления шариков и состава шариков.
[0754] В некоторых вариантах реализации картридж в первоначальном виде содержит все реагенты, необходимые для работы картриджа, и в картридж добавляют только образец (например, образец в буферном/лизирующем/осаждающем растворе). В некоторых вариантах реализации картридж представлен без GTC-EtOH и/или бисульфитных реагентов, и один или оба добавляют во время эксплуатации (применения). Таким образом, в некоторых вариантах реализации реагент GTC-EtOH добавляют в картридж во время эксплуатации, в некоторых вариантах реализации бисульфитный реагент (в дополнение к образцу) добавляют в камеру во время эксплуатации, и в некоторых вариантах реализации и GTC-EtOH, и бисульфитный реагент (в дополнение к образцу) добавляют в картридж во время эксплуатации. В некоторых вариантах реализации данные реагенты добавляют непосредственно в требуемую камеру (см., например, Таблицу 2). В некоторых вариантах реализации имеются порты для загрузки реагентов, и данные порты выполнены с возможность доставки реагента(-ов) требуемые камеры.
[0755] В начале проведения анализа картридж отправляет образец, например, из камеры 2 по колонке из стекловолокна (например, первая колонка) в картридж. Из колонки происходит элюирование ДНК и одновременно денатурация щелочным раствором, например, гидроксидом калия в низкой концентрации, из камеры 10 в концентрированный бисульфитный реагент (например, концентрированный бисульфит аммония) в камере 4. В некоторых вариантах реализации ДНК элюируют щелочным раствором KOH с рН выше, чем примерно 10,5, или рН выше, чем примерно рН 12. В некоторых вариантах реализации ДНК элюируют KOH 10-15 мМ.
[0756] Как указано выше, ДНК элюируют (необязательно с помощью импульса ультразвука) в бисульфитный реагент. В различных вариантах реализации реагент для конверсии (например, бисульфитный реагент) присутствует в концентрации в диапазоне примерно от 4 М до примерно 10 М, или примерно от 5 М до примерно 8 М, или примерно от 6 М или примерно 7 М. В некоторых вариантах реализации бисульфитный раствор содержит метабисульфит натрия, или бисульфит калия, или бисульфит аммония, или бисульфит цезия, или DABSO (1,4-диазониабицикло[2.2.2]октан-1,4-дисульфинат, см., например, фиг. 16). В некоторых вариантах реализации реагент для конверсии (например, бисульфитный реагент) содержит поглотители радикалов, включая, но не ограничиваясь ими, одно или более химических веществ для предотвращения окисления сульфита до сульфата (ТРОЛОКС и гидрохинон), и/или катализаторы (полиамины).
[0757] Смесь ДНК-бисульфит (ДНК/реагент для конверсии) затем вводят внутрь камеры или канала с контролем температуры и инкубируют при температуре в диапазоне примерно от 40°С до примерно 95°С. В некоторых вариантах реализации смесь инкубируют при постоянной температуре, при этом в других вариантах реализации, например, в которых камера или канал с контролем температуры представляет собой камеру или канал термоциклирования (например, пробирка smartcycler в задней части картриджа), смесь термоциклируют (например, между 60°С и 95°С). Смесь инкубируют, пока ДНК станет конвертированной (например, дезаминированной). В некоторых вариантах реализации инкубация длится в течение периода времени, который составляет примерно от 5 минут до примерно 4 часов, или предпочтительно примерно от 15 минут до примерно 45 минут.
[0758] После инкубации раствор ДНК/реагент для конверсии (например, ДНК-бисульфит) смешивают со свежеприготовленным раствором гуанидина тиоцианат-EtOH, например, из камеры 3, и происходит его распределение по матричному материалу. В некоторых вариантах реализации первую колонку используют повторно, т.к. присутствует только одна колонка, и вторая и первая колонки представляют собой одну и ту же колонку. В некоторых вариантах реализации вторая колонка представляет собой отдельную колонку, отличающуюся от первой колонки.
[0759] ДНК, связанную с матричным материалом второй колонки, промывают свежеприготовленным GTC-EtOH (например, из камеры 3) и промывают (например, с промыванием ПЭГ 200, например, из камеры 8). Затем ДНК десульфируют на колонке или одновременно элюируют и десульфируют посредством приведения в контакт дезаминированной нуклеиновой кислоты с щелочным раствором (например, КОН из камеры 10 для получения конвертированной бисульфитом нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации инкубация длится в течение периода времени в диапазоне примерно от 1 минуты до примерно 1 часа, или примерно от 5 минут до примерно 30 минут, или примерно от 10 минут до примерно 20 минут, или в течение примерно 15 минут.
[0760] В случае если начальная инкубация проходила в камере термоциклирования, которая используется в дальнейшем, то камеру или канал термоциклирования промывают буфером для удаления остатков бисульфита и нейтрализации рН. Интересно, что оказалось, что инкубация с реагентом для конверсии (например, бисульфитным реагентом) и/или десульфирование могут быть выполнены в канале или камере, которая далее применяется для проведения ПЦР по существу без влияния контаминации бисульфитом на последующую(-ие) ПЦР.
[0761] Элюированная десульфированная конвертированная бисульфитом ДНК может быть смешана с подходящим буфером и пронализирована на метилирование. В некоторых вариантах реализации конвертированную ДНК смешивают с концентрированным Трис, смесью ферментов и матрицв-специфическими (template specific) шариками (например, шариками, содержащими праймеры и/или зонды для ПЦР или вложенной ПНР) в камерах 9 и 11, и окончательную смесь засасывает внутрь пробирки или камеры термоциклирования для проведения специфичной в отношении метилирования количественной ПЦР.
[0762] Контаминация бисульфитом во время стадии кПЦР может быть первичным видом отказа картриджа метилирования. Остаточный бисульфит может присутствовать в результате либо непосредственной контаминации реакционной пробирки для ПЦР (например, во время стадии бисульфитной конверсии) или опосредованной контаминацией (например, перекрестная контаминация во время жидкостного перемещения бисульфита между камерами). Контаминация остаточным бисульфитом, при его наличии, может быть измерена с помощью опосредованного бисульфитом расщепления зонда во время стадии кПЦР, что приводит к увеличению флуоресценции во время ранних циклов кПЦР (циклы 1-10), как правило, используемой для вычитания фона. Соответственно, в некоторых вариантах реализации картридж содержит шарики, которые обеспечивают наличие одного или более зондов, поддающихся расщеплению во время ПЦР при наличии бисульфита. Результаты анализа при наличии контаминации бисульфитом представлены на фигуре 14.
[0763] Хотя вышеуказанные способы (и в Примере 4, см., например, фиг. 13А) описаны по отношению к специфическим камерам в картридже GENEXPERT, следует понимать, что конкретные распределения реагент/камера могут меняться в зависимости от особенностей применяемого протокола анализа метилирования.
[0764] Таким образом, например, работа картриджа анализа метилирования (например, картриджа GENEXPERT может быть в целом описана диаграммой (см., например, фигуры 1С и 13В). В иллюстративном, но неограничивающем варианте реализации, изображенном на фиг. 13В, образец ДНК представлен в связывающем буфере (например, в буфере, содержащем GTC-EtOH, в некоторых вариантах реализации после того, как образец обработан протеиназой К и/или лизирующим раствором). В некоторых вариантах реализации образец получают из картриджа подготовки образца в соответствии с описанием в настоящем документе (см, например, фигуру 20).
[0765] Образец в связующем буфере вводят внутрь камеры приема образца в картридже. В процессе работы происходит управление картриджем с целью доставки раствора образца к матрице ("колонке"), которая связывает ДНК. Затем происходит элюирование связанной ДНК из колонки с использованием щелочного реагента (например, раствора KOH), совмещенного с бисульфитным реагентом, и перемещение в пробирку для нагревания (как правило, реакционную пробирку для ПНР) в картридже, где проходит реакция с бисульфитом (например, при примерно 50°С или примерно 60°С до примерно 90°С в течение примерно 45 минут (или до примерно 90 минут включительно), в данном иллюстративном протоколе). ДНК объединяют со связывающим буфером (например, 2,25 М гуанидина тиоцианат, 22,5 мМ Трис рН с 7,0, 0,5% Твин 20, 50% этанол и пеногаситель SE-15 0,005% (10% эмульсия активного силиконового пеногасителя и неионогенных эмульгаторов)) и перемещают в ту же колонку или в отличающуюся колонку, где она снова связывается с матрицей колонки. Вступившую в реакцию ДНК отмывают GTC-EtOH, промывают ПЭГ (например, ПЭГ 200) и элюируют снова из колонки с использованием щелочного реагента (например, КОН), который также десульфирует ДНК. В ходе проведения десульфирования ДНК происходит нагревание и промывание (например, 10-кратное промывание) реакционной пробирки (например, реакционной пробирки ПЦР) для полного удаления бисульфитного реагента. Элюированная ДНК (или ее порция) может быть перемещена в реакционную пробирку для ПЦР и/или вложенной ПЦР.
[0766] Следует понимать, что данные операции могут быть выполнены полностью со всем образцом ДНК или с его частью. В последнем случае часть образца может храниться в одной или более камерах и быть использована в качестве контроля, или может быть подвергнута различному анализу/проведению методики.
Совмещенное проведение очистки и детектирования вместе экспресии РНК и метилирования ДНК
[0767] В некоторых вариантах реализации представлены способы совмещенной очистки и детектирования измененной экспрессии РНК генов совместно с метилированием ДНК (MSP) при анализе на базе картриджа (например, с применением картриджа GENEXPERT). В некоторых вариантах реализации данный анализ может идентифицировать измененную экспрессию, например, DNMT, связанного с метилированием, специфичным для опухолей, из того же самого подготовленного образца. В некоторых вариантах реализации данный анализ может быть применен для верификации экспрессии и статуса метилирования.
[0768] Нами была продемонстрирована возможность элюирования нуклеиновых кислот из колонки с использованием Трис-буфера, при этом часть нуклеиновой кислоты остается на колонке. В одном из иллюстративных вариантов реализации фракцию РНК элюируют и оставляют, например, в камере картриджа, используя раствор Трис.
[0769] После выделения фракции РНК, проводят элюирование с NaOH или KOH, при котором происходит десорбирование колонки с элюированием и денатурацией ДНК, которая переходит в бисульфит для конверсии в соответствии с описанием выше. Затем либо с использованием фракции РНК для элюирования из колонки конвертированной бисульфитом ДНК, либо с использованием смеси после элюирования КОН данные две фракции (РНК и конвертированная ДНК) смешивают для проведения qRT-PCR с РНК и конвертированной бисульфитом ДНК. Это включает добавление стадии обратной транскрипции (ОТ) РНК и MSP (или другого аналитического метода) в той же пробирке из того же образца. Альтернативные методы включают, но не ограничиваются ими, независимое выполнение стадии ОТ перед смешением с ДНК (объединение кДНК и ДНК) для проведения кПЦР, либо ПЦР ДНК или ОТ РНК могут быть выполнены независимо/последовательно с применением одной пробирки/камеры термоциклирования или одновременно с применением нескольких пробирок/камер термоциклирования в картридже.
Анализ конвертированной ДНК
[0770] Для оценки метилирования ДНК в картридже может быть использовано множество аналитических методов. В качестве альтернативы в некоторых вариантах реализации картридж может быть совмещен с другим устройством и/или системой для дальнейшего анализа конвертированной (например, конвертированной бисульфитом или DABSO) ДНК. Примеры способов включают, но не ограничиваются ими, специфическую в отношении метилирования ПЦР (MSP), прямое секвенирование, высокоточный анализ кривых плавления (HRM), пиросеквенирование (секвенирование путем добавления), метод расщепления, специфичного к основанию (например, специфичный к основанию MALDI-TOF), и тому подобные.
Специфическая в отношении метилирования ПЦР (MSP).
[0771] В различных вариантах реализации специфическая в отношении метилирования ПЦР может быть применена для оценки статуса метилирования ДНК-мишени. В MSP применяют комплекты праймеров и/или зондов, спроектированные так, чтобы быть «специфичными в отношении метилирования» посредством включения последовательностей, комплементарных исключительно неконвертированному 5-метилцитозину, или, наоборот, «специфичными в отношении метилированых участков», комплементарных тимину, конвертированному из неметилированного цитозина. Далее метилирование определяют с помощью способности специфичного праймера к достижению амплификации. Данный способ в особенности эффективен в отношении исследования островков CpG в участках с повышенной плотностью метилирования, потому что повышенное число неконвертированных метилцитозинов внутри мишени для амплификации повышает специфичность ПЦР. В некоторых вариантах реализации размещение пар CpG на 3'-конце праймера также улучшает специфичность.
[0772] В некоторых вариантах реализации метилирование оценивают с использованием метода MethyLight. Метод MethyLight основан на MSP, но позволяет проводить количественный анализ при применении количественной ПЦР (см., например, Eades et al. (2000) Nucleic Acids Res., 28(8): E32. doi:10.1093/nar/28.8.e32). Применяют специфичные для метилирования праймеры и специфичные для метилирования флуоресцентные репортерные зонды, которые отжигаются на амплифицированной области. В альтернативном случае праймеры или зонды могут быть сконструированы без специфичности к метилированию, если необходима дискриминация (discrimination) между парами CpG внутри затронутых последовательностей. Количественное измерение может быть выполнено по отношению к референсной метилированной ДНК. В одной из модификаций к данному протоколу с целью повышения специфичности ПЦР для успешно конвертированной бисульфитом ДНК (ConLight-MSP) используют дополнительный зонд к неконвертированной бисульфитом ДНК с целью количественного измерения данной неспецифической амплификации (см., например, Rand et al. (2002) Methods 27(2): 114-120).
[0773] В различных вариантах реализации в методах MethyLight применяют технологию TAQMAN, которая основана на расщеплении двояко-меченного зонда флуоресцентной гибридизации за счет 5'-нуклеазной активности Taq-полимеразы в ходе ПЦР-амплификации (Eads et al. (1999) Cancer Res., 59: 2302-2306; Livak et al. (1995) PCR Meth. Appl, 4: 357-362; Lee et al. (1993) Nucleic Acids Res., 21: 3761-3766; Fink et al. (1998) Nat. Med, 4: 1329-1333). Применение в технологии TAQMAN трех различных олигонуклеотидов (прямых и обратных праймеров для ПЦР и зондов флуоресцентной гибридизации) дает возможность для стратегий детектирования нескольких последовательностей.
[0774] Например, дискриминация последовательности (sequence discrimination) может происходить на уровне процесса ПЦР-амплификации (см., например, фиг. 4А, панель С) и/или на уровне флуоресцентной гибридизации зонда (см., например, фиг. 4А, панель В). На обеих стадиях дискриминация основана на разнице в отжиге полностью совпадающих олигонуклеотидов в отношении к не совпадающим олигонуклеотидам. В технологии MethyLight дискриминация последовательности на уровне ПЦР-амплификации происходит посредством конструирования праймеров и зондов, или только праймеров, или только зондов с целью перекрывания потенциальных участков метилирования ДНК (например, CpG-динуклеотидов). Один из подходов просто представляет собой версию методики MSP, основанную на флуоресценции (Herman et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821-9826). Каждый олигонуклеотид (праймеры и зонды) может покрывать в любом месте от нуля до множества CpG-динуклеотидов. Каждый CpG-динуклеотид после бисульфитной конверсии может получиться с двумя различными вариантами последовательности в зависимости от того, был ли метилирован (mCpG) или неметилирован (UpG) конкретный участок. Например, если олигонуклеотид перекрывает два CpG-динуклеотида, то число возможных вариантов последовательности в геномной ДНК, внутри области, покрываемой данным олигонуклеотидом, будет равно 2×2=4. Если оба праймера и зонд каждый перекрывают два CpG, то общее число вариантов, включенных в последовательность, покрываемую данным олигонуклеотидом, составит 4×4×4=64. В теории можно разработать отдельную ПЦР для анализа соответствующих количеств каждого из этих потенциальных 64 вариантов последовательности. Однако существенная информация о метилировании может быть получена из анализа намного меньшего числа вариантов посредством разработки реакций для полностью метилированных и полностью неметилированных молекул, которые представляют собой два наиболее крайних варианта последовательности данного гипотетического примера. Соотношение между этими двумя реакциями или соотношение между метилированной реакцией и контрольной реакцией обеспечивает измерение доли метилированных модекул в данном локусе.
[0775] Технология MethyLight может быть также модифицирована для исключения дискриминации последовательности на уровне ПЦР-амплификации. Если ни праймеры, ни зонды не имеют пересечений с какими-либо CpG-динуклеотидами, то реакция представляет собой амплификацию без системного сдвига (unbiased) и может служить в качестве контроля количества вносимой ДНК. Одна из иллюстративных пригодный для применения контрольных реакций представляет собой реакцию, в которой весь ампликон лишают CpG динуклеотидов в неконвертированной геномной последовательности. В случае если зонд сконструирован для пересечения с CpG-динуклеотидом, то дискриминация последовательности происходит исключительно на уровне гибридизации зонда. В данной версии все варианты последовательности в результате проведения стадии конверсии с бисульфитом натрия амплифицируются с равной эффективностью, при условии, что отсутствует амплификация с системным сдвигом (bias) (см., например, Wamecke et at. (1997) Nucleic Acids Res., 25: 4422-1426). В данном случае дизайн отдельных зондов для каждого из различных вариантов последовательности, связанных с определенным паттерном метилирования (2×2=4 зонда в случае двух CpG), позволяет проводить количественное определение относительной доли каждой пермутации последовательности в смеси продуктов ПЦР.
[0776] В некоторых вариантах реализации методы анализа также задействуют ПЦР, специфичную в отношении неконвертированной ДНК. Данная ПЦР может быть направлена на исследование SNP, мутаций, и/или транслокаций и т.д. С этой целью следует отметить, что детекция мутаций и метилирования в одном картридже приведена в Примере 12 (см., например, фиг. 27А и 27В). Детекция SNP, мутаций, транслокаций и т.д. может быть легко совмещена с включением комплектов праймеров и зондов, специфичных в отношении детекции данных мишеней.
Анализ методами вложенной ПЦР и мультиплексной ПЦР.
[0777] В некоторых вариантах реализации метилированная ДНК может быть детектирована с использованием методов ПЦР, известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации для определения метилирования мишеней применяют вложенную ПЦР. В одном иллюстративном, но неограничивающем варианте реализации (см., например, Пример 4) протокол вложенной ПЦР может быть применен, если первая ПЦР с 15-20 циклами не является специфичной в отношении метилирования, а только лишь в отношении последовательностей конвертированной ДНК (то есть не имеют пересечений с CpG, или в случаях, если пересечения имеются, R = пурин или Y = пиримидин используются для того, чтобы учесть как метилированную, так и неметилированную последовательности матрицы). Вторая кПЦР (например, кПЦР с 45 циклами) может включать праймеры и зонды, главным образом специфичные в отношении 2-3 метилированных CpG.
[0778] Следует отметить, что в некоторых вариантах реализации анализ MethyLight выполняют с использованием одного зонда (см., например, фигура 4В). В данном подходе при использовании одного, например, специфичного в отношении метилирования, зонда (PR3) совместно со специфичными в отношении метилирования прямыми (FW) и обратными (RV) праймерами, специфическая в отношении метилирования ПЦР для зонда (PR3) инициирует сигнал, зависящий от метилирования и бисульфитной конверсии последовательностей FW, RV и PR3.
[0779] В различных вариантах реализации речь идет о мультиплексном ПЦР анализе. В качестве примера на фигуре 4С представлена методика MethyLight с использованием множества зондов (PR1, PR2, … PR5), каждый из которых нацелен на разные области. Комбинированный сигнал от всех зондов (PR1, PR2, PR3, PR4 и PR5) представляет собой меру количества/степени метилирования. В некоторых вариантах реализации каждый зонд имеет свой собственный специфический краситель/флуоресцирующий агент так, что он будет детектирован независимо от других зондов. Таким образом, даже там, где присутствует только одна неметилированная мишень, сигнал все равно будет выявлен (детектирован), например, если PR3 не метилирован, то сигнал от оставшихся зондов будет отсутствовать/будет более слабым. На фиг. 4D представлена методика MethyLight с использованием множества зондов (PR1…PR5), каждый из которых нацелен на одну и ту же область, но формирует сигналы для разных паттернов метилирования. В то время как методика, представленная на фиг. 4С, может обеспечить детекцию в более длинной области, данная методика с множеством зондов на отдельной более короткой области может быть выполнена с помощью специфичных в отношении последовательности праймеров или зондов с целью исследования степени метилирования по всей последовательности после бисульфитной конверсии.
[0780] В некоторых вариантах реализации может быть применен мультиплексный анализ с обратным комплементом для обеих цепей (см., например, фиг. 26). После бисульфитной конверсии обе цепи теряют комплементарность. Таким образом, комплекты праймеров и зондов могут быть сконструированы для одной или другой цепи, и приводят к образованию уникальных ампликонов. Помимо этого, для предоставления «больших возможностей» для детекции, данный подход потенциально может улучшить специфичность (на нижнем пределе детектирования (LOD), если в итоге только одна или другая цепь окажется в пробирке, то данная методика обеспечит возможность уловить сигнал). Данная методика позволяет расширить мультиплексный анализ для детекции разных CpG в одном и том же промоторном участке. Мультиплексный анализ с обратным комплементом предоставляет больше возможностей, чтобы детектировать метилирование мишени и отличить гетерогенное метилирование.
[0781] Вышеизложенные способы являются иллюстративными и неограничивающими. С использованием представленного в настоящем описании руководства для специалистов в данной области техники может быть доступно множество вариаций анализа MSP и/или MethyLight, которые могут быть реализованы в реакционном картридже, например, в соответствии с описанием в настоящем документе.
Прямое секвенирование
[0782] В некоторых вариантах реализации статус метилирования ДНК может быть определен с применением методов прямого секвенирования. В некоторых вариантах реализации способ может задействовать ПЦР и стандартное секвенирование ДНК по Сэнгеру для прямого определения нуклеотидов, устойчивых к бисульфитной конверсии (см., например, Frommer et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (5): 1827-1831). В различных вариантах реализации праймеры сконструированы так, чтобы быть специфичными к мишени, а также к бисульфиту (например, праймеры, содержащие цитозины без CpG, так что они не комплементарны к не обработанной бисульфитом ДНК), фланкируя (но не вовлекаясь) метилирование исследуемого участка. Таким образом, будет происходить амплификация как метилированных, так и неметилированных последовательностей, в отличие от специфической в отношении метилирования ПЦР. Все участки с неметилированными цитозинами представлены тимином в получаемой амплифицированной последовательности кодирующей цепи и аденином в амплифицированной некодирующей цепи. В некоторых вариантах реализации методы вложенной ПЦР могут быть применены для увеличения количества продукта для секвенирования.
[0783] В некоторых вариантах реализации секвенирование может быть выполнено в картридже. В других вариантах реализации картридж может быть соединен (например, соединен по текучей среде) с устройством для секвенирования для проведения анализа секвенирования. В качестве альтернативы в некоторых вариантах реализации продукт амплификации может быть вручную перемещен из картриджа в систему секвенирования.
Высокоточный анализ кривых плавления (HRM)
[0784] В некоторых вариантах реализации для дифференцирования конвертированной от неконвертированной бисульфитом ДНК может быть применен высокоточный анализ кривых плавления (HRM). HRM представляет собой количественную методику ПЦР, в которой ПЦР-ампликоны анализируют непосредственно по скачку температуры (temperature ramping) и последующему освобождению интеркалирующего флуоресцентного красителя во время плавления (см., например, Wojdacz and Dobrovic (2007) Nucleic Acids Res. 35(6): e41). Степень метилирования, как представлено содержанием С/Т в ампликоне, определяет скорость плавления и последующий выход красителя. Данный способ позволяет проводить непосредственное количественное измерение, однако оценка метилирования в амплифицированной области осуществляется в общем, а не по специфическим CpG-участкам.
Пиросеквенирование
[0785] В некоторых вариантах реализации для анализа обработанной бисульфитом ДНК может быть применено пиросеквенирование (секвенирование путем синтеза) без использования специфичной в отношении метилирования ПЦР (см., например, Colella et al. (2003). BioTechniques 35(1): 146-150; Tost et al. (2003) BioTechniques 35(1): 152-156; и тому подобное). Секвенирование путем синтеза отличается от секвенирования по Сангеру в том, что применяет детекцию высвобождения фосфатов при присоединении нуклеотидов, а не окончания цепи с дидезоксинуклеотидами. Последовательность ДНК можно определить по свету, который испускается при внедрении следующего комплементарного нуклеотида, исходя из факта, что обычно только один из четырех возможных нуклеотидов A/T/C/G добавлен и в наличии в данный момент, так что только один тип нуклеотида (letter) может быть внедрен в одноцепочечную матрицу (которая представляет собой определяемую последовательность).
[0786] Пиросеквенирование может быть применено после ПЦР-амплификации исследуемой области для определения конвертированной бисульфитом последовательности в специфической области (например, участки CpG). В некоторых вариантах реализации соотношение С/Т в отдельных участках может быть определено количественно, исходя из внедреного количества С и Т в ходе наращивания последовательности.
[0787] При модификации данной методики могут быть использованы аллельспецифические праймеры, которые внедряют однонуклеотидный полиморфизм (SNPs) в последовательность секвенирующего праймера(-ов), таким образом, обеспечивая раздельный анализ материнских и отцовских аллелей (см., например, Wong et al. (2006) BioTechniques 41(6): 734-739). Данную модификацию в особенности применяют для анализа геномного импринтинга.
Анализ расщепления, специфичного к основанию
[0788] В некоторых вариантах реализации применение расщепления, специфичного к основанию /MALDI-TOF позволяет в полной мере использовать бисульфитную конверсию за счет внедрения стадии расщепления, специфичного к основанию, для получения дополнительной информации об изменении нуклеотидов (Enrich et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102 (44): 15785-15790). Посредством проведения сначала транскрипции in vitro исследуемой области внутри РНК (добавлением при амплификации промоторного участка РНК-полимеразы к праймеру для ПЦР), для расщепления траскрипта РНК на специфических по основанию участках может быть применена РНКаза А. РНКаза А специфично расщепляет РНК на рибонуклеотидах с цитозином и урацилом, и специфичность по основанию достигается за счет встраивания устойчивого к расщеплению дТТФ, если необходимо расщепление, специфичное к цитозину (С-специфичное), и встраивания дЦТФ, если необходимо расщепление, специфичное к урацилу (U-специфичное). Выщепленные фрагменты можно затем анализировать с помощью MALDI-TOF или другим методом. Обработка бисульфитом приводит либо к внедрению/отделению сайта расщепления при конверсии С в U, либо к изменению в массе фрагмента при конверсии G в А в амплифицированной обратной цепи. Расщепление, специфическое к С, будет происходить специфично на всех метилированных CpG-участках. Анализируя размеры полученных фрагментов (например, с применением MALDI-TOF, капиллярного электрофореза, микрочипового электрофореза и тому подобного) возможно определить специфические паттерны метилирования ДНК в CpG-участках внутри области, а не общую степень метилирования области.
Чувствительный к метилированию одноцепочечный конформационный анализ (MS-SSCA).
[0789] Чувствительный к метилированию одноцепочечный конформационный анализ (MS-SSCA) основан на методе анализа одноцепочечного конформационного полиморфизма (SSCA), который разработан для анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP) (Bianco et al. (1999) Hum. Mutat. 14(4): 289-293). SSCA различает одноцепочечные фрагменты ДНК идентичного размера, но с отличающейся последовательностью на основании различной миграции при неденатурирующем электрофорезе. В MS-SSCA это используется для определения различий между обработанными бисульфитом ПЦР-амплифицированными областями, содержащими исследуемые участки CpG. Хотя SSCA не хватает чувствительности при наличии отличия только в одном нуклеотиде, в большинстве исследуемых областей при обработке бисульфитом зачастую происходит некоторое число конверсии Ц/Т, и в итоге чувствительность может быть высока. В некоторых вариантах реализации MS-SSCA также может обеспечивать полуколичественный анализ степени метилирования ДНК, исходя из отношения интенсивности полос. Обычно, однако, MS-SSCA оценивает в исследуемой области все участки CpG в целом, а не метилирование отдельных участков.
Мишени метилирования.
[0790] Как отмечено выше, метилирование ДНК представляет интерес в широком ряде случаев. В некоторых вариантах реализации количество метилирования ДНК представляет клинический интерес, особенно в онкологии. Абберантные паттерны метилирования ДНК (гиперметилирование и гипометилирование при сравнении со здоровыми тканями) были ассоциированы с большим числом злокачественных новообразовании у человека. Гиперметилирование обычно происходит на островках CpG в промоторной области и связано с инактивацией гена. Пониженный уровень метилирования ДНК в лейкоцитах связан со многими типами рака (Zhang et al. (2011) Epigenetics, 6(3): 293-299). Также глобальное гипометилирование причастно к развитию и прогрессированию рака посредством различных механизмов. Главным образом присутствуют гиперметилирование генов-супрессоров опухоли и гипометилирование онкогенов (см., например, Lund et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(28): 29147-29154).
[0791] С этой целью следует отметить, что метилирование ДНК представляет прогностический индикатор 1-ой стадии немелкоклеточного рака легкого (НМКЛ). В частности, обнаружено, что гиперметилирование пяти генов существенно связано с более короткой безрецидивной выживаемостью (RFS) в 1 стадии НМКЛ: HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1 и НОХА9. Сигнатура, опирающаяся на число случаев гиперметилирования, разделяет пациентов с высоким и низким риском на 1-й стадии НМКЛ (см., например, Sandoval et al. (2013) J. Clin. Oncol, 4140-4147).
[0792] Также обнаружено, что при злокачественной глиоме ген MGMT инактивирован по причине метилирования ее промоторного участка. Предварительный вывод, сделанный по результатам данного исследования, заключается в том, что при метилировании гена MGMT возможен лучший ответ на химиотерапию (так как опухоль не имеет средств для репарации повреждений ДНК, вызванных алкилирующими агентами). При глиоме метилирование промотора MGMT является благоприятным прогностическим маркером при назначении как радиотерапии, так и химиотерапии (см., например, //neurosurgery.ucsd.edu/brain-tumor-research-mgmt/).
[0793] В качестве дополнительного примера в Таблице 3 представлены различные гены, которые гиперметилированы при определенных раковых заболеваниях.
[0794] В разных иллюстративных, но неограничивающих вариантах реализации рассмотрено измерение метилирования любого одного или более промоторов следующих генов: АРС, ARF, CDKN2B, CDKN2A, BRCA1, VLH, hMLH1, MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, НОХВ4, RASGRF2, TM6SF1, AKR1B1, HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1 и НОХА9.
Рак поджелудочной железы
[0795] В некоторых вариантах реализации статус метилирования определяют для одного или более промоторов, чей статус метилирования является маркером наличия и/или прогнозирования рака поджелудочной железы. Было определено, что частота метилирования одного или более из ADAMTS1 или BNC1 может быть применена для выявления и/или установления степени рака поджелудочной железы. Таким образом, иллюстративные, но неограничивающие маркеры метилирования для рака поджелудочной железы включают, но не ограничиваются ими, ADAMTS1 и/или BNC1. Примеры праймеров и зондов для определения метилирования в промоторах данных генов представлены в таблице 4 ниже (со ссылкой на Таблицу 5 для конкретных последовательностей) и в таблице 12 в Примере 4). В некоторых вариантах реализации представлены праймеры и зонды для определения метилирования в прямой цепи конвертированной ДНК и/или для определения метилирования в обратной цепи конвертированной ДНК.
Рак молочной железы.
[0796] В некоторых вариантах реализации статус метилирования определяют для одного или более промоторов, чей статус метилирования является маркером наличия и/или прогнозирования рака молочной железы. Примеры маркеров метилирования для рака молочной железы включают, но не ограничиваются ими, RASSF1A, и/или AKR1B1, и/или НОХВ4, и/или HIST1H3C, и/или RASGRF2, и/или TM6SF1. Примеры праймеров и зондов для определения метилирования в промоторах данных генов представлены ниже в таблице 4 (со ссылкой на Таблицу 5 для конкретных последовательностей) и в таблице 11 в Примере 4.
[0797] В некоторых вариантах реализации статус метилирования определяют для одного или более промоторов, чей статус метилирования является маркером наличия или вероятности наличия рака легкого. Примеры маркеров метилирования для рака легкого включают, но не ограничены ими, CDO1, SOX17, ТАС1 и/или НОХА7.
[0798] Способы, представленные в настоящем описании, не ограничены определением метилирования промоторов данных генов. При применении способов, представленных в настоящем описании, возможна оценка метилирования, в большинстве случаев, любой исследуемой мишени.
[0799] Однако следует отметить, что измерение метилирования ДНК не следует ограничивать измерением метилирования CPG-островков в промоторах. Например, было показано, что метилирование транслируемой области (gene body) может также изменять экспрессию гена и представлять терапевтическую мишень при раке (см., например, Yang et al. (2014) Cancer Cell, 26(4): 577-590).
[0800] Дополнительно, измерение метилирования ДНК имеет прогностическое/терапевтическое применение при патологиях, отличающихся от рака. Например, абберантное метилирование в участках хромосом 13, 18, 21, X и Y может быть применено для диагностики синдрома Дауна (см., например, Patsalis et al. (2012) Exp. Opin. Biol. Ther. 12 (Suppl. 1): S155-S161). По причине того, что фетальная ДНК и материнская ДНК метилированы по-разному, внеклеточная ДНК в материнской плазме может представлять источник фетальной ДНК, которая может быть получена неинвазивным методом и использована для оценки статуса метилирования вышеупомянутых хромосом (или других хромосом или генов).
[0801] Как отмечено выше, в некоторых вариантах реализации картриджи и способы, представленные в настоящем описании, также применяют для определения уровней мРНК, например, для определения экспрессии различных метилтрансфераз. В некоторых вариантах реализации уровень экспрессии РНК определяют для метилтрансферазы, выбранной из группы, состоящей из DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B и TNMT3L.
Праймеры/Зонды и мультиплексный анализ
[0802] В различных вариантах реализации способы, представленные в настоящем описании, могут включать вложенные ПЦР и картриджи, представленные в настоящем описании, могут содержать реагенты (например, праймеры и зонды) для таких вложенных ПЦР. Например, в некоторых вариантах реализации метилирование определяют для одного, двух, трех, четырех, пяти или шести генов (промоторов генов). Так как бисульфитная конверсия ДНК преобразует остатки цитозина в урацил, но не затрагивает остатки 5-метилцитозина, прямая и обратная цепочка конвертированной (конвертированной бисульфитом) ДНК больше не будут комплементарны. Соответственно, возможно исследовать прямую и обратную цепи независимо (например, в мультиплексной ПЦР), обеспечивая дополнительную специфичность и чувствительность к определению метилирования. В таких случаях, проведение анализа для единичной мишени может включать мультиплексный анализ в формате дуплекс, а проведение анализа для двух, трех, четырех, пяти или шести целевых генов может включать мультиплексный анализ в формате четырехкратный мультиплекс, шестикратный мультиплекс, 8-кратный мультиплекс, 10-кратный мультиплекс или 12-кратный мультиплекс. В некоторых вариантах реализации анализ может быть разделен на две мультиплексные реакции, например, на независимый анализ прямой и обратной цепи. Однако следует понимать, что при разделении на несколько мультиплексных анализов нет необходимости в их группировке по прямой или обратной цепи, а может просто включать комплекты праймер/зонд, которые наиболее совместимы с условиями проведения конкретной ПЦР.
[0803] Как указано выше, многие раковые заболевания могут быть идентифицированы, и/или установлена их стадия, и/или определен их прогноз посредством детекции/анализа статуса метилирования на промоторах генов прямой и/или обратной цепи, статус метилирования которых (или его отсутствие) связан с раком. Примеры генов-мишеней (промоторов), связанных с различными раковыми заболеваниями, описаны выше и приведены ниже в таблице 4. Следует понимать, что метилирование (в прямой и/или обратной цепи) одного или более генов, представленных в таблице 4 для каждого типа рака, может быть определено с целью идентификации, и/или установления стадии, и/или определения прогноза для приведенного типа рака. В некоторых вариантах реализации статус метилирования всех генов, представленных для конкретного типа рака (прямой и/или обратной цепи) может быть определен в единичной мультиплексной ПЦР.
[0804] Примеры праймеров и зондов для определения метилирования промоторов различных генов приведены ниже в таблице 5 и в таблицах 11 и 12 в Примере 4. В некоторых вариантах реализации данные праймеры и/или зонды особенно подходят для применения в мультиплексной амплификации.
[0805] Следует отметить, что данные праймеры и зонды идентифицируют положение различных флуорофоров и гасителей. Однако следует понимать, что определенные флуорофоры и гасители являются иллюстративными и не ограничивающими, и в картридже, представленном в настоящем описании, может быть применено множество стратегий амплификации и/или детектирования. Соответственно, в различных вариантах реализации способы и устройства, представленные в настоящем описании, могут задействовать множество различных зондов гибридизации нуклеиновых кислот. Как правило, для генерации сигнала зонды используют изменение во флуоресценции флуорофора по причине изменения в его взаимодействии с другой молекулой или фрагментом, вызванным изменением расстояния между флуорофором и взаимодействующей молекулой или фрагментом. В качестве альтернативы другие способы детектирования полинуклеотидов в образце предполагают применение, включая, но не ограничиваясь ими, радиоактивно-меченных зондов.
[0806] Основанный на флуоресценции анализ, главным образом для генерации сигнала опирается на резонансный перенос энергии флуоресценции или «FRET», в соответствии с которым изменение во флуоресценции вызвано изменением в расстоянии, отделяющим флуорофор от взаимодействующего акцептора энергии резонанса, либо другого флуорофора, либо гасителя. Комбинации флуорофора и взаимодействующей молекулы или фрагмента, включая молекулы или фрагменты гасителя, известны как «FRET-пары». Механизм взаимодействия FRET-пар главным образом требует, чтобы спектр поглощения одного члена пары перекрывал спектр испускания другого члена, первого флуорофора. Если взаимодействующая молекула или фрагмент представляет собой гаситель, то его спектр поглощения главным образом перекрывает спектр испускания флуорофора (см., например, Stryer (1978) Ann. Rev. Biochem. 47: 819-846; Selvin (1995) Meth. Enzymol. 246: 300-335; и тому подобное). Эффективное взаимодействие при FRET достигается главным образом, когда спектры поглощения и испускания пары имеют большую степень перекрывания. Эффективность взаимодействия при FRET прямопропорциональна перекрыванию. Как правило, желательна высокая амплитуда сигнала (т.е., высокая степень перекрывания). Таким образом, по данному принципу подбирают FRET-пары, включая пары флуорофор-гаситель.
[0807] Известно множество методов с мечеными зондами гибридизации нуклеиновой кислоты и детектирования, в которых применяют FRET и FRET-пары. Одна такая схема описана Cardullo et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8790-8794 и в Heller et al. EP 0070685. В ней используют зонд, содержащий пару олигонуклеотидов, комплементарных к непрерывному участку цепи-мишени ДНК. Одна молекула зонда содержит флуоресцентную метку, флуорофор, на 5'-конце, а другая молекула зонда содержит отличающуюся флуоресцентную метку, также флуорофор, на 3'-конце. Когда зонд гибридизуется к последовательности-мишени, две метки сходятся очень близко друг к другу. Когда образец стимулирован светом надлежащей частоты, происходит резонансный перенос энергии флуоресценции от одной метки к другой. FRET приводит к измеримому измению в спектральном ответе от меток, сигнализируя о наличии мишеней. Одна из меток может быть «гасителем», который может быть, в том числе, взаимодействующим (interactive) фрагментом (или молекулой), который высвобождает поглощенную энергию в виде тепла.
[0808] Другой вид метода с зондом гибридизации нуклеиновой кислоты, где используют FRET-пары, представляет собой метод «TaqMan», описанный в Gelfand et al. Патент США №5210015 и Livakef al. Патент США№5538848. Зонд, как правило, представляет собой одноцепочечный олигонуклеотид, меченный FRET-парой. В методе TaqMan ДНК-полимераза высвобождает один или множество нуклеотидов расщеплением олигонуклеотидного зонда при гибридизации с цепью-мишенью. Данное высвобождение обеспечивает путь для разделения метки-гасителя и метки-флуорофора из FRET-пары.
[0809] В некоторых вариантах реализации могут быть применены не FRET флуоресцентные зонды, такие как те, которые описаны, например, в Tyagi et al., Патент США №6,150,097. Например, в патенте Tiyagi et al. описано, как изменения в спектрах поглощения пар меток могут быть использовны как детектируемый сигнал в качестве альтернативы изменению во флуоресценции. При использовании изменения в поглощении пара меток может включать любые два хромофора, которые представляют собой флуорофоры, гасители и другие хромофоры. Пара меток может даже быть представлена одинаковыми хромофорами.
[0810] В некоторых вариантах реализации красители и другие агенты, такие как гасители, вводят в праймеры и/или зонды, которые применяют в способах и картриджах, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах реализации такие красители и гасители включают, но не ограничеваются ими, красители (флуорофоры), подходящие для применения в качестве FRET-зондов. В некоторых вариантах реализации красители и/или гасители содержат модифицированные нуклеотиды. «Модифицированный нуклеотид» относится к нуклеотидам, которые являются химически модифицированными, но при этом все еще выполняют функцию нуклеотида. В некоторых вариантах реализации модифицированный нуклеотид имеет химический фрагмент, такой как краситель или гаситель, ковалентно связанный, который может быть введен в полинуклеотид, например, путем твердофазного синтеза полинуклеотида. В некоторых вариантах реализации модифицированный нуклеотид содержит одну или более реакционноспособных групп, которые взаимодействуют с красителем или гасителем перед, в ходе или после введения модифицированного нуклеотида в нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации модифицированный нуклеотид представляет собой амино-модифицированный нуклеотид, т.е. нуклеотид, который был модифицирован с целью наличия реакционноспособной аминогруппы. В некоторых вариантах реализации модифицированный нуклеотид содержит модифицированный фрагмент основания, такого как уридин, аденозин, гуанозин и/или цитозин. В некоторых вариантах реализации амино-модифицированный нуклеотид выбран из 5-(3-аминоаллил)-УТФ; 8-[(4-амино)бутил]-амино-АТФ и 8-[(6-амино)бутил]-амино-АТФ; N6-(4-амино)бутил-АТФ, N6-(6-амино)бутил-АТФ, N4-[2,2-окси-бис-(этиламин)]-СТР; N6-(6-Амино)гексил-АТФ; 8-[(6-Амино)гексил]-амино-АТФ; 5-пропаргиламино-СТР, 5-пропаргиламино-УТФ. В некоторых вариантах реализации нуклеотиды с разными фрагментами нуклеиновых оснований модифицированы подобным образом, например, 5-(3-аминоаллил)-ГТФ вместо 5-(3-аминоаллил)-УТФ. Многие амино-модифицированные нуклеотиды доступны для приобретения в, например, Applied Biosystems, Sigma, Jena Bioscience и TriLink. Иллюстративный, но не ограничивающий список подходящих флуорофоров представлен в таблице 6.
[0811] В случае, если метод анализа разработан с целью детектирования одной целевой последовательности ДНК, то тогда для применения необходим только один зонд флуоресцентной гибридизации и, в некоторых вариантах реализации FAM, ТЕТ или HEX (или один из их альтернативных вариантов, приведенных в таблице 7) будет представлять собой оптимальный флуорофор в качестве метки зонда. Данные флуорофоры могут быть легко возбуждены и детектированы в различных спектрофотометрических термоциклерах. Помимо этого, по причине доступности производных амидофосфитов данных флуорофоров и доступности колонок из пористого стекла со связанным с гасителем контролем (quencher-linked control-), зонды флуоресцентной гибридизации с данными метками могут быть полностью синтезированы в процессе автоматического синтеза ДНК, что является преимуществом, заключающимся в относительно меньшей стоимости и меньших трудозатрат при получении зонда.
[0812] В некоторых вариантах реализации множество целевых генов детектируют в одной мультиплексной реакции. В некоторых вариантах реализации каждый зонд, специфический в отношении особого гена, спектрально различим (детектируемо отличающийся) от других зондов, применяемых в мультиплексной реакции. Специалистам в данной области техники известны комбинации зондов, подходящих для мультплексного детектирования. Например, иллюстративные комбинации детектируемо отличающихся флуорофоров в мультиплексных системах с четырьмя мишенями включают, но неограничиваются ими:
[0813] 1) FAM, TMR, Texas red и Су5;
[0814] 2) FAM, ТЕТ, TMR и Texas Red;
[0815] 3) FAM, HEX, Texas red и Cy5; и
[0816] 4) FAM, Су3, Texas red и Cy5.
[0817] Пример комбинации детектируемо отличающихся флуорофоров в мультиплексных системах с пятью мишенями представляет собой FAM, ТЕТ, TMR, Texas Red и Cy5. Примеры комбинаций детектируемо отличающихся флуорофоров в мультиплексных системах с шестью мишенями включают, но неограничиваются ими:
[0818] 1) FAM, ТЕТ, HEX, TMR, ROX и Texas red; и
[0819] 2) FAM, HEX, LC red 610, LC red 640, LC red 670 и LC red 705.
[0820] Следует понимать, что данные комбинации флуорофоров являются иллюстративными и не ограничивающими, и для специалистов в данной области техники доступны другие различные флуорофоры.
[0821] Как отмечено выше, для конструирования зондов флуоресцентной гибридизации, в которых используют резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET), следует подбирать пары флуорофор-гаситель, имеющие достаточное перекрывание спектров. Флуорофоры с максимумом длины испускания между 500 и 550 нм, такие как FAM, ТЕТ и HEX, лучше всего тушатся гасителями с максимумом длины поглощения между 450 и 550 нм, такие как dabcyl, BHQ-1 и тому подобными (см., например, таблицу 8 с примерами меток-гасителей). Флуорофоры с максимумом длины испускания выше 550 нм, такие как родамины (включая TMR, ROX и Texas red) и красители Су (включая Су3 и Су5) эффективно тушатся гасителями с максимумом длины поглощения выше 550 нм (включая BHQ-2).
[0822] Для конструирования зондов флуоресцентной гибридизации, в которых используют контактное гашение, в качестве требуемого акцептора энергии от флуорофора может служить любой нефлуресцирующий гаситель. Например, Су3 и Су5 эффективно тушатся гасителями BHQ-1 и BHQ-2.
[0823] В некоторых вариантах реализации нуклеотиды могут гасить флуоресценцию флуорофоров, где гуанозин является более эффективным гасителем, и за ним слеудет аденозин, цитидин и тимидин. В целом, флуорофоры с длиной волны возбуждения между 500 и 550 нм более эффективно тушатся нуклеотидами, чем флуорофоры с большей длиной волны возбуждения. При конструировании зондов флуоресцентной гибридизации для обеспечения более мощных сигналов флуоресценции от флуорофора может быть желательным исключение размещения флуоресцентой метки непосредственно рядом с гуанозином.
[0824] Стабилизирующий эффект некоторых пар флуорофор-гаситель, которые взаимодействуют при контактном гашении, может иметь важные последствия для конструирования гибридизационных зондов (см., например, Marras et al. (2002) Nucleic Acids Res. 30: e122; Johansson et al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124: 6950-6956). Например, обнаружено, что гибридизационные зонды, меченные флуорофором, который гасят либо BHQ-1, либо BHQ-2, характеризуются повышением гибридизационной температуры плавления примерно на 4°С, в сравнении с гибридизационными зондами с теми же последовательностями в зондах, но меченных флуорофорами, которые гасятся с помощью DABCYL. Также отмечена высокая аффинность между красителями Су, Су3 и Су5 и гасителями Black Hole, BHQ-1 и BHQ-2.
[0825] Исходя из вышесказанного, а также с учетом примеров и рекомендаций, приведенных в данном документе, понятно, что для применения в способах и картриджах, представленных в настоящем описании, доступно множество комбинаций праймер/зонд.
Картридж, модули и системы для анализа метилирования ДНК
[0826] В некоторых вариантах реализации предложены картриджи для выполнения способов, представленных в настоящем описании (например, определение метилирования ДНК и, необязательно, экспрессии РНК). В некоторых вариантах реализации картридж включает колонку, содержащую первый матричный материал, камеру приема образца, канал или камеру с контролем температуры, множество камер, содержащих реагенты и/или буферы, и в процессе применения по меньшей мере одна из указанных камер содержит реагент для конверсии ДНК (например, 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октан (DABSO)) и/или бисульфитный реагент), и по меньшей мере одна из указанных камер содержит буфер для десульфирования/элюирования, и при этом указанный картридж необязательно содержит вторую колонку, содержащую указанный второй матричный материал. В некоторых вариантах реализации картридж выполнен с возможностью того, что в процессе применения картридж включает камеру, содержащую реагент, содержащий тиоцианат гуанидина - этанол (GTC-EtOH). В некоторых вариантах реализации вторая колонка отсутствует, при этом в других вариантах реализации вторая колонка присутствует. В некоторых вариантах реализации канал или камера с контролем температуры может просто представлять собой канал или камеру нагревания или может представлять собой канал или камеру термоциклирования. В некоторых вариантах реализации картридж дополнительно содержит второй канал или камеру нагревания (например, второй канал или камеру термоциклирования). В некоторых вариантах реализации картридж выполнен с возможностью того, что стадия конверсии ДНК (например, инкубации с бисульфитом) и/или стадия десульфирования происходит в той же реакционной пробирке или камере, в которой позже проходит одна или более ПЦР.
[0827] В некоторых вариантах реализации бисульфитный реагент представлен в качестве компонента картриджа. В определенных других вариантах реализации картридж выполнен с возможностью для добавления бисульфитного реагента в картридж во время или близко ко времени помещения образца в картридж. Необязательно бисульфитный реагент добавляют непосредственно внутрь камеры в картридже, при этом в других вариантах реализации бисульфитный реагент вводят в загрузочный порт на картридже (например, порт для ввода проб) с целью введения внутрь картриджа бисульфитного реагента. В некоторых вариантах реализации бисульфитный реагент вводят внутрь картриджа с помощью системы управления картриджем (например, рабочего модуля) в ходе функционирования картриджа для определения метилирования ДНК.
[0828] В некоторых вариантах реализации реагент, содержащий гуанидина тиоцианат (например, GTC-EtOH), представлен в качестве компонента картриджа. В определенных других вариантах реализации картридж выполнен с возможностью добавления реагента, содержащего гуанидина тиоцианата в картридж во время или близко ко времени помещения образца в картридж. В некоторых случаях реагент, содержащий гуанидина тиоцианат, добавляют непосредственно внутрь камеры в картридже, при этом в других вариантах реализации реагент, содержащий гуанидина тиоцианат, вводят в загрузочный порт на картридже (например, порт для ввода проб) с целью введения бисульфитного реагента внутрь картриджа. В некоторых вариантах реализации реагент, содержащий гуанидина тиоцианат, вводят внутрь картриджа с помощью системы управления картриджем (например, рабочего модуля) в ходе функционирования картриджа для определения метилирования ДНК.
[0829] В различных иллюстративных, но неограничивающих вариантах реализации реагент для конверсии (например, бисульфитный реагент) содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия, 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO) и бисульфита аммония. В некоторых вариантах реализации бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей поглотители (например, Тролокс, гидрохинон и т.д.) для предотвращения окисления сульфитов и/или катализаторы. В некоторых вариантах реализации бисульфит представлен в смеси реагентов, содержащей полиамины в качестве катализаторов.
[0830] В различных вариантах реализации первый матричный материал и/или указанный второй матричный материал, при его наличии, содержит материал, выбранный из группы, состоящей из стекла или кремния диоксида, ионообменной смолы и гидроксиапатита.
[0831] В различных вариантах реализации картридж включает одну или более камер (например, 1 камеру, 2 камеры, 3 камеры, 4 камеры и т.д.), каждая из которых содержит один или более реагентов, выбранных из группы, состоящей из специфических в отношении метилирования ПЦР праймеров, специфических в отношении метилирования ПЦР зондов, фермента(-ов) для ПЦР (например, полимераза), обратной транскриптазы и реакционного буфера для ПЦР.
[0832] В некоторых вариантах реализации картридж включает одну или более камер, которые содержат праймеры, специфические в отношении конвертированных бисульфитом метилированных и/или неметилированных последовательностей. В некоторых вариантах реализации картридж включает одну или более камер, которые содержат праймеры и зонды для методики ПЦР MethyLight. В некоторых вариантах реализации картридж включает одну или более камер, которые содержат реагенты для ПЦР TaqMan. В некоторых вариантах реализации картридж включает одну или более камер, содержащих один или более флуоресцентных зондов, которые являются маркерами для амплифицированных метилированных последовательностей и/или один или более флуоресцентных зондов, которые являются маркерами для амплифицированных не метилированных последовательностей. В некоторых вариантах реализации зонды содержат флуоресцентный репортерный краситель и гасящий краситель, при этом зонд формирует сигнал о расщеплении посредством 5'-3'-нуклеазной активности Taq ДНК-полимеразы. В некоторых вариантах реализации картридж содержит множество зондов, каждый из которых специфичен к разным метилированным участкам в исследуемой амплифицированной области. В некоторых вариантах реализации картридж содержит один зонд, специфичный к одной метилированному участку в исследуемой амплифицированной области. В некоторых вариантах реализации картридж содержит множество зондов, каждый из которых специфичен в отношении одного и того же метилированного участка в исследуемой амплифицированной области.
[0833] Примеры праймеров и зондов включают, но неограничиваются ими, праймеры и/или зонды для определения метилирования промоторной области гена, выбранного из группы, состоящей из АРС, ARF, CDKN2B, CDKN2A, BRCA1, VLH, hMLH1, MGMT. RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, НОХВ4, RASGRF2, TM6SF1, AKR1B1, HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1 и НОХА9. В некоторых вариантах реализации праймеры и/или зонды выбраны для определения метилирования промоторной области гена, выбранного из группы, состоящей из MGMT, RASSF1A, ADAMTS1, BNC1, HIST1H3C, НОХВ4, RASGRF2, TM6SF1 и AKR1B1. В различных вариантах реализации праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты представлены на шариках (beads), например, как описано в патенте США публикации №: 2006/0068399, который включен в настоящее описание посредством ссылки в отношении шариков и состава шариков.
[0834] В различных вариантах реализации картридж выполнен с возможностью того, чтобы камера приема образца, указанная колонка(и), множество камер и канал или камера с контролем температуры имели избирательное соединение по текучей среде. В некоторых вариантах реализации избирательное соединение по текучей среде обеспечено посредством микрофлюидных каналов и клапанов. В некоторых вариантах реализации избирательное соединение по текучей среде обеспечено за счет размещения камеры приема образца, указанной колонки(-ок), указанного множества камер, канала или камеры нагревания или порта внутрь канала или камеры, расположенных вокруг центрального клапана и имеющих избирательное соединение по текучей среде с каналом в указанном центральном клапане.
[0835] В некоторых вариантах реализации картридж выполнен с возможностью того, что в процессе применения картридж содержит: первую камеру, содержащую образец; вторую камеру, содержащую раствор гуанидина тиоцианат-этанол (GTC-EtOH); третью камеру, содержащую бисульфитный реагент; четвертую камеру, содержащую буфер; пятую камеру, содержащую промывочный раствор; и шестую камеру, содержащую реагент для элюирования/десульфирования. В некоторых вариантах реализации картридж содержит седьмую камеру, содержащую праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты для ПЦР. В некоторых вариантах реализации картридж содержит восьмую камеру, также содержащую праймеры для ПЦР, и/или зонды, и/или ферменты для ПЦР.
[0836] На фигурах 1А, 1В и 2 изображен один из картриджей, подходящий для практической реализации способов, представленных в настоящем описании. Пердставленные картриджи реализованы на базе картриджа GENEXPERT (Cepheid, Inc., Sunnyvale, СА). В соответствии с изображением на фигуре 2 панель А картридж 200 включает корпус картриджа 202, содержащий множество камер для реагентов и/или буферов 208. Камеры расположены вокруг центрального шприцеобразного цилиндра (syringe barrel) 206, который имеет соединение по текучей среде с корпусом клапана 210 (панель В и фигура 1В) и герметизирован уплотнением 204. Корпус клапана 210 может содержать заглушку 212 и весь корпус картриджа может быть закреплен на основании картриджа 226. «Поршень» (не изображен) может приводиться в движение для перемещения жидкости внутрь шприцеобразного цилиндра 206, и вращение шприцеобразного цилиндра 206 и связанного корпуса клапана 212 обеспечивает избирательное соединение по текучей среде между полостями 214 камер 208, которые могут содержать матричный материал в соответствии с описанием в настоящем документе и выполнять функцию колонки. В различных вариантах реализации картридж дополнительно включает один или более каналов или камер с контролем температуры 216, которые могут в некоторых вариантах реализации выполнять функцию камер термоциклирования. Каналы или камеры с контролем температуры также имеют избирательное соединение по текучей среде с полостью 214 и/или камерами 208. В соответствии с изображением на фигуре 1А в некоторых вариантах реализации картридж снабжен оптическими окнами для проведения детекции в реальном времени, например, продуктов амплификации, идентификации оснований в операциях секвенирования и тому подобное.
[0837] В некоторых вариантах реализации картридж 200 выполнен с возможностью для установки реакционного модуля 300, например, в соответствии с изображением на фигуре 3А. Как показано на фигуре 3В, модуль выполнен с возможностью для размещения картриджа 200. В некоторых вариантах реализации реакционный модуль снабжен нагревательными пластинами 308 для нагревания камеры или канала с контролем температуры. Необязательно модуль дополнительно содержит вентилятор 304 для обеспечения охлаждения, в случае если канал или камера с контролем температуры представляет собой канал или камеру термоциклирования. Для передачи информации (например, оптической информации) в компьютер с целью ее анализа может быть установлена электронная плата 302. В некоторых вариантах реализации модуль может содержать оптические блоки 306, обеспечивая возбуждение и/или детектирование одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или более) оптических сигналов, представляющих, например, различные мишени нуклеиновых кислот. В различных вариантах реализации может быть установлен электрический разъем 312 для связывания с помощью интерфейса модуля с системой (например, с системным контроллером или с блоком дискретного анализа/контроллера. Как показано на фигуре 3В образец может быть введен внутрь картриджа с помощью пипетки 310.
[0838] В некоторых вариантах реализации модуль также содержит контроллер, который управляет поршнем в шприцеобразном цилиндре и вращением корпуса клапана.
[0839] В некоторых вариантах реализации представлена система (например, устройство). Один иллюстративный, но не ограничивающий вариант реализации изображен на фигуре 3С. В некоторых вариантах реализации устройство содержит отделение, выполненное с возможностью размещения одного или более рабочих модулей, где каждый рабочий модуль выполнен с возможностью для крепления и управления съемным картриджем в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации система выполнена с возможностью управления рабочими модулями для выполнения обработки образца для определения метилирования одной или более целевых нуклеиновых кислот и, необязательно, для определения уровня одной или более целевых последовательностей РНК/ДНК внутри соответствующего съемного картриджа для образца, причем указанная обработка образца внутри соответствующего съемного картриджа для образца задействует способ в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации система выполнена с возможностью размещения одного модуля обработки образца. В некоторых вариантах реализации система выполнена с возможностью для размещения одного или более модулей обработки образца, или по меньшей мере 4 модулей обработки образца, или по меньшей мере 8 модулей обработки образца, или по меньшей мере 12 модулей обработки образца, или по меньшей мере 16 модулей обработки образца, или по меньшей мере 20 модулей обработки образца, или по меньшей мере 24 модулей обработки образца, или по меньшей мере 28 модулей обработки образца, или по меньшей мере 32 модулей обработки образца, или по меньшей мере 64 модулей обработки образца, или по меньшей мере 128 модулей обработки образца. В некоторых вариантах реализации система снабжена пользовательским интрефейсом, который позволяет ввод пользователем операционных инструкций и/или наблюдение за работой картриджей с целью определения метилирования ДНК.
[0840] Помимо того, что способы, представленные в настоящем документе, в первую очередь описаны в отношении картриджа GENEXPERT от Cepheid Inc. (Sunnyvale, СА) (см., например, фигура 1А), следует понимать, что с учетом представленных в настоящем документе рекомендаций способы могут быть реализованы на базе других картриджных/микрофлюидных систем. Такие картриджные/микрофлюидные системы могут включать, например, микрофлюидные системы, реализованные с использованием легкой литографии, микро/нано-изготовленные микрофлюидные системы, реализованные с использованием тяжелой литографии (hard lithography), и тому подобное.
Картридж высокообъемной подготовки образца (HVSP)
[0841] В различных вариантах реализации представлены картриджи для получения образцов большого объема. В некоторых вариантах реализации картриджи подготовки образца включают картриджи GENEXPERT, модифицированные для высокообъемной подготовки образца (например, в соответствии с изображением на фигуре 20). В некоторых вариантах реализации например, в случае если картридж изготовлен на базе картриджа GENEXPERT, то он включает один или более каналов или камер, содержащих аффинную матрицу, которая связывает ДНК, множество камер, раположенных вокруг узла центрального клапана и имеющих избирательное соединение по текучей среде с указанным узлом центрального клапана, при этом узел центрального клапана выполнен с возможностью размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном, где указанное множество камер включает по меньшей мере две различные камеры, каждая из которых выполнена с возможностью приема до примерно 4 мл включительно (или до примерно 5 мл включительно) раствора образца (в некоторых вариантах реализации камера 2 имеет максимальный объем примерно в 4 мл, при этом камера 3 имеет максимальный объем примерно в 4,5 мл), камеру, содержащую ПЭГ (например, ПЭГ200), камеру, содержащую щелочной раствор (например, раствор KOH) и камеру, содержащую буфер (например, Трис). В некоторых вариантах реализации множество камер включает по меньшей мере три различные камеры, каждая из которых выполнена с возможностью приема до примерно 4 мл включительно (или до примерно 5 мл включительно) раствора образца. В некоторых вариантах реализации множество камер включает камеру, содержащую отмывочный раствор (например, отмывочный раствор GTC-этанол, который, как правило, представляет собой гуанидина тиоцианат 1,25 М, Трис 25 мМ с рН 7,0, 50% этанол). В некоторых вариантах реализации картридж включает камеру, выполненную с возможностью изъятия отработанного образца. В некоторых вариантах реализации камеры для образца в процессе применения содержат раствор образца, GTC и спирт (например, изопропанол). В некоторых вариантах реализации камеры для образца в процессе применения содержат раствор образца, GTC и спирт по существу в равных объемах. В некоторых вариантах реализации картридж в процессе применения содержит 4 мл раствора образца, GTC и изопропанол, которые расположены в каждой из указанных камер, выполненных с возможностью приема образца. В некоторых вариантах реализации картридж обеспечивает извлечение (recovery) ДНК или РНК, которое по существу имеет линейную зависимость от объема образца, от 0,5 мл до примерно 4 мл.
[0842] В некоторых вариантах реализации картридж HVSP выполнен с возможностью проведения конверсии ДНК (например, бисульфитной конверсии) с обеспечением проведения анализа метилирования. Соответствующим образом, в некоторых вариантах реализации картридж HVSP выполнен с возможностью размещения или приема непосредственно в процессе или незадолго до использования реагента для конверсии (например, бисульфитного реагента, 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO) и т.д.). В некоторых вариантах реализации картридж HVSP может быть выполнен также с возможностью размещения реагентов для десульфирования конвертированной ДНК и обеспечения десульфирования. В качестве альтернативы в некоторых вариантах реализации конверсию проводят в картридже HSVP, а десульфирование и анализ метилирования (например, ПЦР) выполняют во втором картридже (например, как изображено на схеме процесса на фигуре 20В).
Двухкартриджный анализ метилирования
[0843] В различных вариантах реализации способы анализа метилирования, представленные в настоящем описании, осуществляют с использованием двухкартриджной системы (комплект двух картриджей, таких как «первый» картридж (например, картридж высокообъемной подготовки образца) и «второй» картридж (например, картридж кПЦР)), например, как изображено на фигуре 20В. В соответствии с изображением на данной фигуре, в некоторых вариантах реализации подготовка образца и бисульфитная конверсия могут быть выполнены в первом картридже. Затем конвертированная ДНК перемещается во второй картридж, где происходит ее отмывка и десульфирование. В некоторых вариантах реализации второй картридж дополнительно задействован в анализе конвертированной (или неконвертированной) ДНК, например, с помощью ПЦР (например, ПНР, специфической в отношении метилирования).
[0844] В некоторых вариантах реализации первый картридж может являться картриджем с большим объемом образца, как описано выше, где картридж подготовки образца содержит бисульфитный реагент для конверсии в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации картридж с большим объемом образца снабжен камерой для образца большого объема или множеством камер для образца с целью обеспечения очистки и конверсии больших количеств ДНК.
[0845] В некоторых вариантах реализации первый картридж из двухкартриджного комплекта включает камеру приема образца, «колонку», содержащую первый матричный материал, канал или камеру с контролем температуры, камеру изъятия образца и множество камер, содержащих реагенты и/или буферы. Как правило, в процессе применения по меньшей мере одна из камер содержит бисульфитный реагент (например, в соответствии с описанием в настоящем документе). В некоторых вариантах реализации второй картридж из двухкартриджного комплекта включает камеру приема образца, «колонку», содержащую матричный материал, канал или камеру с контролем температуры, множество камер, содержащих реагенты и/или буферы. Как правило, в процессе применения по меньшей мере одна из множества камер во втором картридже содержит реагент для десульфирования и/или элюирования. В некоторых вариантах реализации второй картридж содержит реагенты ПЦР-амплификации (например, специфической в отношении метилирования ПЦР) и детектирования продуктов амплификации.
[0846] В определенных иллюстративных, но неограничивающих вариантах реализациии первый картридж используют для подготовки образца (например, связывания ДНК с первым матричным материалом (например, стекловолокно), отмывки и элюирования связанной ДНК) и бисульфитной конверсии отмытой ДНК. В некоторых вариантах реализации бисульфитная конверсия включает объединение отмытой ДНК с бисульфитный реагентом и нагревание смеси в канале или камере с контролем температуры. Полученную конвертированную ДНК затем смешивают с отмывочным буфером (например, 1,25 М GTC, 25 мМ Трис с рН 7,0, 50% этанол) и перемещают внутрь камеры изъятия образца (например, Камера 2), откуда она может быть изъята (например, изъята с помощью пипетки, шприца или шприцевого насоса, и тому подобным образом).
[0847] В некоторых вариантах реализации конвертированную бисульфитом ДНК в отмывочном буфер вводят внутрь камеры приема образца второго картриджа. Второй картридж функционирует с целью связывания ДНК со вторым матричным материалом (например, «колонка» из стекловолокна), отмывки и элюирования связанной ДНК и десульфирования ДНК. В некоторых вариантах реализации ДНК десульфируют на колонке или после ее элюирования из второго матричного материала. В некоторых вариантах реализации ДНК десульфируют после удаления со второго матричного материала. В некоторых вариантах реализации десульфированную ДНК затем смешивают, например, шариками с ферментом и шариками с праймером/зондом для проведения ПЦР во втором картридже. В некоторых вариантах реализации десульфированную ДНК изымают и вводят внутрь третьего картриджа или другой реакционной системы для дополнительного анализа (например, секвенирования).
[0848] В некоторых вариантах реализации в первом картридже камера приема образца, колонка, множество камер, камера изъятия образца и нагревательный канал или камера с контролем температуры имеют избирательное соединение по текучей среде (например, посредством микрофлюидных каналов и/или клапанов); и/или, во втором картридже камера приема образца, колонка, множество камер и нагревательный канал или камера с контролем температуры имеют избирательное соединение по текучей среде (например, посредством микрофлюидных каналов и/или клапанов).
[0849] В некоторых вариантах реализации в первом картридже камера приема образца, колонка, множество камер, камера изъятия образца и канал или камера с контролем температуры или порт в канал или камеру с контролем температуры расположены вокруг центрального клапана и имеют избирательное соединение по текучей среде с одним или более каналами в центральном клапане. Центральный клапан может быть выполнен с возможностью размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камер(ы) или из камер(ы) при соединении по текучей среде с центральным клапаном. В некоторых вариантах реализации во втором картридже камера приема образца, колонка, множество камер и канал или камера с контролем температуры или порт в канал или камеру с контролем температуры расположены вокруг центрального клапана и имеют избирательное соединение по текучей среде с одним или более каналами в центральном клапане. В некоторых вариантах реализации центральный клапан выполнен с возможностью размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь или из одной или более камер при соединении по текучей среде с центральным клапаном.
[0850] В некоторых вариантах реализации первый картридж и/или второй картридж представляет собой картридж GENEXPERT или модифицированный картридж GENEXPERT (например, как изображено на фигурах 1А, 1В, 2, 13А, 17 и 20А). В определенных иллюстративных, но не ограничивающих вариантах реализации первый картридж выполнен в конфигурации согласно таблице 9. В некоторых вариантах реализации нумерация камер соответствует нумерации камер, изображенной на фигуре 1В.
[0851] В определенных иллюстративных, но неограничивающих вариантах реализации второй картридж выполнен в конфигурации согласно таблице 10. В некоторых вариантах реализации нумерация камер соответствует нумерации камер, изображенной на фигуре 1В.
[0852] В некоторых вариантах реализации второй картридж выполнен с возможностью применения одного или более из следующих генов в качестве контрольного гена: MYOD1, COL2A1, NONO и/или TUBB.
[0853] В некоторых вариантах реализации применение двухкартриджного формата возможно, помимо прочего, для проведения невложенной ПЦР или специфической в отношении метилирования предварительной амплификации во 2-м картридже.
[0854] Вышеуказанные конфигурации являются иллюстративными и не ограничивающими. С применением приведенных в настоящем описании рекомендаций для специалистов в данной области техники может быть доступно множество других двухкартриджных форматов.
[0855] В качестве примера на фигурах 35, 36 и 37 приведены данные с результатами анализа в двухкартриджном формате для образцов мочи и мокроты. В частности на фигуре 35 изображен анализ метилирования BNC1 и АСТВ в двухкартриджном формате. В сыворотку было занесено по 0, 25, 50 и 100 копий 100%-метилированной контрольной ДНК и обработано в 1-м картридже подготовки образца (см., например, Таблица 9), а затем во втором картридже проведена кПЦР с образцом экстрагированной конвертированной ДНК (см., например, Таблица 10), который содержал комплекты праймеров и зондов для метилированного промотора BNC1 и комплект независящих от метилирования праймеров и зондов для промотора АСТВ.
[0856] На фигуре 36 представлены результаты анализа бисульфитной конверсии образцов мочи здорового субъекта. 2,0 мл мочи здорового субъекта смешивали с 1,5 мл лизирующего буфера [4,5 М GTC, 1% Твин 20] и 0,5 мл этанола в Условиях №6. 1,5 мл мочи здорового субъекта смешивали с 1,25 мл лизирующего буфера и 1,25 мл этанола в Условиях №7. Данные образцы по 4,0 мл добавляли с помощью пипетки в Камеру 2 картридж для анализа метилирования 2 и анализировали конвертированный АСТВ (справа) и неконвертированный HMBS (слева).
[0857] На фигуре 37 представлены результаты анализа метилирования образцов мокроты здорового субъекта и с раком. Семь образцов мокроты исследовали на метилирование SOX17, ТАС1 и НОХА7 с применением картриджа метилирования GENEXPERT (С) и сравнительного анализа (М). На данной фигуре приведены как непосредственные значения Ct, так и deltaCt (для АСТВ).
[0858] Вышеуказанные конфигурации являются иллюстративными и не ограничивающими. С применением приведенных в настоящем описании рекомендаций для специалистов в данной области техники может быть доступно множество других двухкартриджных форматов.
Картридж подготовки образца cf-ДНК.
[0859] В некоторых вариантах реализации предложен картридж подготовки образца, который особенно хорошо подходит для подготовки (и в случае необходимости проведения анализа) нуклеиновой кислоты из плазмы или сыворотки. Один из иллюстративных, но неограничивающих вариантов реализации представлен на фигуре 17. Как при этом представлено в некоторых вариантах реализации картридж содержит канал или камеру, содержащую аффинную матрицу, которая связывает ДНК, множество камер, расположенных вокруг узла центрального клапана и имеющих избирательное соединение по текучей среде с узлом центрального клапана, при этом узел центрального клапана выполнен с возможностью размещения поршня, способного забирать жидкость внутрь камеры или из камеры при соединении по текучей среде с указанным центральным клапаном, причем множество камер включает: камеру, выполненную с возможностью приема примерно до 5 мл включительно или примерно до 4 мл включительно раствора образца; камеру, содержащую ПЭГ (например, ПЭГ200); камеру, содержащую GTC-EtOH; камеру, содержащую щелочной раствор (например, KOH); и камеру, содержащую буфер (например, Трис). В некоторых вариантах реализации множество камер дополнительно включает камеру, содержащую реагент для конверсии (например, бисульфитный реагент). В некоторых вариантах реализации множество камер включает камеру, содержащую отмывочный раствор (например, отмывочный раствор GTC-этанол (как правило, 1,25 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ Трис с рН 7,0, 50% этанол)). В некоторых вариантах реализации множество камер включает камеру, содержащую шарики, содержащие один или более праймеров для ПЦР и/или зонды. В некоторых вариантах реализации камера, содержащая ПЭГ, содержит примерно 1 мл ПЭГ. В некоторых вариантах реализации камера, содержащая щелочной раствор, содержит примерно 500 мкл раствора. В некоторых вариантах реализации камера, содержащая GTC-EtOH, содержит примерно 2 мл GTC-EtOH. В некоторых вариантах реализации камера, содержащая буфер, содержит примерно 2 мл буфера.
[0860] Следует понимать, что данная конфигурация является иллюстративной, и с применением приведенных в настоящем описании рекомендаций для специалистов в данной области техники может быть доступно множество других конфигураций картриджей подготовки.
Использование DABSO в качестве альтернативы бисульфиту
[0861] Неожиданно было обнаружено, что DABSO может быть использован для выполнения конверсии ДНК методом, аналогичным использованию бисульфитов для конверсии ДНК и детекции метилирования. Соответственно, в некоторых вариантах реализации представлены способы использования DABSO для преобразования в ДНК остатков цитозина в урацил, при этом остатки 5-метилцитозина по существу остаются не затронутыми. В некоторых вариантах реализации способы включают приведение в контакт образца, содержащего ДНК с DABSO для конверсии ДНК, и десульфирование конвертированной ДНК с целью получения ДНК, в которой остатки цитозина преобразованы в урацил, но остатки 5-метилцитозина по существу остаются не затронутыми. В некоторых вариантах реализации DABSO представлен в концентрациях в диапазоне примерно от 2 М до примерно 5 М включительно. В некоторых вариантах реализации DABSO представлен в концентрации примерно 2,5 М. В некоторых вариантах реализации DABSO растворяют в водном щелочном растворе (например, растворе КОН). В некоторых вариантах реализации реагент, содержащий DABSO, содержит DABSO, растворенный в растворе, содержащем КОН.
[0862] В некоторых вариантах реализации способы включают нагревание раствора DABSO/ДНК до температуры в диапазоне примерно от 55°С до примерно 90°С. В некоторых вариантах реализации DABSO подвергают взаимодействию с ДНК в течение периода времени в диапазоне примерно от 15 минут до примерно 90 минут включительно. После конверсии ДНК десульфируют (например, посредством приведения в контакт конвертированной ДНК с щелочным реагентом (например, раствор КОН). В некоторых вариантах реализации конверсию и/или десульфирование выполняют с ДНК, связанной на колонке, при этом в других вариантах реализации конверсию и/или десульфирование выполняют с ДНК в растворе.
[0863] Также предложены способы анализа метилирования ДНК, которые включают получение образца ДНК, конверсию ДНК в образце с использованием реагента DABSO, например, как описано выше, и выполнение специфической в отношении метилирования ПЦР и/или секвенирования нуклеиновой кислоты, и/или высокоточного анализа кривых плавления (HRM) конвертированной нуклеиновой кислоты для определения метилирования указанной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации получение образца ДНК включает подготовку образца в соответствии с описанием в настоящем документе (например, с использованием лизирующих растворов и/или картриджей подготовки в соответствии с описанием в настоящем документе.
Наборы
Наборы для определения метилирования
[0864] В некоторых вариантах реализации представлены наборы для выполнения способов, описанных в настоящем документе. В одном иллюстративном варианте реализации наборы включают контейнер, содержащий реакционный картридж в соответствии с описанием в настоящем документе, контейнер, содержащий реагент для обработки образца в соответствии с описанием в настоящем документе, и контейнер, содержащий реагент для конверсии (например, бисульфитный реагент) в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации бисульфитный реагент представлен в камере картриджа. В некоторых вариантах реализации бисульфитный реагент представлен в обособленном от картриджа контейнере. В некоторых вариантах реализации реагент для обработки образца представлен в камере картриджа. В некоторых вариантах реализации, в особенности, где реагент для обработки образца содержит гуанидина тиоцианат, реагент для обработки образца представлен в обособленном от картриджа контейнере.
[0865] В некоторых вариантах реализации наборы могут включать картриджи для двухкартриджного комплекта в соответствии с описанием в настоящем документе. Таким образом, в некоторых вариантах реализации наборы могут включать «первый» картридж, который представляет собой картридж подготовки образца, выполненный с возможностью подготовки образца и проведения бисульфитной конверсии ДНК в образце (см., например, фигуру 20В, панель слева), и «второй» картридж, выполненный в конфигурации для десульфированной конвертированной ДНК и, в некоторых вариантах реализации, для выполнения последующего анализа (например, специфической в отношении метилирования ПЦР) (см., например, фигуру 20В, панель справа). В некоторых вариантах реализации первый картридж и второй картридж в наборе представлены в виде отдельных контейнеров, при этом в других вариантах реализации первый картридж и второй картридж представлены в одном и том же контейнере. В некоторых вариантах реализации двухкартриджный набор может содержать приспособления (например, воронки, наконечники для пипеток и т.д.) для обеспечения переноса образца из камеры изъятия образца первого картриджа в камеру приема образца второго картриджа.
[0866] Помимо этого, наборы необязательно включают обозначения и/или обучающие материалы, содержащие указания (т.е. протоколы) для применения картриджей, представленных в настоящем описании, для определения метилирования ДНК и, необязательно, экспрессии РНК.
[0867] В некоторых вариантах реализации представлен набор для определения метилирования ДНК, который включает контейнер, содержащий картридж для определения статуса метилирования нуклеиновой кислоты в соответствии с описанием в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации набор дополнительно содержит лизирующий раствор в соответствии с описанием в настоящем документе (например, лизирующий раствор для сыворотки или плазмы, например, как описано в таблице 13, и/или лизирующий раствор для образцов FFPE, например, как описано в таблице 14). В некоторых вариантах реализации набор включает контейнер, содержащий протеиназы K. В некоторых вариантах реализации набор содержит реагент для конверсии (например, бисульфитный реагент) в картридже или в обособленном от картриджа контейнере. В некоторых вариантах реализации обособленный контейнер может содержать предварительно отмеренный объем реагента для конверсии, достаточный для одного «цикла работы» картриджа. В некоторых вариантах реализации реагент для конверсии содержит соединение, выбранное из группы, состоящей из метабисульфита натрия, бисульфита калия, бисульфита цезия, бисульфита аммония, и 1,4-диазабицикло[2.2.2]-октана (DABSO). В некоторых вариантах реализации набор включает контейнер, содержащий реагент для обработки образца. В некоторых вариантах реализации реагент для обработки образца содержит гуанидина тиоцианат и/или этанол.
[0868] В различных вариантах реализации набор может дополнительно содержать картридж подготовки образца в соответствии с описанием в настоящем документе (например, как показано на фигуре 20).
[0869] В некоторых вариантах реализации набор содержит инструктирующие материалы для обучения по применению картриджа для определения метилирования ДНК. В случае если в набор входит картридж подготовки образца, то набор может дополнительно содержать инструктирующие материалы для обучения по использованию и работе с картриджем подготовки образца.
Наборы для конверсии ДНК с помощью DABSO и детекции метилирования.
[0870] В некоторых вариантах реализации представлены наборы с применением DABSO в качестве реагента для конверсии, например, в детекции статуса метилирования ДНК. В некоторых вариантах реализации наборы включают контейнер, содержащий реагент для конверсии, содержащий DABSO, и контейнер, содержащий реагент для десульфирования. В некоторых вариантах реализации набор включает колонку, содержащую аффинную матрицу (например, матричный материал из диоксида кремния). В некоторых вариантах реализации наборы включают контейнер, содержащий связывающий буфер и/или контейнер, содержащий буфер для элюирования. В некоторых вариантах реализации набор включает контейнер, содержащий отмывочный буфер.
[0871] В некоторых вариантах реализации набор дополнительно включает лизирующий раствор в соответствии с описанием в настоящем документе (например, лизирующий раствор для сыворотки или плазмы, например, как описано в таблице 13, и/или лизирующий раствор для образцов FFPE, например, как описано в таблице 14). В некоторых вариантах реализации набор включает контейнер, содержащий протеиназы K.
[0872] В различных вариантах реализации набор может дополнительно включать картридж подготовки образца в соответствии с описанием в настоящем документе (например, как показано на фигуре 20).
[0873] В некоторых вариантах реализации набор содержит инструктирующие материалы для обучения по применению набора для конверсии нуклеиновой кислоты с целью определения метилирования нуклеиновой кислоты.
[0874] При том, что описанные выше инструктирующие материалы в наборе, как правило, включены в письменном и печатном виде, они таковыми не ограничены. Данное изобретение подразумевает любой носитель информации для хранения таких инструкций и их передачи конечному пользователю. Такие носители информации включают, но не ограничиваются ими, электронные носители информации (например, магнитные диски, пленку, картриджи, чипы), оптические носители (например, CD ROM) и тому подобное. Такие носители информации могут включать ссылки на интернет-сайты, на которых представлены такие инструктирующие материалы.
ПРИМЕРЫ
[0875] С целью пояснения, но не ограничения заявленного изобретения представлены следующие примеры.
Пример 1
[0876] Для валидации способа геномную ДНК человека (HG-ДНК) использовали в качестве начального образца для наблюдения за подготовкой образца, бисульфитной конверсией, очисткой образца и за проведением специфической в отношении метилирования кПЦР в картридж GENEXPERT от Cepheid. Для того, чтобы измерить эффективность бисульфитной конверсии, половину смеси ДНК-бисульфит загружали и нагревали в пробирке картриджа объемом 50 мкл в ходе стадии бисульфитной конверсии. Таким образом, при оптимальных условиях проведения конверсии примерно половина HG-ДНК была конвертирована, а другая половина осталась неконвертированной.
[0877] Праймеры и зонды Taqman для стадии кПЦР конструировали для одного неконвертированного гена (HMBS (конститутивный ген гидроксиметилбилан синтаза)) и одного конвертированного гена (АСТВ (бета-актин)), и затем эффективность конверсии количественно измеряли сравнением значений порогового цикла (Ct). И АСТВ, и HMBS широко применяют в качестве единичных референсный генов в сверхмалых количествах, и, таким образом, мы ожидаем схожего числа копий для на 1 нг HG-ДНК.
[0878] Репрезентативный цикл работы GENEXPERT от 300 нг HG-ДНК представлен ниже на фигуре 5, с кривой кПЦР зеленого цвета для АСТВ и кривой кПЦР синего цвета для HMBS кПЦР. кПЦР проводили в ходе 45 циклов с 3-х температурным циклом при 96°С в течение 5 секунд, при 60°С в течение 15 секунд и при 72°С в течение 15 секунд. При установке вручную пороговой линии в 20 единиц флуоресценции мы наблюдали Ct 31,7 для конвертированного гена АСТВ и Ct 32,7 для неконвертированного гена HMBS. Важно отметить, что данный результат показывает, что мы способны достичь близкой к оптимальной бисульфитной конверсии HG-ДНК в нашем картридже в физиологическиподобных концентрациях ДНК, присутствующих в срезах тканей FFPE и образцах плазмы/сыворотки. Дополнительная специфичность к полностью конвертированным последовательностям может быть достигнута с помощью вложенной кПЦР или при нагревании всего образца. Однако для специфической в отношении метилирования кПЦР в GENEXPERT ни один из данных вариантов вовсе не требуется, так как наборы праймеров и зондов сконструированы для амплификации только конвертированных последовательностей. Таким образом, остающиеся неконвертированные последовательности ДНК будут действовать в качестве ДНК-носителя, который в особенности часто добавляют в ходе бисульфитной конверсии, выделении ДНК и методах ПЦР.
Пример 2
[0879] На фигурах 6А и 6В показана линейная зависимость для конвертированного АСТВ. В частности, на фиг. 6А представлены результаты вложенной кПЦР с 15 циклами для АСТВ с использованием hg-ДНК. Как видно на панели справа сигнал (значение Ct) по существу линейный между примерно 25000 копий и примерно 100 копиями. На фиг. 6В представлены результаты вложенной кПЦР с 20 циклами для АСТВ с использованием hg-ДНК. Данные графики показывают чувствительность картриджа к hg-ДНК. «Провалы» (dropouts) начинают появляются примерно на 20-50 копии при чувствительности примерно в 25 копий конвертированной ДНК.
[0880] На фигурах 7А, 7В, и 7С представлены результаты кПЦР для шести метилированных целей (AKR1B1, НОХВ4, TM6SF1, RASGRF2 и RASSF1A). На фиг. 7А представлены результаты вложенной кПЦР с 20 циклами для контроля (25 нг HS-ДНК и 5000 клеток МВА-453, ДНК которых конвертирована бисульфитом). На фиг. 7В представлены результаты вложенной кПЦР с 20 циклами для шести метилированных целей с использованием ДНК из клеток МВА-453, которую конвертировали бисульфитом. Мощный сигнал был отмечен для всех целей. HIST1H3C не был достоверно детектирован. На фиг. 7С представлены результаты вложенной кПЦР с 20 циклами для шести метилированных целей с использованием ДНК из клеток МВА-453, которую конвертировали бисульфитом и расположенную на носителе, содержащем 1 мкг SS и 10 нг HS ДНК. «Провалы» (dropouts) наблюдали при примерно 100 клетках и менее, однако, с носителем было значительно меньше таких уменьшений.
Пример 3
[0881] На фигуре 8 представлены результаты определения эффективности конверсии. Эффективность конверсии составляет примерно 66% (~1 Ct) разницы между неконвертированным HMBS и конвертированным АСТВ. Идеальный Ct при 100% связывании/элюировании, 100% конверсии и 100% связывании/элюировании составляет примерно 24-25. В данных экспериментах в целом выявлено 50% связывание/элюирование, 50-66% конверсия и 50% связывание/элюирование при 10-кратном снижении и Ct примерно 27.
[0882] На фигуре 9 показано увеличение специфичности для конвертированной ДНК, полученной при вложенной кПЦР. Вложенная ПЦР, как представляется, увеличивает специфичность для конвертированной ДНК, увеличивает специфичность для метилированной ДНК и сокращает проблемы с контаминацией.
[0883] На фигуре 10 показана специфичность картриджа метилирования. Для неконвертированной ДНК (панель сверху) или неметилированной ДНК (панель снизу) специфичность отсутствует, за исключением HIST1H3C.
[0884] На фигурах 11А и 11В представлены некоторые иллюстративные, но не ограничивающие схемы процесса для анализа метилирования с использованием картриджа (например, картриджа GENEXPERT). На фиг. 11А изображена одна схема процесса для анализа метилирования ДНК в образце сыворотки. Как показано на данной схеме, сыворотку добавляют в пробирку с лизирующим реагентом и перемешивают мешалкой/ вихревым способом. Затем образец вводят в порт для образца на картридже. Картридж помещают в систему для анализа.
[0885] На фиг. 11А изображена одна схема процесса для анализа метилирования ДНК в тканевом срезе (например, замороженном или фиксированном формалином и залитом парафине (FFPE) срезе). Как при этом показано, в одном из вариантов реализации представлен тканевый срез (например, срез FFPE 4 мкм). К FFPE добавляют лизирующий реагент (примеры лизирующих реагентов см., например, в PCT/US2013/061863 (WO/2014/052551)), и смесь может быть нагрета. Могут добавлять этанол, и затем смесь перемешивают вихревым способом. Образец затем вводят внутрь порта для образца в картридже. Картридж помещают в систему для анализа.
[0886] На фигуре 12 представлены результаты для сгустка клеток FFPE для конвертированного ALU и метилированного RASSF1A.
Пример 4
Детекция маркеров для мониторинга рака молочной железы
Материалы и методы:
[0887] 1000 клеток МВА-453 или 25 нг ДНК из человеческой спермы (HS) добавляли к 2,5 мл связывающего буфера (2,25 М гуанидина тиоцианат, 22,5 мМ Трис с рН 7,0, 0,5% Твин 20, 50% этанол и 0,005% пеногаситель SE-15). 2,5 мл раствора клеток или ДНК добавляли в камеру 2 картриджа метилирования Cepheid (компоновка на фигуре 13А). Остальные камеры в картридже метилирования заполняли, как указано далее: Камера 3-3,2 мл отмывочного буфера (1,25 М гуанидина тиоцианата, 25 мМ Трис с рН 7,0, 50% этанол), Камера 4-90 мкл 7 М бисульфита аммония, Камера 5-4 мл 50 мМ Трис с рН 8,5, Камера 8 1 мл ПЭГ200 для промывания, Камера 9 шарики для количественной, включая EZR (Taq) и TSR (6 мишеней для мультиплексного анализа рака молочной железы RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2, TM6SF1, см. Таблицу 11 ниже), Камера 10-500 мкл 15 мМ KOH и Камера 11 - шарики для вложенной ПЦР, включая EZR (Taq) и TSR (6 мишеней для мультиплексного анализа рака молочной железы RASSF1A, AKR1B1, НОХВ4, HIST1H3C, RASGRF2 TM6SF1). Затем картридж метилирования устанавливали в Cepheid GeneXpert, и полный анализ метилирования был выполнен в GeneXpert первая подготовка ДНК образца, бисульфитная конверсия, вторая подготовка ДНК образца после конверсии, десульфирование и вложенная количественная ПЦР с 20 циклами.
[0888] Схема с изображением методики метилирования показана на фигуре 13В. Отмечено, что ПЭГ200 добавляли в Камеру 8 для отходов, и после начала анализа ПЭГ200 переходил в Камеру 1. ПЭГ200 представляет собой вязкую жидкость, которая не может быть легко и непосредственно загружена в небольшую Камеру 1. Дополнительно, камера 1 выполняет функцию камеры для связи с атмосферой, когда в картридж впервые осуществляют загрузку, прежде чем она становится Камерой для ПЭГ200. Таким образом, анализ начинается, когда Камера 1 = заполнена воздухом, а Камера 8 = ПЭГ200, и после загрузки картриджа происходит быстрая смена - Камера 1 = ПЭГ200 и Камера 8 = отход.
[0889] Числа, приведенные в столбце «Начальный объем» на фигуре 13А, относятся только к объему жидкости. В данном случае в Камере 11 присутствует лишь 2хшариков - 1x TSR шарик (праймер и зонды для 6 мишеней) и 1x EZR шарик (Phoenix Taq). Данные шарики предназначены для финальной кПЦР. Подобным образом, в Камере 9 присутствует 3х шариков- 1x TSR шарик (праймеры для 6 мишеней), 1х Трис шарик (для гашения КОН) и 1x EZR шарик (Phoenix Taq). Данные шарики предназначены для первой ПЦР с 15-20 циклами.
[0890] Также отмечено, что Камера 6 представляет собой для связи с атмосферой в ходе всего анализа и никогда не наполняется. Камеру 7 используют в виде шлюза для пробирки ПЦР в тыльной части картриджа. Для начала анализа она не заполняется, но заполняется в ходе анализа в 3 случаях перед загрузкой в пробирку -1) смесь ДНК-бисульфит, которая нагревается в пробирке для конверсии 2) ПЦР с 15-20 циклами и 3) окончательная кПЦР.
[0891] Праймеры, представленные в таблице 11, отражают пять последовательностей для каждого гена - два праймера элонгации и 2 праймера кПЦР для каждой вложенной амплификации и один зонд. Первая ПЦР с 15-20 циклами не является специфической в отношении метилирования, а лишь только в отношении последовательностей конвертированной ДНК (т.е., не имеют пересечений с CpG-нуклеотидами, и в ряде примеров, когда пересечения имеются, используют R = пурин или Y = пиримидин для того, чтобы учесть как метилированную, так и неметилированную ДНК). Вторая кПЦР с 45 циклами включает как праймеры, так зонды, специфические главным образом в отношении 2-3 метилированных CpG.
Результаты:
[0892] Запускали работу картриджа метилирования с использованием 1000 клеток МВА-453 в присутствии и в отсутствие бисульфита (фигура 15А-15В) и 25 нг HS-ДНК с бисульфитом (фигура 15С), которая изначально была неметилированной в каждом промоторе гена, за исключением HIST1H3C. Отсутствовала или была незначительной амплификация любой из данных целей в контрольных реакциях, или с бисульфитом, или неметилированной HS-ДНК (фигура 15А, 15С). При добавлении бисульфита в картридж метилирования регистрировали высокие уровни метилирования на множестве промоторов генов от 1000 Клеток МВА-453, в особенности на AKR1B1, RASSF1A, НОХВ4 и RASGRF2.
[0893] Праймеры, указанные в таблице 11, являются иллюстративными и неограничивающими. Специалистам в данной области техники доступно множество других праймеров и комплектов вложенных праймеров. В качестве примера в таблице 12 приведены иллюстративные праймеры для определения метилирования генов ADAMTS1 и BNC1, которые связаны с раком поджелудочной железы, и для определения метилирования гена MGMT ген, который связан с глиомой.
Пример 5
Подготовка образца из образцов из плазмы и FFPE
[0894] На фигуре 17 изображена одна из конфигураций картриджа, которая может быть применена для подготовки образца ДНК для ПЦР и/или детектирования метилирования. Образец, полученный из сыворотки или плазмы, или образец FFPE могут быть легко введены внутрь камеры для образца в картридже (например, Камера 3), и работа картриджа в соответствии с описанием в настоящем документе обеспечивает то, что образец готов для ПЦР и/или определения метилирования.
Подготовка образца
[0895] В одном из иллюстративных, но не ограничивающих вариантов реализации, идет подготовка образца сыворотки или плазмы (например, для анализа cf-ДНК) обработкой сыворотки или плазмы протеиназой K. Затем обработанную протеиназой K сыворотку/плазму смешивают с лизирующим раствором, содержащим гуанидина тиоцианат (GTC), буфер (например, Трис с рН 7,0), детергент (например, Твин 20) и необязательно пеногаситель (например, пеногаситель SE15). Спирт (например, изопропанол) добавляют в раствор, который затем вводят внутрь картриджа для подготовки образца. В одном из вариантов реализации состав лизирующего раствора представлен в таблице 13. Обработанную протеиназой K сыворотку/плазму смешивают с лизирующим раствором и спиртом в соотношении, соответствующем 1,3 мл обработанной протеиназой K сыворотки/плазмы, 2,2 мл лизирующего раствора и 1,5 мл спирта. В некоторых вариантах реализации образец сыворотки/плазмы обрабатывают протеиназой K в течение примерно 15 минут. Лизирующий раствор добавляют холодным и выдерживают/перемешивают в течение примерно 10 минут. Затем изопропанол добавляют к смеси, которую затем загружают внутрь картриджа для обработки.
[0896] Как отмечено выше, для сыворотки/плазмы осаждение спиртом (например, изопропанолом), как правило, проводят при комнатной температуре, и преимущественно не проводят в «солевых» растворах. В некоторых вариантах реализации может быть применено более продолжительное время осаждения при комнатной температуре.
2
[0897] В других иллюстративных, но не ограничивающих вариантах реализации фиксированный формалином и залитый парафином образец (FFPE) готовят объединением образца FFPE с протеиназой K и лизирующим раствором, содержащим буфер (например, HEPES), хелатирующий агент (например, ЭДТА), NaCl, MgCl, и необязательно азид натрия и/или пеногаситель. Раствор нагревают (например, при температуре от 70°С до 90°С) в течение периода времени в диапазоне, например, примерно от 10 минут до примерно 4 часов включительно. Спирт добавляют в раствор, и затем раствор вводят внутрь картриджа для обработки образца. В одном из вариантов реализации состав лизирующего раствора представлен в таблице 14. В одном из иллюстративных, но не ограничивающих вариантов реализации 1,2 мл лизирующего раствора, представленного в таблице 14, добавляли срезу(-ам) FFPE. Добавляли протеиназу K и нагревали смесь, например, при 80°С в течение примерно 15 минут. В некоторых вариантах реализации нагревание осуществляли при 56°С в течение 2 часов, затем 90°С в течение 30 минут. Затем к смеси добавляли 1,2 мл этанола, и смесь загружали в камеру для образца в картридже для обработки.
Функционирование картриджа и осуществление экстракции
[0898] При подготовке cf-ДНК в некоторых вариантах реализации возможно включение контрольного образца для наблюдения за качеством подготовки ДНК. Как показано на фигуре 18, имеется два разных набора шариков. Один набор шариков содержит эндогенный праймер HMBS и комплект зондов для SAC (контрольного образца для анализа) и экзогенного праймера BG и комплект зондов для SPC (контрольного образца подготовки). Другой содержит эндогенный комплект Бета-глобин РР для SAC (а также BG SPC).
[0899] Кроме того, было обнаружено, что применение GTC в картридже может быть менее важным для образцов из сыворотки, чем образцов из плазмы. Без привязки к какой-либо конкретной теории считается, что это может быть вызвано тем фактом, что сыворотка содержит меньше белка. Соответственно, в некоторых вариантах реализации картридж может содержать меньше GTC, или GTC может отсутствовать.
[0900] На фигурах 19А и 19В представлено сравнение результатов подготовки cf-ДНК, выполненной с использованием картриджа в соответствии с описанием в настоящем документе, по отношению к результатам, полученным с использованием традиционной процедуры «tubefill». Как показывают результаты кПЦР, приведенные на фигуре 19А, эффективность связывания и элюирования при использовании картриджа крайне близка (в пределах одного Ct) к таковым при использовании протокола «tubefill». Как представлено на фигуре 19В, титр концентраций образцов показывает, что подготовка в картридже находится с запасом в пределах одного 1 Ct от подготовки «tubefill» при снижении концентрации образца примерно до 10 пг. Счтается, что подготовка в картридже даже более близка к протоколу «tubefill» при более высоких концентрациях образца.
Пример 6
Тестирование картриджа высокообъемной подготовки образца
[0901] В некоторых вариантах реализации представлены картриджи высокообъемной подготовки образца (HSVP) для получения образцов большого объема (например, включительно до примерно 12-15 мл). В особенности это подходит для применения, когда образец содержит ДНК в низких концентрациях (например, cf-ДНК в сыворотке или плазме). Один такой картридж схематически изображен на фигуре 20 А. Как при этом показано, картридж снабжен тремя камерами (Камеры 2, 3 и 5), которые могут быть использованы для приема образца. В иллюстративных вариантах реализации, каждая из данных камер может принимать примерно 4 мл образца, и, в некоторых вариантах реализации, образец содержит 4 мл плазмы/сыворотки, объединенной с 4 мл GTC и 4 мл спирта (например, изопропанола).
[0902] Образец вводят внутрь данных камер, и картридж функционирует в соответствии с описанием в настоящем документе для подготовки образца для ПЦР и/или анализа метилирования. В качестве примера, в некоторых вариантах реализации работа данного картриджа может включать связывание ДНК на аффинной колонке (например, для очистки) и элюирование ДНК. В некоторых вариантах реализации, когда выполняют анализ метилирования, работа картриджа может дополнительно включать объединение ДНК с реагентом для конверсии (например, бисульфитом в соответствии с описанием в настоящем документе) и нагревание смеси для конверсии ДНК. В некоторых вариантах реализации картридж HSVP может быть также выполнен с возможностью десульфирования конвертированной ДНК. В других вариантах реализации ДНК может быть десульфирована во втором (например, кПЦР) картридже, как схематически изображено на фигуре 20 В. Во втором картридже также может быть выполнен анализ метилирования (например, анализ кПЦР).
[0903] На фигуре 21 представлено сравнение результатов подготовки образца ДНК из плазмы и сыворотки с применением методики с одним или двумя картриджами с использованием праймеров HMBS или бета-глобина и комплекта зондов. Как при этом показано, имеется линейный прирост в извлечении (recovery) ДНК между 0,5 мл и 4 мл сыворотки или плазмы. Кроме того, были крайне малыми или отсутствовали потери при использовании одного картриджа для подготовки и анализа или при использовании раздельных картриджей для подготовки и анализа.
Пример 7
Оптимизация бисульфитной конверсии
[0904] В некоторых вариантах реализации при использовании картриджа для анализа метилирования в соответствии с описанием в настоящем документе одной из потенциальных задач является оптимизация эффективности элюирования при использовании наименьших возможных объемов. Работать с малыми объемами при элюировании наиболее легко при использовании спин-колонок. Данную проблему можно разрешить использованием стадии множественного нагревания для обработки образцов большого объема.
[0905] При нагревании образца большого объема (например, как минимум 100 мкл) с использованием малой (например, 50 мкл) нагревательной пробирки или камеры возникает второй технический вопрос. В некоторых случаях создание избыточного давления между стадиями нагревания может нарушить воспроизводимость объемов всасывания и распределения. Во-вторых, отсутствие избыточного давления может приводить к изменению объема и пузырькам, особенно при более высоких температурах. В-третьих, существует возможность забора воздуха между нагретым и ненагретым образцами в ходе смены портов между стадиями нагревания.
[0906] Изучение данной оптимизации бисульфитной конверсии проводили в 50 мкл пробирке с использованием стадии однократного и двукратного нагревания. Данный эксперимент выполняли, как указано ниже:
Забор 75-80 мкл бисульфит-ДНК; нагревание 95°С - 10 с, 65°С - 300 с х8;
Забор оставшегося количества + 5-10 мкл; создание избыточного давления; нагревание 95°С - 480 с, 65°С - 1800 с x1.
[0907] Результаты для 0,5 мл сыворотки представлены на фигуре 22, где на панели сверху представлено однократное нагревание (конвертированная ДНК - 33,0, неконвертированная - 34,4) N=4, и на панели снизу представлен двукратное нагревание (конвертированная ДНК - 31,9, неконвертированная - 36,1) N=4.
[0908] Присутствует прирост примерно в 1 Ct сигнала для конвертированного АСТВ при переходе от однократного нагревания к двукратному. Это позволяет предположить, что конвертирована почти вся ДНК. Это подтверждается тем фактом, что также присутствует потеря сигнала от неконвертированного HMBS примерно в 2 Ct. Повышение на 1 Ct логично, так как авторы проводили нагревание сначала 50/100 мкл, а затем 100/100 мкл образца ДНК-бисульфит.
Пример 8
Сравнение картриджа метилирования ДНК с коммерческими наборами на базе пробирок
[0909] На фигуре 23А представлено сравнение стадий с участием пользователя, требуемых при выполнении анализа метилирования при применении картриджа в соответствии с описанием в настоящем документе (слева) в отношении стадий, требуемых при применении комерческих наборов (QIAamp MinElute Virus Spin Kit (Qiagen, Inc.) и EZ DNA Methylation -Lightning™ Kit (Zymo Research, Inc.)) для выполнения одного и того же анализа. Как легко можно заметить, для анализа метилирования на базе картриджа необходимо намного меньше стадий с участием пользователя с трудозатратами примерно в 5 минут по сравнению с 2-3 часами трудозатрат, необходимых при использовании указанных наборов.
[0910] Для сравнения результатов, полученных указанными различными способами, было очищено 200 мкл сыворотки при использовании набора Qiagen. ДНК конвертировали с использованием набора Zymo, затем очищали с помощью второй спин-колонки и элюировали с 10 мкл. Ставили все 10 мкл с использованием конвертированных неметилированных праймеров и зондов (TSR) для АСТВ. Для сравнения выполняли постановку 200 мкл сыворотки в картридже метилирования в соответствии с описанием в настоящем документе. Результаты представлены на фигуре 23В. Совершенно очевидно, что при способе с картриджем получены результаты, крайне похожие на результаты, которые были получены при использовании коммерческих наборов. Однако это требовало намного меньше трудозатрат и времени.
Пример 9
Применение DABSO для конверсии ДНК
[0911] Изначально предпринимали попытку растворения 5 г DABSO в 5 мл H2O. В конечном итоге добавляли несколько мл КОН 10М и один мл воды и выполняли нагревание для растворения DABSO и для повышения рН до значения между примерно рН 5 и рН 5,5 при приблизительной конечной концентрации DABSO ~2,5 М.
[0912] На фигуре 24 изображен график по данным, полученных при использовании протокола «tubefill», для 750 нг ДНК, конвертированной с помощью DABSO или реагентом для конверсии Zymo. Материалы нагревали извне (offboard) (1 мкг) в термоциклере, очищали на спин-колонках и выполняли постановку согласно протоколу «tubefill». Было проведено 3 различных эксперимента:
1) 120 мкл DABSO/30 мкл ДНК;
2) 120 мкл Zymo/30 мкл ДНК; и
3) 70 мкл Zymo/30 мкл ДНК (текущее соотношение в картридже).
[0913] В соответствии с изображением на фигуре 24 применение DABSO обеспечивало надлежащую конверсию, практически сравнимую с полученной при использовании реагента Zymo.
Пример 10
Чувствительность детекции метилирования ДНК
[0914] Для оценки чувствительности детекции метилирования ДНК при использовании картриджа в соответствии с описанием в настоящем документе конвертированный промотор гена АСТВ детектировали с учетом зависимости от числа копий. Цель состояла в детектировании менее 25 копий конвертированной неметилированной ДНК. Как показано до этого, скачки (fallouts) детектировалось примерно при 10-50 копиях (по 1 выбросу). Схожую чувствительность наблюдали для мишеней с метилированной ДНК на фоне сыворотки.
[0915] На фигуре 25, панель А, показано детектирование метилированной ДНК в серии разведений (MGMT (ген О-6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы)). Как при этом показано, MGMT детектировали до уровня в 78 пг.
[0916] Детектирование метилированных маркеров рака молочной железы RASSF1A и AKR1B1 в клетках МВА-453 показано на фигуре 25, панель В. Как при этом показано, маркеры рака молочной железы детектировали до уровня в 100 клеток.
[0917] Детектирование метилированных маркеров рака поджелудочной железы АСТВ, BNC1, и ADAMTS1 в серии разведений показано на фигуре 25, панель С. Как при этом показано, маркеры поджелудочной железы детектировали до уровня в 25 копий.
[0918] В таблице 15 приведен показатель эффективности (детектирования для маркеров рака поджелудочной железы BNC1 и ADAMTS1 в зависимости от концентрации. Как в указано в таблице, данные маркеры могут детектироваться при уровне ниже 120 пг. Следует отметить, что положительный "показатель эффективности" «число попаданий») представляет собой амплификацию любого из данных генов на один повтор.
В таблице 15 приведен показатель эффективности для детектирования маркеров поджелудочной железы в зависимости от концентрации.
Пример 11
Мультиплексный анализ с обратным комплементом для обеих цепей
[0919] На фигуре 26 представлены результаты мультиплексного анализа с обратным комплементом для обеих цепей ДНК. После бисульфитной конверсии обе цепи теряют свою комплементарность. Таким образом, комплект праймеров и зондов должен быть сконструирован для одной или другой цепи, что приводит к образованию уникальных ампликонов. Помимо этого, для предоставления «больших возможностей» данный подход может потенциально повышать чувствительность (на нижнем пределе детектирования, если в итоге только одна или другая цепь будет присутствовать в пробирке, то данная методика обеспечит возможность уловить сигнал).
[0920] Мультиплексный анализ позволяет детектировать различные CpG на одном участке промотора. Мультиплексный анализ с обратным комплементом обеспечивает получение большего количество данных в отношении мишени и дает возможность различать гетерогенное метилирование.
Пример 12
Детекция метилирования ДНК и мутаций в одном картридже
[0921] В некоторых вариантах реализации мультиплексная ПЦР может включать праймеры и зонды, которые обеспечивают в том же картридже, в дополнение к метилированию, детекцию мутаций. На фигуре 27А изображена детекция метилирования BNC1 и ADAMTS1 совместно с мутацией KRAS G12D совместно с контрольным образцом БГ (панель сверху) и детектирование метилирования BNC1 и ADAMTS1 совместно с KRAS дикого типа совместно с контрольным образцом БГ (панель снизу).
[0922] На фигуре 27В представлена одновременная детекция метилирования BNC1 и ADAMTS1 в клетках PANC-1 (панель сверху) и в клетках MIA-РаСа (панель снизу) совместно с мутацией KRAS G12D.
Пример 13
Мультиплексная оптимизация для рака поджелудочной железы
[0923] Было установлено, что анализ метилирования ADAMTS1, BNC1 (и определенных других генов) обеспечивает выявление рака и/или установление стадии рака поджелудочной железы. Соответственно, начальный мультиплексный анализ для BNC1 и ADAMTS1 оптимизировали для улучшения внедрения зондов на других генах. Для оптимизации температурные градиенты данного метода исследовали на внешних и внутренних ПЦР прямых/обратных конвертированных бисульфитом цепей. Обычные, не мультиплексные эксперименты (прям./обр. для каждого гена) проводили при внешних температурах в 56°С, 58°С и 60°С и внутренних температурах в 64°С, 66°С и 68°С (см., например, фигура 28). В некоторых вариантах реализации методики анализов разрабатывали как два 4-канальных мультиплекса для BNC1 и ADAMTS1 и два других гена, один 4-канальный мультиплекс для анализа метилирования прямой цепи и один 4-канальный мультиплекс для анализа метилирования обратной цепи.
4
4
2
4
2
4
[0924] Зонды объединяли в два комплекта (см., фигура 29) на основании предпочтительных условий реакции (условия с солями 40 мМ (LS), 60 мМ (MS), 80 мМ (HS) KCl. 15 мМ NHSO) и оптимизировали для специфичности. Окончательный солевой режим для мультиплекса 1 включал 80 мМ KCl, 5 мМ MgCl, 20 мМ Трис с рН 8,5, и 10 мМ NH и для мультиплекса 2 включал 62 мМ KCl, 4 мМ MgCl, 20 мМ Трис с рН 8,5 и 10 мМ NH.
Пример 14
Детекция метилирования MGMT
[0925] Ген O(6)-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) кодирует фермент репарации ДНК, кторый может подавлять действие алкилирующих химиопрепаратов, таких как темозоламид. В случае если ген MGMT активен, то происходит быстрое исправление повреждений. Считается, что при злокачественных глиомах ген MGMT может быть инактивирован по причине метилирования его промоторной области. Метилированный ген MGMT является прогностическим индикатором для БОЛЕЕ ЭФФЕКТИВНОГО ответа на химиотерапию (так как у опухоли отсутствуют средства для репарации повреждений ДНК, вызванных алкилирующими агентами).
[0926] Праймеры и зонды конструировали для детекции метилирования MGMT, как представлено на фигуре 30 и сведено ниже в таблице 16. В частности на фигуре 30 представлена конвертированная матрица с CPGs (как установлено на основании пиросеквенирования), которая выделена серым цветом. В соответствии с изображением, после бисульфитной конверсии прямая и обратная цепи больше не комплементарны, что позволяет проводить отдельный анализ для каждой цепи.
[0927] Для оценки чувствительности детектирования MGMT исследовали на серии разведений (от 5 нг до 78 пг ДНК MGMT на фоне 20 нг HS ДНК)) с использованием АСТВ в качестве контроля. В иллюстративном эксперименте для 78 пг метилированной MGMT ДНК Ct располагалось лишь примерно на 10 циклов ниже, чем Ct для неметилированной HS ДНК.
[0928] В соответствии с изображением на фигуре 31 проведено сравнение результатов, полученных с использованием картриджа метилирования, представленного в настоящем описании, для детекции метилирования MGMT, по отношению к результатам, полученным при пиросеквенировании экстрагированной ДНК (фиг. 31, сверху) и образца FFPE (фиг. 31, снизу). При пиросеквенировании, как правило, используют порог 10-15% для установления стратификации пациентов. Мы использовали произвольно выбранный порог в 12,5 (между АСТВ и MGMT), чтобы можно было сопоставить результаты пиросеквенирования как можно ближе. Соответственно, в данном примере порог был установлен при ΔCt=12,5 и вычисленной согласованности с >15% метилирования. Анализ экстрагированной ДНК в картридже продемонстрировал чувствительность в 90% и специфичность в 86%, в то время как анализ образца FFPE в картридже продемонстрировал чувствительность в 88% и специфичность в 95%.
[0929] Отмечено, что специфичность может быть повышена двумя путями: 1) повышением температуры отжига, так как температуры отжига в 62°С была достаточно низкой. Дополнительно могут быть использованы зонды метилирования которые покрывают 3 (или более) CpG.
Пример 15
Детектирование метилирования BRCA1
BRCA1 представляет собой «защитный» (caretaker) ген, ответственный за репарацию ДНК. Считается, что BRCA1 вовлечен в гомологическую рекомбинацию, негомологичное соединение концов и эксцизионную репарацию нуклеотидов. Женщины с аберрантным геном BRCA1 имели 80%-ную вероятность развития рака молочной железы.
[0930] Без привязки к какой-либо конкретной теории считается, что метилирование BRCA1 является потенциальным прогностическим маркером ответа на химиотерапию у пациентов с тройным негативным РМЖ. Исследование на пациентах с НМКЛ раком, получающих цисплатин, показало, что те, у кого была низкая экспрессия BRCA1, имели более высокие коэффициенты выживаемости. Высокие уровни снижали эффективность химиотерапии за счет репарации повреждений, причиненных раковым клеткам.
[0931] Учитывая эти и другие наблюдения для определения метилирования BRCA1 были разработаны картриджи и способы применения. В частности, были оптимизированы условия ПЦР, как указано ниже: 1) Внешнюю температуру оценивали между 56-62°С, и мы остановились на методике ПЦР с 3-мя стадиями с отжигом при 56°С; 2) Внутреннюю температуру оценивали между 64°С-70°С, и мы остановились на методике ПЦР с 3-мя стадиями с отжигом при 68°С. Результаты представлены на фигуре 32.
4
[0932] Для BRCA1 был проведен анализ с одной мишенью при применении АСТВ в качестве гена контроля. Были исследованы восемь различных клеточных линий, и проведено сравнение эффекта при добавлении NH (см., фигуру 33). Ожидалось выявление метилирования BRCA1 в клеточной линии 3199.
Пример 16
Детекция метилирования генов, связанных с раком легкого.
[0933] Был проведен анализ метилирования генов с тремя мишенями в отношении генов, метилирование которых связано с раком легкого (SOX17, CD01, ТАС1) совместно с АСТВ в качестве гена контроля. Данные, представленные на фигуре 34, показывают, что, как и прогнозировалось, 3 мишени не выявляются в контроле плазмы здорового субъекта, но присутствуют в некоторой степени в трех разных клеточных линиях рака.
[0934] Следует понимать, что примеры и варианты реализации, представленные в настоящем описании, приведены исключительно в иллюстративных целях, и в свете указанных примеров и вариантов реализации специалистами в данной области техники могут быть предложены различные модификации или изменения, которые следует рассматривать как входящие в рамки сущности и объема настоящей заявки и объема прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> CEPHEID
<120> ОБЪЕДИНЕННАЯ ОЧИСТКА И ИЗМЕРЕНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК С СОВМЕСТНЫМ
ИЗМЕРЕНИЕМ МУТАЦИЙ И/ИЛИ УРОВНЕЙ ЭКСПРЕССИИ мРНК В АВТОМАТИЧЕСКОМ
РЕАКЦИОННОМ КАРТРИДЖЕ
<130> CPHDP011WO
<140> PCT/US2017/065905
<141> 2017-12-12
<150> 62/433,165
<151> 2016-12-12
<160> 390
<170> PatentIn, версия 3.5
<210> 1
<211> 162
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический полинуклеотид"
<400> 1
cgcgtttcgg atatgttggg atagttcgcg tttttagaac gttttgcgtt tcgacgttcg       60
taggttttcg cggtgcgtat cgtttgcgat ttggtgagtg tttgggtcgt ttcgttttcg      120
gaagagtgcg gagttttttt tcgggacggt ggtagtttcg ag                         162
<210> 2
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 2
gcgttgaagt cggggttc                                                     18
<210> 3
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 3
cccgtacttc gctaacttta aacg                                              24
<210> 4
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 4
acaaacgcga accgaacgaa acca                                              24
<210> 5
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 5
ttagggtaga ttgtggatat tag                                               23
<210> 6
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 6
atactaacaa ctatccaata caac                                              24
<210> 7
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 7
caggttgaaa ttagtatgtg ttattttggt atgg                                   34
<210> 8
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 8
aatagttcgt aagtttatcg gcg                                               23
<210> 9
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 9
cttcacgcca ccgataaccg a                                                 21
<210> 10
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 10
tacttacgcg aaactttacc gccga                                             25
<210> 11
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 11
gatttagagt tggatgtgtg gat                                               23
<210> 12
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 12
accaccatac taataatcaa atcta                                             25
<210> 13
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 13
aaatatcact catcaccaaa taaatccaa                                         29
<210> 14
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 14
gtaagaagac ggtcgaggcg                                                   20
<210> 15
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 15
acaactctac tcgccctcga a                                                 21
<210> 16
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 16
aacgaaccac ttctcgtacc aacga                                             25
<210> 17
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 17
tgtatgagtt tgtggtgaat aatg                                              24
<210> 18
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 18
aactcaccat caaacacttt ccc                                               23
<210> 19
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 19
tacaaaccca acatcctcta tctattc                                           27
<210> 20
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 20
gcgcgttaat cgtaggcgtt t                                                 21
<210> 21
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 21
cccaatacga tacgacctta ac                                                22
<210> 22
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 22
cgtaccttta aataacccgt aaaatcga                                          28
<210> 23
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 23
tttgttgatg ttttgtggaa gtaag                                             25
<210> 24
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 24
attcatcaat actttcaaat aacaca                                            26
<210> 25
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 25
caaatacatt atcctaccac taacaataca                                        30
<210> 26
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 26
cgggattttg ggttttcgtc g                                                 21
<210> 27
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 27
cgacgaataa cgacgcaaaa ac                                                22
<210> 28
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 28
aaccgaacga taacgaaaac gacgaa                                            26
<210> 29
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 29
gttagttttg tagtgtattg agtat                                             25
<210> 30
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 30
catcttccac aataaacttc caatt                                             25
<210> 31
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 31
taactccacc tattctacct accattt                                           27
<210> 32
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 32
cgtttagcgg gatgcggtga                                                   20
<210> 33
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 33
acacgaaaac cccgataacc g                                                 21
<210> 34
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 34
aaacactcat cgcaaccgcc gcg                                               23
<210> 35
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 35
ttagatgttg attggttgtg tttg                                              24
<210> 36
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 36
atcatcataa aactcaacaa tcaatt                                            26
<210> 37
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 37
ccaaacatca aatctttaac ttttaccaa                                         29
<210> 38
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 38
aggttgaaat tagtatgtgt tattttggta tgg                                    33
<210> 39
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 39
aggttgaaat tagtatgtgt tattttggta tgg                                    33
<210> 40
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 40
aggttgaaat tagtatgtgt tattttggta tgg                                    33
<210> 41
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 41
gttttatagt ttttgtattt agg                                               23
<210> 42
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 42
aactcaataa actcaaactc cc                                                22
<210> 43
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 43
gtgtgtgttt ttattgtaaa tgg                                               23
<210> 44
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 44
ataaaatttc ttcacrccac c                                                 21
<210> 45
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 45
gagggagtta gttgggttat                                                   20
<210> 46
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 46
cctccaaaaa atacataccc                                                   20
<210> 47
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 47
gtgtaattaa ttagaaggtt tttt                                              24
<210> 48
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 48
aacacctacc ttccaaatac                                                   20
<210> 49
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 49
ttagaggyga gagagtagtt                                                   20
<210> 50
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 50
aaactactac taaccrcctc                                                   20
<210> 51
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 51
aggagataty gttgagggga                                                   20
<210> 52
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 52
tcactcatac taaaccrcca a                                                 21
<210> 53
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 53
ttagggtaga ttgtggatat tagatagg                                          28
<210> 54
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 54
taatactaac aactatccaa tacaacac                                          28
<210> 55
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 55
ccgataaccg aaacgctctt ac                                                22
<210> 56
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 56
gcgttaatcg taggcgttt                                                    19
<210> 57
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 57
gtttagcggg atgcggtg                                                     18
<210> 58
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 58
acacgaaaac cccgataac                                                    19
<210> 59
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 59
gygtaattaa ttagaaggtt tttt                                              24
<210> 60
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 60
tcgtacgaag taaatagttc gtaag                                             25
<210> 61
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 61
ggatttttga aatattatag gattaattag                                        30
<210> 62
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 62
gttttatagt ttttgtattt agg                                               23
<210> 63
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)..(11)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 63
acaaacgcga naccgaacga aacca                                             25
<210> 64
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 64
ctggtttcgt tcggttcgcg                                                   20
<210> 65
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 65
caggttgaaa ttagtatgtg ttattttggt atgg                                   34
<210> 66
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 66
caaactactt acgcgaaact ttaccgcc                                          28
<210> 67
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 67
aaatatcact catcaccaaa ntaaatccaa                                        30
<210> 68
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 68
aaacgaacca cttctcgtac caacgac                                           27
<210> 69
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 69
caaacccaac atcctctatc tattc                                             25
<210> 70
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)..(13)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 70
acgcgtacct ttnaaataac ccgtaaaatc g                                      31
<210> 71
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 71
acgcgtacct ttaaataacc cgtaaaatcg                                        30
<210> 72
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 72
caaatacatt atcctaccac taacaataca                                        30
<210> 73
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 73
aaccgaacga taacgaaaac gacga                                             25
<210> 74
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 74
taactccacc tattctacct naccattt                                          28
<210> 75
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 75
caaacatcaa atctttaact tttac                                             25
<210> 76
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 76
cacgcgtacc tttaaataac ccgtaaaatc g                                      31
<210> 77
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 77
aaccgaacga taacgaaana cgacgaa                                           27
<210> 78
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 78
aaacactcat cgcaaccgcc gcg                                               23
<210> 79
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 79
taaccaccac ccaacacaca ataac                                             25
<210> 80
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 80
cccaactact taaaaaacta aaac                                              24
<210> 81
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 81
cacctaaaat caaaaattta aaacc                                             25
<210> 82
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 82
caaataattc tcctacctca acctc                                             25
<210> 83
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 83
cttaactcac tacaacctct acc                                               23
<210> 84
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 84
caaaccgaac gacgcgcaca aacac                                             25
<210> 85
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 85
gtatataggt tggggaagtt tg                                                22
<210> 86
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 86
aactatactc aaccaataaa acc                                               23
<210> 87
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 87
tgttatttag gttggagtgt ag                                                22
<210> 88
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 88
taataactca tacctataat ccc                                               23
<210> 89
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 89
ggttggagtg tagtggtata attttag                                           27
<210> 90
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 90
taataactca tacctataat cccaacac                                          28
<210> 91
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 91
gtagagatag ggttttatta tgttg                                             25
<210> 92
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 92
ggttttatta tgttggttag gttgg                                             25
<210> 93
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 93
gtattttggg aggttaaggt ag                                                22
<210> 94
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 94
atcttactct tattacccaa ac                                                22
<210> 95
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 95
ggttaaggta ggtagattat ttgagg                                            26
<210> 96
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 96
atcttactct tattacccaa actaaaatac                                        30
<210> 97
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 97
gttatttagg aggttgaggt ag                                                22
<210> 98
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 98
gaggtaggag aattatttga atttagg                                           27
<210> 99
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 99
atttgagatt tttgagttgg                                                   20
<210> 100
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 100
aaccctactc cctatctacg                                                   20
<210> 101
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 101
gcgcgcgttt ttttttgaag                                                   20
<210> 102
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 102
ggcgtagata gggagtaggg tt                                                22
<210> 103
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 103
gtgatggagg aggtttagta agtt                                              24
<210> 104
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 104
ccaataaaac ctactcctcc cttaa                                             25
<210> 105
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 105
ccataccaaa ataacacatc taatttcaac ct                                     32
<210> 106
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 106
caaatacatt atcctaccac taacaataca                                        30
<210> 107
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 107
cacgcgtacc tttaaataac ccgtaaaatc g                                      31
<210> 108
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 108
cacgcgtacc tttaaataac ccgtaaaatc g                                      31
<210> 109
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 109
ctaacaaaca caaaccaaac aaaacca                                           27
<210> 110
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 110
ctaacaaaca caaaccaaac aaaacca                                           27
<210> 111
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (20)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 111
aactacttac acaaaacttn taccaccaa                                         29
<210> 112
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 112
aactacttac acaaaacttt accac                                             25
<210> 113
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 113
aaacaaacca cttctcatac caacaac                                           27
<210> 114
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 114
cacatacctt taaataaccc ataaaatcaa c                                      31
<210> 115
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 115
cacatacctt taaataaccc ataaaatcaa c                                      31
<210> 116
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (24)..(24)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 116
caacaaaaac ccaaaatccc aacnaaacca ca                                     32
<210> 117
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 117
caaaatccca acaaaccaca taaca                                             25
<210> 118
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 118
aaacactcat cacaaccacc acacc                                             25
<210> 119
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 119
tggtgtgtta attgtaggtg tttt                                              24
<210> 120
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический лигонуклеотид"
<400> 120
cccaatacaa tacaacctta acc                                               23
<210> 121
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 121
gtggtgtgta ttgtgtagtg tta                                               23
<210> 122
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 122
caaaccaaac aataacaaaa acaac                                             25
<210> 123
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 123
tgtttagtgg gatgtggtga ag                                                22
<210> 124
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 124
acacaaaaac cccaataacc aca                                               23
<210> 125
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 125
gtttaaagtt agtgaagtat gggttt                                            26
<210> 126
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 126
tgtatgaagt aaatagtttg taagtttatt gg                                     32
<210> 127
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 127
tttgttgatg ttttgtggaa gtaag                                             25
<210> 128
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 128
attcatcaat actttcaaat aacaca                                            26
<210> 129
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 129
aaacgaacca cttctcgtac caacgac                                           27
<210> 130
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 130
caaacccaac atcctctatc tattc                                             25
<210> 131
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 131
aaacactcat cgcaaccgcc gcg                                               23
<210> 132
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 132
ccaaacatca aatctttaac ttttaccaa                                         29
<210> 133
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 133
aaacactcat cgcaaccgcc gcg                                               23
<210> 134
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 134
ggtgttgaag ttggggtttg                                                   20
<210> 135
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 135
cccatacttc actaacttta aac                                               23
<210> 136
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 136
gtaaatagtt tgtaagttta ttggtg                                            26
<210> 137
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 137
tttcttcaca ccaccaataa ccaa                                              24
<210> 138
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 138
gagtaagaag atggttgagg tg                                                22
<210> 139
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 139
caacaactct actcaccctc aa                                                22
<210> 140
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 140
tcccaactac ttaaaaaact aaaac                                             25
<210> 141
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 141
tcccaactac ttaaaaaact aaaac                                             25
<210> 142
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 142
tcccaactac ttaaaaaact aaaac                                             25
<210> 143
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 143
tcccaactac ttaaaaaact aaaac                                             25
<210> 144
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 144
tcccaactac ttaaaaaact aaaac                                             25
<210> 145
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 145
ggataagatt tttgatattg tattttttaa gg                                     32
<210> 146
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 146
catattcaaa ctccttaata aacaaacttt tctc                                   34
<210> 147
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 147
ccgaacaaaa aaaacctaaa taaatccctt c                                      31
<210> 148
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 148
ccaccaccca acacacaata acaaacac                                          28
<210> 149
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 149
ggtttagtaa gttttttgga ttgtg                                             25
<210> 150
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 150
ccttaaaaat tacaaaaacc acaac                                             25
<210> 151
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 151
ccaccaccca acacacaata acaaacac                                          28
<210> 152
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)..(13)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 152
ccaccaccca acnacacaat aacaaacac                                         29
<210> 153
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)..(16)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 153
ccaccaccca acacancaat aacaaacac                                         29
<210> 154
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 154
ttcagtgccg gttggtaatg taa                                               23
<210> 155
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 155
caacaacttt aatacctgtt tcaagga                                           27
<210> 156
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 156
ggtatttttg tatttgttgg tgttg                                             25
<210> 157
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 157
catacataca ccaaacaatt cattc                                             25
<210> 158
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 158
gtatggtggt atttttgtat ttgttg                                            26
<210> 159
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 159
cacacataca tacaccaaac aattc                                             25
<210> 160
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 160
aagatccgat tcacaganca agctccgtca                                        30
<210> 161
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 161
aagatccgat tcacaganca agctccgtca                                        30
<210> 162
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 162
caaaatcatt tccttcacaa atacactc                                          28
<210> 163
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 163
ccaaatacca taaccatttt attaataaca c                                      31
<210> 164
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 164
aaaatcattt ccttcacana atacactc                                          28
<210> 165
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 165
ccaaatacca taaccatntt tattaataac ac                                     32
<210> 166
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 166
ccctagtatg ctaggtctct tgctggga                                          28
<210> 167
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 167
cagcctctct gagggtttaa gccca                                             25
<210> 168
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 168
tcagcctatc tgacaccccg gg                                                22
<210> 169
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 169
gactcctgag gagaagtctg ccgtta                                            26
<210> 170
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 170
ccttgatacc aacctgccca ggg                                               23
<210> 171
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 171
aggtgaacgt ggatgaagtt ggtggtg                                           27
<210> 172
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 172
caacatcgcg caagagcacg g                                                 21
<210> 173
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 173
cgtttccttc acgagtacgc tctccga                                           27
<210> 174
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 174
accggcgaat acagagatac cg                                                22
<210> 175
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)..(13)
<223> a, c, t, g, неизвестно или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 175
ccaccaccca acnacacaat aacaaacac                                         29
<210> 176
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 176
gttggtgttg gagagtgtat ttg                                               23
<210> 177
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 177
ggagagtgta tttgtgaagg aaatg                                             25
<210> 178
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 178
ggaaatgatt ttttttatga gatgagtg                                          28
<210> 179
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)..(16)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 179
ccaccaccca acacancaat aacaaacac                                         29
<210> 180
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)..(16)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 180
ccaccaccca acacancaat aacaaacac                                         29
<210> 181
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 181
ccaccaccca acacacaata acaaacac                                          28
<210> 182
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 182
gatggaggag gtttagtaag ttttt                                             25
<210> 183
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 183
aataaaacct actcctccct taaaaa                                            26
<210> 184
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> Универсальный пурин
<400> 184
cttaccataa ctactacnct cc                                                22
<210> 185
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 185
cttaccataa ctactacrct cc                                                22
<210> 186
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 186
gtgtgtgttt ttattgtaaa tggt                                              24
<210> 187
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)..(4)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)..(10)
<223> Универсальный пурин
<400> 187
aacnataacn ataaaatttc ttcac                                             25
<210> 188
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 188
aacrataacr ataaaatttc ttcac                                             25
<210> 189
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)..(7)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 189
gtttgtnggg attttgggt                                                    19
<210> 190
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 190
gtttgtyggg attttgggt                                                    19
<210> 191
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)..(3)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)..(10)
<223> Универсальный пурин
<400> 191
ccnaactccn aaaaaaaaac c                                                 21
<210> 192
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 192
ccraactccr aaaaaaaaac c                                                 21
<210> 193
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)..(10)
<223> Универсальный пиримидин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)..(12)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 193
ggtattaagn gnggtttttt g                                                 21
<210> 194
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 194
ggtattaagy gyggtttttt g                                                 21
<210> 195
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)..(3)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 195
gtngtttagt ttggattttg g                                                 21
<210> 196
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 196
gtygtttagt ttggattttg g                                                 21
<210> 197
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 197
tttcgaaggg taagcgttaa g                                                 21
<210> 198
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)..(14)
<223> Универсальный пурин
<400> 198
aacataaata accnaaataa cc                                                22
<210> 199
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 199
aacataaata accraaataa cc                                                22
<210> 200
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 200
cggttttttg agtaagaaga cggtc                                             25
<210> 201
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)..(17)
<223> Универсальный пурин
<400> 201
tacctttaaa taacccntaa aatcgacaa                                         29
<210> 202
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 202
tacctttaaa taacccrtaa aatcgacaa                                         29
<210> 203
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)..(17)
<223> Универсальный пурин
<400> 203
ataacaaact acttacncga aactttac                                          28
<210> 204
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 204
ataacaaact acttacrcga aactttac                                          28
<210> 205
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)..(9)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 205
aacaaaccna acgataacna aaac                                              24
<210> 206
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 206
aacaaaccra acgataacna aaac                                              24
<210> 207
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 207
cacattctaa taaaaaacna accacttc                                          28
<210> 208
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)..(5)
<223> Универсальный пурин
<400> 208
aaccnaacga aaccacaaaa c                                                 21
<210> 209
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 209
aaccraacga aaccacaaaa c                                                 21
<210> 210
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 210
caaaaacact catcncaacc gcc                                               23
<210> 211
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 211
acaaccctcc aaaaaataca ta                                                22
<210> 212
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 212
ccaaatacca taaccatttt attaataaca c                                      31
<210> 213
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 213
ccaaatacca taaccatttt attaataaca c                                      31
<210> 214
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (4)..(4)
<223> Универсальный пиримидин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 214
tttngaaggg taagngttaa g                                                 21
<210> 215
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 215
tttygaaggg taagygttaa g                                                 21
<210> 216
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)..(7)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)..(16)
<223> Универсальный пурин
<400> 216
caacacnaaa accccnata                                                    19
<210> 217
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 217
caacacraaa accccrata                                                    19
<210> 218
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 218
cctgctgaaa atgactgaat ataaccgcta agaacctctc ggtcagctga t                51
<210> 219
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 219
cctgctgaaa atgactgaat ataaagtctc attataatcg ttcgagctgt t                51
<210> 220
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 220
cctgctgaaa atgactgaat ataagcagac ttggcggtag gtccgagctt g                51
<210> 221
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 221
cctgctgaaa atgactgaat ataagtatcc tgagcacggt tgcgagctgc t                51
<210> 222
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 222
ctcttgccta cgccnccgct aagaacctct cggtc                                  35
<210> 223
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 223
ctcttgccta cgccnagtct cattataatc gttcg                                  35
<210> 224
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 224
ctcttgccta cgccngcaga cttggcggta ggtcc                                  35
<210> 225
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 225
ctcttgccta cgccngtatc ctgagcacgg ttgcg                                  35
<210> 226
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 226
ccaccaccca acacacaata acaaacac                                          28
<210> 227
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 227
cccrcaaacc rcgaaaacct c                                                 21
<210> 228
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 228
gtttttttty gggagaggta aata                                              24
<210> 229
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 229
crcctccraa actaaaacaa c                                                 21
<210> 230
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 230
gggttattgt aaagttaggg tg                                                22
<210> 231
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)..(6)
<223> Универсальный пиримидин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 231
gaggtngtgg ttttngtaga t                                                 21
<210> 232
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (5)..(5)
<223> Универсальный пурин
<400> 232
aaacnccaaa aaacttcaaa ac                                                22
<210> 233
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 233
ttttgttggg ataagaagng ttt                                               23
<210> 234
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 234
accaaaaact attacaaaac caaa                                              24
<210> 235
<211> 13
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 235
ccgacgaccg acg                                                          13
<210> 236
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 236
gggagaggta aatatcgata c                                                 21
<210> 237
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 237
cgcgaaaatt aatacctaac g                                                 21
<210> 238
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 238
ttagggtgcg ttatcggac                                                    19
<210> 239
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 239
cggaggtgtt tgttttcgtc                                                   20
<210> 240
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 240
cgaaaaaaac aaacaccgac acg                                               23
<210> 241
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 241
cgttttcggg gttgaggtaa c                                                 21
<210> 242
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 242
ccaaaatacg ctaccgaacg a                                                 21
<210> 243
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (16)..(16)
<223> Универсальный пурин
<400> 243
aaaatatcta cccccncc                                                     18
<210> 244
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 244
tattactcac tctactcaaa actctcc                                           27
<210> 245
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 245
atatctttta ccaacaaata ccttcaaa                                          28
<210> 246
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)..(6)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 246
gttttngttt tggttgcgat gttgt                                             25
<210> 247
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 247
gggatttttt agaagagngg t                                                 21
<210> 248
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> Универсальный пурин
<400> 248
tactcactaa taacnaaaac tac                                               23
<210> 249
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 249
ggttttgtgt tttattgngg ag                                                22
<210> 250
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)..(7)
<223> Универсальный пурин
<400> 250
cctaacnaac tacaccaata caa                                               23
<210> 251
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)..(17)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 251
gagaggggat tttttgngtt t                                                 21
<210> 252
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (3)..(3)
<223> Универсальный пурин
<400> 252
ccnaaaacca attctaaact aatc                                              24
<210> 253
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 253
tttttagaag agcggtcggc                                                   20
<210> 254
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 254
ctaataacga aaactacgac gacg                                              24
<210> 255
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 255
ttgtgtttta ttgcggagtg c                                                 21
<210> 256
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 256
aaccacatat cgatcacgta cg                                                22
<210> 257
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 257
gcgttttcgg attttagggt c                                                 21
<210> 258
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<400> 258
aactaatcgc cttaaataaa ataccg                                            26
<210> 259
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)..(6)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)..(17)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 259
cctccnaacc ttataanaaa taatccc                                           27
<210> 260
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)..(7)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)..(17)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 260
aaaaacnccc taatccncat ccaac                                             25
<210> 261
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 261
cacttaactt cctctccaaa aatctaaac                                         29
<210> 262
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)..(11)
<223> Универсальный пиримидин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 262
gtttttagaa ngttttgngt tt                                                22
<210> 263
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 263
gtttttagaa ygttttgygt tt                                                22
<210> 264
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)..(11)
<223> Универсальный пурин
<400> 264
aaaaaactcc ncactcttcc                                                   20
<210> 265
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 265
aaaaaactcc rcactcttcc                                                   20
<210> 266
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 266
tttcgacgtt cgtaggtttt cgc                                               23
<210> 267
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 267
gcactcttcc gaaaacgaaa cg                                                22
<210> 268
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 268
ccaaacactc accaaatcnc aaac                                              24
<210> 269
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 269
ccaaacactc accaaatcnc aaac                                              24
<210> 270
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 270
atatctttta ccaacaaata ccttcaaa                                          28
<210> 271
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (6)..(6)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 271
gttttngttt tggttgcgat gttgt                                             25
<210> 272
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)..(9)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 272
ggagataang gggtttttgg                                                   20
<210> 273
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> Универсальный пурин
<400> 273
cactaaaaat ataccaacna cc                                                22
<210> 274
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 274
ggagagttat ttaagaaagg tgg                                               23
<210> 275
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)..(9)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)..(11)
<223> Универсальный пурин
<400> 275
aaaattacnc naaacccac                                                    19
<210> 276
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 276
cgtgttcgta gggttttttc gttttc                                            26
<210> 277
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 277
ccaacgaccc tcgaaaaaaa aacg                                              24
<210> 278
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 278
gattttgcgg gtacggttta cgc                                               23
<210> 279
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 279
gatccctaaa acgccgaaaa caacg                                             25
<210> 280
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 280
cgttattttt tttgggtggt ttttcg                                            26
<210> 281
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (2)..(2)
<223> Универсальный пурин
<400> 281
cnaaaaacca cccaaaaaaa ataac                                             25
<210> 282
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
Синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)..(11)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 282
ggataaatat ngtaaggtat tgag                                              24
<210> 283
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 283
cgaaatacta aatttctcta attcctc                                           27
<210> 284
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (19)..(19)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 284
gagttttttt ggttttttng ag                                                22
<210> 285
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> Универсальный пурин
<400> 285
ctaaaataaa taccncaaaa cac                                               23
<210> 286
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 286
cgcgttcgga tttttttttc ggc                                               23
<210> 287
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 287
aaatttctct aattcctccg aacgcacg                                          28
<210> 288
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 288
gcgtacgttg gtcgtttcgt attttc                                            26
<210> 289
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 289
gcaaaacact aaacaaacga aaaaacgcg                                         29
<210> 290
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)..(9)
<223> Универсальный пиримидин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)..(17)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 290
gtagttatng agagtgngga gcgattag                                          28
<210> 291
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)..(7)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (20)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 291
ctaatcnctc cgcactctcn ataactac                                          28
<210> 292
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (9)..(9)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 292
gtttggagng ttatgagtag                                                   20
<210> 293
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (13)..(13)
<223> Универсальный пурин
<400> 293
cttcatatcc ccnataaaac tc                                                22
<210> 294
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 294
gggtttttag tcggtttagt g                                                 21
<210> 295
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (8)..(8)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)..(17)
<223> Универсальный пурин
<400> 295
ctaaaacnta aaactcnaac c                                                 21
<210> 296
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 296
gatttagagc gcgttgttcg c                                                 21
<210> 297
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 297
catatccccg ataaaactca acgactcg                                          28
<210> 298
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 298
gtcggtttag tgatattgcg ggc                                               23
<210> 299
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 299
ccacgaccta aacgtaaacc taacg                                             25
<210> 300
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (7)..(7)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 300
gatggtnggg ttgggttttt gtttttgg                                          28
<210> 301
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 301
ccaaaaacaa aaacccaacc cgaccatc                                          28
<210> 302
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (11)..(11)
<223> Универсальный пиримидин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (20)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 302
cgtatatttt nggttttttn gggtttcg                                          28
<210> 303
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (2)..(2)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 303
cnaaacccga aaaaaccnaa aatatac                                           27
<210> 304
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (10)..(10)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 304
ggtagttgtn gtcgggaagg aggttcg                                           27
<210> 305
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (2)..(2)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (18)..(18)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 305
cnaacctcct tcccgacnac aactacc                                           27
<210> 306
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 306
ggtttttttt gtatagatgt ggttaatgg                                         29
<210> 307
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 307
ccattaacca catctataca aaaaaaacc                                         29
<210> 308
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (15)..(15)
<223> Универсальный пиримидин
<400> 308
ggtttggttt atagngtatt tagg                                              24
<210> 309
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 309
gaggtttagt aagttttttg gattgtg                                           27
<210> 310
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 310
cccttaaaaa ttacaaaaac cacaac                                            26
<210> 311
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 311
gtagattggg tggttaattt agag                                              24
<210> 312
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (12)..(12)
<223> Универсальный пурин
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (14)..(14)
<223> Универсальный пурин
<400> 312
ctataattcc cncncttttc                                                   20
<210> 313
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 313
ggtggttaat ttagagtttc gagagac                                           27
<210> 314
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 314
cgttaccacg aaaaccaaaa aactaccg                                          28
<210> 315
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 315
gatttcgtat tttgagaggt tgttgtttag                                        30
<210> 316
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 316
ctaaacaaca acctctcaaa atacgaaatc                                        30
<210> 317
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 317
ggtagattgg gtggttaatt tagag                                             25
<210> 318
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 318
ccaaaaaatc tcaacraact c                                                 21
<210> 319
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 319
gggtggttaa tttagagttt cgagagac                                          28
<210> 320
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 320
accacgaaaa ccaaaaaact accg                                              24
<210> 321
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 321
gggattttgt ttaagtatgt taaagg                                            26
<210> 322
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 322
cctaccttac ctctaaatac caacc                                             25
<210> 323
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 323
gtatgttaaa gggttgttgt aagttaagg                                         29
<210> 324
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 324
cctctaaata ccaaccccaa acc                                               23
<210> 325
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 325
ccaactactc caaaaaactt ccaaaaacc                                         29
<210> 326
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 326
ccaactactc caaaaaactt ccaaaaacc                                         29
<210> 327
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 327
gtatgttaaa gggttgttgt aagttaagg                                         29
<210> 328
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 328
cctctaaata ccaaccccaa acc                                               23
<210> 329
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 329
ccaccaccca acacacaata acaaacac                                          28
<210> 330
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 330
ccaccaccca acacacaata acaaacac                                          28
<210> 331
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 331
atttagagcg cgttgttcgc                                                   20
<210> 332
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 332
atatccccga taaaactcaa cgactcg                                           27
<210> 333
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 333
tatccccgat aaaactcaac gactcg                                            26
<210> 334
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 334
atccccgata aaactcaacg actcg                                             25
<210> 335
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 335
gcgttcggat ttttttttcg gc                                                22
<210> 336
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 336
tttctctaat tcctccgaac gcacg                                             25
<210> 337
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 337
ctctaattcc tccgaacgca cg                                                22
<210> 338
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 338
gtgacgatta gagttagatt tagagcgc                                          28
<210> 339
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 339
gtagttatcg agagtgcgga gcgattag                                          28
<210> 340
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 340
ccaacccgac catcaccgcg aacaac                                            26
<210> 341
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 341
ggagagtgta tttgtgaagg aaatg                                             25
<210> 342
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 342
catacataca ccaaacaatt cattc                                             25
<210> 343
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 343
ccaaatacca taaccatttt attaataaca c                                      31
<210> 344
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 344
ccaaatacca taaccatttt attaataaca c                                      31
<210> 345
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 345
ggtttygttg gggatttg                                                     18
<210> 346
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 346
accrctcttc taaaaaatcc                                                   20
<210> 347
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 347
aggttttttc ggttagttgc gc                                                22
<210> 348
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 348
aacgtcgacc gcaaaaaaac g                                                 21
<210> 349
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 349
cgcgatttcg gggattttag g                                                 21
<210> 350
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 350
cctaaaatcc ccgaaatcgc                                                   20
<210> 351
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 351
gaagtagttg tgtaattygt tgg                                               23
<210> 352
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 352
caccctaacr aactacacc                                                    19
<210> 353
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 353
tgcggattag ggcgtttttt attttc                                            26
<210> 354
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 354
tacaaccaca tatcgatcac gtacg                                             25
<210> 355
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 355
ggagttcgtc gattggttgg g                                                 21
<210> 356
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 356
cccaaccaat cgacgaactc c                                                 21
<210> 357
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 357
gagtttttyg gagggttata g                                                 21
<210> 358
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 358
caaactacaa aaaacattca atcc                                              24
<210> 359
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 359
gcgtttgggt tttttcggtg tc                                                22
<210> 360
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 360
atcgccgcaa ttaaaaaacc cg                                                22
<210> 361
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 361
ggttcgcgtt ttaattttta ggtattg                                           27
<210> 362
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 362
caatacctaa aaattaaaac gcgaacc                                           27
<210> 363
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 363
gttatggatt yggaygttag                                                   20
<210> 364
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 364
ctccracraa caatcactc                                                    19
<210> 365
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 365
gtttggtgtt tagtcgttcg tc                                                22
<210> 366
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 366
cactcgaaat aaacgaaaac acg                                               23
<210> 367
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 367
ggtagtagcg gtagcgtttt tattg                                             25
<210> 368
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 368
caataaaaac gctaccgcta ctacc                                             25
<210> 369
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 369
ggygtagttt atttyggtt                                                    19
<210> 370
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 370
atttaaccra ctcraccaac                                                   20
<210> 371
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 371
gtatgtttcg cggtttcgta gttc                                              24
<210> 372
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 372
actaaaccta acgttcgaaa cg                                                22
<210> 373
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 373
cgttcgttcg gtgtattttt ttttcgg                                           27
<210> 374
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 374
ccgaaaaaaa aatacaccga acgaac                                            26
<210> 375
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 375
gtttgagttg ttttgatttt agtg                                              24
<210> 376
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 376
ctccaacctc aactctaaac                                                   20
<210> 377
<211> 26
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 377
gattttagtg tcgcgtattt tggttc                                            26
<210> 378
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 378
ctaaactaaa tcccgcgaac ctcg                                              24
<210> 379
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (17)..(17)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 379
ggttttattg ggggttnatt tcgggtag                                          28
<210> 380
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<220>
<221> модифицированное основание
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другой
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Подробное описание замен и предпочтительных
вариантов реализации см. в поданной заявке"
<400> 380
ctacccgaaa taacccccaa ntaaaacc                                          28
<210> 381
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 381
ggtttttagt atttttayga aggt                                              24
<210> 382
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 382
cratacraaa acctactctc ta                                                22
<210> 383
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 383
tttggatttt gttcgtcgtt agtgc                                             25
<210> 384
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 384
ctactctcta aacccgcgaa cg                                                22
<210> 385
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 385
ggttttagtc gtcgcggacg atgt                                              24
<210> 386
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 386
acatcgtccg cgacgactaa aacc                                              24
<210> 387
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 387
gagttagatt tagagcgcgt tgttc                                             25
<210> 388
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 388
gagcgcgttc ggattttttt ttc                                               23
<210> 389
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 389
tggygggggt agatatttt                                                    19
<210> 390
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности:
синтетический олигонуклеотид"
<400> 390
tctactcaaa actctcccct ctcc                                              24
<---