СПОСОБ ОТБОРА IN VITRO КИСЛОТОВЫНОСЛИВЫХ ФОРМ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО (TRIFOLIUM PRATENSE L.)
METHOD OF SELECTING IN VITRO ACID-TOLERANT FORMS OF RED CLOVER (TRIFOLIUM PRATENSE L.)

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции растений для получения кислотовыносливых форм клевера лугового, в исследованиях по физиологии и генетике растений.
Известен способ отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового методом рулонной культуры [1].
К недостаткам данного способа можно отнести следующее. Способ ограничен отбором кислотоустойчивых форм, но не содержит сведений о вегетативном размножении полученных форм и не обеспечивает длительное сохранение ценных кислотоустойчивых форм, что снижает воспроизводимость контролируемых скрещиваний и проведение генетических исследований признака кислотоустойчивости у такого строгого перекрестно-опыляемого растения, как клевер луговой.
В литературе имеются сведения о способе отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового по рН клеточного сока [2].
К недостаткам данного способа следует отнести то, что он не содержит сведения о микроразмножении ценных кислотоустойчивых генотипов клевера лугового. Это не позволяет длительно сохранять отобранные формы.
Известен способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового [3]. К недостаткам данного способа можно отнести следующее. Число кислотоустойчивых форм в популяциях сортообразцов, отобранных данным способом (образец 30 ВИК 7) варьирует и может не превышать 7,4%. Это значительно обедняет популяцию по другим, не менее ценным селекционным признакам (высокая семенная и кормовая продуктивность, раннеспелость, устойчивость к болезням), не коррелирующих с признаком кислотоустойчивости.
Цель изобретения - разработка способа отбора in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового.
5
3+
3+
3+
В предлагаемом способе поставленная цель достигается получением морфогенной ткани путем субкультивирования эпикотилей проростков без корней и с корнями менее 4-5 мм с селективной питательной агаризованной среды Гамборга В с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al на среду того же состава, но без Al. Оценку кислотовыносливости морфогенной ткани проводят по индексу роста (не ниже 5,0) через 3-4 недели повторного культивирования эксплантов (кусочки морфогенной ткани) на селективной среде с 100 мг/л Al и способности образовавшихся из морфогенной ткани растений-регенерантов выживать после 3-4 скашиваний в грунтовой теплице в течение не менее 3-х лет вегетации.
3+
5
Способ осуществляется следующим образом: из сортообразцов клевера лугового с низкой устойчивостью к почвенной кислотности проводили отбор in vitro генотипов, выдерживающих концентрацию селективного фактора Al 100 мг/л в питательной среде Гамборга В. Среду и соль алюминия стерилизовали раздельно автоклавированием в течение 30 минут при 1,25 атм., а затем смешивали в стерильных условиях до момента застывания среды.
5
5
5
3+
3+
3+
3+
Морфогенную ткань получали путем субкультивирования эпикотилей проростков без корней и с корнями менее 4-5 мм с селективной питательной агаризованной среды Гамборга В с 2 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al на среду того же состава, но без Al. Индекс роста определяли через 3-4 недели после повторного культивирования эксплантов (кусочки морфогенной ткани) на питательной агаризованной среде Гамборга В с 100 мг/л Al. Изучали морфобиологические показатели растений-регенерантов клевера лугового, образовавшихся в морфогенной ткани с различным индексом роста на селективной среде Гамборга В с 100 мг/л Al и выживших после 3-4 скашиваний в течение 3 лет вегетации в грунтовой теплице.
Пример 1.
3+
Изучение токсического влияния Al на корнеобразовательную способность проростков клевера лугового в культуре in vitro.
2
5
2
2
2
3
3+
Исследования проводили на F потомстве растений клевера лугового с низкой кислотоустойчивостью (табл. 1). Число генотипов с корнями ≥4 мм на селективной агаризованной среде Гамборга В с 100 мг/л Al было незначительным у FI 0,9; у FII 18,3 и у FIII 7,4, что составляло 2,1; 59,2 и 23,9 процентов к контролю (среда без Al) соответственно.
2
2
2
2
2
2
2
3+
3+
Наибольшее число проростков в популяциях F потомства при проращивании на среде с 100 мг/л Al было без корней и с корнями менее 4,0 мм (31,1 и 7,1 у FI; 20,7 и 11,0 у FII и 32,0 и 10,6 у FIII), т.е. 444,3% и 788,9% у FI; 279,7% 94,0% у FII; 400,0% и 96,4% у FIII по отношению к контролю (среда без Al).
В связи с низким числом кислотоустойчивых генотипов клевера лугового, отобранных ранее разработанным способом, возникла необходимость в дальнейших исследованиях по увеличению числа генотипов клевера лугового для селекции на кислотовыносливость.
Пример 2.
2
2
2
2
5
2
2
3+
3+
3+
Проводили сравнительную оценку кислотовыносливости in vitro трех популяций F генотипов клевера лугового (FI, FII, FIII). Для чего асептически выращенные экспланты клевера лугового после взвешивания культивировали 3-4 недели на агаризованной среде Гамборга В с 2 мг/л 6-бензиламинопурина с 0 (контроль), 50 и 100 мг/л Al до образования морфогенной ткани с побегами. При определении индекса роста (ИР) получены следующие результаты (табл. 2). Наибольший ИР на селективной среде с 100 мг/л Al отмечался у морфогенной ткани FI (в среднем 7,3 при 41,0% к контролю (среда без Al), наименьший - у FIII (в среднем 2,9 при 37,1% к контролю).
Побеги с корнями, образовавшиеся в морфогенной ткани клевера лугового с индексом роста не ниже 5,0 высаживали из чашек Петри в кассеты для выращивания растений с почвой (рН 4,1), а затем в почву с нормальной кислотностью в грунтовой теплице при индивидуальном стоянии.
Пример 3.
2
2
2
2
2
2
2
3+
Проводили сравнительное изучение морфобиологических показателей в вегетационном опыте F поколения растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с различным индексом роста на селективной среде с 100 мг/л Al. Число выживших растений-регенерантов клевера лугового, полученных из морфогенной ткани с индексом роста не менее 5 после трех скашиваний в течение трех лет вегетации в вегетационном опыте на почве с нормальной кислотностью составляет FI 84,1%; у FII - 89,1%; FIII - 69,3%, что значительно превышает этот показатель у растений-регенерантов, полученных из морфогенной ткани с ИР ниже 5 (FI - в 4,1 раза; FII - 6,2 раза; FIII - 3,8 раза) (табл. 3). При этом эти растения превосходят и по высоте в 2,5-5,9 раза, в 2,0-4,3 раза по числу стеблей и в 2,5-2,6 раза по числу соцветий.
Все это свидетельствует о том, что растения-регенеранты клевера лугового, полученные из морфогенной ткани с ИР не менее 5,0 обладают большей кислотовыносливостью, чем полученные из морфогенной ткани с ИР ниже 5,0.
3+
Таким образом, разработанный способ позволяет проводить отбор in vitro кислотовыносливых форм клевера лугового по индексу роста морфогенной ткани, что значительно увеличивает число генотипов клевера лугового, способных преодолевать токсическое влияние Al и повышенной кислотности среды и формировать растения с высокой кормовой и семенной продуктивностью.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Онучина О.Л., Тумасова М.И. Методы и результаты селекции клевера лугового на повышенную кислотоустойчивость // Кормопроизводство. - 2007. -№4. - с. 27-28.
2. Пат. 2138154 РФ, МПК А01Н 1/04. Способ отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового / Новоселов М.Ю., Пайвин С.Г. (РФ) - №9810620/13; заявлено 15.01.1998; опубл. 27.09.1999. - Бюл. №27. - 5 с.
3. Пат. 2583304 РФ. МПК А01Н 1/04. Способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового / Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н., Лапотышкина Л.И. (РФ) - №2014151553/10; заявлено 19.12.2014; опубл. 10.05.2016. - Бюл. №13.