Фармакодинамическое действие полусинтетических макролидов на состояние антиинфекционной защиты в условиях острого пакреатита

УДК 615.272.4.03:616.37-002.1

ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛУСИНТЕТИЧЕСКИХ МАКРОЛИДОВ НА СОСТОЯНИЕ АНТИИНФЕКЦИОННОЙ ЗАЩИТЫ В УСЛОВИЯХ ОСТРОГО ПАКРЕАТИТА

© Хмелевская Ю.В., Смахтин М.Ю., Конопля Е.Н.

Кафедра пропедевтики внутренних болезней, кафедра биологической химии Курского государственного медицинского университета

Антибиотики группы макролидов (кларитромицин, рокситромицин, азитромицин) не обладали имму-носупресирующим действием в условиях экспериментальной модели острого панкреатита. Азитромицин более выраженно по сравнению с другими макролидами повышал сниженную в условиях экспериментального панкреатита фагоцитарную и кислородзависимую активность нейтрофилов и обладал стимулирующим действием в отношении гуморального иммунного ответа. Использование традиционного лечения в сочетании с азитромицином в клинических условиях приводило к нормализации уровня ИЛ-6, кислородза-висимой активности нейтрофилов и повышало их фагоцитарную активность.

Ключевые слова: острый панкреатит, функциональная активность нейтрофилов, интерлейкины, гуморальный иммунный ответ.

HARFSYNTHETIC MACROLIDES PHARMACODINAMIC ACTION ON ANTIINFECTION DEFENCE IN CASE OF ACUTE PANCREATITIS

Khmelevskaya Yu. V., Smakhtin M. Yu., Konoplya E.N.

Propedeutic of Internal Diseases Department, Biochemistry Department of the Kursk State Medical University

The macrolides (Klaritromycine, Roksitromycine, Azitromycine) didn't have immunosuppressive effects in acute experimental pancreatitis. Azitromycine was the most active macrolide to increase the neutrophile function and humoral immune response in experimental pancreatitis. In the patients' blood the traditional treatment in combination with Azitromycine corrected both the level of IL-6 and the blood neutrophile oxidative activity and increased their phagocytic activity.

Key words: acute pancreatitis, neutrophile functional activity, interleukins, humoral immune response.

Как показывают материалы последних всероссийских конференций по хирургии, острый панкреатит постепенно выходит на первое место в структуре острой хирургической патологии. Причем инфицирование очагов деструкции в поджелудочной железе происходит у 40-70% больных панкреонекрозом в различные сроки заболевания [11], а доля инфекционных осложнений среди причин смерти больных панкреонекрозом составляет 80% [12]. Высокая летальность при острых панкреатитах свидетельствует о необходимости поиска новых путей в решении этой проблемы. Для профилактики гнойно-септических осложнений при острых панкреатитах назначаются антибактериальные препараты [2, 4]. В то же время используемые в клинике антибиотики обладают иммуносу-прессирующей активностью и могут ухуд-

шить состояние антиинфекционной защиты организма [4].

В последнее время одной из наиболее динамично развивающихся групп антибиотиков считаются полусинтетические макролиды [7, 10, 13]. Разработаны новые представители этой группы, обладающие улучшенными фармакокинетическими свойствами и переносимостью. Несмотря на то что исследования последних лет привели к существенному расширению их фармакологических эффектов, потенциальные возможности этих препаратов далеко не исчерпаны. Изучение новых свойств макролидов, в частности иммуно-тропных эффектов, связано со способностью этих препаратов накапливаться преимущественно в фагоцитирующих клетках и таким образом влиять на их функциональную активность [10, 13]. Кроме того, хорошо из-

вестны противовоспалительные эффекты макролидов [9], которые обусловлены их влиянием на секрецию провоспалительных цитокинов [7, 8]. Вместе с тем эффекты этих препаратов и механизмы их реализации в условиях острого панкреатита практически не изучены, что может быть полезным для расширения возможностей антибактериальной профилактики при остром панкреатите.

Целью исследования было изучение на экспериментальной модели острого панкреатита и в клинике иммунотропных эффектов полусинтетических макролидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на крысах-самцах Вистар массой 180-200 г.

Экспериментальный острый панкреатит моделировали под гексеналовым наркозом путем введения 0,5 мл 5% раствора тритона X-100 в паренхиму поджелудочной железы [1, 3]. Морфологически в ткани поджелудочной железы наблюдалось развитие некроза. Развитие панкреатита подтверждалось морфологически. В экспериментах были использованы препараты азитромицин (сумамед -Pliva, Хорватия), кларитромицин (клацид -Sanofi aventis, Франция), которые применяли в дозе 10 мг/кг массы животного, и роксит-ромицин (рулид - Roussel Uc-laf, Франция) -в дозе 3 мг/кг. Препараты вводили внутриже-лудочно в течение 5 дней начиная со дня моделирования острого панкреатита. Первое введение осуществляли через 12 часов после постановки эксперимента.

Активность неспецифических факторов антиинфекционной защиты организма оценивали по фагоцитарной и кислородзависимой активности нейтрофилов периферической крови. Поглотительную стадию фагоцитоза исследовали после инкубации с латексом [5, 6]. Фагоцитарный индекс (ФИ, процент ней-трофилов, участвующих в фагоцитозе) и фагоцитарное число (ФЧ, среднее количество поглощенных частиц латекса на один фагоцит) определяли в мазках, окрашенных по Романовскому [6]. Активность кислородзави-симых механизмов защиты в фагоцитах оценивали в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), в котором в качестве

стимулятора использовали зимозан. При микроскопии определяли количество (в %) диформазан-положительных клеток [5]. Выраженность гуморального иммунного ответа (ГИО) оценивали у крыс по количеству анти-телообразующих клеток (АОК) в селезенке на 5-й день после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) в расчете на 106 ядерных клеток и на весь орган [5].

Клиническая часть исследований выполнена на базе хирургического отделения НУЗ отделенческой больницы ст. Курск ОАО «РЖД». Под наблюдением находилось 22 пациента с диагнозом мелкоочаговый панкрео-некроз в возрасте от 24 до 55 лет (средний возраст - 34 года). Больные были разделены на 2 группы. 1-я группа (11 пациентов) получала базовое лечение (инфузионная терапия, спазмолитики, анальгетики и т.д.), а из антибиотиков - цефазолин (по 1 г 4 раза в сутки 710 дней). Во 2-й группе (11 пациентов) в качестве антибактериального средства был использован азитромицин (500 мг в сутки, однократно 3-5 дней). Контрольную группу составили 10 здоровых доноров добровольцев.

Для анализа у пациентов забирали периферическую кровь из кубитальной вены в момент поступления в стационар и при выписке (10-14 сутки). Пациенты в анализируемую группу включались на основании информированного согласия. В плазме крови определяли содержание ФНОа, ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-4 методом иммуноферментного анализа с помощью многоканального фотометра "Ми1-ЙБкап МСС-340" ("ЬаЬ8у81еш8", Финляндия). Оценка их уровня проводилась с помощью набора реагентов РгоСоп (ООО "Протеиновый контур", г. Санкт-Петербург). Так же, как и у экспериментальных животных, определяли функциональную активность нейтрофилов крови (фагоцитоз, НСТ-тест). Функциональный резерв расчитывали как разность показателей стимулированного и спонтанного НСТ-теста [5, 6].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Через 5 дней после моделирования острого панкреатита выявлено значительное снижение всех показателей нейтрофильного звена антиинфекционной защиты (табл. 1).

Таблица 1

Иммунотропные эффекты макролидов (M±m) в условиях экспериментальной модели

острого панкреатита

№ п/п Условия опыта Фагоцитарный индекс (%) Фагоцитарное число, абс. Спонтанный НСТ-тест (%) Стимулированный НСТ-тест (%) АОК на 106 ядерных клеток АОК, 103 на селезенку

1. Интактные 39,4±4,3 4,1±0,2 13,8±1,1 45,5±4,9 36,7±4,2 26,3±2,4

2. Ложная

лапарато- 41,2±5,3 4,4±0,3 14,4±1,3 46,9±5,1 36,3±4,8 27,1±3,3

мия

3. Острый панкреатит 20,3±2,3*и 2,1±0,2*1'2 6,1±1,1*12 25,2±4,3*и 10,1±1,7*12 8,2±1,5#1'2

4. Острый

панкреатит + кла- 21,4±2,2*и 2,3±0,2*u 6,3±1,2*1'2 27,3±3,8*и 12,4±2,1#1'2 9,0±1,4#1'2

ритроми-

цин

5. Острый

панкреатит + рок- 24,7±3,0*и 2,4±0,2*u 6,3±0,12*1'2 27,2±2,8*и 23,2±2,6*1-3 16,5±2,7*1-3

ситроми-

цин

6. Острый

панкреатит + 27,3±2,1*1-3 3,3±0,3*1-5 10,0±1,3*1-5 37,1±4,2*1-5 25,4±3,8*1-4 18,3±2,9*1-4

азитроми-

цин

Примечание: * - означает достоверность различий средних арифметических величин, р < 0,05. Цифры рядом со звездочкой показывают, по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны.

Причем наблюдалось снижение как поглотительной стадии фагоцитоза (ФИ и ФЧ), так и кислородзависимых механизмов антиинфекционной защиты нейтрофилов (показатели спонтанного и стимулированного НСТ-теста). Так, через 5 дней после развития панкреатита показатели ФИ и ФЧ снижались в 2,0 и 2,1 раза по сравнению с контрольной группой животных с ложной лапаротомией, получавших дистиллированную воду. Также наблюдалось снижение уровня как спонтанной, так и стимулированной реакций НСТ-теста. В этих условиях введение кларитромицина и рокситромицина не влияло на показатели фагоцитарной и кислородзависимой активности нейтрофилов. В то время как азитромицин повышал ФИ и ФЧ в 1,3 и 1,6 раза (р<0,05), а показатели спонтанного и стимулированного

НСТ-теста в 1,6 и 1,5 раза (р<0,05) соответственно по сравнению с группой животных с экспериментальным панкреатитом, получавших дистиллированную воду.

В условиях экспериментальной модели острого панкреатита также наблюдается ослабление гуморального иммунного ответа, о чем свидетельствует снижение числа АОК в селезенке и в миллионе ядерных клеток (табл. 1). Так, через 5 дней после развития панкреатита число АОК на 106 ядерных клеток снижалось в 3,6 раза, а в селезенке - в 3,3 раза (р < 0,05) по сравнению с показателями контрольной группы. В этих условиях введение кларитромицина не приводило к ослаблению иммунологической супрессии. Введение рок-ситромицина повышает число АОК в миллионе ядерных клеток в 2,3 раза, а в селезен-

ке - в 2,0 раза (р<0,05) по сравнению с аналогичной группой животных с экспериментальным панкреатитом, но получавших дистиллированную воду. Использование в этих условиях азитромицина приводит к повышению числа АОК как на 106 ядерных клеток, так и на весь орган. Причем наблюдались достоверные отличия от группы экспериментальных животных, получавших кларитромицин (р<0,05).

Таким образом, все изученные антибиотики группы макролидов не обладали имму-носупрессирующим действием в условиях экспериментальной модели острого панкреатита. Кларитромицин и рокситромицин через 5 дней после моделирования острого панкреатита не оказывали существенного влияния на функциональную активность нейтро-филов, тогда как азитромицин повышал сниженную в условиях экспериментального панкреатита фагоцитарную и кислородзависи-мую активность нейтрофилов, а также обладал более выраженным по сравнению с другими макролидами стимулирующим действи-

ем в отношении гуморального иммунного ответа.

Поскольку в условиях экспериментальной модели острого панкреатита более выраженными иммунотропными эффектами среди изученных макролидных антибиотиков обладал азитромицин, этот препарат был использован для клинических исследований. При изучении цитокинового статуса было установлено, что у больных с острым панкреатитом наблюдалось повышение концентрации изучаемых цитокинов (ИЛ-lß, ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-4) в плазме крови (табл. 2). На фоне традиционной терапии, включавшей в качестве антибактериального средства цефазолин, наблюдалось снижение уровней ФНОа, ИЛ-6 и ИЛ-4, при этом достоверного снижения концентрации ИЛ-lß не наблюдалось. В группе больных, получавших азитромицин в составе консервативной терапии, отмечалась нормализация уровня ИЛ-6, тогда как изменения концентрации остальных цитокинов не было выявлено.

Таблица 2

Изменения уровня цитокинов и функциональной активности нейтрофилов у больных острым панкреатитом

1 2 3 4

Единицы измерения Больные

Показатели Здоровые До лечения Традиционное лечение (цефазолин) Традиционное лечение + азитромицин

ИЛ-lß пкг/мл 1373,6±385,4 2828,4±320,1*1 2378,6±331,2*1 2373,1±344,8*1

ФНОа пкг/мл 66,7±9,6 435,6±57,9*1 246,7±32,8*1,2 241,3±30,2*1,2

ИЛ-6 пкг/мл 86,7±22,8 232,2±60,1*1 145,9±21,4*1,2 84,3±10,2*2'3

ИЛ-4 пкг/мл 97,1±10,5 529,8±93,5*1 171,1±40,8*1,2 198,6±49,4*1,2

Фагоцитарный индекс % 65,7±1,2 36,6±2,2*1 18,1±1,9*12 49,7±4,4*1-3

Фагоцитарное число абс. 9,0±0,9 5,1±0,4 1 2,9±0,4*1,2 6,7±0,5*1-3

НСТ-тест спонтанный % 15,5±2,1 19,4±1,1*1 8,5±2,4*1,2 13,6±2,1*2'3

НСТ-тест стиму- % 45,7±1,8 55,5±1,6*1 24,5±4,6*1,2 39,3±5,8*2'3

лированный

Функциональный резерв нейтрофилов % 30,2±1,6 36,1±1,7Ф1 16,0±1,1*1,2 25,8±4,0*2'3

Примечание: * - означает достоверность различий средних арифметических величин, р < 0,05. Цифры рядом со звездочкой показывают, по отношению к показателю какой группы эти различия достоверны.

При изучении нейтрофильного звена антиинфекционной защиты на момент поступления в клинику отмечалось снижение фагоцитарной (ФИ, ФЧ) активности нейтрофилов (табл. 2). При этом было выявлено повышение активности кислородзависимых механизмов защиты (спонтанного и стимулированного НСТ-теста). Этот факт может быть связан с более выраженным по сравнению с экспериментальным панкреатитом выделением медиаторов воспаления, активирующих преимущественно менее энергоемкие, в отличие от фагоцитоза, кислородзависимые механизмы защиты. Традиционная терапия приводит к еще большему угнетению фагоцитарной активности нейтрофилов, а также и к снижению показателей кислородзависимой активности фагоцитов, так как в этой группе они были ниже, чем у больных до лечения. Использование азитромицина позволило предотвратить подобное угнетение функции ней-трофилов и нормализовать показатели их ки-слородзависимой активности до уровня здоровых доноров. При этом, в отличие от традиционной терапии, фагоцитарная активность нейтрофилов не только не снижалась, но и сопровождалась повышением, хотя и не до уровня нормы.

На сегодняшний день в хирургической практике существуют два тактических подхода к применению антибактериальных препаратов - профилактический и лечебный [2]. По мнению Гельфанд Б.Р. и соавт., 1999, диагноз панкреонекроза является абсолютным показанием к назначению антибактериальных препаратов. Хотя некоторые авторы поднимают вопрос о целесообразности профилактического применения антибиотиков даже при отсутствии инфицирования очагов деструкции [2]. При этом важно, чтобы используемые антибактериальные средства не обладали иммуносупрессирующим действием, что ослабляет активность антиинфекционной защиты [4].

Основными возбудителями панкреатической инфекции являются грамотрицательные микроорганизмы кишечной группы [2, 4]. Азитромицин обладает антибактериальной активностью в отношении кишечной палочки и других грамотрицательных микроорганизмов этой группы [7]. Этот препарат также имеет преимущества перед другими макро-

лидами и по степени накопления в фагоцитах (нейтрофилах, моноцитах, макрофагах) [7, 10], с чем, вероятно, связаны его более выраженные иммунотропные эффекты по сравнению с другими макролидами. В условиях экспериментального панкреатита он наиболее выраженно ослаблял проявления иммунодефицита, вызванного патологией, по сравнению с рокситромицином и, особенно, по сравнению с кларитромицином.

Особое значение для антибактериальной активности макролидов имеет их взаимодействие с нейтрофилами. Эти препараты позитивным образом модифицируют функции этих клеток. При этом наблюдается прямой синергизм между бактерицидным действием нейтрофилов и антибактериальной активностью макролидов. Кроме того, известно, что под влиянием этих антибиотиков имеет место снижение вирулентности бактерий, сопровождающееся повышением активности нейтро-филов, то есть непрямой синергизм действия [7]. Более того, накапливаясь в нейтрофилах, макролиды могут транспортироваться непосредственно к очагу воспаления и оказывать там антибактериальное действие [7, 10].

Кроме того, макролидные антибиотики обладают противовоспалительной активностью, так как способны изменять секрецию провоспалительных цитокинов [8], что отмечалось и в наших исследованиях (снижался уровень ИЛ-6). Возможно, именно с этим эффектом связана нормализация активности кислородзависимых механизмов защиты ней-трофилов в условиях острого панкреатита.

Таким образом, при остром панкреатите применение полусинтетических макролидов, в отличие от большинства других антибиотиков, не усиливает иммунологическую супрессию, а наоборот ослабляет выраженность возникающего иммунодефицита. При использованных дозах и схемах введения препаратов азитромицин обладает более выраженными иммунокорригирующими эффектами по сравнению с кларитромицином и рок-ситромицином. Возможно, что выявленные иммунотропные эффекты макролидов могли бы быть учтены при выборе средств для антибактериальной профилактики в условиях острого панкреатита.

Экспериментальная биология и медицина ЛИТЕРАТУРА

1. Бондаренко Т.И., Калмыкова Ю.А., Шустано-ва Т.А., Михалева И.И. Фармакологическая эффективность дельта-сон индуцирующего пептида при остром панкреатите // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2002 - Т. 65. - № 2. - С. 44-48.

2. Гельфанд Б.Р., Бурневич С.З., Цыденжа-пов Е.Ц., Брюхов А.Н. Антибиотикопрофилак-тика и терапия при панкреонекрозе // Инфекции и антимикробная терапия - 1999. - № 2. -С. 1-11.

3. Гульянц Э.С., Лукаш Н.А., Ткачева Т.Н., Сур-гутанова Т.А., Калмыкова Ю.А. А.с. 1327152 СССР. Открытия, изобретения, № 28, 211 (1987).

4. Егиев В.Н., Макаров В.Н., Шихатов П. И. Антибактериальная терапия острого панкреатита // Советская медицина. - 1991. - № 1. -С. 29-32.

5. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М.: Медицина, 1987. - 472 с.

6. Медведев А.Н., Чаленко В.В. Способ исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. - 1991. - № 2. - С. 19-20.

7. Страчунский Л.С., Козлов С.Н. Макролиды в современной клинической практике. - Смоленск: Русич, 1998. - 304 с.

8. Bryskier A., Labro MT.Macrolides. New therapeutic prospects // Press Med. - 1994 Dec. 3. - V. 23. N. 38. - P. 1762-1766.

9. Scaglione F., Rossoni G. Comparative antiinflammatory effects of roxithromycin, azithromycin and clarithromycin // J. Antimicrob. Chemother. - 1998 Mar. - 41. - Suppl. B - 47-50.

10. Smilack J.D., Wilson W.R., Cockerill F.R. Tet-racyclins, chloram-phenicol, erythromycin, clindamycin, and metronidazol // Mayo Clin. Proc. - 1991. - N. 66. - P. 1270-1280.

11. Pascual A., Lopez-Lopez G., Aragon J., Perea E.J. Effect of azithromycin, roxithromycin and erythromycin on human polymorphonuclear leukocyte function against Staphylococcus aureus // Chemotherapy. - 1990. - V. 36. N. 6. - P. 422-427.

12. Rattner D.W., Legermate D.A., Lee M.J. et al. Early surgical depridement of symptomatic pancreatic necrosis is beneficalirrespective of infection. Am. J. Surg. 1992. - V. 163. N. 1. - P. 105-110.

13. Uhl W., Isenmann R., Buchler M. Infections complications pancreatitis: diagnosing, treating, preventing. // New Horiz. 1998; N. 6 (Suppl 2) -P. 72-79.

14. Wildfeuer A., Laufen H., Zimmermann T. Uptake of azithromycin by various cells and its intra-cellular activity under in vivo conditions // An-timicrob. Agents Chemother. - 1996 Jan. - V. 40. N. l. - P. 75-9.