ГЕННОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЛУБОКИХ ИНТРОННЫХ МУТАЦИЙ

1. Способ создания in vitro модели глазного заболевания, связанного с глубокой интронной мутацией в нуклеиновой кислоте, включающий
a) введение в эукариотическую клетку нуклеиновой кислоты, кодирующей систему CRISPR-Cas, где система CRISPR-Cas содержит
i) единую направляющую РНК для нацеливания на последовательности ДНК интрона в нуклеиновой кислоте,
ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую Cas-белок,
iii) однонитевой олигонуклеотид, содержащий матрицу для репарации, направляемой гомологией (HDR), содержащую гомологичные "плечи", фланкирующие требуемую интронную мутацию, и прилегающий к протоспейсеру мотив (PAM); и
b) выделение клеток, которые содержат мутацию, включенную в нуклеиновую кислоту.
2. Способ по п. 1, где глубокая интронная мутация расположена на приблизительно 1-10000 нуклеотидов, приблизительно 1-1000 нуклеотидов или приблизительно 100-1000 нуклеотидов ниже 5'-конца сайта донора сплайсинга нуклеиновой кислоты.
3. Способ по п. 1 или 2, где глубокая интронная мутация расположена на приблизительно 1-10000 нуклеотидов, приблизительно 1-1000 нуклеотидов или приблизительно 100-1000 нуклеотидов выше 3'-конца сайта акцептора сплайсинга нуклеиновой кислоты.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где посредством глубокой интронной мутации в нуклеиновую кислоту вводят сайт донора сплайсинга или сайт акцептора сплайсинга.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где PAM содержит мутацию, позволяющую избежать расщепления однонитевого олигонуклеотида экспрессированным Cas-белком в клетках.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где Cas-белок представляет собой белок Cas9.
Streptococcus pyogenes
Staphylococcus aureus
Streptococcus thermophilus
Neisseria meningitidis
Treponema denticola
7. Способ по п. 6, где белок Cas9 представляет собой белок Cas9 , белок Cas9 , белок Cas9 , белок Cas9  или белок Cas9 .
8. Способ по п. 6 или 7, где Cas9 кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотических клетках.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где эукариотические клетки представляют собой клетки млекопитающего.
10. Способ по п. 9, где эукариотические клетки представляют собой клетки человека.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где эукариотические клетки представляют собой клетки глаза.
12. Способ по п. 11, где клетки глаза представляют собой клетки сетчатки.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где система CRISPR-Cas дополнительно содержит один или несколько сигналов внутриядерной локализации (NLS).
14. Способ по п. 13, где Cas-белок содержит один или несколько NLS.
15. Способ по п. 13 или 14, где NLS представляет собой С-концевую последовательность в большом T-антигене SV40.
16. Способ по любому из пп. 13-15, где NLS содержит последовательность PKKKRKV (SEQ ID NO:26) или PKKKRKVEDPKKKRKVD (SEQ ID NO:27).
17. Способ по любому из пп. 1-16, где единая направляющая РНК слита с последовательностью трансактивирующей cr (tracr).
18. Способ по п. 17, где последовательность tracr содержит нуклеотидную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:25.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где единая направляющая РНК и/или нуклеиновая кислота, кодирующая Cas-белок, функционально связаны с одним или несколькими регуляторными контрольными элементами.
20. Способ по п. 19, где единая направляющая РНК функционально связана с промотором РНК-полимеразы III.
21. Способ по п. 20, где промотор РНК-полимеразы III представляет собой промотор U6, 7SK или H1.
22. Способ по любому из пп. 19-21, где нуклеиновая кислота, кодирующая Cas-белок и/или однонитевой олигонуклеотид, функционально связана с промотором РНК-полимеразы II.
23. Способ по п. 22, где промотор РНК-полимеразы II представляет собой немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), минимальный промоторный фрагмент, полученный из промотора CMV (промотор minCMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотор гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор CK6, промотор гена транстиретина (TTR), промотор TK, тетрациклин-чувствительный промотор (TRE), промотор HBV, промотор hAAT, промотор LSP, химерные печень-специфичные промоторы (LSP), промотор E2F, промотор EF1α, промотор гена теломеразы (hTERT); составной промотор энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/интрон гена β-глобина кролика (CAG), промотор гена родопсина, промотор гена конопсина, промотор гена бета-фосфодиэстеразы (PDE), промотор гена, связанного с пигментным ретинитом (RP1), или промотор гена межфоторецепторного ретинол-связывающего белка (IRBP).
24. Способ по любому из пп. 1-23, где нуклеиновая кислота, кодирующая одно или несколько из единой направляющей РНК, Cas-белка или однонитевого олигонуклеотида, расположена на одном и том же или на разных векторах системы.
25. Способ по любому из пп. 1-24, где глазное заболевание представляет собой врожденный амавроз Лебера, атрофию зрительного нерва, пигментный ретинит, ретинобластому, заболевание Штаргардта, синдром Ашера или Х-сцепленный пигментный ретинит.
26. Способ по п. 25, где глубокая интронная мутация является глубокой интронной мутацией, представленной в таблице 2.
27. Способ по п. 25 или 26, где глазное заболевание представляет собой врожденный амавроз Лебера.
28. Способ по любому из пп. 25-27, где единая направляющая РНК нацелена на интронную последовательность гена центросомного белка размером 290 кДа (CEP290).
29. Способ по любому из пп. 25-28, где введенная глубокая интронная мутация представляет собой мутацию c.2991+1655A>G.
30. Способ по любому из пп. 25-29, где единая направляющая РНК кодируется ДНК, содержащей последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.
31. Способ по любому из пп. 25-30, где однонитевой олигонуклеотид содержит последовательность SEQ ID NO:3.
32. Способ по любому из пп. 25-31, где CEP290 представляет собой CEP290 человека.
33. Способ по п. 32, где CEP290 содержит глубокую в последовательности, представленной SEQ ID NO:23.