СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ НЕЙРОГЕННЫХ ИЗМЕНЕНИЙ ВОЛОКОН СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ
METHOD FOR QUANTITATIVE ASSESSMENT OF NEUROGENIC CHANGES OF SKELETAL MUSCLE FIBRES

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при патоморфологической диагностике денервационно-реиннервационного процесса по биоптатам скелетных мышц.
Известно, что в дифференциальной диагностике сколиоза используют биопсию мышц для выявления или исключения нейрогенных миопатий (Mertz KD, Jost В, Glatzel М, Min K. Progressive scoliosis in central core disease. Eur Spine J. 2005 Nov; 14(9): 900-5. Epub 2005 May 31).
Описаны нейрогенные изменения скелетных мышечных волокон при болезни центрального стержня, "волокна-мишени" при де- и реиннервационных процессах (Femandez Н.Н., Eisenschenk S., Yachnis A.T., Okun M.S. Ultimate review for the neurology boards. Demos Medical Publication, New York, 2006 - 522 p. - P.91), которые сопровождаются изменением тинкториальных свойств пораженных участков саркоплазмы. Так, в окрашенных трехцветными методами по Гомори или по Массону поперечных срезах мышц саркоплазма по периферии таких волокон сохраняет обычный для нее красный цвет, а в центре меняет на синий (Cohen M.E., Duffner P.K., Heffher R. Central core disease in one of identical twins. Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry, 1978, 41, 659-663).
Однако в литературе нет сведений об использовании этих особенностей окраски для количественной оценки нейрогенных изменений скелетных мышечных волокон.
Известен способ визуализации и колориметрического анализа фаз минерализации костного матрикса в процессе остеогенеза, включающий колориметрическую планиметрию - измерение долей цветовых тональностей в общей площади полноцветных (RGB-модель цветового пространства) цифровых изображений микропрепаратов (RU 2429475, С1).
Но данный способ не предназначен для количественной оценки степени нейрогенных изменений скелетных мышечных волокон.
Задачей изобретения является разработка способа, обеспечивающего возможность количественной оценки нейрогенных изменений волокон скелетных мышц за счет применения информационных технологий для анализа полученных традиционными методами стандартных патогистологических препаратов.
Указанная задача решается тем, что в способе количественной оценки нейрогенных изменений волокон скелетных мышц, включающем колориметрическую планиметрию - измерение долей цветовых тональностей в общей площади полноцветных (RGB-модель цветового пространства) цифровых изображений микропрепаратов, объектом служат поперечные гистологические срезы скелетных мышц, окрашенные трехцветным методом по Массону в прописи с анилиновым синим, в их цифровых изображениях оставляют только те пикселы, в цвете которых красный доминирует над зеленым и синим, а остальные закрашивают фоновым (черным) цветом, подсчитывают количество интактных и поврежденных волокон и рассчитывают экспресс-индекс патологии мышцы - E-Imp как долю (%) поврежденных волокон в общем количестве мышечных волокон, и, если результаты экспресс-диагностики подтверждают наличие измененных волокон, проводят прецизионный анализ, для чего в каждом волокне оконтуривают, кадрируют и замеряют в пикселах площадь саркоплазмы, принимая ее за 100%, в ее составе выделяют, измеряют площади и определяют доли измененной и неизмененной саркоплазмы, результаты протоколируют, заносят в соответствующие поля итоговой таблицы и рассчитывают оценочные показатели на клеточном и органном уровнях, при этом
на клеточном для каждого мышечного волокна регистрируют индекс патологии - Ifp как наличие (1) или отсутствие (0) тинкториально измененной саркоплазмы, при ее наличии рассчитывают уровень патологии - Lfp как долю (%) участков с измененными тинкториальными свойствами в общей площади саркоплазмы, оценивая как низкий (н) Lfp<20%, как средний (ср) Lfp от 20 до 60% и как высокий (в) Lfp>60%, а также степень патологии - Dfp, причем
- к первой степени (1) относят волокна, в которых измененные участки саркоплазмы окрашены в оттенки одной или двух цветовых тональностей при различии занимаемых ими площадей не более двухкратного,
- ко второй степени (2) - волокна, в которых измененные участки саркоплазмы окрашены в оттенки двух цветовых тональностей при явном (более двухкратного) преобладании площади одной из них, и
- к третьей степени (3) - волокна, в которых измененные участки саркоплазмы окрашены в оттенки трех цветовых тональностей,
на органном уровне по результатам прецизионного анализа репрезентативного числа мышечных волокон рассчитывают индекс пораженности мышцы - Imp как долю (%) волокон с измененными тинкториальными свойствами саркоплазмы в общем количестве изученных волокон, уровень пораженности мышцы - Lmp как доли (%) волокон с низким (н), средним (ср) и высоким (в) показателями Lfp, и степень пораженности мышцы - Dmp как доли (%) волокон с изменениями первой, второй и третьей степеней по показателю Dfp.
Способ поясняется описанием, примером практического использования, таблицей и иллюстративным материалом, на котором изображено:
Фиг.1 - Полноцветное цифровое изображение поперечного среза передней большеберцовой мышцы с признаками нейрогенных изменений. Окраска - трихром по Массону в прописи с анилиновым синим. Увеличение - 200x. Каждое мышечное волокно пронумеровано.
Фиг.2 - В изображении 1 оставлены только те пикселы, цвет которых типичен для неизмененной саркоплазмы, а остальные пикселы закрашены в цвет фона (черный). В результате все мышечные волокна дифференцируются на интакгные - не содержащие участков черного цвета, и поврежденные - в саркоплазме которых видны участки черного цвета.
Способ осуществляют следующим образом.
С целью количественной оценки нейрогенных изменений волокон скелетных мышц в качестве объекта используют поперечные гистологические срезы, окрашенные трехцветным методом по Массону (пропись с анилиновым синим). Их цифровые изображения получают при больших увеличениях светооптического микроскопа и сохраняют в памяти компьютера в RGB-модели цветового пространства как полноцветные графические файлы с расширением *.bmp.
int
alt
alt
int
Исследование начинают с экспресс-диагностики нейрогенных изменений мышечных волокон, для чего проводят цветовую сегментацию цифрового изображения, удаляя и закрашивая черным все его участки, окраска которых не соответствует цвету неизмененной (интактной) саркоплазмы (Sarc), для которого характерно преобладание красной RGB-составляющей над зеленой и синей. В результате в поврежденных волокнах (F) визуализируются участки саркоплазмы с измененными тинкториальными свойствами (Sarc) в виде черного цвета включений, что дает возможность отдифференцировать такие волокна от неповрежденных (F), посчитать те и другие и вычислить экспресс-индекс патологии мышцы - E-Imp (Express-Index of muscle pathology) как долю (%) Fait в общем количестве волокон.
alt
B
R
G
B
G
R
B
R
G
Результаты экспресс-диагностики, подтверждающие наличие мышечных волокон с измененными тинкториальными свойствами саркоплазмы, являются показанием для проведения прецизионного количественного анализа с применением технологии колориметрической планиметрии. При этом нумеруют все попавшие в поле зрения мышечные волокна и такое изображение сохраняют в протоколе исследования. Затем в исходном полноцветном изображении в каждом волокне оконтуривают, кадрируют и замеряют в пикселах площадь (А) саркоплазмы, принимая ее за 100%, в ее составе выделяют, измеряют площади и определяют доли (АА %) измененной и неизмененной саркоплазмы, учитывая, что в цвете Sarc встречаются 3 цветовые тональности: в одних пикселах цвет описывается неравенством I>I>I, в других - I>I>I, а в третьих - выражением I=I>I, и для каждой измеряют ее А и АА. Результаты протоколируют, заносят в соответствующие поля итоговой таблицы и рассчитывают оценочные показатели на двух уровнях: клеточном (для каждого мышечного волокна) и органном (для мышцы в целом по результатам исследования репрезентативного числа волокон).
На клеточном для каждого мышечного волокна регистрируют индекс патологии - Ifp (Index of fiber pathology) - наличие (1) или отсутствие (0) тинкториально измененной саркоплазмы, при ее наличии рассчитывают уровень патологии - Lfp (Level of fiber pathology) как долю (%) участков с измененными тинкториальными свойствами в общей площади саркоплазмы, оценивают Lfp<20% как низкий (н), Lfp от 20 до 60% - как средний (ср) и Lip>60% - высокий (в), а также степень патологии - Dfp (Degree of fiber pathology), причем к первой степени (1) относят волокна, в которых измененные участки саркоплазмы окрашены в оттенки одной или двух цветовых тональностей при различии занимаемых ими площадей не более двухкратного, ко второй степени (2) - волокна, в которых измененные участки саркоплазмы окрашены в оттенки двух цветовых тональностей при явном (более двухкратного) преобладании площади одной из них, и к третьей степени (3) - волокна, в которых измененные участки саркоплазмы окрашены в оттенки трех цветовых тональностей.
На органном уровне по результатам прецизионного анализа репрезентативного числа мышечных волокон рассчитывают индекс пораженности мышцы - Imp (Index of muscle pathology) как долю (%) волокон с измененными тинкториальными свойствами саркоплазмы в общем количестве изученных мышечных волокон. Уровень пораженности мышцы - Lmp (Level of muscle pathology) как доли (%) волокон с низким (н), средним (ср) и высоким (в) показателями Lfp, и степень пораженности мышцы - Dmp (Degree of muscle pathology) как доли (%) волокон с изменениями первой, второй и третьей степеней по показателю Dfp.
Пример практического использования.
В поступившем на исследование полноцветном (RGB-модель цветового пространства) цифровом изображении поля зрения (объектив 40x) поперечного гистологического среза скелетной мышцы, окрашенного трехцветным методом по Массону (пропись с анилиновым синим), провели экспресс-диагностику, для чего в изображении оставили только те пикселы, в цвете которых красный доминирует над зеленым и синим (это цвет неизмененной саркоплазмы), а остальные пикселы закрасили фоновым (черным) цветом (фиг.1). В результате этой манипуляции в части мышечных волокнах появились черного цвета включения саркоплазмы, что позволило подсчитать интактные, не содержащие включений, и поврежденные, в саркоплазме которых есть включения черного цвета, волокна. В изображении на фиг.1 интактных волокон 10, а поврежденных - 35. По результатам был расчитан экспресс-индекс патологии мышцы (E-Imp), доля поврежденных волокон составила 77,78%.
NS
NS
AS
AS
CTAS
Результаты экспресс-диагностики подтвердили присутствие в исследуемой мышце волокон с измененными тинкториальными свойствами саркоплазмы, что послужило показанием для проведения прецизионного количественного анализа с применением технологии колориметрической планиметрии. Для этого в исходном изображении пронумеровали все попавшие в поле зрения мышечные волокна (фиг.2) и такое изображение было сохранено в протоколе исследования. Затем в исходном изображении оконтурили и кадрировали саркоплазму каждого волокна, замерили ее площадь (As), в ее составе выделили неизмененную саркоплазму, замерили ее площадь (A) и рассчитали долю (AA) в общей площади саркоплазмы волокна. Те же измерения осуществили в поврежденных волокнах для измененной саркоплазмы, обозначив ее площадь аббревиатурой A, а долю в общей площади саркоплазмы - AA. По результатам колориметрической планиметрии определили площади присутствующих в измененной саркоплазме цветовых тональностей и рассчитали их доли (AA) в общей площади саркоплазмы волокна. Полученные значения занесли в соответствующие поля таблицы (таблица 1), в которой каждому волокну была отведена одна строка.
Затем были вычислены характеризующие каждое волокно параметры клеточного уровня прецизионного анализа:
Ifp (0 или 1)
Lfp (н, ср или в)
Dfp (1, 2 или 3),
а затем характеризующие мышцу в целом параметры органного уровня:
- индекс пораженности мышцы - Imp, составивший 80,00%;
- уровень пораженности мышцы - Lmp (н - 63,89%, ср - 33,33%, в - 2,78%);
- степень пораженности мышцы - Dmp (1 - 25,00%, 2 - 47,22%, 3 - 27,78%).
Применение предлагаемого способа в подразделениях РНЦ "ВТО" показало, что он обеспечивает возможность экспресс-диагностики и количественной оценки нейрогенных изменений волокон скелетных мышц за счет применения информационных технологий для анализа полученных традиционными методами стандартных патогистологических препаратов. Объективная количественная характеристика нейрогенных изменений волокон скелетных мышц является предпосылкой для наблюдения за динамикой патологического процесса при проведении повторных исследований с определенными временными интервалами.