Способ получения модифицированного биопокрытия на имплантате из титана (варианты)
METHOD OF PRODUCING MODIFIED BIOCOATING ON TITANIUM IMPLANT (VERSIONS)

Изобретение относится к области медицинской техники, а именно к способу обработки поверхности титанового имплантата, позволяющему формировать биопокрытие с развитым рельефом и дополнительными функциональными свойствами для имплантации в костную ткань для улучшения его биологической совместимости с живым организмом и может быть использовано при изготовлении поверхностно-пористых дентальных имплантатов, имплантатов для травматологии, ортопедии и различных видов пластической хирургии.
Известны биоактивное покрытие на имплантате из титана и способ его получения, RU2385740, опубл. 10.04.2010 г.
Биоактивное покрытие на имплантате из титана содержит кальций-фосфатные соединения и имеет многоуровневую пористую структуру с шероховатой поверхностью, Покрытие имеет толщину 10-40 мкм, общую пористость 35-45% со средним размером пор 3-8 мкм, шероховатость 2,5-5 мкм, адгезионную прочность 30-35 МПа. Покрытие содержит кальций-фосфаты в рентгеноаморфном состоянии. Описан способ получения биоактивного покрытия на имплантате из титана, который заключается в нанесении покрытия микродуговым оксидированием, но перед нанесением покрытия поверхность титанового имплантата подвергают механической и химической обработке, затем проводят микродуговое оксидирование с получением многоуровневой пористой структуры кальций-фосфатного покрытия.
Недостатком известного способа является наличие стадии кислотного травления в кипящей смеси кислот, что переводит технологический процесс в разряд опасных химических производств и налагает ряд соответствующих требований и ограничений. Также необходимо отметить используемые высокие концентрации химических веществ в составе электролита.
Известны кальций-фосфатное покрытие на титане и титановых сплавах и способ его нанесения, RU2291918, опубл. 20.01.2007 г.
Покрытие содержит, мас.%: титанат кальция 7-9; пирофосфат титана 16-28; кальций-фосфатные соединения - остальное. Способ включает анодирование имплантата импульсным током в условиях искрового микроразряда в растворе ортофосфорной кислоты, содержащем гидроксиапатит и карбонат кальция, при этом анодирование ведут импульсным током со следующими параметрами: время импульса 50-200 мкс; частота следования импульсов 50-100 Гц; начальная плотность тока 0,2-0,25 А/мм2; конечное напряжение 100-300 В. Технический результат: получение покрытия, составом аналогичным составу костной ткани с высоким содержанием кальция, обладающего хорошими остеоиндуктивными и механическими свойствами, толщиной от 40 до 80 мкм.
Недостатком известного изобретения является недостаточный антимикробный эффект покрытия на имплантате из титана, которая не исследовалась авторами, особенно в случае покрытий с высокими значениями шероховатости (Ra до 8 мкм).
Известны кальций-фосфатное покрытие на титане и титановых сплавах и способ его нанесения, RU2221904, опубл. 20.01.2004 г.
Предложен способ нанесения покрытия на имплантат из титана и его сплавов, включающий анодирование имплантата импульсным или постоянным током в условиях искрового разряда с частотой следования импульсов 0,5-10,0 Гц в растворе ортофосфорной кислоты в течение 10-30 мин при постоянном перемешивании, причем анодирование ведут при напряжении 90-200 В и температуре 20-35 °С в растворе фосфорной кислоты с концентрацией 5-25%, содержащем порошок СаО до пересыщенного состояния, или в растворе фосфорной кислоты с концентрацией 5-25%, содержащем порошок СаО до пересыщенного состояния и дополнительно 5-10% суспензии гидроксиапатита дисперсностью менее 70 мкм для создания суспензии. Изобретение позволяет удешевить и упростить способ получения биоактивного покрытия.
Недостатком покрытия, полученного этим способом, является также низкое содержание кальция в нем. Также недостатком этого способа является то, что при его реализации получают покрытие толщиной не более 30 мкм.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ нанесения кальций-фосфатного покрытия на имплантаты из титана и его сплавов, RU2348744, опубл. 10.03.2009 г.
2
2
При нанесении кальций-фосфатного покрытия на имплантаты из титана и его сплавов осуществляют плазменно-электролитическую обработку имплантата импульсным током в электролите, содержащем цитрат кальция и фосфат натрия. Обработку проводят импульсным током с длительностью анодных и катодных импульсов 0,0033-0,02 с первоначально в монополярном гальваностатическом режиме при эффективном значении плотности тока 3-5 А/см и конечном напряжении формирования 350-380 В в течение 10-15 мин. Затем в течение 3-5 мин имплантат обрабатывают в биполярном режиме с потенциодинамической анодной составляющей при напряжении до 280-300 В и гальваностатической катодной составляющей с эффективной плотностью тока 1,0-1,5 А/см. Полученное покрытие обладает высокой биоактивностью и остеоиндуктивностью благодаря качественному и количественному составу, близкому к минеральному составу костной ткани, соотношению кальций/фосфор, сравнимому с соотношением, присущим костной ткани, а также своей пористой структуре.
Недостатком известного изобретения является недостаточный антимикробный эффект покрытия на имплантате из титана, которая не исследовалась авторами, особенно в случае покрытий с высокими значениями шероховатости (Ra до 8 мкм).
Технологической проблемой предлагаемого изобретения является разработка способа получения модифицированного биопокрытия на имплантате из титана (варианты).
Техническим результатом изобретения является получение модифицированных биопокрытий с пористой структурой на имплантате из титана с развитой шероховатой поверхностью и повышенной остеоинтеграцией с костной тканью, при этом модифицированное биопокрытие:
- полученное по первому и второму вариантам способа обладает дополнительно антибактериальными свойствами;
- полученное по третьему варианту обладает дополнительно высокой биологической активностью и хорошей адгезией к материалу имплантата;
- полученное по четвертому варианту способа обладает дополнительно повышенными остеоиндуктивными и антибактериальными свойствами.
3
4
3
9.9
0.1
4
6
2
2
Указанный технический результат достигается тем, что способ (первый вариант) получения модифицированного биопокрытия на имплантате из титана, включающий анодирование имплантата импульсным током в условиях искрового микроразряда в водном растворе ортофосфорной кислоты, содержащем соединения кальция и фосфора, при этом для анодирования используют электролит, в составе которого соединение кальция с фосфором с дополнительно введенными ионами цинка. В первом варианте способа используют электролит состава, масс.%:  HPO - 26,9±0,1; CaCO – 7,2±0,1; CaZn(PO)(OH) – 4,8±0,1; остальное НО.
Указанный технический результат также достигается тем, что способ (второй вариант) получения модифицированного биопокрытия на имплантате из титана, включающий анодирование имплантата импульсным током в условиях искрового микроразряда в водном растворе ортофосфорной кислоты, содержащем соединения кальция и фосфора, при этом для анодирования используют электролит, в составе которого соединение кальция с фосфором с дополнительно введенными ионами меди.
3
4
3
9.9
0.1
4
6
2
2
Во втором варианте способа используют электролит состава, масс.%:  HPO – 26,9±0,1; CaCO – 7,2±0,1; CaCu(PO)(OH) – 4,8±0,1; остальное НО.
Указанный технический результат также достигается тем, что способ (третий вариант)  получения модифицированного биопокрытия на имплантате из титана, включающий анодирование имплантата импульсным током в условиях искрового микроразряда в водном растворе ортофосфорной кислоты, содержащем соединения кальция и фосфора, при этом для анодирования используют электролит в составе которого соединение кальция с кремнием.
3
4
3
10
6
2
2
В третьем варианте способа используют электролит используют электролит состава, масс.%:  HPO - 27,3±0,1; CaSiO – 6,1±0,1; Ca(PO4)(OH)– 4,8±0,1; остальное НО.
3
4 -
3
10
6
2
2
Указанный технический результат также достигается тем, что способ (четвертый вариант) получения модифицированного биопокрытия на имплантате из титана, включающий анодирование имплантата импульсным током в условиях искрового микроразряда в водном растворе ортофосфорной кислоты, содержащем соединения кальция и фосфора, при этом сначала наносят кальций-фосфатное биопокрытие, а затем проводят дополнительное модифицирование биопокрытия наноразмерными частицами оксигидроксида алюминия. В четвертом варианте способа для нанесения кальций-фосфатного биопокрытия используют электролит состава, масс.%: HPO26,9±0,1; CaCO – 7,2±0,1; Ca(PO4)(OH) – 4,8±0,1; остальное НО.
2
о
Дополнительное модифицирование биопокрытия наноразмерными частицами оксигидроксида алюминия проводят ультразвуковой обработкой имплантата в суспензии следующего состава: дистиллированная HO – 25 мл, AlN – 30 мг, а затем суспензию с имплантатом нагревают до температуры 60С.
Способ микродугового оксидирования проводят в анодном режиме при параметрах: напряжение 150-200 В, длительность импульса 100-300 мкс, частота следования импульсов 50 Гц, в течение 10 минут.
В настоящее время актуальным является разработка способа получения модифицированных биопокрытий на титановых имплантатах, обеспечивающих повышенную остеоинтеграцию костных клеток, благодаря пористой структуре и развитой шероховатой поверхности, и дополнительно обладающих антибактериальной активностью, высокой биологической активностью и повышенными остеокондуктивными свойствами. Биопокрытие на имплантате из титана, полученное по предлагаемому способу, включает кальций-фосфатные соединения, применение которых обусловлено сходством химического состава с минеральной составляющей костей человека. Повышению остеоинтеграции костных клеток в живых организмах способствует создание кальций-фосфатного биопокрытия на титановом имплантате c пористой структурой и развитой шероховатой поверхностью. Модифицирование кальций-фосфатного биопокрытия на титановом имплантате с помощью антибактериальных агентов, таких как цинк или медь, придает биопокрытию дополнительно антибактериальные свойства, модифицирование с помощью добавления волластонита придает дополнительное ускорение зародышеобразования гидроксиапатита и улучшает адгезию биопокрытия к титановой подложке, а модифицирование наноразмерными частицами оксигидроксида алюминия (бемит, АlО(OH)) придает биопокрытию дополнительно повышенную остеокондуктивность и антибактериальные свойства.
Заявленный способ получения модифицированного биопокрытия на титановом имплантате осуществляют с помощью микродугового оксидирования в анодном режиме при следующих технологических параметрах: напряжение 150-200 В, длительность импульса 100-300 мкс, частота следования импульсов 50 Гц, в течение 10 минут с использованием растворов электролита определенного состава для каждого варианта способа.
В эксперименте в качестве титанового имплантата используют образец в форме пластины из технически чистого титана марки ВТ1-0, крупнокристаллический, состоящий из зерен α-фазы.
10
4
6
2
9.9
0.1
4
6
2
9.9
0.1
4
6
2
3
3
3
4
Способ получения биопокрытия осуществляют путем микродугового оксидирования образца в электролите разного состава, компонентами которого являются химически чистые соединения, совместимые с биологическими тканями: гидроксиапатит (Ca(PO)(OH), CaZn(PO)(OH) или CaCu(PO)(OH)); карбонат кальция (CaCO); силикат кальция (волластонит, CaSiO); ортофосфорная кислота (НРО).
3
4
3
9.9
0.1
4
6
2
3
4
3
9.9
0.1
4
6
2
Первый и второй варианты способа осуществляют путем микродугового оксидирования образцов в двух электролитах разных составов: первый состав электролита – НРО + CaCO + CaZn(PO)(OH) и второй состав электролита – НРО + CaCO + CaCu(PO)(OH). Добавление в электролит гидроксиапатита с частичным замещением кальция на цинк или медь позволяет ввести в состав кальций-фосфатного биопокрытия элементы Zn или Cu, обладающие антибактериальными свойствами.
3
4
3
10
4
6
2
3
Третий вариант способа осуществляют путем микродугового оксидирования образца в электролите следующего состава – HPO + CaSiO + Ca(PO)(OH). Добавление волластонита (CaSiO) в состав электролита позволяет получить биопокрытия с высокой биологической активностью с Si-OH-группами на его поверхности, которые являются предпочтительными для зародышеобразования и роста гидроксиапатита и дополнительно усиливают процессы образования новой костной ткани.
3
4
3
10
4
6
2
2
2
3
Четвертый вариант способа получения биопокрытия осуществляют путем микродугового оксидирования образца в электролите следующего состава – HPO + CaCO + Ca(PO)(OH). Затем проводят модифицирование биопокрытия наночастицами бемита AlO(OH) путем ультразвукового воздействия в суспензии следующего состава: HO – 25 мл, AlN – 30 мг. Сперва готовят суспензию и подвергают ее ультразвуковой обработке в течение 1 часа для разбивки нанопорошка AlN. Затем образец из титана с нанесенным пористым кальций-фосфатным биопокрытием помещают в приготовленную суспензию и подвергают ультразвуковой обработке в течение 5 минут. Под воздействием ультразвуковых колебаний наночастицы исходного нанопорошка AlN попадают на поверхность и в поры биопокрытия. После этого суспензию вместе с образцом нагревают до 60°С для инициализации реакции гидролиза. В ходе реакции гидролиза наночастицы порошка AlN превращаются в наночастицы бемита AlO(OH) со складчатыми нанолистами с большой удельной поверхностью. Уравнение реакции гидролиза: AlN + 2HО→ AlO(OH) + NH↑. Модифицирование наночастицами бемита способствует формированию электроположительного заряда в биопокрытии, увеличивает его сорбционную способность по отношению к костным клеткам и антибактериальную активность по отношению к патогенным штаммам.
Приборы, с помощью которых проводят измерения свойств биопокрытий.
Исследование морфологии, структуры и элементного состава кальций-фосфатных биопокрытий проводят на растровом электронном микроскопе LEO EVO 50 (Zeiss, Германия) с приставкой для энергодисперсионного микроанализа (INCA Energy-250, Oxford Instruments) Поверхностную пористость биопокрытий рассчитывали, как отношение всех площадей, приходящихся на поры, к общей площади РЭМ-изображения.
Исследования микроструктуры биопокрытий проводились на просвечивающем электронном микроскопе JEM-2100 JEOL.
Съемку рентгенограмм проводили на дифрактометре ДРОН-7 (Буревестник) с фокусировкой по Бреггу-Брентано в Co-Kα излучении (λ = 0.17902 нм) в диапазоне углов 2θ = 10–90º с шагом сканирования 0,02º.
Исследование дзета-потенциала кальций-фосфатных биопокрытий на поверхности титановых пластин выполнялось на Z-потенциометре «Anton Paar SurPASS»
Исследование смачиваемости и расчет поверхностной энергии биопокрытий проводили на установке «Easy Drop DSA1» (Kruss).
Шероховатость поверхности биопокрытий определяли на Профилометре-296 (Россия) по параметру Ra (ГОСТ 2789-73).
Противомикробная активность биопокрытий была проверена методом подсчетов жизнеспособных бактерий. В этом методе in vitro динамика уничтожения бактерий в образце измерялась путем подсчета остаточных бактерий по сравнению со стартером.
Пролиферативную активность клеточных линий определяли методом непосредственного подсчета количества клеток после контакта с образцами при помощи оптического микроскопа.
Примеры выполнения способа.
Пример 1.
Берут образец в форме пластины размером 10×10×1 мм из технически чистого титана марки ВТ1-0, крупнокристаллический, состоящий из зерен α-фазы. Образец подвергают шлифовке до достижения шероховатости Ra = 0.6 мкм, потом проводят ультразвуковую очистку сначала в дистиллированной воде, затем в спирте в течение 10 минут. Микродуговое оксидирование проводят в анодном режиме при параметрах: напряжение 200 В, длительность импульса 100 мкс, частота следования импульсов 50 Гц, в течение 10 минут.
3
4
3
9.9
0.1
4
6
2
Процесс ведут в водном растворе электролита, приготовленного следующим образом. Для получения 1 л электролита смешивают 765 мл дистиллированной воды с 235 мл 85%-ной ортофосфорной кислотой (НРО), затем по очереди небольшими порциями вводят карбонат кальция (CaCO) в количестве 90 г. Затем после окончания процесса газовыделения в электролит при постоянном перемешивании вводят гидроксиапатит с частичным замещением кальция на цинк (CaZn(PO)(OH))в количестве 60 г.
Полученное по первому варианту способа модифицированное биопокрытие обладает повышенной остеоинтеграцией в костную ткань, а состав электролита, содержащий ионы цинка, придает ему дополнительные антибактериальные свойства.
a
2
Биопокрытие, полученное по первому варианту способа, имеет толщину 50 ± 5 мкм, шероховатость по R3,1 ± 0,5 мкм, поверхностную пористость 22%, химический состав: Ca (4,3-11,4 ат.%), P (14,3-21,1 ат.%), Ti (8,1-17,8 ат.%), O (52,0-73,4 ат.%), Zn (до 0,4 ат.%). Краевые углы смачивания водой 20,6 ± 1,5 град и глицерином 42,3 ± 2,2 град. Поверхностная энергия – 69,9 ± 0,4 мДж/м. Адгезионная прочность – 15,5 ± 0,5 МПа.
Пример 2.
Берут образец, аналогичный образцу в примере 1, подвергают его шлифовке и ультразвуковой очистке аналогично примеру 1. Микродуговое оксидирование проводят в анодном режиме при параметрах: напряжение 200 В, длительность импульса 100 мкс, частота следования импульсов 50 Гц, в течение 10 минут.
3
9.9
0.1
4
6
2
Процесс ведут в водном растворе электролита, приготовленного следующим образом. Для получения 1 л электролита смешивают 765 мл дистиллированной воды с 235 мл 85%-ной ортофосфорной кислотой, затем небольшими порциями вводят карбонат кальция (CaCO) в количестве 90 г. Затем после окончания процесса газовыделения в электролит при постоянном перемешивании вводя гидроксиапатит с частичным замещением кальция на медь (CaCu (PO)(OH)) в количестве 60 г.
Полученное по второму варианту способа модифицированное биопокрытие обладает повышенной остеоинтеграцией в костную ткань, а состав электролита, содержащий ионы меди, придает ему дополнительные антибактериальные свойства.
a
2
Биопокрытие, полученное по второму варианту способа, имеет толщину 55 ± 5 мкм, шероховатость по R2,9 ± 0,5 мкм, поверхностную пористость 22%, химический состав: Ca (4,3-11,4 ат.%), P (14,3-21,1 ат.%), Ti (8,1-17,8 ат.%), O (52,0-73,4 ат.%), Cu (до 0,4 ат.%). Краевые углы смачивания водой 19,4 ± 1,2 град и глицерином 39,8 ± 2,1 град. Поверхностная энергия – 69,6 ± 0,9 мДж/м. Адгезионная прочность – 15,0 ± 0,4 МПа.
Результаты 24-часового роста S. aureus штамм 209 в агаровой среде после предварительного 2-часового сокультивирования с экстрактами биопокрытий, полученных первым и вторым вариантами способа представлены в таблице 1.
Оптическая плотность культуры S. aureus в экстракте цинк-содержащего кальций-фосфатного биопокрытия уменьшилась по сравнению с экстрактом кальций-фосфатного биопокрытия без добавок от 64.2 (64.2-64.3) до 38.3 (37.7-38.7) у.е.о.п.
Оптическая плотность культуры S. aureus в экстракте медь-содержащего биопокрытия уменьшилась по сравнению с экстрактом кальций-фосфатного биопокрытия без добавок от 64.2 (64.2-64.3) до 46.4 (46.3-46.5).
Таблица 1
Группы,n = 3
Оптическая плотность культуры S. aureus (по модулю), у.е.о.п.
Число колоний на 1 мм<sup>2</sup>
Диаметр колоний, мм
Контроль роста 1
56,4(55,9–56,7)
0–3
До 0,5
Контроль роста 2
63,0*(63,0–63,1)
–
Экстракт кальций-фосфатного биопокрытия
64,25^(64,2–64,3)
–
Экстракт Zn-содержащего кальций-фосфатного биопокрытия
38,3^(37,7–38,7)
–
Экстракт Cu-содержащего кальций-фосфатного биопокрытия
46,4^(46,3–46,5)
–
Примечание: n – число образцов в каждой группе; * – статистические различия при р < 0,05 с группой 1, ^ – с группой 2 согласно U-критерию Манна-Уитни.
Пример 3.
Берут образец, аналогичный образцу в примере 1, подвергают его шлифовке и ультразвуковой очистке аналогично примеру 1. Микродуговое оксидирование проводят в анодном режиме при параметрах: напряжение 150 В, длительность импульса 300 мкс, частота следования импульсов 50 Гц, в течение 10 минут
3
10
4
6
2
Процесс ведут в водном растворе электролита, приготовленного следующим образом. Для получения 1 л электролита смешивают 765 мл дистиллированной воды с 235 мл 85%-ной ортофосфорной кислотой, затем небольшими порциями вводят силикат кальция (CaSiO) в количестве 75 г. После окончания процесса газовыделения в электролит при постоянном перемешивании вводят стехиометрический гидроксиапатит Ca(PO)(OH) в количестве 60 г.
Полученное по третьему варианту способа модифицированное биопокрытие обладает повышенной остеоинтеграцией в костную ткань, а состав электролита придает биопокрытию дополнительные свойства - высокую биологическую активность Si-OH-групп на его поверхности и повышенную адгезию к титановой подложке.
В результате исследований с фибробластами было выявлено, что процент выживших клеток на волластонит-содержащем биопокрытии составил 94.0±1.5%. Это указывает на высокую жизнеспособность клеточных культур, включая их подвижность на границе раздела оболочка-клетка.
a
3
2
Биопокрытие, полученное по третьему варианту способа, имеет толщину 25 ± 3 мкм, шероховатость по R2,5 ± 0,5 мкм, поверхностную пористость 20 %, кажущуюся плотность 1,0 ± 0,1 г/см. Краевые углы смачивания водой 17,5 ± 1,2 град и глицерином 28,0 ± 2,0 град. Поверхностная энергия – 70,0 ± 2,2 мДж/м. Адгезионная прочность – 57 ± 5 МПа.
Пример 4.
Берут образец, аналогичный образцу в примере 1, подвергают его шлифовке и ультразвуковой очистке аналогично примеру 1. Микродуговое оксидирование проводят в анодном режиме при параметрах: напряжение 200 В, длительность импульса 100 мкс, частота следования импульсов 50 Гц, в течение 10 минут.
3
4
3
10
4
6
2
Сначала проводят процесс формирования кальций-фосфатного покрытия в электролите на основе стехиометрического гидроксиапатита. Для этого готовят раствор электролита состава: 765 мл дистиллированной воды смешивают с 235 мл 85%-ной HPO, затем вводят CaCO в количестве 90 г и Ca(PO)(OH) в количестве 60 г, проводят микродуговое оксидирование с получением кальций-фосфатного покрытия.
2
Затем готовят суспензию следующего состава: HO (дистиллированная) – 25 мл, порошок AlN – 30 мг. Суспензию с порошком подвергают ультразвуковой обработке для разбивания агломератов порошка AlN в течение 60 минут.
2
3
В полученную суспензию помещают образец с кальций-фосфатным покрытием и подвергают ультразвуковой обработке в течение 5 мин. Затем суспензию с образцом нагревают до 60 градусов для инициализации реакции гидролиза (AlN+2HО→ AlO(OH)+NH↑), в результате которой формируются наночастицы бемита AlO(OH) с большой удельной площадью поверхности и осаждаются на поверхности и внутри пор кальций-фосфатного покрытия. Наночастицы бемита являются электроположительными (+40 мВ). Кальций-фосфатное покрытие с положительно заряженными наночастицами бемита будет способствовать ускорению остеокондуктивности отрицательно заряженных костных клеток на свою поверхность и ускорять остеоинтеграцию и заживление имплантата.
Биопокрытие, полученное по четвертому варианту способа, имеет толщину 40 ± 5 мкм, шероховатость по Ra 3,0 ± 0,5 мкм, поверхностную пористость 39 %, химический состав: Ca (5,4 ± 0,5 ат.%), P (19,9 ± 0,9 ат.%), Ti (12,7 ± 0,8 ат.%), O (58,9 ± 5,4 ат.%), Al (до 3,1 ат.%). Краевые углы смачивания водой 10,0 ± 1,2 град и глицерином 30,0 ± 2,0 град. Поверхностная энергия – 102,0 ± 2,2 мДж/м2. Адгезионная прочность – 50 ± 5 МПа. Дзета-потенциал биопокрытий после модифицирования увеличился от - 63 мВ до - 23±3 мВ при pH среды 7.2.
Полученное по четвертому варианту способа модифицированное биопокрытие обладает повышенной остеоинтеграцией в костную ткань, а дополнительное модифицирование наночастицами бемита AlO(OH) придает биопокрытию дополнительно повышенную остеокондуктивность и антибактериальные свойства.
В результате исследований на пролиферативную активность с фибробластами было выявлено, что процент выживших клеток на бемит-содержащем биопокрытии составил 100%, а на биопокрытии без добавок – 92%. Биопокрытие, полученное четвертым вариантом способа, имеет в составе положительно заряженные наноразмерные частицы бемита за счет чего их пролиферационная активность выше, чем у биопокрытия без наночастиц.
5
Результаты по антибактериальным свойствам биопокрытия, полученного четвертым вариантом способа, представлены в таблице 2. Культуру микроорганизмов S. aureus (MRSA) штамм 209 (грамположительные шаровидные клетки диаметром 0,5-1,5 мкм) культивировали в течение 24 часов при температуре 37 ± 1 °C, затем готовили взвесь в концентрации 10 КОЕ/мл. Жизнеспособность бактерий (CFU/мл) подсчитывали после 3 и 6 ч инкубации в контакте с биопокрытиями при 37 °С. Количество колониеобразующих единиц на мл после контакта с бемит-содержащими биопокрытиями уменьшилось по сравнению с экстрактом кальций-фосфатного биопокрытия без добавок от 98 до 87 КОЕ/мл после 3 часов инкубации, и, от 97 до 74 КОЕ/мл после 6 часов инкубирования.
Таблица 2
Время экспозиции, часы
КОЕ/мл
Контроль
Образец с КФ покрытием
Образец с бемит-содержащем КФ покрытием
3
100.0±0.4
98.0±0.2
87.0±0.4
6
107.5±0.2
97.5±0.2
74.4±0.3
2
Результаты описанных четырех примеров, представляющие все варианты реализации заявленного изобретения показывают, что полученные биопокрытия имеют общие достигнутые свойства: гидрофильность с низкими краевыми углами смачивания (10-20° с водой и 36-43° с глицерином) и высокими значениями поверхностной энергии (70-102 мДж/м).
4
2
2
7
Структура биопокрытий находится в рентгеноаморфном состоянии. Рефлексы, соответствующие титану, оксиду титана, CaHPO, β-CaPO и волластониту наблюдаются в рентгеновских спектрах биопокрытий.
Биопокрытия, полученные всеми четырьмя вариантами предлагаемого способа не являются токсичными, что подтверждают исследования цитотоксичности на костномозговых клетках крысы, пренатальных стромальных клеток человека (FL-42) и фибробластах подкожной соединительной ткани мыши (L929).
2+
2+
Результаты биотестирования образцов с костномозговыми клетками через 24 ч культивирования не выявили повышения концентрации калия в межклеточной жидкости. Добавление в состав покрытий ионов Zn или Cu, не вызывают массивного разрушения клеток, сопровождающегося выходом внутриклеточного содержимого в окружающую среду. Для Zn-КФ биопокрытий показатели клеточной жизнеспособности оказались самыми минимальными и составили 71,9 %, для Cu-КФ биопокрытиями на Ti 75% (см. таблицу 3)
Таблица 3
Образцы
Концентрациякалия через24 ч, мМ
Количествожизнеспособных клетокчерез 24 ч, %
Клетки без образцов(фон),
5,1
91,7* (90,0–93,1)P2 < 0,046
Клетки с КФ покрытиями на Ti
5,05(3,8–5,1)
76,7* (75,9–77,8)< 0,00005P2 < 0,0001
Клетки с Zn-КФ покрытиями на Ti
5,1(5,05–5,10)
71,9* (69,0–76,5)< 0,00001P2 < 0,0004
Клетки с Cu-КФ покрытиями на Ti
5,1
75,0* (70,4–78,1)< 0,0002P2 < 0,004
Примечание: * – указаны статистически значимые различия с фоном; Р2 – с соответствующими значениями через 1 ч культивирования; n – число образцов.
Исследовании на цитотоксичность с жидкостью пренатальных стромальных клеток человека (FL-42) показало, что концентрация ионов калия незначительно меняется при взаимодействии клеточной культуры с воллластонит-содержащем биопокрытие. Добавление в состав покрытий волластонита не способствует выходу внутриклеточного содержимого в окружающую среду, следовательно биопокрытия не являются токсичными. Результаты на цитотоксичность представлены в таблице 4.
Таблица 4
Образцы, n=3
Концентрациякалия через24 ч, мМ
Клетки без образцов(фон)
7.8(7.8–7.9)
Клетки с волластонит-содержащими КФ покрытиями
7.7(7.7–7.9)
Примечание: n – число образцов в каждой группе;
MTT-тест (тест на цитотоксичность) бемит-содержащих биопокрытий на клеточной культуре фибробластов подкожной соединительной ткани мыши (L929) подтвердил отсутствие токсичности компонентов биопокрытия, при этом количество жизнеспособных клеток бемит-содержащих биопокрытий (87.3%) на 3% выше, чем у немодифицированных биопокрытий (84.3%).