Морфометрический анализ в оценке биологических свойств C. albicans при различных формах вагинального кандидоза

Статья

Цель работы — оценка влияния отравления ДХЭ на иммунную систему и перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Материал и методы исследования. Опыты проводили на имбредных белых крысах с массой 180-240 г. Вводили ДХЭ в растворе оливкового масла per os в дозе 0,75 ЛД50. Гуморальный иммунный ответ к тимусзависимому (эритроциты барана - ЭБ) и тимуснезависимому (Vi-антиген брюшнотифозной вакцины - ViAg) антигенам оценивали общепринятыми методами через 4 сут. по числу антителообразующих клеток (АОК) в селезенке после введения ДХЭ с одновременной внутрибрюшинной иммунизацией крыс данными антигенами в дозах 2-108 клеток и 8 мкг/кг соответственно [3]. Активность NK-клеток определяли по показателю естественной цитотоксичности (ЕЦ) спектрофотометрически по числу оставшихся неразрушенными в ходе цитотокси-ческого теста клеток мишеней через 72 ч после применения ДХЭ по методу [6]. Антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ) исследовали через 4 сут. после иммунизации (ЭБ в дозе 108 клеток) крыс, используя их спленоциты, спектрофотометрическим методом [7]. Формирование реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), отражающей функцию клеточного иммунного ответа (в частности, активность Th1), оценивали у крыс по приросту (в %) массы стопы задней лапы. При этом животных иммунизировали внутрибрюшинным введением 108 ЭБ. Разрешающую дозу ЭБ (5-108) вводили под апоневроз стопы задней лапы через 4 сут. Реакцию ГЗТ определяли через 24 часа. При исследовании гуморальных и клеточных иммунных реакций крыс иммунизировали практически одновременно с введением ДХЭ. Показатели ПОЛ и связанные с ними параметры антиокси-дантной системы оценивали по активности каталазы и перокси-дазы, содержанию малонового диальдегида (МДА) в крови спектрофотометрически [8] через 4 сут. после отравления ДХЭ. Данные обрабатывали статистически по t-критерию достоверности Стьюдента. Изучали коэффициенты корреляции между параметрами иммунного статуса и ПОЛ.

Результаты исследования. Под влиянием острого отравления ДХЭ шло снижение гуморального иммунного ответа у крыс к Т-зависимому и Т-независимому антигенам соответственно в 2,51 и 1,48 раза (p<0,05) (табл. 1). Острая интоксикация ДХЭ снижала АЗКЦ, ЕЦ и реакцию ГЗТ соответственно в 1,92; 1,73 и 1,84 раза (p<0,05). Редукция показателей системы иммунитета обусловлена действием как ДХЭ, так и его метаболитов [2, 9].

Таблица 1

Токсическое действие ДХЭ в дозе 0,75 ЛД50 на иммунные реакции у крыс

Показатель Контроль ДХЭ

АОК к ЭБ, 103 31,3 + 3,2 16,8 + 2,3*

АОК к Vi-Ag, 103 23,0 + 2,0 12,5 + 2,4 *

АЗКЦ, % 10,9 + 1,2 6,1 + 1,3*

ЕЦ,% 28,3+3,9 12,7+3,0*

ГЗТ, % 29,5 + 3,1 18,3 + 2,2*

Примечание: здесь и в табл. 2 * - р<0,05 по сравнению с контролем

Иммуносупрессивный эффект ДХЭ сопровождается активацией ПОЛ (табл. 2). Падает активность каталазы и пероксидазы соответственно в 1,74 и 1,46 раза (р<0,05). Уровень МДА при остром отравлении ДХЭ вырос в 1,33 раза (р<0,05).

Таблица 2

Влияние ДХЭ в дозе 0,75 ЛД50 на показатели перекисного окисления липидов у крыс через 4 сут

Серии опытов Каталаза, мккатал/мл Пероксидаза, мкмоль/мин/л МДА, нмоль/мл

Контроль 252,7+28,7 37,6+3,8 6,43+0,54

ДХЭ 145,2+ 25,0* 25,7+ 2,4* 8,56+ 0,58*

Изменения показателей ПОЛ в крови отражают процесс свободно-радикального ПОЛ клеток и органов системы иммунитета и лимфоцитов. Рост интенсивности ПОЛ может трансформировать активность ряда ферментов, например, моноаминоок-

сидазы с моноаминов на другие амины, а МДА - образовывать ковалентные связи со многими амидами иммунокомпетентных клеток [10]. Инициация ПОЛ под влиянием острого токсического действия ДХЭ может рассматриваться в качестве одного из механизмов, приводящих к формированию постинтоксикационного иммунодефицитного состояния. Механизмами снижения функции иммунокомпетентных клеток под влиянием ДХЭ могут являться повреждение генома иммуноцитов, ингибирование функции их энзимов, в частности, ферментов тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования [5]. Оценка коэффициентов корреляции при остром отравлении ДХЭ между числом АОК к ЭБ и активностью каталазы и пероксидазы показала, что они составляли соответственно 0,725 (р<0,05) и 0,776 (р<0,05). Коэффициент корреляции между числом АОК к ЭБ и содержанием МДА составлял -0,736 (р<0,05). Значение коэффициента корреляции между реакцией ГЗТ и активностью пероксидазы было равно 0,695 (р<0,05). Коэффициент корреляции между содержанием МДА в крови крыс и реакцией ГЗТ при токсическом действии ДХЭ составил -0,697 (р<0,05).

Выводы. Острое токсическое действие ДХЭ в дозе 0,75 ЛД50 снижает основные гуморальные и клеточные иммунные реакции. Эти изменения происходят на фоне роста интенсивности процессов свободно-радикального ПОЛ.

Литература

1. Курашов О.В., Троцевич В.А. // Врачебное дело.- 1992.-№ 10.- С. 109-111.

2. Лужников Е.А., Костомарова Л.Г. Острые отравления: Рук-во для врачей.- М.: Медицина, 2000.- 434 с.

3. Забродский П.Ф. Иммунотропные свойства ядов и лекарственных средств.- Изд. Саратов. ун-та, 1998.- 214 с.

4. Забродский П.Ф. и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед.-1997.- Т. 123.- №1.- С.51-53.

5. Забродский П. Ф. / В кн.: Общая токсикология / Под ред. Б.А. Курляндского, В.А. Филова.- М.: Медицина, 2002.- С. 352384.

6. Гордиенко С. М. // Иммунология, 1984.- № 1.- С. 31-36.

7. Зимин Ю. И., Ляхов В. Ф. // Иммунология, 1985.- № 1.-С. 27-30.

8. Валеева И.Х. и др. // Эксперим. и клин. фармакол.-2002.- Т. 65, № 2.- С. 40^3.

9. Тиунов Л.А. Хлорпроизводные алканов: Справ. изд. / Под. ред. В. А. Филова и др.- Л.: Химия, 1990.- С. 357-372.

10. Арчаков А.И. Оксигенация биологических мембран.-М.: Медицина, 1993.- 204 с.

УДК 618. 15-002.828(470.53).

МОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ В ОЦЕНКЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ С. ALBICANS ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ВАГИНАЛЬНОГО КАНДИДОЗА

Т.И. КАРПУНИНА, Е.В. ТРУХИНА *

Введение. Кандидоз слизистых оболочек - наиболее распространенный вид патологии среди всех кандидозных поражений. Candida находятся в окружающей среде повсеместно: их природным резервуаром могут быть почва, вода, продукты питания, макроорганизмы. Поэтому контаминация этими грибами пищеварительного, респираторного тракта и урогенитальной сферы человека не является редкостью [6, 8]. Среди генитальных поражений, обусловленных Candida, наибольшее распространение имеет вульвовагинит, частота которого за последние 10 лет удвоилась и составляет 30-45% в структуре инфекционных заболеваний вульвы и влагалища [4, 7]. По данным различных авторов, 70-85% женщин переносят в течении жизни хотя бы один эпизод вульво-вагинального кандидоза. С. olbicans - наиболее часто (до 95% случаев) обнаруживается в содержимом влагалища, но далеко не всегда проявляет себя как этиопатоген и, как правило, не вызывает заболевание в одиночку. Провоцировать

* Пермь, МУЗ ГКБ №4

Т.И. Карпунина, Е.В. Трухина

развитие кандидоза способны различные эндогенные и экзогенные факторы. Обретение Candida агрессивных свойств в полостях, выстланных слизистыми оболочками, связанно не только с угнетением их защитных свойств, но и с формированием парази-тоценозов: ассоциации грибов с вирусами, патогенными и условно-патогенными бактериями. Однако, если подобные сочетания не сопровождаются инвазией гриба в слизистые оболочки, то принято говорить о кандидоносительстве. Вместе с тем, C. albicans способны продуцировать протеолитические и липолитиче-ские ферменты, которые рассматривают как факторы вирулентности грибов [1—3]. Внутриклеточно C. albicans содержит фосфо-липазы с оптимумами активности при рН 3,6; 5,6 и 8,6. Очевидно, что изменение кислотности влагалищной жидкости значительно может определять их активность. В мембранах и клеточной стенке C. albicans содержатся фосфолипазы А1 и А2, способные сек-ретироваться за пределы клетки. Под их влиянием идет гидролитическое отщепление жирной кислоты от второго углеродного атома фосфолипида. Продукт такого гидролиза (лизофосфатид) имеет высокую токсичность и вызывает разрушение клеточных мембран, обусловливая способность к инвазии в ткани макроорганизма. Фосфолипазная активность присуща только C. albicans [3], она усилена у этого вида по сравнению с прочими Candida [9]. Показана корреляция фосфолипазной активности культур с их адгезивной способностью и др. патогенными свойствами.

Диагноз «кандидоз» ставится на основании клинических симптомов заболевания и выявления грибов рода Candida. Лабораторная диагностика включает микроскопический, культуральный, серологический, иммуноферментный анализ и метод ПЦР. Причем последние не регламентированы и внедрены в малом числе лабораторий. Грибки C. аlbicans амбивалентны и могут в норме входить в микробиоценоз влагалища, потому возникают трудности с оценкой получаемых результатов. Ныне нет единых критериев и надежного способа, который позволял бы отличить состояние болезни от кандидоносительства. Спорными остаются целесообразность и методы антимикотической терапии. Неудачи в лечении связаны с малой изученностью влияния на фармакологическую эффективность применяемых препаратов ряда факторов, в частности рН влагалищной жидкости, в которой происходит размножение грибков, и состава микрофлоры вагинального биотопа при сочетанных кандидозно-бактериальных инфекциях.

Цель исследования - экспериментальная оценка информативности изучения морфологических, культуральных и биохимических свойств C. аlbicans, выделенных при кандидозной инфекции влагалища с использованием морфометрического анализа.

Материалы и методы. В исследовании участвовало 107 женщин, у которых в отделяемом влагалища были обнаружены грибы рода Candida. Микробиологические методы: 1) микроскопия вагинального мазка окрашенного по Граму. Учитывали общую микробную обсемененность (скудная, умеренная, обильная флора), преобладание (отсутствие) тех или иных бактериальных морфотипов, наличие или отсутствие воспалительной реакции (по количеству лейкоцитов), присутствие «ключевых клеток», спор, бластоспор и псевдомицелия гриба; 2) посев отделяемого влагалища с количественной оценкой роста следующих групп бактерий: облигатных анаэробов (на обогащенной среде для контроля стерильности), аэробных и факультативно-анаэробных форм (на ЖСА, 5-% кровянном агаре и среде Эндо), лактобактерий (на среде МРС) и грибов рода Candida на агаре Сабуро; все выделенные культуры C. аШгсяпз тестировались на наличие фосфолипазной активности (ФЛА). Для определения ФЛА, использовали плотную среду Сабуро с добавлением яичного желтка. Посевы выдерживали в термостате в течение двух суток при Т=37С°. О наличии ФЛА судили по образованию «ободка» (опа-лесцирующее просветление) вокруг колонии. Степень ее выраженности, определяющую вирулентность C. а1Ысяпв, оценивали по предложенному нами коэффициенту вирулентности (Кв), его величину рассчитывали по отношению ширины «ободка» к диаметру колонии; 4) в серии экспериментов прослежено влияние кислотности среды и препарата «Микосист» на биосвойства C. аШгсяпз. Для этого выделенные культуры C. ^hicans с микробиологической картиной «истинного» кандидоза, засевали на жидкую среду Сабуро, откалиброванную в диапазоне pH от 3,5 до 7,0 с добавлением «Микосиста» в минимальных статических концентрациях и без него, и в течение 30 либо 60 минут выдерживали в термостате при t=37°Q после чего высевали на плотную стан-

дартную среду Сабуро и на Сабуро с добавлением желтка; 5) морфометрический анализ клеток и колоний проводили на установке OLYMPUS (Япония) для компьютерной микроскопии, при инструментальных увеличениях 100x1,36x10 и 4x0,85x10 соответственно. Статистический анализ показателей вели с применением программ Image-Pro.

Результаты. В соответствии с микроскопической и бактериологической картиной все случаи кандидозной инфекции были разделены на четыре микробиологических варианта (табл.), каждому из которых соответствовал типичный симптомокомплекс.

При 1-м микробиологическом варианте (кандидоноситель-ство, N=35) все показатели, характеризующие микроценоз влагалища, укладывались в критерии нормы. При микроскопии вагинального отделяемого обнаруживали единичные споры гриба, а в составе микрофлоры влагалища при бактериологическом исследовании преобладали лактобактерии, число которых было высоким (6,62±0,34 lg КОЕ/мл), в то время как титр грибов был низким (>3-4 lg КОЕ/мл). По данным морфометрии, размеры клеток C. ülbicans составили 2,849±0,877 мкм - в длину и 2,231±0,641 мкм - в поперечнике. РН=3,5^,5. Чаще выделенные штаммы не формировали «ободок» ФЛА либо он был минимально выражен,

о чем свидетельствует Кв = 0,097±0,094.

При 2-м варианте (истинный кандидоз - вагинальный кан-дидоз (ВК), N=20) грибы были моновозбудителями воспалительного процесса, о чем свидетельствовали: многочисленные почкующиеся клетки гриба, псевдомицелий зачастую на фоне сохранившейся лактофлоры. Бактериологическое исследование влагалищной жидкости выявило высокое содержание грибов > 105 КОЕ/мл при отсутствии диагностически значимого роста других условно-патогенных бактерий, в т.ч. и строгих анаэробов. Характерной чертой этого варианта кандидозной инфекции является повышенное число лейкоцитов до 25-30 клеток в поле зрения. Наблюдалась гиперемия вульвы и стенок влагалища, плотный белесоватого цвета налет, обильные творожистые выделения с кислым запахом. Размеры клеток при морфометрии - 2,659±0,855 мкм - в длину, 2,118±0,622 мкм - в поперечнике. Хорошо определялась ФЛА, Кв составил 0,747±0,1061; рН <4.

В 3-м микробиологическом варианте (ВК+ бактериальный вагиноз (БВ), N=33) при микроскопии вагинального мазка определяли обильную коккобациллярную флору («бактериальный песок»), споры, в некоторых случаях мелкие феламентирующие клетки гриба, «ключевые» клетки (3-4 в п. з.), лейкоциты (10-20 в п. з.). Основные морфотипы соответствовали типичным представителям родов Bacteroides, Gardnerella, Mobiluncus. Бактериологическое исследование наряду с C. аlbicans выявило облигатноанаэробные бактерии и гарднареллы при доминировании последних над лактобациллами. В таких случаях при осмотре слизистая вульвы и влагалища имеет очаговую гиперемию, микротрещины, выделения обильные, могут иметь желтоватую окраску и неприятный запах. Положительный аминный тест. Размеры клеток составили от 2,221±0,598 мкм - в длину, 2,118±0,622 мкм - в поперечнике до 2,897±0,891 мкм - в длину и 2,301±0,639 мкм - в поперечнике. «Ободок» ФЛА был различным, от еле заметного до ярко выраженного просветления; Кв = 0-0,9. рН 5,5-7,0.

В 4-м варианте (ВК+ «аэробный» вагинит (АВ), N=19) при микроскопии определяли лейкоциты 10-15-35 в поле зрения, грамположительные и грамотрицательные морфотипы, грамва-риабельные коккобактерии, споры и бластоспоры, псевдомицелий гриба, а бактериологическое исследование обнаружило в составе ассоциаций аэробные и факультативно-анаэробные бактерии (Staphylocjccus spp., Streptococcus spp., колиформные бактерии). Клиническая картина соответствовала неспецифическому, АВ: диффузная гиперемия слизистой влагалища, выделения гомогенные серо-желтого цвета. Размеры клеток - от 2,39±0,825 мкм - в длину, 2,105±0,592 мкм - в поперечнике до 2,855±0,871 мкм - в длину и 2,235±0,647 мкм - в поперечнике. Ширина «ободка» была разной, а Кв = 0-0,87. рН 5,0-5,5.

С целью установить влияние рН и противогрибкового препарата «Микосист», была проведена серия экспериментов, для которых были взяты культуры Candida albicans выделенные от пациенток с клинической картиной «острого» кандидоза. Т. к эти штаммы обладали высокой фосфолипазной активностью и клетки, образующие колонии, были достаточно мелкие, то это позволяло проследить воздействие внешних факторов и лекарства на патогенные свойства гриба с наибольшей достоверностью.

Т.И. Карпунина, Е.В. Трухина

КОНТРОЛЬ

30 60'

3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 pH

7,0

Рис. Влияние рН на фунгицидное действие препарата «Микосист»

В эксперименте получены результаты: количество колоний Candida albicans варьировалось под воздействием pH среды и препарата «Микосист» (рис.). В контроле (без препарата) при значениях рН=3,5 после 30-минутной экспозиции число колоний составило 82,5±3,53; 60-минутной - 102,5±3,53, в незначительной степени проявлялся «ободок» фосфолипазной активности. При pH 4,0 число колоний было минимальным: 30-минутная экспозиция - 70,5±3,53; 60-минутная - 32,5±3,53, ферментативная активность оставалась прежней. В диапазоне рН 4,5-5,5 ободок ФЛА определялся слабо, рост колоний колебался в пределах (30' -77,5±3,53- 105±7,07; 60' - 95±7,07-102,5±3,53) и достигал максимума при pH 6,0 (30' - 165,0±7,07; 60' - 145,0±7,07), отмечена и умеренная ФЛА. Сдвиг рН в щелочную сторону существенно задерживал рост Candida albicans'. рН 6,5 - 30' - 97,5±3,53; 60' -132,5±3,53; рН 7,0 - 30' - 105±7,07; 60' - 125±7,07, но ферментативная активность по прежнему проявлялась. Такое распределение показателей согласуется с данными литературы [3, 9], в соответствии с которыми оптимальным для роста и развития Candida является рН=5,8-6,5, а стабильность фосфолипаз сохраняется в диапазоне рН от 3,0 до 8,5. В колебании численности Candida под влиянием «Микосиста» (рис., опыт) прослеживали аналогичные тенденции, а некоторое ее снижение относительно контроля не было статистически достоверным. Время экспозиции чаще не влияло на количество колониеобразующих единиц и в контроле и в опыте. При визуальном количественном учете выросших колоний создается впечатление, что на рост Candida влияет рН среды, а ингибирующее действие препарата прослеживается лишь при рН=5,5-6,5. Изучение колоний, выросших в условиях опыта и контроля при pH 4,0(min), pH 6,0(max), а также приготовленных из них мазков-препаратов, окрашенных по Граму, с использованием морфометрической установки и статистической обработки полученных данных, позволило установить следующее: при рН = 4,0 диаметр колоний определен в пределах 1,48±0,295 мм (контроль) и 0,405±0,155 мм (опыт), соответственно размеры клеток составили 2,849±0,877 мкм - длина, 2,231±0,641 мкм - ширина (контроль) и 3,113±0,914 мкм - длина, 2,668±0,737 мкм - ширина (опыт), при рН=6,0 диаметр колоний - 1,32±0,229 мм (контроль) и 0,33±0,095 мм (опыт), размеры клеток - 2,659±0,855 мкм -длина, 2,118±0,622 мкм - ширина (контроль) и 3,113±0,956 мкм -длина, 2,685±0,769 мкм - ширина (опыт). Клетки, образующие колонии в опыте крупнее, сгруппированы и образуют между собой тяжи, принимая вид «кристаллической решетки». Самые крупные клетки окрашены интенсивнее других. В контрольных культурах клетки меньше по размеру, равномерно окрашены, располагаются мозаично, не образуя групп и связей. По данным литературы, наличие мелких клеток Candida говорит о их высокой патогенности, крупные же клетки считаются авирулентными [1]. При инструментальной обработке опыта прослежены достоверные различия, отражающие фунгицидное действие «Микоси-ста» и влияние рН среды на морфологические, культуральные и биохимические свойства грибов.

Проведенное клиническое и микробиологическое исследование показало, что грибы рода Candida, как и другие условно -патогенные микроорганизмы, могут участвовать в развитии различных вариантов инфекционного процесса. С микробиологических позиций нами выделены 4 варианта кандидозной инфекции,

характеризующие состояние микробиоценоза влагалища: «кандидоносительство», «истинный» кандидоз, ВК в сочетании с БВ и ВК в сочетании с неспецифическим АВ. Для первого варианта, который мы обозначили как «кандидоносительство», характерно выявление C. аІЬісат практически на фоне «нормоценоза». При этом все выделенные штаммы, численность которых не превышала 104КОЕ/мл, по изученным биологическим свойствам можно отнести к «авирулентным», о чем свидетельствовали показатели ФЛА, коэффициент вирулентности не привышал 0,25, а клетки грибов имели крупные размеры (2,849±0,877 мкм - в длину и 2,231±0,641 мкм - в поперечнике). Во 2-м случае, который мы отнесли к «истинному» кандидозу, обнаруживали грибы C. аlbicans, почкующиеся формы, как правило на фоне сохранившейся лактофлоры. Клетки гриба мелкие (2,659±0,855 мкм - в длину, 2,118±0,622 мкм - в поперечнике), а все выделенные штаммы, количество которых превышало 105К0Е/мл, имели высокую ФЛА, (Кв=0,747±0,1061), что позволяет считать их «вирулентными». При 3-м варианте C. аlbicans вегетируют на фоне доминирующего роста облигатноанаэробных бактерий, ассоциированных с БВ. Степень вирулентности выделенных штаммов по предлагаемым критериям была различной: у одной части культур она соответствовала «авиру-лентным» (ФЛА недостаточно яркая (Кв составил от 0 до 0,250), клетки крупных размеров (2,897±0,891 мкм - в длину и 2,301±0,639 мкм - в поперечнике)), у другой «патогенным» (ФЛА выражена (Кв от 0,250 до 0,9), клетки гриба мелкие (2,221±0,598 мкм - в длину, 2,118±0,622 мкм - в поперечнике)). В 4-м варианте, выделенном нами как ВК в сочетании с неспецифическим АВ, грибы C. аІЬісат были ассоциированы с аэробной и факультативно-анаэробной флорой, на фоне значительного снижения числа лактобацилл. На основании размеров клеток и выраженности ФЛА, штаммы грибов были также разделены на «авирулент-ные» (Кв колебался в пределах 0-0,25, клетки крупных размеров 2,855±0,871 мкм - в длину и 2,235±0,647 мкм - в поперечнике) и «вирулентные» (Кв от 0,25-0,87, клетки мелкие 2,39±0,825 мкм -в длину, 2,105±0,592 мкм - в поперечнике).

Заключение. На основании экспериментальных и клинических наблюдений показана зависимость морфологических, биохимических и культуральных свойств C. аІЬісат от ряда факторов. Наибольшее влияние оказывала кислотность среды обитания, которая во многом определяет и микроэкологию влагалищного биотопа. Морфометрические характеристики клеток и колоний, фосфолипазный тест, характеризующие вирулентность C. Âlbicans, подтверждали прослеженные эффекты, что свидетельствует о возможности их использования для дифференциальной диагностики различных форм ВК. Эти же критерии могут быть использованы при определении целесообразности проведения антимикотической терапии, выборе препаратов (местного или системного действия) и оценке эффективности проводимого лечения. Применение морфометрии способствует объективизации оценки получаемых результатов.

Литература

1. Богомолова Т.С.и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии.- 1987.- № 7.- С. 92-95.

2. Брокерхоф Х.и др. Липолитические ферменты.- М.: Мир,

1978.

3. Кубась В.Г. и др .Кандидозная инфекция.— СПб, 1996.

4. Назароваи Е. К. и др. // Антибиотики и химиотерапия.-2002.- Т. 47, №4.- С. 34-42.

5. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток.— М., 1978.

6. Род-ионов Â.H. Грибковые заболевания кожи: Рук-во для врачей.— СПб, 1998.

7. Ткаченко Л.В. и др. // Рус. мед. ж.- 2003.-Т. 11, № 16.-С. 926-929.

8. О.К. Хмельницкий // Арх. патол.- 2000.- №6.- С. 3-10.

9. Mahmoud A. Ghannoum // Clinical Microbiology.- 2000.-Vol. 13, № 1.- Р. 122-143.

Статья

Таблица 1

Клеточный состав воспалительного инфильтрата в лигатурных анастомозах

Сроки (сут.) Нейтроф. лейкоциты Лимфоциты Плазм. клетки Гистиоциты Фибробласты Фиброциты

1 96,3 3,7 - - - -

3 91,4 5,6 1,1 1,9 - -

7 73,5 18,3 - 4,3 2,9 -

14 46,7 37,1 - 2,5 13,7 -

21 27,1 36,3 1,5 5,4 19,2 10,5

30 10,7 30,4 1,1 7,1 25,6 25,1

MORPHOMETRIC ANALYSIS FOR ESTIMATION OF BIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF C. ALBICANS IN DIFFERENT FORMS OF VAGINAL CANDIDOSIS.

T.I.KARPUNINA, E.V.TRUKHINA Summary

This article presents a new approach no diagnostics of different forms of vaginal candidosis. It is based on studying of morphological, biochemical and cultural characteristics of C. albicans, using the morphometric analysis.

Key words: C. albicans, phospholipasa

УДК 616 - 089.86: 616.34

МОРФОГЕНЕЗ ТОЛСТОКИШЕЧНЫХ КОНЦЕ-КОНЦЕВЫХ АНАСТОМОЗОВ

Ф.Ш. АЛИЕВ, А.И. КЕЧЕРУКОВ, А.М. ЛУНТОВСКИЙ, О.А. МОЛОКОВА, И.А.ЧЕРНОВ, Ю.Б. ЧИНАРЕВ *

Регенерация - фундаментальная проблема в биологии и медицине. Эффективность заживления тканей в восстановительной хирургии зависит от многого, в т.ч. и от техники соединения органов и тканей. Актуальна проблема создания анастомозов полых органов, где чрезвычайно высока концентрация патогенной и условно патогенной микрофлоры. В литературе уделяется внимание ручным и механическим способам восстановления непрерывности желудочно-кишечного тракта [1-3]. Более 20 лет мы изучаем вопрос качества кишечного шва и предпочитаем компрессионной способ формирования межкишечных анастомозов (патенты РФ № 1186199, 2062052, 2126657, 2199961).

Особенности заживления компрессионных анастомозов, выполненных с использованием никелид-титановых имплантатов, еще недостаточно изучены [4-7]. Ряд исследований посвящен динамике заживления механических, компрессионных и ручных анастомозов [8-9]. Эти сведения носят разрозненный характер. Требуется современное комплексное исследование по изучению закономерностей регенераторного процесса, развивающегося при всех способах формирования анастомозов.

Цель - изучение динамики воспалительных, регенераторных и склеротических процессов при заживлении анастомозов.

У 80 беспородных собак формировали три вида толстокишечных конце-концевых анастомозов. Компрессионный анастомоз выполнялся 3-витковым никелид-титановым устройством размером 20x10 и 25x12 мм, сечение провода - 01,9-2,2 мм и сферическим устройством тех же размеров. Для формирования ручных анастомозов применялся 2-рядный шов с использованием современных атравматических материалов (викрил, дексон, полипропилен): 1-й ряд - серозно-мышечно-подслизистый шов по Пирогову - Матешуку, 2-й ряд - узловые серо-серозные швы. Механические соустья накладывались с помощью степлеров фирмы «ЕШюоп» и сшивающих аппаратов отечественного производства СПТУ. Животных выводили из эксперимента на 3, 7, 14, 21, 30, 60, 90 сутки послеоперационного периода. Микроскопическое исследование выполняли с использованием стандартных гистологических методов - окраски гематоксилином и эозином, по Слинченко. При формировании анастомозов ручным способом выявлено, что в течение 14 суток преобладают гнойные воспалительные изменения. Это подтверждают морфометрические данные о составе воспалительного клеточного инфильтрата (табл. 1). В первые 7 суток преобладают лейкоциты, начиная с 14-х суток их число резко уменьшается, растет лимфоцитоз. На 3 сутки раневой канал полностью заполняется фибринозно-гнойным экссудатом. Стенки кишки в зоне анастомоза резко отечны, полнокровны, пропитаны гнойным экссудатом.

С 14-х суток идет стихание воспалительных изменений и развиваются регенераторные процессы. Происходит усиление кроющей функции эпителия - по язвенно-некротической поверхности с краев анастомоза навстречу друг другу начинает расти

однорядный железистый эпителий и идет образование примитивных крипт, глубоко эктопированных в подслизистую основу.

Эпителизация язвенного дефекта заканчивается на 21-е сутки послеоперационного периода. Новообразованный эпителиальный пласт незрелый (рис. 1а на стр. 3 обложки), характеризуется меньшей толщиной, недостаточной дифференцировкой ко-лоноцитов. Полное закрытие язвенного дефекта и прекращение поступления микрофлоры способствует дифференцировке эпителиальных клеток и развитию репаративных процессов в подлежащих тканях. Наряду с заживлением язвенного дефекта идет формирование грануляционной ткани, направленное на восстановление нормальных паренхиматозно-стромальных отношений.

На 21-е сутки воспаление приобретает характер продуктивного с образованием гранулем инородных тел вокруг нерассо-савшихся лигатур. Сохранение воспаления ведет к нарушению процесса созревания соединительной ткани, что проявляется её избыточным разрастанием в области анастомоза. Формирующийся соединительно-тканный рубец широкий, образован грубыми коллагеновыми волокнами. Рубец приобретает характерный Х-образный вид: в подслизистой основе и серозной оболочке новообразованные коллагеновые волокна имеют продольное направление, в мышечной оболочке - поперечное.

На 30-е сутки процессы пролиферации и дифференцировки тканей продолжаются. В краях анастомоза складки слизистой оболочки (СО) компенсаторно гипертрофируются. Гипертрофия складок слизистой оболочки - закономерный процесс, имеющий адаптивное значение. Восстановление функции обеспечивается усилением пролиферации в месте непосредственного повреждения и за его пределами и обусловлено гибелью части эпителиального пласта при резекции и формировании язвенного дефекта. Эпителиальный пласт высокий, крипты выстланы однорядным железистым эпителием, состоящим чаще из бокаловидных клеток. Хронизация воспаления способствует росту соединительной ткани и усилению коллагенизации. Затянутые в рубец фрагменты мышечных волокон, соединительно-тканные кисты вокруг шовного материала провоцируют фиброз, расширяя зону рубца.

Через 45 суток в эпителиальном пласте продолжается диф-ференцировка эпителия с созреванием цилиндрических колоно-цитов и бокаловидных клеток. До этого в подслизистой и мышечной оболочках шла неполная репаративная регенерация с формированием соединительно-тканного рубца, теперь в подсли-зистой основе зоны анастомоза идет пролиферация гладкомышечных клеток, способствующая формированию мышечной пластинки СО (рис. 1б на стр. 3 обложки). Пролиферация гладкомышечных клеток имеет компенсаторно-приспособительное значение, направленное на восстановление нарушенной функции.

Типичное складчатое строение СО не восстанавливается, свежий эпителиальный пласт глубоко погружен в подслизистую основу, встречаются железистые кисты. В зоне рубца выявляются кистозно расширенные лимфатические сосуды, что говорит о сохранении нарушений в микроциркуляторном русле. В рубце имеется хроническое новообразование соединительной ткани.

На 60-е сутки на первый план выходят изменения, развивающиеся в соединительно-тканном рубце. Мышечная пластинка СО восстанавливается на небольшом участке. Развивается компенсаторная гипертрофия продольного мышечного слоя в краях анастомоза. Наряду с этим происходит врастание гладкомышечных клеток в зону рубца. Пролиферирующие гладкомышечные клетки образуют как бы «языки», врастающие в рубец. Одновременное сочетание гипертрофических и гиперпластических процессов со стороны мышечных клеток является типичным [10] и направлено на восстановление нарушенной функции. Нервные

* ГОУ ВПО Тюменская госмедакадемия Минздрава РФ