МОДИФИЦИРОВАННЫЙ ЭКЗОТОКСИН А ПСЕВДОМОНАД

1. Экзотоксин А псевдомонад (РЕ, от англ. Pseudomonas exotoxin), содержащий аминокислотную последовательность РЕ, где один или более чем один из аминокислотных остатков F443, R456, L477, R494 и L552, определенных относительно SEQ ID NO 1, является замещенным независимо от других, где РЕ, возможно, имеет:
(i) дополнительную замену одного или более чем одного аминокислотного остатка в одном или более чем одном В-клеточном эпитопе, и эта дополнительная аминокислотная замена в одном или более чем одном В-клеточном эпитопе представляет собой, независимо от других, замену одного или более чем одного аминокислотного остатка D403, D406, R412, R427, Е431, R432, D461, R463, R467, R490, R505, R513, Е522, R538, Е548, R551, R576, Q592 и L597, определенного относительно SEQ ID NO 1,
(ii) дополнительную замену одного или более чем одного аминокислотного остатка в одном или более чем одном Т-клеточном эпитопе,
(iii) делецию одного или более чем одного из смежных аминокислотных остатков среди остатков с 1 по 273 и с 285 по 394, определенных согласно SEQ ID NO 1, или
(iv) сочетание любого одного, двух или трех пунктов из (i)-(iii).
2. Выделенный мутантный экзотоксин А псевдомонад (РЕ), содержащий последовательность следующей формулы:
1
2
3
n
n
n
R-FCS-R-R - функциональный домен РЕ III, где:
1
2
3
n равно 0 или 1 независимо для каждого из R, R и R,
1
R представляет собой от 1 до 10 аминокислотных остатков
FCS (от англ. furin cleavage sequence) представляет собой фурин-расщепляемую последовательность аминокислотных остатков, которая расщепляется фурином и имеет амино-конец и карбоксильный конец,
2
R представляет собой от 1 до 10 аминокислотных остатков;
3
R представляет собой 1 или более чем один из смежных остатков среди остатков с 365 по 394 последовательности SEQ ID 1; и
функциональный домен РЕ III представляет собой остатки с 395 по 613 последовательности SEQ ID NO 1, где один или более чем один из аминокислотных остатков F443, R456, L477, R494 и L552, определенных относительно SEQ ID NO 1, независимо от других является замещенным, где РЕ, возможно, имеет:
(i) дополнительную замену одного или более чем одного аминокислотного остатка в одном или более чем одном В-клеточном эпитопе, и эта дополнительная замена аминокислоты в одном или более чем одном В-клеточном эпитопе представляет собой, независимо от других, замену одного или более чем одного из аминокислотных остатков D403, D406, R412, R427, Е431, R432, D461, R463, R467, R490, R505, R513, Е522, R538, Е548, R551, R576, Q592 и L597, определенных относительно SEQ ID NO 1,
(ii) дополнительную замену одного или более чем одного аминокислотного остатка в одном или более чем одном Т-клеточном эпитопе, или
(iii) вместе (i) и (ii).
3. Мутантный РЕ по п. 2, дополнительно характеризующийся тем, что FCS представлена формулой Р4-Р3-Р2-Р1, где Р4 представляет собой аминокислотный остаток на амино-конце, Р1 представляет собой аминокислотный остаток на карбоксильном конце, Р1 представляет собой остаток аргинина или лизина, и последовательность может расщепляться фурином на карбоксильном конце Р1.
4. Мутантный РЕ по п. 3, дополнительно характеризующийся тем, что FCS: (i) дополнительно содержит аминокислотные остатки на амино-конце, представленные Р6-Р5, (ii) дополнительно содержит аминокислотные остатки на карбоксильном конце, представленные Р1'-Р2', (iii) если Р1 представляет собой остаток аргинина или лизина, то Р2' представляет собой триптофан, а Р4 представляет собой аргинин, валин или лизин, при условии, что если Р4 не является аргинином, то Р6 и Р2 являются основными остатками, и (iv) последовательность может расщепляться фурином на карбоксильном конце Р1.
5. Мутантный РЕ по п. 2, дополнительно характеризующийся тем, что функциональный домен III РЕ состоит из последовательности остатков с 395 по 613 последовательности SEQ ID NO 1.
6. Мутантный РЕ по п. 2, где мутантный РЕ содержит между FCS и доменом III РЕ один или более чем один из смежных остатков с 365 по 394 последовательности SEQ ID NO 1.
1
2
7. Мутантный РЕ по п. 2, где n равен 1 для R и R.
8. Мутантный РЕ по п. 2, где FCS представляет собой SEQ ID NO 8.
1
2
9. Мутантный РЕ по п. 2, где R представляет собой линкер с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 282, R представляет собой линкер с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 284, и FCS представляет собой SEQ ID NO 8.
3
10. Мутантный РЕ по п. 2, где n равен 0 для R.
11. Мутантный РЕ по п. 2, где функциональный домен III РЕ содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 37.
1
2
n
n
12. Мутантный РЕ по п. 2, где R-FCS-R представляет собой SEQ ID NO 36.
13. РЕ по п. 1 или 2, где замена одного или более чем одного из аминокислотных остатков F443, R456, L477, R494 и L552 представляет собой замену, независимо от других, аланином, глутаминовой кислотой, гистидином или аспарагином одного или более чем одного из аминокислотных остатков F443, R456, R494, L477 и L552.
14. РЕ по п. 1 или 2, где замена L552 представляет собой замену L552 глутаминовой кислотой или аспарагином, а замена L477 представляет собой замену L477 гистидином.
15. РЕ по п. 1 или 2, где дополнительная замена аминокислоты в одном или более чем одном В-клеточном эпитопе представляет собой замену, независимо от других, аланином, глицином, серином или глутамином одного или более чем одного из аминокислотных остатков Е282, Е285, Р290, R313, N314, Р319, D324, Е327, Е331, Q332, D403, D406, R412, R427, Е431, R432, D461, R463, R467, R490, R505, R513, Е522, R538, Е548, R551, R576, K590, Q592 и L597, определенных относительно SEQ ID NO 1.
16. РЕ по п. 1 или 2, где РЕ имеет дополнительную замену аминокислоты в одном или более чем одном Т-клеточном эпитопе, и дополнительная замена аминокислоты в одном или более чем одном Т-клеточном эпитопе представляет собой замену, независимо от других, аланином, глицином, серином или глутамином одного или более чем одного из аминокислотных остатков R421, L422, L423, А425, R427, L429, Y439, Н440, F443, L444, А446, А447, I450, 463-519, R551, L552, Т554, I555, L556 и W558, определенных относительно SEQ ID NO 1.
17. РЕ по п. 1 или 2, где замена одного или более чем одного из аминокислотных остатков F443, R456, L477, R494 и L552 представляет собой замену аланином аминокислотного остатка F443; замену аланином аминокислотного остатка R456; замену гистидином аминокислотного остатка L477; замену аланином аминокислотного остатка R494; и замену глутаминовой кислотой аминокислотного остатка L552, РЕ имеет остаток аргинина в позиции 458, а дополнительная замена аминокислоты в одном или более чем одном В-клеточном эпитопе представляет собой:
(a) замену аланином аминокислотного остатка R427;
(b) замену аланином аминокислотного остатка R463;
(c) замену аланином аминокислотного остатка R467;
(d) замену аланином аминокислотного остатка R490;
(e) замену аланином аминокислотного остатка R505; и
(f) замену аланином аминокислотного остатка R538;
определенных относительно SEQ ID NO 1.
18. РЕ по п. 1 или 2, где замена одного или более чем одного из аминокислотных остатков F443, R456, L477, R494 и L552 представляет собой замену аланином аминокислотного остатка R456, РЕ имеет остаток аргинина в позиции 458, а дополнительная замена аминокислоты в одном или более чем одном В-клеточном эпитопе представляет собой:
(a) замену аланином аминокислотного остатка R427;
(b) замену аланином аминокислотного остатка R463;
(c) замену аланином аминокислотного остатка R467;
(d) замену аланином аминокислотного остатка R490;
(e) замену аланином аминокислотного остатка R505; и
(f) замену аланином аминокислотного остатка R538;
определенных относительно SEQ ID NO 1.
19. РЕ по п. 1 или 2, где замена одного или более чем одного из аминокислотных остатков F443, R456, L477, R494 и L552 представляет собой замену аланином аминокислотного остатка F443; замену аланином аминокислотного остатка R456; замену гистидином аминокислотного остатка L477; замену аланином аминокислотного остатка R494; и замену аспарагином аминокислотного остатка L552, РЕ имеет остаток аргинина в позиции 458, а дополнительная замена аминокислоты в одном или более чем одном В-клеточном эпитопе представляет собой:
(a) замену аланином аминокислотного остатка R427;
(b) замену аланином аминокислотного остатка R463;
(c) замену аланином аминокислотного остатка R467;
(d) замену аланином аминокислотного остатка R490;
(e) замену аланином аминокислотного остатка R505; и
(f) замену аланином аминокислотного остатка R538;
определенных относительно SEQ ID NO 1.
20. Мутантный РЕ по п. 2, где один или более чем один из аминокислотных остатков F443, L477, R494 и L552, определенных относительно SEQ ID NO 1, независимо от других является замещенным.
21. Мутантный РЕ по п. 20, где замена одного или более чем одного из аминокислотных остатков F443, L477, R494 и L552 представляет собой замену аланином аминокислотного остатка F443, замену гистидином аминокислотного остатка L477, замену аланином аминокислотного остатка R494 и замену глутаминовой кислотой или аспарагином аминокислотного остатка L552.
22. Выделенный мутантный экзотоксин А псевдомонад (РЕ), содержащий последовательность следующей формулы:
1
2
3
n
n
R-FCS-R-Rn - функциональный домен III РЕ
где:
1
2
3
n равно 0 или 1 независимо для каждого из R, R и R,
1
R представляет собой от 1 до 10 аминокислотных остатков,
FCS представляет собой фурин-расщепляемую последовательность аминокислотных остатков, которая расщепляется фурином и имеет амино-конец и карбоксильный конец,
2
R представляет собой от 1 до 10 аминокислотных остатков;
3
R представляет собой 1 или более чем один из смежных остатков среди остатков с 365 по 394 SEQ ID 1; и
функциональный домен РЕ III представляет собой остатки с 395 по 613 SEQ ID NO 1, где РЕ включает аргинин в позиции 458, определенной относительно SEQ ID NO 1, и где РЕ имеет:
(a) замену аланином аминокислотного остатка R427;
(b) замену аланином аминокислотного остатка R463;
(c) замену аланином аминокислотного остатка R467;
(d) замену аланином аминокислотного остатка R490;
(e) замену аланином аминокислотного остатка R505; и
(f) замену аланином аминокислотного остатка R538.
23. Химерная молекула, содержащая (а) специфическую группировку, конъюгированную или слитую с (b) РЕ по любому из пп. 1-22.
24. Химерная молекула по п. 23, где специфическая группировка представляет собой моноклональное антитело или антигенсвязывающую часть моноклонального антитела.
25. Химерная молекула по п. 24, где моноклональное антитело или антигенсвязывающая часть моноклонального антитела специфически связывается с маркером клеточной поверхности, выбранным из группы, состоящей из: CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, рецептора трансферрина, рецептора эпидермального фактора роста (EGF, от англ. epidermal growth factor), мезотелина, кадгерина, антигена Льюиса Y, глипикана-3, белка активации фибробластов альфа (FAP, от англ. fibroblast activation protein alpha), простатического специфического мембранного антигена (PSMA, от англ. prostate specific membrane antigen), карбоангидразы IX (CA9 или CAIX, от англ. carbonic anhydrase), молекулы адгезии нервных клеток L1 (L1CAM, от англ. cell adhesion molecule), эндосиалина, HER3 (активированная конформация члена 3 семейства рецепторов эпидермального фактора роста), комплекса Alk1/BMP9 (киназа 1 анапластической лимфомы/костный морфогенетический белок 9), TPBG или 5Т4 гликопротеин трофобласта (TPBG или 5Т4, от англ. trophoblast glycoprotein), CD33 (связывающий сиаловые кислоты lg-подобный лектин 3, миелоидный антиген клеточной поверхности), CD123 (рецептор альфа интерлейкина 3), MUC1 (опухоль-ассоциированный эпителиальный муцин), ROR1 (рецепторный тирозинкиназоподобный поверхностный антиген), HER1 (активированная конформация рецептора эпидермального фактора роста) и CLL1 (семейство лектиновых доменов С-типа 12, член А).
26. Химерная молекула по п. 23, где специфическая группировка выбрана из группы, состоящей из: В3, RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2, MORAb-009, их антигенсвязывающих частей и антигенсвязывающей части НА22.
27. Химерная молекула по п. 23, где специфическая группировка представляет собой гуманизированное SS1 или антигенсвязывающую часть гуманизированного SS1.
28. Химерная молекула по п. 23, где специфическая группировка содержит:
(a) SEQ ID NONO 31 и 34;
(b) SEQ ID NONO 45 и 46;
(c) SEQ ID NONO 61 и 62;
(d) SEQ ID NONO 77 и 78;
(e) SEQ ID NONO 93 и 94;
(f) SEQ ID NONO 109 и 110;
(g) SEQ ID NONO 125 и 126;
(h) SEQ ID NONO 141 и 142;
(i) SEQ ID NONO 157 и 158;
(j) SEQ ID NONO 173 и 174;
(k) SEQ ID NONO 49, 50, 53, 54, 57, и 58;
(l) SEQ ID NONO 65, 66, 69, 70, 73, и 74;
(m) SEQ ID NONO 81, 82, 85, 86, 89, и 90;
(n) SEQ ID NONO 97, 98, 101, 102, 105, и 106;
(о) SEQ ID NONO 113, 114, 117, 118, 121, и 122;
(p) SEQ ID NONO 129, 130, 133, 134, 137, и 138;
(q) SEQ ID NONO 145, 146, 149, 150, 153, и 154;
(r) SEQ ID NONO 161, 162, 165, 166, 169, и 170;
(s) SEQ ID NONO 177, 178, 181, 182, 185, и 186;
(t) SEQ ID NONO 31-32 и 34-36;
(u) SEQ ID NONO 33 и 38; или
(v) SEQ ID NONO 93 и 290.
29. Химерная молекула по любому из пп. 23-28, где химерная молекула содержит линкер, содержащий SEQ ID NO 36.
30. Химерная молекула по любому из пп. 23-28, содержащая:
(a) SEQ ID NONO 39 и 40;
(b) SEQ ID NONO 41 и 42;
(c) SEQ ID NONO 43 и 44;
(d) SEQ ID NONO 291 и 293;
(e) SEQ ID NONO 291 и 294;
(f) SEQ ID NONO 292 и 294;
(g) SEQ ID NONO 295 и 297; или
(h) SEQ ID NONO 296 и 297.
31. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую РЕ по любому из пп. 1-22 или химерную молекулу по любому из пп. 23-30.
32. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 31.
33. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный экспрессионный вектор по п. 32.
34. Популяция клеток, содержащая по меньшей мере одну клетку-хозяина по п. 33.
35. Фармацевтическая композиция, содержащая: (а) РЕ по любому из пп. 1-22, химерную молекулу по любому из пп. 23-30, нуклеиновую кислоту по п. 31, рекомбинантный экспрессионный вектор по п. 32, клетку-хозяина по п. 33 или популяцию клеток по п. 34 и (b) фармацевтически приемлемый носитель.
36. Применение РЕ по любому из пп. 1-22, химерная молекула по любому из пп. 23-30, нуклеиновая кислота по п. 31, рекомбинантный экспрессионный вектор по п. 32, клетка-хозяин по п. 33, популяция клеток по п. 34 или фармацевтическая композиция по п. 35 для получения лекарственного средства для лечения или профилактики рака у млекопитающего.
37. Применение РЕ по любому из пп. 1-22, химерная молекула по любому из пп. 23-30, нуклеиновая кислота по п. 31, рекомбинантный экспрессионный вектор по п. 32, клетка-хозяин по п. 33, популяция клеток по п. 34 или фармацевтическая композиция по п. 35 для получения лекарственного средства для ингибирования роста клетки-мишени.
38. Применение по п. 37, где клетка-мишень представляет собой раковую клетку.
39. Применение по п. 37, где клетка-мишень экспрессирует маркер клеточной поверхности, выбранный из группы, состоящей из: CD19, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33, CD79b, рецептора трансферрина, рецептора EGF, мезотелина, кадгерина, антигена Льюиса Y, глипикана-3, FAP (белка активации фибробластов альфа), PSMA (простатический специфический мембранный антиген), СА9 или CAIX (карбоангидраза IX), L1CAM (молекула адгезии нервных клеток L1), эндосиалина, HER3 (активированная конформация члена 3 семейства рецепторов эпидермального фактора роста), комплекса Alk1/BMP9 (киназа 1 анапластической лимфомы/костный морфогенетический белок 9), TPBG или 5Т4 (гликопротеин трофобласта), CD33 (связывающий сиаловые кислоты lg-подобный лектин 3, миелоидный антиген клеточной поверхности), CD123 (рецептор альфа интерлейкина 3), MUC1 (опухоль-ассоциированный эпителиальный муцин), ROR1 (рецепторный тирозинкиназоподобный поверхностный антиген), HER1 (активированная конформация рецептора эпидермального фактора роста) и CLL1 (семейство лектиновых доменов С-типа 12, член А).
40. Способ получения РЕ по любому из пп. 1-22, включающий: (а) рекомбинантную экспрессию РЕ и (b) очистку РЕ.
41. Способ получения химерной молекулы по любому из пп. 23-30, включающий: (а) рекомбинантную экспрессию химерной молекулы и (b) очистку химерной молекулы.
42. Способ получения химерной молекулы по любому из пп. 23-30, включающий: (а) рекомбинантную экспрессию РЕ по любому из пп. 1-22, (b) очистку РЕ и (с) ковалентное связывание специфической группировки с очищенным РЕ.