Биофармацевтические исследования термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина

УДК 616-006.81-092.4:577.352.2:615.011

E.V. Tazina, V.V. Mescherikova, E.V. Ignatieva, A.P. Polozkova, O.L. Orlova, A.A. Wainson, N.A. Oborotova, A.Yu. Baryshnikov

BIOPHARMACEUTICAL INVESTIGATIONS OF THERMOSENSITIVE LIPOSOMES LOADED WITH DOXORUBICIN

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow

ABSTRACT

Thermosensitive liposomes are capable to capture the drug and release it into the medium when heated up to 40 - 43 °C. The purpose of present work was preparation thermosensitive liposomes loaded with doxorubicin, their standardization and assessment of biological activity in vitro and in vivo. Thermosensitive liposomes were prepared by reverse evaporation method using phospholipids, lipid-grafted polyethylenglycol and cholesterol with their subsequent loading by doxorubicin based on the formation of ammonium gradient between the internal and external aqueous phase of liposomes. The efficacy of doxorubicin encapsulation in thermosensitive liposomes was 87 - 94 %, the diameter of vesicles was 165 ± 10 nm. The heating of thermoliposomal doxorubicin has resulted in more than 10fold decrease of cells growth rate in vitro. The tumor doubling time increased from 2 days in control group up to 11 days in the group of animals that were treated with local hyperthermia after administration of thermosensitive liposomes loaded with doxorubicin at dose of 9 mg/kg. The 50 % survival of animals in this group was 34 days. Based on data obtained, we conclude that both in vitro and in vivo thermoliposomal doxorubicin in combination with local hyperthermia has shown less toxicity and more efficiency compared to free doxorubicin.

Key words: doxorubicin, thermosensitive liposomes, lyophilization, local hyperthermia, melanoma B-16.

E.B. Тазина, B.B. Мещерикова, E.B. Игнатьева, А.П. Полозкова, О.Л. Орлова, А.А. Вайнсон, Н.А. Оборотова, А.Ю. Барышников*

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА

ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН,

115478 Москва, Каширское ш., 24

РЕЗЮМЕ

Смысл термочувствительных липосом заключается в их способности захватывать препарат и при нагревании до 40 - 43 °С высвобождать его в окружающую среду. Целью настоящей работы являлось получение

*Тазина Елизавета Владимировна — аспирант лаборатории разработки лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей (ЭДиТО); тел. (495) 324 18 14; ltazina@yandex.ru

Мещерикова Валерия Викторовна — к. биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории лучевых методов лечения опухолей НИИ ЭДиТО; тел. (499) 612 80 48

Игнатьева Елена Владимировна — к. фарм. наук, заведующая лабораторией химико-фармацевтического анализа НИИ ЭДиТО; тел. (499) 612 77 74

Полозкова Алевтина Павловна — старший научный сотрудник лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО Орлова Ольга Львовна — к. фарм. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО Вайнсон Адольф Адольфович — д. биол. наук, профессор, заведующий лабораторией лучевых методов лечения опухолей НИИ ЭДиТО

Оборотова Наталия Александровна — д. фарм. наук, профессор, заведующая лабораторией разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО

Барышников Анатолий Юрьевич — д. мед. наук, профессор, заместитель директора ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, директор НИИ ЭДиТО; тел. (495) 324 22 74

термолипосом с доксорубицином, их стандартизация и изучение биологической активности in vitro и in vivo. Термолипосомы получали методом обращения фаз из фосфолипидов, пегилированного липида и холестерина с последующей загрузкой доксорубицина против градиента сульфата аммония. Включение доксорубици-на в термолипосомы составило 87 - 94 %, диаметр везикул — 165 ± 10 нм. Термолипосомы с доксорубицином более, чем в 10 раз, снижали скорость роста клеток меланомы B-16 in vitro после их прогревания. В экспериментах на меланоме B-16, привитой мышам, время удвоения объемов опухолей возросло с 2 дней в контрольной группе до 11 в группе животных, которым провели сеанс локальной гипертермии на фоне введения термолипосом с доксорубицином в дозе 9 мг/кг. 50%-ная выживаемость в этой группе составила 34 дня. Таким образом, термолипосомальный доксорубицин в комбинации с локальной гипертермией проявил меньшую токсичность и большую эффективность по сравнению со свободным доксорубицином в исследованиях in vitro и in vivo.

Ключевые слова: доксорубицин, термочувствительные липосомы, лиофилизация, локальная гипертермия, меланома B-16.

ВВЕДЕНИЕ

Липосомы — липидные везикулы диаметром 50 - 200 нм — образуются спонтанно при диспергировании липидов в водной среде. Липосомы увеличивают эффективность противоопухолевой химиотерапии за счет селективной доставки препарата в опухоль, которая возможна благодаря пассивному накоплению липосом в солидных опухолях вследствие повышенной проницаемости капилляров (эффект повышенной проницаемости и удерживания — EPR-эффект). Для предотвращения быстрой опсо-низации и последующего захвата липосом ретику-лоэндотелиальной системой (РЭС) их поверхность модифицируют полиэтиленгликолем (ПЭГ) [2]. Пе-гилирование увеличивает время циркуляции липосом в крови [1; 2; 4; 7]. Липосомальные противоопухолевые препараты, применяемые в клинике, в частности, пегилированный липосомальный доксорубицин ^охП/Сае1ух), снижают побочные эффекты инкапсулированных лекарственных средств, но не повышают эффективности их действия [6; 11]. Одним из способов улучшения селективного высвобождения препарата из липосом является физическая дестабилизация мембраны.

Триггерное высвобождение веществ из термочувствительных липосом впервые было описано Yatvin е! а1. в 1978 г. [12]. Механизм действия термочувствительных липосом — дестабилизация мембраны, вызываемая нагреванием до температуры фазового перехода липидов (Тт). Включением в мембрану лизофосфатидилхолинов (например, 1-пальмитоил-2-гидрокси-^п-глицеро-3-фосфохолина, Р-1уБО-РС) можно ускорить высвобождение липосо-мального содержимого при Тт [3; 10]. Смешивание липидов с разными Тт способствует высвобождению препарата при температуре, лежащей в пределах Тт каждого из липидов. Так, липосомы, полученные из

1,2-дипальмитоил-^п-глицеро-3-фосфохолина ^РРС; Тт = 41,4 °С [9]) и 1,2-дистеароил-яп-глицеро-3-фосфохолина фБРС; Тт = 54,9 °С [9]) в молярном соотношении 3:1, высвобождают внутреннее содержимое при температуре между 42,5 °С и 44,5 °С [12].

Кроме увеличения скорости высвобождения препарата из липосом, локальная гипертермия может повышать скорость кровотока в опухоли и усиливать проникновение липосом в опухоль [5; 8]. В экспериментах на мышах использование термочувствительных липосом, содержавших доксорубицин, метотрексат или цисплатин, приводило к незначительному улучшению доставки лекарств в опухоль, либо незначительному торможению роста опухоли [8] по сравнению с лечением без гипертермии или введением свободного препарата. Поэтому необходимы дальнейшие исследования с целью увеличения количества препарата, высвобождаемого из термочувствительных липосом, или скорости его высвобождения в опухоли.

Данная работа посвящена получению, стандартизации и изучению биологической активности термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина на клетках in vitro и на перевивных опухолях мышей in vivo в комбинации с локальной гипертермией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Препараты и реактивы

Доксорубицина гидрохлорид (ОАО ОНОПБ, Россия);

1,2-дипальмитоил-^п-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-яп-глицеро-З-фосфохолин (DSPC), Lipoid (Германия); 1,2-дистеароил-5п-глицеро-3 -фосфоэтаноламин-№[метокси(полиэтилен-гликоль)-2000] (DSPE-PEG-2000) аммониевая соль, холестерин (Avanti Polar Lipids, Inc., США); а-токоферола ацетат (Марбиофарм, Россия); аммоний сернокислый (х. ч.), натрия хлорид (ч.), сахароза (Химмед, Россия); HEPES (N-2-гидроксиэтил-пиперазин-№-2-этансульфоновая ки-

слота), AppliChem (Германия); коллидон (Kollidon 17 PF), BASF (Германия); L-гистидин (х. ч., Венгрия); глюкоза, раствор для инфузий 10 % (ОАО Биохимик, Россия); гель на основе декстрана — Sephadex G-50 superfine (Amersham Biosciences, Швеция); краситель АламарБлю (BioSource International, Inc., США).

Приборы и аппаратура

Испаритель ротационный BÜCHI Rotavapor R-200 (BÜCHI Labortechnik AG, Швейцария), наносайзер

Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США), термобаня ELMI TW-2 (ELMI Ltd., Латвия), мини-экструдер Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США), поликарбонатные фильтры Whatman (Великобритания), спектрофотометр СФ-46 (ЛОМО), хроматографическая колонка C 10/20, детектор UVis-920, рекордер REC 111 (Amersham Biosciences, Швеция), перистальтический насос Liposomat (Dianorm Geräte, Германия), рН-метр HANNA pH 211 (Hanna Instruments, Германия), сублимационная сушка Minifast DO.2 (Edwards, Великобритания), весы Sartorius LA 1200 S (Sartorius AG, Германия), прибор Униплан (ЗАО Пикон, Россия).

Получение термочувствительных липосом с доксорубицином

Термолипосомы (ТЛ) получали из DPPC, DSPC, холестерина (Chol) и DSPE-PEG-2000 в молярных соотношениях: 9:1:0,2:0,02; 9:1:0,5:0,1; 9:1:0,75:0,2; 9:1:1:0,3; 9:1:1,2:0,4; 7:2:1. Для предотвращения окисления липидов добавляли 2 моль% а-токоферола ацетата (a-TA). После растворения липидов и холестерина в хлороформе органический растворитель упаривали на роторном испарителе, а образующуюся липидную пленку гидратировали 250 мМ раствором сульфата аммония при 50 °С. Полученную дисперсию мультиламеллярных везикул экструдировали через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм при 50 °C с помощью ручного мини-экструдера.

Доксорубицин (Докс) загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония при 50 °C в течение 1 ч. Весовое соотношение препарат : липиды составило

0,13:1. Градиент концентрации сульфата аммония формировался при 20-кратном разбавлении термоли-посомальной дисперсии следующими буферами: 10 мМ HEPES; буфером, содержавшим 10 мМ HEPES и 82 мМ раствор хлорида натрия; 28 мМ гистидином (pH буферов 8,4).

Для разделения Докс-ТЛ от не включившегося в везикулы препарата использовали метод гель-фильтрации. На хроматографическую колонку, заполненную сефа-дексом G-50, наносили 1 мл термолипосомальной дисперсии с Докс, элюент — 0,15 М раствор хлорида натрия, скорость элюции — 0,4 - 0,45 мл/мин. Процесс очистки контролировали с помощью детектора UVis-920 с длиной волны 215 нм. На выходе из колонки получали

3 фракции (рис. 1): I — Докс-ТЛ, II — буфер с криопротектором, III — не включившийся в ТЛ Докс.

Из рис. 1 видно, что ТЛ и Докс-ТЛ начинали сходить через 16 - 20 мин после нанесения на колонку, 10 мМ буфер HEPES с 4,0%-ной сахарозой выходил спустя 39 - 42 мин, а не включившийся Докс — через 59 - 60 мин. Таким образом, весь процесс гель-фильтрации продолжался около 1,5 ч.

Для стабилизации Докс-ТЛ проводили сублимационную сушку с использованием в качестве криопротектора 4,0%-ного раствора сахарозы или 3,7%-ного раствора сахарозы с добавлением 0,4%-ного коллидона. Средний диаметр везикул измеряли на наносайзере.

2*5

2

Q 1,5 1 0,5

/и

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Время, с

Рис. 1. Очистка Докс-ТЛ от невключившегося Докс методом гель-фильтрации:

1 — ТЛ, разбавленные в 20 раз водой;

2 — 10 мМ буфер HEPES с 4,0%-ной сахарозой (pH 8,4);

3 — ТЛ, разбавленные 10 мМ буфером HEPES с 4,0%-ной сахарозой (pH 8,4);

4 — Исходная термолипосомальная дисперсия с Докс.

Количественное определение содержания Докс в ТЛ

Содержание Докс в ТЛ определяли методом спек-трофотометрии с использованием рабочего стандартного образца (РСО) Докс при длине волны 252 нм, т.к. ингредиенты, входившие в состав ТЛ (липиды, сахароза и др.), в этой области практически не поглощали. Оптическую плотность спиртовых растворов Докс-ТЛ и РСО Докс измеряли относительно 95%-ного этилового спирта.

Количество Докс (X, мг) рассчитывали по формуле: D х а х C

X =-----------,

Do х Со

где D — оптическая плотность раствора образца; D0 — оптическая плотность РСО Докс; С — величина разбавления образца; С0 — величина разбавления РСО Докс; а — навеска РСО Докс, мг.

Эффективность включения Докс в ТЛ (B, %) рассчитывали по формуле:

D1 х С х V1

B =-------------х 100 %,

D х С х V

где D1 — оптическая плотность раствора фракции с очищенными Докс-ТЛ; D — оптическая плотность раствора исходной термолипосомальной дисперсии; С1 — величина разбавления фракции с очищенными Докс-ТЛ; С — величина разбавления исходной термо-липосомальной дисперсии; V1 — объем фракции с очищенными Докс-ТЛ, мл; V — объем исходной термоли-посомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл.

Оценка противоопухолевой активности Докс-ТЛ на клетках меланомы В-16 мышей in vitro

Биологическую активность Докс-ТЛ и свободного Докс изучали на клетках меланомы В-16 мышей в

культуре. Критериями активности служили снижение скорости роста клеток и степень сохранения ими способности к неограниченному делению (образованию макроколоний, рассматриваемому как критерий выживаемости клеток).

Клетки меланомы В-16 выращивали в виде монослоя на среде RPMI-1640 + 10 % эмбриональной сыворотки. Перед опытом готовили суспензию клеток (330 тыс. клеток в 1 мл) и вводили туда субстанцию Докс, ТЛ и Докс-ТЛ в количестве от 3 до 15 мкг/мл. Затем клетки с препаратами инкубировали в течение 1 ч при 37 °С или 42,5 °С. Далее суспензию разводили в 20 раз и по 3 тыс. клеток в 0,2 мл среды помещали в лунки 96-луночной планшеты. Через 48 ч роста в каждую лунку добавляли по 0,02 мл красителя АламарБлю, который при метаболизме в клетках меняет цвет с синего на красный, и спустя 18 ч определяли степень конверсии красителя в каждой группе лунок путем измерения поглощения при 530 нм и 595 нм на приборе Униплан.

Кроме того, суспензию клеток с препаратами, разведенную в 20 раз, по 0,04 мл рассеивали в чашки Петри с 9 мл среды и термостатировали при 37 °C. Оценку по критерию выживаемости, т.е. способности клеток образовывать видимые глазом макроколонии, проводили через 8 - 10 дней после посева.

Изучение действия Докс-ТЛ на меланому B-16 мышей in vivo

Меланому В-16 прививали самкам мышей линии C57BL/6j в мышцу голени за 8 дней до эксперимента. В день опыта диаметр растущей опухоли голени был равен 7-9 мм. Каждая экспериментальная группа состояла из 6 животных. Свободный Докс, ТЛ и Докс-ТЛ вводили мышам в ретроорбитальный синус из расчета 9 мг/кг Докс. Локальную гипертермию (ГТ) голени с опухолью проводили в водяном ультратермостате и начинали через 20 мин после введения животным препаратов. Продолжительность ГТ составила 30 мин при 43 °C.

Мыши были разделены на 8 групп: контрольная (не леченные животные); животные, которым вводили Докс; животные, которым вводили ТЛ; животные, которым вводили Докс-ТЛ; животные, которым проводили ГТ; животные, которым вводили Докс и проводили ГТ; животные, которым вводили ТЛ и проводили ГТ; животные, которым вводили Докс-ТЛ и проводили ГТ.

Наблюдение за животными состояло в измерении габаритных размеров опухолей, которое проводили трижды в нед в течение нескольких нед после лечения, и фиксации момента гибели животных. У каждого животного в группе определяли 3 размера опухоли: длину и диаметр в 2 плоскостях, после чего вычисляли ее габаритный объем (V, мм3) перемножением полученных чисел; затем рассчитывали средний габаритный объем опухоли в группе Уср). Динамику роста опухоли в разных группах животных рассчитывали как отношение средних габаритных объемов опухоли

в день измерения (V) к объемам в день начала эксперимента (Уо).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Включение Докс в ТЛ, содержавшие DPPC:DSPC:Chol:DSPE-PEG-2000 в молярных соотношениях 9:1:1:0,3 и 9:1:1,2:0,4, составило 60 % (диаметр везикул — 175 ± 10 нм), при соотношении компонентов ТЛ 9:1:0,5:0,1 и 9:1:0,75:0,2 включение Докс составило 88 % и 86 % соответственно (диаметр везикул — 160 ± 10 нм). В свежеприготовленные ТЛ, содержавшие DPPC:DSPC:Chol в молярном соотношении 7:2:1, включилось 67 % Докс (диаметр везикул — 185 ± 5 нм), а через 15 ч включение Докс в ТЛ увеличилось до 72,5 %. Включение Докс в ТЛ, содержавшие DPPC:DSPC:Chol:DSPE-PEG-2000:a-TA в молярном соотношении 9:1:0,2:0,02:0,2, составило 87 - 94 % (диаметр везикул — 165 ± 10 нм). Этот состав был выбран для получения препарата «Доксорубицин тер-молипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг». Следует отметить, что во всех исследованных составах, в том числе в составе, отобранном для получения лиофилизированной лекарственной формы, в качестве буфера использовали 10 мМ HEPES. После сублимационной сушки препарата и его последующей регидратации водой, 5%-ной, 10%-ной глюкозой или физиологическим раствором хлорида натрия 0,9 %-ным включение Докс снизилось до 72 - 77 %, размер частиц при этом составил 178 ± 8 нм (рис. 2). В меньшей степени Докс вытекал из лиофилизированных ТЛ при их регидратации 5%-ной глюкозой, и, таким образом, этот растворитель был выбран как наиболее подходящий для регидратации данной лекарственной формы. Введение в состав лекарственной формы коллидона как формообразова-теля заметного влияния на ее внешний вид и сохранение высокого включения Докс после сушки не оказало, однако создало трудности при очистке Докс-ТЛ на хроматографической колонке и количественном определении содержания Докс в ТЛ, поэтому в дальнейшем для сублимационной сушки Докс-ТЛ использо-

REL. NICOMP DISTRIBUTION

—

100

80 = i

1 i

60 1 Ё

1 \ =

АО 1 1 Ё

= =

20 = Ё

1 Ё

0 =

10 20 50 100 200 500 1К

Diam. (пт) -> Vesicle

Рис. 2. Распределение Докс-ТЛ по размерам, полученное на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer

вали только 4%-иую сахарозу. С целью предотвращения вытекания Докс из ТЛ после сушки пробовали использовать другой буфер — 28 мМ гистидин, а также буфер, содержавший 10 мМ НЕРЕБ и 82 мМ раствор хлорида натрия (табл. 1). Как видно из табл. 1, введение в состав ТЛ гистидина и хлорида натрия не оказало влияния на сохранение высокой степени загрузки Докс в ТЛ после сушки, а в случае гистидина из ТЛ после сушки вытекло гораздо больше Докс.

клеток в присутствии ТЛ при 37 °С и 42,5 °С практически совпадают. В присутствии свободного Докс конверсия красителя клетками при 42,5 °С снизилась вдвое по сравнению с конверсией клетками, не подвергнутыми воздействию ГТ. Прогревание суспензии клеток с Докс-ТЛ способствовало увеличению проницаемости бислойной мембраны и высвобождению препарата в среду. При этом поражение клеток вызвало более, чем 10-кратное снижение конверсии краси-

Таблица 1

Влияние разных буферов на степень загрузки Докс в ТЛ

Буфер До сушки После сушки

Размер Докс-ТЛ Включение Докс в ТЛ, % Размер Докс-ТЛ Включение Докс в ТЛ, %

28 мМ гистидин + 4% сахароза 150 ± 5 нм 87 150 ± 5 нм 62,5*

10 мМ HEPES + 82 мМ NaCl + 4% сахароза 170 ± 5 нм 92 (через 19 ч) 170 ± 10 нм 73,5*

*При регидратации лиофилизата водой.

Стандартизацию лиофилизированного препарата проводили по следующим показателям: описание, растворимость (регидратация), подлинность, средняя масса содержимого флакона, размер везикул, pH, потеря в массе при высушивании, содержание действующего вещества (табл. 2).

Результаты оценки действия свободного Докс, ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ на клетки меланомы B-16 in vitro представлены на рис. 3 и 4. Как видно из рис. 3, локальное прогревание при 42,5 °С в течение 1 ч не повлияло на степень конверсии красителя Ала-марБлю клетками в присутствии ТЛ, и кривые роста

теля по сравнению с конверсией клетками, инкубированными при 37 °С.

По второму критерию — снижению выживаемости клеток, который рассматривается как наиболее адекватно отражающий их поражение с позиции химиотерапии опухолей, получены аналогичные результаты: усиление поражения клеток термолипосомальным Докс в сочетании с ГТ (рис. 4). По рис. 4 определили концентрацию препарата, вызывающую снижение выживаемости клеток до 20 % от исходной (табл. 3). Видно, что при нагревании до 42,5 °С одинаковая степень поражения клеток свободным Докс наблюдалась при 12-

Таблица 2

Критерии качества препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг»

Критерий качества Пределы по ФСП Серия I Серия II Серия III

Описание Сухая пористая масса красновато-розового цвета

Растворимость (регидратация) Образование термолипосомальной дисперсии красновато-розового цвета после добавления к содержимому флакона 2 мл 5%-ной глюкозы и интенсивного встряхивания в течение 2 мин

Подлинность Наличие в электронном спектре поглощения спиртового раствора характеристических максимумов при длинах волн: 234 нм, 252 нм, 288 нм, 496 нм, 530 нм.

Средняя масса содержимого флакона, г 0,088 - 0,098 0,096 0,093 0,095

pH 7,3 - 7,8 (после добавления к содержимому флакона 10 мл воды) 7,6 7,6 7,6

Потеря в массе при высушивании, % Не более 3 1,5 1,5 1,5

Содержание Докс, мг 0, 6 О 1 0, 8 О 0,76 0,76 0,77

Концентрация Доке, мкг/мл

Рис. 3. Угнетение пролиферативной активности клеток мышиной меланомы В-16 после их инкубации при 37 °С и 42,5 °С в присутствии свободного Докс или Докс-ТЛ трех стандартных серий

А-Ш):

1 — ТЛ (37 °С); 2 — Докс (37 °С); 3 — Докс-ТЛ серия I (37 °С); 4 — Докс-ТЛ серия II (37 °С);

5 — Докс-ТЛ серия III (37 °С); 6 — ТЛ (42,5 °С);

7 — Докс (42,5 °С); 8 — Докс-ТЛ серия I (42,5 °С);

9 — Докс-ТЛ серия II (42,5 °С); 10 — Докс-ТЛ серия III (42,5 °С).

Оценка — по степени конверсии клетками красителя АламарБлю, данные получены по отношению к контролю при 37 °С.

Концентрация Докс, мкг/мл

Рис. 4. Выживаемость клеток мышиной меланомы В-16 после их инкубации при 37 °С и 42,5 °С в присутствии свободного Докс или Докс-ТЛ трех стандартных серий (1-Ш):

1 — Докс (37 °С); 2 — ТЛ (37 °С); 3 — Докс-ТЛ серия I (37 °С); 4 — Докс-ТЛ серия II (37 °С);

5 — Докс-ТЛ серия III (37 °С); 6 — Докс (42,5 °С); 7 — ТЛ (42,5 °С); 8 — Докс-ТЛ серия I (42,5 °С); 9 — Докс-ТЛ серия II (42,5 °С);

10 — Докс-ТЛ серия III (42,5 °С).

Данные получены по отношению к контролю при 37 °С.

Таблица 3

Выживаемость клеток меланомы B-16 в присутствии Докс-ТЛ серий I-III и свободного Докс

Препарат ЛК20*, мкг/мл

37 °С 42,5 °С

Свободный Докс 6 0,5

Докс-ТЛ серия I 55 0,7

Докс-ТЛ серия II 40 0,7

Докс-ТЛ серия III 100 0,7

*Концентрация препарата, вызывающая снижение выживаемости клеток до 20 % от исходной.

кратном снижении его концентрации. При использовании Докс-ТЛ равноэффективная концентрация снизилась более, чем в 50 раз. Следовательно, инкапсулирование Докс в ТЛ способствует значительному уменьшению поражения клеток при физиологической температуре тела по сравнению с ГТ, что при клиническом применении Докс-ТЛ будет полезно с позиций снижения побочного действия препарата на нормальные, не подвергаемые нагреву ткани.

Эффективность действия свободного Докс, ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ in vivo оценивали на меланоме B-16. Наименьшую скорость роста меланомы B-16 наблюдали в группах животных, которым провели ГТ на фоне введения Докс-ТЛ и свободного Докс (рис. 5). Время удвоения объемов опухолей для этих групп животных составило 11 и 10 дней соответственно. Время удвоения объемов опухолей в кон-

трольной группе, а также в группах животных, которым вводили ТЛ или Докс-ТЛ, было примерно одинаковым, около 2 дней. В группе мышей, которым вводили свободный Докс, время удвоения объемов опухолей увеличилось до 4 дней. В группе животных, которым провели сеанс ГТ, время удвоения объемов опухолей возросло до 5 дней, а при локальном прогревании опухолей на фоне введения ТЛ время удвоения объемов опухолей составило 6 дней.

Дни

Рис. 5. Динамика роста мышиной меланомы В-16 после ГТ (43 °С, 30 мин) на фоне введения свободного Докс или Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг:

1 — Контроль; 2 — Докс; 3 — ТЛ; 4 — Докс-ТЛ;

5 — ГТ; 6 — Докс + ГТ; 7 — ТЛ + ГТ;

8 — Докс-ТЛ + ГТ.

Результаты учета продолжительности жизни животных в каждой группе представлены на рис. 6 и в табл. 4. Наибольшая выживаемость наблюдалась в группе мышей, которым провели сеанс ГТ на фоне введения Докс-ТЛ. К 36-му дню от начала эксперимента в живых осталась 1 мышь в группе, которой вводили Докс с последующей ГТ, и 2 мыши в группе, которая подвергалась воздействию ГТ на фоне введения Докс-ТЛ. Поскольку в этих группах животных, а также в группе, получавшей ТЛ, ни одна мышь не погибла раньше контроля, можно заключить, что сами ТЛ не обладают токсическим действием, а включение Докс в ТЛ позволяет снизить его токсичность.

Дни

Рис. 6. Выживаемость мышей с меланомой B-16 после ГТ (43 °С, 30 мин) на фоне введения свободного Докс или Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг:

1 — Контроль; 2 — Докс; 3 — ТЛ; 4 — Докс-ТЛ; 5 — ГТ; 6 — Докс + ГТ; 7 — ТЛ + ГТ;

8 — Докс-ТЛ + ГТ.

Таблица 4

50%-ная выживаемость животных с меланомой B-16 после локального прогревания на фоне в/в введения свободного Докс, ТЛ и Докс-ТЛ

Группы животных 50%-ная выживаемость, дни

Контроль 16

Докс 21

ТЛ 21

Докс-ТЛ 21

ГТ 23

Докс + ГТ 25

ТЛ + ГТ 23

Докс-ТЛ + ГТ 34

Таким образом, препарат «Доксорубицин термоли-посомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» менее токсичен, более эффективен, чем свободный Докс, и может быть рекомендован для термохимиотерапии солидных опухолей.

ВЫВОДЫ

1. Разработана технология получения ТЛ с высокой степенью загрузки Докс (до 94 %).

2. Выбран оптимальный состав компонентов для препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и определены критерии его стандартизации.

3. Показано, что термолипосомальный Докс в комбинации с ГТ менее токсичен и более эффективен по сравнению со свободным Докс при воздействии на опухолевые клетки in vitro и солидные опухоли in vivo.

Работа выполнена при поддержке НПП «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний».

ЛИТЕРАТУРА

1. Allen C., Dos Santos N., Gallagher R. et al. Controlling the physical behavior and biological performance of liposome formulations through use of surface grafted poly(ethylene glycol) // Biosci. Rep. - 2002. - Vol. 22. -P. 225-250.

2. Allen T.M., Hansen C., Martin F. et al. Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation halflives in vivo // Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - Vol. 1066. - P. 29-36.

3. Anyarambhatla G.R., Needham D. Enhancement of the phase transition permeability of DPPC liposomes by incorporation of P-lyso-PC: a new temperature-sensitive liposome for use with mild hyperthermia // J. Liposome Res. - 1999. - Vol. 9. - P. 491-506.

4. Blume G., Cevc G. Molecular mechanism of the lipid vesicle longevity in vivo // Biochim. Biophys. Acta. - 1993. - Vol. 1146. - P. 157-168.

5. Gaber M.H., Wu N.Z., Hong K. et al. Thermosensitive liposomes: extravasation and release of contents in tumor microvascular networks // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. - 1996. - Vol. 36. - P. 1177-1187.

6. Judson I., Radford J.A., Harris M. et al. Randomised phase II trial of pegylated liposomal doxorubicin (DOXIL/CAELYX) versus doxorubicin in the treatment of advanced or metastatic soft tissue sarcoma: a study by the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group // Eur. J. Cancer. - 2001. - Vol. 37. - P. 870-877.

7. Klibanov A.L., Maruyama K., Torchilin V.P., Huang L. Amphipatic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes // FEBS Lett. -1990. - Vol. 268. - P. 235-238.

8. Kong G., Dewhirst M.W. Hyperthermia and liposomes // Int. J. Hypertherm. - 1999. - Vol. 15. - P. 345-370.

9. Mabrey S., Sturtevant J.M. Investigation of phase transitions of lipids and lipid mixtures by sensitivity differential scanning calorimetry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1976. - Vol. 73. - P. 3862-3866.

10. Needham D., Anyarambhatla G., Kong G., Dewhirst M.W. A new temperature-sensitive liposome for use with mild hyperthermia: characterization and testing in a human tumor xenograft model // Cancer Res. - 2000. - Vol. 60. - P. 1197— 1201.

11. Walsh T.J., Finberg R.W., Arndt C. et al. Liposomal amphotericin B for empirical therapy in

patients with persistent fever and neutropenia // N. Engl. J. Med. - 1999. - Vol. 340. - P. 764-771.

12. Yatvin M.B., Weinstein J.N., Dennis W.H., Blumenthal R. Design of liposomes for enhanced local release of drugs by hyperthermia // Science. -1978. - Vol. 202. - P. 1290-1293.

Поступила 29.09.2008.