Определение серотипов Streptococcus pneumoniae в образцах спинномозговой жидкости методом ПЦР

2012, Т. 2, № 1-2

Современное лабораторное обеспечение.

МИКРОФЛОРА ЯЗВЕННЫХ ДЕФЕКТОВ У ПАЦИЕНТОВ С СИНДРОМОМ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ

Н.А. Мациевский1, Н.С. Козлова1, Б.И. Делиев1, Е.П. Баранцевич2

1ГБОУ ВПО Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург; 2ФГУ «Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова Росздрава», Санкт-Петербург

Синдром диабетической стопы остается наиболее тяжелым хроническим осложнением сахарного диабета, и изучение микрофлоры язвенных дефектов стопы у таких больных является крайне актуальным. За период с 2009 по 2010 гг. из язвенных дефектов 42 госпитализированных больных было выделено 98 штаммов микроорганизмов, при этом у подавляющего большинства пациентов микробы выявлялись в ассоциациях (81,0%), чаще представленных двумя видами (40,5% пациентов), реже выявлялись ассоциации трех (28,6%) и четырех видов (11,9%). В микробном пейзаже язвенных дефектов стопы безусловно преобладали грамположительные микроорганизмы (63,3%), грамотрицательные микроорганизмы составили чуть более трети выделенных культур (36,7%).

В целом в структуре выделенных микроорганизмов преобладали штаммы Staphylococcus aureus (31,6%). В два раза реже выявлялись Staphylococcus epidermidis (16,3%), Pseudomonas aeruginosa (15,3%) и энтерококки (14,3%), еще реже — Escherichia coli (9,2%) и Proteus mirabilis (6,1%). Acinetobacter и Enterobacter были представлены единичными штаммами (по 3,1% соответственно), была выявлена только одна культура Corinebacteriae (1%). Таким образом, ведущим грамположительным микроорганизмом оказался Staphylococcus aureus, грамотрица-тельным — Pseudomonas aeruginosa, при этом только они выделялись у больных в монокультуре. Одним из этих возбудителей были инфицированы язвенные дефекты всех пациентов (100%). Хотя S. aureus был выделен более чем от двух третей больных (73,8%), в монокультуре он выявлялся только у 2 пациентов (4,8%), в то время как P. aeruginosa встречалась в два раза реже (35,7%), но почти в половине случаев — в монокультуре (14,3%). Интересно отметить, что только от 4 пациентов (9,5%) была выделена ассоциация этих двух возбудителей, в том числе у одного больного (2,3%) дополнительно с энтерококком.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что основными возбудителями инфекционного процесса у пациентов с синдромом диабетической стопы в данном стационаре являются S. aureus, P. aeruginosae и представители семейства Enterobacteriaceae (E. œli, P.mirabilis), при этом язвенные дефекты всех пациентов (100%) были инфицированы первыми двумя микроорганизмами.

ВЫЯВЛЕНИЕ ХРОМОСОМНЫХ ЛОКУСОВ, ПОЗВОЛЯЮЩИХ ДИФФЕРЕНЦИРОВАТЬ ШТАММЫ BACILLUS ANTHRACIS ОТ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВИДОВ

Н.И. Микшис, Ю.Н. Живова, Л.В. Новикова, Т.Н. Каштанова, Ю.А. Попов

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов

Основные отличия сибиреязвенного микроба от других представителей рода Bacillus обеспечивают плазмидные репликоны pXO1 и pXO2. Однако име-

ются сообщения об обнаружении схожих или идентичных плазмид у отдельных штаммов филогенетически родственных видов. В этой связи встает вопрос о поиске хромосомных локусов, позволяющих надежно дифференцировать штаммы B. anthracis.

В процессе проведенного нами исследования по сравнительному анализу нуклеотидных последовательностей некоторых генов жизнеобеспечения у штаммов B. anthracis и близкородственных бактериальных видов удалось выявить хромосомные мутации, специфичные для возбудителя сибирской язвы. Штаммы сибиреязвенного микроба отличает делеция 42 нуклеотидов в гене hom2, в позициях с 1042 п.н. по 1083 п.н. от начала гена. Ген hom2 детерминирует фермент гомосериндегидрогиназу. Протяженная делеция в этом гене блокирует синтез L-гомосерина, из которого в результате ряда последо -вательных реакций образуются метионин, треонин и цистеин. Кроме того, все тестированные штаммы B. anthracis в гене fliC содержат вставку 231 нуклео-тида (в позиции 383 п.н. от его начала). Ген fliC кодирует синтез бактериального флагеллина. Функции структурного белка нити жгутика у бациллярных видов мало изучены. По-видимому, мутации в генах жизнеобеспечения hom2 и fliC возникли на начальном этапе ответвления от общего предшественника и формирования B. anthracis в качестве самостоятельного вида.

Найдены также 4 единичные нуклеотидные замены, позволяющие идентифицировать возбудителя сибирской язвы. Установлено, что все тестированные штаммы B. anthracis в позиции 712—714 гена metX содержат триплет ТАС, а в позиции 492—494 гена metH — САТ. У близкородственных видов замена А на Т (для metX) или на G (для metH) приводит к изменению в аминокислотных последовательностях кодируемых белков. Замена Т на G в позиции 25 от начала гена asd1 приводит к смене типичного для всех штаммов B. anthracis кодона ТТТ. Единичная нуклеотидная замена А на G в позиции 208 того же гена изменяет кодон GAT, характерный для сибиреязвенного микроба, на один из триплетов — GGT, TGT, AGT или CGT, встречающийся у представителей других бациллярных видов.

С использованием хромосомных мишеней разрабатываются мультилокусные ПЦР.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЕРОТИПОВ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE В ОБРАЗЦАХ СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ МЕТОДОМ ПЦР

К.О. Миронов, В.И. Кусева, М.Л. Яковенко, А.Е. Платонов

ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва

Бактерии вида Streptococcus pneumoniae относятся к частым возбудителям гнойного бактериального менингита. Известно около 90 серотипов S. pneumoniae. Информация о распределении серо-типов у штаммов, циркулирующих на наблюдаемой территории, необходима для планирования имму-нопрофилактических мероприятий. Для определения серотипов S. pneumoniae может быть использован метод ПЦР.

Было исследовано 62 образца спинномозговой жидкости, забранных в 2007—2010 гг. от больных с диагнозом «пневмококковый менингит», лечив-

Материалы X съезда ВНПОЭМП, Москва, 12-13 апреля 2012 г.

Инфекция и иммунитет

шихся во 2-й ИКБ г. Москвы. Для проведения серо-типирования использованы праймеры, опубликованные на сайте http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/ strep/pcr.htm. ПЦР проводилась по программе: 95° — 5 мин.; 40 циклов 95° — 10 с, 60° — 20 с, 72° — 20 с; 72° — 2 мин. Праймеры были распределены по ПЦР-смесям следующим образом: смесь № 1 содержала праймеры для серотипов 14, 6ВА, 19F, 18, 23A; смесь № 2 — 23B, 1, 23F, 11AD, 7FA, 9VA; смесь № 3 — 8, 2, 3, 4, 9NL, 22FA, все смеси содержали праймеры для фрагмента cpsA, специфичного для капсуль-ных штаммов. Все образцы были проставлены последовательно со смесями № 1—3: положительные или cpsA-отрицательные образцы, проставленные с смесью № 1, со смесью № 2 не ставились; со смесью № 3 ставились образцы, серотип которых не удалось определить со смесью № 2.

Удалось определить серотип у 33 образцов, 4 образца были cpsA-отрицательные; у 22 (35%) cpsA-положительных образцов серотип определить не удалось. С смесью № 1 был определен серотип у 10 образцов, смесью № 2 — у 12 и смесью № 3 — у 11. Распределение серотипов было следующим: серотип 3 был выявлен в 8 образцах, серотип 23F — в 7 образцах, серотип 18 — в 4 образцах, серотипы 6BA и 11AD — по 3 образца, серотипы 9NL и 19F — по 2 образца, серотипы 4 и 14 были обнаружены однократно.

Определение серотипов с помощью ПЦР является удобным методом при отсутствии культуры возбудителя, вызванном чаще всего назначением антибиотиков до посева пробы ликвора. ПЦР-методика, включающая 18 серотипов, позволяет определить серотип S. pneumoniae в большинстве случаев. При оценке предполагаемой эффективности пневмококковых вакцин, следует учитывать распределение серотипов: согласно представленным данным наиболее часто пневмококковый менингит в Москве вызывается серотипом 3. Серотип 3 включен только в 13-валентную конъюгированную вакцину, серотипы 11AD и 9NL (8% исследованных образцов) в конъ-югированные вакцины не входят.

ВЛИЯНИЕ TETRAHYMENA PYRIFORMIS НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБИОТИКАМ ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ BURKHOLDERIA

Е.В. Молчанова, Е.В. Король, Е.В. Шубникова, А.С. Антюфеева, Л.К. Меринова

ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, г. Волгоград

Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei — возбудители особо опасных инфекционных заболеваний мелиоидоза и сапа, характеризующиеся высокой природной резистентностью к антибактериальным препаратам. Оба вида являются внутриклеточными патогенами, способными проникать и персистировать в макрофагах, что создает им определенную защиту от химиотерапии. Различия в условиях существования микроорганизмов in vivo и in vitro оказывают влияние на корректность результатов определения чувствительности к антибиотикам и, в конечном итоге, на адекватность выбора препарата для лечения (Илюхин В.И., 2009). Поэтому методы оценки модифицируют, используя культуры клеток или простейших в качестве аналогов макрофагов (Inglis T.J.J., 2004).

Нами была исследована чувствительность к 11 антибактериальным препаратам 10 штаммов B. pseudomallei и B. mallei с помощью метода серийных разведений в жидкой питательной среде в присутствии инфузорий. В качестве модели простейших была взята аксеническая культура T. pyriformis, полученная из Института Цитологии РАМН (г. Санкт-Петербург). Для манипуляций с простейшими использовали методические приемы, описанные Inglis T.J.J. (Inglis T.J.J., 2000). Культуры простейших и микроорганизмов соединяли в количественном соотношении 1:100 и инкубировали при температуре 32° в течение 1—48 ч. Предварительно были получены антибиотикограммы штаммов B. pseudomallei и B. mallei, а также изучена чувствительность к антибиотикам клеток тетрахимен.

Все штаммы отличались высокой резистентностью к большинству изученных антибактериальных препаратов. Устойчивость микроорганизмов в среде, содержащей простейшие, повышалась к спарфлок-сацину, цефтазидиму, доксициклину, амоксиклаву и ко-тримоксазолу (антибиотикам, используемым в лечении больных сапом и мелиоидозом) в 1,5— 2 раза.

Таким образом, тетрахимены могут создавать естественную защитную среду для включенных бактерий и ограничивать подавляющее действие на них ингибиторов. Патогенные буркхольдерии (B. pseudomallei, B. mallei) в присутствии T. pyriformis демонстрируют повышенную в той или иной степени резистентность к антибиотикам различных классов в сравнении с исходной чувствительностью, характерной для каждого вида микроорганизмов.

ПАТОГЕННЫЕ ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Т.И. Москвина, Н.П. Иванова, О.А. Павлова, Н.В. Терентьева, Л.В. Перевалова, Л.А. Федотов

ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Челябинской области», г. Челябинск

С каждым годом увеличивается онкологическая заболеваемость населения. Одной из причин рака является иммунодефицит, вызываемый микроорганизмами-паразитами, обитающими в человеческом организме. Диагностика методом вегетативно-резонансного тестирования указывает на ведущую роль в возникновении опухолей патогенных грибов, которые разными путями проникают в организм, в том числе и с пищевыми продуктами.

Количество исследуемой продукции загрязненной плесневыми грибами увеличивается постоянно: в 2008 г. — 1,39%, в 2009 г. — 1,41%, в 2010 г. — 2,27%, в 2011 г. — 4,83%.

Всего в 2008—2011 гг. лабораторией исследовано 11 832 проб пищевых продуктов.

Наиболее контаминированными плесневыми грибами оказались:

— кондитерские изделия, в том числе изделия с кремом — 26,95%;

— пиво — 17,57%;

— сухие пищевые концентраты и готовые завтраки — 14,29%;

— рыбные пресервы и рыба вяленая — 6,22%;

— биологически активные добавки — 5,43%;

— готовые кулинарные изделия (в том числе салаты) — 4,53%;