Способ диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота
METHOD FOR DIAGNOSIS OF CATTLE LEUKEMIA VIRUS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярно-генетической диагностики и ветеринарной медицины и может найти применение как в ранней диагностике инфекционных заболеваний животных, так и в научных исследованиях для обнаружения и типирования вируса лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Уровень техники
Лейкоз крупного рогатого скота – острое инфекционное заболевание, склонное к хронизации. В качестве основного этиологического агента лейкоза крупного рогатого скота выступает РНК-содержащий вирус рода дельтаретровирусы (лат. Deltaretrovirus) из семейства ретровирусы (лат. Retroviridae), морфологически сходный с возбудителями лейкоза у животных других видов.
Естественным хозяином вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) является крупный рогатый скот, что приводит к значительным экономическим потерям в областях промышленного разведения КРС в России и во всем мире. Существование диких резервуаров возбудителя на сегодняшний день не подтверждено, но предполагается, что вирус может сохраняться в организме многих видов животных: кроликов, крыс, кур, свиней, коз и овец (Riebe R. et al, 2004 [4]).
К основным клиническим проявлениям ВЛКРС относят развитие лимфоидных новообразований в результате пролиферации поликлональных Т-лимфоцитов, с поражением других иммунокомпетентных клеток, органов иммунной системы (селезенка, лимфатические узлы и др.) В тоже время, отсутствие клинической симптоматики примерно у одной трети от общего количества инфицированных животных провоцирует развитие стойкого лимфоцитоза (Mirsky M.L. et al, 1996 [3]). На фоне общего истощения иммунной системы наблюдается снижение устойчивости к инфекционной, инвазионной и соматической патологии. Так как клетки вируса и антитела к нему циркулируют в организме в «неактивном» состоянии в течение всей жизни, ВЛКРС относят к латентным или персистирующим инфекциям.
Подобно прочим инфекционным ретровирусам, вирус лейкоза КРС, имеет три основных структурных гена, кодирующих вирусные протеины в следующем порядке 5’gag – pol – env.
Ген gag (специфичный для ретровирусов) кодирует белки, формирующие «сердцевину» вируса, которые необходимы для его внутриклеточной сборки и высвобождения из клетки. Ген pol кодирует ферментную систему (обратную транскриптазу, интегразу, рибонуклеазу) (Kobayashi S. Et al, 2010 [1]).
Ген гликопротеина (env) ВЛКРС, состоящий из gp51 гликопротеина внешней мембраны и трансмембранного gp30 гликопротеина, участвует в инфицировании клеток тканей, вызывая сильный иммунный ответ у инфицированных животных (Mamoun R. Et al, 1990 [2]).
Важно отметить, подходы к классификации ВЛКРС за последние десятилетия значительно изменились. Однако наиболее современной является оценка генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа локуса env-гена данного вирусного патогена. Это связано в том числе и с получением новых знаний о связи данного гликопротеина с проявляем атипичных форм лейкоза. Сегодня на основе структуры гена env выделяют более 8 генотипов данного возбудителя. Было установлено, что для каждого из них характерна определенная географическая зона распространения, однако зарегистрированы единичные завозные случаи инфекции, вызванные другими генотипами (Rola-Luszczak M. Et al, 2013 [5]).
Диагностика лейкоза может осуществляться с использованием серологических, молекулярно-генетических (полимеразной цепной реакции - ПЦР), гематологических, клинических, патоморфологических методов и метода биопробы. В настоящее время в  государственных программах по борьбе с лейкозом КРС основу диагностики составляют серологические методы исследования - реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА); гематологические, клинические и патоморфологические методы служат для уточнения диагноза. Однако в силу особенностей инфекционного процесса плановые методы неприменимы для ранней диагностики, поскольку ориентированы на выявление иммунного ответа организма (не ранее 5-6-месячного возраста телят). В связи с этим, наиболее современный метод - молекулярно-генетическая диагностика, в частности ПЦР-анализ, за счет обнаружения РНК самого вируса или ДНК образованного им провируса, применим даже для новорожденных телят и, кроме того, обладает значительно большей чувствительностью и специфичностью по сравнению с серологическими методами. Это объясняет ежегодно растущий интерес, как со стороны самих хозяйств, так и надзорных органов именно к этому методу.
Известен способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР, заключающийся в использовании прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров для выявления фрагмента гена pol  провируса лейкоза крупного рогатого скота с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.
В качестве праймеров используют однонуклеотиды следующей последовательности:
F2
:
P5’-TGAACGGACAAATGGACTGCTC-3’;
R2
:
P5’-CCGACAGAGAGCGAGGAGAG-3’.
При постановке ПЦР этим способом размер продукта амплификации составляет 438 пар нуклеотидов (п.н.). Однако, данный способ требует проведения дополнительной стадии электрофоретической детекции, что повышает длительность анализа и вероятность возникновения контаминации (патент RU №2445370 С1, опубл. 20.03.12 г. Бюл. №8).
Известен также способ выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота методом ПЦР в режиме реального времени, заключающийся в использовании прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена pol провируса лейкоза крупного рогатого скота. В качестве праймеров используют:
Pol (nested, sense) 5’-CTACCTTGCAGATCTCATC-3’;
Pol (nested, antisense) 5’- GCTTGTCGAAGCTCTGCAATGC-3.
В реакционную смесь добавляют синтезированный зонд с флуоресцентной меткой – pol (molecular beacon) 5’ (FAM) – CGAGCCACCCACTACCCGCCGCCGCTCG-dabcyl-3’. Размер продукта на выходе составляет 202 п.н. (Гулюкин М.И. и др. Применение ПЦР для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота. Харьков, «Ветеринарная медицина», вып.92. с.145-150).
В этом способе из-за низкой консервативности снижается специфичность и эффективность обнаружения ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus; prospects for novel antiretroviral therapies in human. N.Gillet, A.Florins, M. Boxus, C. Burteau, A. Nigro, F. Vandermeers, H. Balon, Amel-BayaBouzar, J. Defoichel, A. Burny, M. Reichert, R. Kettmann and Luc Willems. Retrovirology 2007, 4:18).
Существует способ обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота, основанный на выявлении фрагмента LTR (Long Terminal Repeat) - последовательности провируса лейкоза (патент RU № 2558252 С2, опубл. 27.07.15 г. бюл. №21). Детекцию продуктов амплификации проводят путем электрофореза реакционной смеси в агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. В качестве праймеров используются олигонуклеотиды:
BL1.F 5´-GAGTTAGCGGCACCAGAAGC-3´;
BL1.R 5´-ATAGAGCTCGCGGTGGTCTC-3´.
Продукт синтеза составляет 175 п.н. Данный способ требует проведения дополнительной стадии электрофоретической детекции, что повышает длительность анализа и вероятность возникновения контаминации.
Известен способ экспресс-диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающий использование прямого и обратного олигонуклеотидного праймера с добавлением в реакционную смесь олигонуклеотидного зонда с флуоресцентной меткой для выявления фрагмента гена р24 провируса лейкоза крупного рогатого скота следующей структуры:
F
P- 5'-GGCACCGGGTTCGCAAGTAT-3';
R
P - 5'-CGGTTAGGCTGGTCATGTGGCC-3';
T
зонд R р24 - AAACACTACGACTTGCAATCTTACAGGCCGAC, меченный с 5'-конца флуоресцентным красителем ROX и с 3'-конца гасителем RTQ2. Результаты интерпретируются на основании наличия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие для данной пробы ампликона, размером 140 п.н. (патент RU 2644233 С2, опубл. 08.02.2018, бюл.№4).
Все вышеперечисленные способы ориентированы на выявление ДНК образованного в клетке провируса, а не РНК самого вируса, что не позволяет выявить вирусоносительство на самой ранней стадии заболевания. Известные способы не фланкируют область env -гена, ассоциированного с проявлением атипичных форм лейкоза. Кроме того, эти методы не позволяют определить генотип выявленного ВЛКРС.
Раскрытие изобретения
Технической задачей, на достижение которой направлено изобретение, является разработка быстрого, высокоспецифичного (отсутствие ложноположительных результатов), чувствительного способа диагностики РНК ВЛКРС на ранней стадии заболевания методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Технический результат заявляемого изобретения заключается в формировании реакционных смесей для проведения ПЦР-РВ в два независимых этапа (обнаружение ВЛКРС и генетическое типирование вируса), включающих для первого этапа пару специфических олигонуклеотидных праймеров, комплиментарных областям, фланкирующим консервативный участок гена env (гена белка оболочки gp51), и TaqMan ДНК-зонд, полностью комплиментарный консервативному участку; для второго – пару специфичных праймеров и два флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных зонда, специфичных к аллелям РНК разных генотипов вируса лейкоза. Это обеспечивает максимальную информативность, чувствительность и специфичность метода, минимизацию контаминации в лаборатории, а также возможность достоверно дискриминировать изоляты российских штаммов от других.
Техническая задача решается, а технический результат достигается за счет последовательного использования в реакционной смеси двух систем праймер-зонд, имеющих следующие характеристики:
1. Прямой и обратный праймеры, а также олигонуклеотидный зонд для этапа обнаружения РНК ВЛКРС имеют следующий нуклеотидный состав (5ґ-3ґ-):
BLVcons-F – CAGGGCCATGGYCACRTATG;
BLVcons-R – GCYTGGGAGGCRTTGTCC;
BLVcons-probe - FAM-CGAGCCCCGATGCCCTTATGTG-BHQ1.
Температура отжига прямого и обратного праймера составляет 58,5 и 59,2°С, зонда – 62,4°С, GC-состав – 60%, 66,7% и 63,6% соответственно, праймеры фланкируют консервативный фрагмент гена gp51 ВЛКРС, самокомплиментарные участки внутри каждого праймера и между прямым и обратным отсутствуют, размер ампликонов 93 п.н.
2. Последовательности праймеров и зондов для генетического типирования ВЛКРС (SNP-типирование) следующие (5ґ-3ґ-):
BLV-F = GGCACCACCCTTCCCAGA;
BLV-R = AGARAGATTAACCAGGGAGATAGG;
BLV-FAM-T = FAM-TTCAATGTTTCTCAAGGC-BHQ1;
BLV-VIC-C = VIC-TCAACGTTTCTCAAGGC-BHQ1.
Прямой и обратный праймеры комплиментарны области вирусного гена gp51, не содержат самокомплиментарных участков внутри каждого из них, температура отжига составляет 60,1 и 55,6°С, GC-состав праймеров – 66,7 и 43,8%, зонда BLV-FAM-T – 38,9%, BLV-VIC-C – 47,1%, размер ПЦР-продукта – 86 п.н. TagMan-зонды специфичны соответственно к аллелям С и Т, что позволяет с высокой степенью вероятности дифференцировать штаммы III и IV генотипов (аллель С), выделяемые на территории Российской Федерации и стран Восточной Европы, от других (аллель Т).
Характеристика разработанных праймеров приведена в таблице 1.
Осуществление изобретения
Разработка способа диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота осуществлялась следующим образом.
На основании филогенетического и сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей гена gp51 155 штаммов ВЛКРС из международной базы данных DDBJ/EMBL/GenBank, доступных на момент проведения исследования, были выделены 3 группы преобладающих генотипов вируса в зависимости от их географического положения. Например, генотипы I и II характерны для стран Тихоокеанского региона и условно были обозначены как генотип «США – Япония». Штаммы близких генотипов III и IV выделяют преимущественно в странах Восточной Европы, поэтому эти генотипы были условно обозначены как генотип «Россия – Европа». Генотип V – наиболее обособленный в генетическом отношении от других – обозначен как генотип «Азия».
При сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей локуса env всех исследуемых штаммов была обнаружена общая консервативная область размером 26 п.н. с координатами 4944 – 4969, которая была использована в качестве мишени при конструировании ПЦР тест-системы для обнаружения ВЛКРС.
В качестве стратегии для генотипирования изолятов ВЛКРС различного происхождения использовался комплекс специфичных SNP в вариабельной области гена gp51. Мишенью была выбрана наиболее перспективная позиция 5427 (С/Т), которая позволяет с высокой степенью вероятности дифференцировать штаммы III и IV генотипов (аллель С), выделяемые на территории Российской Федерации и стран Восточной Европы, от других (аллель Т).
Выбор пар праймеров и зондов, а также проверка их качества и термодинамический анализ осуществляли с помощью компьютерной программы Vector NTI 11 (Invitrogen, США). Праймеры проверяли на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека программой BLAST с помощью web-ресурса Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Оценка специфичности сконструированных праймеров подтвердила гомологичность выбранных пар BLVcons-F - BLVcons-R и BLV-F - BLV-R с нуклеотидной последовательностью гена gp51 и отсутствие значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других видов вирусов.
Дизайн каждой отобранной пары праймеров и зондов (для обнаружения и генетического типирования ВЛКРС) осуществлен в полном соответствии с требованиями, предъявляемыми к олигонуклеотидам: прямой и обратный праймеры, составляющие пару, комплиментарны к выбранному фрагменту РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота; имеют оптимальный размер, структуру и GC-состав; у них отсутствует взаимо- и самокомплиментарность; температуры отжига и плавления близкие. Длина специфического фрагмента составляет соответственно 93 и 86 п.н.
Праймеры и зонды были синтезированы на автоматических ДНК-синтезаторах в коммерческом сервисном центре и очищены с помощью полиакриламидного геля (ПААГ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (чистота продукта 98 %).
2
Состав реакционных смесей представлен в таблицах 2 и 3. Они подбирались таким образом, чтобы концентрация ионов MgClобеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы, а концентрация дНТФ, праймеров, зондов и объем пробы способствовали повышению специфичности реакции.
Амплификацию проводили в объеме реакционной смеси 25 мкл. В качестве положительного контроля прохождения полимеразной цепной реакции с использованием разработанных праймеров использовали синтетические ДНК-матрицы, которые были синтезированы стандартным способом на автоматических ДНК-синтезаторах.
Температурно-временной режим реакции отражен в таблице 4.
ПЦР проводили на термоциклерах Rotor-Gene Q (Qiagen, Германия) и CFX96 (Bio-Rad, США).
Учет результатов ПЦР для этапа обнаружения ВЛКРС проводили на основании регистрации флуоресцентных сигналов по каналу FAM/Green и по наличию (или отсутствию) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией.
Учет результатов ПЦР для SNP-типирования проводили на основании регистрации флуоресцентных сигналов по каналам FAM/Green и JOE/Yellow и по наличию (или отсутствию) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов).
Анализировали кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:
1. По каналу для флуорофора FAM/Green регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента РНК, содержащего в позиции 5427 нуклеотид Т;
2. По каналу для флуорофора JOE/Yellow регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации РНК, содержащего в позиции 5427 нуклеотид С.
Пример 1. Проверка эффективности этапа обнаружения ВЛКРС.
Материалом для исследования служили 22 пробы периферической крови крупного рогатого скота из неблагополучного по лейкозу хозяйства, у которых носительство ВЛКРС было подтверждено в реакции иммунодиффузии (Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, утвержденные приказом Минсельхозпрода РФ от 11 мая 1999 г. № 359).
Принцип интерпретации результатов следующий. РНК ВЛКРС обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green определено значение порогового цикла Ct, не превышающее граничное значение (пороговое значение Ct для положительных проб по каналу FAM/Green брали не более 45). При этом кривая флуоресценции каждой исследуемой пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
РНК ВЛКРС не обнаружена, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green не определено значение порогового цикла Ct.
Испытания показали, что из 22 проб в 20 случаях получен положительный ответ в ПЦР. Отрицательные контроли амплификации и экстракции РНК показали отсутствие вирусной РНК в пробе, что позволяет считать результаты ПЦР-исследований достоверными.
Пример 2. Проверка эффективности этапа генетического типирования ВЛКРС.
В качестве материала для испытаний служили 22 пробы периферической крови крупного рогатого скота из неблагополучного по лейкозу хозяйства, положительно реагирующих в реакции иммунодиффузии (Правила по профилактике и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, утвержденные приказом Минсельхозпрода РФ от 11 мая 1999 г. № 359).
Принцип интерпретации результатов следующий: в позиции 5427 вируса лейкоза находится нуклеотид Т, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green определено значение порогового цикла Ct, не превышающее граничное значение (пороговое значение Ct для положительных проб по каналу FAM/Green брали не более 40). При этом кривая флуоресценции каждой исследуемой пробы должна пересекать пороговую линию на участке характерного экспоненциального подъема флуоресценции.
В позиции 5427 вируса лейкоза не находится нуклеотид Т, если для данной пробы в таблице результатов по каналу для флуорофора FAM/Green не определено значение порогового цикла Ct.
В результате 22 пробы, а также отрицательные контроли выделения и амплификации показали отсутствие нуклеотида Т. Положительный контроль (синтетическая ДНК-матрица Т) имела определенное значение порогового цикла.
Аналогично по каналу для флуорофора JOE/Yellow регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации РНК, содержащего в позиции 5427 нуклеотид С. Пороговое значение Ct для положительных проб по данному каналу - не более 30.
Анализ проб показал в 21 случае из 22 наличие нуклеотида С (принадлежность к генотипу «Россия-Европа»), отрицательный результат в отрицательных контролях выделения и амплификации, а также в положительном контроле нуклеотида Т. В связи с этим, результаты испытаний считали достоверными.
Техническим результатом заявленного изобретения является достоверный, высокочувствительный и высокоспецифичный способ детекции и генотипирования фрагмента РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота в биологическом материале на ранней стадии заболевания в короткие сроки. При этом компьютерный анализ показал отсутствие реакции на гомологичные и гетерологичные организмы.
Предложенный способ апробирован с положительными результатами и регулярной воспроизводимостью этих результатов в 2018 году на 250 пробах РНК, выделенных из периферической крови крупного рогатого скота 5 хозяйств Ставропольского края. Работу проводили на базе ГБУ СК «Ставропольская краевая ветеринарная лаборатория» (г. Светлоград).
Предлагаемый способ может быть использован как в диагностике инфекционных заболеваний животных, так и в научных исследованиях для обнаружения и типирования РНК ВЛКРС методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Источники информации:
1. Kobayashi S., Tsutsui T., Yamamoto T., Hayama Y., Kameyama K., Konishi M., Murakami K. Risk factors associated with within-herd transmission of bovine leukemia virus on dairy farms in Japan  //  BMC veterinary research. – 2010. – V. 6, No. 1. – P. 1.
2. Mamoun R., Morisson M., Rebeyrotte N., Busetta B., Couez D., Kettmann R., et al. Sequence variability of bovine leukemia virus env gene and its relevance to the structure and antigenicity of the glycoproteins // J. Virol. – 1990. – V. 64, No. 9 – P. 4180-4188.
3. Mirsky M.L., Olmstead C.A., Da Y., Lewin H.A. The prevalence of proviral bovine leukemia virus in peripheral blood mononuclear cells at two subclinical stages of infection // J. Virol. – 1996. – V. 70 – P. 2178–2183.
4. Riebe R., Blankenstein P., Starick E., Bondzio A. Establishment of a new bovine leucosis virus producing cell line // J. Virol. Meth. – 2004. – V. 121, No. 2 – P. 239-246.
5. Rola-Luszczak M., Pluta A., Olech M., Donnik I., Petropavlovskiy M., Gerilovych A. et al. The molecular characterization of bovine leukaemia virus isolates from Eastern Europe and Siberia and its impact on phylogeny // PLoS One. – 2013. – V. 8, No.3 – P. e58705.
Цитируемые патенты:
1. RU №2445370 С1, опубл. 20.03.12 г. Бюл. №8.
2. RU № 2558252 С2, опубл. 27.07.15 г. Бюл. №21.
3. RU №2644233 С2, опубл. 08.02.2018 г. Бюл. №4.
Сущность изобретения поясняется таблицами и рисунками, в которых отображается следующая информация.
Таблица 1. Характеристика отобранных праймеров и зондов.
Таблица 2. Состав реакционной смеси для обнаружения РНК ВЛКРС.
Таблица 3. Состав реакционной смеси для SNP-типирования ВЛКРС.
Таблица 4. Температурно-временной режим проведения амплификации
Сопоставительный анализ заявляемого изобретения показал, что совокупность существенных признаков заявленного способа, не известна из уровня техники и значит, соответствует условию патентоспособности «Новизна».
В уровне техники не было выявлено признаков, совпадающих с отличительными признаками заявленного изобретения и влияющих на достижение заявленного технического результата, поэтому заявленное изобретение соответствует условию патентоспособности «Изобретательский уровень».
Приведенные сведения подтверждают возможность применения заявляемого способа в области биотехнологии, молекулярной биологии, молекулярно-генетической диагностики и ветеринарной медицины для ранней диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота, и поэтому соответствует условию патентоспособности «Промышленная применимость».