Использование моноклональных антител в судебно-медицинской экспертизе при исследовании частиц перхоти

которым проводится оценка применимости данного варианта методики для химико-токсикологических анализов наркотических и сильнодействующих веществ.

Разработанная методика охватывает область от 5 до 100 нг/мл буторфанола, что предполагает ее использование только для токсикологических, анализов, так как предел обнаружения выше, чем терапевтические концентрации в крови. Предел количественного определения равен 10 нг/мл. Калибровочная кривая линейна в диапазоне от 10 до 100 нг/мл и описывается уравнением:

Y = 2,121*X - 0,0089 (г = 0,9943), где Y - концентрация буторфанола нг/мл;

X - отношение площади пика целевого иона пропио-новых эфиров буторфанола (328 а.е.м.) и внутреннего стандарта (369 а.е.м.); г - коэффициент корреляции.

Результаты проверки методики на воспроизводимость и точность представлены в табл. 2. Максимальная внутрисе-рийная относительная погрешность не превышает 14% для концентрации 20 нг/мл и 12% для концентрации 100 нг/мл.

Предлагаемая методика прошла апробацию в Челябинском областном бюро судебно-медицинской экспертизы для подтверждения и количественного определения буторфанола в крови. Количественное определение буторфанола в крови проводили при обнаружении буторфанола или его метаболитов при скрининге биологических жидкостей на наркотические, психотропные и сильнодействующие лекарственные вещества. Концентрацию буторфанола более 100 нг/мл определяли по анализу крови, разбавленной водой в соотношении 1:1 с последующим пересчетом на цельную кровь. При определении буторфанола в концентрации от 5 до 10 нг/мл она интерпретируется как следовое количество.

Литература:

1. Современная медицинская энциклопедия/Подред. Г. Б. Федосеева - СПб., Норинт,- 2001. - 1235 с.

2. Мелентъев, А. Б. Обнаружение буторфанола и его основных метаболитов в моче методом газовой хроматографии с масс-селек-тивным детектором /А.Б. Мелентьев,Д.Г. Ким //Известия Челяб. Науч. Центра. -2006. - 1(31). - С.61-66.

3. Andraus, М. Н. Derivatization methodology for the analysis of butorphanol by gas chromatography-mass spectrometry / M.H. Andraus, M.E. de Siqueira //Biomedical Chromatography. - 1998. - Vol.12. P.34-37.

4. Boulton, D. W. Validation and application of a sensitive assay for butorphanol in human plasma by high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry detection /D.W. Boulton, G.F. Duncan, N.N. Vachharajani // J.Chrom. B. - 2002. - Vol.775. -P.57-62.

5. Gaver, R. C. Disposition ofparenteral butorphanol in man / R.C. Gaver, M. Vasiljev, H.Wong, I. Monkovic, J.E. Swigor, D.R. Van Harken, R.D. Smyth //Drug Metabolism andDisposithion. - 1980. - Vol.8. - P.230-235.

6. Willey, T. A. High-performance liquid chromatographic method for the quantitative determination of butorphanol, hydroxybutorphanol, and norbutorphanol in human urine using fluorescence detection / T.A. Willey, G.F. Duncan, L.K. Тау, K.A. Pittman, R.H. Farmen // J. Chrom. B. - 1994. - Vol.652. -P.171-178.

© О.Л. Горбунова, Л.Г. Зорина, 2007 УДК 343.983.7

О.Л. Горбунова, Л.Г. Зорина ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В СУДЕБНОМЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ ЧАСТИЦ ПЕРХОТИ

ГУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» Удмуртской республики

На материале, отобранном с голов лиц с заведомо известной группой крови и категории выделительства, а также их одежды, изучены особенности использования моноклональных антител в судебно-медицинской экспертизе при исследовании частиц перхоти. Изучены частицы различных размеров. Отмечена высокая эффективность данной методики при исследовании малого количества материала, быстрота метода. Использование данного метода незаменимо при производстве срочных экспертиз, связанных с исследованием перхоти и выделений человека.

Кпючевье слова: перхоть, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ, антигены, цоликлоны.

USES OF MONOCLONAL ANTIBODIES IN MEDICOLEGAL EXAMINATION AT RESEARCH OF PARTICLES OF FURFUR

O.L. Gorbunova, L.G. Zorina On a material selected from heads of persons with obviously known group of blood, and also their clothes, are investigated features of use monoclonal antibodies in medicolegal examination at research of particles of furfur. Particles of the various sizes are investigated. High efficiency of the given technique is marked at research of small amount of a material, speed of a method. Use of the given method is irreplaceable by manufacture of the urgent examinations connected to research of furfur and allocation of the person.

Key words: monoclonal antibody, immunofermtal the analysis, antigenes, coliclon.

Одной из задач судебно-биологической экспертизы частиц перхоти. Однако оно резко возрастает при воспа-

является определение групповой принадлежности объек- лительных процессах, когда усиливается митотическая

тов биологического происхождения. К объектам биологи- активность базального слоя и, соответственно, этап кера-

ческого происхождения, в том числе, относится и перхоть. тинизации полностью не завершается.

Частицы перхоти сравнительно недавно стали объектом Обычно частицы перхоти хорошо различимы и несудебно-медицинского исследования и могут представ- редко встречаются в большом количестве. Наиболее часто

лять непосредственный интерес для следствия как одно они встречаются на таких предметах как шапки, маски,

из средств идентификации лица их оставившего. воротники пальто и пиджаков и т.д. Визуально частицы

Перхоть представляет собой чешуйки клеток верхних перхоти значительно отличаются по своему внешнему

слоев эпидермиса, находящихся на различных стадиях виду от частиц почвы, пыли, микроволокон и других

кератинизации. У здоровых людей на волосистой части примесей и представлены в виде блестящих частиц белого

головы можно обнаружить незначительное количество или слегка желтоватого цвета.

Исследуемые частицы, не всегда имеются в достаточном количестве, а с получением высокоактивных изоге-магглютинирующих сывороток возникают определённые трудности. Все это значительно затрудняет определение групповой принадлежности перхоти.

Групповую принадлежность частиц перхоти определяют с помощью моноклональных антител (МКА), учитывая их более высокую специфичность и биологическую активность, а также то, что для данного вида исследования требуется значительно меньшее количество материала, чем для РАЭ (методические рекомендации Института криминалистики УНТО ФСБ России). МКА используются в работе сотрудниками Института криминалистики УН-ТО ФСБ России и в лаборатории физиологии кроветворения ГУ Гематологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук (в данной лаборатории производят цоликлоны, меченные пероксидазой хрена).

В нашей лаборатории накоплен некоторый опыт по применению МКА для определения групповых АВН- антигенов системы АВО и антигенов системы Льюис в следах перхоти методом иммуноферментного анализа. В работе нами были использованы МКА анти-А А27, анти-В В8, анти-Н Н8, полученные из предприятия (ООО) «Гематолог».

Отбор и подготовка материала.

Отбор частиц проводили стряхиванием с волосистой части головы на чистый черный лист бумаги, с одежды их снимали препаровальной иглой, обработанной этиловым спиртом. По возможности отбирали крупные частицы, в то же время мелкие частицы объединяли для проведения одного вида исследования. Учитывая то, что на одном предмете возможно присутствие перхоти разных лиц, частицы с разных сторон и участков предмета отбирали в разные пробирки и исследовали как разные объекты. Так как, в настоящее время не существует каких-либо объективных методов отнесения микрочастиц именно к перхоти, согласно методическим рекомендациям Российского центра судебно-медицинской экспертизы г. Москва перед проведением основного исследования проводился стереомикроскопический контроль всех отобранных частиц по морфологическим признакам.

Исследовали две группы частиц: без обработки этанолом и обработанные смесью этанола с диэтиловым эфиром (1:1). Обработка частиц проводилась следующим образом:

Частицы перхоти (10-15 шт.) помещали в пластиковые пробирки (1,5 мл) с этанол-эфирной смесью, выдерживали 30 мин и центрифугировали при 1000 об/мин для осаждения частиц на дно. Затем удаляли этанол-эфирную смесь и в пробирки заливали этанол. Частицы перхоти осаждали центрифугированием. Этанол удаляли почти полностью. Оставшиеся 50-75 мкл этанола, содержащие частицы перхоти, пипетировали и переносили на предметные стекла, желательно с ограничительными кольцами или на стекла с лунками для предотвращения растекания материала. Этанол высушивали, а частицы перхоти использовали в дальнейших исследованиях.

Параллельно частицам перхоти исследовали образцы слюны исследуемых лиц.

Методика исследования.

РАЭ частиц перхоти.

Определение групповой принадлежности частиц перхоти проводили с помощью РАЭ на стекле. Для проведения исследования отмытые пробы или отдельные частицы переносили на предварительно обезжиренные стекла (по 1-2 частицы перхоти для каждого реагента) и растирали под стереомикроскопом при помощи пробирки до однородного состояния. Препараты фиксировали

этанолом 20 мин. Выявление антигенов системы ABO проводили реакцией абсорбции-элюции с вышеуказаны-ми моноклональными антителами. Абсорбцию антител проводили в течение 2 ч при температуре +4°С во влажных камерах. По окончанию абсорбции несвязавшиеся антитела удаляли промыванием препаратов осажденным изотоническим раствором хлорида натрия два раза по 10 минут. После этого препараты споласкивали холодной водой и подсушивали. Элюцию связавшихся антител проводили в 0,1% взвеси соответствующих тест-эритроцитов при +48°С в течение 30 минут. Экспозиция при комнатной температуре 1 час. Учет результатов микроскопический.

Иммуноферментный анализ.

Принцип метода заключается в одно- или двухстадийном выявлении антигена в образце, нанесенном на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ), способную связывать белки и некоторые другие высокомолекулярные соединения. Детекция антигена проводится с помощью антител, меченных пероксидазой хрена.

Материалы:

1. Боратный буфер (рН 9,0).

2. Нитроцеллюлозная мембрана (НЦМ), размер пор по 45 мкм.

3. Моноклональные антитела (МКА) анти-А, анти-В, анти-Н, анти^е-а, анти^е-в, меченые пероксидазой хрена.

4. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ).

5. ФСБ с 0,3% твином-20.

6. Субстратный раствор (0,25% раствор перикиси водорода в ФСБ с 0,5 мг/мл 4-хлор-1-нафтола).

7. Смесь спирта с диэтиловым эфиром (1:1).

Частиц перхоти.

После предварительной подготовки материала (с помощью этанол-эфирной смеси) 1-2 крупные частицы перхоти или несколько мелких помещали в пробирки, измельчали препаровальной иглой и заливали небольшим избытком дистиллированной воды. После экстракции при 4°С от нескольких часов до суток экстракт центрифугировали. Надосадочную жидкость разводили 1:1 боратным буфером и наносили по 2 мкл на 5 полосок НМЦ. Каждую полоску инкубировали в растворе МКА анти-А, анти-В, анти-Н, анти^е-а, анти^е-в, меченных пероксидазой хрена, в течение 30 минут при комнатной температуре на ротационном шейкере. После инкубации полоски НЦМ отмывали 2 раза по 10 минут в ФСБ с 0,3%-ым TWEEN-20 и 2 минуты в ФСБ. Пероксидазную активность выявляли в субстратном растворе в течение 30 минут. В зонах локализации ферментативной активности образуется нерастворимый темно-синий осадок. Проявленные, таким образом, отмытые в дистиллированной воде и высушенные НЦМ могут храниться в течение длительного времени.

Образцы слюны.

Для подготовки материала кусочки марли с образцами слюны измельчали, помещали в пробирки и заливали небольшим избытком дистиллированной воды. После экстракции при 4°С от нескольких часов удаляли предмет-носитель, экстракт центрифугировали. Надосадочную жидкость разводили 1:1 боратным буфером и наносили по 2 мкл на 5 полосок НМЦ. Каждую полоску инкубировали в растворе МКА анти-А, анти-В, анти-Н, анти^е-а, анти^е-в, меченных пероксидазой хрена, в течение 30 минут при комнатной температуре на ротационном шейкере. После инкубации полоски НЦМ отмывали 2 раза по 10 минут в ФСБ с 0,3%-ым TWEEN-20 и 2 минуты в ФСБ. Пероксидазную активность выявляли в субстратном растворе в течение 30 минут. В зонах локализации ферментативной активности образуется нерастворимый темно-синий осадок. Проявленные таким

Результаты исследования заведомых образцов перхоти, относящихся к категории выделителей, без обработки этанол-эфирной смесью:

Группа

крови

А

В

АВ

0aß

Группа

крови

А

В

АВ

0aß

Группа

крови

А

В

АВ

0aß

Группа

крови

А

В

АВ

0aß

А27

перхоть слюна

• •

о о

• •

о о

со ОД

перхоть слюна

о о

• •

• •

о о

перхоть слюна

• •

• •

• •

• •

Le a

перхоть слюна

о о

о о

о о

о о

Le b

перхоть слюна

• •

• •

• •

• •

Результаты исследования заведомых образцов перхоти, относящихся к категории невыделителей, без обработки этанол-эфирной смесью:

А27

перхоть слюна

• •

О О

• •

О о

В8

перхоть слюна

о о

• •

• •

о о

перхоть слюна

• •

• •

• •

• •

Le a

перхоть слюна

• •

• •

• •

• •

Le b

перхоть слюна

о о

о о

о о

о о

Результаты исследования заведомых образцов перхоти, относящихся к категории выделителей, после обработки этанол-эфирной смесью:

А27

перхоть слюна

• •

О о

• •

о о

В8

перхоть слюна

о о

• •

• •

о о

перхоть слюна

• •

• •

• •

• •

Le a

перхоть слюна

о о

о о

о о

о о

Le b

перхоть слюна

• •

• •

• •

• •

Результаты исследования заведомых образцов перхоти, относящихся к категории невыделителей, после обработки этанол-эфирной смесью:

А27

перхоть слюна

• •

О о

• •

о о

со ОД

перхоть слюна

о о

• •

• •

о о

перхоть слюна

• •

• •

• •

• •

Le a

перхоть слюна

• •

• •

• •

• •

Le b

перхоть слюна

о о

о о

о о

о о

образом, отмытые в дистиллированной воде и высушенные НЦМ могут храниться в течение длительного времени.

Данная методика на наш взгляд очень полезна, так как исследуемые частицы перхоти имеют небольшие размеры и если возможно изъять ее с головы в виде образца, то с одежды в необходимом количестве материала для проведения РАЭ и тем более КРА практически невозможно. Зачастую частицы перхоти на вещественных доказательствах являются единственными следами биологического происхождения, которые можно исследовать и установить их групповую принадлежность. Кроме того, данная методика оказалась полезной при установлении категории выделительства.

Выводы:

1. Данная методика удобна и проста в производстве и может оказаться необходимой при проведении срочных экспертиз, ответ можно дать в течение нескольких часов.

2. Наличие частиц перхоти на вещественных доказательствах, в некоторых случаях может оказаться

единственной уликой, исследование которой поможет следственным органам в установлении принадлежности носильной вещи определенному лицу.

3. В нашем случае разницы между частицами перхоти не обработанными и обработанными эфирно-этиловой смесью не обнаружено, но и вещи с которых изымались частицы были чистыми.

4. При исследовании частиц перхоти и слюны лиц, с заведомой группой крови и категории выделительства, получены однотипные результаты, что дает возможность установить не только группу крови, но и категорию выде-лительства подозреваемого лица по частицам перхоти.

5. Получены однотипные результаты при исследовании групповой принадлежности частиц перхоти в РАЭ и на ацетат-целлюлозных пластинках.

6. Вскрытые ампулы моноклональных антител в холодильнике хранятся не более месяца, при более длительном хранении получаются неспецифические результаты.

Литература:

1.Дерюгина, Е. И. Применение иммуноферментного анализа для определения АВН антигенов в следах слюны и спермы /Е.И.Дерю-гина, Ю.И.Савелъев, А.Е. Носыров, М.И.Лапенков, Т.Л. Николаева // Судебно-медицинская экспертиза. - 1992. №2-С. 23-26.

2. Лапенков, М. И. Получение, определение специфичности и применение моноклональных анти- Le антител / М.И. Лапенков, Т.Л.

Николаева, Е.А. Аборина // Судебно-медицинская экспертиза. - 2000. №4. - С.25-29

3. Лапенков, М. И. Анти-АВН-LEVIS моноклональные антитела получение, определение эптоной специфичности и применение в

судебной медицине: Автореф. дисс... докт. мед. наук / М.И.Лапенков. — М.— 2002.

4. Гуртовая, С. В. О судебно-медицинском исследовании частиц перхоти: Информационное письмо / С.В. Гуртовая. М. - 2001.