СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ У БОЛЬНЫХ НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНЬЮ ПЕЧЕНИ
METHOD FOR DETERMINING MITOCHONDRIAL DYSFUNCTION IN PATIENTS WITH NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE

Изобретение относится к области медицины, в частности к гепатологии и клинической лабораторной диагностике, и может использоваться для определения митохондриальной дисфункции у больных неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП).
Известно, что митохондриальные дисфункции играют важную роль в патогенезе многих заболеваний, в том числе - неалкогольной жировой болезни печени. НАЖБП является одним из самых распространенных заболеваний в гепатологии, приводящих к ухудшению качества жизни, инвалидизации и смерти, что обусловлено высоким риском ее прогрессирования с развитием цирроза, печеночно-клеточной недостаточности, гепатоцеллюлярной карциномы и сердечно-сосудистых осложнений. Распространенность НАЖБП в популяции составляет от 6,3% до 33%, причем заболевание встречается в любом возрасте. В России за последние 7 лет распространенность НАЖБП возросла более чем на 10% и составила 37,3%, что позволило ей занять лидирующее место в структуре заболеваний внутренних органов.
В течение заболевания выделяют несколько стадий, основными из которых являются стеатоз, стеатогепатит, фиброз и цирроз печени. Развитие жирового гепатоза при НАЖБП представляет собой неспецифическую реакцию гепатоцитов на различного рода токсические воздействия. Так, формированию заболевания способствуют абдоминальное ожирение, гипергликемия, малоподвижный образ жизни, высококалорийная пища, а также наличие экопатогенных факторов, таких как: угарный газ, цианиды, соли тяжелых металлов; побочное действие ряда лекарственных веществ (азидотимидина, вальпроатов, аминогликозидов, некоторых других), алиментарные нарушения (дефицит витаминов группы В), что приводит к возникновению полисистемных митохондриальных дисфункций. В свою очередь, увеличение числа митохондриальных дисфункций является одним из важнейших механизмов, способствующих прогрессированию заболевания.
Доказано, что ультраструктурные нарушения митохондриального аппарата обуславливают развитие функциональной недостаточности митохондрий и являются одним из патогенетических факторов развития неалкогольного стеатоза печени. Подтверждением морфологических нарушений гепатоцитов при НАЖБП являются: увеличение размера митохондриального аппарата со значительным его набуханием, незначительное количество митохондрий в поле зрения, специфические паракристаллиновые включения в митохондриальном матриксе со сниженной плотностью, выявляемые при электронной микроскопии.
Своевременное определение митохондриальной дисфункции необходимо для выявления НАЖБП на ранней стадии, что позволит не допустить прогрессирование заболевания и предупредить развитие сердечно-сосудистых осложнений.
Известные способы определения митохондриальной дисфункции, равно как и диагностика НАЖБП, достаточно сложны и трудоемки. Они проводятся с использованием хромато-масс-спектрометрии, электронно-оптического, гистохимического исследований биопсионного материала. Обследование пациентов с подозрением на митохондриальную дисфункцию включает: исследование уровней лактата, пирувата, кетоновых тел и их соотношение натощак, а также после различных нагрузок, определение аминокислотного состава крови и мочи, определение содержания жирных кислот, спектра липидов и фосфолипидов, общего и свободного карнитина, и продуктов перекисного окисления липидов в крови. Для динамической оценки интенсивности аэробных окислительных процессов в организме используют цитохимические тесты с определением активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов периферической крови. Для определения структурных изменений, приводящих к митохондриальной дисфункции, используют электронную микроскопию.
Неалкогольный стеатоз длительное время может протекать бессимптомно и без изменения лабораторных показателей, однако, в ряде случаев возможны минимальные повышения активности печеночных ферментов. Одним из критериев возникновения и развития стеатоза печени является наличие митохондриальной дисфункции [1, 2, 4].
Таким образом, очевидным является поиск унифицированного способа, в полной мере позволяющего верифицировать наличие митохондриальной дисфункции, как уже нами указано выше, являющейся одним из предикторов возникновения стеатоза, который является начальной стадией НАЖБП. Своевременная диагностика стадии НАЖБП и выявление факторов риска, способствующих развитию заболевания, являются актуальной задачей современного здравоохранения. Их констатация позволит выбрать оптимальные диагностические методы и варианты терапии, препятствующие дальнейшему прогрессированию заболевания. Несмотря на то, что неалкогольная жировая дистрофия печени рассматривается как доброкачественное состояние, она может приводить к развитию печеночной недостаточности и внезапной смерти больного. Как правило, патоморфологически в таких случаях выявляется повреждение или разрушение митохондрий, сопровождающееся мелкокапельной липидной инфильтрацией гепатоцитов.
В настоящее время не существует достоверных критериев оценки митохондриальной дисфункции у пациентов с НАЖБП. В результате проведенных исследований различными авторами у больных НАЖБП получены различные результаты. Так, одним из прогностических факторов неблагоприятного течения НАЖБП считается развитие митохондриальных дисфункций [1, 2]. Однако методы, способные выявить митохондриальную дисфункцию при стеатозе у больных с НАЖБП, имеют свои недостатки, такие как: применение нескольких узкоспецифичных реагентов и наукоемких методик, дорогостоящих исследований с использованием хромато-масс-спектрометрии, электронно-оптического, гистохимического исследований биопсионного материала, исследование уровней лактата, пирувата, кетоновых тел и их соотношение натощак и после различных нагрузок, определение аминокислотного состава крови и мочи, определение содержания жирных кислот, спектра липидов и фосфолипидов, общего и свободного карнитина и продуктов перекисного окисления липидов в крови [1, 2, 5]. Указанные недостатки существенно ограничивают внедрение подобных методов в рутинную врачебную практику.
В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ определения митохондриальной дисфункции, заключающийся в исследовании биоптатов печени с помощью электронной микроскопии [1,2].
Способ, выбранный нами в качестве прототипа, обладает следующими недостатками:
• Недостаточно высокие точность (52,5%), специфичность (57,0%) и чувствительность (47,4%) способа.
• Субъективность исследования, зависит от опыта и навыков морфолога, проводящего исследование.
• Зависит от участка забора биоптата и количества забранного материала.
Точность выполнения данного теста напрямую зависит от преаналитического этапа исследования и включает в себя математическую погрешность, заложенную при выполнении любого расчетного показателя [4].
• Прицельная биопсии печени исключает возможность ее выполнения амбулаторно, требует обязательного пребывания пациента в стационаре, что приводит к длительности выполнения способа (на получение результатов патологоморфологического исследования биоптата требуется до 2-х недель) и повышение его стоимости.
• Способ инвазивен, достаточно травматичен, что является риском осложнений и связанных с этим отказом до трети больных от выполнения ПБП.
Техническим результатом изобретения является:
• повышение точности, чувствительности и специфичности способа определения митохондриальной дисфункции у больных с НАЖБП;
• возможность выполнения способа амбулаторно, что сократит время его выполнения и снизит стоимость;
• неинвазивность исследования, что исключит риск осложнений и травматичность выполнения способа, присущих прототипу, и в связи с этим увеличит комплаентность пациентов к обследованию.
Технический результат изобретения достигается тем, что у больного НАЖБП выделяют ДНК из лейкоцитов венозной крови с последующим проведением полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением при этом стандартных пар праймеров с последующим определением длины концевых участков хромосом лейкоцитов периферической крови. При значениях данного показателя выше референсных определяют митохондриальную дисфункцию.
Способ осуществляется следующим образом: Выделяют ДНК из лейкоцитов венозной крови пациента НАЖБП. Проводят ПЦР с применением при этом стандартных пар праймеров Tel1 ggtttttgagggtgagggtgagggtgagggt и Tel2 tcccgactatccctaccctatccctatcccta. Анализ длины концевых участков хромосом (теломер) проводят с использованием набора DAKO Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry (DAKO, Дания), согласно инструкции. В качестве внешнего контроля используют специальную клеточную линию Т-лимфобластной лейкемии 1301 (НРА Culture Collections, Великобритания), которая характеризуется стабильной длиной теломер (Hultdin, 1998). Данную культуру поддерживают в среде RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина и пенициллин/стрептомицина 100 мкг/мл (HyClone, США). Клетки исследуемого образца и контрольной линии 1301 выравнивают по количеству после отмывки в PBS с добавлением 0,1% BSA. Одну часть образца и 1301 ресуспендируют в 300 мкл гибридизационного раствора с пептидо-нуклеиновым зондом, меченным флуорохромом FITC и комплементарным теломерной последовательности ДНК, другую - без зонда. Далее проводят денатурацию ДНК при температуре +82°С в течение 10 мин и гибридизацию в течение 12 часов при комнатной температуре в темноте. Затем дважды осуществляют отмывку клеток с инкубацией в отмывочном буфере DAKO при температуре +40°С в течение 10 мин. На следующем этапе клетки ресуспендируют в растворе DAKO для окраски ДНК (буфер, содержащий пропидиум ийодид и РНК-азу А) и выдерживают в течение 30 мин при температуре +37°С в темноте. После выделения ДНК определяют ее концентрацию, выравнивают для всех образцов и определяют длину теломер. В ходе анализа методом ПЦР в реальном времени оценивают количество ДНК с теломерной последовательностью в геноме. Параллельно проводят ПЦР в реальном времени к одноколейному участку венозной ДНК. Отношение количеств теломерной и одноколейной матриц пропорционально длине теломер. Образцы периферической крови хранят при комнатной температуре в течение 24-48 часов. При полученных значениях длины концевых участков хромосом лейкоцитов периферической крови выше референсных определяют митохондриальную дисфункцию, что, как нами уже было указано выше, является одним из прогностических факторов неблагоприятного течения НАЖБП [1, 2].
Референсные значения теломерного теста, характерные для определенных возрастных категорий, представленные в таблице 2, получены на основании данных исследования Geraldin Aubert [Collapse of Telomere Homeostasis in Hematopoietic Cells Caused by Heterozygous Mutations in Telomerase Genes, PLoS Genet. 2012 May; 8(5): e1002696], длины теломер популяции.
Оборудование: проточный цитометр FC500 (Beckman Coulter, США) с программным обеспечением СХР; анализатор жизнеспособности клеток Vi-CELLTM (Beckman Coulter, США); электронные дозаторы на 20 мкл, 100 мкл, 1000 мкл, 5000 мкл и штатив для дозаторов (Biohit, Финляндия); контейнеры для жидких биологических отходов и твердых отходов; таймер; мешалка типа Вортекс; твердотельный термостат Bio RDB-120 (Biosan); микроцентрифуга 500 × g. Реактивы: Набор Telomtr PNA KitXFITC for Flow Cytometry (Dako, Дания) на 20 тестов, состоял из следующих реагентов: Vial 1 - буфер для гибридизации без зонда (Hybridization Solution - Vial1) - флакон на 12 мл, готовый к использованию, содержит 70% формамид; Vial 2 - буфер для гибридизации с зондом Telomtr PNA Kit\ FITC (Telomtr PNA Kit\FITC in hybridization solution-Vial 2) флакон на 12 мл, готовый к использованию, содержит 70% формамид; Vial 3 - отмывочный буфер (Wash Solution) флакон на 20 мл, перед использованием требуется 10-кратное разведение в дистиллированной воде. Vial 4 - ресуспензионный буфер для окрашивания ДНК (DNA-staining Solution), флакон на 4 мл, для использования требуется 10-кратное разведение в дистиллированной воде. Содержит пропидиум ийодид и РНКазу А. Реактивы хранят при температуре +2...+8°С.
Отличительные существенные признаки и причинно-следственная связь между ними и достигаемым результатом:
Выделяют ДНК из лейкоцитов венозной крови больного НАЖБП с последующим проведением полимеразной цепной реакции с применением при этом стандартных пар праймеров с последующим определением длины концевых участков хромосом лейкоцитов периферической крови, и при полученных значениях данного показателя выше референсных определяют митохондриальную дисфункции у больных НАЖБП.
Из полученных данных обследования нами установлено, что у пациентов с НАЖБП, имеющих теломерный тест в пределах референсных значений, отсутствовали признаки митохондриальной дисфункции. При электронной микроскопии у данной группы пациентов во всех гепатоцитах немногочисленные жировые включения в виде крупных липидных капель. Капли окружены мембраной, к которой часто плотно прилежат митохондрии. Мембраны между ними не нарушены. В органеллах дистрофические и деструктивные изменения отсутствуют. В цитоплазме содержание полисом и гликогена не изменено.
У пациентов с НАЖБП, имеющих количество нуклеотидных пар теломер выше референсных значений, наблюдались изменения, характерные для оксидативного стресса и митохондриальной дисфункции. При электронной микроскопии жировые включения встречаются в виде мелких, средних и крупных липидных капель. Во многих гепатоцитах они занимают значительные участки цитоплазмы. Очень крупные липидные капли занимают большую часть цитоплазмы, смещая ядро с небольшим участком цитоплазмы с органеллами на периферию клетки. Во всех гепатоцитах в органеллах видны выраженные дистрофические и деструктивные изменения. В строении митохондрий наблюдается их набухание или гомогенизация, фрагментация крист, частичное разрушение наружной мембраны. Резко уменьшено в цитоплазме и содержание полисом и гликогена.
Теломерный тест является наиболее объективным, менее затратным и более безопасным для пациентов методом исследования, в отличие от определения митохондриальной цитопатии с использование метода электронной микроскопии биоптатов печени.
Мы предполагаем, что возникновение оксидативного стресса приводит к развитию митохондриальной дисфункции, что, в свою очередь, способствует активации теломеразы, фермента, участвующего в присоединении нуклеотидных пар к концевым участкам ДНК хромосом - теломерам. И, напротив, низкая длина теломер, определяемая у пациентов НАЖБП, указывает на отсутствие оксидативного стресса и митохондриальной дисфункции.
Таким образом, совокупность существенных отличительных признаков является новой и позволяет, по сравнению с прототипом:
• повысить точность, чувствительность и специфичность способа определения митохондриальной дисфункции у больных с НАЖП;
• выполнить способ амбулаторно, что сокращает время его выполнения и снижает стоимость;
• проводить неинвазивное исследование, что исключает риск осложнений и травматичность выполнения способа, присущих прототипу, и в связи с этим увеличивает комплаентность пациентов к обследованию.
Приводим примеры из клинической практики:
Пример 1. Пациент А., 34 года.
Жалобы на выраженную утомляемость, общая слабость, снижение толерантности к физической нагрузке, тянущие боли в правом подреберье, эпизоды тошноты при погрешности в диете. Снижение умственного функционирования, уменьшение объема повседневной деятельности. По шкале FSS пациент набрал 37 баллов, что свидетельствует о наличие астении средней тяжести.
Из анамнеза: Считает себя больным в течение 2 лет, когда впервые отметил утомляемость, снижение толерантности к физической нагрузке, через год стал беспокоить дискомфорт в правом подреберье, переходящий в тупую ноющую боль, обратился за помощью к терапевту, по данным обследования был выявлен синдром цитолиза, маркеры вирусных гепатитов отрицательны, аутоиммунная панель печени без отклонений от референсных значений. На основании полученных данных пациенту установлен диагноз: Неалкогольная жировая болезнь печени. Стеатогепатит, минимальной степени активности.
При объективном осмотре:
Состояние удовлетворительное. Сознание ясное, кожные покровы обычной окраски и влажности, телосложение гиперстеническое.
Язык обложен серым налетом, сосочки выражены. Склеры обычной окраски.
Пульс 80 уд. в мин.
АД 130/89 мм.рт.ст.
Тоны сердца приглушены, ритмичные.
Дыхание жесткое, хрипов нет.ЧДД 18 в мин.
Живот при пальпации мягкий, болезненный в правом подреберье.
Край печени выступает на 2 см из-под края реберной дуги, край печени плотный, ровный, болезненный при пальпации.
Отеков нет.
Клинический анализ крови:
Биохимический анализ крови:
УЗИ печени: Жировой гепатоз II ст.
Генетическое исследование: Теломерный тест (т.п.н.) 7,7, то есть в данном клиническом случае отмечается нормальный показатель теломерного теста, (референсное значение для этой возрастной категории - 5,46-8,14), то есть митохондриальная дисфункция у данного больного отсутствует.
Пример 2. Пациент Н, 32 лет.
Жалобы на общую слабость, снижение работоспособности, невозможность сконцентрироваться, выполнение умственной работы стало практически невозможным, нарушение сна в ночное время, постоянная сонливость днем. По шкале тяжести астении FSS пациент набрал 57 баллов, признаки выраженного астенического расстройства. Боли в правом подреберье, тянущего характера, периодическое появление поносов.
Из анамнеза: Считает себя больным около 2,5 лет, когда впервые отметил утомляемость, общую слабость, снижение толерантности к физическим нагрузкам, дискомфорт в правом подреберье. В связи с чем обратился в поликлинику по месту жительства, где был выявлен синдром цитолиза. В ходе обследования данных вирусные маркеры отрицательные, показатели аутоиммунной панели в норме. Пациенту был уставлен диагноз: Неалкогольная жировая болезнь печени. Стеа-тогепатит умеренной степени активности.
При объективном осмотре: Состояние удовлетворительное. Сознание ясное, кожные покровы обычной окраски и влажности, телосложение нормостеничекое.
Язык обложен белым налетом, сосочки выражены.
Пульс 72 уд. в мин.
АД 120/80 мм.рт.ст.
Тоны сердца приглушены, ритмичные.
Дыхание жесткое, хрипов нет. ЧДД 18 в мин.
Живот при пальпации мягкий, дискомфортный в правом подреберье.
Край печени выступает на 3 см из-под края реберной дуги, край печени плотный, ровный, болезненный при пальпации.
Отеков нет.
Клинический анализ крови:
Биохимический анализ крови:
УЗИ печени: Жировой гепатоз II ст.
Биопсия печени: У пациента при исследовании материала с помощью электронного микроскопа наблюдается нарушение жирового обмена (жировая дистрофия), которое сопровождается появлением в цитоплазме гепатоцитов липидных капель. Жировые включения встречаются преимущественно в виде мелких и средних липидных капель, которые занимают значительные участки цитоплазмы.
Желчные капилляры у без нарушений, что свидетельствует об их проходимости.
Во всех гепатоцитах в органеллах видны выраженные дистрофические и деструктивные изменения. В строении митохондрий наблюдается их набухание или гомогенизация, фрагментация крист, частичное разрушение наружной мембраны. Содержание гранулярной эндоплазматической сети в клетках уменьшено. Она представлена единичными короткими канальцами или вакуолями с уменьшенным количеством связанных с ее мембранами рибосом и расположена вблизи митохондрий. Резко уменьшено в цитоплазме и содержание полисом и гликогена. Все эти изменения в гепатоцитах свидетельствуют о нарушении в них энергетической, синтетической и пластической функции, что приводит к гибели части органелл и появлению в цитоплазме значительных участков, которые выглядят оптически пустыми.
Генетическое исследование: Теломерный тест (т.п.н.) 9,5 то есть у пациента Н. отмечался уровень теломерного теста выше референсного значения (6,46-8,914), таким образом, у данного больного была определена митохондриальная дисфункция.
Это свидетельствует о наличие у пациента выраженного оксидативного стресса и активации теломеразы - фермента, способствующего увеличению концевых участков хромосом (теломер). Таким образом, происходит увеличение регенераторного потенциала организма.
Чувствительность заявляемого способа, составляющая 100%, рассчитана нами по формуле:
где
ЧС - чувствительность способа;
ИП - истинноположительные результаты;
ЛО - ложноотрицательные результаты.
Чувствительность способа прототипа, составляющая 47,4%, рассчитана нами по формуле:
ЧП - чувствительность прототипа;
ИП - истинноположительные результаты;
ЛО - ложноотрицательные результаты.
Точность заявляемого способа, составляющая 100%, рассчитана нами по формуле:
ТС - точность способа;
ИП - истинноположительные результаты;
ИО - истинноотрицательные результаты;
ЛП - ложноположительные результаты;
ЛО - ложноотрицательные результаты.
Точность способа прототипа, составляющая 52,5%, рассчитана нами по формуле:
ТП - точность способа прототипа;
ИП - истинноположительные результаты;
ИО - истинноотрицательные результаты;
ЛП - ложноположительные результаты;
ЛО - ложноотрицательные результаты.
Специфичность заявляемого способа, составляющая 100%, рассчитана нами по формуле:
СС - специфичность способа
ИО - истинноотрицательные результаты;
ЛП - ложноположительные результаты;
Специфичность способа прототипа, составляющая 57%, рассчитана нами по формуле:
СП - специфичность прототипа
ИО - истинноотрицательные результаты;
ЛП - ложноположительные результаты;
Таким образом, заявляемый способ повышает точность определения митохондриальной дисфункции у больных неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), в сравнении с электронной микроскопией биоптатов печени (способ прототип) на 47,5%, чувствительность - на 52,6%, а специфичность - на 43,0%. Заявляемый способ, в отличие от прототипа, возможно выполнять амбулаторно, что сокращает время обследования, проводимого с целью подбора медикаментозной терапии и снижает его стоимость. Неинвазивность исследования исключает риск осложнений и травматичность выполнения способа, присущих прототипу, и в связи с этим увеличивает комплаентность пациентов к обследованию.
Список используемой литературы:
1. Селиверстов П.В., Радченко В.Г. Роль митохондриальной цитопатии при стеатозе у больных неалкогольной жировой болезнью печени // Эффективная фармакотерапия - 2017, №16. - С. 16-24.
2. Радченко В.Г., Селиверстов П.В., Иванова В.Ф., Ситкин С.И. Алгоритм лечения неалкогольной жировой болезни печени и роль митохондриальной дисфункции в ее развитии // Фарматека - 2017. - №6. С. 12-19.
3. Клембовский А.И., Сухорукое B.C. Учение о митохондриальной патологии в современной медицине. Материалы I Всероссийской конференции «Клинические и патогенетические проблемы нарушений клеточной энергетики». М.: 1999: 28-30
4. Селиверстов П.В. Неалкогольная жировая болезнь печени: от теории к практике // Архив внутренней медицины - 2015. - №1 (21). С. 19-26
5. Пути верификации неалкогольной жировой болезни печени / П.В. Селиверстов и др. // Врач- 2015. - №10. С. 53-55