СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В ПЛАСТИЧНЫХ ПОЛИМЕРАХ
METHODS OF DETECTING AND QUANTIFYING NUCLEIC ACIDS WITHIN MALLEABLE POLYMERS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001] В настоящем изобретении предусматриваются способы извлечения (выделения) из клеток микроорганизмов или млекопитающих нуклеиновых кислот, сцепленных с или захваченных полимерами (инкапсулированных в полимеры), которые являются пластичными, податливыми в живом организме, и в частности, которые податливы, пластичны в полости рта живого организма. В изобретении предусматривается также способ обнаружения и количественного определения микроорганизмов, прикрепленных к пластичным полимерам или захваченных пластичными полимерами, например, такими как жевательная резинка.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Первые описания применения жевательной резинки относятся к временам древней Греции, жители которой использовали смолу фисташки мастичной для утоления жажды и освежения дыхания. Первое успешное появление жевательной резинки на рынке относится к концу 19 века, когда основой резинки стал сок каучуконосного дерева Саподилла (Sapodilla) семейства Сапотовых. К концу 20 века жевательная резинка не только стала восприниматься как символ стиля жизни, но, как сообщают, она также оказывает влияние на когнитивную деятельность, настроение, концентрацию внимания и регуляцию аппетита. Кроме того, жевательная резинка все более совершенствуется с целью применения для ухода за полостью рта и в качестве функционального пищевого продукта ("нутрицевтика"), поскольку она предоставляет легко усвояемый носитель для доставки лекарственных средств с потенциальной пользой для здоровья полости рта. Высокие темпы потребления, до 2.5 кг на человека в год, превратили производство жевательной резинки в миллиардную индустрию.
[0003] Как правило, жевательная резинка состоит из нерастворимой в воде смеси синтетических эластомеров, подобных поливинилацетату или полиизобутилену, обычно называемых гуммиосновой (основой жевательной резинки). Важное требование к материалам гуммиосновы состоит в том, чтобы они не растворялись во рту и чтобы их можно было жевать в течение длительного времени без изменения композиции. Все коммерчески доступные типы жевательной резинки в качестве добавок к гуммиоснове содержат структурирующие, смягчающие и вкусоароматические вещества, тогда как сахар в настоящее время часто заменяют искусственными подсластителями, такими как сорбит, ксилит или маннит.
[0004] Было описано включение ксилита и других искусственных подсластителей в состав резинки для уменьшения образования на зубах оральной биопленки. Оральные биопленки являются причиной наиболее широко распространенных в мире инфекционных заболеваний, а именно, кариеса зубов и периодонтальных заболеваний. Кариес возникает в результате отсутствия равновесия между естественными процессами де- и реминерализации зубной эмали. Деминерализация происходит, когда значение pH оральной биопленки падает ниже 5.5 вследствие расщепления углеводов (сахаров) некоторыми компонентами оральных биопленок на зубах. Большинство искусственных сахаров либо совсем не расщепляются, либо с трудом расщепляются бактериями полости рта и при этом не снижают pH. Кроме того, жевательная резинка усиливает процесс жевания, который стимулирует слюноотделение, повышая при этом концентрацию в полости рта необходимых для реминерализации кальция и фосфатов. В продажные жевательные резинки добавляют фториды для предупреждения деминерализации и стимулирования реминерализации зубной эмали. Заманчиво рассматривать процесс жевания резинки как дополнение к ежедневным гигиеническим процедурам по уходу за полостью рта, в особенности потому, что большинство людей с древнейших времен не умели регулировать уровень оральной биопленки, необходимый для предупреждения заболевания. Именно это привело к включению в состав жевательной резинки антимикробных средств, таких как хлоргексидин и экстракты лекарственных трав, и в результате жевательная резинка на самом деле продемонстрировала эффективное предупреждение возобновления роста оральной биопленки. Хотя известно, что жевание резинки способствует удалению остатков инородных тел из промежутков между зубами (Kakodkar et al. Dental Research Journal 7: 64-69, 2011), и для повышения очистительной способности к резинке добавляли детергенты, такие как полифосфаты, остается неясным, действительно ли жевание резинки позволяет удалять бактерии из полости рта. Особенно предпочтительным кажется удаление болезнетворных организмов, таких как кислотообразующие бактерии Streptococcus mutans или виды, которые относят к первичным инвазивным микробам в зубной эмали, с помощью жевательной резинки, если сделать жевательную резинку ценным дополнением к ежедневным гигиеническим процедурам в полости рта.
[0005] В полости рта человека содержатся, различные и в огромном количестве, представители микрофлоры, и многие заболевания желудочно-кишечного тракта и органов дыхания могут проявляться в полости рта. Также имеется множество заболеваний, специфических для полости рта. Помимо бактерий микроорганизмы полости рта могут включать грибы, простейшие и вирусы, и многие из этих микроорганизмов прилипают к эмали зубов, к зубодесневой бороздке, к языку и к слизистой оболочке щеки. Каждый из этих участков по-своему обеспечивает присутствие этих организмов. Многие из этих микроорганизмов могут прилипать к полимерам, с которыми они вступают в контакт в полости рта, и эти полимеры, в дополнение к описанной выше жевательной резинке, входят в состав жевательного (дентального, зубного) и периодонтального аппарата и композиций.
[0006] Таким образом, существует необходимость в разработке новых способов обнаружения, идентификации и количественного определения микроорганизмов, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами (инкапсулированных в полимеры) в полости рта, например, такими как бактерии, которые попали в жевательную резинку в результате ее использования.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Известно, что жевательная резинка способствует здоровому состоянию полости рта; однако, остается неясным, действительно ли жевание резинки позволяет удалять бактерии и другие микроорганизмы из полости рта. В настоящем изобретении предусматривается способ обнаружения и количественного определения нуклеиновых кислот микроорганизмов, которые сцеплены с внешней поверхностью (прикреплены к внешней поверхности) и/или заключены во внутреннюю поверхность пластичного полимера, например, жевательной резинки, в полости рта живого организма, с применением метода амплификации, например, с помощью полимеразной цепной реакции (PCR, ПЦР). В приводимом ниже исследовании описывается способ, которым количественно и качественно определялись бактерии, попавшие в жевательную резинку в результате процесса жевания (in vitro или in vivo).
[0008] В настоящем изобретении предусматриваются способы извлечения нуклеиновых кислот из полимера, податливого, пластичного в полости рта живого организма, включающие а) осуществление контакта полимера с i) органическим растворителем и ii) буферным раствором, и b) отделение органического растворителя и буферного раствора, при этом нуклеиновая кислота, извлеченная (выделенная) из полимера, содержится в буферном растворе. В изобретении рассматривается осуществление способа извлечения нуклеиновых кислот после осуществления контакта полимера с живым организмом. Этот способ можно осуществлять in vitro, или вне живого организма.
[0009] Эти способы могут также включать стадию идентификации источника нуклеиновой кислоты, извлеченной из полимера, и/или стадию количественного определения нуклеиновой кислоты, извлеченной из полимера. Стадию идентификации или стадию количественного определения проводят, применяя метод амплификации, например, такой как полимеразная цепная реакция, метод вытеснения цепи, лигазная цепная реакция, геликаза-зависимая амплификация, термофильная геликаза-зависимая изотермическая амплификация с обратной транскрипцией, амплификация по типу катящегося кольца, петлевая изотермическая амплификация и амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (изотермическая амплификация нуклеиновых кислот).
[0010] Согласно способам изобретения нуклеиновые кислоты извлекают (выделяют) из полимеров, пластичных, податливых в живом организме, например, пластичных (податливых, мягких) в полости рта живого организма. Термин "пластичный (податливый, гибкий, мягкий) в живом организме" относится к полимерам, пластичным и податливым при температуре и pH внутри живого организма, но при этом композиция полимера остается устойчивой к действию различных сил и условий (например, к действию температуры, pH, ферментов) в организме. Например, способ по изобретению включает полимеры, которые становятся пластичными под воздействием усилий, прилагаемых организмом (например, жевания, измельчения резинки или скрежета зубов), температуры в организме (например, температуры в полости рта) или условий химических реакций (например, ферментов, вырабатываемых в организме, pH в полости рта живого организма). Эти пластичные полимеры могут быть органическими (на основе углерода), и, следовательно, эти полимеры будут растворяться в органических растворителях в соответствии со способом по изобретению. Пример такого полимера включает жевательную резинку, надувную жевательную резинку или гуммиоснову.
[0011] Согласно одному варианту мягкий, пластичный полимер, применяемый по любому из способов по изобретению, представляет собой эластомер, такой как поливинилацетат, полибутилен, полиизобутилен, сополимер изобутилена с изопреном (бутилкаучук), сополимеры стирола с бутадиеном, полиизопрен, полиэтилен, сополимер винилацетата с виниллауратом, силикон, джелутонг (смола дерева диеры, малайского камедного дерева), чикле (сок сапотилового дерева), сорва и массарандуба балата или их комбинации.
[0012] Согласно другому варианту мягкий, пластичный полимер, применяемый по любому из способов по изобретению, находится в составе дентальных или периодонтальных композиции, аппарата или устройства. Например, пластичные полимеры могут представлять собой зубные смолы или полимеры, находящиеся на или в эндодонтических (зубных) инструментах или композициях или в инструментах или композициях для периодонтального аппарата, например, таких как полимеры, применяемые в капах, пломбах, зубных протезах, мостах (мостовидных протезах), коронках зуба, корневых каналах пульпы зуба, зубных вкладках, зубных накладках и винирах. Кроме того, пластичный полимер находится на поверхности или внутри хирургических инструментов (например, шаблоны или поддержки (опорные пункты)), челюстнолицевых приспособлений, таких как небные пластинки, челюстные поддержки и зубные брекеты. Эти пластичные полимеры представляют собой метилметакрилат?, полиметилметакрилат (РММА), полиэтилметакрилат (РЕМА), глицидилметакрилат (GMA), диметилакрилат триэтиленгликоля (TEGDMA), бисфенол A глицидилметакрилат (BIS-GMA), гуттаперчу и полибутилен, включая альфа-бутилен, цис-бутилен, бета-бутилен, транс-бета-бутилен, изобутилен, нейлон и биоразрушаемые полимеры, такие как полилактиды (PLA), или их комбинации.
[0013] Согласно любым способам по изобретению нуклеиновые кислоты извлекаются (экстрагируются) из полимеров с помощью органического растворителя и буферного раствора. Термин "органический растворитель" относится к растворителям на основе углерода, которые способны растворять или диспергировать одно или более других веществ. Любой из способов по изобретению можно осуществлять с использованием органического растворителя, например, такого как хлороформ, ксилол, толуол, 1,2-дихлорбензол, гексан, тетрагидрофуран, дихлорметан (хлористый метилен) или ацетон.
[0014] Термин "буферный раствор" относится к водному раствору, который состоит из смеси слабой кислоты и сопряженного с ней основания или слабого основания и сопряженной с ней кислоты, для поддержания почти постоянного значения pH раствора. Любые из способов по изобретению можно осуществлять с применением любого буферного раствора, обычно используемого в области молекулярной биологии, в котором нуклеиновые кислоты являются устойчивыми, например, Трис (Tris) буфер, ТВЕ буфер (Tris (Трис)-борат-EDTA) и ТАЕ буфер (Tris (Трис)-ацетат-EDTA). Согласно конкретному варианту изобретения буферный раствор представляет собой Трис буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан. Трис буфер известен также как Трис основание, Trizma, трисамин (Trisamine), ТНАМ, трометамин, трометамол и трометан.
[0015] При осуществлении любых способов по изобретению полимер может частично или полностью растворяться в органическом растворителе.
[0016] При осуществлении любых способов по изобретению нуклеиновые кислоты извлекают (экстрагируют) с внутренней поверхности полимера. В изобретении также предусматривается способ извлечения нуклеиновых кислот из полимера, при этом извлекается по меньшей мере примерно 99% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам (сцепленных с полимерами) или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 98% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 95% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 90% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 85% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 80% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 75% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 60% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 55% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, или извлекается по меньшей мере примерно 50% нуклеиновых кислот, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами.
[0017] Согласно одному варианту в изобретении предусматриваются способы извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизмов, прикрепленных к полимерам или захваченных полимерами, включая микроорганизм, заключенный во внутреннюю поверхность полимера, или микроорганизм, прикрепленный к внутренней поверхности полимера или заключенный во внешнюю поверхность полимера. Например, в изобретении предусматриваются способы, в которых источником нуклеиновой кислоты является бактерии, вирусы, грибы или простейшие. В частности, источником нуклеиновых кислот могут быть патогенные или условно-патогенные бактерии в полости рта, например, такие как Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Actinomyces naeslundii, Streptococcus sanguinis, Porphyromomas gingivalis, Porphymomas intermedia, Bacteroides forsythus, Tanneraella forsythia, Campylobacter rectus, Eubacerium nodatum, Peptostreptococcus micros, Streptococcus intermedius, Aggregetibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Lactobacillus salivarius, Streptococcus salivarius и Streptococcus sobrinus.
[0018] Согласно другому варианту в изобретении предусматриваются способы извлечения нуклеиновых кислот из клеток млекопитающих, таких как человеческие клетки, клетки собак, клетки кошек, клетки мышей, клетки крыс, клетки крупного рогатого скота, клетки лошадей, клетки овец, клетки коз, клетки приматов, клетки морских млекопитающих, таких как китообразные и дельфины, и клетки других экзотических млекопитающих. Например, в изобретении предусматриваются способы, в которых источником нуклеиновых кислот является эпителиальная клетка, чешуйчатая (плоская, сквамозная) клетка, фибробласт, стволовая клетка или кератоцит. В изобретении предусматриваются также способы извлечения нуклеиновых кислот из раковых клеток.
[0019] Другой аспект изобретения включает способы обнаружения микроорганизма, прикрепленного к полимеру или заключенного в полимер, пластичный в живом организме, включающие а) растворение по меньшей мере части полимера в органическом растворителе и буферном растворе, b) отделение органического растворителя от буферного раствора, при этом нуклеиновая кислота, извлеченная из микроорганизмов, содержится в буферном растворе, и с) амплификацию нуклеиновых кислот с использованием по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера, специфичного для микроорганизма. Кроме того, способы можно осуществлять с использованием двух или более праймеров, трех или более праймеров. Согласно этому способу обнаруживаемый микроорганизм может быть прикреплен к внутренней поверхности или заключен во внешнюю поверхность полимера или заключен во внутреннюю поверхность полимера. В изобретении рассматривается осуществление способа обнаружения микроорганизма, прикрепленного к полимеру или заключенного в полимер после осуществления контакта полимера с живым организмом. Эти способы осуществляются in vitro, или вне живого организма. Эти способы можно осуществлять с целью контроля качества, например, при работе, связанной с безопасностью пищевых продуктов, с порчей и брожением пищевых продуктов; и для оценки риска микрофлоры для полимеров, находящихся в контакте с пищевыми продуктами, например, с полимерами упаковки. Эти способы можно также осуществлять для диагностирования инфекции, заболевания, нарушения или патологического состояния в полости рта субъекта, для определения чувствительности субъекта к развитию заболевания, нарушения или патологического состояния или для создания микробного профиля субъекта.
[0020] Согласно этим способам стадию амплификации можно осуществлять любым методом, известным в уровне техники. Например, нуклеиновые кислоты микроорганизмов, сцепленных с или захваченных полимером, можно амплифицировать с применением полимеразной цепной реакции, методом вытеснения цепи, с помощью лигазной цепной реакции, геликаза-зависимой амплификации, термофильной геликаза-зависимой изотермической амплификации с обратной транскрипцией, амплификации по типу катящегося кольца, петлевой изотермической амплификации и амплификации, основанной на последовательности нуклеиновых кислот.
[0021] Эти способы могут также включать стадию количественного определения микроорганизмов, сцепленных с полимером (прикрепленных к полимеру) или захваченных полимером. Стадию идентификации или стадию количественного определения проводят, применяя метод амплификации, например, такой как полимеразная цепная реакция, метод вытеснения цепи, лигазная цепная реакция, геликаза-зависимая амплификация, термофильная геликаза-зависимая изотермическая амплификация с обратной транскрипцией, амплификация по типу катящегося кольца, петлевая изотермическая амплификация и амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот.
[0022] В изобретении предусматриваются способы обнаружения микроорганизма, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или захваченного полимером, пластичным в живом организме, например, таким как жевательная резинка, надувная жевательная резинка или гуммиоснова. Эти пластичные полимеры могут быть органическими (имеющими углеродную основу), и, следовательно, эти полимеры растворяются в органических растворителях согласно способу по изобретению. Согласно одному варианту этот мягкий, пластичный полимер, представляет собой эластомер, такой как поливинилацетат, полибутилен, полиизобутилен, сополимер изобутилена с изопреном (бутилкаучук), сополимеры стирола с бутадиеном, полиизопрен, полиэтилен, сополимер винилацетата с виниллауратом, силикон, джелутонг, чикле, сорва и массарандуба балата или их комбинации.
[0023] Согласно другому варианту пластичный полимер, к которому прикреплен или в который заключен (которым захвачен) микроорганизм, может находится в составе дентальных или периодонтальных композиции, аппарата или устройства. Например, пластичные полимеры могут представлять собой зубные смолы или полимеры, находящиеся на или в эндодонтических (зубных) или периодонтальных инструментах или композициях или, например, такие как полимеры, применяемые в пломбах, зубных протезах, мостах (мостовидных протезах), коронках зуба, корневых каналах пульпы зуба, зубных вкладках, зубных накладках и винирах. Кроме того, пластичный полимер находится на поверхности или внутри хирургических инструментов (например, шаблоны или поддержки (опорные пункты)), челюстнолицевых приспособлений, таких как небные пластинки, челюстные поддержки и зубные брекеты. Эти пластичные полимеры представляют собой метилметакрилат, полиметилметакрилат (РММА), полиэтилметакрилат (РЕМА), глицидилметакрилат (GMA), диметилакрилат триэтиленгликоля (TEGDMA), бисфенол A глицидилметакрилат (BIS-GMA), гуттаперчу и полибутилен, включая альфа-бутилен, цис-бутилен, бета- бутилен, транс-бета-бутилен, изобутилен, силикон, нейлон и биоразрушаемые полимеры, такие как полилактиды (PLA), или их комбинацию.
[0024] При осуществлении способов обнаружения микроорганизма, сцепленного с полимером (прикрепленного к полимеру) или заключенного в полимер, пластичный, мягкий в живом организме, полимер растворяется в органическом растворителе, например, таком как хлороформ, ксилол или толуол, и в буферном растворе, обычно применяемом в молекулярной биологии, в котором нуклеиновые кислоты являются устойчивыми, например, таком как Трис (Tris) буфер, ТВЕ буфер (Tris (Трис)-борат-EDTA) и ТАЕ буфер (Tris (Трис)-ацетат-EDTA). Согласно конкретному варианту изобретения буферный раствор представляет собой Трис буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан. Трис буфер известен также как Трис основание, Trizma, трисамин (Trisamine), ТНАМ, трометамин, трометамол и трометан.
[0025] В настоящем изобретении предусматриваются способы обнаружения микроорганизмов любого типа, включая бактерии, вирусы, грибы или простейшие. Например, в изобретении предусматриваются способы обнаружения патогенных или условно-патогенных бактерий, присутствующих в полости рта, например, таких как Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis, Streptococcus salivarius, Porphyromomas gingivalis, Porphymomas intermedia, Actinomyces naeslundii, Bacteroides forsythus, Tannerella forsythia, Campylobacter rectus, Eubacerium nodatum, Peptostreptococcus micros, Streptococcus intermedius, Aggregetibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Streptococcus oralis, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Lactobacillus salivarius, Streptococcus salivarius и Streptococcus sobrinus. Необязательно, способ может включать также стадию диагностирования бактериальной инфекции у млекопитающего, например, у человека, посредством обнаружения бактерий, прикрепленных к пластичному полимеру (сцепленной с пластичным полимером) или заключенных в пластичный полимер, который контактировал с полостью рта млекопитающего. Также, но необязательно, способы могут включать стадию информирования человека о наличии бактерий или бактериальной инфекции в полости рта.
[0026] В настоящем изобретении также предусматривается in vitro способ диагностики бактериальной инфекции в полости рта млекопитающего, включающий обнаружение (детекцию) бактерий, прикрепленных к полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в полимер по любому из описанных выше способов, согласно которым полимер находился в контакте с полостью рта субъекта, а присутствие бактерий, прикрепленных к полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в полимер, является признаком бактериальной инфекции в полости рта субъекта.
[0027] В настоящем изобретении также предусматривается in vitro способ определения восприимчивости млекопитающего субъекта к развитию бактериальной инфекции в полости рта, включающий детекцию (обнаружение) бактерий, прикрепленных к полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в полимер по любому из описанных выше способов, согласно которым полимер находился в контакте с полостью рта субъекта, а присутствие бактерий, прикрепленных к полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в полимер, является признаком повышенной восприимчивости к развитию бактериальной инфекции в полости рта субъекта или повышает восприимчивость к прогрессированию заболевания, патологического состояния или нарушения, обусловленного присутствием бактерий в полости рта субъекта.
[0028] Помимо этого в изобретении предусматривается способ обнаружения вируса, присутствующего в полости рта, например, такого как герпес-вирус человека (HHV)-1 (также известный как вирус простого герпеса (HSV)-1, HHV-2 (HSV-2), HHV-3 (также известный как вирус ветряной оспы), HHV-4 (вирус Эпштейна-Барр), HHV-5 (цитомегаловирус), HHV-6, HHV-7, HHV-8, вирус полиомиелита (полиовирус), вирус Коксаки группы A, вирус Коксаки группы B, эховирус и энтеровирус 71 (EV-71), папилломавирус человека (HPV) семейства паповавирусов (Papovaviridae), например, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-35, вирус свинки, вирус болезни Ньюкасла, вирус парагриппа человека типа 2, 4а и 4, парамиксовирус, рубивирус, вирус гриппа человека A, например, H1N1 и H3N3, вирус гриппа человека B, вирус гриппа человека C, риновирус, собачий слизисто-оральный папилломавирус, кошачий калицивирус и кошачий герпес-вирус. Необязательно, способ может включать также стадию диагностики вирусной инфекции у млекопитающего, например, у человека, посредством обнаружения присутствия вируса, сцепленного с пластичным полимером (прикрепленного к пластичному полимеру) или заключенного в пластичный, мягкий полимер, который находился в контакте с полостью рта млекопитающего. Эти способы, необязательно, могут включать также стадию информирования человека о наличии вируса или о диагнозе вирусной инфекции в полости рта.
[0029] В изобретении также предусматривается in vitro способ диагностики вирусной инфекции в полости рта млекопитающего, включающий обнаружение (детекцию) вируса, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер по любому из описанных выше способов, согласно которым полимер находился в контакте с полостью рта субъекта, а присутствие вируса, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер, является признаком вирусной инфекции в полости рта субъекта.
[0030] В настоящем изобретении также предусматривается in vitro способ определения восприимчивости млекопитающего субъекта к развитию вирусной инфекции в полости рта, включающий детекцию (обнаружение) вируса, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер по любому из описанных выше способов, согласно которым полимер находился в контакте с полостью рта субъекта, а присутствие вируса, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер, является признаком повышенной восприимчивости к развитию вирусной инфекции в полости рта субъекта или повышает восприимчивость к прогрессированию заболевания, патологического состояния или нарушения, обусловленного присутствием вируса в полости рта субъекта.
[0031] Изобретение предусматривает также способы обнаружения присутствия (низших) грибов, таких как грибы рода Candida, например, Candida albicans, Aspergillus, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidiodes immites и Zygomycota. Необязательно, способ может включать также стадию диагностики грибковой инфекции у млекопитающего, например, у человека, посредством обнаружения присутствия (низшего) гриба, сцепленного с пластичным полимером (прикрепленного к пластичному полимеру) или заключенного в пластичный, мягкий полимер, который находился в контакте с полостью рта млекопитающего. Эти способы, необязательно, могут включать также стадию информирования человека о наличии гриба или о диагнозе грибковой инфекции в полости рта.
[0032] В изобретении также предусматривается in vitro способ диагностики грибковой инфекции в полости рта млекопитающего, включающий обнаружение (детекцию) вируса, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер по любому из описанных выше способов, согласно которым полимер находился в контакте с полостью рта субъекта, а присутствие гриба, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер, является признаком грибковой инфекции в полости рта субъекта.
[0033] В настоящем изобретении также предусматривается in vitro способ определения восприимчивости млекопитающего субъекта к развитию грибковой инфекции в полости рта, включающий детекцию (обнаружение) гриба, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер по любому из описанных выше способов, согласно которым полимер находился в контакте с полостью рта субъекта, а присутствие гриба, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер, является признаком повышенной восприимчивости к развитию грибковой инфекции в полости рта субъекта или повышает восприимчивость к прогрессированию заболевания, патологического состояния или нарушения, обусловленного присутствием грибка в полости рта субъекта.
[0034] В изобретении также предусматриваются способы обнаружения присутствия простейших (протозойных) в полости рта, например, таких как Entamoeba gingivalis и Trichomonas tenax. Необязательно, способ может также включать стадию диагностики протозойной инфекции у млекопитающего, такого как человек, посредством обнаружения присутствия простейших, прикрепленных к пластичному полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в пластичный полимер, который находился в контакте полостью рта млекопитающего. Эти способы, необязательно, могут включать также стадию информирования человека о наличии простейших или о диагнозе протозойной инфекции в полости рта.
[0035] В настоящем изобретении также предусматривается in vitro способ диагностики протозойной инфекции в полости рта млекопитающего субъекта, включающий обнаружение (детекцию) простейших, прикрепленных к полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в полимер по любому из описанных выше способов, согласно которым полимер находился в контакте с полостью рта субъекта, а присутствие простейших, прикрепленных к полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в полимер, является признаком протозойной инфекции в полости рта субъекта.
[0036] В изобретении также предусматривается in vitro способ определения восприимчивости млекопитающего субъекта к развитию протозойной инфекции в полости рта, включающий детекцию (обнаружение) простейших, прикрепленных к полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в полимер по любому из описанных выше способов, согласно которым полимер находился в контакте с полостью рта субъекта, а присутствие простейших, прикрепленных к полимеру (сцепленных с полимером) или заключенных в полимер, является признаком повышенной восприимчивости к развитию протозойной инфекции в полости рта субъекта или повышает восприимчивость к прогрессированию заболевания, патологического состояния или нарушения, обусловленного присутствием простейших в полости рта субъекта.
[0037] Кроме того, способы обнаружения микроорганизма, прикрепленного к полимеру или заключенного в полимер, можно применять для диагностики любого заболевания, связанного с бактериальной, вирусной, грибковой или протозойной инфекцией в полости рта (ротовой полости). Типичные патологические состояния, заболевания и нарушения включают хронический периодонтит, острый периодонтит у взрослых, гингивит, например, острый некротизирующий язвенный гингивит, болезнь Венсана, кариес зуба, герпес-вирусную инфекцию, первичный герпетический гингивостоматит или внутриротовой герпес (герпес губы и язвенный стоматит), герпес гениталий, вирусную инфекцию ветряной оспы, например, оспу птиц или опоясывающий лишай, грипп, простуду, венерическое заболевание, мононуклеоз, вирусную инфекцию Коксаки, например, синдром рука-нога-рот, герпангину (афтозный фарингит), острый лимфонодулярный фарингит (острый фарингит неуточненный), свинку, корь, краснуху (германскую корь), африканскую лимфому Беркитта, рак носоглотки (назофарингеальную карциному), волосистую лейкоплакию полости рта, детскую розеолу, саркому Капоши, кандидоз, острый псевдомембранозный кандидоз (кандидоз полости рта), острый атрофический (эритематозный) кандидоз, хронический гиперпластический кандидоз, хронический атрофический (эритематозный) кандидоз, аспергиллез, криптококкоз, гистоплазмоз, бластомикоз, паракокцидиоидомикоз и зигомикоз (мукормикоз).
[0038] В другом аспекте изобретения предусматриваются способы идентификации пластичных полимеров, резистентных к адгезии микроорганизма, включающий а) осуществление контакта пластичного полимера с микроорганизмом в условиях, которые способствуют связыванию, b) растворение по меньшей мере части полимера в органическом растворителе и буферном растворе, b) отделение органического растворителя от буферного раствора, при этом нуклеиновые кислоты, извлеченные из микроорганизмов, сцепленных с полимером (прикрепленных к полимеру), находились в буферном растворе, и с) обнаружение присутствия или отсутствия нуклеиновых кислот, специфичных для микроорганизма, в буферном растворе, при этом отсутствие нуклеиновых кислот в буферном растворе свидетельствует о том, что полимер устойчив к адгезии (связыванию) микроорганизма. В изобретении рассматривается осуществление способа идентификации пластичных полимеров, резистентных к адгезии микроорганизма, in vitro, или вне живого организма. Эти способы можно осуществлять с целью контроля качества или с целью? Описанные выше способы можно осуществлять, используя полимер любого типа, который является пластичным, податливым в живом организме. Например, пластичный полимер может представлять собой жевательную резинку, надувную жевательную резинку или гуммиоснову. Кроме того, эти пластичные полимеры могут быть органическими (на основе углерода), и, следовательно, эти полимеры растворяются в органических растворителях в соответствии со способом по настоящему изобретению. Согласно одному варианту пластичный полимер представляет собой эластомер, такой как поливинилацетат, полибутилен, полиизобутилен, сополимер изобутилена с изопреном (бутилкаучук), стирол-бутадиен(?), сополимеры стирола с бутадиеном, полиизопрен, полиэтилен, сополимер винилацетата с виниллауратом, силикон, джелутонг (смола дерева диеры, малайского камедного дерева), чикле, сорва и массарандуба балата или их комбинации.
[0039] Согласно одному варианту осуществление способов проводят на пластичном полимере на или в составе дентальных или периодонтальных композиции, аппарата или устройства. Например, пластичные полимеры могут представлять собой зубные смолы или полимеры, находящиеся на или в эндодонтических (зубных) или периодонтальных (для периодонтального аппарата) инструментах или композициях, например, такие как полимеры, применяемые в пломбах, зубных протезах, мостах (мостовидных протезах), коронках зуба, корневых каналах пульпы зуба, зубных вкладках, зубных накладках и винирах. Кроме того, пластичный полимер находится на поверхности или внутри хирургических инструментов (например, шаблоны или поддержки (опорные пункты)), челюстнолицевых приспособлений, таких как небные пластинки, челюстные поддержки и зубные брекеты. Эти пластичные полимеры представляют собой метилметакрилат, полиметилметакрилат (РММА), полиэтилметакрилат (РЕМА), глицидилметакрилат (GMA), диметилакрилат триэтиленгликоля (TEGDMA), бисфенол A глицидилметакрилат (BIS-GMA), гуттаперчу и полибутилен, включая альфа-бутилен, цис-бутилен, бета- бутилен, транс-бета-бутилен, изобутилен, силикон, нейлон и биоразрушаемые полимеры, такие как полилактиды (PLA), или их комбинации.
[0040] При осуществлении описанных выше способов по меньшей мере часть полимера растворяют в органическом растворителе, например, таком как хлороформ, ксилол или толуол, и в буферном растворе, например, в любом буферном растворе, обычно применяемом в молекулярной биологии, в котором нуклеиновые кислоты являются устойчивыми, например, таком как Трис (Tris) буфер, ТВЕ буфер (Tris (Трис)-борат-EDTA) и TAE буфер (Tris (Трис)-ацетат-EDTA). Согласно конкретному варианту изобретения буферный раствор представляет собой Трис буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан. Трис буфер известен также как Трис основание, Trizma, трисамин (Trisamine), ТНАМ, трометамин, трометамол и трометан.
[0041] В настоящем изобретении предусматриваются способы идентификации пластичных полимеров, устойчивых к адгезии микроорганизмов любого типа, например, таких как бактерии, вирусы, грибы или простейшие (протозойные). Например, в изобретении предусматриваются способы, в которых тестируемый организм представляет собой патогенные или условно-патогенные бактерии в полости рта, например, такие как Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Actinomyces naeslundii, Streptococcus sanguinis, Porphyromomas gingivalis, Porphymomas intermedia, Bacteroides forsythus, Tanneraella forsythia, Campylobacter rectus, Eubacerium nodatum, Peptostreptococcus micros, Streptococcus intermedius, Aggregetibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Lactobacillus salivarius, Streptococcus salivarius и Streptococcus sobrinus.
[0042] В другом аспекте данного изобретения предусматриваются способы создания микробного профиля полости рта млекопитающего субъекта, включающие а) осуществление контакта пластичного полимера с полостью рта субъекта, b) детекцию (обнаружение) присутствия или отсутствия по меньшей мере одного микроорганизма, прикрепленного к пластичному полимеру или связанного с пластичным полимером после контактирования с полостью рта субъекта, при этом присутствие или отсутствие по меньшей мере одного микроорганизма определяет микробный профиль полости рта субъекта. Микробный профиль может содержать информацию по меньшей мере об одном микроорганизме, по меньшей мере о двух микроорганизмах, по меньшей мере о трех микроорганизмах, по меньшей мере о пяти микроорганизмах, по меньшей мере о 10 микроорганизмах, по меньшей мере о 20 микроорганизмах, по меньшей мере о 50 микроорганизмах, по меньшей мере о 100 микроорганизмах и по меньшей мере о 500 микроорганизмах.
[0043] Эти способы могут также включать стадии сравнения микробного профиля млекопитающего субъекта с эталонным микробным профилем, при этом эталонный микробный профиль является показателем повышенной восприимчивости к заболеванию, нарушению или патологическому состоянию полости рта, и оценки микробного профиля с целью определения, действительно ли субъект обладает повышенной восприимчивостью к заболеванию или патологии полости рта. Необязательно, эти способы могут также включать стадию количественного определения микроорганизмов, прикрепленных к полимеру или захваченных полимером.
[0044] Термин "микробный профиль" относится к наличию или к отсутствию по меньшей мере одного микроба, который, по меньшей мере частично, определяется или характеризуется таким образом, чтобы можно было контролировать присутствие или отсутствие микроба в любом конкретном образце. Термин "эталонный микробный профиль" относится к микробному профилю, созданному для известного контрольного или стандартного образца, например, эталонный профиль для субъекта, заведомо обладающего повышенной восприимчивостью к заболеванию, нарушению или патологическому состоянию полости рта.
[0045] Микробный профиль субъекта ассоциируется с эталонным микробным профилем, если один или более микроорганизмов в эталонном микробном профиле присутствуют в микробном профиле субъекта. Для того чтобы определить, действительно ли микробный профиль субъекта ассоциируется с эталонным микробным профилем, профили оценивают, чтобы сравнить микробный профиль пациента с эталонным профилем.
[0046] При осуществлении способов создания микробного профиля можно детектировать, выявлять один или более компонентов, выбранных из группы, включающей бактерии, вирусы, грибы или простейшие. Например, бактерии, детектируемые при создании микробного профиля, включают Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Actinomyces naeslundii, Streptococcus sanguinis, Porphyromomas gingivalis, Porphymomas intermedia, Bacteroides forsythus, Tanneraella forsythia, Campylobacter rectus, Eubacerium nodatum, Peptostreptococcus micros, Streptococcus intermedius, Aggregetibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Lactobacillus, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum и Streptococcus sobrinus. Типичные вирусы, которые можно обнаружить при создании микробного профиля, включают герпес-вирус человека (HHV)-1 (также известный как вирус простого герпеса (HSV)-1, HHV-2 (HSV-2), HHV-3 (также известный как вирус ветряной оспы), HHV-4 (вирус Эпштейна-Барр), HHV-5 (цитомегаловирус), HHV-6, HHV-7, HHV-8, вирус полиомиелита (полиовирус), вирус Коксаки группы A, вирус Коксаки группы B, эховирус и энтеровирус 71 (EV-71), папилломавирус человека (HPV) семейства паповавирусов (Papovaviridae), например, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-35, вирус свинки, вирус болезни Ньюкасла, вирус парагриппа человека типа 2, 4а и 4, парамиксовирус, рубивирус, вирус гриппа человека A, например, H1N1 и H3N3, вирус гриппа человека B, вирус гриппа человека C и риновирус. Примеры грибов, которые могут быть обнаружены при создании микробного профиля, включают грибы рода Candida, например, Candida albicans, Aspergillus, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis и Zygomycota. Примеры простейших, которые могут быть обнаружены при создании микробного профиля, включают Entamoeba gingivalis и Trichomonas tenax.
[0047] Кроме того, микробные профили по настоящему изобретению можно применять для определения восприимчивости субъекта к развитию заболевания, патологического состояния или нарушения, например, такого как хронический периодонтит, острый периодонтит у взрослых, гингивит, например, острый некротизирующий язвенный гингивит, болезнь Венсана, кариес зуба, герпес-вирусная инфекция, первичный герпетический гингивостоматит или внутриротовой герпес (герпес губы и язвенный стоматит), герпес гениталий, вирусная инфекция ветряной оспы, например, оспа птиц или опоясывающий лишай, грипп, простуда, венерическое заболевание, мононуклеоз, вирусная инфекция Коксаки, например, синдром рука-нога-рот, герпангина (афтозный фарингит), острый лимфонодулярный фарингит (острый фарингит неуточненный), свинка, корь, краснуха (германская корь), Африканская лимфома Беркитта, рак носоглотки (назофарингеальная карцинома), волосистая лейкоплакия полости рта, детская розеола, саркома Капоши, кандидоз, острый псевдомембранозный кандидоз (кандидоз полости рта), острый атрофический (эритематозный) кандидоз, хронический гиперпластический кандидоз, хронический атрофический (эритематозный) кандидоз, аспергиллез, криптококкоз, гистоплазмоз, бластомикоз, паракокцидиоидомикоз и зигомикоз (мукормикоз).
[0048] Вышеуказанные способы создания микробного профиля можно осуществлять с применением полимера любого типа, который является пластичным в живом организме. Например, пластичный полимер может представлять собой жевательную резинку, надувную жевательную резинку или гуммиоснову. Кроме того, эти пластичные полимеры могут быть органическими (на основе углерода), и, следовательно, эти полимеры растворяются в органических растворителях в соответствии со способом по настоящему изобретению. Согласно одному варианту пластичный полимер представляет собой эластомер, такой как поливинилацетат, полибутилен, полиизобутилен, сополимер изобутилена с изопреном (бутилкаучук), сополимеры стирола с бутадиеном, полиизопрен, полиэтилен, сополимер винилацетата с виниллауратом, силикон, джелутонг (смола дерева диеры, малайского камедного дерева), чикле, сорва и массарандуба балата или их комбинации.
[0049] Согласно другому варианту способы создания микробного профиля можно осуществлять на пластичном полимере на или в дентальных или периодонтальных композиции, аппарате или инструменте. Например, пластичные полимеры могут представлять собой зубные смолы или полимеры, находящиеся на или в эндодонтических (зубных, дентальных) инструментах или композициях или в инструментах или композициях для периодонта, например, такие как полимеры, применяемые в пломбах, зубных протезах, мостах (мостовидных протезах), коронках зуба, корневых каналах пульпы зуба, зубных вкладках, зубных накладках и винирах. Кроме того, пластичный полимер находится на поверхности или внутри хирургических инструментов (например, шаблоны или поддержки (опорные пункты)), челюстнолицевых приспособлений, таких как небные пластинки, челюстные поддержки и зубные брекеты. Эти пластичные полимеры представляют собой метилметакрилат?, полиметилметакрилат (РММА), полиэтилметакрилат (РЕМА), глицидилметакрилат (GMA), диметилакрилат триэтиленгликоля (TEGDMA), бисфенол A глицидилметакрилат (BIS-GMA), гуттаперчу и полибутилен, включая альфа-бутилен, цис-бутилен, бета- бутилен, транс-бета-бутилен, изобутилен, силикон, нейлон и биоразрушаемые полимеры, такие как полилактиды, или их комбинации.
[0050] В другом аспекте изобретения предусматриваются наборы для осуществления любого из вышеуказанных способов по настоящему описанию. В частности, в изобретении предусматриваются наборы для обнаружения или количественного определения микроорганизма, прикрепленного к полимеру (сцепленного с полимером) или заключенного в полимер, являющийся пластичным в живом организме, которые (наборы) содержат по меньшей мере один праймер, специфичный для микроорганизма, органический растворитель и буферный раствор.
[0051] Эти наборы, необязательно, могут содержать органический растворитель, например, такой как хлороформ, ксилол или толуол, и/или буферный раствор, обычно применяемый в молекулярной биологии, и в котором нуклеиновые кислоты являются устойчивыми, например, такой как Трис (Tris) буфер, ТВЕ буфер (Tris (Трис)-борат-EDTA) и ТАЕ буфер (Tris (Трис)-ацетат-EDTA). Согласно конкретному варианту изобретения буферный раствор представляет собой Трис буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан. Трис буфер известен также как Трис основание, Trizma, трисамин (Trisamine), ТНАМ, трометамин, трометамол и трометан. Наборы по изобретению, необязательно, могут содержать буферы для ПЦР (PCR)-амплификации, dNTPs (дНТФ, дезоксинуклеозидтрифосфаты) и буферы для загрузки образцов в гели.
ОПИСАНИЕ ФИГУРЫ
[0052] На Фигуре 1 показан процесс включения бактерий в жевательную резинку в зависимости от времени in vivo. Число бактерий, включенное в жевательную резинку двух различных типов в зависимости от времени жевания, выражается либо в CFU (КОЕ, log-единицы), определяемых с использованием калибровочной кривой (А), либо в условных (произвольных) единицах, полученных с применением qPCR (B). Величина ошибки ("усы") показывает стандартное отклонение в группе из пяти добровольцев после двух измерений.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0053] В изобретении предусматривается способ извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизма, прикрепленного к полимеру или захваченного полимером, который является пластичным в живом организме. Полимеры, "пластичные в живом организме", являются гибкими и податливыми при температуре и pH в живом организме, но композиция полимера является устойчивой к действию различных сил и в различных условиях (например, к действию температуры, pH, ферментов) внутри организма. Например, способ по изобретению включает полимеры, которые становятся пластичными под действием усилий, прилагаемых организмом (например, при жевании, измельчении или скрежетании зубами и перегрызании резинки), при температуре внутри организма (например, при температуре в полости рта) или в условиях реакций в организме (например, в присутствии ферментов, вырабатываемых организмом, при pH в полости рта живого организма). Эти пластичные полимеры могут быть органическими (на основе углерода), и, следовательно, эти полимеры будут растворяться в органических растворителях согласно способу по изобретению. Примером такого полимера является жевательная резинка, надувная жевательная резинка или гуммиоснова.
[0054] Другие пластичные полимеры, применяемые в способах по изобретению, включают зубные смолы или полимеры, находящиеся на или в эндодонтических (зубных) или периодонтальных инструментах, композициях или аппаратах, например, такие как полимеры, применяемые в пломбах, зубных протезах, мостах (мостовидных протезах), коронках зуба, корневых каналах пульпы зуба, зубных вкладках, зубных накладках и винирах или в хирургических инструментах (например, шаблонах или поддержках (опорных пунктах)), челюстнолицевых приспособлениях, таких как небные пластинки, челюстные поддержки, ортодонтические приспособления, например, приспособления, позволяющие избавиться от вредных привычек (привычки кусать ногти или сосать большой палец), капы, шины, капы от бруксизма, детские соски, пустышки, пузырьки, мундштуки, детские зубные кольца или игрушки, жевательные палочки или игрушки и другие предметы для жевания, предназначенные для людей и животных. Для осуществления способов по изобретению могут также применяться пластичные полимеры, используемые в упаковке для пищевых продуктов. Эти полимеры включают изопрен, метилметакрилат, полиметилметакрилат (РММА), полиэтилметакрилат (РЕМА), полибутилметакрилат (РВМА), глицидилметакрилат (GMA), бисфенол A глицидилметакрилат (BIS-GMA), диметилакрилат триэтиленгликоля (TEGDMA), гуттаперчу и полибутилен. Термин "полибутилен" включает альфа-бутилен, цис-бутилен, бета-бутилен, транс-бета-бутилен, изобутилен, силикон, нейлон и биоразрушаемые полимеры, такие как полилактиды, или их комбинации.
[0055] В изобретении также предусматривается способ извлечения нуклеиновых кислот из микроорганизма, прикрепленного к полимеру или заключенного в полимер, который растворяется в органическом растворителе после контактирования с живым организмом, например, медицинских инструментов, зубных (стоматологических) инструментов или инструментов для периодонта и хирургических инструментов.
[0056] Способы по изобретению можно осуществлять на полимерах, обычно применяемых в медицинских инструментах. Например, термопластичные полимеры, которые обычно применяются в медицинских инструментах, включают полиэтилен, полипропилен, полистирол, сложный полиэфир, такой как полиэтилентерефталат (PET), сложный полиэфир, такой как полилактид (PLA), поликарбонат (PC), поливинилхлорид (PVC), полиэфирсульфон (PES), полиакрилат (РММА), полисульфон (PSU), полиэфирэфиркетон (РЕЕК), сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола (ABS, АБС), политетрафторэтилен, полипропилен, гомополимеры и сополимеры пропилена, сополимеры полиоксиметилен или полиацеталь. Термопластичные полимеры включают аморфные термопластики и полукристаллические термопластики. Кроме того, в медицинских инструментах обычно применяются термореактивные полимеры, такие как гидрогель (акрилатный), полиуретан (PUR, TPU). Также в медицинских инструментах обычно используют эластомеры.
Способы по изобретению можно осуществлять с использованием биоразрушаемых полимеров, включая природные, синтетические и биосинтетические полимеры, такие, как полимеры, применяемые в биорассасывающихся нитях, шаблонах (стентах), штифтах, стержнях и хирургических скобках для ушивания раны, тканеинженерных каркасов и наращивания мягких тканей, в том числе сложные полиэфиры, такие как полимолочная кислота (PLLA), полилактид (PLA), полигликолид (PGA), поликапролактон (PCL). Другие биоразрушаемые полимеры включают полигидроксиалканоаты класса PHB-PHV, другие сложные полиэфиры и природные полимеры, в частности, модифицированные полисахариды, например, крахмал, целлюлозу и хитозан.
Жевательная резинка
[0057] Жевательная резинка обычно состоит из нерастворимой в воде гуммиосновы, растворимой в воде части и вкусоароматического вещества. Растворимая в воде часть вместе с вкусоароматической составляющей жевательной резинки рассеивается за время жевания. Гуммиоснова остается во рту в процессе жевания.
[0058] Нерастворимая основа жевательной резинки (гуммиоснова) обычно содержит эластомеры, смолы, жиры и масла, мягчители и неорганические наполнители. Гуммиоснова может включать, а может не включать, воск. Нерастворимая гуммиоснова может составлять от примерно 5% до примерно 95% вес. от веса жевательной резинки, обычно гуммиоснова составляет от 10% до примерно 50% от веса жевательной резинки, а в некоторых предпочтительных вариантах изобретения от примерно 25% до примерно 35% вес. от веса жевательной резинки.
[0059] Например, основа жевательной резинки по настоящему изобретению содержит от примерно 20% до примерно 60% вес. синтетического эластомера, от примерно 0% до примерно 30% вес. природного эластомера, от примерно 5% до примерно 55% вес. пластификатора эластомера, от примерно 4% до примерно 35% вес. наполнителя, от примерно 5% до примерно 35% вес. мягчителя и необязательно, минорные количества (примерно 1% вес. или менее) прочих ингредиентов, таких как красители, антиоксиданты и т.д.
[0060] Синтетические эластомеры могут включать, но без ограничения, полиизобутилен со средней молекулярной массой (по определению методом гель-проникающей хроматографии (GPC)) от примерно 10,000 до примерно 95,000, сополимер изобутилена с изопреном (бутилкаучук), сополимеры стирола с бутадиеном с соотношением стирол-бутадиен от примерно 1:3 до примерно 3:1, поливинилацетат, имеющий среднюю молекулярную массу (GPC) от примерно 2,000 до примерно 90,000, полиизопрен, полиэтилен, сополимер винилацетата с виниллауратом, содержащий от примерно 5% до примерно 50% вес. виниллаурата от веса сополимера, и их комбинации.
[0061] Предпочтительные значения интервала средней молекулярной массы для полиизобутилена составляет от 50,000 до 80,000 GPC, а соотношение стирола к бутадиену составляет от 1:1 до 1:3 в сополимере стирол-бутадиен, средняя молекулярная масса поливинилацетата находится в интервале от 10,000 до 65,000 GBC, причем поливинилацетат с более высокой молекулярной массой обычно применяют в основе надувной жевательной резинки, а в сополимере винилацетата с виниллауратом содержание виниллаурата составляет 10-45%.
[0062] Природные эластомеры могут включать натуральный каучук, например, такой как смокед-шит или жидкий латекс и гваюла, а также природные смолы, такие как джелутонг, лечи каспи (lechi caspi), перилло, сорва, массарандуба балата (бразильская вишня), массарандуба шоколад, мушмула, розиндинья, чикле (сок сапотилового дерева), гутта ханг кант и их комбинации. Концентрации предпочтительного синтетического эластомера и природного эластомера меняются в зависимости от того, является ли жевательная резинка на этой основе адгезивной или традиционной, надувной жевательной резинкой или обычной резинкой, как описано ниже. Предпочтительные природные эластомеры включают джелутонг, чикле, сорву и массарандубу балату.
[0063] Пластификаторы эластомеров могут включать, но без ограничения, натуральные эфиры канифоли, такие как глицериновые эфиры частично гидрированной канифоли, глицериновые эфиры полимеризованной канифоли, глицериновые эфиры частично димеризованной канифоли, глицериновые эфиры канифоли, пентаэритритовые эфиры канифоли; синтетические пластификаторы, например, такие как терпеновые смолы, полученные из альфа-пинена, бета-пинена и/или d-лимонена; и любые подходящие комбинации вышеуказанных соединений. Предпочтительные пластификаторы эластомеров также варьируются в зависимости от конкретного применения и типа применяемого эластомера.
[0064] Наполнители/структурообразователи (текстуризаторы, улучшители консистенции) могут включать карбонат магния и кальция, известковую муку, силикаты, например, силикат магния и алюминия, глину, оксид алюминия, тальк, оксид титана, моно-, ди- и трикальцийфосфат, полимеры целлюлозы, например, wood, и их комбинации.
[0065] Мягчители/эмульгаторы могут включать жир, гидрогенизированный жир, гидрогенизированные или частично гидрогенизированные растительные масла, масло какао, моностеарат глицерина, триацетат глицерина, лецитин, моно-, ди- и триглицериды, ацетилированные моноглицериды, жирные кислоты (например, стеариновая, пальмитиновая и линолевая кислоты); и их комбинации. Красители и отбеливатели могут включать красители типа FD&C и лаки, фруктовые и растительные экстракты, диоксид титана и их комбинации. Основа может включать, а может не включать, воск.
[0066] Помимо нерастворимой в воде части основы резинки (гуммиосновы), типичная композиция жевательной резинки включает растворимую в воде объемообразующую часть и одно или более вкусоароматических веществ. Водорастворимая часть может включать объемные подсластители, высокоинтенсивные подсластители, вкусоароматические вещества, мягчители, эмульгаторы, красители, подкислители, наполнители, антиоксиданты и другие компоненты, которые обеспечивают нужные свойства.
[0067] Мягчители добавляют в жевательную резинку с целью оптимизировать разжевываемость и вкусовые качества резинки. Мягчители, которые также известны как пластификаторы и вещества, придающие пластичность, обычно составляют от примерно 0.5% примерно до 15% веса жевательной резинки. Мягчители могут включать глицерин, лецитин и их комбинации. Водные растворы подсластителей, такие, как растворы, включающие сорбит, гидрогенизированные гидролизаты крахмала, кукурузную патоку и их комбинации, можно также применять в жевательных резинках в качестве мягчителей и связующих веществ.
[0068] Объемные подсластители включают компоненты как содержащие сахара (подсластители на основе сахаров), так и не содержащие сахаров (бессахарные). Объемные подсластители обычно составляют от примерно 5% до примерно 95% вес. веса жевательной резинки, чаще от примерно 20% до примерно 80% вес., и наиболее часто, от примерно 30% до примерно 60% вес. веса резинки. Подсластители на основе сахаров обычно включают сахариды (углеводы), содержащие компоненты, хорошо известные в технологии жевательной резинки, включая, но без ограничения, сахарозу, декстрозу, мальтозу, декстрин, сухой инвертный сахар, фруктозу, левулозу, галактозу, сухую кукурузную патоку и т.п., индивидуально или в комбинации. Подсластители, не содержащие сахаров, включают, но без ограничения, сахарные спирты, такие как сорбит, маннит, ксилит, гидрогенизированные гидролизаты крахмала, мальтит и т.п., индивидуально или в комбинации.
[0069] Высокоинтенсивные подсластители также можно применять индивидуально или в комбинации с вышеописанными веществами. Предпочтительные подсластители включают, но без ограничения, сукралозу, аспартам, соли ацесульфам, альтитам, сахарин и его соли, цикламиновую кислоту и ее соли, глицирризинат, дигидрохальконы, тауматин, луо хан гуо, монеллин, стевию и ее гликозиды и т.п., индивидуально или в комбинации. Для того чтобы обеспечить более продолжительное ощущение сладости, вкуса и аромата, желательно инкапсулировать компоненты или иным образом контролировать высвобождение по меньшей мере части искусственного подсластителя. Для достижения нужных показателей высвобождения можно применять такие методы, как влажная грануляция, инкапсуляция в воски, сушка распылением, охлаждение распылением, инкапсуляция в псевдоожиженном слое, коацервация и удлинение волокна.
[0070] Комбинации сахаров и/или бессахарных подсластителей могут применяться в жевательной резинке. Кроме того, дополнительную сладость, могут также давать мягчители, например, водные растворы сахара или альдита.
Органические растворители
[0071] Способ по изобретению включает растворение пластичного полимера в органическом растворителе. Растворители представляют собой вещества, которые способны растворять или диспергировать одно или более других веществ. Органические растворители являются растворителями на основе углерода (т.е. они содержат в своей молекулярной структуре углерод). Типичные органические растворители, которые можно применять в способах по изобретению, включают хлороформ, ксилол, толуол, 1,2-дихлорбензол, гексан, тетрагидрофуран, дихлорметан или ацетон.
Буферы
[0072] Термин "буферный раствор" относится к водному раствору, который состоит из смеси слабой кислоты и сопряженного с ним основания или слабого основания и сопряженной с ним кислоты и который применяется для поддержания почти постоянного значения pH раствора. Буферные растворы, применяемые для осуществления способов по изобретению, являются нейтральными или слабоосновными, и нуклеиновые кислоты в этих растворах являются устойчивыми. Примеры буферных растворов, применяемых при осуществлении любых способов по изобретению, представлены в Таблице 1.
[0073] Термин "Трис-буфер" относится к буферному раствору, содержащему трис(гидроксиметил)аминометан. Трис-буфер также известен как Трис основание, Trizma, трисамин (Trisamine), ТНАМ, трометамин, трометамол и трометан.
[0074] Способы по изобретению можно также осуществлять с растворами буферов, которые содержат Трис, например, такой как ТАЕ буфер (Трис-ацетат-EDTA, который является раствором, содержащим Трис основание, уксусную кислоту и EDTA), или ТВЕ буфер (Трис-борат-EDTA), который Tris основание, борную кислоту и EDTA.
[0075] Или же способы по изобретению можно осуществлять с литий-боратным буфером (LB), который представляет собой раствор, содержащий моногидрат гидроксида лития и борную кислоту, или натрий-боратный буфер (SB).
Нуклеиновые кислоты
[0076] Термин "нуклеиновая кислота", "нуклеотидная последовательность" или "молекула нуклеиновой кислоты" относится к последовательности ДНК или РНК. Термин охватывает молекулы, образованные с использованием любых аналогов оснований ДНК и РНК, например, но без ограничения, таких как 4-4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-N6-метиладенозин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбокси-гидроксиметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, N6-изо пентениладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N6-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N6-изопентениладенин, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, урацил-5-оксиуксусную кислоту, оксибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, и 2,6-диаминопурин.
[0077] Способы по изобретению позволяют обнаруживать и/или количественно определять природные, или "натуральные", нуклеиновые кислоты или неприродные, ненатуральные искусственные, синтезированные или искусственные нуклеиновые кислоты. Термин "природные" или "натуральные" в применении к биологическим материалам, таким как нуклеотидные молекулы, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к материалам, имеющимся в природе, а не полученным в результате манипуляций человека. Сходным образом термины "неприродный" или "ненатуральный" в данном контексте употребляются по отношению к материалу, не существующему в природе, или к материалу, структура которого была модифицирована или который был синтезирован человеком.
[0078] Термин "извлеченная нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте, которая (1) была отделена от по меньшей мере 50 процентов белков, липидов, углеводов или других материалов, с которыми она находилась в естественных условиях, когда тотальную ДНК выделили из источника клеток, (2) не связана с целым полинуклеотидом или с частью полинуклеотида, с которым "извлеченная нуклеиновая кислота" связана в естественных условиях. Предпочтительно, молекула выделенной или извлеченной нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению практически не содержит примесей молекул какой-либо другой нуклеиновой кислоты (каких-либо других нуклеиновых кислот) или других примесей, которые имеются в ее естественной окружающей среде.
Способы амплификации нуклеиновых кислот
[0079] Способы по изобретению включают амплификацию нуклеиновой кислоты, которая извлечена (выделена) из организма или клетки, прикрепленных к полимеру или заключенных в полимер. Термин "способ амплификации" относится к любому способу, который повышает число копий конкретного фрагмента нуклеотидной последовательности посредством репликации фрагмента. Для осуществления этих способов обычно применяют приборы, называемые термоциклерами (амплификаторами).
[0080] Полимеразная цепная реакция (PCR, ПЦР) является наиболее распространенным способом амплификации нуклеиновых кислот с применением двух праймеров и ДНК-полимеразы. PCR (ПЦР) в реальном времени, также называемая количественной PCR или qPCR, является наиболее чувствительным способом амплификации и определения количества нуклеиновых кислот. PCR в реальном времени позволяет обнаруживать продукты амплификации нуклеиновых кислот в процессе реакции и обычно считается более точным способом определения числа копий целевой исходной молекулы, чем PCR с анализом "по конечной точке".
[0081] Другие способы амплификации нуклеиновых кислот включают метод вытеснения цепи (SDA), в котором используется ДНК-полимераза, которая обладает активностью по вытеснению цепи, способы изотермической амплификации, например, такие как геликаза-зависимая амплификация (HDA) и термофильная геликаза-зависимая изотермическая амплификация с обратной транскрипцией (RT-tHDA), амплификация по типу катящегося кольца (RCA), представляющая собой однонаправленную репликацию нуклеиновой кислоты, которая позволяет синтезировать множество копий кольцевых нуклеиновых кислот, петлевая изотермическая амплификация (LAMP), в которой для амплификации применяется инкубация при одной температуре, лигазная цепная реакция (LCA), т.е. способ амплификации нуклеиновой кислоты, в котором для амплификации целевой нуклеиновой кислоты применяются термостабильная ДНК-лигаза и термостабильная ДНК-полимераза, амплификация на основе нуклеотидной последовательности (NASBA), которая представляет собой одностадийный изотермический процесс амплификации и in vitro транскрипции РНК. Эти способы можно осуществлять с применением стандартных способов, известных из уровня техники. В изобретении также рассматривается применение методов секвенирования для подтверждения идентичности фрагментов ДНК, амплифицированных с помощью PCR.
2
[0082] При осуществлении способов по изобретению PCR можно проводить, используя "реакционную смесь для PCR", которая представляет собой смесь, пригодную для проведения PCR. Реакционная смесь для PCR содержит соответствующее количество термостабильной ДНК-полимеразы, линейную или кольцевую матричную ДНК, предпочтительно, двухцепочечную ДНК, для амплификации, пару олигонуклеотидных праймеров, таких, чтобы один из праймеров мог применяться для гибридизации (отжига) с другой или комплементарной цепью матрицы, АТР (АТФ), соответствующие количества каждого из четырех дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (dNTPs), и буферы, соли, например, MgCl, консерванты, восстановители и воду, при необходимости.
[0083] Олигонуклеотидные праймеры могут быть предназначены конкретно для амплификации нуклеиновой кислоты, специфичной к целевым генам или генам, которые определяют конкретный микроорганизм. При создании олигонуклеотидных праймеров длина праймера зависит от содержания в нем (A+T) и от Tm его партнера. Кроме того, праймер должен быть достаточно сложным, чтобы уменьшить вероятность гибридизации праймера с последовательностями, отличными от выбранной мишени. В способах по изобретению могут применяться праймеры протяженностью в интервале от 10 до 30 нуклеотидов; предпочтительно, протяженность праймеров составляет 17 нуклеотидов. Как правило, для праймеров рекомендуется содержание G+C 40%-60%, позволяющее исключить внутреннюю вторичную структуру и протяженные участки какого-либо одного основания. Кроме того, праймеры не должны гибридизоваться с областями со вторичной структурой (в мишени) с температурой плавления выше, чем у праймера.
[0084] Олигонуклеотидные праймеры могут являться универсальными праймерами, которые амплифицируют нуклеотидную последовательность, присутствующую во всех типах конкретного микроорганизма, например, такими как универсальные праймеры, которые специфичны для любого типа бактерий, грибов, вирусов или простейших, например, праймеры для гена 16S рибосомной РНК бактерий. Например, универсальные праймеры могут быть специфичными для конкретного типа бактерий, как например, универсальные праймеры, специфичные для анаэробных бактерий, универсальные праймеры, специфичные для аэробных бактерий, универсальные праймеры, специфичные для грамотрицательных бактерий, или универсальные праймеры, специфичные для грамположительных микроорганизмов. Кроме того, универсальные праймеры могут быть специфичными для конкретного рода микроорганизма, например, универсальные праймеры, которые амплифицируют нуклеотидную последовательность, специфичную для стрептококков, или универсальные праймеры могут быть специфичными для конкретного вида микроорганизма, например, универсальные праймеры, которые амплифицируют нуклеотидную последовательность, специфичную для Streptococcus mutans, универсальные праймеры могут быть специфичными для конкретного штамма микроорганизма, например, универсальные праймеры, которые амплифицируют нуклеотидную последовательность, специфичную для Streptococcus mutans МТ8148.
[0085] Дезоксирибонуклеозид-трифосфаты (dNTPs) включают 2'-дезоксиаденозин- 5'-трифосфат (dATP), 2'-дезоксицитидин- 5'-трифосфат (dCTP), 2'-дезоксигуанозин- 5'-трифосфат (dGTP) и 2'-дезокситимидин 5'-трифосфат (dTTP). Как правило, концентрация dNTP в реакции PCR составляет примерно 200 мкМ. Важно поддерживать концентрации четырех dNTP выше расчетной константы Михаэлиса Km каждой dNTP (10 мкМ-15 мкМ) и обеспечивать оптимальное соотношение для наилучшего включения основания. Снижение концентраций dNTP и иона магния за счет равной молярной концентрации может повысить достоверность данных. Также могут использоваться модифицированные dNTPs (dig(дигоксигенин)-11-dUTP, 5-бром-dUTP, инозин, биотин-11-dUTP, биотин-16-dUTP и 7-деаза-dGTP) и 2'-дезоксиуридин 5'-трифосфат (dUTP).
[0086] Далее, помимо PCR и других методов амплификации, извлеченные (выделенные) нуклеиновые кислоты можно анализировать любым другим стандартным методом анализа для идентификации источника или присутствия/экспрессии конкретной последовательности. Эти анализы можно проводить вместо метода амплификации или в комбинации с методом амплификации. Примеры анализов включают традиционный или Саузерн-блоттинг или Саузерн-блоттинг в импульсном магнитном поле, Нозерн-блоттинг, денатурирующий градиентный гель-электрофорез, дот-блот гибридизацию, слот-блоттинг, микрочипы, экзонуклеазную активность, флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) или in situ локализацию посредством связывания с белком-репрессором.
Микроорганизмы
[0087] В изобретении предусматриваются способы обнаружения микроорганизмов, прикрепленных к полимерам или заключенных в полимеры, пластичные в живом организме. Помимо этого, в изобретении предусматриваются способы определения микробного профиля образца слюны живого организма. Профиль микробов образца слюны можно использовать для определения предрасположения организма к риску развития кариеса или заболевания периодонта, вне зависимости от того, вызывают ли микробы инфекцию в настоящее время. Далее, способы по изобретению можно применять в методах контроля качества, чтобы определить, является ли полимер чувствительным или устойчивым к связыванию или захвату микробов.
[0088] Термины "микроорганизмы" или "микробы" относятся к микроскопическим организмам, которые могут быть одноклеточными или многоклеточными организмами и могут быть патогенными или условно-патогенными по отношению к организму-хозяину. В изобретении предусматриваются способы обнаружения и количественного определения микроорганизмов, прикрепленных к полимеру или включенных в полимер, являющийся пластичным в живом организме, и эти микроорганизмы включают бактерии, вирусы, грибы и простейшие.
[0089] Бактерии могут быть грамотрицательными или грамположительными бактериями и анаэробными или аэробными бактериями. В изобретении в частности рассматриваются способы обнаружения бактерий ротовой полости (полости рта), таких как условно-патогенные бактерии ротовой полости и патогенные бактерии полости ротовой полости, например, таких как стрептококки, лактобациллы, стафилококки, коринебактерии, актиномицеты sp., фузобактерии и анаэробные бактерии, в частности, бактероиды (бактерии-сапрофиты). Примеры бактерий ротовой полости включают Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius, Actinomyces naeslundii, Streptococcus sanguinis, Porphyromomas gingivalis, Porphymomas intermedia, Bacteroides forsythus, Tanneraella. forsythia, Campylobacter rectus, Eubacerium nodatum, Peptostreptococcus micros, Streptococcus intermedius, Aggregetibacter actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Eikenella corrodens, Capnocytophaga gingivalis, Streptococcus gordonii, Veillonella parvula, Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia, Lactobacillus salivarius, Streptococcus salivarius и Streptococcus sobrinus
[0090] Вирус может являться членом семейства герпес-вирусов, например, представлять собой герпес- вирус человека (HHV), включая HHV-1 (также известный как вирус простого герпеса (HSV)-1), HHV-2 (HSV-2), HHV-3 (также известный как вирус ветряной оспы), HHV-4 (вирус Эпштейна-Барр), HHV-5 (цитомегаловирус), HHV-6, HHV-7, HHV-8.
[0091] Вирус может являться членом семейства пикорнавирусов (рода энтеровирусов), например, таким как полиовирус, вирус Коксаки группы A, вирус Коксаки группы B, эховирус. В частности, вирус может вызывать болезнь рука-нога-рот, например, вирус Коксаки А16, А5, А7, А10, В2 и В5, вирус, может вызывать герпетическую ангину, например, вирус Коксаки A1-6, А8, А10 и А22 и Энтеровирус 71 (EV-71).
[0092] Вирус может являться членом семейства паповавирусов (Papovaviridae), например членом рода папилломавирусов человека (HPV), включая HPV-16, HPV-18, HPV-33 and HPV-35. Вирус может представлять собой член семейства парамиксовирусов (Paramyxoviridae) (рода Rubulavirus), например, вирус свинки, вирус болезни Ньюкасла, вирус парагриппа человека типа 2, 4а и 4b. Вирус может являться членом семейства парамиксовирусов (рода Morbillivirus). Кроме того, вирус может являться членом семейства тогавирусов (Togaviridae) рода Rubivirus. Вирус может также представлять собой собачий слизисто-оральный папилломавирус, кошачий калицивирус и кошачий герпес-вирус.
[0093] Вирус может также представлять собой вирус гриппа человека A, например, H1N1 и H3N3, вирус гриппа человека B, вирус гриппа человека C. Вирус может представлять собой вирус, который вызывает обычную простуду, например, риновирус.
[0094] Известно, что некоторые вирусы простого герпеса (вирус простого герпеса и вирус ветряной оспы, причина ветряной оспы и опоясывающего лишая) вызывают гингивит. Другие герпес-вирусы (цитомегаловирус и вирус Эпштейна-Барр) могут также играть некоторую роль в возникновении или прогрессировании некоторых типов периодонтальных заболеваний (заболеваний околозубной сферы), включая агрессивную и тяжелую хроническую форму периодонтальных заболеваний. Все заболевания, вызванные герпес-вирусами, проходят через активную фазу с последующей скрытой (латентной) фазой и, возможно, реактивацией. Эти вирусы вызывают периодонтальное заболевание разными путями, включая высвобождение тканеразрушающих цитокинов, чрезмерное развитие микрофлоры в тканях периодонта, подавление иммунных факторов и инициирование других патологических процессов, которые ведут к гибели клеток.
[0095] Способы по изобретению позволяют обнаруживать грибы, такие как Candida, например, Candida albicans, Aspergillus, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidiodes immites и Zygomycota.
[0096] Способы по изобретению позволяют обнаруживать простейшие, такие как Entamoeba gingivalis и Trichomonas tenax.
[0097] В изобретении рассматривается обнаружение микроорганизмов, которые вызывают или обусловливают заболевания полости рта и периодонтальные заболевания (воспаление или инфекцию ткани десен), такие как хронический периодонтит и острый периодонтит у взрослых, гингивит, например, острый некротизирующий язвенный гингивит, болезнь Венсана, кариес зуба, герпес-вирусную инфекцию, первичный герпетический гингивостоматит или внутриротовой герпес (герпес губы и язвенный стоматит), герпес гениталий, вирусную инфекцию ветряной оспы, например, оспу птиц или опоясывающий лишай, грипп, простуду, венерическое заболевание, мононуклеоз, вирусную инфекцию Коксаки, например, синдром рука-нога-рот, герпетическую ангину (афтозный фарингит), острый лимфонодулярный фарингит (острый фарингит неуточненный), свинку, корь, краснуху (германскую корь), африканскую лимфому Беркитта, рак носоглотки (назофарингеальную карциному), волосистую лейкоплакию полости рта, детскую розеолу, саркому Капоши, кандидоз, острый псевдомембранозный кандидоз (кандидоз полости рта), острый атрофический (эритематозный) кандидоз, хронический гиперпластический кандидоз и хронический атрофический (эритематозный) кандидоз, аспергиллез, криптококкоз, гистоплазмоз (также известный как болезнь пещеры, болезнь Дарлинга, болезнь долины Огайо, ретикулоэндотелиоз, легкое спелеолога и болезнь исследователя пещер), бластомикоз (также известный как североамериканский бластомикоз, кожный бластомикоз и бластомикоз Гилкриста), паракокцидиоидомикоз (также известный как бразильский бластомикоз, южноамериканский бластомикоз, болезнь Лутца-Сплендоре-Алмейды и паракокцидиоидная гранулема), мукормикоз (от названия порядка грибов мукоровые, Mucorales), фикомикоз (от названия класса грибов фикомицеты, Phycomycetes) и базидиоболомикоз (от названия грибов порядка Basidiobolus) и зигомикоз (мукормикоз). В изобретении также предусматриваются способы диагностики любого патологического состояния, заболевания или нарушения, которое вызывается или обусловливается присутствием микроорганизма, прикрепленного к полимеру или заключенного в полимер, являющийся пластичным в живом организме.
Клетки млекопитающих
[0098] Любой из способов по изобретению можно также применять для обнаружения нуклеиновых кислот из клеток млекопитающих, например, человеческих клеток, клеток собак, клеток кошек, клеток мышей, клеток крыс, клеток жвачных животных, клеток лошадей, клеток овец, клеток коз, клеток приматов, клеток морских млекопитающих, таких как киты и дельфины, и клеток других экзотических млекопитающих, прикрепленных к полимеру или заключенных в полимер. Клетки млекопитающих, которые могут быть обнаружены, включают эпителиальные клетки, сквамозные клетки, фибробласты, кератиноциты, одонтобласты, амелобласты, клетки вкусовых рецепторов, такие как сенсорные клетки, опорные (или поддерживающие) клетки, стволовые клетки, базальные клетки, клетки слюнных желез, такие как серозоциты и мукоциты.
[0099] Клетки могут также представлять собой раковые клетки опухоли, которая образовалась на поверхности языка, ротовой полости, губ, полости глотки, миндалин или десен, например, клетки плоскоклеточной карциномы полости рта, аденокарциномы слюнной железы, мукоэпидермоидной карциномы, железисто-кистозной карциномы, саркомы (опухоли, возникающей в костях, хряще, жировой клетчатке, волокнистой соединительной ткани или мышцах), лимфомы или меланомы. Клетки могут представлять собой предраковые клетки субъектов, находящихся в предраковом состоянии, например, клетки области лейкоплакии или эритроплакии.
Наборы
[00100] В изобретении также предусматриваются наборы для осуществления способов по изобретению. В частности, в изобретении предусматривается набор, содержащий компоненты для обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот из клетки микроорганизма, прикрепленной к полимеру или заключенной в полимер согласно любому из способов по изобретению. Наборы содержат олигонуклеотидные праймеры для амплификации фрагмента нуклеиновой кислоты, специфичного для целевого микроорганизма, клетки млекопитающего, например, человеческие клетки, или раковые клетки. Наборы могут содержать также универсальные прямой и/или обратный праймеры для амплификации нуклеиновой кислоты. Наборы могут содержать также инструкций по осуществлению способов по изобретению.
2
[00101] Наборы по изобретению могут также содержать компоненты, необходимые для осуществления PCR (ПЦР) или других методов амплификации. Например, набор может содержать один или более нижеприведенных компонентов, выбранных из группы, включающей: Taq полимеразу или другую термостабильную полимеразу, ATP (АТФ), соответствующие количества каждого из четырех дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (dNTPs), и буферы, соли, например, MgCl, консерванты, восстановители или воду.
[00102] Наборы могут содержать любые компоненты, необходимые для осуществления анализов на обнаружение, такие как органический растворитель и буферный раствор, например, хлороформ и/или Трис-буфер. Наборы могут содержать буферы, красители для нанесения образцов, гели, маркеры молекулярной массы, мембраны, фильтры, блокирующие буферы и проявляющие реагенты для Нозерн-блоттинга, Саузерн-блоттинга, слот-блоттинга или анализа с помощью in situ гибридизации и любых других способов, стандартных в данной области техники.
[00103] Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения будут понятны после рассмотрения нижеприведенных иллюстративных примеров.
ПРИМЕРЫ
[00104] В Примере 1 описывается количественное определение бактерий, прилипших (прикрепленных) к пережеванной и вынутой пальцем жевательной резинке, в Примере 2 количественное определение бактерий, прилипших (прикрепленных) к пережеванной жевательной резинке in vivo, и в Примере 3 описываются дополнительные эксперименты по количественному определению бактерий, прилипших (прикрепленных) к жевательной резинке in vivo.
Пример 1
Количественное определение бактерий, прикрепленных к жевательной резинке или заключенных в жевательную резинку In Vivo
[00105] Далее было проведено исследование с целью продемонстрировать, что жевательная резинка может удалять бактерии из полости рта, а бактериальные нуклеиновые кислоты можно извлекать.
[00106] Пять здоровых добровольцев (1 мужчина, 4 женщины в возрасте от 27 до 56 лет) дали свое письменное информированное согласие на участие в данном исследовании. Критерии включения в данное исследование: каждый доброволец должен быть здоров и иметь по меньшей мере 16 собственных постоянных зубов. Критерии исключения: применение антибиотиков или ополаскивателя для полости рта в течение месяца перед исследованием. Добровольцы также не применяли антибиотики, ополаскиватели для полости рта и жевательную резинку других типов во время исследования. Все эксперименты проводили в двух повторностях.
[00107] Затем добровольцев просили жевать резинку двух различных типов в течение разного времени вплоть до 10 минут, и число бактерий, захваченных резинкой при разжевывании, определяли либо в CFU (КОЕ) после разрушения таблеток разжеванного остатка резинки с помощью ультразвука, либо в условных единицах, полученных реакцией qPCR с использованием бактериальной ДНК, выделенной из таблеток разжеванной резинки, растворенных в хлороформе. Определение числа бактерий обоими методами дало начальный пик включенного числа бактерий вскоре после (начала) жевания. По мере увеличения времени жевания вплоть до 10 минут число включенных бактерий снижалось (Фигура 1).
2
2
2
[00108] В определенные дни добровольцев просили жевать 1.5 г жевательной резинки каждого типа в течение 0.5, 1, 3, 5 или 10 минут. Время разжевывания назначалось произвольно, и разжевывание осуществлялось в одно и то же время в течение дня. После разжевывания резинку выплевывали в чашку из полистирола, содержащую 10 мл стерильной воды, после чего разжеванный остаток резинки помещали в тефлоновую форму и подвергали действию ультразвука, как описано в Примере 1 для резинок, которые после разжевывания извлекали пальцами изо рта. Полученные суспензии засевали на плашки с кровяным агаром (кровяной агар основа по. 2 40 г/л, гемин 5 мг/л, менадион 1 мг/л, овечья кровь 50 мл/л) и число CFUs (КОЕ) определяли после инкубации в течение 7 дней при 37°C в анаэробных условиях (5-10% H, 10% CO, 80% N) (анаэробная рабочая станция Concept 400, Ruskinn Technology Ltd., Pencoed, UK).
[00109] В отдельной серии экспериментов пять здоровых добровольцев (4 мужчины, 1 женщина) жевали по 1.5 г жевательной резинки каждого типа в течение 0.5, 1, 3, 5 или 10 минут. И в этом случае разжеванную резинку выплевывали в чашку из полистирола, содержащую 10 мл стерильной воды, после чего резинку растворяли в помещенную в центрифужную пробирку смесь, содержащую 5 мл хлороформа (67-66-3, Fisher Scientific, Waltham, USA) и 3 мл ТЕ буфера (АМ9849, Ambion - LifeTechnologies™, Carlsbad, USA). Пробирки встряхивали по меньшей мере в течение 30 минут до полного растворения резинки. Полученную суспензию центрифугировали в течение 10 минут, чтобы извлечь (удалить) большие частицы и гуммиоснову из верхнего водного слоя.
[00110] Применяли исходную смесь для qPCR анализа, состоящую из 1000 мкл ПЦР-смеси (SsoFast™ EvaGreen  Supermix, Bio-rad, Hercules, USA), 500 мкл воды, не содержащей ДНК (Fisher Scientific, Waltham, USA), и 250 мкл смеси праймеров. Эта последняя представляла собой раствор 15 мкл как прямых, так и обратных праймеров, утвержденных для 9 специфических видов бактерий, в 270 мкл воды, не содержащей ДНК. Подробнее праймеры представлены ниже, в Таблице 2.
х
[00111] В 96-луночном планшете для PCR (MSP-9601, Bio-rad, Hercules, USA) 2.5 мкл образца, взятого из водного раствора, смешивали с 17.5 мкл исходной смеси. Затем проводили qPCR на термоциклере (CFX96, Bio-rad, Hercules, USA) в соответствии с методикой 2-стадийной амплификации (95.0°C в течение 10 секунд, 55.0°C в течение 30 секунд), осуществляя 39 циклов, и анализировали кривую плавления (с 65°C до 95.0°C). Планшеты включали положительный контроль, зависящий от набора праймеров, и отрицательный контроль: не содержащий ДНК и праймеров. Результаты выражали в виде - кратной экспрессии и сравнивали между экспериментами, тогда как численность бактерий выражали в условных единицах (AU).
7
8
9
[00112] По результатам этих in vivo экспериментов численность бактерий, захваченных, заключенных в жевательную резинку, оценивается как 1×10, в зависимости от времени жевания. Общая численность микроорганизмов в слюне оценивается как 10-10 (Burt et al. Journal of the American Dental Association 127: 190-196, 2006), это означает, что фактически 1-10% бактерий слюны может улавливаться и удаляться из полости рта с помощью жевательной резинки.
Пример 2
Количественное определение бактерий, прикрепленных к жевательной резинке или заключенных в жевательную резинку In Vivo. Дополнительные эксперименты.
[00113] Другие эксперименты проводились с целью определить минимальное время, необходимое для насыщения жевательной резинки бактериями, и определить численность бактерий, прикрепленных к жевательной резинке или заключенных в жевательную резинку. Обычно применялись способы, описанные выше, в Примере 1.
[00114] Пять субъектов попросили жевать мятную жевательную резинку в течение 2 недель. Субъектам разрешили жевать только одну пластинку резинки в день. Остатки резинки после разжевывания хранили в стерильных пробирках фирмы Falcon объемом 15 мл до момента PCR анализа. Эти образцы описаны ниже, в Таблице 3.
[00115] Для анализа замороженные остатки жевательной резинки извлекали из морозильника и оставляли нагреваться до комнатной температуры. В пробирку, содержащую остаток жевательной резинки, добавляли ТЕ буфер (3 мл) и хлороформ (5 мл). Образцы перемешивали в течение 30 минут и после полного растворения остатка жевательной резинки образцы центрифугировали при 4500 об/мин в течение 10 минут. Затем отбирали 2 мл верхнего водного слоя и анализировали с помощью PCR.
[00116] PCR проводили с использованием набора SsoFast в соответствии с инструкциями производителя, применяя прямой и обратный праймеры. Далее приводятся условия проведения реакции: 95.0°C в течение 3 минут, 95.0°C в течение 10 секунд, 55.0°C в течение 30 секунд с последующим циклом, повторяющимся 39 раз: 95.0°C в течение 10 секунд, затем анализ кривой плавления с 65.0°C до 95.0°C: Инкремент 0.5°C в течение 5 секунд.
[00117] Согласно результатам, приведенным в Таблице 3, после разжевывания в течение одной минуты число бактерий, прилипших к жевательной резинке, составляет примерно 400. Как показано на Фигуре 1, численность бактерий, прилипших к жевательной резинке, немного снижается по мере увеличения времени разжевывания до 20 минут.
[00118] Настоящее исследование является дополнительным доказательством того, что способы по изобретению позволяют обнаруживать и количественно определять бактерии полости рта, которые прилипли к жевательной резинке (прикреплены к жевательной резинке или заключены в жевательную резинку).
[00119] Предполагается, что при практическом использовании изобретения специалисты в данной области техники, после рассмотрения предпочтительных в настоящее время вариантов этого изобретения, найдут его многочисленные модификации и варианты. Соответственно, объем изобретения ограничивается лишь прилагаемой Формулой изобретения.