НОВЫЕ СИНЕРГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ
NEW SYNERGETIC EFFECTS

Данная заявка претендует на приоритет Временной заявки США №61/061886, поданной 16 июня 2008 г., полное раскрытие которой явно включено в данное описание ссылкой.
Область техники
Настоящее изобретение касается противораковых комбинаций, содержащих их фармацевтических композиций и их применения в лечении рака. В частности, настоящее изобретение основано на открытии того, что введение комбинации, содержащей как минимум один конъюгат лекарственного средства со связывающимся с клетками агентом (например, иммуноконъюгат), и одного или больше химиотерапевтических средств, выбранных из ингибиторов протеасом (например, бортезомиб), иммуномодуляторов/антиангиогенных средств (например, талидомид или леналидомид) и алкилирующих ДНК средств (например, мелфалан), с необязательным дальнейшим добавлением кортикостероида (например, дексаметазон) проявляет терапевтическую синергию или улучшает терапевтический индекс при лечении рака, в сравнении с лечением только противораковым(и) средством(ами). В настоящем изобретении также предлагаются способы модулирования роста выбранных популяций клеток, таких как раковые клетки, путем введения терапевтически эффективного количества такой комбинации.
Уровень техники
В доклинических исследованиях эффект комбинации противораковых лекарственных средств может быть изучен in vitro на линиях клеток или in vivo на различных моделях опухолей. Обычно объединяют противораковые лекарственные средства с различными механизмами индукции гибели клеток, т.е. нацеливание на различные мишени в клетке. В таких экспериментальных системах наблюдали, что два противораковых лекарственных средства с независимыми мишенями (взаимоисключающие лекарственные средства) действуют аддитивным, синергическим или антагонистическим образом. Chou and Talalay (Adv. Enzyme Regul. 1984, 22:27-55) разработали математический метод, позволяющий точно описать полученные экспериментальные данные в качественной и количественной форме. Ими было показано, что для взаимоисключающих лекарственных средств обобщенное уравнение изоболы (кривой одинакового эффекта) применимо к любой степени выраженности эффекта (см. Chou and Talalay, стр.52). Изобола или изоболограмма - это графическое представление всех комбинаций дозы двух лекарственных средств, которые обладают одинаковой степенью выраженности эффекта, например комбинации двух цитотоксических лекарственных средств будут индуцировать одинаковую степень гибели клеток, например гибель 20% или 50% клеток. Уравнение действительно для любой степени выраженности, и графическое представление будет иметь такую же форму (Chou and Talalay, стр.54, линия 1), которая представлена на рис.11D (Chou and Talalay, стр.5). На изоболограммах прямая линия указывает на аддитивный эффект, вогнутая кривая (кривая ниже прямой линии) представляет синергические эффекты, и выпуклая кривая (кривая выше прямой линии) представляет антагонистические эффекты. Эти кривые также показывают, что комбинация двух взаимоисключающих лекарственных средств будет демонстрировать одинаковый вид эффекта на протяжении интервала концентраций для аддитивной, синергической или антагонистической комбинаций. Большинство комбинаций лекарственных средств демонстрируют аддитивный эффект. Однако в некоторых случаях комбинации демонстрируют эффект, меньший или больший, чем аддитивный. Такие комбинации называются антагонистическими или синергическими соответственно. Антагонистические или синергические эффекты не предсказуемы, как и получаемые экспериментальные данные. Комбинации проявляют терапевтическую синергию, если они с терапевтической точки зрения превосходят один или другой из компонентов, применяемых в оптимальной дозе. См. Corbett et al., Cancer Treatment Reports, 66, 1187 (1982). Tallarida RJ (J Pharmacol Exp Ther. 2001 Sep; 298 (3):865-72), где также отмечается: "Два лекарственных средства, которые оказывают очевидно подобное воздействие, иногда будут оказывать усиленное или ослабленное воздействия при сопутствующем применении. Количественная оценка необходима, чтобы отличать эти случаи от простого аддитивного действия».
Непредсказуемость антагонистических или синергических эффектов: хорошо известна специалисту в данной области и продемонстрирована в нескольких других исследованиях, например Knight et al. См. ВМС Cancer 2004, 4:83. В этом исследовании авторы измеряли активности гефитиниба (так же известного как Пресса) против широкого спектра солидных опухолей, включая рак молочной железы, колоноректальной области, пищевода и яичника, карциному с неизвестной локализацией первичной опухоли, меланому кожи и сосудистой оболочки глазного яблока, немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ) и саркому.
SUM
Ими было обнаружено, что существует гетерогенность степени ингибирования роста опухоли (ИРО), наблюдаемой при тестировании опухолей против единственного средства гефитиниб. Для 7% (6/86) опухолей наблюдалось значительное ингибирование роста опухоли, но чаще всего встречалась умеренная реакция, приводящая к низкой степени ИРО. Интересно, что оказывал как позитивное, так и негативное воздействие при применении в комбинации с различными цитотоксическими лекарственными средствами. Для 59% (45/76) исследованных опухолей добавление гефитиниба, по-видимому, усиливает воздействие цитотоксического средства или комбинации (из них, для 11% (5/45) наблюдалось >50% уменьшение Index). Для 38% опухолей (29/76) ИРО снижалось при применении комбинация «гефитиниб + цитотоксическое лекарственное средство» в сравнении с применением только цитотоксического лекарственного средства. Для остальных 3% (2/76) не наблюдалось никаких изменений.
Авторы заключают, что гефтиниб в комбинации с различными цитотоксическими средствами (цисплатин; гемцитабин; оксалиплатин; треосульфан и «треосульфан + гемцитабин») - это обоюдоострое оружие: его влияние на скорость роста может сделать некоторые опухоли более устойчивыми к сопутствующей цитотоксической химиотерапии, в то время как воздействие на опосредованные цитокинами механизмы выживания (антиапоптотические) клеток может потенцировать чувствительность опухолей от других индивидуумов к таким же лекарственным средствам. См. заключение на стр.7; см. также рис.3. Knight et al., ВМС Cancer 2004, 4:83.
Таким образом, данное исследование доказывает, что два соединения с известной пригодностью для одной и той цели, объединенные для этой цели, не обязательно обеспечивают достижение этой цели.
Тем не менее, поиск высокоэффективных комбинаций, т.е. синергических смесей, активных средств являются многообещающим. Интуиция не является действенным средством, поскольку количество потенциальных комбинаций средств чрезвычайно велико. Например, существуют триллионы возможных 5-компонентных комбинаций даже относительно маленькой палитры из 5000 потенциальных средств. Потенциал другой очевидной стратегии открытия путем дедуктивного вывода потенциальных комбинаций на основе знания механизма также ограничен, поскольку на многие конечные биологические точки в живых организмах воздействуют множественные пути. Эти пути часто не известны и даже, когда они известны, способы, которыми такие пути взаимодействуют для обеспечения конечного биологического эффекта, часто не известны.
Ранее нами была продемонстрирована синергическая комбинация иммуноконъюгата мейтанзиноида, содержащего мейтанзиноидное соединение, связанное с моноклональным антителом с таковой таксанового соединения, эпотилонового соединения, соединения платины, соединения эпиподофиллотоксина и соединения камптотецина.
Синергическое применение комбинации лекарственных средств, даже если оно было ранее продемонстрировано, не устраняет необходимости в поиске новых синергических комбинаций, поскольку синергические эффекты непредсказуемы и поскольку непредсказуемы полученные экспериментальные данные. Например, в лечении синдрома аутоиммунного дефицита (СПИД), которое включает высокоактивную антиретровирусную терапию (НААОТ), считается, что коктейль ингибиторов обратной транскриптазы вируса ВИЧ (OT) и вирусной протеазы (ВП), демонстрирует синергическое ингибирование репликации вируса. Позже интригующим образом также наблюдалась синергия в пределах двух классов ингибиторов OT - нуклеозидные ингибиторы OT (НИОТ) продемонстрировали синергию с ненуклеозидными ингибиторами OT (ННИОТ) в отсутствие ингибиторов ВП. Например, НИОТ AZT (зидовудин) и ННИОТ невирапин демонстрируют синергию при введении в комбинации (Basavapathruni A et al., J. Biol. Chem., Vol.279, Issue 8, 6221-6224, February 20, 2004). Таким образом, по-прежнему существует потребность в поиске лекарственных комбинаций, которые демонстрируют синергизм и могут эффективно применяться для лечения и предотвращения инвалидизирующих заболеваний, таких как рак.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение основано на открытии того, что введение комбинации, содержащей как минимум один конъюгат лекарственного средства/средства, связывающегося с клеткой (например, иммуноконъюгат), в дальнейшем "конъюгат", и как минимум одного химиотерапевтического средства, выбранного из ингибиторов протеасом (например, бортезомиб), иммуномодуляторов/антиангиогенных средств (например, талидомид или леналидомид) и алкилирующих ДНК средств (например, мелфалан), с необязательным дополнительным добавлением кортикостероида (например, дексаметазона) проявляет терапевтическую синергию или улучшает терапевтический индекс при лечении рака, в сравнении с отдельно применяемым иммуноконъюгатом или химиотерапевтическим средством, применяемым отдельно или в комбинации с другим химиотерапевтическим средством, без добавления иммуноконъюгата.
В предпочтительном варианте, конъюгат и химиотерапевтическое(ие) средство(а) вводят в комбинации с кортикостероидом, таким как дексаметазон. Например, иммуноконъюгат, такой как конъюгат «гуманизированное антитело N901-мейтанзиноид» (huN901-DM1), вводят в комбинации с сочетанием талидомид/дексаметазон, леналидомид/дексаметазон или бортезомиб/дексаметазон, где такая комбинация проявляет терапевтическую синергию или улучшает терапевтический индекс при лечении рака по сравнению с применяемым отдельно иммуноконъюгатом, химиотерапевтическим средством, применяемым отдельно или в комбинации с другим химиотерапевтическим средством, без добавления иммуноконъюгата.
В другом варианте два или больше химиотерапевтических средств применяются в комбинации с иммуноконъюгатом. Например, бортезомиб и леналидомид применяются в комбинации с конъюгатом huN901-мейтанзиноид, в присутствии или в отсутствие кортикостероида, такого как дексаметазон, где такая комбинация проявляет терапевтическую синергию или улучшает терапевтический индекс при лечении рака, по сравнению с применяемым отдельно иммуноконъюгатом, химиотерапевтическим средством, применяемым отдельно или в комбинации с другим химиотерапевтическим средством, без добавления иммуноконъюгата.
Термин "терапевтическая синергия" в данном описании подразумевает комбинацию конъюгата и одного или больше химиотерапевтических средств, оказывающую более выраженный терапевтический эффект, чем аддитивный эффект комбинации конъюгата и одного или больше химиотерапевтических средств.
В качестве другого объекта настоящего изобретения описаны способы облегчения или лечения рака у больного, который нуждается в этом, путем введения больному терапевтически эффективного количества как минимум одного конъюгата (например, иммуноконъюгата) и одного или больше химиотерапевтических средств, (например, ингибитора протеасом, иммуномодулятора/антиангиогенного средства или алкилирующего ДНК средства), с необязательным дальнейшим добавлением кортикостероида (например, дексаметазона) таким образом, что комбинация проявляет терапевтическую синергию или улучшает терапевтический индекс при лечении рака по сравнению с противораковым(и) средством(ами), применяемыми отдельно или в комбинации, без добавления иммуноконъюгата.
В другом аспекте настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество конъюгата (например, иммуноконъюгата) и одно или больше химиотерапевтических средств (например, ингибитор протеасом, иммуномодулятор/антиангиогенное средство или алкилирующее ДНК средство), необязательно вместе с фармацевтически приемлемым носителем.
В настоящем изобретении также предлагается применение конъюгата (например, иммуноконъюгата) и химиотерапевтического средства (например, ингибитора протеасом, иммуномодулятора/антиангиогенного средства или алкилирующего ДНК средства) с необязательным добавлением кортикостероида, с целью получения лекарственного средства для комбинированной терапии с одновременным, последовательным или отдельным введением при лечении рака или какого-либо заболевания, являющегося результатом аномальной пролиферации клеток. Например, конъюгат и лекарственное(ые) средство(а) можно вводить в те же дни или в другие дни, используя оптимальную схему введения для каждого средства. Например, в одном из вариантов, два соединения могут быть введены с промежутком в пределах 10 дней, в другом варианте - в пределах интервала 5 дней и еще в одном варианте - в пределах 24 часов или даже одновременно. Альтернативно, huN901-DM1, химиотерапевтическое(ие) средство(а), кортикостероид или какая-либо их комбинация может быть введена в каждый 2-й день, через день, на еженедельной основе или с промежутками времени, которые варьируют в пределах 0-7 дней (например, дни 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) или в пределах 0-4 недель (например, недели 0, 1, 2, 3 или 4, в том числе дни, которые могут быть прибавлены между 1 или больше неделями). В некоторых случаях может быть предпочтительным вводить химиотерапевтическое средство непосредственно после конъюгата. Например, бортезомиб вводят в 0-й день, после чего huN901-DM1 вводят в 3-й день. Периоды для введения лекарственного средства могут быть определены специалистом в данной области в соответствии с требованиями клинической ситуации.
В настоящем изобретении также описаны способы модулирования роста выбранных популяций клеток, таких как раковые клетки, путем введения терапевтически эффективного количества как минимум одного конъюгата (например, иммуноконъюгат) и одного или больше химиотерапевтических лекарственных средств (например, ингибитор протеасом, иммуномодулятор/антиангиогенное средство или алкилирующее ДНК средство) с необязательным добавлением кортикостероида таким образом, что комбинация проявляет терапевтическую синергию или улучшает терапевтический индекс при лечении рака по сравнению с противораковым(и) ередством(ами), применяемыми отдельно или в комбинации, без добавления иммуноконъюгата. Конъюгат может включить средства, связывающиеся с клетками и как минимум одно терапевтическое средство, вызывающее гибель выбранных популяций клеток.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения подробно описаны в данном описании.
Краткое описание фигур
Фиг. 1A показывает эффект комбинации «huN901-DM1 плюс мелфалан» на ксенотрансплантатах множественной миеломы Моlp-8.
Фиг. 1B представляет собой таблицу (табл.1), где показаны данные.
Фиг. 2A показывает эффект комбинации «huN901-DM1 плюс талидомид» на ксенотрансплантатах множественной миеломы Моlр-8.
Фиг. 2B представляет собой таблицу (табл.2), где показаны данные.
Фиг. 3A показывает эффект комбинации «huN901-DM1 плюс бортезомиб» на ксенотрансплантатах множественной миеломы ОРМ2.
Фиг. 3B представляет собой таблицу (табл.3), где показаны данные.
Фиг. 4A показывает эффект комбинации «huN901-DM1 плюс бортезомиб» (низкая доза) на крупных ксенотрансплантатах множественной миеломы Н929.
Фиг. 4B представляет собой таблицу (табл.4а), где показаны данные.
Фиг. 4С показывает эффект комбинации «huN901-DM1 плюс бортезомиб» (высокая доза) на крупных ксенотрансплантатах множественной миеломы Н929.
Фиг. 4D представляет собой таблицу (табл.4b), где показаны данные.
Фиг. 5A показывает эффект комбинации «huN901-DM1 плюс леналидомид» на ксенотрансплантатах множественной миеломы ОРМ2.
Фиг. 5В представляет собой таблицу (табл.5), где показаны данные.
Фиг. 6 показывает зависимость противоопухолевой активности huN901-M1 с бортезомибом от схемы введения.
Фиг. 7А показывает эффект тройной комбинации «huN901-DM1 плюс леналидомид плюс низкая доза дексаметазона» на ксенотрансплантатах множественной миеломы MOLP-8.
Фиг. 7B представляет собой таблицу (табл.7a), где показаны данные.
Фиг. 8A показывает результаты иммуногистохимического анализа маркера апоптоза, каспазы-3 в ксенотрансплантатах множественной миеломы MOLP-8 после лечения тройной комбинацией «huN901-DM1 плюс леналидомид плюс низкая доза дексаметазона».
Фиг. 8B показывает статистически значимое синергическое увеличение апоптоза в клетках опухоли на ксенотрансплантатах множественной миеломы MOLP-8 после лечения тройной комбинацией huN901-DM1 с леналидомидом плюс низкая доза дексаметазона по сравнению с лечением любым из терапевтических средств отдельно.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии того, что введение как минимум одного конъюгата (например, иммуноконъюгата) и как минимум одного химиотерапевтического лекарственного средства (например, ингибитора протеасом, иммуномодулятора/антиангиогенного средства или алкилирующего ДНК средства), с необязательным дополнительным добавлением кортикостероида (дексаметазон) проявляет терапевтическую синергию или улучшает терапевтический индекс при лечении рака по сравнению применяемым отдельно иммуноконъюгатом, химиотерапевтическим средством, применяемым отдельно или в комбинации с другим химиотерапевтическим средством, без добавления иммуноконъюгата. Подходящие конъюгаты и химиотерапевтические средства описаны в данном описании.
Конъюгаты
Конъюгаты по настоящему изобретению включают как минимум одно терапевтическое средство, вызывающее гибель выбранных популяций клеток, связанное со связывающимся с клеткой агентом.
Терапевтическое средство, вызывающее гибель выбранных популяций клеток, - это предпочтительно антимитотическое средство. Антимитотические средства, которые известны в данной области, вызывают гибель клеток, препятствуя полимеризации тубулина и таким образом образованию микротрубочек. Любое антимитотическое средство, известное в данной области, может применяться в настоящем изобретении, в том числе, например, мейтанзиноиды, алкалоиды барвинка, доластатины, ауристатины, криптофицины, тубулизин и/или любое другое средство, которое вызывает гибель клеток, препятствуя полимеризации тубулина. Предпочтительно, антимитотическое средство представляет собой мейтанзиноид.
Агент, связывающийся с клетками, может быть каким-либо подходящим средством, которое связывается с клеткой, обычно и предпочтительно с животной клеткой (например, клеткой человека). Агент, связывающийся с клеткой, предпочтительно представляет собой пептид или полипептид. Подходящие агенты, связывающиеся с клетками, включают, например, антитела (например, моноклональные антитела и их фрагменты), лимфокины, гормоны, факторы роста, молекулы-носители питательных веществ (например, трансферрин). Ниже терапевтические средства, вызывающие гибель выбранных популяций клеток, и агенты, связывающиеся с клетками, которые могут быть частью иммуноконъюгата, описаны более подробно.
Мейтанзиноиды
Мейтанзиноиды, которые могут применяться в настоящем изобретении, хорошо известны в данной области и могут быть выделены из природных источников в соответствии с известными способами или получены синтетическим путем в соответствии с известными способами.
Примеры подходящих мейтанзиноидов включают мейтанзинол и аналоги мейтанзинола. Примеры подходящих аналогов мейтанзинола включают содержащие модифицированное ароматическое кольцо и содержащие модификации в других положениях.
Конкретные примеры подходящих аналогов мейтанзинола, содержащих модифицированное ароматическое кольцо, включают:
(1) C-19-дехлор (патент США 4256746) (полученный восстановлением анзамитоцина P2 с помощью ЛАГ);
(2) C-20-гидрокси (или C-20-дезметил)+/-C-19-дехлор (патенты США №№4361650 и 4307016) (полученный деметилированием с помощью Streptomyces или Actinomyces или дехлорированием с помощью ЛАГ); и
(3) C-20-дезметокси, C-20-ацилокси (-OCOR), +/-дехлор (патент США 4294757) (полученный ацилированием хлорангидридами кислот).
Конкретные примеры подходящих аналогов мейтанзинола, содержащих модификации в других положениях, включают:
2
2
5
(1) C-9-SH (патент США 4424219) (полученный реакцией мейтанзинола с HS или PS);
2
(2) C-14-алкоксиметил (дезметокси/СНOR) (патент США 4331598);
2
2
(3) C-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (CHOH или CHOAc) (патент США 4450254) (полученный из Nocardia);
(4) C-15-гидрокси/ацилокси (патент США 4364866) (полученный превращением мейтанзинола Streptomyces);
(5) C-15-метокси (патенты США №№4313946 и 4315929) (выделенный из Trewia nudifloráa);
(6) C-18-N-дезметил (патенты США №№4362663 и 4322348) (полученный дезметилированием мейтанзинола Streptomyces); и
(7) 4,5-дезокси (патент США 4371533) (полученный восстановлением мейтанзинола с помощью титана трихлорида/ЛАГ).
Синтез тиолсодержащих мейтанзиноидов, пригодных в соответствии с настоящим изобретением, полностью раскрыт в патентах США №№5208020, 5416064, 6333410, 7276497 и 7301019).
Ожидается, что будут пригодными все мейтанзиноиды, содержащие тиольный фрагмент в положении C-3, положение C-14, положение C-15 или положение C-20. Положение C-3 мейтанзинола является предпочтительным, и положение C-3 является особенно предпочтительным. Также предпочтительными являются мейтанзиноиды с содержащим N-метил-аланин C-3 тиольным фрагментом и мейтанзиноиды с содержащим N-метил-цистеин C-3 тиольным фрагментом, а также аналоги каждого из них.
Конкретные примеры производных мейтанзиноида с N-метил-аланин содержащим C-3 тиольным фрагментом, пригодных для настоящего изобретения, представлены формулами M1, M2, M3, M6 и M7.
где l равно целому числу от 1 до 10; и may представляет собой мейтанзиноид.
1
2
3
2
3
где R и R представляют собой H, CH или CHCH и могут быть одинаковыми или разными;
m равно 0, 1, 2 или 3; и
may представляет собой мейтанзиноид.
где n равно целому числу от 3 до 8; и
may представляет собой мейтанзиноид.
где l равно 1, 2 или 3;
0
Y представляет собой Cl или H; и
3
3
X представляет собой H или CH.
1
2
3
4
3
2
3
где R, R, R, R представляют собой H, CH или CHCH и могут быть одинаковыми или разными;
m равно 0, 1, 2 или 3; и
may представляет собой мейтанзиноид.
конкретные примеры производных мейтанзиноида с N-метил-цистеин содержащим C-3 тиольным фрагментом, пригодных для настоящего изобретения, представлены формулами M4 и M5.
где o равно 1, 2 или 3;
p равно целому числу от 0 до 10; и
may представляет собой мейтанзиноид.
где o равно 1, 2 или 3;
q равно целому числу от 0 до 10;
0
Y представляет собой Cl или H; и
3
3
X представляет собой H или CH.
Предпочтительные мейтанзиноиды описаны в Патентах США 5208020; 5416064; 6333410; 6441163; 6716821; RE 39151 и 7276497.
Алкалоиды барвинка (например, винкристин), соединения доластатина и соединения криптофицина подробно описаны в WO 01/24763. Ауристатины включают ауристатин E, ауристатин EB (АЕВ), ауристатин EFP (AEFP), монометилауристатин E (ММАЕ), описанные в патенте США №5635483, Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999); Molecular Cancer Therapeutics, vol. 3, No.8, pp.921-932 (2004); заявке США №11/134826. Публикациях США №№20060074008, 2006022925. Соединения тубулизина, описаны в публикации США №20050249740. Многие из средств, перечисленных под данным заголовком, могут также применяться в качестве химиотерапевтических средств, если они предназначены для такого применения.
Связывающиеся с клетками агенты
Связывающиеся с клетками агенты, применяемые в данном изобретении, представляют собой белки (например, иммуноглобулиновые и неиммуноглобулиновые белки), которые специфично связываются с целевыми антигенами на раковых клетках. Такие связывающиеся с клетками агенты включают следующее:
- антитела, в том числе:
- реставрированные антитела (патент США №5639641);
- гуманизированные или полностью человеческие антитела (гуманизированные или полностью человеческие антитела выбирают, не ограничиваясь ими, из huMy9-6, huB4, huC242, huN901, DS6, CD38, IGF-IR, CNTO 95, B-B4, трастузумаба, биватузумаба, сибротузумаба, пертузумаба и ритуксимаба (см., например, патенты США №№5639641, 5665357 и 7342110; Временную Патентную заявку США №60/424332, Международную Патентную заявку WO 02/16,401, Публикацию патента США №20060045877, Публикацию патента США №20060127407, Публикацию патента США №20050118183, Pedersen et al., (1994) J. Mol. Biol. 235, 959-973, Roguska et al., (1994) Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 91, 969-973, Colomer et al., Cancer Invest, 19: 49-56 (2001), Heider et al., Eur. J. Cancer, 3 IA: 2385-2391 (1995), Welt et al, J Clin. Oncol, 12: 1193-1203 (1994), и Maloney et al., Blood, 90:2188-2195 (1997).); и
2
- связывающиеся с эпитопом фрагменты антитела, такие как sFv, Fab, Fab', и F(ab') (Parham. J Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al, J Immunol. 113:470-478 (1974); Nisonoff et al, Arch. Biochem. Biophys. 89:230-244 (I960)).
Дополнительные связывающиеся с клетками агенты включают другие связывающиеся с клетками белки и полипептиды, например, не ограничиваясь ими:
- анкириновые повторяющиеся белки (DARPins; Zahnd et al., J Biol. Chem., 281, 46, 35167-35175, (2006); Binz, H.K., Amstutz, P. & Pluckthun, A. (2005) Nature Biotechnology, 23, 1257-1268) или анкирин-подобные повторяющиеся белки или синтетические пептиды, описанные, например, в Публикации патента США №20070238667: патенте США №7101675; WO/2007/147213; и WO/2007/062466);
- интерфероны (например, α, β, γ);
- лимфокины, например IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
- гормоны, например инсулин, ТВГ (тиреотропин-высвобождающий гормон), МСГ (меланоцитостимулирующий гормон), стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены; и
- факторы роста и колониестимулирующие факторы, такие как EGF, TGF-α, IGF-1, G-CSF, M-CSF и GM-CSF (Burgess, Immunology Today 5:155-158 (1984)).
Если связывающийся с клетками агент представляет собой антитело (например, одноцепочечное антитело, фрагмент антитела, который связывается с клеткой-мишенью, моноклональное антитело, одноцепочечное моноклональное антитело или фрагмент моноклонального антитела, химерное антитело, фрагмент химерного антитела, доменное антитело, фрагмент доменного антитела, реставрированное антитело, реставрированное одноцепочечное антитело или фрагмент реставрированного антитела, человеческое антитело или фрагмент человеческого антитела, гуманизированное антитело или реставрированное антитело, гуманизированное одноцепочечное антитело или фрагмент гуманизированного антитела), он связывается с антигеном, который является полипептидом и может быть трансмембранной молекулой (например, рецептором), или лигандом, таким как фактор роста. Примеры антигенов включают молекулы, такие как ренин; гормон роста, в том числе человеческий гормон роста и бычий гормон роста; фактор высвобождения гормона роста; гормон околощитовидной железы; тиреотропный гормон; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулотропный гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертываемости, такие как фактор vmc, фактор IX, тканевой фактор (TF) и фактор фон Виллебрандта; противосвертывающие факторы, такие как протеин C; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазминогена, такой как урокиназа или человеческая моча или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбазин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; фактор некроза опухоли альфа и бета; энкефалиназа; RANTES (регулируемый активацией, в норме экспрессируемый и секретируемый Т-клетками); человеческий воспалительный белок макрофагов (MIP-1-альфа); альбумин сыворотки, такой как человеческий альбумин сыворотки; ингибирующая субстанция Muellerian; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; мышиный гонадотропин-связанный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; ДНКаза; IgE; связанный цитотоксическими T-лимфоцитами антиген (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF); рецепторы гормонов или факторов роста; протеин A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как костный нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин -3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT4, NT-5, или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-β тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, в том числе TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста I и II (IGF-I и IGF-II); дес(1-3)-IGF-I (IGF-I мозга), белки, связывающиеся с инсулиноподобным фактором роста, EpCAM, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUC1, MUC16, STEAP, СЕА, TENB2, рецепторы EphA, рецепторы EphB, рецептор фолата, FOLR1, мезотелин, крипто, интегрин, VEGF, VEGFR, рецептор тарусферрина, IOTA1, IOTA2, IOТА3, IOTA4, IOTA5; белки CD, такие как CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80, CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138, CD152; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; морфогенетический белок кости (МБК); интерферон, например альфа-, бета- и гамма-интерферон; колониестимулирующие факторы (CSFS), например M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), например от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутаза; рецепторы T-клеток; белки поверхности мембраны; фактор ускорения распада; вирусный антиген, например часть конверта ВИЧ; белки-носители; хоминг-рецепторы; адрессины; регуляторные белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; связанные с опухолью антигены, например рецептор HER2, HER3 или HER4; и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов, антитело, имитирующее аднектины (заявка США 20070082365), или антитело, которое связывается с одним или больше связанными с опухолью антигенами или рецепторами поверхности клетки, раскрытое в Публикации США №20080171040 или: Публикации США №20080305044, включенных путем ссылки во всей их полноте.
Дополнительно, GM-CSF, который связывается с миелоидными клетками, может применяться в качестве агента, связывающегося с пораженными клетками при остром миелогенном лейкозе. IL-2, который связывается с активизированными T-клетками, может применяться для предотвращения отторжения трансплантата, для лечения и профилактики заболевания «трансплантат против хозяина», а также для лечения острого Т-клеточного лейкоза. MSH, который связывается с меланоцитами, может применяться для лечения меланомы. Фолиевая кислота может применяться для нацеливания на рецептор фолата, экспрессирующийся на опухолях яичника и других опухолях. Эпидермальный фактор роста может применяться для нацеливания на различные виды плоскоклеточного рака, такого как рак легкого и рак головы и шеи. Соматостатин может применяться для нацеливания на нейробластому и другие виды опухолей.
Для нацеливания на различные виды рака молочной железы и яичка может успешно служить эстроген (или аналоги эстрогена) или андроген (или аналоги андрогена), соответственно, в качестве связывающегося с клетками агента.
4
7
v
3
v
3
v
5
Предпочтительные антигены для антител, включенных в настоящее изобретение, включают белки CD, такие как CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CD11, CD14, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD70, CD79, CD80, CD81, CD103, CD105, CD134, CD137, CD138 и CD152; члены семейства рецептора ErbB, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, ЕрСАМ, интегрин альфа/бета и интегрин альфа/бета, в том числе его альфа или бета субъединицы (например, анти-CD11a, анти-CD18 или -CD11b антитела); факторы роста, такие как VEGF; тканевой фактор (TF); TGF-β; альфа-интерферон (альфа-IFN); интерлейкин, такой как IL-8; IgE; антигены группы крови Аро2, рецептор гибели; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (ОВ); рецептор mpl; CTLA-4; протеин C и т.д. Наиболее предпочтительными мишенями в соответствии с данным описанием являются IGF-IR, CanAg, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD138, CA6, Her2/neu, EpCAM, CRIPTO (белок, повышенные уровни которого вырабатываются в большинстве клеток рака молочной железы человека), дарпины, интегрин альфа/бета, интегрин альфа/бета, TGF-β, CD11a, CD18, Аро2 и С242 или антитело, которое связывается с одним или больше сопутствующих опухоли антигенов или рецепторов поверхности клетки, раскрытое в патенте США №20080171040 или Публикации США №20080305044, которые включены путем ссылки во всей их полноте.
4
7
v
3
v
3
v
5
Предпочтительные антигены для антител, включенных в настоящее изобретение, также включают белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, CD37, CD38, CD46, CD56 и CD138; члены семейства рецептора ErbB, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Macl, р150.95, VLA-4, ICAM-I, VCAM, ЕрСАМ, интегрин альфабета и интегрин альфа/бета, в том числе его альфа или бета субъединицы (например, анти-CD11a, анти-С018 или анти-CD11b антитела); факторы роста, такие как VEGF; тканевой фактор (TF); TGF-β; альфа-интерферон (альфа-IFN); интерлейкин, такой как IL-8; IgE; антигены группы крови: Аро2, рецептор гибели; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (ОВ); рецептор mpl; CTLA-4; протеин C и т.д. Наиболее предпочтительными мишенями в соответствии с данным описанием являются IGF-IR, CanAg, EphA2, MUC1, MUC16, VEGF, TF, CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD40, CD44, CD56, CD138, CA6, Her2/neu, EpCAM, CRIPTO (белок, повышенные уровни которого вырабатываются в большинстве клеток рака молочной железы человека), интегрин альфа/бета, интегрин альфа/бета, TGF-β, CD1a, CD18, Apo2 и C242.
Методы получения моноклональных антител позволяют продуцирование специфических связывающихся с клетками агентов в форме моноклональных антител. Особенно хорошо известные в данной области методы создания моноклональных антител, продуцированных путем иммунизации мышей, крыс, хомяков или любого другого млекопитающего целевым антигеном, таким как интактная клетка-мишень, антигены, выделенные из клетки-мишени, цельный вирус, анттенуированный цельный вирус и вирусные белки, такие как белки вирусной оболочки. Сенсибилизированные человеческие клетки также могут применяться. Другой способ создания моноклональных антител состоит в применении библиотек фага sFv (одноцепочечный вариабельный участок), конкретно, человеческого sFv (см., например, Griffiths et al., патент США №5885793; McCafferty et al., WO 92/01047; Liming et al, WO 99/06587).
Селекция подходящего связывающегося с клетками агента является вопросом выбора, который зависит от конкретной популяции клетки, которая должна служить мишенью, но в целом моноклональные антитела и их связывающиеся с эпитопом фрагменты предпочтительны, если подходящее антитело доступно.
Например, моноклональное антитело My9 представляет собой мышиное антитело IgG2a, специфичное в отношении антигена CD33, найденного на клетках острого миелоидного лейкоза (ОМЛ) (Roy et al. Blood 77:2404-2412 (1991)), и может применяться для лечения больных ОМЛ. Также, анти-В4 моноклональное антитело представляет собой мышиный IgGi, который связывается с антигеном CD19 на B-клетках (Nadler et al, J Immunol. 131:244-250 (1983)) и может применяться, если клетки-мишени представляют собой В-клетки или пораженные клетки, которые экспрессируют данный антиген, например при неходжкинской лимфоме или хроническом лимфобластном лейкозе. Антитело N901 представляет собой мышиное моноклональное антитело IgGi, которое связывается с CD56, найденным на клетках мелкоклеточной карциномы легкого и на клетках других опухолей нейроэндокринного происхождения (Roy et al. J Nat. Cancer Inst. 88:1136-1145 (1996)); huC242 представляет собой антитело, которое связывается с антигеном CanAg; трастузумаб представляет собой антитело, которое связывается с HER2/neu; и антитело против рецептора EGF связывается с рецептором EGF.
Химиотерапевтические средства
Лекарственные средства, которые могут применяться в настоящем изобретении, включают химиотерапевтические средства. "Химиотерапевтическое средство" представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения рака. Предпочтительные примеры химиотерапевтических средств представляют собой ингибиторы протеасом, иммуномодулирующие средства, антиангиогенные средства, алкилирующие средства или их комбинации.
Ингибиторы протеасом
2
Ингибиторы протеасом представляют собой лекарственные средства, блокирующие действие протеасом, клеточных комплексов, которые расщепляют белки. В одном из вариантов данного изобретения, ингибитор протеасом выбран из группы, включающей: a) природные ингибиторы протеасом, в том числе пептидные производные, содержащие С-концевую эпоксикетонную структуру, β-лактонные производные, аклациномицин A, лактацистин, кластолактацистеин; b) синтетические ингибиторы протеасом, в том числе модифицированные пептидные альдегиды, такие как N-карбобензокси-L-лейцинил-L-лейцинил-L-лециналь (также, обозначается MG132 или zLLL), или производные бороновой кислоты и MG232, N-карбобензокси-Leu-Nva-H (также обозначается MG115), N-ацетил-L-лейцинил-L-лейцинил-L-норлейциналь (также обозначается LLnL), N-карбобензокси-Ile-Glu(OBut)-Ala-Leu-H (также обозначается PS1); c) пептиды, содержащие α,β-эпоксикетонную структуру, винилсульфоны, такие как карбобензокси-L-лейцинил-L-лейцинил-L-лейцин-винил-сульфон или 4-гидрокси-5-йод-3-нитрофенилацетил-L-лейцинил-L-лейцинил-L-лейцин-винил-сульфон (NLVS); d) остатки глиоксаля или борной кислоты, такие как пиразил-СОNH(CHPhe)CONH(CHизобутил)B(OH) и дипептидильные производные борной кислоты; e) сложные эфиры пинакола, такие как сложный эфир бензилоксикарбонил(Cbz)-Leu-лейбор-Leu-пинакол. Ингибиторы протеасом, описанные в J Clin Pathol 116(5):637-646, 2001 или Заявке США №10/522706 (поданной 31 июля 2003 г.), также включены в контекст настоящего изобретения. В предпочтительном варианте ингибитор протеасом представляет собой PS-341/бортезомиб (Velcade™).
Иммуномодулирующие средства
Под "иммуномодулирующим(и) лекарственным(и) средством(ами)" подразумеваются, например, средства, которые воздействуют на иммунную систему, непосредственно или косвенно, например, стимулируя или угнетая клеточную активность; клеток иммунной системы, например T-клеток, B-клеток, макрофагов или презентующих антиген клеток (APC), или воздействуя на компоненты за пределами иммунной системы, что, в свою очередь, стимулирует, угнетает или модулирует иммунную систему, например гормоны, агонисты или антагонисты рецепторов и нейромедиаторы; иммуномодуляторы могут быть, например, иммуносупрессантами или иммуностимуляторами. Под "противовоспалительными лекарственными средствами" подразумеваются, например, средства, которые лечат воспалительные реакции, т.е. реакцию ткани на повреждение, например средства, которые лечат иммунную, сосудистую или лимфатическую систему.
Противовоспалительные или иммуномодулирующие лекарственные средства или агенты, подходящие для применения в данном изобретении, включают, не ограничиваясь ими, производные интерферона, например бетасерон, β-интерферон; производные простана, например соединения, раскрытые в PCT/DE93/0013, например илопрост, цикапрост; глюкокортикоиды, например кортизол, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазон; иммуносупрессивные средства, например циклоспорин, FK-506, метоксален, талидомид, сульфасалазин, азатиоприн, метотрексат; ингибиторы липоксигеназы, например зилейтон, МК-886, WY-50295, SC-45662, SC-41661A, BI-L-357; антагонисты лейкотриена, например соединения, раскрытые в DE 40091171 патентной заявке Германии Р42 42 390.2; WO 9201675; SC-41930; SC-50605; SC-51146; LY 255283 (D.K.Herron et al., FASEB J. 2: Abstr. 4729, 1988); LY 223982 (D.M.Gapinski et al. J. Med. Chem. 33: 2798-2813, 1990); U-75302 и аналоги, например, описанный J. Моррис et al., Tetrahedron Lett. 29:143-146, 1988, С.E.Burgos et al., Tetrahedron Lett. 30: 5081-5084, 1989; B.M.Taylor et al., Prostaglandins 42: 211-224, 1991; соединения, раскрытые в патенте США №5019573; ONO-LB-457 и аналоги, например, описанные K.Kishikawa et al., Adv. Prostagl. Thombox. Leucotriene Res. 21:407-410, 1990; M. Konno et al., Adv. Prostagl. Thrombox. Leucotriene Res. 21:411-414, 1990; WF-11605 и аналоги, например, раскрытые в патенте США №4963583; соединения, раскрытые в WO 9118601, WO 9118879; WO 9118880, WO 9118883, противовоспалительные вещества, например, NPC 16570, NPC 17923, описанный L. Noronha-Blab. et al, Gastroenterology 102 (Suppl.): 672, 1992; NPC 15669 и аналоги, описанные R.M.Burch et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:355-359, 1991; S.Pou et al., Biochem. Pharmacol. 45: 2123-2127, 1993; производные пептидов, например АКТГ и аналоги; растворимые TNF-рецепторы; TNF-антитела; растворимые рецепторы интерлейкинов, другие цитокины, белки T-клеток; антитела против рецепторов интерлейкинов, другие цитокины и белки T-клеток. Дополнительные примеры иммуномодулирующих средств включают, не ограничиваясь ими, метотрексат, лефлуномид, циклофосфамид, циклоспорин и антибиотики (например, макролйд FK506 (такролимус)), метилпреднизолон (MP), кортикостероиды, стероиды, микофенолят мофетил, рапамицин (ситолимус), мизорибин, дезоксиспергуалин, бреквинар, малононитриламиды (например, лефлуномид), модуляторы рецептора T-клеток и модуляторы рецепторов цитокинов. Более подробно о модуляторах рецепторов T-клеток и модуляторах рецепторов цитокинов см. раздел 3.1. Примеры модуляторов рецепторов T-клеток включают, не ограничиваясь ими, антитела против рецепторов T-клеток (например, моноклональные анти-CD4 антитела, моноклональные анти-CD3 антитела, моноклональные анти-CD8 антитела, моноклональные антитела против лиганда CD40, моноклональные анти-CD2 антитела) и CTLA4-иммуноглобулин. Примеры модуляторов рецепторов цитокинов включают, не ограничиваясь ими, растворимые рецепторы (например, внеклеточный домен рецептора TNF-альфа или его фрагмент, внеклеточный домен рецептора IL-6 или его фрагмент), цитокины или их фрагменты (например, интерлейкин (IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-11, IL-12, IL-15, TNF-альфа, интерферон (IFN)-альфа, IFN-бета, IFN-гамма и GM-CSF), антитела против рецепторов цитокинов (например, антитела против рецептора IL-2, антитела против рецептора IL-4, антитела против рецептора IL-6, антитела против рецептора IL-10, антитела против рецептора IL-12), антитела против цитокинов (например, антитела против рецептора IFN, антитела против TNF-альфа, антитела против IL-1β, антитела против IL-6 и антитела против IL-12). Средства, перечисленные в патентной заявке США №11/454559 (поданной 16 июня 2006 г.). Предпочтительные иммуномодулирующие лекарственные средства представляют собой такие, которые эффективны для лечения множественной миеломы, онкологических заболеваний, поражающих кровь, плазму или костную ткань. В предпочтительном варианте, иммуномодулирующее средство выбрано из талидомида (Thalomid) и леналидомида (Revlimid).
Антиангиогенные средства
Антиангиогенные средства включают, не ограничиваясь ими, ингибиторы рецепторной тирозинкиназы (RTKi), описанные более подробно в патентной заявке США №№11/612744 (поданной 19 декабря 2006 г.) или 10/443254 (поданной 22 мая 2003 г.); ангиостатические кортизены; ингибиторы ММР; ингибиторы интегрина; антагонисты PDGF; антипролиферативные средства; ингибиторы HIF-1; ингибиторы фактора роста фибробластов; ингибиторы эпидермального фактора роста; ингибиторы TIMP; ингибиторы инсулиноподобного фактора роста; ингибиторы TNF; антисмысловые олигонуклеотиды; анти-VEGF антитело, ловушку VEGF, НПВП, стероиды, SiRNA и т.п., и пролекарства любого из вышеупомянутых средств. Другие средства, которые будут пригодны в композициях и способах по изобретению, включают анти-VEGF антитело (т.е. бевацизумаб или ранибизумаб); ловушку VEGF; молекулы siRNA, или их смесь, нацеленную как минимум из 2 рецепторных тирозинкиназы; глюкокортикоиды (т.е. дексаметазон, фторметалон, медризон, ацетонид бетаметазон, триамцинолон, триамцинолон, преднизон, преднизолон, гидрокортизон, римексолон и их фармацевтически приемлемые соли, предникарбат, дефлазакорт, галометазон, тиксокортол, преднилиден (21-диэтиламиноацетат), преднивал, параметазон, метилпреднизолон, мепреднизон, мазипредон, изофлупредон, галопредона ацетат, галцинонид, формокортоал, флурандренолид, флупреднизолон, флупреднидина ацетат, флуперолона ацетат, фторкортолон, флуокортин бутил, флуоцинонид, флуоцинолон ацетонид, флунизолид, флуметазон, флудрокортизон, флуклоринид, эноксолон, дифлупреднат, дифлукортолон, дифлоразона диацетат, дезоксиметазон, десонид, десцинолон, кортивазол, кортикостерон, кортизон, клопреднол, клокортолон, клобетазон, клобетазол, хлорпреднизон, кафестол, будесонид, беклометазон, амцинонид, аллопрегнан ацетонид, алклометазон, 21-ацетоксипрегненолон, тралонид, дифлоразона ацетат, дезацилкортивазол, RU-26988, будесонид и дезацилкортивазол оксетанон); нафтогидрохиноновые антибиотики (т.е. рифампицин); и НПВП (т.е. непафенак, амфенак). В предпочтительном варианте, антиангиогенное средство выбирают из талидомида (Thalomid) и леналидомида (Revlimid). Многие из антиангиогенных средств, такие как леналидомид и талидомид, также действуют как иммуномодулирующие средства, т.е. они обладают двойным механизмом действия.
Алкилирующие средства
Алкилирующие ДНК средства или алкилирующие ДНК агенты действуют, повреждая ДНК. Повреждение ДНК может быть достигнуто с помощью любого из следующих механизмов. В первом механизме алкилирующий агент присоединяет алкильные группы к основаниям ДНК. Такая модификация приводит к фрагментации ДНК ремонтными ферментами в попытке заменить алкилированные основания. Второй механизм, по которому алкилирующие агенты повреждают ДНК, представляет собой образование перекрестных мостиков, связей между атомами в ДНК. В ходе данного процесса два основания связываются вместе алкилирующим агентом, который содержит два сайта связывания с ДНК. Перекрестная связь препятствует отделению ДНК для синтеза или транскрипции. Третий механизм действия алкилирующих агентов вызывает неправильное спаривание нуклеотидов, ведущее к мутациям.
Существует 6 групп алкилирующих средств: средства на основе ипритного азота; этиленимы; алкилсульфонаты; триазены; пиперазины и производные нитромочевины. Примеры алкилирующих средств включают, не ограничиваясь ими, тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN™); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, кармустин, метуредофа и уредофа; этиленимины и метиламеламины, в том числе альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтиленфосфорамидтиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (в том числе, синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; CC-1065 (в том числе его синтетические аналоги адоцелезин, карцелезин и бицелезин); криптофицины (особенно криптофицин 1 и криптофицин 8). Предпочтительные алкилирующие средства выбраны из мелфалана и циклофосфамида.
Кортикостероиды
Кортикостероиды представляют собой лекарственные средства, родственные кортизолу, природному гормону, который вырабатывается корой надпочечников (внешний слой надпочечника). Кортикостероидные лекарственные средства включают бетаметазон (Celestone), будесонид (Entocort EC), кортизон (Cortone), дексаметазон (Decadron), гидрокортизон (Cortef), метилпреднизолон (Medrol), преднизолон (Prelone), преднизон (Deltasone) и триамцинолон (Kenacort, Kenalog). Предпочтительным кортикостероидом является дексаметазон (в том числе производные, такие как, не ограничиваясь ими, дексаметазона натрия фосфат и дексаметазона ацетат). Кортикостероиды могут быть введены перорально, внутривенно или внутримышечно, нанесены в определенном месте на кожу или введены прямой инъекцией (например, в воспаленные суставы). Кортикостероиды могут применяться в сочетании с другими лекарственными средствами и их назначают для краткосрочного и длительного применения (например, в форме пульс-терапии, когда препарат вводят в течение короткого периода времени, повторяя введение с определенными промежутками). Рекомендуемая доза кортикостероидов может варьировать от 0,5 до 100 мг/сутки. Например, дексаметазон может быть назначен в интервале доз от 0,5 до 100 мг/сутки, более предпочтительно, от 10 до 80 мг/сутки, даже более предпочтительно, от 15 до 70 мг/сутки или, наиболее предпочтительно, от 20 до 60 мг/сутки для введения в тот же день или в другие дни, например в дни 9-12 и 17-20 каждого 28-дневного цикла для первых 4 циклов терапии, и затем 40 мг/сутки перорально в дни 1-4 каждые 28 дней. Схема введения может сохраняться или быть изменена на основе клинических и лабораторных данных. Например, изначально достаточно высокая доза затем может быть постепенно сведена на нет, или наоборот, или вначале может быть назначена более высокая или более низкая доза, чем рекомендованная, причем доза может зависеть от массы тела пациента-млекопитающего (например, человека).
Конъюгаты лекарственных средств могут быть получены биохимическими методами. Для конъюгации лекарственного средства или пролекарства с антителом используется линкерная группа. Подходящие линкерные группы хорошо известны в данной области и включают дисульфидные группы, чувствительные к действию кислот группы, фоточувствительные группы, чувствительные к пептидазе группы, тиоэфирные группы и чувствительные к эстеразе группы. Предпочтительные линкерные группы представляют собой дисульфидные и тиоэфирные группы. Например, конъюгат может быть сконструирован с применением реакции обмена дисульфида между соответствующим образом модифицированным антителом и лекарственным средством или пролекарством, или реакцией тиолсодержащего лекарственного средства с модифицированным антителом, содержащим малеинимидогруппу. Альтернативно, лекарственное средство может содержать малеинимидогруппу, в антитело - тиольный фрагмент. Способы получения конъюгатов описаны в данной области (см. патенты США 5208030; 5416064; 6333410; 6441163; 6716821; 6913748; 7276497 и Заявку США №2005/0169933. Молекулы лекарственного средства также могут быть связаны с агентом, связывающимся с клетками, через посредника - молекулу-носитель, такую как альбумин сыворотки.
В соответствии с изобретением, связывающийся с клетками агент модифицируют путем реакции бифункционального поперечно-сшивающего реагента со связывающимся с клетками агентом, что приводит к ковалентному присоединению линкерной молекулы у агенту, связывающемуся с клетками. В данном описании, "бифункциональный поперечно-сшивающий реагент" представляет собой какой-либо химический фрагмент, который ковалентно присоединяет агент, связывающийся с клетками, к лекарственному средству, такому как лекарственные средства, описанные в данном описании. В предпочтительном варианте изобретения, часть линкерного фрагмента обеспечивается лекарственным средством. В данном отношении лекарственное средство включает линкерный фрагмент, который является частью большей молекулы-линкера, используемой для присоединения связывающегося с клетками агента, к лекарственному средству. Например, для образования мейтанзиноида DM1 или DM4 боковую цепь эфира в положении C-3 мейтанзина модифицируют таким образом, чтобы она содержала свободную сульфгидрильную группу (SH), как описано в патентах США 5208020; 6333410; 7276497. Данная тиолированная форма мейтанзина может реагировать с модифицированным агентом, связывающимся с клетками, с образованием конъюгата. Таким образом, конечный линкер ассемблирован от двух компонентов, один из которых обеспечивается поперечно-сшивающим реагентом, в то время как другой обеспечивается боковой цепью DM1 или DM4.
Любой подходящий бифункциональный поперечно-сшивающий реагент может применяться в связи с изобретением до тех пор, пока линкерный реагент обеспечивает сохранение терапевтических, например цитотоксичность, и нацеливающих характеристик лекарственного средства и связывающегося с клетками агента, соответственно. Предпочтительно, молекула линкера присоединит лекарственное средство к связывающемуся с клетками агенту химическими связями (как изложено выше) таким образом, что лекарственное средство и связывающийся с клетками агент химически связываются (например, ковалентной связью) друг с другом. Предпочтительно, линкерный реагент представляет собой расщепляемый линкер. Более предпочтительно, линкер расщепляется в мягких условиях, т.е. существующих в пределах клетки условиях, которых не влияют па активность лекарственного средства. Примеры подходящих расщепляемых линкеров включают дисульфидные линкеры, чувствительные к действию кислот линкеры, фоточувствительные линкеры, чувствительные к пептидазе линкеры, тиоэфирные линкеры и чувствительные к эстеразе линкеры. Дисульфидсодержащие линкеры, представляют собой линкеры, расщепляемые через обмен дисульфида, который может происходить в физиологических условиях. Чувствительные к действию кислоты линкеры представляют собой линкеры, расщепляемые при кислых значениях pH. Например, определенным внутриклеточным отсекам, таким как эндосомы и лизосомы, присущи кислые значения pH (pH 4-5), где обеспечиваются условия, подходящие для расщепления чувствительных к действию кислот линкером. Фоточувствительные линкеры пригодны для применения на поверхности тела и во многих полостях тела, которые доступны для освещения. К тому же, инфракрасный свет может проникать в ткани. Чувствительные к пептидазе линкеры могут применяться для расщепления определенных пептидов внутри или за пределами клеток (см., например, Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. США, 79: 626-629 (1982), и Umemoto et al., Int. J. Cancer, 43: 677-684 (1989)).
Предпочтительно, лекарственное средство связано со связывающимся с клетками агентом посредством дисульфидной связи или тиоэфирной связи. Молекула линкера включает реакционноспособную химическую группу, которая может реагировать со связывающимся с клетками агентом. Предпочтительные реакционноспособные химические группы для реакции со связывающимся с клетками агентом представляют собой N-сукцинимидильные эфиры и N-сульфосукцинимидильные эфиры. Дополнительно, молекула линкера включает реакционноспособную химическую группу, предпочтительно дитиопиридильную группу, которая может реагировать с лекарственным средством с образованием дисульфидной связи. Особенно предпочтительные линкерные молекулы включают, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) (см., например, Carlsson et al., Biochem. J., 173: 723-737 (1978)), H-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноат (SPDB) (см., например, патент США 4563304), N-сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноат (SPP) (см., например, регистрационный номер CAS 341498-08-6), и другие реакционноспособные поперечно-сшивающие линкеры, которые описаны в патенте США 6913748, включенном в данное описание путем ссылки во всей его полноте.
Хотя расщепляемые линкеры предпочтительно используются в способе по изобретению, нерасщепляемый линкер также может использоваться для получения вышеописанного конъюгата. Нерасщепляемый линкер представляет собой какой-либо химический фрагмент, который способен связывать лекарственное средство, например мейтанзиноид, алкалоид барвинка, доластатин, ауристатин или криптофицин, со связывающимся с клетками агентом стабильной, ковалентной связью. Таким образом, нерасщепляемые линкеры в существенной мере устойчивы к вызванному кислотой расщеплению, вызванному светом расщеплению, вызванному пептидазой расщеплению, вызванному эстеразой расщеплению и расщеплению дисульфидной связи, в условиях, при которых лекарственное средство или связывающийся с клетками агент остается активным.
Подходящие поперечно-сшивающие реагенты, которые образуют нерасщепляемые линкеры между лекарственным средством и связывающимся с клетками агентом, хорошо известны в данной области. Примеры нерасщепляемых линкеров включают линкеры, содержащие фрагмент N-сукцинимидильного эфира или N-сульфосукцинимидильного эфира для реакции со связывающимся с клетками агентом, а также фрагмент на основе малеинимидо или галогенацетила для реакции с лекарственным средством. Поперечно-сшивающие реагенты, содержащие фрагмент на основе малеинимидо, включают N-сукцинимидил-4-(малеинимидометил) циклогексанкарбоксилат (SMCC), N-сукцинимидил-4-(N-малеинимидометил)-циклогексан-1-карбокси-(6-амидокапроат), который является "длинноцепочечным" аналогом SMCC (LC-SMCC), N-сукцинимидный эфир κ-малеинимидоундекановой кислоты (KMUA), N-сукцинимидный эфир γ-малеинимидомасляной кислоты (GMBS), N-гидроксисукцинимидный эфир ε-малеинимидокапроновой кислоты (EMCS), м-малеинимидобензоил-N-гидроксисукцинимидный эфир (MBS), N-(α-малеинимидоацетокси)-суцинимидный эфир (AMAS), сукцинимидил-6-β-малеинимидопропионамидо)гексаноат (SMPH), N-сукцинимидил-4-(β-малеинимидофенил)-бутират (SMPB) и N-(n-малеинимидофенил)изоцианат (PMPI). Поперечно-сшивающие реагенты, содержащие фрагмент на основе галогенацетила, включают пропионат-N-сукцинимидил-4-(йодацетил)-аминобензоат (SIAB), N-сукцинимидилйодацетат (SIA), N-сукцинимидилбромацетат (SBА) и N-сукцинимидил-3-(бромацетамидо) (SBАР).
Другие поперечно-сшивающие реагенты, в которых отсутствует атом серы и которые образуют нерасщепляемые линкеры, также могут использоваться в способе по изобретению. Такие линкеры могут быть получены из фрагментов на основе дикарбоновой кислоты. Подходящие фрагменты на основе дикарбоновой кислоты включают, не ограничиваясь ими, α,ω-дикарбоновые кислоты общей формулы (IX):
,
где X представляет собой линейный или разветвленную алкильную, алкенильную или алкинильную группу, содержащую 2-20 атомов углерода, Y представляет собой циклоалкильную или циклоалкенильную группу, содержащую 3-10 атомов углерода, Z представляет собой замещенную или незамещенную ароматическую группу, содержащую 6-10 атомов углерода, или замещенную или незамещенную гетероциклическую группу, где гетероатом выбран из N, O или S, и где каждый из 1, m и n равен 0 или 1, при условии, что в то же время не все из 1, m и n равны 0.
Многие из нерасщепляемых линкеров, раскрытых в данном описании, описаны подробно в патентной заявке США №10/960602. Другие линкеры, которые могут применяться в настоящем изобретении, включают заряженные линкеры или гидрофильные линкеры и описаны в патентных заявках США №№12/433604 и 12/433668, соответственно.
Альтернативно, как раскрыто в патенте США 6441163 B1, лекарственное средство может быть сначала модифицировано для введения реакционноспособного эфира, пригодного для реакции со связывающимся с клетками агентом. Реакция таких мейтанзиноидов, содержащих активизированный фрагмент линкера, со связывающимся с клетками агентом представляет другой способ получения расщепляемого или нерасщепляемого конъюгата мейтанзиноида со связывающимся с клетками агентом.
Иммуноконъюгаты и химиотерапевтические средства по настоящему изобретению можно вводить in vitro, in vivo и/или ex vivo для лечения больных и/или модуляции роста выбранных популяций клеток, включая, например, рак легкого, крови, плазмы, молочной железы, колоноректальной области, предстательной железы, почки, поджелудочной железы, мозга, кости, яичника, яичка и лимфатических органов; аутоиммунные заболевания, такие как системная волчанка, ревматоидный артрит и рассеянный склероз; отторжение трансплантата, например отторжение почечного трансплантата, отторжение печеночного трансплантата, отторжение легочного трансплантата, отторжение сердечного трансплантата и отторжение трансплантата костного мозга; болезнь «трансплантат против хозяина»; вирусные инфекции, такие как инфекция ЦМВ, ВИЧ-инфекция и СПИД; и паразитарные инвазии, такие как гиардиаз, амебиаз, шистосомиаз и т.п. Предпочтительно, иммуноконъюгаты и химиотерапевтические средства по изобретению вводят in vitro, in vivo и/или ex vivo для лечения рака у больного и/или модуляции роста раковых клеток, в том числе, например, рака крови, плазмы, легкого, молочной железы, колоноректальной области, предстательной железы, почки, поджелудочной железы, мозга, кости, яичника, яичка и лимфатических органов; предпочтительно, раковые клетки представляют собой клетки рака молочной железы, клетки рака предстательной железы, клетки рака яичника, клетки рака колоноректальной области, клетки множественной миеломы, клетки рака яичника, клетки нейробластомы, клетки рака нейроэндокринной системы, клетки рака желудка, клетки плоскоклеточного рака, клетки мелкоклеточного рака легкого, или клетки рака яичника или их комбинацию.
"Модулирование роста выбранных популяций" клеток включает подавление пролиферации выбранных популяций клеток множественной миеломы (например, клетки: MOLP-8, клетки ОРМ2, клетки Н929 и т.п.), препятствуя образованию большего количества клеток; снижение степени увеличения скорости деления клеток по сравнению, например, с клетками в отсутствие лечения; индуцирование гибели выбранных популяций клеток; и/или подавление метастазирования выбранных популяций клеток (например, раковых клеток). Рост выбранных популяций клеток может модулироваться in vitro, in vivo или ex vivo.
В способах по настоящему изобретению, иммуноконъюгаты и химиотерапевтические средства могут вводиться in vitro, in vivo или ex vivo no отдельности или как компоненты одной композиции. Комбинированное введение включает сопутствующее введение с применением отдельных препаратов или единого фармацевтического препарата и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно присутствует период времени, в течение которого оба (или все) активные средства одновременно проявляют свою биологическую активность. Предпочтительно, такая комбинированная терапия приводит к синергическому терапевтическому эффекту. Противораковые лекарственные средства, которые можно вводить, включают алкилирующие ДНК средства, такие как мелфалан; ингибитор протеасом, такой как бортезомиб (Velcade); и иммуномодулирующие или антиангиогенные средства, такие как талидомид и леналидомид (Revlimid), наряду с кортикостероидом дексаметазоном. Таким образом, например, конъюгат антитело-мейтанзиноид может сочетаться только с одним из химиотерапевтических средств, перечисленных выше, или с комбинацией двух или больше химиотерапевтических средств, перечисленных выше. Например, конъюгат антитело-мейтанзиноид может сочетаться с бортезомибом и леналидомидом или талидомидом с добавлением дексаметазона или без него. Также конъюгат антитело-мейтанзиноид может сочетаться с мелфаланом и бортезомибом или леналидомидом с добавлением дексаметазона или без него. Порядок введения и дозы для каждого средства легко специалистом в данной области с использованием одобренной схемы введения для отдельных средств (см., например, Physicians Desk Reference, (PDR) 2006, где раскрыты предпочтительные дозы и схемы лечения для талидомида (стр.979-983), Velcade (стр.2102-2106) и мелфалана (стр.976-979)).
Иммуноконъюгаты и химиотерапевтические средства могут применяться с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и/или вспомогательными веществами, которые хорошо известны и могут быть определены специалистом в данной области в соответствии с требованиями клинической ситуации. Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или вспомогательных веществ включают: (1) буферизованный фосфатом солевой раствор Дульбекко, pH приблизительно 6.5, который содержит около 1-25 мг/мл альбумина человеческой сыворотки, (2) 0.9% мас./об. раствор натрия хлорида (NaCl) и (3) 5% мас./об. раствор глюкозы.
Соединения и композиции, описанные в данном описании, могут вводиться в подходящей форме, предпочтительно парентерально, более предпочтительно внутривенно. Для парентерального введения, соединения или композиции могут представлять собой водные или неводные стерильные растворы, суспензии или эмульсии. Пропиленгликоль, масла и инъекционные органические эфиры, такие как этилолеат, могут применяться в качестве растворителя или носителя. Композиции могут также содержать адъюванты, эмульгаторы или диспергирующие вещества.
Композиции могут также существовать в форме стерильных твердых композиций, которые могут быть растворены или диспергированы в стерильной воде или любой другой стерильной среде для инъекций.
"Терапевтически эффективное количество" химиотерапевтических средств и иммуноконъюгатов, описанных в данном описании, ссылается на схему лечения для подавления пролиферации выбранных популяций клеток и/или лечения заболевания больного, и выбирается в соответствии с учетом разнообразных факторов, в том числе возраст, масса тела, пол, рацион и медицинское состояние больного, тяжесть заболевания, способ введения и фармакологические соображения, такие как активность, эффективность, фармакокинетический и токсикологический профиль конкретного применяемого соединения. "Терапевтически эффективное количество" может также быть определено со ссылкой на стандартные медицинские тексты, например Physicians Desk Reference 2004. Пациент предпочтительно является животным, более предпочтительно млекопитающим, наиболее предпочтительно человеком. Пол пациента может быть мужским или женским, и пациент может быть младенцем, ребенком или взрослым человеком.
Примеры подходящих протоколов введения иммуноконъюгатов приведены ниже. Иммуноконъюгаты могут вводиться ежедневно в течение приблизительно 5 дней или в виде в/в болюса ежедневно в течение приблизительно 5 дней, или в виде непрерывной инфузии в течение приблизительно 5 дней.
Альтернативно, иммуноконъюгаты можно вводить 1 раз в неделю в течение 6 недель или дольше. В качестве другой альтернативы, иммуноконъюгаты можно вводить 1 раз каждые две или три недели. Дозы в виде болюса вводят в объеме от приблизительно 50 мл до приблизительно 400 мл нормального солевого раствора, к которому может быть прибавлено от приблизительно 5 мл до приблизительно 10 мл альбумина человеческой сыворотки. Методом непрерывной инфузии препарат вводят в объеме от приблизительно 250 мл до приблизительно 500 мл нормального солевого раствора, может быть прибавлено от приблизительно 25 мл до приблизительно 50 мл альбумина человеческой сыворотки, на протяжении 24 часов. Дозы будут составлять от приблизительно 10 пг до приблизительно 1000 мг/кг на человека, в/в (интервал от приблизительно 100 нг до приблизительно 10 мг/кг).
Через 1-4 недели после лечения пациент может получить второй курс лечения. Конкретные клинические протоколы относительно способа введения, вспомогательных веществ, разбавителей, доз и времени введения могут быть определены специалистом в соответствии с требованиями клинической ситуации.
В настоящем изобретении также предлагаются фармацевтические наборы, содержащие один или больше контейнеров, наполненных одним или больше ингредиентов фармацевтических соединений и/или композиций по настоящему изобретению, в том числе один или больше иммуноконъюгатов и одно или больше. химиотерапевтических средств. Такие наборы могут также включать, например, другие соединения и/или композиции, устройство(а) для введения соединений и/или композиций и письменные инструкции в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов или биологических продуктов.
Противораковые терапевтические средства и их дозы, способы введения и рекомендуемое применение известны в данной области и описаны в такой литературе как Physician's Desk Reference (PDR). В PDR раскрыты дозы средств, которые применяются в лечении различных видов рака. Терапевтически эффективные схемы лечения и дозы вышеупомянутых химиотерапевтических лекарственных средств будет зависеть от конкретного вида рака, подлежащего лечению, тяжести заболевания и других факторов, знакомых врачу-специалисту в данной области, и могут быть определены врачом. Содержание PDR явно включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте. В издании Physician's Desk Reference (PDR) 2006 г. раскрыт механизм действия, предпочтительные схемы лечения и дозы для талидомида (стр.979-983), Velcade (стр.2102-2106) и мелфалана (стр.976-979). Содержание PDR явно включено в данное описание путем ссылки во всей его полноте. Специалист в данной области может пересмотреть данные PDR, используя один или больше следующих параметров, чтобы определить схему лечения и дозы химиотерапевтических средств и конъюгатов, которые могут применяться в соответствии с раскрытием данного изобретения. Такие параметры включают:
1. Исчерпывающий указатель:
а) по производителю;
б) по продуктам (название компании или торговое название лекарственного средства);
в) индекс категории (например, «ингибиторы протеасом», «алкилирующие ДНК средства», «мелфалан» и т.д.;
д) индекс генерических/химических названий (общеизвестные непатентованные названия лекарственных средств).
2. Цветные изображения медикаментов.
3. Информация о продукте, согласованная с маркировкой FDA:
а) химическая информация;
б) функция/действие;
в) показания и противопоказания;
д) клинические исследования, побочные эффекты, предупреждения.
Аналоги и производные
Специалисту в данной области терапевтических средств, таких как цитотоксические средства или химиотерапевтические средства, легко будет понятно, что каждое из таких средств, описанных в данном описании, может быть модифицировано таким образом, что полученное соединение сохраняет специфичность и/или активность исходного соединения. Квалифицированному специалисту также будет понятно, что многие из этих соединений могут применяться вместо терапевтических средств, описанных в данном описании. Таким образом, терапевтические средства по настоящему изобретению включают аналоги и производные соединений, описанных в данном описании.
Все ссылки, цитируемые в данном описании и приведенных ниже примерах, явно включены путем ссылки во всей их полноте.
Примеры
Изобретение далее будет описано со ссылкой на неограничивающие примеры. Если не определено иное, все проценты и соотношения приведены по объему.
3
Мышам были привиты линии опухолевых клетки множественной миеломы человека; опухолям давали прижиться (средний размер опухоли приблизительно 100 мм) до лечения. Дозы конъюгатов были описаны на основе концентрации DM1. Эффективность выражали как % роста леченной опухоли против контроля (% T/C) и логарифм гибели клеток (LCK), определенные на основе периода увеличения опухоли вдвое и задержки роста опухоли в результате лечения. Считалось, что процентные значения T/C меньше 42% и/или значения LCK 0,5 или больше указывают на активность; процентные значения T/C меньше 10% рассматривались как указывающие на высокую активность (Bissery et al., Cancer Res, 51: 4845-4852 (1991).
Пример 1. Противоопухолевый эффект комбинированной терапии ксенотрансплантатов множественной миеломы человека (MOLP-8) huN901-DM1 и мелфаланом
7
3
Противоопухолевый эффект комбинации huN901-DMl и мелфалана оценивали на модели прижившегося подкожного ксенотрансплантата множественной миеломы. Голым мышам Balb/c (20 животных) были привиты клетки множественной миеломы человека MOLP-8 (1×10 клеток/животное) путем подкожной инъекции в правое плечо мыши. Когда размер опухолей достигал приблизительно 150 мм (через 21 день после введения опухолевых клеток), мыши были случайным образом распределены на четыре группы (по 5 животных в группе). Первая группа мышей получала huN901-DM1 внутривенно (доза DM1 200 мкг/кг, единичная инъекция, 22-й день после введения опухолевых клеток). Вторая группа животных получала мелфалан интраперитонеально (12 мг/кг, единичная инъекция, 23-й день после введения опухолевых клеток). Третья группа мышей получала комбинацию huN901-DM1 и мелфалана с применением таких же доз, схем и путей введения, как в группах 1 и 2. Контрольная группа животных получала буферизованный фосфатом солевой раствор (ФБР) с применением таких схем и путей введения, как в группах 1 и 2. Рост опухолей контролировали, измеряя размер опухоли дважды в неделю. Размер опухоли вычисляли по формуле
длина × ширина × высота × ½
Данные роста опухолей показаны на фиг.1A. В контрольной группе животных размер опухолей достигал 1000 мм приблизительно за 33 дня. Лечение huN901-DM1 или мелфаланом по отдельности приводило к задержке роста опухолей 11 дней и 14 дней соответственно. И наоборот, лечение комбинацией мелфалана и huN901-DM1 приводило к задержке роста опухолей 35 дней, причем комбинация продемонстрировала высокую активность согласно стандартам NCI (T/C=4%, см. табл.1 (фиг.1B)).
Логарифм гибели клеток (LCK) в результате комбинированной терапии составил 2,1, что превышает сумму значений LCK для отдельных лекарственных средств, указывая на синергическую активность.
Пример 2. Влияние противоопухолевой комбинированной терапии huN901-DM1 и талидомидом на ксенотрансплантаты множественной миеломы человека (MOLP-8)
7
3
Противоопухолевый эффект комбинации huN901-DM1 и талидомида оценивали на модели прижившегося подкожного ксенотрансплантата множественной миеломы. Мышам SCID (36 животных) были привиты клетками множественной миеломы человека MOLP-8 (1×10 клеток/животное) путем подкожной инъекции в правое плечо мыши. Когда размер опухолей достигал около 150 мм (через 15 дней после введения опухолевых клеток), мыши были случайным образом распределены на 6 групп (по 6 животных на группу). Две группы получали монотерапию huN901-DM1 внутривенно в дозах DM1 100 мг/кг и 250 мг/кг, соответственно (1 раз в неделю ×2, 16-й и 23-й дни после введения.опухолевых клеток). Третья группа мышей получала монотерапию талидомидом интраперитонеально в дозе 200 мг/кг (всего 11 доз, дни 16, 18-22 и 25-29 после введения опухолевых клеток) в виде суспензии в 1% растворе карбоксиметилцеллюлозы в фосфатном буферном растворе. Две группы получали комбинации huN901-DM1 (100 мг/кг или 250 мг/кг) плюс талидомид, с применением таких же доз, схем и способов введения, как и в группах монотерапии. Контрольная группа животных получала фосфатный буферный раствор внутривенно (1 раз в неделю ×2, 16-й и 23-й дни после введения опухолевых клеток). Рост опухолей контролировали, измеряя размер опухоли дважды в неделю. Размер опухоли вычисляли по формуле
длина × ширина × высота × ½
Данные роста опухолей показаны на фиг 2А. Комбинация huN901-DM1 плюс талидомид была активной в отношении ксенотрансплантатов MOLP-8, что дополнительно приводило к синергической активности (табл.2 (фиг.2B)). Комбинация huN901-DM1 и талидомида в дозах, в которых монотерапия была неактивной (100 мг/кг huN901-DM1, 200 мг/кг талидомида), была активна согласно стандартам NCI (T/С=26%; табл.2 (фиг.2B)).
Сочетание huN901-DM1 (250 мг/кг) и талидомида (200 мг/кг) дает высокоэффективную комбинацию (T/С=7%) с логарифмом гибели клеток 1,0, что выше суммы значений LCK для отдельных препаратов.
Пример 3. Противоопухолевое действие комбинированной терапии huN901-DM1 и бортезомибом на ксенотрансплантаты множественной миеломы человека (ОРМ2)
7
3
Противоопухолевое действие комбинации huN901-DM1 и бортезомиба (Velcade, Millennium Pharmaceuticals) оценивали на модели прижившихся подкожных ксенотрансплантатов множественной миеломы. Мышам SCID (36 животных) были привиты клетки множественной миеломы человека ОРМ2 (1×10 клеток/животное) путем подкожного введения в правое плечо мыши. Когда размер опухоли достигал около 70 мм (через 12 дней после введения опухолевых клеток), мыши были случайным образом распределены на 6 групп (по 6 животных на группу). Две группы получали монотерапию huN901-DM1 внутривенно в дозах DM1 100 мг/кг и 200 мг/кг, соответственно (12-й день после введения опухолевых клеток). Третья группа мышей получала монотерапию бортезомибом внутривенно в дозе 1 мг/кг (13-й и 16-й дни после введения опухолевых клеток). Две группы получали комбинации huN901-DM1 (100 мг/кг; или 200 мг/кг) плюс бортезомиб, с применением таких же доз, схем и способов введения, как и в группах монотерапии. Контрольная группа животных получала фосфатный буферный раствор внутривенно (12-й день после введения опухолевых клеток). Рост опухолей контролировали, измеряя размер опухоли дважды в неделю. Размер опухоли вычисляли по формуле
длина × ширина × высота × ½
Комбинация huN901-DM1 плюс бортезомиб продемонстрировала высокую активность в отношении ксенотрансплантатов ОРМ2, что приводило к синергической активности для обеих комбинаций обеих доз. Монотерапия huN901-DM1 huN901-DM1 приводила к тому, что у 1 из 6 и у 3 из 6 мышей опухоли отсутствовали на 91-й день в группах доз 100 и 200 мг/кг соответственно (см. табл.3 (фиг.3B)). В то же время, в группе монотерапии бортезомибом опухоли присутствовали у всех мышей. Обе комбинации «huN901-DM1 плюс бортезомиб» (1 мг/кг) приводили к полному регрессу опухолей у 6 из 6 мышей, причем опухоли у мышей отсутствовали на 91-й день, т.е. дату последнего измерения размеров опухоли. Кривые роста опухолей показаны на фиг 3A.
Комбинация huN901-DM1 плюс бортезомиб демонстрировала высокую активность, которая была синергической.
Пример 4. Противоопухолевое действие комбинированной терапии huN901-DM1 и бортезомибом на крупные опухолевые ксенотрансплантаты множественной миеломы человека (Н929)
7
3
Противоопухолевый эффект комбинации huN901-DM1 и бортезомиба оценивали на модели прижившихся подкожных ксенотрансплантатов множественной миеломы. Мышам SCID (54 животных) были привиты клетки множественной миеломы человека Н929 (1×10 клеток/животное) путем подкожного введения в правое плечо мыши. Когда размер опухоли достигал около 300 мм (через 34 дня после введения опухолевых клеток), мыши были случайным образом распределены на 11 групп (по 6 животных на группу). Две группы мышей получали монотерапию huN901-DM1 внутривенно в дозах DM1 50 мг/кг и 100 мг/кг, соответственно (34-й день после введения опухолевых клеток). Две группы мышей получали монотерапию бортезомибом внутривенно в низкой дозе 0,5 мг/кг и в высокой дозе 1 мг/кг (35-й и 38-й дни после введения опухолевых клеток). Оценивали четыре группы комбинированной терапии, получавшие комбинации каждой из доз huN901-DM1 плюс высокая или низкая доза бортезомиба, с применением таких же доз, схем и способов введения, как и в группах монотерапии. Контрольная группа животных получала фосфатный буферный раствор внутривенно (34-й день после введения опухолевых клеток). Рост опухолей контролировали, измеряя размер опухоли дважды в неделю. Размер опухоли вычисляли по формуле
длина × ширина × высота × ½
Комбинация huN901-DM1 с низкой дозой, бортезомиба проявляла синергический эффект в отношении опухолей Н929. Комбинация huN901-DM1 и бортезомиба в дозах, в которых они были неэффективны в качестве монотерапии (50 мкг/кг huN901-DM1,
0,5 мкг/кг бортезомиба), проявляла активность в соответствии со стандартами NCI (T/C=38%; см. табл.4a (фиг.4B)). Комбинация huN901-DM1 (100 мкг/кг) плюс бортезомиб в дозе: 0,5 мкг/кг также проявила себя как активная композиция (T/С=17%,
у 1 из 6 мышей отсутствовали опухоли в конце исследования на 119-й день; см. фиг.4A).
Комбинация huN901-DM1 с высокой дозой бортезомиба также проявляла синергический эффект в отношении опухолей Н929. Высокая доза бортезомиба (1,0 мг/кг) проявляла активность в качестве монотерапии на модели крупных опухолей Н929 (T/С=11%, у 1 из 6 мышей отсутствовали опухоли на 119-й день; см. табл.4b (фиг.4D)). Комбинированное лечение высокой дозой бортезомиба и huN901-DM1 в дозе 50 и 100 мкг/кг было высоко активным, на что указывают низкие значения T/C (7% и 0%, соответственно); причем в группе последней комбинации у 5 из 6 мышей отсутствовали опухоли на 119-й день (см. фиг.4C). Комбинация huN901-DM1 плюс бортезомиб была высоко активной и проявляла синергический эффект.
Пример 5. Противоопухолевое действие комбинированной терапии huN901-DM1 и леналидомидом на ксенотрансплантаты множественной миеломы человека (ОРМ2)
7
3
Противоопухолевый эффект комбинации huN901-DM1 и леналидомида оценивали на модели прижившегося подкожного ксенотрансплантата множественной миеломы. Мышам SCID (20 животных) были привиты клетки множественной миеломы человека MOLP-8 (1×10 клеток/животное) путем подкожной инъекции в правое плечо мыши. Когда размер опухолей достигал около 130 мм (через 16 дней после введения опухолевых клеток), мыши были случайным образом распределены на 4 группы (по 5 животных на группу). Одна группа мышей получала монотерапию huN901-DM1 внутривенно (200 мг/кг, 16-й день после введения опухолевых клеток). Вторая группа мышей получала монотерапию леналидомидом интраперитонеально (100 мг/кг, дни 16-20 и 22-26 после введения опухолевых клеток) в виде суспензии в 1% растворе. карбоксиметилцеллюлозы в фосфатном буферном растворе. Третья группа получала комбинацию huN901-DM1 плюс леналидомид, с применением таких же доз, схем и способов введения, как и в группах монотерапии. Контрольная группа животных получала фосфатный буферный раствор внутривенно (16-й день после введения опухолевых клеток). Рост опухолей контролировали, измеряя размер опухоли дважды в неделю. Размер опухоли вычисляли по формуле
длина × ширина × высота × ½
Лечение однократной инъекцией huN901-DM1 (200 мкг/кг, 16-й день) показало активность против ксенотрансплантатов множественной миеломы ОРМ2 (T/С=26%, LCK=0,9; см. табл.5 (фиг.5B)); активность леналидомида как средства монотерапии (100 мг/кг, дни 16-20, 23-27) была сравнимой (T/С=28%, LCK=0.9). Комбинация «huN901-DM1 плюс леналидомид» была высоко активной (T/С=1,4%, LCK=1,7), причем у 1 из 5 мышей опухоли отсутствовали в конце исследования; опухоли присутствовали у всех животных в группах лечения huN901-DM1 или леналидомидом/дексаметазоном. Результаты данного исследования демонстрируют, что комбинированное лечение является синергическим, и комбинация проявляет более выраженную активность, чем лекарственные средства в качестве монотерапии. Данные роста опухолей показаны в табл.5 (фиг.5B) и на фиг.5A.
Пример 6. Зависимость противоопухолевого эффекта комбинации «huN901-DM1 плюс бортезомиб» от схемы введения
7
3
Противоопухолевый эффект комбинации huN901-DMl и бортезомиба (Velcade, Millennium Pharmaceuticals) оценивали на модели прижившегося подкожного ксенотрансплантата множественной миеломы. Задача данного исследования состояла в определении оптимальной схемы введения для комбинированной терапии. Мышам SCID (18 животных) были привиты клетки множественной миеломы человека ОРМ2 (1×10 клеток/животное) путем подкожной инъекции в правое плечо мыши. Когда размер опухолей достигал приблизительно 70 мм (через 12 дней после введения опухолевых клеток), мыши были случайным образом разбиты на три группы (6 животных за группу). Первая группа мышей получала сначала бортезомиб в дозе 1 мг/кг в дни 0 и 3 и затем huN901-DM1 в дозе 13 мг/кг в 3-й день. При альтернативной схеме введения вторая группа мышей получала сначала huN901-DM1 в дозе 13 мг/кг в дни 0, 3, и на 3 дня позже (3-й и 6-й дни) бортезомиб в доза 1 мг/кг. Контрольная группа животных получала: фосфатный буферный раствор внутривенно (12-й день после введения клеток опухоли). Рост опухоли контролировали, измеряя размеры опухоли дважды в неделю. Размер опухоли вычисляли по формуле
длина × ширина × высота × ½
Неожиданно, комбинация huN901-DM1 плюс бортезомиб показала высокую активность отношении ксенотрансплантатов ОРМ2 только, если бортезомиб вводили первым (см. фиг.6). Таким образом, данная схема приводила к полному регрессу опухолей, где у 5 из 6 мышей опухоли отсутствовали в 120-й день. Если бортезомиб вводили вторым (т.е. после введения huN901-DM1), лечение приводило только к небольшой задержке роста опухоли, и даже на 30-й день у всех животных опухоли присутствовали. Полученные данные свидетельствуют о том, что схема введения является критический для комбинированной терапии бортезомибом и иммуноконъюгатом. Возможно, предварительное лечение бортезомибом делает клетки опухоли чувствительными к индуцированной иммуноконъюгатом huN901-DM1 гибели.
Пример 7. Противоопухолевый эффект лечения тройной комбинацией «huN901-DM1 и леналидомид плюс низкая доза дексаметазона» ксенотрансплантатов множественной миеломы человека (MOLP-8)
7
3
Противоопухолевый эффект тройной комбинации «huN901-DM1 и леналидомид плюс низкая доза дексаметазона» оценивали на модели прижившегося подкожного ксенотрансплантата множественной миеломы. Мышам SCID были привиты клетки множественной миеломы человека MOLP-8 (1,5×10 клеток/животное) путем подкожной инъекции в правое плечо мыши. Когда размер опухолей достигал около 100 мм (через 13 дней после введения опухолевых клеток), 24 мыши были случайным образом распределены на 4 группы (по 6 животных на группу). Одна группа мышей получала монотерапию huN901-DM1 внутривенно (150 мг/кг, 1-й и 8-й дни после введения опухолевых клеток). Вторая группа мышей получала комбинацию леналидомид/низкая доза дексаметазона (100 мг/кг леналидомида, интраперитонеальное введение в виде суспензии в 1% растворе карбоксиметилцеллюлозы в фосфатном буферном растворе в дни 1-5 и 8-12 после введения опухолевых клеток; дексаметазон в дозе 1,5 мг/кг, введение подкожной инъекцией в 1-й и 8-й дни). Третья группа получала тройную комбинацию «huN901-DM1 плюс леналидомид/дексаметазон», с применением таких же доз, схем и способов введения, как и в группах монотерапии. Контрольная группа животных получала фосфатный буферный раствор внутривенно (1-й и 8-й дни). Рост опухолей контролировали, измеряя размер опухоли дважды в неделю. Размер опухоли вычисляли по формуле
длина × ширина × высота × ½
Лечение huN901-DM1 (150 мкг/кг, 1 раз в неделю ×2) или леналидомидом и дексаметазоном продемонстрировало равную активность против опухолей MOLP-8 (T/С=33%, LCK=0,5; см. табл.7 (фиг.7b)). Тройная комбинация huN901-DM1/леналидомид/дексаметазон была высоко активной (T/С=0%, LCK=1,4), с частичным регрессом у всех мышей (6/6) и полным регрессом опухолей у 4 из 6 мышей, по сравнению с отсутствием регресса в группе huN901-DM1 и в группе леналидомида/дексаметазона. Данные роста опухоли показаны в табл.7 (фиг.7b) и на фиг.7A.
Сателлитные группы лечения несущих опухоль мышей MOLP-8 (по 3 животных за группу) получали лечение параллельно с исследованием эффективности; животных: забивали в 3-й день (после 48 часов лечения), и опухоли вырезали для иммуногистохимического анализа с применением антитела к расщепленной каспазе-3, для оценки апоптоза. Опухоли мышей, получавших тройную комбинацию, huN901-DM1/леналидомид/дексаметазон продемонстрировали значительное увеличение окрашивания каспазы-3 относительно контроля и групп монотерапии, где уровни апоптоза соответствовали или приблизительно соответствовали базовому значению (данные показаны на фиг.8A). Такое резкое увеличение апоптоза при применении тройной комбинации очевидно на раннем этапе фазы лечения до того, как какие-либо изменения объема опухоли были обнаружены в изучении противоопухолевой активности.
Результаты проведенных исследований демонстрируют, что лечение тройной комбинацией huN901-DM1/леналидомид/дексаметазон является синергическим, демонстрируя более высокую противоопухолевую активность и значительное увеличение апоптоза опухолевых клеток, по сравнению с монотерапией отдельными средствами.