СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УГЛЕВОДОВ ГИДРОЛИЗОМ ПОЛИСАХАРИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ВОДОРОСЛЕЙ (ВАРИАНТЫ)
METHOD OF PRODUCING CARBOHYDRATES VIA HYDROLYSIS OF POLYSACCHARIDE COMPLEXES OF ALGAE (VERSIONS)

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения из водорослей углеводов, которые могут использоваться в качестве компонентов питательной среды для получения этанола и биологически активных веществ (БАВ).
В гидросфере Земли известно более 28 тысяч видов растений - от одноклеточных микроскопических (фитопланктон) до растений со сложным строением и гигантских по размерам (макрофиты). Водные растения встречаются во всех слоях водоемов.
Водоросли - это низкоорганизованные растения, у которых отсутствуют настоящие корни, стебли и листья. В нашей стране наиболее распространены бурые и красные водоросли. Видовой состав наших морей представлен на 50% красными и на 45% бурыми водорослями.
Растения содержат в тканях намного больше углеводов, чем животные. Морские водоросли в сухом обезжиренном состоянии содержат от 40 до 82% углеводов. К углеводам относят моно-, ди- и полисахариды, мукополисахариды и комплексные полисахариды. Полисахариды, в основном, состоят из пентоз (арабиноза, ксилоза, рибоза и дозоксирибоза) и гексоз (глюкоза, манноза, галактоза, фукоза.)
Углеродсодержащие соединения водного растительного сырья потенциально могут быть превращены в моноуглеводы с использованием комплекса ферментов или комплексных ферментных препаратов растительного или микробного происхождения. Кроме того, различные моносахара или полисахариды могут быть использованы для получения биологически активных веществ, пищевых и кормовых продуктов или в качестве заменителей нефтехимических продуктов при получении органических химических соединений.
Известны различные способы получения углеводов из растительного сырья как химические, так и биохимические.
Наиболее активными химическими катализаторами реакции гидролиза полисахаридов растительной клетки являются минеральные кислоты и щелочи. При обработке растительного сырья кислотой лигнин остается нерастворимым, а целлюлоза и гемицеллюлоза гидролизуются. При кислотном гидролизе кроме низкомолекулярных углеводов образуются лигнин и токсичные компоненты - фурфурол, метилфурфурол, метанол, формальдегид и низкомолекулярные кислоты и эфиры, которые делают производство экологически грязным и опасным для окружающей среды и, в частности, для обслуживающего персонала и жителей близлежащих регионов.
Проблема использования лигнина является самой трудной проблемой, которая не нашла решения до сих пор. После проведения гидролиза в гидролиз-аппарате остается 30% (от исходного растительного сырья) твердого вещества в виде лигнина, пропитанного серной кислотой. Удаляют лигнин из аппарата прямо в открытый аппарат - сцежу, т.е. в атмосферу попадает лигнин, серная кислота, метанол, уксусная кислота, фурфурол, метилфурфурол и другие низкомолекулярные летучие токсичные продукты. Все вышеперечисленное привело к закрытию предприятий, основанных на химическом гидролизе растительного сырья.
При щелочном гидролизе происходит частичное растворение лигнина, но при этом происходит и разрушение углеводов, поэтому этот метод не нашел практического применения.
В патенте US 7262331 описан способ получения жидкого топлива из пульпы, которая для получения продукта подвергается воздействию высокой температуры 280°С и затем воздействию высокого давления 100-250 бар. При этом происходит разрыв и белков и полисахаридов, но разрыв происходит беспорядочный, поэтому их нельзя использовать в качестве источника моноуглеводов.
В патенте РФ 2284355 используется способ гидролиза растительного сырья серной кислотой и нейтрализация гидролизата аммиачной водой. При таком методе получения углеводов происходит разрушение углеводов и образование токсических соединений - фурфурол, метилфурфурол, метанол и сульфатированный лигнин. При удалении которого из аппарата в окружающий воздух попадают перечисленные токсичные компоненты.
В US 6908995 этанол получают из биомассы, в том числе из бурых водорослей (ламинарии) при нагревании в водном растворе щелочи (20-40%) для разрушения лигнин-целлюлозного комплекса. При этом способе не происходит гидролиза полисахаридов до моноуглеводов, поэтому получается низкий выход и в гидролизатах содержатся токсичные компоненты - индол, низкомолекулярные эфиры, толуол и другие бензольные соединения.
Наиболее близким аналогом, принятым за прототип, является способ разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, описанный в заявке ЕА 200701127.
Известное изобретение относится к способу разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, имеющих относительно высокое содержание сухого вещества, выше 20%, и предпочтительно состоящих из относительно крупных волокон и частиц, с таким распределением размера волокон и частиц, при котором по меньшей мере 20% (мас./мас.) биомассы находится в диапазоне 26-70 мм. Кроме того, способ применим для разжижения и осахаривания содержащих полисахариды биомасс, главным образом состоящих из крахмала, очищенного крахмала, целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина, например зерна или пшеничной соломы. В случае лигноцеллюлозных биомасс их предварительно обрабатывают, подвергая воздействию температур от 110 до 250°С в течение 1-60 мин, что обеспечивает доступность целлюлозы для ферментов и в то же время обеспечивает ограниченное содержание ингибиторов ферментации в предварительно обработанной биомассе. В настоящем изобретении объединяют ферментативный гидролиз, основанный на комбинации гидролитических ферментов, включая фермент, вызывающий гидролиз углеводов, и окислительный фермент, с перемешиванием, основанным на принципе действия силы тяжести, обеспечивающим приложение к биомассам механических сил, главным образом усилия сдвига и силы разрыва. Предпочтительными типами перемешивания являются, например, перемешивание в смесителях, работающих по принципу свободного падения, таких как смесители барабанного типа, смесители на основе опрокидывания или сходные смешивающие устройства.
В основном, данный способ разработан применительно к растительным объектам, содержащим в качестве запасных полисахаридов крахмал, содержание которого может доходить до 50-60%, или биомассы, содержащей целлюлозу, гемицеллюлозу и лигнин. В этих случаях сначала проводят предварительную обработку биомассы воздействием высокой температуры от 110°С до 250°С в течение 5-15 мин, а затем ферментативная обработка окислительным и протеолитическим ферментами, что приводит к разрушению клеточной стенки, в частности белков клеточной стенки. Это позволяет обеспечить доступ целлюлазы к фибрилам целлюлозы и амилазы к крахмалу. При этом не разрываются связи лигнина с гемицеллюлозой и пектина с целлюлозой.
Такой метод обработки сопровождается окислением полисахаридных цепочек с получением органических кислот, а также образованием ароматических токсичных соединений. Кроме того, обработка биомассы при высокой температуре приводит к карамелизации углеводов, разрушению пептидов и серосодержащих аминокислот. При такой предварительной обработке доступ к целлюлозе обеспечивается только на 40-50%, а остальная целлюлоза остается негидролизованной и недоступной для действия ферментов, но такой способ обработки позволяет полностью гидролизовать крахмал.
Недостатками прототипа являются:
- большие потери сырья за счет окисления части образовавшейся глюкозы в органические кислоты,
- при обработке целлюлозолигнинованного комплекса происходит неполное освобождение целлюлозы и пектина от связи их с гемицеллюлозой и лигнином, что приводит к неполному гидролизу целлюлозы и гемицеллюлозы до моносахаридов;
- образование лигнина, насыщенного серной кислотой, который не имеет применение и выбрасывается в окружающую среду, что приводит к нарушению экологии;
- это уменьшает выход моносахаридов и снижает выход конечного готового продукта;
- на таких гидролизатах можно получать только технические и кормовые, но не пищевые продукты. Кроме того, чтобы дальше использовать гидролизаты в качестве компонента питательной среды, необходимо вводить стадию очистки от токсичных продуктов - ароматических соединений.
Задачей данного изобретения является разработка экологически чистого и экономичного способа получения углеводов из полисахаридных комплексов водорослей, которые в дальнейшем можно было бы использовать не только для производства этанола и БАВ, но и для получения пищевых продуктов.
Анализ химического состава водорослей показывает, что, прежде всего, они являются источником различных биологически активных веществ (БАВ). Так, по содержанию витаминов ламинариевые и фукусовые водоросли в 100-1000 раз превосходят наземные растения.
Первоначально интерес к водорослям возник в связи с возможностью их использования в качестве источника белка.
Большая часть морских растений представлена группой водорослей, имеющих, как правило, относительно простую структуру. Водоросли представляют собой микроскопические одноклеточные растения, но отдельные экземпляры могут достигать в длину более 80 м. В отличие от наземных растений, у которых фотосинтез происходит лишь в определенных частях растений - в листве, то у морских водорослей в фотосинтезе принимает участие вся поверхность водорослей. Благодаря простой структуре и большому отношению площади поверхности к объему морские водоросли эффективно поглощают солнечную энергию, поэтому продуктивность некоторых морских водорослей гораздо больше, чем продуктивность наземных растений.
По структуре клеточной стенки очень много общего у морских водорослей и у наземных растений, но по содержанию полисахаридов они отличаются. Содержание воды в водорослях составляет 85-90%, сухие вещества водорослей содержат 52-65% органических веществ, т.е. 1 кг сухих водорослей содержит 300-400 г полисахаридов.
У водорослей мы встречаем в качестве запасных продуктов не крахмал, а разнообразные по составу гомо- и гетерополисахариды и сульфатированные полисахариды (агар, каррагинан). В клеточной стенке водорослей находятся только целлюлоза, гемицеллюлоза и пектин, в то время как у наземных растений в состав клеточных стенок входит и лигнин, содержание которого составляет до 30%.
Органические вещества бурых водорослей состоят из углеводов (73-74%), азотистых веществ (5-15%), липидов (1-3%), пигментов и витаминов. В различных водорослях обнаружено несколько типов полисахаридов: целлюлоза (35% от содержания углеводов), гемицеллюлоза (15%), ламинаран (10-15% от углеводов), альгиновые кислоты (15-20%), сульфатированные глюканы - фукоиданы, агар и каррагинаны (их содержание может составлять до 20-30%) и маннит. Сульфатированные полисахариды после отделения сульфатных групп под действием ферментов - десульфатаз, как и другие полисахариды, после гидролиза гидролитическими ферментами (целлюлазами, целлобиазами, гемицеллюлазами, ксиланазами и глюконазами) образуют моносахара - глюкозу, ксилозу, маннозу, фукозу, галактозу и пентозы.
Наибольшее содержание полисахаридов обнаруживается у Z. saccharina, F. vesisulosus, F. Distichus. Причем содержание маннита в ламинариевых водорослях доходит до 30%, а в фукосовых до 20%. Кроме маннита ламинарии содержат до 15-20% веществ, легко подвергающихся ферментативному гидролизу до гексоз и пентоз.
Таким образом, водоросли - хороший углеводный субстрат, который после предварительного ферментативного гидролиза маннита, целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина будет содержать моносахара, хорошо усваиваемые микроорганизмами. Наряду с этим морские водоросли представляют полноценную питательную среду, в которой содержится как источник углерода, так и органического азота (аминокислоты).
2
2
Известно, что среднее количество биомассы, которое дают водоросли, составляет 15-25 г/м сухой массы в сутки, а максимальная скорость роста водорослей достигает 30-40 г/м.
2
2
Для решения поставленной задачи предлагается способ получения углеводов гидролизом полисахаридных комплексов водорослей, включающий реакцию ферментативного гидролиза с получением углеводов, дополнить предварительным химическим гидролизом полисахаридных комплексов водорослей с помощью пергидроля (НO). Реакцию ферментативного гидролиза предлагается проводить с помощью комплексов ферментов - целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Тогда как реакции химического и ферментативного гидролиза предлагается проводить последовательно в многосекционном реакторе барабанного типа.
Дополнительными отличиями является то, что
- комплекс ферментов дополнительно содержит десульфатазы,
- в качестве полисахаридных комплексов водорослей используют промысловые водоросли, например бурые (Laminariales japonica, L. Dentiqera, Fucus sp.), красные (Ahnfeltia plicata, Furcellaria tastigiata), зеленые;
- реакцию химического гидролиза проводят при температуре 50-60°С;
- реакцию ферментативного гидролиза проводят при температуре 45-80°С;
- время проведения реакции химического гидролиза составляет 30-60 мин;
- время проведения ферментативного гидролиза составляет 120 мин;
- в качестве комплексов ферментов применяют комплекс, содержащий Дистицим, Вискофло и десульфатазу, которые вносятся в соотношении 0,1:0,1:0,2 г каждого на 100 г водорослей.
- в качестве комплексов ферментов применяют комплекс, содержащий Целлолюкс, Вискофло и десульфатазу, которые вносятся в соотношении 0,1:0,1:0,2 г каждого на 100 г водорослей.
В качестве комплексов ферментов возможно использовать другие ферментативные комплексы, например содержащий Ультрафло Л, Оллзайм ПТ и церемикс.
Ультрафло Л (фирма Novozymes) - термостабильный мультиактивный препарат, содержащий целлюлазу, глюконазу, ксиланазу и пектиназу, и Оллзайм ПТ (фирма OLTEX) и церемикс (фирма Novozymes), содержащие грибковую целлюлазу, экзо В-глюконазу и эндо В-глюконазу. Данные препараты вносятся в соотношении 0,1:0,1:0,1 г каждого на 100 г водорослей.
Во втором варианте предлагаемого способа, относящегося к использованию сухой биомассы, перед проведением реакции химического гидролиза предлагается проводить замачивание полисахаридных комплексов водорослей в 1:5-1:10.
Примеры выполнения предлагаемого изобретения
Пример 1: Ферментативный гидролиз в лабораторном масштабе
2
2
2
2
+2
+2
Предварительно увлажненную морскую водоросль со средним размером примерно 3×5 см, соответствующую 100 г сухой массы, помещали в емкость типа квадрата, сплетенного из металлической сетки, которую помещали в водяную баню. Прокачивали через нее подогретую жидкость насосом или помещали в барабанную емкость с вращающимся барабаном. В одной секции проводили обработку сырья НО в течение 30-40 мин при концентрации 0,3-0,5% HO. В следующей секции проводилась отмывка от остатков перекиси водорода. Одновременно с обесцвечиванием происходит гидролиз полисахаридов до олигосахаридов, то есть это приводит к уменьшению длины полисахаридной цепи. После отмывания сырья от перекиси водорода в следующую секцию подавался раствор комплексного фермента. Ультрафло Л (термостабильный мультиактивный препарат В-глюконазы, целлюлозная, ксиланозная, пентозаназная, арабаназная активность), Оллзайм ПТ и церемикс (грибковая целлюлоза, экзо В-глюконаза и эндо В-глюконаза). Перед подачей ферментативного комплекса к увлажненным водорослям добавляем 1N HCl для удаления поливалентных ионов (Ca, Mg). После достижения рН 5,0-5,5 раствор ферментативного комплекса приливали к водорослям (в соотношении 0,1:0,1: 0,1 г на 100 г водорослей), затем водоросли промывали таким же объемом воды.
Анализ моносахаров после действия комплекса ферментов показал, что количество редуцирующих веществ увеличилось в 3,5 раза, при действии каждого фермента в отдельности количество редуцирующих веществ увеличивается значительно меньше - на 50-90%, и в растворе определяется моносахарид манноза, примерно 2,5 г в литре раствора.
При добавлении пергидроля уровень редуцирующих веществ увеличивается на 50-60%.
Пример 2: Ферментативный гидролиз в лабораторном масштабе
Предварительно увлажненную морскую водоросль со средним размером примерно 3×5 см, соответствующую 100 г сухой массы, помещали в емкость типа квадрата, сплетенного из металлической сетки, которую помещали в водяную баню, и прокачивали через нее подогретую жидкость насосом или помещали в барабанную емкость.
2
2
2
2
В одной секции проводили обработку сырья пергидролем (НО) в течение 30-40 мин при концентрации 0,3-0,5% НO. В следующей секции проводилась отмывка водой от остатков перекиси водорода. Объем подаваемой воды равен соотношению водоросли: вода 1:5.
После завершения отмывки в емкость с водорослями подается водный раствор ферментного препарата целлолюкс, вискофло и десульфатаза (соотношение ферментов: 0,1:0,1:0,2 г на 100 г водорослей) рН 5,0+/-0,3. Процесс проводится при перемешивании в течение 120 мин при 50°С+/-5°С и рН 5,0+/-0,3.
Анализ моноуглеводов после окончания ферментативного гидролиза показал, что количество редуцирующих веществ увеличилось в 2,5-3,0 раза. При действии каждого фермента в отдельности отмечалось увеличение количества редуцирующих веществ на 70-110%. Следовательно, при совместном действии ферментов проявляется синергидное действие. Вероятно, ферменты гидролизуют различные виды полисахаридов в водорослях, что и сопровождается явлением синергизма. При добавлении десульфатазы (0,2 г) в растворе определяется галактоза - 2,5 г/л.
Пример 3. Ферментативный гидролиз в пилотном масштабе
Предварительно взвешенную суховоздушную массу водорослей со средним размером примерно 5-10 мм (предварительно помещаем в дезинтегратор для размельчения до нужного размера). Помещаем в стандартную 4-секционную стиральную машину. Каждая секция выкладывалась соответствующей металлической сеткой, не пропускающей помещенные водоросли. В I секцию после загрузки увлажненных водорослей подавали разбавленную 0,3-0,5% перекись водорода. Время обесцвечивания 30 мин при вращении барабана. По окончании стадии обесцвечивания барабан останавливается и раствор сливается. В эту же секцию подается вода в соотношении 1:5 для удаления остатка пергидроля. Затем сюда же заливается раствор ферментов - Ультрафло Л, Оллзайм ПТ, церемикс и десульфатазу. Процесс гидролиза проводится при температуре 50+/-5°С, рН 5,0+/-0,3 в течение 120 мин, при вращающимся барабане. В этот период под действием гемицеллюлазы и ксиланазы происходит ферментативный гидролиз гемицеллюлозы и пектиновых компонентов до маннозы, галактозы, арабиногалактуроновой и маннануроновой кислот. Гидролиз данных групп полисахаридов позволяет освободить фибриллы целлюлозы. На следующем этапе происходит под действием целлюлазы гидролиз целлюлозы и моносахаров (глюкозы). Одновременно под действием десульфатазы происходит десульфатирование полисахарида каррагинана, который в дальнейшем гидролизуется до галактозы.
3
После окончания стадии ферментативного гидролиза надосадочная жидкость содержит низкомолекулярные полисахариды и моносахара, вращение барабана останавливали и жидкую фазу сливали в приемную емкость V=20 м. Затем в эту же секцию для промывки оставшихся водорослей заливали объем воды 1,2 и включали вращение барабана в течение 15-20 мин. Затем барабан останавливали и жидкую фазу сливали в приемную емкость к слитой жидкой фазе.
Полученный раствор моносахаридов использовали как источник моносахаров на стадии ферментации при культивировании микроорганизмов.
Проведение полного технологического процесса в пилотной установке подтвердило вышеописанные экспериментальные данные в примере 2. В частности, после окончания процесса гидролиза в присутствии комплекса ферментов содержание редуцирующих веществ увеличилось в 3,0 раза, т.е. количество углеводов было равно 5,0 г/л. В жидкой фазе методом газовой хроматографии были идентифицированы глюкоза, манноза, галактоза и фукоза. Все перечисленные углеводы хорошо утилизируются при росте микроорганизмами.
При использовании предлагаемого способа не образуются токсичные и вредные вещества, что делает данный способ безопасным и экологически чистым.
Применение материала, полученного данным способом, возможно для приготовления питательной среды для получения этанола, антибиотиков, ферментов и аминокислот, а также для получения пищевых и кормовых добавок.
При производстве биоэтанола из морских водорослей стоимость сырья снизится на 30%, если производство будет построено на берегу моря, где будут собираться водоросли (например, берег Баренцевого моря). Плантации водорослей в Баренцевом море ориентировочно составляют 0,1 тыс га, что обеспечит производство (90×200=18000 тыс литров) 18 млн литров биотоплива. Сегодня стоимость биотоплива составляет 40-50 центов. При использовании моносахаридов, полученных из водорослей, составит 15-20 центов за литр. Внедрение данного способа позволит снизить стоимость бензина для автотранспорта в 1,5-2,0 раза.