Микробиота кожи детей с острой крапивницей

Посевина А.Н., Лебеденко А.А., Набока Ю.Л., Аверкина Л.А., Заруцкий С.А. МИКРОБИОТА КОЖИ ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ КРАПИВНИЦЕЙ

МИКРОБИОТА КОЖИ ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ КРАПИВНИЦЕЙ

Посевина А.Н., Лебеденко А.А., Набока Ю.Л., Аверкина Л.А., УДК: 616.24-008.442:616.5-053.37:616.514-036.11

Заруцкий С.А.

Ростовский государственный медицинский университет, Ростов-на-Дону

Резюме

Проведено микробиологическое исследование кожи 94 детей, разделенных на две группы: I группа (п=31) - контрольная, II (п=63) - пациенты с острой крапивницей. У детей II группы изучали неизмененные и пораженные участки кожи. Бактериологическое исследование кожи проводили на расширенном наборе питательных сред для аэробных и анаэробных бактерий. Кластерный анализ показал низкие уровни отличия микробных спектров в изучаемых локусах. Определены значимые различия в частотах обнаружения представителей микробиоты кожи обследуемых I и II групп. Выявлено повышение изучаемого показателя для Bacteroides spp. у детей II группы в обоих локусах, и снижение для Enterococcus spp., Bacillus spp. по сравнению с контрольной группой. При сравнении микробных спектров у детей II группы в двух локусах определены повышенные частоты обнаружения на пораженном участке для S. aureus и Peptococcus spp. Выявленные изменения в микробиоте кожи у детей с крапивницей могут оказывать влияние на течение заболевания, что предполагает включение в терапию симбиотических препаратов.

Ключевые слова: дети, крапивница, микробиота кожи, аллергия, атопия.

SKIN MICROBIOTA OF CHILDREN WITH ACUTE URTICARIA

Posevina A.N., Lebedenko A.A., Naboka Y.L., Averkina L.A., Zarutskiy SA

We performed a microbiological skin testing of 94 children subdivided into two groups: group I (n=31) - control subjects, group II (n=63) - patients suffering from acute urticaria. Affected and unaffected skin areas were examined in children of group II. Bacteriological examination of the skin was performed using an extended set of culture media for aerobic and anaerobic bacteria. Cluster analysis revealed low levels of difference between microbial spectra in the loci under study. Significant difference between the detection frequencies of skin microbiota representatives was identified in patients of the groups I and II. An increase of the figure in question for Bacteroides spp. in children of group II in both loci and its decrease for Enterococcus spp., Bacillus spp. were identified in comparison with the control group. Comparison of microbial spectra in children of group II revealed increased detection frequencies of S. aureus and Peptococcus spp. within the affected area. Discovered changes in the skin microbiota of children with urticaria can influence the course of disease and thus imply therapy enhancement with symbiotic drugs.

Keywords: children, urticaria, skin microbiota, allergy, atopy.

Микробиота кожи является сложной экосистемой и зависит от возраста, пола, изучаемой области, преморбид-ного фона обследуемого, факторов окружающей среды и т.д. [1-4]. На коже верифицирован широкий паттерн микроорганизмов (около 1014 таксонов) [5]. Исследования микробиома кожи вошли в проект «Human microbiome project» [6] с индикацией 19 филов и доминированием Actinobacteria (51,8%), Firmicutes (24,4%), Proteobacteria (16,5%) и Bacteroides (6,3%) [7, 8]. Преобладающими родами являются Corynebacterium spp., Propionibacterium spp, Streptococcus spp [9]. Результаты бактериологического исследования микробиоты кожи во многих позициях корреспондируют с данными секвенирования 16S РНК бактерий данного биотопа [10, 11]. Отдельные атопические заболевания в своей основе имеют микробную этиологию, поэтому детальное изучение микробиоты кожи может привести к разработке новых методов и подходов к диагностике и лечению [12, 13]. Доказано, что эффективность терапии атопического дерматита ассоциируется с доминированием на коже Corynebacterium spp., Streptococcus spp., Propionibacterium spp. [14-16]. Крапивница является одной из сложных проблем современной аллергологии c распространенностью от 15 до 25% в человеческой популяции [17]. Это мультифакториальное заболевание, одним из основных звеньев патогенеза которого является накопление в тканях биологически активных веществ (гистамин и т.д.), что приводит к каскаду патологических реакций и соответствующей клинике [18]. Способность высвобождать гистамин из различных депо человека отмечена у S. aureus, H. pylori, P. aeruginosa и E. coli, что коррелирует с уровнем Ig E. Ряд таксонов микроорганизмов (Acinetobacter, Pseudomonas, Serratia, E. coli, Coryneb-

acterium, Staphylococcus, Micrococcus), изолируемых с поверхности кожи здоровых людей и больных различными аллергическими заболеваниями, обладают выраженной гистидиндекарбоксилирующей активностью [19]. Эти данные позволяют предположить, что качественные и количественные изменения в микробиоте кожи могут оказывать значительное влияние на течение атопических заболеваний, в частности, острой крапивницы [20].

Материалы и методы

Проведено бактериологическое исследование микробиоты кожи 94 детям в возрасте от 3 до 12 лет. Обследуемые разделены на две группы: I группа - контрольная (n = 31), II группа (n = 63) дети с диагнозом острая крапивница. Критерии включения в I группу: возраст (3-12 лет), группы здоровья I и II а, информированное согласие родителей. Критерии включения во II группу: возраст (3-12 лет), диагноз - острая крапивница, отсутствие сопутствующих дерматологических заболеваний, информированное согласие родителей. Исследования проводили на базах: МБУЗ «Детская городская больница №2», педиатрическое отделение клиники РостГМУ и кафедра микробиологии и вирусологии №1 РостГМУ. У детей I группы исследовали микробиоту кожи средней трети внутренней поверхности предплечья. У детей II группы исследовали два участка кожи: пораженный и симметричный непораженный. Бактериологическое исследование кожи проводили по методике А.Б. Покатилова (1993) [21 ] .Забор материала из изучаемых локусов проводили в соответствии с МУ 4.2.2 039-05 (2006), рекомендациями В.В. Меньшикова (2009) и P. Murray (2015) с помощью бакпечаток с различными питательными средами [22, 23].

Посевина А.Н., Лебеденко А.А., Набока Ю.Л., Аверкина Л.А., Заруцкий С.А.

МИКРОБИОТА КОЖИ ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ КРАПИВНИЦЕЙ

Для факультативно - анаэробных бактерий (ФАБ) использовали среды Endo Agar, HiGrome Candida Differential Agar, HiGrome Enterococci Agar, HiGrome Aureus Agar Base, Blood Agar Base. Для выделения неклостридиально - анаэробных (НАБ) бактерий применяли Anaerobic Agar, Shaedler Agar, Bacteroides Bile Esculinum Agar. В работе использованы питательные среды Himedia (Индия). Посевы инкубировали в аэробных (24-48 часов, t-37° C) и анаэробных (48-72 часов, t-37° C) условиях культивирования. Для создания анаэробных условий использовали Anaero HiGas Pak. Идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по морфологическим, тинкториальным, культу-ральным и биохимическим свойствам с помощью энтеро-, стафило-, -неферм, анаэротестов (Lachema, Чехия).

Статистические расчёты выполняли в R (версия 3.2, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Результатом кластерного анализа стали построенные дендрограммы. Различия анализировали на основе оценок частот встречаемости и концентраций. Для анализа сходства использовали метод Варда (расстояние Брея - Кёртиса) [24]. Сравнение зависимых групп по средним значениям проводили с помощью критерия Вилкоксона для связанных выборок, по частотам - с помощью критерия Мак-Немара. При сравнении несвязанных групп использовали критерий Манна - Уитни и точный тест Фишера для средних и частот, соответственно.

Результаты исследования

При бактериологическом исследовании кожи в I группе верифицированы 12 таксонов микроорганизмов. Паттерн ФАБ представлен S. epidermidis (90,3%), Micrococcus spp. (61,3%), S. aureus (38,7%), Bacillus spp. (35,5%), Corynebacterium spp. (22,6%), S. haemolytic-us и Enterococcus spp. (по 16,1%). Спектр НАБ включал Peptococcus spp. (41,9%), Peptostreptococcus spp. (29,0%), Propionibacterium spp. и Veillonella spp. (по 16,1%), Eubac-terium spp. (9,6%). Обсемененность кожи ФАБ составила 2,5 ± 1,5 КОЕ/см2, НАБ - 2,1 ± 1,0 КОЕ/см2.

Во II группе (неизмененный участок кожи) обнаружено 13 микробных таксонов. Группа ФАБ представлена S. epidermidis (69,9%), S. aureus (53,9%), Micrococcus spp. (36,3%), Corynebacterium spp. (34,9%), Bacillus spp. (7,9%), S. pyogenes (4,8%). Таксономическая структура НАБ включала Peptococcus spp. (42,8%), Bacteroides spp. (30,1%), Peptostreptococcus spp. (28,6%), Propionibacterium spp. (26,9%), Veillonella spp. (11,9%), Eubacterium spp. (7,9%), Fusobacterium spp. (4,8%). Средние уровни обсемененности для ФАБ составили 3,2 ± 2,2 КОЕ/см2, НАБ - 1,7 ± 0,7 КОЕ/см2.

Во II группе (пораженный участок кожи) регистрировали 11 таксонов микроорганизмов. ФАБ представлены S. aureus (69,8%), S. epidermidis (60,3%), Corynebacterium spp. (23,8%), Micrococcus spp. (20,6%), Bacillus spp. (7,9%), S. pyogenes (4,8%). Паттерн НАБ включал Peptococcus spp. (61,9%), Propionibacterium spp. (39,7%), Peptostreptococcus spp. (36,5%), Bacteroides spp. (20,6%), Veillonella

spp. (14,3%). Средняя обсемененность ФАБ составила 2,9 ± 2,0 КОЕ/см2, НАБ - 1,7 ± 0,6 КОЕ/см2.

При анализе дендрограммы (рис. 1) подобия частот встречаемости выявлен низкий уровень отличия между спектрами микроорганизмов, верифицированных на коже детей I и II групп.

Однако при сравнении частот встречаемости (тест Фишера) различных таксонов микроорганизмов, обнаруженных на коже детей I и II (неизмененная кожа) групп, выявлены достоверные отличия по 4 микроорганизмам (рис. 2). На неизмененном участке кожи детей II группы повышена частота обнаружения Bacteroides spp. (р < 0,001) и снижена - Enterococcus spp. (р = 0,009), S. haemolyticus (р = 0,009) и Bacillus spp. (р = 0,007).

При сравнении частот встречаемости микроорганизмов между I группой и II (пораженный участок кожи) с помощью теста Фишера, с поправкой на множественные сравнения по методу Холма, статистически значимые различия выявлены по 7 таксонам (рис. 3). Во II группе отмечено повышение частоты обнаружения Bacteroides spp. (р = 0,008), S. aureus (р = 0,02) и снижение - Enterococcus spp. (р = 0,009), S. epidermidis (р = 0,01), S. haemolyticus (0,009), Micrococcus spp. (р < 0,001) и Bacillus spp. (р = 0,007).

Кластер 1

Кластер 2

Рис. 1. Иерархическая кластеризация результатов исследования по встречаемости микроорганизмов

60 50 40 30 20 10 0

I I I группа

II группа

Рис. 2. Частоты обнаружения

57

Посевина А.Н., Лебеденко А.А., Набока Ю.Л., Аверкина Л.А., Заруцкий С.А. МИКРОБИОТА КОЖИ ДЕТЕЙ С ОСТРОЙ КРАПИВНИЦЕЙ

100 80_ 60_ 40_

20_ 0_

M . I

Jiu

80 60 J 40 20 _| 0

I I I I I

S. aureus

Peptococcus spp.

I I I группа

I I II группа

Рис. 3. Частоты обнаружения

При сравнении частот обнаружения микроорганизмов (критерий Мак-Немара) у больных II группы в двух локусах (неизменный и пораженный участки кожи) наблюдали повышение изучаемого показателя для S. aureus (р = 0,002) и Peptococcus spp. (р = 0,023) (рис. 4).

Заключение

Проведенный кластерный анализ показал низкий уровень отличия спектров бактерий между контрольной группой и пациентами с крапивницей, включая неизмененные и пораженные участки, т.е. микробные паттерны кожи у здоровых детей и больных крапивницей схожи. Однако, установлены статистически значимые различия частот встречаемости микроорганизмов, верифицированных на коже детей I и II групп. На пораженном участке по сравнению с контролем выявлены различия по 7 таксонам микроорганизмов, на неизмененном - по 4 таксонам. Сравнение микробных спектров двух локусов у детей II группы выявило статистически значимые различия для 2 таксонов микроорганизмов. Выявленные изменения в микробиоте кожи детей с крапивницей предполагают введение в план терапии заболевания симбиотических препаратов.

Литература

1. Weyrich LS, Dixit S, Farrer AG, Cooper AJ, Cooper AJ. The skin microbiome: Associations between altered microbial communities and disease. Australas J Dermatol. 2015 Feb 25. doi: 10.1111/ajd.12253.

2. Findley K. et al. (2013) Topographic diversity of fungal and bacterial communities in human skin. Nature 498, 367-370.

3. Gioti A. et al. (2013) Genomic insights into the atopic eczemaassociated skin commensal yeast Malassezia sympodialis. MBio 4, e00572.

4. Alexander Salava and Antti Lauerma. Role of the skin microbiome in atopic dermatitis. Clinical and Translational Allergy 2014, 4:33.

5. Tilo Biedermann,* Yuliya Skabytska, Susanne Kaesler, and Thomas Volz . Regulation of T Cell Immunity in Atopic Dermatitis by Microbes: The Yin and Yang of Cutaneous Inflammation. Front Immunol. 2015; 6: 353.

6. Human Microbiome Project Consortium (2012) Structure, function andTdiversity of the healthy human microbiome. Nature 486, 207-214.

7. Yiyin Erin Chen and Cao Hensin. Skin microbiome: Current Perspectives and Future Challenges Capsule Summary. Journal of the American Academy of Dermatology, 01.07.2013, Volume 69, Issue 1, 143-155.e3 page.

8. Nakatsuji T, Chiang HI, Jiang SB, Nagarajan H, Zengler K, Gallo RL: The microbiome extends to subepidermal compartments of normal skin. Nat Commun 2013, 4:1431.

II группа

Рис. 4. Частоты обнаружения

9. Nina N. Schommer and Richard L. Gallo. Structure and function of the human skin microbiome. Division of Dermatology, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA, 660-668.

10. Kuehnert, M.J. et al. (2006) Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United States, 2001-2002. J. Infect. Dis. 193, 172-179.

11. Yockey L.J., Demehri S, Turkoz M, Turkoz A, Ahern PP, Jassim O, Manivas-agam S, Kearney JF, Gordon JI, Kopan R: The absence of a microbiota enhances TSLP expression in mice with defective skin barrier but does not affectthe severity of their allergic inflammation. J Invest Dermatol 2013, 133(12):2714-2721.

12. Wollenberg A, Feichtner K: Atopic dermatitis and skin allergies - update and outlook. Allergy 2013, 68(12):1509-1519.

13. Jagielski T, Rup E, Ziolkowska A, Roeske K, Macura AB, Bielecki J: Distribution of Malassezia species on the skin of patients with atopic dermatitis, psoriasis, and healthy volunteers assessed by conventional and molecular identification methods. BMC Dermatol 2014, 14:3.

14. Chen YE, Tsao H: The skin microbiome: current perspectives and future challenges. J Am Acad Dermatol 2013, 69(1):143-155.

15. Kong, H.H. et al. (2012) Temporal shifts in the skin microbiome associated with disease flares and treatment in children with atopic dermatitis. Genome Res. 22, 850-859.

16. Leung, D.Y. (2013) New insights into atopic dermatitis: role of skin barrier and immune dysregulation. Allergol. Int. 62, 151-161

17. Яловега Г.Э., Лебеденко А.А., Мальцев С.В., Калмыкова Т.С., Аверкина Л.А., Посевина А.Н., Фуник А.О., Семерник О.Е., Новиковский В.М., Моргуль Е.В. Особенности микроэлементного статуса у детей с острой крапивницей. Педиатрическая фармакология. 2016. Т. 13. № 2. С. 101-104.

18. Сизякина Л.П., Лебеденко А.А., Мальцев С.В., Посевина А.Н., Аверкина Л.А. Крапивница у детей: современный взгляд на проблему. Медицинский вестник Юга России. 2015. № 4. С. 5-13.

19. Микробиоценозы и здоровье человека. Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Караулов А.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С., Алешкин А.В., Несвижский Ю.В., Гостищев В.К., Дятлов И.А., Евсегнеева И.В., Фирстова В.В., Леванова Л.А., Кафарская Л.И., Амерханова А.М., Макаров О.В., Борисова О.Ю., Селькова Е.П., Лахтин В.М., Шемякин И.Г., Феклисова Л.В. и др. Москва, 2015.

20. Microbiota-Modulated Metabolites Shape the Intestinal Microenvironment by Regulating NLRP6 Inflammasome Signaling. Levy M, Thaiss CA, Zeevi D, Dohnalova L, Zilberman-Schapira G, Mahdi JA, David E, Savidor A, Korem T, Herzig Y, Pevsner-Fischer M, Shapiro H, Christ A, Harmelin A, Halpern Z, Latz E, Flavell RA, Amit I, Segal E, Elinav E - Cell - December 3, 2015; 163 (6); 1428-43.

21. Покатилов А.Б. Колонизация и адгезия микробами кожи больных хирургического стационара в экологически неблагополучной обстановке: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - Волгоград, 1993. - 24 с.

22. Меньшиков В.В. Методики клинических и лабораторных исследований. М., Лабора. 2009. 880с.

23. Murray PR, Rosental KS, Pfaller MA, Medical Microbiology 8-th edition (United States of America). Elsevier, 2015.

24. Ward J.H. 1963. Hierarchical grouping to optimize an objective function. J. Am. Stat. Assoc. 58:236-244.

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Посевина Aнастасия Николаевна e-mail: anastasia240890@rambler.ru

58