Биохимическая характеристика целлюлозоразлагающих бактерий гидротерм Хойто-Гол

УДК 577.222 © Е.С. Кашкак, Э.В. Данилова

БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЦЕЛЛЮЛОЗОРАЗЛАГАЮЩИХ БАКТЕРИЙ ГИДРОТЕРМ ХОЙТО-ГОЛ

Выявлены физиолого-биохимические характеристики целлюлозоразлагающих бактерий из проб матов гидротерм Хойто-гол. Показано, что исследуемые микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма.

Ключевые слова: целлюлозоразлагающие бактерии, колонии, физиолого-биохимические свойства

E.S. Kashkak, E.V. Danilova

BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF CELLULOSE-FERMENTING BACTERIA OF HYDROTERMS KHOITO-GOL

Physiological-biochemical characteristics of cellulose-fermenting bacteria from samples of mats of hydroterm Khoito-gol are revealed. It is shown that microorganisms are characterized by unequal ability to use various compounds of carbon for constructive and energetic metabolism.

Keywords: cellulose-fermenting bacteria, colonies, physiological-biochemical properties

Целлюлоза является самым распространенным углеводным биополимером на Земле, основными продуцентами которого служат высшие растения и зеленые водоросли. Столь большое количество целлюлозы в природе обусловливает важную роль разлагающих ее микроорганизмов в процессах минерализации и в круговороте углерода [1]. Целлюлозоразлагающие бактерии (ЦРБ) находятся в начале трофической цепи. Они гидролизуют полимерный органический субстрат целлюлозу, образуя растворимые органические соединения, используемые далее аэробными и анаэробными бактериями-деструкторами [2].

Целью данной работы было изучение физиолого-биохимических особенностей целлюлозоразлагающих бактерий в микробных сообществах гидротермы Хойто-Гол.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были три типа микробных матов гидротермы Хойто-Гол (Восточные Саяны): темно-зеленый, белый и черно-зеленый. Темно-зеленый и черно-зеленый маты состояли в основном из цианобактерий; белый мат был представлен бесцветными серными бактериями.

Минеральные источники Хойто-Гол расположены на конусе выхода реки Аршан (приток реки Хойто-Гол) в горной системе Восточных Саян. Хойто-Гол - это группа из пяти выходов термальных вод, температура которых варьирует от 30,5 до 34,40С с суммарным дебитом до 13 л/с. Источники расположены по одной линии, вниз по течению одноименной реки и удалены друг от друга на 50-100 м. Тип минеральных вод - термальный углекисло-азотный, гидрокарбонатно-натриево-кальциевый. Минерализация воды составляет ~0,6 г/дм3. Характерной особенностью воды источников Хойто-Гол является присутствие сероводорода - до 7,0 мг/л [3]

Учет численности ЦРБ, использующих в качестве основного источника углерода целлюлозу, проводили методом предельных разведений на элективной среде Пфеннига следующего состава (г/л): KH2PO4 - 0,3; MgCl22H2O - 0,3; NH4CI - 0,3; CaCl2 - 0.3; дрожжевой экстракт - 0,5. Рост ЦРБ учитывали визуально по разложению фильтровальной бумаги. Инкубировали при 300С [4].

Выделение чистых культур, полученных путем последовательных посевов предельными разведениями производилось на среде с субстратом натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) в количестве 3 г/л и с последующим выделением колоний на агаризованной среде Пфеннига. Чистоту выделенных культур микроорганизмов проверяли визуальным и микроскопическим контролем. Микроскопический контроль проводился с препаратами фиксированных окрашенных клеток с иммерсионной системой и с препаратами живых клеток при помощи световых микроскопов PZO (Польша) и Axiostar plus (Karl Zeiss), снабженного фазово-контрастным устройством и фотодокументирующей системой.

Культуральные и физиолого-биохимические свойства данных культур исследовали по стандартным методикам. Тест на каталазу проводили на предметном стекле, помещая каплю биомассы в каплю 3% перекиси водорода. О наличии каталазы судили по образованию пузырьков газа [5].

Результаты и обсуждение

В исследуемых матах источника Хойто-Гол численность бактерий варьировала от 100 до 1000 кл/мл. Максимальный рост ЦРБ был отмечен в пробах Ц2 (белый мат) и Ц3 (черно-зеленый мат). Консорциум накопительных культур состоял из спорообразующих и неспорообразующих форм. В нем присутствовали морфологически различающиеся палочковидные клетки, часть из которых имела споры (рис. 1).

Клетки изолированных культур: Ц1 - кокки диаметром до 0,83 мкм, Ц2 и Ц3 - прямые палочки толщиной 0,5-0,7 мкм и длиной 0,8-1,5 мкм (рис. 2). Грамотрицательные, неспорообразующие подвижные. Все культуры каталазоположительные, аэробы. Колонии бактерий круглые с выпуклым профилем и ровным краем 1,0-1,2 мм в диаметре с мелкозернистой структурой. Цвета колоний были молочными, кремовыми с различной консистенцией (табл. 1). Исследуемые микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма.

Таблица 1

Дифференцирующие свойства идентифицируемых бактерий

Свойства Ц 1 Ц2 Ц3

Описание пробы темно-зеленый мат белый мат черно-зеленый мат

Описание поверхностной колонии

Форма и поверхность Круглая, гладкая Круглая, гладкая Круглая, гладкая

Размер, мм 1,0-1,2 1,0-1,2 1,0-1,2

Цвет Молочный С желтоватым оттенком Молочный

Край, профиль Гладкий, выпуклый Гладкий, выпуклый Гладкий, выпуклый

Блеск и прозрачность Блестящая, непрозрачная Блестящая, непрозрачная Блестящая, непрозрачная

Поверхность Гладкая Гладкая Гладкая

Структура Мелкозернистая Мелкозернистая Мелкозернистая

Консистенция Вязкая, слизистая Плотная Плотная

Морфология клеток и цитология

Морфология Кокки Прямые палочки Прямые палочки

Размеры, мкм 0,6-0,9 0,5-0,7 х 0,8-1,2 0,5-0,7 х 1,0-1,5

Окраска по Граму - - -

Подвижность + + +

Эндоспоры - - -

Кислотоустойчивость - - -

Физиолого-биохимические свойства

Ксилоза + + +

Г люкоза + + +

Лактоза - + +

Мальтоза + + +

Рафиноза - - +

Г алактоза + + +

Фруктоза - + +

Сахароза - + +

Рамноза - - -

Целлобиоза + - -

Этанол - + +

Сорбит - - -

Г лицерин - - +

Маннит - - +

Дульцит - - +

Цитрат - - -

Лактат - - -

Пируват - + +

Ацетат - + +

Сукцинат - + +

Мочевина - - -

L-цистеин - - -

Казеинолитическая активность - - -

Амилолитическая активность - + +

Тест на каталазу + + +

Культура Ц1 использовала узкий спектр полимерных углеводных субстратов и сахаров: глюкозу, целлобиозу, ксилозу, мальтозу, галактозу. Не использовала натриевые соли органических кислот, спирты, белковые субстраты. Культура Ц2 росла на среде с пептоном и ксилозой, глюкозой, лактозой, мальтозой, галактозой, фруктозой, сахарозой, этанолом, а также с натриевыми солями пировино-градной, уксусной и янтарной кислот. Организм не использовал рафинозу, рамнозу, целлобиозу, многоатомные спирты, натриевые соли лимонной и молочной кислот. Культура Ц3 использовала в качестве единственного источника углерода многие углеводы, спирты и соли органических кислот, кроме рамнозы, целлобиозы, сорбита, лактата и цитрата натрия. Все выделенные культуры не усваивали азот мочевины и цистеина.

Для определения внеклеточных ферментов использовали следующие высокомолекулярные соединения: крахмал и казеин. Крахмал подвергался гидролитическому расщеплению под действием амилаз. Амилолитическая активность была выявлена в культурах Ц2 и Ц3, диаметр светлой зоны у которых достигал 5 мм. В культуре Ц1 гидролитического расщепления крахмала не наблюдалось. Для выявления протеолиза казеина использовали молочный агар. Отличительной особенностью всех изолятов является отсутствие роста на гидролизате казеина.

Г1

Рис. 2. Выделенные культуры микроорганизмов из проб матов Хойто-Г ол: А - культура Ц1; Б - культура Ц2;

В - культура Ц3.

Таким образом, определение физиолого-биохимических особенностей целлюлозоразлагающих бактерий в микробных сообществах гидротерм Хойто-Гол показало, что исследуемые микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма.

Литература

1. Жилина Т.Н. и др. Clostridium alkalicellum sp.nov. - облигатно алкалофильный целлюлозолитик из содового озера Прибайкалья // Микробиология. - 2005. - Т.74, №5. - С. 642-653.

2. http://www.inmi.ru\microbial_communities.psp

3. Геохимическая деятельность микроорганизмов гидротерм Байкальской рифтовой зоны / Б.Б. Намсараев, Д.Д. Бархутова, В.В. Хахинов и др. - Новосибирск: Гео, 2011. - 302 с.

4. Практикум по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. - М.: Изд-во МГУ, 1976. - 153 с.

5. Практикум по микробиологии / под ред. А.И. Нетрусова. - М.: Академия, 2005. - 608 с.

6. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхарда и др. - М.: Мир, 1984. - Т.2 - 327 с.

Кашкак Елена Сергеевна, аспирант, Бурятский государственный университет, 670000, Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а, klslena@yandex.ru

Данилова Эржена Викторовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатория микробиологии, Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047, Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6, т. 8(3012)434902

Kashkak Elena Sergeevna, postgraduate, Buryat State University, 670000, Ulan-Ude, Smolina St., 24a.

Danilova Erzhena Victorovna, candidate of biological sciences, senior researcher, Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 670047, Ulan-Ude, Sakhyanovoy St., 6

УДК 577.472(571.5) © О.В. Шаргаева, Е.С. Кашкак, Д.Д. Бархутова

ГИДРОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕСТООБИТАНИЙ АЭРОБНЫХ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ЧИСЛЕННОСТЬ

Работа выполнена при поддержке интеграционных грантов СО РАН№56 и 94, РФФИ 10-04-01185а

В термальных источниках на территории Бурятии и Монголии изучены физико-химические параметры в местах отбора проб для микробиологических исследований. Они характеризуются высокими температурами, щелочными значениями рН и содержат сероводород в форме сульфидных ионов. В микробных матах и илах гидротерм определена численность термофильных аэробных органотрофных бактерий.

Ключевые слова: термальные источники, термофильные аэробные органотрофные бактерии.

O.V. Shargaevа, E.S. Kashkak, D.D. Barkhutova

THE HYDROCHEMICAL CHARACTERISTICS OF AEROBIC THERMOPHYLLIC BACTERIA

HABITATS AND THEIR AMOUNT

In thermal springs of Buryatia and Mongolia physical and chemical parameters in places of sampling for microbiological researches have been studied. They are characterized by high temperatures, alkaline values of рН and contain hydrogen sulfide in the form of sulphidic ions. In microbial mats and sediments of hot springs the amounts of ther-mophyllic aerobic organotrophic bacteria are defined.

Keywords: thermal springs, thermophyllic aerobic organotrophic bacteria.

Естественными местообитаниями термофильных микроорганизмов в условиях современной биосферы являются горячие источники, глубоководные гидротермы, высокотемпературная подземная биосфера, а также экосистемы, связанные с деятельностью человека (компосты, угольные отвалы, метантенки) [1]. В формировании минеральных вод гидротерм важное значение имеет циркуляция воды, поступающая с поверхности. Взаимодействие термальных вод приводит к выщелачиванию вмещающих пород и насыщению их сопутствующими газами и веществами [2]. Г лубинные воды поступают в вышележащие горизонты, где в той или иной степени смешиваются с грунтовыми водами. Состав и температура термальных вод при выходе их на поверхность определяются при их смешивании с грунтовыми водами. Сочетание нескольких экстремальных факторов в условиях щелочных гидротерм обуславливает присутствие в микробных сообществах бактерий способных переносить как высокую температуру, так и высокие значения рН среды. Температура оказывает наибольшее влияние на видовое разнообразие микробных сообществ горячих источников [3]. Существуют различные классификации микроорганизмов по отношению к температуре [4].

Как правило, к термофилам относятся микроорганизмы, имеющие температурный оптимум развития при 55°С и выше. Одновременно с первичной продукцией в микробном сообществе идет деструкция органического вещества (ОВ), осуществляемая различными функциональными группами микроорганизмов. Деструкция обусловлена целой цепью превращений, организованной таким обра-