СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАЛИЧИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ У ЖИВОТНЫХ ПО ИЗМЕНЕНИЮ ЛЕЙКОГРАММЫ ПОСЛЕ УЛЬТРАЗВУКОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
METHOD OF DIAGNOSING PRESENCE OF DISEASE IN ANIMALS OF CHANGING LEUKOGRAM AFTER ULTRASONIC EXPOSURE

Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных с помощью ультразвуковых волн.
Известен способ диагностики различных заболеваний, связанный с оценкой механической резистентности эритроцитов с использованием ультразвукового воздействия на суспензию эритроцитов (ультразвуковой гемолиз эритроцитов).
Этот способ применяется для оценки патологических состояний организма по появлению на эритрограммах участков с высокоустойчивыми и низкоустойчивыми эритроцитами при различных патологиях.
Недостатком данного способа является оценка состояния по одному виду клеток [1].
С 80-х годов исследуются особенности акустического управления функциональным состоянием отдельных клеток, а также возможности пространственного перемещения клеток и частиц. Проверяются различные возможности применения ультразвука на практике, например, в микроскопии [2, 3], приготовлении образцов [4], биотехнологиях [2, 5-9], микромеханической обработке или космических технологиях [10, 11]. При работе с клетками в ультразвуковом (УЗ) поле необходимо учитывать основные биофизические механизмы взаимодействия ультразвука с биологическими объектами (кавитационный, тепловой и механический) для определения функционального состояния клеток. В зависимости от интенсивности УЗ может преобладать один из механизмов. В терапевтическом диапазоне интенсивностей необходимо обращать основное внимание на изменение функционального состояния клеток под действием механических факторов воздействия: попдермоторных сил, действующих в УЗ полях на клетки, микротечений. При повышении интенсивности УЗ рассматриваются тепловые факторы воздействия как преобладающие. При дальнейшем повышении интенсивности УЗ рассматриваются, в первую очередь, кавитационные эффекты, приводящие, как правило, к повреждению биологических систем по свободнорадикальному механизму и за счет образования мощных микротечений вблизи кавитирующих или осциллирующих микропузырьков. В медицинской лабораторной диагностике УЗ успешно применяется для ускорения проведения серологических реакций. Возможность перераспределения клеток в объеме под действием сил УЗ поля привело к развитию ряда новых методов концентрирования и разделения клеток в поле стоячей УЗ волны для медицинских, биотехнологических целей и для научных исследований в области биологии клетки.
Известны также способы неинвазивного диагностического исследования, в которых широко применяются методы ультразвуковой диагностики, отражающие структурные изменения в исследуемых тканях животных и человека.
Недостатками этих способов является разрешающая способность систем диагностики, ограниченная минимальной длиной волны, применяемой в аппаратуре.
В то же время вопросам функционального изменения нормальных и патологически измененных клеток под действием ультразвука в контексте использования этих изменений в качестве диагностического критерия уделено недостаточно внимания.
Степень выраженности данных изменений зависит от типа излучателя, интенсивности УЗ воздействия, времени воздействия.
2
Прототипом предлагаемого изобретения, наиболее близким ему по совокупности существенных признаков, является способ получения культуры клеток животных (SU 1597387 А1, опубл. 07.10.1990) при помощи воздействия на клетки ультразвуком с частотой 880 кГц и интенсивностью 0,02-0,08 Вт·см в течение 5-30 секунд с целью увеличения прироста клеточной массы.
Недостатком данного прототипа является невозможность проведения анализа функционального состояния всех типов клеток из-за последовательного воздействия ультразвука на разные типы клеток, находящиеся в питательных средах. При этом существенным отличием заявленного изобретения от указанного аналога является обработка проб бегущей, а не стоячей УЗ волной.
Целью предлагаемого изобретения является определение процентного соотношения клеток в образцах крови при оптимальных условиях воздействия непрерывным ультразвуком терапевтической интенсивности и частоты 880 кГц на живую систему/in vitro, приводящих к изменению лейкограммы, которая является основой для определения состояния животного (здоровое или больное).
Поставленная цель осуществляется путем нахождения оптимальных условий ультразвукового воздействия, приводящего к изменению лейкограммы больных животных и сохранению лейкограммы здоровых животных.
Показано, что в большинстве случаев получаемые эффекты воспроизводимы на практически всех тестируемых объектах. Результаты демонстрируют возможности и направления использования подобных методик в ветеринарной медицине.
Задачей заявляемого изобретения является создание способа экспресс-диагностики наличия заболевания у животных при помощи определения особенностей клеточного ответа на действие акустических (УЗ) волн терапевтической интенсивности in vitro. Выявление особенностей взаимодействия клеток крови больных и здоровых животных с УЗ безопасного диапазона: минимальной терапевтической интенсивности и предельно низкого времени экспозиции. Способ позволяет регистрировать наличие ухудшения гематологических показателей больных животных, а следовательно, диагностировать наличие или отсутствие заболевания по изменению лейкограммы, вызванному действием ультразвука определенной частоты и интенсивности на клетки крови.
2
Указанная задача осуществляется тем, что на образцы крови объемом от 1 мл до 1,5 мл, помещенные в кювету, воздействуют непрерывной бегущей ультразвуковой волной частотой 880 кГц интенсивностью от 0,05 до 0,1 Вт/см с экспозицией воздействия на кровь животных от 15 с - 30 с. Обработку образцов крови осуществляют в абсолютно одинаковых условиях, поддерживают постоянную температуру образцов в кюветах с проточным охлаждением, а также проводят анализ морфологического состояния клеток методами световой микроскопии. Ультразвуковое воздействие производится одновременно на все типы клеток крови различных животных, находящиеся в одинаковой среде культивирования. Это позволяет наблюдать изменения в лейкограмме здоровых и больных животных и по этим изменениям делать оценку состояния животных.
Заявленный способ осуществляется следующим образом.
SATA
2
x
х
Воздействовали ультразвуком in vitro (фиг. 1). Экспозиция УЗ: время от 15 с до 30 с, I - средняя по пространству и времени интенсивность - от 0,05 до 0,1 Вт/см, частота 880кГц. Аппараты: УЗТ - 1-01Ф; УЗТ-5 и УЗТ-1.02С. Бегущая УЗ волна, режим непрерывный. Кровь брали из подкожной вены предплечья у кошек, собак, кроликов, яремной вены лошадей натощак в утренние часы. Кровь забирали в ветеринарной клинике во время ежегодного контроля здоровья, а также у животных с выявленными патологиями. Транспортировку образцов осуществляли при температуре 0-4°C без доступа воздуха для стабилизации процессов свободнорадикального окисления и приступали к апробации способа. От лабораторных и мелких домашних животных систематически получать большой объем крови при развернутой серии биофизических экспериментов для достоверной статистики считаем негуманно, поэтому была специально разработана и апробирована методика озвучивания образцов минимально допустимого объема. Для каждого объема крови подбиралась экспозиция таким образом, чтобы получались сопоставимые результаты. Образцы крови от 1,0-1,5 мл (собаки, кошки, лошади) озвучивались в абсолютно одинаковых условиях (площадь излучателя, охлаждение, циркуляция жидкости). Ультразвуковое воздействие на клетки крови, находящейся в термостатируемой кювете, осуществлялось с помощью терапевтического излучателя. Стенки кюветы выполнены из пластика или пластмассы, но могут быть изготовлены из любых, проводящих ультразвук, материалов. В качестве охлаждающей жидкости применялась непрерывно циркулирующая дистиллированная вода (т.н. «проточное охлаждение») (фиг. 2). Результат воздействия УЗ на клетки сразу же наблюдали в световой микроскоп. Число клеток в единице объема крови определяли с помощью камеры Горяева и светового микроскопа. Делали мазки и окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали (микроскоп «Микмед-5», объектив 100/1,25, окуляр 10/18). Подсчет лейкоцитов вели по линии «Меандра»: 3-5 полей зрения вдоль края мазка, 3-5 полей зрения под прямым углом к середине мазка, потом 3-5 полей зрения параллельно краю мазка и вновь под прямым углом к краю мазка. Так продолжали до тех пор, пока не было подсчитано 100 целых клеток [12]. Считали все лейкоциты, находящиеся в 25 больших квадратах, содержащих по 16 малых квадратов (т.е. в 400 квадратах). Для расчета в 1 мл использовали формулу:
где
X - количество лейкоцитов в 1 мл крови; M - количество лейкоцитов, подсчитанное в 25 квадратах; 20 - разведение крови; 400 - количество квадратов [13]. Лейкограмма отражает соотношение между различными видами лейкоцитов периферической крови и в клинической практике выражается в процентах.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверность различий средних значений определяли, используя парный t-критерий Стъюдента; достоверными считали различия при р<0,05.
В результате данного этапа работы была отработана оптимальная схема «озвучивания» крови in vitro. Были определены восприимчивость и резистентность клеток крови здоровых и больных животных к УЗ воздействию, а также отслежены возможные изменения жизнеспособности клеток крови и гематологических показателей в поле бегущей ультразвуковой волны.
Изменение лейкограммы
2
2
При обработке крови здоровых животных минимальной терапевтической интенсивностью 0,05 Вт/см от 5 с до 30 с лейкограмма меняется незначительно (табл. 1, 2). В крови больных может отмечаться значительное уменьшение числа лейкоцитов в поле зрения мазков уже после 10-15-секундного воздействия (табл. 3) или резкое изменение процентного соотношения в лейкограмме (кошки №3, 4; лошадь №2). Повышение времени воздействия до 20-30 с влечет за собой появление поврежденных клеток, частичную их гибель. Дальнейшее увеличение экспозиции (45-60 с) приводит к «съеживанию» клеток, появлению клеточных фрагментов, участков из оформленных белковых масс или нетипируемых клеток, лизису клеток, а также скоплений голоядерных элементов (Табл. 3-5). У здоровых животных такие изменения начинают регистрироваться лишь при УЗ интенсивности, превышающей 0,2 Вт/см, и времени экспозиции не менее 30 с.
2
Дальнейшее последовательное увеличение интенсивности действующего ультразвука от 0,1 до 2,0 Вт/см приводит к экспоненциальному уменьшению числа жизнеспособных клеток. При росте экспозиции озвучивания от 1 до 5 мин в поле зрения микроскопа обнаруживаются морфологически поврежденные комплексы клеток, и отмечается прогрессивно возрастающий цитоцидный эффект. Изменения в лейкограммах различных животных зависят от интенсивности УЗ волны, времени экспозиции, состояния здоровья и, в значительно меньшей степени, от вида животного. Этиология заболевания и степень его проявления никак не влияют на особенности клеточного ответа. Однако стадия развития патологического процесса в ряде случаев (Табл. 3, 4: собаки №1, 2; кошка №5) может быть выявлена при помощи предлагаемой методики.
Выводы.
1. Отработана схема УЗ обработки клеток крови в фиксированном и термостатируемом объеме.
2
2. УЗ интенсивности 0,05 Вт/см является «безопасным» для клеток крови здоровых животных: не влияет на жизнеспособность и лейкограмму.
2
3. Диапазон интенсивностей 0,05-0,1 Вт/см приводит к уменьшению числа жизнеспособных клеток крови больных животных. Степень выраженности изменений зависит главным образом от интенсивности УЗ волны, времени экспозиции и состояния здоровья. Этиология заболевания на особенности клеточного ответа не влияет. При значительном росте экспозиции отмечается прогрессивно возрастающий цитоцидный эффект.
2
4. При наличии заболеваний инвазивной и неинвазивной этиологии у животных разного вида, пола и возраста после кратковременной, до 30 с, обработки крови УЗ минимальной терапевтической интенсивности 0,05 Вт/см достоверно разнонаправлено необратимо изменяется лейкограмма (процентное соотношение лейкоцитов): уменьшается число лимфоцитов, количество нейтрофилов может как увеличиваться, так и уменьшаться. Может наблюдаться лейкопения, лизис цитоплазматической мембраны или клеток полностью, а также деструкция клеток. Изменение лейкограммы может являться диагностическим критерием при выявлении различных патологических состояний животных.
5. Разработанный способ может быть применен в любой диагностической лаборатории благодаря простоте осуществления, доступности и малым временным затратам на его выполнение.
Литература
1. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред проф. Кост Е.А., Москва, «Медицина», 1975.
2. Hertz Н.М. Standing-wave acoustic trap for no intrusive positioning of microparticles. J Appl Phys 78(8), (1995), 4845-4849.
3. Wu J. Acoustical tweezers. J Acoust Soc Am 89(5), (1991) - P. 2140-2143.
4. Holwill I.L., Davies G.B., Titchener-Hooker N.J., Hoare M.. Particle manipulation by ultrasonic standing wave field to complement dynamic light scattering experiments. Part Syst Charact 12(3), (1995), 139-147.
5. Takeuchi M., Yamanouchi K.. Ultrasonic micromanipulation of small particles in liquid. Jpn J Appl Phys (Part 1), 33(5B), (1994). - P. 3045-3047.
6. Takashi M., Tetsuo O. Ultrasonic Radiation - Novel Principle for Microparticle Separation. ANALYTICAL SCIENCES. - 2001, vol. 17.
7. T.N. Pashovkin, D.G. Sadikova, M.S. Pashovkina, G.V. Shil′nikov // Use of ultrasonic standing wave in biological studies and cell technologies. // Bull Exp Biol Med 144(1):118-22 (2007), PMID 18256768.
8. Т.N. Pashovkin, D.G. Sadikova // Cell Exfoliation, Separation, and Concentration in the Field of a Standing Ultrasonic Wave // Acoustical Physics, 2009, Vol. 55, No. 4-5, pp. 584-593.
9. D.G. Sadikova, T.N. Pashovkin // Cell concentration and separation in the field of a standing ultrasonic wave for medicine and biotechnology. // Open Journal of Biophysics, 2013, 3, p. 70-75 (http://www.script.org/journal/ojbiphy)
th
10. Kozuka Т., Tuziuti Т., Mitome H., Fukuda T. One-dimensional transportation of particles using an ultrasonic standing wave. Proc MHS ′95 - IEEE 6 Int Symp on Micro Machine and Human Science, 1995 - P. 179-185. ISBN 0-7803-2676-8.
th
11. Kozuka Т., Tuziuti Т., Mitome H., Fukuda T. Non-contact micromanipulation using an ultrasonic standing wave field. Proc IEEE 9 Ann Int Workshop on Micro Electro Mechanical Systems, 1996. P. 435-440. ISSN 1084-6999.
12. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса - М. Витебск, 1996.
13. Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. и др. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии. - М.: Агропромиздат, 1985. - С. 59-64.
14. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у животных. / Н.А. Любин, Л.Б. Конова. Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у сельскохозяйственных и лабораторных животных при патологиях. Ульяновск: ГСХА, 2005. - 113 с.