Систематика и классификация прокариот, основанная на применении молекулярнобиологических и филогенетических методов

На 20-е сутки опыта у животных этой группы в пришеечной области сохранялся локальный воспалительный процесс, который по своему характеру не отличался какими-либо особенностями. В основном он затрагивал слизистую оболочку прилегающей к зубу десны, располагаясь между волокнами. В десне воспалительная реакция обнаруживалась на ограниченном фрагменте, непосредственно примыкающем к десневому карману. По сравнению с животными контрольной группы деструктивные изменения затрагивали в основном находящиеся непосредственно в зоне воспаления коллагеновые волокна. Выявлялись клетки, характеризующиеся гетероморфизмом, причем сегментоядерные лейкоциты локализовались преимущественно в десневом кармане. За пределами зоны, связанной с десневым карманом, количество клеточных элементов заметно уменьшалось. Десневой карман имел вид узкого щелевидного промежутка между пришеечной частью корня и эпителием десны. Массивного обнажения подлежащих тканей, которое имело место у животных контрольной группы, в данной группе не наблюдалось. Признаков некротических изменений у животных данной группы в этот срок ни в одном случае не обнаруживалось.

На 30-е сутки эксперимента у животных опытной группы преобладали репаративные процессы. Толщина эпителия, прилежащая к дес-невому карману, заметно уменьшилась. Эпителиальные сосочки эпителия десны в основном были короткими и мало чем отличались от таковых в нормальном эпителии десны. Эпителиальное прикрепление хотя и нарушено, однако пласт эпителия достаточно плотно прилегал к прише-ечной части зуба. В расположенной здесь подлежащей соединительной ткани обнаруживались остаточные явления воспаления. Волокнистые структуры в основном имели характерную окра-

ску и расположение. В одном случае отмечалось увеличение волокнистых структур в пришееч-ной зоне. За пределами зоны травмы ткани десны полностью восстанавливали свою структуру. В костной ткани альвеолы также отмечена активная репаративная регенерация. Остеобласты располагались на периферии костных структур. Здесь же отмечено образование костных балочек, которые утолщались, и между ними появлялись анастомозы. Промежутки между балочками заполнены рыхлой тканью, богатой клеточными элементами. Между костными балочками располагались гиперемированные кровеносные сосуды. В некоторых случаях костные балочки почти сливались между собой. Наряду с регенерацией отмечены также процессы перестройки костной ткани и восстановления типичной пластинчатой кости.

Заключение. Применение экспериментальной эубиотической суспензии 5. salivarius и V. рати1а для лечения крыс с лигатурным пародон-титом продемонстрировало возможность колонизации слизистой оболочки полости рта, что констатировали более чем у половины крыс, взятых в эксперимент, причем колонизирующая ассоциация эубиотических штаммов стабильно сохранялась в течение недели после завершения приема взвеси животным.

Таким образом, колонизация слизистой оболочки десен представителями стабилизирующей микробной флоры - штаммами вейллонелл и слюнных стрептококков оказывает благоприятное влияние на динамику цитоморфологиче-ских изменений в тканях пародонта при экспериментальном пародонтите у крыс линии Вистар, что позволяет обосновать целесообразность создания соответствующего биопрепарата - эубиотика и изучить перспективы его применения для лечения пародонтита у человека.

СИСТЕМАТИКА И КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОКАРИОТ, ОСНОВАННАЯ НА ПРИМЕНЕНИИ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков

Омская государственная медицинская академия

С самого начала развития микробиологии как науки изучение фенотипических признаков микроорганизмов применялось для идентификации, систематики и классификации как в прикладном, так и в фундаментальном аспектах.

Наиболее полно задача быстрой идентификации прокариот решается с помощью «Определителя бактерий Берджи» (Bergey's Manual of

Determinative Bacteriology), выпускаемого Американским обществом микробиологов (American Society for Microbiology - ASM). В девятом издании этого документа, вышедшего в 1984-1989 гг. в 4 томах, все обнаруженные организмы, отнесенные в царство Prokaryotae, разделены на 33 группы. Уже в нем совершен отказ от построения классической иерархической системы

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2013. № 2 (9). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК

классификации. Она заменена списком упомянутых выше групп и сохранилась только фрагментами. Ценность «Определителя бактерий Берджи» в том, что он представляет собой наиболее полную сводку известных бактериальных форм и самое современное пособие для идентификации бактерий.

Вопросы систематики и классификации прокариот наиболее полно отражены в «Справочнике Берджи по бактериологической систематике» (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology). Последнее издание состоит из пяти томов, вышедших в период с 2001 (Том I - «The Archaea and the deeply branching and phototrophic Bacteria») по 2011 (Том V - «The Actinobacteria») годы. В 2005 году в трех книгах вышел Том II - «The Proteobacteria». Это издание отличается от первых, так как классификация высших таксонов прокариот основана на изучении филогенетических отношений при изучении гена 16S рибосомной РНК (16S рРНК), а не на фенотипических признаках, как было ранее.

Применение данного подхода стало возможным благодаря тому, что во второй половине XX века в арсенале ученых-микробиологов появились молекулярно-биологические методы (полимераз-ная цепная реакция, секвенирование) и филогенетический анализ. Внедрение этих методов позволило изучать генотипические характеристики представителей микромира. Определение филогенетического положения прокариот, в том числе «некультивируемых», развивалось на основе изучения нуклеотидных последовательностей 16S рРНК. Этот панбактериальный ген присутствует у всех прокариот, определение его первичной структуры позволяет изучать степень гомологии микроорганизмов, строить филогенетические деревья и изучать их эволюционные связи. Изучение структуры генов 16S рРНК (прокариот) и 18S (эукариот) позволило провести разделение клеточных форм жизни на три царства - Archaea, Eukaria и Bacteria (Woese et al., 1990).

Еще в начале 1990-х годов редакцией Bergey's Manual Trust при подготовке второго издания «Справочника Берджи по бактериологической систематике » была предпринята попытка для разработки и создания классификации, которая отражала бы филогению прокариот, в соответствии с анализом структуры нуклеотидных последовательностей 16S рДНК типовых штаммов, видов и родов. В результате этой работы появилась «Таксономическая схема прокариотов Руководства Берджи, систематики бактерий, второго издания, редакции 5,0. Май 2004» (Garrity G. M., Bell J. A. and T. G. Lilburn. Taxonomic outline of the procaryotes Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition, Release 5,0. May 2004).

Следующим этапом стало появление «Таксономической Схемы Бактерий и Архей, Редакция 7.7, март 2007 (Taxonomic Outline of the Bacteria and Archaea, Release 7.7 March 6, 2007, далее по

тексту - «TOBA 7.7»). Материалы, представленные в этой схеме, были получены при секвениро-вании полноразмерных геномов прокариот. Этому предшествовали организация крупномасштабных проектов по полногеномному секвенированию всех типовых штаммов прокариот, обсуждение нынешнего толкования таксономических аспектов Правил Бактериологического Кодекса (Rules of the Bacteriological Code) и составление «краткого списка» коллекций культур микроорганизмов, которые могли бы служить источником для штаммов в рамках этого проекта.

Новая Редакция отличается от предыдущих тем, что были решены проблемы, возникающие при наличии синонимов, за счет определения значимости и приоритетности таких категорий, как базоним (basonym), синоним (ранний гомотипич-ный и гетеротипичный, поздний) и новая комбинация «comb. nov.». В настоящее время примерно 17,5 % от валидированных названий видов бактерий и архей являются синонимами. Небольшое количество (<2 %) типовых штаммов известны под тремя или более именами. Количество уникальных биологических объектов (прокариот), вошедших в «TOBA 7.7», составляет 7031, при этом одно имя имеют - 5965, два имени - 930, три - 123, четыре - 10, и 1 микроорганизм имеет пять имен.

Очень важно, что в «TOBA 7.7» включены имена геномых проектов и она ориентирована на данные, полученные при изучении полных геномов прокариот. «TOBA 7.7» также отличается от более ранних Редакций тем, что в ней представлен только один депонированный штамм и соответствующая последовательность гена 16S рРНК. Создатели «TOBA 7.7» преобразовали RDP (Ribosomal Database Project) идентификаторы для автоматического выравнивания последовательностей 16S рРНК, что было использовано при создании и поддержании таксономии.

Были также включены имена идентификаторы (name-ids) - NamesforLife (N4Lids) с целью обеспечить прямые ссылки на контент, предоставляемый в рамках этого проекта. Это позволяет получать текущие данные, а также связанные с ними понятия, имена и термины в режиме реального времени через доступные для пользователя Интернет-ресурсы. N4Lids - это цифровые идентификаторы объекта (DOIs), которые позволяют получать полную информацию о номенклатуре и таксономии прокариот, а также о членах более высоких таксонов, дополнительную информацию об идентификации штаммов, последовательностях и другую информацию о типовых штаммах и высших таксонах. Индекс N4Lids, стоящий перед «DOI:», решает задачу выхода на веб-страницы, которые являются частью Редакции 6.0 Таксономической Схемы (Release 6.0 of the Taxonomic Outline).

В соответствии с «TOBA 7.7» два домена (domain) прокариот подразделены на 27 отделов

(phylum), 2 из которых находятся в пределах Archaea, и 25 отделов образуют домен Bacteria (рис. 1).

«TOBA 7.7» содержит установленные и общепринятые имена видов и высших таксонов бактерий и архей по состоянию на 1 октября 2006 года, в том числе все эти имена включены в списки Validation Lists № 111.

«TOBA 7.7» незначительно отличается от других документов, содержащих информацию о номенклатуре прокариот. В ней подвид не рассматривается как отдельный уровень в таксономической иерархии, так как это приведет к переоценке истинного количества видов.

Особое внимание уделяется оценке качества применяемых полногеномных последовательностей. Изучение геномных баз данных «GOLD», «GCAT» и «Entrez» показал, что на данный момент опубликованы 973 (703 экземпляра) завершенных или текущих геномных проекта, которые отображают валидированные имена бактерий или архей. Однако из этих геномных проектов только в 285 изучались типовые штаммы.

В «TOBA 7.7» использован американский стиль для представления латинизированных имен, в котором все имена выделены курсивом независимо от ранга таксона. В схеме представлены наименования прокариот, которые были включены в «Утвержденные списки бактериальных имен» (Approved Lists of Bacterial Names), опубликованные в 1980 году, а также названия видов, опубликованных в International Journal of Systematic Bacteriology (в настоящее время International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology), или появилось в одном из валидационных списков этого журнала.

Важным качеством этого документа является то, что можно получить дополнительную информацию о таксономических названиях, таксонах

и публикациях валидировавших названий видов прокариот через проект «Names for Life» с помощью различных инструментов, решаемых с применением DOIs. Доступ к этим данным осуществляется с персонального компьютера с предварительной установкой плагина доступа браузера Firefox. Программа поддерживает прямой ввод строки DOI в навигационной панели. Для других браузеров пользователи могут использовать сервер DOI прокси (например, International DOI Foundation's с использованием префикса http://dx.doi.org/ с последующим N4Lid (например, 10.1601/nm.5468) или ручной прокси-сервер (http://hdl.handle.net/ с последующим введением в поисковую строку N4Lid. Например: N4Lid DOI: 10.1601/nm.3093 для Escherichia coli.

В заключение хочется сказать, что за последние годы с момента издания Таксономической Схемы Бактерий и Архей Редакции 7.7 в 2007 году было описано много новых видов микроорганизмов, осуществлено полногеномное секвени-рование типовых штаммов прокариот, получены другие важные данные. Все это может существенно изменить наше представление о таксономии и классификации прокариот в ближайшее время.

Кафедрой микробиологии, вирусологии с курсом иммунологии ГБОУ ВПО ОмГМА подготовлено на основании ФГОС ВПО и издано учебное пособие «Систематика и классификация прокариот, основанная на молекулярно-биологических и филогенетических методах». Целью обучения по данному учебному пособию является получение комплекса знаний о классификации, таксономии, идентификации, номенклатуре микроорганизмов, применение молекулярно-биологических методов и филогенетического анализа в систематике и классификации прокариот, основанных на изучении генотипических характеристик микроорганизмов.