БИОРАЗЛАГАЕМАЯ МЕДИЦИНСКАЯ КЛЕЯЩАЯ ИЛИ ГЕРМЕТИЗИРУЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ
BIODEGRADABLE MEDICAL ADHESIVE OR SEALANT COMPOSITION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к биоразлагаемой медицинской клеящей или герметизирующей композиции, содержащей окисленный гликозаминогликан, включающий формильную группу, и полиамин.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Биологические клеящие или герметизирующие вещества применяют для соединения биологических тканей или нанесения покрытия на ткани во время хирургических операций или применяют в качестве кровеостанавливающих агентов (вызывающих гемостаз агентов), агентов, блокирующих ток физиологических жидкостей и крови, или подобных агентов. Биологические клеящие или герметизирующие вещества должны обладать биологической совместимостью, поскольку они контактируют с кожей, не должны оказывать токсического действия на организм, должны быть биоразлагаемыми и не должны препятствовать выздоровлению (восстановлению организма).
Применяемые в настоящее время в медицинской практике медицинские клеящие материалы включают цианоакрилаты, фибриновые клеи, желатиновые клеи и полиуретаны. Медицинский клей для тканей на основе октилцианоакрилата, коммерчески доступный под торговым наименованием "Dermabond", который поставляла Closure Medical Corp., США, был разрешен к продаже в ЕС в августе 1997 году и был разрешен для использования Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США в 1998 году. Однако клеящие вещества на основе цианоакрилата могут препятствовать заживлению ран, поскольку образуемые ими твердые продукты не обладают гибкостью и мягкостью и легко превращаются в чужеродные материалы, поскольку они плохо разлагаются в организме и, следовательно, подвергаются инкапсуляции. Кроме того, фибриновые клеи вследствие их достаточно низкой адгезионной прочности могут вызывать отделение образующихся фибриновых сгустков от тканей, а также могут быть небезопасными в отношении возникновения вирусной инфекции, поскольку они представляют собой материалы, получаемые из крови.
Кроме перечисленных выше медицинских клеящих веществ, в корейской патентной публикации KR 10-2009-0083484 рассмотрено двухкомпонентное клеящее вещество для медицинского применения (наименование продукта: LYDEX), содержащее модифицированный альдегидом порошок декстрана и порошок ε-поли-L-лизина; это клеящее вещество было получено лиофилизацией и последующим механическим измельчением. Это двухкомпонентное клеящее вещество отличается тем, что является медицинским клеящим веществом порошкового типа, но при этом для разложения геля требуется относительно длительный период времени, и рассматриваемое вещество не обеспечивает требуемого влагопоглощающего действия. Таким образом, все еще имеется необходимость создания новых медицинских клеящих веществ, обладающих улучшенными свойствами с точки зрения продолжительности разложения, адгезионной прочности и влагопоглощающей способности.
В настоящем описании упоминаются различные статьи и патентные документы, а также приводятся цитаты из них. Содержание цитируемых статей и патентных документов полностью включено в настоящее описание посредством ссылки, и ниже более подробно рассмотрена область техники, к которой относится настоящее изобретение, а также более подробно рассмотрено само изобретение.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения попытались исследовать и создать биоразлагаемые медицинские клеящие и герметизирующие вещества, которые отличались бы достаточной прочностью адгезии, образовывали покрытие и осуществляли гемостаз в тех участках организма, в которых присутствуют физиологические жидкости и кровь; могли бы поглощать гораздо большее количество влаги по сравнению с другими биоразлагаемыми полимерами; и были бы способны к саморазложению в организме. В результате исследований авторами настоящего изобретения было обнаружено, что эффективное склеивание, заполнение, образование покрытия, противоадгезионное действие, нанесение раневого покрытия и гемостаз в биологических тканях могут быть достигнуты при использовании гликозаминогликана, подвергнутого окислению посредством введения формильной группы, совместно с полиамином, что, таким образом, привело к созданию настоящего изобретения.
Один из аспектов настоящего изобретения относится к медицинскому клеящему или герметизирующему веществу (или медицинской клеящей или герметизирующей композиции).
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу обеспечения склеивания, заполнения, нанесения покрытия, создания противоадгезионного действия, образования раневого покрытия или осуществления гемостаза на биологических тканях.
Для лучшего понимания других задач и полезных эффектов настоящего изобретения ниже приведено сопровождаемое графическими материалами подробное раскрытие изобретения, а также пункты формулы изобретения.
Техническое решение
Один из аспектов настоящего изобретения относится к биоразлагаемому медицинскому клеящему или герметизирующему веществу (или медицинской клеящей или герметизирующей композиции), включающему:
(a) первый компонент, содержащий окисленный гликозаминогликан, получаемый окислением посредством введения формильной группы; и
(b) второй компонент, содержащий полиамин, включающий две или более аминогруппы, причем рН второго компонента в водном растворе составляет от 8,5 до 11,0.
Другой аспект настоящего изобретения относится к биоразлагаемому медицинскому клеящему или герметизирующему веществу (или медицинской клеящей или герметизирующей композиции), включающему:
(а) первый компонент, содержащий окисленный гликозаминогликан, получаемый окислением посредством введения формильной группы; и
(b) второй компонент, содержащий полиамин, включающий две или более аминогруппы, причем рН второго компонента в водном растворе составляет от 8,5 До 11,0,
причем при смешивании первого и второго компонентов молярное отношение формильная группа / аминогруппа составляет от 0,1 до 500.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу склеивания, заполнения, нанесения покрытия, создания противоадгезионного действия, образования раневого покрытия или осуществления гемостаза на биологических тканях, причем способ включает этап нанесения биоразлагаемого медицинского клеящего или герметизирующего вещества (или медицинской клеящей или герметизирующей композиции) по пункту 1 на биологические ткани, нуждающиеся в склеивании, заполнении, нанесении покрытия, противоадгезионном действии, раневом покрытии и гемостазе.
Авторы настоящего изобретения попытались исследовать и создать биоразлагаемые медицинские клеящие и герметизирующие вещества, которые отличались бы достаточной прочностью адгезии, образовывали покрытие и осуществляли гемостаз в тех участках организма, в которых присутствуют физиологические жидкости и кровь; могли бы поглощать гораздо большее количество влаги по сравнению с другими биоразлагаемыми полимерами; и были бы способны к саморазложению в организме. В результате исследований авторами настоящего изобретения было обнаружено, что эффективное склеивание, заполнение, образование покрытия, противоадгезионное действие, нанесение раневого покрытия и гемостаз в биологических тканях могут быть достигнуты при использовании гликозаминогликана, подвергнутого окислению посредством введения формильной группы, совместно с полиамином.
В настоящем описании термины "медицинское клеящее или герметизирующее вещество" и "медицинская клеящая или герметизирующая композиция" используются взаимозаменяемо.
Как подтверждено приведенными ниже примерами, композиция согласно настоящему изобретению отличается улучшенными параметрами продолжительности гелеобразования, адгезионной прочности и влагопоглощающей способности по сравнению с существующим двухкомпонентным медицинским клеящим веществом (LYDEX) (см Таблицы 5-7) и обладает усиленным гемостатическим (кровоостанавливающим) действием по сравнению с существующим гемостатическим агентом (Arista™ AH) (см. Фиг. 12). Эти результаты показывают, что композиция согласно настоящему изобретению, которая содержит комбинацию из первого компонента и второго компонента, имеет физические свойства, прекрасно подходящие для применения в медицине, такие как обеспечение склеивания, заполнения, нанесения покрытия, противоадгезионного действия, образования раневого покрытия и обеспечение гемостаза в отношении биологических тканей, и, таким образом, композиция согласно настоящему изобретению может найти применение в области медицины.
В качестве первого компонента композиция согласно настоящему изобретению содержит окисленный гликозаминогликан. Термин "окисленный гликозаминогликан" означает, что гликозаминогликан был окислен посредством введения в него формильной группы (-СНО). Гликозаминогликан, который представляет собой полисахарид, содержащий повторяющуюся дисахаридную структуру, включающую гексозамин, отличается от глюкана, состоящего из моносахаридов, соединенных О-гликозидными связями.
Формильная группа может быть введена при помощи окисления перйодной кислотой. Например, гликозаминогликан может быть окислен перйодной кислотой или солью перйодной кислоты с образованием окисленного гликозаминогликана, в который вводят подходящее количество (например, 0,01-0,95) формильных групп на единицу безводной глюкозы (остаток сахара).
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, степень окисления окисленного гликозаминогликана вычисляют в соответствии со следующим уравнением:
,
получая величину 10-99,5%. Если окисленный гликозаминогликан, имеющий такую степень окисления, применяют в комбинации со вторым компонентом, то он может быстро поглощать кровь и физиологические жидкости организма, что в течение короткого времени приводит к образованию геля из крови и физиологической жидкости.
В одном из конкретных примеров осуществления степень окисления окисленного гликозаминогликана составляет от 10 до 60%, в другом конкретном примере осуществления она составляет от 10 до 55%, в ином конкретном примере осуществления она составляет от 10 до 50%, в дополнительном конкретном примере осуществления она составляет от 10 до 45%, и в другом дополнительном конкретном примере осуществления она составляет от 10 до 40%. Например, первый компонент содержит по меньшей мере один тип окисленного гликозаминогликана, и в тех случаях, в которых этот тип окисленного гликозаминогликана представляет собой окисленную гиалуроновую кислоту, степень окисления окисленной гиалуроновой кислоты может составлять от 10 до 20%.
Степень окисления гликозаминогликана может быть определена титрованием NaOH. Например, готовят раствор гидроксиламина гидрохлорида концентрацией 0,25 моль/л, смешивая 17,5 г гидроксиламина гидрохлорида и 6 мл 0,05%-ного метилоранжа в 994 мл дистиллированной воды, и затем титруют до рН 4. После этого 0,1 г окисленного гликозаминогликана растворяют в 25 мл раствора и титруют раствором гидроксида натрия концентрацией 0,1 моль/л до рН 4, и затем вычисляют степень окисления (%) гликозаминогликана в соответствии со следующим уравнением:
.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, окисленный гликозаминогликан содержит от 0,01 до 0,95 формильных групп на единицу безводной глюкозы (остаток сахара).
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, окисленный гликозаминогликан выбран из группы, состоящей из окисленной гиалуроновой кислоты, окисленного хондроитинсульфата, окисленного хондроитина, окисленного дерматансульфата, окисленного гепарансульфата, окисленного гепарина и окисленного кератансульфата.
Согласно настоящему изобретению, способность к гелеобразованию, продолжительность пребывания в гелеобразном состоянии, и эластичность геля, образуемого клеящей/герметизирующей композицией, можно регулировать, применяя гликозаминогликан соответствующей молекулярной массы.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, молекулярная масса гликозаминогликана, используемого для получения окисленного гликозаминогликана, составляет от 1000 до 5000000. Например, молекулярная масса гликозаминогликана, используемого для получения окисленного гликозаминогликана, может составлять от 10000 до 4000000, от 50000 до 3500000, от 100000 до 3500000, от 100000 до 3000000, от 100000 до 2500000, от 100000 до 2000000 или от 100000 до 1600000.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, первый компонент содержит окисленную гиалуроновую кислоту, молекулярная масса которой составляет от 100000 до 2000000. Согласно одному из примеров осуществления, молекулярная масса окисленной гиалуроновой кислоты составляет от 100000 до 1600000.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, первый компонент содержит два или более типа окисленных гликозаминогликанов.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, массовое отношение этих окисленных гликозаминогликанов составляет 1:0,5-5. В одном из конкретных примеров осуществления массовое отношение окисленных гликозаминогликанов составляет 1:0,5-4, в другом конкретном примере осуществления оно составляет 1:0,5-3,5, в ином конкретном примере осуществления оно составляет 1:0,5-3, в дополнительном конкретном примере осуществления оно составляет 1:0,5-2,5, в другом дополнительном конкретном примере осуществления оно составляет 1:0,5-2, и в другом конкретном примере осуществления оно составляет 1:0,5-1,5.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, два или более типа окисленных гликозаминогликанов представляют собой окисленную гиалуроновую кислоту и окисленный хондроитинсульфат. Массовое отношение количества окисленной гиалуроновой кислоты к количеству окисленного хондроитинсульфата может составлять 1:0,5-5, 1:0,5-4, 1:0,5-3,5, 1:0,5-3, 1:0,5-2,5, 1:0,5-2, 1:0,5-1,5, или 1:0,8-1,2.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, степень окисления окисленной гиалуроновой кислоты составляет от 10 до 40%. В одном из конкретных примеров осуществления степень окисления окисленной гиалуроновой кислоты составляет от 12 до 40%, в другом конкретном примере осуществления степень ее окисления составляет от 12 до 38%, и в другом конкретном примере осуществления степень ее окисления составляет от 13 до 37%.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, степень окисления окисленного хондроитинсульфата составляет от 10 до 55%. В одном из конкретных примеров осуществления степень окисления окисленного хондроитинсульфата составляет от 10 до 50%, в другом конкретном примере осуществления - от 10 до 45%, в другом конкретном примере осуществления от 10 до 40%, и в другом конкретном примере осуществления - от 10 до 35%.
Согласно одному из примеров осуществления, первый компонент находится в порошкообразном состоянии, жидком состоянии или твердом состоянии (например, в виде гранул). Например, первый компонент в порошкообразном состоянии может быть получен сушкой (например, распылительной сушкой, лиофилизацией и т.д.) раствора, содержащего окисленный гликозаминогликан, с последующим измельчением (например, механическим измельчением).
Кроме первого компонента, композиция согласно настоящему изобретению дополнительно содержит в качестве активного ингредиента второй компонент, содержащий полиамин, включающий две или более аминогруппы. Показатель рН водного раствора второго компонента составляет от 8,5 до 11,0. Как показано в приведенных ниже примерах, в тех случаях, в которых рН водного раствора второго компонента составляет от 8,5 до 11,0, образование геля может происходить в течение нескольких секунд (см. Фиг. 7).
Согласно одному из конкретных примеров осуществления, рН водного раствора второго компонента составляет от 9,0 до 11,0.
Согласно одному из примеров осуществления, полиамин может дополнительно содержать вторичную и/или третичную аминогруппу.
Согласно одному из примеров осуществления, второй компонент, содержащий полиамин, находится в порошкообразном состоянии, жидком состоянии или твердом состоянии (например, в виде гранул). Например, второй компонент может быть получен в порошкообразном состоянии посредством сушки содержащего полиамин раствора с последующим измельчением. Согласно изобретению, раствор, содержащий полиамин, может дополнительно содержать регулятор рН, обеспечивающий поддержание рН водного раствора второго компонента в диапазоне от 8,5 до 11,0. Примерами регуляторов рН могут служить одновалентные или поливалентные соединения карбоновых кислот, таких как уксусная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота, глутаровая кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота и маленовая кислота или их ангидриды.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, полиамин выбран из группы, состоящей из полилизина, хитозана, альбумина, путресцина, кадаверина, спермидина, спермина, протамина и полиэтиленимина (сокращенно ПЭИ, англ. PEI - polyethylenimine).
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, молекулярная масса полиамина составляет 100 или более. Например, молекулярная масса полиамина может составлять от 1000 до 200000.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, полиамин представляет собой поли-L-лизин. Поли-L-лизин может представлять собой ε-поли-L-лизин, получаемый с применением микроорганизмов (например, Streptomyces albulus) или фермента.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, кроме полиамина второй компонент может дополнительно содержать регулятор рН.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать лекарственное средство. Например, лекарственное средство может содержаться во втором компоненте. Лекарственное средство может включать по меньшей мере одну аминогруппу, и примеры лекарственного средства могут включать лекарственные средства на основе антрациклина, гемцитабин, ванкомицин, полимиксин, метотрексат, белковые лекарственные средства и пептидные лекарственные средства. В этом случае, при образовании геля из первого компонента и второго компонента, аминогруппа лекарственного средства также реагирует с формильной группой первого компонента, в результате чего три компонента могут образовывать гель совместно. По мере разрушения образованного геля, лекарственное средство медленно высвобождается, оказывая фармацевтическое действие.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, композиция согласно настоящему изобретению может быть приготовлена в виде множества форм и может содержать, например, комбинацию первого компонента в порошкообразном состоянии, жидком состоянии или твердом состоянии (например, в виде гранул) и второго компонента в порошкообразном состоянии, жидком состоянии или твердом состоянии.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, массовое отношение количества первого компонента к количеству второго компонента в композиции согласно настоящему изобретению составляет 0,5-10:1.
В одном из конкретных примеров осуществления массовое отношение количества первого компонента к количеству второго компонента может составлять 0,5-8:1, в другом конкретном примере осуществления массовое отношение может составлять 0,5-6:1, в другом конкретном примере осуществления массовое отношение может составлять 0,5-4:1, в другом конкретном примере осуществления массовое отношение может составлять 0,5-3:1, в другом конкретном примере осуществления массовое отношение может составлять 0,5-2:1, в другом конкретном примере осуществления массовое отношение может составлять 0,5-1,5:1, в другом конкретном примере осуществления массовое отношение может составлять 0,8-1,5:1, и в другом конкретном примере осуществления массовое отношение может составлять 0,8-1,2:1.
Согласно настоящему изобретению, продолжительность гелеобразования или продолжительность разложения образуемого геля можно регулировать, изменяя отношение количества формильной группы первого компонента и аминогруппы второго компонента.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, молярное отношение формильная группа/аминогруппа составляет от 0,1 до 500 в тех случаях, в которых первый компонент смешан со вторым компонентом.
В тех случаях, в которых первый компонент смешан со вторым компонентом, в одном из конкретных примеров осуществления молярное отношение формильная группа/аминогруппа составляет от 1 до 400, в другом конкретном примере осуществления молярное отношение составляет от 1 до 350, в другом конкретном примере осуществления - от 1 до 300, и в ином конкретном примере осуществления - от 10 до 300.
Для создания медицинского эффекта (медицинского применения) первый компонент и второй компонент могут быть нанесены на материал, к которому они должны быть приклеены (поверхность кожи in vivo или in vitro), одновременно или последовательно. Согласно изобретению, в некоторых случаях для образования геля из первого компонента и второго компонента на них может быть распылен солевой раствор или дистиллированная вода.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения, медицинское применение, воздействующее на биологические ткани, выбрано из группы, состоящей из склеивания, заполнения, нанесения покрытия, противоадгезионного действия, раневого покрытия и гемостаза.
Композицию согласно настоящему изобретению выполняют в форме, в которой первый компонент и второй компонент содержатся в одном и том же контейнере или содержатся по отдельности в отдельных контейнерах.
Полезный эффект
Признаки и полезные эффекты настоящего изобретения кратко сформулированы ниже.
(i) Настоящим изобретением предусмотрена биоразлагаемая медицинская клеящая или герметизирующая композиция, содержащая окисленный гликозаминогликан и полиамин.
(ii) Композиция согласно настоящему изобретению отличается улучшенными параметрами биоразлагаемости, способности к нанесению, продолжительности гелеобразования, гемостатической способности, адгезионной прочности и влагопоглощающей способности.
(iii) Композиция согласно настоящему изобретению может найти широкое применение в тех областях медицины, в которых на биологические ткани наносят медицинские клеящие или герметизирующие вещества с целью склеивания, заполнения, нанесения покрытия, оказания противоадгезионного действия, создания раневого покрытия, покрытия, препятствующего протеканию, и гемостаза.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 представлены результаты анализа окисленной гиалуроновой кислоты с помощью инфракрасной спектрофотомерии с преобразованием Фурье (англ. fourier transform infrared spectrophotometry, сокращенно FT-IR).
На Фиг. 2 представлены гелеобразные состояния и величины продолжительности гелеобразования смесей, в которые добавлен второй компонент, имеющий аминогруппу.
На Фиг. 3 представлены результаты оценки гелеобразования смесей первого компонента и второго компонента, смешанных в различных массовых отношениях.
На Фиг. 4 представлены результаты сравнения продолжительности гелеобразования клеящих и герметизирующих композиций согласно настоящему изобретению и существующей клеящей композиции (LYDEX).
На Фиг. 5 представлена диаграмма сравнения адгезионной прочности клеящих и герметизирующих композиций согласно настоящему изобретению и существующей клеящей композиции (LYDEX).
На Фиг. 6 представлены результаты (способности к сцеплению со слизистой оболочкой и гемостатической способности), полученные при нанесении клеящей и герметизирующей композиции согласно настоящему изобретению или существующей клеящей композиции (LYDEX) на кровоточащий участок, полученный после удаления слизистой желудка.
На Фиг. 7 представлены гелеобразное состояние, продолжительность гелеобразования и превращение в гель смеси окисленного гликозаминогликана и полиамина в зависимости от величины рН.
На Фиг. 8-11 представлены результаты сравнительных испытаний действия клеящей и герметизирующей композиции согласно настоящему изобретению и существующего гемостатического агента (Arista™ AH) при моделировании гепатолобэктомии, удаления почки, удаления слизистой желудка и сосудистого кровотечения.
На Фиг. 12 представлена диаграмма, количественно иллюстрирующая результаты, представленные на Фиг. 8-11.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ниже настоящее изобретение раскрыто более подробно с помощью примеров. Эти примеры приведены лишь для лучшей иллюстрации настоящего изобретения, и специалисту в данной области техники должно быть понятно, что объем настоящего изобретения не ограничен приведенными примерами.
Пример 1
Получение медицинского клеящего вещества
(1) Получение окисленной гиалуроновой кислоты (СНО-ГК: первый компонент)
4
1 г или 3 г гиалуроновой кислоты (ГК, англ. НА - hyaluronic acid), молекулярная масса которой составляла 7 кДа, 150 кДа, 1400 кДа или 3000 кДа, растворяли в 150 мл раствора перйодата натрия (NaIO) в воде. Величины концентрации и условия реакции перйодата натрия варьировали, как указано в Таблицах 1-4 с целью достижения различных степеней окисления (степеней замещения (сокращенно С3), %). Реакцию оставляли протекать в реакционной колбе при 15-70°C в течение 3-48 часов. Реакционный материал подвергали диализу с добавлением дистиллированной воды в течение 24 часов с использованием диализной мембраны с диапазоном по молекулярной массе от 1 до 100 кДа. Полученную окисленную гиалуроновую кислоту подвергали лиофилизации в течение 4 суток, затем измельчали, после чего пропускали через сито с диаметром отверстий 500 мкм, получая частицы окисленной гиалуроновой кислоты с диаметром приблизительно 500 мкм или менее.
Окисленная гиалуроновая кислота (ГК)
-1
-1
FT-IR спектральный анализ окисленной гиалуроновой кислоты (спектрометр Сагу 640, Agilent Technologies, США) подтвердил наличие заместителей, имеющих полосы поглощения при 4000-400 см (разрешение 4 см) (Фиг. 1).
Для определения степени окисления гиалуроновой кислоты, 17,5 г гидрохлорида гидроксиламина и 6 мл 0,05%-ного метилоранжа смешивали в 994 мл дистиллированной воды, получая 0,25М раствор гидрохлорида гидроксиламина, который затем титровали до рН 4. В 25 мл раствора растворяли 0,1 г окисленной гиалуроновой кислоты и затем титровали до рН 4 раствором гидроксида натрия концентрацией 0,1 мМ. Степень окисления (%) вычисляли в соответствии со следующим уравнением, и результаты представлены в Таблицах 1-4.
Уравнение 1
(2) Второй компонент, включающий две или более аминогруппы
В качестве второго компонента среди различных полиаминов, содержащих аминогруппы, обычно выбирали хитозан, протамин, ПЭИ (полиэтиленимин), полилизин, спермин, спермидин и альбумин. Для этой цели использовали порошки, которые получали доведением рН растворов полиамина, имеющих концентрацию 5% масс, или более, до величин 8,5, 9,0, 9,5 и 10 добавлением регуляторов рН (кислот, кислотных солей, оснований, основных солей), с последующей лиофилизацией растворов, как указанно в описании получения окисленной гиалуроновой кислоты/окисленного хондроитинсульфата.
Определяли степень гелеобразования и продолжительность гелеобразования перечисленных полиаминов, содержащих аминогруппу. Результаты показали, что наилучшими с точки зрения скорости образования геля и безопасности геля оказались альбумин, основной (щелочной) полилизин (сокращенно ОПЛ) и ПЭИ (Фиг. 2). Из них для последующих испытаний был выбран ОПЛ.
Пример 2
Определение физических свойств
(1) Оценка гелеобразования
Полученные в Примере 1 первый и второй компоненты смешивали в различных массовых отношениях (1:1,2:1,4:1,8:1). Степень гелеобразования смешанных компонентов подтверждали обрызгиванием водой.
Результаты показали, что смесь первого компонента и второго компонента в отношении 8:1 частично превратилась в жидкость спустя 10 минут, а смесь 2:1 и смесь 4:1 имели относительно низкую эластичность геля по сравнению со смесью 1:1 (Фиг. 3). Кроме того, смесь, полученная при добавлении гиалуроновой кислоты с молекулярной массой 3000 кДа, образовывала гель, но он был менее эластичным. При использовании гиалуроновой кислоты, имеющей молекулярные массы 150 кДа и 1400 кДа, полученные смеси подвергались гелеобразованию независимо от степени замещения, но, если степень замещения составляла приблизительно 10% (10-19%), то смеси отличались меньшей продолжительностью гелеобразования и высокой эластичностью.
На основании приведенных выше результатов, первый компонент (окисленную гиалуроновую кислоту со степенью замещения 10%, полученную введением альдегидной группы в гиалуроновую кислоту с молекулярной массой 150 кДа или 1400 кДа) и второй компонент смешивали в массовом отношении 1:1, и полученную смесь использовали в дальнейших испытаниях.
(2) Оценка продолжительности гелеобразования
Компоненты, смешанные в пробирке емкостью 2 мл, разделяли порциями по 30 мг, которые собирали в крышке пробирки. На них в течение 1 секунды разбрызгивали 120 мл воды, после чего определяли продолжительность гелеобразования. Для получения затвердевшего геля из LYDEX требовалось 10 секунд или более, несмотря на то, что его количество было меньше (80 мл), чем количество препарата, полученного из смеси гиалуроновой кислоты. С другой стороны, продолжительность гелеобразования препарата, содержащего смесь с окисленной гиалуроновой кислотой, была меньше и составляла 2-3 секунды (Фиг. 4 и Таблица 5).
(3) Оценка адгезионной прочности
800 мл воды распыляли на 100 мг смешанных компонентов, после чего с помощью анализатора текстуры (Texture Analyzer) определяли адгезионную прочность. Результаты показали, что средняя адгезионная прочность LYDEX составила приблизительно 53,6 г-силы (что приблизительно составляет 0,525 Н), несмотря на то, что количество LYDEX было меньше (500 мл), чем количество препарата на основе смеси окисленной гиалуроновой кислоты. С другой стороны, было показано, что величины средней адгезионной прочности препаратов на основе смеси окисленной гиалуроновой кислоты составили 65,9 г-силы (приблизительно 0,646 Н) и 67,5 г-силы (приблизительно 0,662 Н), соответственно (Фиг. 5 и Таблица 6).
(4) Оценка поглотительной способности
Оценивали поглотительную способность LYDEX, СНО-ГК 150 кДа (С3 10%) и СНО-ГК 1400 кДа (С3 10%), смешанной со вторым компонентом. В чашки Петри (диаметром 60) помещали по 30 мг каждого образца и взвешивали. К образцу добавляли предварительно нагретую до 37°C дистиллированную воду, причем, учитывая поглотительную способность продукта, масса дистиллированной воды в 30 раз превышала массу образца (т.е. составляла 30 г). Полученный материал выдерживали в термостате при 37°C в течение 30 мин, после чего чашку Петри переворачивали на 30 секунд для измерения массы. Поглотительную способность вычисляли в соответствии со следующим уравнением.
Уравнение 2
Результаты показывают, что препарат на основе смеси окисленной гиалуроновой кислоты (СНО-ГК 1400 кДа) имеет прекрасную поглотительную способность, приблизительно в 5 раз превышающую соответствующий параметр существующей композиции LYDEX (Таблица 7).
Пример 3
Оценка in vivo
(1) Животные
В испытаниях использовали трех самцов кролика (порода New Zealand White; Orient Bio, Seongnam, Корея) с массой тела 2-3 кг. Все процедуры, связанные с выращиванием и тестированием, были проведены в соответствии с руководством Комитета по научным исследованиям с использованием подопытных животных Университета Inha (англ. Experimental Animal Research Committee of Inha University).
(2) Моделирование индуцированного желудочного кровотечения у подопытных животных
Модель индуцированного удалением слизистой желудочного кровотечения у кролика была следующей. Кроликов не кормили в течение 24 часов перед хирургическим вмешательством, затем анестезировали внутримышечным вводом смеси кетамина (4,2 мг/кг) и ксилазина (11,7 мг/кг). Верхнюю часть брюха разрезали, обнажая желудок, и вдоль большей кривой делали надрез длиной 5-7 см. Под субмукозный слой желудка вводили 200 мл изотонического солевого раствора, после чего набухшую слизистую желудка иссекали хирургическими ножницами. Диаметр иссеченной части составлял приблизительно 7-10 мм.
(3) Способность к приклеиванию к слизистой оболочке и гемостатическая способность
Приблизительно 0,5 г препарата на основе смеси компонентов (смеси первого компонента и второго компонента в массовом отношении 1:1) наносили на иссеченную кровоточащую слизистую желудка кролика. Как показано на Фиг. 6, в результате реакции препарата на основе смеси компонентов и крови препарат образовывал гель практически немедленно после его нанесения, и продолжительность кровотечения сокращалась по сравнению с контрольной группой. Кроме того, была подтверждена способность композиции согласно настоящему изобретению к приклеиванию к слизистой оболочке (Фиг. 6).
Пример 4
Получение медицинского клеящего вещества (2)
(1) Получение окисленной гиалуроновой кислоты и окисленного хондроитинсульфата (первый компонент)
3 г гиалуроновой кислоты (Shandong Bloomage Freda Biopharm Co., Ltd), молекулярная масса которой составляла 1400 кДа, растворяли в 150 мл дистиллированной воды. Затем, как указано в Таблице 1, добавляли перйодат натрия (молекулярная масса 213,89), и содержимое реакционной колбы оставляли реагировать при перемешивании при 40°C в течение 24 часов. По окончании реакции раствор подвергали диализу в дистиллированной воде в течение 48 часов (с помощью диализной мембраны с ограничением по молекулярной массе от 12000 до 14000) и затем подвергали лиофилизации.
3 г хондроитинсульфата (Yantai Dongcheng Biochemical Co., Ltd), молекулярная масса которого составляла от 5000 до 50000, растворяли в 15 мл дистиллированной воды. Затем, как указано в Таблице 1, добавляли перйодат натрия (молекулярная масса 213,89), и смесь оставляли реагировать при перемешивании и комнатной температуре в течение 18 часов. По окончании реакции раствор подвергали диализу в дистиллированной воде в течение 48 часов (с помощью диализной мембраны с ограничением по молекулярной массе от 12000 до 14000) и затем подвергали лиофилизации.
В последующих испытаниях окисленную гиалуроновую кислоту и окисленный хондроитинсульфат использовали в качестве первого компонента.
Степени замещения (степени окисления) гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата подтверждали посредством титрования NaOH. В частности, 17,5 г гидрохлорида гидроксиламина и 6 мл 0,05%-ного метилоранжа смешивали в 994 мл дистиллированной воды, получая раствор гидрохлорида гидроксиламина концентрацией 0,25 моль/л, который затем титровали до рН 4. В 25 мл раствора растворяли 0,1 г окисленной гиалуроновой кислоты или хондроитинсульфата, и затем титровали до рН 4 раствором гидроксида натрия концентрацией 0,1 моль/л. Степень замещения (С3, %) вычисляли в соответствии со следующим уравнением, и результаты представлены в Таблицах 8 и 9.
Уравнение 3
(2) Получение второго компонента, включающего две или более аминогруппы
В качестве второго компонента среди различных полиаминов, содержащих аминогруппы, обычно выбирали хитозан, протамин, ПЭИ (полиэтиленимин), полилизин, спермин, спермидин и альбумин. Для исследования зависимости гелеобразования от рН, в качестве второго компонента использовали порошки, которые были получены созданием определенных диапазонов рН водного раствора (5,5-6,4, 6,5-7,4, 7,5-8,4, 8,5-9,4, 9,5-10,4 и 10,5-11) и последующей лиофилизацией раствора так, как указано в описании получения окисленной гиалуроновой кислоты/окисленного хондроитинсульфата. Смешивали первый компонент, представлявший собой окисленную гиалуроновую кислоту/окисленный хондроитинсульфат, и полиамин. Результаты показали, что гелеобразование происходило только при рН 8,5-11, независимо от типа полиамина. Например, гель образовывался, если рН поли-L-лизина составлял 8,5, но гель не образовывался, если его рН составлял 5,6. В этом испытании образование или отсутствие образования геля определялось прозрачностью геля (прозрачный - гель образовывался, непрозрачный - гель не образовывался, Фиг. 7).
Пример 5
Нахождение оптимального отношения
(1) Установление оптимальных условий в соответствии с молекулярной массой и соотношением
Порошки окисленного хондроитинсульфата и окисленной гиалуроновой кислоты, молекулярная масса которой составляла от 150 до 3000 (1:1), смешивали с полиамином (ПА; выбирали и использовали полилизин с рН 8,5-8,9) в соответствии со степенью окисления в различных смесевых отношениях, и определяли физические свойства полученных смесей. К 50 мг каждого из порошков, полученных смешиванием в соответствии со степенью окисления в различных смесевых отношениях, добавляли 200 мл стерильной дистиллированной воды, и с помощью наблюдения невооруженным глазом определяли долю поглощенной стерильной дистиллированной воды. Растворимость, определяемую в соответствии с влагопоглощающей способностью, считали высокой (+++), если порошок начинал поглощать стерильную дистиллированную воду в течение 10 секунд, умеренной (++) - в течение 30 секунд и низкой (+) - более чем в течение 60 секунд. Кроме того, определяли наличие гелеобразования при добавлении стерильной дистиллированной воды, а также определяли продолжительность гелеобразования. Также определяли, происходило ли повторное ожижение образовавшегося геля, и оценивали время, истекшее до начала повторного ожижения. Полученные таким образом результаты представлены в нижеследующих таблицах (Таблицы 10 и 11).
Как видно из Таблицы 11, практически все комбинации, включающие первый компонент и второй компонент, демонстрировали требуемые параметры влагопоглощающей способности и продолжительности гелеобразования. Наилучший результат (влагопоглощающая способность: +++; продолжительность гелеобразования: в течение 30 секунд) среди рассмотренных комбинаций имел препарат на основе смеси 10-50% окисленного хондроитинсульфата +10-40% окисленной гиалуроновой кислоты (150, 1400 или 3000 кДа) и полиамина в смесевом отношении 1:1 (образец #: 3, 4, 12, 14, 17, 26, 29). С учетом этих результатов, в рассмотренных ниже примерах проводили испытание с препаратом #14 (названным UI-SAH).
Пример 6
Моделирование кровотечения у крыс и оценка гемостатического действия
(1) Моделирование гепатолобэктомии
Самцов крыс породы SD с массой тела 200-300 г анестезировали посредством внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина и Ромпуна, и затем делали разрез длиной приблизительно 3-4 см в верхней центральной части брюха в вертикальном или горизонтальном направлении. Долю печени открывали, отодвигая ткани надреза на брюхе с помощью влажной марли, и печеночную артерию и воротную вену перетягивали с помощью зажимов для сосудов. Участок, находящийся на расстоянии приблизительно 1 см от края доли печени, рассекали хирургическими ножницами и затем наносили 50-100 мг UI-SAH. В качестве контрольного покрытия наносили покрытие из Arista™ АН (Medafor Inc., США). После нанесения покрытия, перетягивающие зажимы удаляли, определяя, началось ли кровотечение, и затем количество выделившейся крови определяли с помощью стерильной марли.
(2) Моделирование удаления почки
Самцов крыс породы SD с массой тела 200-300 г анестезировали посредством внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина и Ромпуна, и затем в правой части брюха в вертикальном направлении делали разрез длиной приблизительно 3-4 см. Почку открывали, отодвигая ткани надреза на брюхе с помощью влажной марли, и почечную вену и артерию перетягивали с помощью зажимов для сосудов. Участок, находящийся на расстоянии приблизительно 1 см от края почки, рассекали хирургическими ножницами и затем наносили 50-100 мг UI-SAH. В качестве контрольного покрытия наносили покрытие из Arista™ АН (Medafor Inc., США). После нанесения покрытия, перетягивающие зажимы удаляли, определяя, началось ли кровотечение, и затем количество выделившейся крови определяли с помощью стерильной марли.
(3) Моделирование удаления слизистой желудка
Самцов крыс породы SD с массой тела 200-300 г выдерживали без еды в течение 24 часов и затем анестезировали посредством внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина и Ромпуна, после чего делали разрез длиной приблизительно 3-4 см в верхней центральной части брюха в вертикальном или горизонтальном направлении. Желудок открывали, отодвигая ткани надреза на брюхе с помощью влажной марли, и искривленную часть желудка, в которой содержится меньше кровеносных сосудов, иссекали на приблизительно 3 см в горизонтальном направлении, открывая ткани, выстилающие желудок. В ткани, выстилающие желудок, вводили 100 мл изотонического солевого раствора; затем ткани, выстилающие желудок, иссекали на круглом участке диаметром приблизительно 5 мм, после чего наносили покрытие из 50-100 мг UI-SAH. В качестве контрольного покрытия наносили покрытие из Arista™ АН (Medafor Inc., США). Проверяли, открывается ли кровотечение на участке с покрытием, и количество выделившейся крови определяли с помощью стерильной марли.
(4) Моделирование кровотечения из воротной вены
Самцов крыс породы SD с массой тела 200-300 г анестезировали посредством внутрибрюшинной инъекции смеси кетамина и Ромпуна, и затем в верхней центральной части брюха делали разрез длиной приблизительно 5-6 см в вертикальном или горизонтальном направлении. Воротную вену обнажали, отводя остальные органы влево через разрез в брюхе. Два участка выше и ниже воротной вены перетягивали с помощью зажимов для сосудов. Воротную вену протыкали иглой калибра 18, и затем наносили покрытие из 50-100 мг UI-SAH. В качестве контрольного покрытия наносили покрытие из Arista™ АН (Medafor Inc., США). После нанесения покрытия, перетягивающие зажимы удаляли, определяя, началось ли кровотечение, и затем количество выделившейся крови определяли с помощью стерильной марли.
(5) Результаты испытаний
Результаты испытаний представлены на Фиг. 8 и 12. Как видно на Фиг. 12, гемостатическое действие композиции согласно настоящему изобретению превосходило действие контрольного препарата (Arista™ АН).
Несмотря на то, что настоящее изобретение было подробно раскрыто посредством рассмотрения его конкретных воплощений, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что предлагаемое описание представляет собой лишь предпочтительный пример осуществления изобретения и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, объем настоящего изобретения по существу определяется прилагаемыми пунктами формулы изобретения и их эквивалентами.