Экспериментальное воспроизведение губкообразной энцефалопатии КРС на благородном олене (Cervus elaphus elaphus)

НАША СПРАВКА

Протеины, способные связывать прионный белок

Поиск протеинов, способных связывать прионный белок, крайне важен, поскольку позволяет изучить механизмы патогенеза губкообразных энцефалопатий, определить клеточные рецепторы, распознающие прионы (а это служит основой для разработки средств специфической профилактики, а также лечения этих болезней), и, о чем свидетельствует статья К. Негредо и соавт., перевод которой мы публикуем, открывает новые перспективы диагностики прионных инфекций. На сегодняшний день к числу таких белков млекопитающих относят глиальный фиблиллярный кислый протеин [7], глюкозаминогликан [2], индуцируемый стрессом протеин 11 (р66) [12], дистрогликановый комплекс [12], кавеолин-1 [5], плазминоген [4], ламинин [3], адгезин плазмалеммы нейронов NCAM [10], синапсин 1b [11], анги-остатин [9], нейтрофиновый рецептор NRAGE [1], тубулин [6], ß-актин [8].

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Bragason B.T., Palsdottir A. Interaction of PrP with NRAGE, a protein involved in neuronal apoptosis. Mol Cell. Neurosci, 2005, 29, 232—244.

2. Caughey B., Brown K., Raymond G.J. et al. Binding of the protease-sensitive

УДК 619:616.8:639.111.16

form of PrP (prion protein) to sulfated glycosaminoglycan and Congo red. J Virol, 1994, 68, 2135—2141.

3. Graner E., Mercadante A.F., Zanata S.M. et al. Cellular prion protein binds laminin and mediates neuritogenesis. Mol Brain Res, 2000, 76, 85—92.

4. Fischer M.B., Roeckl C., Parizek P. et al. Binding of disease-associated prion protein to plasminogen. Nature, 2000, 408, 479—483.

5. Mouillet-Richard S., Ermonval M., Chebassier C. et al. Signal transduction through prion protein. Science, 2000, 289, 1925—1928.

6. Nieznanski K., Nieznanska H., Skowronek K.J. et al. Direct interaction between prion protein and tubulin. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 334, 403—411.

7. Oesch B., Teplow D.B., Stahl N. et al. Identification of cellular proteins binding to the scrapie prion protein. Biochemistry, 1990, 29, 5848—5855.

8. Petrakis S., Sklaviadis T. Identification of proteins with high affinity for refolded and native PrPC. Proteomics, 2006, 6. 6476—6484.

9. Ryou C., Prusiner S.B., Legname G. Cooperative binding of dominant-negative prion protein to kringle domains. J Mol Biol, 2003, 329, 323—333.

10. Schmitt-Ulms G., Legname G., Baldwin M.A. et al. Binding of neural cell adhesion molecules (N-CAMs) to the cellular prion protein. J Mol Biol, 2001,.314, 1209—1225.

11. Spielhaupter C., Schatzl H.M. PrPC directly interacts with proteins involved in signaling pathways. J Biol Chem, 2001, 276, 44604—44612.

12. Zanata S.M., Lopes M.H., Mercadante A.F. et al. Stress-inducible protein 1 is a cell surface ligand for cellular prion that triggers neuroprotection. EMBO J, 2002, 21, 3307—3316.

Экспериментальное воспроизведение губкообразной энцефалопатии КРС

на благородном олене

М.П. Даглейш1, С. Мартин2, Ф. Стил1, Дж. Финлейсон1, С. Сисо2, С. Хамильтон1, Ф. Чиа-нини1, Х.В. Рейд1, Л. Гонзалес2, М. Джефри2

1 —Moredun Research Institute

2 — Veterinary Laboratories Agency

Ключевые слова: губкообразная энцефалопатия, олень, прион

Сокращения: ГМ — головной мозг; ЦНС — центральная нервная система

Введение

Прион вызывает у КРС и ряда видов животных, а также человека трансмиссивные ГЭ — нейродегенеративные заболевания с неизбежным летальным исходом [6, 17, 18, 30]. Их удается воспроизвести у животных того же вида, от которых выделили прион, а также у животных других видов посредством перорального или парентерального заражения [13]. Относящиеся к ГЭ скрепи овец и коз, спорадическая форма болезни Крейцфельда — Якоба человека и хроническая изнуряющая болезнь оленей [2] характеризуются длительным инкубационным периодом. Патологические изменения развиваются в результате трансформации нормального прионного протеина в изоформу PrPRes, которая аккумулируется в нерв-

ной и в ряде случаев в лимфоретикулярной системах [3]. На обнаружении скоплений изоформы основаны современные методы диагностики трансмиссивных ГЭ [7].

Через 10 лет после первого сообщения о ГЭ КРС [29] у населения в Великобритании стали диагностировать вариантную болезнь Крейцфельда — Якоба [10, 31]. Причиной ее появления оказалось потребление людьми продуктов, контаминирован-ных PrPBSE [1], что стало предпосылкой для более интенсивных исследований ГЭ людей и продуктивных животных [32].

В 1980-х годах британские фермеры, занимавшиеся разведением оленей, скармливали им концентраты с мясо-костной мукой, изготовленной из жвачных, чтобы добиться быстрого роста животных. Так же поступали со свободно живущими, парковыми и содержавшимися в зоопарках различных представителей семейства Cervidae (персональное сообщение Т.Дж. Флетчера). Маловероятно, что концентрированные корма, которые получали олени, никогда не содержали прион. Однако до настоящего времени в Европе не было зарегистрировано ни одного случая прионной инфекции у оленей (хотя

такие исследования никогда не проводили на разводимых на фермах животных, а кроме того, они носили ограниченный

— отдельными регионами и небольшим количеством оленей

— характер [4, 19...22, 28]. В Северной Америке, напротив, среди оленей и лосей весьма распространено прионное заболевание, называемое хронической изнуряющей болезнью; в настоящее время это заболевание является единственным из известных трансмиссивных ГЭ обитающих на воле животных [33].

Нами проведен эксперимент по воспроизведению ГЭ КРС на благородных оленях (Cervus elaphus elaphus) — виде оленей, который наиболее интенсивно разводят фермеры Великобритании.

Материалы и методы

Животные. В опыте использовали молодых благородных оленей, изолированных от матерей при рождении и выкормленных заменителем молока. В последующем их рацион состоял из сена и концентрированного корма. В 10.12-месячном возрасте оленей разделили на 2 группы: опытную (5 кастрированных самцов и 1 самка) и контрольную (2 самки). Животным опытной группы в правое полушарие ГМ под общей анестезией инокулировали по 0,5 мл 10%-й суспензии пула ГМ 5 коров, больных ГЭ КРС. Инфекционный титр материала для КРС при интрацеребральном и мышей при интрацере-бральном/интраперитонеальном заражении составил 106,0 и 103,3 ЛД50/г соответственно. Суспензию готовили на физиологическом растворе с 1,25 мг/мл ампициллина. Оленям контрольной группы физиологический раствор с антибиотиком вводили интрацеребрально описанным выше методом. За животными ежедневно вели клиническое наблюдение, ежемесячно определяя их массу тела.

Генотипирование. Генотип оленей определяли по результатам анализа их крови, взятой при жизни, и проб ГМ, полученных постмортально, в полимеразной цепной реакции. Тест проводили с применением праймеров C.e. 19fwd 5' ATT TTG CAG ATA AGT CAT C 3' и C.e. 778rev 5' AGA AGA TAA TGA AAA CAG GAA G 3' [15]. Реакцию начинали горячим стартом (95 °C, 15 мин), затем следовало 10 циклов при 94 °C по 30 с, 55 °C — 30 с, 72 °C — 45 с, 30 циклов при 95 °C по 30 с, 59 °C — 30 с, 72 °C — 59 с. Продукты амплификации секвени-ровали дидезокси цепным терминационным методом. Постмортальное исследование. Постмортально у всех оленей после вскрытия взяли следующие пробы органов и тканей для исследований: 1) нервную ткань (ГМ, гипофиз, шейный, грудной и поясничный отделы спинного мозга с дорзальными корневыми ганглиями, тройничный, узелковый, звездчатый и краниальный брызжеечный ганглии, н. вагус, 2-ю мышечную ветвь седалищного нерва и глаза; 2) лимфоретикулярную ткань (третье веко, подчелюстной, заглоточный, предлопа-точный, средостенный, подколенный, проксимальный и дис-тальный тощекишечные лимфатические узлы, миндалины и селезенку) и органы пищеварения (пищевод, сычуг, книжку, 12-перстную, тощую, дистальную часть подвздошной, ободочную и прямую кишки; 3) ликворы (спинномозговой, сыворотку и сгустки крови, мочу; 4) другие ткани (кожу нижней губы, межжелудочковую перегородку сердца, левую каудальную долю легких, печень, почки, полусухожильную мышцу, и у самок — матку и молочную железу. Взятые пробы фиксировали 10%-м нейтральным забуференным формалином; часть из них исследовали гистологическими и иммуногистохимическими методами, а часть хранили в замороженном виде при -80 °C. Иммуногистохимическое выявление PrPRes. Проводили описанным ранее методом [8]. Тестируемые пробы смачивали 98 %-й муравьиной кислотой в течение 5 мин, а затем автокла-вировали 30 мин при 121 °C в 0,2%-м цитратном буферном растворе. Эндогенную пероксидазу инактивировали 0,9%-м (v/v) водным раствором пероксида водорода 20 мин. Неспецифическую реактивность тканевых антигенов блокировали

20%-м разведением нормальной сыворотки крови лошади 1 ч. Инкубировали пробы с первичными антителами ночь при 27 °C. В качестве первичных антител пользовались F99, клоном 97.6.1 (VMRD Inc., США), или BAR224 (CEA, Франция), которые распознают аминокислотные последовательности 220.225 и 141.147 прионного белка человека соответственно. Оба моноклональных антитела проявляют широкую межвидовую активность. Дальнейшие этапы иммуногистохимиче-ского выявления PrPRes проводили с применением набора Vector-elite ABC по инструкции его производителя (Vector Lab, Великобритания). После этого пробы смачивали 0,5%-м раствором сульфата меди для усиления иммунопероксидаз-ной окраски, проводили фоновое окрашивание гематоксилином Мейера, обезвоживали и после монтажа препаратов микроскопировали.

Западный иммуноблотинг проб ГМ

Пробы мозжечка размораживали при комнатной температуре и готовили из них 10%-е гомогенаты на лизисном буферном растворе (0,5 % дезоксихолата натрия, 0,5 % NP-40, рН 7.4) с помощью приспособления Fast instrument (Q-bio-gene, Великобритания). Лизаты выдерживали 2 ч при 4 °C и центрифугировали 1 мин при 100 x g, перенося надосадоч-ную жидкость в чистые пробирки, избегая ее контаминации тканевым дебрисом. 100 мкл лизата обрабатывали раствором протеиназы К (50 мкг/мл) 1 ч при 37 °C, встряхивая. Ферментативный процесс останавливали добавлением пефаблока SC (Roche Diagn, Великобритания) до конечной концентрации 1 мМ. Затем пробы центрифугировали (1 ч при 20 000 x g и 10 °C). Надосадочную жидкость удаляли, а осадок ресуспен-дировали в 45 мкл реактива SB 2-кратной концентрации (In-vitrogen, Великобритания), содержавшего 5 мкл 10-кратного концентрата проборедуцирующего реагента. Пробы прогревали 5 мин при 100 °C, центрифугировали (5 с при 20 000 x g). Электрофорезу в ДСН-полиакриламидном геле подвергали 5.20 мкл проб, ресуспендированных 12%-м Bis-Tris NuPAGE гелем (Invitrogen, Великобритания), при 150 В в течение 1 ч. Таким образом, каждый раз тестировали пробы, эквивалентные 1 мг ГМ, за исключением проб ГМ коров, больных ГЭ КРС, овец, экспериментально зараженных PrPBSE, и 1 оленя (в упомянутых случаях тестировали материал, соответствующий 1,5 мг ГМ). Протеины посредством электрофореза переносили на мембранный фильтр Hybond P PVDF (GE Healthcare, Великобритания) при 30 В в течение 1 ч. Неспецифическую антигенность фильтров блокировали 5 %-й суспензией обезжиренного молока, приготовленной на лизисном буферном растворе с 0,1% твина 20 (Sigma Chemical Co, Великобритания). При проведении теста пользовались моноклональными антителами L42 (R-biopharm, Германия, в разведении 1:2 000), которые распознают кодоны 145.163 в прионном белке овцы, или антителами P4 (R-biopharm, Германия, в разведении 1:2 000), которые реагируют с аминокислотами WGQGGSH (последовательности 93.99 прионного белка овцы) [27]. Аналогично в западном иммуноблотинге с помощью моноклональных антител Р4 исследовали те же пробы, но необработанные протеиназой К. Для детекции сигнала пользовались субстратом Super Signal West Fempto Maximum Sensitivity (Pierce, США) и просмотровой станцией Kodak IS440 (Labtech Intern Ltd., Великобритания). Относительную интенсивность ди-, моно- и агликозиловых полос PrPRes оценивали с помощью компьютерных программ Kodak 1D Image Analysis.

Результаты

Все использованные в опыте благородные олени были гомозиготны по наличию метионина в кодоне 132 прионо-вого протеина оленей [15], который соответствует кодону 129 прионового протеина человека [16]. У всех 6 животных опытной группы через 794.1300 дн после заражения PrPBSE

развилась симптоматика, включавшая различные сочетания следующих признаков: атаксии, анорексии, движений по кругу и слепоты, нарушений сезонной линьки, снижения массы тела и возникновения признаков страха (табл. 1). Приступы паники, связанные с испытываемым животными маниакальным страхом, варьировали по тяжести и продолжительности, в двух случаях привели к получению животными тяжелых травм, что послужило причиной их вынужденной эвтаназии.

Эвтаназию провели 5 животным, а у оленя № 5 развилась ингаляционная пневмония, и он умер. Только у этого животного выявили патологоанатомические изменения (интенсивное уплотнение и хрупкость правой верхушечной доли легкого, которая была окрашена в красновато-зеленый цвет; при ее разрезании выделялся вязкий гной). Кроме того, у всех оленей опытной группы отметили пониженное количество жировой клетчатки в грудной и брюшной полостях.

анатомических областях ГМ, расположенных под корой. В патологический процесс вовлекалось только серое вещество, причем чаще всего скопления РгР^ были очень небольшими по размеру, и только в наиболее тяжело пораженных участках ГМ они становились крупными и вытянутыми (рис. 2). Гранулярные отложения РгР^ в цитоплазме нейронов были хорошо заметными в стволе ГМ, а также в ядрах таламуса, но в меньшей степени — в полосатом теле и коре ГМ.

В нейронах глубокого ядра мозжечка и гранулярного слоя выявили интенсивную аккумуляцию РгР^, но клетки Пуркинье его не содержали (рис. 3). РгР^ обнаружили также в астроцитах и клетках микроглии тех участков ГМ, в которых был тяжело поражен нейропиль. РгР^ образовывал в сером веществе ГМ вокруг глиальных клеток диффузные звездообразные муфты. Очень мало его нашли в тканях, прилегающих к стенкам кровеносных сосудов белого вещества ГМ, и в астроцитах мозжечка. РгР^ не удалось обнаружить

1. Клинические параметры, выявленные у экспериментально зараженных PrPBSE оленей

Параметры №№ оленей*

1 2 3 4 5 6 7 8

Инкубационный период, дни 794 930 996 996 1 060 1 290 1 01 7 1 290

Длительность клинической стадии, дни 21 100 105 77 85 22 н/п н/п

Снижение массы тела, кг/%** 12,9/13,2 20,0/27,3 19,8/20,4 19,1/21,8 24,3/39,2 11,5/11,9 9,6/10,3 0,5/0,6

Атаксия + ++ ++ ++ + - - -

Анорексия - + + + ++ - - -

Движения по кругу - + ++ ++ - - - -

Отсутствие сезонной линьки - + + + - - - -

Слепота - - + + - - - -

Приступы страха +++ ++ + - - ++ - -

Ингаляционная пневмония - - - - +++ - - -

Обозначения: н/п — не применимо; - отсутствие; + легкое проявление; ++ умеренное проявление; +++ тяжелое проявление.

* Олени №№ 1...5 — опытная группа, №№7 и 8 — контрольная группа. ** Определяли постмортально.

Губкообразные изменения, обусловленные вакуолизацией перикариона нейронов и нейропиля серого вещества, обнаружили в ГМ всех оленей опытной группы (рис. 1). Внешний вид и распределение вакуолей в ЦНС были такими же, как при других классических трансмиссивных ГЭ, включая хроническую изнуряющую болезнь оленей. В нейропиле находили внешне пустые округлые и овальные вакуоли, в то время как в перикарионе нейронов вакуоли иногда были многокамерными и в ряде случаев содержали мембранный дебрис. Они локализовались преимущественно в стволе ГМ, таламусе и полосатом теле, в молекулярном слое мозжечка и слоях V и VI коры ГМ.

Иммуногистохимическое выявление PrPRes

У экспериментально зараженных оленей PrPRes аккумулировался в центральном и периферическом отделах нервной системы, в т.ч. во всех исследованные отделах спинного мозга, автономных ганглиях, периферических и краниальных нервах, нервной системе органов пищеварения и сетчатке глаз. Различий в результатах иммуногистохимичекого исследования при использовании моноклональных антител F99 и Bar 224 не выявили. У первого заболевшего оленя (это произошло на 794-й день после заражения) аккумуляция PrPRes была менее интенсивной и диссеминированной по сравнению с остальными животными опытной группы (табл. 1). PrPRes обнаружили во всех

в лимфоретикулярных тканях, скелетных мышцах, почках и других исследованных органах.

Западный иммуноблотинг. В западном иммуноблотинге, который проводили с применением моноклональных антител L42 , в обработанных протеиназой К пробах мозжечка оленей опытной группы отметили превалирование дигликозилиро-ванной фракции прионного белка (рис. 4, табл. 2) с небольшой вариабельностью у разных животных. Ди-, моно- и неглико-зилированные фракции проб ГМ оленей мигрировали значительно дальше (р < 0,001), чем соответствующие фракции проб ГМ коровы и овцы, инфицированных РгРвж, которые, в свою очередь, мигрировали значительно дальше фракций ГМ больной скрепи овцы. Ни одна из инфицированных РгРвж проб, независимо от вида животных (КРС, овца, олень), от которых их получили, не реагировала с моноклональными антителами Р4 в западном иммуноблотинге в отличие от ГМ больной скрепи овцы (на рис. 4 этой пробы нет). По отсутствию реакции с моноклональными антителами Р4 можно дифференцировать РгРвж и РгР^ [12]. Необработанные протеиназой К пробы ГМ всех оленей реагировали с моноклональными антителами Р4. Невозможность выявления этими моноклональными антителами РгР^ в ГМ оленей после обработки протеиназой К соответствует результатам исследований ГМ животных других видов, которых экспериментально заражали РгРвж, и ряда овец, экспериментально инфицированных РгР^ [12].

Рис. 1. Вакуоли в перикарионе двух нейронов (черная стрелка) и нейропиле (красная стрелка) ГМ заболевшего оленя. Окраска гематоксилином и эозином. Шкала = 50 мкм

Рис. 4. Западный иммуноблотинг проб ГМ, обработанных проте-иназой К. В пробах всех оленей опытной группы проявилась повышенная

2. Средняя относительная интенсивность реагирования в западном иммуноблотинге ди-, моно- и негликозилировнных фракций РгРВе8

Фракция Головной мозг

овцы, больной скрепи овцы, коровы, оленей №№

зараженной РГРВЭЕ зараженной РГРВЭЕ 1 2 3 4 5 6

Дигликозили-рованная 44 54 62 57 50 51 52 46 61

Моногликози-лированная 36 31 26 32 35 34 33 35 32

негликозили-рованная 20 15 12 11 15 16 15 19 7

Рис. 2. Аккумуляция РгРНет в вестибулярном ядре заболевшего оленя, выявленная иммуногистохимическим методом. В нейропиле видны многочисленные точечные и вытянутые скопления РгРНет (окрашены в коричневый цвет). Стрелкой показан участок нейрона со скоплением РгРНет (стрелка). Шкала = 100 мкм

Рис. 3. Аккумуляция РгРВв5 в нейроне (стрелка), а также гранулярном и молекулярном слоях коры мозжечка заболевшего оленя, выявленная иммуногистохимическим методом. Шкала = 100 мкм

Обсуждение

Проведенный эксперимент — первая успешная попытка экспериментального заражения РгРБ5Е оленей, причем его провели на благородном олене, о воприимчивости которого к приону ничего не известно. Благородный олень был выбран для проведения опыта потому, что в Великобритании в тот период, когда не было запрета на использование продуктов убоя домашних жвачных, больных трансмиссивными ГЭ, этому виду оленей наиболее часто давали на фермах, в зоопарках и парках концентрированный корм, который мог содержать прион. Кроме того, он является ближайшим родственником североамериканского лося, у которого регистрируют хроническую изнуряющую болезнь [33].

У экспериментально зараженных животных развилась такая же симптоматика, которая описана при хронической изнуряющей болезни оленей, включая даже проявления ингаляционной пневмонии [33], ставшей в одном случае причиной летального исхода. Поэтому можно говорить о том, что хроническую изнуряющую болезнь было бы невозможно клинически отличить от ГЭ КРС, если бы дикие жвачные болели последней в естественных условиях.

То же самое можно сказать и о характере вакуолизации головного мозга, если не учитывать более тяжелого поражения среднего мозга при ГЭ КРС [32]. У овец после перорального заражения РгРБ5Е также развивается вакуолизация ЦНС, причем стволовая часть ГМ поражается в наибольшей степени [11]. Сходные патоморфологические изменения ГМ описаны у чернохвостого оленя и лося при хронической изнуряющей болезни [34]. Можно констатировать, что ГЭ КРС и хроническая изнуряющая болезнь оленей невозможно дифференцировать посредством гистологического исследования.

С помощью иммуногистохимического метода установили, что у заболевших благородных оленей РгРк<я локали-

зуется только в ЦНС и периферической нервной системе. Это свидетельствует о том, что в инкубационный период инфекция распространялась из места введения (правое полушарие ГМ) по ЦНС и в периферическую нервную систему, что сопровождалось аккумуляцией РгР^. В целом характер распределения и аккумуляции приона в нервной системе оленей был таким же, как у КРС, овец и коз при экспериментальном и естественном течении трансмиссивных ГЭ, и характеризовался преимущественным внутриклеточным накоплением РгР^ с наибольшей интенсивностью в нейропиле серого вещества, включая тела и отростки прилегающих нейронов. Вытянутые и мульти-очаговые звездчато-сетчатые скопления РгР^ были ассоциированы с глиальными клетками [32]. В ряде экспериментов у КРС после перорального заражения высокими дозами РгРвж с вариабельной регулярностью обнаруживали РгРвж в периферических нервах, пейеровых бляшках и миндалинах [5, 26]. У зараженных тем же методом овец и оленей, больных хронической изнуряющей болезнью, РгРвж локализуется не только в нервной системе, но и в лимфоидных тканях [11, 33]. У интрацеребрально зараженных благородных оленей мы обнаружили РгРвж только в нервных тканях, однако ничего не известно о том, как поведет себя прион в организме этого вида животных при пероральном заражении.

У оленей, пораженных хронической изнуряющей болезнью, в отличие от сделанных нами наблюдений, аккумуляция приона происходит в небольшом количестве нейронов и не носит интенсивного характера (скопления РгР^ небольшие по размерам обнаруживают около и в нервных клетках, рассеянных в различных ядрах преимущественно ствола ГМ [24] и глубоком ядре мозжечка [23]. Однако нейропатология хронической изнуряющей болезни оленей детально описана лишь в единичных публикациях, и не ясно, вызывает ли эту ГЭ один или несколько штаммов приона. Можно ли дифференцировать такие штаммы приона у оленей с помощью эпитопного картирования [14], или по профилю их распределения в ГМ [9], еще предстоит выяснить.

Дифференцировать штаммы приона, вызывающие ГЭ КРС и хроническую изнуряющую болезнь оленей, вероятно, можно иммуногистохимическим методом, поскольку у экспериментально зараженных благородных оленей мы обнаружили РгРвж исключительно в нервных тканях, а при хронической изнуряющей болезни РгР^ локализуется также и лимфоидных тканях. Однако мы вводили прионсодер-жащий материал интрацеребрально, и нельзя исключить, что после перорального заражения оленей сохранится та же закономерность.

При исследовании в западном блотинге ГМ оленей опытной группы и коровы, больной ГЭ КРС, получили сходные результаты (наличие относительно быстро мигрирующей негликозилированной фракции и превалирование дигликозилированной фракции, рис. 4). У оленя № 5 интенсивность реакции была наибольшей. Это была единственная олениха среди животных опытной группы. Однако, по всей видимости, такой характер реагирования в западном блотинге был обусловлен не полом животного, а тем, что оно погибло (остальных оленей опытной группы подвергали убою на более ранних стадиях болезни).

Значительно большая миграция (р < 0,001) всех трех проте-азных фракций (ди-, моно- и негликозилированной) проб ГМ оленей по сравнению с пробами ГМ коровы и овцы, зараженных РгРвж, позволяет предположить, что это стало следствием адаптации приона к нервной системе оленя. Альтернативное объяснение этому может состоять в меньшем размере молекулы прионного белка оленя по сравнению с прионными белками КРС и овцы.

Заключение

Проведенный нами эксперимент показал, что благородный олень восприимчив к РгРвж при интрацеребральном заражении. Экспериментальное течение болезни у этого вида животных клинически ничем не отличается от хронической изнуряющей болезни оленей и лосей [33].

Необходимы жесткие меры предотвращения распространения в Европе хронической изнуряющей болезни, поскольку если будет зарегистрировано даже небольшое число случаев этой болезни у оленей, то придется обеспечивать контроль всей оленины, используемой в пищу населением этого региона.

Остается неизвестным, восприимчив ли благородный олень к естественному пероральному заражению прионом. Отсутствие РгР^ в лимфоидной ткани экспериментально зараженных оленей может свидетельствовать о невысоком риске заражения людей при употреблении в пищу мяса и других ненервных тканей оленей. Не исключено, что такой локализацией агента обусловлено ограничение его распространения среди оленей. Однако для того, чтобы подтвердить данные предположения, необходимо проведения эксперимента по пероральному заражению оленей.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Bruce M.E., Will R.G., Ironside J.W. et al. Transmissions to mice indicate that 'new variant' CJD is caused by the BSE agent. Nature, 1997, 389, 498—501.

2. Collinge J. Prion diseases of humans and animals, Their causes and molecular basis. Ann Rev Neurosci, 2001, 24, 519—550.

3. Collins S.J., Lawson V.A., Masters C.L. Transmissible spongiform encephalopathies. Lancet, 2004, 363, 51—61.

4. De Bosschere H., Saegerman C., Neukermans A. et al. First chronic wasting disease (CWD) surveillance of roe deer (Capreolus capreolus) in the Northern part of Belgium. Vet Quarterly, 2006, 28, 2, 55—60.

5. Espinosa J.C., Morales M., Castilla J. et al. Progression of prion infectivity in asymptomatic cattle after oral bovine spongiform encephalopathy challenge. J Gen Virol, 2007, 88, 1379—1383.

6. Foster J.D., Hope J., Fraser H. Transmission of Bovine Spongiform Encephalopathy to Sheep and Goats. Vet Rec, 1993, 133, 339—341.

7. Gavier-Widen D., Stack M.J., Baron T. et al. Diagnosis of transmissible spongiform encephalopathies in animals, a review. J Vet Diagn Invest, 2005, 17, 509—527.

8. Gonzalez L., Martin S., Begara-McGorum I. et al. Effects of agent strain and host genotype on PrP accumulation in the brain of sheep naturally and experimentally affected with scrapie. J Comp Pathol, 2002, 126, 17—29.

9. Gonzalez L., Martin S., Houston F.E. et al. Phenotype of disease-associated PrP accumulation in the brain of bovine spongiform encephalopathy experimentally infected sheep. J Gen Virol, 2005, 86, 827—838.

10. Hill A.F., Collinge J. Subclinical prion infection. Trends in Microbiol, 2003,

11. 578—584.

11. Jeffrey M., Ryder S., Martin S. et al. Oral inoculation of sheep with the agent of bovine spongiform encephalopathy (BSE). 1. Onset and distribution of disease- specific PrP accumulation in brain and viscera. J Comp Pathol, 2001, 124, 280—289.

12. Jeffrey M., Gonzalez L., Chong A. et al. Ovine infection with the agents of scrapie (CH1641 isolate) and bovine spongiform encephalopathy, Immunochemical similarities can be resolved by immunohistochemistry. J Comp Pathol, 2006, 134, 17—29.

13. Manson J.C., Cancellotti E., Hart P. et al. The transmissible spongiform encephalopathies, emerging and declining epidemics. Biochem Soc Transact, 2006, 34, 1155—1158.

14. Martin S., Gonzalez L., Chong A. et al. Immunohistochemical characteristics of disease-associated PrP are not altered by host genotype or route of inoculation following infection of sheep with bovine spongiform encephalopathy. J Gen Virol, 2005, 86, 839—848.

15. O'Rourke K.I., Besser T.E., Miller M.W. et al. PrP genotypes of captive and free-ranging Rocky Mountain elk (Cervus elaphus nelsoni) with chronic wasting disease. J Gen Virol, 1999, 80, 2765—2769.

16. Palmer M.S., Dryden A.J., Hughes J.T., Collinge J. Homozygous Prion Protein Genotype Predisposes to Sporadic Creutzfeldt-Jakob Disease. Nature, 1991, 352, 340—342.

17. Prusiner S.B. Molecular-Biology of Prion Diseases. Science, 1991, 252, 1515—1522.

18. Prusiner S.B. Prions. Proc Nat Acad Sci USA, 1998, 95, 13363—13383.

19. Schettler E., Steinbach F., Eschenbacher-Kaps I. et al. Surveillance for prion disease in Cervids, Germany. Emerging Infectious Diseases 2006, 12, 319—322.

20. Schwaiger K., Stierstorfer B., Schmahl W., Bauer J. Survey on transmis-