КОМБИНИРОВАННАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ СОЕДИНЕНИЕ FGF-18
COMBINED COMPOSITION CONTAINING FGF-18 COMPOUND

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к применению соединения FGF-18 в комбинации с другим активным ингредиентом, выбранным из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина. Указанная композиция может применяться для лечения расстройства хряща, такого как остеоартрит или повреждение хряща.
Предпосылки создания изобретения
Хрящ состоит из хондроцитов (клеток, полученных из мезенхимных клеток), которые диспергированы в матриксе (твердое, гелеобразное основное вещество). Хрящевой матрикс вырабатывается этими клетками и включает в себя, главным образом, коллагеновые волокна типа II (за исключением волокнистого хряща, который также содержит коллагеновые волокна типа I), протеогликаны и волокна эластина. Хрящ находится среди других участков в суставах, грудной клетке, ухе, носу, в горле, в трахее и в межпозвоночных дисках. Существует три основных типа хряща: гиалиновый, эластичный и фиброкардильный, обеспечивающие различные функциональные свойства в соответствии с их гистологической морфологией. Например, суставной хрящ представляет собой гиалиновый хрящ, имеющий вязкоупругие свойства, покрывающий суставные поверхности костей. Основная цель суставного хряща состоит в том, чтобы обеспечить гладкие поверхности, чтобы обеспечить движение сочлененных костей почти без трения.
Нарушения хряща в широком смысле относятся к заболеваниям, характеризующимся дегенерацией/ разрушением хряща и аномалиями в соединительных тканях, которые проявляются воспалением, болью, жесткостью и ограничением движения пораженных частей тела. Эти расстройства могут быть вызваны патологией или могут быть результатом травмы или повреждения. Зрелый хрящ имеет очень ограниченную способность к самовосстановлению, главным образом потому, что зрелые хондроциты имеют мало возможностей для пролиферации вследствие ограниченного снабжения питательными веществами из-за отсутствия кровеносных сосудов в хряще. Замена поврежденного хряща, в частности суставного хряща, вызванного либо травмой, либо заболеванием, является серьезной проблемой для врачей, а доступные хирургические процедуры лечения считаются непредсказуемыми и эффективными только в течение ограниченного времени у более молодых пациентов без остеоартрических изменений. Поэтому большинство пациентов либо не обращаются за лечением, либо получают рекомендацию отложить лечение на столько, насколько возможно. В случае, когда требуется лечение, стандартная процедура зависит от возраста и варьируется между полной или частичной заменой суставов, трансплантацией кусочков хряща или хондроцитов или способов стимуляции костного мозга (таких как микрофрактурирование). Микрофрактурирование - это недорогая и распространенная процедура, которая включает внедрение субхондральной кости, чтобы стимулировать осаждение хряща стволовыми клетками, полученными из костного мозга. Однако было показано, что этот способ не позволяет в достаточной мере устранить дефект хряща, а новообразуемый хрящ является, главным образом, волокнистым хрящом, что приводит к ткани с короткоживущим восстановлением. Действительно, волокнистый хрящ не обладает такими же биомеханическими свойствами, как гиалиновый суставной хрящ, и часто не обладает правильной латеральной интеграцией в окружающий хрящ. По этой причине вновь синтезированный волокнистый хрящ может разрушаться более легко (ожидаемые временные рамки: 5-10 лет).
Для пациентов с остеоартритом все эти способы восстановления хряща оказываются неподходящими. Остальная нехирургическая терапия включает физиотерапию, изменение образа жизни (например, снижение массы тела), вспомогательные устройства, препараты для перорального применения (например, нестероидные противовоспалительные препараты) и инъекцию лекарств (например, гиалуроновую кислоту и кортикоиды, и пищевую добавку. Все эти способы лечения не могут остановить прогрессирование ОА. Если болевая терапия также терпит неудачу, то оставшимся вариантом для пациентов является хирургическое вмешательство, такое как замена сустава или обширная остеотомия большеберцовой кости для коленного сустава. Тибиальные или бедренные остеотомии (разрезание кости для ребалансировки износа сустава) могут ослабить симптомы, помочь сохранить активный образ жизни и задержать необходимость полной замены суставов. Полная замена суставов может обеспечить облегчение симптомов развитого остеоартрита, но обычно требует значительного изменения образа жизни и/ или уровня активности пациента.
Современная доступная медикаментозная терапия в основном направлена на уменьшение боли. В настоящее время нет коммерчески доступного лечения, которое восстанавливает повреждения хряща (см. Lotz, 2010).
Интерлейкин 6 (IL-6) или рецептор интерлейкина-6 (IL-6R) являются возможной мишенью для лечения боли у пациента с остеоартритом. Действительно, было показано, в WO 2005080429 например, что весовое распределение задних лап (т.е. тест на несостоятельность) уменьшалось, когда вводили антитело к IL-6 в правое артритное колено мышиной модели ОА, что подчеркивает влияние анти-IL-6 при боли.
Ботулинический токсин типа А также описан в контексте боли, связанной с ОА. Появляется все больше свидетельств, подтверждающих его роль в модуляции боли (Boon et al., 2010). Поисковые исследования на людях показали эффективность в нескольких различных болезненных состояниях, включая боль, связанную с повреждением спинного мозга. Некоторые предварительные данные были получены для боли в плече, связанную с OA, с внутрисуставной инъекцией BoNT-A (Singh et al., 2009).
Соединение анти-NGF представляет собой еще одну категорию соединений, описываемую в контексте боли, связанной с ОА. В настоящее время Танезумаб, Фасинумаб или еще Фулранумаб разрабатываются для лечения боли у пациентов с ОА, и все они в настоящее время находятся на стадиях II/III клинических испытаний для артрита и/ или хронической боли, на основании многообещающих результатов на стадиях I или II клинических испытаний (Sanga et al., 2013; Tiseo et al., 2014).
Фактор роста фибробластов 18 (FGF-18) является членом семейства факторов роста фибробластов (FGF) белков, близкородственных FGF-8 и FGF-17. Было показано, что FGF-18 является пролиферативным средством для хондроцитов и остеобластов (Ellsworth et al., 2002; Shimoaka et al., 2002). FGF-18 был предложен для лечения нарушений хряща, таких как остеоартрит и повреждение хряща, либо отдельно (WO 2008023063), либо в сочетании с гиалуроновой кислотой (WO 2004032849).
Для FGF-18 были предложены различные режимы дозирования. Например, Moore et al. (2005) раскрывали введение два раза в неделю в течение 3 недель, а WO 2008023063 указывал на введение один раз в неделю в течение 3 недель. Этот последний режим дозирования был исследован в клинических испытаниях.
Несмотря на то, что режим дозирования, описанный в WO 2008023063, дает хорошие результаты при восстановлении суставного хряща, существует необходимость в способе ослабления боли/улучшения функции, при сохранении эффективности для лечения нарушений хряща. Действительно, боль не только очень часто ассоциируется с нарушениями хряща, но и является ведущим симптомом клинического выявления этих расстройств.
Краткое описание изобретения
Целью настоящего изобретения является предоставление применения соединения FGF-18 в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным активным ингредиентом, причем указанный по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина. FGF-18 в комбинации с дополнительным активным ингредиентом может применяться для лечения расстройства хряща. Указанное расстройство хряща представляет собой, например, остеоартрит или повреждение хряща.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей комбинацию по меньшей мере двух активных ингредиентов, в которой один из активных ингредиентов представляет собой соединение FGF-18 и в которой по меньшей мере один другой активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина. В одном варианте осуществления композиция по меньшей мере двух активных ингредиентов предназначена для лечения расстройства хряща. Указанное расстройство хряща представляет собой, например, остеоартрит или повреждение хряща.
Также охватывается соединение FGF-18 для применения при лечении хрящевого расстройства в сочетании с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом, причем указанный по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина. Указанное расстройство представляет собой, например, остеоартрит или повреждение хряща.
Кроме того, предлагается набор, содержащий соединение FGF-18 вместе с инструкциями для одновременного или последовательного применения по меньшей мере с одним дополнительным активным ингредиентом, причем указанный по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина.
Также включен набор, содержащий соединение FGF-18 и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент, где указанный дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединение ботулинического токсина вместе с инструкциями по применению.
В соответствии с изобретением в целом соединение FGF-18 и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент могут быть частью фармацевтических композиций. Соединение FGF-18 и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент являются частью одного и того же фармацевтического состава или являются частью отдельных фармацевтических составов. Указанные фармацевтические составы могут дополнительно содержать по меньшей мере один наполнитель.
Определения
- Под термином «соединение FGF-18» или «FGF-18», используемым в настоящем документе, подразумевается белок, сохраняющий по меньшей мере одну биологическую активность белка FGF-18 человека (т.е. фактора роста фибробластов 18). FGF-18 может быть нативным, в своей зрелой форме, рекомбинантной форме или укороченной форме. Биологическая активность белка FGF-18 человека включает, в частности, усиление пролиферации хондроцитов или остеобластов (см. W09816644) или образования хряща (см. WO 2008023063). Нативный, или дикого типа, человеческий FGF-18 представляет собой белок, экспрессируемый хондроцитами суставного хряща. Человеческий FGF-18 был впервые обозначен zFGF-5 и полностью описан в W09816644. SEQ ID NO: 1 соответствует аминокислотной последовательности нативного человеческого FGF-18 с сигнальным пептидом, состоящим из аминокислотных остатков от 1 (Met) до 27 (Ala). Зрелая форма человеческого FGF-18 соответствует аминокислотной последовательности от остатка 28 (Glu) до остатка 207 (Ala) SEQ ID NO: 1 (180 аминокислот).
E. coli
E.coli
FGF-18 в настоящем изобретении может быть получен рекомбинантным способом, например, описанным в заявке WO 2006063362. В зависимости от систем и условий экспрессии FGF-18 в настоящем изобретении экспрессируется в рекомбинантной клетке-хозяине со стартовым остатком метионина (Met) или с сигнальной последовательностью для секреции. При экспрессии в прокариотическом хозяине, например, в , FGF-18 содержит дополнительный остаток Met на N-конце своей последовательности. Например, аминокислотная последовательность человеческого FGF-18, экспрессируемая в , начинается с остатка Met на N-конце (положение 1), а затем следуют остатки с 28 (Glu) до остатка 207 (Ala) SEQ ID NO: 1.
E.coli
- Термин «усеченная форма» FGF-18, используемый в настоящем документе, относится к белку, который содержит или состоит из остатков с 28 (Glu) до 196 (Lys) SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, усеченная форма белка FGF-18 представляет собой полипептид, обозначенный как «trFGF-18» (170 аминокислот, также известный как rhFGF-18 или сприфермин), который начинается с остатка Met (в N-конце), за которым следуют аминокислотные остатки 28 (Glu) -196 (Lys) человеческого FGF-18 дикого типа. Аминокислотная последовательность trFGF-18 показана в SEQ ID NO: 2 (аминокислотные остатки от 2 до 170 SEQ ID NO: 2 соответствуют аминокислотным остаткам с 28 по 196 SEQ ID NO: 1). trFGF-18 представляет собой рекомбинантную усеченную форму человеческого FGF-18, продуцируемую в  (см. WO 2006063362). Было показано, что trFGF-18 проявляет активности, сходные с таковыми зрелого FGF-18 человека, например, он увеличивает пролиферацию хондроцитов и осаждение хряща, что приводит к исправлению и восстановлению для различных хрящевых тканей (см. WO 2008023063).
- Используемый в настоящем документе термин «ингибитор IL-6» относится к соединению, которое способно ингибировать активность IL-6 (т.е. интерлейкина 6), частично или полностью. Предпочтительным «ингибитором IL-6» в соответствии с настоящим изобретением является антитело или его фрагменты, а также наночастицы. Таким соединением является, в качестве неограничивающего примера, силтуксимаб (см. SEQ ID 4-5) или PMP6B6 (см. SEQ ID No. 6). Дазакинумаб, клазакизумаб, сирукумаб, олокизумаб или OP-R003 являются другими примерами известных ингибиторов IL-6 (конкретные последовательности не известны).
- Термин «ингибитор рецептора IL-6», используемый в настоящем документе, относится к соединению, которое способно ингибировать активность рецептора IL-6 (т.е. рецептора интерлейкина 6), частично или полностью. Предпочтительными «ингибиторами рецептора IL-6» в соответствии с настоящим изобретением являются антитело или его фрагменты, а также наночастицы. Таким соединением является, в качестве неограничивающего примера, тоцилизумаб (см. SEQ ID NO: 7-8). SA-237 или ALX-0061 являются другими примерами известных ингибиторов рецептора IL-6 (определенные последовательности неизвестны).
- Используемый в настоящем документе термин «ингибитор NGF» относится к соединению, которое способно ингибировать активность NGF (т.е. фактора роста нервов), частично или полностью. Предпочтительными «ингибиторами NGF» в соответствии с настоящим изобретением являются антитело или его фрагменты, а также наночастицы. Таким соединением является, в качестве неограничивающего примера, танезумаб (см. SEQ ID NO: 9-10), фасинумаб (см. SEQ ID No. 11-12), фулранумаб (см. SEQ ID No. 13-14). ANA-02, ABT-1 10, ALD-906 или MEDI-578 являются другими примерами известных ингибиторов рецептора NGF (определенные последовательности неизвестны).
Clostridium botulinum
- Используемый в настоящем документе термин «соединение ботулинического токсина» относится к нейротоксическому белку, продуцируемому бактерией  и родственными видами. Предпочтительным «соединением ботулинического токсина», используемым в соответствии с настоящим изобретением, является ботулинический токсин типа А (также известный как BoNT-A или BoNT/A, см. SEQ ID 3). Такими соединениями являются, например, соединения, известные как абоботулинумтоксинА, абоботулинумтоксинА, инкоботулинумтоксинА.
- Термин «цикл лечения» или «цикл» соответствует периоду, в котором соединение FGF-18 в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным активным ингредиентом. Например, один цикл может состоять из 3 инъекций соединения FGF-18 в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом один раз в неделю. Такой «цикл лечения» можно повторить. Например, второй «цикл лечения» может быть выполнен через 3, 4, 5 или 6 месяцев после последней инъекции предыдущего цикла. Альтернативно, второй цикл также может быть выполнен через 1 год или 2 года после первой инъекции в первом цикле.
http://www.cartilage.org/ files/contentmanagement/ICRS evaluation.pdf,
- Термин «нарушение хряща», используемый в настоящем документе, охватывает нарушения, вызванные повреждениями вследствие травмы, такими как травматическое повреждение, хондропатии или артрита. Примеры нарушений хряща, которые могут быть обработаны путем введения композиции FGF-18, описанной в настоящем документе, включают, без ограничения, артрит, такой как остеоартрит, и повреждение хряща. Этой формулировкой также охватываются дегенеративные заболевания/ расстройства хряща или сустава, такие как хондрокальциноз, полихондрит, рецидивирующий полихондрит, анкилозирующий спондилоартрит или стохондронит. Международное общество восстановления хряща предложило систему артроскопической оценки для оценки степени тяжести дефекта хряща: нормальный здоровый хрящ 0: (нормальный), степень 1: хрящ имеет мягкое пятно или волдыри, степень 2: незначительные надрывы, видимые в хряще, степень 3: поражения имеют глубокие расщелины (более 50% хрящевого слоя) и 4-й степени: хрящный надрыв обнажает лежащую в основании (субкрональную) кость (см. публикацию ICRS:  стр. 13).
- Термин «артрит», используемый в настоящем документе, охватывает такие нарушения, как остеоартрит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, инфекционный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла (начало ювенильного ревматоидного артрита) или рассекающий остеохондрит. Он предпочтительно включает заболевания или расстройства, в которых поврежден хрящ.
th
- Термин «остеоартрит» используется для обозначения наиболее распространенной формы артрита. Термин «остеоартрит» охватывает как первичный остеоартрит, так и вторичный остеоартрит (см., например, The Merck Manual, 17 edition, page 449). Остеоартрит может быть вызван расстройством хряща. Частицы хряща могут разорваться и вызвать боль и отек в суставе между костями. Со временем хрящ может полностью изнашиваться, и кости будут тереться друг о друга. Остеоартрит может влиять на любой сустав, но обычно это касается рук, плеч и суставов, таких как бедра, колени, ноги и позвоночник. В предпочтительном примере остеоартрит может представлять собой остеоартрит коленного сустава или остеоартрит бедра. Эта формулировка охватывает, в частности, формы остеоартрита, которые классифицируются как стадия 1 - стадия 4 или от класса 1 до класса 6 в соответствии с системой классификации Международного общества по изучению остеоартрита (OARSI). Специалист в данной области полностью осведомлен о классификациях остеоартрита, которые используются в данной области, в частности, в системе оценки OARSI (также называемой OOCHAS, см., например, Custers et al., 2007). Остеоартрит является одним из предпочтительных нарушений хряща, которые можно лечить путем введения соединений FGF-18 в соответствии с настоящим изобретением.
- Термин «повреждение хряща», используемый в настоящем документе, представляет собой хрящевое расстройство или повреждение хряща, в частности, в результате травмы. Повреждение хряща может произойти особенно после травматического механического разрушения, особенно в случае аварии или операции (например, операция микротрещин). Этот термин «повреждение хряща» также включает хондральный или остеохондральный перелом и повреждение мениска. Также в этом определении рассматривается спортивная травма или спортивный износ тканей сустава. Этот термин также включает в себя микроразрушение или тупую травму, хондральный перелом, остеохондральный перелом или повреждение мениска.
Подробное описание изобретения
Неожиданно было обнаружено, что композиции и применения по настоящему изобретению по меньшей мере поддерживают активность сприфермина. В самом деле, было обнаружено, что в целом 1) на эффекты соединения FGF-18 не оказывают влияния ингибитор IL-6, ингибитор рецептора IL-6, ингибитор NGF или соединение ботулинического токсина при введении в соответствии с раскрытыми в настоящем документе композициями и применениями и 2), что соединение FGF-18 не оказывает влияния на действие ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина при введении в соответствии с композициями и применениями, описанными в настоящем документе. Это открытие было неожиданным из-за высокой молекулярной массы каждого из соединений комбинации. Также удивительно, что указанные активности поддерживаются даже при очень низкой дозе для каждого соединения. Не только комбинации в целом поддерживают соответствующие активности, но, что еще более удивительно, анаболические эффекты FGF-18 могут быть потенцированы (см. Примеры 1 и 2, например). Другим преимуществом настоящего изобретения является то, что оно позволяет уменьшать боль/ улучшать функцию при по меньшей мере сохранении эффективности FGF-18 для лечения расстройства хряща.
Настоящее изобретение относится к применению соединения FGF-18 в сочетании с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом (в настоящем документе индифферентно альтернативно называется «дополнительным активным ингредиентом» или «другим активным ингредиентом»), причем указанный по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина. В одном варианте осуществления FGF-18 в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом предназначены для лечения расстройства хряща. Указанное расстройство хряща представляет собой, например, остеоартрит или повреждение хряща.
В следующем конкретном варианте осуществления соединение FGF-18 в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом вводят внутрисуставно. Альтернативно, соединение FGF-18 вводят внутрисуставно и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент вводят внутривенно или подкожно.
Соединение FGF-18 можно вводить в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом либо одновременно (совместное введение), либо последовательно (в любом порядке). Если соединение FGF-18 и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент вводят последовательно, указанное последовательное введение предпочтительно следует делать во время того же визита к врачу.
Также объектом изобретения является соединение FGF-18 для применения при лечении хрящевого расстройства. В сочетании с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом, где указанный по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина. Указанное расстройство хряща представляет собой, например, остеоартрит или повреждение хряща. Соединение FGF-18 в комбинации с дополнительным активным ингредиентом предпочтительно вводят внутрисуставно. Альтернативно, соединение FGF-18 вводят внутрисуставно и по меньшей мере дополнительный активный ингредиент вводят внутривенно или подкожно.
Соединение FGF-18 можно вводить в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом либо одновременно (совместное введение), либо последовательно (в любом порядке). Если соединения вводят последовательно, указанное последовательное введение предпочтительно следует делать во время того же визита к врачу.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей комбинацию по меньшей мере двух активных ингредиентов, в которой один из активных ингредиентов представляет собой соединение FGF-18 и в которой по меньшей мере один другой активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина.
В одном варианте осуществления композиция по меньшей мере двух активных ингредиентов предназначена для лечения расстройства хряща. Указанное расстройство представляет собой, например, остеоартрит или повреждение хряща.
В следующем конкретном варианте осуществления композицию по меньшей мере двух активных ингредиентов вводят внутрисуставно.
В контексте изобретения композиция, содержащая комбинацию по меньшей мере двух активных ингредиентов, дополнительно содержит по меньшей мере один эксципиент, по меньшей мере один эксципиент представляет собой, например, буфер, поверхностно-активное вещество, соль, антиоксидант, изотоническое средство, наполнитель, стабилизатор или любую их комбинацию.
Далее предлагается набор, содержащий соединение FGF-18 вместе с инструкциями для одновременного или последовательного применения (в любом порядке) в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным активным ингредиентом, причем указанный по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина. Соединение FGF-18 и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент могут быть частью отдельной фармацевтической композиции. В таком случае каждая фармацевтическая композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, эксципиенты или тому подобное.
Также включен набор, содержащий соединение FGF-18 и по меньшей мере один другой активный ингредиент, где указанный по меньшей мере один другой активный ингредиент выбран из группы, состоящей из ингибитора IL-6, ингибитора рецептора IL-6, ингибитора NGF или соединения ботулинического токсина вместе с инструкциями по применению. Соединение FGF-18 и другой активный ингредиент могут быть частью одной и той же фармацевтической композиции или каждой части отдельной фармацевтической композиции. Указанный фармацевтический состав(ы) может дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, эксципиенты или тому подобное.
Соединение FGF-18 по изобретению в целом предпочтительно выбирают из группы, состоящей из а) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы FGF-18 человека, включающего остатки 28-207 SEQ ID NO: 1 или b) полипептида, содержащего или состоящего из FGF-18 (170AA) (SEQ ID NO.2). В частности, это соединение выбрано из зрелого FGF-18 дикого типа человека или trFGF-18. Указанное соединение увеличивает осаждение хряща и позволяет восстановить хрящ. Соединение FGF-18 предпочтительно вводят внутрисуставно в дозе 3-600 мкг/г (μг или мкг), предпочтительно 3-300 мкг или предпочтительно 10-200 мкг или более предпочтительно 30-150 мкг или даже более предпочтительно 30-120 мкг на одно введение. В предпочтительном варианте осуществления лечение включает введение в дозе или приблизительно 3, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 90, 100, 120, 150, 180, 200, 240 или 300 мкг на одно внутрисуставное введение соединение FGF-18. Предпочтительные дозы включают 10, 20, 30, 60, 90, 120, 180, 240 или 300 мкг на одно внутрисуставное введение соединения FGF-18. Следует понимать, что доза вводимого соединения FGF-18 будет различной в зависимости от того, является ли проходяший лечение пациент человеком или млекопитающим, отличным от человека. Например, для собак доза будет предпочтительно в 5 раз менее существенной, чем для человека. В качестве примера, если доза для человека должна составлять от 30 до 120 мкг на одно внутрисуставное введение, доза для собаки может варьировать от 5 до 20 мкг на одно внутрисуставное введение.
В контексте настоящего изобретения в целом ингибитор IL-6 предпочтительно представляет собой антитело против IL-6 (альтернативно называемое антителом анти-IL-6) или наночастицу, направленную на IL-6 (альтернативно именуемое нано-антителом анти-IL-6). Примеры таких ингибиторов приведены в разделе определений. Указанный ингибитор IL-6 можно вводить в дозе 0,001-1000 миллиграммов (мг), предпочтительно 0,1-500 мг или более предпочтительно 0,2-250 мг на одно введение. В предпочтительном варианте осуществления лечение включает введение в дозе около 0,01, 0,02, 0,03, 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или 300 мг на одно введение ингибитора IL-6. Альтернативно, может использоваться известная схема дозирования для данного лекарственного средства. Следует понимать, что доза ингибитора IL-6 будет различной в зависимости от того, является ли проходяший лечение пациент человеком или млекопитающим, отличным от человека. Например, для собак доза будет предпочтительно в 6 раз менее существенной, чем для человека. В качестве примера, если человеческая доза ингибитора IL-6 составляет 2 мг на одно введение, доза для собаки может составлять около 0,35 мг на одно введение. Врач адаптирует режим дозирования для случая ингибитора IL-6 в зависимости от пациента.
В контексте настоящего изобретения в целом ингибитор рецептора IL-6 предпочтительно представляет собой антитело против рецептора IL-6 (альтернативно называемое антителом анти-IL-6R) или нанотело, направленное на рецептор IL-6 (альтернативно названный нанотело анти-IL-6R). Примеры таких ингибиторов приведены в разделе определений. Указанный ингибитор рецептора IL-6 можно вводить в дозе 0,001-500 миллиграммов (мг), предпочтительно 0,1-250 мг или более предпочтительно 0,5-200 мг на одно введение. В предпочтительном варианте осуществления лечение включает введение в дозе около 0,01, 0,03, 0,1, 0,25, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или 300 мг на одно введение ингибитора IL-6R. Альтернативно, может использоваться известная схема дозирования для данного лекарственного средства. Например, тоцилизумаб одобрен при лечении ревматоидного артрита при дозировке 4 мг на килограмм при внутривенном введении или при 162 мг при подкожном введении. Следует понимать, что доза ингибитора IL-6R будет различной, если пациент должен быть обработан человеком или человеком, не являющимся человеком. Например, для собак доза будет предпочтительно в 6 раз менее важной, чем для человека. Например, если человеческая доза ингибитора IL-6R составляет 150 мг на одно введение, доза для собаки может составлять 25 мг на одно введение. Врач должен адаптировать режим дозирования для ингибитора IL-6R для конкретного случая, в зависимости от пациента.
В контексте настоящего изобретения в целом ингибитор NGF предпочтительно представляет собой антитело против NGF (альтернативно называемое анти-NGF-антителом) или нанотело, нацеленное на NGF (альтернативно называемое анти-NGF-нанотелом). Примеры таких ингибиторов приведены в разделе определений. Указанный ингибитор NGF можно вводить в дозе 0,01-250 миллиграммов (мг), предпочтительно 0,1-100 мг или более предпочтительно 0,5-75 мг на одно введение. В предпочтительном варианте осуществления лечение включает введение в дозе приблизительно 0,03, 0,1, 0,25, 0,3, 0,5, 1, 1,5, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или 150 мг на одно введение ингибитора NGF. Альтернативно, может использоваться известная схема дозирования для данного лекарственного средства. Следует понимать, что доза ингибитора NGF будет различной в зависимости от того, является ли проходяший лечение пациент человеком или млекопитающим, отличным от человека. Например, для собак доза будет предпочтительно в 6 раз менее существенной, чем для человека. Например, если человеческая доза ингибитора NGF составляет 10 мг на одно введение, доза для собаки может составлять около 1,5 мг на одно введение. Врач должен адаптировать режим дозирования для ингибитора NGF для конкретного случая, в зависимости от пациента.
В контексте настоящего изобретения в целом соединение ботулинического токсина, предпочтительно ботулинический токсин типа А (см. Раздел определения), можно вводить в дозе 0,1-1000 единиц (U), предпочтительно 0,2-500 U или более предпочтительно 0,5-300 U на одно введение. В предпочтительном варианте осуществления лечение включает введение в дозе около 0,3, 0,5, 1, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 250 или 300 U ботулинического токсина на одно введение. Альтернативно, может использоваться известная схема дозирования для данного лекарственного средства. Следует понимать, что доза соединения ботулинического токсина будет различной в зависимости от того, является ли проходяший лечение пациент человеком или млекопитающим, отличным от человека. Например, для собак доза будет предпочтительно в 6 раз менее существенной, чем для человека. В качестве примера, если человеческая доза соединения ботулинического токсина составляет 100 U на одно введение, доза для собаки может составлять около 15 U на одно внутрисуставное введение. Врач адаптирует режим дозирования для соединения ботулинического токсина в каждом конкретном случае в зависимости от пациента.
В контексте изобретения в целом соединение FGF-18 и по меньшей мере один дополнительный активный ингредиент являются частью фармацевтических составов. Соединения FGF-18 и/ или по меньшей мере один другой активный ингредиент могут быть составлены в виде фармацевтической композиции (композиций), то есть вместе с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, эксципиентами и т.п. Определение «фармацевтически приемлемый» означает включение любого носителя, эксципиентов или тому подобного, что не мешает эффективности биологической активности активного ингредиента и не токсично для пациента, которому он вводится. По меньшей мере один эксципиент, например, выбран из группы, состоящей из буфера, поверхностно-активного вещества, соли, антиоксиданта, изотонического средства, наполнителя, стабилизатора или любой их комбинации. Например, для парентерального введения активный белок (белки) может быть подготовлен в виде стандартной лекарственной формы для инъекций в носителях, таких как солевой раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера. Препараты для внутрисуставного применения должны соответствовать большинству требований, которые также применимы к другим препаратам для инъекций, то есть они должны быть стерильными и совместимыми с физиологическими условиями на участке применения (например, коленного сустава, синовиальной жидкости). Эксципиенты, используемые для внутрисуставной инъекции, могут также присутствовать в других препаратах для инъекций, например, для внутривенного или подкожного введения. Такие составы соединений FGF-18 и/ или по меньшей мере одного дополнительного активного ингредиента, включая по меньшей мере один дополнительный фармацевтически приемлемый носитель, эксципиенты или тому подобное, также полезны в контексте настоящего изобретения.
В контексте изобретения в целом соединение FGF-18 в комбинации с по меньшей мере одним другим активным ингредиентом будет полезно для лечения нарушений хряща, таких как остеоартрит или повреждение хряща. В частности, оно может использоваться для лечения суставных хрящевых дефектов в синовиальных суставах, которые, например, происходят из-за поверхностной фибрилляции (раннего остеоартрита), дегенерации хряща вследствие остеоартрита и хондральных или остеохондральных дефектов из-за травмы или заболевания. Соединения FGF-18 в сочетании с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом могут также использоваться для лечения заболеваний суставов, вызванных диссекациями остеохондроза и дегенеративными заболеваниями суставов. В области реконструктивной и пластической хирургии соединения FGF-18 в сочетании с по меньшей мере одним другим активным ингредиентом будут полезны для расширения или переноса аутогенного или аллогенного хряща для восстановления обширных дефектов ткани. Композиции FGF-18 могут применяться для восстановления повреждений хряща в сочетании с промыванием сустава, стимуляцией костного мозга, абразивной артропластикой, субхондральным сверлением или микроразрушением субхондральной кости.
В предпочтительном варианте осуществления хрящевое расстройство, подлежащее лечению в соответствии с изобретением, представляет собой остеоартрит, такой как остеоартрит коленного сустава или остеоартрит бедра. Остеоартрит, подлежащий лечению, может представлять собой, например, и без ограничения, первичный остеоартрит или вторичный остеоартрит, а также остеоартрит, который классифицируется как стадия 1 - стадия 4 или с класса 1 до класса 6 в соответствии с классификационной системой OARSI.
В другом предпочтительном варианте хрящевое расстройство, подлежащее лечению в соответствии с изобретением, представляет собой повреждение хряща с хирургическим вмешательством, таким как микрофрактурирование, и без него. Кроме того, после роста хряща вследствие введения соединения FGF-18 в комбинации с по меньшей мере дополнительным активным ингредиентом, может потребоваться хирургическое лечение для создания надлежащего контура новообразованной поверхности хряща.
В предпочтительном варианте осуществления лечение включает пероксиновиальное введение, внутрисиновиальное введение, периартикулярное введение или внутрисуставное введение соединения FGF-18 либо отдельно, либо вместе с по меньшей мере одним другим активным ингредиентом. Соединения FGF-18 могут применяться либо отдельно, либо вместе с по меньшей мере одним другим активным ингредиентом путем прямой инъекции в синовиальную жидкость сустава или непосредственно в дефект, либо самостоятельно, либо в комплексе с подходящим носителем для длительного высвобождения белка (например, препараты с замедленным высвобождением) или ограниченного местного высвобождения. Если по меньшей мере один другой активный ингредиент не вводится в соответствии с тем же режимом введения, что и соединение FGF-18, его можно вводить внутривенно или подкожно. Внутрисуставное введение осуществляется в суставе, выбранном из сустава бедра, колена, локтя, запястья, лодыжки, позвоночника, стоп, пальцев, пальцев ног, рук, плеч, ребер, лопаток, бедер, голени, пятки и вдоль костных точек позвоночника. В еще одном предпочтительном варианте осуществления внутрисуставное введение проводят в сустав тазобедренного сустава или колена.
Для лечения расстройства хряща соединение FGF-18 в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом можно вводить в течение по меньшей мере одного цикла лечения. Цикл лечения может состоять, например, из трех инъекций соединения FGF-18 в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным активным ингредиентом один раз в неделю. Такой цикл лечения можно повторять. Например, второй цикл лечения может быть выполнен через 3, 4, 5 или 6 месяцев после последней инъекции предыдущего цикла. Альтернативно, второй цикл также может быть выполнен через 1 год или 2 года после первой инъекции в первом цикле.
Описание фигур
«*»
Фигура 1: Клетки BaF3/FGFR3 культивировали 48 ч с CNTO328 или PMP6B6 и со сприфермином (квадраты) или без сприфермина (круги). CTR+ представляют собой O.D., полученные с клетками, культивируемыми со сприфермин только, и CTR- - с клетками, культивируемыми без сприфермина. Клетки, культивированные с помощью CNTO328 или PMP6B6 и сприфермина, сравнивали с CTR+, тогда как клетки, культивированные без сприфермина, сравнивали с CTR-. Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает «отличающееся» с p <0,05
Фигура
2
«*»
: Человеческие хондроциты культивировали семь дней в присутствии CNTO328 или PMP6B6 в присутствии (квадраты) или в отсутствии (кругах) сприфермина. Были оценены плотность клеток и продукция GAG. Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает «отличающееся» с p <0,05 от той же концентрации CNTO328 или PMP6B6, но без FGF-18. «#» означает «отличающееся» с p <0,05 от контроля без CNTO328 или PMP6B6 (0 нг/мл).
Фигура
3
«*»
: Человеческие хондроциты культивировали семь дней в присутствии CNTO328 или PMP6B6 в присутствии (квадраты) или в отсутствии (круги) сприфермина. Оценивали экспрессию коллагена типа I, II, Sox9. Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает отличающееся с p <0,05 от той же концентрации CNTO328 или PMP6B6, но без FGF-18. «#» означает отличающееся с p <0,05 от контроля без CNTO328 или PMP6B6 (0 нг/мл).
Фигура
4
«*»
: клетки BaF3/FGFR3 культивировали 48 ч с актемра и со сприфермином (квадраты) или без сприфермина (круги). CTR+ - O.D., полученные с клетками, культивируемыми только со сприфермином 100 нг/ мл и CTR- с клетками, культивируемыми без сприфермина. Клетки, культивируемые с актемра и со сприфермином, сравнивали с CTR+, тогда как клетки, культивируемые без сприфермина, сравнивали с CTR-. Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает отличающееся с p <0,05.
Фигура
5
«*»
: Человеческие хондроциты культивировали семь дней в присутствии актемра в присутствии (квадраты) или в отсутствии (круги) сприфермина. Оценивали плотность клеток и продукция GAG. Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает отличающееся с p <0,05 от той же концентрации актемра, но без FGF-18. «#» означает отличающееся с p <0,05 от контроля без актемра (0 нг/мл).
Фигура
6
«*»
: Человеческие хондроциты культивировали семь дней в присутствии актемра в присутствии (квадраты) или в отсутствии (круги) сприфермина. Оценивали экспрессию коллагена I, II, Sox9. Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает отличающееся с p <0,05 от той же концентрации актемра, но без FGF-18. «#» означает отличающееся с p <0,05 от контроля без актемра (0 нг/мл).
Фигура
7
«*»
: Клетки BaF3/FGFR3 культивировали 48 ч с танезумабом и со сприфермином (квадраты) или без сприфермина (круги). CTR+ представляет собой O.D., полученную с клетками, культивируемыми только со сприфермином 100 нг/мл. Клетки, культивируемые с танезумабом и сприфермином, сравнивали с CTR+. Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает отличающееся с p <0,05.
Фигура
8:
«*»
клетки BaF3/FGFR3 культивировали 48 ч с помощью Xeomin и со (квадраты) сприфермином или без (круги) сприфермина. CTR+ представляет собой O.D., полученную с клетками, культивируемыми только со сприфермином, и CTR- - с клетками, культивируемыми без какого-либо соединения. Клетки, культивируемые с Xeomin и сприфермином, сравнивали с CTR+, тогда как клетки, культивируемые без сприфермина, сравнивали с CTR-.  означает отличающееся с p <0,01.
Фигура
9
«*»
: Бычьи холинциты культивировали семь дней в присутствии Xeomin в присутствии (квадраты) или в отсутствии (круги) сприфермина. Оценивали плотность клеток и продукцию GAG. Клетки, культивируемые с помощью Xeomin, сравнивали со своими соответствующими контролями (0 мЕд/мл Xeomin, с или без сприфермин). Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает отличающееся с p <0,01.
Фигура
10
«*»
: Бычьи хондроциты культивировали семь дней в присутствии Xeomin в присутствии (квадраты) или в отсутствии (круги) сприфермина. Оценивали экспрессию коллагена типа I, II, Sox9 и аггрекана. Клетки, культивированные с помощью Xeomin, сравнивали с их соответствующими контрольными средствами (0 мЕд/мл Xeomin, со сприфермином или без него). Символы представляют собой среднее +/- стандартная погрешность среднего.  означает отличающееся с p <0,01.
Описание последовательностей
SEQ ID N0.1:
Аминокислотная последовательность нативного FGF-18 человека.
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность рекомбинантного усеченного FGF-18 (trFGF-18).
SEQ ID NO.3:
Аминокислотная последовательность ботулинического нейротоксина типа А (Xeomin)
SEQ ID NO.4:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи CNTO328 (силтуксимаб)
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность легкой цепи CNTO328 (силтуксимаб)
SEQ ID NO:
Аминокислотная последовательность PMP6B6
SEQ ID NO.7:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи тоцилизумаба (Actemra)
SEQ ID NO.8:
Аминокислотная последовательность легкой цепи тоцилизумаба (Actemra)
SEQ ID NO.9:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи танезумаба
SEQ ID NO.10:
Аминокислотная последовательность легкой цепи танезумаба
SEQ ID NO.11:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи фасинумаба
SEQ ID NO.12:
Аминокислотная последовательность легкой цепи фасинумаба
SEQ ID NO.13:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи фулранумаба
SEQ ID NO.14
: Аминокислотная последовательность легкой цепи фулранумаба
Примеры
Материал
Соединение FGF-18:
E.coli
рекомбинантный усеченный FGF-18 (trFGF-18) настоящих примеров был получен экспрессией в  в соответствии со способом, описанным в заявке WO 2006063362. В следующих примерах trFGF-18 и FGF-18 используются взаимозаменяемо. Они были составлены в 7мМ Na2HP04, 1мМ KH2P04, 2,7мМ KCI, pH 7,3.
Соединение ботулинического токсина
: ботулинический нейротоксин типа А настоящих примеров представляет собой Xeomin (Мерз, Франкфурт, Германия). Он был составлен в 4,7 мг/мл сахарозы, 1 мг/мл HAS.
Ингибиторы IL-6
: Ингибиторы IL-6 настоящих примеров представляют собой:
- CNTO328 (силтуксимаб) представляет собой антитело против IL-6. Оно было составлено в PBS.
- PMP6B6 представляет собой нанотело, нацеленное на IL-6. Оно было составлено в BMM2.
Ингибитор рецептора IL-6.
Ингибитором рецептора IL-6 настоящих примеров является тоцилизумаб (Actemra).
Ингибитор NGF:
Ингибитором NGF настоящих примеров является танезумаб.
Пример 1 - комбинация FGF-18 и ингибиторов IL-6
Методы
:
Биоанализ BaF3/FGFR3c:
7
2
2
2
За день до начала анализа 1×10 клеток засевали в 20 мл аналитической среды в колбе на 75 см в течение 24 часов при 37°С, 5% СО на стадии ограничения по IL-3. В день анализа 20000 клеток/ лунку засевали в 96-луночный планшет в 50 мкл аналитической среды, содержащей либо CNTO328 при 0,1, 1, 10, 100, 1000 и 10000 нг/ мл, либо PMP6B6 при 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 и 100 нг/ мл и содержащей или не содержащей 100 нг/мл сприфермина. В качестве контролей клетки также культивировали только со 100 нг/мл сприфермина (положительный контроль, CTR+ на графике), с BMM2 1/2200 или без какого-либо соединения (оба отрицательных контроля, CTR- на графике). Все условия были реализованы при N=6. Клетки культивировали в течение 2 дней при 37°С, 5% СО и метаболическую активность определяли при помощи реагента WST-1 (Рош).
Первичная культура хондроцитов человека:
2
после выделения клеток человеческие хондроциты инокулировали в количестве 14-18 миллионов клеток в 75 см колбе и культивировали в течение семи-двенадцати дней в полной HAM's F12. Затем клетки собирали с помощью аккутазы и подсчитывали перед инокулированием в 24-луночный планшет при 200 000 клеток/лунку в 1 мл полного FAM HAM, дополненного различными концентрациями CNTO328 (1, 10, 100, 1000 нг/мл) или PMP6B6 (0,1, 1, 10 и 100 нг/мл) в присутствии или в отсутствие сприфермина 100 нг/ мл. В качестве контролей клетки также культивировали только с помощью сприфермина 100 нг/ мл (положительный контроль), с BMM2 1/2200 или без какого-либо соединения (оба отрицательных контроля). Результаты для отрицательных контролей показаны при значениях 0 нг/ мл для концентраций PMP6B6 и CNTO328. Все условия были реализованы при N=3. Клетки культивировали в течение семи дней при 37°С, 5% СО2 и после трех дней проводили полную смену среды. В конце культивирования клетки разделяли с помощью аккутазы (Сигма-Алдрич) и концентрацию клеток оценивали с помощью Vicell (Бекманн Култер).
Анализ c диметилметиленовым синим (DMMB) использовали для количественного определения гликозаминогликана (GAG) в культуральной среде, отобранной после семи дней культивирования. 50 мкл образцов смешивали с 200 мкл реагента DMMB (16 мг/мл DMMB в этаноле, муравьиной кислоте и формиате азота) в 96-луночных планшетах. Поглощение при 525 нм регистрировали и сравнивали с таковой для стандартов хондроитинсульфата С (Сигма-Алдрич). Концентрации GAG (мкг/мл) делили на концентрацию клеток (миллион клеток/ мл), чтобы нормализовать продукцию GAG (в мкг/миллион клеток)
Экспрессию гена анализировали с помощью количественной ПЦР. РНК сначала была выделена с помощью мининабора RNeasy (Кайджен) и кДНК синтезировали с помощью SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix (Сигма-Алдрич). Затем кДНК расщепляли РНКазой H для расщепления РНК и анализировали с помощью количественной ПЦР с помощью смеси SYBRGreen Jumpstart Taq Ready Mix в присутствии 200 нМ обратного и прямого праймеров в термоциклере Mx3000P (Аджайлент Текнолоджис).
Результаты
:
Клеточный тест BaF/FGFR3 (Фиг. 1):
в отсутствие сприфермина возрастающие концентрации CNTO328 или PMP6B6 не влияли на пролиферацию клеток и O.D. оставалась низкой. Как и ожидалось, пролиферация клеток BaF3/ FGFR3 возрастала в присутствии сприфермина, в результате чего оптическая плотность (O.D.) увеличивалась примерно с 0,12 (CTR-) до примерно 0,5 (CTR +). В присутствии сприфермина CNTO328 и PMP6B6 не проявили четкой тенденции. Некоторые колебания O.D. наблюдались, но она оставалась в диапазоне O.D., наблюдаемых только с помощью сприфермина. Следовательно, можно сделать вывод, что ни CNTO328, ни PMP6B6 не оказывали негативного влияния на действие сприфермина на клетки BaF3/ FGFR3.
Хондроциты человека - Пролиферация и продуцирование GAG (Фигура 2):
сприфермин увеличивал пролиферацию хондроцитов, что приводило в конце культивирования к более высокой концентрации клеток (около 0,7 миллиона клеток/ лунку в отсутствие сприфермина и около 0,9 миллиона клеток/ лунку в присутствии сприфермина). Этот эффект сохранялся в присутствии CNTO328 и PMP6B6. Аналогично, никакого эффекта обоих анти-IL-6 на пролиферацию не наблюдалось в отсутствие сприфермина. Продуцирование GAG немного уменьшалось, когда клетки культивировали при постоянном присутствии сприфермина. Как в отсутствие, так и в присутствии сприфермина, CNTO328 не оказывал никакого влияния на продукцию GAG. Напротив, было обнаружено, что PMP6B6 увеличивает продуцирование GAG зависимым от дозы образом как в присутствии, так и в отсутствии сприфермина.
Хондроциты человека - Генная экспрессия (Фигура 3):
В человеческих ОА-хондроцитах, культивируемых в монослое, сприфермин снижал экспрессию коллагена I (с 0,12 до 0,025) при увеличении экспрессии Sox9 (с 0,00060 до 0,0018) и не влиял на экспрессию коллагена II.
Было обнаружено, что как CNTO328, так и PMP6B6 увеличивают экспрессию коллагена типа II дозозависимым образом. С 1000 нг/ мл CNTO328 экспрессия коллагена типа II возрастала в 2,5 раза в отсутствие сприфермина и, удивительно, в 2,9 раза в присутствии сприфермина. В присутствии 100 нг/ мл PMP6B6 экспрессия коллагена II увеличивалась в 1,6 и, более неожиданно, в 2,6 раза в отсутствии или присутствии сприфермина, соответственно.
Аналогично, CNTO328 и PMP6B6 увеличивали экспрессию Sox9, но только в присутствии сприфермина. Экспрессия неожиданно была увеличенной в 3,85 и 2,5 раза в присутствии CNTO328 (100-1000 нг/мл или PMP6B6 (10-100 нг/мл), соответственно для хондроцитов, культивируемых со сприфермином.
Экспрессия коллагена I в основном не изменялось за счет CNTO328 и PMP6B6 в присутствии сприфермина, по сравнению с одним сприфермином только. Однако в отсутствие сприфермина и с увеличением концентрации CNTO328 и PMP6B6 экспрессия коллагена I уменьшалась.
Выводы
В качестве заключения, антитела анти-IL-6 или их фрагменты, такие как CNTO328 и PMP6B6, не мешают FGF-18. Ингибиторы IL-6 также проявляли явный дозозависимый анаболический эффект на человеческие ОА-хондроциты, в частности, в сочетании с FGF-18. Удивительно, но комбинации FGF-18 с ингибиторами IL-6 оказывают синергическое действие на экспрессию Sox9, которая, как известно, требуется для образования хряща и для экспрессии специфических для хондроцитов генов. Этот удивительный эффект может быть связан с уменьшением воспалительной среды соединениями анти-IL-6, тем самым потенцируя эффект FGF-18 на экспрессию Sox9. В целом, ингибиторы IL-6 способны увеличить анаболический эффект FGF-18.
Пример 2 - комбинация FGF-18 и ингибиторов рецептора IL-6
Методы
Биоанализ BaF3/FGFR3c:
2цукп
Были использованы те же метод и условия, которые описаны в примере 1. В день анализа 20000 клеток/лунку засевали в 96-луночный планшет в 50 мкл аналитической среды, содержащей тоцилизумаб (от Рош) в концентрации 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 или 100 мкг/мл и содержащей или не содержащей сприфермин 100 нг/мл. Контроли проводили с клетками, культивируемыми в присутствии (CTR+) или отсутствии (CTR-) сприфермина, и в присутствии эксципиентов состава тоцилизумаба (15 мМ фосфат натрия, 0,5 мг/ мл полисорбата 80, 50 мг/ мл сахарозы, pH 6,5, разбавленный 1/200 в среде, чтобы соответствовать самой высокой концентрации тоцилизумаба). Все условия были реализованы при N=6. Клетки культивировали в течение 2 дней при 37°С, 5% СО и метаболическую активность определяли при помощи реагента WST-1 (Рош).
Первичная культура хондроцитов человека
: использовали те же метод и условия, что и описанные в примере 1. Затем клетки собирали с помощью аккутазы и подсчитывали перед инокулированием в 24-луночный планшет при 200000 клеток/лунку в 1 мкл полной FAM HAM, дополненной либо тоцилизумабом в различных концентрациях (Рош), либо в присутствии, либо в отсутствии сприфермина 100 нг/мл. Контроли (0 нг/мл тоцилизумаба) проводили с клетками, культивируемыми в присутствии или отсутствии сприфермина, и в присутствии эксципиентов состава тоцилизумаба (см. выше). Все условия были реализованы при N=6.
Использовались аналитические способы, аналогичные таковым в примере 1 (для количественной оценки GAG и анализа экспрессии генов).
Результаты
:
Клеточный тест BaF/FGFR3 (Фигура 4):
Тоцилизумаб не влиял на пролиферацию клеток и не мешал сприфермину. В отсутствие сприфермина возрастающие концентрации тоцилизумаба не влияли на пролиферацию клеток, и O.D. оставалась низкой. Пролиферация клеток BaF3/FGFR3 увеличивалась в присутствии сприфермина, в результате чего O.D. возрастала от приблизительно 0,10 (CTR-) до приблизительно 0,5 (CTR +). В присутствии сприфермина тоцилизумаб не проявлял четкой тенденции. Некоторые небольшие колебания O.D. наблюдались, но она оставалась в диапазоне O.D., наблюдаемых только со сприфермином.
Хондроциты человека - пролиферация и продуцирование GAG (Фигура 5). Как и ожидалось, сприфермин увеличивал пролиферацию хондроцитов, что приводило к концу культивирования к более высокой концентрации клеток (около 0,7 миллиона клеток/ лунку в отсутствие сприфермина и около 0,9 миллиона клеток/лунку в присутствии сприфермина). Этот эффект сохранялся в присутствии тоцилизумаба, который не влияет на пролиферацию, независимо от концентрации, в отсутствие сприфермина. Продуцирование GAG было несколько уменьшено, когда клетки культивировали при постоянном присутствии сприфермина. Было обнаружено, что тоцилизумаб увеличивает дозозависимое GAG-продуцирование хондроцитами человека. Этот эффект можно наблюдать при наличии или отсутствии сприфермина.
Хондроциты человека - Экспрессия генов (Фигура 6).
Как и ожидалось, сприфермин подавлял экспрессию коллагена I. Токилизумаб не влиял на этот эффект. Интересно, что в отсутствие сприфермина тоцилизумаб подавлял экспрессию коллагена I только при концентрации 10 мкг/мл или выше. Ожидалось также увеличение экспрессии Sox9 при помощи сприфермина. Этот эффект уменьшался при помощи тоцилизумаба в концентрации выше 1 мкг/ мл, хотя и не ингибировался. Наконец, эффект тоцилизумаба на коллаген типа II был неясным. Однако в присутствии тоцилизумаба наблюдалось значительное увеличение в 2,2 раза экспрессии коллагена II при 100 мкг/мл по сравнению с одним только сприфермином (от 0,0014 до 0,003 относительного содержания).
Выводы
Тоцилизумаб не влияет на биологическую активность сприфермина. Тоцилизумаб не оказывал отрицательного влияния на эффект сприфермина и показал некоторые положительные эффекты на остеоартритных хондроцитах человека: он дозозависимо увеличивал продуцирование GAG и уменьшал экспрессию коллагена I. Кроме того, он увеличился в 2 раза экспрессию коллагена типа II в хондроцитах, культивируемых в присутствии сприфермина. Хотя эффект ингибиторов IL-6R на экспрессию Sox9 неясен, в целом ингибиторы IL-6, по-видимому, способны увеличить анаболический эффект FGF-18.
Пример 3 - комбинация FGF-18 и ингибитора NGF
Метод
Биоанализ BaF3/FGFR3c:
2
Использовали тот же метод и условия, что и описанные в примере 1. В день анализа 20000 клеток/лунку засевали в 96-луночный планшет в 50 мкл аналитической среды, содержащей танезумаб в количестве 0,01, 0,1, 1, 10, 100 или 1000 нМ, и содержащей или не содержащей сприфермин 100 нг/мл. Положительный контроль (CTR+) был осуществлен с клетками, культивируемыми с помощью сприфермина 100 нг/ мл в отсутствие танезумаба. Все условия были реализованы при N=6. Клетки культивировали в течение 2 дней при 37°С, 5% СО и метаболическую активность измеряли реагентом WST-1 (Рош).
Результаты (фигура 7)
Танезумаб не влиял на пролиферацию клеток и не мешал сприфермину. В отсутствие сприфермина возрастающие концентрации тоцилизумаба не влияли на пролиферацию клеток и O.D. оставалась нулевой. Пролиферация клеток BaF3/FGFR3 увеличивалась в присутствии сприфермина, в результате чего O.D. увеличивалась от приблизительно 0 (CTR-) до приблизительно 0,15 (CTR+). В присутствии сприфермина тоцилизумаб не проявлял какой-либо конкретной тенденции. Некоторые небольшие колебания O.D. наблюдались, но они оставались в диапазоне O.D., наблюдаемых с помощью сприфермина только.
Пример 4 - комбинация FGF-18 и соединения ботулинического токсина
Метод
Биоанализ BaF3/FGFR3c
2
: Были использованы тот же метод и условия, что и описанные в примере 1. В день анализа 20000 клеток/лунку засевали на 96-луночный планшет в 50 мкл аналитической среды, содержащей Xeomin в количестве 0,01, 0,1, 1, 10 или 100 мЕд/мл и содержащей или не содержащей сприфермин 100 нг/мл. В качестве контроля клетки также культивировали с 100 нг/мл сприфермина только (положительный контроль) или без какого-либо соединения (отрицательный контроль). Все условия были реализованы при N=3. Клетки культивировали в течение 2 дней при 37°С, 5% СО и метаболическую активность определяли при помощи реагента WST-1 (Рош).
Первичная культура бычьих хондроцитов
: Использовали тот же метод и условия, что и описанные в примере 1. Затем клетки собирали с помощью аккутазы и подсчитывали перед инокулированием в 24-луночный планшет при 15000 клеток/лунку в 1 мкл полного HAM F12 с добавлением различных концентраций Xeomin (1, 10, 100, 1000 мЕд/мл) в присутствии или в отсутствие 100 нг/мл сприфермина. В качестве контроля клетки также культивировали с 100 нг/ мл сприфермина только (положительный контроль) или без какого-либо соединения (отрицательный контроль). Все условия были выполнены при N=4.
Были использованы аналитические методы, аналогичные использованным в примере 1 (для количественной оценки GAG и анализа экспрессии генов).
Результаты
Клеточный тест BaF/FGFR3 (Фигура 8):
При отсутствии сприфермина возрастающие концентрации Xeomin от 0,01 до 10 ед/мл не влияли на пролиферацию клеток, но при наивысшей тестируемой концентрации (100 Ед./ мл) количество метаболически активных клеток было значительно уменьшено. Как и ожидалось, пролиферация клеток BaF3/FGFR3 увеличивалась в присутствии сприфермина, в результате чего O.D. увеличивалась с 0,011 (CTR-) до 0,194 (CTR+). При наличии сприфермина наблюдались те же результаты. Поскольку это снижение метаболической активности наблюдается при наличии или отсутствии сприфермина, можно сделать вывод, что это прямой эффект Xeomin, а не модуляция биоактивности сприфермина.
Бычьи хондроциты - Пролиферация и продуцирование GAG
(Фигура 9):
как и ожидалось, сприфермин увеличивал пролиферацию хондроцитов, что приводило в конце культивирования к более высокой концентрации клеток (0,78 миллиона клеток/лунку в отсутствие сприфермина и 1,04 миллиона клеток/лунку в присутствии от сприфермина). Этот эффект сохранялся в присутствии Xeomin от 1 до 1000 мЕд/мл. Аналогичным образом, эффект Xeomin на пролиферацию не наблюдался в отсутствие сприфермина. Продуцирование GAG уменьшалось с 9,6 до 7,2 мкг/миллион клеток, когда клетки культивировали при постоянном присутствии сприфермина. Как в отсутствие, так и в присутствии сприфермина было обнаружено, что Xeomin в концентрации от 1 до 1000 мЕд/ мл не влияет на продукцию GAG.
Бычьи хондроциты - Экспрессия гена (Фигура 10):
-5
-4
как и ожидалось, сприфермин при постоянном присутствии подавлял экспрессию коллагена I (от 0,9 до 0,05) при увеличении экспрессии Sox9 (с 7,8×10 до 5,1×10) и экспрессии аггрекана (с 0,11 до 0,3). Сприфермин также оказывал небольшое влияние на экспрессию коллагена II, которая уменьшилась с 0,031 до 0,018 в присутствии сприфермина. В отсутствие или присутствии сприфермина Xeomin в концентрации от 1 до 1000 мЕд/ мл не влиял на экспрессию коллагена I, II, Sox9 и аггрекана.
Выводы
В качестве вывода, неожиданно при максимальной концентрации Xeomin, ожидаемой в человеческом суставе (ок. 10 ед./мл): 1) отрицательное влияние Xeomin на клетках BaF3/FGFR3 и первичных хондроцитах (пролиферация, фенотип и продуцирование матрикса не изменялись) не наблюдалось и 2) никаких эффектов взаимного влияния Xeomin и сприфермина не наблюдалось. Это было неожиданно, поскольку как FGF-18, так и ботулинический токсин типа А связывают один и тот же рецептор, т.е. FGFRIII.
Список литературы
,
1. Lotz 2010, Arthritis research therapy, 12:211
2. WO 2005080429
PM&R,
3. Boon et al. 2010, Vol. 2, 268-276
4. Singh JA et al., 2009, Transl Res;153:205-216
5. Sanga et al., 2013, Pain, 154:1910-1919
6. Tiseo et al., 2014, Pain, 155:1245-1252
et al.
7. Ellsworth , 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320
et al.
8. Shimoaka , 2002, JBC 277(9):7493-7500
9. WO 2008023063
10. WO 2004032849
et al.
11. Moore , 2005, Osteoarthritis and Cartilage, 13:623-631
12. WO 9816644
13. WO 2006063362
et al
14. Custers ., 2007, Osteoarthritis and Cartilage, 15:1241-1248
th
15. The Merck manual, 17 edition, 1999
http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf,
16. ICRS publication: page 13.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Merck Patent GmbH
<120>  Комбинированная композиция, содержащая соединение FGF-18
<130>  P 15/135
<150>  15180859.9
<151>  2015-08-13
<160>  14
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  207
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Tyr Ser Ala Pro Ser Ala Cys Thr Cys Leu Cys Leu His Phe Leu
1               5                   10                  15
Leu Leu Cys Phe Gln Val Gln Val Leu Val Ala Glu Glu Asn Val Asp
20                  25                  30
Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg Ala Arg Asp Asp Val Ser
35                  40                  45
Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr Ser Arg Thr Ser Gly Lys
50                  55                  60
His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser Ala Arg Gly Glu Asp Gly
65                  70                  75                  80
Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr Asp Thr Phe Gly Ser Gln
85                  90                  95
Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe Tyr Leu Cys Met Asn Arg
100                 105                 110
Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly Thr Ser Lys Glu Cys Val
115                 120                 125
Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr Thr Ala Leu Met Ser Ala
130                 135                 140
Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr Lys Lys Gly Arg Pro Arg
145                 150                 155                 160
Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln Asp Val His Phe Met Lys
165                 170                 175
Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln Lys Pro Phe Lys Tyr Thr
180                 185                 190
Thr Val Thr Lys Arg Ser Arg Arg Ile Arg Pro Thr His Pro Ala
195                 200                 205
<210>  2
<211>  170
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  trFGF-18
<400>  2
Met Glu Glu Asn Val Asp Phe Arg Ile His Val Glu Asn Gln Thr Arg
1               5                   10                  15
Ala Arg Asp Asp Val Ser Arg Lys Gln Leu Arg Leu Tyr Gln Leu Tyr
20                  25                  30
Ser Arg Thr Ser Gly Lys His Ile Gln Val Leu Gly Arg Arg Ile Ser
35                  40                  45
Ala Arg Gly Glu Asp Gly Asp Lys Tyr Ala Gln Leu Leu Val Glu Thr
50                  55                  60
Asp Thr Phe Gly Ser Gln Val Arg Ile Lys Gly Lys Glu Thr Glu Phe
65                  70                  75                  80
Tyr Leu Cys Met Asn Arg Lys Gly Lys Leu Val Gly Lys Pro Asp Gly
85                  90                  95
Thr Ser Lys Glu Cys Val Phe Ile Glu Lys Val Leu Glu Asn Asn Tyr
100                 105                 110
Thr Ala Leu Met Ser Ala Lys Tyr Ser Gly Trp Tyr Val Gly Phe Thr
115                 120                 125
Lys Lys Gly Arg Pro Arg Lys Gly Pro Lys Thr Arg Glu Asn Gln Gln
130                 135                 140
Asp Val His Phe Met Lys Arg Tyr Pro Lys Gly Gln Pro Glu Leu Gln
145                 150                 155                 160
Lys Pro Phe Lys Tyr Thr Thr Val Thr Lys
165                 170
<210>  3
<211>  1295
<212>  PRT
<213>  Clostridium botulinum
<400>  3
Pro Phe Val Asn Lys Gln Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly Val
1               5                   10                  15
Asp Ile Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Val Gly Gln Met Gln Pro Val
20                  25                  30
Lys Ala Phe Lys Ile His Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg Asp
35                  40                  45
Thr Phe Thr Asn Pro Glu Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu Ala
50                  55                  60
Lys Gln Val Pro Val Ser Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr Asp
65                  70                  75                  80
Asn Glu Lys Asp Asn Tyr Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu Arg
85                  90                  95
Ile Tyr Ser Thr Asp Leu Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val Arg
100                 105                 110
Gly Ile Pro Phe Trp Gly Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys Val
115                 120                 125
Ile Asp Thr Asn Cys Ile Asn Val Ile Gln Pro Asp Gly Ser Tyr Arg
130                 135                 140
Ser Glu Glu Leu Asn Leu Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile Ile
145                 150                 155                 160
Gln Phe Glu Cys Lys Ser Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr Arg
165                 170                 175
Asn Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Tyr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe Thr
180                 185                 190
Phe Gly Phe Glu Glu Ser Leu Glu Val Asp Thr Asn Pro Leu Leu Gly
195                 200                 205
Ala Gly Lys Phe Ala Thr Asp Pro Ala Val Thr Leu Ala His Glu Leu
210                 215                 220
Ile His Ala Gly His Arg Leu Tyr Gly Ile Ala Ile Asn Pro Asn Arg
225                 230                 235                 240
Val Phe Lys Val Asn Thr Asn Ala Tyr Tyr Glu Met Ser Gly Leu Glu
245                 250                 255
Val Ser Phe Glu Glu Leu Arg Thr Phe Gly Gly His Asp Ala Lys Phe
260                 265                 270
Ile Asp Ser Leu Gln Glu Asn Glu Phe Arg Leu Tyr Tyr Tyr Asn Lys
275                 280                 285
Phe Lys Asp Ile Ala Ser Thr Leu Asn Lys Ala Lys Ser Ile Val Gly
290                 295                 300
Thr Thr Ala Ser Leu Gln Tyr Met Lys Asn Val Phe Lys Glu Lys Tyr
305                 310                 315                 320
Leu Leu Ser Glu Asp Thr Ser Gly Lys Phe Ser Val Asp Lys Leu Lys
325                 330                 335
Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Met Leu Thr Glu Ile Tyr Thr Glu Asp Asn
340                 345                 350
Phe Val Lys Phe Phe Lys Val Leu Asn Arg Lys Thr Tyr Leu Asn Phe
355                 360                 365
Asp Lys Ala Val Phe Lys Ile Asn Ile Val Pro Lys Val Asn Tyr Thr
370                 375                 380
Ile Tyr Asp Gly Phe Asn Leu Arg Asn Thr Asn Leu Ala Ala Asn Phe
385                 390                 395                 400
Asn Gly Gln Asn Thr Glu Ile Asn Asn Met Asn Phe Thr Lys Leu Lys
405                 410                 415
Asn Phe Thr Gly Leu Phe Glu Phe Tyr Lys Leu Leu Cys Val Arg Gly
420                 425                 430
Ile Ile Thr Ser Lys Thr Lys Ser Leu Asp Lys Gly Tyr Asn Lys Ala
435                 440                 445
Leu Asn Asp Leu Cys Ile Lys Val Asn Asn Trp Asp Leu Phe Phe Ser
450                 455                 460
Pro Ser Glu Asp Asn Phe Thr Asn Asp Leu Asn Lys Gly Glu Glu Ile
465                 470                 475                 480
Thr Ser Asp Thr Asn Ile Glu Ala Ala Glu Glu Asn Ile Ser Leu Asp
485                 490                 495
Leu Ile Gln Gln Tyr Tyr Leu Thr Phe Asn Phe Asp Asn Glu Pro Glu
500                 505                 510
Asn Ile Ser Ile Glu Asn Leu Ser Ser Asp Ile Ile Gly Gln Leu Glu
515                 520                 525
Leu Met Pro Asn Ile Glu Arg Phe Pro Asn Gly Lys Lys Tyr Glu Leu
530                 535                 540
Asp Lys Tyr Thr Met Phe His Tyr Leu Arg Ala Gln Glu Phe Glu His
545                 550                 555                 560
Gly Lys Ser Arg Ile Ala Leu Thr Asn Ser Val Asn Glu Ala Leu Leu
565                 570                 575
Asn Pro Ser Arg Val Tyr Thr Phe Phe Ser Ser Asp Tyr Val Lys Lys
580                 585                 590
Val Asn Lys Ala Thr Glu Ala Ala Met Phe Leu Gly Trp Val Glu Gln
595                 600                 605
Leu Val Tyr Asp Phe Thr Asp Glu Thr Ser Glu Val Ser Thr Thr Asp
610                 615                 620
Lys Ile Ala Asp Ile Thr Ile Ile Ile Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu
625                 630                 635                 640
Asn Ile Gly Asn Met Leu Tyr Lys Asp Asp Phe Val Gly Ala Leu Ile
645                 650                 655
Phe Ser Gly Ala Val Ile Leu Leu Glu Phe Ile Pro Glu Ile Ala Ile
660                 665                 670
Pro Val Leu Gly Thr Phe Ala Leu Val Ser Tyr Ile Ala Asn Lys Val
675                 680                 685
Leu Thr Val Gln Thr Ile Asp Asn Ala Leu Ser Lys Arg Asn Glu Lys
690                 695                 700
Trp Asp Glu Val Tyr Lys Tyr Ile Val Thr Asn Trp Leu Ala Lys Val
705                 710                 715                 720
Asn Thr Gln Ile Asp Leu Ile Arg Lys Lys Met Lys Glu Ala Leu Glu
725                 730                 735
Asn Gln Ala Glu Ala Thr Lys Ala Ile Ile Asn Tyr Gln Tyr Asn Gln
740                 745                 750
Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Asn Asn Ile Asn Phe Asn Ile Asp Asp Leu
755                 760                 765
Ser Ser Lys Leu Asn Glu Ser Ile Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn
770                 775                 780
Lys Phe Leu Asn Gln Cys Ser Val Ser Tyr Leu Met Asn Ser Met Ile
785                 790                 795                 800
Pro Tyr Gly Val Lys Arg Leu Glu Asp Phe Asp Ala Ser Leu Lys Asp
805                 810                 815
Ala Leu Leu Lys Tyr Ile Tyr Asp Asn Arg Gly Thr Leu Ile Gly Gln
820                 825                 830
Val Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Asn Asn Thr Leu Ser Thr Asp Ile
835                 840                 845
Pro Phe Gln Leu Ser Lys Tyr Val Asp Asn Gln Arg Leu Leu Ser Thr
850                 855                 860
Phe Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Ile Ile Asn Thr Ser Ile Leu Asn Leu
865                 870                 875                 880
Arg Tyr Glu Ser Asn His Leu Ile Asp Leu Ser Arg Tyr Ala Ser Lys
885                 890                 895
Ile Asn Ile Gly Ser Lys Val Asn Phe Asp Pro Ile Asp Lys Asn Gln
900                 905                 910
Ile Gln Leu Phe Asn Leu Glu Ser Ser Lys Ile Glu Val Ile Leu Lys
915                 920                 925
Asn Ala Ile Val Tyr Asn Ser Met Tyr Glu Asn Phe Ser Thr Ser Phe
930                 935                 940
Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn Glu
945                 950                 955                 960
Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val Ser
965                 970                 975
Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gln Asp Thr Gln Glu Ile
980                 985                 990
Lys Gln Arg Val Val Phe Lys Tyr  Ser Gln Met Ile Asn  Ile Ser Asp
995                 1000                 1005
Tyr Ile  Asn Arg Trp Ile Phe  Val Thr Ile Thr Asn  Asn Arg Leu
1010                 1015                 1020
Asn Asn  Ser Lys Ile Tyr Ile  Asn Gly Arg Leu Ile  Asp Gln Lys
1025                 1030                 1035
Pro Ile  Ser Asn Leu Gly Asn  Ile His Ala Ser Asn  Asn Ile Met
1040                 1045                 1050
Phe Lys  Leu Asp Gly Cys Arg  Asp Thr His Arg Tyr  Ile Trp Ile
1055                 1060                 1065
Lys Tyr  Phe Asn Leu Phe Asp  Lys Glu Leu Asn Glu  Lys Glu Ile
1070                 1075                 1080
Lys Asp  Leu Tyr Asp Asn Gln  Ser Asn Ser Gly Ile  Leu Lys Asp
1085                 1090                 1095
Phe Trp  Gly Asp Tyr Leu Gln  Tyr Asp Lys Pro Tyr  Tyr Met Leu
1100                 1105                 1110
Asn Leu  Tyr Asp Pro Asn Lys  Tyr Val Asp Val Asn  Asn Val Gly
1115                 1120                 1125
Ile Arg  Gly Tyr Met Tyr Leu  Lys Gly Pro Arg Gly  Ser Val Met
1130                 1135                 1140
Thr Thr  Asn Ile Tyr Leu Asn  Ser Ser Leu Tyr Arg  Gly Thr Lys
1145                 1150                 1155
Phe Ile  Ile Lys Lys Tyr Ala  Ser Gly Asn Lys Asp  Asn Ile Val
1160                 1165                 1170
Arg Asn  Asn Asp Arg Val Tyr  Ile Asn Val Val Val  Lys Asn Lys
1175                 1180                 1185
Glu Tyr  Arg Leu Ala Thr Asn  Ala Ser Gln Ala Gly  Val Glu Lys
1190                 1195                 1200
Ile Leu  Ser Ala Leu Glu Ile  Pro Asp Val Gly Asn  Leu Ser Gln
1205                 1210                 1215
Val Val  Val Met Lys Ser Lys  Asn Asp Gln Gly Ile  Thr Asn Lys
1220                 1225                 1230
Cys Lys  Met Asn Leu Gln Asp  Asn Asn Gly Asn Asp  Ile Gly Phe
1235                 1240                 1245
Ile Gly  Phe His Gln Phe Asn  Asn Ile Ala Lys Leu  Val Ala Ser
1250                 1255                 1260
Asn Trp  Tyr Asn Arg Gln Ile  Glu Arg Ser Ser Arg  Thr Leu Gly
1265                 1270                 1275
Cys Ser  Trp Glu Phe Ile Pro  Val Asp Asp Gly Trp  Gly Glu Arg
1280                 1285                 1290
Pro Leu
1295
<210>  4
<211>  449
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  тяжелая цепь CNTO328
<400>  4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Lys Leu Leu Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Phe Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Leu Trp Gly Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  5
<211>  212
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  легкая цепь CNTO328
<400>  5
Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
20                  25                  30
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp
35                  40                  45
Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp
65                  70                  75                  80
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Tyr Thr Phe
85                  90                  95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100                 105                 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala
115                 120                 125
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
130                 135                 140
Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser
145                 150                 155                 160
Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
165                 170                 175
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
180                 185                 190
Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
195                 200                 205
Arg Gly Glu Cys
210
<210>  6
<211>  116
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  PMP6B6
<400>  6
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Ala Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe Ser Ile Asn
20                  25                  30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Arg Glu Leu Val
35                  40                  45
Ala Asp Ile Met Pro Tyr Gly Ser Thr Glu Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85                  90                  95
Ser Tyr Asp Pro Arg Gly Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>  7
<211>  448
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  тяжелая цепь тоцилизумаба
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa может представлять собой природную аминокислоту
Xaa Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20                  25                  30
His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Ser Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210>  8
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  легкая цепь тоцилизумаба
<400>  8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  9
<211>  447
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  тяжелая цепь танезумаба
<400>  9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Gly Tyr
20                  25                  30
Asp Leu Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Ile Ile Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115                 120                 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130                 135                 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195                 200                 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys
210                 215                 220
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
225                 230                 235                 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245                 250                 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260                 265                 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275                 280                 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
290                 295                 300
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305                 310                 315                 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325                 330                 335
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340                 345                 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355                 360                 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370                 375                 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
385                 390                 395                 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405                 410                 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420                 425                 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  10
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  легкая цепь танезумаба
<400>  10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Glu His Thr Leu Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  11
<211>  446
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  тяжелая цепь фасинумаба
<400>  11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Thr Leu Thr Glu Leu
20                  25                  30
Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Gly Phe Asp Pro Glu Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ser Thr Ile Phe Gly Val Val Thr Asn Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435                 440                 445
<210>  12
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  легкая цепь фасинумаба
<400>  12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Arg Asn Asp
20                  25                  30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Phe Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  13
<211>  449
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  тяжелая цепь фулранумаба
<400>  13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Arg Ser Tyr
20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Arg Ser Ser His Thr Ile Phe Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Tyr Ser Ser Gly Trp His Val Ser Asp Tyr Phe Asp Tyr
100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115                 120                 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130                 135                 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145                 150                 155                 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165                 170                 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180                 185                 190
Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195                 200                 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys
210                 215                 220
Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  14
<211>  214
<212>  PRT
<213>  Искусственная
<220>
<223>  легкая цепь фулранумаба
<400>  14
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<---