СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛАКТОЗОСБРАЖИВАЮЩИХ ДРОЖЖЕЙ
METHOD OF PRODUCING CULTURE MEDIUM FOR CULTURING LACTOSE-FERMENTING YEAST

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при производстве лактозосбраживающих дрожжей, а также в молочной промышленности.
Известен способ получения биомассы дрожжей, заключающийся в том, что при выращивании дрожжей на питательной среде, содержащей мелассу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, в качестве стимулятора роста используют остаточный экстракт семян сахарной свеклы при соотношении мелассы и экстракта, равном 1:10-1:13. (см. SU 1630313 A1, C12N 1/18, опубл. 29.12.1988 г.)
Однако описываемый способ является трудоемким и предполагает введение дополнительных источников азота, фосфора. Данный способ не может быть применен в регионах, где нет семенных свекольных заводов, отходы которых являются ключевыми в указанном способе.
Также известен способ выращивания дрожжей Saccharomyces cerevisia, заключающийся в том, что в мелассу вводят разбавленную водой до минерализации 2,0-2,4 г/л геотермальную воду до содержания 9,5% углеводов, затем диаммоний фосфат и перемешивают смесь. При этом соотношение компонентов в среде составляет (г/л): меласса 160-180, диаммоний фосфат 1,0-1,5, геотермальная вода - остальное (RU 2084519 C1, C12N 1/18, опубл. 20.07.1997 г.).
Недостатком известного способа является то, что среда не является избирательной для лактозосбраживающих дрожжей, а также высока трудоемкость данного способа получения биомассы. Кроме того, при составлении многокомпонентных питательных сред повышается риск передозировки некоторых ее составляющих.
Наиболее близким по технологической сущности к заявляемому способу является выбранный в качестве прототипа способ получения питательной среды для выращивания дрожжей. По указанному способу на 1 литр водопроводной (недистиллированной) воды берут 80 гр прессованных пекарских дрожжей, кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 4% глюкозы (или мальтозы), фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований. / Под ред. М.О.Биргера. - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - 464 с.).
Недостатком данного способа является то, что выход биомассы через 48 часов культивирования составляет от 10 до 15 мг/мл (оптическая плотность при этом составляет 2,98 нм). Кроме того, среда не является селективной для лактозосбраживающих дрожжей.
Технический результат изобретения заключается в повышении выхода биомассы лактозосбраживающих дрожжей, в снижении себестоимости питательной среды для их культивирования.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей, предусматривающем приготовление дрожжевого перевара, полученного путем термообработки и фильтрации смеси водопроводной воды и природной минеральной воды и пекарских дрожжей, после чего к полученному дрожжевому перевару добавляют пептон, углеводы, смесь фильтруют, стерилизуют, охлаждают, согласно изобретению при приготовлении дрожжевого перевара в воду дополнительно вводят природную минеральную воду курорта «Аршан» с минерализацией 4,1 мг/л в соотношении 1:1, при этом пекарские дрожжи берут в количестве 10-12 гр на 1 литр смеси водопроводной воды и минеральной природной воды, а в качестве углеводов используют лактозу.
Отличительными признаками заявляемого способа являются введение в состав питательной среды природной минеральной воды курорта «Аршан» в качестве источника минерального питания лактозосбраживающих дрожжей, а также лактозу - в качестве углеводов.
«Аршан» - бальнеологический и горно-климатический курорт на территории России, в Бурятии, в пределах Восточного Саяна, расположен у подножия Тункинских Гольцов на высоте 900 м. Минеральные воды Аршанского месторождения - одно из наиболее известных в России месторождений углексилых минеральных вод.
Природная минеральная вода курорта «Аршан» характеризуется следующим химическим составом (содержание в 1 литре катионов и анионов):
Катионы: Ca - до 0,6 г/л, Na - до 0,2 г/л, K - до 0,03 г/л, Mg - до 0,1 г/л, Mn - до 0,05 г/л, Zn - до 0,008 мг/л, Co - до 0,02 мг/л, Pb - до 0,01 мг/л, Li - до 6,0 мг/л, Fe - до 7 мг/л, Ni - до 0,008 мг/л,
3
4
Анионы: CO - до 2,4 г/л, SO - до 0,7 г/л, Cl - до 0,07 г/л, F - до 1,6 мг/л,
Недиссоциированные молекулы: угольный ангидрид - до 2,4 г/л, кремниевая кислота - до 0,1 г/л, метаборная кислота - 0,4 мг/л.
По химическому составу минеральные воды курорта «Аршан» по классификации В.А.Александрова относятся к 1-му классу, являясь углекислыми с высоким газосодержанием.
Общая минерализация природной минеральной воды курорта «Аршан» составляет 4,1 мг/л, что является наиболее высоким показателем для минеральных вод республики Бурятия.
(Минеральные воды курорта «Аршан» относятся к классу холодных углекислых железистых кремнистых гидрокарбонатно-кальциево-магниевых вод. Они ближе всего к типу Виши и Карловых Вар (по кремнию). Минеральная вода курорта «Аршан» не содержит токсичных и радиоактивных компонентов. От других минеральных вод нашей страны отличается постоянством и более высоким содержанием сухого (макро- и микроэлементов) остатка, а также по значительному содержанию углекислого газа, сульфатов кальция и магния. Она не изменяет свой химический состав на протяжении уже более 100 лет. Ее залегание глубинно: под базальтовым покровом на глубине более 1500 метров расположен бассейн этой минеральной воды. Минеральная вода курорта «Аршан» не оказывает вредного воздействия на метаболизм микробной клетки, т.к. не содержит ртуть, мышьяк.
Использование в качестве источника углеводного питания микроорганизмов лактозы позволяет получить селективную питательную среду для культивирования дрожжей, сбраживающих лактозу.
Использование ресурсов природной минеральной воды в заявляемом способе позволяет снизить затраты на приобретение дорогостоящих химических соединений, которые традиционно используются в качестве источников минеральных веществ, снизить трудоемкость процесса приготовления питательной среды и риск передозировки компонентов питательной среды.
Использование лактозы в качестве источника углеводов позволяет использовать питательную среду как дифференциальную для лактозосбраживающих дрожжей.
Влияние состава питательной среды на динамику роста лактозосбраживающих дрожжей показано на чертеже. За контроль взята питательная среда Сабуро.
Как видно из чертежа, введение минеральной воды курорта «Аршан» в состав питательной среды повышает выход биомассы лактозосбраживающих дрожжей. При этом уменьшено количество прессованных дрожжей по сравнению с известным способом.
В качестве показателя накопления биомассы при постановке экспериментов использовали оптическую плотность микробной взвеси (нм). Оптическую плотность измеряли каждые 24 часа в течение 144 часов, том числе в начале эксперимента (0 ч). Как видно из чертежа, динамика роста лактозосбраживающих дрожжей на различных питательных средах неодинакова. Так, оптическая плотность микробной взвеси, полученной при культивировании лактозосбраживающих дрожжей на опытной питательной среде, через 48 часов достигала значения 3,4685 нм, а при культивировании па контрольной - 2,943 нм. Наибольший прирост биомассы лактозосбраживающих дрожжей при культивировании на опытной питательной среде наблюдался через 48 часов после момента инокулирования, в то время как на контрольной - на третьи сутки (через 72 часа). Таким образом, при культивировании дрожжей на среде Сабуро, являющейся прототипом, выход биомассы через 48 часов составляет от 10 до 15 г/л, а при культивировании на среде по предлагаемому способу выход биомассы достигает 25 г/л.
Очевидно, такая продуктивность лактозосбраживающих дрожжей связана с содержащимися в термальной воде минеральными веществами, находящимися в форме ионов и недиссоциированных молекул, поддерживающих кислотно-основное равновесие, влияющими на ферментативную активность дрожжей. Характер и скорость течения основных метаболических процессов зависят также от изменений функциональной активности мембран. Так как эти параметры влияют на химические реакции, которые сохраняют организм живым, существуют встроенные физиологические механизмы для поддержания их на необходимом уровне. Однако очевидно, что для обеспечения самовоспроизведения дрожжевая клетка выработала регуляторные механизмы, позволяющие ей направлять и координировать биохимические процессы.
Примечательно, что минеральная вода курорта «Аршан» содержит кремниевую кислоту в виде недиссоциированных молекул. Кремний как биогенный элемент принимает участие в разнообразных физиологических процессах, начиная от изменения клеточных мембран до синтеза ДНК. Этот элемент является обязательным компонентом нуклеиновых кислот, где его содержание составляет 0,15-0,36%. В дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) один атом кремния приходится в среднем на 20-30 атомов фосфора.
+
+
2+
2+
В составе опытной питательной среды, полученной по заявленному способу, повышено (в сравнении со средой Сабуро) содержание Na, Ca, Fe, достаточное количество K, Mg, Mn, присутствуют Co, Zn, Ni. Поступление питательных веществ в клетку обусловлено специальными механизмами типа Na-K-АТФ-азы в плазматических мембранах и Ca-Mg-АТФазы в саркоплазматическом ретикулуме, что обеспечивает благоприятное течение практически всех ферментативных реакций. Так, например, вводимая в питательную среду минеральная вода богата ионами магния Mg (143,5 мг/л), что обусловливает активную работу пермеазной системы. Кроме того, ионы Mg оказывают стимулирующее воздействие на количественное содержание рибосом, что ускоряет синтез белка.
Для дрожжей одним из наиболее востребованных микроэлементов является Zn. Содержание Zn в минеральной воде курорта «Аршан» достигает 8 мкг/л.
Марганец минеральной воды курорта «Аршан» - основной активатор целого ряда ферментов, в том числе спиртового брожения. Он активно участвует в синтезе витаминов, белка, а также некоторых аминокислот.
Кобальт воздействует на синтез азотистых веществ небелковой природы (ДНК, РНК, аминокислоты).
Таким образом, богатый минеральный состав вводимой воды курорта «Аршан» оказывает благоприятное влияние на метаболизм лактозосбраживающих дрожжей, которые проявили высокую ферментативную активность, в результате чего повысился выход биомассы (оптическая плотность микробной взвеси через 48 часов после инокулирования достигает значения 3,468 им при культивировании на опытной питательной среде, а при культивировании на среде Сабуро - 2,943 нм) и сократилась длительность процесса ферментации (при культивировании на опытной питательной среде максимальный прирост биомассы наблюдается через 48 часов, а при культивировании на среде Сабуро - через 72 часа). Кроме того, заявляемый способ обеспечивает удешевление процесса, снижение трудоемкости получения питательной среды.
Экспериментально было установлено оптимальное соотношение водопроводной и минеральной воды курорта «Аршан», которое составило 1:1. При увеличении или снижении количества водопроводной воды в указанном соотношении уменьшается выход биомассы лактозосбраживающих дрожжей.
Оптимальное количество вносимых пекарских дрожжей установлено в пределах 10-12 гр на 1 литр смеси водопроводной и минеральной воды курорта «Аршан». При увеличении количества дрожжей более 12 гр и уменьшении менее 10 гр наблюдается снижение продуктивности биомассы.
Применение предлагаемого способа получения лактозосбраживающих дрожжей позволит повысить генеративную активность клеток дрожжей, удешевить и ускорить процесс получения активной биомассы дрожжей.
Предлагаемый способ получения питательной среды для культивирования лактозосбраживающих дрожжей осуществляется следующим образом. На основе смеси природной минеральной воды курорта «Аршан» с минерализацией 4,1 мг/л и водопроводной воды (соотношение 1:1) готовят дрожжевой перевар. Количество сырых прессованных пекарских дрожжей составляет 10-12 г на 1 литр смеси водопроводной воды и природной минеральной воды. Затем дрожжевой перевар фильтруют и стерилизуют, добавляют 4% лактозы, 1% пептона, перемешивают, повторно стерилизуют, охлаждают.
ПРИМЕР 1
К 0,5 литра водопроводной (недистиллированной) воды добавляют 0,5 литра минеральной природной воды курорта «Аршан» и перемешивают. К полученной смеси воды добавляют 10 г прессованных пекарских дрожжей, кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. После чего к 100 мл полученного дрожжевого перевара добавляют 1% пептона, 4% лактозы, подвергают повторной стерилизации при 0,5 атм 20 мин, охлаждают.
ПРИМЕР 2
К 1 литру водопроводной (недистиллированной) воды добавляют 1 литр минеральной природной воды курорта «Аршан» и перемешивают. К полученной смеси воды добавляют 20 г прессованных пекарских дрожжей, кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по колбам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. После чего к 100 мл полученного дрожжевого перевара добавляют 1% пептона, 4% лактозы, подвергают повторной стерилизации при 0,5 атм 20 мин, охлаждают.
ПРИМЕР 3
Приготовленную по примеру 1 питательную среду используют для культивирования лактозосбраживающих. дрожжей. Для этого питательную среду инокулируют лактозосбражвиающими дрожжами в количестве 10% от количества среды, культивирование продолжается 48 часов при температуре 22°C.
Выход дрожжей через 48 часов культивирования составляет до 25 г/л.