Рекомбинантная плазмидная ДНК pTEV-TMS, кодирующая гибридный белок, предназначенный для протеолитического расщепления с образованием антиангиогенного пептида тумастина-производного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека, штамм E. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS-продуцент указанного белка и способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTEV-TMS, кодирующая гибридный белок TrxTEVrs-TMS, содержащего тиоредоксин и антиангиогенный пептид Тумастин (TMS), представляющий собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N-концу и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, разделенные сайтом для расщепления протеиназой вируса гравировки табака (TEV-протеиназой), состоящая из XbaI/BamHI - фрагмента плазмидного вектора pTEV, содержащего участок инициации репликации плазмидного вектора (Ori) и фага М13 (М13 ori), ген репрессора лактозного оперона (lacI), промотор и терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7, ген РНК-организующего белка (Rop), ген β-лактамазы (AmpR), детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pTEV-TMS клеток Е. coli к пенициллиновым антибиотикам, и XbaI/BamHI - фрагмента ДНК, содержащего последовательность гибридного гена TrxTEVrs-TMS, состоящего из слитых в рамке 5′-концевой последовательности, кодирующей N-концевой белок-носитель из тиоредоксина и сайта для расщепления TEV-протеиназой, и 3′-концевой последовательности с оптимизированными для экспрессии в Е. coli кодонами, кодирующей С-концевой отщепляемый антиангиогенный пептид TMS, и содержащая уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии влево от сайта BamHI: SeaI - 583 п.о., PvuI - 695 п.о., EcoRV - 3789 п.о., XbaI - 5820 п.о., BglII - 6308 п.о., NcoI - 6340 п.о.
2. Штамм Е. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS, продуцирующий гибридный полипептид TrxTEVrs-TMS, содержащий тиоредоксин и антиангиогенный пептид, представляющий собой модифицированный фрагмент [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N-концу и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, разделенные сайтом для расщепления протеиназой вируса гравировки табака (TEV-протеиназой), и полученный путем трансформации клеток штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pTEV-TMS по п. 1.
3. Способ получения рекомбинантного антиангиогенного пептида Тумастина - производного модифицированного фрагмента [L69K-95] тумстатина человека с присоединенными к N-концу и С-концам последовательностями Ser-Gly-Ala-Met-Gly и Pro-Gly-Pro соответственно, обладающего антиангиогенным действием, включающий трансформацию штамма Ε. coli BL21(DE3) плазмидной ДНК pTEV-TMS, по п. 1, культивирование штамма-продуцента Ε. coli BL21(DE3)/pTEV-TMS по п. 2, разрушение клеточной биомассы с помощью ультразвукового дезинтегратора в буферном растворе при рН 7.6 в присутствии ингибитора протеаз, центрифугирование клеточного лизата и отделение клеточного супернатанта, содержащего гибридный белок, хроматографическую очистку гибридного белка на колонне с анионообменным сорбентом при рН 8.0 в линейном градиенте от 0 до 500 мМ NaCl, протеолитическое расщепление с помощью TEV-протеиназы в течение 20 ч при значении рН 8.0 и комнатной температуре, очистку антиангиогенного пептида Тумастина с помощью двух последовательных анионообменных хроматографий и доочистку с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной и гель-фильтрационной хроматографий.