СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ФИЦИНА В ГЕЛЕ НА ОСНОВЕ КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗЫ
METHOD FOR PRODUCING FICIN PREPARATION IN GEL BASED ON CARBOXYMETHYLCELLULOSE

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии и исследовательских целях. Изобретение может применяться при создании лекарственных препаратов в виде гелей ранозаживляющего и противоожогового назначения, а также для предотвращения образования шрамов.
Фицин (КФ 3.4.22.3) - протеолитический фермент растительного происхождения класса гидролаз, катализирующий гидролиз пептидов, амидов и сложных эфиров. Фицин выделяют из плодов, стеблей и листьев тропических растений рода Ficus. Его молекулярная масса составляет 23 кДа, активен в диапазоне рН 6.5-9.5, температурный оптимум активности находится в пределах 60-65°С, фермент инактивируется при 80°С.
Фицин применяется во многих областях народного хозяйства, например, в производстве активных пептидов из недорогих белков, для получения антител посредством специфического гидролиза пептидных связей, для улучшения органолептических или функциональных свойств пищевых продуктов, в пивоваренной, фармацевтической и сыродельной промышленностях. Фермент обладает способностью расщеплять фибриноген и поэтому может действовать как антикоагулянт [Hamed Μ. В., El-Badry Μ. О., Kandil Ε. I., Borai I. Η., Fahmy A. S. A contradictory action of procoagulant ficin by a fibrinolytic serine protease from Egyptian Ficus carica latex // Biotechnology Reports. - 2020. - V. 27 - P. 8]. Кроме того, он обладает такими свойствами как противовоспалительное, антитромботическое, противораковое, иммуномодулирующее [Ribeiro J.S., Barboza A.D.S.,  СЕ. et al. Novel in-office peroxide-free tooth-whitening gels: bleaching effectiveness, enamel surface alterations, and cell viability // Scientific Reports. - 2020. V.10. - Р. 8].
Ферменты в целом, и цистеиновые протеазы, в частности - это высокоэффективные биокатализаторы, которые способны работать в мягких условиях реакции, обладающие высокой селективностью и низкой экологической и физиологической токсичностью. Нативные энзимы сильно подвержены изменяющимся условиям среды, поэтому целесообразно их иммобилизовать. Иммобилизация фермента может способствовать его повторному использованию и, таким образом, сделать процесс экономически выгоднее. Более того, улучшается стабильность, устойчивость к химическим веществам или ингибиторам, повышается чистота энзима [Siar Е.-Н.,  Barbosa О., Zidoune M.N., Fernandez-Lafuente R. Immobilization/Stabilization of Ficin Extract on Glutaraldehyde-Activated Agarose Beads. Variables That Control the Final Stability and Activity in Protein Hydrolyses // Catalysts. - 2018. - V. 8. - P. 8].
Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе фицина, полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами, и гиалуроновой кислоты [Патент RU 2744457 С1, МПК A61K 38/00, A61K 38/46, A61K 47/36, C12N 11/08, А61Р 17/02, опубл. 09.03.2021. Бюл. № 7]. Способ включает растворение фицина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа, или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа, или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в соотношении 10 мг фицина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты 300 кДа, или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты 500 кДа, или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты 800 кДа в концентрации 1.5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем проводят иммобилизацию фицина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой 50-100 кДа (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с молекулярной массой 50-100 кДа с N-винилимидазолом (ВИ) или Ν,Ν-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля. К недостаткам способа можно отнести невозможность получения данным способом твердых или порошковых препаратов.
Существует большое количество носителей, используемых для иммобилизации ферментов. Большой интерес отводится биополимерам. Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) - полисахарид, представляющий собой химическую модификацию целлюлозы. КМЦ нетоксична для человека, водорастворима. Широкий спектр применения КМЦ включает: заживление хронических ран (язвы стопы, диабетические) и заживление острых ран, таких как ссадины, ожоги первой и второй степени. Кроме того, раневые повязки с КМЦ известны своей гибкостью, способностью абсорбировать экссудат, способствуют ангиогенезу и аутолитической санации раны. Она послужила основой для многих лекарств и материалов, имплантированных или установленных в человеческом теле.
Предложены препараты эритропоэтина и способ местного нанесения для заживления кожных ран [Патент RU 2465003 С2, МПК A61K 38/18, A61K 9/10, A61K 47/38, А61Р 17/02, опубл. 27.10.2012. Бюл. № 30]. Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности и представляет собой гелеобразную или вязкую композицию, пригодную для местного и локального заживления ран на травмированной коже, содержащую эритропоэтин (ЭПО) и по меньшей мере один гелеобразующий полисахарид, поддающийся разбуханию, в концентрации 0.4-4% мас./мас., выбранный из одного или более чем одного члена группы, состоящей из: гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксиметилцеллюлозы, карбоксиэтилцеллюлозы, карбоксиметилцеллюлозы, которая может быть получена путем смешивания ЭПО в лиофилизированной или суспендированной форме с предварительно разбухшим полисахаридом, имеющим вязкость менее 5000 мПа⋅с, и инициации полного разбухания, где полностью разбухший полисахарид имеет вязкость 20000-60000 мПа⋅с, и ЭПО присутствует в концентрации 100-500 МЕ/г гелеобразной композиции, где указанное смешивание ЭПО достигается путем диффузии ЭПО в геле в течение по меньшей мере 24 ч. Изобретение обеспечивает стабилизацию активного соединения и равномерное его высвобождение, а также эффективное лечение в случае травм или патологически индуцированного повреждения кожи.
Известен способ получения геля на основе карбоксиметилцеллюлозы [Патент RU 2352584 С1, МПК С08В 15/04, A61L 15/60, С08В 15/00, С08В 37/00, опубл. 20.04.2009. Бюл. № 11]. Изобретение относится к технологии получения гелевых растворов на основе модифицированной карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) и может быть использовано в химической промышленности, например, при производстве буровых растворов или в медицине, например, в качестве средства профилактики интраоперационного высыхания брюшины и образования послеоперационных спаек при операциях на органах, имеющих серозное покрытие. В способе получения геля на основе карбоксиметилцеллюлозы исходный продукт карбоксиметилцеллюлозу в натриевой форме (Na-КМЦ) сначала термообрабатывают при 120-140°С в течение 5-30 мин, а затем растворяют в воде при 18-25°С с образованием более вязкого 0.02-4.5%-ного гелевого раствора с повышенной вязкостью. Изобретение обеспечивает упрощение технологического процесса получения геля на основе модифицированной карбоксиметилцеллюлозы, снижение его стоимости. Кроме того, получение растворов с более высокой вязкостью позволяет значительно расширить область их применения, например, при операциях на органах брюшной полости.
Разработан способ получения противоспаечного пленочного материала на основе карбоксиметилцеллюлозы [Патент RU 2629842 С1, МПК A61L 17/10, A61L 31/04, A61L 31/14, А61Р 41/00, C08J 5/18, опубл. 04.09.2017. Бюл. № 25]. Изобретение относится к области медицины и химической технологии высокомолекулярных соединений, а именно к способу получения противоспаечного пленочного материала, включающему растворение полимера, в качестве которого используется смесь карбоксиметилцеллюлозы и гидроксиэтилцеллюлозы в соотношении от 8:2 до 3:7, в воде в присутствии структурирующего агента - глутаровой кислоты в количестве 10-50% от массы полимеров, сушку при 18-25°С и термообработку на воздухе при 98-105°С в течение 180-360 мин. Изобретение обеспечивает более длительное пребывание пленки в зоне постоперационного восстановления и увеличение противоспаечного эффекта, а также упрощение и повышение безопасности технологического процесса и понижение температуры термообработки.
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина, обладающего ранозаживляющими и регенерирующими свойствами [Патент RU 2677858 С2, МПК A61K 31/74, A61K 38/46, А61Р 17/02, C12N 11/08, опубл. 10.01.2019, Бюл. №1], включающий иммобилизацию фицина в буферном растворе на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 в соотношении 20 мл буферного раствора фицина в концентрации 1 мг/мл на 1 г волокон, при этом в качестве буферного раствора используют 0.05 Μ трис-HCl буфер с рН 7.0; далее проводят инкубирование в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; а затем промывают образовавшийся осадок 0.05 Μ трис-HCl буфером с рН 7.0 до отсутствия в промывных водах фицина.
Недостатком прототипа является получение волокнистого средства, не позволяющего проводить ферментативные реакции на твердых субстратах.
Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа носителей, используемых для получения иммобилизованного фицина. Применение с этой целью карбоксиметилцеллюлозы позволит получить биокатализатор с большей активностью и упростить процесс сорбции. Способ прост в исполнении, не требует предварительной активации носителя, а иммобилизованный фицин сохраняет высокую активность и стабильность. Кроме того, по сравнению с прототипом время инкубирования фермента и носителя (т.е. время иммобилизации) сокращается с 24 до 2 часов.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа иммобилизации фицина на носителе - натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, путем включения в гель, благодаря чему возможно проводить ферментативные реакции с большими скоростями в растворах и на твердых субстратах, фермент при этом становится более стабильным и обладает пролонгированным действием, а время иммобилизации составляет не более 2 часов.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного препарата в геле на основе фицина и карбоксиметилцеллюлозы, включающем иммобилизацию ферментного препарата в буферном растворе в соотношении 20 мл раствора фермента на 1 г носителя, инкубирование при комнатной температуре с периодическим перемешиванием и промывку 0.05 Μ трис-HCl буфером до отсутствия в промывных водах белка, согласно изобретению, в качестве носителя используют натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой ~ 90 кДа, концентрация раствора фермента составляет 3 мг/мл; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 Μ боратный буфер с 0.1 Μ KCl в составе с рН 9.0; инкубацию проводят в течение 2 часов; образовавшийся осадок промывают 0.05 Μ трис-HCl буфером с рН 7.5.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в препаратах фицина, включенного в гель натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 Μ ацетатный, 2 - 0.05 Μ фосфатный, 3 - 0.05 Μ боратный буфер с 0.1 Μ KCl в составе, 4 - 0.05 Μ трис-глициновый, 5 - 0.05 Μ глициновый.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) фицина, включенного в гель натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 Μ ацетатный, 2 - 0.05 Μ фосфатный, 3 - 0.05 Μ боратный буфер с 0.1 Μ KCl в составе, 4 - 0.05 Μ трис-глициновый, 5 - 0.05 Μ глициновый.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) фицина, включенного в гель натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0.05 Μ ацетатный, 2 - 0.05 Μ фосфатный, 3 - 0.05 Μ боратный буфер с 0.1 Μ KCl в составе, 4 - 0.05 Μ трис-глициновый, 5 - 0.05 Μ глициновый.
Пример реализации способа
В качестве объекта исследования был выбран фицин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителя для иммобилизации применяли карбоксиметилцеллюлозы натриевую соль с молекулярной массой ~ 90 кДа фирмы «Sigma-Aldrich» (каталожный номер 419273).
Иммобилизацию фицина на матрице карбоксиметилцеллюлозы осуществляли путем включения в гель. К 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы добавляли 20 мл раствора фермента в концентрации 3 мг/мл, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием. После окончания инкубации образовавшийся осадок (в виде геля) промывали 0.05 Μ трис-HCl буфером (рН 7.5) до отсутствия в промывных водах белка (контроль осуществляли на спектрофотометре СФ-2000 при λ=280 нм).
Содержание белка в иммобилизованных препаратах фицина определяли методом Лоури [Lowry О.Η., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. -V. 193. - P. 265-275].
Определение протеазной активности фицина проводили на субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus intermedius // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-425]. К 50 мг иммобилизованного образца добавляли 200 мкл 0.05 Μ трис-HCl буфера с рН 7.5, 800 мкл азоказеина (0.5% в 0.05 Μ трис-HCl буфере, рН 7.5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5%), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (иммобилизованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество фицина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:
А=D*l 000/120/200/С,
где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения гетерогенных биокатализаторов на основе фицина, иммобилизованного путем включения в гель на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, в качестве иммобилизационной среды мы использовали следующие буферы: 0.05 Μ боратный буфер с 0.1 Μ KCl в составе с рН 8.0-10.0, 0.05 Μ ацетатный с рН 4.0-5.8, 0.05 Μ глициновый с рН 8.6-10.5, 0.05 Μ трис-глициновый с рН 8.5-9.0, 0.05 Μ фосфатный с рН 5.8-7.5. Результаты отражены на фиг. 1-3.
Анализ содержания белка в гетерогенных препаратах показал, что наибольшее количество фицина (в мг на г носителя), иммобилизованного путем включения в гель на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, наблюдается при использовании 0.05 Μ ацетатного буфера с рН 4.0, 4.5, 5.8 и 0.05 Μ боратного буфера с 0.1 Μ KCl в составе с рН 8.0 (фиг. 1).
Общая активность (в ед на мл раствора) фицина, иммобилизованного путем включения в гель на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, оказалась выше при использовании 0.05 Μ боратного буфера с 0.1 Μ KCl в составе с рН 9.0 и 10.0 (фиг. 2).
Наибольшую удельную активность показали препараты фицина, иммобилизованные путем включения в гель на основе натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, при использовании 0.05 Μ фосфатного буфера с рН 5.8 (фиг. 3).
Метод иммобилизации путем включения фицина в гель имеет свои преимущества. Благодаря, иммобилизации фермент защищен от неблагоприятных условий среды, повышается его стабильность, биокатализатору можно придавать различные конфигурации, возможна его адресная доставка в организм.
Мы сравнили полученные результаты по определению каталитической активности и содержания белка для препаратов фицина, включенного в гель натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) получено при иммобилизации фицина путем включения в гель натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы при использовании 0.05 Μ боратного буфера с 0.1 Μ KCl в составе с рН 9.0.
Таким образом, была разработана методика получения гетерогенного биокатализатора на основе фицина, иммобилизованного путем включения в гель натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.