СПОСОБ РАННЕГО ВЫЯВЛЕНИЯ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОФЛОУРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КЛЕТОЧНОГО ОСАДКА МОЧИ
METHOD FOR EARLY DETECTION OF BLADDER CANCER USING CYTOFLUORIMETRIC ANALYSIS OF THE URINARY CELLULAR SEDIMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, урологии, и может быть использовано для раннего выявления (проведения скрининга) рака мочевого пузыря.
В связи с объективными трудностями в выявлении начальных этапов опухолевого процесса в мочевом пузыре (отсутствие клинических проявлений заболевания, отсутствие визуально идентифицируемых опухолевых очагов), существующие способы ранней диагностики рака мочевого пузыря относятся к направлению лабораторной диагностики.
Известны способы микроскопической и цитологической диагностики рака мочевого пузыря (Руководство по цитологической диагностике опухолей человека / под ред. А.С. Петрова. - М.: Медицина, 1976. - 304 с.) и способы, их оптимизирующие (Патент РФ №2547567 от 26.02.2014 и пр.). (Суть способов заключается в исследовании цитологического мазка на содержание морфологически атипичных клеток после различных процедур, например, биопсии.) Несмотря на достаточно высокую эффективность таких способов при выявлении злокачественных новообразований мочевого пузыря, их осуществление сопровождается трудностями, связанными со сложностью получения материала для исследования, инвазивностью указанных методов и значительным объемом трудозатрат. Кроме этого, непосредственное осуществление инвазивных процедур способно вызвать проявление некоторых клинических симптомов (например, микрогематурию), не связанных с онкологическим заболеванием.
Известны способы определения в биологических жидкостях (моче, крови, плазме, сыворотке) концентраций различных биомаркеров, ассоциированных с раком мочевого пузыря (Патент US 9892229 от 01.04.20; Патент РФ №2718284 от 01.04.20 и пр.). Данные методы используют различные технологии иммунохимических методов исследования и их чувствительность и специфичность зависят от типа используемого для проведения исследования оборудования. Применимость данной группы методов ранней диагностики заболевания существенно ограничивается фактом того, что до настоящего времени не выявлено ни одного органоспецифического биохимического маркера для рака мочевого пузыря. Кроме того, использование комплекса маркеров существенно повышает стоимость процедуры анализа.
Известны способы исследования молекулярно-генетических маркеров, ассоциированных с раком мочевого пузыря. Так, в способе диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря (Патент РФ №2456607 от 20.07.2012 и пр.) используется FISH-анализ с применением коммерческого ДНК-зонда «UroVysion» (ABBOTT), что делает этот способ доступным для широкого использования. Особенности метода позволяют получать достоверные результаты на меньшем количестве клеточного материала (по сравнению с цитологическими исследованиями) на более ранних стадиях рака мочевого пузыря. Известны способы анализа полиморфизма различных генов или их продуктов методами генетического анализа (Патент РФ №2393772 от 23.03.2009, Патент РФ №2469323 от 28.01.2011 и пр.). Такие способы диагностики позволяют оценить различные этапы канцерогенеза. Однако особенности методов требуют наличия специфических расходных материалов, значимая часть которых отсутствует в коммерческом доступе и должна быть синтезирована в лаборатории. Это накладывает довольно серьезное ограничение, связанное с межсерийной сопоставимостью данных, что отражается на точности проводимых оценок. Кроме того, все связанные с генетической диагностикой способы, сопровождаются высокими финансовыми затратами и должны выполняться специалистами с узкой специализацией.
Известен способ диагностики рака мочевого пузыря на основании клеточного цикла осадка мочи методом проточной цитофлуорометрии (Разрешение на применение новой медицинской технологии серия АА №0001899 ФС №2009/114 от 27 мая 2009 г.). Данный способ позволяет оценить плоидность и соотношение клеток в различных фазах клеточного цикла. Однако, в связи с тем, что клеточный цикл не является опухолеассоциированным явлением и на результат могут оказать влияние различные факторы физиологической (менструальный цикл, половое поведение и пр.), патологической (наличие сопутствующей инфекционной или воспалительной патологии) или терапевтической (проведение лечебных процедур) природы. Таким образом, высокая эффективность такого способа может быть достигнута только при предварительном отборе пациентов в группу с высоким риском развития рака мочевого пузыря.
Задача предлагаемого способа состоит в эффективном обнаружении бессимптомных злокачественных новообразований мочевого пузыря на основании цитометрического анализа осадка мочи с использованием моноклональных антител CD45 и CD326.
Поставленную задачу решали следующим образом. Первую утреннюю порцию мочи обследуемого субъекта центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин для осаждения клеточных элементов. После этого супернатант сливали, к осадку добавляли 2 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. Описанную процедуру отмывки клеточного осадка проводили дважды. Далее супернатант сливали, к осадку добавляли 0,5 мл PBS, проводили ресуспендирование путем пипетирования на протяжении 1-2 мин. К полученной клеточной взвеси добавляли моноклональные антитела к CD45, меченные PerCP-Cyanine5.5 (РегСР-Су5-5 - при возбуждении лазером 488 нм дает максимум флуоресценции на 695 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на вортексе (устройстве для перемешивания жидкостей за счет встряхивания емкости) в течение 20 сек. Добавляли моноклональные антитела к CD326, меченные аллофикоцианином (АРС - при возбуждении лазером 633 нм дает максимум флуоресценции на 650 нм, производитель BD Biosciences, США) в объеме 20 мкл. Перемешивали на персональном вортексе в течение 20 сек и убирали в темное место. Инкубацию клеточной взвеси проводили при комнатной температуре на протяжении 15 минут. После инкубации проводили измерение флуоресценции на проточном цитофлуорометре BD FACSCanto II (BectonDickinson, США).
Для получения результата проводили анализ не менее 1000 событий. После окончания анализа осуществляли работу с полученными скатерограммами в программном обеспечении FACSDiva (BectonDickinson, США).
Первым шагом является гейтирование (установление порогового значения какого-либо параметра на основе контуров вероятности для выбора подмножества собранных событий для дальнейшего анализа) всех событий на скатерограмме (диаграмма, состоящая из образующих «облако» точек, где каждая точка соответствует конкретным сочетаниям параметров), прямого (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния (фиг. 1). Это проводится для исключения из дальнейшего анализа крупных конгломератов клеток и коньюгатов красителей.
+
Следующим шагом является гейтирование CD45 событий (фиг. 2). Клетки, экспрессирующие на своей мембране рецептор CD45 являются по своей природе лейкоцитами и исключаются из дальнейшего анализа.
+
Заключительным этапом является гейтирование CD326 событий (фиг. 3). Анализ проводится только для популяции клеток, не экспрессирующих CD45 (то есть СБ45-негативных). Обосновано это фактом того, что экспрессия CD326 на поверхности клеток лейкоцитарного ряда не наблюдается. CD326 (рецептор ЕрСАМ) экспрессируется только на поверхности эпителиоцитов, которые являются ключевой популяцией клеток для оценки роста эпителиальных опухолей.
Этапы проведения исследования указаны на Фиг. 4.
-
+
При оценке количества CD45CD326 клеток у различных обследуемых субъектов были обнаружены различия, используемые для решения поставленной задачи (Табл. 1).
Способ осуществляют следующим образом:
-
+
-
+
-
+
Для оценки наличия злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений у обследуемых субъектов забирается первая утренняя порция мочи. По вышеописанной методике проводится измерение содержания в осадке мочи CD45CD326 клеток. Если количество CD45CD326 клеток меньше либо равно 2,65%, то злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений у такого обследуемого не предполагается. Если количество CD45CD326 клеток превышает 2,65%, то предполагается наличие у обследуемого субъекта злокачественного новообразования мочевого пузыря на ранней стадии без клинических проявлений. В зависимости от совокупности клинических признаком врач рекомендует усиленное наблюдение за таким пациентом или дополнительное обследование иными методами инструментальной и/или лабораторной диагностики.
Чувствительность предлагаемого метода прогноза развития рецидива рака мочевого пузыря составляет 74,3%, специфичность - 92,1%, диагностическая точность - 98,1%.
Пример №1
Пациент А., 50 лет
-
+
При проведении периодического профосмотра выявлена микрогематурия. При определении уровня экспрессии CD326 выявлено количество CD45CD326 клеток в клеточном осадке мочи - 0,62%. Согласно предлагаемому способу наличие рака мочевого пузыря на ранних стадиях не предполагается. При дополнительном инструментальном обследовании выявлено заболевание мочевого пузыря воспалительной природы (цистит), проведены мероприятия по терапевтическому лечению воспаления.
До настоящего момента (в течение 30 месяцев) пациент находится под наблюдением специалистов, признаков рака мочевого пузыря не наблюдается.
Пример №2
Пациент Б., 66 лет
-
+
При проведении периодического профосмотра взята порция мочи. При определении уровня экспрессии CD326 выявлено количество CD45CD326 клеток в клеточном осадке мочи - 22,1%. Согласно предлагаемому способу у пациента предполагается наличие рака мочевого пузыря на ранних стадиях. В связи с тем, что клинических и лабораторных признаков заболевания не наблюдалось, пациенту рекомендовалось наблюдение у специалиста каждые 3 месяца. На 3 визит (через 9 месяцев) появились клинические признаки заболевания (микрогематурия). Пациенту проведена цистоскопия, показавшая наличие атипичных клеток. УЗИ органов малого таза показало мышечно-неинвазивную опухоль задней стенки мочевого пузыря. Пациенту проведена трансуретральная резекция.
Нами разработан метод скрининга бессимптомных злокачественных новообразований мочевого пузыря на основании цитометрического анализа осадка мочи с использованием моноклональных антител CD45 и CD326. Его достоинствами являются: отсутствие инвазивности для пациента, простота получения материала для исследования, низкий объем трудозатрат, высокая диагностическая точность. Выявление наличия рака мочевого пузыря без клинических проявлений на ранних стадиях снижает смертность больных и улучшает качество и продолжительность их жизни. Метод доступен для широкого применения в амбулаторно-поликлиническом звене здравоохранения. Для использования предлагаемого метода необходимо лишь наличие проточного цитофлуориметра и расходных материалов к нему (моноклональные антитела CD45 и CD326, промывочные растворы). Простота исследования не требует наличия узкой специализации исследователя, оно может быть выполнено средним медицинским персоналом (с верификацией результатов врачом).