ВИРУСНАЯ ДОСТАВКА НЕОАНТИГЕНОВ

1. Аденовирусный вектор шимпанзе, содержащий неоантигенную кассету, причем неоантигенная кассета содержит:
(1) множество последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих неоантигены, полученные из опухоли, присутствующей у субъекта, причем указанное множество включает:
по меньшей мере две специфичные для опухоли и специфичные для субъекта последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие неоантиген ГКГС класса I, каждая из которых содержит:
а. последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эпитоп ГКГС класса I, по меньшей мере, с одним изменением, которое отличает кодируемую пептидную последовательность от соответствующей пептидной последовательности, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты дикого типа,
b. необязательно 5'-линкерную последовательность и
c. необязательно 3'-линкерную последовательность;
(2) по меньшей мере одну промоторную последовательность, функционально связанную с по меньшей мере одной последовательностью указанного множества,
(3) необязательно, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген ГКГС класса II;
(4) необязательно, по меньшей мере, одну кодирующую GPGPG линкер последовательность (SEQ ID NO: 56);
(5) необязательно, по меньшей мере, одну последовательность полиаденилирования, функционально связанную с, по меньшей мере, одной из последовательностей в указанном множестве, необязательно, при этом последовательность полиА расположена 3' от по меньшей мере одной последовательности в указанном множестве, и где необязательно последовательность полиА содержит последовательность полиА SV40; и
(6) где необязательно, по меньшей мере, одно изменение включает в себя точечную мутацию, мутацию со сдвигом рамки считывания, мутацию без сдвига рамки считывания, мутацию делеции, мутацию вставки, вариант сплайсинга, геномную перестройку или сплайсированный антиген, генерируемый протеасомой.
2. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что упорядоченная последовательность каждого элемента указанной неоантигенной кассеты описана в формуле, от 5' к 3', содержащей:
a
b
c
d
X
e
f
Y
g
h
P-(L5-N-L3)-(G5-U)-G3-A
при этом Р содержит по меньшей мере одну промоторную последовательность, функционально связанную с по меньшей мере одной последовательностью из указанного множества, причем а = 1,
N содержит одну из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих эпитоп ГКГС класса I, по меньшей мере, с одним изменением, которое отличает кодируемую пептидную последовательность от соответствующей пептидной последовательности, кодируемой последовательностью нуклеиновой кислоты дикого типа, причем c = 1,
L5 содержит 5'-линкерную последовательность, причем b = 0 или 1,
L3 содержит 3'-линкерную последовательность, причем d = 0 или 1,
G5 содержит одну из, по меньшей мере, одной кодирующей GPGPG линкер последовательности, причем e = 0 или 1,
G3 содержит одну из, по меньшей мере, одной кодирующей GPGPG линкер последовательности, причем g = 0 или 1,
U содержит одну из по меньшей мере одной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген ГКГС класса II, причем f = 1,
А содержит по меньшей мере одну последовательность полиаденилирования, причем h = 0 или 1,
c
Х = от 2 до 400, причем для каждого Х соответствующий N представляет собой отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эпитоп ГКГС класса I, и
f
Y = 0-2, причем для каждого Y соответствующий U представляет собой отличающуюся последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген ГКГС класса II.
3. Вектор по п. 2, отличающийся тем, что
b = 1, d = 1, e = 1, g = 1, h = 1, X = 20, Y = 2,
P представляет собой последовательность промотора CMV,
каждый N кодирует эпитоп ГКГС класса I длиной 7-15 аминокислот,
L5 представляет собой нативную 5'-последовательность нуклеиновой кислоты эпитопа ГКГС I, и при этом 5'-линкерная последовательность кодирует пептид, длина которого составляет по меньшей мере 5 аминокислот,
L3 представляет собой нативную 3'-последовательность нуклеиновой кислоты эпитопа ГКГС I, и при этом 3'-линкерная последовательность кодирует пептид, длина которого составляет по меньшей мере 5 аминокислот,
U представляет собой каждую из последовательностей PADRE ГКГС класса II и последовательность анатоксина столбняка ГКГС класса II,
указанный аденовирусный вектор шимпанзе содержит модифицированную последовательность ChAdV68, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, имеющую делецию E1 с нуклеотида 577 по нуклеотид 3403 и делецию E3 с нуклеотида 27125 по нуклеотид 31825, и кассета неоантигена вставляется в пределах делеции E1, и
каждая из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих неоантиген ГКГС класса I, кодирует полипептид длиной 25 аминокислот.
4. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих неоантиген, в указанном множестве кодирует полипептидную последовательность или ее часть, которая презентирована ГКГС класса I на поверхности опухолевых клеток, где необязательно, по меньшей мере, одна из кодирующих неоантиген последовательностей нуклеиновых кислот в указанном множестве кодирует полипептидную последовательность или ее часть, которая имеет повышенную вероятность презентации на соответствующем аллеле ГКГС относительно транслируемой соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты дикого типа, и
где необязательно указанное множество включает в себя, по меньшей мере, от 2 до 400 последовательностей нуклеиновых кислот, и (1) при этом по меньшей мере две из последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих неоантиген, в указанном множестве кодируют полипептидные последовательности или их части, которые презентуются ГКГС класса I на поверхности опухолевых клеток или (2) при введении субъекту и трансляции, по меньшей мере, один из неоантигенов презентирован на антигенпрезентирующих клетках, что приводит к иммунному ответу, направленному по меньшей мере на один из неоантигенов на поверхности опухолевой клетки; и
где необязательно экспрессия каждой из по меньшей мере от 2 до 400 последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих неоантиген, управляется по меньшей мере одним промотором.
5. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере, одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая неоантиген, в указанном множестве связана с отличающейся последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей неоантиген в указанном множестве посредством кодирующей линкер последовательности.
6. Вектор по п. 5, отличающийся тем, что указанный линкер кодирующей линкер последовательности связывает две последовательности ГКГС класса I или последовательность ГКГС класса I с последовательностью ГКГС класса II, где необязательно указанный линкер выбран из группы, состоящей из: (1) последовательных остатков глицина длиной по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков; (2) последовательных остатков аланина длиной по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков; (3) двух остатков аргинина (RR); (4) аланина, аланина, тирозина (AAY); (5) консенсусной последовательности длиной не менее 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которая эффективно процессируется протеасомой млекопитающего; и (6) одной или более нативных последовательностей, фланкирующих антиген, полученных из когнатного оригинального белка, и которые имеют по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или от 2 до 20 аминокислотных остатков в длину.
7. Вектор по п. 5, отличающийся тем, что указанный линкер кодирующей линкер последовательности связывает две последовательности ГКГС класса II или последовательность ГКГС класса II с последовательностью ГКГС класса I, где необязательно указанный линкер содержит последовательность GPGPG.
8. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что указанное множество включает в себя, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или до 400 последовательностей нуклеиновых кислот.
9. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что каждая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая неоантиген ГКГС класса I, кодирует полипептидную последовательность длиной от 8 до 35 аминокислот, необязательно 9-17, 9-25, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 аминокислот в длину.
10. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что присутствует по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая антиген ГКГС класса II, включающая в себя, по меньшей мере, одну универсальную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген ГКГС класса II, необязательно, при этом, по меньшей мере, одна универсальная последовательность содержит, по меньшей мере, одну последовательность, по меньшей мере, одного из анатоксина столбняка и PADRE.
11. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере одна промоторная последовательность является индуцибельной.
12. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой вектор (ChAdV)68 аденовируса шимпанзе.
13. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что указанный вектор содержит один или более генов или регуляторных последовательностей, полученных из последовательности SEQ ID NO:1, необязательно, при этом один или более генов выбраны из группы, состоящей из инвертированных концевых повторов (ITR - inverted terminal repeat) аденовируса шимпанзе, генов E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 и L5 последовательности, изложенной в SEQ ID NO:1, необязательно, при этом один или более генов содержат каждый из генов аденовируса шимпанзе ITRs, E2A, E2B, L1, L2, L3, L4 и L5 последовательности, изложенной в SEQ ID NO:1.
14. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что неоантигенная кассета встраивается в вектор в удаленную область аденовируса шимпанзе, которая позволяет встраивание неоантигенной кассеты, где необязательно удаленная область аденовируса шимпанзе представляет собой область E1 или область E3.
15. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что аденовирусный вектор содержит одну или более делеций между парой оснований с номером 577 и 3403 последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, или между парой оснований 456 и 3014 последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, и, необязательно, при этом вектор дополнительно содержит одну или более делеций между парой оснований 27125 и 31825 последовательности, показанной в SEQ ID NO: 1, или между парой оснований 27816 и 31333 последовательности, изложенной в SEQ ID NO: 1.
16. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере две последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие неоантиген ГКГС класса I, выбираются путем выполнения этапов:
(1) получения по меньшей мере одних данных сиквенирования нуклеотидов экзома, транскриптома или цельного генома из опухоли, при этом данные сиквенирования нуклеотидов опухоли применяют для получения данных, представляющих пептидные последовательности каждого из набора неоантигенов;
(2) ввода пептидной последовательности каждого неоантигена в презентационную модель для генерации набора числовых вероятностей того, что каждый из неоантигенов презентирован одним или более аллелями ГКГС на поверхности опухолевой клетки опухоли, причем набор числовых вероятностей был идентифицирован, по меньшей мере, на основании полученных масс-спектрометрических данных, где необязательно что презентационная модель представляет зависимость между: присутствием пары конкретной одной из аллелей ГКГС и конкретной аминокислоты в определенном положении пептидной последовательности; и вероятностью презентации на поверхности опухолевых клеток пары конкретной одной из аллелей ГКГС такой пептидной последовательности, содержащей конкретную аминокислоту в определенном положении; и
(3) выбора подмножества из набора неоантигенов на основе набора числовых вероятностей для создания набора отобранных неоантигенов, которые применяются для получения по меньшей мере двух последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих неоантиген ГКГС класса I, где необязательно количество множества выбранных неоантигенов составляет от 2 до 20; и
где необязательно отбор набора отобранных неоантигенов включает в себя отбор неоантигенов, выбранных из группы, состоящей из: (a) неоантигенов, которые имеют повышенную вероятность быть презентированными на поверхности опухолевых клеток по сравнению с невыбранными неоантигенами на основе презентационной модели, (b) неоантигенов, которые имеют повышенную вероятность того, что они способны индуцировать специфический для опухоли иммунный ответ у субъекта по сравнению с невыбранными неоантигенами на основе презентационной модели, (c) неоантигенов, которые имеют повышенную вероятность того, что они могут быть презентированы наивным Т-клеткам специализированными антигенпрезентирующими клетками (АПК) по сравнению с невыбранными неоантигенами на основе презентационной модели, необязательно, при этом АПК представляет собой дендритную клетку (ДК), (d) неоантигенов, которые имеют пониженную вероятность подвергнуться ингибированию через центральную или периферическую толерантность по сравнению с невыбранными неоантигенами на основе презентационной модели, и (e) неоантигенов, которые имеют пониженную вероятность того, что они способны индуцировать аутоиммунный ответ на нормальную ткань у субъекта по сравнению с невыбранными неоантигенами на основе презентационной модели.
отбор набора отобранных неоантигенов включает в себя отбор неоантигенов, которые имеют повышенную вероятность быть презентированными на поверхности опухолевых клеток по сравнению с невыбранными неоантигенами на основе презентационной модели.
17. Вектор по п. 1, отличающийся тем, что кассета неоантигена содержит соединяющие последовательности эпитопов, образованные соседними последовательностями в кассете неоантигена, где по меньшей мере, одна или каждая соединяющая последовательность эпитопов имеет аффинность к ГКГС более 500 нМ, где необязательно каждая соединяющая последовательность эпитопа не является самостоятельной.
18. Фармацевтическая композиция, содержащая указанный вектор по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель, где необязательно указанная композиция дополнительно содержит вспомогательное вещество.
19. Выделенная нуклеотидная последовательность, содержащая неоантигенную кассету по п. 1 и один или более генов, полученных из последовательности SEQ ID NO:1, необязательно, при этом ген выбран из группы, состоящей из генов аденовируса шимпанзе ITRs, E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 и L5 последовательности, изложенной в SEQ ID NO:1, где необязательно один или более генов содержат каждый из генов аденовируса шимпанзе ITRs, E2A, E2B, L1, L2, L3, L4 и L5 последовательности, изложенной в SEQ ID NO:1, и, необязательно, при этом указанная нуклеотидная последовательность представляет собой кДНК.
20. Способ лечения субъекта, страдающего от рака, включающий в себя введение субъекту вектора по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 18, где необязательно способ дополнительно включает в себя введение субъекту иммуномодулятора, где иммуномодулятор представляет собой антитело к CTLA4 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело к PD-1 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело к PD-L1 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело к 4-1BB или его антигенсвязывающий фрагмент, или антитело к OX-40 или его антигенсвязывающий фрагмент, и где необязательно иммуномодулятор вводят до, одновременно или после введения вектора или фармацевтической композиции, и где необязательно указанные вектор, композицию и/или иммуномодулятор вводят внутримышечно (в/м), внутрикожно (в/к), подкожно (п/к) или внутривенно (в/в).
21. Способ изготовления вектора по п. 1, причем указанный способ включает в себя:
получение плазмидной последовательности, содержащей по меньшей мере одну промоторную последовательность и кассету неоантигена;
трансфекцию указанной плазмидной последовательности в одну или более клеток-хозяев; и
выделение указанного вектора из одной или более клеток-хозяев, где необязательно указанное выделение включает в себя: лизирование клетки-хозяина для получения клеточного лизата, содержащего указанный вектор; и очистку указанного вектора из указанного клеточного лизата и, необязательно, также от среды, применяемой для культивирования клетки-хозяина.
22. Способ индуцирования иммунного ответа у субъекта, где способ включает введение субъекту аденовирусного вектора шимпанзе, содержащего антигенную кассету, причем антигенная кассета содержит:
(1) множество последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих антигены, причем указанное множество включает:
по меньшей мере две последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антиген, каждая из которых содержит:
а. последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую эпитоп ГКГС класса I,
b. необязательно 5'-линкерную последовательность и
c. необязательно 3'-линкерную последовательность;
(2) по меньшей мере одну промоторную последовательность, функционально связанную с по меньшей мере одной последовательностью указанного множества,
(3) необязательно, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген ГКГС класса II;
(4) необязательно, по меньшей мере, одну кодирующую GPGPG линкер последовательность (SEQ ID NO: 56);
(5) необязательно, по меньшей мере, одну последовательность полиаденилирования функционально связанную с, по меньшей мере, одной из последовательностей в указанном множестве, необязательно, при этом последовательность полиА расположена 3' от по меньшей мере одной последовательности в указанном множестве, и где необязательно последовательность полиА содержит последовательность полиА SV40.
23. Способ индуцирования иммунного ответа у субъекта на один или более антигенов, причем способ включает введение субъекту:
(1) аденовирусного вектора шимпанзе, содержащего одну или более последовательностей, кодирующих один или более антиген, и
(2) вектор с самореплицирующейся РНК (срРНК), содержащий одну или более последовательностей, кодирующих один или более антиген, и
где аденовирусный вектор шимпанзе вводят в качестве примирущей вакцины, а вектор срРНК вводят в качестве стимулирующей вакцины, или
где вектор срРНК вводят в качестве примирущей вакцины, а аденовирусный вектор шимпанзе вводят в качестве стимулирующей вакцины.