НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 3,5-СЕКО-4-НОРХОЛЕСТАНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NEW DERIVATIVES OF 3,5-SECO-4-NORCHOLESTANE AND THEIR APPLICATION

Настоящее изобретение относится к применению в качестве лекарственных средств производных 3,5-секо-4-норхолестана, в частности, в качестве нейропротекторов, например, при патологиях и травмах, связанных с дегенерацией или гибелью моторных нейронов, фармацевтическим композициям, их содержащим, новым производным и способу их получения.
Нейродегенеративные процессы характеризуются дисфункцией и гибелью нейронов, вызывающими снижение неврологических функций, опосредованных головным мозгом (центральная нервная система, ЦНС), спинным мозгом и периферической нервной системой (ПНС). Они, кроме того, могут быть следствием патологических состояний, объединяемых в группу нейродегенеративных заболеваний или повреждений, травм или действия токсинов.
Наиболее важными патологиями, которые характеризуются дегенеративным процессом, являются:
- наследственные или спорадические хронические нейродегенеративные заболевания, в частности, болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, спинальная амиотрофия, болезнь Крейцфельда-Якоба, рассеянный склероз, адренолейкодистрофия, эпилепсия, деменции, шизофрения, и неврологические синдромы, ассоциированные со СПИДом;
- повреждение нейронов, связанное со старением;
- вызванные повреждением или наследственные периферические нейропатии, такие как болезни Фабри, Шарко-Мари-Тута, Краббе, лейкодистрофии, диабетические нейропатии и нейропатии, индуцированные противораковым лечением;
- травмы головного мозга, периферических нервов или спинного мозга;
- ишемии головного или спинного мозга, возникающие вследствие цереброваскулярных повреждений или индуцированные недостаточностью кровоснабжения;
- наследственная, вызванная повреждением или связанная со старением дегенерация чувствительных зрительных нейронов, такая как макулярная дегенерация, пигментные ретиниты, или дегенерация зрительного нерва, индуцированная глаукомой;
- наследственная, травматическая или связанная со старением дегенерация чувствительных слуховых нейронов, влекущая снижение или потерю слуха.
Часть сигнальных путей, повреждаемых при этих патологиях, является общей для большого числа нейродегенеративных заболеваний. Болезнь Альцгеймера является наиболее часто встречающейся формой деменции. Она проявляется в атрофии головного мозга, преобладающей потере нейронов в гиппокампе и затрагивает также холинергические нейроны. Другие патологии, такие как лобарные атрофии (болезнь Пика, болезнь Крейцфельда-Якоба), деменция, связанная с телом Леви, васкулярные деменции, болезнь Паркинсона, связаны со значительной гибелью нейронов, обуславливающей происхождение симптомов упомянутых деменций.
В настоящее время не существует эффективного лечения для замедления дегенерации нейронов. Терапевтический подход в защите нейронов от гибели состоит во введении нейротрофических белков.
Эти белки, такие как BDNF (нейротрофический фактор головного мозга), CNTF (цилиарный нейротрофический фактор), NGF (фактор роста нервов), GDNF (глиальный нейротрофический фактор) синтезируются в эмбрионе в течение его развития или в организме взрослого после получения повреждения. Такие факторы роста благоприятствуют сохранению, созреванию и дифференцировке нервных клеток. Кроме того, они тормозят апоптотические механизмы, активируют множественные пути выживаемости и защищают большое число нейронных популяций. Их использование предлагается в большинстве случаев дегенерации нейронов.
Соединения, которые могут активировать экспрессию нейротрофических факторов или воспроизводить действие этих факторов, обладают терапевтическим потенциалом для лечения нейродегенеративных синдромов.
В частности, введением нейротрофических соединений при лечении дегенерации нейронов преследуются три цели:
- компенсация потенциального недостатка нейротрофических факторов, связанного с отсутствием поступления к периферическим или центральным мишеням нейронов, и/или деградационное расстройство транспорта этих факторов;
- вмешательство неспецифическим образом в биохимические пути, включенные в дегенеративный каскад;
- благоприятствование естественным компенсационным явлениям роста дендритов и ветвления нервных окончаний.
Таким образом, такие соединения могли бы проявлять благоприятный эффект для большого числа патологий, в частности при патологиях, касающихся периферической и центральной нервных систем.
В то же время, в упомянутом ранее контексте, моторные нейроны представляют собой нейроны, имеющиеся, в частности, в спинном мозге и мозговом стволе. Их дегенерация или гибель может привести к прогрессирующей слабости мышц конечностей, затем к атрофии и к возможной спастичности (то есть к постоянной контракции) мышц.
Наиболее важными патологиями, обуславливаемыми дегенерацией или гибелью спинальных и/или бульбарных моторных нейронов, являются боковой амиотрофический склероз, также известный под названием болезни Шарко или болезни Лоу Герига, и семейная спинальная амиотрофия детского возраста, также известная под названием болезни Верднига-Гоффманна или болезни Кугельберга-Веландера.
Кроме того, дегенерация моторных нейронов наблюдается в случаях травм с раздавливанием и/или рассечением спинного мозга или периферических двигательных нервов.
В более общем случае, о спинальной амиотрофии говорят в случае заболеваний, при которых наблюдается дегенерация или гибель моторных нейронов спинного мозга.
Боковой амиотрофический склероз (SLA или ALS для Amyotrophic Lateral Sclerosis) представляет собой нейродегенеративное заболевание, ассоциированное с различными типами включений, такими как тела Леви, и характеризующееся дегенерацией спинальных и кортикальных моторных нейронов, при котором фатальный исход ассоциирован иногда с фронтальной деменцией. По ходу развития ALS дегенеративные явления происходят не только в головном мозге, но также в спинном мозге и, как следствие, в мышцах по причине отсутствия иннервации.
В настоящее время осуществляется поиск активных соединений для лечения упомянутых ранее заболеваний.
Авторами было обнаружено, что производные 3,5-секо-4-норхолестана, в частности 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол, обладают заметными нейропротективными свойствами, в частности, в отношении моторных нейронов, нейронов центральной нервной системы, двигательных и периферических нервов, и, следовательно, являются полезными в качестве лекарственных средств.
Поэтому объектом настоящего изобретения являются соединения, соответствующие формуле I
в которой:
- X совместно с Y представляет собой кетогруппу или X представляет собой гидроксил, а Y представляет собой атом водорода, или X и Y совместно представляют собой группу оксима (=NOH) или метилоксима (=NHOMe);
- B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой атомы водорода, или C и D представляют собой прямые или разветвленные алкильные радикалы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода, или C представляет собой атом водорода, а D представляет собой прямой или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода,
или B совместно с C представляет собой кетогруппу, а D представляет собой метил, гидроксил или метиламин,
или B и C представляют собой атомы водорода, а D представляет собой метиламин,
или B и C совместно представляют собой группу оксима, а D представляет собой метил,
и R представляет собой прямой или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 10 атомов углерода;
их сложные эфиры, а также их аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами, для использования их в способе терапевтического лечения человека или животных, то есть в качестве лекарственных средств.
Аддитивными солями с фармацевтически приемлемыми кислотами могут быть, например, соли, образованные соляной, бромисто-водородной, азотной, серной, фосфорной, уксусной, муравьиной, пропионовой, бензойной, малеиновой, фумаровой, янтарной, винной, лимонной, щавелевой, глиоксиловой, аспарагиновой кислотами, алкансульфоновыми кислотами, такими как метан- или этансульфоновая кислота, арилсульфоновыми кислотами, такими как бензол- или паратолуолсульфоновая кислота, или карбоновыми кислотами.
Специалисту в данной области техники понятно, что некоторые соединения формулы I, которые содержат одну или несколько гидроксильных групп, могут быть этерифицированы. Такие сложные эфиры, а также их аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами в общем случае непосредственно сами не являются активными веществами, но представляют собой пролекарства для соответствующих гидроксильных аналогов. Такие сложные эфиры, метаболизируемые в человеческом организме, приводят к активным соединениям. Такие сложные эфиры являются в равной мере объектом настоящего изобретения. Можно упомянуть сложные эфиры, вводящие химические функциональные группы, такие как сульфаты, фосфаты, кислотные и основные группы, которые увеличивают растворимость в воде и биодоступность. Предпочтительными являются сложные эфиры соединений, содержащих основную группу, такие как аналоги диалкилглицина с алкильными группами, содержащими от 1 до 4 атомов углерода, в частности, диметилглицин и диэтилглицин, а также метилпиперазин.
В настоящей заявке, здесь и далее, термин «прямой или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода», означает, например, метил, этил, пропил, изопропил, предпочтительно метил или этил, в частности метил.
Термин «прямой или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 10 атомов углерода», означает, например, 2-метил-3-этилгептан, 3-этилгептан, 3-метилгептан, предпочтительно 2-этилгептан, в частности, 2-метилгептанхолестан, представленный далее
Таким образом, более предпочтительно принимают во внимание соединения формулы
в которой B, C, D, X и Y имеют указанные ранее значения.
Среди упомянутых ранее соединений формулы I принимают во внимание, в частности, соединения формулы I, в которых X совместно с Y представляет собой кетогруппу, а также их сложные эфиры и аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.
Более предпочтительно принимают во внимание упомянутые ранее соединения, в которых:
- B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой атомы водорода, или C и D представляют собой 2 прямых или разветвленных алкильных радикала, содержащих от 1 до 4 атомов углерода;
- B совместно с C представляет собой кетогруппу, а D представляет собой метил;
а также их сложные эфиры и аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.
Среди упомянутых ранее соединений формулы I принимают во внимание, в частности, соединения формулы I, в которых X и Y совместно представляют собой группу оксима, а также их сложные эфиры и аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.
Более предпочтительно принимают во внимание упомянутые ранее соединения, в которых:
- B совместно с C представляет собой кетогруппу, а D представляет собой метил, гидроксил, метиламин;
- B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой атомы водорода, или C и D представляют собой 2 прямых или разветвленных алкильных радикала, содержащих от 1 до 4 атомов углерода, или C представляет собой атом водорода, а D представляет собой прямой или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода;
- B и C представляют собой атом водорода, а D представляет собой метиламин;
- B совместно с C представляет собой группу оксима, а D представляет собой метил;
а также их сложные эфиры и аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.
Наиболее предпочтительно принимают во внимание:
- 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол;
- 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиловый спирт;
- 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-диметиловый спирт;
а также их сложные эфиры и аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами.
Также предпочтительно принимают во внимание аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами соединений формулы I или семейства упомянутых ранее соединений, их сложные эфиры и аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами упомянутых сложных эфиров.
Соединения, являющиеся объектом настоящего изобретения, обладают очень интересными фармакологическими свойствами. В частности, они проявляют заметные нейропротективные свойства в отношении моторных нейронов.
Эти свойства проиллюстрированы далее в экспериментальной части. Они дают основания для использования ранее упомянутых соединений, а также их аддитивных солей с фармацевтически приемлемыми кислотами в качестве лекарственных средств.
Лекарственные средства по настоящему изобретению находят свое применение ввиду своих нейропротективных свойств, например, для лечения или профилактики нейродегенеративных заболеваний, таких как, например, болезнь Гентингтона, наследственные или спорадические хронические нейродегенеративные заболевания, повреждение нейронов, связанное со старением, вызванные повреждением или наследственные периферические нейропатии, болезнь Шарко-Мари-Тута, диабетические нейропатии или нейропатии, индуцированные противораковым лечением, травмы головного мозга, периферических нервов или спинного мозга, ишемии головного или спинного мозга, наследственная, вызванная повреждением или связанная со старением дегенерация чувствительных зрительных нейронов или дегенерация зрительных нервов, наследственная, травматическая или связанная со старением дегенерация чувствительных слуховых нейронов, лобарные атрофии и васкулярные деменции, в частности, спинальная амиотрофия, боковой амиотрофический склероз и патологии, вызванные травмами спинного мозга или периферических двигательных нервов.
В контексте настоящего изобретения термин «лечение» означает профилактическое, куративное, паллиативное лечение, а также ведение больных (уменьшение страданий, увеличение продолжительности жизни, замедление развития заболевания) и т.д. Лечение может быть осуществлено, кроме того, в сочетании с другими средствами или способами лечения, такими как, в частности, другие активные соединения для лечения патологий или травм, упомянутых в настоящей заявке.
В частности, они находят применение, ввиду своих нейропротективных свойств в отношении моторных нейронов, особенно при лечении спинальной амиотрофии, в частности, бокового амиотрофического склероза или семейной спинальной амиотрофии детского возраста, и при лечении травм спинного мозга или двигательных периферических нервов, как упомянуто ранее.
В общем случае, суточная доза соединения представляет собой минимальную дозу, обеспечивающую получение терапевтического эффекта. Такая доза зависит от различных факторов, упомянутых ранее. Дозы упомянутых ранее соединений и, например, 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола в общем случае находятся в интервале от 0,001 до 100 мг на кг в день для человека.
При необходимости, суточная доза может вводиться в виде увеличенной в два, три, четыре, пять, шесть или более раз дозы, принимаемой в день, или в виде многократных субдоз, которые вводят с соответствующими интервалами в течение дня.
Выбранное количество зависит от множества факторов, в частности, от пути введения, продолжительности введения, времени введения, скорости выведения соединения, одного или нескольких различных продуктов, используемых в сочетании с соединением, возраста, массы тела и физического состояния больного, а также его истории болезни и любой другой известной информации медицинского характера.
Назначение лечащим врачом доз может начинаться с меньших доз, чем используемые в общем случае, затем эти дозы могут быть прогрессивно увеличены для того, чтобы лучше отслеживать появление вероятных побочных эффектов.
Объектом настоящего изобретения являются также фармацевтические композиции, которые содержат по меньшей мере одно упомянутое ранее соединение или одну из его аддитивных солей с фармацевтически приемлемыми кислотами в качестве активного ингредиента.
В этих композициях активный ингредиент содержится предпочтительно в физиологически эффективных дозах; упомянутые ранее композиции содержат, в частности, эффективную нейропротективную дозу по меньшей мере одного из упомянутых ранее активных ингредиентов.
Соединения, соответствующие формуле I, их сложные эфиры, аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами, а также аддитивные соли с фармацевтически приемлемыми кислотами упомянутых сложных эфиров, могут быть включены в качестве лекарственных средств в фармацевтические композиции, предназначенные для введения через желудочно-кишечный тракт или парентерально.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать, кроме того, по меньшей мере еще один терапевтически активный ингредиент для одновременного, раздельного или распределенного по времени применения, в частности, при лечении больных, пораженных патологиями или травмами, связанными с дегенерацией или гибелью моторных нейронов, как определено ранее.
Фармацевтические композиции или лекарственные средства по настоящему изобретению содержат предпочтительно один или несколько эксципиентов или инертных носителей, то есть фармацевтически неактивных и нетоксичных веществ. Можно упомянуть, например, солевые, физиологические, изотонические, буферные растворы и т.д., приемлемые для фармацевтического применения и известные специалисту в данной области техники.
Композиции могут содержать один или несколько агентов или носителей, выбранных из диспергаторов, солюбилизаторов, стабилизаторов, консервантов и т.д. Агентами или применяемыми носителями в композициях (жидких и/или инъецируемых, и/или твердых) являются, в частности, метилцеллюлоза, гидроксиметилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, циклодекстрины, полисорбат 80, маннит, желатин, лактоза, растительные или животные масла, масло акации и т.д. Композиции могут представлять собой суспензии для инъекций, гели, масла, таблетки, суппозитории, порошки, капсулы с желатиновой оболочкой, капсулы и т.д., при необходимости, в виде галеновых препаратов или устройств, обеспечивающих пролонгированное и/или замедленное высвобождение. Для такого типа композиций используют предпочтительно такие агенты, как целлюлоза, карбонаты или крахмалы.
Введение можно осуществлять любым способом, известным специалисту в данной области техники, предпочтительно перорально или путем инъекции, в частности, интраперитонеально, интрацеребрально, интратекально, внутривенно, внутриартериально или внутримышечно. Более предпочтительным является пероральное введение. В случае долгосрочного лечения предпочтительным путем введения является сублингвальное, пероральное или чрескожное введение.
Используемые для инъекций соединения, в общем случае, применяют в виде жидких суспензий, которые могут быть введены, например, посредством шприца или путем перфузии. Разумеется, скорость ввода и/или инъецируемая доза, или, в общем случае, доза, предназначенная для введения, могут быть адаптированы специалистом в данной области техники в зависимости от особенностей больного, вида патологии, способа введения и т.д. Разумеется, многократное введение можно осуществлять, в случае необходимости, в сочетании с другими активными ингредиентами или любым фармацевтически приемлемым носителем (буферные, солевые, изотонические растворы, в присутствии стабилизаторов и т.д.).
Настоящее изобретение можно применять в отношении млекопитающих, в частности человека.
Объектом настоящего изобретения является также способ получения упомянутой ранее композиции, отличающийся тем, что смешивают известными способами один или несколько активных ингредиентов с приемлемыми эксципиентами, в частности с фармацевтически приемлемыми эксципиентами.
Соединения формулы I, такие как определено ранее, являются известными или могут быть получены способами, описанными в литературе. Некоторые производные соединения формулы I являются новыми продуктами.
Поэтому объектом настоящего изобретения являются также новые соединения, соответствующие формуле I
в которой:
- X и Y совместно представляют собой группу оксима, B и C представляют собой атомы водорода, C представляет собой атом водорода, а D представляет собой метиламин.
- X совместно с Y представляет собой кетогруппу, B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой метильные радикалы;
- X и Y совместно представляют собой группу оксима, B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой метильные радикалы;
- X и Y совместно представляют собой группу оксима, B представляет собой гидроксил, C представляет собой атом водорода, а D представляет собой метил;
- X и Y совместно представляют собой группу метилоксима, B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой атомы водорода;
а также их аддитивные соли с неорганическими или органическими кислотами.
Объектом настоящего изобретения является в равной мере способ получения новых соединений формулы I, таких как определено ранее, а также их солей, отличающийся тем, что приводят во взаимодействие соединение формулы II
в котором R представляет собой прямой или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, подвергая его
или
-
действию метиламина, а затем гидроксиламина для получения соединения формулы I, в которой R имеет указанное ранее значение, X и Y совместно представляют собой группу оксима, B совместно с C представляет собой кетогруппу, а D представляет собой метиламин,
или
-
метилированию для получения соединения формулы III
в котором R имеет указанное ранее значение и которое подвергают действию защитного агента для защиты кетогруппы в положении 5 для получения соединения формулы IV
в котором R имеет указанное ранее значение и которое
или
-
приводят во взаимодействие с метиллитием, затем подвергают действию агента, удаляющего защиту кетогруппы в положении 5, затем приводят во взаимодействие с гидроксиламином для получения соединения формулы I, в которой R имеет указанное ранее значение, X и Y совместно представляют собой группу оксима, B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой прямые или разветвленные алкильные радикалы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода,
или
-
3
3
омыляют, затем приводят во взаимодействие с соединением формулы HC-NH-OCH, далее приводят во взаимодействие с метиллитием для получения соединения формулы V
которое подвергают восстановлению кетогруппы, затем подвергают действию агента, удаляющего защиту кетогруппы в положении 5, затем приводят во взаимодействие с гидроксиламином для получения соединения формулы I, в которой R имеет указанное ранее значение, X и Y совместно представляют собой группу оксима, B представляет собой гидроксил, C представляет собой прямой или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, при необходимости замещенных, а D представляет собой атом водорода,
или
-
восстанавливают для получения соединения формулы VI
в котором R имеет указанное ранее значение, B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой атомы водорода и которое
- или
подвергают действию окислителя для получения соединения формулы VII
в котором R имеет указанное ранее значение, из которого получают основание Шиффа, которое затем восстанавливают, далее подвергают действию агента, удаляющего защиту кетогруппы в положении 5, затем приводят во взаимодействие с гидроксиламином для получения соединения формулы I, в которой R имеет указанное ранее значение, X и Y совместно представляют собой группу оксима, B представляет собой метиламин, а C и D представляют собой атомы водорода,
- или
подвергают действию агента, удаляющего защиту кетогруппы в положении 5, затем приводят во взаимодействие с амином, выбранным из гидроксиламина, метилгидроксиламина и карбоксиметилгидроксиламина, для получения соединения формулы I, в которой R имеет указанное ранее значение, X и Y совместно представляют собой соответственно группу оксима, метилоксима и карбоксиметилоксима, B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой атомы водорода;
выделяют и, при необходимости, соединения формулы I переводят в солевую форму или этерифицируют.
В предпочтительных условиях применения описанного ранее способа:
- Осуществляют взаимодействие соединения формулы II с метиламином в присутствии соединения, активирующего ацидогруппу, такого как BOP (гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфония) или TBTU (тетрафторборат 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония), предпочтительно в присутствии основания, такого как N-метилморфолин, в частности, в приемлемом растворителе, таком как дихлорметан или диметилформамид. Предпочтительно взаимодействие осуществляют в присутствии EDCI (1-этил-3-(3'-диметиламинопропил)карбодиимид) в сочетании с 4-диметиламинопиридином в дихлорметане, причем смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем продукт растворяют предпочтительно в пиридине, затем добавляют от 5 до 7 эквивалентов, в частности 6 эквивалентов гидрохлорида гидроксиламина.
- Метилирование соединения формулы II осуществляют метанолом в присутствии тионилхлорида, предпочтительно растворяя кислоту формулы II в соответствующем объеме смеси из 70% метанола и 30% дихлорметана. Охлаждают до 0°С и по каплям добавляют 3 эквивалента тионилхлорида. Затем перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре.
В этом соединении защиту кетогруппы предпочтительно осуществляют, растворяя продукт в избытке, например в 10 эквивалентах, триметилортоформиата и в достаточном объеме этиленгликоля, добавляя затем безводную п-толуолсульфоновую кислоту.
- Взаимодействие соединения формулы IV с метиллитием предпочтительно осуществляют в безводном ТГФ, при этом после охлаждения приблизительно до -45°С по каплям добавляют избыток метиллития.
Удаление диоксолана, который блокирует кетогруппу в положении 5, осуществляют в ацетоне в присутствии серной кислоты. Предпочтительно удаление защиты осуществляют в диоксане в присутствии смеси вода/уксусная кислота в соотношении 1/1. Получение кетоксима предпочтительно осуществляют по описанной ранее методике.
- Омыление соединения формулы IV осуществляют гидроксидом натрия предпочтительно в диоксане. В частности, добавляют приблизительно 2 эквивалента водного раствора гидроксида натрия.
3
3
Этот продукт приводят во взаимодействие с соединением формулы HC-NH-OCH, например, в присутствии агента, активирующего ацидогруппу, такого как BOP или TBTU, в присутствии основания, такого как N-метилморфолин, в приемлемом растворителе, таком как дихлорметан или диметилформамид. Предпочтительно взаимодействие осуществляют в присутствии EDCI в сочетании с гидроксибензотриазолом, с триэтиламином, добавляемом в раствор по каплям.
Этот продукт приводят во взаимодействие с метиллитием в атмосфере аргона по методике, описанной ранее, затем кетогруппу в положении 3 восстанавливают боргидридом натрия.
Затем из полученного продукта удаляют защиту кетогруппы в положении 5 и приводят во взаимодействие с гидроксиламином по той же описанной ранее методике.
- Восстановление соединения формулы IV для получения соединения формулы VI осуществляют предпочтительно алюмогидридом лития, в частности, в виде суспензии в тетрагидрофуране. С соблюдением осторожности гидролизуют добавлением раствора сульфата натрия.
- Окисление соединения формулы VI осуществляют хлорхроматом пиридиния.
С этим продуктом получают основание Шиффа, которое немедленно восстанавливают, в частности, растворяя предпочтительно в атмосфере аргона в этиловом спирте в присутствии триэтиламина, гидрохлорида метиламина и тетраизопропоксида титана, с последующим добавлением боргидрида натрия.
Удаление защиты кетогруппы в положении 5, а также взаимодействие с гидроксиламином осуществляют в описанных ранее условиях.
Соединения формулы II являются известными, описанными в литературе и имеющимися в продаже соединениями.
Объектом настоящего изобретения является также применение соединения формулы I
в которой:
- X совместно с Y представляет собой кетогруппу или X представляет собой гидроксил, а Y представляет собой атом водорода, или X и Y совместно представляют собой группу оксима (=NOH) или метилоксима (=NHOMe);
- B представляет собой гидроксил, а C и D представляют собой атомы водорода, или C и D представляют собой 2 прямых или разветвленных алкильных радикала, содержащих от 1 до 4 атомов углерода, или C представляет собой атом водорода, а D представляет собой прямой или разветвленный алкильный радикал, содержащий от 1 до 4 атомов углерода,
или B совместно с C представляет собой кетогруппу, а D представляет собой метил, гидроксил или метиламин,
или B и C представляют собой атомы водорода, а D представляет собой метиламин,
или B и C совместно представляют собой группу оксима, а D представляет собой метил;
или одного из его сложных эфиров, или одной из его аддитивных солей с фармацевтически приемлемыми кислотами, или одной из аддитивных солей одного из его сложных эфиров с фармацевтически приемлемыми кислотами для получения нейропротективного лекарственного средства, в частности, предназначенного для лечения или профилактики нейродегенеративных заболеваний, таких как, например, болезнь Гентингтона, наследственные или спорадические хронические нейродегенеративные заболевания, повреждение нейронов, связанное со старением, вызванные повреждением или наследственные периферические нейропатии, болезнь Шарко-Мари-Тута, диабетические нейропатии или нейропатии, индуцированные противораковым лечением, травмы головного мозга, периферических нервов или спинного мозга, ишемии головного или спинного мозга, наследственная, вызванная повреждением или связанная со старением дегенерация чувствительных зрительных нейронов или дегенерация зрительных нервов, наследственная, травматическая или связанная со старением дегенерация чувствительных слуховых нейронов, лобарные атрофии и васкулярные деменции, заболевания и травмы, связанные с дегенерацией моторных нейронов, и более предпочтительно спинальная амиотрофия, в частности, семейная спинальная амиотрофия детского возраста, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз и травмы спинного мозга или периферических двигательных нервов.
Предпочтительно объектом настоящего изобретения является применение упомянутого ранее соединения формулы I, солей или сложных эфиров для получения нейропротективного лекарственного средства, предназначенного, в частности, для лечения патологий или травм, связанных с дегенерацией или гибелью нейронов, у млекопитающих (в общем случае больных), пораженных такими патологиями или травмами.
Более предпочтительно объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы I или одной из его солей, или одного из его сложных эфиров для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения семейной спинальной амиотрофии детского возраста и боковых амиотрофических склерозов.
Применение этих лекарственных средств традиционно состоит во введении в организм млекопитающих терапевтически эффективного количества соединения формулы I или одного из его сложных эфиров, в частности, 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола, предпочтительно для увеличения выживаемости нейронов или благоприятствования росту аксонов. Объектом настоящего изобретения в полной мере является способ лечения заболеваний, в частности, ранее упомянутых нейродегенеративных заболеваний, и, в частности, способ лечения патологий или травм, связанных с дегенерацией или гибелью нейронов, у млекопитающих (в общем случае больных), пораженных такими патологиями или травмами, состоящий во введении в организм млекопитающих терапевтически эффективного количества 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола предпочтительно для увеличения выживаемости нейронов или благоприятствования росту аксонов.
Кроме того, объектом настоящего изобретения является способ лечения одного из описанных ранее заболеваний и, в частности, патологий или травм, связанных с дегенерацией или гибелью моторных нейронов, у млекопитающих (в общем случае больных), пораженных такими патологиями или травмами, состоящий во введении в организм млекопитающих терапевтически эффективного количества соединения формулы I или одной из его солей, или одного из его сложных эфиров предпочтительно для увеличения выживаемости нейронов. Более предпочтительными патологиями, связанными с дегенерацией или гибелью моторных нейронов, являются боковой амиотрофический склероз или семейная спинальная амиотрофия детского возраста.
Объектом настоящего изобретения в полной мере являются новые производные 4-холестен-3-она, отличающиеся от других производных 4-холестен-3-она, которые возможно описаны на предшествующем уровне техники. Таким образом, соединения, описанные в литературе, исключаются.
Описанные ранее предпочтительные условия применения лекарственных средств формулы I приложимы в равной мере к другим упомянутым ранее объектам изобретения, в частности, к композициям, новым производным, применению и способам лечения, и наоборот.
Следующие далее примеры приведены для иллюстрации настоящего изобретения.
Приведенные далее значения времени удерживания выражены в минутах и сотых долях минуты.
Для анализа всей совокупности продуктов использован следующий метод жидкостной хроматографии:
Колонка: Macherey-Nagel - Nucleosil 300-6 C4 - 150×4,6 мм
Градиентное элюирование: вода (с добавлением 0,05% трифторуксусной кислоты)/ацетонитрил (с добавлением 0,05% трифторуксусной кислоты)
2
t = 0 мин: 60% ацетонитрил, 40% HO
2
t = 6 мин: 100% ацетонитрил, 0% HO
2
t = 11 мин: 100% ацетонитрил, 0% HO
2
t = 13 мин: 60% ацетонитрил, 40% HO
2
t = 15 мин: 60% ацетонитрил, 40% HO
Условия ионизации в масс-спектрометре:
Температура источника: 250°С
Напряжение на конусе: 50 В
Напряжение на капилляре: 3 кВ
Rf линзы: 0,3 В
Пример 1: 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиламид
Стадия A
2
2
Вначале в колбу вносят 250 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-овой кислоты, 38 мг гидрохлорида метиламина, 250 мг EDCI, 100 мг DMAP и 2,5 мл дихлорметана. Раствор перемешивают в течение 24 часов при комнатной температуре, затем реакционную массу разбавляют дихлорметаном и промывают 10% раствором бикарбоната натрия. Органический слой сушат над сульфатом магния, затем концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (CHCl/MeOH в соотношении 95/5). Получают 176 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-метиламида с выходом 68%.
Анализ
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 4,42 мин
+
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=418; [2M+H]=835
Стадия B
2
2
2
Затем в колбу вносят 50 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-метиламида и 50 мг гидрохлорида гидроксиламина в 1 мл пиридина. Перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре, затем реакционную массу концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в смеси CHCl/HO; органический слой отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Получают 40,6 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиламида с выходом 78%.
Анализ
1
3
RMN-H (CDCl): соответствует
Время удерживания: 3,70 мин
+
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=433; [2M+H]=865
Пример 2: 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-диметиловый спирт
Стадия A
В колбе растворяют 10,5 г 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-овой кислоты в 378 мл метанола и 146 мл дихлорметана. Охлаждают до 0°С и по каплям добавляют 5,7 мл тионилхлорида. Затем перемешивают в течение 2 часов при комнатной температуре. Реакционную массу концентрируют при пониженном давлении, выпаривают сначала толуол, затем дихлорметан. Получают 10,3 г 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-метилового эфира с выходом 94%. Полученный продукт используют далее без очистки.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 4,69 мин
+
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=419; [2M+H]=785
Стадия B: 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метиловый эфир
В колбу вносят раствор 9,62 г 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-метилового эфира в 25 мл триметилортоформиата и 53 мл этиленгликоля. Затем добавляют 400 мг (2,3 ммоль) безводной п-толуолсульфоновой кислоты, далее перемешивают в течение 1 ночи при комнатной температуре. К реакционной массе добавляют этилацетат. Промывают 10% раствором гидрокарбоната натрия. Органический слой отделяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 9,95 г 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метилового эфира с выходом 93%. Полученный продукт используют далее без очистки.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 5,76 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=463
Стадия C
В колбе растворяют 300 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метилового эфира в 5 мл безводного ТГФ. Раствор охлаждают до -45°С, затем по каплям добавляют 1,36 мл 1,6 M раствора метиллития в диэтиловом эфире. Далее перемешивают в течение 30 минут при -45°С. К реакционной массе добавляют несколько капель метанола и доводят до комнатной температуры. Растворяют в 20 мл диэтилового эфира и промывают сначала насыщенным раствором бикарбоната натрия, затем насыщенным раствором хлорида натрия. Органический слой сушат над сульфатом магния, затем концентрируют при пониженном давлении. Получают 295 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-диметилового спирта (PM=462) с выходом 98%.
Время удерживания: 5,56 мин
2
2
2
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M-(CHOH-CHOH+HO)+H]=401
Стадия D
В колбу вносят 6 мл смеси вода/уксусная кислота в соотношении 1/1 и 295 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-диметилового спирта и нагревают с обратным холодильником в течение 1 ч 30 мин. После охлаждения реакционную массу разбавляют этилацетатом, промывают сначала насыщенным раствором хлорида натрия, затем насыщенным раствором бикарбоната натрия. Далее органический слой сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный сырой продукт очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат в соотношении 8/2). Получают 180 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-диметилового спирта с выходом 68%.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 5,08 мин
+
+
+
2
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=419; [M-HO+H]=401; [2M+H]=837
Пример 3: 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-диметиловый спирт
2
2
2
В колбу вносят 1 г соединения примера 2, 1 г гидрохлорида гидроксиламина в 53 мл пиридина и несколько мл дихлорметана для солюбилизации кетона. Перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре, затем реакционную массу концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в смеси CHCl/HO; органический слой отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Получают 814 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-диметилового спирта с выходом 78%.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 5,09 мин
+
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=434; [2M+H]=867
Пример 4: 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиловый спирт
Стадия A
В колбу помещают 2 г 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метилового эфира в 26 мл диоксана. Добавляют 8,6 мл 1N раствора гидроксида натрия. Реакционную массу нагревают с обратным холодильником в течение 1 ч 30 мин и диоксан выпаривают при пониженном давлении. Полученный раствор подкисляют добавлением 1N раствора соляной кислоты до pH=1 и экстрагируют 2 раза толуолом. Органические слои объединяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 1,92 г 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-овой кислоты с выходом 99%, которую используют без дополнительной обработки на следующей стадии.
Стадия B
2
2
2
2
2
В колбу помещают 1,9 г 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-овой кислоты в 30 мл дихлорметана. К этому раствору добавляют 1,06 г EDCI, 743 мг HOBT, 537 мг гидрохлорида N,O-диметилгидроксиламина, затем по каплям добавляют 1,37 мл триэтиламина. Перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. К реакционной массе добавляют смесь CHCl/HO и экстрагируют 3 раза дихлорметаном. Органические слои объединяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (CHCl/этилацетат в соотношении 8/2). Получают 1,46 г 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-(N,N-метоксиметил)амида с выходом 70%.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 5,31 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=492
Стадия C
В колбу в атмосфере аргона вносят 1,4 г 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-(N,N-метоксиметил)амида в 20 мл безводного тетрагидрофурана и охлаждают до 0°С. Затем по каплям добавляют 3,38 мл 1,6M раствора метиллития в диэтиловом эфире. Реакционную массу перемешивают в течение 3 ч 40 мин при 0°С, затем по каплям добавляют раствор 0,72 мл концентрированной соляной кислоты в 7,28 мл воды. Тетрагидрофуран выпаривают при пониженном давлении; полученный водный раствор подщелачивают добавлением 1N раствора гидроксида натрия до pH=10. Экстрагируют диэтиловым эфиром; органические слои объединяют, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат в соотношении 9/1). Получают 930 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метилкетона с выходом 73%.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 5,65 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=403
Стадия D
В колбу помещают 119 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метилкетона со стадии C в 1,5 мл метанола. Охлаждают до 0°С и добавляют 10 мг боргидрида натрия. Реакционную массу перемешивают при 0°С в течение 1 часа, затем концентрируют при пониженном давлении. Остаток растворяют в воде и экстрагируют дихлорметаном. Органический слой сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 94 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метилового спирта с выходом 78%, полученный продукт используют далее без дополнительной обработки.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 5,22 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=387
Стадия E
Для удаления защиты кетогруппы в положении 5 действуют аналогично стадии D примера 2.
Стадия F
В колбу вносят 121 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-метилового спирта, 1,5 мл пиридина и 121 мг гидрохлорида гидроксиламина. Раствор перемешивают в течение двух дней при комнатной температуре. Реакционную массу концентрируют при пониженном давлении, растворяют в воде и экстрагируют дихлорметаном. Затем органический слой промывают водой, сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный продукт очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат в соотношении 9/1). Получают 66 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-метилового спирта с выходом 53%.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 4,91 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=420
Пример 5: 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиламин
Стадия A
4
В колбу помещают суспензию 615 мг LiAlH в 57 мл ТГФ. Охлаждают до 0°С и по каплям добавляют раствор 3,0 г 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метилового эфира в 57 мл тетрагидрофурана. Затем перемешивают при 0°С в течение 5 ч. С соблюдением осторожности гидролизуют добавлением раствора сульфата натрия; полученный раствор белого цвета перемешивают в течение 30 минут, затем фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении, растворяют в воде и экстрагируют этилацетатом. Органический слой сушат над сульфатом магния, затем концентрируют при пониженном давлении. Получают 2,55 г 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-ола с выходом 85%, полученный продукт используют далее без дополнительной обработки.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 4,82 мин
2
2
2
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M-(CHOH-CHOH+HO)+H]=373
Стадия B
В колбе в атмосфере аргона растворяют 476 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-ола в 7 мл дихлорметана, затем добавляют 189 мг нейтрального гидроксида алюминия и 399 мг хлорхромата пиридиния; перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч 30 мин. Реакционную массу фильтруют через Celite, фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (толуол/этилацетат сначала в соотношении 9/1, затем в соотношении 8/2). Получают 328 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-аля с выходом 69%.
Время удерживания: 5,57 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=433
Стадия C
В колбе в атмосфере аргона растворяют 323 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5(этилендиокси)-3-аля в 3 мл этанола, затем добавляют 209 мкл триэтиламина, 100 мг гидрохлорида метиламина и 444 мкл тетраизопропоксида титана. Реакционную массу перемешивают в течение 6 часов при комнатной температуре, затем добавляют 42,5 мг боргидрида натрия. Далее перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре. Реакционную массу фильтруют и промывают дихлорметаном. Фильтрат сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (дихлорметан/метанол в соотношении от 9/1 до 5/5). Получают 84 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)оксим-3-метиламина с выходом 25%.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 3,93 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=448
Стадия D
В колбу вносят 50 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5,5-(этилендиокси)-3-метиламина и 976 мкл смеси вода/уксусная кислота в соотношении 1/1. Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 6 ч. После охлаждения реакционную массу разбавляют этилацетатом и промывают сначала насыщенным раствором хлорида натрия, затем 5% раствором бикарбоната натрия. Органический слой сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Полученный продукт очищают флэш-хроматографией (дихлорметан/метанол в соотношении 95/5); получают 5 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-метиламина с выходом 11%.
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 3,68 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=404
Стадия E
В колбу вносят 5 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-метиламина, 5 мг гидрохлорида гидроксиламина и 287 мкл пиридина. Смесь перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре. Затем растворяют в дихлорметане и промывают водой. Органический слой сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 5 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-метиламина с выходом 91%.
Время удерживания: 3,66 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=419
Пример 6: 3,5-секо-4-норхолестан-5-онметилоксим-3-ол
2
2
2
В колбу вносят 20 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-ола и 20 мг гидрохлорида O-метилгидроксиламина в 1 мл пиридина. Перемешивают в течение 36 ч при комнатной температуре и добавляют 10 мг гидрохлорида O-метилгидроксиламина. Далее перемешивают еще в течение 16 часов при комнатной температуре, затем реакционную массу концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в смеси CHCl/HO; органический слой отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении. Получают 18 мг подобного маслу продукта желтого цвета, который очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат в соотношении 9/1). Получают 5,8 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-онметилоксим-3-ола с выходом 27%.
Анализ
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 5,50 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=420
Пример 7: 3,5-секо-4-норхолестан-5-онкарбоксиметилоксим-3-ол
2
2
2
В колбу вносят 52 мг кетона, 25 мг полугидрохлорида карбоксиметоксиамина в 0,5 мл пиридина. Перемешивают в течение 2 дней при комнатной температуре, затем реакционную массу концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток растворяют в смеси CHCl/HO; органический слой отделяют, промывают сначала водой, затем 2% раствором соляной кислоты, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (петролейный эфир/этилацетат в соотношении 8/2). Получают 24 мг карбоксиметилоксима с выходом 39%.
Анализ
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 4,40 мин
+
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=464; [2M+H]=927
Пример 8
Готовят суспензию, соответствующую рецептуре:
3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол: 20 мг/мл;
эксципиент: масляная эмульсия.
Пример 9
Готовят сухую форму, соответствующую рецептуре:
гидрохлорид 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-N,N-диметилглицинового эфира
250 мг;
эксципиент: желатиновая капсула, дополненная до
750 мг
Пример 10: пролекарство 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола: 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-N,N-диметилглициновый эфир
В колбу помещают 509 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-ола, 182 мг гидрохлорида N,N-диметилглицина, 275 мг EDCI и 207 мг DMAP в 10-15 мл дихлорметана. Перемешивают при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляют к реакционной массе 5% раствор бикарбоната натрия и экстрагируют дихлорметаном. Органические слои объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (толуол/этилацетат в соотношении 8/2). Получают 488 мг продукта с выходом 78%.
Анализ
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 3,77 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=476
Затем с полученным продуктом проводят следующую реакцию:
2
2
2
В колбу вносят 488 мг полученного продукта и 488 мг гидрохлорида гидроксиламина в 23 мл пиридина. Перемешивают в течение 16 часов при комнатной температуре, затем реакционную массу растворяют в смеси CHCl/HO; затем органический слой отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Получают 378 мг оксима с выходом 75%. Полученный продукт затем переводят в солевую форму в присутствии раствора диэтилового эфира, подкисленного раствором HCl, для получения продукта в виде гидрохлорида.
Анализ
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 3,43 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=491
Пример 11: Пролекарство 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ола: 3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-(4-метил-1-пиперазин)пропаноат
В колбу помещают 264 мг 3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-ола, 121 мг 4-метил-1-пиперазинпропионовой кислоты в виде соли лития, 1425 мг EDCI и 106 мг DMAP в 2-3 мл дихлорметана. Перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ночи. К реакционной массе добавляют воду и экстрагируют дихлорметаном. Органические слои объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток очищают флэш-хроматографией (толуол/этилацетат в соотношении 98/2). Получают 54 мг требуемого продукта с выходом 15%.
Анализ
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 3,66 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=545
Затем с полученным продуктом проводят следующую реакцию:
2
2
2
В колбу вносят 30 мг полученного продукта и 30 мг гидрохлорида гидроксиламина в 1,2 мл пиридина. Перемешивают в течение 5 ч 30 мин при комнатной температуре, затем реакционную массу растворяют в смеси CHCl/HO; органический слой отделяют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Получают 19 мг оксима с выходом 13%.
Анализ
1
3
H-ЯМР (CDCl): соответствует
Время удерживания: 3,62 мин
+
Пики, обнаруженные в масс-спектре: [M+H]=560
Полученный продукт затем переводят в солевую форму в присутствии раствора диэтилового эфира, подкисленного водным раствором HCl, для получения продукта в виде дигидрохлорида.
№ соединения
1
Соединение примера 1
2
Соединение примера 4
3
Соединение примера 3
4
Соединение примера 4
5
Соединение примера 5
6
Соединение примера 6
7
Соединение примера 7
8
3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-овая кислота, описанная в издании Azasteroidal alkaloids. Synthesis of A-nor-B-homo-5-azacholestane. Rodewald, W. J.; Wicha, J. Univ. Warsaw, Bulletin de l'Académie Polonaise des Sciences, Série des Sciences Chimiques (1963), 11(8), 437-41.
9
3,5-секо-4-норхолестан-3,5-диол, описанный в документе USA 2883424
10
3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-ол, описанный в издании Azasteroidal alkaloids. Synthesis of A-nor-B-homo-5-azacholestane. Rodewald, W. J.; Wicha, J. Univ. Warsaw, Bulletin de l'Académie Polonaise des Sciences, Série des Sciences Chimiques (1963), 11(8), 437-41.
11
3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-ол, описанный в издании Azasteroidal alkaloids. Synthesis of A-nor-B-homo-5-azacholestane. Rodewald, W. J.; Wicha, J. Univ. Warsaw, Bulletin de l'Académie Polonaise des Sciences, Série des Sciences Chimiques (1963), 11(8), 437-41.
12
3,5-секо-4-норхолестан-5-оноксим-3-оноксим, описанный в публикации Unusual reactions of steroidal and non-steroidal 1,5-dioximes. Stereochemistry and mechanism of formation of N-hydroxypiperidine analogs. Pradhan, Suresh K.; Akamanchi, Krishnacharya G.; Divakaran, Pulukkunatt P.; Pradhan, Prakash M. Dep. Chem. Technol., Univ. Bombay, Bombay, India. Heterocycles (1989), 28(2), 813-39.
13
3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-метилкетон, описанный в публикации Oxidation of cyclic hemiacetals into diketones: final steps in the conversion of a triterpenoid ring A into a steroidal enone by a new short route. Uusvuori, Raimo; Hase, Tapio A. Dep. Chem., Helsinki Univ. Technol., Espoo, Finland. Synthetic Communications (1982), 12(14), 1081-8.
14
3,5-секо-4-норхолестан-5-он-3-овая кислота, описанная в издании Azasteroidal alkaloids. Synthesis of A-nor-B-homo-5-azacholestane. Rodewald, W. J.; Wicha, J. Univ. Warsaw, Bulletin de l'Académie Polonaise des Sciences, Série des Sciences Chimiques (1963), 11(8), 437-41.
1. Действие соединений формулы I на выживаемость моторных нейронов
in vitro
Для выявления нейропротективного действия соединений формулы I авторами изучена их активность на модели  трофического ограничения моторных нейронов крыс. Здесь может оказаться полезной ссылка на заявку авторов WO 0142784 по культивированию моторных нейронов спинного мозга.
et al
Спинной мозг эмбрионов крысы линии E14 иссекали и вентральную часть диссоциировали растиранием после трипсинизации. Моторные нейроны отделяли от других спинальных клеток известным способом (Camu et al., 1993, Purification of spinal motoneurons from chicken and rat embryons by immunopanning. In “Immunoselection Strategies for Neural cell culture”, Neuroprotocols: A companion to Methods in Neurosciences 2, 191-199; Henderson et al., 1993, Neutrophins promote motor neuron survival and are present in embryonic limb bud. Nature 363 (6426): 266-70). Клетки центрифугировали с градиентом плотности. Моторные нейроны обогащали во фракции крупных клеток (менее плотных). Клетки этой фракции инкубировали антителами anti-p75, поверхностным антигеном, присутствующим на моторных нейронах. Добавляли вторичные антитела, нанесенные на магнитные шарики, и смесь клеток пропускали через колонку с магнитом (Arce , 1999). Задерживались только моторные нейроны: их чистота составляла порядка 90%.
Моторные нейроны засеивали с низкой плотностью в культуральных сосудах на субстрат полиорнитин-ламинин в нейробазальной добавленной среде по Raoul et al, 1999, Programmed cell death of embryonic motoneurons triggered through the Fas death receptor. J Cell Biol 147(5): 1049-62. В каждую серию включали отрицательные контрольные опыты (отсутствие трофических факторов) и положительные контрольные опыты (в присутствии BDNF (нейротрофический фактор головного мозга) с концентрацией 1 нг/мл, GDNF (глиальный нейротрофический фактор) с концентрацией 1 нг/мл и CNTF (цилиарный нейротрофический фактор) с концентрацией 10 нг/мл, выпускаемые американской компанией PEPROTECH, Inc. и компанией Sigma-Aldrich).
2
Испытуемые соединения добавляли через 60 минут после посева и культуры выдерживали при 37°С в атмосфере с содержанием 5% CO в течение 3 дней.
В отсутствие нейротрофических факторов моторные нейроны имели спонтанную тенденцию к гибели (Pettmann et Henderson, 1998, Neuronal cell death. Neuron 20(4): 633-47). Через 3 дня выживаемость оценивали измерением флуоресценции после инкубации клеток в присутствии кальцеина, который проявляет флуоресцентность в живых клетках.
2
После 3 дней культивирования при 37°С в атмосфере с содержанием 5% CO с влажностью, соответствующей насыщению, выживает до 50% моторных нейронов, засеянных изначально в добавленной среде нейротрофических факторов, в то время как в базальной среде выживает только менее 15% моторных нейронов.
Активность испытуемых соединений оценивали по их способности затруднять гибель моторных нейронов, вносимых в нейробазальную среду, по сравнению с выживаемостью моторных нейронов в добавленной среде, содержащей нейротрофические факторы.
Соединения формулы I по настоящему изобретению показали активность с концентрацией, допускающей степень выживаемости моторных нейронов лучшую, чем в базальной среде. Степень выживаемости выражали численным показателем. Если значение показателя превосходило 0, то действие соединений на выживаемость моторных нейронов оценивали положительно.
Были получены следующие результаты:
№ соединения
Концентрация,мкМ
Показатель
1
3
0,4
2
3
0,5
3
3
0,7
4
3
0,5
5
3
0,3
6
3
0,4
7
3
0,4
8
3
0,4
9
1
0,4
10
3
0,6
11
3
0,8
12
3
0,7
13
3
0,7
14
10
0,4
Таким образом, по своему трофическому действию на спинальные моторные нейроны соединения формулы I по настоящему изобретению проявляют себя полезными в качестве лекарственного средства, в частности, при лечении мышечной атрофии, в особенности при лечении бокового амиотрофического склероза или семейной спинальной амиотрофии детского возраста, и при лечении травм спинного мозга.
2. Нейропротективное действие соединений формулы I
Аксотомию лицевого нерва осуществляли на новорожденных крысах в возрасте 2-3 дней. Животным подкожно вводили соединения №№11, 3 и 4 за 4 часа до одностороннего рассечения нерва, затем вводили ежедневно в течение 5 дней. Через семь дней после рассечения нерва животных анестезировали, затем фиксировали внутрисердечной перфузией параформальдегида. Далее головной мозг извлекали и парафинировали. Гистологическое исследование серии сечений через 7 мкм ядра лицевого нерва, окрашенных крезиловым фиолетовым, позволяет подсчитать число моторных нейронов как в незатронутой части, так и в части со стороны отсеченного нерва (Casanovas et al., Prevention by lamotrigine, MK-801 and N omega-nitro-L-arginine methyl ester of motoneuron cell death after neonatal axotomy, Neuroscience, 1996, 71, 313-325).
Были получены следующие результаты:
Выживаемость моторных нейронов ядра лицевого нерва у новорожденных крыс, которых подвергли аксотомии и которым перорально вводили соединения №№11, 3 и 4, дает по сравнению с нерассеченным нервом увеличение до 40% при дозе в интервале от 3 до 30 мг/кг, увеличение до 25% при дозе 10 мг/кг, увеличение до 30% при дозе 30 мг/кг соответственно.
Токсикологическое исследование
11, 3 и 4
В частности, интраперитонеальное введение мышам соединений  в дозе 30 мг/кг/день при ежедневном введении на протяжении до 14 дней не показало значительной токсичности.