Способ выделения полифенолов из корневищ имбиря
METHOD OF EXTRACTING POLYPHENOLS FROM GINGER ROOTSTOCKS

Изобретение относится к фармацевтической и пищевой промышленности и касается выделения биологически активных веществ из растительного сырья, а также имеет отношение к биологической химии и молекулярной биологии.
Известен способ выделения экстрактивных веществ из проб чая и кофе с помощью кипячения водного раствора (Татарченко И.А. Разработка новых видов чайной и кофейной продукции и совершенствование оценки их качества: дис. ... канд. тех. наук. – Краснодар, 2015. – 181 с.).
Способ имеет следующие недостатки:
- получается многокомпонентная смесь, в которой кроме полифенольных соединений присутствуют другие вещества;
- в экстракте после кипячения водных растворов присутствуют в основном полярные соединения.
Известны запатентованные способы выделения полифенолов из различных растительных препаратов с помощью различных органических растворителей с последующим концентрированием экстрактов (Рубчевская Л.П. с соавт. Способ получения полифенолов: Пат. 2174011 от 12.07.1999, опубл. 27.09.2001; Брэдбери А., Копп Г. Обогащённая полифенолами композиция, экстрагированная из шелухи какао-бобов: Пат. 2392954 от 30.05.2006, опубл. 27.06.2010; Яшунский Д.В. с соавт. Способ выделения полифенольных соединений класса стильбенов пиносильвина и метилпиносильвина из отходов переработки сосны: Пат. 2536241 от 05.07.2011, опубл. 20.12.2014). Однако известные способы имеют следующие недостатки:
- применяемые растворители в столь значительных концентрациях не позволяют использовать получаемые экстракты в терапевтических целях;
- удаление растворителей влечёт за собой также и заметные потери экстрагируемых веществ;
- степень удаления побочных компонентов в экстрактах невысокая.
Известны также способы экстракции полифенольных соединений из корневищ имбиря с помощью растворителей метанола, ацетона и этанола в различных модификациях: с использованием методов оттока, вымачивания, применением ультразвука (Sharif M.F., Bennett M.T. The effect of different methods and solvents on the extraction of polyphenols in ginger (Zingiber officinale) // Jurnal Teknologi (Sciences and Engineering). – 2016. – Vol. 78, № 11-2. – P.49–54; Sasikala P., Chandralekha A., Chaurasiya R.S. et al. Ultrasound-assisted extraction and adsorption of polyphenols from ginger rhizome (Zingiber officinale) // Separation Science and Technology. – 2018. – Vol. 53, № 3. – P.439–448. https://doi.org/10.1080/01496395.2017.1391290).
Известные способы имеют недостатки:
- применяемые растворители токсичны в случае использования получаемых экстрактов в медицинских целях, а также в целях дальнейшего их использования в экспериментальной работе с привлечением животных;
- предлагаемые методики довольно сложны в исполнении;
- концентрирование получаемых экстрактов достигается путём упаривания растворов, либо путём перевода экстракта в другой растворитель.
J Food Sci Technol
Известен способ-прототип оптимального выделения полифенольных соединений из корневищ имбиря, заключающийся в применении в качестве экстрагента этанола при умеренных температуре и времени экстракции (Mukherjee S., Mandal N., Dey A., Mondal B. An approach towards optimization of the extraction of polyphenolic antioxidants from ginger (Zingiber officinale). . 2014; 51(11):3301–3308. https://doi.org/10/1007/s13197-012-0848-z). Прототип имеет следующие недостатки:
- применяемый этанол берётся в высокой концентрации, что делает конечный экстракт токсичным для дальнейшего его использования в медицинских целях;
- время воздействия и температурный режим не позволяют в полной мере осуществить экстракцию компонентов;
- не приводится методика концентрирования получаемого экстракта;
- не указывается методика удаления экстрагента (этанола), а также способ концентрирования полифенолов на каком-либо твёрдом адсорбенте.
Предлагаемое изобретение направлено на выделение полифенольных соединений из корневищ имбиря Zingiber officinale с последующим концентрированием этих соединений на микрокристаллической целлюлозе в качестве адсорбента. Предлагаемый способ позволяет также очистить выделенные полифенольные соединения от низкомолекулярных примесей, в том числе этанола.
Указанный технический результат достигается тем, что к измельчённым корневищам имбиря добавляют 40 %-ный водный раствор этанола в пропорции 1 : 7 по массе, тщательно перемешивают, кипятят на водяной бане в течение 15 минут, затем 10 дней настаивают при комнатной температуре, центрифугируют при 10000 оборотов в течение 30 минут и получают в супернатанте экстракт полифенолов; затем центрифугат пропускают через порошок микрокристаллической целлюлозы такой же массы, как измельчённых корневищ имбиря, и обогащённую полифенолами пасту сушат на воздухе трое суток; полученный концентрат содержит 2,50 ± 0,098 мг полифенольных соединений на 1 г высушенной массы.
Особенности структуры полифенольных компонентов имбиря позволяют отнести их к потенциальным антиоксидантным соединениям. Основными компонентами в составе корневища имбиря являются эфирное масло и фенольные соединения – гингеролы и шогаолы. Другими компонентами являются зингероны и парадолы:
Как видно из приведенных выше структур все эти соединения являются веществами оксифенильной природы (фенольная основа) с оптимальной длиной фитильной цепи. Наличие оксифенильного фрагмента обусловливает антирадикальные свойства полифенольных соединений (ПФС). Оптимальная длина фитильной цепи полифенольных соединений имбиря позволяет им не только фиксироваться в липидном бислое биологических мембран, но и свободно циркулировать в жидких средах организма и обеспечивать, таким образом, генерализованное антирадикальное и антиоксидантное действие. Гингеролы представляют собой наиболее распространенные соединения в свежих корнях. Шогаолы, дегидратированные производные гингеролов, встречаются только в небольших количествах в свежем корне; в основном встречаются в высушенных и термически обработанных корнях. Разделение близких по химической структуре соединений, в том числе ПФС, на отдельные фракции – весьма трудоёмкая задача, поскольку химически они очень близки, поэтому предпочтительнее их выделять общей массой (Николаев А.А., Ветошкин Р.В., Логинов П.В. Изменения протеогликанов семенников крыс в условиях экспериментальной хронической интоксикации серосодержащим газом // Астраханский медицинский журнал. – 2012. – Т. 7, № 2. С.75–79).
Food Science and Technology
Другой важной задачей является концентрирование и очистка от примесей выделяемых полифенольных соединений. Было показано, что полифенолы хорошо адсорбируются поверхностью и объёмом полисахаридных волокон целлюлозы и ксилана за счёт межмолекулярных взаимодействий (Costa T.S., Rogez H., Pena R.S. Adsorption capacity of phenolic compounds onto cellulose and xylan. . 2015; 35(2):314–320). В этой связи в качестве адсорбента была выбрана микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ), которая будет эффективно поглощать полифенольные соединения за счёт гидрофобных взаимодействий и пропускать сквозь себя низкомолекулярные примеси, включая этанол.
Создание способа выделения полифенольных соединений из корневищ имбиря осуществлялось путём измельчения и размалывания подсушенных корневищ Zingiber officinale с последующей экстракцией 40%-ным раствором этанола на базе кафедры химии ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России. Для измельчения и размалывания подсушенных корневищ имбиря брали 10-15 г образца. Полученную порошкообразную массу заливали 40%-ным водным раствором этанола, тщательно перемешивали и помещали полученную смесь в водяную баню на 15 минут. Далее настаивали 10 дней при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 10000 оборотов на центрифуге CN-10001 (Япония) в течение 30 минут. Центрифугат аккуратно пропускали через подготовленный заранее порошок микрокристаллической целлюлозы (МКЦ) такой же массы, что и массы измельчённых корневищ имбиря. Порошок готовили путём растирания в ступке твёрдых брикетов МКЦ, после чего этот порошок помещали на бумажный фильтр, установленный в стеклянной воронке. Затем пропитанную полифенольным экстрактом массу извлекали вместе с фильтром из воронки, сам фильтр с полученной массой расправляли на горизонтальной поверхности и сушили на воздухе трое суток.
Для определения содержания полифенольных соединений в высушенной массе проводили измерение полифенолов в центрифугате до пропускания последнего через порошок МКЦ, а затем измеряли содержание полифенольных соединений в фильтрате. По разнице между содержанием полифенолов в центрифугате и фильтрате судили о величине адсорбции и, соответственно, содержании полифенолов в полученной массе на основе МКЦ.
J Food Sci Technol
2
3
Для определения содержания полифенольных соединений использовали реактив Фолина-Чокальтеу, представляющего собой смесь фосфомолибдата и фосфовольфрамата натрия и полученного по известной методике (Студопедия: [сайт]. URL: https://studopedia.ru/12_86442_laboratornaya-rabota--.html). Методика количественного определения полифенольных соединений (ПФС) основана на взаимодействии этих соединений с реактивом Фолина-Чокальтеу, дающих цветную реакцию (Mukherjee S., Mandal N., Dey A., Mondal B. An approach towards optimization of the extraction of polyphenolic antioxidants from ginger (Zingiber officinale). . 2014; 51(11):3301–3308. https://doi.org/10/1007/s13197-012-0848-z). В качестве стандартного раствора берут галловую кислоту, которая также даёт цветную реакцию с реактивом Фолина-Чокальтеу. 1 мл раствора экстракта полифенольных соединений или раствора галловой кислоты (0-2 г/л) смешивают с 10 мл дистиллированной воды и добавляют 1 мл реагента Фолина-Чокальтеу. Через 5 мин добавляют 2 мл 20 %-ного раствора NaCO, далее инкубируют в темноте в течение 1 ч и измеряют оптическую плотность на спектрофотоколориметре при длине волны 750 нм в кювете с толщиной фотометрируемого слоя 1 см. Полученные величины оптической плотности соотносят с таковыми в калибровочном графике, полученном при использовании галловой кислоты в качестве стандартного раствора. Далее производят расчёт ПФС в данном объеме экстракта. Указанные манипуляции проделывают также с пропущенным через порошок МКЦ экстрактом. Затем рассчитывают величину поглощения (адсорбции) ПФС на МКЦ. Содержание ПФС в полученной массе на основе МКЦ выражают в мг/г порошка МКЦ путём деления величины поглощения ПФС (мг) на массу порошка (г).
В предлагаемом способе достигнуты следующие результаты. На основе измерений оптических плотностей стандартных растворов галловой кислоты был построен калибровочный график (Фиг. 1). Были взяты следующие концентрации кислоты: 0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,25; 1,50; 1,75 и 2,00 г/л. Далее измеряли оптические плотности 9 полифенольных экстрактов из корневищ имбиря: сначала измеряли оптические плотности экстрактов до пропускания через порошок МКЦ (первичный центрифугат), а затем измеряли оптические плотности экстрактов после пропускания через порошок МКЦ (таблица 1). Полученные величины оптических плотностей соотносили с таковыми в калибровочном графике и определяли концентрацию ПФС (мг/л) в центрифугате и фильтрате (таблица 2). Затем полученные величины концентраций использовали для вычисления содержания ПФС в экстрактах (в мг) путём умножения величин концентраций на объём раствора. По разнице между содержанием полифенолов в центрифугате и фильтрате вычисляли величину поглощения ПФС частицами порошка МКЦ. Полученное значение переводили в относительные единицы, деля величину поглощения ПФС на массу порошка МКЦ, нанесённого на бумажный фильтр. Ниже приводятся примеры расчётов (для первых трёх опытов) содержания ПФС, концентрированных на МКЦ в качестве твёрдого носителя.
Пример 1. Для опыта брали 10 г измельчённых корневищ имбиря. Для этого брали 75 мл 40-%-ного раствора этанола (плотность 0,935 г/мл), что соответствует 70 г раствора. Таким образом, достигается соотношение измельчённых корневищ имбиря  к раствору этанола 1 : 7 по массе. Измеренные оптические плотности для центрифугата и фильтрата соответственно 1,034 и 0,789. По калибровочному графику находим, что эти значения оптических плотностей соответствуют концентрациям ПФС эквивалентным содержанию галловой кислоты 1,60 и 1,20 г/л. Было получено 50 мл центрифугата и 48 мл фильтрата. Таким образом, из 75 мл добавленного 40%-ного водного раствора этанола 25 мл составили потери в ходе экстракции. Вычисляем содержание ПФС в центрифугате и фильтрате:
Центрифугат: 1,60 г/л × 0,05 л = 0,080 г = 80 мг
Фильтрат: 1,20 г/л × 0,048 л = 0,0576 г = 57,6 мг ≈ 58 мг.
Величина поглощения: 80 – 58 = 22 мг. Тогда относительное содержание в МКЦ (на 10 г порошка) составляет: 22 ÷ 10 = 2,2 мг/г.
Пример 2. Также взяли 10 измельчённых корневищ имбиря. Измеренные оптические плотности для центрифугата и фильтрата соответственно 1,105 и 0,790. По калибровочному графику находим, что этим оптическим плотностям соответствуют концентрации ПФС 1,72 и 1,20 г/л. Было получено также 50 мл центрифугата и 48 мл фильтрата. Вычисляем содержание ПФС в центрифугате и фильтрате:
Центрифугат: 1,72 г/л × 0,05 л = 0,086 г = 86 мг
Фильтрат: 1,20 г/л × 0,048 л = 0,0576 г = 57,6 мг ≈ 58 мг.
Величина поглощения: 86 – 58 = 28 мг. Тогда относительное содержание в МКЦ (на 10 г порошка) составляет: 28 ÷ 10 = 2,8 мг/г.
Пример 3. Взяли 12 г корневищ имбиря. Добавили 84 г 40%-ного раствора этанола, что соответствует объёму V = m/ρ = 84 : 0,935 = 90 мл. Было получено 62 мл центрифугата и 60 мл фильтрата. Измеренные оптические плотности для центрифугата и фильтрата соответственно 0,980 и 0,721. По калибровочному графику находим, что этим оптическим плотностям соответствуют концентрации ПФС 1,50 и 1,12 г/л. Вычисляем содержание ПФС в центрифугате и фильтрате:
Центрифугат: 1,50 г/л × 0,062 л = 0,093 г = 93 мг
Фильтрат: 1,12 г/л × 0,060 л = 0,0672 г = 67,2 ≈ 67 мг.
Величина поглощения: 93 – 67 = 26 мг. Тогда относительное содержание в МКЦ (на 12 г порошка) составляет: 26 ÷ 12 = 2,2 мг/г.
Пример 4. Взяли 10 г корневищ имбиря. Добавили 75 мл 40-%-ного раствора этанола. Получено 54 мл центрифугата и 52 мл фильтрата. Оптические плотности для центрифугата и фильтрата соответственно 1,092 и 0,801. По калибровочному графику находим, что этим оптическим плотностям соответствуют концентрации ПФС 1,65 и 1,25 г/л. Вычисляем содержание ПФС в центрифугате и фильтрате:
Центрифугат: 1,65 г/л × 0,054 л = 0,089 г = 89 мг
Фильтрат: 1,25 г/л × 0,052 л = 0,065 г = 65 мг.
Величина поглощения: 89 – 65 = 24 мг. Тогда относительное содержание в МКЦ (на 10 г порошка) составляет: 24 ÷ 10 = 2,4 мг/г.
Аналогично производят расчёты для опытов 4-9. Далее производили статистическую обработку полученных данных. Расчёты показали, что в среднем содержание ПФС в полученной массе на основе МКЦ составляет 2,50 ± 0,098 мг/г. В обобщенном виде полученные данные представлены в таблице 2.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
2
Полученные результаты прошли апробацию. Идентификацию полифенольных соединений осуществляли с помощью ИК-спектроскопиии (Фиг. 2). ИК-спектры выделенных полифенолов содержат полосы, обусловленные колебаниями связей, характерных для основных структурных элементов фенольных соединений: ароматических колец, карбонильных, спиртовых и фенольных гидроксильных групп. Присутствие фенольного гидроксила подтверждается полосами поглощения (п.п.) при 1230 и 1410 см. Наличие метоксигруппы при ароматическом кольце подтверждается п.п. при 2850 см. Присутствие ароматического кольца доказывается п.п. при 1600 см. Кетогруппа в окружении алифатических радикалов дает п.п. при ≈ 1700 см. Наличие боковой фитильной цепи подтверждается п.п. при 1440-1480 см, а присутствие группировки –CHCO– подтверждается п.п. при 1400-1440 см. Таким образом, в соответствии с Фиг. 2, доказываются следующие элементы ПФС: наличие ароматического кольца, соединённого с гидроксильной группой (фенольная часть), присутствие второго фенольного гидроксила, у которого водородный атом замещён на метильную группу (метоксигруппа), а также фитильной цепи, в которой имеется кетогруппа. Все эти элементы присутствуют в гингеролах и шогаолах, а также зингеролах и парадолах.
Содержащиеся в 1 г порошка ПФС (2,5 мг) составляют вычисляемую в соответствии с особенностями обмена веществ суточную дозу для крыс (Захаров А.А. Морфогенез внутренних органов мужской половой системы экспериментальных животных при иммуносупрессии и иммуностимуляции в постнатальном онтогенезе: дис. ... д-ра мед. наук. – Луганск, 2019. – 356 с.). Таким образом, полученный порошок, содержащий ПФС, можно в дальнейшем использовать в качестве дозированной биодобавки в экспериментальных исследованиях.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет эффективно экстрагировать полифенольные соединения из корневищ имбиря с последующим концентрированием этих соединений на микрокристаллической целлюлозе. Способ также позволяет очистить выделяемые полифенольные соединения от низкомолекулярных примесей, что даёт возможность их дальнейшего использования в экспериментальной работе и клинических исследованиях.