Комплексное экспериментальное моделирование шоковых состояний

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012

© А. А. МАРКИНА, 2012 УДК 616.94-092.9

А. А. Маркина

КОМПЛЕКСНОЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ШОКОВЫХ СОСТОЯНИЙ

ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии

Использование экспериментальных моделей, отображающих различные патогенетические механизмы клинического течения эндотоксического/септического шока, являются наиболее перспективной стратегией по изучению и разработке методов борьбы с сепсисом.

Для изучения токсического действия ФНОа in vivo целесообразно использовать наиболее чувствительную модель эндотоксического шока с использованием сенсибилизатора эндотоксичности - D-галактозамина, который применяют при моделировании экстремального состояния гиперчувствительности к бактериальному эндотоксину. На прямой модели эндотоксического шока воспалительный процесс воспроизводится посредством введения летальной дозы эндотоксина и оценивается уровень ФНОа как основного агента, ответственного за развитие патогенетических событий во время эндотоксического шока.

Модель экспериментального перитонита наиболее точно отображает клиническое септическое состояние как по патофизиологическим характеристикам, так и по этиологии организмов-возбудителей за счет инфицирования собственной эндогенной микрофлорой.

Ключевые слова: модель эндотоксического шока, модель экспериментального перитонита

A.A. Markina

COMPLEX EXPERIMENTAL MODELING OF SHOCK CONDITIONS

Using experimental models representing the different pathogenetic mechanisms of the clinical course of the endotoxic/ septic shock, is the most promising strategy for the study and development of methods of struggle with sepsis.

For the study of the toxic effect of TNF-а in vivo it is expedient to use the most sensitive model endotoxic shock using sensitizer endotoxicity - D-of galactosamine, which is used in the modelling of the extreme state of hypersensitivity to bacterial endotoxine. The direct model endotoxic shock of the inflammatory process is played by the introduction of lethal dose of endotoxin and assessment of the levels of TNF-а, as the main agent responsible for the development of pathogenic events during the endotoxic shock.

The model of experimental peritonitis, the most accurately displays clinical septic, as pathophysiological characteristics, and also on the etiology organisms, pathogens due to the infection of his own endogenous microflora.

Key words: model endotoxic shock, the model of experimental peritonitis

Несмотря на применение антибиотиков последнего поколения, отличающихся широким спектром действия, и усовершенствование методов поддерживающей терапии, сепсис остается серьезной и актуальной проблемой современного здравоохранения. В мире ежегодно регистрируют более 1,5 млн случаев сепсиса [1], более того, наблюдается тенденция повышения септических осложнений примерно на 1,5% в год [2].

Сепсис является главной причиной смерти больных в отделениях реанимации и интенсивной терапии некардиологического профиля. Термины «сепсис», «тяжелый сепсис» и «септический шок» используют для определения продолжительного клинического инфекционного процесса. Сепсис определяется у пациентов с инфекцией и 2 признаками синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) или более: температура > 38°С или < 36°C; пульс более 90 ударов в 1 мин; количество дыхательных движений более 20 в 1 мин; PaCO2

< 32 мм рт.ст.; количество лейкоцитов > 12 000 клеток/мл или

< 4000 клеток/мл; количество незрелых лейкоцитов > 10%. Если дополнительно имеют место поражение или дисфункция органов, то констатируют тяжелый сепсис, а септический шок определяют как тяжелый сепсис, сопровождающийся устойчивой гипотензией [3]. Данные состояния существенно различаются по такому критерию, как смертность, которая достигает 16% при сепсисе, 30-50% при тяжелом сепсисе и 70% при септическом шоке [4, 5].

Маркина Анна Александровна - мл. науч. сотр., тел. 8(499) 618-67-83, e-mail: markinanna@mail.ru

Развитие септического шока чаще всего связано с раневыми инфекциями и послеоперационными осложнениями, причем наиболее высокая частота послеоперационного сепсиса зафиксирована при хирургических вмешательствах на органах брюшной полости [6]. Кроме того, при травматических повреждениях именно собственная микрофлора, преодолевая защитные барьеры организма (проникающее ранение, перфорация стенок кишечника или транслокация микроорганизмов через стенки кишечника), обусловливает развитие инфекционного процесса (сепсис) [7]. Грамотрицательные микроорганизмы являются наиболее часто манифестируемым инфекционным агентом у больных сепсисом [5, 8, 9].

Сепсис имеет природу неспецифического инфекционного процесса. Системный воспалительный ответ отличается универсальностью: его развитие происходит по одному сценарию, и вне зависимости от природы инициирующего бактериального агента пораженные ткани и органы имеют схожие морфологические изменения. В экспериментах in vitro показано, что за патофизиологическое действие грамотрица-тельных бактерий отвечает эндотоксин или липополисахарид (ЛПС) - основной компонент клеточной стенки [4].

Главная роль в ответе организма на инфекционные агенты и их токсины, которые мигрируют из естественных резервуаров организма и/или инфекционного очага, принадлежит системе врожденного иммунитета, направленного на распознавание высококонсервативных антигенных структур - патогенас-социированных молекулярных паттернов (ПАМП), общих для многих групп микроорганизмов. Распознавание ПАМП происходит с участием паттернраспознающих рецепторов, к которым, в частности, относятся представители семейства

- 250 -

ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ

Toll-подобных рецепторов (TLR). TLR, специфичным к ЛПС у млекопитающих, является TLR4 [10]. После присоединения ЛПС к TLR4 происходят димеризация цепей рецептора и привлечение адаптерных белков TIRAP-MyD88 и TRAM-TRIF, которые запускают сигнальный каскад, приводящий к активации транскрипционных факторов ядерного фактора aeB (NFaeB) и интерферонрегулирующего фактора (IRF-3) [11].

За экспрессию большинства провоспалительных цитокинов отвечает транскрипционный фактор NF^B [12]. NF^B, связываясь с соответствующими участками ДНК, активирует гены-мишени, что приводит к выработке ранних (первичных) провоспалительных цитокинов - фактора некроза опухоли а (ФНОа) и интерлейкина (ИЛ)-1р [13-15]. Чрезмерная продукция этих цитокинов весьма опасна за счет преодоления нормальной регуляции иммунной системы и запуска патологических процессов, характерных для сепсиса: диффузные капиллярные повреждения, активация процессов коагуляции и снижение фибринолиза, что может привести к развитию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром), гипоксии тканей и, как следствие, повреждению тканей и органной дисфункции [16]. Спровоцированная цитокинами полиорганная недостаточность (ПОН) является основной характеристикой септического шока [17].

При эндотоксическом шоке, связанном с попаданием чистого эндотоксина грамотрицательных бактерий без заражения, развитие ответа врожденной иммунной системы соответствует классическому пути клеточной активации. Однако при септическом шоке имеется ряд особенностей, отличающих развитие последнего от классических путей активации врожденного иммунного ответа.

Мыши C3H/HeJ и C57Bl/10ScCr, несущие миссенс-мутацию по TIR-домену TLR4 и null-мутацию TLR4 соответственно, устойчивы к эндотоксиновой нагрузке, но высоковосприимчивы к грамотрицательной инфекции [18]. Мыши, у которых отсутствуют MyD88 и TRIF, также не восприимчивы к ЛПС, и у них не развивается септический шок, что свидетельствует о важнейшей роли данных адаптерных белков в развитии ЛПС-обусловленного воспалительного ответа.

В лабораторных условиях можно смоделировать послеоперационный сепсис, индуцируя посредством хирургического вмешательства постоянный приток кишечных бактерий в перитонеальную полость (стентирование брыжейки восходящей ободочной кишки - CASP, или метод перевязки и прокола слепой кишки - CLP). На обеих моделях экспериментального перитонита показано развитие воспалительного процесса, обусловленного обсеменением перитонеальной полости различными видами кишечных бактерий [19].

На CASP-модели продемонстрировано, что выживаемость мышей, у которых отсутствовали оба или по-отдельности TLR4 (распознает ЛПС грамотрицательных бактерий) и TLR2 (распознает липотейхоевые кислоты грам-положительных бактерий), была сравнима с таковой у мышей дикого типа [20]. Эти данные указывают на то, что даже отсутствие TLR4 и TLR2 не оказывает значительного влияния на патогенез полимикробного инфекционного процесса. На CLP-модели также не выявлена разница между выживаемостью мышей дикого типа и мышей, невосприимчивых к ЛПС, линии BALB/c и несущих мутантный ген TLR4 мышей линии C3H/HeJ [21]. Эти результаты сравнимы с данными, полученными при исследовании выживаемости септических больных, имеющих мутантные TLR4: корреляция между потерей активности TLR4 и снижением уровня смертности от полимикробного сепсиса не обнаружена [22].

Сепсис характеризуется чрезвычайно сильным воспалительным процессом и угнетением системы адаптивного иммунитета. Во время полимикробного сепсиса из-за присутствия большого количества патогенов, активирующих клетки врожденной иммунной системы через разные TLR, которые могут действовать как синергисты, порог чувстви-

тельности врожденной иммунной системы к бактериальной нагрузке снижается и происходят усиление воспалительного процесса и повреждение тканей и органов [23]. Таким образом, при сепсисе другие рецепторы могут компенсировать потерю функциональной активности TLR4, обусловливая развитие сепсиса [22]. Показано, что неметилированная бактериальная CpG-ДНК через TLR9 также может индуцировать септический шок [24]: по MyD88-зависимому сигнальному пути происходит активация NFsB, что приводит к выработке провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ФНОа и фактор ингибирования миграции макрофагов, который стимулирует экспрессию ФНОа и TLR4) [25].

Активированные макрофаги секретируют большое количество ФНО. Тяжесть шока коррелирует с плазматическим уровнем ФНО. ФНОа передает трансмембранный сигнал через ФНО-рецепторы. ФНО-Р1 присутствует на поверхности большинства клеток, тогда как ФНО-Р2 - в основном на мембранах иммунных клеток. Через ФНО-рецепторы происходит активация NF^B, что приводит к продукции ФНОа, ИЛ-ф, ИЛ-6, ИЛ-8 и ИЛ-10, NO-синтетазы, молекул клеточной адгезии, способствующих усилению воспаления [4].

Таким образом, даже при функциональной дезактивации TLR4, что наблюдается при сепсисе, когда данные рецепторы фактически «ослепляются» гигантским количеством бактериальных эндотоксинов, сепсис будет развиваться из-за активации TLR9 и выработанным ранее медиаторам воспаления, прежде всего ФНОа, которые через свои собственные рецепторы могут также активировать транскрипционный фактор NF^B, ответственный за транскрипцию генов основных медиаторов воспаления (петля усиления).

С учетом неудач в использовании агентов, направленных на нейтрализацию лавинообразной секреции провоспалительных цитокинов (ФНОа/ИЛ-ф-специфичные антитела, растворимые рецепторы к ФНОа, антагонист рецептора ИЛ-1) [2] и особенности раннего индуцибельного иммунного ответа при септическом шоке, коррекция уже сформировавшегося септического процесса представляется трудноразрешимой задачей, что подчеркивает важность подхода, направленного на профилактику эндотоксического/септического шока. Основная сложность заключается в том, что сепсис - это не сепаративное заболевание, а целый комплекс разнородных, затрагивающих разные системы и органы нарушений функционирования организма. В свете всего вышесказанного использование экспериментальных моделей, воспроизводящих различные варианты клинического течения эндотоксического/септического шока, является наиболее перспективной стратегией по изучению и разработке методов борьбы с сепсисом.

-D-галактозаминовая модель эндотоксического шока

Виды млекопитающих различаются по степени восприимчивости к токсическому действию эндотоксинов на организм, причем различия существенны даже в пределах одного вида. Естественную чувствительность к ЛПС можно повысить, используя D-галактозамин (D-GalN), его одной дозы, введенной мышам внутрибрюшинно (в/б), достаточно для повышения чувствительности к эндотоксину до 100 000 раз [26]. Таким образом, D-галактозаминовая модель эндотоксического шока, с одной стороны, помогает «уравнять» ответ организма на ЛПС в пределах одного вида, линии, а с другой

- значительно снизить дозу бактериального эндотоксина, вызывающего эндотоксический шок, с 100 до 0,001 мкг [27].

При введении D-GalN сенсибилизированным животным эндотоксин не повышает выработку макрофагами ФНОа, а лишь усиливает чувствительность к нему организма. Печень

- специфичный орган-мишень для ФНОа, продуцируемого макрофагами в ответ на введение ЛПС/D-GalN: ФНОа стимулирует апоптоз гепатоцитов [28], что приводит к острой печеночной недостаточности и гибели организма [29]. Таким образом, D-GalN-модель эндотоксического шока помогает

- 251 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012

оценить протективные свойства разрабатываемых противошоковых препаратов от патогенетического действия ФНОа.

Мы показали, что введение сверхмалых доз (10 или 100 нг/мышь или 500 или 5000 нг/кг) эндотоксина E. coli O:55, полученного по методу O. Westphal ^ЛПС) [30], мышам линии (CBA х C57Bl/6)F1 в/б не влияет на их выживаемость. Для определения дозы D-GalN последний вводили мышам в/б в дозе 4 мг/мышь (200 мг/кг) совместно с wЛПС E. coli O:55 в дозах 1 или 10 нг/мышь (50 или 500 нг/кг). Все мыши выжили. При увеличении дозы D-GalN до 15 мг/мышь (750 мг/ кг) при совместном в/б введении с wЛПС E. coli O:55 в дозах 10 или 100 нг/мышь (500 или 5000 нг/кг) все мыши погибли. Таким образом, введение wЛПС E. coli O:55 в сверхмалых дозах совместно с 15 мг/мышь D-GalN вызывает гибель мышей от интоксикации при высвобождении ФНОа.

Предварительное введение эндотоксина на некоторое время до повторного введения ЛПС совместно с D-GalN обеспечивает защиту уже через 1 ч после первичного введения эндотоксина, которая длится в течение 48 ч. В экспериментах показано, что чувствительность (восприимчивость) мышей к ЛПС была максимальной при одновременном введении ЛПС и D-GalN экспериментальным животным [26]. Учитывая эти результаты, полагаем, что для оценки защитных свойств разрабатываемые противошоковые препараты целесообразно вводить за 12 ч до совместного единовременного введения ЛПС с D-GalN.

Поскольку ЛПС при совместном введении с D-GalN не вызывает гиперреактивности макрофагов, ССВО не развивается, а животное погибает от разрушения клеток печени под действием ФНОа, для изучения патогенетического действия эндотоксина на организм необходимо проводить эксперименты по прямому моделированию эндотоксического шока введением очищенного бактериального ЛПС экспериментальным животным без использования сенсибилизаторов D-GalN. ЛПС - основной патогенный агент клеточных стенок грамотрицательных бактерий, являясь эндотоксином, может быть причиной гибели организма в результате активации макрофагов, сопровождающейся сверхпродукцией медиаторов воспаления, которые обусловливают трансформацию ССВО в сепсис и септический шок.

Прямая модель эндотоксического шока

Эндотоксический шок является чрезвычайно опасным патологическим состоянием организма, возникающим при попадании ЛПС в организм в чистом виде. С использованием прямой модели эндотоксического шока достоверно определена деструктивная роль воспалительного процесса, обусловленного действием эндотоксина во время развития сепсиса [2].

На прямой модели эндотоксического шока мы воспроизводим такой важный патогенетический аспект клинического течения шока, как массированное поступление бактериального эндотоксина в организм больного. Этот патогенетический механизм может быть реализован только на прямой модели при введении больших количеств ЛПС (100-200 мг/кг), но не на D-GalN-модели, с низкой эндотоксиновой нагрузкой (5-10 мкг/кг). ЛПС кишечной палочки является, по-видимому, наиболее важным эндотоксическим агентом, попадающим в человеческий организм. С учетом того, что на поверхности каждой клетки E. coli насчитывают приблизительно 106 молекул ЛПС [31], при сепсисе содержание ЛПС в крови может возрастать в 1000 раз. Кроме того, для E. coli определено более 170 сероваров O-антигена, и только некоторые из них вовлечены в патогенез разнообразных заболеваний. Так, с заболеваниями желудочно-кишечного тракта связаны E. coli с серотипом 0:15, 0:26, 0:55, 0:86, 0:91, 0:111, 0:104, 0:157 [32]. Поэтому для моделирования эндотоксического шока был выбран эндотоксин патогенного для человека штамма E. coli 0:55 (получен по методу 0. Westphal и соавт.).

Для определения дозы эндотоксиновой нагрузки, вызывающей эндотоксический шок у мышей линии (CBA х

C57BL/6)F1, последним в/б вводили wЛПС E. coli 0:55 в разных дозах (см. таблицу).

По результатам эксперимента в качестве дозы для индукции эндотоксического шока было решено выбрать летальную дозу эндотоксина wЛПС E. coli 0:55, а именно 3 мг/мышь (150 мг/кг).

Согласно литературным данным, с помощью эндотоксино-вой модели установлено, что развитие сепсиса происходит в результате острого воспалительного процесса в ответ на быструю массивную продукцию цитокинов: при введении экспериментальным животным или добровольцам эндотоксина наблюдается обильное высвобождение провоспалительных цитокинов. Повышение уровня ФНОа в плазме крови при введении эндотоксина достоверно повторимо от эксперимента к эксперименту, причем быстрота выработки ФНОа в ответ на попадание эндотоксина в организм не является видоспецифичной и достигает пика через 2 ч после введения эндотоксина [2, 33].

В нашем эксперименте через 90 мин после иммунизации интактных мышей линии (CBA х C57BL/6)F1 wЛПС E. coli 0:55 в дозе 3 мг/мышь наблюдали подъем концентрации ФНОа до 1000 пг/мл, что свидетельствует о том, что прямая модель эндотоксического шока реально работает: массированное поступление ЛПС (150 мг/кг) вызывает мощный выброс ФНОа, что приводит к гибели экспериментальных животных. Содержание ФНОа в сыворотках крови мышей определяли с помощью тест-системы Quantikine Mouse TNFa/TNFSF1A («R&D Systems», США) методом твердофазного иммуноферментного анализа согласно стандартной методике производителя.

Раньше модели эндотоксического шока широко использовали для изучения патофизиологии сепсиса, и создавалось ощущение адекватного воспроизведения целого спектра изменений, сопутствующих воспалению, схожих с теми, что наблюдались у пациентов в состоянии септического шока. Но, когда эндотоксиновые модели исследовали более обстоятельно, сравнивая непосредственно с инфекционными моделями, которые более точно описывают изменения организма по время развития сепсиса, стало очевидно, что эндотокси-новые модели не дают полного воспроизведения клинического септического состояния больных. Несмотря на схожие иммунный и гематологический статусы, при введении эндотоксина (эндотоксиновая модель) цитокины вырабатываются гораздо быстрее и мощнее (более высокая концентрация), чем при индукции воспаления с помощью экспериментального перитонита. Таким образом, эндотоксиновая модель не является подходящей для изучения сепсиса.

Тем не менее эндотоксиновая модель позволяет воссоздать параметры эндотоксического шока, доминирующего в отделениях кардиопатологий, что связано с использованием аппаратов искусственного кровообращения, катетеров, методов инвазивной терапии. Таким образом, результаты исследований с использованием этой модели могут открыть новый подход к профилактике и терапии эндотоксического шока у больных кардиологического профиля.

Модель экспериментального перитонита

Сепсис является основным осложнением у больных в отделениях реанимации и развивается у половины пациентов

[34] . Однако существенного снижения смертности и частоты возникновения сепсиса у прооперированных или травмированных больных достичь не удалось.

E. Deitch отметил, что причиной неудач разработки новых противосептических препаратов может являться использование неподходящих экспериментальных моделей, не воспроизводящих точно такое же септическое состояние, как у больных

[35] . В качестве возможных факторов, определяющих несоответствие экспериментального состояния с клиническим, он определил смещение в сторону интоксикации, а не инфицирования и инфицирование одним видом микроорганизмов, что

- 252 -

ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ

сильно отличается от полимикробного характера протекания сепсиса в клинике. H. Freise и соавт. [36] также обращают внимание на то, что модели, с высокой точностью имитирующие клиническое септическое состояние, направлены на воспроизведение именно инфекционного процесса, а не системного воспаления. В свете всего вышесказанного использование экспериментальных моделей, воспроизводящих клиническое септическое состояние, является весьма важной и наиболее перспективной стратегией по изучению и разработке методов борьбы с сепсисом. Экспериментальный перитонит, индуцированный методом перевязки и прокола слепой кишки (cecal ligation and puncture - CLP-модель), наиболее точно воспроизводит многие патофизиологические осложнения, которые имеют место при клиническом течении сепсиса/септическом шоке: после CLP-операции у животных наблюдают бактериемию, гипотермию, гипотензию и множественное повреждение органов (ПОН) [37]. Спустя 16 ч после проведения CLP-операции септическое состояние может быть определено по тому, что при перевязке слепой кишки образуются некротические ткани, что близко к клиническому проявлению некроза во время сепсиса, а в перитонеальной полости образуется асцит, и наблюдается полимикробный характер обсеменения (E. coli, B. fragilis, P. aeruginosa, K. Pneumoniae) [7].

Необходимо, чтобы эксперименты по CLP были воспроизводимы и тщательно стандартизированы для снижения вариабельности результатов. Только понимая патофизиологию сепсиса и септического шока, можно разработать эффективную терапию как превентивной направленности, так и лечения сепсиса de facto.

Тяжесть экспериментального перитонита можно контролировать, варьируя размер и количество проколов слепой кишки: использование иглы большего диаметра для прокола слепой кишки повышает смертность при CLP [38].

При моделировании экспериментального перитонита (CLP-модель) мышей линии (CBA х C57Bl/6)F1 усыпляли под общей анестезией, вскрывали брюшину и осторожно, с тем чтобы не повредить сосуды, извлекали слепую кишку и аппендикс. Слепую кишку перевязывали в прилегающей к аппендиксу области и надрезали или прокалывали ее насквозь (1 или 2 раза) иглой диаметром 22G [39]. Содержимое слепой кишки выдавливали через образовавшиеся отверстия для обсеменения содержимым кишечника перитонеальной полости, затем возвращали органы обратно в брюшину и зашивали брюшную полость [7]. После операции животных помещали на чистые бумажные подстилки и обеспечивали достаточное количество питьевой воды в клетке.

При надрезе слепой кишки наблюдается наиболее обильное бактериальное заражение перитонеальной полости в пределах данного эксперимента, которое характеризуется наименее продолжительным временем жизни как первой, так и последней особи в группе. Наибольшими сроками выживаемости и лучшей «разверткой» развития перитонита во времени отличались мыши с одиночным проколом слепой кишки (см. рисунок). Изменяя количество и размер проколов слепой кишки, удалось добиться варьирования уровня бактериального обсеменения перитонеальной полости, а следовательно, и степени тяжести протекания экспериментального перитонита. Кроме того, при перевязке слепой кишки образовывались некротические ткани, что близко к клиническому проявлению некроза во время сепсиса.

Модель септического шока (экспериментальный перитонит) была разработана с акцентом на такие объективные параметры, как воспроизводимость, многосторонность и стандартность. Условия проведения CLP-процедуры можно варьировать по следующим параметрам: использование игл разного диаметра для прокола слепой кишки, варьирование количества проколов; разный подход к оперированию, в частности размер разреза кожи и подлежащей мускулатуры, неодинаковое количество содержимого слепой кишки, попадающего в перитонеальную полость, использование раз-

Определение дозы wЛПC E. coli O:55, вызывающей эндотоксический шок

Доза, мг/мышь Количество мышей Количество погибших мышей % выживаемости

0,5 5 0 100

1 5 2 60

2 5 4 20

4 5 5 0

нообразных веществ для анестезии, проведение операции в разное время суток (эффект изменения сердечного ритма в зависимости от времени суток). Таким образом, от рук исследователя зависят и воспроизводимость, и эффективность процедуры. Для того чтобы наиболее стандартизировать процедуру, CLP-операции проводили всегда по утрам, иглой одного диаметра (22G), производили одинаковое количество проколов в рамках конкретного эксперимента, использовали одно и то же вещество для анестезии. Естественная вариабельность зависела только от содержимого слепой кишки. При травматических повреждениях именно собственная микрофлора, преодолевая защитные барьеры организма (проникающее ранение, перфорация стенок кишечника или транслокация микроорганизмов через слизистые кишечника), обусловливает развитие инфекционного процесса (сепсис). Таким образом, главным достоинством CLP-модели является то, что организм подвергается преимущественно инфицированию собственными эндогенными микроорганизмами (мультимикробная атака), нежели экзогенными.

Заключение

Мы проводили комплексное моделирование, с тем чтобы отразить различные патогенетические механизмы клинического течения шоковых, эндотоксических состояний. Один из подходов к лечению сепсиса связан с подавлением (блокировкой) активности отдельных, точно определенных медиаторов, так как они вызывают поражение (дисфункция) органов и смерть. Данная позиция основывается на феномене эндотоксической толерантности и связана с изучением выживаемости и уровня провоспалительных цитокинов (прежде всего ФНОа) на различных моделях эндотоксического шока.

- -ф-  1 прокол иглой диаметром 22G —— 2 прокола иглой диаметром 22G —А— 1 надрез ножницами

Разработка CLP-модели: влияние варьирования уровня бактериального обсеменения перитонеальной полости (интенсивность перитонита) на выживаемость (в %) мышей линии (CBA х C57BL6)F1.

По оси абсцисс - сутки.

- 253 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012

Изучение токсического действия ФНОа in vivo целесообразно проводить на наиболее чувствительной модели с использованием сенсибилизатора эндотоксичности D-GalN, который применяют при моделировании экстремального состояния гиперчувствительности к ЛПС. Эндотоксический шок развивается при попадании бактериального эндотоксина в организм в чистом виде, его деструктивная роль заключается в массированной выработке провоспалительных цитокинов. На прямой модели мы воспроизводили воспалительный процесс, вводя летальные дозы ЛПС, и оценивали уровень ФНОа как основного агента, ответственного за развитие патогенетических событий во время эндотоксического шока.

Моделирование эндотоксического шока связано с использованием одного вида эндотоксина, что сильно отличается от полимикробного характера протекания сепсиса в клинике, и со смещением в сторону интоксикации [35], а не инфицирования. Модель экспериментального перитонита наиболее точно воспроизводит клиническое септическое состояние как по патофизиологическим характеристикам, так и по этиологии организмов-возбудителей за счет инфицирования собственной эндогенной микрофлорой, что делает ее незаменимой для исследования возможности разрабатываемых противошоковых препаратов модулировать развитие/течение сепсиса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Linde-Zwirbe W. T., Angus D. C., Carcillo J. et al. Age-specific incidence and outcome of sepsis in the US: analysis of incidence, outcome, and associated cost of care. Crit. Care Med. 1999; 27(1): A33.

2. RemickD. G., WardP. A. Evaluation of endotoxin models for the study of sepsis. Shock 2005; 24: 7-11.

3. Bone R. C. Gram-negative sepsis: a dilemma of modern medicine. Clin. Microbiol. Rev. 1993; 6(1): 57-68.

4. Jean-Baptiste E. Cellular mechanisms in sepsis. J. Intern. Care Med. 2007; 22: 63-72.

5. AstizM. E., Rackow E. C. Septic shock. Lancet 1998; 351(9114): 1501-1505.

6. Гельфанд Б. Р., Филимонов М. И., Бурневич С. З. Абдоминальный сепсис. Рус. мед. журн. 1998; 6(11): 697-706.

7. Hubbard W. J., Choudhry M., Schwacha M. G. et al. Cecal ligation and puncture. Shock 2005; 24: 52-57.

8. Willatts S. M., Speller D.C.E., Winter R. J. Incidence of Gramnegative bacteraemia in sepsis syndrome. Anaesthesia 1994; 49: 751-754.

9. Shapiro I., Gelfand J. A. Cytokines and sepsis: pathology and therapy. New Horiz 1993; 1: 13-22.

10. Leon C. G., Tory R., Jia J. et al. Discovery and development of Toll-like receptor 4 (TLR4) antagonists: a new paradigm for treating sepsis and other disease. Pharm. Res 2008; 25(8): 1751-1761.

11. O’Neill L. A., Bowie A. G. The family of five: TIR-domain-contaning adaptors in Toll-like receptor signaling. Nature Rev. Immunol. 2007; 7: 353-364.

12. Matsuda N., Hattori Y. Systemic inflammatory response syndrome (SIRS): molecular pathophysiology and gene therapy. J. Pharmacol. Sci. 2006; 101: 189-198.

13. Cinell I., Dellinger R. P. Advances in pathogenesis and management of sepsis. Curr. Opin. Infect. Dis. 2007; 20: 345-352.

14. FukuiM., ImamuraR., UmemuraM. et al. Pathogen-associated molecular patterns sensitize macrophages to Fas ligand-induced apoptosis and IL-1 beta release. J. Immunol. 2003; 171: 1868-1874.

15. Lin W. J., Yeh W. C. Implication of Toll-like receptor and tumor necrosis factor alpha signaling in septic shock. Shock 2005; 24: 206-209.

16. Ulloa L., Tracey K. J. The ‘cytokine profile’: a code for sepsis. Trends Mol. Med. 2005; 11: 56-63.

17. Dobrovolskaia M. A., Vogel S. N. Toll receptors, CD14, and macrophage activation and seactivation by LPS. Microbes Infect. 2002; 4: 903-904.

18. Poltorak A., He X., Smirnova I. et al. Defective LPS singaling in C3H/HeJ and C57B/10ScCr mice: mutations in TLR4 gene. Science 1998; 282: 2085-2088.

19. Weighardt H., Holzmann B. Role of toll-like receptor responses for sepsis pathogenesis. Immunobiology 2008; 212: 715-722.

20. WeighardtH., Kaiser-Moore S., VabulasR. M. et al. Cutting edge: myeloid differentation factor 88 deficiency improves resistance against sepsis caused by polymicrobial infection. J. Immunol. 2002; 169: 2823-2827.

21. Echtenacher B., Freudenberg M. A., Jack R. S., Mannel D. N. Differences in innate defense mechanisms in endotoxemia and polymicrobial septic peritonitis. Infect. and Immun. 2001; 69(12): 7271-7276.

22. Feterowski C., Emmanuilidis K., Gerauer K. et al. Effects of functional toll-like receptor-4 mutations on the immune response to human and experimental sepsis. Immunology 2003; 109: 426-431.

23. Feterowski C., Novotny A., Kaiser-Moore S. et al. Attenuated pathogenesis of polymicrobial peritonitis in mice after TLR2 agonist pre-treatment involves ST2 up-regulation. Intern. Immunol. 2005; 17(8): 1035-1046.

24. Hemmi H., Takeuchi O., Kawai T. et al. Atoll-like receptors recognizes bacterial DNA. Nature 2000; 408: 740-745.

25. Hanten J. A., Vasilakos J. P., Riter C. L. et al. Comparison of human B cell activation by TLR7 and TLR9 agonists. BMC Immunol. 2008; 9: 39.

26. Lehmann B. V., Freudenberg M. A., Galanos G. Lethal toxicity of lipopolysaccharide and tumor necrosis factor in normal and D-galactosamine-treated mice. J. Exp. Med. 1987; 165: 657-663.

27. Galanos C., Freudenberg M. A., Reutter W. Galactoseamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979; 76: 5939-5943.

28. Bing-Rong Z., Gumenscheimer M., FreudenbergM., Galanos C. A striking correlation between lethal activity and apoptotic DNA fragmentation in liver in response of D-galactosamine-sensitized mice to a non-lethal amount of lipopolysaccharide. Acta Pharmacol. Sin. 2003; 24: 193-198.

29. Mignon A., Rouquet N., Fabre M. et al. LPS challenge in D-ga-lactosamine-sensitized mice accounts for caspase-dependent fulminant hepatitis, not for septic shock. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999; 159: 1308-1315.

30. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure. Meth. Carbohydr. Chem. 1965; 5: 83-91.

31. Raetz C. R., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem. 2002; 71: 635-700.

32. Gibbs R. J., Stewart J., Poxton I. R. The distribution of, and antibody responses to, the core lipopolysaccharide region of Escherichia cili isolated from the faeces of healthy humans and cattle. J. Med. Microbiol. 2004; 53: 959-964.

33. Dinarello C. A. Immediate cytokine responses to endotoxin: Tumor necrosis factor a and interleukin-1 family. In: Endotoxin in health and disease. New York: Marcell Dekker; 1999: 817-830.

34. Baue A. E., Derham R., FaistE. Systemic inflammatory response syndrome (SIRS), multiple organ disfunction syndrome (MODS), multiple organ failure (MOF): are we winning the battle? Shock 1998; 10: 79-89.

35. Deitch E. A. Animal models of sepsis and shock: a review and lessons learned. Shock 1998; 9: 1-11.

36. FreiseH., Bruckner U.B., SpiegelH. U. Animal models of sepsis. J. Invest. Surg. 2001; 14: 195-212.

37. Salkowski C. A., Detore G., Franks A. et al. Pulmonary and hepatic gene expression following cecal ligation and puncture: Monophosphoryl lipid A prophylaxis attenuates sepsis-induced cytokine and chemokine expression and neutrophil infiltration. Infect. and Immun. 1998; 66(8): 3569-3578.

38. EbongS., CallD., Nemzek J. et al. Immunopathologic alterations in murine molels of sepsis of increasing severity. Infect. and Immun. 1999; 67: 6603-6610.

39. Yan J. J., Jung J. S., Lee J. E. et al. Therapeutic effects of lyso-phosphatidylcholine in experimental sepsis. Nature Med. 2004; 10(2): 161-167.

Поступила 02.04.12

- 254 -