Изменение состава микробиоценоза толстого кишечника и антиоксидантных свойств колоноцитов в условиях экспериментального дисбиоза и профилактики эмоксипином

1G. Кашкин К.П., Караев З.О. Иммунная реактивность организма и антибиотическая терапия. Л., Медицина, 1984.

11. Медведева О.А., Калуцкий П.В., Беседин А.В., Жиляева Л.В., Остап Е.В., Иванов А.В., Медведева С.К. Изучение состояния пристеночной микрофлоры и стенки толстой кишки мышей под воздействием аномального магнитного поля. Журн. микробиол. 2G12, 1: 49-54.

12. Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Зверев В.В., Воробьев А.А. Микробиоценоз пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс с индуцированным дисбиозом. Журн. микробиол. 2GG7, 3: 57-6G.

13. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica М., МедиаСфера, 2GG6.

14. Соловьева И.В., Белова И.В., Точилина А.Г., Ефимов Е.И., Пожидаева А.С. Формирование микрофлоры толстой кишки у детей. Вестник Нижегородского университета. 2G12, 2-3: 93-99.

15. Урсова Н.И. Особенности формирования микробиоценоза у грудных детей и дисбактериоз кишечника. Педиатрия. Приложение к журналу Consilium medicum. 2GG5, 2: 56-59.

16. Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет. Рус. мед. журн. 2GG3, 11 (3): 122-126.

17. Костюкевич О.И. Современное представление о микробиоценозе кишечника. Дисбактериоз и его коррекция. Рус. мед. журн. 2GG7, 28: 2176-2182.

18. Завгородняя Е.Ф., Сташкевич Л.А. Особенности микробиологической характеристики дисбио-зов кишечника в современных условиях. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2GG8, 12: 161-162.

19. Geraldine O. et al. Bacteria in the Intestine, helpful residents or enemies from within? Infect. Immun. 2GG8, 76 (8): 336G-3373.

2G. Xiao-Zhong Huang, Li-Bin Zhu, Zhong-Rong Li, Jing Lin. Bacterial colonization and intestinal mucosal barrier. Develop. World J. Clin. Pediatr. 2G13, 2 (4): 46-53.

Контактная информация: Агейченко А.В.,

3G5G41, Курск, ул. Карла Маркса, 3, р.т. (4712)58-81-32

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015

А.В.Агейченко, П.В.Калуцкий, О.А.Медведева, В.А.Королев

ИЗМЕНЕНИЕ СОСТАВА МИКРОБИОЦЕНОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА И АНТИ-ОКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ КОЛОНОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ДИСБИОЗА И ПРОФИЛАКТИКИ ЭМОКСИПИНОМ

Курский государственный медицинский университет

Цель. Изучение состава микробиоценоза толстого кишечника и антиоксидантных свойств колоноцитов в условиях экспериментального дисбиоза и профилактического применения эмоксипина. Материалы и методы. Животным, у которых формировали лекарственный дисбиоз внутрибрюшинным введением гентамицина, с целью профилактики вводили антиоксидант эмоксипин. Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстой кишки мышей проводили бактериологическим методом. О состоянии системы перекисного окисления липидов судили по содержанию ацилгидроперекисей и малонового диальдегида, системы антиоксидантной защиты по активности ферментов (каталаза и супероксиддисмутаза). Результаты. Экспериментальный дисбиоз кишечника проявился изменениями в составе мукозной микрофлоры животных и антиоксидантных свойств колоноцитов. Профилактика дисбиоза эмокси-пином привела к нормализации активности ферментов антиоксидантной защиты и продуктов перекисного окисления липидов в ткани кишечника. Заключение. Результаты исследования позволяют полагать, что использование эмоксипина приводит к повышению адаптивно-компенсаторных возможностей макроорганизма при экспериментальном дисбиозе.

Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 84-88

Ключевые слова: микрофлора толстого кишечника, дисбиоз, перекисное окисление липидов, антиоксидантная система, эмоксипин

A.V.Ageichenko, P.V.Kalutsky, O.A.Medvedeva, V.A.Korolev

CHANGES IN COLON MICROBIOCENOSIS COMPOSITION AND ANTIOXIDANT PROPERTIES OF COLONOCYTES UNDER THE CONDITION OF EXPERIMENTAL DYSBIO-SIS AND EMOXIPIN PROPHYLAXIS

Kursk State Medical University, Russia

Aim. Study the composition ofcolon microbiocenosis and antioxidant properties ofcolonocytes under the conditions of experimental dysbiosis and prophylaxis application of emoxipin. Materials and methods. With the aim of prophylaxis, antioxidant emoxipin was administered to mice, in which medicinal dysbiosis was formed by intraperitoneal administration of gentamicin. Quantitative and qualitative study of mucous microflora of the mice colon was carried out by a bacteriological method. The state of lipid peroxidation system was judged by the content of acylhydroperoxides and malonic dialdehyde, system of antioxidant protection — by enzyme activity (catalase and superoxide dismutase). Results. Experimental dysbiosis of the colon manifested by changes in the composition of mucous microflora of the animals and antioxidant properties of colonocytes. Dysbiosis prophylaxis by emoxipin resulted in normalization of the activity of antioxidant protection enzymes and products of lipid peroxidation in intestine tissue. Conclusion. The study results allow to consider, that use of emoxipin results in an increase of adaptive-compensatory capabilities of the macroorganism during experimental dysbiosis.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 84—88

Key words: colon microflora, dysbiosis, lipid peroxidation, antioxidant system, emoxipin ВВЕДЕНИЕ

Роль микрофлоры как фактора защиты организма человека и поддержания гомеостаза чрезвычайно важна, так как нормофлора регулирует физиологические функции и биохимические реакции макроорганизма [3]. Качественные и количественные изменения состава биотопов, сообщающихся с внешней средой, определяются термином «дисбиоз» [1, 14]. Особый интерес представляет дисбиоз толстого кишечника — биотопа, который наиболее заселен микроорганизмами. Одной из причин, вызывающих дисбиоз, является воздействие на организм ксенобиотиков (в частности, антибиотиков широкого спектра действия) [15]. Под действием ксенобиотиков происходят изменения состава микрофлоры кишечника, которая в виде биопленки препятствует проникновению патогенов [2, 8]. Наряду с этим повышается уровень активных форм кислорода, интенсифицируются процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ), наблюдается развитие общего неспецифического адаптационного стресса, что влечет за собой повреждение клеточных мембран. Типичной реакцией макроорганизма на различные воздействия является нарушение скоординированной работы системы антиоксидантной защиты (АОЗ), с помощью которой обеспечивается поддержание свободнорадикального окисления на уровне, необходимом для нормального течения окислительных процессов [6, 18]. Важным направлением медицинских исследований является разработка профилактических мероприятий для поддержания прооксидантно-антиоксидантного баланса организма [11].

В связи с вышеизложенным, целью исследования было изучение эффективности профилактического использования антиоксиданта эмоксипина на качественный и количественный состав микробиоценоза толстого кишечника мышей и антиоксидантные свойства колоноцитов в условиях экспериментального дисбиоза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на 60 мышах линии BALB/c массой 18 — 20 г. Все животные были разделены на три группы по 20 особей в каждой. Первая группа — контрольная (интактные мыши). Вторую группу составили животные, у которых моделировали лекарственный дисбиоз путем ежедневного в течение 5 дней внутрибрюшинного введения раствора гентамицина в концентрации 80 мкг/мл в пересчете на массу животного (0,02 мл) [10]. Третью группу составили мыши, которым с профилактической целью внутри-

мышечно вводили антиоксидант эмоксипин в дозе 167,18 мг/кг в пересчете на массу животного (0,334 мл) в течение 10 суток до начала введения гентамицина.

У мышей контрольной группы, а также экспериментальных групп после окончания введения гентамицина проводили изучение состава мукозной микрофлоры толстого кишечника, исследование состояния перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты колоноцитов. Количественное и качественное исследование мукозной микрофлоры толстого кишечника мышей проводилось по [7]. Удельное содержание микроорганизмов вычисляли как количество микроорганизмов, выделенных из биопроб, и выражали в lg КОЕ/г массы биологического материала [4, 5, 16]. Более подробно «Материалы и методы» см. предыдущую статью.

Для оценки антиоксидантных свойств колоноцитов навеску ткани толстого кишечника массой 100 мг гомогенизировали в 1 мл 0,025 М трис-HCL буфера (рН 7,4). О состоянии перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по содержанию ацилгидроперекисей (АГП) и малонового диальдегида (МДА), а также активности ферментов антиоксидантной системы: супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы в ткани кишечника. Данные показатели оценивали традиционными методами [12, 13].

Статистическую значимость различий средних величин вычисляли по t-критерию Стьюдента после проверки нормальности распределения изучаемых параметров с помощью программы Statistica 6.0 [17].

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

В составе микробиоценоза толстого кишечника животных контрольной группы количество бифидобактерий составило 7,93+0,93, лактобацилл — 6,15+0,70. Несколько ниже было число кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью (6,77+0,78), еще меньше — со сниженной ферментативной активностью (4,37+0,76). Количество коагулазоотрицательных стафилококков составляло 2,74+0,60, бактерий рода Streptococcus — 2,93+0,60. Содержание Enterobacter spp., Citrobacter spp., Enterococcus spp. составило 4,47+0,79, 4,37+0,92 и 3,42+0,90 соответственно. Сальмонеллы в составе мукозной микрофлоры обнаруживались в количестве 5,65+0,66, грибы рода Candida — 1,26+0,32. Золотистые стафилококки и протей в составе нормофлоры мышей контрольной группы

не определялись.

В условиях экспериментального дисбиоза кишечника было выявлено, что численность бифидобактерий и лактобацилл снизилась в 1,9 и 1,7 раза соответственно по отношению к группе контроля. Количественный показатель эшерихий со сниженной ферментативной активностью увеличился в 1,6 раза, а число кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью снизилось в 1,7 раза. Lg КОЕ/г представителей рода Enterobacter уменьшился в 1,9 раза, стрептококков — увеличился в 2,1 раза по отношению к значениям, определяемым у интактных животных. В составе биоценоза экспериментальной группы с дисбиозом не выявлялись микроорганизмы рода Citrobacter и Enterococcus, но были обнаружены отсутствующие в составе микробиоценоза мышей контрольной группы золотистые стафилококки и протей, которые составили 3,40+0,62 и 4,01+0,66 соответственно. В микробной популяции толстого кишечника мышей в 3,9 раза увеличилось содержание грибов рода Candida. Изменения численности коагулазотрицательных стафилококков и сальмонелл были не достоверны.

Развитие лекарственного дисбиоза сопрово-

Таблица 1. Активность ферментов антиоксидантной защиты колоноцитов мышей в условиях экспериментального дисбиоза и его профилактики эмоксипином

Группы мышей

Каталаза, мкат/г белка ткани

СОД, у.е.

Контроль 14,11+0,88 14,23+1,03

Дисбиоз 10,12+1,62* 7,79+1,22**

Эмоксипин 14,33+0,99х 14,80+0,86ххх

Примечание. Здесь и в табл. 2: * р<0,05, ** р<0,001 по сравнению с контрольной группой; х р<0,05, хх р<0,01, ххх р<0,001 по сравнению с группой «дисбиоз».

Таблица 2. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в коло-ноцитах мышей в условиях экспериментального дисбиоза и его профилактики эмоксипином

Группы мышей

МДА, мкмоль/г ткани

АГП,

у.е

Контроль

Дисбиоз

Эмоксипин

3,57+0,57 6,82+0,72** 4,67+0,42х

0,31+0,03 0,70+0,08** 0,42+0,05хх

ждалось снижением активности обоих изученных ферментов антиоксидантной защиты колоноцитов мышей (табл. 1). Причем более выраженными были изменения активности супероксиддисмутазы.

После введения гентамицина у мышей происходило увеличение концентрации промежуточных и конечных продуктов ПОЛ в ткани кишечника (табл. 2). При этом содержание малонового диальдегида увеличивалось в 1,9 раза, а ацилгидроперекисей — в 2,3 раза по сравнению с группой контроля.

Использование с профилактической целью эмоксипина повышало активность катала-зы в 1,4 раза, а супероксиддисмутазы — в 1,9 раза по сравнению с показателями группы животных с дисбиозом. При этом необходимо отметить, что изучаемые показатели не отличались от значений группы контроля.

Что касается продуктов перекисного окисления липидов, то содержание малонового диальдегида было в 1,5 раза, а ацилгидроперекисей — в 1,7 раза ниже значений соответствующих показателей у мышей с дисбиозом и они были сопоставимы с данными интакт-ных животных.

При профилактическом применении эмоксипина сопоставимыми с показателями у интактных мышей были численность бифидобактерий и лактобцилл, кишечных палочек с нормальной и сниженной ферментативной активностью, коагулазоотрицательных стафилококков, бактерий рода Enterobacter и Salmonella. При этом статистически достоверных отличий всех перечисленных показателей от их значений у мышей с дисбиозом отмечено не было. Число стрептококков и грибов рода Candida превышало значение контроля и не имело достоверных отличий от группы животных, у которых моделировали дисбиоз. Также, как и у мышей с дисбиозом, в составе микрофлоры кишечника обнаруживались не встречавшиеся в контроле золотистые стафилококки и бактерии рода Proteus, отсутствовали представители рода Citrobacter. Вместе с тем, содержание энтерококков было ниже показателей у интактных мышей.

ОБСУЖДЕНИЕ

Воздействие антибиотика широкого спектра действия (гентамицина) приводит к существенным изменениям в составе кишечного микробиоценоза. Достоверно снижается количество бифидобактерий и лактобацилл, энтеробактерий, не идентифицируются представители родов Citrobacter и Enterococcus. Одновременно со снижением количества кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью возрастает количество эшерихий со сниженной ферментативной активностью, стрептококков, грибов рода Candida. При этом в составе микробиоценоза толстого кишечника обнаруживаются золотистые стафилококки и протей. При использовании с профилактической целью эмок-сипина содержание кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью, бактерий родов Enterobacter и Enterococcus достоверно отличалось от показателей у мышей с дисбиозом, а энтерококков и от значений группы контроля. Вместе с тем, количество кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью, сальмонелл, коагула-зоотрицательных стафилококков и лактобацилл соответствовало показателям у интактных мышей. Характеристики остальных изученных представителей микрофлоры толстого кишечника отличались от контрольных и были сопоставимы с данными мышей с дисбио-зом.

В условиях экспериментального дисбиоза в колоноцитах отмечается снижение активности ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы и каталазы), что сопровождается интенсификацией свободнорадикальных процессов, снижением адаптивных возможностей и может в дальнейшем приводить к повреждению клеточных мембран [9]. Низкая активность супероксиддисмутазы и каталазы относительно значений в ткани кишечника интактных мышей может быть результатом воздействия на колоноциты качественных и количественных изменений в составе кишечной микрофлоры. Увеличение концентрации продуктов перекисного окисления липидов (малонового диальдегида и ацилгидроперекисей) в колоноцитах свидетельствует о степени риска нарушения целостности клеточных мембран непосредственно в зоне обитания микроорганизмов и обусловлено как действием самого антибиотика, так и увеличением численности стрептококков, золотистых стафилококков, протея, грибов рода Candida в результате развития дисбакте-риоза.

Профилактическое применение антиоксиданта эмоксипина предотвращает развитие дисбаланса ферментов антиоксидантной защиты, продуктов перекисного окисления липидов и снижает степень выраженности дисбиоза на фоне введения гентамицина.

Это позволяет полагать, что использование эмоксипина приводит к повышению адаптивно-компенсаторных возможностей макроорганизма при экспериментальном дис-биозе.

Л ИТЕРАТУРА

1. Богадельников И.В. Дисбактериоз—желаемое и действительное. Новости медицины и фармации. 2011, 6 (357): 2-3.

2. Бредихин В.Н., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Лещенко А.А., Лазыкин А.Г. Микроэкологические изменения в кишечнике при дисбактериозе: экспериментальное обоснование возможности коррекции дисбиотических изменений пребиотиком стимбифид. Кишечная микрофлора: взгляд изнутри. Инновационный сборник научных статей. 2013, 2: 152.

3. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А. Анализ штаммовой общности пристеночных биотопов желудочно-кишечного тракта. Вестн. РАМН. 2004, 6: 15-18.

4. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Исследование пристеночной микрофлоры кишечника крыс. Журн. микробиол. 2005, 3: 61-65.

5. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Корнеев М.Л. Особенности микробиоценоза пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс. Журн. микробиол. 2005, 6: 3-7.

6. Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состояниях окислительного стресса. Вопросы мед. химии. 2001, 47 (6): 561-581.

7. Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Современные методы оценки качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища. Журн. микробиол. 2002, 4: 72-78.

8. Завгородняя Е.Ф. Дисбактериоз кишечника. Дальневосточный журнал инфекционной патологии. 2010, 16: 131-141.

9. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: Биохимический и патофизиологические аспекты. М., МАИК Наука/Интерпериодика, 2001.

10. Кашкин К.П., Караев З.О. Иммунная реактивность организма и антибиотическая терапия. Л., Медицина, 1984.

11. Королев В.А., Ляшев Ю.Д., Грибач И.В., Кирищева Н.Е. Изменение прооксидантно-антиоксидантного баланса при хронической интоксикации банколом и эффективность профилактических мероприятий с применением мексидола. Человек и его здоровье. 2014, 2: 19-22.

12. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы. Лаб. дело. 1988, 1: 16-19.

13. Макаренко Е.В. Комплексное определение активности супероксиддисмутазы и глутатионредук-тазы в эритроцитах больных с хроическими заболеваниями печени. Лаб. дело. 1988, 11: 48-50.

14. Мубаракшина О.А. Нарушения миробиоценоза кишечника и их коррекция. Мед. вестник. 2008, 33: 18-21.

15. Несвижский Ю.В. Изучение изменчивости кишечного микробиоценоза человека в норме и патологии. Вестн. РАМН. 2003, 1: 49-53.

16. Несвижский Ю.В., Богданова Е.А., Зверев В.В., Воробьев А.А. Микробиоценоз пристеночного муцина желудочно-кишечного тракта крыс с индуцированным дисбиозом. Журн. микробиол. 2007, 3: 57-60.

17. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica М., МедиаСфера, 2006.

18. Bolognesi C. Genotoxicity of pesticides: a review of human biomonitoring studies. Mutation Res. 2003, 2: 251-272.

Контактная информация: Агейченко А.В.,

305041, Курск, ул. Карла Маркса, 3, р.т. (4712)58-81-32