ЭКСТРАКТ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ПОЛИФЕНОЛА
HIGH-POLYPHENOL EXTRACT OF HERBAL RAW MATERIAL

Настоящее изобретение относится к способам для получения содержащих полифенол композиций с высоким содержанием полифенольных олигомеров и/или с высоким содержанием полифенольных мономеров, димеров и тримеров. Настоящее изобретение также относится к композициям, получаемым такими способами.
Предшествующий уровень техники
Существует растущая заинтересованность в полифенолах вследствие их защитного воздействия на здоровье человека. В частности, обнаружено снижение полифенолами риска хронических заболеваний, таких как сердечно-сосудистые заболевания и злокачественные опухоли. Следовательно, можно пытаться использовать полифенолы в функциональных продуктах питания или в качестве лекарственных средств. Их антиоксидантный эффект может дополнительно обуславливать к их применению в косметических средствах.
Традиционно, изучены полифенолы из какао-бобов, но и другие растения, такие как шалфей, зеленый чай, другие продукты какао, многие другие растения также содержат значительное количество указанных природных веществ. Вследствие увеличения повреждения натуральных антиоксидантов и других продуктов, связанных со здоровьем, существует постоянная необходимость изыскивать новое сырье.
Недавние исследования обнаружили, что эффекты различны у полифенолов с различной степенью полимеризации (dp). Например, тетрамеры процианидинов (dp=4), отдельный класс полифенолов, достоверно наиболее эффективны для подавления АСЕ в эндотелиальных клетках пупочной вены человека (Ottaviani et al., Biochimie 88, 2006, 359-265), тетрамеры, пентамеры и гексамеры процианидинов демонстрируют высокое подавляющее АСЕ воздействие в клетках изолированных легких кролика (Actis-Goretta et al., FEBS Letters 555, 2003, 597-600), и защита от окисления возрастает с увеличением длины олигомеров процианидинов (от dp=1 до dp=5) в модели липосом (т.е. пентамеры процианидина демонстрируют лучшую липосомальную защиту, чем мономеры процианидина (Lotito et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 276, 2000, 945-951)).
Более того, пентамеры процианидинов подавляют экспрессию тирозинкиназы ErbB2 и уменьшают клеточную пролиферацию эндотелиальных клеток аорты человека (Kenny et al., Experimental biology and Medicine 229, 2004, 255-263). Мономеры, димеры и триммеры процианидинов, в противоположность, обладают различными фармакокинетическими профилями по сравнению с олигомерами, такими как тетрамеры, пентамеры и гексамеры процианидов.
Osman et al., Food Chemistry 86, 2004, 41-46, описывают, что композиции пищевых продуктов и напитков, богатые фенолами, могут уменьшать риск сердечных заболеваний, замедлять прогрессирование атеросклероза, действуя в качестве антиоксидантов по отношению к липопротеидам низкой плотности. Osman et al. также получили экстракты листьев какао и определили их антиоксидантный потенциал. Однако Osman et al. не обсуждает процианидины; также обнаружено, что общее содержание полифенолов, выделенным способом, примененным Osman et al. было низким.
В Патенте Японии 2000-060485А экстракты получили экстракцией водой/хлороводородом в течение 30 минут при 90°С. Однако процианидины и их композиция не были охарактеризованы; также обнаружено, что общее содержание полифенолов было низким. Экстракция процианидинов из бобов какао описана в Патенте США 6627232.
Таким образом, отсутствуют способы, описанные в предшествующем уровне техники, позволяющие регулирование относительных количеств мономеров, димеров и тримеров по сравнению с высшими олигомерами процианидинов, которые демонстрируют различные физиологические свойства. Дополнительно олигомеры обнаруживают наличие значительно возросшего вяжущего действия по сравнению с мономерами, димерами и тримерами. Более того, некоторые растительные вещества содержат существенные количества теобромина, который также может вызывать увеличение горечи. Следовательно, будут полезны способы, позволяющие уменьшить содержание теобромина при использовании растительных экстрактов в пищу.
Задача предоставления способа для получения содержащих полифенол композиций с высоким содержанием олигомеров полифенолов или с высоким содержанием мономеров, димеров и тримеров полифенола еще не решена. Способы, которые позволяют регулирование относительного содержания мономеров, димеров и/или тримеров и высших олигомеров процианидина (dp= от 4 до 6) и в то же время уменьшающие содержание теобромина не были известны до настоящего изобретения.
Настоящее изобретение предоставляет способ для получения содержащих полифенол композиций с высоким содержанием олигомеров полифенолов или с высоким содержанием мономеров, димеров и тримеров полифенола. Авторы настоящего изобретения усовершенствовали способ для получения содержащих полифенол композиций, который позволяет осуществить специфическое регулирование содержания мономеров, димеров и/или тримеров и высших олигомеров процианидина. Более того, настоящее изобретение значительно уменьшает содержание теобромина.
Раскрытие изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, предоставлен способ для получения полифенольных композиций, включающий первую стадию экстракции растительного сырья однофазной смесью воды и, по меньшей мере, первого органического растворителя при перемешивании, чтобы получить первый экстракт с высоким содержанием олигомеров полифенола. Также предоставлен способ, который дополнительно включает вторую стадию экстракции, по меньшей мере, части первого экстракта двухфазной смесью воды и, по меньшей мере, второго органического растворителя при перемешивании, чтобы получить второй экстракт с высоким содержанием мономеров, димеров и тримеров полифенола.
Один частный вариант осуществления, соответствующий настоящему изобретению, относится к способу для получения полифенолсодержащих композиций, включающему первую стадию экстракции растительного сырья однофазной смесью воды и, по меньшей мере, первого органического растворителя при перемешивании, чтобы получить первый экстракт с высоким содержанием олигомеров полифенола и вторую стадию экстракции, по меньшей мере, части первого экстракта двухфазной смесью воды и, по меньшей мере, второго органического растворителя при перемешивании, чтобы получить второй экстракт с высоким содержанием мономеров, димеров и тримеров полифенола.
Дополнительный вариант осуществления способа для получения содержащих полифенол композиций в соответствии с настоящим изобретением использует обработку паром, сушку и/или обезжиривание растительного сырья в качестве исходного материала.
В альтернативном варианте осуществления, в соответствии с настоящим изобретением, способ дополнительно включает необязательную стадию, такую как лиофилизацию или распылительную сушку водного раствора или суспензии, полученных экстракцией растительного сырья на первой стадии.
Более того, также предоставлены содержащие полифенол композиции, получаемые указанными способами, так же как и пищевые продукты, получаемые включением в их состав композиций.
Более того, настоящее изобретение относится к использованию композиций в качестве пищевого ингредиента, лекарственного средства и косметических продуктов.
Способ, соответствующий настоящему изобретению, предоставляет решение для вышеуказанной проблемы, в котором специфически регулируют содержание мономеров, димеров и/или тримеров и высших олигомеров процианидина и уменьшают содержание теобромина. Растительное сырье, использованное в способе настоящего изобретения, может быть любым растительным сырьем, содержащим полифенолы. В частности, может быть использовано любое растительное сырье, содержащее процианидин. Растительное сырье может быть каким-либо из группы, выбранной из фруктов, зерновых, бобовых, орехов, специй, чая и т.д. Отдельный предпочтительный класс полифенолов, соответствующих настоящему изобретению представляет собой проантоцианидины, такие как процианидины. «Процианидины» в контексте настоящего изобретения включают проантоцианидины на основе катехина и на основе эпикатехина, так же как и катехины. Предпочтительные полифенолы также включают полифенол-о-гликозиды (например, флавонол-О-гликозиды, флавон-О-гликозиды), полифенол-С-гликозиды (например, флавон-С-гликозиды), катехины, N-(гидроксифенилпрпеноил)L-аминокислоты, антоцианины, кловамид и дидиоксикловамид.
Примеры форм фруктов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают целые фрукты, кусочки фруктов, пюре, соки, концентраты соков и их смеси. Примеры фруктов включают сердцевину артишока, клюкву, чернику, сливу, черную смородину, клубнику, яблоки, зеленый виноград, крыжовник, персики, красную смородину и зеленую грушу. Зерновые включают цельное или дробленое зерно или материалы на основе муки. Бобовые включают целые или дробленые бобовые и родственное растительное сырье. Зерновые и бобовые включают какао, листья какао, створки стручков какао, sumac sorghum, фасоль, красную фасоль и ячмень. Орехи включают фундук, пекан, фисташки, миндаль и грецкие орехи. Пряности включают корицу. Чай включает зеленый чай. Более того, растительное сырье, соответствующее изобретению, включает листья кофе, стручки кофе и ягоды кофе.
Предпочтительные примеры растительного сырья включают листья какао, створки стручков какао, зеленый чай и листья кофе. Растительное сырье может быть в форме порошка или в другой форме, подходящей для экстракции.
В соответствии с настоящим изобретением, растительное сырье экстрагируют на первой стадии, используя однофазную смесь воды и, по меньшей мере, первого органического растворителя при перемешивании. Первый органический растворитель, который используют совместно с водой в однофазной смеси, в соответствии со способом настоящего изобретения может быть любым органическим растворителем, который способен смешиваться с водой. Предпочтительно, первый органический растворитель представляет собой какой-либо растворитель, выбранный из группы, состоящей из спиртов и кетонов. Спирты, соответствующие настоящему изобретению, включают ацетон и метилэтилкетон. Предпочтительно, в качестве первого растворителя на первой стадии, в соответствии с настоящим изобретением, используют ацетон.
Растительное сырье, используемое для способов, в соответствии с настоящим изобретением, может быть обработано паром, высушено и/или обезжирено. Обработку паром, в соответствии с изобретением, осуществляют общепринятыми способами, используя водяной пар. Предпочтительно, обработку паром осуществляют в течение приблизительно 5 минут при 98°C для уменьшения активности полифенолоксидазы и увеличения общего выхода полифенола. Сушку осуществляют в течение нескольких часов при повышенной температуре, предпочтительно до 40°С. Необязательную стадию обезжиривания могут выполнять, используя неполярный растворитель. Предпочтительно, неполярные растворители, такие как гексан, используют для обезжиривания, и обезжиривание может быть выполнено в оборудовании Soxhlet.
Однофазная смесь, используемая на первой стадии способа, в соответствии с настоящем изобретением, содержит от 50 до 80 объемных %, предпочтительно от 60 до 80 объемных % и более предпочтительно от 65 до 75 объемных % органического растворителя и от 20 до 50 объемных %, предпочтительно от 25 до 40 объемных % и более предпочтительно от 27 до 35 объемных % воды. В отдельном предпочтительном варианте осуществления, однофазная смесь, кроме того, содержит кислоту, например, в количестве до 5 объемных %, предпочтительно до 3 объемных %. Кислота способствует предупреждению окисления и полимеризации процианидинов.
Кислоты для осуществления первой стадии настоящего изобретения включают какие-либо из муравьиной кислоты, уксусной кислоты, соляной кислоты и фосфорной кислоты. Уксусная кислота представляет собой частный предпочтительный пример кислот. Первую стадию экстракции растительного сырья однофазной смесью выполняют при температуре от 10 до 60°С, предпочтительно при температуре от 20 до 50°С и более предпочтительно при температуре от 35 до 45°С. Кроме того, первую стадию предпочтительно выполняют при нормальном давлении в течение от 10 минут до 4 часов, предпочтительно в течение от 30 минут до 2 часов. Первый экстракт, таким образом полученный, может быть сконцентрирован выпариванием и/или лиофилизацией, или сушкой распылением.
Способ получения содержащих полифенол композиций, в соответствии с настоящим изобретением, включающий первую стадию экстракции растительного сырья однофазной смесью при перемешивании, дает в результате первый экстракт с высоким содержанием олигомеров полифенола. Олигомеры полифенола, в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой тетрамеры, пентамеры и гексамеры процианидина (т.е. степень полимеризации от 4 до 6). Первый экстракт, который богат олигомерами полифенола, содержит от 15 до 25 масс.%, предпочтительно от 18 до 23 масс.% тетрамеров полифенола, от 18 до 30 масс.%, предпочтительно от 20 до 25 масс.% пентамеров полифенола и от 10 до 20 масс.%, предпочтительно от 11 до 18 масс.% гексамеров полифенола, исходя из общей концентрации процианидина. Первый экстракт, который богат олигомерами полифенола, может содержать до 10 масс.% мономеров процианидина (например, катехин и эпикатехин), до 20 масс.% димеров прицианидина и до 25 масс.% триммеров процианидина, исходя из общей концентрации процианидина. В предпочтительном варианте осуществления первый экстракт содержит не более чем от 3 до 8 масс.% мономеров процианидина, не более, чем от 12 до 19 масс.% димеров процианидина и не более, чем от 15 до 20 масс.% триммеров процианидина, исходя из общей концентрации процианидина.
В соответствии с настоящим изобретением, первый экстракт или его часть, которая богата олигомерами полифенола, может быть экстрагирована бифазной смесью воды и, по меньшей мере, второго органического растворителя при перемешивании, для получения второго экстракта с высоким содержанием мономеров и димеров полифенола. Второй экстракт содержит от 10 до 30 масс.%, предпочтительно более, чем 13 масс.% мономеров процианидина, от 20 до 35 масс.%, предпочтительно от 23 до 30 масс.% димеров процианидина, также от 18 до 28 масс.%, предпочтительно от 20 до 25 масс.% триммеров процианидина, исходя из общей концентрации процианидина. Кроме того, второй экстракт может содержать до 20 масс.% тетрамеров процианидина, до 15 масс.% пентамеров процианидина и до 10 масс.% гексамеров процианидина, исходя из общей концентрации процианидина. Предпочтительно, второй экстракт содержит не более, чем 19 масс.% тетрамеров процианидина, не более, чем 12 масс.% пентамеров процианидина и не более, чем 7 масс.% гексамеров процианидина, исходя из общей концентрации процианидина.
Бифазная смесь воды и, по меньшей мере, второго органического растворителя, который используют в соответствии с настоящим изобретением, на необязательной второй стадии экстракции первого экстракта может содержать какой-либо органический растворитель, который образует бифазную смесь с водой. Указанный второй органический растворитель предпочтительно выбран из группы, состоящей из этилацетата, дихлорметана, хлороформа, диэтилового эфира, петролейного эфира, гексана и их смеси.
Вторую стадию экстракции первого экстракта проводят при температуре от 10 до 40°С, предпочтительно при температуре от 15 до 35°С и наиболее предпочтительно при температуре от 20 до 25°С. Кроме того, указанную вторую стадию предпочтительно выполняют при нормальном давлении и объем второго органического растворителя, используемого для экстракции, составляет от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,2 до 2 и более предпочтительно от 0,3 до 1, исходя из объема водной фазы бифазной смеси. Однако, другое объемное соотношение может быть применимо, в зависимости от растворимости полифенолов во втором органическом растворителе. Экстракция может быть повторена, и экстракт таким образом полученный может быть сконцентрирован выпариванием и/или лиофилизацией или сушкой распылением.
Другими словами, предоставлен способ получения содержащих полифенол композиций, включающий первую стадию экстракции растительного сырья, такого как листья какао однофазной смесью воды и, по меньшей мере, первого органического растворителя при перемешивании, в котором однофазная смесь может содержать кислоту, такую как уксусная кислота, таким образом предоставлять первый экстракт, который обогащен олигомерами полифенола в переводе на общее содержание полифенола. «Обогащенный олигомерами полифенола» в контексте настоящего изобретения, означает, что экстракт содержит больше олигомеров процианидина, чем мономеров процианидина, димеров процианидина и тримеров процианидина.
Кроме того, предоставлен способ, который дополнительно включает вторую стадию эктракции первого экстракта или его части смесью воды и, по меньшей мере, второго органического растворителя, который формирует двухфазную систему с водой, таким образом, предоставляет второй экстракт, который обогащен мономерами процианидина, димерами процианидина и тримерами процианидина, исходя из общего содержания полифенола. «Обогащенный мономерами процианидина, димерами процианидина и тримерами процианидина» в контексте настоящего изобретения, означает, что экстракт содержит больше мономеров процианидина, димеров процианидина и тримеров процианидина, чем олигомеров процианидина.
Кроме того, второй экстракт демонстрирует уменьшенное содержание теобромина. В предпочтительном варианте осуществления, в соответствии с настоящим изобретением, содержание теобромина во втором экстракте уменьшено до половины содержания теобромина в первом экстракте. В отдельном предпочтительном варианте осуществления, в соответствии с настоящим изобретением, второй экстракт содержит только приблизительно треть содержания теобромина в первом экстракте.
Изобретение также предоставляет содержащиеся полифенол композиции, получаемые указанными способами. Кроме того, изобретение также направлено на продукты питания, такие как шоколад, напитки какао, напитки кофе, содержащие какао продукты, содержащие шоколад продукты, содержащие кофе продукты и напитки или освежающие напитки, которые получают введением в их состав указанных композиций, так же как и на их использование в качестве пищевого ингредиента, на использование их в качестве лекарственного средства или в качестве косметических средств.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 иллюстрирует способ получения содержащих полифенол композиций в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг.2 изображает относительный профиль полифенола процианидина экстракта листьев какао в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг.3 изображает относительный профиль полифенола процианидина экстракта створок стручков какао в соответствии с изобретением.
Примеры
Далее представлены специфические варианты осуществления изобретения, иллюстрирующие способы и композиции, в соответствии с настоящим изобретением.
Определение относительной концентрации олигомера процианидина (% общей, нормализованная)
Экстракты в соответствие с настоящим изобретением концентрированы, используя параллельную выпарную установку, и очищены посредством твердофазной экстракции (SPE) на Sephadex LH20 оборудовании для отделения целевого аналита от не полифенольных соединений (например, сахаров и алкалоидов). Очищенные экстракты исследованы способами HPLC, используя силикагелевую колонку с прямой фазой. Анализируемые вещества определили, используя флуоресцентный детектор. Результирующие значения вычислены с использованием внешних стандартов (выделенных из листьев какао) и выражены в единицах мг/100 г. Относительные концентрации олигомеров процианидина затем вычислили и выразили, как процент общего содержания процианидина. Указанный способ, в общем случае, основан на Gu et al., J Agric Food Chem 50, 2002, 4852-4860 и Hammerstone et al., J Agric Food Chem 47, 1999, 490-496.
Определение содержания полифенола, в соответствии с методом Фолина-Чикальтеу
Содержащие полифенол экстракты получили в соответствии с настоящим изобретением. Содержание полифенола экстракта определили вступлением экстракта в реакцию с фосфомолибденовым/фосфовольфрамовым кислотным комплексом (реактив Фолина-Чикальтеу) для образования хромогенов при щелочной рН. Голубой окрашенный раствор измерили фотометрически и определили количество посредством внешней калибровки со стандартами галлиевой кислоты. Результаты выразили в виде масс. процентов «эквивалентов галлиевой кислоты» (GAE) в единицах г/100 г. Данный способ в общем описан Singleton et al., Methods in Enzymology (Oxidants and Antioxidants, Part A) 299, 1999, 152-178.
Листья какао.
Листья какао получили из растений какао в Эквадоре, транспортировали в условиях повышенной влажности и использовали сразу же после холодильного хранения. Листья обработали паром в течение 5 минут при 98°С, сушили в течение ночи при 40°С и измельчили, используя измельчитель Retsch (SM 100, трижды 2 с при 9000 об/мин). Измельченные листья обезжирили гексаном в оборудовании Soxhlet, охладили при комнатной температуре и высушили в кристаллизаторе.
Получение из листьев какао первого экстракта, с высоким содержанием олигомеров полифенола
Приблизительно 30 г порошка обезжиренных листьев какао суспендировали в 500 мл растворителя для экстракции (ацетон/вода/уксусная кислота: 70/29,5/0,5, объем/объем/объем) в круглой колбе. Суспензию экстрагировали встряхиванием колбы при 40°С в течение 1 часа при давлении окружающей среды. После фильтрации, экстракцию повторили. Растворители, сочетанные с экстрактами удалили при сниженном давлении при 40°С, используя роторный испаритель. Конечный водный раствор высушили лиофилизацией в течение ночи. Таким образом полученный первый экстракт богат содержанием олигомеров полифенола (фиг.2).
Получение второго экстракта с высоким содержанием мономеров, димеров и триммеров полифенола
Приблизительно 2 г первого экстракта суспендировали в 500 мл дистиллированной воды в ультразвуковой ванне при комнатной температуре. Водную суспензию экстрагировали в разделительной воронке, используя этилацетат (трижды по 200 мл). Растворитель сочетанной органической фазы удалили при сниженном давлении при 40°С. Добавили дистиллированную воду к суспензии и высушили лиофилизацией в течение ночи. Таким образом, полученный второй экстракт обладал неожиданно высоким содержанием полифенола 47 масс.% (опредилили в соответствии с методом Фолина-Чикальтеу), содержащим 20 масс.% процианидинов, исходя из общего содержания полифенола. Относительный профиль процианидинов продемонстрирован на фиг.2.
Створки бобов какао.
Бобы какао получили из растений какао в Эквадоре, транспортировали при условиях окружающей среды и створки бобов отделили от мякоти и зерен. Створки стручков нарезали на маленькие куски, сушили в течение 50 часов при 40°С и измельчили, используя измельчитель Retsch (SM 100, десять раз по 5 с при 5000 об/мин). Измельченные листья обезжирили гексаном в аппарате Соксклета, охладили до комнатной температуры и высушили в кристаллизаторе.
Получение из створок стручков какао первого экстракта, с высоким содержанием олигомеров полифенола
Приблизительно 30 г порошка створок стручков какао суспендировали в 500 мл растворителя для экстракции (ацетон/вода/уксусная кислота: 70/29,5/0,5, объем/объем/объем) в круглой колбе, объемом 1 л. Суспензию экстрагировали встряхиванием колбы при 40°С в течение 1 часа при давлении окружающей среды. После фильтрации экстракцию повторили. Растворители сочетанных экстрактов удалили при пониженном давлении при 40°С, используя роторный испаритель. Конечный водный раствор высушили лиофилизацией в течение ночи. Таким образом, полученный первый экстракт богат содержанием олигомеров полифенола (фиг.2).
Получение второго экстракта с высоким содержанием мономеров, димеров и триммеров полифенола
Первый экстракт (приблизительно 2 г) суспендировали в 250 мл дистиллированной воды в ультразвуковой ванне при комнатной температуре. Водную суспензию экстрагировали в разделительной воронке, используя этилацетат (трижды по 100 мл). Растворитель объединенной органической фазы удалили при сниженном давлении при 40°С. Добавили дистиллированную воду к суспензии и высушили лиофилизацией в течение ночи. Таким образом, полученный второй экстракт обладал неожиданно высоким содержанием полифенола 49 масс.% (определили в соответствии с методом Фолина-Чикальтеу), содержащим 13 масс.% процианидинов, исходя из общего содержания полифенола. Относительный профиль процианидинов продемонстрирован на фиг.3.