СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
METHOD FOR CRYOPRESERVATION OF HAEMOPOIETIC STEM CELLS

Изобретение относится к медицине, а именно к технологии криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) крови человека, и может быть использовано в гематологических, онкологических, хирургических и других центрах для лечения больных с депрессией кроветворения химиолучевого происхождения. Проводят добавление криопротектора диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрат ядросодержащих клеток с ГСК и перемешивание сред при +4,0°C, осуществляют программное замораживание клеточной суспензии от +4,0°C до -196°C с последующим отогреванием. Смешивание сред проводят в окружении слоя толщиной 3 см из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±0,1°C. После холодовой адаптации криопакет с суспензией клеток герметизируют, помещают в металлический пенал-холдер, подвергают программному замораживанию до -196°C с последующим отогреванием биообъекта.
Изобретение позволяет повысить технологичность замораживания ГСК и их сохранность за счет обеспечения стерильности и сохранности максимального количества полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток.
В технологии консервирования гемопоэтических стволовых клеток известны способы их криоконсервирования, например, см. пп. РФ №246197 «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови» или №2233589, A01N 1/02, дата публикации патента 10.08.2004 г. «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток человека», который взят за прототип, предусматривает добавление криопротектора - 10% раствора ДМСО в концентрат ядросодержащих клеток с ГСК и перемешивание сред при +4,0°C, осуществляют программное замораживание клеточной суспензии от +4,0°C до -196°C с последующим отогреванием. Смешивание сред проводят в криопакете, который установлен в кристаллы замороженной воды (тающий лед или снег).
Недостатками такого способа криоконсервирования ядросодержащих клеток являются: способ нетехнологичен, использование в ледяной бане в качестве хладагента кристаллов замороженной воды для охлаждения критичной для ГСК экзотермической реакции, развивающейся в процессе добавления криопротектора - 10% ДМСО во взвесь ядросодержащих клеток, не только неудобно и непрактично, но и опасно из-за риска микробной контаминации биообъекта при контакте с каплями воды растаявших кристаллов льда (снега); способ не способен поддерживать во взвеси ядросодержащих клеток с ГСК температуру в диапазоне 4,0°±1°C на протяжении всего этапа подготовки к замораживанию и холодовой адаптации и не обеспечивает сохранность максимального количества полноценных криоконсервированных ядросодержащих клеток.
Техническим результатом предложенного решения является: повышение технологичности криоконсервирования клеточной взвеси с использованием современного промышленного оборудования, снижение риска инфицирования взвеси ГСК при добавлении к ней криопротектора ДМСО, повышение количества криоконсервированных ядросодержащих клеток, устойчивых к витальному красителю клеточной мембраны.
Этот результат достигается за счет помещения криопакета со взвесью ядросодержащих клеток в хладагент из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4,0±1°C, после смешивания взвеси ядросодержащих клеток с криопротектором ДМСО и холодовой адаптации клеточной суспензии при +4,0°C в течение 10 мин осуществляют ее программное замораживание до -196°C с последующим отогреванием.
После отогрева в водяной бане все пробы ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток составляло от 95,3% до 98,6%, устойчивостью к витальному красителю мембраны обладали от 73,3% до 94,5% ядерных клеток крови.
Сущность изобретения заключается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата.
Существенными признаками предложенного способа, совпадающего с известными признаками, являются: А - добавление ограждающего раствора криопротектора диметилсульфоксид в суспензию ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками при температуре +4,0°C; Б - подготовка полученной смеси к замораживанию, включающая холодовую адаптацию суспензии при +4,0°C в течение 10 мин; В - многоэтапное замораживание суспензии со стволовыми клетками до температуры -196°C с последующим отогреванием.
Существенными отличительными признаками способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови являются: Г - в качестве хладагента клеточной взвеси используют сухие обеззараженные термогранулы Lab Armor с заданной температурой +4±1°C; Д - подготовка термогранул к работе включает фасовку изделий в стеклянные 250-500 мл флаконы и термообработку в сушильном шкафу при температуре +180°C в течение 5 мин с последующим охлаждением до +4°C.
Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови заключается в следующем. Перед криоконсервированием ГСК проводят подготовку клеточной суспензии, являющейся концентратом ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками, к замораживанию. Концентрат ядросодержащих клеток получают методом сепарации на аппарате Amicus в объеме от 38,0 до 81,0 (56,3±7,3) мл в стандартные полимерные контейнеры, откуда закрытым способом переводят в пластиковые криопакеты, герметизируют, после чего переносят в емкость для охлаждения клеточной взвеси, помещают в хладагент из сухих обеззараженных термогранул Lab Armor с заданной температурой +4±1,0°C. Для этого термогранулы фасуют в стеклянные 250-500 мл флаконы, подвергают термообработке в сушильном шкафе при температуре +180°C в течение 5 мин с последующим охлаждением до +4C, достигают обеззараживания термогранул, после чего охлаждают до рабочей температуры +4°±1,0°C. Термогранулы, охлажденные до температуры +4±1,0°C, способны сохранить заданный температурный режим охлажденным клеткам в течение всего этапа подготовки к замораживанию. Далее суспензию ГСК замораживают поэтапно до - 196°C. После отогрева в водяной бане при +38°C все пробы суспензии ядросодержащих клеток с гемопоэтическими стволовыми клетками были стерильными, количество морфологически сохранных ядерных клеток составляло от 95,3% до 98,6%, а устойчивостью к витальному красителю мембраны обладали от 73,3% до 94,5% ядерных клеток крови.
Сравнительный анализ используемых критериев при оценке заявляемого и известного способов криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови представлен в таблице 1.
Предлагаемый «Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток» крови по сравнению с прототипом:
а) обладает повышенной технологичностью;
б) обеспечивает стерильность криоконсервированной клеточной суспензии;
в) обеспечивает морфологическую сохранность большего количества ядерных клеток;
г) обеспечивает высокую устойчивость к витальному красителю мембран большего количества криоконсервированных ядерных клеток.
При использовании фондов научно-технической литературы эквивалентных решений не обнаружено, что подтверждает новизну предлагаемого способа криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток крови.
Использование простых приемов и доступного оборудования подтверждает промышленную применимость.
Неочевидность и оригинальный подход к решению проблемы подтверждает изобретательский уровень.
Исследования выполнены на базе лаборатории консервирования крови и тканей, гематологической клиники ФГБУН «Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России» и кафедры физики и методики обучения физике факультета информатики, математики и физики ФГБОУ ВПО «Вятский государственный гуманитарный университет Минобрнауки России».