Метод получения препарата частиц адено-ассоциированного вируса из клеточных лизатов

1. Способ выделения частиц адено-ассоциированного вируса из клеточной культуры, трансфицированной этим вирусом, включающий следующие стадии:
(а) получают трансфицированную клеточную культуру, содержащую клетки и среду для их культивирования;
(б) лизируют клетки из полученной клеточной культуры с помощью детергента, при этом добавляют эффективные количества ферментов ДНКазы I и РНКазы А;
(в) удаляют клеточный дебрис с помощью центрифугирования;
(г) осаждают вирусные частицы с помощью полиэтиленгликоля и затем ресуспендируют их в водно-солевом буферном растворе;
(д) добавляют хлороформ, интенсивно перемешивают для получения эмульсии и экстрагируют вирусные частицы в водную фазу посредством центрифугирования;
(е) наносят водную фазу из стадии (д), содержащую вирусные частицы, на градиент плотности йодиксанола, подвергают указанные компоненты ультрацентрифугированию и собирают вирусные частицы из градиента плотности йодиксанола после ультрацентрифугирования;
(д) очищают вирусные частицы от компонентов градиента йодиксанола методом диализа, используя диализную мембрану с размером пор от 50 до 200 кДа,
при этом указанный способ выделения частиц адено-ассоциированного вируса характеризуется средним выходом функциональных вирусных частиц около 40%.
2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в составе клеточной культуры для наработки вируса используют клетки линии HEK293.
3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве детергента используют Triton X-100 или дезоксихолат натрия.
4. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве водно-солевого буферного раствора используют натрий-фосфатный буфер, содержащий 350 мМ хлорида натрия, 2,7 мМ хлорида калия, 10 мМ гидрофосфата натрия, 1,76 мМ диидрофосфата калия.
5. Способ по п.1, характеризующийся тем, что содержание полиэтиленгликоля при осаждении вирусных частиц составляет 8% (w/v).
6. Способ по п.1, характеризующийся тем, что соотношение объемов хлороформа и водно-солевого раствора, содержащего вирусные частицы, составляют 1:1.
7. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве градиента плотности йодиксанола применяется градиент с фракциями по содержанию йодиксанола 60%, 40% и 25%.
8. Способ по п.1, характеризующийся тем, что используется диализная мембрана с размером пор 100 кДа.