Композиция с противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью на основе секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и способ ее получения
COMPOSITION WITH ANTI-INFLAMMATORY AND IMMUNOSUPPRESSIVE ACTIVITY BASED ON THE SECRETOME OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STROMAL CELLS AND A METHOD FOR ITS PREPARATION

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно – к фармакологии и фармации, и может быть использовано для получения лекарственных средств с противовоспалительным, иммуномодулирующим и ранозаживляющим свойствами на основе секретома культур клеток.
Известно использование глюкокортикостероидных гормональных препаратов с противовоспалительной и иммуносупрессивной целью. При этом глюкокортикоиды являются препаратами с очень широким спектром биологической активности. Они влияют на все виды обмена веществ: углеводный, белковый, жировой, водно-солевой; подавляют активность фосфолипаза А2, таким образом нарушая образование арахидоновой кислоты из фосфолипидов; подавляют экспрессию циклоксигеназы 2, нарушая образование простагландинов; подавляют деление и функциональную активность лимфоцитов, в первую очередь, Т-клеток; снижают продукцию множества цитокинов, особенно, активирующих клетки иммунной системы, и антител; стабилизируют мембраны клеток, снижая их секреторную и миграционную активность; повышают чувствительность рецепторов к катехоламинам, что приводит к повышению давления; модифицируют психические и поведенческие реакции, например, усиливают аппетит; подавляют деление клеток кожи при местном применении.
Столь широкий охват регулируемых процессов имеет и обратную сторону – не менее широкий спектр побочных эффектов и осложнений:
1) сахарный диабет;
2) ожирение;
3) атрофия мышц;
4) остеопороз и патологические переломы;
5) катаракта;
6) язвенное поражение слизистых оболочек желудка и 12-перстной кишки с кровотечениями;
7) артериальная гипертензия;
8) иммуносупрессия с развитием инфекционных осложнений;
9) обострение хронических инфекций, в т.ч туберкулеза;
10) атрофия кожи;
11) обострение психических заболеваний и ряд других менее тяжелых.
Таким образом, длительное применение высокоэффективных препаратов, содержащих глюкокортикоидные гормоны, при самооподдерживающемся воспалении (чаще всего – аутоиммунного генеза) невозможно из-за абсолютно неизбежного развития какого-либо осложнения, обусловленного их плейотропным действием (1, 2).
В этой связи ведется поиск альтернативных препаратов, обладающих сходной по выраженности противовоспалительной активностью, но с меньшим числом побочных эффектов. Было обнаружено, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки и их секретом обладают искомым набором свойств (10).
Прототипом является секретом мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, которые культивируют на бессывороточной питательной среде в течение 24-96 часов. Жировая ткань является легко доступным источником ММСК, а их количество в ней и противовоспалительный потенциал выше, чем у костномозговых ММСК. Однако секретом нативных, ничем не индуцированных, ММСК жировой ткани обладает меньшей способностью к подавлению продукции провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-α, IL-2, IL-9, IL-17, IFN-γ), чем предлагаемая композиция (8, 9). При этом известные варианты стимуляции ММСК физическими факторами или химическими факторами отличаются от предлагаемых нами (3-7).
Технический результат – повышение противовоспалительной и иммуномодулирующей активности.
Технический результат достигается использованием композиции с противовоспалительной и иммуносупрессивной активностью на основе секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, отличающейся тем, что содержит следующие белки, определяемые масс-спектрометрически в условных единицах “peptide ion abundance” (PIA), принятых за стандарт в этом методе исследования:
Название белка
Среднее нормализованное содержание, PIA
Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 (BGH3_HUMAN)
5.89e+007
Decorin (PGS2_HUMAN)
3.93e+007
Plasma protease Cl inhibitor (IC1JHUMAN)
8.93e+006
Protein disulfide-isomerase (PDIA1_HUMAN)
1.78e+006
Fibulin-1 (FBLN1_HUMAN)
1.42e+006
Dickkopf-related protein 1 (DKK1_HUMAN)
2.65e+006
Galectin-1 (LEG1_HUMAN)
2.31e+006
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PJHUMAN)
9.84e+005
Profilin-1 (PR0F1_HUMAN)
1.30e+006
Laminin subunit alpha-2 (LAMA2_HUMAN)
5.87e+005
Fibromodulin (FMODJHUMAN)
7.60e+005
Endoplasmic reticulum chaperone BiP (BIP_HUMAIM)
8.34e+005
Hemoglobin subunit alpha (HBAJHUMAIM)
2.47e+006
Alpha-actinin-4(ACTN4_HUMAN)
5.26e+005
Beta-mannosidase(MANBA_HUMAN)
7.77e+004
Thioredoxin (THIO_HUMAN)
9.73e+005
Cystatin-C (CYTC_HUMAN)
2.15e+006
Legumain (LGMN_HUMAN)
1.54e+006
Nucleoside diphosphate kinase В (NDKB_HUMAN)
9.84e+005
Lysosomal protective protein (PPGB_HUMAN)
7.88e+005
Reticulocalbin-3(RCN3_HUMAN)
1.42e+004
Thymosin beta-4 (TYB4HUMAN)
6.99e+006
Cathepsin К (CATK_HUMAN)
8.82e+005
Beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA_HUMAN)
4.28e+005
Целью изобретения является получение новой композиции биологического происхождения, содержащего комплекс гуморальных факторов ММСК, для создания на его основе лекарственных средств, а также разработка способа ее получения. Композиция должна обладать высокой противовоспалительныой, иммуномодулирующей активностью, сопоставимой с активностью глюкокортикостероидных гормонов и превышающей активность композиции, полученной из секретома нестимулированных ММСК.
Поставленная задача достигается использованием в качестве указанной композиции кондиционированной среды (супернатанта) от культуры ММСК, предварительно подвергнутых индукции глюкокортикоидными гормонами in vitro.
.
Изобретение осуществляется следующим образом
ММСК получали из фрагментов жировой ткани или липоаспирата, полученных у добровольцев, подписавших информированное согласие на безвозмездное донорство жировой ткани во время оперативных вмешательств на животе.
Цельные образцы жировой ткани подвергали микродисссекции ножницами до фрагментов 1-2 мм, после чего инкубировали в течение 2 часов с 0,075% раствором коллагеназы 2 типа при 37°С на шейкере. Затем ферментированный образец центрифугировали при 450g 10 минут, удаляли надосадочную жидкость с остатками неферментированного жира, а клеточный осадок отмывали дважды фосфатно-солевым буфером (рН = 7,2-7,4).
Липоаспират предварительно центрифугировали при 400g 10 мин, жировую ткань переносили в пробирки 50 мл, куда добавляли 0,075% раствор коллагеназы и далее работали, как описано выше.
Полученный осадок клеток после отмывания ресуспендировали в среде α-МЕМ с 10% эмбриональной бычьей сыворотки, с добавлением антибиотиков и антимикотиков, помещали в культуральные флаконы для адгезивных культур. Выращивание вели во влажной атмосфере с 5% СО2 при 37°С. Через 48 часов микроскопически контролировали прикрепление клеток к дну флаконов, удаляли среду с неприкрепившимися клетками, детритом, вносили свежую среду прежнего состава и продолжали культивирование в условиях СО2-инкубатора.
-
-
-
+
+
+
После получения культуры ММСК ее идентифицировали методом проточной цитометрии по составу поверхностных маркеров: CD31CD34CD45CD73CD90CD105, и по способности к дифференцировке не менее, чем в 2-х направлениях: остеогенном и адипогенном. Подтверждение типовых характеристик ММСК и получение секретома проводили параллельно или подвергали криоконсервации в 90% сыворотке крупного рогатого скота с добавлением 10% диметилсульфоксида, с хранением в парах жидкого азота при -190°С.
2
2
2
-6
-4
Для получения предлагаемой композиции клетки высаживали на культуральные флаконы в одну из питательных сред: α-MEM, DMEM/F12 или DMEM c добавлением 10% сыворотки эмбрионов коров, с культивированием во влажной атмосфере 5-8% СО при 37°С. В случае посева криоконсервированных клеток, через сутки не прикрепившиеся клетки отмывали стерильным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и добавляли свежую среду того же состава. Культивирование вели до достижения клетками 85-95% конфлюэнтности, после чего к среде добавляли дексаметазон или другой водорастворимый глюкокортикоид в конечной концентрации 10 – 10 моль/л. Клетки инкубировали во влажной атмосфере 5-8% СО при 37°С в течение 1-24 часов, достаточных для проникновения глюкокортикоида в ядро клеток и оказания им эффекта. После этого среду удаляли, клетки отмывали 1-2 раза раствором ФСБ, затем к клеткам добавляли ту же бессывороточную среду, на которой проводили предварительное культивирование (α-MEM, DMEM/F12 или DMEM). Культуральную посуду с клетками помещали во влажную атмосферу 5-8% СО при 37°С на 16-96 часов. После этого среду, кондиционированную ММСК, собирали, центрифугировали при 400g 10 минут для удаления остатков клеток. Надосадок для удаления солей и низкомолекулярных веществ подвергали ультрадиафильтрации через мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа, в 10 кратном объеме бидистиллированной воды. Полученный концентрат подвергали высушиванию на роторном испарителе при температуре 37-40°С. Перед исследованием сухой остаток растворяли в ФСБ с нормализацией по содержанию общего белка 1 мг/мл.
Примеры. Полуколичественные отличия в составе секретома ММСК, индуцированных глюкокортикоидом, и необработанных ММСК представлены в таб. 1. Предлагаемая композиция отличается не менее, чем 4-кратным содержанием 24 белков.
Предлагаемая композиция сильнее подавляет продукцию провоспалительных цитокинов по сравнению с прототипом, представленным секретомом нативных ММСК: TNF-α до 17% от контроля против 45%, IL-1β до 42% от контроля против 53%, IL-9 до 28% от контроля против 50%, IL-17A до 20% от контроля против 62% (фиг.1).
Кроме того, предлагаемая композиция более выраженно подавляет продукцию цитокинов иммунного ответа Th2-типа, а именно IL-4 на 52% от контроля против 74% для прототипа, IL-5 на 45% от контроля против 68% для прототипа (фиг. 2). Указанные цитокины играют большую роль в развитии IgE-опосредованных аллергических реакций и эозинофильного воспаления.
Также предлагаемая композиция в отличие от прототипа тормозит пролиферацию донорских лимфоцитов в культуре при стимуляции их фитогемагглютинином на 38% по сравнению с контролем и на 48% по сравнению с прототипом по данным проточной цитометрии (фиг.3 и фиг. 5). В качестве меры измерения выбрана метрика разрешения, которую вычисляли по формуле, представленной на фиг. 4. В отличии от прямого сравнения медиан интенсивности сигнала, данный показатель не зависит от случайных выбросов.
Таб. 1. Отличия в белковом составе между предлагаемой композицией и прототипом.
N
ID UniProt
Название белка
Среднее нормализованное содержание, PIA
Кратность отличия концентрации
Прототип
Композиция
1
Q15582
Transforming growth factor- beta-induced protein ig-h3 (BGH3_HUMAN)
1.23e+007
5.89e+007
4.77
2
P07585
Decorin (PGS2_HUMAN)
8.07e+006
3.93e+007
4.87
3
P05155
Plasma protease Cl inhibitor (IC1JHUMAN)
2.17e+006
8.93e+006
4.12
4
P07237
Protein disulfide-isomerase (PDIA1_HUMAN)
3.85e+005
1.78e+006
4.61
5
P23142
Fibulin-1 (FBLN1_HUMAN)
2.12e+005
1.42e+006
6.68
6
094907
Dickkopf-related protein 1 (DKK1_HUMAN)
5.11e+005
2.65e+006
5.19
7
Р09382
Galectin-1 (LEG1_HUMAN)
5.20e+005
2.31e+006
4.44
8
Р04406
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PJHUMAN)
1.58e+005
9.84e+005
6.24
9
Р07737
Profilin-1 (PR0F1_HUMAN)
2.36e+005
1.30e+006
5.52
10
Р24043
Laminin subunit alpha-2 (LAMA2_HUMAN)
5.60e+004
5.87e+005
10.49
И
Q06828
Fibromodulin (FMODJHUMAN)
7.09e+004
7.60e+005
10.72
12
Р11021
Endoplasmic reticulum chaperone BiP (BIP_HUMAIM)
1.65e+005
8.34e+005
5.05
13
Р69905
Hemoglobin subunit alpha (HBAJHUMAIM)
5.17e+005
2.47e+006
4.77
14
043707
Alpha-actinin-4(ACTN4_HUMAN)
1.02e+005
5.26e+005
5.15
15
000462
Beta-mannosidase(MANBA_HUMAN)
3.22e+005
7.77e+004
4.15
16
Р10599
Thioredoxin (THIO_HUMAN)
2.98e+004
9.73e+005
32.61
17
Р01034
Cystatin-C (CYTC_HUMAN)
3.56e+005
2.15e+006
6.02
18
Q99538
Legumain (LGMN_HUMAN)
2.18e+005
1.54e+006
7.06
19
Р22392
Nucleoside diphosphate kinase В (NDKB_HUMAN)
4.09e+004
9.84e+005
24.06
20
Р10619
Lysosomal protective protein (PPGB_HUMAN)
2.47e+004
7.88e+005
31.87
21
Q96D15
Reticulocalbin-3(RCN3_HUMAN)
2.24e+005
1.42e+004
15.71
22
Р62328
Thymosin beta-4 (TYB4HUMAN)
1.67e+006
6.99e+006
4.17
23
Р43235
Cathepsin К (CATK_HUMAN)
1.97e+005
8.82e+005
4.48
24
Р06865
Beta-hexosaminidase subunit alpha (HEXA_HUMAN)
3.95e+004
4.28e+005
10.84
-5
На Фиг. 1  – продукция провоспалительных цитокинов донорскими мононуклеарами под влиянием дексаметазона 10 ммоль/мл, секретома нативных и индцированных дексаметазоном ММСК в концентрациях 10 мкг общего белка на 1 мл среды.
-5
На Фиг. 2 – продукция цитокинов Th2-ответа донорскими мононуклеарами под влиянием дексаметазона 10 ммоль/мл, секретома нативных и индцированных дексаметазоном ММСК в концентрациях 10 мкг общего белка на 1 мл среды.
-5
На Фиг. 3 – экспрессия маркера пролиферации Ki-67 донорскими мононуклеарами под влиянием дексаметазона 10 ммоль/мл, секретома нативных и индцированных дексаметазоном ММСК в концентрациях 10 мкг общего белка на 1 мл среды.
На Фиг. 4 – формула расчета метрики разрешения Rd.
-5
На Фиг. 5 – гистограммы экспрессии маркера Ki-67 донорскими мононукларами под влиянием дексаметазона 10 ммоль/мл, секретома нативных и индуцированных дексаметазоном ММСК в концентрациях 10 мкг общего белка на 1 мл среды.
На всех фигурах знаком * обозначено достоверное отличие (p<0,05) влияния секретома индуцированных дексаметазоном ММСК от секретома нативных ММСК. Количество исследуемых пар образцов секретома 6, количество доноров мононуклеаров 6. Для статистической обработки использован дисперсионный анализ и критерий Ньюмена-Кейлса.
-6
-4
Поставленная задача достигается использованием в качестве указанной композиции секретома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека, полученного в результате их индукции глюкокортикоидными гормонами в концентрации 10 – 10 моль/л в течение 1-24 часов, с последующей отмывкой от индуктора и инкубацией в бессывороточной среде в течение 16-96 часов. Для очистки от низкомолекулярных соединений секретом подвергают ультрадиафильтрации в 10-кратном объеме бидистиллированной воды через мембрану с порогом отсечения по молекулярной массе 3 кДа.
Список литературы
Litt's Drug Eruptions & Reactions Manual.
1. Wiffen, P. s.l. : CRC Press, 2016. p. 546.
Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics.
2. Brunton L., Knollmann B., Hilal-Dandan R. McGraw-Hill Education,13 ed. 2017. p. 1440.
Tohoku J Exp Med.
3. Cui X., Wang H., Guo H., et al. Transplantation of mesenchymal stem cells preconditioned with diazoxide, a mitochondrial ATP-sensitive potassium channel opener, promotes repair of myocardial infarction in rats. 2010, Vol. 220, pp. 139–147.
J Biomed Sci.
4. Yao Y., Zhang F.,Wang L., et al. Lipopolysaccharide preconditioning enhances the efficacy of mesenchymal stem cells transplantation in a rat model of acute myocardial infarction. 2009, Vol. 16, p. 74.
Am J Trans Res.
5. Li N., Yang Y.J., Qian H.Y., et al. Intravenous administration of atorvastatin-pretreated mesenchymal stem cells improves cardiac performance after acute myocardial infarction: role of CXCR(2013). 2015, Vol. 7, pp. 1058–1070.
Cells Tissues Organs.
6. Kim Y.S., Ahn Y., Kwon J.S., et al. Priming of mesenchymal stem cells with oxytocin enhances the cardiac repair in ischemia/reperfusion injury. 2012, Vol. 195, pp. 428–442.
Stem Cells Int.
7. Liu J., Zhu P., Song P., et al. Pretreatment of adipose derived stem cells with curcumin facilitates myocardial recovery via antiapoptosis and angiogenesis. 2015, Vol. 2015, p. 638153.
Front. Immunol.
8. Ferreira J.R., Teixeira G.Q., Santos S.G., et al. Mesenchymal Stromal Cell Secretome: Influencing Therapeutic Potential by Cellular Pre-conditioning. 2018, Vol. 9, p. 2837.
Stem Cell Res Ther.
9. Kalinina, N., Kharlampieva, D., Loguinova, M. et al. Characterization of secretomes provides evidence for adipose-derived mesenchymal stromal cells subtypes. 2015, Vol. 6, 221.
World J Stem Cells
10. Bassi E.J., Aita C.A.M., Camara N.O.S. Immune regulatory properties of multipotent mesenchymal stromal cells: Where do we stand? 2011 January 26; 3(1): 1-8.