Способ редактирования гена GJB2 для исправления патогенного варианта c.del35G в клетках человека, культивируемых in vitro
METHOD FOR EDITING THE GJB2 GENE TO CORRECT THE PATHOGENIC VARIANT OF c.del35G IN HUMAN CELLS CULTURED IN VITRO

Изобретение относится к клеточной, молекулярной биологии экспериментальной биологии и медицине, может быть использовано для изменения генома клеток человека, культивируемых in vitro.
Настоящее изобретение не предназначено для модификации генетической целостности клеток зародышевой линии человека, не предполагает использование человеческих эмбрионов.
Метод позволяет изменять геном небольшой области (до 120 нуклеотидов) хромосомы 13 для исправления мутации патогенного генотипа c.del35G гена GJB2 (полиморфизм rs80338939). Фенотипическим проявлением этой мутации является (DFNB1) несиндромальная аутосомно-рецессивная глухота (GJB2 mutations and degree of hearing loss: a multicenter study. American Journal of Human Genetics. Snoeckx, R.L. et al., 2005; 77:945-957). Метод может быть использован для создания моделей предотвращения генетически-обусловленной глухоты на генетическом уровне, тестирования методов экспериментальной генетической терапии.
Редактирование (изменение) генома живых клеток активно развивается в последние десятилетия (ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. Gaj T. et al., 2013; VOLUME 31, ISSUE 7, P397-405). В настоящее время набравшие популярность компоненты CRISPR-Cas систем используются как основные инструменты для редактирования геномов различных организмов от простейших до млекопитающих (CRISPR Genome Editing: How to Make a Fantastic Method Even Better. Cells. Brakebusch C, 16 February 2021; 10, 408). Редактирование генома клеток человека направлено на лечение и предотвращение множества заболеваний, и производится в модельных экспериментах (CRISPR-based RNA editing: Diagnostic applications and therapeutic options. Expert Review of Molecular Diagnostics. Gulei D. et al., 2019; 19, 83-88) и в клинических испытаниях (номера на сайте ClinicalTrials.gov, NCT03655678 для препарата CLIMB THAL-111, NCT03745287 для препарата CLIMB SCD-121, NCT04601051 для препарата NTLA-2001). Остро стоит вопрос безопасности генетического редактирования (Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. Naeem M. et al., 2 July 2020; 9, 1608).
Генетическое редактирование методом CRISPR-Cas всегда включает в себя доставку ДНК, и\или РНК, и\или белковых компонентов, приводящих в конечном счете к появлению в клетках эффектор белка CRISPR-Cas систем в комплексе с гидовой РНК: это могут быть плазмиды, вирусные векторы с ДНК или мРНК, белок-РНК комплексы, капсиды вирусов, содержащие белок-РНК комплексы (Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins. Nature communications. Mangeot P.E. et al., 03 January 2019; 10, 45). Самыми безопасными способами доставки, вносящими минимальное количество нецелевых воздействий, являются те, при которых доставляется уже очищенный белок с гидовой РНК, а не РНК или ДНК конструкции, приводящие к синтезу белка машинерией клетки (Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. Liang, X. et al., 2015; 208, 44-53. Evaluation and reduction of CRISPR off-target cleavage events. Nucleic Acid Therapeutics. Vakulskas, C.A. et al., 6 Aug 2019; Vol. 29, No. 4). При этом, эти белки и гидовые РНК часто подвергаются инженерии: изменениям с целью повысить эффективность целевого воздействия на геном и с целью создания принципиально новых способов изменения генома, объединенных друг с другом только принципом комплементарного присоединения гидовой РНК к целевой последовательности ДНК (Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nature biotechnology. Anzalone, A.V. et al., 22 June 2020; 38, 824-844). Использующиеся для инициации гомологично-направленной репарации донорные молекулы ДНК также подвергаются улучшающим технологию модификациям (Improved genome editing efciency and fexibility using modifed oligonucleotides with TALEN and CRISPR-Cas9 nucleases. Cell Reports. Renaud, J.-B. et al., 2016; 14, 2263-2272).
Что касается гена-мишени, подвергающегося изменению в настоящем изобретении: мутация c.35delG в гене GJB2 (полиморфизм rs80338939 номер dbSNP), выбранная нами, является самой распространенной генетически-ассоциированной причиной аутосомно-рецессивной глухоты в России (Updated carrier rates for c.35delG (GJB2) associated with hearing loss in Russia and common c.35delG haplotypes in Siberia. BMC Medical Genetics. Zytsar M.V. et al., 07 August 2018; 19, 138). Гомозиготное носительство этой мутации вызывает серьезные нарушения слуха у подавляющего большинства людей (GJB2 mutations and degree of hearing loss: a multicenter study. American Journal of Human Genetics. Snoeckx, R.L. et al., 2005; 77:945-957). He существует полноценно восстанавливающей слух с GJB2 генетически-обусловленной глухотой терапии. Единственным способом частично восстановить слух является дорогостоящая хирургическая процедура кохлеарной имплантации (Benefits of bilateral cochlear implantation: a review. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery Brown K.D. et al., October 2007). Таким образом, целью генетической модификации является мутация, вызывающая социально значимое, не имеющее полноценного метода лечения, заболевание.
Известен способ генетического изменения клеток человека с помощью генотерапевтического ДНК-вектора (WO 2021137742, А1). Данный способ осуществляет экспрессию выбранного гена HFE с помощью доставленной в клетки ДНК бактериальной плазмиды. В рамках изобретения, способ был протестирован в том числе в клетках кожи пациентов (в организме человека, а не в клетках, культивируемых в пробирке). Недостатками этого изобретения являются: продолжительная и неконтролируемая экспрессия гена HFE с ДНК матрицы, что в рамках изобретения не является критичным, но не применимо к ферментам, осуществляющим генетическое редактирование; данный способ не подразумевает изменение генома хромосом клеток человека, однако, не смотря на меры предосторожности, не может полностью исключить вероятность интеграции в геном клеток, т.к. использует двуцепочечную ДНК плазмиды. Этот метод фокусируется на генах, отличных от GJB2, и таким образом, не может быть использован для решения проблемы предлагаемого нами изобретения.
Известен способ изменения генома эмбрионов животных (US2020385753, А1). Способ полагается на работу ферментов цитидин-деаминаз или аденозин-деаминаз и компонентов CRISPR-Cas систем, соединенных с данными ферментами в один полипептид методом генной инженерии. Компоненты CRISPR-Cas при этом не способны создавать разрезы в ДНК (например т.н. dCas9), это является повышающим безопасность генетического воздействия преимуществом изобретения. Недостатками этого метода являются: не способность изменять геном, производя делеции или вставки нуклеотидов; способность производить только ограниченный набор замен одного нуклеотида в другой (только в рамках функционирования ферментов деаминаз); не смотря на заявление о работоспособности метода для эмбрионов любых млекопитающих, работоспособность метода была продемонстрирована только на эмбрионах мышей; в ряде вариаций способа (например при микроинъекции в зиготу), использовался раствор мРНК молекул, кодирующих гены редактирующих ферментов, это не позволяет контролировать дозировку ферментов и делает метод менее безопасным.
Известен способ локального (не более 90 нуклеотидов) генетического редактирования эмбрионов мышей (RU 2757121, С1). Способ осуществляется с помощью элементов системы CRISPR-Cas. В зиготу мыши через 12 часов после оплодотворения вводят компоненты системы CRISPR-Cas и донорную ДНК в буферном растворе (10 мМ Tris-HCl с рН 7.4 и 0.1 мМ EDTA). Компоненты CRISPR-Cas инициируют двуцепочечный разрез (разрыв) ДНК в выбранном месте (в 6-м экзоне гена GNAO1) и представляют из себя: мРНК с последовательностью cas9 гена организма Streptococcus pyogenes, гидовая РНК (РНК-гида) 5'-GCTTTCCCTGACTCCCTGC-3'. Донорная ДНК служит матрицей для гомологично-направленной репарации, производимой белками зиготы мыши, и является 90-нуклеотидной последовательностью одноцепочечной ДНК, комплементарной области создания разреза. Недостатками этого способа являются: трансляция Cas9 белка с мРНК, что не позволяет контролировать точное количество белка в зиготе, по сравнению с доставкой очищенного белка, и в среднем увеличивает количество нежелательных эффектов редактирования; выбор донорной ДНК достаточно короткой длины (90 нуклеотидов), что снижает вероятность гомологично-направленной репарации, синтез донорной ДНК без химических модификаций связей нуклеотидов, что делает донорную ДНК доступной для деградации экзонуклеазами клетки (зиготы), в совокупности это приводит к необходимости использовать в способе донорную ДНК в относительно большой концентрации (5 мкМ), это может оказывать цитотоксический эффект на клетки; введение смеси редактирующих геном компонентов производят через 12 часов после оплодотворения, что позже начала S-фазы (и начала копирования ДНК), что повышает риск мозаицизма в развивающемся из зиготы организме. Этот метод фокусируется на генах, отличных от GJB2, и таким образом, не может быть использован для решения проблемы предлагаемого нами изобретения.
Известен способ изменения всего гена GJB2 эмбриона свиней (CN110511962, А). Метод использует создание двух разрезов обеих цепей ДНК в геноме зиготы свиней для замещения всего гена GJB2 свиней на человеческий. Человеческий ген при этом имеет мутации, приводящие к нарушениям слуха у человека. Недостатками метода является: использование двух разрезов обоих цепей ДНК, что приводит к большой вероятности делеции всего гена. Изобретение фокусируется на модели животных, и не предусматривает работу с клетками или клеточными линиями человека. Данный способ не предлагает генетического исправления мутации (генетической терапии), а напротив, создает мутации в геноме свиней, приводящие к потере слуха.
Известен способ, временно замещающий ген GJB2 в клетке человека (US 2021079406, A1). Способ использует AAV вирусный вектор для доставки в клетки человека или животного ДНК, несущей правильную копию гена. Некоторое время после доставки, ДНК существует в клетке и обеспечивает присутствие функционирующего белка, кодируемого GJB2 геном. Данный метод не обеспечивает постоянное присутствие правильного функционирующего белка, а лишь временную его экспрессию (до тех пор, пока в клетке присутствует ДНК вирусного вектора). Также, ген находится под промотором, не обеспечивающим экспрессию гена на уровне, идентичном здоровой клетке. Некорректный уровень экспрессии (как меньший, так и больший) может привести к патогенным процессам и даже гибели клеток.
Проблемой, на решение которой направлено данное изобретение, является неизбежное серьезное нарушение слуха у людей с мутацией c.del35G в гомозиготной форме, и отсутствие мер, в полной мере восстанавливающих слух, а также отсутствие генетической терапии, исправляющей эту мутацию. Таким образом, существует нужда в способах восстановления слуха у людей, являющихся гомозиготными носителями c.del35G. Метод редактирования генома, выбранный нами, устраняет первоначальную причину потери слуха - мутацию c.del35G.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в создании возможности исправления участка генома человека размером менее 120 нуклеотидов, несущего мутацию c.del35G в гене GJB2 человека, на вариант генома здорового человека (вариант референсного генома человека) с синонимичной заменой C.G30C в гене GJB2 в клетках, культивируемых in vitro.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Предложен способ редактирования гена GJB2 на основе CRISPR/Cas9 для исправления варианта c.del35G в клетке человека, культивируемой in vitro, исключая клетки зародышевой линии человека. Готовят смесь для редактирования, включающую гидовую РНК, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1, ДНК олигонуклеотид, представляющий собой последовательность 5'-Т*С*GTCTTTTCCAGAGCAAACCGCCCAGAGTAGAAGATGGATTGGGGCACGCTGCAGAC GATCCTCGGGGGTGTGAACAAACACTCCACCAGCATTGGAAAGATCTGGCTCACCGTCC*Т*С*Т-3', где * - фосфоротиоатная межнуклеотидная связь, и белок Cas9 Streptococcus pyogenes с молярным соотношением: белок Cas9/ гидовая РНК / ДНК олигонуклеотид равным 1:1,1:2. Затем доставляют эту смесь в клетку человека, культивируемую in vitro.
Таким образом, смесь для редактирования готовят так, чтобы она содержала белок Cas9 из организма Streptococcus pyogenes, синтетическую гидовую РНК (A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. Jinek M. et al., 17 August 2012), содержащую последовательность мишени (спейсер SEQ ID NO: 1, донорный олигонуклеотид, представляющий собой последовательность 5'-T*C*GTCTTTTCCAGAGCAAACCGCCCAGAGTAGAAGATGGATTGGGGCACGCTGCAGAC GATCCTCGGGGGTGTGAACAAACACTCCACCAGCATTGGAAAGATCTGGCTCACCGTCC*Т*С*Т-3', где * - фосфоротиоатная межнуклеотидная связь связь (The 2-(N-Formyl-N-methyl)aminoethyl Group as a Potential Phosphate/Thiophosphate Protecting Group in Solid-Phase Oligodeoxyribonucleotide Synthesis. Organic Letters. Grajkowski A. et al., April 5,2001; 3,1287-1290). Молярное соотношение белка Cas9, гидовой РНК и ДНК олигонуклеотида равно 1:1,1:2.
Особенностью предлагаемого донорного олигонуклеотида, является наличие фосфоротиоатной межнуклеотидной связию связь между 1 и 2, 2 и 3, 117 и 118, 118 и 119, 119 и 120 нуклеотидами.
Разработан метод исправления мутации c.del35G гена GJB2 человека в клетках, культивируемых в условияхусловиях in vitro. Мы осуществили применение оригинальной гидовой РНК для локального изменения генома в окрестности мутации c.del35G методом CRISPR-Cas. Оригинальная гидовая РНК является максимально безопасной для других регионов генома человека: 99 из 100 возможных баллов специфичности по шкале CFD Specificity score (Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. Doench J. et al., 18 January 2016).
Изобретение включает в себя конкретные последовательности: гидовой РНК для работы CRISPR-Cas компонентов, донорного ДНК олигонуклеотида для гомологично-направленной репарации клеткой.
В то же время, другие части процесса, такие как тип клеток, метод доставки, ккультивировани, генетического анализа, могут различаться и производиться любыми из распространенных методов. Изобретение не ограничено конкретным типом клеток, исключая клетки зародышевой линии человека, методом их культивации клеток, способом доставки редактирующей смеси и генетического анализа.
Способ генетического редактирования гена GJB2 с целью исправления патогенного варианта c.del35G в клетках человека, культивируемых in vitro, исключая клетки зародышевой линии человека, включает в себя этапы: приготовление смеси для редактирования, доставку смеси в живые клетки, культивирование клеток, сбор части клеток, приготовление NGS библиотек для генетического анализа, генетический анализ методом NGS.
Для редактирования гена GJB2 с целью исправления мутации c.del35G в клетках человека, культивируемых in vitro, применяются следующие шаги:
1. Приготовить раствор очищенного белка Cas9 из CRISPR-Cas системы организма Streptococcus pyogenes (или любую модификацию этого белка, способную вносить двуцепочечные разрезы в ДНК) концентрацией выше 3-кратной финальной концентрации, в растворе 300 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol, рН 7.4 при температуре 25°С. Раствор белка хранить при температуре -20°С до смешивания.
2. На льду разморозить раствор гидовой РНК в чистой воде без РНКаз, содержащую последовательность мишени (спейсер последовательность) SEQ ID NO: 1 концентрацией выше 3-кратной финальной концентрации. До использования хранить при температуре 0-4°С, использовать не позднее чем через 30 минут после разморозки.
3. Разморозить раствор одноцепочечной ДНК в чистой воде без РНКаз концентрацией выше 3-кратной финальной концентрации донорного олигонуклеотида 5'-T*C*GTCTTTTCCAGAGCAAACCGCCCAGAGTAGAAGATGGATTGGGGCACGCTGCAGAC GATCCTCGGGGGTGTGAACAAACACTCCACCAGCATTGGAAAGATCTGGCTCACCGTCC*Т*С*Т-3', где * - фосфоротиоатная межнуклеотидная связь. До использования хранить при температуре 0-4°С, использовать не позднее чем через 3 часа после разморозки.
4. Непосредственно перед доставкой в клетки, смешать Cas9, гидовую РНК, донорный олигонуклеотид в молярной пропорции равной 1:1,1:2 в стерильном растворе 150 мМ KCl и 20 мМ HEPES-NaOH, рН7.5.
5. Инкубировать раствор не менее 10 минут и не более 25 минут в температурном диапазоне 20-37°С.
6. Доставить в клетку приготовленный раствор любым из доступных методов.
7. После доставки клетки культивировать индивидуальное время, но не менее 12 часов. В случае доставки в первичные дермальные фибробласты, рекомендуется культивирование 24-48 часов. После чего клетки можно использовать далее.
8. Для анализа результатов редактирования, часть полученных в ходе процедуры клеток отобрать, лизировать, из клеток выделить ДНК, пригодную для генетического анализа.
9. Для генетического анализа отобрать от 5 до 500 нг ДНК, полученной из отобранных клеток.
10. Смешать ДНК с компонентами ПЦР реакции общим объемом 50 мкл. Использовать можно ДНК полимеразу с корректирующей 3'>5' экзонуклеазной активностью согласно протоколу производителя. В качестве праймеров использовать олигонуклеотиды 5'-CATGGCTACGATCCGACTTTGTGCATTCGTCTTTTCCAGAGC-3' и 5'-GCTTGGCCTCCGACTTACACCTCCTTTGCAGCCACAA-3'. Данные олигонуклеодиты предназначены для подготовки образцов к NGS секвенированию на платформе DNBSEQ. Возможна адаптация данного протокола для любой другой NGS платформы.
11. ПЦР осуществить температурной программой:
11.1. 95°С 32 минуты
11.2. 10 циклов:
11.2.1. 95°С 20 секунд
11.2.2. 56°С 1 минута
11.2.3. 72°С 40 секунд
11.3. 22 цикла:
11.3.1. 95°С 20 секунд
11.3.2. 69°С 20 секунд
11.3.3. 72°С 35 секунд
11.4. 72°С 2 минуты
11.5. 4°С хранение
12. Добавить 25 мкл магнитных частиц (AMPure ХР или аналог).
13. 5 минут инкубации на комнатной температуре, поставить на магнитный штатив, отобрать супернатант в новую пробирку. Магнитные частицы из этого шага выкинуть.
14. К супернатанту добавить 100 мкл магнитных частиц (AMPure ХР или аналог).
15. 5 минут инкубации на комнатной температуре, поставить на магнитный штатив, отобрать супернатант.
16. 2 раза промыть 200 мкл 80% этанола на магнитном штативе, отобрать этанол, высушить в течение 5 минут с открытой крышкой.
17. Добавить 20 мкл сверхчистой воды (степень 1 по ГОСТ Р 52501-2005, далее «mQ_воды»), перемешать, инкубировать 5 минут на столе.
18. Перенести на магнитный штатив, отобрать 18 мкл супернатанта, перенести в новую пробирку.
19. Измерить концентрацию с помощью набора Qubit dsDNA HS, в зависимости от начального количества ДНК, взять 2 мкл или более.
20. Полученные ампликоны проанализировать гель-электрофорезом, удостовериться в длине продукта ПЦР около 200-240 пар нуклеотидов (п.н.).
21. Отобрать от 20 до 300 нг ДНК полученного в п. 18 ампликона для следующей ПЦР реакции.
22. ПЦР реакцию собрать с полимеразой КАРА HiFi PCR Kit (KR0368, КАРА BIOSYSTEMS или аналог) согласно протоколу производителя. В качестве праймеров использовать олигонуклеотиды 5'-/5Phos/GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3' и 5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACT-3', где 5'-/5Phos/ означает фосфатную группу в 5' конце праймера, NNNNNNNNNN - 10 нуклеотидов индекса NGS библиотеки платформы DNBSEQ, например, индекс 121 будет иметь последовательность TTGATCAAGG.
23. ПЦР осуществить температурной программой:
23.1. 95°С 3 минуты
23.2. 3-6 циклов (в зависимости от кол-ва ДНК в п. 21):
23.2.1. 98°С 20 секунд
23.2.2. 56°С 50 секунд
23.2.3. 72°С 50 секунд
23.3. 72°С 1 минута
23.4. 4°С хранение.
24. Провести очистку реакции и измерение концентрации идентично пп. 14-19
25. Полученные ампликоны проанализировать гель-электрофорезом, удостовериться в длине продукта ПЦР около 250-270 п.н.
26. Произвести секвенирования полученной NGS библиотеки на платформе DNBSEQ.
27. В полученных данных определить генотип клеток, подвергнутых генетическому редактированию.
Фиг. 1. Электрофорез ДНК NGS библиотек, приготовленных в соответствии с предлагаемым способом для образца клеток, не подвергнувшихся генетическому редактирования (Неред.), образца клеток, подвергнувшихся генетическому редактирования (Ред.), и для отрицательного контроля процесса приготовления NGS библиотек.
Фиг. 2. Результат интерпретации генотипирования образцов клеток, подвергнувшихся (Неред.) не подвергнувшихся генетическому редактирования, образца клеток, подвергнувшихся генетическому редактирования (Ред.). Визуализация генотипирования и отдельных NGS прочтений программным обеспечением.
Пример
В примере мы использовали созданный нами метод редактирования на дермальных фиброластах, культивируемых в планшетах, выполняя пп. 1-27, изложенные выше. Дермальные фибробласты обладают генотипом с гомозиготным носительством c.del35G. Около 100000 фибробластов было использовано для каждого эксперимента. Доставка редактирующей смеси производилась с помощью реагента Lipofectamine™ CRISPRMAX™ Cas9 (CMAX00 Invitrogen).
На фиг. 1 приведены результаты гель-электрофореза (пункта 25) осуществления способа. В качестве образцов взяты (слева направо): отрицательный контроль без ДНК (Отриц. контроль), ДНК из первичных дермальных фибробластов до редактирования предлагаемым способом (Нередактированные), ДНК из первичных фибробластов после редактирования предлагаемым способом (Редактированные). Видны продукты ПЦР - фрагменты ДНК корректной длины на основе ампликонов гена GJB2, а именно место, подвергнутое редактированию. Результат на фиг. 1 является NGS библиотеками. Отрицательный контроль приведен для доказательства специфичности ПЦР реакции к ДНК образца.
На фиг. 2 и таблице представлены результаты генотипирования полученных данных NGS секвенирования. Генотип фибробластов до редактирования поддерживает только c.del35G. После редактирования, часть прочтений (0.5%) поддерживает здоровый генотип без c.del35G с синонимичной заменой C.G30C. Это означает, что часть популяции (около 1%) клеток приобрела исправленную версию гена GJB2.
Таким образом, представленные данные подтверждают создание возможности исправления участка генома человека размером менее 120 нуклеотидов, несущего мутацию c.del35G в гене GJB2 человека, на вариант генома здорового человека (вариант референсного генома человека) с синонимичной заменой C.G30C в гене GJB2; и создание способа проверки результатов изменения генома в месте исправления мутации.
--->
Перечень нуклеотидных последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение
«Национальный медицинский исследовательский центр акушерства,
гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации (Federalnoe
gosudarstvennoe biudzhetnoe uchrezhdenie «Natsionalnyi meditsinskii
issledovatelskii tsentr akusherstva ginekologii i perinatologii
imeni akademika V.I. Kulakova" Ministerstva zdravookhraneniia
Rossiiskoi Federatsii)
<120> Способ редактирования гена GJB2 для исправления патогенного
варианта c.del35G в клетках человека, культивируемых in vitro
<160> 2
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 20
<212> РНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Часть гидовой РНК<400>1
gggcacgcug cagacgaucc 20
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 120
<212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Донорный олигонуклеотид, в котором связь между нуклеотидами 1 и 2,
2 и 3, 117 и 118, 118 и 119, 119 и 120 является фосфоротиоатной
межнуклеотидной связью
<400> 2
tcgtcttttc cagagcaaac cgcccagagt agaagatgga ttggggcacg ctgcagacga 60
tcctcggggg tgtgaacaaa cactccacca gcattggaaa gatctggctc accgtcctct 120
<---