СПОСОБ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ НЕМАТОД
METHOD OF PRODUCING ENTOMOPATHOGENIC NEMATODE-BASED BIOLOGICAL AGENTS

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам и линиям для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод, применяемых в качестве биологических препаратов в борьбе с насекомыми-вредителями.
Известен способ получения биомассы энтомопатогенных нематод, который заключается в том, что компоненты питательной среды - куриные потроха, свиной жир и воду гомогенизируют, пропитывают гомогенатом инертный носитель, засыпают питательную среду в полипропиленовые мешки и стерилизуют. В охлажденную питательную среду инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часового выращивания бактерий в питательную среду инокулируют инвазионных личинок нематод. В процессе развития нематод и бактерий в мешки с питательной средой осуществляется подача стерильного воздуха. Отделение зрелой культуры нематод от инертного носителя проводится путем распределения поролоновой крошки на сита, помещенные в корыта с водой. Осадок нематод на дне емкости спустя 2 часа концентрируют для хранения и дальнейшего использования [1].
В качестве недостатков такого способа культивирования нематод следует отметить следующие: низкий выход зрелой культуры нематод с 1 г питательной среды, трудоемкость процессов инокуляции микроорганизмов в полипропиленовые мешки с питательной средой и не технологичность процесса, связанного с необходимостью принудительной аэрации среды для обеспечения развития бактерий и нематод.
Наиболее близким из известных, принятым за прототип, является способ, включающий получение биомассы нематод с использованием полужидких питательных сред, состоящих из следующего компонентного состава: соевая мука, кукурузное масло, куриное яйцо, пивные дрожжи, поролоновая крошка и вода. После пропитки поролоновой крошки гомогенатом компонентов питательной среды ее переносят в полипропиленовые мешки, снабженные воздушными фильтрами, и автоклавируют. После охлаждения в питательную смесь инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часовой экспозиции содержимое мешков в стерильных условиях пересыпают в другую емкость, выполненную в виде прямоугольного пластмассового корыта и снабженного съемной крышкой из фольги с отверстиями для аэрации питательной среды, куда затем инокулируют и моноксенную культуру нематод. Стерилизация пластмассовых корыт осуществляется в специальном блоке с использованием открытого огня (2).
Прототипом устройства для культивирования нематод являются полипропиленовые мешки для предварительного выращивания симбиотических бактерий, размером 600×300 мм и снабженные воздушным фильтром из фторопластовой мембраны диаметром 50 мм и с размером отверстий 4 мкм. Для выращивания нематодно-бактериального комплекса используются пластмассовые корыта прямоугольной формы размером 500×500×100 мм с бортиками по наружной стороне шириной 10 мм, снабженные съемной крышкой из фольги, края которой подгибаются за внешний бортик корыта. В центре крышки на площади 40000 мм имеются отверстия диаметром 0,5 мм, в количестве - пять отверстий на каждом сантиметре квадратном.
Недостатки прототипа определяются наличием двух устройств сложной конструкции и не обеспечивающих оптимальных условий для развития бактерий и нематод, нестабильным выходом зрелой культуры нематод из-за несовершенной системы аэрации внутренней полости пластмассовых корыт с питательной средой, а так же появления посторонней микрофлоры в питательной среде, на которой развиваются бактерии и нематоды из-за сложности процессов соблюдения стерильности условий инокуляции нематод в корыта и стерилизации самих корыт,
Задача, решаемая изобретением, - повышение выхода биомассы энтомопатогенных нематод за счет сокращения операций и устройств, требующих соблюдения условий высокой стерильности с гарантией стабильности функционировании производства со снижением себестоимости конечного продукта.
Предлагаемый способ культивирования энтомопатогенных нематод заключается в том, что в процессе производства после пропитки поролоновой крошки гомогенатом компонентов питательной среды ее переносят в устройство и автоклавируют. После охлаждения в питательную смесь инокулируют жидкую культуру симбиотических бактерий. После 48-часовой экспозиции в устройство инокулируют жидкую культуру инвазионных личинок - нематод, предварительно очищенную от посторонней микрофлоры в растворе формалина.
2
Устройство состоит из одного полипропиленового мешка (Фиг.1) размером 700×400 мм. В верхней стороне мешка на расстоянии 190 мм от горловины на площади 1500 мм (50×300 мм) имеется 186 сквозных отверстий диаметром 0,5 мм каждое на верхней и нижней стороне мешка. За счет поступления воздуха через отверстия обеспечивается аэрация питательной среды с развивающимися на ней микроорганизмами. Горловина мешка закрывается матерчатой тесьмой (Фото 2), второй тесьмой (Фото 3), расположенной ниже отверстий, перекрывается поступление воздуха от сквозных отверстий к питательной среде внутри мешка.
В опытных вариантах в зависимости от количества отверстий создавались различные условия естественной аэрации внутри мешков, при этом в качестве отдельных вариантов опыта использовались мешки, имеющие 46, 93 и 186 отверстий на данной площади.
9
Устройство работает следующим образом, инертный носитель - поролоновую крошку - пропитывают гомогенатом компонентов питательной среды, которую переносят из расчета 0,5 кг в полипропиленовый мешок, после чего верхнюю открытую часть мешка над отверстиями (Фото 2) и нижнюю часть за отверстиями (Фото 3) закрывают с использованием матерчатых тесемок. Мешки с питательной средой автоклавируют (121°С в течение 30 мин). После охлаждения через открытую сторону мешка, после снятия матерчатых тесемок, над пламенем спиртовки инокулируют симбиотические бактерии (Xenorhabdus nematophilus) в виде водной суспензии бактериальных клеток с титром 3-10 в 1 мл суспензии из расчета 100 мл суспензии на каждый мешок.
После инокуляции бактерий открытую часть мешка над отверстиями и нижнюю часть за отверстиями закрывают двумя тесемками, содержимое мешка перемешивают встряхиванием и после укладки мешка на стеллаж, для аэрации содержимого мешка, снимают тесьму, расположенную за аэрационными отверстиями перед питательной средой. После 48-часовой экспозиции при температуре 20-25°С в мешки с развившейся культурой симбиотических бактерий, предварительно сняв тесьму, через открытую сторону мешка над пламенем спиртовки инокулируют чистую культуру инвазионных личинок нематод из расчета 20 млн особей в 100 мл воды на один мешок. После инокуляции нематод открытую часть мешка над отверстиями и нижнюю часть за отверстиями закрывают двумя матерчатыми тесемками, содержимое мешка перемешивают встряхиванием и после укладки мешка на стеллаж для развития нематодно-бактериального комплекса, с целью обеспечения аэрации содержимого мешка, снимают тесьму, расположенную за аэрационными отверстиями.
Пример 1.
Получение биомассы нематод вида Steinemema carpocapsae штамм "agriotos" проводили в устройствах, заполненных питательной средой и содержащей: соевая мука - 16%, яичный порошок - 20%, кукурузное масло - 5%, пивные дрожжи - 1%, поролоновая крошка - 8%, вода - 50%. Повторность в опытах - пятикратная.
В опытном варианте питательной средой заполняли полипропиленовые мешки из расчета 0,5 кг на один мешок. В зависимости от количества отверстий в качестве отдельных вариантов создавались различные условия естественной аэрации внутри мешков, имеющих 46, 93 и 186 отверстий на данной площади.
9
Мешки с питательной средой автоклавировали (121°С в течение 30 мин). После охлаждения через открытую сторону мешка инокулировали, предварительно выращенные в течение двух суток в жидкой питательной среде на качалке, симбиотические бактерии (Xenorhabdus nematophilus) в виде водной суспензии бактериальных клеток с титром 3·10 из расчета 100 мл суспензии на каждый мешок.
После 48-часовой экспозиции при температуре 20-25°С в мешки с развившейся культурой симбиотических бактерий инокулировали чистую культуру инвазионных личинок нематод из расчета 20 млн особей в 100 мл воды на один мешок. Содержимое мешков перемешивали встряхиванием и укладывали на стеллаж для развития нематодно-бактериального комплекса. Все операции по инокуляции бактерий и нематод в мешки проводили над пламенем горелки.
В контрольном варианте питательной средой сначала заполняли полипропиленовые мешки из расчета 0,7 кг среды на один мешок. Мешки с питательной средой автоклавировали (121°С в течение 30 мин) и после охлаждения в каждый мешок инокулировали симбиотические бактерии (Xenorhabdus nematophilus) в количестве 100 мл бактериальной суспензии с титром 3·10 бактериальных клеток. Бактерий в питательную среду инокулировали в виде водной суспензии бактериальных клеток.
Содержимое мешков после инокуляции бактерий тщательно перемешивали и содержали при температуре 20-25°С. После 48-часовой экспозиции содержимое мешков в стерильных условиях пересыпали в пластмассовые корыта, предварительно простерилизованные над открытым пламенем газовой горелки в течение 10 секунд. Одновременно в питательную среду с выращенной культурой бактерий в стерильных условиях инокулировали моноксенную культуру инвазионных личинок нематод из расчета 30 млн особей на одно корыто. Затем корыта накрывали крышкой из фольги и переносили их в термостатированное помещение с температурой 23-25°С для развития нематодно-бактериального комплекса.
50
Зрелую культуру нематод выделяли вымыванием из поролоновой крошки и подсчитывали количество нематод в полученной водной суспензии инвазионных личинок с одновременным определением их инвазионной (энтомопатогенной) активности по показателю LD для тест-насекомых (3).
Продуктивный выход биомассы нематод в опытном и контрольном вариантах определяли после завершения цикла развития нематод в питательной среде. Результаты оценки продуктивного выхода нематод в расчете на 1 г питательной среды приведены в таблице 1.
50
Выход биомассы нематод из мешков, имеющих аэрируемую поверхность с 186 отверстиями на верхней и нижней стороне мешка, составил 622,2 тыс. инвазионных личинок с 1 г питательной среды, в контрольном опыте соответственно 430,6 тыс. нематод. С увеличением и уменьшением количества отверстий в опытных мешках выход биомассы нематод снижался (табл.1). При этом наилучший показатель инвазионной (энтомопатогенной) активности нематод (LD=23,3±1,9) - был в варианте с 186 отверстиями на верхней и нижней стороне мешка. С увеличением и уменьшением количества отверстий инвазионная активность нематод снижалась (табл.2).
Таким образом, наилучшие результаты по выходу биомассы нематод и их инвазионной (энтомопатогенной) активности получены при использовании естественной аэрации биоректоров. При этом достигается увеличение выхода биомассы нематод с 1 г питательной среды до 30,8% и значительное снижение себестоимости биомассы нематодных препаратов.
Источники информации
1. Bedding R.A. Large scale production, storage and transport of the insectpara-site nematodes Neoaplectana spp. and Heterorhabditis spp.// Ann. Appl. Biol. 1984. Vol.104, №1. P.117-120.
2. Данилов Л.Г., Айрапетян В.Г. Способ и линия для производства биологических препаратов на основе энтомопатогенных нематод. Патент №2239315, Бюл. №31, 2004.
3. Веремчук Г.В., Данилов Л.Г. Методические указания по определению инвазионной активности нематодных культур рода Neoaplectana (Stein-emematidae). Л., 1978, 7 стр.
Таблица 1
Продуктивный выход биомассы энтомопатогенных нематод в расчете на 1 г питательной среды при различных способах их культивирования
Контроль - культивирование нематод с использованием полипропиленовых мешков и пластмассовых корыт
Опыт - культивирование нематод с использованием одного полипропиленового мешка
Количество отверстий на верхней и нижней стороне мешка для выращивания микроорганизмов
46
93
186
430,6
320,3
510,7
622,2
HCP<sub>0,05</sub>-42,6
Таблица 2
2 Инвазионная (энтомопатогенная) активность нематод Steinemema carocapsae штамм "agriotos" в отношении тест-насекомых (Galleria mellonella)
Показатель патогенности нематод
Варианты опыта
Культивирование нематод с использованием полипропиленовых мешков и пластмассовых корыт (контроль)
Культивирование нематод с использованием одного полипропиленового мешка (опыт)
Количество отверстий на верхней и нижней стороне мешка для выращивания микроорганизмов
LD<sub>50</sub>*
24,8±3,7
46
93
186
25,7±3,2
24,2±2,6
23,3±1,9
*LD<sub>50</sub> - количество инвазионных личинок нематод, вызывающих 50%-ную гибель насекомых