Влияние гипотонического шока на инфицирование клеток рекомбинантным лентивирусом in vitro

после трансплантации смеси ММСК, маркированных зеленым белком, и остео-ММСК, маркированных красным, в новообразованных костях доминируют клетки, несущие зеленый белок. Потомки остео-ММСК выявляются в костной мозоли и в фасциях, однако их количество меньше в тысячи раз. Результаты этих экспериментов демонстрируют ограничения пролиферативного потенциала среди ММСК, подвергнутых индукции к дифференцировке, что стоит учитывать при планировании условий для использования ММСК.

Дальнейшие наблюдения в течение года после операции выявили присутствие маркированных клеток в образующихся костной и хрящевой тканях, а также в прилегающих фасциях. Полученные данные говорят о том, что:

1 ) комбинация ММСК с носителями способствует регенерации кости в области обширного незаживающего дефекта;

2) культивированные ММСК способны in vivo к соединительнотканным дифференцировкам и образуют костную, хрящевую и волокнистую соединительную ткани;

3) предварительная индукция дифференцировки ММСК снижает их пролиферативный потенциал in vivo;

4) введение маркерного гена не нарушает способности ММСК к пролиферации и мультипотентной дифференцировке;

5) Терминально дифференцированные потомки маркированных ММСК сохраняются в регенерировавшей ткани по крайней мере в течение года.

ММСК могут быть использованы в терапевтических целях в регенеративной медицине для заживления тяжелых костных и хрящевых повреждений. Длительное сохранение маркированных клеток в регенерате позволяет использовать ММСК для генотерапии.

Е.В. Мартынова 1, Н.Л. Блатта, М.Э. Ялвач 3,

Е.В. Головин 1, O.P. Галеев 1, В.А. Анохин 1,

A.A. Ризванов 123 Влияние гипотонического шока на инфицирование клеток рекомбинантным лентивирусом in vitro

1 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия

2 ФГДОУВПО «Казанский [Приволжский} федеральный университет», Россия

3 Департамент генетики и биоинженерии.

Университет Едитепе, Стамбул, Турция Martynova85@gmail.com

E.V. Martynova, N.L. Blatt, M.E. Yalvac, E.V. Golovin,

ü.R. Galeev, V.A. Anokhin, A.A. Rizvanov

Effect of hypotonic stress on recombinant lentiviral

transduction in vitro

Процесс проникновения ретровирусов в клетку-хо-зяина происходит по одному из двух механизмов: pH-зависимое проникновение в клетку при помощи клатрин-опосредованного эндоцитоза или рН-незави-симое проникновение в клетку посредством прямого взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности клетки с последующим слиянием мембран. Известно, что гипотоническая среда приводит к значительной активации процессов эндоцитоза. В 2009 г. Yu-Hsiang Lee и Ching-An Peng показали, что гипотоническая среда значительно повышала инфек-ционность MoMuLV-GFP ретровируса (экотропный вирус, содержащий геном вируса лейкемии мышей

Молони, экспрессирующий белок GFP; Ecotropic Moloney murine leukemia virus). Лентивирусы, в частности ВИЧ-1, также принадлежат к семейству Retroviridae. Представители этого рода используют связывание поверхностных гликопротеинов с рецепторами на мембране клетки, что, в свою очередь, запускает каскад механизмов, способствующих последующему слиянию внешней оболочки вируса и клеточной мембраны с высвобождением вирусного капсида в цитоплазму.

Лентивирусы — один из наиболее эффективных векторов доставки рекомбинантных генов в клетки мишени. Лентивирусы способны инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки с высокой эффективностью, а современные способы получения рекомбинантных вирусов позволяют работать с ними в стандартных лабораториях 2 уровня биологической опасности. Интеграция провируса, содержащего рекомбинантные гены, в геном клетки-хозяина приводит к перманентной генетической модификации клеток и долговременной экспрессии трансгенов. Одним из применений рекомбинантных векторов на основе ленти-вирусов служит генетическая модификация клеток in vitro для последующего использования в генно-клеточных приложениях. В связи с этим встаёт вопрос о повышении эффективности вирусной трансдукции in vitro.

Цель работы: исследование влияния гипотонической обработки клеток на эффективность инфицирования рекомбинантным лентивирусом.

Материал и методы. Работу проводили в ламинаре

2 класса биологической защиты. В качестве инфекционного агента использовали рекомбинантный ленти-вирус (LV-GFP), созданный на основе генома ВИЧ-1, псевдотипированный поверхностным гликопротеином вируса везикулярного стоматита G (VSV-G) и экспрессирующий зелёный флуоресцентный белок GFP. В качестве модельной культуры клеток использовали клетки человека HeLa. Клетки высевали в 24-х луночный культуральный планшет и инкубировали при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02. Изотоническая среда состояла из 50% культуральной среды и 50% дистиллированной воды. Эксперимент состоял из 3 групп: 1) клетки, инфицированные LV-GFP в изотонической среде (контроль); 2) клетки, прошедшие предобработку гипотонической средой и инфицированные LV-GFP в изотонической среде; 3) клетки, инфицированные LV-GFP в гипотонической среде. Подсчет процента инфицированных клеток осуществляли с помощью проточного цито-флуориметра FACSCalibur (Becton Dickinson).

Результаты и обсуждение. Анализ количества GFP-позитивных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии не показал значительных различий в исследуемых экспериментальных группах. Показано, что гипотоническая среда не оказала влияния на эффективность инфицирования клеток рекомбинантным летивирусом LV-GFP, что свидетельствует о том, что проникновение рекомбинантного лентивируса в клетку, в отличие от ретровируса MoMuLV-GFP, по-видимому, не связано с активностью процессов эндоцитоза.

Таким образом, применение гипотонических сред не повышает эффективность лентивирусной трансдукции in vitro.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010