НОВЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К БЕЛКУ ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ 1(PD-1)
NEW MONOCLONAL ANTIBODIES TO PROGRAMMED CELL DEATH 1 (PD-1) PROTEIN

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится, в общем, к антителам к PD-1 и их композициям, и иммунотерапии при лечении болезни человека с помощью анти-PD-1 антител.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Увеличивающееся число доказательств, полученных из доклинических и клинических результатов, показало, что целенаправленное воздействие на контрольные точки иммунного ответа становится наиболее многообещающим подходом для лечения пациентов с раковыми заболеваниями. Белок программируемой (пер,, запрограммированной) смерти 1 (PD-1), ингибиторный член суперсемейства иммуноглобулинов с гомологией к CD28, экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8) и играет критическую роль в регуляции стимулирующих и ингибирующих сигналов в иммунной системе (Okazaki, Taku et al. 2007 International Immunology 19:813-824). PD-1 был обнаружен путем скрининга на дифференциальную экспрессию в апоптических клетках (Ishida et al. (1992) EMBO J 11:3887-95).
PD-1 является трансмембранным белком типа I, который является частью суперсемейства генов Ig (Agata et al. (1996) Int. Immunol 8:765-72), и структура PD-1 состоит из одного внеклеточного домена, схожего с вариабельным доменом иммуноглобулинов и цитоплазматического домена, содержащего иммунорецепторный ингибирующий мотив на основе тирозина (ITIM) и иммунорецепторный мотив переключения на основе тирозина (ITSM). PD-1, хотя и является структурно сходным с CTLA-4, лишен мотива MYPPPY, который является критическим для связывания с В7-1 и В7-2. PD-1 имеет два известных лиганда, PD-L1 (В7-Н1, CD274) и PD-L2 (B7-DC, CD273), которые являются экспрессируемыми на клеточной поверхности членами семейства В7 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Как PD-LI, так и PD-L2 являются гомологами В7, которые связываются с PD-1, но не связываются с другими членами семейства CD28.
2+
PD-1, в качестве одного из белков иммунных контрольных точек, является ингибирующим членом семейства CD28, экспрессируемым на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8) играет важную роль в ограничении активности Т-клеток, которые обеспечивают основной механизм иммунной резистентности, с помощью которого опухолевые клетки избежали иммунного надзора. PD-1 индуцирует состояние анергии или иммунологической толерантности в Т-клетках, в результате чего клетки не могут продуцировать оптимальные уровни эффекторных цитокинов. PD-1 также может вызывать апоптоз в Т-клетках благодаря своей способности ингибировать сигналы выживания. У животных с дефицитом PD-1 развиваются различные аутоиммунные фенотипы, включающие аутоиммунную кардиомиопатию и волчаночноподобный синдром с артритом и нефритом (Nishimura et al. (1999) Immunity 11:141-51; Nishimura et al. (2001) Science 291:319-22). Кроме того, было обнаружено, что PD-1 играет роль в аутоиммунном энцефаломиелите, системной красной волчанке, болезни трансплантат против хозяина (GVHD), диабете I типа и ревматоидном артрите (Salama et al. (2003) J Exp Med 198:71-78: Prokunina and Alarcon-Riquelme (2004) Hum Mol Genet 13:R143; Nielsen et al. (2004) Lupus 11:510). Было показано, что в линии мышиных опухолевых В-клеток ITSM PD-1 является необходимым для блокирования BCR-опосредованного потока Са и фосфорилирования тирозина эффекторных молекул, находящихся ниже по ходу процесса (Okazaki et al. (2001) PNAS 98: 13866-71).
Взаимодействие PD-1, экспрессируемого на активированных Т-клетках, и PD-L1, экспрессируемого на опухолевых клетках, негативно регулирует иммунный ответ и ослабляет противоопухолевый иммунитет. PD-LI является изобилующим при различных видах рака человека (Dong et al. (2002) Nat. Med 8:787-9). Экспрессия PD-L1 в опухолях коррелирует с пониженной выживаемостью при раке пищевода, поджелудочной железы и других типах рака, особо выделяя этот путь в качестве новой многообещающей мишени для иммунотерапии опухолей. Несколькими группами было показано, что взаимодействие PD-1-PD-L усугубляет заболевание, приводя к уменьшению инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, уменьшению пролиферации, опосредованной Т-клеточными рецепторами, и ускользанию раковых клеток от иммунологического надзора (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol, Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). Иммуносупрессия может быть инверирована ингибированием локального взаимодействия PD-1 с PD-LI, и действие является аддитивным также при блокировании взаимодействия PD-1 с PD-L2.
Несколько фармацевтических компаний, таких как Bristol-Myers Squibb (BMS), Merck, Roche и GlaxoSmithKline (GSK), разработали несколько агентов, нацеленных на путь PD-1. Данные клинических испытаний продемонстрировали ранние доказательства длительной клинической активности и обнадеживающего профиля безопасности у пациентов с различными типами опухолей. Ниволумаб (Nivolumab), анти-PD-l, разработанный BMS, находится в центре внимания следующего поколения. В настоящее время в 6 исследованиях поздней стадии лечение стимулировало уменьшение размеров опухоли в трех из пяти групп рака, включая 18% пациентов с раком легкого (n=72), около трети пациентов с меланомой (n=98) и 27% пациентов с раком почки (n=33). Разработанный Merck, Пембролизумаб (Pembrolizumab), представляет собой гуманизированное моноклональное антитело IgG4, действующее против PD-1, которое получило новое прорывное обозначение FDA после того, как внушительные данные IB были получены для рака кожи. Результаты исследования фазы IB показали объективный противоопухолевый ответ у 51% раковых пациентов (n=85) и полный ответ у 9% пациентов. Экспериментальный MPDL3280A (Atezolizumab, Атезолизумаб) компании Roche продемонстрировал способность уменьшать опухоли у 29 из 140 (21%) пациентов с прогрессирующим раком с различными размерами опухолей.
Существуют некоторые возможности для улучшения антител против PD-1 в качестве терапевтического агента. Большинство из моноклональных антител против PD-1, которые в настоящее время тестируются в клинических испытаниях, являются только против человеческого PD-1, что ограничивает доклинический анализ in vivo и снижает эффективность из-за иммуногенности полученных из мыши белковых последовательностей. Гуманизированное антитело с кросс-реактивностью (перекрестной реактивностью) к мышиному PD-1 преодолевает этот недостаток и проявляет большую переносимость и более высокую эффективность in vivo. Таким образом, все еще существует потребность в новом антителе против PD-1 (анти-PD-l антителе).
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к выделенным антителам, в частности к моноклональным антителам или человеческим моноклональным антителам.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с эпитопом PD-1, содержащим аминокислоты в положениях 128, 129, 130, 131 и 132 и по меньшей мере одну из аминокислот в положениях 35, 64, 82, 83 последовательности SEQ ID NO: 24.
Настоящее изобретение также обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого или мышиного PD-1, где эпитоп содержит аминокислоты в положениях 128, 129, 130, 131 и132 последовательности SEQ ID NO: 24.
Указанное выше антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где мышиный PD-1 представляет собой мышиный или крысиный PD-1.
Указанное выше антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело
D
-6
a) связывается с человеческим PD-1 с K 2,15×10 М или менее; и
D
-8
b) связывается с мышиным PD-1 с K 1,67×10 М или менее.
Указанное выше антитело, где антитело
D
-10
a) связывается с человеческим PD-1 с K 2,15×10М или менее; и
D
-8
b) связывается с мышиным PD-1 с K 1,67×10 М или менее, и
где антитело проявляет по меньшей мере одно из следующих свойств:
D
-10
-10
-8
-8
a) связывается с человеческим PD-1 с K между 4,32×10М и 2,15×10М и с мышиным PD-1 с KD между 5,39×10М и 1,67×10М;
b) по существу не связывается с человеческими CD28, CTLA-4;
c) усиливает пролиферацию Т-клеток;
d) повышает выработку интерферона-гамма; или
e) повышает секрецию интерлейкина-2.
Настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 80%, 90% или 95% является гомологичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, где антитело специфически связывается с PD-1.
Настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, где антитело специфически связывается с PD-1.
Настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 80%, 90% или 95% является гомологичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1 и 2; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, 80%, 90% или 95% является гомологичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9,
где антитело специфически связывается с PD-1.
Настоящее изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1 и 2; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9,
где антитело специфически связывается с PD-1.
В различных воплощениях антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
a) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 8,
где антитело специфически связывается с PD-1;
или антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2; и
b) вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9,
где антитело специфически связывается с PD-1.
Последовательность указанного антитела показана в таблице 1 и в списке последовательностей.
В другом аспекте, изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий определяющую комплементарность область (CDR), имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящую из SEQ ID NOs: 10-23,
где антитело специфически связывается с PD-1.
В другом аспекте, изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий: вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3,
где последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 12 и 13, и их консервативных модификаций,
где антитело специфически связывается с PD-1.
Предпочтительно, когда последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи вышеуказанного антитела содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 20, 21, 22 и 23 и их консервативных модификаций.
Предпочтительно, когда последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи вышеуказанного антитела содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 11 и их консервативных модификаций.
Предпочтительно, когда последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи вышеуказанного антитела содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 19 и их консервативных модификаций.
Предпочтительно, когда последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи вышеуказанного антитела содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 10 и их консервативных модификаций.
Предпочтительно, антитело по данному изобретению, в котором последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи вышеуказанного антитела, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17 и 18, и их консервативные модификации.
В более предпочтительном варианте осуществления изобретение обеспечивает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело специфически связывается с PD-1 и содержит: вариабельную область тяжелой цепи, которая включает последовательности CDR1, CDR2 и CDR3; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, где:
а) последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 10, и последовательность CDR2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11, последовательность CDR3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 12-13;
b) и последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 14-18, последовательность CDR2 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 19, последовательность CDR3 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 20-23.
Предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 12;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NOs: 14;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NOs: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NOs: 20;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NOs: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NOs: 13;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NOs: 14;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 21;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 13;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 15;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 21;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 13;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 16;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 21;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 12;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 17;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 21;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 12;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 16;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 21;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 13;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 17;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 21;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 13;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 17;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 22;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 12;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 18;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 23;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Другое предпочтительное антитело содержит:
a) вариабельную область тяжелой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 10;
b) вариабельную область тяжелой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 11;
c) вариабельную область тяжелой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 12;
d) вариабельную область легкой цепи CDR1, содержащую SEQ ID NO: 18;
e) вариабельную область легкой цепи CDR2, содержащую SEQ ID NO: 19;
f) вариабельную область легкой цепи CDR3, содержащую SEQ ID NO: 20;
где антитело специфически связывается с PD-1.
Последовательность CDR указанного антитела показана в таблице 2 и списке последовательностей.
Антитела изобретения могут быть химерными или гуманизированными или человеческими антителами.
Антитела по изобретению могут проявлять по меньшей мере одно из следующих свойств:
D
D
-10
-8
a) связываться с человеческим PD-1 с K 2,15×10 М или менее и с мышиным PD-1 с K 1,67×10 М или менее;
b) по существу не связывается с человеческими CD28, CTLA-4;
c) усиливать пролиферацию Т-клеток;
d) повышать выработку интерферона-гамма; или
e) повышать секрецию интерлейкина-2.
В дополнительном аспекте изобретение обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Изобретение обеспечивает клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
Изобретение также обеспечивает клетку-хозяин, содержащую один или несколько клонирующих или экспрессирующих векторов.
В еще одном аспекте изобретение обеспечивает способ, содержащий культивирование клетки-хозяина по изобретению и выделение антитела, где антитело получают путем иммунизации крыс SD с помощью внеклеточного домена человеческого PD-1 и внеклеточного домена PD-1 мыши.
Изобретение обеспечивает трансгенную мышь, содержащую трансгены тяжелой и легкой цепи человеческого иммуноглобулина, где мышь экспрессирует антитело по настоящему изобретению.
Изобретение обеспечивает гибридому, полученную из мыши по данному изобретению, где гибридома продуцирует указанное антитело.
В дополнительном аспекте изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антитело или антигенсвязывающий фрагмент указанного антитела по изобретению и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей, разбавителей или носителей.
Изобретение обеспечивает иммуноконъюгат, содержащий указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, в данном изобретении связанный с терапевтическим агентом.
При этом изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую указанный иммуноконъюгат, и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.
Изобретение также обеспечивает способ получения анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащий:
(a) обеспечение: (i) последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10, последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11 и последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 12 и 13; и/или (ii) последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, содержащей последовательность CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 14, 15, 16, 17 и 18, последовательность CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 19 и последовательность CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 20, 21, 22 и 23; и
(b) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка.
Изобретение также обеспечивает способ модуляции иммунного ответа у субъекта, содержащий введение субъекту антитела или антигенсвязывающего фрагмента любого из указанных антител по данному изобретению.
Изобретение также обеспечивает применение указанного антитела в изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики иммунного нарушения или рака.
Изобретение также обеспечивает способ ингибирования роста опухолевых клеток у субъекта, содержащий введение субъекту терапевтически эффективного количества указанного антитела или указанного антигенсвязывающего фрагмента для ингибирования роста опухолевых клеток.
При этом изобретение обеспечивает способ, при котором опухолевые клетки представляют собой рак, выбранный из группы, состоящей из меланомы, рака почки, рака простаты, рака молочной железы, колоректального рака, рака легких, рака костей, рака поджелудочной железы, рака кожи, рака головы или шеи, кожной или внутриглазной злокачественной меланомы, рака матки, рака яичников и рака прямой кишки.
При этом изобретение обеспечивает способ, при котором антитело является химерным антителом или гуманизированным антителом.
ПРИЗНАКИ И ПРЕИМУЩЕСТВА ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения получили гуманизированное антитело против PD-1 с использованием запатентованной гибридомной технологии. Антитела, описанные в этом изобретении, имеют высокую аффинность связывания, конкретно связывание как с человеческим, так и с мышиным белком PD-1 без перекрестно-родственных реакций; и мощные модулирующие иммунные ответы, включающие усиление пролиферации Т-клеток и увеличение выработки цитокина IFN-γ и интерлейкина-2.
Новые анти-PD-1-антитела, связывающиеся с мышиным PD-1, получены из иммунизированных крыс, что устраняет недостаток, заключающийся в том, что анти-PD-1-антитела не могут быть использованы в доклинической мышиной модели; и уровень гуманизирования близок к 100% после гуманизирования последовательности, что значительно снижает вредное воздействие используемых лекарственных средств на организм человека.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
На фиг. 1 показаны графические изображения связывания гибридомных антител с PD-1 клеточной поверхности человека и мыши. На фиг. 1А показано связывание с человеческим PD-1. На фиг. 1В показано связывание с мышиным PD-1.
На фиг. 2 показан результат первого раунда скрининга библиотеки мутированных последовательностей. Секвенирование и анализ мутации на клоны с высокой аффинностью для второго раунда мутации.
На фиг. 3 показаны результаты межвидовых испытаний с помощью FACS. На фиг. 3А показано связывание с клетками CHO-S, трансфицированными PD-1 человека. На фиг. 3В показано связывание с клетками 293F, трансфицированными PD-1 мыши. На фиг. 3С показано связывание с активированными РВМС (мононуклеарными клетками периферической крови человека) cynomolgus. Примечание: изотипом был человеческий IgG4 каппа. То же самое ниже.
На фиг. 4 показан результат межвидового теста методом ИФА. На фиг. 4А показано связывание с человеческим PD-1. На фиг. 4В показано связывание с мышиным PD-1. На фиг. 4С показано связывание с PD-1 cynomolgus.
На фиг. 5 показан результат теста между семействами. Анти-PD-1 антитела связываются специфически с человеческим PD-1, но не с CD28 и CTLA-4.
На фиг. 6А показан результат анти-PD-1-антител, блокирующих связывание человеческого PD-L1 с трансфицированными PD-1 клетками CHO-S. На фиг. 6В показан результат анти-PD-1-антител, блокирующих связывание мышиного PD-L1 с трансфицированными PD-1 клетками 293F.
На фиг. 7 показано, что анти-PD-1 антитела могут блокировать связывание человеческого PD-L2 с PD-1.
На фиг. 8А - 8В показаны результаты анализа эпитоп-специфической сортировки (binning), указывающие на то, что анти-PD-1 антитела находятся в той же или близкой эпитопной группе, что и референсные антитела. На фиг. 8А показано эпитоп-специфическая сортировка (binning) против WBP305BMK1 (патент США №9084776). На фиг. 8В показана эпитоп-специфическая сортировка (binning) против Кейтруда (Keytruda) (патент США №8168757).
На фиг. 9 показана перекрестная реактивность анти-PD-1 антител с человеческим/мышиным PD-1. 2 мкг/мл каждого антитела использовали для покрытия 96-луночного планшета в течение ночи и инкубировали с белком hPD-1/mPD-1-His, для детектирования добавляли антитело HRP-anti-His.
На фиг. 10 показаны остатки «горячей точки», нанесенные на структуру hPD-1. (А). Сайт связывания hPD-L1. Данные были получены из литературы: Zak et al. 2015. (В-С). Сайт связывания антитела W3052_r16.88.9 и Кейтруда (Keytruda), соответственно. Данные из таблицы 8. Цвета на изображениях помогают различать эпитопы.
На фиг. 11 показано сравнение между человеческим и мышиным PD-1. Их очевидные структурные различия (ВС петля и CD петля (или С'' цепь на mPD-1)) отмечены оранжевым цветом. (А). Структуры hPD-1 (код PDB 4ZQK). Недостающая петля (Asp85-Asp92) была восстановлена на основе ее ЯМР структур (код PDB 2M2D). (В). Структура mPD-1 (код PDB 3BIK). (пер., PDB - аббревиатура "Protein Data Bank", банка пространственных структур биологических макромолекул, прежде всего белков).
+
+
На фиг. 12А-12С показаны результаты алло-MLR человека (пер., аллогенные реакции в смешанных культурах лимфоцитов), демонстрирующие, что анти-PD-1 антитела могут усиливать функцию человеческих CD4 Т-клеток. На фиг. 12А показано, что анти-PD-1 антитела увеличивают секрецию IL-2 в зависимости от дозы. На фиг. 12В показано, что анти-PD-1 антитела увеличивали секрецию IFN-γ в зависимости от дозы. На фиг. 12С показано, что анти-PD-1 антитела увеличивают пролиферацию CD4  Т-клеток в зависимости от дозы.
+
+
На фиг. 13А-13С показаны результаты алло-MLR мыши (пер., аллогенные реакции в смешанных культурах лимфоцитов), демонстрирующие, что анти-PD-1 антитела могут усиливать функцию мышиных CD4 Т-клеток. На фиг. 13А показано, что анти-PD-1 антитела повышают секрецию IL-2 в зависимости от дозы. На фиг. 13В показано, что антитела против PD-1 повышают секрецию IFN-γ в зависимости от дозы. На фиг. 13С показано, что анти-PD-1 антитела усиливают пролиферацию CD4 Т-клеток в зависимости от дозы.
На фиг. 14А - 14В показаны результаты алло-MLR человека (пер., аллогенные реакции в смешанных культурах лимфоцитов), демонстрирующие, что анти-PD-1 антитела могут усиливать функцию CD4+ Т-клеток человека. На фиг. 14А показано, что антитела против PD-1 усиливают секрецию IFN-γ в зависимости от дозы. На фиг. 14В показано, что антитела против PD-1 усиливают пролиферацию CD4+ Т-клеток в зависимости от дозы.
На фиг. 15 показано, что анти-PD-1-антитела могут инвертировать супрессивную функцию Tregs. На фиг. 15А показано, что анти-PD-1-антитела могут восстанавливать секрецию IFN-γ. На фиг. 15В показано, что анти-PD-1-антитела могут восстанавливать пролиферацию Т-клеток.
На фиг. 16 показан результат определения ADCC, демонстрирующий, что анти-PD-1-антитела не опосредуют активность ADCC на активированных CD4+ Т-клетках.
На фиг. 17 показан результат определения CDC, демонстрирующий, что анти-PD-1-антитела не опосредуют активность CDC на активированных CD4+ Т-клетках.
На фиг. 18 показаны изменения массы тела в мышиной модели подкожного сингенного ксенотрансплантата после лечения 2Е5. Точка данных представляет средний вес тела; столбцы ошибок представляют стандартную ошибку (SEM).
На фиг. 19 показаны изменения относительного веса (%). Относительное изменение массы тела рассчитывали на основе массы тела в начале введения. Точка данных представляет средний вес тела; столбцы ошибок представляют стандартную ошибку (SEM).
На фиг. 20 показана кривая роста опухоли в модели сингенной опухоли у голых мышей CloudmanS91 после лечения 2Е5. Точка данных представляет средний вес тела; столбцы ошибок представляют стандартную ошибку (SEM).
На фиг. 21 показана кривая выживания в модели сингенной опухоли у голых мышей CloudmanS91 после лечения 2Е5.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
Для того чтобы настоящее изобретение было более понятным, сначала дают определения конкретным терминам. Дополнительные определения приведены в подробном описании.
Термины «белок программируемой гибели 1», «белок программируемой гибели клеток 1», «белок PD-1», «PD-1», «PD1», «PDCD1», «hPD-1» и «hPD-I» используются взаимозаменяемо и включают варианты, изоформы, видовые гомологи PD-1 человека и аналоги, имеющие по меньшей мере один общий эпитоп с PD-1.
Используемый здесь термин «антитело» включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е. «антигенсвязывающую часть») или его отдельные цепи. Термин «антитело» относится к белку, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно здесь VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, СН1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно здесь VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), чередующимися с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDRs и четырех FRs, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном.
Используемый здесь термин «антитело» относится к иммуноглобулину или его фрагменту или его производному и охватывает любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий сайт, независимо от того, продуцируется ли он in vitro или in vivo. Термин включает, но без ограничения перечисленным, поликлональные, моноклональные, моноспецифические, полиспецифические, неспецифические, гуманизированные, одноцепочечные, химерные, синтетические, рекомбинантные, гибридные, мутированные и привитые антитела. Термин «антитело» также включает фрагменты антител, такие как Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb и другие фрагменты антител, которые сохраняют антигенсвязывающую функцию, то есть способность специфически связывать PD-1. Обычно такие фрагменты будут содержать антигенсвязывающий фрагмент.
Термины «антигенсвязывающий фрагмент», «антигенсвязывающий домен» и «связывающий фрагмент» относятся к части молекулы антитела, которая содержит аминокислоты, ответственные за специфическое связывание между антителом и антигеном. В случаях, когда антиген является большим, антигенсвязывающий фрагмент может связываться только с частью антигена. Часть молекулы антигена, которая отвечает за специфическое взаимодействие с антигенсвязывающим фрагментом называется «эпитопом» или «антигенной детерминантой».
Антигенсвязывающий фрагмент обычно содержит вариабельную область легкой цепи антитела (VL) и вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH), однако он необязательно должен содержать оба. Например, так называемый фрагмент антитела Fd состоит только из домена VH, но все еще сохраняет некоторую антигенсвязывающую функцию интактного антитела.
В соответствии с вышеизложенным термин «эпитоп» определяет антигенную детерминанту, которая специфически связана/идентифицирована связывающим фрагментом, как определено выше. Связывающий фрагмент может специфически связываться/взаимодействовать с конформационными или непрерывными эпитопами, которые являются уникальными для структуры-мишени, например, человеческий и мышиный PD-1. Конформационный или прерывистый эпитоп характеризуется для полипептидных антигенов наличием двух или нескольких дискретных аминокислотных остатков, которые являются разделенными в первичной последовательности, но собираются вместе на поверхности молекулы, когда полипептид сворачивается в нативный белок/антиген. Два или более дискретных аминокислотных остатка, вносящих вклад в эпитоп, присутствуют на отдельных участках одной или нескольких полипептидных цепей (цепи). Эти остатки объединяются на поверхности молекулы, когда полипептидная цепь (цепи) складывается (складываются) в трехмерную структуру, образуя эпитоп. Напротив, непрерывный или линейный эпитоп состоит из двух или нескольких дискретных аминокислотных остатков, которые присутствуют в одном линейном сегменте полипептидной цепи.
3
4
5
6
Термин «связывается с эпитопом PD-1» относится к антителам, имеющим специфическое связывание с конкретным эпитопом PD-1, которое может быть определено линейной аминокислотной последовательностью или третичной, то есть трехмерной, конформацией части полипептида PD-1. Связывание означает, что аффинность антител к части PD-1 существенно больше, чем их аффинность к другим родственным полипептидам. Термин «существенно большая аффинность» означает, что существует измеримое увеличение аффинности для части PD-1 по сравнению с аффинностью к другим родственным полипептидам. Предпочтительно, чтобы аффинность являлась выше по меньшей мере в 1,5 раза, 2 раза, 10 раз, 100 раз, 10 раз, 10 раз, 10 раз, 10 раз или выше для конкретной части PD-1, чем для других белков. Предпочтительно аффинность связывания определяют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ИФА), связанного с ферментами, или с помощью анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) или поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Более предпочтительно специфичность связывания получают с помощью анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
Термин «перекрестная реактивность» относится к связыванию описанного здесь фрагмента антигена с одной и той же молекулой-мишенью у человека и мыши (мыши или крысы). Таким образом, «перекрестную реактивность» следует понимать как межвидовую реактивность к одной и той же молекуле X, экспрессируемой у различных видов, но не к молекуле, отличающейся от X. Межвидовая специфичность моноклонального антитела, распознающего, например, человеческий PD-1, к мышиному (мыши или крысы) PD-1 может быть определена, например, анализом FACS.
Используемый здесь термин «субъект» включает любое человекообразное или нечеловекообразное животное. Термин «нечеловекообразное животное» включает всех позвоночных животных, например, млекопитающих и немлекопитающих, таких как нечеловечекообразные приматы, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, цыплята, амфибии, рептилии и т.д. За исключением отмеченных случаев, термин «пациент» или «предмет» используются взаимозаменяемо.
Термины «лечение» и «терапевтический метод» относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим/предупредительным мерам. Те, кто нуждается в лечении, могут включать индивидуумов, уже имеющих конкретное медицинское нарушение, а также тех, кто может в конечном итоге приобрести нарушение.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение материалов для исследований
1. Получение иммуногена
ДНК, кодирующие ECD (пер., внеклеточный домен) или полноразмерный PD-1 и PD-L1, были синтезированы и встроены в экспрессирующий вектор pcDNA3.3. Полученную с помощью набора Max-prep, плазмидную ДНК и ДНК встроенных последовательностей подтверждали секвенированием. Слитые белки PD-1 ECD и PD-L1 ECD, содержащие различные метки, в том числе человеческий Fc, мышиный Fc и His-метки, получали трансфекцией человеческого гена PD-1 ECD в клетки CHO-S или HEK293. Через 5 дней собирали супернатанты культур транзиентно (временно) трансфицированных клеток. Слитые белки очищали и определяли количество для использования иммунизации и скрининга.
2. Создание стабильных клеточных линий
Для получения инструментальных средств для скрининга и валидации антител авторы изобретения получили клеточные линии, трансфицированные генами PD-1 и PD-L1. Вкратце, клетки СНО-K1 или 293F трансфицировали экспрессирующим вектором pcDNA3.3, содержащим полноразмерный PD-1 или PD-L1 с использованием набора для трансфекции с липофектамином Lipofectamine 2000 Transfection kit в соответствии с протоколом производителя. Через 48-72 часов после трансфекции трансфицированные клетки культивировали в среде, содержащей бластицидин (Blasticidin) или генетицин (G418) для отбора клеток, в которых гены PD-1 или PD-L1 стабильно включены (встроены) в их геномную ДНК. В то же время клетки проверяли на экспрессию интересующих генов PD-1 и PD-L1. После подтверждения экспрессии отбирали одиночные интересующие клоны методом предельного разведения и масштабировали до больших объемов. Затем стабильные моноклональные клеточные линии поддерживали в среде, содержащей более низкие дозы антибиотиков бластицидина (Blasticidin) или G418.
Пример 2: Гибридомная технология получения антител.
1. Иммунизация.
Самок крыс SD в возрасте 6-8 недель, иммунизировали инъецированием в подушечку лапы 10 мкг/животное человеческого белка PD-1 ECD и 10 мкг/животное мышиного белка PD-1 ECD, применяя при примировании адъювант TiterMax, и альтернативно стимулировали два раза в неделю человеческим белком PD-1 ECD или мышиным белком PD-1 ECD в алюминии. Титры антител в сыворотке измеряли каждые две недели с помощью ИФА или FACS.
2. Слияние клеток.
6
4
2
Когда титр сывороточного антитела становился достаточно высоким, крысам проводили завершающую иммунизацию как человеческим, так и мышиным белком PD-1 ECD в равном объеме D-PBS (фосфатно-солевого буферного раствора Дульбекко) без адъюванта. Слияние клеток осуществляли следующим образом: готовили клетки миеломы SP2/0, клетки миеломы оттаивали за неделю до слияния и делили из расчета 1:2 каждый день до дня, предшествующего слиянию, для поддержания логарифмического роста. В-лимфоциты, выделенные из лимфатического узла иммунизированных крыс SD, объединяли с клетками миеломы (в соотношении 1:1). Клетки обрабатывали трипсином и взаимодействие останавливали с помощью FBS. Затем клеточную смесь промывали и повторно суспендировали в растворе для электростимулируемого слияния ECF из расчета 2×10 клеток/мл для ECF. После электростимулируемого слияния клеток (ВТХ2000), суспензию клеток из камеры слияния немедленно переносили в стерильную пробирку, содержащую больший объем среды, и инкубировали в течение по меньшей мере 24 часов в инкубаторе при 37°С. Затем суспензию клеток перемешивали и переносили в 96-луночные планшеты (1×10 клеток/лунку). 96-луночные планшеты культивировали при 37°С, 5% CO и периодически подвергали мониторированию. Когда клоны были достаточно большими (через 7-14 дней), 100 мкл супернатанта переносили из планшетов для тканевых культур в 96-луночные аналитические планшеты для скрининга антител.
3. Первый, второй и подтверждающий скрининг супернатантов гибридом.
Первый скрининг гибридомных супернатантов на связывание с белком PD-1 человека или мыши проводили методом ИФА. Кратко, планшеты (Nunc) покрывали человеческим или мышиным PD-1 ECD при 1 мкг/мл в течение ночи при 4°С. После блокирования и промывки на покрытые планшеты наносили гибридомные супернатанты и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем планшеты промывали и впоследствии инкубировали в течение 1 часа со вторичными козьими антителами против крысиного IgG Fc HRP (Bethyl), конъюгированными с пероксидазой хрена. После промывки добавляли субстрат ТМВ и реакцию останавливали 2М HCl. Поглощение считывали при 450 нм с использованием микропланшетного ридера (Molecular Device).
5
Для подтверждения нативного связывания анти-PD-1-антител с конформационными молекулами PD-1, экспрессированными на клеточной мембране, проводили анализ FACS с использованием трансфицированных PD-1 клеточных линий в качестве второго скрининга. Клетки CHO-S, экспрессирующие человеческий PD-1, или клетки 293F, экспрессирующие мышиный PD-1, переносили в 96-луночные планшеты с U-образным дном (Corning) при плотности 1×10 клеток/лунку. Затем добавляли супернатанты гибридом и инкубировали с клетками в течение 1 часа при 4°С. После промывки 1×PBS/1%BSA, вносили вторичное козье анти-крысиное FITC-конъюгированное антитело (Jackson ImmunoResearch Lab) и инкубировали с клетками при 4°С в темноте в течение 1 часа. Затем клетки промывали и ресуспендировали в 1×PBS/1%BSA или фиксировали 4% параформальдегидом и анализировали с помощью проточной цитометрии (BD) и программного обеспечения FlowJo. Связывание антител с родительской клеточной линией CHO-S или 293F использовали в качестве отрицательного контроля, соответственно.
5
Для отбора потенциальных антагонистических попаданий отобранные антитела были протестированы на их способность блокировать связывание лиганда PD-L1 с PD-1 трансфицированных клеток с помощью FACS-анализа. Клетки CHO-S, экспрессирующие человеческий PD-1, или клетки 293F, экспрессирующие мышиный PD-1, переносили в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD) при плотности 1×10 клеток/лунку. Супернатанты гибридом добавляли и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 часа. После промывки добавляли слитый белок мышиный Fc-человеческий PD-L1 или слитый белок мышиный Fc-мышиный PD-L1 и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 часа. Вторичное антитело козье анти-мышиное IgG-Fc-FITC-конъюгированное антитело (не имеющее перекрестной реактивности с крысиным IgG-Fc) инкубировали с клетками при 4°С в темноте в течение 1 часа. Затем клетки промывали и ресуспендировали в 1×PBS/1%BSA или фиксировали 4% параформальдегидом и анализировали с помощью проточной цитометрии (BD) и программного обеспечения FlowJo.
На фиг. 1 показаны графики связывания 16 гибридомных антител с человеческим или мышиным PD-1 клеточной поверхности. На фиг. 1А показано связывание с человеческим PD-1. На фиг. 1В показано связывание с мышиным PD-1.
4. Субклонирование гибридом.
2
После того как специфическое связывание и блокирующая активность были подтверждены с помощью первого и подтверждающего скрининга, линии гибридом, давших положительный ответ, использовали для субклонирования. Кратко, для каждой линии клеток гибридом проводили подсчет клеток и разводили их до концентрации 5 клеток, 1 клетка или 0,5 клеток на 200 мкл среды для клонирования. Суспензию клеток высевали на 96-луночные планшеты в количестве 200 мкл/лунку, так что в одном планшете находилось 5 клеток/лунку, в одном планшете 1 клетка/лунку и в четырех планшетах 0,5 клеток/лунку. Планшеты культивировали при 37°С, 5% CO, пока они не были готовы для скрининга с помощью связывания ИФА или FACS, как описано выше. Были собраны ESN отобранных отдельных клонов и антитела очищали для дальнейшего исследования свойств.
5. Тестирование подтипов.
Планшеты для микротитрования (Nunc) покрывали 50 мкл козьих антител против крысиных IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG или IgM (1 мкг/мл) на лунку в течение ночи. После блокирования 50 мкл образцов супернатанта гибридом добавляли в каждую лунку, инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Козье антитело против крысиной каппа-цепи IgG или второе антитело легкой лямбда-цепи, меченное пероксидазой хрена (HRP) (Bethyl) представляет собой детектирующее антитело. С использованием ТМВ субстрата для окрашивания, взаимодействие затем гасили 2 М HCl. Значение поглощения света при 450 нм считывается с помощью с микропланшетного ридера (планшет-ридера) (Molecular Device).
В таблице 3 приведены результаты 16 подтипов гибридомных антител. 7 антител представляют собой поликлональные антитела, а 9 антител представляют собой каппа-подтип IgG2a. Учитывая потребность в анти-PD-1-антителе, во избежание роли ADCC и CDC in vivo, гуманизированное антитело будет сконструировано в виде человеческого каппа-подтипа IgG4.
Пример 3. Последовательность антител из гибридомных клеток и конструирование молекул гуманизированных антител и аффинное созревание.
1. Аминокислотная последовательность антител из гибридомных клеток.
РНК выделяли из моноклональных гибридомных клеток с помощью реагента Trizol. Вариабельные области тяжелых (VH) и легких цепей (VL) химерных антител PD-1 амплифицировали следующим образом: вначале с РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали кДНК, как описано здесь:
Реакционная система (20 мкл)
10×RT буфер 2,0 мкл
25×dNTP Mix (100 мМ) 0,8 мкл
10×RT случайные праймеры/oligodT/специфичный праймер 2,0 мкл
Обратная траскриптаза MultiScrib 1,0 мкл
Ингибитор РНК-азы 2 мкг
Вода (безнуклеазная) до 20,0 мкл
Условия реакции:
Полученную кДНК использовали в качестве матриц для последующей ПЦР-амплификации с использованием праймеров, специфичных для представляющих интерес генов. ПЦР выполняли следующим образом: кДНК 1 мкл
Буфер для Ех ПЦР 5 мкл
dNTP 2 мкл
ExTaq 0,5 мкл
Р1 (25 пМ) 0,5 мкл
Р2 (25 пМ) 0,5 мкл
2
Вода стерильная ультрачистая (ddHO) 40,5 мкл
Условия реакции:
Полученный ПЦР-продукт (10 мкл) лигировали с вектором pMD18-T. Трансформировали продуктами лигирования (10 мкл) компетентные клетки Е. coli (штамм Тор 10). Положительные клоны проверяли с помощью ПЦР с использованием праймеров М13-48 и М13-47 с последующим секвенированием.
2. Конструирование молекул гуманизированных антител.
Крысиное анти-PD-1-антитело из гибридом отбирали и гуманизировали в соответствии с высокой аффинностью и специфичностью связывания анти-PD-1-антитела с PD-1, улучшая гомологию с последовательностью человеческого антитела. Указанный способ получения гуманизированных антител называется технологией CDR-привития (CDR-grafting). Ген вариабельных областей антитела, таких как FR-области и CDR-области, был разделен в соответствии с системой нумерации КАВАТ и системой нумерации IMGT. В базе данных антител, основанной на выравниваниях на основе гомологии и структурного сходства связывающей последовательности, ген мышиной области FR1-3 был заменен гуманизированной вариабельной областью FR1-3, область FR4 мышиного гена была заменена гуманизированной областью FR4, полученной из генов JH и JK, которые имели наиболее похожие структуры. После проверки последовательности матрицы (template) и оптимизации кодонов вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи синтезировали и клонировали в экспрессирующий вектор, а затем экспрессировали гуманизированное антитело.
В соответствии со способностью связывания с PD-1 клеточной поверхности человека и мыши, для гуманизации были отобраны W3052_r16.88.9 и W3052_r16.81.3. Таблица 2 показывает анализ оценки гуманизации. Клоны W3052-16.88-z9-IgG4 (42720) были отобраны для созревания аффинности с учетом всех этих факторов, таких как оценки лучшей аффинности и гуманизации (таблица 4).
3. Созревание аффинности.
Каждая аминокислота из трех определяющих комплементарность областей (VH CDR3, VK CDR1 и VK CDR3) родительского клона была индивидуально мутирована на другие 20 аминокислот с использованием метода гибридизационного мутагенеза. ДНК-праймеры, содержащие NNS-кодон, кодирующий двадцать аминокислот, использовали для введения мутации в каждое целевое положение CDR. Индивидуальные вырожденные праймеры использовали в реакциях гибридизационного мутагенеза. Вкратце, каждый вырожденный праймер был фосфорилирован, а затем использован в соотношении 10:1 с уридинилированной односпиральной ДНК (ssDNA). Смесь нагревали до 85°С в течение 5 минут, затем охлаждали до 55°С в течение 1 часа. После этого добавляли Т4-лигазу и ДНК-полимеразу Т4 и смесь инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С. Продукты синтеза для VH и VL CDR объединяли соответственно. Как правило, 200 нг объединенной библиотеки ДНК подвергали электропорации в BL21 для образования бляшек на бактериальном газоне BL21 или для получения фрагментов scFv.
2
3
3
Первичный скрининг состоял из одноточечного ИФА (SPE) анализа, который проводили с использованием периплазматического экстракта (РЕ) бактерий, выращенных в 96-луночных планшетах (глубокая лунка). Вкратце, этот ловушечный (capture) вариант ИФА заключался в покрытии отдельных лунок 96-луночного планшета Maxisorp Immunoplate антителом анти-c-myc в покрывающем буфере (200 мМ NaCO/NaHCO) при рН 9,2 в течение ночи при 4°С. На следующий день планшет блокировали казеином в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем в планшет добавляли scFv РЕ и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывки в лунку добавляли белок биотинилированного антигена и смесь инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. За этим следовала инкубация с конъюгатом стрептавидин-HRP (стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP)) в течение 1 часа при комнатной температуре. Активность HRP определяли с субстратом ТМВ (тетраметилбензидином) и реакцию гасили 2 М HCl. Планшеты считывали при 450 нм. Клоны, демонстрирующие сигнал оптической плотности (OD) при 450 нм, превышающий родительский клон, отбирали и повторно анализировали с помощью ИФА (как описано выше) в двух экземплярах для подтверждения положительных результатов. Клоны, которые неоднократно проявляли сигнал, превышающий сигнал родительского антитела, секвенировали. Затем концентрацию белка scFv в каждом клоне, который имел изменение CDR, затем определяли количественным методом scFv ИФА, где в качестве ссылочного образца использовали scFv с известной концентрацией. Концентрацию белка scFv определяли путем сравнения сигналов ИФА с сигналами, генерируемыми ссылочным scFv. Анализ связывания повторяли еще раз для всех положительных вариантов при нормализованной концентрации scFv, чтобы определить относительную аффинность связывания мутантного scFv и родительского антитела.
Точечные мутации в VH и VL, определенные как полезные для связывания с антигеном, были дополнительно объединены для получения дополнительной синергии связывания. Комбинаторные мутанты были экспрессированы в виде scFv и подвергнуты скринингу с использованием ловушечного ИФА. Клоны, демонстрирующие OD-сигнал при 450 нм выше, чем родительский клон, секвенировали и дополнительно подтверждали связыванием в ИФА, как описано выше.
После созревания аффинности было получено всего 10 гуманизированных антител (2Е5, 2G4, 1G10, 2С2, 2В1, 8С10, 1Н6, 5С4, A6W и L1I). На фиг. 2 показан результат первого раунда скрининга библиотеки мутированных последовательностей. Данные о последовательности и аффинности 10 гуманизированных антител человека, cynomolgus (яванских макак) и мыши приведены в таблице 5.
В таблице 5 показаны результаты второго раунда скрининга библиотеки мутированных последовательностей. Клоны 1Н6, 2Е5, 2G4 и 2С2 были отобраны для дальнейшего анализа.
4. Очистка антител.
Вектор, содержащий аффинно-зрелые гуманизированные антитела, трансфицировали в клетки 293F для получения и экспрессии антител. Антитела в супернатанте клеток 293F очищали с использованием аффинной хроматографии на основе белка А.
Пример 4: Исследование свойств гуманизированного антитела.
1. Перекрестная реактивность к PD-1 человека, cvnomolqus (яванских макак) и мыши (межвидовая).
1.1. FACS (метод анализа сортировки клеток с активированной флуоресценцией).
Перекрестную реактивность измеряли с помощью FACS и ИФА. Для FACS анти-PD-1-антитела тестировали на связывание с клеточной поверхностью человека, мыши и Cynomolgus PD-1, как описано в примере 2.3.
На фиг. 3 показаны результаты межвидовых испытаний с помощью FACS. На фиг. 3А показано связывание с клетками CHO-S, трансфицированными PD-1 человека. Антитела могут специфически связываться с человеческим PD-1 с ЕС50 2,20-2,78 нМ. На фиг. 3В показано связывание с клетками 293F, трансфицированными PD-1 мыши. Антитела могут специфически связываться с мышиным PD-1 с ЕС50 11,8-15,1 нМ. На фиг. 3С показано связывание с активированными РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови человека) cynomolgus в зависимости от дозы. Изотипом был человеческий IgG4 каппа. То же самое ниже.
1.2. Перекрестная реактивность к PD-1 человека, cynomolgus и мыши (межвидовая).
Для ИФА чашки (Nunc) покрывали PD-1 человека, cynomolgus или мыши (Sino Biological) при 1 мкг/мл в течение ночи при 4°С. После блокирования и отмывки антитела последовательно разводили в блокирующем буфере и добавляли в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем планшеты промывали и впоследствии инкубировали с вторичным козьим антителом к IgG человека, конъюгированным с пероксидазой хрена HRP (Bethyl) в течение 1 часа. После промывки добавляли субстрат ТМВ и реакцию останавливали 2 М HCl. Абсорбцию при 450 нм считывали с использованием устройства для считывания микропланшетов (Molecular Device).
На фиг. 4 показан результат межвидового теста методом ИФА. На фиг. 4А показано связывание с человеческим PD-1. На фиг. 4В показано связывание с мышиным PD-1. На фиг. 4С показано связывание с PD-1 Cynomolgus.
2. Перекрестная реактивность к человеческим членам семейства PD-1 CD28, CTLA4.
5
Сконструированные клеточные линии, которые соответственно экспрессируют человеческий PD-1, CD28, CTLA-4 или ICOS, переносили в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD) при плотности 2×10 клеток/лунку. Тестируемые антитела разбавляли в промывочном буфере (1×PBS/1% BSA) и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 часа. После промывки добавляли вторичное FITC-конъюгированное козье антитело против человеческого IgG Fc (анти-IgG Fc-FITC) (Jackson ImmunoResearch Lab) и инкубировали при 4°C в темноте в течение 1 часа. Затем клетки промывали один раз и ресуспендировали в 1×PBS/1% BSA и анализировали с помощью проточной цитометрии (BD) и программного обеспечения FlowJo.
На фиг. 5 показан результат теста между семействами. Антитела против PD-1 могут специфически связываться с PD-1 человека, но не с CD28 и CTLA-4.
3. Блокирование связывания лиганда сРР-1.
3.1. Способность анти-PD-1-антител блокировать связывание PD-L1 с PD-1 была протестирована FACS-анализом, как описано в примере 2.3.
3.2. Способность анти-PD-1-антител блокировать связывание PD-L2 с PD-1 тестировали ИФА. Кратко, планшеты (Nunc) покрывали человеческим PD-1 при 1 мкг/мл в течение ночи при 4°С. Антитела серийно разводили в блокирующем буфере и смешивали с PD-L2, конъюгированным с His-меткой. После блокирования и промывки покрытых планшетов смесь антитело/PD-L2 добавляли в планшеты, затем инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем планшеты промывали и впоследствии инкубировали с вторичным козьим анти-His антителом, конъюгированным с HRP (пероксидазой хрена) (anti-his-HRP, GenScript) в течение 1 часа. После промывки добавляли субстрат ТМВ и реакцию останавливали 2 М HCI. Абсорбцию при 450 нм считывали с использованием устройства для считывания микропланшетов (Molecular Device).
На фиг. 6А показан результат анти-PD-1-антител, блокирующих связывание человеческого PD-L1 с трансфицированными PD-1 клетками CHO-S. На фиг. 6В показан результат анти-PD-1-антител, блокирующих связывание мышиного PD-L1 с трансфицированными PD-1 клетками 293F. На фиг. 7 показано, что антитела против PD-1 могут блокировать связывание человеческого PD-L2 с PD-1 зависимым от дозы образом.
4. Полный кинетический анализ аффинности связывания, проверенный поверхностным плазмонным резонансом (SPR).
3
4
Определяли аффинность и кинетические показатели связывания испытываемых антител с PD-1 методом поверхностного плазмонного резонанса, используя оптический биосенсор ProteOn XPR36 (Bio-Rad). Протеин A (Sigma) иммобилизовали на сенсорном чипе GLM (Bio-Rad) посредством конъюгации аминов. Очищенные антитела пропускали через сенсорный чип, где они и захватывались протеином А. Чип поворачивали на 90° и промывали рабочим буфером (1×PBS/0,01% Tween 20, Bio-Rad) до стабилизации базового уровня. Семь концентраций человеческого PD-1 и рабочего буфера пропускали через сенсорный чип со скоростью потока 30 мкл/мин для фазы ассоциации 180 секунд, с последующей диссоциацией в течение 300 секунд. После регенерации семь концентраций мышиного PD-1 и проточного буферного раствора пропускали через сенсорный чип со скоростью потока 30 мкл/мин для фазы ассоциации 180 с, с последующей диссоциацией в течение 300 с. После каждого прогона чип регенерировали HPO (рН 1,5). Кривые ассоциации и диссоциации аппроксимировали к модели связывания Ленгмюра для связывания 1:1 с использованием программного обеспечения ProteOn.
-8
-9
-9
-9
В таблице 6А-6В показаны результаты полного кинетического анализа аффинности связывания с PD-1 человека и мыши методом SPR. WBP305BMK1 синтезировали в соответствии с клоном 5С4 в компании BMS (Bristol-Myers Squibb), патент США №9084776 В2. Кейтруда (Keytruda) был анти-PD-1 лекарственным средством от Merck. То же самое ниже. Результаты показали, что способность к сродству к человеческому PD-1 с помощью анализа SPR составляла от 1,43×10 до 5,64×10 моль/л. При сравнении WBP305BMK1 с Кейтруда (Keytruda) значение KD антител 2Е5, 2G4 или 2С2 было намного меньше, что свидетельствует о том, что 2Е5, 2G4 или 2С2 обладали лучшей способностью связываться с человеческим PD-1. Кроме того, аффинная способность к мышиному PD-1 составляла от 9,37×10 до 3,89×10 моль/л.
5. Аффинность связывания анти-PD-1-антител с молекулами PD-1 на клеточной поверхности, протестированная проточной цитометрией (FACS).
5
Клетки CHO-S, экспрессирующие человеческий PD-1, или клетки 293F, экспрессирующие мышиный PD-1, переносили в 96-луночные планшеты с U-образным дном (BD) с плотностью 1×10 клеток/лунку. Тестируемые антитела серийно разводили в буфере для промывки 1:2 (1×PBS/1% BSA) и инкубировали с клетками при 4°С в течение 1 часа. Добавляли вторичное FITC-конъюгированное козье антитело против человеческого IgG Fc (анти-IgG Fc-FITC) (3,0 моль FITC на моль IgG, (Jackson Immunoresearch Lab) и инкубировали при 4°С в темноте в течение 1 ч. Затем клетки один раз промывали и ресуспендировали в 1×PBS/1% BSA, и анализировали проточной цитометрией (BD). Интенсивность флуоресценции пересчитывали как количество связанных молекул на одну клетку, используя наборы с калибровочными частицами (QuantumTM MESF Kits, Bangs Laboratories, Inc.). KD рассчитывали с помощью программы Graphpad Prism5.
-10
-10
-8
-8
В таблице 7А-7В показаны результаты аффинности связывания анти-PD-1 антител с молекулами PD-1 клеточной поверхности человека и мыши, протестированные проточной цитометрией. Результаты показали, что аффинность к человеческому PD-1 в FACS-анализе составляла от 3,80×10 до 2,15×10 моль/л. Кроме того, аффинность к мышиному PD-1 составляла от 5,39×10 до 1,74×10 моль/л.
6. Анализ эпитоп-специфической сортировки.
Эпитопы PD-1, с которыми связываются антитела против этого белка (anti-PD-1 антитела), анализировали, используя референсные антитела А и В, методом А и В с помощью FACS. Клетки CHO-S, экспрессирующие человеческий PD-1 на поверхности клеток, инкубировали со смесью биотинилированного референсного антитела А или В (1 мкг/мл) и тестировали антитела (серийно разводили в буфере для промывки) при 4 С в течение 1 часа. Клетки промывали и добавляли второе антитело стрептавидин-РЕ и инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки промывали один раз и ресуспендировали в 1×PBS/1% BSA и анализировали проточной цитометрией (BD).
На фиг. 8А-8В показаны результаты анализа эпитоп-специфической сортировки, указывающие на то, что анти-PD-1 антитела находятся в той же или близкой эпитопной группе, что и референсные антитела. На фиг. 8А показано связывание с WBP305BMK1 (патент США №9084776). На фиг. 8В показана эпитоп-специфическая сортировка (binning) против Кейтруда (Keytruda) (патент США №8168757).
Кроме того, были проведены эксперименты по сканированию аланина на hPD-1, и было оценено их влияние на связывание антител. В человеческом белке PD-1 (hPD-1) были сделаны мутации, состоявшие в замене остатков аланина на глициновые кодоны, а всех остальных остатков - на аланиновые кодоны. Для каждого аминокислотного остатка внеклеточного домена (ECD) человеческого PD-1 (hPD-1) были сделаны точечные аминокислотные замены путем двух последовательных этапов ПЦР. В качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3.3-hPD-1_ECD.His, кодирующую внеклеточный домен ECD человеческого PD-1 и С-концевую His-метку, и набор мутагенных праймеров использовали для первого этапа ПЦР с использованием набора для направленного мутагенеза QuikChange lightning multisite-directed mutagenesis kit (Agilent technologies, Palo Alto, CA). Эндонуклеазу Dpn I использовали для расщепления родительской матрицы после реакции синтеза мутантной цепи. Во втором этапе ПЦР амплифицировали экспрессирующую линейную ДНК-кассету, состоящую из промотора цитомегаловируса (CMV), внеклеточного домена (ECD) PD-1, His-метки и сигнала полиаденилирования тимидинкиназы (TK) вируса простого герпеса и обеспечивали ее временную экспрессию в клетках HEK293F (Life Technologies, Gaithersburg, MD).
Лунки планшетов для анализа связывания методом ИФА покрывали моноклональными антителами W3052_r16.88.9 и Кейтруда (Keytruda). После взаимодействия с супернатантом, который содержит определенное количество мутанта PD-1 или человеческого/мышиного белка PD-1_ECD.His (Sino Biological, China), добавляли конъюгированное с HRP анти-His-антитело в качестве детектирующего антитела. Абсорбцию нормализовали в соответствии со средним значением контрольных мутантов. После установки дополнительного отсечения для изменения кратности связывания (<0,55) были определены окончательно определенные остатки эпитопа. Измеренные значения поглощения нормализовали по среднему для контрольных мутантных белков. После введения дополнительной границы отличия отрицательных результатов от положительных для кратности изменения связывания (<0,55), окончательно идентифицировали аминокислотные остатки эпитопа.
Определяли связывающую активность антител W3052_r16.88.9 и Кейтруда (Keytruda) как с человеческим, так и с мышиным PD-1 (фиг. 9). Было обнаружено, что W3052_r16.88.9 связывается как с hPD-1, так и с mPD-1, тогда как Кейтруда (Keytruda) связывается только с человеческим hPD-1 (фиг. 9). Эта уникальная функциональная перекрестная реактивность W3052_r16.88.9 может помочь обеспечить больше вариантов моделей животных в доклинических исследованиях при оценке безопасности лекарственного средства. Для исследования происхождения наблюдаемого поведения связывания, проводили эпитопное картирование обоих антител.
Лучшие 30 мутантных вариантов hPD-1 с точечными аминокислотными заменами, которые значимо снижали связывание антител, представлены в таблице 8. Проверка положений всех этих остатков на кристаллических структурах hPD-1 (код PDB 3RRQ и 4ZQK) показала, что некоторые аминокислоты (например, Val144, Leu142, Val110, Met108, Cys123 и др.) располагаются в глубине белковой глобулы, и маловероятно, что они контактируют с какими-либо антителами. Наблюдаемое снижение связывания, скорее всего, обусловлено нестабильностью или даже разрушением структуры hPD-1 после аланиновых замен. Согласно анализу структуры антигена, некоторые из остатков не участвуют в связывающей активности, но, как ожидается, будут реагировать на стабильность структуры hPD-1, например, V144 и L142. Мутантные варианты, с которыми изменялось связывание обоих антител расценивались как фальшивые горячие точки и исключались из рассмотрения. После введения дополнительной границы отличия отрицательных результатов от положительных для отсечения кратности изменения связывания (<0,55), окончательно идентифицированные аминокислотные остатки эпитопа перечислены в таблице 9. Эти аминокислотные остатки занимают 9 положений в W3052_r16.88.9 и 5 позиций в Кейтруда (Keytruda).
Сравнение аминокислотных остатков эпитопа W3052_r 16.88.9 и Кейтруда (Keytruda) в таблице 9 выявило только два перекрывающихся остатка горячей точки. Остальные аминокислотные остатки выглядели довольно разнообразно, что указывало на то, что два антитела могли использовать совершенно разные механизмы с точки зрения связывания hPD-1 и блокирования hPD-L1. Считывание идентификационных номеров (IDs) остатков в таблице 9 не является простым для интерпретации механизмов. Поэтому все данные в таблице 9, а также сайт связывания hPD-L1 были картированы на кристаллической структуре hPD-1 для лучшей визуализации и сравнения. (См. фиг. 10).
С'' нить, наблюдаемая в мышином mPD-1, отсутствует в структуре hPD-1. Этот β-лист заменяется бесструктурной петлей на hPD-1. Авторы изобретения по-прежнему используют С'' для обозначения этого региона, просто для упрощения сравнения с mPD-1.
Два исследованных антитела W3052_r16.88.9 и Кейтруда (Keytruda), хотя оба являются функциональными в связывании hPD-1 и блокировании hPD-L1, имеют очевидно разные эпитопы (фиг. 10В, 10С). В формировании эпитопа для Кейтруда (Keytruda) участвуют главным образом аминокислотные остатки петли CD (соответствует цепи С'' в мышином PD-1), которая совершенно не пересекается с участком связывания PD-L1. Из этого следует, что в Кейтруда (Keytruda) функция блокирования связывания hPD-L1 (человеческого PD-1 с его лигандом (PD-L1)) определяется более стерическим несоответствием, обусловленным размерами молекулы антитела. Напротив, результаты картирования эпитопа показывают, что эпитоп антитела W3052_r16.88.9 образован "горячими" аминокислотными остатками, расположенными в разных местах, и этот эпитоп имеет прямое перекрытие с сайтом связывания hPD-L1 (фиг. 10А, 10В). W3052_r16.88.9 блокировал hPD-L1 посредством конкуренции с hPD-L1 в реакции за их общий сайт связывания. Более того, W3052_r16.88.9 не взаимодействовал с гибкой петлей CD (или соответствующей цепью С'' в mPD-1), где PD-1 человека и мыши демонстрируют большие структурные отклонения (фиг.11). Его сайт связывания в основном расположен на петле FG (Lin et al. (2008) PNAS 105: 3011-3016). Это объясняет, почему W3052_r16.88.9 может связываться с обоими видами PD-1, тогда как Кейтруда (Keytruda) связывается только с человеческим PD-1 (фиг. 9). Из-за этой уникальной функциональной перекрестной реактивности, доклинические оценки безопасности W3052_r16.88.9 могут быть проведены в мышиной модели, что значительно упростит и ускорит разработку. В целом, ожидается, что антитело W3052_r16.88.9 будет более функциональным и перспективным для развития, чем Кейтруда (Keytruda).
7. In vitro функция анти-РР-1-антител, протестированных клеточными анализами
7.1. Реакцию смешанной культуры лимфоцитов (MLR) использовали для тестирования влияния анти-РР-1 антител на функцию Т-лимфоцитов.
+
+
+
+
+
+
+
+
Выделение человеческих DC, CD4 Т, CD8 Т и суммарных Т-клеток человека: РВМС человека были свежевыделенными от здоровых доноров с использованием центрифугирования в градиенте Ficoll-Paque PLUS (GE). Моноциты выделяли с использованием набора для обогащения человеческих моноцитов Human Monocyte Enrichment Kit (StemCell) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки культивировали в среде, содержащей rhGM-CSF и rhlL-4, в течение 5-7 дней для получения дендритных клеток. За 18-24 часа до MLR к культуре добавляли 1 мкг/мл LPS для индукции созревания DC. Человеческие CD4 Т-клетки выделяли с использованием набора для обогащения человеческих CD4 Т-клеток Human CD4 Т Cell Enrichment Kit (StemCell) в соответствии с протоколом производителя. Мышиные CD4 Т-клетки получали из селезенки мыши Balb/c с использованием набора для выделения CD4 мышиных Т-клеток Mouse CD4 Т Cell Isolation Kit (StemCell) в соответствии с протоколом производителя. Мышиные DC индуцировали из клеток костного мозга мыши C57BL/6 в среде, содержащей rmGM-CSF и rmIL-4, в течение 5-7 дней. За 18-24 часа до MLR в культуру добавляли 1 мкг/мл LPS для индукции созревания дендритных клеток (DCs).
5
+
Вкратце, MLR, стимулированную первичными дендритными клетками (DC), проводили в 96-луночных планшетах для культивирования тканей с U-образным дном в 200 мкл RPMI 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и 1% антибиотиков. DC смешивали с 1×10 CD4 Т-клетками в соотношении 1:10 и 1:200 DC: Т-клетки в присутствии или в отсутствие тестируемых антител или ссылочных антител (от 166,75 нМ до 0,00667 нМ, обычно всего шесть концентраций). Для определения влияния анти-PD-1 антител на функцию Т-клеток определяли продукцирование цитокинов и пролиферацию Т-клеток. Показанные результаты представляют минимум пять проведенных экспериментов.
Обнаружение цитокинов: человеческий IFN-γ и IL-2 измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием пар совместимых (matched) антител. Планшеты предварительно покрывали захватывающим антителом, специфичным для человеческого IFN-γ (каталожный №Pierce-M700A) или IL-2 (каталожный №R & D-MAB602), соответственно. В качестве детектирующего антитела использовали конъюгированное с биотином анти-IFN-γ антитело (каталожный №Pierce-M701B) или анти-IL-2 антитело (каталожный №R & D-BAF202).
На фиг. 12А показано, что анти-PD-1 антитела увеличивали секрецию IL-2 в зависимости от дозы. На фиг. 12В показано, что анти-PD-1 антитела увеличивали секрецию IFN-γ в зависимости от дозы.
2
+
Анализ пролиферации: 3Н-тимидин (каталожный № PerkinElmer-NET027001MC) разводили 1:20 в 0,9% растворе NaCl и добавляли в планшеты для культивирования клеток при 0,5 мкКи/лунку. Планшеты культивировали в 5% CO при 37°С в течение 16-18 часов, прежде чем определяли включение 3Н-тимидина в пролиферирующие клетки. На фиг. 12С показано, что анти-PD-1 антитела увеличивают пролиферацию CD4 Т-клеток в зависимости от дозы.
+
+
Для определения влияния анти-PD-1 антител на функцию мышиных Т-клеток, продуцирование цитокинов и пролиферацию мышиных Т-клеток определяли аналогичным образом. На фиг. 13А-13С показаны результаты мышиного алло-MLR, демонстрирующие, что анти-PD-1 антитела могут усиливать функцию мышиных CD4 Т-клеток. На фиг. 13А показано, что анти-PD-1 антитела повышали секрецию IL-2 в зависимости от дозы. На фиг. 13В показано, что антитела против PD-1 повышали секрецию IFN-γ в зависимости от дозы. На фиг. 13С показано, что анти-PD-1 антитела усиливали пролиферацию CD4 Т-клеток в зависимости от дозы.
7.2. Влияние человеческих анти-PD-1 антител на пролиферацию клеток и выработку цитокинов с помощью аутологичного антигенспецифического иммунного ответа.
В этом анализе CD4+ Т-клетки и дендритные клетки (DCs) были от одного и того же донора. Вкратце, CD4+ Т-клетки очищали от мононуклеарных клеток периферической крови человека (РВМС) и культивировали в присутствии пептида рр65 CMV и низкой дозы IL-2 (20 ЕД/мл), в то же время дендритные клетки (DCs) получали путем культивирования моноцитов из РВМС того же донора в GM- CSF и IL-4. Через 5 дней CD4+ Т-клетки, обработанные пептидом рр65 CMV, совместно культивировали с DCs, в которые вводили пептид рр65 CMV в отсутствие или в присутствии человеческих антител против PD-1 или ссылочных антител (в качестве контроля). На 5 день из каждой культуры отбирали по 100 мкл супернатантов для измерения IFN-γ с помощью ИФА, как описано выше. Пролиферацию CMV рр65-специфичных Т-клеток оценивали по включению 3Н-тимидина, как описано выше.
На фиг. 14А-14В показаны результаты ауто-MLR человека, демонстрирующие, что антитела против PD-1 могут усиливать функцию CD4+Т-клеток человека. На фиг. 14А показано, что антитела против PD-1 усиливают секрецию IFN-γ в зависимости от дозы. На фиг. 14В показано, что антитела против PD-1 усиливают пролиферацию CD4+ Т-клеток в зависимости от дозы.
7.3. Влияние анти-РР-1 антител человека на супрессивную функцию регуляторных Т-клеток (Tregs).
-
5
-
5
2
Tregs, субпопуляция Т-клеток, является ключевым иммуномодулятором и играет критическую роль в поддержании аутотолерантности. Повышенное число CD4+ CD25+ Tregs было обнаружено у пациентов с множественными раковыми заболеваниями и связано с худшим прогнозом. Чтобы определить, влияют ли анти-PD-1-антитела на иммуносупрессивную роль Tregs, авторы изобретения сравнили функцию Т-клеток в присутствии Tregs с обработкой анти-PD-1 антителом или без нее. CD4+CD25+ и CD4+CD25 Т-клетки были разделены с использованием специальных микробусин анти-CD25 (StemCell) в соответствии с инструкцией производителя. Две тысячи зрелых DCs, 1×10 CD4+CD25 Т-клеток, 1×10 Treg-клеток и антител PD-1 инкубировали в 96-луночных планшетах. Планшеты выдерживали при 37°С в 5% CO-инкубаторе в течение 5 дней. Выра IFN-γ и пролиферацию клеток CD4+CD25- тестировали, как описано выше.
На фиг. 15 показано, что анти-PD-1-антитела могут инвертировать супрессивную функциию Tregs. На фиг. 15А показано, что анти-PD-1-антитела могут восстанавливать секрецию IFN-γ. На фиг. 15В показано, что анти-PD-1-антитела могут восстанавливать пролиферацию Т-клеток.
8. Определение ADCC и CDC.
PD-1 экспрессируется на различных типах клеток. Во избежание потенциальной токсичности в отношении нормальных клеток, несущих PD-1, антитела против PD-1 оценивали на их способность опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC).
8.1. Определение ADCC.
2
Активированные человеческие CD4+ Т-клетки и различные концентрации антител к PD-1 предварительно инкубировали в 96-луночном планшете в течение 30 минут, а затем добавляли РВМС при соотношении эффектор/мишень 50:1. Планшет выдерживали при 37°С в инкубаторе с 5% CO в течение 6 часов. Лизис клеток-мишеней определяли с помощью набора для определения цитотоксичности на основе LDH, LDH-based cytotoxicity detection kit (кат. № Roche-11644793001). Поглощение при 492 нм считывали с использованием устройства для считывания микропланшетов (Molecular Device). Индуцированный герцептином лизис клеток SK-Br-3 использовали в качестве положительного контроля.
На фиг. 16 показан результат определения ADCC, демонстрирующий, что анти-PD-1-антитела не опосредуют активность ADCC на активированных CD4+ Т-клетках.
8.2. Определение CDC.
2
Активированные человеческие CD4+ Т-клетки и различные концентрации антител к PD-1 смешивали в 96-луночном планшете. Систему комплемента человека (Quidel-A112) добавляли в соотношении разведений 1:50. Планшет выдерживали при 37°С в инкубаторе с 5% CO в течение 2 часов. Лизис клеток-мишеней определяли с помощью CellTiter-Glo. Ритуксан-индуцированный лизис клеток Раджи использовали в качестве положительного контроля. Люминесценцию считывали с использованием устройства для считывания микропланшетов (Molecular Device).
На фиг. 17 показан результат определения CDC, демонстрирующий, что анти-PD-1-антитела не опосредуют активность CDC на активированных CD4+ Т-клетках.
Пример 5: Лечение опухолевой модели in vivo с использованием моноклональных антител человека против PD-1.
1. Планирование эксперимента.
2. Методы
2.1. Культура клеток.
2
Клетки мышиной меланомы CloudmanS91 (ATCC-CCL-53.1) культивировали in vitro в виде монослоя, и условия культивирования представляли собой среду F-12K с добавлением 2,5% FBS и 15% сыворотки лошади, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, инкубировали при 37°С и 5% CO. Клетки расщепляли с использованием трипсина-ЭДТА и регулярно два раза в неделю проводили пассаж. Клетки собирали, подсчитывали и затем инокулировали, когда сливалось приблизительно 80-90% и число соответствовало требуемому.
2.2. Инъекция опухолевых клеток.
5
3
0,1 мл (5×10 клеток) клеток Cloudman S91 инокулировали подкожно в правую сторону каждого животного. При достижении среднего объема опухоли приблизительно 64 мм, введение начинали в группах. Схемы группирования и режимы дозирования показаны в таблице 10.
2.3. Тестирование опухоли и индекс.
Экспериментальный индекс предназначен для изучения того, был ли рост опухоли ингибирован, отсрочен или излечен. Диаметры опухолей измеряли штангенциркулем три раза в неделю. Объем опухоли рассчитывают с использованием V=0,5а × b2, где а и b представляют собой длинный и короткий диаметры опухоли соответственно.
Противоопухолевую эффективность антитела оценивали по ингибированию роста опухоли TGI (%) или относительной скорости пролиферации опухоли Т/С (%). TGI (%) отражает скорость ингибирования роста опухоли. TGI (%) рассчитывали следующим образом: TGI (%)=[(1- (средний объем опухоли в конце введения в группе лечения - средний объем опухоли в начале введения в группе лечения)) / (средний объем опухоли в конце лечения в контрольной группе с растворителем - средний объем опухоли в начале лечения в контрольной группе с растворителем)] × 100%.
RTV
RTV
RTV
RTV
t
0
0
0
RTV
RTV
Относительную скорость пролиферации опухоли Т/С (%) рассчитывали следующим образом: Т/С%=T / C × 100% (T: группа лечения RTV; C: группа отрицательного контроля RTV). Относительный объем опухоли (RTV) рассчитывали в соответствии с результатами измерений опухоли с использованием RTV=V/V, где V являлся средним объемом опухоли во время деления на группы (то есть d), Vt являлся средним объемом опухоли определенного измерения; данные T и C брали в один и тот же день.
3
ТС (дни) отражали индекс задержки роста опухоли, Т представлял средние дни, прошедшие, когда опухоль достигла заданного объема в группе лечения (например, 300 мм), С представлял средние дни, когда опухоли в контрольной группе достигали того же объема.
3
Были построены кривые выживания; Время выживания животных определяли как время от введения до гибели животных или время, когда объем опухоли достигал 2000 мм. Среднее время выживания (дни) рассчитывали в каждой группе. Увеличение продолжительности жизни (ILS) было рассчитано путем сравнения медианного времени выживания между обработанной группой и контрольной группой модели и представлено в виде процента в течение жизни контрольной группы модели.
2.4. Статистический анализ.
Данные, включающие средний объем опухоли в каждый момент времени в каждой группе и стандартную ошибку (SEM), были проанализированы статистически (конкретные данные приведены в таблице 11). Эксперимент был завершен на 37 день после введения; на 13-й день после введения начинают последовательно умерщвлять животных; и поэтому статистический анализ и оценка межгрупповых различий основывались на объеме опухоли на 13-й день после начала введения. Для сравнения двух групп данные были проанализированы с использованием Т-критерия; для сравнения трех или более групп данные анализировали с использованием однофакторного анализа ANOVA. Если для значения F была обнаружена статистически значимая разница, данные анализировали с использованием критерия Games-Howell. Если не было обнаружено статистически значимой разницы для значения F, для анализа использовали 2-сторонний критерий Даннета. SPSS 17.0 использовали для анализа всех данных, р<0,05 считали достоверной разницей. Время выживания анализировали с использованием кривых Каплана-Мейера и логрангового критерия.
3. Результаты.
3.1. Смертность, развитие заболевания и изменение массы тела.
Вес животного является косвенным эталоном для измерения токсичности лекарственного средства. Воздействие 2Е5 на вес в мышиной модели CloudmanS91 подкожного сингенного ксенотрансплантата у самок мышей линии DBA/2 было таким, как показано на фиг. 18 и фиг. 19. В этой модели все группы введения не показали значительной потери веса (фиг. 18). Таким образом, 2Е5 не обладал очевидной токсичностью в мышиной модели меланомы CloudmanS91.
3.2. Объем опухоли.
Объем опухоли в мышиной модели CloudmanS91 подкожного сингенного ксенотрансплантата у самок мышей линии DBA/2 после обработки 2Е5 был таким, как показано в таблице 11.
3.3. Кривая роста опухоли.
Кривая роста опухоли показана на фиг. 20.
3.4. Оценка противоопухолевой эффективности.
3.5. Кривые выживания.
Кривые выживания в каждой группе показаны на фиг. 21.
3.6. Время выживания.
4. Обсуждение.
3
3
3
3
В этом исследовании авторы изобретения оценили эффективность in vivo 2Е5 на модели сингенной опухоли CloudmanS91. Объем опухоли в каждой группе в разные моменты времени были показаны в таблице 11, таблице 12 и на фиг. 20, время выживания показано на фиг. 21 и в таблице 13. На 13 день после введения объем опухоли у мышей с опухолями в контрольной группе с растворителем достиг 1626 мм. Слабый ингибирующий эффект наблюдали в группе 1 мг/кг 2Е5 по сравнению с контрольной группой, и объем опухоли составлял 1089 мм (Т/С=68,1%, TGI=34,4%, р=0,367), задержка роста опухоли составляла 0 дней. Значимый противоопухолевый эффект наблюдали в группе 3 мг/кг 2Е5 по сравнению с контрольной группой с растворителем, и объем опухоли составлял 361 мм (Т/С=22,9%, TGI=81,0%, р=0,008), задержка роста опухоли составляла 5 дней. Значимый противоопухолевый эффект также наблюдали в группе 2Е5 10 мг/кг по сравнению с контрольной группой с растворителем, объем опухоли составлял 614 мм (Т/С=39,4%, TGI=64,7%, р=0,036), задержка роста опухоли составила 5 дней.
В эксперименте среднее время выживания мышей-опухоленосителей в контрольной группе с растворителем составляло 16 дней. По сравнению с контрольной группой, получавшей носитель, среднее время выживания мышей-опухоленосителей в группе 1 мг/кг 2Е5 составляло 20 дней, выживаемость увеличивалась на 25% (р=0,077); выживаемость мышей-опухоленосителей в группе 3 мг/кг 2Е5 составила 66,7% (р=0,001). Среднее время выживания мышей-опухоленосителей в группе 10 мг/кг 2Е5 составляло 32 дня, выживаемость была увеличена на 100% (р=0,022).
Изменения в массе тела голых мышей показаны на фиг. 19. Хорошая переносимость лекарственного средства 2Е5 была обнаружена у всех мышей с опухолями, и во всех группах лечения не наблюдалось значимой потери веса. Таким образом, в этом эксперименте значимые противоопухолевые эффекты были показаны как в группе 3 мг/кг, так и в группе 10 мг/кг для модели подкожной синергетической опухоли CloudmanS91, которая не зависит от дозы. Противоопухолевый эффект в группе 3 мг/кг был лучше, чем в группе 10 мг/кг.
Описание настоящего изобретения было сделано в указанных выше примерах. Однако специалистам в данной области техники понятно, что настоящее изобретение не ограничивается примерами. Изобретение может быть воплощено в других конкретных формах, не выходя за пределы существа и его основных характеристик. Таким образом, объем изобретения обозначен прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим описанием, и все изменения, которые входят по смыслу, и диапазон эквивалентности формулы изобретения, предназначены для включения в нее.
--->
Перечень последовательностей
<110> СиСТОНЕ ФАРМАСЬЮТИКАЛС
СиСТОНЕ ФАРМАСЬЮТИКАЛС (СУЧЖОУ) КО., ЛТД
СиСТОНЕ ФАРМАСЬЮТИКАЛС (ШАНХАЙ) КО., ЛТД
<120> НОВЫЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К БЕЛКУ ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ 1 (PD-1)
<130>  PCTF1606
<160>  24
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  115
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1                5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr
20                   25                 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Leu
35                   40                 45
Gly Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ile Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  2
<211>  115
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1                5                  10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Thr Tyr
20                   25                 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Tyr Leu
35                   40                 45
Gly Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ile Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
100                 105                 110
Val Ser Ser
115
<210>  3
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  3
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1                5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                   25                 30
Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                   40                 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85                  90                  95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  4
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  4
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1                5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                   25                 30
Asp Gly Ser Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                   40                 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85                  90                  95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  5
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  5
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1                5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                   25                 30
Asp Gly Ala Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                   40                 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85                  90                  95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  6
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  6
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1                5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                   25                 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                   40                 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85                  90                  95
Thr His Trp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  7
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  7
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1                5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                   25                 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                   40                 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85                  90                  95
Thr His Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  8
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  8
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1                5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                   25                 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                   40                 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85                  90                  95
Thr His Glu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  9
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  9
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1                5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20                   25                 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                   40                 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Leu
85                  90                  95
Thr His Glu Asn Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  10
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  10
Thr Tyr Tyr Ile Ser
1                5
<210>  11
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  11
Tyr Ile Asn Met Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1                5                  10                  15
Gly
<210>  12
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  12
Leu Gly Tyr Phe Asp Tyr
1                5
<210>  13
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  13
Ile Gly Tyr Phe Asp Tyr
1                5
<210>  14
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  14
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Leu Tyr
1                5                  10                  15
<210>  15
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  15
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Leu Tyr
1                5                  10                  15
<210>  16
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  16
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Leu Tyr
1                5                  10                  15
<210>  17
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  17
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1                5                  10                  15
<210>  18
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  18
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Tyr
1                5                  10                  15
<210>  19
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  19
Leu Val Ser Thr Leu Gly Ser
1                5
<210>  20
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  20
Met Gln Leu Thr His Glu Asn Tyr Thr
1                5
<210>  21
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  21
Met Gln Leu Thr His Trp Pro Tyr Thr
1                5
<210>  22
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  22
Met Gln Leu Thr His Ala Pro Tyr Thr
1                5
<210>  23
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<400>  23
Met Gln Leu Thr His Glu Pro Tyr Thr
1                5
<210>  24
<211>  288
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  24
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1                5                  10                  15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20                   25                 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35                   40                 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50                  55                  60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65                  70                  75                  80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85                  90                  95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100                 105                 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115                 120                 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130                 135                 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145                 150                 155                 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165                 170                 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180                 185                 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195                 200                 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210                 215                 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225                 230                 235                 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245                 250                 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260                 265                 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275                 280                 285
<---