13
USING MAGNETIC RESONANT IMAGING MEDIUM CONTAINING HYPERPOLARISED C-PIRUVATE FOR DETECTING INFLAMMATION OR INFECTION
13
ПРИМЕНЕНИЕ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ВИЗУАЛИЗИРУЮЩЕЙ СРЕДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГИПЕРПОЛЯРИЗОВАННЫЙ С-ПИРУВАТ, ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ ИЛИ ИНФЕКЦИИ

13
13
Изобретение относится к способу магнитно-резонансной (МР) томографии или спектроскопии на углероде-13 (С) с применением визуализирующей среды, содержащей гиперполяризованное С-вещество. Изобретение относится к применению гиперполяризованных молекул, меченых углеродом-13, для последующего получения изображений посредством МР томографии с целью обнаружения или наблюдения воспаления или инфекции.
Воспаление является биологическим ответом на опасные факторы, которые поражают ткани организма. Воспаление представляет собой баланс между защитными силами организма и повреждением тканей. Ключевую роль в воспалительной реакции играет иммунная система и сосудистые ткани. Иммунную систему образуют лейкоциты и молекулы, которые помогают организму бороться с инфекцией, устранять вредоносные раздражители и восстанавливать пораженные ткани. В течение воспалительного процесса иммунная система и усиленный кровоток помогают удалять патогены и восстанавливать поврежденные ткани.
Воспаление вызывает привлечение новых кровеносных сосудов к доставке питательных веществ и дополнительных компонентов иммунной системы к очагу инфекции или повреждения. Хотя причиной воспаления часто является экзогенный патоген (например, бактерия, вирус, гриб, паразит, прион и вироид), другие инициаторы воспалительного ответа включают аутоантигены, травмы, аллергены и раздражители. В отсутствие воспаления раны и инфекции не излечивались бы и прогрессирующая деструкция ткани приводила бы к гибели организма. Воспаление часто сигнализирует о наличии скрытого заболевания, от которого пытается избавиться организм. Инфекция представляет собой колонизацию организма-хозяина чужеродными видами, которая часто приводит к клинически выраженному заболеванию. Чужеродные виды обычно представляют собой микроскопические патогены, такие как колонии бактерий, грибов, вирусов, паразитов, прионов или вироидов. Воспаление является механизмом, используемым организмом-хозяином для очищения от инфекции. Воспаление также может служить для освобождения от аутоантигенов, пораженных тканей (например, в результате травмы), аллергенов и раздражителей.
Однако нарушение регуляции воспаления или его неконтролируемое развитие может приводить к ряду проблем, включая аутоиммунные заболевания, аллергии, атеросклероз, воспалительный и дегенеративный артрит, астму, хронический бронхит, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ) и рассеянный склероз. Вследствие этого воспаление обычно строго регулируется организмом. Воспаление может быть классифицировано либо как острое, либо как хроническое. Острое воспаление представляет собой первоначальную реакцию организма на опасные раздражители и происходит в результате усиленного перемещения плазмы и лейкоцитов из крови к поврежденным тканям. Происходит каскад биохимических явлений, приводящих к развитию воспалительной реакции с вовлечением местной сосудистой системы, иммунной системы и различных клеток в поврежденной ткани. Длительное воспаление, известное как хроническое воспаление, приводит к изменению типа клеток, которые присутствуют в очаге воспаления и характеризуется одновременной деструкцией и восстановлением ткани в результате воспалительного процесса.
Воспаление и инфекционные заболевания имеют сходные механизмы на молекулярном и клеточном уровне. Эти заболевания вызывают активацию иммунной системы и зачастую их сложно клинически обнаружить и наблюдать. В настоящее время визуальные способы выявления воспаления и инфекции ограничены и не существует хороших клинических тестов для обнаружения и наблюдения за воздействием терапии на эти заболевания. Практикующим врачам приходится полагаться на субъективные показатели самочувствия пациента, вторичные признаки, такие как анализы крови (уровень лейкоцитов, С-реактивный белок (СРБ) и т.д.), неспецифическую радионуклидную визуализацию или анатомические изменения в поздний период болезни, выявленные диагностической визуализацией (традиционной МРТ, ультразвуковым исследованием (УЗИ), компьютерной томографией и рентгенографией). Например, ревматоидный артрит является распространенным заболеванием, поражающим примерно 1% населения пожилого возраста, и в настоящее время не существует хороших неинвазивных способов обнаружения и наблюдения ревматоидного артрита. Практикующим врачам часто остается полагаться только на субъективные показатели для диагностирования заболевания и для оценки того, как пациент реагирует на лечение. Таким образом существует потребность в обнаружении воспаления и инфекции неинвазивным путем in vivo в организме человека или животного, не являющегося человеком.
МР обнаружение, такое как МР томография (МРТ), МР спектроскопия (МРС) и МР спектроскопическая томография (МРСТ), может быть полезным средством обнаружения воспаления и инфекции и это средство является особенно привлекательным для врачей, так как оно позволяет получать изображения организма пациента или его частей неинвазивным путем и без воздействия потенциально опасного излучения, такого как рентгеновские лучи, на пациента и медицинский персонал. Вследствие высокого качества изображений с исключительной контрастностью мягких тканей и благодаря хорошему пространственному и временному разрешению МРТ является подходящим методом диагностической визуализации мягких тканей и органов.
13
13
13
13
Обнаружено, что гиперполяризованное С-вещество можно применять в качестве агента для обнаружения воспаления и инфекции в организме человека или животного, не являющегося человеком, с использованием С-МРТ, С-МРС и С-МРСТ.
13
13
13
13
13
13
1
1
1
1
Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения предложен способ С-МР томографии, и/или С-МР спектроскопии, и/или С-МР спектроскопической томографии для обнаружения воспаления или инфекции с использованием визуализирующей среды, содержащей гиперполяризованное С-вещество. Такие вещества должны содержать ядра со временем продольной релаксации (T) больше чем 10 секунд, предпочтительно больше чем 30 секунд и еще более предпочтительно больше чем 60 секунд. Такие так называемые «агенты с высоким T», например, описаны в WO A-99/35508. Альтернативно, значения T возможных веществ могут быть найдены в литературе или могут быть определены путем получения ЯМР спектра возможного вещества, например С-ЯМР спектра для вычисления T вещества, меченого С.
13
Предпочтительными гиперполяризованными С-веществами являются биомолекулы, которые участвуют в метаболических процессах в организме человека и животного, не являющегося человеком. Таким образом, особенно предпочтительными веществами являются эндогенные соединения, более предпочтительно эндогенные соединения, которые участвуют в метаболических процессах в организме человека и животного, не являющегося человеком. Особенно предпочтительные вещества выбраны из аминокислот (в протонированной и депротонированной форме), предпочтительно аланина, глицина, глютамина, глютаминовой кислоты, цистеина, аспарагина и аспарагиновой кислоты, ацетата, пировиноградной кислоты, пирувата, оксалата, малата, фумарата, лактата, молочной кислоты, цитрата, бикарбоната, малоната, сукцината, оксалоацетата, α-кетоглютарата, 3-гидроксибутирата, изоцитрата и мочевины.
Пируват является эндогенным соединением, которое очень хорошо переносится организмом человека даже в относительно высоких концентрациях. Как предшественник в цикле трикарбоновых кислот пируват играет важную метаболическую роль в организме человека. Пируват преобразуется в различные соединения: его трансаминирование приводит к образованию аланина, в результате окислительного декарбоксилирования пируват превращается в ацетил-КоА и диоксид углерода (который далее преобразуется в бикарбонат), восстановление пирувата приводит к образованию лактата, а его карбоксилирование приводит к образованию оксалоацетата.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
1,2
1,2,3
1
1
Кроме этого, метаболическое превращение гиперполяризованного С-пирувата в его метаболиты, гиперполяризованный С-лактат, гиперполяризованный С-бикарбонат (только в случае С-пирувата, C-пирувата или С-пирувата) и гиперполяризованный С-аланин может быть использовано для изучения метаболических процессов в организме человека с применением МР. С-Пируват в цельной крови человека при 37°С имеет время релаксации T, равное примерно 42 с, однако установлено, что превращение гиперполяризованного С-пирувата в гиперполяризованный С-лактат, гиперполяризованный С-бикарбонат и гиперполяризованный С-аланин происходит достаточно быстро для обнаружения сигнала от исходного соединения С-пирувата и его метаболитов. Количество аланина, бикарбоната и лактата зависит от метаболического статуса исследуемой ткани. Интенсивность МР сигнала гиперполяризованного С-лактата, гиперполяризованного С-бикарбоната и гиперполяризованного С-аланина связана с количеством этих соединений и остаточной степенью поляризации на момент измерения, следовательно, отслеживая превращение гиперполяризованного С-пирувата в гиперполяризованный С-лактат, гиперполяризованный С-бикарбонат и гиперполяризованный С-аланин, можно изучать метаболические процессы in vivo в организме человека или животного, не являющегося человеком, с помощью неинвазивной МРТ, МРС или МРСТ.
13
13
Обнаружено, что амплитуды МР сигнала от различных метаболитов пирувата различаются в зависимости от типа ткани. Уникальная картина метаболических пиков, образуемых аланином, лактатом, бикарбонатом и пируватом, может быть использована в качестве характерного признака метаболического состояния исследуемой ткани, тем самым позволяя отличать здоровые и нездоровые ткани. Применение гиперполяризованного С-пирувата для визуализации опухолей вследствие высокой метаболической активности, проявляемой опухолевыми тканями, детально описано в WO-A-2006/011810. Кроме того, применение гиперполяризованного С-пирувата для визуализации сердца описано в WO-A-2006/054903.
13
13
13
13
Таким образом, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения предложен способ С-МР томографии, и/или С-МР спектроскопии, и/или С-МР спектроскопической томографии для обнаружения воспаления или инфекции с использованием визуализирующей среды, содержащей гиперполяризованный С-пируват.
Изобретение решает задачу обнаружения очагов воспаления или инфекции. Это особенно важно для скрытых инфекций, которые трудно диагностировать и определить. Способом по настоящему изобретению идентифицируют анатомическую локализацию очага поражения. Кроме того, способом по настоящему изобретению очаг воспаления или инфекции может быть измерен и может быть получена информация о метаболических процессах в течение болезни. Следовательно, настоящий способ объединяет преимущества диагностической визуализации с возможностью получать характеристики метаболических процессов. Обнаружение изменений в молекулярных процессах может быть более чувствительным и специфичным, чем анатомическое описание заболевания. МРСТ на гиперполяризованном углероде-13, используемая в способе по настоящему изобретению, значительно увеличивает чувствительность к молекулярным процессам. Субъективные и количественные способы визуализации по настоящему изобретению позволяют раньше обнаружить заболевание, а также лучше адаптировать терапию. Это может быть особенно важно в лечении таких заболеваний с воспалительной составляющей, как астма, хронический бронхит, ХОБЛ и рассеянный склероз, когда выбор лекарственных средств затруднен и сложно отслеживать развитие заболевания. Кроме того, настоящее изобретение может быть полезно для ускорения разработки лекарственных средств за счет сокращения времени и количества испытуемых, так как для оценки течения болезни доступен неинвазивный способ по изобретению.
13
В качестве практического применения авторы изобретения показали, что для обнаружения воспаления может быть использован С-пируват. Однако теоретически любое гиперполяризумое вещество, содержащее изотопы, может быть потенциально пригодно для обнаружения и наблюдения воспаления или инфекции. Другие вещества, потенциально пригодные для обнаружения и наблюдения воспаления или инфекции с помощью способа гиперполяризованной МРТ, включают вещества, содержащие изотопы кислорода, азота, ксенона, гелия и фтора.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
1
1
1
1
1
Термин «С-пируват» означает соль С-пировиноградной кислоты. Далее термины пируват, С-пируват и С-пируват взаимозаменяемы и означают С-пируват. Точно так же термины пировиноградная кислота, С-пировиноградная кислота и С-пировиноградная кислота взаимозаменяемы и означают С-пировиноградную кислоту. Кроме того, термины лактат, С-лактат и С-лактат взаимозаменяемы и означают С-лактат, если не указано иное.
В данном описании термины «гиперполяризованный» и «поляризованный» взаимозаменяемы и означают степень ядерной поляризации более 0,1%, более предпочтительно более 1% и наиболее предпочтительно более 10%.
13
13
13
13
13
13
13
Степень поляризации может быть, например, определена методами С-ЯМР твердого тела для гиперполяризованного С-пирувата в твердом состоянии, например гиперполяризованного С-пирувата в твердом состоянии, полученного динамической поляризацией ядер (ДПЯ) С-пирувата. Для получения С-ЯМР твердого тела предпочтительно применяется простая ЯМР последовательность «импульс-регистрация» (pulse-acquire) с малым углом отклонения вектора намагниченности. Интенсивность сигнала гиперполяризованного С-пирувата в ЯМР спектре сравнивают с интенсивностью сигнала С-пирувата в ЯМР спектре, полученном до процесса поляризации. Степень поляризации рассчитывают как отношение интенсивностей сигнала до и после поляризации.
13
13
13
13
Аналогичным образом может быть определена степень поляризации растворенного гиперполяризованного С-пирувата методами жидкостного ЯМР. Точно так же интенсивность сигнала растворенного гиперполяризованного С-пирувата сравнивают с интенсивностью сигнала растворенного С-пирувата до поляризации. Затем степень поляризации рассчитывают как отношение интенсивностей сигнала С-пирувата до и после поляризации.
13
13
Термин «визуализирующая среда» означает жидкую композицию, содержащую в качестве МР-активного агента гиперполяризованное С-вещество, такое как гиперполяризованный С-пируват, но не ограниченную этим веществом. Визуализирующая среда по изобретению может быть использована как визуализирующая среда в МР томографии или как контрастное вещество в МР спектроскопии и МР спектроскопической томографии.
Визуализирующую среду в соответствии со способом по настоящему изобретению можно использовать как визуализирующую среду для МР томографии, спектроскопии и/или спектроскопической томографии in vivo, т.е. для МР томографии, спектроскопии и/или спектроскопической томографии, которую проводят на живом человеке или животном, не являющемся человеком. Кроме того, визуализирующую среду в соответствии со способом по настоящему изобретению можно использовать как визуализирующую среду для МР томографии, спектроскопии и/или спектроскопической томографии in vitro, т.е. для обнаружения и наблюдения воспаления или инфекции в культурах клеток или тканях ex vivo. Культуры клеток могут быть выращены из клеток, полученных из проб, извлеченных из организма человека или животного, не являющегося человеком, таких как, например, кровь, моча или слюна, тогда как ткани ех vivo могут быть получены биопсией или хирургическими методами.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
1
2
3
1,2
1,3
2,3
1,2,3
1
1
Изотопное обогащение гиперполяризованного С-пирувата, применяемого в способе по изобретению, составляет предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80% и особенно предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительным является изотопное обогащение свыше 90%. В идеале изотопное обогащение составляет 100%. С-пируват, применяемый в способе по изобретению, может быть обогащен изотопом в положении С1 (далее обозначен как С-пируват), в положении С2 (далее обозначен как C-пируват), в положении С3 (далее обозначен как С-пируват), в положениях С1 и С2 (далее обозначен как C-пируват), в положениях С1 и С3 (далее обозначен как С-пируват), в положениях С2 и С3 (далее обозначен как С-пируват) или в положениях С1, С2 и С3 (далее обозначен как С-пируват). Обогащение изотопом в положении С1 является предпочтительным, так как С-пируват имеет более высокое значение времени релаксации T в цельной крови человека при 37°С (примерно 42 с), чем С-пируват, который обогащен изотопом в других положениях С.
13
Гиперполяризация ЯМР-активных ядер С может быть осуществлена различными способами, например способами, описанными в WO-A-98/30918, WO-A-99/24080 и WO-A-99/35508, которые включены в данный документ посредством ссылки. Способы гиперполяризации представляют собой перенос поляризации от благородного газа, метод «грубой силы», замораживание спинов, параводородный метод и динамическая поляризация ядер (ДПЯ).
13
13
13
13
13
Предпочтительно для получения гиперполяризованного С-пирувата либо непосредственно поляризуют С-пируват, либо поляризуют С-пировиноградную кислоту и превращают поляризованную С-пировиноградную кислоту в поляризованный С-пируват, например, путем нейтрализации основания.
13
13
13
13
13
13
Одним из подходящих способов получения гиперполяризованного С-пирувата является перенос поляризации от гиперполяризованного благородного газа, который описан в WO-A-98/30918. Благородные газы, имеющие ненулевой ядерный спин, могут быть гиперполяризованы с использованием циркулярно-поляризованного света. Гиперполяризованный благородный газ, предпочтительно Не или Хе, или смесь таких газов, можно использовать для осуществления гиперполяризации ядер С. Гиперполяризованный газ может находиться в газовой фазе, он может быть растворен в жидкости или растворителе, или гиперполяризованный газ сам может служить растворителем. Альтернативно, газ может быть сконденсирован на охлажденной твердой поверхности и использован в такой форме или после его сублимации. Предпочтительным является тщательное перемешивание гиперполяризованного газа с С-пируватом или С-пировиноградной кислотой. Следовательно, если поляризуют С-пировиноградную кислоту, которая при комнатной температуре является жидкостью, гиперполяризованный газ предпочтительно растворен в жидкости или растворителе или служит растворителем. Если поляризуют С-пируват, гиперполяризованный газ предпочтительно растворен в жидкости или растворителе, которые также растворяют пируват.
13
13
Другим предпочтительным способом получения гиперполяризованного С-пирувата является поляризация ядер С термодинамическим уравновешиванием при очень низкой температуре и в очень сильном поле. Гиперполяризацию по сравнению с рабочими полем и температурой ЯМР спектрометра осуществляют в очень сильном поле и при очень низкой температуре (метод «грубой силы»). Напряженность используемого магнитного поля должна быть как можно более высокой, приемлемо выше чем 1 Тл, предпочтительно выше чем 5 Тл, более предпочтительно 15 Тл или выше и особенно предпочтительно 20 Тл или выше. Температура должна быть очень низкой, например 4,2 К или ниже, предпочтительно 1,5 К или ниже, более предпочтительно 1,0 К или ниже, особенно предпочтительно 100 мК или ниже.
13
2+
Другим предпочтительным способом получения гиперполяризованного С-пирувата является метод замораживания спинов. Этот метод включает спиновую поляризацию твердого соединения или системы путем поляризации замораживания спина. В систему вводят подходящие кристаллические парамагнитные вещества или систему тщательно смешивают с подходящими кристаллическими парамагнитными веществами, такими как N, ионы лантанидов или актинидов с осью симметрии третьего или более порядка. Оборудование более простое, чем для ДПЯ, так как нет необходимости в однородном магнитном поле, поскольку не накладывается поле резонансного возбуждения. Процесс осуществляют физическим вращением образца вокруг оси, перпендикулярной направлению магнитного поля. Необходимым условием для этого метода является наличие у парамагнитных веществ сильно анизотропного g-фактора. В результате вращения образца электронный парамагнитный резонанс воздействует на спины ядер, приводя к уменьшению их температуры. Вращение образца проводят до тех пор, пока поляризация ядерных спинов не достигнет нового равновесия.
13
13
13
В предпочтительном воплощении для получения гиперполяризованного С-пирувата используют метод динамической поляризации ядер (ДПЯ). В ДПЯ поляризацию МР-активных ядер в поляризуемом соединении осуществляют поляризационным агентом или, как его называют, агентом ДПЯ, соединением, содержащим неспаренные электроны. В ходе процесса ДПЯ подводят энергию обычно в форме микроволнового излучения, которая сначала возбуждает парамагнитный агент. При затухании до исходного состояния происходит перенос поляризации от неспаренного электрона агента ДПЯ к ЯМР-активным ядрам поляризуемого соединения, например ядрам С в С-пирувате. Обычно в процессе ДПЯ используют умеренное или сильное магнитное поле и очень низкую температуру, например, проводят процесс ДПЯ в жидком гелии и в магнитном поле около 1 Тл или выше. Альтернативно может быть использовано умеренное магнитное поле и любая температура, при которой достигается достаточное усиление поляризации. Подробнее метод ДПЯ описан, например, в WO-A-98/58272 и в WO-A-01/96895, которые оба включены в данный документ посредством ссылки.
Для поляризации соединения методом ДПЯ готовят смесь поляризуемого соединения и агента ДПЯ («образец»), которую затем замораживают и помещают в ДПЯ поляризатор для поляризации. После поляризации замороженный гиперполяризованный образец быстро переводят в жидкое состояние либо его плавлением, либо растворением в подходящей среде растворения. Растворение является предпочтительным и поэтому способ растворения замороженного гиперполяризованного образца и подходящие устройства подробно описаны в WO-A-02/37132. Способ плавления и подходящие устройства для плавления, например, описаны в WO-A-02/36005.
Для получения высокой степени поляризации поляризуемого соединения указанное соединение в ходе процесса ДПЯ должно находиться в тесном контакте с агентом ДПЯ. Если образец кристаллизуется при замораживании или охлаждении, этого не происходит. Чтобы избежать кристаллизации, либо в образце должны присутствовать стеклообразователи, либо для поляризации следует выбирать соединения, которые не кристаллизуются при замораживании, а образуют стекло.
13
13
13
Как указано ранее, подходящими исходными веществами для получения гиперполяризованного С-пирувата являются С-пировиноградная кислота или С-пируват.
13
13
Обогащенный изотопом С-пируват имеется в продаже, например, в виде С-пирувата натрия. Альтернативно, он может быть синтезирован так, как описано в S. Anker, J. Biol. Chem. 176, 1948, 133-1335.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
1
2
1
2
1,2
В данной области известно несколько способов синтеза С-пировиноградной кислоты. В Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237 кратко описан способ синтеза, основанный на защите и активации карбонилсодержащего исходного вещества в виде S,S-ацеталя, например 1,3-дитиана или 2-метил-1,3-дитиана. Дитиан подвергают металлированию и взаимодействию с метилсодержащим соединением и/или CO. Как описано в этой ссылке, с использованием соответствующего обогащенного изотопом С компонента может быть получен С-пируват, C-пируват или С-пируват. Затем карбонильную функциональную группу освобождают общепринятыми способами, описанными в литературе. Другие способы синтеза начинаются с уксусной кислоты, которую сначала превращают в ацетилбромид, а затем подвергают взаимодействию с CuCN. Полученный нитрил превращают в пировиноградную кислоту через амид (см., например, S.H. Anker et al., J. Biol. Chem. 176 (1948), 1333 или J.E. Thirkettle, Chem. Commun, (1997), 1025). Кроме того, C-пировиноградную кислоту можно получить протонированием имеющегося в продаже С-пирувата натрия, например, способом, описанным в патенте США 6232497, или способом, описанным в WO-A-2006/038811.
13
13
13
13
13
13
13
13
Гиперполяризация С-пировиноградной кислоты с помощью ДПЯ подробно описана в WO-A1-2006/011809, который включен в данный документ посредством ссылки. Кратко, С-пировиноградную кислоту можно непосредственно использовать для ДПЯ, так как при замораживании она образует стекло. После ДПЯ замороженную гиперполяризованную С-пировиноградную кислоту необходимо растворить и нейтрализовать, т.е. превратить в С-пируват. Для превращения требуется сильное основание. Также вследствие того, что С-пировиноградная кислота является сильной, требуется выбирать агент ДПЯ, который остается стабильным в этой сильной кислоте. Предпочтительным основанием является гидроксид натрия и превращение гиперполяризованной С-пировиноградной кислоты с помощью гидроксида натрия приводит к образованию гиперполяризованного С-пирувата натрия, являющегося предпочтительным С-пируватом для визуализирующей среды, которую используют в МР томографии, спектроскопии и/или спектроскопической томографии in vivo, т.е. для МР томографии, спектроскопии и/или спектроскопической томографии, которую проводят на живом человеке или животном, не являющемся человеком.
13
13
13
+
+
+
+
2+
2+
2+
+
+
+
+
+
+
+
+
13
13
+
+
+
+
2+
2+
2+
+
4
4
4
Альтернативно, для ДПЯ может быть использован С-пируват, т.е. соль С-пировиноградной кислоты. Предпочтительными солями являются такие С-пируваты, которые содержат неорганический катион из группы, состоящей из NH , K, Rb, Cs, Ca, Sr и Ва, предпочтительно NH , «K, Rb или Cs, более предпочтительно K, Rb, Cs и наиболее предпочтительно Cs, как подробно описано в WO-A-2007/111515, который включен в данный документ посредством ссылки. Синтез этих предпочтительных С-пируватов также раскрыт в WO-A-2007/111515. Если гиперполяризованный С-пируват используют в визуализирующей среде для МР томографии и/или спектроскопии in vivo, предпочтительно заменять неорганический катион из группы, состоящей из NH , K, Rb, Cs, Ca, Sr и Ва, на более физиологически переносимый катион, такой как Na или меглюмин. Это может быть осуществлено методами, общеизвестными в данной области, например, с использованием катионообменной колонки.
13
13
12
13
Кроме того, предпочтительными солями являются С-пируваты органического амина или аминосоединения, предпочтительно ТРИС-С-пируват или меглюмин-C-пируват, подробно описанные в WO-A2-2007/069909, который включен в данный документ посредством ссылки. Синтез этих предпочтительных С-пируватов также раскрыт в WO-A2-2007/069909.
13
13
13
13
13
Если гиперполяризованный С-пируват, применяемый в способе по изобретению, получают с помощью ДПЯ, поляризуемый образец, содержащий С-пировиноградную кислоту или С-пируват и агент ДПЯ, может также включать ионы парамагнитного металла. Обнаружено, что присутствие ионов парамагнитного металла в композиции, поляризуемой с помощью ДПЯ, приводит к увеличению степени поляризации С-пировиноградной кислоты или С-пирувата, как подробно описано в WO-A2-2007/064226, который включен в данный документ посредством ссылки.
13
13
Как упомянуто ранее, визуализирующую среду согласно способу по настоящему изобретению можно использовать как визуализирующую среду для МР томографии, спектроскопии и/или спектроскопической томографии in vivo, т.е. для МР томографии, спектроскопии и/или спектроскопической томографии, которую проводят на живом человеке или животном, не являющемся человеком. Такая визуализирующая среда в дополнение к МР-активному агенту, представляющему собой С-вещество, такому как С-пируват, предпочтительно содержит водный носитель, предпочтительно физиологически переносимый и фармацевтически приемлемый водный носитель, такой как вода/физиологический раствор, буфер или смесь буферов. Кроме того, визуализирующая среда может содержать традиционные фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты и вспомогательные вещества. Так, например, визуализирующая среда может содержать стабилизаторы, агенты, регулирующие осмотическое давление, солюбилизирующие агенты и тому подобные вещества, например такие, вспомогательные вещества, которые общеприняты для диагностических композиций в медицине или ветеринарии.
13
13
Далее, визуализирующую среду согласно способу по настоящему изобретению можно использовать как визуализирующую среду для МР томографии, спектроскопии и/или спектроскопической томографии in vitro, т.е. для обнаружения и наблюдения воспаления или инфекции в культурах клеток или тканях ex vivo. Такая визуализирующая среда, кроме МР-активного агента, представляющего собой С-вещество, такое как С-пируват, предпочтительно содержит растворитель, который пригоден для исследований клеток и тканей in vitro и используется в них, например ДМСО, или метанол, или смеси растворителей, содержащие водный носитель и неводный растворитель, например смеси ДМСО и воды или буферного раствора или метанола и воды или буферного раствора. Для специалистов очевидно, что фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты и вспомогательные вещества могут присутствовать в визуализирующей среде, но не являются необходимыми для целевого назначения.
13
13
Если гиперполяризованный С-пируват используют в качестве визуализирующего агента для обнаружения инфекции с помощью МР томографии или спектроскопии in vitro, т.е. используя культуры клеток или ткани ех vivo, то добавляемая в культуры клеток или ткани ех vivo визуализирующая среда содержит гиперполяризованный С-пируват в концентрации от 10 мМ до 100 мМ, более предпочтительно от 20 мМ до 90 мМ и наиболее предпочтительно от 40 до 80 мМ.
Далее, типы воспалительных и инфекционных заболеваний, обнаруживаемые способом по изобретению, могут быть различными. Способ может быть использован для определения ряда заболеваний, при которых иммунная система активируется или нарушается. Эти заболевания могут затрагивать любые ткани организма, такие как кожные и скелетные, пищеварительную, мышечную, лимфатическую, эндокринную, нервную, сердечно-сосудистую, мужскую и женскую репродуктивную и мочевую системы. Способом можно обнаруживать аутоиммунные заболевания в любой части организма. Клинические заболевания с аутоиммунной составляющей включают, но не ограничены, ревматоидный артрит, болезнь Стилла, системную красную волчанку, склеродермию, дерматомиозит, миокардит, болезнь Крона и рассеянный склероз. Этот способ может быть использован для обнаружения воспалительной реакции при заживлении травмы. Этот способ может быть использован для обнаружения хронических заболеваний, имеющих воспалительную составляющую, таких как атеросклероз, остеоартрит, тендинит, бурсит, подагрический артрит, ХОБЛ, астма и хронический бронхит. Этот способ может обнаруживать воспаление в результате инфекций (например, бактериальной, вирусной, грибной, паразитической или других источников инфекции) в любой части организма, включая кожу, конечности, мышцы, соединительные ткани, кости, суставы, нервную систему и внутренние органы головы, шеи, грудной клетки и брюшной полости. Воспаление играет большую роль в трансплантации. Способ может обнаруживать нарушения в иммунной системе при трансплантации, такие как острое и хроническое отторжение трансплантированного цельного органа, посттрансплантационное лимфопролиферативное заболевание и реакция «трансплантат против хозяина».
13
13
13
13
13
Способ по изобретению включает обнаружение всех упомянутых выше типов болезненных состояний. Предпочтительным воплощением является способ С-МР томографии, С-МР спектроскопии и/или С-МР спектроскопической томографии для обнаружения артрита, и более предпочтительно ревматоидного артрита, с использованием визуализирующей среды, содержащей гиперполяризованное С-вещество, предпочтительно гиперполяризованный С-пируват.
13
13
В другом воплощении визуализирующая среда дополнительно содержит лактат. Следовательно, визуализирующая среда согласно способу по настоящему изобретению содержит негиперполяризованный лактат, далее обозначаемый как лактат, в дополнение к гиперполяризованному С-пирувату. Соответственно лактат добавляют в виде молочной кислоты или соли молочной кислоты, предпочтительно лактата лития или лактата натрия, наиболее предпочтительно лактата натрия. Визуализирующая среда, содержащая лактат и гиперполяризованный С-пируват, и способ ее использования подробно описаны в WO-2008/020765, который включен в данный документ посредством ссылки.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
Воспаление и инфекция могут быть обнаружены способом по настоящему изобретению путем отслеживания сигнала С-пирувата и сигнала его метаболита С-лактата во времени. В жизнеспособных, т.е. невоспалительных, клетках сигнал С-пирувата ослабевает со временем. Сигнал С-лактата сначала усиливается вследствие метаболического превращения С-пирувата в С-лактат, а затем медленно уменьшается в основном за счет релаксации. В областях воспаления метаболизм пирувата активирован и превращение С-пирувата в С-лактат увеличено. При использовании визуализирующей среды, содержащей гиперполяризованный С-пируват, эту более высокую метаболическую активность можно увидеть по увеличенному образованию С-лактата, которое может быть выявлено с помощью С-МР детекции.
13
13
Кроме того, обнаружено, что добавление лактата, либо присутствующего в визуализирующей среду по настоящему изобретению, либо добавленного или введенного отдельно, приводит к увеличению количества наблюдаемого С-лактата и тем самым усиливает МР сигнал от С-лактата.
13
13
13
13
13
13
13
Термин «С-МР детекция» означает С-МР томографию, или С-МР спектроскопию, или комбинированную С-МР томографию и С-МР спектроскопию, т.е. С-МР спектроскопическую томографию. Кроме того, термин означает С-МР спектроскопическую томографию в различные моменты времени.
13
13
13
13
13
13
1
Применяют последовательность МР визуализации, которая кодирует исследуемый объем комбинированным частотно- и пространственно-избирательным способом, и С-МР сигнал С-пирувата отслеживают с помощью МР томографии или спектроскопической томографии в течение примерно 1 минуты с момента добавления визуализирующего агента (t=0), или пока С-МР сигнал не перестанет обнаруживаться вследствие его затухания, обусловленного T релаксацией. В этот же период времени контролируют появление, увеличение и/или уменьшение сигнала С-лактата. Для получения количественной оценки может быть проведена МР томография, спектроскопия или спектроскопическая томография здоровых клеток или тканей и результаты, т.е. количество С-лактата, выработанного за данный период времени, или скорость образования С-лактата сопоставлены.
13
13
13
13
13
13
13
Если гиперполяризованный С-пируват применяют как визуализирующий агент для обнаружения воспаления или инфекции МР томографией, спектроскопией и/или спектроскопической томографией in vivo, т.е. на живом человеке или животном, не являющемся человеком, визуализирующую среду, содержащую гиперполяризованный С-пируват, предпочтительно вводят в указанный организм парентерально, предпочтительно внутривенно. Обычно исследуемый организм помещают в МР магнит. Специальные С-МР радиочастотные катушки располагают так, чтобы они охватывали исследуемую область. Дозировка и концентрация визуализирующей среды будут зависеть от ряда факторов, таких как токсичность и способ введения. Обычно визуализирующую среду вводят в концентрации до 1 ммоль С-пирувата на килограмм массы тела, предпочтительно от 0,01 до 0,5 ммоль/кг, более предпочтительно от 0,1 до 0,3 ммоль/кг. Скорость введения предпочтительно составляет менее 10 мл/с, более предпочтительно менее 6 мл/с и наиболее предпочтительно от 5 мл/с до 0,1 мл/с. Меньше чем через 400 сек после введения, предпочтительно меньше чем через 120 сек, более предпочтительно меньше чем через 60 сек после введения, особенно предпочтительно через 20-50 сек после введения, применяют последовательность МР визуализации, которая кодирует исследуемый объем комбинированным частотно- и пространственно-избирательным способом. В результате получают метаболические изображения С-пирувата, С-лактата и/или других метаболических С-продуктов. Точное время применения последовательности МР визуализации существенно зависит от объема, исследуемого на обнаружение инфекции или воспаления.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
Кодирование исследуемого объема может быть выполнено с помощью так называемых последовательностей спектроскопической визуализации, например таких, как описаны в T.R. Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3523-3526 (1982); A.A. Maudsley, et al., J. Magn. Res. 51, 147-152 (1983); D. Mayer et al., Magn. Reson. Med. 56, 932-937 (2006); S. J. Kohler et al., Magn. Reson. Med. 58(1), 65-9 (2007); Y-F. Yen et al., Magn. Reson. Med. (Epub ahead of print) Mar 24 (2009), но не ограничено ими. Данные спектроскопического изображения содержат множество элементов объема, при этом каждый элемент содержит полный С-МР спектр. С-пируват и его метаболит С-лактат имеют свои уникальные положения в С-МР спектре и их резонансная частота может быть использована для их идентификации. Интеграл от спектрального пика при его резонансной частоте прямо связан с количеством С-пирувата и С-лактата соответственно. Когда количество С-пирувата и С-лактата оценивают с помощью интегрального анализа спектральных пиков или рутинных методов выравнивания во временной области, как описано, например, в L.Vanhamme et al., J. Magn. Reson. 129, 35-43 (1997), или с помощью разделения химических сдвигов методом наименьших квадратов, как описано, например, в S.В. Reeder et al., J Magn. Reson. Imaging 26, 1145-1152 (2007) and Y. S. Levin et al., Magn. Reson. Med. 58(2), 245-52 (2007), могут быть сформированы изображения для С-пирувата и С-лактата, в которых цветовая или полутоновая кодировка отображает измеренное количество С-пирувата и С-лактата.
1
31
23
13
13
Хотя способы спектроскопической визуализации доказали свою ценность в создании метаболических изображений с использованием всех видов МР ядер, например Н, P, Na, количество повторов, необходимых для полного кодирования спектроскопического изображения, делает этот подход менее подходящим для гиперполяризованного С. Необходимо обеспечить наличие сигнала от гиперполяризованного С в течение всего периода получения данных МР. Этого можно достичь уменьшением углов отклонения ВЧ-импульса возбуждения или использованием переменных углов отклонения, как описано, например, в L. Zhao et al., J. Magn. Reson, B(113), 179-183 (1996), или многополосной схемы ВЧ возбуждения, как описано, например, в Р. Е. Z. Larson et al., J. Magn. Reson. 194: 121-127 (2008), на каждой стадии фазового кодирования. Чем больше размеры матрицы, тем больше требуется стадий фазового кодирования и дольше продолжительность сканирования.
13
13
Способы визуализации, основанные на новаторской работе Р.С.Lauterbur (Nature, 242, 190-191 (1973)) и P. Mansfield ((J. Phys. C.6, L422-L426 (1973)), в которых используют градиент считывания при получении данных, позволяют получать изображения с более высоким отношением сигнал/шум или, что эквивалентно, изображения с более высоким пространственным разрешением. Однако эти способы визуализации в их исходном виде не способны формировать отдельные изображения для С-пирувата и С-лактата, т.е. идентификация конкретных метаболитов невозможна.
1
13
13
13
В другом воплощении применяют последовательности визуализации, в которых используется множественное эхо для кодирования в отношении частотной информации. Последовательности, которые могут формировать отдельные H-изображения воды и жира, описаны, например, в G. Glover, J. Magn. Reson. Visualization 1991:1: 521-530 и S.B. Reeder et al., MRM 51 35-45 (2004). Так как подлежащие обнаружению метаболиты и соответственно их МР частоты известны, подход, рассмотренный в вышеуказанных ссылках, может быть использован для получения прямых изображений С-пирувата и С-лактата. Этот метод делает более эффективным использование гиперполяризованного С-МР сигнала, обеспечивая лучшее качество сигнала, более высокое пространственное разрешение и более короткое время сбора данных по сравнению со спектроскопической визуализацией.
13
13
13
13
13
13
13
13
В предпочтительном воплощении способ по настоящему изобретению включает получение прямых С-МР изображений или спектров С-пирувата и С-лактата организма человека или животного, не являющегося человеком, которому предварительно введена визуализирующая среда, содержащая гиперполяризованный С-пируват, или культуры клеток или ткани ex vivo, к которой добавлена визуализирующая среда. В описанном методе инфекцию или воспаление идентифицируют и обнаруживают по высокой интенсивности С-сигнала С-лактата или по повышенной скорости образования С-лактата. Визуализация гиперполяризованного С-пирувата согласно способу по настоящему изобретению показывает его повышенное метаболическое превращение в лактат в очаге воспаления или инфекции.
13
Для корректировки сигнала пирувата изображения лактата и пирувата нормализуют по отношению к максимальному значению для каждого отдельного изображения. Во-вторых, нормализованное изображение лактата умножают на инвертированное изображение пирувата. Например, для каждого пикселя вычитают уровень пирувата из максимального сигнала пирувата в изображении. На последнем шаге промежуточный результат, полученный в вышеуказанной операции, умножают на исходное изображение лактата. Альтернативно, интенсивности пиков пирувата и лактата для каждого пикселя соответствующих им изображений могут быть подставлены в кинетическую модель потока меток С между пируватом и лактатом для получения констант скорости для потока меток и времен спин-решеточной релаксации. Для учета влияния многократных ВЧ-импульсов на потерю поляризации может потребоваться корректировка.
13
Если способ по изобретению применяют для обнаружения воспаления или инфекции in vivo, то в обнаружение воспаления или инфекции согласно способу по изобретению может быть включена анатомическая и/или перфузионная информация. Анатомическая информация может быть получена, например, путем формирования протонных МР изображений с использованием подходящего контрастного агента или без него. Относительная перфузия может быть определена с помощью МР контрастного агента, такого как, например, Omniscan™. Подобным образом в данной области известны методы МР томографии для измерения перфузии, не требующие введения контрастного агента. В предпочтительном воплощении для количественного определения перфузии используют неметаболизированный гиперполяризованный неконтрастный агент. Подходящие методики и контрастные агенты описаны, например, в WO-A-02/23209. В более предпочтительном воплощении для количественного определения перфузии используют гиперполяризованный С-пируват.
13
В другом предпочтительном воплощении визуализирующую среду, содержащую гиперполяризованный С-пируват, вводят повторно, тем самым обеспечивая возможность проведения динамических исследований. Благодаря низкой токсичности пирувата и его благоприятным показателям безопасности пациенты хорошо переносят повторные дозы этого соединения.
Результаты, полученные способом по настоящему изобретению, например, дают возможность врачу выбрать подходящее лечение для наблюдаемого пациента. В другом предпочтительном воплощении способ по изобретению используют для определения, является ли лечение успешным.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
В другом аспекте в настоящем изобретении предложено применение гиперполяризованного С-вещества для изготовления визуализирующей среды для использования в C-МР томографии, С-МР спектроскопии и/или С-МР спектроскопической томографии для обнаружения воспаления или инфекции. Более предпочтительно, в настоящем изобретении предложено применение гиперполяризованного С-пирувата для изготовления визуализирующей среды для использования в С-МР томографии, С-МР спектроскопии и/или С-МР спектроскопической томографии для обнаружения воспаления или инфекции. Предпочтительно гиперполяризованный С-пируват, применяемый для изготовления визуализирующей среды, получают динамической поляризацией ядер С-пировиноградной кислоты или С-пирувата. Возможно, для изготовления визуализирующей среды к С-веществу может быть добавлен лактат.
13
13
13
13
Изготовление и предпочтительные воплощения изготовления гиперполяризованного С-пирувата из С-пировиноградной кислоты или С-пирувата, а также изготовление визуализирующей среды, содержащей гиперполяризованный С-пируват и возможно лактат, подробно описаны на страницах 8-14 настоящей заявки.
13
13
13
13
13
13
13
13
В предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложено применение гиперполяризованного С-пирувата и возможно лактата для изготовления визуализирующей среды для использования в способе С-МР томографии, С-МР спектроскопии и/или С-МР спектроскопической томографии для обнаружения воспаления или инфекции с помощью получения непосредственных С-изображений и/или С-спектров С-пирувата и С-лактата организма человека или животного, не являющегося человеком, которым предварительно ввели визуализирующую среду, или культуры клеток или ткани ex vivo, к которым добавлена визуализирующая среда.
13
13
13
13
В другом предпочтительном воплощении в настоящем изобретении предложено применение визуализирующей среды, содержащей гиперполяризованное С-вещество, в способе С-МР томографии, С-МР спектроскопии и/или С-МР спектроскопической томографии для обнаружения воспаления или инфекции в организме человека или животного, не являющегося человеком. Визуализирующую среду предпочтительно предварительно вводят в организм человека или животного, не являющегося человеком.
Краткое описание графических материалов
13
13
13
13
13
13
На фиг.1 показаны метаболические карты артритных суставов. Через 20 с после инъекции гиперполяризованного [1-С]пирувата карты показывают повышенную выработку лактата в конечностях, пораженных артритом. А: Т2-взвешенное анатомическое изображение показывает опухание ткани в правой задней конечности, пораженной артритом (показано стрелкой), в сравнении с нормальной левой конечностью и наложено на более поздние метаболические карты хвоста (Т) и эталонной пробирки с неполяризованным С-лактатом (L). Карты показывают В: [1-С]пируват, С:[1-С]лактат и D: отношение [1-C]пируват/[1-C]лактат.
13
На фиг.2 показана временная диаграмма, на которой повышенная выработка [1-С]лактата в пораженной артритом конечности крысы (синий цвет) представлена в сравнении с нормальной конечностью (красный цвет) и хвостом (зеленый цвет).
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Обнаружение артрита
13
1
13
13
13
13
Артрит индуцировали у шести молодых особей крыс линии Sprague Dawley (возраст 4-5 недель, средний вес 114 грамм) инъекцией 0,4 мкл/г полного адъюванта Фрейнда (3 крысам в правое колено и 3 крысам в правую лодыжку). Изображения артритных суставов получали через 7 дней после введения с помощью С-МРС на сканере GE 3 Т, оборудованном автоэкранированной градиентной системой (40 мТл/м, 150 Тл/м/мс) и изготовленной по заказу квадратурной катушкой (диаметр 80 мм) двойной настройки Н/С) для возбуждения и приема сигнала. 0,5 мл 100 мМ раствора С1-пирувата гиперполяризовали с помощью ДПЯ (15%-20% поляризации в жидкой фазе) и инъецировали в хвостовую вену. Однократный МРС анализ С-1-пирувата и его метаболитов проводили через 20 с после инъекции с помощью последовательности CSI FID (воксел=2,5×2,5×10 мм, поле обзора=4×4 см). Временную диаграмму получали с использованием последовательности 1D EPSI в течение второй инъекции гиперполяризованного С-пирувата. В результате анализа исследуемой области суставов получали средние интенсивности сигналов пирувата и лактата, и нормальные и артритные суставы сравнивали с помощью t-теста.
13
13
13
13
Было обнаружено, что артритные суставы были эритематозными и распухшими (среднее значение ±SD составляло 0,5±0,2 мм больше по толщине), имели гистологический индекс 3/4 для воспаления (по сравнению с 0/4 для нормального сустава) и показывали Т2-взвешенные изменения воспаления на анатомических МР изображениях. На FID CSI изображениях (Фиг.1А, В) количество [1-С]пирувата и метаболизированного [1-С]лактата выглядело повышенным на артритных суставах, и по результатам анализа исследуемой области на отношение метаболита в суставах к общему количеству С это отличие стремилось к существенному (0,34 для артритного пирувата по сравнению с нормальным 0,28, р меньше 0,17; 0,21 для артритного лактата по сравнению с нормальным 0,16, р меньше 0,12). Хотя причиной увеличения переноса визуализирующего агента мог явиться повышенный кровоток в воспаленной ткани, в артритных суставах также возрастала скорость превращения в лактат, как показывает временная диаграмма (Фиг.2) и отношение лактата к общему количеству С (0,62 для артритного лактата по сравнению с нормальным 0,56, р меньше 0,03).
13
Следовательно, согласно этим результатам визуализация гиперполяризованного С-пирувата показывает повышенное метаболическое превращение в лактат в суставах, пораженных артритом. Повышенная выработка лактата может служить признаком артритного процесса.