АНТИ-VEGF-АНТИТЕЛО И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ, ДИАГНОСТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ИЛИ СВЯЗАННОГО С АНГИОГЕНЕЗОМ ЗАБОЛЕВАНИЯ
ANTI-VEGF-ANTIBODY AND ITS PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTION, DIAGNOSTICS OR TREATMENT OF CANCER OR ANGIOGENESIS-RELATED DISEASE

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к: новому антителу, которое связывается с фактором роста сосудистого эндотелия (VEGF), имеет высокую аффинность связывания с VEGF и, следовательно, может быть полезным для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания; и к содержащей его фармацевтической композиции.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Хорошо известно, что ангиогенез участвует в патогенезе различных заболеваний, которые включают солидные опухоли, пролиферативную ретинопатию или возрастную макулярную дегенерацию (AMD) и т.д., связанные с глазной неоваскуляризацией.
Endocrinology
В исследованиях по ангиогенезу был идентифицирован ряд индуцирующих факторов, таких как aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-β, ангиогенин и т.д.. Ингибиторы ангиогенеза могут включать тромбоспондин, 16 кДа N-концевой фрагмент пролактина (Clapp et al., , 133: 1292-1299 (1993)), ангиостатин, эндостатин и т.д.
J. Biol Chem.
Индукция или ингибирование ангиогенеза зависят от баланса между индукторами и ингибиторами ангиогенеза (Folkman, J, et al., , 267, 10931-10934 (1992)).
Int J. Mol Med.
Mol. Biol. Cell.
J. Clin Invest
Nat Rev. Cancer
J. Biol Chem
Comp. Meth. Enzy
Nature
J. Clin Invest
Cancer Res
Cancer Res
Arch Ophtalmol
Один из индукторов ангиогенеза, фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), участвует в росте и гомеостазе кровеносных и лимфатических сосудов, а также оказывает существенное влияние на нервные клетки. VEGF производится в основном в клетках сосудистого эндотелия, кроветворных и стромальных клетках в условиях гипоксии или в ответ на стимуляцию факторами роста клеток, такими как TGF, интерлейкин и PDGF. VEGF связывается с рецептором VEGF, и каждая изоформа VEGF связывается со специфическим рецептором, что индуцирует образование гомо- или гетеро-конъюгата рецептора для активации каждого сигнального пути (Karsan A., , 5 (5):447-56 (2000)). Сигнальная специфичность рецептора VEGF более детально модулируется корецепторами, такими как нейтрофилин, гепарансульфат, интегрин, кадгерин и т.п. (Zachary I.C., et al., , 22 (15):2766-76 (2011)). VEGF, как известно, является важным медиатором связанных с ангиогенезом патологий в опухолях и в глазах. Кроме того, мРНК VEGF сверхэкспрессируется в опухолях у большинства исследуемых субъектов (Berkman et al., ., 91:153-159 (1993)). Поскольку раковой опухоли для роста требуются новые капилляры в качестве путей для подачи питательных веществ и удаления отходов, раковые и стромальные клетки непрерывно секретируют VEGF, который распределяется по всей ткани и стимулирует миграцию клеток сосудистого эндотелия (Ferrara.N et al., , 2:795-803, (2002)). Новообразованные сосуды, появление которых индуцировано раковыми клетками, отличаются незавершенностью по сравнению с обычно образуемыми капиллярами, поскольку они не поддерживаются окружающими клетками. Хотя VEGF связывается с рецепторами VEGFR1, 2 и 3, именно через VEGFR2-рецептор VEGF передает сигнал, ведущий к пролиферации, миграции и проницаемости эндотелиальных клеток (H. Zeng et al., , 276:26969-26976 (2001)). Таким образом, путем регулирования ангиогенеза с использованием лекарственных соединений, направленных на VEGF, можно воздействовать на пролиферацию раковых клеток и на заболевания, связанные с ангиогенезом. Из них в качестве лекарственных средств могут использоваться антитела, связывающиеся с VEGF, которые подвергают процессу гуманизации для повышения аффинности связывания с VEGF и снижения иммуногенности антител. Гуманизированные антитела описаны в литературе (Bending, Methods: ., 8:83-93 (1995). Нейтрализующие анти-VEGF антитела подавляют рост различных линий опухолевых клеток человека у бестимусных мышей (Kim et al., , 362:841-844 (1993); Warren et al., etc., ., 95: 1789-1797 (1995); Borgstroem et al., ., 56: 4032-4039 (1996); и Melnyk et al., , 56: 921-924 (1996)) и подавляют внутриглазной ангиогенез в модели ишемических сосудистых заболеваний сетчатки (Adamis et al., ., 114:66-71 (1996)). Анти-VEGF-антитело можно локально вводить в глаз в эффективной концентрации для снижения активности VEGF. Такие ишемические заболевания сетчатки могут включать диабетическую ретинопатию или возрастную макулярную дегенерацию.
Анти-VEGF нейтрализующие антитела, разработанные на сегодняшний момент, включают бевацизумаб (Авастин™, Genentech Roche), который был одобрен FDA для лечения колоректального рака в феврале 2004 года. Показания к применению бевацизумаба были расширены до лечения в общей сложности шести типов прогрессирующих опухолей, включая метастатический колоректальный рак и прогрессирующий рак яичников. Кроме того, заявка на получение регистрационного удостоверения для Афлиберцепта (Bayer Health Care), разработанного для связывания VEGF, был утверждена FDA в 2011 году для лечения макулярной дегенерации. Однако в 2011 году FDA отозвал показания к применению Авастина™, связанные с раком молочных желез, из-за его неспособности показать достоверное увеличение общей выживаемости у больных раком молочных желез по сравнению с плацебо. Последующие данные, указывающие на то, что Авастин™ повышает риск сердечной недостаточности у больных раком молочных желез, позволяют предположить, что существует необходимость улучшить ранее разработанные анти-VEGF нейтрализующие антитела и определить их точное действие на доклинической стадии. Поскольку Авастин™ не связывается с мышиным VEGF, трудно точно определить его действие на доклинических моделях с использованием мышей. Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка антитела, которое связывается с VEGF как мыши, так и человека, посредством чего достигается достоверность результатов в доклинических моделях; и повышение аффинности связывания антитела с VEGF, посредством чего усиливается противоопухолевый эффект.
Посредством биопэннинга и увеличения аффинности авторы настоящего изобретения разработали антитело, содержащее новую определяющую комплементарность область (CDR), которая не была известна ранее, и которая за счет своего специфичного связывания с VEGF позволяет лечение опухолевых и различных внутриглазных неоваскулярных заболеваний.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Таким образом, целью настоящего изобретения является создание антитела, которое специфично связывается с VEGF.
Еще одной целью настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции, содержащей указанное антитело.
Для достижения цели настоящего изобретения, указанной выше, предложено антитело, которое связывается с фактором роста сосудистого эндотелия (VEGF), причем антитело содержит:
1) вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющую комплементарность область (CDR1)1, CDR2 и CDR3, причем CDR2 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; а CDR3 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и
2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, причем CDR3 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Для достижения другой цели настоящего изобретения, описанной выше, предложена фармацевтическая композиция, содержащая указанные антитела, для предупреждения, диагностики или лечения рака или заболевания, связанного с ангиогенезом, вызванным сверхэкспрессией VEGF.
Антитело по настоящему изобретению показывает замечательную способность к связыванию VEGF человека и мыши, подавляет пролиферацию и проницаемость эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) и ингибирует рост опухоли, и, таким образом, оно может быть полезно в качестве антитела для предупреждения, диагностики или лечения рака или заболевания, связанного с ангиогенезом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Указанные выше и другие цели и признаки настоящего изобретения станут очевидными из последующего описания изобретения при рассмотрении в сочетании с прилагаемыми чертежами.
На фиг.1 показаны сенсограммы ассоциации и диссоциации клона HF2-11 с VEGF.
Фиг.2 представляет собой график, на котором показано ингибирование антителами по изобретению связывания VEGF с VEGFR2 без ингибирования связывания VEGF с VEGFR2.
Фиг.3 представляет собой график, на котором показано специфичное связывание антител по изобретению с VEGF-A человека и мыши.
На фиг.4 показаны результаты электрофореза клона HF2-11 в ДСН-ПААГ.
На фиг.5 показаны результаты масс-спектрометрического анализа тяжелой цепи (а) и легкой цепи (b) антитела HF2-4.
На фиг.6 показаны результаты эксклюзионной хроматографии (SEC) клона HF2-8.
На фиг.7 и 8 показаны результаты измерений с помощью ELISA связывающей способности антител по изобретению и Авастина с VEGF человека и мыши.
На фиг.9 показаны результаты испытаний подавляющего действия антител по изобретению и Авастина на пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).
На фиг.10 показаны результаты испытаний подавляющего действия антител по изобретению (а) и Авастина (b) на проницаемость HUVEC.
На фиг.11 показаны результаты испытаний подавляющего действия антител по изобретению на миграцию HUVEC.
На фиг.12 показано ингибирующее действие антител по изобретению на рост опухоли в животной модели с имплантированными клетками НТ29.
На фиг.13 показано подавляющее действие антител по изобретению на хориоидальный ангиогенез.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложено антитело, которое связывается с VEGF (далее указывается как «анти-VEGF антитело»), причем антитело содержит: 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, причем CDR2 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, а CDR3 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3, причем CDR3 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Список аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 (далее указаны как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, соответственно) вариабельных областей легких цепей и CDR1, CDR2 и CDR3 (далее указаны как HCDR1, HCDR2 и HCDR3, соответственно) вариабельных областей тяжелых цепей антител по изобретению приведен в таблице 1 ниже.
[Таблица 1]Аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельных областей легких и тяжелых цепей
<b>Клоны</b>
<b>LCDR1</b>
<b>LCDR2</b><b>(SEQ:1)</b>
<b>LCDR3</b><b>(SEQ:2)</b>
<b>HCDR1</b>
<b>HCDR2</b>
<b>HCDR3</b><b>(SEQ:3)</b>
F
SGGSNSAYGYG(SEQ:4)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFTFSSHGMQ(SEQ: 15)
GISSDGSWTGYGAAVKG(SEQ:35)
DFSTGYGADSIDA
HF2-1
SGGSDSAYGYG(SEQ:5)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
NFVFRSHGMQ(SEQ:16)
GISSDGSWTGYGAAVEG(SEQ:36)
DFSTGYGADSIDA
HF2-2
SGGSDSAYGYG(SEQ:5)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
RFNMRSHGMQ(SEQ:17)
GISSDGSWERVGAAVEG(SEQ:37)
DFSTGYGADSIDA
HF2-3
SGGSDSAYGYG(SEQ:5)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
HFNMRSHGMQ(SEQ:18)
GISSDGSWFRVAAAVEG(SEQ:38)
DFSTGYGADSIDA
HF2-4
SGGSDSAYGYG(SEQ:5)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GWSMRSHGMQ(SEQ:19)
GISSDGSWRRHSAAVEG(SEQ:39)
DFSTGYGADSIDA
HF2-5
SGGSDSAYGYG(SEQ:5)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFMIRSHGMQ(SEQ:20)
GISSDGSWARHSAAVEG(SEQ:40)
DFSTGYGADSIDA
HF2-6
SGGSMEPLGYG(SEQ:6)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
RFLLRSHGMQ(SEQ:21)
GISSDGSWFRVAAAVEG(SEQ:38)
DFSTGYGADSIDA
HF2-7
SGGSMEPLGYG(SEQ:6)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
QFWIRSHGMQ(SEQ:22)
GISSDGSWFRVAAAVEG(SEQ:38)
DFSTGYGADSIDA
HF2-8
SGGSTYSLGYG(SEQ:7)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFHIRSHGMQ(SEQ:23)
GISSDGSWLKLSAAVEG(SEQ:41)
DFSTGYGADSIDA
HF2-9
SGGSMEPLGYG(SEQ:6)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
MFRIRSHGMQ(SEQ:24)
GISSDGSWFRVAAAVEG(SEQ:38)
DFSTGYGADSIDA
HF2-10
SGGSMEPLGYG(SEQ:6)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
FQYFRSHGMQ(SEQ:25)
GISSDGSWFRVAAAVEG(SEQ:38)
DFSTGYGADSIDA
HF2-11
SGGSSEPLGYG(SEQ:8)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFLIRSHGMQ(SEQ:26)
GISSDGSWVKVAAAVEG(SEQ:42)
DFSTGYGADSIDA
HF2-12
SGGSMEPLGYG(SEQ:6)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
YSEVRSHGMQ(SEQ:27)
GISSDGSWFRVAAAVEG(SEQ:38)
DFSTGYGADSIDA
HF2-13
SGGSDLLLGYG(SEQ:9)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFLVRSHGMQ(SEQ:28)
GISSDGSWQRVNAAVEG(SEQ:43)
DFSTGYGADSIDA
HF2-14
SGGSDSAYGYG(SEQ:5)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
HSSIRSHGMQ(SEQ:29)
GISSDGSWLRQDAAVEG(SEQ:44)
DFSTGYGADSIDA
HF2-15
SGGSQESLGYG(SEQ:10)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFVVRSHGMQ(SEQ:30)
GISSDGSWKATAAAVEG(SEQ:45)
DFSTGYGADSIDA
HF2-16
SGGSIEPLGYG(SEQ:11)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFRIRSHGMQ(SEQ:31)
GISSDGSWVKVAAAVEG(SEQ:42)
DFSTGYGADSIDA
HF2-17
SGGSIEPLGYG(SEQ:11)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFMIRSHGMQ(SEQ:20)
GISSDGSWRRHSAAVEG(SEQ:39)
DFSTGYGADSIDA
HF2-18
SGGSIEPLGYG(SEQ:11)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
YWAFRSHGMQ(SEQ:32)
GISSDGSWFSSAAAVEG(SEQ:46)
DFSTGYGADSIDA
HF2-19
SGGSDSAYGYG(SEQ:5)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFSTRSHGMQ(SEQ:33)
GISSDGSWKATAAAVEG(SEQ:45)
DFSTGYGADSIDA
HF2-20
SGGSDSAYGYG(SEQ:5)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
YMEYRSHGMQ(SEQ:34)
GISSDGSWSRVDAAVEG(SEQ:47)
DFSTGYGADSIDA
HF2-21
SGGSMEPLGYG(SEQ:6)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
FQYFRSHGMQ(SEQ:25)
GISSDGSWYRVQAAVEG(SEQ:48)
DFSTGYGADSIDA
HF2-22
SGGSTAGVGYG(SEQ:12)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFRIRSHGMQ(SEQ:31)
GISSDGSWFRVAAAVEG(SEQ:38)
DFSTGYGADSIDA
HF2-23
SGGSDLLLGYG(SEQ:9)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
GFRIRSHGMQ(SEQ:31)
GISSDGSWFSSAAAVEG(SEQ:46)
DFSTGYGADSIDA
HF2-24
SGGSQESLGYG(SEQ:10)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
RFNMRSHGMQ(SEQ:17)
GISSDGSWVKVAAAVEG(SEQ:42)
DFSTGYGADSIDA
HF2-25
SGGSNFPMGYG(SEQ:13)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
YMEYRSHGMQ(SEQ:34)
GISSDGSWFRMNAAVEG(SEQ:49)
DFSTGYGADSIDA
HF2-26
TAPADSAYGYG(SEQ:14)
WDDKRPS
GAWEYSGGVGI
RFNMRSHGMQ(SEQ:17)
GISSDGSWIRVQAAVEG(SEQ:50)
DFSTGYGADSIDA
Антитело, которое связывается с VEGF по настоящему изобретению, может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 4-14; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 15-34; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 35-50; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 15; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 35; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 16; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 36; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 17; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 37; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 18; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 38; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 19; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 39; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 20; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 40; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 21; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 38; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 22; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 38; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 7; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 23; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 41; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 24; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 38; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 25; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 38; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 8; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 26; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 42; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 27; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 38; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 9; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 28; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 43; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 29; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 44; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 10; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 30; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 45; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 11; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 31; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 42; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 11; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 20; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 39; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 11; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 32; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 46; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 33; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 45; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 34; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 47; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 25; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 48; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 12; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 31; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 38; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 9; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 31; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 46; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 10; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 17; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 42; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 13; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 34; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 49; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 14; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 17; CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 50; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
Антитело, которое связывается с VEGF по настоящему изобретению, может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 54-65; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 78-104 (см. таблицу 2).
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 54; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 78.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 55; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 79.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 55; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 80.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 56; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 81.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 55; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 82.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 55; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 83.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 57; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 84.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 57; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 85.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 58; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 86.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 57; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 87.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 57; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 88.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 59; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 89.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 57; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 90.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 60; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 91.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 55; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 92.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 61; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 93.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 62; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 94.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 62; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 95.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 62; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 96.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 55; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 97.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 55; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 98.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 57; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 99.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 63; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 100.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 60; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 101.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 61; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 102.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 64; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 103.
Анти-VEGF антитело по одному варианту осуществления настоящего изобретения может содержать 1) вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 65; и 2) вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 104.
PNAS
Cell
Антитело по настоящему изобретению может содержать константную область легкой цепи и константную область тяжелой цепи, причем константная область легкой цепи и константная область тяжелой цепи могут представлять собой константную область легкой цепи и константную область тяжелой цепи известного антитела человека (U Rutishauser et al., , 61(4): 1414-1421 (1968); и Takahashi N., et al., , 29: 671-679 (1982)).
Антитело по настоящему изобретению может быть антителом человека или гуманизированным антителом.
Антитело по настоящему изобретению может включать иммуноглобулин IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM, и может быть антителом, которое связывается с VEGF, или являться их комбинацией или вариантом.
2
Антитело по настоящему изобретению может иметь форму Fab, Fab', F(ab'), Fv, dAb, scFv или конъюгатом с матрицей, в котором CDR антитела является основным участком для связывания с VEGF.
Также, в настоящем изобретении предложена базовая последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO 66-77, кодирующая вариабельную область легкой цепи, представленную аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 54-65.
В настоящем изобретении предложена нуклеотидная последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO 105-131, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, представленную аминокислотной последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO 78-104.
Список аминокислотных и соответствующих нуклеотидных последовательностей вариабельных областей легких и тяжелых цепей антител по изобретению, приведен в таблице 2 ниже.
[Таблица 2]
<b>Клоны</b>
<b>Аминокислотные последовательности вариабельных областей легких цепей</b>
<b>Нуклеотидные последовательности вариабельных областей легких цепей</b>
<b>Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей</b>
<b>Нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелых цепей</b>
F
SEQ:54
SEQ:66
SEQ:78
SEQ:105
HF2-1
SEQ:55
SEQ:67
SEQ:79
SEQ:106
HF2-2
SEQ:55
SEQ:67
SEQ:80
SEQ:107
HF2-3
SEQ:56
SEQ:68
SEQ:81
SEQ:108
HF2-4
SEQ:55
SEQ:67
SEQ:82
SEQ:109
HF2-5
SEQ:55
SEQ:67
SEQ:83
SEQ:110
HF2-6
SEQ:57
SEQ:69
SEQ:84
SEQ:111
HF2-7
SEQ:57
SEQ:69
SEQ:85
SEQ:112
HF2-8
SEQ:58
SEQ:70
SEQ:86
SEQ:113
HF2-9
SEQ:57
SEQ:69
SEQ:87
SEQ:114
HF2-10
SEQ:57
SEQ:69
SEQ:88
SEQ:115
HF2-11
SEQ:59
SEQ:71
SEQ:89
SEQ:116
HF2-12
SEQ:57
SEQ:69
SEQ:90
SEQ:117
HF2-13
SEQ:60
SEQ:72
SEQ:91
SEQ:118
HF2-14
SEQ:55
SEQ:67
SEQ:92
SEQ:119
HF2-15
SEQ:61
SEQ:73
SEQ:93
SEQ:120
HF2-16
SEQ:62
SEQ:74
SEQ:94
SEQ:121
HF2-17
SEQ:62
SEQ:74
SEQ:95
SEQ:122
HF2-18
SEQ:62
SEQ:74
SEQ:96
SEQ:123
HF2-19
SEQ:55
SEQ:67
SEQ:97
SEQ:124
HF2-20
SEQ:55
SEQ:67
SEQ:98
SEQ:125
HF2-21
SEQ:57
SEQ:69
SEQ:99
SEQ:126
HF2-22
SEQ:63
SEQ:75
SEQ:100
SEQ:127
HF2-23
SEQ:60
SEQ:72
SEQ:101
SEQ:128
HF2-24
SEQ:61
SEQ:73
SEQ:102
SEQ:129
HF2-25
SEQ:64
SEQ:76
SEQ:103
SEQ:130
HF2-26
SEQ:65
SEQ:77
SEQ:104
SEQ:131
Также в настоящем изобретении предложена ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела, которое связывается с VEGF, причем вариабельная область легкой цепи содержит CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2.
ДНК, кодирующая CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, может быть представлена нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 51; и ДНК, кодирующая CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, может быть представлена нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 52.
Таким образом, ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела по настоящему изобретению может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 51, кодирующую LCDR2; и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 52, кодирующую LCDR3.
В настоящем изобретении предложена ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела, которое связывается с VEGF, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3.
ДНК, кодирующая CDR 3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3, может быть представлена нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO 53.
ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи анти-VEGF антитела, может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 53, кодирующую HCDR3.
В настоящем изобретении предложен экспрессионный вектор, содержащий ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, причем с вектора экспрессируется вариабельная область легкой цепи антитела, которое связывается с VEGF.
Предпочтительно, чтобы был предложен экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 51, кодирующую CDR2, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1; и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 52, кодирующую CDR 3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2.
Также, в настоящем изобретении предложен экспрессионный вектор, содержащий ДНК, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи анти-VEGF антитела, причем с вектора экспрессируется вариабельная область тяжелой цепи антитела, которое связывается с VEGF.
Предпочтительно, чтобы был предложен экспрессионный вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую CDR3, представленную аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 3, причем с вектора экспрессируется вариабельная область тяжелой цепи антитела, которое связывается с VEGF.
Экспрессионный вектор по настоящему изобретению может быть трансфецирован в клеточную линую животного, такую как клеточная линия СНО, клеточная линия НЕК или клеточная линия NSO, но не ограниченную ими.
Также, в настоящем изобретении предложен экспрессионный вектор, содержащий ДНК, кодирующую вариабельную область легкой цепи антитела, причем с вектора экспрессируется вариабельная область легкой цепи антитела, которое связывается с VEGF.
Ангиогенез относится к образованию новых капилляров, связанных с ранее существовавшими капиллярами. Термин «связанное с ангиогенезом заболевание», используемый в данном документе, охватывает все заболевания или нарушения, связанные с ангиогенезом, вызванным сверхэкспрессией VEGF. «Связанное с ангиогенезом заболевание» может включать в себя различные виды рака и офтальмологических заболеваний и т.д., но не ограничивается ими. В настоящем изобретении, рак или связанное с ангиогенезом заболевание, вызванное сверхэкспрессией VEGF, может быть выбрано из группы, состоящей из рака, выбранного из группы, состоящей из колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака почки, рака легких, рака молочной железы, рака яичников и рака мозга; офтальмологического заболевания, выбранного из группы, состоящей из макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии и ишемической ретинопатии и т.п.
Анти-VEGF-антитело в клинической практике может быть использовано в сочетании с лекарственным препаратом, таким как препарат на основе фторпиримидина, паклитаксел, препарат на основе платины, интерферон альфа-2а, карбоплатин и т.п. (FDA US BL125085, марка Авастин).
В дополнение к вышеуказанному антителу также может использоваться фармацевтическая композиция по настоящему изобретению в сочетании с лекарственным средством, выбранным из группы, состоящей из лекарственного препарата на основе фторпиримидина, паклитаксела, препарата на основе платины, интерферона альфа-2а, карбоплатина, доксорубицина, цисплатина, гемцитабина, 5-фторурацила, лейковорина, иринотекана, оксалаплатины, капецитабина и доцетаксела, но не ограниченной ими.
Любой химиотерапевтический агент, который демонстрирует противоопухолевую активность, может быть использован в сочетании с фармацевтической композицией по настоящему изобретению. Химиотерапевтический агент может быть выбран из группы, состоящей из алкилирующего агента, антиметаболита, гомолога фолиевой кислоты, пиримидинового гомолога, пуринового гомолога и родственного ингибитора, алкалоида из барвинка, эпиподофиллотоксина, антибиотиков, L-аспарагиназы, ингибитора топоизомеразы, интерферона, координационного комплекса платины, антрацендион-замещенной мочевины, метильного производного гидразина, супрессора надпочечников, адренокортикостероида, прогестина, эстрогена, антиэстрогена, андрогена, антиандрогена и гомолога гонадотропин-рилизинг гормона.
В настоящем изобретении предложен набор для диагностики рака или связанного с ангиогенезом заболевания, вызванного сверхэкспрессией VEGF, причем набор содержит антитело, которое связывается с VEGF. Примеры связанных с ангиогенезом заболеваний описаны выше.
Антитела по настоящему изобретению не влияют на связывание между VEGF и VEGF-рецептором Flt-1 (VEGFR-1), но селективно ингибируют связывание между VEGF и VEGF-рецептором KDR (VEGFR-2) (фиг.2). Кроме того, антитела вообще не связываются с VEGF-B человека, VEGF-C человека, VEGF-D человека или плацентарным фактором роста (PIGF) человека, но проявляют высокую специфичность связывания в отношении VEGF-A человека и VEGF-A мыши (фиг.3).
Аффинность связывания антител по настоящему изобретению с фактором роста сосудистого эндотелия человека оценивали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). В результате антитела показали концентрационно-зависимое связывание с VEGF человека (фиг.7). Антитела также показали отличное связывание с мышиным VEGF (в отличие от Авастина™, ранее существующего анти-VEGF антитела, которое не связывается с мышиным VEGF), что указывает на пригодность антител по изобретению для доклинических исследований на мышах (фиг.8).
Кроме того, антитела по настоящему изобретению подавляли пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), проницаемость HUVEC и миграцию HUVEC, стимулируемые VEGF, в той же степени или выше, что и Авастин™ (фиг.9-11), и подавляли рост опухолей у мышей, которым были имплантированы клетки линии рака толстой кишки человека, в степени, намного превосходящей действие Авастина™ (фиг.12). Также антитела по изобретению значительно подавляли ангиогенез в модели хориоидального ангиогенеза по сравнению с контрольной группой (фиг.13). Таким образом, антитела человека (или гуманизированные антитела) по настоящему изобретению могут быть полезны для лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания, и, поэтому, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей указанное антитело, для профилактики и лечения рака или связанного с ангиогенезом заболевания.
Определения
Science
Mol. Endocrin.
В настоящем изобретении «VEGF» относится не только к 165-аминокислотному фактору роста сосудистого эндотелия человека и родственным 121- 189- и 206-аминокислотным факторам роста сосудистого эндотелия, но также и к природному фактору роста сосудистого эндотелия человека в аллеломорфной или модифицированной форме form (см. [Leung et al., ., 246:1306 (1989); и Houck et al., , 5:1806 (1991)]).
В настоящем изобретении «анти-VEGF антитело» относится к антителу, которое действует путем затруднения связывания VEGF с рецептором VEGF для деактивации VEGF-активированных клеток или ингибирования активации клетки сосудистого эндотелия после связывания VEGF с рецептором VEGF.
В настоящем изобретении «антитело» относится к гликопротеину, который демонстрирует специфичное связывание с определенным антигеном. «Гуманизированная» форма антитела, не принадлежащего человеку (например, антитела грызуна), представляет собой химерное антитело, которое включает минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина, не принадлежащего человеку. В основном, гуманизированное антитело создается путем замены остатками гипервариабельной области антитела мыши, крысы, кролика, курицы или приматов (кроме человека), которые обладают требуемой специфичностью, аффинностью и связывающей способностью, остатков гипервариабельной области иммуноглобулина человека. В некоторых случаях остаток каркасной области (FR) иммуноглобулина человека замещают соответствующим остатком, не принадлежащим иммуноглобулину человека.
H
L
H
L
В настоящем изобретении «одноцепочечный Fv» или «scFv»-фрагмент антитела включает V- и V-домены антитела, которые присутствуют в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно включает полипептидный линкер между V и V-доменами, который помогает scFv сформировать соответствующую структуру для связывания с антигеном.
H
L
1
В настоящем изобретении «Fab-фрагмент антитела» представляет собой фрагмент, полученный расщеплением антитела протеазой папаин, в котором V- и V-домены, и CH- и CL-домены антитела соединены S-S связью, и который имеет антигенсвязывающую функцию.
2
2
3
В настоящем изобретении «F(аb')-фрагмент антитела» относится к участку антитела, исключающему Fc-фрагмент (СН и СН-домены). Он может быть получен путем расщепления антитела ниже его шарнирной области.
2
В настоящем изобретении, «Fab'» имеет форму F(аb')-фрагмента антитела с отсутствующей шарнирной областью и имеет две SH-группы.
В настоящем изобретении, «Fv» относится к вариабельной области антитела, а «dAB» относится к однодоменному фрагменту антитела.
Science
Oncogene
Proc. Nat. Acad. Sci
Oncogene
В настоящем изобретении «VEGF-рецептор» относится к клеточному рецептору VEGF, в общем, к рецептору на клеточной поверхности или его варианту, способному связываться с hVEGF. Одним из примеров рецептора VEGF является трансмембранная рецепторная тирозинкиназа в частности, тирозинкиназа fms-типа (flt) (см. [DeVries et al., ., 255:989 (1992); Shibuya et al., ., 5; 519 (1990)]). Flt-рецептор включает внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный домен с тирозинкиназной активностью. В то время как внеклеточный домен связан со связыванием VEGF, внутриклеточный домен связан с передачей (трансдукцией) сигнала. Другим примером рецептора VEGF является рецептор flk-1 (именуемый далее «KDR») (см. [Matthews et al., ., 88:9026 (1991); Terman et al., ., 6:1677 (1991)).
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с использованием нижеследующих примеров. Нижеследующие примеры приведены для иллюстрации настоящего изобретения, но объем настоящего изобретения ими не ограничивается.
Пример 1. Иммунизация VEGF и конструирование библиотеки кДНК
С целью отбора антител, специфично связывающихся с VEGF, была сконструирована библиотека антител из иммунизированных животных. Библиотека была сконструирована путем получения мРНК из иммунных клеток животных, иммунизированных антигеном, амплификации генов антител с помощью ПЦР с использованием комбинации праймеров для генов антител и клонирования генов в вектор для фагового дисплея.
Более конкретно, VEGF человека и VEGF мыши (R & D Systems, USA) смешивали с полным адъювантом Фрейнда и неполным адъювантом Фрейнда (Sigma, USA), и смесь вводили подкожно трем белым леггорновским курам 5 раз с 3-недельными интервалами. Получали сыворотку иммунизированных животных, разбавляли в соотношении 1:100, 1:500, 1:2500 и 1:12500, используя PBSB (фосфатный буфер, содержащий 3%-й бычий сывороточный альбумин), и оставляли на хранение; а затем ее связывание с VEGF человека и VEGF мыши оценивали с помощью иммуноферментного анализа. Планшеты для ELISA покрывали, соответственно, 0,2 мкг/мл каждого из VEGF человека (VEGF-165, R & D Systems, USA) и VEGF мыши (VEGF-164, R & D Systems, USA) в течение ночи при 4°C, после чего добавляли сыворотку, разведенную как указано выше, и оставляли для взаимодействия на 2 ч. После 3-кратной промывки PBST (PBS, содержащим 0,1%-й Tween-20), добавляли конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) вторичные антитела к куриным иммуноглобулинам (в разведении 1:3000) и оставляли для взаимодействия на 1 час. После 3-кратной промывки PBST добавляли ultra-TMB (Thermo, USA), оставляли для прохождения цветной реакции на 7 минут и измеряли поглощение при 650 нм с использованием микропланшетного спектрофотометра. Сыворотка, собранная перед иммунизацией, не связывалась с VEGF, и были отобраны животные, продуцирующие сыворотку, которая сильно связывалась с VEGF как человека, так и мыши.
Через 5 дней после последней инъекции, собирали ткани костного мозга, селезенки и сумки Фабрициуса у выбранных цыплят. Ткани смешивали с 10 мл TRI-реагента (Molecular Research Center, USA), гомогенизировали, а после добавления 20 мл TRI-реагента центрифугировали, чтобы получить надосадочную жидкость. После добавления 3 мл 1-бром-3-хлорпропана (BCP), получали супернатант после центрифугирования. Общую РНК осаждали путем добавления 15 мл изопропанола. Реакцию обратной транскрипции (65°C в течение 5 мин; 4°C в течение 5 мин; 50°C в течение 50 мин; 85°C в течение 5 мин, и 4°C) проводили с использованием транскрипционной системы Super Script (Invitrogen, USA) и набора случайных гексамеров в качестве праймеров. 5 мкл реакционного раствора, содержащего кДНК, полученную в результате реакции обратной транскрипции, наносили на 1%-й агарозный гель и проводили электрофорез, таким образом подтверждая получение полос кДНК с различными длинами.
Пример 2. Конструирование библиотеки антител
(2-1) Амплификация генов антител, полученных иммунизацией
H
L
Для амплификации вариабельных областей тяжелой и легкой цепей куриного антитела (V и V-доменов), ПЦР-реакции проводили следующим образом.
H
L
H
L
H
L
ПЦР-реакции проводили с использованием в качестве матриц кДНК, полученных в примере 1, и комбинации праймеров из таблицы 3, предназначенной для V и V и одноцепочечного Fv (scFv), соединяющего V и V. 0,5 мкл каждой из кДНК библиотек V и V, 30 пмоль прямого праймера, 30 пмоль обратного праймера, 10x буфер для ПЦР, 200 мкМ dNTP и 0,5 мкл Taq ДНК-полимеразы смешивали в конечном объеме 50 мкл. Смесь оставляли при 94°C на 5 мин и затем проводили 30 циклов по следующей схеме: 94°C в течение 15 с, 56°C в течение 30 с и 72°C в течение 90 с.
[Таблица 3]Праймеры, используемые в ПЦР-реакции.
Праймер
Последовательность
SEQ ID NO
V<sub>H</sub>
Прямой
GGT CAG TCC TCT AGA TCT TCC GGC GGT GGT GGC AGC TCC GGT GGT GGC GGT TCC GCC GTG ACG TTG GAC GAG
132
Обратный
CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GGA GAC GAT GAC TTC GGT CC
133
V<sub>L</sub>
Прямой
GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG CCG TCC TCG GTG TC
134
Обратный
GGA AGA TCT AGA GGA CTG ACC TAG GAC GGT CAG G
135
scFv
Прямой
GAG GAG GAG GAG GAG GAG GTG GCC CAG GCG GCC CTG ACT CAG
136
Обратный
GAG GAG GAG GAG GAG GAG GAG CTG GCC GGC CTG GCC ACT AGT GGA GG
137
ПЦР-амплифицированные ДНК антител подвергали электрофорезу в 1%-м агарозном геле, чтобы разделить амплифицированные ДНК по размеру, и очищали с использованием набора для выделения из геля Gel extraction kit (Qiagen, USA).
H
L
Чтобы получить ДНК scFv, по 50 нг каждой из очищенных ДНК V и V использовали в качестве матрицы, которую смешивали с 30 пмоль прямого праймера и 30 пмоль обратного праймера (таблица 3), 10x ПЦР-буфером, 200 мкМ dNTP и 0,5 мкл Taq полимеразы ДНК в конечном объеме 50 мкл. Смесь оставляли при 94°C на 5 мин и затем проводили 20 циклов по следующей схеме: 94°C в течение 30 с, 56°C в течение 30 с и 72°C в течение 2 мин. ПЦР-амплифицированные ДНК антител подвергали электрофорезу в 1%-м агарозном геле, чтобы разделить амплифицированные ДНК по размеру, которые затем очищали с использованием набора для выделения из геля Gel extraction kit (Qiagen, USA).
(2-2) Расщепление ДНК антител ферментом рестрикции
Фрагменты scFv, полученные выше, и фагмидный вектор pComb3X (Scripps Research Institute, CA, USA) расщепляли рестрикционным ферментом SfiI (Roche, USA).
10 мкг ПЦР-фрагментов, кодирующих scFv, 360 единиц SfiI (Roche, USA) и 20 мкл 10x буфера смешивали в конечном объеме 200 мкл и оставляли для прохождения реакции в течение ночи при 50°С.
Кроме того, 20 мкг вектора pComb3X, 120 единиц SfiI и 20 мкл 10х буфера смешивали в конечном объеме 200 мкл и оставляли для прохождения реакции в течение ночи при 50°С. Фрагменты, полученные после расщепления рестриктазой, разделяли электрофорезом, а затем очищали с использованием набора для выделения из геля Gel extraction kit (Qiagen, USA).
(2-3) лигирование ДНК антител и создание библиотеки
Для того чтобы вставить фрагменты scFv в вектор pComb3X, смешивали 700 нг ПЦР-фрагментов, кодирующих scFv, которые расщеплены в п.(2-2) с использованием SfiI, и 1,4 мкг pComb3X. После добавления ДНК-лигазы Т4 (Invitrogen, USA), смесь оставляли для взаимодействия при 16°C в течение ночи. Смесь для лигирования очищали переосаждением этанолом. Затем клетки E.coli ER2738 (New Englu Biolab, USA) трансформировали смесью посредством электропорации и культивировали в присутствии 46 мкг/мл карбенициллина и 70 мкг/мл канамицина, чтобы получить библиотеку с представительностью 1,5×109.
Пример 3. Выбор фагового клона, содержащего анти-VEGF scFv
Из полученной в примере 2 библиотеки, содержащей рандомизированные тяжелые и легкие цепи в форме scFv, с использованием иммобилизованного на твердой подложке VEGF были отобраны антитела, которые связываются VEGF как человека, так и мыши.
3-1) Отбор антитела, которое связывается с VEGF
Во-первых, 10 мкг каждого из VEGF человека (R & D Systems, USA) и VEGF мыши (R & D Systems, USA) были конъюгированы с магнитными шариками.
E.coli
Полученную в примере 2 библиотеку ДНК антител, которая была сконструирована таким образом, что антитело в форме scFv представлено на поверхности в слитой форме с белком оболочки фага PIII, трансфецировали посредством электропорации в клетки  ER2738 (New England Biolab), которые затем культивировали при 37°С. После добавления хелперного фага VCSM13 (Stratagene, USA) дополнительно добавляли 46 мкг/мл карбенициллина и 70 мкг/мл канамицина, после чего проводили культивирование в течение ночи в культуральной среде SB (30 г/л триптона, 20 г/л дрожжевого экстракта и 10 г/л MOPS, рН 7,0).
E.coli
E.coli
Полученную как указано выше культуральную среду, содержащую  и фаги, центрифугировали, чтобы удалить осадок . После выделения супернатанта добавляли 40 мг/мл полиэтиленгликоля 8000 и 30 мг/мл NaCl с последующим центрифугированием, чтобы собрать осажденные ПЭГ фаги, которые ресуспендировали в PBS.
E.coli
VEGF человека или мыши, конъюгированный с магнитными шариками, оставляли для взаимодействия с фагами при комнатной температуре в течение 2 часов для связывания фагов, имеющих сродство к VEGF, затем полученный образец промывали PBS, содержащим 0,5% Tween 20, элюировали 0,1М глицином (рН 2,2) и нейтрализовали 2М раствором Tris. Для проведения следующего раунда пэннинга элюированными фагами заражали клетки  ER2738 и культивировали в течение ночи. Пэннинг проводили, повторяя этот процесс 4 раза.
Число промывок увеличивали по мере увеличения циклов пэннинга, в результате чего происходило накопление фагов с высокой аффинностью связывания. Чтобы найти антитела, связывающиеся с VEGF человека и мыши, в качестве антигенов использовали только VEGF человека или чередующиеся VEGF человека и мыши.
Индивидуальные клоны, отобранные на выходе каждого из 4 циклов пэннинга, культивировали в течение ночи в глубоких 96-луночных планшетах в присутствии 100 мкг/мл карбенициллина, 70 мкг/мл канамицина и хелперного фага VCSM13 (1:1000), индуцирующего пролиферацию фагов, экспрессирующих антитела.
Полученную таким образом культуральную среду центрифугировали для получения культурального супернатанта, содержащего фаги. Полученный супернатант добавляли в планшет для ELISA, покрытый VEGF, и инкубировали при 37°С в течение 2 ч. VEGF-связывающие антитела были идентифицированы с помощью ELISA с использованием HRP-конъюгированного анти-М13 антитела в качестве вторичного антитела.
(3-2) Секвенирование отобранного антитела
E.coli
Отобранные, как описано в примере 3-1, клетки ER2738, которые содержали клоны, дающие положительные сигналы с VEGF человека и мыши, культивировали в течение ночи в культуральной среде SB и центрифугировали для получения клеток . Для получения плазмидной ДНК использовали набор DNA mini-prep (GeneAll, Korea), и анализировали ее нуклеотидную последовательность. Для определения нуклеотидной последовательности были использованы праймеры для секвенирования, приведенные в таблице 4 (SEQ ID NO 138 и 139). Отобранный клон был назван «клон F». Подробная информация о нуклеотидной последовательности клона F антитела приведена в таблице 1.
[Таблица 4]
Прямой (SEQ ID NO 138)
ACA CTT TAT GCT TCC GGC TC
Обратный (SEQ ID NO 139)
CAA AAT CAC CGG AAC CAG AG
Пример 4. Гуманизация и повышение аффинности
Molecular Immunology
Каркасная область антитела клона F, полученного из библиотеки антител иммунизированного животного, была преобразована в каркасную область антитела человека, тогда как несколько остатков, важных для связывания антигена, не были изменены (Nishibori et al., , 43 (2006)).
Для улучшения аффинности, последовательности CDR тяжелой и легкой цепей были рандомизированы, чтобы получить новую фаговую библиотеку. Таким же способом, как приведенный в примере 2, проводили взаимодействие полученной фаговой библиотеки с 10 мкг человеческого VEGF, иммобилизованного на магнитных шариках, при комнатной температуре в течение 2 ч, и 5 раз промывали PBS, содержащим 0,5% Tween 20. После промывки фаги, которые были связаны с антигенами, элюировали 0,1М раствором глицина (рН 2,2) и нейтрализовали 2М раствором Tris. На 2-м цикле пэннинга образец 10 раз промывали PBS, содержащим Tween 20, а на 3-м цикле пэннинга образец 20 раз промывали PBS, содержащим Tween 20, чтобы усилить отбор.
Варианты клона F, которые прошли через вышеуказанный процесс, были названы HF2-1 - HF2-26, и их сродство было проверено методами ELISA и BIAcore. В результате было подтверждено, что антитела, полученные в вышеописанном процессе, связывались с VEGF человека и мыши с аффинностью, по меньшей мере, в 10 раз выше, чем материнский клон F, причем некоторые из клонов имели аффинность по меньшей мере в 100 раз выше.
Пример 5. Получение антител
Для измерения аффинности и анализа активности полученных выше антител получали scFv-фрагменты или иммуноглобулины (IgG).
E.coli
Для получения scFv-фрагмента клетки  HB2151 трансформировали плазмидой pComb3X, содержащей ДНК выбранного клона, с последующей очисткой экспрессированного scFv.
E.coli
Более конкретно, добавляли 1 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG), когда величина O.D. достигла 1, с последующим культивированием в течение ночи при 37°С. Затем  и культуральную среду разделяли центрифугированием. Для очистки scFv, проводили связывание scFv с никелевой NTA-колонкой (GE, USAA.), которая связывается с С-концевым His-тегом, элюировали 250-300 мМ раствором имидазола и подвергали диализу в PBS-буфере в течение ночи.
Для получения IgG, фрагменты вариабельных и константных областей тяжелой и легкой цепей были получены из pComb3x, содержащих scFv, проводя ПЦР с использованием условий из примера 2 и комбинации праймеров, приведенных в таблице 5.
Н
k
2
E.coli
Вариабельные и константные области тяжелой и легкой цепей (С и C) были получены с помощью ПЦР с использованием комбинаций праймеров HC и LC в таблице 5 и перенесены в плазмиду для экспрессии в клетках млекопитающих с использованием наборов для клонирования pcDNATM3.3-TOPOTA и pOptiTMVEC-TOPOTA (Invitrogen, USA). По 1 мкл каждого вектора (pcDNATM3.3-TOPO и pOptiTM VEC-TOPO) и фрагментов добавляли в буфер, содержащий 200 мМ NaCl и 10 мМ MgCl, до общего объема 6 мкл, и реакцию проводили в течение 5 мин при комнатной температуре. Компетентные клетки  DH5a трансформировали с использованием теплового шока, и полученные таким образом колонии культивировали в большом масштабе для получения плазмид.
Плазмидами, полученными выше, трансфецировали клетки HEK293F (Invitrogen, USA), и антитела, полученные после 7 дней культивирования, очищали с использованием колонки с белком А (GE, USA). Культуральную среду наносили на колонку, чтобы позволить антителам (IgG) в культуральной среде связаться с белком А. Антитела затем элюировали 20 мМ цитрат-натриевым буфером (рН 3,0). Соответствие молекулярных масс легких и тяжелых цепей с теоретически рассчитанными значениями и высокая степень чистоты были подтверждены с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ.
[Таблица 5]
Праймер
Последовательность
SEQ ID NO
V<sub>H</sub>
Прямой
GCT AGC CGC CAC CAT GGG C
140
Обратный
AGG GGC CCT TGG TGG AGG CCT GGC CGG CCT GGC CAC T
141
C<sub>H</sub>
Прямой
GCC TCC ACC AAG GGC CCC TC
142
Обратный
CGG GAT CCC TTG CCG GCC GT
143
HC
Прямой
GCT AGC CGC CAC CAT GGG C
144
Обратный
CGG GAT CCC TTG CCG GCC GT
145
V<sub>L</sub>
Прямой
AAG CTT GCC GCC ACC ATG
146
Обратный
AGG GGG CGG CCA CGG TCC GGG AAG ATC TAG AGG ACT G
147
C<sub>k</sub>
Прямой
CGG ACC GTG GCC GCC CCC TC
148
Обратный
GCT CTA GAC TAG CAC TCG C
149
LC
Прямой
AAG CTT GCC GCC ACC ATG
150
Обратный
GCT CTA GAC TAG CAC TCG C
151
Пример 6. Измерение аффинности
ELISA-планшеты покрывали 0,2 мкг/мл VEGF человека и мышиного VEGF (R & D Systems, USA), соответственно, и инкубировали с очищенными белками, полученными в примере 5, в форме scFv, экспрессированных в клетках HB2151, или IgG, экспрессированных в клетках 293F, в серийно разведенных концентрациях. В результате, клон F, полученный в примере 3-2, и его варианты, полученные с помощью улучшения аффинности, продемонстрировали хорошее связывание с VEGF человека и мыши концентрационно-зависимым образом.
Тем временем, для измерения аффинности VEGF человека и VEGF мыши были связаны с покрытыми карбоксиметилированным декстраном биосенсорными чипами (CM5, GE) в соответствии с инструкциями изготовителя. Для измерения скорости ассоциации и диссоциации, белок IgG серийно разводили в 2 раза до 5 нм, 2,5 нм, 1,25 нм, 0,625 нм, 0,313 нм и 0,156 нМ и наносили на чип.
Скорости ассоциации и диссоциации были выражены с помощью сенсограмм ассоциации и диссоциации и рассчитаны с использованием простой Ленгмюровской модели связывания 1:1 (программное обеспечение BIAcore X100, версия. 2.0). Было подтверждено, что константа равновесной диссоциации (KD), рассчитанная как константа скорости диссоциации (Kd), деленная на константу скорости ассоциации (Ка), имеет значения ниже наномолярного диапазона, что указывает на высокую аффинность. Измеренные для антител HF2-1 HF2-11, HF2-13 и HF2-14 значения сродства к VEGF человека (hVEGF) приведены в таблице 6, а сенсограмма для HF2-11 показана на фиг.1 в качестве типичного примера.
[Таблица 6]
Клоны
Связываемая молекула
Ka (1/M*с)
Kd (1/с)
KD (M)
HF2-1
hVEGF
2,5×10<sup>6</sup>
<1×10<sup>-6</sup>
<1×10<sup>-12</sup>
HF2-2
hVEGF
1,1×10<sup>6</sup>
<1×10<sup>-6</sup>
<1×10<sup>-12</sup>
HF2-3
hVEGF
1,3×10<sup>6</sup>
<1×10<sup>-6</sup>
<1×10<sup>-12</sup>
HF2-4
hVEGF
1,6×10<sup>6</sup>
3,1×10<sup>-6</sup>
1,9×10<sup>-12</sup>
HF2-5
hVEGF
1,3×10<sup>6</sup>
2,6×10<sup>-5</sup>
1,9×10<sup>-11</sup>
HF2-6
hVEGF
1,6×10<sup>6</sup>
<1×10<sup>-6</sup>
<1×10<sup>-12</sup>
HF2-7
hVEGF
1,6×10<sup>6</sup>
2,7×10<sup>-5</sup>
1,6×10<sup>-11</sup>
HF2-8
hVEGF
1,5×10<sup>6</sup>
5,7×10<sup>-5</sup>
3,6×10<sup>-11</sup>
HF2-9
hVEGF
1,7×10<sup>6</sup>
3,2×10<sup>-5</sup>
1,8×10<sup>-11</sup>
HF2-10
hVEGF
1,6×10<sup>6</sup>
<1×10<sup>-6</sup>
<1×10<sup>-12</sup>
HF2-11
hVEGF
1,4×10<sup>6</sup>
6,8×10<sup>-6</sup>
4,7×10<sup>-12</sup>
HF2-13
hVEGF
1,4×10<sup>6</sup>
1×10<sup>-5</sup>
9,0×10<sup>-12</sup>
HF2-14
hVEGF
1,3×10<sup>6</sup>
<1×10<sup>-6</sup>
<1×10<sup>-12</sup>
Пример 7. Подтверждение ингибирования связывания лиганда с рецептором
Чтобы проверить ингибирующее действие отобранных антител (HF2-1, HF2-5, HF2-9 и HF2-11) по настоящему изобретению на связывание VEGF с рецептором VEGF, KDR (далее VEGFR2), или рецептором VEGF, Flt-1 (далее VEGFR1), были проведены следующие эксперименты.
96-луночный планшет для ELISA покрывали 0,5 мкг/мл VEGF человека и блокировали раствором PBS, содержащим 3% BSA и 0,05% Tween 20. В каждую лунку добавляли 6 нМ слитый белок, содержащий внеклеточный домен Flt-1 (Flt-1-ECD) и Fc-область IgG (27-687, R & D Systems, USA), или 9 нМ слитый белок, содержащий внеклеточный домен KDR (KDR-ECD) и Fc-область IgG (R & D Systems, USA), совместно с каждым из антител HF2-1, HF2-5, HF2-9 и HF2-11 в 2-кратных разведениях (0,01 нМ, 0,1 нМ, 0,3 нМ, 1 нМ, 3 нм, 10 нм и 100 нм), и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Слитые белки FLT-1-ECD-IgG-Fc и KDR-ECD-IgG-Fc, которые связывались несмотря на ингибирование, были обнаружены с использованием конъюгированных с HRP антител к IgG-Fc человека (Jackson ImmunoResearch, USA) и последующих ABTS-хромогенной детекции и измерения поглощения при 405 нм.
В результате, как показано на фиг.2, антитела по настоящему изобретению ингибировали связывание VEGF с KDR (VEGFR2) концентрационно-зависимым образом, но не ингибировали связывание VEGF с Flt-1 (VEGFR1). Таким образом, было подтверждено, что отобранные антитела по настоящему изобретению избирательно ингибируют связывание VEGF с рецепторами VEGF.
Пример 8. Подтверждение специфичности связывания
Для измерения специфичности связывания отобранных антител HF2-1, HF2-5, HF2-9 и HF2-11 по настоящему изобретения в отношении VEGF-A (hVEGF-А) человека, VEGF-A (mVEGF-А) мыши, VEGF-B (hVEGF-B) человека, VEGF-C (hVEGF-С) человека, VEGF-D (hVEGF-D) человека и плацентарного фактора роста человека (PIGF) были проведены следующие эксперименты.
Лунки планшета для ELISA покрывали 0,2 мкг/мл каждого из соответствующих белков (hVEGF-A, A-mVEGF, hVEGF-B, hVEGF-C, D hVEGF-и PIGF) (R & D Systems), соответственно. После блокирования поверхности лунок с использованием PBS, содержащего 3% BSA и 0,05% Tween 20 в течение 30 мин при 37°С, инкубировали антитела в возрастающих концентрациях при 37°С в течение 2 ч. Затем лунки 3 раза промывали PBS, содержащим 3% BSA и 0,05% Tween 20, добавляли конъюгированные с HRP антитела к Fab-фрагменту IgG человека (Jackson ImmunoResearch, USA) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем лунки 3 раза промывали PBS, содержащим 3% BSA и 0,05% Tween 20, проявляли с использованием TMB и измеряли оптическую плотность при 650 нм. В качестве контроля использовали Авастин™ (Roche, Switzerlu).
Как показано на фиг.3, клоны антител по настоящему изобретению показали хорошее связывание с hVEGF-A и mVEGF-A, но вообще не связывались с VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D или PIGF, что указывает на высокую специфичность в отношении VEGF.
Пример 9. Анализ физико-химических характеристик
Были проанализированы физико-химические характеристики антител по настоящему изобретению.
Анализ посредством электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле (ДСН-ПААГЭ) с использованием геля NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen Co.) в восстанавливающих условиях в присутствии DTT для удаления дисульфидных связей и в невосстанавливающих условиях в отсутствие DTT подтвердил существование легких и тяжелых цепей полноразмерного антитела. Результаты измерения молекулярного веса для HF2-11 показаны на фиг.4 в качестве типового примера.
Как показано на фиг.4, образцы, проанализированные в невосстанавливающих условиях (NR, 5 мкг), давали 1 основную полосу между маркерами 116 кДа и 205 кДа, подтверждая наличие полосы, соответствующей полноразмерному антителу. Образцы, проанализированные в восстанавливающих условиях (R, 2 мкг), дали основные полосы рядом с маркерами 55 кДа и 20,1 кДа, соответственно, подтверждая наличие полос, соответствующих тяжелой и легкой цепям антитела. Таким образом, с помощью ДСН-ПААГЭ были идентифицированы полосы, соответствующие полноразмерному антителу, тяжелой цепи и легкой цепи, и не было найдено никакие других мажорных примесных полос.
Кроме того, молекулярная масса HF2-4 и ее соответствие значению, полученному из теоретической аминокислотной последовательности, были подтверждены с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (LC/MS). Результаты масс-спектрометрического анализа тяжелой и легкой цепей HF2-4 показаны на фиг. 5(а) и (b) в качестве типового примера.
Масса тяжелой и легкой цепей была проанализирована после частичного восстановления образцов. Тяжелая цепь имела основной пик с размером 50,6 кД, а легкая цепь - с размером 23,3 кД, которые согласуются с расчетными значениями молекулярной массы. Также наблюдались небольшие пики, которые, по-видимому, являлись результатом посттрансляционной модификации, такой как гликозилирование.
Кроме того, агрегированное состояние (т.е. растворимые агрегаты, тип примесей) антитела HF2-8 по настоящему изобретению было проанализировано с помощью гель-проникающей хроматографии (SEC) с использованием колонки TSKgel G3000SWхl (Tosoh Co.), и результаты показаны на фиг.6. При использовании разделения с помощью изократической элюции 100 мМ фосфатным буфером (pH 6,6) в качестве подвижной фазы и контроля при 280 нм, наблюдаемая площадь пика мономера составляла 98% или более от общей площади пика, тогда как площадь пика агрегатов занимала менее 2%, что указывает на высокую чистоту.
Пример 10. Анализ связывания антител с VEGF человека или мыши
Способность антител по настоящему изобретению (от HF2-1 до HF2-26) связываться с фактором роста сосудистого эндотелия человека (VEGF) была проверена с помощью метода ELISA.
1,5 нг VEGF человека, разведенного в 150 мкл буферного раствора, вносили в 96-луночный иммуннологический планшет (Nunc, USA) и оставляли для адсорбции при 4°С в течение ночи, с последующей 3-кратной промывкой буферным раствором, содержащим 0,1% Tween 20. Затем поверхность блокировали буферным раствором, содержащим 1%-й бычий сывороточный альбумин (Sigma, USA), в течение 1 ч при комнатной температуре и промывали 3 раза. Затем в каждую лунку добавляли 150 мкл серийно разведенного антитела (1 нг/мл, 10 нг/мл, 30 нг/мл, 100 нг/мл, 1000 нг/мл и 3000 нг/мл). Планшет оставляли для прохождения реакции на 1 ч при комнатной температуре, для того чтобы антигены могли связаться с антителами, и далее промывали 3 раза буферным раствором.
В каждую лунку добавляли по 150 мкл конъюгированного с HRP антитела против Fc-участка человеческого иммуноглобулина (AbSerotec, USA), разведенного 1:20000, и оставляли взаимодействовать в течение 1 ч при комнатной температуре. После завершения реакции лунки 3 раза промывали буферным раствором, и далее добавляли 150 мкл ТМВ (Sigma, USA) и оставляли для прохождения цветовой реакции на 10 мин. Реакцию останавливали с помощью 1N раствора серной кислоты и измеряли оптическую плотность при 450 нм с использованием спектрофотометра (Molecular Device, USA). Результаты показаны на фиг.7. Авастин™ был использован в качестве контрольной группы, для которой оптическую плотность измеряли таким же образом.
Как показано на фиг. 7, было подтверждено, что связывающая способность HF-клонов (b), которые представляют собой гуманизированные варианты клона F (a), была увеличена посредством процесса повышения аффинности. Было установлено, что большинство этих клонов (HF2-1 - HF2-26) имело более высокое сродство к VEGF, чем Авастин™.
Сродство антител к VEGF мыши было проверено методом ELISA таким же образом, как описано выше. Результаты, представленные на фиг. 8, показывают, что, в отличие от Авастина™, антитела HF2-1, HF2-5, HF2-8 и HF2-9 по изобретению связываются с VEGF мыши, также как и с VEGF человека, указывая на то, что антитела по настоящему изобретению пригодны для проведения доклинических исследований с использованием мышей.
Пример 11. Подтверждение подавляющего действия антител по изобретению на индуцированную VEGF пролиферацию клеток HUVEC
Было подтверждено подавляющее действие антител по изобретению на индуцированную VEGF пролиферацию клеток HUVEC.
Чтобы исключить факторы роста и бычью сыворотку, посредством центрифугирования эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC, Clonetics, USA) получали осадок, который затем ресуспендировали в базальной среде EBM-2 (Clonetics, USA). Клеточные суспензии высевали в 96-луночный клеточный культуральный планшет с одинаковым числом клеток на лунку, которые затем инкубировали в течение 24 ч при постоянной температуре в инкубаторе с увлажнением. После завершения инкубации среду удаляли, и в лунки добавляли смешанные растворы каждого антитела в серийных разведениях (30 нг/мл, 60 нг/мл, 100 нг/мл, 150 нг/мл, 200 нг/мл, 300 нг/мл, 1000 нг/мл и 3000 нг/мл) и VEGF человека, разведенного в заданной концентрации между 30~90 нг/мл. Клетки с добавленными антигеном и антителом культивировали в течение 4 дней при постоянной температуре в инкубаторе с увлажнением, а затем добавляли раствор резазурина (Invitrogen, USA) в количестве 10 мкл на лунку. Через 3~4 часа измеряли флуоресценцию при 530 нм/590 нм. В качестве контроля был использован Авастин™, и эффекты подавления антителами пролиферации клеток оценивали количественно относительно величины флуоресценции для лунки, в которую вносили только VEGF. Результаты скорости пролиферации клеток HUVEC при воздействии антител HF-1, HF-4, HF-5 и HF-8 показаны на фиг.9 (b), а результаты выживаемости клеток при обработке антителами HF-1 HF-5, HF-9 и HF-11, показаны на фиг.9(с) и (d).
Как показано на фиг.9, антитело по изобретению HF2-5 подавляло индуцированную VEGF пролиферацию клеток HUVEC в одинаковой степени с Авастином™ (фиг. 9(b) и (d)). Кроме того, было показано, что активность антитела была повышена путем гуманизации F клона (а) и улучшения аффинности (b, c, d).
Пример 12. Подтверждение подавляющего действия антител по изобретению на индуцированную VEGF проницаемость клеток HUVEC
Оценивали подавляющее действие антител по изобретению индуцированную на VEGF проницаемость клеток HUVEC (Clonetics, USA).
4
За день до теста, лунки Transwell, имеющие 0,4 мкм микропористую мембрану, обрабатывали раствором коллагена (Sigma, USA), чтобы облегчить прикрепление клеток. Клетки собирали с помощью трипсина и ресуспендировали в концентрации 5×10 клеток/мл. Раствора коллагена удаляли из лунок Transwell, и лунки Transwell один раз промывали буферным раствором. 100 мкл клеточной суспензии наливали в каждую лунку. В нижнюю камеру добавляли 600 мкл среды EGM-2 (Clonetics, USA). После образования монослоя эндотелиальных клеток смешанные растворы, содержащие разбавленные антитела (HF2-5, HF2-9, HF2-11 или Авастин™ (контроль), каждое в разведении 1x или 10x) и VEGF человека, разбавленный до 30-90 нг/мл, добавляли в лунки Transwell и нижние камеры в количестве 100 мкл и 600 мкл, соответственно, и оставляли для прохождения реакции в течение ночи в инкубаторе. После завершения реакции, растворы из лунок Transwell удаляли, и в лунки Transwell добавляли по 100 мкл раствора декстрана-FITC. Через 1 ч измеряли флуоресценцию при 490 нм/520 нм для обнаружения декстрана, который прошел через лунки Transwell. В качестве контроля использовали среду EBM, не содержащую VEGF.
Как показано на фиг.10, повышение проницаемости эндотелиальных клеток посредством VEGF подавлялось антителами по настоящему изобретению концентрационно-зависимым образом (а) аналогично используемому в качестве положительного контроля Авастину™ (b).
Пример 13. Подтверждение подавляющего действия антител по изобретению на индуцированную VEGF миграцию клеток HUVEC
Было оценено подавляющее действие антител по изобретению HF2-4 и HF2-8 на индуцированную VEGF миграцию клеток HUVEC (Clonetics, USA).
Для количественной оценки миграционных свойств эндотелиальных клеток, проводили тест с использованием камеры Бойдена с лунками Transwell, имеющими микропористую мембрану 3 мкм. Для повышения реакционной способности VEGF, перед тестом проводили голодание клеток, культивируемых во флаконе, на протяжении более четырех часов в базальной среде EBM-2, содержащей 0,1% BSA. Суспензию клеток помещали в верхнюю камеру в количестве 50000 клеток на лунку в объеме 100 мкл, тогда как по 600 мкл раствора, содержащего смесь 3 нг/мл VEGF, разведенного в базальной среде, и 9 или 90 нг/мл антитела (HF2-4 или HF2-8), помещали в нижнюю камеру.
Клетки, которые мигрировали на противоположную сторону мембраны Transwell, следуя градиенту концентрации VEGF через 24 ч инкубации, открепляли с помощью трипсина. Открепленные клетки собирали центрифугированием и лизировали буфером для лизиса (Invitrogen, USA). ДНК в лизированных клеток окрашивали красителем ДНК (Invitrogen, USA), и измеряли флуоресценцию при 480 нм/520 нм. Результаты показаны на фиг.11.
Результаты на фиг.11 показывают, что миграция эндотелиальных клеток усиливается в результате действия VEGF человека, а усиление миграции может быть подавлено антителами HF2-4 и HF2-8 в концентрационно-зависимым образом.
Пример 14. Подтверждение подавляющего действия антител по изобретению на рост опухоли
Для оценки подавляющего действия антител на рост опухоли, антитела по настоящему изобретению вводили бестимусным мышым, у которых опухоль была получена путем имплантации раковых клеток человека.
6
3
3
В частности, 2~5×10 клеток HT-29 (линии HTB-38 клеток рака толстой кишки человека, АТСС), выращиваемых на среде McCoy's 5A, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина, вводили бестимусным мышам линии BALB/c (Orient Био) с помощью подкожной инъекции. Когда опухоли у мышей достигали достаточного среднего объема примерно 200~300 мм, антитела HF2-1, HF2-5, HF2-9 и HF2-11 вводили с помощью инъекций соответствующим группам. Антитела вводили дважды в неделю внутрибрюшинно в дозах 3 мг/кг или 10 мг/кг. Объем опухоли (мм) измеряли в разные моменты времени (дни 7-й, 14-й, 21-й, 28-й и 35-й). Буферный раствор (PBS) был использован в качестве отрицательной контрольной группы, а Авастин™ вводили группе положительного контроля. Результаты показаны на фиг.12.
Как показано на фиг. 12, рост опухоли был значительно подавлен у мышей, которым вводили антитела, по сравнению с контрольной группой. В частности, группы, которым вводили антитела, показали намного превосходящие эффекты подавления роста опухоли по сравнению с группой, которой вводили Авастин™.
Пример 15. Подтверждение подавляющего действия антител по изобретению на неоваскуляризацию сетчатки
Для того чтобы подтвердить подавляющее действие антител по изобретению на неоваскуляризацию сетчатки, эксперименты проводились следующим образом.
Во-первых, для того чтобы вызвать образование новых сосудов в сетчатке, лазером (150 мВт и 530 нм) воздействовали на правые глаза мышей в течение 0,1 с с использованием фотокоагулятора (Viridis laser, Quantel, France) в 0-й день эксперимента. Поражение после проекции доводили до 0,1 мкм. В 0-й и 7-й день антитела HF2-4 и HF2-11 вводили с помощью инъекции в правое глазное яблоко в дозах 1 мкг и 5 мкг, соответственно. Ангиографию глазного дна с использованием флуоресцеина проводили на 7-й и 14-й день, чтобы оценить степень ангиогенеза глазного дна. PBS использовали в качестве отрицательного контроля (носителя), а Афлиберцепт (Bayer health care) был использован в группе положительного контроля (референсный препарат). Ангиографические оценки глазного дна были проанализированы с помощью теста множественных сравнений Даннета, и результаты показаны на фиг.13.
Как показано на фиг. 13, группы, которым вводили антитела по настоящему изобретению, показали превосходные эффекты подавления хориоидального ангиогенеза в сравнении с группой отрицательного контроля, и по меньшей мере равные доступному в продаже препарату сравнения.
Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на указанные конкретные варианты осуществления, следует признать, что специалисты в данной области техники могут осуществить различные модификации и изменения в настоящем изобретении, которые также входят в объем настоящего изобретения, определенный прилагаемой формулой изобретения.