Биочип для мультиплексного анализа

Предлагаемая полезная модель относится к области медицины, а именно к диагностике, и может быть использована для диагностики онкологических заболеваний. Кроме того, предлагаемая полезная модель может быть использована в ветеринарии, а также в области биологии, иммунологии и цитологии.
Биочип - один из новейших инструментов биологии и медицины 21 века, используя минимум материала и минимум времени для исследования он позволяет определять множество различной и достоверной информации, например, о различных генетических дефектах, онкогенах, аллергенах. Биочипы позволяют обнаружить в организме человека маркеры, соответствующие конкретным заболеваниям, определенным вирусам и раковым клеткам практически в любом анализируемом материале - кровь, слюна, пот.
Широкие диагностические возможности биочипов обуславливают актуальность разработки их новых видов.
Выпускаемые в настоящее время биочипы отличаются друг от друга по методике изготовления, виду подложки и зонда, методу регистрации результата взаимодействия реагента с исследуемым образцом. Для считывания результатов реакции используются флуоресцентные метки, лазеры и оптические сканеры.
В настоящее время известны следующие виды биочипов:
- ДНК-биочипы, используемые для идентификации генов и их мутаций, связанных с различными заболеваниями, диагностики инфекционных болезней, скрининга микроорганизмов;
- белковые чипы, которые используют для обнаружения белковых маркеров, характерных для различных заболеваний на разных стадиях их развития;
- клеточные чипы, позволяющие избежать проблемы нестабильности белков в белковых чипах и проводить более точный анализ взаимодействия белков внутри клетки, визуализация самой клетки и ее органелл;
- тканевые чипы, позволяющие проводить анализ тысяч образцов тканей на одном предметном стекле и использующиеся для определения содержания белков в здоровых и патологически измененных тканях и оценки потенциальных мишеней для лекарственных препаратов;
- микрочипы на основе малых молекул, которые позволяют проводить одновременный скрининг тысяч потенциальных лекарственных средств;
- микрофлюидальные чипы - многофункциональное устройство для обмена, между компонентами которого используются электроды и микрожидкости.
Известна группа биочипов, содержащих твердый носитель, на рабочей зоне которого в форме кластеров иммобилизованы олигонуклеотидные зоны и идентификатор: патент РФ на полезную модель №69866 (МПК C12Q 1/68, дата публикации 10.01.2008), патент РФ на изобретение №2270254 (МПК C12Q 1/68, дата публикации 20.02.2006), патент РФ на изобретение №2436843 (МПК C12Q 1/00, дата публикации 27.12.2008).
Другая группа биочипов представляет собой твердую подложку, выполненную из стекла (патент РФ на полезную модель №141359, МПК G01N 33/552, дата публикации 28.11.2013) с нанесенным на его поверхность покрытием, например из халькогенидного стекла (там же) или из полилизина (патент РФ на полезную модель №142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014) или полимерным рабочим слоем (патент РФ на изобретение №2298797, МПК G01N 33/531, дата публикации 10.05.2007). На покрытии размещены тестовые участки подложки с иммобилизованными антителами, специфичными к поверхностным антигенам клеток.
В качестве ближайшего аналога предлагаемого биочипа выбран известный биочип для мультиплексного анализа, содержащий прозрачную подложку из стекла, разделенную на функциональную и рабочую части, функциональная часть служит для фиксации биочипа в руках, рабочая часть имеет покрытие и разделена на тестовые ячейки посредством решетки из пластика, каждая тестовая ячейка снабжена
иммобилизованными флуоресцентными антителами, специфичными к антигенам клеток, биочип содержит пленку, закрепленную поверх решетки (патент РФ на полезную модель №142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014).
Известный биочип содержит прозрачную подложку, выполненную из стекла с нанесенным на его рабочую поверхность полилизином, биочип разделен на 9 равных ячеек посредством решетки из пластика. В каждой ячейке содержатся флуоресцентные антитела (0,01 мкл). Для исследований используют тестовые участки с антителами к рецепторам эстрогена, рецепторам прогестерона, рецепторам СА-125, рецепторам РЭА, рецепторам СК 7, рецепторам СК 20, рецепторам Ber-ЕР4, рецепторам TTF1 и рецепторам WT1. Для сохранения антител во влажной среде в каждую ячейку добавлен реагент PBS в количестве 0,1 мкл. Биочип покрыт сверху гидрофобной пленкой, фиксированной к верхнему краю пластиковой решетки, создающей герметичные ячейки, ограниченные снизу подложкой с покрытием, сверху - пленкой, с остальных сторон - пластиковыми стенками решетки, которая также препятствует транзиту антител из одной ячейки в другую. Биочип хранится в темном месте для исключения выцветания метки.
Известный биочип работает следующим образом.
Биочип достают из непрозрачного контейнера. Готовят биоматериал для исследования. С рабочей поверхности биочипа снимают защитную гидрофобную пленку, после чего незамедлительно производят инсталляцию исследуемой биожидкости в тестовые ячейки. Затем биочип ставят на нагревательный столик при температуре 37°С и закрывают непрозрачной крышкой, для исключения попадания света, на 30 минут. Далее биочип помещают на предметное стекло флуоресцентного микроскопа и проводят анализ флуоресценции в каждой из ячеек. После проведения исследования производят фиксацию клеток. Далее производят окраску для последующего морфологического исследования клеток.
Известный биочип позволяет исследовать серозную жидкость, жидкость с менее богатым, чем кровь клеточным составом, и определить характер асцита (реактивный или онкологический).
Однако, известный биочип имеет следующие недостатки:
- известное устройство обеспечивает возможность исследования клеток, содержащихся в серозных жидкостях. Однако, на сегодняшний день известно, что не только серозные выпоты являются часто встречающимся симптомом заболеваний как воспалительного характера (острый панкреатит, цирроз печени, гепатиты и других), так и онкологических (рак яичника, рак печени, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки и другие) заболеваний. Уникальной диагностической информацией обладают клетки геморрагической жидкости, клетки мочи, клетки, полученные методом тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии, а также соскобы с резецированной солидной опухоли до ее фиксации в формалине. Однако, известный биочип не обеспечивает возможности исследования вышеуказанных клеток;
- полилизиновое покрытие подложки способствует сорбции как антител, так и клеток, что препятствует полноценному связыванию антител с клетками, также невозможно провести анализ реакции в пятне куда были нанесены антитела, так как свечение вокруг клеток носит фоновый, а не специфический характер;
- флуоресцентная метка FITC, используемая в известном устройстве, является не достаточно стабильной, что влияет на длительность хранения биочипа;
- пластиковая решетка, прикрепленная к биочипу, не позволяет проводить анализ на микроскопе при увеличении более 200 вследствие невозможности приближения объектива максимально близко к дну ячейки. Кроме того, пластиковая решетка прикреплена к подложке с помощью полиакрилатного клея, что может способствовать преждевременной денатурации антител за счет токсических эффектов клея;
- антитела находятся в ячейках в растворе PBS, что не дает возможности длительного хранения по двум причинам: преждевременный рост микроорганизмов и естественная сорбция антител к дну и стенкам ячейки;
- защитная пленка не является стерильной, что представляет дополнительный фактор риска роста микроорганизмов и порчи белковой составляющей (антител);
- известный биочип обеспечивает возможность исследования ограниченного количества маркеров (9-ти), что не всегда достаточно для нужд медицинских исследований.
Известен способ исследования клеток при диагностике онкологических заболеваний с помощью известного биочипа, включающий предварительную подготовку клеток, полученных из серозной жидкости, помещение исследуемого материала в ячейки биочипа, проведение флуоресцентного анализа и последующее исследование наличия и детекции флуоресценции в каждой тестовой ячейке, при э гом на этапе предварительной подготовки серозную жидкость центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин, выбранный в качестве ближайшего аналога (патент РФ на полезную модель №142470, МПК G01N 33/53, дата публикации 27.06.2014).
Известный способ с помощью известного биочипа осуществляют следующим образом.
Забирают серозную жидкость несколькими рутинными способами (интраоперационно в стерильный шприц в количестве не менее 2 мл, при пункции трансвагинально, трансабдоминально в стерильный шприц). Затем материал помещают в пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 оборотов в минуту. Надосадочную жидкость удаляют, осадок микропипеткой вносят в ячейки биочипа в количестве 0,2 мл. Исследуют количество окрашенных клеток и яркость флуоресценции. После чего производят фиксацию клеток и их последующую окраску гематоксилином Майера и проводят морфометрическое исследование.
Однако известный способ имеет следующие недостатки.
Известный способ не обеспечивает возможности исследовать другие биологические клеточные материалы, такие как клетки геморрагической жидкости, клетки в моче, клетки из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клетки из соскобов резецированных солидных опухолей до фиксации опухоли в формалине, что сужает диагностические возможности способа.
Задачей предлагаемой полезной модели является создание биочипа для мультиплексного анализа, который лишен недостатков прототипа.
Технический результат от использования предлагаемого биочипа заключается в обеспечении возможности анализа клеток геморрагической жидкости, клеток мочи, клеток из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток, полученных из соскобов резецированной солидной опухоли, повышении надежности работы биочипа и увеличении срока его годности.
Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом биочипе для мультиплексного анализа, содержащем прозрачную подложку из стекла, разделенную на функциональную и рабочую части, функциональная часть служит для фиксации биочипа в руках, рабочая часть имеет покрытие и разделена на тестовые ячейки посредством решетки из пластика, каждая тестовая ячейка снабжена иммобилизованными флуоресцентными антителами, специфичными к антигенам клеток, биочип содержит пленку, закрепленную поверх решетки, на подложку рабочей части нанесено покрытие, создающее положительный заряд на поверхности стекла, в тестовые ячейки внесены антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой Су-3 и реагент, препятствующий высыханию внесенных антител, рабочая поверхность биочипа покрыта воздухонепроницаемой стерильной пленкой, функциональная часть биочипа снабжена информацией о локализации внесенных антитела.
Предлагаемая полезная модель отвечает критерию «новизна», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников информации, которые бы порочили новизну предлагаемого устройства
Предлагаемый биочип представляет собой подложку размерами 25,4×76,2 мм, толщиной 1 мм. До начала работы биочип хранят в непрозрачном контейнере. Время нахождения на свету не должно превышать 20 минут до начала постановки реакции. Следует избегать попадания прямых солнечных лучей на изделие вне контейнера. Перед началом работы с поверхности биочипа снимают воздухонепроницаемую стерильную пленку.
Предлагаемый биочип обеспечивает возможность анализа клеток геморрагической жидкости, клеток мочи, клеток, полученных из материала тонкоигольной аспирационной биопсии и клеток, поученных из соскобов с солидных опухолей. Выполнение подложки с покрытием, создающим положительный заряд на поверхности стекла, позволяет проводить селективную сорбцию клеток за счет отрицательного заряда мембраны последних, при- этом препятствует сорбции антител за счет положительного заряда последних. В предлагаемые ячейки можно сорбировать антитела к любым антигенам опухоли. Возможность селективного связывания антитела с клеткой, а клетки с подложкой, исключающей неспецифическое осаждение антител на подложку, позволяет сократить время на исполнение анализа и повысить специфичность и надежность работы биочипа.
Внесение в тестовые ячейки антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой, например Су3, позволяет сохранить свечение ячеек до 2 месяцев.
Добавление реагента в каждую тестовую ячейку, содержащего, например, PBS, БСА и 0,06% азида натрия позволяет продлить работоспособность биочипа (более 1 года), так как препятствует высыханию капель антител за счет формирования защитной оболочки на молекулярном уровне, а также препятствует размножению микроорганизмов. Покрытие биочипа воздухонепроницаемой стерильной пленкой также препятствует размножению микроорганизмов.
В результате работы создано простое в использовании устройство, позволяющее одномоментно проводить анализ сразу 30 маркеров клеток, с возможностью оценки связи морфологии клетки и свечения, взаимосвязи антигена и клетки, его локализации, качественной характеристики. Использование вышеуказанных реагентов для анализа обеспечивает возможность длительного ретроспективного исследования
Предлагаемая полезная модель работает следующим образом.
Подготавливают биоматериала в виде взвеси клеток для исследования. Серозную жидкость забирают несколькими рутинными способами (интраоперационно в стерильный шприц в количестве не менее 2 мл, при пункции трансвагинально, трансабдоминально в стерильный шприц). Затем серозную жидкость помещают в пробирку и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин. Удаляют надосадочную жидкость, взвесь клеток в объеме не более 0,7-1 мл микропипеткой вносят в ячейки биочипа.
Мутную с осадком серозную жидкость, берут не более 20 мл (две центрифужные пробирки) и, после центрифугирования, надосадочную жидкость аккуратно удаляют пипеткой, доводя до объема 0,7-1 мл и ресуспендируют, получая концентрированную взвесь клеток. Полученную клеточную взвесь центрифугируют и осадок пипеткой вносят в ячейки биочипа.
Геморрагическую жидкость забирают с помощью пункции, центрифугируют в большом количестве (по 6-8) центрифужных пробирок емкостью 10 мл, далее надсадочные жидкости сливают, осадок ресуспензируют и объединяют в одну пробирку. Если собранная взвесь клеток превышает объем более 1 мл, еще раз центрифугируют и пипеткой аккуратно удаляют лишнюю жидкость, доводя объем до 0,7-1 мл, ресуспензируют, получая концентрированную взвесь клеток в жидкости и вносят мерными микропипетками материал в ячейки биочипа.
Взвесь клеток из материала тонкоигольной аспирационной биопсии помещают в пробирку Эппендорфа с питательной средой объемом 0,8 мл. Накрывают пробирку крышкой и тщательно перемешивают на шейкере, центрифугируют 5 минут при скорости 1500 об/мин, затем вносят мерными микропипетками материал в ячейки биочипа.
Для исследования солидных опухолей выполняют следующее. После получения резецированной опухоли, до ее фиксации формальдегидом, опухолевое образование рассекают и производят соскоб с его поверхности шпателем или краем стекла. Полученный соскоб помещают в пробирку Эппендорфа объемом 0,8 мл, содержащую питательную среду. Затем, закрыв пробирку крышечкой, взвесь тщательно перемешивают на шейкере и центрифугируют 5 минут при скорости 1500 об/мин, после чего вносят мерными микропипетками материал в ячейки чипа.
Внесенный биоматериал, аккуратно ресуспензируют слегка касаясь пипеткой дна для лучшего растворения антител и взаимодействия их с клетками опухоли. Затем биочип накрывают воздухонепроницаемой стерильной пленкой и помещают на шейкер на 2-3 минуты для лучшего растворения антител и взаимодействия их с клетками опухоли. После чего помещают в термостат или в гибридайзер на 25 минут при температуре 37°С. По истечении "указанного времени, соблюдая режим темноты, легким движением чип ополаскивают в стаканчике с Трис-буфером и дают высохнуть. Проводят исследование под флуоресцентным микроскопом. Проводят анализ флуоресценции в каждой из ячеек по следующим параметрам: количество флуоресцентно окрашенных клеток и яркость флуоресценции. После проведения флуоресцентного исследования выполняют фиксацию клеток и окраску по Лейшману. Проводят морфологическое исследование клеток. Результаты флуоресцентного анализа и морфометрического сопоставляют. Если свечения не отмечено, биочип окрашивают по Лейшману и проводят цитологическое исследование, оценивают клеточность и морфологию клеток. После проведенного анализа, чип заворачивают в фольгу и помещают в холодильник при -2-8°С.
Примеры конкретного осуществления даны в виде протоколов исследования.
Протокол №1
Пациентка А. 57 лет, поступила в стационар с подозрение на рак яичников, асцит. Пациентке в условиях поликлиники стерильным шприцом была выполнена пункция заднего свода влагалища. Было получено 20 мл светлой жидкости, соломенного цвета. Исследуемую жидкость поместили в пробирку объемом 20 мл и центрифугировали в течение 5 мин при 2000 об/мин. Затем серозную жидкость без осадка и каких-либо включений центрифугировали в большом количестве (по 4-5) центрифужных пробирок емкостью 4 мл, далее надосадочную жидкость сливали, осадки ресуспензировали и объединяли в одну пробирку. Полученную клеточную взвесь тщательно перемешали на шейкере.
Для исследования был применен биочип для исследования серозных жидкостей. В исследовании бы|ш использованы следующие виды антител: ячейка 1 маркер СА-125, ячейка 2 - РЭА, ячейка 3 - СК7, ячейка 4 - СК20, ячейка 5 - РЭ, ячейки 6 - TTF, ячейка 7 -WT1, ячейка 8 - Ерсат4, ячейка 9 - виментин, ячейка 10 - Cdx2.
С поверхности сняли воздухонепроницаемую стерильную пленку и внесли биоматериал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой. Затем биочип вновь накрыли пленкой и поставили на шейкер, инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37°С. Далее проводили отмывку биочипа в буферном растворе. Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой. Затем решетку снимали и проводили исследование под флуоресцентным микроскопом. Выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках: 1 - ярко выраженное свечение, 8 - ярко выраженное свечение, 3 - умеренно выраженное свечение. В остальных ячейках свечение не выявлено. Результат исследования: на биочипе - иммунофенотип соответствует раку яичников. Заключение исследователя: асцитическая жидкость содержит комплексы аденокарциномы яичника.
После оценки флуоресценции биочип окрасили по Лейшману, проведена морфологическая оценка клеток в каждой ячейке.
Протокол окраски по Лейшману: Мазок высушен на воздухе. Зафиксирован в фиксаторе-красителе Лейшмана в течение 3 минут, промыт водой. Произведена окраска 40 мл 0,1% красителя азур II, 30 мл 0,1% воднорастворимого эозина, 70 мл дистиллированной воды. Смесь красителей готовят перед работой (extempore).
Морфологическое заключение: во всех ячейках комплексы клеток аденокарциномы.
Пациентка, госпитализирована, выполнена операция экстирпации матки с придатками. Оментэктомия. Биопсия брюшины. Результат нистологического исследования: серозная аденокарцинома яичника. Диагноз - рак яичника IIIс стадии
Протокол №2
Пациентка И. 38 лет. Выявлено новообразование молочной железы. Выполнена пункция. Цитологическое исследование: аденогенный рак. Выполнено оперативное вмешательство в объеме секторальной резекции с подмышечной лимфоаденэктомией. Материал был отобран для исследования на биочипе ЕРН (рак молочной железы). В номерах ячеек 1, 6, 11 внесены антитела к рецепторам эстрогена, в номерах ячеек 2,7,12 антителя к рецепторам прогестерона, в номерах ячеек 3, 8, 13 внесены антитела Her2-neu, в номера ячеек 4, 9, 14 внесены антитела Ki67, в номера ячеек 5, 10, 15 внесены антитела EGFR. Для сохранения антител во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06%, БСА.
После получения резецированной опухоли до ее фиксации формальдегидом, опухолевый узел был рассечен и произведен соскоб шпателем с поверхности образования. Полученный соскоб помещен в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл с питательной средой. Затем, закрыв пробирку крышечкой, взвесь центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин. С поверхности биочипа удалили защитную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой.
Так же выборочно взяты и рассечены 2 лимфоузла, произведены соскобы с поверхности каждого лимфоузла. Каждый соскоб был помещен в свою пробирку объемом 1,5 мл с питательной средой. Затем, закрыв пробирку крышечкой, взвесь центрифугировали со скоростью 1500 об/мин в течение 5 минут. С поверхности биочипа удалили защитную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой.
Материал опухоли в ячейки: 1, 2, 3,4, 5.
Материал лимфоузла №1 - 6, 7, 8, 9, 10
Материал лимфоузла №2 - 11, 12, 13, 14,15
Затем биочип накрыт снятой пленкой и помещен на шейкер на 5 минут. Затем помещен в термостат на 30 минут при температуре 37°С. Проведена отмывка в буфере. Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой. Затем была снята решетка и проведено исследование под флуоресцентным микроскопом.
Заключение на биочипе:
Опухоль имеет следующий фенотип:
Рецепторы эстрогена: отрицательные.
Рецепторы прогестерона: отрицательные.
Рецепторы Her2-neu: 3+ (выраженное)
Ki67 - более 30% (2 балла)
Рецепторы EGFR: 1+ (слабо выраженное)
Лимфоузел №1 имеет следующий фенотип:
Рецепторы эстрогена: отрицательные.
Рецепторы прогестерона: отрицательные.
Рецепторы Her2-neu: 3+ (выраженное)
Ki67 -более 30% (2 балла)
Рецепторы EGFR: 1+ (слабо выраженное)
Лимфоузел №2 имеет следующий фенотип:
Рецепторы эстрогена: отрицательные.
Рецепторы прогестерона: отрицательные.
Рецепторы Her2-neu: 3+
(выраженное)
Ki67 - более 30% (2 балла)
Рецепторы EGFR: 0 (отрицательное)
Заключение исследователя: рак молочной железы Her2-neu: 3+, рецепторы эстрогена 0 баллов, рецепторы прогестерона 0 баллов, Ki67-более 30% клеток, рецепторы EGFR-1 балл.
Протокол окраски по Лейшману.
Морфологическое заключение: во всех ячейках комплексы клеток аденокарциномы молочной железы
Результат планового гистологического исследования: инвазивная карцинома молочной железы скирозного строения. В лимфоузлах метастазы аденокарциномы.
Результат иммуногистохимии: рак молочной железы Her2-neu: 3+, рецепторы эстрогена 0 баллов, рецепторы прогестерона 0 баллов, К167 - более 30% клеток, рецепторы EGFR-1 балл.
Пациентке выставлен диагноз рак молочной железы III стадии.
Протокол №3
Пациент Д. 69 лет. Взята моча на цитологический анализ. При цитологии выявлены комплексы атипических клеток. Больной сдал анализ мочи повторно. В лабораторию доставлена моча, соломенно-желтого цвета объемом 50 мл. Исследуемую жидкость поместили в пробирки объемом 20 мл и центрифугировали в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин. Затем мочу центрифугировали в большом количестве (по 4-5) центрифужных пробирок емкостью в 4 мл, после чего надосадочные жидкости слили, осадок ресуспензировали и объединили в одну пробирку.
Для исследования использован биочип NPV (урогенитальный тракт). В тестовых ячейках биочипа размещены антитела конъюгированные с Су3 к рецепторам р16 - ячейка 1, к рецепторам Ki67 - ячейка 2, к рецепторам р 63 - ячейка 3, к рецепторам цитокератины 5/6 - ячейка 4, цитокератин 7 - ячейка 5, цитокератин 20 - ячейка 6, СА 125 - ячейка 7, WT1 - ячейка 8, уроплакин - ячейка 9, CD 95 ячейка 10, Cdx2 - ячейка 11. Для сохранения антител во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06%, БСА.
С поверхности биочипа удалена воздухонепроницаемая стерильная пленка, в каждую ячейку мерной пипеткой внесен исследуемый материал - взвеси клеток мочи. Затем биочип накрыли снятой пленкой. Обработали в течение 5 минут на шейкере. Инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37°С. Далее проведена отмывка в буфере. Лишнюю влагу удалили фильтровальной бумагой. Затем сняли решетку и провели исследование под флуоресцентным микроскопом. При оценки под флуоресцентным микроскопом выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках: 1 - ярко выраженная, 8 - умеренное выраженная, 9 - ярко выраженная. Ячейки 10 и 4 - слабовыраженная. Остальные ячейки отрицательные.
Заключение, полученное на биочипе: иммунофенотип соответствует раку мочевого пузыря высокой степени злокачественности.
Заключение исследователя: в моче присутствую клетки плоскоклеточного рака мочевого пузыря высокой степени злокачественности
После оценки флуоресценции биочип окрашен по Лейшману и проведена морфологическая оценку клеток в каждой ячейке.
Морфологическое заключение: во всех ячейках комплексы атипичных клеток.
Пациентка госпитализирована в стационар. Выполнена цистоскопия с биопсией. Результат гистологического исследования: плоскоклеточный рак. Диагноз рак мочевого пузыря I стадии.
Протокол №4
Пациентка С. 45 лет. Узловое новообразовоание щитовидной железы Пациентке в условиях поликлиники стерильным шприцом была выполнена пункция новообразования. Было получено 5 мл геморрагической жидкости. Жидкость направлена на исследование. Исследование проведено на биочипе TYR (щитовидная железа). Тестовые ячейки биочипа содержали следующие антитела с меткой Су3: тиреоглобулин - ячейка 1, кальцитонин - ячейка 2, TTFI - ячейка 3, галектин - ячейка 4, мезотелиальный антиген HBMEI - ячейка 5, цитокератин 19 - ячейка 6, CD44v6 - ячейка 7, р53 - ячейка 8. Для сохранения антител во влажной среде добавлен реагент PBS, азид натрия 0,06%, БСА.
Исследуемая жидкость перелита в пробирку объемом 10 мл, содержащую питательную среду. Проведено центрифугирование в течение 5 минут при скорости 2000 об/мин. в пробирке объемом 10 мл. Затем геморрагическую жидкость без осадка и каких-либо включений центрифугировали в большом количестве (по 4-5) центрифужных пробирок емкостью в 4 мл, после центрифугирования надосадочные жидкости слили, осадки ресуспензировали и объединили в одну пробирку. Полученную клеточную взвесь тщательно перемешали на шейкере. Затем с поверхности биочипа сняли воздухонепроницаемую стерильную пленку и внесли материал взвеси клеток в каждую ячейку мерной пипеткой. Затем биочип накрыли снятой пленкой. Инкубировали в термостате в полной темноте 30 минут при температуре 37°С. Далее поместили на шейкер. Далее проводили отмывку в буфере. Лишнюю влагу удаляли фильтровальной бумагой. Затем сняли решетку и провели исследование под флуоресцентном микроскопе.
Выявлено свечение в комплексах клеток расположенных в ячейках: 1 - ярко выраженная, 2 - ярко выраженная, 7 - умеренно выраженная, 8 - ярко выраженная. Остальные ячейки отрицательные.
Заключение по результатам анализа на биочипе: иммунофенотип соответствует раку щитовидной железы.
Заключение исследователя: пунктат содержит клетки рака щитовидной железы.
После оценки флуоресценции биочип окрасили по Лейшману и провели морфологическую оценку клеток в каждой ячейке.
Морфологическое заключение: во всех ячейках комплексы клеток карциномы.
Пациентка госпитализирована в стационар. Выполнена операция гемиструмэктомия. Результат гистологического исследования: фолликулярная карцинома щитовидной железы. Пациентке выставлен диагноз рак щитовидной железы.