ИММОБИЛИЗАЦИЯ АКТИВНОГО АГЕНТА НА СУБСТРАТЕ
IMMOBILIZATION OF ACTIVE AGENT ON A SUBSTRATE

Наименования сторон к соглашению о совместных исследованиях
[0001] Настоящее изобретение было осуществлено в результате деятельности, предпринятой в рамках соглашения о совместных исследованиях между Baxter Healthcare Corporation и Northwestern University.
Область техники
[0002] Настоящее изобретение в целом относится к иммобилизации активного агента на субстрате. Конкретнее, настоящее изобретение относится к способам иммобилизации активного агента на субстрате, субстратам с иммобилизованными на них активными агентами, и медицинским устройствам, содержащим субстраты с иммобилизованными на них активными агентами.
Краткое описание родственной технологии
[0003] Медицинские устройства и компоненты медицинских устройств, применяемые для гемодиализа и других применений, включающих осуществление контакта между физиологическими жидкостями, такими как кровь, или тканями, и медицинским устройством или компонентом медицинского устройства, как известно, загрязняются белком, клетками и/или бактериальными отложениями в результате указанного контакта. Отложение белка из крови на медицинских устройствах или компонентах медицинских устройств представляет собой проблему для ряда материалов, широко применяемых в качестве субстратов для медицинских устройств или компонентов медицинских устройств, в частности, полисульфона, поликарбоната и силикона. Во многих случаях загрязнение может нарушать функцию или приводить к разрушению медицинского устройства. Данная проблема особенно значима для экстракорпорального кровообращения и компонентов экстракорпорального кровообращения, таких как трубки, применяемые в наборе для гемодиализа.
[0004] Покрытие субстратов активными агентами, например противообрастающими/противомикробными агентами, известно в данной области техники. Например, 3,4-дигидроксифенилаланин (ДОФА) применяли для синтеза дигидроксифенилсодержащих полимеров, которые можно применять в качестве адгезивных полимеров, также обеспечивающих противообрастающие/противомикробные покрытия, как описано в патенте США № 7618937 и опубликованных заявках на патенты США №№ 2010/0028719, 2009/0123652, 2008/0247984, 2008/0169059 и 2006/0009550. Обычно полимеры, полученные из ДОФА, содержат закрепляющие фрагменты, состоящие из пептидов, таких как лизин, сополимеризованных с ДОФА, как показано на структуре (I) ниже, что может быть дорогостоящим для массового производства. Полагают, что пептид или пептидоподобный фрагмент, сопряженный с закрепляющим фрагментом, в общем, устойчив к адсорбции белков или обрастанию клетками, или ингибирует указанные процессы, на поверхностях, на которые нанесена или прикреплена композиция.
В качестве альтернативы, в патенте США № 7622533 и опубликованной заявке на патент США № 2010/0197868 описан адгезивный полимер, содержащий боковые группы ДОФА или производные дигидроксифенила (ДГФ), присоединенные к полимеру с образованием адгезивных полимеров, способных связываться с разнородными субстратами, как показано на структуре (II) ниже.
Тем не менее, в обоих указанных подходах утечка ДОФА из полимера представляет собой проблему по причине значительной токсичности.
Краткое описание изобретения
[0005] Согласно настоящему изобретению предложены способы иммобилизации активного агента на поверхности субстрата, включающие стадии осаждения праймерного соединения на субстрат с образованием обработанного праймером субстрата, приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, благодаря чему осуществляется связывание тригидроксифенильной группы с субстратом для обеспечения обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата, и приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с раствором активного агента, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на поверхности субстрата. Соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может представлять собой малую молекулу или полимер, содержащий тригидроксифенильную группу. Полимер может представлять собой полимер, содержащий тригидроксифенильную группу в главной цепи полимера, или как вариант, представлять собой полимер, содержащий по меньшей мере один мономер, содержащий боковую тригидроксифенильную группу.
[0006] В одном из аспектов настоящего изобретения дополнительно предложены способы иммобилизации активного агента на субстрате, включающие стадии осаждения праймерного соединения на субстрат с образованием обработанного праймером субстрата, объединения в растворе соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и активного агента, с образованием раствора конъюгата активный агент-тригидроксифенил, и приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата активный агент-тригидроксифенил, благодаря чему осуществляется связывание тригидроксифенильной группы конъюгата активный агент-тригидроксифенил с обработанным праймером субстратом и иммобилизация активного агента на поверхности субстрата. Соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может представлять собой малую молекулу или полимер, содержащий тригидроксифенильную группу. Полимер может представлять собой полимер, содержащий тригидроксифенильную группу в главной цепи полимера, или как вариант, представлять собой полимер, содержащий по меньшей мере один мономер, содержащий боковую тригидроксифенильную группу.
[0007] Кроме того, согласно настоящему изобретению дополнительно предложены способы иммобилизации активного агента на поверхности субстрата, включающие стадии осаждения праймерного соединения на субстрат с образованием обработанного праймером субстрата, приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором галловой кислоты, благодаря чему осуществляется связывание галловой кислоты с субстратом с образованием обработанного галловой кислотой обработанного праймером субстрата, и приведения в контакт обработанного галловой кислотой обработанного праймером субстрата с раствором активного агента, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на поверхности субстрата.
[0008] В другом аспекте настоящего изобретения предложены субстраты, на поверхности которых иммобилизован активный агент, причем указанный субстрат содержит слой праймерного соединения на поверхности субстрата, причем указанный слой праймерного соединения содержит тригидроксифенильную группу, связанную с указанным слоем, причем указанная тригидроксифенильная группа содержит активный агент, связанный с указанной группой и благодаря этому иммобилизованный на поверхности субстрата. Активный агент может быть связан с тригидроксифенильной группой и/или праймерным соединением посредством линкерного соединения, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на субстрате. Соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может представлять собой малую молекулу или полимер, содержащий тригидроксифенильную группу. Полимер может представлять собой полимер, содержащий тригидроксифенильную группу в главной цепи полимера, или как вариант, представлять собой полимер, содержащий по меньшей мере один мономер, содержащий боковую тригидроксифенильную группу.
[0009] В другом аспекте настоящего изобретения предложены медицинские устройства, содержащие субстрат согласно настоящему изобретению.
[0010] Дополнительные аспекты настоящего изобретения будут понятны специалисту в данной области техники при рассмотрении следующего подробного описания, рассматриваемого вместе с прилагаемой формулой изобретения. В то время как настоящее изобретение допускает различные формы вариантов реализации, здесь и далее приведены конкретные варианты реализации настоящего изобретения, и следует понимать, что настоящее описание является только иллюстрацией и не предназначено ограничивать объем изобретения конкретными приведенными вариантами реализации.
Краткое описание чертежей
[0011] На фигуре 1 показаны рентгеновские фотоэлектронные обзорные спектры полисульфоновых поверхностей, модифицированных (i) немодифицированной полисульфоновой поверхностью, (ii) хитоолигосахаридом и галловой кислотой, и (iii) хитоолигосахаридом, галловой кислотой и различными концентрациями гепарина.
[0012] На фигуре 2 показан график зависимости конверсии тромбина (нг/мл) от времени для различных субстратов по сравнению с контролем.
Подробное описание изобретения
[0013] Согласно настоящему изобретению предложены субстраты с активным агентом, преимущественно и надежно иммобилизованным на поверхности субстрата, и способы создания указанных субстратов. Субстраты с иммобилизованным на них активным агентом особенно полезны тем, что их можно изготавливать относительно недорого, в частности, по сравнению с субстратами согласно известному уровню техники, на которые нанесено покрытие из адгезивных полимеров, полученных из сополимеров пептид-ДОФА. Субстраты с иммобилизованным на них активным агентом также могут быть особенно полезными тем, что они обладают низкой токсичностью, в частности, по сравнению с субстратами согласно известному уровню техники, на которые нанесено покрытие с использованием адгезивных полимеров на основе ДОФА.
[0014] Согласно настоящему изобретению предложены способы иммобилизации активного агента на поверхности субстрата, включающие стадии осаждения праймерного соединения (в общем случае, содержащего нуклеофильную группу) на субстрате, с образованием обработанного праймером субстрата, приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, благодаря чему осуществляется связывание тригидроксифенильной группы с субстратом, для обеспечения обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата, и приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с раствором активного агента, для связывания активного агента с тригидроксифенильной группой, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на поверхности субстрата. Способы могут дополнительно включать стадию приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с раствором линкерного соединения, благодаря чему осуществляется связывание линкерного соединения с тригидроксифенильной группой и/или праймерным соединением обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата, до приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с активным агентом.
[0015] В настоящем описании «иммобилизация» или «иммобилизованный» включает любое закрепление, присоединение, прикрепление, соединение и/или связывание, активного агента к поверхности субстрата. Иммобилизация активного агента на поверхности субстрата может быть подтверждена при помощи ряда различных методик. Например, как показано в примерах, иммобилизация активного агента может быть подтверждена путем демонстрации того, что активность активного агента присутствует, при помощи известных в данной области техники анализов. Активность активного агента можно оценивать при помощи функциональных анализов. Например, тромбогенный анализ можно применять для определения антитромботических агентов, таких как гепарин, 4-гидроксикумарин и подобные агенты. Кроме того, например, активный агент можно пометить флуоресцентным красителем, изотопной меткой или радиоактивной меткой, которые можно детектировать на субстрате, на котором иммобилизован активный агент. Присутствие активного агента можно также определять при помощи поверхностной спектроскопии, такой как рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (РФЭС), ИК-спектроскопия отражения-поглощения с Фурье-преобразованием (FTIRRAS) и спектроскопия комбинационного рассеяния. Кроме того, катионные красители могут быть использованы для подтверждения/детектирования анионных активных агентов, например, альциановый синий и толуидиновый синий образуют комплексное соединение с анионными активными агентами, такими как гепарин.
[0016] В настоящем описании «связывание» и «связывать» включает любое образование ковалентной связи, образование водородной связи, образование ионной связи (например, электростатическое притяжение) и ван-дер-ваальсовы взаимодействия, например, посредством которых соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может адсорбироваться на/приклеиваться к/связываться с/ассоциироваться с праймерным слоем или линкерным соединением, и посредством которых активный агент может адсорбироваться на/приклеиваться к/связываться с/ассоциироваться с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу или линкерным соединением.
[0017] В настоящем описании «соединение, содержащее тригидроксифенильную группу» включает низкомолекулярные соединения, полимеры, содержащие тригидроксифенильные группы, и конъюгаты тригидроксифенил-линкерное соединение. Полимеры, содержащие тригидроксифенильные группы, включают полимеры, в которых тригидроксифенильная группа находится в главной цепи полимера, и полимеры, содержащие по меньшей мере один мономер, содержащий боковую тригидроксифенильную группу.
[0018] В настоящем описании «тригидроксифенильная группа» относится к соединению, содержащему фенильное кольцо, содержащее в качестве заместителей по меньшей мере три гидроксильные группы. Следовательно, тригидроксифенильная группа включает соединения, содержащее фенильное кольцо, замещенное тремя гидроксилами, и даже четырьмя гидроксилами. В общем случае, предпочтительными являются соединения, содержащие фенильное кольцо, замещенное по меньшей мере тремя гидроксилами. Соединения, содержащие фенильное кольцо, замещенное тремя гидроксилами, полезны, поскольку кроме трех гидроксильных групп, такие соединения содержат три потенциально доступных реакционных центра, причем указанные центры могут быть выбраны, без ограничения, из незамещенных атомов углерода и реакционноспособных групп. Например, два незамещенных атома углерода и/или реакционноспособных группы, связывают соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, с праймерным соединением и активным агентом, с праймерным соединением и линкерным соединением, или с двумя дополнительными соединениями, содержащими тригидроксифенильную группу, через реакционные центры на дополнительных тригидроксифенильных группах (т.е. с образованием полимера). Соединение с третьим реакционным центром, кроме связывания, которое может быть осуществлено при помощи двух активных центров, может также полезно связываться с линкерным соединением, активным агентом или другим соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, и может быть особенно полезным для поперечного сшивания полимеров, содержащих тригидроксифенильные группы. Кроме того, не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что соединения, содержащие фенильное кольцо, замещенное тремя гидроксилами, полезнее, чем соединения, содержащие один или два гидроксила, поскольку незамещенные атомы углерода в соединениях, содержащих три гидроксила, относительно более реакционноспособны. Например, при увеличении числа гидроксилов в фенильном кольце, в общем случае увеличивается скорость окисления, и таким образом, обычно соединения, содержащие тригидроксифенильные группы, относительно легче образуют хиноноподобные соединения, чем соответствующие соединения, содержащие фенильные группы, замещенные только одним или двумя гидроксилами. Следовательно, соединения, содержащие фенильное кольцо, замещенное по меньшей мере тремя гидроксилами, обычно содержат незамещенные атомы углерода, которые являются более реакционноспособными, чем незамещенные атомы углерода в соответствующих соединениях, содержащих фенильные группы, замещенные только одним или двумя гидроксилами.
[0019] В настоящем описании «центры активности» или «активные центры» соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, не относится к самим гидроксильным фрагментам, но относится к любому другому центру соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, через который активный агент, праймерное соединение, линкерное соединение или дополнительное соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может связываться с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу. Например, центры активности могут включать незамещенные атомы углерода и активные группы, которые могут включать, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды, кетоны и сложные эфиры. Конечно же, гидроксильные фрагменты соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, также могут обладать активностью, например, по отношению к образованию сложноэфирных связей с праймерными соединениями, содержащими кислотные боковые цепи, такими как поли-(метакриловая кислота), поли-(акриловая кислота), поли-(глутаминовая кислота) и поли-(яблочная кислота).
[0020] В настоящем описании «полимер» включает соединение двумя или более повторяющимися звеньями, например, димеры, тримеры и высшие олигомеры. Повторяющиеся звенья могут быть одинаковыми, обеспечивая гомополимер, или различными, обеспечивая сополимер.
[0021] В настоящем описании «активный агент» включает активные агенты (включая активные агенты, конкретно упомянутые в настоящей заявке) и конъюгаты активный агент-линкерное соединение.
[0022] В настоящем описании «линкерное соединение» включает любое соединение, содержащее по меньшей мере две концевые группы, благодаря чему линкерное соединение может связывать и таким образом соединять две отдельные молекулы. Например, линкерное соединение может связываться с активной группой и/или незамещенным атомом углерода тригидроксифенильной группы посредством первой концевой группы, и с полимеризуемым фрагментом посредством второй концевой группы, с образованием полимеризуемого мономера. Как вариант, линкерное соединение может связываться с активной группой и/или незамещенным атомом углерода тригидроксифенильной группы посредством первой концевой группы, и с активным агентом посредством второй концевой группы, с образованием конъюгата тригидроксифенил-линкер-активный агент.
[0023] В одном из связанных аспектов настоящего изобретения дополнительно предложены способы иммобилизации активного агента на субстрате, включающие стадии осаждения праймерного соединения на субстрат с образованием обработанного праймером субстрата, объединения в растворе соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и активного агента, для осуществления связывания соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и активного агента, с образованием раствора конъюгата активного агента-тригидроксифенила, и приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата активного агента-тригидроксифенила, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на субстрате. Соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может представлять собой малую молекулу или полимер, содержащий тригидроксифенильную группу. Полимер может представлять собой полимер, содержащий тригидроксифенильную группу в главной цепи полимера, или как вариант, представлять собой полимер, содержащий по меньшей мере один мономер, содержащий боковую тригидроксифенильную группу. Конъюгат активного агента-тригидроксифенила может содержать активные агенты, связанные с линкерными соединениями, которые, в свою очередь, связаны с конъюгатами тригидроксифенила. Стадии объединения и приведения в контакт можно проводить одновременно, так что соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, и активный агент объединяют в присутствии обработанного праймером субстрата, или как вариант, стадии объединения и приведения в контакт можно осуществлять раздельно и последовательно.
[0024] В настоящем описании «конъюгат» относится к соединениям, получаемым в результате связывания между собой двух или более соединений, включающих тригидроксифенильную группу, линкерное соединение и/или активный агент. Соединения, которые вступили в конъюгацию, перечислены сразу после термина «конъюгат». Конъюгат может быть образован путем связывания двух соединений, которые образуют конъюгат, как определено выше.
[0025] В одном из связанных аспектов настоящего изобретения дополнительно предложены способы иммобилизации активного агента на поверхности субстрата, включающие стадии осаждения праймерного соединения на субстрат с образованием обработанного праймером субстрата, приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором галловой кислоты, благодаря чему осуществляется связывание тригидроксифенильной группы галловой кислоты с праймерным соединением, с образованием обработанного галловой кислотой обработанного праймером субстрата, и приведения в контакт обработанного галловой кислотой обработанного праймером субстрата с раствором активного агента, для связывания активного агента с тригидроксифенильной группой галловой кислоты, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на поверхности субстрата. Указанный способ может дополнительно включать приведение в контакт обработанного галловой кислотой обработанного праймером субстрата с раствором линкерного соединения, благодаря чему осуществляется связывание линкерного соединения с тригидроксифенильной группой и/или праймерным соединением из обработанного галловой кислотой обработанного праймером субстрата, перед приведением в контакт обработанного тригидроксифенилом субстрата с раствором активного агента.
[0026] В другом из связанных аспектов настоящего изобретения дополнительно предложены субстраты, на поверхности которых иммобилизован активный агент, причем указанный субстрат содержит слой праймерного соединения на поверхности субстрата, причем указанный слой праймерного соединения содержит связанную с ним тригидроксифенильную группу, причем указанная тригидроксифенильная группа содержит активный агент, связанный с указанной группой и таким образом иммобилизованный на поверхности субстрата. Соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может представлять собой малую молекулу или полимер, содержащий тригидроксифенильную группу. Полимер может представлять собой полимер, содержащий тригидроксифенильную группу в главной цепи полимера, или как вариант, представлять собой полимер, содержащий по меньшей мере один мономер, содержащий боковую тригидроксифенильную группу. Активный агент может быть связан с тригидроксифенильной группой и/или с праймерным соединением посредством линкерного соединения, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на субстрате.
[0027] В другом из связанных аспектов настоящего изобретения дополнительно предложены медицинские устройства, содержащие субстрат согласно настоящему изобретению. Медицинские устройства и компоненты медицинских устройств, содержащие субстраты согласно настоящему изобретению, могут включать активные агенты, которые полезно придают устройству или компоненту устройства антибактериальные, противообрастающие и/или антитромбогенные свойства. Конечно же, активные агенты могут демонстрировать другие терапевтические или благотворные действия.
[0028] Медицинские устройства и компоненты медицинских устройств, содержащие активные агенты, иммобилизованные на указанных изделиях, могут быть особенно выгодны, поскольку медицинское устройство или компонент устройства можно эффективно «снабдить покрытием» путем иммобилизации активного агента на/к (субстрате) поверхности указанного изделия, и таким образом снизить необходимость воздействия на пациента (тем же или подобным) активным агентом. Например, пациентам, лечение которых требует экстракорпорального кровообращения, такого как гемодиализ, аферез или коронарное шунтирование, часто вводят гепарин (или активные агенты с аналогичным действием) перед процедурой, чтобы предотвратить образование тромбов в насосах и трубках системы кровообращения. Тем не менее, кроме ингибирования тромбообразования, введение значительных количеств гепарина может делать пациента подверженным кровотечению после лечения. Следовательно, было бы выгодно применять устройства для кровообращения, на которых иммобилизован гепарин, благодаря чему снижалось бы количество гепарина, необходимого для лечения перед процедурой и сопутствующий риск того, что у пациента возникнут проблемы, связанные с кровотечением и/или необходимости более длительной госпитализации или медицинского ухода после процедуры.
[0029] В общем случае, способы согласно настоящему изобретению приводят к получению активного агента, иммобилизованного на поверхности субстрата, благодаря применению соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, которое может связываться с праймерным слоем, связанным с и/или осажденном на поверхности субстрата. Способы согласно настоящему описанию могут включать применение растворов и плазм праймерных соединений, растворов соединений, содержащих тригидроксифенильную группу (например, растворов конъюгатов тригидроксифенил-линкерное соединение, растворов низкомолекулярных соединений, содержащих тригидроксифенильные группы, таких как галловая кислота, и растворов полимеров, содержащих тригидроксифенильные группы, таких как полигалловая кислота), растворов линкерных соединений, растворов активных агентов (включая растворы конъюгата активный агент-линкерное соединение), и растворов конъюгата активный агент-тригидроксифенил. Растворители, применяемые для приготовления растворов праймерных соединений, растворов соединений, содержащих тригидроксифенильную группу, растворов линкерных соединений, растворов активных агентов и растворов конъюгатов активный агент-тригидроксифенил, могут представлять собой любой растворитель, подходящий в качестве носителя для праймерных соединений, соединений, содержащих тригидроксифенильную группу, линкерных соединений, активных агентов и/или конъюгатов активный агент-тригидроксифенил. Например, растворы согласно настоящему описанию могут содержать водные растворы, другие растворители, включая, без ограничения, спирты, диолы, сераорганические соединения, такие как сульфолан, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, алканы, ароматические соединения, галогенуглероды, такие как хлороформ и дихлорметан, и комбинации вышеуказанных соединений. Термин «раствор» в настоящем описании не обязательно означает, что содержащиеся в растворе компоненты полностью растворены. Так, в настоящем описании термин раствор включает как дисперсии, в которых компоненты диспергированы, так и растворы, в которых компоненты по существу или даже полностью растворены. В общем случае, предпочтительно полное растворение компонента. Кроме того, в настоящем описании термин «растворы» включает также растворы в виде аэрозолей.
[0030] В одном из аспектов настоящего изобретения способ иммобилизации активного агента на поверхности субстрата включает стадии:
(a) приведения в контакт субстрата с праймерным соединением, с образованием обработанного праймером субстрата;
(b) приведения в контакт обработанного праймером субстрата с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, благодаря чему осуществляется связывание тригидроксифенильной группы с обработанным праймером субстратом, для обеспечения обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата; и
(c) приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с активным агентом, для связывания активного агента с тригидроксифенильной группой, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на субстрате.
[0031] В другом аспекте настоящего изобретения способ иммобилизации активного агента на поверхности субстрата включает стадии:
(a) приведения в контакт субстрата с праймерным соединением, с образованием обработанного праймером субстрата;
(b) приведения в контакт обработанного праймером субстрата с галловой кислотой, для связывания тригидроксифенильной группы галловой кислоты с праймерным соединением, благодаря чему образуется обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат; и
(c) приведения в контакт обработанного галловой кислотой субстрата с активным агентом, для связывания активного агента с тригидроксифенильной группой, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на субстрате.
[0032] В связанном аспекте настоящего изобретения способ иммобилизации активного агента на поверхности субстрата включает стадии:
(a) осаждения праймерного соединения на субстрат, с образованием обработанного праймером субстрата;
(b) объединения в растворе соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и активного агента, для связывания тригидроксифенильной группы и активного агента, с образованием раствора конъюгата активный агент-тригидроксифенил; и
(c) приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата активный агент-тригидроксифенил, благодаря чему осуществляется связывание тригидроксифенильной группы конъюгата активный агент-тригидроксифенил с обработанным праймером субстратом и иммобилизация активного агента на субстрате.
[0033] В модификациях вышеуказанных вариантов реализации способы дополнительно включают промывание водой обработанного праймером субстрата, с образованием промытого обработанного праймером субстрата, и необязательное пропускание инертного газа, такого как азот, над промытым обработанным праймером субстратом перед приведением в контакт промытого обработанного праймером субстрата с раствором соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и/или раствором галловой кислоты.
[0034] В другой модификации вышеуказанных вариантов реализации способы дополнительно включают промывание водой обработанного тригидроксифенилом и/или галловой кислотой обработанного праймером субстрата, с образованием промытого обработанного тригидроксифенилом и/или галловой кислотой обработанного праймером субстрата, и необязательно пропускание инертного газа, такого как азот, над промытым обработанным тригидроксифенилом и/или галловой кислотой обработанным праймером субстратом до приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом и/или галловой кислотой обработанного праймером субстрата с раствором активного агента.
[0035] В другой модификации вышеуказанных вариантов реализации способы дополнительно включают промывание водой субстрата, на поверхности которого иммобилизован активный агент, с образованием промытого субстрата, на поверхности которого иммобилизован активный агент, и необязательно пропускание инертного газа, такого как азот, над промытым субстратом, на поверхности которого иммобилизован активный агент.
[0036] В другой модификации вышеуказанных вариантов реализации способы дополнительно включают стадию приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с раствором линкерного соединения, благодаря чему осуществляется связывание линкерного соединения с тригидроксифенильной группой и/или праймерным соединением обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата, до приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с раствором активного агента.
[0037] Способ может быть выбран так, что плотностью конъюгатов активный агент-тригидроксифенил, связанных с субстратом, можно управлять. Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что когда тригидроксифенильная группа связывается с обработанным праймером субстратом до связывания активного агента с тригидроксифенильной группой, полученный обработанный тригидроксифенилом субстрат имеет относительно плотное покрытие из тригидроксифенильных групп, связанных с субстратом. Кроме того, полагают, что когда конъюгат активный агент-тригидроксифенил образуется до связывания тригидроксифенильной группы с обработанным праймером субстратом, полученный субстрат с иммобилизованным на нем активным агентом имеет относительно меньшую плотность конъюгатов активный агент-тригидроксифенил, связанных с поверхностью, по сравнению с обработанным тригидроксифенилом субстратом, полученным до связывания активного агента с тригидроксифенильной группой. Когда конъюгат активный агент-тригидроксифенил образуется до связывания тригидроксифенильной группы с субстратом, средний специалист в данной области техники может легко управлять условиями так, чтобы связывание незамещенных атомов углерода тригидроксифенильной группы обработанного праймером субстрата было бы предпочтительным по сравнению со связыванием любых возможных центров связывания, имеющихся в активном агенте или активных группах тригидроксифенильной группы обработанного праймером субстрата.
Субстраты
ab initio
[0038] В целом, субстрат, на котором иммобилизован (или будет иммобилизован) активный агент, может представлять собой любой субстрат. Поверхность субстрата может иметь гидрофобную или гидрофильную природу. Подходящие субстраты могут включать, без ограничения, неорганические оксиды (например, кремнеземы, материалы, обычно известные как стекло), керамические материалы, металлы, включая оксиды металлов, полупроводники и/или полимерные субстраты. Металлические субстраты могут включать, без ограничения, нержавеющую сталь, кобальт, титан, никель, цирконий, тантал, хром, вольфрам, молибден, марганец, железо, ванадий, ниобий, гафний, алюминий, олово, палладий, рутений, иридий, родий, золото, серебро, платину, оксиды вышеуказанных металлов, сплавы вышеуказанных металлов и комбинации вышеуказанных материалов. Подходящие полимерные субстраты могут включать, без ограничения, сополимеры акрилонитрила-бутадиена-стирола, полиакрилонитрилы, полиамиды, поликарбонаты, сложные полиэфиры, полиэфирэфиркетоны, полиэфиримиды, полиэтилены, полиэтилентерефталаты, полимолочные кислоты, полиметилметакрилаты, полипропилены, полистиролы, полиуретаны, поливинилхлорид, поливинилиденхлориды, простые полиэфиры, полисульфоны, силиконы, полидиметилсилоксаны, политетрафторэтилен, полиизопрены и смеси и сополимеры указанных полимеров. В одном из аспектов, субстрат имеет поверхность, содержащую подходящий реакционноспособный фрагмент . Субстраты согласно настоящему изобретению также включают субстраты, имеющие поверхности, которые были активированы (или модифицированы) для содействия образованию однородного праймерного слоя. Активные фрагменты, применимые при этом, представляют собой фрагменты, которые могут применяться для ковалентного связывания праймерных соединений с поверхностью субстрата. Такие активные фрагменты, тем не менее, не должны присутствовать, если праймерные соединения все еще будут адсорбироваться на/прилипать к/связываться с/ассоциироваться с субстратом в отсутствии активных фрагментов на поверхности субстрата.
[0039] Субстрат согласно настоящему изобретению можно применять для обеспечения одной или более поверхностей медицинского устройства или компонента медицинского устройства. Медицинское устройство или компонент медицинского устройства может представлять собой любое медицинское устройство или компонент медицинского устройства, которые могут получать выгоду от наличия на их поверхности иммобилизованного активного агента, в частности, медицинские устройства, находящиеся в регулярном контакте с биологическими жидкостями пациента. Медицинские устройства или компоненты медицинского устройства могут включать, без ограничения, инструменты, аппараты, принадлежности, механизмы, приспособления, имплантаты, компоненты и комплектующие к указанным устройствам, предназначенные для применения для диагностики, излечения, облегчения, лечения или предотвращения заболевания или другого состояния у человека и других животных, или предназначенные для воздействия на структуру или любую функцию организма человека или других животных. Примеры медицинских устройств могут включать, без ограничения, устройства для экстракорпорального кровообращения, такие как насосы для гемодиализа и коронарного шунтирования, и компоненты указанных устройств. Аутогемотрансфузия, аферез, гемофильтрация, плазмаферез и экстракорпоральная мембранная оксигенация также включают применение экстракорпорального кровообращения для извлечения крови из кровотока пациента и воздействие на нее указанного процесса перед возвращением крови в кровоток пациента.
[0040] Конкретные медицинские устройства и/или компоненты медицинских устройств, содержащие субстраты, получающие выгоду от наличия на их поверхности иммобилизованного активного агента, включают, без ограничения, трубки; мешки для жидкости; перегородки; краны; зажимы; фильтры; катетеры, такие как венозные катетеры, мочевые катетеры, катетеры Фолея, внутриуретральные катетеры, внутриартериальные катетеры, внутрикостные катетеры, интратекальные катетеры, внутрилегочные катетеры и катетеры для обезболивания; трахеальные трубки; назогастральные зонды; системы для диализа; коннекторы для диализа; стенты; абдоминальные тампоны; зонды для питания; имплантированные устройства; хирургические инструменты; иглы; канюли; медицинские насосы; корпуса насосов; прокладки, такие как силиконовые O-образные кольца; шприцы; шовные материалы; фильтрующие устройства; устройства для растворения лекарственных препаратов; имплантаты; металлические винты; и металлические пластины. Дополнительные примеры медицинских устройств включают, без ограничения, инвазивные медицинские устройства, медицинские устройства длительного пользования, медицинские контейнеры для жидкостей, медицинские системы для протекания жидкостей, инфузионные насосы, мониторы пациента и любые другие медицинские устройства, регулярно вступающие в контакт с биологическими жидкостями пациента.
[0041] Примеры медицинских устройств длительного пользования включают внутривенные (в/в) насосы, мониторы пациента и подобные устройства. Примеры медицинских систем для протекания жидкостей включают системы для в/в введения, системы для интраперитонеального введения, и компоненты указанных систем, например, устройства доступа типа Люэра. Типичные системы для в/в введения включают пластиковые трубки для подключения пациента, которому проведена флеботомия, к одному или более источникам медицинских жидкостей, таких как растворы для внутривенного введения или контейнеры с лекарственными средствами. Системы для в/в введения необязательно включают одно или более устройств доступа, обеспечивающих доступ к пути движения жидкости для обеспечения возможности введения или отбора жидкости в/из трубки для в/в введения. Устройства доступа, как хорошо известно, полезно устраняют необходимость повторного проведения флеботомии пациенту и обеспечивают возможность немедленного введения пациенту медикаментов или других жидкостей. Устройства доступа могут быть выполнены с возможностью использования совместно с соединительными устройствами, соответствующими стандарту Люэра, такие устройства обычно называют «устройства доступа типа Люэра», «Люэр-активируемые устройства» или «ЛАУ». ЛАУ могут быть модифицированы при помощи одного или более признаков, таких как устройства индикации антисептики. Различные ЛАУ показаны в патентах США №№ 5242432, 5360413, 5730418, 5782816, 6039302, 6669681 и 6682509, и опубликованных заявках на патенты США №№ 2003/0141477, 2003/0208165, 2008/0021381 и 2008/0021392, содержание которых полностью включено в настоящую заявку посредством ссылок.
[0042] Системы для в/в введения или системы для интраперитонеального введения, могут включать дополнительные необязательные компоненты, включая, например, перегородки, пробки, краны, коннекторы, защитные колпачки коннекторов, крышки коннекторов, переходники, зажимы, удлинители, фильтры и подобные компоненты. Таким образом, дополнительные подходящие медицинские устройства и компоненты медицинских устройств, которые могут получать выгоду согласно настоящему изобретению, включают, без ограничения, системы для в/в введения, мешки для жидкости для в/в введения, устройства доступа для в/в систем, перегородки, краны, коннекторы для в/в систем, колпачки коннекторов для в/в систем, крышки коннекторов для в/в систем, переходники для в/в систем, зажимы, фильтры для в/в систем, насосы для в/в систем, электроды для в/в систем, катетеры, иглы, канюли, стетоскопы, мониторы пациента, системы для интраперитонеального введения, мешки для жидкости для интраперитонеального введения, устройства доступа для систем для интраперитонеального введения, коннекторы для систем для интраперитонеального введения, переходники для систем для интраперитонеального введения и фильтры для систем для интраперитонеального введения. Примеры устройств доступа включают, без ограничения, устройства доступа типа Люэра, включая, без ограничения, безыгольные устройства доступа типа Люэра. Поверхность медицинского устройства может представлять собой любой субстрат, описанный выше.
Праймерное соединение
[0043] В общем случае праймерное соединение может представлять собой любое соединение, которое при осаждении на субстрат образует слой на поверхности субстрата и обеспечивает возможность связывания тригидроксифенильной группы с праймером. В настоящем описании термин «праймерное соединение» включает как малый молекулы, так и полимеры. Тригидроксифенильная группа адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с праймерным соединением посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, связывается с праймерным соединением посредством образования одной или более ковалентных связей с праймером. В общем случае, полагают, что праймерное соединение образует «сетчатую структуру» с соединениями, содержащими тригидроксифенильную группу. В настоящем описании термин «сетчатая структура» относится к ковалентным связям, образованным между незамещенным атомом углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы и любыми двумя или более соединениями, выбранными из праймерного соединения, второй тригидроксифенильной группы соединения, содержащего тригидроксифенильную группу (которая может представлять собой тригидроксифенильную группу низкомолекулярного соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и/или полимера, содержащего тригидроксифенильную группу), и/или комбинации вышеуказанных соединений. Согласно вариантам реализации, в которых являются ковалентно связанными с относительно высокой плотностью праймерные соединения и/или соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, может быть образована поперечно сшитая сетчатая структура. Согласно вариантам реализации, в которых являются ковалентно связанными с относительно низкой плотностью праймерные соединения и/или соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, образованная сетчатая структура может не являться поперечно сшитой.
[0044] Подходящие праймерные соединения содержат нуклеофильную группу. Подходящие нуклеофильные группы хорошо известны в данной области техники и могут включать, без ограничения, гидроксил, алкоксид, амин, нитрит, тиол, тиолят, имидазол и комбинации указанных групп. Подходящие праймерные соединения включают, без ограничения, олигосахариды, такие как хитоолигосахарид, фруктоолигосахарид, галактоолигосахарид, маннанолигосахарид, полиамины, такие как этилендиамин, 1,2-диаминопропан, гексаметилендиамин, тетраметилендиамин, пентаметилендиамин, тетраэтилметилендиамин, спермин, спермидин и полиэтиленамин, поли(метакриловую кислоту), поли(акриловую кислоту), поли(глутаминовую кислоту), поли(яблочную кислоту), силаны с аминными функциональными группами, включая алкоксиаминосиланы, такие как аминопропилтриэтоксисилан, аминопропилдиэтоксиметилсилан, аминопропилдиметилэтоксисилан и аминопропилтриметоксисилан, и меркаптосиланы, такие как меркаптопропилтриметоксисилан и меркаптопропилметилдиметоксисилан. Нуклеофильные группы в олигосахаридах включают аминные и гидроксильные группы; нуклеофильные группы в полиаминах включают аминные группы. Конечно, возможны и другие нуклеофильные группы, и вышеуказанные группы представлены только для иллюстрации аспектов настоящего изобретения.
[0045] Поскольку праймерное соединение может представлять собой малую молекулу или полимер, молекулярная масса праймерного соединения может соответственно варьироваться в широком диапазоне молекулярных масс. Как описано ниже, молекулярную массу праймерного соединения обычно выбирают так, чтобы праймерное соединение было полностью растворимо в выбранном растворителе (т.е., предпочтительно, без образования насыщенного раствора праймерного соединения). Как вариант, если для осаждения праймерного соединения на субстрат применяют плазму, праймерное соединение может иметь любую молекулярную массу, при условии, что праймерное соединение обладает достаточной летучестью для диспергирования в газовую фазу.
[0046] Как описано для хитоолигосахарида в примере ниже, полагают, что праймерное соединение (хитоолигосахарид) может связываться с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, посредством нуклеофила праймерного соединения, который ковалентно связывается с незамещенным атомом углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы. Другие праймерные соединения с необходимостью содержат подобные нуклеофильные группы, описанные выше, и следовательно могут связываться с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, аналогично хитоолигосахариду. Праймерное соединение может связываться с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, также по другим механизмам. Например, амин, присутствующий в хитоолигосахариде, может образовывать основание Шиффа с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, которое содержит карбонильный фрагмент, например, галловой кислотой. Другие праймерные соединения, содержащие амин в качестве нуклеофильной группы, могут связываться с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, которое содержит карбонильный фрагмент, аналогичным образом.
[0047] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения, праймерное соединение может также выполнять функцию дополнительного активного агента (такого как антибактериальный агент, противообрастающий агент, противовоспалительный агент, антитромботический агент, например, антикоагуляционный агент, и комбинации указанных агентов). Например, олигосахариды, такие как хитоолигосахарид, могут полезно действовать в качестве антибактериальных агентов, в дополнение к основной целевой функции в качестве праймерного соединения. В качестве другого примера, хитозан, функционализированный четвертичными аминогруппами, можно применять в качестве праймерного соединения, которое также полезно придает субстрату антибактериальные свойства.
[0048] В общем случае, праймерное соединение образует по существу однородный слой на поверхности субстрата. В настоящем описании «однородный» относится к плотности количества/числа праймерных соединений на поверхности субстрата на единицу площади поверхности субстрата. Обычно данный термин относится к по существу непрерывному покрытию субстрата. По существу непрерывное покрытие относится к присутствию праймерного соединения на по меньшей мере от примерно 20% до примерно 100% поверхности субстрата, например, примерно 30%, примерно 40%, примерно 50%, примерно 60%, примерно 70%, примерно 80%, примерно 90% и/или примерно 100% покрытия поверхности субстрата. По существу непрерывное покрытие субстрата праймерным соединением полезно приводит к по существу равномерному/управляемому распределению активного агента, в конечном итоге иммобилизованного на субстрате. Однородность данного слоя праймерного соединения может быть подтверждена при помощи известных методик, таких как сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), атомно-силовая микроскопия (АСМ), инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием (ИК-ФП), спектроскопия комбинационного рассеяния, эллипсометрическая спектроскопия, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (РФЭС) в сочетании с профилированием по глубине и/или статическая или динамическая вторично-ионная масс-спектрометрия (ВИМС) в сочетании с профилированием по глубине. Кроме того, как указано выше, праймерное соединение и соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, могут связываться с субстратом, например, посредством образования сетчатой структуры между собой (например, праймерное соединение и соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, могут вводиться последовательно или в комбинации в присутствии субстрата). Однородность слоя сетчатой структуры также может быть подтверждена при помощи известных методик, таких как сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), атомно-силовая микроскопия (АСМ), инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием (ИК-ФП), спектроскопия комбинационного рассеяния, эллипсометрическая спектроскопия, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (РФЭС) в сочетании с профилированием по глубине и/или статическая или динамическая вторично-ионная масс-спектрометрия (ВИМС) в сочетании с профилированием по глубине.
[0049] Диапазоны в настоящей заявке могут быть выражены от «примерно» или «приблизительно» одного конкретного значения и/или до «примерно» или «приблизительно» другого конкретного значения. Если указан такой диапазон, другой вариант реализации настоящего изобретения включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Аналогично, если конкретные значения выражены как приблизительные, при использовании таких предшествующих выражений, как «примерно», «по меньшей мере примерно» или «менее чем примерно», следует понимать, что конкретное значения образует другой вариант реализации.
[0050] Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что однородность праймерного слоя, осажденного на поверхность субстрата, зависит от гидрофобной/гидрофильной природы поверхности субстрата и праймерного соединения, и продолжительности времени, в течение которого праймерный слой наносят на поверхность субстрата. Например, полагают, что по существу однородный слой гидрофильного праймерного соединения будет быстрее образован на гидрофильной поверхности, чем на гидрофобной поверхности.
[0051] Поверхность субстрата можно модифицировать для изменения гидрофильной/гидрофобной природы поверхности субстрата до воздействия на поверхность субстрата праймерного соединения, с целью содействия образованию однородного праймерного слоя. Обработка плазмой, включая, без ограничения, обработку аргоновой плазмой или обработку коронным разрядом, химические обработки, включая, без ограничения, обработку кислотой, обработку щелочью и подобные виды обработки можно применять для активации или модификации неполярной гидрофобной поверхности субстрата до более полярной/гидрофильной. Например, в одном из вариантов реализации, поверхность может быть модифицирована для включения гидроксильной группы путем окисления поверхности субстрата. Подходящие способы окисления поверхностей субстратов известны в данной области техники и могут включать, например, обработку поверхности субстрата каким-либо окисляющим агентом, включая, без ограничения, пероксид водорода, неорганические пероксиды, перманганаты, включая соли калия, натрия, аммония и кальция, тетраоксид осмия и комбинации вышеуказанных соединений. В качестве другого примера, субстраты из сложных полиэфиров могут быть активированы или модифицированы для включения гидроксильной группы путем воздействия на субстрат обработки кислотой, обработки щелочью или обработки аргоновой плазмой. Подходящие способы активации или модификации субстрата для включения амина включают воздействие на полиамидный субстрат обработки кислотой, обработки щелочью или обработки аргоновой плазмой. Подходящие способы модификации субстрата для включения тиола включают воздействие на политиосложноэфирный субстрат обработки кислотой, обработки щелочью или обработки аргоновой плазмой. За обработкой плазмой может следовать воздействие на обработанный плазмой субстрат газом для генерирования активных фрагментов. Например, плазмы можно применять для генерирования радикалов с последующим генерирование активных фрагментов путем воздействия газов, таких как кислород, аммиак и сероводород, для генерирования гидроксила, амина и тиола, соответственно.
[0052] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения, праймерное соединение осаждают на поверхность субстрата путем приведения в контакт поверхности субстрата с раствором праймерного соединения. Способы осаждения могут включать полное погружение субстрата в раствор праймерного соединения, например, посредством нанесения покрытия окунанием. Как вариант, способы осаждения могут включать распыление или наливание раствора праймерного соединения на поверхность субстрата, например, посредством центробежного литья или распыления раствора, такого как раствор в виде аэрозоля. Для субстратов, имеющих внутренний просвет, таких как трубки, раствор можно также пропускать в просвет для покрытия внутренней части субстрата. Растворитель может представлять собой любой растворитель, способный служить носителем праймерного соединения. Например, чаще всего в качестве растворителя применяют воду, но можно применять органические растворители, включая, без ограничения, спирты, диолы, сераорганические соединения, такие как сульфолан, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, галогенуглероды, такие как хлороформ и дихлорметан, и комбинации вышеуказанных растворителей. В общем случае вода предпочтительна для меньших и/или заряженных праймерных соединений, но можно применять обычные органические растворители, особенно для полимерных праймерных соединений. Согласно вариантам реализации способов согласно настоящему изобретению, раствор, содержащий праймерное соединение, имеет величину pH в диапазоне от примерно 7, 5 до примерно 9,5, или от примерно 8 до примерно 9 или примерно 8,5. Раствор праймерного соединения может дополнительно содержать буферное соединение, включая, без ограничения, N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (Бицин), 3-{[трис-(гидроксиметил)-метил]-амино}-пропансульфоновую кислоту (TAPS), трис-(гидроксиметил)-метиламин (Трис) и N-трис-(гидроксиметил)-метилглицин (Трицин). Конечно, можно также применять одну или более карбонатных, фосфатных и других известных буферных систем для поддержания относительно высоких величин pH.
[0053] Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены способы иммобилизации активного агента на поверхности субстрата, включающие стадию осаждения праймерного соединения на субстрате посредством плазменного осаждения. Термин «плазма» в настоящем описании описывает частично или полностью ионизированный газ, состоящий из ионов, электронов и нейтральных частиц. Например, слой активных аминогрупп может быть осажден на поверхности субстрата при помощи плазменной обработки, включающей аллиламин, генерируемый посредством приложения радиочастоты в вакууме от слабого до умеренного. В данном примере обработка плазмой приводит к образованию на поверхности субстрата радикальных частиц, которые будут инициировать радикальную полимеризацию аллиламина на поверхности субстрата. Кроме того, радикалы, образуемые в газовой фазе плазмы, могут взаимодействовать с радикалами, образуемыми на поверхности субстрата, и связываться с субстратом.
[0054] Подходящие плазмы можно генерировать из различных инертных газов и активных газов, а также смесей инертных газов, смесей активных газов и/или смесей инертных газов и активных газов и активных газов. Плазмы для применения в способах согласно настоящему изобретению можно генерировать различными известными способами, такими как приложение электрического и/или магнитного полей. Для генерирования подходящих плазм для применения в способах согласно настоящему описанию можно применять различные типы источников энергии; типичные источники энергии включают источники постоянного тока (DC), радиочастоты (РЧ), микроволнового излучения и лазерной энергии. В плоскопараллельном источнике плазмы, например, применяют источник РЧ энергии для генерирования плазмы посредством газового разряда. Другим примером источника РЧ энергии является источник индукционно связанной плазмы, в котором для генерирования плазмы применяют индуктивно связанный РЧ источник. Источник РЧ энергии может действовать на частоте 13,56 МГц или на другой подходящей частоте, легко определяемой средним специалистом в данной области техники. Источники микроволновой энергии включают, например, источник электронного циклотронного резонанса (ЭЦР). Микроволновая частота может составлять 2,45 ГГц или любую подходящую частоту, определяемую средним специалистом в данной области техники.
[0055] Плазмы можно генерировать при различных давлениях, и подходящие для плазмы давления легко может определить средний специалист с данной области техники. Плазму можно генерировать, например, при атмосферном давлении или под вакуумом. Повреждения субстрата могут быть более распространены при больших давлениях, по сравнению с меньшими давлениями. Применение меньших давлений может предотвратить или уменьшить повреждения субстрата, благодаря чему обеспечивается возможность применения увеличенного времени воздействия и/или увеличенных уровней мощности. Типичные давления, при которых можно генерировать плазму, включают давления от примерно 0,001 торр до примерно 760 торр, например, от примерно 0,01 торр до примерно 100 торр, от примерно 0,05 торр до примерно 50 торр и/или от примерно 0,1 торр до примерно 10 торр, но можно применять также большие или меньшие давления.
[0056] Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, поверхность субстрата может быть модифицирована для включения радикала в качестве активного фрагмента путем УФ облучения и/или тепловой обработки (например, при температуре от примерно 40 до примерно 110°С) субстрата в присутствии инициатора для создания радикалов на поверхности инициатора. Инициатор может представлять собой любой инициатор, известный в данной области техники, способный образовывать радикал под воздействием УФ-излучения и/или повышенных температур, например, от примерно 40 до примерно 110°С. Подходящие инициаторы могут включать, без ограничения, бензофенон, пероксиды, включая, без ограничения, пероксид водорода, бензоилпероксид, ацетилпероксид, лаурилпероксид, трет-бутилпероксиацетат, трет-бутилгидропероксид и ди-трет-бутилпероксид, диоксид азота, азобисизобутиронитрил (АИБН) и 2,2-диметокси-2-фенилацетофенон (ДМФА). Радикалы, генерируемые на поверхности субстрата, могут быть превращены в активные фрагменты, такие как гидроксил, амин и тиол, под воздействием газов, таких как кислород, аммиак и сероводород, соответственно.
[0057] Когда поверхность субстрата модифицирована для включения активного фрагмента, такого как гидроксил, поверхность субстрата может быть дополнительно модифицирована так, чтобы заменить указанный активный фрагмент другим активным фрагментом. Например, тиол можно заменить гидроксилом, или наоборот.
[0058] Праймерное соединение адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с поверхностью субстрата посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий; когда активный фрагмент присутствует на поверхности субстрата, праймерное соединение выгодно адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с активным фрагментом. Праймерное соединение дополнительно связывается с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, которое в свою очередь связывается с активным агентом (до или после связывания соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, с субстратом) через незамещенный атом углерода тригидроксифенильной группы или через активную группу тригидроксифенильной группы, в итоге образуя субстрат, на котором иммобилизован активный агент. Соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с активным агентом посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, связывается с активным агентом посредством образования одной или более ковалентных связей с активным агентом.
[0059] Когда праймерное соединение осаждают на поверхность субстрата путем приведения в контакт поверхности субстрата с раствором праймерного соединения, раствор праймерного соединения может, в общем случае, содержать любую концентрацию праймерного соединения. Концентрацию обычно выбирают так, чтобы праймерное соединение было полностью растворимо в выбранном растворителе, без образования насыщенного раствора праймерного соединения. Другим соображением является продолжительность времени проведения осаждения, которое в общем случае меньше, если используют более высокую концентрацию. Примеры концентраций праймерных соединений могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 60 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 3 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 2 мг/мл и/или от примерно 0,1 до примерно 1,5 мг/мл, например, примерно 0,1 мг/мл и/или примерно 1 мг/мл.
[0060] Поверхность субстрата может находиться в контакте и/или быть погружена в раствор праймерного соединения в течение любого интервала времени, подходящего для осаждения праймерного соединения на поверхность субстрата с желаемой плотностью праймерного соединения. Скорость осаждения праймерного соединения на субстрат может зависеть, в частности, от концентрации праймерного соединения в растворе праймерного соединения, отношения поверхности субстрата к объему раствора, ионной силы раствора, pH раствора и температуры. Продолжительность контакта субстрата с раствором праймерного соединения может варьироваться в течение любого подходящего промежутка времени, в итоге обеспечивающего слой на субстрате, например, от примерно 10 секунд до примерно 24 часов при использовании нанесения покрытия окунанием. Если продолжительность контакта субстрата с раствором праймерного соединения увеличивают свыше 24 часов (и используют одну из вышеуказанных примеров концентраций праймерного соединения), ожидается незначительное различие в количестве осажденного праймерного соединения и в однородности слоя праймера (по сравнению с 24-часовым временем воздействия). Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что, несмотря на то, что спустя 24 часа осаждение праймерного соединения может продолжаться, ожидают, что количество праймерного соединения, осажденного после 24 часов, будет оказывать незначительное влияние на количество активного агента, который в итоге иммобилизуется на поверхности субстрата.
[0061] В другом варианте реализации, праймерное соединение, например, полиамин, осаждают на поверхности субстрата посредством плазменной обработки. Поверхность субстрата можно подвергать воздействию плазмы в течение различных промежутков времени. Длительность воздействия плазмы легко может определить средний специалист в данной области техники и подтвердить при помощи спектроскопических методик определения однородности слоя праймерного соединения, описанных выше. Кроме того, длительность воздействия может варьироваться в зависимости от активности плазмы. Повреждение субстрата может быть более распространено после длительных времен воздействия по сравнению с короткими временами воздействия. Таким образом, применение более коротких времен воздействия может предотвращать или снижать повреждение субстрата, благодаря чему обеспечивается возможность приложения повышенного давления и/или повышенных уровней энергии. Обычно поверхность субстрата подвергают воздействию в течение от примерно 1 секунды до примерно 2 часов, но модно применять большие или меньшие периоды воздействия. В общем случае, поверхность субстрата подвергают воздействию плазмы в течение от примерно 5 секунд до примерно 1 часа, от примерно 10 секунд до примерно 30 минут, от примерно 30 секунд до примерно 20 минут и/или от примерно 1 минуты до примерно 10 минут.
[0062] Поверхности субстрата могут подвергаться воздействию плазмы в течение длительного периода времени. Поверхности субстрата могут также подвергаться воздействию плазмы в течение прерывистых («импульсных») промежутков времени, т.е. способ осаждения из плазмы может включать воздействие плазмы на поверхность субстрата в течение периода времени, за которым следует период, в течение которого поверхность субстрата не подвергается воздействию плазмы. Такие периоды воздействия и отсутствия воздействия могут повторяться многократно. Повреждение субстрата или покрытия субстрата может быть более распространено после способов с непрерывным воздействием, по сравнению со способами с импульсным воздействием. Таким образом, применение способов и импульсным воздействием может предотвращать или снижать повреждение субстрата или покрытия субстрата, благодаря чему обеспечивается возможность приложения повышенного давления и/или повышенных уровней энергии. Повышенные уровни энергии в течение прерывистых периодов могут полезно снижать количество времени, в течение которого субстраты подвергаются воздействию плазмы, благодаря чему снижается время обработки детали и увеличивается эффективность производства.
Соединения, содержащие тригидроксифенильную группу
[0063] Обработанный праймером субстрат подвергают воздействию соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, для связывания тригидроксифенильной группы с обработанным праймером субстратом. Как описано ранее, соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с праймерным соединением посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно тригидроксифенильная группа связывается с праймером посредством образования одной или более ковалентных связей с праймером. Как описано выше, соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, включает низкомолекулярные соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, полимеры, содержащие тригидроксифенильную группу, и конъюгат тригидроксифенил-линкерное соединение. Полимеры, содержащие тригидроксифенильную группу, могут представлять собой полимеры, содержащие тригидроксифенильную группу в главной цепи полимера, а также полимеры, содержащие боковые тригидроксифенильные группы. Конъюгаты тригидроксифенил-линкерное соединение включают низкомолекулярные или полимерные соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, связанную с линкерным соединением.
[0064] В общем случае, подходящие тригидроксифенильные группы содержат по меньшей мере два реакционноспособных центра, благодаря чему тригидроксифенильная группа может связываться с активным фрагментом, присутствующим в/на/внутри праймерного слоя, с образованием сетчатой структуры праймерное соединение-тригидроксифенильная группа, и с по меньшей мере одним активным агентом, другим соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, линкерным соединением и/или комбинациями вышеуказанных соединений. Подходящие низкомолекулярные соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, включают, без ограничения, галловую кислоту, флороглюцин, карбоновую кислоту, галламид, 5-метилбензол-1,2,3-триол, 3,4,5-тригидроксибензальдегид, 2,3,4-тригидроксибензальдегид, галлацетофенон, 3,4,5-тригидроксибензамид, 2,3,4-тригидроксибензойную кислоту, гидрохлорид 5-гидроксидопамина, метилгаллат, пирогаллол, производные указанных соединений и соли указанных соединений. Вышеуказанные низкомолекулярные соединения можно также применять для получения полимеров, содержащих тригидроксифенильные группы. Галловая кислота, посредством по меньшей мере двух незамещенных атомов углерода в фенильном кольце тригидроксифенильной группы, способна связываться по меньшей мере с двумя из праймерных соединений, активных агентов, других молекул галловой кислоты, линкерных соединений и комбинаций вышеуказанных соединений, обеспечивая иммобилизацию активного агента на поверхности субстрата. Галловая кислота также способна связываться с праймерным соединением, активным агентом, другой галловой кислотой и линкерным соединением посредством фрагмента карбоновой кислоты, как описано ниже для линкерного соединения. Таким образом, галловая кислота полезно содержит три гидроксила, а также три активных центра, которые могут принимать участие и способствовать иммобилизации активного агента на поверхности субстрата. Другие соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, с необходимостью содержат по меньшей мере два активных центра, например, по меньшей мере два незамещенных атома углерода в фенильном кольце/или по меньшей мере две активные группы (такие как указанный выше фрагмент карбоновой кислоты) для обеспечения возможности связывания с двумя праймерными соединениями, активными агентами, другим соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, линкерным соединением и комбинациями вышеуказанных соединений, обеспечивая иммобилизацию активного агента на поверхности субстрата. Подходящие активные группы в фенильном кольце тригидроксифенильной группы включают, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды, кетоны и сложные эфиры.
Линкерные соединения
[0065] Соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, могут связываться с линкерным соединением с образованием конъюгата тригидроксифенил-линкер. Соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с линкерным соединением посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно тригидроксифенильная группа связывается с линкерным соединением посредством образования ковалентной связи с линкерным соединением посредством незамещенного атома углерода тригидроксифенильной группы или посредством активной группы тригидроксифенильной группы. Активная группа тригидроксифенильной группы может представлять собой любую активную группу, способную взаимодействовать с нуклеофилом линкерного соединения. Подходящие активные группы тригидроксифенильной группы включают, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды и сложные эфиры. Активная группа тригидроксифенильной группы может связываться с линкерным соединением, например, посредством переэтерификации или переамидирования. Переэтерификацию или переамидирование можно необязательно стимулировать при помощи активирующего соединения, такого как N,N’-дициклогексилкарбодиимид (DCC), N,N’-диизопропилкарбодиимид (DIC), гидроксибензотриазол (HOBt) или 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt). Конечно, аналогично линкерному соединению, активный агент, содержащий нуклеофильную группу, может также связываться с активной группой тригидроксифенильной группы посредством переэтерификации или переамидирования.
[0066] Линкерное соединение может представлять собой любое подходящее соединение, содержащее первую концевую группу и вторую концевую группу, что обеспечивает линкерному соединению возможность связываться с активной группой и/или незамещенным атомом углерода тригидроксифенильной группы и с полимеризуемым фрагментом, с образованием полимеризуемого мономера, или связываться с активной группой и/или незамещенным атомом углерода тригидроксифенильной группы и с активным агентом, с образованием конъюгата тригидроксифенил-линкер-активный агент. Полиэтиленгликоли, диамины, диолы и дитиолы представляют собой подходящие типичные линкерные соединения. В одном из аспектов подходящие линкерные соединения включают, без ограничения, соединения формулы (I):
где n представляет собой целое число, по меньшей мере равное 1, R представляет собой любую нуклеофильную группу, включая, без ограничения, гидроксил, алкоксид, амин, нитрит, тиол, тиолят, имидазол и аминоокси, R´´ представляет собой R или активную группу, включая, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды и сложные эфиры, и каждый из R´ является одинаковым или разным и может быть выбран из группы, состоящей из H и замещенного или незамещенного низшего алкила, например, от C1 примерно до C5-алкила. При использовании водных растворов, n обычно составляет от примерно 1 до 5 (при условии, что достигается растворимость в выбранных водных системах); при использовании органических растворителей, n может составлять от примерно 1 до 10. Например, подходящие линкерные соединения могут включать, без ограничения, линейные бис-амины, содержащие первую и вторую концевые аминогруппы, такие как 1,3-диаминопропан, 1,4-диаминобутан, 1,5-диаминопентан и/или 1,6-диаминогексан.
[0067] Подходящие линкерные соединения, кроме того, включают любое соединение, содержащее две или более концевых функциональных группы, способное связываться с активной группой и/или незамещенным атомом углерода тригидроксифенильной группы, полимеризуемым фрагментом и/или активным агентом. В настоящем описании «концевой» относится к функциональной группе, завершающей любую углеродную цепь или ветвь, включая концевые группы линейных соединений, а также любые окончания ветвей разветвленных соединений. Обычно функциональные группы будут являться нуклеофилами. Нуклеофильные группы хорошо известны в данной области техники и могут включать, без ограничения, гидроксил, алкоксид, амин, нитрит, тиол, тиолят, имидазол, аминоокси и комбинации указанных групп. Например, подходящие линкерные соединения могут включать, без ограничения, разветвленные молекулы полиэтиленгликоля, каждая из ветвей которых заканчивается нуклеофильной группой (включая, без ограничения, ПЭГ-аминоокси с 8 ветвями, ПЭГ-тиол с 8 ветвями, ПЭГ-амин с 8 ветвями, ПЭГ-гидроксил с 8 ветвями, ПЭГ-аминоокси с 4 ветвями, ПЭГ-тиол с 4 ветвями, ПЭГ-амин с 4 ветвями, ПЭГ-гидроксил с 4 ветвями и подобные соединения), дитиолы, бис-амины и подобные полинуклеофилы.
[0068] Полагают, что при приведении в контакт в растворе соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и линкерного соединения, любая активная группа (группы) и/или незамещенные атомы углерода тригидроксифенильной группы могут связываться с линкерным соединением, с образованием конъюгата тригидроксифенил-линкер. Линкерное соединение адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с тригидроксифенильной группой посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно линкерное соединение связывается с тригидроксифенильной группой посредством образования одной или более ковалентных связей с тригидроксифенильной группой. Родовые конъюгаты тригидроксифенил-линкер могут быть представлены формулами (IIa), (IIb) и (IIc):
2
3
4
5
6
где X может представлять собой галоген, амин, тиол, альдегид, карбоновую кислоту, карбоксилат, ацилгалогенид, сложный эфир, акрилат, винил, C1-C10 разветвленный или линейный алкиламин, C1-C10 разветвленный или линейный алкилтиол, C1-C10 разветвленный или линейный алкилальдегид, C1-C10 разветвленную или линейную алкилкарбоновую кислоту, C1-C10 разветвленный или линейный алкилкарбоксилат, C1-C10 разветвленный или линейный алкилацилгалогенид, C1-C10 разветвленный или линейный алкил-сложный эфир или C1-C10 разветвленный или линейный алкилакрилат, и R представляет собой линкерное соединение. Что касается длины цепи углеродных цепей указанных заместителей, длина цепи обычно составляет от C1 до C5 при использовании водных растворов (при условии, что достигается растворимость в выбранных водных системах); при использовании органических растворителей длина цепи может составлять от C1 до C10. Согласно соединениям (IIa), (IIb) и (IIc) три гидроксильные группы могут быть обеспечены в любых трех положениях из C, C, C, C и C. Например, когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой карбоновую кислоту, такую как галловая кислота (то есть X представляет собой карбоксил), конъюгат тригидроксифенил-линкер может иметь формулу (IIa) или формулу (IIb):
3
4
5
2
6
в которой, как выше, R представляет собой линкерное соединение. Кроме того, когда конъюгат тригидроксифенил-линкер представляет собой конъюгат галловая кислота-линкер согласно (IIa) и (IIb), три гидроксильные группы обеспечены в положениях C, C и C, и линкер R обеспечен на карбоксильной группе (IIa) или в одном из положений C или C(IIb). Когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой пирогаллол, конъюгат пирогаллол-линкер может иметь формулу (IIc):
3
4
5
6
где R представляет собой линкерное соединение и три гидроксильные группы могут быть обеспечены в любых трех последовательных положениях из C, C, C и C.
[0069] Линкерное соединение может связываться с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, до приведения в контакт обработанного праймером субстрата с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу. Как вариант, обработанный тригидроксифенилом обработанный праймером субстрат может вступать в контакт с раствором линкерного соединения, благодаря чему осуществляется связывание линкерного соединения с тригидроксифенильной группой. Линкерное соединение также может связываться с праймерным соединением (которое уже связано с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу), например, посредством связывания с восстанавливающим концом олигосахарида. Концевая группа линкера, расположенная вдали от тригидроксифенильной группы, может связываться с активным агентом, с образованием конъюгата тригидроксифенил-линкер-активный агент, или с полимеризуемым фрагментом, с образованием полимеризуемого мономера.
Полимеризуемые мономеры/полимеры, содержащие боковые тригидроксифенильные группы
[0070] В тех вариантах реализации, в которых соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой полимер, указанный полимер может включать по меньшей мере один мономер, содержащий боковую тригидроксифенильную группу. Полимер, содержащий боковую тригидроксифенильную группу, может быть получен полимеризацией полимеризуемых мономеров, полученных из низкомолекулярного соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, которое было модифицировано для включения линкерного соединения, включающего полимеризуемый фрагмент.
[0071] Полимеризуемый мономер можно получить путем связывания полимеризуемого фрагмента с конъюгатом тригидроксифенил-линкер. Конъюгат тригидроксифенил-линкер включает концевую группу линкера, расположенную вдали от тригидроксифенильной группы. Расположенная вдали концевая группа линкера может образовывать ковалентную связь с полимеризуемым фрагментом.
[0072] В общем случае, полимеризуемый фрагмент может представлять собой любую функциональную группу, содержащую полимеризуемую α,β-ненасыщенную концевую группу. Подходящие полимеризуемые фрагменты включают, без ограничения, акрилат, метакрилат, акриламид, метакриламид, винилацетат и сложные эфиры вышеуказанных соединений. Ковалентная связь между линкерным соединением и полимеризуемым фрагментом может образовываться посредством переэтерификации или переамидирования, и может стимулироваться присутствием активирующего соединения, такого как N,N’-дициклогексилкарбодиимид (DCC), N,N’-диизопропилкарбодиимид (DIC), гидроксибензотриазол (HOBt) или 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt).
[0073] В некоторых вариантах реализации полимеризуемый мономер, содержащий тригидроксифенильную группу, также может быть получен посредством связывания активной группы и/или незамещенного атома углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы с линкерным соединением, содержащим первую концевую группу и вторую концевую группу, причем первая концевая группа представляет собой нуклеофильную группу, а вторая концевая группа является полимеризуемой α,β-ненасыщенной концевой группой. Подходящие линкерные соединения согласно указанному варианту реализации включают, без ограничения, 2-гидроксиэтилакрилат, 2-гидроксиэтилметакрилат, 3-гидроксипропилакрилат, 3-гидроксипропилметакрилат, 4-гидроксибутилакрилат, 4-гидроксибутилметакрилат, 6-гидроксигексилакрилат, 6-гидроксигексилметакрилат, N-(3-гидроксипропил)-метакриламид, N-(4-гидроксибутил)-акриламид, N-(4-гидроксибутил)-метакриламид, N-(6-гидроксигексил)-акриламид, N-(6-гидроксигексил)-метакриламид, N-метил-N-(2-гидроксиэтил)-акриламид, N-метил-N-(2-гидроксиэтил)-метакриламид, N-метил-N-(3-гидроксипропил)-акриламид, N-метил-N-(3-гидроксипропил)-метакриламид, N-метил-N-(4-гидроксибутил)-акриламид, N-метил-N-(4-гидроксибутил)-метакриламид, N-метил-N-(6-гидроксигексил)-акриламид, N-метил-N-(6-гидроксигексил)-метакриламид и 4-аминобутилакриламид. В общем случае, подходящие линкерные соединения согласно указанному варианту реализации могут включать, без ограничения, соединения формулы (III):
2
где n представляет собой 0 или целое число, равное по меньшей мере 1, R представляет собой любую нуклеофильную группу, включая, без ограничения, гидроксил, алкоксид, амин, нитрит, тиол и тиолят, и R’ может быть выбран из группы, состоящей из кислорода, NR´´ и CR´´, и каждый R´´ сможет быть одинаковым или разным и может быть выбран из группы, состоящей из H и замещенного или незамещенного низшего алкила, например, от C1 до примерно C5-алкила.
[0074] Родовые полимеризуемые мономеры, содержащие тригидроксифенильную группу, представлены формулами (IVa), (IVb) и (VIc):
2
3
4
5
6
X может представлять собой галоген, амин, тиол, альдегид, карбоновую кислоту, карбоксилат, ацилгалогенид, сложный эфир, акрилат, винил, C1-C10 разветвленный или линейный алкиламин, C1-C10 разветвленный или линейный алкилтиол, C1-C10 разветвленный или линейный алкилальдегид, C1-C10 разветвленную или линейную алкилкарбоновую кислоту, C1-C10 разветвленный или линейный алкилкарбоксилат, C1-C10 разветвленный или линейный алкилацилгалогенид, C1-C10 разветвленный или линейный алкил-сложный эфир или C1-C10 разветвленный или линейный алкилакрилат, Y может представлять собой полимеризуемый фрагмент, такой как акрилат, метакрилат, акриламид, метакриламид, винилацетат и сложные эфиры указанных соединений, и R представляет собой линкерное соединение. Что касается длины цепи углеродных цепей указанных заместителей, длина цепи обычно составляет от C1 до C5 при использовании водных растворов (при условии, что достигается растворимость в выбранных водных системах); при использовании органических растворителей длина цепи может составлять от C1 до C10. Согласно соединениям (IVa), (IVb) и (IVc) три гидроксильные группы могут быть обеспечены в любых трех положениях из C, C, C, C и C. Например, когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой карбоновую кислоту, такую как галловая кислота (то есть X представляет собой карбоксил), полимеризуемый мономер, содержащий тригидроксифенильную группу, может иметь формулу (IIa) или формулу (IIb):
3
4
5
2
6
где R представляет собой линкерное соединение и Y представляет собой полимеризуемый фрагмент. Кроме того, когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой галловую кислоту, полимеризуемый мономер согласно (IVa) и (IVb) содержит три гидроксильные группы в положениях C, C и C, и линкер R обеспечен на карбоксильной группе (IVa) или в одном из положений C или C(IVb). Когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой пирогаллол, полимеризуемый мономер может иметь формулу (IVc):
3
4
5
6
[0075] где R представляет собой линкерное соединение, Y представляет собой полимеризуемый фрагмент и три гидроксильные группы могут быть обеспечены в любых трех последовательных положениях из C, C, C и C.
[0076] Полимеризуемый мономер, содержащий тригидроксифенильную группу, полимеризуется с образованием гомополимера или сополимеризуется с одним или более дополнительными полимеризуемыми мономерами (включая полимеризуемые группы) с образованием полимера, содержащего по меньшей мере один мономер с боковой тригидроксифенильной группой. Сополимеры, содержащие боковую тригидроксифенильную группу и один или более дополнительных полимеризуемых мономеров могут полимеризоваться с образованием статистических сополимеров и/или блок-сополимеров, как известно в данной области техники. Подходящие дополнительные полимеризуемые мономеры могут представлять собой любой мономер, содержащий полимеризуемый фрагмент. Как вариант, дополнительные полимеризуемые мономеры могут содержать боковую активную группу (т.е. активную группу, которая будке находиться в боковой цепи полимера после полимеризации), включая, без ограничения, N-гидроксисукцинимид, сукцинимид и подобные соединения, благодаря чему, когда дополнительный мономер включен в полимер, содержащий по меньшей мере один мономер с боковой тригидроксифенильной группой, боковая активная группа может связываться с активным агентом с образованием конъюгата активный агент- тригидроксифенил, или боковая активная группа может связываться с субстратом, с образованием обработанного тригидроксифенилом субстрата.
[0077] Подходящие свободно-радикальные инициаторы для инициирования полимеризации полимеризуемого мономера, содержащего тригидроксифенильную группу, и, необязательно, дополнительного мономера, включают, без ограничения, азосоединения, органические пероксиды, и комбинации указанных соединений. Подходящие азосоединения включают, без ограничения, азобисизобутиронитрил (AIBN) и 1,1-азобис-(циклогексанкарбонитрил) (ABCN). Подходящие органические пероксиды включают, без ограничения, циклические пероксиды, диацилпероксиды, диалкилпероксиды, гидропероксиды, пероксикарбонаты, пероксидикарбонаты, перокси-сложные эфиры и пероксикетали. Подходящие циклические пероксиды включают, без ограничения, 3,6,9-триэтил-3,6,9-триметил-1,4,7-трипероксононан. Подходящие диацилпероксиды включают, без ограничения, ди-(3,5,5-триметилгексаноил)-пероксид. Подходящие диалкилпероксиды включают, без ограничения, 2,5-диметил-2,5-ди-(трет-бутилперокси)-гексан; 2,5-диметил-2,5-ди-(трет-бутилперокси)-гексин-3; ди-трет-амилпероксид; ди-трет-бутилпероксид; и трет-бутил-кумилпероксид. Подходящие гидропероксиды включают, без ограничения, трет-амилгидропероксид; и 1,1,3,3-тетраметилбутилгидропероксид. Подходящие пероксикарбонаты включают, без ограничения, трет-бутил-перокси-2-этилгексилкарбонат; трет-амил-перокси-2-этилгексилкарбонат; и трет-бутил-перокси-изопропилкарбонат. Подходящие пероксидикарбонаты включают, без ограничения, ди-(2-этилгексил)-пероксидикарбонаты; и ди-втор-бутил-пероксидикарбонаты. Подходящие перокси-сложные эфиры включают, без ограничения, трет-амил-перокси-2-этилгексаноат; трет-амил-перокси-неодеканоат; трет-амил-перокси-пивалат; трет-амил-перокси-бензоат; трет-амил-перокси-ацетат; 2,5-диметил-2,5-ди-(2-этилгексаноилперокси)-гексан; трет-бутил-перокси-2-этилгексаноат; трет-бутил-перокси-неодеканоат; трет-бутил-перокси-неогептаноат; трет-бутил-перокси-пивалат, трет-бутил-перокси-диэтилацетат; трет-бутил-перокси-изобутират; 1,1,3,3-тетраметилбутил-перокси-2-этилгексаноат; 1,1,3,3-тетраметилбутил-перокси-неодеканоат; 1,1,3,3-тетраметилбутил-перокси-пивалат; трет-бутил-перокси-3,5,5-триметилгексаноат; кумил-перокси-неодеканоат; трет-бутил-перокси-бензоат; и трет-бутил-перокси-ацетат. Подходящие пероксикетали включают, без ограничения, 1,1-ди-(трет-амил-перокси)-циклогексан; 1,1-ди-(трет-бутил-перокси)-циклогексан; 1,1-ди-(трет-бутил-перокси)-3,3,5-триметилциклогексан; и 2,2-ди-(трет-бутил-перокси)-бутан.
[0078] Необязательный дополнительный мономер можно включать в сополимер с мономером, содержащим тригидроксифенильную группу, в количестве до примерно 95% мол., например, от примерно 0,5 до примерно 95% мол., от примерно 0,5 до примерно 90% мол., от примерно 1 до примерно 90% мол., от примерно 1 до примерно 85% мол., от примерно 5 до примерно 85% мол., от примерно 5 до примерно 80% мол., от примерно 10 до примерно 80% мол., от примерно 10 до примерно 75% мол., от примерно 15 до примерно 75% мол., от примерно 5 до примерно 70% мол., от примерно 10 до примерно 70% мол., от примерно 15 до примерно 70% мол., от примерно 15 до примерно 65% мол., от примерно 20 до примерно 65% мол., от примерно 20 до примерно 60% мол., от примерно 25 до примерно 60% мол., от примерно 25 до примерно 55% мол., от примерно 30 до примерно 55% мол., от примерно 30 до примерно 50% мол., от примерно 35 до примерно 50% мол., от примерно 35 до примерно 45% мол. и/или от примерно 35 до примерно 40% мол.
[0079] Полимеры, содержащие боковую тригидроксифенильную группу, могут содержать концевую активную группу, посредством которой активный агент может связываться с полимером. Активная группа может представлять собой любую активную группу, описанную ранее, включают, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды и сложные эфиры. Активная группа может быть включена в соединение, действующее как агент передачи цепи при полимеризации. Подходящие агенты передачи цепи с активными группами могут включать, без ограничения, 3-меркаптопропионовую кислоту, изооктил-3-меркаптопропионат и комбинации вышеуказанных соединений. Как вариант, активный агент будет связываться с полимером через незамещенный атом углерода боковых тригидроксифенильных групп, и, следовательно, нет необходимости, чтобы полимер содержал концевую группу, способную связываться с активным агентом.
[0080] Как описано выше, соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, представляющие собой полимеры, содержащие по меньшей мере один мономер с боковой тригидроксифенильной группой, могут дополнительно связываться с линкерным соединением, с образованием конъюгата тригидроксифенил-линкер, который может связываться с активным агентом. Линкерное соединение адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с тригидроксифенильной группой посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно линкерное соединение связывается с тригидроксифенильной группой посредством образования одной или более ковалентных связей с незамещенными атомами углерода тригидроксифенильной группы.
Полимеры, содержащие тригидроксифенильную группу в главной цепи
[0081] В альтернативных вариантах реализации, когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой полимер, тригидроксифенильная группа может находиться в главной цепи полимера. Полимер, содержащий тригидроксифенильные группы в главной цепи, может быть получен полимеризацией низкомолекулярного соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, несущую по меньшей мере два активных центра. Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что низкомолекулярные соединения, содержащие тригидроксифенильную группу, могут подвергаться самополимеризации из хиноноподобных соединений, показанных ниже, посредством образования ковалентных связей между незамещенными атомами углерода в фенильных кольцах двух или более соседних тригидроксифенильных групп.
[0082] Тригидроксифенильные группы соединений, содержащих тригидроксифенильную группу, согласно настоящему изобретению, в общем случае, как считают, в растворе находятся в зависящем от величины pH равновесии с хиноноподобными соединениями. Например, равновесие между галловой кислотой (Соединение A) и хиноноподобными соединениями (Соединение B) показано ниже. Полагают, что равновесие смещается в сторону тригидроксилированных соединений, соединение A, при более кислотных величинах pH.
[0083] После рпиведения в контакт соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, с праймерным слоем, тригидроксифенильная группа может ковалентно связываться с активным фрагментом, присутствующим в/на/внутри слоя праймерного соединения посредством незамещенного атома углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы, с образованием обработанного тригидроксифенилом субстрата.
in situ
[0084] Низкомолекулярное соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может также подвергаться самополимеризации  с образованием полимеров, содержащих повторяющиеся звенья тригидроксифенильной группы в главной цепи полимера. Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что тригидроксифенильная группа может подвергаться самополимеризации из хиноноподобных соединений посредством образования ковалентных связей между незамещенными атомами углерода в фенильных кольцах двух или более соседних тригидроксифенильных групп. Следовательно, в одном из вариантов реализации, незамещенный атом углерода фенильного кольца, с которым может связываться активный агент, может представлять собой концевую тригидроксифенильную группу полимерной цепи, связанной с поверхностью субстрата.
[0085] Кроме того, когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой полимер, содержащий боковые тригидроксифенильные группы, полагают, что незамещенные атомы углерода фенильных колец боковых тригидроксифенильных групп могут подвергаться внутримолекулярному поперечному сшиванию, если находятся в тесной близости с другими боковыми тригидроксифенильными группами полимерной цепи, или могут осуществлять поперечное сшивание множества полимерных цепей.
[0086] Кроме того, полагают, что при воздействии на обработанный тригидроксифенилом обработанный праймером субстрат раствора активного агента, любые свободные центры связывания тригидроксифенильной группы, или связанных с ней линкерных соединений, могут связываться с активным агентом, благодаря чему осуществляется иммобилизация активного агента на поверхности субстрата. Активный агент адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с тригидроксифенильной группой посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно активный агент связывается с тригидроксифенильной группой (которая в свою очередь связана со слоем праймерного соединения) посредством образования одной или более ковалентных связей с тригидроксифенильной группой. Полагают, что тригидроксифенильная группа может связываться с реакционноспособной группой активного агента посредством незамещенного атома углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы. Кроме того, полагают, что когда реакционноспособная группа активного агента представляет собой нуклеофил, ковалентная связь между незамещенным атомом углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы и реакционноспособной группой активного агента может образовываться по механизму присоединения Михаэля. Как показано в примере с гепарином ниже, активный агент связывается с тригидроксифенильной группой посредством нуклеофила в молекуле активного агента, который ковалентно связывается с незамещенным атомом углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы. Другие активные агенты с необходимостью содержат аналогичные нуклеофильные группы, как описано ниже, и следовательно будут связываться с тригидроксифенильной группой аналогично гепарину.
[0087] Активный агент адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с тригидроксифенильной группой посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно активный агент связывается с линкером, связанным с тригидроксифенильной группой (которая, в свою очередь, связана со слоем праймерного соединения) посредством образования одной или более ковалентных связей с активной концевой группой. Если активная группа линкерного соединения, которая будет связываться с активным агентом, представляет собой активную группу, включающую, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды и сложные эфиры, полагают, что линкер связывается с активным агентом посредством активной группы линкера и нуклеофильной группы активного агента. Кроме того, полагают, что если активная группа линкера, которая будет связываться с активным агентом, представляет собой нуклеофил, линкер может связываться с восстанавливающим концом активного агента, включая, без ограничения, гепарин, хитозан, четвертичный хитозан и т.д., посредством активной группы линкерного соединения.
Связывание соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, с обработанным праймером субстратом.
[0088] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, связывается с обработанной праймером поверхностью субстрата посредством приведения в контакт обработанной праймером поверхности субстрата с раствором соединения, содержащего тригидроксифенильную группу. Обработанный праймером субстрат можно полностью погружать в раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, например, посредством нанесения покрытия окунанием. Как вариант, раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, можно распылять или наливать на обработанный праймером субстрат, например, посредством центробежного литья или распыления раствора, такого как раствор в форме аэрозоля. Для субстратов, имеющих внутренний просвет, таких как трубки, раствор можно пропускать во внутренний просвет для покрытия внутренней части субстрата. Растворитель может представлять собой любой растворитель, способный служить носителем соединения, содержащего тригидроксифенильную группу. Например, чаще всего используют воду, но можно применять другие растворители, включая, без ограничения, спирты, диолы, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, галогенуглероды, такие как хлороформ и дихлорметан, и комбинации вышеуказанных растворителей. В вариантах реализации способов согласно настоящему описанию раствор, содержащий соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, имеет величину pH в диапазоне от примерно 7,5 до примерно 9,5, от примерно 8 до примерно 9 и/или примерно 8,5, благодаря чему равновесие не смещается в указанном выше направлении. Раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, может дополнительно содержать буферное соединение для поддержания величины pH в указанных выше диапазонах, включая, без ограничения, N,N-бис-(2-гидроксиэтил)-глицин (Бицин), 3-{[трис-(гидроксиметил)-метил]-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS), трис-(гидроксиметил)-метиламин (Трис), N-трис-(гидроксиметил)-метилглицин (Трицин) и комбинации вышеуказанных соединений. Конечно, можно также применять одну или более из цитратных, карбонатных, лактатных, фосфатных и других известных буферных систем. Конечно, можно также применять одну или более из карбонатных, фосфатных и других известных буферных систем для поддержания относительно высоких величин pH.
in situ
[0089] Концентрация соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, в растворе может в общем случае представлять собой любую концентрацию. Концентрацию обычно выбирают так, чтобы соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, было полностью растворимо в выбранном растворителе, без образования насыщенного раствора соединения, содержащего тригидроксифенильную группу. Кроме того, поскольку соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может подвергаться самополимеризации , концентрацию соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, обычно выбирают таким образом, чтобы соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, связывалось с обработанным праймером субстратом с приемлемой скоростью, желательно без излишней самополимеризации или поперечного сшивания, и, следовательно, гелеобразования в растворе. Примеры концентраций соединений, содержащих тригидроксифенильную группу, могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 60 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл и/или от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл и/или примерно 5 мг/мл.
[0090] Обработанный праймером субстрат может вступать в контакт и/или быть погружен в раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, в течение любого времени, подходящего для связывания соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, с обработанным праймером субстратом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, продолжительность контакта может представлять собой любую продолжительность, подходящую для создания сетчатой структуры праймерного соединения и соединения, содержащего тригидроксифенильную группу. Скорость осаждения соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, на обработанный праймером субстрат, может зависеть, в частности, от концентрации соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, в растворе указанного соединения, отношения поверхности субстрата к объему раствора, ионной силы раствора, величины pH раствора и температуры. Продолжительность контакта обработанного праймером субстрата с раствором соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, может варьироваться в течение любого подходящего промежутка времени для связывания соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, с обработанным праймером субстратом, например, при использовании нанесения покрытия окунанием, от примерно 10 секунд до примерно 24 часов. Если продолжительность контакта обработанного праймером субстрата с раствором соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, увеличивают свыше 24 часов (и используют одну из вышеуказанных примеров концентраций соединения, содержащего тригидроксифенильную группу), ожидается незначительное различие в количестве соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, вступившего в реакцию с праймерным соединением (по сравнению с 24-часовым временем воздействия). Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что, несмотря на то, что спустя 24 часа соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может продолжать связываться с обработанным праймером субстратом, ожидают, что количество соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, обеспеченного после 24 часов, будет оказывать незначительное влияние на количество активного агента, который в итоге иммобилизуется на поверхности субстрата, и, кроме того, полагают, что вероятность самополимеризации соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, в растворе, даже при низких концентрациях, возрастает со временем.
[0091] В вариантах реализации настоящего изобретения, в которых соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, включает конъюгат тригидроксифенил-линкер, конъюгат тригидроксифенил-линкер первоначально образуется посредством связывания тригидроксифенильной группы низкомолекулярного или полимерного соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, с нуклеофилом линкерного соединения через незамещенный атом углерода или активную группу фенильного кольца тригидроксифенильной группы, за которым обычно следует приведение в контакт субстрата с раствором конъюгата тригидроксифенил-линкер. Конъюгат тригидроксифенил-линкер может быть образован путем объединения в растворе соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и линкерного соединения. Раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и/или линкерного соединения может быть приготовлен в любом растворителе, способном служить носителем соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и/или линкерного соединения. Например, чаще всего используют воду, но можно применять другие растворители, включая, без ограничения, спирты, диолы, сераорганические соединения, такие как сульфолан, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, алканы, ароматические соединения, галогенуглероды, такие как хлороформ и дихлорметан, и комбинации вышеуказанных растворителей.
[0092] В усовершенствованиях вышеуказанного варианта реализации растворы соединений, содержащих тригидроксифенильную группу, и линкерных соединений, находятся при pH в диапазоне от примерно 7,5 до примерно 9,5, или от примерно 8 до примерно 9, или примерно 8,5. Раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и/или раствор линкерного соединения могут дополнительно содержать буферное соединение для поддержания величины pH в указанных выше диапазонах, включая, без ограничения, N,N-бис-(2-гидроксиэтил)-глицин (Бицин), 3-[трис-(гидроксиметил)-метил]-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS), трис-(гидроксиметил)-метиламин (Трис) и N-трис-(гидроксиметил)-метилглицин (Трицин). Конечно, можно также применять одну или более из карбонатных, фосфатных и других известных буферных систем.
[0093] Концентрации соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и линкерного соединения, в растворе могут в общем случае представлять собой любые концентрации. Концентрации обычно выбирают так, чтобы соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, и/или линкерное соединение были полностью растворимы в выбранном растворителе, без образования насыщенных растворов. Примеры концентраций соединений, содержащих тригидроксифенильную группу, и/или линкерных соединений могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 60 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл и/или от примерно 0,05 до примерно 3 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 1,5 мг/мл и/или примерно 3 мг/мл. Отношение соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, к линкерному соединению может находиться в диапазоне от примерно 1:8 до примерно 8:1, от примерно 1:7 до примерно 7:1, от примерно 1:6 до примерно 6:1, от примерно 1:5 до примерно 5:1, от примерно 1:4 до примерно 4:1, от примерно 1:3 до примерно 3:1 и/или от примерно 1:2 до примерно 2:1, например, примерно 1:1.
[0094] Конъюгат тригидроксифенил-линкер может связываться с обработанным праймером субстратом путем приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата тригидроксифенил-линкер. Обработанный праймером субстрат можно полностью погружать в раствор конъюгата тригидроксифенил-линкер, например, посредством нанесения покрытия окунанием. Как вариант, раствор конъюгата тригидроксифенил-линкер, можно распылять или наливать на обработанный праймером субстрат, например, посредством центробежного литья или распыления раствора, такого как раствор в форме аэрозоля. Для субстратов, имеющих внутренний просвет, таких как трубки, раствор можно пропускать во внутренний просвет для покрытия внутренней части субстрата.
[0095] Концентрация конъюгата тригидроксифенил-линкер в растворе может в общем случае представлять собой любую концентрацию. Концентрацию конъюгата тригидроксифенил-линкер обычно выбирают так, чтобы конъюгат тригидроксифенил-линкер был полностью растворим в выбранном растворителе, без образования насыщенного раствора. Примеры концентраций конъюгата тригидроксифенил-линкер могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 60 мг/мл, примерно от 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл и/или от примерно 0,05 до примерно 3 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 1,5 мг/мл и/или примерно 3 мг/мл.
[0096] Обработанный праймером субстрат может вступать в контакт и/или быть погружен в раствор конъюгата тригидроксифенил-линкер в течение любого времени, подходящего для связывания конъюгата тригидроксифенил-линкер с обработанным праймером субстратом. Полагают, что конъюгат тригидроксифенил-линкер может связываться с обработанным праймером субстратом посредством концевой группы линкерного соединения, расположенной вдали от тригидроксифенильной группы, и любых оставшихся активных групп тригидроксифенильной группы, или обеих указанных групп. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, продолжительность контакта может представлять собой любую продолжительность, подходящую для создания ковалентной связи между одной или более групп линкера и тригидроксифенила и активным фрагментом (при наличии) на обработанной праймером поверхности субстрата. Скорость связывания конъюгата тригидроксифенил-линкер с обработанным праймером субстратом, может зависеть, в частности, от концентрации конъюгата тригидроксифенил-линкер в растворе, отношения поверхности субстрата к объему раствора, ионной силы раствора, величины pH раствора и температуры. Продолжительность контакта обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата тригидроксифенил-линкер может варьироваться в течение любого подходящего промежутка времени для связывания конъюгата тригидроксифенил-линкер с обработанным праймером субстратом, например, при использовании нанесения покрытия окунанием, от примерно 10 секунд до примерно 24 часов. Если продолжительность контакта обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата тригидроксифенил-линкер увеличивают свыше 24 часов (и используют одну из вышеуказанных примеров концентраций конъюгата тригидроксифенил-линкер), ожидается незначительное различие в количестве конъюгата тригидроксифенил-линкер, связанного с обработанной праймером поверхностью субстрата (по сравнению с 24-часовым временем воздействия). Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что, несмотря на то, что спустя 24 часа конъюгат тригидроксифенил-линкер может продолжать связываться с обработанным праймером субстратом, ожидают, что количество конъюгата тригидроксифенил-линкер, обеспеченного после 24 часов, будет оказывать незначительное влияние на количество активного агента, который в итоге иммобилизуется на поверхности субстрата, и, кроме того, полагают, что вероятность самополимеризации или поперечного сшивания тригидроксифенильной группы, и, следовательно, гелеобразования в растворе, даже при низких концентрациях, возрастает со временем.
Активные агенты
[0097] Активный агент может включать, без ограничения, антимикробные агенты, такие как антибактериальные агенты, противообрастающие агенты, противовоспалительные агенты, такие как ингибиторы комплемента, включая, без ограничения, ингибиторы C1, например, экулизумаб (eculizumab) и ингибиторы C5, антитромботические агенты, такие как антикоагулирующие агенты, и комбинации указанных агентов. Например, активный агент может включать, без ограничения, хитозан, декстран, линейный полиэтиленгликоль (ПЭГ), петлеобразный полиэтиленгликоль (ПЭГ), производные полиэтиленгликоля, включая, без ограничения, ПЭГ с тиольными концевыми группами, ПЭГ с концевыми группами N-гидроксисукцинимида (NHS) и ПЭГ с аминными концевыми группами, поли-(N-винилпирролидон) (ПВП) и производные ПВП, включая, без ограничения, ПВП с тиольными концевыми группами, ПВП с аминными концевыми группам и ПВП с карбоксильными концевыми группами, гепарин, фракционированный гепарин и нефракционированный гепарин, и производные гепарина, включая, без ограничения, эноксапарин (enoxaparin), дальтепарин (dalteparin) и тинзапарин (tinzaparin), четвертичные аммониевые полимеры, альбумин, полиэтиленимин, производные 4-гидроксикумарина, такие как варфарин, куматетралил (coumatetralyl), фенпрокумон (phenprocoumon), аценокумарол (acenocoumarol), дикумарол, тиокумарол и бродифакум (brodifacoum), и комбинации вышеуказанных соединений. В вариантах реализации, включающих полиэтиленгликоль, хитозан или гепарин, молекулярная масса может находиться в диапазоне от примерно 500 Да до примерно 1000000 Да, или от примерно 1000 Да до примерно 500000 Да, примерно от 2000 Да до примерно 500000 Да, от примерно 2000 Да до примерно 250000 Да и/или от примерно 2000 Да до примерно 100000 Да. В общем случае, активный агент содержит функциональную группу. Подходящие функциональные группы включают, без ограничения, нуклеофильные группы. Нуклеофильные группы хорошо известны в данной области техники и могут включать, без ограничения, гидроксил, алкоксид, амин, нитрит, тиол, тиолят, имидазол и комбинации указанных групп. Нуклеофильные группы хитозана включают аминную и гидроксильную группы; нуклеофильные группы ПЭГ и/или производных ПЭГ включают гидроксильные группы, тиольные группы, аминные группы; активные группы производных ПВП включают карбоксильные группы, тиольные группы, аминные группы; нуклеофильные группы гепарина и производных гепарина включают гидроксил, карбоксилат и сульфат. Производные ПВП с тиольными, аминными и карбоксильными концевыми группами могут быть получены посредством обрыва полимеризации ПВП при помощи соответствующих агентов передачи цепи, таких как, например, меркаптоуксусная кислота или меркаптоэтиламин, или путем дополнительного получения производных ПВП с карбоксильными концевыми группами, такого как, например, путем взаимодействия ПВП с карбоксильными концевыми группами с цистеамином, с последующим введением восстановительного агента, такого как трис-(2-карбоксиэтил)-фосфин (TCEP) или дитиотреитол (DTT).
[0098] Полагают, что при воздействии активного агента на обработанный тригидроксифенилом субстрат любые активные центры, доступные в тригидроксифенильной группе (т.е. активные группы и/или незамещенные атомы углерода) или связанном с ней линкерном соединении, могут связываться с активным агентом, таким образом, иммобилизуя активный агент на поверхности субстрата. Активный агент адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с тригидроксифенильной группой посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно активный агент связывается с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, посредством образования одной или более ковалентных связей с незамещенным атомом углерода тригидроксифенильной группы или посредством активной группы тригидроксифенильной группы. Активная группа тригидроксифенильной группы может представлять собой любую активную группу, которая может взаимодействовать с нуклеофилом в активном агенте. Подходящие активные группы тригидроксифенильной группы включают, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды и сложные эфиры. Активная группа тригидроксифенильной группы может связываться с линкерным соединением, например, посредством переэтерификации или переамидирования. Переэтерификацию или переамидирование можно необязательно стимулировать при помощи активирующего соединения, такого как N,N’-дициклогексилкарбодиимид (DCC), N,N’-диизопропилкарбодиимид (DIC), гидроксибензотриазол (HOBt) или 1-гидрокси-7-азабензотриазол (HOAt). В тех вариантах реализации, в которых ковалентная связь образуется между активным агентом и незамещенным атомом углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы, полагают, что ковалентная связь может образовываться по механизму присоединения Михаэля. Например, активный агент хитозан может связываться с тригидроксифенильной группой посредством гидроксильной или аминной группы активного агента, которая образует ковалентную связь с незамещенным атомом углерода фенильного кольца тригидроксифенильной группы. Другие подходящие активные агенты с необходимостью содержат аналогичную нуклеофильную группу и, следовательно, могут связываться с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, аналогично хитозану.
[0099] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения активный агент связывается с обработанной тригидроксифенилом обработанной праймером поверхностью субстрата путем приведения в контакт обработанной тригидроксифенилом обработанной праймером поверхности субстрата с активным агентом. Активный агент может быть обеспечен в растворе или, если активный агент представляет собой жидкость, активный агент может быть обеспечен в чистом виде. Обработанный тригидроксифенилом обработанный праймером субстрат можно полностью погружать в раствор активного агента, например, посредством нанесения покрытия окунанием. Как вариант, раствор праймерного соединения можно распылять или наливать на обработанный тригидроксифенилом обработанный праймером субстрат, например, посредством центробежного литья или распыления раствора, такого как раствор в форме аэрозоля. Для субстратов, имеющих внутренний просвет, таких как трубки, раствор можно пропускать во внутренний просвет для покрытия внутренней части субстрата.
[0100] Растворитель активного агента может представлять собой любой растворитель, способный служить носителем активного агента. Например, чаще всего используют воду, но можно применять другие растворители, включая, без ограничения, спирты, диолы, сераорганические соединения, такие как сульфолан, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, галогенуглероды, такие как хлороформ и дихлорметан, и комбинации вышеуказанных растворителей. В вариантах реализации способов согласно настоящему описанию раствор активного агента имеет величину pH в диапазоне от примерно 5,5 до примерно 8,5, или от примерно 6 до примерно 8 и/или примерно 7,5, во время связывания активного агента с тригидроксифенильной группой или с линкерным соединением. Раствор активного агента может дополнительно содержать буферное соединение для поддержания величины pH в указанных выше диапазонах, как хорошо известно в данной области техники. Подходящие буферные соединения для поддержания указанных величин pH включают, без ограничения, N,N-бис-(2-гидроксиэтил)-глицин (Бицин), 3-{[трис-(гидроксиметил)-метил]-амино}-пропансульфоновую кислоту (TAPS), трис-(гидроксиметил)-метиламин (Трис), 4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES) и N-трис-(гидроксиметил)-метилглицин (Трицин). Конечно, можно также применять одну или более из карбонатных, фосфатных и других известных буферных систем для поддержания относительно высоких величин pH.
[0101] В альтернативных вариантах реализации обработанный тригидроксифенилом обработанный праймером субстрат может вступать в контакт с растворами активных агентов, имеющими меньшие величины pH. Например, раствор активного агента может иметь величину pH в диапазоне от примерно 4 примерно до 5,5, например, примерно 4,0, примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8, примерно 4,9, примерно 5, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, и/или примерно 5,5 при связывании активного агента с тригидроксифенильной группой или с линкерным соединением. Подходящие активные агенты для связывания при более низких pH включают, без ограничения, гепарин и хитозан. Раствор активного агента может дополнительно содержать буферное соединение для поддержания величины pH в указанных выше диапазонах, как хорошо известно в данной области техники. Подходящие буферные системы для указанных величин pH включают одну или более из ацетатных, цитратных, лактатных, фосфатных и других известных буферных систем, которые также можно применять.
[0102] Концентрация активного агента в растворе активного агента может в общем случае представлять собой любую концентрацию. Концентрацию активного агента обычно выбирают так, чтобы активный агент был полностью растворим в выбранном растворителе, без образования насыщенного раствора активного агента. Большие концентрации в целом предпочтительны для снижения времени, необходимого для связывания активного агента с тригидроксифенильной группой. Примеры концентраций активного агента могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 60 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл и/или от примерно 0,05 до примерно 3 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 1,5 мг/мл и/или примерно 3 мг/мл.
[0103] Обработанный тригидроксифенилом обработанный праймером субстрат может вступать в контакт и/или быть погружен в активный агент или в раствор активного агента в течение любого времени, подходящего для связывания активного агента и тригидроксифенильной группы обработанного тригидроксифенилом субстрата. Скорость связывания активного агента с обработанным тригидроксифенилом обработанным праймером субстратом может зависеть, в частности, от концентрации активного агента в растворе активного агента, отношения поверхности субстрата к объему раствора, ионной силы раствора и температуры. Продолжительность контакта обработанного тригидроксифенилом субстрата с активным агентом или с раствором активного агента может варьироваться в течение любого подходящего промежутка времени для обеспечения слоя на субстрате, например, при использовании нанесения покрытия окунанием, от примерно 10 секунд до примерно 24 часов. Если продолжительность контакта обработанного тригидроксифенилом субстрата с раствором активного агента увеличивают свыше 24 часов (и используют одну из вышеуказанных примеров концентраций активного агента), ожидается незначительное различие в количестве активного агента, иммобилизованного на поверхности субстрата (по сравнению с 24-часовым временем воздействия). Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что, несмотря на то, что спустя 24 часа активный агент может продолжать иммобилизовываться на обработанном тригидроксифенилом обработанном праймером субстрате, ожидают, что количество активного агента, иммобилизованного после 24 часов, будет оказывать незначительное влияние на активность (антибактериальную, антимикробную и т.д.) полученного субстрата, на поверхности которого иммобилизован активный агент.
[0104] В тех вариантах реализации настоящего изобретения, в которых соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, включает конъюгат тригидроксифенил-линкер, активный агент может адсорбироваться на/прилипать к/связываться с/ассоциироваться с линкерным соединением, связанным с тригидроксифенильной группой, посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Обычно активный агент связывается с линкером, который связан с тригидроксифенильной группой, посредством образования одной или более ковалентных связей с концевой группой линкерного соединения, расположенной вдалеке от тригидроксифенильной группы. Если группа линкерного соединения, которая будет связываться с активным агентом, представляет собой активную группу, включая, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды и сложные эфиры, полагают, что линкер связывается с активным агентом посредством активной группы линкера и нуклеофильной группы активного агента. Кроме того, полагают, что если концевая группа линкера, которая будет связываться с активным агентом, представляет собой нуклеофил, такой как гидроксил, алкоксид, амин, нитрит, тиол и тиолят, линкер может связываться с активным агентом, включающим, без ограничения, гепарин, хитозан, четвертичный хитозан и т.д.
[0105] Как описано выше, «активный агент» включает конъюгаты активный агент-линкер. В тех вариантах реализации, в которых активный агент включает конъюгат активный агент-линкер, конъюгат активный агент-линкер первоначально образуется посредством связывания нуклеофила линкерного соединения с активной группой активного агента, или посредством связывания нуклеофила активного агента с активной группой линкерного соединения, с последующим приведением в контакт обработанного тригидроксифенилом субстрата с раствором конъюгата активный агент-линкер. Активный агент адсорбируется на/прилипает к/связывается с/ассоциируется с линкерным соединением посредством образования ковалентной связи, образования водородной связи, образования ионной связи, ван-дер-ваальсова взаимодействия или комбинации вышеуказанных взаимодействий. Линкерное соединение может представлять собой любое описанное ранее линкерное соединение. Обычно активный агент связывается с линкерным соединением посредством образования одной или более ковалентных связей с концевой группой линкерного соединения. Полагают, что если линкер связывается с активным агентом посредством активной группы, включая, без ограничения, карбоксилы, карбоксилаты, амиды, ацилгалогениды, альдегиды и сложные эфиры, полагают, что линкер связывается с активным агентом посредством активной группы линкера и нуклеофильной группы активного агента. Кроме того, полагают, что если активная группа линкера представляет собой нуклеофил, такой как гидроксил, алкоксид, амин, нитрит, тиол и тиолят, линкер может связываться с активной группой активного агента, включая, без ограничения, гепарин, хитозан, четвертичный хитозан и т.д., посредством нуклеофильной группы линкерного соединения.
[0106] Конъюгат активный агент-линкер может быть получен путем объединения в растворе линкерного соединения и активного агента. Раствор активного агента и/или линкерного соединения может быть приготовлен на любом растворителе, способном действовать как носитель активного агента и/или линкерного соединения. Например, чаще всего используют воду, но можно применять другие растворители, включая, без ограничения, спирты, диолы, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, галогенуглероды, такие как хлороформ и дихлорметан, и комбинации вышеуказанных растворителей.
[0107] В модификациях вышеуказанного варианта реализации раствор активного агента и//или линкерного соединения имеет величину pH в диапазоне от примерно 5,5 до примерно 9,5, или от примерно 8 до примерно 9, или примерно 8,5, или от примерно 6 до примерно 8, или примерно 7,5. Раствор активного агента и/или линкерного соединения может дополнительно содержать буферное соединение для поддержания величины pH в указанных выше диапазонах, включая, без ограничения, N,N-бис-(2-гидроксиэтил)-глицин (Бицин), 3-{[трис-(гидроксиметил)-метил]-амино}-пропансульфоновую кислоту (TAPS), трис-(гидроксиметил)-метиламин (Трис) и N-трис-(гидроксиметил)-метилглицин (Трицин). Конечно, можно также применять одну или более из цитратных, карбонатных, лактатных, фосфатных и других известных буферных систем.
[0108] В альтернативных вариантах реализации раствор активного агента и/или линкерного соединения может иметь меньшие величины pH. Например, можно применять ацетатный буферный раствор, имеющий величину pH в диапазоне от примерно 4 до примерно 5,5, примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8, примерно 4,9, примерно 5, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4 и/или примерно 5,5, при связывании активного агента с линкерным соединением с образованием конъюгата активный агент-линкер. Подходящие активные агенты для связывания с линкерными соединениями при меньших pH включают, без ограничения, гепарин и хитозан. Растворы активного агента и/или линкерного соединения могут дополнительно содержать буферное соединение для поддержания величины pH в указанных выше диапазонах, как хорошо известно в данной области техники. Подходящие буферные системы для указанных величин pH включают одну или более из ацетатных, цитратных, лактатных, фосфатных и других известных буферных систем, которые также можно применять.
[0109] Концентрации активного агента и линкерного соединения в растворе могут представлять собой любую концентрацию. В некоторых вариантах реализации активный агент непосредственно вводят в раствор линкерного соединения, без предварительного получения раствора активного агента. В альтернативных вариантах реализации активный агент может быть обеспечен в виде раствора линкерного соединения в растворе активного агента. Концентрации обычно выбирают так, чтобы активный агент и/или линкерное соединение были полностью растворимы в выбранном растворителе, без образования насыщенных растворов. Примеры концентраций активного агента и/или линкерного соединения могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 60 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл и/или от примерно 0,05 до примерно 3 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 1,5 мг/мл и/или примерно 3 мг/мл. Отношение активного агента к линкерному соединению может находиться в диапазоне от примерно 1:8 до примерно 8:1, от примерно 1:7 до примерно 7:1, от примерно 1:6 до примерно 6:1, от примерно 1:5 до примерно 5:1, от примерно 1:4 до примерно 4:1, от примерно 1:3 до примерно 3:1 и/или от примерно 1:2 до примерно 2:1, например, примерно 1:1.
[0110] Конъюгат активный агент-линкер может связываться с обработанным тригидроксифенилом обработанным праймером субстратом путем приведения в контакт обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата активный агент-линкер. Обработанный тригидроксифенилом обработанный праймером субстрат можно полностью погружать в раствор конъюгата активный агент-линкер, например, посредством нанесения покрытия окунанием. Как вариант, раствор конъюгата активный агент-линкер, можно распылять или наливать на обработанный праймером субстрат, например, посредством центробежного литья или распыления раствора, такого как раствор в форме аэрозоля. Для субстратов, имеющих внутренний просвет, таких как трубки, раствор можно пропускать во внутренний просвет для покрытия внутренней части субстрата.
[0111] Концентрация конъюгата активный агент-линкер в растворе конъюгата активный агент-линкер может представлять собой любую концентрацию. Концентрацию конъюгата активный агент-линкер обычно выбирают так, чтобы конъюгат активный агент-линкер был полностью растворим в выбранном растворителе, без образования насыщенного раствора. Примеры концентраций конъюгата активный агент-линкер могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 примерно до 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, примерно от 0,0001 до примерно 60 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл и/или от примерно 0,05 до примерно 3 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 1,5 мг/мл и/или примерно 3 мг/мл.
[0112] Обработанный тригидроксифенилом обработанный праймером субстрат может вступать в контакт и/или быть погружен в раствор конъюгата активный агент-линкер в течение любого времени, подходящего для связывания конъюгата активный агент-линкер с обработанным тригидроксифенилом обработанным праймером субстратом. Полагают, что конъюгат активный агент-линкер может связываться с обработанным тригидроксифенилом обработанным праймером субстратом посредством концевой группы линкерного соединения, расположенной вдали от тригидроксифенильной группы, и любых оставшихся нуклеофильных групп активного агента, или обеих указанных групп. Кроме того, полагают, что конъюгат активный агент-тригидроксифенил может связываться с любой или обеими из тригидроксифенильной группы и праймерного соединения на обработанном тригидроксифенилом обработанном праймером субстрате. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, продолжительность контакта может представлять собой любую продолжительность, подходящую для создания ковалентной связи между одной или более групп линкера или активного агента и одним или более из праймерного соединения и/или тригидроксифенильной группы обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата. Скорость связывания конъюгата активный агент-линкер с обработанным тригидроксифенилом обработанным праймером субстратом может зависеть, в частности, от концентрации конъюгата активный агент-линкер в растворе указанного соединения, отношения поверхности субстрата к объему раствора, ионной силы раствора, величины pH раствора и температуры. Продолжительность контакта обработанного тригидроксифенилом обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата активный агент-линкер может варьироваться в течение любого подходящего промежутка времени для связывания конъюгата активный агент-линкер с обработанным тригидроксифенилом обработанным праймером субстратом, например, при использовании нанесения покрытия окунанием, от примерно 10 секунд до примерно 24 часов. Если продолжительность контакта субстрата с раствором конъюгата активный агент-линкер увеличивают свыше 24 часов (и используют одну из вышеуказанных примеров концентраций конъюгата активный агент-линкер), ожидается незначительное различие в количестве активного агента, иммобилизованного на поверхности субстрата (по сравнению с 24-часовым временем воздействия). Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что, несмотря на то, что спустя 24 часа конъюгат активный агент-линкер может продолжать иммобилизовываться на субстрате, ожидают, что количество активного агента, иммобилизованного после 24 часов, будет оказывать незначительное влияние на активность (антибактериальную, антимикробную и т.д.) полученного субстрата, на поверхности которого иммобилизован активный агент.
Конъюгаты активный агент-тригидроксифенил с необязательныс линкером
[0113] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения конъюгатактивный агент-тригидроксифенил первоначально получают путем связывания нуклеофила активного агента с активной группой тригидроксифенильной группы, или путем связывания нуклеофила тригидроксифенильной группы с активной группой активного агента, с последующим приведением в контакт обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата активный агент-тригидроксифенил. Конъюгат активный агент-тригидроксифенил можно получить путем объединения в растворе соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, и активного агента. Как описано ранее, соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, включает конъюгаты тригидроксифенил-линкер. Следовательно, конъюгаты активный агент- тригидроксифенил включают активные агенты, связанные с линкерными соединениями, которые, в свою очередь, связаны с тригидроксифенильными группами. Активные агенты, связанные с линкерными соединениями, могут быть получены, как описано выше для конъюгатов активный агент-линкер, и соединения, содержащие тригидроксифенильные группы, связанные с линкерными соединениями, могут быть получены, как описано выше для конъюгатов тригидроксифенил-линкер. Указанные соединения могут дополнительно взаимодействовать с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, или с активным агентом, соответственно, с образованием конъюгатов активный агент-тригидроксифенил. Родовые конъюгаты активный агент-тригидроксифенил могут быть представлены формулами (Va-c) и (VIa-c):
2
3
4
5
6
где X может представлять собой галоген, амин, тиол, альдегид, карбоновую кислоту, карбоксилат, ацилгалогенид, сложный эфир, акрилат, винил, C1-C10 разветвленный или линейный алкиламин, C1-C10 разветвленный или линейный алкилтиол, C1-C10 разветвленный или линейный алкилальдегид, C1-C10 разветвленную или линейную алкилкарбоновую кислоту, C1-C10 разветвленный или линейный алкилкарбоксилат, C1-C10 разветвленный или линейный алкилацилгалогенид, C1-C10 разветвленный или линейный алкил-сложный эфир или C1-C10 разветвленный или линейный алкилакрилат, и R представляет собой линкерное соединение. Что касается длины цепи углеродных цепей указанных заместителей, длина цепи обычно составляет от C1 до C5 при использовании водных растворов (при условии, что достигается растворимость в выбранных водных системах); при использовании органических растворителей длина цепи может составлять от C1 до C10. Согласно соединениям (Va-c) и (VIa-c), три гидроксильные группы могут быть обеспечены в любых трех положениях из C, C, C, C и C. Например, когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой карбоновую кислоту, такую как галловая кислота (то есть X представляет собой карбоксил), конъюгат активный агент-тригидроксифенил может иметь формулу (Va), (Vb), (VIa) или (VIb):
3
4
5
2
6
где R представляет собой линкерное соединение, и Активный агент обозначает активный агент. Кроме того, когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой галловую кислоту, что соответсвует конъюгатам активный агент-тригидроксифенил согласно формулам (Va), (Vb), (VIa) и (VIb), обеспечены три гидроксильные группы в положениях C, C и C, и линкер обеспечен на карбоксильной группе (IVa) или в одном из положений C или C(IVb). Когда соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой пирогаллол, конъюгат активный агент-тригидроксифенил может иметь формулу (Vc) или (VIc):
3
4
5
6
где R представляет собой линкерное соединение и три гидроксильные группы могут быть обеспечены в любых трех последовательных положениях из C, C, C и C.
[0110] В тех вариантах реализации настоящего изобретения, в которых активный агент обеспечивают в виде чистой жидкости, активный агент может представлять собой растворитель, в котором образуется конъюгат активный агент- тригидроксифенил. В тех вариантах реализации настоящего изобретения, в которых раствор активного агента объединяют с раствором соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, раствор активного агента и/или соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, можно готовить в любом растворителе, способном служить носителем активного агента и/или соединения, содержащего тригидроксифенильную группу. Например, чаще всего используют воду, но можно применять другие растворители, включая, без ограничения, спирты, диолы, сераорганические соединения, такие как сульфолан, простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран, алканы, ароматические соединения, галогенуглероды, такие как хлороформ и дихлорметан, и комбинации вышеуказанных растворителей.
[0114] В модификациях вышеуказанного варианта реализации раствор активного агента и/или раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, имеет величину pH в диапазоне от примерно 7,5 до примерно 9,5, или от примерно 8 до примерно 9, или примерно 8,5. Раствор активного агента и/или раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, может дополнительно содержать буферное соединение для поддержания величины pH в указанных выше диапазонах, включая, без ограничения, N,N-бис-(2-гидроксиэтил)-глицин (Бицин), 3-[трис-(гидроксиметил)-метил]-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS), трис-(гидроксиметил)-метиламин (Трис) и N-трис-(гидроксиметил)-метилглицин (Трицин). Конечно, можно также применять одну или более из цитратных, карбонатных, лактатных, фосфатных и других известных буферных систем. В альтернативных вариантах реализации раствор активного агента и/или раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, может иметь меньшую величину pH. Например, можно применять ацетатные буферные растворы для осаждения активных агентов, с величиной pH в диапазоне от примерно 4 до примерно 5,5, например, примерно 4,0, примерно 4,1, примерно 4,2, примерно 4,3, примерно 4,4, примерно 4,5, примерно 4,6, примерно 4,7, примерно 4,8, примерно 4,9, примерно 5, примерно 5,1, примерно 5,2, примерно 5,3, примерно 5,4, и/или примерно 5,5. Подходящие активные агенты для связывания с соединением, содержащим тригидроксифенильную группу, в растворе при более низких pH, включают, без ограничения, гепарин.
[0115] Концентрации активного агента и соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, в растворе могут в общем случае представлять собой любую концентрацию. В некоторых вариантах реализации активный агент непосредственно вводят в раствор соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, без предварительного получения раствора активного агента. В альтернативных вариантах реализации активный агент может быть обеспечен в виде раствора соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, в растворе активного агента. Концентрации обычно выбирают так, чтобы активный агент и/или соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, были полностью растворимы в выбранном растворителе, без образования насыщенных растворов. Примеры концентраций активного агента и/или соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 60 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл и/или от примерно 0,05 до примерно 3 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 1,5 мг/мл и/или примерно 3 мг/мл. Отношение активного агента к соединению, содержащему тригидроксифенильную группу, может варьироваться в зависимости от того, является ли активный агент малой молекулой или полимером, а также оттого, является ли соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, малой молекулой или полимером. Например, если активный агент представляет собой полимер, а соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой малую молекулу, один активный агент может связать тысячи соединений, содержащих тригидроксифенильную группу. Как вариант, если активный агент представляет собой малую молекулу, а соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, представляет собой полимер, одно соединение, содержащее тригидроксифенильную группу, может связать тысячи активных агентов. Следовательно, подходящие отношения активных агентов к соединениям, содержащим тригидроксифенильную группу, могут находиться в диапазоне от примерно 1:5000 до примерно 5000:1, включая все промежуточные диапазоны, такие как от примерно 1:5 до примерно 5:1, от примерно 1:4 до примерно 4:1, от примерно 1:3 до примерно 3:1 и/или от примерно 1:2 до примерно 2:1, например, примерно 1:1.
[0116] Конъюгат активный агент-тригидроксифенил может связываться с обработанным праймером субстратом путем приведения в контакт обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата активный агент-тригидроксифенил. Обработанный праймером субстрат можно полностью погружать в раствор конъюгата активный агент-тригидроксифенил, например, посредством нанесения покрытия окунанием. Как вариант, раствор конъюгата активный агент-тригидроксифенил, можно распылять или наливать на обработанный праймером субстрат, например, посредством центробежного литья или распыления раствора, такого как раствор в форме аэрозоля. Для субстратов, имеющих внутренний просвет, таких как трубки, раствор можно пропускать во внутренний просвет для покрытия внутренней части субстрата.
[0117] Концентрация конъюгата активный агент-тригидроксифенил в растворе конъюгата активный агент-тригидроксифенил может представлять собой любую концентрацию. Концентрацию конъюгата активный агент-тригидроксифенил обычно выбирают так, чтобы конъюгат активный агент-тригидроксифенил был полностью растворим в выбранном растворителе, без образования насыщенного раствора. Примеры концентраций конъюгата активный агент-тригидроксифенил могут находиться в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 100 мг/мл, от примерно 0,05 примерно до 100 мг/мл, примерно от 0,0001 примерно до 90 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 80 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 70 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 60 мг/мл, от примерно 0,0001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 50 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 40 мг/мл, от примерно 0,001 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 30 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 20 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 15 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/мл, от примерно 0,01 до примерно 5 мг/мл, от примерно 0,05 до примерно 5 мг/мл и/или от примерно 0,05 до примерно 3 мг/мл, например, примерно 1 мг/мл, примерно 1,5 мг/мл и/или примерно 3 мг/мл.
[0118] Обработанный праймером субстрат может вступать в контакт и/или быть погружен в раствор конъюгата активный агент-тригидроксифенил в течение любого времени, подходящего для связывания конъюгата активный агент-тригидроксифенил с обработанным праймером субстратом. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения, продолжительность контакта может представлять собой любую продолжительность, подходящую для создания сетчатой структуры праймерного соединения и тригидроксифенила из конъюгата активный агент-тригидроксифенил. Скорость связывания конъюгата активный агент-тригидроксифенил с обработанным праймером субстратом может зависеть, в частности, от концентрации конъюгата активный агент-тригидроксифенил в растворе указанного соединения, отношения поверхности субстрата к объему раствора, ионной силы раствора, величины pH раствора и температуры. Продолжительность контакта обработанного праймером субстрата с раствором конъюгата активный агент-тригидроксифенил может варьироваться в течение любого подходящего промежутка времени для связывания конъюгата активный агент-тригидроксифенил с обработанным праймером субстратом, например, при использовании нанесения покрытия окунанием, от примерно 10 секунд до примерно 24 часов. Если продолжительность контакта субстрата с раствором конъюгата активный агент-тригидроксифенил увеличивают свыше 24 часов (и используют одну из вышеуказанных примеров концентраций конъюгата активный агент-тригидроксифенил), ожидается незначительное различие в количестве активного агента, иммобилизованного на поверхности субстрата (по сравнению с 24-часовым временем воздействия). Не ограничиваясь никакой конкретной теорией, полагают, что, несмотря на то, что спустя 24 часа конъюгат активный агент-тригидроксифенил может продолжать иммобилизовываться на субстрате, ожидают, что количество активного агента, иммобилизованного после 24 часов, будет оказывать незначительное влияние на активность (антибактериальную, антимикробную и т.д.) полученного субстрата, на поверхности которого иммобилизован активный агент.
[0119] Способы, субстраты и медицинские устройства согласно настоящему изобретению могут быть более понятны при рассмотрении следующих примеров, предназначенных только иллюстрировать способы, субстраты и медицинские устройства согласно настоящему изобретению, и никоим образом не предназначенных ограничивать объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1
Влияние концентрации гепарина на иммобилизацию гепарина на полисульфоновых субстратах
[0120] Антитромботический агент гепарин иммобилизовывали на полисульфоновых субстратах. Анализировали влияние концентрации гепарина на иммобилизацию гепарина на полисульфоновом субстрате, путем изменения концентрации гепарина в растворе гепарина. Концентрация гепарина в растворе гепарина составляла 0,1 мг/мл, 1,0 мг/мл или 5,0 мг/мл. Субстраты готовили следующим образом.
[0121] Полисульфоновый субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бицине (pH 8,5). Раствор с погруженным в него полисульфоновым субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (1 мг/мл), растворенной в 10 мМ Бицине (pH 8,5). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор гепарина (0,1 мг/мл, 1,0 мг/мл или 5,0 мг/мл гепарина), растворенного в 10 мМ - 300 мМ ацетате (pH 4,5), с добавлением 600 мМ NaCl. Раствор гепарина с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора гепарина и промывали фильтрованной дистиллированной водой, получая полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на поверхности гепарином.
[0122] Таким образом, пример 1 иллюстрирует иммобилизацию гепарина на полисульфоновом субстрате согласно настоящему изобретению. Иммобилизацию гепарина подтверждали при помощи РФЭС и при помощи окрашивания альциановым синим анионного гепарина, иммобилизованного на поверхности субстрата.
[0123] На фигуре 1 показаны обзорные спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии полисульфоновых поверхностей, модифицированных хитоолигосахаридом, галловой кислотой и различными концентрациями гепарина. «ПС» обозначает необработанную полисульфоновую поверхность, «ГК» обозначает полисульфоновый субстрат, обработанный хитоолигосахаридом и галловой кислотой, полученный согласно примеру 1. «0,1» обозначает полисульфоновый субстрат, модифицированный хитоолигосахаридом, галловой кислотой и 0,1 мг/мл раствором гепарина, полученный согласно примеру 1. «1,0» обозначает полисульфоновый субстрат, модифицированный хитоолигосахаридом, галловой кислотой и 1,0 мг/мл раствором гепарина, полученный согласно примеру 1. «5,0» обозначает полисульфоновый субстрат, модифицированный хитоолигосахаридом, галловой кислотой и 5,0 мг/мл раствором гепарина, полученный согласно примеру 1. O1s обозначает сигналы кислорода, N1s обозначает сигналы азота, C1s обозначает сигналы углерода, и S2s и S2p обозначает сигналы серы. Сигналы N1s наблюдались на всех поверхностях, содержащих слой хитоолигосахарида-галловой кислоты. Сигналы S1s и S2p отсутствовали на кривой «ГК», указывая на то, что на поверхность субстрата был осажден слой хитоолигосахарида и галловой кислоты. Сигналы S1s и S2p присутствовали на кривых «0,1», «1,0» и «5,0», подтверждая, что гепарин был иммобилизован на субстрате.
[0124] Элементный состав был получен из анализа РФЭС, данные о составе представлены в следующей таблице.
<b>Группа</b>
<b>C (%)</b>
<b>O (%)</b>
<b>N (%)</b>
<b>S (%)</b>
<b>ПС</b>
83,6
12,8
0,0
3,6
<b>ГК</b>
62,4
32,2
4,9
0,6
<b>0,1</b>
63,1
30,2
3,6
3,1
<b>1,0</b>
53,0
38,2
5,1
3,7
<b>5,0</b>
62,4
30,7
3,8
3,2
[0125] Данные по элементному составу позволяют предположить, что количество гепарина, иммобилизованного на субстрате, погруженном в раствор гепарина на 24 часа, определенное по процентному содержанию детектированной серы, не сильно зависит от концентрации гепарина в растворе гепарина в испытанном диапазоне концентраций.
Пример 2
Иммобилизация гепарина на полисульфоновом субстрате
[0126] Антитромботический агент гепарин иммобилизовывали на полисульфоновом субстрате. Полисульфоновый субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,4). Раствор с погруженным в него полисульфоновым субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 90 минут. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (1,5 мг/мл), в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,6). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 90 минут. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор гепарина (1 мг/мл) в растворе 0,3М ацетата натрия и 0,6М хлорида натрия. Раствор гепарина с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение примерно 12 часов. Извлекали субстрат из раствора гепарина и промывали фильтрованной дистиллированной водой, получая полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на поверхности гепарином. Иммобилизацию гепарина подтверждали при помощи окрашивания альциановым синим анионного гепарина, иммобилизованного на поверхности субстрата, как описано в примере 10.
[0127] Таким образом, пример 2 иллюстрирует иммобилизацию гепарина на полисульфоновом субстрате согласно настоящему изобретению.
Пример 3
Антитромботическая активность полисульфонового субстрата с иммобилизованным на нем гепарином
[0128] Антитромботический агент гепарин иммобилизовывали на полисульфоновом субстрате. Полисульфоновый субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (1,3 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,4). Раствор с погруженным в него полисульфоновым субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (3,5 мг/мл), растворенной в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,7). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор гепарина (1,1 мг/мл) в растворе 0,3М ацетата натрия и 0,6М хлорида натрия. Раствор гепарина с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Извлекали субстрат из раствора гепарина и оставляли высохнуть, получая полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на поверхности гепарином.
[0129] Антитромботическую активность полисульфонового субстрата с иммобилизованным на поверхности гепарином оценивали, определяя конверсию протромбина в тромбин в образце крови. Определяли конверсию протромбина в тромбин в образце крови, содержащем полисульфоновый субстрат без покрытия (обозначенный ПС), контрольный, обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат (полученный согласно методике получения обработанного галловой кислотой обработанного праймером субстрата из примера 5, обозначенный ХОС/ГК), и в образце, содержащем полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на нем активным агентом гепарином согласно настоящему изобретению (обозначенный 1 мг/мл Гепарин), по сравнению с конверсией тромбина в контрольном образце крови (обозначенном Кровь). Как показано на фигуре 2, когда полисульфоновые субстраты инкубировали в крови, образец крови, содержащий полисульфоновый субстрат без покрытия, не демонстрировал сниженной конверсии тромбина по сравнению с контрольным образцом крови. Напротив, образец крови, содержащий полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на нем гепарином (1 мг/мл Гепарин) демонстрировал повышенную антитромботическую активность по сравнению как с образцом, содержащим необработанный полисульфоновый субстрат, так и с контрольным образцом крови.
[0130] Измеряли F1+2 с использованием набора для анализа Siemens Enzygnost  F1+2 (моноклональный). Фрагмент F1+2 образуется при конверсии протромбина в активный тромбин, в ходе каскада коагуляции. Измерение фрагмента F1+2 обеспечивает возможность количественного анализа образованного тромбина. Уровни F1+2 определяли путем инкубирования полисульфоновых субстратов в 2 мл человеческой крови, содержащей 0,4 Ед/мл гепарина, при легком перемешивании в течение 2 часов. Отбирали аликвоты крови в течение 2 часов для определения конверсии тромбина в зависимости от времени. Затем обрабатывали образцы крови согласно вкладке в упаковку набора для определения F1+2 Siemens Enzygnost  F1+2 (моноклональный).
[0131] Таким образом, пример 3 иллюстрирует иммобилизацию гепарина на полисульфоновом субстрате согласно настоящему изобретению и сохранение активности гепарина после указанной иммобилизации. В то время как полисульфоновый субстрат без гепарина, ПС, обрастал тромбином, и контрольный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат, ХОС/ГК, обрастал тромбином, полисульфоновый субстрат, обработанный гепарином, 1 мг/мл Гепарин, полезно демонстрировал сниженную конверсию тромбина по сравнению с ПС, подтверждая иммобилизацию гепарина, антитромботического агента, на поверхности субстрата, и сохранение активности гепарина после иммобилизации на указанной поверхности.
Пример 4
Антитромботическая активность полисульфонового субстрата с иммобилизованным на нем гепарином
[0132] Антитромботический агент гепарин иммобилизовывали на полисульфоновом субстрате. Полисульфоновый субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (0,1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,4). Раствор с погруженным в него полисульфоновым субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Извлекали субстрат из раствора. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (1 мг/мл), растворенной в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,7). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор гепарина (5 мг/мл) в растворе 0,3М ацетата натрия и 0,6М хлорида натрия. Раствор гепарина с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Извлекали субстрат из раствора гепарина и промывали фильтрованной дистиллированной водой, получая полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на поверхности гепарином.
[0133] Антитромботическую активность полисульфонового субстрата с иммобилизованным на поверхности гепарином оценивали, определяя конверсию протромбина в тромбин в образце крови. Определяли конверсию протромбина в тромбин в образце крови, содержащем полисульфоновый субстрат без покрытия (обозначенный ПС), контрольный, обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат (полученный согласно методике получения обработанного галловой кислотой обработанного праймером субстрата из примера 5, обозначенный ХОС/ГК), и в образце, содержащем полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на нем активным агентом гепарином согласно настоящему изобретению (обозначенный 5 мг/мл Гепарин), по сравнению с конверсией тромбина в контрольном образце крови (обозначенном Кровь). Как показано на фигуре 2, когда полисульфоновые субстраты инкубировали в крови, образец крови, содержащий полисульфоновый субстрат без покрытия, не демонстрировал сниженной конверсии тромбина по сравнению с контрольным образцом крови. Напротив, образец крови, содержащий полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на нем гепарином, демонстрировал повышенную антитромботическую активность по сравнению как с образцом, содержащим необработанный полисульфоновый субстрат, так и с контрольным образцом крови.
[0134] Измеряли F1+2 с использованием набора для анализа Siemens Enzygnost  F1+2 (моноклональный), как описано в примере 3.
[0135] Таким образом, пример 4 иллюстрирует иммобилизацию гепарина на полисульфоновом субстрате согласно настоящему изобретению и сохранение активности гепарина после указанной иммобилизации. В то время как полисульфоновый субстрат без гепарина, ПС, обрастал тромбином, и контрольный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат, ХОС/ГК, обрастал тромбином, полисульфоновый субстрат, обработанный гепарином, 5 мг/мл Гепарин, полезно демонстрировал сниженную конверсию тромбина по сравнению с ПС, подтверждая иммобилизацию гепарина, антитромботического агента, на поверхности субстрата, и сохранение активности гепарина после иммобилизации на указанной поверхности.
Пример 5
Антитромботическая активность полисульфонового субстрата с иммобилизованным на нем гепарином
[0136] Антитромботический агент гепарин иммобилизовывали на полисульфоновом субстрате. Полисульфоновый субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (5 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,4). Раствор с погруженным в него полисульфоновым субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (2,5 мг/мл), растворенной в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,7). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор гепарина (1 мг/мл) в растворе 0,3М ацетата натрия и 0,6М хлорида натрия (pH 5,17). Раствор гепарина с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора гепарина, промывали фильтрованной дистиллированной водой и высушивали в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха, получая полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на поверхности гепарином.
[0137] Антитромботическую активность полисульфонового субстрата с иммобилизованным на поверхности гепарином оценивали, определяя конверсию протромбина в тромбин в образце крови. Определяли конверсию протромбина в тромбин в образце крови, содержащем полисульфоновый субстрат без покрытия (обозначенный ПС), контрольный, обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат (обозначенный ХОС/ГК), и в образце, содержащем полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на нем активным агентом гепарином (обозначенный 24 ч Гепарин). Каждый из вышеуказанных образцов сравнивали с конверсией тромбина в контрольном образце крови (обозначенном Кровь). Субстраты инкубировали в крови и определяли конверсию тромбина. Как показано на фигуре 2, необработанный полисульфоновый субстрат и обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат не демонстрировали повышенной антитромботической активности (т.е. сниженной конверсии тромбина) по сравнению с контрольным образцом крови, в то время как полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на нем гепарином (24 ч Гепарин), полезно демонстрировал сниженную конверсию тромбина по сравнению с необработанным полисульфоновым субстратом, таким образом, подтверждая иммобилизацию гепарина, антитромботического агента, на поверхности субстрата. Кроме того, на фигуре 2 показано, что субстрат, на котором иммобилизовывали гепарин при той же концентрации гепарина, но меньшем времени погружения (1 мг/мл, 30 мин, пример 3) имел сходную антитромботическую активность по сравнению с субстратом, на котором иммобилизовывали гепарин со временем погружения 24 часа (24 ч Гепарин, пример 5).
[0138] Таким образом, пример 5 иллюстрирует иммобилизацию гепарина на полисульфоновом субстрате и сохранение активности гепарина после указанной иммобилизации.
Пример 6
Стабильность гепарина, иммобилизованного на полисульфоновом/полиизопреновом субстрате по отношению к воздействию крови и смыванию
2
2
[0139] Многокомпонентные полисульфоновые и полиизопреновые проточные ячейки с иммобилизованным на них гепарином согласно настоящему изобретению получали, как описано в примере 5, за исключением того, что для предварительной обработки субстрата применяли смеси концентрированной HCl:30% HO(1:1), для улучшения смачиваемости. Ячейки заполняли раствором HCl:пероксид и оставляли на 5 минут. Затем ячейки промывали дистиллированной водой. Затем иммобилизовывали гепарин на субстрате, как описано в примере 5. Антитромботическую активность полисульфонового/полиизопренового субстрата с иммобилизованным на нем активным агентом гепарином согласно настоящему изобретению оценивали при помощи визуального и микроскопического обследования. Проводили эксперимент, сравнивая проточную ячейку из немодифицированного полисульфона/полиизопрена и проточную ячейку из полисульфона/полиизопрена с иммобилизованным гепарином в отношении тромбообразования. Собирали две петли кровотока, состоящие из силиконовой трубки, резервуара для крови и проточной ячейки из полисульфона/полиизопрена, одну петлю с немодифицированной проточной ячейкой и одну петлю с ячейкой, модифицированной гепарином. Применяли перистальтический насос для обеспечения скорости течения 50 мл/мин в непрерывной петле. Петлю заполняли и подвергали первичной обработке при помощи примерно 175 мл крови, рециркулировавшей в течение 2 часов. Для обеих петель использовали один источник крови, чтобы устранить вариативность доноров. По окончании рециркуляции петли промывали раствором соли, а затем промывали, пропуская > 400 мл/мин воды, нагретой до 85°С, в течение не менее 60 минут. Две ячейки анализировали, затем повторяли описанный процесс в течение 3 циклов. После завершения последнего цикла оптический анализ показал отсутствие видимых тромбов в проточной ячейке, модифицированной гепарином. Напротив, в немодифицированной проточной ячейке присутствовали большие участки тромбов, видимые невооруженным глазом. Анализ при помощи СЭМ показал очень плотную структуру фибрина в немодифицированной проточной ячейке. Напротив, проточная ячейка, модифицированная гепарином, содержала только небольшое количество фибриновой структуры, видимой только при большом увеличении в СЭМ.
[0140] Таким образом, пример 6 демонстрирует, что субстраты с иммобилизованным на них активным агентом гепарином согласно настоящему изобретению могут полезно быть промыты и использованы повторно.
Пример 7
Иммобилизация гепарина на поликарбонатном субстрате с использованием хитоолигосахарида в качестве праймерного соединения
[0141] Антитромботический агент гепарин иммобилизовывали на поликарбонатном субстрате. Поликарбонатный субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,0). Раствор с погруженным в него поликарбонатным субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (2 мг/мл), растворенной в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,5). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор гепарина (1 мг/мл) в растворе 0,3М ацетата натрия и 0,6М хлорида натрия. Раствор гепарина с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора гепарина и промывали фильтрованной дистиллированной водой, получая поликарбонатный субстрат с иммобилизованным на поверхности гепарином.
[0142] Таким образом, пример 7 иллюстрирует иммобилизацию гепарина на поликарбонатном субстрате согласно настоящему изобретению. Иммобилизацию гепарина подтверждали при помощи окрашивания альциановым синим анионного гепарина, иммобилизованного на поверхности субстрата, как описано в примере 10.
Пример 8
Иммобилизация гепарина на поликарбонатном субстрате с использованием полиэтиленимина в качестве праймерного соединения
[0143] Антитромботический агент гепарин иммобилизовывали на поликарбонатном субстрате. Поликарбонатный субстрат погружали в раствор полиэтилениминового (ПЭИ) праймерного соединения (1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,0). Раствор с погруженным в него поликарбонатным субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (2 мг/мл), растворенной в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,5). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор гепарина (1 мг/мл) в растворе 0,3М ацетата натрия и 0,6М хлорида натрия. Раствор гепарина с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора гепарина и промывали фильтрованной дистиллированной водой, получая поликарбонатный субстрат с иммобилизованным на поверхности гепарином.
[0144] Таким образом, пример 8 иллюстрирует иммобилизацию гепарина на поликарбонатном субстрате согласно настоящему изобретению. Иммобилизацию гепарина подтверждали при помощи окрашивания альциановым синим анионного гепарина, иммобилизованного на поверхности субстрата, как описано в примере 10.
Пример 9
Испытание с нитратом серебра для подтверждения связывания соединения, содержащего тригидроксифенильную группу, с праймерным соединением
[0145] Ряд соединений, содержащих тригидроксифенильную группу (ТГФ), связывали с обработанным праймером полисульфоновым субстратом, и подтверждали иммобилизацию ТГФ на субстрате при помощи испытания с нитратом серебра. Полисульфоновый субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,0). Раствор с погруженным в него полисульфоновым субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор одного из соединений, содержащих тригидроксифенильную группу (ТГФ), выбранного из галловой кислоты (2 мг/мл), пирогаллола (2 мг/мл) или 2,4,6-тригидроксибензальдегида (2 мг/мл), растворенного в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,5). Затем раствор ТГФ с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора ТГФ и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный ТГФ обработанный праймером субстрат погружали в раствор 50 мМ нитрата серебра примерно на 16 часов, при слабом перемешивании. Извлекали субстрат из раствора нитрата серебра и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Ожидалось, что все восстанавливающие группы в соединении, содержащем тригидроксифенильную группу, будут восстанавливать нитрат серебра в случае, если ТГФ была связана с обработанным праймером субстратом. Было обнаружено, что ТГФ восстанавливали ионы серебра до наночастиц серебра, что приводило к образованию коричневой окраски на полисульфоновом субстрате.
[0146] Таким образом, пример 7 подкрепляет подтверждение иммобилизации различных ТГФ групп на полисульфоновом субстрате согласно настоящему изобретению, посредством связывания ТГФ с хитоолигосахаридом при сохранении активности указанных групп.
Пример 10
Испытание с альциановым синим для подтверждения иммобилизации гепарина на субстрате
[0147] Антитромботический агент гепарин иммобилизовывали на поликарбонатном субстрате. Поликарбонатный субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,0). Раствор с погруженным в него поликарбонатным субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (2 мг/мл), растворенной в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,5). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор гепарина (1 мг/мл) в растворе 0,3М ацетата натрия и 0,6М хлорида натрия. Раствор гепарина с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора гепарина и промывали фильтрованной дистиллированной водой, получая поликарбонатный субстрат с иммобилизованным на поверхности гепарином. Полученный поликарбонатный субстрат с иммобилизованным на его поверхности гепарином погружали в раствор альцианового синего примерно на 3 часа при слабом перемешивании. Извлекали субстрат из раствора альцианового синего и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Ожидалось, что любые анионные активные агенты, такие как гепарин, иммобилизованные на субстрате, образуют комплекс с катионным красителем альциановым синим. Было обнаружено, что гепарин образовывал комплекс с альциановым синим, что приводило к образованию синего окрашивания на полисульфоновом субстрате.
[0148] Таким образом, пример 10 иллюстрирует подтверждение иммобилизации гепарина на поликарбонатном субстрате согласно настоящему изобретению.
Пример 11
Иммобилизация полиэтиленгликоля на полисульфоновом субстрате
2
[0149] Противообрастающий агент полиэтиленгликоль (ПЭГ) иммобилизовывали на полисульфоновом субстрате. Полисульфоновый субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,4). Раствор с погруженным в него полисульфоновым субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (2,5 мг/мл), растворенной в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,7). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор ПЭГ с концевыми группами NH, ПЭГ с концевыми группами SH и/или ПЭГ с концевыми группами NHS (1 мг/мл, 5000 Mw) в растворе 0,3М ацетата натрия и 0,6М хлорида натрия (pH 5,17). Раствор ПЭГ с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора ПЭГ и промывали фильтрованной дистиллированной водой, получая полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на поверхности ПЭГ.
[0150] Таким образом, пример 11 иллюстрирует, как можно осуществить иммобилизацию гепарина на полисульфоновом субстрате согласно настоящему изобретению.
Пример 12
Иммобилизация поливинилпирролидона на полисульфоновом субстрате
2
[0151] Противообрастающий агент поливинилпирролидон (ПВП) иммобилизовывали на полисульфоновом субстрате. Полисульфоновый субстрат погружали в раствор хитоолигосахаридного праймерного соединения (1 мг/мл, 10000 Mw), растворенного в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,4). Раствор с погруженным в него полисульфоновым субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный праймером субстрат погружали в раствор галловой кислоты (2,5 мг/мл), растворенной в 100 мМ Бициновом буферном растворе (pH 7,7). Затем раствор галловой кислоты с погруженным в него обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора галловой кислоты и промывали фильтрованной дистиллированной водой. Полученный обработанный галловой кислотой обработанный праймером субстрат погружали в раствор ПВП с концевыми группами NH(1 мг/мл, 5000 Mw) в 10 мМ Бициновом буферном растворе (pH 8,5). Раствор ПВП с погруженным в него обработанным галловой кислотой обработанным праймером субстратом слегка перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Извлекали субстрат из раствора ПВП и промывали фильтрованной дистиллированной водой, получая полисульфоновый субстрат с иммобилизованным на поверхности ПВП.
[0152] Таким образом, пример 11 иллюстрирует, как можно осуществить иммобилизацию поливинилпирролидона на полисульфоновом субстрате согласно настоящему изобретению.
[0153] Конечно, в вышеописанных методиках можно применять другие активные агенты, линкерные соединения и соединения, содержащие тригидроксифенильную группу.