ГЕНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ВИЛЬСОНА

1. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция, содержащая:
(а) последовательность 5’-инвертированного концевого повтора (ITR);
(b) последовательность промотора;
(c) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (ATP7B), в которой делецированы металлсвязывающие домены (MBD) 1-3, но присутствует серин-богатая петля, включающая два остатка серина (S340 и S341) между MBD3 и MBD4; и
(d) последовательность 3’-ITR.
2. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.1, где промотор выбран из промотора транстиретина (TTR), промотора куриного β-актина (CBA), немедленного раннего промотора гена цитомегаловируса (CMV), промотора тироксинсвязывающего глобулина (TBG), промотора альфа-1-антитрипсина (A1AT) и промотора CAG.
3. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.2, где промотор представляет собой промотор TTR.
4. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-3, где последовательность 5’-ITR происходит из AAV2.
5. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-3, где последовательность 3’-ITR происходит из AAV2.
6. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-3, где последовательность 5’-ITR и последовательность 3’-ITR происходят из AAV2.
7. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-6, где последовательность 5’-ITR и последовательность 3’-ITR содержит или состоит из SEQ ID NO: 2.
8. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-3, где последовательность 5’-ITR и/или последовательность 3’-ITR происходят из источника, отличного от AAV2.
9. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-8, где рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция дополнительно содержит одну или более энхансерных последовательностей.
10. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.9, где энхансер выбран из энхансера транстиретина (enTTR), немедленного раннего энхансера гена цитомегаловируса (CMV), энхансера куриного β-актина (CBA), энхансера En34 и энхансера аполипопротеина (ApoE).
11. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.10, где энхансером является энхансер enTTR.
12. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.11, где энхансер содержит или состоит из SEQ ID NO: 3.
13. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по пп.10-12, где энхансер расположен апстрим от последовательности промотора.
14. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-13, где рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция дополнительно содержит одну или более интронных последовательностей.
15. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.14, где интрон выбран из малого Т-интрона SV40, интрона бета-субъединицы кроличьего гемоглобина (rHBB), интрона IVS2 человеческого бета-глобина, химерного интрона Promega или интрона hFIX.
16. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.15, где интрон представляет собой малый Т-интрон SV40.
17. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.16, где интрон содержит или состоит из SEQ ID NO: 4.
18. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.15, где интрон представляет собой интрон rHBB.
19. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.18, где интрон содержит или состоит из SEQ ID NO: 5.
20. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-19, где рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция дополнительно содержит сигнальную последовательность полиаденилирования.
21. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.20, где сигнальная последовательность полиаденилирования выбрана из сигнальной последовательности полиаденилирования SV40, сигнальной последовательности полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и сигнальной последовательности полиаденилирования кроличьего бета-глобина.
22. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.21, где сигнальная последовательность полиаденилирования представляет собой сигнальную последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH).
23. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.22, где сигнальная последовательность полиаденилирования содержит или состоит из SEQ ID NO: 6.
24. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.21, где сигнальная последовательность полиаденилирования представляет собой сигнальную последовательность полиаденилирования SV40.
25. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.24, где сигнальная последовательность полиаденилирования содержит или состоит из SEQ ID NO: 7.
26. Рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV), пригодный для лечения болезни Вильсона, где указанный rAAV включает капсид AAV и упакованный в него векторный геном, где указанный векторный геном включает:
а. последовательность AAV 5’-инвертированного концевого повтора (ITR);
b. последовательность промотора/энхансера;
c. последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (ATP7B), в которой делецированы металл-связывающие домены (MBD) 1-3, но присутствует серин-богатая петля, включающая два остатка серина (S340 и S341) между MBD3 и MBD4; и
d. AAV 3’-ITR.
27. rAAV по п.26, где капсид AAV происходит из AAV серотипа 9, 8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 11, 12, rh10 или hu37.
28. rAAV по п.27, где капсид AAV происходит из AAV9.
29. rAAV по п.27, где капсид AAV происходит из AAV8.
30. rAAV по п.28, где капсид AAV представляет собой капсид варианта AAV9.
31. rAAV по любому из пп.26-30, где промотор выбран из промотора транстиретина (TTR), промотора куриного β-актина (CBA), немедленного раннего промотора гена цитомегаловируса (CMV), промотора тироксинсвязывающего глобулина (TBG), промотора альфа-1-антитрипсина (A1AT) и промотора CAG.
32. rAAV по п.31, где промотор представляет собой промотор TTR.
33. rAAV по любому из пп.26-32, где последовательность 5’-ITR происходит из AAV2.
34. rAAV по любому из пп.26-32, где последовательность 3’-ITR происходит из AAV2.
35. rAAV по любому из пп.26-32, где последовательность 5’-ITR и последовательность 3’-ITR происходят из AAV2.
36. rAAV по любому из пп.26-35, где последовательность 5’-ITR и последовательность 3’-ITR содержит или состоит из SEQ ID NO: 2.
37. rAAV по любому из пп.26-32, где последовательность 5’-ITR и/или последовательность 3’-ITR происходят из источника, отличного от AAV2.
38. rAAV по любому из пп.26-37, где упакованный геном дополнительно содержит одну или более энхансерных последовательностей.
39. rAAV по п.38, где энхансер выбран из энхансера транстиретина (enTTR), немедленного раннего энхансера гена цитомегаловируса (CMV), энхансера куриного β-актина (CBA), энхансера En34 и энхансера аполипопротеина (ApoE).
40. rAAV по п.39, где энхансер представляет собой энхансер enTTR.
41. rAAV по п.40, где энхансер содержит или состоит из SEQ ID NO: 3.
42. rAAV по пп. 40, 41, где энхансер расположен апстрим от промоторной последовательности.
43. rAAV по любому из пп.26-42, где упакованный геном дополнительно содержит одну или более интронных последовательностей.
44. rAAV по п.43, где интрон выбран из малого Т-интрона SV40, интрона бета-субъединицы кроличьего гемоглобина (rHBB), интрона IVS2 человеческого бета-глобина, химерного интрона Promega или интрона hFIX.
45. rAAV по п.44, где интрон представляет собой малый Т-интрон SV40.
46. rAAV по п.45, где интрон содержит или состоит из SEQ ID NO: 4.
47. rAAV по п.44, где интрон представляет собой интрон rHBB.
48. rAAV по п.47, где интрон содержит или состоит из SEQ ID NO: 5.
49. rAAV по любому из пп.26-48, где упакованный геном дополнительно содержит сигнальную последовательность полиаденилирования.
50. rAAV по п.49, где сигнальная последовательность полиаденилирования выбрана из сигнальной последовательности полиаденилирования SV40, сигнальной последовательности полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH) и сигнальной последовательности полиаденилирования бета-глобина кролика.
51. rAAV по п.50, где сигнальная последовательность полиаденилирования представляет собой сигнальную последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH).
52. rAAV по п.51, где сигнальная последовательность полиаденилирования содержит или состоит из SEQ ID NO: 6.
53. rAAV по п.50, где сигнальная последовательность полиаденилирования представляет собой сигнальную последовательность полиаденилирования SV40.
54. rAAV по п.53, где сигнальная последовательность полиаденилирования содержит или состоит из SEQ ID NO: 7.
55. rAAV, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-25.
56. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция, содержащая:
а. последовательность AAV 5’-инвертированного концевого повтора (ITR) с SEQ ID NO: 2;
b. последовательность энхансера SEQ ID NO: 3;
c. последовательность промотора SEQ ID NO: 12;
d. последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (ATP7B) SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 15; и
е. 3’-ITR AAV из SEQ ID NO: 2.
57. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.56, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (АТФ7В), представляет собой SEQ ID NO: 1.
58. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по п.56, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (АТФ7В), представляет собой SEQ ID NO: 15.
59. rAAV, содержащий капсид AAV и упакованный в нем векторный геном, где указанный векторный геном содержит:
а. последовательность AAV 5’-инвертированного концевого повтора (ITR) с SEQ ID NO: 2;
b. последовательность энхансера SEQ ID NO: 3;
c. последовательность промотора SEQ ID NO: 12;
d. последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (ATP7B) SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 15; и
е. 3’-ITR AAV из SEQ ID NO: 2.
60. rAAV по п.59, где векторный геном содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (ATP7B) SEQ ID NO: 1.
61. rAAV по п.59, где векторный геном содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (ATP7B) SEQ ID NO: 15.
62. Клетка-хозяин, содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-25 или 56-58, или rAAV по любому из пп.26-55 или 59-61.
63. Композиция, содержащая rAAV по любому из пп.26-55 или 59-61 и фармацевтически приемлемый носитель.
64. Рекомбинантный вектор, содержащий молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-25 или 56-58.
65. Рекомбинантный вектор по п.64, где вектор представляет собой аденоассоциированный вирусный вектор (AAV).
66. Рекомбинантный вектор по п.65, где вектор AAV представляет собой вектор AAV серотипа 9 (AAV9).
67. Способ повышения выхода rAAV для применения в лечении болезни Вильсона, включающий доставку рекомбинантного вектора по любому из пп.64-66 в культуру эукариотических клеток-хозяев и сбор rAAV из культуры эукариотических клеток.
68. Способ лечения болезни Вильсона у человека-субъекта, включающий введение человеку-субъекту терапевтически эффективного количества rAAV по любому из пп.26-55 или 59-61 или его композиции по п.63.
69. Способ по п.68, где rAAV или композицию вводят подкожно, внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшинно или внутривенно.
70. Способ по п.69, где rAAV или композицию вводят внутривенно.
11
14
71. Способ по любому из пп.68-70, где rAAV вводят в дозе примерно от 1 × 10 до примерно 1 × 10 геномных копий (гк/кг).
12
13
72. Способ по п.71, где rAAV вводят в дозе примерно от 1 × 10 до примерно 1 × 10 гк/кг.
73. Способ по любому из пп.68-72, где введение rAAV включает введение разовой дозы rAAV.
74. Способ по любому из пп.68-72, где введение rAAV включает введение нескольких доз rAAV.
75. Рекомбинантная нуклеиновокислотная конструкция по любому из пп.1-25 или 56-58, rAAV по любому из пп.26-55 или 59-61, композиция по п.63, клетка-хозяин по п.62, рекомбинантный вектор по любому из пп.64-66 или способ по любому из пп.67-74, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая усеченную человеческую медь-транспортирующую АТФазу 2 (ATP7B), содержит или состоит из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 15.
76. Рекомбинантная нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая, по меньшей мере, на 80% идентична SEQ ID NO: 14.
77. Рекомбинантная нуклеиновая кислота по п.76, где последовательность нуклеиновой кислоты включает SEQ ID NO: 14.