Особенности мутаций в генах kit, NRAS и BRAF при меланоме слизистых оболочек верхних дыхательно-пищеварительных путей (исследование с участием 21 пациента)

Особенности мутаций в генах KIT, NRAS и BRAF при меланоме слизистых оболочек верхних дыхательно-пищеварительных путей

А.В. Игнатова1, А.М. Строганова2, С.Л. Дранко2, А.И. Сендерович2, С.О. Подвязников1

ФГБОУДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России;

Россия, 123993 Москва, ул. Баррикадная, 2/1; 2НИИклинической онкологии ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;

Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 23

Контакты: Анастасия Валерьевна Игнатова annasurge@gmail.com

Цель исследования — определение частоты мутаций в генах KIT, NRAS и BRAF в 21-м образце меланомы слизистых оболочек (МСО) верхних дыхательно-пищеварительных путей (ВДПП).

Введение. МСО головы и шеи (или МСО ВДПП) — редко встречающиеся опухоли, которые развиваются из меланоцитов и характеризуются агрессивным клиническим течением. Они составляют более половины всех МСО.

Материалы и методы. Опухолевый материал для исследования был выделен из 21 образца опухолей, фиксированных формалином в парафиновых блоках. Оценка статуса генов BRAF, NRAS, C-KITосуществлялась на опухолевой дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) методом прямого секвенирования по Сэнгеру.

Результаты. Среди 21 МСО ВДПП выявлены 4 (19%) случая мутаций в генах KIT, NRAS и BRAF, имеющих спорадический характер, 1 (4,75 %) случай мутаций в генах NRAS и BRAF, возникающих с одинаковой частотой, и 2 (9,5%) случая мутаций в гене KIT в экзоне 11. Заключение. Согласно данным проведенного исследования, мутации в генах NRAS и BRAF, которые имеют значение при современной таргетной терапии, наиболее редко встречаются при МСО ВДПП по сравнению с мутациями в гене KIT.

Ключевые слова: голова и шея, верхние дыхательные и пищеварительные пути, меланома слизистых оболочек, меланома кожи, таргетная терапия, мутации генов BRAF, NRAS, KIT

DOI: 10.17 650 / 2222-1468-2017-7-1-69-74

KIT, NRAS and BRAF mutations in head and neck (upper aerodigestive tract) mucosal melanoma (a study of 21 cases) A.V. Ignatova1, A.M. Stroganova2, S.L. Dranko2, A.I. Senderovich2, S.O. Podvyaznikov'

1Russian Medical Academy of Continuous Professional Education at the Ministry of Health of Russia; 2/1 Barrikadnaya St., Moscow 123993, Russia; 2 Research Institute of Clinical Oncology of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center at the Ministry of Health of Russia;

23 Kashirskoe Sh., Moscow 115478, Russia

Objective. Determination of mutation rates in KIT, NRAS and BRAF genes in 21 samples of mucosal melanoma of the upper aerodigеstive tract. Background. Head and neck mucosal melanomas (or upper aerodigestive tract mucosal melanomas) are rare and aggressive tumors of me-lanocytic origin. Head and neck mucosal melanoma (HNMM) comprises over 50 % of all mucosal melanomas. The aim was to determine the KIT, NRAS and BRAF mutation frequencies in 21 series of primary HNMM.

Methods. Microdissected tumour cells were used from 21 formalin-fixed paraffin-embedded tumours. The tumour cells were screened for KIT, NRAS and BRAF mutations by direct sequencing.

Results. Overall, 19 % (4 out of 21) of HNMMs harboured KIT, NRAS or BRAF mutations. Mutations in these oncogenes occurred in a mutudlly exclusive manner. Both NRAS and BRAF mutations were identified at a similar frequency of 4,75 % each (1 and 1 out of 21), whereas KIT mutations were detected in 9,5 % (2 out of 21) of the HNMMs. KIT mutations were located in exon 11. Conclusion. Our findings show that NRAS and BRAF mutations, which are accessible for present targeted therapies, are only rarely present in HNMMs, whereas KIT mutations seem to be relatively more frequent.

Key words: head and neck, upper aerodigestive tract, mucosal melanoma, cutaneous melanoma, targeted therapy, mutations BRAF, NRAS, KIT

Введение рительных путей (ВДПП) — придаточных пазух носа,

По данным зарубежных авторов, меланомы слизи- слизистой оболочки полости носа и рта — составляют стых оболочек (МСО) верхних дыхательных и пищева- 1 % всех новообразований головы и шеи, 0,7—3,8 %

всех меланом и более 50 % меланом всех слизистых оболочек. МСО ВДПП локализуются (в убывающем порядке по частоте) в околоносовых пазухах, полости рта, глотке, гортани и верхней трети пищевода [1—4], ассоциируются с плохим клиническим исходом и обладают высоким метастатическим потенциалом. Пятилетняя безрецидивная выживаемость больных составляет от 0 до 20 % [5—7].

Эпидемиологические и статистические данные, касающиеся МСО ВДПП, в России не регистрируются из-за небольшого числа случаев и объединения МСО ВДПП с меланомами кожи и другими злокачественными опухолями верхнего отдела пищеварительного тракта и дыхательных путей.

Из-за близкого расположения анатомических областей (нижней носовой раковины, верхнечелюстных пазух, твердого неба, десен верхней челюсти) некоторые авторы полагают, что патогенез МСО ВДПП связан с нарушением эмбрионального развития [8]. Этиопа-тогенез МСО ВДПП остается неизвестным, существует мнение, что они чаще возникают на фоне меланоза слизистых оболочек [9]. В отличие от кожных и глазных форм МСО ВДПП не связаны с воздействием ультрафиолета [10]. Согласно последним исследованиям [3], основным этиопатогенетическим механизмом образования меланом считаются генетические изменения во внутриклеточных сигнальных путях. Каскадная гиперактивация митоген-активированных протеинкиназ MEK и ERK и Akt фосфатидилинозитол-3-киназного сигнального пути (PI3K) играют важную роль в патогенезе меланомы. Активация данных путей при мела-номе кожи и слизистых оболочек происходит вследствие активирующих мутаций в генах BRAF, NRAS и KIT, однако молекулярно-генетические характеристики МСО существенно отличаются от таковых при меланоме кожи. Активирующие мутации в генах BRAF и NRAS обнаруживаются в большинстве случаев заболеваний меланомой кожи (50 и 20 % соответственно), в то время как мутации в гене KIT составляют около 2 % [11].

Согласно данным зарубежных исследований, посвященных МСО различной локализации, наиболее высокая частота мутаций в гене KIT выявлена при ме-ланоме вульвы (35 %) в сравнении с опухолями других локализаций (10 %). Это свидетельствует о разной частоте мутаций в гене KIT и зависимости от анатомической локализации опухоли [12].

Однако все ранее опубликованные исследования, посвященные мутациям при МСО ВДПП, включали малое количество исследуемых образцов опухоли, вследствие чего данные о частоте тех или иных мутаций сильно варьируют: KIT - 0-40 %, NRAS - 22-60 % и BRAF - 0-6 % [13, 14].

С учетом представленных данных можно говорить о том, что для МСО ВДПП характерны относительное

увеличение частоты мутаций генов KIT и NRAS и снижение частоты мутаций гена BRAF по сравнению с ме-ланомой кожи.

МСО ВДПП свойственны агрессивное клиническое течение, частые рецидивы и высокая устойчивость к цитотоксическим препаратам. Таргетная терапия является современным и эффективным методом лечения, успешно применяемым при меланоме кожи. На сегодняшний день данный вид терапии только начинает развиваться и применяться при МСО. Лечение этими препаратами при наличии соответствующих мутаций, согласно исследованиям, значительно увеличивает выживаемость без прогрессирования заболевания и общую выживаемость при меланоме в сравнении с химиотерапией [15, 16].

С учетом редкости МСО ВДПП, различных условий и малых групп больных при проведении молеку-лярно-генетического анализа частота мутаций в генах KIT, NRAS и BRAF остается неясной. В России на сегодняшний день не проводился анализ данных моле-кулярно-генетических исследований с целью изучения частоты мутаций в генах KIT, NRAS и BRAF при МСО ВДПП. Целью данного исследования является определение частоты указанных мутаций с использованием 21 образца опухолевого материала пациентов, наблюдавшихся в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России с 2005 по 2016 г.

Материалы и методы

В период с 1986 по 2016 г. в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России было проведено лечение 73 пациентам с диагнозом МСО ВДПП. Архивный материал больных, наблюдавшихся с 1986 по 2005 г., не был включен в исследование ввиду большого срока давности. Исследованию подлежал архивный патолого-анатомический материал в виде фиксированных в формалине образцов опухоли, заключенных в парафиновые блоки, взятый у 21 больного, получавшего лечение с 2005 по 2016 г., за исключением опухолевого материала, подвергавшегося ранее процедуре декальцинации. В ходе исследования проведен анализ клинического течения, особенностей диагностики и эффективности проведенного лечения.

Изучалась зависимость между частотой генных мутаций и прогнозом заболевания. Статус генов BRAF, NRAS, C-KIT оценивался на опухолевой дезоксирибо-нуклеиновой кислоте (ДНК), полученной из парафиновых блоков.

Экстракция ДНК производилась с помощью коммерческого набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Германия). С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с обратной транскрипцией в реальном времени и ПЦР с высокочувствительным анализом плавления (Rotor Gene 6000, Qiagen, Германия) в гене BRAF были проанализированы кодоны 597—601, в гене

NRAS - кодоны 12-13 (экзон 2) и кодон 61 (экзон 3). С помощью классической ПЦР (C1000 Touch BioRad, USA) с последующим прямым секвенированием по Сэнгеру (ABI Prism 3500, Applied Biosystems, USA) в гене C-KIT были исследованы экзоны 9, 11, 13 и 17.

Результаты молекулярно-генетического анализа были соотнесены с клинической картиной заболевания и патоморфологическими характеристиками опухоли. Однако из-за небольшого количества пациентов и единичных выявленных мутаций статистическая обработка результатов исследования не проводилась.

Результаты

Всего в исследование были включены 15 женщин и 6 мужчин в возрасте от 31 до 84 лет, средний возраст составил 58 лет. Большинство опухолей локализовались в полости носа (n = 17, в том числе в 2 случаях с прорастанием костных структур верхней челюсти), по 2 случая - в околоносовых пазухах и в области верхней челюсти (альвеолярные отростки). В исследуемой группе большинство опухолевых процессов (n = 13) соответствовало III стадии (по международной классификации стадий злокачественных новообразований TNM), в 8 случаях распространенность соответствовала IVa стадии. Пациенты с IVb и IVC стадиями не были включены в исследование. Также у большинства больных по характеру строения встречались эпителиоиднокле-точные пигментные МСО ВДПП (табл. 1).

По данным проведенного нами молекулярно-гене-тического исследования (табл. 2) из 21 образца выявлена 1 мутация V600E гена BRAF в экзоне 15 и еще 1 мутация G13V гена NRAS - в экзоне 2. Мутация гена C-KIT представлена двумя случаями - V555I (в кодоне 555) и W557G (в кодоне 557).

В процентном соотношении частота мутации V600E гена BRAF составила 4,75 %, NRAS - 4,75 % и C-KIT - 9,5 %, что сопоставимо с зарубежными данными, представленными M. Turri-Zanoni и соавт. (2013) [14] и A. Zebary и соавт. (2013) [17], в которых исследуемые группы составили 32 и 56 пациентов соответственно.

Согласно данным зарубежной литературы, мутации гена BRAF встречаются намного реже при МСО ВДПП, чем при меланоме кожи. Мутация V600E гена BRAF является миссенс-мутацией, где нуклеотидная замена T1799A в экзоне 15 приводит к замене валина на глутаминовую кислоту (V600E) в кодоне 600 [15, 16, 18].

В гене NRAS во 2-м экзоне миссенс-мутация представлена нуклеотидной заменой гуанина на тимин (38G>T), что ведет к замене в кодоне 13 глицина на ва-лин (G13V) [19].

В гене C-KIT были выявлены 2 варианта миссенс-мутации: 1) нуклеотидная замена 1663G>A (гуанина на аденин) в экзоне 11 гена C-KIT приводит к замене

Таблица 1. Общая характеристика пациентов с меланомой слизистых оболочек верхних дыхательно-пищеварительных путей, n = 21 Table 1. Characteristics ofpatients with mucosal melanoma of the upper aerodigestive tract, n = 21

Число

Данные больных и признаки имеющейся пациен-

у них опухоли тов

Patient data and tumor characteristics Number of patients

Возраст на момент постановки диагноза, лет:

Age at diagnosis, years:

средний 58

mean

мин—макс 31-84

min—max

Пол, n (%):

Sex, n (%):

мужской 6

male

женский 15

female

Локализация, n (%):

Localization, n (%):

полость носа 17

nasal cavity

околоносовые пазухи 2

paranasal sinuses

верхняя челюсть 2

maxilla

Тип клеточного строения опухоли, n (%):

Type of tumor cell structure, n (%):

эпителиоидноклеточный 11

epithelioid cell

веретеноклеточный 4

spindle cell

невоклеточный 2

nevus cell

смешанный 4

mixed

Наличие пигмента, n (%):

Pigment, n (%):

есть 15

present

нет 6

absent

Стадия по TNM:

TNM stage:

III 13

IVa 8

Статус в настоящее время, n (%):

Current state, n (%):

живы 13

alive

умерли 8

dead

Сокращения: TNM (tumor, nodus и metastasis) — международная классификация стадий злокачественных новообразований.

Abbreviations: TNM stands for tumor, nodus and metastasis, the International Classification of Malignant Tumors.

Таблица 2. Характеристика выявленных мутаций при меланоме слизистых оболочек верхних дыхательно-пищеварительных путей Table 2. Characteristics of identified mutations in mucosal melanoma of the upper aerodigеstive tract

Мужской Male

Женский Female

Мужской Male

Женский Female

31

41

60 34

Верхняя челюсть Maxilla

Полость носа Nasal cavity

KIT

KIT

NRAS

BRAF

11

11

15

c. T1669G p. W557G

c. G1663A p. V555I

c. G38T

c. T1799A

p. G13V

p. V600E

2

валина на изолейцин (V555I) в кодоне 555 [18]; 2) ну-клеотидная замена тимина на гуанин в (1669T>G) приводит к замене триптофана на глицин (W557G) в кодоне 557 [18].

Согласно данным проведенного нами исследования, наиболее часто мутации встречались при локализации опухоли в полости носа, и только в 1 случае обнаружена мутация гена C-KIT в опухоли слизистой оболочки верхней челюсти. При локализации в околоносовых пазухах мутации в генах KIT, NRAS и BRAF не выявлены. Пациентам с выявленными мутациями генов KIT и NRAS молекулярно-генетический анализ был выполнен посмертно, поэтому данные проведенного анализа не смогли повлиять на результаты их лечения. У пациента с мутацией гена BRAF по поводу прогрессирования заболевания и развития отдаленных метастазов была проведена таргетная терапия вемура-фенибом с полным эффектом, однако через 12 мес, вероятно вследствие развития лекарственной устойчивости, появились признаки прогрессирования заболевания. Пациенту произведена смена таргетной терапии на траметиниб (ингибитор протеинтирозинкиназы MEK1 и MEK2) и дабрафениб (конкурентный селективный ингибитор RAF-киназы).

Обсуждение

В литературе информация о характере и частоте мутаций при МСО ВДПП представлена по данным малочисленных исследований с участием малых групп пациентов (табл. 3). В России подобные исследования на сегодняшний день не проводились. В нашем исследовании мы попытались отразить частоту наиболее известных и клинически значимых на данных момент мутаций, известных при меланоме кожи. Согласно

результатам проведенного нами исследования, частота мутаций в генах KIT, NRAS и BRAF была представлена 9,5, 4,75 и 4,75 % соответственно. Мутации в гене KIT обнаружены в 2 случаях из 21, что, по мнению авторов зарубежных публикаций, может быть обусловлено разной частотой мутаций в меланомах слизистых оболочек в зависимости от локализации [12]. Однако полученные данные коррелируют с результатами исследований, проведенных ранее M. Turri-Zanoni и соавт. (2013) [14].

Проведенный нами анализ результатов наиболее крупных исследований за последние 10 лет в итоге показал, что наиболее часто при МСО ВДПП выявлялись мутации в генах NRAS (16,6 %) и KIT(8,0 %), самими редкими были мутации в гене BRAF (2,7 %). С учетом небольшой исследуемой группы пациентов, малого количества выявленных мутаций полученные результаты нельзя интерпретировать как статистически достоверные. Согласно общемировым данным (см. табл. 3), относительно высокая общая частота опухолей с мутациями гена NRAS может служить основой для проведения клинических исследований с использованием ингибиторов MEK. Учитывая частоту выявления мутаций в генах KIT и BRAF, имеет смысл предполагать, что таргетная терапия (ингибиторы KIT и BRAF) может быть эффективно использована только у меньшинства пациентов.

По итоговым данным нашего исследования, мутации в генах KIT, NRAS и BRAF, которые имеют значение для проведения современной таргетной терапии, редко встречаются при МСО ВДПП в отличие от меланомы кожи. Среди выявленных мутаций наиболее часто обнаруживались мутации в гене KIT. Однако при неблагоприятном прогнозе заболевания определение клинически

Tаблица 3. Частота выявления мутаций KIT, NRAS и BRAFпри меланоме слизистых оболочек верхних дыхательно-пищеварительных путей, %

Table 3. Mutation rates for KIT, NRAS and BRAF genes in mucosal melanoma of the upper aerodigstive tract, %

Источники Sources МСО ВДПП UADT MM KIT NRAS BRAF

Текущее исследование This study 21 9,5

C. Beadling и соавт.

R. Carvajal и соавт.

N. Schoenewolf и соавт. (2012) [21] N. Schoenewolf et al. (2012) [21] 12 0,0 (0/12) _*** _***

M. Turri-Zanoni и соавт.

A. Zebary и соавт.

Всего Total 151 8,0

*29 меланом полости носа и околоносовых пазух/ 7 меланом полости рта; **мутации гена NRAS оказались неспецифичны для МСО ВДПП; ***мутации не выявлены.

Сокращения: МСО — меланома слизистых оболочек; ВДПП — верхние дыхательно-пищеварительные пути, KIT, NRAS и BRAF — гены.

*29 melanomas of the nasal cavity and paranasal sinuses /7 melanomas of the oral cavity; ** NRAS gene mutations are not specific for UADT MM; ***no mutations identified.

Abbreviations: MM — mucosal melanoma; UADT — upper aerodigеstive tract; KIT, NRAS and BRAF — genes.

значимых соматических мутаций при МСО ВДПП может в дальнейшем улучшить диагностику и оптимизировать методы лечения распространенных форм опухоли.

Не вызывает сомнений то, что требуется дальнейшее изучение потенциальных мишеней для таргетной терапии с учетом молекулярно-генетических особенностей МСО.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Weber C.O. Surgical experience and research, in addition to interesting observations from the Surgical Clinic and the Protestant Hospital Bonn. Berlin, Germany: G. Reimer, 1859. R 304-5.

2. Manolidis S., Donald P.J. Malignant mucosal melanoma of the head and neck: review of the literature and report of 14 patients. Cancer 1997;80:1373-86. PMID: 9338460.

3. Lourenjo S.V., Sangueza M., Sotto M.N. et al. Primary oral mucosal melanoma:

a series of 35 new cases from South America. Am J Dermatopathol 2009;31:323-30. DOI: 10.1097/DAD.0b013e3181a0d37c. PMID: 19461235.

4. Anderson L.J., Berthelsen A., Hansen H.S. Malignant melanoma of the upper respiratory tract and the oral cavity. J Otolaryngol 1992;21:180-5.

5. Thompson L.D., Weneke J.A., Miettinen M. Sinonasal tract and nasopharyngeal melanomas: a clinicopathologic study

of 115 cases with a proposed staging system. Am J Surg Pathol 2003;27:594-611. PMID: 12717245.

6. Patel S.G., Prasad M.L., Escrig M. Primary mucosal malignant melanoma of the head and neck. Head

Neck 2002;24:247-57. PMID: 11891956.

7. Owens J.M., Roberts D.B., Myers J.N. The role of postoperative adjuvantradiation therapy in the treatment of mucosal melanomas of the head and neck region. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2003;129:864-8.

DOI: 10.1001/archotol.129.8.864. PMID: 12925346.

8. Gorsky M., Epstein J.B. Melanoma arising from the mucosal surfaces of the head and neck. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1998;86:715-9.

PMID: 9868730.

9. Trap T.K., Fu Y., Calcaterra T.C. Melanoma of the nasal and paranasal sinus mu-

cosa. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1987;113(10):1086- 9. PMID: 3620131.

10. Papaspyrou G., Garbe C., Schadendorf D. et al. Mucosal melanomas of the head and neck: new aspects of the clinical outcome, molecular pathology, and treatment with c-kit inhibitors. Melanoma Res 2011;21: 475-82.

DOI: 10.1097/CMR.0b013e32834b58cf. PMID: 21897303.

11. Davies H., Bignell G.R., Cox C. et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002;417(6892):949-54. DOI: 10.1038/nature00766.

PMID: 12068308.

12. Omholt K., Grafström E., Kanter-Lewensohn L. et al. KIT pathway alterations in mucosal melanomas of the vulva and other sites. Clin Cancer Res 2011;17:3933-42.

DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-10-2917. PMID: 21680547.

13. Carvajal R.D., Spencer S.A.,

Lydiatt W. Mucosal melanoma: a clinically and biologically unique disease entity. J Natl Compr Cancer Netw 2012;10(3):345—56. PMID: 22393195.

14. Turri-Zanoni M., Medicina D., Lombar-di D. et al. Sinonasal mucosal melanoma: molecular profile and therapeutic implications from a series of 32 cases.

Head Neck 2013;35:1066-77. DOI: 10.1002/hed.23079. PMID: 22791410.

15. Ascierto P.A., Minor D., Ribas A. et al. Phase II trial

in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol 2013;31(26):3205-11. DOI: 10.1200/JC0.2013.49.8691. PMID: 23918947.

16. Chapman P.B., Hauschild A., Robert C. et al. (BRIM-3 Study Group.). Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation.

N Engl J Med 2011;364(26):2507-16. DOI: 10.1056/NEJMoa1103782. PMID: 21639808.

17. Zebary A., Jangard M., Omholt K. et al. KIT, NRAS and BRAF mutations in sino-nasal mucosal melanoma: a study

of 56 cases: British Journal of Cancer 2013;109:559-64. DOI: 10.1038/bjc.2013.373. PMID: 23860532.

18. Gorden A., Osman I., Gai W. et al. Analysis of BRAF and N-RAS mutations in meta-static melanoma tissues. Cancer research 2003;63(14):3955-7. PMID: 12873990.

19. Wilson M.A., Zhao F., Letrero R. et al. Correlation of somatic mutations and

clinical outcome in melanoma patients treated with Carboplatin, Paclitaxel, and sorafenib. Clin Cancer Res 2014;20(12):3328-37. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-14-0093. PMID: 24714776.

20. Beadling C., Jacobson-Dunlop E., Hodi F.S. et al. KIT gene mutations and copy number in melanoma subtypes. Clin Cancer Res 2008;14:6821-8. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-08-0575. PMID: 18980976.

21. Schoenewolf N.L., Bull C., Belloni B. et al. Sinonasal, genital and acrolentigi-nous melanomas show distinct characteristics of KIT expression and mutations. Eur J Cancer 2012;48: 1842-52.

DOI: 10.1016/j.ejca.2012.02.049. PMID: 22464346.