Патогенетическая роль цитотоксических лимфоцитов у доношенных новорожденных с респираторным дистресс-синдромом

Журнал фундаментальной медицины и биологии оригинальные статьи

УДК 616.89-008.481-053

М.В. Дударева, В.А. Линде

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ РОЛЬ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ У ДОНОШЕННЫХ НОВОРОЖДЕННЫХ С РЕСПИРАТОРНЫМ ДИСТРЕСС-СИНДРОМОМ

Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии

Цель: поиск объективных высокочувствительных и специфичных маркеров для ранней диагностики сепсиса у новорожденных.

Материалы и методы: программа обследования включала определение содержания натуральных киллеров -NK(CD3-CD16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+), содержание количества цитотоксических клеток CD3+CD8+, содержания CD14+CD16+ моноцитов, содержания CD14+HLA-DR+ и экспрессии Толл-подобных рецепторов на моноцитах периферической крови новорожденных с дыхательными расстройствами.

Результаты: в периферической крови новорожденных с респираторными нарушениями выявлена сниженная экспрессия TLR-2 (CD14+CD282+) и TLR-4 (CD14+CD284+). Наиболее высокие показатели процентного содержания TLR-2, CD14+CD16+ и наиболее низкая экспрессия CD14+HLA-DR+ регистрировались у новорожденных с дыхательными расстройствами, осложненных сепсисом.

Выводы: полученные данные свидетельствуют о важной роли механизмов локальной защиты в течении и исходе дыхательных расстройств у новорожденных.

Ключевые слова: новорожденные, РДС, сепсис, натуральные киллеры, моноциты.

M.V. Dudareva, V^. Linde

PATHOGENETIC ROLE OF CYTOTOXIC LYMPHOCYTES IN FULL-TERM NEWBORNS WITH RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME

Rostov Scientific and Research Institute of Obstetrics and Pediatrics

Purpose: Search of objective highly sensitive and specific markers for early recognition of sepsis in newborns.

Materials and methods: The program of examination included the determination of the content of natural killer cells - NK (CD3-CD16+56+) and T-NK (CD3+CD16+56+), contentofcytotoxiccells CD3+CD8+, content of CD14+CD16+ monocytes, content of CD14+HLA-DR+ and the expression of Toll-like receptors at the monocytes of the peripheral blood of newborns with respiratory distress.

Results: Reduced expression of TLR-2 (CD14+CD282+) and TLR-4 (CD14+CD284+) was detected in the peripheral blood of newborns with respiratory distress. The highest indices of the percentage of TLR-2, CD14+CD16+ and the lowest expression of CD14+HLA-DR+ were registered in the newborns with respiratory distress complicated by sepsis.

Summary: The received data indicate an important role of the mechanisms of local protection in the course of respiratory distress in newborns and in the outcome of it.

Keywords: newborns, RDS, sepsis, natural killer cells, monocytes.

оригинальные статьи

Журнал фундаментальной медицины и биологии

Введение

В последнее время в мировой практике достигнут значительный прогресс в совершенствовании медицинских технологий по выхаживанию новорожденных детей с респираторными нарушениями [1]. Среди респираторных нарушений наиболее частой причиной перинатальной заболеваемости и смертности являются респираторный дистресс-синдром (РДС), мекониальная аспирация, асфиксия и не-онатальная пневмония [2]. При этом смертность в перинатальном периоде при этих состояниях составляет более 18%, а важнейшим фактором, осложняющим их течение, является развитие бактериальной инфекции. В последнее время усилен поиск иммунологических диагностических тестов инфекционного процесса у новорожденных в критических состояниях, особенно для ранней диагностики с целью назначения превентивной терапии.

Цель данной работы - изучение цитотоксиче-ской системы лимфоцитов с высоким цитоток-сическим потенциалом у новорожденных с респираторным дистресс-синдромом и у здоровых новорожденных.

Материалы и методы

Исследование выполнено на базе отделения реанимации и интенсивной терапии научно-исследовательского института акушерства и педиатрии. Дети, рожденные в родильных домах города Ростова-на-Дону и области, поступали в течение первых суток жизни в реанимационное отделение РНИИАП.

Обследованы 222 доношенных новорожденных с гестационным возрастом от 39 до 41 недели, массой тела от 3700 до 4200 г, с оценкой по шкале Апгар 3,2+1,6 баллов. Тяжесть состояния новорожденных была обусловлена преимущественно тяжелой дыхательной недостаточностью. Все дети были переведены на искусственную вентиляцию легких (ИВЛ) в родильном зале и транспортированы в отделение реанимации. Новорожденные поступили в отделение в тяжелом и крайне тяжелом состоянии, с выраженными нарушениями деятельности дыхательной, сердечно-сосудистой, нервной системы, с глубокими метаболическими расстройствами. Режимы ИВЛ подбирались соответственно данным кислотно-основного состояния крови и динамического клинического наблюдения за состоянием ребенка. Неврологическая симптоматика отмечалась у 100% новорожденных основной группы, вошедших в исследование.

Всем пациентам в процессе нахождения в отделении реанимации, осуществлялось динамическое клинико-лабораторное и иммунологическое обследование при поступлении, на 3-5-е сутки и 20-е сутки (или исходе заболевания).

У новорожденных детей при поступлении не было зарегистрировано клинических признаков бактериального инфицирования. При наблюдении в динамике на основании клинико-лаборатор-ных данных было установлено, что к 3-5 суткам пребывания в реанимационном отделении у 17 —

ти новорожденных детей развился неонатальныи сепсис. При постановке диагноза сепсис клини-ко-анамнестические и лабораторные данные были подтверждены положительной гемокультурой. В 5-х случаях одновременно выделялись возбудители в крови и ликворе, в 12-ти случаях — в крови и в аспирате из трахеи. Наиболее часто выявлялись Pseudomonasaeruginosa, Kl. pneumoniae, Strept. epidermidis.

Обследуемые новорожденные родились у женщин с отягощенным соматическим и акушерско-ги-некологическим анамнезом при осложненном течении беременности и родов.

У матерей детей основной группы экстрагени-тальная патология была представлена следующим образом: вегетососудистая дистония составила 36,96%, заболевания мочевыделительной системы — 27,7%, заболевания ЛОР-органов — 8,6%, хронический гастрит — 6,8%, ожирение II — III степени - 11,8%.

Анализ гинекологической заболеваемости у матерей детей основной группы показал, что у них чаще всего встречался кольпит — 20,63%, бактериальный вагиноз — 17%, аднексит — 11,34%, эндо-цервицит — 8,16%, эрозия шейки матки — 2,72%.

Из осложнений течения данной беременности у матерей детей основной группы наиболее часто регистрировалась фетоплацентарная недостаточность (ФПН) — 42%, поздний гестоз —18,8%, угроза прерывания — 25,9%, анемия — 22,7%, много-водие — 12,2%, нарушение маточно-плацентарного кровообращения — 8,6%, хроническая внутриутробная гипоксия плода — 22%.

Очевидно, что фетоплацентарная недостаточность, хроническая гипоксия плода, ранний и поздний гестоз, угроза прерывания беременности наиболее часто отягощали течение беременности у матерей детей основной группы.

Контрольную группу для новорожденных с дыхательными расстройствами составили доношенные здоровые новорожденные (n=38). У новорожденных контрольной группы отмечалось физиологическое течение периода адаптации. Все они не имели соматических, неврологических нарушений и были выписаны домой в удовлетворительном состоянии на 4-5 сутки жизни.

29 матерей детей контрольной группы (76,3%) не имели соматической патологии, в то время как у 9 (23,7%) имелась соматическая патология: ве-гетососудистая дистония - 5,3%, заболевания мо-чевыделительной системы — 2,6%, хронический гастрит — 5,3%, хронический тонзиллит — 2,6%, ожирение II — III степени у 7,9%. Необходимо отметить, что у матерей детей контрольной группы только в 2,63% случаев встречался аднексит, а фетоплацентарная недостаточность и хроническая гипоксия плода отмечалась только в 2,6% случаев.

Исследование было одобрено этическим комитетом РНИИАП. У родителей пациентов было получено информированное согласие на все проводимые исследования.

Исследования проводили на 3-х цветном проточном цитометре "BeckmanCoulter" (США) с использованием реагентов фирмы "BeckmanCoulter".

Журнал фундаментальной медицины и биологии

оригинальные статьи

Лизис осуществляли ручным методом раствором "OptiLyseC" "ВесктапСоикег". Для корректного исключения из зоны анализа всех частиц, которые не соответствовали по размерам и гранулярности живым моноцитам, вводили необходимые логические ограничения в гистограммы распределения частиц по малоугловому, боковому светорассеянию.

При определении статистической обоснованности различия исследуемых групп применялся критерий Манна-Уитни для независимых групп и критерий Вилкоксона для связанных групп. В расчет принимались случаи при максимальном уровне ошибки первого рода р<0,05.

Результаты и обсуждение

Натуральные киллеры ^К) являются третьей популяцией лимфоцитов иммунной системы, это клетки врожденного иммунитета. Механизм действия NK- клеток заключается в индукции апоптоза и перфорин-зависимом лизисе. Т^К (CD3+CD16+56+) — уникальный подкласс как Т-клеток, так и NK-клеток, которые регулируют продукцию, а также сами являются продуцентами важнейших цитокинов, направляющих течение иммунной реакции. Их значение важно у детей раннего возраста, когда система адаптивного иммунитета только формируется.

Следует отметить, что у анализируемой группы новорожденных детей было достоверно снижено как абсолютное, так и относительное содержание ^^3^16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+) по сравнению с таковыми в группе здоровых новорожденных ^3^16+56+ - 2,15+0,22% против 7,44+0,31% и 0,05+0,01 х109/л против 0,25+ 0,01 х109/л; CD3+CD16+56+ - 0,76+0,05% против 2,52+0,06% и 0,02+0,004 х109/л против 0,08+0,002 x109/л) (р<0,05). На 3-5-е сутки динамического наблюдения и к 20-м суткам заболевания не наблюдалось увеличения содержания в периферической крови ^^3^16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о выраженной редукции клеток, обладающих киллерной активностью.

У новорожденных с РДС было статистически достоверно снижено процентное и абсолютное содержание количества цитотоксических клеток CD3+CD8+ по сравнению с группой контроля (р<0,05). Эта особенность эффекторного звена иммунного реагирования может лежать в основе сниженной резистентности новорожденных детей к определенным видам бактерий, грибов и вирусов, недостаточной способности к ограничению репликации вирусов и к элиминации данных антигенов.

Нами были проведены исследования иммунного статуса у 17-ти новорожденных с РДС, основное заболевание которых осложнилось бактериальным сепсисом. Ятрогенными факторами высокого риска генерализации бактериальной инфекции у новорожденных явились: ИВЛ аппаратная (интубация трахеи) > 3-х дней, катетеризация периферических вен, длительность внутривенных инфузий.

Как показали результаты проведенных нами ис-

следований, цитотоксический потенциал клеток иммунной системы новорожденных детей с РДС и документированным сепсисом оказался сниженным по сравнению с таковыми без сепсиса. У новорожденных с РДС и документированным сепсисом отмечалось достоверно значимое снижение абсолютного и относительного содержания натуральных киллеров - NK(CD3-CD16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+) по сравнению с таковыми без септических осложнений (р<0,05).

В процессе динамического наблюдения продолжалось достоверное снижение NK(CD3-CD16+56+) и T-NK(CD3+CD16+56+) во все сроки наблюдения.

Резюмируя вышеизложенное можно заключить, что эта особенность эффекторного звена иммунологического реагирования, по-видимому, свидетельствует о напряжении защитной функции натуральных киллеров на фоне бактериальной инфекции и может лежать в основе сниженной резистентности новорожденных детей к инфекционным агентам.

Нами были проведены исследования иммунного статуса у 8-ми новорожденных с РДС, основное заболевание которых осложнилось бактериальным сепсисом и имело неблагоприятный исход заболевания, несмотря на использование различных методов респираторной терапии, новейших антибактериальных препаратов, совершенствование ин-фузионной терапии и парентерального питания.

Было установлено, что у новорожденных с летальным исходом более выраженные отклонения, проявляющиеся снижением содержания в периферической крови ^ ^3^16+56+) - 0,6%, Т^К (CD3+CD16+56+) - 0,15% и CD3+CD8+ - 10,95%.

Полученные нами данные свидетельствовали о резко сниженной защитной функции натуральных киллеров.

Анализ содержания CD14+CD16+ моноцитов показал, что здоровые новорожденные имели значительно более низкий процент CD14+CD16+, чем у новорожденных с РДС (5,51+0,15% против 9,72+0,52%) (р<0,05).

Существенное увеличение экспрессии CD14+CD16+ моноцитов наблюдалось у новорожденных с РДС? осложненных сепсисом (22,25+3,57%) (р<0,05). У новорожденных с РДС и летальным исходом было определено повышение экспрессии на моноцитах CD16+ рецепторов до 33,4+3,1% (р<0,05).

Очевидно, что мониторинговое определение относительного содержания CD16+ на моноцитах позволяет с высокой степенью вероятности диагностировать развитие неонатального сепсиса у новорожденных детей с РДС на доклинической стадии.

Полученные результаты позволяют оптимизировать интенсивную терапию в плане проведения обоснованной иммунокоррекции.

HLA-DR — белок, принадлежащий к молекулам гистосовместимоти 11 класса. Экспрессируется в основном на антиген — представляющих клетках (моноциты, макрофаги, дендритные клетки, В— клетки). Повышение экспрессии HLA-DR+ на лимфоцитах происходит при воспалительных процес-

оригинальные статьи

Журнал фундаментальной медицины и биологии

сах под действием цитокинов. В целом, повышение экспрессии этой молекулы можно ожидать при любых заболеваниях, связанных с воспалением. Однако наиболее информативной является оценка экспрессии HLA-DR+ на моноцитах.

Так, у новорожденных с РДС по сравнению со здоровыми новорожденными, была достоверно снижена экспрессия HLA-DR+ на моноцитах (64,68+0,82% против 86,07+0,92%) (р<0,05).

Моноциты у здоровых новорожденных экс-прессируют на своей поверхности молекулы HLA-DR в высокой плотности. Однако при патологических состояниях (септические, воспалительные, сердечно-сосудистые) экспрессия HLA-DR+ на моноцитах снижается, и моноциты не выполняют антиген-представляющую функцию и не обладают способностью продуцировать медиаторы в ответ на стимуляцию разными антигенами. При снижении экспрессии HLA-DR+ на моноцитах увеличивается риск развития и хронизации инфекционно-воспа-лительных процессов.

Сравнительная оценка содержания CD14+HLA-DR+ у новорожденных с РДС осложненных сепсисом и новорожденных с РДС без сепсиса показала, что у детей с сепсисом достоверно резко снижена экспрессия HLA-DR+ на моноцитах (42,3+3,94% против 65,8+1.9%) (р<0,05). И хотя к 20-м суткам заболевания уровень экспрессии CD14+HLA-DR+ у новорожденных осложненных сепсисом составил 53,14+4,65 %, нормализации данного параметра не наблюдалось (р<0,05).

Таким образом, нашими исследованиями установлено, что моноциты новорожденных с септическими осложнениями в значительно меньшей

степени экспрессируютHLA-DR+, чем моноциты новорожденных без таковых. Мониторинговое определение относительного содержания HLA-DR+ на моноцитах позволяет с высокой степенью вероятности диагностировать развитие неонаталь-ного сепсиса у новорожденных детей на доклинической стадии. (Патент на изобретение «Способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипоксическим поражением ЦНС» №2374646 от 27.11.2009 г.).

Выводы

Таким образом, из приведенного выше текста следует:

Разработанный «Способ ранней диагностики развития неонатального сепсиса у новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и гипокси-ческим поражением ЦНС», дополняя известные методы лабораторной диагностики, позволяет своевременно и обоснованно назначать патогенетически обоснованную терапию, способствуя повышению выживаемости новорожденных и сокращая продолжительность терапии.

Цитотоксический потенциал клеток иммунной системы новорожденных детей с РДС снижен по сравнению со здоровыми новорожденными.

Моноциты новорожденных с септическими осложнениями в значительно большей степени экс-прессируют CD16+, чем моноциты новорожденных без таковых.

Уровень CD14+CD16+ может служить прогностическим маркером септического осложнения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Солдатова И.Г., Дегтярева М.В., Володин Н.Н. и соавт. Применение Ронколейкина в комплексной терапии неонатального сепсиса // Вопросы гематологии, онкологии и иммунопатологии. - 2003. - Т.2., №1. - С. 62-65.

2. Дементьева Г.М., Рюмина И.И., Кушнарева М.В. Актуальные проблемы пульмонологии новорожденных // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2001. - № 5. - С.14-19.