ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДИФТЕРИЙНЫХ МИКРОБОВ
NUTRIENT MEDIUM FOR CULTURING DIPHTHERIA MICROBES

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для культивирования дифтерийных микробов в искусственных питательных средах при бактериологической диагностике дифтерии.
В постэпидемический период основным источником дифтерийной инфекции являются бактерионосители токсигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae. Наиболее опасны в этом отношении бактерионосители, страдающие острыми заболеваниями верхних дыхательных путей (Маркина С.С., Корженкова М.П., Максимова Н.М. Дифтерия // Фельдшер и акушерка. - 1992. - №1. - С.13-19), обусловленными сопутствующей микрофлорой, в частности стафилококками. При этом на долю стафилококков приходится 71,8% от общего числа микробов, выделенных из верхних дыхательных путей (Извин А.И., Катаева Л.В. Микробный пейзаж слизистой оболочки верхних дыхательных путей в норме и патологии // Вестник отоларингологии. - 2009. - №2. - С.64-68). Известно, что возбудители дифтерии и стафилококки, присутствуя на эпителии верхних дыхательных путей, не вступают в антагонистические взаимоотношения друг с другом (Харсеева Г.Г., Алутина Э.Л., Васильева Г.И. Апоптоз макрофагов как один из механизмов патогенного действия возбудителя дифтерии // Журн. микробиол. и эпидемиол. - 2012. - №5. - С.63-66). В связи с этим, в материале, взятом для выделения возбудителя дифтерии от больных и бактерионосителей, содержатся помимо Corynebacterium diphtheriae представители сопутствующей микрофлоры - стафилококки, которые создают сложности при выделении дифтерийных микробов на питательных средах.
Поэтому разработка новых питательных сред для культивирования дифтерийных микробов, обладающих улучшенными ингибирующими свойствами в отношении стафилококков, является актуальной задачей современной микробиологии.
Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе найдены различные питательные среды для культивирования дифтерийных микробов.
Так, в работе Мазуровой И.К., Бочковой В.А., Сальниковой Г.П. (Методические рекомендации «Бактериологические исследования при дифтерийной инфекции», Москва. - 1980. - с.67) описана питательная среда Бучина, применяемая для культивирования дифтерийных микробов. Она содержит на 100 мл питательной агаровой основы 5 мл дефибринированной крови.
В работе Мазуровой И.К., Мельникова В.Г., Комбаровой С.Ю., Борисовой О.Ю. (Методические указания МУ 4.2.698 - 98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - МЗ РФ. - Москва, 1998 г. - с.22) описана питательная среда для культивирования дифтерийных микробов - кровяной теллуритовый агар. Питательная среда содержит на 100 мл питательной агаровой основы 7 мл дефибринированной или 10 мл гемолизированной крови человека или животных, а также 2 мл 2% раствора теллурита калия.
Недостатком данных питательных сред является отсутствие ингибирующих свойств в отношении стафилококков (Методические указания МУ 4.2.698-98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - МЗ РФ. - Москва, 1998 г. - с.22).
В патенте РФ №2041947 (1995 г., БИ №23) описана "Питательная среда для выделения дифтерийного микроба". Указанная питательная среда представляет собой твердую фазу. Среда содержит питательную основу - гидролизат панкреатический рыбной муки с добавлением гидролизата ферментативного черного альбумина, натрий хлористый, агар, теллурит калия - 2% раствор, и воду дистиллированную, при заданном соотношении компонентов.
Недостатком данной питательной среды являются ее невысокие ингибирующие свойства относительно микробов-ассоциантов: стафилококков.
Патентом РФ №2412991 (2011 г. , БИПМ №6) защищена "Питательная двухфазная среда для культивирования микроорганизмов", содержащая жидкую фазу, состав которой определяется биологическими особенностями конкретного микроорганизма, и твердую фазу, содержащую коагулированную сыворотку и агарозу, при заданном соотношении компонентов.
Недостатком этой двухфазной среды является ее ограниченная область применения: ее невозможно использовать для культивирования дифтерийных микробов, так как для их культивирования необходимо наличие в ее составе не коагулированной, а нативной сыворотки (Методические указания МУ 4.2.698 - 98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции». - МЗ РФ - Москва, 1998 г. - с.23-24).
Наиболее близким техническим решением, принятым нами за прототип, является "Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов", защищенная патентом РФ №2455351 (2011 г., БИПМ №19). Указанная питательная среда - прототип, содержит твердую и жидкую фазы.
Твердая фаза содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, агар, теллурит калия - 2%-ный раствор и воду дистиллированнную, при следующем соотношении компонентов твердой фазы на каждый литр воды дистиллированной:
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
20,0-25,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г
10,0-12,0
натрий хлористый, г
4,0-4,5
экстракт дрожжевой, г
3,0-5,0
глюкоза, г
3,0-5,0
агар, г
10,0-12,0
теллурит калия - 2% раствор, мл
13,0-15,0
Жидкая фаза содержит гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, натрий хлористый, экстракт дрожжевой, глюкозу, сыворотку крови крупного рогатого скота и воду дистиллированнную, при заданном соотношении компонентов жидкой фазы на каждый литр воды дистиллированной.
Недостатком прототипа - питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, является ее недостаточно эффективные ингибирующие свойства относительно микробов-ассоциантов - стафилококков, обусловленные составом жидкой фазы питательной среды.
В сответствии с Методическими указаниями (МУК 4.2.2316-08) «Методы контроля бактериологических питательных сред» - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. - с.38-39) характеристикой ингибирующих свойств питательных сред является «показатель ингибиции», который в указанных методических указаниях определен только лишь для плотных и жидких (полужидких) питательных сред. Поэтому в качестве характеристики ингибирующих свойств сред, содержащих твердую и жидкую фазы, т.е. двухфазных питательных сред, мы использовали «показатель ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ2Ф), который определяется как отношение среднего числа колоний микробов на твердой фазе, сформировавшихся после высева из жидкой фазы двухфазной питательной среды, к среднему числу колоний тех же микробов после их культивирования на соответствующих питательных средах (Алутина Э.Л., Айдинов Г.Т., Харсеева Г.Г., Гасретова Т.Д. Питательная среда для культивирования дифтерийных микробов // Проблемы антибиотикорезистентности возбудителей внутрибольничных инфекций: сб. науч. - практ. работ / под общ. ред. Г.Г. Харсеевой. - Ростов-на-Дону: Издательство РостГМУ, 2013. - С.8). При этом соответствующими питательными средами являются среды, ростовые свойства которых полностью удовлетворяют потребностям микробов. Так, для штамма Staphylococcus aureus Wood-46 соответствующей питательной средой является 5% кровяной агар (Приказ №535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» - М.: Министерство здравоохранения СССР, 1985. - С.55). А среднее число колоний микробов на твердой фазе, сформировавшихся после высева из жидкой фазы двухфазной питательной среды и среднее число колоний тех же микробов после их культивирования на соответствующих питательных средах определяется как среднее арифметическое результатов трех повторов культивирования.
Задачей предлагаемого изобретения является создание двухфазной, т.е. содержащей жидкую и твердую фазы питательной среды для культивирования дифтерийных микробов с улучшенными ингибирующими свойствами относительно микробов-ассоциантов.
Техническим результатом, проявляющимся при использовании данной питательной среды, является повышение ее ингибирующих свойств относительно микробов-ассоциантов: стафиллококков, а именно уменьшение значения «показателя ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ2Ф) для культивирования дифтерийных микробов.
Технический результат достигается тем, что жидкая фаза двухфазной питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, в состав которой входят гидролизат панкреатический рыбной муки, пептон ферментативный, экстракт дрожжевой, глюкоза, натрий хлористый, сыворотка крови крупного рогатого скота и вода дистиллированная, дополнительно содержит агар и теллурит калия - 2% раствор. Соотношение компонентов жидкой фазы на каждый литр воды дистиллированной следующее:
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
8,0-9,0
пептон ферментативный, г
8,0-9,0
экстракт дрожжевой, г
3,0-5,0
глюкоза, г
3,0-5,0
натрий хлористый, г
4,0-4,5
агар, г
0,75-1,0
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл
80,0-100,0
теллурит калия - 2% раствор, мл
13,0-15,0
Соотношение компонентов твердой фазы питательной среды для культивирования дифтерийных микробов на каждый литр воды дистиллированной следующее:
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
20,0-25,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г
10,0-12,0
натрий хлористый, г
4,0-4,5
экстракт дрожжевой, г
3,0-5,0
глюкоза, г
3,0-5,0
агар, г
10,0-12,0
теллурит калия - 2% раствор, мл
13,0-15,0
Заявляемая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов готовится следующим образом.
Для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов берут в необходимых соотношениях: гидролизат панкреатический рыбной муки, например, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, например, производства ООО НПО «Порт-Петровск», г. Курск (ГОСТ 13805-76), экстракт дрожжевой, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкозу, например, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), натрий хлористый, производства, например, ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), агар, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), сыворотку крови крупного рогатого скота, например, производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург, теллурит калия - 2% раствор, например, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, и воду дистиллированную, например, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72).
Указанные компоненты, кроме сыворотки крупного рогатого скота и теллурита калия - 2% раствора, смешивают в эмалированной посуде в 1 л воды дистиллированной, кипятят до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, фильтруют через бумажный фильтр, например бумажный фильтр производства завода «Химреактивкомплект» (ТУ 6-09-1706-82), помещают в стерилизатор, например в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживают при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждают до температуры плюс 45°C, добавляют необходимые объемы теллурита калия - 2% раствора, сыворотки крупного рогатого скота и смешивают.
Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов берут в необходимых соотношениях гидролизат панкреатический рыбной муки, например, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, например, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, например, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкозу, например, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975- 88), агар, например, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», (Индия), теллурит калия - 2% раствор, например, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, и воду дистиллированную, например, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72).
Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешивают в эмалированной посуде в 1 л воды дистиллированной, кипятят до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, помещают в стерилизатор, например "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдерживают при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охлаждают до температуры плюс 45°C, добавляют необходимый объем теллурита калия - 2% раствор, смешивают и разливают по 30 мл в стерильные флаконы. Флаконы закупоривают и оставляют в наклонном положении до застывания.
Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открывают, вносят в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрывают. Готовую питательную среду хранят в холодильном шкафу при температуре плюс 4°C.
Практическая реализуемость использования предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1: для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, производства ООО НПО «Порт-Петровск», г. Курск (ГОСТ 13805-76), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), сыворотка крови крупного рогатого скота, производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург, теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
0,8
пептон ферментативный, г
0,8
экстракт дрожжевой, г
0,3
глюкоза, г
0,3
натрий хлористый, г
0,04
агар, г
0,075
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл
8,0
теллурит калия - 2% раствор, мл
1,3
Указанные компоненты, кроме сыворотки крупного рогатого скота и теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр (Завод «Химреактивкомплект», ТУ 6-09-1706-82), поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанные выше объемы теллурита калия - 2% раствора, сыворотки крупного рогатого скота и смешали.
Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
2,0
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г
1,0
натрий хлористый, г
0,4
экстракт дрожжевой, г
0,3
глюкоза, г
0,3
агар, г
1,0
теллурит калия - 2% раствор, мл
1,3
Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанный выше объем теллурита калия - 2% раствор, смешали и разлили по 30 мл в стерильные флаконы. Флаконы закупорили и оставили в наклонном положении до застывания.
Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открыли, внесли в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрыли. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°C.
2Ф
Для определения ингибирующих свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, а именно для определения «показателя ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ), относительно микробов-ассоциантов: стафилококков, нами были проведены три повтора культивирования при вышеуказанном составе фаз питательной среды, результаты которых приведены в таблице 1.
Результаты, полученные при исследовании ингибирующих свойств питательных сред для культивирования дифтерийных микробов.
Табл. 1
Разведения микробной взвеси
Количество колоний стафилококков на предлагаемой питательной среде
Количество колоний стафилококков на 5% кровяном агаре
Показатель ингибиции ПИ<sub>2Ф</sub>
1-й повтор
2-й повтор
3-й повтор
средн знач.
1-й повтор
2-й повтор
3-й повтор
сред. знач.
10<sup>-1</sup>
5
5
7
5,7
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-2</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-3</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-4</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-5</sup>
0
0
0
0
380
364
371
371,7
0
10<sup>-6</sup>
0
0
0
0
48
54
51
51
0
Примечание: при сплошном росте значение ПИ<sub>2ф</sub> не вычисляется.
Пример 2: для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, производства ООО НПО «Порт-Петровск», г. Курск (ГОСТ 13805-76), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), сыворотка крови крупного рогатого скота, производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург, теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
0,9
пептон ферментативный, г
0,9
экстракт дрожжевой, г
0,5
глюкоза, г
0,5
натрий хлористый, г
0,45
агар, г
0,1
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл
10,0
теллурит калия - 2% раствор, мл
1,5
Указанные компоненты, кроме сыворотки крупного рогатого скота и теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр (Завод «Химреактивкомплект», ТУ 6-09-1706-82), поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанные выше объемы теллурита калия - 2% раствора, сыворотки крупного рогатого скота и смешали.
Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
2,5
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г
1,2
натрий хлористый, г
0,45
экстракт дрожжевой, г
0,5
глюкоза, г
0,5
агар, г
1,2
теллурит калия - 2% раствор, мл
1,5
Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанный выше объем теллурита калия - 2% раствор, смешали и разлили по 30 мл в стерильные флаконы. Флаконы закупорили и оставили в наклонном положении до застывания.
Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открыли, внесли в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрыли. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°C.
2Ф
Для определения ингибирующих свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, а именно для определения «показателя ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ), относительно микробов-ассоциантов: стафилококков, нами были проведены три повтора культивирования при вышеуказанном составе фаз питательной среды, результаты которых приведены в таблице 2.
Пример 3: для приготовления жидкой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), пептон ферментативный, производства ООО НПО «Порт-Петровск», г. Курск (ГОСТ 13805-76), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), натрий хлористый, производства ООО Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), сыворотка крови крупного рогатого скота, производства ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург, теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
0,85
пептон ферментативный, г
0,85
экстракт дрожжевой, г
0,4
глюкоза, г
0,4
натрий хлористый, г
0,42
агар, г
0,08
сыворотка крови крупного рогатого скота, мл
9,0
теллурит калия - 2% раствор, мл
1,4
Результаты, полученные при исследовании ингибирующих свойств питательных сред для культивирования дифтерийных микробов
Табл.2
Разведения микробной взвеси
Количество колоний стафилококков на предлагаемой питательной среде
Количество колоний стафилококков на 5% кровяном агаре
Показатель ингибиции ПИ<sub>2Ф</sub>
1-й повтор
2-й повтор
3-й повтор
среди знач.
1-й повтор
2-й повтор
3-й повтор
сред. знач.
10<sup>-1</sup>
12
15
11
12,7
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-2</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-3</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-4</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-5</sup>
0
0
0
0
375
370
381
375,3
0
10<sup>-6</sup>
0
0
0
0
47
51
53
50,3
0
Примечание: при сплошном росте значение ПИ<sub>2ф</sub> не вычисляется.
Указанные компоненты, кроме сыворотки крупного рогатого скота и теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, фильтровали через бумажный фильтр (Завод «Химреактивкомплект», ТУ 6-09-1706-82), поместили в "Стерилизатор паровой ГК-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанные выше объемы теллурита калия - 2% раствора, сыворотки крупного рогатого скота и смешали.
Для приготовления твердой фазы заявляемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов были взяты гидролизат панкреатический рыбной муки, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-27-93), стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, производства ФБУН ГНЦ ПМБ, п. Оболенск, Московская обл. (ТУ 480-00001927-28-93), натрий хлористый, производства ООО «Агат-Мед», г. Москва (ГОСТ 4233-77), экстракт дрожжевой, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), глюкоза, производства ООО «Вита Реактив», г. Дзержинск (ГОСТ 975-88), агар, производства фирмы «HiMedia Laboratories Pvt. Limited» (Индия), теллурит калия - 2% раствор, производства ЗАО «Мосхимфармпрепараты им. Н.А. Семашко», г. Москва, при следующем соотношении компонентов на 100 мл воды дистиллированной, производства ООО МЦ «Эллара», г. Покров (ГОСТ 6709-72):
гидролизат панкреатический рыбной муки, г
2,2
стимулятор роста гемофильных микроорганизмов, г
1,1
натрий хлористый, г
0,42
экстракт дрожжевой, г
0,4
глюкоза, г
0,4
агар, г
1,1
теллурит калия - 2% раствор, мл
1,4
Указанные компоненты, кроме теллурита калия - 2% раствора, смешали в эмалированной посуде в 100 мл воды дистиллированной, кипятили до полного растворения ингредиентов в течение 2 минут, поместили в "Стерилизатор паровой ПС-100-3", производства фирмы «Тюмень Медико», выдержали при температуре плюс 121°C и давлении 1,0 атм в течение 15 минут, охладили до температуры плюс 45°C, добавили указанный выше объем теллурита калия - 2% раствор, смешали и разлили по 30 мл в стерильные флаконы. Флаконы закупорили и оставили в наклонном положении до застывания.
Флаконы с твердой фазой питательной среды с соблюдением правил асептики, стерильно, над факелом открыли, внесли в них по 10 мл жидкой фазы питательной среды и закрыли. Готовую питательную среду хранили в холодильном шкафу при температуре плюс 4°C.
Для определения ингибирующих свойств предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, а именно для определения «показателя ингибиции двухфазной питательной среды» (ПИ2Ф), относительно микробов-ассоциантов: стафилококков, нами были проведены три повтора культивирования при вышеуказанном составе фаз питательной среды, результаты которых приведены в таблице 3.
Для сравнения ингибирующих свойств прототипа и предлагаемой питательной среды для культивирования дифтерийных микробов, а именно для определения показателей ингибиции вышеуказанных двухфазных питательных сред относительно микробов-ассоциантов: стафилококков, нами было проведено 17 исследований ингибирующих свойств заявляемой питательной среды и среды-прототипа, для различных соотношений компонентов фаз указанных выше питательных сред. Каждое исследование состояло из трех повторов культивирования. Итоговые результаты исследований приведены в таблице 4.
Табл.3Результаты, полученные при исследовании ингибирующих свойств питательных сред для культивирования дифтерийных микробов
Разведения микробной взвеси
Количество колоний стафилококков на предлагаемой питательной среде
Количество колоний стафилококков на 5% кровяном агаре
Показатель ингибиции ПИ<sub>2Ф</sub>
1-й повтор
2-й повтор
3-й повтор
среди знач.
1-й повтор
2-й повтор
3-й повтор
сред. знач.
10<sup>-1</sup>
8
11
12
10,3
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-2</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-3</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-4</sup>
0
0
0
0
сплошной рост
сплошной рост
сплошной рост
-
-
10<sup>-5</sup>
0
0
0
0
390
360
393
381,0
0
10<sup>-6</sup>
0
0
0
0
50
52
58
53,3
0
Примечание: при сплошном росте значение ПИ<sub>2ф</sub> не вычисляется.
2Ф
2Ф
Полученные результаты показали, что предлагаемая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов обладает улучшенными ингибирующими свойствами по сравнению со средой-прототипом: значения ПИ у предлагаемой питательной среды (равные 0) много меньше соответствующих значений ПИ питательной среды-прототипа.
Таким образом, по сравнению с прототипом предлагаемая питательная среда для культивирования дифтерийных микробов позволяет значительно повысить ингибирующие свойства питательной среды для культивирования дифтерийных микробов относительно микробов-ассоциантов: стафилококков.
Табл.4Результаты, полученные при характеристике ингибирующих свойств питательных сред для культивирования дифтерийных микробов
Разведения микробной взвеси стафилококков
Среднее количество колоний  стафилококков на предлагаемой питательной среде
Среднее количество колоний на питательной среде-прототипе
Среднее количество колоний стафилококков на 5% кровяном агаре
Показатель ингибиции ПИ<sub>2Ф</sub> предлагаемой питательной среды
Показатель ингибиции ПИ<sub>2Ф</sub> питательной среды-прототипа
10<sup>-1</sup>
9,5
180,2
сплошной рост
-
~
10<sup>-2</sup>
0
130,5
сплошной рост
-
-
10<sup>-3</sup>
0
87,8
сплошной рост
-
-
10<sup>-4</sup>
0
58,6
сплошной рост
-
-
10<sup>-5</sup>
0
42,4
376,1
0
0,11
10<sup>-6</sup>
0
2,0
51,4
0
0,04
Примечание: при сплошном росте значение ПИ<sub>2Ф</sub> не вычисляется.