Методика построения тканеинженерных конструкций на раневой поверхности восстанавливаемых органов

вой мембраны) — на 3 сут. швы состоятельны, на 7 и 14 сут. швы состоятельны и герметичны. В четвертой испытуемой группе (с нанесением суспензии клеток ММСК человека с наложением коллагеновой мембраны) на 3 сут. швы состоятельны, на 7 и 14 сут. швы состоятельны и герметичны.

Гистологические исследования легочных швов, наложенных после иссечения части легкого, показали следующее. По сравнению с контрольной группой у экспериментальных животных, у которых поверхность хирургически травмированной легочной ткани обработана коллагеновой мембраной, культурой фибробластов с коллагеном и культурой ММСК, клеточные и тканевые реакции были более ярко выраженными. Это свидетельствует о стимулирующем влиянии культур клеток фибробластов и ММСК на репаративные процессы.

На основании полученных результатов макроскопических и гистологических исследований можно утверждать, что применение клеточных технологий для профилактики несостоятельности легочных является оптимальным способом лечения. В контрольной группе на 14 сут. не удается добиться герметичности легочного шва. Применение только коллагеновой мембраны позволяет получить герметичный шов на 14 сут. Сочетанное воздействие клеток ЗФЧ 01/05 и ММСК фетального костного мозга человека с коллагеновым матриксом приводит к образованию состоятельного и герметичного легочного шва уже на 7 сут. после операции.

С.Л. Киселев

Репрограммирование соматического генома

УРАН «Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН»,

Москва, Россия

sl_kiselev@yahoo.com

S.L. Kiselev

Reprogramming of somatic genome

В процессе развития организма реализуется онтогенетическая программа, в результате выполнения которой клетки индивидуального организма постепенно утрачивают потенциал дифференцировки. Однако, в целом ряде исследований было показано, что цитоплазматических и ядерных факторов, содержащихся в плюрипотентной клетке, достаточно для репрограммирования генома соматической клетки до плюрипотент-ного состояния (Kato et al., 1998; Matveeva et ai., 1998). С помощью транскрипционных факторов, которые напрямую вовлечены в поддержание плюрипотен-тности, была разработана технология получения клеток с индуцированной плюрипотентностью С i PS) (Takahashi&Yamanaka, 2006). В настоящем исследовании для получения клеток с индуцированной плюрипотентностью нами были использованы фибробласты кожи, полученные от больных с нейродегенеративными заболеваниями. Полученные ¡PS клетки были схожи с эмбриональными стволовыми клетками человека по морфологическим, молекулярно-генетическим и функциональным параметрам. Дифференцированные из ¡PS клеток нейрональные производные могут служить моделями для изучения патогенеза заболеваний и их генетической коррекции.

A.B. Ковалев

Методика построения тканеинженерных конструкций на раневой поверхности восстанавливаемых органов

ФГУ «ЦИТО им. H.H. Приорова Росмедтехнопогий»,

Москва, Россия kovalyovl @mail.ru A.V. Kovalev

Tissue reconstruction build-up on the wounded surface of recovered organs

В настоящее время выделяют три наиболее перспективные стратегии развития регенеративной медицины:

1) трансплантация клеток для формирования новой ткани в области пересадки;

2) внедрение биоискусственных тканей и органов, выращенных in vitro;

3) индукции регенерации в естественных условиях от неповрежденных тканей, смежных с раной (D. Stocum, 2006).

Нами разработан новый подход к восстановлению частей органов и тканей, позволяющий объединить эти стратегии в одной технологии. Для этого созданы специальные растворы и биореакторы, в которые возможно помещать поврежденную часть тела и длительно там удерживать, не извлекая из водной питательной среды, до восстановления целостности органа.

Само по себе длительное и непрерывное удержание травмированных органов в растворе, приближенном по физико-химическим свойствам к межклеточной среде, влияет на регенерацию. В зависимости от возраста животного, локализации и формы раны благодаря воздействию раствора на травмированные ткани в биореакторе исключается рубцевание, или значительно уменьшается фиброз кожного регенерата. Более того, водная изотоническая среда способствует регенерации, не характерной для вида и линии экспериментальных животных при обычных условиях заживления ран: в растворах отрастают кончики хвостов и пальцев у крысят. Этого не происходит при обычных условиях заживления, когда на раневой поверхности образуется рубец и остается очевидный посттравматический дефект. Обнаружено, что окружение раны способно влиять не только на морфогенез, но и на саму возможность заживления. Так, кожа хвоста или лапы у крыс не регенерирует, если циркулярно иссекается кожный полнослойный лоскут шириной 7^8 мм вокруг оси этих наружных органов. На воздухе перешеек, лишенный наружного покрова, гибнет вместе с неповрежденной частью хвоста или лапы, расположенной дистально месту травмы. В растворе-биореакторе при таком же повреждении кожа регенерирует с образованием малозаметного рубца, а конечность или хвост остаются целыми (Иванищук П.П., Ковалев A.B., 1990, Ковалев A.B., Иванищук П.П., 1991 ;1999). Если удалить 30 и более процентов кожи от всей площади поверхности тела у крысы, то регенерации кожи не произойдет, животное гибнет от раневого истощения. Погружение животного в установку с раствором позволяет адаптировать крысу к повреждению и повысить регенеративную способность наружного покрова. В течение 30^60 сут. преимущественно за счет контракции и внераневого вставочного роста обширная рана кожи заживает (Ковалев A.B., Иванищук П.П., 1995, 1997).

Эксперименты показали возможность технического обеспечения длительного окружения области по-

вреждения не просто физиологическим раствором, а стерильной питательной средой. Внутри такого раствора-биореактора создаются условия для выращивания биоискусственных органов. Итак, в растворе-биореакторе, где находится поврежденный сегмент конечности, одновременно выращивается графт. При этом матрица биоискусственной части восстанавливаемого органа плотно взаимодействует с раневой поверхностью. Матрица может иметь различную форму, структуру и состав, и даже наращиваться и собираться в ходе восстановления органа, сразу или постепенно воспроизводя его форму. Эта же матрица является индуктором и проводником репаративной регенерации «по каркасу», в первую очередь для сосудов и нервов из дна раны, обеспечивая интеграцию тканеинженерной конструкции сразу с началом и параллельно ее формированию. Проблема интеграции и васкуляризации трехмерных тканеинженерных конструкций актуальна и в данном случае решается не префабрикацией или использованием принципа трехкомпонентной клеточной культуры, создания артифициальных микрососудистых собственных сосудистых сетей децелюллированной ткани и т.д., а иным путем. Это новая технология восстановления органов эффективна за счет объединения параллельно идущих и взаимно потенцирующих друг друга процессов: репаративной регенерации по каркасу и восполнения травматического дефекта поврежденного органа биоискусственной составляющей, выращиваемой непосредственно на ране.

Н.В. Кудряшова 1, И.И. Салафутдинов 1,

И.Г. Мустафин а, P.P. Исламов а,

A.A. Ризванов 1 а Трансфекция клеток НЕК293 и мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека in vitro плазмидами с помощью высокомолекулярного полиэтиленимина

1 ФГДОУВПО «Казанский [Приволжский} федеральный университет», Казань, Россия

2 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия nkudryashova@gmail.com

N.V. Kudryashova, I.I. Salafutdinov, I.G. Mustafin,

R.R. Islamov, A.A. Rizvanov

Transfection of HEK293 and human multipotential mesenchymal stromal cells in vitro with plasmids using high molecular weight polyethyleneimine

В настоящее время большое значение уделяют стимуляции регенеративных процессов в организме. Одно из перспективных направлений — разработка методов генно-клеточной терапии. В основе подхода лежит генетическая модификация клеток in vitro и ex vivo для коррекции генетического дефекта или для повышения экспрессии рекомбинантных терапевтических биомолекул. Затем генетически модифицированные клетки могут быть трансплантированы пациенту для лечения широкого спектра дегенеративных и ишемических заболеваний. Применение плазмидных экспрессионных векторов — один из наиболее биологически безопасных подходов для генетической модификации клеток. Основной недостаток плазмид — низкая эффективность трансфекции и высокая стоимость химических транс-фекционных препаратов. Кроме того, трансфекционные препараты зачастую обладают выраженной цитотоксичностью. Отдельную проблему представляет низкая

эффективность трансфекции мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК).

Полиэтиленимины (polyethyleneimine, РЕП — нано-размерные положительно заряженные (катионные) частицы, состоящие из синтетического полимера — продукта полимеризации этиленимина. PEI способны конденсировать нуклеиновые кислоты и эффективно проникать внутрь клетки. Для трансфекции клеток чаще всего применяют низкомолекулярные PEI (например 25 ООО кДа). Однако низкомолекулярные PEI обладают относительно высокой цитотоксичностью по сравнению с высокомолекулярными PEI. Кроме того, на сегодняшний день недостаточно исследован вопрос применения высокомолекулярных PEI для трансфекции стволовых клеток человека, в частности ММСК.

Задачи исследования: оценить эффективность трансфекции клеток НЕК293 и ММСК плазмидами, экспрессирующими репотерные белки LacZ (р-галак-тозидаза) и GFP (зелёный флуоресцентный белок), с помощью высокомолекулярного PEI.

Материал и методы. Работу проводили в ламина-ре 2 класса биологической защиты. Клетки НЕК293 культивировали на среде DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium, Invitrogen, США) с добавлением 10% фетальной сыворотки коров FBS и пенициллина/стрептомицина. Культуру ММСК получали методом эксплантации из зачатков зубов мудрости подростков и поддерживали в питательной среде —МЕМ с добавлением 10% FBS и пенициллина/стрептомицина. В работе использовали PEI с молекулярной массой 60 ООО кДа (Acros Organics). Трансфекционный реагент TurboFect (Fermentas) использовали в качестве контроля в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. В качестве репотерных генетических конструкций использовали плазмиды pEGFP-N2 (Clontech), кодирующую ген зелёного флуоресцентного белка GFP, и pAAV-LacZ, р

GFP проводили с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Анализ экспрессии LacZ проводили на планшетном спектрофотометре по уровню накопления продуктов гидролиза о-нитро-р

Результаты и обсуждение. В работе использовали соотношения PEI к плазмидной ДНК (мпмг) 0,5:1, 0,5:2, 1:1 и2:2. Показано, что экспрессия LacZ в клетках НЕК293 при трансфекции с помощью PEI составила приблизительно 50% от уровня экспрессии в клетках, трансфицированных TurboFect. В то же время уровень экспрессии LacZ в МСК, трансфицированных PEI (в соотношении 1:1) или TurboFect, значительно не различались. Таким образом, показано, что высокомолекулярный PEI способен конденсировать плазмид-ную ДНК с последующей трансфекцией клеток НЕК293 и ММСК. В дальнейшем мы планируем продолжить работы по оптимизации режимов трансфекции ММСК препаратами на основе высокомолекулярных PEI.