ФУНГИЦИДНЫЙ МАТЕРИАЛ ДЛЯ ПИЩЕВЫХ И СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ПРОДУКТОВ
FUNGICIDE MATERIAL FOR FOOD AND AGRICULTURAL PRODUCTS

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к фунгицидным материалам с контролируемым и пролонгированным выделением противогрибкового активного агента для борьбы с грибковыми инфекциями и поражениями продуктов питания, сельскохозяйственной продукции и растений.
В последние десятилетия особое внимание уделяется повышению эффективности биологически активных и лекарственных веществ путем создания их форм с контролируемым и пролонгируемым выделением активного вещества. Одним из наиболее перспективных подходов к созданию таких форм является получение препаратов, которые представляют собой биологически активное вещество, связанное с неким носителем (например, полимерным) биодерградируемыми связями (гидролизуемые фрагменты, ионные, водородные связи). Такое строение обеспечивает пролонгированное выделение активного вещества при его постепенном отделении от носителя и обеспечивает повышенную эффективность всей системы при более низких концентрациях активного компонента по сравнению с его обычными формами.
Такой подход представляется перспективным и для создания новых средств борьбы с грибковыми поражениями продуктов питания и сельскохозяйственной продукции.
Каждый год 30-40% пищевых продуктов и фуража в мире поражается микотоксинами грибов с соответствующим влиянием на здоровье человека и экономику. Наиболее распространенными микотоксинами являются aflatoxins, ochratoxins, trichothecenes, zearalenone, которые найдены в ряде продуктов, таких как сухой корм для животных, в злаках, кофе, сыре, фруктах, овощах и т.д.
В последние годы наиболее эффективными средствами для борьбы с грибковыми инфекциями являются две группы фунгицидов: полиеновые противогрибковые антибиотики (натамицин, нистатин, амфотерицин и др.) и карбоновые кислоты (уксусная кислота, пропионовая кислота, сорбиновая кислота и их соли).
Например, натамицин уже более 20 лет успешно применяется для предотвращения роста плесневых грибов на таких продуктах питания, как сыры и колбасы. Но, несмотря на высокую активность натамицина, его плохая растворимость в воде и существование определенных видов грибов, устойчивых к воздействию данного антибиотика, например Verticilium cinnabarimam, Butrytis cinerea, Trichophyton species и Penicillium echinulatum, приводят к заражению некоторой части обрабатываемых продуктов.
Вредное воздействие микрофлоры на продукты питания и сельскохозяйственную продукцию также можно контролировать и предотвращать, используя препараты органических кислот и их солей. Например, сорбиновая кислота, пропионовая кислота, бензойная кислота и их соли прекращают рост грибов и снижают возможность биосинтеза микотоксинов путем ингибирования биологических путей превращения. Недостатком фунгицидных препаратов на основе органических кислот является то, что они эффективны только при высоких концентрациях, что приводит к повышению токсичности таких препаратов, проявлению раздражающего действия на систему пищеварения человека и животных, а также к ухудшению вкусовых качеств продуктов питания. Кроме того, также как и в случае полиеновых антибиотиков существует ряд грибков, устойчивых к антифунгальному действию карбоновых кислот.
В связи с вышеупомянутыми недостатками как полиеновых противогрибковых антибиотиков, так и фунгицидных органических кислот представляется перспективным использование фунгицидных препаратов и материалов, содержащих оба данных вида антифунгальных объектов.
К настоящему времени известно достаточно большое количество примеров использования комбинаций полиеновых противогрибковых антибиотиков вместе с органическими кислотами в различных соотношениях и в различных растворителях в качестве фунгицидных препаратов.
Так, например, патент DE 2529532 (Gist-Brocades N.V.) описывает комбинацию натамицина и органической кислоты в водно-спиртовом растворе. Такая комбинация эффективна для защиты цитрусовых плодов от плесени. Благодаря более высокой растворимости натамицина в этом препарате ингибируется рост грибов не только на поверхности, но и в глубине плода. Недостатком такой системы является необходимость использование спиртов и более низкая стабильность натамицина по сравнению с его водными препаратами.
Патент J 61146153 (Nippon Nosan Kogyo) описывает использование антибиотика и антибактериального вещества в водном растворе органической кислоты для предотвращения поражения плесенью и бактериями листьев шелковицы. При этом в качестве антибиотика предложено использовать макроциклический антибиотик (например, натамицин), а в качестве антибактериального компонента сорбиновую кислоту, сорбаты, пропионовую кислоту или пропионаты.
Патент DE 848934 (Gist-Brocades N.V.) описывает жидкие противогрибковые композиции, содержащие натамицин и органическую карбоновую кислоту для лечения заболеваний животных, в частности домашнего скота. При этом в качестве органической кислоты предложено использовать преимущественно лимонную кислоту. Такой жидкий препарат имеет рН 2-4.5. Препарат особенно эффективен для лечения инфекций крупного рогатого скота, вызванных грибом Trichophyton verrucosum, который более устойчив к действию натамицина, чем плесневые грибы (минимальная подавляющая концентрация или МПК для грибов вида Trichophyton verrucosum составляет 12,5-25,0 мкг/мл, тогда как для плесневых грибов, поражающих продукты питания МПК составляет 1-10 мкг/мл). Повышенная эффективность композиции также связана с увеличением растворимости натамицина при низких значениях рН. Недостатком этого метода является то, что натамицин довольно неустойчив при низких значениях рН, и это приводит к тому, что препарат эффективен в течение малого периода времени.
Наиболее близким решением к предлагаемому является фунгицидный материал, предложенный в патенте US 5597598, и представляющий собой водную безспиртовую композицию, содержащую 0,005-2,0 мас.% полиенового антифунгального агента, 0,01-10,0 мас.% кислотного противогрибкового агента из ряда бензойная кислота, пропионовая кислота, сорбиновая кислота и их солей, и 0,01-10,0 мас.% добавки кислоты или соли щелочного металла кислоты из рада уксусная кислота, молочная кислота. Полиеновый антифунгальный агент используют из ряда натамицин, люцензомицин, нистатин, амфотерицин В. Недостатком данного метода является низкая растворимость полиеновых противогрибковых антибиотиков в воде и высокие концентрации органических карбоновых кислот в препарате, что приводит к увеличению токсичности препарата и ухудшению вкусовых качеств обрабатываемых продуктов. Кроме того, использование чистых низкомолекулярных фунгицидных агентов приводит к очень коротким срокам действия фунгицидной композиции.
В данном случае технический результат заключается в увеличении времени фунгицидного действия нового материала по сравнению с чистыми низкомолекулярными фунгицидами за счет постепенного пролонгированного выделения активных противогрибковых компонентов системы из полимера-носителя, а также в более высоком уровне противогрибковой активности нового материала по сравнению со смесью низкомолекулярных фунгицидов той же концентрации.
Указанный технический результат достигается тем, что предлагаемый фунгицидный материал для пищевых и сельскохозяйственных продуктов состоит из 0,01-10 мас.% полиенового антифунгального агента, в качестве которого используют или натамицин, или люцензомицин, или нистатин, или амфотерицин В, и 0,01-10 мас.% антифунгальной органической кислоты, в качестве которой используют или бензойную кислоту, или пропионовую кислоту, или сорбиновую кислоту, и дополнительно содержит 80-99,98 мас.% сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира в качестве полимера-носителя.
В качестве полимера-носителя для фунгицидного материала используют сополимер N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира (ПВП-АГЭ) с молекулярной массой 2000-50000, который состоит из звеньев N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира в мольном соотношении 1-10:1. Химическое строение используемого полимера-носителя представлено ниже
Используемые в качестве фунгицидного агента полиеновые антибиотики образуют комплекс с полимером-носителем за счет образования водородных связей со звеньями N-винилпирролидона.
Используемые в качестве фунгицидных агентов, органические кислоты образуют комплекс с полимером носителем за счет образования сложноэфирной связи со звеньями аллилглицидилового эфира полимера-носителя.
При этом постепенный гидролиз полимерного фунгицидного материала обеспечивает его противогрибковое действие в течение длительного времени.
Кроме того, предлагаемый фунгицидный материал получают, и он может применяться в виде 0,001-20 мас.% водного раствора.
Сущность предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами конкретного осуществления.
Пример 1. Готовят фунгицидный материал из смеси 99,8 мас.% сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира с молекулярной массой 2000 (мольное соотношение мономеров 4:1 соответственно), 0,1 мас.% нистатина и 0,1 мас.% бензойной кислоты. Полученную смесь растворяют в воде, интенсивно перемешивают при 50°С в течение 8 часов до получения полимерного комплекса амфотерицина и сорбиновой кислоты. Отделение неприсоединенных фунгицидов осуществляют центрифугированием, а затем диализом. Фунгицидный материал высушивают лиофильно.
Пример 2. Готовят фунгицидный материал из смеси 98,0 мас.% сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира с молекулярной массой 50000 (мольное соотношение мономеров 3:1 соответственно), 1,0 мас.% амфотерицина и 1,0 мас.% сорбиновой кислоты. Полученную смесь растворяют в воде, интенсивно перемешивают при 50°С в течение 8 часов до получения полимерного комплекса амфотерицина и сорбиновой кислоты. Отделение неприсоединенных фунгицидов осуществляют центрифугированием, а затем диализом. Фунгицидный материал высушивают лиофильно.
Пример 3. Готовят фунгицидный материал из смеси 80,0 мас.% сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира с молекулярной массой 10000 (мольное соотношение мономеров 2:1 соответственно), 10 мас.% натамицина и 10 мас.% пропионовой кислоты. Полученную смесь растворяют в воде, интенсивно перемешивают при 50°С в течение 8 часов до получения полимерного комплекса амфотерицина и сорбиновой кислоты. Отделение неприсоединенных фунгицидов осуществляют центрифугированием, а затем диализом. Фунгицидный материал высушивают лиофильно.
Пример 4. Готовят водный раствор с концентрацией 10 мас.% фунгицидного материала из смеси 80,0 мас.% сополимера N-винилпирролидона и аллилглицидилового эфира с молекулярной массой 10000 (мольное соотношение мономеров 3:1 соответственно), 10 мас.% натамицина и 10 мас.% пропионовой кислоты путем растворения компонентов в воде при интенсивном перемешивании при 50°С в течение 8 часов.
Для подтверждения достижения технического результата, предусмотренного предложенным изобретением, были изучены антифунгальная активность полученного в примерах 1-3 фунгицидного материала, в сравнении с чистыми низкомолекулярными фунгицидными агентами, а также длительность фунгицидного эффекта полученного материала по сравнению с низкомолекулярными аналогами.
Антифунгальную активность фунгицидного материала определяли по отношению к культуре гриба Fusarium oxysporum методом «бумажный диск». Сущность этого метода заключается в нанесении на бумажный диск, помещенный на поверхность агаровой среды с тестируемым образцом гриба, исследуемого раствора фунгицида и наблюдении скорости радиального роста гриба в этих условиях.
Антифунгальную активность (АА) оценивали по формуле
АА(%)=100 - диаметр колонии образца/диаметр колонии стандарта ×100%
Эксперименты проводились при 25°С в течение 7 дней, рН среды 6.4. Каждое приведенное значение является средним арифметическим трех параллельных экспериментов. Для сравнения измерялась АА водного раствора смеси чистых антифунгального антибиотика и фунгицидной кислоты в той же концентрации, что и в образце полимерного фунгицидного материала.
В таблице 1 приведены данные, которые подтверждают, что антифунгальная активность полимерного фунгицидного материала, содержащего антифунгальный антибиотик и фунгицидную кислоту, выше, чем антифунгальная активность раствора смеси чистых антифунгального антибиотика и фунгицидной кислоты в такой же концентрации. Следовательно, для достижения определенного уровня антифунгальной активности в случае предложенного фунгицидного материала необходимо меньшее количество используемых фунгицидных агентов.
Таблица 1
Антифунгальная активность по отношению к культуре гриба Fusarium oxysporum
Препарат
Антифунгальная активность препарата, %
99,8 мас.% ПВП-АГЭ + 0,1 мас.% нистатина + 0,1 мас.% бензойной кислоты.
8,2%
0,1 мас.% нистатина + 0,1 мас.% бензойной кислоты.
6,4%
98,0 мас.% ПВП-АГЭ + 1,0 мас.% амфотерицина + 1,0 мас.% сорбиновой кислоты.
46,7%
1,0 мас.% амфотерицина + 1,0 мас.% сорбиновой кислоты.
41,1%
80,0 мас.% ПВП-АГЭ + 10,0 мас.% натамицина + 10,0 мас.% пропионовой кислоты.
76,5%
10,0 мас.% натамицина + 10,0 мас.% пропионовой кислоты.
64,8%
Для определения времени эффективного противогрибкового воздействия фунгицидного материала использовали эксперимент с использованием агаровой среды. Для этого в чашку Петри диаметром 150 мм с агаровой средой помещали и равномерно распределяли 0,15 мл суспензии спор грибов штамма Penicillium echinulatum. После инкубации среды в течение 12 часов при 6°С в чашки добавляли раствор фунгицидного материала или раствор смеси чистых фунгицидных агентов для сравнения. После этого образцы инкубировались при 15°С и относительной влажности 95%. Каждый день подсчитывалось количество образующихся видимых колоний грибов и рассчитывалось их среднее значение. После того, как количество колоний в чашке превышало 50, считали, что образец полностью покрыт плесенью, и прошедшее с начала эксперимента время (в сутках) принимали за длительность антифунгального действия материала. Результаты исследований представлены в Таблице 2.
Таблица 2
Сравнение длительности антифунгального действия различных фунгицидных препаратов на рост гриба культуры Penicillium echinulatum.
Препарат
Длительность антифунгального действия, сутки
99,8 мас.% ПВП-АГЭ + 0,1 мас.% нистатина + 0,1 мас.% бензойной кислоты.
10
0,1 мас.% нистатина + 0,1 мас.% бензойной кислоты.
2
98,0 мас.% ПВП-АГЭ + 1,0 мас.% амфотерицина + 1,0 мас.% сорбиновой кислоты.
14
1,0 мас.% амфотерицина + 1,0 мас.% сорбиновой кислоты.
3
80,0 мас.% ПВП-АГЭ + 10,0 мас.% натамицина + 10,0 мас.% пропионовой кислоты.
26
10,0 мас.% натамицина + 10,0 мас.% пропионовой кислоты.
6
Как видно из таблицы 2, предлагаемый фунгицидный материал на основе полимера-носителя с иммобилизованными фунгицидными агентами обеспечивает в несколько раз более долгий антифунгальный эффект по сравнению с низкомолекулярными фунгицидами при одинаковом содержании активных компонентов в препаратах.
Таким образом, предлагаемый фунгицидный материал, представляющий собой полимерный комплекс смеси фунгицидных агентов двух разных классов (полиеновые антибиотики и органические кислоты), обеспечивает более высокую антифунгальную активность и более долгий противогрибковый эффект по сравнению с обычными растворами смесей низкомолекулярных фунгицидов в тех же концентрациях.