Способ получения фукоидана из Laminaria japonica Aresch.

Известия ТИНРО

2005 Том 143

ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ

УДК 577.114

О.Н.Гурулёва, Н.М.Аминина, Т.И.Вишневская

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФУКОИДАНА

ИЗ LAMINARIA JAPONICA ARESCH.

Определены оптимальные условия экстрагирования фукоидана из бурой водоросли Laminaria japonica, позволяющие получать полисахарид с максимальным содержанием фукозы и сульфатных групп. Проведен сравнительный анализ химического состава фукоиданов, выделенных при использовании различных условий экстракции. Показана возможность дальнейшей переработки водорослей после извлечения фукоидана для получения альгинатсодержащих продуктов.

Guruleva O.N., Aminina N.M., Vishnevskaya T.I. Method of fucoidan extraction from Laminaria japonica Aresch. // Izv. TINRO. — 2005. — Vol. 143. — P. 327-331.

Optimal conditions are determined of fucoidan extraction from brown seaweed Laminaria japonica for the maximal percentage of fucose and sulphate groups. Chemical composition of the fucoidans extracted under various conditions is compared. Possibilities are analyzed of further processing of the seaweed after fucoidan extraction for other alginate products preparation.

Бурые водоросли содержат водорастворимые сульфатированные полисахариды — фукоиданы, обладающие разносторонней биологической активностью. Установлено, что они проявляют сильные антикоагулянтные свойства, обладают противоопухолевым и противовирусным действием. Фукоиданы представляют собой сложные гетерогликаны, состоящие из нескольких моносахаридов, преобладающим является фукоза. Активность полисахарида чаще всего связывают с количеством фукозы и сульфатных групп (Nishino, Nagumo, 1987; Chevolot et al., 1999; Soeda et al., 2000). Разные виды бурых водорослей различаются по составу и содержанию фукоидана. Наиболее богатым его источником считались фукусовые водоросли, однако исследования показывают, что многие представители семейства ламинариевых содержат сравнимое с семейством фукусовых количество фукоидана (Усов и др., 1985; Zvyagintseva et al., 1999). Значительное количество этого полисахарида обнаружено в ламинарии японской, на которую приходится основной объем перерабатываемых в промышленности водорослей.

Фукоидан легко извлекается из водорослей водой или слабыми растворами кислот, поэтому он практически полностью теряется при переработке водорослей на стадиях замачивания или варки. Получение фукоидана из промысловых водорослей позволяет не только расширить перечень лечебно-профилактических продуктов, но и повысить рентабельность производства продукции из морской капусты. Цель данной работы — исследование условий извлечения фукоидана из ламинарии японской, при которых возможно дальнейшее использование водорослей для получения пищевых продуктов или добавок.

Фукоиданы и альгинаты выделяли из воздушно-сухой водоросли Laminaria japónica (ламинария японская), собранной в южном Приморье в промысловый период.

Количественное определение моносахаридов после гидролиза фукоидана проводили методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) в виде альдононит-рилов с ацетатом мио-инозита в качестве внутреннего стандарта (Слоникер, 1975). ГЖХ-анализ осуществляли на хроматографе Shimadzu GC-9A (Япония), снабженном пламенно-ионизационным детектором и интегратором, с использованием капиллярной колонки CBP5 (50 m х 0,32 mm I.D.) в токе гелия при градиенте температуры от 180 до 280 °С, со скоростью 5 оС/мин.

Степень извлечения фукоидана (%) рассчитывали по формуле:

X = 100 - (F б . 100 % : F ),

у образца ' водоросли' '

где Fo ^ — содержание фукоидана в водорослевых остатках, %; FBo ocM — содержание фукоидана в исходной водоросли, %.

Содержание фукоидана в исходной водоросли и в водорослевых остатках определяли спектрофотометрическим методом, основанным на специфической цветной реакции фукозы с L-цистеином и серной кислотой (Dische, Shettles, 1948). При спектрофотометрическом анализе фуканов определяется только часть фукозосо-держащих полисахаридов, легко растворимая в разбавленных кислотах. Поэтому содержание фукоидана, найденное этим способом, как правило, ниже, чем содержание, рассчитанное из выхода фукозы при гидролизе биомассы. Для определения фукоидана в биомассе водоросли выход фукозы умножают на 2, исходя из условного среднего содержания фукозы в фукане, равного 50 % (Усов и др., 2001).

Содержание сульфатных групп определяли турбидиметрически в виде BaSO4 (Dodgson, 1961).

Содержание общего азота устанавливали по методу Кьельдаля на приборе "Kjeltec auto" 10 SO Analyser (Tecator, Япония).

Анализ альгината натрия проводили в соответствии с ГОСТом 26185-84.

Способ экстракции фукоидана слабыми растворами минеральных кислот позволяет осуществить его извлечение на стадии предобработки бурых водорослей в процессе производства альгинатов или других альгинатсодержащих добавок. На этом этапе проводят обработку водорослей 0,5-1,0 %-ными растворами соляной кислоты, в результате которой экстрактивные вещества водорослей относят к отходам альгинатного производства.

Анализ показал, что при условиях обработки водоросли, используемых в технологии получения альгинатов (экстрагирование 1 %-ным раствором соляной кислоты в течение 2 ч при комнатной температуре, при соотношении водоросль: кислота 1: 10), выход фукоидана равен 3,4 %, что составило меньше половины его содержания в водоросли (табл. 1). Судя по низкому содержанию основного моносахарида — фукозы — и сульфатных групп, фукоидан содержит значительное количество примесей. В составе полисахарида была обнаружена высокая концентрация маннита, минеральных и азотсодержащих веществ (табл. 1). Анализ моносахаридного состава показал, что в выделенном нами полисахариде отсутствует глюкоза, следовательно, нет ламинарана. Это согласуется с литературными данными, свидетельствующими, что в L. japónica ламинарана очень мало либо он совсем отсутствует (Zvyagintseva et al., 1999).

Для удаления сопутствующих фукоидану примесей нами была введена стадия обработки воздушно-сухих водорослей 75 %-ным раствором этилового спирта при температуре 55 ± 5 °C в течение 2-3 ч при соотношении водоросль: раствор этанола — 1: 10. Эти условия аналогичны режиму экстракции низкомолекулярных соединений в технологии йодсодержащих продуктов, при которой максимально извлекались минеральные вещества, йод, маннит, аминокислоты и липиды (Пат. РФ № 2233104).

Таблица 1

Влияние обработки водорослей этанолом на химический состав фукоиданов,

% на сухое вещество

Table 1

Influence of seaweed's ethanol treatment on chemical composition of fucoidans, %

Условия Вы- Степень Суль- Моносахариды

предварительной экстракции ход извле- фатные Ыо6ш Xyl Fuc Man Gal Man-

обработки чения группы nitol

Без обработки 1 % HCl 3,4 48,8 5,3 2,0 1,1 2,2 0,4 0,5 20,5

75 %-ный этанол 1 % HCl 2,5 58,3 12,1 1,6 2,5 4,2 1,1 1,1 8,1

0,5 % HCl 4,2 45,7 15,5 3,3 0,4 3,1 0,8 1,2 6,4

Примечание. Экстракцию проводили в течение 2 ч при комнатной температуре, при соотношении водоросль: кислота 1: 10.

Результаты исследований показали, что фукоидан после обработки водорослей этанолом содержит меньшее количество примесей (табл. 1). При этом доля извлечения полисахарида увеличилась на 10 %, а содержание сульфатных групп возросло практически в 3 раза. ГЖХ-анализ свидетельствует, что после предварительной обработки водорослей спиртом содержание основных моносахаридов фукоидана, в том числе фукозы, увеличивается в два раза, а маннита понижается в 2,5 раза (табл. 1). В дальнейшем все эксперименты по влиянию условий экстракции на выход и качество фукоидана проводили после обработки водорослей раствором этилового спирта.

Снижение концентрации соляной кислоты до 0,5 % не приводит к улучшению качества полисахарида (табл. 1). Выход полисахарида изменяется за счет дополнительного количества низкомолекулярных примесей, при этом соотношение моносахаров меняется в сторону уменьшения фукозы.

В значительной степени на выход фукоидана влияют продолжительность и температура процесса (табл. 2). Увеличение времени экстракции приводит к повышению степени извлечения полисахарида из водоросли. Такой же эффект наблюдается и при увеличении температуры экстрагирования, однако в результате нагревания происходит снижение количества сульфатных групп в фукоидане и изменение соотношения его моносахаридов в сторону увеличения ксилозы и маннозы. Анализ показал, что выход фукоидана увеличивается за счет низкомолекулярных примесей (табл. 2).

Таблица 2

Влияние температуры и времени экстракции на химический состав фукоиданов,

% на сухое вещество

Table 2

Influence of extraction's temperature and time on chemical composition of fucoidans, %

Условия экстракции Выход Степень извлечения Сульфатные группы No6rn; Xyl Моносахариды Fuc Man Gal Mannitol

2 ч, 25 °С 2,5 58,3 12,1 1,6 2,5 4,2 1,1 1,1 8,1

16 ч, 25 °С 2,1 73,2 19,2 5,8 1,2 12,3 0,5 1,4 2,6

2 ч, 50 °С 4,5 74,0 16,7 8,8 4,6 6,5 1,1 1,3 9,4

Примечание. В качестве экстрагента использовали 1 %-ную соляную кислоту, соотношение водоросль: кислота — 1: 10.

Для увеличения эффективности процесса экстрагирования было изучено влияние ЖК (жидкостного коэффициента), а также кратности обработки на выход фукоидана (табл. 3). Для этого соотношение водоросль: экстрагент (ЖК) уменьшили в два раза; экстракцию проводили в две стадии в течение 16 и 6 ч. Выход и химический состав фукоиданов, полученных на разных стадиях экстрагирования, а также выделенных из суммарного экстракта, представлены в табл. 3.

Влияние продолжительности и кратности экстракции на химический состав фукоиданов, % на сухое вещество

Table 3

Influence of extraction's time and repetition on chemical composition of fucoidans, %

Условия Вы-экстракции ход Степень извлечения Сульфатные группы No6rn; Xyl Моносахариды Fuc Man Gal Man-nitol

Однократная экстракция (2 ч) 1,3 55,9 20,8 4,5 6,1 8,3 3,6 2,6 4,0

Первая экстракция (16 ч) 2,1 65,3 19,6 8,4 6,9 15,4 0 3,1 4,4

Вторая экстракция (6 ч) 0,8 74,0 17,8 12,0 3,4 12,4 0 1,6 2,5

Двукратная экстракция 3,4 82,7 31,1 7,6 1,9 14,4 1,1 2,3 0

Примечание. Экстракцию проводили 1 %-ной соляной кислотой при ЖК 1: 5, при комнатной температуре.

При низком ЖК большую роль для полного извлечения всех фракций фуко-идана играет двукратная обработка водорослей соляной кислотой (табл. 3). Уже на первой стадии в течение 16 ч экстрагируется основная часть фукоидана, в результате повторного экстрагирования наблюдается более полное извлечение фукоидана из водоросли. При проведении двукратной экстракции был получен высокосульфатированный фукоидан, при этом степень извлечения полисахарида из водорослей составила 82,7 % (табл. 3).

Для подтверждения приемлемости разработанного нами способа экстракции фукоидана из ламинарии японской были выделены полисахариды по методикам, описанным в литературе (Усов, Кирьянов, 1994; Park et al., 2002), условия которых наиболее близки к разработанному нами способу. Анализ образцов фукои-данов, полученных разными методами, показал (табл. 4), что фукоидан, выделенный по разработанной нами схеме, максимально экстрагируется из водоросли и имеет наилучшие показатели (наибольшее содержание фукозы и сульфатных групп).

Таблица 4

Влияние условий экстракции на химический состав полисахаридов, % на сухое вещество

Table 4

Influence of extraction's conditions on chemical composition of fucoidans, %

Условия экстракции (методика) Выход Степень извлечения Сульфатные группы No6rn; Xyl Моносахариды Fuc Man Gal Man-nitol

Трижды: 0,04 % HCl, 1: 10,

1 ч, 65 °С (Park et al., 2002) 1,4 74,8 20,1 8,9 2,4 10,0 1,5 4,6 3,43

Трижды (2 % CaCl2, 1: 17,

16 ч, 25 °С; повторно 6 ч,

50 °С)(Усов, Кирьянов, 1994) 2,4 76,5 30,1 9,3 3,3 13,5 1,8 3,6 0

1 % HCl, 1: 5, 16 ч, 25 °С;

повторно 1 % HCl, 1: 5,

6 ч, 25 "С (ТИНРО) 3,5 82,7 31,1 7,6 1,9 14,4 1,1 2,3 0

После экстракции фукоидана была проверена возможность получения альги-ната из остатка водорослей. Для этого после кислотной обработки водорослей их промывали водой и проводили экстракцию альгината раствором карбоната натрия при ЖК 1: 40 сначала при комнатной температуре в течение 10 ч, затем при температуре 80-85 °С в течение 2 ч. Экстракты отделяли от водорослевых остатков центрифугированием, осаждали из раствора альгиновую кислоту и переводили ее в альгинат натрия, смешивая с карбонатом натрия.

Анализ полученных данных показал, что разработанный нами способ извлечения фукоидана из ламинарии японской не снижает качество альгината натрия (табл. 5).

Влияние извлечения фукоидана из ламинарии японской на выход и физико-химические свойства альгината натрия

Table 5

Influence of fucoidan extraction from Laminaria japonica on yield and physical-chemical features of sodium alginate

Выход Содержание, % к сухому Вязкость 0,2 веществу

Сырье альгината водного раствора,

F 0/ Альгиновая Минеральные Г, , „3 „ F '

натрия, % r N ' 10 3 Па  с кислота вещества

Ламинария японская

сушеная 24,8 73,0 22,9 7,5

Водоросль после

извлечения фукоидана 21,4 73,4 22,7 7,6

В результате проведенных исследований определены оптимальные условия получения фукоидана из бурой водоросли Laminaria japonica, а именно: предварительная спиртовая обработка водоросли 75 %-ным раствором этилового спирта, экстрагирование 1 %-ным раствором соляной кислоты при комнатной температуре (ЖК 1: 5) в течение 16 ч, повторная экстракция в течение 6 ч в тех же условиях. Показана возможность дальнейшего использования водорослей после извлечения фукоидана для получения альгинатсодержащих пищевых добавок.

Литература

ГОСТ 26185-84' Водоросли морские, травы морские и продукты их переработки. Методы анализа. — М., 1984. — 53 с.

Пат. РФ № 2233104' Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением йодсодержащих и полисахаридных продуктов / Аминина Н.М., Вишневская Т.И., Гурулева О.Н., Подкорытова А.В. // Офиц. Бюл. "Изобретения". — 2004. — № 21, ч. 2. — С. 256.

Слоникер ДЖ' Методы исследования углеводов / Пер. с англ. Под ред. Хорлина А.Я. — М.: Мир, 1975.

Усов А'И', Кирьянов А.В. Выделение фракций фукоидана из бурой водоросли L. cichorioides Miyabe // Биоорган. химия. — 1994. — Т. 20, № 12. — С. 1342-1348.

Усов А'И., Кошелева E.A., Яковлева А.И. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Японского моря // Биоорган. химия. — 1985. — Т. 11, № 16. — С. 830-836.

Усов А'И', Смирнова Г'П', Клочкова Н'Г' Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Камчатки // Биоорган. химия. — 2001. — Т. 27, № 6. — С. 444-448.

Chevolot L', Foucault A', Chaubet F' et aL Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity // Carbohydrate Research. — 1999. — Vol. 319. — P. 154-165.

Dische Z', Shettles L'B' // J. Biol. Chem. — 1948. — Vol. 175. — P. 595-603.

Dodgson K'S' Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymic and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters // Biochem. J. — 1961. — Vol. 78. — P. 312-319.

Nishino T', Nagumo T' Sugar constituents and blood-anticoagulant activities of fucose-containing sulfated polysaccharides in nine brown seaweed species // Nippon Nogeik-agaku Kaishi. — 1987. — Vol. 61, № 3. — P. 361-363.

Park H'Y', Yoon H'D', Oh E^G- Effects of Fucoidan from weed Sargassum fulvellum on lipid concentration of serum and liver in rats fed high fat diet // Bull. of NFRDI. — 2002. — Vol. 61. — P. 117-124.

Soeda Sv Kozako Tv Iwata K Shimeno H' Oversulfated fucoidan inhibits the basic fibroblast growth factor-induced tube formation by human umbilical vein endothelial cells: its possible mechanism of action // Biochim. Biophys. Acta. — 2000. — Vol. 1497. — P. 127-134.

Zvyagintseva T'N', Shevchenko N'M', Popivnich LB' et aL A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides brown seaweed // Carbohydrate Research. — 1999. — Vol. 322. — P. 32-39.