Ферментативные гидролизаты белков молочной сыворотки и куриного яйца: получение, физико-химическая и иммунохимическая характеристики

ЛЕЧЕБНОЕ ПИТАНИЕ

Для корреспонденции

Сидорова Юлия Сергеевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевых биотехнологий и специализированных продуктов ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» Адрес: 109240, Российская Федерация, г. Москва, Устьинский проезд, д.2/14 Телефон: (495) 698-53-71 E-mail: sidorovaulia28@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2168-2659

Зорин С.Н., Сидорова Ю.С., Мазо В.К.

Ферментативные гидролизаты белков молочной сыворотки и куриного яйца: получение, физико-химическая и иммунохимическая характеристики

Enzymatic hydrolysates of whey protein and chicken egg ppotein: production, physical-chemical and immunochemical characteristics

Zorin S.N., Sidorova Yu.S., Mazo V.K.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи», 109240, г. Москва, Российская Федерация

Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Moscow, Russian Federation

Снижение проявлений пищевой аллергии при включении специализированных пищевых продуктов (СПП) в питание детей и взрослых, страдающих этим заболеванием, представляет актуальную задачу.

Цель работы - получение и характеристика in vitro гидролизатов пищевых белков для оценки возможности их использования в составе СПП со сниженной потенциальной аллергенностью.

Материал и методы. В работе использованы концентрат белка молочной сыворотки (КБМС) и белок куриного яйца (БКЯ), ферменты панкреатин и алка-лаза. Протеолиз белков проводили в ферментере в течение 3 ч при соотношении фермент : субстрат 1:50 (по сухому веществу), при оптимальных для панкреатина и алкалазы рН и температуре. Ферменты инактивировали при +75 °С и проводили ультрафильтрацию. Растворы концентрировали методом обратного осмоса и лиофильно высушивали. Методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления оценивали молекулярно-массовоераспределение пептидных фракций. Остаточную антигенность определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа и выражали как кратность снижения антигенности относительно исходного белка.

Результаты и обсуждение. При протеолизе панкреатином КБМС получен гидролизат с кратностью снижения антигенности 2,3х 103 относительно исход -ного КБМС. Снижение антигенности в 4,7х104раз было достигнуто при протео-

Финансирование. Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликтов интересов.

Для цитирования: Зорин С.Н., Сидорова Ю.С., Мазо В.К. Ферментативные гидролизаты белков молочной сыворотки и куриного яйца: получение, физико-химическая и иммунохимическая характеристики // Вопр. питания. 2020. Т. 89, № 1. С. 64-68. doi: 10.24411/0042-8833-2020-10007 Статья поступила в редакцию 11.09.2019. Принята в печать 24.01.2020.

Funding. The study was carried out under state assignment. Conflict of interests. Authors declare no conflicts of interests.

For citation: Zorin S.N., Sidorova Yu.S., Mazo V.K. Enzymatic hydrolysates of whey protein and chicken egg ppotein: production, physical-chemical and immunochemical characteristics. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2020; 89 (1): 64-68. doi: 10.24411/0042-8833-2020-10007 (in Russian) Received 11.09.2019. Accepted 24.01.2020.

лизе КБМС алкалазой. Сочетание ферментолиза КБМС панкреатином или алкалазой с последующей ультрафильтрацией позволило снизить содержание высокомолекулярных пептидов с массой >8,7 кДа. Кратность снижения анти-генности по отношению к исходному белку составила при этом соответственно 1,64х105 и 1,90х105. При повторной ультрафильтрации кратность снижения антигенности полученных гидролизатов КБМС с использованием алкалазы или панкреатина была соответственно >1,0х106 и >5,0x105. Кратность снижения антигенности гидролизата БКЯ, полученного протеолизом алкалазой и ультрафильтрацией, по сравнению с исходным БКЯ составила 9,9х104, а при повторной ультрафильтрации - >5,0х105.

Заключение. Значительное уменьшение содержания высокомолекулярных пептидов и снижение антигенности пептидных смесей на основе КБМС и БКЯ до значений, позволяющих использовать их в составе гипоаллергенных продуктов, достигается при сочетании протеолиза и двукратной ультрафильтрации через мембрану УФ10.

Ключевые слова: ферментативный гидролизат, белок молочной сыворотки, белок куриного яйца, панкреатин, алкалаза, антигенность, молекулярно-массовое распределение

Reducing the manifestations of food allergy by the inclusion of specialized foods in the nutrition of children and adults suffering from this disease is an important problem. The aim was to obtain and characterize in vitro food protein hydrolysates to evaluate their use in specialized foods with reduced potential allergenicity.

Material and methods. Whey protein concentrate (WPC) and chicken egg protein (CEP) and enzymes such as pancreatin and alkalase have been used. Proteolysis of proteins was carried out in an FA-10 fermenter for 3 hours at an enzyme : substrate ratio of 1:50 in dry matter, at optimal pH and temperature for pancreatin and alkalase. Enzymes were inactivated at +75 °C and fermentolizate was ultrafiltered. The solutions were concentrated by reverse osmosis and freeze-dried. The molecular weight distribution of the peptide fractions was evaluated by HPLC. Residual antigenicity was determined by the method of indirect enzyme-linked immunosorbent assay and expressed as the fold of antigenicity reduction relative to the original protein.

Results and discussion. During WPC proteolysis with pancreatin the hydrolyzate was obtained with a fold reduction of antigenicity of 2.3x103 relative to the initial WPC. A decrease in antigenicity of 4.7x104 times was achieved with proteolysis of WPC by alkalase. The combination of WPC fermentolysis with pancreatin or alkalase followed by ultrafiltration reduced the content of high molecular weight peptides with a mass more than 8.7 kDa. The multiplicity of decrease in antigenicity with respect to the starting protein was 1.64x105 and 1.90x105, respectively. After repeated ultrafiltration the reduction in antigenicity of the obtained WPC alkalase or pancreatin hydrolysate was more than 1.0x106 and more than 5.0x105, respectively. The decrease in antigenicity of the CEP hydrolyzate obtained with proteolysis by alkalase and ultrafiltration compared to the initial CEP was 1.0x105 times, and 5.0x105 times when we used repeated ultrafiltration. Conclusion. A significant decrease in the content of high molecular weight peptides and a decrease in the antigenicity of peptide mixtures based on WPC and CEP to the values that permit their use in hypoallergenic products is achieved by combining proteolysis and double ultrafiltration through a UF10 membrane.

Keywords: enzymatic hydrolyzate, whey protein, chicken egg protein, pancreatin, alkalase, antigenicity, molecular weight distribution

В

^нарастает, что определяет значимость проблемы, года жизни, страдающих тяжелыми и средней тяжести

связанной с возможностями снижения проявлений этого аллергическими реакциями, и продукты профилактиче-

заболевания путем включения специализированных ского назначения, которые могут потребляться детьми

пищевых продуктов (СПП) со сниженной потенциальной с нетяжелыми формами аллергических проявлений,

аллергенностью в рацион питания детей и взрослых, а также входящими в группы риска, и в качестве допол-

страдающих пищевой непереносимостью (аллергией) нительного источника питания при недостатке материн-

или предрасположенных к этому заболеванию [1-3]. ского молока.

последние десятилетия частота пищевой аллергии точника питания при вскармливании детей первого

Анализ научной литературы, патентной информа- В подавляющем большинстве случаев причинно зна-

ции и документации зарубежных фирм-изготовителей чимыми аллергенами пищевых продуктов являются

позволяет выделить продукты лечебного назначения, белки [4, 5]. Способность пищевого белка выступать

т.е. собственно гипоаллергенные продукты, которые в роли аллергена у генетически предрасположенных

могут использоваться в качестве единственного ис- индивидов зависит от наличия антигенных структур

(эпитопов, аллергенных детерминант), которые могут вызвать специфическую активацию ТИ2-хелперов и выработку IgE-антител [6]. В результате ферментативного гидролиза антигенные структуры белка элиминируются, однако на практике в ферментативных гидролизатах, не подвергнутых дальнейшему фракционированию, остаются в заметных количествах нерасщепленные антигены. Современные технологии позволяют в значительной мере преодолеть эти трудности, используя в сочетании с ферментативным гидролизом технологии мембранной ультрафильтрации и/или нанофильтрации [7-9]. В результате удается получить пептидные смеси, в которых содержание антигенных структур снижено на несколько порядков не только по сравнению с исходным белком, но и с его ферментативным гидролизатом. Очевидно, что доклиническая оценка потенциальной аллер-генности СПП должна предшествовать их клиническим испытаниям.

Цель данного исследования - получение и характеристика in vitro гидролизатов концентрата сывороточных белков молока и белка куриного яйца (БКЯ) для предварительной оценки их возможного использования в составе СПП со сниженной потенциальной аллерген-ностью.

Материал и методы

В работе в качестве белковых субстратов были использованы концентрат белка молочной сыворотки (КБМС) «Лакпродан 80» (Arla, Дания; содержание белка 80%) и БКЯ («Овопол», Польша; содержание белка 90%). Перед проведением ферментолиза БКЯ денатурировали при перемешивании в течение 15 мин при 85 °С.

В качестве ферментов были использованы панкреатин (Biosyn, КНР) с протеолитической активностью 2,39 ПС/мг и алкалаза (Novozymes, Дания) с протеолитической активностью 2,4 ПС/мг (определяли по методу Ансона по ГОСТ Р53974-2010 «Ферментные препараты для пищевой промышленности. Методы определения протеолитической активности»).

Гидролиз проводили в автоклавируемом ферментере ФА-10 («Проинтех», Россия).

Протеолиз панкреатином проводили в течение 3 ч при температуре 50±2 °С, соотношении фермент : субстрат 1:50 (по сухому веществу), поддерживая рН реакционной смеси в диапазоне 7,4-7,6 добавлением 5,0% смеси KOH : NaOH (2:1).

Протеолиз белков алкалазой проводили также в течение 3 ч при температуре 60±2 °С, соотношении фермент : субстрат 1:50 (по сухому веществу), поддерживая рН реакционной смеси в диапазоне 7,6-7,8 той же смесью щелочных растворов.

По окончании гидролиза ферменты инактивировали при +75 °С в течение 15 мин, после чего проводили ультрафильтрацию (одно- или двукратную) на лабораторной установке для микро- и ультрафильтрации на базе филь-тродержателя АСФ-018 («Владисарт», Россия) через

мембрану УФ10 (со средним значением пор 10 кДа) со сбором низкомолекулярной фракции. Полученные растворы концентрировали методом обратного осмоса на установке с фильтром рулонным мембранным УРФ-1812 («Владисарт», Россия) и лиофильно высушивали (ЛС-500, «Проинтех», Россия). В полученных образцах оценивали молекулярно-массовое распределение пептидных фракций методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления с использованием колонки «Супероза 12» (1,0x30 см) [10].

Остаточную антигенность КБМС и БКЯ в продуктах определяли методом непрямого твердофазного имму-ноферментного анализа с модификациями [11] (4 параллельных определения) и выражали как кратность снижения антигенности (КСА) относительно исходного белка.

Результаты и обсуждение

В таблице приведены результаты, характеризующие КСА полученных гидролизатов и молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в их составе.

Протеолиз панкреатином КБМС позволил получить практически полностью водорастворимый гидролизат, в котором КСА составила 2,3x103 относительно исходного КСБ. Существенно большее снижение антигенно-сти было достигнуто при протеолизе КБМС алкалазой (таблица). Сочетание ферментолиза КБМС панкреатином или алкалазой с последующей ультрафильтрацией через УФ10-мембрану (пористостью 10 кДа) позволило модифицировать молекулярно-массовое распределение пептидов в составе полученных гидролизатов, снизив в них содержание высокомолекулярных пептидов с массой >8,7 кДа КСА по отношению к исходному белку. Высокая эффективность в плане дальнейшего снижения антигенных свойств получаемых гидролизатов была достигнута повторной ультрафильтрацией через мембрану УФ10.

Использование панкреатина для получения фермен-толизата БКЯ оказалось неэффективным вследствие образования по завершении реакции протеолиза значительных количеств осадка и, соответственно, крайне низкого выхода растворимой пептидной смеси, пригодной для корректного физико-химического и иммунохи-мического анализа.

Исходная антигенность гидролизата БКЯ, полученного сочетанием протеолиза алкалазой и ультрафильтрации, снизилась по сравнению с исходным БКЯ в 9,9x104 раз, а при повторной ультрафильтрации уменьшилась еще более чем в 5 раз.

В ходе первого этапа доклинической оценки in vitro потенциальной аллергенности ферментативных белковых гидролизатов в качестве представляющей наибольший интерес их физико-химической характеристики используются данные о молекулярно-массовом распределении пептидных фракций в их составе. Считается, что короткие пептидные фрагменты не иммуногенны,

П р и м е ч а н и е. КБМС - концентрат белка молочной сыворотки; БКЯ - белок куриного яйца; УФ10 - ультрафильтрация через мембрану УФ10 с пористостью 10 кДа; УФ10 + УФ10 - повторная ультрафильтрация через УФ10.

N o t e. WPC - whey protein concentrate; CEP - chicken egg protein; UF10 - ultrafiltration through the UV10 membrane with a porosity of 10 kDa; UF10 + UF10 - repeated ultrafiltration through the UV10 membrane.

Кратность снижения антигенности и молекулярно-массовое распределение пептидных фракций полученных гидролизатов

The multiplicity of the decrease in antigenicity and molecular weight distribution of the peptide fractions of the obtained hydrolysates

Субстрат Substrate Фермент Enzyme Мембранная обработка Membrane treatment Содержание фракции (по оптической плотности при 280 нм) с диапазоном молекулярных масс, % Fraction content (by optical density at 280 nm) with a range of molecular weights, % Кратность снижения антигенности(относительно исходного белка) Multiplicity of decrease

>8,7 кДа >8.7 kDa 8,7-2,6 кДа 8.7-2.6 kDa <2,6 кДа <2.6 kDa in antigenicity

КБМС WPC Панкреатин Pancreatin Без УФ10 Without UF10 15,9 24,9 59,2 2300±80

УФ10 UF10 5,6 28,3 66,1 164 000±7000

УФ10 + УФ10 UF10 + UF10 1,2 22,3 76,5 >500 000

Алкалаза Alkalase Без УФ10 Without UF10 7,6 61,8 30,6 47 000±12 000

УФ10 UF10 3,7 64,2 32,1 190 000±8000

УФ10 + УФ10 UF10 + UF10 2,6 60,8 36,6 >1 000 000

БКЯ CEP Алкалаза Alkalase УФ10 UF10 1,8 69,9 28,2 99 000±4000

УФ10 + УФ10 UF10 + UF10 1,7 69,9 28,4 >500 000

так как не могут быть представлены антигенпрезен-тирующими клетками [12]. Однако заключение об отсутствии аллергизирующих свойств СПП, содержащих низкомолекулярные пептидные смеси, по-видимому, недостаточно обоснованно. Нельзя исключить, что корот-коцепочечные пептиды могут проявлять иммуногенные (т.е. потенциально аллергизирующие) свойства, выступая в роли гаптенов при связывании с высокомолекулярными ингредиентами СПП, а также с другими пищевыми веществами или эндогенными соединениями в желудочно-кишечном тракте или даже белками крови. Оценка снижения исходной антигенности гидролизуемого белка в опытах in vitro, количественно характеризующая наличие в гидролизате антигенных детерминант исходного белка (т.е. потенциальных гаптенов), на наш взгляд, необходима и должна предшествовать клиническим испытаниям, по результатам которых только и можно делать корректное заключение о возможности использования получаемых гидролизатов (пептидных смесей) в составе гипоаллергенных СПП лечебного назначения.

Заключение

Гидролизаты, используемые для включения в состав гипоаллергенных продуктов, характеризуются значительным содержанием свободных аминокислот и ко-роткоцепочечных пептидов с КСА на уровне 1,0x10 относительно исходного пищевого белка. Такое снижение антигенности характерно для смесей на основе глубокого гидролизата казеина. Полученные в нашей работе результаты свидетельствуют, что значительное уменьшение содержания высокомолекулярных пептидов и снижение антигенности пептидных смесей на основе КБМС до значений, позволяющих использовать их в составе гипоаллергеных продуктов, может быть достигнуто при сочетании протеолиза этого белка алкалазой или панкреатином и последующей двукратной ультрафильтрации через мембрану УФ10. Примененный технологический подход позволяет также получать пептидные смеси на основе БКЯ, антиген-ность которых относительно БКЯ снижена более чем в 5,0х105 раз.

Сведения об авторах

ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Москва, Российская Федерация):

Зорин Сергей Николаевич (Sergey N. Zorin) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевых биотехнологий и специализированных продуктов E-mail: zorin@ion.ru https://orcid.org/0000-0003-2689-6098

Сидорова Юлия Сергеевна (Yuliia S. Sidorova) - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории пищевых биотехнологий и специализированных продуктов E-mail: sidorovaulia28@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2168-2659

Мазо Владимир Кимович (Vladimir K. Mazo) - доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории пищевых биотехнологий и специализированных продуктов E-mail: mazo@ion.ru https://orcid.org/0000-0002-3237-7967

Литература

1. Vandenplas Y., Abkari A., Bellaiche M., Benninga M., Chouraqui J.P. 7. et al. Prevalence and health outcomes of functional gastrointestinal symptoms in infants from birth to 12 months of age //

J. Pediatric Gastroenterol. Nutr. 2015. Vol. 61, N 5. P. 531-537. doi: 10.1097/MPG.0000000000000949

2. van Tilburg M.A., Hyman P.E., Walker L., Rouster A., Palsson O.S., 8. Kim S.M., Whitehead W.E. Prevalence of functional gastrointestinal disorders in infants and toddlers // J. Pediatr. 2015. Vol. 166,

N 3. P. 684-689. doi: 10.1016/j.jpeds.2014.11.039 9.

3. Schmiechen Z.C., Weissler K.A., Frischmeyer-Guerrerio P.A. Recent developments in understanding the mechanisms of food allergy // Curr. Opin. Pediatr. 2019. Vol. 31, N 6, P. 807-814. doi: 10.1097/M0P.0000000000000806

4. Szajewska H., Horvath A. A partially hydrolyzed 100% whey 10. formula and the risk of eczema and any allergy: an updated meta-analysis // World Allergy Organ. J. 2017.Vol. 10, N 1. P. 27.

doi: 10.1186/s40413-017-0158-z

5. Paparo L., Nocerino R., Bruno C., Di Scala C., Cosenza L., Bedo-

gni, G. et al. Randomized controlled trial on the influence ofdietary 11. intervention on epigenetic mechanisms in children with cow's milk allergy: the EPICMA study // Scientific Reports. 2019. Vol. 9, N 1, e2828. doi: 10.1038/s41598-019-38738-w

6. Ногаллер И.С., Гущин И.С., Мазо В.К., Гмошинский И.В. 12. Пищевая аллергия и непереносимость пищевых продуктов.

М. : Медицина, 2008. 336 с.

Гмошинский И.В., Зилова И.С., Зорин С.Н., Демкина Е.Ю. Мембранные технологии — инновационный метод повышения биологической ценности белка для питания детей раннего возраста // Вопросы современной педиатрии. 2012. Т. 11, № 3. С. 57-64. https://doi.org/10.15690/vsp.v11i3.297 Kiewiet M.B.G., Faas M.M., de Vos P. Immunomodulatory protein hydrolysates and their application // Nutrients. 2018. Vol. 10, N 7. P. E904. doi:10.3390/nu10070904

Quintieri L., Monaci L., Baruzzi F., Giuffrida M.G., de Candia S., Caputo L. Reduction of whey protein concentrate antigenicity by using a combined enzymatic digestion and ultrafiltration approach // J. Food Sci. Technol. 2017. Vol. 54, N 7. P.1910-1916. doi: 10.1007/ s13197-017-2625-5

Зорин С.Н., Баяржаргал М. Получение ферментативных гидролизатов пищевых белков с использованием некоторых коммерческих ферментных препаратов и различных схем проведения гидролиза // Биомедицинская химия. 2009. Т. 55, № 1. С. 73-80.

Способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков со средней степенью гидролиза: пат. 2375910 Рос. Федерация N 2008122014/13; заявл. 03.06.08; опубл. 20.12.09, Бюл. № 35 19 с.

Lehrer S.B., Horner W.E., Reese G. Why are some proteins aller-genic? Implications for biotechnology // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1996. Vol. 36, N 6. P. 553-564.

References

Vandenplas Y., AbkariA., Bellaiche M., Benninga M., Chouraqui J.P., et al. Prevalence and health outcomes of functional gastrointestinal symptoms in infants from birth to 12 months of age. J. Pediatric Gastroenterol Nutr. 2015; 61 (5): 531-7. doi: 10.1097/ MPG.0000000000000949

van Tilburg M.A., Hyman P.E., Walker L., Rouster A., Palsson O.S., Kim S.M., Whitehead W.E. Prevalence of functional gastrointestinal disorders in infants and toddlers. The Journal of Pediatrics. 2015; 166 (3): 684-9. doi: 10.1016/j.jpeds.2014.11.039 Schmiechen Z.C., Weissler K.A., Frischmeyer-Guerrerio P.A. Recent developments in understanding the mechanisms of food allergy. Curr. Opin. Pediatr. 2019; 31 (6): 807-14. doi: 10.1097/ MOP.0000000000000806

Szajewska H., Horvath A. A partially hydrolyzed 100% whey formula and the risk of eczema and any allergy: an updated metaanalysis. World Allergy Organ J. 2017; 10 (1): 27. DOI: 10.1186/ s40413-017-0158-z

Paparo L., Nocerino R., Bruno C., Di Scala C., Cosenza L., Bedogni G., et al. Randomized controlled trial on the influence of dietary intervention on epigenetic mechanisms in children with cow's milk allergy: the EPICMA study. Sci Reports. 2019; 9 (1): e2828. doi: 10.1038/s41598-019-38738-w

Nogaller I.S., Gushchin I.S., Maso V.K., Gmoshinsky I.V. Food allergies and food intolerances. Moscow: Meditsina, 2008: 336 p.

10.

11.

12.

Gmoshinsky I.V., Zilova I.S., Zorin S.N., Demkina E.Yu. Membrane technologies — an innovative method of increasing the biological value of protein for nutrition of young children. Voprosy sovremennoy pediatrii [Current Pediatrics]. 2012; 11

Kiewiet M.B.G., Faas M.M., de Vos P. Immunomodulatory protein hydrolysates and their application. Nutrients. 2018; 10 (7): E904. doi:10.3390/nu10070904

Quintieri L., Monaci L., Baruzzi F., Giuffrida M.G., de Candia S., Caputo L. Reduction of whey protein concentrate antigenicity by using a combined enzymatic digestion and ultrafiltration approach. J Food Sci Technol. 2017; 54 (7): 1910-6. doi: 10.1007/s13197-017-2625-5

Zorin S.N., Bayarzhargal M. Obtaining of food proteins enzymatic hydrolysates using some commercial enzyme preparations and various hydrolysis schemes. Biomedicinskay himiya [Biomedical Chemistry]. 2009; 55

Lehrer S.B., Horner W.E., Reese G. Why are some proteins allergenic? Implications for biotechnology. Crit Rev Food Sci Nutr. 1996; 36 (6): 553-64.

1.

7.

2.

8.

3

9

4

6.