Использование молекулярно-генетических маркеров для паспортизации коллекции рода Rhododendron L

ГЕНЕТИКА РАСТЕНИЙ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ПАСПОРТИЗАЦИИ КОЛЛЕКЦИИ РОДА RHODODENDRON L.

Л.В. ГОНЧАРОВА, кандидат биологических наук ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси», Минск, Республика Беларусь О.Ю. БАРАНОВ, кандидат биологических наук ГНУ «Институт леса НАН Беларуси», Гомель, Республика Беларусь А Н. ЮХИМУК; Е В. СПИРИДОВИЧ, кандидат биологических наук; И.К. ВОЛОДЬКО, кандидат биологических наук ГНУ «Центральный ботанический сад НАН Беларуси», Минск, Республика Беларусь

Введение

Несмотря на то, что представители рода Rhododendron L. как декоративные растения известны в Европе с середины XVII века, целенаправленная интродукция рододендронов в Беларуси началась лишь в середине 60-х годов прошлого века с создания коллекции этого рода в Центральном ботаническом саду НАН Беларуси. За прошедший период интродукционные испытания в условиях Беларуси прошли более 90 видов и 20 сортов вечнозеленых, полувечнозеленых и листопадных рододендронов, полученных в виде семян или саженцев из различных ботанических учреждений и, в первую очередь, Германии, Чехословакии, Прибалтики, Украины. На сегодняшний день коллекция рододендронов состоит из 43 видов и 18 сортов зарубежной селекции, в том числе 10 форм находятся в коллекции in vitro, для 7 сортов разработана технология клонального микроразмножения.

Систематика рода Rhododendron сложна и до сих пор окончательно не разработана. В природе среди чистых видов встречается большое количество естественных гибридов, селекционерами создаются гибриды и сорта, несущие признаки, характерные для различных видов [1, 7].

В настоящее время систематики для определения видов используют не только морфологические и анатомические признаки, но и данные биохимических и генетических исследований, хотя доля последних все еще несоизмерима мала [7]. Такой подход дает возможность систематизировать виды рода Rhododendron и разработать естественную классификацию, отражающую не только формовое разнообразие, но и эволюционно-таксономические взаимоотношения видов внутри рода.

Техники маркирования геномов, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР), такие как RAPD, AFLP, SSRs, ISSR [2-5, 7, 8, 12] и др. позволяют разрабатывать ДНК-маркеры растительных геномов, которые легко воспроизводить и анализировать. RAPD-метод давно завоевал ведущее место для выявления генетического разнообразия растительного материала. На сегодняшний день RAPD-ПЦР применен для идентификации генетического полиморфизма огромного числа видов растений с различными целями (классификация, идентификация, паспортизация и т.д.) [5]. В связи с тем, что часть коллекции рододендронов Центрального ботанического сада НАН Беларуси формировалась стихийно, и некоторые данные о происхождении тех или иных форм растений утрачены, весьма актуальной является работа по идентификации, паспортизации и систематизации данной коллекции с целью сохранения, дальнейшей селекции и обмена генетическим материалом с другими ботаническими садами и держателями коллекций.

В рамках комплексного подхода к решению этой проблемы начата работа, целью которой стало молекулярно-генетическое маркирование коллекции рододендронов ЦБС НАН Беларуси с использованием RAPD-метода.

Объекты и методы исследования

Объектом исследования были молодые листья 17 видов рододендронов из коллекции ЦБС НАН Беларуси, список и систематическое положение которых согласно классификации American Rhododendron Society (ARS) представлены в табл. 1. Листья фиксировали в насыщенном растворе NaCl/CTAB по методике [9] с модификациями [11], что позволяет очистить поверхность листьев от вторичных метаболитов и предотвратить последующее бактериальное загрязнение препаратов ДНК и контаминацию при постановке ПЦР.

Таблица 1

Систематическое положение исследуемых видов рода Rhododendron

№ Подрод Секция Вид

1. Hymenanthes Ponticum Rhododendron fortunei Lindl.

2. Rhododendron maximum L.

3. Rhododendron ponticum L.

4. Rhododendron catawbiense Michx.

5. Rhododendron smirnovii Trautv.

6. Rhododendron williamsianum Rehd. et Wils.

7. Pentanthera Pentanthera Rhododendron luteum Sweet.

8. Rhododendron roseum (Loisel) Rehd.

9. Rhodora Rhododendron vaseyi A. Gray

10. Rhododendron canadense (L.) Torr. var. albiflorum

11. Sciadorhodion Rhododendron albrechtii Maxim.

12. Rhododendron schlippenbaehii Maxim.

13. Rhododendron Rhododendron Rhododendron ambiguum Hemsl.

14. Rhododendron micranthum Turcz.

15. Rhododendron mucronulatum Turcz.

16. Rhododendron sichotense Pojark.

17. Tsutsusi Tsutsusi Rhododendron kaempferi Planch.

ДНК из листьев рододендронов выделяли с использованием СТАВ-метода [6] с модификациями [10] для растений, характеризующихся повышенным содержанием вторичных метаболитов. Чистоту и концентрацию препаратов ДНК определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре марки Agilent 8453 (США), в кварцевых кюветах объемом 1 мл. ДНК растворяли в TE-буфере. Этот буфер использовали в качестве раствора, поглощение которого принимается за ноль. Расчет концентрации проводили на основании закона Бугера-Ламберта-Бера, исходя из того, что одна единица оптического поглощения соответствует концентрации ДНК 50 мкг/мл при длине оптического пути 1 см и использовании ТЕ-буфера как растворителя.

ПЦР проводили в амплификаторе Eppendorf Mastercycler personal (Германия). Для постановки ПЦР были использованы следующие праймеры (в скобках приведены температуры отжига): Oligo 1 -CGTCTGCCCG (43,0), Oligo 2 - GGTCTCTCCC (26,7), Oligo 3 - TCCATGCCGT (37,5), Oligo 8 -CGCCCCCATT (44,9), Oligo 11 - TCCCGAACCG (42,0), Oligo 18 - CAATCGCCGT (37,8), Oligo 91 -CCGAACGGGT (41,4), Oligo 94 - GGACGGGTGC (41,5) [3, 12].

Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в агарозном геле, окрашивали раствором бромистого этидия. Размеры выявляемых RAPD-зон определяли с помощью программного обеспечения Quantity One (фирма «Biorad», США).

Результаты и обсуждение

Для проведения RAPD-анализа испытано 8 произвольных десятичленных праймеров, различающихся по нуклеотидной последовательности и проценту G-C-пар нуклеотидов, 5 из них характеризовались четкими и воспроизводимыми ПЦР-спектрами и были использованы для дальнейшей работы.

Размер фрагментов амплификации находился в пределах 200-1450 пар нуклеотидов (п.н.). Количество амплифицированных фрагментов варьировало от 10 до 18 в зависимости от праймера. Некоторые праймеры выявили уникальные, присущие только одному конкретному виду ампликоны: у вида Rh. ambiguum — Oligo 1 (1200 п.н.); Rh. canadense — Oligo 2 (330 п.н.); Rh. kaempferi — Oligo 3 (1280 п.н.); Rh. luteum — Oligo 11 (1125 п.н.); Rh. roseum — Oligo 3 (220 п.н.). Эти уникальные ампликоны могут быть использованы как ДНК-маркеры для идентификации вышеперечисленных видов.

Таким образом, для каждого из 17 исследуемых видов рододендронов получены индивидуальные RAPD-спектры по 5 праймерам. На основании анализа полученных RAPD-спектров были составлены многолокусные генетические паспорта для каждого вида, представляющие собой матрицы состояний бинарных признаков, в которых наличие или отсутствие

в ЯЛРБ-спектрах одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось как состояние 1 и 0 соответственно (табл. 2).

Таблица 2

Многолокусный генетический паспорт исследуемых видов рода Rhododendron на основе _анализа RAPD-спектров_

Вид

а <а « •vS IS Si !fî 55 s a a S a e 54 ! d a n a u e 54 n •S» * a 55 U M n a "K t e a •¡¡e s a e -S maximum m u « « a r mi m u -s s « onr u u m s a •S» n o roseum ih e a "C n w h u s e s « h si smirnovii vaseyi m u n ai 1 ¿5 s

С a; a; a; a; a; a; a; ¿5 a; a; a; a; ¿5 a; a; a; ¿5 a; ¿5 a; a;

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Oligo 1

200 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0

290 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1

345 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

400 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0

450 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

510 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0

615 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

670 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0

780 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1

840 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0

905 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1

960 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0

106 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

112 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

120 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

131 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1

138 5 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0

145 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

Oligo 2

330 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

400 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0

455 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

505 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

570 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0

645 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0

745 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0

815 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

865 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0

905 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

950 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0

105 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1

118 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1

132 5 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1

144 5 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0

ОИцо 3

220 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

300 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1

370 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

455 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1

530 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0

590 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1

650 0 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0

700 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1

770 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0

850 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

100 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1

107 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

119 5 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

128 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

135 5 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ОИцо 11

405 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

445 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0

480 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

565 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0

625 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0

665 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0

740 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 1

875 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0

103 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0

112 5 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

ОИцо 94

425 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0

475 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0

510 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0

550 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0

600 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0

Продолжение таблицы 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

670 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1

720 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0

790 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1

855 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0

910 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0

980 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0

104 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0

109 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0

118 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0

126 5 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1

132 5 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0

145 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0

Примечание: 1 - присутствие и 0 - отсутствие амплифицированного фрагмента указанной длины

Для более полной молекулярно-генетической характеристики видов рода Rhododendron коллекции ЦБС НАН Беларуси и в дальнейшем — для сортов целесообразно будет применение не только RAPD-диагностики, но и других методов ПЦР, что позволит подобрать наиболее рациональные с точки зрения объективности и достоверности получаемых результатов, материальных и временных затрат способы проведения идентификации и систематизации коллекции рододендронов с целью сохранения, селекции и обмена генетическим материалом.

Выводы

Для каждого из 17 исследуемых видов рододендронов получены индивидуальные RAPD-спектры по 5 праймерам, на основании которых были составлены многолокусные генетические паспорта каждого вида. Найдены видоспецифичные уникальные фрагменты, которые могут быть использованы как маркеры для видовой идентификации: Rh. Ambiguum - 1200 п.н. (Oligo 1); Rh. canadense - 330 п.н. (Oligo 2); Rh. kaempferi - 1280 п.н. (Oligo 3); Rh. luteum - 1125 п.н. (Oligo 11); Rh. roseum - 220 п.н. (Oligo 3).

Список литературы

1. Кондратович Р.Я. Рододендроны. - Рига: Авотс, 1981. - 231 с.

2. Выявление специфических RAPD- и ISSR-фрагментов у сомаклонов кукурузы (Zea mays L.) и создание на их основе SCAR-маркеров / Осипова Е.С., Ковеза О.В., Троицкий А.В., Долгих Ю.И., Шамина З.Б., Гостимский С.А. // Генетика. - 2003. - Т. 39, № 12. - С. 1664-1672.

3. Стегний В.Н., Чудинова Ю.В., Салина Е.А. RAPD-анализ разнопродуктивных сортов и гибридов льна культурного // Генетика. - 2000. - Т. 36, № 10. - С. 1370-1373.

4. Awasthi A.K., Nagaraja G.M., Naik G.V., Kanginakudru S., Thangavelu K., Nagaraju J. Genetic diversity and relationships in mulberry (genus Morus) as revealed by RAPD and ISSR marker assays / [BMC Genetics]. - 2004. - режим доступа - http://www.biomedcentral.com/1471-2156/5/1.

5. Christian Schlotterer. The evolution of molecular markers - just a matter of fashion? // Nature reviews. Genetics. - 2004. - Vol. 5. - P. 63-69.

6. Doyle J.J., Doyle J.L. A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue // Focus. - 1990. - N 12. - Р. 13-15.

7. Lanying Zh., Yongqing W., Li Zh. Genetic diversity and relationship of Rhododendron species based on RAPD analysis // American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci. - 2008. - V. 3 (4). - P. 626-631.

S. Novy R.G., Kobak C., Goffreda J., Vorsa N. RAPDs identify varietal misclassification and regional divergence in cranberry Vaccinium macrocarpon (Ait.) Pursh. // Theor. Appl. Genet. - 1994. - V. SS, N S. - P. 1004-1010.

9. Storchova H., Hadlickova R., Chrtek J., Tetera M., Fitze D., J. Fehrer. An improved method of DNA isolation from plants collected conserved in saturated NaCl/CTAB solution // Taxon. - 2000. - V. 49, N 1. - P. 79-S4.

10. Tel-Zur N., Abbo S., Myslabodski D., Mizrahi Y. Modified CTAB Procedure for DNA Isolation from Epiphytic Cacti of the Genera Hylocereus and Selenicereus (Cactaceae) // Plant Mol. Biol. Rep. - 1999. - V. 17, N 3. - Р. 249-254.

11. Thomson J.A. An improved non-cryogenic transport and storage preservative facilitating DNA extraction from «difficult» plants collected at remote sites // Telopea. - 2002. - V. 9, N 4. - Р. 755-760.

12. Wu J., Krutovski K.V., Strauss N.A. Nuclear DNA diversity, population differentiation and phylogenetic relationships in the California closed-cone pines based on RAPD and allozyme markers // Genome. - 1999. - V. 42. - Р. S93-90S.

Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.

ИЗМЕНЧИВОСТЬ КАЧЕСТВА СЕМЯН У КЛИМАТИПОВ СОСНЫ КОРЕЙСКОЙ В

ГЕОГРАФИЧЕСКИХ КУЛЬТУРАХ

Г.В. КУЗНЕЦОВА, кандидат биологических наук Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск, Россия

Введение

Успешный рост сосны корейской (Pinus koraiensis Siebold et Zucc.) во многих регионах страны, ее «цветение», семеношение вне ареала являются важнейшими показателями адаптации в новых условиях. Опыты по выращиванию этого вида в географических культурах показывают, что сосну корейскую за пределами её ареала можно использовать как орехоплодное и декоративное дерево [1, 3 ,6]. Поэтому изучение качества семян у сосны корейской в культуре имеет большое значение для ее размножения в новых условиях выращивания, а также для накопления данных о влиянии географического происхождения и экологических условий на характер роста и развития, что и явилось целью нашего исследования.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования были семена сосны корейской двух происхождений (облученский климатип, Хабаровский край и чугуевский климатип, Приморский край), выращенных в географических культурах на юге Красноярского края, в Ермаковском районе. Район исследования географических культур находится в условиях оптимума произрастания сибирской сосны в предгорье Западного Саяна, в Западно-Саянском округе горно-таежных и подгольцово-таежных кедровых лесов Северной Алтае-Саянской горной лесорастительной провинции пихтовых и кедровых лесов [7]. Среднегодовая температура января — -iS^Q июля — +18,8оС. Климат достаточно влажный. Средняя продолжительность вегетационного периода 144 дня, сумма t° >5о — 1851оС, годовое количество осадков — 8G5 мм. Средняя продолжительность безморозного периода — 9G дней. Географические культуры сосны корейской были созданы в 1983 году Н.А. Ларионовой и Г.В. Кузнецовой посадкой шестилетних сеянцев.

Начиная с IG-летнего возраста в географических культурах проводили наблюдения за развитием репродуктивных органов, изучали семеношение и продуцирование пыльцы. Замерялись показатели шишек, семян, определялась жизнеспособность семян. Существующие методы определения жизнеспособности и степени развития семян (взрезывание, окрашивание, проращивание) очень трудоемки. Поэтому необходимо изыскивать и применять более совершенные методы, позволяющие изучать качество семян, не вскрывая их.

Наиболее перспективным является метод рентгенографии [1G]. Для определения жизнеспособности семян сосны кедровой в наших исследованиях использовали отраслевой стандарт рентгенографического метода, специально разработанный лабораторией лесной генетики и селекции Института леса им. В.Н. Сукачева СО РАН (ОСТ 56-94.87) [8]. Жизнеспособность семян определяли по рентгенограммам на основании анализа внутреннего строения и классов развития