Влияние апотромбостатина и тиакарпина на эффективность цитостатической терапии крыс с перевиваемой опухолью

Вестник ДВО РАН. 2007. № 6

С.Г.КРЫЛОВА, Е.П.ЗУЕВА, Т.Г.РАЗИНА, Е.Н.АМОСОВА, А.М.ПОПОВ, А.А.АРТЮКОВ, Э.П.КОЗЛОВСКАЯ

Влияние апотромбостатина и тиакарпина на эффективность цитостатической терапии крыс с перевиваемой опухолью

В экспериментах на крысах с карциносаркомой 256 Уокера апотромбостатин, получаемый из коллагенового белка дальневосточной голотурии (трепанга) Apostichopus japonicus Selenka, усиливал противоопухолевое и противометастатическое действие широко известного цитостатика циклофосфана. Эффект апотромбостатина, однако, несколько уступал синтетическому тиазольному алкалоиду тиакарпину.

The effects of apothrombostatin and thiacarpin on cytostatic therapy efficiency in rats with transplantable tumor. S.G.KRYLOVA, E.P.ZUEVA, T.G.RAZINA, E.N.AMOSOVA (Institute of Pharmacology of Tomsk Scientific Centre of Sibirian Branch, Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk), A.M.POPOV, A.A.ARTYUKOV, E.P.KOZLOVSKAYA (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

In the experiments on rats with Walker carcinosarcoma 256 apothrombostatin, obtained from collagen protein of h Far-Eastern holothurian (trepang) Apostichopus japonicus Selenka, intensified antitumor and antimetastatic action of the well-known cytostatic cyclophosphan. However, the effect of apothrombostatin was somewhat inferior to the effect of synthetic thiasol alkaloid thiacarpin.

В решении проблемы множественной лекарственной резистентности опухолей, которая является одной из ключевых в современной клинической онкологии, большие надежды возлагаются на природные соединения из морских гидробионтов. Особое место среди них занимают морские алкалоиды [5, 10, 11]. В частности, тиазоль-ные алкалоиды типа тиакарпина имеют перспективы применения как потенциальные противоопухолевые средства, а также специфические ингибиторы внутриклеточных репарационных процессов [5, 6]. Другую группу составляют продукты протеолитиче-ской трансформации некоторых коллагеновых белков [14, 15]. В частности, длительная экспозиция эндостатина, С-концевого фрагмента коллагена XVIII типа человека, ингибирует рост кровеносных сосудов, которые питают опухоль и создают условия для метастазирования путем индукции апоптоза эндотелиальных клеток. После прекращения лечения развитие опухоли не возобновляется. Эндостатин специфично ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток и останавливает рост различных солидных экспериментальных опухолей. Он связывает цинк, гепарин/гепарансульфат, ламинин, сульфатиды и ингибирует ангиогенез [16]. Высокие антиангиогенные свойства в сочетании с низкой токсичностью позволяют рассматривать эндостатин как средство, которое

КРЫЛОВА Светлана Геннадьевна - доктор биологических наук, ЗУЕВА Елена Петровна - доктор биологических наук, РАЗИНА Татьяна Георгиевна - доктор биологических наук, АМОСОВА Евдокия Наумовна - кандидат биологических наук (Институт фармакологии Томского научного центра СО РАМН), ПОПОВ Александр Михайлович - доктор биологических наук, АРТЮКОВ Александр Алексеевич - кандидат химических наук, КОЗЛОВСКАЯ Эмма Павловна - доктор биологических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток).

Работа поддержана грантом РФФИ № 04-04-08083.

может быть использовано для повышения эффективности противоопухолевой терапии различными цитостатиками [9].

Недавно из дальневосточной голотурии (трепанга) Apostichopus japonicus Selenka удалось выделить низкомолекулярный коллагеновый белок, получивший название апотромбостатин (АТС). Разработана унифицированная технология получения АТС, и произведено первичное тестирование его противоопухолевой и антикоагулянтной активности [1, 3, 4]. Трепанг не только считается деликатесным продуктом, но и применяется в качестве лечебно-профилактического средства при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, особенно в случае развития онкопатологий [7]. Первичную оценку противоопухолевой активности АТС проводили на модели солидного и асцитного вариантов опухоли Эрлиха. В обоих случаях зарегистрирован статистически достоверный противоопухолевый эффект данного препарата [1].

В результате изучения антикоагулянтных свойств АТС было обнаружено, что добавление препарата к нестабилизированной крови резко увеличивает время ее свертывания. Уровень активности АТС соответствует 0,035 МЕ/мл гепарина. АТС увеличивает время свертывания тромбоцитарной плазмы при добавлении тканевого тромбопластина, а также блокирует превращение фибриногена в фибрин путем влияния на активность тромбина в ферментативной фазе свертывания крови и на самосборку фибрин-мономера в фазе полимеризации промежуточного продукта [3].

В настоящей работе дана оценка противоопухолевой и антиметастатической активности АТС и тиакарпина при их раздельном и совместном с цитостатиком циклофосфаном введении крысам с карциносаркомой 256 Уокера.

Исследование препаратов осуществляли в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP - good laboratory practice), Приказом Минздрава РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным законом «О лекарственных средствах» (ст. 36), Руководством по экспериментальному доклиническому изучению новых фармакологических веществ (2005 г.). Эксперименты выполнены на 48 беспородных крысах-самцах, разведенных в виварии Отдела экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН. Содержание животных и процедура проведения экспериментов соответствовали требованиям, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986 г.).

Карциносаркому 256 Уокера, которая характеризуется смешанным типом метастази-рования (лимфогенным и гематогенным), перевивали крысам иньекцией 20%-ной взвеси опухолевых клеток в 0,2 мл физиологического раствора под кожу спины.

Модифицированные коллагеновые белки получали путем двукратной обработки белкового экстракта тела дальневосточной голотурии A. japonicus протеолитическим препаратом коллагеназой КК в течение 3,5-4,5 ч при рН 7,5 и температуре 35-37°С. Продукты ферментолиза осаждали добавлением этанола, и осуществляли очистку белка фракционированием на мембранах согласно [6]. После тщательной очистки продуктов протеолити-ческой модификации коллагена из дальневосточного трепанга A. japonicus методом микрофильтрации получен АТС. По данным МАЛДИ-масс-спектрометрии, его молекулярная масса составила ~ 12 кДа. По аминокислотному составу АТС можно отнести к типичным коллагеновым белкам, содержащим 6% сульфатированных углеводных остатков. Сравнительное исследование АТС и коллагенов, выделенных из других источников, обнаружило более высокое содержание отрицательно заряженных аминокислот (аспарагиновой и преимущественно глутаминовой), оксикислот (серина, треонина с преобладанием тирозина), а также повышенное количество валина. По содержанию глицина, оксипролина и пролина выделенные белки соответствуют классическому коллагену. Следует отметить, что эндо-статин, протеолитический фрагмент коллагена XVIII млекопитающих, в отличие от АТС, нельзя отнести к типичным коллагеновым структурам [9].

Животные получали АТС подкожно, а тиакарпин внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг в 0,3 мл физиологического раствора с интервалом 48 ч начиная с 6-х суток после перевивки опухоли. Курс лечения состоял из семи введений. Циклофосфан (ОАО «Биохимик», Саранск), растворенный в ампульной воде для инъекций, вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг на 10-е сутки после перевивки опухоли. Крысам контрольных групп вводили эквивалентные количества физиологического раствора.

Оценку эффективности лечебных воздействий производили на 20-е сутки после перевивки карциносаркомы. Определяли массу первичной опухоли, массу лимфатических (подмышечных, паховых, парааортальных) узлов, количество и площадь метастатических узлов в легочной ткани, а также число лимфогенных и гематогенных метастазов, рассчитывая показатель торможения опухолевого роста и частоту метастазирования в процентах к контролю [8].

Полученные в ходе исследования количественные данные представлены в виде средних значений и их стандартной ошибки, для качественных признаков указана частота выявления в абсолютных или относительных цифрах. Оценка статистической достоверности наблюдаемых изменений производилась с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни и расчета углового преобразования Фишера. Различия между группами считали статистически достоверными при Р < 0,05.

Результаты экспериментов представлены в таблице.

Курсовое назначение крысам известного цитостатика циклофосфана приводило к статистически значимому замедлению роста первичного опухолевого узла. У животных этой группы была уменьшена масса подмышечных и парааортальных, но не паховых лимфоузлов. Цифры, характеризующие количество метастазов в легких, как и их площадь, также

Влияние апотромбостатина и тиакарпина в сочетании с циклофосфаном на развитие карциносаркомы 256 Уокера у крыс

Группа Чис- ло крыс Масса опухоли, г Тормо -жение роста опухоли, % Масса лимфатических узлов, мг Количество метастазов в легких Площадь метастазов в легких, мм2 Количество животных с метастазами, % Общее количество животных с метастазами, %

Подмы- шечные Пахо- вые Пара- аор- таль- ные лим- фоген- ными гемато- генны- ми

1. Контроль 8 55 ± 8,6 - 434 ± 83 62 ± 19 45 ± 6,5 4,0 ± 1,50 6,3 ± 4,67 62,5 87,5 100

2. Цикло- 9 23 ± 3,2 58 222 ± 28 85 ± 49 28 ± 7,8 1,7 ± 0,58 1,6 ± 0,92 44,4 55,6 77,8

фосфан

Р1-2 < 0,01 < 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05

3. АТС 8 64 ± 5,6 -16 588±245 94 ± 35 29 ± 14 2,1 ± 0,67 1,7 ± 0,98 62,5 75,0 100

Р1-3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 -

4. Цикло- 9 36 ± 4,0 36 235 ± 43 96 ± 21 34 ± 6,5 0,6 ± 0,29 0,5 ± 0,43 22,2 33,3 44,4

фосфан +

АТС

Р1-4 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,01 < 0,05

Р2-4 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05* > 0,05* > 0,05* > 0,05* < 0,05*

5. Тиакар- 7 40 ± 9,6 28 217 ± 16,70 36 ± 6,2 22 ± 4,2 1,1 ± 0,46 0,2 ± 0,11 14,3 57,1 57,1

пин

Р1-5 > 0,05 < 0,01 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 < 0,01

6. Цикло- 7 11 ± 3,5 79 188 ± 51 152 ± 89 27 ± 6,5 3,1 ± 2,14 1,0 ± 0,57 28,6 42,9 42,9

фосфан +

тиакарпин

р» < 0,01 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05

Р2-6 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05

* р

были меньше, но вследствие большого разброса данных в контрольной группе наблюдаемый эффект не являлся статистически значимым. Общее количество крыс, у которых обнаруживались метастазы, а также число животных с лимфогенными и гематогенными метастазами под влиянием циклофосфана снижались, правда, статистическая достоверность различий с контролем имела место только в отношении первого показателя.

В отличие от циклофосфана, АТС не влиял на рост первичной опухоли. Вместе с тем у животных, получавших препарат, была уменьшена масса парааортальных лимфоузлов. Количество метастазов в легких и их площадь, как и в предыдущей группе, имели тенденцию к снижению. Число крыс с лимфогенными и гематогенными метастазами не изменялось. Общее число животных с метастазами также оставалось на уровне контроля.

У крыс, получавших комбинацию АТС с циклофосфаном, масса опухоли была меньше, чем в контроле, но больше, чем при введении только циклофосфана. В том и другом случае разница между группами была статистически значимой. Существенного влияния на массу лимфатических узлов не отмечалось. В то же время АТС потенциировал ингибирующее действие циклофосфана на метастазирование опухоли. Если уменьшение количества и площади метастазов, как и числа животных с лимфогенными и гематогенными метастазами, наблюдаемое при введении циклофосфана, имело характер тенденции, то в условиях совместного назначения препаратов изменение всех перечисленных показателей было статистически достоверным. Общее количество животных с метастазами было снижено в сравнении как с контролем, так и при введении только циклофосфана.

Тиакарпин значимо не влиял на рост опухоли, но, как и циклофосфан, препятствовал увеличению массы подмышечных и парааортальных лимфатических узлов. Выявлялась заметная тенденция к снижению количества и площади метастазов в легких в этой группе. Число крыс с лимфогенными метастазами, как и общее число животных, у которых формировались метастазы, было статистически достоверно меньше, чем в контроле.

В условиях совместного введения с циклофосфаном тиакарпин усиливал его противоопухолевое действие. Масса опухоли была статистически достоверно меньше в сравнении не только с контролем, но и с группой, получавшей только циклофосфан. Замедленное увеличение массы лимфатических узлов, вызванное циклофосфаном, при комбинированном введении циклофосфана и АТС дальнейшим изменениям не подвергалось. Подобное заключение можно сделать также в отношении числа и площади метастазов в легких. Количество крыс с лимфогенными и гаматогенными метастазами, а также общее число животных с метастазами было меньше, чем в контроле, но не в группе, которой вводили только циклофосфан.

Из изложенного следует, что на модели карциносаркомы 256 Уокера крыс АТС, как и тиакарпин, повышает противоопухолевый и противометастатический эффект циклофос-фана. При раздельном введении антиметастатическое действие АТС выражено в несколько меньшей степени, чем тиакарпина.

Известно, что физико-химические свойства и структурные особенности определяют не только антикоагулянтную активность сульфатированных соединений, но также пути, посредством которых она осуществляется [2, 13]. Рост степени сульфатирования природных полисахаридов сопровождается усилением их антиангиогенной и антикоагулянтной активности. Соответственно, антикоагулянтный эффект АТС может быть обусловлен наличием в его структуре отрицательно заряженных сульфатированных углеводных и аминокислотных остатков. Согласно литературным данным, антикоагулянты, в частности гепарины, могут подавлять пролиферацию, миграцию и инвазию опухолевых клеток, а также препятствовать адгезии последних на сосудистый эндотелий. Более того, гепарины оказывают влияние на иммунную систему и обладают как ингибирующим, так и стимулирующим действием на ангиогенез [17]. Хотя характер действия АТС на систему коагуляционного звена гемостаза отличается от действия гепарина, его антикоагулянтные

свойства, несомненно, играют важную роль в механизмах регистрируемой противоопухолевой активности. Протеолитический фрагмент коллагена XVIII млекопитающих эн-достатин, вероятно, также имеет в своем составе сульфатированные углеводные остатки и обладает антикоагулянтным эффектом. Это связано с тем, что по химической структуре коллаген XVIII относится к гепарансульфатпротеогликанам, которые несут высоко суль-фатированные углеводные цепи, чувствительные к гепариназе [12].

Таким образом, наличие в структуре сульфатных углеводных остатков предполагает сходство механизмов биологической активности АТС с сульфатированными полисахаридами и эндостатином. Вполне вероятно поэтому, что на основе АТС удастся разработать лекарственные препараты для профилактики и дополнительной терапии онкологических заболеваний, а также сопутствующих им сердечно-сосудистых осложнений.

Авторы выражают благодарность сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН д.х.н. В.Н.Новикову и О.С.Радченко за предоставление для испытаний тиазольного алкалоида тиакарпина.

ЛИТЕРАТУРА

1. Артюков А.А., Попов А.М., Ли И.А., Кофанова Н.Н., Козловская Э.П., Глазунов В.П. Противоопухолевая активность продукта биотрансформации коллагенового белка из морских беспозвоночных // Тез. докл. регион. конф. «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». Владивосток, 2004. С. 64.

2. Джильберт Э.Э. Сульфирование органических соединений: пер. с англ. М.: Химия, 1969. 368 с.

3. Ли И. А., Мандрон Е.В., Попов А.М., Артюков А. А., Кофанова Н.Н. Антикоагулянтная активность апоста-тина - продукта биотрансформации коллагенового белка из морских беспозвоночных // Тез. докл. регион. конф. «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии». Владивосток, 2004. С. 118.

4. Пат. РФ. Средство, обладающее антикоагулянтным действием, и способ его получения / Попов А.М., Артюков А. А., Ли И. А., Глазунов В.П., Кофанова Н.Н., Козловская Э.П. Заявка № 2006104772/15, заявлено 10.01.2006.

5. Попов А.М. Противоопухолевая активность вторичных метаболитов морских беспозвоночных // Вестн. ДВО РАН. 2006. № 5. С. 81-90.

6. Попов А.М., Новиков В.В., Радченко О.С., Еляков ГБ. Цитотоксическая и противоопухолевая активности имидазольного алкалоида поликарпина из тропической асцидии Polycarpa aurata и его синтетических аналогов // Докл. АН. 2002. Т. 385, № 5. С. 693-698.

7. Саватеева Л.Ю., Маслова М.Г., Володарский В.Л. Дальневосточные голотурии и асцидии как ценное пищевое сырье. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 1983. 184 с.

8. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США / под ред. З.П.Софьиной, А.Б.Сыркина, А.Голдина, А.Кляйна. М.: Медицина, 1980. 296 с.

9. Boehm Т., Folkman J., Browder Т., O’Reilly M.S. Antiangiogenic therapy of experimental cancer does not induce acquired drug resistance // Nature. 1997. Vol. 390. P. 404-407.

10. Dassonneville L., Wattez N., Baldeyrou B., Mahieu C., Lansiaux A., Banaigs B., Bonnard I., Bailly C. Inhibition of topoisomerase II by the marine alkaloid ascididemin and induction of apoptosis in leukemia cells // Biochem. Pharm. 2000. Vol. 60. P. 527-537.

11. Erba E., Bergamaschi D., Bassano L., Damia G., Ronzoni S., Faircloth G.T., D’Incalci M. Ecteinascidin-743 (ET-743), a natural marine compound, with a unique mechanism of action // Eur. J. Cancer. 2001. Vol. 37. P. 97-105.

12. Halfter W., Dong S., Schurer B., Cole G.J. Collagen XVIII is a basement membrane heparan sulfate proteoglycan // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273, N 39. P. 25404-25412.

13. Koyanagi S., Tanigawa N., Nakagawa H., Soeda S., Shimeno H. Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angiogenic and antitumor activities // Biochem. Pharmacol. 2003. Vol. 65. P. 173-179.

14. O’Reilly M.S., Boehm Т., Shing Y., Fukai N., Vasios G., Lane W.S., Flynn E., Birkhead J.R., Folkman J. End-ostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth // Cell. 1997. Vol. 88. P. 277-285.

15. Schmidt A., Addicks K., Bloch W. Opposite effects of endostatin on different endothelial cells // Cancer Biol. Ther. 2004. Vol. 3. P. 1162-1166.

16. Schuch G., Heymach J.V., Nomi M. Endostatin inhibits the vascular endothelial growth factor-induced mobilization of endothelial progenitor cells // Cancer Res. 2003. Vol. 63. P 8345-8350.

17. Smorenburg S.M., Van Noorden C.J.F. The complex effects of heparins on cancer progression and metastasis in experimental studies // Pharm. Rev. 2001. Vol. 53. P. 93-105.