СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПО УРОВНЮ мРНК TGEβ и TNFα В ПЛАЗМЕ КРОВИ
METHOD FOR DIAGNOSING BREAST CANCER BY LEVEL OF MRNA TGEβ AND TNFα IN BLOOD PLASMA

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, онкологии, молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики и может быть использовано для ранней диагностики рака молочной железы. Способ основан на измерении в плазме крови уровня мРНК TGFβ и TNFα и сравнении уровня представленности мРНК TGFβ и TNFα с уровнем представленности референсных транскриптов. Для осуществления способа используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в «реальном времени». В качестве референсных транскриптов используют мРНК В2m и/или GUSB. Результат исследования считают положительным при разнице уровней представленности мРНК целевого гена и референсного более десяти раз. Изобретение может быть использовано для выявления ранних стадий рака молочной железы. Использование заявленного способа обеспечивает высокочувствительную и объективную количественную характеристику уровня экспрессии мРНК TGFβ и TNFα, что позволяет провести раннюю малоинвазивную диагностику рака молочной железы.
Уровень техники
Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием среди женщин. В 2018 году в мире от рака молочной железы умерло 627000 женщин - это примерно 15% всех случаев смерти от рака среди женщин [1]. Раннее выявление и адекватная терапия являются неотъемлемой частью в борьбе с высокой смертностью от этого заболевания во всем мире. В настоящее время во многих научных работах получены данные, демонстрирующие увеличение концентрации внеклеточных молекул рибонуклеиновых кислот (внРНК) благодаря гибели значительного числа клеток при опухолевом процессе [2-4].
мРНК циркулируют в плазме крови (внеклеточная фракция, внРНК) как здоровых, так и больных людей, таким образом, предоставляя возможность для выявления различий в уровне экспрессии генов у разных групп пациентов [5-7].
В настоящее время больше исследований проведено в отношении уровня внРНК в сыворотке и опухолевых тканях, чем в плазме. При этом качественный и количественный анализ внРНК в плазме крови в настоящее время можно считать наиболее перспективным диагностическим методом, поскольку он является сравнительно недорогим и малоинвазивным, а правильный выбор исследуемых генов позволит в ближайшем будущем использовать эти гены как маркеры развития РМЖ на разных стадиях этого заболевания.
Известно, что цитокины, а также гены роста и пролиферации участвуют в процессе опухолеобразования [8-10]. Поэтому анализ экспрессии внРНК генов цитокинов и факторов роста при РМЖ актуален не только для фундаментальных исследований, но и для клинических, одним из которых является диагностика заболевания на ранних стадиях.
Цитокины являются высокоиндуцируемыми секреторными белками, обеспечивающими межклеточную связь в иммунной системе. Они сгруппированы в несколько белковых семейств: факторы некроза опухоли, интерлейкины, интерфероны и колониестимулирующие факторы [8]. Согласно литературным данным, цитокины непосредственно вовлечены в патогенез РМЖ, они играют важную роль в регуляции как индукции, так и защиты при РМЖ [11, 12].
Патологический ангиогенез является отличительной чертой онкологических и различных ишемических и воспалительных заболеваний, его развитие устанавливает сосудистую сеть для роста опухоли и гематогенного метастазирования [13]. Следовательно, гены, вовлеченные в этот процесс, активно изучаются для разработки диагностических систем и терапевтических подходов к лечению рака и других заболеваний [14]. Цитокины и факторы роста, продуцируемые множеством типов клеток, присутствующих в микросреде солидных опухолей, образуют сложную динамическую сеть, в которой они индуцируют другие цитокины, изменяют экспрессию растворимых и связанных с поверхностью клетки рецепторов цитокинов, стимулируют пролиферацию эндотелиальных клеток [15].
Члены суперсемейства мультипотентных цитокинтрансформирующих факторов роста TGFβ играют важную роль, контролируя широкий диапазон клеточных ответов. TGFβ обладает двойным действием при раке как супрессор опухоли и промотор опухоли. Как супрессор опухолей, он ингибирует онкогенез, вызывая остановку роста и апоптоз. Как промотор опухоли, он индуцирует миграцию опухолевых клеток и стимулирует переход от эпителия к мезенхиме. TGF-β также косвенно способствует онкогенезу, воздействуя на микроокружение опухоли. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЕМП), индуцированный TGFβ, способствует развитию хеморезистентного фенотипа. Сигнальный путь трансформирующего фактора роста TGFβ не регулируется при многих заболеваниях, включая рак. В здоровых клетках и раковых клетках ранней стадии этот путь выполняет функции по подавлению опухоли, включая остановку клеточного цикла и апоптоз. Тем не менее, его активация при поздней стадии рака может способствовать онкогенезу, включая метастазирование и химиорезистентность [16].
Ген TGFβ, кодирует белок, который является фактором роста, полученным из тромбоцитов, и проявляет интенсивную хемотаксическую активность в отношении нейтрофилов и стимулирует ДНК, гликолиз, митоз, внутриклеточное накопление цАМФ и синтез простагландина Е2, помимо других активностей. В одном из исследований TGFβ выделяют как биомаркер усталости, вызванной химиотерапией у пациентов с РМЖ [17].
Еще одним хорошо освещенным в литературе моментом, касающимся роли TGFβ как маркера РМЖ являются данные статьи, где уровень экспрессии TGFβ имеет различия по группам в плазме больных РМЖ до операции и через два месяца после операции, а также у здоровых женщин: TGFβ в плазме был ниже в случаях с РМЖ, чем в контроле, также наблюдалась тенденция к увеличению TGFβ в плазме через 2 месяца после операции, что свидетельствует о том, что более высокий уровень TGFβ до операции ассоциировался с лучшей выживаемостью без прогрессирования заболевания [18].
Кроме того, известно, что на ранней стадии развития опухоли нарушение регуляции передачи сигналов TGFβ приводит к потере его аутокринного антипролиферативного эффекта, что приводит к увеличению пролиферации клеток. Однако повышенная экспрессия TGFβ опухолевыми клетками обеспечивает явные преимущества для прогрессирования рака [19]. TGFβ индуцирует ЕМП в клетках карциномы, который является центральным механизмом, ответственным за инвазию и метастазирование различных видов рака [20-22].
TNFα участвует в стимуляции опухолевой инвазии и метастазирования [24]. Экспрессия и локализация мРНК и белка TNFα была исследована в различных доброкачественных и злокачественных тканях молочной железы. Группа исследователей [25] наблюдала высокий уровень экспрессии различных генов, кодирующих TNFα и IL8, которые регулируются NF-κΒ и связаны с прогрессированием РМЖ после нокдауна гена-супрессора опухолей цилиндроматоза (CYLD). Кроме того, имеются данные, что TNFα увеличивает эстроген-индуцированную пролиферацию эстроген-зависимых клеток опухоли молочной железы через комплекс, содержащий ядерный фактор NF-κB [26]. Известно также, что TNFα является важной противораковой мишенью [27, 28]. Некоторые авторы сообщали также, что у пациентов с РМЖ в плазме крови уровни TNFα были выше, чем в контрольной группе [29, 30].
Наиболее близким аналогом данного изобретения является патент РФ №2451937 «Способ диагностики рака молочной железы по уровню РНК интерлейкинов IL8 и/или IL18 в плазме крови», где для диагностики рака молочной железы используют измерения уровня мРНК интерлейкинов IL-8 и IL-18 в плазме крови.
Изобретение относится к области медицины, онкологии и молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики рака молочной железы. Отличительным признаком изобретения является использование соотношения уровня РНК интерлейкинов IL-8 и/или IL-18 в сравнении с уровнем референсного транскрипта в плазме крови для диагностики рака молочной железы. Диагностическим маркером является соотношение представленности в плазме крови пациента РНК IL-8 и/или РНК IL-18 и любого другого транскрипта (или группы транскриптов), не меняющих уровень представленности в плазме крови при опухолеобразовании, например, ABL, HPRT или IL 1b. Для осуществления способа используют обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию в «реальном времени». Результат исследования считают положительным при разнице уровней представленности РНК IL8 и HPRT более десяти раз. Использование заявленного способа позволяет осуществлять раннюю диагностику рака молочной железы. Патент не описывает применения ПЦР в реальном времени для диагностики рака молочной железы путем соотношения уровня мРНК TGFβ и/или TNFα с уровнем референсных генов, таких как В2m и/или GUSB, не содержит описания метода определения мРНК TGFβ и/или TNFα и последовательностей праймеров и зондов. Таким образом, заявляемое изобретение не нарушает прав интеллектуальной собственности, описанной в патенте РФ №2451937.
Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок известен также способ выявления опухоли молочной железы и дифференцировки злокачественных и доброкачественных образований путем измерения 18S рРНК, RASSF8 и Ki-67 методом метилспецифичной ПЦР [23].
Известен патент № WO 2002053018 «Способ выявления полиморфизмов, связанных с карциномой молочной железы в генах МНС» (Major Histocompatibility Complex - главный комплекс гистосовместимости). Данное изобретение относится к диагностическим способам, основанным на полиморфизме у индивидуумов, указывающих на повышенный риск рака молочной железы. Более конкретно, данное изобретение относится к способу диагностики повышенного риска рака молочной железы путем скрининга на наличие генетических полиморфизмов у индивидуумов, в частности генов TNF-α и HSP70-2. Также предложен способ прогнозирования вероятной выживаемости пациента с полиморфизмом, связанным с карциномой молочной железы. Изобретение также обеспечивает скрининговые анализы и профилактические и терапевтические методы, обнаруженные с использованием таких скрининговых анализов.
Известен патент № RU 2403575 «Определение снижения уровня мРНК генов itga9, hyal1 и hyal2 как способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления». Изобретение относится к области медицины, в частности к методам диагностики в онкологии. Предложено в качестве маркеров для диагностики плоскоклеточнго рака легкого (ПКРЛ) и аденокарциномы легкого (АК) использовать уровень мРНК генов ITGA9, HYAL1 и HYAL2. Сниженный уровень мРНК данных генов в предположительно пораженной раком ткани человека по сравнению с ее уровнем в здоровой ткани служит диагностическим признаком немелкоклеточного рака легкого. Предложенное изобретение позволяет с высокой достоверностью диагностировать немелкоклеточный рак легкого типа АК и ПКРЛ, в том числе на самой ранней клинической стадии опухолевого заболевания.
Известен патент № «Способ скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему». Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для скрининга рака молочной железы и предрасположенности к нему. Проводят маммографию и УЗИ. Дополнительно проводят радиотермометрическое исследование молочных желез и выделяют панель микро-РНК из биологических жидкостей, включающую miR-199a, miR-222, let-7a, miR-196a, miR-106a, miR-21, miR-137, miR-155. Способ обеспечивает возможность выделить из массы дисгормональных заболеваний молочных желез группу патологий молочной железы, которая в обозримом будущем перейдет в рак, за счет совместного использования радиотермометрии и панели микро-РНК.
Известен патент № WO 2011120984 «Способ предсказания рецидива рака молочной железы при эндокринном лечении» Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу предсказания исхода рака молочной железы в положительной по рецептору эстрогена и отрицательной по HER2 опухоли у пациента с раком молочной железы, предусматривающему определение в образце опухоли от указанного пациента величины уровня экспрессии РНК генов UBE2C, BIRC5, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST и MGP или генов UBE2C, RACGAP1, DHCR7, STC2, AZGP1, RBBP8, IL6ST и MGP, математическое комбинирование величин уровней экспрессии, где более высокий комбинированный показатель указывает на более худший прогноз у указанного пациента по сравнению с более низким комбинированным показателем. Изобретение позволяет эффективно предсказывать исход рака молочной железы.
Известен патент № RU 2517082 «Метод прогноза эффективности иммунотерапии на основании оценки уровня экспрессии мРНК цитокинов в ткани рака почки». Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения чувствительности рака почки к иммунотерапии после проведения нефрэктомии, включающий верификацию диагноза, проведение нефрэктомии рака почки, забор опухолевой и нормальной ткани почки для определения уровня экспрессии цитокинов IL-4, IL-6, IL-10, TGFβ и расчет соотношения уровня экспрессии цитокинов в опухолевой и нормальной ткани почки. При превышении уровня экспрессии цитокинов в опухолевой ткани почки над нормальной терапию считают показанной. Изобретение позволяет эффективно определять чувствительность рака почки к иммунотерапии на основании данных экспрессии цитокинов в опухолевой ткани.
Известен патент № RU 2473555 «Новые способы функционального анализа большого количества экспериментальных данных и групп генов, идентифицированных из указанных данных», который раскрывает способ оценки клинического прогноза для индивида, страдающего раком молочной железы, основанный на измерении экспрессии генов в образце рака молочной железы в следующих дескрипторных группах: (1) ERBB2, STAED3, GRB7, THRAP4, PPARBP; (2) ESR1, GATA3, ХВР1, TFF3, ACADSB; (3) KRT5, KRT17, TRIM29, GABRP; (4) KRT18, KRT8, РРР2СА, KRT8L2; (5) PLAU, COL5A2, FAP, THY1; (6) STAT1, UBE2L6, ТАР1, LAP3 и (7) SEACAM5, SEACAM6, SEACAM7. При этом сверхэкспрессия большинства генов в дескрипторной группе по сравнению с образцом нормальной ткани молочной железы указывает на то, что образец ткани является положительным для данной группы, а отсутствие сверхэкспрессии большинства генов в дескрипторной группе по сравнению с образцом нормальной ткани молочной железы указывает на то, что образец ткани является отрицательным для данной группы.
Таким образом, в настоящее время в РФ нет действующих аналогов заявляемого изобретения.
Описание (раскрытие) изобретения
Предложен способ диагностики опухолей человека путем оценки уровня представленности отдельных мРНК в плазме крови (внеклеточной фракции).
Техническим результатом изобретения является ранняя диагностика рака молочной железы на основе оценки и сопоставления уровня представленности мРНК TGFβ и TNFα с уровнем мРНК В2m и/или GUSB в плазме периферической крови.
В плазме крови больных РМЖ (даже на ранних стадиях заболевания, например, на стадии T1N0M0) существенно возрастает относительное количество мРНК TGFβ и TNFα. Так, относительное количество мPНК TGFβ и TNFα существенно превышает относительное количество мРНК этих цитокинов в плазме крови здоровых индивидов при нормировке по уровню мРНК стабильно представленных транскриптов (Фиг. 1). Кроме того, у больных с метастазирующим раком уровень мРНК TGFβ и TNFα в плазме периферической крови выше, чем у больных с ранним раком молочной железы (стадия T1N0M0).
Уровень представленности внеклеточных РНК цитокинов при развитии РМЖ может служить дополнительно исследуемым параметром при диагностике и оценке степени прогрессии заболевания. В частности, уровень мРНК TGFβ и TNFα позволяет проводить раннюю диагностику РМЖ, делая ее малоинвазивной, а также позволяет осуществлять мониторинг течения заболевания.
Для оценки уровня представленности исследуемых мРНК в плазме периферической крови можно использовать биохимические, генетические, молекулярно-биологические и иные методы, а также их сочетания.
В частности, для оценки уровня представленности исследуемых РНК в плазме периферической крови можно использовать методы обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). В том числе метод полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени».
Для клинической диагностики можно использовать определение уровня представленности в плазме крови пациента мРНК TGFβ и TNFα относительно любого другого мРНК гена (или группы мРНК генов), не меняющих уровень представленности в плазме крови при опухолеобразовании.
В частности, можно использовать определение уровня представленности в плазме крови пациента мРНК генов TGFβ и TNFα относительно уровня представленности мРНК одного из генов «домашнего хозяйства» (например, В2m и/или GUSB)
На основании экспериментальных данных при сравнении пациентов с РМЖ и условно-здоровых пациентов без признаков воспалительных заболеваний методами ОТ-ПЦР и ПЦР «в реальном времени» были получены и проанализированы результаты определения уровня представленности мРНК генов TGFβ и TNFα относительно референсных мРНК генов β2-микроглобулина (В2m) человека и β-глюкуронидаза (GUSB).
Уровень экспрессии мРНК измеряли в относительных единицах, определяемых методом ΔΔ Ct с применением нормировочных генов [31].
Осуществление (реализация) изобретения
Образцы венозной крови необходимо забирать в пробирки с ЭДТА. Процедуру экстракции нуклеиновых кислот желательно начинать не позднее, чем через 2 часа с момента забора крови. Для получения плазмы пробирки с кровью центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин). После центрифугирования верхнюю фракцию переносят в новую пробирку. Выделение РНК проводят согласно прилагающейся инструкции, используя коммерческий набор реагентов «ПРОБА-НК» производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия), затем выделенную РНК в объеме 16,5 мкл немедленно используют для постановки обратной транскрипции.
Метод обратной транскрипции использовали для получения препарата кДНК. Ингредиенты набора «ОТ-буфер», «Смесь праймеров ОТ и dNTP» и «Ревертазу» - реакционную смесь для проведения обратной транскрипции готовили согласно инструкции производителя по следующей прописи в стерильной пробирке объемом 1,5 мл:
1. ОТ-буфер-2×(N+1) мкл.
2. «Праймеры + dNTP» - (N+1) мкл.
3. Ревертаза MuMLV 2 ед./мкл - 0,5×(Ν+1) мкл,
где N - количество анализируемых образцов с учетом отрицательного контроля. Капли со стенок пробирок собирали центрифугированием в течение 3-5 сек.
В пробирки, содержащие по 16,5 мкл препарата подготовленной РНК, добавляли по 3,5 мкл смеси для обратной транскрипции. При постановке отрицательного контроля использовали пробирку, содержащую 16,5 мкл очищенной воды. Перемешивали реакционные смеси 5-7-кратным пипетированием. Пробирки инкубировали при 40°С в течение 30 мин, затем останавливали реакцию прогреванием при 95°С в течение 5 мин. Капли со стенок пробирок собирали центрифугированием в течение 3-5 сек. Полученный препарат кДНК можно хранить при -20°С, либо можно использовать в качестве матрицы сразу для постановки ПЦР-РВ. В качестве матрицы для проведения одной ПЦР-реакции использовали 5 мкл полученного препарата, разбавленного в 2 раза.
Для определения уровня представленности исследуемых мРНК (например, TGFβ и TNFα) используют метод ПНР «в реальном времени» в стандартных условиях с праймерами, специфичными к последовательности определяемых РНК. Для исключения коамплификации геномной ДНК желательно расположить праймеры на стыках зкзонов. Желательно, чтобы длины продуктов амплификации всех анализируемых генов отличались друг от друга незначительно и находились в диапазоне 100-300 п.н. Проявку накопления продуктов реакции можно вести как с помощью интеркалирующих красителей, так и с использованием флуоресцентно-меченых олигонуклеотидов (зондов). Нормированные значения, соответствующие уровню представленности транскриптов каждого гена, можно рассчитывать с помощью метода ΔΔCt или аналогичного.
Для проведения ПЦР использовали следующие олигонуклеотидные праймеры и зонды:
где BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду С на 5'-конце пробы; на основании полученных пороговых циклов (Ct) вычисляют уровень экспрессии генов.
Пробирки (приготовленные как описано выше) устанавливали в детектирующий термоциклер ДТ-прайм (ООО «НПО ДНК-Технология», Москва) и проводили реакцию со следующими параметрами циклирования: Программа амплификации:
Настройки анализа, устанавливаемые на приборе:
Метод - Геометрический (Ср) (BF), cr=9, vt=10, tp=30, tv=5.
Для каждой реакции программное обеспечение термоциклера автоматически вычисляло величину порогового цикла Ct.
В частности, при сравнении уровня экспрессии в плазме крови пациента мРНК TGFβ и TNFα относительно уровня экспрессии мРНК В2m и/или GUSB результат исследования считают положительным (развитие опухоли зарегистрировано) при достоверной разнице (р<0.01) уровней экспрессии мРНК TGFβ и TNFα в группе больных относительно группы здоровых людей. Результат исследования считают отрицательным (развитие опухоли не зарегистрировано) при отсутствии достоверной разницы (р<0.01) экспрессии мРНК TGFβ и TNFα в группе больных относительно группы здоровых людей. Конкретные показатели разницы полученных значений для исследуемых мРНК (например, TGFβ и TNFα) могут отличаться от приведенных в примере вследствие различий в методиках и для каждой конкретной методики должны быть подобраны экспериментально.
Список использованных источников
1. WHO. Breast cancer. WHO (2018). // https://www.who.int/cancer/prevention/diagnosis-screening/breast-cancer/en/
2. Seiden Μ. V., Kantoff P. W., Krithivas K., Propert K. et al. Detection of circulating tumor cells in men with localized prostate cancer. // J Clin Oncol. - 1994.-Vol 12.-№12.-P. 2634-2639.
3. Silva J. M. et al. Detection of epithelial messenger RNA in the plasma of breast cancer patients is associated with poor prognosis tumor characteristics. // Clin. Cancer Res. - 2001. - Vol 7. - №9. - P. 2821 - 2825.
4. Rykova E. Y., Skvortsova Т. E., Hoffmannet A. L. et al. Breast cancer diagnostics based on extracellular DNA and RNA circulating in blood. // Bochem. Suppl. Ser. В Biomed. Chem. - 2008 - Vol 2. - №2. - P. 208 - 213.
5. Турчанинова Μ.Α., Ребриков Д.В. Профиль РНК цитокинов в плазме крови при нормальном физиологическом состоянии организма. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - Т. 24. -№2. - С.68-71. [Turchaninova MA Rebrikov DV Profil RNK tsitokinov ν plazme krovi pri normalnom fiziologicheskom sostoianii organizma. // Molekuliarnaia genetika mikrobio-logiia i virusologiia 2009. - Vol 24. - №2. -P. 68-71.(In Russ.)].
6. Турчанинова Μ.Α., Мещеряков Α.Α., Рахманкулова З.П., Ребриков Д.В. Внеклеточные РНК плазмы крови как диагностический маркер опухолей молочной железы. // Биоорг.химия. - 2011 - Т. 37. - №3 - С.393 - 398. [Turchaninova MA, Meshcheriakov AA, Rakhmankulova ZP, Rebrikov DV. Vnekletochnye RNK plazmy krovi kak diagnosticheskii marker opukholei molochnoi zhelezy. // Bioorg khimiia. - 2011. - Vol 37 - №3. - P. 393 -398. (In Russ.)]
7. Тыщик Ε.Α., Кометова В.В., Родионов В.В., Ребриков Д.В. Оценка представленности внеклеточных РНК изоформ VEGF в плазме крови пациенток с раком молочной железы. // Вестник РГМУ. - 2017. - № 4. - С.26 - 30. [Tyshchik ЕА. Kometova VV, Rodionov VV, Rebrikov DV. Otsenka predstavlennosti vnekletochnykh RNK izoform VEGF ν plazme krovi patsientok s rakom molochnoi zhelezy. // Vestnik RGMU. - 2017 - №4 - P. 26 - 30. (In Russ.)].
8. Esquivel-Velazquez M. et al. The role of cytokines in breast cancer development and progression. // J. Interf. Cytokine Res. - 2015. - Vol 35 - №1. -P. 1 - 16.
9. Ma Y, Ren Y., Dai Z. J., Wu C. J., Ji Υ. H, Xu J. IL-6, IL-8 and TNF-α levels correlate with disease stage in breast cancer patients. // Adv Clin Exp Med. - 2017. - Vol 26 - №3. - P. 421 - 426.
10. Nicolini A, Carpi A, Rossi G. Cytokines in breast cancer. // Cytokine Growth Factor Rev. - 2006. - Vol 17 - №5. - P. 325 - 337.
11. Bertazza L, Mocellin S. The dual role of tumor necrosis factor (TNF) in cancer biology. // Curr. Med. Chem. - 2010. -Vol 17 - №29. - P. 3337 -3352.
12. Jones VS, et al. Cytokines in cancer drug resistance: cues to new therapeutic strategies. // Biochim. biophys. acta-rev. cancer. - 2016. - Vol 1865 -№2.-P. 255 -265.
13. Carmeliet P., Jain R. K., Angiogenesis in cancer and other diseases. // Nature. - 2000 - Vol 407 - №6801. - P. 249 - 257.
14. Welti J, Loges S, Dimmeler S, Carmeliet P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. // J. Clin. Invest. - 2013. - Vol 123 - №8. - P. 3190 - 3200.
15. Leek R. D., Harris A. L., Lewis С.E. Cytokine networks in solid human tumors: regulation of angiogenesis. // J. Leukoc. Biol. - 1994. - Vol 56 -№4-P. 423-435.
16. Colak S., Ten Dijke P. Targeting TGF-β signaling in cancer. // Trends in cancer. - 2017. - Vol 3 - №1. - P. 56 - 71.
17. Cruz F. M., Munhoz B. A. Biomarkers of fatigue related to adjuvant chemotherapy for breast cancer: evaluation of plasma and lymphocyte expression. // Clin Transl Med. - 2015. - Vol 4 - №4. DOI: 10.1186/s40169-015-0051-8
18. Jurisic D., Erjavec I., Trkulja V., Dumic-Cule I. Soluble type III TGF β receptor in diagnosis and follow-up of patients with breast cancer. // Growth Factors. - 2015. -Vol 33 - №3. - P. 200 - 209.
19. Derynck R, Akhurst RJ, Balmain A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. // Nat Genet. - 2001. - Vol 29 - №2. - P. 117-129.
20. Zavadil J., Bottinger E. P. TGF-β and epithelial-to-mesenchymal transitions. // Oncogene. - 2005. - Vol 24 - №37. - P. 5764 - 5774.
21. Christofori G. New signals from the invasive front. // Nature. - 2006; Vol 441 - №7092. - P. 444 - 450.
22. Thiery J. P., Sleeman J. P. Complex networks orchestrate epithelial mesenchymal transitions. // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2006. - Vol 7 - №2. - P. 131 - 142.
23. Рытова Ε. Ю. Циркулирующие внеклеточные ДНК и РНК крови в диагностике опухолей молочной железы. // Биоорганическая химия. - 2008 - Т.54 - №1. - С.94 - 103. [Rytova Ε. Yu. Circulating extracellular DNA and RNA of blood in the diagnosis of breast tumors. // Bioorg khimiia. - 2008. - Vol 54 - №1. - P. 94 - 103. (In Russ.)].
24. Soria G., Ofri-Shahak M., Haas I. et al. Inflammatory mediators in breast cancer: coordinated expression of TNFα and IL-1β with CCL2 and CCL5 and effects on epithelial-to-mesenchymal transition. // BMC Cancer. - 2011 -Vol 11 - №l.-P. 130.
25. Hayashi M., Jono H., Shinriki S. et al. Clinical significance of CYLD downregulation in breast cancer. // Breast Cancer Res. Treat. - 2014. - Vol 143 -№3.-P.447-457.
26. Rubio M. F., Werbajh S., Cafferata E. G. et al. TNF-α enhances estrogen-induced cell proliferation of estrogen-dependent breast tumor cells through a complex containing nuclear factor-kappa B. // Oncogene. - 2006 - Vol 25 - №9. - P. 1367 - 1377.
27. Harrison M. L., Obermueller E., Maisey N. R. et al. Tumor necrosis factor alpha as a new target for renal cell carcinoma: two sequential phase II trials of infliximab at standard and high dose. // Artic. J. Clin. Oncol. - 2007 -Vol 25 - №29 - P. 4542 - 4549.
28. Madhusudan S., Foster M, Muthuramalingam S. R. et al. A phase II study of etanercept (Enbrel), a tumor necrosis factor α inhibitor in patients with metastatic breast cancer. // Clin. Cancer Res. - 2004. - Vol 10 - №19. - P. 6528-6534.
29. Tessitore L., Vizio В., Jenkins O. et al. Leptin expression in colorectal and breast cancer patients. // Int. J. Mol. Med. - 2000. - Vol 5 - №4. - P. 421 -426.
30. Griffith Κ. Α., Chung S-Y, Zhu S., Ryan A. S. Insulin resistance and inflammation in black women with and without breast cancer: cause for concern. // Ethn. Dis. - 2016 - Vol 26 - №4. - P. 513 - 520.
31. Livak K. J., Schmittgen T. D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using RealTime Quantitative PCR and the 22DDCT Method. // Methods. -2001. - Vol 25 - №4. - P. 402 - 408.