Определение среднелетучих органических соединений в препарате “Октреотид” методом хромато‑масс‑спектрометрии

УДК 543:615.2/3

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СРЕДНЕЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ В ПРЕПАРАТЕ "ОКТРЕОТИД" МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

И.Н. Глазков, И.А. Ревельский

Получены данные о составе примесей среднелетучих органических соединений в препарате "Октреотид" с использованием сверхкритической флюидной экстракции и хромато-масс-спектрометрии.

Причиной опасности приема лекарственных препаратов может быть наличие различных примесей, обладающих нежелательным фармакологическим и токсикологическим действием, и это действие может быть сильнее положительного эффекта от применения лекарства. Кроме того, примеси могут мешать проявлению фармацевтических свойств лекарственного вещества.

По современным требованиям нижний предел регистрируемых органических примесей в фармацевтических препаратах составляет от 0,05 до 0,1%, в зависимости от препарата. Примеси с концентрацией выше этого уровня должны быть идентифицированы [1]. Определение примесей на более низком

_3

уровне (10 " % и ниже) требуется лишь в ряде случаев, однако все более актуальным становится снижение пределов обнаружения в связи с накоплением информации о пагубном влиянии примесей, присутствующих в фармацевтических препаратах даже на уровне 10-4 -10-3 %.

В настоящее время органические примеси определяют, как правило, хроматографическими методами, из которых высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) применяется в большинстве случаев при определении средне- и малолетучих веществ [2-5]. Предел обнаружения в стандартных фармакопейных методиках составляет 10-2-10-1 %. Альтернативными методами для решения задачи определения примесей в лекарственных препаратах являются методы высокоэффективной тонкослойной хроматографии [6, 7], газовой хроматографии (ГХ) [8, 9] и реже сверхкритической флюидной хроматографии [10, 11], а также капиллярного электрофореза [12, 13]. Метод ГХ применим в том случае, когда

примеси являются термостабильными и элюируются из колонки без разложения. Необходимо отметить, что подавляющее большинство работ посвящено определению заданных примесей. В случае неизвестных примесей необходимо проведение предварительной идентификации. Идентификация наиболее достоверно осуществляется при использовании сочетания ГХ с масс-спектрометрией (ГХ/МС).

Целью настоящей работы было исследование возможности использования ГХ/МС (ИЭУ) в сочетании с различными методами выделения для определения среднелетучих примесей в фармпрепаратах на примере препарата "Октреотид".

Исследуемый препарат был закуплен в аптечной сети. Концентрация основного компонента в препарате составляла 0,01%.

Для выделения примесей использовали сверхкритическую флюидную экстракцию, которую проводили с помощью насоса для сверхкритической флюидной экстракции SFE-300 (Carlo Erb a Instruments, Италия) из ячейки объемом 12 мл. Ячейку с 5 мл исследуемого препарата помещали в установку для сверхкритической флюидной экстракции SFE-30 (Carlo Erba Instruments, Италия) и термостатировали в течение 5 мин при 50°С. Далее проводили СФЭ в динамическом варианте сверхкритическим диоксидом углерода при давлении 250 атм. Чистота используемого диоксида углерода составляла 99,995 %. Поток экстрагирующей фазы составлял 1 мл/мин (по жидкости). На выходе из экстракционной системы вещества улавливали сорбционным устройством, которое представляло собой металлическую трубку длиной 4 см и внутренним диаметром 3 мм, наполненную активированным углем, сорбентом Тенакс и сорбен-

* ИЭУ - ионизация электронным ударом.

Т а б л и ц а 2

Предполагаемый состав силилированных примесей, выделенных из препарата "Октреотид" и зарегистрированных методом ГХ/МС (ИЭУ) с использованием библиотеки масс-спектров М8Т

Т а б л и ц а 1

Предполагаемый состав примесей, выделенных из препарата "Октреотид" методом СФЭ и зарегистрированных методом ГХ/МС (ИЭУ) с использованием библиотеки масс-спектров ШЗТ

Характеристичные ионы Соединение Мол. масса Брутто-формула

55, 69, 83, 97, 111, 168, 196 1-Гексадеканол 242 С16Н34О

73, 55, 185, 228, 282, 97, 129 Неидентифицировано - -

60, 73, 129, 185, 228 Миристиновая кислота 228 С14Н28О2

88, 101, 57, 157, 256, 211 Этиловый эфир тетрадекановой кислоты 256 С16Н32О2

60, 73, 129, 199, 242 Пентадекановая кислота 242 С15Н30О2

73, 60, 129, 256, 213 Гексадекановая кислота 256 С16Н32О2

88, 101, 149, 284 Этиловый эфир гексадекановой кислоты 284 С18Н36О2

88, 101, 157, 312 Этиловый эфир октадекановой кислоты 312 С20Н40О2

149, 167, 279, 57, 71, 390 Диизооктиловый эфир 1,2-бензолдикарбоновой кислоты 390 С24Н38О4

Характеристичные ионы Соединение Мол. масса Брутто-формула

147, 247, 189, 134, 219, 289 Третбутилдиметилсилилловый эфир уксусной кислоты 304 С„Н32О3Й2

147, 261, 134, 189, 233, 159, 115 Третбутилдиметилсилилловый эфир пропановой кислоты 318 С15Н34О3Й2

231, 147, 134, 184, 99, 117, 273 К,№-бис-(третбутил-диметилсиллил)мочевина 288

305, 134, 184, 147, 117, 247 Неидентифицировано - -

том Хромосорбом W с 15% 8Е-30 в указанном порядке. Зоны различных сорбентов внутри трубки отделялись друг от друга кварцевой ватой. Улавливание определяемых веществ проводили при потоке с направлением от хромосорба W с 15% 8Е-30 к углю. При термодесорбции поток газа пропускали в обратном направлении.

Для ввода органических соединений в газовый хроматограф сорбционное устройство подключали к газовой линии, идущей из баллона к системе таким образом, чтобы поток газа-носителя входил в нагреваемое до 270°С сорбционное устройство через газовую линию, а выходил через иглу в инжектор хроматографа. Время термодесорбции составляло 9 мин. Примеси

Т а б л и ц а 3

Сводные данные по составу предполагаемых примесей и оценка их содержания в исследуемом растворе

Преполагаемое соединение Содержание, мкг/мл

1-Гексадеканол 0,003

Неидентифицировано 0,0007

Миристиновая кислота 0,02

Этиловый эфир тетрадекановой кислоты 0,002

Пентадекановая кислота 0,004

Гексадекановая кислота 0,05

Этиловый эфир гексадекановой кислоты 0,009

Этиловый эфир октадекановой кислоты 0,003

Диизооктиловый эфир 1,2-бензолдикарбоновой кислоты 0,03

Уксусная кислота 0,02

Пропановая кислота 0,2

Мочевина 0,04

Неидентифицировано 0,02

фокусировали в начале капиллярной колонки.

Для обеспечения выделения и хроматографическо-го определения полярных органических соединений средней летучести, газохроматографическое определение которых напрямую затруднительно, была проведена химическая модификация этих соединений с одновременной экстракцией продуктов реакции при использовании МТБСФА*.

Эксперимент проводили следующим образом. Значение рН исследуемого препарата (1 мл) доводили до 2 ед. с помощью 2К соляной кислоты, затем упаривали досуха в токе азота. Далее добавляли 20 мкл дихлорметана и также упаривали досуха в токе азота. Операцию повторяли два раза. Затем к остатку добавляли 200 мкл МТБСТФА, обрабатывали

в ультразвуковом поле в течение 5 мин и термостати-ровали при 50°С в течение 1 ч. Полученный раствор центрифугировали при 4000 об/мин в течение 20 мин, переносили экстракт шприцем в специальную коническую склянку и упаривали в токе азота до 20 мкл. Полученный раствор (1 мкл) анализировали методом ГХ/МС.

Для проведения ГХ/МС-анализа полученных экстрактов использовали масс-спектрометр фирмы Finnigan (модель "1псо850") в сочетании с капиллярным газовым хроматографом "Varian-3400,,. Разделение примесей проводили на капиллярной кварцевой колонке с неподвижной фазой ЯТХ-5 (30 мх0,32 ммх1 мкм) с использованием режима программирования температуры

(50°С(10 мин) ^ 100С/мин ^ 290°С(30 мин)).

Диапазон сканирования составлял 50-500 а.е.м.; температура источника 180°С.

Для проведения идентификации зарегистрированных примесей использовали библиотеку масс-спектров №8Т, полученных ионизацией электронным ударом.

Методом ГХ/МС (ИЭУ) был проанализирован весь объем полученного СФЭ экстракта исследуемого препарата с использованием специального сорбцион-ного картриджа. Предполагаемый состав зарегистрированных примесей представлен в табл. 1.

Методом ГХ/МС (ИЭУ) был проанализирован экстракт из исследуемого препарата после проведения реакции силиллирования с использованием МТБСТФА. Предполагаемый состав зарегистрированных примесей представлен в табл. 2.

В табл. 3 приведены данные по оценке содержания в исследуемом препарате зарегистрированных примесей в мг/мл. Оценку содержания проводили методом внешнего стандарта (нафталин-^), при этом допускали, что чувствительность детектирования всех зарегистрированных соединений была одна и та же и что степень извлечения примесей из препарата во всех случаях была одинаковой (100%) для всех зарегистрированных примесей. Реальное содержание примесей может быть больше приведенных значений или равно им.

Как видно их приведенных в табл. 3 данных, с помощью метода ГХ/МС (ИЭУ) и различных методов выделения в образце препарата "Октреотид" зарегист-

* МТБСФА - метилтретсилилфторацетамид.

рировано 13 примесей, две из которых не идентифицированы при использовании общепринятого подхода, основанного на поиске в библиотеке масс-спектров №8Т. Оценка содержания зарегистрированных примесей в исследуемом растворе составила от 0,0007 до 0,2 мкг/мл. Следует отметить, что в связи с необходимостью работы с разбавленным водным раствором активного вещества, а не с субстанцией, т.е. вследствие малой величины пробы исследуемого препарата, предел обнаружения используемых методов определения был достаточно высок.

В рамках проведенной работы получены данные о составе примесей среднелетучих органических соединений в препарате "Октреотид" с использованием

различных методов выделения и метода ГХ/МС (ИЭУ). Проведенная идентификация зарегистрированных примесей с использованием экспериментальных масс-спектров и библиотеки масс-спектров №8Т показала, что в состав предполагаемых соединений входили карбоновые кислоты и их эфиры, а также мочевина и гексадеканол.

В заключение необходимо еще раз подчеркнуть, что приведенные данные по составу органических примесей являются предварительными и требуют уточнения в дальнейшем.

Работа выполнена в соответствии с контрактом с представительством фирмы "НОВАРТИС ФАРМА СЕРВИСЕЗ

ИНК".

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Krstulovic A.M., Lee C.R. // J. Chromatogr. B: Biomed. Appl. 1997.

689. P. 137.

2. Arioz F., Yalcin G., Dolen E. // Chromatographia. 1999. 49. P. 562.

3. Szasz G., Budvari-Barany Z., Gyimesi-Forras K. // J. Liq.

Chromatogr. Relat. Technol. 1999. 22. P. 747.

4. Orwa J.A., Vandenbempt K., Depuydt S., Roets E., Hoogmartens J.

// J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. 20. P. 745.

5. Goss J.D. // J. Chromatogr. 1998. 828 A. P. 267.

6. Hopirtean I., Bota A., Hopirtean I., Marutoiu C. // J. Planar.

Chromatogr. Mod. TLC. 1999. 12. P. 392.

7. AgbabaD., DjurkovicM., Brboric J., Zivanov-StakicD. // J. Planar.

Chromatogr. Mod. TLC. 1998. 11. P. 447.

8. Iosefzon-Kuyavskaya B. // Accred. Qual. Assur. 1999. 4. P. 240.

9. Mcclure G.L. // PDA J. Pharm. Sci. Technol. 1999. 53. P. 129.

10. Jagota N.K., Nair J.B., Frazer R., Klee M., Wang M.Z. // J. Chromatogr. A. 1996. 721. P. 315.

11. Jagota N.K., Stewart J.T. // J. Liq. Chromatogr. 1992. 15. P. 2429.

12. Jaworska M., Szulinska G., Wilk M., Tautt J. // J. Chromatogr. 1999. 853. P. 479.

13. Gotti R., Pomponio R., Andrisano V., Cavrini.V. // J. Chromatogr. 1999. 844. P. 361.

Поступила в редакцию 27.02.03

CHROMATO-MASS-SPECTROMETRY DETERMINATION OF SEMIVOLATILE ORGANIC COMPOUNDS IN MEDICATION "OCTREOTID" I.N. Glazkov, IA. Revel'skii

The data of semivolatile impurities composition in medication "Octreotid" using supercritical fluid extraction and chromato-mass-spectrometry