Активность внутриклеточных ферментов лимфоцитов при тяжелом ожоговом шоке у детей

© АРТЕМЬЕВ С.А., НАЗАРОВ И.П., КАМЗАЛАКОВА Н.И., БУЛЫГИН Г.В.

АКТИВНОСТЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ

ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ТЯЖЕЛОМ ОЖОГОВОМ ШОКЕ У ДЕТЕЙ

С. А. Артемьев, И.П. Назаров, Н.И. Камзалакова, Г.В. Булыгин Красноярская государственная медицинская академия им. В.Ф. Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П. Артюхов; кафедра анестезиологии и реаниматологии №1, зав. - д.м.н. проф. И.П. Назаров; кафедра клинической иммунологии, зав. - д.м.н. проф. Г.В. Булыгин.

Резюме. Результаты исследования показали, что в условиях тяжелого ожогового шока в лимфоцитах отмечается выраженная активация антиоксидантной системы глутатиона, резкая активация ферментов, обеспечивающих реакции цикла Кребса, а также активация анаэробных процессов. Выявленные закономерности определяют функциональные возможности иммунокомпетентных клеток в условиях ожоговой болезни. На основании полученных данных открывается возможность изучить пути метаболической коррекции в терапии детей с тяжелой ожоговой травмой.

Ключевые слова: ожоговая болезнь, ожоговый шок, ферменты

лимфоцитов.

Организм пострадавших детей реагирует на тяжелый ожоговый шок в первую очередь активацией симпатоадреналовой системы и выбросом в кровь стрессовых гормонов в больших количествах, что соответствует основным физиологическим закономерностям. Но именно активность и направленность реакций внутриклеточного метаболизма

иммунокомпетентных клеток определяет, насколько верно они распознают чужеродные субстанции и, как следствие, формирование адекватного

иммунного ответа организма как единого целого [1, 2]. В связи с этим задачей исследования явилось выявление структурно-метаболических особенностей лимфоцитов, обусловливающих их функциональные возможности в зависимости от регуляторных влияний организма ребенка. Для решения этой задачи в лимфоцитах периферической крови обследованных детей определялись показатели активности дегидрогеназ, характеризующих основные метаболические пути. Выбор спектра энзиматических показателей, определяемых у детей с ожоговым шоком тяжелой степени, был обусловлен тем, что он отражал интенсивность реакций основных метаболических путей лимфоцитов.

Материалы и методы

Для реализации поставленных задач было проведено обследование 25 детей с тяжелой ожоговой травмой, госпитализированных в состоянии тяжелого ожогового шока, в возрасте от 1 до 5 лет. У всех детей, вошедших в работу, на момент получения травмы отсутствовали какие-либо интеркуррентные заболевания. В исследование не включались дети, получившие острое отравление продуктами горения и угарным газом, ожог дыхательных путей, химические ожоги или электротравму, а также ожог в комбинации со скелетной или черепно-мозговой травмой.

Группе пациентов соответствовала контрольная из 20 практически здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту.

Забор крови для исследования проводился у пациентов на 1, 7, 14 и 21 сутки с момента получения травмы. Данные сроки соответствуют основным периодам течения ожоговой болезни.

Активность внутриклеточных ферментов в общей популяции лимфоцитов периферической крови (400 - 500*10 клеток) определялась

биолюминесцентным методом с бактериальной люциферазой [3]. Активность вычислялась по наработке восстановленного или окисленного кофермента в

избыточно обогащенной субстратом среде. Были изучены внутриклеточные НАД(Ф)-зависимые ферменты: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназа (Г3ФДГ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ), малатдегидрогеназы (НАДМДГ и НАДФМДГ), глутамат- и изоцитратдегидрогеназы (НАДГДГ, НАДФГДГ, НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ), обратные НАДФ- и НАД-зависимые глутаматдегидрогеназы (обр.НАДФГДГ, обр.НАДГДГ), а также глутатионредуктаза (ГР). Показатели активности ферментов рассчитывались в мкЕ/104 клетки.

Статистическая обработка результатов клинических наблюдений выполнена методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6,0 for Windows». Данные в тексте и в таблицах приведены в виде среднего значения ± стандартной ошибки среднего значения ^±m). Достоверность различий анализировали с помощью t-критерия Стьюдента-Фишера в доверительном интервале более 95% при нормальном распределении вариационного ряда. В случае ненормального распределения вариационного ряда достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты и обсуждение

По данным, полученным при изучении активности внутриклеточных ферментов лимфоцитов детей, в 1-е сутки после ожоговой травмы активность Г6ФДГ достоверно не отличалась от контрольного значения (рис. 1). Это свидетельствовало о том, что, несмотря на состояние напряжения иммунной системы, вызванное тяжелым ожоговым шоком, циркулирующие в этот период заболевания у детей лимфоциты характеризуются сниженной способностью к пролиферации и макромолекулярному синтезу.

Субстратное обеспечение гликолиза в значительной степени зависело от активности ЛДГ, достоверно превышающей показатель здоровых (Р<0,05).

Реакция же, катализируемая Г3ФДГ - ферментом, подающим субстраты с липидного обмена на гликолиз, оставалась в пределах контрольных значений 26,18±3,26 при значении этого показателя в контрольной группе 24,59±2,29 (табл. 1).

Следует отметить, что интенсивность реакций цикла Кребса как на начальных (НАДИЦДГ; Р<0,05), так и на конечных его этапах (НАДМДГ и НАДФМДГ; Р<0,05 и Р<0,01; соответственно) превышала показатели здоровых детей (табл. 1, рис. 2). Очевидно, это было связано с высокой концентрацией стрессовых гормонов, стимулирующих, как известно, внутриклеточные энергетические процессы в ущерб синтетическим. Высокий уровень реакций ЦТК свидетельствовал о повышенном снабжении цикла субстратами, и их дополнительное поступление с аминокислотного обмена не требовалось, что подтверждалось не отличающимися от контроля активностями НАДГДГ и НАДФГДГ (табл. 1).

Активность глутатионредуктазы (ГР) - основного фермента

антиоксидантной системы глутатиона, в этот срок наблюдений высокодостоверно (Р<0,001) превышала уровень контроля и составила 10,57±0,71. Как известно, катехоламины стимулируют процессы перекисного окисления липидов, что требует активации антиоксидантных систем защиты клетки. Состояние же ожогового шока, которое имеет место у детей, как известно, сопровождается повышенным выделением катехоламинов, чем и объясняется активация ГР (табл. 1).

Седьмые сутки ожоговой болезни характеризовались достоверным, по сравнению с предыдущим днем обследования, повышением активности Г6ФДГ (Р<0,001), (рис. 1). Это указывало на качественно новое состояние лимфоцитов - высокую их пролиферативную и синтетическую активность. К достоверным изменениям относилось и снижение показателя еще одного фермента - ГР - 8,18±0,54 (Р<0,01), обусловленного, вероятно, менее интенсивными в этот срок реакциями перекисного окисления липидов и менее активными реакциями антиоксидантной защиты.

В то же время часть из энзиматических показателей (НАДФМДГ и НАДИЦДГ) сохраняла свой повышенный по сравнению с контролем уровень (табл. 1). Кроме этого обращало на себя внимание увеличение активности обеих глутаматдегидрогеназ, подтверждающее увеличение потока субстратов аминокислотного обмена на ЦТК, характерного для состояния

функционального напряжения лимфоцитов [1].

На 14-е сутки течения заболевания большинство исследуемых ферментных параметров оставались на прежнем уровне. В качестве наиболее значимых особенностей внутриклеточного метаболизма необходимо отметить активацию по сравнению с предшествующим сроком наблюдения реакций ЦТК, катализируемых НАДМДГ (Р<0,05) и НАДИЦДГ (Р<0,05). Последние отражают интенсификацию синтеза макроэргов в цикле на фоне активации у больных симпатоадреналовой системы, стимулирующей энергопродуцирующие процессы в клетках. С этим же, вероятно, связано и увеличение активности ГР, как отражение повышенной антиоксидантной защиты на фоне стимуляции перекисного окисления липидов гормонами стресса.

Характерным для 21-х суток наблюдения было приближение большинства ферментных показателей к контрольным значениям (табл. 1). В этот срок заболевания достоверно не отличалась от уровня контроля активность Г3ФДГ, ЛДГ, НАДМДГ, НАДФМДГ, НАФИЦДГ, НАД- и НАДФГДГ, а также ГР. Определялась достоверно более высокой и максимальной для всех этапов обследования детей активность Г6ФДГ (Р<0,001 по отношению к контролю). Выше, чем в контроле, определялась активность НАДИЦДГ, подтверждающая сохранение интенсификации реакций начального этапа цикла Кребса и выработки АТФ под влиянием все еще высокого уровня стрессовых гормонов у обследованных детей.

Итак, результаты исследования позволяют заключить, что развитие ожоговой болезни у детей сопровождается значительными структурнометаболическими перестройками лимфоцитов, определяющими

функциональные возможности клеток и иммунной системы в целом. Указанные перестройки обусловлены, прежде всего, активацией симпатоадреналовой системы, характерной для стрессовых состояний.

В качестве основных закономерностей структурно-метаболических изменений лимфоцитов больных детей на фоне тяжелого ожогового шока (1-е сутки после травмы) необходимо указать следующие:

• активация антиоксидантной системы глутатиона;

• ограничение поступления метаболитов в клетки вследствие низкой проницаемости их мембран, приводящее к «обеднению» субстратами пентозофосфатного пути;

• высокая интенсивность энергетических процессов (высокая активность ферментов, обеспечивающих реакции цикла Кребса);

• снабжение субстратами гликолиза в значительной степени зависело от анаэробной реакции, катализируемой ЛДГ, а не от поступления метаболитов с липидного обмена;

• отмечается нормализация большинства энзиматических параметров к двадцать первому дню течения ожоговой болезни.

Таким образом, изучение структурно-метаболических параметров лимфоцитов детей показало, что их изменения в динамике ожоговой болезни отражает закономерности реагирования клеток на состояние функционального напряжения, формирующееся при повышении активности симпатоадреналовой системы. Раскрытие клеточных реакций на метаболическом уровне в условиях ожогового шока и продолжающейся в дальнейшем ожоговой болезни позволяет уточнить элементы патогенеза этих критических состояний, а также обосновать возможность применения метаболической коррекции в комплексном лечении детей с тяжелой ожоговой травмой.

ACTIVITY OF THE INTRACELLULAR ENZYMES OF LYMPHOCYTES IN SEVERE CHILDREN’S BURN SHOCK

S.A. Artemyev, I.P. Nazarov, N.I. Kamzalakova, G.V. Bulygin

Krasnoyarsk state medical academy named in honour of V.F. Vojno-Yasenetskij Results of research showed that under the condition of severe burn shock high activation of antioxidant system of glutathione, sharp ferment activation in Krebs cycle as well as activation of anaerobic processes was registered in lymphocytes. Detected regularities determine the functional capabilities of the immunocompetent cells under the condition of a burn disease. Based on the obtained results there is a chance to study the ways of metabolic correction in therapy of children with severe burning injury.

Литература

1. Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И., Андрейчиков А.В. Метаболические основы регуляции иммунного ответа. - Новосибирск: СО РАМН, 1999. - С. 29-38.

2. Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги. - СПб.: Спецлит, 2000. - С. 132 - 156.

3. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом // Лаб. дело. - 1989. - № 11. -С. 23-25.

Таблица 1

Показатели активности ферментов лимфоцитов детей с ожоговым шоком тяжелой степени

Показатели, mkE/10 клетки Контроль (n=20) Изменение показателей в зависимости от сроков, сутки

1 7 14 21

1 2 3 4 5

Г3ФДГ 24,59+2,29 26,18+3,26 25,01+3,68 27,67+3,10 25,43+2,14

ЛДГ 31,79+2,22 39,38+2,72 Р1<0,05 35,11+3,03 37,15+3,26 32,77+2,81

НАДФМДГ 7,09+0,83 10,11+0,64 Р1<0,01 10,22+0,97 Р1<0,05 9,45+0,65 Р1<0,05 8,86+1,03

НАДИЦДГ 1,38+0,14 2,01+0,25 Р1<0,05 2,02+0,23 Р1<0,05 2,96+0,32 Р1<0,001 Р3<0,05 2,17+0,31 Р1<0,05

НАДФИЦДГ 19,76+1,99 21,20+1,84 23,11+2,92 21,91+1,68 20,70+2,19

НАДГДГ 1,60+0,19 1,71+0,15 2,33+0,28 Р1<0,05 2,03+0,22 2,06+0,24

НАДФГДГ 4,07+0,16 4,63+0,48 5,61+0,57 Р1<0,05 5,15+0,65 4,84+0,59

ГР 6,23+0,61 10,57+0,71 Р1<0,001 8,18+0,54 Р1<0,05 Р2<0,01 9,95+0,66 Р1<0,001 Р3<0,05 6,81+0,70 Р4<0,01

Примечение:Р1 - достоверность различий с контролем; Р2,з,4 - с показателем соответствующей графы.

Рис. 1. Динамика уровня Г6ФДГлимфоцитов (шкЕ/104 кл.).

Рис. 2. Динамика уровня МДГлимфоцитов (шкЕ/104 кл.).