СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ КЛЕТОК ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ
METHOD OF PREPARING CELL PREPARATIONS FOR FLUORESCENT IN SITU HYBRIDISATION

Изобретение относится к приготовлению препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации нуклеиновых кислот (fluorescent in situ hybridization - FISH), применяемой в научных и клинико-диагностических исследованиях.
В основе метода FISH лежит гибридизация in situ между созданным по специальным технологиям ДНК-зондом (нуклеотидная последовательность ограниченного размера) и комплементарным ему участком ДНК мишени в препаратах фиксированных метафазных или интерфазных клеток. Визуализация ДНК-зондов, гибридизованных с соответствующим участком ДНК мишени, осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа. Клинико-диагностические исследования обычно проводят с помощью стандартизованных коммерческих ДНК-зондов и в соответствии с протоколами, рекомендуемыми фирмами-производителями этих зондов.
Высокие трудоемкость и себестоимость FISH-анализа препятствуют более широкому его применению в клинико-диагностической практике, несмотря на постоянно растущую потребность в данном анализе. Одним из способов устранения отмеченных недостатков является получение препаратов с множественными зонами одновременной гибридизации на одном предметном стекле благодаря миниатюризации отдельной зоны.
2
Известен способ приготовления препаратов для одновременного FISH-анализа большого числа (до 9) пациентов. Авторы способа достигают этого результата благодаря использованию трафарета с размерами 22×22 мм и 9 круглыми отверстиями. Чтобы не происходила контаминация между фиксированными образцами от разных пациентов, авторы наносят через каждое отверстие в трафарете крайне малый объем суспензии фиксированных интерфазных клеток - по 0,2 мкл с клеточностью примерно 2500 клеток/мкл. Одним из недостатков способа является то, что ввиду очень малых объемов наносимой суспензии и соответственно малых размеров пятен способ пригоден исключительно для интерфазной FISH. Другой недостаток связан с отсутствием возможности разграничить пятна от различных пациентов визуально без микроскопа (например, с помощью маркера или алмазного карандаша), что не позволяет проводить гибридизацию в разных пятнах с различающимися ДНК-зондами. Данная особенность обуславливает еще один недостаток, а именно способ не дает возможности варьировать объем наносимой гибридизационной смеси в зависимости от числа пятен. К числу недостатков следует отнести также то, что ввиду исключительно малого объема наносимых суспензий клеток фиксатор быстро испаряется, что, как правило, ухудшает качество гибридизационного сигнала. (Lymphoma: Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine, Vol.115, Walker JM, series editor) Humana Press; Totowa, NJ 2005, P.93-108).
Известен другой способ приготовления препаратов с множественными зонами гибридизации на стекле с тефлоновым покрытием и прозрачными окошками. Недостатком способа является наличие оптической аберрации при микроскопировании, вызванной толщиной указанного покрытия. Такая аберрация ограничивает сферу применения способа. В частности, последний непригоден для FISH-анализа с помощью транслокационных зондов, которые формируют так называемые слитные (сливные) сигналы при наличии соответствующей транслокации в исследуемых клетках (Duongruitai N., Warren A.D, Olli H.T. Microbial Populations Identified by Fluorescence In Situ Hybridization in a Constructed Wetland Treating Acid Coal Mine Drainage. J. ENVIRON. QUAL., vol.35, 2006, P.1329-1337).
В качестве прототипа изобретения выбран стандартный способ приготовления препарата культивированных или некультивированных фиксированных клеток, в соответствии с которым на поверхность предметного стекла наносят несколько капель суспензии фиксированных клеток, полученной из клинического образца (костный мозг, периферическая кровь) пациента (Czepulkowski В. Analyzing Chromosomes BIOS Scientific Publishers Limited, 2001, P.47, P.173). Недостатком способа является то, что он не обеспечивает возможности приготовления препаратов с множественными изолированными зонами одновременной гибридизации с участием фиксированных клеток от разных пациентов и/или различных ДНК-зондов.
Техническая задача изобретения - устранение указанного недостатка.
Технический результат заключается в повышении пропускной способности используемых технических средств, производительности труда при выполнении больших серий FISH-исследований, а также в снижении себестоимости 1 исследования.
2
Данный технический результат достигнут тем, что разработан способ приготовления препаратов культивированных или некультивированных фиксированных клеток, который включает нанесение их суспензии на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично прилепленной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм благодаря ее раскатыванию вдоль предметного стекла в течение 3-5 с с помощью валика на нагревательном столике с температурой 60°С.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что благодаря герметичному прилипанию полоски парафильма с 8 отверстиями к предметному стеклу удается создать изолированные зоны одновременной гибридизации между ДНК мишени от разных пациентов и/или различными ДНК-зондами на одном предметном стекле.
Способ осуществляют следующим образом.
2
В полоске парафильма с коммерческим бумажным покрытием и размерами 26×56 мм вырезают 8 отверстий диаметром 9 мм с помощью сверла, предварительно подложив несколько листов бумаги под полоску. Для фиксации последней, а также самого сверла используют трафарет из пластика или металла с отверстиями указанного диаметра. Кратчайшее расстояние между отверстиями составляет 4 мм, а от края предметного стекла 2 мм. Накладывают полоску парафильма с бумажным покрытием и отверстиями на предметное стекло с матовым маркировочным окошком так, чтобы его край, разделяющий матовую и прозрачную поверхности, совпал с одним из поперечных краев полоски. Ставят предметное стекло на нагревательный столик с температурой 60°С и раскатывают валиком в течение 3-5 с, чтобы повысить степень адгезии парафильма к стеклу. Предметное стекло с парафильмово-бумажным покрытием и 8 окошками схематично представлено на чертеже.
Необходимость вышеуказанного этапа, связанного с раскатыванием полоски парафильма с помощью валика, обусловлено тем, что при недостаточной степени адгезии происходит просачивание суспензии клеток из одного окошка в другое, что вызывает их взаимную контаминацию. После прилепления полоски парафильма к предметному стеклу на дно каждой лунки наносят по 5 мкл суспензии фиксированных клеток, приготовленной стандартным способом из образцов разных пациентов или одного и того же пациента, если FISH-анализ проводится с помощью большого количества различных зондов. Для FISH-анализа используют как свежеприготовленные суспензии фиксированных клеток, так и хранящиеся при -20°С. В последнем случае, когда срок хранения превышает 24 ч до приготовления препаратов, клетки предварительно переводят в свежий фиксатор. Это осуществляют следующим образом. Суспензию фиксированных клеток центрифугируют при 200 g в течение 10 мин, удаляют супернатант и суспендируют в свежеприготовленном фиксаторе (смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении, равном 3:1). Указанную процедуру повторяют дважды.
После нанесения суспензий клеток оставляют препараты сохнуть на воздухе. Затем на обратной стороне предметных стекол обводят отверстия в полоске парафильма нефлуоресцирующим маркером либо обозначают их местоположение с помощью алмазного карандаша. Проверяют плотность клеток с помощью фазово-контрастной микроскопии. Удаляют полоску парафильма с предметного стекла. На каждое клеточное пятно наносят по 1,2-1,4 мкл свежеприготовленной гибридизационной смеси, содержащей ингредиенты в пропорциях, рекомендуемой фирмой-производителем ДНК-зонда. Накрывают каждое пятно круглым покровным стеклом диаметром 10 мм и наносят по его краям резиновый клей. Вышеуказанный объем наносимой гибридизационной смеси позволяет в 7-8 раз сократить используемые материалы по сравнению с их количеством, расходуемым в соответствии с протоколом, в частности, фирмы-производителя ДНК-зондов «Vysis/Abbott Laboratories», располагающей в настоящее время наиболее полной коллекцией ДНК-зондов для диагностики онкологических и хромосомных болезней. Согласно данному протоколу на предметное стекло наносится 10 мкл гибридизационной смеси.
Дальнейшие процедуры одновременной денатурации ДНК-зонда и ДНК мишени, гибридизации, отмывки и визуализации проводят стандартным способом в соответствии с протоколом фирмы-производителя зонда (зондов). В частности, вышеотмеченная компания «Vysis/Abbott Laboratories» рекомендует осуществлять одновременную денатурацию ДНК-зонда и ДНК мишени, а также их последующую гибридизацию в специально разработанной для этой цели системе для денатурации-гибридизации (гибридайзере) «HY-Brite» или «ThermoBrite» («Vysis/Abbott Laboratories») емкостью 12 предметных стекол, чтобы повысить производительность труда и одновременно стандартизовать выполнение указанных процедур. Постгибридизационную отмывку данная фирма предписывает выполнять в так называемых сосудах Коплина, причем одновременно не более 4 предметных стекол с гибридизационными препаратами из-за возможного охлаждения отмывочного раствора ниже допустимой температуры.
Простые арифметические расчеты показывают, что уже загрузка гибридайзера всего 2 предметными стеклами с 8 препаратами в каждом из них повышает пропускную способность прибора (количество выполненных денатураций-гибридизаций в единицу времени) в 1,3 раза по сравнению с его загрузкой 12 предметными стеклами с одним препаратом в каждом из них. При загрузке 4 предметными стеклами с 8 препаратами в каждом из них пропускная способность прибора возрастает в примерно 2,7 раза по сравнению с его обычной полной загрузкой. Загрузка 12 предметными стеклами с 8 препаратами в каждом из них увеличивает пропускную способность прибора в 8 раз по сравнению с его обычной предельной загрузкой. Наш опыт показывает, что одновременная постановка денатурации-гибридизации на 3-4 предметных стеклах с 8 препаратами на каждом из них не вызывает особых затруднений при 8-часовом рабочем дне.
Пропускная способность используемых технических средств, а также производительность труда возрастают также на этапе отмывки. Как следует из расчетов, загрузка сосуда Коплина одним предметным стеклом с 8 изолированными зонами одновременной гибридизации позволяет повысить пропускную способность (количество отмытых препаратов в единицу времени) сосуда и производительность труда (количество отмытых препаратов в единицу времени) на этапе отмывки в 2 раза по сравнению с полной загрузкой сосуда 4 предметными стеклами с одной зоной гибридизации на каждом из них. Полная же загрузка 4 предметными стеклами с 8 изолированными зонами одновременной гибридизации позволяет повысить производительность труда вместе с пропускной способностью сосуда Коплина в 8 раз по сравнению с обычной полной загрузкой сосуда.
2
Пример. Для верификации диагноза хронический миелолейкоз (ХМЛ) или оценки эффективности его терапии с помощью FISH-анализа были использованы свежеприготовленные или хранящиеся при -20°С суспензии фиксированных клеток, полученных стандартным способом из образцов костного мозга или периферической крови соответственно 16 и 8 больных. Клетки костного мозга у всех больных были предварительно культивированы в течение 24-48 ч в соответствии с общепринятой методикой. Во всех случаях, когда срок хранения при -20°С превышал 24 ч до приготовления препаратов для FISH-анализа, клетки переводили в свежий фиксатор. Для получения препаратов фиксированных клеток приготовили 3 стекла с парафильмово-бумажным покрытием и 8 круглыми окошками диаметром 9 мм. Внесли по 5 мкл суспензии фиксированных клеток от каждого больного в отдельную лунку. После высыхания препаратов проверили плотность клеток на дне лунок с помощью фазово-контрастной микроскопии. Обвели нефлуоресцирующим маркером отверстия с обратной стороны предметных стекол. Удалили полоски парафильма с них. Приготовили гибридизационную смесь объемом 28,9 мкл, включающую 2,9 мкл транслокационного двухцветного зонда LSI BCR/ABL с двойным слиянием («Vysis-Abbott Diagnostics»), 20,2 мкл гибридизационного буфера и 5,8 мкл дистиллированной воды (пропорции ингредиентов гибридизационной смеси соответствуют рекомендациям фирмы-производителя зонда и буфера). Внесли по 1,2 мкл гибридизационной смеси в каждую лунку. Накрыли каждую смесь круглым покровным стеклом диаметром 10 мм и герметизировали его края резиновым клеем. Поставили все 3 предметных стекла на нагревательный столик гибридайзера «HYBrite». Все дальнейшие процедуры денатурации, гибридизации, отмывки и визуализации (с помощью контрастирующего красителя DAPI) выполняли в соответствии с рекомендациями фирмы «Vysis/Abbott Laboratories» и инструкциями к гибридайзеру. Проводили гибридизацию в течение 18 ч. После отмывки и последующей сушки наносили 25 мкл контрастирующего красителя DAPI и накрывали каждое предметное стекло покровным стеклом размерами 24×60 мм. Оценивали не менее 5 метафазных клеток или не менее 200 интерфазных ядер с помощью люминесцентного микроскопа. У 9 диагностических больных присутствовали метафазные пластинки в приготовленных препаратах. У 7 их этих больных была выявлена специфическая для ХМЛ t(9;22): ish t(9;22)(ABL1+,BCR+;BCR+,ABL1+)[5]. У 2 диагностических больных в исследованных метафазных клетках не было обнаружено t(9;22): ish 9q34(ABL1×2),22q11.2(BCR×2)[11]. У 15 больных был проведен интерфазный FISH-анализ. У 11 из них картина флуоресцентных гибридизационных сигналов соответствовала норме: nuc ish(ABL1,BCR)×2[400]. У 4 больных обнаружили аберрантные клетки: nuc ish(ABL1×3), (BCR×3), (ABL1 con BCR×2)[100].
При проведении вышеописанной серии диагностических исследований применение разработанного способа приготовления препаратов клеток для FISH-анализа позволило сэкономить время на этапе денатурации-гибридизации с использованием гибридайзера в 2 раза, а на этапе отмывки - в 6 раз. Кроме того, данный способ обеспечил экономию дорогостоящих реагентов в более чем 8 раз.