Raрd-анализ внутривидового полиморфизма мягкой пшеницы (Triticum aestivum L. ), возделываемой в Таджикистане

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _____________________________________2011, том 54, №3_________________________________

ГЕНЕТИКА

УДК 575.174.575.113

Д.А.Сергеев, |Х.Х.Хурматов|, М.К.Гулов , З.Б.Кавракова, С.Наимов, Ф.Ю.Насырова

ВЛРВ-АНАЛИЗ ВНУТРИВИДОВОГО ПОЛИМОРФИЗМА МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (ТгШеыт авъПхит Ь.), ВОЗДЕЛЫВАЕМОЙ В ТАДЖИКИСТАНЕ

Институт физиологии растений и генетики АН Республики Тажикистан, Таджикский государственный медицинский университет им. Абуали ибн Сино

На примере ряда стародавних местных и современных сортов пшеницы, возделываемых в Таджикистане, показано, что молекулярно-генетический анализ дает возможность выявить специфические RAРD-маркеры генома пшеницы, которые могут использоваться для сортовой идентификации и оценки генотипов, а также установления филогенетических взаимоотношений между различными сортами пшеницы. Результаты исследования могут быть использованы в селекционной программе создания новых сортов пшеницы.

Ключевые слова: сорта мягкой пшеницы - RAPD-анализ - внутривидовой полиморфизм.

Мировые генетические ресурсы растений рассматриваются во всем мире как основной источник улучшения сельскохозяйственных культур на ближайшие десятилетия. Создание источников и доноров селекционно важных признаков, то есть организация предселекционной работы, в большинстве случаев базируется на мировых генетических ресурсах или коллекциях культивируемых растений и их диких сородичей. Раскрытие потенциала генетических ресурсов по основным биологическим и селекционным признакам обеспечивает генетическую базу для реализации селекционных программ различных направлений [1]. В целом же предселекционная работа включает все этапы работы с генофондом - от его сбора, поддержания и изучения до правовых аспектов авторства на доноры и источники ценных признаков. Строго говоря, каждый образец коллекции должен быть идентифицирован и паспортизирован. В эффективности познания генофонда решающая роль принадлежит методам исследования. Сравнительно-генетические исследования помогают эффективно сопоставлять геномы разных видов пшеницы и открывают дополнительные резервы мобилизации генетических ресурсов при создании нового исходного материала, который может быть использован как для повышения эффективности генетических исследований, так и для селекции.

Изучение местных сортов важно для геногеографических исследований, так как позволяет не только получить представление об основных характеристиках аборигенного материала того или иного вида, но и восстановить его филогенетические связи. Эти формы имеют исключительное значение и для селекции. Стародавние сорта и местные формы в результате длительного процесса естественного и искусственного отбора лучше других приспособлены к локальным условиям произрастания и

Адрес для корреспонденции: Насырова Фируза. 734063, Республика Таджикистан, г. Душанбе, ул. Айни, 299/2. Институт физиологии растений и генетики АН РТ. E-mail: firuza_nasyrova@mail.ru

им свойственны не только оптимальная для данной местности продолжительность вегетационного периода, но и комплекс других хозяйственно ценных признаков.

В последние годы для изучения генетических связей у растений, межвидовой и внутривидовой идентификации широко используется метод маркирования генетического материала путем амплификации ДНК с произвольными праймерами (RAPD-PCR) [2]. Ранее нами была проведена оценка генетического родства нескольких сортов пшеницы двух видов (Triticum aestivum L. и Triticum durum Desfj и нескольких коллекционных образцов представителей рода Aegilops с использованием молекулярных маркеров на основе RAPD и SNP-PCR [3]. Было показано, что некоторые морфологически трудноразличимые виды Aegilops по RAPD-профилям четко дифференцированы. Целью данной работы явился анализ ряда стародавних местных и современных сортов пшеницы.

Материал и методы исследований

Материалом для исследования служили 14 стародавних местных сортов и 2 сорта современной селекции мягкой пшеницы (Triticum aestivum, геном AABBDD - гексаплоид [4]), полученные из коллекции Института земледелия ТАСХН: 1. Сафедак (Памир), 2. Бобило (Хорог), 3. Сурхак (Памир),

4. Сурххуша (Памир), 5. Сафедак (Бартанг), 6. Калаки (Бартанг), 7.Навруз (ТНИИЗ), 8. Сафедак (Бар-танг), 9. Содирас (Афганистан), 10. Джалдак (Памир), 11. Сафедак (Ишкошим), 12. Бобило (Гунт), 13. Содирас (Памир красноколосый), 14. Сурххуша (Бартанг), 15. Сурхак (Шохдора), 16. Хуросон (ТНИИЗ).

Для генотипирования были выбраны 17 RAPD-маркеров (олигонуклеотидные праймеры), отобранные ранее из коллекции RAPD-праймеров на основании большего числа ПЦР-фрагментов при использовании их для амплификации геномной ДНК пшеницы.

ДНК пшеницы выделяли согласно описанной ранее [5,6] модифицированной методике, удобной при необходимости анализа большого числа образцов, в частности популяций растений. При этом ДНК выделялась из 6-8 индивидуальных растений.

В чашки Петри на достаточно увлажненную дистиллированной водой фильтровальную бумагу высаживали по 8 зерновок пшеницы. Для предотвращения роста грибов чашки Петри перед высадкой семенного материала стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при давлении в 1 атм. Зерновки обеззараживали, выдерживая их в течение 3-5 мин в 5% растворе диацида с последующей промывкой в трех сменах стерильной дистиллированной воды. После высадки семенного материала чашки закрывали, нумеровали и помещали в термостат при 28оС на 2-3 недели, следя за достаточной увлажненностью содержимого чашек. 50-100 мг свежей зеленой массы (листья 2-3недельных проростков) помещали в пробирку на 1.5 мл, добавляли 200 мкл буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 500 мМ NaCl; 50 мМ ЭДТА; 1.25% SDS; 3.8% Na2S2O5), измельчали с помощью гомогенизатора. Добавляли 500 мкл буфера (100 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 500 мМ NaCl; 50 мМ ЭДТА; 1.25% SDS; 3.8% Na2S2O5), инкубировали на водяной бане при 60°С в течение 30 мин. Добавляли 700 мкл смеси хлороформ/ изоамиловый спирт (24:1), перемешивали и центрифугировали в течение 15 мин при 12000 об ./мин. Для выделения ДНК к водной фазе добавляли 1.4 мл «холодного» (-20°С) 96% этанола. Центрифугировали в течение 10 мин. при 12000 об./мин. Осадок промывали 3-4 раза 70% этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл буфера ТЕ (10мМ трис-НС1, рН 8.0, 1мМ

Генетика Д.А.Сергеев, [Х.Х.Хурмагов| и др.

ЭДТА). Полученную ДНК анализировали в 0.8% агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Количество ДНК в образце определяли относительно маркерной линии с известной концентрацией ДНК [3,4].

Для проведения ПЦР при использовании произвольных праймеров в стерильных условиях готовили реакционную смесь, содержащую 1/10 объема 10х ПЦР буфера (500 мМ KCl, 100 мМ Трис-HCl (pH 8.3) и 15 мМ MgCl2), 0.8 мМ дНТФ, 1мкМ произвольного праймера, 1 единицу активности Taq-полимеразы, 25 нг геномной ДНК и H2O (до общего объема 25 мкл). Реакционную смесь в пробирке покрывали каплей вазелинового масла. Пробирку помещали в амплификатор. Режим реакции: денатурация при 94°С 1 мин, 40 циклов - денатурация 94°C 1 мин, отжиг праймера 37°C 1 мин, элонгация 72°С 2 мин. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1.5% агарозном геле с добавлением этидиум бромида до конечной концентрации 0.6% и документировали с помощью системы BioDoc. Размеры амплифицированных фрагментов определяли при использовании в качестве маркера 1 kb DNA ladder. Статистический анализ включал составление бинарных матриц по каждому из праймеров, в которых отмечалось «присутствие» (1) или «отсутствие» (О) фрагментов с одинаковой молекулярной массой на электрофореграмме. Каждый RAPD-фрагмент рассматривался как отдельный генетический локус. Характер и степень RAPD изменчивости анализировали в отношении праймера и образца [5]. На основании суммарной матрицы RAPD-спектров с помощью программного пакета NTSYS pc V.2/11Q были определены генетические дистанции между исследуемыми образцами. Для построения дендрограммы, демонстрирующей филогенетические отношения между изученными образцами Triticum aestivum по результатам RAPD-анализа, применили метод невзвешенного парно-группового кластерного анализа с арифметическим усреднением (UPGMA) с использованием программы NTSYS pc V.2/11Q [6].

Результаты и их обсуждение

При проведении RAPD-PCR были использованы 17 эффективных произвольных декамерных праймеров, с помощью которых оценивали межсортовое и внутривидовое генетическое разнообразие Triticum aestivum. По таким фенотипическим признакам, как окраска зерна, окраска колоса и остей, ломкость колоса и стебля, наблюдалось внутривидовое разнообразие. Основная зона разделения фрагментов находилась в пределах 2000-200 п.н. В целом учитывалось 273 амплифицированных фрагмента (табл.), от 12 до 23 (в среднем 16) на один RAPD-праймер. Из 273 ПЦР-фрагментов 54% были полиморфны между изученными генотипами, 46% имели одинаковую длину у всех изученных образцов. Самое высокое число полиморфных RAPD-фрагментов - 14 из 16 (87%) было получено при амплификации ДНК с праймером R158. В то же время в случае с RAPD-праймером 039 только 4 из 16 (25%) фрагментов были полиморфны. Этот праймер выявил наименьшее количество полиморфных локусов. Уровень полиморфизма, выявляемый при амплификации геномной ДНК с использованием остальных праймеров, имел промежуточное значение. Все использованные праймеры в различных соотношениях выявляли наличие как мономорфных, так и полиморфных фрагментов у исследуемых образцов. Мономорфные фрагменты могут считаться RAPD-маркерами для представителей вида. Чем больше генетическая дистанция между исследуемыми видами, тем меньше у них общих продуктов амплификации. Выявляемые при электрофорезе мономорфные полосы у различных

сортов предполагают общность структурно-функциональной организации их геномов. Каждый из сортов имел свой определенный набор амплифицируемых RAPD-продуктов, отличавшийся от других количеством фрагментов, их размером и степенью выраженности. Некоторые праймеры выявили присущие только одному конкретному сорту ампликоны и, следовательно, являются сортоспецифичными. Число суммарных зон, полученных при амплификации ДНК 16 изученных сортов пшеницы с каждым из праймеров, варьировало от 12 до 23. Отмечены существенные различия по количеству RAРD-фрагментов между изученными сортами. Исследуемые образцы различались также по числу уникальных, характерных только для одного сорта ампликонов.

Таблица

Структура ЯЛРБ-праймеров и характеристика выявляемых с их помощью ПЦР-фрагментов

№ Символ Структура (в-С состав, %) Количество ПЦР-фрагментов

общее полиморфных мономорфных

1 Я031 -0ТС0Л-С0СЛТ-0-(63%) 17 11 6

2 Я039 -ЛвСЛС-СТСЛС-Л-(54%) 16 4 12

3 Я058 -ЛТСОв-ТСООТ-Л-(54%) 14 9 5

4 Я064 -ЛТвСС-СТЛвЛ-(54%) 15 10 5

5 Я068 -СЛЛСТ-ЛвЛСв-в- (54%) 23 17 6

6 Я074 -СССТв-ЛЛЛСЛ-С-(45%) 12 5 7

7 Я082 -ОЛТОв-ЛЛСОЛ-С-(45%) 16 6 10

8 Я091 -СЛТЛС-ОЛТЛС-в-(45%) 22 10 12

9 Я156 -ТвСЛС-ЛСТ0Л-(50%) 12 6 6

10 Я158 -Т0вТС-ТСТ0Л-(50%) 16 14 2

11 Я159 -Т00ТС-Л0Т0Л-(50%) 19 11 8

12 Я160 -ТввТС-ЛСТСЛ-(50%) 20 5 15

13 Я177 -СС0ЛЛ-С000Т-(70%) 18 12 6

14 Я186 -ТСвТС-ЛСТвЛ-(50%) 13 4 9

15 Я342 -00СТ0-СЛЛТ0-(60%) 13 5 8

16 Я401 -СТвЛЛ-ССвСТ-(60%) 12 9 3

17 Я565 -ССЛЛЛ-ЛТСвТ-Л(60%) 15 12 3

Итого: 273 150 123

В качестве примера на рис.1 приведены результаты электрофоретического анализа ПЦР-продуктов, полученных с праймером КЛРБ158.

В случае использования праймера RAPD 158 выявлено всего 16 ПЦР-фрагментов длиной в пределах от 150 до 1900 п.н. При амплификации ДНК 16 образцов T.aestivum с данным праймером 14 ПЦР-фрагментов длиной около 1850, 1800, 1200, 1000, 950, 900, 840, 760, 740, 700, 650, 500, 320 п.н являлись неполиморфными. RAPD-фрагмент длиной около 820 п.н присутствовал только у 17 образца (Хуросон, местный сорт), а фрагмент длиной около 390 п.н. отсутствовал только у 10 образца (Со-дирас, стародавний местный сорт). Эти фрагменты являются полиморфными, то есть выявляют внутривидовой и межсортовой полиморфизм.

5000

2000

2 3

100

10 11 12 13 14 15 16 17

1

4

5

6

7

8

9

Рис.1. Электрофорез ПЦР-продуктов с 158 RAPD праймером в 2% агарозном геле. 1 - линейка, 2 - Сафедак (Памир), 3 - Бобило (Хорог), 4 - Сурхак (Памир), 5 - Сурххуша (Памир), 6 - Сафедак (Бартанг), 7 - Калаки (Бартанг), 8 - Навруз (ТНИИЗ), 9 - Сафедак (Бартанг), 10 - Содирас (Афганистан), 11 - Джалдак (Памир), 12 -Сафедак (Ишкошим), 13 - Бобило (Гунт), 14 - Содирас (Памир), 15 - Сурххуша (Бартанг), 16 - Сурхак (Шохда-

ра), 17 - Хуросон (ТНИИЗ).

Полученные нами результаты вполне согласуются с уже опубликованными ранее данными по RAPD-анализу различных геномов T.aestivum [7]. По этим данным, уровень внутривидового и межсортового RAPD-полиморфизма составляет 2-8%, что объясняется преимущественно доминантным типом наследования этих маркеров. Для количественной оценки RAPD-полиморфизма и определения уровня дивергенции между изученными генотипами полученные данные были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, в которых наличие или отсутствие в RAPD-наборах одинаковых по размеру ампликонов рассматривалось как состояние 1 и 0 соответственно. На основе матрицы состояний невзвешенным парно-групповым методом кластерного анализа с арифметическим усреднением (UPGMA) была построена дендрограмма генетического подобия между изученными образцами пшеницы (рис.2). Уровень различий по величине генетического сходства [5] между исследуемыми образцами варьировал от 0.98 (между сортами Сафедак) до 0.94 (между сортами Бобило). Из представленной дендрограммы видно, что образцы характеризовались сравнительно высоким уровнем межсортового полиморфизма. При этом коэффициенты сходства между всеми сортами составляли от 0.99 до 0.94. В целом, это сопоставимо с показателями геномного сходства, определенного с помощью других типов маркеров.

Рис. 2. Дендрограмма филогенетических взаимоотношений между представителями вида ТгШсит ае^Иуит, построенная на основании анализ генетических дистанций.

Уровень различий по величине генетического сходства [5] между исследуемыми образцами варьировал от 0.98 (между сортами Сафедак) до 0.94 (между сортами Бобило). Из представленной дендрограммы видно, что образцы характеризовались сравнительно высоким уровнем межсортового полиморфизма. При этом коэффициенты сходства между всеми сортами составляли от 0.99 до 0.94. В целом, это сопоставимо с показателями геномного сходства, определенного с помощью других типов маркеров. Сорта типа Сафедак слабо морфологически обособлены друг от друга и иногда на основании морфологических данных отождествлялись. По данным RAPD-анализа (значения бутстрепа 100%), сорта дифференцированы, несмотря на некоторую степень гомологии как по количеству, так и по размерам фрагментов. Как следует из представленной дендрограммы, правомерно объединить в одну группу сорта типа Сафедак. Сорта Сурхак и сорт Хуросон группируются вместе и наиболее близки в генетическом отношении к возделываемому сорту Навруз. Наиболее удален в генетическом отношении сорт Бобило (Гунт). Следует отметить, что в один кластер попадают сорта, значительно отличающиеся фенотипически (рис.2).Таким образом, молекулярно-генетический анализ дает возможность выявить специфические геномные маркеры, которые могут использоваться для сортовой идентификации генотипов. Показано, что метод молекулярного маркирования генома на основе RAPD-PCR позволяет идентифицировать представителей вида ТгШсит aestivum и установить филогенетические взаимоотношения между различными сортами. Целенаправленное использование видоспецифичных праймеров позволит исследователям сократить затраты труда и средств, необходимые для анализа коллекционных образцов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Международного научно-технического центра, проект Т-1105.

Поступило 20.01.2011 г.

Генетика Д.А.Сергеев, Х.Х.Хурматов| и др.

ЛИТЕРАТУРА

1. Конарев В.Г. Белки пшеницы. - М.: Колос, 1980, 250 c.

2. Williams J.G.K., Kubelik A.R. et all. - Nucl. Acids Res., 1990, v. 18, pp. 6531-6535.

3. Хурматов Х.Х., Сергеев Д.А. и др - Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. н., 2006, №1(154), с. 18-24.

4. Miller T.E. - Wheat breeding (ed. Lupton). - London, New York, 1987, рр. 1-30.

5. Rohlf, FJ. NTSYS-pc: Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System. vers. 2.0. Applied Biostatistics Inc., New York, 1998.

6. Plaschke J., Ganal M.W., Roder M.S. - Theor. Appl. Genet., 1995, v.91, pр. 1001-1007.

7. Langridge P., Lagudah E.S. et all. - Aust. J. Agr. Res. 2001, v.52, pp. 1043-1077.

Д.А.Сергеев, |Х,.Х.Х,урматовГ, М.К.Гулов*, З.Б.Кавракова, С.Наимов, Ф.Ю.Носирова КАРБ ПОЛИМОРФИЗМИ ДОХИЛИНАМУДИИ ГАНДУМИ МУЛОИМИ

(ТгШеит аезііхит Ь.) ТОЧ,ИКИСТОН

Институти физиологияирастани ва генетикаи Академияи илм^ои Чумхурии Точикистон *Донишгохи давлатии тиббии Тоцикистон ба номи Абуали ибни Сино

Дар ма^олаи мазкур тахлили полиморфизми геноми навьхои гандуми мулоими махаллии кухистони Точикистон ва навьхри нав ихтироьгардидаи гандуми дар чумбури парва-ришшаванда оварда шудааст. Тахлили молекулавии геноми гандум, ахбороти аломатхои ноди-ри зурети онхоро ба шароити номусоиди табиат, монанди хушкитобовари, устувори ба касалихои замбуругй ва дигар аломатхои нодири геномиро айен мегардонад, ки ин имконияти истифодаи онхоро дар ихтироь кардани навьхои нави серхосил имконпазир мегардонад. Дар тахлили молекулавии геноми гандум истифодаи маркери ЯЛРО муфид мебошад.

Калимщои калиди: навщои гандуми мулоим - тауияи таулил бо РАПД - полиморфизми дохилинамуди.

D.A.Sergeev, |Kh.Kh.Khurmatov|, M.K.Gulov , Z.B.Kavrakova, S.Naimov, F.Y.Nasirova RAPD-ANALYSES OF THE INTERSPECIFIC POLYMORPHISM OF THE SOFT WHEAT (Triticum aestivum L.), GROWING IN TAJIKISTAN

Institute of Plant Phisiology and Genetics, Academy of Sciences of the Republic of Tajikistan, Abuali ibni Sino Tajik State Medical University

The RAPD genomic analyses of aboriginal landrace wheat collected from nature and cultivars modem varieties of bread wheat (Triticum aestivum L.) are growing in Tajikistan has been applied. The wide range of RAPD genomic interspecific polymorphism has been obtained. The molecular genomic analyze of wheat accessions from various climatic zones allowed to obtain specific RAPD identified DNA fragments characterized as stress affected wheat biotypes. RAPD as more informative molecular marker in wheat genomic investigation where observed.

Key words: soft wheat - RAPD analyses - interspecific polymorphism.