Выделение и характеристика нейральных стволовых клеток из обонятельной области слизистой оболочки носа млекопитающих

......

ш

Новости клеточных технологий. Клеточная биология

13

receptor 3 (Flt4). PNAS 1998; 95; 2: 548-53.

12. Chiang M.K., Flanagan J.G. Interactions between the Flk-1 receptor, vascular endothelial growth factor, and cell surface proteoglycan identified with a soluble receptor reagent. Growth Factors 1995; 12; 1: 1-10.

13. Yamashita J. et al. Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors. Nature 2000; 408; 6808: 92-6.

14. Fang B. et al. Multipotency of Flk1+CD34- progenitors derived from human fetal bone marrow. J Lab Clin Med 2004; 143: 4.

15. Deng W. et al. Allogeneic bone marrow-derived flk-1+Sca-1-

mesenchymal stem cells leads to stable mixed chimerism and donor-specific tolerance. Exp Hematol 2004; 32; 9: 861-7.

16. Fang B., Shi M., Liao L. et al. Systemic infusion of FLK1 + mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver fibrosis in mice. Transplantation 2004; 78: 83-8.

17. Miyagi T. et al. Flk-1+ cells derived from mouse embryonic stem cells reconstitute hematopoiesis in vivo in SCID mice. Exp Hematol 2002; 30: 1444.

Подготовил А.В. Волков; по материалам Tissue Eng 2005; 11; 1-2: 110-119.

Выделение и характеристика нейральных стволовых клеток из обонятельной области слизистой оболочки носа млекопитающих

Мультипотентные стволовые клетки взрослого организма за последние годы были выделены из разных тканей и органов. Однако степень пластичности стволовых клеток дефинитивных тканей в настоящее время активно дискутируется. Так, например, было показано, что нейральные стволовые клетки мыши могут дифференцироваться в гемопоэтические и восстанавливать гемопоэз in vivo [1]. Этот результат был воспроизведён ещё одной группой исследователей [2], однако опровергнут другой [3]. Нейраль-ные стволовые клетки были выделены из разных отделов нервной системы человека, включая и обонятельную область слизистой оболочки носа. 4 года назад Roistein F.J. с соавт. впервые выделил нейральные стволовые клетки из обонятельной области слизистой оболочки носа (ОСН) взрослого человека [4], а позже, Zhang получил аналогичные нейросферы в своей лаборатории [5]. Отдельную субпопуляцию, в обонятельной части слизистой оболочки носа человека образуют так называемые обкладочные нейро-эпителиальные клетки (olfactory ensheathing cells), обладающие свойствами нейральных стволовых [6]. Имеются также указания, что клетки базального слоя «обонятельного эпителия» мыши могут дифференцироваться и в экстра-нейрональном направлении [7, 8].

Исследование австралийской группы Murrell, опубликованное в онлайн-версии журнала Developmental Dynamics, демонстрирует, что нейральные стволовые клетки, выделенные по схожему протоколу из ОСН человека, крысы и мыши обладают мультипотентностью.

Клетки человека выделяли из биоптатов ОСН (полученных после операций септопластики и турбинэктомии) фер-ментативно-механическим методом. Через 7-10 дней после первичного плэтинга неприкрепившиеся клетки образовывали шаровидные колонии, содержащие около 1000 клеток. Способность к образованию сфер не зависела от возраста донора. Клетки сфер экспрессировали не-стин и нейрональные маркёры, характерные для глии (GFAP, O4, GalC) и нейронов (beta-tubulin III, MAP5), то есть являлись нейросферами. Способность к образованию вторичных и третичных сфер сохранялась после диссоциации первичных нейросфер или их криоконсервирования, что указывало на наличие клеток, обладающих свойством самообновления. Было показано, что клетки нейросфер способны к клональному росту без изменения экспрессии маркёров. Степень экспрессии тех или иных нейромаркёров зависела от присутствия различных факторов дифферен-цировки (NGF, CNTF, ретиноевой кислоты, сыворотки). Спо-

собность к дифференцировке изучали в Transwell системе, представляющей из себя кокультуру нейросфер и дифференцированных клеток различных специализированных тканей (мышечных, гепатоцитов) новорожденных крысят, разделённую полупроницаемой мембраной и исключающей прямой межклеточный контакт. При этом клетки нейросфер изменяли свою морфологию и начинали экспрессировать тканеспецифичные маркёры, в зависимости от вида специализированной ткани в кокультуре. Так, при стимуляции дифференцировки клеток сфер гепатоцитами наблюдали экспрессию ими альбумина и ферритина. Кардиомиоцита-ми - альфа-актина и сердечного тропонина I. Скелетной мышечной тканью - миозин, тропомиозин.

Таким образом, способность клеток нейросфер к диф-ференцировке in vitro зависела от наличия в культуральной среде специфических растворимых факторов, выделяемых клетками специализированных тканей. При трансплантации меченых клеток нейросфер в гаструлу куриного эмбриона, наблюдали их включение во многие ткани. Однако диф-ференцировка донорских клеток (человека) была показана только для сердца и головного мозга. В аналогичном эксперименте был показан энграфтинг клеток «обонятельного эпителия» мыши во множество органов и тканей куриного эмбриона. Показана трансдифференцировка клеток в нервную, мышечную ткани и гепатоциты. В контрольных экспериментах (введение в гаструлу неклеточной суспензии и трансплантация клеток крови без эритроцитов) не было получено доказательств множественного энграфтинга и дифференцировки in vivo.

Таким образом, было показано, что клетки нейросфер человека и мыши способны дифференцироваться in vivo в ткани всех трёх зародышевых листков. В подтверждение достоверности экспериментов Bjornson C.R. (1999), исследователи выполняли внутривенную сингенную трансген-дерную трансплантацию клеток нейросфер (выделенных из ОСН) в организм летально облучённых крыс. Перед трансплантацией все донорские клетки были негативны по CD45 (общий маркёр лейкоцитов) и CD34 (маркёр гемопоэтичес-ких клеток). Однако менее 1% клеток трансплантата эксп-рессировали миелоидный маркёр CD11b, что могло указывать на потенциальную контаминацию клетками крови. Через 9 месяцев степень химеризма реципиента донорскими лейкоцитами составляла 5-20% среди всех выживших животных.

Донорские клетки в крови и селезёнке реципиента ко-экспрессировали маркёры Т- , B-, дендритных, миелоид-

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005

мм

ш

Новости клеточных технологий. Клеточная биология

ных и гемопоэтических клеток. Тем не менее, вероятность существования и пролиферации CD11 b-клеток, контами-нировавших трансплантат, была ничтожно мала. Таким образом, результаты этих экспериментов подтвердили, что клетки нейросфер ОСН крысы обладают способностью к восстановлению гемопоэза и дифференцировке в клетки крови. Вероятность слияния, как возможного механизма «псевдодифференцировки», была также отвергнута рядом экспериментов. При кокультивировании меченых клеток нейросфер и костного мозга мыши, нейросфер мыши и суспензии клеток гаструлы куриного эмбриона не было выявлено ни одного факта слияния. Слияние клеток человека после трансплантации в куриную гаструлу было также исключено анализом ДНК и ядер. Таким образом, в работе было доказано, что в ОСН человека (а также крысы и мыши) существуют мультипотентные стволовые клетки. Остаётся неясной природа этих клеток. Хотя их и можно считать ней-рональными стволовыми, поскольку они образуют нейро-сферы в культуре с экспрессией нестина и маркёров всех типов нервных клеток. Однако, это могут быть как клетки обонятельного нейроэпителия (olfactory ensheathing cells и нейроклетки, выделенные Roisen F.J. и Zhang X. [4, 5]), так и базальные клетки ОСН [7, 8]. Незначительная контаминация CD11b+ клетками (менее 1%) может быть объяснена миграцией в ОСН дендритных клеток и макрофагов, однако не отрицает факта дифференцировки. Отсутствие гемопо-этических клеток в трансплантате и неспособность клеток костного мозга образовывать сферы при культивировании в аналогичных условиях культуры (с нейросферами из ОСН) указывает на «чистоту» эксперимента и значительно снижает вероятность артефактов. Исследователи выделили

Рис. Образование нейросфер из клеток, выделенных из обонятельной области слизистой оболочки носа человека, 10 дней культивирования. Из Dev Dyn 2005 Epub Mar 21, с изменениями.

клетки с одинаковым потенциалом пластичности из 2-х гистологических структур - «обонятельного эпителия» и соединительнотканной собственной пластинки (lamina propria). «Производительность» метода составила 500-2000 сфер (около 1000 клеток в каждой) из одного биоптата в течение 7-10 дней.

Таким образом, предложен новый альтернативный ауто-логичный материал для регенеративной медицины. Кроме того, в настоящее время хорошо отработана техника забора такого материала без потери функции обоняния.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Bjornson C.R. et al. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo. Science 1999; 283: 534-7.

2. Shih C. et al. Identification of a candidate human neurohematopoietic stem-cell population. Blood 2001; 98: 2412-22. Morshead C. et al. Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations. Nat Med 2002; 8: 268-73.

Roisen F.J. et al. Adult human olfactory stem cells. Brain Res 2001; 890: 11-22.

3.

4.

Zhang X. et al. Adult human olfactory neural progenitors cultured In defined media. Exp Neurol 2004; 186: 112-23. Barnett S.C. et al. Identification of a human olfactory ensheathing cell that can effect transplant-mediated remyelination of demyelinated CNS axons. Brain 2000; 123: 1581-8.

7. Carter L.A.et al. Olfactory horizontal basal cells demonstrate a conserved multipotent progenitor phenotype. J Neurosci 2004; 24: 5670-83.

Chen X., Fang H., Schwob J. Multipotency of purified, transplanted globose basal cells in olfactory epithelium. J Comp Neurol 2004; 469: 457-74.

6

8

Подготовил А.В. Берсенев; по материалам Dev Dyn 2005 Epub Mar 21

Изучение спонтанной онкогенетической трансформации мезенхимальных стволовых клеток человека в культуре

Мезенхимальные стволовые (стромальные стволовые) клетки (МСК) человека считаются одним из самых перспективных видов аутологичного материала для клеточной терапии и тканевой инженерии. МСК были выделены из различных тканей взрослого человека, эмбриона и новорожденного и характеризуются рядом общих свойств, среди которых: высокая способность к пролиферации и адгезии, фибробласт-подобная морфология и образование колоний в культуре, легко-индуцируемая дифференциров-ка в остео-, хондро-, мио- и адипогенном направлениях. Однозначного мнения по экспрессии маркёров не существует, не описаны и уникальные маркёры МСК. Однако большинство исследователей описывает эти клетки как БН-2, БН-3, БН-4, 8ТГО-1, Бса-1, ТИу-1, 0044, 0029, 0071, 00106, 00120а, 00124 - позитивные и 0034, 0045 -негативные. В биологии МСК ещё очень много вопросов,

ответы на которые будут найдены годами кропотливых фундаментальных исследований. Однако уже сегодня начались клинические испытания по введению этих клеток с целью коррекции той или иной патологии. Вопрос об онкогенной безопасности взрослых стволовых клеток вообще и МСК в частности остаётся неизученным, но крайне актуальным, важным и определяющим будущее регенеративной медицины. Известно, что старение клетки сопряжено с укорочением теломер (потерей активности теломеразы) и остановкой клеточного цикла [1]. При культивировании клеток, в определённый момент неизбежно наступает «кризис» (остановка) клеточного цикла (фаза М1) [2]. Феномен спонтанного обхода «кризиса» остановки клеточного цикла и укорочения хромосом был установлен для человеческих клеток недавно [3]. Варианты «обхода» этого неизбежного процесса связаны с приобретением иммортальности при

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005