Способ определения жизнеспособности сперматозоидов человека
METHOD FOR DETERMINING VIABILITY OF HUMAN SPERMATOZOA

Изобретение относится к области медицины и репродуктивной биологии и может быть использовано для проведения фундаментальных исследований и в клинической практике в рамках вспомогательных репродуктивных технологий для выявления причин мужского бесплодия, определения фертильного статуса, определения криорезистентности сперматозоидов в ходе процедуры экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и создания донорских банков спермы.
Жизнеспособность сперматозоидов в женском репродуктивном тракте по разным оценкам может достигать 3-5 дней, однако их оплодотворяющая способность проявляется в гораздо меньший период, составляющий от нескольких часов до 1-2 дней. В случаях, когда процент прогрессивно-подвижных форм составляет менее 40%, определение жизнеспособности сперматозоидов является необходимым для выбора тактики лечения и прогнозирования эффективности процедуры ЭКО. В образцах с низким процентом прогрессивно-подвижных сперматозоидов необходимо оценивать процент живых клеток, поскольку обычно доля живых клеток превышает долю подвижных.
Данный показатель также важен при проведении ЭКО пациентам с тяжелыми формами мужского фактора бесплодия, что зачастую предусматривает использование оперативных способов получения мужских гамет с последующей криоконсервацией материала. Из-за травматичного характера процедуры и малого количества получаемых клеток, для накопления материала перед ЭКО требуется осуществление криоконсервации материала в жидком азоте, при этом криоконсервация существенным образом сказывается на жизнеспособности гамет и требует использования точных методов оценки этого показателя.
Для оценки жизнеспособности может применяться ряд известных методов, из которых наиболее распространенными являются тесты, основанные на определении целостности мембран при окрашивании сперматозоидов эозин-нигрозином или с помощью гипоосмотического набухания (HOS - тест).
В клинической практике в большинстве случаев принято придерживаться рекомендаций Всемирной Организации Здравоохранения в части определения жизнеспособности сперматозоидов человека, основанных на оценке целостности и проницаемости мембраны сперматозоида.
Водорастворимые красители плохо проникают через мембраны неповрежденных клеток, слабо связываются внутриклеточными структурами и слабо их прокрашивают. Повышение проницаемости плазматической и внутренних мембран приводит к возрастанию количества красителя, вошедшего в клетку и связавшегося с компонентами цитоплазмы.
Следовательно, окрашивание клетки красителями и ее жизнеспособность находятся в противоположных взаимоотношениях, и окрашивание усиливается при повреждении мембраны. Отсутствие окрашивания свидетельствует о том, что неповрежденные плазматические мембраны не пропускают краску. На этом основаны многие гистохимические методы определения жизнеспособности клеток (с помощью нейтрального синего, эозина и др.).
Известен метод одношагового окрашивания эозин-нигрозином, в котором эозин используют для окрашивания цитоплазмы клеток, а нигрозин для увеличения контрастности между основным фоном и головками сперматозоидов, что помогает выявлять отдельные клетки [ L.,  I., Kvist U. Evaluation of the one-step eosin-nigrosin staining technique for human sperm vitality assessment // Hum Reprod. - 2003.- Vol. 18, №4. - P. 813-816.]. Этот метод также позволяет хранить предметные стекла для повторной оценки показателя и в целях контроля качества. Для проведения теста две аликвоты эякулята объемом по 50 мкл смешивают с равными объемами раствора эозин-нигрозина и окрашивают в течение 30 сек. Для каждой аликвоты готовят мазок на предметном стекле, который изучают в световом микроскопе под иммерсионным маслом. Подсчитывают число окрашенных и неокрашенных клеток (по 200 сперматозоидов для каждой аликвоты) и вычисляют среднее значение и различие между процентами живых клеток. Если различие между процентами неприемлемо, т.е. не попадает в 95% доверительный интервал, то готовят два новых препарата и повторяют процедуру.
Недостатками данного метода являются субъективность оценки препарата и высокая трудоемкость, особенно в случаях низкой концентрации сперматозоидов в нативном образце. При выявлении счетной ошибки необходимо повторять приготовление препарата и его оценку, увеличивая затраты времени на оценку одного нативного образца.
Метод 2. [ L., I., Kvist U. Evaluation of the one-step eosin-nigrosin staining technique for human sperm vitality assessment // Hum Reprod. - 2003. - Vol. 18, №4. - Р. 813-816]. Тест на жизнеспособность с использованием одного раствора эозина является простым и быстрым. Готовят реагенты: 1) NaCl, 0,9% (w/v): растворяют 0,9 г NaCl в 100 мл дистиллированной воды; 2) эозин Y, 0,5% (w/v): растворяют 0,5 г эозина Y (цветовой показатель 45380) в 100 мл 0,9% NaCl. Далее берут две аликвоты эякулята по 5 мкл и соединяют с 5 мкл раствора эозина на предметных стеклах, перемешивают наконечником пипетки, покрывают предметные стекла покровными и оставляют на 30 сек. Оценивают каждое стекло в инвертированном фазово-контрастном микроскопе и подсчитывают число окрашенных и неокрашенных клеток; после чего вычисляют среднее значение и различие между процентами живых клеток. Если различие между процентами неприемлемо и не попадает в 95% доверительный интервал, то готовят два новых препарата и повторяют процедуру.
Недостатком этого метода, помимо субъективности, является то, что влажные препараты не подлежат хранению для проведения контроля качества, некоторые коммерчески доступные растворы эозина являются гипотоническими водными растворами, которые негативно влияют на сперматозоиды и дают ложно-положительные результаты.
Метод 3. Как альтернатива методам с окрашиванием может быть использован тест с гипоосмотическим набуханием (HOS-тест) для определения жизнеспособности сперматозоидов [Jeyendran R.S., Van der Ven H.H., Perez-Pelaez M., Crabo B.G., Zaneveld L.J. Development of an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to other semen characteristics // J. Reprod. Fertil. - 1984. - Vol. 70, №1. - P. 219-228]. Данный метод полезен, когда необходимо избежать окрашивания сперматозоидов, например, при отборе сперматозоидов для интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (процедура ИКСИ). Сперматозоиды с интактными мембранами набухают в течение 5 мин в гипоосмотическом растворе, а формы жгутиков стабилизируются к 30 мин [Hossain A.M., Rizk В., Barik S., Huff С., Thorneycroft I.H. Time course of hypo-osmotic swellings of human spermatozoa: evidence of ordered transition between swelling subtypes // Hum. Reprod. - 1998. - Vol. 13, №6. - Р. 1578-1583].
Недостатки совпадают с недостатками Метода 2.
Методы проточной цитометрии для определения уровней жизнеспособности и апоптоза, как и гистохимические методы, основаны на изучении структуры и функционального состояния клеточных мембран. При проведении функциональных тестов используют несколько параметров: оценка митохондриального потенциала, жизнеспособность, статус капацитации и акросомальной реакции. Различия между тестами основаны на свойствах используемых красителей.
Жизнеспособность принято оценивать с помощью липофильных красителей, свободно проникающих через билипидный слой внешних и внутренних клеточных мембран. На основании митохондриального потенциала можно делать выводы о жизнеспособности клетки.
Известны несколько способов оценки мембранного статуса при помощи липофильных красителей и метода проточной цитометрии.
Способ 1. Катионные липофильные красители, к группе которых относится DiOC6(3) в литературе получили название «митохондриальных зондов», так как применяются для изучения мембранного потенциала митохондрий [Cottet-Rousselle С., Ronot X., Leverve X., Mayol J.-F. Cytometric assessment of mitochondria using fluorescent probes // Cytometry Part A. - 2011. - Vol. 79А. - Р. 405-425]. Благодаря своим липофильным свойствам DiOC6(3) способен свободно проникать через билипидные мембраны клетки (поверхностную мембрану клетки, а также внешнюю и внутреннюю мембраны митохондрий) и, благодаря уже катионным свойствам, этот краситель накапливается в областях с высокой концентрацией протонов, то есть под внутренней мембраной митохондрий. Этот эффект сопровождается изменением интенсивности флюоресценции проникшего в клетки красителя в зеленой части спектра, что и регистрируют при анализе на проточном цитофлуориметре [Wlodkowic D., Telford W., Skommer J., Darzynkiewicz Z. Apoptosis and beyond: cytometry in studies of programmed cell death // Methods Cell Biol. - 2011. - Vol. 103, №1. - Р. 55-98]. В том случае, если концентрация протонов снижена, как это имеет место на начальных этапах апоптоза, краситель будет накапливаться в них менее эффективно, и, как следствие, интенсивность его флюоресценции будет снижена. За счет этого можно отличить живые клетки с эффективно функционирующими митохондриями (и, как следствие, высокой интенсивностью флюоресценции), от гибнущих или мертвых клеток, в которых функционирование митохондрий нарушено. В том случае, если деполяризация митохондрий рассматривается как «раннее» событие при запуске апоптоза, то нарушение целостности поверхностной мембраны (то есть ее фрагментация) обычно характерно для клеток, находящихся на терминальных стадиях гибели. Поэтому для выявления разных стадий апоптоза, помимо DiOC6(3), клетки дополнительно окрашиваются йодистым пропидием (PI) - красителем, способным взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами клеток. PI не способен диффундировать через билипидные мембраны и, как следствие, не способен связаться с ДНК клеток. Однако по мере фрагментации цитоплазматической и ядерной мембран краситель проникает в клетку и взаимодействует РНК и ДНК. Следствием подобного взаимодействия является накопления красителя в цитоплазме и ядре, и клетка обретает флуоресценцию в красной части спектра.
bright
-
dim-to-neg
-
dim-to-neg
+
6
Таким образом, живые жизнеспособные клетки будут обладать яркой флуоресценций по каналу, предназначенному для детекции DiOC6(3), но не будут накапливать йодистый пропидий (фенотип DiOC6(3) PI). Клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза (митохондриальный потенциал снижен, но плазматическая мембрана еще сохраняет свою целостность и непроницаемость для йодистого пропидия), будут иметь фенотип DiOC6(3) PI. Вместе с тем, клетки, находящиеся на поздней стадии апоптоза или уже погибшие (некроз), не будут эффективно накапливать DiOC6(3), но будут окрашиваться PI - фенотип DiOC(3)PI.
6
6
2
6
6
Для оценки мембранного потенциала митохондрий к 100 мкл клеточной суспензии (2-3×10 клеток/мл) добавляют 20-кратный рабочий раствор DiOC(3) («Invitrogen», США), получая конечную концентрацию красителя равную 20 нМ [9]. Рабочий раствор готовят ex tempere, добавляя к 10 мкл стокового раствора (стоковый - 1 мг красителя, растворенный в 1 мл ДМСО, аликвотировали по 10 мкл и хранили при -20°С до использования) 4900 мкл ЗФР. После внесения красителя образцы тщательно перемешивают и инкубируют в течение 20 мин при 37°С в атмосфере 5% CO в защищенном от света месте. По завершении инкубации образцы отмывают избытком ЗФР, содержащим 2% FCS (8 минут при 300g). После этого надосадок декантируют, а клеточный осадок переводят в 100 мкл свежего ЗФР. В полученную клеточную суспензию вносят 10 мкл раствора йодистого пропидия («Sigma-Aldrich», США), получая финальную концентрацию PI, равную 1 мкг/мл. Образцы инкубируют в течение 10 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. По завершении инкубации в образцы вносят по 200 мкл ЗФР и проводят цитометричекий учет. Для каждого из образцов анализируют не менее 50000 одиночных клеток. Чтобы отличить одиночные клетки от агрегатов и в последующем дискриминировать агрегаты из анализа, используют следующие сочетания сигналов по прямому (FS, величина, пропорциональная размеру клеток) и боковому (SS, величина, характеризующая структуру клеток) светорассеянию - интенсивность пикового против интенсивности интегрального сигналов по FS или SS, а также время полета против интенсивности интегрального сигналов FS или SS. Анализ полученных результатов проводят при помощи программного обеспечения Kaluza™ («Beckman Coulter», США). Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов методом проточной цитометрии при окрашивании DiOC(3) и PI приведены на фиг. 1, где по оси абсцисс показаны интенсивность свечения DiOC(3), усл. ед.; а по оси ординат - интенсивность свечения йодистого пропидия, усл. ед.
Способ 2. Спектр исследований, равно как и набор модельных объектов, для которых применялись красители группы SYTO, крайне широк. Об универсальности SYTO свидетельствует тот факт, что вещества данного семейства успешно зарекомендовали себя при работе не только с клетками и культурами клеток млекопитающих, но и с бактериями различного происхождения [Guindulain Т., Comas J., Vives-Rego J. Use of nucleic acid dyes SYTO-13, TOTO-1, and YOYO-1 in the study of Escherichia coli and marine prokaryotic populations by flow cytometry // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol. 63, №11. - P. 4608-4611], а также клетками и отдельными органеллами растений [Rowan В.А., Oldenburg D.J., Bendich A.J. A high-throughput method for detection of DNA in chloroplasts using flow cytometry // Plant. Methods. - 2007. - Vol. 3:5, http://www.plantmethods.com/content/3/1/5].
bright
dim
Отличительной чертой красителей семейства SYTO является их способность спонтанно проникать через клеточные билипидные мембраны и связываться с нуклеиновыми кислотами (ДНК и РНК) в цитоплазме, ядре и митохондриях клетки. Такого рода взаимодействие сопровождается многократным (по некоторым оценкам, до 40 раз)  увеличением флуоресценции, тогда как в растворе - в отсутствие связывания с лигандами - флуоресценция данных красителей крайне низка. Подобно большинству флуоресцентных красителей цианиновой группы, молекулы SYTO несут несколько участков, которые могут связываться с фосфатными группировками в составе нуклеиновых кислот, а также интеркалировать между нуклеотидами и встраиваться между бороздками двуцепочечной ДНК. Существенным преимуществом данных красителей является отсутствие выраженного токсического эффекта, что было доказано в экспериментах по длительной инкубации (до 72 ч) клеток с данными красителями [Wlodkowic D., Skommer J., Pelkonen J. Towards an understanding of apoptosis detection by SYTO dyes // Cytometry A. - 2007. - Vol. 71, №2. - Р. 61-72]. В настоящее время точные механизмы взаимодействия красителей SYTO с нуклеиновыми кислотами детально не изучены [Wlodkowic D., Skommer J., Darzynkiewicz Z. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances // Exp. Oncol. - 2012. - Vol. 34, №3. - Р. 255-262]. Но уже первый опыт применения SYTO в проточной цитометрии показал, что эффективность взаимодействия красителя с клетками, находящихся на разных стадиях апоптоза, заметно снижается при сравнении с окраской нормальных живых клеток. Живые клетки обычно характеризуются ярким свечением по SYTO (SYTO), тогда как гибнущие клетки будут SYTO. Поэтому большая часть гипотез касается именно данного аспекта применения красителей SYTO. Так, считается, что описанный эффект может быть вызван взаимным «гашением» молекул SYTO, связанных с ДНК, в результате их пространственного сближения в ходе конденсации хроматина ядра клетки, что имеет место при апоптозе. Вместе с тем, снижение флуоресценции SYTO в погибающих клетках также может быть вызвано резким уменьшением количества сайтов связывания красителя при конденсации хроматина, равно как и падением концентрации РНК в цитоплазме клетки в результате нарушения процессов транскрипции в ядре. Кроме того, при апоптозе нарушается нормальная работа митохондрий, в которых запускаются процессы деградации митохондриальной ДНК, что также сопровождается снижением числа сайтов связывания красителя и сопровождается общим снижением флуоресценции клетки. Нарушение мембранного потенциала митохондрий также может снижать эффективность накопления красителя клеткой. В последнем случае это объясняется наличием в составе всех представителей данной группы красителей положительно-заряженных группировок, определяющих общий положительный заряд молекул при нейтральных рН. Подобное наблюдение, по мнению Wlodkowic и соавторов [Wlodkowic D., Skommer J., Darzynkiewicz Z. SYTO probes in the cytometry of tumor cell death // Cytometry A. - 2008. - Vol. 73, №6. - P. 496-507], позволяет проводить аналогии между механизмом действия липофильных катионных митохондриальных «зондов» (например, JC-1 и TMRM) и красителей SYTO.
Подобные феномены были описаны при комбинированной окраски клеток SYTO16 и TMRM, когда апоптотизирующие клетки слабо окрашивались обоими красителями, а живые клетки обладали выраженной флуоресценцией по каналам, предназначенным для детекции этих красителей.
6
Окраску клеток проводили в пробирках для проведения цитометрического учета 12×75 мм («Beckman Coulter», США). Для этого к 100 мкл клеточной суспензии (2-3×10 кл/мл) добавляли по 5 мкл 20-кратного рабочего раствора SYTO-16 green («Invitrogen», США), получая конечную концентрацию красителя равную 125 нМ. Рабочий раствор готовили ex tempere, добавляя к 5 мкл стокового раствора 1995 мкл ЗФР (стоковый - 1 мМ ДМСО, аликвотировали по 5 мкл и хранили при -20°С до использования). После чего в образцы вносили по 10 мкл раствора йодистого пропидия («Sigma-Aldrich», США), получая финальную концентрацию PI равную 1 мкг/мл. Окраску проводили при комнатной температуре в течение 15 мин в защищенном от света месте. По завершении инкубации к образцам добавляли по 200 мкл ЗФР и анализировали на проточном цитофлуориметре Navios™ («Beckman Coulter», США). Для каждого из образцов анализировали не менее 50000 одиночных клеток. Чтобы отличить одиночные клетки от агрегатов и в последующем дискриминировать агрегаты из анализа, использовали следующие сочетания сигналов по FS/SS, а также время полета против интенсивности интегрального сигналов FS или SS. Анализ полученных результатов проводили при помощи программного обеспечения Kaluza™ («Beckman Coulter», США).
Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов методом проточной цитометрии при окрашивании SYTO-16 Green и PI приведены на фиг. 2., где по оси абсцисс показаны интенсивность свечения SYTO-16 Green, усл. ед.; по оси ординат: интенсивность свечения йодистого пропидия, усл. ед.
Способ 3 основан на применении родамина-123 (Rh123), который был самым первым флуоресцентным красителем, примененным для окрашивания митохондрий и оценки жизнеспособности клеток [Johnson L.V., Walsh M.L., Chen, L.B. Localization of mitochondria in living cells with rhodamine 123 // PNAS. - 1980. - Vol. 77, №2. - Р. 990-994]. Благодаря своим липофильным свойствам Rh123 спонтанно диффундирует через плазматическую мембрану клетки, а наличие катионных свойств помогает ему преимущественно накапливаться в эффективно функционирующих митохондриях клетки, несущих отрицательный заряд на своей внутренней мембране. Вместе с тем, данный краситель может спонтанно окрашивать компоненты эндоплазматической сети и аппарата Гольджи, однако снизить неспецифическое окрашивание позволяет отмывка избытком физиологического раствора по завершении инкубации красителя с клетками. Это связано с тем, что в клетках с нарушенным мембранным потенциалом митохондрий краситель способен с одинаковой скоростью как проникать через мембрану внутрь, так и выходить наружу. Для эффективного возбуждения Rh123 используют источники света с длиной волны около 500 нм, тогда как максимум испускания данного красителя находится в районе 529 нм [Cottet-Rousselle С., Ronot X., Leverve X., Mayol J.-F. Cytometric assessment of mitochondria using fluorescent probes // Cytometry Part A. - 2011. - Vol. 79A. - Р. 405-425]. Обычно Rh123 применяется в концентрациях не более 0,5 мкМ или 0,1 мкг/мл, так как увеличение концентрации сопровождается усилением неспецифического окрашивания. Для приготовления маточных (стоковых) растворов используют ДМСО, после чего аликвотируют и хранят при -20°С до использования. Рабочие растворы готовят на среде, аналогичной той, которую применяют для культивирования клеток. Для исследования апоптоза применяют комбинированную окраску родамином 123, обладающим выраженной флуоресценцией в зеленой части спектра, и йодистым пропидием, максимум эмиссии которого приходится на красную часть спектра. Подобный подход позволяет выделить живые клетки функционирующими митохондриями по свечению Rh123 и целостной поверхностной мембраной, непроницаемой для PI. Клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза, будут негативны по обоим красителям (мембранный потенциал митохондрий нарушен, но поверхностная мембрана еще сохраняет свою целостность), а при позднем апоптозе и некрозе клетки будут окрашиваться только йодистым пропидием.
В рамках проведения собственных экспериментов к 100 мкл клеточной суспензии добавляли 20-кратный раствор Rh123, приготовленный ex tempere, получая конечную концентрацию красителя 100 мкг/мл. Образцы инкубировали 20 мин при 37°С в защищенном от света месте, после чего однократно отмывали избытком ЗФР, содержащим 2% FCS (330g в течении 8 мин при 15°С). Полученный клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл свежего ЗФР, после чего вносили йодистый пропидий в финальной концентрации 1 мкг/мл. По завершении 5-ти минутной инкубации в каждую пробу добавляли по 250 мкл ЗФР, и образцы анализировали на проточном цитометре Navios™. Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов методом проточной цитометрии при окрашивании Rh123и PI приведены на фиг. 3., где по оси абсцисс показаны интенсивность свечения Rh123, усл. ед.; по оси ординат: интенсивность свечения йодистого пропидия, усл. ед.
Однако вышеописанные способы, применяемые в настоящее время, субъективны при оценке препарата и трудоемки в случаях низкой концентрации сперматозоидов в нативном образце или при выявлении счетной ошибки, особенно при проведении массовых тестов. Кроме того при проведении контроля качества, они обладают низкой воспроизводимостью результатов а также приводят к возникновению ложноположительных результатов.
Задачей, поставленной перед изобретением, является повышение объективности оценки жизнеспособности сперматозоидов, повышение точности интерпретации результатов исследования, а также сокращение времени, затрачиваемого на обработку образцов за счет проведения автоматизированного учета результатов, в том числе при массовых исследованиях.
Поставленная цель достигается тем, что в предлагаемом способе определения жизнеспособности сперматозоидов используется сочетание методов лектиногистохимии и проточной цитометрии.
Лектиногистохимия основана на использовании лектинов - в основном растительных углевод-связывающих белков с заданной лигандной специфичностью. Если метод иммуногистохимии основан на использовании антител, специфичных в основном к различным белковым детерминантам, то лектиногистохимия позволяет выявлять локализацию, изменения состава и плотности различных олиго- и полисахаридных структур. Важно, что процесс апоптоза сопровождается изменениями в составе полисахаридных структур гликокаликса животных клеток за счет утраты верхних слоев гликокаликса и демаскирования структур его нижних слоев, содержащих α-D-маннозу, что совпадает с изменениями проницаемости плазматической мембраны и может рассматриваться как один из ранних признаков апоптоза [Bilyy R.О., Antonyuk V.О., Stoika R.S. Cytochemical study of role of α-D-mannose-and β-B-galactose-containing glycoproteins in apoptosis // J. Mol. Hist. - 2004. - Vol. 35. №.8-9. - P. 829-838]. В качестве красителя используется лектин нарцисса ложного (Narcissus pseudonarcissus L., NPA), специфичный к α-D-маннозе, меченный FITC.
Гликолипиды, входящие в состав клеточной мембраны условно принято называть стабилизирующими. Они оказывают двоякое действие на лабильность клеточных мембран. Дестабилизирующее воздействие оказывается за счет более длинных остатков норвоновой и цереброновой кислот. Одновременно с этим наличие холестерина между липидами снижает активность перемещения липидов, чем обуславливается его стабилизирующее воздействие на клеточные мембраны. Мембрана сперматозоидов, подобно внутриклеточным мембранам, содержит небольшое количество гликолипидов. Большая доля фосфолипидов и сфинголипидов обеспечивает большую текучесть мембраны и увеличивает склонность таких мембран к разрыву, что является, с одной стороны, необходимым компонентом успешного проникновения сперматозоида в яйцеклетку, а с другой - потенциальной точкой повреждения при криоконсервации.
На высокой лабильности и, как следствие, высокой проницаемости/способности к диффузии мембраны сперматозоидов основаны методы окрашивания сперматозоидов при помощи липофильных красителей, в том числе для анализа при помощи проточной цитометрии. Однако сперматозоид не относится к клеткам с высоким метаболизмом, и выявление клеток с запущенным процессом апоптоза до разрушения мембраны сперматозоида представляется затруднительным.
Одним из первых событий запуска апоптоза и снижения жизнеспособности является потеря гликопротеинами и гликолипидами сиаловых кислот, которые в норме экранируют остатки α-D-маннозы, локализованные в перимембранной зоне. Десиализация гликолипидов и гликопротеинов открывает возможность взаимодействия с NK-клетками. Данное свойство клеточных мембран позволяет предположить, что красители, связывающиеся с углеводными остатками, позволяют выявлять клетки на более ранних этапах апоптоза по сравнению с липофильными красителями и обеспечивать наиболее достоверные результаты.
Лектины - это белки, обладающие свойством связывать углеводы, при этом такое связывание является высокоспецифичным. Это свойство обусловливает их активное использование в области лектиногистохимии для определения углеводных детерминант на поверхности клеточных мембран. Кроме того, лектины, конъюгированные с биотином и различными флуорохромами, находят свое применение и в проточной цитометрии. В частности, некоторые лектины применяли для определения экспрессии различных углеводных детерминант на плазматической мембране на разных стадиях апоптоза [Batisse Ch., Marquet J., Greffard A., Fleury-Feith J., Jaurand M.-C., Pilatte Y. Lectin-Based Three-Color Flow Cytometric Approach for Studying Cell Surface Glycosylation Changes That Occur During Apoptosis // Cytometry Part A. - 2004. - Vol. 62A. - Р. 81-88]. Изменение гликозилирования плазматической мембраны сопровождает различные процессы, протекающие в клетке, такие как дифференцировка, активация и запуск апоптоза. Подобные изменения могут быть выявлены при помощи лектинов разной углеводной специфичности. В литературе имеются данные об изменении связывания различных лектинов с тимоцитами разной степени зрелости, а также клетками, находящимися на разных стадиях апоптоза [London J., Berrih S., Bach J.F. Peanut agglutinin I. A new tool for studying T lymphocyte subpopulations // J. Immun. - 1978. - Vol. 121, №. 2. - P. 438-443,; Raedler A., Raedler E., Becker W. M., Arndt R., Thiele H.G. Subcapsular thymic lymphoblasts expose receptors for soy bean lectin // Immunology. - 1982. - Vol. 46, №.2. - P. 321-328].
Известны функциональные тесты с применением лектинов для определения акросомального и, как следствие, фертильного статуса сперматозоида, например, с применением высокоспецифичного лектина арахиса (peanut agglutinin, PNA). Метод основан на особенностях строения мембраны сперматозоида в акросомальной области. При капацитации происходят изменения гликоконъюгантов клеточной мембраны сперматозоида. Это выражается в изменении соотношения холестерина и фосфолипидов мембраны. Молекулы сывороточного альбумина в женском репродуктивном тракте способны отнимать холестерин у сперматозоида, что дестабилизирует мембрану на участке акросомного пузырька, что является необходимым условием слияния мембран при акросомальной реакции. На поверхности сперматозоида, не прошедшего капацитацию, находятся углеводы, которые препятствуют его прикреплению к яйцеклетке. Эти углеводы представляют собой полимер из повторяющихся остатков галактозы и N-ацетилглюкозамина, которые блокируют рецепторы сперматозоида, узнающие прозрачную оболочку (zona pellucida) ооцита. Рецепторами сперматозоида являются молекулы фермента N-ацетилглюкозамингалактозилтрансферазы (гликозилтрансферазы).
Молекулы гликозилтрансферазы встроены в плазматическую мембраны сперматозоида непосредственно над акросомой, причем их активные центры обращены наружу. Гликозилтрансфераза «узнает» N-ацетилглюкозаминовые остатки гликопротеинов прозрачной оболочки (гликопротеин ZP3). При капацитации блокировавшие ее углеводы убираются.
При использовании в качестве красителя лектина PNA специфичное связывание с углеводными остатками акросомальной области мембраны не позволяет определить общий фертильный статус сперматозоида и его жизнеспособность, а также сделать выводы о криорезистентности.
Для преодоления этого недостатка в заявленном способе в качестве красителя мы применили лектин нарцисса ложного (Narcissus pseudonarcissus L., NPA), меченный флюоресцеинизотиоцианатом (FITC) специфично связывающийся с остатками α-D-маннозы.
Способ осуществляется следующим образом.
Для оценки уровня апоптоза 100 мкл суспензии клеток, полученной описанным выше способом, переносят в пробирки для цитофлуориметрического учета. Далее в образцы добавляют по 10 мкл раствора NPA, специфически распознающего терминальные остатки α-D-маннозы, конъюгированного с FITC, в финальной концентрации 5 мкг/мл. После внесения реагентов клетки инкубируют 20 мин при 37°С в защищенном от света месте. По завершении инкубации для удаления из суспензии избытка красителя и подавления неспецифического связывания клетки отмывают избытком забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР, рН 7,2-7,4) с добавлением 2% FCS путем центрифугирования при 330g в течение 8 мин при охлаждении до 15°С. Полученный осадок ресуспендируют в 100 мкл ЗФР и к суспензии добавляют 10 мкл раствора йодистого пропидия (PI, финальная концентрация 1 мкг/мл) для выявления клеток, утративших целостность поверхностной мембраны. Пробы инкубируют в течение 5 мин в защищенном от света месте при комнатной температуре, после чего в каждую пробу добавляют по 250 мкл ЗФР, и образцы анализируют на проточном цитометре Navios™ способом, аналогичным для липофильных красителей.
Результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов методом проточной цитометрии при окрашивании NPA-FITC и PI приведены на фиг. 4, где по оси абсцисс показаны интенсивность свечения NPA-FITC, усл. ед.; по оси ординат: интенсивность свечения йодистого пропидия, усл. ед.
Сопоставление результатов применения четырех описанных выше способов было проведено на материале 54 пациентов, сперматозоиды которых были подвергнуты криоконсервации с использованием четырех сред для консервации клеток ("MediCult", "Sage", "Irvine", "Vitrolife", все США).
На фиг. 5. представлены результаты оценки жизнеспособности нативного и криоконсервированного материала с использованием проточной цитометрии и различных красителей, где по оси абсцисс: красители, использованные для оценки уровня жизнеспособности сперматозоидов (DIOC - красители DiOC6(3), SYTO - краситель SYTO-16 Green, RHO - краситель Родамин 123, NPA - лектин нарцисса, меченный FITC). Во всех случаях также использовали йодистый пропидий. По оси ординат: процент живых клеток.
В поле фиг. 5 для каждого вида красителей показана группа столбиков, соответствующих разным консервирующим средам (("MediCult", "Sage", "Irvine", "Vitrolife"), в сравнении с нативным образцом.
Для доказательства более высокой эффективности применения лектина NPA, меченного FITC, было проведено сравнительное исследование с использованием способов 1, 2, 3 и заявленного метода. Указанный способ применяли у 54 супружеских пар, обратившихся по поводу бесплодия.
Клинический пример 1. Супружеская пара Т. Обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 69%. Процент оплодотворения составил 83%, через 10 дней получен положительный результат ХГЧ (наличие хорионического гонадотропина человека, появление которого рассматривается как ранний признак наступления беременности), на 21 день на контрольном УЗИ визуализировано 1 плодное яйцо.
Клинический пример 2. Супружеская пара Ч. обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 16%. Процент оплодотворения составил 50%, через 10 дней получен отрицательный результат ХГЧ.
Клинический пример 3. Супружеская пара Л. Обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 50%. Процент оплодотворения составил 67%, через 10 дней получен положительный результат ХГЧ, на 21 день на контрольном УЗИ визуализировано 1 плодное яйцо.
Клинический пример 4. Супружеская пара П. обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 16%. Процент оплодотворения составил 88%, через 10 дней получен отрицательный результат ХГЧ.
Клинический пример 5. Супружеская пара Г. обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 74%. Процент оплодотворения составил 100%, через 10 дней получен положительный результат ХГЧ, на 21 день на контрольном УЗИ визуализировано 1 плодное яйцо.
Клинический пример 6. Супружеская пара С. Обратилась в амбулаторном порядке по поводу бесплодия. Проведено лечение методом экстракорпорального оплодотворения. На момент оплодотворения процент жизнеспособных форм сперматозоидов при использовании заявленного способа составил 39%. Процент оплодотворения составил 50%, через 10 дней получен отрицательный результат ХГЧ.
Материалы исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием методов параметрического и непараметрического анализа в соответствии с результатами проверки сравниваемых совокупностей на нормальность распределения [Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ., М: Практика 1999; 459 с.; Зайцев В.М., Лифляндский В.Г., Маринкин В.И. Прикладная медицинская статистика. М.: Фолиант, 2006. - 432 с.; Петри А., Сэбин К. Наглядная статистика в медицине: М.: ГэотарМед, 2003. - 139 с.; Плавинский С.Л. Биостатистика: планирование, обработка и представление результатов биомедицинских исследований при помощи системы SAS: Санкт-Петербург: Издат. дом СПбМАПО, 2005. - 559 с.]. Накопление, корректировку, систематизацию исходной информации и визуализацию полученных результатов осуществляли в электронных таблицах Microsoft Office Excel 2010. Статистический анализ проводили с использованием программы IBM SPSS Statistics 20 [Наследов А.Д., SPSS Компьютерный анализ данных в психологии и социальных науках. СПб.: Питер, 2011. - 445 с.].
Были сопоставлены результаты оценки жизнеспособности сперматозоидов при помощи проточной цитометрии в зависимости от различных методик окрашивания. Получены средние значения доли жизнеспособных сперматозоидов при использовании различных красителей. Сопоставление результатов оценки содержания жизнеспособных сперматозоидов в нативном эякуляте при помощи коэффициента конкордации W Кендалла позволило установить наличие статистически значимой взаимосвязи между показателями, полученными с использованием различных красителей (р<0,05 во всех случаях). При этом корреляционные связи отличались слабой теснотой, максимальные значения W Кендалла отмечались для нативного материала, составляя 0,234.
При сопоставлении содержания жизнеспособных сперматозоидов в зависимости от используемой среды для криоконсервации были получены значения коэффициента конкордации W Кендалла, свидетельствующие о наличии статистически значимых корреляционных связей высокой тесноты (р<0,001 для всех красителей). Наибольшим значением W Кендалла характеризовалась корреляция показателей при использовании красителя NPA-FITC, составляющая 0,790.
Нами были оценены различия определения процентного содержания жизнеспособных сперматозоидов в эякуляте при подтвержденной и неподтвержденной беременности при использовании четырех вышеупомянутых красителей. Было установлено, что указанные различия были статистически значимыми в случае окраски красителем NPA-FITC (р=0,049).
Заявленный способ отличается от известных и применяемых в настоящее время снижением субъективности оценки препарата и трудоемкости в случаях низкой концентрации сперматозоидов в нативном образце или при выявлении счетной ошибки, хорошей воспроизводимостью результатов для проведения контроля качества, отсутствием ложноположительных результатов и высокой достоверностью, а также умеренными временными затратами при проведении одиночных тестов и существенным снижением затрат времени при проведении массовых тестов, что позволяет усовершенствовать выбор тактики лечения бесплодия, улучшить отбор доноров спермы при создании донорских банков.