Валидация УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови: прецизионность

O.V. TSULUN, L.V. DERYMEDVID,I.Y. TISHENKO

National University of Pharmacy, Kharkiv, Ukraine

ANTIEXUDATIVE ACTIVITY OF A NEW COMBINED OINTMENT WITH DIHYDROQUERCETIN, COENZYM Q10 AND LICORICE EXTRACT

Resume: The present study was aimed to investigate antiexudative effect of an ointment containing dihydroquercetin, coenzyme Q10 and licorice extract on carrageenan-induced paw edema in rats and compare it with the effect of methyluracil ointment. It was found that treatment with experimental ointment inhibited the edema moderately, and the inhibition was significant on the 2 nd, 3rd and 4th hour of observation, compared to the control group (P<0.05). The average percent of antiexudative activity for methyluracil ointment was 20.2%, and for the study ointment - 32.9%, which exceeded reference drug on 12.7%. Thus, the results of the study demonstrate that topical application of the ointment with suggested formulation possesses significant antiexudative activity, and it can be recommended for further investigation in order to implement in clinical practice.

Keywords: dihydroquercetin, licorice extract, carrageenan-induced paw edema, ointment.

УДК 615.214.24:543.422.3-76:543.054

Л. Ю.КЛИМЕНКО1, С.Н. ТРУТ 2, Т.А. КОСТИНА1, И.М. ИВАНЧУК3

1Национальный фармацевтический университет, кафедра аналитической химии,

г. Харьков, Украина 2ГП «Укрвакцина» МОЗ Украины, г. Киев, Украина

3ГВУЗ «Ивано-Франковский национальный медицинский университет», кафедра фармации, г. Ивано-Франковск, Украина

ВАЛИДАЦИЯ УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОКСИЛАМИНА В КРОВИ:

ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Подходы к процедуре определения и оценке приемлемости прецизионности УФ-спектрофотометрических методик количественного определения аналитов в биологических жидкостях, применяемых в судебно-токсикологическом анализе, предложенные авторами в предыдущей работе, апробированы на примере УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови.

Ключевые слова: валидация, прецизионность, УФ-спектрофотометрия, доксиламин, биоаналитические методики.

Введение. Данная статья является продолжением работы авторов [1 - 4, 6, 7] в области разработки подходов к валидации методик количественного определения для целей судебно-токсикологического анализа и посвящена вопросам разработки процедуры определения и формирования критериев приемлемости для валидационного параметра «прецизионность». Целью данной работы является апробация подходов к процедуре определения и оценке приемлемости прецизионности УФ-спектрофотометрических методик количественного определения аналитов в биологических жидкостях, применяемых в судебно-токсикологическом анализе, предложенных в нашей предыдущей работе [4], на примере УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови. Материалы и методы исследования. Рабочие растворы: 1000,0 мг доксиламина сукцината вносили в мерную колбу емкостью 250,0 мл, растворяли в воде очищенной и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (стандартный раствор 1, концентрация 4000 мкг/мл). В семь мерных колб емкостью 100,0 мл вносили из бюретки 32,50; 30,00; 25,00; 20,00; 15,00; 10,00 и 5,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 1 соответственно и доводили объемы растворов водой очищенной до метки (рабочие растворы 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 соответственно, концентрация 1300, 1200, 1000, 800, 600, 400 и 200 мкг/мл соответственно).

400,0 мг доксиламина сукцината вносили в мерную колбу емкостью 100,0 мл, растворяли в воде очищенной и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (стандартный раствор 2, концентрация 4000 мкг/мл). В пять мерных колб емкостью 100,0 мл вносили из бюретки 32,50; 30,00; 20,00; 10,00 и 5,00 мл стандартного раствора

доксиламина сукцината 2 соответственно и доводили объемы растворов водой очищенной до метки (рабочие растворы 8, 9, 10, 11 и 12 соответственно, концентрация 1300, 1200, 800, 400 и 200 мкг/мл соответственно). Модельные растворы: 100,0 мг доксиламина сукцината вносили в мерную колбу емкостью 500,0 мл, растворяли в 0,1 моль/л растворе кислоты хлористоводородной и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (стандартный раствор 3, концентрация 200 мкг/мл). В семь мерных колб емкостью 100,0 мл вносили из бюретки 26,00; 24,00; 20,00; 16,00; 12,00; 8,00 и 4,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 3 соответственно и доводили объемы растворов 0,1 моль/л раствором кислоты хлористоводородной до метки (модельные растворы 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 соответственно, концентрация 52, 48, 40, 32, 24, 16 и 8 мкг/мл соответственно).

Раствор сравнения: 400,0 мг доксиламина сукцината вносили в мерную колбу емкостью 100,0 мл, растворяли в 0,1 моль/л растворе кислоты хлористоводородной и доводили объем раствора этим же растворителем до метки (стандартный раствор 4, концентрация 4000 мкг/мл). В мерную колбу емкостью 100,0 мл вносили из бюретки 18,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 4 и доводили объем раствора 0,1 моль/л раствором кислоты хлористоводородной до метки (стандартный раствор 5, концентрация 720 мкг/мл). В мерную колбу емкостью 50,0 мл вносили 2,00 мл стандартного раствора доксиламина сукцината 5 и доводили объем раствора 0,1 моль/л раствором кислоты хлористоводородной до метки (раствор сравнения, концентрация 28,8 мкг/мл).

Калибровочные образцы: 3 серии по 7 образцов (20,00 мл) модельной крови (матрица), полученной от 3 различных источников, в которые введено по 1,00 мл рабочих

растворов 1 - 7 соответственно.

Модельные образцы: 3 серии по 5 образцов (20,00 мл) модельной крови, полученной от 3 различных источников, в которые введено по 1,00 мл рабочих растворов 8-12 соответственно;

Анализируемые растворы: полученные по валидируемой методике [3] растворы для калибровочных и модельных образцов.

Измеряли оптическую плотность анализируемых растворов, модельных растворов и раствора сравнения по 3 раза с выниманием кюветы при длине волны 262 нм на спектрофотометре СФ-46 в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве компенсационного раствора использовали 0,1 моль/л раствор кислоты хлористоводородной. Результаты исследования и их обсуждение. Ранее [4] нами были предложены следующие критерии и процедура оценки приемлемости прецизионности УФ-

спектрофотометрических методик количественного определения аналитов в биологических жидкостях, применяемых в судебно-токсикологическом анализе:

• применение нормализованных координат;

• подтверждение прецизионности методики проводят в двух направлениях - на модельных растворах (без матрицы) и на образцах матрицы;

• проверку прецизионности методики по модельным растворам проводят путем расчета их концентрации с использованием соответствующей линейной

лт model

X , %

зависимости; полученные значения

используют для расчета

г) г) model д i

КК , % и А

odel

calc model sample'

A mo a

__.................. sample предложены критерии

приемлемости в рамках двух подходов, основанных на: 1) предположении равенства неопределенности процедуры пробоподготовки и неопределенности количественного определения аналита в модельных

mo del

nple < 10,00%); 2) предположении

m

раств°рах ( А sample

незначимости неопределенности количественного

Л mo del sample

< 4,52%);

• оценку прецизионности методики на образцах матрицы проводят на двух уровнях - within-run и between-run - с использованием калибровочных и модельных образцов;

• определение within-run прецизионности проводят путем расчета концентрации калибровочных образцов для каждой последовательности по индивидуальным значениям оптической плотности с использованием линейной зависимости, полученной для данной последовательности; полученные значения Xcaic, % используют для расчета RR, % и Asampie, для оценки которой предложен следующий критерий приемлемости:

А , < maxA , = 0,707• max А. = 14,14%;

sample sample ' As ' '

ple

• определение between-run прецизионности проводят в три этапа - рассчитывая разность между средними

значениями КК, % в разные дни (она не должна

превышать 4,52%), а также рассчитывая концентрации модельных образцов и средние концентрации калибровочных образцов с использованием линейной зависимости, полученной по средним значениям параллельных последовательностей;

• исследования модельных образцов проводят для трех параллельных последовательностей/run, образцы биологической матрицы для которых получены из различных источников; для D = 25 - 125% каждая последовательность состоит из 3 модельных образцов (концентрации соответствуют точкам 25%, 50% и 100% в нормализованных координатах), для D = 25 - 150% и 25 - 175% - из 4 образцов (концентрации соответствуют точкам 25%, 50% и 150% или 175% соответственно в нормализованных координатах);

• полученные значения Xcaic, % для модельных и калибровочных образцов используют для расчета RR, %,

[Antra

а также величин Аsample и Asampie, для оценки которых

a intra

предложены критерии приемлемости ( Аsample <

20,00% и Asampie < 14,14%). Для иллюстрации предложенных подходов к определению и оценке прецизионности использовали УФ-

спектрофотометрическую методику количественного определения доксиламина в крови [3]; за 100% принимали летальную концентрацию доксиламина в крови [5] - 25 мг/л (что соответствует 36 мг/л доксиламина сукцината). В табл. 1 приведены результаты измерений значений оптической плотности модельных растворов, рассчитанные значения концентраций модельных растворов и величины RR, % для различных диапазонов применения методики. Данные

i model

таблицы 1 относительно величины

Аж

%

sample

свидетельствуют, что требования к сходимости результатов выдерживаются и для Подхода 1, и для Подхода 2. В таблице 2 - 3 приведены результаты измерений значений оптической плотности для калибровочных и модельных образцов, соответствующие им значения Xcaic, % и величины RR, % для различных диапазонов применения методики. Из приведенных в табл. 2 - 3 данных видно, что требования к сходимости и внутрилабораторной прецизионности выполняются для всех предложенных вариантов диапазонов применения методики и для обоих вариантов методики - с ТСХ-очисткой и без нее.

Для диапазона применения 25 - 125% в случае выполнения анализа без предварительной ТСХ-очистки величина kintra

Аsample достигает критических величин - 19,54%,

поэтому для данного варианта методики лучше пользоваться более широким диапазоном применения. Необходимо отметить, что в целом методики с выполнением предварительной ТСХ-очистки обладают лучшей внутрилабораторной прецизионностью и худшей сходимостью, чем методики без ТСХ-очистки, что объясняется введением дополнительных стадий пробоподготовки, естественным образом ухудшающих within-run прецизионность (оценивающую, в первую очередь, случайную ошибку, вносимую пробоподготовкой), но нивелирующих влияние смены источника происхождения матрицы на результаты анализа за счет более качественной очистки пробы (и тем самым улучшающих between-run прецизионность). Выводы. Подходы к процедуре определения и оценке приемлемости прецизионности УФ-спектрофотометрических методик количественного определения аналитов в биологических жидкостях, применяемых в судебно-токсикологическом анализе, предложенные в нашей предыдущей работе [4], апробированы на примере УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови. Полученные результаты показали адекватность сформированных подходов.

Таблица 1 - Результаты определения прецизионности УФ-спектрофотометрической методики количественного определения

Фактическая концентрация доксиламина сукцината в модельном растворе (Q = 28,8 мкг/мл) Оптическая плотность (At = 0,801) Найдено в % к стандартной оптической плотности \т model Y - % Рассчитанная концентрация доксиламина сукцината в модельном v model раств°ре Xicalc , % model RR,% = i,ca'c -100 -у model X i,fact

ç* model i,fact ' мкг/мл у model Xi,fact , %

D = 25 - 175%

8,00 27,78 0,226 28,21 28,35 102,05

16,00 55,56 0,444 55,43 55,70 100,26

24,00 83,33 0,657 82,02 82,42 98,91

32,00 111,11 0,890 111,11 111,66 100,49

40,00 138,89 1,121 139,95 140,64 101,26

48,00 166,67 1,348 168,29 169,12 101,47

52,00 180,56 1,421 177,40 178,27 98,73

rr model % 100,45

RSD™del,% 1,27

= AmRRdel = RSDRROdel • 1,943 подход 1 < 10,00% 2,47

подход 2 < 4,52%

D = 25 - 150%

8,00 27,78 0,226 28,21 27,90 100,43

16,00 55,56 0,444 55,43 54,82 98,67

24,00 83,33 0,657 82,02 81,12 97,34

32,00 111,11 0,890 111,11 109,89 98,90

40,00 138,89 1,121 139,95 138,41 99,65

48,00 166,67 1,348 168,29 166,44 99,86

RR model % 99,14

RSD™del,% 1,09

Amodel,,% = X"°del = RSDZdel • 2,015 sample RR RR ' подход 1 < 10,00% 2,20

подход 2 < 4,52%

D = 25 - 125%

8,00 27,78 0,226 28,21 28,07 101,04

16,00 55,56 0,444 55,43 55,15 99,27

24,00 83,33 0,657 82,02 81,61 97,94

32,00 111,11 0,890 111,11 110,56 99,50

40,00 138,89 1,121 139,95 139,25 100,26

RR model % 99,60

RSD™del,% 1,16

Amodel о/ \model y^or^model --> i о-л Asample,/0 = ARR = RsDRR ' 2,132 подход 1 < 10,00% 2,47

подход 2 < 4,52%

Таблица 2 - Результаты определения прецизионности УФ-спектрофотометрической методики количественного определения

0 = 2 5 - 175%: ^ = 7

мтйт-гип прецизионность

Фактическая юкцектрация ДСКСИЛЗМИНЭ Оптичеэая плотн ость А^ж Я Найденов % к стандартной Рассчитанная концентрация доки -в мина п-щ ката у "" 100

сукцината Е КрСЕК [С*= ЭБтг/н.4 (А, - •— -0.532) 100 опткче скои плотности Е фОЕИ Хш. %

С.« МКГ'М.Т Ч 1-й декь 2-й день 3-й декь 1-й день 2-х день 3-й декь 1-й день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день

1000 27,78 0222 0195 0205 41.73 36 65 38.53 2682 2638 2659 96.54 9496 9572

20.00 55.56 0 368 0,347 0 352 69.17 6523 66.17 5445 5476 5409 9800 9856 9735

3000 £3 33 0.545 0.526 0.537 10244 9837 100 94 8795 8817 8869 105.54 105.81 10643

40.00 111.11 0.662 0.644 0654 12444 121.05 122.93 110.11 11019 110.57 99 10 9917 9951

50 00 138.69 0.795 0.779 0.783 14944 146.43 147.18 13528 135.40 13470 97.40 9749 9698

60.00 166.67 0.986 0.970 0.979 18534 182.33 184 02 171.44 17105 171-36 102-86 102 63 102-81

6500 180.56 1.021 1,008 1.015 191Э2 189.47 190-79 178.06 178.14 178.09 98.62 9866 9863

99.72 9961 9963

ЙЖс» % 3.26 3.56 3.76

1с.».%=1в=ЩгдаЗ' 14.14« 6.33 6.92 7,31

Ьеги'ееп-пл! Генутри.юбораторная) прецизионность

|НГ, - 55,1

1 4.52% 0.11 009 002

Расчет по калибровочным образцам Расчет помательным образцам

Фактическая концентрация дсксиламина сукцината Е фОВИ (С«= 36 яяг/к4 Опти-« за я плотность ... ----* ^ 100 -0.532) Найдено е% к стандартной С1ГГИЧ5 СК)Й ПЛОТНОСТИ >•,% Расэтктаккая концентрация доксиламина сукцината Екрсси Фактическая концентрация доксиламика сукцината в крови (С< = 36ми7кл) Оптическая плотность ^ 100 -0.532) Найдено в % к стандартной аттической плотности У,% Рассчитанная концентрация докскламкка сукцината е крови

С/м ккг/мл % ККГр'Н.Т %

1000 27,78 0207 38.91 26.55 95.57 10,М 27,78 0.188 35.34 82.76

20-00 55 56 0356 66.92 54 50 9809 1000 27.78 0.231 43.42 31.05 111,77

30-00 83 33 0.536 100.75 88.26 105.92 10.00 27.78 0235 44.17 31.80 114.47

40 00 11111 0.653 122,74 11021 99 19 20.00 5556 0.336 63.16 50.75 91.34

50 00 138-89 0,786 147,74 13516 97.31 20.00 55 56 0.377 70.86 58.43 10517

60.00 166.67 0,978 183-83 17118 102,71 2000 55.56 0.332 62.41 50 00 89,99

6500 180-56 1.015 190.79 17812 98.65 40 00 11111 0.633 11898 106,46 95.81

40.00 11111 0-675 126-88 114.34 102 91

40.00 11111 0.671 126.13 113.59 10223

65.00 18056 1.034 194.36 181.69 100.63

65.00 18056 0.998 187.59 174.93 9658

6500 18056 1.040 19549 18232 10125

99.63 99.60

ко.,* 352 898

% = Д» = Кй«-1.943 ? 14.14% 684 А™. .%=А*.Г = 17% <20,00% 16.13

С = 25-1 50%; о = 6

нгАпкп/ п гр€ иизисич ост ь (ассдц-чост ь^

Фактическая юнцентрация доксилаютна сукцината Е кроЕИ [С«= 36 ют «л) Оптичесгая плети ость _ к _ 0 532) 100 Найденов % к стандартной опттге стой плотности К.% Ра считанная концентрация докж -в мкка сукци ката В фОЕИ юо

С.ш ккг/кл % 1-я день 2-й декь 3-й декь 1-й декь 2-й декь 3-й декь 1-й день 2-й декь 3-й декь 1-й декь 2-й декь 3-й декь

10,00 27.78 0222 0195 0.205 41.73 36.65 38-53 2748 2702 2724 98-92 9726 9806

20.00 55.56 0.368 0.347 0.352 69.17 6523 66.17 5467 5496 54 32 9840 98Э2 9777

30 00 £3 33 0.545 0.526 0.537 10244 98.87 100 94 8765 8784 88 3 7 105.18 105.41 106.05

40.00 111 И 0.662 0.644 0654 12444 12105 122.93 109.45 109.52 109.91 98-51 9857 98Э2

50 00 138-83 0.795 0.779 0783 14944 14643 147.18 13423 134-33 133.66 9664 9672 9623

60.00 166 67 0,986 0970 0.979 18534 182.33 18402 169-81 169.43 169.74 101-88 10166 10154

99.92 9976 9981

КС«?» 3.08 326 3,57

А».,. » = А»1 = ВВ«г2Л15-' 14-144 621 6-57 7,19

Ьетм-ееп-гшт (внутри,1аборапкрная) прецизионность

? 4.52% 0.16 0.11 005

Расчет по калибровочным образцам Расчет помазелышм образцам

Фактическая кэкцектрация доксиламина сукцината -- -1-1 [Сж= 36 мкг/м.^ Оптичесгая плотность 1л ___я Найдено е% к стандартной оптической плотности И* Ра считанная концентрация доксиламина сукцината в крови м% Фактическая концентрация доксиламина сукцината Е КрОВИ [ ^ = 36 мкг мл) Оптическая плотность Л . Я Найдено в % к стандартной аттической плотности п% Рассчитанная концентрация докскламкна сукцината Е КрСЕП в.в.%

100 -0.532) 100

С.ЪХ, ккг/кл Л'.Гх^ % Со» мкг 'мл Х.ъх. % -0.532)

1000 27,78 0207 38.91 27.21 97.95 10.00 27.78 0.188 35.34 23.70 8531

20.00 5556 0356 6692 54.75 98.54 10.00 27.78 0.231 43.42 3164 113-89

зооо £3 33 0.536 100,75 8801 105 62 10.00 27,78 0.235 44.17 32 38 11656

40 00 111.11 0653 122.74 10963 98.67 20.00 55,56 0336 63.16 51.05 91-88

50.00 138.89 0 "56 147.74 13422 96.64 2000 55.56 0377 70.86 58.62 105.51

6000 166.6? 0 978 133-33 16970 10182 20.00 55 56 0.332 62 41 5031 9С Е =

4000 11111 0633 11898 10594 95 35

40 00 11111 0.675 126-88 113.71 102.34

4000 11111 0.671 126.13 112,97 101.67

60 00 16657 ода 187 03 17255 103 71

60.00 16667 0.955 179.51 165.46 9927

60 00 16667 0965 18139 167.30 100 38

XX,% 99.87 XX,У. 10054

329 9.09

* - 4" " ЮОм-2,015 ? 14,14% 663 1,796520,00% 16.32

Д = 25 - 125%; д = 5

н|Стгс-гигс прецизионность

Фактическая концентрация доксиламина оукцкната Е КрОЕИ (С«=36 .чкг/н.3 Оптиче пая плотн ость (4=^^=0,532) Найденов % к стандартной оптиче сюй плотное™ Г,* Ра ¡считанная концентрация док» .г мина сунш ката Е >90ЕК Хщт %

бм У.КГ мл % 1-й день 2 нс 1нь 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день

1000 27,78 0222 0195 0205 41.73 36.65 38.53 2615 2585 2594 94.13 9305 9 338

2000 5556 0363 0347 0-352 69.17 6523 66-17 5429 5443 5394 97,71 9343 9703

30.00 33 33 0 545 0526 0.537 102 44 5857 100-94 3342 556-4 3917 106.11 106.37 107,01

40.00 111.11 0.662 0644 0654 12444 12105 122.93 110.98 111.02 11145 9988 9992 100 31

5000 138-89 0.795 0779 0.783 14944 14643 147.18 13662 136 63 13602 98.37 9837 9793

ХХ:% 9924 9923 9914

* = |100-ЯГ|<6,«% 0,76 0,77 056

топ % 4.38 4,77 5.05

^ % = Ли = Л5С!«-2132 ? 14.144 9.34 1017 1077

Ьеп»'«п-гип (внутри-тбораторная) прецизионность

? 4.52% 0.01 0.10 0.09

Расчет по калибровочным образцам Расчет но махелькым образцам

Фактическая юнцентрация доксиламина сукциката Е фОЕИ ГС«= 36 жв/яЦ Оттг-езая плотность 100 -0.532) Найдено е % к стандартной опти-«сюй плотности П% Рассчитанная концентрация доксиламина сукциката ЕКРСЕК Хм« М% Фактическая конце нтрация дсксиламина сукшшата Е крОЕИ (Ь = 36мкт>и} Оптическая плотность и.-4—-'. 100 -0.532) Найдено в % к стандартной агтичегкак плотности п* Рассчитанная концентрация доксиламина сукпината Е КрОЕИ

С.ш мет/"«.! % Сг— ккг/мл Х.Ь» %

10.00 27,78 0,207 38.91 25.93 93.34 1000 27.78 0,188 3534 22.31 80.31

2000 55 56 0.356 66.92 54.37 9756 10.00 27.78 0231 43.42 30-51 10983

3000 83 33 0.536 100.75 88.72 10647 1000 27.78 0.235 4417 31.27 11256

40.00 111 И 0653 122.74 11104 99.94 20.00 5556 0336 63-16 50 55 9098

50 00 138-89 0786 147.74 13642 9822 20.00 55.56 0.377 70.86 58.37 105.06

20.00 Е= 56 0332 62.41 49.79 89-61

40 00 11111 0633 118.98 10722 96.50

40 00 11111 0.675 126.88 115.24 103.72

40.00 11111 0.671 126.13 114.48 103 03

хну. 99,17 XX,% 99.07

КЮм.% 476 10.51

% = Аа = Я5й«-2.132 ? 14,14% 10.15 =ЛГ/ = ^¿ЕГ 1,360220.00% 19.54

Таблица 3 - Результаты определения прецизионности УФ-спектрофотометрической методики количественного определения

доксиламина в крови с предварительной ТСХ-очисткой_

_Д = 2 5 - 175У§; д = 7_

ич'йнд-гцп прецизионнйсть

Фактическая концентрация доксиламина Оггтичесгая плотн ость -0,532) 100 Найденов % к стандартной Ра ¡считанная концентрация докат.ъмкна сукцината

сукшпата в КрОЕИ (Се= 36 МКГ,''М.Т) оптюесгои плотности Е крови Хщ.% •'.Лв

Сл. НКГ ''М-Т Удае % 1-й день 2-й день 3-й день 1-х день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день

10.00 27.78 0.159 0,147 0.151 31.18 2852 29.61 3087 2856 2926 111,12 102.81 105 33

2000 55.56 0297 0295 0287 5824 5754 56.27 5766 57,32 55 60 103 78 103.17 10007

3000 83,33 0415 0420 0410 81.37 82.35 80 39 8056 8162 "3 44 9668 9795 9 533

4000 11111 0583 0.579 0-573 11431 113.53 11235 113.18 112.52 11102 101.86 10127 9992

50.00 13859 0.704 0.698 0695 13804 13686 13627 136,67 135.64 134 65 9840 9766 9695

60.00 166.67 0.882 0.874 0-877 172 34 17137 17196 17123 16954 169.92 102.74 101.90 10195

6500 180.56 0.937 0.931 0929 18373 182.55 18216 181,91 180,92 18000 100.75 100.20 9969

102,19 100,71 9989

465 221 3.25

¿„л, % = А,« = №¡=-1343 ? 14,14% 9 04 429 6.32

Ьенгееп-гип (екутри-ыбораторная) преиизисннссть

74Я* 1.48 2.30 052

Расчет по калибровочным образцам Расчет по модельным образцам

Фактическая концентрация докскламика сукциката Е Ц>ОЕИ ГС«= 36 мкг/мл} Оетичесгая плотность Сд..,^-100 -0.532) Найденов« кстандартной отптг-есизй ПЛОТНОСТИ П% Раслитаккая концентрация докскламика сукцкката ЕкрОЕИ Фактическая концентрация доксхламхка сукциката Е КрОБН (¿ = 36 МКГ;'МД) Оптическая плотность и-4—*- 100 -0.532) Найдено е % к стандартной сстическан платности ПК Рассчитанная концентрация докскламика сукциката Е КрОЕИ ЯП'/,

С.ЪХ- мкг/мл % МКГ,''КЛ %

10.00 27.78 0.152 2980 29.48 10612 10.00 27.78 0.138 27,06 26.77 96 36

20.00 55.56 0293 57,45 5632 102.27 1000 27.78 0.154 3020 2937 107.52

30 00 53 33 0.413 81.37 8048 5638 1000 27.78 0138 30.95 30.64 НС- 30

40.00 111.11 0578 113.33 11210 100.89 20,00 55.56 0279 54,71 54.11 97.39

5000 138.89 0.699 137 06 13557 97.61 20.00 5556 0.290 5636 56 24 10122

60.00 166 67 0378 172.16 17029 102.17 20.00 5556 0297 58.24 57.61 103 69

6500 180.56 0.933 18294 18095 100.22 40 00 11111 0592 116-08 11432 103 34

40 00 11111 0.566 11098 109.77 9Е 79

40.00 11111 0 582 114-12 11288 101.59

6500 18056 0944 185.10 183.09 10140

6500 18056 0.923 18098 179.01 99.14

65 00 18056 0.917 17980 17734 58.49

яя.% 100.84 Ж.'/, 101,60

ВДм,* 318 4,12

Д„.,, * = Д» = Кй«-1.943 ? 14.14« 618 Д^ ,%-А2Г 1,796 <20,00*/. 7.40

В = 25-1 50%; 9 = 6

цч'йш-п/я прецизионность

Фактическая концентрация докскламика сукциката Е фОЕИ (С«= 36 миг/мл} Оптичесгаянлот» ость = 0.532) Найденов« к стандартной ОПТИЧБСЮЙ ПЛОТНОСТ* Рассчитанная концентрация док.« мкка сукци ката В КрСЕН як 100

100

С.«* мкг/мл % 1-й день 2-й день 3-х день 1-й день 2-х день 3-х день 1-й день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день

10.00 27.78 0.159 0.147 0.151 31.18 2832 29 61 3090 2856 2926 111.23 102.81 10533

20.00 5556 0297 0295 0287 5824 5734 5627 5772 5732 5560 103.89 103,17 10007

30.00 83.33 0.415 0.420 0.410 81.37 82,35 8039 8064 8162 79 44 96.77 9795 9533

40,00 11111 0.583 0.579 0.573 11431 11353 112-35 11329 112.52 111.02 101 96 10127 9992

5000 13839 0.704 0.698 0.695 13804 13636 1362 7 136.81 135,64 134.65 98.50 9766 9695

60 00 166-67 0-882 0874 0377 172 94 17137 17196 171.40 169 34 16992 10234 10190 101 95

10253 100,79 9993

5.05 2,41 3.56

% = 4и = №г2015 ? 14.14% 1018 436 7.17

Аегтея-гшт (внутри.та бор опорная) прецизионность

? 452% 1,74 036 2.60

Расчет по калибровочным образцам

Ра гнет по ?! сдельным образцам

Фактическая концентрация дек сила мкка сукциката Е фОЕИ (С== 36 мкг/мл} Оптичвсня плотность и-4—5- 100 -0.532) Найдено в % к стандартной оптаг-еской плотности Г,% Расянтаккая концентрация доксиламква сукциката в крови Дм»% Фактическая концентрация докскламика сукциката Е крови [£ = 36мкг/м.-в Отгтическая плотность 100 -0.532) Найденов % к стандартной оптической плотности П% Рассчитанная концентрация докскламика сундгната в крови

кжг/кл % С*«, ккг/кл АЕл». %

10.00 27,78 0.152 2930 29,48 106,12 10.00 27.78 0.138 27.06 26.77 9636

20,00 55 56 0.293 57.45 >6.82 102.27 10 00 2778 0.154 30.20 29 37 107.52

3000 83.33 0.415 81.37 80 48 96.58 10,00 27.78 0.158 30.98 30.64 110.30

4000 11111 0.57В 113.33 11210 10039 2000 55.56 0.279 54.71 54,11 97.39

5000 13839 0.699 137,06 13557 97,61 20,00 5556 0290 5636 5624 10122

60.00 166.67 0878 172,16 17029 10217 2000 5556 0297 5824 57.61 10369

40 00 11111 0.592 11608 11482 103.34

40 00 11111 0.566 110,98 109.77 9879

40.00 11111 0.582 114.12 11238 10159

6000 16667 0365 169.61 167.76 10065

60 00 16667 0387 17392 17203 10322

60 00 16667 0.893 175.10 173.19 10391

100.« ш.% 102.33

347 3,97

А».,,. % = Аж = Ий.--2.015 ? 14,14% 699 7,13

2? = 25 - 125c/p;fl = 5

n-itftin-run прецизионность (сссди.чостbj

Фактическая концентрация дек сила ми на сукпината Е КрОЕК (С*= 36 мет/Ч,^ Оптичезая плоте ость -Я {А. -  - 0.532) 100 Найденов % к стандартной оппге сюй плотности Ра ¡считанная концентрация докаевмина оунцнната Е Кр-ОЕИ

С.Ъ* ккг/мд % 1-й день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день 1-й день 2-й день 3-й день

1000 27,78 0159 0147 0.151 31.18 2852 29.61 3208 2947 3053 115.48 106.08 109 90

20-00 5556 0297 0.295 0.287 58 24 57.84 56.27 5992 5914 5801 10755 10644 104.41

3000 83 33 0415 0420 0,410 81.37 82 35 80.39 8371 8420 82 88 10046 10104 9946

40.00 111.11 0.583 0.579 0.573 11431 113 53 112.35 117.60 11608 115-82 10554 104.47 10424

50 00 138-89 0-704 0698 : 655 13804 136-86 13627 142 02 139.94 140.48 10225 10076 101.14

RR,% 106.38 103,76 10353

та,» =t 556 2.71 3.99

H«i,»«JBO»jr2132  14.144 12.49 5.78 8.51

Ьйи'ееп-пт (енутрилаборатерная) прецизионность

? 4.524 2.62 255 0.07

Фактическая кэнцентрация доксиламина сукциката Е КрОЕИ [С«= 36 МКГ/МЛ} Оппге стая плотность Л 100 -0.532) Найдено в % к стандартной оптической плотности Ц% Ра считанная концентрация доксиламина сукциката в крови RR,% Фактическая концентрация доксиламина сукцината Е КрСЕИ (Се = 36 MKT Оптическая плотность 100 -0.532) Найдено Е % к стандартной огтической плотности г,% Рассчитанная концентрация доксиламина суишната Е крови RR°,

С*. ККГ/МЛ Abseife мкг/мл Ы %

1000 27.78 0.152 29.80 3063 11026 1000 27-78 0138 27.06 2751 10011

20 00 55.56 0293 57,45 59 04 10626 10.00 27,78 0,154 3020 31,04 111.74

30.00 53.33 0,415 81.37 83,63 100 36 1000 27.78 0,158 30.98 3154 11461

40.00 111.11 0.578 113.33 11647 104-82 20 00 55.56 0.279 54.71 5623 101.21

50 00 13889 0699 137.06 14086 101.42 20.00 55 56 0.290 56 86 58.44 10518

2000 5556 0297 58-24 59.86 107.74

40 00 11111 0.592 116.08 119,30 107.37

40 00 11111 0566 110,98 11406 ::: ¿6

4000 11111 0.582 11412 11729 10556

ж% 104-62 ЯЗ.«« 10624

Kft»,î4 397 RSD^.K 4,76

% = Д» = RS Dt 1-2112 ? 14.14% 846 A*"*f, .*/» =д~ = RSD%°  l.S60< 20,00'i 855

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Клименко, Л. Ю. Анализ подходов к определению специфичности / селективности при проведении валидации аналитических методик в судебно-токсикологическом анализе. // Укр. мед. альм. - 2013. - Т. 16. - №1. - С. 47 - 49.

2 Клименко, Л. Ю. Подходы к определению специфичности / селективности при валидации УФ-спектрофотометрических методик количественного определения в судебно-токсикологическом анализе / Л. Ю. Клименко, Г. П. Петюнин, Т. А. Костина / / Фармация Казахстана. - 2013. - №8. - С. 53 - 56.

3 Л. Ю. Клименко, С. Н. Трут, Г. П. Петюнин, И. М. Иванчук Модификация и валидация УФ-спектрофотометрической методики количественного определения доксиламина в крови: специфичность // Укр. журн. клш. та лаборатор. медицини. - 2013. - Т. 8. -№4. - С. 191 - 199.

4 Klimenko, L. Yu. Approaches to determination of precision for UV-spectrophotometric methods of quantitative determination in forensic and toxicological analysis / / Фармация Казахстана. - 2014. - №3. - С. 43 - 50.

5 A. C. Moffat, M. D. Osselton, B. Widdop Clarke's analysis of drugs and poisons in pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. -London: Pharmaceutical Press, 2011. - 2609 p.

6 L. Yu. Klimenko, S. M. Trut, G. P. Petyunin, I. M. Ivanchuk Validation of UV-spectrophotometric methods of quantitative determination in forensic and toxicological analysis: recovery // Фармация Казахстана. - 2013. - №12. - С. 42 - 48.

7 Klimenko, L. Yu. Development of approaches to validation of UV-spectrophotometric methods of quantitative determination in forensic and toxicological analysis: linearity and range / / Фармацевтичний часопис. - 2014. - №1 (30). - С. 41 - 48.

L. YU. KLIMENKO, S.M. TRUT, T.A. KOSTINA, I.M. IVANCHUK

VALIDATION OF UV-SPECTROPHOTOMETRIC METHOD OF DOXYLAMINE QUANTITATIVE DETERMINATION

IN BLOOD: PRECISION

Resume: The approaches to procedure of determination and acceptability estimation of precision for UV-spectrophotometric methods of analytes quantitative determination in biological fluids used in forensic and toxicological analysis, which were offered in our previous paper, have been tested by the example of UV-spectrophotometric method of doxylamine quantitative determination in blood. Keywords: validation, precision, UV-spectrophotometry, doxylamine, bioanalytical methods.