Действие диклофенака натрия на оксигемоглобин

ДЕЙСТВИЕ ДИКЛОФЕНАКА НАТРИЯ НА ОКСИГЕМОГЛОБИН

Николаевский В.А., Холодов Д.Б., Шамарин С.Н.

Воронежский государственный университет, кафедра фармакологии, г. Воронеж

Несмотря на несомненную клиническую эффективность, применение НПВС имеет свои ограничения. Поэтому изучение изучение молекулярных механизмов процесса взаимодействия Диклофенака натрия (БР-№) с биологическими структурами, особенно с белковыми молекулами в плазматических мембранах соматических клеток организма является актуальным. Настоящее исследования посвящено изучению воздействия ЛП Диклофенак на физико-химические свойства гемоглобина.

Для решения поставленной проблемы наиболее предпочтительным в качестве объекта исследования является использование водно-солевых растворов оксигемоглобина в концентрации 5-10-5 моль/л, поскольку его структура к настоящему времени достаточно полно изучена и отражает структуру большинства белковых молекул в организме.

Предметом исследования является денатурация гемоглобина и изменение его буферной емкости, модифицированных ЛП Диклофенак.

В качестве модифицирующего агента мы использовали коммерческий препарат диклофенака натрия (БР-№) («Лотус Лабораториз Пвт. Лтд.», Индия) в концентрациях 0,7-10-4; 1,4-10-4; 2,8-10-4 моль/л, что соответствует ББ25,50,100, которые были получены в результате определения анальгетической активности по тесту «Уксусные корчи». В опытах было использовано 50 беспородных белых мышей обоих полов, массой 20-30 г. Полученные данные обработаны по методу «Наименьших квадратов» (пробит анализ).

Водно-солевые растворы оксигемоглобина в концентрации 5-10-5 моль/л выделяли по методу Д. Л. Драбкина с модификацией Л. А. Блюменфельда из эритроцитов путем их осмотического гемолиза. В опытах использовали кровь, полученную из хвостовых вен белых беспородных крыс (п = 28), в количестве 1 мл, с соблюдением требований по гуманному обращению с животными. Содержание оксигемоглобина в образцах контролировали спектрофотометрически.

Денатурацию и буферную емкость гемоглобина оценивали с использованием метода изучения оптических свойств и потенциометрического титрования биополимеров. В качестве показателей, характеризующих структурнофункциональное состояние гемоглобина, использовали величину буферной емкости его водных растворов в диапазоне РН = 3,0-11,5, а также интенсивность светорассеяния нативных и термостатированных при 1 = 40-60 °С растворов белка. Степень влияния модификатора на физико-химические свойства белка оценивали на модельной системе БР-№ - гемоглобин по изменению оптической плотности и буферной емкости водных растворов гемоглобина.

Кинетику оптической плотности белка изучали с помощью прибора КФК-3 (ОАО Загорский оптико-механический завод). Для термостатирования кювет с исследуемыми образцами (1 = 55 °С, I = 10 мм) использовали термостат электрический суховоздушный ТС-1/80 СПУ (ООО «Научно-исследовательский институт медицинской инженерии» Москва).

Кинетику буферных свойств гемоглобина оценивали с помощью прибора рН-метр рН-150М (РУП «Гомельский завод измерительных приборов»).

Анализ влияния температуры и БР-№, в различных концентрациях на оптические свойства оксигемоглобина показал, что при действии БР-№ в концентрации 0,7-10-4 моль/л на белок разница между глубиной денатурации интактного и модифицированного гемоглобина составила 15,13%, 1,4-10-4 моль/л - 17,82%, 2,8-10-4 моль/л -42,15% соответственно.

Таким образом установлено: 1) БР-№ вызывает необратимую денатурация белка; 2) при модификации белка БР-№ (в концентрации 0,7-10-4; 1,4-10-4; 2,8-10-4 моль/л) в условиях тепловой инкубации 30 мин. 1 = 55 °С, регистрировали увеличение параметра светопоглощения (А^к=13,05%; Дс0,710-4 моль/л = 15,025%; Дсм-ш-4 моль/л = 15,375%;

ДС2,8.10-4 моль/л =18,55%), это вызвано снижением числа внутримолекулярных связей (водородных), стабилизирующих пространственную структуру белка, то есть лекарственный препарат химически активен. Причем при использовании БР-№ в концентрации 0,7-10-4 моль/л; 1,4-10-4 моль/л изменения белковой глобулы незначительны, в то время как при использовании в концентрации 2,8-10-4 моль/л наблюдается увеличение степени денатурации белка относительно 0,7-10-4 моль/л 1,4-10-4 моль/л на 22,44%.

Изучение изменений буферной емкости оксигемоглоина, модифицированного БР-№ показало увеличение объема титранта, пошедшего на титрование растворов оксигемоглобина, модифицированных БР-№ в концентрациях

0,7-10-4 моль/л; 1,4-10-4 моль/л; 2,8-10-4 моль/л, относительно контроля на 17,6%, 24,7%, 29,1% соответственно. Установлено что связь БР-№ с СОО- группами незначительна. В основном БР-№ связывается с гистидином, лизином и тирозином.

Таким образом при модификации водных растворов гемоглобина БР-№ буферная емкость белковых растворов увеличивается, что свидетельствует о конформационных изменениях, то есть разворачивание молекулы гемоглобина и следовательно увеличение числа ионогенных групп, способных к диссоциации. Следовательно - модификатор вызывает разворачивание молекул (денатурацию) гемоглобина вследствие разрушения или ослабления внутримолекулярных связей, стабилизирующих молекулу; кроме того возможна конформация модификатора с водородными связями внутри белковой глобулы, что также может приводить к денатурации белка, за счет ослабления или разрыва водородных связей. Причем данные изменения пропорциональны увеличению концентрации БР-№.

Материалы IX международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» РУДН, Москва

Таким образом, в ходе проведенных экспериментов установлено:

1. DF-Na вызывает необратимую денатурация белка, обусловленную снижением числа внутримолекулярных (водородных) связей, стабилизирующих пространственную структуру белка, то есть, лекарственный препарат химически активен.

2. Денатурация белка, вызванная DF-Na, пропорциональна увеличению концентрации лекарственного препарата.

3. Химическое связывание DF-Na с белковыми глобулами обусловлено взаимодействием, в основном, с гистидином, лизином и тирозином.

ЛИТЕРАТУРА

1. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2007. Т. 9. № 4.

2. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2006. Т. 8. № 4.

3. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2005. Т. 7. № 4.

4. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2004. Т. 6. № 4.

5. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2003. Т. 5. № 4.

6. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2002. Т. 4. № 4.

7. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2001. Т. 3. № 4.

8. Журнал научных статей. Здоровье и образование в XXI веке. 2000. Т. 2. № 4.

9. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2007. Т. 9. № 12. URL: http ://e-pubmed. org/isu. html.

10. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2006. Т. 8. № 12. URL: http ://e-pubmed. org/isu. html.

11. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2005. Т. 7. № 12. URL: http ://e-pubmed. org/isu. html.

12. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2004. Т. 6. № 12. URL: http ://e-pubmed. org/isu. html.

13. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2003. Т. 5. № 12. URL: http ://e-pubmed. org/isu. html.

14. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2002. Т. 4. № 12. URL: http ://e-pubmed. org/isu. html.

15. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2001. Т. 3. № 1. URL: http ://e-pubmed. org/isu. html.

16. Электронный научно-образовательный вестник «Здоровье и образование в XXI веке». 2000. Т. 2. № 1. URL: http ://e-pubmed. org/isu. html.

МатериалыIIX международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» РУДН, Москва