СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ НАБОРОВ НУКЛЕОТИДНЫХ И/ИЛИ ИНЫХ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОЧАСТИЦ, НЕСУЩИХ МЕТКИ, ВЗАИМНО-ОДНОЗНАЧНО СВЯЗАННЫЕ С ИЗГОТАВЛИВАЕМЫМИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМИ
METHOD FOR MANUFACTURING SETS OF NUCLEOTIDE AND/OR OTHER MOLECULAR SEQUENCES USING MICROPARTICLES BEARING LABELS UNIVERSALLY ASSOCIATED WITH MANUFACTURED SEQUENCES

Область техники.
Настоящее изобретение относится к методам синтеза свободных и связанных с микрочастицами наборов молекулярных последовательностей, в частности наборов олигонуклеотидов или полинуклеотидов, в том числе аптамеров и/или гибридных молекул, в том числе модифицированных, произвольного назначения. В частности, целью изобретения является обеспечение мультиплексных анализов, производимых посредством олигонуклеотидов или полинуклеотидов, в том числе аптамеров и/или гибридных молекул, в том числе с использованием проточной цитометрии и/или флуоресцентной и/или иной микроскопии или имидж-анализа; обеспечение скрининга молекулярных последовательностей;  обеспечение адресной доставки олигонуклеотидов и/или полинуклеотидов, и/или гибридных молекул; обеспечение изготовления функциональных микро- и наноконструктов из микро- и наночастиц, связанных олигонуклеотидными, полинуклеотидными и/или иными линками.
Уровень техники.
Наборы микрочастиц, несущих уникальные флуоресцентные метки, и соответствующие этим меткам функциональные молекулы, активно используются в биоаналитике. Известны мультиплексные проточные цитометрические анализы на основе частиц для биомедицинских исследований и медицинской диагностики (Дарио А.А. Виньяли. Мультиплексные проточные цитометрические анализы на основе частиц. Журнал иммунологических методов. Том 243, выпуски 1–2, 21 сентября 2000 г., страницы 243–255. Режим доступа https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175900002386).  Известны массивы на основе микросфер, закодированных наночастицами, для высокопроизводительного мультиплексного обнаружения (Юанькуй Ленг ,  Кан Сунь, Сяоюань Чен,  Ванван Ли. Суспензионные массивы на основе микросфер, закодированных наночастицами, для высокопроизводительного мультиплексного обнаружения. Обзоры химического общества. Выпуск 15, 2015 г. Режим доступа  https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2015/cs/c4cs00382a ).  Известны флуоресцентные микрочастицы, кодируемые квантовыми точками, для мультиплексной визуализации и диагностики рака (Sukhanova, A. and I. Nabiev, Fluorescent nanocrystal-encoded microbeads for multiplexed cancer imaging and diagnosis. Crit Rev Oncol Hematol, 2008. 68(1): p. 39-59.)
В настоящее время на рынке представлены наборы микрочастиц Luminex (https://www.thermofisher.com/ru/ru/home/life-science/antibodies/immunoassays/procartaplex-assays-luminex.html), содержащие порядка 100-1000 независимых меток, например  семейство функционализированных (магнитных) частиц MagPlex, (https://www.luminexcorp.com/xmap-technology/#microspheres), включающее порядка 80 флуоресцентно-меченных микросфер, с диаметром 6.45 мкм, необходимых как для идентификации, так и в качестве твердой поверхности для иммобилизации.
Используемая последовательная иммобилизация заранее синтезированных функциональных молекул на частицы с каждой меткой, при числе независимых меток более 100 трудозатратна, и неприменима для генерации большего числа (тысячи и миллионы) комплексов метка-функциональная молекула.
Представленные на рынке наборы микрочастиц формируются с использованием комбинаций двух флуорофоров в нескольких концентрациях. Тем не менее, количество уникальных меток в наборе микрочастиц может быть расширено почти неограниченно, при использовании дополнительных флуресцентных и иных меток. В частности, известные цитометры и клеточные сортировщики позволяют проводить одновременный анализ до 12-16 флуорофоров, комбинирование которых, в разных концентрациях, даёт множество, миллиарды и более, уникальных кодов.
До недавнего времени такие большие наборы микрочастиц не были востребованы из-за отмеченных выше ограничений последовательной иммобилизации.
Известен способ изготовления и использования наборов микрочастиц c одновременной функционализацией каждой частицы своей последовательностью нуклеотидов, где наборы микрочастиц несут уникальную для каждой метки, но неизвестную до секвенирования последовательность (кодирующие частицы в микрокапельном баркодировании, например в технологии DropSeq https://mccarrolllab.org/dropseq/) или известную, но случайно выбранную олигонуклеотидную последовательность (система и способ для анализа фенотипа и полинуклеотидного секвенирования биологических частиц с использованием детерминированного штрихкодирования патент RU 2756306, Andreyev, D.; Zybailov, B. Integration of flow cytometry and single cell sequencing. Trends Biotechnol., 2020. 38(2), p. 133-136).
В последнем способе используется цитометр для пассивного отслеживания синтетических траекторий каждой частицы, и в полученных наборах частиц известна нуклеотидная последовательность, соответствующая каждой метке, но эта последовательность случайна, её нельзя задать заранее, до синтеза.
Известны методы синтеза произвольных олигонуклеотидов или полинуклеотидов на двумерной подложке, с использованием фотохимических и/или электрохимических методов (ДНК-матрицы, ДНК-чипы) https://www.pnas.org/doi/pdf/10.1073/pnas.0813011106.  В таких методах добавление нуклеотидов или иных функциональных молекул производится последовательно для каждого олигонуклеотида, и отсутствует возможность выделения и/или сортировки подложки или подмножества подложек с заданными олигонуклеотидами, ДНК-матрица используется только как совокупность всех подложек со всеми синтезированными олигонуклеотидами, и в одной синтетической процедуре синтезируется только одна ДНК-матрица.
На существующем уровне техники нет способов и устройств для одновременного синтеза множества заранее заданных пользователем олигонуклеотидных или иных молекулярных последовательностей, содержащих заранее заданную, однозначно идентифицирующие каждую из последовательностей метку, такую как комбинаторно-меченную микро или наночастицу, в одном общем синтезе, где каждый этап введения нуклеотида или иного молекулярного элемента производится параллельным, а не последовательным синтезом; синтеза, где продукт может  содержать функциональную микро или наночастицу для каждой группы последовательностей, и/или позволяющих выполнять адресную доставку, и/или производить селективное или неселективное высвобождение с поверхности частиц, а также позволяющего варьировать количество и длину последовательностей произвольно, и вводить в последовательности любые произвольные молекулярных элементы, в том числе с использованием нестандартных для автоматизированного ДНК-синтеза методов в физически обособленном, специализированном реакционном компартменте.
Сущность изобретения.
Технический результат, обеспечиваемый способом - получение набора комбинаторно или иначе меченых микрочастиц, каждая из которых несёт задаваемые пользователем для каждой метки молекулярные последовательности, например олигонуклеотиды и их производные.
При этом обеспечивается возможность одновременного синтеза произвольного количества различающихся, заданных пользователем последовательностей (миллионы и более) на частицах, несущих такое же количество взаимно-однозначно связанных с последовательностями меток, в первую очередь комбинаторных. Обеспечивается гибко настаиваемый баланс количества молекулярных последовательностей и количества каждой молекулярной последровательности, возможность изменения общего количества молекулярных последовательностей, возможность отделения заданной совокупности молекулярных последовательностей в заданном месте организма, ткани, клетки.
Технический результат достигается тем, что в способе изготовления наборов нуклеотидных и/или иных молекулярных последовательностей с использованием микрочастиц, несущих метки, взаимно-однозначно связанные с изготавливаемыми последовательностями набор микрочастиц изготавливают в единой синтетической процедуре, не ограничивающей количество микрочастиц, количество меток, длину и состав последовательностей, олигонуклеотидных или иных;  где синтез осуществляют  циклически над всей совокупностью микрочастиц  разделённой на небольшое количество подгрупп в каждом цикле, для чего сортировщиком осуществляют сортировку микрочастиц по уникальной для каждой синтезируемой последовательности метке в каждом цикле синтеза и добавляют нуклеотид или иной элемент последовательности к последовательностям на каждой отсортированной по меткам подгруппе частиц, в каждом цикле синтеза; алгоритм синтеза, и соответствующий ему алгоритм программного обеспечения, управляющего сортировщиками, включает следующую последовательность действий:
а) формирование базы соответствия меток на микрочастицах и синтезируемых на этих частицах молекулярных последовательностей;
б) формирование нескольких множеств меток на каждом шаге синтеза, по количеству молекулярных элементов, вводимых в последовательности в  каждом цикле синтеза;  в частности для синтеза олигонуклеотидных последовательностей – четырёх множеств, по количеству нуклеотидов;
в) сортировку микрочастиц на подгруппы, соответствующие выбранным множествам меток для каждого шага синтеза;
г) добавление требуемого нуклеотида, или иной иного элемента последовательности, к уже иммобилизованным частям синтезируемых последовательностей, иммобилизованным на микрочастицах каждой подгруппы, соответствующей соответствующего множеству меток, выбранных для данной операции на данном цикле синтеза; этап добавления элемента включает вырожденный случай добавления «пустого» элемента последовательности, когда из одна из подгрупп не подвергается модификации;
д) смешивание подгрупп частиц и переход к сортировке для следующего цикла синтеза.
Предусмотрено, что в способе изготовления наборов микрочастиц, несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей и взаимно-однозначно соответствующих им меток, идентифицируемых в проточной детекции, сортировку микрочастиц по уникальной для каждой синтезируемой последовательности метке в подгруппы на каждом цикле синтеза производят с использованием аппаратной базы флуоресцентно-активируемых сортировщиков клеток FACS; в случае, если сортировщик не позволяет сформировать достаточное количество подгрупп – в частности, большинство FACS ограничены 4 подгруппами; либо, если большое количество параллельных синтезов излишне усложняет синтезатор – любой из циклов алгоритма разбивается на произвольное количество подциклов, неограниченно увеличивая количество различающихся вводимых элементов за счёт соответствующего удлинения синтетической процедуры.
Предусмотрено, что в способе  изготовления наборов микрочастиц, несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей и взаимно-однозначно соответствующих им меток   изготовление осуществляют на базе частицы, помимо метки для сортировки в циклах синтеза, несущей магнитную метку и/или являющуюся носителем реагента и/или биоактивного препарата и/или являющейся проводником и/или несущей компоненты плазмонных и/или оптических меток, структур или иных функциональных элементов.
Предусмотрено, что в способе изготовления наборов микрочастиц, несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей и взаимно-однозначно соответствующих им меток иммобилизация молекулярных последовательностей выполняется обратимо, за счёт введения фотоактивируемого или иначе активируемого элемента, разрезающего последовательность по внешнему сигналу, что позволяет высвобождать выбранные молекулярные последовательности в выбранном месте клетки, ткани, организма, культуры, или иного объекта, путём оптического или иного воздействия на частицу, выбранную и локализованную в объекте по оптической или иной метке.
Предусмотрено, что в способе  изготовления наборов микрочастиц, несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей и взаимно-однозначно соответствующих им меток по высвобождение выбранных обратимо иммобилизованных молекулярных последовательностей  производят для всей совокупности микрочастиц или для отсортированной по меткам подгруппы микрочастиц; в частности, возможно параллельное изготовление тысяч и более препаратов олигонуклеотидов или полинуклеотидов, в том числе аптамеров и/или комбинаторно меченных на молекулярном уровне последовательностей, в одной общей синтетической процедуре; при этом свободно изменяется соотношение количества синтезируемых препаратов и количество каждого синтезируемого препарата, а увеличение суммарного количества синтезируемых молекулярных последовательностей ограничивается лишь временем сортировки и/или иммобилизационной ёмкостью частиц.
Предусмотрено, что в способе изготовления наборов микрочастиц несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей, связанных или не связанных с частицей, несущей метку и/или функциональные свойства, в том числе формируемых в 2д или 3д-матрицы, добавление каждого нуклеотида или иного элемента последовательности производят для физически изолированной сортировкой подгруппы молекулярных последовательностей, что позволяет отказаться от использования экономически неэффективных фотоактивируемых или иных локально активируемых прекурсоров, используемых для селективного формирования нуклеотидных или иных последовательностей в параллельных синтезах, и использовать неселективные, экономически эффективные реагенты для параллельного синтеза.
Осуществление изобретения.
Способ изготовления наборов нуклеотидных и/или иных молекулярных последовательностей с использованием микрочастиц, несущих метки, взаимно-однозначно связанные с изготавливаемыми последовательностями применяется для изготовления наборов микрочастиц, несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей, таких как олигонуклеотидные и/или полинуклеотидные и/или функционализированные и/или гибридные последовательности, а также аминокислотные, углеводородные и иные последовательности и их комбинации, и взаимно-однозначно соответствующие молекулярным последовательностям меток, таких как комбинаторные флуоресцентные метки или SERS-метки или иные оптические метки или RFID-метки, или иные метки идентифицируемые в проточной или иной детекции.
В способе изготовления наборов микрочастиц каждая молекулярная последовательность синтезируется на одной или нескольких частицах, несущих уникальную метку, такую как комбинаторная флуоресцентная метка и/или SERS-метка и/или иные оптические метка и/или RFID-метка, и/или иные метка или комбинация меток, идентифицируемая и сортируемая в проточной или иной детекции. Набор молекулярных последовательностей на поверхности микрочастиц изготавливают в единой синтетической процедуре, не ограничивающей количество микрочастиц, количество меток, длину и состав синтезируемых молекулярных последовательностей, олигонуклеотидных или иных. Синтез олигонуклеотида либо иной последовательности осуществляют  циклически, над всей совокупностью микрочастиц  разделённой на небольшое количество подгрупп в каждом цикле, для чего сортировщиком осуществляют сортировку микрочастиц по уникальной для каждой синтезируемой последовательности метке в каждом цикле синтеза и добавляют нуклеотид или иной элемент последовательности к последовательностям на каждой отсортированной по меткам подгруппе частиц, в каждом цикле синтеза. Алгоритм синтеза, и соответствующий ему алгоритм программного обеспечения, управляющего сортировщиками, включает следующую последовательность действий:
а) формирование базы соответствия меток на микрочастицах и синтезируемых на этих частицах молекулярных последовательностей;
б) формирование нескольких множеств меток на каждом шаге синтеза, по количеству молекулярных элементов, вводимых в последовательности в  каждом цикле синтеза;  в частности для синтеза олигонуклеотидных последовательностей – четырёх множеств, по количеству нуклеотидов;
в) сортировку микрочастиц на подгруппы, соответствующие выбранным множествам меток для каждого шага синтеза;
г) добавление требуемого нуклеотида, или иной иного элемента последовательности, к уже иммобилизованным частям синтезируемых последовательностей, иммобилизованным на микрочастицах каждой подгруппы, соответствующей соответствующего множеству меток, выбранных для данной операции на данном цикле синтеза; этап добавления элемента включает вырожденный случай добавления «пустого» элемента последовательности, когда из одна из подгрупп не подвергается модификации;
д) смешивание подгрупп частиц и переход к сортировке для следующего цикла синтеза.
Сортировку микрочастиц по уникальной для каждой синтезируемой последовательности метке в подгруппы на каждом цикле синтеза производят с использованием аппаратной базы флуоресцентно-активируемых сортировщиков клеток FACS.
При проведении сортировки микрочастиц по уникальной для каждой синтезируемой последовательности метке в подгруппы на каждом цикле синтеза производимой с использованием сортировщика, ограниченного в количестве формируюемых подгрупп частиц – например с использованием аппаратной базы флуоресцентно-активируемых сортировщиков клеток FACS, в большинстве случаев ограниченных пятью подгруппами, включая подгруппу «неотсортированных» частиц – при синтезе молекоулярных последовательностей, включающих большее количество элементов, в сравнении с доступным сортировщику количеством подгрупп – шаги сортировки и добавления молекулярную элемента в молекулярную последовательность в алгоритме синтеза разбиваются на несколько последовательных шагов, что позволяет синтезировать молекулярные последовательности из большого количества элементов, такие как пептиды, пептидогликаны, полинуклеотиды, содержащие модифицированные нуклеотиды и иные последовательности.
Изготовление осуществляют на базе частицы, помимо метки для сортировки в циклах синтеза, опционально несущей магнитную метку и/или являющуюся носителем реагента или биоактивного препарата и/или являющейся проводником и/или несущей компоненты плазмонных или оптических меток, структур или иных функциональных элементов.
Иммобилизация олигонуклеотидных, полинуклеотидных, олигонуклеотид-содержащих, полинуклеотид-содержащих или иных молекулярных последовательностей с заранее заданными длиной и структурой - выполняется обратимо,  за счёт введения фотоактивируемого или иначе активируемого элемента, разрезающего последовательность по внешнему сигналу, что позволяет высвобождать выбранные молекулярные последовательности в выбранном месте клетки, ткани, организма, культуры, или иного объекта, путём оптического или иного воздействия на частицу, выбранную и локализованную в объекте по оптической или иной метке.
Для изготовления наборов микрочастиц, несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей, таких как олигонуклеотидные и/или полинуклеотидные и/или функционализированные и/или гибридные последовательности, а также аминокислотные, углеводородные и иные последовательности и их комбинации, высвобождение выбранных обратимо иммобилизованных молекул производят для всей совокупности микрочастиц или для отсортированной по меткам подгруппы микрочастиц.
В частности, возможно параллельное изготовление тысяч и более препаратов олигонуклеотидов или полинуклеотидов, в том числе аптамеров и/или комбинаторно меченных на молекулярном уровне последовательностей, в одной общей синтетической процедуре. При этом свободно изменяется соотношение количества синтезируемых препаратов и количество каждого синтезируемого препарата, а увеличение суммарного количества синтезируемых молекулярных последовательностей ограничивается лишь временем сортировки и/или иммобилизационной ёмкостью частиц.
Для изготовления наборов микрочастиц, несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей, по завершению синтеза связанных или не связанных с частицей, несущей метку и/или функциональные свойства, в том числе формируемых в 2д или 3д-матрицы, добавление каждого нуклеотида или иного элемента последовательности производят для физически изолированной сортировкой подгруппы молекулярных последовательностей, что позволяет отказаться от использования экономическчески неэффективных фотоактивируемых или иных локально активируемых прекурсоров, используемых для селективного формирования нуклеотидных или иных последовательностей в параллельных синтезах, и использовать неселективные, экономически эффективные реагенты для параллельного синтеза.
Применение способа.
Способ применяется для  синтеза свободных и связанных с микрочастицами наборов молекулярных последовательностей, в частности наборов олигонуклеотидов или полинуклеотидов, в том числе аптамеров и/или гибридных молекул, в том числе модифицированных, произвольного назначения. В частности, целью изобретения является обеспечение мультиплексных анализов, производимых посредством олигонуклеотидов или полинуклеотидов, в том числе аптамеров и/или гибридных молекул, в том числе с использованием проточной цитометрии и/или флуоресцентной и/или иной микроскопии или имидж-анализа; обеспечение скрининга молекулярных последовательностей;  обеспечение адресной доставки олигонуклеотидов и/или полинуклеотидов, и/или гибридных молекул; обеспечение изготовления функциональных микро- и наноконструктов из микро- и наночастиц, связанных олигонуклеотидными, полинуклеотидными и/или иными линками.
Поскольку в способе изготовления наборов микрочастиц, несущих большое количество заранее заданных молекулярных последовательностей, таких как олигонуклеотидные и/или полинуклеотидные и/или функционализированные и/или гибридные последовательности, а также аминокислотные, углеводородные и иные последовательности и их комбинации, и взаимно-однозначно соответствующие молекулярным последовательностям меток, таких как комбинаторные флуоресцентные метки или SERS-метки или иные оптические метки или иные метки или комбинации меток, идентифицируемые в проточной детекции, при проведении сортировки микрочастиц по уникальной для каждой синтезируемой последовательности метке в подгруппы на каждом цикле синтеза производимой с использованием сортировщика, ограниченного в количестве формируюемых подгрупп частиц – например с использованием аппаратной базы флуоресцентно-активируемых сортировщиков клеток FACS, в большинстве случаев ограниченных пятью подгруппами, включая подгруппу «неотсортированных» частиц – при синтезе молекоулярных последовательностей, включающих большее количество элементов, в сравнении с доступным сортировщику количеством подгрупп – шаги сортировки и добавления молекулярную элемента в молекулярную последовательность в алгоритме синтеза разбиваются на несколько последовательных шагов, что позволяет синтезировать молекулярные последовательности из большого количества элементов, такие как пептиды, пептидогликаны, полинуклеотиды, содержащие модифицированные нуклеотиды, и иные последовательности.
Возможно использование способа для проведения смешанного анализа, сочетающего анализ последовательностей ДНК/РНК и аффинный анализ, посредством одновременного выращивания заранее заданных для каждой метки олигонуклеотидов и аптамеров в наборах частиц с уникальными метками, либо нуклеотидных и иных молекулярных последовательностей.
Возможно проведение синтеза экспонирующих заранее заданные нуклеотидные и иные последовательности микрочастиц с функциональными свойствами, соответствующими метке – такими как магнитные свойства, загрузка реагентом, проводимость, плазмонные и оптические свойства, для наноинженерных задач.
Возможно проведение синтеза экспонирующих заранее заданные нуклеотидные и иные последовательности микрочастиц с функциональными свойствами, соответствующими метке – такими как магнитные свойства, загрузка реагентом, проводимость, плазмонные и оптические свойства, для биоинженерных задач.
Возможно проведение синтеза множеством заранее заданных пользователем последовательностей, до миллиона и более - в одном синтезе, с последующим высвобождением выбранных целевых олиго/полинуклеотидов или иных молекулярных последовательностей с отсортированных микрочастиц, тогда и там, где синтезированные молекулярные последовательности требуются.
Микрочастицы полученные заявленным способом применимы в системах многокомпонентного анализа олиго и полинуклеотидов и иных молекул, в системах требующих анализа множества, от сотен до миллионов, различных анализируемых молекул в одном эксперименте. Такие эксперименты включают генетическое картирование высокого разрешения, секвенирование, диагностику мутаций, детекцию патогенов по ДНК и РНК, системах основанных на аффинности к аптамерам и иным молекулярным последовательностям, системах требующих множества заданных нуклеотидных последовательностей на индивидуальных носителях, в том числе для моделирования биосистем, ДНК-наноинженерии, скринирования последовательностей в разработке биопродуцентов и лекарственных препаратов.