ВОДНЫЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ЯЗВЫ
AQUEOUS PHARMACEUTICAL PREPARATION AND METHOD OF TREATING CHRONIC ULCER

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к способам применения продуктов для ведения ран. В частности, предлагается лечение хронических язв.
Уровень техники
Заживление повреждения (раны) - это динамический метаболический и физиологический процесс, который в идеале ведет к восстановлению целостности и функции поврежденной ткани. Рана является хронической тогда, когда процесс заживления протекает дольше нормального и не полноценно, так что восстановление целостности ткани не достигается. Хронические раны - это серьезная, требующая решения проблема для больного, медицинских работников и системы здравоохранения в целом, значительно ухудшающая качество жизни миллионов людей. При хронических ранах нужно длительное, повторяющееся лечение, из-за чего весьма страдает общество вследствие затрат на медицинское обслуживание и потери людьми трудоспособности.
Один из вариантов хронических ран - не заживающие, или хронические язвы. Не заживающие язвы нижних конечностей, включая стопу, часто болезненны, обезображивают больного и отрицательно влияют на его трудоспособность.
Трофические язвы нижних конечностей, возникающие из-за нарушения венозного кровотока, представляют собой хронические поражения (изъязвления) кожи и подкожных тканей в дистальной части нижних конечностей (между коленом и лодыжкой). Агентство по продукции медицинского назначения Швеции определяет трофические язвы нижних конечностей как расположенные ниже колена изъязвления, обусловленные венозной недостаточностью, которые не заживают долее шести недель при стандартном лечении (то есть применении обычных продуктов для ведения ран, например традиционных марлевых повязок, бинтов, другого тканого и нетканого перевязочного материала, губок, прилегающих повязок, не прилипающих повязок).
Хроническая венозная недостаточность развивается, когда вены нижних конечностей теряют способность эффективно проталкивать венозную кровь. Она проявляется, в частности, скоплением жидкости в интерстициальном пространстве и впоследствии подверженностью этой области изъязвлениям.
На долю трофических язв нижних конечностей приходится большинство язвенных поражений и 70-90% всех раневых повреждений этой части тела (см. Snyder, Clin. Dermatol., 23, 388 (2005)). По эпидемиологическим данным, у 1,5-3,0 человек из каждой тысячи (0,15-0,3%) имеются выраженные язвенные поражения нижних конечностей, причем среди лиц старше 80 лет частота их достигает 2% (20 человек из каждой тысячи) (см. Valencia et al, J. Am. Acad. Dermatol., 44, 401 (2001)). Из этого следует, что экономические затраты, обусловленные трофическими язвами нижних конечностей велики. Только в Европе суммарные расходы по той статье оцениваются в 6,5 € в год, то есть в среднем 7000 € на каждый случай (см. Posnett, et al, J. Wound Care, 18, 154 (2009)). Расходы на эту патологию включают не только оплату лечения и ухода, но и непрямые затраты, связанные с нетрудоспособностью таких больных, и выплаты по их больничным листам.
Одно из основных осложнений у больных сахарным диабетом - диабетическая язва стопы. При диабете развивается периферическая нейропатия, проявляющаяся помимо прочего нарушением чувствительности и повышенной вероятностью травматического повреждения тканей. Расстройства кровотока препятствуют процессу естественного заживления кожи, что выливается в образование не заживающих (хронических) язвенных поражений. По оценкам Международной диабетической федерации, для больных диабетом риск развития язвы стопы составляет 25% (см. Boulton et al, Lancet, 366, 1719 (2005) и Singh et al, JAMA, 293, 217 (2005)). Частота возникновения и распространенность диабетической язвы стопы у больных диабетом составляют 2-6% и 4-10% соответственно (см. также Ramsey et al, Diabetes Care, 22, 382 (1999)). Кроме того, у 10% больных диабетом имеются усугубляющие факторы, например периферическая нейропатия и сосудистые осложнения, способствующие развитию диабетической язвы стопы. Диабетическая язва стопы склонна инфицироваться, что ведет к значительной болезненности и осложнению течения этого поражения, с которым связаны 25-90% всех случаев ампутации среди больных диабетом (см. также Ragnarson-Tennvall et al, Diabetologia, 44, 2077 (2001)).
Диабетическая язва стопы является причиной существенных экономических затрат. В Европе не заживающая в течение 12 месяцев диабетическая язва стопы обходится в среднем в 20000 € на каждого такого пациента (Prompers et al, Diabetologia, 51, 1826 (2008)).

Нет доказательств того, что обычные перевязочных материалы приносят сколько-нибудь ощутимую пользу при лечении упомянутых выше не заживающих (хронических) язв, даже если такие материалы используются в сочетании с другими обычными средствами (промывание, очищение, перевязка и проч.) В европейских странах для лечения язв, связанных с диабетической нейропатией, которые захватывают подкожную ткань или простираются еще глубже и адекватно снабжаются кровью, назначают препарат в форме геля Regranex (бекаплермин). Он применяется как дополнение к должным мероприятиям по ведению язвы, включая первоначальную хирургическую очистку, ликвидацию нагрузки и предотвращение или лечение инфекции. Regranex - это единственный лекарственный продукт, получивший официальное одобрение на лечение не заживающих (хронических) язв, нет документально подтвержденных сведений о его эффекте при трофических язвах нижних конечностей, обусловленных венозной недостаточностью.
Таким образом, существует настоятельная потребность в усовершенствованном лечении хронических ран, в частности, не заживающих (хронических) язв - трофических язв нижних конечностей, обусловленных венозной недостаточностью, и диабетических язв стопы.
Кателицидин LL-37 происходит из человеческого катионного антимикробного белка 18 (hCAP18) с молекулярной массой 18 кДа. Этот пептид является важным посредником в восстановлении тканей и защите от инфекции. Как hCAP18, так и LL-37 присутствуют в различных жидкостях тела, включая жидкое раневое отделяемое (см., например, Murakami et al, J. Dent. Res., 81, 845 (2002), Schaller-Bals et al, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 165, 992 (2002) и S0rensen et al, J. Biol. Chem., 278, 28540 (2003)). Хотя в острых ранах за несколько часов повышается уровень транскрипции, ведущей к образованию hCAP18/LL-37, и LL-37 экспрессируется по краю раны эпидермальными кератиноцитами базального слоя, в хронических ранах по краю раны не наблюдается иммунологической реакции, свидетельствующей о присутствии LL-37 (см., например, Dressel et al, Exp. Dermatol., 19, 628 (2010) и Rivas-Santiago et al, J. Derm. Sci., 65, 19 (2012)).
В исследованиях in vivo синтетический пептид LL-37 при введении путем подкожной инъекции стимулировал ангиогенез (Koczulla et al, J. Clin. Invest., 111, 1665 (2003)), а при повторном местном применении в случае ран привлекал в окружающую рану ткань клетки воспаления. В экспериментах ex vivo, моделирующих острые раны у человека, антитела против LL-37 подавляли их заживление (Heilborn et al, J. Invest. Dermatol., 120, 379 (2003); см. также заявку на международный патент WO 2004/067025), а у мышей, у которых нормальное заживление ран было нарушено в результате воздействия кортикостероидного препарата, местное применение LL-37 стимулировало заживление (Ramos et al, Peptides, 32, 1469 (2011)). В одном исследовании было показано, что у мышей, больных диабетом, у которых было нарушено заживление ран, введение LL-37 в острые раны оказывало благотворное действие (Carretero et al, J. Invest. Dermatol., 128, 223 (2008)), однако в других исследованиях не удалось продемонстрировать этот эффект (Steinstraesser et al, PLoS ONE, 7, e39373 (2012)). В Европейском патенте №1 358 888 описывается, что LL-37 индуцирует ангиогенез.
В заявке на международный патент WO 2009/001087 описываются продукты для ведения ран, в которых LL-37 импрегнирован в твердый субстрат (перевязочный материал). Но в указанном документе нет сведений о том, что для эффективного лечения раны необходима определенная доза LL-37 в препарате. Не обсуждается возможность существования верхнего предела этой дозы, не говоря уж о предельном значении дозы.
Раскрытие изобретения
2
Авторы данного изобретения обнаружили, что в клинических условиях для лечения не заживающих/хронических язв нижних конечностей можно с успехом применять в определенных дозах LL-37. В частности, как описывается ниже, авторами данного изобретения показано, что, как ни странно, в дозах по меньшей мере около 80 мкг на 1 см площади язвы/раны LL-37 не эффективен в отношении хронических язв, включая трофические язвы нижних конечностей, обусловленные венозной недостаточностью.
Таким образом, по данному изобретению предлагается способ местного лечения хронических язв, например трофических язв нижних конечностей, обусловленных венозной недостаточностью, и диабетических язв стопы, который включает:
(a) местное применение (нанесение на указанные язвы) фармацевтического препарата, содержащего LL-37 или его фармацевтически приемлемую соль и один или более фармацевтически приемлемых разбавителей или носителей с последующим
(b) наложением повязки,
2
причем указанное применение указанного препарата обеспечивает в месте язвенного поражения дозу LL-37 менее чем около 80 мкг на 1 см площади указанного пораженного участка.
Также предлагается указанный фармацевтический препарат для применения в указанной дозировке указанным способом для лечения хронических язв, а также применение LL-37 для изготовления фармацевтического препарата для применения в указанной дозировке указанным способом для лечения хронических язв.
Аминокислотная последовательность человеческого LL-37 приведена ниже; в настоящем документе она обозначается SEQ ID NO: 1:
LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES [SEQ ID NO: 1]
LL-37 можно использовать в форме фармацевтически приемлемых солей присоединения основания, включая соли присоединения оснований катионов щелочных металлов (например, калия и натрия) и щелочноземельных металлов (например, кальция и магния), аммония или водорастворимые соли присоединения аминов, например N-метилглюкамина (меглумина) и продукты взаимодействия аммиака с низшими алифатическими спиртами (алканолами), и среди прочего - другие основные соли фармацевтически приемлемых органических аминов. LL-37 можно использовать в форме соли уксусной кислоты (ацетата).
Способ применения по данному изобретению особенно полезен при лечении хронических язв, включая не заживающие язвы, трофические язвы, обусловленные венозной недостаточностью, диабетические язвы и пролежни. В частности можно упомянуть такие язвы, как диабетическая язва стопы и язвы нижних конечностей, в частности трофические язвы нижних конечностей, обусловленные венозной недостаточностью.
2
2
2
Как описывается ниже, в конкретных примерах препаратов, приведенных в настоящем документе, использовалась концентрация LL-37 0,5 мг на 1 мл определенного носителя и препарат наносили на место поражения раз в три дня, что создавало эффективную дозу около 13 мкг LL-37 на 1 см площади пораженного участка. При концентрации LL-37 1,6 мг/мл эффективная доза составляла 40 мкг/см. Однако при концентрации 3,2 мг/мл, что давало дозу 80 мкг/см, положительного эффекта не наблюдалось.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Таким образом, доза LL-37 в расчете на 1 см площади пораженного участка должна быть меньше некоторого значения в диапазоне от около 40 мкг до около 80 мкг. Подходящий верхний предел дозы LL-37, наносимого на язву, может быть около 75 мкг на 1 см площади пораженного участка, например, около 70 мкг/см, например, около 65 мкг/см или 60 мкг/см, включая около 55 мкг/см, например, около 50 мкг/см или около 45 мкг/см. Подходящий нижний предел дозы LL-37 в расчете на 1 см пораженного участка может быть около 1 мкг, например, около 3 мкг, в том числе около 5 мкг, например, около 10 мкг/см, например, около 15 мкг/см или 20 мкг/см, в том числе около 25 мкг/см, например, около 25 мкг/см, например, около 30 мкг/см или около 35 мкг/см.
2
2
Авторы данного изобретения обнаружили, что хронические язвы, например, трофические язвы нижних конечностей, обусловленные венозной недостаточностью, и диабетические язвы стопы, можно эффективно лечить LL-37 в дозе ниже около 80 мкг на 1 см площади пораженного участка при применении один раз в три дня, что соответствует около 26,7 мкг LL-37 на 1 см площади пораженного участка при ежедневном применении.
2
Формулировка «фармацевтический препарат, обеспечивающий дозу LL-37 менее около 26,7 мкг на 1 см площади пораженного участка при ежедневном применении» в настоящем документе подразумевает, что
(i) препарат природного происхождения; и/или
2
(ii) частота применения препарата такая, что количество LL-37, попадающее на пораженный участок для лечения язвы, в каждый день его применения не превышает 26,7 мкг на 1 см площади пораженного участка.
2
2
2
2
Для ясности отметим, что в конкретных примерах препаратов, приведенных в настоящем документе, использовалась концентрация LL-37 0,5 мг на 1 мл определенного носителя (то есть в конкретных фармацевтических препаратах, описанных в настоящем документе) и препарат наносили на место поражения раз в три дня, что создавало эффективную дозу около 13 мкг LL-37 на 1 см площади пораженного участка, что соответствует около 4,3 мкг LL-37 в расчете на 1 см пораженного участка в каждый день применения. Аналогично, концентрация 1.6 мг/мл дает эффективную дозу 13,3 мкг/см в каждый день применения. Однако концентрация 3,2 мг/мл, обеспечивавшая дозу 26,7 мкг/см в каждый день применения, не приносила клинически выраженной пользы.
В связи с этим можно предсказать, что концентрации LL-37 ниже чем около 0,5 мг на 1 мл того же определенного носителя при более частом применении (например, ежедневном) могут обеспечить большее доступное в участке поражения количество LL-37 и тем самым дать больший клинический эффект при лечении язвы. То же относится к концентрациям около 3,2 мг/мл или больше в том же определенном носителе при применении реже, чем один раз в три дня.
Аналогично, если при лечении язвы используется другой препарат (например, препарат с более длительным и/или медленным высвобождением), то доступное в пораженном участке количество LL-37 в каждый момент времени будет меньше, чем в случае использования препаратов, представленных в качестве конкретных примеров ниже в настоящем документе. Это приведет к тому, что при лечении язвы количество LL-37, доступное в пораженном участке в каждый момент времени, будет меньше. Соответственно, в таком препарате можно брать изначально более высокую LL-37, чтобы обеспечить равноценное доступное в пораженном участке количество LL-37 в любой конкретный момент времени. Кроме того, для достижения того же эффекта такой препарат можно применять менее часто.
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ лечения хронических язв, который включает:
(а) местное применение (нанесение на указанную язву) фармацевтического препарата, содержащего LL-37 и один или более фармацевтически приемлемых разбавителя или носителя с последующим
(b) наложением повязки,
причем указанное применение указанного препарата обеспечивает дозу LL-37 в пораженном участке ниже около 26,7 мкг (например, дозу ниже значения от около 13,3 мкг до около 26,7 мкг) в расчете на 1 см площади пораженного участка в каждый день применения для лечения указанной язвы.
Фармацевтический препарат, применимый в способе по данному изобретению, может быть составлен для местного применения таким образом, чтобы его можно было наносить непосредственно (как описано в настоящем документе) на язву. Примерами таких препаратов (не ограничивающимися перечисленным здесь) являются жидкие и полутвердые препараты, включая растворы, суспензии, эмульсии, кремы, гели или лосьоны, при условии, что препарат при комнатной температуре (например, при температуре от около 20°С до около 25°С) и атмосферном давлении (например, при давлении около 1 атм) обладает достаточной вязкостью, чтобы физически оставаться прилипшим к смазанному им месту.
Жидкий или полутвердый препарат по данному изобретению при комнатной температуре и атмосферном давлении должен быть вязким, а не свободно текучим, например под действием силы тяжести. Однако его вязкость при указанных условиях не должна быть так велика, что из-за густоты его невозможно нормально распределить по больному месту вручную с разумным нажимом, используя подходящий медицинский инструмент. Препараты по данному изобретению можно также наносить на пораженный участок путем разбрызгивания, используя соответствующие устройства (например, пульверизатор или аэрозольный баллончик), обеспечивающие распределение определенной дозы на единицу площади пораженного участка (см., например, заявку на международный патент WO 2011/056116).
Таким образом, вязкость, пригодная для препаратов по данному изобретению, которая зависит от того, какие эксципиенты входят в состав препарата, должна быть в диапазоне от около 1 паскаль-секунда (Па с) до 100 Па с, например около 50 Пас, например около 25 Па с, включая около значения 15 Па с или около 10 Па с. Приведенные значения вязкости представляют динамическую вязкость при комнатной температуре (как определено в настоящем документе) и атмосферном давлении (как определено в настоящем документе), измеренную с помощью стандартного вискозиметра или реометра.
В число фармацевтических препаратов, которые можно использовать для обработки язв LL-37, входят водные растворы. Под водным раствором здесь понимается раствор с физиологически или фармацевтически приемлемыми свойствами (включая рН, ионную силу, осмотическое давление и проч.). Например, можно использовать физиологически изотоничные растворы, содержащие воду или другие биологически совместимые растворители, водные растворы, например физиологический солевой раствор, раствор глюкозы и вещества, образующие гидрогель. Водный раствор может быть забуференным, например, содержать ацетатную буферную систему.
Фармацевтический препарат по данному изобретению может также содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, например, консерванты для предотвращения микробного роста, антиоксиданты, агенты, влияющие на осмотическое давление, красители и проч. В водных суспензиях композиция по данному изобретению может быть объединена с суспендирующими и стабилизирующими агентами.
В одном из аспектов данного изобретения LL-37 растворен в водном растворителе (воде или ацетатном буферном растворе) и в этот раствор добавлен подходящий загуститель для обеспечения должной вязкости, чтобы получился хорошо распределяющийся мягкий гель, крем или лосьон на водной основе
В состав препаратов по данному изобретению в форме водных растворов помимо LL-37 могут также входить загустители, чтобы получался крем, гель или лосьон достаточной вязкости, как описано выше. Пригодные для этого агенты включают вещества, образующие гидрогели, в том числе синтетические полимеры, например поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полиакриловую кислоту, полиэтиленгликоль, такие блок-сополимеры, как полоксамеры, и проч.; полусинтетические полимеры, например, эфиры целлюлозы, в том числе карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гилдроксипропилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, этилгидроксиэтилцеллюлозу и проч.; природные камеди, например аравийскую камедь, каррагенаны, хитозаны, пектины, крахмал, ксантановую камедь и проч. В числе таких материалов можно также упомянуть поливиниловые спирты фармацевтически приемлемой степени очистки (например, со степенью гидролиза в диапазоне от около 70% до около 99% (например, от около 85% до около 89%), и молекулярной массой в диапазоне от около 15000 до около 130000).
Предпочтительно использовать такие составы препаратов по данному изобретению, которые обладают адгезивностью в отношении биологических тканей и слизистых.
Важно, что обладая представленной в настоящем документе существенной информацией относительно максимального количества LL-37 в расчете на единицу площади пораженного места (в день применения), специалист в данной области техники сможет с помощью обычных приемов определить (с учетом используемых эксципиентов - разбавителей, носителей, загустителей и других ингредиентов) должную концентрацию LL-37 в конкретном препарате, необходимую для обеспечения нужной его дозы в расчете на единицу площади обрабатываемого участка (в день применения).
Например, препарат по данному изобретению можно подвергнуть биологическому методу анализа на активность LL-37 и сравнить с активностью LL-37 в физиологическом растворе, забуференном фосфатом (PBS). Биологический метод анализа может представлять собой определение противомикробного действия или реакции культивируемых эукариотических клеток. Для расчета коэффициента дозирования можно использовать ту концентрацию LL-37 в испытываемом препарате по данному изобретению, при которой его биологический эффект эквивалентен таковому определенной концентрации LL-37 в PBS (например, 10 мкг/мл). Например, если при концентрации LL-37 в испытываемом препарате по данному изобретению около 20 мкг/мл достигается такой же биологический эффект, какой дает раствор LL-37 в PBS концентрацией 10 мкг/мл, то коэффициент дозирования составляет около 2, откуда следует, что концентрацию LL-37 в данном препарате можно удвоить и тем самым обеспечить желаемую дозу LL-37 в расчете на единицу площади пораженного участка.
Специалисту в данной области техники ясно, что описанный выше простой подход не применим в том случае, когда один или более из используемых в данном препарате эксципиентов взаимодействует с LL-37 таким образом, что сводит на нет его влияние, существенно препятствует его переходу из препарата в больное место и/или дает синергический эффект, в результате чего доза LL-37 в расчете на единицу площади пораженного места (в день применения) выходит за указанные выше пределы. С другой стороны, если тот или иной эксципиент в составе препарата по данному изобретению обеспечивает замедленное высвобождение LL-37 из препарата, то это следует учитывать при расчете нужной концентрации, как описано выше.
В способах/применениях по данному изобретению фармацевтический препарат, содержащий LL-37, описанный в настоящем документе, вначале применяется непосредственно (то есть без промежуточных этапов) и местно на пораженный участок (язву), как описано выше. Затем, отдельно от нанесения препарата по данному изобретению, на больное место делается повязка. Это последующее отдельное наложение повязки совершается на промежуток времени не менее чем 5 минут, например на 10 минут (чтобы дать возможность LL-37 связаться с пораженной тканью), но повязка может быть наложена и на около 20 минут, например на около 30 минут.
Используемые при этом перевязочные материалы могут быть инертными (то есть практически не токсичными) материалами, пригодными для использования при ведении ран и/или способными помогать процессу заживления (например, ускорять его) и/или предотвращать инфицирование раны. Например, перевязочный материал может способствовать регенерации эпителия и/или заживлению эпителиальной и/или соединительной ткани в области раны. В одном из воплощений данного изобретения продукт для ухода за ранами может усиливать пролиферацию эпителиальных и/или соединительнотканных клеток.
Перевязочный материал, используемый по данному изобретению, также может впитывать раневое отделяемое.
Таким образом, перевязочный материал, используемый по данному изобретению, представляет собой материал, выбираемый из группы, состоящей из альгинатов, листовых гидрогелей, гидроволокон, пены и их смесей.
Кроме того, перевязочные материалы, способные впитывать раневое отделяемое, включают гидроколлоиды, материалы на основе коллагена, материалы на основе гиалуроновой кислоты, декстраномер, декстраномер/кадексомер и окисленную регенерированную целлюлозу.
Перевязочный материал, используемый по данному изобретению, обычно представлен в виде твердого сухого нетканого листа, лиофилизованного листа, ленты или жгута и особенно пригоден для ведения ран с обильным отделяемым.
Примеры имеющихся в продаже повязок на основе альгинатов включают супрасорб (Suprasorb; Sammons Preston, США) и калтостат (Kaltostat; ConvaTec, Великобритания).
Повязка, используемая по данному изобретению, может содержать листовой гидрогель или состоять из него. Такой перевязочный материал для ухода за ранами особенно пригоден для ведения ран с незначительным отделяемым. Пригодный листовой гидрогель может содержать один или более образующих гидрогель полимеров, выбираемых из группы, состоящей из синтетических полимеров, например полиуретанов, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, полиакриловой кислоты, полиэтиленгликоля, блок-сополимеров типа полоксамеров и проч.; полусинтетических полимеров, например эфиров целлюлозы, в том числе карбоксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гилдроксипропилцеллюлозы, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, этилгидроксиэтилцеллюлозы и проч.; природных камедей, например аравийской камеди, каррагенанов, хитозанов, пектинов, крахмала, ксантановой камеди и проч.; и альгинатов.
Примеры имеющихся в продаже листовых гидрогелей включают эластогель (Elastogel; Southwest Technologies Inc., США) и супрасорб (Suprasorb G; Sammons Preston, США).
В качестве перевязочного материала по данному изобретению можно также использовать повязки, содержащие гидроволокна или состоящие из них. Продукты для ухода за ранами, содержащие такой перевязочный материал, обычно представлены в виде сухих нетканых листов, лиофилизованных листов, лент или жгутов и особенно пригодны для использования в случае ран с отделяемым от слабого до обильного или ран, в которых имеются как сухие, так и влажные участки.
Пригодные для использования по данному изобретению гидроволокна содержат карбоксиметилцеллюлозу или состоят из нее и включают аквацел (Aquacel; ConvaTec, Великобритания), версиву (Versiva; ConvaTec, Великобритания) и солвалин N (Solvaline N; Activa Healthcare, Великобритания).
В качестве перевязочного материала по данному изобретению можно также использовать повязки, содержащие полиуретановую пену или состоящие из нее, например линейки продуктов аллевин (Allevyn; Smith & Nephew, Великобритания), мепилекс (Mepilex; , Швеция) и тегадерм (Tegaderm; 3М, Великобритания).
До использования фармацевтические препараты и перевязочный материал по данному изобретению должны быть стерилизованы и упакованы в емкости, непроницаемые для микроорганизмов. Стерильность препаратов и повязок достигается способами, известными в данной области техники, например, их изготовляют в асептических условиях и/или облучают готовый продукт.
Как говорилось выше, перевязочный материал должен быть инертным и никак не взаимодействовать с LL-37, например, не вызывать его разрушения ни химически, ни физически.
Перевязочные средства, используемые по данному изобретению, могут также или в порядке альтернативы содержать синтетические полимеры, крахмал и/или полисахариды. Например, повязка может содержать водный полимерный матрикс, производное целлюлозы, сополимер акрилата, камедь, полисахарид и/или полимер молочной кислоты. Такие материалы могут быть водорастворимыми или перфорированными.
В способах/применениях по данному изобретению фармацевтический препарат, содержащий LL-37, описанный в настоящем документе, наносится непосредственно на язву в должной дозе, как описано выше, и после этого на пораженное место накладывается повязка, покрывающая обработанный участок.
При необходимости поверх первой повязки накладывается вторая из обычного перевязочного материла. Также в некоторых случаях между поверхностью язвы и основной повязкой размещается проницаемая не прилипающая повязка.
После наложения повязки предпочтительно использовать подходящие компрессионные средства, в том числе пластичный мягкий и впитывающий материал типа ваты целлона (Cellona; Activa, Великобритания) или прокладки соффбан Soffban (Smith & Nephew, Великобритания), компрессионные повязки, например эластичный бинт комприлан (Comprilan; Smith & Nephew) и/или компрессионное белье, например чулки ZipZoc (Smith & Nephew).
Специалистам в данной области техники понятно, что прежде чем осуществлять способ/применения по данному изобретению, может понадобиться удалить мертвые, поврежденные или инфицированные ткани (провести санацию раневой полости -иссечение и удаление некротических тканей), обработать соответствующим образом (антисептиками) инфицированные участки, очистить поверхность пораженной области, используя подходящий очищающий агент (например, воду) и обсушить ее, например с помощью марлевых салфеток. Также перед применением способа по данному изобретению может быть проведен кюретаж.
Предпочтительно, чтобы препарат и/или повязка по данному изобретению и обладали способностью предотвращать, ликвидировать, сокращать или иным образом ослаблять микробный рост в области поражения. Таким образом, препараты, используемые в способе/применениях по данному изобретению, могут также содержать какое-либо противомикробное вещество, например полипептид, выбираемый из группы, состоящей из дефенсинов, грамицидина S, маганина, цекропина, гистатина, гифансина (пептида из Hyphantria cunea), циннамицина, бурфорина 1, паразина 1, протаминов и их фрагментов, вариантов и слитых пептидов, которые обладают, по меньшей мере частично, противомикробной активностью исходного пептида; а также серебро, сульфадиазин серебра, полигексанид, иод или метронидазол.
Ясно, что в способе/применениях по данному изобретению препараты, повязки и/или компрессионные средства, используемые для ухода за раной, нужно регулярно заменять, чтобы способствовать процессу заживления и предотвращать инфекции.
В настоящем документе слово «около» употребляется, в частности, применительно к количествам, в том числе дозам LL-37 и концентрациям в препаратах, промежуткам времени, значениям вязкости, коэффициентов дозирования, степени гидролиза, молекулярной массы и проч. Во всех этих случаях подразумевается, что значения этих и подобных переменных величин приблизительны и могут отличаться на ±10%, например на ±5%, предпочтительно на ±2% (например, на ±1%) от значений, приведенных в настоящем документе.
Способ/применения по данному изобретению обеспечивают легко изготавливаемые и недорогие средства ухода за ранами, которые позволяют эффективно лечить хронические раны, в том числе трофические язвы, обусловленные венозной недостаточностью, диабетические язвы стопы и подобные поражения.
Способ/применения по данному изобретению также обладают тем преимуществом, что они осуществляются с использованием сложившихся методов фармацевтической переработки и материалов, получивших официальное одобрение к использованию в пищевых и фармацевтических продуктах, медицинских устройствах или имеющих аналогичный статус.
Способ/применения по данному изобретению также обладают тем преимуществом, что они могут быть более эффективными, обладать меньшими побочными эффектами, лучше переноситься пациентами, характеризоваться лучшими фармакокинетическими показателями и/или иметь другие полезные фармакологические, физические или химические свойства по сравнению со способами, известными в данной области техники - будь то для лечения хронических ран, включая трофические язвы, обусловленные венозной недостаточностью, диабетические язвы стопы или иные случаи применения.
Данное изобретение иллюстрируется приведенными далее примерами и фигурой 1, демонстрирующей результаты оценки путем анализа по правилу сломанной трости скорости заживления ран (не заживающих трофических язв, обусловленных венозной недостаточностью) при их обработке препаратами, содержащими различные концентрации LL-37; на этом рисунке сплошной линией изображены данные для группы пациентов, получавших плацебо, пунктирной линией - для тех, кто получал препарат с концентрацией LL-37 3,2 мг/мл, более мелким пунктиром - данные для концентрации LL-37 1,6 мг/мл, точками - для концентрации LL-37 0,5 мг/мл.
Пример
Двойное слепое плацебо-контролируемое рандомизированное экспериментальное исследование безопасности и влияния величины дозы на эффективность LL-37 при незаживающих трофических язвах нижних конечностей, обусловленных венозной недостаточностью
Было проведено двойное слепое плацебо-контролируемое рандомизированное экспериментальное исследование I/II фазы безопасности и влияния величины дозы на эффективность LL-37 на людях. Первый пациент был привлечен в августе 2012 г., работа с последним пациентом завершилась в апреле 2013 г.
Это исследование было разработано, проведено в трех центрах в Швеции и представлено к отчету в соответствии с согласованным трехсторонним руководством Международной конференции по гармонизации (ICH) применительно к правилам надлежащей клинической практики (GCP) с учетом необходимых местных установлений и этических принципов, изложенных в Хельсинской декларации по доклиническим и клиническим исследованиям.
Критерии отбора
В этом исследовании принимали участие мужчины не младше 18 лет или женщины в постклимактерическом периоде либо клинически стерильные с трофическими язвами нижних конечностей, обусловленными венозной недостаточностью, или с комбинированными венозно-артериальными язвенными поражениями с преобладанием венозного компонента.
К участию в исследовании не допускались пациенты, у которых имелись предназначенные к лечению язвы с преобладанием иной этиологии, нежели у трофических язв, обусловленных венозной недостаточностью, и те индивиды, у которых имелось злокачественное заболевание (кроме базально-клеточной карциномы), если только ремиссия не составляла не менее 5 лет.
Было получено официальное одобрение Агентства по продукции медицинского назначения (MPА) Швеции и местного Комитета по этике, а также информированное согласие испытуемых, представленное в письменном виде, после чего провели скрининг 56 участников исследования и вводное открытое исследование продолжительность 3 недели.
2
2
2
2
В число поражений, предназначенных к наблюдению, первоначально не включали язвы площадью более 30 см и менее 2 см. Однако, чтобы увеличить процент ввода и сократить суммарное время исследования, критерии были изменены после рандомизации 21 пациента, и исключали язвенные поражения площадью более 40 см и менее 1 см. Если у подходящего индивида оказывалось более одного пораженного места, удовлетворяющего критериям ввода, то в расчет брали то, которое имело наиболее подходящие в контексте данного исследования размеры и локализацию. У каждого из участников исследования лечению подвергалось только одно пораженное место (язва).
На протяжении 3-недельного вводного периода пациентам раз в три (±1) дня и не более чем два раза в неделю делали шесть (в сумме) аппликаций плацебо-препарата (см. ниже) в сочетании со стандартной компрессионной повязкой (согласно определению Агентства по продукции медицинского назначения Швеции), включавшей эластичный бинт и необходимый для впитывания раневого экссудата перевязочный материал.
Если в течение вводного периода сокращение площади язвенного поражения было больше, чем от 7% до 13% (в зависимости от размера) в неделю по сравнению с имевшим место значением площади данного пораженного места в начале вводного периода, то язва не характеризовалась как не заживающая (в контексте данного исследования). В таких случаях пациент исключался из исследования и считался не прошедшим скрининг.
По истечении вводного периода 34 индивида, удовлетворявшие критериям отбора, прошли обследование для определения исходного состояния, после чего была проведена рандомизация на предмет получения активного лечения (в трех вариантах, различавшихся по интенсивности воздействия) либо плацебо.
Препараты и воздействие
После вводного периода начинался период лечения продолжительностью 4 недели, в который входило 8 посещений, во время которых пациент получал тот или иной препарат, и завершающее посещение спустя 3 (±1) дня после последнего воздействия. Для последующего наблюдения назначалось еще одно посещение через 4 недели (±1-7 дней) после окончания лечения.
Участники исследования случайным образом распределялись на четыре группы: в одной из них пациенты получали плацебо, в трех остальных - LL-37 (три варианта, различавшиеся по интенсивности воздействия).
Перед началом лечения предназначенное для наблюдения в ходе исследования раневое ложе подготавливали путем хирургической очистки от нежизнеспособных тканей, лечения клинической инфекции и подбора наиболее подходящего перевязочного материала (см. ниже). Пораженное место промывали водой из-под крана, осторожно обсушивали марлевыми салфетками и при необходимости делали кюретаж. Все это делалось до применения испытываемого продукта либо плацебо.
Использовали стерильный водный концентрированный раствор LL-37 в концентрациях 2,5; 8 либо 16 мг/мл, разлитый по 0,7 мл в запаянные стеклянные емкости (APL, , Швеция), которые хранили при температуре от 2 до 8°С. Непосредственно перед нанесением на пораженное место содержимое указанной емкости разводили до объема 5 мл вязким разбавляющим раствором, содержавшим 13,1% (масса/масса) поливинилового спирта в солевом растворе, забуференном ацетатом (APL АВ), до конечной концентрации 0,5; 1,6 или 3,2 мг/мл соответственно. Плацебо содержало тот же раствор, но без LL-37.
2
Разбавленный вязкий раствор LL-37 (активное лечение в трех разных по интенсивности вариантах соответственно указанным концентрациям LL-37) применяли местно: наносили в центр очищенной и обсушенной язвы в количестве 25 мкл/см с помощью градуированного шприца объемом 1 мл и распределяли равномерно по всей поверхности язвенного поражения с помощью круглой головки плунжера шприца, который использовали для смешивания испытываемого препарата.
Через 5 минут после описанной процедуры (это время требовалось, чтобы не дать препарату - с LL-37 или плацебо - сразу впитаться в перевязочный материал) накладывали повязку и компрессионное средство.
В случае язв с умеренным или обильным отделяемым для повязки использовали перевязочный материал на основе полиуретановой пены, который обладает высокой впитывающей способностью, например мепилекс (Mepilex), аллевин (Allevyn) и тегадерм (Tegaderm). Или же брали впитывающую гидроволоконную повязку аквацел (Aquacel). В случае язв с незначительным отделяемым использовали не прилипающие повязки (с липким краем или без него): солвалин N (Solvaline N) или комбинированная полиуретаново-гидроволоконная повязка версива (Versiva). В случае поражений без отделяемого (сухих язв) использовали гидроволоконную повязку аквацел (Aquacel).
Указанные материалы дополняли марлевыми салфетками и прокладками, чтобы снять компрессионную нагрузку с чувствительных участков. Использовали мягкие пластичные впитывающие прокладки из 100%-ной вискозы, в том числе Cellona или Soffban. Чаще всего в данном исследовании использовали компрессионную повязку комприлан (Comprilan). Ногу обматывали начиная от кончиков пальцев двумя бинтами (шириной 8 и 10 см), растягивая их приблизительно на 50% и деля спиральные витки вплоть до колена. Или же использовали медицинское белье (чулки ZipZoc), которое дополняли самоклеящейся повязкой коплюс (Coplus) или сходным продуктом; или использовали эластичные бинты Profore Lite в сочетании с упомянутым выше перевязочным материалом. Можно также использовать эластичные бинты большой растяжимости типа «Dauer». Поскольку такие повязки создают значительное давление и в состоянии покоя, их на время - на ночь или на достаточно продолжительный период отдыха - снимали.
Дополнительное воздействие включало определенные кремы для местного применения при кожных проблемах. Использовали цинковую пасту или защитную пленку кавилон (Cavilon), которыми покрывали кожу вокруг язвы, чтобы предотвратить мацерацию кожи близ краев язвы. В случае экземы вокруг язвы применяли гирокортизоновый крем или мазь (местные кортикостероидные препараты I группы или крем, содержащий гидрокортизон и имидазол). Если кожа в области язвенного поражения была сухая и шелушилась, применяли кремы канодерм (Canoderm) или пропидерм (Propyderm).
Описанные выше процедуры повторяли раз в 3 (±1) дня на протяжении 4 недель периода лечения (не более двух раз в неделю); всего получалось 8 эпизодов воздействия.
После периода лечения проводилось последующее наблюдение пациентов в течение 4 недель (±1-7 дней).
В ходе исследования оценивали скорость заживления язвенного поражения, боль в пораженном месте во время наложения повязки и в течение предшествовавших этому 24 часов, используя визуальную аналоговую шкалу (VAS). Отмечались все случаи полного заживления, хотя в этом аспекте не ожидалось статистически значимых результатов, поскольку данное исследование относительно непродолжительное и выборка маленькая. Для получения свидетельств о степени заживления в ходе исследования регулярно определяли размеры язвенного поражения. При каждом посещении пациента измеряли площадь пораженного участка, используя планиметрическое устройство Visitrak™; оценивали боль в пораженном месте и отмечали свойства поражения (запах, некротические массы и их отторжение, грануляции). Состояние язвы документировали фотографиями.
При каждом посещении пациента оценивали негативные явления и местную переносимость лечения. Участников исследования просили сообщать о любых негативных явлениях и снабжали их специальной карточкой с номером телефона, по которому нужно было сообщать о существенных негативных явлениях. У пациентов также брали кровь на анализ для оценки безопасности лечения и определения антител против LL-37. Отмечали изменения в результатах лабораторных анализов, основных показателях состояния организма и делали анализ на образование аутоантител против LL-37.
Конечные точки безопасности включали:
- число случаев тяжелых местных реакций в области язвенного поражения и окружающей его кожи, оцениваемых по клиническим признакам воспаления (отек, краснота, запах, повышение температуры) или раздражения кожи (шелушение, краснота, высыпания - папулы, пузырьки, пустулы); каждую местную реакцию оценивали по балльной шкале от 0 до 3;
- число случаев более чем 30%-ного увеличения площади поражения по сравнению с исходным состоянием (на момент посещения, при котором проводили рандомизацию);
- изменения данных лабораторных анализов и основных показателей состояния организма по сравнению с исходными значениями;
- общее число негативных явлений.
Конечные точки эффективности включали:
- скорость заживления язвенного поражения за период исследования;
- число язв, площадь которых сократилась более чем на 30% по сравнению с исходным состоянием (на момент посещения, при котором проводили рандомизацию);
- изменения местной боли по шкале VAS (от 0 до 10)
- изменения свойств поражения по балльной шкале (от 0 до 3) (некротические массы и их отторжение, экссудат, грануляции, некроз) по сравнению с исходным состоянием.
Анализ данных

Статистический анализ выполняли с помощью программы SAS software (версия 9.2 или обновленная; SAS Institute, Кэрри, шт. Северная Каролина, США).
Для каждого участника исследования моделировали площадь язвенного поражения во времени, чтобы оценить скорость заживления на протяжении периода лечения и связь между скоростью заживления и дозой действующего вещества.
Для каждой из указанных выше четырех групп пациентов определяли удельную скорость заживления (то есть изменение площади пораженного участка или преобразованной величины площадь/сутки) с 95%-ным доверительным интервалом. Данным соответствовала модель экспоненциального спада с двумя параметрами, представляющими исходную площадь пораженного участка и скорость заживления. Модель описывается формулой
-βt
Y=α×e,
где α - исходная площадь пораженного участка (на момент посещения, при котором проводили рандомизацию), β - уменьшение размеров пораженного участка, выраженное как скорость заживления в сутки, Y - площадь пораженного участка, t - время (в сутках), прошедшее с момента посещения, при котором проводили рандомизацию.
Проводили также дополнительный анализ, включавший все данные за вводный период, для оценки влияния использовавшихся в исследовании воздействий на процесс заживления. При этом применяли «правило сломанной трости», аппроксимирование данных за период до рандомизации и за период после рандомизации линейной зависимостью реакции от времени после соответствующего преобразования данных (например, логарифмирования, извлечения квадратного корня).
При возможности данные по балльной оценке боли анализировали, используя анализ с повторными измерениями, чтобы оценить суммарную разницу между воздействиями во времени. Эта модель включала параметры для воздействия, времени и связи между ними.
Число случаев любых негативных явлений оценивали, используя долю (в процентах) пациентов в каждой группе, испытывавших по меньшей мере один эпизод негативного явления, с 95%-ным доверительным интервалом. Доверительный интервал рассчитывали, используя способ, подробно описанный в работе Altaian et al, Statistics with Confidence, BMJ Publication Group (2000), который подходил для небольших выборок или малого числа случаев. При возможности определяли связь между числом случаев негативных явлений и дозой действующего вещества. Для пациентов, получавших LL-37, определяли суммарное число случаев местных реакций 3-й степени (тяжелых) с 95%-ным доверительным интервалом. Данные лабораторных анализов представляли в виде графиков, построенных по значениям, полученным после воздействия, против исходных значений с референсным диапазоном. Результаты
Всего в ходе исследования полный курс лечения из восьми процедур получил 31 пациент. Из остальных трех человек двоим (из группы, в которой пациенты получали LL-37 в концентрации 0,5 мг/мл) сделали семь процедур и одному (из группы, в которой пациенты получали плацебо) - три процедуры.
Модель экспоненциального спада применительно к площади язвенного поражения хорошо соответствовала полученным данным.
Для дозы LL-37 0,5 мг/мл удельная скорость заживления (0,039) значительно отличалась от таковой в группе пациентов, получавших плацебо (0,007; р=0,003), представляя более быстрое сокращение площади пораженного участка (то есть лучшее заживление). Использовали нелинейную модель смешанных эффектов и рассчитывали значимость разницы между параметрами по оценке разницы и стандартной ошибке; полученный результат сравнивали с t-распределением.
Значение удельной скорости заживления, полученное для концентрации LL-37 1,6 мг/мл (0,019), также представляло более быстрое сокращение площади поражения по сравнению с группой пациентов, получавших плацебо, хотя и не было статистически значимым на уровне достоверности 5% (р=0,09). Между результатами, полученными для группы, в которой пациенты получали самую высокую дозу LL-37 (удельная скорость заживления 0,04), и для группы, в которой пациенты получали плацебо, не было статистически значимой разницы. Результаты, полученные для групп, в которых пациенты получали низкую и среднюю дозы LL-37, статистически не различались. Полученные значения удельной скорости заживления и среднего сокращения площади поражения для каждой из четырех групп пациентов приведены в таблице 1 ниже.
2
В целом, наибольшее сокращение площади поражения отмечалось при концентрации LL-37 1,6 мг/мл во всех случаях посещений пациентов. Среднее значение сокращения площади поражения для концентрации LL-37 1,6 мг/мл составило 5,29 см за период от момента рандомизации до окончания исследования (см. таблицу 2 ниже).
SD - стандартное отклонение; окончание исследования - посещение в период последующего наблюдения приблизительно через 4 недели после последней процедуры.
По модели экспоненциального спада удельная скорость заживления для группы пациентов, получавших самую низкую дозу LL-37 (0,5 мг/мл), отличалась от таковой для группы, в которой пациенты получали плацебо, в 6 раз, а для группы, в которой пациенты получали среднюю дозу LL-37 (1,6 мг/мл), - в 3 раза (р=0,003 для 0,5 мг/мл и р=0,088 для 1,6 мг/мл). Препараты с этими концентрациями LL-37 обеспечивали более быстрое сокращение площади поражения и, тем самым, лучшее заживление. Однако между результатами лечения в группе, в которой пациенты получали самую высокую дозу LL-37 (3,2 мг/мл), и тем, что наблюдалось в группе, в которой пациенты получали плацебо, разницы в скорости заживления не было.
Чтобы включить данные, полученные в вводном периоде исследования, и установить, влияет ли предпринятое лечение на скорость заживления, был проведен анализ по правилу сломанной трости; полученные результаты согласовались с остальными результатами. Как показано на фиг. 1, в период после рандомизации при обеих более низких дозах LL-37 (0,5 мг/мл и 1,6 мг/мл) наблюдалось большее сокращение площади поражения, чем во вводном периоде, что свидетельствовало о статистически значимом улучшении заживления по сравнению с периодом до лечения (р<0,001 и р=0,011 для 0,5 мг/мл и 1,6 мг/мл соответственно). Для самой высокой дозы LL-37 (3,2 мг/мл) и плацебо существенной разницы между характером заживления язвенного поражения в вводном периоде и в период лечения (после рандомизации) не было. Скорость изменений в вводном периоде была близка к нулю, чего и следовало ожидать, поскольку те пациенты, у которых в вводном периоде наблюдалось заживление, исключались из исследования.
Выводы
2
2
В ответ на применение LL-37 в невысоких дозах (0,5 мг/мл и 1,6 мг/мл) наблюдалось выраженное значительное улучшение заживления язвенного поражения. Результаты описанного исследования позволяют считать, что обработка язв раз в три дня препаратами, содержащими LL-37 в концентрациях 0,5 мг/мл (что соответствует 13 мкг LL-37 на 1 см площади пораженного участка) и 1,6 мг/мл (что соответствует 40 мкг LL-37 на 1 см площади пораженного участка), приводит к значительному стимулированию заживления поражения. Также может оказаться оптимальным более частое применение в более высокой дозе.