Гетерогенные биокатализаторы на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в золь-гель матрицу, как биораспознающие элементы биосенсоров

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2013. Вып. 1. С. 215-222

Химия

УДК 543.9:663:664

Гетерогенные биокатализаторы на основе глюкозооксидазы, иммобилизованной в золь-гель матрицу, как биораспознающие элементы биосенсоров *

О. А. Каманина, Т. В. Рогова, О. А. Соколова

Аннотация. Проведена иммобилизация фермента глюкозоокси дазы в гибридные кремнийорганические золь-гель матрицы на основе тетраалкоксисилана, полиэтиленгликоля при варьировании количества гидрофобной добавки метилтриалкоксисилана от 0 до 100% от общего объема этоксипроизводных кремния. Изучено влияние состава кремнийорганических матриц на характеристики гетерогенных биокатализаторов при амперометрическом определении глюкозы с помощью биосенсора. Показано, что наилучшими характеристиками обладает гетерогенный биокатализатор с содержанием гидрофобной добавки 83% (предел обнаружения глюкозы 2 мкмоль/дм3). Проведена апробация биосенсора на основе выбранного рецепторного элемента путем анализа различных образцов вин биосенсорным методом, в качестве референтного метода использовалось иодометри-ческое титрование.

Ключевые слова: биосенсор, гетерогенный биокатализатор, глюкозооксидаза, золь-гель инкапсулирование, бимодальные кремнийор-ганические матрицы.

Введение

Иммобилизация ферментов и клеток микроорганизмов является эффективным подходом к решению задач по интенсификации и повышению экономической привлекательности современных биотехнологических процессов, поскольку позволяет длительно использовать один и тот же биокатализатор, при этом техническое решение таких процессов существенно упрощено по сравнению с процессами на основе свободных (суспензионных) клеток или ферментов [1]. Для иммобилизации биоматериала предложено множе-

* Работа выполнена в рамках гранта ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (соглашение № 14.B37.21.1231, госконтракт № 16.740.11.0766).

ство подходов и методов, каждый из которых имеет свои преимущества и ограничения [2]. Среди различных методов иммобилизации биоматериала в последние 20 лет [3] инкапсулирование в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы привлекает особый интерес из-за простоты исполнения, экспрессности, не токсичности, постоянства занимаемого носителем объема вне зависимости от состава среды, сохранения биологической активности ферментов, низкой стоимости и доступности прекурсоров [4]. Бимодальные матрицы имеют два вида пор: микропоры (0,3-5 мкм, 0,5-8 мкм) и нанопоры (2-20 нм) [5]. Размер кремниевого скелета и поры могут быть проконтролированы изменением условий реакции, включая природу прекурсоров и поро-образователя. Иммобилизованные в золь-гель матрицы ферменты и клетки можно использовать для создания биораспознающих элементов биосенсоров. В литературных источниках описано применение золь-гель матриц для инкапсулирования ферментов глюкозооксидазы [6, 7], ацетилхолинэстеразы [8] и целых клеток микроорганизмов [9] при создании оптических биосенсоров. Окислительно-восстановительные процессы, катализируемые оксидоредук-тазами можно регистрировать с помощью электрохимических преобразователей, например с помощью кислородного электрода. Первый биосенсор, созданный Кларком в 1953 году, представлял собой потенциостат с кислородным электродом и глюкозооксидазой закрепленной на его поверхности полупроницаемой мембраной. Простота конструкции и функционирования такого биоаналитического устройства с одной стороны, и получаемый массив количественной информации с другой стороны, позволяет использовать его для изучения свойств гетерогенных биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток микроорганизмов или ферментов.

В работе исследовали влияние гидрофобной добавки метилтриалкоксиси-лана на стабильность и чувствительность гетерогенных биокатализаторов — иммобилизованной в кремнийорганическую золь-гель матрицу глюкозоокси-дазы. Свойства разрабатываемых биокатализаторов определяли с помощью биосенсора на основе кислородного электрода.

Материалы и методы

Характеристика фермента глюкозооксидазы. В настоящей работе был использован фермент глюкозооксидаза (ГО), выделенный из Aspergillus niger (ИБФМ РАН) с активностью 220 Е/мг.

Формирование рецепторных элементов. К 100 мкл 20 % раствора полиэтиленгликоля 3000 (ПЭГ) («Ferak Berlin», Германия) в фосфатном буферном растворе (pH 6,0, 30 мМ) прибавляли 250 мкл раствора глюкозооксидазы. Полученный раствор перемешивали в течение 3 мин, после чего добавляли 500 мкл смеси тетраалкоксисилана («Sigma», США) и метилтри-алкоксисилана («Sigma», США) и вновь перемешивали в течение 3 мин. В работе варьировали содержание гидрофобной добавки метилтриалкоксисилана относительно тетраалкоксисилана: 0%, 33%, 67%, 83% и 100%. К раствору

добавили 25 мкл 0,2 М раствора основного катализатора NaF. Полученную смесь перемешивали 15 мин, отбирали 5 мкл, наносили на стекловолоконный фильтр GF/A («Whatman», Великобритания) и подсушивали 15 минут. Полученный рецепторный элемент наносили на кислородный электрод, перед использованием промывали в 30 мМ фосфатном буферном растворе (рН 6,0, 30 мМ) в течение 5 мин.

Амперометрические измерения. Исследования проводили на биосен-сорной установке, основными элементами которой являются кислородный электрод Кларка и гальванопотенциостат IPC 2000 (ООО НТФ Вольта, Россия). Между полупроницаемой мембраной электрода и защитным колпачком помещали рецепторный элемент с иммобилизованным ферментом ГО. Измерения проводили при рабочем потенциале -700 мВ в кювете объемом 4 мл с использованием натрий-калиевого фосфатного буферного раствора (рН 6,0, концентрация солей 30 мМ). Ввод пробы осуществляли автоматическими микропипетками переменного объема (20-200 мкл, 200-1000 мкл) («Biotech», США). Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстрата (нА/мин).

Результаты и обсуждение

Процесс формирования золь-гель матрицы на основе тетраалоксисила-на представляет собой последовательное образование на стадии гидролиза гидроксоалкоксопроизводных, а затем при поликонденсации — оксоалкоксо-производных в присутствии основного катализатора [12]. Внесение в качестве порообразователя ПЭГ на стадии гомогенного раствора позволяет получать бимодальные матрицы содержащие два типа пор (микро- и нанопоры). Известно, что введение различного количества метилтриалкоксисилана влияет на гидрофобность матрицы [9], что обеспечивает повышение механической прочности [13]. В работе исследовали влияние содержания гидрофобной добавки метилтриалкоксисилана от 0% до 100% на характеристики биосенсора, которые определяются свойствами рецепторных элементов — иммобилизованной в золь-гель матрицы ГО.

В ходе работы были получены пять рецепторных элементов с иммобилизованным в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы ферментом и определены основные характеристики разработанных рецепторных элементов: чувствительность, диапазон определяемых концентраций, операционная и долговременная стабильность. Вид градуировочных зависимостей представлен на рисунке.

Полученные зависимости апроксимированы уравнением гиперболы типа Михаэлиса-Ментен. Количественной характеристикой операционной стабильности (повторяемости) является относительное стандартное отклонение (Sr) ответа сенсора при пятнадцати параллельных измерениях (табл. 1). Коэффициент чувствительности определяли как тангенс угла наклона ли-

<

л:

го

о_

о

0

1 ф о

I—

0

СП

\-

о

22 20 -18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 2 -0

О 0% гидрофобной добавки

33% гидрофобной добавки

О 67% гидрофобной добавки V^—-

V 83% гидрофобной добавки

X 100% гидрофобной добавки —'

//X  ?

Ж —'

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Концентрация глюкозы, мМ

Градуировочные зависимости ответов биосенсоров на глюкозу (рецепторные элементы — ГО, иммобилизованная в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы с различным содержанием

гидрофобной добавки)

нейных участков градуировочных зависимостей (табл. 1). В качестве верхней границы определяемых концентраций принимали верхнюю границу линейного диапазона численно равную эффективной константе Михаэлиса (Км). Нижняя граница определяемых концентраций — минимальное содержание компонента, которое можно определить с заданной степенью точности, характеризуется предельно допустимой величиной относительного стандартного отклонения по концентрации меньше 0,33 (Бг (С))<0,33.

Все биорецепторные элементы характеризуются высокой операционной стабильностью (относительное стандартное отклонение 2-4%). Биосенсор с рецепторным элементом, полученным на основе ГО иммобилизованной в бимодальную кремнийорганическую матрицу, содержащую 83% гидрофобной добавки, характеризуется максимальной чувствительностью и наиболее широким диапазоном определяемых концентраций (6-280 мкмоль/дм3). Максимальной долговременной стабильностью (8 дней) характеризуется био-рецепторный элемент, не содержащий в своем составе гидрофобную добавку. Снижение долговременной стабильности, по-видимому, связано с вымыванием фермента из матрицы вследствие большого размера пор. Таким образом, гетерогенный биокатализатор, содержащий в своем составе 83% гидрофобной добавки метилтриалкоксисилана, по полученным характеристикам превосходит все биокатализаторы, полученные в данной работе. Показано, что

Таблица 1

Характеристики разработанных рецепторных элементов, полученных на основе иммобилизованной ГО в кремнийорганические матрицы (субстрат

— глюкоза 0,1 моль/дм3)

Параметр Содержание гидрофобной добавки, %

0 33 67 83 100

Относительное стандартное отклонение , % 3 2 3 4 3

Коэффициент чувствительности, нА-дм3-мин_1-ммоль_1 29±3 33±4 43±4 71±2 43±4

Нижняя граница определяемых концентраций, мкмоль/дм3 12 12 9 6 9

Верхняя граница определяемых концентраций (Км), мкмоль/дм3 100± ±10 170± ±40 180± ±10 280± ±30 140± ±10

Долговременная стабильность, сутки 8 6 5 5 5

дальнейшее увеличение содержания гидрофобной добавки нецелесообразно, поскольку оно влечет за собой снижение аналитических характеристик получаемых гетерогенных биокатализаторов, по-видимому, это связано с увеличением размера пор до размера молекул фермента. Это требует дополнительных исследований структуры получаемых золь-гель матриц.

Для апробации полученного гетерогенного биокатализатора (с содержанием гидрофобной добавки 83%) в качестве рецепторного элемента сенсора провели анализ различных образцов вин биосенсорным методом, в качестве референтного метода использовали иодометрическое титрование (табл.2) [14].

Таблица 2

Анализ реальных образцов вин

Название образца Концентрация глюкозы, определенная при помощи полученного рецепторного элемента, ммоль/дм3 Концентрация глюкозы, определенная тит-риметрическим методом, ммоль/дм3

Вино «Требьяно» 40±1 40,0±0,4

Вино «Ламбада» 60±2 61,0±0,5

Вино «Столовое сухое» 75±2 74,8±0,9

Статистический анализ (тест Фишера, модифицированный тест Стью-дента) [15] показал, что значения концентрации глюкозы, определяемые с помощью биосенсора на основе выбранного гетерогенного биокатализатора

и титриметрическим методом незначимо отличаются между собой, полученные выборки однородны по воспроизводимости.

Заключение

В работе получены гетерогенные биокатализаторы на основе иммобилизованной глюкозооксидазы в бимодальные кремнийорганические золь-гель матрицы с содержанием гидрофобной добавки от 0 до 100%. Сравнительный анализ параметров гетерогенных биокатализаторов показал, что увеличение доли метилтриалкоксисилана до 83% от общего объема этоксипроизводных кремния влечет за собой увеличение коэффициента чувствительности и диапазона определяемых концентраций.

Список литературы

1. Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганиче-ских нейротоксинов // Успехи биол. химии. 2004. Т.44. С.307-340.

2. Gorton L. Selective detection in flow analysis based on the combination of immobilized enzymes and chemically modified electrodes // Analytica Chimica Acta. 1991. V.250. Р.203-210

3. Biosensors for Health // Environment and Biosecurity / Ed. By Pier Andrea Serra. Rijeka: InTech. 2011. Р.540.

4. Kumiko Sakai-Kato Integration of biomolecules into analytical systems by means of silica sol-gel technology // National Institute of Health Science. 2005. V.6. Р.70-75.

5. Шабанова Н.А., Саркисов П.Д. Основы золь-гель технологии нанотехнологии нанодисперсного кремнезема. М.: ИКЦ «Академия», 2004. С.208.

6. Pauliukaite R. Electrochemical, EIS and AFM characterisation of biosensors: Trioxysilane sol-gel encapsulated glucose oxidase with two different redox mediators // Electrochimica Acta. 2006. V.52. Р.1-8.

7. Каманин С.С., Арляпов В.А. Разработка модифицированных печатных электродов на основе глюкозоксидазы для анализа глюкозы // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2012. Вып. 2. С.226-236.

8. Waibel M. Screen-printed bienzymatic sensor based on sol-gel immobilized

Nippostrongylus brasiliensis acetylcholinesterase and a cytochrome P450 BM-3

(CYP102-A1) mutant // Biosensors and Bioelectronics. 2006. V.21. Р.1132-1140.

9. Desimone M.F. Production of recombinant proteins by sol-gel immobilized Escherichia coli // Enzyme and Microbial Technology. 2006. V.40. Р.168-171.

10. D’Souza S.F. Microbial biosensors. Review // Biosens. Bioelectron. 2001. V.16. Р.337-353.

11. Понаморева О.Н. Биосенсоры и биотопливные элементы на основе целых клеток микроорганизмов и выделенных из них ферментов. Обзор // Изв. ТулГУ. Естественные науки. 2009. Вып. 1. С.138-157.

12. Brinker C.J., Scherer G.W. Sol-gel science: the physics and chemistry of sol-gel

processing. San Diego: Academic Press, 1990. 908 p.

13. Avnir D., Coradin T. Recent bio-applications of sol-gel materials // J. Mater. Chem. 2006. № 16. P.1013-1030.

14. Коренман Я.И., Лисовицкая Р.П. Практикум по аналитической химии. Анализ

пищевых продуктов: учеб. пособие. Воронеж: Воронеж. гос. технол. акад., 2002.

408 с.

15. Гармаш А.В., Сорокина Н.М. Метрологические основы аналитической химии.

М.: МГУ им. М.В. Ломоносова, 2012. 47 с.

Каманина Ольга Александровна (o.a.kamanina@gmail.com), аспирант, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Рогова Татьяна Валентиновна (rogova_tv@rambler.ru), к.х.н., доцент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Соколова Ольга Алексеевна (o.a.sokolova92@gmail.com), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Heterogeneous biocatalysts based on glucose oxidase immobilized in sol-gel matrix as biodetecting elements biosensors

O.A. Kamanina, T. V. Rogova, O.A. Sokolova

Abstract. Immobilization of enzyme glucose oxidase in hybrid silicon sol-gel matrix based on tetraalkoxysilane, polyethyleneglycol using varying amount of hydrophobic additive methyltrialkoxysilane (from 0 to 100% of the total volume of silicon ethoxy-derivatives) was performed. The influence of the matrix composition on the efficiency of silicon heterogeneous biocatalysts in amperometric determination of glucose using a biosensor was studied. It is shown that heterogeneous biocatalyst containing 83% of hydrophobic additive has the best characteristics (detection limit for glucose is 2 ^mol/dm3). The approbation of the biosensor based on the selected receptor element was carried out by comparing results of wine samples analysis obtained using biosensor method and reference method (iodometric titration).

Keywords: biosensor, heterogeneous biocatalyst, glucose oxidase, sol-gel encapsulation.

Kamanina Olga (o.a.kamanina@gmail.com), postgraduate student, department of chemistry, Tula State University.

Rogova Tatyana (rogova_tv@rambler.ru), candidate of chemical sciences, assciated professor, department of chemistry, Tula State University.

Sokolova Olga (o.a.sokolova92@gmail.com), student, department of chemistry, Tula State University.

Поступила 12.01.2013