СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ПИЩЕВЫХ БЕЛКОВ
QUANTITATIVE FOOD PROTEINS CONTENT DETERMINATION METHOD

Заявляемое изобретение относится к области биохимии и биотехнологии и может быть использовано при биохимических исследованиях для определения количественного содержания не только пищевых белков, но также и пищевых углеводов и жиров в продуктах растительного и животного происхождения.
Известен способ определения количественного содержания пищевых белков, включающий последовательно проводимые смешивание опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37°С и определение количественного содержания пищевых белков расчетным путем (авторское свидетельство SU №1247750, МПК G01N 33/48).
Поскольку в этом известном способе определение количественного содержания пищевых белков производят по количеству общего остаточного белка в опытном образце субстрата в сравнении с контрольной пробой в виде опытного образца субстрата, который не инкубируют в ферментном растворе, то это приводит к повышенной длительности и многоступенчатости процесса исследования, необходимости применения более сложного технологического оборудования и реактивов и не обеспечивает достаточной точности в определении количественного содержания пищевых белков.
Известен способ определения количественного содержания пищевых белков, включающий последовательно проводимые смешивание опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37°С, центрифугирование образовавшегося после инкубирования ферментативно-субстратного комплекса для получения чистой жидкой фракции и определение количественного содержания пищевых белков расчетным путем (патент RU №2022021, МПК C12Q 1/00, 1/37).
Данный способ определения количественного содержания пищевых белков, являющийся наиболее близким по совокупности признаков к заявляемому способу, также не позволяет обеспечить необходимую точность определения количественного содержания пищевых белков и требует повышенных затрат времени и многоступенчатости на процесс исследования и более сложного технологического оборудования и дорогих реактивов, поскольку определение количественного содержания пищевых белков производят по количеству содержания общих белков соответственно в опытных и контрольных пробах. Кроме того, данный способ не имеет возможности определения количественного содержания пищевых углеводов и жиров, поскольку в качестве ферментативного препарата используют только протеолитические ферменты (пепсины, папаины), которые не способны определять содержание пищевых жиров и углеводов.
Технический результат заявляемого способа определения количественного содержания пищевых белков заключается в повышении точности определения количественного содержания пищевых белков.
Указанный технический результат достигается тем, что в способе определения количественного содержания пищевых белков, включающем последовательно проводимые смешивание опытных образцов субстрата и ферментативного вещества в соединении со стабилизирующим раствором, инкубирование образованной смеси при температуре 37°С, центрифугирование образовавшегося после инкубирования ферментативно-субстратного комплекса для получения чистой жидкой фракции и определение количественного содержания пищевых белков расчетным путем, смешивание опытных образцов производят с ферментативным веществом в виде панкреатического сока, предварительно разбавленного стабилизирующим раствором до 50% концентрации при его соотношении с массой опытного образца субстрата 1:10, инкубирование подготовленной смеси ведут в течение 5-15 минут, перед проведением определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем полученный в результате центрифугирования объем чистой жидкой фракции разбавляют стабилизирующим раствором в соотношении 1:100-200, при этом количественное содержание пищевых белков определяют как равное процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока.
Кроме того, на стадии определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем при необходимости дополнительно проводят определение количественного содержания пищевых углеводов и жиров, при этом содержание пищевых углеводов определяют как равное процентному расходу ферментов амилазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока, а содержание пищевых жиров определяют как равное процентному расходу ферментов липазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока.
Использование в предлагаемом способе определения количественного содержания пищевых белков в качестве ферментативного вещества раствора панкреатического сока, представляющего собой натуральное ферментативное вещество, содержащее полный комплекс активных ферментов, включая и протеолитические ферменты, а также создание условий биохимической реакции, максимально приближенной к условиям пищеварения в живом организме, и определение количественного содержания пищевых белков по процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока позволяет повысить точность определения количественного содержания пищевых белков при одновременном устранении многоступенчатости процесса исследования и необходимости применения сложного оборудования и дорогих реактивов.
Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что предлагаемый способ определения количественного содержания пищевых белков отличается тем, что смешивание опытных образцов производят с ферментативным веществом в виде панкреатического сока, предварительно разбавленного стабилизирующим раствором до 50% концентрации при его соотношении с массой опытного образца субстрата 1:10, инкубирование подготовленной смеси ведут в течение 5-15 минут, перед проведением определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем полученный в результате центрифугирования объем чистой жидкой фракции разбавляют стабилизирующим раствором в соотношении 1:100-200, при этом количественное содержание пищевых белков определяют как равное процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока. Кроме того, на стадии определения количественного содержания пищевых белков расчетным путем при необходимости дополнительно проводят оценку количественного содержания пищевых углеводов и жиров, при этом содержание пищевых углеводов определяют как равное процентному расходу ферментов амилазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока, а содержание пищевых жиров определяют как равное процентному расходу ферментов липазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока. Такое отличие от прототипа дает основание утверждать о соответствии предлагаемого способа критерию патентоспособности изобретения «новизна». Сравнение заявляемого способа определения количественного содержания пищевых белков не только с прототипом, но и с другими аналогичными техническими решениями в данной области не позволили выявить в них признаки, аналогичные отличительным признакам, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого способа условию патентоспособности изобретения «изобретательский уровень».
Предлагаемый способ определения количественного содержания пищевых белков осуществляют следующим образом.
В оптимальном режиме, установленном экспериментально, способ осуществляют следующим образом. Навеску опытного образца субстрата (100 мг), предварительно высушенную до воздушно-сухого вещества и измельченную, например зерно сельскохозяйственной культуры, до состояния муки или мясокостную муку смешивают с панкреатическим соком, предварительно разбавленным стабилизирующим раствором, в частности раствором Рингера, до 50% концентрации при его соотношении с массой опытного образца субстрата 1:10, т.е. 1 мл раствора панкреатического сока смешивают со 100 мг опытного образца субстрата. Полученную тщательно перетертую до однородной массы смесь выливают в три центрифужные пробирки, первая из которых предназначена для определения количественного содержания пищевых белков, вторая и третья пробирки могут быть использованы при необходимости определения количественного содержания пищевых углеводов и жиров. В отдельную четвертую пробирку выливают 1 мл раствора панкреатического сока 50% концентрации без добавления субстрата, предназначенной в качестве контрольной пробы. Инкубирование подготовленной смеси в первых трех пробирках и контрольной пробы раствора панкреатического сока в четвертой пробирке ведут в термостате при температуре 37°С в течение 10 минут по секундомеру. Температура 37°С является стабильной и соответствует нормальной температуре внутренних органов животных. Образовавшийся в первых трех центрифужных пробирках в процессе биохимической реакции, произошедшей в период инкубирования, ферментативно-субстратный комплекс подвергают центифугированию при 3000g в течение 2 минут. Полученные в результате центрифугирования объемы чистой жидкой фракции из каждой центрифужной пробирки сливают в отдельные три пробирки и затем разбавляют стабилизирующим раствором Рингера в соотношении 1:100. В этом состоянии и при этом соотношении, отвечающем условию оптимального соотношения субстрата с ферментами, содержимое в первых трех пробирках находится готовым для определения количественного содержания пищевых белков, углеводов и жиров. Четвертая пробирка, содержащая 1 мл раствора панкреатического сока 50% концентрации без субстрата и прошедшая стадию инкубирования, является обязательной в качестве контрольной пробы для применения на стадии определения количественного содержания пищевых белков, углеводов и жиров. Определение и расчет количественного содержания пищевых белков осуществляют по процентному расходу ферментов протеазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока и на основании известной методики расщепления казеина при фотометрическом контроле (Фотометрическое определение активности протеолитических ферментов в поджелудочной железе, соке по уменьшению концентрации казеина. Ц.Ж.Батоев Сб. научн. трудов Бурят. СХИ. 1971 г. №25, стр.122-126). Определение и расчет количественного содержания пищевых углеводов осуществляют по процентному расходу ферментов амилазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока и на основании известной методики оценки активности амилазы, т.е. по гидролизу крахмала (Сравнительная оценка сахарифицирующих и декстректирующих методов при определении активности амилазы в крови здоровых и больных острым панкреатитом. В.М.Мерина-Глузкинаю. Лаб. дело, 1965, №3, стр.143). Определение и расчет количественного содержания пищевых жиров осуществляют по процентному расходу ферментов липазы в сравнении с контрольной пробой раствора панкреатического сока и на основании известной методики гидролиза подсолнечного масла (Определение активности липазы панкреатического сока по гидролизу подсолнечного масла. Ц.Ж.Батоев, Г.Ц.Цыбекмитова. Болезни с-х животных в Забайкалье и на Дальнем Востоке и меры борьбы с ними. Благовещенск, 1985, стр.70-73).
Определив расчетным путем процентный расход ферментов протеазы, ферментов амилазы и ферментов липазы и руководствуясь известным научным положением о том, что молекулы указанных ферментов взаимодействуют исключительно только с молекулами пищевых белков, углеводов и жиров и строго в соотношении 1:1, можно констатировать, что в анализируемом субстрате количественное содержание пищевых белков равно процентному расходу ферментов протеазы, количественное содержание пищевых углеводов равно процентному расходу ферментов амилазы, количественное содержание пищевых жиров равно процентному расходу ферментов липазы. В частности из Таблицы 2 видно, что в оптимальном режиме 33% расхода ферментов протеазы равно 33% содержания пищевых белков, 54% расхода ферментов амилазы равно 54% содержания пищевых углеводов и 27% расхода ферментов липазы равно 27% содержания пищевых жиров, а из Таблицы 4 видно, что в мясокостной муке содержится белков 43,8%, жиров 7,99%, углеводов 0,78%.
Для практического осуществления заявляемого способа определения количественного содержания пищевых белков предлагается использовать в качестве ферментативного вещества панкреатический сок, получаемый в стационарных условиях от постоянных доноров, предпочтительно кур или других домашних птиц. В качестве эквивалентного по ферментативному составу заменителя панкреатического сока может быть использован гомогенат поджелудочной железы животных.
В экспериментальном режиме исследования проводились для определения оптимальной концентрации раствора панкреатического сока, оптимального соотношения раствора панкреатического сока к массе опытного образца субстрата, временного периода инкубирования и соотношения чистой жидкой фракции к раствору Рингера. Как показали данные экспериментов, отраженные в Таблице 1, оптимальная концентрация раствора панкреатического сока, необходимая для смешивания с субстратом опытного образца и проведения инкубирования, должна быть величиной 50%. Данные экспериментов, отраженные в Таблице 1, также дают основание сделать вывод о том, что оптимальным соотношением панкреатического сока 50% концентрации с массой субстрата опытного образца следует признать 1:10. Данные экспериментов, отраженные в Таблице 2, дают основание сделать вывод о том, что допустимый временной диапазон инкубирования, необходимый для осуществления оптимального биохимического взаимодействия ферментов протеазы, амилазы и липазы с субстратами опытных образцов, находится в пределах 5-15 минут. Данные экспериментов, отраженные в Таблице 3, дают основание сделать вывод о том, что оптимальным соотношением чистой жидкой фракции к раствору Рингера является 1:100-200.
Таким образом, как показывают экспериментальные данные, заявляемый способ определения количественного содержания пищевых белков, основанный на использовании панкреатического сока в качестве ферментативного вещества и определении количественного содержания пищевых белков, углеводов и жиров по показателю процентного расхода соответствующих ферментов на биохимическую взаимосвязь исключительно только с пищевыми белками, углеводами, жирами позволяет повысить точность определения количественного содержания указанных компонентов в пищевых продуктах при одновременном сокращении многоступенчатости и устранении необходимости применения сложного технологического оборудования и дорогих реактивов. Кроме того, предлагаемый способ обеспечивает возможность определять количественное содержание не только пищевых белков, но и пищевых углеводов и жиров.
Таблица 1
Сравнительные данные биохимического взаимодействия разной концентрации и объемов панкреатического сока с 0.1 г субстрата опытного образца (горох)
Концентрация панкреатического сока, %
100
50
Объем панкреат. сока (мл)
1.0
2.0
3.0
1.0
2.0
3.0
Активность ферментов протеаз (мг/мл/мин) контрольный образец
435±4.5
440±4.5
440±5,6
223±5.6
270±3.37
280±2.25
Активность ферментов протеаз (мг/мл/мин) опытный образец
155±2.25
260±3.3
370±3,5
152±4.5
290±2.25
287±3.37
Разница между активностью ферментов в контрольном и опытных образцах, %
35.6
59,1
84,1
68.2
107.4
102.5
Таблица 2
Влияние времени инкубации на процесс биохимического взаимодействия ферментов панкреатического сока с субстратом опытных образцов при соотношении 1.0 мл раствора панкреатического сока к 100 мг субстрата опытного образца (горох)
Время инкубации, мин
5
10
15
Образцы
Контрольный
Опытный
Расход ферментов, %
Контрольный
Опытный
Расход фрментов, %
Контрольный
Опытный
Расход фрментов, %
Активность протеаз,(мг/мл/мин)
150±10.6
200±20.6
210±18.6
140±10.1
33
140±10.1
100±8.3
29
Количество белков, %
-
33
29
Активность амилазы, (мг/мл/мин)
2280±125.6
1680±112.3
26.3
2280±150.2
1320±20.8
54
960±86.1
1320±95.7
-
Количество углеводов, %
26.3
-
54
-
-
Активность липазы, (мг/мл/мин)
18±0.6
18±0.5
-
18±0.6
17.5±0.2
2.7
18±0.6
18±0.5
-
Количество жиров, %
-
2.7
-
Таблица 3
Влияние разного соотношения чистой жидкой фракции к раствору Рингера на свободную от ферментсубстратного комплекса ферментативную активность
Соотношения чистой жидкой фракции к раствору Рингера
Активность липазы, мкмоль/мл/мин
Активность амилазы, мг/мл/мин
Активность протеаз, мг/мл/мин
Контроль
Опыт
Количество жира, %
Контроль
Опыт
Количество углеводов, %
Контроль
Опыт
Количество белков, %
1:50
5,0±0,2
5,0±0,1
-
2400±145,1
1600±95,7
33,3
270±17,1
220±12,8
18,5
1:100
15,0±0,3
14,5±0,1
3,4
2160±123,9
960±79,3
55,6
400±12,7
290±18,9
27,5
1:200
25,0±0,3
23,0±0,2
8,0
720±52,8
400±10,6
44,4
720±14,5
500±32,3
30,5