СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ С КСЕНОНОМ
METHOD FOR CRYONIC PRESERVATION OF LEUKOCYTES WITH XENON

Изобретение относится к криобиологии и медицине, а именно к технологии консервирования ядерных клеток крови человека с газовым криопротектором.
Известен способ криоконсервации органов и тканей IN SITU, принятый в качестве прототипа. Способ заключается в том, что биологический объект (сердце, почка и др.) охлаждают в воде до 0°C с одновременным насыщением смесью ксенона, криптона, аргона в соотношении 2,5:47,5:50 об.%, затем вытесняют воду указанной смесью газов и при давлении 1,5 атм понижают температуру до -43°C, далее снижают давление газовой среды до нормального и продолжают охлаждение до -196°C [RU (11) 2268590 C1 (51) МПК A01N 1/02 (2006.01)]. Способ позволил добиться надежной криоконсервации сердца животного в составе всего организма. У пересаженного трансплантата, консервированного шесть часов, восстанавливается адекватная сердечная деятельность.
Недостатком прототипа является громоздкая, дорогостоящая жидкоазотная технология замораживания (-196°C) и высокая трудоемкость с привлечением большого числа квалифицированных исполнителей, что существенно снижает доступность предложенного способа. Кроме того, он предполагает замораживание целого организма животного с последующим извлечением конкретного органа и не предполагает эффективную консервацию ядросодержащих клеток организма человека.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка надежного способа криконсервирования лейкоцитов в среде инертного газа, обеспечивающего высокую сохранность ядросодержащих клеток.
Технический результат достигается путем насыщения клеточных взвесей (лейкоцитных концентратов) в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в металлический криобароконтейнер, инертным газом ксеноном под давлением 0,6 атм в течение 20 мин при комнатной температуре с последующим замораживанием до -28°C в этиловом спирте и хранением в электроморозильнике -80°C, при этом размораживание осуществляют в водяной ванне при температуре 39±1,5°C в течение 1,5 мин. После отогрева в водяной ванне количество морфологически сохранных лейкоцитов в разных сериях экспериментов составляет от 95,3% до 97,6%, устойчивой к витальному красителю мембраной обладает от 43,3% до 64,5% клеток.
Практически способ осуществляют следующим образом.
Экспериментальные исследования выполнены на базе лабораторий криофизиологии крови ФГБУН Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН и консервирования крови и тканей ФГБУН Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России.
Пример 1.
Лейкоцитные концентраты крови доноров-добровольцев объемом 17±2 мл в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в криобароконтейнер, насыщали инертным газом ксеноном 20 минут при комнатной температуре 21±2°C под давлением 0,3 атм. Замораживание осуществляли по двухступенчатой программе: на первом этапе 15 мин в охлажденной до -28°C спиртовой (96°) ванне, на втором этапе перекладывали в воздушную среду электроморозильника на -80°C, где хранили в течение суток. Далее «Компопласт 300» с биообъектом извлекали из криобароконтейнера, предварительно снизив давление ксенона до атмосферного. Размораживали биообъект 10 мин в 20-литровой водяной ванне при температуре 19,6±2,1°C.
Определяли общее количество размороженных лейкоцитов, их морфологическую сохранность и жизнеспособность по витальному красителю трипановому синему. Полученные данные выражали в процентах, приняв исходный уровень за 100% (табл.1).
При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение±среднее квадратичное отклонение (М±δ). Для выявления статистической значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Уилкоксона с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики «BIOSTAT».
Пример 2.
Лейкоцитные концентраты в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в криобароконтейнер, насыщали инертным газом ксеноном 20 минут при комнатной температуре 21±2°C под давлением 0,3 атм. Замораживание осуществляли по двухступенчатой программе: на первом этапе 15 мин в охлажденной до -40°C спиртовой (96°) ванне, на втором этапе перекладывали в воздушную среду электроморозильника на -80°C, где хранили в течение суток. Далее «Компопласт 300» с биообъектом извлекали из криобароконтейнера, предварительно снизив давление ксенона до атмосферного. Размораживали биообъект 10 мин в 20-литровой водяной ванне при температуре 19,6±2,1°C. Полученные данные представлены в табл.1.
Пример 3.
Лейкоцитные концентраты крови доноров-добровольцев в пластикатном контейнере «Компопласт 300», помещенном в криобароконтейнер, насыщали инертным газом ксеноном 20 минут при комнатной температуре 21±2°C под давлением 0,6 атм, с последующим удалением избытка ксенона. Замораживание осуществляли в пластикатном контейнере «Компопласт 300» по двухступенчатой программе: на первом этапе в охлажденной до -28°C спиртовой (96°) ванне в течение 15 мин, на втором этапе перекладывали в воздушную среду электроморозильника на -80°C, где хранили в течение суток. Размораживали биообъект 1,5 мин в 20-литровой водяной ванне при температуре 39±1,5°C. Полученные данные представлены в табл.1.
Таблица 1
Морфофункциональные показатели лейкоцитов после суточной экспозиции в электроморозильнике -80°C
Вариант использования
Жизнеспособность, %
Морфологическая сохранность, %
Сохранность гранулоцитов, %
Пример 1
43,3±3,1
95,3±5,6
51,0±14,0
Пример 2
48,3±16,6
95,1±7,0
83,6±9,9*
Пример 3
64,5±14,4*
97,6±2,5
86±11*
* - различие с показателем примера 1 статистически значимо (p<0,05)
Применение технологии, указанной в Примере 3, обеспечивает более эффективную сохранность ядросодержащих клеток крови человека. Предложенный метод предельно прост в реализации, дает стабильный положительный результат и найдет широкое применение в медицинской практике.