Компьютерная морфометрия сино-виоцитов: диагностические возможности и значение у больных с посттравматическими остеоартритами

© Е. Ю. УДАРЦЕВ, Н. Н. ИЛЬИНСКИХ, 2012 УДК 616.728.3-002-07:616.72-008.8-091:681.31

Е. Ю. Ударцев, Н. Н. Ильинских

компьютерная морфометрия синовиоцитов: диагностические возможности и значение у Больных с посттравматическими остеоартритами

Санаторий «Алтай-ШЕБТ'; г. Белокуриха, кафедра биологии и генетики Сибирского государственного медицинского университета, Томск

Представлены данные компьютерного морфологического изучения клеток синовия у 27 больных в возрасте 35-53 лет с посттравматическим остеоартритом (ПТОА) коленных суставов I-II стадии по классификации Kellgren и Lowrence. Предложенный метод компьютерного анализа изображения позволил провести широкий спектр кариометрических исследований патологических процессов в синовии у больных с ПТОА, а полученные результаты исследования сделали возможным использование при компьютерной морфометрии новых показателей, характеризующих яркость и оптическую плотность изображения и позволяющих оценить степень компактизации и количество ДНК в ядрах клеток. На основании параметров формы и гистограмм распределения яркостей ядер клеток были дифференцированы синовиоциты I, II и III типов. Результаты исследования кинетики пролиферации при компьютерном анализе этих клеток, окрашенных по Фельгену, свидетельствовали о том, что в синовии у больных с ПТОА синовиоциты II типа находятся в G-периоде интерфазы, а синовиоциты III типа - в S-периоде или G2-периоде интерфазы.

Ключевые слова: клетки синовия, компьютерная морфометрия, посттравматический остеоартрит

Ye.Yu. Udartsev, N.N. Ilyinskikh THE COMPUTER MORPHOMETRY OF SYNOVIOCYTES: THE DIAGNOSTIC POSSIBILITIES AND IMPORTANCE FOR PATIENTS WITH POST-TRAUMATIC OSTEOARTHRITIS The article deals with the data of computer morphometric analysis ofsynovial cells in 27 patients 35-53 years old with knee joint posttraumatic osteoarthritis stage I-II according Kellgren and Lowrence classification. The proposed technique of image computer analysis made it possible to apply a large specter of cardio-metric studies of pathologic processes in synovia of patients with post-traumatic osteoarthritis. The study results favored the implementation in computer morphometry new indicators characterizing brightness and optical density of image and permitting to evaluate the degree of compactization and amount ofDNA in cells nuclei. The synoviocytes were differentiated on types I,II and III on basis of form parameters and histograms of distribution of cells nuclei brightness. The results of computer analysis of kinetics ofproliferation of these cells dyed by

Feulgen testified that in synovia ofpatients with post-traumatic osteoarthritis synoviocytes type II were in G1 -period of interphase and synoviocytes type III were in S-period or G2 -period of interphase.

Key words: synovial cells, computer morphometry, post-traumatic osteoarthritis

Известно, что воспалительный процесс, сопровождающий развитие посттравматического остеоартрита, приводит к существенному изменению состава клеток синовия [2, 3, 6, 8]. Имеются работы, в которых описаны изменения синовиоцитов у больных с артритами [1, 5, 7]. В то же время все данные такого рода получены визуально, без морфометрии и тем более без привлечения компьютерных методов анализа этих клеток. Практически отсутствуют также данные по цитологическому количественному изучению ядерного аппарата синовиоцитов, изменения в котором могут свидетельствовать о внутриклеточных процессах на уровне генетических структур клетки. Данные такого рода имеют особое значение при постановке точного диагноза, оценке степени изменений синовия и эффективности терапии этого заболевания.

В настоящей работе представлены результаты компьютерного морфологического изучения клеток синовия у больных с посттравматическими остеоартритами.

Материалы и методы. Обследовано 27 больных в возрасте 35-53 лет с посттравматическим остеоартритом (ПТОА) коленных суставов (КС) 1-11 стадии по классификации Ке1^геп и Lowrence (1957). Больных для исследования отбирали методом сплошной выборки при добровольном пись-

Для корреспонденции:

Ударцев Евгений Юрьевич, канд. мед. наук, врач ортопед-травматолог

Адрес: 659900, Алтайский край, г. Белокуриха, ул. Светлая, 15, а/я 56 Телефон: (38577)3-78-92 E-mail: orthoped2@yandex.ru

менном согласии в соответствии с решением Департамента государственной аттестации научных и научно-практических работников Минобразования России "О порядке проведения биомедицинских исследований у человека" (2002) и "Правилами клинической практики" (приказ Минздрава РФ № 266 от 19.06.2003). Исследование одобрено Этическим комитетом Алтайского государственного медицинского университета (протокол № 26 от 30.04.2008). Диагноз остеоартроза верифицировали на основании клинико-рентгенологического обследования. Синовиальную жидкость в объеме 1-2 мл получали путем пункции сустава.

В настоящей работе изучены одноядерные клетки синовия на препаратах синовиальных клеток, приготовленных методом толстой капли. Препараты окрашивали двумя способами: по Романовскому-Гимзе и с помощью реакции Фель-гена [4]. Исследование проводили с использованием метода компьютерной томографии, разработанного Б. В. Шиловым (2000) (см. рисунок).

Изображение анализировали при помощи светового микроскопа фирмы "Reichert" GIM-358 (Австрия), оснащенного бинокуляром и цифровой фотокамерой Casio QV-100, имеющей разрешение 1640 х 1480 пикселей. Полученные изображения переносили в компьютер, используя программу Qv-Link, поставляемую вместе с фотокамерой (см. рисунок).

Подготовку изображения и собственно его анализ проводили с использованием программы ImageJ, разработанной Wayne Rasband (National Institutes of Health, США). Определяли следующие параметры: площадь, среднюю яркость, стандартное отклонение значений яркости, моду яркости, минимальный и максимальный уровни яркости и периметр.

ГЕМАТОЛОГИЯ

Изучали уровень оптической плотности ядер клеток как косвенный показатель диффузности/конденсированности хроматина.

Полученные данные подвергали статистической обработке при помощи программы STATISTICA 7.0 для Windows. При проверке совпадения распределения исследуемых показателей с нормальными в группах придерживались критерия согласия Колмогорова-Смирнова. Для проверки достоверности различий между исследуемыми группами, в которых данные распределялись по нормальному закону, пользовались t-критерием Стьюдента. Если закон распределения исследуемых числовых показателей отличался от нормального, достоверность различий проверяли при помощи U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Для всех показателей была отвергнута нулевая гипотеза на уровне значимости 0,05. В работе были использованы методы кластерного и пошагового дис-криминантного анализа. Для решения задачи группировки объектов применяли вероятностно-статистический подход к выделению групп. При кластерном анализе пользовались мерой различия между индивидами, основанной на вычислении расстояния Варда. При исследовании патологических моно-нуклеаров окрашенных по Фельгену клеток в той или иной группе прибегали к методам пошагового дискриминантного анализа. В ходе пошагового дискриминантного анализа использовали в качестве допустимого минимума F-включения F = 1,0 и F-исключения F = 0,001, что позволило включить все исследуемые показатели для дальнейшего изучения.

Результаты и обсуждение. Анализ параметров формы и некоторых гистограмм синовиоцитов на стандартных микроскопических препаратах синовия больных с ПТОА выявил характеристические особенности этих клеток.

Основные показатели, полученные при изучении синови-оцитов посредством компьютерного анализа, представлены в таблице.

Синовиоциты II типа с ядром округлой формы встречались в 10,6 ± 2,9% всех клеточных элементов. Средняя площадь ядер этих клеток по данным цитометрического анализа составляла 76,12 ± 4,73 мкм2. Яркость ядер этих клеток лежала в диапазоне от 6,0 ± 1,0 до 131,5 ± 7,5.

Синовиоциты II типа со слабодеформированным ядром были представлены наиболее многочисленной группой и встречались в 29,1 ± 4,2% случаев. Эти клетки были несколько крупнее, чем синовиоциты II типа с округлым ядром, и за счет деформации ядра наблюдалось незначительное увеличение его периметра, мода яркости была меньше среднего значения в 1,6 раза.

характеристика синовиоцитов больных ПтоА, полученных при помощи компьютерного анализа изображений

Тип клеток Вид ядра Параметры формы Параметры гистограммы

площадь ядра, мкм3 периметр ядра, мкм средняя яркость ядра мода яркости минимум яркости максимум яркости

II Округлое 76,12 ± 4,73 32,64 ± 1,04 32,41 ± 0,90 17,0 ± 0,5 6,0 ± 1,0 131,5 ±7,5

Слабодеформированное 87,66 ± 3,66 35,94 ± 0,94 40,97 ± 2,57 25,2 ± 1,7 8,4 ± 1,8 129,0 ± 6,5

Бобовидное 73,28 ± 4,33 32,95 ± 1,90 29,00 ± 4,90 22,0 ± 9,1 3,5 ± 1,5 106,0 ± 1,9

Угловатое 93,42 ± 2,0 37,18 ± 0,57 42,31 ± 4,11 32,8 ± 5,8 8,7 ± 1,1 125,8 ± 5,6

III Бобовидное 96,13 ± 9,60 38,03 ± 2,88 45,72 ± 3,07 28,0 ± 5,0 9,5 ± 0,5 122,5 ± 2,5

Однолопастное 113,43 ± 5,54 40,87 ± 0,22 51,18 ± 3,10 46,0 ± 6,0 9,5 ± 0,5 128,0 ± 1,0

Двухлопастное 101,27 ± 29,61 42,96 ± 3,40 62,70 ± 2,50 35,0 ± 15,0 12,0 ± 2,0 148,0 ± 18,0

Многолопастное 111,22 ± 9,66 52,28 ± 5,73 51,51 ± 12,60 43,7 ± 22,2 9,7 ± 5,2 156,0 ± 15,1

Резкодеформированное 114,24 ± 24,20 48,35 ± 10,26 59,18 ± 1,97 62,5 ± 12,5 6,5 ± 0,5 138,0 ± 3,0

Фрагментоз 120,87 ± 35,52 54,58 ± 32,18 53,41 ± 3,54 54,0 ± 15,6 5,0 ± 1,2 123,0 ± 2,0

I Округлое 82,34 ±5,00 34,35 ± 1,10 51,68 ± 15,09 43,5 ± 20,5 8,0 ± 3,0 142,0 ± 1,0

Слабодеформированное 95,57 ± 8,32 37,96 ± 2,22 41,09 ± 4,39 31,1 ± 6,8 6,6 ± 1,3 126,9 ± 5,6

Бобовидное 94,64 ± 11,09 38,77 ± 3,49 44,45 ± 2,09 35,0 ± 5,0 7,5 ± 3,5 121,0 ± 4,0

Микроскопирование препарата, подготовка поля зрения

Съемка препарата с тубуса микроскопа фотокамерой Casio

Перенос и сохранение изображения с фотокамеры с использованием программы для конвертирования файлов

Открытие изображения в программе ImageJ

Проведение тоновой коррекции для минимизации уровня ошибок, связанных с окраской и освещением

Выделение исследуемого участка на изображении

Проведение измерений выделенного участка

Сохранение полученных результатов в электронной таблице

Поэтапная схема работы с изображением при анализе синовиоцитов больных с ПТОА.

В синовии больных с ПТОА синовиоциты II типа с бобовидным ядром составили 16,4 ± 3,3% от общего количества клеток. Параметры формы этих клеток были близки к параметрам синовиоцитов II типа с округлым ядром, однако бобовидные ядра имели несколько большую оптическую плотность.

На долю синовиоцитов II типа с угловатым ядром приходилось 6,8 ± 1,3% всех атипичных клеток. За счет грубых деформаций эти клетки обладали наибольшими по площади и периметру ядрами среди всех рассмотренных клеток II типа. При этом угловатые ядра на микрофотографии выглядели более светлыми, что подтверждается показателями гистограммы распределения яркостей этих клеток.

Компьютерный анализ ядер синовиоцитов II типа в синовии больных с ПТОА позволяет сделать предположение о том, что ряд бобовидное-слабодеформированное-угловатое ядро отражает последовательность деградационных изменений в ядре, вызванных патологическими процессами в синовии.

В синовии больных с артритами обнаружено 4,1 ± 1,2% синовиоцитов III типа с бобовидным ядром. Эти клетки имели наименьшие площадь и периметр ядра среди всех рассмотренных синовиоцитов III типа, а их ядро выглядело наиболее оптически плотным, о чем свидетельствуют показатели гистограммы распределения яркостей.

Анализ клеток синовия III типа позволил выявить различные деформации в ядрах этих клеток. Синовиоциты III типа с однолопастным ядром встречались в 1,8 ± 0,2% случаев. Их площадь была на 15% больше площади клеток III типа с бобовидным ядром, средняя яркость составила 51,18 ± 3,10. Синовиоциты III типа с двухлопастным ядром встречались в 1,3 ± 0,1% случаев. Эти клетки отличались наименьшей оптической плотностью среди всех рассмотренных синовио-цитов III типа. Удаленность моды яркости от среднего значения составила 1,8 раза. Среди рассмотренных синовиоцитов III типа несколько чаще встречались клетки с фрагментозом - 3,5 ± 0,9%. По площади ядер эти клетки были близки к си-новиоцитам III типа с однолопастным ядром, однако наличие рассеченного ядра приводило к значительному увеличению периметра. Приводим характеристики синовиоцитов III типа с грубыми деформациями ядра.

Синовиоциты III типа с угловатым ядром среди патологических клеток встречались в 2,5 ± 0,2% случаев. Показатели гистограммы угловатых ядер синовиоцитов III типа отличались от вышеописанных и имели тенденцию к сдвигу моды яркости вправо относительно среднего значения.

Синовиоциты III типа с резкодеформированным ядром имели наиболее измененное ядро и встречались в 3,0 ± 1,0% случаев. Это были самые крупные среди всех рассмотренных клетки с большой площадью ядра (120,87 ± 35,52 мкм2) и большим периметром (54,58 ± 32,18 мкм). Окрашенность синовиоцитов III типа с резкодеформированным ядром имела значение моды яркости, приблизительно равное среднему значению. Разброс значений внутри гистограммы был умеренным по сравнению с другими клетками. Минимум был равен 5,0 ± 1,2, а максимум - 123,0 ± 2,0 ед. по шкале яркостей гистограммы.

Группа синовиоцитов I типа была условно представлена тремя морфологическими классами. Синовиоциты I типа с ядром округлой формы обнаружены в 2,7 ± 0,3% случаев. Они имели параметры формы, сходные с имеющимися у си-новиоцитов II типа с округлым ядром, но значительно отличались от них по параметрам гистограммы. Клетки II типа имели меньшую окрашенность, значение моды находилось левее среднего значения яркости.

Среди всех патологических мононуклеарных клеток была достаточно большой доля синовиоцитов I типа со слабо-деформированным ядром - 13,6 ± 2,1%. Такие клетки имели средний размер ядер, который был несколько больше размера ядер синовиоцитов II типа с такой же формой. Периметр у синовиоцитов I и II типов с соответствующей формой ядер

практически не различался. Параметры гистограммы распределения яркостей также были схожими с аналогичными параметрами клеток II типа, однако мода яркости была менее смещена влево относительно среднего значения.

Синовиоциты I типа с бобовидным ядром встречались в 4,3 ± 1,1% случаев и имели среди всех клеток с бобовидной формой ядер характерные только для этого класса значения параметров формы, а окрашенность этих клеток была достаточно насыщенной со средней яркостью 44,45 ± 2,09.

В клетках, окрашенных по Фельгену, определяли количество ДНК в ядре и стадию клеточного цикла. Для этого на основе величин площади и периметра ядер, окрашенных по Романовскому-Гимзе, при помощи процедуры пошагового дискриминантного анализа были получены следующие функции, позволяющие отнести ядра, окрашенные по Фель-гену, к определенной группе атипичных мононуклеаров:

7 = ЛПС-Б s • 3,921 + Р • 7,447 - 266,790 (1),

7 = ЛПС-У s • 5,077 + Р • 8,267 - 392,723 (2),

7 = МПС-Б s • 5,124 + Р • 8,477 - 405,489 (3),

7 = МПС-У s • 5,903 + Р • 10,659 - 578,821 (4),

7 = ППС-Б s • 5,216 + Р • 8,533 - 416,312 (5).

На практике для каждого исследуемого ядра, окрашенного по Фельгену, вычисляли все пять значений. Однако дис-криминантный анализ не помог разделить с высокой степенью достоверности II и III типы клеток с бобовидной формой ядра, и эти клетки были исключены из дальнейшего анализа. Остальные клетки относили к той группе, для которой было получено наибольшее значение Z. Для автоматизации этой процедуры в среде Delphi была написана программа, которая при введении показателей площади (S) и периметра (Р) рассчитывала величину Z и относила исследуемый объект к соответствующему классу. Получив заключение о принадлежности ядра, окрашенного по Фельгену, провели исследование клеточного цикла отдельных морфологических групп на основе плотности окраски ядер. Для оценки количества ДНК (2n-4n) пользовались показателем суммарной (интегральной) оптической плотности. Количество ДНК служило основанием для заключения о нахождении клетки в той или иной фазе клеточного цикла.

Все полученные гистограммы распределения количества клеток по интегральной оптической плотности (ИОП) имели два хорошо выраженных пика и расположенное между ними плато.

В гистограмме, характеризующей синовиоциты II типа с бобовидным ядром, большая часть клеток (71%) находилась в районе точки со значением 14. Второй пик был в районе значения 43 и соответствовал содержанию приблизительно 43% таких клеток. Между пиками располагалось плато, соответствующее содержанию 9% клеток.

Синовиоциты II типа с угловатой формой ядра имели аналогичную гистограмму распределения по ИОП: 68% клеток находилось в районе точки со значением 15, 21% - в районе точки 47, плато формировали 11% клеток.

Гистограмма распределения синовиоцитов III типа с од-нолопастным ядром по ИОП характеризовалась увеличением высоты плато и снижением количества клеток, образующих пики. Соотношение пиков сохранялось. Пик с меньшим значением ИОП = 13 содержал 51% всех синовиоцитов III типа с однолопастным ядром. Другой пик охватывал 28% клеток, на область плато приходилось 21% клеток.

С увеличением количества лопастей в ядре синовиоци-тов III типа наблюдалось изменение соотношения клеток с высокой и низкой ИОП. Так, в точке со значением ИОП, равным 16, находилось 30% всех синовиоцитов III типа с многолопастным ядром, в точке с ИОП = 43 - 48% клеток, а количество клеток, составляющих плато, практически не изменилось (22%).

Среди синовиоцитов III типа с угловатым ядром количество клеток с высокой и низкой оптической плотностью было приблизительно одинаковым. Плато формировали 21%

КОАГУЛОЛОГИЯ

угловатых ядер. На пики с ИОП, равной 18 и 40, приходилось по 41 и 38% клеток соответственно. Подобным образом распределялись по оси ИОП синовиоциты III типа с сильно деформированными ядрами.

Результаты исследований кинетики пролиферации синовиоцитов при ПТОА свидетельствуют о том, что в синовии больных почти всегда встречается определенное количество S-фазных клеток. Высокая корреляция между площадью ядра и его ИОП указывала на то, что по мере прохождения S-фазы площадь ядра прогрессивно увеличивалась. Это нашло подтверждение при исследовании синовиоцитов больных с ПТОА, выполненного при помощи компьютерного анализа. Пики, регистрируемые на гистограммах распределения клеток по ИОП, представляют собой моды 2с и 4с и соответствуют фазам клеточного цикла Gl-период и 02-период. Клетки, формирующие плато, скорее всего проходят S-период интерфазы. Отмечено достоверное увеличение процентао клеток, составляющих плато при возрастании количественных показателей, характеризующих форму, площадь и степень окрашенности ядра клетки.

Компьютерный анализ синовиоцитов, окрашенных по Фельгену, показал, что синовиоциты II типа, поддающиеся классификации, в основной своей массе находятся в G1-периоде интерфазы. Исходя из данных компьютерного анализа логично предположить, что синовиоциты II типа представляют собой бласттрансформированные клетки.

Выводы. 1. Предлагаемый метод компьютерного анализа изображения позволяет проводить широкий спектр кариомет-рических исследований патологических процессов в синовии у больных с ПТОА.

2. Результаты исследования позволяют рекомендовать использование при компьютерной морфометрии новых пока-

зателей, характеризующих яркость и оптическую плотность изображения и позволяющих оценить степень компактиза-ции и количество ДНК в ядрах клеток.

3. Компьютерная морфометрия позволяет дифференцировать синовиоциты I, II и III типов у больных с ПТОА на основании параметров формы и гистограмм распределения яркостей ядер клеток.

4. Компьютерный анализ синовиоцитов, окрашенных по Фельгену, свидетельствует о том, что в синовии у больных с ПТОА синовиоциты II типа в основном находятся в Gj-периоде интерфазы, а синовиоциты III типа - в S-периоде или С2-периоде интерфазы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Базарный В. В. Синовиальная жидкость (клинико-диагностическое значение лабораторного анализа). - Екатеринбург, 1999.

2. Насонов В. А., Астапенко М. Г. Клиническая ревматология. -М., 1989.

3. Чепай В. М.Диагностика и лечение болезней суставов. - М., 1990.

4. Dieppe P., Pascual E, Swan A. // Rheum Eur. - 1997. - Vol. 26. - P. 74/

5. Dougados M. // Baillieres Clin. Rheumatol. - 1996. - Vol. 10. - P. 519-534.

6. PausA. C, Pahle J. A. // Scand. J. Rheumatol. - 1990. - Vol. 19. - P. 193-201.

7. ShmerlingR. H. // Rheum. Dis. Clin. N. Am. - 1994. - Vol. 20. - P. 503-512.

8. Zschabitz A., Neurath M., Grevenstein J. et al. // Surg. Endosc. -1992. - Vol. 6. - P. 277-282.

Поступила 05.10.11

коагулология

© У. в. ХАРЛАМОВА, О. Е. ИЛЬИЧЕВА, 2012 УДК 616.61-78-06:616.1]-074

У. В. Харламова, О. Е. Ильичева

диагностическое значение лабораторных маркеров повреждения эндотелия у Больных на программном гемодиализе

ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава

С целью оценки диагностической значимости лабораторных маркеров дисфункции эндотелия (концентрации гомоцистеина, активности фактора Виллебранда) у больных, находящихся на лечении программным гемодиализом, обследовано 82 пациента. Выявлено достоверное повышение уровня гомоцистеина, активности фактора Виллебранда у пациентов, находящихся на диализе. Отмечена ассоциация увеличения концентрации гомоцистеина, активности фактора Виллебранда и с частотой сердечно-сосудистых осложнений у больных на программном гемодиализе.

Ключевые слова: гемодиализ, гомоцистеин, фактор Виллебранда, сердечно-сосудистые осложнения

U.V. Kharlamova, O.Ye. Ilyitcheva

THE DIAGNOSTIC VALUE OF LABORATORY MARKERS OF EPITHELIUM DAMAGE IN PATIENTS PASSING THE PROGRAM HEMODIALYSIS

The sampling of 82 patients was included into the study to assess the diagnostic value of laboratory markers of endothelium dysfunction (homocysteine concentration, von Willebrand factor activity) in patients passing the treatment of program hemodialysis. The study detected the reliable increase of homocysteine level and activity of von Willebrand factor in patients passing hemodialysis. The association ofincreasing ofconcentration of homocysteine and von Willebrand factor activity with rate ofcardiovascular complications in patients passing the program in patients passing hemodialysis was established.

Key words: hemodialysis, homocysteine, von Willebrand factor, cardiovascular diseases