СОЕДИНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ
COMPOUND FOR TREATING METABOLIC DISORDERS

Сахарный диабет представляет собой одну из основных причин заболеваемости и смертности. Хронически повышенный уровень глюкозы в крови ведет к лишающим трудоспособности осложнениям: нефропатии, часто требующей диализа или трансплантации почки; периферической нефропатии; ретинопатии, ведущей к слепоте; изъязвлению нижних конечностей и стоп, ведущему к ампутации; жировой инфильтрации печени, иногда прогрессирующей в цирроз; и уязвимости для заболеваний коронарных артерий и инфаркта миокарда.
Существует 2 первичных типа сахарного диабета. Сахарный диабет I типа, или инсулинозависимый сахарный диабет (IDDM), вызван аутоиммунным разрушением продуцирующих инсулин бета-клеток в островках поджелудочной железы. Это заболевание обычно начинается в детском или подростковом возрасте. Лечение состоит в первую очередь из множественных ежедневных инъекций инсулина в комбинации с частым тестированием уровней глюкозы в крови для руководства подбором доз инсулина, потому что избыточный инсулин может вызвать гипогликемию и последующее повреждение мозга и других функций.
Сахарный диабет II типа, или инсулиннезависимый сахарный диабет (NIDDM), обычно развивается во взрослом возрасте. NIDDM связан с устойчивостью утилизирующих глюкозу тканей, подобных жировой ткани, мышцам и печени, к действиям инсулина. Первоначально бета-клетки островков поджелудочной железы компенсируют секрецией избыточного инсулина. Конечная недостаточность островков происходит в результате декомпенсации и хронической гипергликемии. Наоборот, умеренная недостаточность островков может предшествовать или совпадать с периферической устойчивостью к инсулину. Существует несколько классов препаратов, которые можно применять для лечения NIDDM: 1) средства, высвобождающие инсулин, которые непосредственно стимулируют высвобождение инсулина, вызывая риск гипогликемии; 2) средства, высвобождающие инсулин, при приеме пищи, которые усиливают секрецию инсулина, вызванную глюкозой, и их следует принимать перед каждым приемом пищи; 3) бигуаниды, включая метформин, которые ослабляют печеночный глюконеогенез (уровень которого парадоксально возрастает при сахарном диабете); 4) сенсибилизаторы к инсулину, например производные тиазолидиндиона росиглитазон и пиоглитазон, которые улучшают периферическую реактивность на инсулин, но которые имеют побочные эффекты, подобные прибавке массы тела, отеку и иногда токсического действия на печень; 5) инъекции инсулина, которые часто необходимы на более поздних стадиях NIDDM, когда развивается недостаточность островков в условиях хронической гиперстимуляции.
Устойчивость к инсулину может также возникнуть без выраженной гипергликемии, и она в целом связана с атеросклерозом, ожирением, гиперлипидемией и эссенциальной гипертонией. Эта группа патологий составляет «метаболический синдром» или «синдром устойчивости к инсулину». Устойчивость к инсулину также связана с жировой инфильтрацией печени, которая может прогрессировать в хроническое воспаление (NASH; «неалкогольный стеатогепатит»), фиброз и цирроз. Кумулятивно синдромы устойчивости к инсулину, включая, но не ограничиваясь, сахарный диабет, лежат в основе многих из основных причин заболеваемости и смерти людей в возрасте более 40 лет.
Несмотря на существование таких препаратов, сахарный диабет остается одной из основных и нарастающих проблем для общественного здравоохранения. Осложнения поздней стадии сахарного диабета потребляют большую часть ресурсов национального здравоохранения. Существует необходимость в новых активных при приеме внутрь терапевтических средствах, которые эффективно направлены на первичные дефекты устойчивости к инсулину и островковую недостаточность с меньшим количеством или более легкими побочными эффектами, чем у существующих препаратов.
В настоящее время не существует безопасных и эффективных способов лечения заболевания вследствие жировой инфильтрации печени. Поэтому такое лечение должно представлять ценность при лечении этого состояния.
WO 02/100341 (Wellstat Therapeutic Corp.) раскрывает 4-(3-2,6-диметилбензилокси)фенил)масляную кислоту. WO 02/100341 не раскрывает никаких соединений в пределах объема представленной ниже формулы I, в которой m=0, 1, 2, 4 или 5.
Изобретение относится к биологически активному агенту, как описано ниже. Это изобретение относится к применению биологически активного агента, описанного ниже, при изготовлении лекарственного средства для лечения синдрома устойчивости к инсулину, сахарного диабета, кахексии, гиперлипидемии, заболевания вследствие жировой инфильтрации печени, ожирения, атеросклероза или артериосклероза. Это изобретение относится к способам лечения млекопитающего с синдромом устойчивости к инсулину, сахарным диабетом, кахексией, гиперлипидемией, заболеванием вследствие жировой инфильтрации печени, ожирением, атеросклерозом или артериосклерозом, включающим введение индивидууму эффективного количества биологически активного агента, описанного ниже. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей биологически активный агент, описанный ниже, и фармацевтически приемлемому носителю.
Биологически активный агент в соответствии с этим изобретением представляет собой соединение формулы I:
Формула I
2
3
где n=1 или 2; m=0, 1, 2, 4 или 5; q=0 или 1; t=0 или 1; R представляет собой алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода; R представляет собой водород, галоген, алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода;
1
1
А представляет собой фенил, незамещенный или замещенный 1 или 2 группами, выбранными из галогена, алкила, имеющего 1 или 2 атома углерода, перфторметила, алкоксигруппы, имеющей 1 или 2 атома углерода, и перфторметокси; или циклоалкил, имеющий от 3 до 6 кольцевых атома углерода, где циклоалкил является незамещенным или один или два кольцевых углерода независимо монозамещены метилом или этилом; или 5- или 6-членное гетероароматическое кольцо, имеющее 1 или 2 кольцевых гетероатома, выбранных из N, S и O, и гетероароматическое кольцо ковалентно связано с остальной частью соединения формулы I углеродом кольца; и R представляет собой водород или алкил, имеющий 1 или 2 атома углерода. Альтернативно, когда R представляет собой водород, биологически активный агент может представлять собой фармацевтически приемлемую соль соединения формулы I.
Биологически активные агенты, описанные выше, обладают активностью в одном или нескольких анализах биологической активности, описанных ниже, которые представляют собой принятые экспериментальные модели сахарного диабета у людей и синдрома устойчивости к инсулину. Поэтому такие агенты можно было бы применять при лечении сахарного диабета и синдрома устойчивости к инсулину. Все из проиллюстрированных соединений, которые были протестированы, продемонстрировали активность, по меньшей мере, в одном из анализов биологической активности, в котором они были испытаны.
Определения
Используемый в настоящем описании термин «алкил» означает линейную или разветвленную алкильную группу. Алкильная группа, идентифицированная как имеющая определенное количество атомов углерода, означает любую алкильную группу, имеющую определенное количество углеродов. Например, алкил, имеющий 3 атома углерода, может представлять собой пропил или изопропил; а алкил, имеющий 4 атома углерода, может представлять собой н-бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил или трет-бутил.
Используемый в настоящем описании термин «галоген» означает фтор, хлор, бром и йод.
Используемый в настоящем описании термин «перфтор», как в перфторметиле или перфторметокси, означает, что рассматриваемая группа имеет атомы фтора вместо всех атомов водорода.
3
Используемый в настоящем описании термин «Ас» относится к группе CHC(O)-.
Определенные химические соединения указаны в настоящем описании показанными ниже их химическими названиями или двухбуквенным кодом. Соединения от СF до CM, включены в пределы диапазона формулы I, показанной выше.
BI
4-(3-(2,6-диметилбензилокси)фенил)-4-оксомасляная кислота
ВТ
4-[[4-(2,6-диметилбензилокси)-3-метокси]фенил]-4-оксомасляная кислота
BU
4-[3-[[N-(4-трифторметилбензил)аминокарбонил]-4-метокси]фенил]-4-оксомасляная кислота
BV
4-[3-[[N-(2,6-диметилбензил)аминокарбонил]-4-метокси]фенил]-4-оксомасляная кислота
СА
(2,6-диметилбензилокси)бензол
CB
3-(3-(2,6-диметилбензилокси)фенил)-3-оксопропионат метила
СС
3-(3-(2,6-диметилбензилокси)фенил)-4-оксобутирамид
CD
5-(3-(2,6-диметилбензилокси)фенил)-5-оксопентановая кислота
СЕ
5-(3-(2,6-диметилбензилокси)фенил)масляная кислота
CF
3-(2,6-диметилбензилокси)фенилуксусная кислота
CG
3-(2,6-диметилбензилокси)бензойная кислота
СН
3-(2,6-диметилбензилокси)бензоат этила
CI
6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]гексановая кислота
CJ
6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]гексаноат этила
СК
5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пентановая кислота
CL
5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пентаноат этила
СМ
3-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пропионовая кислота
CN
3-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пропаноат этила
Используемый в настоящем описании термин «включающее» является неограниченным. Притязание, использующее этот термин, может содержать элементы в дополнение к элементам, изложенным в таком притязании.
Соединения изобретения
3
В одном варианте осуществления агента, применения, способа или фармацевтической композиции, описанных выше, n=1; q=0; t=0; R представляет собой водород и А представляет собой фенил, незамещенный или замещенный 1 или 2 группами, выбранными из галогена, алкила, имеющего 1 или 2 атома углерода, перфторметила, алкоксигруппы, имеющей 1 или 2 атома углерода, и перфторметокси. В более конкретном варианте осуществления А представляет собой 2,6-диметилфенил. Примеры таких соединений включают 3-(2,6-диметилбензилокси)фенилуксусную кислоту; 3-(2,6-диметилбензилокси)бензойную кислоту; 3-(2,6-диметилбензилокси)бензоат этила; 6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]гексановую кислоту; 6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]гексаноат этила; 5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пентановую кислоту; 5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пентаноат этила; 3-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пропионовую кислоту и 3-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пропаноат этила.
В предпочтительном варианте осуществления биологически активного агента этого изобретения агент находится, по существу, в чистой форме (по меньшей мере, 98%).
Схемы реакций
Биологически активный агент настоящего изобретения можно получить в соответствии со следующими схемами реакций.
3
1
Соединение формулы I, где m=0-2, q=0, t=0 или 1 и n=1 или 2, R представляет собой водород, галоген, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, а R представляет собой водород или алкоксигруппу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода, т.е. соединения формулы
где А имеет значение, определенное выше, можно получить посредством реакции по схеме I.
3
4
В реакции по схеме I A, t, n, m и R имеют значения, определенные выше. R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода, а Y представляет собой уходящую группу.
Соединение формулы II превращается в соединение формулы V посредством реакции стадии (а) с использованием конденсации Мицунобу II с III с использованием трифенилфосфина и азодикарбоксилата диэтила или азодикарбоксилата диизопропила. Реакцию проводят в подходящем растворителе, например, тетрагидрофуране. Для проведения реакции стадии (а) можно использовать любое из условий, обычно используемых при реакциях Мицунобу.
Соединение формулы V можно также получить этерификацией или алкилированием соединения формулы II соединением формулы IV, в соответствии со стадией (а). В соединении формулы IV Y включают, но не ограничиваются, мезилокси, тозилокси, хлор, бром, йод и им подобные. Для проведения реакции стадии (а) можно использовать любой обычный способ этерификации гидроксильной группы взаимодействием с уходящей группой.
1
1
1
Соединение формулы V представляет собой соединение формулы I, в котором R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода. Соединение формулы V можно превратить в свободную кислоту, т.е. соединение формулы I, где R представляет собой Н, гидролизом сложного эфира. Любой обычный способ гидролиза сложного эфира даст соединение формулы I, где R представляет собой Н.
Реакция по схеме 1
3
1
Соединение формулы I, где m=3-5, q=0, t=0 или 1 и n=1 или 2, R представляет собой водород, галоген, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, а R представляет собой водород или алкил, имеющий от 1
до 2 атомов углерода, т.е. соединения формулы
где А имеет значение, определенное выше, можно получить посредством реакции по схеме 2.
1
2
4
В реакции по схеме 2 A, t, n, m, R и R имеют определенные выше значения. R представляет собой алкил, имеющий от 1 до 2 атомов углерода, р=1-3 и Y представляет собой уходящую группу.
Соединение формулы VI превращается в соединение формулы VII посредством реакции стадии (b) с использованием конденсации Мицунобу VI с III с использованием трифенилфосфина и азодикарбоксилата диэтила или азодикарбоксилата диизопропила. Реакцию проводят в подходящем растворителе, например, тетрагидрофуране. Для проведения реакции стадии (b) можно использовать любое из условий, обычно используемых при реакциях Мицунобу.
Соединение формулы VII можно также получить этерификацией или алкилированием соединения формулы VI соединением формулы IV посредством реакции стадии (с) с использованием подходящего основания, такого как карбонат калия, гидрид натрия, триэтиламин, пиридин и им подобные. В соединении формулы IV Y включает, но не ограничивается, мезилокси, тозилокси, хлор, бром, йод и им подобные. Для проведения реакции стадии (с) можно использовать любые обычные условия для алкилирования гидроксильной группы галогенидом или уходящей группой. Реакция стадии (с) предпочтительнее стадии (b), если соединение формулы IV легко доступно.
Соединение формулы VII превращается в соединение формулы IX посредством реакции стадии (d) алкилированием соединения формулы VII соединением формулы VIII. Эта реакция проводится в присутствии приблизительно молярного эквивалента обычного основания, которое превращает ацетофенон в сложный 3-кетоэфир (т.е. сложный гамма-кетоэфир). При проведении этой реакции в целом предпочтительно использовать соли щелочных металлов гексаметилдисилана, такие как бис-(триметилсилил)амид лития и ему подобные, но условия проведения реакции не ограничиваются этим. В целом, эта реакция проводится в инертных растворителях, таких как тетрагидрофуран: 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1Н)-пиримидинон. В целом, реакция проводится при температурах от -65°С до 25°С. Для проведения реакции стадии (d) можно использовать любое из условий, обычно используемых при таких реакциях алкилирования.
1
Соединение формулы IX превращается в свободную кислоту гидролизом сложного эфира. Любой обычный способ гидролиза сложного эфира даст соединение формулы IX, где R представляет собой Н.
2
1
Соединение формулы IX превращается в соединение формулы X посредством реакции стадии (e) восстановлением кетогруппы в группу СН. Реакцию проводят посредством нагревания соединения формулы IX с гидратом гидразина и основанием, таким как KOH или NaOH в подходящем растворителе, таком как этиленгликоль. При проведении этой реакции в целом предпочтительно использовать КОН в качестве основания, но условия проведения реакции не ограничиваются этим. Для проведения реакции стадии (е) можно использовать любое из условий, обычно используемых при реакции Вольфа-Кишнера. Соединение формулы Х представляет собой соединение формулы I, где R представляет собой Н.
1
1
2
4
В соединении формулы Х кислота может быть превращена в сложный эфир, т.е. соединение формулы I, где R представляет собой алкил, имеющий от 1 до 2 атомов углерода, этерификацией кислоты использованием катализатора, например, HSO, TsOH и им подобных, или использованием дегидратирующих агентов, например, дициклогексилкарбодиимида и ему подобных в этаноле или метаноле. Для получения соединения формулы I, где R представляет собой алкил, имеющий от 1 до 2 атомов углерода, можно использовать любые обычные условия при таких реакциях этерификации.
Реакция по схеме 2
2
Соединение формулы I, где q=1, R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, m=3-5, t=0 или 1 и n=1 или 2, т.е. соединения формулы
1
3
где А имеет значение, определенное выше, R представляет собой водород или алкил, имеющий от 1 до 2 атомов углерода, R представляет собой водород, галоген, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, можно получить посредством реакции по схеме 3.
1
3
2
4
В реакции по схеме 3 t, n, A, R, R и R имеют значения, определенные выше. R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода. Y представляет собой хлор или бром и р=1-3.
Соединение формулы XI можно мезилировать для получения соединения формулы XII посредством реакции стадии (f). Для проведения стадии (f) можно использовать любые обычные условия для проведения реакции мезилирования гидроксильной группы. Затем соединение формулы XII нагревают с соединением формулы XIII для получения соединения формулы XIV. Для проведения реакции стадии (g) можно использовать любые из условий, обычно используемых для получения аминоспирта.
В соединении формулы XIV спирт может быть замещен хлором или бромом путем обработки соединения формулы XIV хлоридом тионила, бромом и трибромидом фосфора и им подобными для получения соединения формулы XV. Для проведения реакции стадии (h) можно использовать любой обычный способ для замещения спирта хлором или бромом.
Соединение формулы XV может взаимодействовать с соединением формулы VI посредством реакции стадии (i) в присутствии подходящего основания, такого как карбонат калия, гидрид натрия, триэтиламин и им подобные. Реакцию проводят в обычных растворителях, таких как диметилформамид, тетрагидрофуран и им подобные, для получения соответствующего соединения формулы XVI. Для проведения реакции стадии (i) можно использовать любой обычный способ этерификации гидроксильной группы в присутствии основания (причем предпочтительным основанием является карбонат калия) с хлором или бромом.
Соединение формулы XVI можно превратить в соединение формулы XVII посредством реакции стадии (j) алкилированием соединения формулы XVI соединением формулы VIII. Эту реакцию проводят в присутствии приблизительно молярного эквивалента подходящего основания, такого как гексаметилдисилан лития. Эта реакция проводится таким же образом, как описано в связи с реакцией стадии (d) схемы 2.
1
Соединение формулы XVII можно превратить в свободную кислоту гидролизом сложного эфира. Любой обычный способ гидролиза сложного эфира даст соединение формулы XVII, где R представляет собой Н.
2
Соединение формулы XVII можно превратить в соединение формулы XVIII посредством реакции стадии (k) восстановлением кетогруппой в группу СН. Реакцию можно проводить нагреванием соединения формулы XVII с гидратом гидразина и основанием, таким как КОН или NaOH, в подходящем растворителе, таком как этиленгликоль. При проведении этой реакции в целом предпочтительно использовать КОН в качестве основания, но условие проведение реакции не ограничивается этим. Для проведения реакции стадии (k) можно использовать любое из условий, обычно используемых при реакции Вольфа-Кишнера.
1
Соединение формулы XVIII представляет собой соединение формулы I, где R представляет собой Н.
1
1
2
4
В соединении формулы XVIII кислоту можно превратить в сложный эфир, т.е. соединение формулы I, где R представляет собой алкил, имеющий от 1 до 2 атомов углерода этерификацией кислоты с использованием катализаторов, например, HSO, TsOH и им подобных, или использованием дегидратирующих веществ, например, дициклогексилкарбодиимида и ему подобных, в этаноле или метаноле. Для получения соединения формулы I, где R представляет собой алкил, имеющий от 1 до 2 атомов углерода, можно использовать любые обычные условия при таких реакциях этерификации.
Реакция по схеме 3
3
1
Соединение формулы I, где m=0-2, q=1, t=0 или 1 и n=1 или 2, R представляет собой водород, галоген, алкокси, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, а R представляет собой алкил, имеющий от 1 до 2 атомов углерода, т.е. соединения формулы
где А имеет значение, определенное выше, можно получить посредством реакции, показанной на схеме 4.
3
2
4
В реакции по схеме 4 t, n, A, R и R имеют значения, определенные выше. R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода. Y представляет собой хлор или бром.
Соединение формулы XV (полученное таким же образом, как описано в реакции схемы 3) может взаимодействовать с соединением формулы II посредством реакции стадии (l) в присутствии подходящего основания, такого как карбонат калия, гидрид натрия, триэтиламин и им подобных. Реакцию можно проводить в обычных растворителях, таких как диметилформамид, тетрагидрофуран, дихлорметан и им подобных, для получения соответствующего соединения формулы XIX. Для проведения реакции стадии (l) можно использовать любые обычные условия этерификации гидроксильной группы в присутствии основания (причем предпочтительным основанием является карбонат калия) с хлором или бромом.
1
1
1
Соединение формулы XIX представляет собой соединение формулы I, где R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода. Соединение формулы XIX можно превратить в свободную кислоту, т.е. соединение формулы I, где R представляет собой Н, гидролизом сложного эфира. Любой обычный способ гидролиза сложного эфира даст соединение формулы I, где R представляет собой Н.
Реакция по схеме 4
Соединение формулы III, где t=0 или 1, n=1 или 2, т.е. соединения формулы
A(CH
)
-OH,
2
t+n
где А имеет значение, определенное выше, можно получить посредством реакции схемы 5.
В реакции в соответствии со схемой 5 A имеет значение, определенное выше, а Y представляет собой уходящую группу.
Соединение формулы XX можно восстановить в соединение формулы XXI посредством реакции стадии (m). Реакцию проводят с использованием обычного восстанавливающего вещества, например, гидрида щелочного металла, такого как литийалюминийгидрид. Реакцию проводят в подходящем растворителе, таком как тетрагидрофуран. Для проведения реакции стадии (m) можно использовать любые из условий, обычных при таких реакциях восстановления.
Соединение формулы XXI представляет собой соединение формулы III, где t=0 и n=1.
Соединение формулы XXI можно превратить в соединение формулы XXII замещением гидроксильной группы галогеном, причем предпочтительным галогеном является бром или хлор. Соответствующие галоидные реагенты включают тионилхлорид, бром, трибромид фосфора, тетрабромид углерода и им подобные, но не ограничиваются ими. Для проведения реакции стадии (n) можно использовать любые условия, обычные при таких реакциях галогенирования.
Соединение формулы XXII представляет собой соединение формулы IV, где t=0 и n=1.
Соединение формулы XXII можно превратить в соединение формулы XXIII взаимодействием XXII с цианидом щелочного металла, например цианидом натрия или калия. Реакцию проводят в подходящем растворителе, таком как диметилсульфоксид. Для проведения реакции стадии (о) можно использовать любые из условий, обычно используемых при получении нитрила.
Соединение формулы XXIII можно превратить в соединение формулы XXIV реакцией стадии (р) гидролизом кислоты или основания. При проведении этой реакции в целом предпочтительно использовать основный гидролиз, например водную гидроокись натрия. Для проведения реакции стадии (р) можно использовать любые из условий, обычно используемых при гидролизе нитрила.
Соединение формулы XXIV можно восстановить для получения соединения формулы XXV посредством реакции стадии (q). Эту реакцию можно проводить таким же образом, как описано выше в реакции стадии (m).
Соединение формулы XXV представляет собой соединение формулы III, где t=1 и n=1.
Соединение формулы XXV можно превратить в соединение формулы XXVI посредством реакции стадии (r) таким же образом, как описано выше в реакции стадии (n).
Соединение формулы XXVI представляет собой соединение формулы IV, где t=1 и n=1.
Соединение формулы XXVI может взаимодействовать с малонатом диэтила с использованием подходящего основания, например гидрида натрия, для получения соединения формулы XXVII. Реакцию проводят в подходящих растворителях, таких как диметилформамид, тетрагидрофуран и им подобные соединения. Для проведения реакции стадии (s) можно использовать любое из условий, которые обычны при таких реакциях алкилирования.
Соединение формулы XXVII можно гидролизировать кислотой или основанием для получения соединения формулы XXVIII посредством реакции стадии (t).
Соединение формулы XXVIII можно превратить в соединение формулы XXIX посредством реакции стадии (u) тем же образом, как описано ранее, для реакции стадии (m).
Соединение формулы XXIX представляет собой соединение формулы III, где t=1, а n=2.
Соединение формулы XXVIX можно превратить в соединение формулы XXX посредством реакции стадии (v) тем же образом, как описано ранее, в связи с реакцией стадии (n). Соединение формулы XXX представляет собой соединение формулы IV, где t=1, а n=2.
Реакция по схеме 5
4
3
Соединение формулы II, где m=0, R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода, а R представляет собой галоген, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, т.е. соединения формулы
можно получить посредством реакции по схеме 6.
1
3
4
В реакции в соответствии со схемой 6 R представляет собой Н. R и R имеют указанные выше значения.
1
2
4
В соединении формулы XXXI R представляет собой Н. Соединение формулы XXXI можно превратить в соединение формулы II посредством реакции стадии (w) этерификацией соединения формулы XXXI метанолом или этанолом. Реакцию можно проводить или с использованием катализаторов, например, HSO, TsOHи им подобных, или использованием дегидратирующих агентов, например, дициклогексилкарбодиимида и им подобных. Для проведения реакции стадии (w) можно использовать любые из условий, обычных при таких реакциях этерификации.
Реакции по схеме 6
3
Соединение формулы VI, где R представляет собой галоген, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, т.е. соединения формулы
можно получить посредством реакции по схеме 7.
1
3
В реакции по схеме 7 m=0, а R представляет собой Н, а R представляет собой галоген, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода.
В реакции по схеме 7 m=0. Реакция по схеме 7 аналогична способу George M. Rubottom et al., J. Org. Chem. 1983, 48, 1550-1552.
Реакция по схеме 7
4
3
Соединение формулы II, где m=1-2, R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода, а R представляет собой галоген, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, т.е. соединения формулы
можно получить посредством реакции по схеме 8.
1
3
4
5
В реакции по схеме 8 R представляет собой Н, R представляет собой галоген, алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, или алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода, и R представляет собой группу, защищающую гидроксигруппу.
1
Соединение формулы II где m=0, можно превратить в соединение формулы XXXII посредством стадии (y) сначала защитой гидроксигруппы использованием подходящих защитных групп, таких как группы, описанные в публикации T. Greene Protecting Groups in Organic Synthesis, а затем снятием защиты группы сложного эфира гидролизом сложного эфира. Любой обычный способ гидролиза сложного эфира даст соединение формулы XXXII, где R представляет собой Н.
Соединение формулы XXXII может быть восстановлено до соединения формулы XXXIII с помощью обычного восстанавливающего реагента, который превращает кислоту в спирт посредством реакции стадии (z). При проведении этой реакции в целом предпочтительно использование литийалюминийгидрида, но условия проведения реакции не ограничиваются этим. Реакцию проводят в подходящем растворителе, таком как тетрагидрофуран и ему подобные соединения. Для проведения реакции стадии (z) можно использовать любые условия, обычные при таких реакциях восстановления.
Соединение формулы XXXIII можно превратить в соединение формулы XXXIV замещением гидроксигруппы галогеном, причем предпочтительным является бром или хлор. Соответствующие галогенирующие реагенты включают, но не ограничиваются, хлорид тионила, бром, трибромид фосфора, тетрабромид углерода и им подобные. Для проведения реакции стадии (a') можно использовать любые условия, обычные при таких реакциях галогенирования.
Соединение формулы XXXIV можно превратить в соединение формулы XXXV взаимодействием XXXIV с цианидом щелочного металла, например цианидом натрия или калия. Реакцию проводят в подходящем растворителе, таком как диметилсульфоксид. Для проведения реакции стадии (b') можно использовать любые условия, обычно используемые при получении нитрилов.
Соединение формулы XXXV можно превратить в соединение формулы XXXVI посредством реакции стадии (c') гидролизом кислоты или основания. При проведении этой реакции в целом предпочтительно использовать основный гидролиз, например водный гидроксид натрия. Для проведения реакции стадии (с') можно использовать любые из условий, обычные для гидролиза нитрила.
Соединение формулы XXXVI можно превратить в соединение формулы XXXVII посредством реакции стадии (d') удалением группы, защищающей гидроксигруппу, с использованием подходящих снимающих защиту реагентов, таких как реагенты, описанные в публикации T. Greene Protecting Groups in Organic Synthesis.
4
2
4
Соединение формулы XXXVII можно превратить в соединение формулы II, где m=1, и R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода, этерификацией соединения формулы XXXVII метанолом или этанолом. Эту реакцию можно проводить или использованием катализаторов, например, HSO, TsOH и им подобных, или использованием дегидратирующих средств, например дициклогексилкарбодиимида, и ему подобных. Для проведения реакции можно использовать любые из условий, обычных при таких реакциях этерификации.
Соединение формулы XXXIV может взаимодействовать с диэтилмалонатом с использованием подходящего основания, например гидрида натрия, для получения соединения формулы XXXVIII. Реакцию проводят в подходящих растворителях, таких как диметилформамид, тетрагидрофуран и им подобные. Для проведения реакции стадии (e') можно использовать любые из условий, обычных при таких реакциях алкилирования.
Соединение формулы XXXVIII может подвергаться гидролизу кислотой или основанием и удалением группы, защищающей гидроксигруппу, с использованием подходящих снимающих защиту реагентов, таких как реагенты, описанные в публикации T. Greene Protecting Groups in Organic Synthesis, для получения соединения формулы XXXIX посредством реакции стадии (f').
4
2
4
Соединение формулы XXXIX можно превратить в соединение формулы II, где m=2, и R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода, этерификацией соединения формулы XXXIX метанолом или этанолом. Эту реакцию можно проводить или использованием катализаторов, например, HSO, TsOH и им подобных, или использованием дегидратирующих агентов, например дициклогексилкарбодиимида, и ему подобных. Для проведения реакции можно использовать любые из условий, обычных при таких реакциях этерификации.
Реакция по схеме 8
1
1
Соединение формулы XXXI, где m=0, R представляет собой Н, а R представляет собой галоген, т.е. соединения формулы
представляют собой или те, которые имеются в продаже, или которые можно получить в соответствии со способами, описанными в литературе, и представляют собой следующие соединения:
6
3
2
1. 3-Br или F-2-OHCHCOH
Canadian Journal of Chemistry (2001), 79(11) 1541-1545.
6
3
2
2. 4-Br-2-OHCHCOH
WO 9916747 или JP 04154773.
6
3
2
3. 2-Br-6-OHCHCOH
JP 47039101.
6
3
2
4. 2-Br-3-OHCHCOH
WO 9628423.
6
3
2
5. 4-Br-3-OHCHCOH
WO 2001002388.
6
3
2
6. 3-Br-5-OHCHCOH
Journal of labelled Compounds and Radiopharmaceuticals (1992), 31 (3), 175-82.
6
3
2
6
3
2
7. 2-Br-5-OHCHCOH и 3-Cl-4-OHCHCOH
WO 9405153 и US 5519133.
6
3
2
6
3
2
8. 2-Br-4-OHCHCOH и 3-Br-4-OHCHCOH
WO 20022018323
6
3
2
9. 2-Cl-6-OHCHCOH
JP 06293700
6
3
2
10. 2-Cl-3-OHCHCOH
Proceedings of the Indiana Academy of Science (1983), Volume date 1982, 92, 145-51.
6
3
2
11. 3-Cl-5-OHCHCOH
WO 2002000633 и WO 2002044145.
6
3
2
12. 2-Cl-5-OHCHCOH
WO 9745400.
6
3
2
6
3
2
13. 5-I-2-OHCHCOH и 3-I, 2-OHCHCOH
Z. Chem. (1976), 16(8), 319-320.
6
3
2
14. 4-I-2-OHCHCOH
Journal of Chemical Research, Synopses (1994), (11), 405.
6
3
2
15. 6-I-2-OHCHCOH
US 4932999.
6
3
2
6
3
2
16. 2-I-3-OHCHCOH и 4-I-3-OHCHCOH
WO 9912928.
6
3
2
17. 5-I-3-OHCHCOH
J. Med. Chem. (1973), 16(6), 684-7.
6
3
2
18. 2-I-4-ОНСНСОН
Collection of Czechoslovak Chemical Communications (1991), 56(2), 459-77.
6
3
2
19. 3-I-4-ОНСНСО,
J.O.C. (1990), 55(18), 55287-91.
1
3
Соединение формулы XXXI, где m=0, R представляет собой Н, и R представляет собой алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, и фенильное кольцо замещено, как показано ниже:
можно синтезировать посредством реакции по схеме 9.
1
3
4
При реакции в соответствии со схемой 9 R и R имеют значения, указанные выше, а R представляет собой алкильную группу, имеющую от 1 до 2 атомов углерода.
Соединение формулы XL можно превратить в соединение формулы XLI восстановлением альдегида в первичный спирт. При проведении этой реакции предпочтительно использование боргидрида натрия в качестве восстанавливающего реагента, но условия реакции не ограничиваются этим. Для проведения реакции стадии (g') можно использовать любые условия, подходящие при таких реакциях восстановления.
Соединение формулы XLI можно превратить в соединение формулы XLII посредством реакции стадии (h') защитой 1-3 диолов использованием 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксана. Подходящие условия для этой защитной группы могут быть описаны в публикации T. Greene Protecting Groups in Organic Synthesis.
Соединение формулы XLII можно превратить в соединение формулы XLIII посредством реакции стадии (i') защитой фенольной группы с использованием бромида бензила. Подходящие условия для этой защитной группы могут быть описаны в публикации T. Greene Protecting Groups in Organic Synthesis.
Соединение формулы XLIII можно превратить в соединение формулы XLIV снятием защиты с использованием фторида тетрабутиламмония посредством реакции стадии (j'). Подходящие условия для снятия защиты могут быть описаны в публикации T. Greene Protecting Groups in Organic Synthesis.
Соединение формулы XLIV можно превратить в соединение формулы XLV посредством реакции стадии (k') окислением. Для проведения реакции стадии (k') можно использовать любую обычную окисляющую группу, которая превращает первичный спирт в кислоту, например окись хрома и им подобные.
2
4
Соединение формулы XLV можно превратить в соединение формулы XLVI этерификацией соединения формулы XLV метанолом или этанолом. Эту реакцию можно проводить или использованием катализаторов, например, HSO, TsOH и им подобных, или использованием дегидратирующих агентов, например, дициклогексилкарбодиимида и ему подобных. Для проведения реакции стадии (l') можно использовать любые из условий, обычных при таких реакциях этерификации.
Соединение формулы XLVI можно превратить в соединение формулы XLVII этерификацией или алкилированием соединения формулы XLVI с галогенидом метила или галогенидом этила или галогенидом пропила использованием подходящего основания, например карбоната калия, гидрида натрия и им подобных. Реакцию проводят в обычных растворителях, таких как тетрагидрофуран, диметилформамид. Реакцию в целом проводят при температурах от 0°С до 40°С. Для проведения реакции стадии (m') можно использовать любые из условий, подходящие при таких реакциях алкилирования.
Соединение формулы XLVII можно превратить в соединение формулы XLVIII снятием защиты группы сложного эфира и бензильной группы. Подходящие условия снятия защиты могут быть описаны в публикации T. Greene Protecting Groups in Organic Synthesis.
Реакция по схеме 9
1
3
Соединение формулы XXXI, где m=0, R представляет собой Н, а R представляет собой алкоксигруппу, имеющую от 1 до 3 атомов углерода, т.е. соединения формулы
и представляют собой или те, которые имеются в продаже, или которые можно получить в соответствии со способами, описанными в литературе, и представляют собой следующие соединения:
6
3
2
1. 2-ОМе-4-ОНСНСОН
US 2001034343 или WO 9725992.
6
3
2
2. 5-OMe-3-OHCHCOH
J.O.C (2001), 66(23), 7883-88.
6
3
2
3. 2-OMe-5-OHCHCOH
US 6194406 (Page 96) и Journal of the American Chemical Society (1985), 107(8), 2571-3.
6
3
2
4. 3-OEt-5-OHCHCOH
Taiwan Kexue (1996), 49(1), 51-56.
6
3
2
5. 4-0Et-3-OHCHCOH
WO 9626176
6
3
2
6. 2-OEt-4-OHCHCOH
Takeda Kenkyusho Nempo (1965), 24, 221-8.
JP 07070025.
6
3
2
7. 3-OEt-4-OHCHCOH
WO 9626176.
6
3
2
8. 3-ОРr-2-ОНСНСОН
JP 07206658, DE 2749518.
6
3
2
9. 4-OPr-2-OHCHCOH
Farmacia (Bucharest) (1970), 18(8), 461-6.
JP 08119959.
6
3
2
6
3
2
10. 2-OPr-5-OHCHCOH и 2-OEt-5-OHCHCOH
Адаптировать синтез из патента США 6194406 (с.96) использованием йодида пропила и йодида этила.
6
3
2
11. 4-ОРr-3-ОНСНСОН
Адаптировать синтез из WO 9626176
6
3
2
12. 2-OPr-4-OHCHCOH
Адаптировать синтез из Takeda Kenkyusho Nempo (1965), 24, 221-8 использованием пропилгалогенида.
6
3
2
13. 4-OEt-3-OHCHCOH
Biomedical Mass Spectrometry (1985), 12(4), 163-9.
6
3
2
14. 3-ОPr-5-ОHCHCOH
Адаптировать синтез из Taiwan Kexue (1996), 49(1), 51-56 использованием пропилгалогенида.
1
3
Соединение формулы XXXI, где m=0, R представляет собой Н, а R представляет собой алкил, имеющий от 1 до 3 атомов углерода, т.е. соединения формулы
представляют собой или те, которые имеются в продаже, или которые можно получить в соответствии со способами, описанными в литературе, и представляют собой следующие соединения:
6
3
2
6
3
2
1. 5-Me-3-OHCHCOH и 2-Me-5-OHCHCOH
WO 9619437.
J.O.C. 2001, 66,7883-88.
6
3
2
2. 2-Me-4-OHCHCOH
WO 8503701.
6
3
2
6
3
2
3. 3-Еt-2-ОНСНСОН и 5-Et-2-OHCHCOH
J. Med. Chem. (1971), 14(3), 265.
6
3
2
4. 4-Et-2-OHCHCOH
Yaoxue Xuebao (1998), 33(1), 67-71.
6
3
2
6
3
2
5. 2-Et-6-OHCHCOH и 2-n-Рr-6-ОНСНСОН
J. Chem. Soc., Perkin Trans 1 (1979), (8), 2069-78.
6
3
2
6. 2-Et-3-OHCHCOH
JP 10087489 и WO 9628423.
6
3
2
7. 4-Et-3-OHCHCOH
J.O.C. 2001, 66, 7883-88.
WO 9504046.
6
3
2
8. 2-Et-5-OHCHCOH
J.A.C.S (1974), 96(7), 2121-9.
6
3
2
6
3
2
9. 2-Et-4-OHCHCOH и 3-Et-4-OHCHCOH
JP 04282345.
6
3
2
10. 3-n-Pr-2-OHCHCOH
J.O.C (1991), 56(14), 4525-29.
6
3
2
11. 4-n-Pr-2-OHCHCOH
EP 279630.
6
3
2
12. 5-n-Pr-2-OHCHCOH
J. Med. Chem. (1981), 24(10), 1245-49.
6
3
2
13. 2-n-Pr-3-OHCHCOH
WO 9509843 и WO 9628423.
6
3
2
14. 4-n-Pr-3-OHCHCOH
WO 9504046.
6
3
2
15. 2-n-Pr-5-OHCHCOH
Синтез можно адаптировать из J.A.C.S (1974), 96(7), 2121-9 использованием альфа-формилвалерата этила.
6
3
2
16. 3-n-Pr-4-OHCHCOH
Polymer (1991), 32(11) 2096-105.
6
3
2
17. 2-n-Pr-4-OHCHCOH
3
3-пропилфенол можно метилировать в 3-пропиланизол, который был затем формилирован в 4-метокси-3-бензальдегид. Альдегид может быть окислен реагентом Джона с получением соответствующей кислоты, и снятие защиты метильной группы BBr даст указанное в заголовке соединение.
6
3
2
6
3
2
18.1. 3-Et-5-OHCHCOH и 3-Pr-n-5-OHCHCOH
Адаптировать синтез из J.O.C. 2001, 66, 7883-88 использованием 2-этилакролеина и 2-пропилакролеина.
Применение в способах лечения
Настоящее изобретение относится к способу лечения млекопитающего с состоянием, выбранным из группы, состоящей из синдрома устойчивости к инсулину и сахарного диабета (и первичного эссенциального сахарного диабета, такого как диабет I типа или диабет II типа, и виды вторичного неэссенциального сахарного диабета), включающему введение индивидууму количества биологически активного агента, как описано в настоящем описании, эффективного для лечения указанного состояния. В соответствии со способом настоящего изобретения можно уменьшить симптом сахарного диабета или вероятности развития симптома сахарного диабета, такого как атеросклероз, ожирение, гипертензия, гиперлипидемия, жировая инфильтрация печени, нефропатия, нейропатия, ретинопатия, изъязвление стоп и катаракты, причем каждый такой симптом связан с сахарным диабетом. Данное изобретение также относится к способу лечения гиперлипидемии, включающему введение индивидууму количества биологически активного агента, как описано в настоящем описании, эффективного для лечения указанного состояния. Как показано в примерах, соединения снижают уровни триглицеридов и свободных жирных кислот в сыворотке у животных с гиперлипидемией. Это изобретение также относится к способу лечения кахексии, включающему введение индивидууму количества биологически активного агента, как описано в настоящем описании, эффективного для лечения кахексии. Это изобретение также относится к способу лечения ожирения, включающему введение индивидууму количества биологически активного агента, как описано в настоящем описании, эффективного для лечения этого состояния. Это изобретение также относится к способу лечения состояния, выбранного из атеросклероза или артериосклероза, включающему введение индивидууму количества биологически активного агента, как описано в настоящем описании, эффективного для лечения данного состояния. Активные агенты настоящего изобретения эффективны для лечения гиперлипидемии, жировой инфильтрации печени, кахексии, ожирения, атеросклероза или артериосклероза, независимо от наличия у индивидуума сахарного диабета или синдрома устойчивости к инсулину. Агент можно ввести любым обычным путем системного введения. Предпочтительно агент вводят перорально. Соответственно, предпочтительно, чтобы лекарственное средство составлялось в форме, пригодной для перорального введения. Другие пути введения, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, включают ректальный, парентеральный, путем инъекции (например, внутривенную, подкожную, внутримышечную или внутрибрюшинную инъекцию) или интраназальный.
Дальнейшие варианты осуществления каждого из видов применения и способов лечения настоящего изобретения включают введение любого из вариантов осуществления биологически активных агентов, описанных выше. Причем каждый такой агент и группа агентов не повторяются, но они включены в настоящее описание применения и способов лечения, как если бы они повторялись.
Многие из заболеваний или расстройств, на которые направлены соединения изобретения, делятся на две широкие категории: синдромы устойчивости к инсулину и последствия хронической гипергликемии. Нарушение регуляции энергетического метаболизма, особенно устойчивость к инсулину, которая может возникнуть в отсутствие сахарного диабета (стойкая гипергликемия) как такового, связана с разнообразными симптомами, включающими гиперлипидемию, атеросклероз, ожирение, эссенциальную гипертонию, жировую инфильтрацию печени (NASH; неалкогольный стеатогепатит) и особенно, в контексте рака или системного воспалительного заболевания, кахексию. Кахексия может также возникать в контексте сахарного диабета I типа или поздней стадии диабета II типа. Ввиду улучшения энергетического метаболизма ткани активные агенты изобретения можно применять для предотвращения или облегчения заболеваний и симптомов, связанных с устойчивостью к инсулину, как показано у животных в примерах. Хотя группа признаков и симптомов, связанных с устойчивостью к инсулину, может сосуществовать у отдельного пациента, во многих случаях может преобладать только один симптом вследствие индивидуальных различий уязвимости многих физиологических систем, пораженных устойчивостью к инсулину. Тем не менее, поскольку устойчивость к инсулину представляет собой основной фактор многих патологических состояний, препараты, которые направлены на этот клеточный и молекулярный дефект, можно применять для предотвращения или облегчения в сущности любого симптома в любой системе органов, который может быть вызван или обострен устойчивостью к инсулину.
Когда устойчивость к инсулину и сопутствующая неадекватная продукция инсулина островками поджелудочной железы достаточно тяжелые, возникает хроническая гипергликемия, определяющая начало сахарного диабета II типа (NIDDM). В дополнение к метаболическим расстройствам, связанным с указанной выше устойчивостью к инсулину, патологические симптомы, вызванные гипергликемией, также возникают у пациентов с NIDDM. Они включают нефропатию, периферическую нейропатию, ретинопатию, микрососудистое заболевание, изъязвление конечностей и последствия неферментативного гликозилирование белков, например повреждение коллагена и других соединительных тканей. Ослабление гипергликемии снижает частоту начала и тяжесть указанных последствий сахарного диабета. Ввиду того, что, как показано в примерах, активные агенты и композиции изобретения помогают снизить гипергликемию при диабете, их можно применять для предотвращения осложнений хронической гипергликемии.
И людей, и индивидуумов млекопитающих, кроме человека, можно лечить в соответствии со способом лечения настоящего изобретения. Опытный клиницист может в клинических условиях определить оптимальную дозу конкретного активного агента изобретения для конкретного индивидуума. В случае перорального введения человеку для лечения расстройств, связанных с устойчивостью к инсулину, диабетом, гиперлипидемией, жировой инфильтрацией печени, кахексией или ожирением, агент в целом вводят в суточной дозе от 1 мг до 400 мг, вводимой 1 или 2 раза/сутки. В случае перорального введения мыши, агент в целом вводят в суточной дозе от 1 мг до 300 мг агента на 1 кг массы тела. Активные агенты в соответствии с изобретением применяют в виде монотерапии при диабете или синдроме устойчивости к инсулину, или в комбинации с одним или несколькими другими препаратами, используемыми при этих типах диабета, например средствами, высвобождающими инсулин, средствами, высвобождающими инсулин, при приеме пищи, бигуанидами или самим инсулином. Такие дополнительные препараты вводят в соответствии со стандартной клинической практикой. В некоторых случаях агенты изобретения улучшают эффективность других классов препаратов, обеспечивая возможность введения пациентам более низких (и поэтому менее токсичных) доз таких средств с удовлетворительными результатами лечения.
Установленными безопасными и эффективными диапазонами доз у людей для репрезентативных соединений являются для метформина - от 500 до 2550 мг/сутки; для глибурида - от 1,25 до 20 мг/сутки; для GLUCOVANCE (комбинированной композиции метформина и глибурида) - от 1,25 до 20 мг/сутки глибурида и от 250 до 2000 мг/сутки метформина; для аторвастатина - от 10 до 80 мг/сутки; для ловастатина - от 10 до 80 мг/сутки; для правастатина - от 10 до 40 мг/сутки; и для симвастатина - 5-80 мг/сутки; для клофибрата - 2000 мг/сутки; для гемфиброзила - от 1200 до 2400 мг/сутки; для росиглитазона - от 4 до 8 мг/сутки; для пиоглитазона - от 15 до 45 мг/сутки; для акарбозы - от 75 до 300 мг/сутки; для репаглинида - от 0,5 до 16 мг/сутки.
Сахарный диабет I типа: Пациент с диабетом I типа справляется со своим заболеванием в первую очередь самостоятельным введением от одной до нескольких доз инсулина в день при частом мониторинге глюкозы крови для обеспечения возможности соответствующего подбора дозы и времени введения инсулина. Хроническая гипергликемия ведет к осложнениям, таким как нефропатия, нейропатия, ретинопатия, изъязвление стоп и ранняя смертность; гипогликемия вследствие введения избыточной дозы инсулина может вызвать когнитивную дисфункцию или потерю сознания. Пациента с диабетом I типа лечат активным агентом этого изобретения в дозе от 1 до 400 мг/сутки в форме таблетки или капсулы или в виде одной, или дробной дозы. Предполагаемым эффектом является снижение дозы или частоты введения инсулина, требуемой для поддержания глюкозы крови в удовлетворительном диапазоне, и сниженная частота возникновения и тяжесть гипогликемических эпизодов. Клинический исход контролируют измерением глюкозы крови и гликолизированного гемоглобина (показателя адекватности гликемического контроля, интегрированный в течение периода нескольких месяцев), а также сниженной частотой и тяжестью типичных осложнений диабета. Биологически активный агент этого изобретения можно вводить в сочетании с трансплантацией островков для содействия поддержанию антидиабетической эффективности трансплантата островков.
Сахарный диабет II типа: Типичный пациент с сахарным диабетом II типа (NIDDM) справляется со своим заболеванием программами диеты и физической нагрузки, а также приемом лекарственных средств, таких как метформин, глибурид, репаглинид, росиглитазон или акарбоза, все из которых обеспечивают некоторое улучшение гликемического контроля у некоторых пациентов, но ни одно из них не лишено побочных эффектов или фактической несостоятельности лечения вследствие прогрессирования заболевания. Со временем у пациентов с NIDDM возникает островковая недостаточность, требующая инъекций инсулина у большой части пациентов. Предполагается, что ежедневное лечение активным агентом в соответствии с изобретением (с дополнительными классами антидиабетических лекарственных средств или без них) улучшит гликемический контроль, снизит частоту островковой недостаточности и снизит частоту возникновения и тяжесть типичных симптомов диабета. Кроме того, активные агенты в соответствии с изобретением снижают повышенный уровень триглицеридов в сыворотке и жирных кислот, снижая посредством этого риск сердечно-сосудистых заболеваний, основную причину смерти пациентов с диабетом. Как и в случае для всех других терапевтических средств, используемых для лечения диабета, оптимизацию дозы проводят у отдельных пациентов в соответствии с необходимостью, клиническим эффектом и восприимчивостью к побочным эффектам.
Гиперлипидемия: Возросшие уровни триглицеридов и свободных жирных кислот в крови воздействуют на значительную часть населения и представляют собой важный фактор риска атеросклероза и инфаркта миокарда. Активные агенты по изобретению можно применять для снижения уровня циркулирующих триглицеридов и свободных жирных кислот у пациентов с гиперлипидемией. У пациентов с гиперлипидемией часто также имеются повышенные уровни холестерина в крови, которые также увеличивают риск сердечно-сосудистых заболеваний. Препараты, снижающие уровень холестерина, такие как ингибиторы HMG-CoA редуктазы («статины»), можно вводить пациентам с гиперлипидемией в дополнение к средствам изобретения, необязательно включенным в ту же фармацевтическую композицию.
Жировая инфильтрация печени: Существенная часть населения поражена жировой инфильтрацией печени, также известной как неалкогольный стеатогепатит (NASH); NASH часто связан с ожирением и диабетом. Стеатоз печени, присутствие капелек триглицеридов в гепатоцитах, предрасполагает печень к хроническому воспалению (выявляемому в образцах биопсии в виде инфильтрации воспалительных лейкоцитов), которое может привести к фиброзу и циррозу. Жировая инфильтрация печени в целом выявляется наблюдением повышенных уровней в сыворотке специфических для печени ферментов, таких как трансаминазы ALT и AST, которые служат в качестве показателей повреждения гепатоцитов, а также проявлением симптомов, которые включают усталость и боль в области печени, хотя окончательный диагноз часто требует биопсию. Предполагаемым благоприятным эффектом является уменьшение воспаления печени и содержания жира, приводящие к ослаблению, остановке или устранению прогрессирования NASH в направлении фиброза и цирроза.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей биологически активный агент, как описано в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. Дальнейшие варианты осуществления фармацевтической композиции этого изобретения включают любой из вариантов осуществления описанных выше биологически активных агентов. Причем каждый такой агент и группа агентов не повторяются, но они включены в настоящее описание фармацевтических композиций, как если бы они повторялись.
Предпочтительно, композиция приспособлена для перорального введения, например, в форме таблетки, таблетки с покрытием, драже, твердой или мягкой желатиновой капсулы, раствора, эмульсии или суспензии. В целом, пероральная композиция включает от 1 мг до 400 мг такого агента. Удобно для индивидуума глотать одну или две таблетки, таблетки с покрытием, драже или желатиновые капсулы в день. Однако композиция может также быть приспособлена для введения любым другим обычным средством системного введения, включая ректально, например в форме суппозиториев, парентерально, например в форме растворов для инъекций, или интраназально.
Биологически активные соединения можно перерабатывать с фармацевтически инертными, неорганическими или органическими носителями для получения фармацевтических композиций. Лактозу, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновую кислоту или ее соли и им подобные можно использовать, например, в качестве таких носителей для таблеток, таблеток с покрытием, драже и твердых желатиновых капсул. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и им подобные. Однако в зависимости от природы активного ингредиента, носители обычно не требуются в случае мягких желатиновых капсул, отличных от самого мягкого желатина. Подходящими носителями для изготовления растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, глицерин, растительные масла и им подобные. Подходящими носителями для суппозиториев являются, например, естественные или отвержденные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и им подобные.
Фармацевтчисекие композиции могут, более того, содержать консерванты, солюбилизирующие средства, стабилизаторы, смачивающие средства, эмульгаторы, подслащивающие агенты, ароматические вещества, соли для изменения осмотического давления, буферы, покрывающие средства или антиоксиданты. Они могут также содержать еще другие терапевтически ценные вещества, в частности антидиабетические или гиполипидемические средства, которые действуют посредством механизмов, отличных от тех, которые лежат в основе эффектов соединений изобретения. Средства, которые можно преимущественно комбинировать с соединениями изобретения в одной композиции, включают, но не ограничиваются, бигуаниды, такие как метформин, средства, высвобождающие инсулин, такие как высвобождающая инсулин сульфонилмочевина глибурид и другие высвобождающие инсулин сульфонилмочевины, препараты, снижающие уровень холестерина, такие как «статиновые» ингибиторы HMG-CoA редуктазы, такие как атровастатин, ловастатин, правастатин и симвастатин, агонисты PPAR-альфа, такие как клофибрат и гемфиброзил, агонисты PPAR-гамма, такие как тиазолидиндионы (например, росиглитазон и пиоглитазон), ингибиторы альфа-глюкозидазы, такие как акарбоза (которая ингибирует переваривание крахмала) и средства, высвобождающие инсулин, при приеме пищи, такие как репаглинид. Количества дополнительных средств, комбинированных с соответствии с дозами, используемыми в стандартной клинической практике. Установленные безопасные и эффективные диапазоны доз для определенных репрезентативных соединений представлены выше.
Изобретение будет лучше понятно при ссылке на следующие примеры, которые иллюстрируют, но не ограничивают описанное здесь изобретение.
ПРИМЕРЫ ХИМИЧЕСКОГО СИНТЕЗА
Пример 1
3-(2,6-Диметилбензилокси)фенилуксусная кислота
Стадия А: Получение 3-гидроксифенилацетата этила
К перемешиваемому раствору 3-гидроксифенилуксусной кислоты (10 г, 65,7 ммоль) и 1,3-дициклогексилкарбодиимида (DCC, 16,27 г, 78,8 ммоль) в DMF (30 мл) добавляют пиридин (2,5 мл) с последующим добавлением абсолютного этанола (15 мл, 255,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 16 ч, фильтруют, концентрируют и очищают флэш-хроматографией на колонке с силикагелем (гексан:этилацетат 2:1) для получения указанного в заголовке соединения.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,2 (т, 3Н); 3,5 (с, 2Н); 4,1 (кв., 2Н); 6,6-7,2 (м, 4Н).
Стадия В: Получение 3-(2,6-диметилбензилокси)фенилацетата этила
2
4
Раствор 2,6-диметилбензилового спирта (5,25 г, 38,6 ммоль) и азодикарбоксилата диизопропила (DIAD, 8,49 г, 42 ммоль) в THF (30 мл) и DMF (13 мл) добавляют по каплям к раствору 3-гидроксифенилацетата этила (Стадия А, 6,66 г, 37 ммоль) и трифенилфосфина (11 г, 42 ммоль) в THF (100 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч, разбавляют простым эфиром и промывают водой. Органический слой сушат над NaSO, фильтруют, концентрируют и очищают флэш-хроматографией на колонке с силикагелем (гексан:этилацетат 1:1) для получения указанного в заголовке соединения.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,2 (т, 3Н); 2,4 (с, 6Н); 3,5 (с, 2Н); 4,1 (кв., 2Н); 5,1 (с, 2Н); 6,9 (м, 2Н); 7,15-7,35 (м, 5Н).
Стадия С: Получение 3-(2,6-диметилбензилокси)фенилуксусной кислоты
2
4
К перемешанному раствору 3-(2,6-диметилбензилокси)фенилацетата этила (Стадия В, 4 г, 13,6 ммоль) в абсолютном этаноле (30 мл) добавляют 1N NaOH (20 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч, подкисляют 1N HCl и концентрируют. Остаток переносят в хлороформ и промывают 0,1N HCl, сушат над NaSO, фильтруют, концентрируют и очищают флэш-хроматографией на колонке с силикагелем (гексан:этилацетат 1:1) для получения указанного в заголовке соединения.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 2,4 (с, 6Н); 3,65 (с, 2Н); 5,1 (с, 2Н); 6,9 (м, 2Н); 7,15-7,35 (м, 5Н).
Пример 2
3-(2,6-Диметилбензилокси)бензойная кислота
Стадия А: Получение 3-(2,6-диметилбензилокси)бензоата этила
2
4
К перемешанному раствору 3-гидроксибензоата этила (12,21 г, 73,47 ммоль) и трифенилфосфина (21,01 г, 80,13 ммоль) в сухом THF (100 мл) добавляют по каплям раствор 2,6-диметилбензилового спирта (10 г, 73,5 ммоль) азодикарбоксилата диизопропила (16,19 г, 80,13 ммоль) в сухом THF (35 мл) и сухом DMF (15 мл) при температуре окружающей среды. После 3 ч перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь разбавляют диэтиловым эфиром и промывают дважды водой и насыщенным солевым раствором. Объединенные органические слои сушат над NaSO, фильтруют, концентрируют, очищают флэш-хроматографией с использованием в качестве элюента этилацетат:гексан (1:3).
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,4 (т, 3Н); 2,4 (с, 6Н); 4,4 (кв., 2Н); 5,1 (с, 2Н); 7,1 (м, 2Н); 7,2 (м, 2Н); 7,4 (т, 1Н); 7,9 (м, 2Н).
Стадия В: Получение 3-(2,6-диметилбензилокси)бензойной кислоты
2
4
К перемешанному раствору 3-(2,6-диметилбензилокси)бензоата этила (Стадия А, 16,31 г, 57,4 ммоль) в абсолютном спирте (150 мл) добавляют 1N NaOH. После 3 часов перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь подкисляют 1M HCl и концентрируют в вакууме. Органический остаток переносят в хлороформ и промывают 0,1N HCl, сушат над NaSO, фильтруют, концентрируют и очищают флэш-хроматографией с использованием хлороформа:метанола (95:5, усиленных уксусной кислотой) в качестве элюента.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 2,4 (с, 6Н); 5,1 (с, 2Н); 7,15-7,35 (м, 4Н); 7,4 (т, 1Н); 7,8 (м, 2Н).
Пример 3:
3-(2,6-Диметилбензилокси)бензойная кислота
Стадия А: Соединение Мицунобу - 3-(2,6-диметилбензилокси)бензоат этила
Таблица 1
Соеди-нение
Сложный гидроксиэфир
ТРР
THF
Бензил-ОН
DIAD
THF
Продукт
Моле-куляр-ная масса
166,17
262,29
136,19
202,21
284,35
Масса
15,0
25,8
12,3
19,9
Объем
40
19,4
40
Моль
0,090
0,098
0,090
0,098
D
1,027
Теоретический выход 25,7 г; действительный выход 19,85 г; фракционный выход 0,773.
Масса = г; объем = мл.
Раствор 3-гидроксибензоата этила и трифенилфосфина в безводном THF охлаждают в ледяной бане до 5°С в атмосфере азота. В отдельной колбе готовят раствор 2,6-диметилбензилового спирта и DIAD в безводном THF и переносят посредством канюли в первую колбу. Добавление очень экзотермическое с подъемом температуры с 5°С до 18°С в пределах первых 2 мин добавления (нескольких мл). Добавление завершается в течение 22 мин при максимальной температуре 24°С. После 30 мин перемешивания образуется осадок, и ледяную баню удаляют. Тонкослойная хроматография (Tlc) (гексаны:простой эфир 1:1, УФ) через 2,5 ч показывает след оставшегося исходного материала.
2
2
2
2
2
2
2
2
Разнообразные системы растворителей используют для лучшего отделения ТРР от продукта, они включают: 10:3 гексаны:простой эфир; 4:1 гексаны:EtOAc; CHCl; 1:1 CHCl; гексаны; 10% CHCl в гексанах; и 5% простой эфир в гексанах. Последняя система растворителей дает наилучшее отделение, растворители с CHCl имеют тенденцию элюировать продукт и ТРР вместе и достаточно быстро.
Таблица 2
<b>Данные tlc</b>
Соединение
Rf (H:E 1:1)
Rf (5% Е/Н 1:1)
TPP
0,86
0,61
Продукт
0,75
0,27
Фенол
0,49
0
BnOH
0,41
0
TPP=O
0,06
0
Н = гексаны, Е = простой этиловый эфир
Через 7 ч реакционную смесь фильтруют для удаления твердых веществ (14,3 г, tlc показывает, что это окись ТРР) и фильтровальную лепешку промывают гексанами:простым эфиром 1:1 (60 мл). Фильтрат концентрируют до получения желтой смеси масла и твердых веществ. Его собирают в 100 мл простого эфира и 100 мл гексанов и дают возможность осесть в течение примерно 1 ч. Твердые вещества собирают вакуумной фильтрацией (24,0 г, tlc показывает только окись ТРР, общее количество удаленных твердых веществ составляет 38,3 г) и фильтрат концентрируют до получения твердого вещества кремового цвета.
2
2
2
2
Твердое вещество растворяют в 100 мл CHCl и наносят на подушку из силикагеля (диаметр 9,5 см на высоту 6 см, ~325 г). Его элюируют CHCl и собирают в 2×500 мл и 2×250 мл колбы. Продукт и ТРР совместно элюируют в первые 2 колбы и окись ТРР удерживается. Концентрируют первые 2 фракции для получения 23,6 г белого порошка. LC/MS (жидкостная хроматография/масс- спектрометрия) (меченая М02130-01) показывает желаемый продукт с чистотой 78% с 11% ТРР в виде основной примеси.
Неочищенный продукт растворяют примерно в 100 мл простого эфира при нагревании и дают возможность охладиться. Осаждается небольшое количество твердого вещества. Добавляют 70 г силикагеля и концентрируют. Его наносят на подушку из силикагеля (260 г, более чем эквивалент Biotage 75S) и элюируют 1 л 5% простого эфира в гексанах и собирают примерно 200 мл фракций (4 фракции). Первая фракция содержит ТРР, а 4-я фракция представляет собой почти чистый продукт, вторая и третья представляли собой перекрестные фракции. Силикагель элюируют 1 л 30% простого эфира в гексанах и собирают в 3 фракции. Фракции 5 и 6 имеют продукт, и их концентрируют для получения белого твердого вещества, 19,85 г (выход 77%).
1
13
Н и С ЯМР спектры согласуются с желаемым продуктом.
LC/MS показывает М+Н=285,1 и чистоту 97,7% УФ при 250 нм.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,4 (т, 3Н); 2,4 (с, 6Н); 4,4 (кв., 2Н); 5,1 (с, 2Н); 7,1 (м, 2Н); 7,2 (м, 2Н); 7,4 (т, 1Н); 7,7 (м, 2Н).
Стадия В: Сапонификация
Таблица 3
Соединение
Сложный эфир
EtOH
40% NaOH
Вода
Продукт
Молекулярная масса
284,35
10N
256,30
Эквивалент
2,13
Масса
10,0
Объем
250
7,5
10
Моль
0,035
0,075
Теоретический выход 8,01 г; фактический выход 5,0 г; фракционный выход 0,55.
Сложный эфир (10 г) стадии А собирают в 50 мл абсолютного EtOH. Он не очень растворим, и порции по 50 мл EtOH добавляют до тех пор, пока не достигается объем 250 мл. В растворе еще присутствуют некоторые количества твердых веществ, и проводят нагревание для образования раствора (46°С). Добавляют раствор 7,5 мл 10 N NaOH, разведенный 10 мл воды, и раствор перемешивают в течение 1 ч. Tlc (гексаны:простой эфир, УФ) показывает, что сложный эфир израсходован, и интенсивное пятно появляется на нулевой линии.
Разработка
Реакционную смесь концентрируют на роторном испарителе при 50°С с получением белого твердого вещества. Твердое вещество эмульгируют в 250 мл деионизированной воды и нерастворимый материал собирают фильтрацией. Фильтрат отставляют в сторону на некоторое время.
2
5
Фильтровальную лепешку промывают 2×200 мл простого эфира и исследуют LC/MS после каждого промывания. Чистота составляет соответственно 98,4% и 98,7%. Твердые вещества перемешивают в 200 мл простого эфира в течение 15 мин и собирают и фильтруют. LC/MS показывает, что его чистота составляет 99,5%. Твердые вещества эмульгируют в 100 мл деионизированной воды и обрабатывают 2,5 мл концентрированной HCl. Контроль рН с помощью индикаторной бумаги указывает на рН 1. Суспензию перемешивают в течение 22 мин и собирают вакуумной фильтрацией. Фильтровальную лепешку промывают несколькими частями воды (общий объем ~100 мл). Сушат в вакууме при 45°С с PO.
1
Н ЯМР спектр согласуется с желаемым продуктом, широкий ОН, центрированный примерно при 6 м.д.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 2,4 (с, 6Н); 5,1 (с, 2Н); 7,1 (м, 2Н); 7,15-7,3 (м, 2Н); 7,4 (т, 1Н); 7,8 (м, 2Н).
Пример 4
: 6-[3-(2,6-Диметилбензилокси)фенил]гексановая кислота
Стадия А: Синтез бромида трифенилэтилвалерата фосфония
Таблица 4
Соединение
Молекулярная масса
Моли
граммы
мл
Плотность
Трифенилфосфин
262,29
0,0450
11,80
209,08
Этил-5-бромвалерат
209,08
0,0600
12,54
9,46
1,321
Бензол
78,02
25
32
13
Растворяют 11,80 г трифенилфосфина в 25 мл толуола в атмосфере азота в 3-горлой колбе емкостью 100 мл с круглым дном, оборудованноймешалкой, термопарой и обратным холодильником с впуском для азота. 12,54 г этил-5-бромвалерата добавляют к раствору, нагревают с обратным холодильником (110°С) и перемешивают в течение 2 ч. Реакционную смесь анализируют через 1 и 2 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры (<25°C) и толуол декантируют из маслянистого твердого вещества. Остаток эмульгируют в 100 мл гексанов трижды, каждый раз декантируя гексаны. Маслянистый остаток нагревают на аппарате Кугельрора при 40°C, 0,1 торр в течение 30 мин для получения 19,0 г (89,6%) белого маслянистого твердого вещества. ЯМР (Р) и ЯМР (С) показывают желаемый продукт.
Стадия В: Получение сложного этилового эфира 6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]гекс-5-еновой кислоты
<img file="00000028.tif" he="133" wi="122" img-content="undefined" img-format="tif" />
Таблица 5
Соединение
Молекулярная масса
Моли
Граммы
MI
Бромид трифенилэтилвалерата фосфония
471,37
0,0282
13,29
3-(2,6-диметилбензилокси)бензальдегид
240,30
0,0208
5,00
Гидрид натрия
24,00
0,0310
0,745
Диметилсульфоксид
78,13
40/20
Смесь 13,29 г бромида трифенилэтилвалерата фосфония и 0,745 г гидрида натрия в 40 мл DMSO перемешивают в течение 30 мин в атмосфере азота в 3-горлой колбе емкостью 100 мл с круглым дном, оборудованной мешалкой, обратным холодильником с впуском для азота и термопарой. Смесь меняет цвет со светло-желтого и нагревается до 40,2°С с 23,2°С. 5,00 г 3-(2,6-диметилбензилокси)бензальдегида растворяют в 20 мл DMSO и добавляют по каплям в течение 4-минутного периода к реакционной смеси. Смесь нагревается от 21,8°С до 26,8°С. Реакционную смесь перемешивают и дают возможность охладиться до комнатной температуры. Реакционную смесь анализируют через 1 ч, и LC-MS показывает, что остается почти весь исходный альдегид и примерно 3% желаемого продукта. Реакционную смесь нагревают через 2 и 3 ч. LC-MS показывает наличие примерно 20% оставшегося исходного альдегида и 17% желаемого продукта. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и помещают в холодильник на ночь.
Реакционной смеси дают возможность нагреться до комнатной температуры и перемешивают. Смесь 5,56 г (118 мМ) бромида трифенилэтилвалерата фосфония и 0,312 г гидрида натрия в 15,0 мл DMSO перемешивают в течение 30 мин в атмосфере азота. Смесь добавляют в виде болюса к реакционной смеси, нагревают до 50°С и перемешивают в течение 6 ч.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,2 (т, 3Н); 1,8 (м, 2Н); 2,2-2,4 (м, 10Н); 4,2 (кв., 2Н); 5,1 (с, 2Н); 5,6-6,2 (м, 1Н); 6,4 (т, 1Н); 6,9-7,3 (м, 7Н).
Стадия С: Получение 6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]этилгексаноата
Ссылка: Journal of Org. Chemistry, Vol. 34, No. 11, p. 3684-85. Nov. 1969.
Таблица 6
Соединение
Молекулярная масса
ммоли
граммы
мл
Сложный этиловый эфир 6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]-гексеновой кислоты
352,47
7,70
2,71
Трис(трифенилфосфин)-хлорородий (I)
925,23
0,028
0,0259
Бензол
78,11
60,0
Абсолютный этанол
46,07
60,0
2,71 г сложного этилового эфира 6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]гекс-5-еновой кислоты растворяют в 120 мл дегазированной смеси 1:1 бензола и абсолютного этанола в 300 мл компрессионном реакторе Парра из нержавеющей стали. К раствору добавляют 0,259 г трис(трифенилфосфин)хлорородия (I) (катализатора Уилкинсона). Реакционную смесь барботируют 5 раз водородом, нагревают до 60°С, при 80 фунтов/кв. дюйм с водородом и перемешивают в течение ночи.
Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и удаляют газы. Анализ LC-MS не показывает исходного олефина. Реакционный раствор барботируют азотом и фильтруют через слой целита. Фильтрат концентрируют в вакууме для получения 3,40 г коричневого масла. Масло растворяют в 12 мл смеси 1:1 гексанов:хлороформа. Силикагель элюируют 100 мл смеси 1:1 гексанов:хлороформа и 200 мл смеси 95:5 гексанов:этилацетата, собирая 50 мл фракции. Чистые фракции объединяют и концентрируют в вакууме для получения 2,70 г (99,0%) темно-желтого масла. LC-MS показывает желаемый продукт ~72%. Продукт используют без дальнейшей очистки.
Стадия D: Получение 6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]гексановой кислоты
Таблица 7
Соединение
Молекулярная масса
ммоли
граммы
мл
6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]-этилгексаноат
354,48
0,0076
2,69
Этанол
35
1,0 N гидроксид натрия
40,0
10
2,69 г 6-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]этилгексаноата растворяют в 35 мл абсолютного этанола и 10 мл 1N водного гидроксида натрия в колбе емкостью 100 мл с круглым дном, оборудованной мешалкой, термопарой и обратным холодильником. Желтый раствор нагревают с обратным холодильником и перемешивают в течение 2 ч. Реакционную смесь анализируют, и LC-MS не показала исходный сложный этиловый эфир. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме до желтого масла, которое преимущественно отверждается после стояния. 50 мл воды добавляют к остатку и перемешивают 10 мин. Водный раствор экстрагируют трижды 50 мл этилацетата. Водный слой подкисляют 3 мл 6N водного раствора HCl и экстрагируют трижды 50 мл этилацетата. Объединенный органический слой сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме для получения ~2,2 г смолистого желтого твердого вещества. Остаток перемешивают в 75 мл воды в течение 30 мин. Твердые вещества собирают фильтрацией и сушат в вакуумной печи при 40°С для получения 1,62 г (90,5%) бежевого твердого вещества. LC-MS и ЯМР показывают желаемый продукт >98%.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,4 (м, 2Н); 1,7 (м, 4Н); 2,3-2,4 (м, 8Н); 2,6 (т, 2Н); 5,0 (с, 2Н); 6,8 (м, 3Н); 7,0-7,3 (м, 4Н).
Пример 5:
5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пентановая кислота
Стадия А: Получение сложного этилового эфира 5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пент-4-еновой кислоты
Таблица 8
Соединение
Молекулярная масса
моли
граммы
мл
Бромид трифенилэтилбутирата фосфония
457,34
0,0220
10,06
3-(2,6-диметилбензилокси)-бензальдегид
240,30
0,0162
3,89
Гидрид натрия
24,00
0,0242
0,581
Диметилсульфоксид
78,13
30,0/15,0
Смесь 10,06 г бромида трифенилэтилбутирата фосфония и 0,581 г гидрида натрия в 30,0 мл DMSO перемешивают в течение 30 мин в атмосфере азота в 3-горлой колбе емкостью 100 мл с круглым дном, оборудованной мешалкой, обратным холодильником с впуском для азота и термопарой. Смесь меняет цвет с желтого на оранжевый и нагревается до 26,7°С с 19,8°С. 3,89 г 3-(2,6-диметилбензилокси)бензальдегида растворяют в 15,0 мл DMSO и добавляют по каплям в течение 3 мин к реакционной смеси. Смесь меняет цвет с оранжевого на желтый и нагревается до 34,0°С с 26,7°С. Реакционную смесь перемешивают и дают возможность охладиться до комнатной температуры в течение 3 ч. Реакционную смесь анализируют через 1 и 3 ч. LC показывает прогресс реакции при остатке исходного альдегида от ~15% до ~13%. Реакционную смесь нагревают до 50°С и перемешивают в течение 2 ч. Реакционную смесь анализируют через 1 и 2 ч. LC-MS показывает небольшое изменение по сравнению с предыдущими образцами при оставшихся ~12% исходного альдегида. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и помещают на ночь в холодильник.
Реакционной смеси дают возможность согреться до комнатной температуры и перемешивают. Смесь 3,20 г (70 мМ) бромида трифенилэтилбутирата фосфония и 0,185 г гидрида натрия в 10,0 мл DMSO перемешивают в течение 30 мин в атмосфере азота. Смесь добавляют в виде болюса к реакционной смеси при комнатной температуре в течение 2 ч.
Реакционную смесь анализируют через 1 и 2 ч. LC показывает прогресс реакции при остатке исходного альдегида от ~13% до ~4%. Реакционную смесь нагревают до 50°С и перемешивают в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и выливают поверх 50 г льда с 50 мл воды. Водную смесь экстрагируют трижды 125 мл этилацетата и объединенный органический слой сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме для получения 12,9 г коричневого масла. LC показывает ~40% желаемого продукта.
Масло растворяют в 30 мл смеси 95:5 гексанов:этилацетата и хроматографируют на колонке с силикагелем BIOTAGE 75S с использованием 5 л смеси 95:5 гексанов:этилацетата. Желаемый продукт элюируется быстро, возможно, ввиду остаточного DMSO в результате разработки. Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяют и концентрируют в вакууме для получения 4,9 г желтого масла. Масло растворяют в 10 мл смеси 1:1 гексанов:хлороформа. Силикагель элюируют 200 мл смеси 1:1 гексанов:хлороформа и 200 мл смеси 9:1 гексанов:этилацетата, собирая фракции по 50 мл. Чистые фракции объединяют и концентрируют в вакууме для получении 3,40 г (62,0%) бледно-желтого масла, которое в основном отверждается после стояния. LC-MS и ЯМР показывают желательный продукт >98% при соотношении между цис- и транс-изомерами примерно 30:70 на основании реакции Виттига, дающей преимущественно транс-изомер.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,2 (т, 3Н); 2,4-2,7 (м, 10Н); 4,1 (кв., 2Н); 5,1 (с, 2Н); 5,6-6,2 (м, 1Н); 6,5 (т, 1Н); 6,8 (м, 7Н).
Стадия В: Получение 5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]этилпентаноата
Ссылка: Journal of Org. Chemistry, Vol. 34, No. 11, p. 3684-85. Nov. 1996.
Таблица 9
Соединение
Молекулярная масса
ммоли
граммы
мл
Сложный этиловый эфир 5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]-пент-4-еновой кислоты
338,4
6,80
2,30
Трис(трифенилфосфин)хлорородий (I)
925,23
0,24
0,222
Бензол
78,11
55,0
Абсолютный этанол
46,07
55,0
2,50 г сложного этилового эфира 5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пент-4-еновой кислоты растворяют в 110 мл дегазированной смеси 1:1 бензола и абсолютного этанола в 300- мл компрессионном реакторе Парра из нержавеющей стали. К раствору добавляют 0,222 г трис(трифенилфосфин)хлорородия (I) (катализатора Уилкинсона). Реакционную смесь барботируют 5 раз водородом, нагревают до 60°С, при 80 фунтов/кв. дюйм с водородом и перемешивают в течение ночи.
Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и вентилируют. Анализ LC-MS не показывает исходного олефина. Реакционный раствор барботируют азотом и фильтруют через слой целита. Фильтрат концентрируют в вакууме для получения 3,20 г коричневого масла. Масло растворяют в 12 мл смеси 1:1 гексанов:хлороформа и помещают на 30 г силикагеля, уравновешенного смесью 1:1 гексанов:хлороформа. Силикагель элюируют 100 мл смеси 1:1 гексанов:хлороформа и 200 мл смеси 95:5 гексанов:этилацетата, собирая 50 мл фракции. Чистые фракции объединяют и концентрируют в вакууме для получения 2,30 г (99,0%) бледно-желтого масла. LC-MS показывает желаемый продукт ~93%. Продукт используют без дальнейшей очистки.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1 (т, 3Н); 1,4 (м, 4Н); 2,0 (т, 2Н); 2,1 (с, 6Н); 2,4 (м, 2Н); 3,8 (кв., 2Н); 4,7 (с, 2Н); 6,5 (м, 3Н); 6,8-7,0 (м, 4Н).
Стадия С: Получение 5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]пентановой кислоты
Таблица 10
Соединение
Молекулярная масса
ммоли
граммы
мл
5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]-этилпентаноат
340,46
0,0080
2,72
Этанол
35
1,0N гидроксид натрия
40,0
10
2,72 г 5-[3-(2,6-диметилбензилокси)фенил]этилпентаноата растворяют в 35 мл абсолютного этанола и 10 мл 1N водного гидроксида натрия в колбе емкостью 100 мл с круглым дном, оборудованной мешалкой и обратным холодильником. Раствор, приобретший светло-желтый цвет, нагревают с обратным холодильником и перемешивают в течение 1 ч. Реакционную смесь анализируют, и LC-MS не показывает исходный сложный эфир. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме до белого твердого вещества. 50 мл воды добавляют для растворения твердого вещества. Водный раствор экстрагируют трижды 50 мл этилацетата. Водный слой подкисляют 3 мл 6N раствора HCl и экстрагируют трижды 50 мл этилацетата. Объединенный органический слой сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме для получения примерно 2,5 г белого смолистого твердого вещества. Твердое вещество перемешивают в 25 мл гексанов в течение 30 мин, собирают фильтрацией и сушат в вакуумной печи при 40°С для получения 2,12 г (84,8%) белого твердого вещества. LC-MS и ЯМР показывают желаемый продукт >99%.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,7 (м, 4Н); 2,4 (м, 8Н); 2,6 (м, 2Н); 5,0 (с, 2Н); 6,8 (м, 3Н); 7,0-7,3 (м, 4Н).
Пример 6
: 3-[3-(2,6-Диметилбензилокси)фенил]пропионовая кислота
Стадия А: Синтез этил-3-гидроксифенилпропионата
Таблица 11
Соединение
Молекулярная масса
ммоли
граммы
мл
3-(3-гидроксифенил)пропионовая кислота
166,18
0,0301
5,00
Этанол
46,07
5,0
Концентрированная серная кислота
96,03
0,5
5,00 г 3-(3-гидроксифенил)пропионовой кислоты растворяют в 50 мл абсолютного этанола в 3-горлой колбе емкостью 100 мл с круглым дном, оборудованной механической мешалкой, обратным холодильником и термопарой. 0,5 мл концентрированной серной кислоты добавляют к раствору и нагревают с обратным холодильником (80°С) и перемешивают в течение 2 ч. Реакционную смесь анализируют, и LC-MS показывает желаемый продукт без исходного материала. Реакционную смесь охлаждают до <5°С в ледяной бане и нейтрализуют до рН примерно 7 10 мл 10% водного раствора карбоната натрия. Нейтрализованный раствор концентрируют в вакууме примерно до 10 мл и разводят 25 мл воды. Раствор экстрагируют трижды 25 мл этилацетата. Объединенный органический слой сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют в вакууме для получения 5,06 г (86,5%) темного янтарного масла. LC-MS показывает желаемый продукт >99,5%.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,2 (т, 3Н); 2,6 (т, 2Н); 2,8 (т, 2Н); 4,2 (кв., 2Н); 6,7-6,8 (м, 3Н); 7,2 (м, 1Н).
Стадия В: Синтез этил-3-(2,6-диметилбензилокси)фенилпропионата
Таблица 12
Соединение
Молекулярная масса
ммоли
граммы
мл
Этил 3-гидроксифенилпропионат
194,23
0,0260
5,05
2,6-Диметилбензиловый спирт
136,19
0,0271
3,69
Азодикарбоксилат изопропила
202,21
0,0296
5,99
Трифенилфосфин
262,29
0,0296
7,76
Тетрагидрофуран
72,11
24/76
max
Раствор 3,69 г 2,6-диметилбензилового спирта и 5,99 г азодикарбоксилата изопропила в 24 мл THF добавляют по каплям к раствору 5,05 г этил-3-гидроксифенилпропионата и 7,76 г трифенилфосфина в 76 мл THF с такой скоростью, чтобы удерживать температуру реакционной смеси <25°C (T=22,3°C). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч в 3-горлой колбе емкостью 250 мл с круглым дном, оборудованной мешалкой, воронкой для добавления и термопарой. Реакционную смесь анализируют через 3 и 4 ч при комнатной температуре. LC-MS показывает преимущественно желаемый продукт при ~4,5% исходного материала. Реакционную смесь концентрируют в вакууме для получения темно-желтого масла. 200 мл гексанов добавляют к маслу, и раствор перемешивают в ледяной бане (<5°C) в течение 1 ч. Твердые вещества собирают фильтрацией и промывают 3 раза 40 мл гексанов. Твердые вещества анализируют, и ЯМР показывает, что они представляют собой смесь окиси трифенилфосфина и восстановленного DIAD. LC-MS показывает, что гексановый фильтрат содержит ~58% желаемого продукта. Фильтрат концентрируют в вакууме для получения 10,2 г желтого масла. Масло растворяют в 5 мл абсолютного этанола, добавляют 75 мл гексанов и раствор помещают в морозилку на ночь. Твердые вещества собирают фильтрацией и сушат. ЯМР показывает, что 4,3 г белых твердых веществ составляют ~80%. Твердые вещества объединяют с фильтратом гексанов/этанола и концентрируют в вакууме для получения 9,3 г светло-желтого масла, которое омыляется без дальнейшей очистки.
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 1,2 (т, 3Н); 2,6 (т, 2Н); 3,0 (т, 2Н); 4,2 (кв., 2Н); 5,1 (с, 2Н); 6,8 (м, 3Н); 7,2-7,4 (м, 4Н).
Стадия С: Синтез 3-(2,6-диметилбензилокси)фенилпропионовой кислоты
Таблица 13
Соединение
Молекулярная масса
ммоли
граммы
мл
3-(2,6-диметилбензилокси)-фенилпропионат этила
312,40
9,3
Этанол
46,07
75
7,5N гидроксид натрия
40,0
4,0
9,3 г масла, содержащего приблизительно 60% 3-(2,6-диметилбензилокси)фенилпропионата этила, растворяют в 75 мл абсолютного этанола в одногорлой колбе емкостью 250 мл с круглым дном, оборудованной мешалкой и обратным холодильником. К раствору добавляют 4,0 мл 7,5N гидроксида натрия. Светло-желтый раствор нагревают с обратным холодильником (80ºС) и перемешивают в течение 1 ч. Реакционную смесь анализируют, и LC-MS показывает желаемый продукт и отсутствие исходного сложного эфира. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и концентрируют в вакууме для получения желтого масла. Масло растворяют с 25 мл воды и экстрагируют трижды 25 мл простого эфира. Водный слой охлаждают до <5ºС и подкисляют до рН 1 медленным добавлением 15 мл 6N водного раствора HCl. Осажденное твердое вещество собирают фильтрацией, промывают трижды 25 мл воды и сушат на воздухе. Твердые вещества эмульгируют в 100 мл гексанов и собирают фильтрацией, промывают трижды 25 мл гексанов и сушат на воздухе. LC-MS показывает, что твердые вещества составляют ~80% желаемого продукта. Твердые вещества нагревают до 70ºС в 44 мл смеси 3:1 абсолютного этанола:воды. Раствор перемешивают и дают возможность охладиться до комнатной температуры в бане с водопроводной водой. Твердые вещества собирают фильтрацией, промывают 20 мл смеси 3:1 абсолютного этанола:воды и сушат на воздухе. LC-MS показывает, что твердые вещества составляют ~98,5% желаемого продукта. Твердые вещества нагревают до 70ºС в 36 мл смеси 3:1 абсолютного этанола:воды. Раствор перемешивают и дают возможность охладиться до комнатной температуры в бане с водопроводной водой. Твердые вещества собирают фильтрацией, промывают 20 мл смеси 3:1 абсолютного этанола:воды и сушат на воздухе. LC-MS и ЯМР показывают, что твердые вещества составляют >99,5% желаемого продукта. Белое твердое вещество сушат в вакуумной печи при 40ºС в течение 2 ч для получения 3,91 г (52,9%).
1
3
Н ЯМР (270 МГц, CDCl): 2,4 (с, 6Н); 2,2 (м, 2Н); 3,0 (м, 2Н); 5,1 (с, 2Н); 6,8 (м, 3Н); 7,1-7,3 (м, 4Н).
ПРИМЕРЫ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Для всех приведенных ниже примеров биологической активности соединение CF получают в соответствии с примером 1 химического синтеза. Для экспериментов активности in vivo соединение CG получают в соответствии с примером 3 синтеза. Для экспериментов активности in vitro соединение CG получают в соответствии с примером 2 синтеза.
Пример А
Антидиабетические эффекты у мышей ob/ob
:
ob/ob)
У тучных мышей ( имеется дефект белка лептина, регулятора аппетита и энергетического метаболизма, ведущий к гиперфагии, ожирению и сахарному диабету.
Самцов тучных (гомозиготных ob/ob) мышей C57BL/6J возраста приблизительно 8 недель получают в Jackson Labs (Bar Harbor, ME) и методом случайной выборки включают в группы по 5 животных каждая так, чтобы в группах была одинаковая масса тела (45-50 г) и уровень глюкозы в сыворотке (≥300 мг/дкл в сытом состоянии). Минимум 7 дней предоставляют животным для адаптации после поступления. Всех животных держат в условиях регулируемой температуры (23ºС), относительной влажности (50±5%) и света (7:00-19:00) и дают возможность свободного доступа к стандартному корму (Formulab Diet 5020 Quality Lab Products, Elkridge, MD) и воде.
Когортам лечения вводят ежедневно перорально дозы носителя (1% гидроксипропилметилцеллюлоза), соединений BI, CF, CA, CB, CC или CD в течение 2 недель. В конце периода лечения берут 100 мкл венозной крови в гепаринизированную капиллярную трубку из позадиглазничной пазухи мышей ob/ob для химического анализа сыворотки.
Через 2 недели ежедневного перорального введения соединение BI (100 мг/кг) и соединение CF (60 мг/кг) вызывали значительное снижение уровня в крови глюкозы (таблица 14), триглицеридов и свободных жирных кислот (таблица 15), как описано ниже.
Таблица 14
<b>Эффекты соединений BI, CF, CA, CB, CC и CD на модели диабета II типа у самцов мышей ob/ob</b>
Группы
Глюкоза, мг/дкл
Глюкоза (% контроля)
Носитель (контроль)
423,6±55,0
100,0±13,0
BI - 30 мг/кг
301,4±29,0
71,0±7,0
BI - 60 мг/кг
248,8±20,0
59,0±5,0*
BI - 100 мг/кг
196,3±6,0
46,0±1,0*
CF - 60 мг/кг
161,2±14,0
38,0±3,0*
CA - 60 мг/кг
402,6±61,0
95±14,0
CB - 60 мг/кг
494,4±72,3
117,0±17,0
CС - 60 мг/кг
444,4±89,5
105±21,0
CD - 60 мг/кг
505,6±63,5
119,0±15,0
*р<0,05 - статистически значимо по сравнению с контролем носителя.
Таблица 15
<b>Эффекты соединений BI, CF, CA, CB, CC и CD</b><b>на уровни глюкозы, триглицеридов и свободных жирных кислот</b><b>в сыворотке плазмы у тучных (ob/ob) мышей</b>
Группа
Глюкоза ± стандартная погрешность средней (SEM)
Триглицериды ± SEM
Свободные жирные кислоты ± SEM
Носитель
423,6±55,0
121,8±29,4
1612,4±169,7
BI - 30 мг/кг
301,4±29,0
66,6±3,6
1272,8±32,5
BI - 60 мг/кг
248,8±20,0
61,4±3,6
1168,6±56,7
BI - 100 мг/кг
196,3±6,0
55,0±3,4
1245,4±20,0
BI - 60 мг/кг
161,2±14,0
53,8±1,5
1081,6±47,7
CA - 60 мг/кг
402,6±61,0
92,6±13,7
1572,2±118,0
CB - 60 мг/кг
494,4±72,3
118,8±18,0
2076,2±169,0
CС - 60 мг/кг
444,4±89,5
91,6±13,4
2043,6±285,0
CD - 60 мг/кг
505,6±63,5
119,0±14,2
1961,8±194,2
Пример В
Антидиабетические эффекты у мышей db/db
:
У мышей db/db имеется дефект сигнализации лептина, ведущий к гиперфагии, ожирению и сахарному диабету. Кроме того, в отличие от мышей ob/ob на фоне C57BL/6J, мыши db/db на фоне C57BL/KS подвергаются недостаточности их продуцирующих инсулин клеток островков поджелудочной железы, что приводит к прогрессированию от гиперинсулинемии (связанной с периферической устойчивостью к инсулину) до гипоинсулинемического диабета.
Самцов тучных (гомозиготных db/db) мышей C57BL/Ksola возраста приблизительно 8 недель получают в Jackson Labs (Bar Harbor, ME) и методом случайной выборки включают в группы по 5-7 животных каждая так, чтобы в группах была одинаковая масса тела (50-55 г) и уровень глюкозы в сыворотке (≥300 мг/дкл в сытом состоянии); самцы худых (гетерозиготных db/+) мышей служили в качестве когортных контролей. Минимум 7 дней предоставляют животным для адаптации после поступления. Всех животных держат в условиях регулируемой температуры (23ºС), относительной влажности (50±5%) и света (7:00-19:00) и дают возможность свободного доступа к стандартному корму (Formulab Diet 5008, Quality Lab Products, Elkridge, MD) и воде.
Когортам лечения вводят ежедневно перорально дозы носителя (1% гидроксипропилметилцеллюлоза), соединений BI, CE, BT, BU, BV или фенофибрат в течение 2 недель. В конце периода лечения берут 100 мкл венозной крови в гепаринизированную капиллярную трубку из позадиглазничной пазухи мышей db/db для химического анализа сыворотки.
Эффекты соединений изобретения на уровень глюкозы в крови в неголодном состоянии показаны в таблице 16; эффекты на уровни триглицеридов и свободных жирных кислот в сыворотке показаны в таблице 17.
Таблица 16
<b>Эффекты соединений BI, CE, BT, BU, BV или фенофибрата у мышей db/db</b>
Группы
Глюкоза мг/дкл
Глюкоза (% контроля)
Носитель (контроль)
692,5±55,4
100±8
BI - 100 мг/кг
347,0±43,1*
50±6*
CE - 93 мг/кг
372,0±53,8*
54±8*
BT - 107 мг/кг
684,3±63,6
99±9
BU - 128 мг/кг
533,3±46,7
77±7
BV - 115 мг/кг
789,5±38,9
114±6
Фенофибрат - 113 мг/кг
563,2±49,0
81±7
*Уровни глюкозы в крови у худых, не страдающих диабетом гетерозиготных db/+ мышей, составляют 208,5±6,6 мг/дкл.
Таблица 17
<b>Эффекты соединений BI, CE, BT, BU, BV или фенофибрата на уровни триглицеридов и свободных жирных кислот в сыворотке у мышей db/db</b>
Группа
Триглицериды ± SEM (мг/дкл)
Свободные жирные кислоты ± SEM (мкМ)
Худые
114,2±8,7
2315,8±238,3
Носитель
232,8±20,7
3511,8±257,6
BI
77,8±5,3
1997,2±196,4
CE
132,0±15,2
2867,4±267,7
BT
211,5±21,5
3897,7±291,3
BU
172,5±9,9
3587,0±156,3
BV
153,2±14,2
3373,8±233,6
Фенофибрат
109,3±9,1
3318,5±208,7
Пример С
Антидиабетический эффект у мышей db/db
:
У мышей C57BL/Ksola имеется дефект сигнализации лептина, ведущий к гиперфагии, ожирению и сахарному диабету. Кроме того, в отличие от мышей ob/ob на фоне C57BL/6J, мыши db/db на фоне C57BL/KS подвергаются недостаточности их продуцирующих инсулин клеток островков поджелудочной железы, что приводит к прогрессированию от гиперинсулинемии (связанной с периферической устойчивостью к инсулину) до гипоинсулинемического диабета.
Самцов тучных (гомозиготных db/db) мышей C57BL/Ksola возраста приблизительно 8 недель получают в Jackson Labs (Bar Harbor, ME) и сортируют в группы по 7 животных каждая так, чтобы в группах была одинаковая масса тела (40-45 г) и уровень глюкозы в сыворотке (≥300 мг/дкл в сытом состоянии). Минимум 7 дней предоставляют животным для адаптации после поступления. Всех животных держат в условиях регулируемой температуры (23ºС), относительной влажности (50±5%) и света (7:00-19:00) и дают возможность свободного доступа к стандартному корму (Formulab Diet 5008, Quality Lab Products, Elkridge, MD) и воде.
Когортам лечения вводят ежедневно перорально дозы носителя (1% гидроксипропилметилцеллюлоза), соединения BI, CF, CG или фенилацетат в течение 17 дней. В конце периода лечения берут образцы крови и измеряют уровни глюкозы и триглицеридов в сыворотке. Статистически значимое снижение уровней глюкозы или триглицеридов в крови в сравнении с животными, получавшими перорально носитель, считают положительным результатом скрининга для лекарственного препарата.
Таблица 18
<b>Эффекты соединений BI, CF, CG или фенилацетата</b><b>на модели диабета I типа у мышей db/db</b>
Группа
Глюкоза, мг/дкл(±SEM)
Триглицериды (мг/дкл)
Носитель (контроль)
812±34
352±27
BI - 100 мг/кг
472±54
116±4
BI - 150 мг/кг
348±67
90±6
CF - 30 мг/кг
586±31
156±20
CF - 60 мг/кг
604±36
120±13
CF - 100 мг/кг
391±61
92±6
CG - 100 мг/кг
753±24
166±14
Фенилацетат - 300 мг/кг
661±64
171±33
*p<0,05 статистически значимо по сравнению с контролем носителя.
Пример D:
Потенциал активации транскрипции соединений на человеческий и мышиный PPARα и PPARγ
Материалы и методы
:
4
5
2
Клетки высевают в 24-луночные планшеты за 1 день до трансфекции в концентрации 5×10-2×10 клеток/лунку, в зависимости от типа клеток. Клетки трансфецируют с использованием реагента липофектамина 2000 от компании Invitrogen. Всего 0,8 мкг ДНК/лунку добавляют к 50 мкл среды Optimem Reduced Serum (бессывороточной; Gibco). Липофектамин 2000 добавляют (2,5 мкл/лунку) в другую пробирку, содержащую 50 мкл среды Optimem. Плазмидную ДНК добавляют в соотношении 4:3 (репортер:активатор); при целесообразности, ДНК спермы лосося замещали на плазмиду, экспрессирующую активатор. Используемая репортерная плазмида представляет собой pFR-Luc, которая имеет ген люциферазы светлячка GAL4 UAS (STRATAGENE), содержащий промотор. Экспрессирующие активатор плазмиды содержат слияние домена, связывающего ДНК GAL4 дрожжей (dbd) или домена, связывающего лиганд человеческого PPARα (LBD; a.a. 167-468), или человеческого PPARγ LBD (a.a.176-479). Также используют конструкты ДНК, содержащие мышиные PPARα и PPARγ LBD, слитые с доменом связывания ДНК GAL4. Указанные 2 раствора инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем объединяют. Объединенный раствор инкубируют при комнатной температуре в течение приблизительно 30 мин. Клетки однократно промывают PBS и в каждую лунку добавляют 100 мкл трансфекционной смеси. Планшеты инкубируют при 37ºС в инкубаторе 5% СО в течение 4,5 ч с последующей аспирацией трансфекционной смеси при повторной подаче в планшеты полных сред ЕМЕМ (с добавлением 10% FBS (фетальной телячьей сыворотки), 1Х глутамина). Через 24 ч после трансфекции планшеты обрабатывают соответствующими соединениями в полных средах ЕМЕМ с последующим однократным промыванием PBS и добавлением 100 мкл лизисного буфера репортера 1Х/лунку (Promega) через 24 ч после обработки. Планшеты подвергали одному циклу замораживания/оттаивания перед анализом. Примерно 10 мкл лизата добавляют к 100 мкл субстрата люциферазы светлячка, смешивают пипетированием и анализируют на люминометре в течение 10 с использованием функции интегрирования (относительных единиц люциферазы/RLU) или на Microbeta Trilux (импульсов люциферазы в 1 с/LCPS). Каждую обработку выполняют в трех повторениях и во множественныхельных экспериментах.
Результаты:
Таблица 19
<b>Гибридный белок LBD мышиного PPARγ: потенциал активации транскрипции у клеток Hepa1.6 (линии клеток гепатомы мышей).</b><b>Величины представлены в относительных люциферазных единицах (RLU) ± стандартное отклонение</b>
Контроли
BI
CF
Без обработки
208±38
Na
na
3 мкМ росиглитазона
1817±331
Na
na
1 мкМ
na
210±51
361±138
3 мкМ
na
256±33
602±144
5 мкМ
na
254±81
710±87
7 мкМ
na
265±61
786±418
кМ
na
355±53
1140±111
30 мкМ
na
441±203
1253±554
100 мкМ
na
820±353
1534±608
na = неприменимо; nd = не сделано.
Таблицы 20а и 20b
<b>Гибридные белки LBD мышиного PPARα и PPARγ:</b><b>потенциал активации транскрипции у клеток C3A (линии клеток гепатомы человека). Величины представлены в импульсах люциферазы в 1 с (LCPS) ± стандартное отклонение</b>
20а. <b>Мышиный PPARα</b>
Wy/контроль
BI
СЕ
CF
CG
Репортер
8,73±1,85
na
na
na
na
Без обработки
20,27±2,61
na
na
na
na
1 мкМ
406,73±80,11
14,67±1,08
9,47±2,14
13,17±7,84
4,43±2,25
3 мкМ
295,8±40,31
15,2±2,78
9,57±2,61
5,63±0,42
9,17±3,72
10 мкМ
324,37±11,06
15,1±3,78
1,17±2,49
153,15±24,4
7,87±0,7
30 мкМ
414±122,52
10,43±1,81
7,4±0,23
358,6±5,23
11,63±5,01
100 мкМ
325,3±91,83
15,37±6,21
6,23±0,17
201,5±50,84
11,8±8,95
200 мкМ
115,2±21,52
18,6±11,66
8±1,88
106,77±32,53
80,3±2
na = неприменимо.
20b. <b>Мышиный PPARγ</b>
Росиглитазон
BI
СЕ
CF
CG
Репортер
8,73±1,85
na
na
na
na
Без обработки
8,03±1,82
na
na
na
na
1 мкМ
196,8±138,9
2,4±2,26
14,3±4,5
0,33±0,21
8,47±5,01
3 мкМ
60,1±29,14
2,6±1,41
13,43±8,5
10,6±8,74
14,8±4,3
10 мкМ
432,7±137,4
2,2±1,57
6,03±3,75
17,2±21
20,87±4,1
30 мкМ
378±274,5
4,9±4,42
9,6±5,46
88,2±33,2
55,4±30,6
100 мкМ
308,6±110,1
2,63±1,96
11,7±11,7
45,8±36,9
78,8±23,1
200 мкМ
Nd
65,77±10,55
10,5±9,2
93,6±29,7
101,2±59,1
na = неприменимо; nd = не сделано.
Примечание: Концентрации, перечисленные в предыдущей таблице, представлены для тестируемых соединений. Концентрация росиглитазона составляла 1/5 концентрации тестируемого соединения; таким образом, 1 мкМ тестируемого соединения сравнивали с 0,2 мкМ росиглитазона и т.д.
Таблица 21
<b>Гибридные белки LBD мышиного PPARα и PPARγ:</b><b>потенциал активации транскрипции у клеток C3A.</b><b>Величины представлены в RLU ± стандартное отклонение</b>
21а. <b>Мышиный PPARα</b>
Контроли
CF
CG
Только репортер
2259±300
na
na
Без обработки
1217±161
na
na
100 мкМ Wy
55972±5162
na
na
100 мкМфенопрофена
4440±213
na
na
100 мкМ BI
4421±118
na
na
1 мкМ
Na
2694±159
361±398
3 мкМ
Na
4527±740
706±399
5 мкМ
Na
7188±1753
492±160
7 мкМ
Na
14325±1032
652±190
10 мкМ
Na
16680±2432
394±84
30 мкМ
Na
38105±3133
651±643
100 мкМ
Na
41037±5401
926±1362
Na - неприменимо.
21b. <b>Мышиный PPARγ</b>
Контроли
BI
CF
CG
Без обработки
302±119
na
na
na
3 мкМ росиглитазона
17264±8260
na
na
na
1 мкМ
na
746±362
146±119
634±195
3 мкМ
na
174±153
579±557
nd
5 мкМ
na
996±855
476±527
nd
7 мкМ
na
220±137
834±984
nd
10 мкМ
na
479±353
207±107
405±318
30 мкМ
na
557±639
818±1201
1562±354
100 мкМ
na
3330±1848
237±216
2555±1609
na = неприменимо; nd = не сделано.
Таблица 22
<b>Гибридные белки LBD человеческого PPARα и PPARγ:</b><b>потенциал активации транскрипции у клеток C3A.</b><b>Величины представлены в LCPS ± стандартное отклонение</b>
22а. <b>Человеческий PPARα</b>
Wy
BI
CF
CE
CG
Репортер
21,93±6,0
na
na
na
na
Без обработки
180,8±32,2
na
na
na
na
1 мкМ
181,8±47,6
127,7±7,1
37±11,5
14,7±14,6
10,9±11,6
3 мкМ
153,1±2,8
128±70,7
47±22,8
13,2±5,8
19,1±6,1
10 мкМ
315,4±36,5
52,7±8,2
19,9±7,8
26,2±1,4
17,9±5,2
30 мкМ
648,6±47,5
55,4±16,2
40,2±18,9
10,67±1,2
38,2±21,1
100 мкМ
412,23±114
20,9±13,1
19±14,2
6,33±2,6
23,9±5,3
200 мкМ
nd
31,1±29,4
12,9±8,3
12,8±3,7
159,4±29,6
na = неприменимо; nd = не сделано.
22b<b>. Человеческий PPARγ</b>
Росиглитазон
BI
CE
CF
CG
Репортер
21,9±6,1
na
na
na
na
Без обработки
39,9±17,5
na
na
na
na
1 мкМ
124±33,8
43,3±11,6
60±11,6
6,2±0,6
47,9±7,2
3 мкМ
134,8±47,8
26±4,5
73,3±30,9
49,4±7,8
73,6±39,1
10 мкМ
626,6±227
40,1±13,5
57,3±22,6
141,5±25,9
72,5±28,2
30 мкМ
887,2±338,2
22,9±10,3
28,5±16,4
230,4±97,2
205,6±37,1
100 мкМ
1034,1±400,5
34,6±15,6
37,7±23,4
225,2±57,5
403,6±86,1
200 мкМ
Nd
227,3±25,8
12,3±4,8
280,1±89,7
598,1±190,4
na = неприменимо; nd = не сделано.
Примечание: Концентрации, перечисленные в предыдущей таблице, представлены для тестируемых соединений. Концентрация росиглитазона составляла 1/5 концентрации тестируемого соединения; таким образом, 1 мкМ тестируемого соединения сравнивали с 0,2 мкМ росиглитазона и т.д.