Морфологическая характеристика сперматогенеза в норме и при идиопатическом бесплодии (иммуногистохимический аспект)

Морфология. Патология

УДК 591.463.1

© 2015 Г.А. Демяшкин

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕРМАТОГЕНЕЗА В НОРМЕ И ПРИ ИДИОПАТИЧЕСКОМ БЕСПЛОДИИ

В настоящее время недостаточно изучена роль некоторых биологических активных веществ при мужском идиопатическом бесплодии. Кроме того, мало данных о возможной положительной экспрессии онкомаркеров в половых клетках при идиопатическом бесплодии. Существует мало научных доказательств для эмпирического подхода в лечении идиопатического бесплодия. Морфологический анализ нормального и патологического сперматогенеза с использованием иммуногистохимических маркеров (пролиферации и апоптоза, факторов роста, эмбриональных, сперматогониальных и сперматоцитарных, локомоторного аппарата) позволит в дальнейшем обозначить вектор патогенеза и поиск адекватного лечения (прежде всего консервативного), а также возможной профилактики.

Ключевые слова: сперматогенез, пролиферация, апоптоз, CD117, факторы роста, онкомаркеры, мужское идиопатическое бесплодие.

По данным ВОЗ (от 2010 г.) проблемы мужского бесплодия и нарушение сперматогенеза обусловлены высокой частотой заболеваний семенников, связанных с нарушениями процесса их развития, возникновением в репродуктивном периоде дисфункциональных состояний.

К локальным модуляторам сперматогенеза относятся неспецифические факторы роста и многочисленные внутриклеточные белки. Большое значение в настоящее время придаётся показателям баланса между пролиферативной активностью мужских половых клеток и апопто-зом. Установлена также роль мутаций в генах, регулирующих эти процессы (р53, р16). Наиболее информативными маркёрами сперматогенеза являются: эмбриональные - гоноцитарные (PLAP, ОСТ3/4), постнатальные - сперматогенные (MAGEA4, VASA); неспецифические -IGF, ингибин, р53, ю-67, каспазы и другие. Благодаря им, можно изучить синтетические процессы, протекающие в половых клетках. В исследованиях последних лет уделено большое внимание экспрессии этих белков половыми и соматическими клетками яичка [42]. Широко изучается пролиферативная активность, механизмы иммунных клеточных взаимодействий, механизмы апоптоза мужских половых клеток в стадиях созревания и формирования.

Сертоли-ассоциированные паракринные регуляторы

В извитом семенном канальце количество клеток Сертоли достигает до 7 % от общего числа клеток - Сертоли-клеточный индекс (число клеток Сертоли на срез канальца), который имеет важное диагностическое значение (бесплодие, крипторхизм).

При некоторых патологических состояниях (бесплодие, семинома) принято различать следующие виды клеток Сертоли: зрелые, незрелые и дегенеративные и реже эмбриональные. При дифференциальной диагностики и верификации нозологии учитывается соотношение данных видов клеток Сертоли.

Клетки Сертоли синтезируют и секретируют большое разнообразие факторов, включая стероиды, белки, цитокины, факторы роста, опиоиды, протеазы, простагландины, модуляторы клеточного деления и так далее. Таким образом, клетки Сертоли контролируют процесс сперматогенеза во всех его аспектах, обеспечивая развитие половых клеток от стволовых сперматогоний до поздних сперматид.

Механизмы взаимодействий половых клеток с клетками Сертоли ещё недостаточно изучены.

Цитокины. Это секреторные клеточные белки с небольшой массой, которые продуцируются неэндокринными клетками (в основном, иммунными) и оказывают местное воздействие на соседние клетки-мишени. Они участвуют в биорегуляции (вызывают пролиферацию и дифференцировку клеток), хеморегуляции и иммунорегуляции.

Интерлейкины влияют только на фазу размножения сперматогоний: интерлейкин-1 стимулирует её, а интерлейкин-6 - тормозит [2; 14].

Факторы роста. Среди факторов роста лидирующим в воздействии на физиологию семенников является инсулиноподобный фактор роста (IFG), который синтезируется под влиянием хорионического гонадотропина человека. Трансформирующие факторы роста альфа и бета, синтезируемые клетками Сертоли, подавляют стероидогенез в клетках Лейдига, воздействуя на экспрессию рецепторов ЛГ. В то же время образование трансформирующих факторов роста в клетках Сертоли тормозится ФСГ.

Факторы роста вызывают активацию сигнальных путей трансдукции, участвующих в делении клеток и клеточной дифференцировке. Некоторые из этих факторов (IGF, FGF) были обнаружены в клетках Сертоли и в половых клетках. Клетки Сертоли и половые клетки производят FGF-подобные белки. FGF рецепторы присутствуют в клетках Сертоли. Трансформирующий фактор роста (TGF-a) синтезируется и секретируется клетками Сертоли и Лейдига. Многочисленное семейство TGF-P факторов роста, которое также включает в себя инги-бины и активины, является наиболее универсальной группой с наибольшим многофункциональным спектром среди всех известных факторов роста. Рецепторы EGF присутствуют на клетках Сертоли и Лейдига и клетках перитубулярных зон [23].

Миоидные клетки. Исследования in vitro продемонстрировали, что миоидные клетки секретируют ряд веществ, в том числе компоненты внеклеточного матрикса (фибронектин, коллагены I и IV типов, протеогликаны) и факторы роста (PModS, TGF-бета, IGF-I, активин-A). Некоторые из этих веществ, как известно, влияют на функции клетки Сертоли [37].

Мужские половые клетки

Семейство ингибинов. Ингибин и активин являются димерными гликопротеинами, отличающиеся лишь Р-субъединицей.

Некоторые исследования показывают наличие рВ-ингибина в ядрах первичных сперма-тоцитов [5]. Предполагается, что активин может участвовать в мейотическом делении на ранних стадиях сперматогенеза [30]. Доказательства наличия иммунореактивного ингибина и его регулирующая роль на ранние сперматиды представлены в результатах исследований различных авторов [46]. Активин стимулирует пролиферацию половых клеток, тогда как ингибин уменьшает её [58]. Другой клеточной мишенью выступают половые клетки [41], это даёт основание предполагать, что роль ингибина/активина направлена на поликлеточную кооперацию.

Пролиферация соматических и половых клеток. Клеточное обновление в любой ткани является результатом воздействия многочисленных стимулирующих и подавляющих сигналов, получаемых клетками её составляющими. В нормальном и патологическом сперматоге-

незе эти сигналы являются результатом активации ряда генов, что нередко сопровождается инактивацией одного или нескольких генов-супрессоров неоплазии (гипоплазия, гиперплазия, метаплазия и дисплазия) [59;11].

Методы выявления антигенов, специфичных фазам клеточного цикла являются в настоящее время самыми распространёнными. Почти в 90% работ, в которых изучалась пролиферация, использовались методы, в основе которых лежит выявление антигенов, специфичных фазе клеточного цикла с помощью моноклональных антител [16]. Широкому распространению иммуногистохимических методов способствовали их простота, наличие большого спектра антител, стандартная методика визуализации и высокая воспроизводимость результатов. В настоящее время в качестве маркеров пролиферации используются несколько антигенов [16].

Ш-67. Экспрессия Ы-67 наступает во время фазы G1, затем в течение клеточного цикла нарастает и резко уменьшается после митоза [9]. Ы-67 имеет важное прогностическое значение при многих видах злокачественных опухолей [27; 44].

Ш-67 в яичках. В ряде экспериментальных иммуногистохимических исследованиях, отмечалась положительная экспрессия в ядрах А-, и B-сперматогониях после воздействия ЫШ-1 в G1-фазе, направленного против белка И-67 [13]. Экспрессия белка И-67 отсутствовала во время лептотенны и зиготены, но обнаруживалась во время пахитены мейоза I и II [62].

При сравнении экспрессии PCNA и Ы-67 существует определённая корреляция, однако при сравнительных исследованиях этих маркеров с бромдеоксиуредином (маркер S-фазы) оказалось, что экспрессия Ы-67 довольно точно соответствовала распределению метки бромдеоксиуредина (табл. 1) [23].

Таблица 1

Сравнительная характеристика методов оценки пролиферации

Признаки PCNA ki-67

Фаза клеточного цикла G1, S, G2 (G0) G1, S, G2

Материал любой любой/замороженный

Окраска цитоплазмы Да Нет

Однородность окрашивания - +

Апоптоз соматических и половых клеток. Во время развития большинства многоклеточных животных образуется необходимое количество клеток. После того, когда клетки полностью израсходуют свои жизненные ресурсы, они совершают «самоубийство» путем активации внутриклеточной программы смерти. Происходящие при этом события имеют упорядоченный характер, поэтому этот процесс часто называют запрограммированной клеточной смертью (PCD), или апоптозом (табл. 2).

Таблица 2

Основные компоненты механизма апоптоза в животной клетке

Компонент Внутренний путь

Промоутеры апоптоза только белки Bax/BH3 Fas/FasL, TNFR1/TNF-a

Ингибиторы апоптоза Bcl-2, Bcl-x, FLIP

Адапторы (посредники) Apaf- 1 FADD, TRADD

Каспазы-инициаторы каспаза-9 каспаза-8

Каспазы-ингибиторы ингибиторы апоптоза

Каспазы-эффекторы каспаза-3, каспаза-7 каспаза-3, каспаза-7

Каспазы. Они представляют собой семейство протеаз, которые имеют в активной части цистеин (цистеиновая протеаза); во время апоптоза они обеспечивают процессинг цитоки-нов. После активации каспазы, они расщепляют клеточные белки, проявляя определённые морфологические признаки апоптоза [23]. Каспаза-9 расщепляет и, таким образом, активизирует другие каспазы, запуская каскад биохимических реакций и создавая увеличение протео-литической активности, что приводит к перевариванию структурных белков в цитоплазме, деградации хромосомной ДНК, и фагоцитозу клеток.

Судьба мужских половых клеток в яичках определяется сложной системой внешних и внутренних сигналов, которые включают: фактор стволовых клеток (SCF), лейкемия-ингибирующий фактор (иР), и сигнальный белок Dhh, а также эндокринные сигналы, такие как гонадотропины гипофиза и тестостерон. Точная причина запуска апоптоза в мужских половых клеток остаётся неясной, так как при этом не отражается классическая морфологическая картина этой гибели. Сперматогонии и ранние сперматиды почти наверняка умирают от апоптоза, так как их гибель отображает многие классические морфологические и биохимические особенности течения апоптоза [24; 35].

Комплекс Ара^1+АТФ+цитохром-С активирует цитоплазматические каспазы. Предполагается, что цитохром С в яичке является опосредованным фактором апоптоза и имеет важное значение для сперматогенеза [26].

Белок Ьс1-2. Блокада апоптоза под действием Ьс1-2 может наступить в любую фазу клеточного цикла [15], однако механизм, с помощью которого белок блокирует апоптоз, до сих нор не раскрыт.

Ьс1-2 в яичках. Fas/FasL системы и белки семейства Ьс1-2 участвуют в регуляции апоптоза половых клеток [49]. При иммуногистохимических реакциях с использованием Ьс1-2 по литературным данным было показано, что апоптоз в половых клетках был обнаружен во всех исследуемых яичках и, в основном, экспрессия отмечалась в первичных сперматоцитах и сперматидах, а также в единичных сперматогониях [21; 31; 61].

Таким образом, во многих исследованиях на млекопитающих и в меньшей степени на человеке, было показано, что Ьс1 ингибирует сперматогониальный апоптоз [57]. То есть, достоверных данных об антиапоптотической активности Ьс1 в половых клетках и в первую очередь в сперматогониях, в современных исследованиях мало.

Белок р53 был описан в 1979 году и выявляется во многих трансформированных клетках [9]. Было показано, что по сравнению с PCNA, Ы-67 более чувствительный и специфичный в различных анализируемых опухолей. Подобная корреляция наблюдается и при использовании Ьс1 и р53 [39; 52].

р53 в семенниках млекопитающих и человека. В экспериментах на мышах при нормальном сперматогенезе р53 в сперматогониях не экспрессирует и появляется в них только после радиоактивного воздействия. Эти данные показывают, что р53 играет важную роль в регулировании размножения и пролиферации половых клеток при нормальном сперматогенезе, скорее, за счёт регулирования процесса апоптоза в сперматогониях. Кроме того, после облучения р53 играет важную роль в удалении поврежденных клеток.

В экспериментах на крысах выявлена экспрессия р53 в половых клетках в течение мейо-за: прелептотенных и ранних пахитенных сперматоцитах и хорошо выраженное накопление белка в зиготену [56]. Однако в работах по изучению р53 в половых клетках яичек он не был обнаружен [45].

Таким образом, существует тонкая система равновесия между пролиферацией и апопто-зом (жизнью и управляемой смертью), которая контролируется двумя семействами генов, и

мутация в одном из них может приводить к драматическим последствиям для организма в целом. То есть, либо мутация только р53, либо мутация р53 и bcl-2 неспособна привести клетку к апоптозу и это является основной причиной выживания клеток с повреждённым геномом.

Факторы роста - это полипептиды с молекулярной массой 5-50 кДа, объединённые в группу трофических регуляторных субстанций.

IGF (инсулиноподобный фактор роста). Семейство инсулиноподобных факторов роста, по структуре и функциям похожи на инсулин и включает в себя несколько представителей [14]. В его функции входит эндокринная, аутокринная и паракринная регуляция процессов роста, развития и дифференцировки клеток и тканей организма. IGF-1 синтезируется в гепатоцитах. При этом инсулин, андрогены, эстрогены повышают секрецию ИФР-1 печенью, а глюкокортикоиды её снижают [47].

IGF в яичке человека. IGF-I и его рецепторы обладают множеством эффектов на мужские половые клетки, в том числе стимулируют пролиферацию, влияя на стероидогенез и этапы половой дифференцировки сперматогоний в первичные сперматоциты [22; 55], его концентрация прямо коррелирует с числом сперматоцитов, находящихся в фазе пахитены. У человека именно эти сперматоциты производят больше всего IGF-1, который стимулирует синтез ДНК в делящихся митозом зародышевых клетках. IGF-I также обнаружен в клетках Лейдига [22]. Миоидные клетки вырабатывают производные инсулиноподобного фактора роста, которые, в свою очередь, влияют на клетки Лейдига [23].

VEGF (васкулярно-эндотелиальный фактор роста). VEGF - гетеродимерный глико-протеиновый ростовой фактор, продуцируемый различными типами клеток и в первую очередь, эндотелиоцитами [48].

VEGF - потенциальный митоген для эндотелиальных клеток. Он принимает участие в процессах неоваскуляризации при патологии [48]. Из способности VEGF воздействовать на проницаемость сосудов следует возможность вовлечения этого ростового фактора в изменение функций гемато-тестикулярного барьера в пограничных (субнормальных) и патологических условиях.

VEGF в яичке человека. В исследовании яичек плодов человека, подвергшихся различной степени ишемии, связанной с острыми нарушениями маточно-плацентарного и пупо-винного кровообращения, были выявлены многочисленные участки экспрессии VEGF в ядрах и цитоплазме отдельных эндотелиоцитов новообразованных сосудов, что указывает на интенсивность ангиогенеза в ответ на выраженную гипоксию, как проявление компенсаторного механизма.

Кровоснабжение яичка, а также сосудистая пролиферация играет колоссальную роль для нормального сперматогенеза. Дифференциация различной экспрессии VEGF в пределах яичка весьма варьирует, что отражает различные эффекты VEGF в разных компартментах яичка [23]. Тем не менее, Korpelainen et al, (1998) приводят доказательства того, что сверхэкспрессия VEGF в яичке и придатке трансгенных мышей вызывает бесплодие. Полученные результаты свидетельствуют о том, что VEGF трансгенных органов содержат другие клетки-мишени эндотелия в яичках и, что VEGF может регулировать мужскую фертильность.

Отмечается экспрессия VEGFR-1 в зародышевых клетках и в клетках Сертоли, а VEGFR-2 визуализируется в цитоплазме сперматогоний-А. Кроме того, VEGFR-1 обнаружили в ак-росомной области сперматид и сперматозоидов. При этом в пахитенных сперматоцитах данные белки не определяются [43].

VEGF, вероятно, оказывает эффект дифференциальной пролиферации или дифференци-ровки на основе рецепторного подтипа в процессе сперматогенеза. В настоящее время продолжаются функциональные исследования, чтобы установить конкретную роль VEGF в процессе сперматогенеза, особенно у человека.

ЕGF (эпидермальньш фактор роста). EGF - глобулярный белок, который действует как сильный митоген на различные клетки эндодермального, эктодермального и мезодер-мального происхождения. Основным местом синтеза EGF являются слюнные железы (глан-дулоциты). EGF играет важную роль в канцерогенезе. В определенных условиях он может вызывать малигнизацию клеток.

EGF в яичке. EGF участвует в дифференциации мужской репродуктивной системы через модуляцию рецепторов андрогенов [40]. Было отмечено, что высокий уровень EGF является важным для завершения сперматогенеза [32]. EGF наблюдается в зрелых половых клетках, расположенных в адлюминальных отсеках извитых семенных канальцев. В результате ряда исследований, концентрация EGF может сделать процесс бесплодия обратимым: эти эффекты опосредованы интерстициальными (стромальными) клетками яичек [23]. EGF может стимулировать пролиферацию клеток Сертоли и имеет аддитивный эффект с другими факторами роста. Клетки Лейдига экспрессируют на себе рецепторы EGF и трансформирующий фактор роста-а, отвечающие на действие EGF или TGF стимуляцией стероидогенеза и роста зародышевых клеток [18]. Данное явление находит отражение в антенатальном периоде. Имеется предположение, что структуры яичка также способны синтезировать EGF, это вызывает дифференцировку А-сперматогоний при крипторхизме, ингибируя митотиче-скую активность в сперматогониях. EGF был также обнаружен в сперме человека, стимулируя человеческую капацитацию, путём активации тирозинкиназы EGF-R, которая регулирует фосфорилирование [23].

Таким образом, на сегодняшний момент нет достаточных данных о роли EGF в сперматогенезе. Однако достоверно известно, что он присутствует в клетках Сертоли и Лейдига.

Анализ современных литературных данных показывает, что среди имеющихся исследований речь идёт больше о постнатальном сперматогенезе в период препубертата или половой зрелости и меньше в пожилом/старческом возрасте, а также о плюропотентности мужских половых клеток в разные периоды онтогенеза (стволовые маркёры). При этом мало сведений о фертильности (бесплодии) и возможной онкоцитарной направленности течения нормального сперматогенеза в различные возрастные группы (использование онкомаркеров) (табл. 3).

Таблица 3

Влияние факторов роста на половые клетки

Факторы роста Локализация в яичке Эффекты

IGF 1 клетки Сертоли дифференцировка

IGF 2 клетки Сертоли дифференцировка

TGF -a клетки Сертоли стимуляторы роста

TGF-P клетки Сертоли ингибиторы роста

EGF перитубулярные клетки посредники роста

IL 1 клетки Сертоли регуляторы роста

VEGF эндотелиоциты (нео-) ангиогенез

Маркеры гонобластной активности мужских половых клеток

PLAP (ПЩФ) (Placental alkaline phosphatase, плацентарная щелочная фосфатаза).

PLAP - это аллостерический опухолеспецифический изофермент щелочной фосфатазы человека [9]. Он был впервые описан у больного раком лёгких и позже выявлен в сыворотке при других формах рака и идентифицирован как плацентарная щелочная фосфатаза (PLAP) [51].

Плацентарную щелочную фосфатазу (ПЩФ) относят к белкам, ассоциированных с беременностью и опухолевым ростом [3; 4].

PLAP - является одним из основных маркёров герминогенных опухолей [3; 17], и в первую очередь семиномы [European Group on Tumor Markers; 17; 23]. Следует отметить также описанную положительную экспрессию PLAP у пациентов с крипторхизмом (в возрасте 1418 лет), что свидетельствует о наличии потенциала стволовых клеток [61]. Эти наблюдения позволяют предположить действительно плюрипотентные свойства гоноцитов в канцерогенезе (табл. 4).

Таблица 4

Процент положительных реакций герминогенных опухолей яичка с различными антителами

Антитела к: ОПУХОЛИ

Семинома Эмбриональный рак Опухоль желточного мешка Незрелая тератома

OCT 3/4 99 95 0 0

PLAP 86 91 80 0

CD 117 86 4 17 0

Vimentin 20,7 19 16 0

MAGEA 4 0 0 0 0

PLAP в яичках. PLAP экспрессирует в норме в половых клетках яичек плода и новорожденного [54]. В мужских половых клетках в постнатальном периоде в норме PLAP не определяется.

ОСТ 3/4 (Октамер-связывающий трансформирующий фактор). ОСТ (ОСТ 4, или ОСТ 3) является одним из немногих известных факторов транскрипции, который участвует в самообновлении эмбриональных стволовых клеток [23; 53]. Этот фактор транскрипции занимает центральное место в генной цепи и ответственен за самообновление, плюрипотент-ность и коммитирование в эмбриональных стволовых клетках и индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток [50]. По данным литературы, ОСТ 4 визуализировали в цитоплазме половых стволовых клетках и реже в темных А-сперматогониях [10]. Эти данные подтверждаются и в других работах, где ОСТ-4 был обнаружен в примордиальных половых клетках в момент их миграции в половой валик из стенки желточного мешка [33]. ОСТ 4 в конечном итоге исчезает в зрелых половых клетках, а именно в сперматоцитах, сперматидах, и сперматозоидах. ОСТ-4 являются маркером герминогенных опухолей яичка [17].

СD 117. Рецептор фактора роста тучных и стволовых клеток (SCFR), или белковой тиро-зинкиназы Kit (CD117), продукт гена Kit. Существует несколько изоформ белка. Впервые этот фактор описан в 1987 году [9].

CD 117 - стволовой протоонкоген, играющий важную роль в гемопоэзе, сперматогенезе и меланогенезе. Экспрессия Kit играет важную роль в развитии некоторых видов клеток (ме-ланоциты, половые клетки, лаброциты, эритроциты, интерстициальные клетки Кахаля). Различные опухоли часто имеют низкий уровень экспрессии этого белка. Положительными по экспрессии CD 117 являются практически 100 % семином, а в смешанных опухолях он окра-

шивает компонент семиномы [17]. Однако при проведении дифференциальной диагностики необходимо учитывать, что только 40 % случаев сперматоцитарной семиномы - опухоли, которая встречается в яичках пожилых мужчин, являются положительными по реакции с антителами к CD117 [1].

В нормальных яичках экспрессия CD 117 (Kit) наблюдается в клетках Лейдига и частично в сперматогониях. В антенатальном периоде различают три типа половых клеток: гоноци-ты (OCT +/ CD 117), промежуточные популяции - OCT +7CD 117") и сперматогонии (OCT-/CD 117-) [34].

Маркеры постнатальной активности мужских половых клеток

Гены, которые кодируют специфические опухолевые антигены на клеточных линиях ме-ланомы включают: MAGE, BAGE и GAGE.

MAGE А-3/4 (Меланома-ассоциированный ген). Впервые о MAGE-1 сообщил van der Brüggen с соавторами как об «антигене отторгающейся опухоли».

MAGE в яичках. В нормальных тканях взрослого организма более 23 генов MAGE экс-прессируют только в семенниках и только в митотически активных сперматогониях и в первичных сперматоцитах [20]. Яичко экспрессирует все гены MAGE, кроме гена MAGE-7. MAGE-1 и -4 были обнаружены в ядрах и цитоплазме сперматогоний и в сперматидах, а также в клетках Сертоли и в первичных сперматоцитах, локализующихся ближе к базальной мембраной, но не в первичных сперматоцитах, располагающихся в верхних ярусах с небольшими ядрами. Поэтому белки MAGE являются антигенами нормальной ткани, выполняя важную роль на начальных стадиях сперматогенеза [23]. При этом, MAGE-4 обладают специфической экспрессией в фетальной (на поздних сроках) и постнатальной гонаде (первое мейотическое деление) [23].

Маркеры локомоторной активности структур яичка

Виментин (Vimentin) - белок, который является одним из пяти основных промежуточных филаментов в клетке [19]. Данный элемент цитоскелета (филаменты) считается специфичным маркёром для саркомы и других мезенхимальных новообразований [60].

В тканях яичка виментин может использоваться для идентификации сустентоцитов. Некоторые литературные источники указывают на экспрессию виментина не только клетками Сертоли, но и в перитубулярных миоидных клетках и в клетках Лейдига, в связи с чем, совместно с морфометрическими данными этот белок может служить маркером азоспермии -синдрома клеток Сертоли [8].

SMA (Smooth muscle actin, гладкомышечный актин). Этот белок является маркером гладкомышечных клеток и клеток, содержащих а-актин (например, в фибробластах) [9].

В яичке SMA экспрессирует в перитубулярных миоидных клетках вокруг извитых семенных канальцев, а также в гладких миоцитах кровеносных сосудов [28].

Патологический сперматогенез

Роль мужского фактора в бесплодном браке составляет не менее 40 % [25].

Диагностика мужского бесплодия основана на комплексной оценке состояния мужской репродуктивной системы и включает в себя клинические и лабораторно-диагностические методы.

Основным исследованием в определении мужской фертильности является цитоморфоло-гический анализ эякулята - спермограмма. Для окончательной верификации нозологии, её вариантов и степени поражения, выполняют диагностическую биопсию ткани яичка.

Сложным в диагностике и последующем лечении остаётся идиопатическая форма мужского бесплодия. И здесь важная роль в исследовании состояния мужских половых клеток, изучение степени их пролиферации и гибели принадлежит иммуногистохимическому методу. Вторым, не менее важным фактором в пользу иммуногистохимического анализа, это исследование сперматозоидов для интрацитоплазматической инъекции в яйцеклетку.

Не менее важным является корреляция степени экспрессии определённой панели антител в мужских половых клетках у лиц пожилого возраста с физиологическими инволюционными изменениями и мужского бесплодия, которое чаще всего наблюдается в половозрелом возрасте.

Мало изученным остаётся вопрос при бесплодии о количестве клеточных структур и прежде всего половых клеток в извитых семенных канальцах и степени их пролиферации, которая визуализируется при использовании иммуногистохимического метода.

В биоптатах при тестикулярном форме бесплодия при патогистологическом анализе извитых семенных канальцев отмечается гиперплазия клеток Сертоли (аплазия герминативного эпителия, s. Сертоли-клеточный синдром, s. синдром Дель Кастилио) и единичные сперматогонии.

Впервые описан в 1947 г. аргентинским морфологом Е. В. del Castillo у бесплодных мужчин с азооспермией, с нормальным мужским фенотипом и кариотипом и с сохраненной половой функцией. Аплазия герминативного эпителия не является диагнозом, а лишь характеризует гистопатологический фенотип. Такое состояние паренхимы яичка описано как синдром, включающий незначительно уменьшенные в размерах яички нормальной консистенции, азооспермию и повышенный уровень фолликулостимулирующего гормона.

Большинство исследователей относят этот синдром к врожденной первичной гипергона-дотропной форме гипогонадизма с ранней атрофией герминативного эпителия. При полной аплазии гоноцитов, уменьшенные в диаметре канальцы, содержат только клетки Сертоли и полностью лишены половых клеток. При очаговой форме тот или иной процент канальцев содержит половые клетки, но и в этих канальцах сперматогенез часто нарушен как качественно, так и количественно.

ki-67 в яичках при идиопатическом бесплодии. Анализируя имеющиеся работы по нашей теме, можно отметить экспрессию ki-67 в единичных сперматогониях [23].

p53 в яичках при идиопатическом бесплодии. По литературным данным, есть предположение, что p53 играет роль в патогенезе бесплодия, в связи с его экспрессией в первичных сперматоцитах [36]. Ряд исследований показало, что родственный ген ТР53 Arg72Pro может быть связан с нарушением сперматогенеза при идиопатическом бесплодии у мужчин на юго-востоке Китая [29].

bcl в яичках при идиопатическом бесплодии. В исследовании A.E. Omu и др. (2008 г.), антиапоптический белок bcl-2 более высоко экспрессирует при нормоспермии, чем при оли-госпермии.

Caspasa в яичках при идиопатическом бесплодии. Обнаружение активированных каспаз в мужских половых клетках может быть полезным при оценке мужского бесплодия. Необходимо оценить минимальный объем половых клеток для обнаружения активированных каспаз в семенных канальцах. Большинство сперматогоний активированы каспазой-3, -8 и -9 [12].

Ингибин в яичках при идиопатическом бесплодии. На фоне низкого содержания сывороточного ингибина в общем кровотоке при бесплодии, мало данных, показывающих уровень экспрессии этого фактора в половых клетках при нарушении мужской фертильности.

При этом содержание ингибина в клетках Сертоли остаётся неизменным, как и при нормальном сперматогенезе [7].

IGF в яичках при идиопатическом бесплодии. Взаимодействия гормона роста (GH) и его основного медиатора IGF-I с элементами гипоталамо-гипофизарно-тестикулярной оси, и их роли в сперматогенезе были исследованы in viro на различных животных (мышей и крысы). В естественных условиях исследования с использованием незрелых и зрелых гипофи-зэктомированных крыс и GH-дефицитных мутантных мышей-самцов и крыс показали, что IGF-I играет важную роль в регуляции стероидогенеза и сперматогенеза. Кроме того, не смотря на то, что ФСГ и ЛГ являются основными регуляторами синтеза IGF-I в яичках, но GH может играть косвенную роль в потенцировании действия гонадотропинов в регуляции содержание ИФР-I в яичках. В настоящее время продолжаются исследования на животных и на человеке о роли IGF-I при идиопатическом бесплодии. Так, после лекарственной терапии гормоном роста, отмечался положительный эффект среди 10 % мужчин, страдающих идио-патическим бесплодием [38]. Однако не достаточно работ, исследующих патогенез бесплодия, связанный с эффектами гормона роста и/или IGF-I в яичках, и возможно, являющееся причиной мужского бесплодия [6].

Анализируя вышеизложенные литературные данные о роли биологических веществ при мужском идиопатическом бесплодии в уточнении остается ряд вопросов. Кроме того, мало данных о возможной положительной экспрессии онкомаркеров в половых клетках при идио-патическом бесплодии. Существует мало научных доказательств для эмпирического подхода в лечении идиопатического бесплодия.

Следовательно, мужское идиопатическое бесплодие, бесспорно, является предметом всестороннего изучения (патогенез) и в первую очередь необходимо дать максимально возможную в современных условиях морфологическую картину заболевания, основываясь на течении нормального сперматогенеза. Полученные структурно-функциональные данные позволят в дальнейшем обозначить вектор патогенеза и поиск адекватного лечения (прежде всего консервативного), а также возможной профилактики.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Андреева Ю.Ю., Франк Г.А. Опухоли мочевыделительной системы и мужских половых органов. М., 2012. 218 с.

2 Алёшкин В.А. Иммунология репродукции: пособие для студентов, врачей, ординаторов и науч. Работников / В.А. Алёшкин, А.Н. Ложкина, Э.Д. Загородняя. Чита, 2004. 79 с.

3 Мацко Д.Е., Иванцов А.О. Патологическая анатомия герминогенных опухолей // Практическая онкология. 2006. Т .7, № 1. С. 6-15.

4 Сухарев А.Е., Булах Н.А., Ахушкова Л.М. Плацентарная щелочная фосфатаза - маркер эмбриональных и малигнизированных тканей // Успехи современного естествознания. 2011. № 4. С. 41-46.

5 Ackland J.F., Schwartz N.B., Mayo K.E., Dodson R.E. Non-steroidal signal originating in the gonad / Physiol. Rev. 1992. Vol. 72 P. 731-87, 2012.

6 Aimaretti G., Attanasio R., Cannavo S., Nicoletti M.C., Castello R., Di Somma C., Garofalo P., Iughetti L., Loche S., Maghnie M., Mazzanti L., Saggese G., Salerno M., Tonini G., Toscano V., Zucchini S., Cappa M. Growth hormone treatment of adolescents with growth hormone deficiency (GHD) during the transition period: results of a survey among adult and paediatric endocrinologists from Italy. Endorsed by SIEDP/ISPED, AME, SIE, SIMA // Journal of Endocrinological Investigation. 2015. Vol. 38. P. 377-382.

7 Andersson A.M., Petersen J.H., J0rgensen N., Jensen T.K., Skakkebaek N.E. Serum inhibin B and follicle-stimulating hormone levels as tools in the evaluation of infertile men: significance of adequate reference values from proven fertile men // J. Clin Endocrinol Metab. 2004, Jun; 89 (6). P. 2873-9.

8 Anniballo R., Brehm R., Steger K. Recognising the Sertoli-cell-only (SCO) syndrome: a case study // Blackwell. Verlag. GmbH // J. Andrologia. 2011. Vol. 43. P. 78-83.

9 The BioGenex Molecular Pathology Catalog 2014-2015, 245 c.

10 Bhartiya D., Kasiviswanathan S., Unni S.K., Pethe P., Dhabalia J.V., Patwardhan S., Tongaonkar H.B. Newer insights into premeiotic development of germ cells in adult human testis using Oct-4 as a stem cell marker // J. Histo-chem Cytochem. 2010 Dec; Vol. 58 (12). P. 1093-106.

11 Bishop J.M. The molecular genetics of cancer // J. Science. 1987. Vol. 235. P. 305-11.

12 Brugnon F., Pons-Rejraji H. Mammalian glutathione peroxidases control acquisition and maintenance of spermatozoa integrity // J. Anim. Sci. 2010. Vol. 88 (4). P. 1321-1331.

13 Canadian Neighbor Pharmacy Sex-Specific Differences in Mouse: result // J. Treatment of Disease Today. 2014, may.

14 Coates P., Hales S., Hall P. The association between cell proliferation and apoptosis: stydies using the cell cycle-associated proteins Ki-67 and DNA polymerase alpha // J. Pathol. 1996. Vol. 178: P. 71-77.

15 Culig Z., Bartsch G., Hobisch A. (2002) Interleukin-6 regulates androgen receptor activity and prostate cancer cell growth. // Mol Cell Endocrinol., 197, P. 231-238; Coates P., Hales S., Hall P. et al., 2001

16 Dabbs D. J. Diagnostic immunohistochemistry [Text]. Churchill Livingstone, 2006. - 828 p.

17 Droz J.P. [Classification of germ cell tumors of the testis] [French]//Rev. Prat 2007., Feb. Vol. 57(4). P. 375-8.

18 Ergün S., Kilic N., Wurmbach J.H., Ebrahimnejad A., Fernando M., Sevinc S., Kilic E., Chalajour F., Fiedler W., Lauke H., Lamszus K., Hammerer P., Weil J., Herbst H., Folkman J. Endostatin inhibits angiogenesis by stabilization of newly formed endothelial tubes // J. Angiogenesis. 2001. Vol. 4(3)/ P. 193-206.

19 Eriksson J.E., Dechat T., Grin B., Helfand B., Mendez M., Pallari H.M., Goldman R.D. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease // J Clin. Invest. 2009. Vol. 119 (7). P. 1763-71.

20 Fratta E., Coral S., Covre A., Parisi G., Colizzi F., Danielli R., Jean Marie Nicolay, Maio M. // Molecular Oncology. 2011. Vol. 5. P. 164-182.

21 Furuchi T., Masuko K., Nishimune Y., Obinata M., Matsui Y. Inhibition of testicular germ cell apoptosis and differentiation in mice misexpressing Bcl-2 in spermatogonia // J. Development. 2004. Vol. 122. P. 1703-1709.

22 Guoqiu S., Rongpei Wu, Bo Liu, Dong W., Tu Zh., Yang J. Upstream and Downstream Mechanisms for the Promoting Effects of IGF-1 on Differentiation of Spermatogonia to Primary Spermatocytes // J. Life sciences. 2014. Vol. 04/2014. P. 101(1-2).

23 Gupta G.S. Proteomics of Spermatogenesis // Springer Science & Business Media. 2006. 855 p.

24 Gupta S., Hastak K., Afaq F. Essential role of caspases in epigallocatechin-3-gallate-mediated inhibition of nuclear factor kappa B and induction of apoptosis // J. Oncogene. 2004. Vol. 23. P. 2507-2522.

25 Haidl G., Duan Y.G., Chen S.J. New WHO-reference limits-revolution or storm in a teapot? // Asian J. Androl. 2011. Vol. 13 (2). P. 208-211.

26 Honarpour N., Gilbert S. L., Lahn B. T., Wang X., Herz J. Apaf-1 deficiency and neural tube closure defects are found in fog mice // Proc. Nat. Acad. Sci. 2001. Vol. 98. P. 9683-9687.

27 Ihmann T., Liu J., Schwabe W., Häusler P., Behnke D., Bruch H.P. High-level mRNA quantification of proliferation marker pKi-67 is correlated with favorable prognosis in colorectal carcinoma // J. Cancer Res Clin. Oncol. 2004. Vol. 130. P. 749-56.

28 Ji-Eun Im, Sun-Hwa Song, Ji Yeon Kim, Koung Li Kim, Sang Hong Baek, Dong Ryul Lee, Wonhee Suh Vascular differentiation of multipotent spermatogonial stem cells derived from neonatal mouse testis // Experimental & Molecular Medicine. 2012. Vol. 44. P. 303-309.

29 Jin Q., Wang B., Wang J, Liu T, Yu X, Jia C, Fang X, Peng Y, Ma X. Association between TP53 gene Arg72Pro polymorphism and idiopathic infertility in southeast Chinese Han males // Syst Biol Reprod Med. 2013. Vol. 59 (6). P. 342-6.

30 Kaipia R., Holmström J., Hellström M. Measuring the benefit of changing the value offering in grocery supply chains // Production Planning & Control. 2007. Vol. 18, Iss. 2. P. 131-141.

31 Kasai S., Chuma S., Motoyama N., Nakatsuji N. Haploinsufficiency of Bcl-x leads to male-specific defects in fetal germ cells: differential regulation of germ cell apoptosis between the sexes // Dev. Biol. 2003. Vol. 264. P. 202-216.

32 Kollmannsberger C., Mayer F., Pressler H. Absence of c-KIT and members of the epidermal growth factor receptor family in refractory germ cell cancer // J. Cancer. 2002. Vol. 95. P. 301-308.

33 Lau S.K., Weiss L.M., Chu P.G. Immunohistochemistry in the differential diagnosis of seminoma and embryonal carcinoma: a comparative immunohistochemical study with KIT (CD117) and CD30 // J. Mod Pathol. 2007. Vol. 20(3). P. 320-5.

34 Lopez-Beltran A., Menendez C.L., Montironi R., Cheng L. // Tumors and Tumor-like Conditions in Urological Pathology. 2014. P. 437.

35 Loveland K.L. Apoptosis regulator bcl-w is essential for spermatogenesis but appears otherwise redundant // Proc Natl Acad Sci U S A. 1998. Vol. 13. P. 12424-31.

36 Lu N.X., Xia Y.K. Lack of association between polymorphisms in p53 gene and spermatogenetic failure in a Chinese population // Andrologia. 2007. Vol. 39 (6). P. 223-8.

37 Maekawa M., Kamimura K., Nagano T. Peritubular myoid cells in the testis: their structure and function // Arch. Histol. Cytol. 1996. Vol. 59(1). P. 1-13.

38 Mao J., Xu H., Wang X., Huang B., Liu Zh., Zhen J., Nie M., Min L., Wu X. Congenital combined pituitary hormone deficiency patients have better responses to gonadotrophin-induced spermatogenesis than idiopathic hypogo-nadotropic hypogonadism patients // Hum. Reprod. July 3, 2015. P. 32-40.

39 Mateoiu C., Pirici A., Bogdan F. Immunohistochemical nuclear staining for p53, PCNA, Ki-67 and bcl-2 in different histologic variants of basal cell carcinoma // Rom J. Morphol Embryol. 2011. Vol. 52. P. 315-9.

40 Meachem S., Schonfeldt V., Schlatt S. Spermatogonia: stem cells with a great perspective // J. Reprod. 2001. Vol. 121. № 6. P. 825-834.

41 Mendis S.H. Activins and inhibins in mammalian testis development: new models, new insights // Mol. Cell Endocrinol. 2012. Vol. 15. P. 66-77.

42 de Miguel P. M., Royuela M., Bethencourt F. R., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R. Immunohistochemical comparative analysis of transforming growth factor a, epidermal growth factor and epidermal growth factor receptor in normal, hyperplastic and neoplastic human prostates // Cytokine. 2009. Vol. 11. P. 722-727.

43 Nalbandian A., Dettin L., Dym M. Expression of vascular endothelial growth factor receptors during male germ cell differentiation in the mouse // Biol. Reprod. 2003. Vol. 69 (3). P. 985-94.

44 Oka S., Uramoto H., Shimokawa H., Iwanami T., Tanaka F. The expression of Ki-67, but not proliferating cell nuclear antigen, predicts poor disease free survival in patients with adenocarcinoma of the lung // J. Anticancer Res. 2011. Vol. 31. P. 4277-82.

45 Oldereid N.B., De Angelis P., Wiger R. Expression of Bcl-2 family proteins and spontaneous apoptosis in normal human testis // J. MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION. 2001. Vol. 7 (5). P. 403-408.

46 Pineau C., Freour T., Com E., Barriere P., Bouchot O., Jean M., Masson D. Comparative proteomic analysis coupled with conventional protein assay as a strategy to identify predictors of successful testicular sperm extraction in patients with non-obstructive azoospermia // J. Andrology. American Society of Andrology and European Academy of Andrology. 2013. Vol. 1. P. 414-420.

47 Pons-Rejraji H., Brugnon F., Sion B., Maqdasy S., Gouby G., Pereira B., Marceau G., Gremeau A.S., Drevet J., Grizard G., Janny L., Tauveron I. Evaluation of atorvastatin efficacy and toxicity on spermatozoa, accessory glands and gonadal hormones of healthy men: a pilot prospective clinical trial // J. Reprod. Biol. Endocrinol. 2014. Vol. 12. P. 65.

48 A Poché R., Saik J., West J., Dickinson M. The mouse cornea as a transplantation site for live imaging of engineered tissue constructs // Cold Spring Harbor Protocols. 2010-04-01.

49 Print C.G., Loveland K.L. Germ cell suicide: new insights into apoptosis during spermatogenesis // J. Bioessays. 2000. Vol. 22. P. 423-430.

50 Rodney T. Miller // Oct3/4: A New Marker of Embryonal Carcinoma and Seminoma // J. The Focus - Immunohis-tochemistry. 2004.

51 Rump A., Kasper G., Hayes C., Wen G., Starke H., Liehr T., Lehmann R., Lagemann D., Rosenthal A Complex arrangement of genes within a 220-kb region of double-duplicated DNA on human 2q37.1 // J. Genomics. 2001. Vol. 73 (1). P. 51-54.

52 Salehinejad J., Zare-Mahmoodabadi R., Saghafi S., Jafarian A.H., Ghazi N., Rajaei A.R. Immunohistochemical detection of p53 and PCNA in ameloblastoma and adenomatoidodontogenic tumor // J Oral. Sci. Morphol Embryol. 2011. Vol. 53. P. 213-7.

53 Sánchez-Sánchez A.V., Camp E., García-España A., Leal-Tassias A., Mullor J Medaka Oct4 is expressed during early embryo development, and in primordial germ cells and adult gonads // Developmental Dynamics. 2010. Vol. 239. №. 2. P. 680-687.

54 Schmoll H.J., Souchon R., Krege S. European consensus on diagnosis and treatment of germ cell cancer: a report of the European Germ Cell Cancer Consensus Group (EGCCCG) // J. Annals of Oncology. 2004. Vol. 15 (9). P. 1377-99.

55 Shen G., Wu R., Liu B., Dong W., Tu Z., Yang J., Xu Z., Pan T. Upstream and downstream mechanisms for the promoting effects of IGF-1 on differentiation of spermatogonia to primary spermatocytes // Life Sci. 2014. Vol. 101(1-2). P. 49-55.

56 Sjoblom T., Lahdetie J. Expression of p53 in normal and gamma-irradiated rat testis suggests a role for p53 in mei-otic recombination and repair // J. Oncogene. 1996. Vol. 12 (12). P. 2499-505.

57 Sugiyama N., Obinata M., Matsui Y. Bcl-2 inhibits apoptosis of spermatogonia and growth of spermatogonia! stem cells in a cell-intrinsic manner // J. Mol. Reprod. Dev. 2001. Vol. 58 (1). P. 30-8.

58 Tanimoto K., Yoshida E., Mita S., Nibu Y., Murakami K., Fukamizu A. Human activin beta-A gene: identification of novel 5-prime exon, functional promoter, and enhancers // J. Biol. Chem. 2012. Vol. 271. P. 32760-32769.

59 Tumuluri V., Thomas G.A., Fraser I.S. Analysis of the Ki-67 antigen at the invasive tumour front of human oral squamous cell carcinoma // J. Oral. Pathol. Med. 2002. Vol. 31. P. 598-604.

60 Ulirsch J., Fan Ch., Knafl G., Ming Jing Wu, Coleman B., Perou Ch., Swift-Scanlan T. Vimentin DNA methylation predicts survival in breast cancer // Breast Cancer Research and Treatment. 2013. Vol. 137 (2). P. 383-96.

61 Vigueras-Villaseñor R.M., Cortés-Trujillo L., Chávez-Saldaña M., Vázquez F.G., Carrasco-Daza D., Cuevas-Alpuche O., Rojas-Castañeda J.C. Analysis of POU5F1, c-Kit, PLAP, AP2y and SALL4 in gonocytes of patients with cryptorchidism // Acta Histochem. 2015. Vol. 117 (8). P. 752-61.

62 Wrobel K.H., Bickel D., Kujat R. Immunohistochemical study of seminiferous epithelium in adult bovine testis using monoclonal antibodies against Ki-67 protein and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) // J. Cell Tissue Res. 1996. Vol. 283(2). P. 191-201.

63 Yan W., Huang J., Lax A-S., Pelliniemi L. Overexpression of Bcl-w in the Testis Disrupts Spermatogenesis: Revelation of a Role of BCL-W in Male Germ Cell Cycle Control // J. Molecular Endocrinology. 2013. Vol. 17, Iss. 9. P. 45-57.

Статья принята в печать 5 декабря 2015 г.

Рецензент Гелашвили П.А., доктор медицинских наук, профессор кафедры морфологии и

патологии «Медицинский университет «Реавиз».

УДК 611.663/. 664-092.9

© 2015 Г.Н. Суворова, Ю.В. Григорьева, С.Н. Чемидронов, В.А. Ваньков

ГИСТОСТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СТЕНКИ ВЛАГАЛИЩА В МЕСТЕ ЕГО ПЕРЕХОДА В УРОГЕНИТАЛЬНЫЙ СИНУС У КРОЛИКОВ

Методом световой микроскопии уточнено гистологическое строение стенки нижней трети влагалища в месте его перехода в урогенитальный синус. Установлено, что на уровне стыка полового и уретрального синусов слизистая оболочка влагалища, высланная однослойным призматическим реснитчатый эпителием, резко сменяется многослойным переходным эпителием, наблюдаемым в слизистой оболочке уретры. Мышечная оболочка влагалища этой области характеризуется увеличением объема циркулярного слоя и формированием сфинктера.

Ключевые слова: кролик, влагалище, урогенитальный синус, матка, сфинктер.

Одним из наиболее сложных и актуальных вопросов животноводства является проблема воспроизводства. Поэтому всестороннее и глубокое изучение половых органов сельскохозяйственных животных, в частности кролика, необходимо для решения вопросов коррекции и управления процессами репродуктивной функции [3, 5].

Кролики являются не только удобным биологическим объектом в проведении различных экспериментов для моделирования процессов размножения, но и хорошо разводимыми в неволе животные, мясо которых в данное время оценено населением как ценный и питательный продукт.