Клинико-иммунологические взаимосвязи персистирующей вирусной инфекции и атопической бронхиальной астмы у детей

Оригинальные статьи

Клинико-иммунологические взаимосвязи персистирующей вирусной инфекции и атопической бронхиальной астмы у детей

В. А. Булгакова

Научный центр здоровья детей РАМН, Москва

Автором статьи обнаружена высокая инфицированность детей с бронхиальной астмой вирусными и бактериальными респираторными возбудителями, имеющая в основном ассоциативный характер. Показано, что персистирование этих возбудителей способствует утяжелению хронического воспалительного процесса в бронхах, развитию вторичной иммуносупрессии, в формировании которой существенное значение может принадлежать нарушениям процессов апоптоза иммунных клеток, выявленное у обследованных детей.

Ключевые слова: вирусы, персистенция, бронхиальная астма, апоптоз, иммуносупрессия

Clinical and Immunological Relationship of Persistent Viral Infection and Atopic Bronchial Asthma in Children

V. A. Bulgakova

Research Center of Children's Health, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

The author found that among children with bronchial asthma there is a high percentage of children infected with viral and bacterial respiratory pathogens of associative character. It is shown that the persistence of these pathogens promotes severity of chronic inflammation in the bronchi and the development of secondary immunosuppression. The development of this state may be preconditioned by derangements in apoptosis of immune cells which was detected in the examined children.

Key words: viruses, persistence, bronchial asthma, apoptosis, immunosuppression

Контактная информация: Булгакова Виля Ахтямовна — д.м.н., гл.научный сотрудник Научного центра здоровья детей РАМН; 119991, г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 2/62; irvilbulgak@mail.ru

УДК 616.24807

По данным официальной статистики, в Москве за два последних десятилетия заболеваемость аллергическими болезнями органов дыхания (атопической бронхиальной астмой, аллергическим ринитом) практически удвоилась во всех возрастных группах населения. Начиная с 2005 года, показатели распространенности астмы стабилизировались, но продолжают оставаться высокими и особенно у детей и подростков (рис. 1).

Основной вклад в понимание стратегии борьбы с астмой внесли рекомендации Всемирной глобальной инициативы по бронхиальной астме, Национальной педиатрической программы «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика», Международных рекомендаций по бронхиальной астме у детей PRACTALL (Practical Allergology) — Консенсуса, созданного при поддержке EAACI и Американской академии аллергии, астмы и иммунологии. Именно внедрение рекомендаций этих программ, образование не только врачей, но и пациентов, внедрение стандартов противовоспалительной терапии способствовало достижению существенных успехов в диагностике и лечении бронхиальной астмы у детей. Все эти ключевые документы по астме выделяют роль инфекции дыхательной системы, играющей значительную роль в формировании бронхиальной астмы у детей, выступая в роли причинно-значимого фактора. И как самостоятельный клинический фенотип бронхиальной астмы у детей выделяется сегодня форма «вирусиндуцированная бронхиальная астма» [1].

В последние годы существенное значение придается пер-систенции вирусов и других патогенных микроорганизмов в различных отделах респираторного тракта [2—4]. Предполагается, что персистирующая вирусная инфекция способст-

вуют формированию стойкой реактивности бронхов и про-грессированию иммунной недостаточности, определяя склонность детей с бронхиальной астмой к частым респираторным инфекциям, торпидному течению астмы и снижению эффективности стандартных схем противовоспалительной терапии. Вопросы взаимодействия инфекции и аллергии остаются областью интенсивных эпидемиологических, иммунологических и клинических исследований во всем мире, что связано в первую очередь с вопросами профилактики и адекватной терапии аллергических болезней. Понимание роли персистирующей инфекции в развитии и течении аллергии, в том числе атопической бронхиальной астмы, имеет важное клиническое значение для эффективного контроля над течением болезни.

Целью исследования явилось изучение взаимосвязи персистирующей вирусной инфекции и течения атопиче-ской бронхиальной астмы у детей.

показатель на 1000 населения 35

30

25

20

15

CN П Ю Ю К СО О О О О О О О

о о о о о о о

0—14 лет

15—18 лет

18 лет и старше

ю ю к со о 000000 000000 222222

годы

Рисунок 1. Динамика заболеваемости бронхиальной астмой населения Москвы [16]

5

0

Материалы и методы исследования

Проведено комплексное вирусологическое и микробиологическое обследование 65 детей в возрасте от 4 до 15 лет: 50 пациентов с атопической бронхиальной астмой, госпитализированных в аллергологическое отделение НЦЗД РАМН, и 15 относительно здоровых детей без признаков аллергической патологии, проходивших диспансеризацию в НЦЗД РАМН. У каждого обследуемого одномоментно исследовались смывы из носоглотки и аспираты из верхних дыхательных путей на выявление вирусов герпеса 1, 4, 5, 6 типов, Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, респираторных вирусов и бактериальной микрофлоры классическими вирусо-бактериологическими методами. У всех пациентов с бронхиальной астмой определялись специфические противоинфекционные антитела к респираторным вирусам, вирусам герпеса 1, 4, 5, 6 типов, родовые антитела к Chlamydiaceae и видовые к Mycoplas-ma pneumoniae, в сыворотке крови методом ИФА с использованием коммерческих реактивов. Исследование содержания в сыворотке крови растворимых мембранных маркеров апоптоза — sCD95 (sAPO1/FAS), растворимого FAS лиганда (sFASL), индуцирующего апоптоз TNF-зависимого лиганда для рецепторов DR4 и DR5 TRAIL, свидетелей ранней стадии эффекторного этапа апоптоза — фермента, преобразующего IL1ß, Caspase1/ICE (ICE — IL1ß Converting Enzyme) и последующей его стадии белка Annexin V, а также sCD30 и sCD40 — маркеров активации, модулирую-

щих также процессы апоптоза, осуществлялось всем детям посредством иммуноферментного энзим-связанного имму-носорбентного анализа (enzymlinked immunosorbent assay — ELISA) c использованием коммерческих наборов [5]. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием критерия Стьюдента с помощью компьютерной программы Statistica (StatSoft, версия 6,0) с расчетом средней арифметической величины M и ошибки репрезентативности средней величины m (M ± m), для выяснения статистической зависимости между изучаемыми параметрами использовался коэффициент корреляции r, различия считались достоверными при p < 0,05.

Результаты и их обсуждение

В результате исследования нами была обнаружена высокая инфицированность детей с бронхиальной астмой вирусными и бактериальными респираторными возбудителями, имеющая в основном ассоциативный характер (p < 0,05). Однако в период обострения астмы и при тяжелых формах болезни отмечалось наибольшее выявление как вирусных, так и бактериальных инфекционных агентов (p < 0,05). Особенно актуально обнаружение возбудителей оппортунистической и атипичной инфекции (табл. 1). Показано, что инфицирование цитоме-галовирусом, вирусами Эпштейна-Барр, герпеса 6—8 типов не является основным триггером заболевания бронхиальной астмой [6, 7]. Однако обнаружение цито-

Таблица 1. Частота выявления инфекционных антигенов из верхних дыхательных путей у обследованных детей

Возбудители Дети без аллергии, n = 15 Дети с атопической БА, n = 50

Легкая форма, n = 11 Среднетяжелая форма, n = 30 Тяжелая форма, n = 9

период ремиссии, n = 17 период обострения, n = 13

Вирусы гриппа (А1, А2, В) 1 (6%) 3 (27%)* 2 (15%)* 3 (18%) 1 (11%)*

Вирусы парагриппа 1—3 типы 1 (6%) 3 (27%)* 9 (69%)* 5 (29%)* 3 (33%)*

РС-вирус 0 2 (18%)* 3 (23%)* 3 (18%) 1 (11%)*

Аденовирусы (I—III пулы) 3 (20%) 3 (27%) 5 (38%)* 4 (24%)* 4 (44%)*

Вирус простого герпеса 1 типа

Цитомегаловирус (HHV5) 0 0 4 (31%)* 0 1 (11%)*

Вирус Эпштейна-Барр (HHV4) 0 0 1 (8%)* 1 (6%) 0

Вирус герпеса 6 типа (HHV6) 0 0 0 0 0

Chlamydia pneumoniae 3

Mycoplasma pneumoniae 2 (13%) 2 (18%) 11 (85%)* 6 (35%)* 6 (67%)*

Staphilococcus aureus 6

Staphilococcus haemolyticus 1 (6%) 1 (9%) 2 (15%)* 1 (6%)* 2 (22%)*

Streptococcus pneumoniae 3 (20%) 2 (18%) 3 (23%)* 4 (24%) 4 (44%)*

Streptococcus pyogenes 0 1

Haemophilus influenzae 2

Moraxella catarrhalis 1

* — p < 0,05 — достоверность различий между частотой выявления инфекционных антигенов у детей с БА в сравнении с детьми без аллергии

мегаловируса, вируса Эпштейна-Барр в период обострения на фоне незначительного выделения этих возбудителей в целом у детей с астмой, а также более высокое обнаружение антигенов хламидийной и микоплазменной инфекции в период обострения болезни, возможно, является свидетельством давней инфекции и последующей персистенции при недостаточности иммунного ответа при аллергии. Присутствие инфекционных возбудителей в верхних дыхательных путях в период ремиссии астмы может быть связано с недооценкой инфекционного фактора в патогенезе и отсутствием адекватного лечения. Данный факт может также свидетельствовать о недостаточной элиминации возбудителей на фоне иммуносупрессии у пациентов с атопической бронхиальной астмой, что подтверждается недостаточным специфическим иммунным ответом к респираторным вирусам при одновременном выявлении массивной персистенции этих возбудителей в верхних дыхательных путях у обследованных детей (табл. 2). Бактериологическое обследование слизистой носоглотки выявило высокую обсемененность всех обследованных детей. При БА чаще встречалась патогенная флора — Staphilococcus haemolyticus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis. Однако у пациентов с атопической бронхиальной астмой патогенная микрофлора слизистой носоглотки была ассоциирована с вирусными антигенами (табл. 1).

Оценка специфического иммунного ответа к исследуемым возбудителям у детей с атопической БА выявила высокую частоту обнаружения специфических антител к Chlamydiaceae, Mycoplasma pneumoniae, аденовирусам, РС-вирусу, а также к вирусам герпеса 1, 4 и 5 типов (табл. 2). Анализ результатов серологического исследования и сравнение их с результатами исследования на инфекционные

антигены обнаружили особенности продукции противоин-фекционных антител у детей с атопической бронхиальной астмой в виде длительной сохранности IgM и слабой тенденции к синтезу IgG-антител к Mycoplasma pneumoniae, повышения уровней специфических как IgM, так и IgG-ан-тител к РС-вирусу, вирусам герпеса 1, 4, 5 типов, положительные серологические реакции сразу к нескольким возбудителям.

Несмотря на высокое обнаружение антигенов вирусов гриппа и парагриппа в слизистой верхних дыхательных путей у детей с атопической бронхиальной астмой, уровень специфических антител к ним был низким, что, возможно, связано как с изменчивостью антигенного состава возбудителя, так и с особенностями иммунного ответа при аллергии. Отсутствие смены классов специфических IgM на IgG-антитела при отрицательном результате исследования на выявление возбудителей может свидетельствовать о перенесенной ранее инфекции и связано с особенностями иммунного ответа в условиях аллергической патологии. Выявление специфических антител к антигенам разных возбудителей может также являться результатом поликлональной стимуляции специфического гуморального иммунного ответа и перекрестного реагирования инфекционных антигенов, что наблюдали при обследовании детей на условно-патогенную флору и другие исследователи, объясняя данный феномен как важнейший механизм противоинфекционной защиты [8]. Однако, высокая частота выявления возбудителей в верхних дыхательных путях у детей с атопической бронхиальной астмой, сопровождающаяся нарушениями специфического иммунного ответа, возможно, свидетельствует о давности инфицирования и последующей персистен-ции инфекционных агентов и служит существенным отрицательным фактором, способствующим утяжелению хронического воспалительного процесса в бронхах, формированию

Таблица 2. Комплексная оценка этиологической структуры инфицирования детей с атопической бронхиальной астмой по данным серологического обследования

Пациенты с АТ+ Возбудители Легкая форма, n = 11 Среднетяжелая форма, n = 30 Тяжелая форма, n = 9

период обострения, n = 13 период ремиссии, n = 17

Вирус гриппа А 3

Вирус гриппа В 1 (9%) 1 (8%) 2 (12%) 0

Вирусы парагриппа 1—3 типы 2 (18%) 3 (23%)* 3 (18%) 1 (11%)*

РС-вирус 3

Аденовирусы (I—III пулы) 3 (27%) 5 (38%)* 4 (24%) 4 (44%)*

Вирус простого герпеса 1 типа

Цитомегаловирус

Вирус Эпштейна-Барр

Вирус герпеса 6 типа (HHV6) 1 (9%) 0 8 (47%)* 0

Chlamydiaceae 2

Mycoplasma pneumoniae 4

p < 0,05 — достоверность различий между группами

*

Таблица 3. Динамика содержание сывороточных маркеров активации и апоптоза у детей с атопической бронхиальной астмой

sCD95 sFASL (sCD178) TRAIL sCD30 sCD40 Caspase1/ ICE Annexin V

pg/ml pg/ml pg/ml U/ml pg/ml pg/ml ng/ml

Легкая форма БА, П = 11 490,49 ± 32,87* 0,18 ± 0,05 498,92 ± 31,35* 45,7 ± 4,6* 28,76 ± 3,14 47,01 ± 5,52 5,15 ± 0,99*

Среднетяжелая форма БА, период ремиссии, П = 17 593,7 ± 31,2*# 0,15 ± 0,01*# 484,62 ± 22,61* 56,2 ± 6,1*# 24,94 ± 3,24* 45,5 ± 5,11* 4,0 ± 0,89*

Среднетяжелая форма БА, период обострения, П = 13 637,64 ± 38,4*# 0,13 ± 0,01*# 434,78 ± 27,43* 60,1 ± 6,3*# 25,54 ± 3,52* 41,99 ± 5,38* 3,05 ± 0,73*

Тяжелая форма БА, п = 9 598,99 ± 34,32*# 0,14 ± 0,09*# 401,81 ± 28,2# 76,2 ± 5,1*# 19,35 ± 2,96*# 42,17 ± 5,33*# 4,11 ± 0,86*

БА с рецидивирующей респираторной инфекцией, п = 49 592,86 ± 42,31* 0,16 ± 0,01 451,62 ± 29,93* 62,9 ± 5,1* 30,02 ± 4,32 41,12 ± 4,93* 4,9 ± 0,97*

Здоровые дети, п = 15 400,5 ± 4,9 0,21 ± 0,01 706,4 ± 7,4 34,4 ± 0,3 35,3 ± 0,4 53,7 ± 0,5 21,3 ± 0,2

* — p < 0,001 — в сравнении со здоровыми детьми; # — p < 0,05 — в сравнении с легкой формой астмы

иммуносупрессии у этих пациентов, склонности к частым ОРИ. По-видимому, в осуществлении высокой инфициро-ванности вирусами и атипичными возбудителями детей с атопической бронхиальной астмой и недостаточной их элиминации играют роль и нарушения неспецифических иммунных механизмов.

Известно, что развитие инфекционного воспаления связано с процессами торможения апоптоза [9, 10]. Возможно, именно с механизмом апоптоза связана выявленная у детей с атопической бронхиальной астмой персистенция различных респираторных вирусов. Исследования показателей иммунного статуса детей с атопической бронхиальной астмой обнаружили стойкие изменения концентрации исследуемых показателей, особенно в группе пациентов с рецидивирующей респираторной инфекцией. Наиболее выраженные отличия отмечены в содержании sCD95, sCD30, TRAIL, Caspase1/ICE (табл. 3). Предполагается, что повышенный уровень растворимой формы мембранной молекулы CD95, ингибирующей процесс апоптоза, является одной из причин слабого иммунного ответа на вирусную инфекцию и как следствие её длительной персистенции в организме [11]. Показана возможность связывания sCD95 с FAS-лигандом не только на поверхности цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+) и NK-клеток, но и на Т-лимфоцитах-хел-перах 1го типа [12]. Возникающий литический эффект инфицированной вирусом клетки достигается преимущественно за счет цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), а также CD4+ (Th-система). Высокий уровень растворимой мембранной молекулы CD95, способной блокировать Th 1 -клетки, опосредующие свое действие в результате интенсификации процессов апоптоза, также может способствовать дисбалансу T-хелперной субпопуляции лимфоцитов при ато-пии. Кроме того, может служить одним из механизмов недостаточной иммунорегуляции цитотоксичности, которой

отводится ведущая роль в элиминации инфекционного возбудителя, что в свою очередь объясняет склонность пациентов с атопической бронхиальной астмой к инфицированию и персистенции возбудителей как банальных вирусных, так и оппортунистических инфекций.

В патогенезе аллергических болезней, в том числе атопической бронхиальной астмы, важное место занимает вторичная иммуносупрессия, в развитии которой предполагается нарушение апоптотических процессов, в частности связанная с эффектом негативной активации [13—15]. Выявленные изменения в содержании sCD30 и sCD95 у обследованных детей может отражать стойкую активацию ТЬ2-лимфоцитов и свидетельствовать о супрессии ТЫ-отве-та, характерные при атопии. Указанные изменения являются также предрасполагающим фактором, способствующим инфицированию, и наиболее выражены при длительном и тяжелом течении астмы.

Заключение

В результате проведенного комплексного вирусо-бакте-риологического и иммунологического исследования обнаружена высокая инфицированность детей с атопической бронхиальной астмой вирусными и бактериальными респираторными возбудителями, имеющая в основном ассоциативный характер. Однако в период обострения астмы и при тяжелых формах болезни отмечается наиболее высокое выявление как вирусных, так и бактериальных инфекционных агентов. Обнаружение цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр в период обострения на фоне незначительного выделения этих возбудителей в целом у детей с астмой, а также более высокое обнаружение антигенов хламидийной и микоплазменной инфекции в период обострения болезни, предполагает давнее инфицирование и последующую персистенцию возбудителей при недоста-

точности иммунного ответа при аллергии. Присутствие инфекционных возбудителей в верхних дыхательных путях в период ремиссии астмы может быть связано с недооценкой инфекционного фактора в патогенезе и отсутствием адекватного лечения. Высокий уровень серопозитивных пациентов с бронхиальной астмой к возбудителям хламидийной и микоплазменной инфекций, а также к вирусам герпеса 1, 4 и 5 типов может свидетельствовать о латентном персисти-ровании этих возбудителей и одновременном их длительном воздействии на иммунную систему, приводящем к утяжелению хронического воспалительного процесса в бронхах, формированию иммуносупрессии у пациентов с атопической бронхиальной астмой и склонности их к частым респираторным инфекциям. Персистирующая вирусная инфекция у детей с атопической бронхиальной астмой объясняет развитие вторичной иммуносупрессии, в формировании которой существенное значение может принадлежать нарушениям процессов апоптоза иммунных клеток, выявленное у обследованных детей.

Литература:

1. Bacharier L. B. Diagnosis and treatment of asthma in childhood: a PRACTALL consensus report // Allergy. — 2008. — V. 63. — P. 5— 34.

2. Busse WW., Gern J.E. Viruses in asthma // J. Allergy Clin. 1mmunol. — 1997. — V. 100. — P. 147—150.

3. Смоленов И.В. Астма и свистящие хрипы, индуцированные вирусной инфекцией // Consilium medicum (приложение). — 2001. — С. 9—13.

4. Кузьменко Л.Г. Значение внутриклеточных патогенов в формировании хронических бронхолегочных заболеваний // Детские инфекции. — 2003. — № 1. — С. 54—57.

5. www.biochemmack.ru

6. Human herpesvirus 8 viral FLICEinhibitory protein inhibits Fasmediated apoptosis through binding and prevention of procaspase 8 maturation / C. Belanger et al. // J. Hum. Virol. — 2001. — V. 4, № 2. — P. 62—73.

7. Johnston S.L. Viruses and asthma // Allergy. — 1998. — V. 53. — P. 922—932.

8. Катосова Л.К. Условно-патогенная флора дыхательных путей и ее роль в этиологии пневмоний / Под ред. В.К. Таточенко. — Чебоксары, 1994. — 323 с.

9. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под редакцией Быкова А.С., Воробьева А.А., Зверева В.В. — 2е изд. — М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. — С. 201—254.

10. Рабсон А., Ройт А., Делвз П. Основы иммунологии. — М.: Мир, 2006. — 320 с.

11. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы при социально-значимых заболеваниях. Сообщение II. Исследование их роли при вирусных инфекциях / В.В. Новиков, И.В. Евсегнеева, А.В. Караулов, А.Ю. Барышников // Росс. биотерапевтический журнал. — 2005. — № 3. — С. 131 — 142.

12. Система FAS — FASL в норме и патологии / С Г. Аббасова, В.М. Липкин, Н.Н. Трапезников, Н.Е. Кушлинский // Вопр. биол., мед., фарм. химии. — 1999. — № 3. — С. 3—17.

13.Апоптоз в иммунологических процессах / Р.И. Сепиашвили и др. // Аллергология и иммунология. — 2000. — Т. 1, № 1. — С. 15—23.

14.Апоптоз и активность рибосомальных цистронов клеток периферической крови при бронхиальной астме / В.И. Минеев, И.И. Нестерович, Е.С. Оранская, А.Л. Тафеев // Аллергология. — 2001. — № 1. — С. 3—9.

15. Спонтанный и глюкокортикоидиндуцированный апоптоз лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой: роль митохондрий и CD95 (APO1) / С.В. Бойчук, И.Г. Мустафин, Р.С. Фассахов, Д.В. Терещенко // Аллергология. — 2002. — № 1. — С. 13—20.

16. Ежегодный доклад «О положении детей в Российской Федерации в 2009 году». — М., 2010 г. — 31 с.

Смешанная Коксаки В — герпесвирусная инфекция у детей в возрастном аспекте

В. К. Слободенюк1, И. К. Бессергенева1, Н. В. Пацук1, М. А. Бубеншикова3, А. В. Слободенюк2, Ю. В. Григорьева2

ФБУН Екатеринбургский НИИ вирусных инфекций Роспотребнадзора1,

ГБОУ ВПО Уральская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России2, ООО «Урал — Лазер»3, Екатеринбург

Представлены результаты серологической детекции антител к вирусам Коксаки В, цитомегаловирусу, вирусу Эпштейна—Барр и вирусам простого герпеса типа 1 и 2 в сыворотках крови 3946 предположительно иммунокомпрометированных детей в возрасте от 2 до 14 лет. Антитела к вирусам Коксаки В определены в 824 случаях, из них в ассоциации с антителами к вирусам из группы герпеса в 464 образцах. На фоне Коксаки В инфицирования у детей до 3 лет выявляли преимущественно антитела к цитомегаловирусу. В сыворотках 2—3-летних детей чаще находили ассоциации, включающие антитела к Эпштейна—Барр вирусу (42,8%). Среди детей в возрасте 3—6 лет — в 53,6%. Группа детей 7—14 лет отличалась меньшим числом случаев выявления антител к Эпштейна—Барр вирусу и ростом частоты ассоциированных антител к вирусам простого герпеса типа 1 и 2. Ключевые слова: серодиагностика, Коксаки В вирусы, герпесвирусы, смешанное инфицирование, дети

Mixed Coxsackie B — Herpes Virus Infection in Children of Different Age Groups

V. K. Slobodenyuk, I. K. Bessergeneva, N. V. Patsuk, M. A. Bubenshikova2, A. V. Slobodenyuk1, Yu. V. Grigorieva1

Yekaterinburg Research Institute of Viral Infections1, Ural State Medical Academy2, «Ural - Laser Ltd.»3, Yekaterinburg

This work presents the results of detection of antibodies to Coxsackie B virus, cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and herpes simplex viruses 1 and 2 in sera of 3,946 presumably immunocompromised children aged from 2 to 14. Antibodies to Coxsackie B virus were identified in 824 cases including 464 samples associated with antibodies to viruses from the herpes simplex group. In children under 3, antibodies to cytomegalovirus were predominantly detected on the Coxsackie B background. Virus-specific IgM antibodies to cytomegalovirus were found in 9,6% cases in children under 1, in 13,5% cases in children aged 1 to 2, and in