ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
MEDICATION FOR PREVENTION OF GASTROINTESTINAL TRACT INFECTIONS IN AGRICULTURAL ANIMALS AND POULTRY AND METHOD OF ITS OBTAINING

Изобретение относится к ветеринарии, позволяет получать из дрожжевой биомассы Saccharomyces cerevisiae препарат, действующими веществами которого являются маннанопротеины, интегрированные в частично гидролизованную клеточную стенку дрожжей, и водорастворимые маннанопротеины клеточной стенки дрожжей. Препарат может быть использован для профилактики инфекций пищеварительного тракта в животноводстве и птицеводстве.
Известно, что для развития большинства заболеваний желудочно-кишечного тракта необходимо, чтобы болезнетворная бактерия закрепилась на слизистой оболочке пищеварительного тракта [1, 2]. Прикрепление бактерий происходит путем связывания пектинов (специфических белков на поверхности бактерий) с маннаноолигосахаридами на поверхности эпителия. Добавление биологически доступных маннаноолигосахаридов в корм животных препятствует развитию инфекции, поскольку маннаноолигосахариды блокируют бактериальные пектины.
Таким действием обладают как водорастворимые маннаноолигосахариды и маннанопротеины, так и доступные для связи с пектинами маннанопротеины, интегрированные в частично гидролизованную клеточную стенку [2, 3].
Клеточная стенка дрожжей S. cerevisiae является слоистой структурой (фиг.1). Средний слой, ответственный за поддержание прочности клеточной стенки, состоит преимущественно из β-глюкана [4-7]. С внешней и внутренней сторон этот слой покрыт маннанопротеинами. Липидная мембрана разделяет клеточную стенку и жидкое содержимое клетки.
β-Глюкан - полимер, состоящий из последовательно соединенных β-1,3-связью мономеров глюкозы. β-1,3-Глюкан обеспечивает жесткость и прочность клеточной стенки, устойчивость ее к воздействиям окружающей среды. Большая часть его не экстрагируется ни кислотами, ни щелочами. Этот тип глюкана можно селективно гидролизовать только ферментами, проявляющими 1,3-глюканазную активность.
Маннанопротеины различают по типу связи маннаноолигосахаридной части с белком [7]. Наиболее распространены два типа маннанопротеинов: O-связанные, в которых присоединение маннаноолигосахаридной части к белку происходит посредством O-гликозидной связи между остатком маннозы и гидроксильной группой серина или треонина, и N-связанные маннанопротеины с N-гликозидной связью между остатком N-ацетилглюкозамина и β-амидным азотом аспарагина.
N-связанный маннаноолигосарид может быть отщеплен от белковой молекулы под действием специфических ферментов - EndoH-EndoF-гликозидаз. Обработка биомассы щелочью приводит к экстракции маннаноолигосахарида в составе маннанопротеина без разрушения связи с белком. Степень экстракции зависит от степени разупорядочения структуры клеточной стенки. Из нативной клеточной стенки N-маннанопротеины экстрагируются слабо.
O-гликозидная связь маннанопротеинов, напротив, легко разрушается при действии слабой щелочи (β-элиминирование). В большинстве случаев достаточно обработки 0,1-0,5 М гидроксидом натрия в течение 12 часов (или при 0-5°С в течение нескольких суток), чтобы отщепить углеводный компонент от белка [8]. Можно предположить, что при нарушении структуры клеточной стенки, O-связанные маннанопротеины также экстрагируются щелочью, но из-за неустойчивости O-связи, быстро отщепляют маннаноолигосахаридный компонент.
Таким образом, маннанопротеины в значительной степени интегрированы в глюкановый слой, чтобы перевести их в биологически доступную форму, необходимо разрушить связь маннанопротеинов с глюканом. Для этого используют различные методы, например индуцированный автолиз, ферментативный или кислотный гидролиз. В результате получается продукт, содержащий биологически доступные маннанопротеины, интегрированные в частично гидролизованную клеточную стенку.
Известен метод выделения маннанопротеинов из пекарских дрожжей [9]. Для этого дрожжи измельчают и нагревают в автоклаве. При этом часть белков клеточной стенки гидролизуется пептидазами клеточной стенки до аминокислот и коротких пептидов и переходит в водорастворимую форму. За счет частичного гидролиза белков водорастворимые маннанопротеины клеточной стенки дрожжей частично переходят в раствор. После охлаждения и отделения осадка на центрифуге его еще раз нагревают в автоклаве. Надосадочные растворы объединяют и концентрируют в вакууме. К полученному концентрированному раствору добавляют уксусную кислоту, выделившуюся коричневую слизь промывают небольшим количеством разбавленной уксусной кислоты и отбрасывают.Промывные растворы объединяют и концентрируют в вакууме. Чтобы осадить маннанопротеины, прибавляют этиловый спирт. Маннанопротеины отфильтровывают и дважды промывают 60%-ным спиртом.
Полупродукт очищают многократной промывкой горячей водой, обработкой реактивом Фелинга, спиртом и уксусной кислотой. По этому методу получают водорастворимые маннанопротеины, образующиеся в результате автолиза дрожжевой биомассы, в количестве 4% (в пересчете на сухие дрожжи). Недостатками метода, ограничивающими промышленное получение маннанопротеинов, являются его сложность, многостадийность и низкий выход целевого продукта. Продукт обладает пониженной кормовой ценностью, поскольку в процессе получения и очистки маннанопротеинов отбрасывается большая часть питательных компонентов, содержащихся в дрожжевой биомассе.
Для получения свободных маннаноолигосахаридов из маннанопротеинов, содержащих O-связанные маннаноолигосахариды, авторы в работе [10] использовали нерастворимую часть автолизата, получаемую в результате индуцированного толуолом автолиза [11]. Часть белков клеточной стенки в процессе автолиза гидролизуется до аминокислот и коротких пептидов пептидазами, содержащимися в клеточной стенке. Нерастворимые вещества автолизата, а именно целые клетки и частично гидролизованные клеточные стенки, отделяют от раствора центрифугированием и нагревают в автоклаве в растворе NaOH. При этом маннанопротеины и белки переходят в раствор. Также под действием щелочи от O-связанных маннанопротеинов отщепляется маннаноолигосахаридная часть. Надосадочную жидкость нейтрализуют соляной кислотой и центрифугируют. Из супернатанта спиртом осаждают смесь O-маннаноолигосахаридов, N-маннанопротеинов и белков. Для удаления белков и маннанопротеинов, полупродукт обрабатывают едким натром, Фелинговой жидкостью и отмывают от белков и маннанопротеинов водой с уксусной кислотой. Полученный продукт является O-маннаноолигосахаридами нерастворимой части автолизата и состоит на 98% из маннозы.
Недостатками данного метода являются его сложность, использование автоклавирования щелочных растворов, что требует наличия особой стойкой аппаратуры, расхода энергии на поддержание давления и высокой температуры.
В качестве сырья используют дрожжевой автолизат, что связано с трудностями его получения. Работа со щелочными растворами представляет опасность для персонала. Поскольку в ходе получения O-маннаноолигосахаридов отбрасываются маннанопротеины, водорастворимые белки и водорастворимые глюкосахариды дрожжевой биомассы, уменьшается антибактериальная активность и кормовая ценность продукта.
Наиболее близким техническим решением, выбранным за прототип, является препарат, получаемый по методу [12]. Препарат, содержащий маннанопротеины, интегрированные в частично гидролизованную клеточную стенку, предложено использовать в качестве средства от кокцидиоза. Действующим началом препарата является частично гидролизованная протеазами многократно отмытая клеточная стенка дрожжей, содержащая интегрированные в нее маннанопротеины.
Препарат по прототипу имеет более низкую антибактериальную активность и кормовую ценность из-за того, что процесс его получения предусматривает отбрасывание водорастворимой фракции, содержащей водорастворимые маннанопротеины.
Задача, решаемая заявляемым техническим решением, заключается в создании препарата, содержащего маннанопротеины и обладающего высокой антибактериальной активностью для животноводства и птицеводства, а также разработка экологически чистого, простого способа получения данного препарата, позволяющего использовать доступное сырье, такое как отработанная дрожжевая биомасса, послеспиртовая барда и т.д.
Поставленная задача решается благодаря тому, что заявляемый препарат для профилактики инфекций пищеварительного тракта у сельскохозяйственных животных и птицы, включающий маннанопротеины дрожжевой биомассы Saccharomyces cerevisiae, интегрированные в клеточную стенку дрожжей, дополнительно содержит водорастворимые маннанопротеины клеточной стенки дрожжей при следующем соотношении, % мас.:
- маннанопротеины, интегрированные в клеточную стенку дрожжей - 2,5-4,5%;
- водорастворимые маннанопротеины клеточной стенки дрожжей - 0,8-2,5%;
- водорастворимые белки дрожжевой биомассы - 10-40%;
- водорастворимые глюкосахариды дрожжевой биомассы - 10-20%,
- ферментативный комплекс, обладающий деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану - 0,5-10%;
- механически активированная биомасса дрожжей - остальное.
Существенными отличиями заявляемого препарата является его состав.
2
Поставленная задача решается также благодаря заявляемому способу, характеризующемуся тем, что включает предварительное смешение дрожжевой биомассы с ферментативным комплексом, обладающим деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану, при необходимости, с добавкой воды в количестве 0,5-5% от массы вышеперечисленных компонентов, полученную смесь подвергают механической активации в активаторах планетарного, или вибрационного, или виброцентробежного типов, или роликовых мельницах, обеспечивающих ускорение мелющих тел 60-400 м/с и время пребывания в зоне обработки 0,5-10 минут, после механической активации полупродукт подвергают таблетированию и прогреванию при температуре действия ферментативного комплекса 40-60°С.
2
Предпочтительно, таблетирование проводят при давлении 10-20 кг/см.
Предпочтительно, прогревание таблетированного полупродукта проводят в течение 25-35 часов.
Проведенный патентный поиск не выявил препаратов аналогичного состава, поэтому сделан вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «новизна». Совокупность существенных признаков заявляемого способа также не выявлена, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого препарата и способа его получения критерию «изобретательский уровень».
Технический результат заключается в создании препарата, содержащего маннанопротеины как интегрированными в частично гидролизованную клеточную стенку, так и в водорастворимой форме, что позволяет ему проявлять свойства сорбента за счет наличия на поверхности частично гидролизованных клеточных стенок доступных маннанопротеинов, а также служить источником водорастворимых маннанопротеинов.
Кроме этого благодаря заявляемому способу препарат содержит водорастворимые белки и водорастворимые глюкосахариды дрожжевой биомассы, повышающие кормовую ценность препарата.
При механической активации смеси дрожжевой биомассы с ферментативным комплексом происходит частичное механическое разрушение клеток, разупорядочение надмолекулярной структуры клеточных стенок (фиг.2), повышение их реакционной способности по отношению к ферментативному гидролизу, формирование механокомпозита - продукта с повышенной реакционной способностью, в котором реализуются уменьшенные диффузионные пути, структурные слои клеточной стенки разупорядочены и носят диффузный характер.
Таблетирование полученного полупродукта позволяет повысить объемную концентрацию фермента, облегчить массоперенос между частицами композита, а также предотвратить потерю воды, которая необходима для ферментативного гидролиза.
Прогрев таблетированного полупродукта при оптимальной температуре действия фермента приводит к гидролизу β-глюкана - структурного элемента клеточной стенки. Благодаря этому существенная часть маннанопротеинов переходит в водорастворимую форму. Также увеличивается доступность маннанопротеинов, интегрированных в клеточную стенку.
Термическое превращение таблетированного полупродукта происходит за счет образования локальных зон гидролиза и их распространения на весь препарат. Разрушенные на стадии механической активации клетки служат центрами локализации ферментативного гидролиза (фиг.3). Остаточная влага способствует продвижению фронта реакции, повышение температуры дополнительно снимает диффузионные затруднения, увеличивает подвижность и гидролитическую активность ферментов.
Проведение ферментативного гидролиза таблеток в присутствии естественной влаги биомассы позволяет получать конечный продукт в виде таблеток, что увеличивает срок хранения препарата.
В качестве метода определения биологической доступности маннанопротеинов препарата использовали водную и щелочную экстракцию [8, 9]. Экстракция водой позволяет определить выход маннанопротеинов при контакте с биологическими средами или водой. В результате механической активации и последующего ферментативного гидролиза увеличивается количество водорастворимых маннанопротеинов, что связано с гидролизом связей «глюкан-маннанопротеины».
Экстракция раствором едкого натра позволяет определить количество доступных для реакций с растворами маннанопротеинов, интегрированных в клеточную стенку. В результате механической активации и последующего ферментативного гидролиза благодаря частичному гидролизу глюкана происходит увеличение доступности маннанопротеинов, интегрированных в клеточную стенку. На фиг.4 представлена микрофотография дрожжевой биомассы после механической активации и ферментативного гидролиза. Наличие в клеточной стенке электронно-плотных частиц, образующихся на реакционно-способных дефектах структуры маннанопротеинов при обработке фиксирующим реагентом, свидетельствует о повышении доступности маннанопротеинов стенки для реакций с растворами.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1.
2
2
Высушенные до влажности 12% прессованные хлебопекарные дрожжи ГОСТ 171-81 смешивают с ферментативным комплексом «Целлолюкс-А» (производство ООО ПО «СИББИОФАРМ» г.Бердск), обладающим деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану, в соотношении 99,5-0,5. Смесь механически активируют в проточном активаторе типа ЦЭМ или ВЦМ, обеспечивающем ускорение мелющих тел 60 м/с и время пребывания в зоне обработки 0,5 минут. Полупродукт таблетируют при давлении 10 кг/см и выдерживают при температуре 40°С в течение 25 часов.
2
При ускорении мелющих тел менее 60 м/с не обеспечивается внедрение частиц ферментативного комплекса в частицы дрожжевой биомассы, что снижает эффективность последующего ферментативного гидролиза. Применение обработки менее 0,5 минут не обеспечивает необходимого накопления свободной энергии и практически не приводит к образованию механокомпозита. Понижение температуры прогрева ниже 40°С отрицательно сказывается на скорости протекания гидролиза, а проведение прогрева менее чем за 25 часов не обеспечивает оптимальной степени превращения.
Полученный продукт содержит доступные маннанопротеины дрожжевой биомассы Saccharomyces cerevisiae, интегрированные в клеточную стенку дрожжей, а также другие компоненты при следующем соотношении, % мас.:
маннанопротеины, интегрированные в клеточную стенку дрожжей - 2,5%,
водорастворимые маннанопротеины клеточной стенки дрожжей - 0,8%,
водорастворимые белки дрожжевой биомассы - 10%,
водорастворимые глюкосахариды дрожжевой биомассы - 10%,
ферментативный комплекс, обладающий деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану - 0,5%,
механически активированная биомасса дрожжей - остальное.
Для определения водорастворимых маннанопротеинов клеточной стенки полученный продукт суспендируют в воде при гидромодуле, равном 10. Полученную суспензию центрифугируют 15 минут при 7000 об/мин. Осадок содержит частично гидролизованные клеточные стенки с интегрированными в них маннанопротеинами. Надосадочная жидкость содержит водорастворимые маннанопротеины, водорастворимые белки и глюкосахариды, ферментативный комплекс, обладающий деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану. Показано, что выход водорастворимых маннанопротеинов в результате механоферментативной обработки увеличился в 1,4 раза по сравнению с исходными дрожжами.
Для определения маннанопротеинов, интегрированных в клеточную стенку дрожжей, полученный продукт экстрагируют слабым раствором щелочи при гидромодуле, равном 10. В условиях щелочной экстракции O-маннаноолигосахариды и N-маннанопротеины, интегрированные в частично гидролизованную клеточную стенку, переходят в растворимую форму. Показано, что выход маннанопротеинов, интегрированных в частично гидролизованную клеточную стенку, в результате механоферментативной обработки увеличился в 2,9 раза по сравнению с исходными дрожжами.
Пример 2.
2
2
Высушенные до влажности 12% прессованные хлебопекарные дрожжи ГОСТ 171-81 смешивают с ферментативным комплексом «Целлолюкс-А» (производство ООО ПО «СИББИОФАРМ» г.Бердск), обладающим деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану в соотношении 9-1. Смесь механически активируют в проточном активаторе типа ЦЭМ или ВЦМ, обеспечивающем ускорение мелющих тел 400 м/с и время пребывания в зоне обработки 10 минут. Полупродукт таблетируют при давлении 10 кг/см и выдерживают при температуре 50°С в течение 30 часов.
2
При ускорении более 400 м/с происходит разогрев обрабатываемой смеси, что может привести к разрушению биологически активных веществ, а именно маннанопротеинов и ферментативного комплекса. Применение обработки свыше 10 минут может приводить к механодеструкции целевых компонентов и ферментативного комплекса. Повышение температуры свыше 50°С приводит к денатурации ферментативного комплекса. Увеличение времени прогрева свыше 30 часов несущественно сказывается на степени превращения ввиду постепенного уменьшения скорости реакции от времени.
Полученный продукт содержит доступные маннанопротеины дрожжевой биомассы Saccharomyces cerevisiae, интегрированные в клеточную стенку дрожжей, а также другие компоненты при следующем соотношении, % мас.:
маннанопротеины, интегрированные в клеточную стенку дрожжей - 4,5%,
водорастворимые маннанопротеины клеточной стенки дрожжей - 2,5%,
водорастворимые белки дрожжевой биомассы - 40%,
водорастворимые глюкосахариды дрожжевой биомассы - 20%,
ферментативный комплекс, обладающий деполимеразной активностью по
отношению к β-глюкану - 10%,
механически активированная биомасса дрожжей - остальное.
Определение маннанопротеинов, интегрированных в клеточную стенку дрожжей и водорастворимых маннанопротеинов, проводят аналогично примеру 1.
Пример 3.
2
Осуществляется в условиях примера 2. Полученный в результате механической активации полупродукт таблетируют при давлении 20 кг/см.
2
2
Таблетирование полученного полупродукта позволяет повысить объемную концентрацию фермента, облегчить массоперенос между частицами композита, а также предотвратить потерю воды, которая необходима для ферментативного гидролиза. Применение давлений меньше 10 кг/см нецелесообразно ввиду того, что при низких давлениях таблетки получаются неплотными и пористыми, что затрудняет массоперенос между частицами композита. Применение давлений выше 20 кг/см нецелесообразно потому, что не существенно влияет на свойства и структуру таблетки и может приводить к нежелательному отделению жидкой фазы.
Пример 4.
Осуществляется в условиях примера 2. Дрожжи хлебопекарные сушеные ГОСТ 28483-90 с влажностью менее 12% смешивают с ферментативным комплексом «Целлолюкс-А», в соотношении 9-1 и добавляют воду 0,5-5% от массы сухой смеси (до влажности смеси 12%).
Влажность исходной дрожжевой биомассы обусловлена наличием в клетках связанной недоступной для реакции воды, поэтому добавление указанного количества воды в смесь позволяет увеличить скорость ферментативного гидролиза за счет более быстрого продвижения фронта реакции, а также улучшить качество прессуемых таблеток. Добавление воды до влажности менее 12% нецелесообразно ввиду малого влияния на скорость реакции, а добавление воды до влажности более 12% не рекомендуется во избежание налипания порошка на мелющие тела и стенки механических активаторов.
Пример 5.
Осуществляется в условиях примера 2. В качестве ферментативного комплекса используется смесь ферментативного комплекса «Целлолюкс А», обладающего деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану, и ферментативного комплекса «Протосубтилин г3х» (производство ООО ПО «СИББИОФАРМ» г.Бердск), обладающего деполимеразной активностью по отношению к белкам клеточной стенки. Оптимальная температура проведения ферментативного гидролиза для данного ферментативного комплекса 60°С. Продолжительность реакции 25 часов.
Использование смеси ферментативных комплексов, обладающих деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану и к белкам клеточной стенки, позволяет увеличить скорость ферментативной реакции гидролиза клеточной стенки за счет комплексного воздействия на все ее структурные компоненты.
Пример 6.
Осуществляется в условиях примера 2. В качестве сырья используется дрожжевая биомасса послеспиртовой барды (ТУ 9296-302-00008064-98), высушенная до влажности 12%. Ввиду наличия в дрожжевой биомассе послеспиртовой барды соединений, способных инактивировать ферментативный комплекс, затрудняя протекание ферментативного гидролиза, целесообразно использовать дрожжевую биомассу и ферментативный комплекс, обладающий деполимеразной активностью по отношению к β-глюкану, в соотношении 90-10. Продолжительность реакции составляет в данном случае 35 часов. Вовлечение в производство дешевого и некондиционного сырья позволяет рационально утилизировать перечисленные отходы, а также сократить расходы на получение препарата.
Пример 7.
Осуществляется в условиях примера 2. Работа проводилась в Научно-исследовательском проектно-технологическом институте животноводства СО РАСХН. Полученный продукт в количестве 1% мас. добавляли в рацион гусей мясного направления продуктивности в период откорма (с.Бурмистрово Искитимского р-на Новосибирской обл.). Продолжительность эксперимента составляла 55 дней. Животные контрольной группы в составе рациона полученный продукт не получали.
Валовой прирост подопытных гусей был выше, чем у животных из контрольной группы, на 14,0%. Подопытные гуси на 15,5% меньше контрольных затрачивали корма на 1 г прироста живой массы.
Взятые образцы крови показали, что содержание меди в крови контрольных животных превышало норму в 2-4 раза, в то время как у животных подопытной группы содержание меди находилось в пределах нормы. Это можно объяснить тем, что количество меди в крови возрастает при инфекционных заболеваниях, вследствие повышения продукции антител. Следовательно, гуси из контрольной группы были подвержены инфекционным заболеваниям, а гуси подопытной группы были защищены от инфекций полученным продуктом.
Заявляемый препарат по сравнению с прототипом обладает более высокой антибактериальной активностью и кормовой ценностью, прошел испытания и поэтому соответствует критерию «промышленная применимость».
Источники информации
1. Будущее стимуляторов роста. Европейский лекционный тур компании Alltech, 13. февраля - 5 марта 2006 г. http://www.alltech.com.
2. А.Е.Wold, J.Mestecky, M.Tomana, A.Kobata, H.Ohbayashi et al.. Secretory immunoglobulin a carries oligosaccharide receptors for Escherihia coli Type 1 fimbrial lectin // Infection and Immunity 58:9 (1990) 3073-3077.
3. L.C.V.Emmerik, E.J.Kuijper, C.A.P.Fijen, J.Dankert, S.Thiel, Binding of mannan-binding protein to various bacterial pathogens of meningitis // Chin. Exp. Immunol. 97 (1994)411-416.
4. I.H.Bjomdal, B.Lindberg, The Structure of a β-(1-6)-D-glucan from yeast cell walls // Biochem. J., 135 (1973) 31-36.
5. D.J.Manners, A.J.Masson, J.C.Patterson, The structure of a β-(1-3)-D-glucan from yeast cell walls // Biochem. J., 135 (1973) 19-30.
6. В.И.Бирюзова, Ультраструктурная организация дрожжевой клетки / M.: Наука, 1993. - 224 с.
7. Т.С.Калебина, И.С.Кунаев, Успехи биологической химии, 41 (2001) 105-130.
8. Гликопротеины, под ред. А.Готтшалка, T1. / M.: Мир, 1969. - 304 с.
9. Методы химии углеводов, под ред. H.К.Кочеткова / M.: Мир, 1967, пер. с англ.
10. Т.Л.Бабаян, В.К.Латов, Выделение физиологически активного маннана и других полисахаридов из автолизатов пекарских дрожжей // Биотехнология, 2 (1992) 23-26.
11. В.К.Латов, Т.Л.Бабаян, С.В.Гордиенко, А.С.Коган, В.А.Цыряпкин и др., Комплексная переработка дрожжевой биомассы // Биотехнология, 3 (1990) 14-18.
12. K.A.Dawson et al., Methods and compositions for control of coccidiosis // Pat. USA №7048937 B2, (23.05.2006).
13. К. Kitamura et al., Physiologically active polysaccharides, production and uses thereof // Pat. US №4313934, (02.02.1982).