БИОМАРКЕРЫ, АССОЦИИРОВАННЫЕ С ПРЕДИАБЕТОМ, ДИАБЕТОМ И СВЯЗАННЫМИ С ДИАБЕТОМ СОСТОЯНИЯМИ
BIOMARKERS ASSOCIATED WITH PRE-DIABETES, DIABETES AND DIABETES-RELATED CONDITIONS

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к биомаркерам, ассоциированным с предиабетом, диабетом и связанными с диабетом состояниями, такими как диабетическая нефропатия, способам применения биомаркеров для определения риска того, что у индивидуума разовьется предиабет, диабет и связанные с диабетом состояния, способам скрининга популяции для идентификации людей с риском развития предиабета, диабета и связанных с диабетом состояний, и мишеням лекарственных средств в отношении предиабета, диабета и диабета.
Предпосылки к изобретению
Сахарный диабет представляет собой хроническое заболевание и является одной из основных проблем общественного здравоохранения нашего времени. По всему миру наблюдается все возрастающая популяция пациентов с диабетом, возлагающих значительную финансовую нагрузку на системы здравоохранения. Подсчитано, что по всему миру встречаемость диабета для всех возрастных групп составит 2,8% в 2000 году и 4,4% к 2030 году. Прогнозируется, что общее число людей с диабетом возрастет от 171 миллионов в 2000 году до 366 миллионов в 2030 году. В 2002 году встречаемость диабета в австралийской популяции составляла 7,4%, у людей 25 лет и старше, и число австралийцев с диабетом с 1981 года утроилось.
Диабет 2 типа, вне всяких сомнений, является самым распространенным, например, поражает 90-95% популяции с диабетом США. Встречаемость сахарного диабета увеличивается с возрастом, и, как ожидается, число пожилых людей с диабетом будет возрастать по мере численного возрастания популяции людей преклонного возраста. Помимо возрастающей доли диабета также наблюдается более высокая встречаемость нарушенного метаболизма глюкозы, ассоциированного с повышенным риском сердечной недостаточности и диабета. Диажирение представляет собой термин, который охватывает встречаемость диабета, ожирения, нарушенного метаболизма глюкозы и ассоциированных факторов риска гипертензии и атипичной липидограммы плазмы (дислипидемия). «Эпидемия диабета» будет продолжаться, даже если уровни ожирения останутся постоянными. С учетом увеличения встречаемости ожирения вполне вероятно, что данные количественные данные недооценивают встречаемость диабета в будущем.
Сахарный диабет представляет собой состояние, при котором организм не может поддерживать нормальные уровни глюкозы в крови. В большинстве случаев сахарный диабет разделяют на три широкие категории: 1 типа, 2 типа и гестационный диабет. Диабет 1 типа является следствием неспособности организма вырабатывать инсулин, и в настоящее время человеку необходимо инъецировать инсулин. Диабет 2 типа является следствием инсулинорезистентности, состояния при котором клетки не способны использовать инсулин правильно, иногда в сочетании с полным отсутствием инсулина.
Диабет 2 типа в первом случае можно обычно контролировать регулярными упражнениями и диетой. По мере прогрессирования заболевания может появиться необходимость в таблетках и, в конечном счете, инъекциях инсулина. С течением времени высокие уровни глюкозы в крови могут повреждать кровеносные сосуды и нервы. Эти осложнения диабета могут стать причиной повреждения глаз, нервов и почек и повысить риск инфаркта миокарда, инсульта, импотенции и проблем со стопами. Это повреждение может произойти до того, как человек узнает, что у него диабет, если таковой остается не выявленным в течение длительного времени. Поэтому важно диагностировать и контролировать диабет и его осложнения на очень ранней стадии.
Диабет также является крупнейшей причиной заболевания почек (нефропатии) в развитых странах и несет ответственность за огромные расходы на диализ. От 10% до 20% людей с диабетом погибнут от почечной (ренальной) недостаточности. Причины, лежащие в основе осложнения нефропатии при диабете, сложны и включают токсические эффекты высоких уровней глюкозы; повышенное кровяное давление; атипичные уровни липидов и патологии малых кровеносных сосудов. Кумулятивный результат таков, что приводит к утолщению гломерул в почке, что позволяет белку (альбумину) выделяться в мочу.
Диабет стал единственной наиболее распространенной причиной терминальной стадии почечной недостаточности (ESRF) в 40-50% случаях ESRD, и ежегодные расходы системы государственного медицинского страхования Австралии являются наибольшими для больных с ESRF, вызванной диабетом, по сравнению со всеми другими первичными диагнозами ESRD. До одной трети взрослых с впервые выявленным диабетом 2 типа уже имеют хроническое заболевание почек, и данные наводят на мысль, что у многих из этих больных оно могла развиться в ходе предиабетического состояния. Заболевание является прогрессирующим и поражает чаще мужчин, чем женщин.
Диабетическую нефропатию, в первую очередь, определяют измерением количества альбумина, выделяемого в моче (альбуминурия). Альбуминурию обычно измеряют с помощью соотношения альбумин-креатинин (ACR). Это соотношение между альбумином и креатинином в моче. Соотношение учитывает концентрацию альбумина в зависимости от скорости гломерулярной фильтрации, которую определяют по количеству креатинина в моче. Альбуминурию определяется как: ACR>2,5 мг/ммоль (у мужчин) или >3,5 мг/ммоль (у женщин).
Несмотря на многочисленные исследования и алгоритмы, которые были использованы для оценки риска диабета и связанных состояний, остается необходимость в точных способах оценивания таких рисков или состояний, которые без труда могут быть взяты на вооружение врачами первичной медицинской помощи, которые наиболее вероятно первыми встречаются с больным предиабетом или не диагностированным больным диабетом на ранней стадии.
Соответственно, остается необходимость в относительно недорогих и удобных способах скрининга людей с риском развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния и мониторинга больных с предиабетом, диабетом и/или связанным с диабетом состоянием. Такие способы могут применяться для скрининга большой популяции для идентификации людей с риском диабета, для тестирования отдельного человека для определения риска развития диабета у данного индивидуума, для мониторинга здоровья больных диабетом и оценки эффективности вмешательств, разработанных для лечения диабета, предиабета и/или связанных с ним состояний. Также существует необходимость в идентификации новых мишеней лекарственных средств в отношении предиабета, диабета и/или связанных с диабетом состояний, включая мишени белковых лекарственных средств. Идентификация новых мишеней лекарственных средств даст возможность разрабатывать новые вмешательства в отношении предиабета, диабета и/или связанных с диабетом состояний.
В противовес данным предпосылкам, а также проблемам и трудностям, связанным с ними, было разработано настоящее изобретение.
Краткое описание изобретения
В одном аспекте, настоящее изобретение предоставляет способ оценки субъекта в отношении предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, где указанный по меньшей мере один биомаркер выбирают из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
Таблица 1
Белок
Код доступа (база данных UniProt)
Пероксиредоксин-2
Р32119
Белок АМВР
Р02760
Субъединица C1q-субкомпонента комплемента
Р02746
Аполипопротеин A-IV
Р06727
Аполипопротеин C-III
Р02656
Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста
P17936
Адипонектин
Q15848
Белок 2, родственный фактору Н комплемента
Р36980
Бета-субъединица гемоглобина
Р68871
Подобный антигену CD5
O43866
Аполипопротеин В-100
Р04114
Сульфгидрилоксидаза 1
O00391
Бета-цепь С8-компонента комплемента
Р07358
Таблица 2
Белок
Код доступа (база данных UniProt)
Пероксиредоксин-2
Р32119
Белок АМВР
Р02760
Субъединица В C1q-субкомпонента комплемента
Р02746
Адипонектин
Q15848
Белок 2, родственный фактору Н комплемента
Р36980
Аполипопротеин В-100
Р04114
Сульфгидрилоксидаза 1
O00391
Аполипопротеин A-IV
Р06727
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет набор, содержащий реагенты для измерения в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, где указанный по меньшей мере один биомаркер выбран из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет читаемый компьютером носитель с инструкциями, выполняемыми компьютером, для оценки субъекта в отношении предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, при этом читаемый компьютером носитель содержит стандартную программу, хранящуюся на читаемом компьютером носителе и адаптированную для выполнения процессором, для хранения данных измерений биомаркера, отражающих по меньшей мере один биомаркер, выбранный из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ оценки лечения предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта, включающий измерение в образце от субъекта, подвергающегося лечению, по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2, по меньшей мере два раза за время курса лечения.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ оценки риска развития у субъекта предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ мониторинга предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2, и сравнение полученного измерения с другим показателем по меньшей мере одного биомаркера.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ диагностики или идентификации предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ дифференциальной диагностики заболевания почек среди других состояний, которые также вызывают протеинурию у субъекта, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ дифференциальной диагностики подклассов или стадий предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет тест-систему, содержащую:
(i) средство для получения данных результатов тестирования, отражающих уровни по меньшей мере одного биомаркера, выбранного из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2, в образце от субъекта;
(ii) средство для сбора и отслеживания данных результатов тестирования, полученных на этапе (i);
(iii) средство для расчета значения индекса риска предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния из данных результатов тестирования, где указанное значение индекса риска отражает риск развития или наличия у индивидуума предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния; и
(iv) средство для предоставления отчета об указанном значении индекса риска.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ ранжирования или группировки популяции индивидуумов, включающий получение данных индекса риска предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния для индивидуумов в указанной популяции и ранжирование индивидуумов в популяции относительно остальных индивидуумов в популяции или разделение популяции по меньшей мере на две группы на основании факторов, включающих указанные полученные данные индекса риска.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ оценки суррогатной конечной точки для предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта, при этом способ включает измерение по меньшей мере одного биомаркера из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2 и оценку суррогатной конечной точки для предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта на основании указанного показателя.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ оценки риска развития у субъекта предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, где указанный по меньшей мере один биомаркер выбирают из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ мониторинга риска развития у субъекта предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, где указанный по меньшей мере один биомаркер выбирают из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ диагностики или идентификации субъекта с предиабетом, диабетом и/или связанным с диабетом состоянием, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, где указанный по меньшей мере один биомаркер выбирают из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ мониторинга терапии или вмешательства в отношении предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, где указанный по меньшей мере один биомаркер выбирают из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ дифференциальной диагностики стадии заболевания или подкласса предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, включающий измерение в образце от субъекта по меньшей мере одного биомаркера, где указанный по меньшей мере один биомаркер выбирают из перечня биомаркеров в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта, включающий оценку риска для субъекта развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния с применением по меньшей мере одного биомаркера из таблицы 1 или 2 и лечение субъекта, если он идентифицирован как подвергающийся повышенному риску в отношении предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, со схемой лечения для замедления или предупреждения проявления предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ ранжирования или группировки популяции субъектов, включающий получение данных, отражающих балл риска предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния для субъектов, включенных в состав указанной популяции, где указанный балл риска рассчитывают с применением по меньшей мере одного биомаркера из таблицы 1 или 2, и ранжирование субъектов в популяции относительно остальных индивидуумов в популяции или разделение популяции по меньшей мере на две группы на основании факторов, включающих указанные полученные данные балла риска.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ идентификации или оценки средства для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, включающий:
(i) приведение в контакт клеток, экспрессирующих по меньшей мере один биомаркер из таблицы 1 или 2, с предполагаемым средством и
(ii) сравнение экспрессии и/или уровней по меньшей мере одного биомаркера из таблицы 1 в клетках перед контактом с предполагаемым средством с экспрессией и/или уровнями по меньшей мере одного биомаркера из таблицы 1 или 2 в клетках после контакта с предполагаемым средством;
где изменение уровня или экспрессии идентифицирует средство как средство для лечения предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения предусматривает применение по меньшей мере одного биомаркера в таблице 1 или 2 в качестве мишени лекарственного средства в отношении предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества средства, адаптированного для изменения экспрессии или уровня по меньшей мере одного биомаркера в таблице 1 или 2.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает применение средства, адаптированного для изменения экспрессии или уровня по меньшей мере одного биомаркера в таблице 1 или 2, для приготовления лекарственного препарата для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния.
Краткое описание графических материалов
Следующее подробное описание настоящего изобретения, приведенное в качестве примера, но не предназначенное для ограничения настоящего изобретения до конкретных описанных вариантов осуществления, может быть понятно совместно с сопутствующими фигурами, в которых:
Фигура 1 представляет собой таблицу, перечисляющую данные по биомаркерным белкам, полученные из трех исследований относительно наличия диабетической нефропатии у больных диабетом, измеренные с помощью мониторинга множественных реакций (MRM);
Фигура 2 представляет собой серию диаграмм типа «ящик с усами» для каждого биомаркера, перечисленного на фигуре 1, из исследования FDS1 (левый «ящик»: группа диабетиков; правый «ящик»: группа диабетиков с тяжелой нефропатией; ось х: белок/пептид; ось у: показатель относительной распространенности; пептидные последовательности: ATA = ATAWDGAFK; TVA=TVAACNLPIVR; EYC = EYCGVPGDGDEELLR; LEP = LEPYADQLR и ISA = ISASAEELR);
Фигура 3 представляет собой серию диаграмм типа «ящик с усами» для каждого биомаркера, перечисленного на фигуре 1, из исследования FDS2 (левый «ящик»: группа диабетиков; правый «ящик»: группа диабетиков с тяжелой нефропатией; ось х: белок/пептид; ось у: показатель относительной распространенности; пептидные последовательности: IAF = IAFSATR; LEP = LEPYADQLR; ISA = ISASAEELR; ALA = ALAQCAPPPAVCAELVR и FLN = FLNVLSPR; DAL = DALSSVQESQVAQQAR; TVA = TVAACNLPIVR; EYC = EYCGVPGDGDEELLR; GDI = GDIGETGVPGAEGPR; TGD = TGDIVEFVCK; LVY = LVYPSCEEK);
Фигура 4 представляет собой серию диаграмм типа «ящик с усами» для каждого биомаркера, перечисленного на фигуре 1, из исследования BDS (левый «ящик»: группа диабетиков; правый «ящик»: группа диабетиков с тяжелой нефропатией; ось х: белок/пептид; ось у: показатель относительной распространенности; пептидные последовательности: LVG = LVGGDNLCSGR; IWL = IWLDNVR; SVS = SVSLPSLDPASAK и TEV = TEVIPPLIENR) и
Фигура 5 представляет собой таблицу, перечисляющую данные биомаркерных белков, полученные из исследования BDS, касающегося больных с диабетической нефропатией и здоровых пациентов, измеренные с помощью MRM.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к идентификации биомаркеров, ассоциированных с предиабетом, диабетом и/или связанными с диабетом состояниями, такими как диабетическая нефропатия. Соответственно, настоящее изобретение представляет способы идентификации субъектов, которые подвергаются риску развития предиабета, диабета и/или связанных с диабетом состояний, в том числе тех субъектов, у которых не проявляются симптомы или проявляются только неспецифические признаки предиабета, диабета и/или связанных с диабетом состояний, путем определения биомаркеров, раскрытых в данном документе. Данные биомаркеры также применимы для мониторинга субъектов, проходящих лечение и терапию в отношении предиабета, диабета и/или связанных с диабетом состояний, или для выбора или модификации терапий и лечений, которые потенциально эффективны у субъектов с предиабетом, диабетом и/или связанными с диабетом состояниями, где выбор и применение таких лечений и терапий замедляет прогрессирование предиабета, диабета и/или связанных с диабетом состояний или предупреждают их проявление. Настоящее изобретение также представляет новые мишени лекарственных средств в отношении предиабета, диабета и/или связанных с диабетом состояний, включающие по меньшей мере один биомаркер в таблице 1 или 2.
Определения
«Средства для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния» включают: инсулин, такой как зрелый инсулин, проинсулин и растворимый с-пептид (SCp), быстродействующие формы инсулина, инсулин-регуляр, инсулин с промежуточным действием и долго действующие формы инсулина; гипогликемические средства; противовоспалительные средства; средства, снижающие уровень липидов; антигипертензивные средства, такие как блокаторы кальциевых каналов, блокаторы бета-адренергических рецепторов, ингибиторы циклооксигеназы-2, в том числе пролекарственные средства ингибиторов СОХ-2, ингибиторы ангиотензиновой системы, в том числе блокаторы рецепторов ангиотензина II (ARB), ингибиторы АСЕ и ингибиторы ренина, в том числе аминокислоты и их производные, пептиды и их производные и антитела к ренину.
«Антагонисты ангиотензина II» представляют собой соединения, которые подавляют активность ангиотензина II путем связывания с рецепторами ангиотензина II и подавления его активности и включают пептидные соединения и непептидные соединения. Большинство антагонистов ангиотензина II являются слегка модифицированными конгенерами, у которых агонистическая активность ослаблена путем замены фенилаланина в 8-м положении на некоторую другую аминокислоту. Примеры антагонистов ангиотензина II включают: пептидные соединения (например, саралазин, октапептид ангиотензин-(1-8) и родственные аналоги); N-замещенный имидазол-2-он; имидазолацетатные производные, в том числе 2-N-бутил-4-хлор-1-(2-хлорбензил)-имидазол-5-уксусную кислоту; 4,5,6,7-тетрагидро-1Н-имидазо[4,5-с]пиридин-6-карбоновую кислоту и аналогичные производные; аналоги N2-тетразол-бета-глюкуронида; замещенные пирролы, пиразолы и триазолы; фенольные и гетероциклические производные, такие как 1,3-имидазолы; слитые с имидазольным кольцом гетероциклы с 7-членным кольцом; антитела к ангиотензину II и аралкилимидазольные соединения, такие как бифенилметил-замещенные имидазолы; ES8891 (N-морфолиноацетил-(1-нафтил)-b-аланил-1-(4-тиазолил)-L-аланил-(3S,4S)-4-амино-3-гидрокси-5-циклогексапентаноил-N-гексиламид); SKF108566 (Е-альфа-2-[2-бутил-1-(карбоксифенил)-метил]-1Н-имидазол-5-ил[метилан-е]-2-тиофенпропановая кислота); лозартан (DUP753/MK954) и ремикирин.
«Ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ)» включают аминокислоты и их производные, пептиды, в том числе ди- и трипептиды, и антитела к АСЕ, которые включаются в ренин-ангиотензиновую систему путем ингибирования активности АСЕ, таким образом снижая или исключая образование прессорного вещества ангиотензина II. Классы соединений, известные как применимые в качестве ингибиторов АСЕ, включают ацилмеркапто- и меркаптоалканоилпролины, такие как каптоприл и зофеноприл, карбоксиалкилдипептиды, такие как эналаприл, лизиноприл, квинаприл, рамиприл и периндоприл, карбоксиалкилдипептидные миметики, такие как цилазаприл и беназеприл, фосфинилалканоилпролины, такие как фозиноприл и трандолоприл.
«Противовоспалительные» средства включают алклофенак; алклометазона дипропионат; алгестона ацетонид; альфа-амилазу; амцинафал; амцинафид; амфенак-натрий; амиприлозы гидрохлорид; анакинру; аниролак; анитразафен; апазон; балсалазид-динатрий; бендазак; беноксапрофен; бензидамина гидрохлорид; бромелайны; броперамол; будесонид; капрофен; циклопрофен; цинтазон; клипрофен; клобетазола пропионат; клобетазона бутират; клопирак; клотиказона пропионат; корметазона ацетат; кортодоксон; дефлазакорт; дезонид; дезоксиметазон; дексаметазона дипропионат; диклофенак-калий; диклофенак-натрий; дифлоразона диацетат; дифлумидон-натрий; дифлунизал; дифлупреднат; дифталон; диметилсульфоксид; дроцинонид; эндрисон; энлимомаб; эноликам-натрий; эпиризол; этодолак; этофенамат; фелбинак; фенамол; фенбуфен; фенклофенак; фенклорак; фендозал; фенпипалон; фентиазак; флазалон; флуазакорт; флуфенамовую кислоту; флумизол; флунизолида ацетат; флуниксин; флуниксин меглумин; флуокортин бутил; флуорометолона ацетат; флюквазон; флурбипрофен; флуретофен; флутиказона пропионат; фурапрофен; фуробуфен; халцинонид; халобетазола пропионат; халопредона ацетат; ибуфенак; ибупрофен; ибупрофен-алюминий; ибупрофен пиконол; илонидап; индометацин; индометацин-натрий; индопрофен; индоксол; интразол; изофлупредона ацетат; изоксепак; изоксикам; кетопрофен; лофемизола гидрохлорид; лорноксикам; лотепреднола этабонат; натрия меклофенамат; меклофенамовую кислоту; меклоризона дибутират; мефенамовую кислоту; мезаламин; мезеклазон; метилпреднизолона сулептанат; морнифлумат; набуметон; напроксен; напроксен-натрий; напроксол; нимазон; олсалазин-натрий; орготеин; орпаноксин; оксапрозин; оксифенбутазон; паранилина гидрохлорид; натрия пентозана полисульфат; фенбутазон натрия глицерат; пирфенидон; пироксикам; пироксикама циннамат; пироксикам оламин; пирпрофен; предназат; прифелон; продоловую кислоту; проквазон; проксазол; проксазола цитрат; римексолон; ромазарит; салколекс; салнацедин; салсалат; салицилаты; сангвинариума хлорид; секлазон; серметацин; судоксикам; сулиндак; супрофен; талметацин; талнифлумат; талосалат; тебуфелон; тенидап; тенидап-натрий; теноксикам; тесикам; тесимид; тетридамин; тиопинак; тиксокортола пивалат; толметин; толметин-натрий; триклонид; трифлумидат; зидометацин; глюкокортикоиды; зомепирак-натрий, аспирин, ингибиторы цитокинов, такие как антогонисты цитокинов (например, антагонисты рецепторов IL-6), азаалкиллизофосфолипиды (AALP) и ингибиторы фактора некроза опухолей альфа (TNF-альфа), такие как антитела к TNF-альфа, растворимый рецептор TNF, TNF-альфа, антисмысловые молекулы нуклеиновой кислоты, поливалентный гуанилгидразон (CNI-1493), N-ацетилцистеин, пентоксифиллин, окспентифиллин, карбоциклические аналоги нуклеозидов, дексанабинол и ингибиторы TNF-альфа, такие как этанерцепт и инфликсимаб.
«Средства, блокирующие бета-адренергические рецепторы» противодействуют кардиоваскулярным эффектам катехоламинов при стенокардии, гипертензии и сердечных аритмиях и включают атенолол, ацебутолол, алпренолол, бефунолол, бетаксолол, бунитролол, картеолол, целипролол, гидроксалол, инденолол, лабеталол, левобунолол, мепиндолол, метипранол, метиндол, метопролол, метризоранолол, окспренолол, пиндолол, пропранолол, практолол, практолол, соталолнадолол, типренолол, томалолол, тимолол, бупранолол, пенбутолол, тримепранол, 2-(3-(1,1-диметилэтил)-амино-2-гидроксипропокси)-3-пиридинкарбонитрил-HCl, 1-бутиламино-3-(2,5-дихлорфенокси)-2-пропанол, 1-изопропиламино-3-(4-(2-циклопропилметоксиэтил)фенокси)-2-пропанол, 3-изопропиламино-1-(7-метилиндан-4-илокси)-2-бутанол, 2-(3-трет-бутиламино-2-гидрокси-пропилтио)-4-(5-карбамоил-2-тиенил)тиазол и 7-(2-тидрокся-3-трет-бутиламинпропокси)фталид.
«Блокаторы кальциевых каналов» принадлежат к одной из трех ведущих химических групп лекарственных средств, дигидропиридинам, таким как нифедипин, фенилалкиламинам, таким как верапамил, и бензотиазепинам, таким как дилтиазем. Другие блокаторы кальциевых каналов, применимые в соответствии с настоящим изобретением, включают аминон, амлодипин, бенциклан, фелодипин, фендилин, флунаризин, исрадипин, никардипин, нимодипин, пергексилен, галлопамил, тиапамил и аналоги тиапамила, фенилоин, барбитураты и пептиды динорфин, омега-конотоксин и омега-агатоксин.
«Диабет» включает диабет 1 типа, как аутоиммунный, так и идиопатический, диабет 2 типа и гестационный диабет. Диабет можно охарактеризовать рецидивирующей и постоянной гипергликемией и можно диагностировать по повышенным уровням глюкозы в крови и повышенному гликированному гемоглобину (≥6,5%). В соответствии с настоящим определением диагностическими для сахарного диабета считаются два измерения глюкозы натощак, превышающие 126 мг/дл (7,0 ммоль/л).
«Связанное с диабетом состояние» включает любое состояние или заболевание, которое является результатом или осложнением или иным способом находится в связи или ассоциировано с диабетом, в том числе состояние, вызванное уровнями глюкозы в крови выше нормы, и состояние, выбранное из перечня, состоящего из: гипогликемии, диабетического кетоацидоза, диабетической невропатии, заболевания почек, в том числе диабетической нефропатии, сердечнососудистого заболевания, инсульта и диабетической ретинопатии, а также артериоваскулярного заболевания.
«Биомаркер» в контексте настоящего изобретения охватывает, без ограничения, белки в таблице 1 или 2 и их фактические показатели; нуклеиновые кислоты, кодирующие белки в таблице 1 или 2; метаболиты и продукты распада белков в таблице 1 или 2; полиморфизмы, мутации, варианты, модификации, субъединицы, пептиды (такие как указанные в таблице 3) и фрагменты белков в таблице 1 или 2; а также комплексы белок-лиганд, включающие белки в таблице 1 или 2. Биомаркеры могут также включать белки с по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью или подобием с белками в таблице 1 или 2, а также мутантные формы белков в таблице 1 или 2 и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие мутации. Биомаркеры можно применять для подсчета математических индексов или других измерений, в том числе временных тенденций и отличий, которые применимы для настоящего изобретения.
«Гестационный диабет» относится к непереносимости глюкозы во время беременности. Это состояние приводит к высокому сахару в крови, возникающему или впервые диагностируемому во время беременности.
«Гипогликемические» средства включают пероральные гипогликемические средства и включают, без ограничения, сульфонилмочевины первого поколения: ацетогексамид, хлорпропамид, толбутамид; сульфонилмочевины второго поколения: глипизид, глибурид, глимепирид; бигуаниды: метформин; ингибиторы альфа-глюкозидазы: акарбозу, миглитол, тиазолидиндионы: розиглитазон, пиоглитазон, троглитазон; меглитиниды: репаглинид; а также другие гипогликемические препараты, такие как: акарбоза; буформин; бутоксамина гидрохлорид; камиглибоза; циглитазон; энглитазон-натрий; дарглитазон-натрий; этоформина гидрохлорид; глиамилид; глибомурид; глицетанил; гликлазид-натрий; глифлумид; глюкагон; глигексамид; глимидин-натрий; глиоктамид; глипарамид; линоглирид; линоглирида фумарат; метилпалмоксират; палмоксират-натрий; пироглирида тартрат; проинсулин человека; сеглитида ацетат; толазамид; толпиррамид; зополрестат.
«Нарушенная гликемия натощак» (IFG) является предиабетическим состоянием, ассоциированным с уровнем глюкозы в крови, который выше нормального, но не настолько высокий, чтобы быть классифицированным как диабет. Субъект с IFG может иметь уровень сахара (глюкозы) в крови натощак ниже или равный 125 мг/л, от 100 до 125 мг/дл или от 105 до 125 мг/дл.
Термин «идентичность», применяемый в данном документе, относится к взаимосвязи между последовательностями двух или более молекул, определяемой посредством сравнения последовательностей. «Идентичность» также означает степень родства последовательностей между полипептидными последовательностями или последовательностями молекул нуклеиновой кислоты, в зависимости от обстоятельств, которое определяется при помощи совпадения между нитями нуклеотидных или аминокислотных последовательностей. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений между двумя или более последовательностями с помощью выравниваний с гэпами, рассматриваемых конкретной математической моделью компьютерных программ.
«Нарушенная толерантность к глюкозе» (IGT) является предиабетическим состоянием, ассоциированным с уровнем глюкозы в крови, который выше нормального, но не достаточно высок, чтобы быть классифицированным как диабет. У субъекта с IGT уровни глюкозы через два часа после проведения тестирования на толерантность к 75 г пероральной глюкозы могут составлять от 140 до 199 мг/дл (от 7,8 до 11,0 ммоль).
«Средства, снижающие уровень липидов» включают гемфиброзил, холистирамин, колестипол, никотиновую кислоту и ингибиторы HMG-CoA-редуктазы, такие как симвастатин, ловастатин, правастатин-натрий, флувастатин, аторвастатин и церивастатин.
Термин «измерение» и варианты, такие как «измерять», применяемые в данном документе в связи с биомаркерами, описанным в данном документе, относится к определению наличия и/или количества данного биомаркера.
«Предиабет» представляет собой состояние, при котором встречаются некоторые, но не все, диагностические критерии диабета. Он включает состояния, при которых у субъектов обнаруживаются уровни сахара в крови между нормальными и диабетическими уровнями, состояния, при которых субъекты страдают от нарушенной толерантности к глюкозе (IGT), нарушенной гликемии натощак (IFG) и/или гликированного гемоглобина от 5,7 до 6,4%.
«Образец» в контексте настоящего изобретения является биологическим образцом, выделенным из субъекта, и может включать, в качестве примера, а не ограничения, цельную кровь, фракцию крови, сыворотку, плазму, клетки крови, эндотелиальные клетки, биопсии тканей, лимфатическую жидкость, асцитную жидкость, интерстициальную жидкость (также известную как «внеклеточная жидкость» и охватывает жидкость, обнаруживаемую в пространствах между клетками, в том числе, среди прочего, жидкость десневой борозды), костный мозг, спинномозговую жидкость (CSF), слюну, слизь, мокроту, пот, мочу или любой другой секрет, экскрет или другие жидкости организма.
Термин «подобие» является родственным понятием «идентичности», но, в отличие от него, относится к показателю подобия, включающему как идентичные совпадения, так и совпадения по консервативным заменам. В связи с тем, что консервативные замены применяются к полипептидам, а не к молекулам нуклеиновых кислот, подобие занимается только сравнением полипептидных последовательностей. Если две полипептидные последовательности имеют, например, 10 идентичных аминокислот из 20, а все остальные являются неконсервативными заменами, тогда как процент идентичности, так и процент подобия составляет 50%. Если в таком же примере имеется 5 дополнительных положений, где наблюдаются консервативные замены, тогда процент идентичности остается 50%, но процент подобия составит 75% (15 из 20). Следовательно, в случаях, где наблюдаются консервативные замены, степень подобия между двумя полипептидными последовательностями будет выше, чем процент идентичности между этими двумя последовательностями.
Термин «консервативная замена аминокислоты» относится к замене нативного аминокислотного остатка на нормативный остаток так, что наблюдается небольшое воздействие или отсутствие воздействия на полярность или заряд аминокислотного остатка в этом положении. Например, консервативная замена является следствием замены неполярного остатка в полипептиде на любой другой неполярный остаток. Кроме того, любой нативный остаток в полипептиде может также быть заменен аланином. Общие правила для консервативных замен аминокислоты изложены в приведенной ниже таблице.
Первоначальные остатки
Приводимые в качестве примера замены
Предпочтительные замены
Ala
Val, Leu, Ile
Val
Arg
Lys, Gln, Asn
Lys
Asn
Gln, His, Lys, Arg
Gln
Asp
Glu
Glu
Cys
Ser
Ser
Gln
Asn
Asn
Glu
Asp
Asp
Gly
Pro, Ala
Ala
His
Asn, Gln, Lys, Arg
Arg
Ile
Leu, Val, Met, Ala, Phe, норлейцин
Leu
Leu
Норлейцин, Ile, Val, Met, Ala, Phe
Ile
Lys
Arg, Gln, Asn
Arg
Met
Leu, Phe, Ile
Leu
Phe
Leu, Val, Ile, Ala, Tyr
Leu
Pro
Ala
Ala
Ser
Thr
Thr
Thr
Ser
Ser
Trp
Tyr, Phe
Tyr
Tyr
Trp, Phe, Thr, Ser
Phe
Val
Ile, Met, Leu, Phe, Ala, норлейцин
Leu
Консервативные замены аминокислот также охватывают не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые, как правило, вводятся посредством химического синтеза пептидов, а не путем синтеза в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие обратные или инвертированные формы аминокислотных фрагментов. Как ожидается, консервативные модификации в аминокислотной последовательности (и соответствующие модификации в кодирующих нуклеотидах) дают полипептиды с функциональными и химическими характеристиками, сходными с характеристиками биомаркеров в таблице 1. Наоборот, существенные модификации функциональных и/или химических характеристик биомаркеров в таблице 1 можно выполнять путем отбора замен, которые значительно отличаются по их воздействию на сохранение (а) структуры молекулярного скелета в области замены, например, складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (с) объема боковой цепи. Встречающиеся в природе остатки можно разделить на группы на основании свойств боковых цепей:
1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) нейтрально-гидрофильные: Cys, Ser, Thr;
3) кислотные: Asp, Glu;
4) основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и
6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Для получения наибольшего совпадения между тестируемыми последовательностями разрабатываются предпочтительные способы определения идентичности и/или подобия. Способы определения идентичности и подобия закодированы в публично доступных компьютерных программах. Предпочтительные способы компьютерных программ для определения идентичности и подобия между двумя последовательностями включают пакет программ GCG, в том числе GAP (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN и FASTA (Atschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10 (1990)). Программа BLAST X публично доступна в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI) и других источниках (Altschul et al., BLAST Manual (NCB NLM NIH, Bethesda, Md.); Altschul et al., 1990, выше). Для определения идентичности также можно применять хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.
«Субъект» в контексте настоящего изобретения предпочтительно является млекопитающим. Млекопитающее может быть человеком, приматом, кроме человека, мышью, крысой, собакой, лошадью или коровой. Субъектом может быть субъект, который был предварительно диагностирован или идентифицирован как имеющий диабет, предиабет или связанное с диабетом состояние, и, необязательно, уже подвергавшийся или подвергающийся терапевтическому вмешательству в отношении диабета, предиабета или связанного с диабетом состояния. Альтернативно, субъект также может быть субъектом, который не был предварительно диагностирован как имеющий предиабет, диабет и/или связанное с диабетом состояние. Например, субъектом может быть субъект, у которого обнаруживается один или несколько факторов риска в отношении предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, или субъект, у которого не обнаруживаются какие-либо подобные факторы риска, или субъект, у которого не проявляются симптомы предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния. Субъектом также может быть субъект, страдающий или находящийся в группе риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния.
Диагностика и прогнозирование
Настоящее изобретение предоставляет улучшенную диагностику и прогнозирование предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Риск развития предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния можно оценивать измерением одного или нескольких биомаркеров, описанных в данном документе, и сравнением измеренных значений с референтными или заданными значениями. Такое сравнение можно подвергнуть обработке с помощью математических алгоритмов или формул, чтобы объединить информацию от результатов многочисленных индивидуальных биомаркеров и других параметров в одно измерение или индекс. Субъектов, идентифицированных как имеющих повышенный риск предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, необязательно можно отбираться, чтобы они получали схемы лечения, такие как введение профилактических или терапевтических соединений или обеспечение схем упражнений или пищевых добавок, для предупреждения, лечения или замедления проявления предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния.
Количество биомаркера можно измерять в тестовом образце и сравнивать с референтным или нормальным уровнем с использованием таких методик, как пределы нормального диапазона значений, пределы распознавания или пороги, определяющие риск, для определения предельных точек и атипичных значений для предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Нормальный контрольный уровень представляет собой уровень одного или нескольких биомаркеров или объединенных индексов биомаркеров, обычно обнаруживаемый у субъекта, не страдающего от предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Нормальные и атипичные уровни и предельные точки могут варьировать на основании того, применяется ли биомаркер отдельно или в формуле, объединяющей его с другими биомаркерами в индекс. Альтернативно, нормальный или атипичный уровень может представлять собой базу данных паттернов или «сигнатур» биомаркера от предварительно протестированных субъектов, у которых заболевание развилось или не развилось, или преобразовалось в предиабет, диабет или связанное с диабетом состояние за клинически релевантный период времени.
Настоящее изобретение можно применять для получения непрерывных или категориальных измерений риска развития или перехода в предиабет, диабет или связанное с диабетом состояние, таким образом, диагностируя и определяя спектр риска категории субъектов с определенным клиническим статусом. При категориальном варианте способы настоящего изобретения можно применять для различения нормальных когорт от когорт с предиабетом, диабетом или связанным с диабетом состоянием. В других вариантах осуществления настоящее изобретение можно применять для различения предиабета от диабета, диабета от нормы, различных связанных с диабетом состояний или различных диабетических состояний от нормы. Для такого отличающегося применения могут требоваться различные комбинации биомаркеров в индивидуальных панелях, математические алгоритмы и/или предельные точки, но оно руководствуется такими же вышеупомянутыми измерениями с точностью для предполагаемого применения.
Идентификация субъектов до того, как у них разовьется предиабет, диабет или связанное с диабетом состояние, делает возможным отбор и начало различных терапевтических вмешательств или схем лечения с целью замедления, снижения или предупреждения перехода субъекта в болезненное состояние. Мониторинг уровней по меньшей мере одного биомаркера также делает возможным проведение мониторинга хода лечения предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Например, может предоставляться образец от субъекта, подвергающегося схемам лечения или терапевтическим вмешательствам, например медикаментозному лечению, в отношении предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Такие схемы лечения или терапевтические вмешательства могут включать схемы упражнений, видоизменения диеты, введение пищевых добавок, бариатрическое оперативное вмешательство, введение фармацевтических препаратов и лечение при помощи терапевтических или профилактических средств, применяемые к субъектам, у которых диагностирован или идентифицирован предиабет, диабет или связанное с диабетом состояние. Образцы можно получать от субъекта в различные моменты времени: до, в течение или после лечения.
Настоящее изобретение также можно применять для скрининга популяций по различным параметрам. Можно проводить скрининг для групп субъектов: для идентификации субъектов, нуждающихся во вмешательствах; для сбора эпидемиологических данных; чтобы оценить их для целей медицинского страхования. Данные, полученные в результате скринингов популяций, будут особенно ценными при сопоставлении с клиническими показателями предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, и они могут храниться в массивах данных или других совокупностях на машиночитаемом носителе для удобного применения представителями системы здравоохранения и смежной со здравоохранением отрасли промышленности для улучшения предоставления услуг и эффективности и, следовательно, улучшения результатов лечения больных.
Машиночитаемый носитель для хранения включает любой закодированный материал хранения данных с машиночитаемыми данными или массивами данных, который, при применении машины, запрограммированной с помощью инструкций для использования указанных данных, может применяться для различных целей, таких как, без ограничения, предоставление или генерирование информации о субъекте, относящейся к факторам риска предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния с течением времени или в ответ на вмешательства или терапии, а также исследование лекарственных средств. Оценка или измерение биомаркеров по настоящему изобретению и/или соответствующего риска, определяемого посредством них, может предоставляться в компьютерных программах, выполняемых на программируемых компьютерах, включающих, кроме прочего, процессор, систему хранения данных (в том числе оперативную и неоперативную память и/или запоминающие элементы), по меньшей мере одно устройство для ввода данных и по меньшей мере одно устройство для вывода данных. Программный код или программное обеспечение может применяться к введенным данным для выполнения функций, необходимых для генерирования необходимого результата вычисления.
Программный код или программное обеспечение может исполнять одну или несколько функций в отношении данных, касающихся биомаркеров, в том числе: определение нормальных или атипичных уровней биомаркера и сравнение уровня биомаркера с референтным значением, например, контрольным субъектом или популяцией, у которых известно состояние предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, или заданным значением или исходным значением. Референтный образец или заданное значение, или исходное значение могут быть взяты или получены от одного или нескольких субъектов, которые были подвергнуты лечению, или могут быть взяты или получены от одного или нескольких субъектов, которые находятся в группе низкого риска развития предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, или могут быть взяты или получены от субъектов, которые продемонстрировали улучшения одного или нескольких факторов риска, ассоциированных с предиабетом, диабетом или связанным с диабетом состоянием (в том числе установленных клинических параметров), как результат воздействия лечения. Референтный образец или заданное значение, или исходное значение могут также быть взяты или получены от одного или нескольких субъектов, которые не были подвергнуты лечению. Например, для мониторинга прогресса лечения образцы можно собирать от субъектов, которые получили первоначальное лечение в отношении предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния и последующее лечение в отношении предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Референтное значение может также включать значение, полученное при помощи алгоритма предсказания риска, или вычисленные индексы из исследований популяций.
Биомаркеры настоящего изобретения, таким образом, можно применять для создания биомаркерного профиля или сигнатуры субъектов: (i) не имеющих и для которых не предполагают развитие предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния и/или (ii) имеющих или для которых предполагают развитие предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Биомаркерный профиль субъекта можно сравнить с предварительно определенным или референтным биомаркерным профилем для диагностики или идентификации субъектов с риском развития предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, для мониторинга прогрессирования заболевания, а также скорости прогрессирования заболевания, и для мониторинга эффективности лечения предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Биомаркерные профили настоящего изобретения предпочтительно входят в состав машиночитаемого носителя и являются «живыми», поскольку их можно обновлять с помощью дополнительных получаемых данных, таким образом, повышая силу и клиническую значимость биомаркеров. Данные, касающиеся биомаркеров настоящего изобретения, также можно объединять или соотносить с другими данными или результатами тестов, такими как, без ограничения, измерения клинических параметров или другие алгоритмы для предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Другие данные включают возраст, этническую принадлежность, индекс массы тела (BMI), общие уровни холестерина, уровни глюкозы в крови, кровяное давление, уровни LDL и HDL. Машиночитаемый носитель может также содержать информацию о субъекте, такую как история болезни и любой релевантный семейный анамнез.
Настоящее изобретение также предоставляет способы идентификации средств для лечения предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, которые подходят или же адаптированы к конкретному субъекту. При этом можно отбирать тестовый образец у субъекта, подвергаемого воздействию терапевтического или лекарственного средства, и можно определять уровень одного или нескольких биомаркеров. Уровень одного или нескольких биомаркеров можно сравнить с образцом, полученным от субъекта до и после лечения, или можно сравнить с образцами, полученными от одного или нескольких субъектов, которые продемонстрировали улучшения в отношении факторов риска в результате такого лечения или воздействия.
Тесты
Биомаркеры и их панели по настоящему изобретению могут воплощаться в ряде тест-систем. Как правило, тест-системы включают средство для получения результатов тестирования из образца, средство для сбора, хранения, обработки и/или отслеживания результатов тестирования для образца, обычно в базе данных, и средство для предоставления отчета о результатах тестирования. Средство для получения результатов тестирования могут включать модуль, адаптированный для автоматического тестирования с использованием одного или нескольких биохимических, иммунологических анализов и анализов обнаружения нуклеиновых кислот. Некоторые тест-системы могут обрабатывать несколько образцов и могут проводить несколько тестов на данном образце. Средство для сбора, хранения, обработки и/или отслеживания результатов тестирования могут включать физическое и/или электронное устройство хранения данных, такие как жесткий диск или флеш-память, или бумажные распечатки. Средство для предоставления отчета о результатах тестирования могут включать дисплей, канал передачи со структурой данных или базой данных, или принтер. В этом отношении, средством предоставления отчета может быть просто канал передачи данных, который адаптирован для отправки результатов на другое устройство, такое как база данных, визуальный дисплей или принтер.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет тест-систему, адаптированную для оказания помощи в идентификации индивидуумов с риском развития предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, или для диагностики предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, при этом тест-система включает средство, которое использует данные, касающиеся по меньшей мере одного из биомаркеров, описанных в данном документе. Как правило, результаты тестирования из системы настоящего изобретения служат в качестве данных, вводимых в компьютер или микропроцессор, запрограммированный с помощью машинного кода или программного обеспечения, которое получает данные, касающиеся по меньшей мере одного из биомаркеров, описанных в данном документе, и определяет риск развития или уже имеющийся предиабет, диабет или связанное с диабетом состояние.
Выбор биомаркеров
Как было установлено, что обнаруженные биомаркеры в таблице 1 имеют измененное или модифицированное наличие или уровни концентрации у субъектов, имеющих диабет и/или диабетическую нефропатию. Таким образом, биомаркеры и способы настоящего изобретения позволяют специалисту в данной области идентифицировать, диагностировать или иным способом оценивать субъектов, у которых не проявляются какие-либо симптомы предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, но которые, тем не менее, могут иметь или могут находиться в группе риска в отношении развития предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния.
Для образования панели маркеров можно выбирать один или несколько биомаркеров в таблице 1 или 2. Например, один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ оценки риска развития предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния, включающий этап измерения уровней по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 биомаркеров из таблицы 1 или 2. Предпочтительно, панель включает по меньшей мере один из: пероксиредоксина-2 (Р32119), белка АМВР (Р02760); аполипопротеина A-IV (Р06727) и субъединицы C1q-субкомпонента комплемента (Р02746); по меньшей мере один из адипонектина (Q15848), белка 2, родственного фактору Н комплемента (Р36980), бета-субъединицы гемоглобина (Р68871), аполипопротеина В-100 (Р04114) и сульфгидрилоксидазы 1 (O00391) или; по меньшей мере один из аполипопротеина С-III (Р02656), белка, связывающего инсулиноподобный фактор роста 3 (Р17936), подобного антигену CD5 (O43866) и бета-цепи компонента С8 комплемента (Р07358).
Клинические алгоритмы
Результаты, полученные с применением биомаркеров настоящего изобретения, можно объединять в индексы, полезные при практическом осуществлении настоящего изобретения, с помощью какой-либо одной или нескольких формул. Как указано выше, и без ограничения, такие индексы могут указывать, среди прочих других признаков, на возможность, вероятность, абсолютный или относительный риск, время до или скорость перехода из одной в другую стадию заболевания, или делать предсказания будущих измерений биомаркеров предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Они могут служить для определенного отрезка или промежутка времени, или расчета возрастного риска, или просто предоставляться в качестве индекса относительно другой референтной популяции субъектов.
Предпочтительные формулы включают широкий класс алгоритмов статистической классификации, таких как относительная рабочая характеристика (ROC), применение дискриминантного анализа, например линейного дискриминантного анализа (LDA). Для LDA признаки можно идентифицировать с применением подхода на основе eigengene с различными порогами (ELDA) или пошагового алгоритма, основанного на многофакторном дисперсионном анализе (MANOVA). Можно осуществлять прямые, обратные и ступенчатые алгоритмы, что минимизирует вероятность отсутствия разделения на основании статистического метода Хотеллинга-Лоули. Другие формулы, в том числе метод опорных векторов (SVM), метод случайного леса (Random Forest) или рекурсивное разделение, также можно применять отдельно или в сочетании для идентификации сочетаний биомаркеров, которые являются наиболее важными.
Для предварительной обработки результатов измерений индивидуальных биомаркеров в более подходящие формы информации перед последующей обработкой может применяться другая формула. Предварительная обработка включает обратное преобразование и преобразование с квадратными корнями, нормализацию результатов биомаркеров, применение математических преобразований, таких как логарифмические и логистические функции. Особенно предпочтительны нормализации на основании клинических параметров, таких как возраст, половая идентичность, раса, BMI или пол.
При практическом осуществлении настоящего изобретения можно применять один или несколько клинических параметров в сочетании с биомаркерами настоящего изобретения в качестве вводимых данных в формулу или в качестве критериев предварительного отбора, определяющих релевантную популяцию для измерения с применением конкретной панели биомаркеров и формулы. Клинические параметры также могут быть применимы при нормализации и предварительной обработке биомаркеров или при выборе биомаркеров, создании панели, выборе типа формулы и выводе и последующей обработке результата формулы.
Панели биомаркеров настоящего изобретение можно адаптировать к популяции и конечной точке или применению, которое подразумевается. Например, панели биомаркеров и формулы можно применять для оценки субъектов в отношении первичной профилактики и диагностирования, а также в отношении вторичной профилактики и ведения терапии. Для первичной оценки панели и формулы можно применять для предсказания и выделения групп риска по состояниям, для диагностирования диабетических состояний, для прогнозирования уровня глюкозы и скорости изменения и для показания в отношении дальнейшего диагностирования. Для вторичной профилактики и ведения терапии панели и формулы можно применять для прогнозирования и выделения групп риска в отношении осложнений диабета. Панели и формулы можно применять для поддержки принятия клинических решений, таких как определение того, можно ли отложить вмешательство до следующего посещения, рекомендовать стандартный профилактический осмотр, рекомендовать повышенную частоту посещений, рекомендовать усиленное тестирование и рекомендовать терапевтическое вмешательство. Панели и формулы могут также быть применимы для вмешательств у субъектов с диабетическими состояниями, как, например, выбор терапевтического средства и ответ на него, корректировка и дозирование терапии, мониторинг эффективности продолжающейся терапии и показание для изменения в терапевтическом вмешательстве.
Конечные точки заболевания по настоящему изобретению включают предиабет, диабет или связанное с диабетом состояние. Панели и формулы в данном документе можно применять для оценки текущего статуса конечных точек заболевания посредством содействия в диагностировании и/или определении тяжести предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния и/или определении подкласса заболевания или состояния. Панели и формулы в данном документе также применимы для определения будущего статуса вмешательства, как, например, определение прогноза будущего предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния при терапии, вмешательстве и терапии лекарственными средствами. Настоящее изобретение можно адаптировать для определенного вмешательства, класса лекарственных средств, класса терапевтических средств, или терапии, или терапии лекарственными средствами, или их комбинации.
Суррогатные конечные точки настоящего изобретения включают измерение HBAIc, глюкозы (I7PG и OGTT) и класса глюкозы (нормальная толерантность к глюкозе (NGT), IGT, IFG и T2DM). Панели и формулы данного документа применимы для определения текущего статуса суррогатных конечных точек посредством диагностирования класса глюкозы натощак или не натощак. Будущий статус суррогатных конечных точек можно определять с применением панелей биомаркеров данного документа, как, например, определение прогноза будущего класса глюкозы. Панели биомаркеров и формулы также применимы для определения будущего статуса вмешательства, как, например, определение прогноза будущего класса глюкозы при терапии лекарственными средствами.
Конечные точки осложнений диабетических состояний включают связанные с диабетом состояния данного документа, такие как заболевание почек, ретинопатия глаза, микрососудистое повреждение, повреждение печени, ампутация конечности и сердечнососудистые осложнения. Панели биомаркеров и формулы можно применять для оценки текущего статуса конечных точек заболевания посредством содействия диагностике предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Будущий статус конечных точек осложнений можно определять с помощью панелей биомаркеров и формул, как, например, определение прогноза будущего предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Панели и формулы также применимы для определения будущего статуса вмешательства, как, например, определения прогноза будущего предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния при терапии.
Средства для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния
Биомаркеры настоящего изобретения также можно применять для идентификации и оценки средств для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета или связанного с диабетом состояния. Таким образом, настоящее изобретение также предоставляет способ идентификации или оценки средства для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, включающий:
(i) приведение в контакт клеток, экспрессирующих по меньшей мере один биомаркер из таблицы 1 или 2, с предполагаемым средством и
(ii) сравнение экспрессии или уровня по меньшей мере одного биомаркера из таблицы 1 или 2 в клетках до контакта с предполагаемым средством с экспрессией по меньшей мере одного биомаркера из таблицы 1 или 2 в клетках после контакта с предполагаемым средством;
где изменение экспрессии или уровня идентифицирует средство как средство для лечения предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния.
Клетки можно приводить в контакт с предполагаемым средством in vivo, как, например, в животной модели, или in vitro, как, например, в клеточной культуре или линии. Экспрессию или уровень можно сравнивать с применением программы или программного обеспечения, управляемого компьютером.
Настоящее изобретение также предоставляет способ лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества средства, адаптированного для изменения экспрессии или уровня у субъекта по меньшей мере одного биомаркера в таблице 1 или 2.
Средство можно вводить в соответствии с любым из известных способов, выбираемых практикующим врачом соответствующей квалификации. Средства можно вводить как часть композиции, содержащей эффективное количество средства в смеси с фармацевтически приемлемым средством, таким как фармацевтически приемлемый носитель. Материалом-носителем может быть вода для инъекций, предпочтительно дополненная другими материалами, обычными в растворах для введения млекопитающим. При желании можно включать стандартные фармацевтически приемлемые средства, такие как носители, разбавители и наполнители. Другие приводимые в качестве примера композиции содержат Tris-буфер, pH приблизительно 7,0-8,5, или ацетатный буфер, pH приблизительно 4,0-5,5, которые дополнительно могут включать сорбитол или его подходящий заменитель.
Оптимальный состав средства будет определяться специалистом в данной области в зависимости от предполагаемого пути введения, формата доставки и требуемой дозировки. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1435-1712 (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo.
Таким образом, настоящее изобретение также предусматривает применение средства, адаптированного для изменения экспрессии или уровня по меньшей мере одного биомаркера в таблице 1 или 2, для приготовления лекарственного препарата для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния.
Предпочтительно, средство, адаптированное для изменения экспрессии или уровня по меньшей мере одного биомаркера в таблице 1 или 2, представляет собой средство для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанного с диабетом состояния, как определено в данном документе. Другие средства для лечения или снижения риска развития предиабета, диабета и/или связанных с диабетом состояний включают ингибиторы липазы, такие как цетилистат; синтетические аналоги амилина, такие как симлин прамлинтид с или без рекомбинантного лептина; ингибиторы контранспортера 2 натрия и глюкозы, как серглифозин, YM543, дапаглифозин, двойные активаторы триглицеридлипазы жировых клеток и киназы PI3, как адивиа; антагонисты рецепторов нейропептидов Y2, Y4 и Y5, синтетический аналог гормонов человека PYY3-36 и панкреатический полипептида; антагонисты каннабиоидного рецептора СВ1, такие как римонабант, таранабант, СР-945598, гормоны, как олеоил-эстрон; ингибиторы серотонина, дофамина и норэпинефрина (также известные в области техники как «ингибиторы обратного захвата моноаминов тройного действия»), как тезофензин; ингибиторы повторного захвата норэпинефрина и допамина, как контрав (бупропион плюс опиоидный антагонист налтрексон) и экскалия (бупропион плюс антиконвульсивное средство зонисаминд); ингибиторы 111.бета.-гидроксистероидной дегидрогеназы типа 1 (11b-HSD1); ингибиторы синтеза кортизола, такие как кетоконазол; ингибиторы глюконеогенеза; активаторы глюкокиназы; антисмысловые ингибиторы протеинтирозинфосфатазы-1В; а также другие средства, как инъекции аналогов гастрина и эпидермального фактора роста (EGF), такие как терапия неогенеза островков (E1-I.N.T.); и бетагистин.
Измерение биомаркеров
Биомаркеры можно измерять с применением одной или нескольких из ряда техник. Предпочтительно биомаркеры измеряют способом, минимизирующим изменчивость субъекта. Например, их можно измерять натощак и обычно утром, что обеспечивает сниженный уровень изменчивости субъекта, связанной как с потреблением пищи и метаболизмом, так и с суточными изменениями. В настоящем изобретении может применяться любая процедура отбора проб натощак или отбора, ограниченного временем.
Фактическое измерение уровней биомаркеров в данном документе можно определять на уровне белка или нуклеиновой кислоты с применением любого способа, известного в данной области. Например, на уровне нуклеиновой кислоты для определения генной экспрессии можно применять анализ нозерн-блот и саузерн-блот гибридизации, а также анализ с помощью защиты от рибонуклеазы с применением зондов, которые специфически распознают одну или несколько из этих последовательностей. Уровни биомаркеров также можно измерять с помощью анализа ПЦР с обратной транскрипцией (RT-PCR), например, с применением праймеров, специфичных к дифференциально экспрессируемым последовательностям генов. Предпочтительно, уровни биомаркеров определяют на уровне белка, например, путем измерения уровней пептидов, кодируемых генными продуктами, описанными в данном документе, или их активностей. Такие способы включают, например, иммуноанализы, основанные на антителах к белкам, кодируемым генами, аптамерах или молекулярных импринтах.
Биомаркеры в таблице 1 или 2, полипептиды, пептиды, мутации и их полиморфизмы можно определять любым подходящим способом, но обычно их определяют приведением в контакт образца от субъекта с антителом, которое связывается с биомаркерным белком, полипептидом, мутацией или полиморфизмом, и затем определением наличия или отсутствия продукта реакции. Антитела могут быть моноклональными, поликлональными, химерными или фрагментом вышеперечисленного, и этап определения продукта реакции может проводиться посредством любого подходящего иммуноанализа.
Иммуноанализы, проводимые в соответствии с настоящим изобретением, могут представлять собой гомогенные анализы или гетерогенные анализы. В гомогенном анализе в иммунологической реакции обычно участвуют специфическое антитело к биомаркеру, помеченный аналит и представляющий интерес образец. Сигнал, возникающий от метки, модифицируется, прямо или опосредованно, при связывании антитела с помеченным аналитом. Как иммунологическая реакция, так и определение ее степени может проводиться в гомогенном растворе. Иммунохимические метки, которые можно использовать, включают свободные радикалы, радиоизотопы, флуоресцентные красители, ферменты, бактериофаги или коферменты.
В подходе гетерогенного анализа реагентами обычно являются образец, антитело и средства для создания определяемого сигнала. Можно применять образцы, как описано выше. Антитело можно иммобилизировать на подложке, такой как гранулы (такие как, агарозные гранулы с белком А и белком G), планшет или предметное стекло, и его приводят в контакт с образцом, предположительно содержащим антиген в жидкой фазе. Подложку затем отделяют от жидкой фазы и либо фазу подложки, либо жидкую фазу исследуют на определяемый сигнал с использованием средств для создания такого сигнала. Сигнал зависит от наличия аналита в образце. Средства для создания определяемого сигнала включают применение радиоактивных меток, флуоресцентных меток или ферментных меток. Например, если определяемый антиген содержит второй сайт связывания, антитело, которое связывается с данным сайтом, можно конъюгировать с определяемой группой и добавлять к жидкой фазе реакционного раствора до этапа отделения. Наличие определяемой группы на твердой подложке указывает на наличие антигена в тестовом образце. Примеры подходящих иммуноанализов включают олигонуклеотиды, иммуноблоттинг, иммунопреципитация, иммунофлуоресцентные способы, хемилюминисцентные способы, электрохемилюминисценцию (ECL) или иммуноанализы с молекулами, меченными ферментом.
С помощью информации о последовательностях, предоставляемой значениями в базе данных для биомаркеров в таблице 1, экспрессию биомаркерных последовательностей можно обнаруживать (при наличии) и измерять с применением методик, хорошо известных рядовому специалисту в данной области, таких как анализ нозерн-блот гибридизации или способы, которые специфично и, предпочтительно, количественно амплифицируют специфические последовательности нуклеиновых кислот. В качестве другого примера, последовательности можно применять для конструирования праймеров для специфической амплификации биомаркерных последовательностей, например, в способах обнаружения, основанных на амплификации, таких как полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-PCR). Когда изменения в генной экспрессии ассоциированы с амплификацией, делецией, полиморфизмами и мутациями гена, то можно осуществлять сравнения последовательностей в тестовой и референтной популяциях путем сравнения относительных количеств изучаемых последовательностей ДНК или РНК в тестируемой и референтной клеточных популяциях.
Также можно измерять метаболиты биомаркерного белка и/или нуклеиновой кислоты с применением одного или нескольких различных способов, известных специалисту в данной области, в том числе рефракционной спектроскопии (RI), ультрафиолетовой спектроскопии (UV), флуоресцентного анализа, радиохимического анализа, спектроскопии в ближней инфракрасной области спектра (near- IR), ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (NMR), анализа по светорассеянию (LS), масс-спектрометрии, в том числе масс-спектрометрии с мониторингом множественных реакций (MRM), масс-спектрометрии на основе пиролиза, нефелометрии, дисперсионной раман-спектроскопии, газовой хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрией, времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (MALDI-TOF), спектроскопии с ионораспылением, совмещенной с масс-спектрометрией, капиллярного электрофореза, NMR- и IR-определения.
При измерении биомаркеров с применением масс-спектрометрии они могут измеряться с помощью пептида, выбранного из перечня:
(i) 5-25 - аминокислотный пептид белка из таблицы 1 или 2;
(ii) 5-20 - аминокислотный пептид белка из таблицы 1 или 2;
(iii) 10-20 - аминокислотный пептид белка из таблицы 1 или 2;
(iv) 10-15 - аминокислотный пептид белка из таблицы 1 или 2 или
(v) пептид в таблице 3.
Наборы
Настоящее изобретение также включает реагент для обнаружения биомаркера, например, антитело, специфичное к биомаркерному белку в таблице 1 или 2 или пептиду в таблице 3, или нуклеиновую кислоту, которая специфично идентифицирует или связывается с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами, кодирующими биомаркерный белок в таблице 1 или 2 или пептид в таблице 3, обладая гомологичными последовательностями нуклеиновой кислоты, такими как олигонуклеотидные последовательности или аптамеры, комплементарными к части нуклеиновой кислоты, упакованной вместе в форме набора. Набор может содержать в отдельных контейнерах нуклеиновую кислоту или антитело (либо уже связанные с твердой матрицей, либо упакованные отдельно с реагентами для связывания их с матрицей), контрольные составы (положительные и/или отрицательные) и/или определяемую метку, такую как флуоресцин, зеленый флуоресцирующий белок, родамин, цианиновые красители, красители Alexa, люцифераза, радиометки, в числе прочих. Инструкции для проведения анализа также могут включаться в набор. Анализ может быть, например, в форме комплекта для нозерн-блот гибридизации, «сендвич» ELISA или комплекта с белковыми антителами.
Реагенты для обнаружения биомаркеров по настоящему изобретению можно иммобилизировать на твердой матрице, такой как пористая полоска, с образованием по меньшей мере одного участка обнаружения биомаркера. Зона измерения или обнаружения пористой полоски может включать множество участков, содержащих антитело или нуклеиновую кислоту. Тест-полоска может также содержать участки для отрицательного и/или положительного контролей. Альтернативно, контрольные участки могут располагаться на полоске, отделенной от тест-полоски. Необязательно различные участки обнаружения могут содержать различные количества иммобилизированных антител или нуклеиновых кислот, например, большее количество в первом участке обнаружения и меньшее количество в последующих участках. При добавлении тестового образца ряд участков, обнаруживающих определяемый сигнал, предоставляет количественное обозначение количества биомаркера, присутствующего в образце. Участки обнаружения можно формировать в любую подходящую обнаруживаемую форму, и они обычно имеют форму полоски или точки, охватывающей ширину тест-полоски.
Альтернативно, набор содержит субстратную матрицу нуклеиновой кислоты, включающую одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты. Нуклеиновые кислоты на матрице специфично идентифицируют одну или несколько последовательностей нуклеиновой кислоты, адаптированных для связывания последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей биомаркер в таблице 1 или 2. Субстратная матрица может быть, например, на твердом субстрате или «чипе». Альтернативно, субстратная матрица может быть матрицей-раствором.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Идентификация и валидация биомаркеров диабета
1. Материалы/способы
А. Описание когорты
А.1. Исследование диабета в Фремантле (Фаза 1)
Обоснование: когорта FDS1 включала 1294 пациентов с диабетом 2 типа. Выбирали больных диабетом субъектов с и без диабетической нефропатии для обеспечения заметно отличающихся фенотипических представлений, дающих наибольшее различие в белковой экспрессии.
Фаза I исследования диабета в Фремантле (FDS) представляла собой долговременное наблюдательное исследование ухода, контроля, осложнений и затрат у больных диабетом из стабильного городского сообщества, определяемого с помощью почтового кода в 120097 человек. В 1991 году, когда разрабатывали фазу I, существовало всего несколько опубликованных данных о естественном ходе развития диабета.
Изучаемые группы:
Взрослые больные диабетом 2 типа, англо-кельты
Группа 1:
Нормоальбуминурия (ACR 0,57-1,53 мг/ммоль)
Группа 2:
Макроальбуминурия (ACR 49,0-300,0 мг/ммоль)
Возраст:
33-84 года
Количество субъектов:
20 в группе; 40 всего
Диапазон отбора:
1294
Протокол:
Пробирка с EDTA, центрифугировали в течение 4 часов, разделяли и хранили при -80°C
Образцы:
Плазма, моча
А.2. Исследование диабета в Фремантле (Фаза 2)
Обоснование: когорту FDS2 укомплектовали больными диабетом, предложенными врачами-консультантами в окрестностях Фремантла, и больными диабетом из базы данных когорты FDS1. Выбирали больных диабетом субъектов с и без диабетической нефропатии для обеспечения заметно отличающихся фенотипических представлений, дающих наибольшее различие в белковой экспрессии.
Фазу II разрабатывали в 2007 для улучшенного и расширенного сбора данных, чтобы охарактеризовать природу диабета в современной городской Австралии.
Исследуемые группы:
Все взрослые больные диабетом 2 типа, не дифференцированные по расе
Группа 1:
Нормоальбуминурия (ACR 0,3-2,3 мг/ммоль)
Группа 2:
Макроальбуминурия (ACR 34,1-405,0 мг/ммоль)
Группа 3:
Микроальбуминурия (ACR 3,5-18,3 мг/ммоль)
Возраст:
44-85 лет
Согласие на генетическое исследование:
Кровь собрали и сохранили
Количество субъектов:
20 в группе; 60 всего
Диапазон отбора:
2000
Укомплектованы из:
Фазы 13 исследования диабета в Фремантле (680) + новые участники в районе Фремантла
Протокол:
Международный стандартный протокол для протеомики
Образцы:
Плазма, сыворотка, цельная кровь и моча
Образцы:
Плазма, моча
А.3. Исследования диабета в Бюссельтоне
Обоснование: Расширяет информацию о больных диабетом из сельского сообщества. Дополняет информацию, полученную из городских исследований FDS1 и FDS2. Включает подходящих контрольных субъектов без диабета.
Исследование состояния здоровья в Бюссельтоне является одной из наиболее долгосрочных продолжающихся программ эпидемиологического исследования в мире. Постоянные жители городка Бюссельтон, сообщество побережья юго-запада Западной Австралии, были вовлечены в серию исследований в области здравоохранения с 1966 года. К настоящему времени более 16000 мужчин, женщин и детей всех возрастов приняли участие в исследованиях и помогли внести вклад в понимание многих общих заболеваний и состояний здоровья.
Исследуемые группы:
Все взрослые с/без диабета, не дифференцированные по расе, не подобранные по возрасту
Группа 1:
Диабетики с самой тяжелой альбуминурией (ACR 17,5-408 мг/ммоль)
Группа 2:
Диабетики с нормоальбуминурией (ACR 0,4-2,6 мг/ммоль)
Группа 3:
Контрольные субъекты с нормоальбуминурией (ACR 0,2-1,7 мг/ммоль)
Возраст:
41-94 года
Согласие на генетическое исследование:
Кровь собрали и сохранили
Число субъектов:
20 в группе; 60 всего
Диапазон отбора:
250 из 329 взрослых с диабетом, 250 контрольных субъектов из 2595 без диабета
Укомплектованы из:
Исследование в области здравоохранения в Бюссельтоне
Протокол:
Международный стандартный протокол для протеомики
Образцы:
Плазма, сыворотка, цельная кровь и моча
В. Выявление белкового биомаркера с применением iTRAQ и 2D LC MALDI TOF/TOF
Данная методология выявления включает химическое мечение плазмы различных групп пациентов (например, больной диабетом с нефропатией в сравнении с больным диабетом без нефропатии) и определение посредством масс-спектрометрии относительной степени наличия конкретного белка. Белки со значительно измененными концентрациями после анализа указывают на изменение в биохимии одной группы пациентов в сравнении с другой. Эту методику применяли для измерения относительных концентраций 130-200 белков на каждый образец. Были идентифицированы белки со значительно отличающейся концентрацией между группами и их выбрали для дальнейшего изучения посредством методологии MRM (раздел С ниже).
B.1. Подготовка образца
Образцы плазмы (N=10 или 20) объединили перед иммунодеплецией 14 наиболее распространенных белков с применением колонки для HPLC MARS 14 (Agilent Technologies). В иммуноистощенных образцах провели замену буфера с применением спиновых фильтров с границей пропускания 10 кДа (Sartorius) на 1М триэтиламония бикарбонат. Образцы белков восстановили, алкилировали, расщепили трипсином и пометили в соответствии с протоколом iTRAQ (Applied Biosystems).
B.2. Инструментальный анализ
Пептиды обессолили на полимерной колонке для обращенно-фазовой хроматографии 33 мкМ Strata-X (Phenomenex) перед разделением посредством сильной катионообменной жидкостной хроматографии (SCX) на Agilent 1100 HPLC с применением колонки PolySulfoethyl (4,6×100 мм, 5 мкм, 300 Å). Пептиды элюировали линейным градиентом 0-400 мМ KCl. SCX-фракции обессолили и загрузили на систему Ultimate 3000 nano HPLC (Dionex С18, PepMap 100, 3 мкм), и разделили при помощи градиента 10-40% ацетонитрила (0,1% муравьиная кислота) с нанесением проб с применением автоматизированного устройства для нанесения проб ProBot (LC Packings). Полученные в результате зоны проанализировали на анализаторе 4800 MALDI TOF/TOF.
В.3. Анализ данных
Анализ данных выполнили с применением программного обеспечения ProteinPilot™ 2.0.1 (Applied Biosystems). Уровень ложноположительных результатов рассчитали с помощью алгоритма PSPEP, который работает во взаимодействии с ProteinPilot™ 2.0.1 и были допущены только белки с общим уровнем ложноположительных результатов (FDR) приблизительно <5%.
С. Валидация биомаркерного кандидата с применением мониторинга множественных реакций (MRM)
Мониторинг множественных реакций (MRM) представляет собой подход, основанный на масс-спектрометрии, для специфичного нацеливания на переходы (ионная пара предшественник-фрагмент) для сигнатурного пептида, который представляет собой заменитель полного белка-кандидата биомаркера. Для каждого кандидата применяли один или два пептида, уникальных для этого белка (при сравнении с базой данных SwissProt Human Database ver 57.1). Этот высокопроизводительный подход применяли для валидации биомаркеров из фазы выявления (см. раздел В выше) в большем количестве образцов плазмы индивидуального пациента.
С.1. Подготовка образца
18
Подготовили объединенные образцы, такие же как в предыдущих экспериментах iTRAQ, а также индивидуальные образцы (N=10 на группу), отличные от предыдущих объединенных образцов iTRAQ (образцы для валидации). Образцы подвергли иммунодеплеции по 14 наиболее многочисленным белкам с помощью колонки MARS 14 HPLC. В иммуноистощенных образцах провели замену буфера с применением спиновых фильтров с границей пропускания 10 кДа. Образцы белков восстановили, алкилировали, расщепили трипсином и обессолили. Кроме того, один референтный образец плазмы (пул здоровых индивидуумов) пометили О и, наконец, добавили в каждый образец когорты (1:1) перед анализом LC-MRM/MS.
С.2. Перевод перечней биомаркеров в перечни переходов MRM
Предварительные перечни переходов MRM создавали посредством серии этапов, которые включали скачивание белковых последовательностей, расщепление белков in silico в соответствии с фильтром (например, 7-21 аминокислот, 0 пропущенных расщеплений) и отбор минимум 4 переходов на пептид (обычно, заряд предшественника z2, заряд продукта z1). Также включалась полезная информация, касающаяся протеотипичных пептидов, из литературы и репозиториев (PeptidAtlas, MRMaid), и выбор переходов поддерживался спектральными библиотеками (ISB, NIST, GPM, BiblioSpec). Для создания и уточнения переходов MRM, а также для анализа данных переходов MRM применяли открытое программное обеспечение под названием Skyline (MacCoss laboratory, University of Washington, Сиэтл, Вашингтон, США).
18
Аликвоту 1 мкг продукта расщепления плазмы загрузили прямо на наноколонку (Dionex С18, РерМар 100, 3 мкм) и пептиды элюировали с помощью 100 мин. градиента 2-30% ацетонитрила (0,1% муравьиной кислоты) в 4000 QTrap, оснащенном источником ионизации электрораспылением в нанопотоке. Максимум 200 MRM получили за проход при времени задержки 20 мс и цикле 5 с. Проходы проанализировали (т.е. удалили пептиды без целесообразных переходов) и уточненный перечень пептидов и переходов подвергли MS/MS эксперименту с инициированным MRM для валидации установлений пептидов. Поскольку установление пептидов для малораспространенных белков представляет собой весьма трудную задачу без стандартов, настройки сканирования ионных продуктов (EPI) варьировали, например, частота сканирования (1000-4000), разностное время LIT (20-300 мс). Два наиболее интенсивных перехода на каждый пептид отобрали для валидации и отправили в MS/MS (диапазон массы 200-1200), если переход превышал порог 1000 имп./с. Всего использовали 40 MRM за проход с выдержкой времени 20 мс и циклом ~7 с. Для полученных данных MS/MS провели поиск относительно действующей базы данных SwissProt при помощи таксономического фильтра для человека с применением MASCOT. Идентифицированные пептиды сопоставили с данными MRM (пептидная последовательность, время удержания). Наконец, валидированные пептиды протестировали на их пригодность для применения со способом мечения O MRM. Окончательный перечень переходов для исследования каждой когорты состоял из 1-2 пептидов (см. таблицу 3) на каждый белок-кандидат (см. таблицу 1) и 3 переходов на каждый пептид. По возможности исключались пептидные последовательности, которые не являлись уникальными для белка-кандидата, и пептиды с аминокислотами М, W, N-концевыми Q или Е и т.д.
Таблица 3
Название белка (см. таблицу 1)
Код доступа (Uniprot)
Положение/пептидные последовательности (SEQ ID NO)
Ключ
Сульфгидрил оксидаза 1
sp|O00391|QSOX1_HUMAN
257-265 SFYTAYLQR (SEQ ID NO:1)
L
Аполипопротеин A-IV
sp|P06727|APOA4_HUMAN
135-143 LEPYADQLR (SEQ ID NO:2)
APOA4/LEP
sp|P06727|APOA4_HUMAN
256-264 ISASAEELR (SEQ ID NO:3)
APOA4/ISA
Подобный антигену CD5
sp|043866|CD5L_HUMAN
246-256 LVGGDNLCSGR (SEQ ID NO:4)
CD5L/LVG
sp|043866|CD5L_HUMAN
308-314 IWLDNVR (SEQ ID NO:5)
CD5L/IWL
Бета-цепь компонента С8 комплемента
sp|P07358|CO8B_HUMAN
122-132 CEGFVCAQTGR (SEQ ID NO:6)
M
Аполипопротеин В-100
sp|P04114|APOB_HUMAN
642-654 SVSLPSLDPASAK (SEQ ID NO:7)
APOB/SVS
sp|P04114|APOB_HUMAN
950-960 TEVIPPLIENR (SEQ ID NO:8)
APOB/TEV
Пероксиредоксин-2
sp|P32119|PRDX2_HUMAN
17-26 ATAVVDGAFK (SEQ ID NO:9)
PRDX2/ATA
Белок АМВР
sp|P02760|AMBP_HUMAN
283-293 TVAACNLPIVR (SEQ ID NO:10)
AMBP/TVA
sp|P02760|AMBP_HUMAN
335-349 EYCGVPGDGDEELLR (SEQ ID NO:11)
AMBP/EYC
Бета-субъединица гемоглобина
sp|P68871|HBB_HUMAN
10-18 SAVTALWGK (SEQ ID NO:12)
I1
sp|P68871|HBB_HUMAN
19-31 VNVDEVGGEALGR (SEQ ID NO:13)
I2
Субъединица C1q-субкомпонента комплемента
sp|P02746|C1QB_HUMAN
122-128 IAFSATR (SEQ ID NO:14)
C1QB/IAF
Аполипопротеин С-III
sp|P02656|APOC3_HUMAN
45-60 DALSSVQESQVAQQAR (SEQ ID NO:15)
APOC3/DAL
Белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста
sp|P17936|IBP3_HUMAN
47-63 ALAQCAPPPAVCAELVR (SEQ ID NO:16)
IBP3/ALA
sp|P17936|IBP3_HUMAN
226-233 FLNVLSPR (SEQ ID NO:17)
IBP3/FLN
Адипонектин
sp|Q15848|ADIPO_HUMAN
78-92 GDIGETGVPGAEGPR(SEQ ID NO:18)
ADIPO/GDI
Белок 2, родственный
sp|P36980|FHR2_ HUMAN
233-242 TGDIVEFVCK (SEQ ID NO:19)
FHR2/TGD
фактору Н комплемента
sp|P36980|FHR2_HUMAN
262-270 LVYPSCEEK (SEQ ID NO:20)
FHR2/LVY
C.3. Инструментальный анализ
18
Все образцы перерастворили и добавили 1:1 референтную плазму, помеченную O (пул здоровых индивидуумов), перед анализом LC-MRM/MS для корректировки различий в эффективности распыления и ионизации между проходами. Каждый образец вводили в двух повторах непосредственно на наноколонку (Dionex С18, РерМар 100, 3 мкм) и пептиды элюировали в 100 мин. градиенте 2-30% ацетонитрила (0,1% муравьиной кислоты) в 4000 QTrap, оснащенном источником ионизации электрораспыления в нанопотоке. Для всех регистрации данных применяли запланированную опцию MRM с временем сканирования мишени 4 сек (по меньшей мере 8 точек данных по пику) и окна выявления MRM 6-8 минут, что в результате дает минимальные времена выдержки 50-60 мс.
С.4. Анализ данных
Все переходы объединили и для каждого пептида подсчитали (взвешенное) соотношение площади непомеченного пептида к площади помеченного пептида. Соотношения нормализовали в отношении популяционных различий на основании инвариантного набора белков. Наконец, к нормализированным соотношениям применили тест Манна-Уитни для непараметрических данных и подсчитали р-значение, определяющее значимость дифференциальной экспрессии белка у двух групп субъектов, например, здоровые в сравнении с больными.
Чувствительность, или показатель истинноположительных результатов в сравнении с показателем ложноположительных результатов (кривые относительных рабочих характеристик), также нанесли на график для ряда маркеров (однофакторный и многофакторный). Для увеличения порядка величин использовали ряд статистических преобразований, в том числе натуральный логарифм (ln), обращение (inv) и квадратный корень (√).
2. Результаты
D. Биомаркеры
D1. Биомаркеры диабетической нефропатии у больных диабетом
На таблице фигуры 1 показаны данные биомаркерных белков из исследований диабета в Бюссельтоне и обоих исследований в Фремантле относительно наличия диабетической нефропатии, при этом все субъекты с диабетом. Вопрос, который рассматривается: «Какие биомаркеры характерны для диабетической нефропатии у пациентов-диабетиков?»
Результаты таблицы на фигуре 1 иллюстрируются в виде диаграмм «ящик с усами» на фигуре 2 (исследование FDS1), фигуре 3 (исследование FDS2) и фигуре 4 (исследование BDS). Для каждого биомаркера-кандидата измеряли при помощи MRJVI один или два сигнатурных пептида на каждый белок (левый «ящик»: группа диабетиков; правый «ящик»: группа диабетиков с тяжелой нефропатией; ось х: белок/пептид; ось у: показатель относительной распространенности).
Данные ROC в таблицах 4-8 дополнительно показывают, что биомаркер(ы) можно применять в качестве диагностического средства в отношении диабетической нефропатии.
Таблица 4
Однофакторный анализ
Пептид (Ключ - см. таблицу 3)
Отношение шансов
Чувствительность
Специфичность
Р
AUC ROC
Средние
контроль
случай
n
PRDX2/ATA (ln)
17,7
80,0
80,0
0,040
0,860
0,245
0,507
20
AMBP/TVA
22,6
70,0
70,0
0,034
0,840
2,00
2,63
20
AMBP/EYC
1,42
60,0
80,0
0,061
0,850
10,6
14,1
20
C1QB/IAF (ln)
0,002
90,0
87,5
0,088
0,950
1,08
0,363
18
Таблица 5
Многофакторный анализ (модель 3)
Пептид (Ключ - см. таблицу 3)
Отношение шансов
Чувствительность
Специфичность
Р
AUC ROC
Средние
n
контроль
случай
PRDX2/ATA (ln)
6,06
0,678
0,265
0,61
AMBP/TVA
0,109
0,697
2,04
2,68
AMBP/EYC
2,10
0,426
11
14,3
C1QB/IAF (ln)
0,0004
90,0
87,5
0,287
0,9625
1,2
0,41
18
Таблица 6
Многофакторный анализ (Модель FDS1)
Пептид (Ключ - см. таблицу 3)
Отношение шансов
Чувствительность
Специфичность
Р
AUC ROC
Средние
n
контроль
случай
PRDX2/ATA (ln)
6,52
0,254
-1,41
-0,68
AMBP/TVA
6,61
0,355
2,04
2,67
AMBP/EYC
1,01
90
90
0,97
0,89
10,98
14,34
20
Таблица 7
Многофакторный анализ (Модель FDS2)
Пептид (Ключ - см. таблицу 3)
Отношение шансов
Чувствительность
Специфичность
Р
AUC ROC
Средние
n
контроль
случай
C1QB/IAF (ln)
0,016
0,167
1,08
0,363
AMBP/EYC
0,044
0,218
2,78
2,28
ADIPO/GDI (ln)
0,281
0,589
0,797
0,394
FHR2/LVY (√)
0,342
88,9
100
0,842
0,958
1,46
1,08
17
Таблица 8
Многофакторный анализ (Модель BDS)
Пептид (Ключ - см. Таблица 3)
Отношение шансов
Чувствительность
Специфичность
Р
AUC ROC
Средние
n
контроль
случай
CD5L/LVG (√)
34679
0,209
0,796
0,890
CD5L/IWL (ln)
0,0009
0,151
3,11
1,65
APOB/SVS
5,42е<sup>25</sup>
0,076
0,146
0,308
APOB/TEV
1,95е<sup>-40</sup>
66,7
80
0,092
0,922
0,130
0,237
19
D2. Биомаркеры больных диабетом с нефропатией в сравнении со здоровыми пациентами
Таблица на фигуре 5 описывает биомаркеры, обнаруженные для пациентов с диабетической нефропатией в сравнении со здоровой контрольной группой без диабета. Эти данные получены из исследования в Бюссельтоне.
Как будет очевидно, различные изменения и эквивалентные формы могут предоставляться без отклонения от сущности и объема настоящего изобретения. Это включает модификации в пределах объема прилагаемой формулы изобретения вместе со всеми модификациями, альтернативными конструкциями и эквивалентами.
В настоящем описании наличие отдельных признаков не исключает существование дополнительных признаков. Слова «содержащий», «включающий» и «имеющий» следует интерпретировать во включающем, а не исключающем смысле.