N-7 ЗАМЕЩЕННЫЕ ПУРИНЫ И ПИРАЗОЛОПИРИМИДИНЫ, ИХ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
N-7 SUBSTITUTED PURINES AND PYRAZOLOPYRIMIDINES, COMPOSITIONS THEREOF AND METHODS FOR USE

Мишенью рапамицина у млекопитающих (mTOR) является 289 кДа серин-треониновая киназа, которую считают членом семейства фосфатидилинозитол-3-киназа-подобной киназы (PIKK), поскольку она содержит карбокси-концевой киназный домен, который обладает значительной гомологией последовательности с каталитическим доменом липидкиназ фосфатидилинозитол-3-киназ (PI3K). Кроме каталитического домена на С-конце, киназа mTOR также содержит FKBP12-рапамицин-связывающий домен (FRB), предполагаемый репрессорный домен, вблизи С-конца, и вплоть до 20 тандемно повторяющихся мотивов HEAT на N-конце, а также С-концевой домен FRAP-ATM-TRRAP (FAT) и FAT. См. Huang and Houghton, Current Opinion in Pharmacology, 2003, 3, 371-377). В литературе на киназу mTOR также ссылаются как на FRAP (FKBP12 и рапамицин-ассоциированный белок), RAFT1 (мишень 1 рапамицина и FKBP12), RAPT1 (мишень рапамицина 1)).
Киназа mTOR может быть активирована факторами роста посредством биохимического пути PI3K-Akt или клеточными стрессами, такими как истощение питательных веществ или гипоксия. Считают, что активация киназы mTOR играет центральную роль в регуляции клеточного роста и выживания клетки посредством широкого ряда клеточных функций, включающих трансляцию, транскрипцию, обмен мРНК, стабильность белка, реорганизацию актинового цитоскелета и аутофагию. Подробный обзор биологии клеточной передачи сигнала mTOR и потенциальных терапевтических эффектов модулирования взаимодействий передачи сигнала mTOR см. в Sabatini, D.M. and Guertin, D.A. (2005) An Expanding Role for mTOR in Cancer TRENDS in Molecular Medicine, 11, 353-361; Chiang, G.C. and Abraham, R.T. (2007) Targeting the mTOR signaling network in cancer TRENDS 13, 433-442; Jacinto and Hall (2005) Tor signaling in bugs, brain and brawn Nature Reviews Molecular and Cell Biology, 4, 117-126; и Sabatini, D.M. and Guertin, D.A. (2007) Defining the Role of mTOR in Cancer Cancer Cell, 12, 9-22.
Исследователи, изучающие биологию киназы mTOR, открыли патологическую связь между нарушением регуляции клеточной передачи сигнала mTOR и рядом заболеваний, включающих иммунологические расстройства, рак, метаболические заболевания, сердечно-сосудистые заболевания и неврологические заболевания.
Например, имеются данные, показывающие, что биохимический путь передачи сигнала PI3K-АКТ, который находится выше киназы mTOR, часто гиперактивирован в раковых клетках, что впоследствии приводит в результате к гиперактивации мишеней, расположенных ниже, таких как киназа mTOR. Более конкретно компоненты биохимического пути PI3K-АКТ, которые мутированы в различных опухолях человека, включают мутации активации рецепторов факторов роста, а также амплификации и гиперэкспрессии PI3K и АКТ. Кроме того, существуют данные, которые показывают, что многие типы опухолей, включающие глиобластому, печеночно-клеточный рак, карциному легкого, меланому, карциномы эндометрия и рак простаты, содержат мутации с потерей функции отрицательных регуляторов биохимических путей PI3K-АКТ, таких как гомолог фосфатаз и тензина, делегированный на хромосоме 10 (PTEN), и комплекс туберозного склероза (TSC1/TSC2), которые также приводят в результате к гиперактивной передаче сигнала киназы mTOR. Вышеописанное позволяет предположить, что ингибиторы киназы mTOR могут быть эффективными терапевтическими средствами для лечения заболеваний, вызванных, по меньшей мере частично, гиперактивностью передачи сигнала mTOR.
Киназа mTOR существует в виде двух физически и функционально отдельных комплексов передачи сигнала (то есть mTORC1 и mTORC2). mTORC1 также известен как "комплекс mTOR-Raptor" или "рапамицин-чувствительный комплекс", поскольку он связывается с низкомолекулярным ингибитором рапамицином и ингибируется им. mTORC1 определяется присутствием белков mTOR, Raptor и mLST8. Сам рапамицин является макролидом и был открыт в качестве первого низкомолекулярного ингибитора киназы mTOR. Чтобы обладать биологической активностью, рапамицин образует тройной комплекс с mTOR и FK-связывающим белком 12, который относится к цитозольным связывающим белкам, которые все вместе называют иммунофиллинами. Действие рапамицина индуцирует димеризацию mTOR и FKBP12. Образование комплекса рапамицин-FKBP12 приводит в результате к приобретению новых функций, поскольку этот комплекс связывается непосредственно с mTOR и ингибирует функцию mTOR.
Второй комплекс mTORC, открытый в более недавнее время, mTORC2, характеризуется присутствием белков mTOR, Rictor, Protor-1, mLST8 и mSIN1. mTORC2 также называют "комплексом mTOR-Rictor" или "рапамицин-нечувствительным" комплексом, поскольку он не связывается с рапамицином.
Оба комплекса mTOR играют важные роли в биохимических путях внутриклеточной передачи сигнала, которые влияют на клеточный рост, а также пролиферацию и выживание. Например, нижележащие белки-мишени mTORC1 включают рибосомные киназы S6 (например, S6K1, S6K2) и белок, связывающий эукариотический фактор инициации 4Е (4Е-ВР1), которые являются ключевыми регуляторами трансляции белка в клетке. Также mTORC2 ответственен за фосфорилирование АКТ (S473); и исследования показали, что неконтролируемая клеточная пролиферация вследствие гиперактивации АКТ является важнейшим маркером некоторых типов раков.
В настоящее время несколько аналогов рапамицина находится в клинической разработке для лечения рака (например, Wyeth's CCI-779, Novartis' RAD001 и Ariad Pharmaceuticals' AP23573). Интересно, что клинические данные показывают, что аналоги рапамицина, по-видимому, эффективны для определенных типов рака, таких как лимфома из клеток мантии, рак эндометрия и почечно-клеточная карцинома.
Открытие второго белкового комплекса mTOR (mTORC2), который не ингибируется рапамицином или его аналогами, позволяет предположить, что ингибирование mTOR рапамицином является неполным, и что прямой ингибитор киназы mTOR, который может ингибировать как mTORC1, так и mTORC2 в каталитическом АТФ-связывающем сайте, может быть более эффективным и обладать более широкой противоопухолевой активностью, чем рапамицин и его аналоги.
Недавно раскрыты низкомолекулярные ингибиторы mTOR, включая заявки на патент США №№11/599663 и 11/657156 от OSI Pharmaceuticals Inc.; международные заявки WO/2008/023161 и WO/2006/090169 от Kudos Pharmacuticals; международные заявки WO/2008/032060, WO/2008/032086, WO/2008032033, WO/2008/032028, WO/2008/032036, WO/2008/032089, WO/2008/032072, WO/2008/031091 от AstraZeneca; международную публикацию WO/2008/116129 и заявку на патент США №12/276459 от Wyeth.
В предварительной заявке на патент США 61/085309 раскрыт класс N-гетероциклических конденсированных соединений пиримидина с активностью mTOR.
В свете возрастания знаний о роли передачи сигнала mTOR при заболеваниях (например, при раке) желательно иметь низкомолекулярные ингибиторы mTOR (включая mTORC1 и mTORC2), которые можно применять для лечения заболеваний, где наблюдается аберрантная активность mTOR, как, например, при раке. Кроме того, может быть желательным иметь низкомолекулярные ингибиторы родственных ферментов (например, PI3K, АКТ), которые функционируют выше или ниже mTOR в биохимическом пути передачи сигнала.
В одном аспекте в настоящем изобретении предложено соединение формулы I:
1
2
1
1
2
1
1
1
R1
a
b
a
a
a
a
b
a
a
b
c
a
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
c
c1
1
a
b
1
a
1
a
1
a
1
a
b
1
a
1
a
b
1
a
1
a
a
b
1
a
b
1
a
a
b
1
a
1
a
b
1
1
1
1
c1
a
b
a
b
c
1
c1
c1
a
b
a
a
a
a
b
2
2
R2
d
e
d
d
d
d
e
d
d
e
f
d
d
e
d
e
d
d
e
d
d
e
2
d
e
2
d
2
d
2
d
2
d
e
2
d
2
d
e
2
d
2
d
d
e
2
d
e
2
d
d
e
2
d
2
d
e
2
2
2
d
e
d
e
f
2
3
3
R3
g
g
h
g
h
g
g
i
i
i
g
h
g
h
i
3
R3
3
1
2
3
4
A
1
2
3
4
A
A
A
4
5
6
5
6
5
6
5
5
6
4
5
6
4
5
5
6
4
5
5
6
4
5
4
5
4
5
6
4
5
4
5
6
5
6
D
4
5
6
D
D
j
k
j
j
j
j
k
j
k
j
m
3
j
k
3
j
3
j
3
j
3
j
k
3
j
k
3
j
k
3
3
m
m
m
j
k
m
3
A
D
1-6
2-6
2-6
1-6
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-4
2-4
2-4
2
2
2
3
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
2-6
2-6
1-6
6-10
1-9
3-12
2-12
1-6
2-6
2-6
1-6
2
2
2
f
2
3
2
2
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-4
2-4
2-4
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
3-6
1-6
1-6
2-6
3-6
2
1-4
2-4
2-4
2-6
3-7
1-5
2
2
1-6
1-6
2-6
1-6
1-6
2-6
2-6
3-10
2-10
6-10
1-9
2
2
2
1-6
1-6
2-6
2-6
1-6
3-7
3-7
6-10
1-9
1-6
1-6
3-7
3-7
6-10
1-9
1-4
2-4
2-4
В формуле I Y и Y каждый независимо представляет собой N или C(R), но Y и Y оба не представляют собой N или оба не представляют собой C(R), где R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, 6-10-членного арила, 5-9-членного гетероарила, 3-12-членного гетероциклоалкила, 3-12-членного циклоалкила, где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 5, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -C(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)R, -NRC(O)R, -OC(O)R, -NRC(O)NRR, -OC(O)NRR, -NRS(O)NRR, -S(O)R, -S(O)NRR, -R, -NO, -N, =O, -CN, R, -X-NRR, -X-SR, -X-OR, -X-C(O)OR, -X-C(O)NRR, -X-C(O)R, -X-NRC(O)R, -X-OC(O)R, -X-NRC(O)NRR, -X-OC(O)NRR, -X-NRS(O)NRR, -X-S(O)R, -X-S(O)NRR, -X-NO, -X-N, -X-CN и X-R; где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила, необязательно R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S; R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила; X выбран из группы, состоящей из Cалкилена, Cалкенилена и Cалкинилена; и R выбран из группы, состоящей из фенила, 2-пиридила, 3-пиридила, 4-пиридила, 2-имидазолила, 2-индолила, 1-нафтила, 2-нафтила, 2-тиенила, 3-тиенила, 2-пирролила, 2-фуранила и 3-фуранила, и где R замещен заместителями в количестве от 0 до 3, выбранными из F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -S(O)R, -S(O)NRR, -NO, -N, =O, -CN, пиридила, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила и Cгетероалкила. В формуле I R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Салкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, -L-Cарила, -L-Cгетероарила, -L-Cциклоалкила и -L-Cгетероциклоалкила, где L выбран из Cалкилена, Cалкенилена, Cалкинилена и Cгетероалкилена, и где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 5, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -С(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)R, -NRC(O)R, -OC(O)R, -NRC(O)NRR,-OC(O)NRR, -NRS(O)NRR, -S(O)R, -S(O)NRR, -R, -NO, -N, =O, -CN, -X-NRR, -X-SR, -X-OR, -X-C(O)OR, -X-C(O)NRR, -X-C(O)R, -X-NRC(O)R, -X-OC(O)R, -X-NRC(O)NRR, -X-OC(O)NRR, -X-NRS(O)NRR, -X-S(O)R, -X-S(O)NRR, -X-NO, -X-N and -X-CN; где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила, необязательно R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S; R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила; и X выбран из группы, состоящей из Cалкилена, Cалкенилена и Cалкинилена. R представляет собой 5-12-членное моноциклическое или мостиковое гетероциклоалкильное кольцо, где группа R замещена заместителями R в количестве от 0 до 3, выбранными из группы, состоящей из -C(O)OR, -C(O)NRR, -NRR, -OR, -SR, -S(O)R, -S(O)R, -R, атома галогена, F, Cl, Br, I, -NO, -CN и -N, где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила и Cциклоалкила, где необязательно R и R вместе с атомом азота, к которому присоединен каждый, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S, и R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cциклоалкила; и, когда R представляет собой моноциклическое гетероциклоалкильное кольцо, любые две группы R, присоединенные к одному и тому же атому R, необязательно объединены с образованием 3-7-членного карбоциклического или 3-7-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 атомов, выбранных из N, O и S в качестве вершин кольца. A, A, A и A каждый представляет собой элемент, независимо выбранный из N, С(R) или C(H), где по меньшей мере три из A, A, A и A каждый независимо представляет собой C(H) или C(R), где R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из F, Cl, Br, I, -NO, -CN, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, или любые две группы R, присоединенные к соседним атомам, необязательно объединены с образованием Cгетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S в качестве вершин кольца, Cциклоалкильного кольца, Cгетероарильного кольца, содержащего от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N, O и S в качестве вершин кольца, или фенильного кольца. D представляет собой элемент, выбранный из группы, состоящей из -NRC(O)NRR, -NRR, -C(O)NRR, -OC(O)OR, -OC(O)NRR, -NRC(=N-CN)NRR, -NRC(=N-OR)NRR, -NRC(=N-NR)NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -NRS(O)NRR и -NRS(O)R, где R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила и Cалкенила; R и R каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, Cарила и Cгетероарила, и R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, необязательно объединены с образованием 5-7-членного гетероциклического или 5-9-членного гетероарильного кольца, содержащего от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O и S в качестве вершин кольца, и замещенного 0-3 заместителями R; и где R, R и R дополнительно замещены 0-3 заместителями R, где R независимо выбран из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NO, -CN, -NRR, -OR, -SR, -C(O)OR, -C(O)NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -X-NRR, -X-OR, -X-SR, -X-C(O)OR, -X-C(O)NRR, -X-NRC(O)R, -X-NRC(O)OR, -X-CN, -X- NO, -S(O)R, -S(O)R, =O и -R; где R и R выбраны из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, Cарила, Cгетероарила; и R в каждом случае независимо выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, Cарила и Cгетероарила; X выбран из группы, состоящей из Cалкилена, Cалкенилена и Cалкинилена; и где D и заместитель R, присоединенный к атому, который является соседним с атомом, к которому присоединен D, необязательно объединены с образованием необязательно замещенного 5-6-членного гетероциклического или гетероарильного кольца, замещенного 0-4 заместителями R.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или эксципиент и соединение формулы I.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложены способы применения соединений формулы I для лечения заболеваний или расстройств, которые можно лечить путем ингибирования киназы mTOR.
Определения:
1-8
3-6
5-12
Как используют в данной заявке, термин "алкил", сам по себе или как часть другого заместителя, означает, если не указано иное, прямоцепочечный или разветвленный углеводородный радикал, имеющий обозначенное число атомов углерода (то есть C означает от одного до десяти атомов углерода). Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил и тому подобное. Термин "алкенил" относится к ненасыщенному алкильному радикалу, имеющему одну или более чем одну двойную связь. Подобным образом, термин "алкинил" относится к ненасыщенному алкильному радикалу, имеющему одну или более чем одну тройную связь. Примеры таких ненасыщенных алкильных групп включают винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил, а также высшие гомологи и изомеры. Термин "циклоалкил", "карбоциклический" или "карбоцикл" относится к углеводородным кольцам, имеющим указанное число кольцевых атомов (например, Cциклоалкил), которые являются полностью насыщенными или имеющими не более чем одну двойную связь между вершинами кольца. Как используют в данной заявке, "циклоалкил," "карбоциклический" или "карбоцикл" также подразумевают как относящийся к бициклическим, полициклическим и спироциклическим углеводородным кольцам, таким как, например, бицикло[2.2.1]гептан, пинан, бицикло[2.2.2]октан, адамантан, норборнен, спироциклический Cалкан и т.д. Как используют в данной заявке, термины "алкенил", "алкинил", "циклоалкил", "карбоцикл" и "карбоциклический" подразумевают как включающие их моно- или полигалогенированные варианты.
2
2
3
2
2
3
2
2
3
2
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
3
3
3
3
2
3
3
3
2
3
2
3
3
Термин "гетероалкил", сам по себе или в комбинации с другим термином, означает, если не указано иное, стабильный прямоцепочечный или разветвленный углеводородный радикал, состоящий из указанного числа атомов углерода и от одного до трех гетероатомов, выбранных из группы, состоящей из О, N, Si и S, и где атомы азота и серы могут быть необязательно окислены, а гетероатом азота может быть необязательно кватернизирован. Гетероатом(ы) О, N и S могут быть расположены в любом внутреннем положении гетероалкильной группы. Гетероатом Si может быть расположен в любом положении гетероалкильной группы, включающем положение, при котором алкильная группа присоединена к остальной части молекулы. "Гетероалкил" может содержать вплоть до трех единиц ненасыщенности, а также включает моно- и полигалогенированные варианты или их комбинации. Примеры включают -CH-CH-O-CH, -CH-CH-O-CF, -CH-CH-NH-CH, -CH-CH-N(CH)-CH, -CH-S-CH-CH, -S(O)-CH, -CH-CH-S(O)-CH, -СН=СН-O-CH, -Si(CH), -CH-CH=N-OCH и -СН=СН=N(CH)-CH. Вплоть до двух гетероатомов могут быть последовательными, как, например, -CH-NH-OCH и -CH-O-Si(CH).
Термин "гетероциклоалкил", "гетероциклический" или "гетероцикл" относятся к циалоалкановой группе, которая содержит от одного до пяти гетероатомов, выбранных из N, O и S, где атомы азота и серы необязательно окислены, а атом(ы) азота необязательно кватернизированы. Если не указано иное, "гетероциклоалкил", "гетероциклическое" кольцо или "гетероцикл" может представлять собой моноциклическую, бициклическую, спироциклическую или полициклическую кольцевую систему. Не ограничивающие примеры "гетероциклоалкила", "гетероциклического кольца" или "гетероцикла" включают пирролидин, пиперидин, имидазолидин, пиразолидин, бутиролактам, валеролактам, имидазолидинон, гидантоин, диоксолан, фталимид, пиперидин, пиримидин-2,4(1H, 3H)-дион, 1,4-диоксан, морфолин, тиоморфолин, тиоморфолин-S-оксид, тиоморфолин-S,S-оксид, пиперазин, пиран, пиридон, 3-пирролин, тиопиран, пирон, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, хинуклидин, тропан и тому подобное. "Гетероциклоалкильная", "гетероциклическая" группа или "гетероцикл" может быть присоединен к остальной части молекулы посредством одного или более чем одного кольцевого атома углерода или гетероатома. "Гетероциклоалкил", "гетероциклическое" кольцо или "гетероцикл" может включать их моно- и полигалогенированные варианты.
2
2
2
2
Термин "алкилен" сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, образованный из алкана, примером которого является -CHCHCHCH-. Типично алкильная (или алкиленовая) группа имеет от 1 до 24 атомов углерода, где в настоящем изобретении предпочтительны те группы, которые имеют 10 или меньшее число атомов углерода. "Галогеноалкилен" относится к моно- и полигалогенированному варианту алкилена. "Алкенилен" и "алкинилен" относятся к ненасыщенным формам "алкилена", имеющим двойные или тройные связи, соответственно, и также подразумеваются как включающие моно- и полигалогенированные варианты.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Термин "гетероалкилен" сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, насыщенный, ненасыщенный или полиненасыщенный, образованный из гетероалкила, примерами которого являются -CH-CH-S-CHCH- и -CH-S-CH-CH-NH-CH-, -O-CH-CH=CH-, -CH-СН=С(Н)CH-O-CH- и -S-CH-C≡C-. Для гетероалкиленовых групп гетероатомы могут также занимать любой или оба конца цепи (например, алкиленокси, алкилендиокси, алкиленамино, алкилендиамино и тому подобное).
a
b
Термины "алкокси", "алкиламино" и "алкилтио" (или тиоалкокси) используют в их общепринятом смысле, и они относятся к алкильным группам, присоединенным к остальной части молекулы через атом кислорода, аминогруппу или атом серы, соответственно. Кроме того, для групп диалкиламино алкильные части могут быть одинаковыми или разными, а также могут быть объединены с образованием 3-7-членного кольца с атомом азота, к которому присоединена каждая. Соответственно, группу, представленную как -NRR, подразумевают как включающую пиперидинил, пирролидинил, морфолинил, азетидинил и тому подобное.
1-4
Термины "галогено" или "атом галогена", сами по себе или как часть другого заместителя, означают, если не указано иное, атом фтора, хлора, брома или йода. Кроме того, термины, такие как "галогеноалкил", подразумевают как включающие моногалогеноалкил и полигалогеноалкил. Например, термин "Cгалогеноалкил" подразумевают как включающий трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3-бромпропил, дифторметил и тому подобное.
Термин "арил" означает, если не указано иное, полиненасыщенную, типично ароматическую, углеводородную группу, которая может представлять собой одно кольцо или множественные кольца (вплоть до трех колец), которые конденсированы вместе. Термин "гетероарил" относится к арильным группам (или кольцам), которые содержат от одного до пяти гетероатомов, выбранных из N, O и S, где атомы азота и серы необязательно окислены, а атом(ы) азота необязательно кватернизирован. Гетероарильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы через гетроатом. Неограничивающие примеры арильных групп включают фенил, нафтил и дифенил, тогда как неограничивающие примеры гетероарильных групп включают пиридил, пиридазинил, пиразинил, пиримидинил, триазинил, хинолинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, фталазинил, бензотриазинил, пуринил, бензимидазолил, бензопиразолил, бензотриазолил, бензизоксазолил, изобензофурил, изоиндолил, индолизинил, бензотриазинил, тиенопиридинил, тиенопиримидинил, пиразолопиримидинил, имидазопиридины, бензотиаксолил, бензофуранил, бензотиенил, индолил, хинолил, изохинолил, изотиазолил, пиразолил, индазолил, птеридинил, имидазолил, триазолил, тетразолил, оксазолил, изоксазолил, тиадиазолил, пирролил, тиазолил, фурил, тиенил и тому подобное. Необязательные заместители для каждого из вышеуказанных арильных и гетероарильных кольцевых систем могут быть выбраны из группы приемлемых заместителей, дополнительно описанных ниже.
Вышеописанные термины (например, "алкил", "арил" и "гетероарил") в некоторых формах осуществления включают как замещенные, так и незамещенные формы указанного радикала. Предпочтительные заместители для каждого типа радикала приведены ниже.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
2
1-4
1-6
1-6
1-6
1-6
1-4
2
1-4
2
1-4
Заместители для алкильных радикалов (включая группы, часто называемые алкилен, алкенил, алкинил, гетероалкил и циклоалкил) могут представлять собой разнообразные группы, включающие, но не ограниченные ими, -атом галогена, -OR', -NR'R'', -SR', -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -COR', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'''C(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NHC(NH)=NH, -NR'C(NH)=NH, -NHC(NH)=NR', -NR'''C(NR'R'')=N-CN, -NR'''C(NR'R'')=NOR', -NHC(NH)=NR', -S(O)R', -S(O)R', -S(O)NR'R'', -NR'S(O)R'', -NR'''S(O)NR'R'', -CN, -NO, -(CH)-OR', -(CH)-NR'R'', -(CH)-SR', -(CH)-SiR'R''R''', -(CH)-OC(O)R', -(CH)-C(O)R', -(CH)-COR', -(CH)CONR'R'', в количестве в интервале от нуля до (2m'+1), где m' представляет собой суммарное число атомов углерода в таком радикале. R', R'' и R''' каждый независимо относится к группам, включающим среди прочего, например, атом водорода, незамещенный Cалкил, незамещенный гетероалкил, незамещенный арил, арил, замещенный 1-3 атомами галогена, незамещенный Cалкил, группы Cалкокси или Cтиоалкокси или незамещенные группы арил-Cалкил, незамещенный гетероарил, замещенный гетероарил. Когда R' и R'' присоединены к одному и тому же атому азота, они могут быть объединены с этим атомом азота с образованием 3-, 4-, 5-, 6- или 7-членного кольца. Например, -NR'R'' подразумевают как включающий 1-пирролидинил и 4-морфолинил. Другие заместители для алкильных радикалов, включая гетероалкил, алкилен, включают, например, =O, =NR', =N-OR', =N-CN, =NH, где R' включает заместители, как описано выше. Когда заместитель для алкильных радикалов (включая группы, часто называемые алкилен, алкенил, алкинил, гетероалкил и циклоалкил) содержит алкиленовый линкер (например, -(CH)-NR'R''), этот алкиленовый линкер включает также галогено-варианты. Например, линкер "-(CH)-" при использовании в качестве части заместителя подразумевают как включающий дифторметилен, 1,2-дифторэтилен и т.д.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
1-4
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
1-4
2
2
1-4
1-6
3-6
2-6
2-6
1-4
1-4
2
1-4
2
1-4
Подобным образом, заместители для арильных и гетероарильных групп варьируют и обычно выбраны из группы, включающей, но не ограниченной ими, -атом галогена, -OR', -OC(O)R', -NR'R'', -SR', -R', -CN, -NO, -COR', -CONR'R'', -C(O)R', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR''C(O)R', -NR'C(O)NR''R''', -NHC(NH)=NH, -NR'C(NH)=NH, -NHC(NH)=NR', -S(O)R', -S(O)R', -S(O)NR'R'', -NR'S(O)R'', -N, перфтор-Cалкокси и перфтор-Cалкил, -(CH)-OR', -(CH)-NR'R'', -(CH)-SR', -(CH)-SiR'R''R''', -(CH)-OC(O)R', -(CH)-C(O)R', -(CH)-COR', -(CH)CONR'R'', в количестве в интервале от нуля до суммарного числа открытых валентностей на ароматической кольцевой системе; и где R', R'' и R''' независимо выбраны из атома водорода, Cалкила, Cциклоалкила, Cалкенила, Cалкинила, незамещенного арила и гетероарила, (незамещенный арил)-Cалкила и незамещенного арилокси-Салкила. Другие подходящие заместители включают каждый из вышеописанных заместителей арила, присоединенных к кольцевому атому через алкиленовую цепь из 1-4 атомов углерода. Когда заместитель для арильной или гетероарильной группы содержит алкиленовый линкер (например, -(CH)-NR'R''), этот алкиленовый линкер включает также галогено-варианты. Например, линкер "-(CH)-" при использовании в качестве части заместителя подразумевают как включающий дифторметилен, 1,2-дифторэтилен и т.д.
Как используют в данной заявке, термин "гетероатом" подразумевают как включающий атом кислорода (О), азота (N), серы (S) и кремния (Si).
Как используют в данной заявке, термин "хиральный" относится к молекулам, которые обладают свойством невозможности наложения друг на друга с зеркальным отображением партнера, тогда как термин "ахиральный" относится к молекулам, которые взаимно накладываются на зеркальное изображение партнера.
Как используют в данной заявке, термин "стереоизомеры" относится к соединениям, которые имеют идентичный химический состав, но отличаются в отношении расположения атомов или групп в пространстве.
Как используют в данной заявке, волнистая линия "", которая пересекает связь в химической структуре, указывает на точку присоединения атома, с которым связана эта связь в химической структуре, к остальной части молекулы или к остальной части фрагмента молекулы.
"Диастереомер" относится к стереоизомеру с двумя или более чем двумя центрами хиральности, и молекулы которого не являются зеркальными отображениями друг друга. Диастереомеры обладают различными физическими свойствами, например, точками плавления, точками кипения, спектральными свойствами и реакционными способностями. Смеси диастереомеров можно разделить аналитическими методами высокого разрешения, такими как электрофорез и хроматография.
"Энантиомеры" относятся к двум стереоизомерам соединения, которые представляют собой не накладывающиеся друг на друга зеркальные отображения друг друга.
Стереохимические определения и условные обозначения, используемые в данной заявке, как правило, следуют S.P.Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. Соединения по изобретению могут содержать асимметрические или хиральные центры, и, следовательно, существуют в различных стереоизомерных формах. Подразумевают, что все стереоизомерные формы соединений по изобретению, включающие, но не ограниченные ими, диастереомеры, энантиомеры и атропизомеры, а также их смеси, такие как рацемические смеси, составляют часть настоящего изобретения. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, то есть они обладают способностью вращать плоскость плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения префиксы D и L или R и S используют для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно ее хирального центра(ов). Префиксы d и I или (+) и (-) используют для обозначения знака вращения плоскополяризованного света соединением, где (-) или I означает, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или d является правовращающим. Для данной химической структуры эти стереоизомеры идентичны за исключением того, что они являются зеркальными отображениями друг друга. Конкретный стереоизомер может также называться энантиомером, и смесь таких изомеров часто называют энантиомерной смесью. Смесь энантиомеров 50:50 называют рацемической смесью или рацематом, который может образоваться, где при химической реакции или процессе отсутствовала стереоселективность или стереоспецифичность. Термины "рацемическая смесь" и "рацемат" относятся к эквимолярной смеси двух энантиомерных молекул при отсутствии оптической активности.
Как используют в данной заявке, термин "таутомер" или "таутомерная форма" относится к структурным изомерам различных энергий, которые являются взаимопревращаемыми посредством низкого энергетического барьера. Например, протонные таутомеры (также известные как прототропные таутомеры) включают взаимные превращения посредством миграции протона, такие как кето-енольная и имино-енаминная изомеризация. Валентные таутомеры включают взаимные превращения посредством реорганизации некоторых из связывающих электронов.
Как используют в данной заявке, термин "сольват" относится к ассоциации или комплексу одной или более чем одной молекулы растворителя и соединения по изобретению. Примеры растворителей, которые образуют сольваты, включают, но не ограничены ими, воду, изопропанол, этанол, метанол, ДМСО, этилацетат, уксусную кислоту и этаноламин. Термин "гидрат" относится к комплексу, где молекула растворителя представляет собой воду.
th
Как используют в данной заявке, термин "защитная группа" относится к заместителю, который обычно используют, чтобы блокировать или защитить конкретную функциональную группу на соединении. Например, "амино-защитная группа" представляет собой заместитель, присоединенный к аминогруппе, который блокирует или защищает функциональную группу амино в соединении. Подходящие амино-защитные группы включают ацетил, трифторацетил, трет-бутоксикарбонил (ВОС), бензилоксикарбонил (CBZ) и 9-флуоренилметиленоксикарбонил (Fmoc). Подобным образом, "гидрокси-защитная группа" относится к заместителю гидроксигруппы, который блокирует или защищает функциональную группу гидрокси. Подходящие защитные группы включают ацетил и силил. "Карбокси-защитная группа" относится к заместителю карбоксигруппы, который блокирует или защищает функциональную группу карбокси. Общепринятые карбокси-защитные группы включают фенилсульфонилэтил, цианоэтил, 2-(триметилсилил)этил, 2-(триметилсилил)этоксиметил, 2-(пара-толуолсульфонил)этил, 2-(пара-нитрофенилсульфенил)этил, 2-(дифенилфосфино)-этил, нитроэтил и тому подобное. Общее описание защитных групп и их использования см. в P.G.M. Wuts and T.W.Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis 4 edition, Wiley-Interscience, New York, 2006.
Как используют в данной заявке, термин "млекопитающее" включает, но не ограничено ими, людей, мышей, крыс, морских свинок, обезьян, собак, кошек, лошадей, коров, свиней и овец.
Как используют в данной заявке, термин "фармацевтически приемлемые соли" подразумевают как включающий соли активных соединений, которые получают с относительно нетоксичными кислотами или основаниями в зависимости от конкретных заместителей, находящихся на соединениях, описанных в данной заявке. Когда соединения по настоящему изобретению содержат относительно кислые функциональные группы, соли присоединения основания могут быть получены путем приведения в контакт нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством желаемого основания, либо в чистом виде, либо в подходящем инертном растворителе. Примеры солей, образованных из фармацевтически приемлемых неорганических оснований, включают соли алюминия, аммония, кальция, меди, железа, двухвалентного железа, лития, магния, марганца, двухвалентного марганца, калия, натрия, цинка и тому подобные. Соли, образованные из фармацевтически приемлемых органических оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, включающих замещенные амины, циклические амины, природные амины и тому подобное, такие как аргинин, бетаин, кофеин, холин, N,N'-дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, N-этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, полиаминные смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и тому подобное. Когда соединения по настоящему изобретению содержат относительно основные функциональные группы, соли присоединения кислоты могут быть получены путем приведения в контакт нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством желаемой кислоты, либо в чистом виде, либо в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты включают соли, образованные из неорганических кислот, таких как соляная, бромистоводородная, азотная, карбоновая, моногидрокарбоновая, фосфорная, моногидрофосфорная, дигидрофосфорная, серная, моногидросерная, йодистоводородная или фосфористая кислота и тому подобное, а также соли, образованные из относительно нетоксичных органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, изомасляная, малоновая, бензойная, янтарная, пробковая, фумаровая, миндальная, фталевая, бензолсульфоновая, пара-толуолсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и тому подобное. Также включены соли аминокислот, такие как аргинат и тому подобное, и соли органических кислот, таких как глюкуроновая или галактуроновая кислота и тому подобное (см., например, Berge, S.M., et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Некоторые конкретные соединения по настоящему изобретению содержат как основные, так и кислые функциональные группы, которые дают возможность преобразовывать соединения в желаемые соли присоединения основания или кислоты.
Нейтральные формы соединений могут быть регенерированы путем приведения соли в контакт с основанием или кислотой и выделения исходного соединения общепринятым способом. Исходная форма соединения отличается от различных солевых форм некоторыми физическими свойствами, такими как растворимость в полярных растворителях, но в остальном соли эквивалентны исходной формы соединения для целей настоящего изобретения.
В дополнение к солевым формам, в настоящем изобретении предложены соединения, которые находятся в форме пролекарства. Как используют в данной заявке, термин "пролекарство" относится к тем соединениям, которые легко претерпевают химические изменения в физиологических условиях с получением соединений по настоящему изобретению. Кроме того, пролекарства могут быть преобразованы в соединения по настоящему изобретению химическими или биохимическими методами в окружающей среде ex vivo. Например, пролекарства могут медленно преобразовываться в соединения по настоящему изобретению при помещении в резервуар чрескожного пластыря с подходящим ферментом или химическим реагентом.
Пролекарства по изобретению включают соединения, где аминокислотный остаток или полипептидная цепь из двух или более чем двух (например, двух, трех или четырех) аминокислотных остатков ковалентно соединена посредством амидной или эфирной связи к свободной амино-, гидрокси- или карбоново-кислотной группе соединения по настоящему изобретению. Эти аминокислотные остатки включают, но не ограничены ими, 20 природных аминокислот, обычно обозначаемых трехбуквенными символами, а также включают фосфосерин, фосфотреонин, фосфотирозин, 4-гидроксипролин, гидроксилизин, десмозин, изодесмозин, гамма-карбоксиглутамат, гиппуровую кислоту, октагидроиндол-2-карбоновую кислоту, статин, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, пеницилламин, орнитин, 3-метилгистидин, норвалин, бета-аланин, гамма-аминомасляную кислоту, цитруллин, гомоцистеин, гомосерин, метилаланин, пара-бензоилфенилаланин, фенилглицин, пропаргилглицин, саркозин, метионинсульфон и трет-бутил глицин.
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-4
2
1-6
2
Включены также дополнительные типы пролекарств. Например, свободная карбоксильная группа соединения по изобретению может быть дериватизирована в виде амида или алкилэфира. В качестве другого примера, соединения по данному изобретению, содержащие свободные гидроксигруппы, могут быть дериватизированы в виде пролекарств путем преобразования гидроксигруппы в группу, такую как, но не ограниченную ими, фосфатноэфирная, гемисукцинатная, диметиламиноацетатная или фосфорилоксиметилоксикарбонильная группа, как описано в Fleisher, D. et al. (1996) Improved oral drug delivery: solubility limitations overcome by the use of prodrugs Advanced Drug Delivery Reviews, 19:115. Карбаматные пролекарства гидрокси- и аминогрупп также включены, как и карбонатные пролекарства, сложные эфиры сульфонаты и сложные эфиры сульфаты гидрокси групп. Также включена дериватизация гидроксигрупп в виде (ацилокси)метиловых и (ацилокси)этиловых эфиров, где ацильная группа может представлять собой сложный алкилэфир, необязательно замещенный группами, включающими, но не ограниченными ими, эфирные, аминные и карбоново-кислотные функциональные группы, или где ацильная группа представляет собой сложный эфир аминокислоты, как описано выше. Пролекарства этого типа описаны в J. Med. Chem., (1996), 39:10. Более конкретные примеры включают замещение атома водорода спиртовой группы группой, такой как (C)алканоилоксиметил, 1-((C)алканоилокси)этил, 1-метил-1-((C)алканоилокси)этил, (C)алкоксикарбонилоксиметил, N-(C)алкоксикарбониламинометил, сукцинил, (C)алканоил, альфа-амино(C)алканоил, арилацил и альфа-аминоацил или альфа-аминоацил-альфа-аминоацил, где каждая альфа-аминоацильная группа независимо выбрана из природных L-аминокислот, Р(O)(OH), -P(O)(O(C)алкил) или гликозила (радикала, полученного в результате удаления гидроксильной группы углевода в форме полуацеталя).
Дополнительные примеры пролекарственных производных см., например, в a) Design of Prodrugs, edited by H.Bundgaard, (Elsevier, 1985) и Methods in Enzymology, Vol.42, p.309-396, edited by K.Widder, et al. (Academic Press, 1985); b) A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen and H.Bundgaard, Chapter 5 "Design and Application of Prodrugs," by H.Bundgaard p.113-191 (1991); с) H.Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8: 1-38 (1992); d) H.Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77:285 (1988); и е) N.Kakeya, et al., Chem. Pharm. Bull., 32:692 (1984), где каждая ссылка конкретно включена в данную заявку посредством ссылки.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены метаболиты соединений по изобретению. Как используют в данной заявке, "метаболит" относится к продукту, образующемуся посредством метаболизма конкретного соединения или его соли в организме. Такие продукты могут образоваться в результате, например, окисления, восстановления, гидролиза, амидирования, дезамидирования, этерификации, деэтерификации, ферментативного расщепления и тому подобного введенного соединения.
14
3
Продукты, являющиеся метаболитами, типично идентифицируют путем получения радиоактивно меченого (например, C или H) изотопа соединения по изобретению, введения его парентерально в обнаружимой дозе (например, более чем примерно 0,5 мг/кг) животному, такому как крыса, мышь, морская свинка, обезьяна, или человеку, давая возможность пройти достаточному времени для прохождения метаболизма (типично примерно от 30 секунд до 30 часов), и выделения продуктов его преобразования из мочи, крови или других биологических образцов. Эти продукты легко выделяются, поскольку они являются мечеными (другие выделяют с использованием антител, способных к связыванию эпитопов, выживающих в метаболите). Структуры метаболитов определяют общепринятым путем, например, с помощью анализа МС, ЖХ/MS или ЯМР. Как правило, анализ метаболитов осуществляют таким же путем, как при общепринятых исследованиях метаболизма лекарств, хорошо известных специалистам в данной области техники. Продукты, являющиеся метаболитами, поскольку они не обнаруживаются in vivo иным путем, полезны при диагностических анализах для терапевтического дозирования соединений по изобретению.
Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать как в несольватированных формах, так и в сольватированных формах, включая гидратированные формы. Как правило, сольватированные формы эквивалентны несольватированным формам и подразумеваются как включенные в объем настоящего изобретения. Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в множественных кристаллических или аморфных формах. Как правило, все физические формы эквивалентны для применений, рассматриваемых настоящим изобретением, и подразумеваются как находящиеся в пределах объема настоящего изобретения.
Некоторые соединения по настоящему изобретению обладают асимметрическими атомами углерода (оптическими центрами) или двойными связями; рацематы, диастереомеры, геометрические изомеры, региоизомеры и индивидуальные изомеры (например, отдельные энантиомеры) - все подразумевают как включенные в объем настоящего изобретения.
2
3
11
13
14
13
15
15
17
18
32
33
35
18
36
123
125
3
14
3
14
2
15
13
11
18
Соединения по настоящему изобретению могут также содержать неприродные доли атомных изотопов в одном или более чем одном из атомов, которые составляют такие соединения. Например, настоящее изобретение также заключает в себе изотопно-меченые варианты по настоящему изобретению, которые идентичны описанным в данной заявке, кроме того факта, что один или более чем один атом замещен атомом, имеющим атомную массу или массовое число, отличающееся от преобладающей атомной массы или массового числа, обычно обнаруживаемого в природе для этого атома. Все изотопы любого конкретного атома или элемента, как указано, рассматривают в пределах объема соединений по изобретению и их применений. Примерные изотопы, которые могут быть включены в соединения по изобретению, включают изотопы атома водорода, углерода, азота, кислорода, фосфора, серы, фтора, хлора и йода, такие как H, H, C, C, C, N, N, O, O, O, P, P, S, F, Cl, I и I. Некоторые изотопно-меченые соединения по настоящему изобретению (например, меченые H или C) полезны при анализах тканевого распределения соединения и/или субстрата. Мечение изотопами тритием (H) и углеродом-14 (C) полезно в связи с легкостью их получения и обнаружения. Дополнительное замещение более тяжелыми изотопами, такими как дейтерий (то есть H), может дать определенные терапевтические преимущества в результате большей метаболической стабильности (например, увеличенное время полувыведения in vivo или сниженные потребности в дозировке) и, следовательно, могут быть предпочтительными при некоторых обстоятельствах. Изотопы, испускающие позитроны, такие как O, N, C и F, полезны для исследований позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ), чтобы исследовать занятость рецепторов субстратом. Изотопно-меченые соединения по настоящему изобретению в целом могут быть получены нижеследующими методами, аналогичными раскрытым в Схемах и/или в Примерах в данной заявке ниже, путем замены не меченого изотопом реагента изотопно-меченым реагентом.
Термины "лечить" и "лечение" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам, где целью является предупреждение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения или расстройства, такого как развитие или распространение рака. Для целей данного изобретения полезные или желательные клинические результаты включают, но не ограничены ими, облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания, стабилизированное (то есть не ухудшающееся) состояние заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, ослабление или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию (либо частичную, либо полную), либо обнаружимые, либо не обнаружимые. "Лечение" может также означать продление выживания по сравнению с ожидаемым выживанием, если не получать лечения. Нуждающиеся в лечении включают как тех, кто уже страдает состоянием или расстройством, так и тех, кто склонен к этому состоянию или расстройству, или тех, у кого нужно предупреждать это состояние или расстройство.
Выражение "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения по настоящему изобретению, которое (i) лечит или предупреждает конкретное заболевание, состояние или расстройство, (ii) ослабляет, облегчает или устраняет один или более чем один симптом конкретного заболевания, состояния или расстройства или (iii) предупреждает или задерживает возникновение одного или более чем одного симптома конкретного заболевания, состояния или расстройства. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарства может снизить число раковых клеток, уменьшить размер опухоли; ингибировать (то есть замедлить до некоторой степени и предпочтительно остановить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (то есть замедлить до некоторой степени и предпочтительно остановить) метастазы опухоли; ингибировать до некоторой степени опухолевый рост и/или облегчить до некоторой степени один или более чем один симптом, связанный с раком. До той степени, до которой лекарство может предупреждать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Для терапии рака эффективность может быть измерена, например, путем оценки времени до прогрессирования заболевания (ТТР) и/или определения скорости ответа (RR).
Термины "рак" и "раковый" относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих, которое типично характеризуется нерегулируемым клеточным ростом, или описывают это состояние. "Опухоль" включает одну или более чем одну раковую клетку. Примеры рака включают, но не ограничены ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфоидные злокачественные опухоли. Более конкретные примеры таких раков включают чешуйчато-клеточный рак (например, эпителиальный чешуйчато-клеточный рак), рак легкого, включающий мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого ("НМКРЛ"), аденокарциному легкого и чешуйчато-клеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночно-клеточный рак, рак ЖКТ или рак желудка, включая рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки или почечно-клеточный рак, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, анальную карциному, карциному полового члена, а также рак головы и шеи.
Как используют в данной заявке, термин "вспомогательное средство" относится к применению активных соединений в сочетании с известными терапевтическими средствами. Такие средства включают цитотоксические режимы лекарств и/или ионизирующее излучение, которые используют при лечении различных типов рака. Примеры химиотерапевтических агентов, которые можно комбинировать с соединениями по изобретению, включают эрлотиниб (Тарцева, Genentech/OSI Pharm.), бортезомиб (Велкейд, Millennium Pharm.), фулвестрант (Фазлодекс, AstraZeneca), сутент (SU 11248, Pfizer), летрозол (Фемара, Novartis), иматиниб мезилат (Гливек, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), оксалиплатин (Элоксатин, Sanofi), 5-FU (5-фторурацил), лейковорин, рапамицин (Сиролимус, Рапамун, Wyeth), лапатиниб (Тайкерб, GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафарниб (SCH 66336), сорафениб (BAY43-9006, Bayer Labs) и гефитиниб (Иресса, AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), алкилирующие агенты, такие как тиотепа и Цитоксан циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбохинон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включающие алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметиломеламин; ацетогенины (в частности, буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, меклоретамин, меклоретамин окид гидрохлорид, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихеамицин, в частности, калихеамицин гамма 1I и калихеамицин омегаI1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33: 183-186); динемицин, включая динемицин А; бифосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; а также неокарзиностатин хромофор и родственные хромопротеиновые хромофоры ендииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, актиномицин, карабицин, карминомицин, карзинофиллин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, Адриамицин (доксорубицин), морфолинодоксорубицин, цианоморфолинодоксорубицин, 2-пирролинодоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофенольную кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанидин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналиновые средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиний ацетат; эпотилон; этоглуцид; галлия нитрат; гидроксимочевину; лентинан; лонидаинин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK полисахаридный комплекс (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангвидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-C"); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, Таксол (паклитаксел; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), Абраксан™ (без кремофора), препараты паклитаксела в виде наночастиц, сконструированных с альбумином (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, III.), и Таксотер (доксетаксел; Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; Гемзар (гемцитабин); 6-тиогуанидин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; Навелбин (винорелбин); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; капецитабин (Кселода); ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; а также фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеописанного.
В определение "химиотерапевтический агент" также включены: (i) антигормональные агенты, которые действуют таким образом, что регулируют или ингибируют действие гормонов на опухоли, такие как антиэстрогены и селективные модуляторы рецептора эстрогена (SERM), включающие, например, тамоксифен (включая Нолвадекс; тамоксифен цитрат), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и Фарестон (торемифин цитрат); (ii) ингибиторы ароматазы, которые ингибируют фермент ароматазу, которые регулируют продуцирование эстрогена в надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, MEGASE (мегестрол ацетат), Аромазин (эксеместан; Pfizer), форместан, фадрозол, Ривизор (ворозол), Фемара (летрозол; Novartis) и Аримидекс (аназострол; AstraZeneca); (iii) антиандрогенные средства, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, леупролид и гозерелин; а также троксацитабин (1,3-диоксолан, аналог нуклеотида цитозина); (iv) ингибиторы протеинкиназы, например, ингибитор PI3K, ингибитор МЕК и т.д; (v) ингибиторы липидкиназы; (vi) антисенс-олигонуклеотиды, в частности, те, которые ингибируют экспрессию генов в биохимических путях передачи сигнала, вовлеченных в аберрантную клеточную пролиферацию, такие как, например, РКС-альфа, Ralf и H-Ras; (vii) рибозимы, такие как ингибиторы экспрессии VEGF (например, Ангиозим) и ингибиторы экспрессии HER2; (viii) вакцины, такие как генотерапевтические вакцины, например, Алловектин, Леувектин и Ваксид; Пролейкин rIL-2; ингибитор топоизомеразы 1, такой как Лутротекан; Абареликс rmRH; (ix) антиангиогенные агенты, такие как бевацизумаб (Авастин, Genentech); и (х) фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеописанного. Активные соединения можно также применять в качестве добавок клеточной культуры, чтобы ингибировать mTOR, например, с целью сенсибилизации клеток к известным химиотерапевтическим агентам или ионизирующим радиотерапиям in vitro.
I.A Соединения
В одном аспекте в настоящем изобретении предложено соединение формулы I:
1
2
1
1
2
1
1
1
R1
a
b
a
a
a
a
b
a
a
b
c
a
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
c
c1
1
a
b
1
a
1
a
1
a
1
a
b
1
a
1
a
b
1
a
1
a
a
b
1
a
b
1
a
a
b
1
a
1
a
b
1
1
1
1
c1
a
b
a
b
c
1
c1
c1
a
b
a
a
a
a
b
2
2
R2
d
e
d
d
d
d
e
d
d
e
f
d
d
e
d
e
d
d
e
d
d
e
f
2
d
e
2
d
2
d
2
d
2
d
e
2
d
2
d
e
2
d
2
d
d
e
2
d
e
2
d
d
e
2
d
2
d
e
2
2
2
d
e
d
e
f
2
3
3
R3
g
g
h
g
h
g
g
i
i
i
g
h
g
h
i
3
R3
3
1
2
3
4
A
1
2
3
4
A
A
A
4
5
6
5
6
5
6
5
5
6
4
5
6
4
5
5
6
4
5
5
6
4
5
4
5
4
5
6
4
5
4
5
6
5
6
D
4
5
6
D
D
j
k
j
j
j
j
k
j
k
j
3
j
k
3
j
3
j
3-
j
3
j
k
3
j
k
3
j
k
3
3
m
m
m
j
k
m
3
A
D
1-6
2-6
2-6
1-6
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-4
2-4
2-4
2
2
2
3
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
2-6
2-6
1-6
6-10
1-9
3-12
2-12
1-6
2-6
2-6
1-6
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-4
2-4
2-4
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
3-6
1-6
1-6
2-6
3-6
2
1-4
2-4
2-4
2-6
3-7
1-5
2
2
1-6
1-6
2-6
1-6
1-6
2-6
2-6
3-10
2-10
6-10
1-9
2
m
2
2
1-6
1-6
2-6
2-6
1-6
3-7
3-7
6-10
1-9
1-6
1-6
3-7
3-7
6-10
1-9
1-4
2-4
2-4
В формуле I Y и Y каждый независимо представляет собой N или C(R), но Y и Y оба не представляют собой N или оба не представляют собой C(R), где R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, 6-10-членного арила, 5-9-членного гетероарила, 3-12-членного гетероциклоалкила, 3-12-членного циклоалкила, где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 5, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -C(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)R, -NRC(O)R, -OC(O)R, -NRC(O)NRR, -OC(O)NRR, -NRS(O)NRR, -S(O)R, -S(O)NRR, -R, -NO, -N, =O, -CN, R, -X-NRR, -X-SR, -X-OR, -X-C(O)OR, -X-C(O)NRR, -X-C(O)R, -X-NRC(O)R, -X-OC(O)R, -X-NRC(O)NRR, -X-OC(O)NRR, -X-NRS(O)NRR, -X-S(O)R, -X-S(O)NRR, -X-NO, -X-N, -X-CN и X-R; где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила, необязательно R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S; R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила; X выбран из группы, состоящей из Cалкилена, Cалкенилена и Cалкинилена; и R выбран из группы, состоящей из фенила, 2-пиридила, 3-пиридила, 4-пиридила, 2-имидазолила, 2-индолила, 1-нафтила, 2-нафтила, 2-тиенила, 3-тиенила, 2-пирролила, 2-фуранила и 3-фуранила, и где R замещен заместителями в количестве от 0 до 3, выбранными из F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -S(O)R, -S(O)NRR, -NO, -N, =O, -CN, пиридила, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила и Cгетероалкила. В формуле I R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, -L-Cарила, -L-Cгетероарила, -L-Cциклоалкила и -L-Cгетероциклоалкила, где L выбран из Cалкилена, Cалкенилена, Cалкинилена и Cгетероалкилена, и где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 5, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -C(O)OR, -C(O)NRR, -С(O)R, -NRC(O)R, -OC(O)R, -NRC(O)NRR, -OC(O)NRR, -NRS(O)NRR, -S(O)R, -S(O)NRR, -R, -NO, -N, =O, -CN, -X-NRR, -X-SR, -X-OR, -X-C(O)OR, -X-C(O)NRR, -X-C(O)R, -X-NRC(O)R, -X-OC(O)R, -X-NRC(O)NRR, -X-OC(O)NRR, -X-NRS(O)NRR, -X-S(O)R, -X-S(O)NRR, -X-NO, -X-N и -X-CN; где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила, необязательно R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S; R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила; и X выбран из группы, состоящей из Cалкилена, Cалкенилена и Cалкинилена. R представляет собой 5-12-членное моноциклическое или мостиковое гетероциклоалкильное кольцо, где группа R замещена заместителями R в количестве от 0 до 3, выбранными из группы, состоящей из -C(O)OR, -C(O)NRR, -NRR, -OR, -SR, -S(O)R, -S(O)R, -R, атома галогена, F, Cl, Br, I, -NO, -CN и -N, где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила и Cциклоалкила, где необязательно R и R, вместе с атомом азота, к которому присоединен каждый, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S, и R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cциклоалкила; и, когда R представляет собой моноциклическое гетероциклоалкильное кольцо, любые две группы R, присоединенные к одному и тому же атому азота R, необязательно объединены с образованием 3-7-членного карбоциклического или 3-7-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 атомов, выбранных из N, O и S, в качестве вершин кольца. A, A, A и A каждый представляет собой элемент, независимо выбранный из N, C(R) или C(H), где по меньшей мере три из A, A, A и A каждый независимо представляет собой C(H) или C(R), где R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из F, Cl, Br, I, -NO, -CN, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, или любые две группы R, присоединенные к соседним атомам, необязательно объединены с образованием Cгетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S, в качестве вершин кольца, Cциклоалкильного кольца, Cгетероарильного кольца, содержащего от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N, O и S, в качестве вершин кольца, или фенильного кольца. D представляет собой элемент, выбранный из группы, состоящей из -NRC(O)NRR, -NRR, -C(O)NRR, -OC(O)OR, -OC(O)NRR, -NRC(=N-CN)NRR, -NRC(=N-OR)NRR, -NRC(=N-NR)NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -NRS(O)NRR и -NRS(O)R, где R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила и Cалкенила; R и R каждый независимо выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, Cарила и Cгетероарила, и R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, необязательно объединены с образованием 5-7-членного гетероциклического или 5-9-членного гетероарильного кольца, содержащего от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O и S, в качестве вершин кольца и замещенного 0-3 заместителями R; и где R, R и R дополнительно замещены 0-3 заместителями R, где R независимо выбран из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NO, -CN, -NRR, -OR, -SR, -С(O)OR, -С(O)NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -X-NRR, -X-OR, -X-SR, -XC(O)OR, -X-C(O)NRR, -X-NRC(O)R, -X-NRC(O)OR, -X-CN, -X-NO, -S(O)R, -S(O)R, =O и -R; где R и R выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, Cарила, Cгетероарила; и R в каждом случае независимо выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, Cарила и Cгетероарила; и X выбран из группы, состоящей из Cалкилена, Cалкенилена и Cалкинилена, и где D и заместитель R, присоединенный к атому, который является соседним с атомом, к которому присоединен D, необязательно объединены с образованием необязательно замещенного 5-6-членного гетероциклического или гетероарильного кольца, замещенного 0-4 заместителями R.
В одной форме осуществления соединения формулы I имеют формулу I-A:
.
В другой форме осуществления соединения формулы I имеют формулу I-B:
.
3
3
R3
g
g
h
g
h
g
g
i
i
i
g
h
g
h
i
3
R3
3
3
R3
g
h
g
i
3
R3
3
3
3
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
3-6
1-6
1-6
2-6
3-6
В другой форме осуществления в соединениях формулы I, I-A и I-B R выбран из группы, состоящей из морфолин-4-ила, 3,4-дигидро-2H-пиран-4-ила, 3,6-дигидро-2H-пиран-4-ила, тетрагидро-2H-пиран-4-ила, 1,4-оксазепан-4-ила, 2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ила, 3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ила, пиперидин-1-ила и 8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ила, где группа R замещена заместителями R в количестве от 0 до 3, выбранными из группы, состоящей из -C(O)OR, -C(O)NRR, -NRR, -OR, -SR, -S(O)R, -S(O)R, -R, атома галогена, F, Cl, Br, I, -NO, -CN и -N, где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила и Cциклоалкила, где необязательно R и R, вместе с атомом азота, к которому присоединен каждый, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S, и R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cциклоалкила; и, если R представляет собой моноциклическое гетероциклоалкильное кольцо, любые две группы R, присоединенные к одному и тому же атому R, необязательно объединены с образованием 3-7-членного карбоциклического или 3-7-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 атомов, выбранных из N, O и S, в качестве вершин кольца. В некоторых аспектах данной формы осуществления R замещен заместителями R в количестве от 0 до 2, выбранными из -NRR, -OR и R, и, если R представляет собой моноциклическое гетероциклоалкильное кольцо, любые две группы R, присоединенные к одному и тому же атому R, необязательно объединены с образованием 3-7-членного карбоциклического или 3-7-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 атомов, выбранных из N, O и S, в качестве вершин кольца. В некоторых аспектах данной формы осуществления R необязательно замещен метилом или этилом. В некоторых аспектах данной формы осуществления R выбран из группы, состоящей из морфолин-4-ила, 3(R)-метилморфолин-4-ила, 3(S)-метилморфолин-4-ила, 3(R)-этилморфолин-4-ила, 3(S)-этилморфолин-4-ила, 3(R)-изопропилморфолин-4-ила, 3(S)-изопропилморфолин-4-ила, 3,3-диметилморфолин-4-ила, 3,4-дигидро-2H-пиран-4-ила, 3,6-дигидро-2H-пиран-4-ила, тетрагидро-2H-пиран-4-ила, 1,4-оксазепан-4-ила, пиперидин-1-ила, 2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ила, 3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ила, 4-метоксипиперидин-1-ила и 8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ила.
В другой форме осуществления соединения формулы I выбраны из группы, состоящей из
, , ,
,  и
В другой форме осуществления соединения формулы I имеют формулу I-С:
1
2
2
3
5
6
где Y, Y, R, R, R и R являются такими, как определено в данной заявке.
4
5
6
5
6
5
6
4
5
6
4
5
4
5
4
5
6
4
5
2
2
В другой форме осуществления в соединениях формулы I, I-A или I-B D выбран из группы, состоящей из -NRC(O)NRR, -NRR, -C(O)NRR, -NRC(=N-CN)NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -NRS(O)NRR и -NRS(O)R.
4
5
6
5
6
4
5
6
5
6
D
5
6
5
6
5
6
5
6
1-6
1-6
1-6
3-7
2-7
6-10
1-9
1-3
6-10
1-9
3-7
1-3
3-7
В другой форме осуществления в соединениях формулы I D представляет собой -NRC(O)NRR или NRR, где R представляет собой атом водорода, R и R каждый независимо представляет собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cгетероалкила, Cгалогеноалкила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, Cарила и Cгетероарила, и R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, необязательно объединены с образованием 5-7-членного гетероциклического кольца или 5-9-членного гетероарильного кольца, содержащего от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O и S, в качестве вершин кольца, и замещенного заместителями R в количестве от 0 до 3. В некоторых аспектах данной формы осуществления D представляет собой -NRR, где R представляет собой атом водорода или Cалкил, и R представляет собой необязательно замещенный  Cарил, Cгетероарил или Cгетероциклоалкил. В некоторых аспектах данной формы осуществления D представляет собой -NRR, где R представляет собой атом водорода или Cалкил, и R представляет собой необязательно замещенный Cгетероциклоалкил, выбранный из группы, состоящей из:
, , , , ,
, , , , ,
и ;
3-7
D
j
k
j
s
где атом водорода, присоединенный к одной или более чем одной азотной или углеродной вершине кольца в Cгетероциклоалкильном кольце необязательно замещен заместителем R, выбранным из группы, состоящей из F, Cl, Br, I, -NRR, -OR и R. В некоторых аспектах данной формы осуществления D выбран из группы, состоящей из
, , , ,
, , , ,
, ,  и .
5
6
5
6
В другой форме осуществления в соединениях формулы I D представляет собой -NRR, где R и R объединены с образованием необязательно замещенного 5-членного гетероарильного кольца, выбранного из группы, состоящей из пирролила, пиразолила, имидазолила и триазолила.
4
5
6
4
5
6
5
6
4
5
6
6
1-6
1-6
1-6
3-7
3-7
1-6
1-6
В другой форме осуществления в соединениях формулы I D представляет собой -NRC(O)NRR, где R представляет собой атом водорода; R и R каждый независимо представляет собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, 5-6-членного гетероарила и необязательно замещенного фенила. В некоторых аспектах данной формы осуществления один из R и R представляет собой атом водорода. В некоторых аспектах данной формы осуществления R и R каждый представляет собой атом водорода, и R представляет собой необязательно замещенную группу, выбранную из Cалкила и Cгалогеноалкила. В некоторых аспектах данной формы осуществления R выбран из группы, состоящей из
, , , , ,
, , , , ,
,  и .
6
В некоторых аспектах данной формы осуществления R представляет собой этил.
4
5
6
4
5
6
6
j
k
j
6
1-3
В другой форме осуществления в соединениях формулы I D представляет собой -NRC(O)NRR, где R представляет собой атом водорода и R представляет собой атом водорода или Cалкил, и R представляет собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из необязательно замещенного изоксазол-3-ила, изоксазол-4-ила, изоксазол-5-ила, оксазол-2-ила, оксазол-4-ила, оксазол-5-ила, пиразол-3-ила, пиразол-4-ила, пиразол-5-ила, 1,2,3-оксадиазол-4-ила, 1,2,3-оксадиазол-5-ила, 1,3,4-оксадиазол-2-ила, 1,3,4-оксадиазол-5-ила, 2-пиридила, 3-пиридила, 4-пиридила, 5-пиридила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, 2-оксепанила, 3-оксепанила, 2-тетрагидрофуранила, 3-тетрагидрофуранила и фенила. В некоторых аспектах данной формы осуществления R независимо замещен 0-3 заместителями, выбранными из F, Cl, Br, I, -CN, -NRR и -OR. В некоторых аспектах данной формы осуществления R выбран из группы, состоящей из
, , , , ,
, , , ,
, , , , ,
и .
4
5
6
4
5
6
1-3
В другой форме осуществления в соединениях формулы I D представляет собой -NRC(O)NRR, где R представляет собой атом водорода, R представляет собой атом водорода или Cалкил, и R выбран из группы, состоящей из:
A
D
A
В другой форме осуществления в соединениях формулы I D и заместитель R, присоединенный к атому, который является соседним с атомом, к которому присоединен D, необязательно объединены с образованием необязательно замещенного 5-6-членного гетероциклического или гетероарильного кольца, замещенного 0-4 заместителями R. В некоторых аспектах данной формы осуществления это образованное 5-6-членное гетероциклическое или гетероарильное кольцо выбрано из группы, состоящей из необязательно замещенного имидазолидинона, пиразола, имидазола, пирролидинона и пиримидина. В другом аспекте данной формы осуществления D и заместитель R, присоединенный к атому, который является соседним с атомом, к которому присоединен D, необязательно объединены с образованием необязательно замещенного 5-6-членного гетероциклического или гетероарильного кольца, выбранного из группы, состоящей из:
, , ,
,  и .
1
1
R1
a
b
a
a
a
a
b
a
a
b
c
a
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
c
c1
1
a
b
1
a
1
a
1
a
1
a
b
1
a
1
a
b
1
a
1
a
a
b
1
a
b
1
a
a
b
1
a
1
a
b
1
1
1
1
c1
a
b
a
b
c
1
c1
c1
a
b
a
a
a
a
b
2
2
R2
d
e
d
d
d
d
e
d
d
e
f
d
d
e
d
e
d
d
e
d
d
e
f
d
e
d
e
f
1
1
R1
a
b
a
a
a
a
b
a
a
b
c
a
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
c
1
c1
2
R2
1
1
1
1
R1
2
R2
1
1-6
2-6
2-6
1-6
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-4
2-4
2-4
2
2
2
3
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
2-6
2-6
1-6
2
2
2
2
3
1-6
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-6
1-6
2-6
2-6
3-7
2-7
2
1-4
1-6
2-6
2-6
1-6
2
2
2
3
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
1-6
1-6
2-6
2-6
1-6
В другой форме осуществления в соединениях формулы I, I-А или I-В R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, фенила, 5-6-членного гетероарила, 3-7-членного гетероциклоалкила, 3-7-членного циклоалкила, где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 5, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -C(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)R, -NRC(O)R, -OC(O)R, -NRC(O)NRR, -OC(O)NRR, -NRS(O)NRR, -S(O)R, -S(O)NRR, -R, -NO, -N, =O, -CN, R, -X-NRR, -X-SR, -X-OR, -X-C(O)OR, -X-C(O)NRR, -X-C(O)R, -X-NRC(O)R, -X-OC(O)R, -X-NRC(O)NRR, -X-OC(O)NRR, -X-NRS(O)NRR, -X-S(O)R, -X-S(O)NRR, -X-NO, -X-N, -X-CN и X-R; где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила, необязательно R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S; R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила; X выбран из группы, состоящей из Cалкилена, Cалкенилена и Cалкинилена, и R выбран из группы, состоящей из фенила, 2-пиридила, 3-пиридила, 4-пиридила, 2-имидазолила, 2-индолила, 1-нафтила, 2-нафтила, 2-тиенила, 3-тиенила, 2-пирролила, 2-фуранила и 3-фуранила, и где R замещен заместителями в количестве от 0 до 3, выбранными из F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -S(O)R, -S(O)NRR, -NO, -N, =O, -CN, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила и Cгетероалкила. R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила и Cгетероалкила, и где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 3, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -С(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)R, -NRC(O)R, -ОС(O)R, -NRC(O)NRR, -OC(O)NRR, -NRS(O)NRR, -S(O)R, -S(O)NRR, -R, -NO, -N, =O и -CN; где R и R каждый независимо выбран из атома водорода, Cалкила, Cгалогеноалкила, Cгетероалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила, необязательно R и R, когда они присоединены к одному и тому же атому азота, объединены с образованием 3-6-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 2 гетероатомов, выбранных из N, O и S; и R выбран из Cалкила, Cгалогеноалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cциклоалкила, Cгетероциклоалкила, фенила и -(CH)-фенила. В некоторых аспектах данной формы осуществления R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 5, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -C(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)R, -NRC(O)R, -OC(O)R, -NRC(O)NRR, -OC(O)NRR, -NRS(O)NRR, -S(O)R, -S(O)NRR, -R, -NO, -N, =O -CN и X-R; и R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила и замещен заместителями R в количестве от 0 до 3. В некоторых аспектах данной формы осуществления R представляет собой атом водорода или Cалкил, где Cалкил необязательно замещен OH. В некоторых аспектах данной формы осуществления R выбран из группы, состоящей из атома водорода, метила, этила, пропила, изопропила, 2-гидроксипроп-2-ила, бутила, втор-бутила, трет-бутила, изобутила, пентила, диметиламинометила и гексила. В некоторых аспектах данной формы осуществления R выбран из группы, состоящей из циклопропила, циклобутила, циклопентила, циклогексила, азетидин-1-ила, азетидин-2-ила, азетидин-3-ила, пирролидин-1-ила, пирролидин-2-ила, пирролидин-3-ила, пиперидин-1-ила, пиперидин-2-ила, пиперидин-3-ила, пиперидин-4-ила, оксетан-2-ила, оксетан-3-ила, тетрагидрофуран-2-ила, тетрагидрофуран-3-ила, тетрагидропиран-2-ила, тетрагидропиран-3-ила и тетрагидропиран-4-ила, оксепан-2-ила, оксепан-3-ила, оксепан-4-ила, фенила, пиррол-2-ила, пиррол-3-ила, пиразол-3-ила, пиразол-4-ила, пиразол-5-ила, фуран-2-ила, фуран-3-ила, тиен-2-ила, тиен-3-ила, тиазол-2-ила, тиазол-3-ила, тиазол-4-ила, имидазол-1-ила, имидазол-4-ила, пирид-2-ила, пирид-3-ила, пирид-4-ила, пиримидин-1-ила, пиримидин-2-ила, пиримидин-3-ила, пиразин-2-ила, пиридазин-2-ила, пиридазин-3-ила и триазин-2-ила, где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 3; и R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила и замещен заместителями R в количестве от 0 до 3. В некоторых аспектах данной формы осуществления, R выбран из группы, состоящей из:
, , , , ,
, , , , ,
, , ,  и .
1
В некоторых аспектах данной формы осуществления, R выбран из группы, состоящей из:
1
1
R1
a
b
a
a
a
a
b
a
a
b
c
a
a
b
a
b
a
a
b
a
a
b
c
1
c1
2
1-6
2-6
2-6
1-6
2
2
2
2
3
В другой форме осуществления в соединениях формулы I R выбран из группы, состоящей из атома водорода, Cалкила, Cалкенила, Cалкинила, Cгетероалкила, где R замещен заместителями R в количестве от 0 до 5, выбранными из группы, состоящей из атома галогена, F, Cl, Br, I, -NRR, -SR, -OR, -C(O)OR, -C(O)NRR, -C(O)R, -NRC(O)R, -OC(O)R, -NRC(O)NRR, -OC(O)NRR, -NRS(O)NRR, -S(О)R, -S(O)NRR, -R, -NO, -N, =O -CN и X-R; и R выбран из группы, состоящей из атома водорода,
, , , , , , ,
, , , , ,
, , , ,
, , ,  и .
2
2
В некоторых аспектах данной формы осуществления R выбран из группы, состоящей из атома водорода, метила, этила, пропила, изопропила, циклопропилметила и метоксиэтила, в частности, R представляет собой метил или этил.
В другой форме осуществления соединения формулы I выбраны из таблицы 1.
Таблица 1
№
Структура
Название
101
<img file="00000154.tif" he="45" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
1-этил-3-(4-(7-метил-6-морфолино-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина
102
<img file="00000155.tif" he="45" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-этил-3-(4-(7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина
№
Структура
Название
103
<img file="00000156.tif" he="41" wi="52" img-content="undefined" img-format="tif" />
(R)-1-этил-3-(4-(7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина
104
<img file="00000157.tif" he="39" wi="50" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-этил-3-(4-(6-(3-этилморфолино)-7-метил-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина
105
<img file="00000158.tif" he="40" wi="50" img-content="undefined" img-format="tif" />
1-этил-3-(4-(7-метил-6-(1,4-оксазепан-4-ил)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина
106
<img file="00000159.tif" he="39" wi="54" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-этил-3-(4-(7-этил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина
107
<img file="00000160.tif" he="39" wi="66" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-(4-(8-бутил-7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)-3-этилмочевина
108
<img file="00000161.tif" he="39" wi="62" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-этил-3-(4-(8-(2-гидроксипропан-2-ил)-7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина
№
Структура
Название
109
<img file="00000162.tif" he="46" wi="63" img-content="undefined" img-format="tif" />
1-(4-(7-((1S,4S)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ил)-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)-3-этилмочевина
110
<img file="00000163.tif" he="45" wi="63" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-этил-3-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)мочевина
111
<img file="00000164.tif" he="45" wi="63" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-этил-3-(4-(7-(3-этилморфолино)-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)мочевина
112
<img file="00000165.tif" he="45" wi="63" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-этил-3-(4-(7-(3-этилморфолино)-1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)мочевина
113
<img file="00000166.tif" he="45" wi="64" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)-3-(оксетан-3-ил)мочевина
№
Структура
Название
114
<img file="00000167.tif" he="45" wi="73" img-content="undefined" img-format="tif" />
(S)-1-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)-3-(2-(метилсульфонил)этил)мочевина
I.В Синтез соединений
2
Как показано ниже в разделе Примеров, существуют разнообразные пути синтеза, с помощью которых специалист в данной области техники может получить соединения по настоящему изобретению и родственные промежуточные соединения, используемые для получения таких соединений. Приведенные ниже схемы иллюстрируют некоторые общие способы получения соединений по изобретению и ключевых промежуточных соединений. Если не указано иное, сокращения, используемые в приведенных ниже схемах, имеют приведенные ниже значения: R, R', R'', R''' = в каждом случае независимо представляет собой незамещенный или замещенный алкил, алкенил, алкинил, гетероалкил, циклоалкил, гетероциклоалкил, арил или гетероарил, при необходимости защищенный таким образом, чтобы представлять собой не взаимодействующую группу, LG = уходящая группа (например, галогенид, тозилат), Cyc = карбоцикл или гетероцикл, H(Ar) = арильное или гетероарильное кольцо, LDA = диизопропиламид лития, THF = тетрагидрофуран, Х=О, NP, CH, CHR, CRR, Р = защитная группа (например, ВОС),и n = от 1 до 6.
Схема 1 иллюстрирует общий способ синтеза для синтеза 2-хлорпуриновых промежуточных соединений, полезных для получения соединений формулы I. В результате замены атома азота N-7 в дихлорпурине (i), путем, например, алкилирования с использованием R-LG с последующим вытеснением группы С-6 хлоро группой морфолино или другой аминогруппой получают С-6 амино-замещенное соединение iii. Замещение в положении С-8 соединения iii путем, например, первоначального галогенирования соединения iii дает промежуточное соединение iv. В результате последующего опосредованного палладием кросс-сочетания (например, сочетания Сузуки) соединения iv с арил-, гетероарил-. циклоалкил- или гетероциклоалкилборонатом получают промежуточные продукты замещения С-8 (то есть соединение v-a или v-b). Альтернативно в результате депротонирования соединения in с использованием сильного основания с последующим гашением полученного в результате аниона электрофилом, таким как циклический кетон, получают другие промежуточные продукты замещения С-8, например, соединения vi. Преобразование функциональной группы гидрокси соединения vi в группу фторо (как в соединении vii) можно осуществить, используя фторирующий реагент, такой как трифторид диэтиламиносеры (DAST).
Схема 1
th
Схема 2 иллюстрирует способ получения промежуточных соединений по изобретению, при котором порядок замещения положения N-7 и положения С-8 пурина является обратным. Сначала атом азота N-7 дихлорпурина (i) защищают защитной группой пара-метоксибензил (РМВ) с образованием соединения viii. Это положение N-7 может быть также защищено другой защитной группой, такой как группы, которые удаляют в основных или восстановительных условиях, такой как тозилат.Другие защитные группы, подходящие для защиты положения N-7, описаны в P.G.M. Wuts and T.W.Greene, Greene's Protective Groups in Organic Synthesis 4 edition, Wiley-lnterscience, New York, 2006. Вытеснение группы С-6 хлоро группой морфолино или другой аминогруппой дает С-6 амино-замещенный (например, морфолино-замещенный) продукт ix. В результате алкилирования положения С-8 путем депротонирования соединения ix с последующим гашением электрофилом (например, циклическим кетоном) дает соединение х. В результате опосредованного палладием кросс-сочетания (например, сочетания Сузуки) соединения х с арилборонатным реагентом получают арилированный продукт xi. Удаление защитной группы N-7 пара-метоксибензил в окислительных условиях с последующим замещением (например, алкилированием с использованием R-LG) полученного в результате N-7 незащищенного продукта xii дает соединение xiii. Гидрогенизация нитрогруппы в соединении xiii дает промежуточное амино-соединение xiv, которое может быть обработано дополнительно с получением других соединений формулы I, используя способы, дополнительно описанные в резделе Примеров данной заявки.
Схема 2
Схема 3 иллюстрирует некоторые способы обработки положения С-2 пуриновых промежуточных соединений с получением соединений по изобретению. Как показано на схеме 3-А, опосредованная палладием реакция кросс-сочетания с использованием хлоро-соединения xv и соединения фенилмочевина-боронат дает соединение мочевины xvi. Как показано на схеме 3-В, гидрогенизация соединения xvii с последующим ацилированием амино-соединения xviii трифосгеном и взаимодействием полученного в результате карбамоильного соединения с амином обеспечивает альтернативный способ получения мочевинного соединения формулы I с группой фенилмочевина. Схема 3-С иллюстрирует использование арилхлоридного реагента кросс-сочетания в реакции опосредованного палладием кросс-сочетания (сочетания Бухвальда-Хартвига) для получения других соединений формулы I.
Схема 3
Схема 4 иллюстрирует общий синтез пиразоло[4,3-d]пиримидинов формулы I. Дополнительные подробности этого способа синтеза с получением соединений xxiii-xxx описаны в разделе Примеров.
Схема 5 иллюстрирует способ синтеза для получения 1H-пиразоло[4,3-d]пиримидинового соединения формулы I. В результате защиты атома азота пиразоло соединения xxxi тетрагидропиранильной (ТНР) группой получают соединение xxxii. Дальнейшая обработка соединения xxxii аналогично тому, как описано на приведенных выше схемах (например, замещение морфолино, опосредованная палладием реакция кросс-сочетания), дает соединение xxxiv. В результате удаления защитной группы ТНР получают соединение xxxv, которое может быть дополнительно замещено на атоме азота пиразоло с получением дополнительного соединения формулы I. См. Схему 6 ниже.
Схема 5
Схема 6 иллюстрирует некоторый общий способ синтеза для замещения на атоме азота пиразоло в соединениях формулы I, например, путем алкилирования (схема 6А); ацилирования (схема 6В) и восстановительного алкилирования (схема 6С).
Схема 6
4
Схема 7 иллюстрирует общие способы синтеза для получения пиразоло[4,3-d]пиримидиновых соединений формулы I или их промежуточных соединений, полузных для получения соединений формулы I. Схема 7А иллюстрирует способ бромирования соединения xxxvii с использованием N-бромсукцинимида. Схема7 В иллюстрирует восстановление сложного эфира xxxviii с использованием гидридного реагента (LiBH) с последующим тозилированием продукта восстановления с получением тозилата xxxviii-a. Схема 7 С иллюстрирует восстановление сложного эфира xxxviii с использованием гидрида диизобутилалюминия с получением альдегида xxxviii-b. Схема 7D иллюстрирует условия аминокислотного сочетания с использованием N,N'-дициклогексилкарбодиимида и гидроксибензотриазола и амина с образованием амидного соединения xxxvix-a.
II. Фармацевтические композиции
Кроме одного или более чем одного соединения, предложенного выше (или его стереоизомеров, геометрических изомеров, таутомеров, сольватов, метаболитов или фармацевтически приемлемых солей, либо их пролекарств), композиции для модулирования активности mTOR у людей и животных типично содержат фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
Термин "композиция", как используют в данной заявке, подразумевает как включающий препарат, содержащий указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любой препарат, который является результатом, прямым или косвенным, объединения указанных ингредиентов в указанных количествах. Под "фармацевтически приемлемым" подразумевают, что носитель, разбавитель или эксципиент должен быть совместимым с другими ингредиентами препарата и безвредным для его реципиента.
С целью применения соединения по данному изобретению для терапевтического лечения (включая профилактическое лечение) млекопитающих, включая людей, его обычно включают в препарат в соответствии со стандартной фармацевтической практикой в виде фармацевтической композиции. В соответствии с данным аспектом изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение по данному изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или эксципиентом.
Типичный препарат готовят путем смешивания соединения по настоящему изобретению и носителя, разбавителя или эксципиента. Подходящие носители, разбавители и эксципиенты хорошо известны специалистам в данной области техники и включают вещества, такие как углеводы, воски, водорастворимые и/или набухающие полимеры, гидрофильные или гидрофобные вещества, желатин, масла, растворители, воду и тому подобное. Конкретный используемый носитель, разбавитель или эксципиент зависит от средств и цели, для которой применяют соединение по настоящему изобретению. Растворители, как правило, выбраны на основе растворителей, признанных специалистами в данной области техники как безопасные (GRAS) для введения млекопитающим. Как правило, безопасными растворителями являются нетоксичные водные растворители, такие как вода и другие нетоксичные растворители, которые являются растворимыми в воде или смешиваемыми с водой. Подходящие водные растворители включают воду, этанол, пропиленгликоль, полиэтиленгликоли (например, ПЭГ 400, ПЭГ 300) и т.д. и их смеси. Препараты могут также включать один или более чем один буфер, стабилизирующий агент, сурфактант, увлажняющий агент, смазывающий агент, эмульгатор, суспендирующий агент, консервант, антиоксидант, агент, придающий непрозрачность, глидант, вспомогательное вещество, краситель, подсластитель, ароматизирующий агент, корригент и другие известные добавки для обеспечения лучшего представления лекарства (то есть, соединения по настоящему изобретению или его фармацевтической композиции) или содействия при получении фармацевтического препарата (то есть, лекарственного средства).
Препараты можно готовить, используя общепринятые методики растворения и смешивания. Например, нерасфасованное лекарственное вещество (то есть, соединение по настоящему изобретению, или стабилизированную форму соединения (например, комплекс с производным циклодекстрина или другим комплексообразующим агентом) растворяют в подходящем растворителе в присутствии одного или более чем одного из эксципиентов, описанных выше. Соединение по настоящему изобретению обычно включают в фармацевтические лекарственные формы, чтобы обеспечить более легко контролируемую дозировку лекарства, и чтобы дать возможность соблюдения пациентом предписанного режима.
Фармацевтическая композиция (или препарат) для применения может быть упакована разнообразными путями в зависимости от способа, используемого для введения лекарства. Как правило, препарат для продажи включает контейнер, в который помещен фармацевтический препарат в соответствующей форме. Подходящие контейнеры хорошо известны специалистам в данной области техники и включают материалы, такие как бутылки (пластмассовые и стеклянные), пакетики, ампулы, пластмассовые коробки, металлические цилиндры и тому подобное. Контейнер может также включать устройство гарантированной укупорки, чтобы предотвратить неосторожный доступ к содержимому упаковки. Кроме того, на контейнере помещен ярлык, на котором описано содержимое контейнера. Ярлык может также включать соответствующие предупреждения.
st
Фармацевтические препараты соединений по настоящему изобретению можно готовить для разнообразных путей и типов введения. Например, соединение по изобретению (например, соединение формулы I), имеющее желаемую степень чистоты, можно необязательно смешивать с фармацевтически приемлемыми разбавителями, носителями, эксципиентами или стабилизаторами (см. Remington: The Science and Practice of Pharmacy: Remington the Science and Practice of Pharmacy (2005) 21 Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philidelphia, PA), в форме лиофилизированного препарата, порошка, полученного размолом, или водного раствора. Приготовление препарата можно осуществлять путем смешивания при температуре окружающей среды при соответствующем pH и при желаемой степени чистоты с физиологически приемлемыми носителями, то есть с носителями, которые являются нетоксичными для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях. pH препарата, в основном, зависит от конкретного применения и от концентрации соединения, но может находиться в интервале от примерно 3 до примерно 8. Препарат в ацетатном буфере при pH 5 является пригодной формой осуществления.
Соединение по данному изобретению (например, соединение формулы I) для применения в данной заявке предпочтительно является стерильным. В частности, препараты, применяемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Такую стерилизацию легко осуществить путем фильтрования через стерильные фильтрационные мембраны.
Соединение по изобретению обычно можно хранить в виде твердой композиции, лиофилизированного препарата или в виде водного раствора.
Фармацевтическую композицию по изобретению готовят, дозируют и вводят способом, то есть в количествах, концентрациях, режимах, курсах, носителях и путем введения, в соответствии с хорошей медицинской практикой. Факторы для учета в данном контексте включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину расстройства, сайт доставки агента, способ введения, планирование введения и другие факторы, известные практикующим врачам. "Терапевтически эффективное количество" соединения, которое нужно вводить, регулируется такими соображениями и представляет собой минимальное количество, необходимое для предупреждения, облегчения или лечения расстройства, опосредованного факторами свертывания крови. Такое количество предпочтительно ниже количества, которое является токсичным для хозяина или делает хозяина значительно более склонным к кровотечению.
В качестве общего предположения, исходное фармацевтически эффективное количество ингибиторного соединения по изобретению, вводимое парентерально на дозу, находится в диапазоне примерно 0,01-100 мг/кг, конкретно примерно от 0,1 до 20 мг/кг массы тела пациента в сутки, где типичный исходный диапазон применяемого соединения составляет от 0,3 до 15 мг/кг/сутки.
st
Приемлемые разбавители, носители, эксципиенты и стабилизаторы нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты, такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол; низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные сурфактанты, такие как ТВИН™, ПЛЮРОНИКИ™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ). Активный фармацевтический ингредиент по изобретению (например, соединение формулы I) может быть также заключен в микрокапсулы, полученные, например, методами коацервации или путем полимеризации на границе раздела фаз, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметилметакрилат) микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы раскрыты в Remington: The Science and Practice of Pharmacy: Remington the Science and Practice of Pharmacy (2005) 21 Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philidelphia, PA.
Можно готовить препараты соединений по изобретению (например, соединения формулы I) пролонгированного высвобождения. Подходящие примеры препаратов пролонгированного высвобождения включают полупроницаемые матриксы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие соединение формулы I, где эти матриксы находятся в форме формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриксов пролонгированного высвобождения включают сложные полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт)), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамата, неразлагаемые сополимеры этилена и винилацетата, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата), и поли -D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
st
Препараты включают те, которые пригодны для путей введения, подробно описанных в данной заявке. Эти препараты могут быть удобно представлены в стандартной лекарственной форме, и их можно готовить любыми способами, хорошо известными в области фармацевтики. Способы и препараты в целом можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy: Remington the Science and Practice of Pharmacy (2005) 21 Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philidelphia, PA. Такие способы включают стадию приведения в контакт активного ингредиента с носителем, который состоит из одного или более чем одного вспомогательного ингредиента. Как правило, препараты готовят путем однородного и тесного приведения в контакт активного ингредиента с жидкими носителями, либо тонко измельченными твердыми носителями, либо и с теми, и с другими, а затем при необходимости формования препарата.
Препараты соединений по изобретению (например, соединения формулы I), подходящие для перорального введения, можно готовить в виде дискретных единиц, таких как пилюли, капсулы, крахмальные капсулы или таблетки, где каждая содержит предопределенное количество соединений по изобретению.
Прессованные таблетки можно готовить путем прессования в подходящем аппарате активного ингредиента в свободно текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанные со связующим веществом, смазывающим веществом, инертным разбавителем, консервантом, поверхностно-активным или диспергирующим агентом. Формованные таблетки можно готовить путем формования в подходящем аппарате смеси порошкообразного активного ингредиента, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки могут необязательно иметь покрытие или риску, и их необязательно готовят таким образом, чтобы обеспечить медленное или контролируемое высвобождение из них активного ингредиента.
Таблетки, пастилки, лепешки, водные или масляные суспензии, диспергируемые порошки или гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, например, желатиновые капсулы, сиропы или эликсиры можно готовит для перорального применения. Препараты соединений по изобретению (например, соединения формулы I), предназначенные для перорального применения, можно готовить в соответствии с любым способом, известным в данной области техники для получения фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или более чем один агент, включающий подсластители, корригенты, красители и консерванты, с целью получения препарата с привлекательным вкусом. Таблетки, содержащие активный ингредиент в смеси с нетоксичным фармацевтически приемлемым эксципиентом, который является подходящим для получения таблеток, являются приемлемыми. Эти эксципиенты могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция или натрия, лактозу, фосфат кальция или натрия; гранулирующие агенты и разрыхлители, такие как кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; и смазывающие агенты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть не покрытыми или покрытыми известными методами, включающими микроинкапсуляцию, чтобы замедлить разрыхление и всасывание в желудочно-кишечном тракте и посредством этого обеспечить пролонгированное действие в течение более длительного периода. Например, можно использовать задерживающее вещество, такое как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, отдельно или с воском.
Для лечения глаза или других наружных тканей, например, полости рта и кожи, предпочтительно применяют препараты в виде местной мази или крема, содержащие активный ингредиент(ы) в количестве, например, от 0,075 до 20% масс/масс. При включении в мазь активный ингредиент можно применять либо с вазелиновой, либо со смешиваемой с водой основой мази. Альтернативно активные ингредиенты можно включать в крем с основой крема в виде эмульсии масло-в-воде.
При желании в водную фазу кремовой основы можно включать многоатомный спирт, то есть спирт, имеющий две или более чем две гидроксильных группы, такой как пропиленгликоль, бутан-1,3-диол, маннит, сорбит, глицерин и полиэтиленгликоль (включая ПЭГ 400) и их смеси. Местные препараты могут желательно включать соединение, которое усиливает всасывание или проницаемость активного ингредиента через кожу или другие пораженные области. Примеры таких усилителей кожной проницаемости включают диметилсульфоксид и родственные аналоги.
Масляную фазу эмульсий по данному изобретению можно составлять из известных ингредиентов известным способом. Хотя эта фаза может содержать исключительно эмульгатор, она желательно содержит смесь по меньшей мере одного эмульгатора с жиром или маслом, либо и с жиром, и с маслом. Предпочтительно гидрофильный эмульгатор включают вместе с липофильным эмульгатором, который действует как стабилизатор. Также предпочтительно включать как масло, так и жир. Вместе эмульгатор(ы) со стабилизатором(ами) или без него создают так называемый эмульгирующий воск, и этот воск вместе с маслом и жиром создает так называемую эмульгирующую мазевую основу, которая образует масляную дисперсную фазу препаратов в виде крема. Эмульгаторы и эмульсионные стабилизаторы, подходящие для использования в препарате по изобретению, включают Твин 60, Спан 80, цетостеариловый спирт, бензиловый спирт, миристиловый спирт, глицерилмоностеарат и лаурилсульфат натрия.
Водные суспензии соединений по изобретению (например, соединения формулы I) содержат активные вещества в смеси с эксципиентами, подходящими для получения водных суспензий. Такие эксципиенты включают суспендирующий агент, такой как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, кроскармелоза, повидон, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь, и диспергирующие или увлажняющие агенты, такие как природный фосфатид (например, лецитин), продукт конденсации алкиленоксида с жирной кислотой (например, полиоксиэтиленстеарат), продукт конденсации этиленоксида с длинноцепочечным алифатическим спиртом (например, гептадекаэтиленоксицетанол), продукт конденсации этиленоксида с частичным сложным эфиром, образованным из жирной кислоты и ангидрида гексита (например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат). Водная суспензия может также содержать один или более чем один консервант, такой как этил- или н-пропил-пара-гидроксибензоат, один или более чем один краситель, один или более чем один корригент и один или более чем один подсластитель, такой как сахароза или сахарин.
Фармацевтическая композиция соединений по изобретению (например, соединения формулы I) может находиться в форме стерильного инъекционного препарата, такого как стерильная инъекционная водная или масляная суспензия. Эту суспензию можно готовить в соответствии с известной областью техники, используя те подходящие диспергирующие или увлажняющие агенты и суспендирующие агенты, которые упомянуты выше. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой стерильный инъекционный раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, как, например, раствор в 1,3-бутандиоле, либо приготовлен в виде лиофилизированного порошка. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, находится вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла можно общепринято использовать в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое легкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, подобным образом можно использовать жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, при получении инъекционных препаратов.
Количество активного ингредиента, которое можно объединять с веществом-носителем для получения отдельной лекарственной формы, варьирует в зависимости от хозяина, подлежащего лечению, и от конкретного способа введения. Например, препарат с модифицированным высвобождением, предназначенный для перорального введения людям, может содержать примерно от 1 до 1000 мг активного вещества, смешанного с подходящим и удобным количеством вещества-носителя, которое может варьировать от примерно 5 до примерно 95% суммарных композиций (масс:масс). Фармацевтическую композицию можно готовить таким образом, чтобы обеспечить легко измеримые количества для введения. Например, водный раствор, предназначенный для внутривенной инфузии, может содержать от примерно 3 до 500 мкг активного ингредиента на миллилитр раствора, чтобы можно было осуществлять инфузию подходящего объема со скоростью примерно 30 мл/ч.
Препараты, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают препарат изотоническим с кровью предназначенного реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители.
Препараты, подходящие для местного введения в глаз, также включают глазные капли, где активный ингредиент растворен или суспендирован в подходящем носителе, в частности, в водном растворителе для активного ингредиента. Активный ингредиент предпочтительно присутствует в таких препаратах в концентрации примерно от 0,5 до 20% масс/масс, например, примерно от 0,5 до 10% масс/масс, например, примерно 1,5% масс/масс.
Препараты, подходящие для местного введения в полость рта, включают лепешки, содержащие активный ингредиент в корригированной основе, обычно сахарозе и аравийской камеди или трагаканте; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и аравийская камедь; и полоскания для рта, содержащие активный ингредиент в подходящем жидком носителе.
Препараты для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория с подходящей основой, содержащей, например, масло какао или салицилат.
Препараты, подходящие для внутрилегочного или назального введения, имеют размер частиц, например, в интервале от 0,1 до 500 микрон (включая размеры частиц в интервале от 0,1 до 500 микрон с инкрементами микрон, такими как 0,5, 1, 30 микрон, 35 микрон и т.д.), которые вводят путем быстрого вдыхания через носовые пути или путем ингаляции через рот, чтобы достичь альвеолярных мешочков. Подходящие препараты включают водные или масляные растворы активного ингредиента. Препараты, подходящие для аэрозольного введения или введения сухого порошка, могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами и могут быть доставлены с другими терапевтическими агентами, такими как соединения, до настоящего времени применяемые при лечении или профилактике расстройств, как описано ниже.
Препараты, подходящие для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пенок или распыляемых препаратов, содержащих в дополнение к активному ингредиенту такие носители, которые известны в данной области техники как пригодные.
Препараты могут быть упакованы в контейнеры, содержащие одноразовую дозу или множественные дозы, например, герметичные ампулы и флаконы, и могут храниться в высушенном вымораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Инъекционные растворы и суспензии, приготовленные для немедленного применения, готовят из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного вида. Предпочтительные препараты стандартной дозы представляют собой препараты, содержащие суточную дозу или однократную суточную субдозу, как описано в данной заявке выше, или ее соответствующую часть, активного ингредиента.
В изобретении, кроме того, предложены ветеринарные композиции, содержащие по меньшей мере один активный ингредиент (например, соединение формулы I), как определено выше, вместе с ветеринарным носителем для него. Ветеринарные носители представляют собой вещества, полезные в целях введения композиции, и могут представлять собой твердые, жидкие или газообразные вещества, которые являются в остальном инертными или приемлемыми в области ветеринарии, и совместимы с активным ингредиентом. Эти ветеринарные композиции можно вводить парентерально, перорально или любым другим желаемым путем.
III. Способы
В другом аспекте в настоящем изобретении предложено соединение по изобретению (например, соединение формулы I) или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемая соль или пролекарство, которые ингибируют активность киназы mTOR. В одной форме осуществления соединение по изобретению (например, соединение формулы I) или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемая соль или пролекарство ингибируют активность mTORC1 и mTORC2. В другой форме осуществления соединение по изобретению (например, соединение формулы I) или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемая соль или пролекарство ингибируют активность mTORC1. В другой форме осуществления соединение по изобретению (например, соединение формулы I) или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемая соль или пролекарство ингибируют активность mTORC2. В некоторых формах осуществления соединение формулы I обладает 1х, 2х, 3х, 4х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 11х, 12х, 13х, 14х, 15х, 16х, 17х, 18х, 19х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х или 1000х большей селективностью при ингибировании активности mTORC1 по сравнению с mTORC2. В некоторых других формах осуществления соединение формулы I обладает 1х, 2х, 3х, 4х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 11х, 12х, 13х, 14х, 15х, 16х, 17х, 18х, 19х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х или 1000х большей селективностью при ингибировании активности mTORC2 по сравнению с mTORC1. В некоторых формах осуществления соединения по изобретению обладают большей селективностью при ингибировании активности mTORC1 и/или mTORC2 по сравнению с родственными липидкиназами PI3. В некоторых формах осуществления соединение формулы I обладает 1х, 2х, 3х, 4х, 5х, 6х, 7х, 8х, 9х, 10х, 11х, 12х, 13х, 14х, 15х, 16х, 17х, 18х, 19х, 20х, 25х, 30х, 40х, 50х, 60х, 70х, 80х, 90х, 100х, 200х, 300х, 400х, 500х, 600х, 700х, 800х, 900х или 1000х большей селективностью при ингибировании активности киназы mTOR (например, mTORC1, mTORC2) по сравнению с липидкиназой PI3K. В одном аспекте соединения по изобретению демонстрируют удивительно лучшую селективность к ингибированию киназы mTOR по сравнению с родственными липидкиназами PI3, например, PI3K-альфа. Например, соединение, являющееся N-7 замещенным пурином, (S)-1-этил-3-(4-(7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина, обладает 357х большей селективностью к киназе mTOR по сравнению с родственной киназой PI3 (PI3K-альфа), соединение, являющееся N-1 замещенным пиразолопиримидином, (S)-1-этил-3-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-с)]пиримидин-5-ил)фенил)мочевина, обладает 1250х большей селективностью к киназе mTOR по сравнению с родственной киназой PI3 (PI3K-альфа), тогда как изомерное соединение (S)-1-этил-3-(4-(9-метил-6-(3-метилморфолино)-9Н-пурин-2-ил)фенил)мочевина обладает 29х большей селективностью к киназе mTOR по сравнению с родственной киназой PI3 (PI3K-альфа). Соединение, являющееся N-7 замещенным пурином, (S)-1-этил-3-(4-(7-этил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина, обладает 250х большей селективностью к киназе mTOR по сравнению с родственной киназой PI3 (PI3K-альфа), тогда как изомерное соединение (S)-1-этил-3-(4-(9-этил-6-(3-метилморфолино)-9Н-пурин-2-ил)фенил)мочевина обладает 45х большей селективностью к киназе mTOR по сравнению с родственной киназой PI3 (PI3K-альфа).
В каждой из вышеописанных форм осуществления в одном конкретном аспекте соединение по изобретению (например, соединение формулы I) или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемая соль или пролекарство готовят в виде фармацевтической композиции.
В настоящем изобретении, кроме того, предложен способ ингибирования активности киназы mTOR в клетке, включающий приведение клетки в контакт с эффективным количеством активного соединения по изобретению (например, соединения формулы I) или его стереоизомера, геометрического изомера, таутомера, сольвата, метаболита или фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. В настоящем изобретении, кроме того, предложен способ ингибирования клеточной пролиферации, включающий приведение клетки в контакт с соединением формулы I или его подродом. Такие способы можно практиковать in vitro или in vivo.
Соединение по настоящему изобретению или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемая соль или пролекарство полезны для лечения заболеваний, состояний и/или расстройств, включающих, но не ограниченных ими, те, которые характеризуются гиперэкспрессией киназ PIKK, например, киназы mTOR. Соответственно, другой аспект данного изобретения включает способы лечения заболеваний или состояний, которые можно лечить посредством ингибирования киназы mTOR. В одной форме осуществления этот способ включает введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения по изобретению (например, соединения формулы I) или его стереоизомера, геометрического изомера, таутомера, сольвата, метаболита или фармацевтически приемлемой соли или пролекарства. В вышеописанной форме осуществления в одном конкретном аспекте соединение по изобретению (например, соединение формулы I) или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемую соль или пролекарство готовят в виде фармацевтической композиции.
Соединения по изобретению можно вводить любым путем, соответствующим состоянию, подлежащему лечению. Подходящие пути включают пероральный, парентеральный (включая подкожный, внутримышечный, внутривенный, внутриартериальный, внутрикожный, подоболочечный и эпидуральный), чрескожный, ректальный, назальный, местный (включая трансбуккальный и подъязычный), вагинальный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и интраназальный. Для локального иммуносупрессивного лечения соединения можно вводить путем введения внутрь пораженной ткани, включая перфузию или иное приведение в контакт трансплантата с ингибитором перед трансплантацией. Понятно, что предпочтительный путь может варьировать, например, в зависимости от состояния реципиента. Если соединение вводят перорально, его можно включать в препарат в виде пилюли, капсулы, таблетки и т.д. с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом. Если соединение вводят парентерально, его можно включать в препарат с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем и в стандартной лекарственной инъекционной форме, как подробно описано ниже.
Доза для лечения млекопитающего (например, человека) может находиться в диапазоне от примерно 10 мг до примерно 1000 мг соединения формулы I. Типичная доза может составлять от примерно 100 мг до примерно 300 мг соединения. Дозу можно вводить один раз в сутки (QID), дважды в сутки (BID) или чаще в зависимости от фармакокинетических и фармакодинамических свойств, включающих всасывание, распределение, метаболизм и выведение конкретного соединения. Кроме того, факторы токсичности могут влиять на дозировку и режим введения. При пероральном введении пилюлю, капсулу или таблетку можно принимать ежесуточно или реже в течение определенного периода времени. Режим можно повторять в течение определенного числа циклов терапии.
Заболевания и состояния, которые можно лечить в соответствии со способами по данному изобретению, включают, но не ограничены ими, рак, удар, диабет, гепатомегалию, сердечно-сосудистое заболевание, болезнь Альцгеймера, муковисцидоз, вирусное заболевание, аутоиммунные заболевания, атеросклероз, рестеноз, псориаз, аллергические расстройства, воспаление, неврологические расстройства, гормонально-обусловленное заболевание, состояния, связанные с трансплантацией органов, иммунодефицитные расстройства, деструктивные расстройства костей, пролиферативные расстройства, инфекционные заболевания, состояния, связанные с гибелью клеток, индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов, хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ), заболевание печени, синдром Пейтца-Егерса, туберозный склероз, патологические состояния иммунной системы, включающие активацию Т-клеток, расстройства ЦНС у пациента и старение. В одной форме осуществления пациента-человека лечат соединениями по изобретению (например, соединением формулы I) и фармацевтически приемлемым носителем, адъювантом или наполнителем, где соединение по изобретению присутствует в количестве, чтобы обнаружимо ингибировать активность киназы mTOR.
Раки, которые можно лечить в соответствии со способами по данному изобретению, включают, но не ограничены ими, рак молочной железы, яичника, шейки матки, простаты, яичка, мочеполовых путей, пищевода, гортани, глиобластому, нейробластому, рак желудка, кожи, кератоксантому, рак легкого, эпидермоидную карциному, крупноклеточную карциному, немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ), мелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, рак кости, ободочной кишки, аденому, рак поджелудочной железы, аденокарциному, рак щитовидной железы, фолликулярную карциному, недифференцированную карциному, папиллярную карциному, семиному, меланому, саркому, карциному мочевого пузыря, капциному печени и желчных протоков, карциному почки, миелоидные расстройства, лимфоидные расстройства, 'волосатые' клетки, рак буккальной полости и глотки (полости рта), губы, языка, полости рта, глотки, тонкого кишечника, колоректальный рак, рак толстого кишечника, прямой кишки, головного мозга и центральной нервной системы, лимфому Ходжкина и лейкоз. В некоторых формах осуществления соединения по изобретению полезны для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака молочной железы, НМКРЛ, мелкоклеточного рака легкого, карциномы печени, лимфоидных расстройств, саркомы, колоректального рака, рака прямой кишки и лейкоза.
Сердечно-сосудистые заболевания, которые можно лечить в соответствии со способами по данному изобретению, включают, но не ограничены ими, рестеноз, кардиомегалию, атеросклероз, инфаркт миокарда и застойную сердечную недостаточность.
Нейродегенеративные заболевания, которые можно лечить в соответствии со способами по данному изобретению, включают, но не ограничены ими, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, болезнь Гентингтона и ишемию головного мозга, а также нейродегенеративное заболевание, вызванное травматическим повреждением, глутаматной нейротоксичностью и гипоксией.
Воспалительные заболевания, которые можно лечить в соответствии со способами по данному изобретению, включают, но не ограничены ими, ревматоидный артрит, псориаз, контактный дерматит и отсроченные реакции гиперчувствительности.
В другом аспекте данного изобретения предложено соединение по изобретению или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемая соль или пролекарство при лечении заболеваний или состояний, описанных в данной заявке, у млекопитающего, например, человека, страдающего таким заболеванием или состоянием. Также предложено применение соединения по данному изобретению или его стереоизомера, геометрического изомера, таутомера, сольвата, метаболита или фармацевтически приемлемой соли или пролекарства при получении лекарства для лечения заболеваний и состояний, описанных в данной заявке, у млекопитающего, например, человека, страдающего таким расстройством.
В одной форме осуществления соединение по изобретению (например, соединение формулы I) или его стереоизомер, геометрический изомер, таутомер, сольват, метаболит или фармацевтически приемлемую соль или пролекарство применяют в качестве противоракового агента или в качестве вспомогательного агента для лечения рака в комбинированной терапии. Обычный специалист в данной области техники сможет легко определить, лечит ли соединение-кандидат раковое состояние, для любого конкретного типа клеток, либо отдельно, либо в комбинации. В пределах некоторых аспектов данной формы осуществления соединения по изобретению применяют в качестве вспомогательного средства при других терапиях, включающих общепринятую операцию, радиотерапию и химиотерапию, для лечения рака. Такая химиотерапия может включать, но не ограничиваться ими, один или более чем один из химиотерапевтических агентов, описанных в данной заявке.
Комбинированную терапию можно вводить в одновременном или последовательном режиме. При последовательном введении комбинацию можно вводить за два или более чем два введения. Комбинированное введение включает совместное введение, используя отдельные препараты, или единый фармацевтический препарат, и последовательное введение в любом порядке, где предпочтительно существует период времени, когда оба (или все) активных агента одновременно проявляют их биологические активности.
Подходящие дозировки для любого из вышеуказанных агентов, вводимых совместно, представляют собой дозировки, применяемые в настоящее время, и могут быть снижены за счет комбинированного действия (синергизма) вновь идентифицированного агента и других химиотерапевтических агентов или терапий.
Комбинированная терапия может обеспечить "синергизм" и оказаться "синергической", то есть, эффект, достигнутый при совместном применении активных ингредиентов, выше, чем сумма эффектов, которые являются результатом применения соединений по отдельности. Синергический эффект может быть достигнут, когда активные ингредиенты: (1) совместно включают в препарат и вводят или доставляют одновременно в комбинированном стандартном лекарственном препарате; (2) доставляют поочередно или параллельно в виде отдельных препаратов; или (3) путем какого-либо другого режима. При доставке в виде поочередной терапии синергический эффект может быть достигнут, когда соединения вводят или доставляют последовательно, например, путем различных инъекций в отдельных шприцах, отдельных пилюль или капсул или в отдельных инфузиях. Как правило, во время поочередной терапии эффективную дозу каждого активного ингредиента вводят последовательно, то есть серийно, тогда как при комбинированной терапии эффективные дозы двух или более чем двух активных ингредиентов вводят совместно.
ПРИМЕРЫ
Данные примеры не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения, но, вероятнее, для того, чтобы обеспечить руководство для специалиста в данной области техники по получению и применению соединений, композиций и способов по настоящему изобретению. Хотя описаны конкретные формы осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области техники понятно, что можно производить различные изменения и модификации без отклонения от сущности и объема изобретения.
Химические реакции в описанных Примерах можно легко адаптировать к получению ряда других ингибиторов mTOR по изобретению, и альтернативные способы получения соединений по данному изобретению считают находящимися в пределах объема данного изобретения. Например, синтез соединений, не приведенных в примерах в соответствии с изобретением, можно успешно осуществлять путем модификаций, очевидных специалистам в данной области техники, например, путем соответствующей защиты взаимодействующих групп, путем использования других подходящих реагентов, известных в данной области техники, иных, чем описаны в данной заявке, и/или путем проведения обычных модификаций условий реакции. Альтернативно другие реакции, раскрытые в данной заявке или известные на уровне техники, признаны как имеющие применимость для получения других соединений по изобретению. Соответственно, нижеследующие примеры предложены для иллюстрации, но не для ограничения изобретения.
1
1
-1
-1
3
6
3
6
В описанных ниже Примерах, если не указано иное, все температуры приведены в градусах Цельсия. Имеющиеся в продаже реагенты приобретали от поставщиков, таких как Aldrich Chemical Company, Lancaster, TCI или Maybridge, и использовали без дополнительной очистки, если не указано иное. Реакции, описанные ниже, проводили, как правило, при положительном давлении азота или аргона или с хлоркальциевой трубкой (если не указано иное) в безводных растворителях, и реакционные колбы были, как правило, оборудованы резиновыми септами для введения субстратов и реагентов через шприц. Стеклянную посуду высушивали в печи и/или высушивали нагреванием. Колоночную хроматографию проводили на системе Biotage (изготовитель: Dyax Corporation), включающей колонку силикагеля, или на картридже силикагеля SEP РАК (Waters); либо альтернативно колоночную хроматографию проводили, используя хроматографическую систему ISCO (изготовитель: Teledyne ISCO), включающую колонку силикагеля. Спектры H ЯМР записывали на приборе Varian, работающем при 400 МГц. Спектры H ЯМР были получены в растворах в дейтеризованном CDCl, d-ДМСО, CHOD или d-ацетоне (приведенные в млн), используя хлороформ в качестве внутреннего стандарта (7,2δ млн). При описании множества пиков использованы приведенные ниже сокращения: s (синглет), d (дублет), t (триплет), m (мультиплет), br (широкий), dd (дублет дублетов), dt (дублет триплетов). Константы взаимодействия, если приведены, представлены в Герцах (Гц).
T
4
По возможности мониторинг продуктов, образующихся в реакционных смесях, проводили с помощью ЖХ/МС. Эксперименты по жидкостной хроматографии высокого давления - масс-спектрометрии (ЖХ/МС), чтобы определить время удерживания (R) и присоединенные массы ионов, проводили, используя один из нижеописанных способов. Способ А: Эксперименты проводили на квадрупольном масс-спектрометре РЕ Sciex API 150 EX, соединенном с системой ЖХ Shimadzu LC-10AD с цифровым диодным детектором и автоматическим дозатором 225 положений, используя колонку Kromasil C18 50 × 4,6 мм и скорость тока 3 мл/минута. Система растворителей представляла собой градиент, начинающийся со 100% воды с 0,05% ТФУ (растворитель А) и 0% ацетонитрила с 0,0375% ТФУ (растворитель В), линейно увеличивающийся до 10% растворителя А и 90% растворителя В в течение 4 минут. Конечную систему растворителей держали постоянной в течение следующих 0,50 минут. Способ В: Эксперименты проводили на масс-спектрометре с жидкостной хроматографией Agilent Technologies, соединенном с системой ЖХ Agilent Technologies Series 1200 LC с цифровым диодным детектором, используя колонку Zorbax 1,8 микрон SB-C18 30×2,1 мм при скорости тока 1,5 мл/минута. Способ В1: Исходная система растворителей представляла собой 95% воды, содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты (растворитель А) и 5% ацетонитрила, содержащего 0,05% трифторуксусной кислоты (растворитель В) с последующим градиентом вплоть до 5% растворителя А и 95% растворителя В в течение 1,5 минут. Конечную систему растворителей держали постоянной в течение следующей 1 минуты. Способ В2: Исходная система растворителей представляла собой 95% воды, содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты (растворитель А) и 5% ацетонитрила, содержащего 0,05% трифторуксусной кислоты (растворитель В) с последующим градиентом вплоть до 5% растворителя А и 95% растворителя В в течение 3,0 минут. Конечную систему растворителей держали постоянной в течение следующей 1 минуты. Способ С: Эксперименты проводили на масс-спектрометре с жидкостной хроматографией Agilent Technologies, соединенном с системой ЖХ Agilent Technologies Series 1200 LC с цифровым диодным детектором, используя колонку Zorbax 1,8 микрон SB-C18 30×2,1 мм при скорости тока 0,6 мл/минута. Исходная система растворителей представляла собой 95% воды, содержащей 0,05% трифторуксусной кислоты (растворитель А) и 5% ацетонитрила, содержащего 0,05% трифторуксусной кислоты (растворитель В) с последующим градиентом вплоть до 5% растворителя А и 95% растворителя В в течение 9,0 минут. Конечную систему растворителей держали постоянной в течение следующей 1 минуты. Продукты, образовавшиеся в реакционных смесях, можно очистить с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (ОФ-ВЭЖХ), используя описанные ниже условия: ВЭЖХ с обращенной фазой проводили на колонке Gemini-NX (100×30 мм, 10 микрон); 5-85% ACN в течение 10 мин градиент либо 0,1% FA, либо 0,1% NHOH при 60 мл/мин, 254 нм, или на колонке Zymor Pegasus (150×21,2 мм, 5 микрон); 5-60% метанол при 70 мл/мин, 254 нм.
Все сокращения, использованные для обозначения реагентов, условий реакций или используемого оборудования, соответствуют определениям, изложенным в "List of standard abbreviations and acronyms", публикуемом ежегодно в Journal of Organic Chemistry (American Chemical Society journal). Химические названия дискретных соединений по изобретению были получены, используя признак названия структур ChemBioDraw версия 11.0, или программу наименования соединений ИЮПАК oт Accelrys' Pipeline Pilot.
Пример 1
Синтез 2,6-дихлор-7-метил-7H-пурина из 3,7-диметил-1H-пурин-2,6(3H,7H)диона(теобромина) (а-2):
1
1
6
2,6-Дихлор-7-метил-7H-пурин был получен из теобромина (a-1) при 10% выходе, следуя методике Uretskaya, G.Ya., Rybinka, E.I., and Men'shikov, G.P. Zh. Obshch. Ki., 1960, 30, 327 с модификацией N,N-диэтиланилина, описанного Stanovik, В. et al в Australian Journal of Chemistry, 1981, 34, 1729. H ЯМР был во всех отношениях идентичен веществу, полученному путем алкилирования имеющегося в продаже 2,6-дихлорпурина с основанием и йодометаном. Например, в методике, описанной Feng et al. (WO 2004/087053), используют 60% NaH в качестве основания, диметилформамид (ДМФ) в качестве растворителя и йодометан с получением смеси 1:1 N-7/N-9 метилированных продуктов, которые разделяли хроматографией на силикагеле. В методике, описанной Lewi et et al (WO 2005/028479 A2), используют карбонат калия в качестве основания, ацетонитрил в качестве растворителя (кг 70 ч) и йодометан и получают отдельный выход 2:1 метилированных пуринов после хроматографии на силикагеле (60% выход N9Me/30% выход N-7 метилированного). Подобным образом, ацетоном можно заменять ацетонитрил в качестве растворителя, и после кипячения с обратным холодильником с карбонатом калия и йодометаном в течение 24 ч получают смесь 3:1 N9/N7. N-7 метилированный продукт выделяли при чистом выходе 16,3% после хроматографии на силикагеле. В сообщении Chi-Huey Wong et al. (см. Bioorg & Med Chem 13(2005) 4622-4626) используют тетрабутиламмония фторид в качестве основания (1 М раствор ТГФ) и йодометан с получением подобного отношения 3:1 N-9/N-7 метилированных пуринов, которые можно разделить хроматографией на силикагеле. H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.79 (s, 1H, H8), 4.06 (s, 3H, N7Me).
Пример 2
Синтез 1-этил-3-(4-(7-метил-6-морфолино-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (b-2):
+
1
2
2
2
4
6
Получение 4-(2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)морфолина (b-1): Высушенную в печи 15 мл пробирку под давлением, оборудованную магнитной мешалкой и септой, охлаждали в атмосфере азота, загружали 123,1 мг (0,61 ммоль) 2,6-дихлор-7-метил-7H-пурина и растворяли в безводном этаноле/ДМФ (0,5 мл / 0,3 мл, 0,76 М). N,N-диизопропилэтиламин (0,130 мл, 0,73 ммоль) добавляли через шприц с последующим добавлением морфолина (0,064 мл, 0,73 ммоль). Пробирку под давлением продували азотом, и септу заменяли тефлоновой завинчивающейся крышкой. Реакционную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. ЖХ/МС (способ А) показала полное расходование а и один основной УФ активный продукт (время удерживания 1,17 мин), который проявлял правильное значение M+H для (b). Анализ с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) в 20% МеОН/ЕА подтверждает один основной УФ активный продукт. Реакционную смесь наливали в колбу, содержащую 30 мл 50/50 EtO/EA, и пробирку под давлением ополаскивали 2×10 мл 50/50 EtO/EA, затем 10 мл ЕА  переносили в делительную воронку и промывали 1×50% рассолом и 1×рассолом. Повторно экстрагированные объединенные водные слои дополнительно промывали 50/50 EtO/EA (диэтиловый эфир:этилацетат) (2×20 мл), объединенные органические экстракты высушивали (MgSO), фильтровали, концентрировали и высушивали в высоком вакууме с получением 119,3 мг сырого продукта (77,6%), который брали непосредственно в следующую стадию. H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.44 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.80-3.71 (m, 4H), 3.53-3.44 (m, 4H). ЖХ/MC-m/z + 254.5 (М+Н)+.
+
1
4
6
Получение соединения, указанного в заголовке (b-2): Азот барботировали через воду и ацетонитрил в течение ночи для дегазирования. В коническую пробирку для микроволновой печи на 2-5 мл загружали 84 мг (0,29 ммоль) [(4-этилуреидо)фенил]бороновой кислоты пинаконового эфира, 17 мг (0,015 ммоль) тетракис(трифенилфосфин)палладия(0), 39 мг (0,37 ммоль) карбоната натрия и 40 мг (0,4 ммоль) ацетата калия. Добавляли 56,8 мг (0,224 ммоль) 4-(2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)морфолина с последующим перемешиванием магнитной мешалкой, и смесь растворяли в ACN (3,0 мл)/воде (0,9 мл). Микроволновую виалу нагревали в микроволновой печи (300 ватт, 130°C, 15 мин). После охлаждения анализ ЖХ/МС (способ А) показал полное расходование b с получением основного УФ активного продукта (время удерживания 1,30 мин), который проявлял правильное значение M+H для мочевины вместе с трифенилфосфином в качестве побочного продукта (время удерживания 2,24 мин). Реакционную смесь разводили в 30 мл ЕА, и пробирку ополаскивали дополнительным ЕА. ЕА переносили в делительную воронку на 125 мл, промывали 1х водой, 1х рассолом, высушивали (MgSO), фильтровали и концентрировали с получением 96,4 мг сырого продукта, который очищали ОФ-ВЭЖХ с получением 32,5 мг (38%), которые анализировали на идентичность и чистоту с помощью ЖХ/МС (способ С). H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ 8.64 (s, 1H), 8.38 (s, 1H), 8.25 (d, J=8.7Hz, 2H), 7.49 (d, J=8.7Hz, 2H), 6.18 (t, J=5.5 Гц, 1H), 3.99 (s, 3H), 3.87-3.77 (m, 4H)., 3.53-3.45 (m, 4H), 3.19-3.06 (m, 2H), 1.06 (t, J=7.2 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z + 382.1 (М+Н)+.
Пример 3
Синтез (S)-1-этил-3-(4-(7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (с-2):
1
6
Получение (S)-4-(2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)-3-метилморфолина (с-1): Соединение (с-1) было получено, как описано для Примера 2, с той модификацией, что (S)-3-метилморфолин использовали вместо морфолина, и 1,0 мл/0,6 мл этанола/ДМФ при осторожном нагревании было необходимо для осуществления растворения (а-2). После солюбилизации реакционная смесь оставалась гомогенной при охлаждении до комнатной температуры. Диизопропилэтиламин (DIPEA) и (S)-3-метилморфолин добавляли при комнатной температуре. Промежуточное соединение (с-1) было получено в виде белой пены при выходе 85% после обработки и было взято непосредственно в следующую стадию. H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.44 (s, 1H), 4.04 (dd, J=6.7, 3.3 Гц, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.84 (dt, J=10.8, 2.8 Гц, 1H), 3.76 (dd, J=11.3, 2.8 Гц, 1H), 3.68-3.49 (m, 3H), 3.40-3.37 (m, 1H), 1.20 (d, J=6.6 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z + 268,1 (M+H)+.
1
6
Получение соединения, указанного в заголовке (с-2): (S)-1-этил-3-(4-(7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина была получена, как описано для Примера 2, и очищена с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 37,2 мг (48%), которые анализировали на идентичность и чистоту с помощью ЖХ/МС (способ С). H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ 8.67 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.25 (d, J=8.8 Гц, 2H), 7.50 (d, J=8.8 Гц, 2H), 6.21 (t, J=5.6 Гц, 1H), 3.99 (s, 4H), 3.94-3.81 (m, 2H), 3.75 (t, J=8.4 Гц, 1H), 3.62-3.47 (m, 3H), 3.20-3.0 (m, 2H), 1.19 (d, J=6.4 Гц, 3H), 1.06 (t, J=7.2 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z + 396,2 (М+Н)+.
Пример 4
Синтез (R)-1-этил-3-(4-(7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (d-2):
1
6
Получение (R)-4-(2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)-3-метилморфолина (d-1) осуществляли, как описано в Примере 2, с той модификацией, что (R)-3-метилморфолин использовали вместо морфолина, и 2,0 мл/0,75 мл этанола/ДМФ при осторожном нагревании было необходимо для осуществления растворения (а-1). После солюбилизации реакционная смесь оставалась гомогенной при охлаждении до комнатной температуры. Диизопропилэтиламин и (R)-3-метилморфолин добавляли при комнатной температуре, и реакционную смесь нагревали до 50°C в течение 36 ч. Промежуточное соединение (d-1) было получено в виде воскового рыжеватого твердого вещества при выходе 68% после обработки и было взято непосредственно в следующую стадию. H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.44 (s, 1H), 4.04 (dd, J=6.7, 3.3 Гц, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.84 (dt, J=10.8, 2.8 Гц, 1H), 3.76 (dd, J=11.3, 2.8 Гц, 1H), 3.68-3.49 (m, 3H), 3.40-3.37 (m, 1H), 1.20 (d, J=6.6 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z + 268,1 (М+Н)+.
1
6
Получение соединения, указанного в заголовке (d-2): (R)-1-этил-3-(4-(7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина (d-2) была получена, как описано для Примера 2, и очищена с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 23,5 мг (32%), которые анализировали на идентичность и чистоту посредством ЖХ/МС (способ С). H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ 8.67 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 8.25 (d, J=8.8 Гц, 2H), 7.50 (d, J=8.8 Гц, 2H), 6.21 (t, J=5.6 Гц, 1H), 3.99 (s, 4H), 3.94-3.81 (m, 2H), 3.75 (t, J=8.4 Гц, 1H), 3.62-3.47 (m, 3H), 3.20-3.0 (m, 2H), 1.19 (d, J=6.4 Гц, 3H), 1.06 (t, J=7.2 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z + 396,2 (М+Н)+.
Пример 5
Синтез (S)-1-этил-3-(4-(6-(3-этилморфолино)-7-метил-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (е-2):
1
6
Получение (S)-4-(2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)-3-этилморфолина (е-1) осуществляли, как описано в Примере 2, с той модификацией, что (S)-3-этилморфолин HCl соль использовали вместо морфолина, и смесь 3,5/1 этанола/ДМФ, требующая осторожного нагревания, была необходима, чтобы осуществить растворение (а-2). После солюбилизации реакционная смесь оставалась гомогенной при охлаждении до комнатной температуры. Диизопропилэтиламин и (S)-3-этилморфолин HCl добавляли при комнатной температуре, и реакционную смесь перемешивали в течение 20 ч. Дополнительное нагревание до 60°C в течение 24 ч требовалось для полного преобразования в (е-1). Промежуточное соединение (е-1) было получено в виде рыжеватого твердого вещества при выходе 87% после обработки и было взято непосредственно в следующую стадию. H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.43 (s, 1H), 4.03 (m, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.78 (m, 3H), 3.62 (m, 1H), 3.52 (dd, J=7.3, 18.4 Гц, 2H), 1.79 (m, 2H), 0.79(t, J=7.4 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z + 282.5 (М+Н)+.
1
6
Получение соединения, указанного в заголовке (е-2): (S)-1-этил-3-(4-(7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина (е-2) была получена, как описано для Примера 2, и очищена с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 136,5 мг (56%), которые анализировали на идентичность и чистоту посредством ЖХ/МС (способ С). H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.61 (s, 1H), 8.36 (s, 1H), 8.24 (d, J=8.7 Гц, 2H), 7.49 (d, J=8.7 Гц, 2H), 6.17 (t, J=5.4 Гц, 1H), 3.97 (s+m, 4H), 3.83 (dtd, J=14.1, 11.4, 2.8 Гц, 4H), 3.63 (d, J=9 Гц, 2H), 3.45 (m, 1H), 3.14 (dd, J=14.1, 7.1 Гц, 2H), 1.79 (p, J=7.4 Гц, 2H), 1.07 (t, J=7.2 Гц, 3H), 0.83 (t, J=7.4 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z + 410,2 (М+Н)+.
Пример 6
Получение 1-этил-3-(4-(7-метил-6-(1,4-оксазепан-4-ил)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (f-2):
1
3
Получение 4-(2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)-1,4-оксазепана: Соединение (f-1) было получено, как описано в Примере 2, с той модификацией, что 1,4-оксазепан использовали вместо морфолина, и смесь 3/1 этанола/ДМФ, требующая осторожного нагревания, была необходима, чтобы осуществить растворение а. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 часов и обрабатывали, как описано в Примере 2. Сырой продукт дополнительно очищали хроматографией на силикагеле (ISCO, 0-30% МеОН/ЕА) с получением (f-1) при выходе очищенного соединения 40%. H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7.86 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 3.92-3.87 (m, 2H), 3.86-3.78 (m, 6H), 2.15-2.05 (m, 2H). ЖХ/MC-m/z +268,3 (М+Н)+.
1
6
Получение соединения, указанного в заголовке (f-2): Соединение, указанное в заголовке, было получено, как описано для Примера 2, и очищено с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 7,5 мг (13%), которые анализировали на идентичность и чистоту посредством ЖХ/МС (способ С). H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.58 (s, 1H), 8.29 (s, 1H), 8.23 (d, J=8.7 Гц, 2H), 7.47 (d, J=8.7 Гц, 2H), 6.15 (t, J=5.5 Гц, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.87 (m, 6H), 3.74 (t, J=5.5 Гц, 2H), 3.19-3.06 (m, 2H), 2.25-1.97 (m, 2H), 1.07 (t, J=7.2 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z +396,2 (М+Н)+.
Пример 7
Получение (S)-1-этил-3-(4-(7-этил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (g-3)
1
6
Получение 2,6-дихлор-7-этил-7H-пурина (g-1): Соединение (g-1) было получено с использованием метода, описанного Chi-HueyWong et al. Bioorg. & Med. Chem. 13(2005) 4622-4626 с использованием тетрабутиламмония фторида в качестве основания (1 М раствор в ТГФ) и йодоэтана с получением 2,6-дихлор-7-этил-7H-пурина при выходе 6,5% после обработки и разделения региоизомеров на силикагеле (ISCO, 10-100% ЕА/гексан). H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ 8.91 (s, 1H), 4.49 (q, J=7.2 Гц, 2H), 1.46 (t, J=7.2 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z +217,2 (М+Н)+.
1
6
Получение (S)-4-(2-хлор-7-этил-7H-пурин-6-ил)-3-метилморфолина (g-2): Соединение (g-2) было получено, как описано для Примера 2, с той модификацией, что (S)-3-метилморфолин использовали вместо морфолина. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 72 ч и обрабатывали, как описано в Примере 2, с получением (g-2) при выходе 74%. Сырое вещество использовали без дальнейшей очистки. H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.60 (s, 1H), 4.31 (m, 2H), 3.93 (m, 1H), 3.81 (m, 2H), 3.65 (t, J=9.0 Гц, 1H), 3.53 (m, 2H), 3.29 (m, 1H), 1.39 (t, J=7.2 Гц, 3H), 1.17 (d, J=6.5 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z +282,3 (М+Н)+.
1
6
Получение (S)-1-этил-3-(4-(7-этил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (g-3): (S)-1-этил-3-(4-(7-этил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевина была получена, как описано для Примера 2, и очищена с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 61,6 мг (77,4%), которые анализировали на идентичность и чистоту посредством ЖХ/МС (способ С). H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ 8.65 (s, 1H), 8.54 (s, 1H), 8.27 (d, J=8.8 Гц, 2H), 7.51 (d, J=8.8 Гц, 2H), 6.20 (t, J=5.6 Гц, 1H), 4.36 (m, 2H), 4.02-3.71 (m, 4H), 3.60-3.44 (m, 2H), 3.18 (m, 2H), 1.44 (t, J=7.2 Гц, 3H), 1.15 (d, J=6.3 Гц, 3H), 1.07 (t, J=7.2 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z +410,2 (М+Н)+.
Пример 8
Получение (S)-1-(4-(8-бутил-7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)-3-этилмочевины (h-2):
1
6
Получение (S)-4-(8-бутил-2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)-3-метилморфолина (h-1): Соединение (h-1) было получено путем растворения (S)-4-(2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)-3-метилморфолина (с-1, 52,3 мг, 0,195 ммоль) в безводном ТГФ (1,6 мл) в атмосфере азота, охлаждения до -78°C в охлаждающей бане сухого льда и ацетона, медленного добавления по каплям при -78°C nBuLi (0,23 мл 2,5 М раствора н-бутиллития в гексане, 0,58 ммоль). После энергичного перемешивания при -78°C в течение 2 ч реакционную смесь гасили избытком ацетона с получением желаемого третичного спирта. Реакцию нагревали до комнатной температуры, и растворитель удаляли с получением воскового твердого вещества. ЖХ/МС показала присутствие основного УФ активного продукта со временем удерживания 2,30 мин (способ С), проявляющего М+Н+ 324,1, что согласуется с продуктом присоединения С-8 бутила. Сырой продукт очищали с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 24 мг (20%) (b) чистоты более 95%. H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ 3.93-3.80 (m+s, 5H), 3.66 (m, 1H), 3.54 (dd, J=11.4, 3.8 Гц, 1H), 3.52-4.42 (m, 1H), 3.21 (m, 1H), 2.86 (dd, J=8.2, 6.6 Гц, 2H), 1.81-1.69 (m, 2H), 1.42 (dq, J=14.7, 7.4 Гц, 2H), 1.13 (d, J=6.5 Гц, 3H), 0.94 (t, J=7.4 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z +324.1 (М+Н)+.
1
6
Получение (S)-1-(4-(8-бутил-7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)-3-этилмочевины (h-2): (S)-1-(4-(8-бутил-7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)-3-этилмочевина была получена, как описано для Примера 2, из 24 мг (П-1) и очищена с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 11,9 мг (35%), которые анализировали на идентичность и чистоту посредством ЖХ/МС (способ С). H ЯМР (500 МГц, ДМСО-d) δ 8.80 (s, 1H), 8.22 (d, J=8.8 Гц, 2H), 7.49 (d, J=8.8 Гц, 2H), 6.36 (t, J=5.3 Гц, 1H), 3.99-3.82 (m+s 5H), 3.75 (m, 2H), 3.21-3.02 (m, 5H), 2.96-2.75 (m, 2H), 1.92-1.69 (m, 2H), 1.44 (dd, J=15, 7.4 Гц, 2H), 1.12 (d, J=6.2 Гц, 3H), 1.05 (t, J=7.2 Гц, 3H), 0.95 (t, J=7.4 Гц, 3H) ЖХ/MC-m/z +452,3 (М+Н)+.
Пример 9
Получение (S)-1-этил-3-(4-(8-(2-гидроксипропан-2-ил)-7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (i-2):
Получение 0,52 M LDA в ТГФ: В высушенную в печи круглодонную колбу на 100 мл, оборудованную магнитной мешалкой, в атмосфере азота загружали диизопропиламин (2,0 мл, 1,43 г, 14,1 ммоль), безводный ТГФ DriSolv (26,4 мл, стабилизированный примерно 25% ВНТ) и охлаждали до 0°C. Добавляли по каплям 2,5 М nBuLi в ТГФ (6,0 мл, 15 ммоль, 1,06 экв.) при 0°, извлекали из ледяной бани и нагревали до комнатной температуры и перемешивали в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 2,5 ч. LDA типично использовали сразу после получения, но можно хранить его в холодильнике в течение недельного периода.
4
3
1
Получение (S)-2-(2-хлор-7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-8-ил)пропан-2-ола (i-1): В высушенную в печи круглодонную колбу на 25 мл, оборудованную магнитной мешалкой и охлажденную в атмосфере азота, загружали 5,3 мл 0,52 М LDA (2,8 ммоль, 5,0 экв.), охлаждали до -78°C и перемешивали при -78°C в течение 10 минут. (S)-4-(2-хлор-7-метил-7H-пурин-6-ил)-3-метилморфолин (с-1, 148 мг, 0,553 ммоль) растворяли в безводном ТГФ (6,0 мл, 0,092 М) и медленно добавляли по каплям в течение 12 минут. При добавлении было отмечено изменение цвета с оранжевого на светло-желтый. После завершения добавления (а) реакционную смесь перемешивали при -78°C в течение 55 мин, и в это время ее гасили избытком ацетона (1,0 мл, 13,6 ммоль, 25 экв.) и нагревали до комнатной температуры. Анализ ЖХ/МС показал основной УФ активный продукт, проявляющий М=Н+ для (i-1). Реакционную смесь обрабатывали выпариванием до сухости. Остаток растворяли в этилацетате, переносили в делительную воронку, обрабатывали 1х водой и 1х рассолом. Водный экстракт дополнительно экстрагировали этилацетатом, этилацетатные экстракты объединяли, высушивали (MgSO), фильтровали и концентрировали с получением 152,5 мг сырого оранжевого/желтого твердого вещества. Это сырое вещество очищали хроматографией на силикагеле (ISCO гептан/этилацетат 15-100%) с получением 109 мг (60%) (b) в виде белой пены. H ЯМР (400 МГц, CDCl) 5.28 (s, 1H), 4.15 (s, 3H), 3.88 (dd, J=8.2, 3.7 Гц, 3H), 3.78 (m, 1H), 3.59 (dd, J=12, 5.0 Гц, 1H), 3.50 (ddd, J=11.7, 8.4, 3.1 Гц, 1H), 3.28 (m, 1H), 1.78 (s, 3H), 1.75 (s, 3H), 1.22 (d, J=6.7 Гц, 3H). ЖХ/MC-m/z +326,4 (М+Н)+.
1
6
Получение (S)-1-этил-3-(4-(8-(2-гидроксипропан-2-ил)-7-метил-6-(3-метилморфолино)-7H-пурин-2-ил)фенил)мочевины (i-2): Соединение (i-2) было получено, как описано для Примера 2, из 44 мг (i-1) и очищено с помощью ОФ-ВЭЖХ с получением 26,7 мг (45%), которые анализировали на идентичность и чистоту посредством ЖХ/МС (способ С). H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d) δ 8.60 (s, 1H), 8.24 (d, J=8.7 Гц, 2H), 7.49 (d, J=8.7 Гц, 2H), 6.17 (t, J=5.5 Гц, 1H), 5.69 (s, 1H), 4.18 (s, 3H), 4.02-3.67 (m 4H), 3.68-3.39 (m, 2H), 3.24-3.0 (m, 3H), 1.66 (s, 3H), 1.64 (s, 3H), 1.13 (d, J=6.4 Гц, 3H)., 1.07 (t, J=7.2 Гц, 3H) ЖХ/MC-m/z +454,2 (М+Н)+.
Пример 10
Синтез (S)-3-этилморфолина гидрохлорида (j-1):
Стадия 1: Получение (S)-N-(1-гидроксибутан-2-ил)-4-метилбензолсульфонамида (j-2):
3
4
1
(2S)-2-Аминобутан-1-ол (2,1 мл, 22 ммоль) и триэтиламин (3,8 мл, 27 ммоль) растворяли в метиленхлориде (30 мл, 500 ммоль), и раствор перемешивали при 0°C в течение 5 минут.Затем добавляли пара-толуолсульфонилхлорид (4,3 г, 22 ммоль), и смесь перемешивали, при этом давая нагреться до комнатной температуры. Реакционную смесь гасили водой, и фазы разделяли. Водную фазу экстрагировали 1×50 мл ДХМ. Объединенные органические фазы промывали 1 н. HCl (50 мл), насыщенным NaHCO (50 мл) и рассолом (50 мл), высушивали MgSO, фильтровали и концентрировали с получением белого твердого вещества. Сырое вещество кристаллизовали в эфире/гексане с получением (S)-N-(1-гидроксибутан-2-ил)-4-этилбензолсульфонамида G-2) в виде белого твердого вещества: H ЯМР (400 МГц, ДМСО) δ 7.69 (d, J=8.2 Гц, 2H), 7.38 (t, J=9.0 Гц, 3H), 4.62 (t, J=5.6 Гц, 1H), 3.24 (dd, J=10.3, 5.2 Гц, 1H), 3.18-3.02 (m, 1H), 2.92 (dd, J=7.9, 4.2 Гц, 1H), 1.61-1.39 (m, 1H), 1.19 (dd, J=14.5, 7.1 Гц, 1H), 0.63 (t, J=7.4 Гц, 3H); ЖХ-МС: m/z=244 (М+Н).
Стадия 2: Получение (S)-3-этил-4-тозилморфолина (j-3):
4
4
3
1
(S)-N-(1-гидроксибутан-2-ил)-4-метилбензолсульфонамид (800 мг, 3 ммоль) растворяли в дихлорметане (20 мл) и добавляли триэтиламин (0,92 мл, 6,6 ммоль). Смесь перемешивали при 0°C в течение 10 минут. Дифенил(винил)сульфония трифторметансульфонат (1,25 г, 3,45 ммоль), растворенный в дихлорметане (10 мл), добавляли по каплям в течение 5 минут. Смесь перемешивали, при этом давая ей нагреться до комнатной температуры в течение ночи. Добавляли насыщенный водный NHCl и разделяли фазы. Водную фазу экстрагировали 2×30 мл ДХМ. Объединенные органические фазы высушивали MgSO и фильтровали. Фильтрат концентрировали на силикагеле и очищали флэш-хроматографией (от 100% Hex до 60% EtOAc/Нех) с получением (S)-3-этил-4-тозилморфолина (j-3) в виде белого твердого вещества: H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7.71 (d, J=8.3 Гц, 2H), 7.30 (t, J=8.3 Гц, 2H), 3.77-3.60 (m, 3H), 3.60-3.44 (m, 2H), 3.44-3.19 (m, 3H), 2.43 (s, 3H), 1.67 (dtd, J=28.6, 14.0, 7.4 Гц, 2H), 1.31-1.12 (m, 2H), 0.97-0.84 (m, 3H); ЖХ-МС: m/z=270 (M+H).
1
3
Стадия 3: Получение (S)-3-этилморфолина гидробромида (j-1): (S)-3-этил-4-тозилморфолин (220 мг, 0,82 ммоль) и фенол (150 мг, 1,6 ммоль) растворяли в 4,1 М бромида водорода в уксусной кислоте (2,4 мл), и раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь наливали на эфир, и твердое вещество собирали фильтрованием и промывали эфиром с получением (S)-3-этилморфолина гидробромида (j-1) в виде белого твердого вещества: H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 3.77-3.60 (m, 3H), 3.60-3.44 (m, 2H), 3.44-3.19 (m, 3H), 1.67 (dtd, J=28.6, 14.0, 7.4 Гц, 2H), 1.31-1.12 (m, 2H), 0.97-0.84 (m, 3H).
Пример 11
Синтез (S)-4-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-метилморфолина (k-1):
Стадия 1: Получение 1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5,7(4H,6H)-диона (k-2):
2
6
1
-1
Это соединение было получено, следуя способу, описанному в WO 2008/071650. К перемешанному раствору 1-метил-4-нитро-1H-пиразол-5-карбоксамида (1,27 г, 9,06 ммоль) в ацетонитриле (35,6 мл), кипящему с обратным холодильником при 100°C, добавляли N,N-карбонилдиимидазол (1,91 г, 11,78 ммоль, 1,3 экв.) порциями в течение 1 часа. Реакционную смесь перемешивали при 100°C в атмосфере N в течение 18 часов. Полученный в результате осадок фильтровали, хорошо перемешивали с холодным ацетонитрилом и откачивали до сухости в высоком вакууме с получением 1,38 г (91,5%) белого твердого вещества. H ЯМР (ДМСО-d, 500 МГц) δ млн 11.04 (широкий d, 2H), 7.34 (s, 1H), 4.04 (s, 3H).
Стадия 2: Получение 5,7-дихлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидина (k-3):
2
2
4
3
T
1
-1
+
К гетерогенной смеси 1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5,7(4H,6H)-диона (k-2, 500,0 мг, 2,97 ммоль) в N,N-диэтиланилине (14 мл) добавляли фосфорилхлорид (20 мл), и реакционную смесь перемешивали при 130°C в атмосфере N в течение 18 часов. Реакционную смесь охлаждали до 0°C и гасили насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Водную фазу экстрагировали этилацетатом (3х), и объединенную органическую фазу промывали водой и рассолом, высушивали над NaSO, фильтровали и концентрировали в вакууме. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией (Si-PPC, градиент от 0 до 60% ДХМ в гептане). В результате кристаллизации из эфира - гептана получили желаемый продукт в виде твердого вещества (435,8 мг, 72,2%). H ЯМР (CDCl, 500 МГц) δ млн 8.17 (s, 1H), 4.41 (s, 3H); ЖХ-МС m/z (способ В2) = 203/205 [M+H], R=1,55 мин.
2
2
4
3
T
1
-1
+
Стадия 3: Получение (S)-4-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-метилморфолина (k-1): К перемешанному раствору 5,7-дихлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидина (200,0 мг, 0,98 ммоль) в безводном ДМФ (2 мл) добавляли N,N-диизопропилэтиламин (0,21 мл, 1,18 ммоль, 1,2 экв.) с последующим добавлением (S)-3-метилморфолина (199,3 мг, 1,9 ммоль, 2,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при KT в атмосфере N в течение 4 ч и разбавляли эфиром (50 мл). Органический слой промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, водой и рассолом, высушивали над NaSO, фильтровали и концентрировали в вакууме. Полученный в результате остаток очищали колоночной хроматографией (Si-PPC, градиент от 0 до 100% этилацетата в гептане) с получением желаемого продукта (k-1) в виде пены (245,4 мг, 93,0%). H ЯМР (CDCl, 500 МГц) δ млн 8.03 (s, 1H), 4.21 (широкий d, J=6.2 Гц, 1H), 4.15 (s, 3H), 3.97 (d, J=10.7 Гц, 1H), 3.90 (d, J=9.8 Гц, 1H), 3.81-3.65 (m, 3H), 3.56 (d, J=12.4 Гц, 1H), 1.38 (d, J=6.6 Гц, 3H); ЖХ-МС m/z (способ А) = 268 [М+Н], R=1,71 мин.
Пример 12
Синтез (S)-4-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-этилморфолина (l-1):
1
-1
+
3
T
Это соединение было получено аналогично (S)-4-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-метилморфолину с использованием (S)-этил-морфолина гидробромида в качестве исходного вещества. H ЯМР (CDCl, 500 МГц) δ млн 8.00 (s, 1H), 4.15-4.07 (m, 4H), 3.92 (dd, J=11.8 Гц, 3.8 Гц, 1H), 3.88 (d, J=1.9 Гц, 2H), 3.82-3.71 (m, 1H), 3.67-3.56 (m, 2H), 2.03-1.82 (m, 2H), 0.90 (t, J=7.4 Гц, 3H); ЖХ-МС m/z (способ А) = 282 [М+Н], R=1,95 мин.
Пример 13
Получение (1S,4S)-5-(5-xлop-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]-пиримидин-7-ил)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептана (m-1):
1
-1
+
3
T
Это соединение было получено аналогично (S)-4-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-метилморфолину с использованием (1S,4S)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептана соли гидрохлорида в качестве исходного вещества. H ЯМР (CDCl, 500 МГц) δ млн 7.96 (s, 1H), 5.15 (s, 1H), 4.76 (s, 1H), 4.20 (s, 3H), 4.13 (d, J=8.1 Гц, 1H), 3.97 (ddd, J=7.0 Гц, 4.7 Гц, 1.5 Гц, 2H), 3.69 (d, J=9.5 Гц, 1H), 2.09-1.94 (m, 2H); ЖХ-МС m/z (способ А) = 266,1 [М+Н], R=1,37 мин.
Пример 14
Получение (S)-4-(5-хлор-1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-этилморфолина (n-1):
Стадия 1: Получение 1,3-диметил-4-нитро-1H-пиразол-5-карбоновой кислоты (n-2):
2
2
4
6
f
1
-1
К дымящей азотной кислоте (1,26 мл, 29,97 ммоль, 2,0 экв.) при 0°C медленно добавляли дымящую серную кислоту (9,76 мл, 104,90 ммоль, 7,0 экв.) по каплям в течение 30 минут. Затем добавляли порциями 1,3-диметил-1H-пиразол-5-карбоновую кислоту (2,10 г, 14,98 ммоль), поддерживая внутреннюю температуру ниже 60°C. Реакционную смесь перемешивали при 60°C в атмосфере N в течение 4 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры (KT). Реакционную смесь наливали на лед. Как только лед таял, реакционную смесь экстрагировали EtOAc (3×500 мл). Органические слои объединяли и промывали водой и рассолом, высушивали (NaSO), фильтровали и выпаривали в вакууме с получением желаемого соединения в виде белого твердого вещества (2,67 г, 96,1%). H ЯМР (ДМСО-d, 500 МГц) δ млн 3.87 (s, 3H), 2.39 (s, 3H); ТСХ (15% МеОН/ДХМ): R=0,12.
Стадия 2: Получение 1,3-диметил-4-нитро-1H-пиразол-5-карбоксамида (n-3):
2
2
4
6
1
-1
К 1,3-диметил-4-нитро-1H-пиразол-5-карбоновой кислоте (1,08 г, 5,84 ммоль) в безводном дихлорметане (ДХМ) (25 мл) и ДМФ (0,5 мл) добавляли по каплям оксалилхлорид (0,74 мл, 8,77 ммоль, 1,5 экв.) в течение 10 минут. Реакционную смесь перемешивали при KT в атмосфере N в течение 17 часов. Летучий растворитель выпаривали в вакууме, и сырое вещество растворяли в безводном ТГФ (20 мл) и ацетоне (10 мл). Медленно добавляли концентрированный водный гидроксид аммония (5,0 мл, 128,4 ммоль, 22 экв.), и реакционную смесь перемешивали при KT в течение 16 часов. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, и остаток разбавляли этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором бикарбоната натрия, водой и рассолом, высушивали (NaSO), фильтровали и концентрировали в вакууме. В результате растирания с эфиром - гептаном получили желаемый продукт в виде белого твердого вещества (550,0 мг, 51,5%). H ЯМР (ДМСО-d, 500 МГц) δ млн 8.39 (широкий s, 1H), 8.21 (широкий s, 1H), 3.77 (s, 3H), 2.42 (s, 3H).
Стадия 3: Получение 4-амино-1,3-диметил-1H-пиразол-5-карбоксамида (n-4):
2
2
6
t
1
-1
+
К раствору 1,3-диметил-4-нитро-1H-пиразол-5-карбоксамида (730 мг, 3,96 ммоль) в безводном этаноле (100 мл) и этилацетате (100 мл) добавляли 10% масс/масс Pd на углероде (100,0 мг). Реакционную смесь откачивали в вакууме и продували H (3х), затем перемешивали в атмосфере H при 50 фунт на кв. дюйм (344,74 кПа) в течение 5 часов. Затем реакционную смесь фильтровали через слой целлита. Фильтрат концентрировали в вакууме, и сырой продукт очищали колоночной хроматографией (Si-PPC, градиент от 0 до 30% метанола в дихлорметане) с получением желаемого продукта (597,0 мг, 97,7%) в виде твердого вещества. H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц) δ млн 7.26 (br s, 2H), 4.03 (br s, 2H), 3.84 (s, 3H), 2.02 (s, 3H); ЖХ-МС m/z (способ A) = 155,2 [M+H], R=0,35 мин.
Стадия 4: Получение 1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5,7(4H,6Н)-диона (n-5):
1
-1
6
Это соединение было получено аналогично 1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5,7(4Н,6H)-диону с использованием 4-амино-1,3-диметил-1H-пиразол-5-карбоксамида в качестве исходного вещества. H ЯМР ((ДМСО-d, 400 МГц) δ млн 11.02 (s, 2H), 3.97 (s, 3H), 2.20 (s, 3H).
Стадия 5: Получение 5,7-дихлор-1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидина (n-6):
1
-1
+
3
t
Это соединение было получено аналогично 5,7-дихлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидину с использованием 1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]-пиримидин-5,7(4H,6Н)-диона в качестве исходного вещества. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ млн 4.32 (s, 3H), 2.60 (s, 3H); ЖХ-МС m/z (способ В2) = 217,2/219,2 [M+H], R=1,688 мин.
1
-1
+
3
t
Стадия 6: Получение (S)-4-(5-хлор-1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-этилморфолина (n-1): Это соединение было получено аналогично (S)-4-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-метилморфолину с использованием 5,7-дихлор-1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидина в качестве исходного вещества. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ млн 4.08 (t, J=7.3 Гц, 1H), 4.01 (s, 3H), 3.96-3.84 (m, 3H), 3.79-3.67 (m, 1H), 3.67-3.56 (m, 2H), 2.53 (s, 3H), 2.05-1.78 (m, 2H), 0.89 (t, J=7.5 Гц, 3H); ЖХ-МС m/z (способ А) = 296,3 [М+Н], R=2,16 мин.
Пример 15
Синтез (S)-1-этил-3-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)мочевины (о-1):
2
4
6
t
1
-1
+
В 5-мл микроволновой сосуд, оборудованный магнитной мешалкой, помещали (S)-4-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-метилморфолин (91,5 мг, 0,34 ммоль), [4-этилуреидо)фенил]бороновой кислоты пинаконовый эфир (121,0 мг, 0,42 ммоль, 1,22 экв.), тетракис(трифенилфосфин)палладий(0) (24,5 мг, 0,022 ммоль, 0,062 экв.), карбонат натрия (55,4 мг, 0,52 ммоль, 1,53 экв.) и ацетат калия (54,7 мг, 0,56 ммоль, 1,63 экв.). Добавляли дегазированный ацетонитрил (3,5 мл) и воду (1,2 мл). Микроволновую виалу закрывали крышкой, и реакционную смесь нагревали при микроволновом излучении (300 Вт, 120°C) в течение 15 минут. Реакционную смесь разбавляли этилацетатом (10 мл) и фильтровали через слой целлита. Органический слой промывали водой и рассолом, затем высушивали (NaSO), фильтровали и выпаривали в вакууме. Полученный в результате остаток очищали ВЭЖХ с обращенной фазой с получением соединения, указанного в заголовке, в виде белого твердого вещества (102,6 мг, 75,9%). H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц) δ млн 8.62 (s, 1H), 8.24 (d, J=8.7 Гц, 2H), 8.20 (s, 1H), 7.50 (d, J=8.8 Гц, 2H), 6.16 (t, J=5.5 Гц, 1H), 4.25-4.11 (m, 4H), 3.96-3.83 (m, 2H), 3.73 (t, J=11.2 Гц, 1H), 3.69-3.59 (m, 2H), 3.50 (d, J=13.3 Гц, 1H), 3.19-3.06 (m, 2H), 1.27 (d, J=6.5 Гц, 3H), 1.07 (t, J=7.2 Гц, 3H); ЖХ-МС m/z (способ С1) = 396,2 [M+H], R=3,31 мин.
Пример 16
Синтез (S)-1-этил-3-(4-(7-(3-этилморфолино)-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)мочевины (р-1):
1
-1
+
6
t
Соединение, указанное в заголовке, было получено в соответствии с методикой, описанной в Примере 15. С использованием (S)-4-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-этилморфолина было получено соединение, указанное в заголовке. H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц) δ млн 8.60 (s, 1H), 8.23 (d, J=8.7 Гц, 2H), 8.18 (s, 1H), 7.49 (d, J=8.7 Гц, 2H), 6.16 (t, J=5.5 Гц, 1H), 4.19-4.07 (m, 4H), 3.92-3.80 (m, 3H), 3.75-3.54 (m, 3H), 3.19-3.07 (m, 2H), 1.91-1.79 (m, 2H), 1.07 (t, J=7.2 Гц, 3H), 0.83 (t, J=7.4 Гц, 3H); ЖХ-МС m/z (способ С2)=410,2 [М+Н], R=9,11 мин.
Пример 17
Синтез 1-(4-(7-((1S,4S)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептан-5-ил)-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)-3-этилмочевины (q-1):
1
-1
+
6
t
Соединение, указанное в заголовке, было получено в соответствии с методикой, описанной в Примере 15. С использованием (1S,4S)-5-(5-хлор-1-метил-1H-пиразоло[4,3-d]-пиримидин-7-ил)-2-окса-5-азабицикло[2.2.1]гептана было получено соединение, указанное в заголовке. H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц) δ млн 8.62 (s, 1H), 8.22 (d, J=8.7 Гц, 2H), 8.11 (s, 1H), 7.47 (d, J=8.7 Гц, 2H), 6.16 (t, J=5.5 Гц, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.73 (s, 1H), 4.19 (s, 3H), 4.09 (d, J=9.6 Гц, 1H), 4.02 (d, J=7.6 Гц, 1H), 3.91 (d, J=7.6 Гц, 1H), 3.63 (d, J=9.8 Гц, 1H), 3.15-3.07 (m, 2H), 1.94 (dd, J=25.8 Гц, 9.8 Гц, 2H), 1.07 (t J=7.1 Гц, 3H).; ЖХ-МС m/z (способ С) = 394,2 [М+Н], R=3,07 мин.
Пример 18
Синтез (S)-1-этил-3-(4-(7-(3-этилморфолино)-1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)мочевины (r-1):
1
-1
+
6
t
Соединение, указанное в заголовке, было получено в соответствии с методикой, описанной в Примере 15. С использованием (S)-4-(5-хлор-1,3-диметил-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)-3-этилморфолина было получено соединение, указанное в заголовке. H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц) δ млн 8.60 (s, 1H), 8.24 (d, J=8.7 Гц, 2H), 7.49 (d, J=8.7 Гц, 2H), 6.14 (t, J=5.5 Гц, 1H), 4.09 (широкий s, 1H), 4.03 (s, 3H), 3.92-3.79 (m, 3H), 3.73-3.54 (m, 3H), 3.20-3.05 (m, 2H), 2.48 (s, 3H), 1.90-1.76 (m, 2H), 1.07 (t, J=7.2 Гц, 3H), 0.82 (t, J=7.4 Гц, 3H); ЖХ-МС m/z (способ С) = 424,2 [М+Н], R=3,65 мин.
Пример 19
Синтез (S)-1-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)-3-(оксетан-3-ил)мочевины (s-1):
Стадия 1: Получение (S)-3-метил-4-(1-метил-5-(4-нитрофенил)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)морфолина (s-2):
1
-1
3
Это соединение было получено аналогично (S)-1-этил-3-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)мочевине с использованием 4-нитрофенилбороновой кислоты пинаконового эфира в качестве исходного вещества. H ЯМР (CDCl, 400 МГц) δ млн 8.62 (d, J=9.0 Гц, 2H), 8.32 (d, J=9.0 Гц, 2H), 8.22 (s, 1H), 4.27-4.17 (m, 4H), 4.08-3.95 (m, 2H), 3.93-3.82 (m, 1H), 3.79-3.67 (m, 2H), 3.60-3.50 (m, 1H), 1.38 (d, J=6.6 Гц, 3H).
Стадия 2: Получение (S)-4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)анилина (s-3):
+
t
Раствор (S)-3-метил-4-(1-метил-5-(4-нитрофенил)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)морфолина (122,4 мг, 0,345 ммоль), растворенного в безводном ТГФ (15 мл), подвергали гидрогенизации в аппарате с непрерывным потоком (Н-Cube: картридж 10% Pd/C, скорость тока 1,0 мл/мин). Сырой продукт концентрировали в вакууме и очищали колоночной хроматографией (Si-PPC, градиент от 0 до 100% EtOAc в гептане) с получением желаемого продукта в виде желтой пены (92,0 мг, 82,1%). ЖХ-МС m/z (способ А) = 325,4 [М+Н], R=1,34 мин.
2
2
2
4
6
t
1
-1
+
Стадия 3: Получение (S)-1-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)-3-(оксетан-3-ил)мочевины (s-1): К перемешанному раствору (S)-3-метил-4-(1-метил-5-(4-нитрофенил)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-7-ил)морфолина (50,0 мг, 0,154 ммоль) в безводном 1,2-дихлорэтане (5,0 мл) добавляли триэтиламин (0,071 мл, 0,51 ммоль, 3,3 экв.). Реакционную смесь охлаждали до 0°C и добавляли трифосген (45,7 мг, 0,154 ммоль, 1,0 экв.) одной порцией. После перемешивания при 0°C в атмосфере N в течение 5 минут реакционную смесь перемешивали при 70°C в течение 1 ч. Реакционную смесь охлаждали до KT, а затем добавляли 3-оксетанамина гидрохлорид (84,4 мг, 0,77 ммоль, 5,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при KT в атмосфере N в течение 16 ч, а затем разбавляли EtOAc (25 мл). Органический слой промывали водой и рассолом, высушивали (NaSO), фильтровали и концентрировали в вакууме. Сырой продукт очищали колоночной хроматографией (Si-PPC, градиент от 50 до 100% EtOAc в гептане, а затем от 0 до 30% метанола в дихлорметане). В результате растирания с метанолом получили соединение, указанное в заголовке (49,3 мг, 75,5%), в виде твердого вещества. H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц) δ млн 8.76 (s, 1H), 8.25 (d, J=8.8 Гц, 2H), 8.21 (s, 1H), 7.50 (d, J=8.8 Гц, 2H), 6.97 (d, J=6.7 Гц, 1H), 4.85-4.69 (m, 3H), 4.44 (t, J=6.0 Гц, 2H), 4.23-4.12 (m, 4H), 3.96-3.81 (m, 2H), 3.72 (dd, J=14.7 Гц, 5.8 Гц, 1H), 3.69-3.58 (m, 2H), 3.50 (d, J=13.3 Гц, 1H), 1.26 (d, J=6.5 Гц, 3H); ЖХ-МС m/z (способ С1) = 424,2 [М+Н], R=3,12 мин.
Пример 20
Синтез (S)-1-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло-[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)-3-(2-(метилсульфонил)этил)мочевины (t-1):
1
-1
+
6
t
Это соединение было получено аналогично (S)-1-(4-(1-метил-7-(3-метилморфолино)-1H-пиразоло[4,3-d]пиримидин-5-ил)фенил)-3-(оксетан-3-ил)мочевине с использованием 2-(метилсульфонил)этанамина гидрохлорида в качестве исходного вещества. H ЯМР (ДМСО-d, 400 МГц) δ млн 8.96 (s, 1H), 8.25 (d, J=8.8 Гц, 2H), 8.21 (s, 1H), 7.51 (d, J=8.8 Гц, 2H), 6.42 (t, J=5.9 Гц, 1H), 4.25-4.13 (m, 4H), 3.96-3.83 (m, 2H), 3.78-3.79 (m, 1H), 3.79-3.60 (m, 2H), 3,60-3.47 (m, 3H), 3.37-3.30 (m, 5H), 1.27 (d, J=6.5 Гц, 3H); ЖХ-МС m/z (способ С1) = 474,2 [М+Н], R=3,13 мин.
Пример 21
Биологическая оценка соединений:
а. Анализ киназы mTOR in vitro
2
Киназную активность фермента mTOR оценивают путем инкубации очищенного рекомбинантного фермента (mTOR(1360-2549)+GBL, полученного в лаборатории компании) в реакционной смеси, содержащей АТФ, MnCl и субстрат mTOR, меченный флуоресцентной меткой, например, GFP-4E-BP1 (Invitrogen, продукт № PR8808A). Реакцию останавливали добавлением меченного тербием фосфо-специфического антитела, например, Tb-меченного антитела анти-р4Е-ВР1 Т37/Т46, (Invitrogen, продукт № PR8835A), ЭДТА и буферного раствора TR-FRET (Invitrogen, продукт № PR3756B). Образование продукта обнаруживали с помощью времяпролетного резонансного переноса энергии флуоресценции (TR-FRET), который происходит, когда фосфорилированный субстрат и меченое антитело находятся в тесном контакте за счет фосфо-специфического связывания. Ферментативную активность измеряют по возрастанию сигнала TR-FRET, используя считывающее устройство для планшетов Perkin Elmer Envision. Анализ проводят в 384-луночном планшете Proxiplate Plus (Perkin Elmer, продукт №6008269), используя приведенный ниже протокол:
2
Активность соединений тестируют в виде кривых дозы по 10 точкам, начиная с самой высокой конечной концентрации 10 мкМ. Соединения серийно разводят в 100% ДМСО перед последующим разведением аналитическим буфером. Реакционную смесь (8 мкл), содержащую 0,25 нМ фермента mTOR+GBL, 400 нМ GFP-4E-BP1, 8 мкМ АТФ, 50 мМ ГЭПЭС pH 7,5, 0,01% Твин 20, 10 мМ MnCl, 1 мМ ЭГТА, 1 мМ ДТТ, 1% ДМСО (+/- соединение), инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем добавляют 8 мкл раствора, содержащего 2 нМ антитела Tb-анти-р4Е-ВР1 и 10 мМ ЭДТА, разведенные буфером TR-FRET, и инкубируют в течение 30 минут для остановки реакции. Планшет сканируют в считывающем устройстве для планшетов Envision. Значения Ki вычисляют в программе Assay Explorer, используя уравнение АТФ-конкурентного прочного связывания Моррисона для определения кажущейся Ki.
Соединения по изобретению (например, соединения формулы I) обладают уровнем активности (Ki) в киназном анализе mTOR от примерно 0,0001 нМ до примерно 5 мкМ, и в некоторых формах осуществления от примерно 0,0001 нМ до примерно 1 мкМ, и в некоторых других формах осуществления менее чем от примерно 0,0001 нМ до примерно 0,5 мкМ. Соединения 101-114 по изобретению, представленные в таблице 1, имеют приведенный ниже уровень активности (в мкМ): 0,143, 0,028, 0,069, 0,004, 0,121, 0,040, 0,053, 0,030, 0,008, 0,001, 0,028, 0,002, 0,039 и 0,145, соответственно.
b. Клеточный анализ фосфо-АКТ серин 473 in vitro
В данном анализе измеряют ингибирование тестируемыми соединениями фосфорилирования серина-473 АКТ (протеинкиназы В) в клетках PC-3 (ATCC CRL-1435), имеющих происхождение от аденокарциномы простаты человека, которые были стимулированы эпидермальным фактором роста (EGF).
2
Клеточную линию РС-3 поддерживают в среде RPMI1640 с добавлением 10% ФБС (фетальной бычьей сыворотки), 2 мМ глутамина и 10 мМ ГЭПЭС pH 7,4 при 37°C в увлажненном инкубаторе при 5% CO.
Клетки высевают в 384-луночные планшеты при 7000 клеток/лунка в 50 мкл ростовой среды. Через 24 часа ростовую среду удаляют и заменяют RPMI1640, не содержащей ФБС. Клетки обрабатывают 10 концентрациями тестируемых соединений или одним ДМСО для контролей (конечная концентрация ДМСО 0,5%) и инкубируют при 37°C в течение 30 минут. Затем клетки стимулируют в течение 10 минут 100 нг/мл EGF (конечная концентрация). Одну колонку контролей не стимулируют EGF, чтобы наблюдать отношение сигнала к шуму между стимулированными и нестимулированными клетками. Через 10 минут соединения и стимулирующую среду удаляют и заменяют 25 мкл буфера для лизиса, содержащего ингибиторы протеаз и ингибиторы фосфатаз. Этот буфер содержит детергент для осуществления разрушения клеток. После полного разрушения клеток 20 мкл лизата переносят в 384-луночный 4-точечный планшет MesoScale Discovery, покрытый антителом к АКТ (MesoScale Discovery (MSD) продукт K211CAD-2), который предварительно блокирован 3% бычьим сывороточным альбумином в физиологическом растворе, забуференном Трис. После переноса лизата в планшет MSD АКТ в лизате иммобилизуют антителом посредством инкубации на качалке при 4°C в течение 16 часов. После стадии иммобилизации планшет промывают, а затем инкубируют в течение двух часов с антителом к S473 фосфорилированной АКТ, которое конъюгировано с Сульфо-меткой. Эта метка дает сигнал при контакте с электродом на дне планшета MSD. Связывание меченого антитела с иммобилизованным белком дает возможность обнаружения считывающим устройством MSD.
50
50
ЕС определяют как концентрацию, при которой данное соединение достигает 50% снижения измеренных уровней фосфорилирования S473 АКТ. Значения EC вычисляют, используя программу MDL Assay Explorer 3.0.1.8 соответствия сигмоидной кривой с переменным углом наклона.
50
Соединения 101-108, описанные в таблице 1, имеют уровень активности EC (в мкМ): НА (не анализировали), 0,632, НА, 0,069, НА, 0,511, НА и 3,5, соответственно.
с. Анализ клеточной пролиферации in vitro
Эффективность соединений формулы I измеряли с помощью анализа клеточной пролиферации, используя приведенный ниже протокол:
3
1. Аликвоту 20 мкл клеточной культуры, содержащую примерно 10 клеток (РСЗ или MDAMB361.1) в среде, помещали в каждую лунку 384-луночного планшета с непрозрачными стенками.
2. Готовили контрольные лунки, содержащие среду без клеток; клеткам давали возможность прикрепиться в течение ночи.
3. Соединения добавляли в опытные лунки и инкубировали в течение 3 суток.
4. Планшеты уравновешивали до комнатной температуры в течение примерно 30 минут.
5. В каждую лунку добавляли объем реагента CellTiter-Glo, равный объему клеточной культуральной среды, присутствующему в каждой лунке.
6. Содержимое перемешивали в течение 2 минут на орбитальном встряхивателе, чтобы индуцировать лизис клеток.
7. Планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут для стабилизации сигнала люминесценции.
8. Люминесценцию считывали и представляли в виде графиков RLU=относительные единицы люминесценции.
50
50
Альтернативно клетки высевали при оптимальной плотности в 96-луночный планшет и инкубировали в течение 4 суток в присутствии тестируемого соединения. Затем в аналитическую среду добавляли Alamar Blue™, и клетки инкубировали в течение 6 ч, после чего считывали при возбуждении 544 нм, испускании 590 нм. Значения IC вычисляли, используя соответствие сигмоидной кривой доза - ответ. Соединения 101-114 по изобретению, описанные в таблице 1, имеют значение IC (в мкМ, с клетками РСЗ): НА, 0,294, 10, 0,737, НА, 4,2, 2,4, 8, 0,399, 0,131, 2,9, 0,086, 5,9 и НА, соответственно.
d. Анализ связывания PI3K р110α (альфа)
2
2
Анализы связывания: Эксперименты по исходной поляризации проводили на приборе Analyst НТ 96-384 (Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA.). Образцы для измерений сродства с помощью флуоресцентной поляризации готовили путем добавления серийных разведении 1:3 PI3K р110 альфа (Upstate Cell Signaling Solutions, Charlottesville, VA), начиная с конечной концентрации 20 мкг/мл, в поляризационном буфере (10 мМ Трис pH 7,5, 50 мМ NaCl, 4 мМ MgCl, 0,05% Chaps и 1 мМ ДТТ), к 10 мМ PIP (Echelon-Inc., Salt Lake City, UT), конечная концентрация. После периода инкубации 30 минут при комнатной температуре реакции останавливали добавлением GRP-1 и зонда PIP3-TAMRA (Echelon-lnc., Salt Lake City, UT), конечные концентрации 100 нМ и 5 нМ соответственно. Считывание осуществляли со стандартными фильтрами с ограниченной полосой пропускания для родаминового флуорофора (λех=530 нм; λem=590 нм) в 384-луночных черных планшетах малого объема Proxiplates (PerkinElmer, Wellesley, МА). Значения флуоресцентной поляризации наносили на график как функцию концентрации белка, и значения ЕСво были получены путем приведения данных в соответствие с 4-параметрическим уравнением с использованием программы KaleidaGraph (программное обеспечение Synergy, Reading, PA). В данном эксперименте также устанавливают соответствующую концентрацию белка для использования в последующих экспериментах по конкуренции с ингибиторами.
50
2
50
Значения ингибиторной концентрации IC определяли путем добавления 0,04 мг/мл PI3K р110 альфа (конечная концентрация), объединенной с PIP (конечная концентрация 10 мМ) в лунки, содержащие серийные разведения 1:3 антагонистов при конечной концентрации 25 мМ АТФ (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA) в поляризационном буфере. После периода инкубации 30 минут при комнатной температуре реакции останавливали добавлением GRP-1 и зонда PIP3-TAMRA (Echelon-lnc., Salt Lake City, UT), конечные концентрации 100 нМ и 5 нМ соответственно. Считывание осуществляли со стандартными фильтрами с ограниченной полосой пропускания для родаминового флуорофора (λех=530 нм; λem=590 нм) в 384-луночных черных планшетах малого объема Proxiplates (PerkinElmer, Wellesley, MA). Значения флуоресцентной поляризации наносили на график как функцию концентрации антагониста, и значения IC были получены путем приведения данных в соответствие с 4-параметрическим уравнением в программе Assay Explorer (MDL, San Ramon, CA).
Приведенное выше описание рассматривают только как иллюстративное для принципов изобретения. Кроме того, поскольку различные модификации и изменения легко очевидны специалистам в данной области техники, нежелательно ограничивать изобретение точными конструкциями и способом, показанными, как описано выше. Соответственно, все целесообразные модификации и эквиваленты можно рассматривать как входящие в объем изобретения, как определено нижеследующей формулой изобретения.