СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОДИМЕРНЫХ АНТИТЕЛ

1. Способ получения гетеродимерного антитела, включающий
a) обеспечение первого гомодимерного антитела, содержащего первую Fc-область иммуноглобулина, содержащую первую область CH3, и второго гомодимерного антитела, содержащего вторую Fc-область иммуноглобулина, содержащую вторую область CH3, где аминокислотные последовательности первой области CH3 и второй области CH3 различны и таковы, что гетеродимерное взаимодействие между первой областью CH3 и второй областью CH3 сильнее, чем гомодимерное взаимодействие между первой областью CH3 или гомодимерное взаимодействие между второй областью CH3;
b) объединение первого гомодимерного антитела и второго гомодимерного антитела в смесь;
2
2
2
c) инкубацию смеси в присутствии восстанавливающего агента и растворенного кислорода окружающей среды (DO), с получением гетеродимерного антитела, где в способе отсутствует одна или более стадий измерения процентного содержания (%) DO в смеси, контроля процентного содержания DO в смеси или добавления кислорода в смесь во время получения гетеродимерного антитела.
2
2. Способ по п.1, где % DO в смеси составляет примерно 30% или более на стадии 1b).
2
3. Способ по п.1 или 2, где % DO составляет от примерно 10% до примерно 90% во время получения гетеродимерного антитела.
4. Способ по любому из пп.1-3, где первое гомодимерное антитело и второе гомодимерное антитело объединяют в смесь на стадии 1b) в молярном соотношении от примерно 1:1 до примерно 1:2.
5. Способ по любому из пп.1-3, где первое гомодимерное антитело и второе гомодимерное антитело объединяют в смесь на стадии 1b) в молярном соотношении примерно 1,05:1.
6. Способ по любому из пп.1-5, где общая концентрация иммуноглобулина в смеси составляет от примерно 8 г/л до примерно 13 г/л, как например примерно 10,5 г/л.
7. Способ по любому из пп.1-6, где смесь инкубируют в присутствии восстанавливающего агента в течение примерно 10 минут или дольше.
8. Способ по п.7, где смесь инкубируют в присутствии восстанавливающего агента от примерно 10 минут до примерно 24 часов.
9. Способ по любому из пп.1-8, где восстанавливающий агент представляет собой 2-меркаптоэтиламин (2-MEA), химическое производное 2-MEA, L-цистеин или D-цистеин.
10. Способ по п.9, где концентрация 2-MEA в смеси составляет примерно от 20 до 40 мМ, как например примерно 35 мМ.
11. Способ по любому из пп.1-10, где смесь содержит буфер.
12. Способ по п.11, где буфер включает натрий ацетатный буфер.
13. Способ по п.12, где буфер дополнительно содержит NaCl.
14. Способ по п.13, где буфер содержит примерно 100 мМ ацетата натрия и примерно 30 мМ NaCl.
15. Способ по п.14, где pH буфера составляет примерно 7,3.
16. Способ по любому из пп.1-15, включающий стадию удаления восстанавливающего агента из смеси.
17. Способ по п.16, где восстанавливающий агент удаляют фильтрацией.
18. Способ по п.17, где фильтрация представляет собой диафильтрацию.
19. Способ по любому из пп.1-18, где первое гомодимерное антитело и второе гомодимерное антитело представляют собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.
20. Способ по п.19, где первый домен CH3 и второй домен CH3 содержат следующие мутации по сравнению с IgG1 дикого типа SEQ ID NO: 1, IgG2 дикого типа SEQ ID NO: 2 или IgG4 дикого типа SEQ ID NO: 3: F405L/K409R, дикий тип/F405L_R409K,
T350I_K370T_F405L/K409R, K370W/K409R, D399AFGHILMNRSTVWY/K409R, T366ADEFGHILMQVY/K409R, L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH, D399FHKRQ/K409AGRH, F405IKLSTVW/K409AGRH, Y407LWQ/K409AGRH, T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S, T366W/T366S_L368A_Y407V, L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, K409D/D399K, K409E/D399R, K409D_K360D/D399K_E356K, K409D_K360D/D399E_E356K, K409D_K370D/D399K_E357K, K409D_K370D/D399E_E357K, K409D_K392D/D399K_E356K_E357K или K409D_K392D/D399E_E356K_E357K.
21. Способ по п.20, где первая Fc-область и/или вторая Fc-область содержит одну или более мутаций по сравнению с IgG1 дикого типа SEQ ID NO: 1, IgG2 дикого типа SEQ ID NO: 2 или IgG4 дикого типа SEQ ID NO: 3, которые модулируют связывание первой Fc-области и/или второй Fc-области с рецептором Fcγ (FcγR), FcRn или с протеином A.
22. Способ по п.21, где FcγR представляет собой FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb или FcγRIII.
23. Способ по п.21, где одна или более замен, которые модулируют связывание первой Fc-области и/или второй Fc-области с Fcγ, представляют собой L234A_L235A, F234A_L235A,
S228P_F234A_L235A, S228P_L234A_L235A, V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S, V234A_G237A, H268Q_V309L_A330S_P331S, S267E_L328F, L234F_L235E_D265A, L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S или S228P_F234A_L235A_G237A_P238S.
24. Способ по п.21, где одна или более замен, которые модулируют связывание первой Fc-области и/или второй Fc-области с FcRn, представляют собой M428L_N434S, M252Y_S254T_T256E, T250Q_M428L, N434A и T307A_E380A_N434A, H435A, P257I_N434H, D376V_N434H, M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F, T308P_N434A или H435R.
25. Способ по п.21, где одна или более замен, которые модулируют связывание первой Fc-области и/или второй Fc-области с протеином А, представляют собой Q311R, Q311K, T307P_L309Q, T307P_V309Q, T307P_L309Q_Q311R, T307P_V309Q_Q311R или HR435Y.
26. Способ по любому из пп.1-25, где стадии получения гетеродимерного антитела проводят в условиях соответствия GMP.
27. Способ по п.26, где стадии получения гетеродимерного антитела проводят во время производства лекарственного вещества, содержащего гетеродимерное антитело.
28. Способ по любому из пп.1-27, где гетеродимерное антитело представляет собой биспецифическое антитело.
29. Способ по п.28, где биспецифическое антитело связывается с CD3, CD123, BCMA, EGFR или c-Met или любой их комбинацией.
30. Способ по любому из пп.1-29, где массовое соотношение восстанавливающего агента к суммарным иммуноглобулинам в смеси составляет от примерно 1 до примерно 5.
31. Способ по п.30, где массовое соотношение составляет от примерно 1,4 до примерно 3,8.
32. Способ по п.30, где массовое соотношение составляет от примерно 3,3 до примерно 4,4.
33. Способ получения гетеродимерного антитела, включающий
a) обеспечение первого гомодимерного антитела, содержащего первую Fc-область иммуноглобулина, содержащую первую область CH3, и второго гомодимерного антитела, содержащего вторую Fc-область иммуноглобулина, содержащую вторую область CH3, где аминокислотные последовательности первой области CH3 и второй области CH3 различны и таковы, что гетеродимерное взаимодействие между первой областью CH3 и второй областью CH3 сильнее, чем гомодимерное взаимодействие между первой областью CH3 или гомодимерное взаимодействие между второй областью CH3;
b) объединение первого гомодимерного антитела и второго гомодимерного антитела в смесь;
c) инкубацию смеси в присутствии восстанавливающего агента;
d) удаление восстанавливающего агента с получением гетеродимерного антитела, где
2
процентное содержание (%) растворенного кислорода (DO) регулируется на уровне примерно 30% или ниже на стадии c), стадии d) или на обеих стадиях c) и d).
2
34. Способ по п.33, где % DO в смеси составляет примерно 25% или меньше, 20% или меньше, примерно 15% или меньше, примерно 10% или меньше, примерно 9% или меньше, примерно 8% или меньше, примерно 7% или меньше, примерно 6% или меньше, примерно 5% или меньше, примерно 4% или меньше, примерно 3% или меньше, примерно 2% или меньше или примерно 1% или меньше.
2
35. Способ по п.34, где % DO регулируется верхним слоем азота.
36. Способ по п.34 или 35, где первое гомодимерное антитело и второе гомодимерное антитело объединяют в смесь на стадии b) в молярном соотношении от примерно 1:1 до примерно 1:2.
37. Способ по п.34 или 35, где первое гомодимерное антитело и второе гомодимерное антитело объединяют в смесь на стадии b) в молярном соотношении примерно 1,05:1.
38. Способ по любому из пп.33-37, где суммарная концентрация иммуноглобулина в смеси составляет примерно 10,5 г/л.
39. Способ по любому из пп.33-38, где смесь инкубируют в присутствии восстанавливающего агента в течение примерно 10 минут или дольше.
40. Способ по любому из пп.33-39, где смесь инкубируют в присутствии восстанавливающего агента от примерно 10 минут до примерно 24 часов.
41. Способ по любому из пп.33-40, где восстанавливающий агент представляет собой 2-меркаптоэтиламин (2-MEA), химическое производное 2-MEA, L-цистеин или D-цистеин.
42. Способ по п.41, где концентрация 2-MEA в смеси составляет примерно 35 мМ.
43. Способ по любому из пп.33-42, где смесь содержит буфер.
44. Способ по п.43, где буфер включает натрий ацетатный буфер.
45. Способ по п.44, где буфер дополнительно содержит NaCl.
46. Способ по п.45, где буфер содержит примерно 100 мМ ацетата натрия и примерно 30 мМ NaCl.
47. Способ по п.46, где pH буфера составляет примерно 7,3.
48. Способ по любому из пп.33-47, включающий стадию удаления восстанавливающего агента из смеси.
49. Способ по п.48, где восстанавливающий агент удаляют фильтрацией.
50. Способ по п.49, где фильтрация представляет собой диафильтрацию.
51. Способ по любому из пп.33-50, где первое гомодимерное антитело и второе гомодимерное антитело представляют собой изотип IgG1, IgG2 или IgG4.
52. Способ по п.51, где первый домен CH3 и второй домен CH3 содержат следующие мутации по сравнению с IgG1 дикого типа SEQ ID NO: 1, IgG2 дикого типа SEQ ID NO: 2 или IgG4 дикого типа SEQ ID NO: 3: F405L/K409R, дикий тип/F405L_R409K, T350I_K370T_F405L/K409R, K370W/K409R, D399AFGHILMNRSTVWY/K409R,
T366ADEFGHILMQVY/K409R, L368ADEGHNRSTVQ/K409AGRH, D399FHKRQ/K409AGRH, F405IKLSTVW/K409AGRH, Y407LWQ/K409AGRH, T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S, T366W/T366S_L368A_Y407V, L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W, K409D/D399K, K409E/D399R, K409D_K360D/D399K_E356K, K409D_K360D/D399E_E356K, K409D_K370D/D399K_E357K, K409D_K370D/D399E_E357K, K409D_K392D/D399K_E356K_E357K или K409D_K392D/D399E_E356K_E357K.
53. Способ по п.52, где первая Fc-область и/или вторая Fc-область содержит одну или более мутаций по сравнению с IgG1 дикого типа SEQ ID NO: 1, IgG2 дикого типа SEQ ID NO: 2 или IgG4 дикого типа SEQ ID NO: 3, которые модулируют связывание первой Fc-области и/или второй Fc-области с рецептором Fcγ (FcγR), FcRn или с протеином A.
54. Способ по п.53, где FcγR представляет собой FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb или FcγRIII.
55. Способ по п.53, где одна или более замен, которые модулируют связывание первой Fc-области и/или второй Fc-области с Fcγ, представляют собой L234A_L235A, F234A_L235A,
S228P_F234A_L235A, S228P_L234A_L235A, V234A_G237A_P238S_H268A_V309L_A330S_P331S, V234A_G237A, H268Q_V309L_A330S_P331S, S267E_L328F, L234F_L235E_D265A, L234A_L235A_G237A_P238S_H268A_A330S_P331S или S228P_F234A_L235A_G237A_P238S.
56. Способ по п.53, где одна или более замен, которые модулируют связывание первой Fc-области и/или второй Fc-области с FcRn, представляют собой M428L_N434S, M252Y_S254T_T256E, T250Q_M428L, N434A и T307A_E380A_N434A, H435A, P257I_N434H, D376V_N434H, M252Y_S254T_T256E_H433K_N434F, T308P_N434A или H435R.
57. Способ по п.53, где одна или более замен, которые модулируют связывание первой Fc-области и/или второй Fc-области с протеином A, представляют собой Q311R, Q311K, T307P_L309Q, T307P_V309Q, T307P_L309Q_Q311R, T307P_V309Q_Q311R или HR435Y.
58. Способ по любому из пп.33-57, где стадии получения гетеродимерного антитела проводят в условиях соответствия GMP.
59. Способ по любому из пп.33-57, где стадии получения гетеродимерного антитела проводят во время производства лекарственного вещества, содержащего гетеродимерное антитело.
60. Способ по любому из пп.33-59, где гетеродимерное антитело представляет собой биспецифическое антитело.
61. Способ по п.60, где биспецифическое антитело связывается с CD3, CD123, BCMA, EGFR или c-Met или любой их комбинацией.
62. Способ по любому из пп.33-61, где массовое соотношение восстанавливающего агента к суммарным иммуноглобулинам в смеси составляет от примерно 1 до примерно 5.
63. Способ по п.62, где массовое соотношение составляет от примерно 1,4 до примерно 3,8.
64. Способ по п.62, где массовое соотношение составляет от примерно 3,3 до примерно 4,4.
65. Выделенное биспецифическое антитело, полученное способом по п.1.
66. Биспецифическое антитело по п.65, которое связывается с EGFR и c-Met.
67. Биспецифическое антитело по п.65 или 66, содержащее первую тяжелую цепь (HC1) SEQ ID NO: 4, первую легкую цепь (LC1) SEQ ID NO: 5, вторую тяжелую цепь (HC2) SEQ ID NO: 6 и вторую легкую цепь (LC2) SEQ ID NO: 7.
68. Биспецифическое антитело по п.65, которое связывается с CD3.
69. Выделенное биспецифическое антитело, полученное способом по п.33.
70. Биспецифическое антитело по п.69, которое связывается с EGFR и c-Met.
71. Биспецифическое антитело по п.69 или 70, содержащее первую тяжелую цепь (HC1) SEQ ID NO: 4, первую легкую цепь (LC1) SEQ ID NO: 5, вторую тяжелую цепь (HC2) SEQ ID NO: 6 и вторую легкую цепь (LC2) SEQ ID NO: 7.
72. Биспецифическое антитело по п.69, которое связывается с CD3.