КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ОРГАНИЗМА С УЛУЧШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ САХАРА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
COMPOSITION FOR OBTAINING PLANT BODY HAVING IMPROVED SUGAR CONTENT AND USE THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции, включающей вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки и используемое для получения растительного организма с повышенным содержанием сахара. Также настоящее изобретение относится к применению такой композиции.
Уровень техники
Растения, например, такие как фрукты, овощи и злаки, как правило, содержат сахар. Количество сахара в растении представлено содержанием сахара. Содержание сахара влияет на коммерческую ценность растения в зависимости от вида растения. Поэтому в последнее время ведутся технические разработки возможности увеличения содержания сахара в растении.
Например, томаты с высоким содержанием сахара получают, главным образом, путем культивирования в грунте. Затем были предложены способы получения томатов с высоким содержанием сахара путем гидропонного культивирования (см. источник 1 Патентной литературы).
Известно, что вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, например глутатион, может выполнять функцию агента, контролирующего дифференцировку клетки или органа (см. источник 2 Патентной литературы). Кроме того, известно, что глутатион может выполнять функцию вспомогательного агента, контролирующего рост растения (см. источник 3 Патентной литературы).
Перечень ссылок
Источник патентной литературы 1:
Публикация заявки на получение патента Японии, Tokukaihei, No. 10-271924 (дата публикации 13 октября 1998)
Источник патентной литературы 2:
Международная публикация WO 01/080638 (дата публикации 1 ноября 2001)
Источник патентной литературы 3:
Публикация заявки на получение патента Японии, Tokukai No. 2004-352679 (дата публикации 16 декабря 2004)
Сущность изобретения
Недостатком традиционных способов повышения содержания сахара в растениях является сложность реализации. Лишь небольшое число специалистов могут получать томаты с высоким содержанием сахара путем культивирования в почве. Более того, для получения томатов с высоким содержанием сахара с помощью гидропоники необходимы специальные методики и специальное производственное оборудование для управления культивированием.
Настоящее изобретение было выполнено с учетом этих обстоятельств, и задачей настоящего изобретения являлось обеспечение композиции для простого получения растений с повышенным содержанием сахара и обеспечение способа ее применения.
Для решения указанной задачи авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования. В результате было обнаружено, что содержание сахара в растительном организме повышается в том случае, если растение культивировали в культуральной среде (которая содержала почву и улучшающий почву агент), в которую добавляли вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, или в том случае, если растительный организм опрыскивали или непосредственно покрывали этим веществом. Настоящее изобретение составлено на основании указанных совершенно новых обнаруженных данных и включает следующие объекты изобретения.
Композиция согласно настоящему изобретению представляет собой композицию для получения растительного организма с повышенным содержанием сахара, указанная композиция содержит вещество (за исключением перекиси водорода), регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки.
Композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно составлена таким образом, что указанное вещество представляет собой глутатион, полинуклеотид, кодирующий γ-глутамилцистеинсинтетазу или полинуклеотид, кодирующий глутатион-связывающую фруктозо-1,6-дифосфатальдолазу пластидного типа.
Композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно составлена таким образом, что указанное вещество представляет собой окисленный глутатион.
Набор согласно настоящему изобретению является набором для получения растительного организма с повышенным содержанием сахара, включающий вещество (за исключением перекиси водорода), регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки.
Способ получения согласно настоящему изобретению представляет собой способ получения растительного организма с повышенным содержанием сахара, включающий стадию культивирования растительного организма с использованием вещества (за исключением перекиси водорода), регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки.
Также настоящее изобретение включает растительный организм, полученный по способу получения согласно настоящему изобретению.
Дополнительные задачи, характеристики и преимущества настоящего изобретения станут ясны из подробного описания, представленного ниже. Для более полного понимания преимуществ изобретения далее представлено подробное описание, которое следует рассматривать совместно с сопроводительными чертежами.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 иллюстрирует результаты определения содержания сахара в плоде Lycopersicum esculentum, полученном в примере 2.
Фиг.2 иллюстрирует результаты анализа ANOVA, полученные на основании результата определения сахара, представленного на фиг.1.
Фиг.3 иллюстрирует результаты определения взаимосвязи между содержанием сахара и количеством дней со дня обработки GSSG или GSH.
Фиг.4 иллюстрирует результаты определения крахмала и глюкозы 35S-GSH1.
Фиг.5 иллюстрирует результаты определения содержания сахара в плоде Prunus avium, полученном в примере 8.
Фиг.6 иллюстрирует результаты определения содержания сахара в плоде Citrus unshiu, полученном в примере 9.
Фиг.7 иллюстрирует результаты определения содержания сахара в плоде Fragaria ananassa, полученном в примере 10.
Фиг.8 иллюстрирует результаты определения содержания сахара в плоде Zea mays L. var. saccharata Sturt, полученном в примере 11.
Фиг.9 - это изображение, иллюстрирующее генетическое дерево семейства генов SEQ ID NO:15-36.
Фиг.10 иллюстрирует результаты определения глюкозы, сахарозы и крахмала в растении 35S-FBA1.
Описание вариантов реализации изобретения
<1.Композиция согласно настоящему изобретению для получения растительного организма с улучшенным содержанием сахара>
Композиция согласно настоящему изобретению для получения растительного организма с улучшенным содержанием сахара (здесь и далее в настоящем изобретении обозначается как «композиция согласно настоящему изобретению») в качестве обязательного компонента содержит вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки.
Применение композиции согласно настоящему изобретению позволяет упростить получение растительного организма с улучшенным содержанием сахара. Например, растительный организм можно получить в питательной среде, которая включает композицию согласно настоящему изобретению. Кроме того, в том случае, если вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, представляет собой полинуклеотид, как описано ниже, все, что нужно сделать - это ввести полинуклеотид в растение посредством общепринятой методики трансформации и затем вырастить растение. Это позволяет получить растение с улучшенным содержанием сахара чрезвычайно простым путем по сравнению с традиционными методиками, такими, как описанное выше культивирование в почве. Это объясняется тем, что в данном случае не требуются навыки, специальные методики, специальное производственное оборудование и т.п.
В настоящем изобретении вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, используют для получения растения с повышенным содержанием сахара. Такое применение вещества является новым и существенно отличается от традиционного применения данного вещества. В частности, тот факт, что можно получить растение с повышенным содержанием сахара, является неожиданным и не следует из опыта традиционного использования. Таким образом, настоящее изобретение создано на основании совершенно новых фактов, обнаруженных авторами настоящего изобретения.
В описании настоящего изобретения «растительный организм с повышенным содержанием сахара» представляет собой растительный организм, обладающий повышенным содержанием сахара, по сравнению с растительным организмом дикого вида. Другими словами, «растительный организм с повышенным содержанием сахара» имеет более высокое содержание сахара, чем дикий вид. Это означает, что композиция согласно настоящему изобретению представляет собой композицию, используемую для получения растительного организма с более высоким содержанием сахара, по сравнению с диким видом. Например, при культивировании растительного организма с применением композиции согласно настоящему изобретению можно повысить содержание сахара в растительном организме по сравнению с культивированием растительного организма без использования композиции согласно настоящему изобретению. Содержание сахара можно определять общепринятым способом. Также содержание сахара можно определять, используя общепринятый рефрактометр со шкалой Брикса (Brix), как описано в примерах.
В настоящем описании изобретения «вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки» представляет собой вещество, которое регулирует процесс окисления/восстановления вещества, которое отвечает за окисление-восстановление клетки. Вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, включает вещества, которые меняют свое значение, например, частота появления форм активного кислорода, абсолютное количество глутатиона, соотношение между восстановленным глутатионом и окисленным глутатионом, абсолютное количество восстановленного никотинамид-аденин-динуклеотид-фосфата (NAD(P)H), соотношение NADPH/NADP+, соотношение между окисленным цитохромом с и восстановленным цитохромом с и соотношение между процессами окисления и восстановления компонентов электронтранспортной цепи, таких как пластохинон и убихинон. Вещество, отвечающее за окисление-восстановление клетки, известно из уровня техники, однако не ограничивается только уже известными в данной области веществами. Веществом, которое меняет значение, может быть, например, вещество, которое влияет на синтез глутатиона или количество глутатиона, вещество, которое способствует или подавляет синтез активных форм кислорода, и вещество, которое способствует или подавляет превращение некоторых соединений либо в их окисленную, либо в восстановленную форму.
Данное вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, включенное в композицию согласно настоящему изобретению, не ограничивается указанными выше примерами. Однако предпочтительно, чтобы это вещество влияло на синтез глутатиона или количество глутатиона. Такое вещество позволяет получать растение с повышенным содержанием сахара.
В описании настоящего изобретения «вещество, влияющее на синтез глутатиона или количество глутатиона» представляет собой вещество, которое изменяет количество глутатиона в клетке, и предпочтительно данное вещество увеличивает количество глутатиона, например, собственно глутатиона, фермента, необходимого для синтеза глутатиона и полинуклеотида, кодирующего этот фермент.
Вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки может подразделяться на 1) вещество, которое может поглощаться растением при непосредственном контакте с растением, и 2) вещество, которое встраивают в геном растения. Очевидно, что эти вещества можно использовать по отдельности или в сочетании.
Веществом, которое влияет на синтез глутатиона или количество глутатиона и может поглощаться растением при непосредственном контакте с растением может быть, например, глутатион, конъюгат глутатиона, активный кислород (например, перекись водорода), активный азот, полиамин, окисленный титан, жасмоновая кислота, салициловая кислота, цистеин, цистин, ионы тяжелых металлов кадмия или железа. Полиамин может давать перекись водорода. Окисленный титан генерирует активный кислород на свету. Цистеин и цистин - предшественники глутатиона. Предпочтительно повышенное применение ионов тяжелых металлов кадмия и железа. Среди всех представленных выше соединений наиболее предпочтительным является глутатион. Глутатион включает восстановленный глутатион (здесь и далее обозначен "GSH") и окисленный глутатион (здесь и далее обозначен "GSSG"). Согласно настоящему изобретению GSSG является предпочтительной формой глутатиона для включения в композицию. Как описано ниже в примерах, при прменении GSSG можно получать растение с повышенным содержанием сахара. Кроме этого, при применении GSSG можно увеличить количество плодов и их размер.
Веществом, которое влияет на синтез глутатиона или на количество глутатиона и встраивается в геном растения, предпочтительно может быть, например, γ-глутамилцистеинсинтетаза, полинуклеотид, кодирующий γ-глутамилцистеинсинтетазу (здесь и далее обозначен "GSH1 ген"), глутатионсвязывающая фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза пластидного типа, или полинуклеотид, кодирующий глутатион-связывающую фруктозо-1,6-дифосфатальдолазу пластидного типа (здесь и далее обозначен "FBA ген").
Частные примеры гена GSH1 не ограничиваются конкретными вариантами и включают, например, такие гены, как Zinnia elegans (идентификационный номер в Genbank: АВ158510), Oryza sativa (идентификационный номер в Genbank: AJ508915), и Nicotiana tabacum L. (идентификационный номер в Genbank: DQ444219). Указанные гены данных растений могут быть соответствующим образом использованы в настоящем изобретении. У каждого продукта трансляции указанных генов на N-концевом участке есть сигнальный пептид, направляющий транспорт белка в хлоропласт, как у Arabidopsis thaliana.
В настоящем изобретении в качестве гена GSH1 предпочтительно используют следующие примеры а)-г):
(а) полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или 3;
(б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, обладающий γ-глутамилцистеинсинтетазной активностью и имеющий аминокислотную последовательность с делецией, заменой или встраиванием одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или 3;
(в) полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:2 или 4 и
(г) полинуклеотид, который при жестких условиях подвергается гибридизации с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований, комплементарную любому из полинуклеотидов, представленных в примерах а)-в).
Заметим, что последовательность SEQ ID NO:2 представляет собой пример последовательности оснований, кодирующей полипетид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. Также заметим, что последовательность SEQ ID NO:4 является примером последовательности оснований, кодирующей полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.
Ген FBA не ограничивается частным образом, но предпочтительно может быть одним из примеров д)-з):
(д) полинуклеотид, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность любую из следующих: SEQ ID NO:5, 6 и 15-36;
(е) полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий активностью глутатион-связывающей фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы пластидного типа и имеющий аминокислотную последовательность с делецией, заменой или встраиванием одной или нескольких аминокислот в любую из аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:5, 6 и 15-36;
(ж) полинуклеотид, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO: 7 и 37-56 и
(з) полинуклеотид, который при жестких условиях подвергается гибридизации с полинуклеотидом, имеющим последовательность оснований, комплементарную любому из полинуклеотидов, представленных в примерах е)-ж).
Последовательность SEQ ID NO:8 показывает последовательность кДНК, кодирующую белок, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5. В последовательности оснований SEQ ID NO:8 последовательность в положениях от 145 до 147 представляет собой старт-кодон и последовательность в положениях от 1318 до 1320 представляет собой стоп-кодон. Другими словами, в гене FBA1 Arabidopsis thaliana в качестве открытой рамки считывания имеется последовательность оснований в положениях от 145 до 1320 последовательности оснований SEQ ID NO:8.
Последовательность SEQ ID NO:9 показывает пример последовательности оснований, кодирующей белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6. В последовательности SEQ ID NO:9 последовательность в положениях от 104 до 1300 - это участок, кодирующий белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6. Заметим, что пептид, составленный из аминокислот между метионином в положении 1 и аланином в положении 48 последовательности SEQ ID NO:6, представляет собой хлоропластный транзитный пептид.
Последовательность оснований SEQ ID NO:7 представляет собой последовательность, которая служит открытой рамкой считывания в гене FBA1 Arabidopsis thaliana. Последовательность оснований гена FBA1 Arabidopsis thaliana гомологична, например, гену (dbj|BAB55475.1) в геноме Oryza sativa.
Последовательности SEQ ID NO:37 - 56 являются примерами последовательностей ДНК, кодирующих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:15 - 34 соответственно.
В качестве ссылки, фиг.9 иллюстрирует дендрограмму аминокислотной последовательности SEQ ID NO:15-36.
Специалисту в данной области будет ясно, что в том случае, если вышеуказанные аминокислотные последовательности или ДНК-последовательности включают участок, соответствующий сигналу транспорта белка в хлоропласт, то данный участок может быть замещен сигналом транспорта другого белка в хлоропласт.
В настоящей заявке формулировка «делеция, замена или встраивание одной или нескольких аминокислот» означает делецию, замену или вставку такого количества аминокислот (предпочтительно 10 или менее, более предпочтительно 7 или менее, более предпочтительно 5 или менее), которое можно удалить, заменить или вставить посредством известного способа получения мутантного пептида, например, методом индукции сайт-специфического мутагенеза. Такой мутантный белок не ограничивается белком, который искусственно подвергают мутации с помощью известного способа получения мутантного полипептида, он также может быть выделенным и очищенным природным белком.
В данной области техники известно, что некоторые аминокислоты в аминокислотной последовательности белка можно легко изменить без оказания существенного влияния на структуру или функцию белка. Также в данной области техники известно, что, наряду с искусственно измененным белком, у белка есть природный мутант, не имеющий существенных изменений структуры или функции.
Предпочтительно, чтобы у мутантов были консервативные или неконсервативные замены, делеции или встраивания аминокислот(ы). В этом отношении более предпочтительны молчащие замены, встраивания и делеции, особенно предпочтительны консервативные замены. Согласно настоящему изобретению такие мутации не меняют активность полипептида.
Считается, что типичными примерами консервативных замен являются замена одной аминокислоты на другую из числа алифатических аминокислот Ala (аланин), Val (валин), Leu (лейцин) и Ile (изолейцин); замена гидроксильных групп Ser (серин) и Thr (треонин); замена кислотных групп Asp (аспартат) и Glu (глютамин); замена аминогрупп Asn (аспарагин) и Gln (глютамин); замена основных групп Lys (лизин) и Arg (аргинин); и замена аромагрупп Phe (фенилаланин) и Туr (тирозин).
В настоящем описании изобретения под «жесткими условиями» понимаются такие условия, при которых последовательность подвергается гибридизации с другой последовательностью только в том случае, если последовательности идентичны по меньшей мере на 90%, предпочтительнее, по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно на 97%. В частности, «жесткие условия» включают, например, инкубацию в течение ночи при 42°С в растворе для гибридизации (50% формамид, 5×SSC (15 мМ тринатриевого цитрата и 150 мМ NaCl), 50 мМ фосфата натрия (рН 7.6), 5 × раствор Денхардта, 10% декстран сульфата и 20 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося) и промывание на фильтре в 0.1×SSC при приблизительно 65°С. Гибридизацию можно поводить с помощью известного метода, например, описанного в Molecular cloning, A Laboratory Manual, 3rd Ed., Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory (2001). Обычно, чем выше температура и меньше концентрация солей, тем жестче становятся условия (труднее происходит гибридизация). Более жесткие условия позволяют получить полинуклеотид с более высокой степенью гомологии.
В том случае, если композиция согласно настоящему изобретению включает полинуклеотид из числа указанных выше полинуклеотидов, то такая композиция согласно настоящему изобретению может включать вектор экспрессии с этим нуклеотидом. Вектор экспрессии можно сконструировать с помощью известного способа, который не ограничивается каким либо конкретным способом.
В качестве основы для вектора экспрессии можно использовать различные известные векторы. Например, в качестве подходящего вектора в соответствии со способом введения или типом растительной клетки, в которую вводится вектор, могут быть использованы и выбраны в качестве подходящих плазмида, фаг, космида и т.п. В частности, можно использовать, например, вектор pBR322, вектор pBR325, вектор pUC19, вектор pUC119, вектор pBluescript, вектор pBluescriptSK, вектор pBI и т.п. В частности, в тех случаях, когда композицию согласно настоящему изобретению применяют для введения вектора, содержащего полинуклеотид, в растительный организм с помощью способа Agrobacterium, предпочтительно использовать бинарный вектор pBI. В частности, например, бинарным вектором pBI могут быть pBIG, pBIN 19, pBI101, pBI121, pBI221 или т.п.
В векторе экспрессии промотор не ограничивается каким либо конкретным промотором, при условии, что в растительном организме он принимает участие в экспрессии гена, может быть использован соответствующий известный промотор. Промоторами могут быть, например, промотор вируса 35S мозаики цветной капусты (CaMV35S), промотор актина, промотор нопалин синтетазы, промотор гена PR1a табака, промотор гена малой субъединицы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы/оксидазы томата и т.п. Из числа указанных промоторов предпочтительно можно использовать промотор вируса 35S мозаики цветной капусты или промотор актина. При введении в растительную клетку вектор экспрессии с любым из промоторов может стабильно экспрессировать введенный ген.
Важным условием является введение промотора в вектор таким образом, чтобы можно было их соединить, обеспечив экспрессию гена, кодирующего фактор транскрипции. Структура промотора не ограничивается какой либо конкретной структурой в отличие от вектора экспрессии.
Кроме того, в дополнение к промотору и полинуклеотиду, вектор экспрессии может включать фрагмент ДНК. Фрагмент ДНК не ограничивается конкретным фрагментом и может представлять собой терминатор, маркер селекции, энхансер, последовательность оснований для увеличения эффективности трансляции и т.п. Кроме того, вектор экспрессии может включать фрагмент Т-ДНК. Фрагмент Т-ДНК может увеличивать эффективность введения гена, в частности, если вектор экспрессии вводится в растительный организм с помощью Agrobacterium.
Терминатор не ограничивается конкретным вариантом терминатора, при условии, что он выполняет функцию сайта терминации транскрипции, и указанным терминатором может быть известный терминатор. В частности, например, предпочтительно использовать сайт терминации транскрипции гена нопалин-синтетазы (Nos терминатор), вируса 35S мозаики цветной капусты (CaMV35S терминатор) и т.п. Из их числа предпочтительнее использовать терминатор Nos. Благодаря встраиванию терминатора в соответствующий сайт вектора экспрессии после введения этого вектора экспрессии в растительный организм можно избежать таких явлений, как синтез излишне длинного транскрипта, а также снижения числа копий плазмиды при использовании сильного промотора.
Маркером селекции может быть, например, ген резистентности к лекарственному средству. Например, ген резистентности к лекарственному средству может быть геном резистентности к гидромицину, блеомицину, канамицину, гентамицину, хлорамфениколу и т.п. С помощью гена резистентности к лекарственному средству можно легко вывести трансформированное растение, культивируя растительные организмы на культуральной среде, включающей упомянутый выше антибиотик, и затем отбирая растительный организм, способный расти на данной культуральной среде.
Полинуклеотидом для повышения эффективности трансляции может быть, например, последовательность омега, полученная из вируса табачной мозаики. Встраивая последовательность омега в нетранслируемый участок (5'UTR) промотора, можно повышать эффективность трансляции гена, кодирующего фактор транскрипции. Как описано выше, для различных целей в вектор экспрессии можно встраивать различные фрагменты ДНК.
В частности, вектор экспрессии конструируют с помощью, например, способа, при котором промотор, полинуклеотид и фрагмент ДНК, при необходимости, встраивают в соответствующим образом выбранный базовый вектор в строго определенном порядке. Полинуклеотид и промотор (и терминатор и т.п., при необходимости) могут быть связаны с образованием кассеты экспрессии, которую можно ввести в базовый вектор. При конструировании кассеты экспрессии можно обеспечить, чтобы каждый фрагмент ДНК включал сайт расщепления в качестве липкого конца, комплементарного липкому концу другого фрагмента ДНК, и эти липкие концы взаимодействуют посредством фермента, катализирующего лигирование. Это позволяет регулировать порядок фрагментов ДНК. В том случае, если в кассету экспрессии включен терминатор, тогда промотор, полинуклеотид, кодирующий N-ацетилглюкозаминтрансферазу, и данный терминатор встраивают в указанном порядке выше по ходу транскрипции. Реагенты, используемые для конструирования вектора экспрессии, например ферменты рестрикции, лигирования и т.п., частным образом не ограничены определенными типами и соответственно могут быть выбраны и использованы коммерчески доступные реагенты.
Вектор экспрессии можно мультиплицировать с помощью известного способа, и способ мультипликации (способ получения) вектора экспрессии частным образом неограничен. Обычно вектор экспрессии мультиплицируют в клетке Escherichia coli в качестве клетки-хозяина. В таком случае соответствующий тип Е. coli выбирается на основании типа вектора экспрессии.
Можно использовать представленные выше вещества по отдельности, а также использовать два или более типов веществ в комбинации.
В том случае, если композиция согласно настоящему изобретению в качестве вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки, включает вещество, которое может поглощаться растением при непосредственном контакте, тогда количество вещества частным образом не ограничивается, но предпочтительно составляет 0.01 мМ - 20 мМ, белее предпочтительно 0.1 мМ - 2 мМ. Если количество вещества находится в этих пределах, можно эффективно повысить содержание сахара в получаемом растении. Следует отметить, что концентрацию вещества можно изменить в соответствии с требуемым содержанием сахара, типом растения, к которому вносят вещество, и т.п.
Композиция согласно настоящему изобретению может включать другой компонент в таком количестве, при котором он не мешает действию композиции согласно настоящему изобретению. Например, если композиция согласно настоящему изобретению в качестве вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки, включает вещество, которое может поглощаться растением при непосредственном контакте, композицию можно растворять в воде, известном жидком носителе и т.п. для того, чтобы получить ее в жидкой форме, эмульсии, геле и т.п. Такими жидкими носителями могут быть, но не ограничиваются ими, например, ароматический углеводород, например ксилол; спирт, например этанол и этиленгликоль; кетон, например ацетон; простой эфир, например диоксан и тетрагидрофуран; диметилформамид, диметилсульфоксид, ацетонитрил и т.п.
Альтернативно, вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, может иметь основу в виде твердого носителя, и таким образом, получают композицию в форме твердого агента, порошкообразного агента и т.п. Такими компонентами твердых носителей могут быть, без ограничения, неорганические вещества, например тальк, глина, вермикулит, диатомит, каолин, карбонат кальция, гидрохлорид кальция, белая глина и силикагель, и органические вещества, например мука и крахмал. Кроме того, композицию согласно настоящему изобретению можно сочетать с другим вспомогательным агентом соответственно. Таким вспомогательным агентом может быть, например, поверхностно-активный анионный агент, например алкилсульфат, алкилсульфонат, алкиларилсульфонат, диалкилсульфосукцинат; поверхносто-активный катионный агент, например соль высшего алифатического амина; неионный поверхностно-активный агент, например алкиловый эфир полиоксиэтиленгликоля, ациловый эфир полиоксиэтиленгликоля, полиспиртовый ациловый эфир полиоксэтиленгликоля и производные целлюлозы; загуститель, например желатин, казеин и гуммиарабик; утяжелитель, связывающий агент и т.п.
Применение композиции согласно настоящему изобретению частным образом не ограничено. Например, в случае, если композиция согласно настоящему изобретению в качестве вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки, включает вещество, которое может поглощаться растением при непосредственном контакте, и при условии, что композиция является жидким агентом, указанную композицию можно добавить в питательную среду или ту среду, которая используется для культивирования растения, или может быть распылена, разбрызгана, или нанесена на растительный организм целиком или на его часть, например вегетативную точку роста, почки, листья и стебель. Отметим, что «питательная среда», используемая для культивирования растительного организма в настоящем описании изобретения включает почву и улучшающий почву агент.
В случае, если композиция согласно настоящему изобретению является твердым агентом или подобным ему агентом, указанную композицию можно добавлять в питательную среду, которую используют для культивирования растения. Альтернативно, при гидропонном культивировании композицию можно добавлять в воду и постепенно растворять в ней. Композицию можно применять в твердой форме или подобном виде для растворения в воде и в растворенном на момент использования виде. Кроме того, композицию согласно настоящему изобретению можно вносить растению в виде смеси с известным удобрением и агентом, например фитогормоном.
Композиция согласно настоящему изобретению частым образом не ограничена временем ее внесения растению. Например, можно применять композицию, начиная с момента посева. В частности, в случае, если композицию вносят такому растению, как, например, Lycopersicum esculentum, которое плодоносит спустя приблизительно от двух месяцев до полугода после посева, то композицию можно вносить в день высева и предпочтительно через постоянные промежутки времени в течение 30 дней после посева, более предпочтительно в течение 60 дней после посева, наиболее предпочтительно с момента посева до сбора урожая. В этом случае периодичность внесения композиции частным образом не ограничивается, но предпочтительно составляет от одного до четырех раз в неделю, более предпочтительно дважды или трижды в неделю. Вносимое количество композиции частным образом не ограничивается. Можно установить подходящее вносимое количество композиции в соответствии с типом растения. В случае Lycopersicum esculentum и т.п., например, вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, вносят единовременно в количестве предпочтительно 0.001 мМ или более и 0.1 мМ или менее, более предпочтительно 0.01 мМ или более и 0.05 мМ или менее на каждое растение. В случае, если композицию добавляют в питательную среду, как описано выше, композицию вносят растению, начиная с момента посева в питательную среду или с момента, когда рассаду растения или т.п. пересаживают на питательную среду.
Композицию согласно настоящему изобретению можно вносить растению после посева и после того, как растение выросло до некоторой степени, например после получения всходов. Например, если композицию вносят злаковым, например Zea mays L. var. saccharata Sturt, композицию можно вносить после того, как получены всходы растения. В этом случае композицию согласно настоящему изобретению можно заранее добавить в питательную среду, в которую будут пересаживать рассаду, или можно периодически добавлять в питательную среду после пересадки в нее рассады. В том случае, если композицию вносят после пересадки рассады, периодичность ее внесения конкретно не ограничивается. Однако предпочтительно вносить композицию от одного до четырех раз в неделю, более предпочтительно дважды или трижды в неделю после пересадки рассады до сбора урожая. Вносимое количество композиции частным образом не ограничено. Можно подобрать вносимое количество композиции в зависимости от вида растения. В случае Zea mays L. var. saccharata Sturt и т.п., например, предпочтительно вносить вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, единовременно в количестве 0.001 мМ или более и 0.1 мМ или менее, более предпочтительно 0.01 мМ или более и 0.05 мМ или менее на каждое растение.
Также можно определить момент внесения композиции с учетом времени цветения растения. Например, можно вносить композицию до момента расцветания бутона, после опадания лепестков, начиная с периода пока не распустился бутон и до момента плодоношения, или начиная с момента цветения до момента плодоношения, или с момента опадания лепестков до плодоношения. В том случае, если композицию вносят Vitis labrusca, как описано ниже в примерах, то композицию можно вносить к антотоксии. В этом примере композицию смешивают с фитогормоном (гиберрелин), это необходимо для получения бессемянных плодов Vitis labrusca, и вносят в момент подачи фитогормона.
Также можно определить момент времени внесения композиции на основании обратного отсчета дней от момента сбора урожая. Например, композицию можно вносить за 10 или 20 дней до сбора урожая.
В том случае, если композицию согласно настоящему изобретению применяют в процессе культивирования растения, как описано выше, то композицию можно смешать с удобрением и/или агентом, например фитогормоном, как описано выше. В таком случае, момент внесения композиции и удобрения и т.п. не ограничены конкретными значениями, и смесь можно вносить в период, описанный выше, или в момент времени, предпочтительный для внесения удобрения и т.п.
Если композиция согласно настоящему изобретению в качестве вещества, повышающего содержание глутатиона в клетке, включает вещество, вводимое в геном растения, например полинуклеотид, описанный выше, то можно применять данную композицию таким образом, чтобы введение полинуклеотида в геном растения осуществлялось посредством известного способа трансформации. Например, композиция может включать полинуклеотид, и ее можно вводить в растительный организм с помощью известного растительного вектора экспрессии или же композиция может включать вектор, который содержит полинуклеотид.
Состав полинкулеотида в композиции согласно настоящему изобретению частным образом не ограничен. Полинуклеотид можно растворить в буфере и т.п., что обычно используется для сохранения полинуклеотидов.
Введение вектора в растительную клетку осуществляется по известным в данной области техники способам трансформации (например, с помощью метода агробактериальной трансформации (Agrobacterium), метода «генной пушки», с помощью метода с использованием полиэтиленгликоля и метода электропорации). Например, при использовании метода Agrobacterium сконструированный вектор экспрессии вводят в соответствующую бактерию рода Agrobacterium (например, Agrobacterium tumefaciens) и асептически выращенный листовой диск инфицируют этим штаммом по соответствующему способу (Hirofumi UCHIMIYA, Manuals for plant genetic manipulation, 1990, 27-31 pp, Kodansha Scientific Ltd., Tokyo) и т.п., для получения трансформированного растения. В случае применения метода «генной пушки» можно использовать 1) растительный организм, орган растения или растительную ткань без специальной подготовки; 2) вырезанный фрагмент растительного организма, органа растения или растительной ткани или 3) протопласт растительного организма, органа растения или растительной ткани. Такие подготовленные образцы можно обработать с использованием оборудования для введения генов (например, PDS-1000, Bio-Rad Laboratories, Inc.). При этом процессе условия различаются в зависимости от растения или типа образца, однако обычно их подбирают таким образом, что давление составляет приблизительно 450-2000 psi и расстояние составляет приблизительно от 4 до 12 см.
Клетку или растительную ткань, в которые вводят целевой ген, отбирают с помощью маркера резистентности к лекарственному средству, например маркеров резистентности к канамицину и гидромицину, и затем с помощью стандартного способа репродуцируют до растительного организма. Репродукцию растительного организма из трансформированной клетки можно осуществлять по известному в данной области техники способу в соответствии с типом растительной клетки.
Для того, чтобы определить, встроился ли целевой ген в растение, можно использовать ПЦР, Саузерн-гибридизацию, Нозерн-гибридизацию и т.п. Например, выделяют ДНК из трансформированной клетки и затем проводят ПЦР с праймерами, специфичными для ДНК, которую вводили в трансформированное растение. Затем продукты амплификации подвергают электрофорезу на агарозном геле или полиакриламидном геле или капиллярному электрофорезу и потом окрашивают бромистым этидием. В результате можно определить целевой продукт амплификации. Таким образом, можно определить, трансформировано ли растение.
После получения трансформированного растительного организма, в котором целевой ген встроен в геном, можно получить потомство трансформированного растительного организма с помощью полового или бесполого размножения. Далее можно серийно получать целевые растительные организмы с помощью репродуктивного материла (например, семян, протопластов), полученных от растительного организма или клона растительного организма.
В настоящем изобретении целевое для трансформации растение представляет собой целый растительный организм, орган растения (например, лист, лепесток, стебель, корень и семя), растительную ткань (например, эпидерма, флоэма, паренхима, ксилема, сосуды, палисадная паренхима, губчатая паренхима), культуру растительных клеток, растительные клетки в различных формах (например, суспензионная клеточная культура), протопласт, кусок листа, каллуса и т.п. Целевое растение для трансформации частным образом не органичено, и соответственно можно вывести растение, способное экспрессировать целевой ген.
Полинуклеотид, указанный выше, получают из Arabidopsis thaliana. Сообщалось, что, используя ген Arabidopsis thaliana, можно получить, например, такие трансформированные растения, как Nicotiana tabacum L., Populus, Citrus limon и т.п. Такие сообщения также могут быть использованы в качестве источника информации относительно применения композиции согласно настоящему изобретению (Franke R, McMichael CM, Meyer К, Shirley AM, Cusumano JC, Chappie C. (2000) Modified lignin in tobacco and poplar plants over-expressing the Arabidopsis gene encoding ferulate 5-hydroxylase. Plant J. 22: 223-234; Pena L, Martin-Trillo M, Juarez J, Pina JA, Navarro L, Martinez-Zapater JM. (2001) Constitutive expression of Arabidopsis LEAFY or APETALA1 genes in citrus reduces their generation time. Nat Biotechnol. 19: 263-267).
Вид целевого растения, которому можно вносить композицию согласно настоящему изобретению, не ограничен конкретными видами. Композицию можно вносить практически для всех растений, например, различным однодольным, двудольным растениям или деревьям. В числе примеров однодольных растений: Lemnaceae, например, Spirodela (Spirodela polyrhiza Schleid) и Lemna (Lemna paucicostata и Lemna trisulca); Orchidaceae, например, Cattleya, Cymbidium, Dendrobium, Phalaenopsis, Vanda, Paphlopedllum и Oncidium; Typhaceae; Sparganiaceae; Potamogetonaceae; Najadaceae; Scheuchzeriaceae; Alismataceae; Hydrocharitaceae; Triuridaceae; Gramineae (например, Zea mays, такой как Zea mays L. var. saccharata Sturt), Cyperaceae; Palmae; Araceae; Eriocaulaceae; Commelinaceae; Pontederiaceae; Juncaceae; Stemonaceae; Liliaceae; Amaryllidaceae; Dioscoreacea; Iridaceae; Musaceae; Zingiberaceae; Cannaceae и Burmannia.
В числе примеров двудольных растений: Convolvulaceae, например, Pharbitis (Pharbitis nil Choisy), Calystegia (Calystegia japonica Choisy, Calystegia hederacea и Calysteegia soldanella Rohm, et Schult.), Ipomoea (Ipomoea pes-caprae и Ipomoea batatas Lam. var. edulis Maikno) и Cuscuta (Cuscuta japonica Chois. и Cuscuta australis); Caryophyllaceae, например, Dianthus (Dianthus caryophillus L.), Stellaria, Minuartia, Cerastium, Sagina, Arenaria, Moehringia, Pseudostellaria, Hankenya, Spergula, Spergularia, Silene, Lychnis, Melandryum и Cucubalus; Casuarinaceae; Saururacea; Piperaceae; Choranthaceae; Sailicaceae; Myricaceae; Juglandaceae; Betulaceae; Fagaceae; Ulmaceae; Moraceae; Urticaceae; Podostemaceae; Proteaceae; Olacaceae; Santalaceae; Loranthaceae; Aristolochiaceae; Rafflesiaceae; Balanophoraceae; Polygonaceae; Chenopodiaceae; Amaranthaceae; Nyctaginaceae; Cynocrmbaceae; Phytolaccaceae; Aizoaceae; Portulacaceae; Magnoliaceae; Trochodendraceae; Cercidphyllaceae; Nymphaeaceae; Ceratophyllaceae; Ranunculaceae; Lardizabalaeae; Berberidaceae; Menispermaceae; Calycanthaceae; Lauraceae; Papaveraceae; Capparidaceae; Cruciferae; Droseraceae; Nepenthaceae; Crassulaceae; Saxifragaceae; Pittosporaceae; Hamamelidaceae; Platanaceae; Rosaceae; Leguminosae; Oxalidaceae; Geraniaceae; Linaceae; Zygophyllaceae; Rutaceae; Cimaroubaceae; Meliaceae; Polygalaceae; Euphorbiaceae; Callitrichaceae; Buxaceae; Empetraceae; Coriariaceae; Anacardiaceae; Aquifoliaceae; Celastraceae; Staphyleaceae; Icacinaceae; Aceraceae; Hippocastanaceae; Sapindaceae; Sabiaceae; Balsaminaceae; Rhamnaceae; Vitaceae; Elaeocarpaceae; Tiliaceae; Malvaceae; Stearculiaceae; Actinidiaceae; Theaceae; Guttiferae; Elatinaceae; Tamaricaceae; Violaceae; Flacourtiaceae; Stachyuraceae; Passifloraceae; Begoniaceae; Cactaceae; Thymelaeaceae; Elaegnaceae; Lythraceae; Punicaceae; Rhizophoraceae; Alangiaceae; Melastomataceae; Hydrocaryaceae; Oenotheraceae; Haloragaceae; Hippuridaceae; Araliaceae; Umbelliferae; Cornaceae; Diapensiaceae; Clethraceae; Pyrolaceae; Uricaceae; Myrsinaceae; Primulaceae; Plumbaginaceae; Ebenaceae; Symplocaceae; Styracaceae; Oleaceae; Loganiaceae; Gentianaceae; Apocynaceae; Asclepiadaceae; Polemoniaceae; Boraginaceae; Verbenaceae; Labiatae; Solanaceae (например, Lycopersicum esculentum); Scrophulariaceae; Bignoniaceae; Pedaliaceae; Orobanchaceae; Gesneriaceae; Lentibulariaceae; Acanthaceae; Myoporaceae; Phrymaceae; Plantaginaceae; Rubiaceae; Caprifoliaceae; Adoxaceae; Valerianaceae; Dipsacaceae; Cucurbitaceae; Campanulaceae и Compositae.
Настоящее изобретение включает набор для получения растительного организма с повышенным содержанием сахара (здесь и далее "набор согласно настоящему изобретению"). Набор согласно настоящему изобретению включает в качестве обязательного компонента вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки (например, глутатион, полинкулеотид, кодирующий γ-глутамилцистеинсинтетазу, или полинуклеотид, кодирующий глутатионсвязывающую фруктозо-1,6-дифосфатальдолазу пластидного типа). Дополнительно набор согласно настоящему изобретению может включать другой компонент, отличный от приведенных выше веществ. Вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки, и указанный компонент можно хранить вместе в одном контейнере, предназначенном для хранения вещества и компонента в соответствующих количествах и/или в подходящей форме, или отдельно в разных контейнерах. Далее, набор согласно настоящему изобретению может включать приспособление для культивирования растений, питательную среду и т.п. В том случае, если в набор согласно настоящему изобретению включен полинуклеотид, тогда набор может быть составлен таким образом, что базовый вектор вектора экспрессии для экспрессии полинуклеотида можно хранить в отдельном от полинуклеотида контейнере. Альтернативно, набор может включать базовый вектор, в который заранее встроен полинуклеотид. Далее, набор согласно настоящему изобретению может включать реагент или т.п., который используется в известном способе трансформации растений.
<2. Способ согласно настоящему изобретению для получения растительного организма с повышенным содержанием сахара.>
Способ согласно настоящему изобретению для получения растительного организма с повышенным содержанием сахара (здесь и далее «способ согласно настоящему изобретению») включает в качестве обязательной стадию культивирования растительного организма с применением вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки (например, глутатион, полинуклеотид, кодирующий γ-глутамилцистеинсинтетазу или полинуклеотид, кодирующий глутатион-связывающую фруктозо-1,6-дифосфатальдолазу пластидного типа).
Если в качестве вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки, используют вещество, которое может поглощаться растением при непосредственном контакте, указанная стадия может включать, например, стимулирование растения к поглощению вещества. Способ стимулирования растения к поглощению вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки, не ограничен конкретными способами. Например, можно стимулировать растение к поглощению указанного вещества, культивируя растение на питательной среде (включающей почву и улучшающий почву агент), включающей данное вещество, или распыляя или покрывая растение этим веществом в процессе культивирования растения. Альтернативно, можно культивировать растение на питательной среде, включающей абсорбент, например ионообменную смолу с сорбированным на ней веществом, причем абсорбент, например, зарывают в почву питательной среды.
В том случае, если в качестве вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояния клетки, используют вещество, например, полинуклеотид, который должен быть встроен в геном растения, указанный способ не включает стадию стимулирования растения к поглощению вещества, но может включать предварительное введение вещества в растение с получением трансформированного растения, и стадию культивирование полученного растения. Способ введения полинуклеотида в растение описан выше в описании композиции согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение включает растительный организм, полученный по способу согласно настоящему изобретению. Можно легко идентифицировать такой растительный организм, измеряя, по меньшей мере, либо содержание, либо соотношение вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки в растительном организме. Таки образом, можно четко отличить данный растительный организм от другого, полученного иным способом. Также можно идентифицировать такой растительный организм, например, с помощью технологии ДНК-микрочипа и т.п., помимо измерения содержания и концентрации указанного вещества. В том случае, если в качестве такого вещества используется GSSG, можно применить следующие методики: 1) проведение предварительного анализа паттерна экспрессии генов растения, культивированного после внесения GSSG; 2) определение паттерна экспрессии, уникального для растительного организма, обработанного GSSG (паттерн экспрессии GSSG) на основании сравнения паттерна экспрессии генов растительного организма, обработанного GSSG, и растительного организма, которое культивировали другим способом; 3) проведение анализа паттерна экспрессии целевого растения и затем 4) сравнение паттерна экспрессии целевого растительного организма с паттерном экспрессии GSSG. Это позволяет легко идентифицировать растительный организм, обработанный GSSG. Далее, в качестве другого примера идентификации, определить, был ли внесен GSSG, можно путем сравнения профиля двумерного электрофоретического спектра глутатионсвязывающего белка с профилем, для которого был проведен предварительный анализ изменений паттерна. В том случае, если используется полинуклеотид, растительный организм согласно настоящему изобретению можно отличить от другого растительного организма, путем определения полинуклеотида в растительном организме с помощью ПЦР, Суазерн-гибридизации, Нозерн-гибридизации и т.п.
Более подробные варианты реализации изобретения описаны ниже в примерах. Очевидно, что настоящее изобретение не ограничено нижеприведенными примерами и возможны различные модификации настоящего изобретения. Настоящее изобретение не ограничивается описанием вышеприведенных вариантов реализации, но может быть изменено специалистом в рамках формулы изобретения. Вариант реализации, основанный на соответствующей комбинации технических средств, раскрытых в различных способах реализации, включен в технический объем настоящего изобретения. Все отмеченные документы включены в настоящее изобретение посредством ссылки.
Примеры
<Пример 1. Получение Lycopersicum esculentum>
В настоящем примере Lycopersicum esculentum культивировали с применением GSSG или GSH. Культивирование подробно описано ниже.
Сначала проростки Lycopersicum esculentum (TAKII & CO. Ltd., название продукта: Osama tomato reika) пересаживали в емкость для гидропонной культуры (1/2000 а). В емкость для гидропонной культуры помещали 6 л вермикулита (ASAHI INDUSTRIES Co., LTD.), 3 л огородной почвы KUREHA (KUREHA CORPORATION) и 3 л вермикулита в качестве нижнего, промежуточного и верхнего слоев соответственно.
В процессе культивирования Lycopersicum esculentum дважды в неделю к корням каждого растения вносили 50 мл 0.5 мМ GSSG или 0.5 мМ GSH (с рН 7, доведенным с помощью 0.1 N NaOH). Растения Lycopersicum esculentum культивировали в течение 60 дней без удаления почек. Последние десять дней считали периодом сбора урожая, когда собирали урожай плодов растения. Для сравнения результатов растения Lycopersicum esculentum культивировали в аналогичных условиях, но без добавления GSSG и GSH. Раз в две недели все растения независимо от условий культивирования дополнительно удобряли 3 г сложного азотно-фосфорно-калийного удобрения Kumiai S-604 (Chisso Asahi Fertilizer Co., Ltd.).
Затем в собранных плодах проводили сенсорный тест на определение содержания сахара и т.п. В результате обнаружено, что в плодах растений, обработанных GSSG, увеличилось содержание сахара по сравнению с плодами растений, которые не обрабатывали GSSG или GSH. Также установлено, что у растений, обработанных GSSG, возросло количество плодов. Обнаружено, что в плодах растений, обработанных GSH, увеличилось содержание сахара и кислотность.
Эти результаты показали, что с помощью культивирования на питательной среде, содержащей GSSG или GSH, можно получить Lycopersicum esculentum с повышенным содержанием сахара.
<Пример 2. Определение содержания сахара>
Культивировали растения Lycopersicum esculentum с использованием GSSG или GSH по способу, описанному в примере 1. Затем в полученных плодах растений определяли содержание сахара с помощью портативного рефрактометра "Pocket" APAL-1 (ATAGO CO., LTD.).
Для сравнения растения Lycopersicum esculentum культивировали при двух режимах условий (обозначенных "Cont" и "Cont2 Sunny"). В условиях Cont растения Lycopersicum esculentum культивировали согласно способу примера 1, но без внесения GSSG и GSH. В условиях Cont2 Sunny при культивировании растений Lycopersicum esculentum не вносили GSSG или GSH и растения независимо культивировали в достаточно освещенном солнечным светом месте таким образом, чтобы освещенность растений Lycopersicum esculentum достигала 100%. В условиях Cont и в условиях, при которых вносили GSSG или GSH, растения высаживали с интервалом от 40 см до 50 см. В этом случае растения могли заслонять друг друга от света. Таким образом, освещенность таких растений становилась менее 100%.
Три растения Lycopersicum esculentum культивировали при условии внесения GSSG, при условии внесения GSH и в условиях Cont соответственно. Одно растение Lycopersicum esculentum культивировали в условиях Cont2 Sunny.
На фиг.1 и 2 показаны результаты определения содержания сахара. На фиг.1 показан результат определения содержания сахара в растениях Lycopersicum esculentum, полученных в условиях настоящего примера. На фиг.1 по вертикальной шкале показано содержание сахара (Brix, единицы: %) и на горизонтальной шкале указаны условия культивирования. На фиг.1 знак ссылки * указывает на то, что плоды не были получены в период сбора урожая. На фиг.2 показаны результаты анализа ANOVA, полученные на основании результатов определения содержания сахара, показанных на фиг.1. На фиг.2 вертикальная шкала показывает содержание сахара, а горизонтальная шкала показывает условия культивирования. На фиг.2, буквенные обозначения наверху каждого столбца указывают на принадлежность таких столбцов, полученных на основании анализа ANOVA, к одной группе. Анализ ANOVA проводили с помощью StatView 5.0 (SAS Institute Inc.), значение достоверного отклонения 5%.
Как показано на фиг.1 и 2, применение GSSG или GSH позволяет получать плоды Lycopersicum esculentum со значительно повышенным содержанием сахара по сравнению с плодами Lycopersicum esculentum, которые культивировали в условиях Cont, и по сравнению с плодами Lycopersicum esculentum, которые в достаточной степени освещались солнечным светом. Особенно применение GSSG обеспечило получение Lycopersicum esculentum с чрезвычайно высоким содержанием сахара.
<Пример 3. Получение Zea mays L. var. saccharata Sturt>
В настоящем примере культивировали Zea mays L. var. saccharata Sturt. Сначала семена Zea mays L. var. saccharata Sturt (TAKII & CO. Ltd., номер продукта: Canberra 90) посеяли в вермикулит (ASAHI INDUSTRIES Co., LTD.). Спустя две недели после посева растение Zea mays L. var. saccharata Sturt пересаживали в емкость для гидропонной культуры, описанную в примере 1. В качестве дополнительного удобрения растения вносили 3 г сложного азотно-фосфорно-калийного удобрения Kumiai S-604 (Chisso Asahi Fertilizer Co., Ltd.) в течение четырех и шести недель после посева.
В течение двух недель начиная с пятой недели после посева четыре раза вносили 50 мл 0.2 мМ GSSG к корням растения. В течение двух недель начиная с седьмой недели после посева четыре раза листья растения опрыскивали 50 мл 0.2 мМ GSSG. Для сравнения растение Zea mays L. var. saccharata Sturt культивировали аналогичным способом, описанном в настоящем примере, но без внесения GSSG с последующим сбором плодов растения.
Плоды собирали через 90 дней после посева и проводили сенсорный тест на определение содержания сахара. По результатам эксперимента содержание сахара в плодах растений, обработанных GSSG, увеличивалось по сравнению с растениями, которые не обрабатывали GSSG. Далее, установлено, что у растений, обработанных GSSG, увеличивалось количество плодов и их размер.
Пример 4. Получение Zea mays L. var. saccharata Sturt (2)>
В настоящем примере Zea mays L. var. saccharata Sturt культивировали при условиях, отличающихся от примера 3 способом внесения GSSG. Сначала семена Zea mays L. var. saccharata Sturt (TAKII & CO. Ltd., номер продукта: Canberra 90) посеяли в вермикулит (ASAHI INDUSTRIES Co., LTD.). Через неделю после посева растения Zea mays L. var. saccharata Sturt пересаживали в емкость для гидропонного культивирования, описанную в примере 1. В качестве дополнительного удобрения в течение четырех и шести недель после посева применяли 3 г сложного азотно-фосфорно-калийного удобрения Kumiai S-604 (Chisso Asahi Fertilizer Co., Ltd.).
В течение двенадцати недель после прорастания дважды в неделю к корням растений вносили 200 мл 0.5 мМ GSSG. Для сравнения растение Zea mays L. var. saccharata Sturt культивировали методом, аналогичным представленному в настоящем примере, за исключением того, что не вносили GSSG, с последующим сбором плодов растения.
Плоды собирали через двенадцать недель после посева и проводили сенсорный тест на содержание сахара. По результатам эксперимента установлено, что в плодах растений, которые культивировали с применением GSSG, обнаружено повышенное содержание сахара по сравнению с плодами растения, которое культивировали без GSSG. Кроме того, установлено, что у растений, обработанных GSSG, увеличивалось количество плодов и их размер.
<Пример 5. Получение Vitis labrusca>
В настоящем изобретении культивировали Vitis labrusca. В частности, непосредственно после цветения растения Vitis labrusca (Delaware), к антотаксии растения вносили смешанный раствор 1 мМ гиббереллина (GA3) и 1 мМ агента. В качестве агента использовали GSSG или GSH. Затем растение покрывали агентом, после чего собирали плоды. Для сравнения растение Vitis labrusca культивировали аналогичным способом, за исключением того, что вносили GA3, а не GSSG или GSH, его плоды собирали и проводили сенсорный анализ.
Собранные плоды исследовали с использованием сенсорного анализа на содержание сахара. В результате эксперимента установлено, что в плодах растения, обработанного GA3 и GSSG или GSH, содержание сахара повысилось по сравнению с плодами растения, удобренного только GA3. Далее, обнаружено, что у растения, обработанного GSSG и GA3, увеличивался размер плода.
Кроме того, установлено, что у растения Vitis labrusca, обработанного GSSG или GSH, но не GA3, возросло содержание сахара. В этом случае в отсутствие GA3 подавлялся процесс получения бессемянного винограда.
<Пример 6. Варьирование времени после внесения вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки>
В настоящем примере определяли содержание сахара в растении после внесения вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки. В качестве вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки, использовали GSH или GSSG. Как и в примере 1, в качестве образца использовали Lycopersicum esculentum. В частности, проводили следующую последовательность операций.
Через 90 дней после посева семян Lycopersicum esculentum растения Lycopersicum esculentum обрабатывали GSH и GSSG. Растения Lycopersicum esculentum культивировали по способу, аналогичному примеру 1, но без обработки GSH или GSSG. Обработка GSH или GSSG заключалась в том, что 50 мл 0.5 мМ GSSH или 0.5 мМ GSH (рН 7, доведенный 0.1 N NaOH) вносили к корням каждого растения один раз. Затем ежедневно, начиная с нулевого дня и до 4 дня после обработки GSH или GSSG, собирали плоды растений и определяли в них содержание сахара. Фиг.3 показывает результаты определения содержания сахара. На фиг.3 представлен график, иллюстрирующий результат определения взаимосвязи между содержанием сахара и числом дней начиная со дня применения GSH или GSSG. На фиг.3, на вертикальной шкале показано содержание сахара (Brix, единицы: %) и на горизонтальной шкале показано количество дней со дня применения. На фиг.3 линии, отмеченные кружками, треугольниками и квадратами, показывают результаты обработки растений, которым вносили GSH, GSSG и не вносили GSH и GSSG соответственно. Отметим, что GSSG или GSH вносили утром на нулевой день, и результаты нулевого дня на фиг.3 получили после сбора плодов и определения содержания сахара в плодах вечером нулевого дня.
Как показано на фиг.3, применение GSSG или GSH позволяет быстро повысить содержание сахара в плодах.
<Пример 7. Получение растения, в которое встроен ген GSH1>
В настоящем примере в качестве вещества, регулирующего окислительно-восстановительное состояние клетки, использовали клон гена γ-глутамилцистеин синтетазы. Данный клон представляет собой полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO:4, является одним из генов GSH1 и в настоящем примере обозначен как "ген GSH1".
(1) Используемое растение
Для получения трансформированного растения в качестве материнского растения использовали Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) дикого типа. Columbia (Col-0) посеяли в почву в квадратный пластиковый поддон (6.5×6.5×5 см), почва состояла из трех слоев: вермикулита (ASAHI INDUSTRIES Co., LTD., Okayama), садовой земли KUREHA (KUREHA horticultural soil, KUREHA CORPORATION, Tokyo) и вермикулита, которые в помещали на дно в указанном порядке в пропорции 2:1:1. Затем культивировали Columbia (Col-0) при температуре 22°С в условиях длинного дня (16-часовой световой день/8-часовой период темноты).
(2) Клонирование гена GSH1, модификация гена GSH1 и получение GSH1-трансформированного растения.
Выделяли всю РНК трехнедельного Arabidopsis thaliana Columbia (Col-O) дикого типа и синтезировали кДНК на основе данной РНК, используя набор «Prostar first strand RT-PCR» (Stratagene, La Jolla, CA, USA).
Используя следующие специфические праймеры, сконструированные на основе последовательности кДНК гена GSH1, полноразмерную кДНК амплифицировали с помощью ПЦР в виде двух фрагментов:
GSH1_5'-3: 5'-GCTTTCTTCTAGATTTCGACGG-3' (SEQ ID NO:10),
GSH1_3'-3: 5'-CCTGATCATATCAGCTTCTGAGC-3' (SEQ ID NO:11),
GSH1_5'-2: 5'-ATGCCAAAGGGGAGATACGA-3' (SEQ ID NO:12),
GSH1_3'-2: 5'-GGAGACTCGAGCTCTTCAGATAG-3' (SEQ ID NO:13).
Затем проводили субклонирование для того, чтобы вставить фрагменты в вектор pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, USA). Праймеры GSH1_5'-3 и GSH1_3'-2 соответственно включали сайты расщепления Xbal и Sacl, необходимые для введения фрагментов в бинарный вектор рВI12, используемый при трансформации растения.
Два фрагмента соединяли друг с другом по сайту расщепления KpnI, конструируя таким образом вектор (Chl.GSH1-pGEM), включающий полноразмерную кДНК. Chl.GSH1-pGEM обрабатывали ферментами рестрикции XbaI и SacI и полученный фрагмент заменяли участком бинарного вектора pB1121, кодирующим β-глюкуронидазу (GUS) и расположенный ниже по ходу транскрипции от промотора вируса мозаики цветной капусты 35S. В результате получали конструкцию (35S-ChI.GSH1-pBI121) для получения трансформированного продукта.
В геноме Arabidopsis thaliana находится только одна копия гена GSH1, и указанный ген GSH1 включает сигнал транспорта в хлоропласт. Для накопления продуктов гена GSH1 (γ-глутамилцистеинсинтетаза) в цитоплазме, создавали конструкцию (35S-cyt.GSH1-pBI121) для экспрессии белка, в котором удаляли 73-ю аминокислоту с N-концевого участка, предполагая, что она является сигналом транспорта в хлоропласт, а также замещали остаток аланина в 74 положении с N-конца на остаток метионина. Сначала проводили ПЦР с праймером GSHI_3'-3 и следующим праймером GSH1(cyt.)_5' (подчеркнут сайт замены оснований), в котором остаток аланина в 74 положении с N-конца был замещен остатком метионина, и сайт расщепления Xbal вставлен выше по ходу транскрипции от положения 74:
GSH1(cyt.)_5': 5'-AGGGCATCTAGAGACCATGGCAAGTCC-3' (SEQ ID NO:14).
Затем полученный фрагмент обрабатывали ферментами рестрикции XbaI и KpnI. После чего проводили субклонирование для встраивания фрагмента в вектор pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA USA) (cyt.GSH-1pBS). Cyt.GSH1-pBS обрабатывали ферментами рестрикции XbaI и KpnI и полученный фрагмент замещали на XbaI-KpnI фрагмент 35S-ChI.GSHI-pBI121. В результате получали 35S-cyt.GSH1-pBI121.
Два вида векторов экспрессии, описанных выше, например 35S-Chl.GSH1-pBI121 и 35S-cyt.GSH1-pBI121, вводили в Col-0 с помощью метода агробактериальной трансформации Agrobacterium (Clough, S.J. and SH1-pB Bent, A.F. (1998) Floral dip: A simplified method for Abrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743). В результате получали трансформированное растение.
В частности, повторяли отбор трансформированных растений на агарозной среде (полуконцентрированная среда Murashige-Skoog), содержащей в качестве маркера селекции канамицин, до тех пор пока не получали поколение, в котором все семена обладали резистентностью к канамицину (в поколении не проявляется дивергенция). В процессе селекции установлено, что в характере резистентности к канамицину наблюдаюся отклонения в соотношении 3:1, а векторы экспрессии встроены по меньшей мере в одну хромосому.
Растение, полученное по способу, описаному выше, обозначается в дальнейшем как "35S-GSH1".
(3) Определение содержания сахара
-
-
-
-
Культивировали 35S-GSH1 и для сравнения культивировали Arabidopsis thaliana (Col-0) дикого типа при интенсивности света 50 µEm2s1 или 500 uEm2s1. После культивирования, длившегося одну неделю, растительные организмы собирали. Затем каждый растительный организм замораживали в жидком азоте, измельчали в порошок, после чего проводили экстракцию с использованием 100 мкл 50 мМ натрий-ацетатного буфера на 50 мг растительного организма.
-
-
Затем в каждом полученном экстракте определяли содержание глюкозы и крахмала. Содержание глюкозы определяли с помощью набора для анализа Glucose CII-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Содержание крахмала определяли путем смешивания экстракта с амилоглюконазой в количестве 35 ед./мл и натрий-ацетатным буфером (50 мМ, рН 4.5), выдерживая полученную смесь в течение часа и затем определяя количество глюкозы. Результаты измерения показаны на фиг.4. На фиг.4 представлены результаты определения содержания крахмала и глюкозы в образце 35S-GSH1. На фиг.4 (а) показано содержание крахмала и на фиг.4 (б) показано содержание глюкозы. На (а) и (б) фиг.4 на вертикальной шкале показано относительное содержание крахмала и глюкозы соответственно, и горизонтальная шкала представляет тип растения. А и В, показанные на фиг.4, являются результатами для 35S-GSH1. В настоящем примере два растения образца 35S-GSH1 использовали в эксперименте, в качестве А и В, показанных на фиг.4. Вышеуказанный термин «относительное содержание» означает относительное количество вещества при условии, что количество данного вещества в Col-0, культивированном при интенсивности света 50 uEm2s1, принято за 100.
Как показано на фиг.4, в образце 35S-GSH1 наблюдается повышенное содержание крахмала и сахара, по сравнению с Col-0.
<Пример 8. Получение Prunus avium>
В настоящем примере культивировали Prunus avium. В частности, за четыре недели и три недели до предполагаемой даты сбора урожая плодов Prunus avium (Napoleon) поверхность листьев на ветке с плодами покрывали 0.5 мМ GSSG. Плоды собирали в предполагаемый срок.
Затем в собранных фруктах проводили сенсорный тест на содержание сахара. В результате установлено, что в плодах растений, которым вносили GSSG, увеличилось содержание сахара и понизилась кислотность. Далее обнаружено, что у плодов растения, которому вносили GSSG, возрастала масса. Также в полученных плодах определяли содержание сахара с помощью портативного рефрактометра "Pocket" APAL-1 (ATAGO CO., LTD.). Для сравнения в плодах растений, которым не вносили GSSG, также определяли содержание сахара. Фиг.5 показывает результат определения содержания сахара в плодах Prunus avium, полученных в условиях настоящего примера. На фиг.5 вертикальная шкала показывает содержание сахара (Brix, единицы: %). Далее с помощью StatView 5.0 (SAS Institute Inc. значение достоверного отклонения 5%) проводили анализ ANOVA. В результате было обнаружено существенное различие между образцами. Как описано выше, внесение GSSG позволяет получать плоды Prunus avium с повышенным содержанием сахара.
<Пример 9. Получение Citrus unshiu>
В настоящем примере культивировали Citrus unshiu. В частности, за неделю до предполагаемой даты сбора плодов Citrus unshiu, поверхность листьев ветки с плодами, покрывали 0.5 мМ GSSG. Плоды собирали в предполагаемый срок.
Затем в собранных плодах проводили сенсорный тест на содержание сахара. В результате установлено, что в плодах растений, которым вносили GSSG, увеличилось содержание сахара и понизилась кислотность. Далее обнаружено, что у плодов растения, которому вносили GSSG, возрастала масса. Также в полученных плодах определяли содержание сахара с помощью портативного рефрактометра "Pocket" APAL-1 (ATAGO CO., LTD.). Для сравнения в плодах растений, которым не вносили GSSG, также определяли содержание сахара. Фиг.6 показывает результат определения содержания сахара в плодах Citrus unshiu, полученных в условиях настоящего примера. На фиг.6 вертикальная шкала показывает содержание сахара (Brix, единицы: %). Далее с помощью StatView 5.0 (SAS Institute Inc. значение достоверного отклонения 5%) проводили анализ ANOVA. В результате было обнаружено существенное различие между образцами.
Как описано выше, внесение GSSG позволяет получать плоды Citrus unshiu с повышенным содержанием сахара.
<Пример 10. Получение Fragaria ananassa>
В настоящем примере культивировали Fragaria ananassa с применением GSSG или GSH. Культивирование подробно описано ниже.
Сначала проростки Fragaria ananassa перемещали в вазон. В вазон помещали 6 л вермикулита (ASAHI INDUSTRIES Co., LTD.), 3 л садовой земли KUREHA (KUREHA CORPORATION) и 3 л вермикулита в виде нижнего, среднего и верхнего слоев соответственно.
В процессе культивирования растений Fragaria ananassa к корням каждого растения раз в неделю вносили 50 мл 0.2 мМ или 0.5 мМ GSSG или 50 мл 0.4 мМ или 0.5 мМ GSH (рН 7 доводили 0.1 N NaOH). Растения культивировали в течение 63 дней без удаления почек. Для сравнения растение Fragaria ananassa культивировали в аналогичных условиях, но без внесения GSSG и GSH. Растениям, культивированным при обоих режимах условий, раз в две недели в качестве дополнительного удобрения вносили 3 г сложного азотно-фосфорно-калийного удобрения S-604 Kumiai (Chisso Asahi Fertilizer Co., Ltd.).
Затем проводили сенсорное тестирование собранных плодов на содержание сахара и т.п. В результате установлено, что в плодах растения, обработанного GSSG, повысилось содержание сахара и понизилась кислотность по сравнению с растением, которому не вносили GSSG или GSH. Далее обнаружено, что у растения, обработанного GSSG, возрастало количество плодов. Также установлено, что в плодах растения, которому вносили GSH, повышалось содержание сахара и кислотность. Далее в полученных плодах определяли содержание сахара с использованием портативного рефрактометра "Pocket" APAL-1 (ATAGO CO., LTD.). Для сравнения плоды растений, не обработанные GSSG или GSH, тоже анализировали на содержание сахара. Фиг.7 показывает результат определения сахара в плодах Fragaria ananassa, полученных в условиях настоящего примера. На фиг.7 вертикальная шкала показывает содержание сахара (Brix, единицы: %). Далее с помощью StatView 5.0 (SAS Institute Inc.) при значении достоверного отклонения 5% проводили анализ ANOVA. В результате было обнаружено существенное различие между образцами.
Эти результаты показывают, что посредством культивирования с применением питательной среды, содержащей GSSG или GSH, можно получить плоды Fragaria ananassa с повышенным содержанием сахара.
<Пример 11. Получение Zea mays L. var. saccharata Sturt>
В настоящем примере культивировали Zea mays L. var. saccharata Sturt. Сначала семена Zea mays L. var. saccharata Sturt (TAKII & CO. Ltd., номер продукта: Canberra 86) посеяли в вермикулит (ASAHI INDUSTRIES Co., LTD.). Спустя две недели после посева растение Zea mays L. var. saccharata Sturt пересадили в емкость для гидропонной культуры, описанную в примере 1. В качестве дополнительного удобрения спустя четыре недели и шесть недель после посева растению вносили 3 г сложного азотно-фосфорно-калийного удобрения S-604 Kumiai (Chisso Asahi Fertilizer Co., Ltd.).
Спустя пять, шесть, семь и восемь недель после посева поверхность листьев опрыскивали 0.5 мМ GSSG (растворенном в 0.1% Tween80 в качестве лиофилизирующего агента). Для сравнения растение Zea mays L. var. saccharata Sturt культивировали аналогичным способом, как описано в настоящем примере, за исключением того, что вместо GSSG вносили Tween 80, и собирали плоды растения.
Плоды собирали спустя 86 дней после посева и проводили сенсорное тестирование на содержание сахара. В результате установлено, что в плодах растения, обработанного GSSG, увеличилось содержание сахара по сравнению с плодами растения, не обработанного GSSG. Далее в собранных фруктах определяли содержание сахара с помощью портативного рефрактометра "Pocket" APAL-1 (ATAGO CO., LTD.). Для сравнения в плодах растения, не обработанного GSSG, также определяли содержание сахара. Фиг.8 показывает результаты определения содержания сахара в плодах Zea mays L. var. saccharata Sturt, полученных в условиях настоящего примера. На фиг.8 вертикальная шкала показывает содержание сахара (Brix, единицы: %). Далее проводили анализ ANOVA с помощью StatView 5.0 (SAS Institute Inc.) при значении достоверного отклонения 5%. В результате было обнаружено значительное различие между образцами.
Также установлено, что у растения, обработанного GSSG, увеличивалось количество плодов и их размер. Далее обнаружено, что плоды растения, обработанного GSSG, достигли зрелости уже спустя 70 дней после посева.
Приведенные выше результаты показывают, что можно получить плоды Zea mays L. var. saccharata Sturt с повышенным содержанием сахара посредством культивирования с использованием питательной среды, включающей GSSG.
Композиция согласно настоящему изобретению для получения растительного организма с повышенным содержанием сахара включает вещество, регулирующее окислительно-восстановительное состояние клетки. Таким образом, с помощью композиции согласно настоящему изобретению можно легко получить растительный организм с повышенным содержанием сахара. Варианты реализации и конкретные примеры выполнения рассмотрены в вышеприведенном подробном описании исключительно с целью пояснения технических деталей настоящего изобретения, которое не должно узко интерпретироваться в рамках данных способов реализации и конкретных примеров, а скорее может быть применено в многочисленных вариантах, находящихся в рамках настоящего изобретения, если такие варианты не выходят за пределы формулы изобретения, приведенной ниже.
Промышленное применение
Композицию согласно настоящему изобретению, при помощи которой можно достаточно просто получить растительный организм с повышенным содержанием сахара, можно использовать в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и т.п. Кроме того, в связи с тем, что из растительного организма с большим содержанием сахара с высокой эффективностью можно получать этанол, композиция согласно настоящему изобретению применима в различных отраслях промышленности, таких как энергетическая промышленность.
Пример 12. Получение растения, в которое встроен ген фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы.
(1) Определение содержания сахара
Собирали листовые пластинки розеток растения и измеряли их вес в сыром виде. Листовые пластинки замораживали в жидком азоте и измельчали в порошок для последующей экстракции углеводов 80% этанолом (об.%) при 80°С в течение 20 минут. Экстракцию 80% этанолом (об.%) осуществляли три раза. После этого осуществляли центрифугирование с последующим выпариванием супернатанта для удаления этанола, а затем остаток растворяли в воде. Для удаления хлорофилла добавляли эквивалентный объем хлороформа, а затем центрифугировали водно-хлороформную смесь. Верхнюю фазу использовали для определения содержания глюкозы и сахарозы. Сахарозу в указанном растворе гидролизовали инвертазой (из Saccharamyces cerevisiae, Sigma-Aldrich) при 55°С в течение 1 часа. Концентрацию сахарозы определяли по разнице между общим содержанием глюкозы при добавлении инвертазы и чистой глюкозы. Концентрацию глюкозы определяли с помощью набора для определения содержания глюкозы (Glucose CII-test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan). Нерастворимый в этаноле осадок использовали для определения содержания крахмала. Осадок ресуспендировали в воде и кипятили в течение 2 часов. После охлаждения добавляли эквивалентный объем раствора амилоглюкозидазы (из Aspergillus niger, Sigma-Aldrich, 35 ед/мл в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН4.5) и полученную смесь инкубировали при 55°С в течение 1 часа. После расщепления крахмала до глюкозы реакционную смесь центрифугировали и определяли содержание глюкозы в супернатанте с использованием указанного выше набора для определения содержания глюкозы.
(2) Используемое растение.
Использовали растение Arabidopsis thaliana, Columbia (Col-0) дикого типа. Указанные растения высевали в квадратный пластиковый поддон (6.5×6.5×5 см), заполненный почвой, состоящей из трех слоев: вермикулита (Asahi-Kogyo, Okayama, Japan), садовой земли Kureha (садовая почва для выращивания Kureha, Kureha Со, Tokyo, Japan) и вермикулита, в указанном таком порядке, начиная со дна. Слои изготавливали в соотношении 2:2:1 (в указанном порядке). Затем растения культивировали в условиях короткого дня (8-часовой световой период/16-часовой темновой период) при температуре 22°С.
(3) Клонирование гена FBA1 и получение трансформированного растения с повышенной экспрессией гена FBA1.
Тотальную РНК выделяли из растения Arabidopsis thaliana, Columbia (Col-0) дикого типа в возрасте 4 недель. Затем проводили ОТ-ПЦР (количество РНК в качестве матрицы: 5.0 мкг) с использованием набора «Prostar first strand RT-PCR» (Stratagene, La Jolla, CA, USA), получая кДНК.
Для получения двух фрагментов полноразмерной кДНК использовали следующие специфические праймеры, сконструированные на основе последовательности кДНК гена FBA 1 (последовательность SEQ ID NO:15 в Перечне последовательностей, приложенном к описанию настоящей заявки):
1F-1: 5'-GGATCCTATGGCGTCTGCTAG-3' (SEQ ID NO:57),
1R-1: 5'-ATCTGCAACGGTCTCGGGAGA-3' (SEQ ID NO:58),
1F-2: 5'-GTGTGGTCCGAGGTGTTCTTCT-3' (SEQ ID NO:59),
1R-2: 5'-GAGCTCGAGTAGGTGTAACCCTTG-3' (SEQ ID NO:60).
Затем каждый из фрагментов клонировали по ТА-концам в вектор pGEM-T (Promega, Madison, WI, USA).
Два указанных фрагмента соединяли по сайту BstPI с получением вектора pGEM-FBA1, содержащего полноразмерную кДНК. Для целей получения трансформированного растения вектор pGEM-FBA1 обрабатывали рестриктазами BamHI и Sacl, а полученные фрагменты вводили в вектор pBI121.
Вектор экспрессии pBI121, полученный в соответствии с вышеописанной методикой, вводили в растение Col-0 с использованием метода агробактериальной трансформации (Clough, S.J. and SH1-pB Bent, A.F. (1998) Floral dip: A simplified method for Abrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16: 735-743) с получением трансформированного растения.
В частности, повторяли отбор трансформированных растений на агарозной среде (полуконцентрированная среда Murashige-Skoog), содержащей в качестве маркера селекции канамицин. При достижении фазы, в которой все семена обладали способностью к росту на среде, содержащей канамицин (поколения, в котором не проявляется дивергенция), уровень экспрессии введенного гена определяли методом ОТ-ПЦР, подтверждая таким образом получение трансформированного растения 35S-FBA1.
(4) Выращивание растений
-2
-1
Полученные растения выращивали в течение 46 дней при интенсивности света 100 µEms (8-часовой световой период/16-часовой темновой период). После культивирования определяли содержание сахара с использованием метода, описанного выше.
Результаты измерений приведены на фиг.10. Как видно из фиг.10, использование полинуклеотида, кодирующего фруктозо-1,6-дифосфатальдолазу (ген FBA), приводит к достижению результата согласно настоящему изобретению, а именно увеличению содержания сахара в растительном организме.