СПОСОБ ОЦЕНКИ ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ВОДНЫХ СРЕД
METHOD OF ESTIMATING GENOTOXICITY OF AQUATIC MEDIA

Изобретение относится к водной токсикологии и токсикогенетике и может быть использовано для оценки генотоксических эффектов водорастворимых соединений, в частности для оценки эколого-гигиенического состояния водоемов, испытывающих постоянное воздействие промышленных сточных вод и их растворимых компонентов, по комплексу количественных показателей.
Известен способ оценки генотоксичности оценки загрязнителей прибрежных морских акваторий по частоте хромосомных аномалий у представителя равноногих рачков отряда Isopoda (Jaera.sp) [Самбук И.С., Варгузина Е.Н., Дукельская А.В., Барабанова Л.В. Оценка частоты хромосомных аномалий у Jaera.sp в различных биотапах Белого моря. - Тезисы докладов IV научной сессии морской биологической станции Санкт-Петербургского Государственного университета. - Санкт-Петербуг, 2003, с.18-19]. Способ основан на цитогенетическом анализе кариотипов особей, различающихся средой обитания, учете хромосомных аберраций ана-телофазным методом.
Существенным недостатком этого метода является отсутствие оценки токсичности и оценивание мутагенности только по частоте хромосомных аномалий. Учет генных мутаций предлагаемым методом не проводится, хотя они являются наиболее значимыми в прогностическом отношении.
Известен способ биотестирования загрязнителей [Положительное решение о выдаче патента №2008105242. Способ биотестирования активности препаратов, полученных из дождевых червей. Стом Д.И., Балаян А.Э., Полехина С.В., Быбин В.А.]. Способ основан на помещении червей (олигохет) в испытуемый раствор и использовании в качестве тест-реакции изменения поведения объекта (сползание в клубок).
Существенным недостатком этого способа является отсутствие количественных показателей для оценки тестируемого агента, не разработана критериальная оценка уровня мутагенности, а также отсутствует валидизация показателей сравнения биологической активности исследуемого загрязнителя со стандартным токсикантом и мутагеном.
Известен способ оценки вредного влияния токсического стресса на баланс энергии подопытных организмов по локализации клеточной энергии (ЛКЭ) [The missing biomarker link: relationships between effects on the cellular energy allocation biomarker of toxicant-stressed Daphnia magna and corresponding population characteristics / De Coen Wim M., Janssen Colin R. // Environ. Toxicol. and Chem., 2003. 22, №7. - С.1632-1641]. Способ основан на количественной оценке изменений имеющихся запасов энергии, Е[а] (общее содержание карбогидратов, протеина и липидов) и поглощения энергии Е[с] (активность переноса электронов) у новорожденных особей Daphnia magna, которых в течение 96 ч подвергают воздействию токсических веществ. Авторы сравнивают внутренний отклик организмов с параметрами всей популяции, такими как внутренняя скорость естественной прибыли и среднюю общую продуктивность на одну женскую особь. Наблюдаемые снижения значений ЛКЭ являются результатом как снижения Е[а], так и увеличения Е[с].
Существенным недостатком данного способа является отсутствие оценки генетических эффектов токсикантов.
Известен способ биологической оценки токсичности воды и устройство для биологической оценки токсичности воды [А.С. СССР №1068083 (СССР). Кл. G01N 33/18, 1982]. Способ основан на помещении дафний в специальное устройство с последующей регистрацией изменения физиологического состояния под действием токсикантов. Токсичность оценивают по изменению частоты движения эпиподитов ракообразных.
Недостатком данного способа является оценка токсичности только по одному показателю - частоте движения эпиподитов, для регистрации которого требуется специальное устройство. Кроме того, способ не позволяет оценивать мутагенность испытуемых растворов.
Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является «Способ оценки токсичности водных сред» [А.С.№1234770 (СССР). Заявл. 25.06.84, №3765741/23-26; МКИ G01N 33/18// С02А 3/34. Павленко В.В., Денисова Т.П. - Опубл. 30.05.86, Бюл. №20]. Способ оценивает токсические и генетические эффекты водных растворов на дафниях, учитывая гибель и плодовитость особей в исходном и втором поколениях.
Недостатком данного способа является использование несинхронизированной культуры дафний, вследствие чего получаемые результаты имеют выраженную гетерогенность. Кроме того, уровень генотоксической активности сравнивается только с контролем (вода), что не дает возможности оценивать их активность в сравнении с эталонными токсикантами и мутагенами на основе изоэффективных концентраций; не разработаны оценочные шкалы, а при расчете показателей мутагенности не учитывается суммарное мутирование: индуцированное и спонтанное.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа оценки генотоксичности водных сред, повышающего точность оценки токсических и генетических эффектов, индуцированных исследуемыми агентами.
т
м
0
0
0
2
oп
к
оп
к
+
+
Поставленная задача решается предлагаемым способом, включающим приготовление опытных проб, получение синхронизированной культуры дафний от одного наиболее плодовитого клона из популяции дафнии за исключением лабораторной популяции, экспонирование одновозрастных, партеногенетических дафний из синхронизированной культуры параллельно в исследуемом растворе (опыт), в воде (К-контроль), в растворе эталонного токсиканта (К ), в растворе эталонном мутагена (К ), регистрацию физиологического состояния у особей исходного поколения (F), определение коэффициентов токсичности, а именно коэффициента гибели (L) и коэффициента плодовитости (Р), регистрацию физиологического состояния дафний второго поколения (F), определение суммарной мутагенной активности по формуле &=f/f, где f - частота появления летальных и сублетальных мутаций в опыте, а f - частота появления летальных и сублетальных мутаций в контроле, сравнение ее значения с изоэффективными концентрациями эталонных мутагенов и токсикантов, выделение лимитирующего показателя вредности, установление уровня генотоксической активности на основании полученных результатов.
Способ осуществляется следующим образом.
Используют дафний из любой популяции дафний за исключением лабораторной популяции. От дафний используемой популяции получают синхронизированную двухсуточную тест-культуру одного вымета [Бакаева Е.Н., Никаноров A.M. Гидробионты в оценке качества вод суши. - М.: Наука, 2006. - с.106, с.194, с.215-216]. Такая культура обладает достаточной стабильностью и однородностью по генетическим и физиолого-биохимическим свойствам, что позволяет снизить ошибку опыта [Строганов Н.С., Колосова Л.В. Ведение лабораторной культуры и определение плодовитости дафний в ряде поколений. - Методики биологических исследований по водной токсикологии. - М.: Наука, 1971. -с.213-214].
т
м
+
+
Дафний из полученной синхронизированной тест-культуры экспонируют в водном растворе агента. Выживших после экспонирования особей помещают в чистую водную среду. Параллельно опытным вариантам ставят три контроля. В первом дафний содержат в дехлорированной водопроводной воде (К), во втором - в растворе эталонного токсиканта (К ), в третьем - в растворе эталонного мутагена (К ).
0
т
м
+
+
У обработанных дафний (F) регистрируют гибель и плодовитость выживших особей. Сравнивают показатели гибели обработанных особей, показатели плодовитости выживших особей исходного поколения с соответствующими величинами в контролях (К, К  и К ).
0
0
Количественным выражением изменения гибели и плодовитости исходного поколения, индуцированного агентами за счет их токсичности, являются коэффициенты гибели (L) и плодовитости (Р).
0
0
Коэффициент гибели L определяют как отношение величины летального эффекта у дафний F в опытном варианте к контрольному: .
0
0
Коэффициент плодовитости Р определялся отношением величины плодовитости дафний F в опытном варианте к соответствующему показателю в контроле: .
0
0
Анализ величин показателей Lи Р позволяет сделать заключение о степени выраженности токсической активности агента. Для ее определения используют оценочные шкалы, где величина определяемого показателя коррелирует со степенью активности эталонного токсиканта (таблица 1, 2).
2
Во втором поколении (F) учитывают появление мутантных особей, причем отдельно регистрируют индуцированных (опыт) и спонтанно возникших (контроль-вода) мутантов. На основании полученных данных рассчитывают коэффициент суммарной мутагенности &, по которому оценивают степень мутагенной активности (таблица 3):
,
oп.
к.
где f - частота появления мутантов в опыте, f - частота появления мутантов в контроле.
Степень генотоксической опасности исследуемых агентов определяется по ранее разработанным шкалам (табл.1-3) [Денисова Т.П.Токсико-генетический подход к санитарно-гигиенической оценке промышленных сточных вод и их химических компонентов. Дис., Иркутск, 2006, с.56, с.58].
Таблица 1
Шкала оценки токсичности по коэффициенту L<sub>0</sub>
Величина коэффициента
Степень выраженности эффекта действия
Изоэффективная концентрация вещества ГСО - фенола, мг/л
L<sub>0</sub>≥10
Чрезвычайно токсичное
1,0-100,0
10>L<sub>0</sub>≥8
Высокотоксичное
-
8>L<sub>0</sub>≥5
Токсичное
0,1
5>L<sub>0</sub>≥2
Умеренно токсичное
0,01
L<sub>0</sub><2
Нетоксичное
-
Таблица 2
Шкала оценки токсичности по коэффициенту Р<sub>0</sub>
Величина коэффициента
Степень выраженности эффекта действия
Р<sub>0</sub>≤0,4 или Р<sub>0</sub>≥4
Токсичное
0,4<Р<sub>0</sub>≤0,8 или 1,5≤Р<sub>0</sub><4
Умеренно токсичное
0,8<Р<sub>0</sub><1,5
Нетоксичное
Таблица 3
Шкала оценки мутагенности по коэффициенту &
Величина коэффициента
Степень выраженности эффекта действия
Изоэффективные концентрации N-HMM, мг/л
≥100
Сильное мутагенное
-
≥10
Средне мутагенное
0,1-10,0
≥2-5
Слабо мутагенное
-
Пример 1. С целью получения синхронизированной культуры популяции любого вида дафний, отличающейся физиологической и генетической однородностью, производят следующие операции. От дафний, взятых из любой популяции, за исключением лабораторной популяции получают одновозрастное потомство, из которого отбирают 8-10 партеногенетических самок, рассаживают их индивидуально в сосуды с дехлорированной водой. Плотность посадки: 1 особь на 50 мл воды. Через 12-18 дней от каждой из них получают до 300 и более одновозрастных партеногенетических потомков (рисунок 1). Потомки от каждой материнской особи не смешиваются. Для опыта отбирают потомство одного наиболее плодовитого клона.
В качестве примеров в предлагаемом способе использовали дафний из популяций различных водоемов Иркутской области (р.Ангара и Братское водохранилище): Daphnia galeata, Daphnia longispina, Daphnia cristata.
Пример 2. Определяют токсичное действие стандартного токсиканта - фенола в диапазоне концентраций 0,01 мг/л - 100,0 мг/л. По десять дафний из синхронизированной культуры в двухсуточном возрасте помещают в аквариумы с растворами фенола на каждый опытный образец. Параллельно опытному образцу ставят контрольный вариант с водой. Плотность посадки во всех вариантах - 10 особей на 500 мл среды. В течение 24 часов экспонирования дафний учитывают их гибель. После окончания экспозиции выживших особей переносят в аквариумы с чистой водой и содержат в ней до достижения ими 20-суточного возраста. При этом учитывают гибель дафний и плодовитость выживших.
0
По результатам повторных опытов рассчитывают среднюю гибель дафний F, определяя достоверность отличий по сравнению с контролем. В растворах фенола от 10,0 мг/л до 100 мг/л все дафнии погибают, а в растворах от 1,0 мг/л до 0,01 мг/л выживает часть дафний.
0
Фенол в концентрации 1,0-0,01 мг/л индуцирует снижение плодовитости обработанных особей F по сравнению с контрольным уровнем (Р<0,05).
На основании изложенного фенол оценивают как чрезвычайно токсичное соединение в диапазоне концентраций от 1,0 до 100,0 мг/л (D.longispina, D.cristatd). Для D.galeata фенол является чрезвычайно токсичным соединением в диапазоне концентраций от 10,0 до 100,0 мг/л, высокую токсичность он обнаруживает при концентрации 1,0 мг/л.
При концентрации 0,1 мг/л фенол проявляет себя как токсичный, а при концентрации 0,01 мг/л - как умеренно токсичный агент для всех видов дафний (табл.4).
Пример 3. Исследуют мутагенное действие супермутагена N-НММ (N-нитрозо-N-метилмочевины).
Двухсуточных дафний из подготовленной синхронизированной культуры помещают в аквариумы с растворами N-HMM по 10 штук на каждый опытный образец. Исследуют растворы N-HMM в диапазоне концентраций 0,1 мг/л - 100,0 мг/л. Параллельно опытному образцу ставят контрольный вариант с водой. Плотность посадки во всех вариантах - 10 особей на 500 мл среды. Дафний экспонируют 24 ч. После окончания экспозиции выживших особей переносят в аквариумы
Таблица 4
Уровень токсической активности фенола
Вид дафний
Концентрация, мг/л
Уровень токсичности по показателям:
Степень эффекта действия агента
L<sub>0</sub>
P<sub>0</sub>
D.galeata
100,0
25,0
-
Чрезвычайно токсичный агент
10,0
25,0
-
Чрезвычайно токсичный агент
1,0
8,0
0,3
Высоко токсичный агент
0,1
6,0
0,3
Токсичный агент
0,01
4,0
0,7
Умеренно токсичный агент
D.longispina
100,0
16,7
-
Чрезвычайно токсичный агент
10,0
16,7
-
Чрезвычайно токсичный агент
1,0
14,0
0,0
Чрезвычайно токсичный агент
0,1
7,7
0,4
Токсичный агент
0,01
3,0
0,6
Умеренно токсичный агент
D.cristata
100,0
25,0
-
Чрезвычайно токсичный агент
10,0
25,0
-
Чрезвычайно токсичный агент
1,0
25,0
-
Чрезвычайно токсичный агент
0,1
7,0
0,2
Токсичный агент
0,01
3,0
0,5
Умеренно токсичный агент
1
2
с чистой водой и содержат в ней до достижения ими 20-суточного возраста. Все появившееся потомство (первое поколение - F) пересаживают в аквариумы с чистой водой и содержат там до достижения ими 20-суточного возраста. В течение этого периода появляющееся от них потомство (второе поколение - F) пересаживают в аквариумы с чистой водой. За появившимися особями второго поколения ежедневно наблюдают и учитывают их гибель и плодовитость.
В таблице 5 представлены данные о токсичности N-HMM. Растворы N-HMM в концентрациях 50,0 и 100,0 мг/л индуцируют у всех видов давний несовместимые с жизнью физиологические нарушения, приводящие к гибели дафний.
0
При концентрации 10,0 мг/л N-НММ характеризуется как токсичный агент: L в диапазоне от 6,8 до 7,8 (табл.5). Более низкие концентрации N-HMM в основном характеризуются умеренной токсичностью по показателю гибели.
0
У всех выживших особей во всех опытных вариантах с N-НММ отмечают снижение плодовитости дафний (Р≤0,05). Это свидетельствует о токсичности низких концентраций N-HMM (Р, табл.5).
0
0
Итак, N-HMM проявляет чрезвычайную токсичность при концентрациях от 50,0 до 100,0 мг/л. При концентрации 10,0 мг/л N-HMM характеризуется как токсичный агент, а при концентрациях от 5,0 до 0,1 мг/л - как умеренный токсикант, на что указывают коэффициенты Lи Р (табл.5).
2
Генетические эффекты, индуцированные N-HMM, оценивают среди дафний F - внуков особей, выживших после обработки N-HMM. В таблице 6 представлены данные о мутагенной активности N-HMM для исследуемых популяций дафний.
Таблица 5
Уровень токсической активности N-HMM
Вид дафний
Концентрация, мг/л
Уровень токсичности по показателям:
Степень эффекта действия агента
L<sub>0</sub>
P<sub>0</sub>
D.galeata
100,0
25,0
-
Чрезвычайно токсичный агент
50,0
25,0
-
Чрезвычайно токсичный агент
10,0
7,0
0,3
Токсичный агент
5,0
4,8
0,4
Умеренно токсичный агент
1,0
4,3
0,7
Умеренно токсичный агент
0,1
2,8
0,8
Умеренно токсичный агент
D.longispina
100,0
16,7
-
Чрезвычайно токсичный агент
50,0
16,7
-
Чрезвычайно токсичный агент
10,0
7,8
0,0
Токсичный агент
5,0
6,0
0,4
Токсичный агент
1,0
3,8
0,6
Умеренно токсичный агент
0,1
3,0
0,6
Умеренно токсичный агент
D.cristata
100,0
25,0
-
Чрезвычайно токсичный агент
50,0
9,0
0,0
Высокотоксичный агент
10,0
6,8
0,4
Токсичный агент
5,0
4,5
0,5
Умеренно токсичный агент
1,0
4,3
0,5
Умеренно токсичный агент
0,1
2,3
0,9
Умеренно токсичный агент
Таблица 6
Мутагенное действие N-HMM
Вид дафний
Концентрация, мг/л
Гибель, %
Плодовитость
D.galeata
10,0
7,2
2,1
5,0
4,1
2,2
1,0
3,3
4,1
0,1
3,1
4,7
Контроль
2,1
10,1
D.longispina
5,0
8,3
1.5
1,0
7,5
3,2
0,1
4,0
5,1
Контроль
4,1
12,5
D.cristata
10,0
6,1
3,3
5,0
5,7
4,2
1,0
2,7
5,3
0,1
2,5
6,7
Контроль
2,4
8,9
N-HMM индуцирует появление сублетальных мутантов, частота которых в основном достоверно выше контрольного значения (Р≤0,05) и выражается в гибели дафний второго поколения.
Так, в популяции D.galeata дафнии второго поколения в опытных вариантах гибнут в 1,5-3,4 раза больше, чем в контроле. В популяции D.longispina эти различия составляют 1,8-2,0, а в популяции D.cristata 1,04-2,5 раза.
2
Летальные мутации, индуцированные N-HMM, проявляются в достоверном снижении плодовитости самок F по сравнению контролем (Р≤0,05). Плодовитость дафний второго поколения в популяции D.galeata ниже контрольной в 2,1-4,8 раза; в популяции D.longispina эти различия составляют 2,5-8,3 раза, а в популяции D.cristata - 1,3-2,7.
Полученные данные указывают на то, что в популяциях сохраняются сублетальные и летальные мутации, которые являются компонентами суммарной мутагенности N-HMM.
Все исследованные растворы N-HMM генетически активны, на это указывает величина коэффициента & (табл.7): 100>&>10. N-HMM в исследованном диапазоне концентраций оценивают как мутаген средней активности.
Таким образом, N-HMM обладает токсичным и средним мутагенным действием на дафний исследованных популяций: D.galeata, D.longispina, D.cristata. Уровень биологической активности N-HMM зависит от ее концентрации.
Пример 4. Исследуют токсичное и мутагенное действие сточной воды ОАО «ЦКК», прошедшей полный технологический цикл очистки перед сбросом в природный водоем.
Сточные воды, прошедшие все этапы очистки, достоверно снижают жизнеспособность дафний всех трех популяций (табл.8): превышение по показателю гибели составляет 7,8-10,8 при экспозиции 24 часа. При экспозиции 96 часов все дафнии D.longispina погибают, в популяциях D.galeata и D.cristata часть дафний выживает.
Плодовитость выживших дафний во всех опытных вариантах ниже контрольного значения в 2 и более раза (табл.8).
Во втором поколении (в опытных вариантах) обнаруживают мутантных особей (табл.9). У дафний всех трех популяций индуцированы сублетальные мутации, выражающиеся в гибели особей, и летальные мутации, проявляющиеся в снижении плодовитости.
В целом, очищенные неразбавленные сточные воды оценивают как мутагены средней активности (табл.10).
Таким образом установлено на всех трех популяциях дафний, что уровень генотоксичности неразбавленных очищенных сточных вод увеличивается от длительности их воздействия. Анализируемые сточные
Таблица 7
Уровень мутагенной активности N-HMM
Вид дафний
Концентрация, мг/л
Уровень мутагенной активности по &
Степень выраженности мутагенности
D.galeata
10,0
40,1
Средний мутаген
5,0
38,2
Средний мутаген
1,0
28,9
Средний мутаген
0,1
27,3
Средний мутаген
D.longispina
5,0
22,5
Средний мутаген
1,0
19,0
Средний мутаген
0,1
14,4
Средний мутаген
D.cristata
10,0
29,9
Средний мутаген
5,0
23,4
Средний мутаген
1,0
17,0
Средний мутаген
0,1
11,0
Средний мутаген
Таблица 8
Уровень токсической активности неразбавленных сточных вод, прошедших очистку на ОАО «Братский ЦКК»
Вид дафний
Экспозиция, час
Уровень токсичности по показателям:
Степень эффекта действия агента
L<sub>0</sub>
P<sub>0</sub>
D.galeata
24
9,8
0,5
Чрезвычайно токсичный агент
96
17,5
0,3
Высоко токсичный агент
D.longispina
24
10,8
0,2
Чрезвычайно токсичный агент
96
16,7
-
Чрезвычайно токсичный агент
D.cristata
24
7,8
0,3
Токсичный агент
96
15,0
0,4
Чрезвычайно токсичный агент
Таблица 9
Мутагенное действие неразбавленных сточных вод, прошедших очистку на ОАО «Братский ЦКК»
Вид дафний
Экспозиция, час
Гибель, %
Плодовитость
D.galeata
24
4,8
5,1
96
5,3
1,3
Контроль
2,1
10,1
D. longispina
24
6,1
7,3
Контроль
4,1
12,5
D.cristata
24
3,0
6,4
96
4,6
3,7
Контроль
2,4
8,9
воды при экспозиции 96 час оценивают как чрезвычайно токсичные, а при экспозиции 24 часа - как, в основном, токсичные со средней мутагенной активностью. Лимитирующим показателем вредности является мутагенность (табл.11).
Таблица 10
Уровень мутагенной активности неразбавленных сточных вод, прошедших очистку на ОАО «Братский ЦКК»
Вид дафний
Экспозиция, час
Уровень мутагенной активности по &
Степень выраженности мутагенности
D.galeata
24
24,9
Средний мутаген
96
43,0
Средний мутаген
D. longispina
24
10,6
Средний мутаген
D.cristata
24
12,0
Средний мутаген
96
25,3
Средний мутаген
Таблица 11
Токсикогенетическая активность очищенных неразбавленных сточных вод ОАО « ЦКК»
Вид дафний
Показатели генотоксичного действия
Экспозиция, час
24,0
96,0
D.galeata
Токсичность
L<sub>0</sub>
9,8
17,5
Р<sub>0</sub>
0,5
0,3
Мутагенность
&
24,9
43,0
Степень выраженности эффекта действия
Токсичный со средней мутагенностью
Чрезвычайно токсичный со средней мутагенностью
Лимитирующий показатель вредности
Мутагенность
D.longispina
Токсичность
L<sub>0</sub>
10,8
16,7
Р<sub>0</sub>
0,2
-
Мутагенность
&
10,6
-
Степень выраженности эффекта действия
Чрезвычайно токсичный со средней мутагенностью
Чрезвычайно токсичный
Лимитирующий показатель вредности
Мутагенность
токсичность
D.cristata
Токсичность
L<sub>0</sub>
7,8
15,0
Р<sub>0</sub>
0,3
0,4
Мутагенность
&
12,0
25,3
Степень выраженности эффекта действия
Токсичный со средней мутагенностью
Чрезвычайно токсичный со средней мутагенностью
Лимитирующий показатель вредности
Мутагенность