Адаптация ПЦР для диагностики лептоспироза и эпидемиологического надзора за лептоспирозной инфекцией

Цель работы заключалась в оценке схемы MLVA типирования на соответствие основным критериям типирования возбудителя бруцеллеза до уровня штам-мовой дифференциации.

В работе были использованы 26 штаммов бруцелл трех основных патогенных видов (B. melitensis, B. abortus, B. suis), представленных 14 известными референтными, двумя вакцинными, восемью полевыми штаммами и двумя австралийскими изолятами, выделенными от мышевидных грызунов Австралии, имеющими неясное таксономическое положение.

Схема MLVA-типирования включала анализ вариабельных тандемных повторов штаммов бруцелл в ПЦР с праймерами, ограничивающими 9 VNTR-локусов из обеих панелей (мини- и микросателлитная) MLVA-15.

Референтные и вакцинные штаммы бруцелл с известными генотипами использовали для подтверждения стабильности сохранения количества повторов в анализируемых локусах и оценки воспроизводимости MLVA специфических штаммовых генотипов, стабильности тандемных повторов в анализируемых локусах и соответствия фенотипическим методам анализа.

Для решения этой задачи полученные MLVA генотипы на основе сиквенсного анализа для лабораторных референтных (15) и вакцинных (2) штаммов сравнивали с одноименными штаммовыми генотипами, представленными в международных базах данных. Для 13 штаммов результаты сравнения показали идентичность MLVA генотипов со стабильным наследованием тандемных повторов в анализируемых локусах. Воспроизводимость результатов MLVA-типирования для этих штаммов не зависела от интенсивности проводимых лабораторных пересевов или длительности хранения штаммов.

С другой стороны, было установлено, что три референтных штамма B.melitensis 16М (по всем 9 локу-сам), B.suis Thomsen, B.abortus 292 (по 7 локусам) и

вакцинный штамм B.melitensis Rev-1 (по 8 локусам) имели MLVA генотипы, не соответствующие представленным в международной базе данных. Эти штаммы также не отвечали результатам детальной фенотипи-ческой идентификации, что мы объясняем их исходным несоответствием и возможным загрязнением при пересевах и хранении.

Дендрограмма, построенная с использованием программного обеспечения SAS JMP 8 версии, на основе данных MLVA-9 типирования 26 изолятов выявила генетически родственный кластер, составленный из полевых штаммов B. melitensis C-457, 548, 565 вместе с референтным штаммом B. melitensis 63/9 второго биовара. Этот кластер при сравнении с Международной MLVA систематикой показывал наибольшее родство со Средиземноморским восточным генотипом 45, что согласуется с ранее полученными Ю.К. Кулаковым и др. данными о циркуляции изолятов этого генотипа как на территории России, так и в приграничных государствах.

Полевые штаммы B.abortus 1552, A-422 группировались в родственный кластер вместе с большинством референтных штаммов вида B.abortus.

Штамм B. suis 6 попал в кластер вместе с референтными штаммами B.suis 1-4 биоваров, а штамм B. suis 3-4 - с референтным штаммом B.suis 5 биовара.

Австралийские штаммы Brucella 83-4, 83-6 формировали общий, но удаленный от других штаммов бруцелл кластер.

Таким образом, анализ полученных данных показал, что MLVA-типирование, проведенное по девяти локусам, позволяет систематизировать штаммы бруцелл в соответствии с существующим таксономическим положением видов бактерий рода Brucella. В то же время подтверждение более тонких дискриминационных возможностей данной системы генотипирова-ния требует проведения дальнейших исследований.

АДАПТАЦИЯ ПЦР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА И ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА ЗА ЛЕПТОСПИРОЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

А.Н. Ваганова, Н.А. Стоянова, Н.К. Токаревич

ФБУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера», Санкт-Петербург

Лептоспироз - инфекционное заболевание, тяжело протекающее у человека и поражающее ряд млекопитающих, в том числе домашних и сельскохозяйственных животных, для которых часто характерно бессимптомное течение. Лептоспирозная инфекция характеризуется разнообразными клиническими проявлениями, в связи с чем необходимо лабораторное подтверждение диагноза. Актуальной проблемой является также разработка доступных методов для скрининговых исследований на носительство лептоспир у животных.

«Золотым стандартом» диагностики лептоспиро-за является реакция микроагглютинации (РМА), требующая наличия живых культур лептоспир, с чем свя-

зана ее трудоемкость. Результаты РМА, свидетельствующие о лептоспирозной инфекции, могут быть получены, как правило, на второй неделе заболевания и в ряде случаев диагноз может быть поставлен только на основании повторного исследования сыворотки с интервалом в несколько дней. Антитела к лептоспирам, выявляемые в РМА, могут длительно сохраняться после перенесенного заболевания и вакцинации, что усложняет интерпретацию результата.

Доказательством лептоспирозной этиологии заболевания является обнаружение возбудителя в организме хозяина. Применяемые для этих целей классические микробиологические методы исследования обладают

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ

рядом недостатков, таких как низкая чувствительность микроскопии и длительность проведения бактериологического исследования, связанная с тем, что лепто-спиры относятся к микроорганизмам, медленно растущим на питательных средах. Указанные ограничения лабораторной диагностики лептоспироза могут быть преодолены при внедрении молекулярно-биологиче-ских методов, характеризующихся более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяющих быстро (в течение нескольких часов) получить ответ.

Метод ПЦР позволяет исследовать на присутствие лептоспир сыворотку, мочу, внутриглазную жидкость и биоптаты различных органов. В настоящее время большая часть тест-систем для детекции лептоспир методом ПЦР рассчитана на выявление возбудителей в сыворотке. Однако немаловажное значение имеет выявление лептоспир в моче, необходимое как для адекватной диагностики, так и для контроля лечения лептоспироза у людей и животных, поскольку к концу первой недели заболевания происходит резкое снижение содержания возбудителя в крови, что связано с выработкой специфических антител в организме хозяина. Персистенция лептоспир в почках как при острой, так и при хронической инфекции сопровождается выделением лептоспир с мочой. Важна также адаптация метода для выявления лептоспир в полевом материале, поскольку обнаружение лептоспир в органах животных, отловленных в местах их обитания, необходимо для контроля распространения лепто-спирозной инфекции.

Целью исследования является разработка тест-системы для детекции лептоспир в биологическом материале и оценка ее чувствительности и специфичности.

В качестве генетической мишени был выбран ген colA, продуктом которого является микробная колла-геназа. Анализ структуры данного гена с использованием алгоритма BLAST показала, что наиболее близкие по структуре коллагеназы характерны для представителей рода Bacillus, однако в этом случае сходство не превышает 47 %. Сходство последовательности между видами патогенных лептоспир составляет 88 %, в то время как у сапрофитных лептоспир данного гена не найдено. Праймеры были подобраны к консервативным, специфическим для лептоспир, участкам данного гена. Длина амплифицируемого участка составляет 447 п.н. Сравнение структуры праймеров с коллекцией последовательностей GenBank показало, что полностью комплементарны оба праймера только последовательности гена colA, характерной для патогенных лептоспир, что теоретически исключало неспецифический результат при ПЦР с препаратами ДНК из образцов различной природы.

Разработанная система была оптимизирована для проведения реакции в режиме стандартной ПЦР с последующей визуализацией полученных ампликонов методом электрофореза в агарозном геле. Для подтверждения специфичности данных праймеров было проведено исследование из взаимодействия с препаратами ДНК патогенных лептоспир различных видов (L.inter-rogans, L.kirschneri, L.borgpetersenii и L.noguchii). При проведении реакции с ДНК всех положительных образцов происходило образование специфического ам-пликона. В отрицательных контрольных образцах на-

копления продуктов реакции не наблюдалось. Также не было отмечено взаимодействие с ДНК сапрофитных лептоспир.

Чувствительность ПЦР с использованием разработанных праймеров оценивалась путем проведения реакции на препаратах ДНК, выделенных из образцов мочи и сыворотки людей, не больных лептоспирозом, контаминированных лептоспирами в лабораторных условиях. Были протестированы разведения, содержащие 105 - 50 клеток лептоспир на мл. Выделение ДНК проводилось из объема 1 мл мочи и 0,1 мл сыворотки. Установлено, что чувствительность данных праймеров составляет 2 геномных эквивалента на аликвоту ДНК препарата (50 клеток на мл). В то же время не было отмечено образование неспецифических продуктов реакции.

Специфичность праймеров была оценена при исследовании десяти образцов мочи людей, не болевших лептоспирозом, и пяти образцов мочи собак, перенесших лептоспироз и получивших антибиотикотера-пию, приведшую к элиминации патогена. Во всех случаях не наблюдалось неспецифического взаимодействия праймеров с ДНК, выделенной из анализируемого материала.

Для подтверждения того, что в реакции происходит амплификация специфического фрагмента генома лептоспир, было проведено секвенирование ампли-конов, полученных в реакции ПЦР, с разработанными праймерами на матрице ДНК штамма Перепелицин -эталонного штамма серогруппы Tarassovi, принадлежащего к виду L.borgpetersenii. При анализе полученной последовательности с использованием алгоритма BLAST было установлено, что она соответствует участку генома, являющегося мишенью разрабатываемой тест-системы. Структура ампликонов штамма Перепелицин имеет более высокий уровень сходства с аналогичной последовательностью в геноме лептоспир вида L.borgpetersenii (сходство последовательностей 95 %), к которому принадлежит данный штамм, чем со сходной последовательностью в геноме лептоспир вида L.interrogans (сходство последовательностей 24 %).

Исследование мочи пяти собак, больных лепто-спирозом, до начала антибиотикотерапии показало наличие лептоспир в образцах. Лептоспирозная этиология инфекции была подтверждена положительными результатами РМА, однако в трех случаях титр антител не превышал 1:200, то есть был сопоставим с титром, который может наблюдаться после вакцинации.

Для оценки возможности применения разработанной системы в эпидемиологическом надзоре за очагами лептоспирозной инфекции было проведено исследование полевого материала. Всего было исследовано 89 особей грызунов и насекомоядных различных видов, пойманных на территории г. Санкт-Петербурга, в том числе Apodemus agrarius - 56 особей, Apodemus uralensis - 7, Microtus arvalis - 6, Sorex araneus - 20. Для исследования отбирались печень и почки. ДНК патогенных лептоспир обнаружена у 4,5 % исследованных животных (M.arvalis - 2 особи, A.uralensis - 1 особь, S.araneus - 1 особь).

Таким образом, разработанная тест-система обладает достаточным уровнем чувствительности, позволяет в короткие сроки проводить исследование

биологического материала различной природы на наличие патогенных лептоспир. Данная диагностическая система может быть использована для диагностики лептоспироза у людей и животных, выявления леп-

тоспироносительства у животных и контроля эффективности лечения, а также получения данных о наличии патогенных лептоспир в полевом биологическом материале.

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ЗООНОЗНОГО САЛЬМОНЕЛЛЕЗА НА ЮГЕ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

Ф.Н. Шубин, Н.А. Кузнецова, А.В. Раков, О.Ю. Якунина НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, г. Владивосток, ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области», ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Томской области», ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Омской области»

В современных условиях эпидемиологический надзор получил возможность использовать достоверные сведения о генетическом родстве циркулирующих штаммов возбудителей инфекций путем применения молекулярно-генетических методов внутривидового типирования микроорганизмов. При этом методы различаются по их воспроизводимости, дифференцирующей способности, сложности интерпретации результатов и трудоемкости. Нашими исследованиями обоснована целесообразность создания системы централизованного микробиологического молекулярно-генетиче-ского мониторинга за сальмонеллами, основанного на данных плазмидного анализа микроба.

Изучение молекулярной эпидемиологии сальмо-неллеза в Приморском крае позволило раскрыть основные закономерности развития эпидемического процесса сальмонеллезной инфекции, вызванного гетерогенной популяцией Salmonella enteritidis (S. enteritidis).

Актуальность исследований, направленных на изучение характеристики популяций сальмонелл на других административных территориях Дальнего Востока, определяется, с одной стороны, их неизученностью, а с другой - их значимостью для цельного понимания молекулярной эпидемиологии сальмонеллеза и профилактики инфекции.

Цель исследования - изучение плазмидной характеристики популяций сальмонелл в Новосибирской, Томской и Омской областях и закономерностей развития эпидемического процесса среди населения, вызванного гетерогенной популяцией возбудителя сальмонеллеза.

Материалы и методы исследования. Изучена плаз-мидная характеристика у 1246 штаммов S. enteritidis, выделенных в 2005-2010 гг. в Новосибирской, Томской и Омской областях из различных экологических источников, в том числе от 961 больного сальмонеллезом при спорадической заболеваемости, от 216 человек во время вспышек болезни и из 69 проб продукции предприятий промышленного птицеводства, в том числе из мяса кур, субпродуктов, полуфабрикатов. Результаты обработаны статистически с использованием критерия Стьюдента.Внутривидовое типирование штаммов S.enteritidis выполнено методом плазмидного анализа бактерий.

Результаты и обсуждение. Плазмидный анализ штаммов S.enteritidis, изолированных в указанных областях в 2006-2010 гг. от 961 больного при спорадической заболеваемости (табл. 1), показал, что по плазмид-ным характеристикам популяции микроба в каждой из областей гетерогенны и представлены 34 плазмид-ными типами. При этом штаммы микроба, выделенные от больных, дифференцированы на две группы: основные и редко выявляемые. Первая из них включала штаммы девяти плазмидных типов, на долю которых пришлось 91,2 % культур, и они изолированы от 876 больных.

В соответствии с частотой выделения от больных среди основных плазмидных типов выделен явно доминирующий тип, маркированный плазмидами 38:1,4 Mda, на долю которого пришлось 49,5 % штаммов микроба. Вторыми по частоте встречаемости были два плазмидных типа микроба 38 Mda и 38:2,6:1,4 Mda, каждый из которых выявлен соответственно у 12,8 и 8,6 % больных. Частота выделения от больных остальных плазмидных типов S.enteritidis, отнесенных в группу основных, была значительно ниже, а редко выявляемые типы не имели сколько-нибудь существенной этиологической значимости в заболеваемости населения.

Частота выделения от больных в различных областях Западной Сибири основных плазмидных типов S. enteritidis неоднозначна. Среди представленных трех областей наиболее близкая плазмидная характеристика S. enteritidis в Новосибирской и Томской области. Из выявленных на территории областей 33 плазмидных типов микроба 14 являются общими для обеих территорий, а основная часть заболеваемости обеспечивается участием трех типов микроба 38 Mda, 38:1,4 Mda и 38:2,6:1,4 Mda, на долю которых приходится свыше 70 % больных. Напротив, популяция микроба у больных в Омской области имеет существенные отличия. Прежде всего, среди штаммов микроба, выделенных от больных, не дифференцируется доминирующий плазмид-ный тип, а у 72,8 % заболевших выявлены штаммы S. enteritidis плазмидных типов 38 Mda, 38:1,4 Mda и 38:2,3 Mda, при этом микроб последнего плазмидного типа не играет существенной роли в этиологии саль-монеллеза в Новосибирской и Томской области.