Способ сканирования генных мутаций в опухолях человека
METHOD FOR SCANNING GENE MUTATIONS IN HUMAN TUMOURS

Изобретение относится к области медицины, а именно к генетике, молекулярной диагностике и онкологии, и касается способа сканирования генных мутаций в опухолях человека для использования таргетной терапии.
При многих онкологических заболеваниях, в частности при раке легких, толстой кишки, меланоме, обязательными объектами сканирования генных мутаций являются гены KRAS, NRAS, BRAF. С этой целью используют секвенирование по Сэнгеру - «золотой стандарт» клинической генодиагностики.
Недостатки способа: низкая чувствительность, трудоемкость, риск перекрестного загрязнения клинических образцов.
Известен способ сканирования генных мутаций посредством плавления ДНК (DNA Melting Analysis, DMA) с использованием интеркалирующих красителей (SYBR Green, EvaGreen и др.), реализуемый в режиме высокого разрешения (High Resolution Melting Analysis, HRMA) (Erali and Wittwer, High resolution melting analysis for gene scanning. Methods, 2010, 50, 250-261; Krypuy et al., High resolution melting analysis for the rapid and sensitive detection of mutations in clinical samples: KRAS codon 12 and 13 mutations in non-small cell lung cancer. BMC Cancer, 2006, 6, 295).
Недостатки способа: низкая специфичность, необходимость дорогостоящего оборудования.
Прототипом заявляемого способа является способ сканирования генных мутаций посредством DMA с использованием флуоресцентных зондов TaqMan (Huang et al., Multiplex fluorescence melting curve analysis for mutation detection with dual-labeled, self-quenched probes. PLoS ONE, 2011, 6, e19206). Сущность прототипа заключается в том, что зонды TaqMan могут гибридизоваться только с однонитевой ДНК; при этом образуются дуплексы, плавление которых позволяет судить о присутствии мутации в гене KRAS. В прототипе используется асимметричная полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, в результате которой одна нить ампликона, синтезированная в большем числе копий, чем другая, оказывается в избытке и доступна для взаимодействия с зондом TaqMan. Прототип включает следующие приемы: а) выделение ДНК из образца опухолевой ткани; б) амплификацию определенного фрагмента гена в асимметричной ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентного зонда TaqMan; в) использование зонда TaqMan также на этапе плавления ДНК. Характерные изменения пиков плавления дуплексов зонда с однонитевой ДНК позволяют обнаружить в анализируемой последовательности мутацию.
Недостатки прототипа: необходимость проведения ПЦР в реальном времени в асимметричном варианте, не позволяющем проводить количественную оценку числа копий анализируемого генного фрагмента; возможность мутационного сканирования в одной реакции лишь одной из двух нитей ампликона.
Задачей заявляемого изобретения является создание нового способа сканирования генных мутаций в опухолях человека, позволяющего проводить симметричную ПЦР для количественной оценки числа копий анализируемого генного фрагмента и проводить в одной реакции одновременное мутационное сканирование обеих нитей ампликона.
Технический результат: заявляемый способ позволяет в процессе стандартной симметричной ПЦР в реальном времени сканировать мутации в обеих нитях ампликона одновременно, что дает дополнительную информацию о типе мутации; повышает надежность и чувствительность анализа, сохраняя при этом возможность количественно оценивать число копий анализируемого генного фрагмента. Способ прост в исполнении, реализуется в одной пробирке без промежуточных или дополнительных процедур с однократной регистрацией результатов и без риска перекрестного загрязнения клинических образцов ДНК.
Сущность способа заключается в двунитевом сканировании генных мутаций в опухолях человека посредством симметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan, используемыми для пост-амплификационного плавления ДНК. Анализ результатов плавления осуществляют с помощью стандартного модуля плавления (DNA Melting Analysis) аппарата ПЦР (Bio-Rad CFX-96).
В процессе симметричной ПЦР в реальном времени обе комплементарные нити ампликона синтезируются в равных количествах и некоторая их часть принимает конформацию «сковородок» (pans), однонитевые участки которых взаимодействуют с зондами TaqMan, но не друг с другом. Конформация «сковородки» обусловлена использованием комбинированных праймеров, состоящих из двух частей: специфической последовательности и присоединенной к ее 5'-концу «универсальной» последовательности (Universal Primer Sequence, UPS). В результате на концах каждой из двух комплементарных нитей ампликона формируются «липкие концы» (cohesive ends), способные гибридизоваться друг с другом с образованием «ручки сковородки» (panhandles) (Guthrie Р.А. et al. Amplification ratio control system for copy number variation genotyping. Nucleic Acids Res 2011; 39:e54). По окончании амплификации в инкубационной среде оказываются структуры, способные гибридизоваться с зондами TaqMan.
Способ включает следующие этапы: амплификацию исследуемого фрагмента гена KRAS посредством симметричной ПЦР в реальном времени с двумя зондами TaqMan, смысловым и антисмысловым (sense и antisense); плавление дуплекса зонд-«сковородка»; построение пиков плавления встроенной программой Bio-Rad CFX Manager. Способ осуществляют в одном приборе и одной пробирке без вмешательства оператора.
Способ осуществляли следующим образом:
а) Получение биологического материала - опухолевой ткани, замороженной в жидком азоте или фиксированной формальдегидом и заключенной в парафиновые блоки.
б) Выделение ДНК из опухолевой ткани депротеинизацией фенолом и хлороформом, а из парафиновых блоков - с использованием коммерческого набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen).
2
4
2
в) Амплификация фрагмента гена KRAS в симметричной ПЦР в реальном времени. Реакцию проводили в 96-луночных планшетах на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, США). Инкубационная смесь (25 мкл) содержала 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,6 мМ (NH4)SO; 0,01% Tween 20; 2,5 мМ MgCl; по 0,2 мМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов; по 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров; по 0,1 мкМ зондов TaqMan K2-ROX(25)s и K2-Cy5(25)as (см. табл. 1); 1,5 ед. Hot-rescue Taq полимеразы; 5 мкл раствора ДНК (30-100 нг) в воде. Условия ПЦР: начальная денатурация - 5 мин при t=95°C, после чего 50 циклов плавления (15 сек при t=95°C), отжига (30 сек при t=56°C) и элонгации (30 сек при t=72°C) с регистрацией флуоресценции.
г) Плавление дуплексов однонитевых ампликонов с зондами TaqMan: продукты реакции денатурировали 3 мин при t=95°С, выдерживали 3 мин при t=55°С, после чего повышали температуру до t=85°C с шагом 0,4°С (выдержка 10 сек); данные анализировали с помощью программы Bio-Rad CFX Manager (version 1.6).
Продолжительность ПЦР и плавления ДНК составляет ~2,5 часа.
Способ иллюстрирован табл. 1, фиг. 1 (А, В, С), 2, 3, 4, 5 (А и В), 6 (А и В).
В табл. 1 представлены последовательности праймеров и зондов, использованных для мутационного сканирования экзона 2 гена KRAS (кодоны 12 и 13). Специфические последовательности праймеров указаны строчными буквами; в комбинированных праймерах универсальная последовательность показана прописными буквами и выделена жирным шрифтом, а специфическая последовательность - строчными буквами. В названии зонда TaqMan указаны соответствующий ампликон, флуорофор, длина олигонуклеотида и его направление (смысловой или антисмысловой).
На фиг. 1 (А, В, С) представлены этапы сканирования генных мутаций методом симметричной ПЦР в реальном времени с последующим плавлением ДНК с зондами TaqMan в приборе Bio-Rad CFX96: на фиг. 1(A) - симметричная ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan сопровождается усилением флуоресценции из-за гидролиза зонда, что позволяет в реальном времени судить о ходе реакции; на фиг. 1 (В) - плавление дуплексов приводит к фазовому переходу ДНК из двунитевой в однонитевую форму, что сопровождается падением флуоресценции; на фиг. 1 (С) - пики плавления (отрицательные первые производные кривых плавления по температуре): симметричный пик, гомодуплекс (кривая 1) свидетельствует о присутствии только аллеля дикого типа, тогда как дополнительный пик гетеродуплекса слева (кривая 2) свидетельствует о присутствии мутантного аллеля.
На фиг. 2 схематически представлены ампликоны размером 114 пар оснований, синтезированные согласно прототипу с использованием специфических праймеров, и размером 174 пар оснований, синтезированные заявляемым способом с использованием комбинированных праймеров. Указано расположение праймеров, зондов и кодонов 12 и 13, где мутации возникают особенно часто. Зонды смещены друг относительно друга (перекрывание - 8 оснований) для того, чтобы исключить возможность их гибридизации, конкурентной по отношению к гибридизации каждого из них с ДНК (во время ПЦР в реальном времени и плавления).
На фиг. 3 схематически представлены продукты ПЦР в реальном времени, возникающие при реализации прототипа и заявляемого способа. После денатурации при t=95°C и при последующем охлаждении продукты прототипа представляют собой линейные дуплексы, состоящие из двух комплементарных нитей; в заявляемом способе наряду с линейными двунитевыми дуплексами формируются структуры типа «сковородки», «ручка» которой образована комплементарными «липкими концами», а однонитевая последовательность способна взаимодействовать с зондом TaqMan.
На фиг. 4. представлена электрофореграмма продуктов ПЦР в реальном времени, синтезированных в соответствии с заявляемым способом. Ампликоны разделяли методом SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), позволяющим эффективно разделять однонитевые ДНК (12% полиакриламидный гель; отношение акриламид/бисакриламид 1:50; 0,5 х кратный трис-ацетатный буфер, рН 8; 400 V, 2,5 час при t=4°C). Показано положение маркеров молекулярного веса (дорожка М), линейного дуплекса размером 174 п.о., а также смысловой и антисмысловой «сковородок», которые обозначены как Ск-с и Ск-ас соответственно (дорожка 1). При добавлении к среде зондов TaqMan K2-ROX(25)s и K2-Cy5(25)as раздельно или вместе (дорожки 2, 3 и 4) электрофоретические подвижности антисмысловой и смысловой «сковородок» меняются (соответствующие сдвиги указаны стрелками), что свидетельствует об образовании соответствующих гибридов (а и b). Эффект более выражен в в случае K2-ROX(25)s вследствие, по-видимому, более высокой способности связывания этого зонда.
2
На фиг. 5 (А и В) представлены результаты количественной симметричной ПЦР с использованием комбинированных праймеров TaqMan K2-ROX(25)s (кривые 1) и К2-Cy5(25)as (кривые 2), отражающих амплификацию антисмысловой и смысловой нитей ампликона соответственно. Стандартные кривые (В) свидетельствуют о высокой эффективности использованных комбинированных праймеров (эффективность обоих зондов превышает 98%; коэффициент R в обоих случаях 0,988). Таким образом, в отличие от прототипа, в котором проводится асимметричная ПЦР, не пригодная для количественных измерений, заявляемый способ совместим с количественной симметричной ПЦР, позволяющей оценивать амплификацию обеих нитей.
На фиг. 6 (А и В) представлены результаты двунитевого мутационного сканирования в соответствии с заявляемым способом гена KRAS в ДНК нормальной ткани (А) и гена KRAS, содержащего мутацию GGC13GAC, в ДНК рака толстой кишки (В). Кривая 1 - сканирование антисмысловой нити ампликона зондом K2-ROX(25)s; кривая 2 - сканирование смысловой нити ампликона зондом K2-Cy5(25)as. Стрелками указаны гомодуплексы (дикий тип, wt) и идентифицирующие мутацию гетеродуплексы (mut).
Одновременное сканирование обеих нитей ампликона повышает надежность и чувствительность анализа, поскольку разные мутации по-разному проявляют себя при тестировании комплементарных нитей, не требует проведения с этой целью двух независимых ПЦР, что сокращает вдвое затраты времени, труда и расходных материалов. Величина температурных сдвигов гетеродуплексов относительно соответствующих гомодуплексов позволяет судить во многих случаях о конкретном типе мутации.