МИКРОФЛУОРИМЕТР ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ОДИНОЧНЫХ КЛЕТОК
MICROFLUOMETER FOR STUDYING THE FLUORESCENCE OF SINGLE CELLS

Изобретение относится к микрофлуориметрическим исследованиям одиночных клеток и может быть использовано в биофизике, биологии, физиологии и медицине для изучения действия биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, на одиночные клетки.
Наиболее близким аналогом данного изобретения является микроспектрофлуориметр RatioMaster™ фирмы Photon Technology International, Inc., США (http://www.pti-nj.com/RatioMaster/RatioMaster.htmt), предназначенный для измерения и визуализации концентраций различных ионов внутри клеток по уровню флуоресценции предварительно загруженных в эти клетки флуоресцирующих зондов (красителей), интенсивность эмиссии которых пропорциональна концентрации соответствующих ионов, и состоящий из флуоресцентного микроскопа, снабженного камерой/микрофотометром, регистратора и источника излучения возбуждения флуоресценции, выполненного на ксеноновой лампе сверхвысокого давления и управляемом сканирующем монохроматоре. Ксеноновая лампа обеспечивает непрерывное освещение входа монохроматора в широком спектральном диапазоне; излучение возбуждения установленной регистратором длины волны с выхода монохроматора, управляемого регистратором, передается флуоресцентным микроскопом на предварительно загруженные флуоресцирующим зондом клетки. Излучение эмиссии флуоресцентного зонда собирается флуоресцентным микроскопом и принимается камерой/микрофотометром, которые передают сигнал эмиссии клетки для записи и анализа на регистратор, роль которого выполняет компьютер со специализированным программным обеспечением для анализа флуоресценции. Известное устройство наряду со сложностью и дороговизной обладает следующими существенными недостатками:
1) использование монохроматора для возбуждения флуоресценции при работе на одиночных клетках не обеспечивает достаточной чувствительности измерения флуоресценции одиночной клетки из-за низкого энергетического соотношения сигнал/шум за счет высокого (сравнимого с сигналом эмиссии) уровня паразитного излучения монохроматора в спектральной области эмиссии (из-за рассеяния света на решетках и также наличия у решеток дифракционных максимумов выше 1-го порядка), вследствие чего поступающий на регистратор измеряемый сигнал эмиссии является нечетким, что не позволяет обеспечивать нормальную точность измерения;
2) высокий разброс регистрируемого таким устройством сигнала эмиссии флуоресцентного зонда за счет нестабильной яркости и непостоянства размера разряда в лампе сверхвысокого давления осветителя, уменьшение которого при помощи фильтрации принципиально невозможно, поскольку энергетические временные спектры шумов лампы и сигналов эмиссии частично перекрываются;
3) возможности повышения энергетического соотношения сигнал/шум за счет повышения мощности излучения возбуждения при использовании этого устройства сильно ограничены мощностью лампы, низким (~1:100) выходным относительным отверстием монохроматора, конечными значениями квантового выхода и поглощательной способности загруженных в клетку флуоресцентных зондов, а также быстрым выгоранием зондов при непрерывном воздействии излучения на клетку, что приводит к снижению чувствительности и точности измерения.
Задачей данного изобретения является повышение чувствительности измерения за счет снижения уровня паразитного излучения в спектральной области эмиссии и улучшение точности измерения путем снижения разброса регистрируемого сигнала эмиссии при микрофлуориметрических исследованиях одиночных клеток.
Указанная цель достигается тем, что в микрофлуориметре для исследования флуоресценции одиночной клетки, содержащем флуоресцентный микроскоп, снабженный камерой/микрофотометром, регистратор и источник излучения возбуждения флуоресценции, согласно изобретению, последний выполнен в виде сверхярких излучающих полупроводниковых диодов с фиксированной длиной волны излучения, соединенных между собой устройством переключения диодов и связанных с регистратором, посредством которого осуществляется синхронизация включения диодов с регистрацией сигнала эмиссии.
На Фиг.1 представлена схема реализации предлагаемого устройства.
Микрофлуориметр для исследования флуоресценции одиночной клетки содержит оптический канал 1, сверхяркий излучающий полупроводниковый диод 2, конденсор 3, фильтр 4, световод 5, фотометр 6, камеру 7, флуоресцентный микроскоп 8, препарат 9, микрообъектив 10, дихроичное зеркало 11, линзу 12, устройство переключения диодов 13, источник тока 14, регистратор 15, представляющий собой, как и в аналоге, компьютер со специализоварнным программным обеспечением для анализа флуоресценции.
Источник излучения возбуждения флуоресценции содержит пять идентичных оптических каналов 1, каждый из которых включает сверхяркий излучающий полупроводниковый диод 2 (длины волн максимума спектральной плотности/мощность излучения на ней каждого диода = 340/20, 380/50, 440/70, 480/70, 530/70 нм/мВт, соответственно) и конденсор 3 для согласования числовой апертуры входного торца световода 5 и диаграммы направленности излучения диода 2. Устранение второй гармоники излучения и сужение спектральной полосы излучающего диода достигается оптическим фильтром 4. Световоды всех оптических каналов конвергированы в единый световод с регулярной укладкой волокон, выходная ветвь которого установлена в эпифлуоресцентный порт микроскопа 8. Линза 12 проецирует торец выходной ветви световода 5 через дихроичное зеркало 11 в плоскость выходного зрачка микрообъектива 10, что обеспечивает равномерность освещения препарата 9. Излучающий диод 2 в каждом оптическом канале управляется источником тока 14 от устройства переключения диодов 13. Регистратор 15 осуществляет синхронизацию включения излучающих диодов с регистрацией сигнала эмиссии, полученного от камеры 7 и/или фотометра 6.
Предлагаемое устройство работает следующим образом. Препарат 9 - живые одиночные клетки, предварительно нагруженные выбранным для измерения интересующего иона флуоресцирующим зондом, располагаются под микрообъективом 10 на флуоресцентном микроскопе 8. Затем на регистраторе 15 устанавливается длина волны возбуждения (или несколько длин волн при мультиволновом режиме возбуждения), соответствующая максимуму спектральной поглощательной способности выбранного флуоресцентного зонда. В процессе измерения эмиссии клетки регистратор обеспечивает периодическое включение диода с длиной волны максимума спектральной плотности излучения, равной установленной длине (длинам) волны возбуждения. Излучение возбуждения из оптического блока по световоду 5 передается во флуоресцентный микроскоп 8, отражается дихроичным зеркалом 11 в микробъектив 10, который фокусирует это излучение на расположенных под ним клетках препарата 9. Одновременно излучение эмиссии собирается микрообъективом 10 на камеру 7 и/или фотометр 6, сигнал от которых синхронно с включением диода 2 принимается регистратором 15 для хранения и анализа. При аппликации на клетку различных биологически активных веществ происходит изменение концентрации интересующего иона внутри нее. Это изменение оценивается регистратором по разнице сигналов эмиссии клетки в покое и при действии на нее апплицируемого вещества.
2+
2+
Результаты сравнения прототипа и предлагаемого устройства в проведенных нами экспериментах по регистрации кальциевых сигналов эмиссии в цитоплазме одиночных клеток показаны на Фиг.2. Одиночные клетки линии COS-1, предварительно нагруженные кальциевым зондом Fluo-4 (Molecular Probes, США), располагались на стекле на микроскопе Axiovert-100 ("Zeiss", Германия) с микрообъективом Achroplan-40, NA=0.8 ("Zeiss", Германия) как в приборе прототипа, так и в заявленном микрофлуориметре. Флуоресценция возбуждалась на длине волны 480 нм при помощи монохроматора, входящего в состав прототипа RatioMaster™ (Photon Technology International, Inc., США), и при помощи сверхярких излучающих полупроводниковых диодов заявленного устройства. Сигнал эмиссии с ICCD-камеры IC-200 (Photon Technology International, Inc., США) и/или микроскопного фотометра М-40 (Photon Technology International, Inc., США), установленных на микроскопе, как в прототипе, так и в заявленном устройстве поступал на регистратор. В качестве регистратора в обоих случаях использовался персональный компьютер со специализированным программным обеспечением. Аппликация АТФ вызывала кратковременное повышение иона кальция Ca в цитоплазме одиночной клетки COS-1, нагруженной кальциевым зондом Fluo-4 в обоих случаях. Ca-сигналы регистрировались от одной и той же клетки с помощью прототипа (Фиг.2А, В) и при помощи заявленного устройства (Фиг.2Б, Г). Линии над кривыми флуоресценции на графиках обоих экспериментов соответствуют аппликации АТФ, цифры - значению концентрации АТФ в наномолях.
При стимуляции клеток COS-1 агонистом пуринорецепторов - АТФ, регистрируемое относительное изменение интенсивности эмиссии (ΔF/F) в случае аналога было ниже (Фиг.2А, ΔF/F=2.0±0.3, n=3), чем в случае предлагаемого устройства (Фиг.2Б, ΔF/F=2.5±0.2, n=3). Энергетическое отношение сигнал/шум было 15 для предлагаемого устройства и 7 для монохроматора, соответственно. Это обусловлено наличием на выходе монохроматора паразитного излучения в спектральной области эмиссии из-за неидеальности его решеток и вызванного этим рассеяния света, а также наличия у решеток дифракционных максимумов выше 1-го порядка. Нестабильность яркости и непостоянство размера тела разряда в лампе сверхвысокого давления осветителя аналога приводили к девиации интенсивности излучения возбуждения флуоресценции и более высокому разбросу регистрируемого сигнала эмиссии (Фиг.2А), по сравнению с заявленным устройством (Фиг.2Б). Достигнутое в заявленном устройстве снижение уровня паразитного излучения и уменьшение разброса регистрируемого сигнала позволило увеличить чувствительность и улучшить точность измерения эмиссии одиночной клетки при аппликации минимальных (субмикромольных) концентраций АТФ, что не достигалось с помощью прототипа. Ответ клетки на 100 нМ АТФ является пороговым в случае регистрации прототипом (Фиг.2В), а в случае использования заявленного устройства такой ответ уверенно регистрируется (Фиг.2Г), при этом заявленное устройство способно регистрировать и более слабые сигналы флуоресценции. Синхронизация включения светоизлучающих диодов с камерой/микрофотометром в предложенном устройстве позволяет значительно снизить выгорание зонда, а быстрое переключение диодов - реализовать мультиволновое возбуждение на двух и более длинах волн.
Достигнутые при помощи предложенного устройства высокая чувствительность и точность регистрации сигнала эмиссии позволяют проводить первичный отбор и испытания различных биологически активных веществ и новых лекарственных препаратов на одиночных клетках в биологии, медицине и фармакологии. Характерное время службы светоизлучающих диодов составляет примерно 30-50 тысяч часов против 1-2 тысяч часов у ксеноновых ламп, что является дополнительным преимуществом заявленного устройства согласно изобретению.