КОМПОЗИЦИЯ БИОЧЕРНИЛ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ХРЯЩА, СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛИЗИРОВАННОГО КАРКАСА ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ХРЯЩА С ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕМ И ИНДИВИДУАЛИЗИРОВАННЫЙ КАРКАС ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ХРЯЩА, ИЗГОТОВЛЕННЫЙ С ПОМОЩЬЮ СПОСОБА ИЗГОТОВЛЕНИЯ
BIO-INK COMPOSITION FOR REGENERATION OF CARTILAGE, METHOD FOR MANUFACTURE OF INDIVIDUALIZED FRAME FOR REGENERATION OF CARTILAGE, USING IT, AND INDIVIDUALIZED FRAME FOR REGENERATION OF CARTILAGE, MADE USING MANUFACTURING METHOD

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет и преимущество на основании патентной заявки Кореи №10-2018-0012221, поданной в ведомство по интеллектуальной собственности Кореи 31 января 2018 г., все содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к композиции биочернил для регенерации хряща, способу изготовления индивидуализированного каркаса для регенерации хряща с использованием композиции биочернил и индивидуализированному каркасу для регенерации хряща, изготовленному с использованием указанного способа изготовления.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Дегенеративный артрит - это заболевание, при котором появляются местные дегенеративные изменения во время износа суставного хряща, и его также называют остеоартритом или остеоартрозом. Дегенеративный артрит является одним из типов хронического артрита и представляет собой заболевание, при котором происходит дегенеративное изменение суставного хряща, которое подвергается весовой нагрузке, что приводит к разрастанию кости на поверхности сустава и часто наблюдается у взрослых среднего возраста. При этом заболевании, во-первых, хрящ теряет эластичность, а функция хондроцитов, продуцирующих компоненты хрящевой композиции, ухудшается из-за старения. Более того, со временем поверхность хряща становится шероховатой, и в суставную полость, окруженную суставной мембраной, попадают различные типы материалов, что вызывает воспаление. Клинически появляются периодические боли, скованность суставов, прогрессирующее нарушение движений в суставах и тому подобное. Причина дегенеративного артрита тесно связана с явлениями старения или избыточной массой тела, а дегенеративный артрит чаще и серьезнее проявляется у женщин с возрастом. В качестве начального симптома в одном или двух суставах проявляется пульсирующая боль вместе со скованностью и далее наблюдается затвердение субхондральной кости, чрезмерное образование кости вокруг сустава, деформация сустава и тому подобное.
Причины дегенеративных изменений суставного хряща еще не выяснены, но известно, что одной из причин является абсолютное уменьшение количества хондроцитов и дисбаланс между синтезом и деградацией хрящевого матрикса, происходящий в хондроцитах. Следовательно, дегенеративные изменения суставного хряща снижают прочность хряща и его способность служить подушкой из-за разрушения хрящевого матрикса.
Недостатком существующих клеточных терапевтических агентов является то, что имплантированные клетки смещены в одном направлении из-за силы тяжести, так что трудно равномерно распределить терапевтический агент в месте дефекта, и есть трудности с приживлением клеток, что снижает регенерацию клеток в место дефекта хряща. Кроме того, в случае имплантации аутологичных хондроцитов и имплантации стволовых клеток, ткань применяется к пациенту посредством процесса культивирования после извлечения ткани, так что требуются две операции и приблизительно 4-недельный период культивирования клеток или манипуляций. Кроме того, существуют проблемы, связанные с тем, что из-за силы тяжести имплантированным клеткам трудно равномерно распределиться и прижиться в месте дефекта, а также индуцируется дифференцировка в волокнистый хрящ вместо гиалинового хряща, так что легко возникает явление, при котором происходит разрушение хряща. Следовательно, существует потребность в разработке способа, способного эффективно регенерировать клетки в месте дефекта хряща.
ДОКУМЕНТЫ ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
[Патентный документ]
Опубликованная заявка на патент Кореи №10-2017-0012099.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Настоящее изобретение было создано при работе над обеспечением композиции биочернил для регенерации хряща для производства индивидуализированного каркаса для регенерации хряща дефектного участка хряща. Кроме того, настоящее изобретение было создано при работе над обеспечением способа изготовления индивидуализированного каркаса для регенерации хряща с использованием композиции биочернил для регенерации хряща и индивидуализированного каркаса для регенерации хряща, изготовленного с использованием указанной композиции.
Техническое решение
Один из примеров осуществления настоящего изобретения обеспечивает композицию биочернил для регенерации хряща, которая включает первую жидкость, содержащую стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, порошок гиалинового хряща и фибриноген; и вторую жидкость, содержащую тромбин.
Другой пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ изготовления индивидуализированного каркаса для регенерации хряща, при этом способ включает: а) получение трехмерных данных участка дефекта хряща с использованием 3D-сканера и изготовление формы для создания каркаса с использованием 3D-принтера; b) использование первой жидкости, содержащей стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, порошок гиалинового хряща и фибриноген, и нанесение первой жидкости в форму для создания каркаса с образованием первого слоя; с) нанесение второй жидкости, содержащей тромбин, на первый слой с образованием второго слоя; и d) формирование индивидуализированного каркаса для регенерации хряща путем обеспечения взаимодействия первого слоя со вторым слоем.
Еще один пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает индивидуализированный каркас для регенерации хряща, изготовленный с использованием указанного способа изготовления.
Преимущества изобретения
Композиция биочернил для регенерации хряща согласно настоящему изобретению обладает преимуществом в том, что может быть изготовлен каркас для регенерации хряща, подходящий для пациента.
Индивидуализированный каркас для регенерации хряща, изготовленный с использованием композиции биочернил для регенерации хряща в соответствии с настоящим изобретением, может эффективно лечить хрящ за счет повышения способности имплантированной стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, дифференцироваться в хрящ и также за счет усиления процесса регенерации хряща в месте имплантации.
Индивидуализированный каркас для регенерации хряща согласно изобретению имеет превосходную силу связывания с пораженной областью и обладает преимуществом в том, что способность к дифференцировке хряща и эффект регенерации хряща являются превосходными благодаря превосходной силе связывания.
Способ изготовления индивидуализированного каркаса для регенерации хряща в соответствии с настоящим изобретением обладает преимуществом в том, что каркас может быть имплантирован с помощью одной хирургической процедуры, поскольку индивидуализированный каркас для регенерации хряща может быть немедленно изготовлен путем трехмерного сканирования участка дефекта пораженной области хряща в операционной.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показан процесс получения осадка для подтверждения способности дифференцировки хряща согласно экспериментальному примеру 1.
На фиг. 2 показан результат окрашивания сафранином О осадка из сравнительного примера 1 (МССМ 0 мг) в соответствии с экспериментальным примером 1.
На фиг. 3 показан результат окрашивания сафранином О осадка из примера 1 (МССМ 10 мг) в соответствии с экспериментальным примером 1.
На фиг. 4 показан результат окрашивания сафранином О осадка из примера 2 (МССМ 50 мг) в соответствии с экспериментальным примером 1.
На фиг. 5 показан результат окрашивания сафранином О осадка из примера 3 (МССМ 100 мг) в соответствии с экспериментальным примером 1.
На фиг. 6 показана процедура эксперимента на животных для подтверждения того, регенерирован ли хрящ в экспериментальном примере 2.
На фиг. 7 показаны изображения во время процедуры эксперимента на животных из примера 4 согласно экспериментальному примеру 2 и микро-КТ (компьютерная томография) изображение области дефекта через 6 недель после имплантации каркаса.
На фиг. 8 показаны изображения во время процедуры эксперимента на животных из сравнительного примера 2 согласно экспериментальному примеру 2 и микро-КТ изображение области дефекта через 6 недель после имплантации каркаса.
На фиг. 9 показан результат окрашивания сафранином О области дефекта через 6 недель после имплантации из сравнительного примера 2 в соответствии с экспериментальным примером 2.
На фиг. 10 показан результат окрашивания сафранином О области дефекта через 6 недель после имплантации из примера 4 согласно экспериментальному примеру 2.
На фиг. 11 показан результат иммуногистохимической (ИГХ) обработки коллагеном 1 типа области дефекта через 6 недель после имплантации из сравнительного примера 2 согласно экспериментальному примеру 2.
На фиг. 12 показан результат иммуногистохимической (ИГХ) обработки коллагеном 1 типа области дефекта через 6 недель после имплантации из примера 4 согласно экспериментальному примеру 2.
На фиг. 13 показан результат иммуногистохимической (ИГХ) обработки коллагеном 2 типа области дефекта через 6 недель после имплантации из сравнительного примера 2 согласно экспериментальному примеру 2.
На фиг. 14 показан результат иммуногистохимической (ИГХ) обработки коллагеном 2 типа области дефекта через 6 недель после имплантации из примера 4 согласно экспериментальному примеру 2.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Когда в настоящем описании один элемент расположен «на» другом элементе, это включает не только случай, когда один элемент приводят в контакт с другим элементом, но также случай, когда еще один элемент присутствует между двумя элементами.
Когда одна часть «включает» один составной элемент в настоящем описании, если иное специально не описано, это не означает, что другой составной элемент исключен, но означает, что еще один составной элемент может быть дополнительно включен.
Далее настоящее изобретение далее будет описано подробно.
Один из примеров осуществления настоящего изобретения обеспечивает композицию биочернил для регенерации хряща, которая включает первую жидкость, содержащую стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, порошок гиалинового хряща и фибриноген; и вторую жидкость, содержащую тромбин.
Композиция биочернил для регенерации хряща в соответствии с настоящим изобретением является двухжидкостной, и первая жидкость и вторая жидкость могут наноситься последовательно, а затем вступать в реакцию с образованием каркаса для регенерации хряща. В частности, тромбин во второй жидкости может реагировать с фибриногеном в первой жидкости с образованием фибриновой сети, которая может служить для достаточной фиксации стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, и внеклеточного матрикса.
Стромально-васкулярная фракция жировой ткани включает стволовые клетки, полученные из жировой ткани. Предпочтительно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может по существу не включать клетки (например, адипоциты, эритроциты, другие стромальные клетки и т.п.), кроме стволовых клеток, полученных из жировой ткани, и материалов внеклеточного матрикса, и, более предпочтительно, может полностью не включать другие клетки и материалы внеклеточного матрикса.
Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть получена из жировой ткани аллогенного животного или гетерологичного животного. Предпочтительно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть получена из аутологичной жировой ткани. Более конкретно, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может быть получена с использованием адипоцитов пациента или животного, подлежащего лечению.
5
7
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения содержание стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, в первой жидкости может составлять от 10 до 10 клеток/мл относительно первого раствора. Когда содержание стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, находится в пределах указанного выше диапазона, способность к дифференцировке хряща и способность к регенерации хряща изготавливаемого каркаса могут быть значительно улучшены.
Стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, может использоваться с порошком гиалинового хряща для дифференцировки в клетки хряща и дифференцировка в хондроциты может активно индуцироваться, когда для этого в пораженную область имплантируют индивидуализированный каркас для регенерации хряща.
Порошок гиалинового хряща может представлять собой элемент, который составляет основу каркаса, изготовленную с использованием композиции биочернил для регенерации хряща. В частности, фибриновая матрица посредством реакции фибриногена и тромбина может позволить частицам порошка гиалинового хряща связываться друг с другом.
Порошок гиалинового хряща может быть получен из аллогенного или гетерологичного гиалинового хряща. Предпочтительно порошок гиалинового хряща может быть получен из аллогенного гиалинового хряща. В частности, когда субъектом лечения хряща является человек, можно использовать порошок гиалинового хряща, выделенный из гиалинового хряща человека. Кроме того, если субъектом лечения хряща является животное, можно использовать порошок гиалинового хряща, выделенный из гиалинового хряща животного того же вида.
Порошок гиалинового хряща может индуцировать дифференцировку стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, в хондроциты за счет высвобождения факторов роста, связанных с регенерацией хряща. Кроме того, белки, входящие в состав порошка гиалинового хряща, могут способствовать активной регенерации хряща в пораженной области.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения порошок гиалинового хряща может быть получен из реберного хряща. В частности, когда индивидуализированный каркас для регенерации хряща применяется к человеку, порошок гиалинового хряща может быть получен из реберного хряща человека. Кроме того, когда индивидуализированный каркас для регенерации хряща применяется к животному, порошок гиалинового хряща может быть получен из реберного хряща того же вида, что и животное-субъект. Например, порошок гиалинового хряща можно использовать путем измельчения коммерчески доступного аллогенного реберного хряща.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения диаметр частиц порошка гиалинового хряща может составлять от 30 до 300 мкм. Когда средний диаметр частиц порошка гиалинового хряща находится в указанном выше диапазоне, это обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что хондроциты эффективно дифференцируются и регенерируются.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения концентрация порошка гиалинового хряща может составлять от 0,005 до 0,1% (мас./об.). То есть порошок гиалинового хряща может быть включен в количестве от 0,005 до 0,1 г на мл первой жидкости. Концентрация порошка гиалинового хряща может составлять предпочтительно от 0,005 до 0,07% (мас./об.), более предпочтительно от 0,005 до 0,03% (мас./об.) и наиболее предпочтительно от 0,007 до 0,03% (мас./об.). Когда концентрация порошка гиалинового хряща находится в указанном выше диапазоне, выживаемость хондроцитов, дифференцировка в хондроциты и морфология могут быть наилучшим образом реализованы после имплантации индивидуализированного каркаса для регенерации хряща.
5
7
5
7
5
7
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения количество клеток в стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, может составлять от 10 до 10 относительно 5-100 мг порошка гиалинового хряща. Предпочтительно количество клеток в стромально-сосудистой фракции, полученной жировой ткани, может составлять от 10 до 10 относительно 5-70 мг порошка гиалинового хряща. Более предпочтительно, количество клеток в стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, может составлять от 10 до 10 относительно 5-30 мг порошка гиалинового хряща.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения первая жидкость может дополнительно включать апротинин. Апротинин является ингибитором протеолитических ферментов, секретируемых поджелудочной железой, и представляет собой полипептид, состоящий в общей сложности из 58 аминокислот. Апротинин обычно извлекают из легких крупного рогатого скота и, известно, что он обладает кровоостанавливающим действием, подавляя разложение фибрина в крови.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения фибриноген может быть включен в количестве от 65 до 115 мг на мл первой жидкости.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения апротинин может быть включен в количестве от 900 кининоген инактивирующих единиц (KIU) до 1100 KIU, в частности 1000 KIU, на мл первой жидкости.
5
7
В частности, согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения первая жидкость может включать от 10 до 10 клеток стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани, от 5 до 100 мг порошка гиалинового хряща, от 65 до 115 мг фибриногена и от 900 до 1100 KIU апротинина на мл первой жидкости.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения вторая жидкость может представлять собой тромбин, растворенный в растворе хлорида кальция. В частности, вторая жидкость может включать от 400 до 600 ME тромбина и от 5 до 6,5 мг хлорида кальция на мл второй жидкости.
Растворителем первой жидкости и второй жидкости может быть вода, в частности физиологический раствор. Кроме того, фибриноген в первой жидкости и тромбин во второй жидкости могут быть получены с помощью коммерчески доступного набора фибринового клея.
Поскольку реакция первой жидкости и второй жидкости завершается в течение 10 минут, предпочтительно в течение 5 минут, композиция биочернил для регенерации хряща имеет преимущество в том, что индивидуализированный каркас для регенерации хряща может быть немедленно изготовлен с использованием 3D-принтера в месте лечения.
В настоящем изобретении в качестве адгезива используется фибриновый клей, включающий фибриноген и фибрин в качестве адгезива, который может обеспечить более высокую вязкость, чем вязкость адгезива на основе гиалуроновой кислоты или адгезива на основе коллагена, так что индивидуализированный каркас для регенерации хряща имеет превосходную силу связывания с пораженной областью, и, кроме того, может сохранять высокую прочность.
Другой пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ изготовления индивидуализированного каркаса для регенерации хряща, при этом способ включает: а) получение трехмерных данных участка дефекта хряща с использованием 3D-сканера и изготовление формы для создания каркаса с использованием 3D-принтера; b) использование первой жидкости, содержащей стромально-васкулярную фракцию, полученную из жировой ткани, порошок гиалинового хряща и фибриноген, и нанесение первой жидкости в форму для создания каркаса с образованием первого слоя; с) нанесение второй жидкости, содержащей тромбин, на первый слой с образованием второго слоя; и d) формирование индивидуализированного каркаса для регенерации хряща путем обеспечения взаимодействия первого слоя со вторым слоем.
На этапе а) может быть использовано оборудование для 3D-сканирования и оборудование для 3D-печати, известное в данной области техники. Кроме того, форма для образования каркаса может служить для фиксации трехмерной формы при нанесении первой и второй жидкости. Форма для образования каркаса может быть удалена после того, как каркас для регенерации хряща будет сформирован. Форма для образования каркаса может быть сформирована с использованием биосовместимого полимера, обычно используемого в данной области.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этапы b) и с) можно выполнять с использованием струйной печати или 3D-печати. В частности, на этапах b) и с) можно использовать печатающее устройство, имеющее два или более сопел, известное в данной области техники, и трехмерная форма может быть создана путем выпуска первой жидкости и второй жидкости из соответствующих сопел.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этапы b) и с) могут повторяться поочередно. В частности, когда необходимо сформировать лист для каркаса для регенерации хряща большого объема, этапы b) и с) поочередно выполняют для ламинирования слоев, а именно: "первый слой / второй слой / первый слой / второй слой", и затем эти слои могут быть коагулированы для формирования каркаса для регенерации хряща.
Согласно одному из примеров осуществления настоящего изобретения этап d) может быть завершен в течение 10 минут, предпочтительно в течение 5 минут. В частности, на этапе d) реакция может проводиться в течение 3-7 минут, и первый слой и второй слой могут вступать в реакцию с образованием каркаса для регенерации хряща.
В случае имплантации аутологичных хондроцитов и имплантации стволовых клеток в настоящее время существует проблема, заключающаяся в том, что после того, как на пораженном участке делается первичный разрез для извлечения ткани дефектной области хряща пациента, для имплантации в пораженный участок требуется вторичный разрез после процесса культивирования ткани, поэтому требуются две хирургические процедуры. В отличие от этого, способ изготовления индивидуализированного каркаса для регенерации хряща обладает преимуществом в том, что после подтверждения дефектной области хряща через первичный разрез, в течение короткого периода времени изготавливается каркас, соответствующий дефектной области хряща, который быть имплантирован в дефектную область хряща. Таким образом, способ изготовления индивидуализированного каркаса для регенерации хряща обладает преимуществом в том, что индивидуализированный каркас можно имплантировать в пораженную область с помощью только одного разреза.
Еще один пример осуществления настоящего изобретения обеспечивает индивидуализированный каркас для регенерации хряща, изготовленный с использованием указанного способа изготовления.
Индивидуализированный каркас для регенерации хряща может быть изготовлен в форме, соответствующей области дефектного хряща, в течение короткого периода времени и имплантирован, как описано выше. Индивидуализированный каркас для регенерации хряща не требует процесса культивирования клеток, стромально-васкулярная фракция, полученная из жировой ткани, в каркасе после имплантации дифференцируется в хондроциты, а порошок гиалинового хряща может активировать регенерацию хряща и повысить жизнеспособность регенерированных хондроцитов.
Когда индивидуализированный каркас для регенерации хряща имплантируют в пораженный участок, природный гиалиновый хрящ может быть стимулирован к регенерации с помощью факторов роста гиалинового хряща и белков, секретируемых из порошка гиалинового хряща. Когда индивидуализированный каркас для регенерации хряща применяется таким образом к пораженному участку, пораженный участок может быть эффективно восстановлен до того же или похожего состояния, что и исходный хрящ.
Далее настоящее изобретение будет описано подробно со ссылкой на примеры для конкретного описания настоящего изобретения. Однако примеры согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы различным образом, и не следует понимать, что объем настоящего изобретения ограничен примерами, которые будут описаны ниже. Примеры настоящего описания предоставлены для более полного объяснения настоящего изобретения специалистам в данной области техники.
Выделение клеток стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани (SVF)
Клетки стромально-васкулярной фракции, полученной из жировой ткани (SVF), получали с помощью следующих этапов.
3
1. Приблизительно 60 см жировой ткани извлекали путем липосакции под руководством врача в стерильной операционной, добавляли в том же объеме 0,075% липидной фазы коллагеназы к ткани, и полученная смесь вступала в реакцию путем инкубации при встряхивании при 230 об/мин при температуре 37°С в течение 30 минут.
2. После описанной выше реакции продукт реакции центрифугировали со скоростью 420 g при 25°С в течение 10 минут, и в результате центрифугирования продукт реакции разделяли на три слоя гранул SVF, слой коллагеназы и масляный слой.
3. После удаления верхнего раствора за исключением слоя гранул SVF и ресуспендирования слоя гранул SVF в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), волокнистые материалы и оставшиеся примеси ресуспендированного слоя SVF были удалены с использованием 100 мкм нейлонового фильтра (сетчатый фильтр).
5
7
4. После ресуспендирования раствора, содержащего отфильтрованный SVF, и трехкратного центрифугирования все оставшиеся материалы были удалены за исключением осадка в нижнем слое, и затем в результате подсчета ядерных клеток с использованием счетчика клеток можно было подтвердить, что было получено от 10 до 10 клеток SVF.
Приготовление порошка гиалинового хряща
Порошок гиалинового хряща получали в виде порошка с размером частиц от 30 до 300 мкм с использованием коммерчески доступного реберного хряща. В дальнейшем порошок гиалинового хряща будет обозначаться как микронизированная матрица реберного хряща.
Экспериментальный пример 1 - изготовление гранул для подтверждения хондрогенной дифференциации (эксперимент in vitro)
[Примеры 1-3]
На фиг. 1 показан процесс получения осадка для подтверждения способности дифференцировки хряща. В частности, эксперимент по подтверждению способности к дифференцировке хряща проводили следующим образом.
5
7
1. Полученный SVF (10-10 клеток) смешивали с физиологическим раствором, в котором диспергировали 10 мг (пример 1), 50 мг (пример 2) и 100 мг (пример 3) приготовленного порошка гиалинового хряща (МССМ).
2. После центрифугирования этой смешанной жидкости при 1000 об/мин при 4°С в течение 5 минут была получена смесь MCCM/SVF путем удаления надосадка физиологического раствора.
3. Смесь MCCM/SVF смешивали с 1 мл апротининовой жидкости, в которую был вмешан фибриноген, с использованием шприца для смешивания.
4. 1 мл раствора MCCM/SVF/фибриноген и 1 мл раствора хлорида кальция, в котором был растворен тромбин, присоединяли к Y-образному соединению, и 20 мкл каждого раствора вносили в 15 мл коническую пробирку и отверждали при комнатной температуре в течение 5 минут до образования осадка.
2
5. Среду, не содержащую фактора роста, заменяли и вводили три раза в неделю таким образом, чтобы осадок был достаточно погружен, осадок инкубировали при 37°С и 5% СО в течение 5 недель, а затем подтверждали хондрогенную дифференцировку выполняя окрашивание сафранином О.
Сравнительный пример 1
Осадок был сформирован и инкубирован таким же образом, как описано выше, путем смешивания только SVF с апротининовой жидкостью, в которую был вмешан фибриноген без МССМ (0 мг МССМ, сравнительный пример 1), а затем хондрогенная дифференцировка была подтверждена путем окрашивания сафранином О.
На фиг. 2-5 показан результат окрашивания сафранином О осадка в соответствии со сравнительным примером 1 (0 мг МССМ), примером 1 (10 мг МССМ), примером 2 (50 мг МССМ) и примером 3 (100 мг МССМ). На Фиг. 2-5 может быть подтверждено, что участок хряща и МССМ были окрашены в красный цвет в соответствии с окрашиванием сафранином О, и ядра хондроцитов наблюдали вокруг МССМ в примерах 1-3, и может быть подтверждено, что присутствовало некоторое количество живых хондроцитов. При этом нельзя подтвердить, что в случае сравнительного примера 1, в котором МССМ не использовался, хондроциты были дифференцированы. Из этих результатов можно сделать вывод о том, что белки МССМ, факторы роста и т.п. высвобождались и индуцировали дифференцировку SVF в хондроциты. Кроме того, что касается содержания МССМ, можно подтвердить, что Пример 1 (10 мг МССМ) имел наиболее активную жизнеспособность хондроцитов и дифференцировку в хондроциты по сравнению с примерами 2 и 3. То есть, когда содержание МССМ слишком высоко, определяется, что дифференцировка в хондроциты задерживается, поскольку пространство, где SVF может дифференцироваться в хондроциты, уменьшается.
Экспериментальный пример 2 Эксперимент на животных для подтверждения регенерации хряща (эксперимент in vivo)
Пример 4
На фиг. 6 показана процедура эксперимента на животных для подтверждения того, регенерирован ли хрящ. Более конкретно указанный эксперимент проводили следующим образом.
5
7
1. Полученный SVF (от 10 до 10 клеток) смешивали с физиологическим раствором, в котором было диспергировано 10 мг приготовленного порошка гиалинового хряща (МССМ).
2. После центрифугирования этой смешанной жидкости при 1000 об./мин при 4°С в течение 5 минут была получена смесь MCCM/SVF путем удаления надосадка физиологического раствора.
3. Смесь MCCM/SVF смешивали с использованием 1 мл раствора апротинина, в который был вмешан фибриноген, и шприца для смешивания.
4. Готовили по 1 мл раствора MCCM/SVF/фибриноген и по 1 мл раствора хлорида кальция, в котором был растворен тромбин.
5. Обнажали мыщелок бедренной кости коленного сустава экспериментального бигля, и в этой части формировали область дефекта диаметром около 6 мм и глубиной около 2 мм.
6. Чтобы изготовить форму для образования каркаса, с помощью 3D-сканера были получены трехмерные данные дефектного участка хряща экспериментального бигля, и на основании этих данных внешняя стенка из поликапролактона (PCL) медицинского качества была напечатана с помощью 3D-принтера 3D Bio (INVIVO, ROKIT). Кроме того, после того как раствор MCCM/SVF/фибриногена и раствор хлорида кальция, в котором был растворен тромбин, были последовательно нанесены в форму для образования каркаса с использованием 3D-принтера Bio 3D (INVIVO, ROKIT), был изготовлен индивидуализированный каркас для регенерации хряща путем отверждения растворов.
7. 100 мкл фибринового клея (Beriplast) вводили в область дефекта экспериментального бигля, имплантировали изготовленный индивидуализированный каркас для регенерации хряща, а затем зашивали область хирургического вмешательства.
8. Через 6 недель подтверждали, образовались ли хондроциты в имплантированном индивидуализированном каркасе для регенерации хряща.
Сравнительный пример 2
Эксперимент на животных проводили таким же образом, как описано выше, путем смешивания только SVF с апротининовой жидкостью, в которую был вмешан фибриноген без МССМ.
На фиг. 7 и 8 показаны изображения, полученные во время процедуры эксперимента на животных из примера 4 и сравнительного примера 2 в соответствии с экспериментальным примером 2 и микро-КТ (компьютерная томография) изображение области дефекта через 6 недель после имплантации каркаса. На Фиг. 7 и 8 может быть подтверждено, что результаты микро-КТ визуализации согласно примеру 4 демонстрируют очень высокую плотность кости по сравнению с результатами микро-КТ визуализации согласно сравнительному примеру 2. Таким образом, можно подтвердить, что в случае примера 4, где используют МССМ, имеется высокая способность к образованию хряща.
На фиг. 9 и 10 показан результат окрашивания сафранином О области дефекта через 6 недель после имплантации согласно сравнительному примеру 2 и примеру 4 в соответствии с экспериментальным примером 2. В результате окрашивания сафранином О может быть подтверждено, что только в случае примера 4 хрящ в области дефекта регенерировался. Это может быть подтверждено в области, где объем, показанный красным цветом, создается в части, отмеченной стрелкой на фиг. 10. Кроме того, выделенная красным часть на фиг. 9 представляет собой область, где остается только нормальный хрящ, когда создается область дефекта.
На фиг. 11 и 12 показаны результаты иммуногистохимической (ИГХ) обработки коллагеном 1 типа для подтверждения того, какой тип хряща регенерируется в области дефекта через 6 недель после имплантации согласно сравнительному примеру 2 и примеру 4 в соответствии с экспериментальным примером 2. Коллаген 1 типа связывается с антителом для подтверждения наличия фиброзного хряща и служит для обнаружения только фиброзного хряща и его экспрессии, показанных коричневым цветом. Согласно фиг. 12, можно подтвердить, что регенерированная часть в области дефекта отображена синим цветом, и можно видеть, что регенерированный хрящ представляет собой не фиброзный хрящ, а гиалиновый хрящ, и происходит регенерация в хондроциты, подходящие для области дефекта. Напротив, в случае фиг. 11, область, дифференцирующаяся в гиалиновый хрящ, не подтверждена.
На фиг. 13 и 14 показаны результаты иммуногистохимической (ИГХ) обработки коллагеном 2 типа для подтверждения того, какой тип хряща регенерируется в области дефекта через 6 недель после имплантации согласно сравнительному примеру 2 и примеру 4 в соответствии с экспериментальным примером 2. Коллаген 2 типа связывается с антителом для подтверждения наличия гиалинового хряща и служит для обнаружения только гиалинового хряща и его экспрессии, показанных коричневым цветом. На фиг. 14 может быть подтверждено, что регенерированная часть в области дефекта отображена коричневым цветом, и можно видеть, что регенерированный хрящ представляет собой не фиброзный хрящ, а гиалиновый хрящ, и происходит регенерация в хондроциты, подходящие для области дефекта. Напротив, в случае фиг. 13, область, дифференцирующаяся в гиалиновый хрящ, не подтверждена.
На основании результатов примеров и сравнительных примеров можно подтвердить, что при имплантации индивидуализированного каркаса для регенерации хряща одновременно со стромально-васкулярной фракцией, полученной из жировой ткани, и порошком гиалинового хряща, как показано в примерах, дифференциация хондроцитов осуществляется эффективно, и, кроме того, улучшаются диффузия и регенерация хондроцитов.