СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ АГРЕГАЦИИ КЛЕТОК КРОВИ
METHOD FOR DETERMINING DEGREE OF BLOOD CELL AGGREGATION

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для оценки изменений агрегатного состояния клеток крови и точной диагностики расстройств микроциркуляции крови при различных заболеваниях и патологических состояниях.
Известен способ определения агрегации эритроцитов на основе оценки скорости оседания эритроцитов (СОЭ). Способ заключается в сравнении уровня свободно осевших клеток, в вертикально установленном капилляре с кровью в течение 2 часов и принудительно осажденных эритроцитов крови путем их центрифугирования в течение 20 минут при 3000 об/мин [1].
Был предложен новый вариант оценки агрегации эритроцитов на основе исследования микроскопической картины оседания эритроцитов в гематокритном капилляре, с регистрацией скорости оседания клеток [2]. Однако круглое сечение капиллярной трубки не позволяет точно сфокусировать изображение клеток или их агрегатов. Кроме того, на скорость оседания эритроцитов и в этом случае существенно сказывается разная вязкость среды (плазмы) и концентрация эритроцитов (их гематокрит). Следовательно, точность определения агрегации эритроцитов этим методом будет заметно ограничена.
Общим существенным недостатком вариантов метода СОЭ для анализа агрегации эритроцитов является то, что скорость оседания клеток сильно зависит от плотности среды (вязкости плазмы) и от концентрации клеток (гематокрита), и в меньшей степени от объединения клеток в комплексы-агрегаты. Вследствие чего точность и достоверность метода вызывает сомнение.
Также известен способ измерения степени агрегации эритроцитов на основе оценки светопропускания через пробу цельной крови или суспензии эритроцитов в агрегирующей среде [3]. Способ основан на измерении интенсивности светопропускания в зависимости от агрегатного состояния крови. Интенсивная агрегация в образце крови характеризуется более высокой интенсивностью прохождения света через образец крови и наоборот.
Фотометрический метод является наиболее распространенным для исследования агрегационных свойств эритроцитов. С помощью этого метода возможна количественная оценка агрегатного состояния крови - размеров и плотности микроагрегатов эритроцитов.
Интенсивность света, прошедшего через слой суспензии эритроцитов, изменяется в соответствии с их агрегатным состоянием, которое характеризуется размерами и плотностью образующихся агрегатов. Возможности измерения прозрачности крови практически ограничены слоями толщиной 2-3 мм. Так как исследуемая проба крови представляет собой суспензию взвешенных эритроцитов, то на интенсивность прошедшего светового потока будут оказывать большое влияние рассеивающие свойства агрегатов эритроцитов. Кроме этого при измерении в суспензии взвешенных эритроцитов интенсивность прошедшего светового потока зависит не только от размеров и формы эритроцитов, но и от их объемной концентрации и функционального состояния гемоглобина. В связи с этим более широкое применение получили методы исследования суспензии эритроцитов в отраженном световом потоке.
Для изучения агрегации эритроцитов применяют метод «силлектрометрии», сущность которого состоит в уменьшении светорассеивания после прекращения перемешивания в процессе дезагрегации-агрегации клеток [4].
Разновидностью способа оценки агрегации при светопропускании является пьезодинамическая агрегатометрия [5]. В поле зрения микроскопа со встроенным фоторезистором располагается предметное стекло с наклеенным на расстоянии 3 диаметров эритроцита покровным стеклом. На покровном стекле жестко закреплен пьезокристалл, питаемый от звукового генератора. В полость между стеклами вводится проба гепаринизированной цельной крови. По мере увеличения напряжения звукового генератора возрастает мощность колебания верхнего стекла, и агрегаты начинают разрушаться. Соответственно меняются экстинция и сигнал с фоторезистора. По достижении полной дезагрегации и выход кривой, регистрируемой самописцем, на плато, напряжение сбрасывается и регистрируется процесс спонтанной агрегации.
Недостатком способа светопропускания является невозможность дифференцировать истинные агрегаты от простого оптического сближения клеток. Также невозможно корректно определить агрегацию эритроцитов при низких величинах гематокрита (Hct>35%), что снижает степень достоверности полученного результата.
Наиболее близки к заявленному является способ определения агрегации эритроцитов путем прямой микроскопии разбавленной (1:200) суспензии эритроцитов в собственной плазме или декстране [6]. Способ заключается в приготовлении суспензии эритроцитов, помещении ее в счетную камеру Горяева, и под микроскопом подсчитываются отдельно неагрегированные клетки и агрегаты эритроцитов. Рассчитывается индекс агрегации эритроцитов как отношение числа агрегатов к числу неагрегированных эритроцитов.
Основным недостатком способа является то, что при ручном подсчете клеток и агрегатов процесс агрегатообразования в счетной камере продолжается, и их число изменяется в разных местах камеры непредсказуемо, что влечет за собой большие ошибки в определении уровня агрегации в целом. Кроме того, в данном способе увеличение размеров агрегатов существенно скажется на итоговом результате.
Способ очень трудоемок и требует значительных затрат времени и опытного персонала для адекватной обработки микроскопической картины агрегации.
Целью изобретения является повышение производительности и точности определения степени агрегации клеток крови.
Поставленная цель достигается тем, что в способе определения степени агрегации клеток крови получают препарат клеток крови и определяют степень агрегации клеток крови в зависимости от оптических свойств препарата.
1
2
2
1
Новым является то, что производится микросъемка препарата крови в момент времени t вблизи начала агрегации клеток крови и в момент времени t вблизи окончания агрегации клеток крови. Затем распознаются на микроснимках единичные клетки крови, и степень агрегации клеток крови определяется по формуле А=1-N/K, где А - степень агрегации крови, N -количество единичных клеток крови на снимке, полученном в момент времени t, K - количество единичных клеток крови на снимке, полученном в момент времени t.
Способ может быть реализован с помощью устройства, включающего, например, микрокамеру для съемки препарата крови, микроскоп, оборудованный цифровым окуляром и компьютер.
0
1
0
2
1
2
1
2
Реализация способа осуществляется следующим образом. Известным способом приготавливается препарат крови и фиксируется начало момента времени t. Препарат крови помещается на предметный столик микроскопа и в момент времени близкий к началу агрегации крови t, например спустя 60 сек после момента приготовления препарата t, получают цифровой снимок. Затем в момент времени t, близкий к моменту завершения агрегации, например спустя 180 сек после приготовления препарата крови, производят второй снимок. На полученных снимках осуществляют распознавание единичных клеток крови. Распознавание единичных клеток крови наиболее простая задача потому, что форма и размеры единичной клетки известны. Подсчитывается количество единичных клеток на снимках полученных в моменты времени t и t. Очевидно, что из всех единичных клеток крови, зарегистрированных в момент времени t, количество которых обозначим K, к моменту времени t останется не образовавших агрегаты N единичных клеток крови. Поэтому для определения степени агрегации клеток крови предлагается формула
А=1-N/K,
где А - степень агрегации клеток крови,
2
N - количество единичных клеток в момент времени t,
1
K - количество единичных клеток в момент времени t.
1
На фиг.1 представлен микроснимок препарата крови (для определения степени агрегации эритроцитов) в момент времени t.
2
На фиг.2 представлен микроснимок препарата крови (для определения степени агрегации эритроцитов) в момент времени t.
Количество единичных эритроцитов на фиг.1 K=65, количество единичных эритроцитов на фиг.2 N=24. Подставляя значения K и N в формулу, получаем значение степени агрегации клеток крови А.
А=1-24/65=0,63.
Компьютерная обработка полученных микроснимков крови позволяет полностью автоматизировать весь процесс и реализовать его в короткое время.
Преимущество данного метода заключается в повышении точности, оперативности и производительности, за счет сокращения времени анализа, определения степени агрегации клеток крови при компьютерном анализе изображения процесса агрегации.
Литература
1. Dintenfass L., Elevation of plasma viscosity and aggregation of red blood cells in melanoma metastasis // Biorheoloigy. - 1978. - Vol.15. - 99-106.
2. Baskurt O.K. Uyuklu M., Sebahat O., Meiselman H.J. Measurement of red blood cell aggregation in disposable capillary tubes. Clinical Hemorheol. and Microcirculation. - 2011. - Vol.47. - 295-305.
3. Левтов B.A., Левкович Ю.И., Потапова И.В. и др. Об исследовании агрегационных свойств крови // Физиология человека. - 1978. - №3. - С.504-513.
4. Schmid-Schönbein Н., Barcard В., Hilbrand Е. Erythrocyte aggregation: causes, consequences and methods of assesment // Tijdschr. NVKC. - 1990 - Vol.15. - P.88-97.
5. Тухватуллин P.T., Левтов B.A., Шуваева B.H. Агрегация эритроцитов в крови, помещенной в макро- и микрокюветы // Физиол. журнал. - 1986. - Т.72. - №6. - С.775-7784.
6. Селезнев С.А., Вашетина С.М., Музаркевич Г.Е. Комплексная оценка кровообращения в экспериментальной патологии. - Л.: Медицина, 1976. - 207 с.