СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО СОСУДИСТОГО ПРОТЕЗА
METHOD FOR MANUFACTURING BIOLOGICAL VASCULAR PROSTHESIS

Изобретение относится к медицине, а именно к сердечно-сосудистой хирургии. Может быть использовано в отделениях сердечно-сосудистой хирургии.
Вся история и прогресс сосудистой хирургии неразрывно связаны с созданием и совершенствованием сосудистых протезов, применяемых при различных оперативных вмешательствах. О нерешенности проблемы выбора вида протеза при конкретной клинической ситуации говорит огромное количество существующих на данный момент типов трансплантатов и отсутствие четких рекомендаций по их применению. На сегодняшний день вариантом выбора при шунтирующих и протезирующих операциях являются синтетические протезы. Однако существует ряд клинических случаев, когда их применение невозможно.
Биологические сосудистые протезы используются при замещении артерий малого диаметра (от 6 мм и меньше), так как синтетические протезы такого диаметра зачастую подвергаются тромбозу, что приводит к их дисфункции [1].
Другим вариантом использования биологических сосудистых протезов является комплексное хирургическое лечение инфекции ранее установленного синтетического протеза. При этом удаляют старый инфицированный синтетический протез и замещают его биологическим протезом, более устойчивым к инфекционному процессу [2].
В настоящее время существуют следующие варианты биологических сосудистых протезов.
1. Аутографты - сосудистые протезы, изготавливаемые из ткани непосредственно самого реципиента.
2. Аллографты (гомографты) - это протезы, получаемые из ткани представителя того же вида.
3. Ксенографты представляют собой ткани, взятые от представителя другого вида, чаще всего от свиньи или крупного рогатого скота [1].
Известен способ изготовления биологического протеза методом дубления биологических тканей глутаровым альдегидом. Методика впервые была предложена в 1969 году A. Carpentier. В дальнейшем способ получил большое распространение и неоднократно модифицировался. В различных вариантах применялась разная концентрация глутарового альдегида (от 0,25% до 0,625% и более) при низком (2-4 мм рт.ст.) или нулевом давлении [3]. Недостатками предложенного способа является невозможность длительного хранения, коллагеновая денатурация протезов, повышенная кальцификация графтов и их низкая проходимость в отдаленном периоде, токсичность используемых химических агентов.
Существует способ приготовления биологического протеза, который включает в себя забор сосудистого комплекса, его препаровку, стерилизацию и введение полученного продукта в среду для хранения. При этом препаровку проводят в 0,9% растворе натрия хлорида (физиологический раствор), а затем вводят в среду для обработки сосудистого комплекса, представляющую собой смесь антибиотиков в физиологическом растворе в концентрации: цефокситин 240 г/л; линкомицина гидрохлорид 120 г/л; полимиксина В сульфат 100 г/л; ванкомицина гидрохлорид 50 г/л; амфотерицина В 25 г/л. Обработку ткани проводят в течение 48 ч при 4°С, после чего полученный продукт помещают в среду для хранения - питательную среду [4]. Недостатками предложенного способа является невозможность длительного хранения, отсутствие надежной консервации и сшивающего эффекта, сохранение высокой антигенной нагрузки на реципиент, повышенная кальцификация графтов.
Описан способ изготовления биологического протеза методом обработки раствором ДМЭМ-Ф12. Технология изготовления включает в себя изъятие из трупа участка магистральных сосудов. Затем полученный препарат подвергается обработке средой, представляющей собой водный раствор, содержащий 0,05-0,5% гентамицина сульфата, 8,0-12,0% дифлюкана и 0,1-0,5% компонентов фосфатного буферного раствора в течение 30 минут. Затем на стадии препаровки протез обрабатывается в среде с рН 7,0-7,4, представляющей собой раствор ДМЭМ-Ф12, содержащий 3,0-7,0% дифлюкана, 0,05-0,1% гентамицина сульфата, 1,5-3,0% цефалоспорина, 0,1-0,3% метрогила и 0,3-0,5%. компонентов фосфатного буферного раствора. Протез хранится в среде, представляющей собой раствор ДМЭМ-Ф12, содержащий 8,0-12,0% дифлюкана, 0,05-0,15% гентамицина сульфата и 0,1-0,5% компонентов фосфатного буферного раствора [5]. Недостатками предложенного способа является невозможность длительного хранения, отсутствие надежной консервации и сшивающего эффекта, сохранение высокой антигенной нагрузки на реципиент, повышенная кальцификация графтов.
За прототип предлагаемого способа был взят способ изготовления биологического протеза методом обработки биологических тканей эпоксисоединениями. Методика разработана в 1987-1989 годах японскими учеными (Nojri et al., Muruyama Y et al., Noishiki Y et al.). Данный способ претерпел различные модификации. В качестве основного химического агента использовались полиглицидиловый эфир глицерола, полиглицидиловый эфир полиглицерола, полиэтиленгликоль, диглицидиловый эфир этиленгликоля. Применяемые концентрации растворов 2-5%. Время изготовления - 15-20 суток при температуре 20-25°С и рН 7,4 [6]. Недостатками предложенного метода является невозможность длительного хранения, выраженная цитотоксичность, короткий антибактериальный эффект.
Целью изобретения является внедрение в клиническую практику способа изготовления биологического сосудистого протеза, который был бы герметичным, атромбогенным, стерильным, нетоксичным, иммунологически инертным к окружающим тканям, имел бы высокую прочность и длительный срок функционирования и хранения.
Предложенный способ реализуется следующим образом.
Этап 1. Забор аутопсийного материала. Проводят с помощью хирургического инструментария в течение 4-24 часов после летального исхода (рисунок 1). Забирают участок нативного сосуда.
3
Этап 2. Препаровка материала. Выполняют с помощью хирургического инструментария с удалением соединительной ткани (рисунок 2). После проведенных манипуляций препарат отмывают от сгустков крови и помещают в 1% раствор формальдегида, в пластиковую тару объемом 500 см.
3
Этап 3. Антимикробная обработка протеза. Реализуют в 1% растворе формальдегида, в герметичной таре объемом 3000 см при температуре +20°С и отсутствии прямого воздействия солнечных лучей в течение 7 дней. По истечению срока протез извлекают из раствора формальдегида и отмывают физиологическим раствором.
3
Этап 4. Децеллюляризация протеза. Проводят в растворе гексана чистого для анализа, в герметичной таре объемом 3000 см и морозильной установке размерами 50x50 см при температуре -18°С в течение 14 дней. Во время данного периода из тары периодически удаляют излишки воды. По истечению срока протез извлекают из раствора и отмывают физиологическим раствором.
Этап 5. Хранение. Полученный в результате предыдущих этапов биологический протез (рисунок 3) помещается в раствор гексана чистого для анализа, где происходит его дальнейшее хранение.
Для оценки свойств полученного биологического сосудистого протеза был проведен ряд экспериментальных исследований.
3
Физические свойства протеза были изучены на универсальной испытательной машине согласно ГОСТ. Эластичность протеза колебалась в пределах 0,7-0,9 МПа. Плотность составила 1060 кг/м. Растяжимость оценивалась до момента разрыва экспериментального образца. Получены значения в диапазоне от 1,1-1,9 МПа, подтверждающие удовлетворительные прочностные характеристики протеза.
Далее была проведена электронная микроскопия экспериментальных образцов. Исследование проводилось на растровом электронном микроскопе «Supra-25» («Carl Zeiss», Германия). На полученных микрофотографиях отмечается дифференцировка всех слоев сосудистой стенки биологического протеза, отсутствие повреждений внутренней оболочки, а также сохранность структурной организации эластических волокон (рисунок 4).
Следующим этапом выполнялось гистологическое исследование протеза. Препараты окрашивались с использованием гематоксилина и эозина, гематоксилина и пикрофуксина по методу Ван-Гизона. На микропрепарате сосуда до обработки отмечается нормальная клеточная структура стенки, дифференцируемость слоев, сохранность соединительнотканного каркаса (рисунок 5). На микропрепарате биологического сосудистого протеза наблюдается эффект децеллюляризации - отсутствие клеточных ядер и цитоплазмы. Однако при этом остаются полностью сохранными эластические волокна (рисунок 6).
-1
Децеллюляризация - удаление из препарата клеточного содержимого -является важным показателем иммунологической инертности биологического сосудистого протеза. Эффект децеллюляризации оценивали методом спектроскопии комбинационного рассеяния. Исследование проводилось на лабораторной установке, которая включала в себя диодный лазер (LML-785.0RB-04), оптический рамановский модуль (PBL 785), спектрограф (Sharmrock SR-303i) со встроенной цифровой камерой (ANDOR DV-420A-OE) и компьютер. Анализ спектров комбинационного рассеяния позволил установить, что для биологического протеза интенсивность пика 1337 см (деформация белков и нуклеиновых кислот) ниже по сравнению с сосудами до химической обработки (рисунок 7). Следовательно, в результате обработки в протезе снижается количество молекул ДНК, что приводит к уменьшению его иммунологической реактивности.
Длительность хранения протеза без признаков изменения структуры, цвета и консистенции составила на момент исследования 36 месяцев.
Далее проведено изучение характеристик протезов после их имплантации в живой организм. Исследование проводилось на 6 половозрелых крысах породы Wistar. Распределение по половому признаку: 4 особи мужского пола и 2 - женского. Средняя масса составила 355±84,02 гр.
Для выполнения оперативных вмешательств проводилась инъекционная общая анестезия. Использовались препараты «Золетил» (Тилетамина гидрохлорид + Золазепам) в дозировке 15 мг/кг и «Рометар» (Ксилазина гидрохлорид) в дозировке 15 мг/кг. Инъекции выполнялись подкожно в зону холки. Оперативные вмешательства проводились в стерильной операционной. После обработки операционного поля 70% спиртовым раствором хлоргексидина выполнялся разрез в шейно-затылочной области крысы и тупым способом формировался подкожный карман. В полученный карман имплантировался участок биологического сосудистого протеза.
Наблюдение за крысами включало в себя ежедневный осмотр кожных швов, измерение температуры, измерение массы тела.
Выведение из эксперимента осуществлялось по следующей схеме. Введение в общий наркоз введением «Золетила» подкожно из расчета 15 мг/кг. После достижения эффекта выполнялся прямой забор артериальной крови из левого желудочка сердца. Затем интракардиально вводился «Золетил» в объеме 2 мл. После наступления смерти животного выполнялся забор имплантированного протеза с окружающими тканями, окружающих лимфатических узлов, селезенки, печени, сердца. Артериальная кровь анализировалась на гематологическом аппарате «Mindray» (Китай). Оценивались показатели общего анализа крови.
Результаты наблюдения представлены в таблице 1.
Во всех группах отсутствовали воспалительные изменения (гиперемия, отек) послеоперационных ран. Все животные набрали в весе. Все швы заживали первичным натяжением. Данные результаты подтверждают иммунологическую инертность и стерильность биологического протеза.
При гистологическом исследовании воспалительные явления вокруг протеза отсутствуют, сформирована рубцовая ткань (рисунок 8). Сохраняется незначительная лейкоцитарная инфильтрация протеза (рисунок 9). Регионарные лимфатические узлы без признаков активации фолликулярного и паракортикального роста. При анализе препаратов селезенки, печени и сердца какой-либо патологии обнаружено не было. Сохранена нормальная структура селезенки без фолликулярной гиперплазии. Признаков токсической дистрофии гепатоцитов не выявлено. Миокард без лейкоцитарной инфильтрации, сохранена исчерченность миокардиоцитов. Данные результаты подтверждают отсутствие локального и системного токсического воздействия биологического протеза на организм.
Далее проведено изучение характеристик биологического сосудистого протеза после его имплантации в живой организм в остром эксперименте. Исследование проводилось на 2 половозрелых кроликах. Распределение по половому признаку: 1 особь мужского пола и 1 - женского. Средняя масса составила 4000 гр.
Для выполнения оперативных вмешательств проводилась комбинированная анестезия. Использовались препараты «Кетамин» для ввода в анестезию и «Пропофол» для поддержания анестезии. Инъекция кетамина выполнялась внутримышечно. Пропофол вводился внутривенно перфузором с постоянной скоростью через предварительно установленный венозный катетер.
Оперативные вмешательства проводились в стерильной операционной. После обработки операционного поля 70%-ным спиртовым раствором хлоргексидина выполнялась лапаротомия. Затем тупым и острым способом выделялся брюшной отдел аорты. После внутривенного введения гепарина выполнялось пережатие сосуда. Резецировался участок аорты и проводилось линейное протезирование удаленного сегмента биологическим протезом полипропиленовой нитью 8/0. После пуска кровотока анализировалось состояние швов, герметичность протеза, его проходимость, наличие стеноза проксимального и дистального анастомозов. Состояние швов, герметичность оценивали визуально. Проходимость протеза признавали удовлетворительной при отчетливой пульсации на бедренных артериях. Стеноз в области сформированного анастомоза фиксировали при наличии систолического дрожания в дистальной части аорты. Оценка функционирования протеза проводилась в течение 30 минут. Затем внутривенно вводилось 4 мл пропофола и достигалась биологическая смерть животного. Выполнялась резекция протеза, его рассечение и оценка тромбогенности.
У всех животных после пуска кровотока протез был полностью герметичным, не требующим дополнительного прошивания (рисунок 10).
Остальные характеристики биополимерного протеза представлены в таблице.
Преимуществами предложенного способа являются.
1. Герметичность - подтверждена отсутствием кровотечения из протеза и в области анастомозов в остром эксперименте.
2. Атромбогенность - подтверждена отсутствием тромбов в просвете протеза в остром эксперименте.
3. Стерильность - подтверждена на животных в хроническом эксперименте.
4. Отсутствие токсичности - подтверждено отсутствием как локальной, так и системной токсичности на животных в хроническом эксперименте.
5. Биологическая инертность - подтверждена с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, гистологическим методом и в хроническом эксперименте на животных.
6. Высокая прочность - подтверждена на этапе исследования физических свойств и прочностных характеристик.
7. Длительный срок хранения - на момент проведенных исследований протез сохранял свои свойства на протяжении 36 месяцев.
Предложенный способ и признаки, отличающие его от известных методик, в медицинской и патентной литературе не обнаружены.
Источники информации
1. Ивченко А.О., Шведов А.Н., Ивченко О.А. Сосудистые протезы, используемые при реконструктивных операциях на магистральных артериях нижних конечностей. Бюллетень сибирской медицины. 2017; 16 (1): 132-139.
2. Khaladj N., Pichlmaier U., Stachmann A., Peterss S., Reichelt A., Hagl C. et al. Cryopreserved human allografts (homografts) for the management of graft infections in the ascend-ing aortic position extending to the arch. Eur J Cardiothorac Surg. 2013;43:1170-1175.
3. Малиновский H.H., Константинов Б.А., Дземешкевич С.Л. Биологические протезы клапанов сердца. - М.: Медицина, 1988.
4. Hoprins R.A. Cardiac Reconstructions with Allograft Valves. - Springer-Verlag, 1990. - p. 44-46.
5. Гомографт сердечно-сосудистой системы (варианты), способ получения гомографта, среда для воздействия на ткани гомографта (варианты): пат. 2525197 Рос. Федерация / Болсуновский В.А., Болсуновский А.В. - 2013125373/14; заявл. 28.05.2013; опубл. 10.08.2014, Бюл. № 22.
6. Барбараш Л.С., Криковцов А.С., Журавлева И.Ю. Биологические протезы артерий. - Кемерово: 1996. - 208 с.