АППАРАТ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И МИКРООРГАНИЗМОВ

Полезная модель относится к оборудованию для осуществления процессов выращивания клеток ткани животных или культивирования микроорганизмов в питательных пленках, а также процессов глубинного культивирования микроорганизмов, чувствительных к механическим воздействиям, возникающим при интенсификации газообмена, и может быть использовано в производстве биомассы микроорганизмов, стволовых клеток или биологически активных веществ.
Известен аппарат для культивирования клеток и микроорганизмов (RU 69518 U1, публ. 27.12.2007 Бюл. № 36), выбранный за прототип. Аппарат содержит две ферментационные емкости с теплообменными рубашками и крышками, патрубки для подачи аэрирующего газа, питательной среды, инокулюма посевной культуры и отвода газовой среды, матриксы, размещенные в полости каждой емкости, трубопровод нижнего слива, соединяющий обе емкости, насос, буферную емкость, шлюзовую камеру, сеть трубопроводов с управляемыми клапанами и прибор управления.
Известный аппарат может эффективно работать только в условиях ферментации малых объемов, когда перемещение рабочей жидкости из одной ферментационной емкости в другую занимает незначительное время и исключает образование застойных зон рабочей жидкости. При масштабировании ферментационного процесса, время на перемещение рабочей жидкости из одной емкости в другую увеличивается пропорционально рабочему объему аппарата, в связи с чем, микроорганизмы все больше пребывают в условиях застоя, что приводит к снижению качества продуктов ферментации и существенному снижению производительности аппарата. Для сохранения оптимальных условий аэрации и перемешивания рабочей жидкости, можно повышать давление и расход аэрирующего воздуха, однако при этом существенно повышаются гидродинамические нагрузки на морфологическую структуру микроорганизмов и клеток, что приведет к невозможности применения аппарата с продуцентами, чувствительными к механическим воздействиям.
Обмен рабочей жидкости между емкостями осуществляют посредством трубопровода нижнего слива, подключенного к патрубкам, расположенным на крышках, закрепленных на консоли корпуса каждой из емкостей, что способствует образованию расслоения и застойных зон рабочей жидкости снижающих качество управления ферментационными процессами. К недостаткам, можно также отнести точечный ввод в емкости аэрирующих газов, что приводит к недостаточной и неравномерной аэрации рабочей жидкости в ферментационных емкостях, и тем самым снижает производительность аппарата.
Кроме того, конструкция известного аппарата не содержит системы контроля условий реализации ферментационных процессов, что существенно снижает качество продуктов ферментации и производительность аппарата.
Технический результат заключается в исключении застойных зон рабочей жидкости, активизации массообменных процессов и в применении интерактивного управления, что создает оптимальные условия реализации пленочных и глубинных ферментационных процессов больших объемов.
Технический результат достигается тем, что аппарат для культивирования клеток и микроорганизмов, содержит две ферментационные емкости с теплообменными рубашками, крышками для герметизации емкостей и матриксами, размещенные внутри каждой из них, патрубки для ввода в емкости питающих и отвода отработанных газов, трубопровод нижнего слива, патрубок для ввода в емкость посевной культуры или питательных растворов, буферную емкость, соединенную трубопроводами с управляемыми клапанами с патрубками для отвода отработанных газов из ферментационных емкостей, шлюзовую камеру, сообщенную трубопроводами с управляемыми клапанами с патрубками сбора получаемых продуктов и слива, и прибор управления, соединенный с управляемыми клапанами сети трубопроводов, а каждая из ферментационных емкостей снабжена распределительным коллектором рабочей жидкости и аэратором для дисперсионного ввода в емкости питающих газов, закрепленными параллельно каждому из коллекторов, при этом распределительные коллекторы соединены трубопроводом нижнего слива с измерительной ячейкой, снабженной датчиками и включенной в разрыв трубопровода нижнего слива, а аэраторы сообщены трубопроводами с управляющими клапанами через бактериальный фильтр с патрубком подачи питающих газов, а буферная емкость снабжена сетчатым фильтром, подключенным к ее входному патрубку и откачивающим насосом, сообщенным с нижней частью второй ферментационной емкости, причем буферная емкость соединена с бактериальным фильтром отработанных газов, а шлюзовая камера трубопроводами с управляемыми клапанами сообщена с патрубком для загрузки питательного раствора и с нижней полостью второй ферментационной емкости, кроме того, аппарат снабжен асептическими разъемами, один из которых подключен к патрубку для ввода в емкость посевной культуры, а другой, для отбора проб, подключен к нижней полости второй емкости, при этом каждый асептический разъем выполнен в виде узла с управляемыми клапанами, перепускной канал которого снабжен отбойной пластиной и легкосъемной заглушкой;
а также тем, что сетчатый фильтр размещен в полости буферной емкости коаксиально к ее стенкам.
Оснащение каждой из ферментационных емкостей распределительным коллектором, формирующим потоки струй рабочей жидкости, омывающих пленки клеточной ткани или микроорганизмов, закрепленных на расширенной поверхности матриксов, обеспечивает идеальное перемешивание, насыщение пленки кислородом и отвод метаболитных газов, транспорт и замещение питательных веществ рабочей жидкости в указанных пленках, что позволяет создать оптимальные условия реализации пленочных ферментационных процессов и, как следствие, существенно повысить качество продуктов ферментации и производительность аппарата.
Оснащение каждой из ферментационных емкостей аэратором, формирующим мелкодисперсную фракцию питающих газов в объеме рабочей жидкости в период ее протока из емкости в емкость, исключает образование застойных (не аэрируемых) зон рабочей жидкости, что способствует оптимизации условий реализации глубинных ферментационных процессов.
2
Применение измерительной ячейки для размещения датчиков T°C; pH; pO обеспечивает интерактивный контроль за состоянием ферментационных процессов, что повышает эффективность управления. Ячейка включена в разрыв трубопровода нижнего слива таким образом, что проток через нее рабочей жидкости перемешивается с периодически обновляемым объемом питающих газов, что позволяет интенсифицировать перемешивание рабочей жидкости и обеспечить защиту датчиков от налипания биомассы.
Указанные отличия позволяют масштабировать аппарат, существенно повысить производительность, управляемость и качество получаемых продуктов.
На фиг.1 представлена структурная схема аппарата для культивирования клеток и микроорганизмов.
На фиг.2 представлен асептический разъем в разрезе, для ввода в ферментационную емкость посевной культуры или питающих растворов.
На фиг.3 представлен асептический разъем в разрезе, для отбора проб рабочей жидкости.
2
Аппарата для культивирования клеток и микроорганизмов содержит ферментационные емкости 1 и 2, с крышками для герметизации емкостей 3 и 4 и теплообменными рубашками 5 и 6; матриксы 7 и 8, размещенные внутри емкостей; распределительные коллекторы 9 и 10 рабочей жидкости и аэраторы 11 и 12 для дисперсионного ввода в емкости питающих газов, закрепленные параллельно соответствующему коллектору внутри емкостей 1 и 2 соответственно; трубопровод 13 нижнего слива, соединяющий распределительные коллекторы 9 и 10 с измерительной ячейкой 14, в которой концы трубопровода 13 расположены на одном уровне 15; датчики 16, например, датчики T°C; pH; pO, установленные в ячейке 14; асептический разъем 17 с заглушкой 18, для ввода в ферментационную емкость 1 посевной культуры или питающих растворов; асептический разъем 19 с заглушкой 20, для отбора проб рабочей жидкости; буферную емкость 21 с коаксиально размещенным в ней сетчатым фильтр 22, подключенным к ее входному патрубку и соединенную с откачивающим насосом 23; бактериальный фильтр 24 питающих газов; бактериальный фильтр 25 отработанных газов; шлюзовую камеру 26; патрубки 27 и 28 для подключения разъемов 17 и 19 соответственно; патрубки 29 и 30 для подключения бактериальных фильтров; патрубок 31 для подключения источника питающих газов, патрубки 32; 33 и 34 для подключения источника водяного пара, патрубок 35 для подключения источника питательного раствора, патрубок 36 для сбора продуктов ферментации, сеть трубопроводов с управляемыми клапанами 37-59, прибор 60 управления, соединенный управляющей шиной с управляемыми клапанами (далее но тексту клапан) и насосом.
Асептический разъем 17 с заглушкой 18, для ввода в ферментационную емкость посевной культуры или питающих растворов, включающий клапан 37 для ввода пара, клапан 38 для отвода пара, клапан 39 перепускного канала и отбойную пластину 61 (фиг.2) соединен через клапан 37 с патрубком 33 и через клапан 39 с патрубком 27 ферментационной емкости 1.
Асептический разъем 19 с заглушкой 20, для отбора проб рабочей жидкости, включает клапан 50, соединенный с патрубком 32 для ввода пара, клапан 49 для отвода пара, клапан 48 перепускного канала, соединенный с патрубком 28 ферментационной емкости 2 и отбойную пластину 62 (фиг.3).
К патрубку 29 буферной емкости 21 подключены бактериальный фильтр 25 для отвода отработанных газов и клапан 40 сообщенный с патрубком 33 подачи пара.
Входной патрубок буферной емкости 21 через клапаны 42 и 44 сообщен, соответственно с ферментационными емкостями 1 и 2 в верхней их части.
Выход откачивающего насоса 23 сообщен с ферментационной емкости 2 через патрубок, установленный в нижней ее части и с клапаном 56.
Аэраторы 11 и 12 через клапаны 45 и 46, соответственно, бактериальный фильтр 24 и клапан 52 сообщены с патрубком 31 для подключения источника питающих газов.
Шлюзовая камера 26 соединена через клапан 59 с патрубком для подключения источника питательного раствора и с коллектором, снабженным клапаном 56 для отбора продукта из ферментационной емкости 2, клапаном 57, сообщенного с патрубком 36 и клапаном 58, для отвода жидкости и пара в канализацию. Она также сообщена через клапан 55 с патрубком 32, подачи пара и через клапан 53 с патрубком 30, для подключения бактериального фильтра и клапаном 51, другой конец которого тоже сообщен с патрубком 32.
Патрубки 32 и 34 через клапаны, 43 и 47 соединены, соответственно, с теплообменными рубашками 5 и 6.
Аппарат работает следующим образом.
Работу начинают со стерилизации аппарата. Управляемые клапаны в исходном положении закрыты, заглушки 18 и 20 установлены. После включения на приборе 60 управления программы «Стерилизация», клапаны 37; 39; 40; 42; 44; 45; 46; 51; 56; 58 открываются, насос 21 включается. Насыщенный водяной пар с заданными температурой и давлением по сети трубопроводов с открытыми клапанами поступает в емкости 1, 2, буферную емкость 21, ячейку 14 и бактериальные фильтры 24; 25 и отводится в канализационный слив через клапаны 56; 58. Паровая обработка выдерживается заданное время, после чего клапаны 56; 58 закрываются и открываются клапаны 41 и 54. Такое состояние клапанов, обеспечивает промывку паром фильтрующих элементов бактериальных фильтров 24 и 25 в течение времени, заданного на приборе 60. Затем клапаны 41; 54 закрываются и открываются клапаны 53; 55; 58. Пар протекает через камеру 26, вытесняет из нее воздух, промывает паром и образующийся конденсат отводится в канализационный слив через клапан 58. После истечения заданного времени клапаны 50; 56 открываются и конденсат, образующийся в емкости 2, отводится в канализационный слив через клапаны 56 и 58. Время операции задается на приборе 60. После истечения заданного времени клапан 58 закрывается.
Аппарат герметизируется и выдерживается в таком состоянии заданное время, после чего клапаны 41; 54; 56; 58 открываются и конденсат, накопившийся в аппарате, отводится в канализационный слив. Клапаны и насос принимают исходное положение, завершается первый цикл стерилизации аппарата.
Программа «Стерилизация» позволяет производить заданное число циклов стерилизации с временной паузой между циклами.
Затем проводится термостатирование рабочей жидкости в аппарате, которое осуществляется протоком пара заданной температуры через открытые клапаны 43; 47, теплообменные рубашки 5; 6 ферментационных емкостей 1 и 2.
2
Состояние ферментационных процессов отслеживается прибором 60 посредством датчиков 16 (Т°C; pH; pO), размещенных в ячейке 14 и управляемых клапанов 37-59.
После выполнения известных процедур подключения аппарата к внешним источникам питания, стерилизации, заполнения рабочей жидкостью, термостатирования ферментационных емкостей и размещения датчиков 10 в ячейке 9, на приборе 60 управления ферментационными процессами применяют одну из рабочих программ: «Периодическая ферментация» или «Отъемно-доливная ферментация».
При выполнении программы «Периодическая ферментация» проводят процедуру «Проток 1», при этом клапаны 52; 46; 42; 41 открываются и от источника питающих газов, в аэратор 12, через патрубок 31, клапан 52, бактериальный фильтр 24, патрубок 30 и клапан 46 поступает газ заданного давления. Из аэратора 12, газ вытесняется в рабочую жидкость емкости 2 в виде мелкодисперсной фракции равномерно распределенной по всей длине емкости 2, обеспечивая идеальное перемешивание газа с жидкостью. После прохождения газа через рабочую жидкость в газовой полости емкости 2 повышается давление газа, под действием которого рабочая жидкость из емкости 2 вытесняется в емкость 1 по коллектору 10, трубопроводу 13, через ячейку 14 и коллектор 9. Воздух, находящийся в емкости 1, отводится в атмосферу через клапан 42, сетчатый фильтр 22, буферную емкость 21, патрубок 29, бактериальный фильтр 25 отработанных газов и клапан 41.
В процессе прохождения рабочей жидкости через разрыв трубопровода 13 на уровне 15, в ячейке 14 остается объем периодически замещаемой и перемешиваемой рабочей жидкости, обеспечивающей непрерывную работу датчиков 16, осуществляющих измерение рабочих показателей ферментационного процесса.
После вытеснения рабочей жидкости из емкости 2 в емкость 1, на всей поверхности матрикса 8 остается жидкостная пленка, включающая клетки микроорганизмов и питательного раствора. Созданная пленка находится под действием питающих газов, что создает идеальные условия для культивирования тканевых клеток или микроорганизмов. В емкость 1, после полного вытеснения рабочей жидкости из емкости 2, поступает питающий газ, который на выходе из коллектора 9 превращается в мелкодисперсную фракцию газа, аэрирующего и перемешивающего рабочую жидкость в емкости 1 по всему объему. В процессе аэрации и роста микроорганизмов рабочая жидкость может образовывать пену, которая при прохождении через сетчатый фильтр 22 уплотняется и откачивается посредством насоса 23 в емкость 2.
В результате проведения указанной процедуры в емкости 2 реализуется «пленочный» ферментационный процесс, а в емкости 1 - «глубинный» ферментационный процесс. Так как пленочные процессы, в сравнении с глубинными процессами, протекают существенно активней, время процессов определяют и задают программой «Периодическая ферментация» по качественным показателям пленочного процесса.
По истечении времени процедуры «Проток 1», выполняют процедуру «Проток 2».
При выполнении процедуры «Проток 2» клапаны 46 и 42 закрывают, а клапаны 45 и 44 открывают и от источника питающих газов, в аэратор 11, через патрубок 31, клапан 52, бактериальный фильтр 24, патрубок 30 и клапан 45 поступает газ заданного давления. Из аэратора 11, газ вытесняется в рабочую жидкость емкости 1 в виде мелкодисперсной фракции равномерно распределенной по всей длине емкости 1, обеспечивая идеальное перемешивание газа с жидкостью. После прохождения газа через рабочую жидкость в газовой полости емкости 1 повышается давление газа, под действием которого рабочая жидкость из емкости 1 вытесняется в емкость 2 по коллектору 9, трубопроводу 13, через ячейку 14 и коллектор 10. Воздух, находящийся в емкости 2, отводится в атмосферу через клапан 44, сетчатый фильтр 22, буферную емкость 21, патрубок 29, бактериальный фильтр 25 отработанных газов и клапан 41.
В процессе прохождения рабочей жидкости через ячейку 14 происходит замещение объема и перемешивание рабочей жидкости, обеспечивающей непрерывную работу датчиков 16.
После вытеснения рабочей жидкости из емкости 1 в емкость 2, на всей поверхности матрикса 7 остается жидкостная пленка, включающая клетки микроорганизмов и питательного раствора. Созданная пленка находится под действием питающих газов, что создает идеальные условия для культивирования тканевых клеток или микроорганизмов.
В емкость 2, после полного вытеснения рабочей жидкости из емкости 1, поступает питающий газ, который на выходе из коллектора 10 превращается в мелкодисперсную фракцию газа, аэрирующего и перемешивающего рабочую жидкость в емкости 2 по всему объему. В процессе аэрации и роста микроорганизмов рабочая жидкость может образовывать пену, которая при прохождении через сетчатый фильтр 22 уплотняется и откачивается посредством насоса 23 в емкость 2. В результате реализации указанной процедуры в емкости 1 реализуется «пленочный» ферментационный процесс, а в емкости 2 - «глубинный» ферментационный процесс. По истечении заданного времени клапаны 45 и 44 закрываются, а клапаны 46 и 42 - открываются. Рабочая жидкость вновь перетекает из емкости 2 в емкость 1.
Процесс реверсивного протока рабочей жидкости продолжается непрерывно до остановки ферментационного процесса. Управляемые клапаны при остановке ферментационного процесса принимают исходное положение, после чего на приборе 60 применяют процедуру «Слив продуктов ферментации».
Процедура «Слив продуктов ферментации» проводится следующим образом, клапаны 52; 45; 56; 57 открываются, продукты ферментации из емкости 2, через клапаны 56; 57 и патрубок 34 сливают в приемную емкость. После полного опорожнения емкости 2, клапаны принимают исходное положение.
Выполнение программы «Отъемно-доливная ферментация».
«Отъемно-доливная ферментация» является продолжением «Периодической ферментации» и реализуется следующим образом. К патрубку 35 подключают емкость со стерильным питательным раствором, а к патрубку 36 - приемная емкость. Затем в соответствии с программой прибора управления 60 «Слив-Долив» открываются клапаны 55 и 58. Водяной пар, через патрубок 32 и клапан 55 поступает в шлюзовую камеру 26 и через клапан 58 отводится в канализационный слив. Процедура продолжается заданное время, за которое камера 26 промывается и стерилизуется воздействием насыщенного водяного пара, после чего клапаны 55; 58 закрываются. Камера 26 выдерживается в закрытом положении время, достаточное для ее охлаждения и создания в ней пониженного атмосферного давления за счет конденсации пара, после чего клапан 56 открывается. Жидкие продукты ферментации из емкости 2 и клапан 56 перетекают в камеру 26 до полного ее заполнения, затем клапан 56 закрывается, и открываются клапаны 53 и 57. В камеру 26, через клапан 53 поступают газы, и находящиеся в камере продукты ферментации сливаются через клапан 57 и патрубок 36 в приемную емкость, затем клапаны 53 и 57 закрываются, а клапаны 55 и 58 открываются. Камера 26 вновь промывается и стерилизуется насыщенным водяным паром заданное время, после чего клапаны 55 и 58 закрываются. Камера 26 выдерживается в закрытом положении заданное время, достаточное для охлаждения камеры 26 и создания в ней пониженного атмосферного давления за счет конденсации пара, после чего открывается клапан 59 и стерильный питательный раствор, через патрубок 35 и клапан 59 заполняет камеру 26. Затем клапаны 59; 45 и 46 закрываются и открываются клапаны 53 и 56.
В камеру 26, через клапан 53 поступают газы, а питательный раствор из камеры 26 вытесняется в емкость 2 через клапан 56. Затем клапаны 53 и 56 закрываются, а клапаны 45; 46; 55; 58 открываются. Камера 26 вновь промывается и стерилизуется насыщенным водяным паром заданное время, после чего клапаны 55 и 58 закрываются. Камера 26 охлаждается и выдерживается в таком положении заданное время, до реализации очередного цикла программы «Слив-Долив».
Продолжительность программы «Отъемно-доливная ферментация» задается необходимым временем, после чего выполняется описанная выше процедура «Слив продуктов ферментации».
Асептический разъем 17 (фиг.2) подключен к емкости 1 через патрубок 27 и предназначен для ввода в емкость 1 посевной культуры клеток, микроорганизмов или корректирующих растворов. Перед началом работы надо с разъема 17 снимают заглушку 18 и на ее место подключают шланг от емкости с исследуемой жидкостью, конец которого герметизируют, например, пружинным зажимом. На приборе 60 управления применить процедуру «Титрант». При этом клапаны 37 и 38 открываются и насыщенный водяной пар, через патрубок 33 и клапан 37 поступает в перепускной канал разъема 17 и, упираясь в отбойную пластину 61, растекается в сторону подключения клапана 39 и сторону подключения шланга емкости с посевной культурой. После протока пара вокруг пластины 61 отработанный пар через клапан 38 отводится в канализационный слив. Время протока пара через разъем 17 задается процедурой «Титрант». После истечения времени стерилизации разъема 17 клапаны 38; 37 закрываются, а клапан 39 открывается. На шланге емкости с исследуемой жидкостью открывают зажим и в емкость 1 вносят объем посевной культуры, затем зажим закрывают, а на приборе 60 управления, повторно применяют процедуру «Титрант». После ее выполнения клапаны 37 и 38 закрывают.
Асептический разъем (фиг.3) 19 подключен к емкости 2 через патрубок 28 и предназначен для стерильного отбора проб продуктов ферментации из емкости 2 при сохранении стерильности процесса для этого перед началом работы с разъема 19 снимают заглушку 20 и на ее место подключают пробоприемник (колба с перепускным шлангом, конец которого закрыт зажимом). Пробоприемник предварительно стерилизуется в автоклаве. На приборе 60 управления применяют процедуру «Проба», при этом клапаны 49 и 50 открываются. Насыщенный водяной пар, через патрубок 32 и клапан 50 поступает в перепускной канал разъема 19 и, упираясь в отбойную пластину 62, растекается в сторону подключения клапана 48 и сторону зажима шланга пробоприемника. После протока пара вокруг пластины 62 отработанный пар через клапан 49 отводится в канализационный слив. Время протока пара через разъем 19 задается процедурой «Проба».
После истечения заданного времени стерилизации перепускного канала с отбойной пластиной 62 клапаны 49 и 50 закрываются.
Выполняется ручная операция по открытию зажима на перепускном шланге пробоприемника. Затем, на приборе 60 управления, повторно применяют процедуру «Проба». Клапан 48 - открывается короткими импульсами, число и продолжительность которых задается процедурой «Проба», затем пробоприемник с рабочей жидкостью отсоединяют от разъема, а перепускной канал разъема 19 закрывают заглушкой 20.