Ферментативная и микробиологическая активность загрязненных нефтью глееподзо-листых почв на разных стадиях их восстановления

УДК 579 ББК 28.4

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ ГЛЕЕПОДЗОЛИСТЫХ ПОЧВ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ИХ ВОССТАНОВЛЕНИЯ Киреева Н.А., Маркарова М.Ю., Щеме, пишна Т.Н., Рафикова Г. Ф.

Показано влияние нефтяного загрязнения на общую численность функциональных групп микроорганизмов, видовую структуру микромицетов и ферментативную активность глееподзолистых почв.

К числу наиболее масштабных источников загрязнения различных экосистем относятся добыча, транспортировка и переработка нефти. Ферментативную активность наряду с дыханием почвы, почвенной биомассой и микробиологической активностью предлагается использовать как показатель мониторинга эволюции биологической активности почв и процессов минерализации нефти, техногенного засоления. Биодиагностика загрязненности почв, основанная на определении ферментативной активности, позволяет выявить загрязнения на самых ранних стадиях.

Одним из основных компонентов почвенных экосистем являются микроскопические грибы. В почвах грибы участвуют в важнейших почвообразующих процессах, в первую очередь в деструкции органических веществ, а также в разнообразных процессах биогеохимической трансформации минеральных элементов. Вместе с тем, почвенные микромицеты представляют собой группу микроорганизмов, универсальную по своему значению для формирования плодородия почвы [1].

Целью нашего исследования явилось изучение ферментативной и микробиологической активности и возможности их использования как индикаторов биодеградации нефти в почве в северном регионе.

В качестве объектов исследования были рассмотрены опытные и производственные участки загрязненные нефтью в районе Верхевозейского

месторождения Усинского района Республики Коми.

К окислительно-восстановительным ферментам, участвующим в процессах окисления нефти относится каталаза. Повышение и снижение ката-лазной активности после нефтяных загрязнений связано с рядом факторов, наиболее существенными из которых являются доза загрязнения, состав нефти, буферная емкость почв, длительность нефтяного воздействия. Усиление активности каталазы характеризует стабилизацию почвенных условий. В результатах, полученных в нашем исследовании, наблюдается четкая корреляция между каталазной активностью и содержанием остаточной нефти в пострекультивированных почвах (рис.1). Каталаз-ная активность приближается к фоновым значениям на участках, где массовая доля остаточной нефти тоже приближается к фоновым значениям.

Нефтяное загрязнение ингибирует дегидроге-назную активность. Почвенные дегидрогеназы ингибируются в наибольшей степени не самими углеводородами, а продуктами их деградации, которые могут аккумулироваться в почве и длительное время оказывать токсическое влияние, несмотря на снижение в почве содержания углеводородов [2]. Из рисунка 2 видно, что спустя 10 лет после рекультивации загрязненных почв показатели дегидрогеназ-ной активности ниже фоновых.

с -о

5 В

К •'у

і * °

і 8 *

Ё “ §

ТО 5 2

£ 2

си V"

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0 4-1 фон 0-5см

оп. 1995 контроль 5-10 см

і і каталазная активность, мл КМпО4/1 г почвы за 20 минут

—♦—массовая доля нефти

Рис.1. Зависимость величины каталазной активности фоновых и рекультивированных

почв от содержания углеводородов

I 2

П

то а X н

о о

л ° £ 1 & “ 3 5

О (О

0 то

У

яз ^

1 сч 3 то

2 « то _

2 .0

ш

° % & £

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

600

500

400

300

200

100

0

&

о

X

к

]дегидрогеназная активность —♦—массовая доля нефти

Рис.2. Дегидрогеназная активность загрязненных, рекультивированных и фоновых почв

Дегидрогеназная активность на почвах рекультивированных позже, в 2000 году, несколько выше, чем дегидрогеназная активность на почвах после рекультивации, проведенной в 1995 и 1997 годах (рис.3). Повышение дегидрогеназной актив-

ности связано с усилением процессов жизнедеятельности почвенных микроорганизмов и наличием субстратов (углеводородов), индуцирующих активность данного фермента.

СО <& .0 I н ф о •- о

о I

^ оо

Ч 5

Ф СЗ

СТ

I- ^

О

О ТО Т

а ^ X сч

со ^ га м 2 3

^ оо

о з-&

1

0,8

0,6

0,4

0,2

0

И

200

150

100

50

0

фон 0-5см 0 оп.2000

праваячасть левая часть 5-15 см 5-15 см

&

ф

I I дегидрогеназная активность —ф— массовая доля нефти

Рис.3. Зависимость величины дегидрогеназной активности от содержания углеводородов

Липазная активность - еще один показатель, который можно использовать в качестве индикатора нефтяного загрязнения исследуемых почв. Липазы - это ферменты, которые ответственны за расщепление масел и жиров перед усвоением их микроорганизмами. Процессы окисления нефтяных углеводородов происходят по пути образования жирных кислот. Вполне логично было предположить, что показатели липазной активности могут более информативно, чем другие виды ферментативной активности характеризовать интенсивность окислительно-восстановительных процессов при

деструкции нефтяных углеводородов. И после нефтяного загрязнения, и после ее рекультивации в почве наблюдается высокий уровень липазной активности, значительно превышающий таковую для фоновых почв. Это связано в первую очередь с тем, что в почве накапливаются битуминозные вещества в процессе разложения нефти, которые индуцируют активность липазы [3]. В наших исследованиях хорошо прослеживается корреляция между липазой и остаточным содержанием нефти (рис.4). С повышением массовой доли нефти липазная активность снижается.

=;

2 _

¡5 £

И I

00

I £

к х

£ О

X Ы

то

с о

0,4

0^

* ч

0,1’

000:

]липазная активность

массовая доля нефти

Рис.4. Зависимость величины липазной активности фоновых и рекультивированных почв от остаточного содержания нефти в почве

Вестник Башкирского университета.2006.№4.

59

Известно, что продуцентами ферментов в почвах являются микроорганизмы. Поэтому на втором этапе исследований мы изучали их численность и видовое разнообразие. При всех концентрациях нефтяного загрязнения численность практически всех функциональных групп микроорганизмов снижается. Поэтому можно говорить о том, что комплексы микроорганизмов глееподзолистой почвы являлись довольно чувствительными к нефтяному загрязнению.

Было отмечено, что при средней и низкой степени нефтяного загрязнения микроорганизмы, использующие органический азот (среда МПА) угнетаются, однако при высоких дозах наблюдается их стимулирование. В сильнозагрязненных почвах также стимулируются некоторые другие функциональные группы микроорганизмов (азотфиксаторы на среде Эшби, сахаролитики на среде Чапека и аммонификаторы на КАА). Чувствительными даже к небольшим концентрациям нефти являются нит-рификаторы, целлюлозолитики и азотфиксаторы. Действие небольших концентраций нефти на микроорганизмы, которые выделяются на мясо-пептонном агаре (гетеротрофы) и среде Виноград-

ского (нитрификаторы), незначительно.

Из исследованных почвенных образцов было выделено 40 культур грибов (табл.), 35 из них были идентифицированы до вида, 4 до рода и 2 культуры представляли собой стерильный мицелий (J^ycelia sterilia). Идентифицированные виды относятся к 18 родам из 3 классов: Zygomycetes, Ascomycetes, Hyphomycetes. К несовершенным грибам относится подавляющее число видов - 27 из 11 родов; зиго-мицеты представлены 10 видами из родов Disso-phora, Mucor, Mortierella, сумчатые грибы - одним видом Chaetomium. Выделенная микобиота характеризуется преобладанием пенициллиев, которые насчитывают 10 видов, что составляет 24,4% от всех выделенных микромицетов. Идентифицированные виды неравномерно представлены в образцах разной степени загрязненности. Видами, характерными только для незагрязненных фоновых почв являются Chaetomium sp., Cladosporium herbarum, Macrosporium commune, Penicillium dalae, P. de-cumbens, P. tomii. Для этой почвы не характерен темноокрашенный стерильный мицелий, представители рода Fusarium, Aspergillus, некоторые виды пенициллиев (Penicillium frequentans, P. raciborskii,

Т аблица

Толерантные к нефтяному загрязнению виды микромицетов, выделенные из глееподзолистых почв в Коми

Микромицеты Участки

№1 №2 №3 №4 №5

Класс Zygomycetes

Dissophora decumbens + +

Mortierella sp. +

M. cephalosporina Thaxter +

M. humicola Oudemans +

Класс Hyphomycetes

Acremonium vitis Cattaneo + +

Aspergillus clavatus Desmaz +

A. fumiga tus Fres. + +

A. niger Teigh. +

A. wentii Wehmer +

Aureobasidium pullulans (De Bari) Arnaud + + +

Cephalosporium atrum (Corda) Pidopliczko +

Cladosporium cladosporioides (Fresen G. A.) de Vries + + +

Fusarium moniliforme Sheldon +

Penicillium sp. +

P. frequentans Westl +

P. raciborskii Zaleski +

P. lanosum Westl + +

P. funiculosum Thom + + +

P.paxilli Bainier +

P.tardum Thom +

Torula convoluta Harz + + + +

Trichoderma harzianum Rifai + + +

I^ycelia sterilia

Темноокрашенный мицелий + + + + +

Всего 23 5 5 11 14 7

Примечание. №1 - почва с уровнем нефтяного загрязнения 5,16+1,45 мг/г, №2 - 25,98+ 7,89 мг/г, №3 -64+22 мг/г, №4200+70 мг/г, №5- горелый грунт 56+18 мг/г

P. lanosum, P. funiculosum, P.paxilli, P.tardum). В целом в незагрязненной почве доминируют микро-мицеты, характерные для северных широт [4]. Из загрязненных почв были выделены светло- и тем-ноокрашенный стерильный мицелий. Только в загрязненной почве встречались Hycelia sterilia (тем-ноокрашенный), 5 видов микромицетов, которые относятся к роду Aspergillus, 3 вида, относящиеся к роду Mortierella, 6 видов пенициллиев, Dissophora decumbens, Acremonium vitis, Aureobasidium pullu-lans, Cephalosporium atrum, Cladosporium cladosporioides, Fusarium moniliforme, Torula convoluta и Trichoderma harzianum.

Таким образом, выделенная микобиота как и на незагрязненном участке характеризуется преобладанием пенициллиев. Хотя между почвами с разной степенью загрязненности были обнаружены отличия, но существуют определенные тенденции (появление видов аспергиллов, фузариев, стериль-

ного темноокрашенного мицелия и др.), которые сохраняются в загрязненных почвах. Виды Aspergillus fumigatus, Penicillium funiculosum, P.paxilli, P. lanosum, выделенные из нефтезагрязненных почв по результатам исследования ряда авторов являются устойчивыми к антропогенным воздействиям и являются надежным биоиндикационным показателем неблагоприятного состояния изучаемого объекта [5, 6].

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать заключение о возможности использования в качестве индикаторов процесса завершения биодеградации нефти в почве показатели ферментативной активности, а общая численность микроскопических грибов и бактерий, численность целлюлозоразрушающих и азотфиксирующих микроорганизмов, видовая структура микромицетов зависела от концентрации загрязнителя.

ЛИТЕРАТУРА

1. Киреева Н. А., Мифтахова А. М., Бакаева М. Д., Водопьянов В. В. Комплексы почвенных микромицетов в условиях техногенеза. Уфа: Гилем, 2005. 360с.

2. Исмаилов Н. М., Гаджиева В. И., Гасанова М. Г. Коэффициент минерализации углеводородов как показатель самоочищения способности нефтезагрязненных почв и эффективности применяемых методов их рекультивации // Изв.АН АзССР, Сер. Биол. Н. 1984.-№ 6. С. 76-85

3. Киреева Н.А., Тарасенко Е. М., Шамаева А. А., Новоселова Е. И. Влияние загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами на активность липазы // Почвоведение. 2006. №8.

4. Гришкан И.Б. Микобиота и биологическая активность почв верховий Колымы. - Владивосток,1997. -136с.

5. Микроорганизмы и охрана почв / Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: МГУ, 1989. - 206с.

6. Лебедева Е.В. Микромицеты-индикаторы техногенного загрязнения почв // Микология и криптограммная ботаника в России: традиции и современность: Тр. Международной конференции, посвященной 100-летию организации исследований по микологии и криптограммной ботанике в Ботаническом институте им. В.Л. Комарова РАН. - СПб, 2000. - 560 с.

Поступила в редакцию 13.07.06 г.