Ускоренный метод микробиологического контроля безопасности пищевой продукции

[гиена и санитария 1/2012

токсическое действие на организм экспериментальных животных и вызывает достоверное изменение биохимических, физиологических, гематологических и эмбриотоксических показателей.

Недействующими по различным показателям биологического воздействия оказались концентрации в пределах от 0,02 до 0,2 мг/м3.

Сопоставление пороговых и недействующих концентраций далзлака-Т по общетоксическому и рефлекторному воздействию свидетельствует, что препарат оказывает как рефлекторное, так и резорбтивное действие. В связи с этим гигиеническое регламентирование далзлака-Т в атмосферном воздухе целесообразно осуществлять как по величине максимальных разовых, так и по среднегодовой ПДК.

Минимальная недействующая концентрация (0,02 мг/м3), полученная по показателю АЛТ, предложена в качестве среднегодовой ПДК далзлака-Т в атмосферном воздухе. Среднесуточная и среднемесячная ПДК в атмосферном воздухе с учетом соотношения между максимально разовой и среднегодовой ПДК рекомендуются соответственно 0,035 и 0,025 мг/м3.

Выводы

1. По лимитирующим показателям вредности биологического воздействия далзлак-Т относится к веществам, оказывающим рефлекторно-резорбтивное действие.

2. По степени опасности альфакторных реакций и резорб-тивного действия далзлак-Т относится к 3-му классу опасности, т. е. к умеренно опасным веществам.

3. Максимальная разовая ПДК далзлака-Т в атмосферном воздухе составляет 0,045 мг/м3, среднегодовая - 0,02 мг/м3, среднемесячная - 0,025 мг/м3 и среднесуточная - 0,035 мг/м3.

Литер атура

1. Аидреещева Н. Г. // Гиг. и сан. - 1977. - С. 69-74.

2. Временные методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций (ПДК), загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест. - М., 1989.

3. Искандаров Т. И., МахаматхановМ. М., Хамидов Л. Методические указания по газохроматографическому определению препарата Далзлак-Т в воздухе, воде, почве и растительном материале (№ 012-3/0171). - Ташкент, 2009.

4. Искандарова Ш. Т. Методические указания по обоснованию предельно допустимых концентраций (ПДК), загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест. - Ташкент, 1995.

5. Методы экспериментального исследования по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования. - М., 1978.

6. Пинигин М. А. // Методические и теоретические вопросы гигиены атмосферного воздуха: Сборник науч. трудов. - М., 1976. - С. 3-10.

7. Пинигин М. А. Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. - М., 1977. - Вып. 5. - С. 8-11.

8. Тепикина Л. А., ШербаковБ. Д. Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. - М., 1976. - Вып. 3. - С. 30-35.

9. Тепикина Л. А. Научно-методические основы ускоренной оценки токсичности и опасности веществ, загрязняющих атмосферный воздух: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - М., 2007.

10. Рахманин Ю. А., ПинигинМ. А. // Теоретические основы и практические решения проблем санитарной охраны атмосферного воздуха / Под ред. Ю. А. Рахманина. - М., 2003. - С. 30-41.

Поступила 15.04.10

Методы гигиенических исследований

О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 614.31-078

Ю. Г. Костенко1, Д. М. Соколов2, М. С. Соколов2

ускоренный метод микробиологического Контроля безопасности пищевой продукции

1ГНУ Всероссийский НИИ мясной промышленности РАСХН; 2ООО «МикроБио», Москва

Рассмотрены принцип действия и устройство экспресс-тестов Singlepath производства фирмы “Merck KGaA”. Тесты Singlepath предназначены для ускоренного выявления патогенных бактерий (Salmonella spp., Campylobacter spp. Listeria monocytogenes, E. mli 0157) в пищевых продуктах и продовольственном сырье. Их испытания в сравнении с традиционными методами при выявлении сальмонелл в мясном сырье показали высокую сходимость результатов. Иммунохроматографический анализ не требует оборудования, характеризуется простой пробоподготовкой и высокой надежностью. Тесты также эффективно используются для экспрессной идентификации патогенных бактерий. Внедрение экспресс-тестов Singlepath позволяет сократить время анализа на 24-48 ч. Тесты Singlepath официально рекомендованыМинздравсоцразвития РФ для практического применения.

Ключевые слова: микробиологический контроль, патогенные бактерии, экспресс-тесты, ИФА, пищевые продукты, ИСО 6579-2002, Campylobacter, Salmonella, Listeria monocytogenes, E. coli 0157, Singlepath, Duopath

Yu. G. Kostenko1, D. M. Sokolov2,1. V. Kashintsev2, M. S. Sokolov2 — ACCELERATED METHOD FOR MICROBIOLOGICAL CONTROL OF THE SAFETY OF FOODSTUFFS

1All-Russian Research Institute for Meat Industry, Russian Academy of Agricultural Sciences, Moscow 2OOO “Lab-BioMed”, Moscow

72

The action and devices of rapid Singlepath (Merck KGoA) tests are considered. The Singlepath tests are used for the accelerated detection of pathogenic bacteria (Salmonella spp., Campylobacter spp., Listeria monocytogenes, E. coli 0157) in the raw products and foodstuff. The tests as compared to conventional methods showed a high similarity of results in identifying Salmonella in raw meat material. The immunochromatographic test requires no equipment and it is characterized by simple sample preparation and high reliability. The tests are also effectively used for the rapid identification of pathogenic bacteria. The introduction of the rapid Singlepath tests reduces the time of analysis to 24-48 hours. The Singlepath tests are officially recommended by the Ministry of Health of the Russian Federation for practical application.

Key words: microbiological control, pathogenic bacteria, rapid tests, ELISA, foodstuffs, ISO 6579:2002, Campylobacter, Salmonella, Listeria monocytogenes, E. coli 0157, Singlepath, Duopath

Известно, что скоропортящиеся пищевые продукты, особенно мясные, могут быть причиной заболевания людей. Особую значимость при этом имеют патогенные бактерии рода Salmonella, Campylobacter, Listeria monocytogenes, E. coli O157 и др. Вырабатываемая предприятиями пищевая продукция должна быть безопасной для потребителей. Поэтому первостепенное внимание уделяется ее обязательному микробиологическому контролю, который должен проводиться в кратчайшие после изготовления сроки. Однако традиционные (классические) методы анализа обычно занимают несколько суток. Это создает риски для производителей пищевой продукции, реализуемой, как правило, сразу после ее изготовления из-за ограниченных сроков годности. Поэтому использование ускоренных методов микробиологического контроля в процессе производства и хранения пищевых продуктов является весьма актуальным. Экспресс-методы микробиологического анализа широко применяются в развитых странах [3]. Правомочность использования ускоренных методов при исследовании пищевой продукции одобрена контролирующими организациями за рубежом, а в последние годы и в России [2].

Одним из ускоренных методов выявления патогенных микроорганизмов является разновидность иммунохроматографического метода - иммуноферментный анализ (ИФА). Компания “Merck KGaA” (Германия) производит экспресстесты Singlepath и Duopath. Их действие основано на принципе ИФА [2, 4]. Метод не требует сложных процедур пробоподготовки и использования приборов, для выполнения исследований необходимы только тесты. Их использование существенно сокращает продолжительность анализа и обеспечивает высокую специфичность результатов исследований. Так, например, в контрольных испытаниях при искусственном заражении проб пищевых продуктов бактериями рода Salmonella (в пределах 0,23-6,0 КОЕ/25 г) [5] подавляющее большинство результатов с экспресс-тестом Singlepath подтверждено референтным методом (ИСО 6579-2002) [5].

Костенко Ю. Г. - гл. науч. сотр., д-р вет. наук, проф. (Yu.Kos-tenko@inbox.ru); Соколов Д. М. - ген. дир., канд. биол. наук (info@ mibio.ru); СоколовМ. С. - науч. консультант, д-р биол. наук, проф.

При этом доля ложноотрицательных результатов не превышала 2,5%, а ложноположительных - 7,5%, что вполне приемлемо для микробиологического анализа (табл. 1).

Устройство экспресс-тестов и принцип их действия

Диагностическая панель теста Singlepath (рис. 1) состоит из лунки для введения анализируемого образца, тестовой (T) и контрольной (C) зон. Тест содержит меченные золотом и красителем антитела к искомому патогенному микроорганизму или токсину.

В процессе выполнения исследований предварительно обогащенный образец анализируемого продукта вносят в лунку диагностической панели. Если в образце присутствует искомый антиген (клетки патогенного микроорганизма или бактериальный токсин), то образуется комплекс антиген-антитело. Этот комплекс, проходя через тестовую зону (T) и взаимодействуя с иммобилизованными антителами, образует красную линию. Избыток подвижных антител, достигнув контрольной зоны (C), образует вторую красную линию, свидетельствующую о завершении анализа.

Области применения экспресс-тестов

Применение экспресс-тестов Singlepath и Duopath позволяет визуально выявлять в анализируемых образцах наличие патогенных микроорганизмов (Salmonella, Campylobacter, Listeria monocytogenes, E. тоИ O157 и др.) или их токсинов (табл. 2). Меченые антитела экспресстестов обладают высокой специфичностью (99%) к определяемым бактериям даже в смешанных культурах микроорганизмов. В практике микробиологического контроля экспресс-тесты обычно используют для ускоренного скрининг-тестирования патогенных бактерий, а также для их идентификации.

Скрининг-тестированию анализируемого образца на наличие контролируемого микроорганизма должно предшествовать его обогащение в селективных питательных средах. Это связано с тем, что нижний предел чувствительности экспресс-тестов составляет 105-106 бактерий/см3. После обогащения культуральную жидкость оценивают на соответствующем тесте Singlepath. При получении

Таблица 1

результаты выявления бактерий рода Salmonella в различных пищевых продуктах с использованием теста Singlepath-SalmoneUa [5]

Тип продукта КОЕ/25 г Singlepath -тест Референтный метод (ИСО 6579: 2002)* Чувствительность, % Селективность, % Ложноотрицательные результаты, % Ложноположительные результаты, %

Сырая говядина 6 14/20 14/20 100 100 0 0

Сырая индейка 2,325 16/20 13/20 92 67 7,7 33,3

Сухое молоко 0,23 10/20 10/20 100 100 0 0

Черный перец 1,08 13/20 13/20 100 100 0 0

Кокосовый орех 1,08 23/25 23/25 100 100 0 0

Замороженные креветки 1,08 11/20 11/20 100 100 0 0

Примечание. *В числителе - положительные результаты, в знаменателе - общее число исследованных проб продукта.

73

гиена и санитария

1/2012

предварительного положительного результата культуру контролируемого микроорганизма выделяют и идентифицируют классическим методом на селективных средах с последующей постановкой биохимических тестов. Отрицательный ответ является окончательным и свидетельствует об отсутствии контролируемого микроорганизма в анализируемом образце.

Для идентификации бактерий на тесте Singlepath отбирают несколько характерных колоний контролируемого микроорганизма, выросших на агаризованных средах. Их ресуспендируют в физиологическом растворе, после чего проводят экспресс-идентификацию на соответствующем Singlepath^^^ Полученный результат является окончательным.

Таблица 2

Экспресс-тесты Singlepath и Duopath (Merck KGaA) для анализа патогенных бактерий или токсинов

Определяемый микроорганизм или токсин Singlepath или Duopat^-тест Время тестиро- вания, мин Среды для этапа обогащения Общее время исследования, ч

Singlepath- 1. Забуференная пептонная вода, кат. № 107228

Salmonella spp. Salmonella, кат. № 104140 20 2. Среда (RVS)-Раппапорт- 48

Listeria

monocytogenes

Ускоренное определение патогенных бактерий на тесте Singlepath при скрининг-тестировании

Питательные среды и экспресс-тесты. Согласно [2], для выявления в анализируемом образце бактерий рода Salmonella, а также Listeria monocytogenes, Campylobacter и Е. coli O157 необходимо иметь соответствующие тесты и питательные среды (см. табл. 2).

Иеселективное обогащение (рис. 2). Навеску измельченного в гомогенизаторе анализируемого образца (массой 25 ± 0,1 г) вносят в 225 см3 забуференной пептонной воды; при необходимости анализа других масс образца их высевают в забуференную пептонную воду в соотношении 1:9 (по объему). Посевы инкубируют при 37 ±

1oC в течение 21 ± 3 ч.

Селективное обогащение. По окончании инкубирования 0,1 см3 обогащенной культуры вводят в 9,9 см3 среды Раппапорт-Василиадиса и посев инкубируют при 41 ± 1oC в течение 21 ± 3 ч.

Инактивация. 1-2 см3 культуры, полученной после селективного обогащения, переносят в пробирку. Обогащенную культуру инактивируют на водяной бане при 100oC в течение 15 мин. Оставшуюся после обогащения культуру используют для подтверждения положительного ответа тестирования.

Singlepath-теcтиpoвание. Обогащенную культуру

Е. coli 0157

Campylobacter

sPP.

Веротоксины

Энтеротоксины Bac. cereus

Legionella pneumophila, Legionella spp.

Singlepath-L'mono, кат.

№; 104148

Singlepath-E. coli O157, кат.

№ 104141

Singlepath-

Campylobacter,

кат.

№ 104143

Duopath-Verotoxins, кат.

№ 104144

Duopath-Cereus Enterotoxins, кат. № 104146 Duopath-Legionella, кат.

№ 104147

30

20

20

20

20

30

Василиадиса, кат. № 107700 Бульон Фразера, кат. № 1Ш398 или UVM-бульон, кат. № 110824 Модифицированный бульон EC с новобиоцином, кат. № 114582

Селективный бульон Болтона, кат. № 100068

Среда для индукции синтеза шигоподобных токсинов CAYE broth, кат. № 100060 Селективный агар Мозеля (MYP-агар), кат. №«105267

Legionella CYE-агар, кат. № 110242

48

24

48

Рис. 1. Экспресс-тест Singlepath-Salmonella. а - отрицательный ответ; б - положительный ответ.

после инактивирования охлаждают до комнатной температуры, затем отбирают пробу (160 мкл) и вносят в лунку Singlepath-теста. Через 20 мин считывают результат анализа. Он считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зонах. Результат считается недействительным, если красная линия отсутствует в контрольной (C) зоне. Если получен предварительный положительный ответ, то для его подтверждения используют дифференциально-диагностические среды, а окончательную идентификацию сальмонелл проводят согласно ГОСТ Р 52814-2007 [1].

идентификация сальмонелл с использованием теста Singlepath-Salmonella

Несколько характерных по окраске колоний бактерий Salmonella, выросших на селективных дифференциальнодиагностических агаризованных средах - Рамбах-агаре (хромогенный агар), ксилозо-лизиновом агаре с дезокси-холатом (XLD-агар) или других средах (рис. 3), переносят в 2 мл физиологического раствора. Затем суспензию инактивируют на кипящей водяной бане (100oC) в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, отбирают пробу в 160 мкл и тестируют, используя Singlepath-Salmonella-тест [2]. При положительном ответе патогенные микроорганизмы идентифицируют биохимическим и/или серологическим методом.

З аключение

Singlepa^-тесты - это высокочувствительные, специ-

6

74

Рис. 2. Выявление бактерий рода Salmonella с использованием экспресс-теста Singlepath-Salmonella.

фичные и простые в исполнении экспресс-тесты, предназначенные для микробиологического контроля продовольственного сырья и пищевой продукции. Они эффективны при скрининге образцов продукта на наличие патогенных бактерий рода Salmonella, Campylobacter, Listeria monocytogenes, E. шИ O157 и др. Их использование на пищевых предприятиях с целью обнаружения патогенной микрофлоры обеспечивает высокую надежность определения, существенно сокращает время анализа (до 24-48 ч) и затраты на его проведение. Метод также эффективно используется при идентификации колоний патогенных

Рис. 3. Использование теста Singlepath-Salmonella для идентификации сальмонелл.

микроорганизмов. Singlepath-тестирование не требует сложных процедур подготовки проб и использования приборов. Испытания экспресс-тестов Singlepath во ВНИИ мясной промышленности РАСХН при выявлении сальмонелл в мясном сырье (в сравнении с классическим методом определения по ГОСТ 7702.2.3-93) показали высокую сходимость результатов.

Литер атур а

1. ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579-2002). Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella. - М., 2008. (Переиздан в 2009 г. с поправкой от 29.05.2009).

2. Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием хроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия): Метод. рекомендации. № 24ФЦ/976. - М., 2004.

3. Fung D. Y. С. // Rapid Meth. Automation in Microbiol. - 20022003. - Vol. 1.

4. Singlepath и Duopath // Питательные среды и лабораторное оборудование. - М., 2009. - С. 35-39.

5. Thompson L., Lindhardt Ch. Singlepath Salmonella // J. AOAC Int. - 2006. - Vol. 89, N 2. - P. 417-432.

Поступила 29.10.10

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 614.31:579.862.1.083.12

С. М. Суханова, Н. Е. Захарова, И. А. Голубенко

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА НОВЫХ КОММЕРЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ

выделения стафилококков

ФГБУ «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича» Минздравсоцразвития России, Москва

Проведены сравнительные испытания новых коммерческих питательных сред Для выделения стафилококков отечественных и зарубежных производителей (ФГУП “НПО “Микроген” Минздравсоцразвития РФ; ФГУП Государственный научный центр прикладной микробиологии, пос. Оболенск; ОАО “Биомед” им. И. И. Мечникова, Московская обл.; ЗАО Научно-исследовательский центр фармакологии, Санкт-Петербург; “НоваМед Лтд.”, Израиль). Качество оценивали по физико-химическим и биологическим показателям. Испытуемые питательные среды обеспечивали хороший рост специфически значимых тест-штаммов стафилококков, а также ингибирующие свойства в отношении тест-штаммов энтеробактерий. Техника использования традиционного посева на чашки гарантирует более высокую чувствительность и степень ингибиции питательных сред в сравнении с техникой нанесения инокулята на “НоваСтрик”.

Ключевые слова: питательные среды, стафилококк, элективный солевой агар, выделение, чувствительность, ингибиция

75