СПОСОБЫ И НАБОРЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО СУБТИПИРОВАНИЯ ОПУХОЛЕЙ

1. In vitro способ идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного, указанный способ, включающий стадии:
(a) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) в образце опухоли;
(b) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора эстрогена (ESR1) в образце опухоли;
(c) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта рецептора прогестерона (PGR) в образце опухоли; и
(d) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта антигена пролиферации Ki-67 (Ki67) в образце опухоли; и/или
(e) определение уровня экспрессии РНК-транскрипта активирующего GTPазу Rac белка 1, (RACGAP1) в образце опухоли.
2. Способ по п. 1, в котором определение уровня экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1 включает определение уровня экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1, который ниже или выше определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2, ESR1, PGR и Ki67 и/или RACGAP1.
3. Способ по п. 1, в котором стадию (а) выполняют перед стадиями (b), (с) и (d) и/или (е).
4. Способ по п. 1, в котором стадию (d) и/или стадию (е) выполняют после стадий (а), (b) и (с).
5. Способ по п. 1, в котором стадию (а) выполняют перед стадией (b), стадию (b) выполняют перед стадией (с), и стадию (с) выполняют перед стадией (d) и/или стадией (е).
6. Способ по п. 1, в котором молекулярный подтип выбирают из группы, включающей HER2-позитивный, трижды негативный, люминальный А и люминальный В подтипы.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта HER2, выявляет молекулярный подтип опухоли как HER2-позитивный.
8. Способ по любому из пп. 1-6, в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который ниже или выше определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67,
выявляет молекулярный подтип опухоли как трижды негативный.
9. Способ по любому из пп. 1-6, в котором молекулярный подтип представляет собой люминальный А или люминальный В подтип.
10. Способ по п. 9, в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67,
выявляет молекулярный подтип опухоли как люминальный В.
11. Способ по п. 9, в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67,
выявляет молекулярный подтип опухоли как люминальный А.
12. Способ по п. 9, в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который ниже или выше определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67,
выявляет молекулярный подтип опухоли как люминальный В подтип.
13. Способ по п. 9, в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67,
выявляет молекулярный подтип опухоли как люминальный В.
14. Способ по п. 9, в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта ESR1;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта PGR; и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67,
выявляет молекулярный подтип опухоли как люминальный А.
15. Способ по п. 9, в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта HER2, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта HER2;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта ESR1, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта ESR1;
- уровень экспрессии РНК-транскрипта PGR, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта PGR; и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67,
выявляет молекулярный подтип опухоли как люминальный В.
16. Способ по п. 9, в котором молекулярный подтип люминальный А связан с вероятностью отдаленной пятилетней безрецидивной выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 11%, предпочтительно, по меньшей мере, на 13% выше чем вероятность отдаленной пятилетней безрецидивной выживаемости после лечения, связанного с молекулярным подтипом люминальный В, и/или с вероятностью пятилетней выживаемости после лечения, которая, по меньшей мере, на 7%, предпочтительно, по меньшей мере, на 9% выше, чем вероятность пятилетней выживаемости после лечения, связанного с молекулярным подтипом люминальный В.
17. Способ по любому из пп. 1-6, в котором способ включает стадию (е) и в котором уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного.
18. Способ по любому из пп. 1-6, в котором способ включает стадии (d) и (е), и в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, который ниже определенного порога экспрессии РНК-транскрипта Ki67, и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1,
указывает на повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного.
19. Способ по любому из пп. 1-6, в котором способ включает стадии (d) и (е) и в котором
- уровень экспрессии РНК-транскрипта Ki67, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта Ki67, и
- уровень экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1, превышающий определенный порог экспрессии РНК-транскрипта RACGAP1,
указывает на дополнительно повышенный риск неблагоприятного клинического исхода для онкологического больного.
20. Способ по п. 17, в котором неблагоприятный клинический исход включает относительное или более снижение в выживаемости, безрецидивной выживаемости и отдаленной безрецидивной выживаемости.
21. Способ по любому из пп. 1-6, в котором опухоль представляет собой солидную опухоль.
22. Способ по любому из пп. 1-6, в котором опухоль представляет собой опухоль молочной железы или происходит от опухоли молочной железы.
23. Способ по любому из пп. 1-6, в котором рак представляет собой рак молочной железы.
24. Способ по любому из пп. 1-6, в котором образец представляет собой РНК, экстрагированную из опухоли.
25. Способ по любому из пп. 1-6 в котором уровень экспрессии РНК-транскрипта определяют с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT).
26. Способ по п. 25, в котором количественная ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой.
27. Способ по п. 25, включающий применение ESR1-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов, включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2, и/или HER2-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов, включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5, и/или Ki67-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов, включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, и/или PGR-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов, включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 10 и 11, и/или RACGAP1-специфических праймеров длиной от 15 до 30 нуклеотидов, включающих, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 13 и 14.
28. Способ по п. 25, включающий применение ESR1-специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов, включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 3, и/или HER2-специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов, включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 6, и/или Ki67-специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов, включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 9, и/или PGR-специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов, включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 12, и/или RACGAP1-специфического зонда длиной от 20 до 35 нуклеотидов, включающего, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 15.
29. Способ по любому из пп. 1-6, в котором уровень экспрессии нормализуют по отношению к (среднему) уровню экспрессии одного или нескольких референсных генов в образце опухоли.
30. Способ по п. 29, в котором один или несколько референсных генов выбирают из группы, включающей CALM2, В2М, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH.
31. Способ стратификации онкологических больных для лечения опухоли, указанный способ, включающий в качестве первой стадии идентификацию молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного с применением in vitro способа по любому из пп. 1-30 и в качестве второй стадии выбор схемы лечения опухоли на основании молекулярного подтипа, идентифицированного in vitro способом.
32. Способ по п. 31, в котором молекулярный подтип выбирают из группы, включающей HER2-позитивный, трижды негативный, люминальный А и люминальный В.
33. Способ по п. 32, в котором
- молекулярный подтип представляет собой HER2-позитивный подтип, и схема лечения опухоли включает введение анти-HER2 антител и химиотерапевтических средств;
- молекулярный подтип представляет собой трижды негативный подтип, и схема лечения опухоли включает введение химиотерапевтических средств;
- молекулярный подтип представляет собой люминальный А подтип, и схема лечения опухоли включает эндокринную терапию; или
- молекулярный подтип представляет собой люминальный В подтип, и схема лечения опухоли включает эндокринную терапию и/или введение химиотерапевтических средств.
34. Способ по п. 33, в котором молекулярный подтип представляет собой люминальный В подтип, и схема лечения опухоли включает введение таксана, предпочтительно доцетаксела.
35. Способ по п. 34, в котором таксан вводят в комбинации с фторурацилом, эпирубицином и циклофосфамидом (FEC).
36. Способ по п. 31, в котором опухоль представляет собой солидную опухоль.
37. Способ по п. 31, в котором опухоль представляет собой опухоль молочной железы или происходит от опухоли молочной железы.
38. Способ по любому из пп. 31-37, в котором рак представляет собой рак молочной железы.
39. Набор, применяемый для идентификации молекулярного подтипа опухоли у онкологического больного с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ), указанный набор, включающий:
- по меньшей мере, одну пару HER2-специфических праймеров и, по меньшей мере, один HER2-специфический зонд;
- по меньшей мере, одну пару ESR1-специфических праймеров и, по меньшей мере, один ESR1-специфический зонд;
- по меньшей мере, одну пару PGR-специфических праймеров и, по меньшей мере, один PGR-специфический зонд; и
- по меньшей мере, одну пару Ki67-специфических праймеров и, по меньшей мере, один Ki67-специфический зонд; и/или
- по меньшей мере, одну пару RACGAP1-специфических праймеров и, по меньшей мере, один RACGAP1-специфический зонд.
40. Набор по п. 39, в котором количественная ПЦР представляет собой количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной меткой.
41. Набор по п. 39, в котором обнаружение зонда основано на опосредованном амплификацией вытеснении зонда.
42. Набор по п. 41, в котором зонд представляет собой зонд с двойной меткой, включающей фрагмент репортера флуоресценции и фрагмент гасителя флуоресценции.
43. Набор по п. 39, дополнительно включающий обратную транскриптазу и ДНК-полимеразу.
44. Набор по п. 43, в котором обратную транскриптазу и полимеразу обеспечивают в виде смеси ферментов, что позволяет проводить количественную ПЦР с обратной транскриптазой (ОТ) в одну стадию.
45. Набор по п. 39, дополнительно включающий, по меньшей мере, одну пару специфических для референсных генов праймеров и, по меньшей мере, один специфический для референсных генов зонд.
46. Набор по п. 45, в котором референсный ген представляет собой один или несколько референсных генов, которые выбирают из группы, включающей CALM2, В2М, RPL37A, GUSB, HPRT1 и GAPDH.
47. Набор по п. 39, дополнительно включающий, по меньшей мере, один контрольный образец РНК.
48. Набор по п. 39, в котором праймеры обеспечивают ампликон, размером менее чем 120 п.о.
49. Набор по п. 39, в котором ESR1-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 1 и 2, и/или в котором HER2-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5, и/или в котором Ki67-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 7 и 8, и/или в котором PGR-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 10 и 11, и/или в котором RACGAP1-специфические праймеры имеют длину, равную от 15 до 30 нуклеотидов, и включают, по меньшей мере, 10 последовательных нуклеотидов из последовательностей SEQ ID NO: 13 и 14.
50. Набор по п. 39, в котором ESR1-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов, и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 3, и/или в котором HER2-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов, и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 6, и/или в котором Ki67-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 9, и/или в котором PGR-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов, и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 12, и/или wherein RACGAP1-специфический зонд имеет длину, равную от 20 до 35 нуклеотидов, и включает, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 15.
51. Набор по п. 39, в котором опухоль представляет собой солидную опухоль.
52. Набор по п. 39, в котором опухоль представляет собой опухоль молочной железы или происходит от опухоли молочной железы.
53. Набор по любому из пп. 39-52, в котором рак представляет собой рак молочной железы.