Апоптоз, роль в патологии и значимость его оценки при клинико-иммунологическом обследовании больных

Медицинская иммунология 2000, Т. 2, №1, стр 7-16 © 2000, СПб РО РААКИ

Обзоры

АПОПТОЗ, РОЛЬ В ПАТОЛОГИИ И ЗНАЧИМОСТЬ ЕГО ОЦЕНКИ ПРИ КЛИНИКОИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОБСЛЕДОВАНИИ БОЛЬНЫХ

Ярилин А.А., Никонова М.Ф., Ярилина А.А., Варфоломеева М.И., Григорьева Т.Ю.

ГНЦ - Институт иммунологии МЗ России, Институт ревматологии РАМН, Москва.

Резюме. В обзоре кратко охарактеризована феноменология, механизмы индукции и реализации апоп-тоза. Представлены сведения о роли нарушений апоптоза в иммунопатологии; в частности, рассмотрены последствия мутаций, затрагивающих гены Fas (lpr), FasL (gld), p53. Описаны принципы и методы выявления апоптоза с акцентом на использовании с этой целью цитофлуорометрических подходов. Рассмотрены некоторые собственные работы авторов по обоснованию альтернативности апоптоза и пролиферации как форм ответа Т-клеток на стимуляцию. Показано, что при ревматоидном артрите для Т-клеток крови (в противоположность Т-клеткам пораженных синовиальных полостей) свойственна повышенная склонность к развитию активационного апоптоза, что коррелирует с некоторыми клиническими показателями. Усиление апоптоза Т-клеток крови при ответе на митоген (ФГА) проявляется также при бронхиальной астме, хронических воспалительных заболеваниях легких и общей вариабельной иммунной недостаточности. Авторы считают, что параллельное определение апоптоза и пролиферации Т-клеток крови при ответе на ми-тогены является более информативным, чем традиционная оценка их пролиферативного ответа, и служит дополнительным источником сведений об иммунопатогенезе ряда заболеваний.

Ключевые слова: апоптоз, Т-лимфоциты, пролиферация, иммунопатология

Yarilin A.A., Nikonova M.F., Yarilina A.A., Varfolomeeva M.I., Grigorieva T. Yu.

APOPTOSIS, IMORTANCE OF ITS EVALUATION IN IMMUNOPATHOLOGICAL STATES

Abstract. The phenomenology, mechanisms of induction and realization of apoptosis are considered in this review. The data on the role of apoptosis disorders in the development of the immunopathological states are presented. The special role of genes fas, fasL and p53 mutations is emphasized. The main principles and methods of apoptosis estimation are described with a special reference to the cytofluorometric methods. Some own results of authors are referred to. They interprete apoptosis and proliferation as alternative forms of T cell response to mitogenic stimulation. The prevalence of activation-induced apoptosis over proliferation was observed in PHA response of peripheral T cells in rheumatoid arthritis patients. Preferable apoptotic reaction of blood T cells to PHA stimulation correlates with some manifestations of disease activity. Increased activation-induced apoptosis of blood T cells was observed in patients with bronchial asthma, chronic inflammatory lung diseases, common variable immunodeficiency syndrome. Authors consider that the measurement of both apoptosis and proliferation of stimulated T cells is more informative than the estimation of cell proliferation alone and can be an additional source of information about immunopathogenesis of some diseases.

Адрес для переписки:

Ярилин Александр Александрович - академик РАЕН, д. м. н., профессор, руководитель лаборатории механизмов дифференцировки Т-лимфоцитов, ГНЦ-Институт иммунологии М3 РФ,

115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2 ГНЦ-Институт иммунологии М3 РФ, лаборатория механизмов дифференцировки Т-лимфоцитов Тел.: (095) 117-79-19 Факс: (095) 117-10-27

Апоптоз, или программированная гибель клеток привлекает всеобщее внимание в последние 5-7 лет, хотя история его изучения исчисляется тремя десятками лет [23]. Этот феномен оказался весьма значимым для иммунологии, прежде всего, потому, что он является составляющей ряда фундаментальных иммунологических процессов. Проявлениям и молекулярным механизмам апоптоза посвящены многочисленные исследования, обобщенные в обзорных статьях [4, 5, 24, 25, 38, 45], к которым мы отсылаем

читателей, интересующихся проявлениями и механизмами апоптоза. Здесь мы остановимся лишь на прикладных иммунологических аспектах этого явления, обратив особое внимание на методические возможности и практическую значимость оценки апоптоза лимфоцитов в повседневной практике клинической иммунологии.

1. КРАТКИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ АП0ПТ03Е И ЕГО МЕСТЕ В ИММУННЫХ ПРОЦЕССАХ

Гибель клеток может осуществляться в активной и пассивной форме - путем апоптоза и некроза. При некрозе начальные события связаны преимущественно с нарушением целостности клеточной мембраны. Апоптоз, напротив, является активным процессом, формой реакции клетки на внешние или внутренние сигналы. В наиболее общей форме назначение апоптоза в целостном организме (в сочетании с его альтернативой - пролиферацией клеток) состоит в определении размеров и “архитектуры” организма, что проявляется в поддержании постоянства численности клеток, определении формы организма и его частей, обеспечении правильного соотношения численности клеток различных типов, удалении генетически дефектных клеток.

Известно по меньшей мере два рецептора, принимающих сигналы к развитию апоптоза - Fas (CD95) [31] и рецептор для фактора некроза опухоли I типа (р55) - TNFRI [11]. Оба они имеют в своей цитоплазматической части “домен смерти”, способный передавать сигнал гибели внутрь клетки. Генерация внутриклеточных сигналов такого рода связана в первую очередь с белком р53, который экспрессируется при наличии поломок хромосом, накоплении нерепарированных разрывов ДНК и других генетических нарушениях [37].

Хотя пути запуска апоптоза весьма разнообразны, в конечном счете они объединяются в единый эффекторный путь, включение которого связано с активацией сериновых протеаз (каспаз) [28]. Кас-пазы расщепляют ряд молекул-мишеней, в том числе ядерных. В конечном счете это приводит к активации эндонуклеаз, осуществляющих расщепление ДНК сначала на крупные фрагменты, а в конечном счете (при участии Са2+Mg2+-зависимой эндонуклеазы, разрывающей ДНК в участках между нуклео-сомами) на фрагменты, содержащие около 190 пар оснований, что соответствует длине нити ДНК в нуклеосоме. Следствием этого является конденсация хроматина, затем его фрагментация и отшну-ровка от клетки фрагментов ядра, окруженных мембраной, - “апоптотических телец”; таким образом, при апоптозе клетка теряет часть генетического

материала. В отличие от некроза, при котором клетка набухает, при апоптозе клетка сморщивается, и ее мембраны уплотняются без существенного повышения проницаемости.

В клетках существует сбалансированная система протоонкогенов, в которой в качестве факторов, сдерживающих апоптоз, выступают ЬЫ-2 (или его гетеродимер с baх) и “длинная” форма молекулы bcl-x фЫ-xL), а в качестве факторов, способствующих включению апоптоза - гомодимер bах, “короткая” форма bcl-x (bcl-xS), а также ряд других протоонкогенов [21].

Роль апоптоза возрастает в условиях активации клеток (активационный апоптоз [18, 36]), когда он выступает в роли процесса, альтернативного пролиферации. На ранних стадиях лимфопоэза клетки весьма чувствительны к развитию апоптоза, избежать которого им удается при достаточной концен-тарции ростовых факторов (прежде всего ^-7) или при действии стимулов, приводящих к экспрессии ЬЫ-2 или ЬЫ^. На этапе положительной селекции клонов тимоцитов источником таких стимулов являются аутологичные молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГ), экспрессируемые эпителиальными клетками тимуса. На этапе отрицательной селекции, напротив, распознавание тимоцитами аутологичных пептидов в комплексе с молекулами ГКГ приводит к индукции апоптоза и элиминации аутоспецифических клонов Т-клеток [42].

Апоптоз зрелых лимфоцитов осуществляется при их ответе на стимуляцию антигеном и развивается при “некомплектности” активирующего сигнала - отсутствии костимуляции через CD28 (в случае Т-кле-ток) или через CD40 (в случае В-клеток), дефиците факторов роста (для Т-клеток - интерлейкина 2), а также при повторном действии активационного стимула на уже активированные клетки, и т.д. [32, 42, 44]. Этому способствует экспрессия Т-клетками в процессе активации как Fas-рецептора, так и Fas-лиганда; их взаимодействие порождает сигнал к индукции апоптоза [13, 24], что закономерно происходит на поздних этапах иммунного ответа. Более длительный срок жизни клеток памяти связан с замедлением осуществления этих событий.

Апоптоз играет роль также в реализации эффек-торной функции Т- и NK-киллеров. В основе вызываемой ими гибели клеток-мишеней лежит индукция апоптоза вследствие проникновения в клетку-мишень гранзимов через поры, формируемые в ее мембране в результате полимеризации перфорина [16].

Таким образом, роль апоптоза в иммунной системе в первую очередь обусловлена его вовлечением в формирование антигенраспознающего репертуара и аутотолерантности, контролем численности клеток иммунной системы, в частности лимфоцитов, вовлекаемых в иммунный ответ и выбраковкой чужеродных клеток и клеток, несущих генетические дефекты.

2. ИММУНОПАТОЛОГИЯ, СВЯЗАННАЯ С НАРУШЕНИЯМИ АПОПТОЗА

Существуют патологические процессы, основой которых служит нарушение (ослабление или усиление) апоптоза клеток иммунной системы [5, 6] (табл.1). Из сказанного в главе 1 следует, что его недостаточность должна отразиться прежде всего на формировании аутотолерантности и контроле численности иммунокомпетентных клеток. Действительно, основные последствие мутаций генов Fas и Fas-l (их носителями являются мыши линий MRLlpr/lpr MRL-gld/gld), а также трансфекции гена bcl-2 состоят в развитии системных аутоиммунных процессов (гломерулонефрита, васкулитов, волчаночно-го синдрома), а также гиперплазии лимфатических узлов с накоплением необычных клеток Т-ряда с фенотипом CD3 TCRaP+CD4-CD8-B220+ (т.е. лишенных корецепторов и несущих маркер В-клеток В220), в норме обнаруживаемых в малом количестве в основном в печени. При сочетании гиперэкспрессии трансфецированных генов bcl-2 и c-myc у мышей наряду с аутоиммунными развивались лимфопролиферативные процессы [13, 33, 43].

В связи с описанными наблюдениями на мышах возник вопрос о состоянии апоптоза и связанных с

ним факторов при аутоиммунных заболеваниях человека, прежде всего при системной красной волчанке (СКВ). Подавление экспрессии Fas-рецептора при этом заболевании, как правило, не обнаруживается, а экспрессия FasL может быть даже усилена. Тем не менее при этом заболевании неоднократно описывалось ослабление активационного апоптоза Т-клеток [2, 9, 22], а также апоптоза клеток гломерул почки. Одной из причин этого ослабления может служить повышение секреции активированными Т-клетками растворимой формы Fas-рецептора [11], регистрируемое при СКВ и других коллагенозах. Накопление растворимых Fas-рецепторов в окружении лимфоцитов конкурентно подавляет эффект взаимодействия Fas-FasL.

В то же время у человека описаны случаи мутаций генов Fas и FasL с клиническими проявлениями, сходными с вышеописанными, и диагностированные первоначально как СКВ [15]. Более распространенная патология, обусловленная мутациями гена Fas, обозначается как семейный аутоиммунный лимфопролиферативный синдром [14, 15, 30]. 19 из почти 100 известных случаев этого заболевания наблюдалось в нашей стране [1].

Изменение чувствительности Т-лимфоцитов к индукции Fas-зависимого апоптоза - зарегистриро-

Таблица 1. ПАТОЛОГИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ, СВЯЗАННАЯ С НАРУШЕНИЯМИ АПОПТОЗА

Группы заболеваний Заболевания Комментарии

Заболевания, связанные с ослаблением апоптоза

Аутоиммунные процессы Семейный аутоиммунный лимфопролиферативный синдром, связанный с дефицитом Fas Аналоги у мышей - носители мутаций lpr, gld и трансфектанты по Ьс1-2. СКВ-подобный синдром в сочетании с накоплением CD3+CD4-CD8-B220+ клеток

Системная красная волчанка, ревматоидный артрит, синдром Бехчета Ослабление апоптоза невыясненного генеза. Образование растворимого Fas-рецептора

Злокачественные опухоли Лимфома Беркита Транслокация и гиперэкспрессия генов Ьс1-2 и с-тус; ослабление апоптоза

Лейкозы Мутации и экспрессия р53 приводят к ослаблению апоптоза, что часто коррелирует с прогрессированием лейкозов и их устойчивостью к терапии

Заболевания, связанные с усилением апоптоза

Первичные иммунодефици-ты Вариант тяжелого комбинированного иммунодефицита, обусловленного мутацией гена ^-7

Инфекционные (бактериальные) заболевания Различные инфекционные процессы, сепсис Апоптоз клеток иммунной системы вызывают суперантигены, токсины; при сепсисе -накапливающиеся в циркуляции TNF-a

Вирусные инфекции Различные вирусные заболевания, в том числе СПИД Индукторами апоптоза при СПИД служат вирусные факторы, в частности др120, взаимодействующий с CD4

вано при ревматоидном артрите. При этом заболевании в полости пораженных суставов накапливаются Т-клетки, несущие CD95 (Fas), FasL и CD45R0 (маркер клеток, контактировавших с антигеном) и слабо экспрессирующие bcl-2, т.е. именно те лимфоциты, которые особенно чувствительны к активационному апоптозу. Однако по какой-то причине они не гибнут. В сходной ситуации при подагре происходит массовый апоптоз активированных Т-клеток в пораженных суставах. Основой этих различий является разный уровень экспрессии факторов, ингибирующих апоптоз, особенно bcl-xL - высокий при ревматоидном артрите и низкий при подагре.

К заболеваниям, патогенез которых связан с подавлением апоптоза, относят злокачественные опухоли, особенно имеющие гематогенное происхождение. В этом случае ключевым событием, способствующим развитию патологии, чаще всего служат соматические мутации, затрагивающие ген р53 (обычно его экзоны 5-8) [37]. При опухолях мутантную форму белка р53 экспрессирует до 70% трансформированных клеток.

При лимфоме Беркита и некоторых формах фолликулярных лимфом повышение резистентности измененных клеток к индукции апоптоза обусловлено рекомбинациями, в которые вовлекается ген bcl-2, перемещающийся из хромосомы 18 в ген Igh хромосомы 14 [39].

Вариантами патологии, основой которых является усиление апоптоза, являются гематологические заболевания, относящиеся к группе цитопений (ряд анемий, нейтропении, тромбоцитопении, миелодис-палстические процессы). К этой группе может быть отнесен вариант тяжелой комбинированной недостаточности, обусловленный мутацией гена IL-7, служащего фактором выживаемости юных форм лимфоцитов [35].

При инфекционных процессах избыточный апоп-тоз развивается в ответ на действие бактериальных суперантигенов и токсинов (например, липополисаха-ридов кишечных микробов, суперантигенов стафилококков и т.д.), а также вирусных факторов. Массовый апоптоз, опосредованный фактором некроза опухоли и его рецепторами 1 типа, развивается при сепсисе.

Особое внимание привлекает роль апоптоза в патогенезе СПИД. Значительная часть CD4+ клеток при этом заболевании не содержит ВИЧ-1, но подвергаются апоптозу [7, 19]. К индукции апоптоза Т-клеток причастно по крайней мере два белка ВИЧ-1 - gp120 и tat. Gp120 обладает сродством к CD4 и обусловливает его перекрестное связывание, что, как было показано ранее, с использованием моноклональных антител к CD4, сенсибилизирует Т-клетки к индукции апоптоза, опосредованного через связывание антигена [19]. Индукция апоптоза наблюдается также при взаимодействии gp120 с рецептором хемокинов CXCR4 [8]. Белок tat способен как

сенсибилизировать клетки к индукторам апоптоза, так и непосредственно индуцировать его [27]. Развитию апоптоза Т-клеток при СПИД способствует усиление экспрессии Fas-рецептора и ослабление экспрессии Вс1-2, а также изменение оксилительно-восстановительного статуса (повышение внутриклеточного содержания дисульфида глутатиона, снижение уровня глутатиона и других антиоксидантов), наблюдаемое при этом заболевании.

Многие факторы, определяющие экологическое неблагополучие, способны вызвать апоптоз, к которому особенно чувствительны лимфоциты, в том числе покоящиеся. Наиболее известным повреждающим агентом, действие которого в значительной степени основано на индукции апоптоза, является ионизирующая радиация [41]. Вызываемый ею апоп-тоз кроветворных и лимфоидных клеток в основном обусловливает симптоматику лучевой болезни. Аналогичным эффектом обладают многие химиотерапевтические препараты, как и облучение, используемые при лечении опухолей [14, 25], а также гормоны, например глюкокортикоиды, также широко применяемые в качестве лекарственных средств.

Таким образом, в основе многих иммунопатологических процессов лежат нарушения апоптоза. Проявлением недостаточности апоптоза служит развитие аутоиммунных и лимфопролиферативных процессов, проявлениями повышенной подверженности клеток иммунной системы апоптозу - различные формы иммунодефицитов.

3. ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ АПОПТОЗА ПРИ КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Методы выявления апоптоза достаточно разнообразны. Часть из них основывается на регистрации морфологических признаков апоптоза - конденсации хроматина, уменьшении размеров клеток, появлении апоптотических телец. Как правило, такие подходы используются в сочетании с более объективными и доказательными методами.

К таковым относятся методы, основанные на выявлении разрывов ДНК, ее деградации и потере клеткой части генетического материала. Для оценки этих явлений используют спектрофотометрическое определение полидезоксирибонуклеотидных фрагментов, экстрагируемых из клеток, или их электрофоретическую идентификацию; при электрофорезе фрагменты, формируемые вследствие межнук-леосомных разрывов, образуют характерную “лесенку” (серию прерывистых полос), отражающую дискретный характер разрывов [10].

Для визуализации апоптоза используют методы, основанные на регистрации встраивания в поврежденные участки ДНК меченых олигонуклеотидов,

катализируемого терминальной дезоксирибонукле-отидилтрансферазой. Включение меченых нуклеотидов затем выявляется с помощью морфологических или цитофлуорометрических методов. К этой группе относится TUNEL-метод (TdT-mediated dUTR-biotin nick end-labeling) [17].

В настоящее время для регистрации апоптоза, в особенности при работе с лимфоцитами, все шире применяют методы, основанные на проточной ци-тофлуорометрии. К скрининговым методам этой группы относится метод, основанный на выявлении гиподиплоидных клеток (гиподиплоидия является следствием утраты в процессе апоптоза части хроматина) [29]. При этом фиксированные клетки обрабатывают иодидом пропидия, который проникает в апоптотические клетки и взаимодействует с ДНК, после чего клетки подвергают цитофлуорометрии и оценивают процент клеток во фракции, расположенной в зоне гистограммы, которая соответствует суб-диплоидному содержанию ДНК. Иногда параллельно используют другие красители для одновременного выявления некротизированных клеток и распределения нормальных клеток по циклу.

Чрезвычайно удобным и информативным является метод, при котором регистрируется ранний признак апоптоза - экспрессия на поверхности клеток фосфа-тидилсерина (в нормальных жизнеспособных клетках он располагается на внутренней поверхности плазматической мембраны и не экспонируется на поверхности; появление на поверхности клетки фосфатидилсе-рина, распознаваемого рецепторами макрофагов, служит одним из факторов, обусловливающих быстрый фагоцитоз апоптотических клеток [12]). Для обнаружения экспрессии фосфатидилсеринсерина используют конъюгат аннексина V, который обладает сродством к фосфорилсерину, с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) [40]. Существенными достоинствами метода является возможность регистрации апоптоза на ранних этапах его развития, а также надежного дифференцирования апоптоза от некроза: если одновременно с аннексином V нефиксированные клетки обрабатывают пропидия йодидом, а затем анализируют клетки методом двуцветной цитофлуорометрии, удается разграничить клетки в состоянии апоптоза (связывание аннексина V), некроза (окрашивание пропидия йодидом или связывание обоих реагентов).

На регистрации снижения трансмембранного потенциала митохондрий основан метод выявления апоптоза по изменению окрашивания липофильны-ми катионными флуорохромами (например, родамином или йодидом дигексилоксикарбоцианина), троп-ными к внутренней поверхности митохондриальной мембраны [26].

Ориентировочное представление о “склонности” лимфоцитов к развитию апоптоза можно получить, оценивая экспрессию на их поверхности Fas-рецептора (CD95) и в митохондриях - протонкогена bcl-2.

Фенотип CD95+bcl-2- соответствует высокому риску развития апоптоза, а CD95-bcl-2+ - состоянию устойчивости к нему [5, 11]. Однако следует оговорить, что фенотип CD95+bcl-2- означает лишь готовность клетки к развитию апоптоза, для реализации которой требуются дополнительные условия, в частности экспрессия на окружающих клетках Fas-лиганда и его взаимодействие с Fas-рецептором клетки-мишени. При этом именно экспрессия Fas-лиганда является “узким местом” этого взаимодействия.

Мы использовали в наших исследованиях комбинацию определения численности гиподиплоидных клеток и экспрессии фосфатидилсерина. Это позволяло оперативно и достаточно рано оценить процент лимфоцитов, подвергающихся апоптозу. Как правило, параллельно методом проточной цитофлуоромет-рии оценивалась экспрессия на поверхности лимфоцитов CD95 (Fas-рецептора).

Приводим описание использованных нами методов оценки апоптоза. Для определения гиподиплоидии клетки фиксировали 70%-ным этанолом в течение 1 ч. После отмывания их прокрашивали в течение 15 мин

0,15%-ным раствором пропидия йодида (“Sigma”, США) на физиологическом растворе, забуференном фосфатом (рН 7,4) и содержащем 0,1% тритона Х-100 и 0,1% цитрата натрия. Клетки подвергали проточной цитофлюориметрии на цитометре FACSCalibur (“Becton Dickinson”, США). Оценивали содержание клеток во фракции, находящее левее главного пика, соответствующего фракции диплоидных клеток. Апоптоз клеток выявляется этим способом через 12-24 ч после воздействия индуктора апоптоза.

При постановке “аннексинового теста” клетки не подвергали фиксации. Их суспензировали (106 в 1 мл) в HEPES-буфере, содержащем аннексин V, меченый ФИТЦ, (3 мкг/мл) и пропидия йодид (50 мкг/мл). После 5-минутной инкубации клетки подвергали двуцветной цитофлуорометрии на цитофлуориметре FACSCalibur (зеленое окрашивание аннексином определяли при 515 нм, красное окрашивание пропидия йодида - при 640 нм). На гистограммах апоптотические клетки оказываются в квадранте, соответствующем наличию окрашивания аннексином, но не пропидия йодидом, тогда как некротические клетки окрашиваются пропидия йодидом, а часть из них - также аннек-сином. Жизнеспособные клетки не окрашиваются ни одним из этих красителей. При использовании этого метода апоптоз может быть зарегистрирован уже через 2 ч после воздействия индуцирующего фактора.

Вторым важным аспектом при разработке подходов к оценке апоптоза лимфоцитов в практике клинической иммунологии является выбор способов индукции апоптоза, поскольку определение спонтанного апоптоза клеток, как правило, мало информативно. С этой целью используются различные агенты - ионизирующее и ультрафиолетовое излучение, стероидные гормоны, топоизомераза и т.д. Как выяснилось

(см. далее), некоторое усиление апоптоза Т-клеток можно вызвать обычной стимуляцией этих клеток митогенами. Для усиления активационного апоптоза CD95+ лимфоцитов используют антитела к Fas-рецептору (точнее, те варианты таких антител, которые могут индуцировать апоптоз). Подъем апоптоза может быть достигнут при повторной стимуляцией Т-клеток антителами к CD3•, однако для достижения выраженного эффекта этих антител необходимо длительное (около 20 сут) культивирование стимулированных Т-клеток [44]; антитела к CD3 вызывают интенсивный апоптоз клеток Т-гибридомы [34].

Нами использованы подходы, основанные на индукции апоптоза при стимуляции Т-клеток ФГА и его усилении моноклональными антителами к CD3 (1СО-90) и CD95. При действии антител на 3 сут стимуляции Т-лимфоцитов прирост интенсивности апоптоза хотя и наблюдался, но не был сильно выражен. Значительно более эффективным было усиление активационного апоптоза при введении в культуру стимулированных мононуклеаров крови супернатанта амебы, выделенной нами ранее из тимуса ребенка (штамм CDHT). Как сами амебоциты, так и их гуморальные продукты вызывают апоптоз тимоцитов и активированных Т-клеток, не оказывая влияния на покоящиеся лимфоциты. Супернатант вводится в культуру в разведении 1:10 на 1 или 3 сутки культивирования лимфоцитов в присутствии ФГА. Контролем служат культуры без добавления указанных агентов и с раздельным добавлением ФГА и супернатанта амебы.

Аналогичные подходы используются нами при изучении апоптоза тимоцитов - с тем различием, что при этом не требуется предварительная активация клеток, а в качестве индукторов апоптоза используется сокуль-тивирование тимоцитов с тимусными эпителиальными клетками (ТЭК) при соотношении 1:20-1:100 или вышеупомянутый супернатант амебы CDHT.

4. АПРОБАЦИЯ МЕТОДА ОЦЕНКИ АПОПТОЗА Т-ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ПРИ КЛИНИКОИММУНОЛОГИЧЕСКОМ ОБСЛЕДОВАНИИ БОЛЬНЫХ

4.1. Взаимосвязь апоптоза и пролиферации при ответе Т-лимфоцитов на стимуляцию

Ранее мы сообщали о результатах паралльного изучения уровней пролиферации и апоптоза при ответе Т-лимфоцитов на митогенную стимуляцию [3]. Здесь мы кратко подытожим результаты этого исследования. На 3 и 4 сут ответа мононуклеаров

Рис. 1. Кинетика развития пролиферации и апоптоза в популяции мононуклеаров крови человека, стимулированных ФГА.

1 - пролиферативный ответ на ФГА (включение 3Н-тимидина); 2 - апоптоз при действии ФГА (процент гипо-диплоидных клеток); 3 - апоптоз при действии ФГА и супернатанта амебы штамма CDHT.

По оси абсцисс - срок культивирования, сут; по оси ординат: для кривой 1 - включение 3Н-тимидина, имп/мин х 10-3, для кривых 2 и 3 - процент гиподиплоидных клеток.

здоровых людей на ФГА выявлена значимая отрицательная корреляция между включением Н-тими-дина (показатель пролиферации) и процентом гипо-диплоидных клеток (показатель апоптоза); коэфи-циенты корреляции равны соответственно -0,57 и -0,52, р<0,05. Это дало основание заключить, что пролиферация и апоптоз в определенной степени можно расценивать как варианты выбора клеткой формы ответа на стимуляцию.

На рис. 1 отражена динамика развития этих реакции на митогенную стимуляцию мононуклеаров крови здоровых людей in vitro. Из графиков следует, что на ранних этапах ответа преобладает пролиферация клеток (она достигает максимума на 3-4 сут), тогда как к 5 сут апоптоз достигает своего максимального уровня, который, однако, не превышает 15%. Если в культуру наряду с ФГА вводили супернатант амебоцитов штамма CDHT (разведение 1:10), выраженность апоптоза резко возрастала, затрагивая на 5 сут 40 % клеток. Повышая концентрацию клеток, можно было добиться более высокого уровня апоптоза (6070% при концентрации клеток 2106 в 1 мл).

К этим материалам, отраженным в публикации, можно добавить, что оценка экспрессии маркеров Т-, NK- и В-лимфоцитов во фракции гиподиплоидных клеток (ее осуществляли методом двуцветной проточной цитофлуорометрии) показала, что в процессе ответа мононуклеаров на ФГА из лимфоцитов указанных типов гибнут практически только Т-клетки, однако не все гибнущие клетки экспрессируют мембранные маркеры (что соответствует ранее установленным фактам). На 3 сут ответа мононуклеаров

Табл. 2. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ АПОПТОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК (ПРОЦЕНТ ГИПОДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК) В СУБПОПУЛЯЦИЯХ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ИХ ОТВЕТЕ НА ФГА В НОРМЕ И ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

Группа обследованных п Все мононуклеары CD3+ CD4+ СО о О

Доноры 8 23,6+2,3 21,6+1,8 20,4+1,9 24,5+2,1

Ревматоидный артрит 4 20,6 27,1 20,2 27,9

СКВ 10 24,0+1,6 20,4+1,9 20,3+2,0 21,3+2,5

Бронхиальная астма 4 26,8 21,1 21,1 26,2

ОВИН 3 22,2 20,3 22,3 29,2

крови здоровых доноров на ФГА доля гибнущих клеток в популяции CD3+ лимфоцитов практически не отличалась от их доли во всей популяции мононук-леаров (табл. 2). Доля клеток в апоптозе несколько выше среди CD8+, чем среди CD4+ клеток. Примерно таково же соотношение апоптотических клеток, несущих разные рецепторы, в культурах мононуклеаров крови больных различными заболеваниями. Несколько более выраженное чем у доноров преобладание гибели CD8+ клеток по сравнению с CD4+ клетками наблюдается (по предварительным данным) при ревматоидном артрите (РА) и общей вариабельной иммунологической недостаточности (ОВИН).

4.2. Индукция активационного апоптоза Т-лимфоцитов при ревматоидном артрите

Определяли апоптоз лимфоцитов больных РА и здоровых доноров, инкубированных в течение четырех суток без стимуляторов, в присутствии ФГА или ФГА и усилителей активационного апоптоза - моноклональных антител к CD3 или супернатанта амебоцитов штамма CDHT. Параллельно оценивалась пролиферативная реакция стимулированных клеток. Данные представлены на рис. 2.

Спектр апоптотических реакций лимфоцитов больных и доноров в указанных ситуациях был сходным: стимуляция ФГА сопровождалась усилением апоптоза, а комбинация ФГА с амебным супернатантом и аCD3 дополнительно увеличивала процент гибнущих клеток по сравнению с эффектом одного ФГА. Однако во всех группах процент лимфоцитов, подвергшихся апоптозу, у больных был выше, чем у доноров.

Установлена положительная корреляция между степенью активности заболевания и уровнем апопто-

за. Уровни спонтанного апоптоза и апоптоза, вызванного комбинацией ФГА и супернатанта амебы, прямо коррелировали с концентрацией С-реактивного белка в крови (соответственно г=0,53; р<0,01 и г=0,55; р<0,05). Обнаружены также отдельные связи между уровнями апоптоза, пролиферативного ответа лимфо-

К 0

К чэсог

ФГА ¿иш

ип-.н.глг

шс

I Ц0[к™ ІГО.ТПЕЕЕ

Рис. 2. Развитие апоптоза в ответ на различные воздействия у доноров и больных РА

К - контроль.

Указана достоверность различий между данными для доноров и больных.

цитов больных на активацию, и их фенотипом. Для доноров не было установлено корреляций апоптоза с другими иммунологическими показателями.

С целью определения соотношения пролиферации или апоптоза как двух форм ответа на стимуляцию мы сопоставили на одном графике (рис.3) апоптоз и пролиферацию лимфоцитов больных РА (38 человек) и доноров (21 человек) в ответ на действие ФГА, поскольку данный агент индуцирует и апоптоз, и пролиферацию. Как видно из рисунка, у 5 (13,2%) больных и 6 доноров (28,5%) процессы апоптоза и пролиферации были сбалансированы (1 квадрант). Выраженная индукция апоптоза в сочетании со слабым пролиферативным ответом (2 квадрант) наблюдалась у 15 больных (39,4%) и только у 1 донора. Высокий уровень пролиферации при слабо выраженном апоптозе (4 квадрант) наблюдался у 9 доноров (42,9%) и всего у 6 больных (15,8%). У оставшихся 12 больных и 5 доноров зарегистрированы высокие значения как апоптоза, так и и пролиферации (3 квадрант).

Таким образом, выраженность спонтанного и активационного апоптоза мононуклеаров крови (при активации ФГА - Т-клеток) при РА выше, чем у здоровых лиц, и его уровень коррелирует с показателями активности процесса. При ответе на митоген Т-клеток, полученных от больных РА, баланс проли-

/IJ

2 3

S" ;о о о

i о о С- •

JÚ i   а О О * -V * * ,

о 20  0 ф

3 10 VÍ К t 1 * ф 4

"í lü 20 30 ¿0 50 ÍG 70 80

ПРиЛ1ФЕРАЦДЯ(ИС?

Рис.3. Соотношение пролиферации и апоптоза клеток при ответе мононуклеаров крови доноров и больных РА.

◊ - ответ лимфоцитов больных РА; • - ответ лимфоцитов здоровых доноров. Квадранты: 1 - нормальное соотношение процессов апоптоза и пролиферации лимфоцитов; 2 - преобладание процессов апоптоза над пролиферацией; 3 - высокие значения апоптоза и пролиферации; 4 - преобладание пролиферации над апоптозом.

Различия показателей в областях с преобладанием процессов апоптоза и пролиферации (квадранты 2 и 4) оказались достоверными (Х2=10,24, р<0,01; с поправкой по Йетсу х2=7,92, р<0,01). Поскольку в первой области преобладали показатели больных, а во второй - доноров, можно сделать вывод о том, что у больных апоптоз являлся преобладающей формой ответа лимфоцитов на активацию.

ЛЬ

40

35

csviv* гонграль ЗГД ФГ A.-CDHT

Рис. 4. Выраженность апоптоза мононуклеаров крови здоровых людей (1), больных бронхиальной астмой (2), НВЗЛ (3) и ОВИН (4) непосредственно после выделения клеток (“ex vivo”) и на 4 сутки их культивирования без митогена (“контроль”), в присутствии ФГА (“ФГА”) или в присутствии ФГА и супернатанта клеток амебы штамма CDHT (ФГА+CDHT).

По оси ординат - процент гиподиплоидных клеток.

ферации и апоптоза сдвигается в пользу апоптоза. Эти данные свидетельствуют о том, что характер изменений, регистрируемых при РА в Т-клетках крови противоположны тем, которые описаны для Т-клеток в пораженных суставах (о снижении их чувствительности к индукции апоптоза говорилось в главе 2).

4.3. Особенности проявлений активационного апоптоза при заболеваниях легких

По аналогичной схеме исследовали чувствительность к индукции апоптоза Т-клеток больных бронхиальной астмой (БА), неспецифическими воспалительными заболеваниями легких (НВЗЛ), а также при общем вариабельном иммунодефиците (ОВИН), сопровождающемся воспалительными процессами в легких. Результаты сравнительной оценки уровней спонтанного и индуцированного апоптоза отражены на рис. 4.

Уровень спонтанного апоптоза (в группах “ex vivo” и “контроль”) был примерно одинаков у здоровых людей, больных БА и НВЗЛ и лишь при ОВИН он был повышен. После стимуляции ФГА уровень активационного апоптоза Т-клеток оказывается повышенным по сравнению с нормой при всех заболеваниях, однако и в этом случае наиболее интенсивный апоптоз наблюдается при ОВИН.

Сопоставлялось также действие усилителей апоп-тоза на фоне митогенной стимуляции Т-клеток, полученных от больных названными заболеваниями

(рис. 5). Оказалось, что и в норме и при заболеваниях реальное усиление апоптоза достигается при действии супернатанта амебы, причем оно сильнее проявляется в культурах мононуклеаров здоровых людей и слабее всего - в культуре клеток больных НВЗЛ.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Из приведенного материала следует ряд выводов, важных для определения позиции в отношении необходимости и потенциальной значимости оценки

Рис. 5. Усиливающее действие на активационный апоптоз моноклональных антител к CD3 (“анти^3”)и CD95 (“анти-Fas”), а также супернатанта клеток амебы штамма CDHT (“CDHT”) при ответе на ФГА мононуклеаров здоровых людей (1), больных БА (2), НВЗЛ (3) и ОВИН (4).

По оси ординат - коэфициенты усиления апоптоза относительно его уровня при действии одного ФГА.

апоптоза лимфоцитов при клинико-иммунологическом обследовании.

• Апоптоз наряду с пролиферацией является формой ответа зрелых лимфоцитов на внешние сигналы; поскольку эти реакции альтернативны, их параллельная оценка может дать более полные сведения о состоянии изучаемых клеток и об особенностях их реакции на внешние сигналы, чем оценка одного митогенеза. Такой расширенный подход полнее характеризует функциональные потенции лимфоцитов.

• Определение чувствительности клеток к индукции апоптоза дает возможность выявить связь патологии с усилением или ослаблением этой чувствительности. Это может иметь диагностическое значение (особенно в редких случаях наследственной патологии апоптоза). Выявление аномалий апопто-за по крайней мере потенциально должно способствовать совершенствованию патогенетической терапии соответствующих заболеваний.

В представленный материал не вошли данные о нормализации уровня апоптоза при изученной патологии, которыми мы располагаем. Эти данные дают возможно рассчитывать, что влияние лечения на состояние апоптоза лимфоцитов может стать дополнительным средством оценки нормализующего эффекта лечения на клетки иммунной системы. С другой стороны, оценка способности лекарственных средств и воздействий, а также иных факторов индуцировать апоптоз лимфоцитов позволит расширить представления о спектре биологических эффектов и механизмах действия соответствующих агентов, а также оценить пригодность препарата для использования при цитотоксической терапии конкретных пациентов (в особенности при лимфопролиферативных заболеваниях).

Список литературы

1. Коноплева Е.А. Аутоиммунный лимфопролиферативный синдром у детей: клеточные дефекты, критерии диагностики и эффективность лечения.. Дисс. ...канд.мед наук. Москва, 1999.

2. Никонова М.Ф., Буланова Е.Г., Станислав М.А., Чегаева Е.В., Литвина М.М., Шарова Н.И., Балабанова Р.М., Ярилин А.А. Различная готовность к развитию апоптоза активированных Т-лимфоцитов в норме и при СКВ // Иммунология.- 1997. - N 4.- С. 21-24.

3. Никонова М.Ф., Литвина М.М., Варфоломеева М.И., Ярилина А.А., Ярилин А.А. Апоптоз и пролиферация как альтернативные формы ответа Т-лимфоцитов на стимуляцию // Иммунология.-1999.- № 2.- С. 20-23.

4. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах //Иммунология.- 1996.- N6.- C. 10-23.

5. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его место в целостном организме // Бюлл.эксп. биол. мед.- 1998.- №2.- С. 38-48.

6. Ярилин А.А. Апоптоз и патология // В кн. “Аллергия и иммунопатология (иммунные механизмы формирования и принципы терапии)” под ред. Г.В.Порядина.- Москва, 1999.- С. 167-184.

7. Amieson J.C., Capron A. Cell dysfunction and depletion in AIDC: the programmed cell death hypothesis // Immunol.Today.- 1991.- V. 12.- P. 102-

105.

8. Berndt C., Mopps B., Angermuller S., Giershik P., Krammer P.H. CXCR4 and CD4 mediate a rapid CD95-independent cell death in CD4 T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.- V. 95.- P. 12556-12561.

9. Budagyan V.M., Bulanova E.G., Sharova N.I., Nikonova M.F., Stanislav M.L., Yarilin A.A. The resistance of activated T cells from SLE patients to apoptosis induced by human thymic stromal cells// Immunol.Letters.- 1998.- V.60.- P. 1-5.

10. Cheng J. Zhou T., Liu C., Shapiro J.P., Brauer MJ. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Gas molecule // Science.- 1994.- V. 263.- P. 1754-1762.

11. Cleveland J.L., Ihle J.N. Contenders in Fas/TNF death signaling// Cell.- 1995.- V. 81.- P. 479-482.

12. Diaz C., Schroit A.J., Role of translocations of the generation of phosphatidylserine assymmetry // J. Membr. Biol. - 1996.- V. 151.- P. 1-9.

13. Drappa J., Brot N., Elkon K.B. The Fas protein is expressed at high levels in CD4 CD8 thymocytes and activated mature lymphocytes but not in the lupus-prone strain, MRL lpr/lpr // Proc.Natl.Acad.Sci.USA.-1993.- V. 90.- P. 10340-10344.

14. Fisher D.E. Apoptosis in cancer therapy: crossing the threshold // Cell. 1994.- V. 78.- P.539-542.

15. Fisher G.H., Rosenberg F.J., Straus S.E., Dale J.K., Middlestone L.A. // Dominant interfering Fas gene mutations impair apoptosis in a human autoimmune lymphoproliferative syndrome // Cell.- 1995.- V. 81.-P. 936-946.

16. Froehlich C.J., Dixit V.M., Yang X. Lymphocyte granule-mediated apoptosis: matters of viral mimicry and deady proteases // Immunol.Today.- 1998.- V. 19.-P. 30-36.

17. Gavrieli Y., Sherman Y., Ben-Sasson S.A.// J.Cell.Biol. 1992.- V. 119.- P. 493-501.

18. Green D.R., Bissonnette R.P., Glynn J.M., Shi Y. Activation-induced apoptosis in lymphoid system / / Sem. Immunol - 1992.- V.4.- P. 379-388.

19. Groux H., Torpier G., Monte D., Mouton Y., Capron A., Amieson J.S. Activation-induced apoptosis in CD4 T cells from human immunodeficiency virus-infected asymptomatic individuals // J.Exp.Med.-

1992.- V. 175.- P. 331-340.

20. Hewish D.R., Burgoyne L.A. Chromatin substructure. The digestion of chromatin DNA at regularly spaced sites by a nuclear deoxyribonuclease // Biochim. Biophys. Res. Commun.- 1973.- V. 52.- P. 504-510.

21. Jacobson M.D. Bcl-2-related proteins get connected // Current Biology.- 1997.- V. 7.- P.277-281.

21. Kaneko H., Saito K., Hashimoto H., Yagita H., Okumura K., Azuma M. Preferential elimination of CD28 T cells in SLE and the relation with activation-induced apoptosis// Clin. Exp. Immunol.- 1996.- V.

106.- P. 218-229.

22. Kerr J.F., Wyllie A.H., Curie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Br. J. Cancer.- 1972.-V. 26.- P. 239-257.

24. Krammer P.H. CD95 (APO-1/Fas)-mediated apoptosis: live and let die // Adv. Immunol.- 1999.-V.71.- P.163-210.

25. Kroemer G. Pharmacology of T cell apoptosis // Adv. Immunol. 1995.- V.58.- P.211-296.

26. Kroemer G., Zamzami N., Susin S.A. Mitochondrial control of apoptosis // Immunol. Today.-

1997.- V.18.- P.44-51.

27. Li C.J., Friedman D.J., Wang C., Metelev V., Pardee A.B. Induction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 tat protein // Science.- 1995.-V. 268- P. 429-431.

28. Martins L.M., Earnshaw W.C. Apoptosis: alive and kicking in 1997 // Trends in Cell Biology. 1997.-V. 7.- P.111-114.

29. McCloskey T.W., Oyaizu N., Coronezi M., Pahwa S. Use of a flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes// Clin. Immunoljgy Immunopathology.- 1994.- V.71.- P. 14-18.

30. Mysler E., Bini P., DrappaJ., Ramos P., Friedman

S.M., Kramer P.H., Elkon K.B. The Apo-1/Fas protein in human SLE // J.clin Invest.- 1994.- V. 93.- P. 10291034.

31. Nagata S., Golstein P. Fas death factor // Science.- 1995.- V. 267.- P. 1449-1456.

32. Newell M.K., Haughn L.J., Maroun R.S., Julius M.C.// Nature.- 1990.- V. 347.- P. 286-289.

33. Nunez G., Hockenbery D., McDonell T.J., Sorensen C.M., Korsmeyer SJ. Bcl-2 maintains B cell memory // Nature.- 1991.- V. 353.- P. 71-73.

34. Odaka C., Kizaki H., Tadakuma T. TCR-mediated DNA-fragmentation and cell death in T cell hybridomas // J.Immunol.- 1990.- V. 144.- P. 2096-2103.

35. Puck J.M. X-linked immunodeficiencies // Adv. Hum.Genet.- 1993.- V. 21.- P. 107-135.

36. Russel J.H. Activation-induced apoptosis of mature T cells in the regulation of immune responses / / Curr. Opin. Immunol. 1995.- V. 7.- P.382-388.

37. Shaw P., Bovey R., Tardy S., Sahli R., Sordat B., Costa J. Induction of apoptosis by wild-type p53 in a human colon tumor derived cell line // Proc. Natl.Acad.Sci.USA.- 1992.- V.89.- P. 4495-4499.

38. Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide // Science.- 1995.- V. 267.- P.1145-1149.

39. Tsijimota Y., Louie E., Bashir M., Croce C. The reciprocal patterns of both the t(14;18) and the t(11;14)translocations involved in B cell neoplasms are rearranged by the same mechanism // Oncogene.- 1988.-V. 2.- P. 347-351.

40. Van Engeland M., Nieland L.J.W., Ramaekers F.C.S., Schutte B., Ruetelingsperger C.P.M. Annexin V-affinity assay: a review on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure // Cytometry.-

1998.- V. 31.- P. 1-9.

41. Umansky S.R., Korol B.A., Nelipovich P.A. In vitro DNA degradation in the thymocytes of y-irradiated or hydrocortisone-treated rats // Biochim. Biophys. Acta.- 1981.- V. 655- P.9-14.

42. Von Boehmer H., Sarukhan A., Buer J Induction of and rescue from programmed cell death // Immunologist.- 1997.- V. 5.- P. 185-190.

43. Watanabe-Fukunaga R., Brannan C.I., Copeland N.G., Jenkins N.A., Nagata S. Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediate apoptosis // Nature.- 1992.- V. 356.- P. 314-317.

44. Wesselborg S., Janssen O. Kabelitz D. Induction of activation-driven death (apoptosis) in activated but not resting peripheral blood T cells // J.Immunol.-

1993.- V. 150.- P. 4338-4345.

45. Wong B., Choi Y. Pathways leading to cell death in T cells // Curr.Op. Immunol. 1997.- V.9.- P.358-364.

поступила в редакцию 24.02.2000 принята к печати 06.03.2000