АНАЛИТИЧЕСКИЙ СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ОДНОЙ ГЛИКОФОРМЫ БЕЛКА ТРАНСФЕРРИНА
ANALYTICAL METHOD FOR IDENTIFYING AT LEAST ONE GLYCOL FORM OF TRANSFERRIN PROTEIN

Настоящее изобретение в целом относится к аналитическому способу идентификации по меньшей мере одной гликоформы и/или изоформы трансферрина, в частности, в отношении углеводдефицитного трансферрина (УДТ), возможно присутствующего в сложной биологической среде (матрице), путем приведения в контакт (функционализации) последнего указанного вещества с источником ионов лантанида 3+. Образовавшийся аддукт гликоформы иона лантанида может быть идентифицирован с помощью известных аналитических способов, предпочтительно путем детектирования флуоресценции.
Уровень техники
3+
Трансферрин представляет собой гликопротеин, выполняющий функцию транспорта железа в организме человека. Его структура характеризуется наличием двух доменов на С- идетект N-конце, каждый из которых способен связывать ион Fe. Таким образом, каждая молекула трансферрина способна связывать два иона железа, уравновешивая заряд анионом (синергический анион, обычно карбонат-ион), обычно в зависимости от pH. У клинически здоровых ("нормальных") людей, уровень насыщения железом сыворотки крови человека составляет приблизительно 30%, что означает, что указанный белок все еще имеет некоторый процент свободных участков, потенциально способных взаимодействовать с ионами 3+.
Трансферрин в его различных изоформах характеризуется высокой микрогетерогенностью как аминокислотной последовательности и последовательности гликозилирования, так и сиаловых групп. В частности, в своей структуре молекула трансферрина содержит цепи гликанов, каждая из которых обычно оканчивается остатком сиаловой кислоты. Теоретически возможно существование трансферринов с количеством остатков сиаловой кислоты от 0 до 8 (с изоэлектрическими точками (pI) от 5,1 до 5,9). Тем не менее, основная гликоформа/сиалоформа в сыворотке крови человека (65-80%), представляет собой тетрасиало-трансферрин, то есть трансферрин, содержащий четыре цепи гликанов, то есть четыре остатка сиаловой кислоты и имеющий pI 5,4 (см., например, Schellenberg et al., Clin Chem Lab Med 2013, 51 (5), 991-996 для общей информации).
Существуют гликоформы трансферрина, у которых наблюдается недостаточность цепей глицидной и сиаловой кислоты, и которые могут быть использованы в качестве диагностического маркера. Указанные гликоформы (как правило, называемые УДТ) были названы: асиало-, моно- и ди-асиало трансферрин, указанные формы содержат 0, 1 и 2 остатка сиаловой кислоты, соответственно. Кроме того, указанные гликоформы характеризуются значениями pI в диапазоне от 5,7 до 5,9.
Изменения указанных форм наблюдали при врожденных неврологических нарушениях, относимых к недостаточности гликозилирования белков (CDGS - синдромы углеводдефицитного гликозилирования). Даже во время беременности наблюдали небольшое увеличение количества углеводдефицитных трансферринов. Широко известно применение некоторых из этих гликоформ в качестве биохимических маркеров при диагностике злоупотребления алкоголем. В частности, увеличение количества дисиало-компонента при злоупотреблении алкоголем было связано как с нарушениями гликозилирования, так и с увеличением количества плазматических и мембранных процессов десиализации, что приводит к частичной десиализации трансферрина (см., например, van Eijk et al. Clin Chim Acta, 132, 20 (1983), 167-171).
Таким образом, в рамках настоящей заявки были разработаны и оптимизированы в клинических и токсикологических областях диагностики аналитические способы качественного/количественного определения количества гликоформ трансферрина, с особым вниманием к изоформам УДТ.
В патентах US 4626355 и WO 95/04932 описан способ аналитического разделения некоторых УДТ путем разделения на ионообменной твердой фазе при контролируемых условиях pH для удерживания некоторых гликоформ в колонке с обеспечением элюирования асиало-, моно- и дисиало-форм.
В US5432059 раскрыт способ детектирования гликоформ УДТ путем повторного гликозилирования белка с помощью флуоресцентного гликопротеина в присутствии подходящих реагентов и ферментов.
Кроме того, известны способы детектирования УДТ, включающие применение антител в качестве биологических маркеров, способных избирательно связываться с УДТ, что позволяет проводить последующий их анализ.
В источник ЕР 1378521 описан способ, включающий применение антител, которые - в водной среде - способны связываться с УДТ, отличающийся тем, что указанный способ позволяет избежать использования твердых фаз, которые обычно применяют для этого типа модификаций (например, см. GB 9827411).
Следовательно, существует потребность в поиске способа, который является простым в применении, который можно применять для различных типов сложных биологических сред и который является достаточно чувствителным, чтобы позволить детектировать даже небольшие изменения количества гликоформ трансферрина, с особым вниманием к углеводдефицитным трансферринам, особенно к дисиало-трансферрину.
На данный момент, заявитель обнаружил, что можно пометить трансферрин, возможно присутствующий в сложной биологической среде, ионом лантанида 3+, с получением функционализированного белка (аддукт трансферрина-иона лантанида 3+), который можно отделить от его гликоформ и детектировать с использованием аналитических способов, известных в данной области техники. Настоящий способ позволяет обеспечить высокую чувствительность, что позволяет в дополнение к идентификации и измерению различных гликоформ трансферрина, включая УДТ, как с качественной, так и с количественной точки зрения, предоставить основные показатели клинического состояния пациента, также включая возможное злоупотребление алкоголем.
Краткое описание изобретения
В своем первом аспекте настоящее изобретение относится к способу идентификации по меньшей мере одной гликоформы и/или изоформы трансферрина, возможно присутствовующих в сложной биологической среде, включающему этапы:
а. приведения в контакт указанной среды с источником ионов лантанида 3+;
б. функционализации по меньшей мере одной гликоформы и/или изоформы трансферрина с помощью ионов лантанида 3+;
в. аналитического разделения и детектирования указанной по меньшей мере одной функционализированной гликоформы и/или изоформы.
В одном из вариантов реализации настоящий способ относится к идентификации и, возможно, измерению по меньшей мере одной гликоформы трансферрина, предпочтительно углеводдефицитного трансферрина, (УДТ), еще более предпочтительно дисиалотрансферрина.
Настоящее изобретение также относится к применению настоящего способа для детектирования заболеваний или клинических состояний, связанных с изменением концентрации одной или более гликоформ трансферрина, в частности, одной или более изоформ УДТ.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к диагностическому способу детекции заболеваний или клинических состояний, связанных с присутствием одной или более гликоформ и/или изоформ трансферрина, предпочтительно углеводдефицитных трансферринов, включающему:
- сбор образца сложной биологической среды человека или животного; приведение в контакт указанного образца с источником ионов лантанида 3+;
- аналитическое разделение и детектирования, предпочтительно с помощью флуоресцентного теста, по меньшей мере одной функционализированной гликоформы трансферрина;
- возможно сравнение полученных значений с эталонными значениями, измеренными у контрольных субъектов (клинически здоровых и не злоупотребляющих алкоголем).
Краткое описание чертежей
Фиг. 1: Хроматограмма ВЭЖХ в режиме флуоресценции (возбуждение 298 нм, эмиссия 550 нм - мВ-мин) сыворотки крови человека с высоким значением содержания производного дисиалотрансферрина.
Фиг. 2: Электрофореграмма капиллярного электрофореза (КЭ) в режиме флуоресценции (возбуждение 298 нм, эмиссия 460 нм - мВ-мин - ОЕФ-мин) производной сыворотки крови человека.
Фиг. 3: Хроматограмма ВЭЖХ в режиме флуоресценции (возбуждение 298 нм, эмиссия 550 нм - мВ-мин) производной сыворотки крови человека.
Подробное описание изобретения
Термин "аналитическое разделение и детектирование" означает, что гликоформ трансферрина, функционализированных ионами лантанида 3+, идентифицируют посредством качественного разделения, например, с помощью хроматографии в соответствии с их временами элюирования, и, затем, обнаруживают и измеряют с помощью аналитических детекторов.
"Количественное разделение" означает, что гликоформы трансферрина также разделяют и выделяют после идентификации.
Если не указано иное, термин "УДТ" обозначает углеводдефицитный белок трансферрин в виде гликоформ: асиало-, моно- и диасиалоформ, которые могут присутствовать в анализируемой биологической среде.
Как упоминалось ранее, указанные гликоформы содержат остатки сиаловой кислоты в количестве меньше 3 и их pI больше или равно 5,7. Они формируются из-за отсутствия одного или более остатков сиаловой кислоты, которые в ином случае присутствуют в трансферрине в "нормальных" физиологических условиях.
3+
Выражение "маркированная или функционализированная гликоформа" обозначает рассматриваемые гликоформы трансферрина (включая углеводдефицитные трансферрины), функционализированные с помощью ионов лантанида 3+, как подробно описано ниже. На практике в результате контакта между биологической средой и источником ионов лантанида, свободные участки связывания Fe - белка заняты выбранным ионом лантанида, в некоторых случаях вплоть до насыщения, что приводит к образованию аддукта белок-лантанид, предпочтительно аддукта УДТ- ион лантанида 3+.
Как было упомянуто ранее, настоящее изобретение относится к способу, который можно применять для идентификации одной или нескольких гликоформ и/или изоформ и/или сиалоформ трансферрина и, в частности, УДТ, в сложной биологической среде, включающему приведение в контакт последнего с источником ионов лантанида 3+ (этап «а»), получение аддукта белок-ион лантанида 3+, (этап «б») и последующее аналитическое разделение и детектирование по меньшей мере одной маркированной лантанидной гликоформы (этап «в»). Предпочтительно, настоящий способ также позволяет измерять минимальные вариации процентного содержания различных гликоформ трансферрина простым, точным и воспроизводимым путем.
Биологическая среда согласно настоящему способу предпочтительно представляет собой жидкость организма человека или животного, причем особенно предпочтительной является жидкость организма человека. Более предпочтительно, биологическая среда выбрана из крови, плазмы, жидкости стекловидного тела, слюны и, предпочтительно, сыворотки крови или спинномозговой жидкости (ликвора).
В одном из вариантов реализации источник ионов лантанида 3+содержит органическую или, предпочтительно, неорганическую соль иона 3+ элемента, выбранного из: европия (Eu), тербия (Tb), эрбия (Er), празеодима (Pr), иттербия (Yb), предпочтительно тербия.
Предпочтительные соли выбраны из: хлоридов, нитратов, ацетилацетонатов, нитрилоацетатов (НТА) и ацетатов, причем особенно предпочтительным является хлорид.
В общем случае, источник иона лантанида 3+ представляет собой органический или, предпочтительно, водный раствор, содержащий соль лантанидного металла, как упомянуто выше. В случае органических растворов указанные растворы получают путем растворения соли в органическом растворителе, выбранном из: ацетонитрила, тетрагидрофурана и, предпочтительно, спиртов, содержащих от 1 до 4 атомов углерода, особенно предпочтительным является метанол. Предпочтительные водные растворы получают путем растворения соли в солевом растворе, предпочтительно в воде.
Растворы ионов лантанида, которые можно применять в настоящем способе, могут иметь конечные концентрации от 0,1 мкмоль/л до 1 мМ, например, выбранные в зависимости от типа применяемой жидкости или иона.
Перед тем этапом приведения в контакт согласно а., может оказаться целесообразным разбавить выбранную биологическую среду раствором для разбавления, таким как, например, вода или солевой раствор. В общем случае среду разбавляют в соотношении от 1:2 до 1:10, в зависимости от типа применяемого аналитического способа и/или в зависимости от состава и химических/физических характеристик среды. Это разбавление полезно для оптимизации анализа с учетом эффекта гашения, насыщения некоторой части применяемых образцов, а также защиты применяемых аналитических систем. Возможно, к образцу также может быть добавлен подходящий стабилизирующий агент, главным образом, имеющий функцию хелатирования свободного железа, то есть не связанного с белком железа. В случае ВЭЖХ-анализа стабилизирующий агент может быть добавлен во время приготовления образца или даже непосредственно в фазу для элюирования. В любом случае, наличие стабилизатора позволяет получить лучший сигнал, таким образом обеспечивая получение растворов образца с большей стабильностью, что значительно уменьшает образование в качестве производного гидроксида выбранного лантанида, который может образовываться в противном случае. Подходящие хелатирующие агенты могут быть выбраны из: ЭДТА, дефероксамина В (FeDFO, например, коммерчески доступного под названием десферал, мезилатная соль) и тому подобное. Приведение в контакт согласно этапу «а» может происходить при комнатной температуре (приблизительно в интервале от 15°C до 40°C), например, путем смешивания жидкости организма человека, возможно, разбавленной, и водного раствора, содержащего хлорид тербия, в присутствии дефероксамина В.
3+
Смеси дают отстояться в течение инкубационного периода, чтобы обеспечить функционализацию гликоформ трансферрина ионом лантанида 3+, в соответствии со этапом «б». Указанный инкубационный период позволяет обеспечить образование аддукта белок-ион лантанида 3+, предпочтительно путем насыщения свободных участков связывания Fe, и указанный период также может быть осуществлен в течение очень короткого периода времени, то есть порядка 4 или 5 минут.
Следует отметить, что аддукт, образованный на этапе «б», стабилен в течение долгого времени, и его также можно хранить в течение нескольких дней без существенных искажений при анализе и в составе обрабатываемой жидкости организма. Возможно, в конце этапа «б», можно провести промежуточный этап разделения твердой/жидкой фазы, например, путем центрифугирования, которое обычно проводят, когда проба демонстрирует наличие примеси или опалесценции, которые могут повлиять на легкость выполнения теста, или каким-то образом поставить под угрозу чувствительность способа.
Образец, содержащий аддукт трансферрин-ион лантанида 3+ подвергают аналитическому разделению и детектированию в соответствии с этапом «в».
Предпочтительно на этапе «в» проводят качественное разделение гликоформ асиало, моно- и дисиало-трансферрина (т.е. углеводдефицитных трансферринов, обозначенных УДТ в настоящем документе), причем особенно предпочтительно дисиалогликоформа.
В связи с этим, могут быть с успехом использованы аналитические способы и инструменты, известные специалисту в данной области техники, например, выбранные в зависимости от типа использованной среды или доступного количества образца (см. Biochimica Clinica, 2006, Vol 30, n. 3 pages 203-209). Предпочтительно этап «в» настоящего способа включает аналитическое разделение с помощью ВЭЖХ или капиллярного электрофореза (КЭ). В случае разделения с помощью ВЭЖХ, фаза элюента может содержать подходящее соединение, используемое в качестве ионно-парного агента для вторичного отрицательного заряда, что позволяет достигнуть лучшего разрешения конечного сигнала. Предпочтительно, указанное соединение представляет собой 1,4-диаминобутан (ДАБ). В случае разделения с помощью КЭ, подвижный буфер может содержать покрывающее соединение для уменьшения ионных взаимодействий между стенками капилляра, и разделяемым ионным аналитом, указанное соединение предпочтительно представляет собой ДАБ.
В качестве неограничивающего примера, аналитическое разделение одной или нескольких гликоформ аддукта УДТ-ион лантанида 3+ в соответствии с настоящим способом можно осуществлять с использованием колонки для слабой анионообменной ВЭЖХ, с элюированием в градиенте концентрации буферным раствором с pH, например, находящимся в интервале от 6 до 9, в присутствии возможных стабилизаторов или разделяющих агентов. Тем не менее, в качестве примера, в случае анализа с помощью КЭ можно применять капилляры с диаметром 25-50 мкм, с длиной от 20 до 100 см, с применением боратного буфера или ему подобного, возможно, содержащие следы соли ионов лантанида 3+, предпочтительно в количестве от 0,1 до 1000 мкмоль/л.
В равной мере предпочтительном варианте реализации, этап «в» включает аналитическое детектирование и измерение гликоформ трансферрина с помощью флуоресценции.
Применение флуоресцентного детектора, с использованием подходящих длин волн возбуждения и излучения, особенно удобно тем, что оно позволяет достичь оптимальной чувствительности и специфичности детектирования, позволяя измерять даже незначительные вариации в процентном содержании различных гликоформ трансферрина, в том числе УДТ.
Типичные применяемые конечные условия детекторов флуоресценции для ВЭЖХ и КЭ могут представлять собой длину волны возбуждения (ех) в интервале от 250 до 320 нм и эмиссии (em) больше или равную 400 нм.
Таким образом, на Фиг. 1 показана хроматограмма ВЭЖХ сыворотки крови человека, обработанной водным раствором хлорида тербия, полученная с детектированием флуоресценции на длинах волн: ех 298 нм, em 550 нм. Можно наблюдать сигналы дисиало- (приблизительно 13 мин), трисиало-(приблизительно 14 мин); тетрасиало- (приблизительно 15-16 мин) и пентасиалотрансферрина (между 17 и 18 мин).
На Фиг. 2 показана флуоресцентная электрофореграмма образца сыворотки, обработанного водным раствором хлорида тербия, где можно идентифицировать ди-, трисиало углеводдефицитные сигналы (при 23 и 24 мин соответственно), а также тетра- и пентасиало- формы трансферрина (от 24,5 до приблизительно 26 мин).
Как можно видеть из Фиг. 1-2, присутствие больших количеств тетрасиалотрансферрина можно применять в качестве внутреннего стандарта для времени элюирования/миграции с целью достижения более точной идентификации остальных компонентов путем измерения относительного времени.
Помимо высокой чувствительности, настоящий способ позволяет получать графики (хроматограммы/электрофореграммы), на которых мешающие анализу эффекты, обусловленные типом анализируемой биологической среды, в целом являются минимальными, в отличие от тех, что наблюдают при способах, известных из предшествующего уровня техники. В связм с этим см., например, Фиг. 2, на которой можно отметить отсутствие мешающих сигналов, макроскопически видимых при анализе, выполненном с применением традиционных способов с УФ-детектированием. Это говорит о том, что настоящий способ является также потенциально применимым для биологических сред, отличных от сыворотки крови или крови человека, в целом, обеспечивая при этом оптимальные результаты с точки зрения и четкости, и чувствительности.
Измерение площадей хроматографических пиков обеспечивает преимущество, позволяющее рассчитать процентное содержание детектированных гликоформ, что позволяет получить таким образом основную информацию о клинической/токсикологической картине отдельного пациента, например, по отношению к величинам, полученным с применением той же биологической среды у здоровых контрольных пациентов. На практике, значения, относящиеся к гликоформе, измеренные с применением настоящего способа, соответствуют процентному значению относительного пика по отношению к общему количеству белка. Например, как показано на Фиг. 3, в отношении областей дисиало (56786, 12,7 мин), трисиало (592805, на 13.9 мин) и тетра + пентасиало (10487682,16,4 мин), рассчитанное процентное содержание дисиало-гликоформы составляет 0,51% от общей площади.
В дополнительном варианте реализации настоящий способ может включать возможный этап количественного разделения «г», например, одной или более гликоформ и/или изоформ УДТ, обычно с помощью способов, известных специалистам в данной области техники, таких как, например, препаративные колонки и тому подобное.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению настоящего способа для идентификации возможных заболеваний или клинических состояний, связанных с присутствием одной или нескольких гликоформ, предпочтительно УДТ, в частности дисиало-гликоформ. Если биологическая среда, о которой идет речь, представляет собой среду человека, настоящий способ подходит для диагностирования состояния алкогольной зависимости или злоупотребления алкоголем у исследуемого пациента.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к диагностическому способу детекции заболеваний или клинических состояний, связанных с присутствием по меньшей мере одной гликоформы и/или изоформы трансферрина у живого существа, предпочтительно у человека, включающему:
- отбор пробы жидкости человека, выбранной, как указано выше;
- приведение в контакт указанного образца с источником ионов лантанида 3+, как указано выше;
- аналитическое разделение и детектирование по меньшей мере одной гликоформы и/или изоформы трансферрина, как указано выше;
- возможно, сравнение полученных значений со значениями, измеренными у здоровых контрольных субъектов.
Выражение "здоровые субъекты" обозначает людей, имеющих углеводдефицитные гликоформы, и, в частности, дисиало-гликоформы, которые являются нормальными и не ассоциированы с измененными клиническим/токсикологическими состояниями.
Помимо высокой чувствительности, настоящий способ также характеризуется простотой исполнения в том, что он не требует каких-либо конкретных реагентов или предварительных обработок анализируемого образца. Кроме того, возможность применения аналитических способов с детектированием флуоресценции также позволяет анализировать ограниченное количество биологического образца, обеспечивая высокую надежность способа. Действительно, в случае предполагаемых положительных результатов не обязательно проводить тест на подтверждение результатов, как требуется в некоторых диагностических способах согласно предшествующему уровню техники.
Еще одно преимущество заключается в том, что способ согласно настоящему изобретению также может быть адаптирован к различным типам сложных биологических сред, что делает изобретение чрезвычайно универсальным и широко применимым.
Далее настоящее изобретение будет описано в последующей экспериментальной части, предназначенной для иллюстрации и не накладывающей каких-либо ограничений.
Экспериментальная часть
Пример 1.1: получение аддукта трансферрин-ион лантанида 3+ в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.
Образец: 40 мкл образца сыворотки (или стандартного аполипротеина в концентрации приблизительно 10 мкмоль/л или контроля, применяемого в способах из предшествующего уровня техники), к которому добавили 8 мкл водного солевого раствора соли хлорида лантанида (конечная концентрация приблизительно 500 мкмоль/л), с последующим добавлением 15 мкл стабилизатора дефероксамина-В (FeDFO, например, коммерчески доступный под названием Десферал, мезилатная соль) и добавлением воды до конечного объема 150 мкл.
Пример 1.2: детектирование аддукта примера 1.1 с помощью ВЭЖХ (Фиг. 1).
Применяемая колонка представляет собой колонку WAX (слабая анионообменная CLINREP) 4,6×5 мм×см со специальной предколонкой и 0,22 мкМ фильтром с термостатированием при 50°C. Скорость потока -1 мл/мин. Подвижная фаза - 20 мМ трис-буфер при pH в диапазоне приблизительно от 7 до 9, с добавлением NaCl, 0,5 М и ДАБ (1,4 диаминобутан) в концентрации 18 мМ. Градиент от 0 до 20% фазы В. Фаза А также содержит стабилизатор Дефероксамин-В (FeDFO, десферал) в концентрации 50-100 мкмоль/л.
В конце анализа колонку регенерируют с помощью 2 М раствора хлорида 15 натрия. Общая продолжительность анализа составляет приблизительно 40 минут.
Эти условия были испытаны на образце сыворотки крови человека, обработанной хлоридом тербия, и хроматограмма показана на Фиг. 1.
Пример 1.3: детектирование аддукта примера 1.1 с помощью КЭ-анализа (Фиг. 2).
Предварительные данные показали присутствие ди-, три-, тетра- и пентасиало-изоформ трансферрина. Применяли детектор флуоресценции светодиодного типа. В проведенных исследованиях применяли капилляры с диаметром 50 мкм, длиной около 50-70 см. подвижный буфер представлял собой боратный буфер, pH 7-9, 120 мМ, содержащий ДАБ в концентрации 6 мМ, разделение проводили при напряжении 30 кВ. Образец вводили под давлением (0,5 фунтов на квадратный дюйм) и время разделения составляло приблизительно 30 минут. Обработка образца полностью аналогична той, что предусмотрена для ВЭЖХ в примере 1.2, т.е.: сыворотка (стандарт или контроль), добавление солевого раствора лантанида (конечная концентрация во вводимой пробе 500 мкмоль/л).
На Фиг. 2 показан спектр КЭ, полученный с применением образцов сыворотки, обработанной хлоридом тербия.