Способ выделения целлюлозы из биомассы арктических бурых водорослей
METHOD FOR ISOLATING CELLULOSE FROM THE BIOMASS OF ARCTIC BROWN ALGAE

Изобретение относится к технологии комплексной переработки бурых водорослей. Областью применения предлагаемого изобретения является медицинская, лечебно-профилактическая, фармацевтическая сфера.
Бурые водоросли являются источником получения широкого спектра биологически активных веществ: альгинатов, маннита, хлорофилла, жирных кислот. В процессе одной из технологических стадий получения альгинатов образуется водорослевая клетчатка, основу которой составляет целлюлозная матрица. По результатам ранее проведенных авторами изобретения исследований, содержание целлюлозы в ламинариевых видах водорослей варьирует в пределах 4.75 - 6.10% масс. [К.Г. Боголицын, А.Э. Паршина, А.С. Дружинина, Е.В. Шульгина. Сравнительная характеристика химического состава некоторых представителей бурых водорослей Белого и Желтого морей / Химия растительного сырья. 2020. №3. С. 35-46]. Однако имеются сведения о содержании целлюлозы в альгинофитах и агарофитах на уровне 10-13% [Siddhanta AK, Prasad K, Meena R, et al (2009) Profiling of cellulose content in Indian seaweed species. Bioresour Technol 100:6669-6673].
Свойства продуктов, получаемых на основе водорослевой целлюлозы (в первую очередь композиционных и сорбционных материалов) зависят от таких параметров как: окисленность целлюлозы, ее функциональный состав, механические свойства, степень кристалличности и упорядоченности, степень полимеризации и др. [Doh H, Lee MH, Whiteside WS (2020) Physicochemical characteristics of cellulose nanocrystals isolated from seaweed biomass. Food Hydrocoll 102:105542; El-Sakhawy M, Hassan ML (2007) Physical and mechanical properties of microcrystalline cellulose prepared from agricultural residues. Carbohydr Polym 67:1-10; Kazharska M, Ding Y, Arif M et al (2019) Cellulose nanocrystals derived from Enteromorpha prolifera and their use in developing bionanocomposite films with watersoluble polysaccharides extracted from E. prolifera. Int J Biol Macromol 134:390-396].
Целлюлоза является ценным компонентом водорослей. Доказано противовоспалительное действие водорослевой целлюлозы, например ослабление воспалительных процессов в кишечнике [Azuma K, Osaki T, Ifuku S et al (2013) Suppressive effects of cellulose nanofibers-made from adlay and seaweed-on colon inflammation in an inflammatory bowel-disease model. Bioact Carbohydr Diet Fibre 2:65-72]. Пленки на основе водорослевой целлюлозы применяются для лечения ран [Hua K,  Mihranyan A, Ferraz N (2015) Nanocellulose from green algae modulates the in vitro inflammatory response of monocytes/macrophages. Cellulose 22:3673-3688]. Водорослевая целлюлоза как фильтровальный материал удерживает частицы размером 20 нм, в том числе вирусы [Quellmalz A, Mihranyan A (2015) Citric acid cross-linked nanocellulose-based paper for size-exclusion nanofiltration. ACS Biomater Sci Eng 1:271-276]; является эффективным сорбентом красителей (моделирующих низкомолекулярные токсиканты), а также ионов тяжелых металлов [Sebeia N, Jabli M, Ghith A et al (2019) Production of cellulose from Aegagropila linnaei macro-algae: chemical modification, characterization and application for the bio-sorption of cationic and anionic dyes from water. Int J Biol Macromol 135:152-162; Bogolitsyn KG, Ovchinnikov D V., Kaplitsin PA, et al (2017) Isolation and structural characterization of cellulose from Arctic brown algae. Chem Nat Compd 53:533-537]. Однако, по сравнению с использованием других компонентов водорослей (альгинатов, фукоидана, ламинарана) такие исследования немногочисленны, и, до настоящего времени, водорослевая целлюлоза не нашла широкого применения.
Большинство научных работ посвящено выделению из бурых водорослей целлюлозы в чистом виде [Baba HS, Baba HMB, Kassouar S, Abi AS-ME-A (2016) Physicochemical analysis of cellulose from microalgae Nannochloropsis gaditana. Afr J Biotechnol 15:1201-1207; He Q, Wang Q, Zhou H et al (2018) Highly crystalline cellulose from brown seaweed Saccharina japonica: isolation, characterization and microcrystallization. Cellulose 25:5523-5533], с дальнейшей функционализацией путем гидролиза до микро- и наноструктурных материалов [Chen YW, Lee HV, Juan JC, Phang SM (2016) Production of new cellulose nanomaterial from red algae marine biomass Gelidium elegans. Carbohydr Polym 151:1210-1219; Doh H, Lee MH, Whiteside WS (2020) Physicochemical characteristics of cellulose nanocrystals isolated from seaweed biomass. Food Hydrocoll 102:105542; Feng X, Meng X, Zhao J et al (2015) Extraction and preparation of cellulose nanocrystals from dealginate kelp residue: structures and morphological characterization. Cellulose 22:1763-1772].
В последнее время актуальным становится получение целлюлозных материалов из твердых остатков от других производственных процессов [Gao H, Duan B, Lu A et al (2018) Fabrication of cellulose nanofibers from waste brown algae and their potential application as milk thickeners. Food Hydrocoll 79:473-481; Liu Z, Li X, Xie W, Deng H (2017) Extraction, isolation and characterization of nanocrystalline cellulose from industrial kelp (Laminaria japonica) waste. Carbohydr Polym 173:353-359], например, водорослевый остаток после получения агар-агара [El Achaby M, Kassab Z, Aboulkas A et al (2018a) Reuse of red algae waste for the production of cellulose nanocrystals and its application in polymer nanocomposites. Int J Biol Macromol 106:681-691; Martı'nez-Sanz M, Cebria'n-Lloret V, Mazarro-Ruiz J, Lo'pez-Rubio A (2020) Improved performance of less purified cellulosic films obtained from agar waste biomass. CarbohydrPolym 233:115887].
В настоящее время существуют многочисленные разработки в области переработки бурых водорослей и получения из них ценных продуктов.
- Известен способ получения полисахаридсодержащих полимерных матриц [Патент RU 2657608 C1, 2018 г.], при этом в качестве раствора полисахарида в одном из вариантов используют водный раствор фукоидана, полученный фракционной экстракцией из бурой водоросли Laminaria saccharina. Изобретение позволяет получать полимерные матрицы, используемые в качестве оболочек микрокапсул. При этом такие полимерные матрицы могут храниться до 3 лет без агрегирования и потери активности инкапсулированного вещества. Использование биосовместимых полисахаридов позволяет использовать микрокапсулы в качестве лекарственных средств, обеспечивающих pH-чувствительное высвобождение активного инкапсулируемого вещества.
- Авторы изобретения [Патент RU 2699362, 2019 г] предлагают использовать композицию на основе наночастиц диоксида церия и полисахаридов бурых водорослей для лечения ран, ожогов, воспалительных состояний кожи и слизистых оболочек. Композиция наружного применения содержит эффективное количество наночастиц оксида церия, фармацевтически приемлемый носитель, целевую добавку и воду. Указанный носитель включает водорастворимые производные целлюлозы и водорастворимые полисахариды бурых водорослей - пектин, фукоидан и альгинат. При этом носитель нетоксичен, биосовместим и проницаем для воздуха и влаги. В качестве целевой добавки могут выступать:
иммуномодуляторы, антибактериальные препараты, стимуляторы репаративных процессов, анальгетики, анестетики, противовоспалительные агенты, антиоксиданты, витамины, полисахариды или их смеси.
Отмечается простота и удобство применения композиции в процессе лечения, а также синергетическое действие компонентов, входящих в ее состав.
Также в качестве раневого покрытия может быть использован материал природного происхождения,содержащий бактериальную целлюлозу в качестве матрицы-носителя и антибактериальный компонент, выделенный из бурых водорослей, а именно фукоидан [Патент RU 2706726 C1 2019 г.]. Изобретение предназначено для лечения ожогов 2-4 степени.
Вместе с тем, синтез пленок бактериальной целлюлозы в больших количествах является сложным и дорогостоящим процессом. Использование водорослевой целлюлозы, способ выделения которой предложен в настоящем изобретении, могло бы способствовать снижению затрат на производство раневых покрытий и повысить эффективность переработки ценного водорослевого сырья.
Все вышеперечисленные разработки направлены на выделение и использование наиболее ценных углеводных компонентов бурых водорослей. Однако, в целях наиболее полной переработки водорослевого сырья необходимо также уделять внимание использованию других компонентов, входящих в состав белково-полисахаридного комплекса бурых водорослей, в том числе, содержащейся в наибольшем количестве, водорослевой целлюлозе. Зачастую, данный компонент рассматривается как побочный продукт. Но, с учетом доказанных важных свойств водорослевой целлюлозы, таких как сорбционные, антиоксидантные, антибактериальные, необходимо расширять области применения данного компонента.
Известно изобретение, основанное на получении биоразлагаемых полимерных композиций, содержащих синтетические и природные полимеры [Патент RU 2674212 C1, 2018 г.]. Получаемые материалы могут быть использованы в производстве тары и упаковки, упаковочных и сельскохозяйственных пленок, других товаров потребительского назначения с коротким сроком использования, способных к биодеструкции под воздействием факторов окружающей среды.
Биоразлагаемая полимерная композиция состоит из смеси полиэтиленов высокого и низкого давления преимущественно из отходов производства и/или вторичного сырья и порошковой целлюлозы, выделенной из морских бурых водорослей, преимущественно рода фукус, при следующем содержании компонентов, мас.%: полиэтилен 50-90, порошковая целлюлоза 10-50. Технический результат изобретения заключается в повышении стабильности эксплуатационных свойств получаемой продукции при одновременном удешевлении композиции и упрощении способа ее приготовления.
Необходимо отметить, что в настоящее время использование упаковочных материалов на основе биоразлагаемых полимеров признано псевдоэкологичным решением. Добавки, для ускоренного распада пластиковой упаковки ускоряют образование микропластика, но не способствует полному его разложению, также они мешают использовать материал повторно. Биоразлагаемый пластик препятствует переработке обычного, так как добавка может испортить качество целой партии сырья.
Целлюлоза, выделенная из водорослей, может быть использована во многих других областях, без нанесения ущерба для окружающей природной среды.
3
Авторами изобретения [Патент DE10140772A1, 2003 г] предложен способ получения формованных изделий и профилей из целлюлозы с включенными водорослями. Содержание бурых водорослей в волокне составляет 11,39 мас.%. Формованные изделия могут адсорбировать тяжелые металлы, в том числе серебро из раствора AgNO, при этом достигают содержания серебра 1885 мг/кг волокна. Формованные изделия, содержащие ионы серебра, могут быть использованы в качестве антибактериального и/или фунгицидного материала. Содержание серебра, адсорбированного волокнистым материалом, составляет около 70 мг/кг в расчете на общий вес формованного изделия. За счет содержания водорослей в формованном изделии, изменяется относительно ограниченная способность связывания тяжелых металлов. При этом связывание происходит за счет различных механизмов, в том числе ионного обмена и комплексообразования.
В данном изобретении сорбционные свойства водорослевой целлюлозы рассмотрены только по отношению к «полезному» тяжелому металлу - ионам серебра, обладающим бактерицидным действием. Вместе с тем, авторами настоящего изобретения в предыдущих работах, установлена эффективность сорбции и по отношению к опасным тяжелым металлам (кадмий, свинец, хром) и среднемолекулярным токсикантам, на примере красителей метиленового синего и метилового оранжевого. Потенциально возможные направления использования водорослевой целлюлозы не ограничиваются только лишь использованием в качестве сорбентов.
Известен способ получения целлюлозного полуфабриката из бурых водорослей [Патент RU 2556115, МПК С08В 15/02, 2014 г.], заключающийся в последовательной обработке сырья 5-6% серной кислотой при температуре кипения и последующим кипячением твердого остатка с 2,5-5,0% гидроксидом калия, промывание и сушку целевого продукта. Недостатком способа является значительная гидролитическая деструкция целлюлозной составляющей сырья ввиду использования повышенных температур и агрессивных сред, отсутствие перспективы использования продуктов в качестве сорбента, разрушение прочих водорослевых биологически активных веществ, что ставит под вопрос экономическую эффективность получения данного продукта.
Наиболее близкими к предлагаемому способу являются результаты исследований, направленных на получение и изучение состава и свойств белково-полисахаридных комплексов бурых водорослей [К.Г. Боголицын, А.Э. Паршина, А.С. Дружинина, Е.В. Шульгина. Сравнительная характеристика химического состава некоторых представителей бурых водорослей Белого и Желтого морей. // Химия растительного сырья. - 2020. - №3. - С. 35-46].
Авторами предложена схема экстракции биомассы бурых водорослей с получением различных компонентов макрофитов, которые имеют высокий потенциал дальнейшей переработки и применения.
Препараты белково-полисахаридных комплексов, содержащие в основной массе целлюлозную и белковую составляющую, получают из измельченных водорослей путем сверхкритической флюидной экстракции углекислым газом с использованием этанола в качестве сорастворителя, дальнейшей экстракции обезжиренных водорослей раствором соляной кислоты в трех повторностях, промывки биомассы дистиллированной водой до нейтральной реакции, экстракции раствором карбоната натрия для удаления альгинатов в три последовательных стадии, отмывки биомассы водой в шесть стадий и ее лиофильной сушки.
Laminaria saccharina и
Laminaria digitata.
Результаты исследований, представленные в прототипе, в основном направлены на сравнительную характеристику химического состава различных видов бурых водорослей, в том числе Арктических бурых водорослей Схема экстракции бурых водорослей, представленная в прототипе, позволяет получить широкий спектр химических компонентов, но не учитывает возможность более полной переработки биомассы водорослей, с получением в качестве конечного, не менее ценного продукта водорослевой целлюлозы, а не белково-полисахаридного комплекса.
Целью предлагаемого изобретения является разработка способа выделения целлюлоз из белково-полисахаридных комплексов бурых водорослей и характеристика выделенных целлюлозных образцов.
Техническим результатом изобретения является усовершенствование схемы комплексной безотходной переработки арктических бурых водорослей с возможностью получения водорослевой целлюлозы с широким спектром применения.
Технический результат достигается в результате установления оптимальных условий, способствующих получению наиболее чистых образцов целлюлозы с максимально-возможным выходом.
В отличие от прототипа в предлагаемом изобретении из бурых водорослей выделяют целлюлозу, путем включения в схему выделения белково-полисахаридного комплекса двух стадий отбелки 30%-ным раствором пероксида водорода при температуре 90°С, при продолжительности каждой стадии 1,5 часа и гидромодуле 1:50; а также стадии лиофильной сушки выделенной целлюлозы при давлении 8,9 Па, температуре ледового конденсатора -55,4°С, в течение 24 часов с предварительным замораживанием препаратов целлюлозы при -20°С в течение 8 ч.
Усовершенствование схемы разделения биомассы бурых водорослей с получением водорослевой целлюлозы, дает возможность расширения сфер использования полезных продуктов на основе водорослей и способствует их более полной, комплексной переработке.
Схема выделения целлюлозы из водорослей представлена на фиг. 1 и предусматривает выделение белково-полисахаридного комплекса (БПК), его селективное разделение с получением целевого продукта - малоизмененных препаратов нативной водорослевой целлюлозы (альгулезы) и последующую сушку выделенных препаратов лиофильным способом.
Laminaria digitata
Saccharina latissima
Laminaria saccharina
Целлюлозу получали из белково-полисахаридных комплексов бурых водорослей  и  ().
Первый этап - из массы водоросли (1) проводили извлечение липидно-пигментного комплекса (2) путем сверхкритической флюидной экстракции (СКФЭ) на установке ASFE, Waters, США. Экстракцию проводили при давлении 300 атм, 80°С углекислым газом с этанолом в качестве сорастворителя, скорость подачи 6 мл/мин (CO2), 0.6 мл/мин (этанол), время экстракции - 1 ч. Далее обезжиренную водорослевую массу (3) подвергали последовательно кислотной, щелочной и водной экстракции при термостатировании и постоянном перемешивании. В ходе трехкратной кислотной экстракции HCl при 60°С извлечена совокупность водорастворимых компонентов (4). После кислотной экстракции биомасса (5) была промыта дистиллированной водой до нейтральной реакции и подвергнута экстракции 1.5%-ным (мас.) раствором карбоната натрия для извлечения альгинатов (6). Водорослевый остаток (7) подвергали экстракции водой для удаления остаточных количеств водорастворимых веществ (8) при температуре 60°С в 6 стадий с получением белково-полисахаридного комплекса (9).
Водорослевую целлюлозу (10) получали путем отбелки БПК перекисью водорода.
Для оптимизации процесса отбелки варьировали следующие параметры:
- концентрация перекиси водорода: 10, 20, 30%
- температура отбелки: 70, 80, 90°С
- количество стадий отбелки: 1, 2.
Отбелку проводили в термостатирующем устройстве с периодическим перемешиванием с гидромодулем 1:50, время одной стадии отбелки - 1,5 ч.
В результате экспериментов по отбелке были получены образцы целлюлозы с различной степенью удаления сопутствующих компонентов. С учетом степени чистоты полученных материалов, установленной методом ИК-спектроскопии (фиг. 2), определено, что оптимальными условиями отбелки являются:
- концентрация перекиси водорода 30% (мас.)
- температура отбелки 90°С
- две стадии по 1,5 ч
- гидромодуль 1:50.
Laminaria saccharina и
Laminaria digitata,
При данных условиях выходы целлюлозы из БПК составили: 49,8% (мас.) и 49,6% для водорослей соответственно.
Исследовано влияние трех методов сушки (вакуумной, лиофильной и сверхкритической) на физикохимические свойства и макроскопическую структуру водорослевых целлюлоз. Сравнение способов сушки позволило сделать вывод, что наиболее оптимальным методом, исходя из полученных характеристик целлюлозы (степени кристалличности, удельной поверхности, пористости и др.), а с другой стороны, доступности и стоимости метода - является метод лиофильной сушки (ЛС).
Сушка в условиях лиофилизации позволяет получить малоизмененные структуры без агрегации, при этом достигается высокая дисперсность частиц и низкая усадка материала, благодаря отсутствию капиллярных напряжений при дегидратации [Cassanelli M., Prosapio V., Norton I., Mills T. // Food Bioprocess Technol. 2019. Vol. 12. No 2. P. 313.; Liu J., Jiang W., Zeng J-B., Yang Q., Wang Y-J., Li F-S. // Def. Technol. 2014. Vol. 10. No 1. P. 9.; К.Г. Боголицын, А.Э. Паршина, Н.В. Шкаева, Л.А. Алешина, А.И. Прусский, О.В. Сидорова, Н.И. Богданович, М.А. Архилин. Влияние вида сушки на структурно-поверхностные характеристики целлюлозы бурых водорослей. // Сверхкритические флюиды: теория и практика. - 2021. - Том 16. - №2. - С. 110 - 130].
Таким образом, включение в схему выделения белково-полисахаридного комплекса стадии двухкратной отбелки перекисью водорода и лиофильной сушки позволяет получить общую схему разделения биомассы бурых водорослей с получением в качестве конечного продукта водорослевой целлюлозы.
Характеристика выделенных образцов водорослевых целлюлоз.
Целлюлоза бурых водорослей представляет собой рыхлый материал белого цвета. По результатам данных сканирующей электронной микроскопии (фиг. 3), образцы имеют волокнистую природу с тонкой сетчатой структурой.
Целлюлоза, полученная из бурых водорослей, обладает низкой степенью полимеризации в сравнении с древесными образцами, для которых степень полимеризации по литературным данным составляет от 6000 до 14000 ед. Показатель медного числа выше, чем для древесных целлюлоз, что указывает, во-первых, на невысокую СП, во-вторых, на наличие слабовыраженных окислительных процессов, сопровождающих ее выделение (таблица 1, см. графическую часть).
L. digitata
S. latisssima
Методом рентгеновской дифракции определена степень кристалличности двух образцов целлюлозы. При определении на просвет степень кристалличности двух образцов незначительно различается и составляет: 58% - для целлюлозы и 48% - для целлюлозы ; в режиме отражения значения совпадают и составляют 64%.
Методом термогравиметрии были установлены характеристики термической устойчивости образцов (таблица 2, см. графическую часть). Целлюлозы двух видов бурых водорослей обладают схожими свойствами, некоторые расхождения могут быть обусловлены структурными характеристиками целлюлоз, в том числе размерами кристаллитов, степенью их упорядоченности и упаковки. Низкое содержание остатка после нагрева до 600°С в инертной атмосфере указывает на чистоту полученных материалов.
L. digitata
S. latissima
3
2
Для целлюлоз бурых водорослей были установлены параметры их пористой структуры методом низкотемпературной сорбции-десорбции азота. Выявлено, что целлюлозы  и  - мезопористые материалы (объем мезопор 0,021 и 0,023 см/г, соответственно) с удельной поверхностью 9,72 и 8,48 м/г, соответственно. Средний диаметр пор составляет 9,09 и 11,05 нм, что является достаточным для сорбции не только неорганических ионов, таких как ионы тяжелых металлов, но и для сорбции среднемолекулярных органических токсикантов.
Вышеописанный способ выделения целлюлозы из бурых водорослей поясняется следующими примерами.
Пример 1
Laminaria digitata,
Образец белково-полисахаридного комплекса массой 2 г, выделенный из биомассы водоросли помещали в колбу объемом 250 мл и проводили отбелку путем обработки раствором пероксида водорода при гидромодуле 1:50 в две стадии в термостатирующем устройстве с периодическим перемешиванием. Между стадиями отбелки суспензию фильтровали на стеклянном фильтре, затем биомассу обратно количественно переносили в колбу с использованием раствора перекиси. Продолжительность каждой стадии составляла 1,5 часа. При этом варьировали температуру отбелки: 70, 80, 90°С; и концентрацию пероксида водорода: 10, 20, 30%. По окончании отбелки проводили отмывку целлюлозы дистиллированной водой на фильтре. Выход целлюлозы составил 49,6%.
Пример 2
Saccharina latissima.
Отбелку проводили способом, аналогичным описанному в примере 1, с использованием белково-полисахаридного комплекса, выделенного из биомассы водоросли Выход целлюлозы составил 49,8%.
Пример 3
Перед проведением лиофильной сушки образцы водорослевых целлюлоз предварительно замораживали при температуре -20°С в течение 8 ч. Лиофилизацию проводили на приборе Lyovapor L-200 (BUCHI, Швейцария) при давлении 8,9 Па, температуре ледового конденсатора -55,4°С, в течение 24 ч.
Пример 4
-1
-1
-1
Для записи ИК спектров использовали образцы целлюлозы, выделенные из бурых водорослей при различных параметрах отбелки и образец микрокристаллической целлюлозы (образец сравнения). Образцы водорослевой целлюлозы исследовались после высушивания лиофильным способом. Образец микрокристаллической целлюлозы находился в воздушно- сухом состоянии. ИК-спектры образцов водорослевых и микрокристаллической целлюлоз записывали в диапазоне от 4000 до 600 см с помощью ИК-спектрометра Prestige 21 (Shimadzu, Япония) с приставкой нарушенного полного внутреннего отражения MIRacle (Pike Tech., США) с кристаллом из селенита цинка (Pike, США) при разрешении 4 см, число сканирований 128. ИК-спектры (фиг. 2) анализировались в координатах: поглощение (Absorbance) - волновое число (Wavenumber, cm).