СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БУСЕРЕЛИНА И ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
WAY OF BUSERELIN PRODUCTION AND INTERMEDIATE COMPOUNDS FOR ITS PRODUCTION

Изобретение относится к области фармацевтической химии, конкретно к новому способу получения нонапептидэтиламида формулы:
и промежуточным соединениям для его получения.
Нонапептидэтиламид известен под названием бусерелин и представляет собой синтетический аналог природного гонадотропинрилизинг гормона, обладающего сильной LH-RH/FSH-RH-активностью [1].
Известен способ получения бусерелина путем конденсации фрагментов пептидной цепи, по схеме: 1-3+4-9 или 1-2+3-9 [2].
Недостатком известного способа получения бусерелина является низкий выход целевого продукта и необходимость защиты боковой гуанидиновой группы аргинина в процессе синтеза нитрогруппой, которая удаляется с большими трудностями и процесс ее удаления является весьма длительным.
Из патента РФ №2086561, 10.08.1997 [3] известен способ получения нонапептидэтиламида, обладающего сильной LH-RH/FSH-RH-активностью, формулы
Нонапептидэтиламид получается конденсацией пептидных фрагментов 1-4 формулы
t
2
5
и 5-10 формулы H-Tyr-D-Ser(Bu)-Leu-Arg-Pro-NH-CH с последующей очисткой и выделением.
Способ осуществляется по следующей схеме 4+5, согласно которому тетрапептид формулы (II)
конденсирует с пентапептидом формулы (III)
,
полученным каталитическим гидрогенолизом защищенного пентапептида формулы (IV)
,
где Z - карбобензоксигруппа; Bzl - бензильная группа.
При конденсации тетрапептида (II) и пентапептида (III) могут быть использованы обычные в пептидном синтезе методы конденсации, например карбодиимидный метод.
Тетрапептид формулы (II) является известным и используется в синтезе полипептидов.
Этот известный способ позволяет получить конечный продукт с высоким выходом, но не обеспечивает высокий выход промежуточных продуктов на отдельных стадиях.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предложенному способу является способ получения нонапептидэтиламида формулы (I) конденсаций пептидных фрагментов по схеме 2+7, согласно которому дипептид формулы:  подвергают взаимодействию с гептапептидом формулы
в диметилацетамиде в присутствии дициклогексилкарбодиимида и 1-оксибензотриазола. Защитные группы удаляют и целевой продукт очищают и выделяют в виде моноацетатной соли [4].
Недостатком данного способа получения нонапептидэтиламида формулы (1) является низкий выход (30%) целевого продукта на последней стадии синтеза, кроме того, использование Dnp-защищенного гистидина увеличивает общее количество стадий синтеза, а использование защищенного производного O-трет.бутил-D-серина на стадии получения гептапептида усложняет процесс за счет дополнительных стадий по получению N-защищенного производного O-трет.бутил-D-серина и ведет к снижению выхода в целом.
Технической задачей заявленного способа является упрощение процесса получения бусерелина и повышение выхода конечного продукта.
Поставленная техническая задача достигается заявленной группой изобретений.
В заявленную группу изобретений входит способ получения бусерелина формулы (I)
t
2
5
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu)-Leu-Arg-Pro-NH-CH·2ACOH (в виде ацетатной соли) путем конденсации защищенного дипептида формулы (IIa): X-pGlu-His-OH, где Х - защитная группа, с C-концевым гептапептидом формулы (III) , последующей обработки деблокирующим агентом полученного N-защищенного нонапептидэтиламида формулы (IV)  для удаления N-защитной группы и выделения (IV) и очисткой конечного продукта с помощью хроматографии.
Защитная группа, в частности, представляет собой бензилоксикарбонил (Z), а деблокирование N-защищенного нонапептидэтиламида формулы (IV) осуществляют последовательно путем каталитического гидрирования в присутствии 5% катализатора палладий/на угле (Pd/C).
Другим изобретением заявленной группы является трипептид формулы (V)
,
где Z - бензилоксикарбонил, Bzl - бензил, в качестве промежуточного соединения при получении нонапептидэтиламида формулы (I)
являющегося одним из изобретений заявленной группы.
Еще одним изобретением заявленной группы является дипептид формулы (IIб)
,
где Z - бензилоксикарбонил, в качестве промежуточного соединения при получении нонапептидэтиламида формулы (I)
t
2
5
Итак, поставленная цель достигается описываемым способом, согласно которому синтез бусерелина осуществляют путем блочного наращивания пептидной цепи, начиная с C-концевого гептапептида формулы Н-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu)-Leu-Arg-Pro-NH-CH, который конденсируют с дипептидом формулы Z-pGlu-His-OH, а на стадии получения C-концевого гептапептида используется бензилоксикарбонил-D-серин.
Список сокращений
Boc - трет.-бутилоксикарбонил
Bzl - бензил
Z - бензилоксикарбонил
Dnp - 2,4-динитрофенил
Et - этил
ДЦГК - N,N′-дициклогексилкарбодиимид
ДЦГМ - N,N′-дициклогексилмочевина
ДМФА - N,N-диметилформамид
EtOH - этанол
HOBt - 1-гидроксибензотриазол
HONp - паранитрофенол
HOPfp - пентафторфенол
TFA - трифторуксусная кислота
MeOH - метанол
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ТСХ - тонкослойная хроматография
Экспериментальная часть
В синтезе используют производные L-аминокислот фирмы Bachem (Швейцария), DCC, HOBt, HONp и HOPfp фирмы Fluka (Швейцария). ДМФА очищают перегонкой над нингидрином и окисью бария. Аналитическую ВЭЖХ проводят на хроматографе фирмы Gilson (Франция).
ТСХ проводят на стеклянных хроматографических пластинках Merck-Kiselgel (ФРГ) в следующих системах растворителей:
А - хлороформ:метанол:АсОН 9:1:0.5 (Fijino)
А1 - хлороформ-метанол-уксусная к-та 5-3-1
Б - хлороформ:метанол:32% АсОН 15:4:1
В - хлороформ:метанол:32% АсОН 5:3:1
Г - хлороформ:метанол:этилацетат 6:3:1
Д - Хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода 60:45:6:14
Е - Этилацетат-пиридин-уксусная кислота-вода 120:20:6:11.9
1
6
H-ЯМР - спектры снимают на спектрометре WH-500 Bruker 500 МГц (ФРГ) в DMSO-d при 300 K. Химические сдвиги (δ, м.д.) измеряют относительно тетраметилсилана. Масс-спектры регистрируют на масс-спектрометре Analytical Compact MALDI 4 фирмы Kratos (Великобритания).
Изобретение иллюстрируется следующим примером
Пример. Получение гептапептида формулы (III)
1. Бензиловый эфир бензилоксикарбонил-O-трет.бутил-D-серил-лейцин
2
4
3
4,8 г (20,0 ммоль) бензилоксикарбонил-O-серина (Z-D-Ser-ОН) растворяли в 30 мл ДМФА, добавляли 2,22 мл N-метилморфолина. Реакционную смесь охлаждали до -30°C и добавляли к ней при перемешивании 2,6 мл изобутилхлорформиата. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при -20°C и добавляли к ней раствор 8,0 г тозилата бензилового эфира лейцина Tos·H-Leu-OBzl. Полноту протекания реакции контролировали с помощью ТСХ в системе 2. Через 30 минут реакционную смесь упаривали, остаток растворяли в этилацетате, промывали раствором бикарбоната натрия, водой, разбавленным раствором серной кислоты, водой, органический слой отделяли, упаривали, к остатку добавляли бензол и вновь упаривали, остаток растворяли в эфире, выпавшие при стоянии кристаллы отделяли и сушили. Продукт растворяли в 100 мл диоксана, полученный раствор помещали в стеклянный автоклав, который охлаждали на ледяной бане, добавляли 6 мл HSO и 200 мл изобутилена. Реакционную смесь перемешивали в закрытом автоклаве при комнатной температуре в течение трех суток, охлаждали, открывали и содержимое выливали в раствор 8 г NaHCO в 400 мл воды + 600 мл серного эфира. Реакционную смесь промывали водой до рН 7, упаривали и получали 4.1 г подвижного масла, которое при стоянии (комнатная температура) закристаллизовалось. Полученные кристаллы растирали с гексаном, отфильтровывали и сушили. В итоге получали 9,5 г (95%) хроматографически однородного продукта (ТСХ в системе этилацетат-гексан 1:1).
2. Получение трипептида формулы (V)
Бензилоксикарбонил-O-бензил-тирозил-O-трет.бутил-D-серил-лейцин
2.4 г (4.8 ммоль) Бензилового эфира бензилоксикарбонил-O-трет.бутил-D-серил-лейцин  гидрировали в этаноле в присутствии 2,4 мл 40% раствора тритона Б. Катализатор отфильтровывали, промывали на фильтре этанолом, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 20 мл ДМФА и добавляли р-р 2.52 г (4.8 ммоль) п-нитрофенилового эфира бензилоксикарбонил-O-бензил-тирозина (Z-Tyr(Bzl)-ONp) в 20 мл ДМФА. Полноту протекания реакции контролировали с помощью ТСХ в системе В. Реакционную смесь упаривали, остаток пытались растворить в воде. Вещество растворилось только при добавлении этилацетата. Органический слой промывали раствором лимонной кислоты, водой до нейтральной реакции. Органический слой упаривали с бензолом. При переосаждении из этилацетата гексаном образуется масло.
Супернатант трижды декантировали, остаток растворяли в эфире, при стоянии при комнатной температуре выпали кристаллы, кристаллы отфильтровывали, промывали эфиром, сушили. Получено 3,25 г (90%) химически однородного V.
α
3. Этиламид N-бензилоксикарбонил-аргинил-пролина
α
6.16 г (20 ммоль) N-бензилоксикарбонил-аргинина (Z-Arg-OH) растворяли в 60 мл ДМФА, добавляли 3.1 г HOBt, 6,3 г (30 ммоль) ДЦГК и раствор этиламида пролина
(H-Pro-NH-Et) в ДМФА. Реакционную смесь охлаждали до -20°C и выдерживали в холодильнике в течение двух суток, далее - в течение двух суток при комнатной температуре. Ход реакции контролировали с помощью ТСХ в системе Б. Выпавшую ДЦГМ отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растворяли в 120 мл н.-бутанола, дважды промывали раствором бикарбоната натрия, трижды - насыщенным раствором NaCl, упаривали, остаток затирали в эфире. Получено 11.15 г (98%) VI.
t
4. Бензилоксикарбонил-O-бензил-тирозил-O-трет.бутил-O-серил-лейцил-аргинил-пролин-этиламид Z-Tyr(Bzl)-D-Ser(Bu)-Leu-Arg-Pro-NH-Et (VII)
α
1.7 г (3 ммоль) этиламид N-бензилоксикарбонил-аргинил-пролина  гидрировали в этаноле. После стандартной обработки полученное масло растворяли в 30 мл ДМФА. К полученному раствору добавляли 1.98 г (3 ммоль) бензилоксикарбонил-O-бензил-тирозил-O-трет.бутил-D-серил-лейцина  в 30 мл ДМФА, 0.45 г HOBt, реакционную смесь охлаждали до -20°C и добавляли раствор 0.63 г ДЦГК в ДМФА. Реакционную смесь выдерживали в холодильнике в течение ночи (ТСХ - система Е), ДЦГМ отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток растирали с эфиром, отфильтровывали. Осадок растворяли в этилацетате, легкую взвесь отфильтровывали, органический слой промывали водой, раствором бикарбоната натрия, водой, упаривали. Вещество кристаллизуется из этилацетата. Получено 2,06 г (73%) VII чистого по ТСХ продукта. Rf=0,47 (A).
5. Бензилоксикарбонил-триптофил-серин
2
4
D
0,12 г (12 ммоль) L-серина растворяют в 30 мл 2 н. раствора едкого натра, добавляют 60 мл ДМФА и при перемешивании добавляют по каплям раствор 4,6 г (10 ммоль) п-нитро-фенилового эфира бензилоксикарбонил-триптофана Z-Trp-ONp в 90 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают еще в течение 4 ч, упаривают, к остатку добавляют 200 мл этилацетата и 300 мл воды. Водный слой подкисляют до рН 3 5%-ным раствором серной кислоты, экстрагируют этилацетатом, органический слой отделяют, промывают водой до нейтрального рН, отделяют, сушат над безводным NaSO и упаривают. Остаток кристаллизуют из эфира. В итоге получают 4,0 г (93,3%) хроматографически однородного VIII с т.пл. 149°С; [α]20=-11.3° (с=1; ДМФА). Rf 0,65 (система А).
6. Этиламид бензилоксикарбонил-триптофил-серил-тирозил-O-трет.бутил-O-серил-лейцил-аргинил-пролина
а) 2.06 г (2 ммоль) этиламид бензилоксикарбонил-O-бензил-тирозил-O-трет.бутил-O-серил-лейцил-аргинил-пролина  гидрировали в метаноле. После стандартной обработки полученное масло осадили из метанола эфиром, отфильтровали. По данным ВЭЖХ - чистота продукта 95% (градиент от 20 до 80%, ацетонитрил - TFA, за 30 минут).
б) 0.85 г (2 ммоль)  растворяли в 10 мл ДМФА, добавляли 0.22 мл N-метилморфолина, реакционную смесь охлаждали до -20°C и прибавляли 0.26 мл (2 ммоль) изобутилхлорформиата. Реакционную смесь выдерживали при -10°C в течение 5 минут, упаривали, остаток растирали с эфиром, отфильтровывали, осадок растворяли в н.-бутаноле, дважды промывали водой, упаривали, остаток растирали с эфиром, отфильтровывали.
В итоге получено 2.4 г IX. Продукт хроматографически однороден (ТСХ в системе Е). Аминокислотный анализ: Trp 0,86 (1), Ser 1,96 (2), Tyr 0,96 (1), Leu 1,00 (1), Arg 1,06 (1), Pro 0,98(1).
7. Бензилоксикарбонил-пироглутамил-гистидин
2
4
15 г Z-Pyr-ONp растворяли в ДМФА, охлаждали, к полученному раствору добавляли 6.2 г гистидина в 40 мл 1 н. NaOH. После завершения реакции растворитель упаривали, остаток растворяли в воде и трижды экстрагировали эфиром. Водный слой подкисляли до рН 3 5%-ным раствором серной кислоты, экстрагировали этилацетатом, органический слой отделяли, промывали водой до нейтрального рН, отделяли, сушили над безводным NaSO и упаривали.
8. Этиламид бензилоксикарбонил-пироглутамил-гистидил-триптофил-серил-тирозил-О-трет.бутил-О-серил-лейцил-аргинил-пролина
2.4 г
гидрировали в метаноле. После обычной обработки полученное масло осадили из метанола эфиром, отфильтровали. Получено 1.45 г продукта (1.3 ммоль), ВЭЖХ - чистота продукта 82% (градиент от 10 до 70%, ацетонитрил - TFA, за 30 минут). Полученный продукт растворили в ДМФА, к раствору добавили 0.7 г (1.3 ммоль) , охладили до -10°C и добавили 1.34 г (1.4 ммоль) комплекса "F", представляющего собой пентафторфенол с дициклогексилкарбодиимидом. Полноту протекания реакции контролировали в системе А1. Реакционную смесь выдерживали при комнатной температуре в течение суток, упаривали в вакууме до небольшого объема, добавляли 100 мл воды, осадок отфильтровывали, раствор упаривали досуха и растирали с эфиром. В итоге получали 1,75 г (98%) X.
9. Этиламид пироглутамил-гистидил-триптофил-серил-тирозил-О-трет.бутил-О-серил-лейцил-аргинил-пролина ацетат
бусерелин ацетат:
D
200 мг X гидрировали в метаноле. После обычной обработки остаток растворяли в воде, легкую взвесь отфильтровывали. Для очистки продукт растворяли в 0,05 М пиридин-ацетатном буфере, наносили на колонку 50×600 мм с SP-сефадексом и элюировали в градиенте 0,05-1 М пиридин-ацетатного буфера. Выделенные фракции упаривали, растворяли в 2%-ной уксусной кислоте и лиофилизовывали. После выделения продукта с помощью препаративной ВЭЖХ получено 144 мг (80%) продукта с 98% чистотой. Продукт хроматографически однороден ТСХ, система Е. Rf=0,53 (1). Аминокислотный анализ: Glu 0,91 (1), His 0,93 (1), Trp 0,83 (1), Ser 1,90 (2), Tyr 0,93 (1), Leu 1,00 (1), Arg 1,06 (1), Pro 1,11 (1). [α]20=-45.3° (с=1; вода).
ТСХ проводили на пластинках Merck Kieselgel-60 в системе Д. Проявление проводили обработкой пластинок хлором и затем раствором толидина.
im
Как видно из приведенного примера, предложенный способ позволяет значительно упростить процесс получения бусерелина за счет отказа от использования труднодоступного N-защищенного производного O-трет.бутил-D-серина на стадии получения промежуточного C-концевого гептапептида III и за счет отказа от использования производного N2,4-ди-нитрофенил-гистидина на стадии получения N-концевого дипептида и повысить выход целевого продукта.
Источники информации
1. Sandow J., Konig W. Studies with Fragments a Highly active Analogues of Luteinizing Hormone - rebasing Hormone, J. Endocrinol, 1979, 81 (2), 175-182.
2. Konig W, Geiger R., Sandow J.K., Peptides having LH-RH/FSH-RH activity.
3. Патент РФ №2086561, приоритет 10.08.1997. Пат. США №4024248 (1977).
4. Konig; W., Teetz V., Jager; G., Geiger R., 1 Process for the manufacture of LH-RH and LH-RH analogs using Glu-His(DnP)-OH. Пат. США №4275001 (1981).