ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО
ANTICANCER AGENT

Изобретение относится к лекарственным средствам, которые могут найти применение в химико-фармацевтической и медицинской промышленности, конкретно к средствам, обладающим способностью замедлять опухолевый рост и подавлять процессы метастазирования новообразований.
Несмотря на частичный успех и прогресс в борьбе с раком, многие виды злокачественных опухолей, по-прежнему, с трудом поддаются лечению. Так, по данным Российского Онкологического Научного Центра им. Н.Н. Блохина, рак молочной железы, ежегодно поражающий около 50 тысяч женщин России, является причиной смерти 40% заболевших, а летальность рака легких, которым ежегодно заболевает 65 тысяч россиян, достигает 85%.
Перспективным направлением в онкологии, получившим развитие в последние десятилетия, является применение при лечении новообразований антиангиогенных средств - химических и биотехнологических препаратов, подавляющих развитие сосудистой сети опухолей (Mocellin S. Tumor Vasculature: The Achilles' Heel of Cancer? // Int. J. Cancer Res. 2006. V.2, N.2. P.176-187).
Известные противоопухолевые антиангиогенные средства Cilengitide, Abegrin, Volociximab, 17AAG, FG-3019, MLN2704 замедляют опухолевый рост, угнетают метастазирование и повышают чувствительность опухолей к химиотерапии и лучевым воздействиям (Nabors L.B., Mikkelsen Т., Rosenfeld S.S. et al. Phase I and correlative biology study of cilengitide in patients with recurrent malignant glioma // J. Clin. Oncol. 2007. V.25. P.1651-1657; Bhaskar V., Zhang D., Fox M. et al. A function blocking antimouse integrin a5pl antibody inhibits angiogenesis and impedes tumor growth in vivo II J. Transl. Med. 2007. V.5. P.61-69; Domhofer N., Spong S., Bennewith K. et al. Connective tissue growth factor-specific monoclonal antibody therapy inhibits pancreatic tumor growth and metastasis // Cancer. Res. 2006. V.66. P.5816-5827).
Однако действие этих препаратов во многих случаях вызывает развитие негативных эффектов, в том числе, угрожающего характера. Так, их длительное применение сопровождается нарушением репродуктивных функций и тератогенным действием на плод, нарушениями функций ЖКТ, повышением кровоточивости слизистых вплоть до желудочно-кишечных кровотечений и перфораций ЖКТ, повышением тромбообразования и риска тромбоэмболии, нарушениями со стороны иммунной системы и склонностью к развитию вторичных инфекций. (Brunton L.L., Blumenthal D.K., Mum N. et al. Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics / 12th ed. New York: McGraw-Hill, 2011; Машковский М.Д. Лекарственные средства / 16-е изд., перераб., испр., и доп. - М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2010. 1215 с).
Известны антиангиогенные средства, представляющие собой производные гуминовых веществ (RU 2404783), характеризующиеся отсутствием строгого постоянства химического состава гуминовых кислот. Однако, являясь, как указывают авторы, ингибиторами VEGF, блокирующими пролиферативную активность эндотелиальных клеток, эти средства неизбежно будут иметь аналогичные побочные эффекты: вызывать грубые нарушения функционирования жизненноважных органов, прежде всего желудочно-кишечного тракта и легких, что является недостатком.
Известен конъюгат, обладающий избирательным действием по отношению к раковым опухолям (RU 2303997), представляющий собой цитотоксический химический препарат (доксорубицин, карминомицин, дауномицин и другие), ковалентно связанный с полипептидом, представляющим собой ангиостатин, эндостатин или их фрагмент. Недостатком данного средства является то, что высокотоксичный цитостатический агент соединен с полипептидом кислотолабильной связью, предполагая, что такая связь будет гидролизоваться лишь в малигнизированных тканях. На практике же частое состояние ацидоза у онкологических больных может спровоцировать неконтролируемое высвобождение высокотоксичного цитостатического агента в системный кровоток, нивелируя целесообразность использования данного средства.
Прототипом предлагаемого технического решения является наиболее изученный и уже применяемый в онкологической практике антиангиогенный препарат Bevacizumab (в Российской Федерации используется как Авастин). Препарат представляет собой моноклональные антитела, которые необратимо инактивируют VEGF. Результаты клинического применения Bevacizumab весьма обнадеживают - добавление этого препарата к химиотерапии метастатических форм колоректального рака и гепатоцеллюлярной карциномы снижает летальность, достоверно повышает общий период выживания больных и период выживания без прогрессирования заболевания на 60-80% (Hurwitz H., Fehrenbacher L., Novotny W. et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer // N. Engl. J. Med. 2004. V.350. P.2335-2342; Zhu A.X., Blaszkowsky L.S., Ryan D.P. et al. Phase II study of gemcitabine and oxaliplatin in combination with bevacizumab in patients with advanced hepatocellular carcinoma // J. Clin. Oncol. 2006. V.24. P.1898-1903; Willett C.G., Duda D.G., di Tomaso E. et al. Complete pathological response to bevacizumab and chemoradiation in advanced rectal cancer // Nat. Clin. Pract. Oncol. 2007. V.4. P.316-321).
Однако, существенные недостатки Bevacizumab (гипертензия, протеинурия, тромбозы, кровотечения, миокардиопатии, головная боль, перфорация органов пищеварительнго тракта, замедление заживления ран), высокие риски негативных эффектов значительно сужают круг больных, для которых допустимо его применение. Кроме того, при его назначении требуются особые меры врачебного контроля и своевременная коррекция негативных эффектов. В этой связи разработка противоопухолевых средств антиангиогенного действия, имеющих более приемлемые фармакологические свойства, оправдана и имеет высокое практическое значение.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в применении ингибиторов синтаз оксида азота (NOS) из класса линейных S ^-замещенных производных изотиомочевины (ИТМ) в качестве противоопухолевых антиангиогенных препаратов, для которых не характерно развитие угрожающих побочных эффектов.
Ранее авторами настоящего изобретения были разработаны методы синтеза, и впервые получены и исследованы новые оригинальные соединения класса линейных S,N-замещенных производных изотиомочевины (ИТМ) общей формулы (I) (Проскуряков С.Я., Верховский Ю.Г., Филимонова М.В. и соавт. Антигипотензивное средство / Патент РФ на изобретение RU 2353614. Дата публикации: 27.04.2009; Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Макарчук В.М. и соавт).
Сущность предлагаемого изобретения заключается в применении соединений S,N-замещенных изотиомочевины формулы (1) в качестве противоопухолевых средств.
1
2
5
3
7
Где R=CH; i-СН;
2
2
5
3
7
R=CH; i-СН;
в виде солей: 1-изопропиноил-2-этилизотиомочевины гидробромид (далее Т-1004);
1-изопропиноил-2-изопропилизотиомовины гидробромид (далее Т-1006);
1-изобутаноил-2-изопропилизотиомочевины гидробромид (далее Т-1023);
1-изобутаноил-2-этилизотиомочевины гидробромид (далее Т-1032).
Биологическое действие и фармакологические свойства заявленных соединений.
6
Пример 1. Исследования противоопухолевого действия соединений Т-1023 и Т-1032 выполнены на перевиваемой карциноме Льюиса, которая, согласно действующим инструкциям, является обязательным видом опухолей для изучения противоопухолевых средств (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. члена-корреспондента РАМН, проф. Р.У. Хабриева. - 2-изд., перераб. и доп. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 832 с). Эксперименты проведены на самцах мышей С57В1/6 и F1(CBAxC57B1/6) массой 23-24 г. Всем животным перевили карциному легких Льюиса путем подкожной инъекции в область бедра 0,1 мл суспензии, содержащей 10 опухолевых клеток. Животные были разделены на 4 группы по 20 мышей в каждой: группа контроля, животные которой не подвергались в дальнейшем никаким воздействиям; группа положительного контроля, животным которой, начиная с первых суток после перевивки опухоли, в течение всего периода наблюдения ежедневно внутрибрюшинно вводили Bevacizumab в стандартной терапевтической дозе для этого вида животных - 250 нг/кг в 0,1 мл раствора, и две опытных группы, животным которых, начиная с первых суток после перевивки, ежедневно внутрибрюшинно вводили в 0,1 мл раствора испытуемые соединения в дозе 60 мг/кг. Начиная с 7-х суток эксперимента проводилось измерение объема опухоли у всех животных. Срок наблюдения составлял 21 сутки.
Введение испытуемых соединений не сопровождалось какими-либо признаками токсического или раздражающего действия. Между тем, примерно у 30% животных, получавших Bevacizumab, с 10-12 суток эксперимента и до конца периода наблюдения отмечались умеренно выраженные признаки повышенной проницаемости и кровоточивости слизистых - прозрачные выделения розового цвета в области глаз. Каких-либо изменений во внешнем виде и поведении животных, получавших соединения Т-1023 и Т-1032, не наблюдалось в течение всего периода наблюдения.
Данные динамики опухолевого роста (табл.1) свидетельствуют о том, что Bevacizumab и соединения Т-1023 и Т-1032 в равной степени вызывают задержку роста карциномы Льюиса на 2-2,5 суток на ранних этапах развития опухоли, в результате чего средний объем опухоли в опытных группах и группе положительного контроля в течение всего периода измерений статистически достоверно ниже контрольного и составляет 60-70% от контроля в случае соединения Т-1032, и 65-75% - в случае Bevacizumab и Т-1023. Статистически значимых различий по динамике роста карциномы между группами, получавшими Bevacizumab, Т-1023 и Т-1032, не наблюдается.
Таблица 1
Влияние Bevacizumab и соединений Т-1023 и Т-1032 на рост перевиваемой карциномы Льюиса.
Период наблюдения
Контроль, V<sub>с</sub>, см<sup>3</sup>
Bevacizumab
T-1032
T-1023
V, см<sup>3</sup>
V/V<sub>с</sub>, %
V, см<sup>3</sup>
V/V<sub>с</sub>, %
V, см<sup>3</sup>
V/V<sub>с</sub>, %
7 сутки
0,76±0,09
0,48±0,07*
63,2
0,45±0,06*
58,5
0,50±0,05*
65,4
9 сутки
1,21±0,13
0,82±0,08*
67,8
0,85±0,11
70,2
0,78±0,07*
64,8
12 сутки
2,22±0,21
1,43±0,13*
64,4
1,32±0,11*
59,2
1,51±0,11*
67,9
15 сутки
3,44±0,28
2,37±0,21*
68,9
2,21±0,20*
64,1
2,56±0,18*
74,3
19 сутки
6,63±0,37
4,53±0,32*
68,3
4,31±0,35*
65,0
4,60±0,25*
69,5
21 сутки
7,13±0,23
5,34±0,35*
74,9
4,96±0,38*
69,5
5,67±0,31*
79,5
Примечание: * - статистически достоверное различие с контрольной группой (р<0,05) по U-критерию Манна-Уитни.
Пример 2. На 21-е сутки после перевивки карциномы Льюиса проведена эвтаназия (цервикальная дислокация под эфирным наркозом) контрольных животных и животных, получавших Bevacizumab, T-1023 и T-1032 (Пример 1). Из опытных животных были выделены легкие и произведен подсчет легочных метастазов. Полученные оценки числа метастазов (Табл.2) свидетельствуют, что Bevacizumab и T-1023 статистически достоверно снижают в 2-3 раза число малых метастазов карциномы Льюиса в сравнении с контролем. Соединение T-1032 также на 40% снижает среднее число малых метастазов, хотя эта тенденция осталась в пределах статистической погрешности (р≈0,08). В целом это указывает на то, что Bevacizumab и соединения T-1023 и T-1032 не только замедляют рост первичного очага опухоли (Пример 1), но и подавляют процессы метастазирования.
В меньшей степени Bevacizumab, T-1023 и T-1032 влияли на рост метастазов - под влиянием этих соединений среднее число крупных легочных метастазов карциномы снижалось на 30-40% (Табл.2), но это изменения оставались статистически недостоверными.
Таблица 2
Влияние Bevacizumab и соединений Т-1023 и Т-1032 на метастазирование карциномы Льюиса.
Показатель
Контроль
Bevacizumab
T-1032
T-1023
Среднее число малых метастазов
15,8±2,7
7,3±1,1*
9,4±1,4
4,9±0,6*
Среднее число крупных метастазов
2,2±0,9
1,6±0,5
1,4±0,6
1,5±0,5
Примечание: аналогично Таблице 1.
Пример 3. Исследования противоопухолевого действия соединений Т-1004 и Т-1006 (синтез соединений защищен патентом № RU 2353614) также выполнены на перевиваемой карциноме Льюиса на 80 гибридах-самцах мышей F1 (СВАхС57В1/6) массой 21-23 г по методике как в Примере 1. Bevacizumab ежедневно вводился животным группы положительного контроля в дозе 250 нг/кг, соединения Т-1004 и Т-1006 ежедневно вводились животным опытных групп в дозе 80 мг/кг. Срок наблюдения составил 22 суток.
Введение испытуемых соединений не сопровождалось какими-либо признаками токсического или раздражающего действия. Между тем, как и в Примере 1, у 20-25% животных, получавших Bevacizumab, с 11-14 суток эксперимента и до конца периода наблюдения отмечались признаки повышенной проницаемости и кровоточивости слизистых - прозрачные выделения розового цвета в области глаз. Каких-либо изменений во внешнем виде и поведении животных, получавших соединения Т-1004 и Т-1006, не наблюдалось в течение всего периода наблюдения.
Данные динамики опухолевого роста (табл.3) свидетельствуют о том, что Bevacizumab и соединение Т-1004 примерно в равной степени вызывают задержку роста карциномы Льюиса на 2-е суток на ранних этапах развития опухоли, в результате чего средний объем опухоли в группах, получавших эти соединения, на многих этапах наблюдения статистически достоверно ниже контрольного и составляет 55-70% от контроля в случае Т-1004, и 65-70% - в случае Bevacizumab. Статистически значимых различий по динамике роста карциномы между группами, получавшими Bevacizumab и Т-1004, не наблюдается.
Таблица 3
Влияние Bevacizumab и соединений Т-1004 и Т-1006 на рост перевиваемой карциномы Льюиса.
Период наблюдения
Контроль, V<sub>с</sub>, см<sup>3</sup>
Bevacizumab
T-1004
T-1006
V, см<sup>3</sup>
V/V<sub>c</sub>, %
V, см<sup>3</sup>
V/V<sub>c</sub>, %
V, см<sup>3</sup>
V/V<sub>с</sub>, %
8 сутки
0,15±0,02
0,10±0,02
67,3
0,09±0,02
58,5
0,19±0,03#
127,2
11 сутки
0,41±0,05
0,28±0,04
68,1
0,23±0,05*
55,3
0,39±0,06
94,9
14 сутки
0,85±0,10
0,57±0,08*
66,9
0,59±0,13
69,4
0,76±0,09
88,8
17 сутки
1,87±0,19
1,31±0,18*
69,8
1,24±0,26*
66,3
1,59±0,15
84,8
20 сутки
3,45±0,35
2,39±0,23*
69,3
2,04±0,37*
59,2
2,68±0,22
77,7
22 сутки
4,38±0,47
3,09±0,31*
70,5
2,56±0,46*
58,5
3,70±0,24
84,5
Примечание: * - статистически достоверное различие с контрольной группой (р<0,05) по U-критерию Манна-Уитни; # - статистически достоверное различие по U-критерию Манна-Уитни с группой, получавшей Bevacizumab.
Влияние соединения Т-1006 на опухолевый рост не сопровождалось статистически достоверным снижением объема опухоли в сравнении с контролем на всех этапах наблюдения. Тем не менее, под влиянием этого соединения наблюдается устойчивая тенденция к замедлению скорости роста опухоли (Табл.3): если на раннем этапе наблюдения средний объем опухоли в группе, получавшей T-1006, составлял 100-125% от контроля, то далее эта величина устойчиво снижается и на поздних сроках составляет 75-80% от контроля.
Пример 4. На 22-е сутки после перевивки карциномы Льюиса проведена эвтаназия контрольных животных и животных, получавших Bevacizumab, T-1004 и T-1006 (Пример 3). Были выделены легкие и произведен подсчет легочных метастазов. Оценки числа метастазов (Табл.4) свидетельствуют, что Bevacizumab и соединения T-1004 и T-1006 снижают в 2-3 раза число малых метастазов карциномы Льюиса в сравнении с контролем, хотя в случае соединения T-1004 различие остается в пределах статистической погрешности (р≈0,10). Это указывает на то, что Bevacizumab, T-1004 и T-1006 не только замедляют рост первичного очага опухоли (Пример 3), но и подавляют метастазирование.
Как и в Примере 2, испытуемые соединения в меньшей степени влияли на рост метастазов - под влиянием Bevacizumab, T-1004 и T-1006 среднее число крупных легочных метастазов карциномы снижалось на 35-50% (Табл.4), но эти изменения оставались статистически недостоверными.
Таблица 4
Влияние Bevacizumab и соединений Т-1004 и Т-1006 на метастазирование карциномы Льюиса.
Показатель
Контроль
Bevacizumab
T-1004
T-1006
Среднее число мелких метастазов
22,8±6,7
8,3±1,1*
10,8±1,6
7,0±1,2*
Среднее число крупных метастазов
3,2±2,0
1,8±0,6
1,6±0,7
2,1±0,4
Примечание: аналогично Таблице 1
Доказательство достижения заявленного результата
50
Примеры 1 -4 показывают, что соединения формулы (I), являющиеся ингибиторами NOS, примененные в заведомо нетоксичных дозах (1/8-1/6 ЛД) практически полностью воспроизводят противоопухолевое действие антиангиогенного средства Bevacizumab, с VEGF-ингибирующим механизмом действия. Противоопухолевое действие соединений формулы (I) проявляется статистически достоверным замедлением роста перевиваемой карциномы Льюиса у экспериментальных животных (Примеры 1, 3) и подавлением процессов ее метастазирования (Примеры 2, 4), что в целом характерно для эффективных антиангиогенных средств (Mocellin S. Tumor Vasculature: The Achilles' Heel of Cancer? // Int. J. Cancer Res. 2006. V.2, N.2. P.176-187; Domhofer N.. Spong S., Bennewith K. et al. Connective tissue growth factor-specific monoclonal antibody therapy inhibits pancreatic tumor growth and metastasis // Cancer. Res. 2006. V.66. P.5816-5827). Причем, наблюдаемые показатели противоопухолевой активности соединений формулы (I) в большинстве случаев не уступают Bevacizumab, примененному в стандартной терапевтической дозе, а в ряде случаев даже несколько превосходят его эффективность: T-1004, Т-1032 - по степени подавления роста первичного очага опухоли (Табл.1, 3), T-1006, Т-1023 - по степени подавления метастазирования (Табл.2, 4).
Важным аргументом в пользу перспективности соединений формулы (I) в качестве противоопухолевых средств является отсутствие каких-либо признаков токсического или раздражающего действия при использовании их в эффективных «противоопухолевых» дозах, в то время как применение Bevacizumab сопровождалось развитием у 20-30% опытных животных симптоматики осложнения, характерного для антиангиогенных средств VEGF-ингибирующего действия (Brunton L.L., Blumenthal D.K., Murri N. et al. Goodman&Gilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics / 12th ed. New York: McGraw-Hill, 2011; Машковский М.Д. Лекарственные средства / 16-е изд., перераб., испр., и доп. - М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2010. 1215 с) - поражения слизистых оболочек и сосудов (Примеры 1, 3).
В связи с вазопрессорными свойствами, характерными для ингибиторов NOS (Bian K., Doursout M.F., Murad F. Vascular system: role of nitric oxide in cardiovascular diseases // J. Clin. Hypertens. (Greenwich). 2008. V.10, N.4. P.304-310), возможным негативным эффектом применения соединений формулы (I) может являться развитие гипертензивного состояния. Однако такое осложнение скорее возможно при передозировке этих средств, поскольку, как показывают наши исследования, выраженный и длительный подъем артериального давления под действием соединений формулы (I) развивается только при исходно пониженном давлении. При нормотонии или умеренно повышенном давлении эти соединения вызывают лишь кратковременный и слабый подъем АД - на 10-15% в течение 5-10 минут (Проскуряков С.Я., Филимонова М.В., Боровая О.Н. и соавт. Влияние NO-ингибиторов на гипотензию, вызванную гиповолемическим шоком // Бюлл. эксп. биол. мед. 2010. Т.150, N.7. С.23-27; Филимонова М.В., Шевченко Л.И., Суринова В.И. и соавт. Влияние N-пропионил-S-изопропил-изотиомочевины на продукцию биогенного оксида азота (NO) и гемодинамические параметры животных при эндотоксическом шоке // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. 2011. №9. С.35-39), что характерно и для используемых в клинической практике вазопрессоров с NOS-ингибирующим действием (этирон, изотурон, дифетур) (Mizhakh I.L., Gikavy I.V., Znamensky V.V. et al. Pharmaceutical composition comprising S-alkylisothiouronium derivates / WIPO Patent Application WO/1998/013036).
Иным возможным осложнением применения соединений формулы (I) может являться развитие брадикардии. Однако снижение частоты сердечных сокращений под влиянием ингибиторов NOS носит рефлекторный и кратковременный характер, и в случае необходимости устраняется назначением атропина (Brunton L.L., Blumenthal D.K., Murri N. et al. Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics / 12th ed. New York: McGraw-Hill, 2011; Машковский М.Д. Лекарственные средства / 16-е изд., перераб., испр., и доп. - М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2010. 1215 с).
Таким образом, приведенные экспериментальные данные и анализ клинической и научной литературы позволяют сделать следующие выводы:
1. Соединения формулы (1), являющиеся ингибиторами NOS, превосходят антиангиогенный препарат Bevacizumab по противоопухолевому действию.
2. Соединения формулы (1) более приемлемы в клинической практике, так как исключают риски, связанные с развитием негативных эффектов угрожающего характера.
50
В этой связи можно утверждать, что соединения формулы (I) могут применяться для лечения онкологических заболеваний, как в качестве монотерапии, так и в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией, при назначении их в эффективной дозе 20-120 мг/кг (1/20-1/4 ЛД) или в составе фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество этих соединений. Такие композиции могут быть назначены в виде твердых лекарственных форм, содержащих 0,1-20 мг простого либо сложного состава. Кроме того, принимая во внимание высокую растворимость соединений формулы (1), их можно применять в виде ампульных растворов, содержащих 1-10% действующего вещества в этих соединениях, что также является аспектом данного изобретения.