Способ сохранения биологического материала

МЕДИЦИНА И ЗДРАВООХРАНЕНИЕ

УДК 57.082.52

О. К. Зенин, О. В. Калмин

СПОСОБ СОХРАНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА

Аннотация. В статье дана характеристика принципиально нового способа сохранения биологического материала. Этот метод был разработан на кафедре анатомии человека Медицинского института Пензенского государственного университета. Необходимость в изобретении нового способа была продиктована недостатками уже имеющихся методов сохранения биологического материала. К этим недостаткам относятся: 1) использование ядовитых веществ в составе фиксирующих смесей, 2) изменение цветовых особенностей препарата во время фиксации, 3) утрата эластичности тканей препарата во время фиксации. Эти недостатки удается свести к минимуму при использовании фиксирующих смесей, в состав которых входит бензоат натрия.

Ключевые слова: сохранение, биологический материал, аутолиз, гниение, бензоат натрия.

Основные трудности изучения биологических объектов связаны с их недолговечностью, связанной с посмертным разложением органических тканей. Разложение - естественный процесс дезорганизации биологических тканей, обусловленный двумя процессами: аутолизом и гниением. Аутолиз значим на ранних стадиях разложения и определяется действием собственных литических ферментов клеток. Под термином «гниение» понимают разрушение органики под действием ферментов различных микроорганизмов [1-4].

Существует множество методов сохранения биологического материала, основанных на использовании различных физических (высушивание, замораживание) и химических (консерванты) факторов. Кроме того, отдельно выделяют методы фиксации биологических тканей и методы бальзамирования трупов. Фиксация - это обработка биологических тканей веществами, предотвращающими гниение, сохраняющими форму, структуру, окраску и обеспечивающими длительное хранение в специальных фиксирующих растворах; термин применим как к макро-, так и микропрепаратам. Бальзамирование - это обработка трупов человека и животных веществами, предотвращающими гниение, сохраняющими форму, окраску, препятствующими высыханию тканей, изменению их цвета и обеспечивающими длительное хранение трупов в контакте с окружающей средой без их дальнейшей обработки; термин применяется только к трупу или макропрепарату [1-4].

В современной анатомической практике используются различные методы обработки препарата, предполагающие применение консервирующих средств. Все консервирующие средства по механизму действия могут быть разделены на две группы: дезинфицирующие средства, в основе действия которых лежит денатурация белков и токсичное действие на микробные клетки, и пластифицирующие средства, создающие в препарате связнодисперсную среду. Первую группу составляют такие соединения, как формальде-

гид (формалин), фенол, тимол, лизол, этанол, метанол, мышьяковистая кислота, уксусная кислота, соли ртути, хромовая кислота, бихромат калия. Из второй группы следует назвать эпоксидные смолы, силикон, каучук. Также имеются средства, занимающие промежуточное положение и способные как фиксировать препарат подобно антисептикам, так и полимеризоваться в его тканях (полигексаметиленгуанидин). В связи с дороговизной и недавним сроком открытия метода пластинации, наибольшее значение имеют соединения первой группы [1—4].

Чаще всего на практике в качестве консерванта применяется 10 % водный раствор формалина. Однако у данного консерванта имеется множество недостатков. Во-первых, под влиянием формалина изменяются консистенция и размеры препарата: формальдегид денатурирует белки, что приводит к их уплотнению и сжатию, вследствие чего они теряют эластичность, быстро сохнут и мумифицируются. Во-вторых, формалин изменяет окраску препарата: в результате окисления гемоглобина и превращения его в метгемо-глобин ткани приобретают буровато-серый оттенок. Для сохранения цвета и объема препарата приходится применять дополнительные реактивы, что усложняет методику и требует дополнительных финансовых затрат. Кроме того, формалин слабо подавляет жизнедеятельность плесневых грибов, что уменьшает сроки хранения препаратов и приводит к необходимости реставрации. Растворы формалина нестойки при хранении (концентрация постепенно снижается при недостаточно герметично закрытой таре из-за летучести формальдегида), а также мутнеют из-за выпадения белого осадка парафор-мальдегида. При изготовлении и последующем использовании анатомического препарата неизбежен контакт с формалином. Между тем формальдегид является токсичным веществом, проявляет тератогенные, мутагенные и канцерогенные свойства. Особенно неблагоприятно влияние на верхние дыхательные пути и роговицу глаза, обусловленное местно-раздражающим действием.

Всех этих недостатков лишены препараты, изготовленные с помощью пластинации. Однако этот метод сложен, требует наличия специального дорогостоящего оборудования и реактивов, что препятствует его массовому применению. К тому же этот метод не исключает предварительной фиксации препарата формалином.

Цель предлагаемого авторами способа состоит в улучшении качества, информативности и эстетичности препаратов за счет предупреждения изменений их естественной окраски, консистенции и размеров, устранения неприятного запаха, увеличения срока службы и устранения таких факторов профессиональной вредности персонала анатомических и патологоанатомических лабораторий, которые обусловлены применением формалина, что осуществляется посредством замены консерванта, используемого для изготовления и хранения биологического материала.

Для достижения указанной цели препараты отмываются от крови в проточной воде, помещаются для фиксации в 1-10 % раствор бензоата натрия, объем которого в 10 раз больше объема фиксируемого органа. Необходимо выдерживать препарат в растворе до достижения концентрации консерванта в его тканях не менее 1 %. Препараты больших размеров и трупы консервируют путем инъекции раствора в кровеносные сосуды с последующим погружением препарата в аналогичный раствор.

Бензоат натрия представляет собой натриевую соль бензойной кислоты. Это белый порошок без запаха, вкус которого в зависимости от индивидуальных особенностей вкусовых рецепторов может казаться сладковатым, кислым, горьким или безвкусным; легко растворим в воде, труднее - в спирте. Молярная масса 144,11 г/моль; температура плавления 410 °С. Обладает выраженной противомикробной и фунгицидной активностью, однако уступает по данным характеристикам бензойной кислоте. Применяется в качестве консерванта в пищевой промышленности (Е211) и как отхаркивающее средство в медицине. Не вызывает грубой денатурации белков, приводящей к изменению консистенции

и объема тканей. Малотоксичен: ЛД50 при пероральном введении для мышей -1600 мг/кг, для крыс - 4980 г/кг. Растворы бензоата натрия нелетучи, не образуют паров, химически стойки, не обладают токсическим и раздражающим действием на верхние дыхательные пути и кожу. Бензоат натрия разрешен к применению в качестве пищевой добавки Е211 в странах Европы и СНГ. Используется как консервант при производстве безалкогольных напитков и рыбных пресервов или консервов, а также для увеличения сроков годности соусов, фруктовых и овощных продуктов, колбасных изделий, сыров, кондитерских изделий и обработки упаковочных материалов для пищевых продуктов.

Для экспериментальной проверки предлагаемого вещества был приготовлен 1 % раствор бензоата натрия, в который помещали фиксируемые анатомические макропрепараты (сердце, почки человека). Обследование проводили в разные сроки. Для сравнения параллельно осуществляли фиксацию аналогичных препаратов водным раствором формалина стандартной концентрации. Кроме того, производилась оценка способности раствора бензоата восстанавливать цвет, консистенцию и объем ранее фиксированных формалином препаратов.

Анатомические препараты, фиксированные 1 % раствором бензоата натрия, имеют более близкую к естественной окраску, не уменьшаются в объеме, сохраняют естественную консистенцию (более упруги и эластичны) при сопоставимой по качеству с формалином фиксации, длительно хранятся в водном растворе бензоата натрия.

Изменение естественной окраски органов при консервации формалином и заявленным способом оценивали полуколичественным методом с учетом внешней окраски и окраски на разрезе. Критерии оценки:

а) окраска не изменена - 0 баллов;

б) слабое изменение естественной окраски на наружной поверхности - 1 балл;

в) изменение естественной окраски на наружной поверхности и на разрезе - 2 балла;

г) полная утрата естественной окраски на поверхности - 3 балла;

д) обесцвечивание органа - 4 балла.

Изменение окраски тканей при их фиксации предлагаемым консервантом (бензоат натрия) и формалином представлено в табл. 1.

Таблица 1

Изменение окраски тканей при их фиксации предлагаемым консервантом

(бензоат натрия) и формалином

Орган Фиксация бензоатом натрия Фиксация формалином

10 дней 180 дней 360 дней 10 дней 180 дней 360 дней

Почка 1 1 1 2 3 4

Сердце 1 1 1 2 2 3

Препараты, фиксированные формалином, теряют естественную окраску, причем со временем изменения нарастают и к году происходит обесцвечивание органа. При консервации заявленным способом отмечается слабое изменение естественной окраски органа как на внешней поверхности, так и на разрезе. Прогрессирующего обесцвечивания, характерного для фиксации формалином, не наблюдается. Таким образом, заявленный консервант в отличие от формалина незначительно изменяет окраску органа.

Для оценки изменения консистенции и размеров анатомических препаратов были измерены объем и масса анатомических препаратов до и после консервации формалином и заявленным способом. Анализ полученных данных показал, что при консервации препаратов в растворе формалина в течение 10 дней происходит достоверное уменьшение исходных показателей их объема и массы, а также уплотнение и снижение эластич-

ности тканей (препараты становятся жесткими, неподатливыми). При консервации препаратов заявленным способом исходные показатели объема и массы существенно не изменялись. Следовательно, заявленный консервант в отличие от формалина не изменяет консистенцию и размеры анатомических препаратов.

При изучении сохранности препаратов, консервированных по прототипу и по заявленному способу, установлено, что препараты, фиксированные формалином, подвергаются разложению вследствие развития грибковой флоры. Первые признаки поражения препаратов появляются уже через 5-6 месяцев. В то же время на препаратах, фиксированных раствором заявленного консерванта, не обнаруживается признаков развития сапрофитной микрофлоры в течение 2-3 лет.

Для оценки способности раствора бензоата восстанавливать цвет, консистенцию и объем ранее фиксированных формалином препаратов осуществлялась повторная фиксация предлагаемым раствором заформалиненных препаратов (сердце). С этой целью производилось отмывание препарата от формалина в 10 % растворе хлорида натрия с последующим помещением в предлагаемый раствор бензоата натрия. Отмечено частичное восстановление цвета, объема и массы. Для оценки наблюдаемых изменений для данных препаратов использовалась методика, аналогичная рассмотренной выше. Пальпаторно ткань препаратов определялась как более эластичная и более соответствующая естественной консистенции органа. Полученные результаты показывают перспективность предлагаемого консерванта для реставрации анатомических препаратов.

Важным фактором профессиональной вредности для работников анатомических и патологоанатомических лабораторий является формальдегид, обладающий выраженным местнораздражающим и токсическим действием. Длительный контакт с парами формалина приводит к снижению мукоцилиарного клиренса за счет гибели клеток реснитчатого эпителия дыхательных путей и снижения выработки сурфактанта, что способствует развитию и хронизации инфекционной патологии верхних дыхательных путей. Также при длительном хранении формальдегид разлагается на метиловый спирт и муравьиную кислоту, значительно превосходящие исходное вещество по токсичности и обладающие нейротропностью. Растворы бензоата натрия не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку дыхательных путей, нелетучи, вследствие чего не вызывают поражения органов дыхания. Данный консервант малотоксичен, поэтому даже при длительном контакте с предлагаемым раствором практически исключаются ситуации, сопровождающиеся нежелательными последствиями для здоровья человека.

Список литературы

1. Цуренко, Г. И. Основные методы бальзамирования / Г. И. Цуренко // Архив патологии. - 1957. -№ 2. - С. 79-82.

2. Кузнецов, Л. Е. Руководство по бальзамированию и реставрации трупов / Л. Е. Кузнецов, В. В. Хохлов. - М. : РМАПО, 1999. - 496 с.

3. Автандилов, Г. Г. Основы патолого-анатомической практики : руководство / Г. Г. Автандилов. -2-е изд. - М. : РМАПО, 1998. - 505 с.

4. Техника изготовления анатомических препаратов : руководство / Э. И. Борзяк, А. К. Усович, И. Э. Борзяк, С. Ю. Тузова, А. А. Ромашев, В. Ю. Череминский ; под ред. А. К. Усовича, Э. И. Борзяка. - Витебск : Изд-во ВГМУ, 2010. - 317 с.

Зенин Олег Константинович

доктор медицинских наук, профессор, кафедра анатомии человека, Пензенский государственный университет E-mail: zen.olegz@gmail.com

Zenin Oleg Konstantinovich

doctor of medical sciences, professor, sub-department of human anatomy, Penza State University

Калмин Олег Витальевич

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, Пензенский государственный университет E-mail: ovkalmin@gmail.com

Kalmin Oleg Vital'evich

doctor of medical sciences, professor, head of sub-department of human anatomy, Penza State University

УДК 57.082.52 Зенин, О. К.

Способ сохранения биологического материала / О. К. Зенин, О. В. Калмин // Вестник Пензенского государственного университета. - 2016. - № 1 (13). - С. 22-26.