Способ профилактики инфекционных процессов при свободной кожной пластике
METHOD FOR PREVENTION OF INFECTIOUS PROCESSES WITH FREE SKIN GRAFTING

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к хирургии, и может быть использовано для профилактики госпитального инфицирования аутодермотрансплантата в послеоперационном периоде.
В настоящее время наблюдается рост количества больных, которые нуждаются в кожно-пластических операциях для закрытия дефектов мягких тканей. Это объясняется как увеличением количества военных, бытовых и техногенных травм, так и растущим уровнем техники в области сосудистой хирургии, обеспечивающей сохранение конечности при облитерирующих заболеваниях сосудов, в том числе, при наличии трофических язв мягких тканей.
Одной из наиболее распространенных кожно-пластических операций при закрытии кожных дефектов является пластика расщепленным кожным трансплантатом. Особенностью этой операции является чувствительность трансплантата к развитию инфекции. Это объясняется с одной стороны тем, что хронические раны всегда контаминированы, а присутствующая в ране микрофлора приобретает устойчивость к антибактериальным препаратам, поскольку в анамнезе у таких больных обычно имеется не один курс антибиотикотерапии. Особенности техники оперативного вмешательства при выполнении свободной кожной пластики расщепленным аутодермотрансплантатом подразумевают наложение на реципиентную рану после фиксации на ней трансплантата многослойной повязки на период до 4-7 суток. В это время под повязкой за счет наличия питательных веществ, жидкости, благоприятного температурного режима создаются практически идеальные условия для роста и деления микроорганизмов, попавших под нее. Все это способствует развитию инфекционных осложнений, перед которыми трансплантат, первые 4-5 суток питающийся лишь за счет диффузии кислорода и нутриентов из сосудов реципиентной раны, практически беззащитен. Таким образом, профилактика инфекционного процесса в области реципиентной раны является одним из принципиальных условий неосложненного течения раннего послеоперационного периода и приживления трансплантата.
Для достижения этой цели предлагаются различные варианты повязок на реципиентную рану после свободной кожной пластики. В настоящее время для преодоления феномена антибиотикорезистентности активно исследуется возможность использования бактериофагов [3, 5]. Бактериофаги - это вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Сущность феномена бактериофагии состоит в том, что при встрече бактерий с бактериофагом происходит разрушение бактериальной клетки. Основной принцип лечения инфекционных процессов бактериофагом сформулирован первооткрывателем этого рода вирусов Ф.Д'Эреллем так: «вводить бактериофаг в организм нужно таким образом, чтобы реализовать возможно быстрый и возможно более интимный контакт его с бактериями, подлежащими разрушению» (цит. по [8]). На данном этапе можно выделить ряд очевидных преимуществ бактериофагов [3]:
- высокая избирательность действия, в том числе при наличии биопленок;
- отсутствие влияния на физиологическую микрофлору;
- стимуляция факторов специфического и неспецифического иммунитета;
- возможность применения у пациентов с аллергическими реакциями к антибиотикам;
- полная совместимость с любыми лекарственными средствами;
- отсутствие токсических и тератогенных эффектов;
- отсутствие побочных эффектов;
- сокращение сроков лечения за счет быстрого действия и глубокого проникновения в очаг инфекции.
Способ местного применения бактериофага подробно описан в [8] и заключается в обильном орошении раневой поверхности раствором, содержащим бактериофаги и затем наложении на рану марлевой повязки. Способ имеет очевидный недостаток - поскольку бактериофаги функционируют только во влажной среде с определенными химико-физическими параметрами, при высыхании марлевой повязки их активность резко падает. Это требует повторного периодического обильного смачивания повязки раствором бактериофага и частых перевязок.
С целью упрощения технологии применения и удлинения срока активности бактериофагов на раневой поверхности предлагается осуществлять их иммобилизацию в структуре полимерных носителей. В работе [11] осуществлена ковалентная иммобилизация бактериофага на наноструктурированном носителе в виде нетканого нановолокнистого материала из поликапролактона. При этом иммобилизованные бактериофаги ориентированы таким образом, что их расположение позволяет им воздействовать на бактерии: капсид прочно связан с носителем, а хвост остается свободным.
В другой работе с целью промышленного получения раневых покрытий с бактериофагами исследовано влияние типа полимерной матрицы на активность бактериофагов, иммобилизованных в структуре покрытий путем введения в раствор полимера и последующего высушивания разными способами [4]. Однако при этом не дана характеристика используемых полимеров (молекулярная масса, степень замещения карбоксиметилцеллюлозы, содержание ацетильных групп в поливиниловом спирте и т.д.), что может существенно влиять на активность иммобилизованных бактериофагов. Кроме того, не указывается рН композиций, что является важным для стабильности бактериофагов. Наилучшие результаты получены авторами при иммобилизации стафилококкового и синегнойного фагов в структуре полимерной биодеградируемой повязки из полиэфирамида с использованием лиофильной сушки. Описанный способ имеет недостатки, в частности невозможно выполнить подбор бактериофага к актуальному именно в данной медицинской организации патогену, поскольку иммобилизация бактериофагов широкого спектра действия выполняется заранее, в промышленных условиях, без учета чувствительности конкретного штамма микроорганизма. Кроме того, необходимо решить технически сложную задачу сохранения жизнеспособности бактериофагов в период создания, транспортировки и хранения повязки, а предлагаемая авторами технология лиофилизации, обеспечивающая длительный срок годности раневых покрытий, достаточно трудоемка и дорогостояща. Кроме того, не указано, каким образом будем обеспечиваться стерильность повязки.
Для промышленного получения раневых покрытий с бактериофагами предлагается иммобилизовывать стафилококковый и синегнойный фаги на композиционной полимерной биодеградируемой основе с последующей лиофилизацией.
Однако такой способ имеет недостатки - невозможно выполнить подбор бактериофага к актуальному именно в данной медицинской организации патогену, поскольку иммобилизация бактериофагов широкого спектра действия выполняется заранее, в промышленных условиях, без учета чувствительности конкретного штамма микроорганизма. Кроме того, необходимо решить технически сложную задачу сохранения жизнеспособности бактериофагов в период создания, транспортировки и хранения повязки, а предлагаемая авторами технология лиофилизации, обеспечивающая длительный срок годности раневых покрытий, достаточно трудоемка и дорогостояща.
Известен способ подготовки кожных трансплантатов и закрываемой раневой поверхности, защищенный патентом [7]. Способ включает обработку кожных трансплантатов и закрываемой раневой поверхности озонированной нативной плазмой. Недостатком является недостаточная устойчивость расщепленного аутодермотрансплантата к госпитальной инфекции.
Наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату, выбранным в качестве прототипа, является способ профилактики инфекционных процессов при кожной пластике, описанный в [6].
Способ заключается в том, что при закрытии раны для пролонгирования действия бактериофагов на срок до двух суток предлагается наносить раствор, содержащий бактериофаги на коллагеновую гемостатическую губку, имеющую в своем составе: 0,98 г коллагена (сухого вещества), нитрофурал (фурацилин) - 0,0075 г, борную кислоту - 0,0125 г. Однако и этот способ имеет недостатки:
1. Способ подразумевает использование борной кислоты и, кроме того, повязка содержит некоторое количество уксусной кислоты, т.к. губку получают из уксуснокислого раствора коллагена. Таким образом, создается кислая среда, в которой бактериофаги инактивируются, т.к. их максимальная активность проявляется при рН от 6,6 до 7,8 [1].
2. В условиях раневой экссудации высоковероятна элиминация бактериофагов из раневого покрытия.
3. Используемый коллаген в виде толстой губки слабо набухает в водной среде, плохо моделируется на ранах и проявляет адгезию к ране в сухом состоянии.
4. Повязка непрозрачна и не позволяет контролировать состояние аутодермотрансплантата без снятия раневого покрытия.
5. Способ подразумевает смену повязки на вторые сутки, этот период недостаточен для надежной фиксации трансплантата, которая отмечается лишь к 3-4 суткам после операции [2], смена повязки на вторые сутки сопровождается высоким риском смещения трансплантата и в настоящее время допускается только по экстренным показаниям - признакам местного инфекционного процесса: повышение температуры тела, пропитывание повязки гнойным отделяемым, боли в области раны.
Указанные недостатки значительно снижают эффективность способа.
Технологическая проблема, решаемая предлагаемым изобретением, - обеспечение устойчивости расщепленного аутодермотрансплантата к госпитальной инфекции путем иммобилизации бактериофагов, специфичных к актуальным для конкретной медицинской организации патогенам, в повязке, накладываемой на реципиентную рану.
Технический результат от использования предлагаемого способа заключается в возможности иммобилизации актуальных для данной медицинской организации бактериофагов в области кожной пластики и создании среды, обеспечивающей поддержание активности бактериофагов в составе повязки в течение 3-4 суток, обеспечении возможности в этот период не менять повязку, сводя риск смещения трансплантата к минимуму.
-5
2
Указанный технический результат достигается тем, что в способе профилактики инфекционных процессов при кожной пластике, включающем применение бактериофагов, методом ретроспективного анализа выявляют актуальную госпитальную микрофлору, являющуюся причиной местных раневых осложнений при кожной пластике, подготавливают набор бактериофагов, к которым чувствительны выявленные госпитальные патогены, затем готовят повязку на реципиентную рану путем нанесения на пленку из поливинилового спирта, содержащую фосфатный буфер с рН 6,6÷7,8 в количестве (1÷3)×10 моль/г,. 0,05-0,2 мл/см раствора бактериофагов, предпочтительно 0,1 мл/см к которым чувствительны выявленные госпитальные патогены, с последующим укрытием трансплантата и реципиентной раны полученной гелевой пластиной.
-5
2
2
Повязку выполняют из поливинилового спирта - гидрофильного биосовместимого полимера, который является подходящей матрицей для иммобилизации биоактивных веществ, например протеаз [10]. В составе повязки используется поливиниловый спирт с содержанием ацетильных групп не более 2%. Для создания рН, оптимального для бактериофагов, в состав пленки вводят фосфатный буфер с рН 6,6÷7,8 в количестве (1÷3)×10 моль/г (сухой остаток). Толщина повязок может варьироваться от 30 мкм до 60 мкм. При нанесении на повязку раствора с бактериофагами пленка впитывает его, набухает в течение 30-60 с и преобразуется в гель с образованием гелевой пластины. При меньшем чем 0,05 мл/смраствора бактериофагов, гель не образуется, количество большее, чем 0,2 мл/см ведет к нецелевому расходу раствора бактериофагов, поскольку степень набухания повязки от 500 до 1200%. Повязку упаковывают в индивидуальные пакеты из воздухо- и водонепроницаемых материалов. Упакованная повязка подвергается радиационной стерилизации дозой 20±5 кГр.
Способ осуществляют следующим образом.
-5
2
Методом ретроспективного анализа, выполнение которого регламентировано [9], выявляют актуальную госпитальную микрофлору, являющуюся наиболее частой причиной местных раневых осложнений при кожной пластике. Подготавливают набор бактериофагов, к которым выявленные госпитальные патогены чувствительны. Бактериофаги находятся в жидкой среде во флаконах емкостью 20 мл. Выполняют аутодермопластику расщепленным трансплантатом. После фиксации аутодермотрансплантата на реципиентной ране интраоперационно готовят повязку на реципиентную рану. Для этого на пленку из поливинилового спирта, содержащую фосфатный буфер с рН 6,6÷7,8 в количестве (1÷3)×10 моль/г, добавляют 0,05-0,2 мл/смраствора бактериофагов, к которым чувствительны выявленные госпитальные патогены, в результате чего пленка и раствор переходят в гелевую форму в виде пластины. Затем укрывают трансплантат и реципиентную рану полученной гелевой пластиной.
-5
-5
Предпочтительно толщина повязки составляет 30-75 мкм. При толщине повязки менее 30 мкм происходит ее фрагментация из-за снижения прочности во влажном состоянии, а при толщине более 75 мкм в результате набухания получается излишне толстая гелевая пластина. Предпочтительно рН повязки 6,6÷7,8, изменение рН в кислую или щелочную область дестабилизирует бактериофаги. Снижение содержания фосфатного буфера в повязке менее 1×10 моль/г (сухой остаток) недостаточно для поддержания необходимого рН, а увеличение более 3×10 моль/г (сухой остаток) приводит к кристаллизации солей на поверхности повязки.
Для контроля эффективности бактериофагов, иммобилизованных в гелевой повязке, выполнили бактериологические исследования in vitro и in vivo.
Предложенным способом получали гелевую пластину, содержащую бактериофаги, которую инкубировали in vitro при температуре 37°С в течение 24 часов. При исследовании in vitro жизнеспособность и биологическую доступность (высвобождение) бактериофагов из гелевой повязки определяли на газонах культуры тест-штамма Staphylococcusaureus.
Изобретение иллюстрируется следующими фото, на которых изображены:
Фиг. 1 - Чашка Петри с негативными колониями (зонами лизиса) на газонах культуры тест-штамма Staphylococcus aureus в местах нанесения раствора, содержащего бактериофаг (контроль) и геля, полученного из раствора бактериофага (экспозиция геля - 24 часа), отсутствие зон лизиса в области нанесения геля, полученного из стерильного физиологического раствора.
Фиг. 2 - Чашка Петри с негативными колониями (зонами лизиса) на газонах культуры тест-штамма Staphylococcus aureus в местах нанесения раствора, содержащего бактериофаг (контроль), и геля, полученного из раствора бактериофага (экспозиция геля - 48 часов).
Фиг. 3 - Чашка Петри с негативными колониями (зонами лизиса) на газонах культуры тест-штамма Staphylococcus aureus в местах нанесения раствора, содержащего бактериофаг (контроль), и геля, полученного из раствора бактериофага (экспозиция геля - 72 часа).
Фиг. 4 - Чашка Петри с негативными колониями (зонами лизиса) на газонах культуры тест-штамма Staphylococcus aureus в местах нанесения раствора, содержащего бактериофаг (контроль), и геля, полученного из раствора бактериофага (экспозиция геля - 96 часов).
2
2
На чашку Петри, с газоном культуры тест-штамма Staphylococcus aureus, в качестве контроля нанесли каплю раствора, содержащего бактериофаги (контроль 1), образец раневого покрытия, полученного нанесением на пленку физиологического раствора (контроль 2) и опытный образец раневого покрытия площадью 1 см, полученный путем нанесения на пленку раствора бактериофага, а затем инкубировали при температуре 37°С, оценку результатов проводили визуально через 24 часа по наличию или отсутствию зон лизиса. Отмечено появление на месте капли фага (контроль 1) «негативной колонии», то есть зоны лизиса (полного подавления видимого роста микроорганизма) (Фиг. 1). Такая же зона лизиса отмечена в геле, содержащем фаг. В области геля, содержащем физиологический раствор, зон лизиса не обнаружено. Для определения жизнеспособности бактериофагов в геле, его образцы площадью 1 см наносили на газоны тестовых культур через 48, 72, и 96 часов после формирования гелевой пластины. Литические свойства бактериофагов сохранялись через 48 (Фиг. 2), 72 (Фиг. 3), и 96 (Фиг. 4) часов после формирования гелевой пластины из раствора бактериофага.
Приводим клинический пример использования предложенного способа.
Больная П., 1969 г. р. (история болезни №5355), поступила в отделение гнойной хирургии ГБУЗ НО «ГКБ №30 Московского района г. Нижний Новгород» 29.08.2018 с диагнозом: Посттромбофлебитический синдром правой нижней конечности. Трофическая язва правой голени. Сопутствующий диагноз: Гипертоническая болезнь II стадии, 2 степени, риск сердечно-сосудистых осложнений 3. Общее состояние средней степени тяжести.
Жалобы на момент поступления: на наличие хронической раны в области правой голени.
Локальный статус: кожные покровы обеих голеней с явлениями гиперпигментации, участками индурации. Нижние конечности на ощупь теплые. Активные и пассивные движения во всех суставах в полном объеме, безболезненные. Рана на латеральной поверхности правой голенитрапецевидной формы 5×6 см, глубиной около 0,3 см, со скудным серозно-гнойным отделяемым, вяло гранулирует, имеет участки, покрытые желто-зеленым фибрином, некротизированными тканями.
7
По данным рентгенографии правой голени и стопы костной деструкции не определяется. При УЗДГ вен нижних конечностей выявлено наличие эхоскопических признаков ПТФС, данных за острый венозный тромбоз нет. По данным микробиологического исследования раневого экссудата выявлено наличие в нем ассоциации Pseudomonas aeruginosa и Proteus mirabilis 10 КОЕ\мл.
В предоперационном периоде больная получала антибактериальную терапию в соответствии с чувствительностью микроорганизмов (цефтриаксон 1,0 2 раза в сутки, цефоперазон-сульбактам 1,0 2 раза в сутки). Местное лечение состояло из ежедневных перевязок, включающих санацию хронических ран водным раствором Хлоргексидина; на заключительном этапе перевязки производилось закрытие раны марлевой салфеткой, пропитанной йодсодержащим антисептиком «Бетадин». После перехода раневого процесса во II фазу и элиминации микроорганизмов из раны принято решение выполнить закрытие хронической раны латеральной поверхности правой голени свободным расщепленным кожным трансплантатом.
Методом ретроспективного анализа выявили актуальную госпитальную микрофлору, являющуюся наиболее частой причиной местных раневых осложнений при кожной пластике. В данном отделении гнойной хирургии наиболее часто встречались следующие микроорганизмы: Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. Способностью лизировать штаммы Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, а также Streptococcus, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae обладает, согласно аннотации производителя (ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России), «Пиобактериофаг поливалентный». Подготовили раствор бактериофагов, к которым по данным бактериологического анализа чувствительны выявленные госпитальные патогены. Бактериофаги находились в жидкой среде во флаконах емкостью 20 мл.
-5
19.09.2018 выполнена свободная аутодермопластика расщепленным лоскутом толщиной 0,3 мм, который был взят с передне-латеральной поверхности правого бедра. После фиксации аутодермотрансплантата интраоперационно подготовили повязку на реципиентную рану. Для этого на пленку размером 10×10 см из поливинилового спирта, содержащую фосфатный буфер с рН 6,6÷7,8 в количестве (1÷3)×10 моль/г, нанесли 10 мл раствора «Пиобактериофага поливалентного», в результате чего образовалась гелевая пластина Затем укрыли трансплантат и реципиентную рану полученной гелевой пластиной (Фиг. 5).
На гелевую пластину наложили раневое покрытие «Воскопран», асептическую повязку, которые сняли через четверо суток (Фиг. 6). При визуальном осмотре аутодермотрансплантат жизнеспособен, фиксирован к реципиентной ране, покрыт тонким слоем геля. Признаков инфекционного процесса нет. Гель собрали стерильным шпателем, направили на микробиологическое исследование. Выявлены прозрачные зоны лизиса тестовой культуры в области нанесения геля (Фиг. 7), что свидетельствует о наличии в геле бактериофага, обладающего литической активностью +++ (3 плюса).
Таким образом, заявляемое изобретение обладает следующими преимуществами:
1. Способ обеспечивает кислотность, оптимальную для активности и стабильности бактриофагов.
2. Преобразование раствора бактериофага в гелевую форму обеспечивает условия стабильности бактериофага в течение 3-4 суток за счет сохранения влажности. Полученный гель обеспечивает иммобилизацию бактериофагов на этот же срок в области аутодермотрансплантата.
3. Полученный гель обладает пластичностью и легко моделируется на поверхностях сложной формы.
Проведенный анализ патентной и научно-медицинской литературы показал, что предлагаемый способ содержит признаки, отличающие его не только от прототипа, но и от других способов профилактики инфекционных процессов при кожной пластике. Введение в гелевую повязку бактериофагов extempore обеспечивает защиту реципиентной области от актуальных госпитальных штаммов. В разработанном способе активность бактериофагов в повязке сохраняется до 4-х суток, то есть на срок, достаточный для прорастания трансплантата собственными сосудами в результате процессов ангиогенеза и обеспечения питания и иммунной защиты. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения "новизна" и «изобретательский уровень».
Литература
1. Бактериофаги. Общая фармакопейная статья. ОФС.1.7.1.0002.15. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIII издание. Том II.
2. Грибань, П.А. Анализ морфологических изменений в аутодермотрансплантате после кожной пластики / П.А. Грибань, Е.Е. Мартыненко, Т.Н. Лемешко // Фундаментальные исследования. - 2010. - №11. - С. 37-41. Режим доступа: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=14013 (дата обращения: 25.10.2018).
3. Додова, Е.Г. Постантибиотиковая эра: бактериофаги как лечебная стратегия / E.Г. Додова, Е.А. Горбунова, И.А. Аполихина // Медицинский вестник. - 2015. - №1. - С. 49-53;
4. Ковязина, Н.А. Подходы к конструированию полимерных раневых покрытий с бактериофагами / Н.А. Ковязина, П.С. Лукин, Е.В. Функнер и др. // Медицинский альманах. - 2013. - №2 (26). - С. 72-74.
5. Назаров, П.А. Альтернативы антибиотикам: литические ферменты бактериофагов и фаговая терапия / П.А. Назаров // Вестник РГМУ. - 2018. - №1. - С. 6-15.
6. Орлов А.Г. Коллагеновые губчатые повязки в сочетании с бактериофагами в комплексном лечении синдрома диабетической стопы. Пилотное наблюдение / А.Г. Орлов, А.Н. Липин // Хирургические инфекции кожи и мягких тканей у детей и взрослых: материалы Международной научно-практической конференции. - Симферополь, 2017. - С. 184-187.
7. Пат. 2344773 Российская Федерация, МПК А61В 17/322, А61К 33/08, А61K 35/16, А61Р 41/00. Способ подготовки кожных трансплантатов и закрываемой раневой поверхности при выполнении свободной кожной пластики / Атясова М.Л., Аминев В.А., Перетягин С.П.; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение "Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи". - №2007122861/14; заявл. 18.06.2007; опубл. 27.01.2009, Бюл. №3. - 3 с.
8. Покровская, М.П. Лечение ран бактериофагами / М.П. Покровская, Л.С. Каганова, М.А. Морозенко, А.Г. Булгакова, Е.Е. Скаценко - Москва: Наркомздрав СССР Государственное издательство медицинской литературы «МЕДГИЗ», 1941. - 51 с.
9. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 18 мая 2010 г. N 58 "Об утверждении СанПиН 2.1.3.2630-10 "Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность". - Режим доступа: http://base.garant.ru/12177989/#ixzz5VKNx0nMI (дата обращения: 30.10.2018).
10. Юданова Т.Н. Полимерные раневые покрытия с ферментативным и антимикробным действием: автореферат дис. … доктора химических наук: 02.00.06 / Моск. гос. текст. ун-т им. А.Н. Косыгина. - Москва, 2004. - 32 с.
11. Nogueira, F. Immobilization of bacteriophage in wound-dressing nanostructure / F. Nogueira, N. Karumidze, I. Kusradze, M. Goderdzishvili, P. Teixeira, I.C. Gouveia // Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2017. - V. 13, №8. - P. 2475-2484.