ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА "СЕМАКС" В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА АКТИВАЦИИ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА
USING PREPARATION "SEMAX" AS MEANS OF ACTIVATION OF ADAPTIVE IMMUNITY

Изобретение относится к медицине и касается использования пептида Семакс в качестве препарата, активирующего адаптивный иммунитет для коррекции иммунного статуса и устранения дисбаланса провоспалительных и противовоспалительных факторов при заболеваниях центральной нервной системы, сопровождающихся нарушением иммунного ответа, включая инсульт.
Семакс - синтетический аналог АКТГ(4-7) - гептапептид (формула Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), являющийся стимулятором памяти пролонгированного действия (патент СССР №939440, C07C 103/52, 1981 г. ), обладает нейропротекторным свойством и в настоящее время используется в качестве субстанции для приготовления ноотропного лекарственного средства (Патент РФ №2045958, A61K 37/02, 1994 г. ). В настоящее время пептидный препарат Семакс успешно используется для лечения инсульта.
Ишемический инсульт является одной из ведущих причин смертности и инвалидизации населения в мире. Это заболевание возникает как следствие критического снижения кровотока в тканях мозга, которое ведет к массовой гибели нейронов, а также формированию некротического ядра и области пенумбры. Как показали исследования, Семакс способствует выживанию нейронов в условиях гипоксии (Kaplan, Koshelev, Nezavibat′ko, & Ashmarin, 1992) и в условиях глутаматной нейротоксичности (Storozhevykh et al., 2007). Он обладает нейропротективными свойствами и способствует устойчивости митохондрий в условиях стресса, вызванного дисрегуляцией потока ионов кальция (Storozhevykh et al., 2007), обладает ноотропной активностью (De Wied, 1997), воздействует на экспрессию генов нейротрофических факторов и их рецепторов в условиях экспериментальной ишемии мозга крыс (Dmitrieva et al., 2010; Stavchansky et al., 2011). Иммунобиохимическое исследование содержания основных триггеров воспалительного ответа (интерлейкина 1-β, фактора некроза опухолей α, С-реактивного белка), а также противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10 и трансформирующего ростового фактора β) в спинномозговой жидкости больных, перенесших инсульт и принимавших Семакс, позволило предположить об иммуномодуляторной активности препарата (Мясоедов и др., 1999). Семакс участвовал в сдвиге баланса пептидергических систем мозга в сторону преобладания противовоспалительных защитных факторов над факторами, поддерживающими воспалительную реакцию. Эти свойства препарата были использованы в офтальмологии (Курышева и др., 2001).
Авторами впервые обнаружена способность Семакса воздействовать на иммунную систему при ишемическом инсульте за счет активации приобретенного специфического (адаптивного) иммунитета.
Задачей создания предлагаемого решения является реализация его назначения. Для решения такой задачи предлагается применить гептапептид формулы Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro (Семакс) в качестве средства, активирующего адаптивный (приобретенный) иммунитет, в частности, при инсульте.
Изобретение поясняется схемой участия генов в регуляции синтеза иммуноглобулинов (Рис. 1).
Нижеследующее описание содержит пример, подтверждающий возможность реализации заявленного назначения.
Принципиально, возможность реализации такого назначения была выявлена по результатам исследования глобальных изменений транскриптома в мозге крыс в условиях экспериментальной ишемии, получавших препарат Семакс. В частности, был выявлен эффект воздействия пептидного препарата на экспрессию генов, обеспечивающих как гуморальное, так и клеточное звено адаптивного иммунитета: генов иммуноглобулинов; генов главного комплекса гистосовместимости; генов, влияющих на активность клеток иммунной системы, а также ряда других генов иммунной системы. Гены иммунной системы, статистически значимо изменившие уровень экспрессии под действием Семакса, представлены в таблице 1.
Пример 1. В исследованиях, проводимых на самцах белых крыс линии Вистар массой 200-250 г, изучали изменение транскриптома в мозге крыс в ответ на внутрибрюшинное введение Семакса в условиях экспериментальной церебральной ишемии. Была применена модель «фокальной ишемии мозга», заключающаяся в электрокоагуляционной окклюзии дистального участка левой средней мозговой артерии (СМА). Крыс содержали в условиях естественного освещения и свободного доступа к еде и воде. Операцию проводили под действием хлоралгидратного наркоза (300 мг/кг). Животные были поделены на группы: 1) «ишемия» и 2) «ишемия + Семакс». Все животные подвергались окклюзии левой средней мозговой артерии. В течение эксперимента животные группы «ишемия + Семакс» внутрибрюшинно получали Семакс (100 мкг/кг), тогда как животным группы «ишемия» вводили физраствор. Введение Семакса и физраствора осуществляли через 15 мин, 1, 4 и 8 ч после окклюзии СМА. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом путем декапитации через 3 и 24 ч после операции. В каждой временной точке было не менее 5 животных соответствующей группы. У каждого животного выделяли лобно-теменную долю коры, где, согласно гистологическим исследованиям (предыдущие наши исследования), располагается очаг ишемии (Dmitrieva et al., 2008). Из тканей выделяли суммарную РНК и синтезировали комплементарную ДНК (кДНК) с использованием набора «RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit» (Fermentas, Lithuania) в соответствии с приложенным протоколом. Суммарную РНК выделяли из образцов тканей с использованием гуанидин-тиоцианата (Chomczynski & Sacchi, 1987). Целостность РНК оценивали сравнением полос рРНК, полученных методом электрофореза в агарозном геле при денатурирующих условиях. Количество РНК рассчитывалось с помощью Nanodrop, а качество оценено с использованием Agilent RNA 6000 наночипа. 400 нг суммарной РНК были амплифицированы с помощью набора Illumina TotalPrep™ (Ambion, USA). Амплифицированная РНК была гибридизована с биочипами RatRef-12 (Illumina, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Биочипы содержали олигонуклеотидные пробы, соответствующие 22226 последовательностям NCBI. Для считывания данных применяли Bead Array Reader. Анализировали материал программным обеспечением GenomeStudio (Illumina, USA), используя модуль генной экспрессии.
Для дальнейшего анализа были отобраны только те гены, уровень транскриптов которых изменился не менее чем в 1.5 раза, пороговый уровень значения p составил 0.05. В каждой из временных точек (3 и 24 ч) сравнивали данные по изменению экспрессии генов под влиянием пептида с экспрессией генов контрольной группы «ишемия». В ответ на введение Семакса через 3 ч после начала ишемии по сравнению с контролем изменили экспрессию 96 генов, через 24 ч - 68 генов. В число этих генов вошли гены иммунной системы. Спустя 3 и 24 ч после окклюзии изменилась экспрессия ряда генов главного комплекса гистосовместимости (МНС), спустя 24 ч - генов иммуноглобулинов и хемокинов (Табл. 1). Следует отметить, что через 24 ч после окклюзии СМА влияние Семакса на иммунный ответ существенно усилилось. Гены, участвующие в этом ответе, составили более 50% от всего количества генов, изменивших экспрессию. Для большинства генов иммунного ответа под влиянием препарата выявлено увеличение уровня транскриптов. Наиболее заметную группу из числа генов иммунного ответа составили гены иммуноглобулинов, при этом амплитуда изменения экспрессии половины из них является самой высокой среди всех генов, на уровень транскриптов которых повлияло введение пептида (табл. 1).
В ряде работ было показано, что иммуноглобулины, введенные внутривенно, (IVIG) обладают сильным нейропротективным действием против ишемического повреждения головного мозга (Arumugam, Selvaraj, Woodruff, & Mattson, 2008). Считается, что применение IVIG является одной из концепций лечения острого инсульта (Walberer et al., 2010). Через 24 ч после окклюзии СМА под действием Семакса в участке мозга животных, включающем очаг поражения, активно экспрессируются и другие важные участники адаптивного иммунного ответа - хемокины. Большое количество работ свидетельствует о том, что продуцировать хемокины способны как астроциты и микроглия, так и нейроны (De Haas, Van Weering, De Jong, Boddeke, & Biber, 2007). Широко известно, что некоторые хемокины и их рецепторы вовлечены в разнообразные нейродегенеративные заболевания (Bajetto, Bonavia, Barbero, & Schettini, 2002), включая ишемическое повреждение мозга (Minami & Satoh, 2003).
Недавние исследования показали, что хемокины представляют уникальный класс нейромедиаторов, обеспечивающих взаимодействия между нейронами и клетками, составляющими окружающую их микросреду (Rostène et al., 2011). В соответствии с этим, деление хемокинов на про- и противовоспалительные факторы является слишком упрощенным и порождает много противоречащих друг другу фактов о нейропротективньгх и нейродегенеративных функциях хемокинов (Jaerve & Müller, 2012). Увеличение экспрессии генов, кодирующих хемокины, является дополнительным свидетельством активации приобретенного иммунитета Семаксом в условиях фокальной церебральной ишемии головного мозга. Увеличение экспрессии генов семейства МНС спустя 3 и 24 ч после окклюзии СМА также свидетельствует об активации адаптивного иммунитета (табл. 1).
С использованием технологии полногеномных экспрессионных кДНК-микрочипов, нами также проведено исследование изменения экспрессии транскриптома мозга крыс спустя 24 ч относительно 3 ч в условиях ишемии под воздействием Семакса или при введении физиологического раствора. Число генов, статистически достоверно изменивших экспрессию в ответ на введение Семакса, спустя 24 ч после окклюзии по сравнению с 3 ч составило 857, при введении физиологического раствора - 769 генов. Анализ генов, изменивших экспрессию в ответ на периодическое введение Семакса ишемизированным животным, с помощью он-лайн программы (Ingenuity Systems, http://www.ingenuity.com) позволил идентифицировать биологические процессы, ассоциированные с выявленными изменениями экспрессии генов. Наряду с жизненно важными процессами, связанными с функционированием мозга, выживанием нейронов, памятью и обучением, были выявлены процессы, связанные с функционированием иммунной системы. К числу таких процессов относятся иммунный ответ, развитие и привлечение лейкоцитов, развитие лимфоцитов, активация микроглии и др. На рис. 1 представлены гены, участвующие в регуляции синтеза иммуноглобулинов, изменившие экспрессию спустя 24 ч относительно 3 ч после окклюзии СМА крыс при введении физраствора, а также при введении Семакса. Наряду с 15 генами, изменившими экспрессию при ишемии (введение физраствора), были выявлены гены (указаны в пересекающихся областях), изменившие экспрессию как в условиях ишемии, так и под воздействием пептида при ишемии. Для большей части этих генов уровни транскрипции изменились схожим образом и были обусловлены, по-видимому, действием повреждения. Однако для нескольких генов воздействие пептида сопровождалось более высоким уровнем экспрессии ряда генов, чем действие ишемии (таблица 2). Кроме того, 11 генов изменили экспрессию под воздействием Семакса, но не отреагировали на ишемическое повреждение при введении физраствора. Согласно полученным данным, Семакс участвует в регуляции генов, обеспечивающих синтез иммуноглобулинов.
Анализ глобальных изменений транскриптома на биочипах с использованием крупномасштабных баз данных позволил нам выявить несколько сигнальных и метаболических путей, участвующих в активации иммунной системы в ответ на введение нейропептида Семакс в условиях экспериментальной ишемии мозга крыс. В табл. 3 представлены сигнальные и метаболические пути, участвующие в них гены, их количество, а также уровень значимости ассоциации p. Перечень сигнальных путей расположен в порядке увеличения значения p.
Среди сигнальных путей, участвующих в клеточном ответе, следует выделить Антигенпредставляющий Сигнальный Путь (Antigen Presentation Pathway, р=4.4Е-11), получивший наивысший бал в системе ранжирования BioRank (программа Ingenuity iReport, Ingenuity Systems). Эта система опирается не только на количество представленных генов, значительность их перекрытия со схемами сигнальных путей в библиотеке данных Ingenuity iReport, но и учитывает, какую роль (ключевую роль или вспомогательную) играют анализируемые гены в функционировании сигнальных путей, ассоциированных с представленным набором генов. К данному сигнальному пути были отнесены 13 генов (см. таблицу 3 - сигнальные и метаболические пути, участвующие в активации иммунной системы в ответ на введение нейропептида Семакс в условиях экспериментальной ишемии мозга крыс).
Семакс увеличил экспрессию всех упомянутых генов к концу первых суток на фоне ишемического повреждения тканей головного мозга. Данный путь отображает молекулярные события, которые приводят к представлению внутриклеточных антигенов и внеклеточных антигенов (полученных за пределами клеточной мембраны), на поверхности CD4+ и CD8+ Т-клеток соответственно.
Таким образом, приведенные данные подтверждают наличие у пептида Семакс свойства активации приобретенного иммунитета.