Жидкостный ин виво биореактор для выращивания костной ткани
LIQUID IN VIVO BIOREACTOR FOR GROWING BONE TISSUE

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к области медицины и медицинской технике, а именно к экспериментальной травматологии и ортопедии, регенеративной медицине. Изобретение может быть использовано в травматологии и ортопедии для восстановления целостности поврежденных трубчатых костей после утраты костной ткани (посттравматические дефекты кости, превышающие критический размер), изобретение позволяет тестировать лекарственные средства, исследовать длительное влияние растворов биофармацевтических препаратов на костную регенерацию.
Предпосылки создания изобретения.
Заполнение травматического дефекта кости костным регенератом в идеале является сочетанием совокупности сложноорганизованных, скоординированных в пространстве и времени морфогенетических процессов и многокомпонентного физиологического ответа организма на травму, включает в себя накопление в области дефекта необходимого для реализации костного сращения количества клеток-предшественников остеогенеза и их потомков, а также эндотелиальных клеток и клеток-потомков гемопоэтических стволовых клеток, являющихся эффекторами регенерации, а также сопутствующих регенераций нервов и сосудов, являющихся неотъемлемой и необходимой составляющей регенерации кости. В процесс вовлекаются несколько молекулярных сигнальных путей, ряд цитокинов и активируется экспрессия сотен генов, работающих над восстановлением структурной целостности кости без образования рубцов, в ходе регенерации взаимоотношения между регенерирующей костью и организмом меняются в динамике.
Клеточные и молекулярные события строго регулируются во время этапов (фаз) регенерации кости спонтанно. Этапы включают в себя начальную воспалительную фазу, образование гематомы и миграцию клеток-предшественников, формирование промежуточного каллуса, созревание каллуса и окончательную реконструкцию костного каллуса с восстановлением первоначальной структуры и формы кости (репаративное, адаптивное или функциональное ремоделирование кости). Согласованное действие клеток строго регулируется критическим взаимодействием биохимических, физических и механических факторов, что в совокупности воспроизводит феноменологически непрямой остеогенез - эндохондральное окостенение - развитие костей во время эмбриогенеза. В результате многие из гомеотических генов и первичных морфогенетических путей, которые активны во время развития скелета, также играют определенную роль и во время восстановления целостности кости при посттравматической регенерации. В идеальном случае регенерация кости должна развертываться так, чтобы регенерат догонял в своем развитии и прочностных характеристиках сам орган и оставался его полноценной составной частью.
Лечение крупных посттравматических костных дефектов представляет собой серьезную и нерешенную проблему, так как регенерация костной ткани может потребоваться в большем количестве, превышающим пределы естественной ограниченной способности организма к генерации костной массы при костном заживлении, важно понимать, что отсутствуют механизмы репаративной регенерации для спонтанного восстановления костей при крупных дефектах.
Количественным показателем предела регенерационной способности кости, как органа, является величина дефекта критического размера - это костный дефект минимальной длины, который не может быть спонтанно в течение жизни индивида замещен костным регенератом, объединяющим костные отломки в единую кость. Недостаточные размеры костных регенератов (костных мозолей на краях отломков), растущих от костных отломков к центру крупного дефекта, не позволяют им объединиться и восстановить целостность кости. Очевидно, при несоответствии размеров мозолей от двух противоположно расположенных отломков размеру костного дефекта сращения фрагментов кости не происходит, а открытый костномозговой канал в таких случаях закрывается замыкательной костной пластинкой, возможно образование ложного сустава. Параметры дефектов критического размера свои для каждой кости, и зависят от особенностей травмы, формы дефекта, возраста, пола и т.д.
При заполнении костных дефектов аутологичная кость считается золотым стандартом в травматологии и ортопедии благодаря ее способности успешно интегрироваться в собственный организм, и отсутствию осложнений, связанных с иммунологическими реакциями реципиента на чужеродный материал. Тем не менее, использование аутологичной кости затрудняется из-за дефицита собственной костной ткани пациента, доступной для безопасного для здоровья пациента забора. Хирургическая операция по забору аутологичной кости, например, костной ткани из гребня подвздошной кости или иной части скелета, является травматичной, после такой операции возникает болевой синдром и долговременный дискомфорт в месте забора, остаются рубцы на коже, а крыло подвздошной кости останется изувеченным. Следовательно, увеличение искусственным путем доступной для пересадок живой аутологичной костной ткани для удовлетворения клинических потребностей травматологии и ортопедии побуждает исследователей к поиску альтернатив. Даже пересадка собственного аутологичного костного трансплантата не всегда приводит к восстановлению анатомической целостности костей, крайне важна разработка способов повышения эффективности костной пластики.
Чтобы эффективно залечить посттравматические дефекты костей у животных, необходимо применять мембраны в сочетании с аутогенным костным трансплантатом и/или подходящим заменителем кости (Gugala Z, Gogolewski S. Regeneration of segmental diaphyseal defects in sheep tibiae using resorbable polymeric membranes: a preliminary study. J Orthop Trauma. 1999; 13:187-195. doi: 10.1097/00005131-199903000-00006).
В условиях исключения врастания в костный регенерат конкурирующих за пространство регенератов соединительной ткани, окружающей кость, за счет мембран, не происходит экспоненциального снижения скорости образования и распространения регенератов костной ткани в выделенном пространстве. Изоляция костного регенерата от окружающих ткани может осуществляться с применением мембран либо непроницаемых, либо полупроницаемых для растворенных веществ. Такой метод стимуляции восстановительных процессов получил собственное название - направленная костная регенерация. Исключение негативного влияния неостеогенных тканей на регенерацию кости является ключевым принципом направленной костной регенерации. Сама мембрана, является главным компонентом лечения. Использованы различные материалы и их модификации для их создания. К желательным характеристикам мембраны относятся биосовместимость, доступность для клеточной адгезии, способность к интеграции с тканями реципиента, клиническая управляемость, способность создавать защищенное пространство для костной регенерации и адекватные механические и физические свойства. Использование мембран для укрытия костного дефекта вместе с костными трансплантатами и материалами-заменителями для заполнения дефекта усиливают регенеративный потенциал тканей реципиента. Таким образом, использование мембран повышает эффективность одного из известных способов регенерации кости - трансплантационной регенерации или же регенерации костной ткани по каркасу или трансплантату, заполняющим пустоту на месте удаленного фрагмента кости. Трансплантат стимулирует регенерационный процесс и обеспечивает возможность восстановления целостности кости путем постепенного замещения трансплантата собственным костным регенератом реципиента. Трансплантат или любой разрешенный к клиническому применению костнопластический материал в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, но создают временную модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять регенерацию и заместить трансплантат костным регенератом, полноценно интегрированным в организм и обладающим всеми прочностными характеристиками здоровой кости.
Известна мембрана RegeneCure (RegeneCure's regenerative АМСА membrane Implant), улучшающая естественное заживление костей благодаря катионным свойствам мембраны привлекающих стволовые клетки, способствуя их адгезии, усиливающей их пролиферации для более быстрого образования новой костной ткани. Мембрана является полностью синтетической, что устраняет риск заражения патогенами, присутствующими в мембранах из животных тканей. Она также достаточно прочна, и медленно разлагается с течением времени, благодаря чему у естественной кости остается больше времени для полноценной регенерации. Кроме того, новая мембрана сокращает время регенерации, способствуя клеточной адгезии, распространению и распределению стволовых клеток в костной ткани, при этом также предотвращается проникновение соединительной ткани в зону дефекта. Мембрана представляет собой каркас из микропористого полимера (сополимер метакрилата аммиака типа А) и пластификатора. Кроме того, этот имплант-мембрана, по мнению авторов, позволяет концентрировать факторы роста, цитокины и мезенхимальные стволовые клетки там, где это необходимо, действуя в качестве барьера для предотвращения диффузии в соседние мягкие ткани, что способствует более быстрому заживлению кости за счет управляемой регенерации кости (Kirmayer D. et al. Guided Bone Regeneration with Ammoniomethac-rylate-Based Barrier Membranes in a Radial Defect Model. Biomed Res Int. 2020 Oct 13; 2020:5905740. doi: 10.1155/2020/5905740. eCollection 2020). Несмотря на свойство такой мембраны накапливать на своей поверхности остеогенные клетки, добиться костной регенерации без костной трансплантации или использования костнопластических материалов сложно.
Известна техника индуцированной мембраны (Masquelet's induced membrane technique), которая приобрела популярность для лечения дефектов костей критического размера и псевдоартрозов. Двухэтапная процедура основана на формировании псевдосиновиальной мембраны - соединительнотканного регенерата, образование которого в организме индуцируется временно устанавливаемым полнотелым полиметилметакрилатным спейсе-ром (изготовленного из полиметилметакрилатного костного цемента), помещенным в костный дефект. Псевдомембрана (псевдосиновиальная мембрана) по сути является аутологичной мембраной инородного тела, создается на первом этапе выполнения техники реакцией иммунной системы на спейсер из полиметилметакрилатного костного цемента, имеет решающее значение для поддержки морселизированного костного трансплантата, трансплантируемого на втором этапе лечения. Псевдомембрана окружает спейсер и секре-тирует ряд цитокинов, в том числе, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), трансформирующий фактор роста-В (TGF-B) и костный морфогенетический белок (ВМР-2). Максимальная продукция ВМР-2 у животных моделей была зарегистрирована через 4 недели после имплантации спейсера. Принцип концепции индуцированной мембраны А. Маскелета заключается в создании путем индукции псевдосиновиальной мембраны, основные свойства которой - действовать в качестве биологической камеры, которая предотвращает резорбцию костного трансплантата и секретирует факторы роста, поддерживающие репаративный остеогенез. В совокупности это позволяет повысить эффективность восстановления костного дефекта диафизов длинных трубчатых костей за счет костной трансплантации (Morelli I., Drago L., George D.A., Gallazzi Е., Scarponi Sio, Romano C.L. Masquelet technique: myth or reality? A systematic review and meta-analysis. Injury. 2016 Dec;47 Suppl6: S68-S76. doi: 10.1016/S0020-1383(16)30842-7).
Метод применения индуцированных мембран (Masquelet technique) имеет ряд преимуществ, и его часто предпочитают васкуляризированному костному лоскуту или методу Илизарова. Однако, недостаточные показатели успешности метода, необходимость улучшения техники и отбора пациентов стали серьезной проблемой и препятствием более широкому внедрению этой технологии (Alford A.I., Nicolaou D., Hake M., McBride-Gagyi S. Masquelet's induced membrane technique: Review of current concepts and future directions. J Or-thopRes. 2020 Dec 31. doi: 10.1002/jor.24978).
Известна «алмазная концепция» лечения повреждений костей, иначе называемая концепцией политерапии сложных случаев травматических повреждений костей. В рамках этой концепции сформулировано представление о биологической камере, основанное на необходимости длительного воздействия на область регенерации: любое биологическое усиление, которое может быть помещено в место несращения костных отломков, должно удерживаться локально и длительно, чтобы проявился эффект и можно было достичь его максимальных проявлений (Giannoudis PV, Einhorn Т.А., Marsh D. Fracture healing: the diamond concept. Injury 2007;38(Suppl. 4): S3-6).
Ин виво биореактор. Концептуально биореактор in vivo возник из-за отсутствия универсальных эффективных методов костной пластики для восстановления сложных переломов костей с крупными дефектами костной ткани, лечения утраты костной массы, в том числе, вследствие инфекционных процессов, некрозов и удаления опухолей. Традиционные стратегии костной пластики требуют свежей аутологичной кости, взятой из гребня подвздошной кости; это место сбора ограничено количеством кости, которое можно безопасно удалить, а также связанной с этим болью и болезненностью. Аутотрансгшантаты считаются золотым стандартом, поскольку они могут сохранять кровеносные сосуды и нервные волокна и могут обеспечивать надлежащие остеогенные сигналы, направляющие рост новой кости. Аутотрансплантаты содержат смесь факторов роста и остеогенных клеток, необходимых для регенерации костей. Однако использование аутотрансплантатов имеет известные недостатки, такие как риск возникновения боли в донорском участке, повышенная кро-вопотеря, инфекция донорского участка и, главное, ограниченное количество трансплантата, доступного от одного пациента.
Другие методы включают трупные аллотрансплантаты и синтетические варианты (часто сделанные из гидроксиапатита), которые стали доступны в последние годы, имеют известные недостатки. Большинство доступных костных биоматериалов часто не вызывают достаточного образования кровеносных сосудов и нервов в костных регенератах. Отчасти это связано со сложностью интеграции и регулирования нескольких типов тканей в искусственных материалах, что вызывает разрыв между интактной частью кости и менее полноценным регенератом, что часто не позволяет эффективно вылечить пациента.
Концепция таких биореакторов основана на манипулировании искусственно созданным пространством внутри тела реципиента таким образом, что само тело служит «биореактором in vivo», в таких устройствах конструирование и выращивание новой ткани в пространстве биореактора не имеющего ограничительных стенок искусственного происхождения (чужеродного материала, инородного тела) и внутри привнесенной (имплантируемой) конструкции. Внутрь пространства могут быть помещены плюрипотентные или специализированные стволовые клетки, тканевые каркасы и ключевые биомолекулы, используемые в тканевой инженерии кости, необходимые для формирования и роста биоискусственных тканей. Одна из особенностей применения ин виво биореактора - формирование новых тканей часто идет параллельно с их интеграцией в организм-носитель биореактора.
3
Есть три главных подхода к созданию ин виво биореакторов. Первый подход основан на хирургическом доступе внутрь тела, раздвижении анатомических структур, между которыми искусственно создается свободное пространство, вокруг которого роль биореактора выполняют прилежащие собственные ткани. Например, известен способ создания свободного пространства между поверхностью длинной кости и надкостницей. С помощью способа гидравлического подъема надкостница приподнимается над костью водным раствором или гелем, вводимыми под нее через прокол надкостницы с помощью иглы. Так можно создать лишь небольшое внутреннее пространство объемом до 200 мм, заполненное кальциево-альгинатным гелем. В таком биореакторе роль стенок устройства выполняют собственные же ткани, причем в своей наружной стенке - надкостнице с внутренней стороны расположен камбий, такой биореактор обеспечен собственными необходимыми для остеогенеза биомолекулярными сигналами, все необходимое для формирования кости может быть получено локально и не требует дополнительных внешних воздействий (Stevens М. М. et al. In vivo engineering of organs: The bone bioreactor PNAS August 9,2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102).
Второй подход связан, с так называемыми, перфузионными биореакторами для лечения ран - медицинскими устройствами для современных методов местной терапии ран отрицательным давлением, которые были отнесены рядом авторов к ин виво биореакторам. Эти устройства располагаются вне тела - на поверхности кожи над раной.
Третий подход связан с разработкой камер для васкуляризированной тканевой инженерии. Эти камеры берут свое начало от хирургических концепций формирования трансплантатов на сосудистой ножке, применяемых в микрохирургии при проведении пластических операций. Камера служит биореактором in vivo в форме закрытого, защищенного пространства. Хирургическим путем создается пространство в теле между здоровыми тканями вокруг кровеносных сосудов, на сосуд устанавливаются камеры. Это создает между сосудом и стенкой камеры высоко ангиогенную среду, которая облегчает приживление и выживание внутри камеры трансплантированных клеток и тканеинженерных конструкций. Известно, что васкуляризация является ключом к разработке больших трансплантируемых тканевых конструкций, способных обеспечить терапевтический эффект (Polykandriotis Е. et al. Bio-reaktoren in der Regenerativen Medizin - Vom technischen Apparat zur rekonstruktiven Alternative? Handchir Mikrochir Plast Chir 2012; 44: 198-203, DOI http://dx.doi.org/10.1055/s-0032-1321838). Поскольку в зоне посттравматического костного дефекта отсутствуют сосуды, ортотопически ин виво биореакторы такого типа для восстановления костей не устанавливаются.
Следует отметить, что в настоящее время преобладает подход, согласно которому адекватное эктопическое расположение ин виво биореактора в теле более предпочтительно, поскольку может обеспечить лучшие условия для клеточной колонизации тканеинженерных матриц, их васкуляризации, удобнее проводить механическую стимуляцию тканеинженерных конструкций, а выращенная новая ткань может быть легко доступна для несложных хирургических манипуляций по переносу в ортотопическое положение. Важно разработать ин виво биореактор, обеспечивающий ортотопическую сборку костей, которые позволяют восстанавливать дефект кости в нужном месте без необходимости вторичной операции по пересадке созданного искусственным путем костного трансплантата на новое место. Крайне важно, что одновременно с построением новой ткани идет врастание в нее сосудов и нервов из отломков костей. Основные препятствия для создания таких устройств связаны с тем, что во многих случаях участок костного дефекта не может обеспечить приемлемую локальную регенеративную микросреду для выращивания новых тканей из-за инфекции, недостаточного кровоснабжения, трофики, последствий лучевого лечения или чрезмерной дегенерации окружающих тканей. Суть изобретения.
Задача настоящего изобретения состоит в повышении эффективности выращивания костной ткани методом ин виво биореактора за счет выращивания костных структур в благоприятной жидкой среде с питательными веществами и биостимуляторами на обычном для кости месте (ортотопически), а также расширении показаний к применению ортотопически расположенных ин виво биореакторов.
Расширение показаний к применению за счет возможности использовать биореактор для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его внутреннем пространстве, что позволяет оздоровить ткани, ликвидировать микробное загрязнение и создать благоприятную локальную среду для регенерации, для разработки новых технологий тканевой инженерии и регенеративной медицины, направленных на стимуляцию роста новой костной ткани, за счет применения новой жидкой композиции стимулирующей рост костной мозоли, врастающей в полость ин виво биореактора и объединяющейся с костной мозолью другого конца отломка, а также обеспечении быстрого доступа к области дефекта в любое удобное время в течение всего периода восстановления дефекта кости водорастворимых биологически активных веществ. Стенки биореактора могут быть импрегнированы антибиотиками по аналогии с антибактериальным спейсером. Полиметилметакрилат (из которого состоит ин виво биореактор), пропитывается антибиотиками, и может быть успешно применен для лечения инфекционных процессов. Костный цемент (метилметакрилата) в составе биоректора обеспечивает локальную концентрацию высоких доз антибиотиков, биореактор заполняет пространство, предотвращая инволюцию окружающих мягких тканей и доставляет соответствующие антибиотики вокруг себя. Технический результат данного изобретения заключается в разработке нового устройства
- ин виво биореактора для создания контролируемого внутреннего пространства, которое может быть заполнено жидкой средой - композицией, применяемой по новому назначению
- для стимуляции репаративной регенерации кости, благоприятной для костной регенерации, в которой выращивается новая кость (на месте костного дефекта критического размера) в обычном для данной ткани или органа опорно-двигательного аппарата (кости) месте. Вокруг ин виво биореактора, как реакция организма на инородное тело из метилметакрилата, формируется естественным путем псевдосиновиальная мембрана, которая продуцирует цитокины, стимулирующие костную регенерацию. При удалении ин виво биореактора из организма эта мембрана продуцирует морфогенетические белки и факторы роста сосудов, которые способствуют ремоделированию регенерата костной ткани и повышают эффективность лечения. Использование новых устройства, композиции и способа выращивания костной ткани внутри этого устройства позволит получить эффективный и постоянный доступ к области костной регенерации для ее подпитки растворами, стимулирующими костную регенерацию с целью восстановления (заживления) костного дефекта, превышающего критический размер (критический костный дефект). Устройство позволяет использовать костные морфогенетические белки в физиологических дозах длительное время, добиваясь повышение эффективности применения этих биофармацевтических препаратов, причем действие этих препаратов будет преимущественно местным, распространение путем диффузии вокруг ин виво биореактора, ограничено стенками биореактора. Крайне важным результатом является возможность использования ин виво реактора для проведения активного антибактериального дренирования тканей внутри его пространства по показаниям. Подача физиологического раствора натрия хлорида и его одновременное извлечение из полости биореактора позволяет промыть и очистить тканевые поверхности внутри пространства этого биореактора, в том числе и от микробного загрязнения, с раствором могут подаваться антимикробные средства в концентрациях в сотни раз превышающие допустимые дозы при их парентеральном введении, также возможно введение невсасывающиеся антибактериальных препаратов, например, рифаксимина. Это существенно расширяет применимость изобретения в клинической практике. Способ выращивания костной ткани в биореакторе по изобретению основан на применении устройства и композиции в определенных режимах и временной последовательности заполнения пространства биореактора композициями разного состава.
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что предлагаемое устройство жидкостный ин виво биореактор для выращивания новой костной ткани на месте костного дефекта выполнено в виде полой круглой трубы, стенки которой ограничивают внутреннее пространство ин виво биореактора, труба выполнена из костного цемента (метилметакрилата), имеет утолщения по краям обоих отверстий трубы из этого же цемента, размеры трубы и ее отверстий позволяют ввести внутрь через отверстия края отломков или опилов костей, труба устанавливается на место костного дефекта, уплотнение контакта трубы и костных краев, а также ее удержание опосредовано и обеспечивается двумя воронками в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса, на концах полых конусов воронок расположены две манжеты воронки, выполненные из того же биоинертного натурального латекса, воронки расположены на обоих концах трубки ин виво биореактора, во внутренней части стенки трубки ин виво биореактора имеется два дополнительных отверстия, расположенных друг напротив друга, в которые открываются просвет одной из гибких, тонких трубок из медицинской силиконовой резины и металлического штуцера, выполненного из титана. Ввинчивающийся штуцер для силиконовой трубки соединен с концом одной из гибких, тонких трубок из медицинской силиконовой резины, со свободного внешнего конца у двух трубок из силиконовой резины имеется соединение типа Луер или Луер-Лок с защитным колпачком. Причем через любую из гибких, тонких трубок из силиконовой резины можно как подавать, так и извлекать жидкость из пространства ин виво биореактора, так и подавать туда, часть одной из силиконовых трубок находиться внутри стенки трубы из метилметакрилата ин виво биореактора и идет к противоположному дополнительному внутреннему отверстию в стенке трубы ин виво биореактора.
В частных вариантах воплощения изобретения внешняя поверхность круглой трубы, образующей емкость биореактора может быть импрегнирована антибиотиками.
В частных вариантах воплощения изобретения вся поверхность трубы, образующей емкость биореактора может быть импрегнирована антибиотиками.
В частных вариантах могут использоваться фосфомицин, гентамицин, винкомицин или иной антибиотик с учетом верифицированной патогенной микрофлоры.
В частных вариантах воплощения изобретения трубки из силиконовой резины могут быть подключены к промывной системе и биореактор может быть использован для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его пространстве.
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что использовалась известной композиции культуральной питательной среды, а именно среды ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, полученных известным способом для местной стимуляции роста костной мозоли в полости ин виво биореактора. Применение известных веществ по новому назначению позволило добиться неожиданного результата - выраженного регенеративного роста костной мозоли в пространстве ин виво биореактора без применения костных трансплантатов, тканеинженерных конструкций, остеогенных клеток, костнопластических материалов. Костные мозоли с противоположных отломков костей сливались в единый регенерат, в ходе ремоделирования восстанавливалась полноценная кость. Это позволяет расширить области применения культуральных питательных сред.
В частных вариантах воплощения изобретения в культуральную среду добавляется костный морфогенетический белок ВМР-2 в концентрации 25 нанограммов на миллилитр (рекомби-нантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2).
В частных вариантах воплощения изобретения в культуральную среду добавляется костный морфогенетический белок ВМР-7 в концентрации 25 нанограммов на миллилитр (рекомби-нантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7).
В частных вариантах воплощения изобретения в культуральную среду добавляются остео-генные добавки 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты (Sigma,repMaHHfl), 10 мМ/л β-глицерофосфата натрия (Sigma, Германия) и 100 нМ дексаметазона (KRKA, Словения) или 10 нМ 1α,25- дигидроксикальциферола (витамин D3) (Roshe, Швейцария).
Известно, что для стимуляции костного сращения в место костного дефекта помещают кол-лагеновую губку, содержащую в одном миллилитре объема 1,5 миллиграмма рекомбинантного ВМР-2 (Infuse™ Bone Graft). Меньшие дозы малоэффективны. Однако в столь высокой дозировке ВМР-2 часто приводит к развитию серьезных неврологических, дыхательных и воспалительных побочных эффектов, что ограничивает применение костных морфо-генетических белков.
Технический результат и техническая задача обеспечиваются за счет того, что предлагаемый способ выращивания костной ткани в пространстве ин виво биореактора для восстановления костных дефектов включает следующие этапы:
- подготавливается операционное поле и выполняется хирургический доступ к большебер-цовой кости кролика, иссекается участок диафиза большеберцовой кости длиной 3 см в его нижней трети, с формированием посттравматического дефекта (операционная травма в эксперименте),
- с краев опилов костей снимается надкостница лоскутом циркулярно шириной 0,5 см,
- на полую трубку ин виво биореактора с двух сторон надеваются воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса,
- в отверстие трубки ин виво биореактора вставляется сначала опил дистальной части кости, затем проксимальной части кости, манжеты воронки должны плотно прилегать к наружным поверхностям фрагментов кости по всей длине их окружности, - для трубок из силиконовой резины делаются два отдельных раневых канала по которым их свободные концы от трубы биореактора идут к поверхности кожи, причем для прохождения через дерму кожи делается прокол кожи с наружной стороны через слой эпидермиса и с помощью прямого зажима типа москит трубка через отверстие в дерме вытягивается наружу,
- свободные концы трубок крепятся через штуцер к разъему типа "Луер-Лок" с защитным колпачком,
-производится стабилизация костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза,
- ушивание операционный раны с наложением асептической повязки,
- животное укладывается на бок,
- трубки из силиконовой резины с металлическим штекер / соединительным разъемом для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком переводятся в вертикальное положение, колпачки открываются,
- через силиконовую трубку с зеленым маркером вводиться композиция, заполнение ин виво биореактора контролируется по уровню жидкости в другой трубке,
- смена раствора в первые 2 суток от момента операции проводится 2 раза в сутки, в качестве раствора используется среда ДМЕМ или F12 с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси и Фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл композиции, после слива раствора ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,
- далее 1 раз в сутки в течение 8 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл среды, после слива композиции ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,
- далее 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой F12 с добавлением ВМР-7 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр среды по четным дням, средой F12 с добавлением ВМР-2 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр по нечетным дням,
- через 25-30 суток проводится хирургическая операция по извлечению ин виво биореактора, доступ через шов от операции по установке биореактора, со стороны трубок из силиконовой резины обнажается стенка ин виво биореактора, трубки из силиконовой резины отсекаются у места вхождения трубки в стенку трубы, металлический штуцер выкручивается, с обоих концов трубы ин виво биореактора стягиваются воронки, кусачками рассекаются стенки воронки по всей длине, кусачками раскалывается стенка трубы ин виво биореактора вдоль, удаляются осколки костного цемента из раны,
- труба ин виво биореактора проворачивается вокруг своей оси и кусачками раскалывается вдоль, образуются две части трубы, которые ротационными движениями извлекаются из тканей,
- трубки из силиконовой резины полностью удаляются, для этого их вытягивают зажимом за концы торчащие из поверхности кожи,
- проводиться послойное ушивание раны,
- аппарат Илизарова демонтируют после минерализации костного регенерата, не позже, чем через 5 месяцев.
Способ по изобретению основан на том, что в области травматического дефекта по краю отломка или опила кости всегда формируется костная мозоль -костный регенерат, который под действием композиции более выраженно, чем в контрольной группе прорастает в пространство ин виво биореактора, развитие двух костных мозолей с двух сторон костного дефекта позволяет им сомкнуться внутри пространства ин виво биореактора, что обеспечивает соединение костных фрагментов между собой и при последующем регенерационном и адаптивном ремоделировании костного регенерата обеспечивает эффективное восстановление целостности кости. Источником костеобразования в этом случае являются недифференцированные соединительнотканные клетки, располагающиеся в костномозговой полости, в межбалочных пространствах губчатого вещества и в сосудистых каналах коркового вещества, а также в меньшей степени расположенных вокруг кости (камбиальный слой надкостницы). Стенки биореактора препятствуют негативному влиянию параоссальных тканей на костную регенерацию, а композиция обеспечивает зону костной регенерации питательными и биологически активными веществами.
Устройство, композиция и способ, согласно настоящему изобретению, позволяют эффективно стимулировать рост костных регенератов внутри пространства биореактора для слияния между собой и объединения отломков кости, для этого не требуются дополнительно ни костные трансплантаты, ни костнопластические материалы, ни биомедицинские клеточные продукты. А костная мозоль состоит преимущественно не из хрящевой ткани, а из костных балок с хорошей сопутствующей васкуляризацией. Хорошая изоляция от пара-оссальных тканей и водонепроницаемый корпус биореактора позволяют обеспечить прицельную стимуляцию цитокинами только нужных тканей и добиться выраженного эффекта от цитокинов при существенно меньшей их концентрации, в отличие от существующих сегодня способов их применения, для которых характерен целый ряд осложнений. Известно, что для стимуляции костного сращения в место костного дефекта помещают коллагеновую губку, содержащую в одном миллилитре объема 1,5 миллиграмма рекомбинантного ВМР-2 (Infuse™ Bone Graft). Меньшие дозы малоэффективны. Однако в столь высокой дозировке ВМР-2 часто приводит к развитию серьезных неврологических, дыхательных и воспалительных побочных эффектов, что ограничивает применение костных морфогенетиче-ских белков. Материал, из которого изготовлен ин виво биореактор (из полиметилметакрилатного костного цемента) вызывает образование вокруг себя псевдосиновиальной мембраны, которая продуцирует целый ряд цитокинов, в том числе костные морфогенетические белки, которые усиливают репаративный остеогенез. Корпус ин виво биореактора (труба из костного цемента) в частных вариантах может быть импрегнирован антибиотиками, а само устройство может быть подключено к системе активного промывного дренирования, в пространство ин виво биореактора могут вводиться антибиотики в концентрациях существенно выше, чем при парентеральном ведении тех же препаратов. Все в совокупности позволяет использовать такой биореактор и при открытых костных повреждениях, с возможным микробным обсеменением. Краткое описание чертежей
Прилагаемый чертеж, который включен в состав настоящего описания и является его частью, иллюстрирует варианты осуществления изобретения и совместно с вышеприведенным общим описанием изобретения и нижеприведенным подробным описанием вариантов осуществления служат для пояснения принципов настоящего изобретения.
На фиг. 1 показана принципиальная схема жидкостного ин виво биореактора для выращивания костной ткани.
На фиг. 1 цифрами обозначены следующие позиции. 1 - труба ин виво биореактора.
2 - утолщения по краям обоих отверстий трубы ин виво биореактора.
3 - воронка в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса.
4 - манжета воронки из биоинертного натурального латекса.
5 - гибкая, тонкая трубка из силиконовой резины.
6 - соединительный разъем/металлический штекер для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком.
7 - ввинчивающийся металлический штуцер для силиконовой трубки.
8 - тонкая трубка из силиконовой резины внутри стенки трубы ин виво биореактора.
9 - диафиз длинной трубчатой кости.
10 - спицы аппарата внешней фиксации.
11 - костный мозг.
12 - отверстие трубы ин виво биореактора.
Термины и определения
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
8 настоящем описании и в формуле изобретения термины «включает», «включающий» и «включает в себя», «имеющий», «снабженный», «содержащий» и другие их грамматические формы не предназначены для истолкования в исключительном смысле, а, напротив, используются в неисключительном смысле (т.е., в смысле «имеющий в своем составе»). В качестве исчерпывающего перечня следует рассматривать только выражения типа «состоящий из».
В материалах настоящей заявки под термином «костный регенерат», «регенерат» понимают. 1 - совокупность незрелых пролиферирующих клеток в зоне повреждения - заново образованную в результате регенерации ткань, в данном случае костную.
В материалах настоящей заявки под термином «активное дренирование» понимают метод принудительного удаления содержимого из раневой полости в случаях обширных повреждений со сложной конфигурацией раневого канала и при наличии в нем замкнутых карманов. Среди таких методов выделяют аспирационное дренирование (через введение в полость раны трубки и создание внутри низкого давления), промывное дренирование (механический удаление раневого содержимого путем промывания) и т.п. Считается, что длительное капельное промывание и аспирация являются одним из самых перспективных методов дренирования гнойных ран.
В материалах настоящей заявки под термином «биореактор» понимают любое устройство, которое способно динамически поддерживать биологические и/или биохимические процессы в точно контролируемых и контролируемых экспериментальных и рабочих условиях (например, рН, температура, механические воздействия, время, подача питательных веществ и удаление отходов). Биореактор может быть определен как динамическая платформа для трехмерного культивирования клеток для различных биомедицинских применений, таких как: расширение различных типов клеток, включая PSC, генерация трехмерных органоидов из PSC и тканеспецифической дифференциации органоидов, полученных из стволовых клеток.
В материалах настоящей заявки под термином «ин виво биореактор» понимают тканеинженерный биореактор, который имплантируется в организм, использует и усиливает естественную регенеративную способность организма генерировать новую ткань для наращивания новообразованной ткани внутри своего пространства. В пространстве ин виво биоректора могут быть размещены скаффолды, живые клетки и костнопластические материалы.
В материалах настоящей заявки под термином «костный морфогенетический белок (ВМР)» понимают группу факторов роста (цитокины), которые были первоначально открыты благодаря их способности воздействовать на формирование кости и хряща, являются одной из основных групп морфогенетических сигнальных белков, которые организуют построение тканей в теле.
В материалах настоящей заявки под термином «медицинский костный цемент» понимают специальный искусственный материал (полиметилметакрилат, Polymethylmetacrylat, РММА). В состав которого входит, как минимум, два компонента: порошковый (полимер) и жидкий (мономер) в соотношении 2:1 или 3:1.
В материалах настоящей заявки под термином «направленная регенерация кости (Guided bone regeneration))) понимают хирургическую процедуру, включающую установку физического барьера, закрывающего клетки, между соединительной параоссальной тканью и дефектом кости, обеспечивает с помощью барьерных мембран защищенное пространство для роста новой кости.
Управляемая регенерация кости (GBR) - это метод регенерации кости, который возник на основе управляемой регенерации ткани (GTR).
В материалах настоящей заявки под термином «органотипическая регенерация или полная (реституция)» понимают замещение дефекта идентичными погибшим структурами. Органотипическая регенерация делится на интраморфоз- гиперплазия клеток структурно-функциональной единицы, без увеличения их количества; интерморфоз - образование новых структурно-функциональных единиц.
Регенерат (лат.re- повторное действие: genero, generaturn - порождать, производить): 1 - совокупность незрелых пролиферирующих клеток в зоне повреждения; 2 - заново образованная в результате регенерации ткань.
В материалах настоящей заявки под термином «спейсер» понимают специальное приспособление, изготовленное в форме какой-нибудь части тела для замены утраченной природной («временный» имгшантат), может быть изготовленного из костного цемента на основе полиметилметакрилата, импрегнированного антибиотиками, обеспечивающего их высвобождение в течение длительного периода времени порядка 2-3 месяцев (антибактериальный спейсер).
В материалах настоящей заявки под термином «биофармацевтический препарат» понимают лекарство, в котором активное вещество производится или извлекается из материалов биологического происхождения (живых клеток или тканей). Примерами биофармацевтических препаратов являются вакцины, сыворотки и инсулин.
В материалах настоящей заявки под термином «трансплантационная регенерация» понимают регенерацию костной ткани по трансплантату, стимуляцию регенерацион-ного процесса или обеспечения самой возможности восстановления путем трансплантации тканей в дефект, которые в дальнейшем подвергаются разрушению и рассасыванию, создают модель (каркас), которая позволяет местным тканям осуществлять органотипичную регенерацию. Метод трансплантации используют для стимуляции регенерационного процесса или обеспечения самой возможности восстановления.
В материалах настоящей заявки под термином «дефекты кости критического размера» понимают наименьший костный дефект в конкретной кости и видах животных, который не заживает самопроизвольно в течение жизни животного. Эти крупные дефекты кости представляют собой серьезную ортопедическую проблему, поскольку такие дефекты костей оказывают негативное влияние на качество жизни пациентов из-за сложности заживления и вынужденных последовательных повторных операций, и длительных госпитализаций.
Спонтанный -возникающий вследствие внутренних причин, без непосредственного воздействия извне.
Спонтанность - самопроизвольность; характеристика процессов, вызванных не внешними влияниями, а внутренними причинами; самодеятельность, способность активно действовать под влиянием внутренних побуждений.
Цитокины - большое семейство небольших молекул сигнальных белков, которые сек-ретируются клетками для передачи сигналов и межклеточной коммуникации.
В материалах настоящей заявки термины «остеогенные структуры», «остеогенные клетки» являются синонимами, представляют собой следующие за стволовыми стро-мальными клетками клетки этапа остеобластической дифференцировки, являются частично коммитированными, камбиальными в остеобластическом клеточном диффе-роне.
В материалах настоящей заявки под термином «костная мозоль (каллус, callus)» понимают структуру, образующуюся в ходе регенерации костной ткани после нарушения целостности кости при нормальном течении процесса заживления; обеспечивает спаяние рядом расположенных костных фрагментов, представляет собой соединительную ткань, образующуюся в месте перелома. Вначале образуется соединительнотканная провизорная мозоль, к концу 1-й недели образуется остеоидная ткань, которая превращается либо непосредственно в костную, либо вначале в хрящевую, а затем в костную.
В материалах настоящей заявки под терминами «индукторы остеогенеза», «факторы или индукторы костной дифференцировки», «остеоиндукторы» понимают вещество, которое может стимулировать дифференцировку стволовых клеток и клеток предшественников в направлении остеобластического дифферона - остеобластов, образования костной ткани.
В материалах настоящей заявки под термином «индуктор дифференцировки» понимают вещество, которое может стимулировать дифференцировку стволовых клеток и клеток предшественников в определенном направлении.
В материалах настоящей заявки под термином «остеогенная среда для костной регенерации» понимают локальную искусственно поддерживаемую тканевую среду для направленной дифференцировки стволовых и прогениторных клеток в направлении остеобластической линии дифференцировки, благоприятную для костной регенерации, содержащую индукторы костной регенерации, в том числе 0,1 мкМ дексамета-зона, 0,05 мМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ глицерол-2-фосфата.
В материалах настоящей заявки под термином «питательные вещества» (в контексте клеточных технологий) понимают все вещества в легко усваиваемом виде, необходимые для удовлетворения пищевых и энергетических потребностей живых клеток вне организма.
Используемый в данной заявке термин «питательная среда» - это смесь неорганических солей и других питательных соединений, предназначенная для обеспечения выживания, поддержания роста и/или пролиферации клеток за пределами организма в искусственных условиях, обычно используется основная среда с добавками, например сывороткой или факторами роста.
Термин «соединенный» означает функционально соединенный, при этом может быть использовано любое количество или комбинация промежуточных элементов между соединяемыми компонентами (включая отсутствие промежуточных элементов). Кроме того, термины «первый», «второй», «третий» и т.д. используются просто как условные маркеры, не накладывая каких-либо численных или иных ограничений на перечисляемые объекты.
Подробное описание изобретения.
В целом настоящее изобретение относится к жидкостному ин виво биореактору, композиции для стимуляции костного регенерата и способу выращивания костной ткани в пространстве этого биореактора. Часто ин виво биореакторы заполняются гелями или твердым веществом, термин жидкостный делает акцент на длительном погружении регенерата в жидкую среду поддерживающую продукцию новой костной массы.
Жидкостный ин виво биореактор для выращивания новой костной ткани на месте костного посттравматического дефекта изготавливается в виде полой круглой трубы из полиметилметакрилатного костного цемента, стенки которой ограничивают внутреннее пространство ин виво биореактора, труба имеет утолщения по краям обоих отверстий трубы, выполненные сразу при заливке формы трубы вместе с наружными утолщениями на краях полиметилметакрилатным костным цементом, размеры трубы и ее отверстий позволяют ввести внутрь через отверстия края отломков или опилов костей, труба устанавливается на место костного дефекта, уплотнение контакта трубы и костных краев травмированной кости, а также удержание жидкостного ин виво биореактора в нужном положении опосредовано и обеспечивается двумя воронками в виде усеченного полого конуса, выполненных из биоинертного натурального латекса, на концах полых конусов воронок расположены неразрывно спаянные с усеченным конусом две манжеты воронки, выполненные из того же биоинертного натурального латекса, воронки расположены на обоих концах трубки ин виво биореактора, биоинертный натуральный латекс биоинертен и не вызывает заметных реакций иммунной системы, во внутренней части стенки трубки ин виво биореактора имеется два дополнительных отверстия, расположенных друг напротив друга, в которые открываются просвет одной из гибких, тонких трубок из медицинской силиконовой резины и металлического штуцера, выполненного из титана. Ввинчивающийся штуцер для силиконовой трубки соединен с концом одной из гибких, тонких трубок из медицинской силиконовой резины, со свободного внешнего конца две трубки из биоинертной силиконовой резины через металлический штуцер соединены с адаптером инфузионным с прямоточным каналом для герметичного соединения типа Люэр Лок (соединитель с наружной резьбой, с одной стороны), выполненного из прозрачного поликарбоната с защитным колпачком. Причем через любую из гибких, тонких трубок из силиконовой резины можно как подавать, так и извлекать жидкость из пространства ин виво биореактора, часть одной трубок из силиконовой резины находиться внутри стенки трубы из метилметакрилата ин виво биореактора и идет к противоположному дополнительному внутреннему отверстию в стенке трубы ин виво биореактора. Размещение трубки внутри стенки круглой трубы ин виво биореактора
В частных вариантах воплощения изобретения внешняя поверхность круглой трубы, образующей емкость биореактора может быть импрегнирована антибиотиками.
В частных вариантах воплощения изобретения вся поверхность трубы, образующей емкость биореактора может быть импрегнирована антибиотиками.
В частных вариантах могут использоваться фосфомицин, гентамицин, винкомицин или иной антибиотик с учетом верифицированной патогенной микрофлоры.
В частных вариантах воплощения изобретения трубки из силиконовой резины могут быть подключены к промывной системе и биореактор может быть использован для активного промывного дренирования тканей, расположенных в его пространстве.
В изобретении используется известная композиции культуральной питательной среды, а именно среды ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пенициллин-стрептоми-циновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, полученных известным способом (Mohamed Н. Е., et al. Human platelet lysate efficiency, stability, and optimal heparin concentration required in culture of mammalian cells// Blood Res. 2020 Mar; 55(1): 35-43. Published online 2020 Mar 30. doi: 10.5045/br.2020.55.1.35) для заполнения пространства жидкостного ин виво биореактора и локальной местной стимуляции роста костной мозоли на костном опиле, введенном в полость ин виво биореактора. Применение известных веществ по новому назначению позволило добиться неожиданного результата - выраженного регенеративного роста костной мозоли в пространство ин виво биореактора без применения костных трансплантатов, тканеинженерных конструкций, остеогенных клеток, костнопластических материалов. Костные мозоли с противоположных отломков костей сливались в единый регенерат, в ходе репаративного и регенерационного ремоделирования восстанавливалась полноценная кость. Это позволяет расширить области применения культуральных питательных сред и повысить эффективность лечения травм костей, с формированием костных дефектов. В культуральную среду могут добавляться костные морфогенетические белки ВМР-2 в концентрации 25 нанограммов на миллилитр (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) и ВМР-7 в концентрации 25 нанограммов на миллилитр (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7), которые проявляют высокую активность при столь малых концентрациях. В частных вариантах воплощения изобретения в культуральную среду добавляются остеогенные добавки 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты (SigmaJepMamw), 10 мМ/л β-глицерофосфата натрия (Sigma, Германия) и 100 нМ дексаметазона (KRKA, Словения) или 10 нМ 1α,25- дигидроксикальциферола (витамин D3) (Roshe, Швейцария). Известно, что для стимуляции костного сращения в место костного дефекта помещают коллагеновую губку, содержащую в одном миллилитре объема 1,5 миллиграмма рекомбинантного ВМР-2 (Infuse™ Bone Graft). Меньшие дозы малоэффективны. Однако в столь высокой дозировке ВМР-2 часто приводит к развитию серьезных неврологических, дыхательных и воспалительных побочных эффектов, что ограничивает применение костных морфогенетических белков. Ин виво биореактор позволяет повысить эффективность этих биофармацевтических средств и снизить риски развития осложнений.
Способ выращивания костной ткани в пространстве ин виво биореактора для восстановления костных дефектов включает следующие этапы:
- подготавливается операционное поле и выполняется хирургический доступ к болыпебер-цовой кости кролика, иссекается участок диафиза болыпеберцовой кости длиной 3 см в его нижней трети, с формированием посттравматического дефекта (операционная травма в эксперименте),
-с краев опилов костей снимается надкостница лоскутом циркулярно шириной 0,5 см,
- на полую трубку ин виво биореактора с двух сторон надеваются воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса,
- в отверстие трубки ин виво биореактора вставляется сначала опил дистальной части кости, затем проксимальной части кости, манжеты воронки должны плотно прилегать к наружным поверхностям фрагментов кости по всей длине их окружности,
- для трубок из силиконовой резины делаются два отдельных раневых канала по которым их свободные концы от трубы биореактора идут к поверхности кожи, причем для прохождения через дерму кожи делается прокол кожи с наружной стороны через слой эпидермиса и с помощью прямого зажима типа москит трубка через отверстие в дерме вытягивается наружу,
- свободные концы трубок крепятся через штуцер к разъему типа "Луер-Лок" с защитным колпачком,
-производится стабилизация костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза,
- ушивание операционный раны с наложением асептической повязки,
- животное укладывается на бок,
- трубки из силиконовой резины с металлическим штекер / соединительным разъемом для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком переводятся в вертикальное положение, колпачки открываются,
- через силиконовую трубку с зеленым маркером вводиться композиция, заполнение ин виво биореактора контролируется по уровню жидкости в другой трубке,
- смена раствора в первые 2 суток от момента операции проводится 2 раза в сутки, в качестве раствора используется среда ДМЕМ или F12 с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси и Фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл композиции, после слива раствора ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,
- далее 1 раз в сутки в течение 8 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пеш1циллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл среды, после слива композиции ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида,
- далее 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой F12 с добавлением ВМР-7 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр среды по четным дням, средой F12 с добавлением ВМР-2 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр по нечетным дням,
- через 25-30 суток проводится хирургическая операция по извлечению ин виво биореактора, доступ через шов от операции по установке биореактора, со стороны трубок из силиконовой резины обнажается стенка ин виво биореактора, трубки из силиконовой резины отсекаются у места вхождения трубки в стенку трубы, металлический штуцер выкручивается, с обоих концов трубы ин виво биореактора стягиваются воронки, кусачками рассекаются стенки воронки по всей длине, кусачками раскалывается стенка трубы ин виво биореактора вдоль, удаляются осколки костного цемента из раны,
-труба ин виво биореактора проворачивается вокруг своей оси и кусачками раскалывается вдоль, образуются две части трубы, которые ротационными движениями извлекаются из тканей,
-трубки из силиконовой резины полностью удаляются, для этого их вытягивают зажимом за концы торчащие из поверхности кожи,
-проводиться послойное ушивание раны,
- аппарат Илизарова демонтируют после минерализации костного регенерата, не позже, чем через 5 месяцев, под контролем методов медицинской визуализации.
Пример осуществления способа по изобретению.
В условиях операционной подопытное животное - кролик вводится в состояние наркоза. Подготавливается операционное поле, удаляется шерсть с бедра и голени задней конечности животного, производится обработка операционного поля антисептиками. Выполняется чрезкожный хирургический доступ к болынеберцовой кости кролика с латеральной стороны и продольным кости разрезом кожи, с помощью иглы Джигли выпиливается участок диафиза болынеберцовой кости длиной 3 см в его нижней трети, формируется послеоперационный асептический дефект болынеберцовой кости. Концы опилов костей на 1-2 см выдвигаются из окружающих мягких тканей. Далее приступаем к сборке и креплению стерильного ин виво биореактора. Для это на полую трубу ин виво биореактора с двух сторон надеваются воронки в виде усеченного полого конуса из биоинертного натурального латекса, больший диаметр воронки натягивается на трубу биореактора, манжета воронки должна плотно прилежать к наружной поверхности трубы. Утолщение на трубе препятствует смещению воронки и разрушению конструкции. Далее аккуратно растягивается менее широкое отверстие воронки и в него вставляется сначала опил дистального фрагмента травмированной кости, а затем проксимальной части кости, для облегчения задачи костные отломки могут аккуратно отодвигаться, манжеты воронки должны плотно прилегать к наружным поверхностям фрагментов кости по всей длине их окружности. Для трубок из силиконовой медицинской резины делаются два отдельных раневых канала в мягких тканях по которым их свободные концы от трубы биореактора идут к поверхности кожи, причем для прохождения через дерму кожи делается прокол кожи с наружной стороны через слой эпидермиса и с помощью прямого зажима типа москит трубка через отверстие в дерме вытягивается наружу, трубки должны быть плотно окружены кожей, важно, чтобы трубки шли отдельно от накладываемых на рану швов при послойном ушивании операционной раны. Выведенные наружу свободные концы трубок крепятся через штуцер к разъему типа "Луер-Лок" и этот адаптер остается закрытым защитным колпачком, до ушивания раны проводиться стабилизация костных отломков с помощью аппарата внешней фиксации для чрескостного остеосинтеза (Накладывается аппарат внешней фиксации Илизарова, «Комплект аппаратов спице-стержневых для чрескостного остеосинтеза длинных и коротких трубчатых костей АСС-ЧК-ТЭП ЦИТО" с набором инструментов для их установки (по типу ГА. Илизарова) ("Аппарат Илизарова"). После установки аппарата Илизарова костные отломки должны быть направлены открытыми костномозговыми каналами друг напротив друга. Далее проводится послойное ушивание операционный раны с наложением асептической повязки. Сразу производится заполнение пространства ин виво биореактора растворами, сначала удаляется кровь, для этого с помощью шприца вводится изотонический раствор натрия хлорида. Перед заполнением животное укладывается на бок со стороны неповрежденной конечности, трубки из силиконовой резины с металлическим штекер / соединительным разъемом для шприца типа "Луер-Лок" с защитным колпачком переводятся в вертикальное положение, колпачки открываются, через силиконовую трубку вводиться раствор, заполнение ин виво биореактора контролируется по уровню жидкости в другой открытой трубке, промывают до почти прозрачного раствора. Далее заполняется биореактор композицией, причем смена раствора в первые 2 суток от момента операции проводится 2 раза в сутки, в качестве раствора используется среда ДМЕМ с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата аллогенных кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактора роста эндотелия сосудов- А, изоформа 165, рекомби-нантного (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл композиции.
При смене раствора ин виво биореактор промывается 1 раз стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Далее 1 раз в сутки на протяжении 8 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой ДМЕМ с глутамином (ПанЭко, РФ), с добавлением пенициллин-стрептомициновой смеси, с добавлением 10% лизата кроличьих тромбоцитов, с добавлением фактор роста эндотелия сосудов- А человека, изоформа 165, рекомбинантный (rhVEGF-A165) в количестве 0,25 нг на 1 мл среды, после слива композиции ин виво биореактор промывается стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. По мере заполнения пространства ин виво биореактора костным регенератом количество вводимого раствора уменьшается. Через десять дней с момента операции 1 раз в сутки в течение 15 дней пространство ин виво биореактора заполняется средой F12 с добавлением ВМР-7 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-7 (rhBMP-7) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр среды по четным дням, средой F12 с добавлением ВМР-2 (рекомбинантный человеческий морфогенетический белок-2 (rhBMP-2) в концентрации 25 нанограммов на миллилитр по нечетным дням. Через 25-30 суток с момента начала эксперимента проводится хирургическая операция по извлечению ин виво биореактора, доступ осуществляется тем же путем через шов от операции по установке биореактора, со стороны трубок из силиконовой резины обнажается стенка ин виво биореактора, трубки из силиконовой резины отсекаются у места вхождения трубки в стенку трубы из костного цемента, металлический штуцер выкручивается, с обоих концов трубы ин виво биореактора стягиваются воронки, кусачками рассекаются стенки воронки по всей длине, кусачками раскалывается стенка трубы ин виво биореактора вдоль, удаляются осколки костного цемента из раны, труба ин виво биореактора проворачивается вокруг своей оси и кусачками раскалывается вдоль, образуются две части трубы, которые ротационными движениями извлекаются из тканей, аккуратно, чтобы не повредить костный регенерат. Трубки из медицинской силиконовой резины полностью удаляются, для этого их вытягивают зажимом за концы торчащие на поверхности кожи, проводится гемостаз и послойное ушивание раны.
Аппарат Илизарова демонтируют после минерализации костного регенерата, не позже, чем через 4 месяца с момента установки. За состоянием кости необходим контроль с помощью рентгеноскопических методов исследования.
Изобретение позволяет добиться эффективного сращения кости и быстрой реабилитации животного.
Таким образом, предложенные согласно настоящему изобретению жидкостный ин виво биореактор, композиция, используемая для заполнения внутреннего пространства этого устройства и способ выращивания костной ткани в нем позволяет использовать иные протоколы введения композиций, биофармацевтических и лекарственных средств, за счет непроницаемости корпуса, эффективно поддерживать режим ин виво биореактора с подачей цитокинов, поддерживающих костную регенерацию. При этом жидкостный ин виво биореактор и способ выращивания костной ткани позволяют осуществлять все манипуляции безболезненно, не требует дополнительного наркоза и местной анестезии при терапии костных повреждений.
Хотя настоящая патентная заявка относится к определенному в прилагаемой ниже в формуле изобретения, важно отметить, что настоящая заявка на патент содержит основание для формулировки других изобретений, которые могут, например, быть заявлены как объект уточненной формулы изобретения настоящей заявки или как объект формулы изобретения в выделенной и/или продолжающей заявке. Такой объект может быть охарактеризован любым признаком или комбинацией признаков, описанных в настоящем документе.