СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ВРЕДНЫХ ЭФФЕКТОВ ОБЩЕТОКСИЧЕСКОГО И ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НАНОСЕРЕБРА НА ОРГАНИЗМ
METHOD FOR PREVENTION OF ADVERSE EFFECT OF GENERAL TOXIC AND GENOTOXIC ACTION OF NANOSILVER ON HUMAN BODY

Изобретение относится к медицине, в частности к токсикологии наноматериалов (нанотоксикологии), и может быть использовано для снижения общетоксического и генотоксического эффектов действия наносеребра на организм в группах риска, охватывающих лиц, которые подвергаются воздействию этого наноматериала в условиях его производства и применения.
Высокая практическая значимость наносеребра в разнообразных сферах технического и медицинского применения является причиной изучения токсических эффектов этого металла и поиска средств снижения его общетоксического и генотоксического действия на организм.
Опубликованы работы, в которых различными тестами и на различных клеточных объектах демонстрируется генотоксическое действие наносеребра, хотя и преимущественно «ин витро» (например, Ahamed М., Karns М., Goodson М. et al. DNA damage response to different surface chemistry of silver nanoparticles in mammalian cells. // Toxicol, and Applied Pharm. - 2008. - Vol.233, №3. - P.404-410) [1]. В некоторых исследованиях не только показано, что наносеребро значительно увеличивает образование кислородных радикалов, но и обнаружено существенное блокирование генотоксических эффектов наносеребра в присутствии антиоксидантов и «подбиральщиков» (scavengers) свободных радикалов (например, Choi JE, Kim S, Ahn JH et al. Induction of oxidative stress and apoptosis by silver nanoparticles in the liver of adult zebrafish. // Aquatic Toxicology. - 2010. - Vol.100, №2. - P.151-159) [2]. Однако примеров использования этого защитного эффекта при длительном воздействии наносеребра на целостный организм млекопитающих информационный поиск не обнаружил.
С практических позиций профилактической токсикологии и оценки рисков для здоровья, обусловленных воздействием наночастиц, существенно, что генотоксичность наносеребра «ин виво» показана при таком низком уровне экспозиции, при котором общетоксическое действие еще мало выражено. По-видимому, для каких-то наноматериалов не столько общая токсичность, сколько генотоксичность и тем самым вероятная канцерогенность, должна рассматриваться, как лимитирующий риск. Наносеребро, судя по результатам исследований, проведенных авторами, относится именно к таким наноматериалам (Katsnelson В.А., Privalova L.I., Gurvich V.B. et al. Comparative in vivo assessment of some adverse bioeffects of equidimensional gold and silver nanoparticles and the attenuation of nanosilver's effects with a complex of innocuous bioprotector // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - V.14. - P.2449-2483) [3]. Поэтому задачей изобретения является создание средств защиты организма не только от общетоксического, но и от генотоксического эффекта наносеребра.
Исходя из предполагаемых механизмов токсического и генотоксического действия наносеребра на организм, разработан способ профилактики вредных эффектов общетоксического и генотоксического действия наносеребра на организм, заключающийся в том, что лицам, относящимся к группе риска этого действия, назначают комплекс биологически активных препаратов, включающий глютамат, глицин, цистеин, пектиновый энтеросорбент, селен-содержащий поливитаминно-полиминеральный комплекс, кальцийсодержащий препарат, а также препарат рыбьего жира, богатый неэстерифицированными жирными кислотами класса омега-3, причем лица группы риска принимают препараты комплекса повторными курсами 1-2 раза в год в течение 4-6-недель ежедневно в дозах, обеспечивающих получение 300 мг глицина, 600 мг цистеина, 4 г глутаминовой кислоты, 100 мкг селена, 4 г кальция, 25 мл рыбьего жира с 12-15%-ным содержанием неэстерифицированных жирных кислот класса омега-3, 4-5 г пектина, а также других микроэлементов и витаминов в дозах, обеспечивающих нормальные физиологические потребности организма.
Заявленный комплекс биологически активных препаратов включает аминокислоты, а именно глютамат, глицин и цистеин как предшественники биосинтеза восстановленного глютатиона, являющегося системным протектором от оксидативного и свободно-радикального повреждения, притом что глютамат является еще и мощным стабилизатором клеточных мембран. Пектиновый энтеросорбент в заявленном комплексе предназначен для выполнения функции блокатора кишечной реабсорбции выделенных с желчью металлов. Кальций, содержащийся в кальцийсодержащем препарате, выступает как антагонист серебра. Селенсодержащий поливитаминно-полиминеральный комплекс содержит селен, выступающий как компонент антиоксидантной системы и как антагонист серебра, при этом поливитаминно-полиминеральный комплекс содержит также другие микроэлементы и витамины в дозах, обеспечивающих нормальные физиологические потребности организма. Заявленный комплекс содержит также препарат рыбьего жира, богатый неэстерифицированными жирными кислотами класса омега-3, внутриклеточными производными которых являются эйкозаноиды, активирующие репликацию ДНК, тем самым играя важную роль в репарации ее повреждений. Схема применения комплекса лицами группы риска, а именно: в повторными курсами 1-2 раза в год в течение 4-6-недель ежедневно в дозах, обеспечивающих получение 300 мг глицина, 600 мг цистеина, 4 г глутаминовой кислоты, 100 мкг селена, 4 г кальция, 25 мл рыбьего жира с 12-15%-ным содержанием неэстерифицированных жирных кислот класса омега-3, 4-5 г пектина, а также других микроэлементов (в частности, меди) и витаминов в дозах, обеспечивающих нормальные физиологические потребности организма, обоснована пересчетом содержания перечисленных активных факторов (биопротекторов) в биопрофилактическом комплексе (БПК), защитная эффективность которого доказана в эксперименте, проведенном на лабораторных белых крысах, в дозы для человеческого применения на основе соотношения уровней основного обмена крысы и человека с учетом также справочных и литературных данных о суточной потребности человека в этих веществах.
Механизмы защитного действия входящих в комплекс биопротекторов сложны и, по-видимому, взаимно потенцируют друг друга. Важное значение могут иметь: (а) разное по молекулярным механизмам антиоксидантное действие, в той или иной степени присущее ряду биопротекторов заявляемого комплекса (антиоксидантный синергизм); (б) мембрано-стабилизирующее действие глутамата, поскольку оно может препятствовать повреждению митохондрий наночастицами серебра и тем самым - оксидативному стрессу; (в) антагонизм ряда микроэлементов (селена, меди, отчасти кальция) и серебра. Впервые показано, что на фоне пероральной комбинации биопротекторов: пектина, витаминов, глютамата, глицина, цистеина, кальция, селена и неэстерифицированных жирных кислот класса омега-3 субхроническая токсичность и, в особенности генотоксичность наносеребра могут быть существенно ослаблены. В результате поиска по источникам научно-технической и патентной литературы не выявлены средства, направленные на решение такой задачи. Новый технический результат, достигаемый заявленным изобретением, заключается в снижении вредных эффектов общетоксического и генотоксического действия наносеребра на организм.
Заявленный способ экспериментально опробован на белых аутбредных крысах-самках с начальным весом тела 150-220 г. Животные содержались в условиях специально организованного вивария, соответствующих ветеринарным требованиям. В питье они получали артезианскую воду, дочищенную до первой категории качества, в пищу - полнорационный комбикорм ООО «Лабораторкорм». Суспензии (коллоидные растворы) наносербера изготавливались методом лазерной абляции металла в жидкости с помощью лазерной системы для обработки материалов Fmark-20 RL (ЦЛТ, Россия). Характеристика распределения размеров наночастиц давалась их прямым измерением при сканирующей электронной микроскопии и методом динамического рассеяния света с помощью анализатора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, UK). Средний диаметр частиц серебра составлял 49±5 нм и сохранялся стабильным на протяжении недели после приготовления. Тем не менее для каждого введения животным использовались свежеприготовленные суспензии.
Полученные наносуспензии с концентрацией 0,5 мг/мл вводили крысам внутрибрюшинно в дозе по металлу 10 мг/кг массы тела по 3 раза в неделю. Контрольным животным аналогичным образом вводили соответствующей объем той же стерильной деионизированной воды, на которой готовились суспензии. Каждой крысе было проведено в целом по 20 введений на протяжении неполных 7 недель.
Введение наносеребра или воды и умерщвление животных разных групп проводились параллельно. Также параллельно была проведена через эксперимент группа животных, у которых аналогичное воздействие наносеребра осуществлялось на фоне перорального приема биопрофилактического комплекса.
Крысам давали глутаминат натрия в виде 1,5% раствора в неограниченное питье вместо воды. Яблочный пектин производства (предприятие Промавтоматика, г. Белгород, Россия) давали в качестве добавки в корм в количестве, соответствующем средней потребляемой дозе приблизительно 1000 мг/кг веса тела. Глицин, цистеин в более доступной и метаболически активной форме ацетилцестеина, «Компливит-селен» как источник витаминов, селена и кальция, «Компливит-кальций» как источник витаминов и кальция использовались в таблетках, которые измельчали и добавляли к другой порции корма в расчете на среднюю потребляемую дозу в соответствии с рекомендуемыми потребностями организма крысы. В качестве препарата рыбьего жира, богатого неэстерифицированными жирными кислотами класса омега-3, использовали препарат «Эйкозавитол» (предприятие Фармавит, г. Тюмень, Россия), который давали внутрижелудочно через зонд в дозе 1 мл на крысу.
У 4-х животных каждой группы органы извлекали из тела в течение 2-3 минут после умерщвления крыс декапитацией в последовательности: печень - селезенка - почка - бедренная кость - и сразу же помещали, как и вытекшую при декапитации кровь, в охлажденные до -80°C специальные сосуды, которые в крио-контейнерах срочно доставлялись в генетическую лабораторию для исследования.
++
++
Для выделения геномной ДНК проанализировали 96 тканевых образцов, каждый в трех повторностях. Образцы солидных органов измельчали скальпелем. Затем, с целью получения однородной массы, образцы четырехкратно подвергали замораживанию в жидком азоте и оттаиванию в водяной ультразвуковой ванне (38°C) в растворе PBS (Ca, Mg free, Sigma) с последующим пропусканием через шприцевые иглы уменьшающегося диаметра. Клетки костного мозга вымывали тем же раствором из бедренной кости после отсечения эпифизарных и диафизарных участков с последующим пропусканием через иглы уменьшающегося диаметра. Ядросодержащие клетки периферической крови выделяли из цельной крови путем центрифугирования в градиенте перкола (Sigma). Для выделения ДНК из культур клеток использовали набор реагентов GenElute (Sigma) согласно рекомендованному протоколу фирмы-изготовителя. В полученных образцах спектрофотометрически (Ultraspec 1100 pro) определяли количество ДНК (Ultraspec 1100 pro), замораживали и хранили при -84°C в кельвинаторе (Sanyo) до начала исследования.
ПДАФ анализ (ПДАФ - полиморфизм длин амплифицированных фрагментов ДНК) производили следующим образом. Рандомизированные олигонуклеотидные и NotI-STS праймеры конструировали on line с помощью сервиса Oligo version 3.0 (http://www.oligo.net) и синтезировали на автоматическом синтезаторе ASM 800 (фирма «Биоссет»).
ден
ден
отж
элон
элон
Выбор оптимального режима амплификации проводили, исходя из длины амплифицируемого фрагмента, после пробного цикла моделирования температурного градиента. Стадии начальной денатурации (2 мин при 94°C) и конечной полимеризации (3 мин при 72°C) были обязательными в каждом пробном цикле амплификации. Количество циклов подбирали эмпирически для наибольшего выхода специфичного ампликона при минимальном содержании неспецифических фрагментов. Смесь в объеме 25 мкл помещали в амплификатор с заданной программой температурно-временных циклов: Т940°C - 2 мин; (Т95°C - 0,2 мин, Т64°C, Т 72°C - 0,5 мин) - 29 циклов, Т 72°C - 3 мин.
С целью повышения чувствительности при постановке реакции использовали специфические праймеры и нуклеотиды (dCTP, dATP, метил-dTTP, Amersham), меченые тритием. Полученный амплификат был разделен в процессе горизонтального агарозного гель-электрофореза в TAE-буфере при 100 B в течение 15 мин. По окончании электрофореза гелевые пластины были разделены на дорожки, каждая из которых была разрезана на участки длиной 5 мм. Полученные фрагменты геля помещали во флаконы, содержащие 3.0 мл абсолютного изопропанола. Флаконы нагревали до 80°C в течение 2 часов. После экстракции из геля амплифицированных фрагментов, содержащих изотопную метку, во флаконы добавлялся простой толуоловый сцинтиллятор (6.0 мл). Регистрация результатов производилась на автоматическом жидкостном сцинтилляционном счетчике «Бета-2».
Эта методика позволяет количественно определить степень фрагментации ДНК, как показатель генотоксичности оцениваемых повреждающих агентов и эффекта воздействия исследованного комплекса биопротекторов. Основой метода является то, что в отличие от фрагментированной ДНК, образующей при электрофорезе в агарозном геле так называемый «хвост кометы», не фрагментированная ДНК имеет крайне низкую степень миграции и остается практически на месте («ядро кометы»), причем степень миграции прямо пропорциональна степени фрагментации ДНК. Для характеристики степени повреждения ДНК использовали «коэффициент фрагментации», то есть отношение суммарной радиоактивности всех фракций «хвоста» к радиоактивности «ядра».
Состояние организма крыс во всех группах оценивалось по большому числу (свыше 40) общепризнанных функциональных, биохимических и морфологических критериев токсического действия. В качестве примера защитной эффективности примененного БПК по эффектам общетоксического действия наносеребра приведены: нормализация перекисного окисления липидов (одного из важнейших свободно-радикальных процессов в организме), усиленного при действии наносеребра, а также некоторые морфметрические показатели действия на печень и селезенку как органы, богатые клетками ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС) и потому служащие одним из основных накопителей любых наночастиц, попавших в кровоток.
Статистически значимое усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ) при субхронической интоксикации частицами наносеребра без биологической защиты и отсутствие этого эффекта при такой же интоксикации на фоне приема БПК иллюстрируются данными таблицы 1, в которой приведена концентрация конечного продукта ПОЛ - малонилдиальдегида (МДА) в сыворотке крови крыс.
В таблице 2 приведены морфометрические показатели, характеризующие состояние печени и селезенки крыс при действии наносеребра при защите организма с помощью БПК и без нее. Показано, что хотя основной показатель повреждения печени (% безъядерных гепатоцитов) был лишь несущественно повышен под влиянием наносеребра, однако на фоне БПК он был статистически значимо ниже не только этого, но и контрольного показателя, что свидетельствует о выраженном неспецифически гепатозащитном действии примененного комплекса. Наряду с этим, судя по проценту двуядерных клеток, был существенно усилен регенеративный митоз гепатоцитов, что является положительным эффектом действия БПК. Активированное под влиянием БПК освобождение печени от наночастиц сказалось статистически значимым снижением как процента клеток Купфера (клеток РЭС), так и их нагруженности частицами. О нормализации под влиянием БПК морфо-функционального состояния селезенки говорит отсутствие того статистически значимого снижения показателя «отношение белой пульпы к красной», которое наблюдалось при интоксикации наносербром без БПК.
Для этих же двух органов в таблице 3 приведены коэффициенты фрагментации (Кфр) геномной ДНК крыс, подвергшихся затравке частицами наносеребра без защиты и на фоне приема заявляемого комплекса. Показано, что при субхронической интоксикации частицами НС происходит существенное повреждение ДНК в клетках печени, селезенки, почек, костного мозга и периферической крови, которое заметно ослаблено, если такое же воздействие наносеребра происходило на фоне приема БПК.
Сопоставление полученных данных с литературными свидетельствует о том, что заявителями впервые убедительно продемонстрирована полиорганная генотоксичность наносеребра при длительном воздействии на целостный организм, причем в дозировке, проявляющей лишь умеренную системную токсичность, и впервые показано, что на фоне воздействия на организм предложенного комплекса биопротекторов генотоксичность наносеребра и его общетоксическое действие могут быть существенно ослаблены.
Таблица 1
Влияние субхронической интоксикации крыс наносеребром на уровень перекисного окисления липидов без защиты и на фоне приема БПК (по концентрации малонилдиальдепгида в сыворотке крови, X±S<sub>x</sub>)
Концентрация МДА в сыворотке крови, нМоль/л
Контрольная группа (введение воды)
Группа, получавшая наносеребро (НС)
Группа, получавшая НС на фоне БПК
5,84±0,12
6,23±0,14*
5,72±0,25
* - Отличие от контрольного показателя статистически значимо при Р<0,05 (по t-критерию Стьюдена).
Таблица 2
Некоторые морфометрические показатели клеточной структуры печени и селезенки крыс при интоксикации наносеребром без защиты и на фоне приема БПК (x±s.e.)
Показатели
Контроль
Наносеребро
Наносеребро на фоне БПК
Число безъядерных гепатоцитов на 100 клеток печени
17,6±0,6
18,5±1,3
13,0±1,0*<sup>•</sup>
Число двуядерных гепатоцитов на 100 клеток печени
5,9±0,8
7,8±0,6
12,0±1,5*<sup>•</sup>
Число клеток Купфера на 100 клеток печени
16,5±0,5
25,0±0,8*
20,0±0,6*<sup>•</sup>
Средневзвешенный балл нагруженности клеток Купфера частицами
0
0,91±0,7
0,51±0,09<sup>•</sup>
Отношение белой к красной пульпе селезенки
0,59±0,036
0,37±0,035*
0,59±0,086<sup>•</sup>
* - статистически значимое различие с контрольной группой;
• - статистически значимое различие с группой «наносеребро» (Р<0,05; по t-критерию Стьюдента).
Таблица 3
Коэффициенты фрагментации (Кфр) геномной ДНК крыс, подвергшихся субхронической затравке частицами наносеребра без защиты и на фоне приема БПК (по результатам ПДАФ-теста), X±S<sub>x</sub>
Группа крыс, получавших:
Ткани
Печень
Костный мозг
Селезенка
Почка
Ядросодержащие клетки периферической крови
Воду (контроль)
0,399±0,001
0,385±0,003
0,379±0,002
0,385±0,003
0,383±0,001
Нано-серебро (НС)
0,461±0,002*
0,455±0,032*
0,462±0,001*
0,423±0,008*
0.413±0,012*
НС+БПК
0,408±0,011<sup>+</sup>
0,373±0,003*<sup>+</sup>
0,419±0,003*<sup>+</sup>
0,407±0,006*<sup>+</sup>
0,390±0,007
*статистически значимое (Р<0,05 по t-критерию Стьюдента) отличие от контрольной группы.
<sup>+</sup>статистически значимое (Р<0,05 по t-критерию Стьюдента) отличие группы, получавшей НС и БПК, от группы, получавшей только НС,