Устройство для мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа с использованием одноразовых картриджей

Полезная модель относится к области устройств, предназначенных для идентификации множества различных аналитов в биологических жидкостях с помощью иммунофлуоресцентного анализа.
Известна система на основе микрочипа для обнаружения и идентификации одного или нескольких целевых аналитов, присутствующих в образце [1]. Микрочип содержит лунки, в которых иммобилизуются микросферы. Тип микросфер с известным активным агентом, способным связываться с соответствующим целевым аналитом, определяется пространственным положением микросфер. Связавшиеся с аналитом микросферы флуоресцируют.
Недостаток данной системы заключается в низкой точности анализа и частых ошибках, связанных со сложностью определения пространственного положения микросфер. Кроме того, такой подход ограничивает степень мультиплексности анализа. Недостатком также являются сложность и высокая стоимость изготовления одноразовых микрочипов.
Известна также система для сверхчувствительного обнаружения молекул или частиц с помощью микросфер [2]. Принцип работы данной системы основан на считывании флуоресцентного сигнала от отдельных микросфер, попавших в микролунки чипа. Магнитные микросферы с антителами добавляются к образцу, таким образом, чтобы в образце было больше микросфер, чем целевых молекул. После этого на микросферы наносятся ферментные метки. При этом количество микросфер с меченым иммунным комплексом соответствует распределению Пуассона из-за небольшого отношения молекул белка к микросферам. Если концентрация белка низкая, распределение Пуассона указывает на то, что микросферы несут либо один иммунный комплекс, либо не содержат ни одного.
Обнаружение микросфер, связанных с молекулой фермента, осуществляется с помощью получения флуоресцентных изображений чипа с микролунками с использованием оптической микроскопии. Отношение количества лунок, содержащих меченую микросферу, к общему количеству лунок, содержащих микросферу без меток, соответствует концентрации аналита в образце.
Основным недостатком данной системы является низкая степень мультиплексности. Недостатками также являются большие габариты прибора, высокая стоимость и сложность изготовления одноразового чипа.
Наиболее близким к предложенной полезной модели по технической сущности и достигаемому эффекту является устройство для иммунофлуоресцентного анализа с использованием флуоресцентных магнитных микросфер [3]. Каждая микросфера кодирована уникальным спектральным адресом, что позволяет идентифицировать различные биомолекулы, прикреплённые к поверхности микросферы. Кодирование микросфер достигается за счёт внесения нескольких флуорофов в микросферы в разных концентрациях. Идентификация микросфер и анализ биомолекул происходят в оптической системе устройства, которая включает в себя светодиоды, оптические фильтры и камеру. Во время визуализации магнитные микросферы иммобилизуются в проточной ячейке с помощью магнитной подсистемы. Также устройство содержит флюидную систему, используемую для загрузки и доставки образцов в проточную ячейку, удаления образцов из неё, а также для промывки и очистки прибора.
К недостаткам данного устройства следует отнести необходимость контакта пользователя с едкими жидкостями для промывки прибора и образовавшимися отходами. Это является в особенности важным, если реагенты являются токсичными, или если исследуемый образец является потенциально заразным или любым образом опасным. Также трубки флюидной системы могут загрязняться и забиваться, что может приводить к нарушениям работы прибора и снижению точности анализа. Кроме того, в качестве среды для доставки пробы к оптической системе прибора требуется специальная жидкость, и анализ требует расхода большого количества реагентов. Недостатком также являются большие габариты прибора.
Техническим результатом, на получение которого направлена полезная модель, является повышение мобильности и компактности устройства с обеспечением высокой степени мультиплексности анализа.
Технический результат достигается в устройстве для иммунофлуоресцентного анализа с использованием одноразовых картриджей, отличающемся тем, что исследуемые аналиты, конъюгированные со спектрально-кодированными микросферами, загружаются в прибор и иммобилизируются при помощи магнита в одноразовом картридже.
Использование одноразовых картриджей исключает необходимость использования флюидной системы, что обеспечивает уменьшение габаритов и веса устройства по сравнению с аналогами, позволяя использовать его в пунктах мобильной диагностики. Также использование одноразовых картриджей исключает ошибки анализа и дополнительный расход реагентов, связанные с загрязнением флюидной системы в ходе её эксплуатации. Описанное исполнение устройство упрощает процесс настройки и калибровки прибора, упрощает процедуры проведения анализа, в связи с чем уменьшаются трудозатраты пользователей. При этом использование магнитных флуоресцентных микросфер, кодированных различными флуоресцентными красителями, позволяет проводить анализы с высокой степенью мультиплексности.
Анализ в устройстве проводится с использованием магнитных микросфер, в которые внесено один или несколько флуорофоров в различной концентрации, что обеспечивает кодирование микросфер. На поверхности микросфер в ходе пробоподготовки формируются иммунокомплексы с флуоресцентными метками. Например, к микросферам могут быть прикреплены антитела, специфичные исследуемым антигенам. В случае связывания антител с антигеном, антигены связываются с вторичными антителами, содержащими флуоресцентную метку.
Образец помещается в картридж, содержащий ёмкость для образца, входной и выходной порты для внесения образца. Картридж имеет оптически прозрачную область детекции для регистрации флуоресценции образца. Образец, находящийся в картридже, иммобилизуется при помощи неодимового магнита и поочередно облучается светодиодами, возбуждающими флуоресценцию флуорофоров и флуоресценцию меток. Магнит представляет собой прямой круговой цилиндр, основание которого расположено параллельно плоскости картриджа. Флуоресценция регистрируется с помощью соответствующего фильтра и видеокамеры, расположенных параллельно плоскости картриджа. Для фокусировки видеокамеры и установки нужного фильтра используются устройства перемещения с шаговыми двигателями. В ходе анализа полученных изображений измеряется интенсивность флуоресценции красителей каждой микросферы, а также интенсивность флуоресценции меток.
На фиг. 1 представлена структурная схема устройства, где
1 - отделение для установки одноразовых картриджей;
2 - одноразовый картридж;
3 - магнит;
4 - светодиоды;
5 - объектив;
6 - блок светофильтров;
7 - видеокамера;
8 - блок перемещения видеокамеры;
9 - система управления устройством;
10 - управляющий компьютер.
В отделение для установки одноразовых картриджей 1 устанавливается одноразовый картридж 2, в котором находится исследуемый образец жидкой дисперсии микросфер. Микросферы иммобилизованы в одной плоскости при помощи магнита 3. Светодиоды 4 используются для возбуждения флуоресценции красителей и флуоресцентных меток. Флуоресценция красителей и меток регистрируется с помощью объектива 5 и соответствующих оптических светофильтров, устанавливаемых при помощи блока светофильтров 6, видеокамерой 7. Для фокусировки изображения на сенсоре видеокамеры используется блок перемещения видеокамеры 8. Управление светодиодами, блоком светофильтров, блоком перемещения видеокамеры и видеокамерой осуществляется при помощи системы управления устройством 9. Анализ полученных изображений и управление устройством осуществляется при помощи управляющего компьютера 10.
Конструктивно элементы устройства связаны между собой следующим образом. Светодиоды, блок светофильтров, блок перемещения видеокамеры и видеокамера соединены с системой управления устройством при помощи соединительных кабелей, которая, в свою очередь, подключена к управляющему компьютеру при помощи соединительного кабеля.
Блок светофильтров крепится к видеокамере при помощи креплений с винтовым соединением. Видеокамера крепится к блоку перемещения видеокамеры при помощи креплений с винтовым соединением. Одноразовый картридж помещается в отделение для установки одноразовых картриджей, которое обеспечивает фиксированное положение картриджа относительно светодиодов, фильтров и камеры, а также возможность многократной установки картриджа с исследуемым образцом в устройство и его извлечения. Магнит, отделение для картриджа, светодиоды, объектив, блок перемещения видеокамеры, система управления прибором, управляющий компьютер крепятся к каркасу устройства при помощи креплений с винтовым соединением.
Все элементы устройства находятся внутри прочного непрозрачного корпуса, обеспечивающего светозащиту оптических элементов устройства - светодиодов, оптических фильтров, объектива, видеокамеры, а также защиту всех элементов устройства от механического воздействия.
Описанное устройство может использоваться для определения различных аналитов в жидких образцах. Для этого исследуемый образец помещается в одноразовый картридж и облучается при помощи светодиодов. С помощью соответствующих оптических фильтров и видеокамеры осуществляется получение флуоресцентных изображений образца. В процессе анализа полученных изображений распознаются отдельные микросферы в кадре, после чего для каждой микросферы вычисляется интенсивность флуоресценции красителей, по которой определяется код микросферы и её соответствие определённому аналиту, а также интенсивность флуоресценции от меток, которая свидетельствует о наличии и концентрации аналитов в образце.
В устройстве для мультиплексного иммунофлуоресцентного анализа повышается мобильность и компактность устройства с обеспечением высокой степени мультиплексности анализа за счёт использования одноразовых картриджей, содержащих исследуемые аналиты, конъюгированные с кодированными микросферами.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
1. Патент США № US10927406B2.
2. Патент США № US20110212848A1.
3. Патент США № US8296088B2 - прототип.