БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПОЛИПЕПТИДЫ К GITR И CTLA-4

1. Мультиспецифический полипептид, содержащий первый связывающий домен, обозначенный В1, который способен специфически связываться с GITR, и второй связывающий домен, обозначенный В2, который способен специфически связываться с CTLA-4.
2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что первый и/или второй связывающие домены выбраны из группы, состоящей из антител или их антигенсвязывающих фрагментов.
2
3. Полипептид по п. 2, отличающийся тем, что антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fv-фрагмента (такого как одноцепочечный Fv-фрагмент или связанный дисульфидной связью Fv-фрагмент), Fab-подобного фрагмента (такого как Fab-фрагмент; Fab'-фрагмент или F(ab)-фрагмент) и доменных антител.
4. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полипептид представляет собой биспецифическое антитело.
5. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что:
(a) В1 содержит или состоит из антитела IgG1, а В2 содержит или состоит из scFv или наоборот; или же
(b) В1 содержит или состоит по меньшей мере из одного scFv, а В2 содержит или состоит по меньшей мере из одного scFv.
6. Полипептид по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что первый и/или второй связывающие домены представляют собой не являющийся антителом полипептид.
7. Полипептид по п. 6, отличающийся тем, что В1 содержит или состоит из антитела IgG1, а В2 содержит или состоит из не являющегося иммуноглобулином полипептида или наоборот.
8. Полипептид по п. 6 или 7, отличающийся тем, что В2 содержит или состоит из домена CD86 или его варианта, способного связываться с CTLA-4.
9. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, в котором В1 содержит по меньшей мере одну тяжелую цепь (Н) и/или по меньшей мере одну легкую цепь (L), а В2 присоединен к указанной по меньшей мере одной тяжелой цепи (Н) или по меньшей мере одной легкой цепи (L).
10. Полипептид по п. 9, в котором В1 содержит:
(a) по меньшей мере одну тяжелую цепь (Н) и по меньшей мере одну легкую цепь (L), а В2 присоединен либо к тяжелой цепи либо к легкой цепи; или же
(b) две идентичные тяжелые цепи (Н) и две идентичные легкие цепи (L), а В2 присоединен к обеим тяжелым цепям или к обеим легким цепям.
11. Полипептид по п. 9 или 10, который содержит или состоит из полипептидной цепи, расположенной в соответствии с любой из следующих формул, написанных в направлении N-C:
(a) L-(X)n-B2;
(b) B2-(X)n-L;
(c) В2-(Х)n-Н; или
(d) Н-(Х)n-В2;
где X представляет собой линкер, а n равно 0 или 1.
12. Полипептид по п. 11, отличающийся тем, что X представляет собой пептид с аминокислотной последовательностью SGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 47), SGGGGSGGGGSAP (SEQ ID NO: 48), NFSQP (SEQ ID NO: 49), KRTVA (SEQ ID NO: 50), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 51) или (SG)m, где m=1-7.
13. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, содержащий человеческую Fc-область или вариант указанной области, при этом область представляет собой область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно область IgG1 или IgG4.
14. Полипептид по п. 13, отличающийся тем, что Fc-область представляет собой встречающуюся в природе (т.е. дикого типа) человеческую Fc-область.
15. Полипептид по п. 13, отличающийся тем, что Fc-область представляет собой не встречающуюся в природе (например, мутировавшую) человеческую Fc-область.
16. Полипептид по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что Fc-область является афукозилированной.
17. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полипептид способен индуцировать антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ), антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЗКФ), комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ) и/или апоптоз.
18. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полипептид способен индуцировать противоопухолевый иммунитет.
-9
-9
-9
-9
-9
-9
19. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, который связывается с GITR человека со значением Kd менее чем 10×10 М, 4×10 М или 1×10 М и/или который связывается с CTLA-4 человека со значением Kd, которое составляет менее 60×10 М, 25×10 М или 10×10 М.
20. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, который индуцирует увеличение активности эффекторной Т-клетки, при этом необязательно указанное увеличение составляет по меньшей мере в 1,5 раза, в 4,5 раза или в 7 раз выше, чем увеличение активности эффекторной Т-клетки, индуцированное комбинацией первого и второго связывающих доменов, вводимых в Т-клетку в виде отдельных молекул.
21. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что полипептид способен:
i) уничтожать опухолевые клетки, экспрессирующие GITR; а также
ii) активировать иммунную систему посредством активации эффекторных Т-клеток.
22. Полипептид по п. 20, отличающийся тем, что увеличение активности Т-клеток заключается в увеличении пролиферации и/или продуцирования ИФН или продуцирования ИЛ-2 Т-клеткой.
23. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что В1 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфичный к GITR; а В2 представляет собой полипептидсвязывающий домен, специфичный к CTLA-4, который включает или состоит из:
(a) аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3; или
(b) аминокислотной последовательности, в которой по меньшей мере одна аминокислота изменена по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, при условии, что указанный связывающий домен связывается с CTLA-4 человека с более высокой аффинностью, чем CD86 дикого типа человека.
24. Полипептид по любому из пп. 13-20, отличающийся тем, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот в указанной аминокислотной последовательности В2 (ii) замещены по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3; при этом необязательно отсутствуют вставки или делеции по сравнению с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.
25. Полипептид по п. 23, отличающийся тем, что по меньшей мере одна из указанных аминокислотных замен в указанной аминокислотной последовательности В2 находится в положении 122, и при этом необязательно указанная аминокислотная последовательность также замещена по меньшей мере в одном из положений 107, 121 и 125.
26. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанная аминокислотная последовательность В2 содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 6-24.
27. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, в котором связывающий GITR домен (В1) способен конкурентно ингибировать связывание с GITR человека антитела, содержащего аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, 63, 65 и 67, и аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52, 54, 56 и 58.
28. Полипептид по п. 26, отличающийся тем, что В1 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую CDR из SEQ ID NO: 88, 89 и 90, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую CDR из SEQ ID NO: 76, 77 и 78.
29. Полипептид по п. 26, отличающийся тем, что В1 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую CDR из SEQ ID NO: 91, 92 и 93, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую CDR из SEQ ID NO: 79, 80 и 81.
30. Полипептид по п. 26, отличающийся тем, что В1 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую CDR из SEQ ID NO: 94, 89 и 95, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую CDR из SEQ ID NO: 82, 83 и 84.
31. Полипептид по п. 26, отличающийся тем, что В1 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую CDR из SEQ ID NO: 94, 89 и 96, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую CDR из SEQ ID NO: 85, 86 и 87.
32. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что связывающий GITR домен (В1) содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61, 63, 65 и 67, и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52, 54, 56 и 58.
33. Полипептид по п. 31, отличающийся тем, что В1 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 61 и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи из SEQ ID NO: 52.
34. Полипептид по п. 31, отличающийся тем, что В1 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 63 и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи из SEQ ID NO: 54.
35. Полипептид по п. 31, отличающийся тем, что В1 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 65 и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи из SEQ ID NO: 56.
36. Полипептид по п. 31, отличающийся тем, что В1 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 67 и/или аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи из SEQ ID NO: 58.
37. Полипептид по любому из пп. 31-35, отличающийся тем, что В1 содержит или состоит из:
(a) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 61 и аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи из SEQ ID NO: 52;
(b) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 63 и аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи из SEQ ID NO: 54;
(c) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 65 и аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи из SEQ ID NO: 56; или
(d) аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 67 и аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи из SEQ ID NO: 58.
38. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что связывающий GITR домен содержит человеческую Fc-область или вариант указанной области, при этом область представляет собой область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно область IgG1 или IgG4.
39. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, содержащий или состоящий из:
(a) аминокислотной последовательности легкой цепи, выбранной из SEQ ID NO: 69, 71, 73 и 75; а также
(b) аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из 52, 54, 56 и 58.
40. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, содержащий или состоящий из аминокислотных последовательностей:
(a) SEQ ID NO: 52 и 69; или
(b) SEQ ID NO: 54 и 71; или
(c) SEQ ID NO: 56 и 73; или
(d) SEQ ID NO: 58 и 75.
41. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий по меньшей мере один дополнительный связывающий домен.
2
42. Полипептид по п. 40, отличающийся тем, что по меньшей мере один связывающий домен представляет собой антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из группы, состоящей из: Fv-фрагмента (такого как одноцепочечный Fv-фрагмент или связанный дисульфидной связью Fv-фрагмент), Fab-подобного фрагмента (такого как Fab-фрагмент; Fab'-фрагмент или F(ab)-фрагмент) и доменных антител.
43. Полипептид по п. 40 или 41, отличающийся тем, что содержит по меньшей мере один дополнительный связывающий домен.
44. Полипептид по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий дополнительный терапевтический фрагмент.
45. Композиция, содержащая биспецифический полипептид по любому из пп. 1-38 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель или носитель.
46. Антитело, специфичное к GITR, которое определено в любом из пп. 26-37.
47. Полинуклеотид, кодирующий биспецифический полипептид по любому из пп. 1-42 или компонент его полипептидной цепи.
48. Биспецифический полипептид по любому из пп. 1-44 для применения в способе лечения или предупреждения неопластического заболевания или патологического состояния у индивидуума.
49. Биспецифический полипептид по п. 48, отличающийся тем, что заболевание или состояние представляет собой рак.
50. Биспецифический полипептид по п. 49, отличающийся тем, что рак выбран из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака яичников, рака легких, рака шейки матки, рабдомиосаркомы, нейробластомы, множественной миеломы, лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, меланомы, рака мочевого пузыря, рака желудка, рака головы и шеи, рака печени, рака кожи, лимфомы и глиобластомы.
51. Применение биспецифического полипептида по любому из пп. 1-43 в получении лекарственного препарата для лечения или предупреждения неопластического заболевания или патологического состояния у индивидуума.
52. Способ лечения или предупреждения неопластического заболевания или патологического состояния у индивидуума, отличающийся тем, что способ включает в себя введение индивидууму биспецифического полипептида по любому из пп. 1-43.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что способ включает в себя введение биспецифического антитела системно или местно, например, в месте опухоли или в лимфатический узел, дренирующий опухоль.