СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПСИЙНОГО МАТЕРИАЛА ИЗ СОСУДОВ, ПОРАЖЕННЫХ АТЕРОСКЛЕРОЗОМ
METHOD OF OBTAINING BIOPSY MATERIAL FROM ATHEROSCLEROSIS-AFFECTED VESSELS

Изобретение относится к области медицины, а именно к кардиологии, и может быть использовано для исследования патогенетических механизмов развития атеросклероза.
Этиология и патогенез атеросклероза до настоящего времени недостаточно изучены. Отсутствие достаточной и точной информации о конкретных патогенетических звеньях атеросклеротического процесса затрудняет изучение патогенеза и разработку адекватных методов лечения.
Для изучения атеросклеротического процесса существуют различные методы исследования. Часть из них относится к инвазивным прижизненным исследованиям, другие представляют собой постмортальную диагностику. Они служат для определения липидного состава крови, изучения поперечных и продольных срезов артериальных сосудов, на основе которых создается представление о процессах, происходящих в их стенке.
Прицельное изучение сосудистой стенки с помощью известных в настоящее время методов позволяет получить информацию об изменениях ее микроструктуры: местах отложения липидов, расположении в липидном ядре клеточных элементов - макрофагов, пенистых клеток.
Известен способ исследования биоптата сосудистой стенки, пораженной атеросклеротическим процессом, методом иммуногистохимического анализа (А.Н.Восканьянц, В.А.Нагорнев. Пролиферация клеток стенки артерий человека при атерогенезе как фактор проявления иммунного воспаления. // Цитокины и воспаление, 2004, № 4, с.10-11).
Для исследования используют продольные или поперечные срезы стенки сосуда, включающие все слои.
Исследование полученных биоптатов включает использование мышиных моноклональных антител против ядерного антигена пролиферирующих клеток (Anti-Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA)), меченных пероксидазой хрена (HRP). Антитела реагируют с эпитопами ядерных антигенов в пролиферирующих клетках. Максимальная экспрессия PCNA характерна для клеток, находящихся в S-фазе.
Недостатком метода является то, что он позволяет получить информацию лишь о наличии или отсутствии повышения экспрессии в изучаемых клетках. Количественная же оценка изменений остается субъективной. Это связано с тем, что при работе с материалом, включающем все слои, сложно установить в ядрах каких клеток и какого слоя, который удалось зафиксировать, имеет место повышение или снижение экспрессии PCNA.
Данный вид способов исследования на основе иммуногистохимического анализа сосудистой стенки дает возможность постановки диагноза атеросклероза, но не позволяет выявить патогенетические механизмы его развития на уровне молекулярной генетики.
В качестве ближайшего аналога принят способ получения биопсийного материала для диагностики патологических изменений сосудистой стенки при атеросклеротическом поражении (Автандилов Г.Г. Основы патологоанатомической практики. Руководство. 2-е изд. - М.: РМПО, 1998. - 505 с.). Способ включает взятие биоптата исследуемого сосуда с последующей обработкой и подготовкой к микроскопическому исследованию.
Биоптат, представляющий собой поперечный или продольный срез стенки сосуда, позволяет изучить ее строение, оценить изменения, вызванные атеросклеротическим поражением.
Способ информативен в случаях, когда необходимо поставить клинический или патологоанатомический диагноз, ответить на вопрос о наличии или отсутствии поражений стенки сосуда, а также описать их локализацию.
Однако известный способ не может быть использован для проведения генетического анализа. Это обусловлено тем, что в процессе приготовления материала для биопсии в срез захватываются все слои сосуда, а именно:
интима, медия и адвентиция. Полученный образец содержит разнообразный генетической материал, не позволяющий судить об изменениях только во внутреннем слое сосудистой стенки. В образце присутствуют эндотелиальные, гладкомышечные клетки, Т-лимфоциты, макрофаги, большое количество липидов.
Кроме того, в процессе приготовления образцов для гистологического исследования материал подвергается воздействию различных химических веществ - формалина, спиртов, парафина. Для дифференцировки слоев используют различные методы окраски. После подобных манипуляций генетический аппарат клетки и белки не пригодны для молекулярного исследования.
В настоящее время большое количество отечественных и зарубежных работ посвящено генетическим исследованиям при многофакторных заболеваниях, в частности при атеросклерозе.
Выявление и изучение патологических звеньев атеросклеротического процесса, а именно генов, ответственных за развитие атеросклероза, поможет изучить патогенез данного заболевания. Эффективным методом в разработке подходов для диагностики, лечения и создания лекарственных препаратов при атеросклерозе является поиск критических звеньев патологического процесса - генов-кандидатов, ответственных за развитие атеросклероза, и соответствующих белковых продуктов, выделенных из материала аутопсии интимы сосудов.
Задачей изобретения является создание способа получения биопсийного материала из артериальных сосудов, пораженных атеросклерозом, позволяющего провести корректные генетические исследования для оценки уровня экспрессии генов.
Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения биопсийного материала из артериальных сосудов, пораженных атеросклерозом, включающий вскрытие заданного участка стенки сосуда и взятие образца постмортального биологического материала с его последующей обработкой, для взятия постмортального биологического материала используют артерии среднего и/или крупного калибров мышечно-эластического или эластического типов с признаками атеросклероза, заданный участок стенки сосуда вскрывают вдоль, производят надрез интимальноого слоя сосуда глубиной не более 0,1 мм, длиной 1 см, шириной - 2 см для достижения массы образца не менее 10 мг, у края надреза захватывают выделенный участок интимального слоя движением, перпендикулярным направлению линии надреза вдоль поверхности сосуда и отделяют его от подлежащих слоев, полученный образец промывают в 0,9% растворе натрия хлорида, взвешивают и замораживают в жидком азоте, при этом время забора ткани, включая вскрытие и замораживание, составляет не более 15 минут.
Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.
Способ позволяет извлечь пораженные атеросклеротическим процессом образцы биопсийного материала, включающие только интиму, свободную от подлежащих тканей и продуктов атеросклеротического процесса и имеющие массу не менее 10 мг, оптимально необходимую для высокого выхода РНК.
Полученный таким способом биопсийный материал позволяет провести объективную корректную оценку уровня экспрессии генов, что дает возможность выявить и изучить патологические звенья атеросклеротического процесса с целью разработки эффективных методов диагностики и лечения.
Технический результат достигается за счет того, что авторами впервые разработана методика получения биопсийного материала, позволяющая извлечь ткань интимы сосуда для генетических исследований при атеросклеротическом поражении на различных этапах его развития: визуально здорового участка, липидного пятна и атеросклеротической бляшки с целью получения максимально возможного выхода РНК.
При решении поставленной задачи авторы исходили из того факта, что атеросклероз является хроническим заболеванием, проявляющимся очаговым утолщением интимы артерий эластического и мышечно-эластического типов за счет отложения липидов (липопротеинов) и реактивного разрастания соединительной ткани.
Морфогенез атеросклероза включает несколько стадий, среди которых можно выделить долипидную, липоидоз, липосклероз, атероматоз, изъязвление, атерокальциноз. Появлению ясной микроскопической картины изменений сосудистой стенки предшествуют изменения на молекулярном уровне.
Поскольку атеросклеротические поражения формируются внутри интимы, для осуществления генетического анализа необходим метод, с помощью которого можно добиться корректных результатов оценки уровня экспрессии генов на основе анализа РНК, выделенной из интимы сосудов, пораженных атеросклерозом, освобожденных от тканей различного типа: мышечных волокон, тромбов, фрагментов крови, содержимого атеросклеротической бляшки, затрудняющие исследование. Именно поэтому отделение интимы визуально здорового участка сосуда от липидного пятна, атеросклеротической бляшки необходимо для корректной оценки полученных результатов экспрессии генов.
При этом способ разработан с учетом того, что патологические изменения, возникающие при атеросклерозе, возникают в интиме артерий среднего и крупного калибра.
Биопсийный материал, полученный предлагаемым способом, позволяет впервые провести сравнение уровня экспрессии генов в различных участках сосуда у одного и того же пациента. Интима сосуда включает в себя эндотелий, базальную мембрану, подэндотелиальный слой и внутреннюю эластическую мембрану. Сравнение уровня экспрессии генов в различных участках сосудов - визуально здоровом участке, участке с липидным пятном и участке с атеросклеротической бляшкой у одного и того же пациента, позволяет на генетическом уровне выявить изменения экспрессии определенных генов для более детального изучения и определения патогенетических механизмов возникновения атеросклероза.
Разработанная авторами технология получения биопсийного материала обеспечивает точное извлечение интимы, свободной от продуктов атеросклеротического процесса, позволяет исключить захват средней и наружной оболочки в исследуемый образец, имеющий массу не менее 10 мг, что является принципиальным для выделения РНК. Весь процесс забора ткани, включая вскрытие и замораживание, составляет не более 15 минут. Это обусловлено тем, что позднее в тканях начинаются окислительные и другие биохимические процессы, ведущие к деградации РНК и изменению необходимых параметров, что не позволяет провести корректные измерения.
На основе предлагаемого способа впервые будут произведены поиск, идентификация и сравнительный анализ предполагаемых генов, ответственных за возникновение и развитие атеросклероза, а также сравнительный анализ РНК - в пораженных и непораженных участках интимы сосудов, взятых у одного и того же пациента. При использовании молекулярно-генетических методов исследования станет возможным также проведение идентификации генов-кандидатов, ответственных за атеросклеротический процесс, что позволяет приблизиться к патогенетическим процессам при атеросклерозе на генетическом уровне и, в дальнейшем, определить белковые продукты данных генов, использовать их для поиска новых лекарственных препаратов, воздействующих на белки-мишени патологических процессов.
Таким образом, на основе и с учетом вышеперечисленных факторов авторами разработан способ выделения интимы сосуда для генетических исследований при атеросклеротическом поражении на различных этапах его развития с целью получения максимально возможного выхода РНК, что позволяет получить статистически достоверные и воспроизводимые результаты полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией.
Способ осуществляется следующим образом.
Для взятия постмортального биологического материала используют артерии среднего и крупного калибров мышечно-эластического или эластического типов с признаками атеросклероза, например брюшную аорту.
Заданный участок стенки сосуда вскрывают вдоль для получения максимального доступа к внутренней поверхности. При помощи острого инструмента (например, ланцета) производят надрез на внутренней поверхности стенки сосуда глубиной не более 0,1 мм, то есть не более толщины интимального слоя сосуда, длиной 1 см и шириной 2 см, что гарантирует достижение массы образца не менее 10 мг.
При помощи зубчато-лапчатого пинцета у края надреза захватывают поверхностный слой - интиму, движением, перпендикулярным направлению линии надреза, вдоль поверхности сосуда, отделяют интиму от подлежащего, медиального слоев. Этот технический прием позволяет осуществить отделение интимального слоя от среднего слоя сосуда и получить образец без дополнительных слоев среднего и адвентициального (наружного) слоев. Присутствие в образце дополнительных слоев сосуда (среднего и адвентициального) могут изменить показатели экспрессии гена.
Полученный образец промывают в 0,9% растворе натрия хлорида, который является изотоническим по отношению к крови, в непосредственном контакте с которой находится интимальный слой сосуда и позволяет отделить его от тканей другого типа, таких как мышечные элементы среднего слоя сосуда, содержимого атеросклеротической бляшки (гранул холестерина), от элементов крови (лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов), которые могут повлиять на процесс выделения РНК. Раствор используют однократно, поскольку использованный раствор может контаминировать вышеуказанными элементами тканей следующий образец. Полученный образец взвешивали на электронных весах фирмы OHAUS.
Забор ткани, включая вскрытие, производят в течение не более 15 минут.
Затем образец замораживают в жидком азоте для предотвращения деградации РНК и отправляют для дальнейшего выделения РНК.
Способ испытан в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики им. Н.И.Вавилова на 20 пациентах, из них 8 женщин и 12 мужчин в возрасте от 58 до 73 лет. Образцы были использованы для анализа уровня экспрессии генов АР-1 (Activating protein 1) транскрипционного комплекса методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Они позволили провести корректные генетические исследования на уровне экспрессии генов. Во всех случаях достигнут высокий выход РНК из образцов. Профили экспрессии исследуемых генов были стабильно высокими на всех пораженных атеросклерозом образцах.
Пример 1. Взятие образца постмортального биологического материала осуществляли через 12 часов после биологической смерти, при этом брюшная аорта длиной 12 см вскрыта вдоль. С помощью ланцета в участке визуально здорового сосуда, не пораженного атеросклерозом, произведен надрез длиной 1 см, шириной 2 см и глубиной 0,1 мм, что гарантирует достижение массы ткани не менее 10 мг. При помощи зубчато-лапчатого пинцета у края надреза захвачен поверхностный слой - интима. Движением, перпендикулярным направлению надреза, вдоль поверхности сосуда, интима отделена от подлежащего, медиального слоя площадью около 2 кв. см. Выделенный фрагмент промыт в 0,9% растворе натрия хлорида и взвешен на электронных весах фирмы OHAUS, после чего заморажен в жидком азоте и отправлен для последующего выделения РНК и проведения оценки уровня экспрессии генов.
Пример 2. Взятие образца постмортального биологического материала осуществляли через 12 часов после биологической смерти. Брюшная аорта длиной 12 см вскрыта вдоль. С помощью ланцета в участке липидного пятна произведен надрез сосуда, величиной с липидное пятно, глубиной 0,1 мм. При помощи зубчато-лапчатого пинцета у края надреза захвачен поверхностный слой - интима, которая отделена от подлежащего, медиального слоев, суммарной площадью около 2 кв. см, весом 11 мг. Выделенный фрагмент промыт в 0,9% растворе натрия хлорида и заморажен в жидком азоте для последующего выделения РНК и проведения оценки уровня экспрессии генов.