Нормы затрат времени на постановку ПЦР при описторхозе плотоядных животных

установить количественное значение ряда факторов. Главнейшей задачей является создание системной математической модели, имитирующей возникновение, развитие и течение эпифитотического процесса глободероза картофеля (4).

Такой подход в значительной мере облегчает рассмотрение отдельных составных частей системы, которые в свою очередь могут быть рассмотрены как состоящие из ряда более малых частей или компонентов, блоков или факторов, охватывающих отдельные звенья эпифитотического процесса, включающих в себя развитие глободероза, биологию и экологию золотистой картофельной нематоды (ЗКН), а также некоторые абиотические, биотические и антропогенные факторы. Она может быть построена на основе литературных, собственных и экспериментальных данных (1,5).

Литература: 1. Поляков И.Я. и др. Прогноз развития вредителей и болезней с.-х. растений. «Колос». -Л.- 1984. -318с. 2. Поляков И.Я. и др. Фитосанитарная диагностика в интегрированной защите растений. «Колос». -М.- 1995. -208 с. 3. Савотиков Ю.Ф. и др. Рекомендации по выявлению и мерам борьбы с очагами глободероза картофеля. М. Госагропром РСФСР. 1986. -126 с. 4. Сагитов А.О., Перевертин К.А. Фитонематология - с.х. производству. Алма-Ата.- Кайнар, 1987. - 180с. 5. Шестеперов А.А., Савотиков Ю.Ф. Карантинные фитогельминтозы. Кн. 1. «Колос». - М. -1995. -463 с.

Some methological explanations to prognosis of Globodera infection development in foci of golden potato nematode. Shesteperov A.A., Sagitov A.O. All-Russian K.I. Skryabin Scientific Research Institute of Helmitnhology.

Summary. It is necessary to collect the data base as well as to develop the scoring systems for visual evaluation of lesions, mathematical models imitating the Globodera development in relation to abiotic, biotic and anthropogenic factors.

НОРМЫ ЗАТРАТ ВРЕМЕНИ НА ПОСТАНОВКУ ПЦР ПРИ ОПИСТОРХОЗЕ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ

Шибитов С.К., Сафиуллин Р.Т.

ГНУ ВНИИ гельминтологии им.К.И.Скрябина

Ведение. По проблеме описторхоза, в нашей стране работали многие исследователи, выполнен ряд научных работ, однако от этого проблема менее актуальной не стала. Справедливости ради следует отметить, что, во-первых, данная проблема очень сложна, во-вторых, заболевание распространено на большой территории, а в-третьих, требуется изучение и уточнение следующих вопросов: биология паразита, экология его хозяев, влияние на паразита и его хозяев разнообразных факторов антропопрессии, особенностей

455

географического распространения, воздействие паразита на организм человека и животных.

Западная Сибирь является самым крупным и постоянным источником описторхоза, как среди плотоядных животных, так и среди местного населения. Обычно кошки служили индикаторами местности в отношении неблагополучия ее по данному заболеванию. Однако установить истинную зараженность кошек, а тем более диких плотоядных на такой большой территории практически не возможно. Данные ветеринарной отчетности по формам 1-вет и 4-вет не дают четкого ответа по описторхозу, поскольку там указывается общая инвазированность собак и кошек гельминтами. А используемые в настоящее время методы диагностики и лечения нуждаются в усовершенствовании.

Описторхоз - биогельминтоз. Один из возбудителей - сибирский сосальщик, или кошачий сосальщик (Opisthorchis felineus), паразитирует у человека, кошек, собак, и др., в печени, желчном пузыре, поджелудочной железе. Основной источник распространения инвазии - животное, которое употребило в пищу зараженную рыбу семейства карповых, в том числе и человек, с фекалиями которого, а также больных животных, яйца паразита попадают в воду, где их заглатывают улитки (Bithynia leachi), в которых происходит превращение личинок паразита, заканчивающееся выходом в воду - церкарий и они проникают в карповых рыб (язя, ельца, плотву и др.). Человек заражается при употреблении в пищу сырой, недостаточно прожаренной и слабопросоленной рыбы. Срок жизни паразита в организме человека или животных без дегельминтизации может длиться десятки лет и ведет к хроническому заболеванию печени, поджелудочной железы, желчного пузыря, способствует возникновению рака печени и желчных протоков.

Материалы и методы. Стандартным методом для диагностики описторхоза является копроовоскопия. Однако существующие методы не достаточно эффективны, из-за того, что яйца у описторхид мелкие, практически не диагностируются с применением солей для флотации, зачастую оболочка яиц деформируется при обработке реактивами входящими в состав диагностических средств, а на межвидовом уровне яйца описторхид практически не различимы между собой, то же можно отнести и к метацеркариям описторхид. Разработанные относительно недавно серологические методы диагностики оказались также не способными достоверно различать виды описторхид из-за большого количества гомологичных белков. В связи с этим, в настоящее время особо актуальным становится подход к диагностике описторхоза плотоядных с применением метода полимеразно-цепной реакции (ПЦР), в том числе для дифференциальной диагностики между другими описторхидами. Следует отметить, что ПЦР-метод может использоваться для выявления метацеркариев Opisthorchis felineus в мышцах карповых рыб в ветеринарно-санитарных лабораториях на рынках, для диагностики описторхоза у плотоядных животных в ветеринарных лабораторях, а также при детекции взрослых червей (марит) из печени зараженных лабораторных животных в научных

456

целях.

Норму затрат времени на постановку ПЦР при описторхозе плотоядных животных устанавливали по данным хронометражных наблюдений за работой каждой категории исполнителей в условиях ПЦР лаборатории ВИГИС.

Результаты исследований. При проведении прижизненной диагностики описторхоза плотоядных животных путем постановки ПЦР подготовительное время состояло из следующих элементов:

- подготовка необходимой посуды и оборудования;

- взвешивания реактивов и приготовление буферных растворов;

- взвешивание материала и его гомогенизация при помощи керамической колонки.

Оперативное время работы включало следующие элементы: выделение и очистка геномной ДНК, проведение ПЦР, амплификация и электрофорез, которые в свою очередь состоят из более конкретных операций.

1. Выделение геномной ДНК

- внесение переваривающего геномного буфера и инкубирование в термостате при 56 0С, временами перемешивая;

- удаление частиц материала путем центрифугирования;

- внесение РНК-зы, перемешивание и инкубирование при комнатной температуре;

- внесение буфера, связывающего геномную ДНК, перемешивание в вортексе до получения гомогенного раствора;

- внесение 96-100%-ного этанола, перемешивание в вортексе до гомогенного раствора.

2. Очистка геномной ДНК с использованием специальных фильтрколонок состояла из следующих операций:

- установление специальных фильтр-колонок;

- внесение буферного раствора, связывающего генную ДНК и добавление этанола;

- центрифугирование при комнатной температуре 3 раза при 10000 обор. в течение минуты и 1 раз в течение 3 минут;

- внесение промывочного буфера;

- перемещение колонок в чистую пробирку, поставляемую с набором;

- внесение геномного элюирующего буфера;

- инкубирование при комнатной температуре.

3. Проведение ПЦР состояло из следующих элементов:

- маркировка необходимого количества пробирок и внесение праймеров OfF и ITS2exR;

- внесение во все пробирки ПЦР растворителя GenePak  PCR core;

- внесение в соответствующие пробирки Мастер Микса GenePak  PCR core по 5 мкл (20-200 нг) исследуемого ДНК. В качестве контроля используют бидистиллированную воду или растворитель в котором растворена исследуемая ДНК;

- передача материала в комнату для амплификации.

4. Процесс амплификации выполнялся следующим образом:

457

- выбор заранее подготовленной программы амплификации состоящая из денатурации ДНК при 950С - 2 мин - 1 цикл, затем 35 циклов, включающих денатурацию 10 секунд при 950C, отжиг праймеров 20 секунд при 560C, элонгацию 30 секунд при 720C;

- передача материала для проведения электрофореза.

5. Проведение электрофореза состояло из следующих этапов:

- заполнение устройства для электрофореза трис-ацетатный буфер (ТАЕ) (на 1л: трис - 242 г, ледяная уксусная кислота - 57 мл, 0,5 М ЭДТА, рН 8,0, 100 мл);

- приготовление 1,5%-ного агарозного геля с этидия бромидом (на 100 мл раствора добавить 1,0 мкл);

- нагревание раствора до кипения, затем остудить до 50-550C;

- заполнение раствором формы с установленной гребенкой для лунок;

- удаление гребенки не повреждая целостность лунок, гель поместить в устройство для электрофореза;

- внесение в лунки по 5-20 мкл ПЦР продукта и внести контроль;

- включение устройства для электрофореза в сеть и выбрать режим

100 В на 30 минут;

- выключить аппарат по окончание электрофореза, промыть гель в дистиллированной воде и перенести электрофореграмму в комнату для чтения;

- фотодокументирование, распечатка результатов и их анализ.

Заключительное время состояло из:

- уборки использованного оборудования, промывки посуды;

- оформление результатов проведенного исследования.

Заключение. В структуре затрат времени на прижизненную. диагностику

описторхоза плотоядных животных с использованием ПЦР на подготовительные работы затрачивается 11,1%, оперативное - 80,65% и заключительное - 8,25%. Нормы времени на прижизненную диагностику описторхоза плотоядных животных путем постановки ПЦР с использованием насадки автоматической пипетки на 10 лунок у ветеринарного врача составила 25,2 минуты, лаборанта 4,7, санитара - 1,6 минуты, а общее время - 31,5 минуты.

Литература: 1. Инструкция «Мероприятия по предупреждению и

ликвидации заболеваний животных гельминтозами». - М., 1999. 2.

Ветеринарные правила и нормы. Вет. ПиН. 13.7.1. 2000. 3. Федеральный закон «О техническом реформировании». - М., №184-ФЗ 27.12.2002. 4.

Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации. СанПиН 3.2.1333-03. - М., 2003. 5. Сафиуллин Р.Т., Шеховцов Н.В. // Сб.матер.научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 2006. - вып.7. - С. 353-354.

458

Norms of time expenditures on assay of Opisthorchis felineus by PCR in carnivores. Shibitov S.K., Safiullin R.T. All-Russian K.I. Skryabin Scientific Research Institute of Helminthology.

Summary. One established the norms of time expenditures on vital diagnosis of O. felineus in carnivores by polymerase chain reaction; those indices were 25,2; 4,7 and 1,6 minutes for veterinary doctor, laboratory assistan, attendant respectively; the total spent time appeared to be 31,5 minutes.

ТРИХИНЕЛЛЕЗ - ЗООПАРАЗИТОЗ КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ

Шипкова Л.Н., Пескова Т. Ю., Казакова Е.А.

ГБОУ ВПО Кубанский медицинский университет

ГБОУ ВПО Кубанский государственный университет

Введение. В Краснодарском крае трихинеллез является природноочаговым заболеванием. Анализ эпизоотической ситуации по трихинеллезу в Краснодарском крае показал, что за последние четыре года (2008-2011) г. в крае зарегистрированы 319 очагов трихинеллеза, из них в 139 (43,6%) выявленны больные. Вспышка трихинеллеза зарегистрирована на протяжении всего года с подъемом в зимне-весенний период. Отмечена связь частоты вспышек от свинины с интенсивностью убоя скота (праздничные дни весны и зимы), а вспышек от мяса диких животных - с началом сезона охоты (декабрь - январь). Среди лиц, употребляющих домашнюю свинину, заболело 8,5%, удельный вес среди употреблявших инвазированное мясо диких животных был значительно выше -14%.Подобные различия можно объяснить с преимущественным употреблением инвазированного мяса дичи после недостаточной термической обработки в виде шашлыка, сала, сырокопченого окорока.

В Краснодарской инфекционной больнице были зарегистрированы случаи заболевания трихинеллезом. В 2008 году - десять человек были госпитализированы с лихорадкой, отеками, миалгиями, а так же кожным синдромом, который проявлялся обильной папульной сыпью. В 2009 году заболевших было пятнадцать человек, среди них были 48,85% с кожным синдромом и 51,15% с абдоминальным синдромом, сопровождающимся тошнотой, рвотой, болями в эпигастрии, диареей. В 2010 году зарегистрировано 25 человек, из них 25% с кожным синдромом и 75% с абдоминальным синдромом. В 2011 году число обращений в больницу увеличилось до 45 человек.

Большая пораженность трихинеллезом регистрируется в горной и горноприморской зоне Краснодарского края (Туапсинский, Лазареский, Апширонский районы). Это объясняется практикой свободного выпаса свиней

459