Сравнительная характеристика клеточных субпопуляций мозжечка серой жабы (bufo bufo) и остромордой лягушки (Rana arvalis) в условиях антропогенного воздействия

БИОЛОГИЯ

Л.Н. Афанаскина

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОЧНЫХ СУБПОПУЛЯНИЙ МОЗЖЕЧКА СЕРОЙ ЖАБЫ {BUFO BUFO)

И ОСТРОМОРДОЙ ЛЯГУШКИ

В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ

Земноводные, антропогенные биотопы, мозжечок, клеточные популяции.

Амфибии, обитающие на границе двух сред — водной и наземной, являются связующим звеном в трофических цепях пресноводных водоемов и экосистем суши. Состояние их организма в полной мере отражает состояние окружающей среды и делает их очень удобными в качестве биоиндикаторов, используемых для оценки изменений среды (в том числе и под влиянием антропогенного фактора). Обычно их местообитание связано с определенным водоемом, что облегчает интерпретацию полученных данных: состояние их организма отражает состояние локального местообитания [Пескова, Жукова, 2007, с. 22]. Особо важно, что на урбанизированных территориях, где человек оказывает сильное давление на природу, степень этого влияния на живые организмы может быть выявлена и на уровне морфофизиологических исследований. Так, изменения химического состава водной среды оказывают стрессирующее действие на организмы, жизнедеятельность которых непосредственно связана с водоемами, что приводит к изменению их морфофизиологических параметров [Седалищев, 2005, с. 209].

Антропогенное влияние пригородных зон сказывается на жизнедеятельности животных, обитающих на этих территориях, и требует всестороннего анализа адаптивных возможностей приспособления земноводных к новым трансформированным условиям.

Изучение проблемы переадаптации нервной системы, являющейся одной из ведущих интегративных систем, на клеточном уровне с учетом поддержания стабильности белкового фонда, активного накопления и локализации в гиалоплазме рибонуклеопротеидных комплексов (РНП), поддержания процессов внутриклеточной регенерации при контакте с экстремально меняющимися условиями среды обитания первых наземных позвоночных, является актуальным.

Объектом изучения были бесхвостые земноводные — остромордая лягушка (Rana arvalis) и серая жаба (Bufo Bufo). Зоной совместного обитания земноводных в При-чулымской лесостепи являются долины р. Чулыма и его притоков. Здесь изученные

бесхвостые слабо дифференцируются по биотопам, где населяют старицы и пойменные луга, которые сильно нарушены неумеренным выпасом: достаточно засорены, кочковаты, закустарены, содержат много розеточного разнотравья. Распространение особей по территории носит мозаичный характер и связано в основном с их образом жизни (водный, полуводный, наземный) [Городилова, 2010, с. 87].

Цель исследования: изучение вариабельности морфологических показателей на популяционно-клеточном уровне мозжечка бесхвостых земноводных с позиций оценки толерантности и резистентности первичноназемных позвоночных, обитателей некоторых антропогенных биотопов Красноярского края.

Животные (7 особей серой жабы массой 48,6±0,9 г, 12 особей остромордой лягушки массой 15,2±0,3 г) отловлены на биотопах в периоды максимальной активности земноводных на нерестилищах (период размножения) [Измерение и мониторинг ..., 2003, с. 127]. Идентификация вида батрахофауны осуществлялась по морфологическим признакам при помощи определителей [Кузьмин, 1999, с. 153]. Земноводные помещались в специальные контейнеры для транспортировки и доставлялись в лабораторию для проведения забора материала.

Забор материала у исследуемых животных осуществлялся с соблюдением правил, утвержденных Международной федерацией по защите животных (Приложение к приказу М3 СССР № 755 от 12.08.77; Приказ № 1179 М3 СССР от 11.10.1983 и № 267 М3 РФ от 19.06.2003).

Забор материала производился под воздушно-эфирным наркозом путем декапи-тации головы или отсечения верхней челюсти с головным мозгом.

Головной мозг после извлечения из черепной коробки целиком быстро и аккуратно помещали в фиксатор (жидкость Карнуа), затем заливали в парафин с последующим изготовлением серийных срезов на санном микротоме «Slide 2002». На срезах толщиной 5—6 мкм проводили качественные реакции на рибонуклеопроте-идные комплексы, окрашивали тионином по Нисслю. Данные реакции отражают метаболическую активность нейронов. На гистологических препаратах с помощью микроскопа Zeiss Axioskop со встроенной видеокамерой и прилагаемым программным обеспечением (Axio Vision LE Rel. 4.3) количественными методами исследованы субпопуляции нейронов и глиоцитов слоев мозжечка амфибий.

Объектом исследования служил мозжечок, обеспечивающий регуляцию и координацию движений этих животных на суше. Исследованы нейронные популяции молекулярного слоя, представленные звездчатыми клетками (ЗК), ганглионарного слоя, представленные клетками Пуркинье (КП), выносящими информацию за пределы головного мозга; зернистого слоя, представленные клетками-зернами (КЗ). Глиальные компоненты, имеющиеся в каждом слое (свободная и сателлит-ная макроглия), выполняют важнейшую для нервных клеток вспомогательную функцию и обеспечивают связь нервных элементов с кровеносными сосудами [Verkhratsky, Butt, 2007, с. 201]. Для дифференцировки структур использованы атласы мозга земноводных [Kemali, Breitenberg, 1969, с. 27].

Изучены линейные характеристики клеток нейронных популяций (площадь сечения тела — St, цитоплазмы — Яц, ядра — Яя); оценены производные линейных характеристик (ядерно-цитоплазматическое отношение — ЯЦО) изучаемых слоев мозжечка у особей данного биотопа.

На уровне субпопуляций проанализированы плотность распределения нейронов и глиоцитов на единицу фиксированной площади (1 мм2); глио-нейрональные индексы (отражают число клеток макроглии: сателлитной и свободной, приходящиеся на один нейроцит). В клеточных популяциях подсчитывали число нейронов

с разной степенью хромофилии их цитоплазмы: нормохромные, гипохромные и ги-перхромные, функционирующих в пределах биологической нормы, без явлений деструктивных нарушений. Уделялось внимание появлению нейронов, находящихся на границе нормального функционирования, и клеткам с явлениями де-компинсации.

Полученные результаты обработаны с использованием программы «М1сготес1 81аЙ8Йса».

На гистологических препаратах в мозжечке изученных видов земноводных выделяются три слоя: молекулярный с редко встречающимися крупными звездчатыми клетками; ганглионарный, представлен грушевидными нейронами, аморфно расположенными на границе молекулярного и зернистого слоев. Нейроны этого слоя не имеют четкой локализации и часто внедряются в соседние слои. Зернистый слой наиболее мощно выражен и представлен крупными клетками-зернами.

В молекулярном слое мозжечка ЗК имеют наибольшую площадь профильного поля тела 8,0 ± 0,25 мкм2 серые жабы, а наименьшие показатели 7,3 ± 0,18 мкм2 — остромордые лягушки. Ядерно-цитоплазматические отношения у особей разных видов находятся на одном уровне и составляют значение 1,1 (табл.).

В ганглионарном слое эфферентные нейроны — клетки Пуркине — самые крупные, чаще овальной формы, ядра таких клеток светлые, ядрышко не всегда четко дифференцируется и имеет разную локализацию (либо в центре, либо смещено на периферию клетки). В клеточной популяции нейронов ганглионарного слоя показатели площади тела клетки варьировали от 26,9 ± 0,6 мкм2 у жаб до

27.6 ± 0,8 мкм2 у лягушек. Показатели площади цитоплазмы и ядра у особей обоих видов достоверно не различаются и составили 15,8 ± 0,3 мкм2 у жаб,

15.7 ± 0,6 мкм2 — у лягушек, площади ядер соответственно у остромордых лягушек — 11,9 ± 0,5 мкм2, у серой жабы — 11,1 ± 0,5 мкм2. Ядерно-цитоплазматическое отношение в клеточных популяциях ганглионарного слоя мозжечка составило от

0,7 ± 0,04 у жаб, до 0,8 ± 0,03 у лягушек, т. е. цитоплазма во всех клетках Пуркине превышает площадь ядра в 1,4 раза у жаб и 1,3 у лягушек (табл.).

Зернистый слой у изученного вида земноводных выделяется наличием в клеточных популяциях крупных КЗ. Показатели площади профильного поля тела у амфибий значительно варьируют: 6,9 ±0,1 мкм2 у жаб и достоверно выше 10,0 ± 0,2 мкм2 у лягушек. Ядерно-цитоплазматические отношения достоверно отличаются: 1,1± 0,03 у серой жабы и 1,8± 0,04 у особей остромордой лягушки.

Плотность распределения нейронов в исследуемых слоях земноводных на фиксированную единицу площади существенно отличается. Показатели плотности ЗК в молекулярном слое жаб в 4,4 раза выше, чем у лягушек. Плотность КП ганглионарного слоя в мозжечке соответственно в 2,3 раза выше у жаб, а в зернистом — в 1,3 раза. В клеточных популяциях молекулярного слоя свободные (1684,5 ± 67,6) и саттелитные глиоциты (2024,0 ± 101,4) преобладали у жаб, а у остромордой лягушки эти показатели значительно меньше — 196,3 ± 8,6 и 233,0 ± 10,2 соответственно (табл.). Следовательно, интенсивность пролиферативных процессов глиоцитов активизирована в мозжечке жаб, что указывает на интенсивность процессов реактивных перестроек.

Полиморфизм включения пролиферативных процессов у исследуемых видов неоднозначен: в ганглионарном слое наблюдается преобладание у серой жабы сатте-литных глиоцитов (3674,2 ± 81,6), а у остромордой лягушки свободной глии (227,8 ± 14). Глионейрональные индексы в системе «нейрон — свободный глиоцит» в молекулярном и ганглионарном слоях у серой жабы существенно отличаются от

Таблица

Морфологические характеристики нейронных популяций слоев мозжечка серой жабы

Показатель Молекулярный слой Ганглионарный слой Зернистый слой

М ± s

В. bufo R. arvalis В. bufo R. arvalis В. bufo R. arvalis

Линейные параметры нейронов (мкм2) и их производные

S клетки 8,0 ±0,25 7,3 ± 0,18* 26,9 ±0,6 27,6 ±0,8 6,9 ±0,1 10,0 ±0,2*

S ядра 4,0 ±0,15 3,8 ±0,12 11,1 ± 0,5 11,9 ±0,5 3,5 ±0,08 6,4 ±0,2*

S цитоплазмы 4,0 ±0,14 3,6 ±0,08* 15,8 ±0,3 15,7 ±0,6 3,4 ±0,06 3,6 ±0,06*

ЯЦО 1,1 ±0,04 1,1 ± 0,02 0,7 ±0,04 0,8 ±0,03* 1,1 ±0,03 1,8 ±0,04*

Показатели системы «нейрон-глия»

р нейронов 2628,8 ± 113,7 598,9 ±21,5* 2841,8 ± 72,5 1244,0 ± 50,8* 36 233,9 ± 753,2 28 545,3 ± 444*

р глии своб. 1684,5 ± 67,6 196,3 ± 8,6* 1853,5 ± 54,5 227,8 ± 14* - -

р глии сат. 2024,0 ± 101,4 233 ± 10,2* 3674,2 ± 81,6 221,8 ± 12,6* - -

ГНИ своб. 0,7 ±0,04 0,4 ±0,02* 0,7 ±0,04 0,2 ±0,01* - -

ГНИ сат. 0,8 ±0,04 0,4 ±0,02* 1,4 ±0,05 0,2 ±0,01* - -

Оценка хроматофильной субстанции нейронов ганглионарного слоя

В. bufo R. arvalis

Нормохромные 57,6 ±2,2 91,6 ± 1,0*

Гиперхромные 23,2 ± 1,7 5,4 ±0,8*

Гипохромные 19,2 ± 1,7 3,1 ±0,6*

Соотношение клеток-зерен зернистого слоя по содержанию глыбок хроматина

2—3 — низкое 13,9 ±0,1 13,4 ±0,08*

4—5 — умеренно-среднее 36,8 ±0,1 48,5 ±0,14*

6—7 — средне-высокое 32,0 ±0,14 31,5 ±0,1*

8—9 — высокое 12,9 ±0,07 5,4 ±0,07*

10 и более — крайне высокое 5,3 ±0,07 1,3 ±0,03*

Примечание: в — площадь профильного поля; ЯЦО — ядерно-цитоплазматическое отношение; в — стандартное отклонение; р — плотность; своб. — свободная глия; сат. — сателлитарная глия; ГНИ — глионейрональный индекс; * — достоверность различий, р < 0,01.

лягушек, соответственно в 1,75 и в 3,5 раза выше (табл.). Соответственно ГНИ в молекулярном слое в 2 раза, а в ганглионарном в 1,4 раза достоверно выше у серых жаб, что отражает высокую пролиферативную и миграционную активность глиальных компонентов. Известно, что функции глии для нейронных популяций существенны — это связь нервных элементов с кровеносными сосудами, питание нейронов, выделение продуктов метаболизма, участие в восстановлении и внутриклеточной регенерации нервной ткани, обеспечение успешного включения и поддержания компенсаторно-приспособительных механизмов [Verkhratsky, Butt, 2007, с. 218].

Показатели плотности нейронов в зернистом слое мозжечка у особей различаются значительно: 36233,9 ± 753,2 у жаб и 28545,3 ± 444 у остромордой лягушки.

В исследуемых нейрональных популяциях КП сибирской лягушки, согласно классификации типовых форм морфологической изменчивости ЦНС при действии антропогенных факторов, по оценке хроматофильной субстанции преобладал нор-мохромный тип клеток. На фоне нормохромных клеток у особей в биотопе чаще встречались темные — гиперхромные с сохранной структурой, реже светлые — ги-похромные нейроны, что указывает на включение компенсаторно-приспособительных реакций, связанных с нарастанием в клеточной популяции темных нейронов — гиперхромных, накапливающих и сохраняющих базофильное вещество в клетке (табл.).

Оценка клеток-зерен по количеству гетерохроматиновых глыбок в ядре показала разброс в диапазоне от 2-3 крупных до 10 и более мелких. У особей в популяции КЗ доминировали нейроны с умеренно средним, средневысоким содержанием глыбок хроматина, что может отражать повышенный процесс функционирования белоксинтезирующей системы в нейроцитах зернистого слоя (табл.).

В популяциях зернистого слоя у амфибий преобладали нейроны со смещенным к периферии ядрышком: 68 % у серой жабы и 64,2 % у остромордой лягушки.

Проведенный комплексный анализ количественных параметров на уровне клеток, их компонентов и клеточных популяций слоев мозжечка амфибий свидетельствует о разной интенсивности включения компенсаторно-приспособительных процессов, что может быть вызвано действием антропогенного фактора на окружающую среду.

Полученные морфометрические характеристики нейроглиальных популяций мозжечка амфибий можно рассматривать как оптимальный вариант, обеспечивающий функционирование нервной системы, направленной на поддержание относительного динамического равновесия организма этого вида в условиях испытываемого антропогенного воздействия на урбанизированных территориях Причулым-ской лесостепи.

Библиографический список

1. Городилова С. Н. Симбиотическое сосуществование земноводных (Amphibia) Назаров-ской лесостепи (средняя Сибирь) // Вестник КрасГАУ. 2010. № 2. С. 87-92.

2. Измерение и мониторинг биологического разнообразия: стандартные методики для земноводных / пер. с англ. С. М. Ляпкова. М.: КМК, 2003. 380 с.

3. Кузьмин С. Л. Земноводные бывшего СССР. М.: Изд-во КМК, 1999. С. 153-154.

4. Пескова Т.Ю., Жукова Т.И. Использование земноводных для биоиндикации загрязнения водоемов // Наука Кубани. 2007. № 2. С. 22-25.

5. Седалищев В.Т. Сибирская лягушка (Rana amurensis) как индикатор антропогенных воздействий // Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных: международная научная конференция. Саранск, 2005. С. 209-211.

6. Kemali М., Breitenberg V. Atlas of the forg brain. Berlin: Springer Verl., 1969. 284 p.

7. Verkhratsky A., Butt. A. Glial neurobiology: A textbook. West Sussex, 2007. 224 p.