ФЕРМЕНТ, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ АКТИВНОСТЬ ФРУКТАНАЗЫ
ENZYME EXHIBITING FRUCTANASE ACTIVITY

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
В соответствии с настоящим изобретением предложен фермент, который обеспечивает эффективное удаление фруктана из зернового и овощного сырья. Фермент согласно настоящему изобретению обеспечивает получение зернового и овощного материала, имеющего значительно более низкое содержание фруктана по сравнению с его содержанием в исходном материале. Зерновые и овощные материалы с низким содержанием фруктана можно использовать для получения зерновых и овощных ингредиентов с низким содержанием фруктана, продуктов, подходящих, например, для диеты с низким содержанием FODMAP, а также различных зерновых и овощных пищевых продуктов, обладающих диетическими преимуществами. Настоящее изобретение также относится к продуктам, содержащим зерновые или овощные ингредиенты с низким содержанием фруктана, и к продуктам, содержащим указанный фермент, таким как улучшители и премиксы для применения в выпечке.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Проблемы, связанные с пищеварением, являются частой причиной общего и социального дискомфорта. Эти проблемы охватывают широкий спектр желудочно-кишечных симптомов, среди которых наиболее частыми являются вздутие живота, образование газов, боли в животе, общий дискомфорт, запоры и жидкий стул. На сегодняшний день считают, что многие из индивидуумов, у которых наблюдают указанные симптомы, страдают от синдрома раздраженного кишечника (СРК). СРК однозначно чаще встречается у женщин и полагают, что от него страдает 10-20% западной популяции; таким образом, СРК в западной популяции встречается чаще, чем непереносимость лактозы (однако у многих людей, имеющих непереносимость лактозы, может присутствовать СРК, и наоборот).
В настоящее время удовлетворительного медицинского лечения СРК не существует. Большое внимание уделяют лечению СРК путем диеты. Наибольшее внимание уделяют диете, называемой диета LOW-FODMAP. Идея данной диеты состоит в том, чтобы избегать продуктов, которые содержат соединения FODMAP. Термин FODMAP является производным от «Ферментируемые, Олиго-, Ди-, Моносахариды и Полиолы». FODMAP представляют собой короткоцепочечные углеводы и моносахариды, которые плохо всасываются в тонком кишечнике. Соединения FODMAP включают фруктаны (в том числе FOS), галактаны (особенно GOS) и полиолы. Лактозу и избыточную фруктозу также можно рассматривать как соединения FODMAP в случае людей с нарушением переваривания или всасывания этих соединений.
Типичные источники фруктанов включают, например, пшеницу, рожь, лук, топинамбур и чеснок. Ниже приведены некоторые примеры содержания фруктана в зерновых: рожь (отруби) 7% (в пересчете на зерновой материал), рожь (зерно) 3-7% и пшеничная мука 1-4%. Хотя пшеницу, как правило, не считают особенно богатой соединениями FODMAP, ее относительно высокое потребление делает ее значимым источником фруктанов. Вследствие этого руководства по диете FODMAP предписывают избегать потребления пшеницы. Потребление ржи является высоким в Северной Европе. Ржаной хлеб содержит больше соединений FODMAP по сравнению с пшеничным хлебом, потому что цельнозерновая рожь содержит больше фруктанов, чем пшеничная мука.
Фруктаны состоят из остатков фруктозы, обычно с одной концевой группой сахарозы (то есть дисахаридом глюкоза-фруктоза). Тип фруктана определяет положение связи между остатками фруктозы. Основные типы фруктанов с одной связью - инулин и леван (или флеин). Кроме того, существует фруктан со смешанной связью, называемый граминаном.
В уровне техники существуют источники, относящиеся к содержанию фруктана в хлебе. В статье Andersson et al. (2009) было показано, что ферментированный дрожжами хлеб, и особенно хлеб на закваске имеет более низкое содержание фруктана по сравнению с цельнозерновой ржаной мукой. Результаты Andersson et al. показывают, что содержание фруктана в цельнозерновой ржи может быть уменьшено с 5,0% до 1,9% с помощью закваски (снижение на 62%) и до 3,4% с помощью дрожжевой ферментации (снижение на 32%). Указанные результаты также показывают, что фруктаны разрушаются в процессе производства хлеба, что приводит к снижению содержания общего и экстрагируемого пищевого волокна в хлебе.
В статье Rakha et al. (2010) раскрыто, что во время производства хлеба массовая доля низкомолекулярного фруктана наиболее доступна для расщепления дрожжами или эндогенными ферментами, присутствующими в ингредиентах. Согласно Rakha et al., содержание фруктана во фракциях ржаного помола находится в диапазоне от 3,4% во внутреннем эндосперме до 5,0% в отрубях. Содержание фруктана в ржаном хлебе варьировало от 1,9% до 4,0%, при этом среднее значение в хрустящих хлебцах составляло 2,8%, а наиболее высоким было содержание фруктана в образце, содержавшем только ржаную цельнозерновую муку.
Тесто согласно заявке на патент США 2011/0129572 А1 содержит по меньшей мере один фруктозосодержащий полисахарид и по меньшей мере один фермент, способный расщеплять указанный полисахарид на короткоцепочечные фруктоолигосахариды (FOS) и фруктозу. Указано, что выпеченное изделие, полученное из этого теста, имеет повышенную мягкость по сравнению с идентичными в остальном отношении представляющими собой контроль хлебом или выпеченным изделием, полученными из теста, которое не содержит указанного фермента.
Открытие, относящееся к снижению количества фруктана в растительном материале согласно заявке на патент ЕР 1084624 А2, заключается в том, что хотя обычно штаммы Lactobacillus не расщепляют фруктан, существуют штаммы Lactobacillus, которые обладают этим свойством. Согласно ЕР 1084624 А2, указанные штаммы представляют собой предпочтительно Lactobacillus paracasei и Lactobacillus plantarum.
et al (1994) изучали ферментацию фруктанов эпифитными молочнокислыми бактериями. Штаммы эпифитных молочнокислых бактерий выделили из кормовых трав и изучили их способность гидролизовать фруктаны. Только 16 из 712 штаммов утилизировали фруктаны. Указанные штаммы идентифицировали как Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus brevis и Pediococcus pentosaceus.
Как можно заметить из вышесказанного, в настоящее время известны и используются некоторые техники изменения содержания фруктана. Кроме того, известно, что в кислом хлебе содержание фруктана от природы ниже. Эти техники снижения содержания фруктана обычно основаны на использовании ферментации или особых ферментов, расщепляющих фруктан.
В данной области техники известно несколько ферментов, расщепляющих фруктан. Семейство гликозидгидролаз GH32 содержит инвертазы, а также ферменты, которые гидролизуют фруктозосодержащие полисахариды, такие как инулиназы, экзо-инулиназы, леваназы и β-2,6-фруктан 6-леванбиогидролазы, фруктан β-(2,1)-фруктозидаза/1-экзогидролазы или β-(2,6)-фруктозидаза/6-экзогидролазы фруктана, а также ферменты, проявляющие трансгликозилирующую активность, такие как сахароза : сахароза 1-фруктозилтрансферазы, фруктан : фруктан 1-фруктозилтрансферазы, сахароза : фруктан 6-фруктозилтрансферазы, фруктан : фруктан 6G-фруктозилтрансферазы и фруктозилтрансферазы левана.
Внеклеточные ферменты, такие как инулиназа, которые гидролизуют фруктаны, экстрагированы, например, из Aspergillus niger и имеются в продаже. Эти внеклеточные ферменты представляют собой встречающиеся в природе ферменты, которые выделены или экстрагированы из своей естественной среды. Однако эти внеклеточные ферменты с фруктаназной активностью дороги, и их сложно получить в достаточном количестве и с высокой чистотой для крупномасштабных применений.
Например,  et al (2002) исследовали очистку и характеристики внеклеточной фруктан-β-фруктозидазы из штамма Lactobacillus pentosus, выделенного из ферментированной рыбы.  et al (1997) исследовали внеклеточную фруктангидролазу из Lactobacillus paracasei ssp. paracasei P 4134, a Goh et al (2007) описали фруктангидролазу из Lactobacillus paracasei 1195. В документе WO 2010/097416 A1 описан рекомбинантный белок с активностью фруктаназы, включающий фрагмент встречающегося в природе белка, полученного из молочнокислых бактерий, таких как Lactobacillus.
Кроме того, при использовании известных ферментов, расщепляющих фруктан, таких как эндофруктаназа, инулиназа или леваназа, существует вероятность того, что в качестве продуктов расщепления образуются фруктоолигосахариды (FOS), поскольку благодаря этому не весь фруктан превращается в фруктозу. Следовательно, все еще существует потребность в специфичном ферменте, расщепляющем фруктан (фруктаназа, фруктангидролаза), который способен эффективно расщеплять фруктаны без образования FOS.
FOS представляют собой углеводы, которые человеческий организм не может полностью усваивать, и которые таким образом могут функционировать как пребиотики. Предполагают, что у FOS есть несколько положительных эффектов. Например, они могут производить вещества, которые останавливают рост вредных, токсичных грам-отрицательных и грам-положительных бактерий в кишечнике. Однако, согласно имеющимся в настоящее время научным данным, FOS могут отвечать за некоторые негативные эффекты. FOS могут вызвать, например, вздутие живота, метеоризм, абдоминальный и кишечный дискомфорт и отрыжку. Кроме того, показано, что люди с непереносимостью лактозы особенно страдают от указанных побочных эффектов. Причиной этих симптомов может быть то, что FOS, как правило, более активны в желудочно-кишечном тракте, чем полимер фруктана, поскольку кишечная микрофлора расщепляет их быстрее. Кроме того, фруктозу также можно рассматривать как FODMAP-соединение, если речь идет о людях с нарушением всасывания фруктозы. Это становится проблемой, если в пищевом продукте или порции пищи не содержится соответствующего количества глюкозы. Это связано с тем, что всасывание фруктозы в организме человека происходит параллельно с индуцируемой глюкозой системой поглощения. Однако проблему избытка концентрации фруктозы (по сравнению с концентрацией глюкозы) легко решить с помощью рецептуры пищевых продуктов или состава порции пищи.
В данной области техники по-прежнему необходимы зерновые и овощные материалы, которые по существу не содержат фруктанов и FOS и, следовательно, могут использоваться для приготовления продуктов, подходящих для диет с низким содержанием FODMAP. В данной области техники также по-прежнему необходим эффективный способ и средства для удаления фруктана из зернового и овощного материала, который не приведет к получению нежелательных продуктов расщепления, в особенности FOS. Следовательно, способ и средства, которые могут обеспечить эффективное удаление фруктана, были бы очень полезны при разработке пищевых продуктов, подходящих для диеты с низким содержанием FODMAP. Потребление этих пищевых продуктов не вызвало бы проблем с желудочно-кишечным трактом. Указанные пищевые продукты даже могли бы оказывать положительное влияние на здоровье желудочно-кишечного тракта и тем самым на общее самочувствие.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение определено признаками независимых пунктов формулы изобретения. Некоторые конкретные варианты реализации определены в зависимых пунктах формулы изобретения.
Настоящее изобретение основано на открытии, что новый фермент, выделенный из штамма Lactobacillus, способен эффективно расщеплять и удалять фруктан из зерновых и овощных материалов.
Согласно первому аспекту настоящего изобретения, предложена конструкция ДНК, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую внеклеточную фруктаназу, при этом указанная нуклеотидная последовательность содержит последовательность нуклеотидов SEQ ID No. 1 или аналогичную ей последовательность, обладающую по меньшей мере 96% идентичностью с нуклеотидной последовательностью SEQ ID No. 1.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен фермент, проявляющий активность фруктангидролазы, при этом указанный фермент содержит полипептид, имеющий аминокислотную последовательность по существу соответствующую SEQ ID No. 2.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий вышеупомянутую конструкцию ДНК, а также клетка, содержащая указанный рекомбинантный вектор экспрессии.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения фермента, проявляющего активность фруктангидролазы, который включает культивирование клетки, как определено выше, в условиях, обеспечивающих возможность продуцирования фермента и выделение указанного фермента из культуры.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен фермент, проявляющий активность фруктангидролазы, который кодирует конструкцию ДНК, как определено выше, или получен определенным выше способом.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено получение фермента для расщепления фруктана, при этом указанное получение включает фермент согласно настоящему изобретению.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение фермента или ферментного препарата согласно настоящему изобретению для расщепления фруктана в зерновых материалах или в овощах.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение фермента или ферментного препарата согласно настоящему изобретению для изготовления выпеченных изделий или получения овощей с низким содержанием фруктана.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложен премикс для выпечки, содержащий фермент или ферментный препарат согласно настоящему изобретению, совместно с одним или более ингредиентами, необходимыми или подходящими для выпечки.
Еще один аспект изобретения представляет собой улучшитель для выпечки, содержащий фермент или ферментный препарат согласно настоящему изобретению, совместно с одним или несколькими ингредиентами из группы, состоящей из ферментов, пшеничного глютена, наполнителей (пшеничный глютен, мальтодекстрин и т.д.), эмульгаторов, таких как, но не ограничиваясь перечисленным, DATEM, и моно- и диглицеридов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На Фигуре 1 показано процентное содержание остаточного фруктана, где способность фермента расщеплять два инулина разной длины, соединения FOS и экстракт ржаной муки исследовали как функцию от времени. Во всех реакциях соотношение фермент/субстрат составляло приблизительно 2.
На Фигуре 2 показано количество субстрата, расщепленного ферментом, на единицу активности фермента.
Фигура 3 иллюстрирует количество образовавшейся фруктозы.
На Фигуре 4 показаны результаты гель-фильтрационной хроматографии для инулина (DPav=12) и продуктов его распада. Образцы отбирали после времени реакции 30 минут, 60 минут и 120 минут. Во всех образцах фоновый сигнал, вызванный ферментом, был снижен.
На Фигуре 5 показаны результаты гель-фильтрационной хроматографии для инулина (DPav=12) и продуктов его распада. Образцы отбирали после времени реакции 30 минут, 60 минут и 120 минут. Во всех образцах фоновый сигнал, вызванный ферментом, был снижен.
На Фигуре 6 показаны концентрации фруктана в пшеничном тесте в течение двух часов подъема. На фигуре также показана расчетная концентрация фруктана в начале подъема на основе измеренного содержания фруктана в пшеничной муке.
Фигура 7 иллюстрирует изменение концентраций фруктана в ржаном тесте в течение двух часов подъема. На фигуре также показаны теоретические концентрации фруктана в начале подъема с учетом и без учета фруктана в стартовой заквасочной культуре.
Фигура 8 иллюстрирует концентрации фруктозы в пшеничном тесте в начале и в конце подъема.
Фигура 9 иллюстрирует концентрации фруктозы в ржаном тесте в начале и в конце подъема.
На Фигуре 10 показан внешний вид выпеченного хлеба с добавлением фермента и без него. Контрольный хлеб слева, ферментированный хлеб справа.
На Фигуре 11 показан процент остаточного фруктана, при этом способность фермента расщеплять чеснок и топинамбур исследовали как функцию от времени.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем контексте термин «аналогичный», используемый для определения конструкции ДНК согласно настоящему изобретению, понимают как включающий любую последовательность ДНК, которая кодирует фермент с активностью фруктаназы, и которая является по меньшей мере на 96% гомологичной или имеет по меньшей мере 96% идентичность с последовательностью ДНК SEQ ID No. 1. Аналогичная последовательность ДНК может, например, быть выделена из другого организма или может быть получена на основе последовательности ДНК SEQ ID No. 1, например, путем введения нуклеотидных замен, которые не приводят к другой аминокислотной последовательности фермента. Другими примерами возможных модификаций являются вставка одного или более нуклеотидов в последовательность, добавление одного или более нуклеотидов на любом конце последовательности или делеция одного или более нуклеотидов на любом конце или внутри последовательности.
В настоящем изобретении предложен новый фермент, который способен эффективно расщеплять фруктаны. Фермент выделили и идентифицировали из штамма Lactobacillus, обладающего расщепляющей фруктан активностью. Более определенно, новый штамм, вырабатывающий внеклеточную фруктаназу, идентифицировали как Lactobacillus crispatus. Образец указанного микроорганизма был депонирован в Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen ГмбХ (DSM) под номером доступа DSM 29598.
Штаммы Lactobacillus, обладающие активностью в отношении расщепления фруктана, выделяли из закваски, полученной путем повторного использования закваски из предыдущей партии (back-slopping). Закваску изготовляли из зернового материала, имеющего низкое содержание расщепленного крахмала, как описано в находящейся одновременно на рассмотрении заявке PCT/ FI2016/050011.
Вкратце, закваску изготовляли с применением повторного использования закваски из предыдущей партии. Повторное использования закваски из предыдущей партии означает, что небольшие количества теста от производства ферментированного продукта из предыдущей партии используют как инокулят или закваску для производства следующей серии. При изготовлении закваски применяли зерновой материал с низким содержанием, предпочтительно менее 1,0% (в пересчете на зерно), расщепленного крахмала. Зерновой материал замачивали в жидкости, предпочтительно в воде, и инкубировали при 20-50°С в течение 4-72 часов. На следующий день свежую партию зернового материала и жидкости, предпочтительно воды, смешивали, как указано выше, и инокулировали 1-10% предварительно инкубированной смеси. Указанный процесс повторного использования закваски из предыдущей партии выполняют несколько раз, предпочтительно по меньшей мере 3-6 раз, и его можно продолжать так долго, как необходимо.
Результатом повторного использования закваски из предыдущей партии, начатого с зернового материала, имевшего низкое содержание расщепленного крахмала, стало образование самопроизвольной микрофлоры, которая содержит бактерии, способные эффективно использовать фруктаны в качестве источника углеводов и количественно потреблять (и таким образом удалять) фруктаны из зернового сырья. Адаптированная микрофлора имела способность гидролизировать фруктан и дополнительно использовать для роста возможные продукты расщепления и метаболиты (фруктозу, FOS, маннитол). Флора может также иметь транспортную систему для фруктанов или их продуктов гидролиза или метаболитов.
Из закваски, приготовленной, как указано выше, в чистые культуры были выделены бактериальные колонии с различной морфологией (по внешнему виду). Бактерии в колониях анализировали по их эффективности в отношении удалении фруктана из зернового материала, используя их как чистые инокуляты культур в лабораторных ферментациях.
Один изолят, эффективно удаляющий фруктан, секвенировали и идентифицировали как Lactobacillus crispatus (DSM 29598). Из указанного штамма выделили и идентифицировали новый фермент согласно настоящему изобретению, внеклеточную фруктозидазу и члена семейства гликозилгидролаз 32. Ожидают, что подобным образом, посредством скрининга штамма другого микроорганизма, предпочтительно Lactobacillus, который выделен из закваски, приготовленной, как описано выше, можно получить последовательность ДНК, кодирующую гомологичный фермент, т.е. аналогичную последовательность ДНК. Примеры таких штаммов Lactobacillus включают, в числе прочего, другие штаммы Lactobacillus crispatus, а также штаммы Lactobacillus helveticus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus ultunensis, Lactobacillus amylolyticus, Lactobacillus amylovorans, Lactobacillus sobrius или Lactobacillus acidophilus.
Обнаружили, что белок, представляющий собой фермент, выделенный из Lactobacillus crispatus, на 95% идентичен соответствующим белкам в другой Lactobacillus crispatus, и на 94% и 93% идентичен соответствующим белкам в L. amylovorus. Биохимически ни один из указанных ферментов Lactobacillus не охарактеризован. Ранее была охарактеризована фруктангидролаза в L. paracasei (Goh et al 2007), но не гомологи фруктангидролазы L. crispatus, описанные в настоящей заявке. Белок имеет предсказанный sec-зависимый сигнальный пептид (VKA-DT) и является внеклеточным белком.
Новый фермент согласно настоящему изобретению работает в широком диапазоне температур и демонстрирует относительно высокую активность в диапазоне 30-60°С. Оптимальная температура для гидролиза фруктана составляет приблизительно 50°С (100% активность), а активность при 30°С и 60°С составляет 80%. Фермент проявляет 60% активность при 65°С и 50% активность при 20°С. Фермент проявляет высокую активность при рН в диапазоне 4-6. Он демонстрирует максимальную активность при рН 5,0 и очень высокую активность (>95%) при значениях рН 4,5 и 5,5. При значениях рН 4,0 и 6,0 активность составляет 75-80% от максимальной.
Вышеупомянутые свойства показывают, что фермент согласно настоящему изобретению является стабильным и активным в широком диапазоне температур и рН. Указанные свойства делают фермент согласно настоящему изобретению в особенности подходящим для применения в приготовлении зерновых и овощных материалов с низким содержанием фруктана, а также зерновых и овощных материалов с низким содержанием фруктана, которые подходят, например, для диеты с низким содержанием FODMAP.
Понятно, что конструкция ДНК согласно настоящему изобретению включает любую последовательность ДНК, которая кодирует фермент с активностью фруктаназы и которая имеет по меньшей мере 96%, предпочтительно по меньшей мере 97%, даже более предпочтительно по меньшей мере 98% и еще более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью ДНК SEQ ID No. 1. Таким образом, предполагается, что в объем настоящего изобретения включены любые изменения в кодирующем фруктаназу участке, которые приводят либо к получению той же самой аминокислотной последовательности, либо к аминокислотной последовательности, которая, вне зависимости от одного или более отклонений от исходной аминокислотной последовательности, соответствует ферменту, по существу имеющему фруктаназную активность.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен рекомбинантный вектор экспрессии, который содержит конструкцию ДНК, определенную выше. В еще одном дополнительном аспекте клетка-хозяин трансформирована рекомбинантным вектором экспрессии, определенным выше. Клетка-хозяин может представлять собой, например, бактерию, такую как штамм Escherichia coli, или дрожжи, такие как Pichia pastoris.
Настоящее изобретение охватывает фермент независимо от того, как он был получен, например, технологией рекомбинантной ДНК, методом химического синтеза, ферментным расщеплением или их комбинацией. Кроме того, настоящее изобретение не только включает фермент как таковой, но также в форме гибридного белка или белка, физически или химически связанного с любым веществом и имеющего фруктаназную активность.
Другим аспектом настоящего изобретения является способ получения фермента, демонстрирующего фруктаназную активность, включая экспрессию в подходящем хозяине ДНК, как определено в настоящем документе, которая кодирует фермент фруктаназу. Как указано выше, экспрессия может осуществляться в различных клетках-хозяинах, среди которых предпочтительной является Pichia pastoris. Настоящее изобретение также включает способ, как определено выше, в котором полученный фермент фруктаназу выделяют из культуральной среды.
Объектом настоящего изобретения также является ферментный препарат или улучшитель, содержащий фермент согласно настоящему изобретению, совместно с носителями и/или эмульгаторами. Носители могут включать, например, пшеничный глютен, мальтодекстрин и так далее. Подходящие эмульгаторы включают эмульгаторы, известные специалистам в данной области техники, такие как, например, DATEM.
Ферментный препарат может быть приготовлен согласно способам, известным в данной области техники, и он может быть в виде жидкого или сухого препарата. Например, ферментный препарат может быть в форме гранулята или микрогранулята. Фермент, который вводят в препарат, можно стабилизировать в соответствии со способами, известными в данной области техники.
В дополнение к ферменту согласно изобретению, ферментный препарат может также содержать один или несколько ферментов, обладающих гидролазной активностью. Ферменты, обладающие гидролазной активностью, могут высвобождать, например, глюкозу или мальтозу. Такие ферменты включают, например, α-глюкозидазу (высвобождающую глюкозу из крахмала/мальтодекстрина) и β-глюкозидазу (высвобождающую глюкозу из β-глюкана), инвертазу (высвобождающую глюкозу из сахарозы) и амилолитические ферменты (высвобождающие мальтозу из крахмала). Преимущество наличия в составе продукта глюкозы и фруктозы состоит в том, что поглощение фруктозы из тонкой кишки улучшается, когда глюкоза присутствует в равных или более высоких количествах по сравнению с фруктозой. Другое преимущество заключается в достижении сбалансированного сладкого вкуса; хотя фруктоза слаще, чем глюкоза или мальтоза или сахароза, ее сочетание с глюкозой, например, создает сладость, которая воспринимается более полно в своем профиле сладкого вкуса. Таким образом, высвобождение сахаров (глюкозы, фруктозы, мальтозы) от сырья или ингредиентов во время производства пищевых продуктов увеличивает «естественную» сладость и тем самым уменьшает необходимость включения дополнительного сахара в состав продуктов.
Новый фермент и новый ферментный препарат согласно настоящему изобретению можно использовать при расщеплении фруктана зерновых материалов или овощей. Подходящие зерновые материалы включают, без ограничения, пшеницу, рожь, ячмень и их смеси. Смесь может содержать все три упомянутых зерновых материала или сочетание любых двух из них. Подходящие овощные материалы включают все овощи, которые содержат фруктан (например, инулин). Примеры таких овощей включают лук, чеснок, топинамбур, корень цикория и т.д.
Дозировка нового фермента и нового ферментного препарата, необходимая для расщепления фруктана в определенном материале, зависит от активности фермента, количества фруктана в материале и условий, при которых используют фермент или препарат, и ее можно определить на основе способов, известных в данной области техники. Например, при уровне активности приблизительно 500 ед./г можно использовать соотношение фермент/субстрат в диапазоне от 2:1 до 3:1, предпочтительно приблизительно 2,5:1. При выпечке необходимое количество фермента естественным образом зависит от количества фруктана в используемой муке. В случае пшеницы достаточным может быть 0,1% фермента в пересчете на массу пшеничной муки. В случае ржи количество фермента предпочтительно составляет более 0,5% в пересчете на массу ржаной муки.
Таким образом, новый фермент можно использовать при изготовлении выпеченных изделий, где, как было установлено, он эффективно снижает содержание фруктана. В лабораторных условиях соединения FOS были почти полностью расщеплены за счет применения фермента. В экстракте ржи новый фермент обеспечил расщепление более 70 или 80% фруктана в экстракте ржи.
При использовании в выпечке новый фермент снижал содержание фруктана в ржаном и пшеничном тесте приблизительно до нуля к концу поднятия теста. В то же время количество фруктозы возросло по сравнению с тестом в контроле без фермента.
Новый фермент также можно использовать при приготовлении овощей с низким содержанием фруктана, где обнаружено, что указанный фермент расщепляет приблизительно 60% или более исходного содержания фруктов в овощах.
Таким образом, с новым ферментом или новым ферментным препаратом можно получать пшеничные, ржаные, ячменные и овощные материалы и продукты, которые по существу не содержат фруктана и, следовательно, подходят для определенной диеты, такой как диета с низким содержанием FODMAP.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является премикс для выпечки, содержащий новый фермент согласно изобретению или ферментный препарат согласно настоящему изобретению. Без ограничения, премиксы обычно включают в себя цельную, измельченную или размолотую пшеницу, другие зерновые, бобовые, орехи и семена, а также носители, волокна и гидрофильные вещества, такие как, в числе прочего, мальтодекстрины, целлюлозы, пектины, белковые концентраты (глютен и т.д.). Премиксы могут включать или не включать улучшители хлеба/теста и/или их составляющие.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является улучшитель для выпечки, содержащий фермент или ферментный препарат согласно настоящему изобретению, совместно с одним или несколькими ингредиентами из группы, состоящей из ферментов, пшеничного глютена, наполнителей (пшеничный глютен, мальтодекстрин и т.д.), эмульгаторов, таких как, но не ограничиваясь перечисленным, DATEM, и моно- и диглицеридов.
Фермент также можно использовать для высвобождения фруктозы из фруктана. Его можно использовать совместно с другими ферментами, например, гидролазами, которые высвобождают глюкозу или мальтозу из сахарозы, глюканами в виде крахмала или бета-глюкана, или мальтодекстрином. Ферменты, которые могут высвобождать глюкозу из описанных субстратов, включают инвертазы, амилолитические ферменты, альфа-глюкозидазы и бета-глюкозидазы. Высвобождение фруктозы и/или глюкозы позволяет уменьшить количество добавляемого сахара, которое необходимо для обеспечения желаемой сладости рассматриваемого продукта.
По меньшей мере некоторые варианты реализации настоящего изобретения находят промышленное применение в пищевой промышленности, в частности, в выпечке и при приготовлении овощей с низким содержанием FODMAP. Кроме того, специфичное высвобождение фруктозы также находит промышленное применение в пищевой промышленности.
Фермент согласно настоящему изобретению, очевидно, также можно применять вне пищевой промышленности. Например, фермент можно использовать при производстве биотоплива для высвобождения фруктозы из материалов, содержащих фруктан, или при производстве кормов для предварительной обработки кормов для животных с целью уменьшения количества фруктана и, тем самым, улучшения переваривания и пищевой ценности корма. Например, лошади могут страдать от воспаления копыта, причиной которого, как предполагают, является корм, содержащий зерно или траву с высоким содержанием неусваиваемых углеводов, например, фруктана. Это приводит к избыточной ферментации в кишечнике, которая, как считают, вызывает заболевание. Фермент можно также применять в качестве фермента для пищеварения в биологически активных добавках подобно ферменту лактазе, добавляемому для улучшения переваривания лактозы. Фермент также можно использовать в стоматологическом уходе для уменьшения количества зубного налета. Известно, что фруктаны играют роль в формировании биопленки зубного налета, и что применение фруктаназы может уменьшить количество зубного налета.
Несмотря на то, что приведенные примеры иллюстрируют принципы настоящего изобретения в одном или нескольких конкретных применениях, специалистам в данной области техники понятно, что многочисленные модификации формы, применения и деталей реализации можно сделать без приложения изобретательских усилий и без отступления от принципов и сущности изобретения. Соответственно, предполагается, что объем настоящего изобретения не ограничен каким-либо образом, кроме как прилагаемой формулой изобретения.
Глаголы «содержать» и «включать» использованы в данном документе как открытые ограничения, которые не исключают и не требуют наличия не перечисленных признаков. Признаки, перечисленные в зависимых пунктах формулы изобретения, могут быть свободно комбинированы, если явно не указано иное. Кроме того, следует понимать, что использование формы единственного числа в данном документе не исключает множественного числа.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение исходной закваски и выделение чистых культур
Исходную закваску получали из молотых зерен ржи без существовавшей ранее закваски. Использованные в примере молотые зерна содержат 0,2% разрушенного крахмала.
100 г молотых зерен замачивали в 150 г воды и инкубировали при 45°С. Через 24 часа 10 г вышеуказанной смеси смешивали с 100 г молотых зерен ржи и 150 г воды и инкубировали при 45°С в течение 24 часов. Это повторное использование закваски из предыдущей партии повторяли еще пять раз.
9
Из закваски, приготовленной, как указано выше, в чистые культуры выделяли бактериальные колонии с различной морфологией (по внешнему виду). Бактерии в колониях анализировали по их эффективности в отношении удалении фруктана из зернового материала, используя их как чистые инокуляты культур в лабораторных ферментациях. В каждой реакции ферментации 20 г молотых зерен ржи смешивали с 30 г водопроводной воды и 500 мг чистой суспензии стартовой культуры, содержащей 10 клеток микробного изолята. После 16 часов ферментации при 37°С содержание фруктана в смесях анализировали с помощью коммерческого набора (K-FRUC, Megazyme). Исходное содержание фруктана в зерновом материале составляло 5% (в пересчете на сухое вещество).
Один изолят, эффективно удаляющий фруктан, идентифицировали как Lactobacillus crispatus.
Пример 2. Идентификация фруктангидролазы из L. crispatus (DSM 29598)
Выделение и секвенирование геномной ДНК: Геномную ДНК выделяли с использованием набора для очистки геномной ДНК Wizard  (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Качество и количество каждого образца оценивали с помощью гель-электрофореза и спектрофотометра NanoDrop. Образцы были отправлены в Axeq Technologies (Сеул, Южная Корея), где они прошли дальнейшие проверки качества и были использованы для секвенирования генома.
Полногеномное секвенирование, сборка и аннотация: Образцы секвенировали с помощью Illumina HiSeq2000 с> 500-кратным покрытием, а качество парно-концевых прочтений оценивали с использованием инструмента FastQC, поставляемого в комплекте программного обеспечения Galaxy. Прочтения были собраны de novo с помощью ABySS (Assembly By Short Sequence); в контиги с использованием значения k-mer 63. Повторяющиеся последовательности и короткие сборки удаляли путем фильтрации контигов размером <500 пар оснований. В результате секвенирования было получено 103 контига.
Эволюционная история была выведена с помощью метода максимального правдоподобия, основанного на матричной модели JTT. Дерево построено в масштабе, длина ветвей измерена по количеству замен на участок. Эволюционные анализы провели в MEGA6.
В результате идентифицировали внеклеточную фруктозидазу, члена семейства гликозилгидролаз 32. Белок фермента более чем на 93% идентичен соответствующим белкам в L. amylovorus, на 56% идентичен фруктангидролазе в Atobobium parvulum и более чем на 55% идентичен фруктангидролазам в S. mutans. Белок имеет предсказанный sec-зависимый сигнальный пептид (VKA-DT) и, таким образом, по всей вероятности представляет собой внеклеточный белок. Филогенетический анализ показал, что в Lactobacillus spp. присутствует небольшое число гомологов, ни один из них не охарактеризован с точки зрения биохимии. Фруктангидролаза в L. paracasei, описанная ранее, не гомологична фруктангидролазе исследуемой в данной работе L. crispatus.
Пример 3. Получение фермента
Фермент получали в Pichia pastoris, метилотрофных дрожжах, которые широко используют для внеклеточной экспрессии рекомбинантных белков с помощью стандартных процедур рекомбинантной ДНК. Стандартные способы получения фермента применяли, по существу, как описано в Maniatis 1989, Molecular Cloning, CSH, NY, USA.
Пример 4. Ферментативные реакции
Расщепление фруктана
Способность фермента расщеплять фруктан исследовали с помощью двух инулинов разной длины (инулин HP (DPav=25) и инулин GR (DPav=12)), с помощью соединений FOS и с помощью экстракта ржаной муки. Для ферментативной реакции приготовляли раствор фермента с концентрацией 10 мг/мл и раствор субстрата с концентрацией 4 мг/мл. Для изготовления обоих растворов использовали 0,1 М натрий-ацетатный буфер (рН 4,5). В реакционную смесь переносили по 0,5 мл каждого раствора. Если в качестве субстрата использовали экстракт ржи, концентрации были вдвое меньше. Ферментативную реакцию проводили при 50°С, а время реакции составляло 2 часа. Образцы отбирали через 60 минут и через 120 минут. В качестве стандарта использовали раствор, в котором раствор фермента заменяли 0,5 мл 0,1 М натрий-ацетатного буфера (рН 4,5). Реакции останавливали, помещая образцы на 5 минут в кипящую водяную баню, а затем их оставляли на 5 минут в холодной водяной бане. Перед определением концентраций фруктана образцы оставляли на приблизительно 10 минут при комнатной температуре. Их разбавляли деионизированной водой, чтобы максимальная концентрация фруктана составляла 1 мг/мл. Количество фруктана, расщепленного ферментом, определяли путем вычитания количества фруктана в реакционной смеси из количества фруктана в стандартном растворе.
В реакциях использовали соединение фермента, заявленная активность которого составляла 516,6 ед/г. Соотношение фермент/субстрат в реакциях было приблизительно 2. На Фигуре 1 показан процент оставшегося остаточного фруктана в зависимости от начальной концентрации. На диаграмме показано, что фермент расщепляет в основном соединения FOS, тогда как инулин, имеющий более длинную цепь, подвержен расщеплению в меньшей степени. Через два часа оставалось 68,5% более длинного инулина, при этом соединений FOS оставалось лишь 3,0%. Более короткий инулин и экстракт ржи в процентном отношении подверглись расщеплению примерно одинаково (фруктана не было в 25,3% инулина и 27,1% экстракта ржи).
Поскольку соотношения фермент/субстрат незначительно различались в каждом субстрате, количество субстрата, расщепляемого ферментом, рассчитывали также на единицу активности фермента (Фиг. 2). Наибольшее расщепление обнаружили у соединений FOS, а наименьшее расщепление - у более короткого инулина. Скорость расщепления соединений FOS в течение двух часов составляла 0,654 мг/ед., а инулина - 0,25 мг/ед. Фруктан из экстракта ржи имел более высокую скорость расщепления относительно количества фермента, чем более короткий инулин (рожь 0,598 мг/ед., а инулин 0,541 мг/ед.).
Обе диаграммы показывают, что фермент в течение первого часа расщепляет субстраты с более высокой скоростью, а потом скорость расщепления уменьшается.
Образование фруктозы
В дополнение к концентрациям фруктана, в реакциях измеряли также концентрации фруктозы через 60 минут и 120 минут времени реакции. На Фигуре 3 показано увеличение концентраций фруктозы в зависимости от времени. Образовавшаяся фруктоза показана на единицу активности фермента. Наибольшие количества фруктозы получили с экстрактом ржи и соединениями FOS в качестве субстратов. Из более короткого инулина за 2 часа получили 0,775 мг/ед. фруктозы. Наименьшее количество фруктозы получили, когда субстратом был более длинный инулин (0,431 мг/ед.). Если в качестве субстрата использовали экстракт ржи и соединения FOS, образование фруктозы через час было значительно ниже. Образование фруктозы из инулина находилось почти на одном уровне в течение двух часов. В образцах также анализировали содержание глюкозы и сахарозы, но эти соединения почти не образовывались в ходе реакций.
Степени гидролиза рассчитывали на основании образования в различных субстратах фруктозы. Соединения FOS были гидролизированы почти полностью (96,6%), что очень близко к значению, полученному при анализах фруктана. Кроме того, степени гидролиза более короткого инулина и экстракта ржи были очень близки к предполагаемой скорости расщепления, основанной на измерениях фруктана. Напротив, более длинный инулин гидролизировался значительно выше при расчете на основе концентраций фрукозы при этом степень гидролиза составляла 55,0% в пересчете на фруктозу и 31,5% в пересчете на фруктан.
Метод гидролиза
Для уточнения того, расщепляет ли первый фермент свой субстрат до соединений FOS или же высвобождает отдельные молекулы фруктозы с концов фруктановой цепи, использовали гель-фильтрационную хроматографию. В ходе реакций с инулином делали измерения, и определяли продукты разложения для образцов, взятых через 30 минут, 60 минут и 120 минут. Кроме того, определяли чистые образцы, содержавшие только субстрат. На Фигуре 4 показан подъем, связанный с более коротким инулином и продуктами его распада. Низкий пик через приблизительно 50 минут представляет инулин, а другие пики представляют продукты распада. Самый высокий пик на графике показывает фруктозу, и в ходе реакции также образуются соединения FOS. Исходя из молекулярной массы соединения FOS имеют от 2 до 3 единиц фруктозы.
На Фигуре 5 показан пик, связанный с более длинным инулином и продуктами его распада. При реакции образуются те же конечные продукты, что и при реакции с более коротким инулином. Однако в районе соединений FOS больше таких соединений FOS, длина которых составляет три единицы, чем тех, длина которых составляет две единицы. Более того, из графика ясно видно, что даже через два часа остается большое количество инулина.
Пример 5. Выпекание
Способность фермента расщеплять фруктан в процессе выпечки изучили путем добавления фермента в пшеничное и ржаное тесто. В Таблице 1 приведены основные рецепты пшеничного и ржаного теста. Количество фермента в пшеничном тесте составляло 0,175% в пересчете на массу пшеничной муки, а в ржаном тесте - 0,68% в пересчете на массу ржаной муки. Муку в стартовой заквасочной культуре при расчетах не учитывают. Помимо ферментированного теста/хлеба готовили контрольное тесто без добавления фермента.
Тесто готовили путем смешивания всех ингредиентов. Пшеничное тесто перемешивали в течение приблизительно 5 минут, а ржаное тесто до тех пор, пока ингредиенты не смешались. Фермент добавляли в воду перед другими ингредиентами. Тесту давали возможность подняться в течение двух часов при температуре 37°С. Образцы теста отбирали сразу после смешивания, после подъема в течение 30 минут, 60 минут и в конце подъема. Тесто выпекали в течение 20 мин при температуре 210°С. Последний образец отбирали из охлажденного хлеба. Все образцы замораживали и анализировали в них концентрацию фруктана и фруктозы. В образцах ржаного теста анализировали также концентрации маннита.
Концентрация фруктана в тесте
Концентрации фруктана в пшеничном тесте в течение двух часов подъема показаны на Фигуре 6. Концентрация фруктана в контрольном тесте составляли 0,43% в начале подъема и снижались до 0,23% в течение двух часов. В тесте с добавленным ферментом концентрация составляла 0,37% в начале подъема и 0,04% в конце подъема. В обоих тестах концентрации фруктана были ниже, чем ожидалось на основе концентрации фруктана в пшеничной муке.
На Фигуре 7 показано изменение концентраций фруктана в ржаном тесте в течение двух часов подъема. На Фигуре 7 также показаны теоретические концентрации фруктана в начале подъема с учетом и без учета фруктана в стартовой заквасочной культуре. В контрольном тесте концентрация фруктана составляла 1,6% в начале подъема и 1,3% в конце подъема. В тесте с добавленным ферментом концентрации составляли 1,0% в начале подъема и 0,08% в конце. На диаграмме также показано, что уже в начале подъема содержание фруктана в ферментированном тесте заметно меньше, чем в контрольном.
Концентрации фруктана в тесте
Концентрации фруктозы в тесте определяли в начале и в конце подъема. На Фигуре 8 показаны изменения концентрации фруктозы в пшеничном тесте через два часа. Неожиданным образом содержание фруктозы в контрольном тесте (0,64%) в начале подъема было выше, чем в ферментированном тесте (0,54%). Однако в течение двух часов концентрация в контрольного теста значительно снизилась по сравнению с ферментированным тестом, причем в контрольном тесте концентрации составляли 0,17%, а в ферментированном тесте - 0,38%.
В ржаном тесте концентрации фруктозы также оставались неизменными при сравнении концентраций в начале и в конце подъема (Фигура 9). Концентрации фруктозы в контрольном тесте в начале подъема составляли 0,30%, а в конце подъема - 0,32%. В ферментированном тесте концентрация фруктозы составляла 1,29% в начале подъема и 1,39% в конце подъема.
Выпеченный хлеб
Наконец, тесто выпекали и определяли концентрации фруктана и фруктозы в итоговом выпеченном хлебе. В ржаном хлебе определяли также концентрации маннита. Анализ маннита проводили по методу набора для анализа D-маннита/L-арабита. 1-2 г образцов взвешивали, а затем растворяли в воде при нагревании и перемешивании. Анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя. При обработке твердых образцов образцы не отфильтровывали после растворения в воде, но центрифугировали в течение 5 минут (5000 об/мин).
Результаты приведены в Таблице 2. В целом, уровни немного увеличились во время приготовления (испарение воды). Содержание фруктана в пшеничном хлебе, содержащем фермент, составляло 0,05%. Содержание фруктана в ржаном хлебе, содержащем фермент, составляло 0,15%. Концентрации маннита в ржаном хлебе была очень близки друг к другу. В частности, ржаной хлеб с ферментом содержал больше фруктозы, чем контрольный.
Выпеченный пшеничный и ржаной хлеб также подвергали сенсорной оценке. Оцениваемые свойства включали цвет корки, текстуру и мягкость хлеба, а также срок годности. Хлеб также взвешивали и измеряли по объему. Ферментированный хлеб практически не отличался от контрольного хлеба. Единственным обнаруженным отличием был цвет корки пшеничного хлеба. Корка на ферментированном хлебе была немного темнее, чем на контрольном (Фигура 11).
Пример 6. Обработка овощей
a) Чеснок
Чеснок содержал приблизительно 20 г фруктана/100 г (свежего веса). Четыре грамма чеснока измельчали и смешивали с 50 мл водопроводной воды. Добавляли фермент фруктаназу (1000 ед.) и суспензию инкубировали при 50°С в течение 5 часов. Образцы анализировали на временных точках 0 ч, 4 ч и 5 ч. Содержание фруктана снижалось в течение 4-5 часов инкубации, и остаточное содержание фруктана составляло 40% от содержания в пробе 0 ч (Фиг. 11).
b) Топинамбур
Топинамбур содержал приблизительно 12% фруктана/100 г (свежая масса). Восемь граммов топинамбура нарезали на мелкие кусочки и смешивали с 30 мл водопроводной воды. Добавляли фермент фруктаназу (1250 ед.) и смесь инкубировали при 50°С в течение 5 часов. Образцы анализировали на временных точках 0 ч, 1 ч, 2 ч, 3 ч, 4 ч и 5 ч. Содержание фруктана постоянно снижалось, и содержание остаточного фруктана после 5 ч инкубации составляло 32% (Фиг. 11).
Пример 7. Выпечка (смесь муки)
Фермент испытывали непосредственно в процессе выпекания теста для смешанного хлеба, содержащего смесь пшеничной, овсяной и ржаной муки. Ингредиенты (см. Таблицу 3) смешивали в течение 5 минут в смесителе для теста, и тесто оставляли на 20 минут.
Из теста сформировали лепешки, которые выдерживали в течение 45 мин при 40 выпекали в печи при 230°С в течение 15 мин и охлаждали при комнатной температуре. Содержание фруктана определяли после охлаждения. Содержание фруктана составляло 0,34% в контрольном хлебе и 0,17% в ферментированном хлебе.
ПЕРЕЧЕНЬ ЛИТЕРАТУРЫ
Патентная литература
ЕР 1084624 А2
US 20110129572 A1
WO 2010/097416 A1
Непатентная литература
Andersson, R., Fransson, G., Tietjen, M. &  P. (2009). Content and molecular-weight distribution of dietary fiber components in whole-grain rye flour and bread. Journal of Agricultural and Food Chemistry 57 (5), 2004-2008.
Goh YJ., Lee JH & Hutkins RW. (2007) Functional Analysis of the Fructooligosaccharide Utilization Operon in Lactobacillus paracasei 1195. Appl. Environ. Microbiol. 73 (18) 5716-5724.
, M. and Lier, D. (1994). Fermentation of fructans by epiphytic lactic acid bacteria. Journal of Applied Bacteriology 76 (4), 406-411.
, M. and Seyfarth, W. (1997). Purification and substrate specificity of an extracellular fructanhydrolase from Lactobacillus paracasei ssp. paracasei P 4134. New Phytol. 136, 89-96.
C., Gram L. & Rattray, F.P. (2002). Purification and Characterisation of an Extracellular Fructan β-fructosidase from a Lactobacillus pentosus Strain isolated from Fermented Fish. System. Appl. Microbiol. 25, 13-20.
Rakha A.,  P. & Andersson, R. (2010). Characterisation of dietary fibre components in rye products. Food Chemistry 119 (3), 859-867.