ИМПЛАНТАТЫ ДЛЯ ЗАМЕНЫ "НЕСУЩЕЙ НАГРУЗКУ" КОСТИ, ИМЕЮЩИЕ ИЕРАРХИЧЕСКИ ОРГАНИЗОВАННУЮ АРХИТЕКТУРУ, ПОЛУЧЕННЫЕ ПОСРЕДСТВОМ ПРЕВРАЩЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ СТРУКТУР
IMPLANTS FOR REPLACEMENT "LOAD-BEARING" BONES HAVING HIERARCHICALLY ORGANISED ARCHITECTURE OBTAINED THROUGH TRANSFORMATION OF PLANT STRUCTURES

Настоящее изобретение относится к биоморфному заменителю кости для замены и восстановления частей кости, подверженной механическим нагрузкам (несущей нагрузку).
Социальные и экономические последствия дегенеративных заболеваний, влияющих на костную ткань, приводят к необходимости разработки синтетических заменителей кости, которые способны проявлять улучшенные биофункциональные свойства, прежде всего в области ортопедии, где количество хирургических операций по реконструкции и восстановлению кости неуклонно растет и вовлекает все большее число молодых пациентов, которые по-прежнему активны. В связи с этим биомеханические свойства, необходимые для заменителя кости, особенно важны для того, чтобы он содействовал развитию и перестройке новой костной ткани при механических нагрузках, максимально сокращая использование способов фиксации и в то же время интегрируясь и резорбируясь в максимально возможной степени вновь образующейся костной тканью.
Выдающиеся и непревзойденные биомеханические свойства природной кости определенно являются следствием ее анизотропной структуры, которая организована иерархически в диапазоне масштабов от субмикрометра до макроскопических размеров, так что костная ткань может постоянно адаптироваться к изменениям механических нагрузок. На основе этих непрерывных и различных нагрузок кость перестраивается посредством механизмов в клетках, которые выступают в качестве датчиков изменения давления внеклеточной жидкости из-за механических раздражителей. Такие механизмы позволяют удалять поврежденную кость и заменять ее новой тканью, имеющей организованную и таким образом полностью функциональную структуру. Этот механизм имеет решающее значение для выживания костной ткани, подверженной механическим нагрузкам, и он может быть активирован только при наличии иерархически организованной структуры.
До сих пор не нашли оптимального решения для замены и восстановления частей кости, подверженной механическим нагрузкам (несущей нагрузку), так как не известны поддерживающие структуры для кости, которые биоактивны/биорезорбируемы, а также устойчивы к механическим нагрузкам, которым подвергаются определенные части костей тела, таких как длинные кости ноги или руки (например, плюсневая кость, бедренная кость, большеберцовая кость, плечевая и лучевая кости).
Этот недостаток можно преодолеть с помощью настоящего изобретения, которое предлагает заменитель кости для образования кости в общем, и в частности для восстановления частей кости, предпочтительно подвергаемой механической нагрузке (несущей нагрузку), как описано в прилагаемой формуле изобретения.
Заменитель кости согласно изобретению снабжен структурой, организованной в иерархическом порядке в трех пространственных измерениях. Заменитель кости получают из растительных структур, которые сами имеют иерархически организованную структуру и диапазон пористости, совместимый с требованиями, необходимыми для заменителя кости, то есть макропористость, позволяющую клеткам образовывать колонии и пролиферировать, и формировать соответствующее сосудистое дерево, соединенную с микропористостью, позволяющей обеспечивать обмен питательных жидкостей и жидкостей, которые содержат отходы клеточного метаболизма.
Такие растительные структуры превращают в неорганические биоактивные/биорезорбируемые материалы посредством соответствующих термических и химических способов, сохраняя их первоначальное строение и структуру. Эти устройства, которые по своей природе являются биоморфными (то есть, они детально воспроизводят структуру природного материала), предназначены для имитации в живом организме биомеханического поведения кости и благодаря их химическому составу, который хорошо воспроизводит состав природной кости, они способны вызывать такие же реакции на клеточном уровне, стимулируя формирование, пролиферацию и созревание новой костной ткани.
В то же время, заменитель кости согласно изобретению способен проявлять такое биомеханическое поведение, которое предоставляет возможность его использования для замены и восстановления частей кости, подверженной механическим нагрузкам (несущей нагрузку), такой как, например, длинные кости ног и рук. Заменитель кости согласно изобретению можно также использовать для замены и восстановления частей кости, которая не подвергается механическим нагрузкам. Собственно, заменитель можно адаптировать к любому необходимому восстановлению.
Изобретение детально описано здесь, также со ссылками на прилагаемые чертежи, где:
на Фиг.1 представлено схематическое изображение конкретного воплощения биоморфного заменителя кости согласно изобретению;
на Фиг.2 представлена блок-схема, которая иллюстрирует возможные воплощения изобретения биоморфного заменителя согласно изобретению;
на Фиг.3 показаны фотографии микроструктуры SiC (карбида кремния) после удаления избыточного кремния, сделанные в течение времени;
на Фиг.4 представлена фотография оболочки из SiC в соответствии с одним из воплощений изобретения, где оболочка имеет форму полого цилиндра;
на Фиг.5 показана прочность на сжатие нескольких образцов SiC;
на Фиг.6 представлена фотография оболочки из SiC до (слева) и после (справа) осаждения гидроксиапатитового (ГАП)/коллагенового композиционного покрытия;
на Фиг.7 показано ТЭМ-изображение, которое свидетельствует о зарождении нанометровых кристаллов ГАП на волокнах коллагена при электрофорезном осаждении;
-
-
на Фиг.8 показаны результаты рентгеновской фотоэмиссионной спектроскопии поверхности оболочек из SiC, где выделено образование СОО групп после воздействия кислоты; СОО группы способствуют координации ионов кальция в процессе нанесения покрытия посредством погружения в раствор, моделирующий состав межтканевой жидкости организма (SBF);
-
-
на Фиг.9 показаны результаты ИК-Фурье-спектроскопии поверхности оболочек из SiC, где выделено образование СОО групп после воздействия кислоты; СОО группы способствуют координации ионов кальция в процессе нанесения покрытия посредством погружения в раствор SBF;
на Фиг.10 представлена фотография микроструктуры оболочки из SiC, покрытой слоем биомиметических гидроксиапатитов, посредством погружения в раствор SBF (после того, как поверхность подвергли воздействию кислот, как указано на двух предыдущих чертежах);
на Фиг.11А показан завершенный заменитель кости согласно изобретению, в котором оболочка покрыта SiC, и сердечник представляет собой коллаген, минерализованный гидроксиапатитом, замещенным ионами карбоната и магния;
на Фиг.11В показан завершенный заменитель кости согласно изобретению, в котором оболочка покрыта SiC, а сердечник представляет собой биоморфный гидроксиапатит, замещенный карбонатом;
на Фиг.12 показана рентгенограмма биоморфного имплантата с серьезным дефектом в плюсневой кости овцы, с яркостным выделением остеоинтеграции оболочки из SiC;
на Фиг.13 показаны гистологические срезы биоморфного имплантата с серьезным дефектом в плюсневой кости овцы, с яркостным выделением остеоинтеграции оболочки из SiC;
на Фиг.14 показана микро-КТ биоморфного имплантата из ГАП, полученного из древесины ротанга, в губчатой кости в дистальном отделе бедренной кости кролика, с яркостным выделением идеальной остеоинтеграции поддерживающей структуры в примыкающую кость.
Авторы настоящей заявки на патент неожиданно обнаружили, что при инкапсуляции биоморфной поддерживающей структуры на основе гидроксиапатита (ГАП), полученной из древесины с высокой пористостью (или поддерживающей структуры на основе волокон коллагена и гидроксиапатита), в биоморфную оболочку на основе гидроксиапатита (ГАП) или карбида кремния (SiC), полученную из древесины с более низкой пористостью, получают такой заменитель кости, который имеет свойства механической прочности, а также характеристики биоактивности и/или биорезорбируемости. Заменитель кости, таким образом, можно использовать для замены и восстановления частей кости, подверженной механическим нагрузкам (несущей нагрузку), но также частей кости, не подверженной механическим нагрузкам. Такими частями кости являются длинные кости ноги и руки, например большеберцовая кость, плюсневая кость, бедренная кость, плечевая и лучевая кость.
Таким образом, заменитель кости согласно изобретению включает сердечник на основе гидроксиапатита (ГАП), полученный по меньшей мере из одного вида пористой древесины (или на основе коллагена и гидроксиапатита) и оболочку на основе гидроксиапатита (ГАП) или карбида кремния (SiC), полученную по меньшей мере из одного вида древесины, имеющей более низкую пористость, чем по меньшей мере один вид древесины сердечника.
Древесину, используемую для сердечника, можно определить как древесину с высокой пористостью, где под высокой пористостью понимают общую пористость от 60% до 95%, предпочтительно от 65% до 85%.
Предпочтительно древесина с высокой пористостью включает широкие поры, количество которых лежит в диапазоне между 35% и 70%, предпочтительно между 40% и 65% от общего количества пор. Такие поры предпочтительно имеют диаметр в диапазоне между 70 до 400 мкм, предпочтительно между 80 и 300 мкм. Примерами древесины с высокой пористостью являются ротанг, сосна, абачи и пробковое дерево.
Древесину, используемую для оболочки, можно определить как древесину с более низкой пористостью, где под более низкой пористостью понимают пористость от 20% до 60%, предпочтительно от 30% до 50%.
Примерами древесины с более низкой пористостью являются сипо, дуб, палисандр и кемпас.
Сердечник на основе коллагена и гидроксиапатита предпочтительно включает коллагеновые волокна, минерализованные биомиметическим гидроксиапатитом. Здесь и далее в настоящем описании биомиметическим гидроксиапатитом назван гидроксиапатит, частично замещенный ионами, способствующими стимуляции процессов восстановления кости, предпочтительно карбонатными, ионами магния, кремния и/или стронция, более предпочтительно, карбонатными и ионами магния или только карбонатными ионами.
Сердечник, выполненный из древесных структур с высокой пористостью или из коллагеновой структуры, минерализованной замещенным ионами ГАП, имитирует внутреннюю губчатую часть природной кости, в то время как оболочка, выполненная из древесины с более низкой пористостью и высокой механической прочностью, имитирует кортикальную часть кости.
В одном воплощении изобретения оболочка покрыта тонким слоем на основе гидроксиапатита (ГАП) и/или коллагена для того, чтобы улучшить клеточную адгезию и пролиферацию, и, таким образом остеоинтеграцию в окружающей костной ткани.
Указанный слой предпочтительно включает коллаген, минерализованный ГАП или ГАП, замещенным ионами, способствующими стимуляции процессов восстановления кости, предпочтительно, карбонатными ионами, ионами магния, кремния и/или стронция, более предпочтительно карбонатными (биомиметический ГАП) ионами.
3
4
2
Сердечник на основе гидроксиапатита, выполненный из древесины с высокой пористостью, предпочтительно включает гидроксиапатит, частично замещенный ионами, способствующими стимуляции процессов восстановления кости, предпочтительно, карбонатными ионами, ионами магния, кремния и/или стронция, более предпочтительно карбонатными ионами, или двухфазную смесь, включающую замещенный ионами гидроксиапатит и β-трикальцийфосфат (бета-ТКФ; Са(PO)). Альтернативно, сердечник может включать гибридное соединение, включающее коллаген, минерализованный биомиметическим гидроксиапатитом.
3
4
2
Оболочка на основе гидроксиапатита, выполненная из древесины с более низкой пористостью, предпочтительно включает биомиметический гидроксиапатит или двухфазную смесь, включающую биомиметический гидроксиапатит и β-трикальцийфосфат (бета-ТКФ; Са(PO)). Альтернативно, оболочка, выполненная из древесины с более низкой пористостью, предпочтительно включает карбид кремния.
В предпочтительном воплощении, когда используют оболочку из карбида кремния, такую оболочку покрывают биоактивным слоем коллагена, минерализованного биомиметическим гидроксиапатитом или самим биомиметическим гидроксиапатитом.
Фактически, хотя карбид кремния является инертным нетоксичным материалом, в то же время он не способствует адгезии клеток и пролиферации. Таким образом, использование непокрытого карбида кремния может замедлить заживление кости.
В другом воплощении такой покрывающий слой также можно применить в случае, когда оболочка включает ГАП, частично замещенный ионами, способствующими стимуляции процессов восстановления кости, или двухфазную смесь ГАП и бета-ТКФ, чтобы еще сильнее способствовать восстановлению природной кости. В этом случае нанесение покрытия предпочтительно осуществляют посредством погружения в раствор SBF (как описано ниже). Фактически, таким образом можно осуществить обогащение оболочки ионами, способствующими восстановлению кости.
Различные типы оболочки, перечисленные выше, можно сопоставить с различными типами сердечника, указанными выше, в зависимости от конкретной области применения, в частности, в зависимости от необходимой механической прочности. Схема различных воплощений заменителя кости согласно изобретению представлена на Фиг.2.
Для области применения, требующей высокую механическую прочность (например, в случае восстановления бедренной или плюсневой кости), предпочтительным является использование заменителя кости, включающего сердечник на основе одного любого указанного типа и оболочку из карбида кремния. В этом случае предпочтительно покрыть оболочку биоактивным слоем коллагена, минерализованного биомиметическим ГАП, или самим биомиметическим ГАП.
В одном воплощении заменитель кости включает сердечник из коллагена, минерализованного ГАП, частично замещенного ионами, способствующими стимуляции процессов восстановления кости (биомиметический ГАП), и оболочку из карбида кремния.
В другом воплощении заменитель кости включает сердечник из двухфазной ГАП /бета-ТКФ смеси и оболочку из SiC.
В другом воплощении заменитель кости включает сердечник, состоящий из коллагена, минерализованного биомиметическим ГАП и оболочку из биомиметического ГАП или двухфазной смеси ГАП/бета-ТКФ.
В случае, когда оболочка состоит из SiC, предпочтительно покрыть ее слоем биоактивного материала, такого как коллаген, минерализованный биомиметическим ГАП, или биомиметический ГАП, предпочтительно полученного способом погружения в раствор SBF. Заменитель кости согласно изобретению можно выполнить в любой желаемой форме, которую можно менять в зависимости от конкретной области применения, в которой его используют. На Фиг.1 проиллюстрировано предпочтительное воплощение изобретения, в котором сердечник имеет форму сплошного цилиндра, при этом оболочка представляет собой цилиндр, имеющий полую часть, так что ее форма соответствует форме цилиндра сердечника, и таких размеров, чтобы вместить сам сердечник.
Оболочку выполняют в соответствии со способами, описанными ниже, в форме цилиндра, имеющего полую часть, подходящую для вмещения сердечника, который, в свою очередь, можно выполнить в виде сплошного цилиндра, который вставляют в полость оболочки. Альтернативно, сердечник можно вставить внутрь цилиндрической полости оболочки в гелеобразной форме и затем лиофилизировать для идеального заполнения полости. Альтернативно, сердечник можно лиофилизировать и затем ввести в цилиндрическую полость корпуса.
Оболочка заменителя кости имеет толщину, которую меняют в зависимости от конкретной области применения, но в любом случае в диапазоне от 1 до 5 мм, предпочтительно от 2 до 4 мм.
Сердечник заменителя кости также имеет толщину, которую меняют в зависимости от конкретной области применения. Толщину всего устройства делают по индивидуальному заказу на основе дефекта кости, который необходимо исправить. Принимая во внимание то, что толщину оболочки сводят к минимуму (см. выше), в результате этого вычисляют толщину сердечника.
Слой, покрывающий оболочку, может иметь толщину от 40 до 100 мкм, предпочтительно от 50 до 80 мкм. Сердечник и оболочку из гидроксиапатита, частично замещенного ионами, способствующими стимуляции процессов восстановления кости, в частности, ионами магния, кремния и/или ионами стронция, более предпочтительно карбонатными ионами, или из двухфазной смеси частично замещенного ГАП и бета-ТКФ, можно получить посредством двух различных способов: многостадийным способом превращения или золь-гель методом.
Многостадийный способ превращения известен в отрасли, например, из публикации Tampieri A, Sprio S, Ruffini A, Celotti G, Lesci IG, Roveri N. «От древесины к кости: многостадийный способ для превращения иерархических структур древесины в биомиметические гидроксиапатитовые поддерживающие структуры для конструирования костной ткани. (From Wood to Bone: multi-step process to convert wood hierarchical structures into biomimetic hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering.) J Mater Chem 2009,19 (28): 4973-4980.
Такой способ включает следующие стадии:
1) пиролиз природной древесины: древесину с высокой пористостью (например, ротанг или сосну) или древесину с более низкой пористостью (например, сипо или дуб), нагревают до температуры между 800 и 2000°C в инертной атмосфере, обеспечивая разложение и удаление всех органических веществ. Из этого процесса получают углеродный материал.
2) Науглероживание: углеродный материал пропитывают кальцием в паровой фазе при температуре 1500-1700°C в инертной атмосфере, превращая его в карбид кальция согласно следующей реакции:
2
2С+Са→СаС.
2
2
2
3) Окисление: материал с карбидом кальция полностью окисляют при температуре 900-1100°C согласно реакции: 2СаС+5О→2СаО+4CO.
2
3
4) Карбонизация: материал с оксидом кальция полностью карбонизируют при температурах от 400°C до 850°C согласно реакции: СаО+CO→СаСО.
5) Фосфатирование: материал с карбонатом кальция полностью превращают в гидроксиапатит, частично замещенный карбонатом, посредством обработки фосфатной солью, например фосфатом калия.
Замещение ионами, отличными от карбонатных, можно осуществить посредством введения подходящих растворимых солей, включающих необходимые ионы из перечисленных выше, в реакционную среду процесса фосфатирования.
2
Многостадийный способ получения может также факультативно включать дополнительную стадию, заключающуюся в термической обработке, в которой гидроксиапатит, частично замещенный карбонатными ионами, частично превращают в β-трикальцийфосфат. Таким образом формируют двухфазную смесь частично замещенного гидроксиапатита и бета-ТКФ. Такой состав является особенно предпочтительным как для сердечника, так и для оболочки, так как он имеет лучшую биоактивность и биорезорбируемость в отношении самого замещенного гидроксиапатита, а также превосходную механическую прочность. Предпочтительно, термическую обработку проводят при температуре в диапазоне 700-900°C, предпочтительно в атмосфере CO.
В качестве альтернативы многостадийному способу превращения биомиметическую гидроксиапатитную оболочку и сердечник можно выполнить посредством золь-гель метода. Древесину с высокой пористостью (например, ротанг или сосна) или древесину с более низкой пористостью (например, сипо или дуб) пропитывают предшественником, содержащим фосфит (или фосфат) и/или нитраты. После пропитки получают гель при температуре между 100 и 150°C, за этим следует проведение процесса пиролиза и прокаливание с целью удаления всей органической части, оставляя пористый керамический материал, имитирующий структуру природной древесины.
Для получения замещенного гидроксиапатита замещающие ионы, перечисленные выше, диспергируют в исходном растворе посредством использования растворимых солей.
В случае золь-гель метода производства, способ термической обработки, нацеленный на формирование двухфазной смеси частично замещенного ГАП и бета-ТКФ, не предусмотрен. Такую смесь можно получить только многостадийным способом.
Сердечник, включающий коллаген, минерализованный ГАП, частично замещенный ионами, способствующими стимуляции процессов восстановления кости, предпочтительно, карбонатными ионами, ионами магния, кремния и/или ионами стронция, более предпочтительно, карбонатными и ионами магния, получают посредством процесса, известного в данной отрасли, например из патентных публикаций ЕР 1447104, WO 2007045954 и WO 2006092718.
Композиционный материал включает волокна коллагена, собранные самопроизвольно и минерализованные гидроксиапатитом, замещенным ионами, способствующими стимуляции восстановления кости (карбонатными ионами, ионами магния, кремния, стронция). Гибридный композиционный материал покрывают сеткой из соответствующего материала (например, генипина, глутаральдегидбутандиолдиглицидилового эфира и т.д.), с целью улучшить пористость, микроструктуру и механические свойства. Такой материал характеризуется высокой пористостью и биоактивностью, определяющей адекватную кинетику резорбции и образование хорошо организованной новой костной ткани.
Композиционный материал вставляют в полость оболочки в гелеобразной форме и затем лиофилизируют с целью идеального заполнения полости.
Оболочку из карбида кремния получают посредством процесса пропитки подвергнутой пиролизу древесины кремнием в жидкой фазе, с последующим удалением избыточного кремния посредством подходящего химического воздействия и конечной промывки для удаления всех следов остаточных химических веществ. Этот материал биоинертен и хорошо переносится организмом, и при этом сохраняет структуру и пористость, типичные для первоначальной структуры древесины. Это способствует заселению и пролиферации клеток, наряду с достаточной механической прочностью, характерной для материалов на основе карбида кремния, что позволяет использовать его в местах имплантата, которые подвергаются механическим нагрузкам. Механическая прочность этого устройства также определяется его иерархически организованной микроструктурой, которая характерна для веществ природного происхождения, что делает возможным достижение лучшего и наиболее эффективного компромисса между легкостью и механической прочностью, превосходящего компромиссы в случае других материалов с аналогичным объемом искусственно полученной пористости. Полый цилиндр получают путем поддержания соответствующей толщины внешней стенки с целью достижения требуемых свойств механической прочности.
Более конкретно, предшественник древесины с более низкой пористостью сначала подвергают циклу пиролиза при температуре до 1000°C в инертной (неокислительной) атмосфере. Во время пиролиза органические компоненты древесины (целлюлоза, лигнин и т.д.) разлагаются, оставляя углеродный скелет, который воспроизводит структурные характеристики природной древесины.
Образец, подвергнутый пиролизу, затем механически обрабатывают для получения желаемой формы и размеров, например его можно уменьшить до размеров соответствующего полого цилиндра.
Образец, подвергнутый пиролизу, затем пропитывают кремнием в жидкой фазе и под вакуумом с целью обеспечения проникновения кремния в поры и его реакции с углеродом с образованием карбида кремния согласно реакции:
С(тв)+Si(ж)→SiC(тв)
Превращение в карбид кремния происходит при конечной температуре между 1300 и 1600°C.
Полученный материал включает остаточный металлический кремний в порах. С целью его устранения образец подвергают химическому воздействию сильных кислот, таких как фтористоводородная кислота и/или азотная кислота.
3
3
После этого следует стадия промывки, где удаляют остатки кислот. Промывку осуществляют предпочтительно с помощью раствора НВО.
Оболочку из SiC или другого материала можно покрыть слоем биомиметического материала, чтобы улучшить клеточное сродство и способствовать остеоинтеграции. Покрытие биомиметическим материалом можно осуществлять посредством двух процессов: электроосаждением минерализованного коллагена и осаждением слоя ГАП, предпочтительно путем погружения в раствор, моделирующий состав межтканевой жидкости организма (SBF).
При электроосаждении используют двойной электродный элемент, один электрод которого представляет собой тонкий лист металла, предпочтительно платины, а другой представляет собой оболочку, которую необходимо покрыть.
Процесс электроосаждения происходит предпочтительно при заданном постоянном токе и с числом стадий покрытия, которое меняется в зависимости от микроструктуры и толщины, которые необходимо получить.
Жидкость, в которой осуществляют электроосаждение, представляет собой смесь двух растворов, источников кальция и фосфора, соответственно, и суспензии коллагена.
При указанных условиях на поверхности оболочки формируют однородную пленку минерализованного коллагена, микроструктура и толщина которой зависит от используемых параметров.
В качестве альтернативы способу электроосаждения в случае, если необходимо получить слой в замещенном ГАП, слой биомиметического материала получают посредством кристаллизации слоя ГАП после пропитки в растворе, моделирующем состав межтканевой жидкости организма (SBF), содержащем ионы, способствующие стимуляции процессов восстановления кости (ионы магния, кремния и т.п.).
2+
В качестве первого шага оболочку подвергают воздействию сильной кислоты, предпочтительно раствора азотной кислоты и соляной кислоты. Оболочку затем погружают в раствор ионов Са, которые связываются с поверхностью оболочки. Последующее погружение в обогащенный раствор SBF обеспечивает образование сплошного слоя, замещенного ионами ГАП.
Заменитель кости согласно изобретению обладает характеристиками биологической активности и биорезорбируемости в сочетании с характеристиками механической прочности, которые делают его особенно подходящим для замены и восстановления частей кости, подверженных механическим нагрузкам, например длинных костей ноги и руки (например, большеберцовой кости, бедренной кости, плюсневой кости, плечевой и лучевой кости и т.д.)
Примеры
Получение сердечника из гидроксиапатита, частично замещенного карбонатными ионами.
Многостадийный способ превращения:
1) Пиролиз природной древесины
Древесину ротанга сушат в нагревателе при 70°C в течение 24 часов, а затем термически нагревают до 1000°C в инертной атмосфере с целью обеспечить разложение и удаление всех органических веществ. На этой стадии получают углеродный материал.
2) Науглероживание
Углеродный материал пропитывают кальцием в парообразной фазе при температуре 1500-1650°C в инертной атмосфере, превращая его в карбид кальция согласно следующей реакции:
2
2С+Са→СаС
3) Окисление
Материал с карбидом кальция полностью окисляют в печи при температуре 900-1100°С в течение 1 часа согласно реакции:
2
2
2
2СаС+5O→2СаО+4CO.
4) Карбонизация
2
2
2
Материал с оксидом кальция полностью карбонизируют в печи при температурах, превышающих 750°C, в атмосфере CO или под давлением CO, или в автоклаве при температуре 400°C с давлением CO, составляющим 2,2 МПа, в течение 24 часов, согласно реакции:
2
3
СаО+CO→СаСО
5) Фосфатирование
Материал с карбонатом кальция полностью превращают в гидроксиапатит, частично замещенный карбонатом в условиях окружающей среды (Т<100°C, давление 0,1 МПа (1 атм)), или в гидротермальных условиях при Т=200°C, давлении 1,2 МПа в течение 24 ч, согласно следующей реакции:
3
2
4
2
10
4
6
2
3
2
3
10СаСО+6KHPO+2HO→Са(PO)(ОН)+6KHCO+4HCO
Такая формула является примером при условии, что можно использовать разные источники фосфата.
Устройство, полученное таким образом, обладает структурой, пористостью и механической прочностью совместимыми с характеристиками губчатой кости.
Золь-гель метод
Сердечник заменителя кости также получают, используя золь-гель метод. Древесину ротанга пропитывают предшественником, содержащим триэтилфосфит и тетрагидрат нитрата кальция в водно-спиртовом растворе (вода/этанол). Молярное соотношение воды к фосфору поддерживают равным 8 для достижения полного гидролиза и отношением Са к Р, равным 1,67 (как и для ГАП). Раствор выдерживают в течение 2 часов при 60°C, пока он не станет прозрачным.
Природную древесину сначала очищают от смолы, имеющей низкую молекулярную массу, посредством экстракции в аппарате Сокслета с использованием смеси толуола и этанола (2:1) в течение 17 часов. Затем образцы сушат при 105°C в течение 24 часов перед проведением второй экстракции с использованием этанола в течение 19 часов.
После этого образцы выдерживают в кипящей дистиллированной воде в течение нескольких часов и сушат при 105°C в течение 24 часов.
Пропитку осуществляют под вакуумом в стакане, содержащем золь; после пропитки образцы оставляют сохнуть в течение нескольких часов при температуре 80°C, чтобы обеспечить образование геля. Процесс пропитки можно повторять для увеличения количества ГАП.
Образцы затем подвергают пиролизу при 800°C в течение 1 ч в атмосфере азота. Наконец, углеродную матрицу удаляют прокаливанием при 1300°C.
Такой процесс превращения позволяет получить биоморфный гидроксиапатит, то есть превращение структуры древесины в структуру гидроксиапатита, которая сохраняет исходную структуру древесины.
Получение оболочки из карбида кремния
Оболочку из SiC можно получить в соответствии со способами, указанными в патентных публикациях Р 200102278 и PCT/ES 02/00483.
Древесину сипо сначала подвергают периодическому процессу пиролиза, который включает:
1) сушку древесины при 75°C в течение 24 ч и при 120°C в течение 24 ч;
2) нагревание до 1000°C в инертной (неокислительной) атмосфере в течение 30 минут, в течение которых органические компоненты древесины (целлюлоза, лигнин и т.д.) разлагаются, оставляя углеродный скелет, который воспроизводит структурные характеристики исходной древесины.
Образец, подверженный пиролизу, затем механически обрабатывают для получения желаемой формы и размеров; в этом случае его уменьшают до соответствующих размеров полого цилиндра.
Образец, подверженный пиролизу, затем пропитывают кремнием в жидкой фазе и под вакуумом с целью обеспечения проникновения кремния в поры и его реакции с углеродом для образования карбида кремния согласно реакции
С(тв)+Si(ж)→SiC(тв)
Условия, необходимые для получения материала с SiC: нагрев 5°C/мин и поддержание конечной температуры 1550°C в течение 30 минут.
Полученный материал содержит остаточный металлический кремний в порах. Для его устранения образец подвергают химическому воздействию согласно следующей схеме реакций:
Процесс промывки основан на использовании гидроксида бора и позволяет удалить остатки фтористоводородной кислоты посредством перевода в растворимые соединения:
<mrow><mi>B</mi><msub><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>O</mi><mi>H</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mn>3</mn></msub><mo>+</mo><mn>4</mn><mi>H</mi><mi>F</mi><mo>→</mo><msub><mi>H</mi><mn>3</mn></msub><msup><mi>O</mi><mo>+</mo></msup><mo>+</mo><mi>B</mi><msubsup><mi>F</mi><mn>4</mn><mo>−</mo></msubsup><mo>+</mo><mn>2</mn><msub><mi>H</mi><mn>2</mn></msub><mi>O</mi></mrow>
На Фиг.3 показана микроструктура SiC после удаления избыточного кремния. Это изображение иллюстрирует как воздействие кислот постепенно освобождает поры от присутствия остаточного металлического кремния.
Фиг.4 представляет собой фотографию оболочки из SiC, полученной описанным способом и выполненной в форме полого цилиндра.
На Фиг.5 показаны значения прочности на сжатие образцов из SiC, полученных данным способом.
Получение гибридного композиционного материала (коллагеновых волокон, минерализованных ГАП, замещенным ионами карбоната и магния) в качестве сердечника.
В суспензию гидроксида кальция (1,47 г в 300 мл воды), также содержащую другие требуемые ионы (с использованием подходящих растворимых солей магния, кремния, стронция и др.), добавляют раствор ортофосфорной кислоты (1,17 г в 200 мл воды), содержащий 50 г суспензии коллагена в уксусной кислоте при 1% при 25°C. Зарождение фазы апатита на коллагене происходит при рН в диапазоне 9-12, предпочтительно при 35°C.
Вещество, создающее сетчатую структуру (например, 1,4-бутандиол-диглицидиловый эфир), добавляют, погружая композиционный материал в 2,5 мМ раствор агента на 48 часов. Как правило, желательно достижение определенных соотношений вещества, создающего сетчатую структуру, к композиционному материалу (в данном случае 1% по массе). После такой обработки конструкцию промывают, фильтруют и вставляют в полость цилиндра из SiC в виде геля и затем лиофилизируют для идеального заполнения полости. Альтернативно, конструкцию можно лиофилизировать и затем ввести в полость цилиндра из SiC.
Получение оболочки из SiC, покрытой биоактивной пленкой.
Покрытие биомиметическим веществом осуществляют двумя способами: электроосаждением минерализованного коллагена и осаждением слоя биомиметического ГАП, путем погружения в раствор, моделирующий состав межтканевой жидкости организма (SBF).
Способ электроосаждения
Покрытие осуществляют путем электроосаждения двойным электродным элементом, при этом один электрод представляет собой тонкий лист платины, а другой - оболочку из SiC.
Процесс осуществляют при заданной постоянной температуре (например, при температуре среды Т), в пределах заданного периода времени (например, 15 минут), при заданном постоянном токе (например, 34 мА), и он включает определенное количество стадий покрытия, которое меняют в зависимости от микроструктуры и толщины, которые необходимо получить.
Жидкость, в которой происходит процесс электроосаждения, представляет собой смесь двух растворов, источников кальция (например, нитрат кальция, 42 мМ) и фосфора (например, одноосновный фосфат аммония, 25 мМ) соответственно, а также суспензии коллагена, полученной на основе лошадиного ахиллова сухожилия, посредством способа, разработанного Opocrin S.p.A (WO 0209790).
В условиях, указанных выше, на поверхности SiC образуется однородная пленка минерализованного коллагена, микроструктура и толщина которой зависят от используемых параметров.
На Фиг.6 показана цилиндрическая оболочка до и после нанесения покрытия из пленки коллагена, минерализованного гидроксиапатитом в соответствии с описанным способом.
На Фиг.7 показано присутствие наномерных кристаллов ГАП на волокнах коллагена, полученных описанным способом.
Способ с раствором SBF
Функционализацию поверхности цилиндров в биоSiC осуществляют посредством кристаллизации слоя ГАП после погружения в раствор, моделирующий состав межтканевой жидкости организма (SBF), содержащий ионы, способствующие стимулированию процессов восстановления кости (ионы магния, кремния и др.).
3
-
2+
В качестве предварительной стадии поверхность цилиндров подвергают воздействию кислот, используя раствор HNO/HCl, что приводит к образованию ионов СОО. Цилиндр затем погружают в раствор хлорида кальция, так что предварительно активированная поверхность может связывать ионы Са, присутствующие в растворе. Последующее погружение в обогащенный раствор SBF позволяет формировать сплошной слой замещенного ионами ГАП.
-
-
На Фиг.8 показаны результаты рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии поверхности оболочек из SiC, где выделено образование СОО групп, следующее за воздействием кислот; СОО группы служат для координации ионов кальция в процессе нанесения покрытия посредством погружения в раствор SBF.
-
-
На Фиг.9 показаны результаты ИК-Фурье-спектроскопии поверхности оболочек из SiC, где выделено образование СОО групп, следующее за воздействием кислот; COO группы служат для координации ионов кальция в процессе нанесения покрытия посредством погружения в раствор SBF.
На Фиг.10 показана микроструктура SiC, покрытого биоактивной пленкой из биомиметического гидроксиапатита, полученного из раствора SBF.
На Фиг.11 показан собранный заменитель кости согласно изобретению; ГАП/коллагеновый сердечник и оболочка из SiC показаны на фото А, а сердечник из замещенного ГАП и оболочка из SiC показаны на фото В.
Биоморфные заменители кости обладают ориентированной и анизотропной структурой и, таким образом, их механическая прочность существенно изменяется в двух направлениях. Например, оболочки из SiC, полученные из красного дуба и сипо, имеют прочность на сжатие 150 и 50 МПа в продольном и поперечном направлениях, соответственно. Биомиметическая поддерживающая структура из ГАП, полученная из ротанга, например, показывает прочность на сжатие 4-5 и приблизительно 1 МПа, соответственно.
Изображения испытаний, проведенных в живом организме, на овце (Фиг.12-13) и кролике (Фиг.14) показывают, соответственно, остеоинтеграцию оболочки из SiC, полученной из сипо, и остеоинтеграцию биомиметического ГАП-сердечника, полученного многостадийным способом (Фиг.14).