Штамм Bifidobacterium bifidum, используемый в качестве пробиотика
BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM STRAIN USED AS A PROBIOTIC

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, фармацевтической и пищевой промышленности и представляет собой штамм бифидобактерий вида Bifidobacterium bifidum, который может быть использован в лекарственных средствах, функциональных и специализированных пищевых продуктах, в том числе, биологически активных добавках к пище.
Уровень техники.
Бифидобактерий являются основными представителями индигенной микрофлоры человека. Описаны следующие основные функции бифидобактерий в организме человека: бифидобактерий образуют основу микрофлоры, в результате высокой адгезивности к слизистой оболочке кишечника и определяют основные ниши сосуществования для других микроорганизмов, стабилизируют биопленку кишечника; укрепляют эпителиальный барьер кишечника, необходимы для созревания эпителиоцитов; белок клеток бифидобактерий содержит все незаменимые аминокислоты, включая триптофан (Терешкова Е.А. и др., 2020; Иванова Е.В., 2018).
Вид Bifidobacterium bifidum согласно современным исследованиям преобладает в кишечном микробиоценозе и необходим для нормального функционирования организма человека (Иванова Е.В., 2018; Turroni F. et al., 2019). Вид Bifidobacterium bifidum является доминирующим видом у лиц с нормальным составом микрофлоры и с начальными степенями дисбиоза 1-2 степени. При глубоких нарушениях в микросимбиоценозе (3 степень дисбиоза) выявляемость вида Bifidobacterium bifidum снижается (Иванова Е.В., 2018).
В литературе имеется много данных, свидетельствующих о том, что Bifidobacterium bifidum может взаимодействовать с человеком и с микроорганизмами микрофлоры кишечника с помощью различных механизмов, в частности, активировать иммунитет человека, адгезировать на слизистую оболочку кишечника и метаболизировать гликаны, такие как муцин (Turroni F. et al., 2019). Примечательно, что вид Bifidobacterium bifidum является единственным представителем среди всех признанных видов бифидобактерий, способным к росту посредством метаболизма муцина (Ruas-Madiedo P. et al., 2008, Turroni F. et al., 2011). Причем метаболизм муцина, осуществляемый Bifidobacterium bifidum, может активировать выработку муцина, тем самым увеличивая глубину слоя слизи, обволакивающей слизистую оболочку, и, таким образом, усиливая функцию эпителиального барьера (Rokhsefat S. et al., 2016). Данные свойства позволяют отнести представителей данного вида бифидобактерий к пробиотическим микроорганизмам.
Штамм Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium bifidum 791 в составе отечественных препаратов-пробиотиков применяется в широком масштабе во всех возрастных группах с 1972 года по настоящее время (Терешкова Е.А. и др., 2020).
В современной концепции функционального питания существенным весом обладают пребиотики и синбиотики. Согласно общепринятому в научной литературе определению, пребиотики - это пищевые ингредиенты, сочетающие следующие признаки: 1) устойчивые к желудочному соку, гидролизу пищеварительными ферментами человека, и не всасывающиеся в тонком кишечнике, 2) ферментируемые кишечной микрофлорой 3) избирательно стимулируют рост и/или активность одной или ограниченного числа групп бактерий микробиоты кишечника, которые положительно влияют на здоровье хозяина. Смесь синергетически взаимодействующих пробиотиков и пребиотиков, в которой они взаимно усиливают эффективность друг друга, называют синбиотиками (Gibson G.R., Roberfroid М.В., 1995). Также пребиотики часто связывают с так называемым бифидогенным эффектом (Roberfroid М. et al., 2010).
Известен штамм Bifidobacterium bifidum 792 (патент RU 2215028), который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, активно размножающийся в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования с высокой концентрацией бифидобактерий. Обладает кислотообразующими и ингибирующими свойствами в отношении патогенной и гнилостной микрофлоры. Это позволяет получить кисломолочные, ферментированные и неферментированные пищевые продукты, закваски, гигиенические и косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, обеспечивающие нормализацию микробиоценозов организма человека. Известны штаммы Bifidobacterium bifidum 79-32 (патент RU 2314340) и Bifidobacterium bifidum B-UH ВКПМ Ac-1875 (патент RU 2453592), выделенные из содержимого кишечника здорового ребенка грудного возраста, которые, кроме указанных выше свойств, заквашивают, либо сквашивают молоко.
Однако, для указанных штаммов не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам, что осложняет возможность их применения в качестве активного компонента лекарственных препаратов в комплексной терапии ряда заболеваний. Также, для всех указанных штаммов видовая принадлежность не подтверждена современными молекулярно-генетическими методами, что для выделенных из природных источников микроорганизмов в настоящее время является обязательным (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5).
Известен штамм Bifidobacterium bifidum 791/БАГ (патент RU 2165454), полученный селекцией штамма Bifidobacterium bifidum 791. Штамм более устойчив к повреждающим факторам сред культивирования и агрессивных сред гастроинтестинального тракта человека, обеспечивает утилизацию более широкого спектра аминокислот, т.е. обладает более высокой жизнеспособностью и колонизирующими свойствами, что обеспечивает получение препаратов и продуктов на его основе с более длительными сроками хранения и более высокими лечебно-профилактическими свойствами. Однако, для указанного штамма также не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам, что осложняет возможность его применения как активного компонента лекарственных препаратов в комплексной терапии ряда заболеваний.
Известен штамм Bifidobacterium bifidum OV-19 (патент RU 2375444), выделенный из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, который, кроме указанных выше свойств, устойчив к широкому спектру антибиотиков, а также сквашивает молоко с образованием ровного сгустка.
Недостатком всех указанных выше штаммов является то, что ни на уровне генотипа, ни на уровне фенотипа не определено отношение к муцину и желчным солям, что, как указывалось выше, является важными особенностями, влияющими на эффективность штамма, как пробиотика.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм Bifidobacterium IATA-ES2 WO 2010007198 A1, выделенный из фекалий здорового ребенка на грудном вскармливании и идентифицированный секвенированием 16S рРНК как представитель вида Bifidobacterium bifidum. Штамм предложено применять с целью улучшения защитных функций и снижения риска заболеваний. Показаны следующие механизмы его действия: 1) регуляция гликозилирования кишечника, благоприятствующую таковому у здоровых людей, 2) модуляция взаимодействия между эпителиальными клетками и микробиотой кишечника, способствующую адгезии полезных бифидобактерий, и 3) регуляцию иммунологического ответа. Однако, для указанного штамма не приведена информация об устойчивости к антибактериальным веществам.
Для всех указанных выше штаммов не приведена оценка способности ферментировать селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, что ограничивает возможность их применения в синбиотических функциональных и специализированных продуктах питания. Данная особенность, как указывалось выше, является основным критерием для разработки на основании штамма синбиотических продуктов. Изучение эффективности in vivo либо не проводилось, либо проводилось на животных моделях, т.е. полученные результаты не могут в полной мере быть перенесены на человека.
Раскрытие сущности изобретения.
Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов, с подтвержденной молекулярно-генетическими методами исследования принадлежностью к виду Bifidobacterium bifidum, охарактеризованного по показателям необходимым для включения в состав пробиотических лекарственных средств, функциональных и специализированных пищевых продуктов, в том числе, биологически активных добавок к пище.
При решении поставленной задачи достигаются следующие технические результаты: штамм является антагонистом патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, сбраживает молоко с образованием сгустка, отличается активным ростом и образованием органических кислот в средах, содержащих селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, что обусловливает усиление антагонизма против условно-патогенных микроорганизмов. Штамм устойчив к антимикробным веществам канамицину, гентамицину, амикацину. В результате полногеномного исследования показано, что штамм характеризуется наличием генов, кодирующих пептиды, которые отвечают за адгезию к муцину и слизистой кишечника, а также генов, кодирующих ферменты, осуществляющие гидролиз муцина. В результате полногеномного исследования показано, что штамм характеризуется наличием генов, отвечающих за гидролиз желчных солей, что указывает на устойчивость к желчи и участие в регулировании трансформации указанной группы веществ в цикле печень-кишечник-печень, способствуя пищеварению. Применение ферментированных продуктов и бактерийных препаратов на основе заявляемого штамма приводит к исчезновению клинических проявлений дисбактериоза (дисбиоза) кишечника, боли в желудке, улучшению функции иммунной системы, улучшению общего состояния, повышению работоспособности.
Осуществление изобретения
Указанный технический результат достигнут получением нового штамма бактерий Bifidobacterium bifidum 8, который выделен из содержимого кишечника здорового человека, идентифицирован по 16S рРНК, и депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика, коллекционный номер АС-2136.
Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.
Полноразмерная последовательность гена, кодирующего 16S рибосомальную РНК, SEQ ID NO 1 на 100% гомологична типовому штамму вида Bifidobacterium bifidum DSM 20456 (АТСС 29521).
Культурально-морфологические свойства.
Облигатный анаэроб, оптимальная температура роста 36-38°С.
Грамположительные, неподвижные, неспорообразующие прямые или слегка изогнутые палочки с утолщением или бифуркацией на одном или обоих концах. Располагаются по одной, чаще по 2 или скоплениями. Характерной особенностью является расположение парных клеток под углом 90° друг к другу на поздних фазах роста.
При культивировании в среде Блаурокка в модификации Г.И. Гончаровой при температуре 37-38°С в течение 36-48 часов образует колонии белого цвета в виде слаборасширяющихся конусов длиной до 10 мм. При культивировании на поверхности агаризованной (плотной) среды Bifidobacterium Broth фирмы Himedia в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer, температура 37-38°С, продолжительность 72 часа) образует плоские сероватые колонии R-формы, диаметром до 5 мм.
Физиолого-биохимические свойства штамма
Штамм желатин не разжижает, каталазу не продуцирует, молоко сквашивает с образованием сгустка. Утилизирует глюкозу без образования газа, с образованием молочной и уксусной кислот, снижая рН среды до 3,8-4,2. Утилизирует сахарозу, лактозу, маннозу, целлобиозу. Не утилизирует: арабинозу, ксилозу, инулин (высокой степени очистки), салицин, сорбит.
Штамм устойчив к канамицину, гентамицину, амикацину. Штамм чувствителен к азитромицину, амоксицилину, кларитромицину, доксициклину, тетрациклину, цефтриаксону, ванкомицину, цефепиму, линкомицину, имипенему. В отношении, левофлоксацина, метронидазола, триметоприма, ципрофлоксацина, офлоксацина является промежуточным с учетом концентрации, минимально подавляющей рост (см. примеры).
Штамм является активным антагонистом патогенных микроорганизмов. В присутствии пребиотиков фрутоолигосахаридов (ФОС), либо лактулозы в качестве единственного углевода в питательной среде отличается наибольшей степенью подавления микробных контаминантов пищи и возбудителей инфекционных заболеваний на примере тестовых штаммов Bacillus cereus и Staphylococcus aureus.
9
Установлена безвредность штамма на белых беспородных мышах массой 14-16 г. Суспензию лиофилизированного штамма вводили из расчета примерно 1×10 КОЕ. В течение 5 суток все мыши остались живы и не потеряли в весе.
Штамм хранится в лиофлизированном виде в сахарозо-желатиновой среде высушивания не менее 5 лет в герметично укупоренных флаконах без потери указанных свойств.
Пример 1
Для подтверждения антагонистической активности штамма суспензию лиофилизата, восстановленного в физиологическом растворе, высевали на чашки Петри со средой МРС-5 штрихом по диаметру. Инкубировали культуру в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer) при 37°С в течение 48 часов. После этого перпендикулярно зоне роста штамма, но не касаясь ее, высевали тестовые штаммы, используя для каждого отдельную чашку. Через 20 часов определяли зону отсутствия роста (табл. 1). Штамм Bifidobacterium bifidum 8 показал высокую антагонистическую активность в отношении тест-штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Пример 2
6
Лиофилизированную культуру штамма Bifidobacterium bifidum 8 ресуспендировали в физиологическом растворе и инокулировали предварительно подвергнутую пастеризации 10% суспензию обрата молока из расчета примерно 2×10 КОЕ/мл. Инкубацию проводили при 37°С в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице 2. Штамм Bifidobacterium bifidum 8 сквашивает молоко с образованием сгустка.
Пример 3

Подтверждение активного роста штамма Bifidobacterium bifidum 8 и образованием органических кислот в средах, содержащих селективно стимулирующие рост бифидобактерий углеводные субстраты - пребиотики, а также их синергетического эффекта против условно-патогенных микроорганизмов проводили по описанному ранее методу (Karetkin В.А. et al., 2019). Представители вида В. cereus являются контаминатами пищевых продуктов и возбудителями кишечных инфекций. В качестве тестового использовали штамм В. cereus АТСС 9634. Ферментацию смешанной культуры бифидобактерий и тест-штамма проводили при температуре 37°С в анаэробных условиях (2% углекислого газа, 98% азота) при постоянном перемешивании в жидкой среде, содержащей в качестве единственного углевода 1% одного из известных коммерческих пребиотиков: фруктоолигосахариды (ФОС, Orafti  Р95, BENEO ORAFTI, Бельгия), изомальтулоза (Palatinose™, BENEO Palatinit GmbH, Германия), лактулоза сухая Лактусан (ООО Фелицата Холдинг, РФ) и D-раффиноза (ООО ДиаМ, РФ). В начальный момент эксперимента и после 9 ч роста оценивали численность обоих микроорганизмов высевом на селективные среды. Определение кислот проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе Agilent 1220 с рефрактометрическим детектором и колонкой Hi-Plex Н (4.6×250 мм). Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum 8 характеризуется активным ростом и наибольшим подавлением тест-штамм в синбиотической композиции с ФОС и лактулозой (Таблица 3).
Staphylococcus aureus считается одной из основных причин энтероколита и диареи у пациентов, прошедших курс лечения антибиотиками в госпитальных условиях (Lo T.S., Borchardt S.M., 2009). Исследования проводили по аналогичной методике. Заявляемый штамм Bifidobacterium bifidum 8 характеризуется активным ростом и наибольшим подавлением тест-штамм S. aureus АТСС 43300 в синбиотической композиции с ФОС и лактулозой (Таблица 4).
Пример 4
Определяли чувствительность заявляемого штамма к антимикробным веществам диско-диффузионным методом и методом серийных разведений в жидкой питательной среде по МУК 4.2.1890-04.
Суточную культуру штамма, полученную инкубированием в среде Блаурокка при температуре 37°С, стандартизовали стерильным забуференным физиологическим раствором до OD560 - 2,1 и высевали по 0,1 мл полученной суспензии на чашки со средой Bifidobacterium Broth фирмы Himedia. На поверхность среды помещали диски с антибиотиками (см. табл.5). Инкубацию проводили в анаэробных условиях (bioMerieux GENbox anaer) при температуре 37°С в течение 3 суток, после чего определяли диаметр зоны угнетения роста (табл. 5).
с
560
Для метода серийных разведений использовали жидкую питательную среду MRS с цистеином и аскорбиновой кислотой и антимикробные вещества (см. табл. 6) для биохимических исследований. Лекарственные препараты на основе данных веществ наиболее часто применяются в современной терапии. Для каждого вещества готовили серию последовательных двукратных разведений в стерильной среде от 512 до 0,125 мкг/мл. Инокулировали 10% суточной культурой штамма, предварительно стандартизованной по OD=1,5. Через 10 часов инкубирования при температуре 37°С в анаэробных условиях (2% углекислого газа, 98% азота) и при постоянном перемешивании измеряли мутность суспензии, кривые зависимости данной величины от концентрации антимикробного вещества носили сигмоидальный характер. Из зависимостей определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) и минимальную концентрация антимикробного вещества, при которой начинается наблюдаемое подавление роста (табл. 6). Определение данной величины связано со следующими соображениями. Для достижения лечебного действия необходимо попадание в кишечник человека или животного определенного количества живых клеток бифидобактерий, что может быть обеспечено только при минимальном воздействии антибактериальных веществ. Поэтому устойчивость определяли с учетом указанной величины, а не только с учетом МПК, как это принято для патогенных микроорганизмов, когда выживание доже небольшого количества клеток может привести к заболеванию.
Штамм устойчив (У) к канамицину, гентамицину, амикацину. Чувствителен (Ч) к амоксицилину, цефтриаксону, цефепиму, имипенему, тетрациклину, доксициклину, азитромицину, кларитромицину, линкомицину, ванкомицину. В отношении офлоксацина, ципрофлоксацина, левофлоксацина, метронидазола, нифуроксазида, триметоприма является промежуточным (П) с учетом минимальной концентрации начала наблюдаемого подавления роста.
Результаты полногеномного исследования показали отсутствие генов с маркерами устойчивости к тетрациклину tet(W) (SEQ ID NO: 2) и trp-tet(W) (SEQ ID NO: 3), что также подтверждено фенотипически.
Пример 5
Молекулярно-биологические признаки штамма определяли на основании полногеномного исследования.
Анализ полученного генома показал, что штамм Bifidobacterium bifidum 8 не содержит плазмид.
Анализ полученного генома показал наличие генов, кодирующих пептиды клеточной стенки, отвечающие за специфическую адгезию. Коллаген связывающий протеин участвует в адгезии к эпителию. Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 4) с пептидом фимбринального пили Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: BBA48285.1) составляет 99%.
Протеин, кодируемый геном ОррА, отвечает за связывание с клетками эпителия кишечника Сасо-2 (Guglielmetti S. ety al., 2008). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 5) с олигопептид связывающим протеином ОррА Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: KLN80891.1) составляет 100%.
Образование трансальдолазы значительно увеличивает степень связывания клеток бактерий - представителей кишечной микробиоты с муцином (Gonzalez-Rodriguez I. et al., 2012). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 6) с трансальдолазой Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP_003813255.1) составляет 100%.
Эндо альфа-N-ацетилгалактозаминидаза участвует в гидролитическом разложении муцина (отщеплении от пептидной цепи углеводных остатков). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 7) с эндо альфа-N-ацетилгалактозаминидазой Bifidobacterium bifidum АТСС 29521 (NCBI GenBank SEQ ID NO: BAQ97477.1) составляет 99%.
Одним из основных механизмов, обуславливающих устойчивость бактерий кишечника к солям желчи, секретируемым печенью, является их расщепление ферментами (Ruiz L. et al., 2013). Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 8) с гидролазой солей желчи Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: AAR39435.1) составляет 99%.
Фосфопируват гидролаза также участвует в расщеплении желчных солей. Гомологичность обнаруженной структуры (SEQ ID NO: 9) с фосфопируват гидролазой Bifidobacterium bifidum (NCBI GenBank SEQ ID NO: WP_003812660.1) составляет 100%.
Пример 6.
9
10
8
Использование штамма Bifidobacterium bifidum 8 в лекарственных средствах. На основе штамма Bifidobacterium bifidum 8 получали лиофилизированную биомассу бифидобактерий. Из чистой культуры путем проведения 2-3 пассажей получали маточную культуру (инокулят) в среде Блаурокка по одному из известных способов. Инкубирование проводили при 37°С. Далее проводили культивирование с поддержанием рН в интервале 5,5-7,0. Полученную культуру, содержащую не менее 2×10 КОЕ/мл, отделяли от среды культивирования с применением центрифугирования, сепарирования, либо других способов, применяемых для суспензий бактериальных клеток. К полученному концентрату добавляли сахарозо-желатиновую среду высушивания, замораживали во флаконах или на поддонах для сушки из пищевой легированной стали до температуры не выше минус 40-45°С и подвергали лиофильному высушиванию. Остаточная влажность составляла не более 5%. Полученную лиофилизированную биомассу, содержащую не менее 5хЮ КОЕ/г, используют в качестве активного компонента лекарственных средств, стандартизуя наполнителем из расчета разовой дозы (5-10)×10 КОЕ.
Пример 7.
8
9
6
7
Использование штамма Bifidobacterium bifidum 8 в функциональных и специализированных пищевых продуктах, в том числе, биологически активных добавках к пище. Полученную аналогично описанному в примере 6 методу лиофилизированную биомассу применяют в качестве основного ингредиента пробиотических биологически активных добавок к пище в различных товарных формах (порошки, капсулы и т.п.) из расчета 1×10 - 1×10 КОЕ в разовой дозе. Лиофилизированную биомассу бифидобактерий штамма Bifidobacterium bifidum 8 вносят в жидкие ферментированные продукты для заквашивания и сквашивания, либо для обогащения в ферментированные или не ферментированные продукты из расчета 10 - 10 КОЕ в 1 г готового продукта. Благодаря этому получаемые продукты могут быть отнесены к функциональным продуктам питания.
Пример 8.
8
Полученную, как описано в примере 6, суспензию клеток штамма Bifidobacterium bifidum 8 в среде высушивания дозировали в пенициллиновые флаконы из расчета разовой дозы (5-10)×10 КОЕ и лиофилизировали. Применение лиофилизированной биомассы в указанной разовой дозе 4 раза в день внутрь курсами от 8 до 32 дней у добровольцев мужчин и женщин в возрасте 45 лет, 61 год, 66 лет, 72 года, 93 года приводило к исчезновению выраженных болей в желудке, развившихся на фоне обострения хронического гастрита (без приема лекарственных препаратов); исчезновению проявлений дисбактериоза (дисбиоза) кишечника (метеоризм, боли в животе, нерегулярный стул, разжиженный стул, задержка стула); быстрому купированию симптомов ОРВИ (в течение 1-3 дней), особенно при приеме в ранние сроки заболевания; исчезновению лабиального герпеса; улучшению общего состояния, повышению физической, умственной активности, работоспособности, улучшению эмоционального состояния (исчезновение пониженного настроения, раздражительности, эмоциональной лабильности).
Пример 9.
6
Женщина, 57 лет. Многократные курсы химиотерапии в связи с раком яичников. На этом фоне выраженный дисбактериоз (дисбиоз) кишечника, боли в животе, прием любых продуктов сопровождается метеоризмом, диарейный синдром с водянистым стулом. Употребляла кефир, обогащенный бифидобактерими штамма Bifidobacterium bifidum 8 в количестве 10 КОЕ в 1 мл в течение 4 дней, первые два дня по 300 мл в день, последующее дни по 200 мл в день. Общий объем кефира 1 литр. Диарея полностью исчезла на второй день приема кефира, на четвертый день стул приобрел оформленную консистенцию, исчезли боли в животе, значительно уменьшился метеоризм, улучшилось общее состояние.
Библиография:
1. Терешкова Е.А., Кареткин Б.А., Дорошенко Е.О., Ланских А.Г. Сорбированные пробиотики. Механизм действия. - М.: ТД ДеЛи, 2020 - 36 с.
2. Иванова Е.В. Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной миробиоты человека. Дисс. д.м.н. Оренбург.2018:295.
3. Turroni F., Duranti S., Milani С, Lugli G.A., van Sinderen D., Ventura M. Bifidobacterium bifidum: A Key Member of the Early Human Gut Microbiota. //Microorganisms. 2019, 9; 7(11).
4. Ruas-Madiedo P., Gueimonde M, Fernandez-Garcia M., de los Reyes-Gavilan C.G., Margolles A. Mucin degradation by Bifidobacterium strains isolated from the human intestinal microbiota. //Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 1936-1940.
5. Turroni F., Milani C., van Sinderen, D., Ventura, M. Genetic strategies for mucin metabolism in Bifidobacterium bifidum PRL2010: An example of possible human-microbe co-evolution. Gut Microbes 2011, 2, 183-189.
6. Rokhsefat S., Lin A.F., Comelli E.M. Mucin-Microbiota Interaction During Postnatal Maturation of the Intestinal Ecosystem: Clinical Implications. Dig. Dis. Sci. 2016, 61, 1473-1486.
7. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: introducing the concept of prebiotics // The Journal of Nutrition. 1995, Vol. 125, p. 1401-1412
8. Roberfroid M., Gibson G.R., Hoyles L., et al. Prebiotic effects: metabolic and health benefits. //Br J Nutr. 2010, Vol. 104, S. 2, S1-S63
9. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 5: The Actinobacteria Editors: Whitman, W., Goodfellow, M., Kampfer, P., Busse, H.-J., Trujillo, M., Ludwig, W., Suzuki, K.-I., Parte, A. (Eds.) 2012
10. Karetkin B.A., Guseva E.V., Evdokimova S.A. et al. A quantitative model of Bacillus cereus ATCC 9634 growth inhibition by bifidobacteria for synbiotic effect evaluation // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2019. Vol. 35. P. 89
11. Lo T.S., Borchardt S.M. Antibiotic-associated diarrhea due to methicillin-resistant Staphylococcus aureus // Diagnostic microbiology and infectious disease. 2009. Vol. 63 (4), P. 388-389
12. Guglielmetti S., Tamagnini I., Mora D., Minuzzo M., Scarafoni A., Arioli S., Hellman J., Karp M., Parini C. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco-2 cells. Applied and environmental microbiology, 2008, 74(15), 4695-4702
13. Gonzalez-Rodriguez I., Sanchez В., Ruiz L., Turroni F., Ventura M., Ruas-Madiedo P., Gueimonde M., Margolles A. Role of extracellular transaldolase from Bifidobacterium bifidum in mucin adhesion and aggregation. Applied and environmental microbiology, 2012, 78(11), 3992-3998.
14. Ruiz L., Margolles A., Sanchez B. Bile resistance mechanisms in Lactobacillus and Bifidobacterium. //Frontiers in microbiology, 2013, 4, 396