СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ДИСПЛАЗИИ ЭПИТЕЛИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА ПРИ ЕЕ АТРОФИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ
METHOD FOR DETECTION OF EPITHELIAL DYSPLASIA OF GASTRIC MUCOSA IN ATROPHIC CHANGES

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка.
Дисплазия - нарушение структуры ткани, характеризующееся патологической пролиферацией и атипией эпителия. В слизистой оболочке желудка дисплазия может быть трех степеней: легкая - 1-я степень, умеренная - 2-я степень и тяжелая - 3-я степень
(http://guzood.ru/index.php?what=page&id=10).
Известны способы выявления дисплазии (атипических клеток) эпителия слизистой оболочки желудка при атрофическом гастрите и аденомах, которые относят к предраковым состояниям.
1. Проведение эндоскоцической биопсии, при которой у пациента берут ткань слизистой оболочки желудка, затем биоптат окрашивают и под микроскопом определяют наличие или отсутствие атипичных клеток. Недостатком этого способа является инвазивность, вероятность получения материала из участков без дисплазии, что может привести к ложноотрицательным результатам [Lee SB, Kang HY, Kim KI, Arm DH. The diagnostic accuracy of endoscopic biopsy for gastric dysplasia // J Gastric Cancer. 2010. Vol. 10, №4. - P. 175-181].
2. Определение экспрессии Toll-like рецепторов, являющихся маркерами дисплазии в биоптатах слизистой оболочки желудка. Метод инвазивен и при его осуществлении также имеется вероятность получения материала из участков, не имеющих дисплазии, что может привести к ложноотрицательным результатам [Pimentel-Nunes P1, Afonso L, Lopes Р, Roncon-Albuquerque R Jr, Goncalves N, Henrique R, Moreira-Dias L, Leite-Moreira AF, Dinis-Ribeiro M. Increased expression of toll-like receptors (TLR) 2, 4 and 5 in gastric dysplasia // Pathol Oncol Res. 2011. - Vol. 17, №3. - P. 677-683].
3. Определение провоспалительных цитокинов IL-6, VEGF и C-реактивного белка в сыворотке крови пациентов, по уровню которых можно судить об остроте воспалительного процесса (прототип). Однако этот способ не является специфичным, поскольку многие патологические процессы, в частности воспаления различной локализации, могут приводить к повышению уровней этих цитокинов в сыворотке крови, и многие клетки организма могут быть их источниками: моноциты-макрофаги, лимфоциты, гранулоциты, гепатоциты, кератиноциты, жировые клетки и т.п. [Jang JS, Choi SR, Han SY, Roh MH, Lee JH, Lee SW, Jeung JS, Kim MC, Son YK, Baek YH. Predictive significance of serum IL-6, VEGF, and CRP in gastric adenoma and mucosal carcinoma before endoscopic submucosal dissection // Korean J Gastroenterol. 2009. - Vol. 54, №2. - P. 99-107].
Известно, что информативными маркерами атрофических изменений в теле желудка могут служить уровни пепсиногена I (PG1) и пепсиногена II (PG2) в сыворотке крови и величина отношения уровня пепсиногена I к уровню пепсиногена II [Успенская М.Н., Калиновский В.П., Ткаченко Е.И. Биохимические и иммунологические критерии оценки состояния слизистой оболочки желудка при ее опухолевой и неопухолевой патологии // Вопросы онкологии. - 2007. - Т. 53, №3. - С. 304 - 310; Song H.J., Jang S.J., Yun S.C:, et al. Low Levels of Pepsinogen I and Pepsinogen I/II Ratio are Valuable Serologic Markers for Predicting Extensive Gastric Corpus Atrophy in Patients Undergoing Endoscopic Mucosectomy. // Gut Liver. - 2010. - Vol. 4. - №4. - Р. 475-480].
Пепсиногены I и II - функционально неактивные белки-предшественники фермента пепсина, который образуется из них в присутствии соляной кислоты желудочного сока. У здоровых людей количество секретируемого PG1 в три и более раз выше, чем PG2. Хронический атрофический гастрит обнаруживается у 90% больных раком желудка. Поэтому в настоящее время считают, что своевременная диагностика атрофии слизистой оболочки желудка должна стать первым этапом определения риска развития рака желудка. Чувствительность и специфичность количественного анализа пепсиногенов для диагностики атрофического гастрита (в том числе его ранней бессимптомной формы) составляет более 90%, а достоверность получаемых результатов заметно выше, чем при использовании эндоскопии и гистологии (Молчанова А.Р., Сорокина Н.Н., Рукавишников М.Ю. Диагностическая значимость комплексного лабораторного исследования пепсиногенов // Новости «Вектор-Бест», 2010, №2 (56). http://www.vector-best.ru/publ/nvb/n56.pdf).
Раскрытие изобретения
Предлагаемый способ выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка характеризуется тем, что определяют концентрации пепсиногена I и пепсиногена II в сыворотке крови пациента, вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II. При величине данного отношения, равной нижней границе нормы или меньше ее, определяют концентрацию интерферона-γ (IFNγ) в супернатанте пробы крови данного пациента после ее инкубации с раково-эмбриональным антигеном (РЭА) и без него, вычисляют индекс влияния (ИВ) РЭА на продукцию IFNγ (ИВ РЭА IFNγ) клетками крови по формуле: ИВ РЭА IFNγ=А/Б, где А - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови после ее инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в супернатанте пробы крови без ее инкубации с РЭА, и при величине ИВ РЭА IFNγ, равной 1,2 или ниже 1,2, делают вывод о наличии у пациента дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени, а при величине ИВ РЭА IFNγ, превышающей 1,2, делают вывод об отсутствии дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка у данного пациента или о наличии у него дисплазии 1 степени.
Величина нижней границы нормы отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II может меняться в зависимости от наборов реагентов, используемых при определении концентраций пепсиногена I и пепсиногена II в сыворотке крови. При использовании для иммуноферментного анализа наборов реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест» нижнюю границы нормы отношения концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II принимают равной трем.
Технические результаты:
1) высокая чувствительность способа выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка: дисплазия 2-й и 3-й степени была выявлена с помощью предлагаемого способа у всех 5 пациентов, у которых после гистологического исследования биоптата была также выявлена дисплазия слизистой оболочки желудка 2-й и 3-й степени - т.е. в 100% случаев;
2) высокая специфичность предлагаемого способа: отсутствие дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка или выявление дисплазии 1-й степени было установлено на основе предлагаемого способа у всех 4-х пациентов, у которых после гистологического исследования биоптата также было установлено либо отсутствие дисплазии, либо дисплазия 1 степени - т.е. в 100% случаев;
3) выявление дисплазии (клеточного атипизма) эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени у пациентов, у которых еще не была обнаружена атрофия эпителия слизистой оболочки желудка, т.е. предлагаемый способ дает возможность формировать группы риска среди пациентов по развитию у них предрака и/или рака желудка и проводить у них профилактику опухолевой патологии желудка;
4) низкая инвазивность способа, обусловленная взятием крови из пальца или вены пациента (а не биоптата из желудка);
5) отличное качество модели (диагностического способа), определенное с помощью ROC-анализа с расчетом показателя AUC (Area Under Curve) при помощи метода трапеций.
Осуществление способа
Концентрации пепсиногенов I и II в сыворотке крови определяют методом иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов «Пепсиноген 1 - ИФА - БЕСТ» и «Пепсиноген 2 - ИФА - БЕСТ» производства ЗАО «Вектор-Бест» согласно методике, приложенной к указанным наборам, и выражают в мкг/л. Затем вычисляют отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II. У пациентов, у которых данное отношение равно 3-м или ниже 3-х, проводят вычисление ИВ РЭА на продукцию клетками крови IFNγ согласно приведенной ниже методике.
Цельную кровь, взятую из вены пациента в количестве 1 мл, помещают в стерильный флакон с 4 мл среды (стерильная питательная среда ДМЕМ), содержащей гепарин 2,5 МЕ/мл и гентамицин 100 мкг/мл. Аккуратно перемешивают содержимое, флакона, затем из него в стерильных условиях забирают две пробы. Одну пробу объемом 0,98 мл помещают в стерильный флакон, содержащий 0,02 мл РЭА (Canceroembryonic Antigen Human Colon Adenocarcinoma Cell Line) производства Calbiochem, Германия, концентрация РЭА составляет 2 мкг/мл.
Другую пробу объемом 0,98 мл помещают также в стерильный флакон, содержащий 0,02 мл питательной среды ДМЕМ (внутренний контроль без РЭА - определение спонтанной продукции IFNγ). Концентрация клеток в пробах и объемы проб в обоих стерильных флаконах одинаковы.
Содержимое флаконов аккуратно перемешивают и помещают в термостат при 37°C на 24 часа. В течение первого часа инкубации содержимое флаконов аккуратно перемешивают 1 раз. После инкубации осаждают клетки крови путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 минут и отбирают пробы из супернатанта крови, инкубированной с РЭА (продукция IFNγ под влиянием РЭА) и из супернатанта крови, инкубированной без РЭА (спонтанная продукция IFNy). С помощью стандартной тест-системы для определения IFNγ твердофазным иммуноферментным анализом производства ЗАО «Вектор-Бэст» определяют согласно приложенной инструкции концентрацию IFNγ в обеих пробах. ИВ РЭА IFNγ клетками крови вычисляют по формуле: ИВ РЭА=А/Б, где А - концентрация IFNγ в пробе супернатанта крови, после ее инкубации с РЭА, Б - концентрация IFNγ в пробе супернатанта крови без ее инкубации с РЭА.
Обоснование способа
Было обследовано 24 пациента. Пациенты были взяты в исследование на основании жалоб и в связи с подозрением на развитие у них гастропатологии. Всем пациентам была проведена фиброгастроскопия и гистологическое исследование биоптата, на основании чего был выставлен диагноз, который сравнивался с результатами исследования, полученными с помощью предлагаемого способа.
У 15 пациентов отношение PG1/PG2 было больше 3-х. У этих пациентов при эндоскопии не было обнаружено атрофии слизистой оболочки желудка.
У остальных 9 (из 24) пациентов отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II оказалось ниже 3-х или равным 3-м. В данной группе пациентов ИВ РЭА IFNγ от 0 до 1,20 был обнаружен у 5-ти человек, т.е. у них согласно предлагаемому способу была выявлена дисплазия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени. У этих 5-ти пациентов при эндоскопическом исследовании желудка и гистологическом исследовании биоптатов также была выявлена дисплазия эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени, т.е. выявленная по предлагаемому способу дисплазия 2-й или 3-й степени в 100% случаев подтверждалась патогистологическим исследованием.
У остальных 4-х из 9 пациентов ИВ РЭА IFNγ был выше 1,20. У этих 4-х пациентов, т.е. в 100% случаев, в эпителии слизистой оболочки желудка дисплазии не было выявлено либо была выявлена дисплазия 1 степени. Наличие/отсутствие дисцлазии эпителия слизистой оболочки желудка контролировали путем патогистологического исследования биоптатов.
Оценка статистической значимости различий проводилась с использованием точного метода Фишера, р=0,008.
Для получения численного значения клинической значимости предлагаемого способа выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка использовали ROC-анализ с определением показателя AUC (Area Under Curve), который рассчитывали при помощи метода трапеций. О качестве теста судят по экспертной шкале для значений AUC: 0,9-1,0 - отличное качество модели, 0,8-0,9 - очень хорошее качество модели, 0,7-0,8 - хорошее качество модели, 0,6-0,7 - среднее качество модели, 0,5-0,6 - неудовлетворительное качество модели.
Предлагаемый способ выявления дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка показал отличное качество модели.
Клинические примеры
1. Больная Д., 72 года, у пациентки были признаки патологии желудочно-кишечного тракта.
На основании эндоскопического и гистологического исследований ей был выставлен диагноз - хронический атрофический гастрит. Заключение патоморфолога: дисплазия 0 баллов (нет), согласно действующей классификации ВОЗ-отсутствие интраэпителиальной неоплазии/дисплазии.
При обследовании пациентки в соответствии с предлагаемым способом было обнаружено, что отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II у нее равно 1,4, а ИВ РЭА IFNγ равно 5, что дает возможность сделать вывод об отсутствии у данной пациентки дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка или о наличии у нее дисплазии 1 степени.
2. Б-ная М., 61 год, признаки патологии желудочно-кишечного тракта. На основании эндоскопического и гистологического исследований ей был выставлен диагноз - хронический атрофический гастрит, аденома желудка. Заключение патоморфолога: дисплазия 2-й степени, согласно действующей классификаций ВОЗ-интраэпителиальная неоплазия высокой степени/дисплазия.
При обследовании пациентки в соответствии с предлагаемым способом было обнаружено, что отношение концентрации пепсиногена I к концентрации пепсиногена II у нее равно 1,7, а ИВ РЭА IFNγ равно 1, что приводит к выводу о наличии у пациентки дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка 2-й или 3-й степени.