СПОСОБЫ УЛУЧШЕННОГО УДАЛЕНИЯ ПРИМЕСЕЙ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ХРОМАТОГРАФИИ НА ОСНОВЕ СВЯЗЫВАНИЯ С БЕЛКОМ А
METHODS FOR IMPROVED IMPURITY REMOVAL DURING CHROMATOGRAPHY BASED ON BINDING WITH PROTEIN A

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка заявляет преимущество приоритета по предварительной заявке на патент США с регистрационным номером 62/609214, поданной 21 декабря 2017 года, и по предварительной заявке на патент США с регистрационным номером 62/694387, поданной 5 июля 2018 года, содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки в полном их объеме.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0002] Настоящее изобретение относится к способам очистки полипептида, содержащего Fc-область (например,антитела), посредством хроматографии на основе связывания с белком А.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Антитела и другие белки, содержащие Fc-область (такие как иммуноадгезины), нашли широкое использованием в разновидностях фармацевтического/терапевтического применения. Применение данных молекул (например,у пациентов-людей) требует тщательной очистки от любых загрязнений/примесей, которые могут появиться в ходе получения белка. Очистка терапевтических белков часто осуществляется с использованием одной или нескольких стадий хроматографической очистки; особенно применимым типом хроматографической очистки белков, которые содержат Fc-область иммуноглобулина (например,антитело), является хроматография на основе связывания с белком А. Однако было показано, что белки клетки-хозяина (HCP) элюируются совместно с антителами в ходе традиционной хроматографии в режиме захвата белка (в том числе хроматографии на основе связывания с белком А), что может представлять собой проблему для последующего применения данных антител. Как правило, используют одну или несколько стадий промывки после связывания продукта (например,белка, содержащего Fc-область иммуноглобулина) с хроматографической смолой до элюирования. К сожалению, современные промывочные составы, изготовленные из соли и буферных веществ, могут оказаться неподходящими для разрушения взаимодействия HCP и других примесей с различными продуктами на основе моноклональных антител (mAb). Следовательно, существует потребность в улучшенных способах очистки (например,при внедрении новых промывочных составов), которые уменьшают концентрацию/количество примесей (например,HCP) при совместной очистке с антителами (например,в ходе аффинной хроматографии на основе связывания с белком А).
[0004] Все ссылки, цитируемые в данном документе, включая патентные заявки, патентные публикации, непатентную литературу и номера доступа в базах UniProtKB/Swiss-Prot, включены в данный документ посредством ссылки в полном своем объеме, как если бы каждая отдельная ссылка была конкретно и отдельно указана для включения в качестве ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Для удовлетворения вышеуказанных и других потребностей в данном документе раскрыты улучшенные способы очистки полипептидов, содержащих Fc-область, от одной или нескольких примесей. Данные способы предусматривают приведение в контакт матрицы для хроматографии на основе связывания с белком А с образцом (например,клеточным лизатом), содержащим (i) полипептид, содержащий Fc-область, и (ii) одну или несколько примесей, и промывку матрицы промывочным раствором, характеризующимся показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до 10,0, и содержащим бензоатную соль и/или бензиловый спирт. Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на неожиданном открытии того, что применение бензоатной соли (например,бензоата натрия) и/или бензилового спирта в промывочном растворе при показателе pH от приблизительно 4,0 до 10,0 в ходе хроматографии на основе связывания с белком А обеспечивает превосходную очистку от примесей (например,примесей клеток-хозяев) по сравнению с используемыми в настоящее время промывочными составами (см.фиг. 1, пример 1). Настоящее изобретение также по меньшей мере частично основано на открытии того, что включение одного или нескольких дополнительных компонентов, выбранных из бензолсульфоната (например,бензолсульфоната натрия), каприловой кислоты, гексиленгликоля и/или аргинина, может дополнительно улучшить очистку от примесей при включении в промывочный раствор (см.фиг. 2 и 3, пример 1).
[0006] Следовательно, согласно одному аспекту в данном документе представлен способ очистки полипептида, содержащего Fc-область, при этом способ предусматривает стадии: (a) приведения в контакт матрицы для хроматографии на основе связывания с белком А с образцом, содержащим (i) полипептид, содержащий Fc-область, и (ii) одну или несколько примесей, при условии, что полипептид, содержащий Fc-область, связывается с белком A; и (b) промывки матрицы промывочным раствором, где промывочный раствор содержит одно из (i) бензоатной соли при концентрации от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M и (ii) бензилового спирта при концентрации от приблизительно 0,5% до приблизительно 4% объем/объем (об./об.) или как первое, так и второе, и где промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит: (1) бензоатную соль; (2) бензиловый спирт или (3) бензоатную соль и бензиловый спирт. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, бензоатная соль представляет собой бензоатную соль щелочного металла. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, бензоатная соль представляет собой бензоат натрия. В некоторых вариантах осуществления бензоат натрия присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,3 M. В некоторых вариантах осуществления бензоат натрия присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 0,3 M. В некоторых вариантах осуществления бензоат натрия присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, бензиловый спирт присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 4% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, бензиловый спирт присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 2% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, бензиловый спирт присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, бензиловый спирт присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 4% (об./об.).
[0007] В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, промывочный раствор дополнительно содержит буферное средство. В некоторых вариантах осуществления буферное средство выбрано из фосфата, триса, аргинина, ацетата и цитрата. В некоторых вариантах осуществления буферное средство присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферное средство присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферное средство присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 5,0, приблизительно 6,0, приблизительно 7,0, приблизительно 8,0, приблизительно 9,0 или приблизительно 10,0.
[0008] В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, промывочный раствор дополнительно содержит бензолсульфонат натрия. В некоторых вариантах осуществления бензолсульфонат натрия присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, промывочный раствор дополнительно содержит каприловую кислоту. В некоторых вариантах осуществления каприловая кислота присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, промывочный раствор дополнительно содержит гексиленгликоль. В некоторых вариантах осуществления гексиленгликоль присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 10% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, промывочный раствор дополнительно содержит креатин. В некоторых вариантах осуществления креатин присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, промывочный раствор дополнительно содержит аргинин. В некоторых вариантах осуществления аргинин присутствует в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления аргинин присутствует в концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления аргинин представляет собой аргинин-HCl. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор, содержащий аргинин, характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор, содержащий аргинин, характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 8,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, промывочный раствор дополнительно содержит одну или несколько солей, не являющихся буферными. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько солей, не являющихся буферными, выбраны из хлорида натрия, бромида натрия, хлорида калия, бромида калия, хлорида магния, бромида магния, хлорида кальция, бромида кальция и любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько солей, не являющихся буферными, представляют собой хлорид натрия и/или хлорид калия. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько солей, не являющихся буферными, присутствуют в концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M.
[0009] В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, промывочный раствор представляет собой раствор, выбранный из: (i) раствора, содержащего бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и бикарбонат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 10,0; (ii) раствора, содержащего бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2%, аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и фосфат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 9,0; (iii) раствора, содержащего бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 7,0; (iv) раствора, содержащего бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 7,0; (v) раствора, содержащего гексиленгликоль при концентрации, составляющей приблизительно 10% (об./об.), бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 7,0; (vi) раствора, содержащего бензолсульфонат при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 7,0; (vii) раствора, содержащего каприловую кислоту при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 7,0; (viii) раствора, содержащего бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 6,0; (ix) раствора, содержащего бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 5,0; (x) раствора, содержащего бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 4% (об./об.), характеризующегося показателем pH, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 10; (xi) раствора, содержащего бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 4% (об./об.), характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 9,0; и (xii) раствора, содержащего бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризующегося показателем pH, составляющим приблизительно 5,0.
[0010] В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, способ дополнительно предусматривает стадию промывки матрицы первым раствором до промывки матрицы промывочным раствором, описанным выше. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит буфер, выбранный из фосфатного буфера, трис-буфера, ацетатного буфера, карбонатного буфера, цитратного буфера и любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит буфер при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления первый раствор представляет собой фосфатный буфер.
[0011] В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, способ дополнительно предусматривает стадию промывки матрицы вторым раствором после промывки матрицы промывочным раствором, описанным выше. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит буфер, выбранный из фосфатного буфера, трис-буфера, ацетатного буфера, карбонатного буфера, цитратного буфера и любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит буфер при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления второй раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит по сути низкое количество соли или не содержит соль.
[0012] В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, способ дополнительно предусматривает стадию приведения в контакт матрицы для хроматографии на основе связывания с белком А с элюирующим раствором после одной или нескольких стадий промывки. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию сбора элюата, содержащего полипептид, содержащий Fc-область. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию фильтрования элюата посредством глубинного фильтрования. В некоторых вариантах осуществления элюат содержит менее приблизительно 500 частей на миллион (ppm) одной или нескольких примесей.
[0013] В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, применение способов, описываемых в данном документе, обеспечивает в результате полипептид, содержащий Fc-область, очищенный от одной или нескольких примесей до более высокой степени, чем обеспечивает соответствующий способ, в котором отсутствует стадия промывки матрицы промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, одна или несколько примесей представляют собой белки клетки-хозяина (HCP). В некоторых вариантах осуществления один или несколько HCP выбраны из фосфолипаз (например, белка 2, подобного гипотетической фосфолипазе В), кластерина, сериновых протеаз, факторов элонгации и любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO).
[0014] В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область человека предусматривает Fc-область IgG1, IgG2 или IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область мыши. В некоторых вариантах осуществления Fc-область мыши предусматривает Fc-область IgG1, IgG2 или IgG3 мыши. В некоторых вариантах осуществления, которые могут быть объединены с любым из предыдущих вариантов осуществления, полипептид, содержащий Fc-область, является антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой биспецифическое антитело или триспецифическое антитело.
[0015] В некоторых вариантах осуществления любой из упомянутых выше способов дополнительно предусматривает до приведения в контакт матрицы для хроматографии на основе связывания с белком А с образцом, содержащим (i) полипептид, содержащий Fc-область, и (ii) одну или несколько примесей, корректирование собранного материала, содержащего полипептид, содержащий Fc-область, с достижением конечной концентрации бензоатной соли, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M, и показателя pH, составляющего от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0, например,для получения образца, содержащего (i) полипептид, содержащий Fc-область, и (ii) одну или несколько примесей. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоатную соль щелочного металла. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоат натрия. В некоторых вариантах осуществления конечная концентрация бензоатной соли в собранном материале составляет от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления показатель pH собранного материала после корректирования составляет от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,0. В некоторых вариантах осуществления показатель pH собранного материала после корректирования составляет от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления собранный материал получен из культуры, содержащей клетку-хозяина, сконструированную для экспрессии полипептида. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO). В некоторых вариантах осуществления собранный материал осветляют до корректирования. В некоторых вариантах осуществления собранный материал осветляют после корректирования.
[0016] В родственном аспекте представлен способ очистки полипептида, содержащего Fc-область, при этом способ предусматривает стадии: (A) корректирования собранного материала, содержащего полипептид, содержащий Fc-область, с достижением конечной концентрации бензоатной соли, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M, и показателя pH, составляющего от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0, например,с получением образца, содержащего (i) полипептид, содержащий Fc-область, и (ii) одну или несколько примесей; и (B) приведения в контакт образца с по меньшей мере одной матрицей для хроматографии. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна матрицы для хроматографии предусматривает матрицу для аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления матрица для аффинной хроматографии представляет собой матрицу для хроматографии на основе связывания с белком А или матрицу для хроматографии на основе связывания с белком G. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию приведения в контакт по меньшей мере одной матрицы для хроматографии с по меньшей мере одним промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию приведения в контакт по меньшей мере одной матрицы для хроматографии с элюирующим раствором. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию сбора элюата, содержащего полипептид, содержащий Fc-область. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию фильтрования элюата посредством глубинного фильтрования. В некоторых вариантах осуществления элюат содержит менее приблизительно 500 частей на миллион (ppm) одной или нескольких примесей.
[0017] В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоатную соль щелочного металла. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоат натрия. В некоторых вариантах осуществления конечная концентрация бензоатной соли в собранном материале составляет от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления показатель pH собранного материала после корректирования составляет от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,0. В некоторых вариантах осуществления показатель pH собранного материала после корректирования составляет от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления собранный материал получен из культуры, содержащей клетку-хозяина, сконструированную для экспрессии полипептида. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления эукариотическая клетка-хозяин представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO). В некоторых вариантах осуществления собранный материал осветляют до корректирования. В некоторых вариантах осуществления собранный материал осветляют после корректирования. В некоторых вариантах осуществления способ обеспечивает в результате полипептид, содержащий Fc-область, очищенный от одной или нескольких примесей до более высокой степени, чем обеспечивает соответствующий способ получения образца, в котором отсутствует стадия корректирования собранного материала, содержащего полипептид, содержащий Fc-область, с получением образца. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько примесей представляют собой белки клетки-хозяина (HCP). В некоторых вариантах осуществления один или несколько HCP выбраны из группы, состоящей из фосфолипаз, кластерина, сериновых протеаз, факторов элонгации и любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления HCP представляет собой белок 2, подобный гипотетической фосфолипазе В (PLBL2). В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область человека предусматривает Fc-область IgG1, IgG2 или IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область мыши. В некоторых вариантах осуществления Fc-область мыши предусматривает Fc-область IgG1, IgG2 или IgG3 мыши. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий Fc-область, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой биспецифическое антитело или триспецифическое антитело.
[0018] Следует понимать, что один, несколько или все признаки различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, можно комбинировать с получением других вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники. Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно раскрываются в следующем подробном описании.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
фиг. 1
[0019] На показана концентрация примесей белков (HCP) клеток-хозяев яичника китайского хомячка (CHO) в образцах антител, элюированных из колонок с белком А после промывки указанным контролем или тестируемыми промывочными растворами.
фиг. 2A - B
фиг. 2A
фиг. 2B
[0020] На показаны концентрации специфического HCP (HCP-A) в образцах антител, элюированных из колонок с белком А. На  показана концентрация HCP-A в образцах антител, элюированных из колонок с белком А, после промывки 2% бензиловым спиртом ± 0,5 M бензоата натрия и/или 0,5 M аргинина по сравнению с контрольной промывкой согласно оценке с помощью ELISA. На  показана концентрация HCP-A в образцах антител, элюированных из колонок с белком А, после промывки различными промывочными растворами при показателе pH, составляющем 9,0 или 10,0, по сравнению с контрольной промывкой согласно оценке с помощью ELISA.
фиг. 3
[0021] На  показана концентрация HCP-A в образцах антител, элюированных из колонок с белком А, после промывки указанными промывочными растворами, содержащими дополнительные тестируемые соединениями, согласно оценке с помощью ELISA.
фиг. 4А - В
фиг. 4A
фиг. 4B
[0022] На  показаны концентрации общего HCP и PLBL2 в образцах антител, элюированных из колонок с белком А.На  показана концентрация общего HCP в образцах антител, элюированных из колонок с белком А, после промывки с помощью 0,5 M аргинина, 0,5 M бензоата натрия или 4% бензилового спирта по сравнению с процессом контрольной промывки согласно оценке с помощью ELISA. На  показана концентрация общего PLBL2 в образцах антител, элюированных из колонок с белком А, после промывки с помощью 0,5 M аргинина, 0,5 M бензоата натрия или 4% бензилового спирта по сравнению с процессом контрольной промывки согласно оценке с помощью ELISA.
фиг. 5
[0023] На  показано улучшение визуальной прозрачности образцов антител, элюированных из колонок с белком А, промытых с помощью промежуточной промывки, предусматривающей 2% бензилового спирта и 0,5 M бензоата натрия.
фиг. 6A - B
фиг. 6A
фиг. 6B
[0024] На  показано снижение показателя выхода после колонки и удаление PLBL2 при загрузке колонок с белком A более 40 г/л. На  показано, что процент выхода после колонки снижается линейно от 93,1% до 78,1% при повышении плотности загрузки колонок с белком A от 40 г/л до 60 г/л. На  показано, что уровень PLBL2, вымываемого из колонки с белком A, снижается от 32,1 ppm до 17 ppm при повышении плотности загрузки колонок с белком A от 40 г/л до 60 г/л.
фиг. 7
[0025] На  показано, что корректирование собранного материала до 0,5 M бензоата натрия и показателя pH 7,2 или корректирование собранного материала до 0,5 M бензоата натрия и показателя pH 9 до очистки на основе связывания с белком A приводит к улучшенному удалению примесей PLBL2 и HCP. Корректирование собранного материала до 0,5 M бензоата натрия при pH 9,0 показывало наиболее низкий уровень примесей PLBL2 и HCP и продемонстрировало степень очистки от PLBL2, которая на порядок превышает такую степень очистки по сравнению с корректированием только показателя pH.
фиг. 8
[0026] На  показано, что взаимосвязь между содержанием PLBL2 и концентрацией бензоата натрия является практически сигмоидальной. Уменьшение прироста в очистке от PLBL2 наблюдали для концентраций бензоата натрия, составляющих более 0,4 М.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0027] В данном документе описаны способы снижения количества примесей (например,примесей белка клетки-хозяина) в ходе совместной очистки с выделением белков, содержащих Fc-область, на основе связывания с белком A. В способах по настоящему изобретению используют промежуточную стадию промывки с применением нового промывочного раствора, содержащего бензоатную соль и/или бензиловый спирт, что, как было показано, значительно снижает уровни примесей белков клетки-хозяина в элюатах, собранных в ходе аффинной хроматографии на основе связывания с белком А (см.примеры 1 и 2). Включение одной или нескольких добавок (например,бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, креатина и/или аргинина) в этот новый промывочный раствор дополнительно улучшает очистку от примесей белкового элюата, содержащего белок, содержащий Fc-область, после захвата и элюирования из матрицы белка А.
I. Определения
[0028] Рассматривая подробное описание настоящего изобретения следует учитывать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными композициями или биологическими системами, которые, конечно же, могут варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в данном документе, предназначена только для целей описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.
[0029] Используемые в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа предусматривают ссылки на множественное число, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, например, упоминание термина “молекула” необязательно включает комбинацию двух или более таких молекул и т. п.
per se
[0030] Используемый в данном документе термин “приблизительно” относится к обычному диапазону погрешностей для соответствующего значения, хорошо известному специалисту в данной области техники. Ссылка на "приблизительно" в отношении значения или параметра в данном документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на данное значение или данный параметр .
[0031] Подразумевается, что аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, включают выражения "содержащий", "состоящий из" и "состоящие по сути из" аспектов и вариантов осуществления.
[0032] Используемый в данном документе термин “и/или” в такой фразе, как “A и/или B”, означает включение как A, так и B; A или B; A (отдельно) и B (отдельно). Подобным образом используемый в данном документе термин “и/или” в такой фразе, как “A, B и/или C” охватывает каждый из следующих вариантов осуществления: A, B и C; A, B или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (отдельно); B (отдельно) и C (отдельно).
[0033] Термин "полипептид" и "белок" используют в данном документе взаимозаменяемо по отношению к полимерам из аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может быть разделен соединениями, не являющимися аминокислотами. Термины также охватывают полимер из аминокислот, который был модифицирован естественным путем или посредством вмешательства; например, посредством образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой манипуляции или модификации, такой как конъюгирование с метящим компонентом или токсином. В объем данного определения также включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (в том числе, например, неприродные аминокислотыи т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники.
[0034] Используемый в данном документе термин “антитело” в широком смысле и конкретно включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например,биспецифические антитела, триспецифические антителаи т. д.), фрагменты антитела или синтетические полипептиды, несущие одну или несколько последовательностей CDR или происходящих из CDR, при условии, что полипептиды проявляют требуемую активность. Антитела (Ab) и иммуноглобулины (Ig) представляют собой гликопротеины с одинаковыми структурными характеристиками. Как правило, антителами считаются Ig с определенной или распознанной специфичностью. Таким образом, в то время как антитела проявляют специфичность связывания с конкретной мишенью, иммуноглобулины включают как антитела, так и другие антитело-подобные молекулы, которые не обладают специфичностью по отношению к мишени. Антитела по настоящему изобретению могут принадлежать к любому классу (например,IgG, IgE, IgM, IgD, IgAи т. д.) или подклассу (например,IgG1, IgG2, IgG2a, gG3, IgG4, IgA1, IgA2и т. д.). Термины “тип”, “класс”, “подтип” и “подкласс” используют в данном документе взаимозаменяемо. Антитела и иммуноглобулины, нативные или дикого типа (полученные из не подвергнутому искусственной манипуляции представителя популяции), обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами массой приблизительно 150000 дальтон, состоящими из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), после которого следует ряд константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL) на одном конце и константный домен на другом конце. Антитела, описываемые в данном документе, могут представлять собой человеческие антитела, гуманизированные антитела, антитела животных, отличных от человека (например,мыши, крысы, хомяка, кролика верблюдаи т. д.), или химерные антитела.
et al.
et al.
[0035] Термин “вариабельные” в контексте вариабельного домена антител может относиться к определенным частям соответствующей молекулы, которые сильно отличаются по последовательности среди антител и используются для специфического распознавания и связывания, или конкретного антитела по отношению к его конкретной мишени. Однако вариабельность не распределена равномерно в вариабельных доменах антител. Вариабельность сконцентрирована в трех сегментах, называемых областями, определяющими комплементарность (CDR), также известными как гипервариабельные области, в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Наиболее высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными (FR) областями или последовательностями. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелых и легких цепей содержит четыре FR-области, по большей части принимающих конфигурацию β-листа, соединенные тремя CDR, которые образуют петли, объединяющие структуру β-листа и в некоторых случаях образующие ее часть. CDR в каждой цепи удерживаются вместе часто в непосредственной близости от FR-областей и вместе с CDR2 из другой цепи способствуют образованию сайта связывания с мишенью (эпитопом или детерминантой) антител (см.Kabat  Sequences of Proteins of Immunological Interest, Nation Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Используемая в данном документе нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулина осуществляется в соответствии с системой нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулина согласно Kabat , если не указано иное. Одна CDR может характеризоваться способностью специфически связываться с генетически родственным эпитопом.
[0036] Используемый в данном документе термин “шарнир” или “шарнирная область” может относиться к гибкому полипептиду, содержащему аминокислоту между первым и вторым константными доменами антитела.
[0037] Термин “биспецифические антитела” может относиться к молекулам, которые объединяют антигенсвязывающие сайты двух антител в одной молекуле. Таким образом, биспецифическое антитело способно одновременно связываться с двумя различными антигенами.
[0038] Используемый в данном документе термин “моноклональное антитело” может относиться к антителу, полученному из популяции по сути однородных антител, т. е.отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела в данном документе, в частности, включают “химерные” антитела, в которых часть тяжелых и/или легких цепей идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от определенного вида или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, при этом остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они сохраняют требуемую активность.
[0039] Используемый в данном документе термин “мультивалентное антитело” или “поливалентное антитело” может относиться к антителу, содержащему два или более антигенсвязывающих сайта, способному таким образом одновременно связывать два или более антигена, которые могут иметь одинаковую или разную структуру. Термин “двухвалентное” означает, что антитело содержит два антигенсвязывающих сайта. Термин “четырехвалентное” означает, что антитело содержит четыре антигенсвязывающих сайта.
[0040] Используемый в данном документе термин “антигенсвязывающий сайт” может относиться к части антитела, которая содержит участок, специфически связывающийся с частью или всем антигеном и комплементарный им. Когда антиген является большим, антитело может связываться только с определенной частью антигена, которая называется эпитопом. Антигенсвязывающий домен может быть обеспечен одним или несколькими вариабельными доменами антитела и может состоять из ассоциации вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела и вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела.
[0041] “Гуманизированные” формы антител, не являющихся человеческими (например,мышиных), представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты, которые содержат последовательности, полученные из иммуноглобулина, не являющегося человеческим, в отличие от человеческого антитела. В целом гуманизированное антитело будет содержать по сути все из одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по сути все области CDR соответствуют таким областям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по сути все FR-области являются такими, как в матричной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина, как правило, выбранной матрицы иммуноглобулина человека. Как правило, цель заключается в получении молекулы антитела, обладающей минимальной иммуногенностью в организме человека. Таким образом, возможно, что одна или несколько аминокислот в одной или нескольких CDR также могут быть заменены на аминокислоту, которая является менее иммуногенной для человека-хозяина, без существенной минимизации функции специфического связывания одной или нескольких CDR с мишенью. В качестве альтернативы FR может быть отличной от человеческой, но наиболее иммуногенные аминокислоты замещают менее иммуногенными. Тем не менее, прививание CDR (как это описано выше) не является единственным способом получения гуманизированного антитела. Например, модифицирование только областей CDR может быть недостаточным, поскольку нередко каркасные остатки играют роль в определении трехмерной структуры петель CDR и общей аффинности антитела к его лиганду. Следовательно, могут быть использованы любые средства, поэтому молекулы родительского антитела, не являющегося человеческим, модифицируют так, чтобы они были менее иммуногенными для человека, а общая идентичность последовательности с антителом человека не всегда является необходимым условием.
[0042] Термин “примесь” может относиться к любой чужеродной или нежелательной молекуле, которая присутствует в растворе (таком как образец, содержащий полипептид, содержащий Fc-область). Примесь может быть биологической (молекулой) (например,макромолекулой), такой как ДНК, РНК или белок, которая также присутствует в образце, содержащем представляющий интерес белок. Примеси могут включать нежелательные белковые варианты (например,агрегированные белки, неправильно уложенные белки, белки с пониженным содержанием дисульфидных связей, фрагментыи т. д.), другие белки из клеток-хозяев, компоненты среды для клеточной культуры, молекулы, которые являются частью абсорбента, используемого для аффинной хроматографии (например,белок A), эндотоксины, нуклеиновые кислоты,вирусы и т. д.
II. Способы выделения и/или очистки полипептидов, содержащих FC-область
Обзор
[0043] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способу очистки полипептида, содержащего Fc-область (например,антитела), посредством хроматографии на основе связывания с белком А. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает стадии приведения в контакт матрицы или смолы для хроматографии на основе связывания с белком А с образцом, содержащим (1) полипептид, содержащий Fc-область (например,антитело), и (2) одну или несколько примесей (например,примесей клетки-хозяина), при условии связывания полипептида, содержащего Fc-область (например,антитела), с белком A и промывки матрицы промывочным раствором, содержащим бензоатную соль и/или бензиловый спирт. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензиловый спирт при концентрации, составляющей от приблизительно 0,5% до приблизительно 4% объем/объем (об./об.). В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит одну или несколько добавок (например,одно или несколько из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной (такой как хлорид натрия), креатина и/или аргинина). В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор дополнительно содержит буферное средство. В некоторых вариантах осуществления осуществляют корректирование собранного материала, который содержит полипептид, содержащий Fc-область, с достижением конечной концентрации бензоатной соли, составляющей от приблизительно 0,1 M до 0,5 M, и показателя pH, составляющего от приблизительно 7 до приблизительно 9, с получением образца, содержащего (1) полипептид, содержащий Fc-область (например,антитело), и (2) одну или несколько примесей (например,примесей клетки-хозяина).
Приведение в контакт образца с матрицей или смолой, содержащей белок А
[0044] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способам очистки полипептида, содержащего Fc-область (например,антитела), посредством хроматографии на основе связывания с белком А. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает стадию приведения в контакт матрицы или смолы для хроматографии на основе связывания с белком А с образцом, содержащим (1) полипептид, содержащий Fc-область (например,антитело), и (2) одну или несколько примесей (например,примесей клетки-хозяина), при условии связывания полипептида, содержащего Fc-область (например,антитела), с белком A.
[0045] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам выделения полипептида, содержащего Fc-область (например,антитела, иммуноадгезина, слитого белкаи т. д.), из образца (например,образца клеточного лизата, образца супернатанта клеточной культурыи т. д.). В некоторых вариантах осуществления образец представляет собой супернатант клеточной культуры (например,супернатант таких клеток, как клетки CHO, сконструированные для продуцирования и секреции полипептида), или получен из супернатанта клеточной культуры (например,образец частично очищенного супернатанта клеточной культуры). В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий Fc-область, представляет собой секретируемый полипептид. В некоторых вариантах осуществления Fc-область является C-концевой областью тяжелой цепи иммуноглобулина и может включать Fc-области нативной последовательности и Fc-области вариантов. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как участок от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до его карбоксильного конца (нумерация остатков в Fc-области является индексом по EU, как и по Kabat). Fc-область иммуноглобулина, как правило, содержит два константных домена, CH2 и CH3, и необязательно содержит домен CH4. В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область, полученную из любого подходящего иммуноглобулина, такого как подтипы IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, IgA, IgE, IgD или IgM. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит Fc-область с аминокислотной последовательностью Fc-области человека, Fc-области животного, отличного от человека (например,мыши, крысы, кролика, хомякаи т. д.), или любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область мыши. В некоторых вариантах осуществления Fc-область мыши предусматривает Fc-область IgG1, IgG2 или IgG3 мыши. В некоторых вариантах осуществления Fc-область представляет собой Fc-область человека. В некоторых вариантах осуществления Fc-область человека предусматривает Fc-область IgG1, IgG2 и/или IgG4 человека.
[0046] В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий Fc-область, представляет собой антитело. В некоторых вариантах осуществления термин “антитело” используется в данном документе в самом широком смысле и, в частности, включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультивалентные антитела (например,двухвалентные, трехвалентные, четырехвалентныеи т. д.) и мультиспецифические антитела (например,биспецифические, триспецифическиеи т. д.). Антитела могут быть любого происхождения, в том числе, например, получены от людей, отличных от человека приматов, грызунов (например,мыши, крысы, хомякаи т. д.), кроликов, верблюдов, акул, и/или могут быть получены рекомбинантным путем. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой человеческое антитело, гуманизированное антитело и/или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой мультиспецифическое и/или мультивалентное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой биспецифическое антитело или триспецифическое антитело.
E. сoli,
A. niger
.
[0047] В некоторых вариантах осуществления образец (например,образец клеточного лизата, образец супернатанта клеточной культурыи т. д.), содержащий полипептид, содержащий Fc-область, дополнительно содержит одну или несколько примесей. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько примесей присутствуют в образце из-за способа, используемого для получения полипептида, содержащего Fc-область (например,способа получения секретируемого антитела). В некоторых вариантах осуществления одна или несколько примесей представляют собой одну или несколько примесей, полученных из клетки-хозяина (например,один или несколько белков клетки-хозяина, одну или несколько нуклеиновых кислот клетки-хозяина, один или несколько липидов клетки-хозяинаи т. д.). Клетка-хозяин может быть любой клеткой-хозяином, известной в данной области техники, подходящей для продуцирования полипептида, содержащего Fc-область, включая, например, прокариотические клетки (такие как клетки , клетки  и т. д.), эукариотические клетки (такие как клетки дрожжей, клетки растений, клетки насекомых (например,клетки S1) и/или клетки млекопитающих (мыши, крысы, хомяка, кролика, человека, отличного от человека приматаи т. д.) (например,гибридомы, клетки CHO, клетки 293T, клетки PER.C6, клетки NS0и т. д.). В некоторых вариантах осуществления одна или несколько примесей представляют собой один или несколько белков клетки-хозяина (HCP). В некоторых вариантах осуществления HCP относится к белку, не являющемуся продуктом, продуцируемому клеткой-хозяином в ходе культивирования клетки или ферментации. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько примесей представляют собой один или несколько (например,один или несколько, два или более, три или более, четыре или более и т. д) белков клетки-хозяина (HCP), выбранных из фосфолипаз, кластерина, сериновых протеаз, факторов элонгации и/или любых их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку СНО. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько примесей представляют собой один или несколько HCP клетки CHO. В некоторых вариантах осуществления один или несколько HCP клетки CHO представляют собой одно или несколько из фосфолипаз, кластерина, сериновых протеаз, факторов элонгации и/или любых их комбинаций.
[0048] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам очистка полипептида, содержащего Fc-область, от одной или нескольких примесей в образце посредством хроматографии на основе связывания с белком А. В некоторых вариантах осуществления образец приводят в контакт с матрицей или смолой, содержащей белок А. В некоторых вариантах осуществления образец приводят в контакт с матрицей или смолой, содержащей белок А, при условиях, подходящих для связывания полипептида, содержащего Fc-область, в образце с белком A. Способы и подходящие условия для приведения в контакт и связывания содержащего Fc-область полипептида с матрицей или смолой, содержащей белок А, хорошо известны специалисту в данной области техники (например,способы, описанные в протоколе изготовителя коммерчески доступных матрицы или смолы, содержащих белок А). Любые подходящие матрица или смола, содержащие белок А, известные в данной области техники, могут быть использованы в способах по настоящему изобретению, в том числе, например: MabSelect, MabSelect Xtra, MabSelect Sure, MabSelect Sure LX Protein A, MabSelect pcc, MabSelect PrismA, rProtein A Sepharose CL-4B и nProtein A Sepharose 4 FF (GE Healthcare); EshmunoA, ProSep A, ProSep-vA High Capacity, ProSep-vA Ultra и ProSep-vA UltraPlus (Millipore); Poros A и Mabcapture A (Poros); IPA-300, IPA-400 и IPA-500 (RepliGen Corp.); Protein A Affigel и Protein A Affiprep (Bio-Rad); MABsorbent A1PP и MABsorbent A2P (Affinity Chromatography Ltd.); Protein A Ceramic Hyper D F (Pall Corp.); Protein A Ultralink Immobilized и Protein A Agarose (PIERCE); Protein A Cellthru 300 и Protein A Ultraflow (Bioseparation); Amsphere A3 (JSR) и/или Toyopearl AF-rProtein A HC-650F (Tosoh Biosciences). В некоторых вариантах осуществления матрицу или смолу, содержащую белок А, используют в формате колоночной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления один или несколько параметров для матрицы или смолы, содержащей белок А (таких как показатель pH, ионная сила, температура, добавление других веществ), корректируют перед приведением в контакт матрицы или смолы, содержащей белок А, с образцом. В некоторых вариантах осуществления матрицу или смолу, содержащую белок А, споласкивают, промывают, уравновешивают, подвергают стриппингу и/или обеззараживают до и/или после приведения в контакт матрицы или смолы, содержащей белок А, с образцом. В некоторых вариантах осуществления матрицу или смолу, содержащую белок А, уравновешивают и/или промывают до приведения в контакт матрицы или смолы, содержащей белок А, с образцом. Можно использовать любой подходящий буфер для уравновешивания и/или промывки, известный данной области техники. В некоторых вариантах осуществления матрицу или смолу, содержащую белок А, обеззараживают, подвергают стриппингу и/или регенерируют до использования.
Промывка матрицы или смолы, содержащей белок А, промывочным раствором
[0049] Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к способам очистки полипептида, содержащего Fc-область, посредством хроматографии на основе связывания с белком А с помощью промывки матрицы или смолы, содержащей белок А, связанной с полипептидом, содержащим Fc-область (например,антителом), промывочным раствором, содержащим бензоатную соль и/или бензиловый спирт. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает стадию приведения в контакт матрицы или смолы для хроматографии на основе связывания с белком А с образцом, содержащим (1) полипептид, содержащий Fc-область (например,антитело), и (2) одну или несколько примесей (например,примесей клетки-хозяина), при условии связывания полипептида, содержащего Fc-область (например,антитела), с белком A и промывки матрицы или смолы промывочным раствором, содержащим бензоатную соль при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M, и/или бензиловый спирт при концентрации, составляющей от приблизительно 0,5% до приблизительно 4% объем/объем (об./об.), где промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензиловый спирт. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и бензиловый спирт.
[0050] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, содержащему бензоатную соль и/или бензойную кислоту (например,со скорректированным показателем рH). Любые подходящие источник или форма бензоатной соли (например,соли щелочного металла) и/или бензойной кислоты, известные в данной области техники, могут быть использованы в промывочных растворах по настоящему изобретению, в том числе, например, бензоат натрия, бензоат калия, бензоат лития, бензоат кальция, бензоат магния, бензоат бериллия, бензоат бария, бензоат стронция, бензоат рубидия, бензоат цезия и/или любые их комбинации.В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоатную соль щелочного металла. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоат натрия или бензоат калия. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоат натрия.
[0051] В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль (например,бензоат натрия) и/или бензойная кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M. Например, бензоатная соль (например,бензоат натрия) и/или бензойная кислота может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,3 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,2 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,3 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,7 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,7 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,7 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,8 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,8 M до приблизительно 0,9 M или от приблизительно 0,9 M до приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль (например,бензоат натрия) и/или бензойная кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль (например,бензоат натрия) и/или бензойная кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,3 M.
[0052] В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль (например,бензоат натрия) и/или бензойная кислота присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M или 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль (например,бензоат натрия) и/или бензойная кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль (например,бензоат натрия) и/или бензойная кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,1 M или менее приблизительно 0,1 M, приблизительно 0,3 M или менее приблизительно 0,3 M, приблизительно 0,5 M или менее приблизительно 0,5 M, приблизительно 0,75 M или менее приблизительно 0,75 M или приблизительно 1,0 M или менее приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль (например,бензоат натрия) и/или бензойная кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M или менее приблизительно 0,5 M.
[0053] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, содержащему бензиловый спирт. Любые подходящие источник или форма бензилового спирта, известные в данной области техники, могут быть использованы в промывочных растворах по настоящему изобретению.
[0054] В некоторых вариантах осуществления бензиловый спирт присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,5% до приблизительно 4,0% объем/объем (об./об.). Например, бензиловый спирт может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,5% до приблизительно 4%, от приблизительно 1% до приблизительно 4%, от приблизительно 1,5% до приблизительно 4%, от приблизительно 2% до приблизительно 4%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 4%, от приблизительно 3% до приблизительно 4%, от приблизительно 3,5% до приблизительно 4%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 1% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 1,5% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 2% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 3% до приблизительно 3,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 3%, от приблизительно 1% до приблизительно 3%, от приблизительно 1,5% до приблизительно 3%, от приблизительно 2% до приблизительно 3%, от приблизительно 2,5% до приблизительно 3%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 2,5%, от приблизительно 1% до приблизительно 2,5%, от приблизительно 1,5% до приблизительно 2,5%, от приблизительно 2% до приблизительно 2,5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%, от приблизительно 1% до приблизительно 2%, от приблизительно 1,5% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5%, от приблизительно 1% до приблизительно 1,5% или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления бензиловый спирт присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 4% объем/объем (об./об.). В некоторых вариантах осуществления бензиловый спирт присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 2% объем/объем (об./об.).
[0055] В некоторых вариантах осуществления бензиловый спирт присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 0,5%, 0,75%, 1%, 1,25%, 1,5%, 1,75%, 2%, 2,25%, 2,5%, 2,75%, 3%, 3,25%, 3,5%, 3,75% или приблизительно 4% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления бензиловый спирт присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления бензиловый спирт присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 1% или менее приблизительно 1%, приблизительно 2% или менее приблизительно 2%, приблизительно 3% или менее приблизительно 3% или приблизительно 4% или менее приблизительно 4%. В некоторых вариантах осуществления бензиловый спирт присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 4% или менее приблизительно 4% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления бензиловый спирт присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 4% или менее приблизительно 2% (об./об.).
Добавки
[0056] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению дополнительно содержит одну или несколько (например,одну или несколько, две или более, три или более, четыре или более или все пять) из следующих добавок: бензолсульфонат, каприловая кислота, гексиленгликоль, соль, не являющаяся буферной, и/или креатин при любой из концентраций, описываемых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор, содержащий одну или несколько добавок, характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления включение одной или нескольких добавок в промывочный раствор дополнительно улучшает очистку полипептида, содержащего Fc-область, от одной или нескольких примесей (например,примесей клетки-хозяина) при проведении способов, описываемых в данном документе.
[0057] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт и одно из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. Например, промывочный раствор может содержать бензоатную соль и/или бензиловый спирт и бензолсульфонат; бензоатную соль и/или бензиловый спирт и каприловую кислоту; бензоатную соль и/или бензиловый спирт и гексиленгликоль; бензоатную соль и/или бензиловый спирт и соль, не являющуюся буферной; или бензоатную соль и/или бензиловый спирт и креатин при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0.
[0058] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт и два из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. Например, промывочный раствор может содержать бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат и каприловую кислоту; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат и гексиленгликоль; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, каприловую кислоту и гексиленгликоль; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, каприловую кислоту и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, каприловую кислоту и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, гексиленгликоль и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, гексиленгликоль и креатин; или бензоатную соль и/или бензиловый спирт, соль, не являющуюся буферной, и креатин при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0.
[0059] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт и три из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. Например, промывочный раствор может содержать бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, каприловую кислоту и гексиленгликоль; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, каприловую кислоту и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, каприловую кислоту и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, гексиленгликоль и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, гексиленгликоль и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, соль, не являющуюся буферной, и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, каприловую кислоту, гексиленгликоль и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, каприловую кислоту, гексиленгликоль и креатин; или бензоатную соль и/или бензиловый спирт, каприловую кислоту, соль, не являющуюся буферной, и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, гексиленгликоль, соль, не являющуюся буферной, и креатин при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0.
[0060] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт и четыре из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. Например, промывочный раствор может содержать бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, каприловую кислоту, гексиленгликоль и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, каприловую кислоту, гексиленгликоль и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, каприловую кислоту, соль, не являющуюся буферной, и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, бензолсульфонат, гексиленгликоль, соль, не являющуюся буферной, и креатин; или бензоатную соль и/или бензиловый спирт, каприловую кислоту, гексиленгликоль, соль, не являющуюся буферной, и креатин, при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0.
[0061] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт и все пять из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и креатина при показателе pH, составляющем от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0.
[0062] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, содержащему бензолсульфонат. Любые подходящие форма или источник бензолсульфоната, известные в данной области техники, могут быть использованы в промывочных растворах по настоящему изобретению, в том числе, например, бензолсульфонатная соль (например,соль щелочного металла), такая как бензолсульфонат натрия или бензолсульфонат калия, бензолсульфоновая кислота и/или любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления бензолсульфонат представляет собой бензолсульфонат натрия.
[0063] В некоторых вариантах осуществления бензолсульфонат (например,бензолсульфонат натрия) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M. Например, бензолсульфонат натрия может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,3 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,2 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,3 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,4 M или от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления бензолсульфонат натрия присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0, 1 M до приблизительно 0,3 M.
[0064] В некоторых вариантах осуществления бензолсульфонат натрия присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M или 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления бензолсульфонат натрия присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления бензолсульфонат натрия присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,1 M или менее приблизительно 0,1 M, приблизительно 0,3 M или менее приблизительно 0,3 M или приблизительно 0,5 M или менее приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления бензолсульфонат натрия присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M или менее приблизительно 0,5 M.
[0065] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, содержащему каприловую кислоту. Любые подходящие форма или источник каприловой кислоты, известные в данной области техники, могут быть использованы в промывочных растворах по настоящему изобретению.
[0066] В некоторых вариантах осуществления каприловая кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ. Например, каприловая кислота может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 20 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 20 мМ или от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления каприловая кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ.
[0067] В некоторых вариантах осуществления каприловая кислота присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ или 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления каприловая кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления каприловая кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 10 мМ или менее приблизительно 10 мМ, приблизительно 30 мМ или менее приблизительно 30 мМ или приблизительно 50 мМ или менее приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления каприловая кислота присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ или менее приблизительно 50 мМ.
[0068] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, содержащему гексиленгликоль. Любые подходящие форма или источник гексиленгликоля, известные в данной области техники, могут быть использованы в промывочных растворах по настоящему изобретению.
[0069] В некоторых вариантах осуществления гексиленгликоль присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (об./об.). Например, гексилен может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,5% до приблизительно 10%, от приблизительно 1% до приблизительно 10%, от приблизительно 2% до приблизительно 10%, от приблизительно 4% до приблизительно 10%, от приблизительно 6% до приблизительно 10%, от приблизительно 8% до приблизительно 10%, от приблизительно 9% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 9%, от приблизительно 1% до приблизительно 9%, от приблизительно 2% до приблизительно 9%, от приблизительно 4% до приблизительно 9%, от приблизительно 6% до приблизительно 9%, от приблизительно 8% до приблизительно 9%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 8%, от приблизительно 1% до приблизительно 8%, от приблизительно 2% до приблизительно 8%, от приблизительно 4% до приблизительно 8%, от приблизительно 6% до приблизительно 8%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 6%, от приблизительно 1% до приблизительно 6%, от приблизительно 2% до приблизительно 6%, от приблизительно 4% до приблизительно 6%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 4%, от приблизительно 1% до приблизительно 4%, от приблизительно 2% до приблизительно 4%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%, от приблизительно 1% до приблизительно 2% или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления гексиленгликоль присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1% до приблизительно 10% (об./об.).
[0070] В некоторых вариантах осуществления гексиленгликоль присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4%, 4,5%, 5%, 5,5%, 6%, 6,5%, 7%, 7,5%, 8%, 8,5%, 9%, 9,5% или 10% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления гексиленгликоль присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 10% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления гексиленгликоль присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 1% или менее приблизительно 1%, приблизительно 2% или менее приблизительно 2%, приблизительно 4% или менее приблизительно 4%, приблизительно 6% или менее приблизительно 6%, приблизительно 8% или менее приблизительно 8% или приблизительно 10% или менее приблизительно 10% (об./об.). В некоторых вариантах осуществления гексиленгликоль присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 10% или менее приблизительно 10% (об./об.).
[0071] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, содержащему одну или несколько (например,одну, две или более, три или болееи т. д.) солей, не являющихся буферными. Любые подходящие форма или источник соли, не являющейся буферной, известные в данной области техники, могут быть использованы в промывочных растворах по настоящему изобретению. Соли, не являющиеся буферными, могут включать соли галогенов (такие как содержащие Cl или Br), в частности, соли галогенов, содержащие щелочные металлы (такие как Na или K) или щелочноземельные металлы (такие как Ca или Mg). В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной, представляет собой хлорид натрия или хлорид калия. В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной, представляет собой хлорид натрия.
[0072] В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M. Например, соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,2 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 0,8 M или от приблизительно 0,8 M до приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1,0 M.
[0073] В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M или 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,1 M или менее приблизительно 0,1 M, приблизительно 0,2 M или менее приблизительно 0,2 M, приблизительно 0,4 M или менее приблизительно 0,4 M, приблизительно 0,5 M или менее приблизительно 0,5 M, приблизительно 0,6 M или менее приблизительно 0,6 M, приблизительно 0,8 M или менее приблизительно 0,8 M или приблизительно 1,0 M или менее приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M или менее приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления соль, не являющаяся буферной (например,хлорид натрия), присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 1,0 M или менее приблизительно 1,0 M.
[0074] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, содержащему креатин. Любые подходящие форма или источник креатина, известные в данной области техники, могут быть использованы в промывочных растворах по настоящему изобретению, в том числе, например, креатин-HCl, сложные эфиры креатина, креатина пируват, креатина фосфат, креатина альфа-кетоглутарат, креатина цитрат и/или любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления креатин представляет собой креатин-HCl.
[0075] В некоторых вариантах осуществления креатин присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ. Например, креатин может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ или от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления креатин присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления креатин присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления креатин присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ, 60 мМ, 65 мМ, 70 мМ, 75 мМ, 80 мМ, 85 мМ, 90 мМ, 95 мМ или 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления креатин присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ.
Аргинин
[0076] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, дополнительно содержащему аргинин и/или производное аргинина. В некоторых вариантах осуществления включение аргинина и/или производного аргинина в промывочный раствор дополнительно улучшает очистку полипептида, содержащего Fc-область, от одной или нескольких примесей (например,примесей клетки-хозяина) при проведении способов, описываемых в данном документе. Любые подходящие форма или источник аргинина и/или производного аргинина, известные в данной области техники, могут быть использованы в промывочных растворах по настоящему изобретению, в том числе, например, аргинин, аргинин-HCl, ацетиларгинин, агматин, аргининовая кислота, N-альфа-бутироил-L-аргинин, N-альфа-пивалоиларгинин и/или любые их комбинации.Аргинин и/или производное аргинина может представлять собой L-аргинин и/или D-аргинин и их производные. В некоторых вариантах осуществления аргинин и/или производное аргинина представляет собой аргинин-HCl.
[0077] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к применению аргинина и/или производного аргинина (например,аргинина-HCl) в промывочном растворе, содержащем бензоатную соль и/или бензиловый спирт. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl). В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензиловый спирт и аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl). В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль, бензиловый спирт и аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl). В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор дополнительно содержит одно или несколько (например,одно или несколько, два или более, три или более, четыре или более или все пять) из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина при любых из концентраций, описываемых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор, содержащий аргинин и/или производное аргинина, характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор, содержащий аргинин и/или производное аргинина, характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор, содержащий аргинин и/или производное аргинина, характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 5,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор, содержащий аргинин и/или производное аргинина, характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 8,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор, содержащий аргинин и/или производное аргинина, характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,0.
[0078] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) и одно из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина. Например, промывочный раствор может содержать бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и бензолсульфонат; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и каприловую кислоту; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и гексиленгликоль; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и соль, не являющуюся буферной; или бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и креатин.
[0079] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) и два из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина. Например, промывочный раствор может содержать бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат и каприловую кислоту; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат и гексиленгликоль; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, каприловую кислоту и гексиленгликоль; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, каприловую кислоту и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, каприловую кислоту и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, гексиленгликоль и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, гексиленгликоль и креатин; или бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, соль, не являющуюся буферной, и креатин.
[0080] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) и три из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина. Например, промывочный раствор может содержать бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, каприловую кислоту и гексиленгликоль; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, каприловую кислоту и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, каприловую кислоту и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, гексиленгликоль и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, гексиленгликоль и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, соль, не являющуюся буферной, и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, каприловую кислоту, гексиленгликоль и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, каприловую кислоту, гексиленгликоль и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, каприловую кислоту, соль, не являющуюся буферной, и креатин; или бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, гексиленгликоль, соль, не являющуюся буферной, и креатин.
[0081] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) и четыре из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и/или креатина. Например, промывочный раствор может содержать бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, каприловую кислоту, гексиленгликоль и соль, не являющуюся буферной; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, каприловую кислоту, гексиленгликоль и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, каприловую кислоту, соль, не являющуюся буферной, и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, бензолсульфонат, гексиленгликоль, соль, не являющуюся буферной, и креатин; бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин, каприловую кислоту, гексиленгликоль, соль, не являющуюся буферной, и креатин.
[0082] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоатную соль и/или бензиловый спирт, аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) и все пять из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля, соли, не являющейся буферной, и креатина.
[0083] В некоторых вариантах осуществления аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M. Например, аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,3 M, от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,2 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,2 M до приблизительно 0,3 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,3 M до приблизительно 0,4 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,4 M до приблизительно 0,5 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,5 M до приблизительно 0,6 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,6 M до приблизительно 0,7 M, от приблизительно 0,7 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,7 M до приблизительно 0,9 M, от приблизительно 0,7 M до приблизительно 0,8 M, от приблизительно 0,8 M до приблизительно 1,0 M, от приблизительно 0,8 M до приблизительно 0,9 M или от приблизительно 0,9 M до приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,3 M.
[0084] В некоторых вариантах осуществления аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,55 M, 0,6 M, 0,65 M, 0,7 M, 0,75 M, 0,8 M, 0,85 M, 0,9 M, 0,95 M или 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,1 M или менее приблизительно 0,1 M, приблизительно 0,2 M или менее приблизительно 0,2 M, приблизительно 0,3 M или менее приблизительно 0,3 M, приблизительно 0,4 M или менее приблизительно 0,4 M, приблизительно 0,5 M или менее приблизительно 0,5 M, приблизительно 0,75 M или менее приблизительно 0,75 M, или приблизительно 1,0 M или менее приблизительно 1,0 M. В некоторых вариантах осуществления аргинин и/или производное аргинина (например,аргинин-HCl) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M или менее приблизительно 0,5 M.
Показатель pH
[0085] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывочному раствору, характеризующемуся показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. Например, промывочный раствор может характеризоваться показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 10,0, от приблизительно 7,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 7,5 до приблизительно 10,0, от приблизительно 8,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 9,0 до приблизительно 10,0, от 4,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 9,0, от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 7,5 до приблизительно 9,0, от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,0, от 4,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,0, от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 7,5 до приблизительно 8,0, от 4,0 до приблизительно 7,5, от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,5, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,5, от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,5, от приблизительно 4,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 6,5 до приблизительно 7,0, от 4,0 до приблизительно 6,5, от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,5, от приблизительно 6,0 до приблизительно 6,5, от 4,0 до приблизительно 6,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0 или от приблизительно 4,0 до приблизительно 5,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 5,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 8,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,0.
[0086] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется любым показателем pH из приблизительно 4,0, 4,25, 4,5, 4,75, 5,0, 5,25, 5,5, 5,75, 6,0, 6,25, 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75, 8,0, 8,25, 8,5, 8,75, 9,0, 9,25, 9,5, 9,75 или 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 4,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 5,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 6,5. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,5. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 10,0.
Буферное средство
[0087] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению дополнительно содержит одно или несколько (например,одно или несколько, два или более, три или более, четыре или более, пять или болееи т. д.) буферных средств. Любое подходящее буферное средство, известное в данной области техники, может быть использовано в промывочных растворах по настоящему изобретению, в том числе, например, фосфат, трис(трис(гидроксиметил)метиламин), бис-трис, бис-триспропан, аргинин, гистидин, триэтаноламин, диэтаноламин, формиат, ацетат, карбонат MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), цитрат, HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота), бицин (N, N-бис(2-гидроксиэтил)глицин), трицин (N-трис(гидроксиметил)метилглицин), TES (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота), PIPES (пиперазин-N, N’-бис(2-этансульфоновая кислота), какодилат (диметиларсиновая кислота), SSC (солевой раствор цитрата натрия) и/или любые их комбинации.В некоторых вариантах осуществления буферное средство представляет собой одно или несколько из фосфата, триса, аргинина, ацетата и/или цитрата.
[0088] В некоторых вариантах осуществления буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ. Например, буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) может присутствовать в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ, от 10 мМ до приблизительно 500 мМ, от 50 мМ до приблизительно 500 мМ, от 100 мМ до приблизительно 500 мМ, от 150 мМ до приблизительно 500 мМ, от 200 мМ до приблизительно 500 мМ, от 250 мМ до приблизительно 500 мМ, от 300 мМ до приблизительно 500 мМ, от 350 мМ до приблизительно 500 мМ, от 400 мМ до приблизительно 500 мМ, от 450 мМ до приблизительно 500 мМ, от 1 мМ до приблизительно 450 мМ, от 1 мМ до приблизительно 400 мМ, от 1 мМ до приблизительно 350 мМ, от 1 мМ до приблизительно 300 мМ, от 1 мМ до приблизительно 250 мМ, от 1 мМ до приблизительно 200 мМ, от 1 мМ до приблизительно 150 мМ, от 1 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 25 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ или от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ.
[0089] В некоторых вариантах осуществления буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 1 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ, 60 мМ, 65 мМ, 70 мМ, 75 мМ, 80 мМ, 85 мМ, 90 мМ, 95 мМ или 100 мМ. В качестве альтернативы буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при любом значении концентрации из приблизительно 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ, 300 мМ, 350 мМ, 400 мМ, 450 мМ или 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 10 мМ или менее приблизительно 10 мМ, приблизительно 25 мМ или менее приблизительно 25 мМ, приблизительно 50 мМ или менее приблизительно 50 мМ, приблизительно 75 мМ или менее приблизительно 75 мМ, или приблизительно 100 мМ или менее приблизительно 100 мМ, или приблизительно 500 мМ или менее приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ или менее приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления буферное средство (например,фосфат, трис, аргинин, ацетат и/или цитрат) присутствует в промывочном растворе при концентрации, составляющей приблизительно 500 мМ или менее приблизительно 500 мМ.
Иллюстративные промывочные растворы
[0090] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия и/или бензиловый спирт и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и/или бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор дополнительно содержит фосфатный буфер (например,при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ).
[0091] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия, бензиловый спирт и/или хлорид натрия и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и/или хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор дополнительно содержит фосфатный буфер (например,при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ).
[0092] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия, бензиловый спирт, аргинин и/или хлорид натрия и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и/или хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор дополнительно содержит фосфатный буфер (например,при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ).
[0093] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия, бензиловый спирт, фосфатный буфер и/или аргинин и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), фосфатный буфер при концентрации, составляющей приблизительно 50 mM, и/или аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), фосфатный буфер при концентрации, составляющей приблизительно 50 mM, и аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 9,0.
[0094] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия, бензиловый спирт и/или аргинин и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и/или аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и аргинин при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 6,0.
[0095] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит гексиленгликоль, бензоат натрия и/или бензиловый спирт и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит гексиленгликоль при концентрации, составляющей приблизительно 10% (об./об.), бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и/или бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит гексиленгликоль при концентрации, составляющей приблизительно 10% (об./об.), бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0.
[0096] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензолсульфонат, бензоат натрия и/или бензиловый спирт и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензолсульфонат при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 М, бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и/или бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензолсульфонат при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 М, бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0.
[0097] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия, бензиловый спирт и/или аргинин (например,аргинин-HCl) и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 5,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и/или аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 5,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 5,0.
[0098] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия, бензиловый спирт и/или аргинин (например,аргинин-HCl) и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и/или аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 6,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 6,0.
[0099] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензиловый спирт и/или аргинин (например,аргинин-HCl) и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 5,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и/или аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 5,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 2% (об./об.), и аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 5,0.
[0100] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия, аргинин (например,аргинин-HCl), каприловую кислоту и/или хлорид натрия и характеризуется pH, составляющим приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, каприловую кислоту при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и/или хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, каприловую кислоту при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 9,0.
[0101] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия, аргинин (например,аргинин-HCl), каприловую кислоту и/или хлорид натрия и характеризуется pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, каприловую кислоту при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и/или хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, аргинин (например,аргинин-HCl) при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, каприловую кислоту при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0.
[0102] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензоат натрия и/или бикарбонат натрия и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и/или бикарбонат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензоат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и бикарбонат натрия при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 10,0.
[0103] В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор по настоящему изобретению содержит бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 4% (об./об.), и характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 10. В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор содержит бензиловый спирт при концентрации, составляющей приблизительно 4% (об./об.), и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 9,0.
Корректирование собранного материала, который содержит полипептид, содержащий Fc-область, до проведения хроматографии
[0104] Согласно одному аспекту представлен способ очистки полипептида, содержащего Fc-область, предусматривающий стадии: (A) корректирования (A) корректирования собранного материала, содержащего полипептид, содержащий Fc-область, с достижением конечной концентрации бензоатной соли, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M, и показателя pH, составляющего от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0, с получением образца, содержащего (i) полипептид, содержащий Fc-область, и (ii) одну или несколько примесей; и (B) приведения в контакт образца с по меньшей мере одной матрицей для хроматографии. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна матрица для хроматографии представляет собой матрицу для аффинной хроматографии, например, матрицу для хроматографии на основе связывания с белком А и/или матрицу для хроматографии на основе связывания с белком G. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию приведения в контакт по меньшей мере одной матрицы для хроматографии с по меньшей мере одним промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию приведения в контакт по меньшей мере одной матрицы для хроматографии с элюирующим раствором. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию сбора элюата, содержащего полипептид, содержащий Fc-область.
[0105] В некоторых вариантах осуществления термин “собранный материал/собираемый материал” относится к жидкости, присутствующей в конце культивирования клеток или после культивирования клеток, например,к образцу клеточного лизата или образцу супернатанта клеточной культуры (например,супернатанта клеток, таких как клетки CHO, сконструированные для продуцирования и секреции полипептида). В некоторых вариантах осуществления собранный материал содержит интактные клетки-хозяева и/или клеточный дебрис. В некоторых вариантах осуществления собранный материал не содержит интактные клетки-хозяева и/или клеточный дебрис. Например, в некоторых вариантах осуществления жидкость, присутствующую в конце культивирования клеток или после культивирования клеток, подвергают одной или нескольким стадиям центрифугирования и/или фильтрации до корректирования с достижением конечной концентрации бензоатной соли, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 0,5 M, и показателя pH, составляющего от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0. В некоторых вариантах осуществления собранный материал получают из жидкости, присутствующей в конце культивирования клеток или после культивирования клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления жидкость, присутствующую в конце культивирования клеток или после культивирования клеток, подвергают одной или нескольким стадиям предварительной обработки с целью оптимизации отделения клеток и/или очистки полипептида, содержащего Fc-область.
[0106] Согласно родственному аспекту любой из способов очистки полипептида, содержащего Fc-область, описываемый в данном документе, дополнительно предусматривает стадию корректирования собранного материала, который содержит полипептид, содержащий Fc-область, с достижением конечной концентрации бензоатной соли, составляющей от 0,1 M до приблизительно 0,5 M, и показателя pH, составляющего от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0, с получением образца, содержащего (i) полипептид, содержащий Fc-область, и (ii) одну или несколько примесей.
[0107] В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоатную соль щелочного металла. В некоторых вариантах осуществления бензоатная соль представляет собой бензоат натрия. В некоторых вариантах осуществления собранный материал корректируют с достижением конечной концентрации бензоатной соли (например, бензоата натрия) из любого значений из приблизительно 0,025 M, 0,05 M, 0,075 M, 0,1 M, 0,125 M, 0,15 M, 0,175 M, 0,2 M, 0,225 M, 0,25 M, 0,275 M, 0,3 M, 0,325 M, 0,35 M, 0,375 M, 0,4 M, 0,425 M, 0,45 M, 0,475 M, 0,5 M, 0,525 M, 0,55 M, 0,575 M, 0,6 M, 0,625 M, 0,65 M, 0,675 M, 0,7 M, 0,725 M, 0,75 M, 0,775 M или 0,8 M, включая любой диапазон между этими значениями. В некоторых вариантах осуществления показатель pH собранного материала корректируют с достижением любого значения из приблизительно 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 или 10,0, включая любой диапазон между данными значениями. В некоторых вариантах осуществления собранный материал осветляют перед корректированием (например, добавлением бензоата натрия и корректированием показателя pH). В некоторых вариантах осуществления собранный материал осветляют после корректирования (например, добавлением бензоата натрия и корректированием показателя pH).
[0108] В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает корректирование собранного материала с достижением конечной концентрации бензоата натрия, составляющей приблизительно 0,5 M, и показателя pH, составляющего приблизительно 7. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает корректирование собранного материала с достижением конечной концентрации бензоата натрия, составляющей приблизительно 0,1 M, и показателя pH, составляющего приблизительно 9. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает корректирование собранного материала с достижением конечной концентрации бензоата натрия, составляющей приблизительно 0,2 M, и показателя pH, составляющего 9. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает корректирование собранного материала с достижением конечной концентрации бензоата натрия, составляющей приблизительно 0,3 M, и показателя pH, составляющего 9. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает корректирование собранного материала с достижением конечной концентрации бензоата натрия, составляющей приблизительно 0,4 M, и показателя pH, составляющего 9. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает корректирование собранного материала с достижением конечной концентрации бензоата натрия, составляющей приблизительно 0,5 M, и показателя pH, составляющего 9.
[0109] В некоторых вариантах осуществления корректирование собранного материала (например, за счет добавления бензоата натрия и корректирования показателя pH) обеспечивает в результате полипептид, содержащий Fc-область, очищенный от одной или нескольких примесей до более высокой степени, чем обеспечивает соответствующий способ, в котором отсутствует стадия корректирования собранного материала, содержащего полипептид, содержащий Fc-область, с получением образца. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько примесей представляют собой белки клетки-хозяина (HCP), такие как фосфолипазы, кластерин, сериновые протеазы, факторы элонгации и любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления HCP представляет собой белок 2, подобный гипотетической фосфолипазе В (PLBL2).
[0110] В некоторых вариантах осуществления подвергнутый корректированию собранный материал (например, в который добавили бензоат натрия с достижением конечной концентрации, описываемой в данном документе, и показатель pH которого корректировали так, как это описано в данном документе) содержит или представляет собой образец, содержащий (i) полипептид, содержащий Fc-область, и (ii) одну или несколько примесей. В некоторых вариантах осуществления образец приводят в контакт с по меньшей мере одной матрицей для хроматографии (например, образец подвергают по меньшей мере одной стадии хроматографии). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна матрица для хроматографии предусматривает любую одну или несколько из матрицы для аффинной хроматографии, матрицы для хроматографии со смешанным режимом (например, матрицы для хроматографии на мультимодальной разделительной матрице), матрицы для хроматографии с гидрофобным взаимодействием (HIC), матрицы для анионообменной хроматографии, матрицы для катионообменной хроматографии, матрицы для эксклюзионной хроматографии, матрицы для хроматографии с керамическим гидроксиапатитом (CHT) и/или матрицы для жидкостной хроматографии с гидрофильным взаимодействием (HILIC) и т. д.в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления образец приводят в контакт с матрицей для аффинной хроматографии, например, матрицей, содержащей белок А, или матрицей, содержащей белок G. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию приведения в контакт по меньшей мере одной матрицы для хроматографии с по меньшей мере одним промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию приведения в контакт по меньшей мере одной матрицы для хроматографии с элюирующим раствором. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает стадию сбора элюата, содержащего полипептид, содержащий Fc-область.
Удаление примеси
[0111] Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к способам очистки полипептида, содержащего Fc-область, посредством хроматографии на основе связывания с белком А с помощью промывки матрицы, содержащей белок А, связанный с полипептидом, содержащим Fc-область (например,антителом), промывочным раствором, содержащим бензоатную соль и/или бензиловый спирт, для улучшения очистки полипептида от одной или нескольких примесей. В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает стадии приведения в контакт матрицы для хроматографии на основе связывания с белком А с образцом, содержащим (1) полипептид, содержащий Fc-область (например,антитело), и (2) одну или несколько примесей (например,примесей клетки-хозяина), при условии связывания полипептида, содержащего Fc-область (например,антитела), с белком A и промывки матрицы промывочным раствором, содержащим бензоатную соль при концентрации, составляющей от приблизительно 0,1 M до приблизительно 1,0 M, и/или бензиловый спирт при концентрации, составляющей от приблизительно 0,5% до приблизительно 4% объем/объем (об./об.), где промывочный раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 10,0. В некоторых вариантах осуществления промывка матрицы, содержащей белок А, промывочным раствором обеспечивает в результате полипептид, содержащий Fc-область, очищенный от одной или нескольких примесей до более высокой степени, чем обеспечивает соответствующий способ (описанный выше), в котором отсутствует стадия промывки матрицы промывочным раствором.
таблице A
[0112] Стандартный способ на основе связывания с белком А обычно обеспечивает чистоту продукта приблизительно 95% без применения стадии промывки, описываемой в данном документе. Наибольшие доли примесей в продукте обусловлены высокомолекулярными агрегатами (HMW) и/или фрагментами низкомолекулярного продукта (LMW). Данные варианты продукта считают примесями из-за их способности отделяться от продукта, что обусловлено различными параметрами (например,зарядом, гидрофобностью, отличиями по размеруи т. д.). Данные HMW- и LMW-примеси составляют приблизительно 4-5% пула белка A. Кроме того, стандартный способ на основе связывания с белком А, в котором не используют стадию промывки, описываемую в данном документе, также, как правило, приводит в результате к включению примесей белка клетки-хозяина (HCP) порядка 1000 ppm или ~0,1% пула продукта. Однако из-за спецификаций, установленных для инъекционных продуктов на основе mAb (см., например,рекомендации FDA), снижение и/или полное удаление этого 0,1% примесей HCP имеет большое значение. Включение стадии применения промывочного раствора, описываемого в данном документе, может снизить количество HCP, присутствующих в пуле, до ~100-10 ppm (снижение HCP в 10-100 раз по сравнению с тем же способом на основе связывания с белком A, в котором отсутствует стадия промывки, описываемая в данном документе), что составляет 90-99% относительного улучшения. Способы измерения чистоты и/или уровней примеси образца белка (например,с помощью анализа ELISA) обычно известны специалисту в данной области техники. Иллюстративная очистка моноклонального антитела (mAb) от одного или нескольких белков клетки-хозяина с использованием стандартного способа по сравнению с любым из способов, описываемых в данном документе, показана в  ниже.
Таблица A. Иллюстративный способ очистки
<b>Состав (после белка A)</b>
<b>HCP</b>
<b>mAb</b>
<b>Условие:</b>
ppm:
%
%
Стандартное
1000
0,10
94,90
С включением стадии промывки (описываемой в данном документе)
100
0,01
94,99
Изменение (%)
90
90
0,09
[0113] В некоторых вариантах осуществления способы, описываемые в данном документе, дают пул белков содержащий полипептид, содержащий Fc-область (например,моноклональное антитело), после элюирования белка А, который содержит менее приблизительно 500 ppm (частей на миллион) HCP (например,одного или несколько HCP из клетки CHO). Например, пул белков, содержащий полипептид, содержащий Fc-область, полученный способами, описываемыми в данном документе, может содержать менее приблизительно 500 ppm, менее приблизительно 450 ppm, менее приблизительно 400 ppm, менее приблизительно 350 ppm, менее приблизительно 300 ppm, менее приблизительно 250 ppm, менее приблизительно 200 ppm, менее приблизительно 150 ppm, менее приблизительно 100 ppm, менее приблизительно 75 ppm, менее приблизительно 50 ppm, менее приблизительно 25 ppm, менее приблизительно 10 ppm или менее приблизительно 1 ppm HCP (например,одного или нескольких HCP из клетки CHO). В некоторых вариантах осуществления пул белков, содержащий полипептид, содержащий Fc-область, полученный способами, описываемыми в данном документе, содержит менее приблизительно 100 ppm HCP (например,одного или нескольких HCP из клетки CHO). В некоторых вариантах осуществления пул белков, содержащий полипептид, содержащий Fc-область, полученный способами, описываемыми в данном документе, содержит менее приблизительно 10 ppm HCP (например,одного или нескольких HCP из клетки CHO).
[0114] В некоторых вариантах осуществления способы, описываемые в данном документе, дают пул белков содержащий полипептид, содержащий Fc-область (например,моноклональное антитело), после элюирования белка А, который содержит менее приблизительно 0,1% HCP (например,одного или несколько HCP из клетки CHO). Например, пул белков, содержащий полипептид, содержащий Fc-область, полученный способами, описываемыми в данном документе, может содержать менее приблизительно 0,1%, менее приблизительно 0,09%, менее приблизительно 0,08%, менее приблизительно 0,07%, менее приблизительно 0,06%, менее приблизительно 0,05%, менее приблизительно 0,04%, менее приблизительно 0,03%, менее приблизительно 0,02% или менее приблизительно 0,01% HCP (например,одного или нескольких HCP из клетки CHO). В некоторых вариантах осуществления пул белков, содержащий полипептид, содержащий Fc-область, полученный способами, описываемыми в данном документе, содержит менее приблизительно 0,05% HCP (например,одного или нескольких HCP из клетки CHO). В некоторых вариантах осуществления пул белков, содержащий полипептид, содержащий Fc-область, полученный способами, описываемыми в данном документе, содержит менее приблизительно 0,01% HCP (например,одного или нескольких HCP из клетки CHO).
[0115] В некоторых вариантах осуществления способы, описываемые в данном документе, обеспечивают снижение количества и/или концентрации (например,в частях на миллион) одной или нескольких примесей (например,одного или нескольких HCP, таких как один или несколько HCP из клетки CHO) при совместной очистке с полипептидом, содержащим Fc-область, на по меньшей мере приблизительно 10% по сравнению с количеством одной или нескольких примесей при совместной очистке с полипептидом, содержащим Fc-область, очищенным соответствующим способом без стадии промывки матрицы, содержащей белок А, промывочным раствором.Например, способы, описываемые в данном документе, снижают количество и/или концентрацию (например,в частях на миллион) одной или нескольких примесей (например,одного или нескольких HCP, таких как один или несколько HCP из клетки CHO) при совместной очистке с полипептидом, содержащим Fc-область, на по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95% или по меньшей мере приблизительно 99% по сравнению с количеством одной или нескольких примесей при совместной очистке с полипептидом, содержащим Fc-область, очищенным соответствующим способом без стадии промывки матрицы, содержащей белок А, промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления способы, описываемые в данном документе, снижают количество и/или концентрацию (например,в частях на миллион) одной или нескольких примесей (например,одного или нескольких HCP, таких как один или несколько HCP из клетки CHO) при совместной очистке с полипептидом, содержащим Fc-область, в по меньшей мере приблизительно 1,5 раза по сравнению с количеством одной или нескольких примесей при совместной очистке с полипептидом, содержащим Fc-область, очищенным соответствующим способом без стадии промывки матрицы, содержащей белок А, промывочным раствором. Например, способы, описываемые в данном документе, снижают количество и/или концентрацию (например,в частях на миллион) одной или нескольких примесей (например,одного или нескольких HCP, таких как один или несколько HCP из клетки CHO) при совместной очистке с полипептидом, содержащим Fc-область, в по меньшей мере приблизительно 1,5 раза, по меньшей мере приблизительно 2 раза, по меньшей мере приблизительно 2,5 раза, по меньшей мере приблизительно 3 раза, по меньшей мере приблизительно 3,5 раза, по меньшей мере приблизительно 4 раза, по меньшей мере приблизительно 4,5 раза, по меньшей мере приблизительно 5 раз, по меньшей мере приблизительно 5,5 раза, по меньшей мере приблизительно 6 раз, по меньшей мере приблизительно 6,5 раза, по меньшей мере приблизительно 7 раз, по меньшей мере приблизительно 7,5 раза, по меньшей мере приблизительно 8 раз, по меньшей мере приблизительно 8,5 раза, по меньшей мере приблизительно 9 раз, по меньшей мере приблизительно 9,5 раза, по меньшей мере приблизительно 10 раз, по меньшей мере приблизительно 50 раз или по меньшей мере приблизительно 100 раз по сравнению с количеством одной или нескольких примесей при совместной очистке с полипептидом, содержащим Fc-область, очищенным соответствующим способом без стадии промывки матрицы, содержащей белок А, промывочным раствором.
Дополнительные стадии
[0116] В некоторых вариантах осуществления способы, описываемые в данном документе, дополнительно предусматривают одну или несколько дополнительных стадий промывки. В некоторых вариантах осуществления способы, описываемые в данном документе, дополнительно предусматривают одну или несколько стадий элюирования. В некоторых вариантах осуществления способы, описываемые в данном документе, дополнительно предусматривают одну или несколько стадий промывки и одну или несколько стадий элюирования.
[0117] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывке матрицы, содержащей белок А, первым раствором перед промывкой матрицы промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления матрицу промывают первым раствором один или несколько (например,один или несколько, два или более, три или более, четыре или более, пять или болееи т. д.) раз до промывки матрицы промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления матрицу промывают однократно первым раствором до промывки матрицы промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит буфер. Любой подходящий буфер, известный данной области техники, может быть использован в первом растворе, в том числе, например, фосфат, трис(трис(гидроксиметил)метиламин), ацетат, карбонат, цитрат, бис-трис, бис-триспропан, аргинин, гистидин, триэтаноламин, диэтаноламин, формиат, MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота), бицин (N, N-бис(2-гидроксиэтил)глицин), трицин (N-трис(гидроксиметил)метилглицин), TES (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота), PIPES (пиперазин-N, N’-бис(2-этансульфоновая кислота), какодилат (диметиларсиновая кислота), SSC (солевой раствор цитрата натрия) и/или любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит фосфатный буфер, трис-буфер, ацетатный буфер, карбонатный буфер и/или цитратный буфер. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит фосфатный буфер. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит один или несколько дополнительных компонентов (например,бензоатную соль, бензиловый спирт, одну или несколько добавок, описываемых в данном документе,и т. д.). В некоторых вариантах осуществления первый раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 10,0 (например,от приблизительно 6,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 7,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 7,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 8,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 8,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 9,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0 или от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0). В некоторых вариантах осуществления первый раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0.
[0118] В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит буфер при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ. Например, первый раствор может содержать буфер при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 250 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 300 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 350 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 400 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 450 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 40 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит буфер при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ.
[0119] В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит буфер при любом значении концентрации из приблизительно 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мM, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ, 60 мМ, 65 мМ, 70 мМ, 75 мМ, 80 мМ, 85 мМ, 90 мМ, 95 мМ или 100 мМ. В качестве альтернативы первый раствор содержит буфер при любом значении концентрации из приблизительно 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ, 300 мМ, 350 мМ, 400 мМ, 450 мМ или 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит буфер при концентрации, составляющей приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит буфер при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит фосфатный буфер при концентрации, составляющей приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит фосфатный буфер при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ.
[0120] В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит фосфатный буфер (например,фосфат натрия) и хлорид натрия. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит фосфатный буфер (например,фосфат натрия) и хлорид натрия и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит фосфатный буфер (например,фосфат натрия) при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M. В некоторых вариантах осуществления первый раствор содержит фосфатный буфер (например,фосфат натрия) при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и хлорид натрия при концентрации, составляющей приблизительно 0,5 M, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0.
[0121] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к промывке матрицы, содержащей белок А, вторым раствором после промывки матрицы промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления матрицу промывают вторым раствором один или несколько (например,один или несколько, два или более, три или более, четыре или более, пять или болееи т. д.) раз после промывки матрицы промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления матрицу промывают однократно вторым раствором после промывки матрицы промывочным раствором. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит буфер. Любой подходящий буфер, известный данной области техники, может быть использован во втором растворе, в том числе, например, фосфат, трис(трис(гидроксиметил)метиламин), ацетат, карбонат, цитрат, бис-трис, бис-триспропан, аргинин, гистидин, триэтаноламин, диэтаноламин, формиат, MES (2-(N-морфолино)этансульфоновая кислота), HEPES (4-2-гидроксиэтил-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), MOPS (3-(N-морфолино)пропансульфоновая кислота), TAPS (3-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}пропансульфоновая кислота), бицин (N, N-бис(2-гидроксиэтил)глицин), трицин (N-трис(гидроксиметил)метилглицин), TES (2-{[трис(гидроксиметил)метил]амино}этансульфоновая кислота), PIPES (пиперазин-N, N’-бис(2-этансульфоновая кислота), какодилат (диметиларсиновая кислота), SSC (солевой раствор цитрата натрия) и/или любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит фосфатный буфер, трис-буфер, ацетатный буфер, карбонатный буфер и/или цитратный буфер. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит фосфатный буфер.В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит по сути низкое количество соли или не содержит соль. В некоторых вариантах осуществления второй раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,0 (например,от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 7,0 до приблизительно 8,0, от приблизительно 4,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 6,0 до приблизительно 7,0, от приблизительно 4,0 до приблизительно 6,0, от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0 или от приблизительно 4,0 до приблизительно 5,0). В некоторых вариантах осуществления второй раствор характеризуется показателем pH, составляющим от приблизительно 5,0 до приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления второй раствор характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит по сути низкое количество соли. В некоторых вариантах осуществления второй раствор не содержит соль.
[0122] В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит буфер при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ. Например, второй раствор может содержать буфер при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 100 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 150 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 200 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 250 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 300 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 350 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 400 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 450 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 450 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 400 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 350 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 300 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 200 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 75 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 60 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 50 мМ до приблизительно 60 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 40 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 40 мМ, от приблизительно 25 мМ до приблизительно 40 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит буфер при концентрации, составляющей от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ или от приблизительно 10 мМ до приблизительно 500 мМ.
[0123] В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит буфер при любом значении концентрации из приблизительно 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мM, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ, 55 мМ, 60 мМ, 65 мМ, 70 мМ, 75 мМ, 80 мМ, 85 мМ, 90 мМ, 95 мМ или 100 мМ. В качестве альтернативы второй раствор содержит буфер при любом значении концентрации из приблизительно 150 мМ, 200 мМ, 250 мМ, 300 мМ, 350 мМ, 400 мМ, 450 мМ или 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит буфер при концентрации, составляющей приблизительно 500 мМ. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит буфер при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ.
[0124] В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит фосфатный буфер (например,фосфат натрия). В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит фосфатный буфер (например,фосфат натрия) и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит фосфатный буфер (например,фосфат натрия) при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления второй раствор содержит фосфатный буфер (например,фосфат натрия) при концентрации, составляющей приблизительно 50 мМ, и характеризуется показателем pH, составляющим приблизительно 7,0.
[0125] В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению касаются промывки матрицы, содержащей белок А, промывочным раствором и не включают стадию промывки матрицы первым раствором (до промывочного раствора) или вторым раствором (после промывочного раствора). В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению касаются промывки матрицы, содержащей белок А, первым раствором с последующей промывкой матрицы промывочным раствором и не включают стадию промывки матрицы вторым раствором (после промывочного раствора). В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению касаются промывки матрицы, содержащей белок А, промывочным раствором с последующей промывкой матрицы вторым раствором и не включают стадию промывки матрицы первым раствором (до промывочного раствора). В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению касаются промывки матрицы, содержащей белок А, первым раствором с последующей промывкой матрицы промывочным раствором, а затем промывкой матрицы вторым раствором.
[0126] В некоторых вариантах осуществления матрицу, содержащую белок А, приводят в контакт с элюирующим раствором один или несколько (например,один или несколько, два или более, три или более, четыре или более, пять или болееи т. д.) раз после одной или нескольких стадий промывки. В некоторых вариантах осуществления матрицу однократно приводят в контакт с элюирующим раствором. Любой раствор, известный в данной области техники, подходящий для элюирования полипептида, связанного с матрицей, содержащей белок А, может быть использован в качестве элюирующего раствора в способах по настоящему изобретению (например,элюирующий раствор, содержащий 40 мМ ацетата натрия и характеризующийся показателем pH, составляющим приблизительно 3,1). В некоторых вариантах осуществления элюирующий раствор дополнительно содержит один или несколько дополнительных компонентов (например,аргинин при любых значениях концентрации, описываемых в данном документе). В некоторых вариантах осуществления элюат, содержащий полипептид, содержащий Fc-область, собирают после приведения в контакт матрицы с элюирующим раствором. В некоторых вариантах осуществления два или более элюата, содержащих полипептид, содержащий Fc-область, собирают после приведения два или более раз в контакт матрицы с элюирующим раствором. В некоторых вариантах осуществления два или более элюата объединяют после элюирования. В некоторых вариантах осуществления элюат (элюаты) фильтруют. Может быть использован любой подходящий способ фильтрования элюата, известный в данной области техники, в том числе, например, посредством глубинного фильтрования. В некоторых вариантах осуществления элюат (элюаты) фильтруют посредством глубинного фильтрования.
[0127] В некоторых вариантах осуществления элюаты, полученные из матрицы, содержащей белок А, как описывается в данном документе, могут быть дополнительно подвергнуты обработке и/или очищены (например,с использованием дополнительной стадии хроматографии и/или фильтрации (например, путем применения одной или нескольких из ионообменной хроматографии, хроматографии со смешанным режимом, аффинной хроматографии, хроматографии с гидрофобным взаимодействием, аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов, эксклюзионной хроматографии, диафильтрации, ультрафильтрации и/или фильтрации с удалением вирусов)), и/или составлены (например,с получением фармацевтического состава, подходящего для введения нуждающемуся в этом субъекту (такому как субъект-человек)).
[0128] Приведенное выше описание считается достаточным для того, чтобы позволить специалисту в данной области техники осуществить настоящее изобретение. Следующие примеры предлагаются исключительно для иллюстративных целей и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В действительности, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в данном документе, станут очевидными для специалистов в данной области техники из предшествующего описания и попадают в объем прилагаемой формулы изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Промывочные растворы для улучшенного или усиленного удаления примесей в ходе очистки антитела
[0129] В следующем примере описано применение различных комбинаций бензоата натрия и бензилового спирта в промежуточных промывочных растворах для улучшенного/усиленного удаления примесей в ходе хроматографии на основе связывания с белком А.
Материалы и способы
Получение образцов
[0130] Получали два отдельных собранных материала с человеческим моноклональным антителом для хроматографии на основе связывания с белком А следующим образом: собранный материал получали в суспензионной культуре рекомбинантных клеток яичника китайского хомячка (CHO), сконструированных для конститутивной экспрессии любого из антител. Рекомбинантный продукт секретировался в культуральную среду, которую затем центрифугировали и осветляли глубинным фильтрованием для последующей обработки. Осветленный собранный материал фильтровали с помощью 0,22 мкм полиэфирсульфонового (PES) фильтра перед загрузкой в колонку с белком А.
Хроматография на основе связывания с белком A
TM
[0131] Смолу/колонки с белком А готовили следующим образом: смолу для хроматографии на основе связывания с белком А MabSelect Sure LX (GE Healthcare Life Sciences; № по каталогу 17-5474) подвергали реакции обмена путем гравитационного осаждения с помощью 0,5 M раствора хлорида натрия. Колонки заполняли с использованием AKTA Pure или AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences) с использованием либо (A) колонки диаметром 1,0 см (Essential Life Solutions 10/250 Snap Column; № по каталогу S10/250-PPSL-OE-FP10), либо (B) колонки диаметром 0,66 см (Omnifit 6,6/100; № по каталогу 006BCC0610FF). Смолой заполняли до высоты слоя 20 см ± 10% для колонки (A) или до высоты слоя 5 см ± 10% для колонки (B). Оценивание качества колонки проводили с использованием введения 1% объема колонки 1,0 M раствора хлорида натрия в колонку, уравновешенную в 0,1 M растворе хлорида натрия, и проводимость следов анализировали с использованием программного обеспечения Unicorn Evaluation. Эффективность колонки должна составлять по меньшей мере 775 теоретических тарелок на метр и должна демонстрировать асимметрию 0,8-1,8.
[0132] Перед загрузкой собранного материала колонки промывали обратно осмотической деионизированной водой для удаления буфера для хранения из 20% этанола. Затем колонку промывали 0,5 M уксусной кислотой для обеспечения удаления любых связанных веществ перед уравновешиванием. Колонку уравновешивали 50 мМ фосфатным буфером с 0,5 М хлоридом натрия до тех пор, пока показатель pH колонки не составил > 6,5.
таблице 1
[0133] Подготовленные образцы затем загружали в колонки с белком А. Колонки загружали либо mAb A (подтип IgG1), либо mAb B (подтип IgG4) до целевого значения 40 г/л смолы. Загруженные колонки промывали, как описано выше, раствором фосфатного буфера, содержащим 50 мМ фосфат и 0,5 M хлорид натрия.Затем колонки промывали тестируемым промывочным раствором с последующей промывкой бессолевым буферным раствором при рН 7. Наконец, антитело элюировали из колонки с использованием раствора, содержащего 40 мМ ацетат натрия, при pH 3,1. В  ниже представлен иллюстративный способ хроматографии.
Таблица 1. Описание способа колоночной хроматографии
<b>Стадия</b>
<b>Буфер/раствор</b>
<b>Направление потока</b>
<b>Время удержи-вания (минуты)</b>
<b>Объем (CV)</b>
Промывание
Вода для инъекции (WFI)
Нисходящий поток
8
2,5
Cтриппинг
0,5 M уксусная кислота
Нисходящий поток
5
2
Уравновешивание
50 мМ фосфат натрия, 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0
Нисходящий поток
5
3
Загрузка
Собранный материал mAb, отфильтрованный через 0,22 мкм фильтр
Нисходящий поток
5
Промывка 1
50 мМ фосфат натрия, 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0
Нисходящий поток
5
3
Промывка 2
Тестируемый раствор
Нисходящий поток
5
2
Промывка 3
50 мМ фосфат натрия, pH 7,0
Нисходящий поток
5
3
Элюирование
40 мМ ацетат натрия, pH 3,1
Нисходящий поток
5
2
Cтриппинг
0,5 M уксусная кислота
Нисходящий поток
5
3
Последующее уравновешивание
50 мМ фосфат натрия, 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0
Восходящий поток
5
3
Обеззараживание
0,5 M гидроксид натрия
Восходящий поток
5
3
Последующее уравновешивание
50 мМ фосфат натрия, 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0
Восходящий поток
5
2
Хранение
20% этанол
Восходящий поток
8
2
Выявление белка клетки-хозяина
го
[0134] После элюирования образцы антитела тестировали в отношении присутствия примесей белка клетки-хозяина (HCP) с использованием набора CHO HCP ELISA 3 поколения (Cygnus Technologies) в соответствии с протоколом изготовителя. ELISA HCP проводили при разведениях от 1:400 до 1:800 и поглощение считывали при 450/600 нм с использованием устройства для считывания планшетов Spectramax Plus 384.
Выявление специфического “HCP-A”
[0135] Концентрацию специфического HCP (HCP-A) определяли количественно в элюированных образцах антитела с использованием коммерчески доступного набора Hamster (CHO) ELISA (ICL Labs) в соответствии с протоколом изготовителя. ELISA HCP-А проводили при разбавлениях от 1:100 до 1:800 и поглощение считывали при 450 нм с использованием устройства для считывания планшетов Spectramax Plus 384.
Результаты
см.
таблицу 1
фиг. 1
фиг. 1
[0136] Было показано, что белки клеток-хозяев (HCP) элюируются совместно с моноклональными антителами (mAb), что может представлять собой проблему для последующего применения данных антител. Для идентификации потенциальных промывочных добавок, способных снизить количество загрязняющих HCP, которые элюируются совместно с представляющим интерес mAb, в 1,7 мл колонку для хроматографии на основе связывания с белком А загружали образец, содержащий секретируемое человеческое моноклональное антитело IgG1 (mAb A), собранный из клеток СНО, который был и центрифугирован, и осветлен с помощью глубинного фильтрования перед последующей обработкой (). Колонки сначала промывали раствором фосфатного буфера. Затем колонки промывали одним из ряда тестируемых промывочных растворов, содержащих 50 мМ фосфат и добавку, либо по отдельности, либо в комбинации с бензоатом натрия, бензиловым спиртом и аргинином, при рН 7,0 (). В контрольные прогоны не включали никакой добавки для промывки. После тестируемых промывок колонки промывали бессолевым 50 мМ фосфатом, pH 7,0. Наконец, моноклональное антитело элюировали из колонки и рН доводили до рН 6,0 с использованием 2 М трис-основания. После корректирования пулы элюата фильтровали с использованием 0,22 мкм PES-фильтра и тестировали в отношении присутствия примесей HCP (). Интересно, что промывки, содержащие 2% бензиловый спирт и/или 0,5 М бензоат натрия, эффективно снижали уровни загрязняющих HCP в образцах элюированных антител. Также отмечали, что включение аргинина в промывку улучшает очистку от HCP.
таблице 2
[0137] Затем исследовали специфического присутствие HCP-A в антителах, элюированных из колонок с белком A. Исследуемые и контрольные промывочные растворы, используемые в данном эксперименте, показаны в  ниже.
Таблица 2. Тестируемые промывочные растворы
<b>Тестируемый раствор:</b>
<b>Компоненты:</b>
<b>pH:</b>
Контроль
Без дополнительной промывки
7,0
1
2% бензиловый спирт; 0,5 M бензоат натрия
7,0
2
2% бензиловый спирт; 0,5 M бензоат натрия; 0,5 M аргинин
6,0
3
0,5 M бензолсульфонат; 0,5 M бензоат натрия; 2% бензиловый спирт
7,0
4
50 мМ каприловая кислота; 0,5 M бензоат натрия; 0,5 M аргинин, 0,5 M хлорид натрия
9,0
5
10% гексиленгликоль; 2% бензиловый спирт; 0,5 M бензоат натрия
7,0
6
2% бензиловый спирт; 0,5 M бензоат натрия; 0,5 M аргинин
6,0
7
2% бензиловый спирт; 0,5 M аргинин
5,0
8
0,5 M бензоат натрия, 50 мМ бикарбонат натрия
10,0
9
2% бензиловый спирт, 0,5 M бензоат натрия, 0,5 M аргинин, 40 мМ фосфат натрия
9,0
таблице 1
таблице 2
фиг. 2A
[0138] Продемонстрировав способность комбинации бензилового спирта и бензоата натрия удалять примеси HCP, тестировали дополнительные составы для целевого удаления HCP-A. Антитело IgG4 (mAb B) с известной высокой экспрессией HCP-A использовали для специфического увеличения нагрузки HCP-A на колонку. В  представлено краткое описание стадий, которые проводили в ходе способа очистки. Вкратце, после уравновешивания для загрузки pH и проводимости в 15,7 мл колонку для хроматографии на основе связывания с белком А загружали образец, содержащий секретируемое человеческое моноклональное антитело, собранный из клеток СНО посредством центрифугирования и осветления глубинным фильтрованием перед последующей обработкой. После достижения нагрузки 40 г/л (смолы) колонку повторно уравновешивали с использованием раствора фосфатного буфера. Затем один из промывочных растворов (тестируемые растворы 1, 2 и 7), показанных в , наносили в виде 2 объемов колонки (CV), после чего сразу следовало 3 CV раствора бессолевого фосфатного буфера при pH 7,0. После элюирования 40 мМ ацетатом натрия показатель рН пулов элюатов доводили до 5,5 с использованием 2 М трис-основания. Затем пулы элюатов фильтровали либо через 0,22-мкм PES-фильтр, либо через глубинный фильтр Millipore C0HC и тестировали в отношении содержания HCP-A с помощью ELISA (). Промывочные растворы при всех трех условиях (тестируемые растворы 1, 2 и 7) были способны очистить дополнительный HCP-A по сравнению с контролем (294 ppm). Результаты также показали, что эффект удаления HCP-A был кумулятивным, поскольку комбинация бензилового спирта, бензоата натрия и аргинина удаляла почти 90% HCP-A по сравнению с контролем. Кроме того, глубинное фильтрование обеспечивало последующее дополнительное удаление HCP-A на 15-25% для элюатов в условии промывки.
таблице 1
таблица 2
фиг. 2В
фиг. 2А - В
[0139] Следуя процедуре, аналогичной описанной выше, затем тестировали эффективность промывочных растворов с высоким pH путем промывки колонок при pH 9,0 или 10,0. Антитело IgG4 (mAb B) получали в клеточной линии с известной высокой экспрессией HCP-A, чтобы специфически увеличивать нагрузку HCP-A на колонку с белком A. В  представлено краткое описание стадий, которые проводили в ходе способа очистки. Вкратце, после уравновешивания для загрузки pH и проводимости в 15,7 мл колонку для хроматографии на основе связывания с белком А загружали образец, содержащий секретируемое человеческое моноклональное антитело, собранный из клеток СНО, собранных посредством центрифугирования и осветления глубинным фильтрованием перед последующей обработкой. После достижения нагрузки 60 г/л (смолы) колонку повторно уравновешивали с использованием раствора фосфатного буфера. Один из тестируемых растворов 8 или 9 () использовали для двух CV, и сразу после этого следовало три CV бессолевого раствора фосфатного буфера при pH 7,0. После элюирования 40 мМ ацетатом натрия показатель рН пулов элюатов доводили до 5,5 с использованием 2 М трис-основания. Пулы элюатов затем фильтровали через 0,22 мкм PES-фильтр. Как показано на , 0,5 М бензоат натрия с буферной солью при рН 10,0 является высокоэффективным при удалении HCP-A (снижение на 92%) по сравнению с контролем. Кроме того, добавление бензилового спирта и аргинина снова было комплементарным и улучшало очистку от HCP-A при pH 9,0. В совокупности результаты, представленные на , показывают тот устойчивый диапазон рН, при котором обеспечивалась значительная очистка от HCP-A.
таблице 1
таблице 2
фиг. 3
[0140] Наконец, дополнительные добавки подвергали скринингу для дальнейшего улучшения промывки раствором из 2% бензилового спирта и 0,5 М бензоата натрия. То же самое mAb IgG4 (mAb B) использовали на колонке со значением шкалы 1,7 мл. В  представлено краткое описание стадий, которые проводили в ходе способа очистки. Вкратце, колонку загружали до 40 г/л после уравновешивания. Затем один из четырех промывочных растворов (тестируемых растворов 3-6), показанных в , наносили на колонку. После образцы элюирования доводили до pH 5,5 2 M трис-основанием и фильтровали с использованием 0,22 мкм PES-фильтра. Затем измеряли содержание HCP-A с использованием HCP-A-специфического ELISA (). Промывки тестируемыми растворами продемонстрировали кумулятивный ответ при удалении HCP-A из-за добавления аргинина, каприловой кислоты, бензолсульфоната и гексиленгликоля по сравнению с комбинацией 2% бензилового спирта и 0,5 М бензоата натрия (201,3 ppm). Промывочный раствор, содержащий 2% бензиловый спирт, 0,5 M бензоат натрия и компонент, выбранный из гексиленгликоля, бензолсульфоната натрия, каприловой кислоты или аргинина, был очень эффективным в удалении HCP-A.
[0141] В совокупности данные, представленные в данном примере, показывают, что промежуточная стадия промывки, предусматривающая бензоат натрия и/или бензиловый спирт, способна обеспечить превосходную очистку от примесей белков клетки-хозяина в ходе очистки человеческого моноклонального антитела с помощью белка А. Более того, включение одной или нескольких добавок, выбранных из бензолсульфоната, каприловой кислоты, гексиленгликоля и/или аргинина, в промывочный раствор еще больше улучшало очистку от примесей белков клетки-хозяина в ходе очистки целевого моноклонального антитела с помощью белка А.
Пример 2. Идентификация специфических белков клетки-хозяина, присутствующих после хроматографии на основе связывания с белком А, разработка промывочных растворов для улучшенного или усиленного удаления примесей в ходе очистки антитела и оценка взаимодействия белка 2, подобного гипотетической фосфолипазе В, с человеческим моноклональным антителом
[0142] В следующем примере описана идентификация специфических белков клетки-хозяина (HCP) в элюате очищенного антитела после хроматографии на основе связывания с белком А. Далее в примере описано применение бензоата натрия и бензилового спирта в промежуточных промывочных растворах для улучшенного/усиленного удаления HCP, включающих белок 2, подобный гипотетической фосфолипазе В (PLBL2), в ходе хроматографии на основе связывания с белком А. Наконец, в примере описано влияние условий загрузки на эффективность хроматографии на основе связывания с белком А.
Материалы и способы
Получение образцов
[0143] Получали собранные материалы человеческого моноклонального антитела для хроматографии на основе связывания с белком А, как описано в примере 1. Вкратце, собранный материал получали в суспензионной культуре рекомбинантных клеток CHO, сконструированных для конститутивной экспрессии любого из человеческих моноклональных антител. Рекомбинантный продукт секретировался в культуральную среду, которую затем центрифугировали и осветляли глубинным фильтрованием для последующей обработки. Осветленный собранный материал фильтровали с помощью 0,22 мкм полиэфирсульфонового (PES) фильтра перед загрузкой в колонку с белком А.
Хроматография на основе связывания с белком A
TM
[0144] Смолу/колонки с белком А готовили, как описано в примере 1. Вкратце, смолу для хроматографии на основе связывания с белком А MabSelect Sure LX (GE Healthcare Life Sciences; № по каталогу 17-5474) подвергали реакции обмена путем гравитационного осаждения с помощью 0,5 M раствора хлорида натрия. Колонки заполняли с использованием AKTA Pure или AKTA Avant (GE Healthcare Life Sciences) с использованием либо (A) колонки диаметром 1,0 см (Essential Life Solutions 10/250 Snap Column; № по каталогу S10/250-PPSL-OE-FP10), либо (B) колонки диаметром 0,66 см (Omnifit 6,6/100; № по каталогу 006BCC0610FF). Смолой заполняли до высоты слоя 20 см ± 10% для колонки (A) или до высоты слоя 5 см ± 10% для колонки (B). Оценивание качества колонки проводили с использованием введения 1% объема колонки 1,0 M раствора хлорида натрия в колонку, уравновешенную в 0,1 M растворе хлорида натрия, и проводимость следов анализировали с использованием программного обеспечения Unicorn Evaluation. Эффективность колонки должна составлять по меньшей мере 775 теоретических тарелок на метр и должна демонстрировать асимметрию 0,8-1,8.
[0145] Перед загрузкой собранного материала колонки промывали обратно осмотической деионизированной водой для удаления буфера для хранения из 20% этанола. Затем колонку промывали 0,5 M уксусной кислотой для обеспечения удаления любых связанных веществ перед уравновешиванием. Колонку уравновешивали 50 мМ фосфатным буфером с 0,5 М хлоридом натрия до тех пор, пока показатель pH колонки не составил > 6,5.
таблице 1
[0146] Подготовленные образцы затем загружали в колонки с белком А. Как правило, в колонки загружали к мишени из 40 г/л смолы либо человеческое моноклональное антитело A (подтип IgG1), либо человеческое моноклональное антитело B (подтип IgG4).Загруженные колонки промывали, как описано выше, раствором фосфатного буфера, содержащим 50 мМ фосфат и 0,5 M хлорид натрия.Затем колонки промывали тестируемым промывочным раствором с последующей промывкой бессолевым буферным раствором при рН 7. Однако контрольные обработки не промывали тестируемым промывочным раствором. Наконец, антитело элюировали из колонки с использованием раствора, содержащего 40 мМ ацетат натрия, при pH 3,1. В  представлен иллюстративный способ хроматографии.
Выявление HCP с помощью масс-спектрометрии
E
[0147] После очистки колонки с белком А и элюирования в стандартных условиях элюаты человеческого моноклонального антитела анализировали с помощью масс-спектрометрии для определения относительного количества каждого HCP. В частности, относительное количество кластерина и белка 2, подобного предполагаемой фосфолипазе В (PLBL2), идентифицировали в образцах очищенного с помощью белка A человеческого моноклонального антитела. Масс-спектроскопию проводили с использованием Acquity H-Class Xevo G2-XS Q-Tof и колонки 2,1×150 мм ACQUITY UPLC с 1,7 мкм CSH C18. Образцы сначала денатурировали с использованием 0,05% Rapigest в 50 мМ бикарбонате аммония, а затем восстанавливали и алкилировали с использованием 20 мМ DTT (дитиотреитола) и 40 мМ IAA (йодацетамида). Проводили ферментативное расщепление с помощью 2% LysC в течение ночи, а затем в течение 3 часов с 4% трипсином. Rapigest удаляли центрифугированием и образцы подкисляли с использованием муравьиной кислоты. Затем вносили внутренний стандарт с добавлением 2,5 фмоль/мкл ClpB E. coli для сравнения относительных количеств HCP и PLBL2. Калибровку фиксированной массы проводили при приблизительно 785,8426 масса/заряд. Использовали MS для анализа данных по ионам и идентификации HCP.
Выявление HCP с помощью ELISA
го
[0148] После элюирования оценивали присутствие общих HCP в образцах человеческого моноклонального антитела, как описано в примере 1. Вкратце, образцы антитела тестировали в отношении присутствия примесей HCP с использованием набора CHO HCP ELISA 3 поколения (Cygnus Technologies) в соответствии с протоколом изготовителя. ELISA HCP проводили при разведениях от 1:400 до 1:800 и поглощение считывали при 450/600 нм с использованием устройства для считывания планшетов Spectramax Plus 384.
Выявление PLBL2 с помощью ELISA
[0149] Концентрацию PLBL2 определяли количественно в элюированных образцах антитела с использованием коммерчески доступного набора Hamster (CHO) ELISA (ICL Labs, E-65PLB) в соответствии с протоколом изготовителя. ELISA PLBL2 проводили при разбавлениях от 1:100 до 1:800 и поглощение считывали при 450 нм с использованием устройства для считывания планшетов Spectramax Plus 384.
Результаты
Выявление HCP с помощью масс-спектрометрии
таблицу 1
[0150] Было показано, что после очистки с помощью белка A HCP элюируются совместно с человеческим моноклональным антителом, что может представлять собой проблему для последующего применения данных антител. Для идентификации специфических HCP, присутствующих в растворе очищенного человеческого моноклонального антитела после очистки с помощью белка А, в 1,7 мл колонку для хроматографии с белком А загружали образец, содержащий секретируемое человеческое моноклональное антитело IgG1 (mAb A), собранное из клеток CHO, который был и центрифугирован, и осветлен глубинным фильтрованием перед последующей обработкой (см.). Колонки сначала промывали раствором фосфатного буфера. Затем колонки промывали бессолевым 50 мМ фосфатом, pH 7,0. Наконец, моноклональное антитело элюировали из колонки и рН доводили до рН 6,0 с использованием 2 М трис-основания. После корректирования пулы элюатов фильтровали с использованием 0,22 мкм PES-фильтра и анализировали с помощью масс-спектрометрии для идентификации относительных количеств HCP. Следует отметить, что кластерин и PLBL2 были двумя наиболее распространенными HCP, присутствующими в элюате человеческого моноклонального антитела.
Идентификация условий промежуточной промывки для улучшенного удаления HCP/PLBL2
фиг. 4A и 4B
[0151] Масс-спектрометрический анализ, подробно описанный выше, обеспечивал дополнительные доказательства того, что HCP, включающие в себя PLBL2, совместно элюируются с человеческими моноклональными антителами после очистки с помощью белка А. Затем разрабатывали ELISA-скрининги для идентификации промежуточных промывочных растворов, которые можно было бы использовать для дальнейшего улучшенного и усиленного удаления HCP и PLBL2 (). Интересно, что промежуточные промывки, предусматривающие 4% бензиловый спирт или 0,5 М бензоат натрия, эффективно снижали уровни загрязняющих HCP и PLBL2 в образцах элюата антитела. Промывочные растворы, содержащие только 0,5 М аргинина, не снижали уровень общих HCP, но снижали уровень загрязняющего PLBL2.
[0152] Скрининги ELISA PLBL2, кроме того, показывают, что глубинное фильтрование в сочетании с промежуточными промывками, включающими в себя 1) 2% бензиловый спирт и 0,5 M аргинин, pH 5,0, 2) 2% бензиловый спирт и 0,5 M бензоат натрия, pH 7,0, или 3) 2% бензиловый спирт, 0,5 M бензоат натрия, 0,5 M аргинин, pH 6,0, эффективно удаляло PLBL2 в ходе очистки с помощью белка А. Кроме того, промывочные растворы с повышенными уровнями рН (0,5 M бензоат натрия и 50 мМ бикарбонат натрия pH 10,0 или 2% бензиловый спирт, 0,5 M бензоат натрия, 0,5 M аргинин и 50 мМ фосфат натрия pH 9,0) были высокоэффективными в удалении PLBL2 в ходе очистки с помощью белка А. Действительно, промывочный раствор бензоата натрия с 50 мМ бикарбонатом натрия, рН 10,0, был способен удалять более 92% PLBL2 по сравнению с контрольной обработкой. Наконец, промывочные растворы, включающие в себя 1) 0,5 M бензоат натрия, 2% бензиловый спирт и 0,5 M бензолсульфонат, pH 7,0, 2) 0,5 M бензоат натрия, 50 мМ каприловая кислота, 0,5 M аргинин и 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0, 3) 0,5 M бензоат натрия, 2% бензиловый спирт и 10% гексиленгликоль, pH 7,0, или 4) 0,5 M бензоат натрия, 2% бензиловый спирт и 0,5 M аргинин, pH 6,0, демонстрировали устойчивую способность удалять PLBL2 по сравнению с контрольными промывочными растворами.
фиг. 5
[0153] Кроме того, визуальное сравнение элюата антител после и экспериментальной, и контрольной промывок показало, что образцы, промытые 2% бензиловым спиртом и 0,5 М бензоатом натрия, имели улучшенную прозрачность по сравнению с образцами, промытыми контрольными промывочными растворами ().
[0154] ELISA PLBL2, подробно описанные выше, демонстрируют, что промежуточная промывка, предусматривающая бензиловый спирт и бензоат натрия, может эффективно снижать уровень PLBL2 в элюате антител, очищенных с помощью белка А. Затем этот результат был дополнительно подтвержден ортогонально с помощью масс-спектрометрии. Результаты масс-спектрометрии показывают, что тестируемый промывочный раствор с 0,5 M бензоатом натрия, 0,5 M аргинином, 50 мМ каприловой кислотой, 0,5 M NaCl, pH 9,0, удалял почти 93% PLBL2 из элюата относительно контрольной обработки.
Оценка влияния нагрузки колонки на выход и удаление PLBL2
фиг. 6А и 6В
[0155] Приведенные выше эксперименты демонстрируют, что белок PLBL2 клетки-хозяина присутствует в элюате очищенного с помощью белка A антитела и может быть эффективно удален с использованием промежуточных промывочных растворов, содержащих бензиловый спирт и бензоат натрия. Затем оценивали влияние уровня загрузки колонки с белком A на выход после колонки и удаление PLBL2. Для идентификации идеальных условий загрузки для максимизации как выхода после колонки, так и удаления PLBL2 колонки с белком А загружали в диапазонах от 40 до 60 г/л (). Результаты показывают, что увеличение загрузки в колонку свыше 40 г/л снижает как выход после колонки, так и удаление PLBL2.
[0156] В совокупности данные, представленные в этом примере, показывают, что PLBL2 входит в число белков клетки-хозяина, которые элюируются совместно с человеческим моноклональным антителом после очистки с помощью белка А. Кроме того, данные демонстрируют, что промежуточная стадия промывки, содержащей бензоат натрия и/или бензиловый спирт, способна обеспечивать превосходную очистку от примесей белков клетки-хозяина и PLBL2 в ходе очистки с помощью белка А человеческого моноклонального антитела. Более того, данные показывают, что избыточная загрузка колонки смолой с белком A снижает выход после колонки и удаление PLBL2.
Пример 3. Оценивание влияния pH и концентрации бензоатной соли в собранном материале, содержащем антитело, в отношении удаления примесей в ходе очистки антитела
[0157] В следующем примере описаны эксперименты, которые проводили для определения того, улучшает или усиливает ли корректирование концентрации бензоата натрия и pH собранного материала, содержащего моноклональное антитело, удаление примесей в ходе очистки антитела.
таблицу 3.
[0158] Собранный материал человеческого моноклонального антитела получали как описано в примере 1. Осветленный и подвергнутый глубинному фильтрованию собранный материал доводили до варьирующих значений pH и концентраций добавок для скрининга воздействий на очистку от HCP и PLBL2. Бензоат натрия, ранее демонстрировавший эффективность в отношении удаления PLBL2 в качестве части дополнительной стадии промывки, добавляли в виде твердого вещества в количествах, достаточных для достижения целевой конечной концентрации для данного объема собранного материала. После добавления достигали целевого pH путем добавления 2 М трис-основания. В первый собранный материал добавляли бензоат натрия с достижением конечной концентрации, составляющей 0,5 M бензоата натрия, и корректировали показатель pH до 7,2. Во второй собранный материал добавляли бензоат натрия для достижения конечной концентрации 0,5 M бензоата натрия и корректировали показатель pH до 9. Третий собранный материал доводили до pH 9 (бензоат натрия не добавляли). См.
Таблица 3
<b>Добавки к собранному материалу</b>
<b>Показатель pH</b>
Корректирование с помощью только трис-основания
9,0
0,5 M бензоат натрия
7,2
0,5 M бензоат натрия
9,0
таблице 4
[0159] После того как каждый собранный материал корректировали и фильтровали через 0,22 мкм фильтр в каждую из трех колонок с белком А загружали скорректированный собранный материал до целевого показателя 50 г/л смолы. Загруженные колонки промывали раствором фосфатного буфера, содержащим 50 мМ фосфат и 0,5 М хлорид натрия. Затем колонки промывали обратно осмотической деионизированной (RODI) водой. Наконец, антитело элюировали из колонки с использованием раствора, содержащего 40 мМ ацетат натрия, при pH 3,1. В  ниже представлен иллюстративный способ хроматографии.
Таблица 4
<b>Стадия</b>
<b>Буфер/раствор</b>
<b>Направление потока</b>
<b>Время удерживания (минуты)</b>
<b>Объем (CV)</b>
Промывание
Вода для инъекции (WFI)
Нисходящий поток
8
2,5
Cтриппинг
0,5 M уксусная кислота
Нисходящий поток
5
2
Уравновешивание
50 мМ фосфат натрия, 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0
Нисходящий поток
5
3
Загрузка
Скорректированный собранный материал mAb, отфильтрованный через 0,22 мкм фильтр
Нисходящий поток
5
Промывка 1
50 мМ фосфат натрия, 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0
Нисходящий поток
5
3
Промывка 2
Обратно осмотическая деионизированная (RODI) вода
Нисходящий поток
5
2
Элюирование
40 мМ ацетат натрия, pH 3,1
Нисходящий поток
5
2
Cтриппинг
0,5 M уксусная кислота
Нисходящий поток
5
3
Последующее уравновешивание
50 мМ фосфат натрия, 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0
Восходящий поток
5
3
Обеззараживание
0,5 M гидроксид натрия
Восходящий поток
5
3
Последующее уравновешивание
50 мМ фосфат натрия, 0,5 M хлорид натрия, pH 7,0
Восходящий поток
5
2
Хранение
20% этанол
Восходящий поток
8
2
фиг. 7
[0160] Каждый из трех элюатов белка A затем тестировали в отношении присутствия примесей белка клетки-хозяина (HCP) с помощью ELISA, как описано в примере 1, и в отношении присутствия PLBL2 с помощью специально разработанного ELISA. Как показано на , при использовании 0,5 М бензоата натрия при pH 9,0 проявлялся наиболее низкий уровень примесей PLBL2 и HCP и демонстрировалась очистка от PLBL2, на порядок превышающую таковую по сравнению с корректированием только pH. При добавлении 0,5 M бензоата натрия к собранному материалу при pH 7,2 улучшалась только очистка от HCP. Для воздействия на PLBL2 требовалось корректирование собранного материала как в отношении pH, так и в отношении бензоата натрия. Корректирование не влияло на HMW (не показано). По сравнению с не подвергнутым корректированию собранным материалом только с промывкой RODI в ходе стадии связывания с белком A HCP был снижен на 65%, тогда как PLBL2 был снижен на приблизительно 79%.
таблицу 5.
[0161] Затем в собранные материалы добавляли бензоат натрия с достижением конечной концентрации 0,1 М, 0,2 М, 0,3 М, 0,4 М или 0,5 М и доводили до рН 9 перед очисткой с помощью белка А, как описано выше. См.
Таблица 5
<b>Добавки к собранному материалу</b>
<b>Показатель pH</b>
0,1 M бензоат натрия
9,0
0,2 M бензоат натрия
9,0
0,3 M бензоат натрия
9,0
0,4 M бензоат натрия
9,0
0,5 M бензоат натрия
9,0
фиг. 8
[0162] Затем тестировали каждый элюат белка А в отношении присутствия PLBL2 с помощью специально разработанного ELISA и оценивали выход антитела в каждом элюате. На  показано, что взаимосвязь между содержанием PLBL2 и концентрацией бензоата натрия является практически сигмоидальной. Уменьшение прироста в очистке от PLBL2 наблюдали для концентраций бензоата натрия, составляющих более 0,4 М. Выход антитела несколько снижался с повышением концентрации бензоата натрия. От 0,1 М до 0,5 М бензоата натрия выход антитела снизился от 94,8% до 89,4%. Наивысший выход и наивысшую степень очистки от PLBL2 наблюдали при доведении собранного материала до 0,4 M бензоата натрия и pH 9,0 перед очисткой с помощью белка А. Повышение концентрации бензоата натрия до значений выше 0,4 М приводило к снижению прироста степени очистки за счет незначительно сниженного выхода антитела. Все образцы с 0,1 М бензоатом натрия характеризовались сравнимой очисткой HCP до приблизительно 250 ppm. При 0,1 M бензоата натрия и ниже HCP составлял приблизительно 500 ppm. Концентрация бензоата натрия от 0,2 М до 0,5 М не влияла на профиль дисперсии заряда, и все элюаты находились в указанных пределах.
[0163] В совокупности эти данные позволяют предположить, что присутствие бензоата натрия в растворе делает ассоциацию примесей клеток-хозяев с mAb крайне неблагоприятной при высоких значениях pH. Данные условия могут быть достигнуты либо посредством отдельной стадии промывки после того, как mAb был связан со смолой с белком А, либо в растворе перед фазой загрузки колонки или в ходе таковой. Это обеспечивает большую гибкость в работе стадии очистки с помощью белка А и дополнительно поддерживает уникальные свойства бензоата натрия в качестве добавки для промывки.
[0164] Хотя приведенное выше изобретение было описано более подробно с помощью иллюстрации и примера для ясности и понимания, настоящие описания и примеры не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.