Биореактор для культивирования мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток
BIOREACTOR FOR CULTIVATION OF MULTIPOTENT MESENCHYMAL STEM CELLS

Биореактор для культивирования мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК) предназначен для применения в биотехнологии получения мяса in vitro. Биореактор позволяет реализовать процессы культивирования, протекающие с использованием различных биологических продуцентов и источников питания в условиях высокой производительности, качества получаемых продуктов, асептической надежности, экономичности и удобства обращения. Отличительной особенностью биореактора, является наличие двух соединенных между собой биореакторных емкостей в виде вертикально расположенных одна в другой труб из боросиликатного стекла и снабженных диализной мембраной, а также наличие аппарата интенсификации роста. Конструкция биореактора обеспечивает эффективный массообмен веществ и газов в объеме питательного субстрата. Целевое применение биореактора - реализация биотехнологических процессов, протекающих в жидкофазных условиях культивирования биологических продуцентов, иммобилизованных на микроносителях.
Изобретение относится к аппаратурному оснащению процессов культивирования стволовых клеток, в том числе мультипотентных мезенхимальных стволовых клеток (ММСК), и может быть использовано в производстве мышечной ткани животных, например, крупного рогатого скота.
ММСК характеризуются высокой чувствительностью к ранению, вызываемому кавитацией жидкой среды, ударами мешалок, отбойников и пузырьками газов. Эти свойства клеток оказывают влияние на конструкцию биореакторов, особенно на конструкцию устройств аэрации и перемешивания рабочих сред, которые в процессе культивирования не должны оказывать разрушающего воздействия на морфологическую структуру клеток.
Известна конструкция клеточного биореактора BLBIO-XGCC фирмы Bioengineering для культивирования животных клеток (www.bio-rus.ru) с автоклавируемым стеклянным сосудом, который применяется для культививания с подпиткой или непрерывного культивирования клеток млекопитающих. Биореактор оснащен различными устройствами аэрации и перемешивания рабочих сред, работа которых позволяет культивировать клетки животных в суспензионной культуре.
Биореактор представляет собой емкость с мешалкой. Для минимизации стресса при ранении, перемешивание осуществляется либо мешалкой подъемного типа, либо мешалкой толкающего типа. Механическая мешалка приводится в движение магнитным приводом, расположенным в нижней части. Культивирование может быть стационарным, стационарным с подпиткой, а также непрерывным благодаря наличию тензодатчиков. Биореактор используется для культивирования взвеси клеток или клеток, иммобилизованных на микроносителях. Для задержания биомассы при непрерывном культивировании используют роторные или спиральные фильтры.
Существующая конструкция обуславливает возможность культивирования животных клеток только в суспензионной культуре, что не лишено многих недостатков, например:
- культивирование клеток сопровождается малой скоростью роста при низкой концентрации клеток, что требует применения дополнительных устройств, для выделения клеточной массы из отработанной жидкости и утилизацию больших объемов фильтрата содержащего, как неиспользованные дорогие компоненты питательной среды, так и токсичные метаболиты, что существенно повышает себестоимость целевых продуктов;
- для выделения выращенной биомассы из отработанной жидкости, в биореакторе применяют роторные или спиральные фильтры, что повышает опасность бактериального загрязнения получаемых продуктов;
- клетки после фильтрации необходимо очищать от низкомолекулярных веществ, а фильтры подвергать тщательной промывке и стерилизации для инактивации патогенных микроорганизмов, что также повышает себестоимость целевых продуктов и способствует загрязнению окружающей среды производственными отходами.
Известна установка для культивирования клеток или микроорганизмов (пат. на изобретение RU №2021350, МПК 7 С12М 3/00, 22.07.1991), содержащая камеру, представляющую собой эластичную емкость, размещенную на жестком каркасе и разделенную на питательный, ростовой и накопительный отсеки. В ростовом отсеке расположен материал для иммобилизации клеток, накопительный отсек выполнен с возможностью независимого газообмена, а жесткий каркас имеет два излома, размещенные между отсеками, и установлен с возможностью изменения угла наклона к горизонту от 0° до 45°. Части каркаса под накопительным и ростовым отсеками снабжены вибраторами.
Недостатком известной конструкции является низкая производительность биореактора обусловленная совмещением нескольких технологических операций внутри одной камеры.
Известен биореактор для культивирования клеток, преимущественно эукариотических (пат. на полезную модель RU №117916, МПК 7 С12М 1/00, 23.12.2011 - прототип), включающий биореакторную емкость в виде трубы, герметизированной загрузочным люком и технологическим фланцем; аэратор, состоящий из газопроницаемых трубок, расположенных внутри емкости, штуцеры и трубопроводы для подачи и отвода рабочих газов и жидкостей, бактериальные фильтры питающих и отработанных газов, соединенные с прибором управления клапаны, камеру для приготовления смеси питающих газов.
Недостатком известной конструкции является сложность выделения целевого продукта, обусловленная наличием силиконовых уплощенных трубок, горизонтально расположенных внутри емкости биореактора.
Техническим преимуществом заявляемой конструкции биореактора по сравнению с прототипом является то, что наличие двух соединенных между собой биореакторных емкостей - камеры смешивания и камеры роста, в виде вертикально расположенных одна в другой труб из боросиликатного стекла и снабженных диализной мембраной позволяет повысить эффективность культивирования ММСК, за счет повышения технологичности выделения целевых продуктов при использовании микроносителей для культивирования опорозависимых клеток и высокой асептической надежности технологического процесса. Применение аппарата интенсификации роста позволяет увеличить производительность биореактора путем повышения пролиферативной активности ММСК.
Биореактор, представленный на фиг.1, содержит камеру смешивания 1 и камеру роста 2, образованные трубами, торцевые отверстия которых герметизированы загрузочными люками 3 и технологическими фланцами 4 и 5. Камеры установлены вертикально с возможностью изменения высоты установки. Технологические фланцы имеют штуцеры 6, 7 для подвода и отвода теплоносителя. Люк 3 имеет штуцеры 8, 9, 10 для циркуляции газовой смеси. Штуцеры 11 и 12, установленные на нижних фланцах камер, служат для перемещения питательного раствора и отвода жидких отходов. На люке установлен регулировочный клапан 13 сброса давления. Камера смешивания имеет аэратор 14, выполненный из газопроницаемых трубок. Камера роста имеет штуцер отбора проб 15 и диализную мембрану 16, перекрывающую штуцер 12 отвода жидких отходов. Биореактор содержит камеру для приготовления смеси питающих газов 17, аппарат интенсификации роста 18 с цилиндрической антенной 19. Камера роста позволяет вводить матриксы 20 с ММСК. Камеры выполнены круглого сечения в виде вертикально расположенных одна в другой труб из боросиликатного стекла с соотношением высоты к диаметру как 2:1, а также конструкция биореактора позволяет изменять данное соотношение при необходимости путем замены труб другой высоты. Внутренние полости каждой камеры заполнены теплоносителем и с помощью штуцеров 6 и 7 соединены с терморегулятором 21. Биореактор снабжен бактериальными фильтрами питающих и отработанных газов, а также клапанами 22 на трубопроводах для подачи и отвода рабочих газов и жидкостей, и соединенными с прибором управления.
Устройство работает следующим образом. Компоненты питательной среды загружается в камеру смешивания 1 через штуцер 8. Далее через воздушный штуцер 9, соединенный с одной стороны с камерой для приготовления смеси питающих газов 17, а с другой - с аэратором 14 внутрь камеры подается газ заданного состава и температуры. Проходя через жидкие компоненты снизу-вверх газ непрерывно перемешивает их и насыщает воздушной смесью с углекислотой заданного параметра. При достижении предельного давления газ стравливается в атмосферу через обратный клапан 13. При открытии крана подготовленный питательный раствор через штуцеры 11 и 12 нижних фланцев камер и систему трубок перемещается в камеру роста 2, заполняя 2/3 ее объема. Матриксы 20 с ММСК предварительно помещаются в камеру роста через загрузочный люк 3 камеры роста.
В камерах постоянно поддерживается уровень углекислого газа 5% в воздушной смеси и температуры 37°С с помощью камеры для приготовления смеси питающих газов 17 и терморегулятора 21, а также избыточное давление газа с помощью обратных клапанов 13 и соединенных с прибором управления клапанов 22.
Культивирование клеток производится без перемешивания до истощения среды, после чего производится ее слив из камеры роста и замена удаленного объема новой порцией питательной среды из камеры смешивания. Этот цикл повторяется многократно. Среда из камеры роста сливается через штуцер 12, снабженный диализной мембраной 16 для предотвращения потерь биомассы клеток.
В процессе культивирования ММСК обрабатывается КВЧ-излучением (крайне высокочастотное излучение) с помощью аппарата интенсификации роста 18. Под воздействием миллиметровых волн запускается процесс нормализации развития роста биомассы. Клетки реагируют на поступающие сигналы как единое целое, что способствует восстановлению между ними информационных связей, необходимых для пролиферации.
2
Камера роста располагается внутри цилиндрической антенны 19 аппарата. С целью увеличения пролиферативной активности ММСК используются волны миллиметрового диапазона с длиной волны 7,1 мм и интенсивностью облучения 0,05 Вт/см. Для снижения тепловых эффектов воздействие осуществляется в импульсном режиме с частотой 100 Гц.