Комплексы ДНК с соединением платины, содержащим цитозин

УДК 577. 34 Всстник СПбГУ. Сер. 4, 2007, вып. 1

Н. А. Касъяненко, М. Ю. Шейнин, К. И. Яковлев

КОМПЛЕКСЫ ДНК С СОЕДИНЕНИЕМ ПЛАТИНЫ, СОДЕРЖАЩИМ ЦИТОЗИН

Медицинские препараты, синтезированные на основе координационных соединений платины, используются в противоопухолевой терапии. Самым известным препаратом этой серии является í/wc-дихлородиаминоплатина, или цисплатин (i/wc-ДДП), отличающийся высокой эффективностью. Но плохая растворимость в воде, неизбирательность действия и серьезные побочные явления значительно ограничивают его применение. Основным направлением поиска новых лекарственных форм среди координационных соединений является синтез и испытание аналогов г/г/с-ДДП, сохраняющих высокую активность наряду с низкой токсичностью. До недавнего времени интерес ограничивался препаратами цис-строения, так как транс-дихлордиаминоплатина (транс-ДДП) не проявляет противоопухолевого действия. Вместе с тем существовали данные о высокой биологической активности других соединений платины транс-строения [1, 2], а в последнее время были получены обнадеживающие результаты о возможном их применении в противоопухолевой терапии [3, 4]. Обнаружено, что противоопухолевое действие препаратоз на основе платины вызвано образованием их комплексов с молекулой ДНК, препятствующих делению клетки. В связи с этим удобно изучать молекулярный механизм действия таких предаратов, используя модельные системы - водные растворы ДНК, содержащие тестируемые соединения платины. Платина с помощью координационной связи прочно соединяется с азотистыми основаниями ДНК, вызывая характерные конформационные изменения макромолекулы, которые фиксируются экспериментально [5-7].

Сопоставляя влияние соединений платины различной структуры и состава на конформа-цию молекулы ДНК в растворе с результатом действия активного препарата i/ис-ДДП и неактивного транс-ДДГ1, можно получить информацию о преимуществах того или иного •способа связывания соединений с макромолекулой, с точки зрения антимитотического действия, лежащего в основе противоопухолевой терапии. В работе изучается взаимодействие молекулы ДНК с соединением двухвалентной платины, содержащим цитозин. Введение ароматических лигандов в состав координационных соединений платины показывает меньшую токсичность и в некоторых случаях большую избирательность действия препаратов этого класса. Проведенные исследования позволяют рассмотреть влияние такой модификации соединения транс-ДДП на характер его взаимодействия с молекулой ДНК в растворе.

Материалы и методы исследования. Использовали тимусную ДНК (Sigma) с молекулярной массой 9 • 106. Соединение w/7tfHc-[Pt(NH3)2ClCytjCl (Cyt - цитозин) было синтезировано в Санкт-Петербургской химико-фармацевтической академии. Комплексы готовили сливанием равных объемов выбранных концентраций ДНК и препарата в 0,005 М NaC! и выдерживали сутки при температуре 4 °С.

Спектры кругового дихроизма (КД) и ультрафиолетового (УФ) поглощения регистрировали на автодихрографе Jobin Ivon (Франция) и спектрофотометре СФ-56 соответственно. Относительные вязкости растворов г|г = г|/г|0, где г) и г|0 - вязкость раствора и растворителя, определяли на низкоградиентном ротационном вискозиметре [8], величину двойного лучепреломления Ап измеряли при разных градиентах скорости потока g на установке с полутеневым эллиптическим компенсатором [9]. Все измерения проводили при температуре 21 °С.

*' Санкт-Пстербургская химико-фармацевтичсская академия. © Н. А. Касьяненко, М. Ю. Шейнин, К. И. Яковлев, 2007

Результаты и их обсуждение. Исследование взаимодействия /Mpö«c-[Pt(NH3)2ClCyt]CI с ДНК проводили в водном растворе, содержащем 0,005 М NaCl. Концентрация низкомолекулярного электролита примерно моделирует физиологические условия внутри клетки. Лабильный лиганд хлора во внутренней координационной сфере платины при переходе из внеклеточной среды с высокой концентрацией натрия и хлора в клетку может замещаться на молекулу воды. В водном растворе в результате диссоциации и последующей аквата-ции комплексного иона присутствуют катионы /Mp<2wc-[Pt(NH3)2ClCyt]+ и транс-[Pt(NH3)2(H20)Cyt]2+. При исследовании комплексов макромолекул с лигандами с использованием методов, требующих проведения концентрационных исследований, важным вопросом является выбор способа разбавления. При так называемом равновесном связывании (энергия взаимодействия лиганда с макромолекулой сравнима с энергией теплового движения, а равновесие в растворе устанавливается между связанными и свободными лигандами) при разбавлении необходимо поддерживать неизменной концентрацию свободных лиган-дов. В случае неравновесного (сильного) связывания вопрос о выборе растворителя не так актуален. В работе определяли характеристическую вязкость ДНК в комплексе с соединением платины [г|], экстраполируя к нулевой концентрации ДНК (С = 0) зависимость приведенной вязкости г|пр = (г|г — 1 )/С. Использовали два способа разбавления: при неизменном отношении концентраций платиновых лигандов СР( и СДНк (рис. 1, кривая /) и с сохранением постоянства суммарной концентрации платиновых лигандов в растворе (рис. 1, кривая 2). В пределах экспериментальной погрешности полученные при этом значения [г|] совпадали при исходной концентрации платины в растворе Cpt > 10 5 М, но различались при ее меньших величинах. Таким образом, концентрация свободных лигандов в эксперименте изменяется при разбавлении по-разному, и, по нашему мнению, нельзя утверждать, что комплексы образуются только с помощью сильной координационной связи, хотя и не исключается ее реализация.

(Г|г-1)/С, дл/г

Сднк-103,%

Рис. I. Концентрационная зависимость приведенной вязкости растворов, содержащих комплексы ДНК с соединением платины в 0,005 М NaCl, при разных способах разбавления.

1 - Cpt/Сднк = const, 2 - Ср, = const. Изучаемый комплекс готовили при С*днк = 0,007% и С?, = 510М и выдерживали сутки при температуре 4 °С перед измерениями.

Значение характеристической вязкости ДНК [г|] и относительное изменение оптической анизотропии макромолекулы -уг) / -у2 )0 в комплексе, приготовленном при Сднк = 0,007% и разных СР, в 0,005 М NaCl

СР, • 1 о5 м [л]. дл/г i/i ~Уг ~Уг )о

0 118 ± 6 ]

0,2 0,55 ±0,06

0,75 - 0,56 ± 0,05

1 94 ± 5 0,9 ± 0,04

1,5 96 ±5 0,85 ± 0,06

3 92 ±4 0,83 ± 0,05

В таблице приведены значения характеристической вязкости ДНК при разных величинах Cpi, определенные в области концентраций платины, в которой оба способа разбавления приводили к одинаковому результату (что соответствует заполнению всех возможных мест связывания на ДНК). Можно видеть, что взаимодействие ДНК с препаратом платины сопровождается уменьшением объема макромолекулы примерно на 20%. Согласно извест-

ной формуле [г|] = Ф———а3, это может быть обусловлено изменением либо контурной

длины ДНК L (что маловероятно), либо изгибной жесткости А, либо коэффициента набухания а. В частности, последний может уменьшаться за счет электростатического экранирования фосфатных групп связавшимися лигандами, но при используемом отношении концентраций Ср, / Сднк < 0,1 с учетом значительной фракции свободных лигандов это обстоятельство вряд ли окажет сильное влияние на [г|].

Использование метода динамического двойного лучепреломления для определения ве-

- / ч

личины -, пропорциональной оптическои анизотропии макромолекулы (у -уг),

(Л.-1)Ло

при Сднк = const и разных СР, показало, что оптическая анизотропия ДНК меняется при связывании с соединением платины существенно (см. таблицу), особенно при малых величинах CPt. Сходный результат наблюдался ранее для двуядерного соединения платины, содержащего пиразин [10]. Известно, что уменьшение оптической анизотропии макромолекулы может быть обусловлено падением термодинамической жесткости А или изменением разности поляризуемостей пары оснований вдоль оси спирали и в перпендикулярном направле-

А nig

нии Др. Если предположить, что изменение -связано с падением жесткости, то из

(Лг - ОЛо

данных вискозиметрии следует, что невозможно объяснить падение оптической анизотропии только этой причиной.

В состав исследуемого комплекса платины входит цитозин, сродство которого к азотистым основаниям ДНК чрезвычайно велико. Пиримидиновое кольцо обладает заметной оптической анизотропией и при связывании препарата может вносить вклад в величину а,-а2. Кроме того, связывание может провоцировать локальное изменение ориентации оснований относительно оси спирали. Характер изменения оптической анизотропии ДНК при варьировании концентрации препарата указывает на наличие нескольких причин, влияющих на структуру ДНК.

Ас, М-1  см"1

X, нм

Рис. 2. Спектры КД соединения от/?анс-[Р1(ЫН3)2С1Су1]С1 в 0,005 М К'аС1 и для разных концентраций Р1 (А). ДНК в комплексе с т/>а//с-Р1(1чгН3)2С1Су1]С1 в 0,005 М №С1 (Б).

Значения С?,(в М): А - 1 - IО"6, 2 - 3 • 10"6, 3 - 5  I(Г6, 4-1-10"6, 5 -10"5, 6-3-10"5; Б-/-0,2-10"6, 5 - 3 • 10"6, 4 - 5 • 1О'"6, 5 - ¡О"5, б-3  10"5, 7 -4,7 10"5.

Использованный в работе метод КД выявляет изменение спектра КД ДНК при связывании с препаратом платины. Так как исследуемое соединение платины обладает собственным спектром КД (рис. 2, А), то из сравнения спектров комплекса (рис. 2, Б) с рассчитанной суммой спектров компонентов до приготовления следует, что спектральные данные также отражают образование комплексов, меняющих конформацию ДНК. В спектрах комплекса наблюдаются немонотонный сдвиг нулевой точки и максимума положительной полосы спектра в длинноволновую область с последующим насыщением, а также немонотонное изменение амплитуды положительного максимума (рис. 3). Так как амплитуда максимума в спектрах КД свободного соединения платины в пределах использованных концентраций меняется монотонно, полученный результат свидетельствует о связывании, причем изменение СР1 при приготовлении комплекса приводит к реализации разных способов этого взаимодействия. Заметное увеличение амплитуды положительного максимума наблюдается уже при и вплоть до Ср( < 0,75-10 5 М особые изменения в спектрах КД не обнару-

жены. Именно в этой области фиксируется падение вязкости и оптической анизотропии ДНК, Можно предположить, что даже малое количество связанной платины (порядка 7 молекул на 100 пар оснований, оценка дана в предположении о полном связывании, что вряд ли справедливо с учетом экспериментов по вискозиметрии) приводит к изменению оптической анизотропии ДНК. Возможно, связывание вызывает резкий изгиб спирали ДНК.

АЕтах

Рис. 3. Зависимость амплитуды положительного максимума в спектре КД ДНК в комплексе с соединением платины от концентрации Р1.

Несмотря на то что спектры поглощения компонентов перекрываются, был проведен анализ УФ-спектров комплексов ДНК и платины при разных концентрациях препарата. Тем не менее фиксируемое увеличение поглощения (до 13% при длине волны X = 260 нм, соответствующей максимуму поглощения ДНК) может быть обусловлено тремя причинами: дестабилизацией ДНК, изменением поглощения ДНК из-за взаимодействия и изменением поглощения соединения платины.

С помощью УФ-спектрометрии была также предпринята попытка проследить кинетику связывания. Для этого регистрировали спектры сразу после приготовления систем, через сутки и через 5 суток. Раствор при этом хранился при температуре 4 °С. Было установлено, что в течение 1 ч после приготовления спектральные характеристики меняются незначительно, в то время как через сутки наблюдается существенное увеличение поглощения, которое остается неизменным и через 5 суток.

На основе экспериментальных данных с учетом вида исследуемого соединения можно предположить, что способами связывания w/>awc-[Pt(NH3)2ClCyt]Cl с ДНК могут являться монодентатное взаимодействие (одна координационная связь платины с азотистым основанием ДНК) и частичная интеркаляция цитозина между основаниями. По-видимому, в растворе одновременно реализуются оба типа взаимодействия. Известно, что полная интеркаляция приводит к увеличению длины ДНК и, как следствие, к росту характеристической вязкости. Между тем частичная интеркаляция может вызвать появление изгибов ДНК. 7/?онс-конфигурация затрудняет одновременную реализацию этих способов для одной молекулы соединения, хотя именно она может способствовать появлению изгибов спирали.

Summary

Kasyanenko N. A., Sheinin М. Yu., Yakovlev К. I. DNA complexes with platinum compound comprising cytosine.

DNA interaction with //-o«i-[Pt(NH3):>ClCyt]Cl (Cyt - cytosine) in 0,005 M NaCl solution is examined with lowgradi-ent viscosity, flowbirefrigcncc, circular dichroism methods. The molecular mechanism of interaction is considered.

Литература

1. В rabee V., Kasparkova J., Vrana O. et al. //Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 6781-6790. 2. Mukhopadhyay R., Dubey P., Sarkar S. //J. of Struct. Biology. 2005. Vol. 150. P. 277-283. 3. Giovanni N.. Mauro С. II Coord. Chem. Rev. 2001. Vol. 216. P. 383- 410. 4. McGregor T. D„ Bousflelcl W., Qu Y., Farrell N. // J. of Inorg. Biochemistry. 2002. Vol. 91. P. 212-219. 5. Касьяненко //. А., Вачуева С. В.. Сморыго H. А. и др. //Молекулярная биология. 1995. Т. 29. С. 345-351. 6. Kasyanenko N.. Prokhorova S„ Haya E. E. F. et al. // Colloids and Surfaces. A. 1999. Vol. 148, N 1-2. P. 121-128. 7. Касьяненко H. А., Абрамчук С. С. , Благодатских И. В. и др. //' Высокомолекулярные соединения. А. 2003. Т. 45, № 10. С. 1626-1637. 8. Frisman Е. V., Schagina L. V., Vorobiev V. I. И Biorhcology. 1965. Vol. 2. P. 189-194. 9. Фрисман Э. В., Цветков В. Н. И Журн. экспер. и теор. физики. 1952. Т. 23. С. 690-702. 10. Касьяненко Н. А., Айа Э. Ф., Богданов А. А. и др. //Молекулярная биология. 2002. Т. 36. С. 1-8.

Статья принята к печати 19 сентября 2006 г.