Штамм Emericellopsis alkalina Bilanenko & Georgieva - продуцент антибиотиков - пептаиболов с антигрибной и антибактериальной активностью
EMERICELLOPSIS ALKALINA BILANENKO & GEORGIEVA - PRODUCER OF ANTIBIOTICS - PEPTAIBOLS WITH ANTIFUNGAL AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано в фармакологии и медицине.
За последние десятилетия грибковые заболевания стали серьезной клинической проблемой. Всемирная смертность от грибковых инфекций сопоставима со смертностью от туберкулеза или малярии и, как считается, превышает 1350000 пациентов в год. Только в России, количество пациентов с тяжелыми и хроническими микозами в 2011 году составляло около трех миллионов человек, большинство из которых были поражены инвазивными и хроническими грибковыми инфекциями (инвазивный кандидоз, инвазивный и хронический аспергиллез, криптококковый менингит, мукоромикоз и пневмоцистная пневмония), а также заболеваниями с аллергическим бронхолегочным аспергиллезом, характеризующимися тяжестью клинических проявлений на фоне высокой смертности [Klimko, N. The burden of serious fungal diseases in Russia /N. Klimko, Y. Kozlova, S. Khostelidi, O. Shadrivova, Y. Borzova, E. Burygina, N. Vasilieva and D. W. Denning //Mycoses, 2015, 58 (Suppl. S5), 58-62]. Особенно опасно развитие грибных инфекций у иммуноскопрометированных и онкологических больных [Рунке М. Грибковые инфекции у иммуноскомпрометированных пациентов (Эпидемиология, диагностика, терапия, профилактика) Проблемы медицинской микологии - 2000. - №1. - С. 4-16; В.М. Гельфонд Инфекционные осложнения у онкологических больных / Практическая онкология, Т. 10, №3 - 2009, с. 141-146].
Биологически активные пептиды грибов являются важным ресурсом в получении новых продуктов как медицинского назначения, так и антибиотиков. Пептаиболы - мембранно-активные линейные пептиды, содержащие диалкиламинокислоты и аминоспирты. Они обладают широким спектром действия в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фитопатогенных и патогенных грибов, опухолевых клеток и характеризуются низкой токсичностью. Широко известна группа пептаиболов - зервамицинов, проявляющих антибактериальную, фунгицидную и цитотоксическую активность [Balashova, Т.А., Shenkarev, Z.O., Tagev, A.A., Ovchinnikova, T.V., Raap, J. and Arseniev, A.S. (2000). "NMR structure of the channel-former zervamicin IIB in isotrop solvents". FEBS Letters, 466: 333-336], выделены и описаны эмеримицины II, III, IV (продуцент Emericellopsis microspora) [12]. А. Берг с соавторами выделил из культуры Emericellopsis donezkii HKI0059 бергофунгины А и В, для которых в 2017 г установлена структура методом рентгенструктурного анализа [Berg, A., Schlegel, В., Ihn, W., Demuth, U. and , U. (1999). "Isolation and Structural Elucidation of New Peptaibols, Bergofungins В, С and D, from Emericellopsis donezkii HKI 0059". The Journal of Antibiotics, 52(7): 666-669]. Их гомологи, бергофунгины С и D, были обнаружены и у вида Е. salmosynnemata [Gessmann R., Axford D.,  H., Berg A., Petratos K. A natural, single-residue substitution yields a less active peptaibiotic: the structure of bergofungin A at atomic resolution/ Acta Cryst. - 2017. - P. 1-6].
Известны штаммы видов Trichoderma asperellum и Т. koningii, синтезирующие пептаиболы, ингибирующие патогенные дрожжевые грибы и обладающие антипротозойной активностью [Reino J.L. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma / J.L. Reino, R.F. Guerriero, R. , I.G. Collado // Phytochem Rev. - 2008. - Vol. 7. - P. 89-123].
Известен штамм Trichoderma longibrachiatum, продуцент пептаибола брачианин D проявляющий цитотоксическую и противоопухолевую активность [Патент WO 2015029069 А1].
Известна композиция из комплекса пептаиболов, выделенная из продуцента Apiocrea sp., проявляющая антипротозойную и нейролептическую активность [Патент WO 1020070008073].
Наиболее близким к предлагаемому изобретению по спектру антибиотической активности, который следует принять за ближайший аналог, является штамм микромицета Trichoderma citrinoviride Bissett ВКПМ F-1228 - продуцент мембрано-активных антибиотиков пептаиболов, обладающих антигрибной и антибактериальной активностью (патент РФ №2564577 от 07.09.2015). Однако этот штамм не обладает антимикотической активностью в отношении резистентных патогенных мицелиальных и дрожжевых грибов - возбудителей системных и инвазивных микозов.
В последнее десятилетие особые надежды связаны с изучением грибов - эндофитов и штаммов, выделенных из морских и донных отложений, других экстремальных или нетипичных для грибных организмов местообитаний. Задачей настоящего изобретения является выделение штамма экстремофильного микроскопического гриба, продуцирующего пептидные антибиотики - пептаиболы с высокой активностью к микроскопическим и дрожжевым патогенным грибам, включая клинические изоляты, с мультирезистентностью к известным антимикотикам, применяющимся в медицинской практике для лечения глубоких микозов и условно-патогенным бактериям, способным к формированию биопленок.
Предложен штамм алкалофильного микромицета Emericellopsis alkalina, депонированный в ВКПМ под номером F-1428, который продуцирует пептаиболы с высокой фунгицидной активностью, в том числе к резистентным микроскопическим и дрожжевым патогенным грибам и к условно-патогенным грамположительным бактериям, препятствуя образованию у них биопленок.
Штамм ВКПМ F-1428 алкалофильного микромицета Emericellopsis alkalina относится к аскомицетам: род Emericellopsis, порядок Hypocreales, класс Sordariomycetes, отдел Ascomycota (www.indexfungorum.org). Использованные процедуры идентификации и таксономический анализ подробно приведены в статье [Grum-Grzhimaylo А.А., Georgieva M.L., Debets A.J.M., Bilanenko E.N. Are alkalitolerant fungi of the Emericellopsis lineage (Bionectriaceae) of marine origin? // IMA Fungus. Vol. 4. N. 2. 2013. P. 211-226. DOI: 10.5598/imafungus.2013.04.02.07 http://www.imafungus.org/Issue/42/17.pdf).
Пример 1. Определение видовой принадлежности штамма
Молекулярно-генетические признаки. Определение до вида молекулярно-генетическими методами проводили на основании данных сиквенсов участков ITS rDNA, LSU rDNA, SSU rDNA, TEF-1α, β-tub, а также RPB2 в лаборатории генетики университета Вагенингена, Нидерланды (Laboratory of Genetics, Plant Sciences Group, Wageningen University, Droevendaalsesteeg 1, 6708PB Wageningen, The Netherlands). Штамм имеет соответствующие последовательности, зарегистрированные в NCBI под шифрами:
Культурально-морфологические признаки. Макроморфологические признаки. На сусло-агаре штамм медленно растущий, может быть как слизистый, так и с ватообразным воздушным мицелием, чаще светло-бежевого цвета, иногда с небольшим розоватым оттенком, край ровный. Размер колонии достигает 32-38 мм в диаметре за 10 дней. Воздушный мицелий ватообразный, иногда отдельными клочьями, светлый, чаще светло-бежевого цвета, иногда с небольшим розоватым оттенком. Конидиальное спороношение обильное. Обратная сторона колонии не окрашена или имеет светло-бежевый оттенок. Эксудат отсутствует.
По мере старения штамм обильно спороносит, конидии сливаются в единую слизистую массу, воздушный мицелий приобретает более выраженные розовые оттенки цвета. Помимо сусло-агара хороший рост наблюдается на щелочном агаре (рН 10,0-10,5); также культура способна к росту на агаре Чапека, овсяном агаре (рис. 1).
Микроморфологические признаки: Гифы мицелия тонкостенные, неокрашенные, 0,5-2,0 мкм толщиной, часто объединены в тяжи. Конидиальное спороношение типа Acremonium, обильное. Конидиеносцы в основном простые, длиной 20-35 мкм, суженные от 1,5 до 1,8 мкм в основании до 0,7-0,8 мкм на вершине, иногда образуются боковые ответвления. Конидии узкоовальные до эллиптических, варьирующие в размерах и форме, с гладкой поверхностью, 3,5-6,0×1,8-2,2 мкм, собраны в шаровидные слизистые головки. Хламидоспоры, склероции отсутствуют (рис. 1).
Физиолого-биохимические признаки.
Аэроб, оптимальные температуры роста 25-26°С, алколотолерантный, оптимальная для роста рН 10,5. Штамм усваивает различные углеводы - маннозу, рафинозу, лактозу и другие, минеральные и органические (пептон) источники азота, устойчив к повышенным концентрациям солей в среде. Хорошо растет и спороносит на средах, содержащих сусло и/или глюкозу.
Штамм хранят на сусло-агаре в пробирках при температуре 5-6°С с периодическим пересевом (1 раз в 12-24 месяца). Для длительного хранения используют методы лиофилизации и криоконсервации.
Штамм является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом.
Изобретение подтверждают следующие примеры:
Пример 2. Определение фунгицидной активности штамма в отношении штаммов условно-патогенных и токсигенных мицелиальных и дрожжевых грибов
В качестве посевного материала используют 5-ти суточную культуру гриба, полученную на сусло-агаре. Штамм выращивают в специализированной жидкой щелочной среде (300 мл) с рН 10,5 в стационарных условиях в колбах на 500 мл в течение 14 суток при 25°С. Биомассу мицелия и спор отделяют центрифугированием на центрифуге. Антибиотические вещества из отфильтрованной культуральной жидкости (кж) и грибной биомассы экстрагируют этилацетатом (при соотношении экстрагента и культуральной жидкости 3:1). Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе  (Швейцария) досуха при 42°С, сухой остаток - препарат хранят при 4°С. Для определения антибиотической активности используют диско-диффузионный метод [Егоров, 2006]. Диски пропитывают препаратом, растворенным в 60% водном растворе этанола, и сушат их на воздухе в стерильных условиях. Антимикробную активность определяют в исходной культуральной жидкости, в спиртовых концентратах КЖ с помощью стерильных бумажных дисков (бумага фильтровальная Ф ГОСТ 12026-76. Россия), смоченных в экстрактах и высушенных в стерильных условиях.
Тест-объектами берут коллекционные штаммы условно - патогенных мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans ATCC 2091, C. tropicales INA 00763 и условно-патогенных микромицетов - A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fumigatus 4К, A.terreus 4К, A. fisheri 3К, A. flavus 7К, A.ustus 8К. Контролем служат стандартные диски с амфотерицином В («НИИ Пастера», 40 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают на 5-7 сутки. Чашки Петри с дрожжами инкубируют при 37°С на среде Сабуро, с патогенными и условно-патогенными микроскопическими грибами при 28°С на среде Чапека.
Экстракты культуральной жидкости штамма Emericellopsis alkalina ВКПМ F-1428 обладают широким спектром фунгицидной активности в отношении условно-патогенных грибов. Экстракты ингибируют рост всех условно-патогенных и токсигенных тест-культур мицелиальных грибов, но особенно эффективны против A.fumigatus 4K, A.niger INA 00760, P.chrysogenum VKM F-4499. Высокую активность проявляют в отношении дрожжей C.tropicales INA 00763. Антибиотическая активность экстрактов из культуральной жидкости штамма Emericellopsis alkalina ВКПМ F-1428 в подавляющем большинстве случаев превышает активность амфотерицина В (таблица 2).
* - ошибка измерения зоны подавления 1-2 мм.
Пример 3. Определение фунгицидной активности этилацетатной фракции (комплекса пептаиболов) штамма в отношении клинических изолятов мицелиальных и дрожжевых грибов, резистентных к азолам.
Опыт проводят согласно примеру 2, но в качестве тест-объектов используют клинические изоляты дрожжевых грибов, возбудителей инвазивных кандидозов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Candida albicans 1582м 2016 - возбудитель кандидоза пищевода на фоне туберкулеза с легочным компонентом, туберкулезом селезенки и ВИЧ, Candida glabrata 1402м 2016 - возбудитель кандидоза легких на фоне туберкулеза и ВИЧ, Candida krusei 1447м 2016 - содержимое плевральной полости; фиброзно-кавернозный туберкулез легких, Saccharomyces cerevisiae 775м 2017 - туберкулезный плеврит, Cryptococcus laurentii 801 м 2017 - туберкулез легких. Также используют изоляты мицелиальных грибов - возбудителей инвазивных аспергиллезов с множественной резистентностью к применяемым антибиотикам - азолам: Aspergillus fumigatus 163м 2016 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Aspergillus flavus 905м 2016 - Содержимое легочной полости; фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Aspergillus terreus 1133м 2011 - туберкулез легких, микобактериоз; Aspergillus ochraceus 497м 2015 - БАЛ; очаговый туберкулез легких; Aspergillus niger 219_2016 Мокрота; фиброзно-кавернозный туберкулез легких; Bipolaris hawaiiensis 988м 2015 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, микобактериоз с распадом легких, вторичный иммунодефицит, гормонально зависимая бронхиальная астма на фоне ФКТ.
* - ошибка измерения зоны подавления 1-2 мм.
Экстракты ингибируют рост всех патогенных изолятов грибов, но особенно эффективен против С.albicans 1582 2016, Aspergillus ochraceus 497м 2015, Bipolaris hawaiiensis 988м 2015 и Aspergillus terreus 1133 м 2011 (рисунок 4).
Пример 4. Выделение комплекса активных пептаиболов из этилацетаной фракции штамма Emericellopsis alkalina ВКПМ F-1428
Для выделения антибиотических веществ культуральную жидкость (КЖ) продуцента экстрагируют этилацетатом в соотношении органический растворитель-КЖ 5:1. Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе  (Швейцария) при 42°С досуха, остаток растворяют в водном 70%-ном этаноле и получают спиртовые концентраты.
Для дальнейшего фракционирования антибиотического комплекса экстракта используют тонкослойную хроматографию в системе хлороформ-метанол 10:1. Дальнейшее разделение фракции с помощью прямофазной флеш-хроматографии проводят последовательно в системах: хлороформ-метанол (50:1→20:1→10:1→3:1), 96% этанол и этанол-вода (7:3).
Последовательное разделение антибиотического комплекса экстракта из КЖ на силикагеле методом флэш-хроматографии позволяет получить 5 обогащенных фракций, у которых оценивают спектр антифунгальной активности в отношении условно-патогенных грибов.
Пример 5. Разделение на ВЭЖХ и идентификация активного вещества (пептаибола) из активной фракции штамма Emericellopsis alkalina ВКПМ F-1428
Для дальнейший очистки сырец антибиотика после флэш-хроматографии подвергают фракционированию методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) с использованием колонки XBridge 5 мкм 100А размером 250×4.6 мм («Waters», США) в растущем линейном градиенте концентрации ацетонитрила в качестве подвижной фазы (элюент А - 0.1%ная трифторуксусная кислота, ТФУ, в воде MQ; элюент В - 80%-ный ацетонитрил с 0.1%-ным водным раствором ТФУ) при скорости потока 950 мкл/мин. Для ОФ-ВЭЖХ используют ультраградиентный ацетонитрил фирмы «Panreac» (Испания) и ТФУ производства «Sigma-Aldrich» (США). Детектирование разделяемых веществ осуществляют при трех длинах волн (214, 247 и 280 нм) в градиенте концентрации элюента В: 16-28%) - за 12 мин; 28-55% - за 27 мин; 55-75% - за 20 мин и 75-85% - за 10 мин с последующим изократическим элюированием в течение 25 мин. С целью масштабирования получения индивидуальных компонентов спиртового концентрата экстракта культуральной жидкости продуцента проводят его аналогичное разделение методом полупрепаративной ОФ-ВЭЖХ на колонке XBridge 10 мкм 100А (250×10 мм). Поглощение определяют при длине волны 214 нм и скорости потока подвижной фазы 4 мл/мин. Полученные в ходе ОФ-ВЭЖХ фракции, соответствующие отдельным пикам, собирают вручную, затем избыток органического растворителя (ацетонитрила) удаляют упариванием на вакуумной центрифуге SpeedVac («Savant», США) и лиофилизируют («Labconco», США) для удаления остаточных количеств ТФУ. Спектр антимикробного действия веществ, содержащихся во фракциях, определяют диско-диффузионным методом, как описано выше.
Молекулярные массы активных соединений в выделенной фракции устанавливают на MALDI времяпролетном масс-спектрометре AutoSpeed MALDI TOF/TOF «BrukerDaltonics» (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd:YAG) в режиме положительных ионов с использованием рефлектрона. На мишени смешивают по 1 мкл раствора образца и 1 мкл раствора 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) с концентрацией 10 мг/мл в 20%-ном ацетонитриле с 0.5%-ной ТФУ кислотой, полученную смесь высушивают на воздухе.
Спектры поглощения снимают с использованием спектрофотометра UV-1800 («Shimadzu», Япония) и кварцевых кювет на 2 мл с длиной оптического пути 1 см.
N-концевое секвенирование по методу Эдмана проводят на автоматическом секвенаторе белков и пептидов PPSQ-33A («Shimadzu», Япония) в точном соответствии с протоколом фирмы-производителя.
В результате разделения получают профиль компонентов активного концентрата, насчитывающий около 30 преобладающих фракций (рисунок 3) с различной степенью гидрофобности.
Поглощение при всех трех длинах волн с наибольшим при 214 и 247 нм в гидрофобной зоне, предположительно характерно для соединений пептаибольной природы. Методом масс-спектрометрического анализа локализуют активные компоненты А 118/35, А 118/36 и А 118/37 в диапазоне значений m/z 1015-1230 Да (рисунок 4).
Пример 6. Определение минимальной подавляющей концентрации препарата (пептаибола А118/37) в отношении условно-патогенных и патогенных грибов
Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) тестируемых соединений in vitro проводят методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде с использованием 96-луночных стерильных планшетов, в соответствии с требованиями Американского национального комитета клинических лабораторных стандартов [8, 9].
8
5
Для экспериментов по определению антимикробной активности тестируемых соединений готовят инокулюм грибных тест-культур, для чего используют чистую 2х суточную культуру грибов, выращенных на соответствующих плотных питательных средах при температуре 35°С. Далее в стерильном физиологическом растворе (0.85% NaCl) готовят взвесь тест-микроорганизмов, доводя ее до определенной плотности. Плотность грибных суспензий составляет 0.5 по стандарту МакФарланда (1.5×10 КОЕ/мл) и при дальнейшем разведении средой в 100 раз концентрация микробных клеток снижается до 5×10 КОЕ/мл.
Тестируемые вещества растворяют в стерильной воде с начальной концентрацией мкг/мл и в том же растворителе готовят серии двукратных разведений от 16 мкг/мл до 0.25 мкг/мл в растворе среды RPMI 1640 с феноловым красным. Эксперименты проводят в стерильных 96-луночных плоскодонных планшетах. В лунки каждого планшета вносят сначала по 100 мкл растворов серийных разведений тестируемых препаратов в питательной среде, а затем по 100 мкл раствора инокулята тест-культуры в среде RPMI 1640. В панель эксперимента в качестве контроля включают лунки, не содержащие тестируемых препаратов или растворителя.
Планшеты инкубируют при температуре 35°С. Оценку роста культур проводят визуально через 24 часа для дрожжей и 48 часов для мицелиальных грибов по изменению цвета индикатора. МПК определяют как минимальную концентрацию препарата, полностью предотвращающую рост тест-организма.
Минимальная подавляющая концентрация пептаибола А118/37 для патогенных дрожжей - возбудителей кандидозов легких составляет 2 мкг/мл действующего вещества, для мицелиальных патогенных грибов - возбудителей инвазивных микозов - от 4 до 8 мкг/мл.
Пример 7. Определение минимальной подавляющей концентрации препарата (пептаибола А118/37) в отношении условно-патогенных бактерий
Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) тестируемых соединений in vitro проводят методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде с использованием 96-луночных стерильных планшетов, в соответствии с требованиями Американского национального комитета клинических лабораторных стандартов [8, 9].
Для экспериментов по определению антимикробной активности тестируемых соединений готовят инокулюм бактериальных тест-культур, для чего используют суточную культуру бактерий, выращенных на соответствующих плотных питательных средах при температуре 35°С. Далее в стерильном физиологическом растворе (0.85% NaCl) готовят взвесь тест-микроорганизмов, доводя ее до определенной плотности. Плотность бактериальных суспензий составляет 0.5 по стандарту МакФарланда. Контролем служит антибиотик - энтероцин 7.
Динамику роста бактерий оценивают спектрофотометрически при 620 нм на спектрофотометре IEMS MF (Labsystems, Finland). Антимикробная активность BLIS была выражена минимальной ингибирующей концентрацией (MIC), которая определялась как самая низкая доза пептида, при которой не было обнаружено видимого роста (таблица 4).
Минимальная подавляющая концентрация пептаибола А118/37 для грамположительных бактерий составляет от 4 до 32.5 мкг/мл действующего вещества для В. cereus АТСС 14893 и S. aureus FDA 209 Р, что сопоставимо с контрольным антибиотиком ванкомицином, в отношении грамотрицательных бактерий вещество неактивно в концентрации до 300 мкг/мл.
Пример 8. Определение ингибирования формирования биопленок у бактерий и дрожжей.
Формирование биопленки у бактерий и дрожжей анализируют с использованием методов, описанных  [ GA (2011) Microliter dish biofilra formation assay. Journal of Visualized Experiments 47:1-2].
Готовят суспензию тест-организмов и совместно инкубируют с пептидом в 96-луночных полипропиленовых микротитрационных планшетах. После инкубации в течение 42 ч планктонные клетки удаляют, клетки биопленки, прилипающие к стороне пробирок, окрашивают кристаллом фиолетового цвета 0,1% (мас. / Об.). После инкубации в течение 15 мин каждую лунку промывают три раза водой MilliQ. Для солюбилизации кристаллического фиолетового цвета добавляют 200 мкл 95% (об. / Об.) этанола. Полученные растворы переносят на плоский 96-луночный планшет для количественной оценки поглощения каждого образца с помощью планшетного ридера при 595 нм.
Пептаибол A118/37 нарушает адгезионный потенциал и препятствует формированию биопленок у бактерий на 20-48% в зависимости от вида микроорганизма, при этом не влияя на жизнеспособность планктонных клеток (рисунок 5).