СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВИРУСИНАКТИВИРОВАННЫХ РАСТВОРОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
METHOD OF PREPARATION OF VIRUS-INACTIVATED SOLUTIONS OF IMMUNOGLOBULINS

Предлагаемое изобретение относится к процессу получения лечебных препаратов из плазмы крови, а именно к способу очистки препаратов иммуноглобулинов (IgG, IgM и IgA), получаемых промышленным способом спиртового фракционирования, от примесей растворителя и детергента, применяемого на стадии дополнительной инактивации вирусов.
Несмотря на тщательный отбор доноров и скрининговые исследования индивидуальных донаций, использование препаратов, произведенных из плазмы крови, связано с проблемой передачи вирусов. Традиционные схемы спиртового фракционирования и его модификации [Cohn E.J. et all. Preparation and properties of serum and plasma proteii // J.Am Chem Soc. - 1946. - 68. - P.459-475; Onclay J.L. et all. The separation of the antibodies, isoagglutinins, plasminogen and B-lipoprotein into subtractions of human plasma // J.Am Chem Soc.-1949. -71. -P.541-550] существенно снижают риск вирусных трансмиссий. Известно, что в процессе спиртового фракционирования происходит уменьшение концентрации вирусов, однако распределение вирусных частиц по белковым фракциям происходит неравномерно [Yei S., Yu M.W., Tankersley D.L. Partitioning of hepatitis С virus during Cohn-Oncley fraction of plasma // Transfusion. - 1992. - 32(9). - Р.824-828]. Чтобы гарантировать вирусную безопасность, препараты иммуноглобулинов для клинического применения должны быть получены с применением дополнительных стадий обработки, направленных на инактивацию вирусов, но не оказывающих неблагоприятного воздействия на качество продукта. Одним из таких способов является сольвент-детергентная (СД) обработка. В качестве вируцидного раствора обычно используют смесь растворителя трибутилфосфата (ТБФ) с ионными детергентами натрием холатом или натрием дезоксихолатом в конечной концентрации в растворе иммуноглобулина 0,3% и 0,2% соответственно [Horowitz В., Wiebe M.E., Lippin A. Inactivation of viruses in labile blood derivatives // Transfusion. - 1985 - 25(6). - P.516-522]. Можно применять и другие комбинации вирусинактивирующих агентов: 0,3% ТБФ, 1% твин-80; 1% ТБФ, 1% тритон Х-100), а также использовать растворитель без детергентов (2% ТБФ) [Horowitz В., Prince A.M., Horowitz M.S.Viral safety of solvent-detergent treated blood products // Dev Biol Stand. - 1993. - 81. - P.147-161]. В качестве вирусинактивирующих агентов могут использоваться также другие триалкилфосфаты как вместе с детергентом или поверхностно-активным веществом, так и без них.
Сольвент-детергентная обработка является признанной и надежной технологией, высокоэффективной против вирусов с липидной оболочкой. В эту категорию попадает большинство клинически значимых вирусов, передающихся при трансфузии, как например, вирусы гепатитов В и С, а также ВИЧ.
Преимуществом сольвент-детергентной обработки перед другими технологиями инактивации вирусов является тот факт, что можно добиться таких условий обработки, при которых не повреждается структура белковых молекул. Однако при инактивации вирусов с помощью химических добавок возникает серьезная проблема эффективного удаления последних из растворов. Присутствие остаточных количеств реагентов в препаратах может оказывать негативное воздействие на физико-химические свойства и функциональную активность антител.
Наиболее близким техническим решением к предлагаемому способу является патент США №5648472 (Gehringer Werner, Selosse Patrick), где описан процесс приготовления вирусинактивированного раствора иммуноглобулина, характеризующийся тем, что иммуноглобулин, обработанный смесью ТБФ и тритона, очищают от примесей путем экстракции реагентов касторовым или соевым маслом, а остаточные количества реагентов удаляют обратнофазовой хроматографией на гидрофобном носителе.
Использование касторового или соевого масел нетехнологично. Для удаления последних из растворов необходимы стадия центрифугирования или сепарации на специальных установках. Хроматографическая очистка на гидрофобном носителе усложняет технологический процесс и повышает его стоимость. При этом не улучшается качество очистки от вирусинактивирующих реагентов, а прохождение гидрофильных белков через колонку с гидрофобным носителем может оказать влияние на физико-химические свойства молекул и вызвать повреждение их структуры.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является усовершенствование технологии получения безопасных для пациентов вирусинактивированных растворов иммуноглобулинов с сохраненными физико-химическими свойствами и специфической активностью.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения - упрощение способа получения препарата иммуноглобулина и повышение экономичности.
Указанный результат достигается тем, что в способе приготовления вирусинактивированных растворов иммуноглобулинов, включающих сольвент-детергентную обработку и очистку от примесей вирусинактивирующих реагентов, сольвент-детергентную обработку проводят стерильной сольвент-детергентной смесью в количестве, достаточном для создания вирусинактивирующей дозы реагентов в растворе, а очистку от примесей вирусинактивирующих реагентов проводят путем осаждения раствором кислоты с последующей экстракцией сольвента и детергента растительным маслом с температурой затвердевания не ниже 8°С, например маслом какао, предварительно обработанным раствором соляной кислоты, промытым дистиллированной водой до постоянного значения рН и простерилизованным.
Обработку масла какао раствором соляной кислоты проводят при температуре кипения.
Сольвент-детергентную обработку проводят при концентрации белка в растворе 2,5-10% при рН 4,5-7,5 в присутствии стабилизатора глицина в концентрации 1,0-3,0% для стабилизации молекул IgG, IgA, IgM.
Экстракцию сольвента и детергента маслом какао проводят при активном перемешивании при повышенной температуре 37-45°С, а затем смесь выдерживают до укрупнения и осаждения мицелл с последующим их удалением из раствора.
Сущность метода заключается в следующем.
Согласно настоящему изобретению в качестве исходного материала для обработки используются фракции, содержащие иммуноглобулины. Конкретными примерами таких фракций являются: фракция II (паста иммуноглобулина G), очищенная от других плазменных белков путем дополнительной стадии спиртового осаждения и диа/ультрафильтрации, а также комплексный иммуноглобулиновый препарат из фракции III, содержащий иммуноглобулины классов G, А, М. При этом можно использовать как свежевыделенные фракции, так и замороженные при низких температурах, предварительно растворив их в воде апирогенной (воде для инъекций) или подходящем буферном растворе. Перед внесением вирусинактивирующих агентов в растворы иммуноглобулинов желательно провести различные предварительные этапы очистки растворов с целью снижения уровня опалесценции и количества агрегатов, которые влияют на вируцидное действие трибутилфосфата и детергентов. При этом процедура обработки растворов иммуноглобулинов не должна изменять структуру белковых молекул, а также изменять их специфическую активность.
Наиболее предпочтительно для СД-обработки использовать смесь трибутилфосфата (ТБФ) с натрием холатом или натрием дезоксихолатом в конечной концентрации в растворе иммуноглобулина 0,3% и 0,2% соответственно. Это обусловлено тем, что натрия холат и дезоксихолат являются солями желчной кислоты и относятся к категории малотоксичных для человека продуктов. Но можно применять и другие комбинации вирусинактивирующих агентов. Сольвент-детергентную смесь готовят заранее, используя соответствующие реагенты и воду очищенную апирогенную (для инъекций), проводят корректировку рН и стерилизацию стандартным способом. 1 мл готовой сольвент-детергентной смеси должен содержать действующие вещества в таких пропорциях, чтобы при внесении в раствор иммуноглобулина можно было бы получить конечную концентрацию растворителя и детергента, как описано выше.
Во время обработки иммуноглобулины должны находиться в водной среде или подходящем буферном растворе при рН от 4,5 до 7,5 при концентрации белка от 2,5 до 10% в присутствии стабилизатора глицина в концентрации 1-3%. Снижение рН среды менее 4,5 приводит к фрагментации IgG, а повышение рН более 7,5 - к агрегации молекул. Снижение концентрации белка менее 2,5% технологически нецелесообразно, а при концентрации белка более 10% возрастают потери иммуноглобулинов на стадиях очистки. Присутствие стабилизатора предохраняет лабильные молекулы иммуноглобулинов G, А, М от повреждающего действия реагентов в процессе обработки. Однако при концентрации глицина менее 1% стабилизирующее действие его ослабляется, а добавление глицина более 3% нецелесообразно из-за отсутствия усиления стабилизирующего эффекта. Раствор иммуноглобулина должен быть стерильным.
При температуре менее 37°С снижается эффективность экстракции реагентов маслом, а при температуре более 45°С повышается риск денатурации белка.
К стерильному раствору иммуноглобулина добавляют стерильную сольвент-детергентную смесь в количестве, достаточном для создания вирусинактивирующей концентрации в растворе, например, 0,3% ТБФ и 0,2% натрия холата (натрия дезоксихолата), или 0,3% ТБФ и 1% твина-80, или 1% трибутилфосфата и 1% тритона X-100 и инкубируют смесь стандартным способом с целью инактивации вирусов при температуре 37°С в течение 6 часов. Затем добавляют 0,1 N раствор соляной кислоты до появления белого осадка и фармакопейное масло какао. Масло какао перед добавлением в раствор иммуноглобулина подвергают специальной обработке, которая включает кипячение в растворе 0,1 N соляной кислоты, двух-трехкратную промывку в воде для инъекций до постоянного значения рН промывных вод рН 5,0-7,0 и стерилизацию.
Стерильное масло какао добавляют в обработанный растворителем и детергентом раствор иммуноглобулина в конечной концентрации 5-10%, предпочтительно 5%, и инкубируют смесь, активно перемешивая, при 37-45°С в течение 30-60 минут, предпочтительно 45 минут, для экстракции в масляную фазу ТБФ и детергентов. Затем раствор охлаждают до 2-8°С и оставляют на 10-500 часов для затвердевания масла, укрупнения мицеллярных структур и выпадения их в осадок. В конце инкубации температуру раствора можно понизить до 1,5-2,0°С, что создает благоприятные условия для лучшего удаления полученного осадка из раствора иммуноглобулина при минимальном снижении концентрации белка. Удаление масла производят на грубых капроновых фильтрах, а осадка - на осветляющих и стерилизующих глубинных фильтрах. При этом полученный раствор должен быть прозрачным и без опалесценции. При наличии опалесценции стерильный раствор необходимо выдерживать дополнительно в течение не менее 48 часов.
Окончательную очистку препаратов иммуноглобулинов проводят обычным способом путем диализа против воды для инъекций или соответствующего буфера, ультрафильтрации или спиртового переосаждения. В полученном растворе иммуноглобулинов корректируют содержание белка, рН, добавляют необходимые стабилизаторы. Затем раствор подвергают стерилизующей фильтрации и разливают во флаконы.
Как видно из представленных данных (табл.1, 2), при получении иммуноглобулинов по заявленному способу не выявлено ухудшения физико-химических и биологических свойств препаратов, снижения концентрации антибактериальных и противовирусных антител. Эффективность очистки, которую оценивали по остаточному содержанию ТБФ, как более токсичного по сравнению с натрием холатом реагента, соответствовала необходимым требованиям (менее 2 мкг/мл в соответствии с требованиями Европейской фармакопеи, 5-е издание) и не уступала качеству других аналогичных препаратов (Octagam 5%, менее 1 мкг/мл). При этом показано (табл.3), что использование предлагаемого способа в отличие от способа-прототипа позволяет получать препарат без образования агрегатов и изменения молекулярного состава.
Пример 1. 5 кг пасты иммуноглобулина G (фракция II), полученной в результате спиртового фракционирования, растворяют в воде для инъекций при рН 6,8-7,2. Нерастворившиеся белки отделяют от иммуноглобулина осветляющей и стерилизующей фильтрацией. Корректируют концентрацию белка до 2,5%, добавляют глицин до конечной концентрации 1%. Полученный раствор иммуноглобулина подвергают стерилизующей фильтрации и используют в дальнейшем для сольвент-детергентной обработки.
Готовят сольвент-детергентную смесь, состоящую из ТБФ, натрия холата и воды для инъекций. Указанные компоненты берут в следующих соотношениях: 40 г натрия холата растворяют в 500 мл воды для инъекций, корректируют рН до 7,0±0,1, затем прибавляют 60 г (61 мл) ТБФ, доводят объем до 1000 мл, тщательно перемешивают, дозируют и стерилизуют.
Фармакопейное масло какао кипятят в растворе 0,1 N соляной кислоты в течение 20-30 минут, промывают дистиллированной водой при кипячении до постоянного значения рН промывных вод 5,0-7,0. Масло охлаждают, дозируют по флаконам, укупоривают и стерилизуют.
В подготовленный раствор иммуноглобулина добавляют сольвент-детергентную смесь из расчета 50 мл/л и инкубируют при 37°С в течение 6 часов при постоянном перемешивании. Затем добавляют соляную кислоту (0,1 N раствор) до появления белого осадка и подготовленное стерильное масло какао до конечной концентрации 5% и инкубируют, активно перемешивая при температуре 37°С в течение 45 минут.
Затем температуру смеси понижают до 8°С и выдерживают стерильный раствор иммуноглобулина в течение 16 часов для укрупнения и выпадения в осадок мицеллярных структур. В последние 1-1,5 часа инкубации температуру понижают до 1,5-2,0°С. Масло какао удаляют механически на капроновых фильтрах, а образовавшийся осадок путем глубинной фильтрации.
Контролируют рН и концентрацию белка, разбавляют полученный раствор в 30 раз и подвергают ультрафильтрации на установке с использованием мембран 30 кДа до концентрации белка 7-15%.
Полученный раствор стабилизируют мальтозой до конечной концентрации 8-10%, корректируют рН до 4,0-4,5 и белок до 4,5-5,5%, подвергают стерилизующей фильтрации и разливают по флаконам.
Пример 2. Фракцию II+III растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида в соотношении 1:18. Температуру раствора снижают до 0°С и проводят осаждение этанолом до конечной концентрации 26%, при ионной силе 0,15, рН 6,8-7,2. Температуру снижают до -10°С. Раствор центрифугируют. Полученный осадок растворяют в ацетатном буфере рН 5,25-5,40 с ионной силой до 0,01 в соотношении 1:20. Температуру устанавливают 0°С. В раствор добавляют этанол до конечной концентрации 17%. Температуру раствора снижают до -5°С. Затем раствор центрифугируют. Осадок фракции III используют для получения комплексного иммуноглобулинового препарата (КИП). В центрифугате устанавливают рН 6,8-7,4, добавляют этанол до концентрации его в растворе 26%. Температуру снижают до -10°С. Затем раствор центрифугируют и получают осадок пасты, фракции II (иммуноглобулина G). 5 кг пасты, растворяют в водном растворе с ионной силой 0,01-0,05 при рН 6,8-7,2 до концентрации белка 10%. Нерастворившиеся белки отделяют от иммуноглобулина осветляющей фильтрацией. Добавляют глицин до концентрации 1% и проводят стерилизующую фильтрацию.
Добавляют стерильную сольвент-детергентную смесь к раствору иммуноглобулина из расчета 50 мл на литр раствора и инкубируют при 37°С в течение 6 часов.
Добавляют раствор соляной кислоты (0,1 N) до появления белого осадка и подготовленное стерильное масло какао до конечной концентрации 5% и инкубируют, активно перемешивая при температуре 45°С в течение 45-60 минут. Затем понижают температуру смеси до 2-8°С и удаляют затвердевшее масло.
Стерильный раствор иммуноглобулина инкубируют при температуре 2-8°С в течение 500 часов для укрупнения и выпадения в осадок мицеллярных структур. Образовавшийся осадок удаляют путем глубинной фильтрации.
Затем в растворе устанавливают рН 7,0-7,4, ионную силу 0,015, концентрацию этанола 26%, температуру до -10°С. Раствор центрифугируют и выделяют осадок иммуноглобулинов. Осадок иммуноглобулинов растворяют в водном растворе с ионной силой 0,01-0,05 до концентрации белка 1,0-1,5% и подвергают процедуре ультрафильтрации на установке с использованием мембран 30 кДа, белок концентрируют до 10-15%.
Полученный раствор стабилизируют мальтозой до конечной концентрации 10%, корректируют рН до 4,0-4,5 и белок до 9,5-10,5% подвергают стерилизующей фильтрации и разливают по флаконам.
Пример 3. 5 кг пасты комплексного иммуноглобулинового препарата, полученного в результате спиртового фракционирования фракции III (Анастасиев В. В., Пискарева Ю.К., Змачинская Т.Е., Крайнева Т.А., Гольговская С.А., Короткова Т.В. Способ получения иммуноглобулинового препарата. Патент на изобретение №2199343. зарегистрирован 27.03.2003) и состоящего в основном из смеси иммуноглобулинов G, А, М, растворяют в водном растворе глицина (концентрация около 3%), рН 4,5-5,5 до концентрации белка 5-6%. Нерастворившиеся белки отделяют от иммуноглобулина осветляющей и стерилизующей фильтрацией. К раствору добавляют стерильную сольвент-детергентную смесь из расчета 50 мл на литр раствора и инкубируют при 37°С в течение 6 часов. Добавляют раствор соляной кислоты (0,1 N) до появления белого осадка и подготовленное стерильное масло какао до конечной концентрации 5% и инкубируют, активно перемешивая при температуре 37°С в течение 45-60 минут. Затем понижают температуру смеси до 2-8°С, инкубируют смесь в течение 240 часов и удаляют затвердевшее масло. Взвесь отделяют от иммуноглобулина осветляющей и стерилизующей фильтрацией. Раствор препарата разбавляют в 20-30 раз дистиллированной водой апирогенной (водой для инъекций), концентрируют ультрафильтрацией с использованием мембран 50 кДа до концентрации белка 5-6%. Затем проводят осветляющую и стерилизующую фильтрацию, розлив препарата во флаконы и лиофилизацию.
Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что разработанная технология получения растворов иммуноглобулинов позволяет получать вирусбезопасные препараты с сохраненными физико-химическими и биологическими свойствами, а также специфической активностью. Высокая эффективность очистки достигается простыми технологическими приемами путем осаждения, масляной экстракции при повышенной температуре и выдерживания смеси в прохладном месте с целью укрупнения мицеллярных структур. Очистка проводится без использования дорогостоящих хроматографических сорбентов, благодаря чему упрощается технология получения вирусбезопасных препаратов и повышается экономичность.
Таблица 1
Изменение физико-химических и биологических свойств иммуноглобулина G, полученного по заявленному способу (n=20)
№ п/п
Наименование показателей
До обработки
Готовый препарат
Допустимые содержания по НТД
1
Прозрачность
0,015-0,027
0,011-0,021
ОП* не более 0,05
2
Цветность
0,001-0,004
0,001-0,003
ОП* не более 0,05
3
Фракционный состав
2-3
2
Дуга преципитации IgG и не более одной дополнительной дуги
4
Антикомплементарная активность
0,5
0,3-0,6
1 мг белка IgG не должен потреблять более 1 ед. (СН<sub>50</sub>) комплемента
5
Токсичность
не токсичен
Должен быть нетоксичным
6
Специфическая активность: -антиальфастафилолизин
3МЕ**/мл
3МЕ**/мл
не менее 2 МЕ/мл
- антитела к вирусу кори
25ME**/мл
25МЕ**/мл
не менее 25 МЕ/млне менее 0,5 ME в 1 г
- антитела к HBsAg
6,9-12,7 МЕ/г
7,5-16,6 МЕ/г
иммуноглобулина
- антитела к вирусугепатита А
43210-69395 мМЕ/мл
42360-95145 мМЕ/мл
не нормируется
7
Остаточное содержание ТБФ
-
0,2-0,6 мкг/мл
менее 2 мкг/мл
ОП* - оптическая плотность; * * ME - Международные единицы
Таблица 2
Изменение физико-химических и биологических свойств иммуноглобулинового комплексного препарата для энтерального применения (смесь иммуноглобулинов G, А, М), полученного по заявленному способу (n=10)
№ п/п
Наименование показателей
До обработки
Готовый препарат
Допустимые содержания по НТД
1
Растворимость
4 мин
4 мин
В 5 мл очищенной воды в течение не более 5 мин.
2
Прозрачность
0,01-0,02
0,01-0,02
ОП* не более 0,05
3
Цветность
0,025-,032
0,015-0,030
ОП* не более 0,1
4
Количественное определение
IgG-66,4-68,4%,
IgG-68,5-69,2%,
IgG-50-70%,
классов
IgA-15,6-16,4%,
IgA-14,2-15,5%,
IgA-15-25%,
иммуноглобулинов
IgM- 15,2-18,0%
IgM-15,3-17,3%
IgM-15-25%
5
Токсичность
не токсичен
не токсичен
Должен быть нетоксичным
6
Специфическая активность: - титр антител против сальмонелл и шигелл
1:320
1:320
Титр антител против сальмонелл и шигелл не менее 1:320
7
Остаточное содержание ТБФ
0
1,5 мкг/мл
менее 2 мкг/мл
ОП* - оптическая плотность;
Таблица 3
Изменение молекулярного состава иммуноглобулинов G, полученных по заявляемому способу и прототипу
№ п/п
Способ получения
Стадия
Молекулярный состав, %
Р
полимеры
димеры
мономеры
фрагменты
1
заявленный способ (n=20)
до обработки
1,9±0,2
18,7±0,5
78,1±0,4
1,3±0,1
95%
очищенный препарат
0,9±0,3
13,8±0,6
82,6±0,6
2,7±0,7
95%
2
прототип (n=10)
До обработки
2,4±0,8
10,6±1,3
85,0±2,2
2,0±0,5
95%
очищенный препарат
11,6±1,2
12,8±0,9
69,6±1,8
6,0±1,3
95%