Окислительная модификация белков и липидов плазмы крови при различных гистологических типах рака легкого

© БЕЛОНОГОВ Р. Н., ТИТОВА Н. М., ДЫХНО Ю. А., САВЧЕНКО А. А.

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ И ЛИПИДОВ

ПЛАЗМЫ КРОВИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ТИПАХ

РАКА ЛЕГКОГО

Р. Н. Белоногов, Н. М. Титова, Ю. А. Дыхно, А. А. Савченко Сибирский федеральный университет, ректор - акад. РАН Е. А. Ваганов; Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.

Войно-Ясенецкого, ректор - д. м. н., проф. И. П. Артюхов.

Резюме. С целью определения уровня показателей окислительной модификации белков и липидов в плазме крови больных различными гистологическими типами рака легкого обследовано 57 человек. В плазме крови больных оценивалось содержание диеновых конъюгатов, малонового диальдегида, карбонильных производных белков, среднемолекулярных пептидов, битирозина, SH-групп белков. Изменение содержания данных показателей свидетельствует об увеличении интенсивности свободно-радикальных процессов и варьирует в зависимости от гистологического типа заболевания. Установлено, что при немелкоклеточных формах рака легкого

(плоскоклеточный рак и аденокарцинома) изменения показателей во многом имеют сходный характер, в то время, как их значения при мелкоклеточном раке могут иметь существенные отличия.

Ключевые слова: рак легкого, перекисное окисление липидов, окислительная модификация белков.

Белоногов Роман Николаевич - аспирант кафедры физико-химической биологии Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета; e-mail: ro-x@ya.ru.

Титова Надежда Митрофановна - к.б.н., проф. кафедры физико-химической биологии Института фундаментальной биологии и биотехнологии Сибирского федерального университета.

Дыхно Юрий Александрович - д.м.н., профессор, зав. кафедры онкологии и лучевой терапии КрасГМУ, тел. 8 (391)2671710.

Рак легкого занимает одно из первых мест по распространенности среди онкологических заболеваний. От прочих онкологических заболеваний злокачественные новообразования легкого отличаются чрезвычайным разнообразием гистологических вариантов. Скорость роста и распространения опухоли на соседние ткани, склонность к метастазированию и другие биологические особенности опухоли в значительной мере зависят от ее гистологической структуры.

Рост опухоли сопровождается изменением показателей антиокислительной активности и окислительного стресса в опухоли, что также отражается на состоянии органов и тканей организма. Увеличение интенсивности воздействия активных форм кислорода вызывает усиление процессов окисления биологических молекул и может приводить к повреждению клеток и тканей, что предположительно играет важную роль в патогенезе рака легкого. В ряде работ приводятся результаты исследований, свидетельствующие, что в первую очередь окислительной модификации подвергаются молекулы белков [2, 5, 9]. Белки плазмы, подвергшиеся окислительной деструкции, имеют длительный период распада, по сравнению с продуктами перекисного окисления липидов (ПОЛ), что делает их перспективным маркером интенсивности свободнорадикального окисления [5]. Процессы окисления белков и липидов при различных гистологических типах могут иметь свои особенности. Тем не менее, их характер и выраженность при данной патологии практически не изучены.

Таким образом, целью настоящего исследования явилось определение уровня показателей окислительной модификации белков и липидов в плазме крови больных раком легкого при различных гистологических типах заболевания.

Материалы и методы

На базе Красноярского краевого онкологического диспансера обследовано 57 мужчин 35-60 лет с раком легкого. У 30 больных диагностирован плоскоклеточный рак легкого (ПКРЛ), у 17 - аденокарцинома легкого (АКЛ), у 10 - мелкоклеточный рак легкого (МКРЛ). Все больные имели IIIA, IIIB и IV стадии заболевания, согласно международной классификации TNM. В качестве контроля было обследовано 18 здоровых мужчин. Забор крови производился из локтевой вены в гепаринизированные пробирки, утром натощак, на следующий день после поступления больного в стационар. Верификация диагноза осуществлялась после оперативного вмешательства и гистологического исследования образцов опухоли.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в плазме оценивали по уровню диеновых конъюгатов (ДК) [6] и малонового диальдегида (МДА) [8]. Уровень карбонильных производных белков (КПБ) определяли по методу, предложенному L. R. Levine [12], содержание битирозина оценивалось спектрофлуориметрическим методом (спектрофлуориметр Aminco Bowman Series 2) [1], о содержании среднемолекулярных пептидов (СМП) судили по результатам прямой спектрофотометрии депротеинизированного супернатанта [3], определение количества восстановленных тиоловых групп белков осуществляли по их взаимодействию с 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой [7].

Для всех полученных данных определяли среднее арифметическое значение (М) и ошибку средней арифметической (m). Проверку гипотезы о статистической достоверности величин, исследуемых показателей несвязанных выборок, проводили с помощью критерия Манна-Уитни. Статистический

анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft Inc., 2004).

Результаты и обсуждение

Анализ полученных данных свидетельствует об усилении образования продуктов перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков (ОМБ) в плазме крови у больных при всех рассмотренных формах рака легкого.

Уровень диеновых конъюгатов при ПКРЛ возрастает относительно контроля на 41,5%, при АКЛ и МКРЛ незначительно различается между собой и превышает контроль на 168,3% и 173,2% соответственно (рис. 1 А).

Содержание малонового диальдегида значительно возрастает при немелкоклеточных формах рака: на 218,5% при ПКРЛ и на 321,5% при АКЛ, и практически не изменяется при МКРЛ (рис. 1 Б). Таким образом, при плоскоклеточном раке при относительно небольшом увеличении уровня ДК, значительно возрастает содержание МДА, в то же время при мелкоклеточном раке при практически трехкратном усилении образования ДК, накопления МДА почти не происходит. При аденокарцинома значительно возрастают значения обоих показателей - ДК и МДА.

Содержание карбонильных производных белков имеет максимальные значения при ПКРЛ, минимальные при МКРЛ и превышает контрольные значения при ПКРЛ - на 221,4%, при АКЛ - на 114,3% и при МКРЛ - на 92,9% (рис. 2 А). Содержание битирозина, напротив, минимально при ПРКЛ, максимально при МКРЛ и увеличивается по сравнению с нормой при ПКРЛ на 28,9%, при АКЛ на 48,9%, при МКРЛ его уровень возрастает более чем в 2 раза

- на 115,6% (рис. 2 Б).

Наряду с повышением уровня битирозина и карбонильных производных белков, в плазме крови отмечалось увеличение концентрации среднемолекулярных пептидов, высокий уровень которых является отражением

степени фрагментации белков [4]. Их уровень увеличивается на 69,9%, 115,5% и 95,4% при ПКРЛ, АКЛ и МКРЛ, соответственно (рис. 2 В).

При немелкоклеточных формах рака легкого наличие окислительного стресса также подтверждается снижением содержания восстановленных тиоловых групп в белках. Их уровень снижен по сравнению с нормой на 42,4% при ПКРЛ и на 39,0% при АКЛ. При МКРЛ содержание восстановленных тиоловых групп превышает нормальные значения на 7,1% (рис. 2 Г).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что действительно при раке легкого наблюдается усиление процессов свободно-радикального окисления. В ходе заболевания происходят изменения практически всех показателей, которые в свою очередь зависят от гистологического типа злокачественного новообразования. При немелкоклеточных формах рака легкого (ПКРЛ и АКЛ) изменения показателей во многом имеют сходный характер, в то время, как их значения при мелкоклеточном раке имеют существенные отличия.

Интенсификация процессов ПОЛ способствует образованию и накоплению токсических продуктов. Диеновые конъюгаты являются первичными продуктами липопероксидации, в результате их дальнейшего окисления образуются такие продукты, как малоновый диальдегид, который в определенных условиях может и не накапливаться, но содержание промежуточных продуктов будет увеличмваться. Вероятно, при ПКРЛ действие окислительного стресса носит хронический характер, что приводит к накоплению конечных продуктов липопероксидации, таких как МДА. При МКРЛ также происходит усиление окислительных процессов, но оно вызвано значительно более тяжелым течением заболевания, при котором организм включает все возможные защитные механизмы, что вероятно приводит к тому, что на фоне увеличения первичных продуктов ПОЛ, конечные продукты окисления липидов образуются в незначительных количествах.

Помимо увеличения интенсивности ПОЛ в плазме наблюдалось также и увеличение содержания продуктов окислительной модификации белков. Учитывая большую и очень разнообразную функциональную нагрузку белков,

их окислительная модификация может носить в отличие от пероксидации липидов более специфический характер при различных патологических состояниях.

Образование карбонильных производных белков может осуществляться как путем прямого окисления аминокислотных остатков, так и при взаимодействии с продуктами липопероксидации (МДА, 4-гидрокси-2-ноненалем) и

гликооксидации. Их содержание может служить показателем общего окислительного стресса [10, 13]. Исходя из полученных данных, можно предположить, что уровень карбонильных производных имеет обратную зависимость от скорости роста опухоли. Максимальный уровень КПБ при ПКРЛ, вероятно, может являться следствием усиления образования аддуктов белков с продуктами окисления других биомолекул, например, липидов и углеводов при более длительном сроке заболевания, чем АКЛ и МКРЛ.

Увеличение содержания битирозина подтверждает представленные выше данные, свидетельствующие об увеличении интенсивности окислительной модификации белков. Поскольку битирозин образуется, главным образом, при прямом воздействии активных форм кислорода на белковые молекулы [10], более значительное увеличение его содержания при МКРЛ, вероятно, связано с относительно более злокачественным его течением.

Окислительная модификация белков также может быть связана с изменением их структурной организации, сопровождающейся фрагментацией с образованием низкомолекулярных компонентов. Так в плазме крови отмечалось увеличение концентрации среднемолекулярных пептидов, высокий уровень которых является отражением степени фрагментации белков [4]. Образование СМП происходит с разной интенсивностью при различных типах рака легкого. Поскольку известно, что многие пептиды обладают определенной биологической активностью, то это может свидетельствовать об их роли в реализации общетоксического действия на организм.

Исследование содержания тиоловых групп белков в плазме крови больных раком легкого выявило снижение их уровня относительно представителей

контрольной группы. Это также свидетельствует об увеличении интенсивности окислительных процессов в плазме, а также об истощении защитных возможностей организма при данной патологии. Окисление белков, содержащих БИ-группы, приводит к снижению восстановленных и повышению уровня окисленных тиоловых-групп. Отличие окисленных тиоловых групп от других форм окислительной модификации белков в том, что клетка имеет механизмы, способные обратить окисление, например, глутатионовую и тиоредоксиновую редокс-системы. По этой причине сульфгидрильные группы белков могут обладать регуляторной функцией. Обратимое

окисление/восстановление может защищать белки от других, более сильных повреждающих форм окислительной модификации, например образования карбонильных производных [11]. Отсутствие заметных изменений уровня тиоловых групп белков при МКРЛ, относительно контрольных показателей, также можно связать с тем, что в организме включаются имеющиеся защитные механизмы.

Проведенный нами сравнительный анализ окисления по уровню показателей перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков показал четкие различия между здоровыми лицами и больными раком легкого. Таким образом, определение различных показателей ПОЛ и ОМБ в плазме крови, позволяет более полноценно охарактеризовать состояние окислительного стресса в организме больных раком легкого, что может являться эффективным и целесообразным дополнением других диагностических процедур при определении тяжести заболевания, гистологического типа, в качестве прогностических критериев и др.

PDF created with pdfFactory Pro trial version www. pdffactory. com

OXIDATIVE MODIFICATION OF SERUM PROTEINS AND LIPIDS IN DIFFERENT HISTOLOGICAL TYPES OF LUNG CANCER.

R.N. Belonogov, N.M. Titova, U.A. Dihno, A.A. Savchenko Siberia Federal University

Abstract. We examined 57 patients to determine the protein and lipid oxidative modification indexes in the serum. We studied the content of diene conjugates, malonalaldehyde, carbonyl peptide derivatives, middle-molecular peptides, bityrosine, SH peptide groups in the serum. The revealed changes indicate the increase of free radical processes and vary in relation with histological type of the disease. We found out that in non-small cell lung carcinoma forms (squamous cell lung carcinoma and adenocarcinoma) the changes are similar while case of small cell lung carcinoma the changes differ.

Key words: lung cancer, lipid peroxidation, oxidative peptide modification.

Литература

1. Арутюнян А. В., Дубинина Е. Е., Зыбина Н. Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма.

- СПб.: Фолиант, 2000. - 103 с.

2. Болдырев А.А., Кяйвяряйнен Е.И., Илюха В.А. Биомембранология.

- Петрозаводск: Издательство Кар НЦ РАН, 2006.- 226 с.

3. Габриэлян Н. И., Дмитриев А. А., Савостьянова О. А. и др. Средние молекулы и уровень эндогенной интоксикации у реанимационных больных // Анестезиол. и реаниматол. - 1985. - №1. - С. 36-38.

4. Дубинина Е.Е., Морозова М.Г., Леонова Н.В. и др. Окислительная модификация белков плазмы крови больных психическими

расстройствами (депрессия, деперсонализация)// Вопр. медицинской химии. - 2000. - Т. 46, №4. - С. 398-409.

5. Дубинина Е. Е., Пустыгина А. В. Свободнорадикальные процессы при старении, нейродегенеративных заболеваниях и других патологических состояниях // Биомедицинская химия. - 2007. - Т. 53, №4.

- С. 351-372.

6. Каган В. Е., Орлова О. Н., Прилипко Л. Л. Проблемы анализа

эндогенных продуктов перекисного окисления липидов. - М.:

издательство ВИНИТИ АН СССР,1986. - 136 с.

7. Карузина А.И., Арчаков А.И. Выделение микросомной фракции печени и характеристика окислительных систем // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977.- С. 49-62.

8. Стальная И. Д., Гаришвили Т. Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 66-68

9. Du J., Gebicki J. M. Proteins are major initial cell targets of hydroxyl free radicals // The international journal of biochemistry and cell biology. -2004. - Vol. 36, №11. - P. 2334-2343.

10. Giulivi C., Traaseth N. J., Davies K. J. A. Tyrosine oxidation products: analysis and biological relevance//Amino acids. - 2003. - Vol. 25, №3. - P. 227-232.

11. Kemp M., Go Y., Jones D. P. Nonequilibrium thermodynamics of thiol/disulfide redox systems: A perspective on redox systems biology // Free Radical Biology & Medicine. - 2008, №6. - Vol. 44. - P. 921-937

12. Levine L. R., Williams J. A., Stadtman E. R., Shacter E. Carbonyl assay for determination of oxidatively modified proteins // Methods in enzymology.

- 1994. - Vol.233, №37. - P. 346 - 357.

13. Zitnanova I., Sumegova K., Simko M., Maruniakova A. Protein carbonyls as a biomarker of foetal-neonatal hypoxic stress // Clinical biochemistry. - 2007. - Vol. 40, №8. - P. 567-570.