СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОГЕРПЕТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ВИРУС ПРОСТОГО ГЕРПЕСА (ВПГ) in vitro
METHOD FOR ASSESSING ANTI-HERPETIC EFFICACY in vitro OF PHOTODYNAMIC EXPOSURE ON HERPES SIMPLEX VIRUS (HSV)

Предлагаемое изобретение относится к области медицины и вирусологии и может быть использовано для изучения противогерпетической активности фотодинамической терапии.
По современным представлениям доказана этиологическая роль герпесвирусной инфекции, в частности, вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) и цитомегаловируса (ЦМВ) в привычном невынашивании беременности (ПНБ) [1]. Существует большой арсенал медикаментозных средств и методов лечения ПНБ вирусного генеза. Несмотря на разработку новых методов лечения ПНБ вирусного генеза нет четкой тенденции к снижению частоты данной патологии. Необходим поиск альтернативных методик лечения рассматриваемой патологии.
Фотодинамическая терапии (ФДТ) - новая медицинская технология, основанная на использовании фотодинамического повреждения клеток в ходе фотохимических реакций. Метод заключается во введении в организм раствора фотосенсибилизатора (биохимически инертного в темноте вещества), который под действием лазерного облучения приводит к образованию активных форм кислорода (АФК) (синглетный кислород, пероксиды и т.п.) [2]. При фотодинамической терапии АФК обладают цитотоксическим действием. Механизмы, лежащие в основе ФДТ, являются предметом многочисленных исследований и до конца не изучены.
Таким образом, для возможного в дальнейшем применения ФДТ в качестве лечения герпесвирусной инфекции у женщин с ПНБ вирусного генеза первоначально необходим способ оценки противовирусного эффекта ФДТ in vitro.
Предшествующий уровень техники
Известны способы фотодинамического воздействия на вирусы с различными фотосенсибилизаторами in vitro. Так Bernstein EF и соавт.создали in vitro модель для изучения воздействия ФДТ на вирус папилломы человека (ВПЧ) с использованием ФС дигематопорфирина (Фотофрин II) [3]. В экспериментах использовали клеточные линии кератиноцитов, как инфицированных ВПЧ 18 типа, так и незараженных. После воздействия ФС наблюдали его накопление в клеточных линиях, но более чувствительные к ФС были клетки, инфицированные ВПЧ 18 типа. Недостатки вышеописанной модели: специфичность только в отношении ВПЧ, культура клеток кератиноцитов плохо поддается стандартизации, в экспериментах использовался Фотофрин II - ФС, характеризующийся значительной токсичностью. Несмотря на то, что исследователи показали эффект накопления ФС в клетках, инфицированных вирусом папилломы человека, на данной модели не был показан фотодинамический эффект - в экспериментах не осуществлялось лазерное воздействие.
2
Известен способ того же назначения, включающий фотодинамическое ингибирование герпесвирусной инфекции с использованием порфиринов, индуцируемых 5-аминолевуленовой кислотой (5-АЛК) [4]. Согласно этому способу были использованы культуры клеток почки африканской зеленой мартышки Vero и глиомы крысы С6; в качестве вируса использовали штамм ВПГ-1; фотосенсибилизатор - эндогенный порфирин, индуцируемый 5-АЛК. Облучение проводили светом видимого диапазона (3-5 мин, дозы 19,5-32,5 кДж/м). Была установлена повышенная способность клеток-мишеней накапливать индуцируемые 5-аминолевуленовой кислотой эндогенные порфирины, что обусловило избирательность их фотоповреждения. В данном способе было изучено действие фотосенсибилизатора только на вновь продуцируемый вирус (вирусное потомство) с определением только титра потомства вируса в культуральной жидкости. Этот способ принят за ближайший аналог.
Задачей изобретения является разработка усовершенствованного способа оценки противогерпетического эффекта фотодинамической терапии in vitro.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность более точной оценки эффекта фотодинамической терапии in vitro с возможностью изучения механизмов различных вариантов проведения ФДТ для дальнейшего прогнозирования эффективности ФДТ у герпесинфицированных больных.
Технический результат достигается за счет того, что ФДТ эффект оценивают комплексно через воздействие in vitro в трех направлениях: непосредственно на вирус простого герпеса (ВПГ-1 и ВПГ-2), на вирусинфицированные клетки, а также на вирусное потомство.
Сущность изобретения заключается в том, что для оценки эффективности фотодинамических воздействий на вирусы используется система для определения прямого и опосредованного действия in vitro. Существует необходимость использования одновременно всех трех подходов при оценке механизмов противогерпетического действия ФДТ, которые заключаются в воздействии на вирусные частицы, на инфицированные клетки, а также на вновь продуцируемый вирус. Необходимость изучения механизмов противогерпетического действия ФДТ непосредственно на вирусные частицы обусловлена тем, что фотосенсибилизатор может накапливаться на вирусной оболочке и при активации лазером разрушать вирусные частицы, или накапливаться в вирусинфицированных клетках или воздействовать на вирусное потомство. При получении достоверного эффекта во всех трех образцах можно говорить о перспективе клинического применения ФДТ при лечении герпетической инфекции. Полученные данные в дальнейшем помогут подобрать адекватную схему ФДТ для больных герпетическими инфекциями с использованием различных фотосенсибилизаторов.
Принцип фотодинамического лазерного воздействия состоит в том, что вводят вещество - фотосенсибилизатор, которое в темноте инертно, но при действии лазерного облучения фотосенсибилизатор активируется (вырабатываются активные радикалы), что и приводит к цитотоксическому или противовирусному действию. Для данного способа дозы препарата подбирали по такому принципу, что его внесенное количество в отсутствие лазурного облучения спонтанно не должно было приводить к гибели клеток в монослое. Дозы препарата, не обладающие токсическим действием, использовались в дальнейших экспериментах. Относительно подбора доз лазерного облучения в экспериментах использовали дозы облучения, которые без фотосенсибилизатора не приводят к разрушению клеток или вирусных частиц.
Перед проведением оценочных экспериментов существует необходимость подбора дозы облучения и дозы препарата - фотосенсибилизатора.
В качестве фотосенсибилизатора в экспериментах in vitro был использован препарат нового поколения, который содержит в качестве основного компонента производное хлорина Е6, - «Фотодитазин», изготовленный в соответствии с ТУ 4-19-162-92, и соответствует санитарным правилам СанПиН 1.2681-97 (Санитарно-эпидемиологическое заключение №77.99.03.915.Д.008729.12.03 от 03.12.2003 г.). В опытах использовали стерильный раствор препарата «Фотодитазин».
В качестве источника светового воздействия для осуществления лазерного облучения применяли аппарат физиотерапевтический «АФС» (ООО «Полироник») с длиной волны 662 нм и максимальной мощностью излучения на выходе 180 мВт. Данный источник лазерного облучения имеет соответствующие сертификаты и регистрационные номера в Государственном реестре медицинской аппаратуры.
50
50
Вирус простого герпеса 1 типа (штамм VR-3), вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS) были получены из Национальной вирусной коллекции (Великобритания). Титр ВПГ-1 составлял 6,0 ТЦД/0,1 мл, а ВПГ-2 - 4,5 ТЦД/0,1 мл.
Фотосенсибилизатор «Фотодитазин» разводили до концентраций 10, 25, 50, 100, 200, 400 мкг/мл физиологическим раствором (NaCl 0,9%).
2
2
2
2
2
2
Для подбора оптимальной дозы лазерного излучения образцы вирусной культуры по 200 мкл были распределены в пробирки. Все образцы были облучены изолированно друг от друга лазерным светом в дозах 0,285, 0,57, 1,8, 3,42, 10,62 Дж/см. Затем после облучения были помещены на 24-часовой монослой клеток. Инкубацию культуры клеток проводили при температуре +37°С в атмосфере 5% СО в течение 48 часов. Было установлено, что максимальная доза лазерного облучения, при которой не наблюдалось значительных изменений в культуре клеток, составила 1,8 Дж/см. При других дозах лазерного облучения (3,42 Дж/см и 10,62 Дж/см) наблюдалась деградация клеток. Поэтому в качестве рабочей дозы лазерного облучения использовали дозу 1,8 Дж/см.
2
2
Перед проведением оценочных экспериментов существует необходимость подбора концентраций препарата фотосенсибилизатора «Фотодитазин», при которых изменения в культуре клеток достоверно не отличались от монослоя в контрольных образцах. Для эксперимента был использован препарат в концентрациях 0, 10, 25, 50, 100, 200 мкг/мл, который вносили в монослой культуры клеток Vero в объеме 200 мкл в условиях темноты. Часть проб была подвергнута лазерному облучению (1,8 Дж/см - нетоксичная доза для используемой культуры клеток). Инкубацию культуры клеток проводили при температуре +37°С в атмосфере 5% СО в течение 48 часов. Было получено, что при концентрации препарата «Фотодитазин» 100 и выше наблюдалась полная деградация клеток, следовательно, такие концентрации губительны для культуры клеток. Лазерное облучение никак не влияло на полученный результат.
Таким путем можно подбирать дозы различных лазерных воздействий и фотосенсибилизаторов для оценки эффективности ФДТ.
Способ осуществляют следующим образом.
Фотодинамическому воздействию подвергают: 1) перевиваемую культуру клеток Vero почки африканской зеленой мартышки (получена из Института им. Пастера (С-Петербург), инфицированную ВПГ-1и ВПГ-2; 2) вирус простого герпеса - ВПГ-1 и ВПГ-2; 3) вирусное потомство.
2
Клетки Vero заражают вирусом простого герпеса и культивируют в среде DMEM с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (2%). Культивирование клеток проводят в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах (COSTAR, США) при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO [5, 6]. Через пять суток определяют титр вируса по цитопатическому действию на монослое клеток Vero, например, по методу Рида и Менча [5].
Для определения титра вирусного потомства готовят десятикратные разведения культуральной жидкости (полученной через пять суток после культивирования вируса при действии ФДТ), а затем вносят эти разведения на полный монослой клеток Vero. Титр вновь синтезированного вируса (вирусное потомство) определяют через пять суток по цитопатическому действию на монослое клеток, например, по методу Рида и Менча [5].
50
Для определения прямого противогерпетического действия ФДТ к вируссодержащей жидкости (объем 0,5 мл) вносят 0,5 мл различных концентраций препарата фотосенсибилизатора. В качестве отрицательного контроля используют полную культуральную среду DMEM. Затем проводят инкубацию при комнатной температуре в темноте в течение полутора часов. Лазерным излучением воздействуют в течение 30 секунд. Контрольные образцы не подвергают лазерному воздействию. В полученных образцах проводят определение титра вируса. Для этого в лунки 96-луночных плоскодонных планшетов с монослоем клеток Vero, выращенных на среде DMEM с 5% содержанием эмбриональной телячьей сыворотки, вносят по 200 мкл полученных образцов и через пять суток определяют титр вируса по цитопатическому действию на монослое клеток, например, по методу Рида и Менча [5]. Значимым результатом считается изменение титра вируса после обработки на 2 и более lg ТЦД/0,1 мл.
50
Оценку эффективности противогерпетического действия проводят по титру вируса для культуры клеток, образцов вирусов и для вирусного потомства. При снижении титра от исходного значения на 2 и более lg ТЦД/0,1 мл в культуре клеток, вирусном потомстве и образцах вирусов оценивают противогерпетическое действие как эффективное.
Пример 1
50
Эксперимент был поставлен по схеме для определения прямого противогерпетического действия ФДТ. Так, к 0,5 мл вируссодержащей жидкости (с ВПГ-2) вносили 0,5 мл препарата фотосенсибилизатора «Фотодитазин» (50, 100, 200 мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали полную культуральную среду DMEM. Проводили инкубацию при комнатной температуре в темноте в течение полутора часов и далее на вируссодержащую жидкость воздействовали лазерным излучением в течение 30 секунд. Контрольные образцы не подвергали лазерному воздействию. В полученных образцах проводили определение титра вируса через пять суток по цитопатическому действию на монослое клеток по методу Рида и Менча [5]. В образцах без воздействия лазерного облучения (контрольные образцы) титр ВПГ-2 статистически не отличался от такового в контрольном образце (без препарата). В образцах вируса, которые были обработаны ФС в концентрации 100 и 200 мкг/мл, были выявлены достоверные отличия. Так, титр ВПГ-2 снижался в среднем на 2 ТЦД/0,1 мл (т.е. в 100 раз и более). Таким образом, в образцах с концентрациями ФС «Фотодитазин» 100 и 200 мкг/мл получено достоверное снижение титра вируса ВПГ 2 типа.
Пример 2
6
6
-1
-
9
50
Для определения опосредованного противогерпетического действия ФДТ готовили взвесь клеток Vero 2,5*10 кл/мл и вносили по 200 мкл в лунки 96-луночного планшета (т.е. по 0,5*10 клеток на лунку). Через 24 часа после образования монослоя клеток Vero готовили десятикратные разведения ВПГ-1 (от 10 до 10). В качестве отрицательного контроля использовали культуральную жидкость. В лунки с монослоем вносили по 100 мкл вируссодержащей жидкости (приготовленных разведении) и инкубировали в течение часа (далее освобождали лунки от несвязавшегося вируса). Инкубировали инфицированный монослой с ФС (10, 50, 100, 200 мкг/мл) при комнатной температуре в темноте в течение полутора часов, далее воздействовали лазерным излучением в течение 30 секунд. Контрольные образцы не подвергались лазерному воздействию. Через пять суток проводили определение титра ВПГ-1 в полученных образцах по цитопатическому действию на монослое клеток по методу Рида и Менча [5]. При концентрациях ФС 10 и 50 мкг/мл наблюдались незначительные изменения в культуре клеток (контрольные образцы), поэтому можно считать эту концентрацию и выбранные дозы облучения условно оптимальными для последующих экспериментов. Титр ВПГ-1 в результате проведенного эксперимента снижался более чем в 100 раз (т.е. на два порядка и более). Так, титр ВПГ-1 снижался на 2 ТЦД/0,1 мл (т.е. в 100 раз).
Пример 3
6
6
-1
-9
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
Для определения действия ФДТ на вновь синтезированный вирус (вирусное потомство) готовили взвесь клеток Vero 2,5*10 кл/мл и вносили по 200 мкл в лунки 96-луночного планшета (т.е. по 0,5*10 клеток на лунку). После образования монослоя клеток (через 24 часа) готовили десятикратные разведения ВПГ-1 и ВПГ-2 (от 10 до 10). В качестве отрицательного контроля использовали культуральную жидкость. В лунки с монослоем вносили по 100 мкл вируссодержащей жидкости (приготовленных разведении) и проводили инкубацию в течение часа, далее освобождали лунки от несвязавшегося вируса. Инкубировали инфицированные клетки с ФС (10, 25, 50, 100 мкг/мл) при комнатной температуре в темноте в течение полутора часа и воздействовали лазером в течение 30 секунд. Контрольные образцы не подвергали лазерному воздействию. Через пять суток после инкубации собирали культуральную среду с опытных и с контрольных лунок и вносили в 100% монослой клеток Vero в следующих разведениях: исходная культуральная жидкость, разведения культуральной средой без сыворотки до разведения 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10. Через пять суток проводили определение титра в полученных образцах по методу Рида и Менча [5].
50
Контроль препарата без облучения и контроль с облучением, но без препарата, достоверно не отличались от образцов с вирусом (без какого-либо воздействия). При комплексном воздействии лазерного облучения и ФС на культуру клеток, инфицированных ВПГ-1 и ВПГ-2, титр вновь продуцируемого вируса снижался на 2,3 (в случае ВПГ-1) и 2,5 (в случае ВПГ-2) ТЦД/0,1 мл.
Способ отличает простота в использовании, возможность применения в моделировании любых типов (тропных к клеткам Vero) вирусов. Способ позволяет провести анализ противогерпетической активности ФДТ непосредственно на вирус простого герпеса, в культуре клеток in vitro, зараженных ВПГ-1 и ВПГ-2, а также оценить противогерпетическое действие ФДТ на потомство вновь продуцируемого вируса. Также способ позволяет изучать точки действия ФС при ФДТ: либо на вирус герпеса (эксперименты с прямым действием на вирусные частицы), либо на вирусинфицированные клетки, либо на процессы репродукции вируса в клетках (изменение титра вирусного потомства). Представленный способ позволяет оценить механизм действия ФДТ на систему вирус-клетка.
Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение данных, необходимых для оценки эффективности противогерпетического действия фотодинамической терапии in vitro.
Источники информации
1. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и др. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет // - М., 2007. - 176 с.
2. Патент RU 2291700 (13) С2, 20.01.2007.
3. Bernstein EF, Glass JM, DeGraff WG, Schlegel R, Black C, Fisher JM, Cook SN, Glatstein E, Russo A, Mitchell JB // In vitro photodynamic treatment of normal and human papilloma virus-transfected keratinocytes with photofrin II and red light // Arch Dermatol, 1991 May; 127 (5): 683-7.
4. Квачева З.Б. и соавт. Фотодинамическое ингибирование инфекции; вызванной вирусом простого герпеса типа 1 в культуре клеток, при использовании порфиринов, индуцируемых 5-аминолевуленовой кислотой // Вопросы вирусологии, 2005 №4, с.44-47.
5. Фрешни Р. Культура животных клеток. Практическое руководство // Москва, Изд. Мир, 1989, 333 с.
6. Биргер М.О., Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования // Изд. Медицина, 1982.