Микрофлюидные чипы для исследования биологических объектов методами микроскопии высокого разрешения

И.В. Кухтевич, А.С. Букатин, И.С. Мухин, А.А. Евстрапов_

МАТЕРИАЛОВЕДЕНИЕ И НАНОТЕХНОЛОГИИ

УДК 53.082.5+53.086+532.5.011

МИКРОФЛЮИДНЫЕ ЧИПЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ МЕТОДАМИ МИКРОСКОПИИ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ

И.В. Кухтевич, А.С. Букатин, И.С. Мухин, А.А. Евстрапов

Микрофлюидные устройства в сочетании с методами микроскопии высокого разрешения позволяют создавать новые аналитические системы для исследований биологических объектов в естественном состоянии. Сформулированы основные требования, предъявляемые к методам микроскопии при неразрушающем изучении биологических объектов. Рассмотрены и обсуждены варианты фиксации биологических объектов. Приведены примеры экспериментальных образцов микрофлюидных чипов для методов микроскопии высокого разрешения.

Ключевые слова: микрофлюидный чип, биологическая проба, микро- и наноструктуры, конфокальная микроскопия, микроскопия ближнего поля, атомно-силовая микроскопия, литография.

Введение

Концепция создания аналитических систем на микрочиповой платформе (микрофлюидных чипах), предложенная проф. A. Manz в конце 80-х г.г. XX в., явилась основой новых высокопроизводительных приборов [1], получивших за рубежом названия «lab-on-a-chip» (лаборатория на чипе) и «micro Total Analysis Systems» (микросистемы «полного» анализа) [2]. Заинтересованность государственных организаций и коммерческих фирм в создании микроаналитических систем и новые возможности современных технологий вызвали прогресс в разработке приборов на микрочиповой платформе, изучении процессов и явлений в микро- и наноразмерном масштабе, создании новых методов синтеза и анализа веществ на микрочипах, исследовании возможностей микрофлюидики [3]. За последние 10 лет по теме микрофлюи-дика (microfluidic), по данным ISI Web of Science, было издано более 10 тыс. статей, и динамика публикаций непрерывно растет. За рубежом по микроаналитическим системам и смежным направлениям издается значительное число монографий и книг [4]. Современным развитием микрофлюидики является на-нофлюидика [5], изучающая эффекты в наноразмерных системах, транспорт молекул через наноканалы, взаимодействие с наноструктурами и т.д. Развитие микрофлюидики привело к появлению приборов, в которых осуществлялось воспроизводимое управление нано- и пиколитровыми объемами жидкости. В настоящее время микрофлюидные устройства востребованы в научной сфере и в промышленности как новый многообещающий инструмент для развития и создания новых методов и продуктов.

Для получения новых знаний важным является разработка высокочувствительных методов и приборного обеспечения для исследования биологических объектов (клеток, бактерий, вирусов и т.д.) в естественном состоянии. К наиболее эффективным системам при реализации неразрушающих методов анализа следует отнести микрофлюидные чипы (МФЧ), а регистрация изменений, происходящих в объектах под воздействием внешних факторов, может осуществляться разными методами, но достигнуть высокого пространственного разрешения можно, используя методы конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), сканирующей ближнепольной оптической микроскопии (СБОМ), атомно-силовой микроскопии (АСМ). Визуализация в жидкости требует стабильной иммобилизации или фиксации биологических объектов. По этой причине поверхность материала часто подвергают специальной химической обработке, где впоследствии фиксируются биологические объекты. Но это может приводить к разрушению функциональных групп и повреждению структуры изучаемого объекта. Актуальным является разработка альтернативных методов фиксации объекта, в том числе на основе физических методов, не повреждающих биообъект. Микрофлюидные технологии позволяют осуществлять манипуляции с исследуемым объектом, воздействовать на объект, фиксировать его на заданном участке и измерять характеристики объекта, в том числе реологические [6]. Известны системы для исследований биологических объектов (клеток), сочетающие методы микроскопии высокого разрешения (МВР) и микрочиповые технологии [7, 8]. При этом стремятся создать различные гибридные методы и техники, обеспечивающие получение новой информации об объектах.

В настоящей работе приведены некоторые результаты исследований и работ авторов по созданию МФЧ для исследований биологических объектов достаточно больших размеров (1-7 мкм) методами МВР.

Исследование биологических объектов методами МВР

В процессе исследований были сформулированы следующие основные требования, которые необходимо соблюдать при изучении биологических объектов в естественном состоянии методами МВР:

7

- при наличии зондирующего излучения (светового потока) плотность мощности излучения не должна приводить к негативному воздействию на объект, при этом длительность воздействия излучения должна быть минимизирована;

- если в процессе измерений исследуемый объект подвергается нагреву, то должен быть предусмотрен отвод избыточного тепла от нагреваемого пространства;

- применение красителей и флуорофоров для усиления контраста или дополнительной индикации элементов структуры объекта не должно приводить к изменению функций исследуемого объекта;

- при сканировании объекта с применением методов зондовой микроскопии должно быть обеспечено минимальное физическое воздействие на объект, что может быть получено при использовании специальных зондов и полуконтактных методов исследований, кроме того, необходимо использовать малые амплитуды колебаний зонда;

- для получения достоверной и воспроизводимой информации время сканирования объектов должно быть минимизировано;

- в методах оптической микроскопии для достижения наилучшего разрешения объектив должен быть максимально приближен к изучаемому объекту, что приводит к определенным требованиям к реакционной камере, где размещен исследуемый объект;

- для методов зондовой микроскопии необходимо обеспечить доступ зонда к исследуемому объекту.

При исследовании биологических препаратов процесс подготовки образцов имеет определяющее значение для любого вида микроскопии. Методы и способы фиксации клетки в микрочиповых устройствах подразделяются на иммунологические и неиммунологические (физические). Иммунологические методы, в которых используются высокоспецифичные иммунные реакции между мембранными белками и антителами, реализованы в коммерческих продуктах многих биотехнологических фирм. Недостатками их являются дороговизна реагентов, необходимость специального оборудования и высокие требования к квалификации исследователя. Эти методы непрестанно развиваются, появляются новые методики фиксации объектов на различных подложках. Получила широкое распространение иммобилизация клеток путем включения в различные гели, мембраны, волокна, основанная на химических и физических взаимодействиях. При такой иммобилизации клетки могут сохранять жизнеспособность и в присутствии питательной среды размножаться в приповерхностных слоях гелей. Но такой способ подходит только для методов оптической микроскопии и для КЛСМ.

Приготовление образцов для зондовой микроскопии предполагает иммобилизацию объекта на поверхности подложки, что приводит к дополнительным экспериментальным и методическим трудностям. Например, в случае бактерий вместо такой характеристики, как диаметр бактериальной клетки, появляются две новые - ширина и высота, причем высота меньше ширины из-за «сплющивания» клетки при ее фиксации к поверхности подложки. При получении изображений методом сканирующей зондовой микроскопии общепризнанным методом фиксации является обработка глутаровым альдегидом [9]. Поскольку при обработке глутаровым альдегидом клетка сохраняет воду и не расплывается по подложке, то считается, что ее изображение идентично изображению нативных клеток. При исследовании образцов в жидкости возникает проблема фиксации биологических объектов. В этом случае на поверхность подложки, на которой должны располагаться изучаемые объекты, наносится поли-Ь-лизин, лак (раствор нитроцеллюлозы и дибутилфталата в этилацетате и бутилацетате) или агароза.

В рамках данного проекта исследован вариант методики модификации стеклянной поверхности микрочипа для селективной фиксации биологического объекта, содержащей стадии активации поверхности, силанизации, обработки глутаровым диальдегидом и иммобилизации чувствительного слоя (белка или других агентов) [10]. Такой метод позволяет реализовать высокоселективную реакцию, например, взаимодействие антиген-антитело, с последующим детектированием образованного комплекса методами МВР.

К физическим методам фиксации биологических объектов в микрочипе следует отнести механические и гидродинамические «ловушки» с микро- и наноразмерными структурами. Суть действия такой «ловушки» заключается в том, что под действием ламинарных потоков изучаемый объект попадает в область, где его движение ограничено или затруднено. Структурами, затрудняющими движения объекта могут являться микро- и наноканалы с размерами меньше размеров объекта. Эти методы можно назвать пассивными, так как при этом воздействие на исследуемый объект минимально. К другим физическим методам следует отнести те, в которых применяются электрические, магнитные, электромагнитные и ультразвуковые поля [11-13]. Эти методы можно определить как активные, так как они в какой-то степени меняют исходные характеристики объекта. Физические методы позволяют создавать быстрые и простые технологии фиксации объектов. Наиболее простыми и эффективными методами для применения в микрочиповых устройствах являются механические и гидродинамические «ловушки» с микро- и нанопо-ристыми мембранами, микро- и наноструктурами в канале или реакторе чипа. В работе уделялось внимание созданию МФЧ с функциональными микро- и наноструктурами для удерживания и фиксации клетки. Другим перспективным методом удержания и фиксации клетки является диэлектрофорез (ДЭ) [14]. Из-за простоты ДЭ широко используется в микрочиповых приборах для разделений бактерий, рако-

вых клеток, стволовых клеток, субпопуляций лейкоцитов. Различные типы клеток могут быть отделены с одной и той же конструкцией электрода при соответствующей частоте для каждого типа клетки. Преимуществом ДЭ является гибкость, полная контролируемость, удобство для автоматизации, а недостатком - нагрев системы и необходимость подбора буферного раствора с требуемой диэлектрической проницаемостью и проводимостью, а это означает, что клетки не могут быть непосредственно отделены в исходном образце.

МФЧ для микроскопии высокого разрешения

Существует множество технологий и методов формирования микро- и наноструктур в различных подложках, но выбор нужной технологии всегда в значительной степени определяется применяемым материалом и характеристиками формируемых структур. Все технологии (например, лазерная микрообработка, кислотное травление, ионно-реактивное травление и т.п.) связаны с активным воздействием на поверхность материала, что приводит к изменению свойств поверхности. Подробно с технологиями и методами формирования микроструктур можно ознакомиться в соответствующих обзорах и книгах [15, 16].

Микроразмерные каналы и реакторы для МФЧ из стекла марки К8 были получены методами фотолитографии и кислотного травления, а сеть наноразмерных каналов между микроканалами - методом ионной литографии [17]. Герметизация микро- и наноканалов осуществлялась разными методами: термического связывания (спекания), с применением полидиметилсилоксановых пленок или с помощью фотоотверждаемых клеев [18].

Были изготовлены и исследованы экспериментальные образцы МФЧ для методов КЛСМ, для СБОМ и АСМ: микрочипы с квадрупольными электродами для диэлектрофоретических методов и микрочипы с системой наноканалов для фиксации микрообъектов [19].

а б в

Рис. 1. Микрофлюидные чипы для КЛСМ: (а) - двухканальный микрочип с реакционными камерами (размеры МФЧ 24*24 мм, толщина 3 мм); (б) - чип с топологией «ступенька» (размеры МФЧ 30*40 мм, толщина 3 мм); (в) - область пересечения каналов МФЧ с топологией «ступенька» (изображение получено

на КЛСМ Leica TCS SL)

МФЧ (рис. 1, а) предназначен для исследований биологических объектов методами оптической микроскопии и КЛСМ в реакционных камерах диаметром 5 мм и глубиной 20 мкм, имеет два независимых канала и реактора. Герметизация чипа проведена фотоотверждающим клеем Rite Lock. Размеры чипа составляют 24*24 мм, толщина - 3 мм. МФЧ для исследований биологических объектов, изображенный на рис. 1, б, позволяет отделить объекты размером более 5 мкм на ступеньке, сформированной на пересечении каналов (рис. 1, в). Выделенные объекты могут быть перенаправлены в боковые каналы. В микрочипе имеется отдельный транспортный канал, обеспечивающий стабильный поток буферного раствора, канал ввода пробы и реакционный канал (шириной 60 мкм, глубиной 15 мкм), где происходит смешивание пробы и буфера. Такая универсальная топология позволяет реализовать широкий круг различных методик при исследовании образцов.

а б в г

Рис. 2. Принцип действия гидродинамической ловушки (а) и изображения: МФЧ с наноканалами (б);

наноканалов, соединяющих микроканалы: (в) - изображение получено на КЛСМ Leica TCS SL, длина волны сканирования 488 нм, (г) - 3й-реконструкция). Размеры МФЧ 24*24 мм, толщина 3 мм Особенностью МФЧ для СБОМ и АСМ является необходимость открытого доступа зонда к исследуемому объекту. Это подразумевает, что микроканал или реактор, в котором располагается объект в естественной жидкой среде, имеют контакт с воздушной средой. При этом наблюдается испарение жидкости, которое должно быть каким-то способом скомпенсировано. Были выбраны геометрические харак-

теристики канала, обеспечивающие максимальный приток жидкости на порядок больше, чем скорость испарения - 10 нл/с. Другим эффективным методом является применение жидких масел для предотвращения испарения жидкости, но это влияет на процедуру и точность измерений.

а б

Рис. 3. МФЧ для диэлектрофореза: (а) - с открытой реакционной камерой (для АСМ и СБОМ); (б) - с закрытой реакционной камерой и подводящими каналами (для КЛСМ). Размеры МФЧ 24*24 мм,

толщина 1,3 мм

На рис. 2, а, поясняется принцип действия гидродинамической ловушки. МФЧ с системой микроканалов имеет размеры 24*24 мм, толщину около 1,3 мм (рис. 2, б). Между микроканалами (шириной 50 мкм) расположена сеть из 10 наноканалов шириной 260-270 нм (рис. 2, в, г). Две разных конструкции МФЧ для ДЭ приведены на рис. 3. Микрочип (рис. 3, а) с открытой реакционной камерой предназначен для исследований методами АСМ и СБОМ, другой микрочип (рис. 3, б) - с закрытой реакционной камерой и подводящими каналами для буферного раствора и пробы - предназначен для оптической микроскопии и КЛСМ. В последнем случае необходимо использование при измерениях микрообъектива с рабочим расстоянием не менее 0,5 мм.

Все конструкции МФЧ были апробированы на модельных системах - буферных растворах, растворах флуоресцеина и полистирольных латексах размером 3 мкм и 6 мкм. Более подробную информацию о чипе для ДЭ можно найти в [19].

Заключение

Сочетание микрофлюидных технологий и методов микроскопии высокого разрешения позволяет создавать приборы и системы для исследований живых биологических объектов в естественной среде. При этом возникает ряд научных и технических задач, требующих решения. В методах микроскопии высокого разрешения необходимым является:

- фиксация объекта на время измерений;

- создание условий, при которых оказывается минимальное воздействие на изучаемый объект.

Авторами разработаны, изготовлены и апробированы несколько вариантов экспериментальных образцов микрофлюидных чипов для оптической микроскопии, КЛСМ, СБОМ и АСМ, позволяющих осуществлять исследования биологических объектов. Работоспособность микрофлюидных чипов была проверена на тестовых образцах и модельных системах.

Работа проведена при поддержке: АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011)» (РНП 2.1.2/9501); ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК П557, ГК 14.740.11.0451, ГК 14.740.11.1218); Программы У.М.Н.И.К.

Литература

1. Manz A., Graber N., Widmer H.M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing // Sensors and Actuators B: Chemical. - 1990. - № 1. - Р. 244-248.

2. Reyes D., Iossifidis D., Auroux P., Manz A. Micro total analysis systems. 1. Introduction, theory and technology // Analytical Chemistry. - 2002. - № 74. - Р. 2623-2636.

3. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics / Editor-in-Chief Li Dongqing. - New York: Springer Science & Business Media, 2008. - 2226 p.

4. Microarrays. Preparation, Microfluidics, Detection Methods and Biological Applications / Ed. K. Dill, R.H. Liu, P. Grodzinski. - New York: Springer Science & Business Media, 2009. - 356 p.

5. Nanofluidics. Nanoscience and Nanotechnology / Ed. by J.B. Edel, A.J. deMello. - Cambridge: The Royal Society of Chemistry, Thomas Graham House, 2009. - 198 p.

6. Nagai M., Oishi M., Oshima M., Asai H., Fujita H. Three-dimensional two-component velocity measurement of the flow field induced by the Vorticella picta microorganism using a confocal micro-PIV technique // Biomicrofluidics. - 2009. - V. 3. - Р. 014105.

7. Meister A., Gabi M., Behr P., Studer P., Voros J., Niedermann P., Bitterli J., Polesel-Maris J., Liley M., Heinzelmann H., Zambelli T. FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond // Nano Lett. - 2009. - V. 9. - № 6. - Р. 25012507.

8. Flores S.M., Toca-Herrera J.L. New future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques // Nanoscale. -2009. - № 1. - Р. 40-49.

9. Dufrene Y.F. Application of atomic force microscopy to microbial surfaces: from reconstituted cell surface layers to living cells // Micron. - 2001. - V. 32. - № 2. - Р. 153-165.

10. Евстрапов А.А., Есикова Н.А., Рудницкая Г.Е., Антропова Т.В., Анфимова И.Н. Разработка оптического сенсорного элемента для микрофлюидных чипов на основе натриево-боросиликатного пористого стекла // Научное приборостроение. - 2010. - Т. 20. - № 1. - С. 52-58.

11. Tsutsui H., Ho C.-M. Cell separation by non-inertial force fields in microfluidic systems // Mech. Res. Comm. - 2009. - № 36. - Р. 92-103.

12. Евстрапов А.А. Физические методы управления движением и разделением микрочастиц в жидких средах. Ч. 1. Диэлектрофорез, фотофорез, оптофорез, оптический пинцет // Научное приборостроение. - 2005. - Т. 15. - № 1. - С. 8-21.

13. Manneberg O., Vanherberghen B., Önfelt B., Wiklund M. Flow-free transport of cells in microchannels by frequency-modulated ultrasound // Lab Chip. - 2009. - № 9. - P. 833-837.

14. Voldman J. Electrical Forces For Microscale Cell Manipulation // Annu. Rev. Biomed. Eng. - 2006. - № 8. -Р. 425-454.

15. Lab-on-a-Chip Technology: Fabrication and Microfluidics / Ed. K.E. Herold and Rasooly A. - Norwich: Caister Academic Press, 2009. - V. 1. - 410 p.

16. Becker H., Gärtner C. Polymer microfabrication technologies for microfluidic systems // Anal. Bioanal. Chem. - 2008. - V. 390. - № 1. - Р. 89-111.

17. Евстрапов А.А., Мухин И.С., Кухтевич И.В., Букатин А.С. Применение ионной литографии для формирования наноразмерных каналов микрофлюидных чипов в стеклянных подложках // Научно-технический вестник СПбГУ ИТМО. - 2010. - № 4 (68). - С. 59-63.

18. Евстрапов А.А., Лукашенко Т.А., Тупик А.Н. Применение фотоотверждаемых оптических клеев для герметизации аналитических микрочипов // Научное приборостроение. - 2010. - Т. 20. - № 1. -С. 29-38.

19. Кухтевич И.В., Букатин А.С., Евстрапов А.А., Мухин И.С. Создание аналитической установки для биологических исследований на основе оптического микроскопа Axio Observer D1 и микрочиповых технологий. Ч. 1 // Научное приборостроение. - 2010. - Т. 20. - № 3. - C. 3-8.

Кухтевич Игорь Владимирович - Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, аспирант, ba@inbox.ru

Букатин Антон Сергеевич - Санкт-Петербургский академический университет - научно-

образовательный центр нанотехнологий РАН, аспирант, antbuk.fiztek@gmail.com

Мухин Иван Сергеевич - Санкт-Петербургский академический университет - научно-

образовательный центр нанотехнологий РАН, аспирант, imukhin@yandex.ru

Евстрапов Анатолий - Институт аналитического приборостроения РАН, кандидат техничеких

Александрович наук, доцент, an_evs@mail.ru