КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ
COMBINED THERAPY FOR TREATING GLIOBLASTOMA

Область изобретения
Настоящее изобретение в целом относится к лечению заболеваний и патологических состояний с применением антител против ФРЭС (фактора роста эндотелия сосудов). Конкретнее, настоящее изобретение относится к лечению пациентов-людей, подверженных или страдающих глиобластомой, с применением антитела против ФРЭС в комбинации с одним или более дополнительными противоопухолевыми терапевтическими агентами.
Уровень техники
Глиомы составляют до 81% от всех злокачественных опухолей головного мозга и ЦНС. Глиобластома (мультиформная глиобластома (GBM); астроцитома IV класса согласно Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ)), в частности, составляет от 60% до 70% случаев злокачественных глиом и остается наиболее агрессивным подтипом глиомы. Она возникает главным образом у взрослых (средний возраст на момент постановки диагноза: 64 года); частота ее встречаемости в США составляет 3,05/100000. При 1- и 5-летнем общем выживании (ОВ), равном 29% и 3%, соответственно, прогноз глиобластомы остается особенно неблагоприятным (Центральный реестр опухолей головного мозга США (2005) (CBTRUS; http://www.cbtrus.org)).
Хотя в области лечения глиобластомы достигнут определенный прогресс, это заболевание вызывает нереализованную потребность в области медицины с ограниченными вариантами лечения. В частности, значительным терапевтическим потенциалом обладает бевацизумаб (Avastin), моноклональное антитело против проангиогенного фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС).
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предложены способы и наборы для лечения пациентов, у которых диагностирована глиобластома, в том числе пациентов, у которых глиобластома диагностирована недавно.
В одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения пациента, у которого диагностирована глиобластома, включающие введение пациенту терапевтического средства, содержащего эффективное количество антитела против ФРЭС, эффективное количество химиотерапевтического агента и эффективное количество радиотерапевтического средства, причем указанное лечение продлевает медианное время общего выживания пациента по сравнению с пациентом с глиобластомой, получающим химиотерапевтический агент без антитела против ФРЭС.
В еще одном аспекте особенностью настоящего изобретения является применение эффективного количества антитела против ФРЭС, химиотерапевтического агента и лучевой терапии при производстве медикамента для увеличения медианного времени общего выживания пациента, у которого диагностирована глиобластома, по сравнению с пациентом с глиобластомой, получающим указанный химиотерапевтический агент без антитела против ФРЭС.
В еще одном аспекте особенностью настоящего изобретения является композиция, содержащая эффективное количество антитела против ФРЭС, химиотерапевтического агента и радиотерапевтического средства для применения в способе увеличения медианного времени общего выживания пациента, у которого диагностирована глиобластома, по сравнению с пациентом с глиобластомой, получающим указанный химиотерапевтический агент без антитела против ФРЭС.
2
2
В некоторых вариантах реализации любого из вышеуказанных аспектов у пациента может быть показатель общего состояния ВОЗ ≤ 2. В некоторых вариантах реализации химиотерапевтический агент может представлять собой темозоломид (TMZ). В некоторых вариантах реализации эффективное количество TMZ может составлять 150 мг/м, необязательно принимаемое перорально. В некоторых вариантах реализации эффективное количество TMZ может составлять 200 мг/м, необязательно принимаемое перорально. В некоторых вариантах реализации радиотерапевтическое средство может обеспечивать дозу в 2 Гр. В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС может связывать эпитоп А4.6.1. В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС может представлять собой бевацизумаб. В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС может содержать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), причем аминокислотная последовательность VH может представлять собой EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTTSFYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 2, а аминокислотная последовательность VL может представлять собой DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTV PWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 1). В некоторых вариантах реализации эффективное количество антитела против ФРЭС может составлять приблизительно 10 мг/кг (например, 10 мг/кг), которые необязательно вводят внутривенно каждые две недели; можно, например, вначале вводить его внутривенно в течение 90 минут с последующим вливанием в течение 60 минут, а затем 30 минут. В некоторых вариантах реализации эффективное количество антитела против ФРЭС может составлять приблизительно 15 мг/кг (например, 15 мг/кг), необязательно вводимые внутривенно каждые две недели; можно, например, вначале вводить его внутривенно в течение 90 минут с последующим вливанием в течение 60 минут, а затем 30 минут. В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС можно вначале вводить пациенту в первом цикле, и, необязательно, можно осуществлять последующие процедуры введения антитела против ФРЭС до или после введения химиотерапевтического средства. В еще одном варианте реализации антитело против ФРЭС можно вводить одновременно с химиотерапевтическим и, при необходимости, радиотерапевтическим средством. В некоторых вариантах реализации можно прекратить введение стероидов пациенту. В некоторых вариантах реализации глиобластома принадлежит к пронейральному подтипу. В некоторых вариантах реализации глиобластома является недавно диагностированной глиобластомой.
В способах, вариантах применения и композициях, описанных выше, можно продлить медианное время общего выживания приблизительно на 4,9 месяца при отношении рисков (ОР) приблизительно 0,42 по сравнению с пациентом с глиобластомой, получающим химиотерапевтическое средство без антитела против ФРЭС. В еще одном варианте реализации можно продлить медианное время общего выживания приблизительно на 4,9 месяца при ОР от приблизительно 0,24 до приблизительно 0,72 по сравнению с пациентом с глиобластомой, получающим химиотерапевтическое средство без антитела против ФРЭС. В еще одном варианте реализации можно продлить медианное время общего выживания по меньшей мере на 5 месяцев или более при ОР от приблизительно 0,24 до приблизительно 0,72 по сравнению с пациентом с глиобластомой, получающим химиотерапевтическое средство без антитела против ФРЭС. В некоторых вариантах реализации вышеописанных способов пациенту может быть менее 65 лет. В других вариантах реализации вышеописанных способов пациенту может быть 65 лет или более.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены наборы, содержащие антитело против ФРЭС, связывающееся по существу с эпитопом А4.6.1, химиотерапевтический агент и вкладыш в упаковку или этикетку с инструкциями по лечению пациента, у которого диагностирована глиобластома, включающему введение пациенту эффективного количества антитела против ФРЭС и химиотерапевтического агента, причем указанное лечение продлевает медианное время общего выживания пациента по сравнению с пациентом с глиобластомой, получающим химиотерапевтический агент без антитела против ФРЭС. В некоторых вариантах реализации данного аспекта пациент может получить лечение согласно двум или менее предшествующим схемам противораковой терапии. В некоторых вариантах реализации данного аспекта антитело против ФРЭС может представлять собой бевацизумаб. В некоторых вариантах реализации данного аспекта глиобластома принадлежит к пронейральному подтипу. В некоторых вариантах реализации данного аспекта глиобластома является недавно диагностированной глиобластомой.
Краткое описание чертежей
ФИГУРА 1 представляет собой диаграмму, на которой показана последовательность лечения схемы исследования III фазы в двух группах, подробнее описанная в примере 1. Лечение в рамках исследования начинали между 4 и 7 неделями после циторедуктивной операции или биопсии глиобластомы и включало 3 различных фазы: синхронизированную фазу, в течение которой каждые две недели вводили 10 мг/кг бевацизумаба или плацебо в комбинации с темозоламидом (ТМЗ) и лучевой терапией с последующим перерывом лечения на 28 дней; поддерживающую фазу, в ходе которой каждые две недели вводили 10 мг/кг бевацизумаба или плацебо в комбинации с ТМЗ; и фазу монотерапии, во время которой каждые три недели вводили 15 мг/кг бевацизумаба или плацебо до прогрессирования заболевания.
ФИГУРА 2А представляет собой график, на котором показана кривая выживания без прогрессирования (PFS) Каплана-Мейера оцениваемых пациентов с глиобластомой пронейрального типа (PN) из групп исследования AvaGlio III фазы, получающих плацебо и бевацизумаб, показанных на фигуре 1. n=99.
ФИГУРА 2В представляет собой график, на котором показана кривая общеговыживания (ОВ) Каплана-Мейера оцениваемых пациентов с глиобластомой пронейрального типа (PN) из групп исследования AvaGlio III фазы, получающих плацебо и бевацизумаб, показанных на фигуре 1. n=99.
ФИГУРА 3 представляет собой график, на котором показано ОВ пациентов с глиобластомами PN- (n=95) и не PN-типа (n=235) из экспериментальных групп исследования AvaGlio III фазы с поправкой на известные клинические прогностические факторы за счет многофакторного анализа. Добавление бевацизумаба к RT и химиотерапевтическому лечению придает статистически значимое преимущество увеличению ОВ для пациентов с PN-глиобластомой дикого типа IDH1 (ОР: 0,42, 95% ДИ: 0,24-0,72, р=0,002; взаимодействие между подтипом PN и лечением с применением бевацизумаба: р=0,012). n=10 пациентов, положительных по мутации IDH1, и n=9 пациентов с отсутствующей информацией о независимой переменной исключили из многофакторного анализа с использованием модели пропорциональных рисков Кокса. Фигура 3 представляет собой сводку на основе того же многофакторного анализа, показанного на фигурах 4А и 4В.
ФИГУРА 4А представляет собой график, на котором показано значительное преимущество в ОВ у пациентов с глиобластомой подтипа PN по классификации Филипса, получавших бевацизумаб, с учетом известных прогностических независимых переменных. *р<0,5, **р<0,05.
ФИГУРА 4В представляет собой график, на котором показано, что у пациентов с глиобластомой подтипа не-PN по классификации Филипса, получавших бевацизумаб, не наблюдалось существенного улучшения ОВ с учетом известных прогностических независимых переменных. *р<0,5, **р<0,05.
ФИГУРА 5А представляет собой график, на котором показано значительное преимущество в ОВ у пациентов с глиобластомой подтипа PN по классификации TCGA, получавших бевацизумаб, с учетом известных прогностических независимых переменных. *р<0,5, **р<0,05.
ФИГУРА 5В представляет собой график, на котором показано, что у пациентов с глиобластомой подтипа не-PN по классификации TCGA, получавших бевацизумаб, не наблюдалось существенного улучшения ОВ с учетом известных прогностических независимых переменных. *р<0,5, **р<0,05.
Подробное описание вариантов реализации настоящего изобретения
I. Определения
Термин «антиангиогенный агент» или «ингибитор ангиогенеза» относится к низкомолекулярному веществу, полинуклеотиду, полипептиду, выделенному белку, рекомбинантному белку, антителу или его конъюгату или гибридному белку, прямо или косвенно ингибирующему ангиогенез, васкулогенез или нежелательную проницаемость сосудов. Следует понимать, что термин «ингибитор ангиогенеза» включает агенты, связывающие и блокирующие ангиогенную активность ангиогенного фактора или его рецептора. Например, ингибитор ангиогенеза является антителом или другим антагонистом ангиогенного агента, описанным в спецификации или литературе, например, антителами против ФРЭС-А или рецептора ФРЭС-А (например, рецептора KDR или рецептора Flt-1), соединением, связывающим ФРЭС, ингибитором PDGFR, например, Gleevec™ (иматиниб мезилат), но не ограничивается ими. Антиангиогенные агенты также включают природные ингибиторы ангиогенеза, например, ангиостатин, эндостатин и т.д. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53: 217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22: 3172-3179 (2003) (например, список антиангиогенных терапевтических средств для лечения злокачественной меланомы в таблице 3); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5: 1359-1364 (1999); Tonini et al., Oncogene, 22: 6549-6556 (2003) (например, список известных антиангиогенных факторов в таблице 2); и Sato. Int. J. Clin. Oncol., 8: 200-206 (2003) (например, список антиангиогенных факторов, применявшихся в клинических исследованиях, в таблице 1).
Термин «антитело» в настоящем документе используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желательную антиген-связывающую активность, но не ограничивается ими.
Термин «ФРЭС» («VEGF») или «ФРЭС-А» используется для обозначения фактора роста эндотелия сосудов человека размером 165 аминокислот и родственных факторов роста эндотелия сосудов человека размером 121, 145, 189 и 206 аминокислот, описанных, например, в Leung et al. Science, 246: 1306 (1989), и Houck et al. Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991), вместе с их природными аллельными вариантами и формами, подвергшимися процессингу. ФРЭС-А является частью семейства генов, включающего ФРЭС-В, ФРЭС-С, ФРЭС-D, ФРЭС-Е, ФРЭС-F и P1GF. ФРЭС-А в первую очередь связывается с двумя высокоаффинными рецепторными тирозинкиназами, VEGFR-1 (Fit-1) и VEGFR-2 (Flk-1/KDR), причем последняя является основным передатчиком митогенных сигналов ФРЭС-А в клетки эндотелия сосудов. Кроме того, установлено, что нейропилин-1 является рецептором гепарин-связывающих изоформ ФРЭС-А и может играть роль в развитии сосудов. Термин «ФРЭС» или «ФРЭС-А» также относится к ФРЭС видов, не являющихся человеком, например, мыши, крысы или примата. Иногда ФРЭС конкретного вида животных обозначают такими терминами, как hVEGF для ФРЭС человека или mVEGF для ФРЭС мыши. Как правило, термин «ФРЭС» относится к ФРЭС человека. Термин «ФРЭС» также используется для обозначения укороченных форм или фрагментов полипептида, содержащих 8-109 или 1-109 аминокислоты 165-аминокислотного фактора роста эндотелия сосудов человека. Упоминание любой из таких форм ФРЭС может быть указано в заявке, например, как «ФРЭС (8-109)», «ФРЭС (1-109)» или «ФРЭС165». Положения аминокислот для «укороченного» природного ФРЭС пронумерованы, как в природной последовательности ФРЭС. Например, положение аминокислоты 17 (метионин) в укороченном природном ФРЭС также является положением 17 (метионин) в природном ФРЭС. Укороченный природный ФРЭС обладает сродством связывания к рецепторам KDR и Fit-1, сравнимым со сродством природного ФРЭС.
«Антитело против ФРЭС» представляет собой антитело, связывающееся с ФРЭС с достаточным сродством и специфичностью. Выбранное антитело обычно обладает сродством связывания с ФРЭС, например, антитело может связывать hVEGF со значением Kd в диапазоне от 100 нМ до 1 пМ. Сродство антител можно определить, например, с помощью анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса (например, анализа BIAcore, описанного в публикации заявки РСТ № WO 2005/012359); твердофазного иммуноферментного анализа (твердофазного ИФА); и конкурентных анализов (например, РИА). В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС в соответствии с настоящим изобретением можно применять в качестве терапевтического средства для целенаправленного воздействия и вмешательства в ход заболеваний или состояний, в которые вовлечена активность ФРЭС. Кроме того, антитело можно подвергать другим анализам биологической активности, например, с целью оценки его эффективности как терапевтического средства. Такие анализы известны в данной области техники и зависят от антигена-мишени и планируемого применения антитела. Примеры включают анализ ингибирования HUVEC; анализы ингибирования роста опухолевых клеток (например, описанные в WO 89/06692); анализы антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-опосредованной цитотоксичности (CDC) (патент США №5500362); и анализы агонистической активности или кроветворения (см WO 95/27062). Антитело против ФРЭС, как правило, не связывается с другими гомологами ФРЭС, например, ФРЭС-В или ФРЭС-С, и другими факторами роста, например, P1GF, ТФР или bFGF.
Антитело против ФРЭС «бевацизумаб (BV или Bev)», также известное как «rhuMAb VEGF» или «Avastin», представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против ФРЭС, полученное в соответствии с Presta et al, Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997). Оно содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антиген-связывающие области, определяющие комплементарность, из моноклонального антитела А.4.6.1 мыши против ФРЭС, которые блокируют связывание ФРЭС человека с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных областей, происходят от IgG1 человека, а приблизительно 7% последовательности происходят от антитела А4.6.1 мыши. Молекулярная масса бевацизумаба составляет приблизительно 149000 дальтон; он является гликозилированным антителом. Другие антитела против ФРЭС включают антитела, описанные в патенте США №6884879 и WO 2005/044853.
«Эпитоп А4.6.1» относится к эпитопу, распознаваемому антителом против ФРЭС «бевацизумаб» (Avastin) (см. Muller et al. Structure. 6: 1153-1167, 1998). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитела против ФРЭС включают моноклональное антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело против ФРЭС А4.6.1, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709; рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против ФРЭС, полученное согласно Presta et al. {Cancer Res. 57: 4593-4599, 1997), но не ограничиваются ими.
«Функциональный эпитоп» в соответствии с настоящим изобретением относится к аминокислотным остаткам антигена, которые вносят энергетический вклад в связывание антитела. Мутация любого из остатков антигена, вносящих энергетический вклад (например, мутация ФРЭС дикого типа путем замены на аланин или гомологичная мутация) должна нарушать связывание антитела таким образом, что относительное соотношение сродства (IC50 мутантный ФРЭС/IС50ФРЭС дикого типа) антитела будет превышать 5 (см. пример 2 заявки WO 2005/012359). В одном варианте реализации относительное соотношение сродства определяют с помощью твердофазного ИФА со связыванием в растворе и фаговым дисплеем. Вкратце, 96-луночные иммунологические планшеты Maxisorp (NUNC) покрывают в течение ночи при 4°С Fab-формой тестируемого антитела в концентрации 2 мкг/мл в PBS и блокируют PBS, 0,5% БСА и 0,05% твин-20 (РВТ) в течение 2 ч при комнатной температуре. Серийные разведения фага, обеспечивающего дисплей hVEGF с точечными аланиновыми мутациями (остатки 8-109 формы) или hVEGF дикого типа (8-109) в РВТ, вначале инкубируют на покрытых Fab планшетах в течение 15 мин при комнатной температуре и промывают планшеты PBS с 0,05% твин 20 (PBST). Связанный фаг обнаруживают с использованием конъюгата моноклонального антитела против М13 с пероксидазой хрена (Amersham Pharmacia), разбавленного РВТ в соотношении 1:5000, развивая окрашивание с использованием субстрата-3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ, Kirkegaard & Perry Labs, Гейтерсберг, штат Мэриленд, США) в течение приблизительно 5 мин, останавливая реакцию 1,0 М НЗР04 и считывая ответ спектрофотометрически при 450 нм. Отношение значений IC50 (IC50, ala/IC50, дт) представляет собой кратность снижения сродства связывания (относительного сродства связывания).
Антитело против ФРЭС «ранибизумаб» или антитело LUCENTIS или rhuFab V2 представляет собой гуманизированный Fab-фрагмент против ФРЭС человека, подвергшийся созреванию сродства. Ранибизумаб продуцируют с применением стандартных методов рекомбинантной технологии в экспрессирующем векторе Escherichia coli путем ферментации бактерий. Ранибизумаб не является гликозилированным, его молекулярная масса составляет ~ 48000 дальтон. См. WO 98/45331 и US 2003/0190317.
«Выделенное» антитело - это антитело, выявленное и отделенное от и/или извлеченное из компонента его природной среды. Загрязняющие компоненты окружающей природной среды представляют собой материалы, которые могут мешать исследовательскому, диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах реализации антитело является очищенным (1) более чем на 95% по массе антитела, согласно, например, методике Лоури, а в некоторых вариантах реализации - более чем на 99% по массе; (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности путем использования, например, секвенатора с вращающимся стаканом, или (3) до однородности согласно электрофорезу в ДСН-ПААГ в восстановительных или невосстановительных условиях с использованием, например, красителя Кумасси синего или серебряного. Выделенное антитело включает антитело in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один из компонентов природной среды антитела отсутствует. В то же время обычно выделенное антитело получают с использованием по меньшей мере одного этапа очистки.
H
L
«Природные антитела» обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой приблизительно 150000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, хотя количество дисульфидных связей варьирует среди тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов. Каждая тяжелая и легкая цепи также содержат регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. На одном конце каждой тяжелой цепи находится вариабельный домен (V), а затем - ряд константных доменов. На одном конце каждой легкой цепи находится вариабельный домен (V), а на другом конце - константный домен; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, а вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют область взаимодействия между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепи.
«Вариабельная область» или «вариабельный домен» антитела относится к N-концевым доменам тяжелой или легкой цепи антитела. Вариабельный домен тяжелой цепи можно называть "VH." Вариабельный домен легкой цепи можно называть "VL." Эти домены обычно являются наиболее изменчивыми частями антитела и содержат антиген-связывающие сайты.
Термин «вариабельный» относится к тому факту, что последовательности некоторых частей вариабельных доменов сильно различаются у разных антител и вносят вклад в связывание и специфичность каждого конкретного антитела по отношению к его конкретному антигену. В то же время изменчивость не является равномерно распределенной по вариабельным доменам антител. Она сосредоточена в трех сегментах вариабельных доменов как легкой, так и тяжелой цепи, называемых гипервариабельными областями (HVR). Более консервативные фрагменты вариабельных доменов называются каркасными областями (FR). Каждый вариабельный домен природных легких и тяжелых цепей содержит четыре FR-области, преимущественно принимающих конфигурацию бета-листа и соединенных тремя HVR, образующими петли, соединяющие структуры бета-типа, а в некоторых случаях - являющиеся их частью. HVR каждой цепи объединены друг с другом в непосредственной близости от FR-областей и, вместе с HVR другой цепи, участвуют в образовании антиген-связывающего сайта антитела (см. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Константные домены не принимают непосредственного участия в связывании антитела с антигеном, однако проявляют различные эффекторные функции, например, участие антитела в антитело-зависимой клеточной токсичности.
«Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) любых позвоночных можно отнести к одному из двух четко различных типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотных последовательностей их константных доменов.
1
2
3
4
1
2
В зависимости от аминокислотных последовательностей константных доменов тяжелых цепей, антитела (иммуноглобулины) можно отнести к различным классам. Существует пять классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них дополнительно делятся на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно. Хорошо известны субъединичная структура и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов, которые в общем случае описаны, например, в публикации Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W. B. Saunders, Co., 2000). Антитело может являться частью большей гибридной молекулы, образованной путем ковалентного или нековалентного связывания антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами.
Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» в настоящем документе являются взаимозаменяемыми и относятся к антителу в практически интактной форме, а не фрагментам антител, определение которых приведено ниже. Эти термины в особенности относятся к антителу с тяжелыми цепями, содержащими Fc-область.
2
«Фрагменты антитела» содержат часть интактного антитела, предпочтительно содержащую его антиген-связывающую область. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab') и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела; одноцепочечные антитела; и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
2
При папаиновом гидролизе антител образуются два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых «Fab»-фрагментами, каждый из которых содержит одиночный антиген-связывающий сайт, и остаточный «Fc»-фрагмент, название которого отражает его способность к кристаллизации. Обработка пепсином позволяет получить F(ab')-фрагмент, содержащий два антиген-связывающих сайта и по-прежнему способный к перекрестному связыванию антигена.
«Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий полный антиген-связывающий сайт. В одном варианте реализации двуцепочечная разновидность Fv состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, соединенных жесткой ковалентной связью. В однойцепочечных разновидностях Fv (scFv) один вариабельный домен тяжелой цепи и один вариабельный домен легкой цепи могут быть ковалентно связаны гибким пептидным линкером таким образом, что легкая и тяжелая цепи могут образовывать «димерную» структуру, аналогичную структуре двуцепочечных разновидностей Fv. Именно в этой конфигурации три HVR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антиген-связывающего домена на поверхности димера VH-VL. Совместно шесть HVR придают антителу специфичность связывания с антигеном. В то же время даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три HVR, специфичных по отношению к антигену) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низким сродством, чем полный сайт связывания.
2
Fab-фрагмент содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, а также константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на С-конце СН1-домена тяжелой цепи, содержащие один или более остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH - это обозначение, используемое в настоящем документе для Fab', в котором остаток (остатки) цистеина в константных доменах содержит(ат) свободную тиоловую группу. F(ab')-фрагменты антитела первоначально получали в виде пар Fab'-фрагментов, между которыми находятся шарнирные остатки цистеина. Кроме того, известны другие варианты химического сопряжения фрагментов антител.
«Одноцепочечные Fv-фрагменты» или «scFv»-фрагменты антитела содержат VH- и VL-домены антитела, причем эти домены находятся в одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид scFv дополнительно содержит полипептидный линкер между VH- и VL-доменами, позволяющий scFv образовывать желательную структуру для связывания антигена. Обзора scFv см., например, в публикации Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. (Springer-Verlag, New York: 1994), pp 269-315.
Термин «диатела» относится к фрагментам антител, содержащим два антиген-связывающих сайта, причем указанные фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) той же полипептидной цепи (VH-VL). За счет линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить сопряжение между двумя доменами на одной той же цепи, домены вынуждены соединяться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антиген-связывающих сайта. Диатела могут быть двухвалентными или биспецифическими. Диатела подробнее описаны в, например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003); и Hollinger et al, PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в публикации Hudson et al, Nat. Med. 9: 129-134 (2003).
Термин «моноклональное антитело» в настоящем документе относится к антителу, полученному из популяции практически однородных антител, т.е., отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных мутаций, например, естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Таким образом, модификатор «моноклональное» указывает на то, что антитело не является смесью отдельных антител. В некоторых вариантах реализации такое моноклональное антитело обычно содержит антитело, содержащее полипептидную последовательность, связывающую мишень, причем указанную полипептидную последовательность, связывающую мишень, получают за счет способа, включающего выбор одной полипептидной последовательности, связывающей мишень, из множества полипептидных последовательностей. Например, процесс выбора может представлять собой выбор уникального клона из множества клонов, например, пула гибридомных клонов, фаговых клонов или клонов рекомбинантных ДНК. Следует понимать, что выбранную последовательность, связывающую мишень, можно дополнительно модифицировать, например, с целью улучшения сродства по отношению к мишени, гуманизации последовательности, связывающей мишень, улучшения ее продукции в культуре клеток, снижения ее иммуногенности in vivo, создания полиспецифического антитела и т.д., и что антитело, содержащее модифицированную последовательность, связывающую мишень, также является моноклональным антителом согласно настоящему изобретению. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат различные антитела против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты антигена. Кроме специфичности, преимуществом препаратов моноклональных антител обычно является отсутствие загрязнения другими иммуноглобулинами.
Модификатор «моноклональное» указывает на то, что антитело получено из практически однородной популяции антител; его не следует интерпретировать как требование о продукции антитела посредством какого-либо конкретного способа. Например, моноклональные антитела, которые планируют применять в соответствии с настоящим изобретением, можно получить различными способами, включая, например, гибридомную технологию (например, Kohler and Milstein., Nature 256: 495-497 (1975); Hongo et al, Hybridoma 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al, in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), технологии рекомбинантных ДНК (см., например, патент США №4816567), технологии фагового дисплея (см., например, Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et ah, J. Mol Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al, J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al, J. Mol Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol Methods 284(1-2): 119-132 (2004), и технологии продукции антител человека или аналогов антител человека в организмах животных, частично или полностью содержащих локусы или гены иммуноглобулинов человека, кодирующие последовательности иммуноглобулинов человека (см., например, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al, PNAS USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al, Year in Immunol. 7:33 (1993); патенты США №5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; и 5661016; Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996); и Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol 13: 65-93 (1995).
Моноклональные антитела в настоящем документе включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител конкретного вида животных или антител, принадлежащих к конкретному классу или подклассу, в то время как остальная часть цепи(ей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител другого вида животных или антител, принадлежащих к другому классу или подклассу, а также фрагменты таких антител, пр условии, что они демонстрируют желательную биологическую активность (например, патент США №4816567 и Morrison et al, PNAS USA 81:6851-6855 (1984)). Химерные антитела включают PRIMATIZED антитела, в которых антиген-связывающая область антитела происходит от антител, полученных, например, путем иммунизации макаков исследуемым антигеном.
«Гуманизированные» формы антител нечеловеческого происхождения (например мыши) представляют собой химерные антитела, содержащие минимальные последовательности, происходящие от иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. В одном варианте реализации гуманизированное антитело представляет собой иммуноглобулин человека (реципиентное антитело), в котором остатки из HVR реципиента заменяют остатками из HVR вида, не являющегося человеком (донорного антитела), например, мыши, крысы, кролика или примата, не являющегося человеком, обладающий желательной специфичностью, сродством и/или активностью. В некоторых случаях FR-остатки иммуноглобулина человека заменяют соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, не встречающиеся в реципиентном антителе или донорном антителе. Эти модификации можно внести для дальнейшего улучшения характеристик антитела. В общем случае, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного, а обычно - двух вариабельных доменов, в которых все или практически все гипервариабельные петли соответствуют аналогичным участкам из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или практически все FR-области соответствуют последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также необязательно содержит по меньшей мере фрагмент константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно происходящий из иммуноглобулина человека. Дополнительную информацию см., например, в публткациях Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Кроме того, см., например, Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994); и патенты США №6982321 и 7087409.
«Антитело человека» представляет собой антитело, обладающее аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности антитела, продуцированного в организме человека и/или полученной с использованием любой методики получения антител человека, описанных в настоящем документе. Из этого определения антитела человека, в частности, исключено гуманизированное антитело, содержащее антиген-связывающие остатки нечеловеческого происхождения. Антитела человека можно получить, используя различные методики, известные в данной области техники, в том числе библиотеки фагового дисплея. Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581 (1991). Кроме того, моноклональные антитела человека можно получить с помощью способов, описанных в публикациях Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al, J. Immunol. 147(1): 86-95 (1991). См. также van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-374 (2001). Антитела человека можно получить путем введения антигена в организм трансгенного животного, модифицированного с целью продукции таких антител в ответ на антигенную стимуляцию, причем эндогенные локусы указанного животного отключены, например, иммунизированных ксеномышей (о технологии XENOMOUSE™ см., например, патенты США №6075181 и 6150584). Кроме того, информацию об антителах человека, полученных посредством технологии В-клеточных гибридом человека, см., например, в публикации Li et al, PNAS USA 103: 3557-3562 (2006).
Термин «гипервариабельная область», «HVR» или «HV» в настоящем документе относится к областям вариабельного домена антитела, обладающим гипервариабельными последовательностями и/или образующим структурно определенные петли. Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). В природных антителах Н3 и L3 характеризуются наибольшим разнообразием из шести HVR, и в частности, считается, что Н3 играет уникальную роль в высокой специфичности антител. См., например, Xu et al, Immunity 13: 37-45 (2000); Johnson and Wu in Methods in Molecular Biology 248: 1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). Фактически, природные антитела верблюдовых, состоящие только из тяжелой цепи, являются функциональными и стабильными в отсутствие легкой цепи. См., например, Hamers-Casterman et al, Nature 363: 446-448 (1993) и Sheriff et al, Nature Struct. Biol. 3: 733-736 (1996).
Существует ряд определений HVR, охватываемых настоящей заявкой. Определение HVR по Kabat, которое соответствует областям, определяющим комплементарность (CDR), основано на изменчивости последовательности и используется наиболее часто (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Chothia вместо этого указывает на расположение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 196: 901-917 (1987)). AbM HVR представляют собой компромисс между CDR по Кабату и структурными петлями по Chothia, и используются программным обеспечением для моделирования антител AbM от Oxford Molecular. «Контактные» HVR основаны на анализе доступных сложных кристаллических структур. Остатки каждого из этих HVR указаны ниже.
HVR могут содержать "расширенные HVR": 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL, и 26-35 (H1), 50-65 или 49-65 (Н2), и 93-102, 94-102 или 95-102 (Н3) in the VH. Для каждого из этих определений расширенного HVR остатки вариабельного домена пронумерованы согласно Kabat et al, supra.
«Каркасные» или «FR»-остатки представляют собой остатки вариабельного домена, не являющиеся остатками HVR, согласно определению в настоящем документе.
Выражения «нумерация остатков вариабельного домена по Kabat» или «нумерация положений аминокислот по Kabat» и их варианты относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой или легкой цепи согласно представлению об антителах в публикации Kabat et al, supra. При использовании этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие укорачиванию или инсерции в FR или HVR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать себя инсерцию одной аминокислоты (остаток 52А согласно Kabat) после 52 остатка в Н2 и вставленные остатки (например, остатки 82А, 82b и 82с и т.д. согласно Kabat) после 82 остатка FR тяжелой цепи. Нумерацию остатков по Kabat можно определить для данного антитела путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной по Kabat последовательностью.
Антитело «с созревшим сродством» представляет собой антитело, содержащее одну или более модификаций в одном или более HVR, приводящих к усилению сродства антитела к антигену по сравнению с исходным антителом, не содержащим указанной(ых) модификации(й). В одном варианте реализации антитело с созревшим сродством обладает наномолярными или даже пикомолярными значениями сродства к антигену-мишени. Антитела с созревшим сродством получают с помощью известных в данной области техники процедур. Например, в работе Marks et al, Bio/Technology 10: 779-783 (1992) описано созревание сродства путем перетасовки VH- и VL-доменов. Случайный мутагенез HVR и/или каркасных остатков описан, например, в источниках: Barbas et al, Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994); Schier et al, Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al, J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7): 3310-3319 (1995); и Hawkins et al, J. Mol Biol 226: 889-896 (1992).
Термин «антинеопластическае композиция» или «противораковая композиция» или «противораковый агент» относится к композиции, которую можно применять для лечения рака, содержащую по меньшей мере один активный терапевтический агент, например, «противораковый агент». Примеры терапевтических агентов (противораковых агентов) включают, например, химиотерапевтические агенты, ингибиторы роста, цитотоксические агенты, агенты, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные агенты, апоптотические агенты, антитубулиновые агенты и другие агенты для лечения рака, например, антитела против HER-2, антитела против CD20, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva™), ингибиторы тромбоцитарного фактора роста (например, Gleevec™ (иматиниб мезилат)), ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), связывающиеся с одной или несколькими из следующих мишеней: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BlyS, APRIL, ВСМА ФРЭС или рецептор(ы) ФРЭС, TRAIL/Аро2 и другие биологически активные и органические химические агенты и т.д., но ограничиваются ими Настоящее изобретение также включает их комбинации.
«Химиотерапевтический агент» или «химиотерапевтическое средство» представляет собой химическое соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов представляют собой химическое соединение, пригодное для лечения рака. Примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, например, темозоламид (ТМЗ), имидазотетразиновое производное алкилирующего агента дакарбазина. Дополнительные примеры химиотерапевтических агентов включают, например, паклитаксел или топотекан или пэгилированный липосомальный доксорубицин (PLD). Другие примеры химиотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, например, тиотепа и CYTOXAN (циклофосфамид); алкилсульфонаты, например, бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, например, бензодопу, карбоквон, метуредопу и уредопу; этиленимины и метиламеламины, например, алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилолмеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин; бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адоцелезин, карцелезин и бицелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктиин; спонгистатин; производные азотистого иприта, например, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, мехлоретаминоксидгидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урамустин; производные нитрозомочевины, например, кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, например, энедииновые антибиотики (например, калихеамицин, особенно калихеамицин-гамма-11 и калихеамицин-омега-11 (см., например, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); динемицин, в том числе динемицин А; бисфосфонаты, например, клодронат; эсперамицин; а также неокарциностатиновый хромофор и родственные хромофоры на основе хромопротеиновых эндииновых антибиотиков), а также аклациномицины, актиномицин, антрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, каминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, ADRIAMYCIN (доксорубицин, в том числе морфолиндоксорубицин, цианморфолиндоксорубицин, 2-пирролиндоксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, например, митомицин С, микофеноловую кислоту, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, например, метотрексат и 5-фторурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, напрмиер, деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, например, флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, например, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, например, калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; антиадреналовые средства, например, аминоглютетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, например, фолиновую кислоту; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновую кислоту; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элформитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглюцид; нитрат галлия; гидроксимочевину; лентинан; лонидамин; майтансиноиды, например, майтансин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраэрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновую кислоту; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK (JHS Natural Products, Юджин, штат Орегон, США); разоксан; ризоксин; сизофуран; спирогерманий; тенуазониевую кислоту; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин, митобронитол, митолактол, пипоброман; гацитозин; арабинозид (»Ara-C»); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, TAXOL (паклитаксел; Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, штат Нью-Джерси, США), ABRAXANE (без кремофора), составы паклитаксела на основе наночастиц, сконструированных с использованием альбумина (American Pharmaceutical Partners, Шаумберг, штат Иллинойс, США) и TAXOTERE (доксетаксел; Rhone-Poulenc Rorer, Антони, Франция); хлорамбуцил; GEMZAR (гемцитабин), 6-тиогуанин; меркаптопурин, метотрексат; аналоги платины, например, цисплатин, оксалиплатин и карбоплатин; винбластин; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин; NAVELBINE (винорелбин); новантрон; тенипозид; эдатрексат; дауномицин, аминоптерин; кселоду; ибандронат (камптозар; СРТ-11, в том числе схему лечения с применением иринотекана с 5-ФУ и лейковорином; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, например, ретиноевую кислоту; капецитабин; комбретастатин, лейковорин (LV); оксалиплатин, в том числе схему лечения с применением оклиплатина (FOLFOX); лапатиниб (Tykerb); ингибиторы PKC-alpha, Raf, H-Ras, EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva)) и ФРЭС-А, снижающие пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты и производные любого из вышеуказанных соединений.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
Термин «цитотоксический агент» в настоящем документе относится к веществу, ингибирующему или предотвращающему функционирование клеток и/или приводящему к разрушению клеток. Подразумевается, что этот термин включает радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P и радиоактивные изотопы Lu), химиотерапевтические агенты, например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты, ферменты и их фрагменты, например, нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, например, низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже. Ниже описаны другие цитотоксические агенты. Туморицидный агент вызывает разрушение опухолевых клеток.
«Ингибитор роста» в настоящем документе относится к соединению или композиции, ингибирующим рост и/или пролиферацию клеток (например, клеток, экспрессирующих Robo4) in vitro или in vivo. Таким образом, ингибитор рста может представлять собой агент, значительно снижающий процент Robo4-экспрессирующих клеток в S-фазе. Примеры ингибиторов роста включают агенты, блокирующие ход клеточного цикла (на этапе, отличающемся от S-фазы), например, агенты, индуцирующие остановку G1 и М-фазы. Классические блокаторы М-фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин), таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, например, антрациклиновый антибиотик доксорубицин ((8S-цис)-10-[(3-амино-2,3,6-тридезокси-α-L-ликсогексапиранозил)окси]-7,8,9,10-тетрагидро-6,8,11-тригидрокси-8-(гидроксиацетил)-1-метокси-5,12-нафтацендион), эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Агенты, блокирующие G1, также приводят к остановке S-фазы, например, ДНК-алкилирующие агенты, например, тамоксифен, преднизолон, дакарбазин, мехлорэтамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ага С.Дополнительную информацию можно найти в работе The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1 под названием "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особенно p. 13. Таксаны (паклитаксел и доцетаксел) являются противораковыми препаратами, получаемыми из тиса. Доцетаксел (TAXOTERE, Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из европейского тиса, является полусинтетическим аналогом паклитаксела (TAXOL, Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел стимулируют сборку микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки, предотвращая их деполимеризацию, что приводит к ингибированию митоза в клетках.
Термины «образец» и «биологический образец» используются на равных основаниях для обозначения любого биологического образца, полученного от особи, включая физиологические жидкости, ткани организма (например, опухолевую ткань), клетки, или других источников. Физиологические жидкости представляют собой, например, лимфу, сыворотку, цельную свежую кровь, мононуклеары периферической крови, замороженную цельную кровь, плазму (в том числе свежую или замороженную), мочу, слюну, сперму, синовиальную жидкость и спинномозговую жидкость. Образцы также включают ткань молочной железы, ткань почек, ткань толстой кишки, ткань головного мозга, мышечную ткань, синовиальную ткань, кожу, волосяной фолликул, костный мозг и опухолевую ткань. Способы получения биоптатов тканей и физиологических жидкостей и разделения стереоизомеров хорошо известны в данной области техники.
В настоящем документе термин «лечение» (и его грамматические варианты, например, «лечить») относится к клиническому вмешательству при попытке изменить естественный ход развития личности, подвергаемой лечению, и может осуществляться для профилактики или в ходе клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают предотвращение возникновения или возобновления болезни, облегчение симптомов, уменьшение прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращая метастазирования, увеличение/продление общего выживания (ОВ), увеличение/продление выживания без прогрессирования (PFS), снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или паллиативное лечение болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими.
Под «монотерапией» понимают схему лечения, включающую только один терапевтический агент для лечения рака или опухоли в течение всего периода лечения. Монотерапия с применением антагониста ФРЭС (например, антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба) означает, что во время лечения антагонист ФРЭС вводят в отсутствие дополнительных терапевтических средств против рака.
Термин «эффективное количество» относится к количеству лекарственного вещества, эффективно лечащему заболевание или расстройство, например, глиобластому, у субъекта или пациента, например, млекопитающего, например, человека. В случае рака, например, глиобластомы, терапевтически эффективное количество лекарственного вещества может снизить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлить и предпочтительно остановить) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (т.е. до некоторой степени замедлить и предпочтительно остановить) метастазирование опухоли; до определенной степени ингибировать рост опухоли; и/или до некоторой степени облегчить один или более симптомов, связанных с раком (например, глиобластомой). В тех случаях, когда лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. При лечении рака эффективность in vivo можно, например, измерить путем оценки продолжительности выживания, продолжительности выживания без прогрессирования (PFS), общего выживания (ОВ), скорости реакции (RR), продолжительности реакции и/или качества жизни.
«Выживание» относится к субъекту, оставшемуся в живых, и включает выживание без прогрессирования (PFS) и общее выживание (ОВ). Выживание можно оценить по методике Каплана-Мейера, различия в выживании вычисляют с помощью стратифицированного лог-рангового критерия.
«Общее выживание» или «ОВ» относится к субъекту, остающемуся в живых в течение определенного времени, например, приблизительно 1 года, приблизительно 2 лет, приблизительно 3 лет, приблизительно 4 лет, приблизительно 5 лет, приблизительно 10 лет и т.д., от начала лечения или от постановки первоначального диагноза. В исследованиях, лежащих в основе настоящего изобретения, событие, используемое для анализа выживания, представляло собой смерть от любой причины.
«Выживание без прогрессирования» или «PFS» относится ко времени от начала лечения (или рандомизации) до первого прогрессирования заболевания или смерти. Например, оно представляет собой время, в течение которого субъект остается в живых без рецидива рака, например, к определенному периоду времени, например, приблизительно 1 месяцу, приблизительно 2 месяцам, приблизительно 3 месяцам, приблизительно 4 месяцам, приблизительно 5 месяцам, приблизительно 6 месяцам, приблизительно 7 месяцам, приблизительно 8 месяцам, приблизительно 9 месяцам, приблизительно 1 году, приблизительно 2 годам, приблизительно 3 годам и т.д., от начала лечения или от постановки первоначального диагноза. В одном аспекте настоящего изобретения PFS можно оценивать по критериям реакции Макдональда, описанным в MacDonald et al. (J. Clin. Oncol. 1990; 8: 1277-80, 1990).
«Общая скорость реакции» или «объективная скорость реакции» (ORR) относится к проценту людей, испытывающих снижение размера или количественных характеристик рака (например, глиобластомы) в течение минимального времени, и может быть представлена в виде суммы скоростей полной и частичной реакции.
«Продление выживания» или «увеличение вероятности выживания» означает увеличение PFS или ОВ у субъекта, получившего лечение (например, субъекта, получавшего лечение с применением антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба) или популяции субъектов, получавших лечение, по сравнению с субъектом, не получившим лечения (например, субъектом, не получавшим лечение с применением антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба), или популяцией субъектов, не получавших лечения, соответственно, или по сравнению с контрольным протоколом лечения, например, лечением только с применением химиотерапевтического агента, например, используемого при стандартном лечении глиобластомы, например, темозоламида (ТМЗ) с лучевой терапией или без нее. Выживание отслеживают в течение по меньшей мере приблизительно одного месяца, приблизительно двух месяцев, приблизительно четырех месяцев, приблизительно шести месяцев, приблизительно девяти месяцев, или по меньшей мере приблизительно 1 года, или по меньшей мере приблизительно 2 лет, или по меньшей мере приблизительно 3 лет, или по меньшей мере приблизительно 4 лет, или по меньшей мере приблизительно 5 лет, или по меньшей мере приблизительно 10 лет и т.д. после начала лечения или после постановки первоначального диагноза.
Отношение рисков (ОР) представляет собой статистическое определение частот событий. Для целей настоящего изобретения считают, что отношение рисков представляет собой вероятность события в экспериментальной группе, разделенную на вероятность события в контрольной группе в любой конкретный момент времени. «Отношение рисков» при анализе выживания без прогрессирования представляет собой сводное различие между двумя кривыми выживания и без прогрессирования, представляющее собой снижение риска смерти при лечении по сравнению с контролем в ходе последующего наблюдения.
«Пациент» или «субъект» в настоящем документе относится к любому отдельно взятому животному (включая, например, млекопитающее, например, собаку, кошку, лошадь, кролика, животное, содержащееся в зоопарке, корову, свинью, овцу, примата, не являющегося человеком, и человека), например, человеку, соответствующему критериям лечения, испытывающему или испытавшему один или более из признаков, симптомов или других индикаторов заболевания или расстройства, например, глиобластомы (GBM). Подразумевается, что термин «пациент» включает любых пациентов, участвующих в клинических исследованиях и не демонстрирующих каких-либо клинических признаков заболевания, или пациентов, участвующих в эпидемиологических исследованиях, или пациентов, используемых в качестве контроля. Пациент может ранее получать лечение с применением антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба, или другого лекарственного вещества, или не получать такого лечения. Пациент может ранее не получать дополнительных лекарств, используемых при начале лечения, соответствующего настоящей заявке, т.е. пациент может ранее не получать лечения с применением, например, терапевтического средства, не являющегося антителом против ФРЭС, например, бевацизумабом, в «исходный момент» (т.е., в заданный момент времени до введения первой дозы антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) в соответствии со способом лечения, описанным в настоящем документе, например, в день скрининга субъекта до начала лечения). Такие «наивные» пациенты или субъекты обычно считаются кандидатами на лечение с применением таких дополнительных лекарственных средств.
Термины «рак» и «раковый» относятся к или описывают физиологическое состояние млекопитающих, обычно характеризующееся нерегулируемым ростом клеток. Данное определение включает доброкачественные и злокачественные опухоли, а также неактивные опухоли или микрометастазы. Примеры рака включают карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз, но не ограничиваются ими. Более конкретные примеры таких раковых опухолей включают глиобластому (GBM), включая, например, пронейральную GBM, нейральную GBM, классическую GBM и мезенхимальную GBM, но не ограничиваются ими. GBMs может быть недавно диагностированной, диагностированной или рецидивирующей. Другие виды рака включают, например, рак молочной железы, плоскоклеточный рак, рак легкого (в том числе мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточный рак легкого), рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка (в том числе рак желудочно-кишечного тракта), рак поджелудочной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак толстой кишки, рак ободочной и прямой кишки, рак матки или эндометрия, рак слюнной железы, рак почек, рак печени, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, кациному печени и различные виды рака головы и шеи, а также В-клеточную лимфому (включая низкодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ); мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) НХЛ; промежуточную/фолликулярную НХЛ; прмежуточную диффузную НХЛ; высокодифференцированную иммунобластную НХЛ; высокодифференцированную лимфобластную НХЛ; высокодифференцированную мелкоклеточную НХЛ с нерасщепленными ядрами; генерализованную НХЛ; лимфому из клеток мантии; лимфому, связанную со СПИДом; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационные лимфопролиферативные расстройства (PTLD), а также аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, отеками (например, связанными с опухолями головного мозга) и синдромо Мейгса.
«Опухоль» в настоящем документе относится ко всем вариантам роста и пролиферации опухолевых клеток, злокачественным или доброкачественным, и всем предраковым и раковым клеткам и тканям. Термины «рак», «раковый», «расстройство пролиферации клеток» «пролиферативное расстройство» и «опухоль» не являются взаимоисключающими в настоящем документе.
Термин «фармацевтический состав» относится к стерильному препарату, представленному в форме, обеспечивающей эффективность биологической активности медикамента, и не содержащему дополнительных компонентов, обладающих неприемлемой токсичностью для субъекта, которому следует вводить состав.
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличающемуся от активного ингредиента и являющемуся нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.
«Набор» представляет собой любое изделие (например, пакет или контейнер), содержащее по меньшей мере один реагент, например, лекарственное средство для лечения пациента с глиобластомой, или зонд для специфического обнаружения биомаркерного гена или белка согласно изобретению. Изделие предпочтительно популяризируют, распространяют или продают в виде блока для осуществления способов согласно настоящему изобретению.
II. Варианты терапевтического применения и композиции для лечения глиобластомы
Настоящее изобретение охватывает антиангиогенную терапию, стратегию лечения рака, направленную на ингибирование развития опухолевых кровеносных сосудов, необходимых для доставки питательных веществ для поддержки роста опухоли. Поскольку ангиогенез участвует в первичном опухолевом росте и метастазировании, антиангиогенное лечение, предложенное в настоящем изобретении, способно ингибировать рост новообразований в первичных сайтах, а также предотвращать метастазирование опухолей во вторичные сайты, таким образом обеспечивая атаку опухолей другими терапевтическими средствами.
В частности, в настоящей заявке предложены способы лечения пациента, у которого диагностирована глиобластома, включающие введение пациенту лекарственного средства по схеме, комбинирующей эффективное количество химиотерапевтического агента и антитела против ФРЭС. Схема лечения, комбинирующая химиотерапию и введение антитела против ФРЭС, увеличивает общее выживание (ОВ) и/или выживание без прогрессирования (PFS) субъекта.
А. Способы лечения
В настоящем изобретении предложены способы лечения пациента, у которого диагностирована глиобластома, включающие введение пациенту терапевтического средства, содержащего эффективное количество антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) и эффективное количество химиотерапевтического агента (например, темозоламида (ТМЗ)). Субъекта также можно подвергнуть лучевой терапии (радиотерапии). Такое лечение может привести к увеличенному медианному времени общего выживания или PFS пациента, получившего лечение, по сравнению с пациентом, получившим тот же химиотерапевтический агент (например, ТМЗ) без антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба).
Комбинированная терапия может включать одно или более антитело против ФРЭС (например, 1, 2, 3, 4 или 5 или более антител против ФРЭС), используемых в комбинации с одним или более дополнительными противораковыми агентами и/или способами лечения (например, 1, 2, 3, 4 или 5 или более дополнительными противораковыми агентами и/или способами лечения). Примеры способов лечения рака включают, без ограничения, хирургию, лучевую терапию (радиотерапию), биотерапию, иммунотерапию, химиотерапию (например, с применением химиотерапевтического агента ТМЗ) или комбинацию указанных агентов и/или способов лечения. Кроме того, в комбинации с антителом против ФРЭС (например, бевацизумабом) можно использовать цитотоксические агенты, антиангиогенные и антипролиферативные агенты. Один или более из дополнительных противораковых агентов или способов лечения предпочтительно обладает взаимодополняющей активностью по отношению к антагонисту ФРЭС, так, что они не оказывают отрицательного влияния друг на друга. Комбинированное введение включает совместное введение при использовании раздельных препаратов или единого фармацевтического состава и последовательное введение в любом порядке, причем предпочтительно, чтобы существовал период времени, когда оба (или все) активные агенты одновременно проявляют свою биологическую активность.
Один или более дополнительных противораковых агентов может представлять собой химиотерапевтический агент, цитотоксический агент, цитокин, ингибитор роста, антигормональный агент и их комбинации. Такие молекулы выгодно присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для достижения предполагаемой цели (т.е., лечения пациентов с глиобластомой). Например, фармацевтическая композиция, содержащая антитело против ФРЭС (например, бевацизумаб), может также содержать терапевтически эффективное количество антинеопластического агента, химиотерапевтического агента, ингибитора роста, цитотоксического агента или их комбинации.
Другие терапевтические схемы, соответствующие настоящему изобретению, могут включать применение противоракового агента, включая, без ограничения, лучевую терапию и/или трансплантатов костного мозга и периферической крови, и/или цитотоксического агента, химиотерапевтического агента или ингибитора роста. В одном из таких вариантов реализации химиотерапевтический агент представляет собой агент или комбинацию агентов, например, циклофосфамида, гидроксидаунорубицина, адриамицина, доксорубицина, винкристина (ONCOVIN™), преднизолона, CHOP, CVP или СОР, или иммунотерапевтических средств, например, антитела против PSCA, антитела против HER2 (например, HERCEPTIN, OMNITARG™). В еще одном варианте реализации комбинация содержит доцетаксел, доксорубицин и циклофосфамид. Комбинированную терапию можно применять согласно одновременной или последовательной схеме. При последовательном введении комбинацию можно вводить в два или более приема. Комбинированное введение включает совместное введение при использовании раздельных препаратов или единого фармацевтического состава и последовательное введение в любом порядке, причем предпочтительно, чтобы существовал период времени, когда оба (или все) активные агенты одновременно проявляют свою биологическую активность.
В одном варианте реализации лечение с применением антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) включает комбинированное введение противоракового агента, приведенного в настоящем документе, и одного или более из химиотерапевтических агентов (например, ТМЗ) или ингибиторов роста, в том числе совместное введение смесей различных химиотерапевтических агентов. Химиотерапевтические агенты включают таксаны (например, паклитаксел и доцетаксел) и/или антрациклиновые антибиотики. Препараты и графики приема таких химиотерапевтических агентов можно использовать согласно инструкциям изготовителя или согласно эмпирическому определению, выполненному специалистом. Кроме того, препараты и графики приема таких химиотерапевтических агентов описаны в "Chemotherapy Service," (1992) Ed., М.С. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.
Подходящие дозировки любого из вышеупомянутых совместно вводимых агентов соответствуют дозировкам, используемым в настоящее время, и могут быть снижены за счет комбинированного действия (синергии) антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) и других химиотерапевтических агентов или способов лечения.
Комбинированная терапия может обеспечить «синергию» и подтвердить «синергетический эффект», т.е. что эффект, достигаемый при совместном применении активных ингредиентов, превышает сумму эффектов, полученных с применением этих соединений по отдельности. Синергетический эффект можно получить, если активные ингредиенты: (1) совместно составляют и вводят или одновременно доставляют в составе комбинированного дозированного состава; (2) доставляют по очереди или параллельно в виде отдельных составов; или (3) посредством некоторых других схем. При поочередной доставке синергетический эффект можно получить, если соединения вводят или доставляют последовательно, например, посредством различных инъекций в отдельных шприцах. В целом во время поочередной терапии эффективную дозу каждого активного ингредиента вводят последовательно, т.е. друг за другом, тогда как при комбинированной терапии эффективные дозы двух или более активных ингредиентов вводят совместно.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
В общем случае дозировка дополнительного терапевтического агента, соответствующая профилактике или лечению заболевания, зависит от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и хода заболевания, введения антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) и дополнительных агентов и/или терапевтических средств (например, ТМЗ и/или лучевой терапии) в профилактических или терапевтических целях, предыдущей терапии, истории болезни пациента и его реакции на антитело против ФРЭС и дополнительные агенты и/или терапевтические средства, и решения лечащего врача. Антитело против ФРЭС и дополнительные агенты и/или терапевтические средства вводят пациенту в одно и то же время или в ходе ряда сеансов лечения. Антитело против ФРЭС обычно вводят, как указано ниже. В зависимости от вида и тяжести заболевания, первоначальная предполагаемая дозировка дополнительного агента для введения пациенту, например, посредством одного или более раздельных введений или непрерывного вливания, составляет от приблизительно 20 мг/м до 600 мг/м. Одна из типичных ежедневных дозировок может варьироваться от приблизительно, или приблизительно 20 мг/м, 85 мг/м, 90 мг/м, 125 мг/м, 200 мг/м, 400 мг/м, 500 мг/м или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. При повторном введении в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до желаемого подавления симптомов заболевания. Так, пациенту можно вводить одну или более из доз, приблизительно составляющих 20 мг/м, 85 мг/м, 90 мг/м, 125 мг/м, 200 мг/м, 400 мг/м, 500 мг/м, 600 мг/м (или любые их комбинации). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые две, три, четыре, пять или шесть недель (например, таким образом, что пациент получает от приблизительно двух до приблизительно двадцати, например, приблизительно шесть доз дополнительного агента). Можно вводить начальную повышенную нагрузочную дозу, за которой следует одна или более пониженные дозы. В то же время можно применять другие схемы приема. Ход лечения можно контролировать с помощью обычных методик и анализов.
В одном варианте реализации субъект никогда ранее не получал каких-либо препаратов для лечения глиобластомы. В еще одном варианте реализации субъект или пациент ранее получал один или более из медикаментов для лечения глиобластомы. В другом варианте реализации субъект или пациент не реагировал на один или более из ранее введенных медикаментов. Такие препараты, к которым субъект может быть нечувствительным, включают, например, антинеопластические агенты, химиотерапевтические агенты, цитотоксические агенты и/или ингибиторы роста, по отдельности или в комбинации друг с другом, но в отсутствие комбинированного лечения с применением антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба. Другие способы лечения, к которым субъект может быть нечувствительным, включают, например, монотерапию с применением антагониста ФРЭС, например, монотерапию с применением антитела против ФРЭС.
Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ популяризации введения антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба и одного или более других терапевтических агентов для лечения глиобластомы (например, вновь диагностированной глиобластомы и/или глиобластомы пронейрального типа) пациенту/субъекту-человеку. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает популяризацию введения по меньшей мере одного химиотерапевтического агента. Введение антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) может происходить одновременно или последовательно по отношению к введению химиотерапевтического агента (например, ТМЗ). Популяризацию можно осуществлять любыми доступными средствами. В некоторых вариантах реализации популяризацию осуществляют с помощью вкладыша в упаковку, сопровождающего коммерческий состав антитела против ФРЭС. Популяризацию также можно осуществлять с помощью вкладыша в упаковку, сопровождающего коммерческий состав химиотерапевтического агента. Популяризацию можно осуществлять путем письменного или устного сообщения врачу или медицинскому работнику. В некоторых вариантах популяризацию осуществляют с помощью вкладыша в упаковку, причем вкладыш в упаковку содержит инструкции по лечению глиобластомы с применением антитела против ФРЭС в комбинации с одним или несколькими другими химиотерапевтическими агентами и/или способами лечения. В дополнительном варианте реализации вкладыш в упаковку содержит некоторые или все из результатов, полученных в примере 4. В некоторых вариантах реализации после популяризации осуществляют лечение субъекта с применением антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) и химиотерапевтического агента (например, ТМЗ), и, необязательно, еще одного способа лечения (например, лучевой терапии).
В настоящем изобретении предложен коммерческий способ, включающий маркетинг антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) в комбинации с одним или более другими терапевтическими агентами, например, химиотерапевтическими агентами (например, ТМЗ), и/или способами лечения (например, лучевой терапией) для лечения глиобластомы у пациента/субъекта-человека с целью увеличить время ОВ и/или PFS у субъекта, снизить вероятность рецидива глиобластомы у субъекта и/или увеличения вероятность выживания субъекта. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает маркетинг химиотерапевтического агента для применения в комбинации с антителом против ФРЭС (например, бевацизумабом). В некоторых вариантах реализации после маркетинга осуществляют лечение субъекта с применением антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) и химиотерапевтического агента.
1. Дозировка и способ применения
Способы лечения согласно настоящему изобретению могут привести, например, к снижению размера опухоли (например, размера глиобластомы), увеличенному медианному времени общего выживания или выживания без прогрессирования (PFS) пациента, получившего лечение, по сравнению с пациентом, получившим химиотерапевтический агент (например, ТМЗ) без антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба). Как описано выше, лечение с применением комбинации антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) и по меньшей мере одного дополнительного лекарственного средства/способа лечения (например, химиотерапевтического агента, например, ТМЗ, и/или лучевой терапии), может привести к аддитивному или синергичному (более чем аддитивному) терапевтическому эффекту для пациента.
Сроки между по крайней мере одним применением дополнительного лекарственного средства/способа лечения (например, химиотерапевтического агента, например, ТМЗ, и/или, например, лучевой терапии) и по меньшей мере одним введением антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) в настоящем документе составляет приблизительно один месяц или менее, приблизительно две недели или менее, приблизительно одну неделю или менее, в один и тот же день, в один и тот же час, или приблизительно в одно и то же время (одновременное введение). В некоторых случаях по меньшей мере одно антитело против ФРЭС можно вводить до по меньшей мере одного дополнительного лекарственного средства/способа лечения. В некоторых случаях по меньшей мере одно антитело против ФРЭС можно вводить после по меньшей мере одного дополнительного лекарственного средства/способа лечения. В некоторых случаях по меньшей мере одно антитело против ФРЭС и/или по меньшей мере одно дополнительное лекарственное средство/способ лечения вводят пациенту в ходе одного или более циклов (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более циклов).
Специалисты в области медицины должны принимать во внимание, что точный способ введения терапевтически эффективного количества антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) для пациента после диагностики глиобластомы остается на усмотрение лечащего врача. Например, диагноз глиобластомы может быть поставлен недавно или не недавно, и глиобластома может представлять собой рецидивирующую глиобластому.
На способ введения, в том числе дозировку, комбинирование с другими агентами, сроки и частоту введения и т.п. может влиять диагноз вероятности реакции пациента на такое антитело против ФРЭС (например, бевацизумаб), а также состояние и анамнез пациента. Таким образом, даже пациенты с глиобластомой, которые, согласно прогнозам, должны быть относительно нечувствительны к антителу против ФРЭС самому по себе, все же могут получить пользу от лечения с его применением, особенно в комбинации с другими агентами и/или способами лечения (например, химиотерапевтическим агентом, например, ТМЗ, или, например, лучевой терапией), что может изменить способность пациента реагировать на антитело против ФРЭС.
Композицию, содержащую антитело против ФРЭС (например, бевацизумаб) следует составлять, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые следует учитывать в данном контексте, включают конкретный тип глиобластомы, подлежащей лечению (например, недавно диагностированная глиобластома или рецидивирующая глиобластома, глиобластома пронейрального типа, глиобластома мезенхимального типа или глиобластома пролиферативного типа), конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению (например, человек), клиническое состояние пациента, причину глиобластомы, область доставки агента, возможные побочные эффекты, конкретное антитело против ФРЭС, способ введения, график введения и другие факторы, известные медицинским работникам. Эффективное вводимое количество антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) должно зависеть от таких соображений.
Врач, обладающий обычными навыками в данной области техники, может определить и назначить эффективное количество требуемой фармацевтической композиции в зависимости от таких факторов, как конкретное антитело против ФРЭС (например, бевацизумаб). Например, врач может начать с доз такого антитела против ФРЭС, используемых в фармацевтической композиции, уровень которых ниже, чем требуется для достижения желательного терапевтического эффекта, и постепенно увеличивать дозу до достижения желательного эффекта. Эффективность заданной дозы или схемы лечения с применением антагониста можно определить, например, путем оценки признаков и симптомов у пациента с помощью стандартных показателей эффективности.
В некоторых примерах пациента лечат с применением одного и того же антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) по меньшей мере дважды. Так, первоначальное и второе воздействие антитела против ФРЭС осуществляют с применением одного и того же антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба), и, в некоторых случаях, все воздействия антител против ФРЭС осуществляют с применением одного и того же антитела против ФРЭС, т.е. лечение при первых двух воздействиях и предпочтительно - всех воздействиях осуществляют с применением одного типа антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба.
В качестве общего предложения, эффективное количество антитела против ФРЭС при парентеральном введении на дозу должно находиться в диапазоне от приблизительно 20 мг до приблизительно 5000 мг, в виде одной или более доз. Типичные схемы приема для антител, например, антител против ФРЭС (например, бевацизумаба), включают 100 или 400 мг каждые 1, 2, 3 или 4 недели или введение дозы 1, 3, 5, 10, 15 или 20 мг/кг каждые 1, 2, 3 или 4 недели. Например, эффективное количество антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) можно вводить по 10 мг/кг каждые две недели, необязательно путем внутривенного (в/в) введения. В еще одном примере, эффективное количество антитела против ФРЭС можно вводить по 15 мг/кг каждые три недели, необязательно путем в/в введения. Дозу можно вводить в виде однократной дозы или многократных доз (например, 2 или 3 доз), например, вливаний.
В некоторых случаях, в зависимости от вида и тяжести заболевания, первоначальная предполагаемая дозировка антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) для введения субъекту, например, посредством одного или более раздельных введений или непрерывного вливания, составляет от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг (например, 0,1-20 мг/кг). В одном варианте реализации желательные дозировки включают, например, 6 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг и 15 мг/кг. При повторных введениях или циклах в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до лечения рака, измеряемого посредством способов, описанных выше или известных в данной области техники. В то же время можно применять другие схемы приема. В одном примере антитело против ФРЭС вводят раз в неделю, раз в две недели или раз в три недели в диапазоне доз от приблизительно 6 мг/кг до приблизительно 15 мг/кг, включая дозы 6 мг/кг, 8 мг/кг, 10 мг/кг или 15 мг/кг, но не ограничиваясь ими. Ход лечения согласно настоящему изобретению можно контролировать с помощью обычных методик и анализов. В других вариантах реализации такую схему приема применяют в комбинации со схемой химиотерапии при глиобластоме. Дополнительные сведения о подходящих дозировках приведены ниже в примере.
Продолжительность лечения можно продлить в соответствии с медицинскими показаниями или до достижения желательного терапевтического эффекта (например, описанного в настоящем документе). В некоторых вариантах реализации лечение продолжают в течение 1 месяца, 2 месяцев, 4 месяцев, 6 месяцев, 8 месяцев, 10 месяцев, 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет, 5 лет или в течение всей жизни субъекта.
Если выполняют несколько воздействий с применением антитела против ФРЭС, каждое воздействие можно осуществлять с использованием одних тех же или разных средств для введения. В одном варианте реализации каждое воздействие осуществляют путем внутривенного (в/в) введения. В еще одном варианте реализации каждое воздействие осуществляют путем подкожного (п/к) введения. В еще одном варианте реализации воздействие осуществляют как путем в/в, так и п/к введения.
В одном варианте реализации антитело против ФРЭС (например, бевацизумаб) вводят путем медленного внутривенного вливания вместо внутривенного впрыскивания или болюса. Например, стероид, например, преднизолон или метилпреднизолон (например, приблизительно 80-120 мг в/в, конкретнее, приблизительно 100 мг в/в) вводят приблизительно за 30 минут до начала вливания антитела против ФРЭС. Например, антитело против ФРЭС, например, бевацизумаб, можно вводить путем вливания через выделенную линию. Например, антитело против ФРЭС, например, бевацизумаб, можно первоначально вводить внутривенно в течение приблизительно 90 минут с последующим вливанием в течение приблизительно 60 минут, а затем - приблизительно 30 минут.
Для начальной дозы при многократном воздействии антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба), или для однократной дозы, если воздействие включает только одну дозу, такое вливание предпочтительно начинать со скоростью приблизительно 50 мг/час. Ее можно увеличить, например, путем приращения скорости, приблизительно равной 50 мг/час, каждые 30 минут до максимальной скорости приблизительно 400 мг/час. В то же время, если субъект испытывает реакцию, связанную с вливанием, скорость вливания предпочтительно уменьшать, например, до половины от текущей скорости, например, со 100 мг/час до 50 мг/час. Например, вливание такой дозы антитела против ФРЭС (например, общей дозы, составляющей приблизительно 1000 мг) завершается в течение приблизительно 255 минут (4 часов 15 минут). Субъекты необязательно получают профилактическое лечение с применением ацетаминофена/парацетамола (например, приблизительно 1 г) и дифенилгидрамина-HCl (например, приблизительно 50 мг или эквивалентную дозу аналогичного агента) перорально приблизительно за 30-60 минут до начала вливания.
При введении более чем одного вливания (дозы) антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) с целью достижения общего воздействия, второе или последующие вливания антитела против ФРЭС в данном варианте реализации начинают с более высокой скоростью, чем первоначальное вливание, например, при скорости приблизительно 100 мг/час. Эту скорость можно увеличить, например, путем приращения скорости, приблизительно равной 100 мг/час, каждые 30 минут до максимальной скорости приблизительно 400 мг/час. У субъектов, испытывающих реакцию, связанную с вливанием, скорость вливания предпочтительно снижают, например, до половины указанной скорости, например, со 100 мг/час до 50 мг/час. Предпочтительно, вливание такой второй или последующей дозы антитела против ФРЭС (например, общей дозы, составляющей приблизительно 1000 мг) завершается в течение приблизительно 195 минут (3 часов 15 минут).
В одном варианте реализации антитело против ФРЭС (например, бевацизумаб) вводят в дозе приблизительно 0,4-4 грамма, а более предпочтительно - в дозе приблизительно 0,4 -1,3 г с частотой от одной до четырех доз в течение приблизительно одного месяца. Еще более предпочтительно, доза составляет от приблизительно 500 мг до 1,2 г, а в других вариантах реализации - от приблизительно 750 мг до 1,1 г. В таких аспектах антитело против ФРЭС предпочтительно вводят в виде двух-трех доз, и/или вводят в течение приблизительно 2-3 недель.
В то же время, как отмечалось выше, эти предлагаемые количества антитела против ФРЭС часто используются как предпочтительные при терапевтическом лечении. Ключевым фактором при выборе соответствующей дозы и планировании является полученный результат, как указано выше. В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС вводят как можно скорее после появления первого признака, диагноза, обнаружения или возникновения глиобластомы.
2. Пути введения
Антитело против ФРЭС (например, бевацизумаб) можно вводить с применением любых соответствующих средств, в том числе путем парентерального, местного, подкожного, внутрибрюшинного, внутрилегочного, интраназального и/или внутриочагового введения. Парентеральные вливания включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Кроме того, предусмотрено интратекальное введение. Кроме того, антитело против ФРЭС можно надлежащим образом вводить путем импульсного вливания, например, при снижении доз антитела против ФРЭС. Наиболее предпочтительно введение дозы путем внутривенной (в/в) инъекции/вливания.
Помимо введения антител против ФРЭС пациенту традиционным путем, как отмечено выше, настоящее изобретение включает введение посредством генной терапии. Применение генной терапии для получения внутриклеточных антител, например, антител против ФРЭС, см., например, в WO 1996/07321.
Существует два основных подхода к внедрению нуклеиновой кислоты (необязательно, содержащейся в векторе) в клетки пациента: in vivo и ex vivo. Для доставки in vivo нуклеиновую кислоту вводят путем инъекции непосредственно пациенту, обычно вобласть, где требуется воздействие антагониста. Для лечения ex vivo клетки пациента удаляют, нуклеиновую кислоту вводят в эти выделенные клетки, и модифицированные клетки вводят пациенту либо непосредственно, либо, например, инкапсулируют в пористые мембраны, которые имплантируют пациенту (см., например, патент США №4892538 и 5283187). Существуют различные способы введения нуклеиновых кислот в жизнеспособные клетки. Эти способы зависят от того, переносят ли нуклеиновые кислоты в культивируемые клетки in vitro или в клетки предполагаемого хозяина in vivo. Методики, пригодные для переноса нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих in vitro, включают использование липосом, электропорацию, микроинъекцию, слияние клеток, обработку ДЭАЭ-декстраном, осаждение с фосфатом кальция и т.д. Распространенный вектор для доставки гена ex vivo представляет собой ретровирус.
Предпочтительно применяемые в настоящее время методики переноса нуклеиновых кислот in vivo включают трансфекцию с помощью вирусных векторов (например, аденовируса, вируса простого герпеса I или аденоассоциированного вируса) и системы на основе липидов (липиды, пригодные для липид-опосредованного переноса генов, представляют собой, например, DOTMA, DOPE и DC-Chol). В некоторых ситуациях желательно присоединить исходную нуклеиновую кислоту к агенту, специфичному по отношению к клеткам-мишеням, например, антителу, специфичному по отношению к белку поверхности мембраны клетки-мишени, лиганду рецептора клетки-мишени и т.д. При использовании липосом для адресного воздействия и/или облегчения поглощения можно использовать белки, связывающиеся с белком поверхности мембраны клеток, ассоциированные с эндоцитозом, например, белки капсида или их фрагменты, тропные по отношению к клеткам конкретного типа, антитела к белкам, подвергающимся интернализации при клеточном цикле, и белки, мишенью которых являются внутриклеточные структуры, и белки, повышающие внутриклеточный период полужизни. Методика рецептор-опосредованного эндоцитоза описана, например, в публикациях Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); и Wagner et al, PNAS USA 87: 3410-3414 (1990). Протоколы маркировки генов и генной терапии описаны, например, в источниках Anderson et al, Science 256: 808-813 (1992) и WO 1993/25673.
В. Антитела против ФРЭС
Во всех способах лечения, изложенных в настоящем документе, антитело против ФРЭС связывается к ФРЭС с достаточной специфичностью и сродством и может быть химерным, гуманизированным, антителом человека или антителом, полученным из библиотеки, или фрагментом антитела.
1. Химерные и гуманизированные антитела
В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС может представлять собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте США №4816567 и статье Morrison et al. PNAS USA, 81: 6851-6855, 1984). В одном примере химерное антитело содержит вариабельную область нечеловеческого происхождения (например, вариабельную область, происходящую от антитела мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, не являющегося человеком, например, обезьяны) и константную область человека. В еще одном примере химерное антитело представляет собой антитело с «переключенным изотипом», в котором изменен класс или подкласс по сравнению с исходным антителом. Химерные антитела содержат их антиген-связывающие фрагменты.
В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС может представлять собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело нечеловеческого происхождения гуманизируют с целью снижения иммуногенности для людей, сохраняя при этом специфичность и сродство исходного антитела нечеловеческого происхождения. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их фрагменты) происходят от антитела нечеловеческого происхождения, a FR (или их фрагменты) происходят от последовательностей антитела человека. Гуманизированное антитело также необязательно содержит по меньшей мере фрагмент константного участка антитела человека. В некоторых вариантах реализации некоторые FR-остатки в гуманизированном антителе заменяют соответствующими остатками антитела нечеловеческого происхождения (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, с целью восстановления или улучшения специфичности или сродства антитела. Гуманизированные антитела и способы их изготовления рассмотрены, например, в публикациях Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), и дополнительно описаны, например, в Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); патентах США №5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (где описана пересадка SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (где описано "изменение поверхности"); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (где описана "перетасовка FR"); и Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (где описан подход "направленного отбора" к перетасовке FR).
2. Антитела человека
В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС может представлять собой антитело человека. Гуманизированные антитела и способы их изготовления рассмотрены, например, в публикациях Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008), и дополнительно описаны, например, в Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1989); патентах США №5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36: 25-34 (2005) (где описана пересадка SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28: 489-498 (1991) (где описано "изменение поверхности"); Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60 (2005) (где описана "перетасовка FR"); и Osbourn et al., Methods 36: 61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (где описан подход "направленного отбора" к перетасовке FR).
Каркасные области антитела человека, которые можно применять для гуманизации, включают, но не ограничиваются: каркасные области, отобранные с использованием способа «максимального соответствия» (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151: 2296 (1993)); каркасные области, происходящие от консенсусной последовательности антител человека конкретной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепи (см., например, Carter et al. PNAS USA, 89: 4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol., 151: 2623 (1993)); зрелые (содержащие соматические мутации) каркасные области человека или эмбриональные каркасные области человека (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)); и каркасные области, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272: 10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271: 22611-22618 (1996)).
Антитела человека можно получить, используя различные методики, известные в данной области техники. Антитела человека в общих чертах описаны в статьях van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008). Антитела человека можно получить, например, путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному с целью продукции интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями человека в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные, как правило, целиком или частично содержат локусы иммуноглобулинов человека, замещающие эндогенные локусы иммуноглобулинов или локализованные вне хромосом или случайным образом интегрированные в хромосомы животного. Как правило, у таких трансгенных мышей инактивированы эндогенные локусы иммуноглобулинов. Обзор способов получения антител человека из трансгенных животных см. в Lonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005). Кроме того, см., например, патенты США №6075181 и 6150584, в которых описана технология XENOMOUSE™; патент США №5770429, в котором описана технология HUMAB; патент США №7041870, в котором описана технология K-М MOUSE, и публикацию патентной заявки США № US 2007/0061900, в которой описана технология VELOCIMOUSE). Вариабельные области человека из интактных антител, генерируемых такими животными, можно дополнительно модифицировать, например, путем объединения с другой константной областью человека.
Антитела человека можно получить с помощью способов на основе гибридом. Описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для продукции моноклональных антител человека. (См., например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Антитела человека, полученные посредством технологии на основе В-клеточной гибридомы человека, также описаны в Li et al., PNAS USA, 103: 3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают способы, описанные, например, в патенте США №7189826 (где описана продукция моноклональных IgM-антител человека гибридомной линией) и статье Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (где описаны гибридомы человека-человека). Технология на основе гибридомы человека (Trioma technology) также описана в статьях Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3): 927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
В некоторых случаях антитела человека также можно получить путем выделения Fv-клона последовательностей вариабельного домена, выбранных из библиотек фагового дисплея человеческого происхождения. Такие последовательности вариабельного домена затем можно объединять с желательными константными доменами человека.
3. Антитела, полученные из библиотек
В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС можно получить или получали путем скрининга комбинаторных библиотек на предмет антител с желательной активностью или активностями. Например, в данной области техники известны различные способы получения библиотек фагового дисплея и скрининг таких библиотек на предмет антител, обладающих желательными характеристиками связывания. Такие методы рассмотрены, например, в публикации Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178: 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001), и дополнительно описаны, например, в статьях McCafferty et al., Nature 348: 552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248: 161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, PNAS USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).
В некоторых способах на основе фагового дисплея репертуары VH- и VL-генов по отдельности клонируют посредством полимеразной цепной реакции (ПНР) и случайным образом рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем можно подвергать скринингу на предмет антиген-связывающего фага, как описано в статье Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг обычно осуществляет дисплей фрагментов антитела в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) или Fab-фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников позволяют получить антитела с высоким сродством к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В качестве альтернативы, можно клонировать наивный репертуар (например, человека) для получения единого источника антител к широкому спектру чужеродных антигенов и аутоантигенов без иммунизации, как описано в статье Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Наконец, наивные библиотеки можно также получить путем синтеза, клонируя сегменты V-генов стволовых клеток, не подвергавшиеся реаранжировке, и используя ПЦР-праймеры, содержащие случайные последовательности, для кодирования гипервариабельной области CDR3 и осуществления реаранжировки in vitro, как описано в статье Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, в которых описаны фаговые библиотеки антител человека включают, например: патент США №5750373 и патентные публикации США №2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
4. Получение и свойства антител
Антитела против ФРЭС, которые можно применять в способах согласно настоящему изобретению, могут включать любые антитела или их антиген-связыващие фрагменты, связывающиеся с ФРЭС с достаточным сродством и специфичностью и/или способные снизить или ингибировать биологическую активность ФРЭС. Антитело против ФРЭС, как правило, не связывается с другими гомологами ФРЭС, например, ФРЭС-В или ФРЭС-С, и другими факторами роста, например, P1GF, ТФР или bFGF.
165
В некоторых случаях антиген ФРЭС, который планируют использовать для продукции антител против ФРЭС, может представлять собой, например, молекулу ФРЭС, а также другие изоформы ФРЭС или их фрагмент, содержащий желательный эпитоп. В одном варианте реализации желательный эпитоп представляет собой эпитоп, распознаваемый бевацизумабом, который связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело А4.6.1 против ФРЭС, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709 (известный как «эпитоп А.4.6.1», согласно определению в настоящем документе). Другие формы ФРЭС, которые можно применять для создания антител против ФРЭС согласно настоящему изобретению, очевидны для специалистов в данной области техники.
165
ФРЭС человека получили в ходе первого скрининга библиотеки кДНК, полученной из клеток человека, с использованием кДНК ФРЭС крупного рогатого скота в качестве зонда для гибридизации. Leung et al. (1989) Science, 246: 1306. Одна кДНК, выявленная таким образом, кодирует белок из 165 аминокислот, обладающий более чем 95% гомологией с ФРЭС крупного рогатого скота; этот белок из 165 аминокислот обычно называют ФРЭС человека (hVEGF) или ФРЭС. Митогенная активность ФРЭС человека подтверждена путем экспрессии кДНК ФРЭС человека в клетках хозяина-млекопитающего. Среда, кондиционированная клетками, трансфицированными кДНК ФРЭС человека, но не контрольными клетками, стимулировала пролиферацию клеток эндотелия капилляров. Leung et al. (1989) Science, supra. Предпринимались дальнейшие усилия для клонирования и экспрессии ФРЭС посредством методик рекомбинантных ДНК. (См., например, статью Ferrara, Laboratory Investigation 72: 615-618 (1995), и источники, процитированные в ней).
121
110
111
165
ФРЭС экспрессируется в различных тканях в виде нескольких гомодимерных форм (121, 145, 165, 189 и 206 аминокислот на мономер), образующихся при альтернативном сплайсинге РНК. ФРЭС является растворимым митогеном, не связывающим гепарин; более длинные формы ФРЭС связывают гепарин с постепенно возрастающим сродством. Гепарин-связывающие формы ФРЭС можно расщеплять по С-концу плазмином, выпусвобождая диффундирующие формы ФРЭС. Аминокислотная последовательность С-концевого пептида, выявленного после расщепления плазмином, представляет собой Arg-Ala. N-концевой «основной» белок, ФРЭС (1-110), выделяемый в виде гомодимера, связывает нейтрализующие моноклональные антитела (например, антитела, называемые 4.6.1 и 3.2Е3.1.1) и водорастворимые формы рецепторов ФРЭС со сродством, аналогичным сродству интактного гомодимера ФРЭС.
В последнее время выявлено несколько молекул, структурно близких ФРЭС, в том числе фактор роста плаценты (PIGF), ФРЭС-В, ФРЭС-С, ФРЭС-D и ФРЭС-Е. Ferrara and Davis-Smyth (1987) Endocr. Rev., supra; Ogawa et al. J. Biological Chem. 273: 31273-31281 (1998); Meyer et al. EMBO J., 18: 363-374 (1999). Выявлено, что рецепторная тирозинкиназа, Flt-4 (VEGFR-3), является рецептором ФРЭС-С и ФРЭС-D. Joukov et al. EMBO. J. 15: 1751 (1996); Lee et al. PNAS USA 93: 1988-1992 (1996); Achen et al. (1998) PNAS USA 95: 548-553. Показано, что ФРЭС-С участвует в регуляции лимфатического ангиогенеза. Jeltsch et al. Science 276: 1423-1425 (1997).
Выявлено два рецептора ФРЭС, Fit-1 (также называемый VEGFR-1) и KDR (также называемый VEGFR-2). Shibuya et al. (1990) Oncogene 8: 519-527; de Vries et al. (1992) Science 255: 989-991; Terman et al. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 187: 1579-1586. Показано, что нейропилин-1 является селективным рецептором ФРЭС, способным связывать гепарин-связывающие изоформы ФРЭС (Soker et al. (1998) Cell 92: 735-45).
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антитела против ФРЭС включают моноклональное антитело, связывающееся с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело против ФРЭС А4.6.1, продуцируемое гибридомой АТСС НВ 10709; рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело против ФРЭС, полученное согласно Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599. В одном варианте реализации антитело против ФРЭС представляет собой бевацизумаб (BV или Bev), также известное как «rhuMAb ФРЭС» или «AVASTIN». Оно содержит мутантные каркасные области IgG1 человека и антиген-связывающие области, определяющие комплементарность, из моноклонального антитела А.4.6.1 мыши против ФРЭС, которые блокируют связывание ФРЭС человека с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных областей, происходят от IgG1 человека, а приблизительно 7% последовательности происходят от антитела А4.6.1 мыши.
Бевацизумаб (AVASTIN) был первым антиангиогенезным терапевтическим средством, утвержденным FDA и одобренным для лечения метастатического рака ободочной и прямой кишки (лечение первой и второй линии в комбинации с внутривенным введением химиотерапевтического препарата на основе 5-ФУ), поздних стадий неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) (лечение первой линии при неоперабельном, локально распространенном рецидивирующем или метастатическогм НМРЛ в комбинации с карбоплатином и паклитакселом) и метастазирующего HER2-отрицательного рака молочной железы (ранее не подвергавшийся лечению метастазирующий HER2-отрицательный рак молочной железы в комбинации с паклитакселом).
Бевацизумаб и другие гуманизированные антитела против ФРэС описаны в патенте США №6884879, выданном 26.02.2005. Дополнительные антитела включают антитела серии G6 или В20 (например, G6-31, В20-4.1), описанные в публикации РСТ № WO 2005/012359, публикации РСТ № WO 2005/044853 и патентной заявке США 60/991302, содержание которых прямо включено в настоящий документ посредством ссылки.
Антитело серии G6 согласно настоящему изобретению представляет антитело против ФРЭС, происходящее от последовательности антитела G6 или антитела, производного от антитела G6, согласно любой из фигур 7, 24-26 и 34-35 публикации РСТ № WO 2005/012359, содержание которой прямо включено в настоящий документ посредством ссылки. См. также публикацию РСТ № WO 2005/044853, содержание которой прямо включено в настоящий документ посредством ссылки. В одном варианте реализации антитело серии G6 связывается с функциональным эпитопом на ФРЭС человека, содержащим остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63,183 и Q89.
Антитело серии В20 согласно настоящему изобретению представляет антитело против ФРЭС, происходящее от последовательности антитела В20 или антитела, производного от антитела В20, согласно любой из фигур 27-29 публикации РСТ № WO 2005/012359, содержание которой прямо включено в настоящий документ посредством ссылки. См. также публикацию РСТ № WO 2005/044853 и патентную заявку США 60/991302, содержание которых прямо включено в настоящий документ посредством ссылок. В одном варианте реализации антитело серии В20 связывается с функциональным эпитопом на ФРЭС человека, содержащим остатки F17, М18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, Е103 и С104.
В других вариантах реализации другие антитела против ФРЭС применяют при комбинированной терапии, описанной выше, в качестве единственного антитела против ФРЭС или в качестве дополнения к применению антитела против ФРЭС, описанного выше. Такие антитела описаны, например, в патентах США №7060269, 6582959, 6703020; 6054297; WO 98/45332; WO 96/30046; WO 94/10202; ЕР 0666868 В1; публикациях патентных заявок США №2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 и 20050112126; и статье Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288: 149-164 (2004). Эти другие антитела могут включать антитела, связывающиеся с функциональным эпитопом на ФРЭС человека, описанным в настоящем документе и содержащим остатки F17, М18, D19, Y21, Y25, Q89, I191, K101, Е103 и С104 или, в качестве альтернативы, содержащим остатки F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 и Q89.
В некоторых вариантах реализации антитело против ФРЭС, которое можно применять в любом из способов, описанных в настоящем документе, может содержать вариабельную область легкой цепи, содержащую следующую аминокислотную последовательность:
и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую следующую аминокислотную последовательность:
В других вариантах реализации антитело против ФРЭС может быть неконъюгированным, например, свободным антителом против ФРЭС, или может быть конъюгированным с другой молекулой для дополнительной эффективности, например, улучшения времени полужизни. В любом из способов и вариантов применения конъюгированное антитело и/или антиген, с которым оно связывается, интернализированы в клетке, что приводит к увеличению терапевтической эффективности конъюгата при уничтожении раковых клеток (например, раковых клеток глиобластомы) с которыми оно связывается. Например, цитотоксический агент может адресно действовать или мешать нуклеиновым кислотам в раковой клетке. Примеры таких цитотоксических агентов включают майтансиноиды, калихеамицины, рибонуклеазы и ДНК-эндонуклеазы.
IV. Фармацевтические составы
Терапевтические составы используемых антител, описанные в настоящем документе, применяемые в соответствии с настоящим изобретением, получают для хранения путем смешивания антитела с желательной степенью чистоты с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами в виде лиофилизированных препаратов или водных растворов. Общие сведения о составах см., например, в источниках Gilman et al, (eds.) (1990), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; A. Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, (1990), Mack Publishing Co., Eastori, Pennsylvania.; Avis et al, (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, New York; Lieberman et al, (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, New York; and Lieberman et al, (eds.) (1990), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, New York, Kenneth A. Walters (ed.) (2002) Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker.
Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают буферные вещества, например, фосфат, цитрат и другие органические соли; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (например, хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензэтония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, например, метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и m-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, например, сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, например, поливинилпирролидон; аминокислоты, например, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, например, ЭДТА; сахара, например, сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, например, натрия; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок) и/или неионогенные ПАВ, например, TWEEN™, плюроники (PLURONICS™) или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Типичные составы антитела против ФРЭС описаны в патенте США №6884879. В некоторых вариантах реализации антитела против ФРЭС составлены по 25 мг/мл в одноразовых флаконах. В некоторых вариантах реализации 100 мг антитела против ФРЭС составлены с 240 мг дигидрата α,α-трегалозы, 23,2 мг фосфата натрия (одноосновный моногидрат), 4,8 мг фосфата натрия (двухосновной безводный), 1,6 мг полисорбата 20 и водой для инъекций, USP. В некоторых вариантах реализации 400 мг антитела против ФРЭС составлены с 960 мг дигидрата α,α-трегалозы, 93,8 мг фосфата натрия (одноосновный моногидрат), 19,2 мг фосфата натрия (двухосновной безводный), 6,4 мг полисорбата 20 и водой для инъекций, USP.
Описаны лиофилизированные составы, приспособленные для подкожного введения, например, в патенте США №6267958 (Andya et al). Такие лиофилизированные составы можно восстановить с помощью подходящего растворителя до раствора с высокой концентрацией белка, а восстановленный состав можно ввести подкожно млекопитающему, подлежащему лечению в настоящей заявке.
Кроме того, предусмотрены кристаллические формы антагониста. См., например, US 2002/0136719 А1.
Состав, описанный в настоящем документе, также может содержать более одного активного соединения (второе лекарственное средство, как отмечалось выше), предпочтительно с дополняющей активностью, которые не оказывают нежелательного действия друг на друга. Тип и эффективное количество таких лекарственных средств зависит, например, от количества и типа антагониста ФРЭС (например, антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба), присутствующего в составе, и клинических параметров субъектов. Такие предпочтительные вторые лекарственные средства отмечены выше.
Активные ингредиенты можно включить в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или межфазной полимеризации, например, микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и полиметилметакрилата, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Можно получить препараты замедленного высвобождения. Подходящие примеры препаратов замедленного высвобождения включают полупроницаемые матриксы твердых гидрофобных полимеров, содержащие антагонист и присутствующие в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Примеры матриксов замедленного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат) или поливиниловый спирт), полилактиды (патент США №3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ-этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, например, LUPRON DEPOT™ (микросферы для инъекций, содержащие сополимер молочной кислоты-гликолевой кислоты и лейпролидацетат) и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.
Составы для введения in vivo должны быть стерильными. Это легко достигается путем фильтрации через мембраны для стерильной фильтрации.
V. Наборы
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено изделие, содержащее материалы, пригодные для лечения пациента, у которого диагностирована глиобластома, (например, недавно диагностированной глиобластомы или глиобластомы пронейрального типа). Изделие содержит контейнер, этикетку и вкладыш в упаковку. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры можно сформировать из различных материалов, например, из стекла или пластика. Контейнер содержит композицию, эффективно лечащую указанное состояние, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок с раствором для внутривенного введения или флакон, содержащий пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антитело против ФРЭС (например, бевацизумаб). На этикетке, нанесенной на контейнер или связанной с контейнером, указано, что композицию используют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может содержать второй контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, например, физиологический раствор с фосфатным буфером, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно также может содержать другие материалы, желательные с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы. Кроме того, изделие содержит вкладыши в упаковку с инструкциями по применению, в том числе, например, инструкции для пользователя композиции о введении композиции антитела против ФРЭС (например, бевацизумаб) и химиотерапевтического агента (например, ТМЗ) пациенту/субъекту. Вкладыш в упаковку необязательно может содержать некоторые или все из результатов, полученных в примере 4.
Антитело против ФРЭС можно упаковать отдельно или в комбинации с другими противораковыми терапевтическими соединениями в виде набора. Набор может содержать дополнительные компоненты, используемые при введении однократной дозы субъектам, например, флаконы для восстановления порошкообразных форм, шприцы для инъекций, индивидуализированные системы в/в доставки, ингаляторы и т.д. Кроме того, набор с разовыми дозами может содержать инструкции по получению и введению композиций. Набор можно производить в виде одноразовой дозы для одного субъекта или для многократного применения конкретным субъектом (при постоянной дозе или с возможностью изменения отдельных соединений по ходу лечения). Набор может содержать несколько доз, подходящих для введения нескольким субъектам («нефасованная упаковка»). Компоненты набора можно собраны в коробки, блистерные упаковки, бутылки, пробирки и т.п.
В некоторых вариантах реализации набор предназначен для предполагаемого применения по отношению к пациенту, получившему две или менее (например, две, одну или ноль) предшествующих противораковых схем лечения.
Примеры
Следующие примеры приведены для иллюстрирования, а не для ограничения настоящего изобретения, изложенного в формуле изобретения.
Пример 1. Исследование AvaGlio
В исследовании AvaGlio оценивали эффективность и безопасность бевацизумаба в комбинации с темозоламидом и лучевой терапией при вновь диагностированной глиобластоме. Это исследование разработано как проспективное, рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое исследование III фазы по оценке бевацизумаба в комбинации с химиотерапией по сравнению с химиотерапией самой по себе. Для участия в исследовании у пациента должна была быть недавно диагностированная глиобластома с тканевым диагнозом, установленным после хирургической резекции или биопсии. За счет добавления бевацизумаба к химиотерапии и лучевой терапии целью исследования AvaGlio являлось улучшение общего выживания (ОВ) и выживания без прогрессирования (PFS) для данной группы пациентов с ограниченными терапевтическими возможностями и особенно неблагоприятным прогнозом. Основной целью было сравнение ОВ и PFS у пациентов, рандомизированных для получения только темозоламида (ТМЗ) и лучевой терапии или темозоламида и лучевой терапии в комбинации с бевацизумабом.
Обзор исследования AvaGlio
Исследование состояло из трех фаз (одновременной, поддерживающей и монотерапии) и двух (2) экспериментальных групп: ТМЗ и лучевая терапия (JIT) (1 группа) и ТМЗ и ЛИ в комбинации с бевацизумабом (2 группа). Пациентов рандомизировали (1:1) по группам. См. фигуру 1.
2
Группа 1 (только химиотерапия и лучевая терапия): Допущенные пациенты получили 2 Гр ЛТ в 5 дней в неделю в течение 6 недель и 75 мг/м ТМЗ перорально каждый день в течение 6 недель с первого до последнего дня ЛТ в комбинации с 10 мг/кг плацебо в/в каждые 2 недели. После 4-недельного перерыва в лечении допущенные пациенты получили 6 циклов 150-200 мг/м ТМЗ в 1-5 дни каждого 4-недельного графика в комбинации с 10 мг/кг плацебо в/в каждые 2 недели. ТМЗ вводили перорально, начиная с дозы 150 мг/м, которую можно увеличить. Затем продолжали монотерапию с применением плацебо (15 мг/кг каждые 3 недели) до прогрессирования заболевания. После прогрессирования заболевания пациентов лечили по усмотрению исследователя.
Группа 2 (химиотерапия и лучевая терапия плюс бевацизумаб): Допущенные пациенты получили 2 Гр ЛТ в 5 дней в неделю в течение 6 недель и 75 мг/м ТМЗ перорально каждый день в течение 6 недель с первого до последнего дня ЛТ в комбинации с 10 мг/кг бевацизумаба в/в каждые 2 недели. После 4-недельного перерыва в лечении допущенные пациенты получили 6 циклов 150-200 мг/м ТМЗ в 1-5 дни каждого 4-недельного графика в комбинации с 10 мг/кг бевацизумаба в/в каждые 2 недели. ТМЗ вводили перорально, начиная с дозы 150 мг/м, которую можно увеличить. Затем продолжали монотерапию с применением бевацизумаба (15 мг/кг каждые 3 недели) до прогрессирования заболевания. После прогрессирования заболевания пациентов лечили по усмотрению исследователя.
Первоначальное вливание бевацизумаба продолжалось в течение 90 минут, следующее вливание - в течение 60 минут, а затем - 30 минут, в соответствии с переносимостью. Бевацизумаб вводили в последний день лечения с применением ЛТ и ТМЗ, т.е. за день до начала перерыва в лечении с применением ТМЗ.
Анализ PFS был основан на оценке опухоли по критериям реакции Макдональда (модифицированным критериям ВОЗ) с использованием МРТ головного мозга и неврологической оценки, как описано в статье Macdonald et al. (J. Clin. Oncol. 8: 1277-80, 1990). Оценку опухоли выполняли в исходный момент, в конце 4-недельного перерыва в лечении, а затем каждые 8 недель.
Исследуемая популяция - критерии включения
В исследование включали пациентов в возрасте ≥ 18 лет с недавно диагностированной супратенториальной глиобластомой (GBM) с тканевым диагнозом, установленным после хирургической резекции или биопсии. Эта популяция содержал пациентов с неблагоприятным диагнозом низкодифференцированной астроцитомы, развившейся в гистологически подтвержденную GBM, ранее не получавших химиотерапии и лучевой терапии. Пациенты должны были характеризоваться показателем общего состояния ВОЗ ≤ 2.
Исследуемая популяция - критерии исключения
Доказательства недавнего кровоизлияния при послеоперационной МРТ головного мозга исключали участие пациентов-кандидатов. Однако пациентов с клинически бессимптомным наличием гемосидерина, у которых прошли геморрагические изменения, имеющие отношение к хирургической операции, и наличием точечного кровоизлияния в опухоли, допускали к участию в исследовании. Предшествующий централизованный скрининг статуса MGMT для зачисления в клиническое исследование; любая предшествующая химиотерапия (в том числе кармустин-содержащие вафли (Gliadel) или иммунотерапия (в том числе вакцинная терапии) глиобластом и низкодифференцированных астроцитом; любая предшествующая лучевая терапия головного мозга или предшествующая лучевая терапия, приведшая к потенциальному перекрыванию полей облучения; гипертонической криз или гипертоническая энцефалопатия в анамнезе; гемолиз ≥ 2 степени согласно критериям NCI-KTK в анамнезе в течение 1 месяца до рандомизации; доказательства геморрагического диатеза или коагулопатии (в отсутствие приема антикоагулянтов); крупные хирургические процедуры, открытая биопсия, внутричерепная биопсия, вентрикулоперитонеальный шунт или значительные травмы в течение 28 дней до рандомизации; кор-биопсия (за исключением внутричерепной биопсии) или другая незначительная хирургическая процедура в течение 7 дней до рандомизации также исключали участие пациентов. Размещение устройства для центрального сосудистого доступа (CVAD) в течение 2 дней до введения бевацизумаба/плацебо; свищ брюшной полости или перфорация желудочно-кишечного тракта в анамнезе в течение 6 месяцев до рандомизации; внутричерепной абсцесс в анамнезе в течение 6 месяцев до рандомизации; серьезные незаживающие раны, активные язвы или переломы костей без лечения также исключали участие пациентов. По отношению к беременным или кормящим женщинам, тесты сыворотки на беременность оценивали в течение 7 дней до начала лечения в рамках исследования или в течение 14 дней (с подтверждающим тестом на беременность в моче в течение 7 дней до начала лечения в рамках исследования). Кроме того, исключали женщин, способных иметь детей (определяемых по продолжительности < 2 лет после последней менструации и отсутствию хирургической стерилизации), и мужчин, не использующих высокоэффективные гормональные или негормональные противозачаточные средства (т.е. внутриматочную спираль); пациентов с инсультом или транзиторной ишемической атакой (TIA) в анамнезе в течение ≤ 6 месяцев до рандомизации, с неадекватным контролем гипертензии (стойкое систолическое давление > 150 мм рт.ст. и диастолическое давление > 100 мм рт.ст.) или серьезным сосудистым заболеванием, в том числе аневризмой аорты, требующей хирургического лечения, или недавним тромбозом периферических артерий в течение ≤ 6 месяцев до рандомизации. Кроме того, исключали пациентов с инфарктом миокарда или нестабильной стенокардией в течение ≤ 6 месяцев до рандомизации, застойной сердечной недостаточностью (CHF) II или большей степени согласно критериям Нью-Йоркской кардиологической ассоциации (NYHA) или известной повышенной чувствительностью к любому из исследуемых лекарственных веществ или вспомогательных веществ.
Пример 2. Классификация FFPE-фиксированных образцов с использованием данных Nanostring об экспрессии генов
Стратификация клинических образцов по подтипам экспрессии генов осложнена тем фактом, что стандартная пробоподготовка, например, с использованием методики фиксации формалином и включения в парафин (FFPE), снижает качество и количество РНК, доступной для анализа с использованием стандартных методов, например, микрочипов. В последнее время стали доступными технологии анализа одиночных молекул, обеспечивающие анализ экспрессии генов в FFPE-материале, например, Nanostring nCounter (Geiss et al. Biotechnol. 26(3): 317-325, 2008).
Для установления соответствия образцов, полученных от пациента, и подтипов экспрессии генов, первоначально определенных в свежезамороженных образцах, проанализированных на микрочипах, авторы изобретения применили четырехэтапный подход. В частности, они:
1. Повторно нормировали опубликованные данные микрочипов для 98 образцов, классифицированных Lai et al, и рассчитали центроиды экспрессии генов для 35 классификаторных генов (эталонные данные).
2. Применили центроиды для классификации нового набора из 47 образцов глиобластомы, проанализированных на одной и той же платформе Affymetrix на основе микрочипов (нормированных по тому же эталонному распределению, что и эталонные данные) (обучающие образцы).
3. Установили профиль экспрессии классификаторных генов в тех же 47 обучающих образцах в системе Nanostring nCounter.
4. Перекалибровали центроиды для платформы Nanostring с использованием меток подтипов, присвоенных 47 обучающим образцам на основе данных микрочипа Affymetrix.
Авторы получили три центроида для платформы Nanostring, по одному для каждого подтипа, которые можно непосредственно применять для классификации новых образцов, проанализированных только на этой технологической платформе.
Получение центроидов экспрессии генов для данных микрочипа Affymetrix
Авторы получили исходные данные об экспрессии для 98 проанализированных образцов и классифицировали их по Lai et al (Clin. Oncol. 29(34): 4482-4490, 2011) на микрочипах hgul33plus2 Affymetrix из исследовательской базы данных Genentech, нормировали данные (чтобы обеспечить возможность сравнения между чипами) и нашли эталонное распределение (Harbron др. Bioinformatics. 23(18): 2493-2494, 2007).
Как показано ниже в таблице 1, авторы распределили данные по подгруппам для 35 классификаторных зондов для микрочипов (из которых 30 были ассоциированы с аннотированными генами на момент написания) и связали каждый образец с меткой подтипа, присвоенной Lai et al.
Для получения трех подтип-специфических центроидов авторы усреднили экспрессию каждого гена по отдельности для всех образцов, присвоенных данному подтипу, путем расчета среднего значения (Таблица 1). Кроме того, авторы нашли среднее и стандартное отклонение для каждого наблюдаемого классификаторного зонда во всем наборе данных. Этот эталонный набор данных содержит 38 мезенхимальных (Мез), 30 пронейральных (PN) и 30 пролиферативных (Пролиф) образцов по классификации Lai et al. (Таблица 2).
Классификация образцов глиобластомы согласно перекрестному анализу на микроматрицах Affymetrix и Nanostring nCounter
Затем авторы получили исходные данные микрочипов из исследовательской базы данных Genentech для 47 новых образцов глиобластомы (обучающие образцы), которые также проанализировали в системе Nanostring nCounter. Для сопоставимости между исследованиями каждый микрочип нормировали по тому же эталонному распределению, что и данные, обработанные выше.
Для установления связи обучающих образцов с подтипами, заданными в статье Phillips et al. (Cancer Cell. 9(3): 157-173, 2006), авторы распределили данные об экспрессии по подгруппам для тех же 35 классификаторных зондов (соответствующих 30 аннотированным генам, кодирующим белки) и масштабировали экспрессию каждого зонда для соответствия среднему значению и стандартному отклонению, наблюдаемым для того же зонда в эталонном наборе данных.
Для каждого образца авторы определили коэффициент корреляции Пирсона для каждого из трех центроидов экспрессии, определенных выше, и установили его соответствие подтипу с максимальным неотрицательным коэффициентом корреляции. Образцы без положительной корреляции с любым из центроидов остались неустановленными.
Из 47 образцов 26 классифицированы как «Мез», 14 как «PN» и 7 как «Пролиф» (таблица 3).
Получение подтип-специфичных центроидов для платформы nCounter Nanostring
Кроме того, те же 47 обучающих образцов проанализировали на Nanostring nCounter, выявляя зонды, мишенями которых являлись следующие 30 классификаторных генов, представляющих все исходные 35 зондов микрочипов, для которых на данный момент было установлено соответствие локусам, кодирующим белки: ANGPTL4, ATP6V1G2, CENPK, CHI3L1, COL4A1, COL4A2, CSDC2, DLL3, DTL, E2F7, FOSL2, GABBR1, GALNT13, HMMR, KLRC3, LIF, MYL9, NCAM1, NDRG2, PDLIM4, PDPN, PLA2G5, RASL10A, SCG3, SERPINE1, SNAP91, SOX8, SPOCD1, TAGLN и TIMP1.
Необработанные данные Nanostring, полученные с помощью аналитического программного обеспечения nCounter, преобразовали в log2 и нормировали все образцы путем коррекции среднего значения и стандартного отклонения экспрессии для всех проанализированных зондов в соответствии с теми же эталонными значениями. Для определения Nanostring-специфических центроидов для трех подтипов авторы повторно рассчитали среднее значение экспрессии для каждого классификаторного гена и каждого из трех подтипов (таблица 4).
Как и выше, образцы приписали к подтипу с максимальным значением коэффициента корреляции Пирсона. Для оценки правильности присваивания подтипа на основе Nanostring авторы сравнили исходные метки классов на основе микрочипа. Авторы наблюдали совпадающие результаты присваивания для 38/47 (80,1%) образцов (таблица 5).
Для снижения количества неправильных результатов присваивания можно использовать более жесткие фильтры для присваивания подтипа, например, требование как минимум положительного коэффициента корреляции Пирсона для классификации образца.
Пример 3. Классификация образцов из исследования AvaGlio на основе Nanostring
Затем авторы классифицировали 349 образцов из исследования AvaGlio, для которых была возможна оценка подтипов экспрессии генов согласно Филлипсу на основе биомаркеров (Cancer Cell. 9(3): 157-173, 2006). Выбранные исходные характеристики пациентов, оцениваемых по 349 биомаркерам, в пределах каждой экспериментальной группы показаны в таблице 6.
Образцы проанализировали с тем же набором зондов Nanostring, который использовали для получения подтип-специфичных центроидов, показатели экспрессии для тех же генов получили с помощью той же технологии и последовательностей зондов. Из данного анализа исключили 10 из 349 образцов пациентов, несущих мутацию(и) в гене изоцитратдегидрогеназы 1 (IDH1), заведомо ассоциирующиеся с благоприятным прогнозом. Необработанные результаты Nanostring из оставшихся 339 образцов дикого типа IDH1 преобразовали в сырье log2 и скорректировали среднюю экспрессию и стандартное отклонение во всех образцах по тем же эталонным значениям, которые использовали для учебного набора в примере 2 выше.
Для классификации учитывали только значения экспрессии 30 классификаторных зондов и для каждого образца определили коэффициент корреляции Пирсона по отношению к каждому из трех Nanonstring-специфичных центроидов. Образцы приписали к подтипу с максимальным положительным значением коэффициента корреляции. Сорок два (12,3%) образца не продемонстрировали какой-либо положительной корреляции с каким-либо из центроидов и были помечены как «неклассифицируемые».
Сравнение между классификацией подтипов по Филлипсу на основе 30 классификаторных генов, описанных выше, и классификацией подтипов по TCGA (Verhaak et al. Cancer Cell. 17(1): 98-110, 2010) на основе 95 классификаторных генов показано ниже в таблице 8.
Выбранные исходные характеристики 99 пациентов с классифицированным PN-подтипом глиобластомы согласно Phillips et al., разделенные по экспериментальным группам, приведены ниже в таблице 9.
Для исследования надежности классификации образцов AvaGlio по трем подтипам экспрессии генов авторы также выполнили независимый анализ (структуризацию вокруг медоидов (Kaufman & Rousseeuw, Clustering by Means of Medoids. Reports of the Faculty of Mathematics and Informatics, Delft University of Technology, 1987) с использованием тех же 30 классификаторных генов, сортируя образцы по трем кластерам (k=3). Важно отметить, что характер кластеров не был задан заранее, но автоматически определялся алгоритмом. Образцы с отрицательной шириной силуэта, что указывало на несоответствие их экспрессии окончательным результатам присвоения кластера, были отмечены как «Неклассифицированные».
Авторы наблюдали очень высокую степень соответствия между контролируемым и независимым анализом, например, автоматически определяемые кластеры образцов в значительной мере перекрывались с подтипами на основе центроидов (таблица 10).
Пример 4. Пациенты с глиобластомой пронейрального (PN) подтипа продемонстрировали увеличенние продолжительности выживания без прогрессирования (PFS) и общего выживания (ОВ) после лечения с применением бевацизумаба в исследовании AvaGlio
В исследовании AvaGlio III фазы добавление лечения с применением антитела против ФРЭС к экспериментальной группе привело к общему увеличению медианного времени выживания без прогрессирования (PFS) приблизительно на 4,4 месяца по сравнению с группой плацебо, однако значимые различия медианного общего времени выживания между группами отсутствовали. Поэтому авторы изобретения определили возможность развития благоприятного эффекта для ОВ от добавления терапевтического средства на основе антитела против ФРЭС к ЛТ и химиотерапии у пациентов в зависимости от подтипа глиобластомы на основании классификации по Филлипсу за счет экспрессии генов в опухоли.
При стратификации данных о PFS и ОВ в соответствии с подтипом глиобластомы согласно классификации по Филлипсу, авторы изобретения наблюдали повышение PFS и ОВ в экспериментальной группе исследования AvaGlio по сравнению с группой плацебо для пациентов с глиобластомой PN-подтипа (n=99 пациентов, что составляло приблизительно 28,3% всех пациентов в исследовании AvaGlio).
По отношению к PFS у PN-пациентов с наихудшим прогнозом ОВ при стандартном лечении авторы изобретения наблюдали увеличение медианы PFS приблизительно на 4,3 месяца при отношении рисков (ОР) 0,58 (95% доверительный интервал (ДИ) = 0,37-0,9; р=0,015) в экспериментальной группе по сравнению с группой плацебо (см. фигуру 2А). По отношению к ОВ у PN-пациентов авторы изобретения наблюдали увеличение медианы ОВ приблизительно на 4,9 месяца при значении ОР, равном 0,63 (95% ДИ=0,4-0,99; р=0,043) в экспериментальной группе по сравнению с группой плацебо (см. фигуру 2В).
Авторы изобретения также провели многофакторный анализ влияния лечения с применением антагониста ФРЭС (например, антитела против ФРЭС, например бевацизумаба) в комбинации с ЛТ и химиотерапией на ОВ для учета известных клинических прогностических независимых переменных (например, возраста, кортикостероидов, степени резекции, пола, показателя состояния по Карновскому (KPS), статуса метилирования промотора O-6-метилгуанидин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT), показателя мини-экспертизы психического состояния (MMSE), класса согласно анализу с использованием рекурсивного расщепления (RPA) и показателя общего состояния ВОЗ). Этот анализ выполняли с помощью многофакторной модели пропорциональных рисков Кокса (РН) с аппроксимацией по отношению к ОВ для пациентов с глиобластомой PN-подтипа и других подтипов согласно определению Филлипса. Многофакторная РН-модель Кокса показала, что лечение с применением антитела против ФРЭС привело к значительному улучшению ОВ у пациентов с глиобластомой PN-подтипа, но не для пациентов с глиобластомой других подтипов (фигура 3). В частности, для пациентов с глиобластомой PN-подтипа медиана ОВ в экспериментальной группе составила 17,1 месяцев по сравнению с 12,2 месяцами в группе плацебо, причем ОР составило 0,42 (95% ДИ=0,24-0,72; р=0,002) (фигура 4А). Для пациентов с глиобластомой других подтипов ОР составило 1,03 (95% ДИ=0,76-1,39; р=0,863) (фигура 4 В).
Многофакторный анализ влияния лечения с применением антагониста ФРЭС (например, антитела против ФРЭС, например, бевацизумаба) на ОВ пациентов с глиобластомой PN-подтипа и других подтипов согласно классификации TCGA (Verhaak et al. Cancer Cell. 17(1): 98-110, 2010) также продемонстрировал значительный благоприятный эффект для ОВ пациентов с глиобластомой PN-подтипа (фигуры 5А и 5В).
Эти данные показывают, что лечение с применением антитела против ФРЭС (например, бевацизумаба) ассоциировано с улучшением PFS и ОВ (т.е. увеличением продолжительности PFS и ОВ) для пациентов с глиобластомой PN-типа.
Хотя для ясности понимания некоторые детали настоящего исследования описаны посредством иллюстраций и примеров, не следует считать, что описание и примеры ограничивают рамки настоящего изобретения. Описание всех патентов, патентных заявок, научных источников и номеров доступа в Genbank, приведенных в настоящей заявке, явным образом и полностью включено в настоящий документ посредством ссылок для всех целей, как если бы каждый патент, патентная заявка, научный источник и номер доступа в Genbank были специально и по отдельности включены в настоящий документ посредством ссылок. Такие патентные заявки, в частности, включают предварительные патентные заявки США №61/872165 и 62/004687, поданные 30 августа 2013 года и 29 мая 2014 года, соответственно, из которых настоящая заявка испрашивает приоритет.