Гармонизация отечественных и международных подходов при оценке фармакопейных микробиологических питательных сред

О.В. Гунар, К.А. Каграманова, Г.М. Булгакова

ГАРМОНИЗАЦИЯ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ И МЕЖДУНАРОДНЫХ ПОДХОДОВ ПРИ ОЦЕНКЕ ФАРМАКОПЕЙНЫХ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

О.В. Гунар, К.А. Каграманова, Г.М. Булгакова

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздравсоцразвития России, Москва

Резюме: В статье обоснована необходимость совершенствования методик испытания фармакопейных питательных сред, используемых при определении микробиологических показателей качества лекарственных средств. Методики, описанные в ОФС 42-0067-07 ГФ XII издания гармонизированы с международными требованиями. Дополнительно введены способы подтверждения дифференциально-диагностических свойств питательных сред. Проведенные испытания ростовых, селективных и дифференциально-диагностических свойств некоторых питательных сред согласно совершенствованным методикам подтверждают качество и доказывают возможность использования проанализированных испытанных сред.

Ключевые слова: лекарственные средства, микробиологическая чистота, питательные среды, гармонизация методов исследований.

HARMONISATION OF LOCAL AND INTERNATIONAL APPROACHES TO THE ASSESSMENT OF PHARMACOPOEIAL MICROBIOLOGICAL CULTURE MEDIA O.V. Gunar, KA. Kagramanova, G.M. Bulgakova

Abstract: The article substantiates the relevance of improving testing methods for pharmacopoeial culture media used to determine microbiological quality of medicines. Testing methods described in General Monograph 42-0067-07 of the Russian State Pharmacopoeia XII edition have been harmonized with international requirements. Additionally certain methods to confirm differential and diagnostic properties of culture media have been implemented. Performed tests for growth, selective and differential-diagnostic properties of some culture media, according to the improved methods, confirm quality and demonstrate ability to use the analyzed tested media.

Key words: medicines, microbiological purity, culture media, harmonization of research methods.

Определение стерильности и микробиологической чистоты, как наиболее важных критериев безопасности лекарственных средств (ЛС), проводят с использованием широкого набора жидких и плотных микробиологических питательных сред (ПС) общего и специального назначения.

ПС общего назначения используют для количественного определения микроорганизмов в лекарственных препаратах и фармацевтических субстанциях, а также для инокуляции и дальнейшей инкубации разнообразных видов тест-штаммов и микроорганизмов-контам инантов.

Гунар Ольга Викторовна, доктор фарм. наук, начальник лаборатории микробиологии Испытательного Центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУНЦ ЭСМП Минздравсоцразвития России gunar@regmed.ru

Каграманова Кальвина Арменовна, канд. биол. наук, главный эксперт лаборатории микробиологии Испытательного Центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ НЦ ЭСМП Минздравсоцразвития России Bulgakova@regmed.ru

Булгакова Галина Михайловна, эксперт 1 категории лаборатории микробиологии Испытательного Центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ НЦ ЭСМП Минздравсоцразвития России Kagramanova@regmed.ru

К специальным ПС относятся среды, применяемые для избирательного выявления в исследуемом препарате какого-либо рода (вида) микроорганизмов, а также подтверждения отдельных биохимических или физиологических свойств конкретных бактерий или грибов.

Плотные (агаризованные) ПС используют, как правило, для точного определения количества бактерий и грибов в образцах ЛС в соответствии с фармакопейными нормами, для получения чистых культур микроорганизмов, для изучения культуральных и морфологических свойств обнаруженных микроорганизмов-контаминантов. Жидкие питательные среды используют при определении микробиологической чистоты ЛС в качестве накопительных, селективных и дифференциально-диагностических. Для подтверждения возможности применения питательных сред, описанных в стандартных фармакопейных методиках микробиологического контроля ЛС, используют разнообразные биологические и физико-хими-

ческие критерии. В частности, согласно ОФС 42-0067-07 ГФ XII изд. в качестве биологических показателей используемых питательных сред контролируют их ростовые и селективные свойства [1].

С целью гармонизации с ведущими международными фармакопеями (Европейской [2] и Американской [3]) и для актуализации методов анализа в лаборатории микробиологии ИЦ экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» была проведена работа по совершенствованию статьи 32 (ОФС 42-0067-07) «Микробиологическая чистота» ГФ XII издания в части, посвященной испытанию качества используемых питательных сред. Кроме уточнения методик определения ростовых и селективных свойств питательных сред в переработанный и совершенствованный проект ОФС включены требования и методы анализа дифференциально-диагностических питательных сред аналогично Европейской фармакопее.

Сравнение требований и методов контроля используемых при испытании качества ЛС питательных сред, пред-

ставленных в ГФ XII издания в настоящее время и включенных в переработанный проект ОФС, приведено в таблице 1.

Следует отметить, что во всех испытанию по указанным показателям как в отечественной, так и в Европейской фармакопеях подвергают каждую серию среды, готовой к использованию, и каждую партию среды, приготовленной из сухого порошка или из отдельных ингредиентов.

Определение ростовых свойств питательных сред

При анализе качества питательную среду в чашках и пробирках иноку-лировали тест-микроорганизмами, каждым в отдельности в количестве не более 100 КОЕ/мл.

Критерием соответствия заданным требованиям ростовых свойств основ-

ных плотных ПС является коэффициент прорастания, который не должен быть менее 0,7. Определение коэффициента прорастания проводили по формуле, приведенной в ГФ XII изд., ч. 1 ОФС 42-0067-07 «Микробиологическая чистота» (с. 189).

Изменения, включенные в проект ОФС, в первую очередь коснулись определения ростовых свойств жидких ПС в связи с многоступенчатостью методики и тройной повторностью экспе-

Таблица 1. Требования и методы определения качества питательных сред, используемых при испытании микробиологической чистоты ЛС

Питательная среда Требования ГФ XII изд. ОФС 42-0067-07 Требования по проекту ОФС

Ростовые свойства:

Плотная Испытуемая агаризованная среда годна к использованию, если коэффициент прорастания (Кпр) не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой (с. 189 ГФ XII изд.) Испытуемая среда годна к использованию, если коэффициент прорастания (Кпр.) не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой

Жидкая Испытуемая среда считается годной к употреблению, если Кпр не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой. На испытуемых и стандартных питательных средах визуально должен наблюдаться одинаковый рост тест- микроорганизмов

Селективные свойства:

Плотная На всех засеянных чашках после оптимального срока инкубации при соответствующей температуре отмечают рост характерных колоний тест-микроорганизмов при отсутствии или угнетении роста штамма- ассоцианта На всех засеянных питательных средах (в чашках и пробирках) после наиболее длительного срока инкубации для этого теста отмечают отсутствие роста штамма- ассоцианта при посевной дозе на 2 1д выше, чем доза тест- микроорганизма

Жидкая После пересева с жидкой испытуемой среды на соответствующую плотную среду должен наблюдаться рост характерных колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста штамма- ассоцианта при посеве его в количестве на 2 порядка выше, чем количество тест- штамма

Диагностические свойства:

Плотная Раздел отсутствует Контролируют диагностические среды (например, Мосселя бульон, Мак-Конки бульон, среду № 3, № 4 и др.) Морфологические и диагностические признаки тест-микроорганизмов после посева петлей на поверхность среды и инкубации в стандартных условиях должны соответствовать описанию, приведенному в фармакопее, а рост штаммов-ассоциантов должен полностью отсутствовать

Жидкая

римента, который чрезвычайно трудоемок и занимает значительное время исследователя. С целью упрощения метода без снижения его эффективности была предложена и апробирована следующая модификация методики. Для определения ростовых свойств бульона Сабуро использовали тест-микроорганизмы C. albicans ATCC 10231 и A. brasiliensis (прежнее название - A. niger) ATCC 16404. Культуры грибов выращивали на среде № 2 при температуре (22,5 ± 2,5)0 С в течение 2-3 сут (C. albicans) и 7 сут (до появления обильного спороношения - A. brasiliensis).

Перед испытанием выросшую культуру

С. э1Ь1сап5 смывали со скошенной среды № 2 0,9% раствором натрия хлорида изотонического, стандартизовали по международному стандарту мутности 10 ЕД и разводили до концентрации взвеси не более 1000 КОЕ/мл. Споры А. brasiliensis смывали с агара 0,9% раствором натрия хлорида, содержащего 0,05 % твина - 80. Количество конидий определяли с помощью камеры Горяева и чашечным поверхностным методом на среде № 2.

Испытуемую и стандартную среды инокулировали двумя тест-штаммами грибов, внося в пробирки с испытуемой и стандартной средой по 0,1 мл взвеси, содержащей не бо-

лее 100 КОЕ/мл каждой культуры по отдельности.

Опыт проводили в двойной повторности. Посевы инкубировали при соответствующей температуре в течение 48-72 ч. Рост грибов был сравнимым с ростом на предварительно приготовленной и прошедшей испытание партии питательной среды. Результаты по количеству грибов и коэффициент их прорастания приведены в таблице 2.

Для определения ростовых свойств среды № 8 использовали тест-микроорганизмы S. aureus АТСС 6538, P. aeruginosa АТСС 9027, B. cereus АТСС 10702, E. coli АТСС 25922.

Таблица 2. Результаты анализа качества питательных сред по ростовым, селективным и диагностическим свойствам

Наименование среды Используемые бактерии и грибы Полученный результат

Тест- микроорганизмы Штаммы- ассоцианты Фактическое количество КОЕ/мл

Ростовые свойства:

Бульон Сабуро C. albicans ATCC 10231 Не требуются 82 ± 2 Типичный рост, аналогичный контролю

A.brasiliensis ATCC 16404 66 ± 1

Среда № 2 C. albicans ATCC 10231 Не требуются 82 ± 2 Кпр=0,82

A.brasiliensis ATCC 16404 66 ± 2 Кпр=0,93

Среда № 8 S. aureus ATCC 6538 Не требуются 131 ± 4 Типичный рост, аналогичный контролю

P. aeruginosa ATCC 9027 94 ± 3

B. cereus ATCC 10702 86 ± 2

C. albicans ATCC 10231 82 ± 2

Селективные свойства:

Бульон Мосселя E. coli АТСС 25922 S. aureus ATCC 6538 101 ± 1 (1,0±0,5)-104 Типичный рост E. coli, отсутствие роста S. aureus

Бульон Раппопорта-Василиадиса S. а bony IHE 103/39 S. aureus ATCC 6538 81 ± 3 (1,0±0,5)-104 Типичный рост S. abony, отсутствие роста S. aureus

Диагностические свойства:

Среда № 4 (агар Эндо) E. coli АТСС 25922 Не требуются - Типичный рост E.coli

XLD- агар S. а bony IHE 103/39 Не требуются - Типичный рост S^bony

При стандартизации суспензий клеток тест-штаммов учитывали, что за счет размеров клеток оптический стандарт мутности 10 ЕД для культур Б.аигеиБ и Р.аегид'твБа соответствует концентрации 109 КОЕ/мл, а для культур В.сегеиБ и С.а1ЫсапБ - 107 КОЕ/мл. Для определения фактической концентрации посевной дозы тест-микроорганизмов культуральные взвеси с концентрацией 103 КОЕ/мл высевали поверхностным методом по 0,1 мл на среду № 1 для

бактерий, на среду № 2 - для грибов (рис. 1).

Перед испытанием тест-микроорганизмы выращивали в пробирках на скошенной среде № 1 при температуре (30-35)0 С в течение 18-24 ч, смывали с поверхности агара 0,9% раствором натрия хлорида, стандартизовали по оптическому стандарту мутности 10 ЕД и разводили до концентрации около 100 КОЕ/мл методом последующих десятикратных разведений.

Далее в ходе испытания в 2 пробирки с 10 мл испытуемой среды вносили по 0,1 мл суспензии тест-микроорганизма, каждого отдельно. Параллельно инокулировали стандартную среду того же наименования. Посевы инкубировали при соответствующей температуре, но не более, чем в течение самого короткого периода времени рекомендованной инкубации (при рекомендованном периоде инкубации 24-48 ч, посевы выдерживали в течение 24 ч).

Рис. 1. Рост грибов рода Candida на среде № 2 после посева поверхностным методом

Рис. 2. Рост бактерий рода Salmonella на агаре с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, с лактозой и сахарозой

Рис. 3. Рост бактерий рода Salmonella на среде ксилозо-лизин-дезоксихолат (XLD) агар после посева микробиологической петлей

Рис. 4. Рост бактерий S. aureus после посева на маннитно-солевой агар микробиологической петлей

Рис. 5. Проявление пигмента пиоцианина при росте P. aeruginosa на триптиказо- соевом бульоне

к Я * ^

Определение селективных свойств питательных сред

Селективность питательных сред -это способность частично или полностью подавлять рост сопутствующих штаммов-ассоциантов при обеспечении роста тест-микроорганизмов. Селективные свойства ПС определяли следующим образом. В 2 пробирки с испытуемой и стандартной средами вносили по 0,1 мл взвеси тест-микроорганизма (не более 100 КОЕ) и параллельно по 0,1 мл штамма-ассоцианта (количество КОЕ штамма-ассоцианта на 2 1д выше, чем количество КОЕ тест-микроорганизма). После инкубации при соответствующей температуре в течение не менее самого длительного периода времени рекомендованной инкубации (в данном случае 72 ч) содержимое каждой пробирки перемешивали и высевали по 0,1 мл на соответствующие плотные среды общего назначения в чашках Петри или на специфические диагностические среды, используя бактериологическую петлю (рис. 2). Контролем служила жидкая стандартная среда, в которую вносили по отдельности те же количества тест-микроорганизмов и штаммов-ассоциантов.

Все посевы инкубировали в стандартных условиях в течение 24-72 ч. Испытуемая селективная среда обе-

спечивала рост тест-микроорганизма при полном отсутствии роста штаммов-ассоциантов при сравнении с ростом на стандартной среде того же наименования.

Например, для бульона Мосселя в качестве тест-микроорганизма использовали Escherichia coli АТСС 25922, а в качестве штамма-ассоцианта -Staphylococcus aureus АТСС 6538.

Для жидкой среды обогащения Раппапорта-Вассилиадиса тест-микроорганизмом являлась - Salmonella abony NCTC 6017, а штаммом-ассоци-антом - также Staphylococcus aureus ATCC 6538.

Определение диагностических свойств питательных сред

Большинство диагностических сред для испытания качества ЛС по показателю «Микробиологическая чистота» -это агаризованные среды.

Во время исследования каждый отдельный тест-микроорганизм из суточной бульонной культуры с соответствующей жидкой среды пересевали на испытуемую плотную диагностическую микробиологической петлей (рис. 3, 4). После стандартной инкубации учитывали рост и типичный вид колоний согласно представленному описанию в ГФ XII изд.

Диагностические среды считали

пригодными, если выявленный рост тест-микроорганизмов являлся типичным для используемых бактерий и грибов.

Результаты определения ростовых

свойств бульона Сабуро, среды № 2, среды № 8 (рис. 5); селективных свойств бульонов Мосселя и Раппапорта-Василиадиса; диагностических свойств среды № 4 (агара Эндо для диагностики E.coli) и среды XLD-агар (для идентификации бактерий рода Salmonella) представлены в таблице 2.

Таким образом, изученные ростовые свойства бульона Сабуро, среды № 2, среды № 8; селективные свойства бульонов Мосселя и Раппапорта-Василиадиса; диагностические свойства среды № 4 (агара Эндо для диагностики E. coli) и среды XLD-агар (для идентификации бактерий рода Salmonella) соответствуют предъявляемым требованиям, а указанные среды могут быть использованы при испытании качества ЛС по показателю «Микробиологическая чистота». Доработанные гармонизированные методики анализа ростовых, селективных и диагностических свойств питательных сред включены в проект ОФС «Микробиологическая чистота» и переданы на рассмотрение и утверждение в установленном порядке.

Литература

1. Государственная Фармакопея Российской Федерации XII издания, часть 1 (ГФ XII). Москва. 2007.

2. European Pharmacopoeia 7.0 (ЕФ 7 изд.). Strasbourg. 2010.

3. United States Pharmacopeia (USP 34-NF 29). RockwiU. 2011