Средство, повышающее антиметастатическую активность циклофосфана
AGENT INCREASING ANTI-METASTATIC ACTIVITY OF CYCLOPHOSPHAN

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для повышения эффективности цитостатического лечения больных со злокачественными новообразованиями.
В современной клинической онкологии химиотерапия остается одним из наиболее востребованных и высокоэффективных способов воздействия на распространенный опухолевый процесс. Внедрение новых схем комбинированной медикаментозной терапии позволяет значительно повысить эффективность химиотерапии, выживаемость пациентов, увеличить продолжительность жизни и улучшить ее качество (1, 2). Однако использование цитостатической терапии не дает полной гарантии выздоровления, не исключает возникновения рецидивов и метастазов, приводит к развитию токсических эффектов, которые часто являются показанием для прекращения лечения и проведения коррекционных мер по устранению побочных реакций и осложнений (3, 4). Поэтому поиск средств, повышающих эффективность антибластомной терапии и уменьшающих ее токсичность, представляет большой интерес для современной клинической онкологии.
В качестве примера известного средства с подобными свойствами можно привести родиолы жидкий экстракт (Extrectum Phodiolae fluidum) спиртовой (на 40% этиловом спирте) (1:1) из корневищ с корнями родиолы розовой. У экстракта родиолы обнаружены свойства снижать частоту метастазирования экспериментальных опухолей, предупреждать развитие метастазов на фоне удаления опухолевого узла, уменьшать интенсивность процесса диссеминации на фоне введения цитостатика (5). Препарат относится к группе тонизирующих центральную нервную систему, при его использовании возможно развитие повышенной возбудимости у пациентов, бессонницы, лабильности артериального давления и головной боли. Иногда наблюдается развитие аллергических реакций. Недостатком родиолы жидкого экстракта является ограничение при назначении больным с выраженной артериальной гипертензией, лихорадкой, сахарным диабетом, заболеваниями сердечно-сосудистой системы, а также пациенты с повышенной чувствительностью к компонентам, входящим в состав препарата. Не применяют экстракт у детей до 12 лет, в период беременности и грудного вскармливания (6).
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала средств растительного происхождения, повышающих антиметастатическую активность циклофосфана.
Перспективным в этом отношении является экстракт надземной части лабазника вязолистного, приготовленный на 70% этаноле. В литературе известно, что экстракт лабазника вязолистного на 70% этаноле обладает иммуномодулирующим, антифунгальным действием (7). Получены патенты на использования экстракта лабазника вязолистного на 70% этаноле в качестве ноотропного и адаптогенного (8), антиоксидантного и гепатопротекторного (9), церебропротекторного и противоневротического (10) средства.
Для решения поставленной задачи используют экстракт надземной части лабазника вязолистного (Filipendula ulmaria (L.) Maxim.) на 70% этаноле, полученный следующим способом: надземную часть лабазника вязолистного, высушенную воздушным способом, измельчают и просеивают через сито с диаметром отверстий 2 мм (влажность 9,1%). 50 г измельченного сырья помещают в стеклянную колбу, заливают 900 мл 70% этанола и нагревают при температуре 90°C на водяной бане с обратным холодильником в течение 60 мин. Полученное извлечение фильтруют, сырье отжимают. Экстракт упаривают в вакууме при температуре не выше 60°C досуха. Выход сухого экстракта составляет 38,8% (7).
Экстракт надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле содержит простые фенолы (рододендрол, салигенин, салицин, анисовый и конифериловый спирты, 1-(4-гидроксифенил)-2-метил-1-пропанон); флавоноиды (кверцетин, кемпферол, апигенин, лютеолин, таксифолин, гиперозид, изокверцитрин, авикулярин, 4'-O-β-D-галактопиранозид кверцетина, спиреозид, рутин); органические кислоты и их эфиры (бензойная, салициловая, м-гидроксибензойная, анисовая, ванилиновая, гентизиновая, галловая и ее этиловый эфир, коричная, п-кумаровая, кофейная, феруловая, хлорогеновая, (4-метоксифенил)-метиловый эфир бензолуксусной, диэтилфталат, диизооктил-фталат, бис-(2-метилпропил)-фталат бутилоктилфталат, бис-(2-этилгексил)-фталат, пальмитиновая и ее этиловый эфир, линолевая, α-линоленовая, метиловый эфир 14-метил-пентадекановой), кумарины (эскулетин); дубильные вещества гидролизуемой группы, в том числе эллаговая кислота, предельные алифатические углеводороды (генеикозан, трикозан, пентакозан); алифатические альдегиды (гексаналь); алифатические кетоны (6,10,14-триметил-2-пентадеканон, 2-гептадеканон, 2-нонадеканон); ароматические углеводороды (о-ксилол); ациклические терпеноиды (фитол); моноциклические циклогексановые монотерпеноиды (3-оксо-α-ионол, дигидроактинидиолид); тритерпеновые соединения (β-амирин, олеаноловая, урсоловая кислоты); стерины, углеводы (D-глюкоза, D-галактоза, L-арабиноза); амины; аминокислоты (в том числе, валин, глутаминовая кислота, гистидин); макро- и микроэлементы [7, 11, 12].
Новым является то, что в качестве средства, повышающего антиметастатическую активность циклофосфана, применяют экстракт надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле.
Новые свойства явным образом не следуют из уровня техники в данной области и неочевидны для специалистов. В научно-медицинской и патентной литературе не найдено сведений о способности экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле повышать антиметастатическую активность циклофосфана.
Предлагаемое изобретение может быть использовано в онкологической практике с целью повышения эффективности цитостатической терапии.
Исходя из вышеизложенного следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Данное средство прошло экспериментальное исследование в лаборатории онкофармакологии и лаборатории фитофармакологии и специального питания НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (Томск).
Новые свойства экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле были обнаружены экспериментальным путем. Исследование проведено на мышах-самках линии C57BL/6 массой 19-20 г в возрасте 9 недель. В качестве модели экспериментального злокачественного роста использовали гематогенно метастазирующую карциному легких Льюис, перевиваемую внутримышечно по 4-5 млн опухолевых клеток на мышь.
Для проведения экспериментов животные (мыши-самки линии C57BL/6) были распределены на группы:
1. Контроль - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили 0,2 мл дистиллированной воды начиная с 8 сут после перевивки в течение 11 сут. На 12 сут после перевивки опухоли животным однократно внутрибрюшинно инъецировали физиологический раствор в объеме 0,1 мл.
2. Циклофосфан (ЦФ) - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили 0,2 мл дистиллированной воды начиная с 8 сут после перевивки в течение 11 сут. На 12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
3. ЦФ + экстракт надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле (50 мг/кг) - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили 0,2 мл разведенного в дистиллированной воде сухого экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле в дозе 50 мг/кг начиная с 8 сут после перевивки в течение 11 сут. На 12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
4. ЦФ + экстракт надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле (100 мг/кг) - животные с опухолью, которым зондом в желудок вводили 0,2 мл разведенного в дистиллированной воде сухого экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле в дозе 100 мг/кг начиная с 8 сут после перевивки в течение 11 сут. На 12 сут после перевивки опухоли мышам вводили однократно внутрибрюшинно ЦФ в дозе 125 мг/кг в 0,1 мл воды для инъекций.
По окончании эксперимента (на 20 сут после перевивки опухоли) животных умерщвляли, соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденные Министерством здравоохранения РФ. Проводили вскрытие животных, ревизию внутренних органов, выделение опухоли, подсчет метастазов. Эффективность проведенных курсов лечения оценивали по противоопухолевому и противометастатическому действию препаратов, определяя массу опухоли, процент торможения ее роста, частоту метастазирования, количество и площадь метастазов в легких, индекс ингибирования метастазирования [13, 14].
Обработку полученных результатов проводили с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни (U) и углового преобразования Фишера (ϕ). Различия считали достоверными при Р<0,05 [15].
Повышение эффективности цитостатической терапии экстрактом надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле было продемонстрировано в следующих экспериментах.
Пример 1
В эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис обнаружено, что использование циклофосфана приводило к достоверному уменьшению масса опухоли в 1,7 раза, количество метастазов снизилось в 6,3 раза, их площадь оказалась значительно меньше контрольных значений, индекс ингибирования метастазирования составил 86% (таблица 1).
Включение экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле в схему химиотерапии не повлияло на эффективность лечения в отношении первичной опухоли, однако привело к повышению антиметастатического действия циклофосфана. Так, у мышей, получавших совместно с цитостатиком сухой экстракт лабазника вязолистного на 70% этаноле в дозе 50 мг/кг, количество метастазов в легких достоверно снизилось в 1,4 раза, их площадь - в 3,1 раза (Р<0,05) по сравнению с этими показателями у животных, получавших один циклофосфан. Индекс ингибирования метастазирования в этой группе увеличился до 92%. Если введение цитостатика значимо не влияло на частоту метастазирования опухоли, то его использование в сочетании с исследуемым средством в дозе 50 мг/кг приводило к уменьшению этого показателя по сравнению с группой не получавших лечения мышей. Аналогичный эффект наблюдался при использовании в схеме химиотерапии экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле в дозе 100 мг/кг: частота метастазирования снизилась до 60% против 90% (Р<0,05) у мышей, получавших циклофосфан, количество метастазов уменьшилось в 2,7 раза (Р<0,05), а их площадь - в 4,6 раза (Р<0,01), индекс ингибирования метастазирования оказался самым высоким - 97% (таблица 1).
Пример 2
В эксперименте на мышах-самках линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис обнаружено, что однократное внутрибрюшинное введение циклофосфана в дозе 125 мг/кг оказало достоверное ингибирующее влияние на развитие первичной опухоли и метастазов. Так, масса опухоли снизилась в 1,3 раза (Р<0,01), количество метастазов - в 2,0 раза (Р<0,01), многократно меньше оказалась площадь метастатического поражения легких (Р<0,01) по сравнению с контрольными значениями, индекс ингибирования метастазирования составил 50% (таблица 2).
Добавление в схему лечения циклофосфаном экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле дозе 50 мг/кг вызвало повышение противоопухолевого и антиметастатического эффекта химиотерапии. Так, торможение роста опухоли составило 37%, количество метастазов снизилось в 3,8 раза (Р<0,01), их площадь оказалась меньше значений у мышей в группе, получавших один цитостатик. Кроме того, если в группе монохимиотерапии у всех мышей отмечены метастазы в легочной ткани, то после введения цитостатика совместно с экстрактом надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле дозе 50 мг/кг частота метастазирования составила 64% (Р<0,01) (таблица 2).
Включение в схему химиотерапии экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле дозе 100 мг/кг приводило к повышению антиметастатического действия циклофосфана. Так, у мышей в этой группе наблюдалось достоверное снижение площади метастазов в легких (в 4,3 раза) относительно таковых показателей у животных, получавших один цитостатик (таблица 2).
Таким образом, в экспериментах на мышах-самках линии C57BL/6 с перевитой метастазирующей карциномой легких Льюис выявлена способность экстракта надземной части лабазника вязолистного на 70% этаноле повышать антиметастатическое действие циклофосфана.
Список использованной литературы
1. Патент 2455986 Российская Федерация, МПК А61К 31/282 (2006.01), А61К 31/475 (2006.01), А61Р 35/00 (2006.01) Способ комбинированного лечения немелкоклеточного рака легкого II и III стадии [Текст] / Полищук Т.В., Миллер С.В., Тузиков С.А., Гольдберг В.Е., Юмов Е.Л.; заявитель и патентообладатель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт онкологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (НИИ онкологии СО РАМН) (RU), - №2011105847/15, заявл. 16.02.2011; опубл. 20.07.2012.
2. Патент 2461375 Российская Федерация, МПК А61К 31/282 (2006.01), А61К 31/513 (2006.01), А61К 31/522 (2006.01), А61Р 35/00 (2006.01) Способ комбинированного лечения больных местно-распространенным раком желудка [Текст] / Афанасьев С.Г., Гольдберг В.Е., Августинович А.В., Перельмутер В.М., Завьялова М.В., Степанов И.В., Рудык Ю.В.; заявитель и патентообладатель: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт онкологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (НИИ онкологии СО РАМН) (RU), - №2011120212/15, заявл. 19.05.2011; опубл. 20.09.2012.
3. Филатова Л.В., Плотникова А.А., Гершанович М.Л., Семиглазова Т.Ю. Эффективность и токсичность программ МОРР, ABVD, ВЕАСОРР-базовый у первичных больных лимфомой ходжкина с неблагоприятным прогнозом // Вопросы онкологии. - 2013. - Т. 59. - №2. - С. 59-65.
4. Вершинина С.Ф., Гершанович М.Л., Махнова Е.В., Стуков А.Н., Тарасенко А.А., Чернолихов О.О. Токсическое действие противоопухолевой терапии на сердечно-сосудистую систему // Вопросы онкологии. - 2010. - Т. 56. - №2. - С. 234-239.
5. Пат. 2023446 Российская Федерация, МПК А61К 35/78. Антиметастатическое средство [Текст] / Яременко К.В., Дементьева Л.А., Саратиков А.С.; заявитель и патентообладатель: Научно-исследовательский институт фармакологии Томского научного центра РАМН (RU), - №4082815/14; заявл. 13.05.1993; опубл. 30.11.1994.
6. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - М.: Медицина, 1984. - т. 1, с. 140.
7. Шилова И.В., Самылина И.А., Суслов Н.И. Разработка ноотропных средств на основе растений Сибири. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2013. - С. 130-152.
8. Пат. 2311193 Российская Федерация, МПК А61К 36/73 (2006.01), А61Р 25/28 (2006.01). Средство, обладающее ноотропной и адаптогенной активностью [Текст] / Суслов Н.И., Шилова И.В., Провалова Н.В. и др.; заявитель и патентообладатель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет Федерельного агентства по здравоохранению и социальному развитию" (ГОУ ВПО СибГМУ) (RU), - №2006114551/15; заявл. 27.04.2006; опубл. 27.11.2007.
9. Пат. 2310467 Гепатопротекторное средство, обладающее антиоксидантной активностью, и способ его получения [Текст] / Краснов Е.А., Шилова И.В., Хоружая Т.Г., Новожеева Т.П., Жаворонок Т.В., Суслов Н.И., Авдеева Е.Ю.; заявитель и патентообладатель: Государственное Образовательное учреждение Высшего Профессионального Образования Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУВПО СибГМУ) (RU), Краснов Ефим Авраамович (RU), Шилова Инесса Владимировна (RU), - №2005126107/15; заявл. 17.08.2005; опубл. 20.11.2007.
10. Пат. 2535024 Фармацевтический состав, обладающий церебропротекторным и противоневротическим действием [Текст] / Шилова И.В., Хоружая Т.Г., Суслов Н.И.; заявитель и патентообладатель: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (RU), - №2013131943; заявл. 09.07.2013; опубл. 10.12.2014.
11. Шилова И.В., Семенов А.А., Суслов Н.И., Короткова Е.И., Вторушина А.Н., Белякова В.В. Химический состав и биологическая активность фракции экстракта лабазника вязолистного // Химико-фармацевтический журнал. - 2009. - Т. 43, №4. - С. 7-11.
12. Шилова И.В. Химический состав растений Сибири и разработка ноотропных средств на их основе: автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук. - Пятигорск, 2011 - С. 27-31.
13. Архипов С.А., Юнкер В.М. Изменение интенсивности метастазирования в легкие перевиваемых опухолей мышей в зависимости от величины перевивочной дозы опухолевых клеток // Исследование по индукции и метастазированию опухолей у экспериментальных животных. - Новосибирск, 1984. - С. 14-32.
14. Софьина З.П. и др. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. - М.: Медицина, 1980. - С. 131.
15. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. - Л.: Медицина, 1978. - С. 210-211.