Способ проведения фотодинамической терапии солидной карциномы Эрлиха мышей
METHOD FOR CARRYING OUT PHOTODYNAMIC THERAPY OF SOLID EHRLICH CARCINOMA IN MICE

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к фотодинамической терапии перевивной солидной карциномы Эрлиха мышей.
При проведении ФДТ вводится фотосенсибилизатор (ФС), избирательно накапливающийся в злокачественных новообразованиях. Затем опухоль подвергается дистанционному облучению лазерным светом определенной длины волны, в соответствии со спектром возбуждения ФС. В результате облучения происходит фотохимическая реакция, где ФС фактически играет роль катализатора, при участии которого происходит образование активных форм кислорода (основным из которых является синглетный кислород) и различных активных радикалов, которые являются цитотоксическими агентами и вызывают прямое разрушение клеток опухоли. Также к механизмам ФДТ относятся: деструкция эндотелия кровеносных сосудов в зоне лазерного облучения, в результате которой возникает тромбоз сосудов и нарушение гемодинамики опухолевого узла, воспалительная реакция и иммунный ответ.
Эффективность фотодинамического воздействия зависит от трех составляющих: ФС, света и кислорода. Избирательность разрушения опухоли связана с избирательностью накопления ФС в опухоли по отношению к здоровой ткани и с воздействием света определенной длины волны. Не пораженные опухолью ткани в меньшей степени поглощают ФС, но в результате лазерного облучения может иметь место нежелательная частичная деструкция здоровых тканей, если фотосенсибилизатор не обладает достаточной селективностью.
Известен способ ФДТ злокачественных опухолей (заявка на изобретение N 96115789/14, МПК A61N 5/06, публ. Бюл. 1998 г. N 30). Фотосенсибилизатор вводят непосредственно перед сеансами облучения терапевтическим лазерным светом (не менее чем перед двумя), при этом доза фотосенсибилизатора при первом введении составляет от 0,1 мг/кг до 0,5 мг/кг веса тела, при последующих введениях от 0,05 мг/кг до 0,25 мг/кг веса тела. В результате дробного введения суммарная доза ФС перед проведением лазерного облучения остается равной общепринятой терапевтической дозе. В этих условиях интенсивное лазерное воздействие, осуществляемое за короткий промежуток времени после введения ФС, приводит к полному терапевтическому эффекту.
Недостатком данного способа являются нежелательные последствия терапии: глубокий некроз опухоли и части окружающих нормальных тканей.
2
Известен способ ФДТ злокачественных опухолей (RU 2169015 C1), в котором ФДТ осуществляют путем введения ФС "Фотосенс" в дозе 0,3-0,8 мг/кг веса тела больного с последующим воздействием на зону опухолевого роста дистанционным лазерным излучением мощностью 100-500 мВт/см. В этих условиях интенсивное лазерное воздействие, осуществляемое за короткий промежуток времени после введения ФС, приводит к полному терапевтическому эффекту при воздействии на поверхностные опухоли и сопровождается глубоким некрозом опухоли и части окружающих нормальных тканей.
Однако фотосенсибилизатор второго поколения Фотосенс вызывает длительную (до 2х месяцев) фоточувствительность, обусловленную медленным выведением его из кожи. Повышенная кожная фоточувствительность требует соблюдения строгого светового режима от пациентов, что создает ряд неудобств.
2
2
Самым близким (прототипом) является способ ФДТ злокачественных новообразований (RU 2704202 С1). Вводят фотосенсибилизатор «Фоторан Е6» в дозах 5,0 мг/кг, что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,85 мг/кг веса тела больного. Через 2,5 часа после введения фотосенсибилизатора проводят облучение лазером с длиной волны 660-670 нм с плотностью мощности 0,25 Вт/см и плотностью энергии 300 Дж/см лазерного излучения, время облучения - 20 минут.
Однако, известный способ направлен на терапию соединительнотканной солидной опухоли - саркома М-1 и не рассчитан на применение для ФДТ других видов опухолей, в частности такой опухоли, как солидная карцинома Эрлиха мышей.
Техническим решением является разработка схемы лечения перевивной опухоли карцинома Эрлиха мышей методом фотодинамической терапии, приводящая к максимальному противоопухолевому эффекту со 100% излечением животных на 90 сутки после сеанса терапии.
2
Техническое решение достигается тем, что также как и в известном способе вводят фотосенсибилизатор в дозе 5 мг/кг с последующим облучением опухоли лазерным излучением Е = 150 Дж/смс длиной волны 662 нм.
2
Особенностью заявляемого способа является то, что внутривенно вводят фотосенсибилизатор Гелиохлорин, плотность мощности Ps=0,48 Вт/см, лекарственно-световой интервал составляет 45 минут.
Изобретение поясняется подробным описанием, таблицами и примерами выполнения.
Способ осуществляют следующим образом.
В эксперименте in vivo использовались белые аутбредные лабораторные мыши, в качестве экспериментальной модели опухоли использовали карциному Эрлиха. Эта опухоль имеет перевиваемость опухолевых клеток 100%. По гистологическому строению - это недифференцированная опухоль, утратившая эпителиальный характер. Работа выполнена с соблюдением международных рекомендаций по проведению исследований с использованием лабораторных животных, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1987), на половозрелых самках мышей массой тела 20-25 г с имплантированной подкожно с внешней стороны бедра карциномой Эрлиха. Асцитическую жидкость по 0,05 мл вводили подкожно в область бедра, для воспроизведения солидной опухоли. Штамм опухоли получен из банка опухолевых материалов РОНЦ им. Н.Н. Блохина. На 3 сутки после перевивки при достижении наибольшего диаметра опухолевых узлов 0,4-0,6 см животных методом рандомизации распределяли на опытные и контрольную группы.
Проведение ФДТ.
Экспериментальные исследования выполнялись на двух группах животных. Контролемслужили мыши-опухоленосители без какого-либо воздействия (Таблица 1)
Таблица 1.Схема эксперимента
Опухоль
Тест-система
Препарат
Доза ФСмг/кг
МетодВведения
Параметры облучения
Время облучения
ЕДж/см<sup>2</sup>
PsВт/см<sup>2</sup>
Карцинома Эрлиха
мыши
Гелиохлорин
2,5
Внутривенно
150
0,48
5 минут 30 секунд
Карцинома Эрлиха
мыши
Гелиохлорин
5
Внутривенно
150
0,48
5 минут 30 секунд
Контроль
мыши
-
2
0
t
Лазерное облучение проводили в период максимального индекса контрастности опухоль/здоровая ткань после введения ФС (оптимальный лекарственно-световой интервал - 45 минут). Для воздействия лазерным излучением на опухоли мышей использовали полупроводниковый аппарат «Аткус-2» (ЗАО «Полупроводниковые приборы», Санкт-Петербург). Длина волны излучения 662 нм, плотность энергии лазерного излучения (Е) - 150 Дж/см, диаметр светового пятна - 1 см. Объемы опухолевых узлов определяли в день экспериментального воздействия (V), на 3, 7, 10, 14 и 21 сутки (V) после ФДТ.
0
Объем опухоли измеряли: до проведения лечения (V), и на 3, 7, 10, 14, и 21 сутки после терапии. Конечный срок исследования был выбран исходя из необходимости сравнения динамики роста опухоли у крыс с продолженным ростом после терапии с контрольными животными, так как на данный срок исследования уже начинается гибель контрольных животных.
В качестве критериев определения противоопухолевой эффективности использовали:
1. Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К). Для этого сначала вычисляли объемы опухолей по формуле:
1,
2
3,
где: dd,d- три взаимно перпендикулярные диаметры опухоли,
3
V - объем опухоли в см.
Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) рассчитываем по формуле:
0
где: V -объем опухоли до воздействия,
t
V - объем опухоли на определенный срок наблюдения;
2. Торможение роста опухоли (ТРО%) по формуле:
3. Процент животных в группе с полной регрессией (ПР) опухоли (К = -1,00). За полную регрессию опухоли принимали отсутствие видимой и пальпируемой опухоли.
4. Средняя продолжительность жизни животных (СПЖ, сут) животных и увеличение продолжительности жизни (УПЖ%) по сравнению с контролем. Значимым считается УПЖ ≥ 50%.
5. Критерий излеченности животных - отсутствие рецидивирования опухоли в течение 90 суток после ФДТ
Статистическую обработку результатов для независимых групп выполняли с использованием программ Statistica 6.0. Описательная статистика представлена в виде среднего арифметического и стандартной ошибки среднего (M±m). Для оценки уровня значимости межгрупповых различий использовали U-критерий Манна-Уитни при p<0,05.
Изучение эффективности ФДТ с Гелиохлорином.
На 3 сутки после ФДТ на облученной коже над опухолями появлялись эрозии, покрытые тонкими струпами. На 7-10 сутки формировались плотные струпы с демаркационной линией между окружающей кожей и некротизированной тканью новообразований.
В экспериментальных группах у животных до 21 суток после сеанса ФДТ отмечалась полная регрессия опухоли. В контрольных группах наблюдался прогрессирующий рост опухолей (табл. 1)
В I группе с дозой ФС 2,5 мг/кг на 58 сутки после ФДТ отмечалось возобновление роста карциномы Эрлиха, в основном, по периферии зон лазерного воздействия. При дозе ФС 5,0 мг/кг на 96 сутки не было отмечено рецидивов новообразований.
Увеличение дозы Фоторана до 5,0 мг/кг привело к полной регрессии карциномы Эрлиха при отсутствии видимой и пальпируемой опухоли у 100% животных на протяжении всего периода наблюдений (табл. 2).
Результаты количественного анализа исследованных показателей эффективности действия ФДТ с Гелиохлорином на карциному Эрлиха даны в таблице 2.
Таблица 2Показатели противоопухолевой эффективности ФДТ с внутривенным введением препарата Гелиохлорин в разных дозах при параметрах воздействия лазерным излучением Е = 150 Дж/см<sup>2</sup>; Ps = 0,48 Вт/см<sup>2</sup> на карциному Эрлиха мышей
№гр.
ДозаФС(мг/кг)
Срок наблюдений (сут)
7
14
21
90
1
2,5
(1) 100
(2) 66,6
2
5,0
(1) 100
(2) 100
Контроль
V
0,09 ± 0,02
0,94 ± 0,16
4,05 ± 2,43
K
10,7 ± 3,2
49,2 ± 30,7
<i>Примечание:</i>(1) процент животных с полной регрессией опухоли (ПР);(2) процент излеченных животных;* р < 0,05 по сравнению с контролем.
Показатели увеличения продолжительности жизни и излеченности животных на 90 сутки после ФДТ представлены в таблице 3.
Таблица 3Увеличение продолжительности жизни мышей после ФДТ с внутривенным введением Гелиохлорина
Параметры лазерного излучения: Е = 150 Дж/см<sup>2</sup>, Ps = 0,48 Вт/см<sup>2</sup>
Доза ФС (мг/кг)
СПЖ
УПЖ
2,5
>86 ±4,0 *
>45
5
>90*
>100*
Контроль
59,3 ± 3,0
-
<i>Примечание:</i> СПЖ - средняя продолжительность жизни, сутки; УПЖ - увеличение продолжительности жизни, %; * значимое увеличение продолжительности жизни по сравнению с контролем (УПЖ ≥ 50%).
2
2
По данным сравнительного анализа, после ФДТ, проведенной в оптимальные сроки после введения ФС и подбора параметров проведения терапии получено значимое увеличение продолжительности жизни мышей при дозе ФС 5,0 мг/кг, параметрах лазерного облучения Е-150 Дж/см, Ps-0,48 Вт/см и достигнута 100% излеченность на 90 сутки.
Предложенный способ позволяет определить параметры проведения фотодинамической терапии при лечении перевивной карциномы Эрлиха мышей и увеличить продолжительность жизни животных.