ВИРУСНАЯ ВАКЦИНА И СПОСОБЫ ЕЕ ПРОИЗВОДСТВА
VIRUS VACCINE AND METHODS FOR PRODUCTION THEREOF

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области вирусных вакцинных композиций. В частности, настоящее изобретение относится к вакцинной композиции против японского энцефалита и к процессам или способам производства вакцинной композиции против инфекций японского энцефалита. Настоящее изобретение относится к процессам получения и очистки вирусной массы и способам инактивации указанной вирусной массы вируса японского энцефалита.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Вирусяпонского энцефалита (JEV) представляет собой переносимую комарами инфекцию, является ведущей причиной вирусного энцефалита по всей Азии, и он распространяется за пределы его континентальных границ. JEV относят к семейству флавивирусов и роду флавивирусов. Он представляет собой небольшой оболочечный вирус (50 нм), содержащий отрицательный смысловой РНК-геном в виде единой цепи размером 10,9 т.п.о. РНК вириона кодирует 11 белков, включая четыре структурных и семь неструктурных белков. Среди 4 структурных белков поверхностный белок оболочки (E-белок) служит в качестве белка, связывающего клеточные рецепторы, и белка слияния для прикрепления вируса и проникновения в организм хозяина. Таким образом, антитела против E-белка нейтрализуют вирус и играют важную роль в защите от него. Поверхностный структурный E-белок является важным компонентом вакцины, так что является очень важной стабилизация этой белковой молекулы подходящим стабилизатором для эффективности вакцины.
o
o
Вследствие широкой площади распределения вакцин и разнообразия температуры окружающей среды, существует необходимость в улучшении биопроцесса производства вирусной массы вируса японского энцефалита для производства микроорганизма для получения и дальнейшего применения вакцин. Биопроцесс в случае японского энцефалита вовлекает либо выращивание во вращающихся флаконах, либо клеточные фабрики. Продуцирование промышленных количеств вакцины против японского энцефалита посредством культивирования клеток во вращающихся флаконах или с использованием клеточных фабрик требует более длительных периодов времени со сравнительно меньшими выходами, а также занятия большого количества пространства, что затрудняет контроль и регуляцию экспериментальных параметров на регулярной и постоянной основе в каждой клеточной фабрике. Продуцирование вирусной массы, таким образом, по своей природе лишено единообразия процесса. Настоящее изобретение позволяет преодолеть эти трудности посредством новой технологии биопроцесса, где время, требуемое для получения высоких количеств промышленной вирусной массы вируса японского энцефалита снижено в значительной степени. Коммерческое продуцирование вакцинной массы обеспечивается в течение значительно меньшего периода времени по сравнению с предшествующими способами культивирования. Сначала выращивают клетки Vero в одноразовом биореакторе с последующим инфицированием посредством JEV, где осуществляют многократные сборы вируса в качестве нового признака настоящего изобретения. После продуцирования вируса следуют способы одновременной инактивации и стабилизации, в частности, применимые для вакцинного антигена японского энцефалита. Стабилизация вакцины против японского энцефалита, как правило, требует поддержания вакцинных флаконов или массы при заданных диапазонах температур 2°-8°C для стабилизации в течение более длительных периодов времени. Это требует дополнительного инфраструктурного помещения для транспортировки и хранения вакцины, что, тем самым, повышает стоимость вакцин. Для преодоления некоторых из самых практических ограничений для вируса японского энцефалита требуются альтернативные способы стабилизации. Вакцина, полученная таким образом из вирусной массы в соответствии со способами, описанными в рамках настоящего изобретения, не требует какого-либо специального холодильного оборудования, упомянутого выше, и является стабильной в условиях температуры окружающей среды, т.е. при комнатной температуре (25°C). Стабильность, достигнутая в рамках настоящего изобретения, сравнима со стабильностью, наблюдаемой для вакцин против японского энцефалита, хранящихся при температурах охлаждения (2-8C). Эффективность и иммуногенность вирусной массы и вакцины для обеспечения достаточной иммунизации индивидуумов также сохраняются.
ЗАДАЧИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одной из задач настоящего изобретения является получение стабильной инактивированной вакцинной композиции, которая способна обеспечивать профилактику, а также лечение инфекций японским энцефалитом, вызываемых индийским штаммом Kolar вируса японского энцефалита.
Другой задачей изобретения является разработка способа адаптации штамма Kolar вируса японского энцефалита в клетках Vero.
Другой задачей изобретения является разработка подходящего способа коммерческого продуцирования очищенной инктивированной вирусной массы вируса японского энцефалита при заданных экспериментальных параметрах, и способов, которые обеспечивают многократный сбор вирусной массы вируса японского энцефалита со значительно более высокими выходами с использованием одноразового биореактора.
Одной или несколькими задачами изобретения являются разработка новых способов очистки с использованием колонки со специализированным матриксом при последующем процессинге вирусной массы вируса японского энцефалита в коммерческом масштабе.
Другой задачей изобретения является разработка способа одновременной инактивации и стабилизации очищенной вирусной массы вируса японского энцефалита.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно одному варианту осуществления изобретения описаны различные способы культивирования клеток Vero в одноразовом биореакторе. Удовлетворительные уровни роста клеток Vero при различных экспериментальных параметрах, вовлекающих надлежащую композицию среды и потребность в замене среды, оптимизируют для получения удовлетворительных количеств клеток в течение желаемого количества времени. Клетки Vero инфицируют живым вирусом японского энцефалита индийского штамма Kolar, и, таким образом, в этом варианте осуществления описан способ адаптации вируса японского энцефалита к росту в клетках Vero в одноразовом биореакторе.
Согласно другому варианту осуществления изобретения, адаптацию штамма Kolar вируса японского энцефалита в клетках Vero масштабируют от одноразового биореактора до следующих размеров одноразовых биореакторов для обеспечения выхода продукции очищенной массы JEV, имеющей размер партии. Одноразовые биореакторы обозначают следующим образом: от DB-1 до DB-100 до DB-500, в зависимости от клеточной емкости.
В следующем варианте осуществления описаны альтернативные способы последующей очистки живой массы JEV с использованием различных новых хроматографических способов, которые обеспечивают получение высоких количеств очищенной массы JEV.
В одном дополнительном варианте осуществления изобретения описаны новые способы одновременной инактивации и стабилизации очищенной массы JEV.
Также изобретение относится к экспериментальным данным о стабильности очищенной инактивированной массы JEV при 25°C-37°C, являющейся готовой для вакцинного состава.
В следующем варианте осуществления изобретения предусматривается вакцинная композиция против японского энцефалита, содержащая вакцинный антиген, где антиген представляет собой штамм Kolar вируса японского энцефалита.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения:
Первоначальный посев клеток: первоначальное количество клеток, требуемое для посева во флакон для культивирования.
DMEM: Модифицированная способом Дульбекко среда Игла
EMEM: Минимальная поддерживающая среда Игла
NBCS: Сыворотка новорожденного теленка
В рамках настоящего изобретения описан новый индийский штамм вируса японского энцефалита JEV821564-XY, который представляет собой штамм Kolar вируса японского энцефалита. Этот штамм Kolar JEV821564 вируса японского энцефалита (далее называемый "штаммом Kolar") был транспортирован в Bharat Biotech International Limited согласно Material Transfer Agreement от National Institute of Virology, Pune. В настоящее время отсутствует вакцинная композиция против индийского штамма (Kolar) вируса японского энцефалита. Более того, этот конкретный штамм вируса японского энцефалита выращивают способом, в котором штамм адаптируют в клетках Vero для его культивирования. Вирусную культуру обычно выращивают в жидких средах. Клеточная культура в клетках Vero для любого биологического продукта включает очень высокое количество вращающихся флаконов или клеточных фабрик. Культивирование вируса в клеточных фабриках занимает много времени. Клеточные фабрики занимают большие пространства, и также является трудным индивидуальный мониторинг всех экспериментальных параметров в процессе культивирования вируса в клеточных фабриках. Продуцирование вируса японского энцефалита с использованием общепринятых клеточных фабрик является минимальным.
Таким образом, настоящее изобретение относится к новому способу производства этого штамма Kolar вируса японского энцефалита в одноразовом биореакторе. Вирус японского энцефалита адаптирован для выращивания в клетках Vero, и этот конкретный штамм вируса адаптирован для размножения в клетках Vero, предоставляемых с конкретными средами. Одни и те же клетки Vero способны обеспечивать многократный сбор вирусной массы в рамках однократной инфекции. Этот конкретный способ многократного сбора вируса японского энцефалита (JEV), описанный в рамках настоящего изобретения, является уникальным и индивидуальным, хотя увеличение в количестве вируса JE в клетках Vero уже известно. Более того, достижение желаемого уровня клеточного роста (клеток Vero) в новом устройстве (отличном от вращающихся флаконов и клеточных фабрик), таком как устройство, используемое в рамках настоящего изобретения, которое представляет собой одноразовый биореактор, и масштабирование от одноразовых биореакторов меньшей емкости к размерам одноразовых биореакторов для партий с более высокой емкостью, не были предоставлены ранее. Обычно используемым способом увеличения в количестве вируса японского энцефалита в клетках Vero, как правило, является выращивание в клеточных фабриках или вращающихся флаконах, в которых клетки Vero используют для формирования слоя только один раз. Клеточную линию Vero используют посредством инфицирования вирусом японского энцефалита и клеточная линия истощается после только одного инфицирования инокулятом вируса. Однако в рамках настоящего изобретения клетки Vero выращивают с использованием такого уникального и нового способа и экспериментальные параметры устанавливают таким образом, что однократное инфицирование инокулятом вируса японского энцефалита способно продуцировать по меньшей мере от трех до пяти раз урожай вирусной массы из одной и той же культуры линии клеток Vero с использованием одноразового биореактора. В то же время это снижает количество инфицирований, а также количество пространства и, более того, количества клеточных фабрик, требуемых для инфицирования и выращивания того же количества вирусной клеточной культуры. Кроме того, многократны сборы с клеточной культуры также автоматически увеличивают уровень выхода, как с точки зрения количества, так и с точки зрения качества сбора вируса до очень высоких количеств по сравнению с процессами, вовлеченными в обеспечение и достижение сходных выходов с клеточными фабриками.
Более того, настоящее изобретение направлено на стабилизацию очищенной массы JEV как в процессе инактивации, так и в процессе хранения вирусной массы. Содержание каждого стабилизатора находится в диапазоне от 0,5 до 1% масс./об. Химические стабилизаторы, которые добавляют к вирусному антигену, представляют собой D-сорбит и глицин. Вирусный антиген с подходящим стабилизатором хранят в достаточном физиологически приемлемом фосфатно-солевом буфере для поддержания pH от 7,0 до приблизительно 7,4.
Пример 1: Клеточная культура и адаптация штамма Kolar вируса JE к клеткам Vero
Первоначальный посев клеток Vero проводят во флаконе T-175, содержащем клетки Vero. Культивирование клеток Vero проводят во флаконах T-175 и выращивают в подходящей среде. Выращенные клетки, полученные из 1 флакона T-175, переносят в 5 флаконов T-175 через 4-5 суток. Далее их переносят в 1 клеточную фабрику 10 (CF10) вновь через 4-5 суток, а затем вновь переносят в 5 клеточных фабрик 40 (CF-40). CF-40 используют в настоящее время для коммерческой продукции массы JEV. Одну партию массы JEV, вовлекающую по меньшей мере 30 CF-40, продуцируют в течение одного месяца для продуцирования одной коммерческой партии массы JEV. Настоящее изобретение относится к конкретному способу увеличения в количестве указанного штамма Kolar JE в клетках Vero, пригодному для коммерческого масштабирования массового производства, и оно способно продуцировать массу JEV вплоть до приблизительно 140 CF-40 за один период времени, т.е. приблизительно за один месяц. Это приводит к более высоким выходам вируса, поскольку общее количество экстрагированной вирусной массы является очень высоким по сравнению с 30 CF40. Такой высокий выход массы JEV в течение одного и того же периода времени является большим преимуществом для коммерческого увеличения производительности. Более того, практически невозможно осуществлять мониторинг и контролировать приблизительно 200 CF40 за один раз в течение некоторого периода времени, т.е. в течение приблизительно одного месяца. В соответствии с современной практикой, для обслуживания размера партии 30 CF-40, минимальным требованием для помещения для культивирования является инкубатор комнатного типа, в котором может помещаться по меньшей мере 3-4 человека для эксплуатации и проведения экспериментов. В инкубаторе комнатного типа должна поддерживаться постоянная заданная температура 37°C на протяжении культивирования партии. Таким образом, можно констатировать, что потребность в наличии работы инкубатора комнатного типа постоянно в течение периода 5-6 месяцев, который может обеспечить выход 200 клеточных фабрик 40 (200 CF40), определенно увеличит стоимость производства. Альтернативно эксплуатация вплоть до приблизительно 150 CF-40 за раз в течение одного месяца потребует огромного и сверхбольшого размера инкубатора комнатного типа, поддерживаемого постоянно при 37°C, для обеспечения достаточного пространства, чтобы по меньшей мере 20 человек осуществляли эксплуатацию и контролировали экспериментальные параметры. Построение такого помещения вовсе не является экономичным. Такой огромный инкубатор комнатного типа будет вовлекать дополнительные и очень большие инвестиции, что сделает вакцину непозволительной для тех, кто в наибольшей степени нуждаются в вакцине против JE. Все экспериментальные параметры будут варьироваться и конечных результатов эксперимента нельзя будет достигнуть в одно и то же время для выделения массы вируса японского энцефалита, т.е. для продуцирования вакцины. Культивирование клеток в 150-200 CF40 будет отнимать более чем приблизительно 6 месяцев для эквивалентного уровня продуцирования массы JEV. Важные экспериментальные параметры, такие как температура, pH, растворенный кислород, перемешивание и подача среды, невозможно контролировать одновременно для 150-200 CF40 в течение одного месяца. Более того, контроль всех из указанных экспериментальных параметров 30 CF40 в одной партии массы JEV также является очень сложным и требует высокоразвитых навыков и человеческих ресурсов и труда для обеспечения успешной продукции требуемого количества массы JEV. В отличие от ситуации с CF40, в рамках настоящего изобретения описан новый способ производства массы JEV в одноразовом биореакторе, но не в клеточных фабриках (CF40), где все технические характеристики одноразового биореактора можно контролировать с требуемой аккуратностью и точностью, которые требуются для клеточной культуры и вирусной культуры, которые не могут быть достигнуты в случае клеточных фабрик. Настоящее изобретение заменяет применение CF40 при продуцировании массы JEV таким подходящим одноразовым биореактором. Данный одноразовый биореактор обеспечивает необходимые каналы, зонды и сенсоры, посредством которых можно регулировать процесс культивирования клеток и культивирования вируса автоматически. Таким образом, контроль различных экспериментальных параметров, таких как температура, pH, растворенный кислород, встряхивание и подача среды, легко проводить в данном одноразовом биореакторе с требуемой аккуратностью и точностью. Кроме того, адаптация штамма Kolar вируса JE в клетках Vero в биореакторе способна продуцировать массу JEV до количества по меньшей мере от 40 CF40 до 200 CF40 при продуцировании одной партии за то же время, которое требуется для 30 CF40 в одной партии. Достигнутые выходы, как правило, являются более высокими как в случае эквивалентной соответствующей производительности, так и выхода 30 CF40, и очевидно они являются очень высокими в случае соответствующей производительности, и имеют продукцию, которая была бы достигнута посредством вплоть до 200 CF40 в течение 5-6 месяце. Также в случае применения биореакторов вместо CF40 уровень потерь значительно минимизирован на существенную величину. Является очевидным, что в случае продуцирования, вовлекающего приблизительно 200 клеточных фабрик, в течение периода 5-6 месяцев должна существовать и является присущей потеря продукции партии. Эта возможность полностью устраняется с использованием биореактора для продуцирования массы JEV согласно способам, описанным в рамках настоящего изобретения. В представленных ниже экспериментах, показано, что настоящее изобретение, состоящее в адаптации конкретного штамма Kolar вируса JE в клетках Vero, выращиваемых в биореакторе, увеличивает выход продукции вируса при сравнении уровня продукции как с 30 CF40, так и/или с 200 CF40. В дополнение к упомянутым выше преимуществам продукции массы JE в одноразовом биореакторе, одним дополнительным преимуществом является тот факт, что риск контаминации минимизирован в значительной степени в случае одноразовых биореакторов, как описано в рамках настоящего изобретения. Поскольку все экспериментальные параметры контролируются посредством электронных инструкций, при массовой продукции JE в одноразовом биореакторе эксплуатация вручную является минимальной. Таким образом, в отличие от случаев продукции партии в клеточных фабриках, где существует более высокая вероятность и возможность контаминации партии, указанное не применимо для массовой продукции JE в одноразовых биореакторах различных размеров, обозначаемых как DB, DB-100 и DB-500, как описано ниже в следующих абзацах. Одним следующим преимуществом одноразового биореактора является то, что он может продуцировать клетки непрерывно, тем самым, обеспечивая непрерывный выход, в то время как в случае клеточных фабрик невозможно поддерживать непрерывный выход в сходной степени с выходом одноразовых биореакторов вследствие ручного управления для регуляции экспериментальных параметров.
2
6
2
2
6
6
Как правило, общая доступная площадь поверхности для роста клеток в 30 CF40 составляет 763200 см, что может соответствовать емкости ~75000-90000 x10 клеток, в то время как одноразовый биореактор, используемый в рамках настоящего изобретения, имеют общую площадь поверхности, доступную для роста клеток, в диапазоне от 26000 см до 5000000 см, которая поддерживает рост требуемого количества клеток и дальнейшую доступность клеток Vero в качестве субстрата для вируса, так что он может инфицировать все большее количество клеток Vero, чтобы оно достигло требуемых количеств для увеличенной массовой продукции JE в биореакторе. Общая клеточная емкость находится в диапазоне приблизительно от 7800×10 до 1500000×10 клеток. Увеличение количества доступных клеток означает увеличение доступного субстрата для вируса, чтобы он инфицировал все большее количество клеток, и, таким образом, может быть достигнут более высокий уровень массовой продукции JE.
<b>Таблица 1.1</b>
<b>Сравнение клеточных фабрик и одноразового биореактора(ов)</b>
МОДЕЛЬ КУЛЬТУРЫ
Доступная площадь для роста клеток Vero
Устройство
Количество времени, требуемое для выращивания одной партии
Общая величина клеточной емкости для выращивания=коли-чество клеток, доступных для инфицирования вирусом JE клеток Vero
Флакон T175
175 см<sup>2</sup>
----
----
(20-30×10<sup>6</sup>)
1 CF10=36 флаконов T-175
36×175=6300 см<sup>2</sup>
----
----
(600-900×10<sup>6</sup>)
1 CF40=4 CF10
4×6300=25200 см<sup>2</sup>
Одноразо-вый биореактор (DB)
1 CF40: (2500-3000×10<sup>6</sup>)DB:(7800×10<sup>6</sup>)
30 CF40
30×25200=756000 см<sup>2</sup>
Инкубатор комнатного типа, содержащий клеточные фабрики для одной коммерчес-кой партии
40 суток
30 CF40:(75000-90000×10<sup>6</sup>)
40 CF40
40×25200=1008000 см<sup>2</sup>
Одноразо-вый биореактор-100(DB-100)
Приблизительно 45 суток в клеточных фабриках.Приблизительно 38 суток в DB-100.
40 CF40:(100000-120000×10<sup>6</sup>)DB100:(300000×10<sup>6</sup>)
200 CF40
200×25200 5040000 см<sup>2</sup>
Одноразо-вый биореактор-500(DB-500)
Приблизительно 280 суток в клеточных фабриках.Приблизительно 38 суток в DB-500
200 CF40:(500000-600000×10<sup>6</sup>)DB500:(1500000×10<sup>6</sup>)
2
Клеточная культура представляет собой широко используемый способ в биотехнологических процессах. Однако, хотя данная клетка способна расти более чем в одной данной среде, ее характеристики могут изменяться, когда среду заменяют. Также важно отметить, что в отношении клеточной линии также варьируются время и длительность клеточного роста. Рост клеток зависит от нескольких важных факторов, таких как среда, факторы роста, концентрация глюкозы, доступность кислорода, и величина первоначального инокулята и множественность инфекции (MOI). Более того, рост клеток также подвержен нерегулярным изменениям pH, что требует постоянного мониторинга в различные фазы культивирования клеток. Таким образом, уже установлено, что выращивание клеток является специфическим в отношении назначения, и окружающих условий, и физико-химических факторов. Выращивание клеточной линии Vero в упомянутом выше биореакторе вместо клеточных фабрик в отличие от предшествующей практики является отдельной проблемой, которая была решена в рамках настоящего изобретения. Кроме того, выращивание клеточной линии Vero в биореакторе может требовать частых замен среды с конкретными и подходящими временными интервалами для оптимального роста клеток. Замена среды также требует конкретных вычисленных экономических мер для поддержания максимального роста клеток. Контроль колебаний температуры в биореакторе также является важным вопросом для поддержания хорошего роста клеток. В то же время, очень высокий уровень роста клеток может приводить к низкому выходу, в то время как в случае очень низкого клеточного роста ниже желаемых уровней также результатом является неуспех экспериментов. Таким образом, является желательным усиление и настройка всех из упомянутых выше параметров в новой окружающей среде (т.е. одноразовый биореактор) чтобы достигнуть требуемого количества здоровых клеток Vero, которые будут обеспечивать наилучшие выходы массы JE. Таким образом, был проведен ряд экспериментов для выращивания клеток Vero в клеточной культуре на основе микроносителя в данном подходящем одноразовом биореакторе, и рост клеток в соответствующей среде наблюдали и вносили в таблицу в соответствии с соответствующим количеством суток. Отмечали эксперименты, в которых было успешно достигнуто более 100000 клеток/см и соответствующие сутки от первоначального посева. Результаты далее использовали для инфицирования вирусом японского энцефалита в соответствующих экспериментах с множественностью инфекции (MOI) 0,005.
2
2
6
6
2
6
6
Адаптация конкретного штамма вируса к конкретному клеточному субстрату также является проблемой. Хотя адаптация вируса JE на клетках Vero известна, тем не менее, она всегда является специфической для штамма. Каждый индивидуальный штамм вируса вовлекает конкретные условия для роста и инфицирования клеток Vero заданным образом, что обеспечивает высокий рост и быстрое увеличение вируса в количестве. Изобретение, описанное в настоящей заявке, относится к адаптации штамма Kolar вируса японского энцефалита к клеткам Vero. Охарактеризация лабораторно адаптированного штамма вируса JE может проявлять характеристики, отличающиеся от характеристик ранее выделенных штаммов с точки зрения быстрого роста клеток Vero, титра вируса и их конечной эффективности. Характеристики вируса и генетическая стабильность могут определить выход и необходимые процессы, требуемые для коммерческой продукции массы JE. Трудности, ассоциированные с различием штаммов вируса, не могут быть прямо скоррелированы с более ранними адаптированными процессами. Таким образом, в рамках настоящего изобретения описана адаптация нового штамма вируса японского энцефалита, который представляет собой штамм Kolar вируса JE, выделенный и эндемичный для индийского субконтинента, к клеткам Vero в специализированном одноразовом биореакторе, как упоминается в описанных выше примерах, который способен к высокому выходу массы JE с высокой эффективностью, достаточной для индукции защитного иммунного ответа у данных индивидуумов против инфекций вирусом японского энцефалита. В примерах, представленных в рамках настоящего изобретения, описан уникальный способ адаптации нового штамма Kolar вируса японского энцефалита к клеткам Vero, и его многократный сбор из первоначальной клеточной линии. Эксперименты, подробно описывающие многократный сбор вирусов, описаны в упомянутых ниже экспериментах и внесены в таблицы следующим образом (таблица 1.2) для одноразового биореактора (DB) и дальнейшего масштабирования в DB-100 (эксперименты I-II) и DB-500. Хотя культивирование клеток проводят в клеточных фабриках, клеточную культуру постепенно, последовательно и хронологически масштабируют от флаконов T-175 до клеточных фабрик в данном порядке: от 1 T-175 до 5 T-175 до 1 CF10 до 5 CF10 до 5CF40 до 30CF40. Перенос живых клеточных линий Vero из одной платформы в следующую платформу требует трипсинизации. Трипсинизация представляет собой процесс, посредством которого прикрепленные клетки вынуждают открепиться от монослоя, чтобы их можно было использовать на следующем уровне, что называется клеточной экспансией. Такая трипсинизация представляет собой ключевой процесс, и она требует навыков для ее проведения, а также трипсинизация на каждой конкретной промежуточной стадии является времязатратной. Первоначальные эксперименты, проведенные с первоначальным посевом клеток, состоящим из 26000 клеток/см, в одноразовом биореакторе первоначального объема, обозначаемом как DB, показали, что, несмотря на использование DB100 или DB500, трипсинизация все еще требуется несколько раз перед первоначальным посевом клеток в одноразовый биореактор. Таким образом, необходимо минимизировать посев клеток в одноразовый биореактор, поскольку он прямо пропорционален крупномасштабному посеву в биореактор. Например, для оптимизации посева, составляющего 26000 клеток/см для одноразового биореактора (DB) первоначального размера, тогда посев в DB-100 будет требовать 10 CF-40 выращенных клеток (26000×10 клеток), где для DB-500 потребуется 50 CF-40 клеток (130000×10 клеток). Является в высокой степени трудным манипулирование этими многими CF для трипсинизации для сбора клеток из них. С модифицированным или минимизированным посевом 3000 клеток/см DB-100 требует 1 CF-40 выращенных клеток (3000×10 клеток), где DB-500 будет требовать 6 CF-40 клеток (15000×10 клеток).
2
2
Проводили эксперименты с одноразовым биореактором с первоначальным посевом клеток, составляющим 3000 клеток/см с EMEM, глюкозой 1 г/л. Для многократного роста клеток среду заменяли и поддерживали при приблизительной концентрации глюкозы приблизительно 1 г/л. Количество клеток умножалось постепенно, однако скорость роста была более медленной и отнимающей время, замедляя инфицирование вирусом, что далее приводило к низкому сбору вируса после первого и второго сборов. Таким образом, последующие эксперименты проводили для достижения задачи, состоящей в минимизации первоначального посева клеток до приблизительно 3000 клеток/см в одноразовом биореакторе, так чтобы достигался значительный рост клеток Vero, вместе с соответствующим предоставлением среды, такой как DMEM, и высоких концентраций глюкозы (4,5 г/л). Достигали более высокой скорости роста по сравнению с предшествующими экспериментами с оптимизированными средами, также не требующими замены среды.
(Эксперименты III-IV) представлены в таблице ниже:
<b>Таблица 1.2</b>
<b>Масштабирование от одноразового биореактора (DB) до DB-100 и DB-500 и величины многократного сбора вируса. Все данные сбора вируса представлены в бляшкообразующих единицах.</b>
Эксперимент I в DB-100
Эксперимент II в DB-100
Эксперимент III в DB-500
Эксперимент IV в DB-500
Посев клеток
3000 клеток/см<sup>2</sup>
3000 клеток/см<sup>2</sup>
3000 клеток/см<sup>2</sup>
3000 клеток/см<sup>2</sup>
VH1
10<sup>6,88</sup>
10<sup>6,75</sup>
10<sup>7,22</sup>
10<sup>7,41</sup>
VH2
10<sup>7,02</sup>
10<sup>7,16</sup>
10<sup>6,92</sup>
10<sup>7,11</sup>
VH3
10<sup>6,49</sup>
10<sup>6-53</sup>
10<sup>6,41</sup>
10<sup>6,47</sup>
VH4
10<sup>5,84</sup>
10<sup>6,01</sup>
10<sup>5,84</sup>
10<sup>5,78</sup>
Использован-ная среда
EMEM, 1,5 г/л глюкозы
DMEM, 4,5 г/л глюкозы
EMEM, 1,5 г/л глюкозы
DMEM, 4,5 г/л глюкозы
Инфицирова-ние вирусом JE на
5 сутки
5 сутки
7 сутки
7 сутки
MOI
0,005
0,005
0,005
0,005
Количество клеток/см<sup>2</sup>
Замены сред
Без замены среды, поддержание глюкозы на уровне приблизитель-но 1 г/л
Без замены среды, поддержание глюкозы на уровне приблизитель-но 1 г/л
Без замены среды, поддержание глюкозы на уровне приблизитель-но 4,5 г/л
Без замены среды, поддержание глюкозы на уровне приблизитель-но 4,5 г/л
<b>Таблица 1.3</b>
<b>Рабочие параметры одноразового биореактора для экспериментов, проведенных согласно упомянутой выше таблице 1.2</b>
S. No
Описание
Диапазон
1
Растворенный кислород в м.д.
50-70
2
pH
7,2-7,6
3
Температура в °C
35,5-37,5
4
Встряхивание в об./мин.
260-280
5
Скорость входящего потока в мл/мин
80-150
6
Скорость выходящего потока в мл/мин
84-156
Задачи и результаты каждого эксперимента
Эксперимент I - Задача: Масштабирование от одноразового биореактора до одноразового биореактора 100 (DB-100) коммерческого размера партии.
2
2
Этот эксперимент проводили с одноразовым биореактором 100 (DB100) с первоначальным посевом клеток 3000 клеток/см с EMEM, глюкозой 1,5 г/л. Для выращивания клеток среду не заменяли и концентрацию глюкозы поддерживали на уровне приблизительно 1,0 г/л. Среда также содержала 5% NBCS (moregate). Происходило постепенное умножение количества клеток. На 5 сутки оно достигало максимума 100000 клеток/см. Штамм Kolar вируса JE получали для инфицирования клеток Vero на 5 сутки с MOI (множественность инфекции) 0,005. Сбор вируса 1 (VH1) проводили с использованием бессывороточной среды на 4 сутки после инфицирования и VH2, VH3 и VH4 собирали с интервалами 3 суток, соответственно, начиная с дня инфицирования. Собранные вирусы очищали микрофильтрацией или с использованием глубинных фильтров. Очищенные собранные вирусы концентрировали с использованием 300-кДа кассеты для проточной фильтрации вдоль потока и концентрированный собранный вирус далее подвергали очистке на колонке.
6,88
7,02
6,49
5,84
Результаты: Индивидуальные величины тира собранного вируса упомянуты в представленной выше таблице. Достигнут желаемый рост титра вируса. Замена среды не требуется. VH1 продемонстрировал величину титра 10 б.о.е. и VH2 продемонстрировал величину титра 10б.о.е. Титры вируса VH3 и VH4 продемонстрировали 10 б.о.е. и 10 б.о.е., соответственно.
Эксперимент II - Задача:
Масштабирование от одноразового биореактора до одноразового биореактора 100 коммерческого размера партии
2
2
Этот эксперимент проводили с одноразовым биореактором 100 (DB100) с первоначальным посевом клеток 3000 клеток/см с DMEM, глюкозой 4,5 г/л. Для выращивания клеток среду не заменяли и концентрацию глюкозы поддерживали на уровне приблизительно 1,0 г/л. Среда также содержала 5% NBCS (moregate). Происходило постепенное умножение количества клеток. На 5 сутки оно достигало максимума 100000 клеток/см. Клетки инфицировали на 5 сутки с MOI 0,005. Сбор вируса 1 (VH1) проводили с использованием бессывороточной среды на 4 сутки после инфицирования и VH2, VH3 и VH4 собирали с интервалами 3 суток, соответственно, начиная с дня инфицирования. Собранные вирусы очищали микрофильтрацией или с использованием глубинных фильтров. Очищенные собранные вирусы концентрировали с использованием 300-кДа кассеты для проточной фильтрации вдоль потока и концентрированный собранный вирус далее подвергали очистке на колонке.
6,75
7,16
7
Результаты: Индивидуальные величины тира собранного вируса упомянуты в представленной выше таблице. Достигнут желаемый рост титра вируса. Замена среды не требуется. VH1 продемонстрировал величину титра 10 б.о.е. и VH2 продемонстрировал величину титра 10б.о.е. Титры вируса VH3 и VH4 продемонстрировали 10 б.о.е.
Эксперимент III - Задача: Масштабирование от одноразового биореактора 100 (DB100) до коммерческого биореактора 500 (DB500) коммерческого размера партии.
2
Этот эксперимент проводили с одноразовым биореактором 100 (DB100) с первоначальным посевом клеток 3000 клеток/см с EMEM, глюкозой 1,5 г/л. Для выращивания клеток среду не заменяли и концентрацию глюкозы поддерживали на уровне приблизительно 1,0 г/л. Среда также содержала 5% NBCS (moregate). Происходило постепенное умножение количества клеток. Клетки инфицировали на 5 сутки с MOI 0,005. Сбор вируса 1 (VH1) проводили с использованием бессывороточной среды на 4 сутки после инфицирования и VH2, VH3 и VH4 собирали с интервалами 3 суток, соответственно, начиная с дня инфицирования. Собранные вирусы очищали микрофильтрацией или с использованием глубинных фильтров. Очищенные собранные вирусы концентрировали с использованием 300-кДа кассеты для проточной фильтрации вдоль потока и концентрированный собранный вирус далее подвергали очистке на колонке.
7,22
6,92
7
Результаты: Индивидуальные величины тира собранного вируса упомянуты в представленной выше таблице. Достигнут желаемый рост титра вируса. Замена среды не требуется. VH1 продемонстрировал величину титра 10 б.о.е. и VH2 продемонстрировал величину титра 10б.о.е. Титры вируса VH3 и VH4 продемонстрировали менее 10 б.о.е.
Эксперимент IV - Задача: Масштабирование от одноразового биореактора 100 (DB100) до коммерческого биореактора 500 (DB500) коммерческого размера партии.
2
Этот эксперимент проводили с одноразовым биореактором 100 (DB100) с первоначальным посевом клеток 3000 клеток/см с DMEM, глюкозой 4,5 г/л. Для выращивания клеток среду не заменяли и концентрацию глюкозы поддерживали на уровне приблизительно 1,0 г/л. Среда также содержала 5% NBCS (moregate). Происходило постепенное умножение количества клеток. Клетки инфицировали вирусом JE штамма Kolar на 7 сутки с MOI 0,005. Сбор вируса 1 (VH1) проводили с использованием бессывороточной среды на 4 сутки после инфицирования и VH2, VH3 и VH4 собирали с интервалами 3 суток, соответственно, начиная с дня инфицирования. Собранные вирусы очищали микрофильтрацией или с использованием глубинных фильтров. Очищенные собранные вирусы концентрировали с использованием 300-кДа кассеты для проточной фильтрации вдоль потока и концентрированный собранный вирус далее подвергали очистке на колонке.
7,41
7,11
6,47
5,78
Результаты: Индивидуальные величины тира собранного вируса упомянуты в представленной выше таблице. Достигнут желаемый рост титра вируса. Замена среды не требуется. VH1 продемонстрировал величину титра 10 б.о.е. и VH2 продемонстрировал величину титра 10б.о.е. Титры вируса VH3 и VH4 продемонстрировали 10 б.о.е. и 10 б.о.е., соответственно.
Пример 2: Очистка массы JE с использованием матрикса с сульфатным сложным эфиром Celufine и инактивация массы JE
Очистку массы JE, продуцированной в одноразовом биореакторе, проводят с использованием колонки с сульфатом Celufine на основе аффинной хроматографии. Очистка на колонке с сульфатом Celufine включает хроматографический способ, в котором указанный сульфат celufine представляет собой матрикс колонки, изготовленный из целлюлозного матрикса подложки в присутствии сложного эфира активированной сульфатной группой. Общий объем сбора сначала концентрируют с использованием 300-кДа мембраны от 300 литров до 50 литров с получением ретентата, содержащего живой JEV. Фильтрат выбрасывают. Ретентат содержит вирус JE. Ретентат подвергают очистке на колонке с использованием указанного матрикса на основе сульфата Celufine. Концентрированный объем собранного вируса, составляющий 50 литров, пропускают через колонку с сульфатом Celufine и прошедшую через колонку фракцию выбрасывают, поскольку она содержит нежелательный белок и другой генетический материал. Вирус, который связался с колонкой, элюируют с использованием элюирующего буфера, содержащего высокие количества солей. Элюат количественно определяют с использованием измеренных величин оптической плотности, дающих острый пик, который означает присутствие очищенного живого вируса японского энцефалита. Вирус, собранный при элюировании, подвергают диафильтрации для удаления солей, определенных нежелательных белков и другого генетического материала посредством замены буфера против фосфатно-солевого буфера многократно в течение по меньшей мере 5-6 раз. Ретентат собирают и пропускают 0,45-мкм мембранный фильтр из PVDF (поливинилиденфторид). Затем живую массу JE инактивируют формалином в соотношении от 1:1500 об./об. до 1:2500 об./об. в течение 7 суток при 22°C вместе со смесью стабилизаторов, содержащей 0,1-1% сорбит и 0,1-1% глицин, добавленные только в процессе инактивации. К живому вирусу JE добавляют стабилизаторы в конкретной концентрации 0,5% масс./об. глицина и 1% масс./об. сорбита вместе с инактивирующим агентом, представляющим собой либо формалин, либо BPL. Стабилизаторы добавляют для предупреждения деградации вируса только в процессе периода инкубации для инактивации, составляющего 7 суток, как упоминалось выше, вследствие добавления инактивирующего агента формалина или бета-пропиолактона (BPL). После инактивации массу JE далее подвергают диафильтрации посредством замены буфера по меньшей мере 5-6 раз против фосфатно-солевого буфера для удаления формалина из очищенной инактивированной массы JE. Подвергнутую диафильтрации массу JE подвергают стерилизации фильтрованием с использованием 0,22-мкм мембранного фильтра из PVDF (поливинилиденфторид). Инактивированную массу JE хранят для исследований стабильности при 5°C±3°C в течение по меньшей мере от 24 месяцев до 36 месяцев. Стадии очистки и инактивации массы вируса японского энцефалита (штамм Kolar) в соответствии с одним из способов, описанных в рамках изобретения, могут быть обобщенно представлены ниже:
(a) очистка сбора вируса с использованием 0,45-мкм мембраны для удаления клеточного дебриса из сбора вируса;
(b) концентрирование объема сбора по меньшей мере в 4 раза с использованием 300-кДа кассеты с мембраной из полиэфирсульфона (PESU) для получения концентрированного ретентата;
(c) очистка на колонке концентрированного собранного ретентата стадии (b) с использованием колонки с матриксом на основе сульфата Celufine, где указанный матрикс состоит из матрикса с целлюлозной подложкой в присутствии сульфатного сложного эфира с активированной группой для сбора элюата, содержащего желаемый вирус, высокое количество солей клеточных белков и материал нуклеиновых кислот;
(d) диафильтрация и замена буфера с использованием 300-кДа кассеты с мембраной из PESU против фосфатно-солевого буфера элюата стадии (c) в течение по меньшей мере 5-6 раз для сбора ретентата для удаления нежелательного высокого количества солей клеточных белков и материала нуклеиновых кислот из представляющего интерес вируса для сбора очищенной концентрированной массы вируса;
(e) Проведение фильтрации очищенной концентрированной вирусной массы стадии (d) через 0,45-мкм мембрану из PVDF (поливинилиденфторид) для устранения каких-либо примесей в процессе;
(f) одновременная стабилизация и инактивация очищенного вируса стадии (e) формалином в соотношении от 1:1500 об./об. до 1:2500 об./об. (т.е. на 2500 объемов живого JE добавляют 1 объем формалина) вместе со стабилизаторами, где указанные стабилизаторы состоят из глицина и сорбита, в течение периода 7 суток при 22°C, или с бета-пропиолактоном в соотношении от 1:1500 об./об. до 1:2500 об./об. (т.е. на 2500 объемов живого JE добавляют 1 объем формалина) вместе со стабилизаторами, где указанные стабилизаторы состоят из глицина и сорбита, в течение периода 7 суток при 5°C±3°C;
(g) диафильтрация и замена буфера инактивированной очищенной вирусной массы стадии (f) с использованием 300-кДа кассеты с мембраной из PESU против фосфатно-солевого буфера по меньшей мере 5-6 раз для удаления только формалина в случае инактивации формалином;
(h) Фильтрация через 0,22-мкм мембрану из PVDF (поливинилиденфторид) очищенной инактивированной вирусной массы стадии (g) для получения конечной и стабилизированной массы JEV при 5°C±3°C в течение по меньшей мере от 24 месяцев до 36 месяцев, свободной от каких-либо примесей, пригодной для составления вакцины против японского энцефалита.
Предоставлены результаты очистки через матрикс на основе сульфата Celufine в случае продукции с размером партии 30 CF40 посредством многократного сбора вируса. Общая вирусная масса, полученная для одной партии 30 CF40 с использованием сульфата Celufine за один месяц, упомянута ниже. Таким образом, количеств доз вакцины JE, которое может быть доступно с НМЧ (не менее чем) 5 мкг инактивированного JE на дозу, также значительно возрастает от по меньшей мере 60000 доз в случае 30 CF40 до по меньшей мере 1 сотни тысяч доз до 3 сотен тысяч доз в одноразовом биореакторе 100 (DB-100) и одноразовом биореакторе 500 (DB-500), соответственно.
<b>Таблица 2.1</b>
<b>Очищенная инактивированная масса JEV и количество доз за 1 месяц с использованием 30 CF40 с очисткой на матриксе на основе сульфата Celufine.</b>
Детали сбора
Объем сбора (л)
Титр в б.о.е.
Конечный объем массы
Концентрация массы JE в мкг/мл
Общая масса JE в мг
VH1
300
10<sup>7,45</sup>
3,8 л
67,65
257,1
VH2
300
10<sup>7,39</sup>
1,8 л
60,23
108,42
VH3
300
10<sup>6,17</sup>
1,8 л
36,17
65,12
VH4
300
10<sup>4,35</sup>
1,0 л
20
20
Итого
450,64
Общая вирусная масса, полученная для одной партии DB100 за один месяц, упомянута ниже. Таким образом, количество доз вакцины JE, которые могут быть доступными с использованием 7 мкг инактивированного JE на дозу, также вычислено и представлено ниже:
<b>Таблица 2.2</b>
<b>Очищенная инактивированная масса JEV и количество доз за 1 месяц с использованием DB-100 с очисткой на матриксе на основе сульфата Celufine.</b>
Детали сбора
Объем сбора (л)
Титр в б.о.е.
Конечный объем массы
Концентрация белка в мкг/мл
Общая масса JE в мг
VH1
300
10<sup>6,54</sup>
3,4 л
191,4
650,76
VH2
300
10<sup>6,03</sup>
2,0 л
35,9
71,8
VH3
300
10<sup>5,49</sup>
1,2 л
28,1
33,7
Итого
756,26
Общая вирусная масса, полученная для одной партии DB-500 за один месяц, упомянута ниже. Таким образом, количество доз вакцины JE, которые могут быть доступными с использованием 7 мкг инактивированного JE на дозу, также вычислено и представлено ниже:
<b>Таблица 2.3</b>
<b>Очищенная инактивированная масса JEV и количество доз за 1 месяц с использованием DB-500 с очисткой на матриксе на основе сульфата Celufine.</b>
Детали сбора
Объем сбора (л)
Титр в б.о.е.
Конечный объем массы
Концентрация белка, мкг/мл
Общая масса JE в мг
VH1
500
10 <sup>7,41</sup>
8,0
237,6
1900
VH2
500
10<sup>6,8</sup>
6
68,3
409,8
VH3
500
10<sup>6,2</sup>
3,7
48,2
178,3
Итого
2488,1
Таким образом, можно видеть, что общая масса JE, продуцированная в одной коммерческой партии в одноразовом биореакторе DB-100, эквивалентна количеству массы JE, которое продуцировалось бы по меньшей мере в 48 CF40, в течение того же периода времени или даже меньше (38 суток). Аналогично, в случае коммерческой партии с использованием DB-500 количество продуцированной массы JE эквивалентно количеству массы JE, которое продуцировалось бы по меньшей мере в 147 CF40 в течение того же периода времени (39 суток). Это обеспечивает существенное техническое достижение, осуществленное путем проведения коммерческого продуцирования вируса японского энцефалита в новых одноразовых биореакторах размеров DB-100 и DB-500.
Пример 3: Очистка вируса JE с использованием колонки с матриксом на основе агарозы и инактивация вируса JE
Очистка вируса JE с использованием колонки на основе агарозы Capto Core-700 является другим новым аспектом настоящего изобретения. Количества доз, которое можно производить в одной партии размера DB-100 и DB-500, являются еще более высокими по сравнению с очисткой на матриксе на основе сульфата Celufine. Колонка Capto core 700 состоит из в высокой степени сшитого агарозного матрикса с функционально активным лигандом октиламином, как ответственным гидрофобные взаимодействия, так и положительно заряженным для прочного взаимодействия с большинством примесей на протяжении широкого диапазона pH и концентраций соли. В этом способе очистки вируса JE с использованием матрикса Capto Core-700 преимуществом является то, то концентрирование сбора вируса не требуется. Принципом, вовлекающим матрикс Capto Core, является исключение по размеру вместе с аффинными хроматографическими способами, оба из которых действуют одновременно. Очистку колонки проводят, пропуская весь объем сбора через матрикс Capto Core. Белки, имеющие молекулярную массу ниже 700 кДа, и другой генетический материал, присутствующий в сборе, связываются с матриксом Capto Core. Собирают прошедшую фракцию, содержащую живой вирус JE, поскольку вирусы не связываются с матриксом Capto Core. После этого следует концентрирование через 300-кДа кассету с мембраной из полиэфирсульфона (PESU). Фильтрат выбрасывают, а ретентат содержит живой вирус JE на этой стадии. После этого концентрированный живой вирус JE, присутствующий в ретентате, химически инактивируют посредством обработки инактивирующим агентом формалином или бета-пропиолактоном (BPL) в соотношении от 1:1500 об./об. до 1:2500 об./об. (т.е. на 2500 объемов живого JE добавляют 1 объем формалина) в течение периода 7 суток при 22°C вместе со смесью стабилизаторов, содержащей 0,1-1% сорбит и 0,1-1% глицин, добавляемой только в процессе инактивации. Стабилизаторы в конкретной концентрации 0,5% масс./об. глицина и 1% масс./об. сорбита добавляют к живому вирусу JE вместе с инактивирующим средством, представляющим собой либо формалин, либо BPL. Стабилизаторы добавляют для предупреждения деградации вируса только в процессе инкубационного периода для инактивации, составляющего 7 суток, как упоминалось выше, вследствие добавления инактивирующего агента формалина или BPL. После инактивации массу JE подвергают диафильтрации и концентрированию посредством замены буфера против фосфатно-солевого буфера многократно по меньшей мере 5-6 раз для удаления формалина. В случае инактивации BPL диафильтрация не требуется. BPL нейтрализуется посредством инкубации массы при 37°C в течение 3 часов. Подвергнутую диафильтрации массу JE подвергают стерилизации фильтрованием с использованием 0,22-мкм мембранного фильтра из PVDF (поливинилиденфторид). Инактивированную массу вируса японского энцефалита далее хранят при 5°C±3°C в течение по меньшей мере от 24 месяцев до 36 месяцев. Стадии очистки и инактивации массы вируса японского энцефалита штамма Kolar согласно одному из способов, описных в рамках настоящего изобретения, могут быть обобщенно представлены ниже:
(a) очистка сбора вируса с использованием 0,45-мкм мембраны для удаления клеточного дебриса из сбора вируса;
(b) очистка на колонке с использованием комбинированной эксклюзионной и аффинной хроматографии с матриксом Capto Core-700, где указанный матрикс состоит из в высокой степени сшитого агарозного матрикса с функциональной активной лигандной октиламиновой группой для сбора прошедшей фракции, содержащей очищенный вирус;
(c) концентрирование и диафильтрация прошедшей фракции стадии (b) с использованием 300-кДа кассет с мембранами из полиэфирсульфона (PESU) с получением очищенной концентрированной вирусной массы;
(d) проведение фильтрации очищенной концентрированной вирусной массы стадии (с) через 0,45-мкм мембрану из PVDF (поливинилиденфторид) для устранения каких-либо примесей в процессе;
(e) одновременная стабилизация и инактивация очищенного вируса стадии (d) формалином в соотношении от 1:1500 об./об. до 1:2500 об./об. (т.е. на 2500 объемов живого JE добавляют 1 объем формалина) вместе со стабилизаторами, где указанные стабилизаторы состоят из глицина и сорбита, в течение периода 7 суток при 22°C, или с бета-пропиолактоном в соотношении от 1:1500 об./об. до 1:2500 об./об. (т.е. на 2500 объемов живого JE добавляют 1 объем формалина) вместе со стабилизаторами, где указанные стабилизаторы состоят из глицина и сорбита, в течение периода 7 суток при 5°C±3°C;
(f) диафильтрация и замена буфера инактивированной очищенной вирусной массы стадии (e) с использованием 300-кДа кассеты с мембраной из PESU против фосфатно-солевого буфера по меньшей мере 5-6 раз для удаления только формалина в случае инактивации формалином;
(g) Фильтрация через 0,22-мкм мембрану из PVDF (поливинилиденфторид) очищенной инактивированной вирусной массы стадии (f) для получения конечной и стабилизированной инактивированной массы JEV при 5°C±3°C в течение по меньшей мере от 24 месяцев до 36 месяцев, свободной от каких-либо примесей, пригодной для составления вакцины против японского энцефалита.
Ниже в таблицах представлены результаты очистки через матрикс на основе сульфата Celufine в случае продукции с размером партии 30 CF40, DB-100, DB-500 посредством многократного сбора вируса. Общая вирусная масса, полученная для одной партии 30 CF40 с использованием сульфата Celufine за один месяц, упомянута ниже. Таким образом, количеств доз вакцины JE, которое может быть доступно с НМЧ 5 мкг на дозу, также значительно возрастает от приблизительно одной сотни тысяч доз в случае 30 CF40 до по меньшей мере от 9 сотен тысяч доз до 20 сотен тысяч доз в случае от DB-100 до DB-500, соответственно.
<b>Таблица 3.1</b>
<b>Очищенная инактивированная масса JEV и количество доз за 1 месяц с использованием 30 CF40 посредством очистки на матриксе Capto Core-700.</b>
Инактивация формальдегидом и очистка с использованием captocore
Титр
Объем в литрах
Концентрация белка, мкг/мл
VH1
Сбор вируса
10<sup>7,26</sup>
300
633,9
Прошедшая через колонку фракция
--
326
442,8
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
8
168,75
VH2
Сбор вируса
10<sup>7,41</sup>
300
528,2
Прошедшая через колонку фракция
--
331
379,2
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
7,2
175
VH3
Сбор вируса
10<sup>6,67</sup>
300
540,7
Прошедшая через колонку фракция
--
408,3
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
6,3
181
VH4
Сбор вируса
10<sup>5,15</sup>
300
601
Прошедшая через колонку фракция
--
312
399
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
5,0
150
Общий белок
(168,75×8)+(175×7,2)+(181×6,3)+(150×5,0)=4500 мг
<b>Таблица 3.2</b>
<b>Очищенная инактивированная масса JEV и количество доз за 1 месяц с использованием DB-100 посредством очистки на Capto Core-700.</b>
Инактивация формальдегидом и очистка с использованием captocore
Титр
Объем в литрах
Концентрация белка, мкг/мл
VH1
Сбор вируса
10<sup>6,75</sup>
300
648,4
Прошедшая через колонку фракция
--
327
481,6
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
18
391,5
VH2
Сбор вируса
10<sup>7,16</sup>
300
598,5
Прошедшая через колонку фракция
--
320
448
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
13,2
193,5
VH3
Сбор вируса
10<sup>6-53</sup>
300
632,2
Прошедшая через колонку фракция
--
311
476
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
5,9
900
Общий Белок
(391,5×18)+(193,5×13,2)+(900×5,9)=675,0 мг
<b>Таблица 3.3</b>
<b>Очищенная инактивированная масса JEV и количество доз за 1 месяц с использованием DB-500 посредством очистки на Capto Core-700.</b>
Инактивация формальдегидом и очистка с использованием captocore
Титр
Объем в литрах
Концентрация белка, мкг/мл
VH1
Сбор вируса
10<sup>6,82</sup>
500
598,6
Прошедшая через колонку фракция
--
565
476,9
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
41
211
VH2
Сбор вируса
10<sup>6,26</sup>
500
540,8
Прошедшая через колонку фракция
--
553
423,5
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
31,5
160,1
VH3
Сбор вируса
10<sup>5-16</sup>
500
603,3
Прошедшая через колонку фракция
--
527
485,8
Масса после диализа через 0,22 мкм/ конечная масса
--
17
103
Общий белок
(211×41)+ (160,1×31,5)+ (103×17)=15445 мг
Кроме того, сравнение увеличения выхода очищенной массы JEV с использованием колонки Capto Core-700 в случае размера партии 30 CF40, DB-100 и DB-500, соответственно, представлено в таблице ниже (таблица 3.4). Можно видеть, что общая масса JEV в случае 30 CF40 с использованием очистки capto core составляет 642857 мг, и в случае DB-100 она составляет 964285 мг, что эквивалентно продукции 45 CF40 в течение того же требуемого периода времени, и 2206428 мг инактивированной массы JEV, что эквивалентно продукции приблизительно 140 CF40 в тот же требуемый период времени. Обобщение сравнения между очисткой сульфатом Celufine и Capto Core 700 массы JEV представлено ниже:
<b>Таблица 3.4</b>
<b>Сравнение очищенной массы JEV, полученной с использованием матрикса на основе сульфата Celufine и матрикса Capto Core 700.</b>
Устройство для получения партии
Общая масса JE в мг(колонка с сульфатом Celufine)
Общая масса JE в мг(колонка Capto Core 700)
Эквивалентный выход в значениях клеточных фабрик
Время для одной коммерческой партии
Увеличение в количестве раз
Выход 30 CF40
450,64
642857
30 CF40
40 суток
Приблизительно в 10 раз
Выход DB-100
722,56
964285
48 CF40
38 суток
Приблизительно в 9 раз
Выход DB-500
2216,3
2206428
147 CF40
39 суток
Приблизительно в 8 раз
Пример 4: Исследования стабильности инактивированной массы JEV
Подвергнутую диализу инактивированную массу JEV хранили с подходящим содержанием химического стабилизатора(ов) или без него при 5±3°C. Антиген отбирали с различными интервалами и исследовали посредством нейтрализации уменьшения бляшек (PRNT50). Стабильность антигена определяли с использованием вирусного тира нейтрализации антисыворотки мыши согласно IP.2007; WHO TRS No.771. Нейтрализацию вируса в антисыворотке определяли способом 50% уменьшения бляшек. Титр нейтрализации вируса выражали в качестве обратного значения разведения сыворотки, которое продемонстрировало 50% уменьшение бляшек по сравнению с количеством бляшек в контрольных лунках без живого вирусного антигена.
<b>Таблица 4.1</b>
<b>Стабильность очищенной инактивированной массы JEV в течение 36 месяцев</b>
Время
Описание
pH
Идентификация
Аномальная токсичность
Бактериальный эндотоксин
Стерильность
Эффективность
Белая или практически белая прозрачная жидкость, свободная от частиц
От 6,50 до 7,50
Должен удовлетворять тесту эффективности
Должен удовлетворять тесту аномальной токсичности
Не более 25 МЕ на однократную дозу у человека
Должен удовлетворять тесту стерильности
NLT 50% PRNT, индуцируемого исследуемой вакциной по сравнению с эталонной вакциной
Нулевые сутки
соответствует
7,10
удовлетворяет
удовлетворяет
<25 МЕ на SHD
удовлетворяет
Относительная эффективность 1,26
1 месяц
соответствует
7,07
удовлетворяет
NA
NA
NA
Относительная эффективность 1,29
2 месяц
соответствует
7,03
удовлетворяет
NA
NA
NA
Относительная эффективнос28
3 месяц
соответствует
7,08
удовлетворяет
NA
NA
NA
Относительная эффективность 1,24
6 месяц
соответствует
7,12
удовлетворяет
удовлетворяет
NA
NA
Относительная эффективность 1,25
12 месяц
соответствует
7,12
удовлетворяет
NA
NA
NA
Относительная эффективность 1,22
24 месяц
соответствует
7,09
удовлетворяет
удовлетворяет
<25 МЕ на SHD
удовлетворяет
Относительная эффективность 1,24
36 месяц
соответствует
7,11
удовлетворяет
удовлетворяет
<25 МЕ на SHD
удовлетворяет
Относительная эффективность 1,23