СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЪЮВАНТА
METHOD TO PRODUCE ADJUVANT

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано при разработке, производстве и применении средств специфической профилактики (лечения) болезней в составе инактивированных или "живых" вакцин для профилактики (лечения) заболеваний, а также в составе смеси антигена при получении гипериммунных (иммунноспецифических) сывороток и их препаратов, и в частности для получения противовирусных вакцин, противобактерийных вакцин, получения высоко активных гипериммунных сывороток в том числе на низкоактивные антигены разного происхождения для создания диагностических иммуноферментных тест-систем, а также в составе других композиций для нормализации иммунного статуса организма животного.
Известен способ получения биологически активного продукта гепатопротекторного действия, включающий культивирование гриба вида Fusarium sambucinum на питательной среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 48-72 ч с последующим отделением биомассы и получением культуральной жидкости, причем для культивирования используют посевной материал, полученный путем предварительного выращивания гриба вида Fusarium sambucinum в присутствии этанола, а при культивировании в качестве фактора усиления продуцирования метаболитов гепатопротекторного действия в питательную среду добавляют 0,5-1,5 об.% этанола (Патент РФ №2289957, МПК A23L 1/30, БИ №36, 2006).
Однако известный биологический продукт не обладает адъювантным действием (Адъювант /adjuvant/ - вещество или комплекс веществ, используемое для усиления иммунного ответа при введении одновременно с иммуногеном).
Известен способ получения адъюванта при взаимодействии солей алюминия с водными растворами щелочи (адъювант/сорбент) на основе геля гидроокиси алюминия (Ярилин А. А., Основы иммунологии: Учебник. - М.: Медицина, 1999. - С.608. - ISBN 5-225-02755-5).
Известен также способ получения адъюванта (Фрейнда) путем культивирования живых клеток с последующим отделением продукта их жизнедеятельности (выделения из микобактерий туберкулеза липополисахаридов, сложных жирных кислот /дериваты ланолина/). Продукт жизнедеятельности смешивают с маслом и эмульгатором до получения стойкой эмульсии типа вода/масло, масло/вода или вода/масло/вода (Большая медицинская энциклопедия. Том 1 /Главный редактор академик Б.В.Петровский; издательство «Советская энциклопедия»; Москва, 1974. - 576 с.).
Известные способы получения адъюванта основаны на выполнении сложных технологических процедур, требующих длительного времени, кроме того известные адъюванты недостаточно эффективны, проявляют низкое качество целевого продукта, выявляемое в низкой степени стимуляции иммуногенности, высокой реактогенности, токсичности.
Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет повышения иммуногенной активности (устранения и/или значительного снижения реактогенности и токсичности конечного продукта, что повышает антигенную и иммуногенную активности, уменьшает неспецифическую нагрузку на иммунную систему организма и снижает реактогенность).
Задача настоящего технического решения достигается в способе получения адъюванта, характеризующегося тем, что гриб вида Fusarium sambucinum культивируют на питательной среде, содержащей источник углерода 3-4%, азота 0,2-0,3%, фосфора 0,2-0,3% и микроэлементы 0,07-0,08%, в стерильных условиях при температуре 26-30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36-72 ч с последующим отделением культуральной жидкости от биомассы гриба, причем культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15-20 мин при 800-1500 об/мин, а целевой продукт получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да.
Кроме того, в способе получения адъюванта предварительно перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 110-115°С и давлении 1,3-1,5 атм по 1,5-2 град/мин с последующей экспозицией в течение 1,5-2,5 часа.
В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие признаки, аналогичные заявляемым, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».
Предложение осуществимо в лабораторных и промышленных условиях, направлено на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».
Впервые получен адъювант для получения противовирусных вакцин, противобактерийных вакцин, получения высоко активных гипериммунных сывороток из продукта жизнедеятельности гриба вида Fusarium sambucinum, что отвечает критерию «изобретательский уровень».
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
4
3
2
4
3
Пример 1. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum, штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 3% источника углерода /сахароза/, 0,2% азота /аммоний азотнокислый NHNO/, 0,2% фосфора /калий фосфорнокислый однозамещенный KHPO/, 0,07% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 26°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 16 м. По истечении времени культивирования производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 об/мин, а адъювант 1 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.
4
3
2
4
Пример 2. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 4% источника углерода /сахароза/, 0,3% азота /аммоний азотнокислый NHNO/, 0,3% фосфора /калий фосфорнокислый однозамещенный KHPO/, 0,08% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 72 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 5 литров. По истечении времени культивирования производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин, а адъювант 2 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.
4
3
2
4
3
Пример 3. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum, штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 3% источника углерода /сахароза/, 0,2% азота /аммоний азотнокислый NHNO/, 0,2% фосфора /калий фосфорнокислый однозамещенный KHPO/, 0,07% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 26°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 16 м. Перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 110°С и с давлением 1,3 атм по 1,5 град/мин с последующей экспозицией в течение 1,5 часа. По истечении времени прогревания производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 об/мин, а адъювант 3 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.
4
3
2
4
Пример 4. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 4% источника углерода /сахароза/, 0,3% азота /аммоний азотнокислый NHNO/, 0,3% фосфора /калий фосфорнокислый однозамещенный KHPO/, 0,08% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 72 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 5 литров. Перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 115°С и с давлением 1,5 атм по 2 град/мин с последующей экспозицией в течение 2,5 часа. По истечении времени прогревания производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин, а адъювант 4 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.
4
2
4
2
4
3
Пример 5. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum, штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 3% источника углерода /глюкоза/, 0,2% азота /сульфат аммония (NH)SO/, 0,2% фосфора /натрий фосфорнокислый однозамещенный NaHPO/, 0,07% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 26°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 16 м. По истечении времени культивирования производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 об/мин, а адъювант 5 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.
4
2
4
2
4
Пример 6. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 4% источника углерода /глюкоза/, 0,3% азота /сульфат аммония (NH)SO/, 0,3% фосфора /натрий фосфорнокислый однозамещенный NaHPO/, 0,08% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 72 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 5 литров. По истечении времени культивирования производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин, а адъювант 6 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.
4
2
4
2
4
3
Пример 7. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum, штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 3% источника углерода /глюкоза/, 0,2% азота /сульфат аммония (NH)SO/, 0,2% фосфора /натрий фосфорнокислый однозамещенный NaHPO/, 0,07% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 26°С с перемешиванием и аэрацией в течение 36 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 16 м. Перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 110°С и давлении 1,3 атм по 1,5 град/мин с последующей экспозицией в течение 1,5 часа. По истечении времени прогревания производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 об/мин, а адъювант 7 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.
4
2
4
2
4
Пример 8. Для приготовления адъюванта используют гриб вида Fusarium sambucinum штамм Sambucinum Fuckel F-3051D, который культивируют на среде, содержащей 4% источника углерода /глюкоза/, 0,3% азота /сульфат аммония (NH)SO/, 0,3% фосфора //натрий фосфорнокислый однозамещенный NaHPO/, 0,08% микроэлементов Mg, Mn, Fe, Ca, Zn, взятых в равных соотношениях, остальное вода до 100%, в стерильных условиях при температуре 30°С с перемешиванием и аэрацией в течение 72 часов. Культивирование гриба производят в ферментерах (биореакторах) объемом 5 литров. Перед центрифугированием культуральную жидкость нагревают до температуры 115°С и давлении 1,5 атм по 2 град/мин с последующей экспозицией в течение 2,5 часа. По истечении времени прогревания производят отделение биомассы от культуральной жидкости одним из известных способов. Культуральную жидкость центрифугируют при комнатной температуре в течение 20 мин при 1500 об/мин, а адъювант 8 получают из супернатанта отделением пептидов и белков с молекулярной массой от 3000 до 60000 Да с помощью пористого фильтра.
Пример 9. Адъювант 1-9, полученный по примерам 1-9, обеспечивает специфический иммунный ответ на введение гаптенов в сочетании (химическом соединении) с крупномолекулярным белком в значительно более высокой степени по сравнению с классическим адъювантом - полным адъювантом Фрейнда.
3
3
Влияние адъюванта, приготовленного по заявляемому способу, на иммуногенность адгезивных антигенов эшерихий изучали в сравнительных опытах на кроликах. Для опытов использовали адгезивный антиген эшерихий (вакцина №1 - контроль 1), адгезивный антиген в смеси с гидроокисью алюминия в соотношении 7:3 (вакцина №2 - контроль 2), адгезивный антиген эшерихий в смеси с адъювантом, приготовленным по заявляемому способу, в соотношении 1:4 (вакцина 3 - опытная с адъювантом 1; вакцина 4 - опытная с адъювантом 2; вакцина 5 - опытная с адъювантом 3; вакцина 6 - опытная с адъювантом 4; вакцина 7 - опытная с адъювантом 5, вакцина 8 - опытная с адъювантом 6, вакцина 9 - опытная с адъювантом 7, вакцина 10 - опытная с адъювантом 8). Для проведения испытаний были сформированы шесть групп (две контрольных и четыре опытных) кроликов массой по 2,8-3,0 кг, по 9 голов в каждой группе. Каждому кролику опытных и контрольной групп вводили подкожно по 1 см соответствующей вакцины, через 7 дней повторяли введение подкожно кроликам соответствующих групп соответствующих вакцин в дозе по 3 см.
Представленные в таблице данные свидетельствуют о том, что адъювант, полученный по заявляемому способу, обеспечивает повышение иммунного ответа на адгезивные антигены эшерихий в 2-8 раз. По адъювантным свойствам заявляемый препарат значительно превышает адъювантные свойства гидроокиси алюминия в составе вакцин.
При производстве адъюванта полностью исключается необходимость проведения специальных операций по выделению, рафинированию минеральных масел или приготовлении геля гидроокиси алюминия, практически полностью исключается необходимость проведения трудоемких операций.
Адъювант, приготовленный согласно изобретению, при более производительном и технологическом способе изготовления, обладает большей стимулирующей иммунитет потенцией, безвреден в составе вакцин и других продуктов иммунологического назначения, ареактогенен, может применяться как самостоятельно, так и в сочетании с масляными адъювантами или адъювантами-сорбентами на основе геля гидроокиси алюминия и других веществ.
Таблица 1
Титры кроличьих сывороток, полученных с использованием и без использования адъюванта, приготовленного по заявляемому способу
Иммуноген
Титры сывороток
С применением заявляемого адъюванта
С адъювантом Фрейнда
KLH-CP-AOZ
30000-40000
5000-10000
KLH-NCA
30000-50000
4000-8000
KLH-QSA
30000-50000
2000-7000
Таблица 2
Результаты испытания активности адъюванта, приготовленного по заявляемому способу, с рекомбинантными белками
Состав иммунизирующей смеси
Доза заражения
ЛД<sub>50</sub>
ИЭ*
oprF + гидроокись алюминия
PA 103
200
57,43
1,77
100
50
25
12,5
oprF + адъювант 1
PA 103
200
91,38
2,83
100
50
25
12,5
oprF + адъювант 2
PA 103
200
101,03
3,12
100
50
25
12,5
oprF + адъювант 3
PA 103
200
96,22
2,97
100
50
25
12,5
oprF + адъювант 4
PA 103
200
91,41
2,82
100
50
25
12,5
АВ + гидроокись алюминия
PA 103
200
61,56
1,9
100
50
25
12,5
АВ + адъювант 1
РА 103
200
72,46
2,22
100
50
25
12,5
АВ + адъювант 2
PA 103
200
76,27
2,36
100
50
25
12,5
АВ + адъювант 3
PA 103
200
80,08
2,47
100
50
25
12,5
АВ + адъювант 4
PA 103
200
72,4
2,24
100
50
25
12,5
Контроль
PA 103
200
32,42
100
50
25
12,5
6,25
* где ИЭ - индекс эффективности вакцинации.
Таблица 3
Титр антител к адгезивным антигенам эшерихий в пробах сыворотки крови кроликов опытной и контрольных групп
Наименование вакцины
Титр антител в РА
Через 7 суток после второй вакцинации
Через 14 суток после второй вакцинации
Через 21 сутки после второй вакцинации
Адгезивный антиген (контроль №1)
1:10
1:20
1:50
Адгезивный антиген + гидроокись алюминия (контроль 2)
1:20
1:100
1:200
Адгезивный антиген + адъювант Фрейнда (контроль 3)
1:20
1:100
1:200
Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 1
1:100
1:200
1:400
Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 2
1:100
1:200
1:400
Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 3
1:100
1:400
1:800
Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 4
1:100
1:400
1:800
Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 5
1:100
1:200
1:400
Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 6
1:100
1:200
1:400
Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 7
1:100
1:400
1:800
Адгезивный антиген + АДЪЮВАНТ 8
1:100
1:400
1:800