Влияние /3-циклодекстрина на факторы удерживания стероидных гормонов в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии

УДК 543.544

Вестник СПбГУ. Сер. 4, 2005, вып. 1

Л. А. Карцова, Е. А. Бессонова, Л. И. Великанова, Е. Г. Павлова ВЛИЯНИЕ /3-ЦИКЛОДЕКСТРИНА

НА ФАКТОРЫ УДЕРЖИВАНИЯ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Введение. Расширение аналитических возможностей при использовании комплек-сообразования было осознано еще на ранних стадиях развития хроматографии [1].

Известно, что процесс комплексообразования между комплексообразующим агентом, введенным в состав подвижной фазы (либо иммобилизованным на сорбенте), и анализируемым веществом может обеспечить большую селективность при разделении сложных многокомпонентных смесей органических соединений с различными функциональными группами.

Макроциклы (краун-соединения, каликсарены, циклодекстрины, макроциклические антибиотики и т.д.), введенные в состав хроматографических фаз, позволяют регулировать селективность хроматографического разделения органических соединений с различными функциональными группами. Это в значительной степени обусловлено их уникальной способностью к комплексообразованию с анализируемыми веществами по типу «гость» - «хозяин».

В последние годы большое внимание уделяется использованию циклодекстринов в качестве компонентов хроматографических фаз:

Благодаря внутренней гидрофобной полости, они могут образовывать комплексы включения с неполярными органическими молекулами, а за счет внешних гидроксильных групп вступать в специфические взаимодействия с нейтральными, катионными и анионными субстратами, склонными к образованию водородных связей [2]. Возможность

© Л. А. Карцова, Е. А. Бессонова, Л. И. Великанова, Е. Г. Павлова, 2005

но

он

он

образования комплексов включения зависит от пространственных факторов, гидрофобных взаимодействий, водородных связей и сольватационных эффектов.

/?-Циклодекстрины(/?-ЦД) являются неионными, циклическими хиральными углеводами, построенными из 7 остатков В(+).глюкопиранозы (каждая из которых находится в конформации кресло), соединенными друг с другом а-1,4-связями. Эти макроциклы имеют 14 вторичных и 7 первичных групп ОН и пригодны для разделения оптических изомеров, широкого спектра диастереомеров, структурных изомеров, геометрических изомеров и стероидных эпимеров. Ранее нами было установлено [3] влияние этого макроцикла в качестве компонента подвижной фазы на факторы удерживания ароматических соединений с амино-, хлор-, гидрокси-, нитро- и карбоксильными группами, включая позиционные изомеры и лекарственные препараты при различных концентрациях /3-ЦД и pH подвижной фазы.

Стероидные гормоны коры надпочечников играют значительную роль в обеспечении основных жизненных процессов, являются важным звеном в развитии стрессовой реакции в организме. Определение кортикостероидов в биологических объектах нашло практическое применение в области клинической медицины при диагностике эндокринных нарушений, анализе лекарственных препаратов [4-14J. В основном для количественной оценки содержания кортикостероидов в сыворотке крови используются иммунологические методы анализа, которые, однако, позволяют определить в одном аналитическом цикле лишь какое-либо одно соединение и ограничены имеющимся набором антител. В настоящее время широкое применение в аналитической и клинической практике находит метод обращен но-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). обеспечивающий получение полной информации обо всех компонентах разделяемой смеси.

Цель настоящего исследования - разработка метода изократического ОФ ВЭЖХ определения кортикостероидов на модельной системе с использованием /?-ЦД в качестве компонента подвижной фазы.

Аппаратура, условия анализа и материалы. Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе НРР 4001 (Чехия) с насосом высокого давления в режиме изократического элюирования с УФ-детектиррванием (254 нм); колонки стеклянные Separon SGX'C-18 (5 мкм) 100x2 мм и ISN Silica RP 18 (5 мкм), 160x2 мм. Самописец КСП4-039-УХЛ.4.2; микропипетки на 5-1000 мкл (Plastomed. Польша); микрошприц Hamilton объемом 100 мкл; скорость элюирования - 0.3 мл/мин; объем вводимой пробы - 20 мкл.

Материалы: ацетонитрил. сорт «0»; хлороформ, марка «ч.д.а.», дихлорметан, «х.ч.»; ме-тиленхлорид, «х.ч »; этилацетат. «х.ч.»; диэтиловый эфир, «х.ч.»; ацетон, «ч.д.а.»; метанол, «ч.д.а »; этанол (для хроматографии); соляная кислота (фиксанал, J, HCl); ортофосфор-ная кислота, «х.ч.»; гидроксид натрия, «х.ч.»; фосфатный буфер (фиксанал, J, Nas НРО4, КН2 РО4, pH 6,84); /З-ЦД. Набор для ТСХ («Ленхром»). Стандартные растворы кортизо-ла (F), кортизона (Е), 11-дегидрокортикостерона (А), кортикостерона (В), тестостерона (Т), 11-дезоксикортикостерона (DOC). 11-дезоксикортизола (S), андростендиона (And) концентрацией 1 мг/мл готовили растворением точных навесок по 1 мг каждого из стероидов в 1 мл ацетонитрила во фторопластовых пробирках; рабочие растворы - разбавлением стандартных в необходимое количество раз (до концентрации 10 и 1 мкг/мл) с помощью микрошприца и автоматического дозатора. Полученные растворы до хроматографического анализа хранились в морозильной камере при -20° С.

В качестве подвижной фазы применяли 30%- и 45%-ные растворы ацетонитрила в дистиллированной воде, а также указанные подвижные фазы с добавлением 0,3; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3,0 мМ /3-ИД («Sigma», США).

Предел детектирования (2 нг/л) определяли-*ак концентрацию аналита, соответствующую

IS

s

u 0

о ч и о С

Г

а

о с; и о С

О

10

V '•"!-1 ' г--I-Т-~Г—-

20 30

10

20

t, мин

Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси стероидов в отсутствие /3-ЦД в составе элюента (а) и с добавлением 3 мМ /3-ЦД в состав элюента {б).

Условия хроматографического анализа: колонка Берагоп ЭвХ С-18 100x2 мм, 5 мкм (Чехия); подвижная фаза: CHзCN : НгО (45:55, по объему), скорость элюента 0,3 мл/мин, чувствительность регистрации 8, объем вводимой-пробы 20 мкл.

соотношению сигнал/шум, равному 2. Количественный анализ стероидных гормонов осуществляли методом стандартной добавки.

Результаты и их обсуждение. Перед нами стояла задача - исследовать влияние /3-ЦД на селективность разделения стероидных гормонов коры надпочечников и разработать методику их определения методом ОФ ВЭЖХ.

Оптимизацию условий хроматографического разделения проводили на растворах стандартов стероидов (F, Е, А, В, Т, DOC, S). Варьирование таких параметров как концентрация органического модификатора в составе элюента и рН подвижной фазы показало, что анализ выбранных стероидов в режиме изократического элюирования не позволяет получать информацию обо всех компонентах за один хроматографический цикл из-за сильно различающейся гидрофобности аналитов (рис. 1, а). При оптимизации условий изократического режима применили /3-ЦД (рис. 1, б) как компонент подвижной фазы. Известна способность циклодекстринов образовывать комплексы включения со стероидами с участием гидрофобной полости макроциклов и стабилизировать образующиеся ассоциаты за счет внешних гидроксильных групп [13, 14].

Были проведены серии экспериментов с /3-ЦД в подвижной фазе с различными концентрациями макроцикла и соотношением адетонитрил : вода.

При использовании элюирующей системы CH3CN : Н2О (45 : 55, по объему) концентрация /3-ЦД варьировалась от 0,5 до 3 мМ. Установлено, что добавка /3-ЦД 3 мМ в подвижную фазу привела к улучшению разрешения пиков стероидов, имеющих близкие параметры удерживания, - кортизола и кортизона, а сама форма хроматографи-ческих пиков приблизилась к «гауссовой» (рис. 1, б). /3-ЦД, имеющий гидрофобную внутреннюю полость, образует комплексы включения (полностью или частично) с ана-

Лу 0,9

0,8

0,7

0,6

0,5<

0,4

0,3

0,2

0,1

0

О

0,5

1,5 2

2,5

3 3,5 С, мМ

Рис. 2. Зависимость разрешения пиков {Кв) корти-зола и кортизона от концентрации /3-ЦЦ.

Ы, т.т. / м 4000

0,5

1,5 2

2,5

С, мМ

Рис. 3~. Зависимость эффективности (теоретические л тарелки на метр (т.т./м)) от концентрации /3-ЦЦ.

лизируемыми компонентами, причем кортикостероиды по-разному взаимодействуют с комплексообразователем. Кортизол и кортизон являются наиболее полярными (гидрофильными) из рассматриваемых стероидов, поэтому они в меньшей степени встраиваются в структуру /?-ЦД- В то же время их молекулы отличаются функциональными группами, следовательно, и характер их взаимодействия с /?-ЦД может различаться, что и сказалось на разрешении этих хроматографических пиков (рис. 2). Наличие макроцикла в составе элюента привело и к увеличению эффективности разделения (рис. 3).

При использовании элюента с большим содержанием воды (CHзCN : Н20, 30 : 70, (по объему)) было выявлено, что времена удерживания (рис. 4, а), уменьшаются для всех стероидов стандартной смеси, причем для тестостерона и 11-дезоксикортикостерона весьма значительно.

Фактор удерживания

3 3,5 С, мМ

Рис. 4- Зависимость времени удерживания (а) и относительных факторов удерживания (б) стероидов от концентрации /3-ЦЦ (элюент: ацетонитрил : вода, 30 : 60 (по объему)).

1 - кортизол; 2 - кортизон; 3 - 11-дегидрокортизон; 4 ~ тестостерон; 5 - 11-дезоксикортикостерон.

Рост концентрации /3-ЦД в подвижной фазе снижает факторы удерживания стероидов (рис. 4, б). В случае тестостерона эта зависимость выражена наиболее отчетливо.

В области 0,5-1,0 мМ (рис. 4, б) можно отметить, что факторы удерживания для кортизола, кортизона и 11-дегйдрокортикостерона или не изменяются, или увеличиваются. Этот факт можно объяснить тем, что более гидрофильные стероиды при данной концентрации /3-ЦД, встраиваясь в его неполярную полость, более прочно удерживаются на поверхности стационарной фазы. Для других же стероидов (тестостерона и 11-дезоксикортикостерона) такой зависимости не наблюдается, так как полученные их комплексы с /3-ЦД более гидрофильны, чем сами стероиды.

Таким образом, присутствие /3-ЦД в зависимости от состава подвижной фазы не только увеличивает разделение стероидов, имеющих близкие параметры удерживания, но и значительно уменьшает времена удерживания более гидрофобных стероидов.

Была проведена количественная оценка возможного комплексообразования в сис-. теме макроцикл-субстрат для стероидных гормонов (кортизол. кортизон, 11-де-гидрокортикостерон, кортикостерон, тестостерон, 11-дезоксикортикостерон, 11-дезоксикортизол) для двух элюирующих систем с содержанием 45 и 30% ацетонитрила в воде. Расчет производился по формуле

[ц+ 1

к0 к0'

где ко - значение фактора емкости аналита в отсутствие макроцикла, к' - значение фактора емкости комплекса; К - константа устойчивости комплекса.

Полученные данные (таблица) находятся в хорошем соответствии с установленными закономерностями о влиянии циклодекстринов на параметры удерживания. Так, максимум константы устойчивости комплекса в первой серии (ацетонитрил : вода 45 : 55, по объему) наблюдается для кортизола, а во второй (ацетонитрил : вода 30 : 60, по объему) - для 11-дегидрокортикостерона. Изменение содержания органического компонента в составе подвижной фазы сказывается и на процессах комплексообразования. Так, для более гидрофобных кортикостероидов (тестостерона, 11-де-

Константы устойчивости комплексов стероидов с /3-ЦД, введенным в состав подвижной фазы

Состав подвижной фазы

Стероиды

CH3CN : Н20

45 : 55 30 : 70

Кортизол Кортизон

11-Дегидрокортикостерон

Кортикостерон

Тестостерон

11-Дезоксикортикостерон 11-Дезоксикортизол

158 ±6 128 ±6

121 ±5 101 ±7

106 ± 5 97 ± 7

130 ±5 218 ±5

140 ± 5 363 ± 7

138 ± 3 280 ± 6

63,00 ±0,21

зоксикортизола, 11-дезоксикортикостерона) меньшее содержание органического компонента в составе элюента приводит к большим константам комплексообразования, что связано, по-видимому, с их меньшей сольватацией в более гидрофильной среде. Для кортизола и кортизона наблюдается обратная зависимость.

В результате был найден оптимальный состав подвижной фазы - СНзСМ : Н2О (45 : 55, по объему) с добавкой 2,5 мМ /3-ЦД.

Заключение. Разработан метод определения кортикостероидов на модельной системе в режиме изократической обращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-детектированием с использованием /3-ЦД в составе подвижной фазы ацетонитрил : вода (45 : 55, по объему). Предел обнаружения 3 нг/мл. Ошибка метода 5%. В процессе исследования влияния /3-ЦД, введенного в состав подвижной фазы, на параметры удерживания стероидных гормонов выявлено максимальное влияние концентрации макроцикла на изменение удерживания более гидрофобных аналитов. Проведена количественная оценка возможного комплексообразования в системе макроцикл-субстрат для стероидных гормонов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Конкурсного центра фундаментального естествознания Министерства образования РФ (грант № АОЗ-2.11-394).

Kartsova L. A., Bessonova Е. A., Velikanova L. I., Pavlova Е. G. The influence of /3-cyclodextrin on the retention parameters of corticosteroids by reversed-phase HPLC.

The influence of /З-cyclodextrin (/3-CD) as the component of the mobile phase (CH3CN: H2O) on the retention parameters of diagnostically important corticosteroids (Cortisol, cortisone, corti-costerone, 11-deoxycorticosterone and 11-deoxycortisol) in isocratic mode of reversed-phase HPLC (RP HPLC) with UV-detection (254 nm) we have investigated.

Литература

1. Хираока M. Краун-соединения. Свойства и применения / Пер. с англ.; Под ред. Н. М. Эмануэля. М., 1986. 2. Gubitz G.t Schmidt М. G-.// Electrophoresis. 2000. Vol. 21, N 8. P. 4112-4135. 3. Карцова Л. А, Маркова О. В. // Журн. аналит. химии. 2000. Т. 55, № 7. С. 728-731. 4. Stoner Е., Loche S., Mirth А. М., New М. I. // J. Chromatography. 1986. Vol. 374. P. 358-362. 5. Nozaki О. 11 J. Chromatography. A. 2001. Vol. 935. P. 267-278. 6. Wudy S. A., Harmann M., Homoki J. 11 J. Endocrinology 2000. Vol. 165. P. 679-683. 7. Ghu-lam A., Kouach M., Racadot A. et. al. // J. Chromatography. B. 1999. Vol. 727. P. 227-233. 8. Hay M., Mormede P. // J. Chromatography. B. 1997. Vol. 702. P. 33-39. 9. Морозова M. Г.,

Summary

Гампер Н. Л., Дубинина Е. Е. // Клинич. лаб. диагностика. 2000. № 4 (1). С. 14-16. 10. Flood К. G., Reynolds Е. R., Snow N. Н. // J. Chromatography. А. 2000. Vol. 903. Р. 49-65. 11. Stolker А. А. М., Schwillens P. L. W. J., Ginkel L. A., van Brinkman U. A. Th. // J. Chromatography. A. 2000. Vol. 893. P. 55-67. 12. Forgacs E., Cserhati T. // J. Chromatography. A. 1999. Vol. 845. P. 447-453. 13. Bevalot F., Gaillard Y., Lhermitte M. A.. Pepin G. // J. Chromatography. B. 2000. Vol. 740. P. 227-236. 14. Schneiderman E.: Stalcuy A. M. Ц J. Cromatography. B. 2000. Vol. 745. P. 83-102.

Статья поступила в редакцию 10 сентября 2004 г.