ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO МЕРИСТЕМНЫХ ЭКСПЛАНТОВ ЯБЛОНИ РАЗНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

DOI: 10.25930/0372-3054/002.1.13.2020 УДК 634.1:581.143.6

ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO МЕРИСТЕМНЫХ ЭКСПЛАНТОВ ЯБЛОНИ РАЗНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Л.Г. Браткова, Н.Н. Цаценко, М.Н. Мащенко, К.А. Макаров

Исследования проводились с целью оптимизации первичных сред для подвоев и привоев сортов яблони. В результате установлено, что лучшим временем для введения в культуру in vitro меристем яблони является февраль-март. Отработана схема стерилизации исходного материала однолетних побегов с покоящимися почками. Развитие ме-ристемной ткани наиболее активно происходит на питательных средах М 1-3 и М 1-4, а введение в питательную среду в качестве антиоксиданта активированного угля способствует ингибированию фенольных соединений и не требует нового пассирования на среды. Анализ полученных данных показал высокую зависимость развития меристем от генотипических особенностей сорта. Почти у всех сортов были индуцированы конгломераты. Самый высокий процент прижившихся меристем наблюдался у сортов: Золотой поток (на всех вариантах питательной среды почти стопроцентная регенерация меристемных эксплантов), Марго (60,0-100%), Новелла (42,9-83,3%), Флорина, Любимое Дутовой, Либерти М, Михсан, а самый низкий темп развития меристем отмечался у сортов: Ст-04-26, Кармен, Щедрость и Орфей. Влияние длительности вегетационного периода на индукцию развития меристемных эксплантов не установлено.

Ключевые слова: яблоня, сорт, эксплант, конгломерат, побег

INTRODUCTION TO THE CULTURE IN VITRO OF APPLE TREE MERISTEM EXPLANTS OF DIFFERENT GENETIC ORIGIN

L.G. Bratkova, N.N. Tsatsenko, M.N. Mashchenko, K.A. Makarov

The research was conducted to optimize the primary media for rootstocks and grafts of apple tree varieties. As a result, it was found that the best time to introduce in vitro apple tree meristems into the culture is February-March. The scheme of the parent material sterilization of annual shoots with resting buds has been worked out. It was found that the development of meristemic tissue occurs most actively in the nutrient media of M 1-3 and M 1-4, and the introduction of activated carbon into the nutrient medium as an antioxidant contributes to the inhibition of phenolic compounds and does not require a new passaging on media. The analysis of the obtained data showed a high dependence of the meristem development on the geno-typic features of the variety. Almost all varieties had induced conglomerates. The highest percentage of meristems that took root was observed in the varieties: Zolotoy potok (on all variants of the nutrient medium, almost one hundred percent regeneration of meristem explants), Margot (60.0-100%), Novella (42,9-83,3%), Florina, Lyubimoe Dutovoy, Liberty M, Mi-khsan, and the lowest rate of meristem development was observed in the varieties: St-04-26, Carmen, Shchedrost, Orfeus. The effect of the growing season duration on the induction of meristem explants has not been established.

Key words: apple tree, variety, explant, conglomerate, shoot

Введение. Плодоводство является традиционной и социально значимой отраслью растениеводства южных регионов страны, развитие которого определяется уровнем развития питомниководческих хозяйств.

Одним из эффективных специальных мероприятий является закладка сада оздоровленным in vitro безвирусным посадочным материалом. Закладка промышленных садов сертифицированными саженцами обеспечивает удешевление посадочного материала и рост его выхода с единицы площади, повышает продуктивность (30,0-45,0%), продлевает сроки эксплуатации. Оздоровление через культуру меристемы in vitro с последующим микрочеренкованием позволяет получать генетически стабильный материал без опасности повышения изменчивости [1, 2, 3]. Метод микроклонального размножения применяется не только в питомниководстве, но и активно используется в селекционном процессе. Использование этого метода позволяет в лабораторных условиях за короткий срок получать большое количество оздоровленного материала и поддерживать его круглый год. Кроме того, использование оздоровленных саженцев ускоряет их переход к репродуктивной фазе развития [4].

Для повышения биологического потенциала актуально создание коллекций современных и районированных сортов и подвоев семечковых культур с новыми качественными характеристиками [5].

У многолетних культур очень низкая воспроизводимость результатов in vitro, которая во многом зависит от генетических особенностей сорта и высокой инфициро-ванности используемого материала при отборе его в полевых посадках. Кроме того, в тканях яблони отмечается высокое содержание фенолов, что ведет к ингибированию ростовых процессов эксплантов.

Цель исследования: оптимизация первичных питательных сред для культивирования in vitro меристем подвоев и привоев яблони. На этом этапе решались следующие задачи: отработка техники стерилизации растительного материала и подбор питательных сред для индукции и развития меристемной ткани подвоев и сортов яблони разного генетического происхождения, определение их регенерационной способности.

Материал и методы исследований. Введение меристем яблони в культуру in vitro проводилось с использованием рекомендаций Н.И. Туровской [6] и др. на базе ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ» в отделе биотехнологии с использованием необходимого оборудования и реактивов. Объектами изучения были 5 подвоев и 16 сортов привоев яблони. В качестве исходного материала использовали апексы верхушек однолетних побегов, в период покоя (февраль-март) и в период активного роста (май-июнь). Всего было высажено 1050 меристемных эксплантов.

Результаты исследований. Основной метод, используемый при клональном микроразмножении растений - активация развития меристем, основывающийся на снятии апикального доминирования. Метод верхушечной меристемы из апикальных зон делящихся клеток многолетних культур включает несколько этапов, у которых наиболее важными являются генотип растений, состав питательных сред, тип первичного экспланта и его стерилизация [6, 7, 8].

Введение меристемной культуры является одним из важнейших этапов в получении оздоровленной стерильной культуры яблони. На этом этапе проявляются основные свойства генотипа, которые будут характеризовать в дальнейшем морфофизиоло-гическую активность.

На первом этапе проводили исследования по установлению оптимального срока введения почек в меристемную культуру; определению оптимальной схемы стерилиза-

ции первичных эксплантов; подбору питательных сред для индукции и культивирования меристемных эксплантов яблони.

С целью повышения результативности введения меристем в культуру in vitro нами испытывались различные варианты стерилизации первичных эксплантов, различающихся по составу стерилизующих агентов, их концентраций, времени стерилизации, а также режимам и этапам стерилизации. Лучшие результаты приживаемости ме-ристемных эксплантов из однолетних побегов с покоящимися почками получены при поэтапной стерилизации. Побеги на 15 минут опускаются в раствор с детергентом с последующей промывкой в течение 120 минут, затем заливаются на 7 минут слабым раствором марганцово-кислого калия, после чего в течение 30 минут промываются в проточной воде. Затем почки побегов срезаются скальпелем с небольшой пяткой, помещаются на 45 секунд в стакан с 70%-ным этанолом (для лучшего смачивания) и перекладываются в стакан с 10%-ным раствором гипохлорида натрия на 10 минут с последующей промывкой в течение 15 минут под проточной водой. Дальнейшие операции по стерилизации осуществляются в ламинарном боксе: почки опускаются в стакан с 7%-ным раствором гипохлорида натрия на 15-17 минут и далее по 5 минут промываются в пяти стаканах с автоклавированной водой.

Успех введения культуры ткани и получение полноценных растений непосредственно связан с оптимизацией питательных сред на каждом этапе технологии. Использование методических рекомендаций различных авторов [1, 2, 8,] по введению мери-стемных эксплантов яблони в культуру не позволило успешно провести этот этап. Приживаемость меристем достигала всего лишь 19%. Меристемы погибали в большей степени от окисления фенольными соединениями. В наших опытах количество феноль-ных соединений наблюдалось выше у эксплантов, вычлененных при весенней вегетации, самый низкий уровень получен при введении эксплантов из покоящихся почек.

Введение в культуру in vitro меристем яблони проводили на 4 различных усовершенствованных нами питательных средах. При этом учитывали зависимость успешности регенерации меристем от наличия фитогормонов и их комбинаций в питательной среде.

В литературных источниках имеются указания на то, что аскорбиновая кислота в составе питательной среды снимает отрицательное действие фенолов яблони при ме-ристемном оздоровлении in vitro. Но использование этого приема требует последующего ежедневного пассирования на свежую среду до момента исчезновения видимых изменений питательной среды. В средах MS1-3 и MS1-4 в качестве антиоксиданта был использован активированный уголь как один из перспективных, на наш взгляд, вариантов адсорбции токсичных веществ, выделяемых при росте мериклонов. В ходе экспериментов было установлено, что введение в питательную среду в качестве антиокси-данта активированного угля способствовало ингибированию фенольных соединений и не требовало нового пассирования на среды, тогда как при использовании в качестве антиоксиданта Vit. C в среде наблюдалось высокое содержание фенолов, что отрицательно повлияло на жизнеспособность меристемных эксплантов. Первичные экспланты культивировали в течение 4-5 недель при 16-часовом фотопериоде и температуре воздуха 26оС.

Анализ эффективности введения в культуру клоновых подвоев яблони (табл. 1) в среднем показал высокий процент приживаемости эксплантов на изучаемых средах. Для подвоев лучшей из сред для развития меристем был вариант MS 1-3 с уменьшен-

ным количеством макро - и микроэлементов, повышенным содержанием Бе-хелата, 6 БАП (1,5 мг/л) и активированным углем (приложение).

Таблица 1 - Эффективность введения в культуру in vitro клоновых _подвоев яблони, %_

№ п/п Клоновый подвой Вариант среды

МБ1-1 МБ1-2 МБ1-3 МБ1-4

1 М 9 60,0 58,8 65,0 35,0

2 СК-2 53,3 67,9 75,0 0,0

3 ММ 102 40,0 60,0 66,7 100

4 М 4 20,0 25,0 50,0 0,0

5 ММ 106 42,9 40,0 60,0 80,0

Наиболее высокий уровень регенерационной способности проявился у подвоев ММ 102 и ММ 106. В отношении жизнеспособности меристемных эксплантов сортов яблони разного происхождения выявлено, что наиболее благоприятными средами на этом этапе были МБ 1-3 и МБ 1-4 (табл. 2).

Таблица 2 - Эффективность введения в культуру in vitro сортов яблони, %

№ п/п Сорт, клон Вариант среды

МБ1-1 МБ1-2 МБ1-3 МБ1-4

1 Новелла 83,3 81,8 42,9 66,7

2 Подарок Ставрополью 40,0 35,7 61,5 33,3

3 Щедрость 0,0 0,0 10,0 20,0

4 Фортуна - - 47,4 88,9

5 Кармен 22,2 20,0 20,0 40,0

6 Михсан 100,0 0,0 60,0 50,0

7 Ст-04-26 0,0 18,6 16,7 31,6

8 Либерти М 50,0 50,0 90,9 20,0

9 Марго 80,0 75,0 60,0 100

10 Орфей 44,4 44,4 20,0 27,8

11 Ст-04-13 40,0 40,0 40,0 47,1

12 Ника - 75,0 - 31,8

13 Любимое Дутовой 45,4 54,5 66,7 66,7

14 Флорина 53,1 71,4 60,0 46,2

15 Золотой поток 100 100 100 89,5

16 Престиж 58,3 42,9 7,8 45,4

Анализ полученных данных показал зависимость развития меристем от геноти-пических особенностей сорта.

Самый высокий процент прижившихся меристем наблюдался у сортов: Золотой поток (на всех вариантах питательной среды почти стопроцентная регенерация меристемных эксплантов), Марго (60,0-100%), Михсан (0,0-100%), Новелла (42,9-83,3%), Либерти М (50,0-90,9%), а самый низкий процент роста и развития меристем отмечался у сортов: Ст-04-26, Кармен, Щедрость и Орфей (0,0-44,4%).

Длительность вегетационного периода сортов не оказала существенного влияния на индукцию развития меристем.

Выводы. В результате исследований выявлено, что лучшим временем для введения в культуру in vitro меристем яблони был февраль-март. В результате исследований отработана схема стерилизации исходного материала однолетних побегов с покоящимися почками, срезанными в феврале: промывка в растворе с детергентом - 15 минут; промывка в проточной воде - 120 минут; промывка в слабом растворе марганцовокислого калия - 7 минут; промывка в проточной воде - 30 минут; вымачивание в 2%-ном растворе индолилмасляной кислоты в течение суток. Далее почки побегов срезаются скальпелем с небольшой пяткой и помещаются в марлевые узелки, после чего они опускаются на 45 секунд в стакан с 70%-ным этанолом (для лучшего смачивания), затем перекладываются в стакан с 10%-ным раствором гипохлорида натрия на 10 минут и промываются под проточной водой - 15 минут. В ламинарном боксе верхушки побегов в марлевых узелках перекладываются в стакан с 7%-ным раствором гипохлорида натрия на 15 минут и промываются в пяти стаканах с автоклавированной водой.

Установлено, что развитие меристемной ткани наиболее активно происходит на питательных средах М 1 -3 и М 1 -4, а введение в питательную среду в качестве антиок-сиданта активированного угля способствует ингибированию фенольных соединений, поэтому не требуется новое пассирование на среды. Анализ полученных данных показал высокую зависимость развития меристем от генотипических особенностей сорта. Почти у всех сортов были индуцированы конгломераты. Самый высокий процент прижившихся меристем наблюдался у сортов: Золотой поток (на всех вариантах питательной среды почти стопроцентная регенерация меристемных эксплантов), Марго (60,0100%), Михсан (0,0-100%), Новелла (42,9-83,3%), Либерти М (50,0-90,9%), а самый низкий процент роста и развития меристем отмечался у сортов: Ст-04-26, Кармен, Щедрость и Орфей (0,0-44,4%). Влияние вегетационного периода сортов на индукцию развития меристемных эксплантов не установлено, что требует дополнительного изучения.

Литература

1. Высоцкий В.А. Культура изолированных тканей и органов плодовых растений: оздоровление и микроклональное размножение //Сельскохозяйственная биология: Ежемесячный научно-теоретический журнал. - М., 1983. № 7. С. 42-47.

2. Кашин В.И., Борисова А.А., Приходько Ю.Н., Суркова О.Ю., Упадышев М.Т. Технологический процесс получения безвирусного посадочного материала плодовых и ягодных культур: Метод. указания. - М., 2001. 100 с.

3. Шипунова А.А. Клональное микроразмножение плодовых растений: автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. с.-х. наук: - М., 2003. 24 с.

4. Долгих С.Г. Размножение и выращивание яблони в корнесобственной культуре //Садоводство и виноградарство. 2004. №5. С. 14-17.

5. Седов Е.Н. Помология: Т. I Яблоня /под общ. ред. акад. РАСХН Е.Н. Седова. - Орел: Издат. ВНИИСПК, 2005. 576 с.

6. Туровская Н.И. Микроразмножение яблони и груши in vitro //Садоводство и виноградарство. 1994. № 1. С. 10-12.

7. Трускинов Э.В. Культура in vitro как современный способ воспроизведения, сохранения и интродукции вегетативно размножаемых растений //Биолог. разнообразие. Интродукция растений. - СПб, 2007. С. 85-86.

8. Матушкина О.В. Оптимизация процессов регенерации при размножении клоновых подвоев и сортов яблони и груши: автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. с.-х. наук: 06.01.07. - Мичуринск, 2008. 22 с.

Приложение

Варианты питательных сред для регенерации меристем яблони_

Компонент среды Вариант среды

МС 1-3 МС 1-4

Макроэлементы - МС, мл/л 50,0 50,0

Микроэлементы - МС, мл/л 1,0 1,0

Бе - хелат, мл/л 15,0 10,0

Витамины, мг/л

Мезоинозит 100,0 100,0

Никотиновая кислота - РР 0,5 0,5

Тиамин HCl - vit. Bj 0,5 0,5

Пиродоксин HCl - vit. B6 0,5 0,5

Vit. C 1,5 1,0

Аминокислоты, мг/л

Глицин - 2,0

Биологически активные вещества, мг/л

6-Бензиламинопурин (БАП) 1,5 2,0

ß-индолил-З-уксусная кислота - 1,0

Феррулловая кислота - 1,0

Другие вещества

Сахароза (г/л) 30,0 30,0

Агар-Агар (г/л) 5,0 5,0

Активированный уголь 0,7 1,0

Браткова Любовь Гавриловна - заведующая отделом, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, отдел биотехнологии, (8 6553) 2-33-91, 8-962024-93-70, 356241, Ставропольский край, Шпаковский район, г. Михайловск, ул. Нико-нова, д. 49. E-mail: bio26@yandex.ru

Цаценко Нионила Николаевна - старший научный сотрудник, кандидат сельскохозяйственных наук, отдел биотехнологии (86553) 2-33-91, 356241, Ставропольский край, Шпаковский район, г. Михайловск, ул. Никонова, д. 49. E-mail: bio26@yandex.ru

Мащенко Марина Николаевна - научный сотрудник, отдел биотехнологии, (86553) 2-33-91, 356241, Ставропольский край, Шпаковский район, г. Михайловск, ул. Никонова, д. 49. E-mail: bio26@yandex.ru

Макаров Константин Анатольевич - младший научный сотрудник, отдел биотехнологии, (86553) 2-33-91, 356241, Ставропольский край, Шпаковский район, г. Михайловск, ул. Никонова, д. 49. E-mail: bio26@yandex.ru

Bratkova Lyubov' Gavrilovna - North Caucasus Federal Agricultural Research Centre (North Caucasus FARC), 49, Nikonov str., Mikhailovsk, Stavropol Territory, 356241, Russia, e-mael: bio26@yandex.ru.

Tsatsenko Nionila Nikolaevna - North Caucasus Federal Agricultural Research Centre (North Caucasus FARC), 49, Nikonov str., Mikhailovsk, Stavropol Territory, 356241, Russia, e-mael: bio26@yandex.ru

Mashchenko Marina Nikolaevna - North Caucasus Federal Agricultural Research Centre (North Caucasus FARC), 49, Nikonov str., Mikhailovsk, Stavropol Territory, 356241, Russia, e-mael: bio26@yandex.ru

Makarov Konstantin Anatol'evich - North Caucasus Federal Agricultural Research Centre (North Caucasus FARC), 49, Nikonov str., Mikhailovsk, Stavropol Territory, 356241, Russia, e-mael: bio26@yandex.ru

DOI: 10.25930/0372-3054/003.1.13.2020 УДК 631.5:633.2.03

ЭФФЕКТИВНОСТЬ УСКОРЕННОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ НИЗКОПРОДУКТИВНЫХ МНОГОЛЕТНИХ КОРМОВЫХ УГОДИЙ

В.Г. Гребенников, И.А. Шипилов, О.В. Хонина

Развитие овцеводства и скотоводства в Ставропольском крае требует создания хорошей кормовой базы, развитие которой невозможно без улучшения природных кормовых угодий (ПКУ), которые остаются основным источником получения зеленого корма, сбалансированного по всем питательным веществам. Однако в последнее время продуктивность таких угодий значительно снизилась из-за увеличения нагрузки на них, отсутствия ухода и бессистемного использования. В этой связи применение технологических методов и приемов выращивания, направленных на повышение продуктивности и эффективности природных кормовых угодий с применением низкозатратных приемов их улучшения, позволит быстро увеличить урожайность таких фитоценозов. Исследования по изучению ускоренного восстановления низкопродуктивных многолетних кормовых угодий были проведены в 2013-2018 гг. (закладка в 2013 и в 2014 гг.) в СПК племзаводе «Дружба» Апанасенковского района Ставропольского края в крайне засушливой зоне. Опытами было установлено, что применение поверхностного улучшения увеличивает производственные затраты совокупной энергии в 1,38-2,38 раза, однако они с лихвой компенсируются дополнительно полученным урожаем, снижением затрат на единицу продукции в 1,9-2,5 раза, повышением рентабельности производства на 57,0-92,0%. Суммарные 5-летние затраты, которые были направлены на выполнение предлагаемой технологии, превышали затраты на контрольном варианте без улучшения травостоя в 1,93-2,52 раза, однако за счет получения дополнительного урожая было получено за 5 лет продукции на сумму 56,0-86,4 тыс. руб., себестоимость 1 т произведенной продукции снизилась с 2801,8 до 2156,8-2704,8 рублей.

Ключевые слова: многолетние травы, бобово-злаковые травосмеси, поверхностное улучшение травостоя, энергетическая и экономическая эффективность

EFFICIENCY OF ACCELERATED RESTORATION OF LOW-PRODUCTIVE PERENNIAL FORAGE LANDS

V.G. Grebennikov, I.A. Shipilov, O.V. Khonina

The development of sheep and cattle breeding in the Stavropol Territory requires the creation of a good fodder base, the development of which is impossible without improving the