Способ и система для анализа спектральных данных
METHOD AND SYSTEM FOR ANALYZING SPECTRAL DATA

Родственная заявка
[1] Настоящая заявка заявляет преимущество предварительной заявки на патент США № 62/281630, поданной 21 января 2016 г., полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.
Предпосылки изобретения
[2] Явления агрегации белков являются широко распространенными на всех этапах промышленного биопроцесса. Экспрессия, выделение и очистка белков являются дорогостоящими, что обусловлено их комплексными физико-химическими характеристиками. Агрегация считается основным путем разрушения белков, иногда обуславливая иммуногенность, образование антител к лекарственному средству (ADA) у пациентов и потерю эффективности. Выявление и определение белковых агрегатов является основной задачей в биофармацевтической отрасли и других областях научно-исследовательской деятельности. Образование белковых агрегатов имеет важное значение в промышленных областях применения, поскольку они могут в значительной степени влиять на производство белковых терапевтических средств (т.е. биологических препаратов или биоаналогичных препаратов), существенно снижая показатели выхода продукта.
Сущность изобретения
[3] Рассматриваемая технология проиллюстрирована, например, в соответствии с различными аспектами, описанными ниже. Различные примеры аспектов рассматриваемой технологии описаны ниже. Они представлены в качестве примеров и не ограничивают рассматриваемую технологию.
[4] В аспектах рассматриваемой технологии представлен способ определения агрегации в белковом, пептидном и/или пептоидном составе в растворе или лиофилизированном состоянии без применения зондов или добавок.
[5] В соответствии с аспектами рассматриваемой технологии образец белка подвергают спектроскопическому анализу, и спектральные данные анализируют с помощью общепринятого способа для определения жизнеспособности образца белка. Способ и/или его части можно полностью автоматизировать и применять для определения механизма агрегации.
[6] В соответствии с аспектами рассматриваемой технологии способы, описанные в данном документе, можно применять в отношении мембранных белков, гидрофильных белков, пептидов и пептоидов в качестве единственного компонента или в двухкомпонентных или трехкомпонентных смесях с другими пептидами или смесях с липидами. При нахождении в смесях один из компонентов должен быть изотопно меченным для обеспечения одновременного выявления каждого компонента.
[7] Аспекты рассматриваемой технологии допускают гибкость подготовки образцов, ее потенциал автоматизации и анализ данных, которые доказывают ее полезность для получения фармацевтических белковых составов.
[8] В соответствии с аспектами рассматриваемой технологии способы, описанные в данном документе, можно применять в отношении любого образца белка, пептида или пептоида в некоторых водных или жидких средах. Способы, описанные в данном документе, можно применять для качественного и/или количественного определения агрегации белков. Осуществляют анализ данных, посредством которого определяют механизм агрегации белков и можно определить стабильность и/или жизнеспособность белка, пептида или пептоида.
[9] В соответствии с одним аспектом рассматриваемой технологии способ предусматривает трансмиссионную инфракрасную спектроскопию с преобразованием Фурье («FT-IR») и/или спектроскопию нарушенного полного внутреннего отражения («ATR»), квантово-каскадную лазерную микроскопию («QCL»), двумерную корреляционную спектроскопию («2DCOS») и/или двумерную спектроскопию совместного распределения («2DCDS») для анализа этих белков, пептидов или пептоидов. В соответствии с аспектами рассматриваемой технологии спектральные данные можно получать с помощью любого подходящего способа и оборудования, такого как FT-IR-спектрометр, FT-IR-микроскоп, QCL-спектрометр или QCL-микроскоп. В аспектах рассматриваемой технологии предпочтительно получать спектральные данные с помощью QCL-микроскопа.
[10] Способы, системы и инструкции для обработки данных, представляющих собой характеристику белков, пептидов и/или пептоидов, могут включать в себя: получение спектральных данных о белках, пептидах и/или пептоидах в соответствии с приложенным возмущением; применение анализа двумерного совместного распределения для построения асинхронного графика совместного распределения для белков, пептидов и/или пептоидов; идентификацию на асинхронном графике совместного распределения кросс-пика, коррелирующего с автопиком, ассоциированным с агрегацией белков, пептидов и/или пептоидов; и использование кросс-пика для определения порядка распределения наличия спектральных интенсивностей в соответствии с приложенным возмущением.
1
2
1
2
1
2
2
1
[11] Использование кросс-пика может включать: определение для двух волновых чисел ν и ν того, имеет ли кросс-пик, соответствующий двум волновым числам, положительное значение; и в случае, если кросс-пик имеет положительное значение, определение того, что наличие спектральной интенсивности при ν распределено в более низком интервале приложенного возмущения, чем интервал, в котором распределено наличие спектральной интенсивности при ν. Использование кросс-пика может включать: определение для двух волновых чисел ν и ν того, имеет ли кросс-пик, соответствующий двум волновым числам, отрицательное значение; и в случае, если кросс-пик имеет отрицательное значение, определение того, что наличие спектральной интенсивности при ν распределено в более низком интервале приложенного возмущения, чем интервал, в котором распределено наличие спектральной интенсивности при ν.
[12] Операции могут включать в себя: применение двумерного корреляционного анализа для построения синхронного графика для белков, пептидов и/или пептоидов; идентификацию на синхронном графике синхронных пиков, ассоциированных с агрегацией белков, пептидов и/или пептоидов; и использование синхронных пиков для определения степени перекрывания схем распределения спектральных интенсивностей в соответствии с приложенным возмущением.
[13] Операции могут также включать в себя: применение двумерного корреляционного анализа с построением синхронного графика и асинхронного графика для белков, пептидов и/или пептоидов; идентификацию на синхронном графике положительных кросс-пиков, коррелирующих с автопиками, ассоциированными с агрегацией белков, пептидов и/или пептоидов; и использование интенсивностей идентифицированных пиков в спектральных данных для определения величины агрегации белков, пептидов и/или пептоидов.
[14] Величину агрегации белков, пептидов и/или пептоидов можно сравнивать с порядком распределения наличия спектральных интенсивностей в соответствии с приложенным возмущением. Можно распознавать области, представляющие интерес, для установления различий между твердыми частицами и раствором. Можно определять размер и количество твердых частиц для установления распределения популяции твердых частиц. Можно анализировать спектральные данные для проверки соотношения сигнал/шум, осуществления поправки на фоновый уровень, определения содержания водяного пара и/или определения интенсивности сигнала в области спектра. На основании возмущения образца можно получить данные ковариационного или динамического спектра. В спектральных данных можно установить корреляцию между изменениями, охватывающими интенсивности пиков, которые совпадают по фазе друг с другом согласно полученному на синхронном графике. Можно определить элементы, изменяющиеся в спектральных данных. Можно определить наибольшее общее изменение интенсивности в спектральных данных. Можно определить наименьшее общее изменение интенсивности в спектральных данных. Можно определить минимальное количество основных спектральных вкладов в полосе, осуществляя анализ по методу подбора кривой, и состав вторичной структуры образца. В спектральных данных можно установить корреляцию между изменениями, охватывающими интенсивности пиков, которые не совпадают по фазе друг с другом согласно полученному на асинхронном графике.
[15] Дополнительные признаки и преимущества рассматриваемой технологии будут изложены ниже в настоящем описании и частично будут очевидны из настоящего описания или могут быть изучены при практическом осуществлении рассматриваемой технологии. Преимущества рассматриваемой технологии будут реализованы и достигнуты с помощью структуры, особым образом указанной в письменном описании и формуле изобретения в данном документе, а также в прилагаемых графических материалах.
[16] Следует понимать, что как предшествующее общее описание, так и нижеследующее подробное описание являются приводимыми в качестве примера и пояснительными и подразумевают предоставление дополнительного пояснения заявляемой рассматриваемой технологии.
Краткое описание графических материалов
[17] Прилагаемые графические материалы, включенные для обеспечения дополнительного понимания рассматриваемой технологии и включенные в состав и составляющие часть настоящего описания, иллюстрируют аспекты рассматриваемой технологии и вместе с настоящим описанием служат для пояснения принципов рассматриваемой технологии.
[18] На фиг. 1А, 1В и 1С показаны результаты выполнения независимых друг от друга биоаналитических методик, применяемых для определения агрегации белков в соответствии с некоторыми аспектами рассматриваемой технологии. На фиг. 1А показан результат эксклюзионной хроматографии («SEC»). На фиг. 1В показан результат дифференциальной сканирующей калориметрии («DSC»). На фиг. 1С показан результат динамического рассеяния света («DLS»).
[19] На фиг. 2 показана блок-схема, на которой указаны различные фазы способа в соответствии с некоторыми аспектами рассматриваемой технологии.
[20] На фиг. 3 показаны результаты многостадийного анализа.
[21] На фиг. 4 показана диаграмма, представляющая приводимую в качестве примера вычислительную систему в соответствии с некоторыми аспектами рассматриваемой технологии.
[22] На фиг. 5 показана блок-схема, на которой указаны операции приводимого в качестве примера способа в соответствии с некоторыми аспектами рассматриваемой технологии.
[23] На фиг. 6 показана блок-схема, на которой указаны операции приводимого в качестве примера способа в соответствии с некоторыми аспектами рассматриваемой технологии.
[24] На фиг. 7 показаны результаты многостадийного анализа.
[25] На фиг. 8А показано сравнение аминокислотных последовательностей-кандидатов фрагментов ADC для оценки возможности разработки. Фрагмент ADC 0 («ADC0»; SEQ ID NO: 1) представляет собой полноразмерный фрагмент, содержащий дополнительные 7 аминокислот (APELLGG; SEQ ID NO: 2) на N-конце. Фрагмент ADC 1 («ADC1»; SEQ ID NO: 3) усечен на N-конце и, подобно верхнему фрагменту, содержит 1 дисульфидный мостик. Фрагмент ADC 2 («ADC2»; SEQ ID NO: 4) имеет две точечные мутации (L5C/K97C) по сравнению с фрагментом ADC 1, поэтому в него при этом добавлен дополнительный дисульфидный мостик для стабилизации фрагмента ADC 2.
31
91
[26] На фиг. 8В показана ленточная модель Ричардсон, содержащая главным образом β-листы, β-изгибы и шарниры, а также 2 короткие спирали во фрагменте ADC. Показаны N-конец, С-конец, 3 Arg в положениях 25, 62 и 71, соседние остатки Pro в положениях 27 и 61, а также дисульфидная связь между Cys и Cys. Эти 3 аргининовых остатка служат в качестве внутренних зондов для ADC.
2
[27] На фиг. 9А и 9В показаны размер и принадлежность агрегатов. На фиг. 9А показано наложение инфракрасных спектров в QCL для ADC0 и ADC1. На фиг. 9В показаны графики соответственно для 24°С и 28°С. Все фрагменты ADC были полностью подвергнуты обмену Н→D. Кроме того, максимум полосы амида I при 24°С соответствует агрегированному ADC1, тогда как при 28°С максимум соответствует ADC1 в растворе DO.
[28] На фиг. 10 показаны результаты анализа совместного распределения. В механизме агрегации участвуют аргининовые остатки и отдельные антипараллельные β-листы и β-изгибы в белке. Таким образом, данный анализ предоставляет информацию об области белка, которая вызывает агрегацию.
[29] На фиг. 11А показаны изображения, полученные с помощью QCL-микроскопа, а на фиг. 11В показаны соответствующие QCL-спектры фрагмента ADC 2 в 15% сахарозе. Их можно использовать для подтверждения наличия и количества как наполнителя, так и белка-кандидата.
-1
[30] На фиг. 12А, 12В и 12С показаны результаты спектрального анализа по методу QCL, полученные для ADC2 в HEPES при рН 6,6 в присутствии NaCl и различных количеств сахарозы (фиг. 12А: 15% сахароза, фиг. 12В: 30% сахароза, и фиг. 12С: 60% сахароза) в качестве наполнителя при 26°С в области спектра 1400-1800 см. Эти результаты демонстрируют степень, в которой можно осуществлять количественный анализ, предоставляя критически важную информацию, которую трудно получить в иных случаях. Стабильность и конформацию белка можно подтвердить в желаемых условиях содержания наполнителя, которые при этом также позволяют определить концентрацию белка, представляющего интерес, и его наполнителя в растворе. Кроме того, в этих условиях для ADC2 образование частиц агрегатов не наблюдалось.
[31] На фиг. 13 показаны результаты анализа нормального распределения, осуществленного в 43 экспериментах с помощью QCL-микроскопа в различных условиях. Организация экспериментов согласно QbD заключалась в анализе 324 наборов спектральных данных, представляющем собой оценивание фрагмента ADC 2 в присутствии различных количеств NaCl, сахарозы и различных соотношений обоих наполнителей (т.е. NaCl и сахарозы).
[32] На фиг. 14 показаны результаты поэтапного подбора модели по принципу DOE, включающие прогностические профили спектральных данных об ADC2, полученных с помощью QCL-микроскопии, при использовании второй наилучшей подобранной модели (AIC-модели).
[33] На фиг. 15 показаны результаты поэтапного подбора модели по принципу DOE, включающие прогностические профили спектральных данных об ADC2, полученных с помощью QCL-микроскопии, при использовании наилучшей подобранной модели (BIC-модели). Результаты позволяют предположить, что 18,5% сахароза является наилучшим наполнителем для ADC2 в условиях температуры, близкой к комнатной.
-1
[34] На фиг. 16А и 16В показаны графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров (фиг. 16А: синхронный, FIG. 16В: асинхронный), для фрагмента ADC 2 в присутствии HEPES и 15% сахарозы в диапазоне температур 26-28°С. Полосы амида I и боковых цепей исследовали в области спектра 1720-1500 см. На синхронном графике (фиг. 16А) наблюдали, что ADC2 имеет во вторичной структуре главным образом β-листы и β-изгибы при отсутствии частиц агрегатов.
[35] На фиг. 17 показан последовательный порядок событий для фрагмента ADC 2 в 50 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ KCl и 15% сахарозе при рН 6,6 и температуре 26°С, используемый для подтверждения роли сахарозы в стабилизации белка.
[36] На фиг. 18А и 18В показаны графики для 2D-анализа совместного распределения в IR-спектре (фиг. 18А: синхронный, фиг. 18В: асинхронный) ADC2 в HEPES и 15% сахарозе в качестве наполнителя в диапазоне температур 26-28°С. Боковые цепи наряду с π-спиралью и β-изгибами (шарнирными петлями) подвергали возмущению при низких температурах.
2
[37] На фиг. 19 показан типичный анализ по методу подбора кривой с использованием отнесений полос, полученных в корреляционном 2D-анализе IR-спектров, для фрагмента ADC 2 в DO, для которого было определено, что 80,4+/- 1,1% белка имеет β-структуру (см. также таблицы 2 и 3).
-1
2
[38] На фиг. 20А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы амида I, II и III для mAb NIST при 50 мг/мл в средней IR-области спектра 1750-1400 см, сбор данных о которых проводили в диапазоне температур 24-60°С в HO.
[39] На фиг. 20В и 20С показаны графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров (фиг. 20В: синхронный, фиг. 20С: асинхронный) для образца из фиг. 16А.
-1
2
[40] На фиг.21А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы как амида I, так и амида II для mAb NIST при 50 мг/мл в средней IR-области спектра 1750-1500 см, сбор данных о которых проводили в диапазоне температур 24-60°С в НО.
[41] На фиг. 21В и 21С показаны графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров (фиг. 21В: синхронный, фиг. 21С: асинхронный) для образца из фиг. 21А.
2
[42] На фиг. 22 показан последовательный порядок событий для mAb NIST при 50 мг/мл в HO в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С.
2
[43] На фиг. 23 показан асинхронный график для 2D-анализа совместного распределения в IR-спектре mAb NIST при 50 мг/мл в HO в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С.
[44] На фиг. 24А, 24В, 24С и 24D показаны воспроизведенные изображения графиков из фиг. 21А, 21В, 21С и 22 соответственно с добавлением вертикальных пунктирных линий, пересекающих автопики на синхронных графиках для корреляционного 2D-анализа IR-спектров (фиг. 24В).
-1
2
[45] На фиг. 25А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы как амида I, так и амида II для BSA при 40 мг/мл в средней IR-области спектра 1750-1500 см, сбор данных о которых проводили в диапазоне температур 24-60°С в HO.
[46] На фиг. 25В и 25С показаны графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров (фиг. 25В: синхронный, фиг. 25С: асинхронный) для образца из фиг. 25А.
2
[47] На фиг. 26 показан последовательный порядок событий для BSA при 40 мг/мл в HO в условиях теплового стресса (24-60°С).
2
-1
[48] На фиг. 27 показан асинхронный график для 2D-анализа совместного распределения в IR-спектре BSA при 40 мг/мл в HO в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С и в области спектра 1750-1380 см.
-1
2
[49] На фиг. 28А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы как амида I, так и амида II для смеси mAb NIST/BSA (молярное соотношение 1:2) в области спектра 1750-1500 см, сбор данных о которых проводили в диапазоне температур 24-60°С в HO.
[50] На фиг. 28В и 28С показаны графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров (фиг. 28В: синхронный, фиг. 28С: асинхронный) для образца из фиг. 28А.
-1
2
[51] На фиг. 29А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы как амида I, так и амида II для лизоцима при 600 мг/мл в области спектра 1750-1500 см, сбор данных о которых проводили в диапазоне температур 24-60°С в HO.
[52] На фиг. 29В и 29С показаны графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров (фиг. 29В: синхронный, фиг. 29С: асинхронный) для образца из фиг. 29А.
[53] На фиг. 30 показан последовательный порядок событий для лизоцима при 600 мг/мл в H2O в условиях теплового стресса (24-60°С).
2
-1
[54] На фиг. 31 показан асинхронный график для 2D-анализа совместного распределения в IR-спектре лизоцима при 600 мг/мл в HO в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С и в области спектра 1750-1500 см.
[55] На фиг. 32 показана приводимая в качестве примера схема вычислительной системы.
Подробное описание
[56] В нижеследующем подробном описании изложены конкретные детали для обеспечения понимания рассматриваемой технологии. Тем не менее, среднему специалисту в данной области будет очевидно, что рассматриваемую технологию можно осуществлять на практике без некоторых из этих конкретных деталей. В иных случаях хорошо известные структуры и методики не были показаны подробно, чтобы не затмевать рассматриваемую технологию.
[57] Белки являются крупными органическими соединениями, образованными аминокислотами, расположенными в виде линейной цепи и соединенными друг с другом пептидными связями между карбоксильными группами и аминогруппами прилежащих аминокислотных остатков. Большинство белков сворачиваются в уникальные 3-мерные структуры. Форма, в которую белок сворачивается в естественных условиях, известна как его нативное состояние. Хотя многие белки могут сворачиваться самостоятельно, попросту благодаря химическим свойствам их аминокислот, другие требуют помощи молекулярных шаперонов для сворачивания в их нативные состояния. Существует четыре различных аспекта структуры белка.
• Первичная структура: аминокислотная последовательность.
• Вторичная структура: регулярно повторяющиеся локальные структуры, стабилизированные водородными связями. Поскольку вторичные структуры являются локальными, то в одной и той же молекуле белка может присутствовать много областей с разной вторичной структурой.
• Третичная структура: общая форма отдельной молекулы белка; пространственное взаимное расположение вторичных структур друг относительно друга.
• Четвертичная структура: форма или структура, образующаяся в результате взаимодействия нескольких молекул белка, обычно называемых в данном случае белковыми субъединицами, которые функционируют в качестве части более крупной сборки или белкового комплекса.
[58] Белки не являются полностью жесткими молекулами. В дополнение к этим уровням структуры, белки могут переключаться между несколькими взаимосвязанными структурами, осуществляя при этом свою биологическую функцию. В контексте этих функциональных перестроек эти третичные или четвертичные структуры обычно называются «конформациями», и переходы между ними называются конформационными изменениями.
[59] Агрегация белков характеризуется как группирование неправильно свернутых жестких молекул белков, которое считается широко распространенным явлением на всех этапах промышленного биопроцесса. Агрегация считается основным путем разрушения белков, часто обуславливая иммуногенность белка и потерю биологической активности. Агрегация белков является критически важной в широком спектре биомедицинских ситуаций в диапазоне от аномальных болезненных состояний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, до получения, обеспечения стабильности и доставки белковых лекарственных средств. Агрегация белков, которая по своей природе может быть аморфной или фибриллярной, может начинаться благодаря одному из двух механизмов: А) аутоагрегации, при которой частично свернутые промежуточные соединения являются непосредственными предшественниками для агрегации, и В) гетероагрегации, при которой агрегация одного белка опосредуется другим белком.
[60] Образование белковых агрегатов является критически важным в промышленных областях применения, поскольку оно может в высокой степени влиять на получение белковых лекарственных средств или коммерческих ферментов, значительно снижая показатели выхода продукта. Отрасль производства биологических препаратов и биоаналогичных препаратов участвует в исследовании, разработке и производстве комплексных лекарственных средств, включающих в себя белковые терапевтические средства. Эффективность исследования и разработки может быть нежелательно низкой, что увеличивает затраты на разработку лекарственных средств в связи с высоким коэффициентом потерь белковых терапевтических средств. На стоимость разработки белковых терапевтических средств значительно влияют неудачи на поздней стадии. Одним из способов снижения затрат на исследование и разработку является осуществление ряда процедур оценивания белкового терапевтического средства-кандидата в ранней фазе исследования и разработки. Осуществляя определение характеристик терапевтического белка в различных условиях составления и под воздействием различных факторов, вызывающих стресс, в ранней фазе исследования и разработки, получают прогностический профиль терапевтического средства-кандидата для оценки риска агрегации белка. Данный подход был определен как оценка возможности разработки. Данная оценка может предоставлять важную информацию для принятия решений, как, например, при выборе белковых терапевтических средств-кандидатов для дальнейшей разработки. В случаях, когда происходит агрегация белков, белковое терапевтическое средство, как правило, обладает сниженной эффективностью и может вызывать иммунный ответ. В тяжелых случаях такой иммунный ответ может быть смертельным.
[61] В прошлом было предложено несколько способов для определения агрегатов в смесях. Эти прежние способы разработаны для конкретного белка или пептида и/или требуют добавления чужеродного зонда и поэтому не представляют обобщенный способ с универсальным применением в отношении класса биологических молекул. Использовали некоторые спектроскопические методики, такие как спектроскопия в UV- и видимой областях спектра с использованием зондов и флуоресцентная спектроскопия, в которой также используются внутренние или экзогенные зонды. Аналогичным образом использовали круговой дихроизм в ближней UV-области спектра («CD»), но он ограничен выявлением агрегата в непосредственной близости от него, и для выявления агрегации белка по появлению расширения полосы можно использовать ядерный магнитный резонанс («NMR»). Для идентификации степени олигомеризации также можно применять седиментационный анализ, при условии, что белок, представляющий интерес, имеет достаточно большой коэффициент молярной экстинкции. С помощью хроматографических методик, таких как исключение по размеру, также можно выявлять наличие белковых агрегатов. Однако эти методики могут требовать использования экзогенных зондов, больших количеств белка, являются времязатратными, и ни одна из них не позволяет определить механизм агрегации.
[62] Проблема агрегации белков является сложной и зачастую предусматривает несколько различных химических и/или вычислительных процессов, трудных для понимания. Агрегация может быть вызвана стрессом и предусматривает физические или химические изменения, такие как перемешивание, окисление, дезаминирование и температурные изменения. Даже незначительное изменение рН, условий содержания солей, концентрации белка или условий составления также могут вызывать агрегацию белков. Агрегация опять-таки приводит к снижению показателей выхода продукта, потере эффективности белкового терапевтического средства и проблемам безопасности, связанным с рисками иммуногенности. Доступные в настоящее время методики оценки агрегации не затрагивают все факторы, участвующие в процессе, такие как размер, принадлежность, механизм и степень агрегации, а также стабильность белкового терапевтического средства в растворе. Было разработано несколько методик, затрагивающих размер агрегата или твердой частицы, однако все же с их помощью нельзя определить принадлежность. С помощью других методик можно определить размер и принадлежность агрегатов, но нельзя определить степень агрегации. Боковые цепи аминокислот, присутствующих в белке, вносят важный вклад в стабильность белков. Однако все же взаимосвязь между слабыми химическими взаимодействиями, наблюдаемыми в боковых цепях, и стабильностью вторичной структуры белка нельзя определить с помощью стандартных настольных инструментов в рамках высокопроизводительного способа.
[63] Стабильность белкового терапевтического средства также является критически важной для разработки лекарственных средств и не может быть охарактеризована в полной мере путем простого определения температуры теплового перехода белка. Для понимания стабильности белковых терапевтических средств и разрешения вопросов, связанных с ней, требуется более высокий уровень понимания. Например, будет полезным понимание 1) относительной стабильности доменов в белке, представляющем интерес, 2) того, какой вклад вносят боковые цепи аминокислот в стабильность доменов, 3) того, участвуют ли боковые цепи аминокислот в механизме агрегации, и 4) того, может ли наполнитель стабилизировать слабые взаимодействия (например, в боковых цепях аминокислот) в критически важных областях в конкретных доменах белкового терапевтического средства. Существует пробел в понимании параметров, имеющих важное значение для определения механизма агрегации белков.
[64] При независимом применении коммерчески доступных в настоящее время методик проблемой являются различия в чувствительности доступных методик. Как правило, такие методики сосредоточены на определении размера, чистоты и стабильности белкового терапевтического средства, а также оценивании наличия или отсутствия белковых агрегатов или твердых частиц в составе для достижения однородности характеристик от партии к партии.
[65] Существует потребность в технологии, которую можно применять для лучшей оценки возможности разработки белковых терапевтических средств и для оценок сопоставимости, требуемых для поддержания и обеспечения целостности, эффективности и безопасности продукта. Такой способ должен быть признан в качестве подходящего для обеспечения целостности, эффективности и безопасности продукта Центром по оценке лекарственных средств («CDER»), являющимся подразделением Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов («FDA»), и другими соответствующими контролирующими органами.
[66] Решение проблемы агрегации белков в биофармацевтической отрасли приведет к: (1) уменьшению затрат на R&D, (2) увеличению показателей выхода продукта с обеспечением таким образом его предложения и спроса на него, (3) снижению риска изъятия из продажи, (4) увеличению уровней одобрения FDA, (5) уменьшению срока вывода на рынок и (6), в свою очередь, увеличению его оценки стоимости. Портфель разработок новых белковых терапевтических средств также имеет своей целью разрешение вопросов, связанных с лечением рака и хронических заболеваний, таких как, помимо прочего, ревматоидный артрит, болезнь Крона и нейродегенеративные нарушения, с улучшением таким образом качества жизни пациентов.
[67] В аспектах рассматриваемой технологии представлена быстрая, точная и воспроизводимая методика определения размера, принадлежности, механизма и степени агрегации и стабильности белкового терапевтического средства или другого химического вещества в рамках одного эксперимента. Аспекты рассматриваемой технологии касаются оценки сопоставимости различных белковых терапевтических средств-кандидатов и оценки возможности разработки белковых терапевтических средств-кандидатов. Данные можно использовать для классификации и определения химических характеристик белков, полимеров, органических материалов, неорганических материалов для изыскания, исследования и разработки в полупромышленном масштабе или для производства или для целей контроля качества и предоставления гарантии. Также это используют для оценки стабильности при хранении и доставке белкового терапевтического средства.
[68] Вычислительные способы и системы, описанные в данном документе, обеспечивают значительные улучшения по сравнению с существующим анализом белков. В вычислительных способах и системах, описанных в данном документе, происходит получение и хранение данных в формах, облегчающих эффективный и целенаправленный анализ, не требующий использования нескольких единиц оборудования. Соответственно, вычислительные способы и системы, описанные в данном документе, могут улучшать эффективность анализа спектральных данных для оценивания лекарственных средств-кандидатов.
[69] Аспекты рассматриваемой технологии включают применение двумерной корреляционной спектроскопии («2DCOS») и двумерной спектроскопии совместного распределения («2DCDS») для получения существенной информации о степени и механизме агрегации белкового терапевтического средства. Способы, описанные в данном документе, могут включать анализ колебательных мод боковых цепей в качестве внутренних зондов, предоставляющий информацию, подтверждающую стабильность структурного мотива или домена в белках. Было показано, что способы, описанные в данном документе, являются применимыми в высокопроизводительной оценке возможности разработки и сопоставимости («НТ-DCA») с использованием подхода «планирование эксперимента» («DOE»), соответствующего принципу «качество через разработку» («QBD»).
[70] Согласно некоторым вариантам осуществления системы и способы, описанные в данном документе, также можно применять для определения белок-белковых взаимодействий («PPI») или взаимодействий белков и макромолекул (взаимодействий белков и липидов, белков и ДНК или белков и РНК или взаимодействий белков и лекарственных средств). Системы и способы, описанные в данном документе, также можно применять для анализа органических растворов, полимеров, гелей, наноструктур или мелких жидких кристаллов и т.д.
[71] На фиг. 1А показан результат эксклюзионной хроматографии («SEC»), на фиг. 1В показан результат дифференциальной сканирующей калориметрии («DSC»), а на фиг. 1С показан результат динамического рассеяния света («DLS»). Эти методики могут приводить к определению размера, принадлежности и степени агрегации, но ни одна из них не обеспечивает определение механизма агрегации. Понимание механизма агрегации является основополагающим для разработки белкового лекарственного средства, которая обеспечит его способность к действию надлежащим образом с небольшим риском иммуногенности или при его отсутствии.
[72] Согласно некоторым вариантам осуществления, например, показанным на фиг. 2, образцы из разных частей биопроцесса, которые могут быть водными или лиофилизированными, подвергают мониторингу с помощью инфракрасной спектроскопии (ATR или трансмиссионной) с преобразованием Фурье («FT-IR») и анализируют с помощью 2DCOS с целью поиска агрегатов. Можно использовать другие типы анализа, такие как рамановская спектроскопия, спектроскопия поглощения излучения квантово-каскадного лазера, инфракрасная микроскопия с преобразованием Фурье с использованием источника синхротронного излучения и/или их комбинации. В случае обнаружения агрегатов можно начать процедуру оценивания, которая может включать сравнение результатов с хорошо известной базой данных, и в результате этого можно модифицировать или изменить протокол, используемый в биопроцессе. FT-IR-спектроскопия обеспечивает высокую степень гибкости и скорости определения белковых агрегатов с ограниченным числом манипуляций и без использования экзогенных зондов. Приводимый в качестве примера способ может включать в себя FT-IR-спектроскопию в сочетании с 2DCOS, позволяющую проводить определение наличия агрегатов, определение механизма агрегации, что позволяет скорректировать конвейерный процесс производства белка для того, чтобы вновь получить жизнеспособный белок. Другой приводимый в качестве примера способ может включать в себя квантово-каскадную лазерную микроскопию в сочетании с 2DCOS, позволяющую проводить определение наличия агрегатов, определение механизма агрегации, что позволяет скорректировать конвейерный процесс производства белка для того, чтобы вновь получить жизнеспособный белок. В дополнение, также можно определить тепловой переход белка и построить график 2DCOS для сравнения с хорошо известным жизнеспособным белком, что обеспечивает контроль качества, стабильность и жизнеспособность желаемого белкового продукта. Кроме того, простота подготовки образцов и анализа данных позволяет автоматизировать данный способ.
[73] FT-IR-спектроскопия является чувствительной к конформационным изменениям и агрегации. Эта методика позволяет проводить качественный и количественный анализ степени агрегации белков, пептидов и пептоидов. Применение 2DCOS позволяет проводить дальнейший анализ и предоставляет информацию о механизме, связанную с процессом агрегации. Способ может включать в себя одну или более следующих методик: трансмиссионную FT-IR-спектроскопию, FT-IR-спектроскопию нарушенного полного внутреннего отражения («ATR»), анализ по методу 2DCOS и/или анализ по методу 2DCDS.
2
[74] В трансмиссионной FT-IR-микроскопии или QCL-микроскопии подготовка образцов может предусматривать использование чистого белка, пептида или пептоида в соответствующем буфере. Образец можно лиофилизировать и ресуспендировать в DO. Раствор белка можно нанести между предметным и покровным стеклом и запечатать для предотвращения испарения растворителя. Предметное стекло может быть установлено в штативе для предметных стекол. Аналогичную процедуру применяют для эталона с использованием соответствующего буфера (PBS или HEPES). Температурный зонд, расположенный в непосредственном контакте с предметным стеклом, используют для регистрации температуры образца. Можно использовать временной градиент температуры, и собираемые спектральные данные получают в автоматическом режиме с помощью интерфейса для термопары. В ходе спектрального анализа можно определить полную ширину на половине высоты (FWHH) для полосы амида I в зависимости от температуры для установления температуры перехода.
2
2
[75] Для исследований водородно-дейтериевого обмена, экспериментов по титрованию и определения ориентации восстановленных мембранных белков можно применять FT-IR-спектроскопию нарушенного полного внутреннего отражения (ATR). В этом способе белок может быть полностью подвергнут обмену путем многократной лиофилизации и повторного растворения образца в DO. Образец белка, полностью подвергнутого замене, и буфер можно независимо распределять по поверхности в виде пленки, где буфер считается эталоном. Как правило, образец белка в DO распределяют по поверхности кристалла для ATR, и ему позволяют высохнуть, используя продувку сухим воздухом. Полученный в результате спектр будет характеризовать образец белка, а также, в случае наличия, агрегированную форму белка.
2
2
2
[76] Согласно некоторым вариантам осуществления спектральные данные можно получить с помощью любого подходящего способа, такого как один или более из вышеописанных способов. Молекула, подлежащая анализу, при необходимости может быть представлена в растворе с растворителем, таким как вода или DO. Концентрация молекулы, подлежащей анализу, в растворе предпочтительно находится в диапазоне, обеспечивающем сильный сигнал от молекулы по сравнению с любым сигналом от растворителя (например, воды) или других компонентов образца (т.е. подходящее соотношение сигнал/шум), что может облегчить дальнейший анализ, описанный в данном документе. Концентрация молекулы белка или пептида, которая будет обеспечивать желаемое соотношение сигнал/шум, как правило, связана с размером белка или пептида и пропорциональна ему. Предпочтительные концентрации обеспечивают надлежащее соотношение сигнал/шум для анализа. Например, как описано далее в данном документе, образец может облегчать анализ спектров молекулы, представляющей интерес, без необходимости в вычитании спектров, присущих растворителю (например, воде или DO) или другим компонентам образца. Например, в случае с IgG или другим белком размером приблизительно 150 кДа образец может содержать белок в концентрации от приблизительно 50 мг/мл до приблизительно 150 мг/мл. Количество белка можно изменять в этом диапазоне пропорционально размеру белка, представляющего интерес, например, BSA размером приблизительно 67 кДа можно анализировать в растворе при концентрации от приблизительно 25 мг/мл до приблизительно 75 мг/мл. Образец может быть представлен в кювете, имеющей длину пробега. Длина пробега может быть большей (например, 30-50 мкм, предпочтительно приблизительно 40 мкм) для DO и меньшей (например, 4-12 мкм) для воды.
[77] Согласно некоторым вариантам осуществления спектральный анализ можно осуществлять постадийно, например, как проиллюстрировано на фиг. 3. Способ, проиллюстрированный на фиг. 3, может включать стадии, осуществляемые в качестве по меньшей мере части стадии «анализа по методу 2DCOS/2DCDS», проиллюстрированного на фиг. 2.
[78] Согласно некоторым вариантам осуществления образец белка подвергают возмущению (тепловому, химическому, обусловленному давлением или акустическому), вызывающему динамическую флуктуацию в спектре колебаний. На стадии 310 можно собирать и/или анализировать необработанные спектральные данные. Спектральные данные можно собирать с равными температурными интервалами и последовательно. Согласно некоторым вариантам осуществления в данные можно внести поправку на фоновый уровень.
[79] Согласно некоторым вариантам осуществления спектральные данные можно использовать для определения существования агрегированной формы белка, пептида или пептоида. Для этого первый спектр вычитают из последующих спектров с получением динамического спектра. На стадии 320 можно получить ковариационные (разностные) спектры путем вычитания первого спектра (24°С) из всех последующих спектров. Соответственно, ковариационные (разностные) спектры содержат положительные и отрицательные пики; также называемые совпадающими и не совпадающими по фазе друг с другом.
[80] Примечательно, что в способе, описанном в данном документе, не требуется вычитание данных о воде или другом эталоне (например, растворителе) из спектральных данных вручную. Такое вычитание вручную является крайне субъективным этапом, зачастую требующимся в спектральном анализе белков. Вместо этого в способе, описанном в данном документе, получают набор разностных спектральных данных на основании возмущения образца, представляющего интерес. Его результат можно затем использовать в дальнейшем анализе. При вычитании первого спектра, характеризующегося перекрыванием полосы воды и полосы амида I, из всех последующих спектров автоматически вычитаются спектральные вклады воды.
[81] На стадии 330 можно применять методику корреляционного 2D-анализа IR-спектров для построения синхронного графика (стадия 340) и асинхронного графика (стадия 350). Например, спектральные данные можно подвергнуть быстрому преобразованию Фурье («FFT») с построением комплексной матрицы, из которой получают матрицу интенсивности, и посредством вычисления произведения взаимной корреляции строят синхронные и асинхронные графики. Методики построения этих графиков будут обсуждаться более подробно в данном документе.
[82] Синхронный график представляет изменения интенсивности, происходящие во время возмущения. На диагонали данного графика расположены пики или полосы (известные как автопики), изменяющиеся на всем протяжении спектра. Вне диагонали расположены кросс-пики, демонстрирующие корреляцию между автопиками, т.е. взаимосвязь между наблюдаемыми изменениями вторичной структуры. Синхронный график можно использовать для установления взаимосвязи между изменениями или сдвигами интенсивности пиков, совпадающими по фазе.
[83] В синхронном корреляционном спектре автопики в положениях на диагонали представляют степень вызванных возмущением динамических флуктуаций спектральных сигналов. Кросс-пики представляют одновременные изменения спектральных сигналов при двух различных волновых числах, позволяющие предположить сочетанное или взаимосвязанное происхождение вариаций интенсивности. Если знак кросс-пика является положительным, то интенсивности при соответствующих волновых числах увеличиваются или уменьшаются совместно. Если знак является отрицательным, то одна из них увеличивается, а другая уменьшается.
[84] Асинхронный график содержит только кросс-пики, используемые для определения порядка событий и, следовательно, механизма агрегации белка. Асинхронный график можно использовать для установления взаимосвязи между изменениями или сдвигами интенсивности пиков, не совпадающими по фазе.
2
1
2
1
1
2
[85] В асинхронном корреляционном спектре кросс-пики проявляются только в тех случаях, когда колебания интенсивности для некоторых подвергнутых преобразованию Фурье частотных компонентов флуктуаций сигналов не совпадают по фазе друг с другом. Знак кросс-пика является положительным, если изменение интенсивности при волновом числе ν происходит до изменения при волновом числе ν. Знак кросс-пика является отрицательным, если изменение интенсивности при волновом числе ν происходит после изменения при волновом числе ν. Вышеприведенные правила применения знаков используются в противоположном смысле, если одно и то же положение кросс-пика на асинхронном графике, переносимое на синхронный график, попадает в область отрицательных значений (Ф(ν, ν) < 0).
[86] В корреляционном 2D-анализе IR-спектров повышается спектральное разрешение основных пиков широких полос, таких как полосы амида I и II, путем расширения пиков в двух измерениях. Эти графики являются симметричными по своей природе, и для целей обсуждения ссылка будет делаться на верхний треугольник для анализа. Синхронный график (показанный в 340) содержит два типа пиков: (а) автопики, представляющие собой положительные пики на диагонали, и (b) кросс-пики, представляющие собой пики вне диагонали, которые могут быть положительными либо отрицательными. Асинхронный график (показанный в 350) содержит исключительно кросс-пики, которые устанавливают взаимосвязь между пиками, не совпадающими по фазе. В результате этого на данном графике выявляется более значительное повышение спектрального разрешения. Для установления порядка молекулярных событий можно применять следующие правила.
1
2
1
2
1
I. Если кросс-пик на асинхронном графике при ν является положительным, то возмущение при ν происходит раньше, чем при ν (ν→ν).
2
2
1
2
1
II. Если кросс-пик на асинхронном графике при ν является отрицательным, то возмущение при ν происходит позже, чем при ν. (ν←ν).
III. Если кросс-пики на синхронном графике (пики вне диагонали, не показанные на фиг. 3) являются положительными, то порядок событий устанавливается исключительно с помощью асинхронного графика (правила I и II).
IV. Если синхронный график содержит отрицательные кросс-пики, а соответствующие кросс-пики на асинхронном графике являются положительными, то порядок является обратным.
V. Если синхронный график содержит отрицательные кросс-пики, а соответствующие кросс-пики на асинхронном графике являются отрицательными, то порядок сохраняется.
2
2
[87] Порядок событий можно установить для каждого пика, наблюдаемого на оси ν. Может быть представлена таблица, в которой обобщен порядок наступления каждого события. На стадии 360 строят график последовательного порядка событий с помощью таблицы, в которой обобщен порядок наступления каждого события. Сверху каждого этапа (события) приведена спектроскопическая информация о кросс-пике при ν, а снизу каждого этапа приведены соответствующее отнесение пиков или биохимическая информация для каждого события в порядке воздействия соответствующего им возмущения в зависимости от температуры. В данном документе представлены примеры.
[88] Для разложения сложных полос, таких как полоса амида I, можно применять анализ по методу двумерной корреляционной спектроскопии («2DCOS»). Пример анализа по методу 2DCOS описан в патенте США №8268628, включенном в данный документ посредством ссылки. Внимание специалиста в данной области обращается на публикацию Isao Noda, «Two-dimensional co-distribution spectroscopy to determine the sequential order of distributed presence of species», Journal of Molecular Structure, Vol. 1069, pp. 51-54, в которой описаны алгоритмы, подходящие для применения в анализе по методу 2DCOS.
j
k
j
k
1
m
[89] Сводная информация о проведении 2DCOS представлена ниже. Для системы, измеряемой под воздействием внешнего возмущения, вызывающего изменения наблюдаемых спектральных интенсивностей, можно получить набор раздельно отобранных спектров A(ν, t). Спектральная переменная ν с j = 1, 2, …, n может представлять собой, например, волновое число, частоту, угол рассеяния и т.д., а другая переменная t с k = 1, 2, …, m представляет эффект приложенного возмущения, например, времени, температуры и электрического потенциала. Для анализа по методу 2DCOS будет использоваться только набор последовательно отобранных спектральных данных, полученный в течение явно определенного интервала наблюдения между t и t. Для простоты в данном случае для обозначения двух переменных используются волновое число и время, но следует понимать, что использование других физических переменных также допустимо.
[90] Динамический спектр, используемый в корреляционной 2D-спектроскопии, явно определен как
1
m
где  представляет собой спектр в эталонном состоянии системы. В отсутствие априорных знаний об эталонном состоянии эталонный спектр также может быть задан как усредненный по времени спектр в интервале наблюдения между t и t.
1
2
1
2
С учетом данного конкретного выбора эталонного спектра часть динамических спектров в интервале наблюдения по сути становится эквивалентной спектрам, центрированным к среднему значению. Синхронные и асинхронные корреляционные 2D-спектры Ф(ν, ν) и Ψ(ν, ν) заданы формулами:
ij
[91] Термин N означает элемент так называемой матрицы преобразования Гильберта-Ноды, задаваемой формулой:
1
2
1
2
k
1
2
Синхронный спектр Ф(ν, ν) представляет согласованные или одновременные изменения спектральных интенсивностей, наблюдаемые при двух различных волновых числах ν и ν, вдоль оси переменной возмущения t. Знак синхронной корреляционной функции интенсивности становится положительным, если спектральные интенсивности, измеряемые при двух волновых числах, изменяются главным образом в одном и том же направлении, увеличиваясь либо уменьшаясь. В то же время если одна из них увеличивается, а другая уменьшается, то знак Ф(ν, ν) становится отрицательным.
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
[92] Асинхронный спектр Ψ(ν, ν) представляет не совпадающие по фазе или последовательные изменения спектральных интенсивностей. Если Ψ(ν, ν)=0, то вариации спектральных интенсивностей при двух волновых числах ν и ν полностью синхронизированы. Если знаки Ф(ν, ν) и Ψ(ν, ν) являются одинаковыми, то общая вариация спектральной интенсивности, наблюдаемая при ν, преимущественно происходит раньше, чем при ν. Если знаки являются разными, то порядок является обратным. Наконец, если Ф(ν, ν)=0, то последовательный порядок вариаций интенсивности нельзя определить. Важно подчеркнуть, что корреляционные 2D-спектры дают информацию только о последовательном порядке вариаций спектральной интенсивности, но не о порядке распределения наличия частиц, обуславливающих спектральные сигналы.
[93] Как опять-таки видно из фиг. 3, на стадии 370 на корреляционном графике совместного распределения представлено распределение подвергнутых возмущению областей в популяции белков (пороговый уровень 80%) в растворе.
[94] Для анализа популяции молекул белков, находящихся в растворе, и того, как себя ведут различные популяции этих белков, можно применять анализ по методу двумерной спектроскопии совместного распределения («2DCDS»). Внимание специалиста в данной области обращается на публикацию Isao Noda, «Two-dimensional co-distribution spectroscopy to determine the sequential order of distributed presence of species», Journal of Molecular Structure, Vol. 1069, pp. 54-56, в которой описаны алгоритмы, подходящие для применения в анализе по методу 2DCDS.
j
k
1
k
m
[95] Для набора из m времязависимых спектров A(ν, t), последовательно полученных в течение интервала наблюдения t ≤ t ≤ t, где усредненный по времени спектр  задан уравнением (2), характеристический (временной) индекс определен как
j
[96] Динамический спектр  используемый в данном случае, является таким же, как и определенный в уравнении (1). Соответствующее характеристическое время распределения спектральной интенсивности, наблюдаемого при волновом числе ν, задается формулой:
j
k
1
m
[97] Как и в предыдущем случае, следует понимать, что время, используемое в данном случае, подразумевается как общее описание типичной переменной приложенного возмущения, поэтому его можно заменить любыми другими подходящими физическими переменными, такими как температура, концентрация и давление, выбранными специально для данного экспериментального условия. Характеристическое время  является первым моментом (в окрестности точки начала временной оси, т.е. t=0) плотности распределения спектральной интенсивности A(ν, t) вдоль временной оси, ограниченным интервалом наблюдения между t и t. Оно соответствует положению центра тяжести распределения наблюдаемой спектральной интенсивности во времени.
1
2
[98] С учетом показателей характеристического времени  временных распределений спектральных интенсивностей, измеренных при двух разных волновых числах ν и ν, синхронные и асинхронные спектры совместного распределения определяются как
1
2
где Т(ν, ν) представляет собой общую совместную дисперсию, задаваемую формулой
1
2
1
2
[99] Синхронная функция совместного распределения интенсивности Г(ν, ν) является показателем совместного существования или перекрывания распределений двух отдельных спектральных интенсивностей вдоль временной оси. В противоположность этому, асинхронная функция совместного распределения интенсивности Δ(ν, ν) является показателем различия в распределении двух спектральных сигналов. Термин «совместное распределение» обозначает сравнение двух отдельных распределений, проводя различие между этим метрическим показателем и понятием «корреляции», основанным на сравнении двух вариаций.
[100] Путем объединения уравнений 6, 7 и 9 выражение для асинхронного спектра совместного распределения задается как
1
2
[101] Значение Δ(ν, ν) устанавливается равным нулю, если имеет место условие  которое указывает на отсутствие сигналов спектральной интенсивности при обоих волновых числах. Синхронный спектр совместного распределения можно получить из взаимосвязи
1
2
1
2
1
2
1
2
[102] В асинхронном спектре совместного распределения и для кросс-пика с положительным знаком, т.е. Δ(ν, ν)=0, наличие спектральной интенсивности при νраспределено преимущественно на более ранней стадии вдоль временной оси по сравнению с таковым для ν. В то же время если Δ(ν, ν)<0, то порядок является обратным. В случае Δ(ν, ν) ≈ 0 средние распределения во времени спектральных интенсивностей, наблюдаемых при двух волновых числах, являются сходными. Знак синхронных пиков совместного распределения всегда является положительным, что в некоторой степени ограничивает информативность синхронного спектра за рамками очевидного качественного показателя степени перекрывания схем распределения.
1
2
1
2
1
2
1
2
[103] 2DCDS способна обеспечивать взвешенное исследование элементов механизма агрегации в белке или любого процесса. 2DCDS можно применять для прямого получения последовательности распределения наличия частиц вдоль оси переменной возмущения (например, времени, температуры, концентрации, давления и т.д.). Данную методику можно применять в качестве дополнительного инструмента для увеличения мощности анализа по методу 2DCOS при прямой идентификации наличия промежуточных частиц. Согласно некоторым вариантам осуществления спектры, зависимые от возмущения, получают последовательно в течение интервала наблюдения. Корреляционные 2D-спектры (синхронный спектр и асинхронный спектр) выводят из спектральных вариаций. Синхронная функция совместного распределения интенсивности измеряется как совместное существование или перекрывание распределений двух отдельных спектральных интенсивностей вдоль оси возмущения. Асинхронная функция совместного распределения интенсивности измеряется как различие в распределении двух спектральных сигналов. Для кросс-пика с положительным знаком, т.е. Δ(ν, ν)>0, наличие спектральной интенсивности при ν распределено преимущественно на более ранней стадии вдоль временной оси по сравнению с таковым для ν. В то же время если Δ(ν, ν)<0, то порядок является обратным. В случае Δ(ν, ν) ≈ 0 средние распределения во времени спектральных интенсивностей, наблюдаемых при двух волновых числах, являются сходными.
[104] Различия между анализами по методу 2DCOS обеспечивают усредненное описание хода событий, связанных с процессом возмущения, и его эффекта в отношении образца, а анализ по методу 2DCDS обеспечивает взвешивание элементов в популяции молекул (белков) во время процесса возмущения. Результатом применения 2DCOS и 2DCDS является непосредственное и упрощенное описание элементов, спектральные данные которых изменяются вследствие возмущения.
[105] Согласно некоторым вариантам осуществления, например, показанным на фиг. 4, система для осуществления анализа данных может содержать по меньшей мере показанные компоненты для осуществления функций способов, описанных в данном документе. Собранные данные могут передаваться в один или более вычислительных блоков, в том числе процессоров, для анализа. Могут быть представлены модули для осуществления анализа данных или управления им. Такие модули могут включать в себя модуль корреляционного анализа, модуль построения визуальных моделей и/или модуль взаимодействия с человеком. Модули могут быть соединены друг с другом. В некоторых вариантах осуществления модули могут быть реализованы в виде программного обеспечения (например, подпрограмм и кода). Например, модули могут храниться в запоминающем устройстве и/или устройстве для хранения данных и исполняться процессором. В некоторых аспектах некоторые или все модули могут быть реализованы в виде аппаратного обеспечения (например, специализированной интегральной микросхемы (ASIC), программируемой пользователем вентильной матрицы (FPGA), программируемого логического устройства (PLD), контроллера, конечной машины, управляемого логического устройства, дискретных компонентов аппаратного обеспечения или любых других подходящих устройств), встроенного программного обеспечения, программного обеспечения и/или их комбинации. Дополнительные признаки и функции этих модулей в соответствии с различными аспектами рассматриваемой технологии дополнительно описаны в настоящем раскрытии.
[106] Согласно некоторым вариантам осуществления, например, показанным на фиг. 5, можно осуществлять способ проверки и подготовки собранных данных. Тип данных идентифицируют и проверяют. На основании этой проверки данные можно преобразовывать и/или хранить или отклонять с отображением ошибки пользователю.
[107] Согласно некоторым вариантам осуществления, например, показанным на фиг. 6, можно осуществлять способ анализа собранных данных. Тип данных проверяют на надлежащее соотношение сигнал/шум по сравнению с пороговым уровнем. На основании этой проверки данные можно подвергнуть анализу или обработке с помощью сглаживающего фильтра перед анализом.
[108] Согласно некоторым вариантам осуществления, например, показанным на фиг. 6, данные можно анализировать посредством операций, которые включают в себя применение поправки на фоновый уровень, определение местоположения пиков, расчет окон данных, расчет корреляций, расчет совместных распределений и/или расчет корреляции возмущений.
[109] Манипуляции с данными могут включать в себя автоматическое распознавание областей, представляющих интерес (ROI), для установления различий между твердыми частицами и раствором. Можно определять размер и количество твердых частиц для установления распределения популяции твердых частиц. Манипуляции с данными можно осуществлять для обеспечения согласованности, как, например, путем определения соотношения сигнал/шум, внесения поправки на фоновый уровень, определения содержания водяного пара и определения интенсивности сигнала от элементов, представляющих интерес, в исследуемой области спектра. Вывод данных для статистического анализа можно упростить с помощью, помимо прочего, подхода «планирование эксперимента». Интенсивность и положение в спектре элементов, представляющих интерес, могут быть выведены в виде файлов с разделителями-запятыми (*.csv). Наборы данных ковариационного или динамического спектра можно получить на основании возмущения образца, представляющего интерес, и их выходные параметры можно использовать для дальнейшего анализа. Например, выходные параметры данных могут быть представлены в формате, облегчающем объединение с другими биоаналитическими результатами для оценки сопоставимости, и иметь источником тип возмущения, наполнитель, белковое терапевтическое средство, концентрацию белка, температуру, дату сбора и/или биоаналитическую методику. Данный подход будет позволять осуществлять статистический анализ для всех экспериментов, проводимых в сходных условиях. Что более важно, результаты анализа по принципу DOE будут представлять собой самостоятельный документ, готовый для предоставления конечного отчета и позволяющий принимать решения.
[110] Согласно некоторым вариантам осуществления в способах и системах, описанных в данном документе, в отношении данных ковариационного или динамического спектра можно применять корреляционную функцию для построения двух графиков (синхронного и асинхронного), и этот алгоритм называется корреляционной 2D-IR-спектроскопией. Между изменениями (например, интенсивностей пиков) в спектральных данных, которые совпадают по фазе друг с другом согласно полученному на синхронном графике, можно установить корреляцию. Можно определить элементы, изменяющиеся в спектральных данных. Можно определить наибольшее общее изменение интенсивности в спектральных данных. Можно определить наименьшее общее изменение интенсивности в спектральных данных. В анализе по методу подбора кривой можно определить минимальное количество основных спектральных вкладов в широкой полосе, такой как полоса амида для белков и пептидов, что позволяет определить состав вторичной структуры. Можно повысить разрешение исследуемой области спектра, в частности, для широких полос в спектре.
[111] Между изменениями (например, интенсивностей пиков) в спектральных данных, которые не совпадают по фазе друг с другом согласно полученному на асинхронном графике, можно установить корреляцию. Асинхронный график также содержит порядок событий, описывающий молекулярные подробности поведения белка. Можно осуществлять подробное оценивание графиков для установления порядка событий. В качестве альтернативы или в комбинации, этот процесс можно автоматизировать. В отношении данных ковариационного или динамического спектра можно применять функцию совместной дисперсии для построения объединенного асинхронного графика, который можно непосредственно интерпретировать для определения порядка событий. Этот способ можно в качестве альтернативы применять для подтверждения вышеописанных интерпретаций для описания молекулярного поведения белка, которое является комплексным описанием. Ввод информации о количестве, положении и интенсивности для стандартной процедуры подбора кривой, предоставляющий дополнительную информацию для стандартной процедуры подбора кривой, также может быть автоматизированным процессом, в результате которого получают данные о составе вторичной структуры белка и степени агрегации белковых частиц в анализируемых образцах. Информацию об интенсивности из корреляционных графиков 2D-IR-спектров можно использовать для количественного определения продуктов окисления, таких как продукты дезаминирования. Например, дезаминирование можно выявлять в боковых цепях. Такой анализ можно применять для отбора лекарственных средств-кандидатов или в течение фазы разработки белка. В качестве долгосрочного решения проблемы сложности параметров, которые нужно найти и для которых нужно установить корреляцию, можно реализовать подход с машинным обучением.
-1
-1
-1
[112] Согласно некоторым вариантам осуществления, например, показанным на фиг. 7, анализ собранных данных можно осуществлять постадийно с получением комплексного решения, которое является статистически обоснованным и высокоинформативным в отношении исследований агрегации белков. Согласно некоторым вариантам осуществления способ, проиллюстрированный на фиг. 7, может представлять пути применения способа, проиллюстрированного на фиг. 3. Результаты инфракрасной QCL-микроскопии (слева вверху на фиг. 7) показаны с начальным и конечным QCL-спектрами при низкой температуре 5°С (с большим максимальным значением) и высокой температуре 90°С (с меньшим максимальным значением) для подвергнутого обмену Н→D (водород→дейтерий) полноразмерного IgG (150 кДа), показанного в области спектра 1700-1500 см. Наблюдаются различия в полосах амида I (1700-1600 см, главным образом вследствие валентных колебаний карбонильных групп в пептидных связях) и боковых цепей (1600-1500 см, определенных в таблице 1).
[113] Путем вычитания начального спектра при низкой температуре из всех последующих спектров выявляют спектральные изменения, обусловленные увеличением температуры (выявляющие изменения в поведении белка), которые называются данными ковариационного спектра, но также часто называются разностными спектрами. Затем в отношении этих спектральных изменений применяют взаимнокорреляционную функцию для определения взаимосвязи между наблюдаемыми пиками. Строят два графика - синхронный и асинхронный графики, на которых представлена корреляция между полученными в результате пиками, наблюдаемыми вследствие возмущения образца белка. На этих графиках представлено большое количество молекулярной информации и последовательный порядок молекулярных событий, описывающих поведение белка. Синхронный график (слева внизу на фиг. 7), содержащий автопики (пики на диагонали), показан с пиком агрегации. На данной диаграмме представлено наибольшее изменение интенсивности белка и наблюдаются два дополнительных автопика с менее значительными изменениями интенсивности. Взаимосвязь между этими пиками определяют на основании наблюдения кросс-пиков (пиков вне диагонали), которые являются положительными либо отрицательными и предоставляют информацию о взаимосвязи между различными автопиками, наблюдаемыми на диагонали (т.е. изменениями интенсивности вследствие вычитания начального спектра). В этом гипотетическом случае наблюдаемая взаимосвязь приводит к событию агрегации, в котором участвует спиральная вторичная структура белка, которое также подтверждается наличием тирозинового остатка, обнаруживаемого в данном спиральном мотиве, который, таким образом, служит в качестве внутреннего зонда для процесса агрегации белка. Таким образом, пик тирозина определяет область белка, отвечающую за агрегацию. Анализ по методу 2DCOS предоставляет ценную подробную молекулярную информацию, ранее недоступную с помощью других независимых методик, таких как SEC, DSC и DLS. Результаты, полученные в QCL, являются высоковоспроизводимыми и были подвергнуты строгой проверке с помощью статистического анализа. QCL в инфракрасной области спектра является высокоизбирательной и высокочувствительной, что, таким образом, позволяет проводить одновременное исследование конформационных изменений белка, а также колебательных мод боковых цепей 6 из 20 аминокислот (см. таблицу 1).
ПРИМЕР 1
[114] Оценку возможности разработки и сопоставимости осуществляли для трех фрагментов конъюгатов антитело-лекарственное средство (фиг. 8А-В). Анализ предусматривал в общей сложности 47 экспериментов. QCL-микроскоп использовали для осуществления получения изображений для 43 условий по принципу DOE, 16 из которых предусматривали сравнение 3 фрагментов ADC, называемых ADC0, ADC1 и ADC2, в растворе, забуференном HEPES, при рН 6,6 и Т=24-30°С. Было определено, что ADC2 не содержал агрегатов в исследуемых условиях, тогда как ADC1 имел некоторое количество частиц агрегатов, но при нагревании до 28°С агрегат возвращался в раствор (фиг. 9А-В). Кроме того, кандидат ADC0 характеризовался наличием частиц агрегатов, но при увеличении температуры увеличивалось и количество присутствующих частиц агрегатов. Было определено, что эти частицы агрегатов представляют собой ADC0. Аналогичные результаты были обнаружены для ADC1 с помощью анализа по методу 2DCDS (фиг. 10).
-1
-1
[115] Кроме того, осуществляли спектральный анализ ADC2, не содержащего агрегатов, в присутствии различных наполнителей (сахарозы и NaCl) при температурах, близких к комнатной: Т=24-26°С (фиг. 11А-В). Дополнительная ценность заключается в определении воспроизводимости анализа путем выбора отдельных областей, представляющих интерес (ROI), показанных в рамках на изображениях, полученных с помощью QCL (фиг. 11А), которые анализировали спектроскопически в автономном режиме (фиг. 11В). Наполнитель сахароза показан в области 1420-1520 см. Также показаны полосы амида I и боковых цепей (1520-1700 см), что, таким образом, доказывает высокую чувствительность и избирательность методики. Дополнительные экспериментальные данные показаны на фиг. 12А-С. С точки зрения анализа способность к прямому выявлению как наполнителя, так и белкового терапевтического средства имеет высокую ценность для биофармацевтической отрасли, поскольку она позволяет подтверждать наличие наполнителя в каждом составе. Платформа HT-DCA будет обеспечивать как точность, так и воспроизводимость, требуемые для статистического анализа, а также особо ценную молекулярную информацию о составляющих в образце.
[116] Планирование полного факторного эксперимента с 516 спектрами и анализ нормального распределения осуществляли для 43 экспериментов с использованием QCL-микроскопа (QCL) в различных условиях. Организация экспериментов согласно QbD заключалась в анализе 324 наборов спектральных данных, представляющем собой оценивание ADC2 в присутствии различных количеств NaCl, сахарозы и различных соотношений обоих наполнителей (т.е. NaCl и сахарозы). Размер выборки определяли как n=8-12 в зависимости от среднеквадратического отклонения. Оценку возможности разработки и сопоставимости проводили с ADC2, и ниже представлена сводная информация о результатах, полученных с 15%, 30% и 60% сахарозой при 26° и 28°С. Аналогичные результаты были получены для различных концентраций (325, 350 и 400 мМ) NaCl и различных соотношений сахарозы и NaCl в качестве наполнителей. Как правило, полученные результаты сходились при р-значениях, превышающих 0,8 (фиг. 13). После анализа распределения следовало статистическое оценивание по принципу DOE с использованием поэтапного подбора всех моделей, заканчивающегося получением AIC- и BIC-моделей (фиг. 14, 15), в которых достигался один и тот же результат, заключающийся в том, что 18,5% сахароза является наилучшим наполнителем для ADC2.
[117] Возможности платформы HT-DCA для проведения спектрального анализа по методу QCL обеспечивают дополнительный молекулярный анализ и определение стабильности белкового терапевтического средства. Данный тип анализа является высокоинформативным, позволяя проводить оптимальную разработку белкового терапевтического средства-кандидата. Осуществляли два типа корреляционного анализа: анализ по методу 2DCOS и анализ по методу 2DCDS, предоставляющие информацию, касающуюся поведения белкового терапевтического средства в растворе.
[118] В отношении инфракрасных спектров белков применяли концептуальный анализ корреляционных графиков 2D-IR-спектров. Полосы амида I и боковых цепей являются широкими и содержат много основных вкладов вне зависимости от того, являются ли они конформационно чувствительными, как валентные колебания карбонильных групп в пептидных связях или колебательные моды боковых цепей, которые являются источником информации об их ближайшем окружении и слабых взаимодействиях. Для извлечения этой информации получают ковариационные спектры путем вычитания эталонного спектра из всех последующих спектров. Например, в исследовании тепловой денатурации белков (температурного возмущения) для вычитания будет использоваться начальный спектр при низкой температуре. Получаемые ковариационные спектры содержат в себе изменения интенсивности вследствие увеличения температуры. Затем в отношении набора данных применяют корреляционную функцию, с помощью которой устанавливают взаимосвязь между изменениями интенсивности, наблюдаемыми в ковариационных спектрах в виде 2 отдельных графиков с увеличенным разрешением. С помощью этих графиков можно разложить сильно перекрывающиеся полосы с установлением наиболее гибких областей белка, расшифровкой механизма агрегации белка и установлением взаимодействий белка и мишени. Корреляционные графики 2D-IR-спектров называются синхронными и асинхронными графиками. Эти графики являются симметричными по своей природе, и для целей интерпретации ссылка делается на верхнюю половину каждого графика. Синхронный график имеет положительные пики на диагонали, известные как автопики. Автопики содержат в себе общие изменения интенсивности, наблюдаемые для всего набора спектральных данных. Величину изменения можно идентифицировать и использовать для определения гибкости или восприимчивости, которой может обладать область белка вследствие возмущения. Положение и количество этих пиков используют для определения основных спектральных вкладов в полосах амида I и боковых цепей (см. таблицу 2).
[119] Синхронный график также имеет пики вне диагонали, известные как кросс-пики. Эти кросс-пики определяют взаимосвязь между автопиками. Кросс-пики, наблюдаемые на синхронном графике, обусловлены изменениями интенсивности, совпадающими по фазе друг с другом. Можно рассмотреть 2 пика, интенсивность которых изменяется ступенчато, или, наоборот, эти два автопика будут иметь сопутствующий кросс-пик, представляющий взаимосвязь между ними (фиг. 16А-В).
1
2
[120] Асинхронный график не содержит пики на диагонали, но при этом представляет повышенное спектральное разрешение. Полученные в результате кросс-пики обусловлены изменениями интенсивности пиков в ковариационных спектрах, не совпадающими друг с другом по фазе, и, соответственно, предоставляют подробную информацию. В ее числе находится последовательный порядок молекулярных событий, обусловленных тепловым возмущением. Кросс-пики на асинхронном графике являются положительными либо отрицательными, и можно определить последовательный порядок. Как правило, если знак кросс-пиков является положительным на обоих графиках, то порядок, определенный на асинхронном графике, сохраняется. Таким образом, положительный кросс-пик означает, что событие при ν происходит раньше, чем при ν. Данная интерпретация принимается как истинная тогда и только тогда, когда тот же самый кросс-пик на синхронном графике также является положительным. Однако, если знаки кросс-пиков на обоих графиках являются разными, то порядок является обратным.
-1
-1
-1
1
2
[121] При применении данной процедуры в отношении графиков на фиг. 16А-В обнаруживают, что кросс-пик на асинхронном графике является положительным при (1652, 1632). Возмущение, соответствующее пику при 1652 см (ν), происходит раньше, чем при 1632 см (ν). Молекулярная интерпретация будет заключаться в том, что π-спираль подвергается возмущению раньше, чем антипараллельные (3-листы в белке (таблица 2). Аналогично, β-изгибы (шарнирные петли, 1670,3 см) подвергаются возмущению раньше, чем антипараллельные β-листы. Кроме того, эти графики использовали для определения того, каким образом сахароза стабилизировала ADC2 в растворе. Образование водородных связей между боковыми цепями и сахарозой стабилизировало β-изгибы (шарнирные петли) и, таким образом, также стабилизировало β-листы. Что более важно, молекулярные изменения, происходящие во фрагменте белка, представляющем интерес, показаны на фиг. 17.
[122] Хотя температурное возмущение было ограничено температурой, близкой к комнатной, анализ по-прежнему позволял определять взаимодействие с образованием Н-связей между боковыми цепями и их водной средой и наполнителем (сахарозой). Эти взаимодействия также стабилизировали вторичную структуру ADC2.
1
2
2
1
[123] Было обнаружено, что анализ по методу 2DCDS являлся применимым для оценивания динамических свойств раствора белка и распределения конформационно-динамических свойств в диапазоне температур, и в данном случае диапазон температур был узким, составляя лишь 26-28°С для ADC2 в буферах HEPES и в присутствии 15% сахарозы (фиг. 18А-В). Интерпретация асинхронного графика совместного распределения заключается в простом сравнении с корреляционным графиком 2D-IR-спектра. Не требуется сравнение знаков кросс-пиков между графиками. Для положительного кросс-пика можно определить, что событие при ν происходит раньше, чем при ν. Кроме того, для отрицательного кросс-пика можно определить, что событие при ν наступает раньше, чем при ν.
-1
-1
-1
[124] Для данного белка агрегация не наблюдалась. Как видно из асинхронного графика (фиг. 18В), наблюдается взаимозависимость между β-изгибами, также называемыми шарнирными петлями (1660 см), и отрицательно заряженными аспартатными (1553 см) и глутаматными (1543 см) остатками в данном белке в растворе. Этот результат согласуется с их местоположением в мотивах β-изгибов ADC2. Анализ по методу 2DCOS и анализ по методу 2DCDS позволяли проводить полное описание ADC2 и стабилизирующего эффекта сахарозы в отношении ADC2 на молекулярном уровне (фиг. 16А-18В). Говоря в общем, основным признаком стабилизации ADC2 была стабилизация шарнирных петель посредством взаимодействий с образованием солевых мостиков, наблюдаемых между аргининовыми остатками и близлежащими аспартатными остатками. Нарушение взаимодействий с образованием солевых мостиков предотвращалось введением второго дисульфидного мостика путем сайт-направленного мутагенеза. Дополнительная стабилизация достигалась под влиянием условий составления, которые включали применение сахарозы в качестве наполнителя. В частности, 15% сахароза также обеспечивала стабилизацию путем образования Н-связей с теми же самыми остатками.
[125] На фиг. 19 показаны графики, соответствующие результатам, показанным в таблице 3.
ПРИМЕР 2
2
2
-1
-1
[126] Образцы, содержащие эталонный материал 8671 (RM8671) Национального института стандартов и технологий с № партии 14HB-D-002, представляющий собой гуманизированное моноклональное антитело IgG1κ (mAb NIST), в HO, исследовали в анализе в соответствии со способами, описанными в данном документе. Образцы добавляли в кюветы из стекла из CaF для сбора данных с помощью QCL-микроскопа. Приложенное возмущение представляло собой воздействие температуры в диапазоне 24-60°С с температурными интервалами 4°С. Данные QCL-IR-спектров собирали с помощью объектива с увеличением 4х при 4 см, при этом данные были закодированы в каждых 0,5 см, и в них вносили поправку на фоновый уровень.
[127] Стандартное mAb NIST представляет собой белок IgG1κ. Аминокислотные последовательности тяжелой цепи (SEQ ID NO: 5) и легкой цепи (SEQ ID NO: 6) антитела представлены ниже.
Аминокислоты тяжелой цепи RM 8671
Легкая цепь RM 8671
[128] Отнесение боковых цепей аминокислот для образца представлено в таблицах 4 и 5.
-1
2
2
2
[129] Как показано на фиг. 20А, данные QCL-спектров mAb NIST при 50 мг/мл в средней IR-области спектра 1750-1400 см собирали в диапазоне температур 24-60°С в HO. На фиг. 20А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы амида I, II и III. На основании спектральных данных строили синхронный (фиг. 20В) и асинхронный (фиг. 20С) графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров. Перекрывающееся поглощение HO наблюдалось в полосе амида I, но не в полосах амида II и III, что позволяло предположить достижение достаточной концентрации белка для анализа. Применяемый способ согласно вариантам осуществления настоящего изобретения устраняет необходимость в субъективной манипуляции, заключающейся в вычитании спектра HO или эталона пользователем.
-1
2
[130] Как показано на фиг. 21А, данные QCL-спектров mAb NIST при 50 мг/мл в средней IR-области спектра 1750-1500 см собирали в диапазоне температур 24-60°С в HO. На фиг. 21А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы как амида II, так и амида III. На основании спектральных данных строили синхронный (фиг. 21В) и асинхронный (фиг. 21С) графики. Устанавливали корреляцию между полосами амида I и II. Повышение разрешения достигается посредством использования асинхронного графика.
2
[131] Отнесения пиков mAb NIST при 50 мг/мл в HO представлены в таблице 6.
2
-1
-1,
-1
-1
[132] Последовательный порядок событий для mAb NIST при 50 мг/мл в HO в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С показан на фиг. 22. Пик при 1635,5 см отнесен к антипараллельному β-листу вследствие возмущения β-изгиба при 1692 см и обе эти колебательные моды являются наиболее стабильными. Кроме того, на основании данной работы пик при 1618 см был отнесен кагрегации белка, индуцируемой термически при 60°С. Пик при 1652 см может быть отнесен к α-спирали.
2
[133] Последовательный порядок событий для mAb NIST при 50 мг/мл в НО представлен в таблице 7.
β-лист и β-изгиб появляются в качестве связанных мод, что указывает на наличие антипараллельного β-листа
2
-1
[134] На фиг. 23 показан асинхронный график для 2D-анализа совместного распределения в IR-спектре mAb NIST при 50 мг/мл в НО в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С. MAb NIST (50 мг/мл) подвергали тепловому стрессу в диапазоне температур 24-60°С и в области спектра 1760-1380 см. На данном графике представлен наиболее распространенный отклик в популяции белков в растворе. Таким образом, в случае с mAb NIST при 50 мг/мл его тепловой стресс был связан с возмущением глутаматных остатков вместе с Arg, предположительно благодаря взаимодействию с образованием солевых мостиков. Глутаматные остатки образовывали Н-связи с остатками His, и эти остатки были расположены в α-спиралях и β-листах.
[135] На фиг. 24А-D показан пример автоматизированного анализа, предоставляющего информацию о взаимосвязи в (А) наложенных необработанных спектральных данных, на (В) синхронном и (С) асинхронном корреляционных графиках 2D-IR-спектров и (D) на асинхронном графике совместного распределения. Вертикальные пунктирные линии создаются в ходе автоматизированного анализа на основании значений абсолютной интенсивности автопиков (положительных пиков на диагонали, показанных на фиг. 24В) на синхронном графике.
ПРИМЕР 3
2
2
-1
-1
[136] Образцы, содержащие бычий сывороточный альбумин («BSA») в HO, исследовали в анализе в соответствии со способами, описанными в данном документе. Образцы добавляли в кюветы из стекла из CaF для сбора данных с помощью QCL-микроскопа. Приложенное возмущение представляло собой воздействие температуры в диапазоне 24-60°С с температурными интервалами 4°С. Данные QCL-спектров собирали с помощью объектива с увеличением 4х при 4 см, при этом данные были закодированы в каждых 0,5 см, и в них вносили поправку на фоновый уровень.
[137] Ниже приведена анализируемая аминокислотная последовательность BSA.
[138] Отнесение боковых цепей аминокислот для образца представлено в таблице 8.
-1
2
[139] Как показано на фиг. 25А, данные QCL-спектров BSA при 40 мг/мл в средней IR-области спектра 1750-1500 см собирали в диапазоне температур 24-60°С в НО. На фиг. 25А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы амида I и II. На основании спектральных данных строили синхронный (фиг. 25В) и асинхронный (фиг. 25С) графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров. Устанавливали корреляцию между полосами амида I и II. Повышение разрешения достигается посредством использования асинхронного графика. Кроме того, автопик с наиболее высокой интенсивностью на синхронном графике обусловлен возмущением спирали в этом глобулярном белке. В дополнение, агрегация не наблюдалась.
[140] Отнесения пиков BSA при 40 мг/мл представлены в таблице 9.
[141] Последовательный порядок событий для BSA при 40 мг/мл в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С показан на фиг. 26. Последовательный порядок событий для BSA при 40 мг/мл также представлен в таблице 10.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
[142] Аспартатные (1567 см) и глутаматные остатки (1584 см), расположенные в спиральных областях (1653,9 см), которые участвуют во взаимодействиях с образованием солевых мостиков с лизиновыми остатками (1530,0 и 1525,5 см), подвергаются возмущению в первую очередь; после этого возмущению подвергаются β-листы (1629,6 см), а затем тирозиновые (1518 см) и гистидиновые остатки (1606,5 см) в антипараллельных β-листах (1629,6 см) и β-изгибах (1698 см). Наконец, при высокой температуре возмущению подвергаются взаимодействия с образованием солевых мостиков, в которых участвуют аргининовые остатки с глутаматными (1560 см) и аспартатными остатками (1576,4 см), расположенные вблизи β-изгибов (1684,0 см).
2
-1
[143] На фиг. 27 показан асинхронный график для 2D-анализа совместного распределения в IR-спектре BSA при 40 мг/мл в HO в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С и в области спектра 1750-1380 см. В случае с BSA при 40 мг/мл его тепловой стресс был связан с возмущением глутаматных остатков в β-изгибах и спиральных областях.
ПРИМЕР 4
2
2
-1
-1
[144] Образцы, содержащие смесь mAb NIST и BSA в HO, исследовали в анализе в соответствии со способами, описанными в данном документе. Образцы добавляли в кюветы из стекла из CaF для сбора данных с помощью QCL-микроскопа. Приложенное возмущение представляло собой воздействие температуры в диапазоне 2А-60°С с температурными интервалами 4°С. Данные QCL-спектров собирали с помощью объектива с увеличением 4х при 4 см, при этом данные были закодированы в каждых 0,5 см, и в них вносили поправку на фоновый уровень.
-1
2
[145] Как показано на фиг. 28А, данные QCL-спектров смеси mAb NIST/BSA (молярное соотношение 1:2) в области спектра 1750-1500 см собирали в диапазоне температур 24-60°С в HO. На фиг. 28А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы амида I и II. На основании спектральных данных строили синхронный (фиг. 28В) и асинхронный (фиг. 28С) графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров. В целом конфигурация синхронного графика демонстрировала признаки, являющиеся отличительными как для mAb NIST, так и для BSA в качестве чистых компонентов.
[146] Отнесения пиков mAb NIST/BSA представлены в таблице 11.
ПРИМЕР 5
2
2
2
-1
-1
[147] Образцы, содержащие лизоцим в HO, исследовали в анализе в соответствии со способами, описанными в данном документе. Для образцов в HO использовали специально изготовленные кюветы из стекла из CaF с длиной пробега 7 мкм. Приложенное возмущение представляло собой воздействие температуры в диапазоне 24-60°С с температурными интервалами 4°С. Данные QCL-IR-спектров собирали с помощью объектива с увеличением 4х при 4 см, при этом данные были закодированы в каждых 0,5 см, и в них вносили поправку на фоновый уровень.
[148] Ниже приведена анализируемая аминокислотная последовательность лизоцима.
[149] Отнесение боковых цепей аминокислот для образца представлено в таблице 12.
-1
2
[150] Как показано на фиг. 29А, данные QCL-спектров лизоцима при 600 мг/мл в области спектра 1750-1500 см собирали в диапазоне температур 24-60°С в HO. На фиг. 29А показаны наложенные спектры, в которых показаны полосы амида I и II. На основании спектральных данных строили синхронный (фиг. 29В) и асинхронный (фиг. 29С) графики для корреляционного 2D-анализа IR-спектров. Можно установить корреляцию между спиральными областями белка и β-изгибами под воздействием теплового стресса. Также, как установлено по корреляциям, наблюдаемым как на синхронном, так и на асинхронном графике, слабые взаимодействия между глутаматными, аспартатными и аргининовыми, лизиновыми, гистидиновыми остатками являются критически важными для стабильности лизоцима. Для данного белка агрегация не наблюдалась.
[151] Отнесения пиков лизоцима при 600 мг/мл представлены в таблице 13.
[152] Последовательный порядок событий для лизоцима при 600 мг/мл в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С показан на фиг. 30. Последовательный порядок событий для BSA при 40 мг/мл также представлен в таблице 14.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
[153] В первую очередь возмущению подвергаются тирозиновые (1514,6 см) и лизиновые (1526,9 см) остатки, после этого аргининовые остатки (1628,7 см),затем β-листы (1637,2 см), затем глутаматные остатки (1536,8 см) в β-листах, после этого глутаматные остатки (1556 см), расположенные в спиральных областях (1647,0 см) и β-изгибах (1698,0 см и 1683,8 см), и после этого глутаматные остатки (1547,8 см) в шарнирных петлях (1660,5 см), затем аспартатные остатки (1566,1, 1672,3 см) и отдельный гистидин (1596,6 см), предположительно взаимодействующий с аспартатом путем взаимодействия с образованием Н-связей, расположенный возле N-конца, и, наконец, Arg, Asn, Gln, все из которых отнесены к (1666,6 см). Агрегация не наблюдалась.
2
-1
[154] На фиг. 31 показан асинхронный график для 2D-анализа совместного распределения в IR-спектре лизоцима при 600 мг/мл в HO в условиях теплового стресса в диапазоне температур 24-60°С и в области спектра 1750-1500 см. В случае с лизоцимом (600 мг/мл) его тепловой стресс был связан с возмущением тирозиновых остатков, расположенных в шарнирных петлях, и лизиновых и глутаматных остатков, расположенных возле β-изгибов и спиральных областей или в них.
[155] Фиг. 32 представляет собой принципиальную схему, иллюстрирующую приводимую в качестве примера вычислительную систему, с помощью которой может быть реализовано вычислительное устройство (например, из фиг. 4). В определенных вариантах осуществления вычислительная система 1900 может быть реализована с использованием аппаратного обеспечения или комбинации программного обеспечения и аппаратного обеспечения на выделенном сервере, либо будучи интегрированной в другой объект, либо будучи распределенной по нескольким объектам.
[156] Вычислительная система 1900 содержит шину 1908 или другой механизм передачи данных для передачи информации, а также процессор 1902, соединенный с шиной 1908, для обработки информации. В качестве примера, вычислительная система 1900 может быть реализована с одним или более процессорами 1902. Процессор 1902 может представлять собой микропроцессор общего назначения, микроконтроллер, цифровой сигнальный процессор (DSP), специализированную интегральную микросхему (ASIC), программируемую пользователем вентильную матрицу (FPGA), программируемое логическое устройство (PLD), контроллер, конечную машину, управляемое логическое устройство, дискретные компоненты аппаратного обеспечения и/или любой другой подходящий объект, который может осуществлять расчеты или другие манипуляции с информацией.
[157] Вычислительная система 1900 может содержать в дополнение к аппаратному обеспечению код, создающий среду исполнения рассматриваемой компьютерной программы, например, код, составляющий встроенное программное обеспечение процессора, пакет протоколов, систему управления базами данных, операционную систему или комбинацию одного или более из них, хранящийся во включенном в ее состав запоминающем устройстве 1904, таком как запоминающее устройство с произвольным доступом (RAM), устройство флэш-памяти, постоянное запоминающее устройство (ROM), программируемое постоянное запоминающее устройство (PROM), стираемое PROM (EPROM), регистры, накопитель на жестких дисках, съемный диск, CD-ROM, DVD и/или любое другое подходящее устройство для хранения данных, соединенное с шиной 1908, для хранения информации и команд, подлежащих исполнению процессором 1902. Процессор 1902 и запоминающее устройство 1904 могут быть дополнены логическими схемами специального назначения или включены в их состав.
[158] Команды могут храниться в запоминающем устройстве 1904 и быть реализованы в виде одного или более компьютерных программных продуктов, т.е. одного или более модулей команд компьютерных программ, закодированных на компьютерочитаемом носителе для исполнения вычислительной системой 1900 или для управления ее работой и в соответствии с любым способом, хорошо известным специалистам в данной области техники, включающих в себя без ограничения языки программирования, такие как языки программирования, ориентированные на обработку данных (например, SQL, dBase), языки системного программирования (например, С, Objective-C, С++, Assembly), языки программирования архитектуры (например, Java, .NET) и/или языки программирования приложений (например, PHP, Ruby, Perl, Python). Команды также могут быть реализованы в таких языках программирования, как языки массиво-ориентированного программирования, языки аспектно-ориентированного программирования, языки ассемблера, авторские языки разработки, языки интерфейса командной строки, компилируемые языки программирования, языки параллельного программирования, языки программирования, в которых используются фигурные скобки, языки потоков данных, языки описания структуры данных, декларативные языки программирования, эзотерические языки программирования, языки расширений, языки программирования четвертого поколения, языки функционального программирования, диалоговые языки программирования, интерпретируемые языки программирования, итеративные языки программирования, списочные языки программирования, малые языки программирования, языки логического программирования, машинные языки, языки макроассемблера, языки метапрограммирования, мультипарадигматические языки программирования, языки численного анализа, неанглийские языки программирования, объектно-ориентированные языки программирования, основанные на классах, объектно-ориентированные языки программирования, основанные на прототипах, языки программирования, использующие «правило офсайда», процедурные языки программирования, рефлексивные языки программирования, языки программирования на основе продукционных правил, сценарные языки программирования, стековые языки программирования, синхронные языки программирования, языки обработки синтаксиса, языки визуального программирования, языки программирования Вирта и/или языки программирования на основе XML. Запоминающее устройство 1904 также можно использовать для хранения временной переменной или другой промежуточной информации в ходе исполнения команд, подлежащих исполнению процессором 1902.
[159] Компьютерная программа, обсуждаемая в данном документе, не обязательно соответствует файлу в файловой системе. Программа может храниться в части файла, содержащего другие программы или данные (например, один или более скриптов, хранящихся в документе, созданном с помощью языка разметки), в одном файле, специально предназначенном для рассматриваемой программы, или в нескольких взаимодействующих файлах (например, в файлах, в которых хранятся один или более модулей, подпрограмм или частей кода). Компьютерная программа может быть развернута для исполнения на одном компьютере или на нескольких компьютерах, расположенных в одном месте или распределенных по нескольким местам и соединенных друг с другом сетью передачи данных. Процессы и логические потоки, описанные в настоящем описании, могут осуществляться одним или более программируемыми процессорами, исполняющими одну или более компьютерных программ с осуществлением функций путем произведения действий над входными данными и генерирования выходных данных.
[160] Вычислительная система 1900 дополнительно содержит устройство 1906 для хранения данных, такое как магнитный диск или оптический диск, соединенное с шиной 1908, для хранения информации и команд. Вычислительная система 1900 может быть соединена с помощью модуля 1910 ввода/вывода с различными устройствами (например, устройствами 1914 и 1916). Модуль 1910 ввода/вывода может представлять собой любой модуль ввода/вывода. Приводимые в качестве примера модули 1910 ввода/вывода включают в себя порты передачи данных (например, USB-порты), аудиопорты и/или видеопорты. В некоторых вариантах осуществления модуль 1910 ввода/вывода включает в себя модуль передачи данных. Приводимые в качестве примера модули передачи данных включают в себя сетевые интерфейсные платы, такие как Ethernet-платы, модемы и маршрутизаторы. В определенных аспектах модуль 1910 ввода/вывода выполнен с возможностью соединения со множеством устройств, таких как устройство 1914 ввода и/или устройство 1916 вывода. Приводимые в качестве примера устройства 1914 ввода включают в себя клавиатуру и/или указательное устройство (например, мышь или трекбол), с помощью которых пользователь может вводить входные данные в вычислительную систему 1900. Для обеспечения взаимодействия с пользователем также можно использовать другие типы устройств 1914 ввода, такие как устройство ввода тактильной информации, устройство ввода визуальной информации, устройство ввода звуковой информации и/или устройство по типу нейрокомпьютерного интерфейса. Например, обратная связь, предоставляемая пользователю, может представлять собой любую форму сенсорной обратной связи (например, зрительную обратную связь, слуховую обратную связь и/или тактильную обратную связь), и входные данные могут быть получены от пользователя в любой форме, включающей акустический, речевой, тактильный ввод и/или ввод с помощью мозговых волн. Приводимые в качестве примера устройства 1916 вывода включают в себя устройства отображения, такие как монитор с электронно-лучевой трубкой (CRT) или жидкокристаллическим дисплеем (LCD), для отображения информации пользователю.
[161] Согласно определенным вариантам осуществления с использованием вычислительной системы 1900 в ответ на исполнение процессором 1902 одной или более последовательностей одной или более команд, содержащихся в запоминающем устройстве 1904, могут быть реализованы клиентское устройство и/или сервер. Такие команды могут быть переданы в запоминающее устройство 1904 с другого машиночитаемого носителя, такого как устройство 1906 для хранения данных. Исполнение последовательностей команд, содержащихся в запоминающем устройстве 1904, заставляет процессор 1902 осуществлять этапы способа, описанные в данном документе. Для исполнения последовательностей команд, содержащихся в запоминающем устройстве 1904, также можно использовать один или более процессоров в многопроцессорной конфигурации. В некоторых вариантах осуществления для реализации различных аспектов настоящего изобретения вместо команд программного обеспечения или в комбинации с ними можно использовать аппаратно реализованные схемы. Таким образом, аспекты настоящего изобретения не ограничены какой-либо конкретной комбинацией схем аппаратного обеспечения и программного обеспечения.
[162] Различные аспекты объекта настоящего изобретения, описанного в настоящем описании, могут быть реализованы в виде вычислительной системы, содержащей внутренний компонент (например, сервер базы данных), или содержащей промежуточный компонент (например, сервер приложений), или содержащей интерфейсный компонент (например, клиентский компьютер, имеющий графический интерфейс пользователя, и/или веб-браузер, посредством которого пользователь может взаимодействовать с реализацией объекта настоящего изобретения, описанного в настоящем описании), или любой комбинации одного или более таких внутреннего, промежуточного или интерфейсного компонентов. Компоненты системы 1900 могут быть соединены друг с другом с помощью любой формы или среды передачи цифровых данных (например, сети передачи данных). Примеры сетей передачи данных включают в себя локальную вычислительную сеть и глобальную вычислительную сеть.
[163] Термин «машиночитаемый носитель информации» или «компьютерочитаемый носитель», используемый в данном документе, относится к любому носителю или носителям, принимающим участие в передаче команд процессору 1902 для исполнения. Такой носитель может иметь много форм, в том числе, без ограничения, энергонезависимые носители, энергозависимые носители и среды передачи информации. Энергонезависимые носители включают в себя, например, оптические или магнитные диски, такие как устройство 1906 для хранения данных. Энергозависимые носители включают в себя динамическое запоминающее устройство, такое как запоминающее устройство 1904. Среды передачи информации включают в себя коаксиальные кабели, медные провода и оптоволоконные кабели, в том числе провода, содержащие шину 1908. Широко распространенные формы машиночитаемых носителей включают в себя, например, флоппи-диск, гибкий диск, жесткий диск, магнитную ленту, любой другой магнитный носитель, CD-ROM, DVD, любой другой оптический носитель, перфокарты, бумажную перфоленту, любой другой физический носитель с узором из отверстий, RAM, PROM, EPROM, FLASH EPROM, любую другую микросхему или картридж памяти или любой другой носитель, который может считываться компьютером. Машиночитаемый носитель информации может представлять собой машиночитаемое устройство для хранения данных, машиночитаемый носитель информации, запоминающее устройство, композицию, производящую машиночитаемый распространяемый сигнал, или комбинацию одного или более из них.
[164] Как используется в данном документе, «процессор» может включать в себя один или более процессоров, и «модуль» может включать в себя один или более модулей.
[165] В одном аспекте рассматриваемой технологии машиночитаемый носитель представляет собой компьютерочитаемый носитель, в котором закодированы или хранятся команды и который представляет собой вычислительный элемент, определяющий структурные и функциональные взаимосвязи между командами и остальной частью системы, позволяющие реализовать функциональное назначение команд. Команды могут исполняться, например, системой или процессором системы. Команды могут представлять собой, например, компьютерную программу, содержащую код. Машиночитаемый носитель может включать в себя один или более носителей.
[166] Используемое в данном документе слово «модуль» относится к логическому устройству, воплощенному в виде аппаратного обеспечения или встроенного программного обеспечения, или к совокупности команд программного обеспечения, вероятно имеющих точки входа и выхода, записанных на языке программирования, таком как, например, С++. Модуль программного обеспечения может быть скомпилирован и подключен к исполняемой программе, установлен в динамически подключаемую библиотеку или может быть записан на интерпретируемом языке, таком как BASIC. Будет понятно, что модули программного обеспечения могут быть вызваны из других модулей или сами из себя и/или могут быть активизированы в ответ на выявленные события или прерывания. Команды программного обеспечения могут быть внедрены во встроенное программное обеспечение, такое как EPROM или EEPROM. Кроме того, будет понятно, что модули аппаратного обеспечения могут содержать соединенные логические элементы, такие как вентили и триггеры, и/или могут содержать программируемые элементы, такие как программируемые вентильные матрицы или процессоры. Модули, описанные в данном документе, предпочтительно реализованы в виде модулей программного обеспечения, но могут быть представлены в виде аппаратного обеспечения или встроенного программного обеспечения.
[167] Предполагается, что модули могут быть объединены в меньшее количество модулей. Один модуль также может быть разделен на несколько модулей. Описанные модули могут быть реализованы в виде аппаратного обеспечения, программного обеспечения, встроенного программного обеспечения или любой их комбинации. Дополнительно, описанные модули могут находиться в разных местоположениях и быть соединенными с помощью проводной или беспроводной сети или Интернета.
[168] Как правило, будет понятно, что процессоры могут включать в себя, в качестве примера, компьютеры, программные логические устройства или другие конфигурации субстратов, представляющие данные и команды, которые работают согласно описанному в данном документе. В других вариантах осуществления процессоры могут включать в себя схемы контроллеров, схемы процессоров, процессоры, однокристальные или многокристальные микропроцессоры общего назначения, цифровые сигнальные процессоры, встроенные микропроцессоры, микроконтроллеры и т.п.
[169] Кроме того, будет понятно, что в одном варианте осуществления программное логическое устройство может быть преимущественно реализовано в виде одного или более компонентов. Компоненты могут быть преимущественно выполнены с возможностью исполнения на одном или более процессорах. Компоненты включают в себя без ограничения компоненты программного обеспечения или аппаратного обеспечения, модули, такие как модули программного обеспечения, компоненты объектно-ориентированного программного обеспечения, компоненты класса и компоненты задачи, процессы, методы, функции, атрибуты, процедуры, подпрограммы, сегменты программного кода, драйверы, встроенное программное обеспечение, микрокод, схемы, данные, базы данных, структуры данных, таблицы, массивы и переменные.
[170] Вышеприведенное описание представлено для обеспечения специалисту в данной области возможности реализации на практике различных конфигураций, описанных в данном документе. Хотя рассматриваемая технология была описана со ссылкой на различные конкретные фигуры и конфигурации, следует понимать, что они приведены только в целях иллюстрации и не должны считаться ограничивающими объем рассматриваемой технологии.
[171] Может существовать много других способов реализации рассматриваемой технологии. Различные функции и элементы, описанные в данном документе, могут быть разделены на части иначе, нежели показано, без отступления от объема рассматриваемой технологии. Различные модификации этих конфигураций будут очевидными специалистам в данной области, и общие принципы, определенные в данном документе, могут применяться в отношении других конфигураций. Таким образом, средний специалист в данной области может произвести многие изменения и модификации рассматриваемой технологии без отступления от объема рассматриваемой технологии.
[172] Следует понимать, что конкретный порядок или иерархия этапов раскрытых способов является иллюстрацией приводимых в качестве примера подходов. Следует понимать, что на основании предпочтений в планировании можно перестроить конкретный порядок или иерархию этапов раскрытых способов. Некоторые из этапов можно осуществлять одновременно. В прилагаемых пунктах формулы изобретения на способ представлены элементы различных этапов в образцовом порядке, и не подразумевается их ограничение представленными конкретным порядком или иерархией.
[173] Используемая в данном документе фраза «по меньшей мере один из», предшествующая ряду объектов, где термин «и» или «или» служит для отделения какого-либо из объектов, модифицирует перечень в целом, а не каждый элемент перечня (т.е. каждый объект). Фраза «по меньшей мере один из» не требует выбора по меньшей мере одного из каждого перечисленного объекта; наоборот, фраза допускает значение, включающее по меньшей мере один из любого из объектов, и/или по меньшей мере один из любой комбинации объектов, и/или по меньшей мере один из каждого из объектов. В качестве примера, каждая из фраз «по меньшей мере один из А, В и С» или «по меньшей мере один из А, В или С» относится только к А, только к В или только к С; к любой комбинации А, В и С и/или по меньшей мере к одному из каждого из А, В и С.
[174] Такие термины, как «верхний», «нижний», «передний», «задний» и т.п., используемые в настоящем раскрытии, следует понимать как относящиеся к произвольной системе координат, а не к обычной гравитационной системе координат. Таким образом, верхняя поверхность, нижняя поверхность, передняя поверхность и задняя поверхность могут проходить по направлению вверх, по направлению вниз, по диагонали или по горизонтали в гравитационной системе координат.
[175] Кроме того, в той степени, в которой термины «включать», «содержать» или подобные используются в описании или формуле изобретения, подразумевается, что такие термины являются включающими аналогично термину «содержать», то есть так, как «содержать» интерпретируется при использовании в качестве переходного слова в пункте формулы изобретения.
[176] Слова «приводимый в качестве примера» используются в данном документе для обозначения понятия «служащий в качестве примера, образца или иллюстрации». Любой вариант осуществления, описанный в данном документе как «приводимый в качестве примера», не обязательно следует истолковывать как предпочтительный или преимущественный относительно других вариантов осуществления.
[177] Ссылка на элемент в единственном числе не подразумевается как обозначающая «один и только один», если это конкретно не указано, а скорее означает «один или более». Местоимения мужского рода (например, его) включают женский и средний род (например, ее и его) и наоборот. Термин «некоторое количество» относится к одному или более. Подчеркнутые и/или выделенные курсивом заголовки и подзаголовки используются только в целях удобства, не ограничивают рассматриваемую технологию и не упоминаются в связи с интерпретацией описания рассматриваемой технологии. Все структурные и функциональные эквиваленты элементов различных конфигураций, описанных во всем настоящем раскрытии, которые являются известными или которые позже станут известными средним специалистам в данной области, явным образом включены в данный документ посредством ссылки и подразумеваются как охватываемые рассматриваемой технологией. Кроме того, ничто из раскрытого в данном документе не подразумевается как всеобщее достояние независимо от того, изложено ли такое раскрытие явным образом в вышеприведенном описании.
[178] Хотя были описаны определенные аспекты и варианты осуществления рассматриваемой технологии, они были представлены только в качестве примера и не подразумеваются как ограничивающие объем рассматриваемой технологии. В действительности новые способы и системы, описанные в данном документе, могут быть воплощены в ряде других форм без отступления от их сущности. Подразумевается, что прилагаемая формула изобретения и ее эквиваленты охватывают модификации, которые будут находиться в пределах объема и сущности рассматриваемой технологии.