ШТАММЫ Lactobacillus plantarum И Lactobacillus brevis, СИНТЕЗИРУЮЩИЕ ГАММА-АМИНОМАСЛЯНУЮ КИСЛОТУ
STRAINS OF Lactobacillus plantarum AND Lactobacillus brevis SYNTHESISING GAMMA-AMINOBUTYRIC ACID

Изобретение относится к фармакологии и медицине, в частности неврологии, и касается штаммов лактобацилл, способных синтезировать ГАМК, известную как релаксирующее средство, из ее предшественника глютаминовой кислоты с помощью фермента глутаматдекарбоксилазы. Штаммы могут быть использованы для получения препаратов, используемых в комплексном лечении нейродепрессивных состояний и сопутствующих заболеваний.
Уровень техники
4
9
2
γ-Аминомасляная кислота (ГАМК, GABA; CHNO) - аминокислота, важнейший нейромедиатор, участвующий в процессах торможения центральной нервной системы млекопитающих. Не является альфа-аминокислотой и не входит в состав белков. Действие ГАМК в ЦНС осуществляется путем ее взаимодействия со специфическими ГАМКергическими рецепторами (подразделяются на ГАМК-А- и ГАМК-Б-рецепторы), приводящего к ингибированию нервного импульса. Под влиянием ГАМК активируются также энергетические процессы мозга, повышается дыхательная активность тканей, улучшается утилизация мозгом глюкозы, улучшается кровоснабжение. За пределами нервной системы ГАМКергическая система была описана в различных тканях и органах тела человека (кишечнике, желудке, поджелудочной железе, почках, легких, печени и других).
Гамма-аминомасляная кислота в организме образуется из другой аминокислоты, L-глутамата, с помощью фермента глутаматдекарбоксилазы (GAD, ЕС 4.1.15) в ходе необратимой реакции альфа-декарбоксилирования; кофактором является пиридоксаль 5′-фосфат (активная форма витамина В6).
ГАМК обнаружена у растений, животных, микроорганизмов (бактерий, грибов, дрожжей).
ГАМК способствует секреции инсулина клетками поджелудочной железы (Adeghate, Ponery, 2002, GABA in the endocrine pancreas: cellular localization and function in normal and diabetic rats. Tussue Cell, 34, 1-6), снижает давление, имеет диуретический и транквилизационный эффект (Jakobs et al, 1993, Inherited disorders of GABA metabolism. J. Inherit. Metab. Dis., 16, 704-715; Wong et al., 2003, GABA, gamma-hydroxybutyric acid, and neurological disease. Ann. Neurol, 54, suppl 6, S3-S12). Есть данные о том, что ГАМК способствует лечению бессоницы, депрессии, вегетативных расстройств (Okado et al., Effect of the defatted rice germ enriched with GABA for sleeplessness, depression, autonomic disorder by oral administration, 2000, Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi, 47, 596-603; Chuang et al., 2011, Antidepressant effect of GABA-rich Monascus-fermented product on forced swimming rat model, J Agric Food Chem, 59, 3027-3034), симптомов хронической алкогольной зависимости (Oh et al., 2003, Germinated brown rice extract shows a nutraceutical effect in the recovery of chronic alcohol-related symptoms, JMedFood 6, 115-121), стимулирует иммунные клетки, имеет антиканцерогенные свойства (Al-Wadei et al., 2012, Social stress promotes and γ-aminobutyric acid inhibits tumor growth in mouse models of non small cell lung cancer, Cancer Prev Res (Phila), 5, 189-196). Наиболее выраженным является действие ГАМК на заболевания нервной системы.
Огромную роль в жизнедеятельности организма человека играет микробиом, совокупность населяющих его микроорганизмов (преимущественно бактерий). Наиболее сложным по общему числу микроорганизмов и числу составляющих его видов является микробиом кишечника. Совокупность микроорганизмов, населяющих кишечник, выполняет многочисленные функции: участвует в переваривании пищи, подавляет патогенную микрофлору, проявляет антиканцерогенные и иммуномодулирующие свойства и является частью т.н. оси кишечник - мозг (gut - brain axis) (Young, 2012, The intestinal microbiota in health and disease, Curr Opin Gastroenterol, 28:63-9; Cryan and O′Mahony, 2011, The microbiome-gut-brain axis: from bowel to behavior. Neurogastroenterol Motil., 23:187-92). Населяющие ЖКТ бактерии выделяют ряд низкомолекулярных веществ, которые являются нейромедиаторами и гормоноподобными веществами, действующими в первую очередь на нервные окончания в ЖКТ и предающими сигналы в ЦНС. К таким веществам относятся ацетилхолин и другие холины, серотонин, норадреналин, гистамин и другие амины, жирные кислоты с короткими цепями, ГАМК (Roshchina, 2010, Evolutionary Considerations of Neurotransmitters in Microbial, Plant, and Animal Cells, In: Microbial Endocrinology, p. 17-52). Такими связями микробиоты и ЦНС занимается новая область науки - микробная эндокринология. (Clarke et al., 2014, Gut microbiota: the neglected endocrine organ, Mol Endocrinol., 28:1221-38).
Влияние кишечной микробиоты на эмоциональное поведение, восприятие боли, сигнальные механизмы, реакцию на стресс у животных, преимущественно грызунов, показано неоднократно (Bravo et al, 2011; Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve, Proc Natl Acad Sci USA, 108:16050-5; Diaz et al., 2011, Normal gut microbiota modulates brain development and behavior, Proc Natl Acad Sci USA, 108:3047-52). Эти данные позволяют предполагать, что аналогичный эффект кишечная микробиота может проявлять в организме человека, влияя на его эмоциональное поведение и течение психических заболеваний, что и было показано в ряде работ (Finegold et al., 2002, Gastrointestinal microflora studies in late-onset autism. Clin Infect Dis., 35(Suppl 1):S6-S16; Messaoudi et al., 2011, Assessment of psychotropic-like properties of a probiotic formulation (Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175) in rats and human subjects, Br J Nutr, 105:755-764; Tillisch et al., 2013, Consumption of fermented milk product with probiotic modulates brain activity. Gastroenterology, 144, 1394-1401).
Лактобактерии обнаруживаются практически во всех отделах тела человека: ЖКТ, коже, вагинальной полости. В отличие от подавляющего большинства бактерий микробиоты человека лактобактерии являются культивируемыми организмами и хорошо изучены генетически. Лактобактерии являются пробиотическими микроорганизмами и считаются безопасными (GRAS - generally regaded as safe), они широко используются в функциональных пищевых продуктах, биологически активных добавках, лекарственных средствах. Пробиотики, и лактобактерии в частности, все чаще используются в комбинированном лечении начальных стадий различных заболеваний (язвенного колита, синдрома воспаленного кишечника, аллергических заболеваний). Преимуществами использования пробиотиков в качестве лекарственных средств является их относительная безвредность и физиологичность по сравнению с химическими препаратами и возможность подбора конкретного препарата - вплоть до индивидуальной терапии - для лечения одного и того же заболевания у разных пациентов.
Синтез ГАМК показан у ряда лактобацил, преимущественно у L. brevis (Li et al., 2008, A high gamma-aminobutyric acid-producing Lactobacillus brevis isolated from Chinese traditional paocai, Annales Microbiol., 58, 649-653; Seo et al., 2013, Expression and characterization of a glutamate decarboxylase from Lactobacillus brevis 877G producing gamma-aminobutyric acid, Biosci. Biotechnol. Biochem., 77:853-856; патенты WO 2013107913, 2013 г., KR 20140100370, 2013; KR 20140048488, 2012), у некоторых штаммов L. plantarum (патенты KR 20140087518, 2012 г., KR 20120007917, 2010 г.), а также у L. paracasei, L. buchneri, L. helveticus, L. delbrueckii, L. reuteri, L. zymae (см. обзор Li, Cao, 2010, Lactic acid bacterial cell factories for gamma-aminobutyric acid, Amino Acids, 39:1107-1116).
Введение лактобацилл перорально животным (мышам и крысам) снижает состояние тревоги, регулирует эмоциональное состояние и обцессивно-компусивное поведение (Luo et al., 2014, Ingestion of Lactobacillus strain reduces anxiety and improves cognitive function in the hyperammonemia rat, Sci China Life Sci. 57:327-35; Perez-Burgos et al., 2013, Psychoactive bacteria Lactobacillus rhamnosus (JB-1) elicits rapid frequency facilitation in vagal afferents, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304:G211-20;
Показана связь между продукцией ГАМК лактобактериями и их действием на нервную систему (Cho et al., 2007, Production of gamma-aminobutyric acid (GABA) by Lactobacillus buchneri isolated from kimchi and its neuroprotective effect on neuronal cells, J Microbiol Biotechnol., 2007, 17:104-9; Bravo et al., 2011, Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve, Proceedings of the National Academy of Sciences of the US America, 108:16050-16055).
На данный момент лекарственные препараты на основе лактобактерий, направленные на комплексное лечение нейродепрессивных сосотояний (тревоги, нарушений сна, депрессии и др.) отсутствуют. Есть отдельные зарубежные работы, предлагающие штаммы лактобактерий для таких целей (Barrett et al., 2012, γ-Aminobutyric acid production by culturable bacteria from the human intestine, J Appl Microbiol., 113:411-7; патент WO 2013107913, Stanton et al, 2013, Gaba-producing culturable bacteria derived from the human gastrointestinal tract). Описанные в них штаммы являются ближайшим аналогом изобретения.
Мы полагаем, что разработка таких штаммов и препаратов на их основе необходимы. В России необходимы препараты на основе российских штаммов лактобацилл, адаптированных для российской популяции, с учетом происхождения штамма (т.е. выделенные из ЖКТ людей - жителей центрального региона России). Депонируемые штаммы отличаются от всех описанных ранее тем, что они 1. выделены из ЖКТ именно жителей центрального региона России; 2.имеют отличную от других штаммов последовательность гена глутаматдекарбоксилазы (см. ниже).
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является поиск и отбор штаммов лактобацилл, выделенных из организма людей - жителей центрального региона России, обладающих пробиотическими свойствами и способных синтезировать и выделять в среду ГАМК.
Отбор штаммов.
Была проверена коллекция штаммов лактобацилл, состоящая из видов L. rhamnosus, L. fermentum, L. brevis, L. casei, L. plantarum, L. helveticus, L. salivarius, L. sakei, L. reuteri, L. mucosa, L. crispatus, L. buchneri, L. gasseri, L. delbrieckii, всего 100 штаммов, на наличие ГАМК в культуральной среде. Штаммы выращивали в среде MRS с 1% глутамата натрия и определяли наличие ГАМК методом тонкослойной хромотографии на пластинах на стеклянной подложке Silica gel 60 F254 (Merck). Количество образуемой ГАМК определяли методом двумерного сканирования пластинок на денситометре Shimadzu. Синтез ГАМК был установлен у штаммов L. plantarum и L. brevis (см пример 1). Были отобраны два штамма, принадлежащие к этим видам, имеющие достаточно высокий уровень синтеза ГАМК и характеризующиеся рядом пробиотических свойств - Lactobacillus brevis 15f и Lactobacillus plantarum 90sk.
Штамм L. brevis 15f выделен в 2010 г. в г. Твери из фекалий здоровой девушки в возрасте 19 лет.
Штамм L. plantarum 90sk выделен в 2011 г. в г. Твери из кишечного биоптата женщины 56 лет.
Штаммы охарактеризованы в соответствии с требованиями по биобезопасности, опубликованными в Фармакопейной статье «Пробиотики для медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Государственный стандарт качества лекарственных средств).
Штаммы депонированы в ВКПМ (г. Москва) в октябре 2014 г., коллекционные номера
Для L. brevis 15f - В-12077
Для L. plantarum 90sk - В-12076
Определение видовой принадлежности патентуемых штаммов.
Определение видовой принадлежности штамма L. brevis 15st было проведено по нуклеотидной последовательности гена 16S РНК. Штамм был идентифицирован как L. brevis, см. пример 2.
Определение видовой принадлежности штамма L. plantarum 90sk проводили: 1. по нуклеотидной последовательности гена 16S рибосомной РНК; 2. с помощью видоспецифических праймеров, сделанных по гену recA; 3. с помощью видоспецифических праймеров и НП межгенного района, предшествующего первому гену оперона F0F1 синтазы atpB. Штамм был идентифицирован как L. plantarum, см. пример 3.
Культурально-морфологические особенности штаммов:
По данным свойствам оба штамма неотличимы друг от друга.
Морфологические и тинкториальные свойства: грамположительные бесспоровые палочки короткие и длинные (2-5 мкм) с закругленными концами, некоторые расположены в цепочку.
Выросшие колонии имели следующие культуральные свойства: колонии S-формы 1-2 мм, выпуклые, гладкие, светло-желтого или белого цвета с ровными краями. При культивировании в жидкой среде MRS в течение 22-24 ч происходит равномерное помутнение среды по всему ее объему, кроме зоны аэробиоза, с образованием осадка.
Способ, условия и состав сред для размножения штаммов.
Штаммы культивировали на жидкой и агаризованной средах MRS (Himedia) в течении 24-48 час. Состав среды MRS на 1 литр в граммах: протеозопептон - 10,0; мясной экстракт - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 20,0; полисорбат 80-1,0; цитрат аммония - 2,0; ацетат натрия - 5,0; сульфат магния - 0,1; сульфат марганца - 0,05; фосфат калия двузамещенный - 2,0. pH (при 25°С) 6,5. Культивирование осуществляли как в анаэробных условиях с использованием анаэростата и системы GasPak+, так и в аэробном режиме. Температура инкубации 37°С.
Активность (продуктивность) штаммов.
9
В MRS-бульоне продуктивность штаммов достигала 10 кл/мл.
1
Антагонистическое действие на бактериальные и дрожжевые тест-культуры выявляли методом агаровых слоев на бактериальных тест-штаммах: Staphylococcus aureus АТСС 25923, Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853, Shigella sonnei I фазы 941, Bacillus subtillis 534, Escherichia coli 25922, Klebsiella pneumoniae K 5054, Candida albicans ATCC 885-653. Штамм L. plantarum 90sk проявлял во всех случаях высокую антагонистическую активность, штамм L. brevis 15st - среднюю и низкую (см. пример 4).
У обоих штаммов выявлено отсутствие гемолитической, протеолитической, летициназной, ДНК-ной и РНК-ной активностей.
Устойчивость (чувствительность) к антибиотикам.
Штамм L. brevis 15f устойчив к канамицину, амикацину, полимиксину В, бацитрацину, ванкомицину, стрептомицину, линкомицину, промежуточно устойчив к ампициллину, тетрациклину, чувствителен к рифампицину, хлорамфениколу, азитромицину, олеандомицину, эритромицину, гентамицину, неомицину. Штамм L. plantarum 90sk устойчив к канамицину, гентамицину, стрептомицину, неомицину, амикацину, линкомицину, полимиксину В, ванкомицину, промежуточно устойчив к ампициллину, азитромицину, олеандомицину, чувствителен к рифампицину, хлорамфениколу, тетрациклину, эритромицину. Устойчивость не связана с генами, расположенными на мобильных генетических элементах.
Продукты, синтезируемые штаммами:
При выращивании в питательном бульоне MRS с 1% глутамата натрия патентуемые штаммы синтезируют и секретируют в среду ГАМК. Максимальное количество ГАМК в этих условиях обнаруживается при 80-90 часах инкубации (3-3,7 суток) и достигает 770 мг/мл для L. brevis 15f и 220 мг/мл для L. plantarum 90sk (см. примеры 5, 6).
Гены глутаматдекарбоксилазы у патентуемых штаммов.
У патентуемых штаммов было установлено наличие генов gad (глютаматдекарбоксилазы) и определена нуклеотидная последовательность генов (см. пример 7). Нуклеотидная последовательность генов gad у патентуемых штаммов отличалась от таковой для всех генов gad, депонированных в GenBank, и была уникальной (см. пример 7).
Таким образом, способность штаммов Lactobacillus brevis 15f и Lactobacillus plantarum 90sk продуцировать ГАМК, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, отсутствие протеазной и др. активностей делают возможным использование штаммов по отдельности и в составе различных смесей бактериальных штаммов при производстве лекарственных средств в виде лиофилизированных препаратов, капсул, жидких культур и других аналогичных средств для лечения вегето-сосудистых расстройств и депрессивных состояний. Штаммы отличны от всех описанных ранее штаммов L. plantarum и L. brevis, продуцирующих ГАМК, т.к. выделены из организма людей - жителей центрального региона Российской Федерации и имеют уникальную последовательность генов gad.
Примеры по характеристике получения и свойствам штаммов L. brevis 15f и L. plantarum 90sk по настоящему изобретению.
Пример 1.
Отбор штаммов, продуцирующих ГАМК.
Пример 2.
Определение видовой принадлежности штамма L. brevis 15f
Использовали стандартные праймеры 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r (GGTTACCTTGTTACGACTT); (Lane, D.J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp. 115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley). Ген состоит из 1563 пн; определяли НП 500 пн (с 46 по 545).
Пример 3.
Определение видовой принадлежности штамма Lactobacillus plantarum 90sk
1. Для определения вида по нуклеотидной последовательности гена 16S РНК использовали стандартные праймеры 27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r (GGTTACCTTGTTACGACTT) (Lane, D.J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp. 115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley). Ген состоит из 1519 пн; определяли НП 1450 нуклеотидов, с 19 по 1468.
по этим данным штамм 90sk неотличим от видов L. plantarum, L. pentosus, L. paraplantarum. С видами L. fabifermentans и L. xiangfangensis он имеет 99% идентичности по НП гена 16S рибосомной РНК, однако различие составляет 10 и более пар нуклеотидов на исследуемый фрагмент, тогда как отличия внутри вида составляют 1-2 пары нуклеотидов. С видом L. mudanjiangensis имеет 98% идентичности, различия обнаруживаются более чем по 30 пн. С видами L. xiangfangensis и L. mudanjiangensis гомологична только часть рассматриваемой нуклеотидной последовательности (1411/1429 и 1405/1437 пар нуклеотидов соответственно).
2. Для уточнения идентификации штамма 90sk и более точного отнесения его к одному из близкородственных видов L. plantarum, L. paraplantarum, и L. pentosus, мы провели идентификацию с помощью видоспецифических F-праймеров, сделанных по гену recA: paraF (5′-GTC АСА GGC ATT ACG AAA AC-3′), pentF (5′-CAG TGG CGC GGT TGA TAT C-3′), planF (5′-CCG TTT ATG CGG AAC ACC TA-3′) и общего для них R-праймера pREV (5′-TCG GGA TTA CCA AAC АТС AC-3′), (Torrianiet al. 2001. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus, and L. paraplantarum by recA gene sequence analysis and multiplex PCR assay with recA gene-derived primers. Appl. Env. Microbiol. 67, 3450-3454).
По этому тесту штамм 90sk достоверно отличен от видов L. paraplantarum и L. pentosus и принадлежит к виду L. plantarum.
3. Помимо гена 16S рРНК мы используем в работе видоспецифические праймеры и НП межгенного района, предшествующего первому гену оперона F0F1 синтазы atpB
[Патент Ru 2508406 "Метод видовой идентификации лактобацилл L. casei/paracasei, L. fermentum, L. plantarum, L. rhamnosus" AHO «НИЦ «БИОАН» 2012 г.]. Праймеры F0F1Lp1-F (5′-CAAGTCACAATTACTGAGATG-3′) и F0F1Lp-R (5′-TTCAGTTCAGTGGTCTAGCA-3′).
Для штамма 90sk эта последовательность выглядит так:
Внутри вида L. plantarum различия в последовательности не превышают 1 нуклеотида на последовательность (256 пн). Идентичность с соответствующей НП штаммов L. pentosus составляет менее 92%. Для видов L. paraplantarum, L. fabifermentans гомологичных последовательностей в геномах не обнаруживается.
Севенированные геномы видов L. xiangfangensis и L. mudanjiangensis в базе данных отсутствуют, сравнение с данными видами невозможно.
Таким образом, штамм 90sk относится к виду L. plantarum.
Пример 4.
Синтез ГАМК штаммом L. plantarum 90sk.
Опыт проводили в обычной ростовой среде для лактобактерий MRS, в которую добавляли 1% глютамата натрия - предшественника ГАМК. Синтез и количество ГАМК определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silica gel 60 F254 (Merck) и двумерного сканирования пластинок на денситометре Shimadzu. Перед нанесением на пластинку пробы разводили в 10 раз. 2 мкл культуры наносили на пластинку, использовали смесь растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:1; в общую смесь добавляли 0,2% нингидрина. После разделения фракций нагревали пластинку при 70°С в течении 10 минут для проявления пятен. Результаты представлены на рис. 1. На рис. 2 представлены графики роста культуры штамма L. plantarum 90sk и продукции ГАМК.
Пример 5.
Синтез ГАМК штаммом L. brevis 15st.
Опыт проводили в обычной ростовой среде для лактобактерий MRS, в которую добавляли 1% глютамата натрия - предшественника ГАМК. Синтез и количество ГАМК определяли методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silica gel 60 F254 (Merck) и двумерного сканирования пластинок на денситометре Shimadzu. Перед нанесением на пластинку пробы разводили в 10 раз. 2 мкл культуры наносили на пластинку, использовали смесь растворителей н-бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:1; в общую смесь добавляли 0,2% нингидрина. После разделения фракций нагревали пластинку при 70°С в течении 10 минут для проявления пятен. Результаты представлены на рис. 3. На рис. 4 представлены графики роста культуры штамма L. brevis 15f и продукции ГАМК.
Пример 6.
Определение антагонистической активности штаммов.
Антагонистическую активность определяли при помощи модификации метода отсроченного антагонизма в агаре (Muriana P.M., Klaenhammer T.R. 1987. Conjugal transfer of plasmid-encoded determinants for bacteriocin production and immunity in Lactobacillus acidophilus 88. Appl. Environ. Microbiol. 53, 553-560). Для этого на поверхность плотной питательной среды MRS-aгар бактериологической петлей бляшками с диаметром 15 мм засевали 24 часовые культуры лактобактерий и культивировали 24 часа при 37°С в анаэробных условиях. После культивирования круглым металлическим пробойником с диаметром 16 мм удаляли фрагмент агара с выросшими бактериями. Затем на подготовленные таким образом чашки наносили 5,5 мл расплавленной и остуженной до 50°С полужидкой (0,5% агара) среды Columbia agar, в которую предварительно вносили 0,1 мл суточной культуры индикаторного штамма. После 18-часовой инкубации при 37°С измеряли величину зон задержки роста от края удаленной бляшки до края роста индикаторных штаммов. Исследования по определению антагонистической активности по отношению к индикаторным штаммам микроорганизмов повторяли три раза. Из полученных данных вычисляли среднюю величину. Полученные результаты представлены в таблице 4.
Степень антагонизма определяли по следующим критериям:
10 мм и менее - низкая,
10-20 мм - средняя,
21 мм и более - высокая.
Р - резистентность.
Пример 7.
Нуклеотидная последовательность gad-генов (генов глютаматдекарбоксилазы) патентуемых штаммов.
Ген gad L. plantarum 90sk
Для определения НП были использованы праймеры
Выравнивание нуклеотидной последовательности с наиболее близким по НП геном штамма Lactobacillus plantarum subsp. plantarum ST-III gb|CP002222.1| (nucleotide BLAST).
Ген gad L. brevis 15f
Для определения НП были использованы праймеры
Выравнивание нуклеотидной последовательности гена с наиболее близким по НП геном штамма Lactobacillus brevis КВ290 из GenBank dbj|АР012167.1| (nucleotide BLAST)
Краткое описание чертежей (рисунков)
Рис. 1. Динамика синтеза гамма-аминомасляной кислоты штаммом L. plantarum 90sk.
Контрольные пробы: позиции 1-3 - ГАМК 1-0,5-0,25 мг/мл; позиция 4: глютамат натрия (Глт - 1 мг/мл); позиция 5: смесь питательной среды MRS и ГАМК. Позиции 6-19 - культуры штамма L. plantarum 90sk, выращенные разное время; время роста культур в часах указано под рисунком.
Рис. 2. Характер роста штамма L. plantarum 90sk (синтез ГАМК, KOE). Количество синтезированной ГАМК определялось методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silica gel 60 F254 (Merck) и двумерного сканирования пластинок на денситометре Shimadzu. Число колониеобразующих единиц бактерий (КОЕ) определяли высевом разведений бактериальной культуры на твердую среду MRS.
Рис. 3. Динамика синтеза гамма-аминомасляной кислоты штаммом L. brevis 15st.
Контрольные пробы: позиции 1-3 - ГАМК 1-0,5-0,25 мг/мл; позиция 4: глютамат натрия (Глт - 1 мг/мл); позиция 5: смесь питательной среды MRS и ГАМК. Позиции 6-19 - культуры штамма L. brevis 15f, выращенные разное время; время роста культур в часах указано под рисунком.
Рис. 4. Характер роста штамма L. brevis 15st (синтез ГАМК, KOE). Количество синтезированной ГАМК определялось методом тонкослойной хроматографии на пластинах Silica gel 60 F254 (Merck) и двумерного сканирования пластинок на денситометре Shimadzu. Число колониеобразующих единиц бактерий (КОЕ) определяли высевом разведений бактериальной культуры на твердую среду MRS.
Пример 2.
L.brevis
Определение видовой принадлежности штамма 15f
Использовали стандартные праймеры  27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r  (GGTTACCTTGTTACGACTT); (Lane, D. J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp. 115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley). Ген состоит из 1563 пн; определяли НП 500 пн (с 46 по 545).
ATACATGCAAGTCGAACGAGCTTCCGTTGAATGACGTGCTTGCACTGATTTTAACAATGAAGCGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAATCTGCCCAGAAGCAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAACAAAATCCGCATGGATTTTGTTTGAAAGGTGGCTTCGGCTATCACTTCTGGATGATCCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTGAGGTAAAGGCCCACCAAGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACACCTTTGAGAGTAACTGTTCAAGGGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC
Пример 3.
Lactobacillus plantarum
Определение видовой принадлежности штамма  90sk
1
. Для определения вида по нуклеотидной последовательности гена 16S РНК использовали стандартные праймеры  27f (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) и 1492r  (GGTTACCTTGTTACGACTT) (Lane, D. J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing. In: Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics, pp. 115-175. Edited by E. Stackebrandt & M. Goodfellow. Chichester: Wiley). Ген состоит из 1519 пн; определяли НП 1450 нуклеотидов, с 19 по 1468.
GCCTAATACATGCAAGTCGAACGAACTCTGGTATTGATTGGTGCTTGCATCATGATTTACATTTGAGTGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTGCCCAGAAGCGGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACTTGGACCGCATGGTCCGAGCTTGAAAGATGGCTTCGGCTATCACTTTTGGATGGTCCCGCGGCGTATTAGCTAGATGGTGGGGTAACGGCTCACCATGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTCGGGGACATGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTATCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAACTCGCGAGAGTAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAACCAGCCGCCTAAG
3.
atpB
Помимо гена 16S рРНК мы используем в работе видоспецифические праймеры и НП межгенного района, предшествующего первому гену оперона F0F1 синтазы
L.casei/paracasei, L.fermentum, L.plantarum, L.rhamnosus
.
[Патент Ru 2508406 “Метод видовой идентификации лактобацилл ”  АНО «НИЦ «БИОАН» 2012 г]. Праймеры F0F1Lpl-F  (5'-CAAGTCACAATTACTGAGATG-3')  и F0F1Lp-R (5'- TTCAGTTCAGTGGTCTAGCA -3').
Для штамма 90sk  эта последовательность выглядит так:
GCCGTCATTGCGCGTGCCAAGAATGAAAATAAAGTCAAAATAATGAAAATCCAACGATTTGAAAGCTTAATGAAAGCTTGATATTGTTGGATTTTTATTGATTGACGAAATGTTGAAATTATTTTGAATTTTTTCGACGGTGGTGGTATTATTACCTTTGTATTTTGATTAGGGGTGTCTCTAATCTACCATTTCAGGTTACGATAAAATTGACGTTGACTAGCTCAAAGGTTAAGGTTATCGTAGCACCGAAATTAAAGGAAAGAGGTGATATTCA
Пример 7.
gad
Нуклеотидная последовательность -генов (генов глютаматдекарбоксилазы) патентуемых штаммов.
gad L.plantarum
Ген  90sk
Для определения НП были использованы праймеры
GDLp1-F   CCTGTTATCACCTCGTGCTA;  GDLp1-R   TTGAATCTCGCGGTAACCGT;
GDLp2-F   ATGGGCATCACTTATACCGG; GDLp2-R   CACCAAGCTTTGCTATCCAC.
НП1
ATGGCAATGTTATACGGTAAACACAATCATGAAGCTGAAGAATACTTGGAACCAGTCTTTGGTGCGCCTTCTGAACAACATGATCTTCCTAAGTATCGGTTACCAAAGCATTCATTATCCCCTCGAGAAGCCGATCGCTTAGTTCGTGATGAATTATTAGATGAAGGCAATTCACGACTGAACCTGGCAACTTTTTGTCAGACCTATATGGAACCCGAAGCCGTTGAATTGATGAAGGATACGCTGGCTAAGAATGCCATCGACAAATCTGAGTACCCCCGCACGGCCGAGATTGAAAATCGGTGTGTGAACATTATTGCCAATCTGTGGCACGCACCTGATGACGAACACTTTACGGGTACCTCTACGATTGGCTCCTCTGAAGCTTGTATGTTAGGCGGTTTAGCAATGAAATTCGCCTGGCGTAAACGCGCTCAAGCGGCAGGTTTAGATCTGAATGCCCATCGACCTAACCTCGTTATTTCGGCTGGCTATCAAGTTTGCTGGGAAAAGTTTTGTGTCTACTGGGACGTTGACATGCACGTGGTCCCAATGGATGAGCAACACATGGCCCTTGACGTTAACCACGTCTTAGACTACGTGGACGAATACACAATTGGTATCGTCGGTATCATGGGCATCACTTATACCGGTCAATATGACGACCTAGCCGCACTCGATAAGGTCGTTACTCACTACAATCATCAGCATCCCAAATTACCAGTCTACATTCACGTTGACGCAGCGTCAGGTGGCTTCTATACCCCATTTATTGAGCCGCAACTCATCTGGGACTTCCGGTTGGCTAACGTCGTTTCGATCAACGCCTCCGGGCACAAGTACGGTTTAGTTTATCCCGGGGTCGGCTGGGTCGTTTGGCGTGATCGTCAGTTTTTACCGCCAGAATTAGTCTTCAAAGTTAGTTATTTAGGTGGGGAGTTGCCGACAATGGCGATCAATTTCTCACATAGTGCAGCCCAGCTCATTGGACAATACTATAATTTCATTCGCTTTGGTATGGGCGGTTACCGCGAGATTCAAACAAAGACTCACGATGTTGCCCGCTACCTGGCAGCCGCTCTGGATAAAGTTGGTGAGTTTAAGATGATCAATAACGGACACCAACTCCCCCTGATTTGTTACCAACTAGCCCCGCGCGAAGATCGTGAATGGACCCTTTATGATTTATCGGATCGCCTATTAATGAACGGTTGGCAAGTACCAACGTATCCTTTACCTGCTAATCTGGAACAACAAGTCATCCAACGAATCGTCGTTCGGGCTGACTTTGGCATGAATATGGCCCACGATTTCATGGATGACCTGACCAAGGCTGTCCATGACTTAAACCACGCCCACATTGTCTATCATCATGACGCGGCACCTAAGAAATACGGATTCACACACTGA
Выравнивание
Lactobacillus plantarum
plantarum
нуклеотидной последовательности с наиболее близким по НП геном штамма  subsp.  ST-III  gb|CP002222.1|   (nucleotide BLAST).
Query  1        ATGGCAATGTTATACGGTAAACACAATCATGAAGCTGAAGAATACTTGGAACCAGTCTTT  60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2998620  ATGGCAATGTTATACGGTAAACACAATCATGAAGCTGAAGAATACTTGGAACCAGTCTTT  2998679
Query  61       GGTGCGCCTTCTGAACAACATGATCTTCCTAAGTATCGGTTACCAAAGCATTCATTATCC  120
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2998680  GGTGCGCCTTCTGAACAACATGATCTTCCTAAGTATCGGTTACCAAAGCATTCATTATCC  2998739
Query  121      CCTCGAGAAGCCGATCGCTTAGTTCGTGATGAATTATTAGATGAAGGCAATTCACGACTG  180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2998740  CCTCGAGAAGCCGATCGCTTAGTTCGTGATGAATTATTAGATGAAGGCAATTCACGACTG  2998799
Query  181      AACCTGGCAACTTTTTGTCAGACCTATATGGAACCCGAAGCCGTTGAATTGATGAAGGAT  240
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2998800  AACCTGGCAACTTTTTGTCAGACCTATATGGAACCCGAAGCCGTTGAATTGATGAAGGAT  2998859
Query  241      ACGCTGGCTAAGAATGCCATCGACAAATCTGAGTACCCCCGCACGGCCGAGATTGAAAAT  300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2998860  ACGCTGGCTAAGAATGCCATCGACAAATCTGAGTACCCCCGCACGGCCGAGATTGAAAAT  2998919
Query  301      CGGTGTGTGAACATTATTGCCAATCTGTGGCACGCACCTGATGACGAACACTTTACGGGT  360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2998920  CGGTGTGTGAACATTATTGCCAATCTGTGGCACGCACCTGATGACGAACACTTTACGGGT  2998979
Query  361      ACCTCTACGATTGGCTCCTCTGAAGCTTGTATGTTAGGCGGTTTAGCAATGAAATTCGCC  420
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2998980  ACCTCTACGATTGGCTCCTCTGAAGCTTGTATGTTAGGCGGTTTAGCAATGAAATTCGCC  2999039
Query  421      TGGCGTAAACGCGCTCAAGCGGCAGGTTTAGATCTGAATGCCCATCGACCTAACCTCGTT  480
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999040  TGGCGTAAACGCGCTCAAGCGGCAGGTTTAGATCTGAATGCCCATCGACCTAACCTCGTT  2999099
Query  481      ATTTCGGCTGGCTATCAAGTTTGCTGGGAAAAGTTTTGTGTCTACTGGGACGTTGACATG  540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999100  ATTTCGGCTGGCTATCAAGTTTGCTGGGAAAAGTTTTGTGTCTACTGGGACGTTGACATG  2999159
Query  541      CACGTGGTCCCAATGGATGAGCAACACATGGCCCTTGACGTTAACCACGTCTTAGACTAC  600
||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999160  CACGTGGTCCCAATGGATGAGCAACACATGGTCCTTGACGTTAACCACGTCTTAGACTAC  2999219
Query  601      GTGGACGAATACACAATTGGTATCGTCGGTATCATGGGCATCACTTATACCGGTCAATAT  660
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999220  GTGGACGAATACACAATTGGTATCGTCGGTATCATGGGCATCACTTATACCGGTCAATAT  2999279
Query  661      GACGACCTAGCCGCACTCGATAAGGTCGTTACTCACTACAATCATCAGCATCCCAAATTA  720
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999280  GACGACCTAGCCGCACTCGATAAGGTCGTTACTCACTACAATCATCAGCATCCCAAATTA  2999339
Query  721      CCAGTCTACATTCACGTTGACGCAGCGTCAGGTGGCTTCTATACCCCATTTATTGAGCCG  780
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999340  CCAGTCTACATTCACGTTGACGCAGCGTCAGGTGGCTTCTATACCCCATTTATTGAGCCG  2999399
Query  781      CAACTCATCTGGGACTTCCGGTTGGCTAACGTCGTTTCGATCAACGCCTCCGGGCACAAG  840
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999400  CAACTCATCTGGGACTTCCGGTTGGCTAACGTCGTTTCGATCAACGCCTCCGGGCACAAG  2999459
Query  841      TACGGTTTAGTTTATCCCGGGGTCGGCTGGGTCGTTTGGCGTGATCGTCAGTTTTTACCG  900
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999460  TACGGTTTAGTTTATCCCGGGGTCGGCTGGGTCGTTTGGCGTGATCGTCAGTTTTTACCG  2999519
Query  901      CCAGAATTAGTCTTCAAAGTTAGTTATTTAGGTGGGGAGTTGCCGACAATGGCGATCAAT  960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999520  CCAGAATTAGTCTTCAAAGTTAGTTATTTAGGTGGGGAGTTGCCGACAATGGCGATCAAC  2999579
Query  961      TTCTCACATAGTGCAGCCCAGCTCATTGGACAATACTATAATTTCATTCGCTTTGGTATG  1020
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999580  TTCTCACATAGTGCAGCCCAGCTCATTGGACAATACTATAATTTCATTCGCTTTGGTATG  2999639
Query  1021     GGCGGTTACCGCGAGATTCAAACAAAGACTCACGATGTTGCCCGCTACCTGGCAGCCGCT  1080
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999640  GACGGTTACCGCGAGATTCAAACAAAGACTCACGATGTTGCCCGCTACCTGGCAGCCGCT  2999699
Query  1081     CTGGATAAAGTTGGTGAGTTTAAGATGATCAATAACGGACACCAACTCCCCCTGATTTGT  1140
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999700  CTGGATAAAGTTGGTGAGTTTAAGATGATCAATAACGGACACCAACTCCCCCTGATTTGT  2999759
Query  1141     TACCAACTAGCCCCGCGCGAAGATCGTGAATGGACCCTTTATGATTTATCGGATCGCCTA  1200
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999760  TACCAACTAGCCCCGCGCGAAGATCGTGAATGGACCCTTTATGATTTATCGGATCGCCTA  2999819
Query  1201     TTAATGAACGGTTGGCAAGTACCAACGTATCCTTTACCTGCTAATCTGGAACAACAAGTC  1260
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999820  TTAATGAACGGTTGGCAAGTACCAACGTATCCTTTACCTGCTAATCTGGAACAACAAGTC  2999879
Query  1261     ATCCAACGAATCGTCGTTCGGGCTGACTTTGGCATGAATATGGCCCACGATTTCATGGAT  1320
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999880  ATCCAACGAATCGTCGTTCGGGCTGACTTTGGCATGAATATGGCCCACGATTTCATGGAT  2999939
Query  1321     GACCTGACCAAGGCTGTCCATGACTTAAACCACGCCCACATTGTCTATCATCATGACGCG  1380
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2999940  GACCTGACCAAGGCTGTCCATGACTTAAACCACGCCCACATTGTCTATCATCATGACGCG  2999999
Query  1381     GCACCTAAGAAATACGGATTCACACACTGA  1410
||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  3000000  GCACCTAAGAAATACGGATTCACACACTGA  3000029
gad L.brevis
Ген  15f
Для определения НП были использованы праймеры
GDLb1-F    TGAGTGCCTTTGTGGTCATG;   GDLb1-R   TGTTGTGCCGCCAAACAATC;
GDLb2-F  CTAGATAACCTCGTGACCGA;    GDLb2-R   TGGGCATTGCCAATGTGCAA.
НП2
ATGAATAAAAACGATCAGGAAACACAGCAGATGATTAATAATGTGGATTTAGAAAAAACGTTTTTAGGCAGTGTCGAAGCCGGACAATCCTTACCTACCAATACATTACCAAATGATCCCATGGCACCGGATGTTGCCGCTCAATTGGTGGAACACTATCGTTTAAATGAAGCCAAGGCTAATCAAAATCTGGCGACCTTCTGTACCACGCAAATGGAACCGCAAGCCGACGAATTAATGAAGAACGCGTTGAATACCAATGCGATTGATAAATCGGAATACCCTAAGACCGCGGCAATGGAAAATTACTGTGTCAGCATGATTGCTCACCTATGGGGAATTCCTGACAATGAAAAGATTTACGATGATTTCATTGGGACCTCAACGGTAGGTTCTTCTGAAGGATGTATGTTAGGCGGCTTGGCGCTGCTACATAGTTGGAAGCACCGGGCCAAGGCAGCTGGATTTGATATTGAAGACCTGCATAGCCACAAGCCCAACTTGGTCATCATGTCAGGTTACCAAGTCGTTTGGGAAAAGTTCTGTACCTACTGGAATGTCGAGATGCGCCAAGTGCCGATTAATGGTGACCAGGTTTCCTTAGATATGGATCATGTGATGGATTACGTTGATGAAAATACGATTGGGATTATCGGAATTGAGGGCATTACGTACACAGGCTCCGTTGATGATATTCAAATGCTAGATAACCTCGTGACCGAATATAACAAGACCGCGACGATGCCGGTACGGATTCACGTTGATGCTGCCTTTGGTGGTCTGTTCGCGCCGTTCGTCGATGGCTTTAACCCGTGGGACTTCCGGTTGAAGAACGTGGTTTCCATTAACGTTTCGGGCCATAAATACGGGATGGTTTACCCTGGGTTGGGGTGGATTGTTTGGCGGCACAACACGGCTGATATTTTACCCGCAGAAATGCGATTTCAAGTGCCATATCTAGGTAAGACCGTTGATTCAATCGCCATTAACTTCTCGCACAGTGGTGCCCATATCAGTGCACAATACTACAATTTCATTCGATTTGGATTATCAGGTTACAAGACGATCATGCAAAATGTTCGGAAGGTGTCATTGAAGCTGACGGCGGCTCTGAAAACGTATGGGATTTTCGATATTTTAGTTGATGGGTCACAGCTACCAATTAACTGTTGGAAACTAGCGGACGATGCGCCGGTTGGTTGGACGTTGTATGATTTGAAGTCCGAGTTGGCTAAGTATGGTTGGCAAGTTCCGGCTTATCCACTGCCAAAGAATCGCGACGATGTGACAATTAGCCGGATCGTGGTGCGCCCATCCATGACCATGACGATTGCCGATGATTTCTTGGATGATTTGAAATTAGCGATTGATGGATTAAATCACACATTTGGCGTGACGACCACCGTTGATCAAGATAACAAGACCACCGTTCGGAGTTAA
Выравнивание
Lactobacillus brevis
нуклеотидной последовательности гена с наиболее близким по НП геном штамма  KB290 из GenBank    dbj|AP012167.1|  (nucleotide BLAST)
Query  1      ATGAATAAAAACGATCAGGAAACACAGCAGATGATTAATAATGTGGATTTAGAAAAAACG  60
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  68817  ATGAATAAAAACGATCAGGAAACACAGCAGATGATTAATAATGTGGATTTAGAAAAAACG  68876
Query  61     TTTTTAGGCAGTGTCGAAGCCGGACAATCCTTACCTACCAATACATTACCAAATGATCCC  120
||||||||||||||||||||||| ||||||||||| ||||||||||||||| ||||||||
Sbjct  68877  TTTTTAGGCAGTGTCGAAGCCGGGCAATCCTTACCCACCAATACATTACCAGATGATCCC  68936
Query  121    ATGGCACCGGATGTTGCCGCTCAATTGGTGGAACACTATCGTTTAAATGAAGCCAAGGCT  180
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  68937  ATGGCACCGGATGTTGCCGCTCAATTGGTGGAACACTATCGTTTAAATGAAGCCAAGGCT  68996
Query  181    AATCAAAATCTGGCGACCTTCTGTACCACGCAAATGGAACCGCAAGCCGACGAATTAATG  240
|||||||| || ||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| |||||||||
Sbjct  68997  AATCAAAACCTAGCGACCTTCTGTACCACGCAAATGGAACCACAAGCCGATGAATTAATG  69056
Query  241    AAGAACGCGTTGAATACCAATGCGATTGATAAATCGGAATACCCTAAGACCGCGGCAATG  300
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69057  AAGAACGCGTTGAATACCAATGCGATTGATAAATCGGAATACCCTAAGACCGCGGCAATG  69116
Query  301    GAAAATTACTGTGTCAGCATGATTGCTCACCTATGGGGAATTCCTGACAATGAAAAGATT  360
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69117  GAAAATTACTGTGTCAGCATGATTGCTCACCTATGGGGAATTCCTGACAATGAAAAGATT  69176
Query  361    TACGATGATTTCATTGGGACCTCAACGGTAGGTTCTTCTGAAGGATGTATGTTAGGCGGC  420
|||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69177  TACGATGATTTCATTGGGACCTCAACTGTAGGTTCTTCTGAAGGATGTATGTTAGGCGGC  69236
Query  421    TTGGCGCTGCTACATAGTTGGAAGCACCGGGCCAAGGCAGCTGGATTTGATATTGAAGAC  480
|||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
Sbjct  69237  TTGGCGCTACTACATAGTTGGAAGCACCGGGCCAAGGCAGCTGGTTTTGATATTGAAGAC  69296
Query  481    CTGCATAGCCACAAGCCCAACTTGGTCATCATGTCAGGTTACCAAGTCGTTTGGGAAAAG  540
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||
Sbjct  69297  CTGCATAGCCACAAGCCCAACTTGGTCATCATGTCAGGTTACCAAGTTGTTTGGGAAAAG  69356
Query  541    TTCTGTACCTACTGGAATGTCGAGATGCGCCAAGTGCCGATTAATGGTGACCAGGTTTCC  600
||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||
Sbjct  69357  TTCTGTACCTATTGGAATGTCGAGATGCGCCAAGTGCCAATTAATGGTGACCAAGTTTCC  69416
Query  601    TTAGATATGGATCATGTGATGGATTACGTTGATGAAAATACGATTGGGATTATCGGAATT  660
|||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69417  TTAGATATGGATCATGTGATGGATTATGTTGATGAAAATACGATTGGGATTATCGGAATT  69476
Query  661    GAGGGCATTACGTACACAGGCTCCGTTGATGATATTCAAATGCTAGATAACCTCGTGACC  720
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||
Sbjct  69477  GAGGGCATTACGTACACAGGCTCCGTTGATGATATTCAAACGCTAGATAACCTCGTGACC  69536
Query  721    GAATATAACAAGACCGCGACGATGCCGGTACGGATTCACGTTGATGCTGCCTTTGGTGGT  780
|||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69537  GAATATAATAAGACCGCGACGATGCCGGTACGGATTCACGTTGATGCTGCCTTTGGTGGC  69596
Query  781    CTGTTCGCGCCGTTCGTCGATGGCTTTAACCCGTGGGACTTCCGGTTGAAGAACGTGGTT  840
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69597  CTGTTCGCGCCGTTCGTCGATGGCTTTAACCCGTGGGACTTCCGGTTGAAGAACGTGGTT  69656
Query  841    TCCATTAACGTTTCGGGCCATAAATACGGGATGGTTTACCCTGGGTTGGGGTGGATTGTT  900
||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69657  TCCATTAACGTTTCGGGCCATAAGTACGGGATGGTTTACCCTGGGTTGGGGTGGATTGTT  69716
Query  901    TGGCGGCACAACACGGCTGATATTTTACCCGCAGAAATGCGATTTCAAGTGCCATATCTA  960
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||
Sbjct  69717  TGGCGGCACAACACGGCTGATATTTTACCCGCAGAAATGCGATTCCAAGTGCCATATCTA  69776
Query  961    GGTAAGACCGTTGATTCAATCGCCATTAACTTCTCGCACAGTGGTGCCCATATCAGTGCA  1020
||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||
Sbjct  69777  GGTAAGACCGTTGATTCAATCGCCATTAACTTCTCACACAGTGGTGCCCATATCAGTGCG  69836
Query  1021   CAATACTACAATTTCATTCGATTTGGATTATCAGGTTACAAGACGATCATGCAAAATGTT  1080
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69837  CAATACTACAATTTCATTCGATTTGGATTATCAGGTTACAAGACGATCATGCAAAATGTT  69896
Query  1081   CGGAAGGTGTCATTGAAGCTGACGGCGGCTCTGAAAACGTATGGGATTTTCGATATTTTA  1140
|||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69897  CGGAAGGTGTCATTGAAGCTGACGGCAGCTCTGAAAACGTATGGGATTTTCGATATTTTA  69956
Query  1141   GTTGATGGGTCACAGCTACCAATTAACTGTTGGAAACTAGCGGACGATGCGCCGGTTGGT  1200
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  69957  GTTGATGGGTCACAGCTACCAATTAACTGTTGGAAACTAGCGGACGATGCGCCGGTTGGT  70016
Query  1201   TGGACGTTGTATGATTTGAAGTCCGAGTTGGCTAAGTATGGTTGGCAAGTTCCGGCTTAT  1260
|||||||| ||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||
Sbjct  70017  TGGACGTTATATGATTTGGAGTCCGAGTTGGCTAAGTATGGTTGGCAAGTTCCGGCATAT  70076
Query  1261   CCACTGCCAAAGAATCGCGACGATGTGACAATTAGCCGGATCGTGGTGCGCCCATCCATG  1320
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||
Sbjct  70077  CCACTGCCAAAGAATCGCGACGATGTGACAATTAGCCGGATCGTGGTACGCCCATCCATG  70136
Query  1321   ACCATGACGATTGCCGATGATTTCTTGGATGATTTGAAATTAGCGATTGATGGATTAAAT  1380
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  70137  ACCATGACGATTGCCGATGATTTCTTGGATGATTTGAAATTAGCGATTGATGGATTAAAT  70196
Query  1381   CACACATTTGGCGTGACGACCACCGTTGATCAAGATAACAAGACCACCGTTCGGAGTTAA  1440
||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||
Sbjct  70197  CACACATTTGGCGTGACGACCACCGTTGATCAAAATAACAAGACCACCGTTCGAAGTTAA  70256