Способ диагностики респираторной вирусной инфекции у детей
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR RESPIRATORY VIRAL INFECTION IN CHILDREN

Изобретение относится к медицине и может найти применение для определения респираторной вирусной инфекции на разных стадиях развития респираторного заболевания у детей в возрасте от 4 месяцев до 14 лет.
Ранняя этиологическая диагностика вирусных инфекций необходима для рациональной этиотропной терапии, прогнозирования тяжести заболевания, предотвращения внутрибольничного заражения и сокращения сроков госпитализации. Для этой цели чаще всего применяется метод полимеразной цепной реакции, который базируется на обнаружении фрагментов нуклеиновых кислот генетического материала вируса и определении их групповой принадлежности по этому критерию. Вместе с тем, стоимость и трудоемкость этого метода, а также недостаточная оснащенность лечебно-профилактических учреждений оборудованием и квалифицированными кадрами являются препятствием для массового применения этого метода в практическом здравоохранении. Применение микробиом-ассоциированной метаболомики позволяет детектировать респираторный вирус в слизистой оболочке верхних дыхательных путей по специфическому соотношению концентраций коротко цепочечных жирных кислот в слюне, полученных методом линейного дискриминантного анализа их концентраций [1, 2].
Известно, что при заражении вирусами меняется метаболический профиль как макроорганизма, так и микробиоценоза. В работе J. Munger, опубликованной в журнале Nat Biotechnol в 2008 г., показано, что синтез жирных кислот важен для репликации вирусов и что профилирование метаболического потока на системном уровне может идентифицировать метаболические мишени для противовирусной терапии. Вирусы полагаются на метаболическую сеть своих клеточных хозяев, чтобы обеспечить энергию и строительные блоки для своей репликации [3].
Впервые идею о том, что вся информация о функциональном состоянии организма отражена в качественном и количественном составе биологических жидкостей организма высказали Linus Pauling с соавторами в 1971 г. [4]. Позже Nicholson J.K. с соавторами (1999) ввел понятие «метабономика», означающее динамический метаболический ответ живых систем на биологические стимулы, в то время как под термином «метаболомика» понималась наука, изучающая метаболические профили на клеточном и органном уровне и связанная преимущественно с нормальным эндогенным метаболизмом [5].
Биологический объект - это единая система, проявляющая реакцию на эндогенные и экзогенные факторы воздействия. Большое количество факторов в многоуровневой системе взаимодействия всех компонентов объекта - это множество одновременно происходящих процессов, которые накладываются друг на друга, и дают нечеткий ответ. Для обработки таких данных применяются методы математического моделирования [6].
Использование концентраций короткоцепочечных жирных кислот для детекции респираторных вирусов с применением проекционных методов многомерной статистики позволяет эффективно детектировать множество респираторных вирусов вне зависимости от его вида и возможных мутаций [7]. Наиболее простым и надежным методом математического моделирования является линейный дискриминантный анализ (ЛДА), который демонстрирует высокие показатели чувствительности и специфичности за счет алгоритма пошагового исключения малоинформативных компонентов и выявления специфического соотношения компонентов, характерного для состояния, заданного обучающей выборкой [1].
Золотым стандартом выделения респираторных вирусов является выделение респираторного вируса на развивающихся куриных эмбрионах или клеточных линиях с последующим анализом [9]. Наиболее распространенными методами идентификации подтипов вируса гриппа А являются реакция торможения гемагглютинации (РТГА) с антисыворотками к эталонным штаммам вируса гриппа для определения подтипа гемагглютинина и реакция ингибирования нейраминидазной активности (РИНА) - для определения подтипа нейраминидазы [10]. Преимуществом культивирования вируса является то, что вирус может быть использован для дальнейших исследований, молекулярно-генетической характеризации и др. Недостатком является повышенная биологическая опасность, трудоемкость и длительное время, требуемое для культивирования (от 3 до 7 дней).
Известен способ выявления антител к гемагглютинину вируса гриппа А путем иммобилизации эритроцитарных рецепторов к гемагглютинину вируса гриппа А в лунках микропланшета, смешивание образцов с конъюгатом вируса гриппа/щелочной фосфатазы и фотометрическое определение количества конъюгата, связавшегося с рецепторами [12]. Метод выявления вирусных агентов ИФА в клинических образцах обладает недостаточной чувствительностью и специфичностью из-за высокого антигенного разнообразия многих групп респираторных вирусов.
Наиболее распространенной диагностикой респираторных вирусных инфекций является метод мультиплексной полимеразно-цепной реакции с детекцией в режиме реального времени образцов крови или соскобов со слизистой носа [11]. Способ позволяет дифференциально выявлять последовательности нуклеиновых кислот, которые принадлежат основным возбудителям ОРВИ в биологических образцах. Наличие определенной последовательности нуклеиновых кислот, характерной для фрагмента ДНК или РНК респираторного вируса в изучаемой пробе определяется ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в реакционной смеси. Список возбудителей ограничен известными последовательностями нуклеиновых кислот, а именно вирусов гриппа А и В, короновирусов, вирусов парагриппа 1-4 тип, аденовирусов, риновирусов, энтеровируса и респираторно-синцитиального вируса. Данный метод является достоверным и адекватным, но может учитывать только известные респираторные вирусы по наиболее стабильным участкам ДНК/РНК. При появлении новых форм респираторных вирусов, которые могут приобретать патогенный потенциал, в результате мутаций из безобидных ранее видов вирусов, метод потребует подбора новых праймеров и модификации технологии.
Известен способ идентификации РНК вирусов гриппа А и В с одновременным определением вариантов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А, идентификацией генетических маркеров патогенности и устойчивости к противогриппозным препаратам на биологических микрочипах, биочип, набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе [6]. Способ основан на проведении реакции обратной транскрипции для получения кДНК с использованием вирусной РНК в качестве матрицы, полимеразной цепной реакции (ПЦР) и последующей гибридизации полученного одноцепочечного флуоресцентно-меченного ПЦР-продукта на биологическом микрочипе. Биологический микрочип представляет собой подложку с упорядоченно расположенными гидрогелевыми элементами, содержащими ковалентно иммобилизованные олигонуклеотидные зонды, которые обеспечивают гибридизацию со специфическими участками генома вируса гриппа, определяющими его тип, субтип и генетические маркеры, включая детерминанты устойчивости к противовирусным препаратам. Преимущество данного способа заключается в том, что предоставляется возможность одновременно (в одном эксперименте) осуществить идентификацию РНК вируса гриппа и определить его типовую принадлежность (тип А либо тип В), выполнить субтипирование вируса гриппа А с определением молекулярных вариантов генов гемагглютинина и нейраминидазы, молекулярного анализа генетических маркеров, характеризующих степень патогенности вируса гриппа А и его устойчивость к основным противовирусным препаратам. Способ не требует дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Ограничение данного способа состоит в том, что он предоставляет возможность детекции известных респираторных вирусов, без учета новых форм респираторных вирусов, которые могут приобретать патогенный потенциал в результате мутаций.
Известен способ дифференциальной диагностики острого бронхита и острой пневмонии, в котором устанавливают содержание уксусной, валериановой и изокапроновой кислот в слюне и определяют диагноз по значениям классификационных уравнений дискриминантного анализа [14]. Этот способ дифференциальной диагностики является прототипом предлагаемого способа. Для детекции респираторного вируса математическая модель строилась на группе пациентов, находящихся в стационаре с диагнозами острый бронхит и острая пневмония, по показателям концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне. В основную группу были включены пациенты с подтвержденным респираторным вирусом в соскобе со слизистой носа методом ПЦР, а в группу сравнения - пациенты, для которых результаты ПЦР-анализа были отрицательными. Методом пошагового исключения и анализа сопряженности линейного дискриминантного анализа концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне были получены решающие правила.
Технической проблемой настоящего изобретения является разработка быстрого и достоверного способа диагностики респираторной вирусной инфекции у детей путем идентификации специфического соотношения концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне.
Указанная проблема решается определением концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне газохроматографическим методом и формированием результатов по классификационным уравнениям дискриминантного анализа, подтверждающих наличие или отсутствие респираторной вирусной инфекции у ребенка.
Детекция респираторного вируса у пациента осуществляется с помощью математической модели, полученной каноническим линейным дискриминантным анализом, анализом сопряженности с прямой пошаговой процедурой включения показателей относительных концентраций изокапроновой и капроновой кислот в слюне. Относительные концентрации КЖК в слюне (концентрации, приведенных к сумме определяемых кислот) для математического моделирования используются, чтобы избежать влияния количества ротовой жидкости на значения определяемых концентраций.
Технический результат предлагаемого метода детекции респираторного вируса позволяет учесть наличие патогенных респираторных вирусов вне зависимости от их видовой принадлежности по метаболическому отпечатку микробиоценоза ротоглотки, то есть по реакции микробиоты и изменению метаболических путей сбраживания субстратов. Метод является универсальным, быстрым, безопасным, неинвазивным, простым в использовании и достаточно легко воспроизводимым.
Сущность изобретения: методом газожидкостной хроматографии определяют концентрации низкомолекулярных короткоцепочечных жирных кислот в слюне пациентов. Полученные результаты умножают на коэффициенты классификационных уравнений, и суммируют с учетом знаков коэффициентов. Затем по величине полученных значений определяют наличие респираторного вируса.
Определение концентрации КЖК в слюне проводят газожидкостной хроматографией, методом прямого ввода в испаритель хроматографа супернатанта водного раствора слюны, подкисленного 40% раствором хлорной кислоты до рН 1,9-2,1.
Способ осуществляют следующим образом.
Для определения КЖК использовали супернатант пробы слюны. Получение его проходит по следующей схеме:
Пробоподготовка.
1. В одноразовой пластиковой пробирке взвешивают 2-3 грамма слюны на аналитических весах с точностью до 3-го знака.
2. К пробе добавляют 1 мл 40% хлорной кислоты и 1 мл стандартного вещества (диметилмасляная кислота). Гомогенизируют смесь путем энергичного встряхивания в закрытой пробирке.
3. Пробирку с гомогенной смесью центрифугируют 10 минут при 6000 об./мин.
4. Полученный супернатант является прозрачным и имеет кислую реакцию (рН 1,9-2,1).
Хроматографирование.
Для хроматографирования используют газо-жидкостной хроматограф Кристалл 5000.2 с капиллярной колонкой FFAP диаметр - 0,25 мм, длина 32 м (неподвижная фаза - пленка с 2-нитротерефталевой кислотой) и детектором пламенно-ионизационного типа. Газ - носитель азот. Температурный режим термостата колонки - изотерма 155°С. Температура испарителя и детектора -250°С. Скорость газа носителя - 60 см/сек при давлении газа носителя 136 кПа. Деление потока газа носителя -1:35.
Пробу - супернатант отбирают из пластиковой пробирки хроматографическим шприцом 1 мкл и вводят в испаритель хроматографа. Пики концентраций короткоцепочечных жирных кислот определяют по времени удержания. Времена удержания определяли на основании разделения стандартного образца - смеси монокарбоновых кислот гомологического ряда от уксусной до капроновой кислоты.
Времена удержания:
Уксусная кислота, мин 1,36
Пропионовая кислота, мин 1,59
Изомасляная кислота, мин 1,69
Масляная кислота, мин 1,94
Изовалериановая кислота, мин 2,16
Стандартное вещество (α,α-диметилмасляная кислота), мин 2,39
Валериановая кислота, мин 2,6
Изокапроновая кислота, мин 3,16
Капроновая кислота, мин 3,6
Обработка хроматограмм.
Расчет пиков проводят с помощью компьютерной программы прибора путем анализа последовательности пиков, их границ и высот. Площади пиков определяют как площади треугольников с основанием, равным ширине пика и высотой равной высоте пика. Исходя из площади пика стандарта (α,α-диметилмасляной кислоты) с известной концентрацией и отношениям площадей анализируемых пиков, рассчитывают концентрацию каждого компонента смеси КЖК. В формуле расчета используют также коэффициенты горения, которые являются коэффициентами перевода молярной концентрации в весовую. Концентрации отдельных компонентов рассчитывают по формуле:
где
i
ст.
C, С- концентрации стандарта и компонента,
i
ст.
S, S - площади пиков,
i
K - переводной коэффициент.
Определение диагностических коэффициентов.
Расчет диагностических коэффициентов проводят по формулам классификационных уравнений линейного дискриминантного анализа:
F1=-185,459*iC6+883,891 *С6-2,241
F2=-25,8862*iC6+427,7867*C6-1,8652 где
F1 - диагностический коэффициент, при максимальном значении которого детектируется респираторный вирус;
F2 - диагностический коэффициент, при максимальном значении которого респираторный вирус не детектируется;
iC6 - относительная концентрация изокапроновой кислоты;
С6 - относительная концентрация капроновой кислоты.
Изобретение иллюстрируют следующими примерами.
Пример 1. Пациент К. Возраст 5 лет, поступил в стационар с диагнозом острая внебольничная пневмония. Анализ концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне показал следующие концентрации (ммоль/г): уксусная - 4,656 ммоль/г; пропионовая - 0,483 ммоль/г; изомасляная - 0,225 ммоль/г; масляная - 0,122 ммоль/г; изовалериановая - 0,0545 ммоль/г; валериановая - 0,0545 ммоль/г; изокапроновая - 0,0479 ммоль/г; капроновая 0,0479 ммоль/г. Суммарная молярная концентрация короткоцепочечных жирных кислот - 5,691 ммоль/г. Из полученных концентраций рассчитали относительные концентрации: изокапроновой - 0,0084 ед.; капроновой кислот - 0,0084 ед. Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения относительных концентраций короткоцепочечных жирных кислот были умножены на коэффициенты классификационных уравнений дискриминантного анализа и сложены с учетом знака.
F1=-185,459*0,0084+883,891*0,0084-2,241=3,637
F2=-25,8862*0,0084+427,7867*0,0084-1,8652=1,518
Полученные значения диагностических коэффициентов сравнили между собой. Максимальное значение F1=3,637, указывает на присутствие респираторного вируса у пациента. При проведении полимеразной цепной реакции обнаружен Human rhinovirus А. Таким образом, молекулярно-генетический анализ подтвердил наличие респираторного вируса у пациента.
Вариант 2. Пациент Т. Возраст 6 лет, поступил в стационар с диагнозом острый бронхит.
Анализ концентраций короткоцепочечных жирных кислот в слюне показал следующие концентрации (ммоль/г): уксусная - 3,047 ммоль/г; пропионовая - 0,6525 ммоль/г; изомасляная - 0,206 ммоль/г; масляная - 0,1396 ммоль/г; изовалериановая - 0,1496 ммоль/г; валериановая - 0,0774 ммоль/г; изокапроновая - 0,2278 ммоль/г; капроновая 0,05634 ммоль/г. Суммарная молярная концентрация короткоцепочечных жирных кислот - 4,557 ммоль/г. Из полученных концентраций рассчитали относительные концентрации: изокапроновой - 0,050 ед.; капроновой кислот - 0,0124 ед. Для расчета значений диагностических коэффициентов полученные значения относительных концентраций короткоцепочечных жирных кислот были домножены на коэффициенты классификационных уравнений дискриминантного анализа и сложены с учетом знака.
F1=-185,459*0,05+883,891*0,0124-2,241=-0,584
F2=-25,8862*0,05+427,7867*0,0124-1,8652=2,13
Полученные значения диагностических коэффициентов сравнили между собой. Максимальное значение F2=2,13, указывает на отсутствие респираторного вируса у пациента. Проведенная полимеразная цепная реакция подтвердила отсутствие фрагментов ДНК следующих вирусов: Human metapneumovirus, Human rhinovirus, Influenza virus A, Influenza virus B, Epstein-Barr virus, Human respiratory syncytial virus, Human adenovirus, Human parainfluenza virus 1/3, 2/4, Human coronavirus, Human bocavirus, Herpes simplex virus 1/2, Cytomegalovirus. Таким образом, молекулярно-генетический анализ подтвердил отсутствие респираторного вируса у пациента.
Метод диагностики респираторной вирусной инфекции был использован для верификации этиологии острых респираторных заболеваний у пациентов в детском инфекционном отделении ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского за период с 2016 по 2017 г. Были исследованы 78 образцов слюны пациентов для биохимического анализа и такое же количество мазков из носа для молекулярно-генетического анализа. Чувствительность заявляемого метода составила 75%, специфичность 89,47%.
Литература:
1. Рязанцев, С.В. Роль слизистой оболочки в защите ЛОР-органов от потенциально патогенных для организма антигенных факторов. / С.В. Рязанцев, Н.М. Хмельницкая, Е.В. Тырнова // Вестник оториноларингологии. - 2000. - №3. - С. 60-64.
2. Зверев, В.В. Микроэкология и гуморальный иммунитет слизистых открытых полостей человека в норме и при патологических состояниях. Учебное пособие для системы послевузовского профессионального образования врачей / В.В. Зверев, Ю.В. Несвижский, Е.А. Воропаева, С.С.Афанасьев, В.А. Алёшкин, А.В. Караулов, Х.М. Галимзянов, О.В. Макаров, Е.А. Богданова, О.В. Рубальский, М.С.Афанасьев, Н.С. Матвеевская, Д.С. Афанасьев, Т.Н. Савченко, В.А. Метельская, Е.Е. Рубальская, Е.О. Рубальский. - Астрахань - Москва: АГМА, 2011. - 80 с.
3. Munger J, Systems-level metabolic flux profiling identifies fatty acid synthesis as a target for antiviral therapy / Bennett BD., Parikh A., Feng XJ., McArdle J, Rabitz HA, Shenk T., Rabinowitz JD. // Nat Biotechnol. 2008 Oct;26(10):l 179-86.
4. Pauling L., Robinson A.B., Teranishi R., Cary P. Quantitative analysis of urine vapor and breath by gas-liquid partition chromatography // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1971. - Vol. 68, No. 10. - P. 2374-2376.
5. Nicholson J.K., Lindon J.C., Holmes E. 'Metabonomics': understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic data // Xenobiotica. - 1999. - Vol.29, No. 11. - P. 1181-1189.
6. Затевалов A.M., Оценка степени микробиологических нарушений микрофлоры ротоглотки и кишечника с помощью методов математического моделирования / Селькова Е.П., Афанасьев С.С., Алешкин А.В., Миронов А.Ю., Гусарова М.П., Гудова Н.В. // Клиническая лабораторная диагностика. 2016. Т. 61. №2. С. 117-121.
7. Затевалов A.M., Возрастная динамика продукции короткоцепочечных жирных кислот микробиотой ротоглотки у пациентов, не имеющих заболеваний респираторного тракта и ротовой полости / Селькова Е.П., Гудова Н.В., Оганесян А.С. // Альманах клинической медицины. 2018. Т. 46. №8. С. 784-791.
8. Боровиков, В.П. STATISTIC А: Статистический анализ и обработка данных в среде Windows / В.П. Боровиков, И.П. Боровиков. - М.: Филинъ, 1997. - 608 с. - ISBN 589568033-Х.
9. Stamboulian D., Bonvehi P. Е., Nacinovich F. M., Сох N. Influenza Infect. Dis. Clin. North. Am., 2000, v. 14., p. 141-166.
10. WHO Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. WHO, Geneva, 2002, document WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5 Rev.l
11. Патент РФ №2460803, МПК C12Q 1/68. Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления.
12. Патент РФ №2423145 МПК A61K 39/42. Способ выявления антител к гемагглютинину вируса гриппа А.
13. Патент РФ №2603000 МПК C12Q 1/68. Способ идентификации РНК вирусов гриппа А и В с одновременным определением вариантов гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа А, идентификацией генетических маркеров патогенности и устойчивости к противогриппозным препаратам на биологических микрочипах, биочип, набор олигонуклеотидных зондов, используемые в способе
14. Патент РФ №2608548 МПК C1 G01N 33/50. Способ дифференциальной диагностики острого бронхита и острой пневмонии.