МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО К NAV1.7
MONOCLONAL ANTIBODY TO NAV1.7

[Область техники]
[0001]
Настоящее изобретение относится к новому моноклональному антителу к Nav1.7 или его фрагменту. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антителу или его фрагменту, которые специфически связываются с Nav1.7. Более конкретно, настоящее изобретение относится к моноклональному антителу или его фрагменту, которые селективно ингибируют Nav1.7, или к фрагменту антитела, или к фармацевтической композиции, содержащей такое антитело, или к набору для детекции Nav1.7.
[Предшествующий уровень техники]
[0002]
Nav1.7 представляет собой потенциалозависимый натрий-ионный канал, который кодируется геном SCN9A и экспрессируется преимущественно в периферических нервах (непатентная литература: 1). Nav1.7 содержит четыре домена A, B, C и D, каждый из шести трансмембранных белковых спиралей (S1, S2, S3, S4, S5 и S6) и трех внеклеточных гидрофильных петель E1, E2 и E3.
[0003]
Известно, что воспалительная боль снижена у мыши, нокаутной по Nav1.7 (непатентная литература: 2). Подтверждено, что ингибитор Nav1.7, который является низкомолекулярным соединением, эффективен при эритромелалгии (непатентная литература: 3), невралгии тройничного нерва (непатентная литература: 4) и т.п.
[0004]
Моноклональное антитело к Nav1.7, которое эффективно при боли (обезболивающее) и зуда (противозудное), описано в патентной литературе: с 1 по 7, и т.д. Антитело, которое связывается с внеклеточной областью E3 домена C, описано в патентной литературе: с 1 по 3.
[Список цитирования]
[Патентная литература]
[0005]
[Патентная литература: 1] WO2011/051350
[Патентная литература: 2] US8734798
[Патентная литература: 3] US8986954
[Патентная литература: 4] US9266953
[Патентная литература: 5] WO2014/159595
[Патентная литература: 6] WO2015/032916
[Патентная литература: 7] WO2015/035173
[Непатентная литература]
[0006]
[Непатентная литература: 1] PNAS(1997)94:1527-1532
[Непатентный документ: 2] PNAS(2004)101:12706-12711
[Непатентный документ: 3] Pain(2012)153(1):80-85
[Непатентный документ: 4] THE LANCET NEUROLOGY(2017)16(4):291-300
[Сущность изобретения]
[Задача, подлежащая решению посредством изобретения]
[0007]
Задачей настоящего изобретения является создание нового моноклонального антитела к Nav1.7 или фрагмента антитела, которое можно использовать в качестве терапевтического средства при боли, зуде и т.п.
[Решение проблемы]
[0008]
Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования и обнаружили моноклональное антитело, которое специфически связывается с внеклеточной областью E3 домена C Nav1.7 и селективно ингибирует Nav1.7. Мы также обнаружили, что моноклональное антитело по настоящему изобретению имеет анальгезирующее или противозудное ингибирующее действие.
[0009] Конкретно, настоящее изобретение относится к:
(1-1)
Моноклональному антителу или его фрагменту, который связывается с Nav1.7,
имеющему
a1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 27, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 28 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 29, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 50, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 12H4, h12H4, h12H4-2 и h12H4-3 в соответствии с примером или их варианты),
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую
b1-1) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 3, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 5, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены,
b1-2) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 15, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 16 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 17, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены,
b1-3) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 15, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 24 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 25, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, или
b1-4) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 21, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 22 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 17, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 36, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 3B2, 3B2/15C8, 15C8, 29G3, или 28B5/15C8 в соответствии с примером или их варианты)
c1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 7, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 8 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 9, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 38, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 39 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 40, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 5E12 в соответствии с примером или их варианты)
d1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 11, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 12 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 13, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 38, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 42 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 40, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержащие CDR из 7B9 в соответствии с примером или их варианты)
e1) вариабельную область тяжелой цепи
содержащую a CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 15, a CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 19 и a CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 17, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и
вариабельная область легкой цепи
содержащую a CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, a CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 45 и a CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 36, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 15H6 в соответствии с примером или их варианты),
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую
f1-1) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 21, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 22 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 17, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, или
f1-2) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 3, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 5, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 47, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 28B5 или 3B2/28B5 в соответствии с примером или их варианты),
g1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 31, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 32 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 29, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 50, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 22D3 в соответствии с примером или их варианты),
h1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 56: G-Y-Y-Xaa4-H (где Xaa4 представляет собой M или I), CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 57: L-I-I-P-Y-Xaa5-G-Xaa6-Xaa7-F-Y-N-Xaa8-K-F-Xaa9-G (где Xaa5 представляет собой S или N, Xaa6 представляет собой D или E, Xaa7 представляет собой T или I, Xaa8 представляет собой Q или P, и Xaa9 представляет собой K или R) и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 58: A-Xaa10-V-S-Y-A-M-D-Y (где Xaa10 представляет собой E или D), где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 54: K-V-S-N-R-Xaa1-S (где Xaa1 представляет собой F или I) и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 55: S-Q-S-Xaa2-H-V-P-Xaa3-T (где Xaa2 представляет собой T или I, и Xaa3 представляет собой F или W), где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены.
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR с консенсусными последовательностями множества антител в соответствии с Примером 3, или их варианты).
[0010]
(1-2) Антитело или фрагмент антитела в соответствии с (1-1),
имеющее
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую
CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 27, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены по любому положению, иному чем положение 10;
CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 28, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 29, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены по любому положению, иному чем положение 2 и 6, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены, и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 50, где одна или две аминокислоты могут быть удалены, замещены, вставлены и/или добавлены по любому положению, иному чем положение 5. (т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR, в которых критические последовательности в 12H4 являются необходимыми в соответствии с Примером 6, или их варианты)
[0011]
(2) Антитело или фрагмент антитела в соответствии с (1-1) или (1-2),
имеющее
a1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 27, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 28 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 29, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 50;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 12H4, h12H4, h12H4-2 и h12H4-3 в соответствии с примером),
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую
b1-1) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 3, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 5,
b1-2) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 15, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 16 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 17,
b1-3) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 15, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 24 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 25, или
b1-4) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 21, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 22 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 17, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 36;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 3B2, 3B2/15C8, 15C8, 29G3 или 28B5/15C8 в соответствии с примером)
c1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 7, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 8 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 9, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 38, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 39 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 40;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 5E12 в соответствии с примером);
d1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 11, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 12 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 13, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 38, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 42 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 40;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 7B9 в соответствии с примером)
e1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 15, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 19 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 17, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 45 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 36;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 15H6 в соответствии с примером);
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую
f1-1) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 21, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 22 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 17, или
f1-2) CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 3, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 4 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 5, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 47;
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 28B5 или 3B2/28B5 в соответствии с примером);
g1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 31, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 32 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 29, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 35 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 50; или
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR из 22D3 в соответствии с примером);
h1) вариабельную область тяжелой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 56, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 57 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 58, и
вариабельную область легкой цепи,
содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 34, CDR2 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 54 и CDR3 с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 55.
(т.е., вариабельные области тяжелой и легкой цепей, содержащие CDR с консенсусными последовательностями множества антител в соответствии с Примером 3)
[0012]
(3) антитело или фрагмент антитела в соответствии с (1-1) или (1-2),
имеющее
a2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 52, 59 или 60 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 52, 59 или 60, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 53 или 61 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 53 или 61;
b2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 26 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 26, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 49 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 49;
c2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 23 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 23, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 48 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 48;
d2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 2, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 33 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 33;
e2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 6 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 6, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 37 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 37;
f2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 10 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 10, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 41 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 41;
g2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 14 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 14, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 43 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 43;
h2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 18 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 18, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 44 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 44;
i2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 20 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 20, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 46 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 46;
j2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 30 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 30, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 51 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 51;
k2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 2, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 46 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 46;
l2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 2 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 2, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 43 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 43; или
m2) вариабельную область тяжелой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 20 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 20, и
вариабельную область легкой цепи
с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 43 или аминокислотной последовательностью, по меньшей мере, на 95% идентичной аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 43.
Конкретные примеры антител перечислены в таблице 1 в Примере.
[0013]
(4) Антитело или фрагмент антитела в соответствии с (3), имеющее
a2-1) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 52, и
вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 53;
a2-2) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 59, и
вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 53; или
a2-3) вариабельную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 60, и
вариабельную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 61.
(5) Антитело или фрагмент антитела в соответствии с любым из (1)-(4),
дополнительно имеющее
константную область тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 62 или 63, и
константную область легкой цепи с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO: 64.
Конкретные примеры антител в (4) и (5) перечислены в таблице 2 в Примере.
[0014]
(6) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его фрагмент в соответствии с любым из (1-1), (1-2) и (2)-(5).
(7) Фармацевтическая композиция в соответствии с (6) для лечения или предупреждения боли и/или зуда.
(8) Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи антитела в соответствии с (3) или (4), где полинуклеотид необязательно кодирует константную область тяжелой цепи антитела в соответствии с (5).
(9) Полинуклеотид, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи антитела в соответствии с (3) или (4), где полинуклеотид необязательно кодирует константную область легкой цепи антитела в соответствии с (5).
(10) Экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид в соответствии с (8) или (9).
[0015]
(11) Полинуклеотид кодирующий антитело или его фрагмент в соответствии с любым из (1-1), (1-2), и (2)-(5).
2
(12) Антитело или его фрагмент в соответствии с любым из (1-1), (1-2), и (2)-(5), где фрагмент представляет собой Fab, Fab', F(ab'), scFv, dsFv или диатело.
(13) Способ профилактики или лечения заболевания, связанного с Nav1.7, включающий введение моноклонального антитела или его фрагмента, в соответствии с любым из (1-1), (1-2), и (2)-(5).
(14) Моноклональное антитело или его фрагмент в соответствии с любым из (1-1), (1-2) и (2)-(5) для производства средства для лечения или профилактики заболевания, связанного с Nav1.7.
(15) Моноклональное антитело или его фрагмент в соответствии с любым из (1-1), (1-2) и (2)-(5) для лечения или профилактики заболевания, связанного с Nav1.7.
(16) Способ в соответствии с (13), или антитело или его фрагмент в соответствии с (14) или (15), где заболевание, связанное с Nav1.7 представляет собой боль и/или зуд.
(17) Набор для детекции Nav1.7, включающий моноклональное антитело или его фрагмент в соответствии с любым из (1-1), (1-2) и (2)-(5).
[Эффект изобретения]
[0016]
Поскольку моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению специфически связывается с Nav1.7, его можно использовать для обнаружения Nav1.7 в биологических образцах. Кроме того, поскольку моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению обладает свойством селективно ингибировать Nav1.7, фармацевтическая композиция, содержащая его, очень полезна в медицине, особенно для лечения или профилактики заболевания, связанного с Nav1.7.
[Краткое описание чертежей]
[0017]
[Фигура 1] Нумерация по Кабат и результаты выравнивания тяжелой цепи из 15C8 (SEQ ID NO: 14), 15H6 (SEQ ID NO: 18), 28B5 (SEQ ID NO: 20), и 29G3 (SEQ ID NO: 23).
[Фигура 2] Нумерация по Кабат и результаты выравнивания легкой цепи из 15C8 (SEQ ID NO: 43), легкой цепи из 15H6 (SEQ ID NO: 44), 28B5 (SEQ ID NO: 46) и 29G3 (SEQ ID NO: 48).
[Фигура 3] Нумерация по Кабат тяжелой цепи h12H4 (SEQ ID NO:52, ФИГ. 3A) и легкой цепи h12H4 (SEQ ID NO:53, ФИГ. 3B).
[Фигура 4] Оценка эффективности лекарственного средства путем местного внутриподошвенного введения моделям с лигированием части седалищного нерва.
[Фигура 5] Оценка эффективности лекарственного средства путем внутривенного введения моделям с лигированием части седалищного нерва.
[Вариант осуществления изобретения]
[0018]
Термины в настоящем описании относятся к широко используемым в данной области значениям, если не указано иное.
В настоящем изобретении для получения антител можно использовать способы, известные в данной области. Примеры включают способы, описанные в «Immunochemistry in Practice» (Blackwell Scientific Publications).
Также можно использовать способы генетической инженерии, известные в данной области. Примеры включают способы, описанные в Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012), Current Protocols Essential Laboratory Techniques, Current Protocols (2012).
[0019]
Человеческий Nav1.7 представляет собой белок (UniProtKB/Swiss-Prot:Q15858), состоящий из аминокислот, которые кодируются геном SCN9A.
[0020]
Моноклональное антитело или его фрагмент в настоящем изобретении представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент, имеющее CDR или вариабельные области тяжелой/легкой цепей, представленные в настоящем описании. Антитело или его фрагмент могут происходить из любого класса (например, IgG, IgE, IgM, IgD или IgA) или подкласса иммуноглобулиновых молекул и их можно получить от любого вида, включая мышь, крысу, акулу, кролика, свинью, хомяка, верблюда, ламу, козу и человека. Предпочтительным антителом или его фрагментом является гуманизированное моноклональное антитело или его фрагмент.
[0021]
В изобретении «фрагмент моноклонального антитела» означает часть моноклонального антитела, где фрагмент специфически связывается с Nav1.7 и селективно ингибирует Nav1.7, так же, как и указанное моноклональное антитело.
[0022]
2
Конкретные примеры включают Fab (фрагмент связывания антигена), Fab', F(ab'), одноцепочечное антитело (одноцепочечный Fv; также в настоящем документе, обозначаемый как scFv), стабилизированное дисульфидом антитело (стабилизированный дисульфидом Fv; далее в в настоящем документе, обозначаемый как dsFv), димеризованные фрагменты V-области (далее в настоящем документе, обозначаемые как диатело) и пептиды, содержащие CDR, которые специфически связываются с человеческим Nav1.7 (Expert Opinion on Therapeutic Patents, Vol. 6, No. 5, pp. 441-456, 1996).
[0023]
Fab представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу приблизительно 50000 с активностью связывания антигена и состоящий приблизительно из половины N-концевой области H-цепи и всей L-цепи, полученный путем разрушения с помощью фермента папаина пептидной части верхней части двух дисульфидных связей (SS-связей), которые сшивают две H-цепи в шарнирной области IgG. Fab, используемый в настоящем изобретении, можно получить путем обработки папаином моноклонального антитела по настоящему изобретению. Альтернативно, Fab можно получить путем вставки ДНК, кодирующей Fab из моноклонального антитела по настоящему изобретению, в экспрессирующий вектор и путем трансдукции вектором клетки для экспрессии.
[0024]
2
2
Fab' представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу приблизительно 50000 с активностью связывания антигена и с расщепленными связями S-S между шарнирами F(ab'). Fab', используемый в настоящем изобретении, можно получить путем обработки F(ab')моноклонального антитела по настоящему изобретению с восстановителем дитиотрейтолом. Fab' также можно получить путем вставки ДНК, кодирующей Fab' из моноклонального антитела по настоящему изобретению, в экспрессирующий вектор для клеток и трансдукции вектором клеток E. coli, дрожжей или животных для экспрессии.
[0025]
2
2
2
2
F(ab') представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу приблизительно 100000 с активностью связывания антигена и образованный связыванием двух областей Fab' в шарнирной части, полученной путем разрушения ферментом пепсином нижней части двух связей S-S в шарнирной области IgG. F(ab'), используемый в настоящем изобретении, можно получать путем обработки моноклонального антитела по настоящему изобретению пепсином. Альтернативно, F(ab'), используемый в настоящем изобретении, также можно получать путем вставки ДНК, кодирующей F(ab') из моноклонального антитела, в экспрессирующий вектор для клеток и трансдукции вектором клеток E. coli, дрожжей или животных для экспрессии.
[0026]
ScFv представляет собой полипептид VH-P-VL или VL-P-VH, в котором одна цепь VH и одна цепь VL соединены с использованием подходящего пептидного линкера (далее в настоящем документе, обозначенного P), и это фрагмент антитела, обладающий антигенной активностью. VH и VL, содержащиеся в scFv, используемом в настоящем изобретении, могут быть производными моноклонального антитела по настоящему изобретению. ScFv, используемый в настоящем изобретении, можно получить путем конструирования вектора, экспрессирующего scFV, с использованием кДНК, кодирующей VH и VL из моноклонального антитела по настоящему изобретению, и путем трансдукции вектором клеток E. coli, дрожжей или животных для экспрессии.
[0027]
dsFv получают при связывании полипептидов, в которых каждый аминокислотный остаток в VH и VL замещен остатком цистеина через связь S-S. Аминокислотный остаток, замененный на остаток цистеина, можно выбирать на основе предсказания третичной структуры антитела согласно способу, указанному Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)). VH или VL, содержащиеся в dsFv по настоящему изобретению, можно получать из моноклонального антитела по настоящему изобретению. dsFv, используемый в настоящем изобретении, можно получать путем вставки в соответствующий экспрессирующий вектор с использованием кДНК, кодирующей VH и VL из моноклонального антитела по настоящему изобретению, для конструирования экспрессирующего вектора dsFV, и путем трансдукции вектором клеток E. coli, дрожжей или животных для экспрессии.
[0028]
Диатело представляет собой фрагмент антитела с scFv, имеющим такую же или другую специфичность связывания антигена, образующим димер, и фрагмент антитела с двухвалентной активностью связывания для одного и того же антигена или с двумя типами активностей связывания антигена, специфичными для разных антигенов. Например, двухвалентное диатело, которое специфически взаимодействует с моноклональным антителом по настоящему изобретению, можно получить путем конструирования ДНК, кодирующей scFV с пептидным линкером длиной от 3 до 10 остатков, с использованием кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, вставки ДНК в клеточный экспрессирующий вектор для клеток и трансдукции вектором клеток E. coli, дрожжей или животных для экспрессии диатела.
[0029]
Пептид, содержащий CDR, включает, по меньшей мере, один или несколько участков CDR в VH или VL. Множество CDR могут быть связаны напрямую или через соответствующий пептидный линкер. Пептид, содержащий CDR, в настоящем изобретении можно получать путем конструирования ДНК, кодирующей CDR, с использованием кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, вставки ДНК в экспрессирующий вектор для клеток животных и трансдукции вектором клеток E.coli, дрожжей или животных для экспрессии. Пептид, содержащий CDR, можно также получать способом химического синтеза, таким как способ Fmoc (флуоренилметилоксикарбонильный способ) или способом tBoc (трет-бутилоксикарбонильный способ).
[0030]
Моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению характеризуется специфическим связыванием с Nav1.7. Пример способов измерения способности специфически связываться с Nav1.7 показан далее.
[0031]
-6
Специфические связи могут характеризоваться равновесной константой диссоциации, по меньшей мере, 1×10 M или менее (например, меньшая KD представляет более прочные связи). Способы определения того, связываются ли специфически две молекулы, хорошо известны в данной области, и они включают способ конкурентного ELISA, описанный в примере 5 и поверхностного плазмонного резонанса. Однако изолированное антитело, которое специфически связывается с Nav1.7, может проявлять перекрестную реактивность с другими антигенами, такими как молекулы Nav1.7, происходящие от других видов. Однако мультиспецифическое антитело, которое связывается с hNav1.7 и одним или несколькими дополнительными антигенами, или биспецифическое антитело, которое связывается с двумя различными областями hNav1.7 (например, петля EC 3-1 и петля EC 3-3), считается антителом, которое «специфически связывается» с hNav1.7.
[0032]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению или его фрагмент характеризуется ингибированием Nav1.7. Ниже приведен пример способа измерения способности ингибировать Nav1.7.
[0033]
4
ДНК, кодирующую Nav1.7, клонируют в pcDNA3.1 (Invitrogen). Экспрессирующим вектором трансфицируют клетки FreeStyle 293 (Thermo Fisher Scientific) для конструирования клеток со стабильной экспрессией Nav1.7. Специфическое ингибирование Nav1.7 антителом оценивают путем выполнения ручной фиксации потенциала с использованием этой клетки согласно способам, описанным ниже. Кусочки стекла, покрытые поли-L-лизином, располагают в чашках диаметром 35 мм. Клетки со стабильной экспрессией Nav1.7, суспендированные в 10% FBS-содержащей DMEM (SIGMA), высевают на чашки (4×10 клеток/чашку). Через сутки после посева кусочки стекла переносят в мерную камеру для формирования целых клеток. Антитело обрабатывают с фиксацией -70 мВ прямоугольной волной 10 мс при 0,1 Гц. Измерение проводят до и после обработки антителом (действие занимает >2 минут).
[0034]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению можно получить, используя CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепей, описанные в настоящем описании, в соответствии с обычными способами в данной области.
[0035]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению дополнительно включает гуманизированное моноклональное антитело. Гуманизированное антитело имеет сниженную антигенность в организме человека, поэтому оно подходит для введения людям с целью терапии и т.п. Гуманизированное моноклональное антитело получают путем пересадки определяющей комплементарности области (CDR) антитела млекопитающего, отличного от человека, такого как мышь, в каркасную область (FR) антитела человека. Таким образом, область FR получают из антитела человека. Подходящие FR можно выбирать, ссылаясь на литературу Kabat E A. et al. FR можно выбирать таким образом, что CDR может образовывать соответствующий антигенсвязывающий участок. При необходимости, аминокислоты FR вариабельных областей могут быть заменены так, чтобы CDR восстановленного гуманизированного антитела могли образовывать соответствующий антигенсвязывающий участок (Sato, K. et al., Cancer Res. Vol. 53, p. 851, 1993). Доля замещенных аминокислот в FR составляет от 0 до 15% от всей области FR, предпочтительно от 0 до 5% от всей области FR.
[0036]
Кроме того, в качестве гуманизированного антитела по настоящему изобретению доступна константная область антитела человека. В качестве предпочтительной константной области антитела человека, для тяжелой цепи можно использовать Cγ, например, можно использовать Cγ1, Cγ2, Cγ3 и Cγ4. Для легкой цепи можно использовать Cκ и Cλ. Кроме того, область С антитела человека может быть модифицирована для повышения стабильности антитела или его продуктивности. При гуманизации доступное антитело человека может быть любого изотипа, такого как IgG, IgM, IgA, IgE и IgD. В настоящем изобретении предпочтительным является IgG и наиболее предпочтительным IgG1 или IgG4.
[0037]
Гуманизированное моноклональное антитело по настоящему изобретению может иметь или не иметь лизин, добавленный к C-концу константных областей тяжелой цепи. Предпочтительно, оно содержит константную область легкой цепи из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64 и константную область тяжелой цепи из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 62 или 63 и может иметь или не иметь лизин, добавленный к C-концу SEQ ID NO: 62 или 63.
[0038]
Гуманизированное моноклональное антитело можно получать общепринятыми способами производства (см., например, Пример 4 ниже, публикацию WO95/14041 и публикацию WO96/02576). В частности, последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область, разработанную для связывания CDR мышиного антитела с FR антитела человека, синтезируют с помощью способа ПЦР из ряда олигонуклеотидов, приготовленных с частично перекрывающимися концами (см. публикацию WO98/13388). Полученную ДНК лигируют с ДНК, кодирующей константную область антитела человека, а затем вставляют в экспрессирующий вектор. Альтернативно, ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, можно вставлять в экспрессирующий вектор, содержащий ДНК константной области антитела. Для производства антител по настоящему изобретению гены антител вставляют в экспрессирующие векторы для экспрессии под контролем областей контроля экспрессии, например, энхансеров/промоторов. Затем, экспрессирующим вектором можно трансформировать клетки-хозяева для экспрессии антитела.
[0039]
Клетки-хозяева указанных выше трансформантов включают клетки позвоночных, такие как клетки COS или клетки CHO, прокариоты и дрожжи. Трансформантов можно культивировать способами, известными специалисту. Посредством культивирования моноклональное антитело по настоящему изобретению производится внутри трансформантов или вне их. Среду для культуры можно соответствующим образом выбирать из общепринятых сред в зависимости от клетки-хозяина. В случае клеток COS доступны среда RPMI-1640 и минимальная эссенциальная среда Игла (DMEM), модифицированная Дульбекко, и при необходимости можно добавлять ингредиенты сыворотки, а также эмбриональную телячью сыворотку (FBS). Температура выращивания трансформантов не ограничена, поскольку не снижает серьезно способность продуцировать белки в клетке. Предпочтительными являются температуры от 32 до 42ºC. Наиболее предпочтительной является температура 37ºC. По мере необходимости, культивирование можно проводить в атмосфере, содержащей диоксид углерода от 1 до 10% (об./об.).
[0040]
Фракции, содержащие моноклональное антитело по настоящему изобретению, которые получают в трансформантах или вне трансформантов описанными ранее способами, могут быть разделены и очищены известными ранее способами разделения. Эти способы основаны на физическом или химическом свойстве целевого белка. Конкретно, примеры включают обработку общепринятым осадителем белков, ультрафильтрацию, хроматографию на молекулярных ситах (гель-фильтрацию), адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию, различную хроматографию, такую как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), диализ и их сочетания. Способы позволяют легко производить моноклональное антитело по настоящему изобретению с высоким выходом и чистотой.
[0041]
Моноклональное антитело или его активный фрагмент по настоящему изобретению можно дополнительно модифицировать различными молекулами, такими как полиэтиленгликоли (ПЭГ), радиоактивные вещества, токсины и т.п. В данной области известны способы для модификации антител.
[0042]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению также может быть слито с другим белком по их N- или C-концам (Clinical Cancer Research, 2004, 10, 1274-1281). Специалист может приблизительно выбрать слитый белок.
[0043]
Фармацевтическую композицию, содержащую моноклональное антитело по настоящему изобретению или его фрагмент (фармацевтическая композиция по настоящему изобретению), можно вводить системно или местно перорально или парентерально. Для парентерального введения можно выбрать, например, внутривенную инъекцию, такую как капельная инфузия, внутримышечную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию, подкожную инъекцию, интраназальное введение, ингаляцию и т.п.
[0044]
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению очень полезна в качестве лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с Nav1.7.
Заболевания, связанные с Nav1.7, включают боль, зуд, нейрогенные воспаления, кашель и т.п.
«Боль» включает в себя острую боль, хроническую боль, нейропатическую боль, воспалительную боль, артрит, остеоартрит, мигрень, кластерные головные боли, невралгию тройничного нерва, герпетическую невралгию, генерализованную невралгию, нейродегенеративные заболевания, нарушения движения, нейроэндокринную боль, атаксию, сепсис, висцеральную боль, острую подагру, постгерпетическую невралгию, диабетическую нейропатию, ишиас, позвоночную боль, боль в голове или шее, сильную боль или непреодолимую боль, внезапную боль, боль после операции, генетическую эритромелалгию, зубную боль, ринит, боль при злокачественной опухоли, нарушения мочевого пузыря.
«Зуд» включает острый зуд, хронический зуд, гистамин-зависимый зуд, гистамин-независимый зуд.
«Нейрогенное воспаление» может быть связано с астмой, артритом, экземой, головной болью, мигренью, псориазом или их сочетанием.
«Кашель» включает патологический или хронический кашель.
[0045]
Эффективная доза выбрана в диапазоне от 0,01 мг до 100 мг на 1 кг массы тела за раз. Альтернативно, можно выбирать дозу от 5 до 5000 мг, предпочтительно дозу от 10 до 500 мг на пациента. Однако доза фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело по настоящему изобретению или его фрагмент, не ограничена этими дозами. Длительность введения может быть также соответствующим образом выбрана в зависимости от возраста, симптома и т.п. у пациента. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению также может включать фармацевтически приемлемый носитель или добавку в зависимости от пути введения. Примеры такого носителя и добавки включают воду, фармацевтически приемлемый органический растворитель, коллаген, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, альгинат натрия, водорастворимый декстран, пектин, метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, казеин, диглицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, вазелин сывороточный альбумин человека (САЧ), маннит, сорбит, лактозу, поверхностно-активные вещества, разрешенные в качестве фармацевтической добавки. Добавка для применения соответствующим образом выбрана или комбинирована из вышеперечисленных в зависимости от лекарственной формы, но не ограничивается этим.
[0046]
Настоящее изобретение включает полинуклеотид, кодирующий вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению. Полинуклеотид, кодирующий вариабельные области тяжелой цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению, может дополнительно кодировать константные области тяжелой цепи. Полинуклеотид, кодирующий вариабельные области легкой цепи моноклонального антитела по настоящему изобретению, может дополнительно кодировать константные области легкой цепи. Настоящее изобретение также относится к экспрессирующим векторам, содержащим, по меньшей мере, один из этих полинуклеотидов.
[0047]
Полинуклеотид представляет собой полимер, состоящий из нуклеотидов, таких как несколько дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) или рибонуклеиновых кислот (РНК), поскольку он кодирует антитело по настоящему изобретению. Они могут включать основания, отличающиеся от природных продуктов. Полинуклеотид по настоящему изобретению доступен для получения антител с помощью генетической технологии, и он пригоден в качестве зонда для скрининга антител, обладающих эквивалентной активностью с антителом по настоящему изобретению. То есть, используя полинуклеотид, кодирующий антитело по настоящему изобретению, или его часть в качестве зонда и используя способ, такой как способ гибридизации или амплификации гена, такой как ПЦР, можно получить ДНК, которая может гибридизоваться с указанным полинуклеотидом в жестких условиях и кодирует антитело, обладающее эквивалентной активностью с антителом по настоящему изобретению. Такие ДНК также включены в полинуклеотид по настоящему изобретению.
[0048]
Способ гибридизации (Sambrook, J et al., Molecular cloning, 2-е изд., 9,47-9,58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) хорошо известен специалисту в данной области. Условие для гибридизации, например, включает условия с низкой жесткостью. Условия с низкой жесткостью означают, что этап отмывки после гибридизации проводится, например, при 0,1×SSC, содержащем 0,1% SDS при 42°C, предпочтительно при 0,1×SSC, содержащем 0,1% SDS при 50°C. Более предпочтительным условием для гибридизации является условие с высокой жесткостью. Условие с высокой жесткостью означает, например, при 5×SSC, содержащем 0,1% SDS, при 65ºC. В этих условиях при более высокой температуре ожидается эффективное получение полинуклеотида с более высоким сходством. В отношении жесткости гибридизации перечисляются несколько факторов, такие как температура или концентрация соли. Специалист может выбрать эти факторы соответствующим образом и может получить аналогичную жесткость.
[0049]
Антитела, функционально эквивалентные моноклональному антитело по настоящему изобретению, имеют в основном высокое сходство в аминокислотной последовательности. Эти антитела кодируются полинуклеотидом, который получают с помощью описанных выше способов гибридизации или амплификации гена. В настоящее изобретение включены антитела, которые функционально эквивалентны антителам по настоящему изобретению и имеют высокое сходство по аминокислотной последовательности антител. Высокое сходство означает сходство, по меньшей мере, более чем 75% аминокислотной последовательности, предпочтительно, сходство 85%, и более предпочтительно, сходство 95%. Для определения подобия полипептидов доступен алгоритм, описанный в литературе (Wilbur, W. J. и Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730).
[0050]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению или его фрагмент специфически связывается с Nav1.7, поэтому его можно использовать для обнаружения Nav1.7 в биологических образцах. Биологические образцы включают кровь, плазму, сыворотку, мочу, органы, ткани, костный мозг, лимфоузлы и т.п. Таким образом, набор, содержащий моноклональное антитело по настоящему изобретению, можно использовать в качестве набора для обнаружения Nav1.7. Этот набор включает моноклональное антитело по настоящему изобретению или его фрагмент, а также может включать меченное вторичное антитело, субстрат, необходимый для детекции меток, носитель, промывочный буфер, разбавитель для образца, субстрат для фермента, раствор, останавливающий реакцию, белок Nav1.7 в качестве очищенного стандарта для сусбстрата, инструкции по применению и т.п.
[Пример]
[0051]
Далее в настоящем документе настоящее изобретение будет конкретно описано со ссылкой на Примеры. Однако настоящее изобретение не ограничено примерами, приведенными ниже.
[0052]
Пример 1: Получение антитела к Nav1.7
В качестве антигена выбирали пептид (1418-SVNVDKQPKYEYSL (SEQ ID NO: 1)-1431; пептиды hCE3C), соответствующий С-концевым областям внеклеточной петли домена C и E3 человеческого Nav1.7 (UniProtKB/Swiss-Prot: Q15858).
Синтезировали пептид (Cys-SVNVDKQPKYEYSL (SEQ ID NO: 1); Cys-hCE3C), к которому добавляли остаток Cys на N-конец (произведено Toray Corporation). Пептид был связан с малеимидированным гемоцианином гигантского моллюска (KLH, произведено Thermo Scientific Corporation) для получения иммуногена. Этим комплексом пептид-KLH иммунизировали самок мышей A/J Jms Slc при помощи полного адъюванта Фрейнда. Затем проводили дополнительную иммунизацию неполным адъювантом Фрейнда четыре раза.
Через трое суток после последней иммунизации вырезали селезенку. Клетки селезенки и миеломную клетку мыши (p3×6363-Ag8., Tokyo-based Mass Laboratory) сливали с помощью способа с PEG и проводили отбор в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Гибридому, продуцирующую связанные антитела, устанавливали способами ELISA с использованием иммуногенных пептидов с культуральным супернатантом.
[0053]
Пример 2: Определение последовательностей антител
Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела, определяли из гибридомных клеток установленных клонов общепринятыми способами (Таблица 1).
[Таблица 1]
mAb
Вариабельные области
SEQ ID
SEQ ID
Вариабельные области
SEQ ID
SEQ ID
3B2
Тяжелая цепь
2
CDR1
3
Легкая цепь
33
CDR1
34
CDR2
4
CDR2
35
CDR3
5
CDR3
36
5E12
Тяжелая цепь
6
CDR1
7
Легкая цепь
37
CDR1
38
CDR2
8
CDR2
39
CDR3
9
CDR3
40
7B9
Тяжелая цепь
10
CDR1
11
Легкая цепь
41
CDR1
38
CDR2
12
CDR2
42
CDR3
13
CDR3
40
15C8
Тяжелая цепь
14
CDR1
15
Легкая цепь
43
CDR1
34
CDR2
16
CDR2
35
CDR3
17
CDR3
36
15H6
Тяжелая цепь
18
CDR1
15
Легкая цепь
44
CDR1
34
CDR2
19
CDR2
45
CDR3
17
CDR3
36
28B5
Тяжелая цепь
20
CDR1
21
Легкая цепь
46
CDR1
34
CDR2
22
CDR2
35
CDR3
17
CDR3
47
29G3
Тяжелая цепь
23
CDR1
15
Легкая цепь
48
CDR1
34
CDR2
24
CDR2
35
CDR3
25
CDR3
36
12H4
Тяжелая цепь
26
CDR1
27
Легкая цепь
49
CDR1
34
CDR2
28
CDR2
35
CDR3
29
CDR3
50
22D3
Тяжелая цепь
30
CDR1
31
Легкая цепь
51
CDR1
34
CDR2
32
CDR2
35
CDR3
29
CDR3
50
3B2/28B5
Тяжелая цепь
2
CDR1
3
Легкая цепь
46
CDR1
34
CDR2
4
CDR2
35
CDR3
5
CDR3
47
3B2/15C8
Тяжелая цепь
2
CDR1
3
Легкая цепь
43
CDR1
34
CDR2
4
CDR2
35
CDR3
5
CDR3
36
28B5/15C8
Тяжелая цепь
20
CDR1
21
Легкая цепь
43
CDR1
34
CDR2
22
CDR2
35
CDR3
17
CDR3
36
[0054] Пример 3: Выравнивание последовательностей антител
Аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей 15C8, 15H6, 28B5 и 29G3 нумеровали по Кабат с использованием программного обеспечения abYsis для анализа последовательности антител и выравнивания с помощью программного обеспечения GENETIX для анализа генов (фиг. 1 и 2). В результате аминокислотные последовательности 15C8, 15H6, 28B5 и 29G3 были сходными, как описано ниже.
CDR1 легкой цепи состояла из 16 аминокислот из SEQ ID NO:34.
CDR2 легкой цепи состояла из семи аминокислот K-V-S-N-R-Xaa1-S, где Xaa1 являлась F или I: SEQ ID NO:54.
CDR3 легкой цепи состояла из 9 аминокислот S-Q-S-Xaa2-H-V-P-Xaa3-T, где Xaa2 являлась T или I, и Xaa3 являлась F или W: SEQ ID NO: 55.
CDR1 тяжелой цепи состояла из 5 аминокислот G-Y-Y-Xaa4-H, где Xaa4 являлась M или I: SEQ ID NO: 56.
CDR2 тяжелой цепи состояла из 17 аминокислот L-I-I-P-Y-Xaa5-G-Xaa6-Xaa7-F-Y-N-Xaa8-K-F-Xaa9-G, где Xaa5 являлась S или N, Xaa6 являлась D или E, Xaa7 являлась T или I, Xaa8 являлась Q или P, и Xaa9 являлась K или R: SEQ ID NO:57.
CDR3 тяжелой цепи состояла из 9 аминокислот A-Xaa10-V-S-Y-A-M-D-Y, где Xaa10 являлась E или D: SEQ ID NO:58.
[0055]
Пример 4: Гуманизация антитела
12H4 гуманизировали следующим способом. При помощи программного обеспечения Absis для анализа последовательностей проводили поиск и отбирали акцепторные последовательности зародышевой линии человека, аналогичные последовательностям V-гена для доменов тяжелой и легкой цепей в аминокислотных последовательностях мышиного антитела. Для областей J-цепи с помощью IMGT (http://www.imgt.org/) был проведен поиск последовательностей с высокой гомологией с ДНК мышиного антитела, чтобы получить человеческую каркасную последовательность. Последовательность гуманизированного антитела, указанная в таблице 2, была разработана путем имплантации CDR1, CDR2 и CDR3 на тяжелые и легкие цепи мышиного антитело к этой человеческой каркасной последовательности, как определено путем нумерации по Кабат (Wu, TT and Kabat, EA, J. Exp. Med. Aug1;132(2):211-50 (1970)). В качестве константной области для тяжелой цепи использовали h12H4, h12H4-2 и h12H4-3, hIgG4Pro (SEQ ID NO: 62) или hIgG1 (SEQ ID NO: 63) и для легкой цепи использовали hIgK (SEQ ID NO: 64).
Гуманизированные 12H4 (h12H4), h12H4-2 и h12H4-3, имплантированные с CDR к другим акцепторным человеческим последовательностям зародышевой линии, показали аналогичную аффинность антитела мыши против иммуногенного пептида (Cys-CE3C), как описано в примере 5.
[Таблица 2]
mAb
Вариабельные области
SEQ ID
SEQ ID
Вариабельные области
SEQ ID
SEQ ID
h12H4
Тяжелая цепь
52
CDR1
27
Тяжелая цепь
53
CDR1
34
CDR2
28
CDR2
35
CDR3
29
CDR3
50
h12H4-2
Тяжелая цепь
59
CDR1
27
Тяжелая цепь
53
CDR1
34
CDR2
28
CDR2
35
CDR3
29
CDR3
50
h12H4-3
Тяжелая цепь
60
CDR1
27
Тяжелая цепь
61
CDR1
34
CDR2
28
CDR2
35
CDR3
29
CDR3
50
[0056]
Пример 5: Оценка аффинности
Аффинность для иммуногенных пептидов (Cys-hCE3C) определяли конкурентным методом ELISA, описанным ниже.
50
Разбавленный раствор полученного антитела мыши добавляли к планшету с иммобилизованным анти-мышиным антителом IgG и позволяли ему связываться при комнатной температуре в течение 3 часов. После трехкратной промывки очищающим буфером для ELISA добавляли меченный биотином иммуногенный пептид и стрептавидин-HRP (производен PIERCE). Одновременно добавляли серию разведений немеченого иммуногенного пептида и проводили реакцию в течение ночи при 4ºC. После трехкратной промывки с помощью промывки для ELISA добавляли для окрашивания TMB-Substrate Chromogen (производимый Thermo Fisher Scientific). Реакцию гасили равным объемом 0,05N серной кислоты, и измеряли оптическую плотность при 450 нм. Концентрацию немеченого пептида, которая ослабляла сигнал меченного биотином пептида на половину принимали за IC. В результате, антитело показало сильную аффинность к иммунному пептиду, как показано в таблице 3.
[0057]
[Таблица 3]
mAb
IC<sub>50</sub> (нМ)
3B2
9,5
15C8
6,3
28B5
0,2
29G3
7,0
12H4
0,3
h12H4
0,4
h12H4-2
0,5
h12H4-3
0,5
[0058]
Пример 6: Идентификация аминокислот, критичных для связывания гуманизированного 12H4
Для гуманизированного 12H4 (h12H4) проводили нумерацию по Кабат и определение CDR с помощью программного обеспечения abYsis для анализа последовательности антител. Результаты показаны на ФИГ. 3А, 3B. Кроме того, был получен мутант, в котором точечная мутация была введена в аминокислота, соответствующую CDR, и аффинность рассчитывали способом, описанным в примере 5. В это время пептид (SVNVDKQPKYEYSL; SEQ ID NO: 1) за исключением N-концевого Cys иммуногенного пептида использовали в качестве немеченого пептида, и рассчитывали аффинность для этого пептида. Результаты для легкой цепи показаны в таблице 4, а результаты для тяжелой цепи показаны в таблице 5. В результате, легкая цепь Q90 и V94 теряла свою аффинность для этого пептида, когда эти положения были заменены другой аминокислотой. В таблице 4 n.d. означает необнаруживаемый. Это позволяет предположить, что Q90 и V94 легкой цепи являются особенно важными аминокислотами для связывания. При этом аффинность легкой цепи N28 и тяжелой цепи M99 снизилась более чем в 10 раз, когда эта аминокислота была заменена другой аминокислотой. Исходя из этого факта, N28 легкой цепи и M99 тяжелой цепи считаются важными аминокислотами для связывания.
[0059]
[Таблица 4]
Мутант
Соотношение IC<sub>50</sub>(мутант/wt)
CDR1
R24K
0,8
S25T
0,8
S26T
1,3
Q27N
1,5
S27aT
1,3
L27bI
1,8
V27cL
1,4
H27dR
2,1
S27eT
1,0
N28Q
10,0
G29A
0,8
N30Q
1,0
T31S
1,0
Y32F
3,9
L33I
0,9
H34R
1,3
CDR2
K50R
1,5
V51L
1,6
S52T
1,3
N53Q
1,4
R54K
1,4
F55L
2,3
S56T
1,5
CDR3
S89T
1,4
Q90N
n.d.
S91T
2,3
T92S
1,3
H93R
2,4
V94L
n.d.
P95Gz
1,5
W96Y
2,4
T97S
1,4
[0060]
[Таблица 5]
Мутант
Соотношение IC<sub>50</sub>(мутант/wt)
CDR1
Y31F
0,6
Y32F
0,8
Y33F
1,0
I34L
0,9
Q35N
1,3
CDR2
W50Y
2,0
I51L
1,7
Y52aF
1,4
P52bG
1,0
G53A
1,1
N54Q
1,2
G55A
1,3
N56Q
1,3
S57T
1,2
N58Q
1,2
I59L
0,9
T60S
2,6
E61D
1,9
K62R
1,8
F63L
1,1
K64R
2,2
G65A
2,5
CDR3
I95L
1,2
F96L
2,3
T97S
2,1
T98S
1,6
M99L
32,0
V100L
0,6
G100aA
1,2
D101E
1,4
Y102F
0,4
[0061]
Пример 7: Оценка эффективности лекарственного средства
(7-1) Получение моделей частичного лигирования седалищного нерва крысы
Крысе делали анестезию изофлураном и брили левую ногу. Надрезали кожу верхней части бедра и разрезали мышцы, чтобы обнажить седалищный нерв. Приблизительно половину седалищного нерва плотно перевязывали нейлоновой нитью и зашивали мышцы и кожу. Это считали хирургической операцией. Аналогичные действия, за исключением перевязки седалищного нерва, проводили на правой ноге, в качестве симуляции операции.
[0062]
(7-2) Оценка эффективности лекарственного средства путем местного внутриподошвенного введения
Крысу, подготовленную в (7-1), применяли для оценки болевого поведения при механической гипералгезии с помощью анальгезиометра (метод Рэндала Селитто) через две недели после операции. Заднюю конечность крысы сжимали таким образом, что давящий стимул увеличивался на 16 г в секунду по анальгезиометру, а давление, когда крыса демонстрировала реакцию избегания, было установлено в качестве болевого порога. Болевой порог оценивали для левой и правой задних конечностей и считали болевым порогом до лечения. Выбранные животные имели болевой порог 60-90 г при операции и 100-175 г при ложной операции. Для тренировки животных аналогичные процедуры проводили перед измерением болевого порога перед лечением. Антитело по настоящему изобретению получали в концентрации 300 мкг/40 мкл с использованием PBS и вводили 40 мкл внутриподошвенно. Через пять минут после введения оценивали болевой порог правой и левой задних конечностей и считали его болевым порогом после лечения.% Обратных значений рассчитывали способами, описанными ниже, для оценки болевых эффектов антитела.
Для оценки воздействия антитела на боль рассчитывали % купирования симптомов при помощи способов, описанных ниже.
% купирования симптомов = (болевой порог после лечения на оперированной лапе - болевой порог перед лечением на оперированной лапе)/(болевой порог после лечения при ложной операции - порог боли перед лечением при ложной операции)×100
Результаты 3B2, 15C8, 28B5, 29G3 и 12H4 показаны на ФИГ. 4. Антитело по настоящему изобретению ингибирует Nav1.7 путем интраплантарного введения и показывает значимую эффективность для болевого поведения.
[0063]
(7-3) Оценка эффективности лекарственного средства путем внутривенного введения
Крысу, подготовленную в (7-1), применяли для оценки поведения механической аллодинии с помощью нити фон Фрея через две недели после операции. Крысу помещали в пластиковую клетку на проволочную сетку для акклиматизации. После введения антитела нити фон Фрея (0,4-26 г) прижимали к лапе крысы со стороны проволочной сетки. Крыса начинает проявлять реакцию избегания при определенном значении давления нити. Это значение устанавливали в качестве болевого порога. Порог оценивали для левой и правой задних лап и установливали как болевой порог перед лечением. Выбранные животные имели болевой порог 0,6-2 г при хирургическом вмешательстве и 8-15 г при имитации операции. Для тренировки животных аналогичные процедуры проводили перед измерением болевого порога перед лечением. Получали антитело по настоящему изобретению в концентрации 50 мг/кг с использованием физиологического раствора и вводили внутривенно. Через 0,5-72 часа после введения, измеряли болевой порог правой и левой задних лап. Он был установлен как болевой порог после лечения.
Для оценки воздействия соединения на боль рассчитывали % купирования симптомов при помощи способов, описанных ниже.
% купирования симптомов = (логарифм болевого порога после лечения на оперированной лапе - логарифм болевого порога перед лечением на оперированной лапе)/(логарифм болевого порога после лечения при ложной операции - логарифм болевого порога перед лечением при ложной операции)
Результат для гуманизированного 12H4 (h12H4) показан на ФИГ. 5. Антитело по настоящему изобретению показало значительную лекарственную эффективность в отношении болевого поведения при внутривенном введении.
[Промышленная применимость]
[0064]
Моноклональное антитело по настоящему изобретению или его фрагмент можно использовать для обнаружения Nav1.7 в биологических образцах. Кроме того, фармацевтическая композиция, содержащая моноклональное антитело по настоящему изобретению или его фрагмент, очень полезна в качестве лекарственного средства для лечения или предотвращения заболеваний, связанных с Nav1.7 связанных заболеваний.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  SHIONOGI & CO., LTD.
<120>  Моноклональные антитела к Nav1.7
<130>  19P00036WO
<160>  64
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  14
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  пептид hCE3C
<400>  1
Ser Val Asn Val Asp Lys Gln Pro Lys Tyr Glu Tyr Ser Leu
1               5                   10
<210>  2
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь 3B2
<400>  2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Ser Trp Tyr
20                  25                  30
Val Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Leu Trp Asp Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  3
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 3B2 VH
<400>  3
Trp Tyr Val Met Ser
1               5
<210>  4
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 3B2 VH
<400>  4
Thr Ile Ser Ser Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Met Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  5
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 3B2 VH
<400>  5
Leu Trp Asp Pro Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  6
<211>  121
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь 5E12
<400>  6
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Tyr Asp Gly Asn Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  7
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 5E12 VH
<400>  7
Asp Thr Tyr Met His
1               5
<210>  8
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 5E12 VH
<400>  8
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Ser Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  9
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 5E12 VH
<400>  9
Val Tyr Asp Gly Asn Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  10
<211>  121
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь 7B9
<400>  10
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Ile Gln Phe Thr Ser Leu Thr Ser Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Val Asp Asp Gly Asn Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  11
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 7B9 VH
<400>  11
Asp Thr Tyr Ile His
1               5
<210>  12
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 7B9 VH
<400>  12
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Ala Ser Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  13
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 7B9 VH
<400>  13
Val Asp Asp Gly Asn Tyr Val Gly Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210>  14
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь 15C8
<400>  14
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Leu Ile Ile Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ile Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Ile Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Glu Val Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  15
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 15C8 VH, 15H6 VH и 29G3 VH
<400>  15
Gly Tyr Tyr Met His
1               5
<210>  16
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 15C8 VH
<400>  16
Leu Ile Ile Pro Tyr Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  17
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 15C8 VH, 15H6 VH и 28B5 VH
<400>  17
Ala Glu Val Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  18
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   Тяжелая цепь 15H6
<400>  18
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Leu Ile Ile Pro Tyr Ser Gly Glu Ile Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Ile Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Glu Val Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  19
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 15H6 VH
<400>  19
Leu Ile Ile Pro Tyr Ser Gly Glu Ile Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  20
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь 28B5
<400>  20
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Leu Gly Pro
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Leu Ile Ile Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Pro Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Glu Val Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  21
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 28B5 VH
<400>  21
Gly Tyr Tyr Ile His
1               5
<210>  22
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 28B5 VH
<400>  22
Leu Ile Ile Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Pro Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  23
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь 29G3
<400>  23
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro
1               5                   10                  15
Ser Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Leu Ile Ile Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Ala Leu Gly Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ala Asp Val Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  24
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 29G3 VH
<400>  24
Leu Ile Ile Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
1               5                   10                  15
Gly
<210>  25
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 29G3 VH
<400>  25
Ala Asp Val Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  26
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь 12H4
<400>  26
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Asn Ile Thr Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ser Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Glu Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Phe Thr Thr Met Val Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  27
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 12H4 VH, h12H4 VH, h12H4-2 VH и h12H4-3 VH
<400>  27
Tyr Tyr Tyr Ile Gln
1               5
<210>  28
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 12H4 VH, h12H4 VH, h12H4-2 VH и h12H4-3 VH
<400>  28
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Asn Ile Thr Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  29
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 12H4 VH, 22D3 VH, h12H4 VH, h12H4-2 VH и h12H4-3 VH
<400>  29
Ile Phe Thr Thr Met Val Gly Asp Tyr
1               5
<210>  30
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь 22D3
<400>  30
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Asn Asn Thr Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Phe Thr Thr Met Val Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  31
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 22D3 VH
<400>  31
His Tyr Tyr Ile Gln
1               5
<210>  32
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 22D3 VH
<400>  32
Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Thr Asn Asn Thr Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  33
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 3B2
<400>  33
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  34
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 3B2 VK, 15C8 VK, 15H6 VK, 28B5 VK, 29G3 VK, 12H4 VK, 22D3
VK, h12H4 VK, h12H4-2 VK и h12H4-3 VK
<400>  34
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1               5                   10                  15
<210>  35
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 3B2 VK, 15C8 VK, 28B5 VK, 29G3 VK, 12H4 VK, 22D3VK, h12H4
VK, h12H4-2 VK и h12H4-3 VK
<400>  35
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  36
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 3B2 VK, 15C8 VK, 15H6 VK и 29G3 VK
<400>  36
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Phe Thr
1               5
<210>  37
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 5E12
<400>  37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Asn Ile Asn Ser Val Glu Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Tyr Trp Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Arg Ile Lys Arg
100                 105
<210>  38
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 5E12 VK и 7B9 VK
<400>  38
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1               5                   10
<210>  39
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 5E12 VK
<400>  39
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1               5
<210>  40
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 5E12 VK и 7B9 VK
<400>  40
Gln Gln Ser Asn Tyr Trp Pro Phe Thr
1               5
<210>  41
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 7B9 VK
<400>  41
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Thr Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Tyr Trp Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys Arg
100                 105
<210>  42
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 7B9 VK
<400>  42
Tyr Thr Ser Gln Ser Ile Ser
1               5
<210>  43
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 15C8
<400>  43
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  44
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 15H6
<400>  44
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Lys Phe Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  45
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 15H6 VK
<400>  45
Lys Val Ser Asn Arg Ile Ser
1               5
<210>  46
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 28B5
<400>  46
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Ile His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  47
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 28B5 VK
<400>  47
Ser Gln Ser Ile His Val Pro Trp Thr
1               5
<210>  48
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 29G3
<400>  48
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  49
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 12H4
<400>  49
Asp Val Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  50
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 12H4 VK, h12H4 VK, h12H4-2 VK и h12H4-3 VK
<400>  50
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1               5
<210>  51
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь 22D3
<400>  51
Asp Val Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg
<210>  52
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь h12H4
<400>  52
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Asn Ile Thr Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Phe Thr Thr Met Val Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  53
<211>  114
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь h12H4 и h12H4-2
<400>  53
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<210>  54
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VK
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa может быть Ile или Phe
<400>  54
Lys Val Ser Asn Arg Xaa Ser
1               5
<210>  55
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VK
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa может быть Thr или Ile
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa может быть Phe или Trp
<400>  55
Ser Gln Ser Xaa His Val Pro Xaa Thr
1               5
<210>  56
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR1 VH
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa может быть Met или Ile
<400>  56
Gly Tyr Tyr Xaa His
1               5
<210>  57
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR2 VH
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa может быть Ser или Asn
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa может быть Asp или Glu
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa может быть Thr или Ile
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (13)..(13)
<223>  Xaa может быть Gln или Pro
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (16)..(16)
<223>  Xaa может быть Lys или Arg
<400>  57
Leu Ile Ile Pro Tyr Xaa Gly Xaa Xaa Phe Tyr Asn Xaa Lys Phe Xaa
1               5                   10                  15
Gly
<210>  58
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR3 VH
<220>
<221>  прочий признак
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa может быть Glu или Asp
<400>  58
Ala Xaa Val Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  59
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь h12H4-2
<400>  59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Asn Ile Thr Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Phe Thr Thr Met Val Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  60
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Тяжелая цепь h12H4-3
<400>  60
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Tyr Tyr
20                  25                  30
Tyr Ile Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asn Ser Asn Ile Thr Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ile Phe Thr Thr Met Val Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  61
<211>  114
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь h12H4-3
<400>  61
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr
<210>  62
<211>  327
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  hIgG4Pro
<400>  62
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210>  63
<211>  330
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  hIgG1
<400>  63
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210>  64
<211>  105
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  hIgK
<400>  64
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
1               5                   10                  15
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
20                  25                  30
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
35                  40                  45
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
50                  55                  60
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
65                  70                  75                  80
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
85                  90                  95
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<---