СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОДЛИННОСТИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
METHOD OF AUTHENTICATING MEDICINAL PLANT MATERIAL

Изобретение относится к газовой хроматографии и может быть использовано для стандартизации и оценки подлинности различного лекарственного растительного сырья в медицине, фармакологии, пищевой, парфюмерной и других отраслях промышленности.
Известны способы стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) и фитопрепаратов (ФП) на их основе, основанные на определении биологически активных соединений (БАС) и стандартных образцов состава (СО) с использованием различных видов хроматографии и УФ-спектроскопии. Данные методы позволяют быстро и надежно оценить качество сырья по ведущей группе БАС (см.: Отраслевой стандарт Минздрава РФ. ОСТ 91500.50.001-00. Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения. Введ. 01.01.01., 2000. 12 C.; также см.: Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник. 2-е изд., перераб. и доп., Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО СамГМУ, 2007. 1239 С.).
Для определения подлинности ЛРС и ФП также используют, так называемый метод «отпечатков пальцев», при котором на хроматограмме оценивают не индивидуальные соединения или отдельные классы веществ, а совокупность БАС. (см.: Терешина Н.С., Абрамов А.А., Маркарян А.А. Анализ гомеопатических препаратов барбариса хроматографическими методами // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия, 2006. Т. 47. №5. С. 346-349).
Однако известные способы определения подлинности ЛРС не обеспечивают возможности прямого анализа БАС непосредственно в самом ЛРС, а требуют заранее приготовленных препаратов, например эфирного масла, настоек, экстрактов, отваров и т.д.
Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков является способ оценки подлинности лекарственного растительного сырья, при котором фиксированное количество исследуемой пробы помещают в герметичный сосуд, выдерживают при температуре 100°C в течение 40 минут, компоненты равновесной паровой фазы дозируют через узел ввода с делителем потока в хроматографическую капиллярную колонку для анализа при линейном программировании температуры, выходные сигналы компонентов равновесной перовой фазы сравнивают с сигналом внешних стандартных гомологов н-алканов для расчета интерполяционных характеристик сорбатов, а синхронизацию момента ввода анализируемых проб осуществляют по сигналу детектора на фиксированную часть потока из линии сброса делителя узла ввода пробы (см. Арутюнов Ю.И., Онучак Л.А., Куркин В.А., Платонов И.А., Никитченко Н.В. Способ оценки подлинности лекарственного растительного сырья и устройство для его осуществления. Патент РФ №2452944 от 10 июня 2012 г. // Бюл. №16, 2012).
Известный способ оценки подлинности ЛРС основан на том, что каждое растение выделяет в газовую фазу характерные для него летучие компоненты, формирующие специфический запах растения и ФП на его основе.
Недостатком известного способа является относительно невысокая достоверность при стандартизации ЛРС, так как результаты измерений летучих компонентов в виде совокупности индексов удерживания при линейном программировании температуры получают только на одной капиллярной колонке и отсутствует возможность проверки правильности другим независимым методом измерения. Задачей изобретения является повышение достоверности при стандартизации и оценке подлинности ЛРС.
Эта задача решается за счет того, что в способе оценки подлинности лекарственного растительного сырья, при котором фиксированное количество исследуемой пробы помещают в герметичный сосуд, выдерживают при заданной температуре, а летучие компоненты равновесной паровой фазы анализируют на капиллярной колонке при линейном программировании температуры с пламенно-ионизационным детектором, причем исследуемую пробу выдерживают при температуре 60°C в течение 40 минут, летучие компоненты равновесной паровой фазы независимо анализируют на двух капиллярных колонках с полярной и неполярной неподвижными фазами, для каждой колонки измеряют выходные сигналы трех летучих компонентов равновесной паровой фазы (маркеров) с максимальным содержанием в исследуемой пробе, которые составляют два независимых «отпечатка пальцев» исследуемого ЛРС.
При решении поставленной задачи создается технический результат, заключающийся в следующем:
1. Для оценки подлинности ЛРС используют вместо одной две независимые совокупности выходных сигналов, измеренные на неполярной и полярной капиллярных колонках.
2. Исследуемую пробу выдерживают при 60°C вместо 100°C в прототипе, что исключает возможность искажения состава исследуемой пробы при повышенной температуре.
3. Так как при температуре 60°C значительно уменьшаются концентрации летучих компонентов в равновесной паровой фазе исследуемой пробы, то для оценки подлинности используют только три летучих компонента с максимальным содержанием, равновесная концентрация которых при этой температуре достаточна для получения приемлемых выходных сигналов.
4. Технический результат способствует повышению достоверности при оценке подлинности ЛРС.
Эксперимент проводили на газовом хроматографе «Кристалл 5000.2» ЗАО СКВ «Хроматэк» с пламенно-ионизационным детектором.
Порядок проведения эксперимента
3
3
1. Известный способ. Измельченное ЛРС массой 1 г. Помещают в пенициллиновый флакон, который герметично закрывали резиновой пробкой с фторопластовой прокладкой. Флакон с пробкой устанавливали в контейнер и выдерживали 40 мин при 100°C. Равновесную паровую фазу объемом не более 1,0 см дозировали в испаритель хроматографа для анализа. Использовали капиллярную колонку VF-1 фирмы Varian (30 м × 0,32 мм × 0,5 мкм) с неполярной полидиметилсилоксановой неподвижной фазой. Начальная температура колонки 40°C, линейное программирование со скоростью 5°C/мин, конечная температура колонки 240°C. Температура испарителя 200°C. Температура детектора 200°C. Газ-носитель - водород. Скорость газа-носителя на выходе колонки 1 см/мин. Избыточное давление газа-носителя на входе в колонку 36 кПа. Деление потока на входе в колонку 1:30.
3
3
2. Предлагаемый способ. Равновесную паровую фазу ЛРС получали аналогично известному способу, но пробу выдерживали 40 минут при температуре 60°C. Хроматографирование проводили на двух капиллярных колонках. Первая колонка с неполярной фазой аналогична колонке, используемой в известном способе. Вторая капиллярная колонка INNOWAX фирмы Agilent Technologies (30 м × 0,32 мм × 0,5 мкм) с полярной неподвижной фазой ПЭГ-20М. Начальная температура термостата колонок 40°C, линейное программирование со скоростью 4°C/мин, конечная температура 200°C. Температура испарителей обоих колонок 200°C. Температура детекторов 200°C. Газ-носитель - водород. Скорость газа-носителя на выходе колонок 1 см/мин. Деление потока на входе колонок 1:30. Равновесную паровую фазу дозировали в испарители обеих колонок для анализа, объемом не более 1,0 см.
По результатам газохроматографического анализа определяли:
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mi>i</mi><mi>T</mi></msubsup></mrow>
- Индексы удерживания Ван-ден-Доола и Кратца
на каждой колонке для летучих компонентов равновесной паровой фазы исследуемого ЛРС
<mrow><msubsup><mi>I</mi><mi>i</mi><mrow><mi>T</mi><mrow><mo>(</mo><mn>1</mn><mo>)</mo></mrow><mo>,</mo><mrow><mo>(</mo><mn>2</mn><mo>)</mo></mrow></mrow></msubsup></mrow>
где
- индекс удерживания сорбатов. Для неполярной колонки верхний индекс (1), для полярной колонки верхний индекс (2).
<mrow><msub><mi>t</mi><mrow><msub><mi>R</mi><mi>i</mi></msub></mrow></msub></mrow>
<mrow><msub><mi>t</mi><mrow><msub><mi>R</mi><mi>z</mi></msub></mrow></msub></mrow>
<mrow><msub><mi>t</mi><mrow><msub><mi>R</mi><mrow><mi>z</mi><mo>+</mo><mn>1</mn></mrow></msub></mrow></msub></mrow>
<mrow><msub><mi>t</mi><mrow><msub><mi>R</mi><mrow><mi>z</mi><mo>+</mo><mn>1</mn></mrow></msub></mrow></msub><mo>></mo><msub><mi>t</mi><mrow><msub><mi>R</mi><mi>i</mi></msub></mrow></msub><mo>></mo><msub><mi>t</mi><mrow><msub><mi>R</mi><mi>z</mi></msub></mrow></msub></mrow>
- время удерживания i-го компонента равновесной паровой фазы;
и
- время удерживания соседних гомологов н-алканов с числом углеродных атомов в молекулах Z и Z+1 соответственно, причем
.
отн,i
- Относительное содержание летучих компонентов равновесной паровой фазы в исследуемой пробе методом внутренней нормализации А, в процентах для каждой колонки.
i
где A - площадь хроматографического пика i-го компонента исследуемой пробы; N - число пиков на хроматограмме.
Сравнение известного и предлагаемого способов оценки подлинности ЛРС проводили по результатам анализа следующих ЛРС: лаванды колосовой, травы зверобоя, листьев мяты перечной и эвкалипта прутовидного.
Результаты экспериментов сведены в таблицу «Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов».
Из приведенных в таблице 1 данных видно, что:
1. Предлагаемый способ обеспечивает значительно большую достоверность оценки подлинности ЛРС, так как содержит два независимых «отпечатка пальцев» трех маркеров с максимальным содержанием в пробе  которые сравниваются с данными справочного банка для различных ЛРС.
2. Количество летучих компонентов равновесной паровой фазы, образующих «отпечатки пальцев» исследуемых ЛРС известным способом, сильно различаются между собой. Так, для мяты перечной число компонентов равно 18, а для эвкалипта прутовидного составляет всего 8 компонентов, что усложняет математическую обработку при использовании справочного банка.
3. В предлагаемом способе исследуемую пробу ЛРС выдерживают при 60°C, что исключает возможность искажения состава равновесной паровой фазы при повышенной температуре (100°C в известном способе) и повышает достоверность при оценке подлинности ЛРС.
Использование предложенного способа оценки подлинности ЛРС позволяет:
<mrow><msub><mi>A</mi><mrow><mi>о</mi><mi>т</mi><mi>н</mi><mo>,</mo><mi>i</mi></mrow></msub><mo>=</mo><mi>f</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><msubsup><mi>I</mi><mi>i</mi><mi>T</mi></msubsup></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow>
1. Создать справочно-информационный банк данных по совокупности выходных сигналов
для трех маркеров с максимальным содержанием в пробе для двух независимых измерений с использованием полярной и неполярной газохроматографических колонок.
2. Проводить оценку подлинности ЛРС с использованием справочного банка.
3. Проводить экспресс анализ качества ЛРС и определять принадлежность различных биологически активных добавок (БАД) и других ФП данному ЛРС на имеющемся в лабораториях доступном оборудовании.