СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ АГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ С НОВОЙ КОРОНАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
METHOD FOR QUANTITATIVE ASSESSMENT OF THROMBOCYTE AGGREGATION ACTIVITY IN PATIENTS WITH NEW CORONAVIRAL INFECTION

Изобретение относится к медицине, а именно к гемостазиологии, трансфузиологии и клинико-лабораторной диагностике. Может применяться для оценки агрегации тромбоцитов у пациентов с новой коронавирусной инфекцией (COVID-19), которым проводится интенсивная терапия, в том числе с применением антиагрегантных и антикоагулянтных лекарственных препаратов и трансфузией тромбоцитарной массы.
Известен способ оценки агрегационной активности тромбоцитов на предметном стекле с применением индуктора агрегации (Шитикова А.С. Визуальный микрометод исследования агрегации тромбоцитов. В кн.: Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Под ред. Н.Н. Петрищева, Л.П. Папаян, СПб.: 1999. - С. 49-52). Недостатками данного способа является невозможность смоделировать физиологические условия агрегации тромбоцитов in vivo, а также визуальная оценка агрегации и отсутствие ее четких количественных критериев.
Известен способ определения агрегационной способности тромбоцитов с применением импедансной агрегатометрии [патент US на изобретение №4319194]. Данный способ основан на регистрации изменения электрического сопротивления после формирования монослоя тромбоцитов на электродах и их последующей агрегации, позволяющей оценивать агрегационную активность тромбоцитов в образце цельной крови. К недостаткам данного способа следует отнести высокую стоимость оборудования и более высокую цену за тест. Также данным способом затруднена регистрация эффекта дезагрегации тромбоцитов.
Более распространенным методом определения агрегационной способности тромбоцитов является метод оптической трансмиссионной агрегатометрии (Анализатор агрегации тромбоцитов АР 2110. Инструкция по определению агрегационной активности тромбоцитов. - Минск, 1995). Принцип данного метода - это исследование процесса агрегации тромбоцитов, индуцируемого добавлением к богатой тромбоцитами исследуемой плазме стандартного количества агониста агрегации тромбоцитов (индуктора), который регистрируется фотометрически по снижению оптической плотности. По результатам анализа для каждого индуктора выстраивается агрегатограмма и определяются количественные параметры агрегации: максимальная степень агрегации (%) - самый максимальный показатель светопропускания плазмы от добавления индуктора; время агрегации (с) - время, которое соответствовало максимальной степени агрегации; скорость агрегации (%/мин) - изменение светопропускания плазмы после добавления индуктора, которое определяется на отрезке длиной 30 с от точки минимального светопропускания во время латентного периода агрегации. Недостатком данного метода является большое число регистрируемых параметров агрегации и отсутствие единого интегративного показателя.
Наиболее близким к нашему способу является «Способ оценки агрегационных свойств тромбоцитов» [патент RU на изобретение №2213976]. Данный способ основан на расчете интегрального показателя агрегации тромбоцитов, который определяется как сумма отношений показателей степени и скорости агрегации с индуктором аденозиндифосфатом (АДФ) и коллагеном к средним арифметическим аналогичным показателям здоровых людей. В данный показатель включается и коэффициент Z, который характеризует качественные параметры агрегатограммы: наличие второй волны агрегации, отсутствие феномена дезагрегации, отсутствие волны агрегации тромбоцитов при индукции процесса коллагеном. Существенным недостатком данного способа является отсутствие в формуле показателя времени агрегации и необходимость проведения качественного анализа агрегатограммы. Кроме того, в данном способе в качестве одного из индукторов агрегации тромбоцитов применяется АДФ в концентрации 1,25 мкг/мл, что затрудняет выявление гиперагрегации у пациентов с COVID-19 инфекцией, получающих специфическую лекарственную терапию антиагрегантными и антикоагулянтными препаратами.
Технической задачей, для решения которой направлено настоящее изобретение, является создание способа быстрой количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов у пациентов с новой коронавирусной инфекцией, основанного на результате измерения площади под оптической кривой до максимальной степени агрегации, что позволит объективизировать и повысить диагностическую значимость способа у пациентов, которым проводится лечение COVID-19 инфекции. Задача решается следующим образом: способ количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов у пациентов с новой коронавирусной инфекцией, заключающийся в заборе крови у пациента, получении тромбоцитарной массы, подготовке ее и проведении исследования агрегации тромбоцитов спектрометрическим методом с индуктором аденозиндифосфатом в концентрации 0,3 мкг/мл с измерением значений максимальной степени, скорости и времени агрегации тромбоцитов, отличающийся тем, что дополнительно определяют площадь под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации и при ее значении в пределах 9,8-20,4 усл. ед. агрегационную активность тромбоцитов оценивают как нормальную, свыше 20,4 усл. ед. - как повышенную, а ниже 9,8 усл. ед. - как пониженную.
Способ осуществляется следующим образом. У пациентов, которым проводится лечение COVID-19 инфекции, проводят забор крови из локтевой вены, получают сыворотку крови и с применением известной методики приготавливают образец тромбоцитов для анализа. Анализ агрегации проводят с применением автоматического анализатора агрегации тромбоцитов АР 2110 (ЗАО «СОЛАР», Минск, Республика Беларусь). Агрегацию тромбоцитов проводят по установленной инструкцией по применению данного аппарата методике с помощью индуктора АДФ в концентрации 0,3 мкг/мл. В нашем исследовании мы применяли набор реагентов (АДФ и растворитель) производства ООО «Технология-Стандарт» (Барнаул, Российская Федерация). По полученным с помощью агрегометра данным (степень светопропускания, измеряемая каждую секунду на протяжении 10 минут) строилась кривая оптической плотности и рассчитывалась площадь под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации. Для построения кривой и расчета данного показателя использовалась программа из модуля «Scikit-learn» для языка программирования Python. За единицу измерения была принята условная единица (усл.ед.=%*мин). Затем проводят оценку площади под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации в сравнении с референтными интервалами у здоровых людей.
Площадь под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации является интегративным показателем, характеризующим первичную агрегацию тромбоцитов без учета последующей дезагрегации. Применение АДФ в низкой концентрации 0,3 мкг/мл вызывает у пациентов с нормальной агрегацией тромбоцитов одноволновую спадающуюся кривую (агрегация с последующей дезагрегацией), что свидетельствует о нормальных агрегационных свойствах тромбоцитов. У пациентов с COVID-19 инфекцией, с развитием гиперкоагуляционного синдрома, данная концентрация АДФ вызывает одноволновую гиперагрегационную кривую, несмотря на проведение пациенту антиагрегантной и антикоагулянтной терапии.
Основанием для определения референтных границ площади под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации явились результаты проведенного исследования агрегации тромбоцитов у здоровых людей (n=30). В условиях нормы анализируемый параметр варьировал в пределах от 9,8 до 20,4 усл. ед. (М±2σ). Данный способ оценки агрегационной активности тромбоцитов был применен у 35 пациентов, которым проводилась интенсивная терапия новой коронавирусной инфекции. Значение площади под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации было выше максимального референтного значения у 19 пациентов, что свидетельствовало о гиперагрегации тромбоцитов у пациентов с инфекцией COVID-19, а значение ниже порогового уровня - у 8 пациентов, что свидетельствовало о гипоагрегации тромбоцитов.
Использование данного способа подтверждается конкретными клиническими примерами.
Пример 1.
Пациент Л. 70 лет, женщина. Появились следующие симптомы: повышение температуры тела, легкая одышка. Диагноз COVID-19 инфекции был подтвержден методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и компьютерной томографией органов грудной клетки (КТ ОГК), на которой были соответствующие изменения по типу матового стекла. С целью определения состояния системы гемостаза у пациента была исследована агрегационная активность тромбоцитов. По данным анализа агрегатограммы агрегационная способность тромбоцитов оказалась в пределах нормы (значение площади под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации равнялось 14,4 усл. ед.). Пациенту была назначена лекарственная терапия инфекции COVID-19 с назначением антиагрегантных и антикоагулянтных лекарственных средств в профилактических дозах.
Пример 2.
Пациент С., 43 года, мужчина. Появились характерные симптомы коронавирусной инфекции: повышение температуры тела, сухой кашель, одышка, потеря обоняния. При поступлении в стационар пациенту был выставлен клинический диагноз: двусторонняя полисегментарная пневмония COVID-19 средней тяжести течение ДНI-II. Диагноз COVID-19 инфекции был подтвержден методом ОТ-ПЦР и КТ ОГК. Пациенту была назначена лекарственная терапия инфекции COVID-19, в том числе антиагрегантные и антикоагулянтные лекарственные средства. С целью определения состояния системы гемостаза у пациента была исследована агрегационная активность тромбоцитов. По данным анализа агрегатограммы была выявлена пониженная агрегация (значение площади под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации равнялось 3,2 усл. ед.). Пациенту было продолжено введение антиагрегантных и антикоагулянтных лекарственных средств в прежних дозах.
Пример 3.
Пациент О., 44 года, мужчина. Появились характерные симптомы коронавирусной инфекции: повышение температуры тела, сухой кашель, одышка, потеря обоняния. Поступил в специализированное лечебное учреждение для лечения больных с COVID-19, где после обследования был выставлен клинический диагноз: двусторонняя полисегментарная пневмония COVID-19 средней тяжести течение ДНI-II. Диагноз COVID-19 инфекции был подтвержден методом ОТ-ПЦР и КТ ОГК. Пациенту была назначена лекарственная терапия инфекции COVID-19, в том числе антиагрегантные и антикоагулянтные лекарственные средства. С целью определения состояния системы гемостаза у пациента была исследована агрегационная активность тромбоцитов. По данным анализа агрегатограммы была выявлена повышенная агрегация (значение площади под кривой оптической плотности до максимальной степени агрегации равнялось 78,6 усл. ед.). С целью предупреждения возникновения тяжелых тромбоэмболических осложнений пациенту были увеличены дозы вводимых антиагрегантных и антикоагулянтных лекарственных средств.