КОСМЕТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ЭКСТРАКТА ДЖИМНЕМЫ СИЛЬВЕСТРА
COSMETIC USE OF EXTRACT OF GYMNEMA SYLVESTRE

Настоящее изобретение относится к области косметического ухода за кожей.
2
Кожа представляет собой особый орган в организме человека. Она является тонкой и очень чувствительной, так как покрывает всю поверхность тела и у взрослых имеет общую площадь поверхности приблизительно 1,6 м. Ее функцией является защита глубоких тканей от внешней среды в смысле физического проникания инородных организмов, иммунитета, регулирования температуры, потери жидкости и т.д. Наконец, механическое напряжение, которому она непрерывно подвергается, означает, что для кожи требуется прочная и связанная структура, ассоциированная с высокой эластичностью. Из-за воздействий окружающей среды, испытываемых кожей, важно поддерживать ее обновление и восстановление путем стимуляции метаболизма составляющих ее клеток.
В объеме своих исследований по регуляции метаболических и энергетических процессов в клетках кожи, Заявитель обнаружил благоприятное действие экстракта джимнемы сильвестра на метаболизм клеток кожи; в частности, показано, что такой экстракт может стимулировать митохондрии и повышать энергетический уровень клеток и таким образом возможно предупреждать или бороться с признаками старения кожи и также вредом, вызванным внешними воздействиями, такими как холод, ветер, УФ-излучение, радиация, или воздействиями токсинов или загрязняющих веществ.
Эти исследования показывают, в частности, действие экстракта джимнемы сильвестра на указанное далее.
- На синтез АТФ в кератиноцитах человека в культуре.
Энергия в клетке производится из основных молекул (углеводов, белков, жиров), полученных по существу из пищи. Окисление этих соединений в митохондриях приводит к высвобождению энергии в форме высокоэнергетического соединения аденозинтрифосфата (АТФ).
Когда клетка нуждается в энергии, концевая фосфатная группа АТФ гидролизуется с высвобождением энергии из связи аденозиндифосфата (АДФ). Согласно потребностям клеток, АТФ постоянно гидролизуется и затем восстанавливается. Однако с возрастом и различными окислительными стрессами, испытываемыми клетками кожи, целостность и функция митохондрий ухудшаются: снижается синтез нового АТФ.
Таким образом, может оказаться важной идентификация агентов, способных повышать содержание АТФ в клетках и ускорять метаболизм в клетках кожи путем стимуляции синтеза нового АТФ.
Результаты, представленные в экспериментальной части в настоящем описании, показывают, что экстракт джимнемы сильвестра вызывает существенное повышение синтеза АТФ.
- На активность цитохром-С-оксидазы – комплекса IV дыхательной цепи в кератиноцитах человека в культуре, подвергавшейся окислительному стрессу или не подвергавшейся.
2+
Цитохром-С-оксидаза обнаружена в различных типах клеток кожи и волос; известно, что она вовлекается в энергетический метаболизм в митохондриальной дыхательной цепи или редокс-цепи, которая контролирует уровень энергии, метаболизм и гомеостаз клеток. Этот фермент представляет собой фоторецептор, активируемый красным светом: когда протоны абсорбируются редокс-цепью, они переносят их энергию к дыхательной системе, включающей, через изменение электрохимического потенциала фотоактивированной клетки и трансдукцию внутриклеточных сигналов, опосредуемую Са и сАМР, каскад событий в клетке (синтез ДНК и РНК, пролиферативную активность клетки) и продуцирование энергии в форме АТФ.
Этот фермент способен катализировать перенос электронов к молекулярному кислороду для конверсии его в молекулы воды без образования промежуточных свободных радикалов, вредных для клетки, согласно следующей схеме:
Схема реакции, вызывающей продуцирование АТФ и молекул воды из кислорода цито-С-оксидазой
Цитохром С как один из его субстратов является необходимым компонентом дыхательной цепи. Цитохром С играет существенную роль в митохондриальной функции и выживании клеток. Главной ролью цитохрома С является обеспечение переноса электронов посредством изменения валентности атома железа. Таким образом цитохром С, который растворим, несет электроны из комплекса III к комплексу IV (цитохромоксидаза). Электроны, которые являются субстратом цитохромоксидазы, затем переносятся этим ферментом к кислороду.
Многочисленные данные позволяют в настоящее время утверждать, что свободные радикалы, вызывая реакции перокисления липидов, ответственны за существенную долю снижения текучести мембран и падения активности некоторых переносчиков, таких как цитохромоксидаза, в митохондриях старой ткани; следовательно, идентификация соединений, способных повышать активность цитохром-С-оксидазы, может оказаться полезной.
2
2
Показано, что экстракт джимнемы сильвестра стимулирует активность цитохром-С-оксидазы кератиноцитов человека; кроме того, проверяли действие экстракта джимнемы сильвестра на кератиноциты человека, предварительно обработанные пероксидом водорода (НО), который имеет эффект индукции существенного снижения активности цитохром-С-оксидазы; затем было показано, что экстракт джимнемы сильвестра существенно восстанавливает активность цитохром-С-оксидазы.
Как вывод, экстракт джимнемы сильвестра имеет существенное влияние на регуляцию метаболических и энергетических процессов в кератиноцитах человека в культуре.
- На метаболический путь пентозы в фибробластах человека в культуре с помощью анализа на рибоза-5-фосфат.
Тесты Заявителя также показали, что экстракт джимнемы сильвестра оказывает действие на регуляцию метаболических и энергетических процессов в кератиноцитах и фибробластах человека в культуре путем индукции существенного повышения синтеза рибоза-5-фосфата.
Параллельно с гликолизом, который вовлечен в продуцирование АТФ, путь фосфата пентозы является метаболическим путем, который продуцирует НАДФ - донор электронов, промотирующий в особенности клеточное дыхание (цикл Кребса, дыхательная цепь), и рибоза-5-фосфат (биосинтез ДНК, РНК).
Таким образом, оказывается, что экстракт джимнемы сильвестра из-за своих свойств является полезным средством для повышения метаболизма в клетках кожи.
Джимнема сильвестра является диким растением тропических лесов Центральной и Южной Индии и Шри-Ланки; это растение традиционно используют в медицинских препаратах для различных лечебных целей, в частности, для лечения диабета.
Известно применение экстракта джимнемы сильвестра в композициях, предназначенных для нанесения на кожу, в частности, из-за красящего свойства этого соединения или его свойств ингибировать рост волос (WO 2005/067953).
Однако по сведениям Заявителя до настоящего времени никогда не предполагалось, что экстракт джимнемы сильвестра может иметь свойства, перечисленные выше, и не утверждалось о его применимости в качестве средства активации метаболического пути снабжения энергией клеток кожи.
Таким образом, настоящее изобретение относится к косметическому применению экстракта джимнемы сильвестра или к косметической композиции, включающей такой экстракт, для активации энергопродуцирующих метаболических путей клеток кожи; для повышения синтеза АТФ; для стимуляции активности цитохром-С-оксидазы; для индукции синтеза рибоза-5-фосфата; и таким образом, для регуляции метаболических и энергетических процессов в коже.
Экстракт джимнемы сильвестра предпочтительно получают из надземной части растения, преимущественно из листьев, и его можно получить с использованием любого способа экстрагирования, известного специалистам в данной области техники.
Согласно одному отдельному варианту осуществления, экстракцию выполняют с использованием фрагментов надземных частей джимнемы сильвестра путем следующей обработки:
- сушка с последующим измельчением;
1
4
- экстракция в системе твердое вещество – жидкость в водно-спиртовой фазе, например, в смеси воды и низшего С-С спирта, такого как этанол;
- грубая фильтрация;
- обесцвечивание с активированным углем;
- пластинчатая фильтрация с отсечением 1 мкм;
- концентрирование.
Для того, чтобы облегчить его последующее использование, экстракт затем можно солюбилизировать в косметически приемлемом субстрате, таком как глицерин.
Таким путем получают прозрачный жидкий экстракт янтарного цвета.
Преимущественно экстракт джимнемы сильвестра представляет собой водно-спиртовой экстракт и/или стабилизированный глицерином.
Для его косметического применения экстракт джимнемы сильвестра вводят в косметическую композицию, включающую от 0,01 до 10 мас.%, предпочтительно, от 0,01 до 5 мас.%, экстракта джимнемы сильвестра на сухую массу относительно общей массы композиции.
Такая композиция может быть представлена в любой из лекарственных форм, обычно используемых в области косметики и дерматологии, и особенно она может находиться в форме необязательно гелеобразного водного раствора, необязательно двухфазного лосьона типа дисперсии, эмульсии, полученной диспергированием масляной фазы в водной фазе (м/в) или наоборот (в/м) или тройной эмульсии (в/м/в или м/в/м) или дисперсии из пузырьков ионного и/или неионного типа. Такие композиции получают с использованием обычных способов.
Такая композиция может быть более или менее жидкой и иметь вид белого или окрашенного крема, мази, молочка, лосьона, сыворотки, пасты или пенки. Ее можно наносить на кожу необязательно в аэрозольной форме. Она также может быть представлена в твердой форме, в частности, в форме карандаша. Ее можно использовать как средство для ухода за кожей и/или как средство макияжа.
Композиция по изобретению также может содержать адъюванты, применимые в косметической отрасли, такие как гидрофильные или липофильные желирующие компоненты, консерванты, антиоксиданты, растворители, отдушки, компоненты для увеличения объема, наполнители, пигменты, поглотители запаха и красители. Количества таких различных адъювантов являются количествами, обычно используемыми в данной области, и составляют, например, 0,01-20% от общей массы композиции. Такие адъюванты, в соответствии с их природой, можно вводить в масляную фазу, в водную фазу, в липидные везикулы и/или в наночастицы. В любом случае такие адъюванты и их пропорции следует выбирать так, чтобы не мешать свойствам экстракта джимнемы сильвестра, которых добиваются по изобретению.
Согласно предполагаемому применению композиции по изобретению экстракт джимнемы сильвестра может быть скомбинирован с дополнительными антивозрастными средствами, в частности, средствами против морщин, для депигментации, для укрепления, для подсушивания, для уплотнения, против радикалов и/или иммунопротекторными средствами и/или средствами, стимулирующими клеточный метаболизм (особенно синтез белков) и/или пролиферацию клеток кожи.
Заявитель показал, что экстракт джимнемы сильвестра и также косметическую композицию по изобретению, содержащую его, можно использовать для активации метаболических путей клеток кожи, в частности, путей, поставляющих энергию клетки. Термин «клетки кожи» обозначает кератиноциты, фибробласты и меланоциты; предпочтительно, он включает кератиноциты и фибробласты.
Следовательно, применение экстракта джимнемы сильвестра является способом тонизирования клеток кожи и/или стимуляции метаболизма клеток кожи; таким образом, такой экстракт и/или косметическую композицию по изобретению можно использовать в качестве средства для тонизирования клеток кожи и/или стимуляции метаболизма клеток кожи.
Экстракт джимнемы сильвестра и/или косметическую композицию по изобретению, содержащую его, дополнительно можно использовать для создания возможности оптимального функционирования клеток кожи, обеспечения их гомеостаза, обновления и восстановления.
Как таковые, экстракт джимнемы сильвестра и/или косметическую композицию по изобретению выгодно использовать для питания энергией, тонизирования, ревитализаации или детоксификации кожи, в частности, «угнетенной» и «уставшей» кожи, путем улучшения цвета кожи лица и вида поверхности кожи; их также используют для предупреждения и/или восстановления от признаков усталости на лице, таких как вялость и/или посерение кожи лица; их также используют для защиты клеток кожи и кожи от агрессивных факторов окружающей среды, таких как погодные факторы, подобные холоду и ветру, или запыленность.
Экстракт джимнемы сильвестра и/или косметическая композиция по изобретению также применимы для улучшения цвета и/или сияния кожи лица; как таковые, они предотвращают появление вялости и/или потускнения кожи.
Экстракт джимнемы сильвестра и/или косметическая композиция по изобретению дополнительно применимы для тонизирования контура глаз, питания энергией уставших глаз, уменьшения мешков и теней под глазами и общего восстановления расслабленного и отдохнувшего лица.
Экстракт джимнемы сильвестра и/или косметическую композицию по изобретению можно использовать при уходе за кожей для питания энергией или против усталости.
Указанные выше применения преимущественно относятся к коже лица, т.е., коже лица, шеи, зоны декольте и/или вокруг глаз, но также подходят для косметического ухода, специфического для кожи тела.
Настоящее изобретение также относится к способу косметического ухода для активации метаболических путей снабжения энергией клеток кожи; питания энергией, тонизирования, обновления или детоксификации кожи и тонизирования контура глаз, питания энергией уставших глаз, уменьшения мешков и теней под глазами и общего восстановления расслабленного и отдохнувшего лица, включающему нанесение на кожу экстракта джимнемы сильвестра и/или косметической композиции, включающей экстракт джимнемы сильвестра, описанной выше.
Так, нанесение на кожу можно осуществить согласно используемой лекарственной форме. Оно может заключаться, например, только в нанесении на кожу или нанесении, сопровождаемом массажем кожи с композицией по настоящему изобретению.
Предпочтительно осуществляют нанесение достаточного количества композиции с тем, чтобы обрабатывалась вся поверхность обрабатываемой кожи. Оно может состоять в обычном нанесении на кожу, например, крема. Оно также может состоять, например, в нанесении для воздействия как маска для ухода.
Примеры в настоящем описании относятся к оценке биологического действия, с одной стороны, экстракта джимнемы сильвестра и, с другой стороны, композиций по настоящему изобретению.
2
2
В примерах делаются ссылки на следующие фигуры, причем гистограммы на фигурах 1, 2А, 2В и 3 представляют, соответственно, содержание АТФ, активность цитохром-С-оксидазы с НО или без него и содержание рибоза-5-фосфата в необработанной клеточной культуре или обработанной 0,125% или 0,25% экстрактом листьев джимнемы сильвестра.
В наборе примеров в настоящем описании испытываемый продукт представляет собой экстракт листьев джимнемы сильвестра, полученный с использованием способа водно-спиртовой экстракции, описанного выше, и последующей стабилизации в глицерине (1,5% сухого экстракта в смеси глицерин/вода 70%/30%).
Пример 1. Исследование действия экстракта по изобретению на синтез АТФ в кератиноцитах человека в культуре
Материалы и способ
Состав партий:
партия 1 – необработанная контрольная;
партия 2 – обработанная экстрактом джимнемы сильвестра, разбавленным до 0,125% в культуральной среде;
партия 3 – обработанная экстрактом джимнемы сильвестра, разбавленным до 0,25% в культуральной среде.
Клеточная культура
5
2
Культуры кератиноцитов получают с использованием кожи крайней плоти человека, собранной при циркумцизии, и амплифицируют в среде KGM2 (среда для выращивания кератиноцитов, KGN2, клонетики (clonetics)) с добавлением инсулина, EGF и экстракта гипофиза. Испытания проводят на кератиноцитах 3-го пассажа. Клетки инокулируют в многолуночные планшеты на уровне 1×10 клеток. После 24 часов инкубации при 37°С (5% СО) клетки в логарифмической фазе роста обрабатывают экстрактом джимнемы сильвестра в концентрациях 0,125% и 0,25%. После 24 часов обработки берут образцы клеток и проводят анализ на АТФ.
Анализ на АТФ
Анализ на АТФ проводят с использованием набора для анализа PROMOKINE (Promocell, Франция). Колориметрический анализ проводят с использованием спектрофотометра при 570 нм.
Результаты
Таблица I
ATФ(нмоль/10<sup>6</sup> клеток)
%
Среднее
Стандартное отклонение
Отрицательный контроль
2,55
0,18
/
Джимнема 0,125%
3,04
0,14
+19
Джимнема 0,25%
3,11
0,21
+22
Полученные результаты показывают, что экстракт джимнемы сильвестра в концентрациях 0,125% и 0,25% вызывает существенное повышение синтеза АТФ на 19% и 22% соответственно.
Пример 2. Исследование действия экстракта по изобретению на активность цитохром-С-оксидазы - комплекс IV дыхательной цепи, в кератиноцитах человека в культуре, подвергнутой или не подвергавшейся окислительному стрессу
Материалы и способ
Состав партий:
партия 1 – необработанная контрольная;
партия 2 – обработанная экстрактом джимнемы сильвестра, разбавленным до 0,125% в культуральной среде;
партия 3 – обработанная экстрактом джимнемы сильвестра, разбавленным до 0,25% в культуральной среде;
2
2
партия 4 – обработанная НО;
2
2
партия 5 – обработанная экстрактом джимнемы сильвестра, разбавленным до 0,125% в культуральной среде + НО;
2
2
партия 6 – обработанная экстрактом джимнемы сильвестра, разбавленным до 0,25% в культуральной среде + НО.
Клеточная культура
6
2
2
2
Культуры кератиноцитов получают с использованием кожи крайней плоти человека, собранной при циркумцизии, и амплифицируют в среде KGM2 (среда для выращивания кератиноцитов, KGN2, клонетики) с добавлением инсулина, EGF и экстракта гипофиза. Испытания проводят на кератиноцитах 3-го пассажа. Клетки инокулируют в многолуночные планшеты на уровне 1×10 клеток. После 24 часов инкубации при 37°С (5% СО) клетки в логарифмической фазе роста обрабатывают экстрактом джимнемы сильвестра в концентрациях 0,125% и 0,25% одним или в присутствии НО.
Оценка активности цитохром-С-оксидазы
После 24 часов обработки берут образцы клеток и затем промывают и ресуспендируют в холодном PBS. Затем осуществляют оценку активности цитохром-С-оксидазы с использованием набора для анализа (набор для анализа на цитохром-С-оксидазу, Sigma) согласно установленному протоколу.
Результаты
Таблица II
ATФ(нмоль/10<sup>7</sup> клеток)
%
Среднее
Стандартное отклонение
Отрицательный контроль
1,32
0,21
/
Джимнема 0,125%
1,55
0,07
+17
Джимнема 0,25%
1,63
0,05
+23
Положительный контроль (H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>)
0,87
0,05
-34
Джимнема 0,125% + H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
0,98
0,07
+13
Джимнема 0,25% + H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>
1,01
0,06
+16
Полученные результаты показывают, что экстракт джимнемы сильвестра в концентрациях 0,125% и 0,25% стимулирует активность цитохром-С-оксидазы в кератиноцитах человека в культуре на 17% и 23% соответственно по сравнению с отрицательным контролем.
2
2
2
2
Обработка клеток одним пероксидом водорода (НО) вызывает существенное снижение активности цитохром-С-оксидазы (-34%). В присутствии НО экстракт джимнемы сильвестра в концентрациях 0,125% и 0,25% восстанавливает активность цитохром-С-оксидазы (+13% и +16%).
Как вывод, экстракт джимнемы сильвестра оказывает существенное влияние на регуляцию метаболических и энергетических процессов в кератиноцитах человека в культуре.
Пример 3. Исследование действия экстракта по изобретению на метаболический путь пентозы в кератиноцитах человека в культуре с использованием анализа на рибоза-5-фосфат
Материалы и способ
Состав партий:
партия 1 – необработанная контрольная;
партия 2 – обработанная экстрактом джимнемы сильвестра, разбавленным до 0,125% в культуральной среде;
партия 3 – обработанная экстрактом джимнемы сильвестра, разбавленным до 0,25% в культуральной среде.
Клеточная культура
5
2
В способе используют ферментативный гидролиз, подходящий для получения первичных культур фибробластов из биопсии кожи человека. Полученные клетки амплифицируют в среде RPMI 1640 с добавлением телячьей сыворотки, L-глутамина и антибиотиков. Испытания проводят на кератиноцитах 3-го пассажа. Клетки инокулируют в многолуночные планшеты на уровне 1×10 клеток. После 24 часов инкубации при 37°С (5% СО) клетки в логарифмической фазе роста обрабатывают экстрактом джимнемы сильвестра в концентрациях 0,125% и 0,25%.
Анализ на рибоза-5-фосфат
После 24 часов обработки берут образцы клеток, и клетки осаждают, воздействуя ультразвуком в течение 30 с на ледяной бане, и центрифугируют в течение 5 мин при 11000 g при 10°С. Затем супернатанты переносят в новые пробирки. Остаточную ферментативную активность останавливают, добавляя 50 мкл перхлорной кислоты (2,5%), содержащей 3 мкмоль/л IS, к образцам, которые затем хранят при -20°С по меньшей мере в течение 30 мин для депротеинизации. Затем добавляют 15 мкл фосфатного буфера (рН 11,5; 1 моль/л) для нейтрализации раствора, и образцы центрифугируют в течение 5 мин при 21000 g при 4°С. Супернатанты переносят в стеклянные флаконы, которые хранят при -20°С до инжекции. Получают ряд стандартных растворов, в которых соответственно 0,625, 1,25, 2,5, 3,75 и 6,25 мкмоль/л рибоза-5-фосфата. Ряд стандартных растворов обрабатывают так же, как образцы. Анализ на содержание рибоза-5-фосфата выполняют методом ЖХ-МС/МС.
Результаты
Таблица III
Рибоза-5-фосфат(нмоль/10<sup>6</sup> клеток)
%
Среднее
Стандартное отклонение
Отрицательный контроль
0,256
0,01
/
Джимнема 0,125%
0,322
0,03
+26
Джимнема 0,25%
0,34
0,01
+33
Полученные результаты показывают, что экстракт джимнемы сильвестра в концентрациях 0,125% и 0,25% вызывает значительное повышение синтеза рибоза-5-фосфата на 26% и 33%, соответственно.
Как вывод, экстракт джимнемы сильвестра оказывает существенное влияние на регуляцию метаболических и энергетических процессов в кератиноцитах и фибробластах человека в культуре.
Пример 4. Композиции
Сыворотка                                             %
Карбомер.............................................0,60
Камедь целлюлозы.....................................0,20
Пентиленгликоль......................................2,00
Трометамин...........................................0,52
Глицерин и вода и ПЭГ-8 и каприлилгликоль и
полиакрилат натрия...................................5,00
Вода и глицерин и глицерилакрилат/акриловая кислота и
сополимер...........................................10,00
джимнема сильвестра...................................3,00
консерванты............................................QS
хелатообразователь.....................................QS
отдушка................................................QS
деионизованная вода................................QS 100
Увлажняющий крем
%
Цетеариловый спирт и лаурилсульфат натрия и
цетеарилсульфат натрия...............................1,70
гидрированный полизобутен............................7,00
изононилизононаноат...................................5,00
глицерилстеарат SE...................................5,60
алкилбензоат С12-15..................................3,50
ПЭГ-20 метилглюкозы сесквистеарат....................0,50
глицерин.............................................3,00
карбомер.............................................0,25
диоксид кремния......................................0,15
слюда................................................0,10
тальк................................................0,50
Глицерин и вода и ПЭГ-8 и каприлилгликоль и
полиакрилат натрия...................................5,00
диметикон и диметиконол..............................0,15
токоферола ацетат....................................0,20
джимнема сильвестра.................................. 1,00
консерванты............................................QS
хелатообразователь.....................................QS
отдушка................................................QS
деионизованная вода................................QS 100
Увлажняющий гель
%
Тапиоковый крахмал...................................1,00
Аммоний- и акрилоилдиметилтаурат/вп и
сополимер............................................1,00
гликоли..............................................5,00
этилгексилглицерин...................................0,20
Вода и глицерин и глицерилакрилат/акриловая кислота и
сополимер............................................5,00
каприловый/каприновый триглицерид....................1,50
циклометикон.........................................5,00
фенилтриметикон......................................1,00
циклопентасилоксан и ПЭГ/ППГ-18/18 диметикон.........1,00
токоферола ацетат....................................0,20
джимнема сильвестра.................................. 1,00
тетранатрий ЭДТА.....................................0,05
консерванты............................................QS
отдушка................................................QS
деионизованная вода................................QS 100