УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ, КАСАЮЩИЕСЯ ВЕЗИКУЛ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ МЕНИНГОКОККОВ
IMPROVEMENTS DEALING WITH MENINGOCOCCUS OUTER MEMBRANE VESICLES

Все процитированные здесь документы во всей полноте включены в настоящее описание посредством ссылки.
Область техники настоящего изобретения
Изобретение относится к области везикул внешней мембраны менингококков для целей иммунизации.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Один из многочисленных подходов к иммунизации против инфекции Neisseria meningitidis (менингококка) заключается в использовании везикул внешней мембраны (OMV). Эффективная вакцина против менингококка серогруппы В на основе OMV была получена в Национальном институте здравоохранения Норвегии (Norwegian National Institute of Public Health) ['MenBvac™'; например, ссылка
1], но хотя эта вакцина безопасна и предотвращает заболевание, вызываемое MenB, ее эффективность ограничена гомологичным серотипом, используемым для приготовления вакцины.
Вакцина 'RIVM' основана на OMV, содержащих шесть различных подтипов PorA. В ходе фазы II клинических испытаний было показано, что она иммуногенна у детей [2].
В ссылке 3 раскрыта вакцина против различных патогенных серотипов менингококка серогруппы В на основе OMV, в которых сохранился белковый комплекс массой 65 кДа. В ссылке 4 раскрыта вакцина, содержащая OMV из штаммов генетически сконструированных менингококков, причем OMV содержат, по меньшей мере, один белок внешней мембраны (ОМР) класса 1, но не содержат ОМР классов 2/3. В ссылке 5 раскрыты OMV, содержащие ОМР, содержащие мутации в поверхностных петлях, и OMV, содержащие производные менингококкового липополисахарида (LPS). В ссылке 6 раскрыт способ приготовления вакцин против менингококка серогруппы А на основе OMV.
Высказано множество предложений по повышению эффективности OMV. В ссылке 7 раскрыты композиции, содержащие OMV, дополненные трансферринсвязывающими белками (например, TbpA и TbpB) и/или Cu,Zn-супероксиддисмутазой. В ссылке 8 раскрыты композиции, содержащие OMV, дополненные множеством белков. В ссылке 9 раскрыты препараты мембранных везикул, полученных из N. meningitidis с модифицированным геном fur. В ссылке 26 описано, что экспрессия nspA должна положительно регулироваться одновременным выключением porA и cps. Другие нокаут-мутанты N. meningitidis для получения OMV раскрыты в ссылках 26-28. В отличие от этих попыток усовершествования OMV путем изменения профилей экспрессии авторы ссылки 29 сосредоточили усилия на изменении способов получения OMV и сообщили, что такие антигены, как NspA, могут быть сохранены в ходе экстракции везикул путем избегания использования таких поверхностно-активных веществ, как дезоксихолат.
Неспособность менингококковых OMV индуцировать перекрестную защиту от менингококков негомологичных серотипов ограничивает их использование в качестве общих вакцин, но они могут быть весьма полезны при эпидемиях, при которых заболевание вызвано по существу клональными патогенными штаммами. Так, вакцина, разработанная в Finlay Institute (VA-MENGOC-BC™), оказалась полезна в Латинской Америке, где вызвавшие заболевание менингококки серогруппы В преимущественно принадлежали к серотипу Р1.19,15, но больше нигде не была эффективна [10]. Аналогично, разработанная Chiron вакцина MeNZB™ была направлена против эпидемического штамма (Р1.7b,4, известного в последней номенклатуре как Р1.7-2,4), который преобладал в Новой Зеландии с 1991 года.
В ссылке 11 раскрыта вакцина на основе мультивалентных композиций менингококковых пузырьков, содержащих первый тип пузырьков, полученных из менингококков штамма, характеризующегося сероподтипом, преобладающим в государстве применения, и второй тип пузырьков, полученных из менингококков штамма, необязательно характеризующегося сероподтипом, преобладающим в государстве применения.
Целью изобретения является создание дополнительных и усовершенствованных препаратов менингококковых OMV.
Раскрытие настоящего изобретения
Опыт применения MeNZB™ показал, что OMV, направленные против конкретных эпидемических штаммов, могут быть чрезвычайно эффективно использованы для борьбы с локальными вспышками заболевания. При вспышке вакцина может быть быстро произведена с помощью крупномасштабных и воспроизводимых технологий производства. Таким образом, изобретение относится к способу получения вакцины на основе везикул внешней мембраны (OMV) менингококков, предусматривающему следующие стадии: (i) идентификация сероподтипа штамма менингококков, связанного со вспышкой менингококкового менингита; (ii) получение OMV из менингококкового штамма, характеризующегося сероподтипом, идентифицированным на стадии (i), для использования в производстве вакцин. Способ может предусматривать одну или обе из следующих дополнительных стадий: (iii) приготовление указанных OMV в форме вакцины и (iv) распределение указанной вакцины по географической области, которая подвержена или может быть подвержена указанной вспышке. Изобретение также относится к такому же способу без стадии (i), применимому в ситуациях, в которых ответственный за вспышку сероподтип уже идентифицирован. Менингококковый штамм, как правило, принадлежит к серогруппе В, но альтернативно может относиться к серогруппе А, С, W135, Y и т.д.
Опыт применения MeNZB™ также позволил авторам настоящего изобретения предположить, что OMV применимы для иммунизации против менингококков серогрупп А, С, W135 и Y либо по отдельности, либо в сочетании и что их производство может обойтись дешевле, чем производство предлагаемых в настоящее время конъюгированных вакцин. Таким образом, изобретение относится к (а) композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококка штамма серогруппы С; (b) композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококка штамма серогруппы W135; (с) композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококка штамма серогруппы Y; и (d) композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококка штаммов двух или более серогрупп А, В, С, W135 и Y. В разделе (d) предпочтительные композиции включают в себя следующие смеси серогрупп: А+В; А+С; A+W135; A+Y; B+C; B+W135; B+Y; C+W135; C+Y; W135+Y; А+В+С; A+B+W135; A+B+Y; A+C+W135; A+C+Y; A+W135+Y; B+C+W135; B+C+Y; C+W135+Y; A+B+C+W135; A+B+C+Y; B+C+W135+Y и A+B+C+W135+Y.
Поскольку существует общность субкапсулярных антигенов между серогруппами, OMV (и смеси OMV) способны обеспечивать защиту от менингококков не только той серогруппы, из которой они были получены. Например, субкапсулярные антигены штаммов серогрупп А и W135, наблюдающихся в африканских государствах, расположенных южнее Сахары, идентичны с таковыми штаммов серогрупп С и Y, наблюдающихся по всему миру. Таким образом, изобретение относится к применению OMV из штамма менингококков первой серогруппы для защиты от одного или нескольких штаммов менингококков второй серогруппы, причем указанные первая и вторая серогруппы отличны. Штаммы предпочтительно содержат одинаковые субкапсулярные антигены и могут характеризоваться одним подтипом, сероподтипом и/или иммунотипом даже несмотря на то, что принадлежат к различным серогруппам. Предпочтительной является смесь OMV менингококков серогрупп А и W135, а также смесь OMV менингококков серогрупп С и Y.
Опыт применения MeNZB™ также позволил авторам настоящего изобретения предположить, что смесь OMV из штаммов, используемых для получения OMV новозеландских штаммов, OMV норвежских штаммов и OMV кубинских штаммов, характеризуется приемлемой эффективностью. Таким образом, изобретение относится к композиции, содержащей везикулы внешней мембраны из двух из трех следующих менингококков: (i) менингококк сероподтипа Р1.7b,4; (ii) менингококк сероподтипа Р1.7,6 и (iii) менингококк сероподтипа P1.19,15. Различные OMV предпочтительно находятся в смеси, но, альтернативно, они могут содержаться в отдельных контейнерах в составе набора.
Комбинируя OMV менингококков различных сероподтипов, авторы настоящего изобретения обнаружили, что дозы OMV менингококков отдельных сероподтипов могут быть снижены без потери эффективности. Тогда как VA-MENGOC-B™ содержит 50 мкг OMV (в объеме 0,5 мл), НехаМеn™ содержит около 1 мг OMV (в объеме 0,3 мл), а как MenBVac™, так и MeNZB™ содержат 25 мкг OMV (в объеме 0,5 мл) в расчете на общее содержание белка, авторы настоящего изобретения обнаружили, что доза отдельных OMV может быть снижена, если смесь используется без потери индивидуальной эффективности. Таким образом, изобретение относится к композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококков первого сероподтипа и менингококков второго сероподтипа, причем концентрация OMV менингококков первого сероподтипа составляет менее 45 мкг/мл и концентрация OMV менингококков второго сероподтипа составляет менее 45 мкг/мл. Изобретение также относится к композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококков, по меньшей мере, двух сероподтипов, причем совокупная концентрация OMV составляет менее 90 мкг/мл. Изобретение также относится к композиции, содержащей везикулы внешней мембраны менингококков n различных сероподтипов, причем концентрация OMV менингококков каждого сероподтипа составляет менее 45 мкг/мл (т.е. совокупная доза OMV составляет менее 45n мкг/мл). Значение n может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.
Изобретение также относится к набору, содержащему OMV, полученные из менингококков n различных сероподтипов. Везикулы могут содержаться или храниться в составе набора раздельно до тех пор, пока не возникнет необходимость их совместного использования, например, в виде смеси или одновременного раздельного или последовательного использования. Аналогично, изобретение относится к способу, предусматривающему получение n серий OMV, по одному из менингококков каждого из n различных сероподтипов; и объединение n серий везикул. Различные серии могут быть объединены в набор или в смесь.
Изобретение также относится к композиции, содержащей OMV, полученные из менингококков штамма серогруппы В, характеризующегося сероподтипом Р1.7b,4, причем концентрация OMV в композиции составляет около 50 мкг/мл. Композиция предпочтительно содержит адъювант на основе гидроксида алюминия и гистидиновый буфер. Композиция может быть введена в составе дозы объемом около 0,5 мл.
Везикулы
Изобретение основано на везикулах внешней мембраны (OMV), полученных из Neisseria meningitidis. Термин "OMV" относится к любой протеолипосомной везикуле, полученной путем разрушения внешней мембраны бактерии с образованием из внешней мембраны везикул, содержащих белковые компоненты внешней мембраны. OMV искусственно получают из бактерий (например, путем обработки поверхностно-активными веществами или средствами, отличными от поверхностно-активных веществ [29]). Термин также охватывает пузырьки, микровезикулы (MV [12]) и 'нативные OMV' ('NOMV [13]), которые представляют собой природные мембранные везикулы, которые спонтанно образуются в процессе роста бактерий и высвобождаются в культуральную среду. MV могут быть получены путем культивирования Neisseria в бульонной культуральной среде, отделения цельных клеток от меньших MV в бульонной культуральной среде (например, путем фильтрования или низкоскоростного центрифугирования для осаждения только клеток, но не меньших везикул) с последующим сбором MV из бесклеточной среды (например, путем фильтрования, дифференциального осаждения или агрегации MV, высокоскоростного центрифугирования для осаждения MV). Штаммы, применимые для получения MV, как правило, могут быть выбраны по количеству MV, получаемых в культуре, например, в ссылках 14 и 15 описана Neisseria с высоким выходом MV.
OMV могут быть получены различными способами. Способы получения подходящих препаратов раскрыты, например, в процитированных здесь ссылках. Методики получения OMV включают в себя обработку бактерий поверхностно-активными солями желчных кислот (например, солей литохолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, холевой кислоты, урсохолевой кислоты и т.д., причем предпочтительным для обработки Neisseria является дезоксихолат натрия [16 и 17]) при значении рН, достаточно высоком для того, чтобы не вызвать преципитацию поверхностно-активного вещества [6]. Другие методики могут быть осуществлены по существу в отсутствие поверхностно-активного вещества [29], включая такие методики, как обработка ультразвуком, гомогенизация, микрофлуидизация, кавитация, осмотический удар, размалывание, обработка с помощью пресса Френча, смешивание и т.д.
Предпочтительный способ получения OMV предусматривает ультрафильтрацию [18] вместо высокоскоростного центрифугирования неочищенных OMV. Это позволяет перерабатывать гораздо большие количества содержащего OMV супернатанта за гораздо более короткое время (как правило, >15 литров за 4 часа по сравнению с <1,5 литрами за 10 часов) и избегать необходимости повторного диспергирования OMV после центрифугирования. Ультрацентрифугирование позволяет гораздо легче получать большие количества OMV и обеспечивает быстрое получение OMV из выбранного штамма для использования в приготовлении вакцин.
Менингококковые штаммы, используемые для приготовления вакцин
Идентификация сероподтипа интересующего менингококкового штамма может быть проведена в соответствии со стандартными методиками на основе белка внешней мембраны порина класса I (PorA). После того как определен сероподтип, найти другие известные штаммы, принадлежащие к тому же сероподтипу, можно в соответствии с рутинными процедурами. Другие штаммы могут принадлежать к той же серогруппе и/или серотипу (PorB), что и первый штамм, но не обязательно. Однако, как правило, предпочтительно, чтобы совпали как серогруппа, так и сероподтип.
Менингококковые штаммы, используемые в соответствии с изобретением, как правило, относятся к одной из следующих серогрупп: А, В, С, W135 или Y.
Менингококковые штаммы, используемые в соответствии с изобретением, как правило, не являются штаммами, экспрессирующими множественные сероподтипы (т.е. множественные аллели PorA). Таким образом, предпочтительные бактерии, используемые в соответствии с изобретением, экспрессируют одну последовательность PorA, т.е. они не принадлежат к одному сероподтипу.
Также могут быть использованы штаммы с отрицательно регулированным PorA, например штаммы, в которых количество PorA снижено, по меньшей мере, на 20% (например, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, >90%, >95% и т.д.) или в которых его ген даже выключен относительно содержания в штамме дикого типа (например, относительно штамма Н44/76, раскрытого в ссылке 11).
Менингококки, используемые в соответствии с изобретением, могут принадлежать к любому серотипу (например, 1, 2а, 2b, 4, 14, 15, 16 и т.д.) и/или к любому иммунотипу (например, L1; L3,3,7; L10 и т.д.). Менингококки могут относиться к любой подходящей группе, включая гиперинвазивные и гипервирулентные группы, например к любой из следующих семи гипервирулентных групп: подгруппе I; подгруппе III; подгруппе IV-1; комплексу ЕТ-5; комплексу ЕТ-37; кластеру А4; группе 3. Эти группы определяли по методу мультилокусного ферментного электрофореза (MLEE), но для классификации менингококков также использовали мультилокусное типирование последовательностей (MLST) [ссылка 19], например, комплекс ЕТ-37 определяется по методу MLST как ST-11, комплекс ЕТ-5 определяется как ST-32 (ЕТ-5), группа 3 определяется как ST-41/44 и т.д.
Менингококки могут содержать одну или несколько мутаций гена(ов). Например, для снижения пирогенной активности бактерия должна содержать мало эндотоксинов (LPS), и это может быть достигнуто выключением генов ферментов, участвующих в биосинтезе LPS. Уже известны подходящие мутантные бактерии, например мутантная Neisseria [20, 21] и мутантная Helicobacter [22]. Способы получения лишенных LPS внешних мембран грамотрицательных бактерий раскрыты в ссылке 23.
Помимо отрицательной регуляции экспрессии конкретных белков, бактерия может усиленно экспрессировать (относительно соответствующего штамма дикого типа) иммуногены, такие как NspA, белок 287 [8], белок 741 [30], TbpA [7], TbpB [7], супероксиддисмутаза [7] и т.д.
Помимо выключенных определенных эндогенных генов, бактерия может экспрессировать один или несколько генов, не являющихся эндогенными. Например, изобретение может предусматривать использование рекомбинантного штамма, экспрессирующего новые гены относительно соответствующего штамма дикого типа. Экспрессия неэндогенных генов, таким образом, может быть достигнута различными способами, например с помощью введения хромосом (используемого для введения множественных генов PorA [24]), включающих мутаций, экспрессии экстрахромосомными векторами (например, плазмидами) и т.д.
Бактерия также может нести одну или несколько мутаций, детерминирующих выключение и/или усиленную экспрессию, описанных в ссылках 25-30. Предпочтительные гены, подходящие для отрицательной регуляции и/или выключения, включают в себя: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [25]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [26]; (с) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [27] и (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB и/или SynC [28].
Помимо объединения OMV на основании различных сероподтипов, сочетания могут быть составлены в соответствии с другими критериями. Показательные критерии включают в себя серотип (PorB, ОМР класса 2 или 3); иммунотип (липополисахарид или липоолигосахарид); географическое происхождение штаммов; локальное преобладание клинических штаммов; гипервирулентная группа, например две или более из подгрупп I, III и IV-1, комплекса ЕТ-5, комплекса ЕТ-37, кластера А4 и группы 3; мультилокусный тип последовательности (MLST) [19]; более одного из трех различных вариантов NMB1870 [31].
Дозирование OMV
Существующие вакцины на основе менингококковых OMV обеспечивают фармацевтический, позологический и композиционный аспекты для осуществления изобретения. Например, VA-MENGOC-BC™ представляет собой инъецируемую суспензию объемом 0,5 мл, содержащую 50 мкг OMV из штамма Сu-385-83 и 50 мкг капсульного полисахарида серогруппы С, адсорбированного на 2 мг гелеобразного гидроксида алюминия с добавлением 0,01% тиомерсала и фосфатного буфера. MeNZB™ также представляет собой суспензию объемом 0,5 мл, содержащую 25 мкг OMV из штамма NZ98/254, адсорбированных на 1,65 мг адъюванта на основе гидроксида алюминия, с гистидиновым буфером и хлоридом натрия. MenBvac схожа с MeNZB™, но приготовлена из штамма 44/76.
Концентрация OMV менингококков каждого подтипа должна быть достаточно высока для того, чтобы обеспечить формирование протективного иммунитета после введения пациенту. Концентрация OMV в композициях согласно изобретению, как правило, находится в диапазоне от 10 до 500 мкг/мл, предпочтительно, от 25 до 200 мкг/мл и, более предпочтительно, около 50 мкг/мл или около 100 мкг/мл (в расчете на общее содержание белка в OMV).
Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что если композиция содержит OMV более чем из одного менингококкового сероподтипа, дозы OMV отдельных сероподтипов могут быть снижены без потери эффективности. В частности, доза новозеландского и норвежского подтипов может быть снижена вдвое с 25 мкг до 12,5 мкг в дозе объемом 0,5 мл без потери иммуногенности. Таким образом, композиция согласно изобретению, содержащая везикулы внешней мембраны из менингококков более одного подтипа, может содержать менее 100 мкг/мл, чего можно было бы заведомо ожидать в результате простого смешивания MenBvac™ и MeNZB™, и менее 150 мкг/мл, чего можно было бы заведомо ожидать в результате простого смешивания VA-MENGOC-ВС™ либо с MenBvac™, либо с MeNZB™. Таким образом, такие композиции согласно изобретению характеризуются совокупной концентрацией OMV не более 90 мкг/мл (например, не более 80 мкг/мл, 70 мкг/мл, 60 мкг/мл, 50 мкг/мл, 40 мкг/мл, 30 мкг/мл или даже менее).
Более обобщенно, если композиция содержит везикулы внешней мембраны из менингококков n различных подтипов, концентрация OMV из менингококков каждого подтипа составляет менее 45 мкг/мл (например, менее 40 мкг/мл, 35 мкг/мл, 30 мкг/мл, 25 мкг/мл, 20 мкг/мл или даже менее). Предпочтительной является концентрация около 25 мкг/мл.
Если композиция содержит везикулы внешней мембраны из менингококков n различных подтипов, количества OMV каждого подтипа предпочтительно отличаются друг от друга не более чем на ±10%, т.е. композиция содержит по существу равные массы каждого OMV. Однако в определенных обстоятельствах количество OMV одного подтипа может быть приблизительно в х раз больше, чем количество OMV другого, причем х равно 2, 3 или 4, например, композиция может содержать двойную дозу OMV одного подтипа относительно содержания в композиции OMV другого(их) подтипа(ов).
Фармацевтические композиции, содержащие OMV
Композиции согласно изобретению могут представлять собой фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель. Такие композиции могут быть приготовлены в соответствии со способом, предусматривающим стадию смешивания OMV с фармацевтически приемлемым носителем.
Типичные "фармацевтически приемлемые носители" включают в себя любой носитель, который сам по себе не индуцирует выработку антител, вредных для субъекта, получающего композицию. Подходящие носители, как правило, представляют собой крупные медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и агрегаты липидов (такие как масляные капли или липосомы). Такие носители хорошо известны средним специалистам в данной области техники. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин и т.д. Кроме того, в таких носителях могут содержаться вспомогательные вещества, такие как увлажняющие вещества или эмульгаторы, рН-буферные вещества, сахароза и т.п. Типичным носителем является стерильный апирогенный фосфатно-буферный физиологический раствор (например, на основе воды для инъекций). С подробным обсуждением фармацевтически приемлемых наполнителей можно ознакомиться в ссылке 32.
Композиции согласно изобретению, как правило, находятся в водной форме (например, растворов или суспензий) предпочтительнее, чем в сухом виде (например, лиофилизированном). Водные композиции также применимы для восстановления других вакцин из лиофилизированной формы (например, лиофилизированной конъюгированной вакцины против Hib, лиофилизированной конъюгированной вакцины против менингококка и т.д.). Если композиция согласно изобретению подлежит использованию, предусматривающему такое восстановление непосредственно перед применением, изобретение относится к набору, который может содержать два флакона или может содержать один шприц-тюбик и один флакон, причем водное содержимое шприц-тюбика используют для реактивации сухого содержимого флакона перед инъекцией.
Композиции согласно изобретению могут находиться во флаконах, или они могут находиться в шприц-тюбиках. Шприцы могут поставляться с иглами или без них. Композиции могут быть упакованы в однократную дозированную форму или многократную дозированную форму. Шприц, как правило, содержит однократную дозу композиции, тогда как флакон может содержать однократную дозу или многократные дозы. Таким образом, для многократных дозированных форм флаконы предпочтительны по сравнению со шприц-тюбиками.
Эффективные объемы доз могут быть установлены в соответствии с рутинными процедурами, но типичная доза композиции для введения человеку имеет объем около 0,5 мл, например, для внутримышечной инъекции. Вакцину RIVM на основе OMV вводили в объеме 0,5 мл [33] внутримышечной инъекцией в бедро или плечо. MeNZB™ вводят в объеме 0,5 мл внутримышечной инъекцией в переднелатеральную часть бедра или область дельтовидной мышцы руки. Аналогичные дозы могут быть использованы при других путях доставки, например, за одно распыление может быть интраназально распылено около 100 мкл или около 130 мкл вакцины RIVM на основе OMV [13], причем четыре распыления обеспечивают введение суммарной дозы в объеме около 0,5 мл.
Значение рН композиции, предпочтительно, составляет от 6 до 8 и, более предпочтительно, от 6,5 до 7,5 (например, около 7). Значение рН вакцины RIVM на основе OMV составляет 7,4 [34], а значение рН <7,5 является предпочтительным для композиций согласно изобретению. Стабильное значение рН может поддерживаться путем использования буфера, например трис-буфера, фосфатного буфера или гистидинового буфера. Композиции согласно изобретению, как правило, содержат буфер. Если композиция содержит гидроксид алюминия, предпочтительно использовать гистидиновый буфер [35], например, в концентрации 1-10 мМ, предпочтительно, около 5 мМ. Значение рН вакцины RIVM на основе OMV поддерживается путем использования 10 мМ буфера трис/HCl. Композиция может являться стерильной и/или апирогенной. Композиции согласно изобретению могут быть изотоничны относительно физиологических сред организма человека.
Композиции согласно изобретению являются иммуногенными и, более предпочтительно, представляют собой вакцинные композиции. Вакцины согласно изобретению могут быть либо профилактическими (т.е. предназначенными для профилактики инфекции), либо терапевтическими (т.е. предназначенными для лечения инфекции), но, как правило, являются профилактическими. Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцин, содержат иммунологически эффективное количество антигена(ов), а также при необходимости любых других компонентов. Под термином "иммунологически эффективное количество" подразумевается, что введение такого количества субъекту либо однократной дозой, либо в качестве части курса эффективно для лечения или профилактики. Это количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению субъекта, возраста, таксономической группы подлежащего лечению субъекта (например, нечеловекообразный примат, примат и т.д.), способности иммунной системы субъекта синтезировать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, суждения лечащего врача о клинической ситуации и других влияющих факторов. Ожидается, что количество будет разниться в относительно широких пределах, которые могут быть определены в соответствии с рутинными испытаниями. Содержание антигена в композициях согласно изобретению, как правило, выражают в количестве белка на дозу. Типичной для интраназально вводимых вакцин на основе OMV является доза, составляющая около 0,9 мг белка на мл [13].
Менингококки поражают различные отделы организма, и, соответственно, композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде препаратов для инъекций либо в форме истинных растворов, либо суспензий. Может быть приготовлена композиция для легочного введения, например, в форме ингалятора, содержащего мелкодисперсный порошок или спрей. Может быть приготовлена композиция в форме суппозитория или пессария. Может быть приготовлена композиция для назального, ушного или глазного введения, например, в форме спрея, капель, геля или порошка [например, ссылки 36 и 37]. Типичными являются инъецируемые препараты для внутримышечного введения.
Композиции согласно изобретению могут содержать антимикробное вещество, особенно при упаковке в форму многократного дозирования. Обычно в вакцинах содержатся такие антимикробные вещества, как тиомерсал и 2-феноксиэтанол, но предпочтительно использовать либо не содержащий ртуть консервант, либо не использовать консервант совсем.
Композиции согласно изобретению могут содержать поверхностно-активное вещество, например Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Поверхностно-активные вещества, как правило, содержатся в низких концентрациях, например <0,01%.
Композиции согласно изобретению могут содержать остаточное количество поверхностно-активного вещества (например, дезоксихолата) из препарата OMV. Остаточное количество поверхностно-активного вещества предпочтительно составляет менее 0,4 мкг (более предпочтительно, менее 0,2 мкг) на каждый мкг белка.
Композиции согласно изобретению могут содержать LPS менингококков. Количество LPS предпочтительно составляет менее 0,12 мкг (более предпочтительно, менее 0,05 мкг) на каждый мкг белка.
Композиции согласно изобретению могут содержать соли натрия (например, хлорид натрия) для обеспечения нужной тоничности. Типичной является концентрация 10±2 мг/мл NaCl. Концентрация хлорида натрия предпочтительно составляет около 9 мг/мл.
Композиции согласно изобретению, как правило, вводят в сочетании с другими иммунорегуляторными агентами. В частности, композиции обычно содержат один или несколько адъювантов, и изобретение относится к способу приготовления композиции согласно изобретению, предусматривающему стадию смешивания везикул согласно изобретению с адъювантом, например, в фармацевтически приемлемом носителе. Подходящие адъюванты включают без ограничения:
А. Минералсодержащие композиции
Минералсодержащие композиции, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция. Изобретение предусматривает использование минеральных солей, таких как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [см., например, главы 8 и 9 ссылки 38], или смесей различных минеральных соединений, причем указанные соединения принимают любую подходящую форму (например, геля, кристаллического вещества, аморфного вещества и т.д.), причем предпочтительной является адсорбция. Минералсодержащие композиции также могут быть приготовлены в форме частиц солей металлов [39].
4
3+
3+
Типичный адъювант на основе фосфата алюминия представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением РО/Al, составляющим от 0,84 до 0,92, содержащийся в концентрации 0,6 мг Al/мл. Может быть использована адсорбция на малом количестве фосфата алюминия, например от 50 до 100 мкг Al на дозу. Если используют фосфат алюминия и желательно не адсорбировать антиген на адъювант, этого достигают путем включения в состав раствора свободных фосфат-ионов (например, путем использования фосфатного буфера).
Вакцину RIVM испытывали при адсорбции либо на адъювант на основе фосфата алюминия, либо на адъювант на основе гидроксида алюминия, и было обнаружено, что при использовании адъюванта на основе фосфата алюминия достигаются лучшие результаты [34]. Каждый из продуктов MeNZB™, MenBvac™ и VA-MENINGOC-BC™ содержит адъювант на основе гидроксида алюминия.
3+
Типичная доза адъюванта на основе соединений алюминия составляет около 3,3 мг/мл (выраженная в расчете на концентрацию Al).
В. Масляные эмульсии
Композиции в форме масляной эмульсии, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат эмульсии сквалена-воды, такие как MF59 [глава 10 ссылки 38; см. также ссылку 40] (5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85, приготовленные в виде субмикронных частиц с помощью микрофлуидайзера). Также могут быть использованы полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA).
С. Сапонинсодержащие составы [глава 22 ссылки 38]
В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы сапонинсодержащие составы. Сапонины представляют собой разнородную группу стероидных гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые содержатся в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветках широкого круга видов растений. В качестве адъюванта был хорошо исследован сапонин из коры мыльного дерева Quillaia saponaria Molina. Сапонин также может быть промышленно получен из Smilax ornata (сарсапарели), Gypsophilla paniculata (гипсофилы ползучей) и Saponaria officinalis (мыльного корня). Сапонинсодержащие адъювантные составы включают в себя очищенные составы, такие как QS21, равно как и липидные составы, такие как ISCOM. QS21 распространяется на рынке под наименованием Stimulon™.
Сапонинсодержащие композиции очищали по методу ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. С помощью этих методов были выделены конкретные очищенные фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. Предпочтительно, сапонин представляет собой QS21. Методика получения QS21 описана в ссылке 41. Сапонинсодержащие составы также могут содержать стерин, такой как холестерин [42].
Сочетания сапонинов и холестеринов может быть использовано для формирования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) [глава 23 ссылки 38]. ISCOM, как правило, также содержат фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Для получения ISCOM может быть использован любой известный сапонин. Предпочтительно, ISCOM содержит один или несколько из QuilA, QHA и QHC. ISCOM более подробно описаны в ссылках 42-44. При необходимости ISCOM могут не содержать дополнительных поверхностно-активных веществ [45].
С обзором разработки адъювантов на основе сапонинов можно ознакомиться в ссылках 46 и 47.
D. Виросомы и вирусоподобные частицы
Виросомы и вирусоподобные частицы (VLP) также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Эти структуры, как правило, содержат один или несколько вирусных белков, необязательно объединенных или включенных в композицию с фосфолипидом. Как правило, они не патогенны, не способны к репликации и не содержат каких-либо частей нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть получены в соответствии с рекомбинантными методиками или выделены из цельных вирусов. Такие вирусные белки, пригодные для использования в получении виросом или VLP, включают в себя белки, полученные из вируса гриппа (такие как НА или NA), вируса гепатита В (такие как коровые или капсидные белки), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящура, ретровируса, вируса Норуолк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, Qβ-фага (такие как белки оболочки), GA-фага, fr-фага, фага АР205 и Ту (такие как белок р1 ретротранспозона Ту). VLP более подробно обсуждаются в ссылках 48-53. Виросомы более подробно обсуждаются, например, в ссылке 54.
Е. Бактериальные или микробные производные
Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя бактериальные или микробные производные, такие как нетоксичные производные энтеробактериального липополисахарида (LPS), производные липида А, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и АДФ-рибозилирующие токсины и их обезвреженные производные.
Нетоксичные производные LPS включают в себя монофосфорил-липид A (MPL) и 3-O-дезацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3-дез-O-ацилированного монофосфорил-липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительная форма 3-дез-O-ацилированного монофосфорил-липида А в виде "мелких частиц" описана в ссылке 55. Такие "мелкие частицы" 3dMPL достаточно малы для того, чтобы стерильно фильтроваться через мембрану с размером ячеи 0,22 мкм [55]. Другие нетоксичные производные LPS включают в себя миметики монофосфорил-липида А, такие как производные аминоалкилглюкозаминидфосфата, например RC-529 [56, 57].
Производные липида А включают в себя производные липида А из Escherichia coli, такие как ОМ-174. ОМ-174 описан, например, в ссылках 58 и 59.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя нуклеотидные последовательности, содержащие мотив CpG (динуклеотидную последовательность, состоящую из неметилированного цитозина, связанного фосфатной связью с гуанозином). Также был продемонстрирован иммуностимулирующий эффект двухцепочечных РНК и олигонуклеотидов, содержащих палиндромные или поли(dG) последовательности.
CpG могут содержать нуклеотидные модификации/аналоги, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. В ссылках 60, 61 и 62 описаны возможные аналогичные замены, например замена гуанозина 2'-дезокси-7-дезазагуанозином. Адъювантный эффект олигонуклеотидов CpG более подробно обсуждается в ссылках 63-68.
Последовательность CpG, такая как мотив GTCGTT или TTCGTT, может быть направлена на TLR9 [69]. Последовательность CpG, такая как CpG-A ODN, может специфично индуцировать Тh1-зависимый иммунный ответ, или последовательность CpG, такая как CpG-B ODN, может более специфично индуцировать В-клеточный ответ. CpG-A и CpG-B ODN обсуждаются в ссылках 70-72. Предпочтительно, CpG представляет собой CpG-A ODN.
Предпочтительно, олигонуклеотид CpG конструируют таким образом, что 5'-конец доступен для распознавания рецептора. Необязательно две олигонуклеотидные последовательности CpG могут быть соединены своими 3'-концами с образованием "иммуномеров". См., например, ссылки 69 и 73-75.
В качестве адъювантов в соответствии с изобретением могут быть использованы бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины и их детоксифицированные производные. Белок предпочтительно происходит из E.coli (из термолабильного энтеротоксина Е.coli "LT"), возбудителя холеры ("СТ") или возбудителя коклюша ("РТ"). Использование детоксифицированных АДФ-рибозилирующих токсинов в качестве мукозальных адъювантов описано в ссылке 76, а в качестве парентеральных адъювантов - в ссылке 77. Токсин или анатоксин предпочтительно находятся в виде голотоксина, содержащего как субъединицу А, так и субъединицу В. Субъединица А предпочтительно содержит детоксифицирующую мутацию; субъединица В предпочтительно не содержит мутаций. Предпочтительно, адъювант представляет собой детоксифицированный мутант LT, такой как LT-K63, LT-R72 и LT-G192. Использование АДФ-рибозилирующих токсинов и их детоксифицированных производных, в частности LT-K63 и LT-R72, в качестве адъювантов описано в ссылках 78-85. Численные обозначения аминокислотных замен предпочтительно основаны на результатах выравнивания субъединиц А и В АДФ-рибозилирующих токсинов, приведенных в ссылке 86, конкретно включенной в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.
F. Иммуномодуляторы человека
Иммуномодуляторы человека, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [87] и т.д.) [88], интерфероны (например, γ-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли.
G. Биоадгезивные и мукоадгезивные вещества
Биоадгезивные и мукоадгезивные вещества также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Подходящие биоадгезивные вещества включают в себя микросферы этерифицированной гиалуроновой кислоты [89] или мукоадгезивные вещества, такие как сшитые производные полиакриловой кислоты, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисахариды и карбоксиметилцеллюлоза. В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы хитозан и его производные [90].
Н. Микрочастицы
В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы микрочастицы. Предпочтительными являются микрочастицы (т.е. частица ~100 нм - ~150 мкм в диаметре, более предпочтительно, ~200 нм - ~30 мкм в диаметре и, наиболее предпочтительно, ~500 нм - ~10 мкм в диаметре), образованные биоразлагаемыми и нетоксичными веществами (например, поли(α-гидроксикислотой), полигидроксимасляной кислотой, сложным полиортоэфиром, полиангидридом, поликапролактоном и т.д.), причем предпочтительным является поли(лактидсогликолид), необязательно обработанный с образованием отрицательно заряженной поверхности (например, SDS) или положительно заряженной поверхности (например, катионным поверхностно-активным веществом, таким как СТАВ).
I. Липосомы (главы 13 и 14 ссылки 38)
Примеры липосомных составов, пригодных для использования в качестве адъювантов, описаны в ссылках 91-93.
J. Составы на основе полиоксиэтиленовых эфиров и сложных полиоксиэтиленовых эфиров
Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя полиоксиэтиленовые эфиры и сложные полиоксиэтиленовые эфиры [94]. Такие составы дополнительно включают в себя поверхностно-активные полиоксиэтиленсорбитановые сложные эфиры в сочетании с октоксинолом [95], равно как и поверхностно-активные полиоксиэтиленалкильные эфиры или сложные эфиры в сочетании, по меньшей мере, с одним дополнительным неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [96]. Предпочтительные полиоксиэтиленовые эфиры выбирают из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет-9), полиоксиэтилен-9-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-8-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.
K. Полифосфазен (РСРР)
РСРР составы описаны, например, в ссылках 97 и 98.
L. Мурамилпептиды
Примеры мурамилпептидов, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP) и N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин МТР-РЕ).
М. Имидазохинолоновые соединения
Примеры имидазохинолоновых соединений, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя Imiquamod и его гомологи (например, "Resiquimod 3M"), более подробно описанные в ссылках 99 и 100.
Изобретение также может предусматривать использование сочетаний компонентов одного или нескольких адъювантов, описанных выше. Например, в соответствии с изобретением могут быть использованы следующие адъювантные композиции: (1) сапонин и эмульсия "масло-в-воде" [101]; (2) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) [102]; (3) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) + холестерин; (4) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IL-12 (необязательно + стерин) [103]; (5) сочетания 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями "масло-в-воде" [104]; (6) SAF, содержащий 10% сквалан, 0,4% Tween 80™, 5% Pluronic-блок-сополимер L121 и thr-MDP, либо микрофлуидизированный в субмикронную эмульсию, либо встряхиваемый до образования эмульсии с большим размером частиц; (7) адъювантная система Ribi™ (RAS) (Ribi Immunochem), содержащая 2% сквален, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки, выбранных из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL+CWS (Detox™); и (8) одна или несколько минеральных солей (таких как соль алюминия) + нетоксичное производное LPS (такое как 3dMPL).
Другие вещества, действующие как иммуностимулирующие агенты, описаны в главе 7 ссылки 38.
Особенно предпочтительным является использование адъювантов на основе солей алюминия, и антигены, как правило, адсорбированы на эти соли. В композициях согласно изобретению некоторые антигены могут быть адсорбированы на гидроксид алюминия, а некоторые антигены могут быть связаны с фосфатом алюминия. Однако, вообще, предпочтительно использовать только одну соль, например гидроксид или фосфат, а не обе. Не все везикулы обязательно должны быть адсорбированы, т.е. некоторые или все они могут находиться в растворе в свободной форме.
Способы лечения
Изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа у млекопитающего, предусматривающему введение млекопитающему фармацевтической композиции согласно изобретению. Иммунный ответ предпочтительно является протективным и гуморальным. В соответствии со способом у пациента, ранее первично иммунизированного N. meningitidis, может быть индуцирован вторичный иммунный ответ. Схемы подкожной и интраназальной схем первичной/вторичной иммунизации раскрыты в ссылках 105.
Млекопитающее, предпочтительно, представляет собой человека. Если вакцину применяют в профилактических целях, человек предпочтительно представляет собой ребенка (например, в возрасте от 1 до 2 лет или до 1 года) или подростка; если вакцину применяют в терапевтических целях, человек предпочтительно является взрослым. Вакцина, предназначенная для детей, также может быть введена взрослым, например, для установления безопасности, дозы, иммуногенности и т.д.
Изобретение также относится к композициям и смесям OMV согласно изобретению для применения в качестве лекарственного препарата. Лекарственный препарат предпочтительно способен индуцировать иммунный ответ у млекопитающего (т.е. он является иммуногенной композицией) и, более предпочтительно, является вакциной.
Изобретение также относится к применению композиций и смесей OMV согласно изобретению для производства лекарственного препарата для индукции иммунного ответа у млекопитающего.
Эти применения и способы особенно применимы для профилактики/лечения заболевания, вызванного N. meningitidis, например бактериального (и более конкретно, менингококкового) менингита и септицемии.
Одним путем проверки эффективности терапевтического лечения является мониторинг инфекции Neisseria после введения композиции согласно изобретению. Одним путем проверки эффективности профилактического лечения является мониторинг иммунных ответов против антигенов OMV после введения композиции согласно изобретению. Иммуногенность композиций согласно изобретению может быть определена путем их введения участвующим в испытании субъектам (например, детям в возрасте 12-16 месяцев или в животных моделях [106]) с последующим определением стандартных параметров, включая сывороточные бактерицидные гуморальные (SBA) и ELISA титры (GMT). Эти иммунные ответы, как правило, определяют приблизительно через 4 недели после введения композиции и сравнивают со значениями, определенными до введения композиции. Предпочтительным является, по меньшей мере, 4-кратное или 8-кратное повышение титра SBA.
Если вводят более одной дозы композиции, может быть проведено более одного количественного определения после введения.
Предпочтительные композиции согласно изобретению способны обеспечивать наработку у пациента титра антител, превышающего критерий серозащиты по каждому антигенному компоненту для приемлемого процентного количества пациентов-людей. Антигены с указанным выше ассоциированным титром антител, нарабатываемым хозяином в результате сероконверсии против антигена, хорошо известны, и значения таких титров публикуются такими организациями, как ВОЗ. Предпочтительно, сероконверсию претерпевает более 80% статистически значимой выборки субъектов, более предпочтительно, более 90%, еще более предпочтительно, более 93% и, наиболее предпочтительно, 96-100%.
Как правило, композиции согласно изобретению вводят пациенту непосредственно. Непосредственная доставка может быть осуществлена с помощью парентеральной инъекции (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или путем ректального, перорального, вагинального, местного, чрескожного, интраназального, глазного, ушного, легочного или иного чресслизистого введения. Предпочтительным является внутримышечное введение в бедро или плечо. Инъекция может быть проведена с помощью иглы (например, иглы для подкожных инъекций), но альтернативно может быть применена безыгольная инъекция. Типичная доза при внутримышечном введении составляет 0,5 мл.
Композиция может быть введена по схеме однократного дозирования или по схеме многократного дозирования. Многократные введения могут быть использованы в протоколе первичной иммунизации и/или в протоколе вторичной иммунизации. За выполнением протокола первичной иммунизации может следовать протокол вторичной иммунизации. Надлежащие временные промежутки между первично иммунизирующими дозами (например, 4-16 недель) и между первичной и вторичной иммунизациями могут быть определены в соответствии с рутинными методиками. Вакцину RIVM на основе OMV испытывали, используя 3- или 4-дозную первичную схему при вакцинации на 0, 2 и 8 или 0, 1, 2 и 8 месяцы. MeNZB™ вводят тремя дозами с шестинедельными интервалами.
Как описано выше, изобретение может предусматривать введение везикул из N. meningitidis более одного сероподтипа либо раздельно, либо в смеси.
Изобретение может быть использовано для индукции системного и/или мукозального иммунитета.
Как правило, композиции по изобретению способны индуцировать сывороточные бактерицидные гуморальные ответы после введения субъекту. Количественно эти ответы легко оцениваются на мышах и являются стандартным индикатором эффективности вакцины [см., например, концевую сноску 14 в ссылке 166]. Сывороточная бактерицидная активность (SBA) свидетельствует об уровне бактериального лизиса, опосредованного комплементом, и ее анализ может быть проведен с помощью комплемента человека или крольчонка. Стандарты ВОЗ требуют, чтобы вакцина индуцировала, по меньшей мере, 4-кратный рост SBA у более 90% реципиентов. MeNZB™ индуцирует 4-кратный рост SBA через 4-6 недель после введения третьей дозы.
10
11
12
13
14
15
16
17
18
14
В результате смешивания OMV из менингококков различных сероподтипов композиции по изобретению могут индуцировать бактерицидные гуморальные ответы более чем на одну гипервирулентную группу менингококков. В частности, они предпочтительно могут индуцировать бактерицидные реакции против двух или трех из следующих трех гипервирулентных групп: (i) кластера А4; (ii) комплекса ЕТ5 и (iii) группы 3. Они могут дополнительно индуцировать бактерицидные гуморальные ответы на одну или несколько из гипервирулентных групп подгруппы I, подгруппы III, подгруппы IV-1 или комплекса ЕТ-37 и на другие группы, например гиперинвазивные группы. Это не обязательно означает, что композиция способна индуцировать наработку бактерицидных антител против всех и каждого штамма менингококков этих гипервирулентных групп, например, предпочтительнее, для каждой данной группы из четырех или более штаммов менингококка в составе конкретной гипервирулентной группы индуцированные композицией антитела проявляют бактерицидное действие в отношении, по меньшей мере, 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90% или более) группы. Предпочтительные группы штаммов включают в себя штаммы, выделенные, по меньшей мере, в четырех из следующих государств: GB, AU, СА, NO, IT, US, NZ, NL, BR и CU. Сыворотка предпочтительно характеризуется бактерицидным титром, составляющим, по меньшей мере, 1024 (например, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 или более, предпочтительно, по меньшей мере, 2), например, сыворотка способна убить, по меньшей мере, 50% исследуемых бактерий конкретного штамма, будучи разведена 1:1024, как описано в ссылке 166.
Предпочтительные композиции способны индуцировать бактерицидные реакции против менингококка следующих штаммов серогруппы В: (i) из кластера А4 штамма 961-5945 (B:2b:P1.21,16) и/или штамма G2136 (В:-); (ii) из комплекса ЕТ-5 штамма МС58 (В:15:Р1.7,16b) и/или штамма 44/76 (В:15:Р1.7,16); (iii) из группы 3 штамма 394/98 (В:4:Р1.4) и/или штамма BZ198 (B:NT:-). Более предпочтительные композиции способны индуцировать бактерицидные ответы против штаммов 961-5945, 44/76 и 394/98.
Штаммы 961-5945 и G2136 серогруппы В являются референсными штаммами Neisseria MLST [№№638 и 1002 в ссылке 107]. Штамм МС58 широко доступен (например, АТСС ВАА-335) и является штаммом, секвенирование генома которого описано в ссылке 108. Штамм 44/76 широко используется и подробно охарактеризован (например, в ссылке 109) и является одним из референсных штаммов Neisseria MLST [№237 в ссылке 107; ряд 32 в таблице 2 в ссылке 19]. Штамм 394/98 был первоначально выделен в Новой Зеландии в 1998 году, и на тему исследований с использованием этого штамма существует несколько публикаций (например, ссылки 110 и 111). Штамм BZ198 является еще одним референсным штаммом MLST [№409 в ссылке 107; ряд 41 в таблице 2 в ссылке 19].
Дополнительные антигенные компоненты
Помимо OMV, композиции согласно изобретению могут содержать дополнительные невезикулярные антигены. Например, композиция может содержать один или несколько из следующих дополнительных антигенов:
- сахаридный антиген N. meningitidis серогруппы А, С, W135 и/или Y, такой как олигосахарид серогруппы С, описанный в ссылке 112, или олигосахариды, описанные в ссылке 113. Продукт VA-MENINGOC-BC™ содержит полисахарид серогруппы С;
- сахаридный антиген Streptococcus pneumoniae [например, ссылки 114-116; гл. 22 и 23 ссылки 123];
- антиген вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например, 117, 118; глава 15 ссылки 123];
- антиген вируса гепатита В, такой как поверхностный и/или коровый антигены [например, 118, 119; глава 16 ссылки 123];
- антиген вируса гепатита С [например, 120];
- антиген Bordetella pertussis, такой как столбнячный голотоксин (РТ) и волокнистый гемагглютинин (FHA) В. pertussis, необязательно также в сочетании с пертактином и/или агглютиногенами-2 и -3 [например, ссылки 121 и 122; глава 21 ссылки 123];
- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный анатоксин [например, глава 13 ссылки 123];
- столбнячный антиген, такой как столбнячный анатоксин [например, глава 27 ссылки 123];
- сахаридный антиген Haemophilus influenzae В [например, глава 14 ссылки 123];
- антиген N. gonorrhoeae [например, ссылка 124];
- антиген Chlamydia pneumoniae [например, 125-131];
- антиген Chlamydia trachomatis [например, 132];
- антиген Porphyromonas gingivalis [например, 133];
- антиген(ы) полиовируса [например, 134, 135; глава 24 ссылки 123], такие как IPV;
- антиген(ы) вируса бешенства [например, 136], такой(ие) как лиофилизированный инактивированный вирус [например, 137, RabAvert™];
- антигены возбудителей кори, эпидемического паротита и/или краснухи [например, главы 19, 20 и 26 ссылки 123];
- антиген(ы) вируса гриппа [главы 17 и 18 ссылки 123], такой(ие) как поверхностные белки гемагглютинин и/или нейраминидаза;
- антиген Moraxella catarrhalis [например, 138];
- белковый антиген Streptococcus agalactiae (стрептококка группы В) [например, 139, 140];
- антиген Streptococcus pyogenes (стрептококка группы А) [например, 140, 141, 142].
Если используют сахаридный или углеводный антиген, его предпочтительно конъюгируют с носителем для повышения иммуногенности. Конъюгирование сахаридных антигенов Н. influenzae В, менингококков и пневмококков хорошо известно.
Токсичные белковые антигены при необходимости могут быть обезврежены (например, детоксификация коклюшного токсина химическим и/или генетическим способами описана в ссылке [122]).
Если в состав композиции включен дифтерийный антиген, также предпочтительным является включение в состав столбнячного антигена и коклюшных антигенов. Аналогично, если присутствует столбнячный антиген, также предпочтительным является включение в состав дифтерийных и коклюшных антигенов. Аналогично, если присутствует коклюшный антиген, также предпочтительным является включение в состав дифтерийных и столбнячных антигенов. Таким образом, сочетания DTP являются предпочтительными.
+
Сахаридные антигены, предпочтительно, находятся в форме конъюгатов. Предпочтительными белками-носителями для конъюгатов являются бактериальные токсины или анатоксины, такие как дифтерийный анатоксин или столбнячный анатоксин. Особенно предпочтительным носителем являются мутантный дифтерийный токсин CRM197 [143-145], а также дифтерийный анатоксин. Другие подходящие белки-носители включают в себя белок внешней мембраны N.meningitidis [146], синтетические пептиды [147, 148], белки теплового шока [149, 150], белки возбудителя коклюша [151, 152], цитокины [153], лимфокины [153], гормоны [153], факторы роста [153], искусственные белки, содержащие множественные эпитопы человеческих CD4 Т-клеток из антигенов различных патогенов [154], белок D H. influenzae [155, 156], поверхностный белок PspA пневмококков [157], пневмолизин [158], железосвязывающие белки [159], токсин А или В С. difficile [160] и т.д.
Антигены, как правило, содержатся в композиции в концентрации, составляющей, по меньшей мере, 1 мкг/мл каждый. Вообще, концентрация любого данного антигена должна быть достаточна для индуцирования иммунного ответа на этот антиген.
Альтернативно использованию в композиции согласно изобретению белковых антигенов может быть использована нуклеиновая кислота, кодирующая антиген. Таким образом, белковые компоненты композиций согласно изобретению могут быть заменены нуклеиновой кислотой (предпочтительно, ДНК, например, в виде плазмиды), кодирующей белок.
Предпочтительные композиции содержат OMV менингококков, описанные выше, и конъюгированный капсульный сахарид менингококков одной или нескольких (т.е. 1, 2, 3 или 4) серогрупп А, С, W135 и Y. Если OMV получены из менингококков серогруппы В, то такой подход позволяет охватить следующие серогруппы: В+А; В+С; B+W135; B+Y; B+C+W135; B+C+Y; B+W135+Y; B+A+C+W135; B+A+C+Y; B+A+W135+Y; B+C+W135+Y и B+A+C+W135+Y. Два предпочтительных сочетания включают в себя OMV менингококков серогруппы В и конъюгированные антигены менингококков либо серогрупп A+W135+Y, либо серогрупп A+C+W135+Y. Вообще, выбрав OMV менингококков х серогрупп и конъюгированные сахариды остальных 5-х серогрупп, можно охватить все пять серогрупп А, В, С, W135 и Y.
Также для дополнения композиций OMV могут быть добавлены конкретные менингококковые белковые антигены (предпочтительно, серогруппы В). В частности, может быть добавлен такой белковый антиген, как описан в ссылках 30 и 161-169. Может быть добавлено малое количество определенных антигенов (смесь из 10 или менее (например, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) очищенных антигенов). Предпочтительные дополнительные иммуногенные полипептиды, применимые в соответствии с изобретением, раскрыты в ссылке 169: (1) белок 'NadA'; (2) белок 741'; (3) белок '936'; (4) белок '953' и (5) белок '287'. Другие возможные дополняющие менингококковые антигены включают в себя трансферринсвязывающие белки (например, TbpA и TbpB) и/или Cu,Zn-супероксиддисмутазу [7]. Другие возможные дополняющие менингококковые антигены включают в себя белки, содержащие одну из следующих аминокислотных последовательностей: SEQ ID NO:650 из ссылки 161; SEQ ID NO:878 из ссылки 161; SEQ ID NO:884 из ссылки 161; SEQ ID NO:4 из ссылки 162; SEQ ID NO:598 из ссылки 163; SEQ ID NO:818 из ссылки 163; SEQ ID NO:864 из ссылки 163; SEQ ID NO:866 из ссылки 163; SEQ ID NO:1196 из ссылки 163; SEQ ID NO:1272 из ссылки 163; SEQ ID NO:1274 из ссылки 163; SEQ ID NO:1640 из ссылки 163; SEQ ID NO:1788 из ссылки 163; SEQ ID NO:2288 из ссылки 163; SEQ ID NO:2466 из ссылки 163; SEQ ID NO:2554 из ссылки 163; SEQ ID NO:2576 из ссылки 163; SEQ ID NO:2606 из ссылки 163; SEQ ID NO:2608 из ссылки 163; SEQ ID NO:2616 из ссылки 163; SEQ ID NO:2668 из ссылки 163; SEQ ID NO:2780 из ссылки 163; SEQ ID NO:2932 из ссылки 163; SEQ ID NO:2958 из ссылки 163; SEQ ID NO:2970 из ссылки 163; SEQ ID NO:2988 из ссылки 163, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая (а) характеризуется идентичностью с указанными последовательностями, составляющей 50% или более (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или более); и/или (b) содержит фрагмент, по меньшей мере, из n последовательных аминокислот из указанных последовательностей, причем n составляет 7 или более (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или более). Предпочтительные фрагменты (b) содержат эпитоп соответствующей последовательности. В состав композиции может быть включено более одного (например, 2, 3, 4, 5, 6) из этих полипептидов. Также могут быть добавлены трансферринсвязывающий белок менингококковых антигенов и/или белок Hsf [170].
Подобное дополнение OMV определенными менингококковыми антигенами особенно применимо, когда OMV получены из менингококка сероподтипа Р1.7b,4 или менингококка сероподтипа Р1.7,16. Предпочтительным является дополнение смеси OMV из менингококков обоих этих сероподтипов.
Конкретные сероподтипы
Изобретение относится к композиции, содержащей OMV, полученные из менингококка, относящегося к одному из следующих подтипов: Р1.2; Р1.2,5; Р1.4; Р1.5; Р1.5,2; Р1.5,с; Р1.5с,10; Р1.7,16; P1.7,16b; P1.7h,4; P1.9; Р1.15; P1.9,15; Р1.12,13; Р1.13; Р1.14; P1.21,16; P1.22,14.
Менингококк предпочтительно принадлежит к серогруппе В.
Эти OMV подходят для использования в соответствии с изобретением, описанным выше.
Схема введения OMV
Изобретение относится к способу введения вакцины на основе менингококковых OMV пациенту, в котором первую дозу вводят в нулевой момент времени, вторую и третью дозы вводят в течение следующих двух месяцев, а четвертую дозу вводят через 11-13 месяцев после нулевого момента времени.
Изобретение также относится к способу введения вакцин на основе менингококковых OMV пациенту, в котором первую дозу вводят в нулевой момент времени, вторую и третью дозы вводят в течение следующих двух месяцев, а четвертую дозу вводят через 11-13 месяцев после нулевого момента времени и в котором (а) первая, вторая и третья дозы содержат OMV, характеризующиеся одинаковым сероподтипом, а (b) четвертая доза содержит OMV, характеризующиеся сероподтипом, отличным от такового OMV первых трех доз. Четвертая доза может содержать OMV, характеризующиеся только сероподтипом, отличным от такового OMV первых трех доз, или она может содержать два типа OMV, причем один тип характеризуется сероподтипом, отличным от такового OMV первых трех доз, а другой характеризуется одинаковым подтипом.
Первую, вторую и третью дозы предпочтительно вводят с интервалами от 6 до 8 недель. Четвертую дозу предпочтительно вводят приблизительно через 1 год после нулевого момента времени.
Пациент предпочтительно получает одинаковое количество вакцины в каждой из четырех доз.
OMV предпочтительно получены из менингококков сероподтипов Р1.7b,4 и/или Р-1.7,16.
Изобретение также относится к способу введения вакцин против менингококков пациенту, в котором (а) вакцина содержит менингококковые OMV, характеризующиеся первым сероподтипом; (b) пациент ранее получал вакцину на основе отличных OMV, характеризующихся вторым сероподтипом, причем первую дозу вакцины на основе отличных OMV вводили более чем за 11 месяцев до осуществления этого способа.
Изобретение также относится к применению менингококковых OMV, характеризующихся первым сероподтипом, для производства лекарственного препарата для иммунизации против менингококкового менингита, причем лекарственный препарат предназначен для введения пациенту, предварительно иммунизированному OMV, характеризующимися вторым сероподтипом.
Введение OMV также может следовать за иммунизацией конъюгированной вакциной против менингококков. Таким образом, изобретение относится к применению менингококковых OMV, полученных из менингококков первой серогруппы, для производства лекарственного препарата для иммунизации, по меньшей мере, против менингококкового менингита, причем лекарственный препарат предназначен для введения пациенту, предварительно иммунизированному конъюгированным капсульным сахаридом менингококка второго сероподтипа. Аналогично, оно относится к способу введения вакцины против менингококков пациенту, в котором (а) вакцина содержит менингококковые OMV, характеризующиеся первым сероподтипом; (b) пациент ранее получал конъюгированный капсульный сахарид менингококка второй серогруппы.
Предварительная иммунизация может быть проведена более чем за 6 месяцев до введения OMV (например, более чем за 11 месяцев). Таким образом, например, пациент может получить конъюгированные сахариды в нулевой момент времени, а затем спустя 11 месяцев получить OMV.
Предварительную иммунизацию менингококковым сахаридом предпочтительно проводят сахаридом, по меньшей мере, серогруппы С, но можно проводить ее и сахаридами более одной серогруппы, например А+С, A+C+Y, A+C+W135+Y и т.д.
Первой серогруппой предпочтительно является серогруппа В.
OMV могут быть введены одновременно с конъюгатами менингококковых сахаридов, т.е. пациент получает дополнительную дозу конъюгата менингококкового сахарида одновременно с получением OMV.
Пациент может быть или не быть предварительно иммунизирован OMV менингококков первой серогруппы.
Пациент может быть предварительно иммунизирован конъюгатом капсульного сахарида Н. influenzae типа b.
Пациент может быть предварительно иммунизирован дифтерийным анатоксином и столбнячным анатоксином.
Общие определения
Термин "содержащий" охватывает термин "включающий в себя", равно как и "состоящий из", например, композиция, "содержащая" Х, может состоять исключительно из Х или может включать в себя что-либо отличное, например X+Y.
Термин "около" применительно к численному значению х означает, например, х±10%.
Словосочетание "по существу" не исключает значения "полностью" или "абсолютно", например, композиция, "по существу не содержащая" Y, может абсолютно не содержать Y. При необходимости словосочетание "по существу" может быть опущено из определения согласно изобретению.
Способы осуществления изобретения
Дозировка OMV - один штамм
Исследования дозировки продукта MeNZB™ проводили на здоровых взрослых. Взрослые получали три дозы либо по 25 мкг, либо по 50 мкг OMV, вводимые с 6-недельными интервалами с помощью 25 мм иглы 23 размера. У пациентов, получивших 25 мкг дозы, четырехкратное повышение SBA титра против вакцинирующего штамма по результатам измерения через 4-6 недель после третьей вакцинации наблюдали в 100% случаев, а у пациентов, получивших более высокие дозы, такое повышение неожиданно наблюдали лишь в 87% случаев. Доля пациентов, у которых наблюдали ответ, также была выше при меньших дозах после введения второй дозы (87% против 78%). Таким образом, для дальнейшего использования выбирали меньшую дозу, тем самым обеспечивая возможность иммунизации с помощью маточных растворов вакцины вдвое большего количества пациентов.
Дозировка OMV - множественные объединенные штаммы
OMV, полученные из норвежского штамма Н44/76, ранее описывали и вводили пациентам-людям в ходе клинических испытаний фазы I, II и III. Они составляют основу продукта MenBvac™. Аналогично, OMV, полученные из новозеландского штамма HZ98/254, составляют основу продукта MeNZB™. Их безопасность и эффективность были подтверждены.
Как MeNZB™, так и MenBvac™ содержат OMV в концентрации 50 мкг/мл (в расчете на количество белка) в составе дозы объемом 0,5 мл. При испытании сочетания двух типов OMV на людях для сохранения эффективности против менингококков двух различных сероподтипов должно быть проведено наиболее прямое сравнение для поддержания концентрации каждого типа OMV на уровне 50 мкг/мл. Напротив, авторы настоящего изобретения решили поддерживать общую дозу OMV той же, что и в двух моновалентных продуктах (50 мкг/мл), и вместо применения описанного подхода снизить количество каждого типа OMV, т.е. использовать по 25 мкг/мл OMV каждого сероподтипа.
Объединенную вакцину вводили пациентам, предварительно получившим либо MeNZB™, либо MenBvac™. Сочетание вводили через 1 год после введения первоначальной дозы моновалентных OMV.
Следует понимать, что изобретение описано выше исключительно в иллюстративных целях и модификации могут быть осуществлены без выхода за пределы объема и сущности изобретения.
Ссылки
(содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки)
[1] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775): 1093-1096.
[2] de Kleijn et al. (2001) Vaccine 20:352-358.
[3] Патенты США №№5,597,572 & 5,747,653; см. также Европейский патент №0301992.
[4] Европейский патент №0449958 (выданный по заявке WO 90/06696).
[5] Патент США №5,705,161; см. также WO 94/08021.
[6] WO 01/91788.
[7] WO 00/25811.
[8] WO 01/52885.
[9] WO 98/56901.
[10] Sacchi et al. (1998) Rev Inst Med Trop Sao Paulo 40:65-70.
[11] WO 03/105890.
[12] WO 02/09643.
[13] Katial et al. (2002) Infect. Immun. 70:702-707.
[14] Патент США №6,180,111.
[15] WO 01/34642.
[16] Европейский патент №0011243.
[17] Fredriksen et al. (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80.
[18] PCT/IB2004/002475.
[19] Maiden et al. (1998) PNAS USA 95:3140-3145.
[20] WO 99/10497.
[21] Steeghs et al. (2001) The EMBO Journal 20:6937-6945.
[22] WO 02/07763.
[23] Европейский патент №0624376.
[24] van der Ley et al. (1995) Vaccine 13:401-7.
[25] WO 01/09350.
[26] WO 02/09746.
[27] WO 02/062378.
[28] WO 2004/014417.
[29] WO 2004/019977.
[30] WO 2004/048404.
[31] Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799.
[32] Gennaro. (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.
[33] Отчет RIVM №124001 004.
[34] Отчет RIVM №000012 003.
[35] WO 03/009869.
[36] Almeida & Alpar. (1996) J. Drug Targeting 3:455-467.
[37] Agarwal & Mishra. (1999) Indian J Exp Biol 37:6-16.
[38] Vaccine Design… (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.
[39] WO 00/23105.
[40] WO 90/14837.
[41] Патент США №5,057,540.
[42] WO 96/33739.
[43] ЕР-А-0109942.
[44] WO 96/11711.
[45] WO 00/07621.
[46] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.
[47] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.
[48] Niikura et al. (2002) Virology 293:273-280.
[49] Lenz et al. (2001) J Immunol 166:5346-5355.
[50] Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338.
[51] Gerber et al. (2001) Virol 75:4752-4760.
[52] WO 03/024480.
[53] WO 03/024481.
[54] Gluck et al. (2002) Vaccine 20:В10-В16.
[55] ЕР-А-0689454.
[56] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.
[57] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.
[58] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491.
[59] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842.
[60] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.
[61] WO 02/26757.
[62] WO 99/62923.
[63] Krieg. (2003) Nature Medicine 9:831-835.
[64] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.
[65] WO 98/40100.
[66] Патент США №6,207,646.
[67] Патент США №6,239,116.
[68] Патент США №6,429,199.
[69] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3):654-658.
[70] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068.
[71] Krieg. (2002) Trends Immunol 23:64-65.
[72] WO 01/95935.
[73] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953.
[74] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861.
[75] WO 03/035836.
[76] WO 95/17211.
[77] WO 98/42375.
[78] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.
[79] Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541.
[80] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461.
[81] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68:5306-5313.
[82] Ryan et al. (1999) Infect Immun 67:6270-6280.
[83] Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67:209-216.
[84] Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293.
[85] Pine et al. (2002) J Control Release 85:263-270.
[86] Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.
[87] WO 99/40936.
[88] WO 99/44636.
[89] Singh et al. (2001) J Cont Release 70:267-276.
[90] WO 99/27960.
[91] Патент США №6,090,406.
[92] Патент США №5,916,588.
[93] ЕР-А-0626169.
[94] WO 99/52549.
[95] WO 01/21207.
[96] WO 01/21152.
[97] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115.
[98] Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.
[99] Stanley. (2002) Clin Exp Dermatol 27:571 -577.
[100] Jones. (2003) CurrOpin Investig Drugs 4:214-218.
[101] WO 99/11241.
[102] WO 94/00153.
[103] WO 98/57659.
[104] Заявки на выдачу Европейского патента №№0835318, 0735898 и 0761231.
[105] Bakke et al. (2001) Infect. Immun. 69:5010-5015.
[106] WO 01/30390.
[107] http://neisseria.org/nm/typing/mlst/
[108] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.
[109] Pettersson et al. (1994) Microb Pathog 17(6):395-408.
[110] Welsch et al. (2002) Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Genome-derived antigen (GNA) 2132 elicits protective serum antibodies to groups В и С Neisseria meningitidis strains.
[111] Santos et al. (2002) Thirteenth International Pathogenic Neisseria Conference, Norwegian Institute of Public Health, Oslo, Norway; Sept. 1-6, 2002. Serum bactericidal responses in rhesus macaques immunized with novel vaccines containing recombinant proteins derived from the genome of N. meningitidis.
[112] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-698. [113] WO 03/007985.
[114] Watson. (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.
[115] Rubin. (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.
[116] Jedrzejas. (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.
[117] Bell. (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.
[118] Iwarson. (1995) APMIS 103:321-326.
[119] Gerlich et al. (1990) Vaccine в Suppl:S63-68 & 79-80.
[120] Hsu et al. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915.
[121] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355.
[122] Rappuoli et al. (1991) TIBTECH 9:232-238.
[123] Vaccines. (2004) Ред. Plotkin & Orenstein. ISBN 0-7216-9688-0.
[124] WO 02/079243.
[125] WO 02/02606.
[126] Kalman et al. (1999) Nature Genetics 21:385-389.
[127] Read et al. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406.
[128] Shirai etal. (2000) J. Infect. Dis. 181(Suppl 3):S524-S527.
[129] WO 99/27105.
[130] WO 00/27994.
[131] WO 00/37494.
[132] WO 99/28475.
[133] Ross et al. (2001) Vaccine 19:4135-4142.
[134] Sutter et al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.
[135] Zimmerman & Spann. (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.
[136] Dreesen. (1997) Vaccine 15 Suppl:S2-6.
[137] MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998 Jan 16;47(1):12, 19.
[138] McMichael. (2000) Vaccine 19 Suppl 1:S101-107.
[139] Schuchat. (1999) Lancet 353(9146):51-6.
[140] WO 02/34771.
[141] Dale. (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii.
[142] Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663.
[143] Анонимное сообщение (Jan 2002) Research Disclosure, 453077.
[144] Anderson. (1983) Infect Immun 39(1):233-238.
[145] Anderson et al. (1985) J Clin Invest 76(1):52-59.
[146] EP-A-0372501.
[147] EP-A-0378881.
[148] EP-A-0427347.
[149] WO 93/17712
[150] WO 94/03208.
[151] WO 98/58668.
[152] EP-A-0471177.
[153] WO 91/01146
[154] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.
[155] ЕР-А-0594610.
[156] WO 00/56360.
[157] WO 02/091998.
[158] Kuo et al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.
[159] WO 01/72337.
[160] WO 00/61761.
[161] WO 99/24578.
[162] WO 99/36544.
[163] WO 99/57280.
[164] WO 00/22430.
[165] WO 96/29412.
[166] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820.
[167] WO 01/64920.
[168] WO 03/020756.
[169] WO 2004/032958.
[170] WO 2004/014419.