УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНО МЕЧЕННЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ КОМПОНЕНТОВ
DEVICE AND METHOD FOR DETECTING FLOURESCENT MARKED BIOLOGICAL COMPONENTS

Область техники
Настоящее изобретение относится к устройству для отбора образцов, к способу и системе для детектирования и определения численной объемной концентрации флуоресцентно меченных биологических компонентов в жидком образце.
Уровень техники
Когда анализируется биологический образец, такой как образец клеток, желательно иметь возможность для идентификации различных компонентов образца, например различных типов присутствующих клеток. Эти различные компоненты демонстрируют соответствующие молекулярные структуры, такие как маркеры клеточной поверхности, с помощью которых могут различаться компоненты. Посредством использования молекул, конъюгированных с флуорофором, приспособленных для связывания с этими молекулярными структурами, биологические компоненты могут быть флуоресцентно помечены. В данной области известно несколько методик для детектирования и анализа флуоресцентно меченных компонентов, в основном клеток, прежде всего методики проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.
Во время проточной цитометрии суспендированные флуоресцентно меченые клетки проходят одна за другой через проточный канал перед лазерным лучом, и может измеряться флуоресценция на нескольких различных длинах волн, а также рассеяние света вперед и в перпендикулярном направлении. Таким образом может анализироваться мечение нескольких различных флуорофоров, а также размер и неоднородность клеток. Способы проточной цитометрии описываются, например, в патентах США №№ 3826364, 4248412 и 5047321.
Флуоресцентная микроскопия, как правило, осуществляется посредством облучения флуоресцентного образца, который должен исследоваться, обычно размазанного по предметному стеклу микроскопа, с помощью электромагнитного излучения конкретной более короткой длины волны, которая заставляет флуорофоры в образце поглощать указанное излучение, а впоследствии испускать электромагнитное излучение конкретной большей длины волны. Испускаемое излучение детектируют с использованием микроскопа, снабженного хроматическим фильтром или эквивалентным монохроматором, который делает возможным прохождение по существу только испускаемого излучения с большей длиной волны.
В патентах США №№ 4125828 и 2006/0017001 описываются флуоресцентные микроскопы и способы детектирования флуоресцентного образца, который размазывается по предметному стеклу микроскопа.
В патенте США № 5932428 описывается смесь образца и компонентов для анализа с целью количественного определения флуоресцентно окрашенных целевых компонентов образца крови с помощью инструмента для анализа изображений. В одном из аспектов патента США № 5932428 цельная кровь смешивается с высушенным флуоресцентно меченым антителом и цвиттерионным детергентом, после чего смесь с кровью вводится в капилляр для сканирования. Заполненный капилляр сканируют с использованием лазерного луча, который сужается в форме Гауссовой перетяжки, которая пересекает капилляр. Таким образом, лазер освещает участок в виде столбика в капилляре, у которого объем равен площади Гауссовой перетяжки, умноженной на глубину просвета капилляра, и возбуждает любой флуоресцентный материал в этой области. Флуоресценция из этой области детектируется с помощью детектора света. Затем лазер освещает другую область капилляра, и флуоресценция этой области также детектируется и тому подобное. Таким образом, заданный объем образца сканируется на флуоресценцию.
В документе США № 2006/0024756 описывается устройство, способ и алгоритм для количественного определения флуоресцентно и магнитно меченных клеток. В соответствии с описываемым способом все клетки метятся флуоресцентно, но только целевые клетки метятся также магнитно. Образец с мечеными клетками помещают в камеру или кювету между двумя клинообразными магнитами для селективного перемещения магнитно меченных клеток к поверхности наблюдения кюветы. LED (светодиод) освещает клетки, и CCD камера (цифровая камера с зарядовой связью) захватывает изображения флуоресцентного света, испускаемого целевыми клетками. Мечение клеток может иметь место в кювете или камере, используемой для анализа, или же образец переносится в такую кювету или камеру после того как проходит достаточное время для получения возможности для мечения клеток. Объем кюветы известен и используется для определения абсолютной концентрации целевых клеток в образце крови. Однако это требует ожидания до тех пор, пока целевые клетки не переместятся под действием магнитов на поверхность наблюдения до того как их можно будет детектировать и сосчитать.
Европейский патент EP 0422708 описывает устройство для использования в процедурах химических тестов. Устройство содержит полость, определяемую двумя плоскими и параллельными стенками, одна из которых удерживает ковалентно иммобилизованные антитела, и эта или другая стенка удерживает высушенные, но не иммобилизованные ковалентно флуоресцентно меченые антитела. Целью является использование устройства для сэндвич-анализов антигена, который может связываться как с иммобилизованными, так и с мечеными антителами. Образец жидкости, содержащий антиген, который должен анализироваться, засасывается под действием капиллярных сил в устройство, растворяя меченые антитела. Антиген связывается посредством иммобилизованных антител, а также меченые антитела связываются с антигеном, при этом флуоресцентно меченые антитела концентрируются на стенке, удерживающей ковалентно иммобилизованные антитела. Эта стенка изготавливается из стекла или другого пропускающего свет материала и имеет способность проводить свет подобно оптическому волокну или волноводу. Присутствие антигена в жидком образце детектируется посредством измерения интенсивности света на торце стенки, то есть света, проводимого стенкой, который испускается флуоресцирующими антителами, присутствующими на указанной стенке.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание простого анализа для детектирования флуоресцентно меченных биологических компонентов жидкого образца. В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения задачей является создание простого анализа для определения численной объемной концентрации флуоресцентно меченных биологических компонентов жидкого образца. Дополнительной задачей настоящего изобретения является создание быстрого анализа без необходимости в сложных устройствах или излишней подготовке образца.
Эти задачи частично или полностью решаются с помощью устройств для отбора образцов, способа и системы в соответствии с независимыми пунктами формулы изобретения. Предпочтительные варианты осуществления ясны из зависимых пунктов формулы изобретения.
В соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение относится, таким образом, к устройству для отбора образцов, для детектирования биологических компонентов в жидком образце, при этом указанное устройство для отбора образцов содержит измерительную полость для приема жидкого образца, где измерительная полость имеет заданную фиксированную толщину. Устройство для отбора образцов также содержит реагент, который располагается в сухой форме внутри измерительной полости, указанный реагент содержит молекулу, конъюгированную с флуорофором.
В соответствии с другим аспектом настоящее изобретение относится к способу детектирования биологических компонентов, меченных флуорофором, в жидком образце. Способ включает в себя смешивание реагента, содержащего молекулу, конъюгированную с флуорофором, с жидким образцом, так что молекула, конъюгированная с флуорофором, связывается с конкретной молекулярной структурой биологического компонента в жидком образце, введение жидкого образца в измерительную полость устройства для отбора образцов, при этом измерительная полость имеет заданную фиксированную толщину; облучение участка образца в измерительной полости электромагнитным излучением с длиной волны, соответствующей длине волны возбуждения флуорофора; и детектирование меченных флуорофором биологических компонентов по всей толщине измерительной полости, указанное детектирование включает в себя получение цифрового изображения облучаемого участка в измерительной полости.
Устройство для отбора образцов предусматривает возможность непосредственного получения образца цельной крови в измерительной полости и доставку его для анализа. Нет необходимости в подготовке образца. Фактически, образец крови может засасываться в измерительную полость непосредственно из проколотого пальца пациента. Снабжение устройства для отбора образцов реагентом делает возможным реакцию в устройстве для отбора образцов, которая делает образец готовым для анализа. Реакция инициируется, когда образец крови вступает в контакт с реагентом. Таким образом, нет необходимости в подготовке образца вручную, что делает анализ особенно пригодным для непосредственного осуществления в комнате для осмотра, пока пациент ожидает.
Поскольку реагент предусматривается в сухой форме, устройство для отбора образцов может транспортироваться и храниться в течение продолжительного времени без воздействия на потребительские свойства устройства для отбора образцов. Таким образом, устройство для отбора образцов с реагентом может производиться и приготавливаться задолго до осуществления анализа образца крови.
Устройство для отбора образцов по настоящему изобретению может, таким образом, легко и с хорошей воспроизводимостью использоваться даже нетренированным лицом и, необязательно, в обычной стандартизованной окружающей среде лаборатории, поскольку устройство для отбора образцов может представлять собой часть готового к употреблению набора, где вход для образца устройства для отбора образцов должен только быть приведен в контакт с образцом для получения образца в форме, готовой для анализа.
Кроме того, фиксированная толщина измерительной полости обеспечивает возможность определения количества биологических компонентов на единицу объема жидкого образца. Поскольку способ приспособлен для детектирования меченных флуорофором биологических компонентов по всей глубине измерительной полости, можно осуществлять быстрый анализ жидкого образца. Нет необходимости ожидать пока биологические компоненты, представляющие интерес, осядут в измерительной полости или попадут на поверхность наблюдения.
Биологические компоненты жидкого образца могут представлять собой, например, эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих (например, лейкоциты и тромбоциты); бактерии; вирусы и макромолекулы, такие как ДНК.
Жидкий образец может представлять собой, например, телесную жидкость, такую как неразбавленная цельная кровь, моча или спинномозговая жидкость; или культуру клеток, такую как культура клеток млекопитающих или бактериальная культура. Жидкий образец может представлять собой неразбавленную биологическую жидкость, которая не подвергается никакой предварительной обработке. Предварительная обработка биологического образца, такая как разбавление, центрифугирование и лизирование, ведет к понижению точности при соотнесении количественно определенных целевых клеток и анализируемого объема. Чем больше стадий предварительной обработки, тем меньше точность количественного определения. Посредством отсутствия необходимости использования любого типа предварительной обработки перед введением образца в готовое к использованию устройство для отбора образцов способ дополнительно упрощается.
Таким образом, возможно детектирование присутствия или количества, например, конкретного типа клеток в образце крови.
Устройство для отбора образцов может содержать элемент корпуса, имеющий две плоские (планарные) поверхности для определения указанной измерительной полости. Планарные поверхности могут располагаться на заданном расстоянии друг от друга для определения толщины образца с целью оптического измерения. Это означает то, что устройство для отбора образцов обеспечивает определенную толщину для оптического измерения, которое может использоваться для точного определения количества меченных флуорофором биологических компонентов на единицу объема жидкого образца. Объем анализируемого жидкого образца будет определяться толщиной измерительной полости и площадью образца, изображение которой получают. Таким образом, определенный объем мог бы использоваться для соотнесения количества меченных флуорофором биологических компонентов к объему образца, так что определяется количество меченных флуорофором биологических компонентов в единице объема.
Измерительная полость предпочтительно имеет однородную толщину 50-170 микрометров. Толщина, равная, по меньшей мере, 50 микрометров, дает то, что измерительная полость не дает жидкому образцу, такому как образец с клетками, размываться в виде монослоя, давая возможность для анализа большего объема жидкого образца на маленькой площади поперечного сечения. Таким образом, достаточно большой объем жидкого образца для получения надежных значений для количества меченных флуорофором биологических компонентов может анализироваться с использованием относительно малого изображения образца с клетками. Толщина, более предпочтительно, составляет, по меньшей мере, 100 микрометров, что дает возможность для анализа еще меньшей площади поперечного сечения или для анализа большего объема образца. Кроме того, толщина, по меньшей мере, 50 микрометров, а более предпочтительно, 100 микрометров, также упрощает изготовление измерительной полости, имеющей определенную толщину, между двумя планарными поверхностями.
Для большинства образцов, например для образца крови, расположенного в полости, имеющей толщину не более чем 170 микрометров, количество меченных флуорофором биологических компонентов, таких как клетки в образце крови, настолько мало, что будут только малые отклонения из-за компонентов, которые расположены, перекрывая друг друга. Однако эффект таких отклонений будет связан с количеством меченных флуорофором биологически компонентов и может таким образом, по меньшей мере, до некоторой степени, обрабатываться посредством статистической корректировки результатов, по меньшей мере, для больших значений количества меченных флуорофором биологически компонентов. Эта статистическая корректировка может основываться на калибровках измерительного устройства. Отклонения будут еще меньшими для измерительной полости, имеющей толщину не более чем 150 микрометров, при этом может использоваться более простая калибровка. Эта толщина может даже и не требовать какой-либо калибровки для перекрывания биологических компонентов.
Кроме того, толщина измерительной полости является достаточно малой, чтобы дать измерительному устройству возможность получения цифрового изображения, так что вся глубина измерительной полости может анализироваться одновременно. Если в измерительном устройстве должна использоваться система увеличения, будет непросто получить большую глубину резкости. По этой причине толщина измерительной полости предпочтительно не должна превышать 150 микрометров, чтобы вся толщина одновременно анализировалась в цифровом изображении. Глубина резкости может устанавливаться для работы с толщиной измерительной полости 170 микрометров.
Цифровое изображение может быть получено с глубиной резкости, по меньшей мере, соответствующей толщине измерительной полости. Это означает, что получается достаточная фокусировка по всей толщине образца, так что вся толщина измерительной полости может одновременно анализироваться на цифровом изображении образца. Таким образом, нет необходимости ожидать того, что, например, клетки осядут в измерительной полости, при этом время осуществления анализа уменьшается. Выбирая не очень резкую фокусировку на конкретной части образца, получается достаточная фокусировка на всей толщине образца, чтобы сделать возможной идентификацию количества меченных флуорофором биологически компонентов в образце. Это обеспечивает то, что флуоресцентный компонент может иногда размываться и по-прежнему рассматриваться как находящийся в фокусе глубины резкости.
Фиксированная толщина измерительной полости делает возможным анализ определенного объема образца. В частности, участок измерительной полости приспособлен для изображения, чтобы обеспечить анализ определенного объема образца, при этом может быть получено определение численной объемной концентрации биологических компонентов в образце. Площадь, изображение которой получается вместе с толщиной измерительной полости, обеспечивает определенный объем образца. С помощью подсчета количества меченных биологических компонентов внутри этого статичного объема легко может быть получено количество биологических компонентов в единичном объеме образца. Объемная численная концентрация может быть получена посредством анализа цифрового изображения объема. Таким образом, объемная численная концентрация может быть получена без необходимости прохождения образца перед анализатором, что осуществляется в соответствии с принципом проточной цитометрии.
Устройство для отбора образцов может снабжаться реагентом, который может наноситься на поверхность растворенным в летучей жидкости, которая испаряется, оставляя реагент в сухой форме.
Считается преимущественным растворение реагента в летучей жидкости перед введением в измерительную полость. Это обеспечивает то, что жидкость может эффективным образом испаряться из узкого пространства измерительной полости во время производства и подготовки устройства для отбора образцов.
Реагент предпочтительно может растворяться в органическом растворителе, более предпочтительно, растворяться в метаноле. Такие растворители являются летучими и могут соответствующим образом использоваться для сушки реагента на поверхности измерительной полости.
Реагент, включая все его компоненты, по настоящему изобретению предпочтительно является растворимым и/или суспендируемым в жидком образце, который должен анализироваться, и предпочтительно предназначен для пребывания в растворе/суспензии в течение анализа. Поскольку, как сформулировано выше, способ приспособлен для детектирования меченных флуорофором биологических компонентов по всей толщине измерительной полости, следовательно, нет необходимости в перемещении или иммобилизации биологических компонентов, представляющих интерес, на поверхности наблюдения, нет также и необходимости в иммобилизации или предотвращении другим путем растворения/суспендирования реагента или любого компонента реагента. Наоборот, использование растворимого/суспендируемого реагента, предпочтительно легко растворимого/суспендируемого реагента, облегчает перемешивание реагента с жидким образцом и ускоряет любые реакции между реагентом и жидким образцом, содержащим биологический компонент, который должен измеряться.
Реагент по настоящему изобретению содержит молекулу, конъюгированную с флуорофором. Флуорофор или флуорохром определяется здесь как остаток молекулы, который заставляет молекулу быть флуоресцентной. Молекула является флуоресцентной, если она испускает электромагнитное излучение конкретной длины волны в качестве отклика на то, что она подвергается воздействию излучения другой длины волны.
Используемые в большинстве случаев флуорофоры или флуорохромы включают в себя, например, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (PE), белок перидинхлорофилл (PerCP), аллофикоцианин (APC) и цианин-5.5 (Cy5.5).
Молекула, конъюгированная с флуорофором, предпочтительно приспособлена для связывания с конкретной молекулярной структурой биологического компонента. Примеры таких молекул включают в себя, но, не ограничиваясь этим, лиганды, рецепторы, антигены, антитела и фрагменты антител. Примеры фрагментов антител представляют собой, например, фрагмент связывания с антигеном (Fab) и одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). Антитела и фрагменты антител являются предпочтительными, поскольку они относительно легко получаются с родством ко всем видам молекулярных структур, и известно множество схем конъюгирования их с различными видами флуорофоров.
Молекулярная структура может представлять собой любую конкретную молекулярную структуру биологического компонента, например маркер клеточной поверхности, такой как CD4 или CD8, или внутриклеточную структуру, такую как ДНК. Маркер клеточной поверхности определяется здесь как любая молекулярная характеристика плазматической мембраны клетки, которая доступна извне клетки, такая как антиген или эпитоп. Это обеспечивает то, что любые типы клеток могут детектироваться для любой цели, такой как детектирование и количественное определение клеток CD4+ для цели мониторинга инфекции ВИЧ.
Количество молекул, конъюгированных с флуорофором, предпочтительно выбирается таким образом, что имеется достаточное их количество для связывания с биологическими компонентами. Для обеспечения того, что по существу все целевые биологические молекулы адекватно метятся с помощью молекул, конъюгированных с флуорофором, в пределах разумного времени, молекулы, конъюгированные с флуорофором, должны присутствовать в избытке. Однако по-прежнему будут оставаться несвязанные молекулы, конъюгированные с флуорофором, в смешанном образце, и желательно, чтобы эта несвязанная концентрация поддерживалась достаточно низкой для понижения фоновой флуоресценции, когда образец анализируется. Таким образом, молекулы, конъюгированные с флуорофором, не должны присутствовать в слишком большом избытке. Отношение связанных и несвязанных молекул, конъюгированных с флуорофором, зависит от сродства между молекулами, конъюгированными с флуорофором, и биологическим компонентом и времени, предназначенного для смешивания молекул, конъюгированных с флуорофором, с биологическим компонентом.
Устройство для отбора образцов может дополнительно содержать вход для образца, соединяющий измерительную полость с внешним пространством устройства для отбора образцов, указанный вход приспособлен для отбора жидкого образца. Вход для образца может располагаться для приема жидкого образца с помощью капиллярных сил, и измерительная полость может дополнительно извлекать жидкость из входа в полость. В результате, жидкий образец может легко отбираться в измерительную полость просто посредством приведения входа для образца в контакт с жидкостью. Затем капиллярные силы входа для образца и измерительной полости будут извлекать в измерительную полость хорошо определенное количество жидкости. Альтернативно, жидкий образец может засасываться или закачиваться в измерительную полость посредством приложения внешней силы для прокачки к устройству для отбора образцов. В соответствии с другой альтернативой жидкий образец может отбираться в пипетку, а затем вводиться в измерительную полость посредством пипетки.
Устройство для отбора образцов может быть одноразовым, то есть оно предусмотрено для использования только один раз. Устройство для отбора образцов образует часть набора для осуществления счета меченных флуорофором биологических компонентов, поскольку устройство для отбора образцов способно принимать жидкий образец и удерживать все реагенты, необходимые для предоставления образца для счета. Это возможно, в частности, потому что устройство для отбора образцов приспособлено только для однократного использования и может быть сформировано без учета возможностей для очистки устройства для отбора образцов и повторного нанесения реагента. Также устройство для отбора образцов может формироваться в материале пластика и по этой причине производиться с низкими затратами. Таким образом, еще может быть экономически эффективным использование одноразового устройства для отбора образцов.
В соответствии с одним из вариантов осуществления способа детектирования меченных флуорофором биологических компонентов в жидком образце устройство для отбора образцов содержит реагент, который располагается в сухой форме внутри измерительной полости, где реагент содержит молекулу, конъюгированную с флуорофором. Затем смешивание осуществляется посредством введения жидкого образца в измерительную полость для осуществления контакта с реагентом. Это означает, что нет необходимости в подготовке образца. Реакция может инициироваться, когда образец крови вступает в контакт с реагентом. Таким образом, нет необходимости в подготовке образца вручную, что делает анализ особенно пригодным для непосредственного осуществления в комнате для осмотра, в то время когда пациент ожидает.
Однако в соответствии с альтернативным вариантом осуществления смешивание реагента с жидким образцом может осуществляться до того как жидкий образец вводится в измерительную полость. В соответствии с другой альтернативой смешивание может осуществляться, по меньшей мере, в две стадии, где первая стадия осуществляется до того как образец вводится в измерительную полость, а вторая стадия осуществляется в измерительной полости. Это обеспечивает то, что подготовка образца, по меньшей мере, частично осуществляется вне устройства для отбора образцов, и что он попадает в устройство для отбора образцов. Однако преимущество использования устройства для отбора образцов, имеющего измерительную полость с фиксированной толщиной, по-прежнему сохраняется. Таким образом, способ предусматривает возможность определения количества биологических компонентов на единицу объема жидкого образца.
Кроме того, нет необходимости в ожидании, пока биологические компоненты, представляющие интерес, осядут внутри измерительной полость или попадут на поверхность наблюдения.
Для облучения образца, который должен изучаться, является предпочтительным использование источника излучения, приспособленного для того, чтобы не дать излучению с длинами волн, которые соответствуют длинам волн, которые испускаются флуорофорами образца или близки к ним, достигнуть образца, поскольку это помешало бы детектированию испускаемого излучения. Для получения такого излучения, ограниченного по длинам волн, предпочтительно используется источник излучения в сочетании с хроматическим фильтром. Альтернативно, может использоваться лазер, который испускает конкретную длину волны, которая поглощается флуорофором. Призма или растр (решетка) также могут использоваться для направления только определенных длин волн излучения от источника излучения к образцу. Источник излучения предпочтительно представляет собой светодиод (LED), но может использоваться любой источник излучения, такой как лазер или обычная лампочка накаливания. LED является предпочтительным, поскольку он является относительно дешевым и надежным.
Детектирование меченных флуорофором биологических компонентов предпочтительно включает в себя получение цифрового изображения облучаемого образца в измерительной полости, где биологические компоненты, демонстрирующие флуорофор, выделяются как флуоресцирующие точки, испускающие электромагнитное излучение с длиной волны, соответствующей длине волны испускания флуорофора. Цифровое изображение удобно получать посредством использования цифровой видеокамеры CCD, встроенной во флуоресцентный микроскоп, удобно, чтобы микроскоп предпочтительно адаптировался посредством использования хроматического фильтра, чтобы давать только электромагнитному излучению с длиной волны испускания флуорофора возможность для достижения камеры.
Детектирование меченных флуорофором биологических компонентов, предпочтительно, дополнительно включает в себя численный анализ цифрового изображения для идентификации биологических компонентов, демонстрирующих флуорофор, и определение количества биологических компонентов, демонстрирующих флуорофор, в образце. Это обеспечивает то, что детектирование и/или счет биологических компонентов могут легко быть получены с помощью анализа изображения посредством компьютера. Таким образом, могут быть получены надежные и воспроизводимые результаты.
Жидкий образец предпочтительно вводится в измерительную полость устройства для отбора образцов через капиллярный вход для образца посредством капиллярных сил.
Цифровое изображение может быть получено с использованием увеличения 3-50×, более предпочтительно, 3-10×. В этих диапазонах увеличения большинство биологических компонентов, таких как клетки млекопитающих, являющихся целевыми для настоящего способа, достаточно увеличиваются для детектирования, в то время как глубина резкости должна приспосабливаться для перекрытия образца по толщине. Низкое увеличение обеспечивает то, что может быть получена большая глубина резкости. Однако если используется низкое увеличение, детектирование биологических компонентов может быть сложным. Более низкое увеличение может использоваться посредством увеличения количества пикселей в получаемом изображении, то есть посредством увеличения разрешения цифрового изображения. Таким образом, является возможным использование увеличения 3-4×, по-прежнему сохраняя возможность детектирования биологических компонентов, таких как клетки млекопитающих.
Анализ может включать в себя идентификацию участков сильного испускания электромагнитного излучения конкретной длины волны, соответствующей длине волны испускания флуорофора, которым метится биологический компонент, на цифровом изображении. Кроме того, анализ может включать в себя идентификацию световых точек на цифровом изображении, возникающих в результате испускания конкретного электромагнитного излучения. Поскольку молекулы, конъюгированные с флуорофором, могут аккумулироваться вокруг целевых биологических компонентов, испускание конкретной флуоресценции может иметь пики в отдельных точках. Эти точки будут образовывать светлые точки на цифровом изображении, которые могут детектироваться как соответствующие целевому биологическому компоненту.
Анализ может, кроме того, включать в себя электронное увеличение полученного цифрового изображения. В то время как образец увеличивается для получения увеличенного цифрового изображения образца, полученное цифровое изображение само по себе может с помощью электроники увеличиваться для упрощения нахождения различий между объектами, которые изображены очень близко друг к другу на полученном цифровом изображении.
Если две или более различные молекулы, конъюгированные с флуорофором, конъюгированные, соответственно с различными флуорофорами, испускающими электромагнитное излучение, соответственно, с различными длинами волн, и приспособленные для связывания, соответственно, с различными молекулярными структурами, содержатся в реагенте, может быть получено изображение каждой испускаемой длины волны излучения для образца. Затем эти изображения могут накладываться друг на друга, при этом анализ может показывать некоторые биологические компоненты, представляющие одну молекулярную структуру, некоторые другие, представляющие другую, и некоторые, представляющие их обе. Если используют более двух различных молекул, конъюгированных с флуорофором, рассуждения являются сходными.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к системе для определения численной объемной концентрации меченных флуорофором биологических компонентов в жидком образце, указанная система содержит устройство для отбора образцов, как определено выше; а также к измерительному устройству, содержащему держатель устройства для отбора образцов, приспособленный для приема устройства для отбора образцов, которое содержит жидкий образец в измерительной полости, источник, приспособленный для облучения жидкого образца электромагнитным излучением заданной длины волны, систему получения изображения, содержащую средства для получения цифрового изображения облучаемого образца в измерительной полости, где конъюгированные с флуорофором биологические компоненты различаются на цифровом изображении посредством получения селективных изображений с помощью различных длин волн электромагнитного излучения, и анализатор изображений, приспособленный для анализа полученного цифрового изображения для идентификации конъюгированных с флуорофором биологических компонентов и определения количества конъюгированных с флуорофором биологических компонентов в жидком образце.
Измерительное устройство может использовать свойства устройства для отбора образцов, как описано выше, для осуществления анализа жидкого образца, который отбирается непосредственно в измерительную полость. Измерительное устройство может получать изображение определенного объема образца для осуществления определения численной объемной концентрации биологических компонентов в образце.
Краткое описание чертежей
Настоящее изобретение теперь будет описываться более подробно посредством примеров со ссылками на прилагаемые чертежи.
Фиг.1 представляет собой схематический вид устройства для отбора образцов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
Фиг.2 представляет собой схематический вид устройства для отбора образцов в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения.
Фиг.3 представляет собой схематический вид измерительной системы в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
Фиг.4 представляет собой блок-схему способа в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления
Обращаясь теперь к Фиг.1, будет описываться устройство 10 для отбора образцов в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Устройство 10 для отбора образцов является одноразовым и должно выбрасываться после использования для анализа. Это означает, что устройство 10 для отбора образцов не требует сложного обращения. Устройство для отбора образцов формуется в материале пластика и производится посредством литья под давлением. Это делает производства устройства 10 для отбора образцов простым и дешевым, при этом стоимость устройства для отбора образцов понижается.
Устройство 10 для отбора образцов содержит элемент 12 корпуса, который имеет основание 14, которого может касаться оператор, не вызывая никакого вмешательства в результаты анализа. Основание 14 также имеет выступы 16, которые соединяются с держателем в устройстве для анализа. Выступы 16 располагаются таким образом, что устройство для отбора образцов 10 будет правильно позиционироваться в устройстве для анализа.
Устройство 10 для отбора образцов дополнительно содержит вход 18 для образца. Вход 18 для образца определяется между противоположными стенками в устройстве для отбора образцов, стенки располагаются настолько близко друг к другу, что на входе 18 для образца создаются капиллярные силы. Вход 18 для образца сообщается с внешним пространством устройства для отбора образцов, чтобы сделать возможным поступление крови в устройство 10 для отбора образцов. Устройство 10 для отбора образцов дополнительно содержит камеру для счета меченных флуорофором биологически компонентов, таких как клетки, в форме измерительной полости 20, расположенной между противоположными стенками внутри устройства 10 для отбора образцов. Измерительная полость 20 выполнена с возможностью сообщения с входом 18 для образца. Стенки, определяющие измерительную полость 20, располагаются ближе друг к другу, чем стенки входа 18 для образца, так что капиллярные силы могут извлекать кровь из входа 18 для образца в измерительную полость 20.
Стенки измерительной полости 20 располагаются на расстоянии в 140 микрометров друг от друга. Расстояние является одинаковыми по всей измерительной полости 20. Толщина измерительной полости 20 определяет объем крови, который исследуется. Поскольку анализ результата должен сравниваться с объемом образца крови, который исследуется, толщина измерительной полости 20 должна выдерживаться очень точно, то есть только очень небольшой разброс по толщине является допустимым внутри измерительной полости 20 и между измерительными полостями 20 различных устройств 10 для отбора образца. Толщина делает возможным анализ относительно большого объема образца на малом участке полости. Толщина теоретически позволяет клеткам располагаться одной поверх другой в измерительной полости 20. Однако количество клеток в образце, таком как образец крови, является настолько низким, что вероятность осуществления этого является очень низкой.
9
9
9
9
Устройство 10 для отбора образцов приспособлено для измерения количеств клеток, меченных флуорофором, свыше 0,5·10клеток/литр крови. При меньших количествах клеток объем образца будет слишком малым для подсчета статистически значимых количеств клеток. Кроме того, когда количество меченных флуорофором клеток превосходит 12·10клеток/литр крови, влияние клеток, расположенных с перекрыванием друг друга, станет значимым при измерении количества клеток. При таком количестве клеток, меченных флуорофором, меченые клетки будут покрывать приблизительно 8% поперечного сечения образца, который облучается, когда толщина измерительной полости составляет 140 микрометров. Таким образом, для получения правильного количества клеток, меченных флуорофором, этот эффект должен приниматься во внимание. По этой причине может использоваться статистическая корректировка значений количества меченных клеток свыше 12·10 меченных клеток/литр крови. Эта статистическая корректировка будет увеличиваться при увеличении количества клеток, меченных флуорофором, поскольку влияние перекрывающихся меченных клеток будет большим для большего количества клеток. Статистическая корректировка может определяться посредством калибровки измерительного устройства. В качестве альтернативы, статистическая корректировка может определяться на общем уровне для настройки измерительных устройств, которые должны использоваться в сочетании с устройством 10 для отбора образцов. Предполагается, что устройство 10 для отбора образцов могло бы использоваться для анализа количеств клеток, меченных флуорофором, достигающих 50·10 меченнных клеток/литр крови.
В соответствии с альтернативным вариантом осуществления детектирование меченных флуорофором биологических компонентов используется для определения того, присутствует ли конкретный биологический компонент в образце. В этом варианте осуществления нет необходимости в осуществлении подсчета объемной численной концентрации и, таким образом, присутствие биологического компонента может детектироваться даже для очень малых количеств компонента в образце.
Поверхность стенки измерительной полости 20, по меньшей мере, частично покрывается реагентом 22. Реагент 22 может высушиваться вымораживанием, высушиваться термически или в вакууме и наноситься на поверхность измерительной полости 20. Когда образец отбирается в измерительную полость 20, образец вступает в контакт с высушенным реагентом 22 и инициирует реакцию связывания между реагентом 22 и компонентами образца.
Реагент 22 наносится посредством размещения реагента 22 в измерительной полости 20 с использованием пипетки или распределительного устройства. Реагент 22 растворяется в метаноле, когда поступает в измерительную полость 20. Растворитель с реагентом 22 заполняет измерительную полость 20. Затем осуществляют сушку, так что растворитель испаряется, и реагент 22 прикрепляется к поверхности измерительной полости 20.
Поскольку реагент должен сушиться на поверхности узкого пространства, жидкость будет иметь очень малую поверхность в контакте с окружающей атмосферой, по этой причине испарение жидкости становится затрудненным. Таким образом, является предпочтительным использование летучей жидкости, такой как метанол, что делает возможным эффективное испарение жидкости из узкого пространства измерительной полости.
В соответствии с альтернативным способом изготовления устройство 10 для отбора образцов формируется посредством соединения двух деталей вместе, при этом одна деталь образует нижнюю стенку измерительной полости 20, а другая деталь образует верхнюю стенку измерительной полости 20. Это делает возможным сушку реагента 22 на открытой поверхности до того как две детали соединяются друг с другом. Таким образом, реагент 22 может растворяться в воде, поскольку растворитель не должен быть летучим.
Реагент 22 может содержать один или более антител, конъюгированных с флуорофором. Антитела приспособлены для связывания с конкретной молекулярной структурой, характерной для целевого биологического компонента, такого как клетка. Структура может представлять собой маркер клеточной поверхности, такой как CD4 или CD8. Когда образец крови вступает в контакт с реагентом 22, антитела будут действовать, связываясь с конкретной молекулярной структурой целевых клеток крови, таким образом, аккумулируясь на клетках. Реагент 22 предпочтительно должен содержать достаточные количества антител, чтобы отчетливо метить части целевых клеток, по существу покрывающие все клетки. Это означает, что по существу все меченые клетки являются флуоресцентными и таким образом могут легко детектироваться на цифровом изображении образца. Кроме того, часто будет присутствовать избыток антител, конъюгированных с флуорофором, которые будут смешиваться в плазме крови. Избыток антител даст гомогенный низкий фоновый уровень флуоресценции в плазме крови. Аккумулированные антитела на целевых клетках будут различимы над фоновым уровнем флуоресценции.
Реагент 22 может также содержать другие составляющие, которые могут быть активными, то есть принимающими участие в химическом связывании, например, с клетками образца крови, или неактивными, то есть не принимающими участие в связывании. Активные составляющие могут, например, приспосабливаться для облегчения связывания антител с соответствующими им целевыми молекулярными структурами. Неактивные составляющие могут, например, приспосабливаться для улучшения присоединения реагента 22 к поверхности стенки измерительной полости 20.
В пределах нескольких минут образец крови прореагирует с реагентом 22, так что антитела, меченые флуорофором, свяжутся с целевыми клетками.
Обращаясь к Фиг.2, будет описан другой вариант осуществления устройства для отбора образцов. Устройство 110 для отбора образцов содержит камеру 120, формирующую измерительную полость. Устройство 110 для отбора образцов имеет вход 118 в камеру 120 для переноса крови в камеру 120. Камера 120 соединяется с насосом (не показан) через трубу 121 для отсоса. Насос может прикладывать отсасывающую силу в камере 120 через трубку 121 для отсоса, так что образец отсасывается в камеру 120 через вход 118. Устройство 110 для отбора образцов может отсоединяться от насоса до того как осуществляется измерение. Подобно измерительной полости 20 устройства 10 для отбора образцов в соответствии с первым вариантом осуществления камера 120 имеет определенную толщину, определяющую толщину образца, который должен исследоваться. Кроме того, реагент 122 наносится на стенки камеры 120 для взаимодействия с образцом.
Обращаясь теперь к Фиг.3, будет описана система для детектирования и определения численной объемной концентрации меченных флуорофором биологических компонентов. Система 30 содержит держатель 32 для образца, для приема устройства 10 для отбора образцов с образцом крови. Держатель 32 образца приспособлен для приема устройства 10 для отбора образцов, так что измерительная полость 20 устройства для отбора образцов правильным образом позиционируется в системе 30. Система 30 содержит источник света 34 для освещения образца в устройстве 10 для отбора образцов. Источник света 34 может представлять собой LED, который в сочетании с хроматическим фильтром излучает свет 48, соответствующий длине волны возбуждения флуорофора, используемого вместе с образцом. Кроме того, длина волны должна выбираться так, чтобы поглощение флуоресцентных соединений образца, иных, чем компоненты, меченые флуорофором, было относительно низким. Кроме того, стенки устройства 10 для отбора образцов должны быть по существу прозрачными для этой длины волны. После прохождения через хроматический фильтр свет направляется на образец посредством использования дихроичного зеркала 35. Флуорофоры, которые аккумулируются вокруг (или внутри) меченных биологических компонентов образца, таких как клетки, будут поглощать этот свет 48 конкретной длины волны и испускать свет 50 конкретной большей длины волны. Этот испускаемый свет 50 большей длины волны получает возможность для прохождения через дихроичное зеркало и попадания в систему создания изображения 36, так что компоненты будут появляться в цифровом изображении образца как светлые участки или точки. Если получается цветное изображение, меченые клетки будут появляться как точки конкретного цвета. Если получается черно-белое изображение, меченые клетки будут появляться как светлые точки на более темном фоне.
Альтернативно, источник света 34 может представлять собой свет от лампы накаливания в сочетании с хроматическим фильтром или лазер.
Альтернативно, свет 48 может направляться непосредственно на образец, под некоторым углом, без использования дихроичного зеркала.
Кроме того, система 30 содержит систему получения изображения 36, которая располагается над держателем 32 образца. Таким образом, система получения изображения 36 располагается для приема излучения 50, которое испускается образцом крови. Система 36 получения изображения может содержать систему 38 оптического увеличения и средства 40 получения изображения. Для предотвращения попадания света, не испускаемого флуорофорами образца, в средства 40 для получения изображения может использоваться хроматический фильтр. Система 38 увеличения может быть приспособлена для обеспечения увеличения 3-50×, более предпочтительно, 3-100×, а наиболее предпочтительно, 3-4×. В этих диапазонах увеличения является возможным различение меченных клеток. Изображение может быть получено с улучшенным разрешением, чтобы сделать возможным использование меньшего увеличения. Кроме того, глубина резкости 38 системы увеличения может еще быть приспособлена так, чтобы она, по меньшей мере, соответствовала толщине измерительной полости 20.
Система 38 увеличения может содержать линзу или систему 42 линз объектива, которая располагается вблизи держателя 32 образца, и линзу или систему 44 линз окуляра, которая располагается на некотором расстоянии от линзы 42 объектива. Линза 42 объектива обеспечивает первое увеличение образца, которое дополнительно увеличивается с помощью линзы 44 окуляра. Линза 42 объектива может располагаться между дихроичным зеркалом 35 и держателем 32 образца. Система 38 увеличения может содержать дополнительные линзы для осуществления соответствующего увеличения и создания изображения образца. Система 38 увеличения располагается так, что образец в измерительной полости 20 при ее размещении в держателе 32 образца сфокусируется на плоскости изображения средств 40 получения изображения.
Средства 40 получения изображения предусмотрены для получения цифрового изображения образца. Средства 40 получения изображения могут представлять собой любой вид цифровой камеры, такой как CCD-камера. Размер пикселя цифровой камеры налагает ограничения на систему 36 получения изображения, так чтобы кружок рассеяния в плоскости изображения не мог превосходить размер пикселя в пределах глубины резкости. Однако меченые клетки могут по-прежнему детектироваться, даже если они несколько размыты и по этой причине кружок рассеяния может быть таким, что он превосходит размер пикселя, в то же будучи рассматриваемым в пределах глубины резкости. Цифровая камера 40 будет получать цифровое изображение образца в измерительной полости 20, где вся толщина образца является по существу сфокусированной в цифровом изображении для счета меченных клеток крови. Система 36 получения изображения будет определять участок измерительной полости 20, который будет изображаться на цифровом изображении. Площадь, которая изображается, вместе с толщиной измерительной полости 20 определяет объем образца, который изображается. Система 36 получения изображения настроена для получения изображения образцов крови в устройствах 10 для отбора образцов. Нет необходимости в изменении настроек системы 36 получения изображения. Предпочтительно, система 36 получения изображения располагается внутри корпуса, так что настройки не изменяются случайным образом.
Альтернативно, система 30 может содержать более одной системы 36 получения изображения, при этом испускаемая флуоресценция различных длин волн может направляться в соответствующие различные системы получения изображения. Направление различных длин волн света в различные системы 36 получения изображения может достигаться посредством использования, например, одного или более дихроичныих зеркал или решеток.
Также может использоваться множество источников 34 света, при этом образец может облучаться светом нескольких различных конкретных длин волн одновременно или последовательно. Это может достигаться посредством использования множество LED в сочетании, по меньшей мере, с одним хроматическим фильтром для каждого. Удобно, чтобы все хроматические фильтры, используемые в системе 30, могли располагаться на каруселях, на которых все наиболее часто требующиеся хроматические фильтры могут располагаться, так что конкретный фильтр, необходимый для конкретного детектирования, может легко переключаться в активное положение. Фильтр находится в активном положении, когда он пересекает свет от LED до того как он достигает образца, если фильтр используется для возбуждения света или когда он пересекает свет флуоресценции от образца до того как он достигает средств 40 получения изображения, если фильтр используется для испускаемого света.
Система 30 дополнительно содержит анализатор 46 изображений. Анализатор 46 изображений соединяется с цифровой камерой 40 для приема цифровых изображений, полученных с помощью цифровой камеры 40. Анализатор 46 изображений предусмотрен для идентификации структур на цифровом изображении, которые соответствуют меченым клеткам, для счета количества меченных клеток, которые присутствуют на цифровом изображении. Таким образом, анализатор 46 изображений может устанавливается для идентификации светлых точек на более темном фоне. Анализатор 46 изображений может быть приспособлен для электронного увеличения цифрового изображения сначала, перед анализом цифрового изображения. Это обеспечивает то, что анализатор 46 изображений может иметь возможность для более легкого различения меченных клеток, которые изображаются близко друг к другу, даже если электронное увеличение цифрового изображения сделает цифровое изображение несколько размытым.
Анализатор 46 изображений может вычислять количество меченных клеток крови в единице объема крови посредством деления количества меченных клеток крови, которые идентифицируются на цифровом изображении, на объем образца крови, который хорошо определяется, как описано выше. Объемная численная концентрация меченных клеток крови может быть представлена на дисплее устройства 30.
Анализатор 46 изображений может реализоваться как узел процессора, который содержит коды для осуществления анализа изображения.
Обращаясь к Фиг.4, будет описан способ флуоресцентно меченных биологических компонентов. Способ будет описываться конкретно со ссылками на способ детектирования и определения численной объемной концентрации меченных T лимфоцитов. Однако специалист в данной области поймет, что способ может модифицироваться для детектирования и определения численной объемной концентрации других биологических компонентов. Соответствующий реагент для мечения биологических компонентов, представляющих интерес, должен использоваться, и облучение, и детектирование должны адаптироваться для длин волн возбуждения и испускания выбранных флуорофоров, как будет ясно специалистам в данной области.
Способ детектирования и определения численной объемной концентрации T лимфоцитов включает в себя отбор образца крови в устройстве для отбора образцов, стадия 102, имеющем фиксированную толщину 140 мкм. Неразбавленный образец цельной крови человека отбирается в устройство для отбора образцов. Образец может отбираться из капиллярной крови или венозной крови. Образец капиллярной крови может поступать в измерительную полость непосредственно из проколотого пальца пациента. Образец крови вступает в контакт с реагентом 22 в устройстве для отбора образцов, инициируя реакцию связывания. Реагент содержит одно меченное Fitc антитело анти CD4 и одно меченное APC антитело анти CD8. В пределах нескольких минут образец крови прореагирует с реагентом 22, так что меченые флуорофором антитела свяжутся с маркерами CD4 хелперных T лимфоцитов и с маркерами CD8 T лимфоцитов киллеров образца крови, соответственно, и теперь образец готов для анализа. Устройство для отбора образцов помещается в устройство для анализа, стадия 104. Анализ может инициироваться посредством нажатия кнопки устройства для анализа. Альтернативно, анализ автоматически инициируется посредством устройства, детектирующего присутствие устройства для отбора образцов.
Образец облучается с использованием LED в сочетании с хроматическим фильтром, приспособленным, чтобы делать возможным прохождение только света около 450 нм, стадия 106. Этот разрешенный свет направляется непосредственно на образец, под небольшим углом по отношению к верхней поверхности устройства для отбора образцов. Свет LED поглощается флуорофорами Fitc, метящими лимфоциты CD4+, при этом Fitc испускает свет около 500 нм. CCD камера используется для получения изображения флуоресцентного образца без какого-либо оптического увеличения, стадия 108. Камера находится в соединении с хроматическим фильтром, приспособленным для прохождения только света длины волны около 500 нм в камеру. Это обеспечивает то, что цифровое изображение будет содержать светлые точки/участки в положениях меченных хелперных T лимфоцитов.
Затем образец опять, таким же путем, как описанный выше, облучается с помощью LED, теперь в сочетании с хроматическим фильтром, делающим возможным прохождение только света около 590 нм через образец, таким образом, возбуждая флуорофоры APC, метящие T лимфоциты киллеры CD8+. По аналогии с детектированием клеток, меченных Fitc, используется хроматический фильтр, дающий возможность только свету около 640 нм для прохождения в CCD камеру, при этом получают второе цифровое изображение, в этот раз содержащее светлые точки/участки в положениях меченных T лимфоцитов киллеров, присутствующих в образце.
Полученные цифровые изображения переносятся в анализатор изображений, осуществляющий анализ с электронным увеличением изображения, стадия 110, для счета количества светлых точек на соответствующем цифровом изображении. Анализатор изображений является, таким образом, способным к определению концентраций хелперных T лимфоцитов и T лимфоцитов киллеров, соответственно, в образце крови. Анализатор изображений также способен совмещать два изображения для определения того, имеются ли какие-либо клетки, которые, против ожидания, демонстрируют как CD4, так и CD8.
Альтернативно, жидкий образец, цельная кровь, в данном случае, может реагировать или частично реагировать с реагентом 22 (антителами) вне устройства 10 для отбора образцов, после чего прореагировавший или частично прореагировавший образец может отбираться в устройство для отбора образцов.
В одном из вариантов осуществления реагент 22 содержит меченное флуорофором вторичное антитело, имеющее сродство к первичному антителу, это вторичное антитело присутствует в измерительной полости 20 устройства 10 для отбора образцов в сухой форме. Жидкий образец, таким образом, сначала, вне устройства для отбора образцов, обрабатывается первичным антителом, которое связывается с конкретной заданной молекулярной структурой целевых биологических компонентов образца. Образец, включая первичные антитела, затем отбирается в устройство для отбора образцов, удерживающее вторичное антитело. Таким образом, вторичные антитела смешиваются с образцом и связываются с первичными антителами, которые, в свою очередь, связываются с целевыми биологическими компонентами, при этом целевые биологические компоненты метятся флуорофором. Этот вариант осуществления обеспечивает то, что антитело, конъюгированное с сухим флуорофором, может использоваться для мечения множества различных видов биологических компонентов, постольку, поскольку эти компоненты предварительно обрабатываются первичным антителом, имеющим сродство к ним. Таким образом, предварительная обработка образца делает возможным использование устройства 10 для отбора образцов для многих различных применений, и нет необходимости в адаптации устройства для отбора образцов для использования при детектировании только одного биологического компонента.
Необходимо подчеркнуть, что предпочтительные варианты осуществления, описанные здесь, не являются ограничивающими, и множество альтернативных вариантов осуществления возможно в рамках объема защиты, определяемого прилагаемой формулой изобретения.