КОМБИНАЦИИ ЭЛЕМЕНТОВ ЭКСПРЕССИОННОГО ВЕКТОРА, НОВЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК-ПРОДУЦЕНТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

1. Способ селекции рекомбинантных кратковременно трансфецированных клеток млекопитающих, включающий следующие этапы:
a) трансфекция клеток млекопитающего экспрессионным вектором, содержащим:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора hGT,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора hGT, и
где первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях,
и таким образом, получение множества рекомбинантных клеток млекопитающего,
b) селекция из множества рекомбинантных клеток млекопитающего (единичных) кратковременно трансфецированных рекомбинантных клеток млекопитающего.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
3. Способ по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, НЕК, ВНК, NS0 и клеток SP2/0.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки НЕК для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит либо:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- четвертую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора;
либо:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
при этом легкая цепь антитела является общей легкой цепью для обеих тяжелых цепей антитела.
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что экспрессионный вектор кодирует биспецифичное антитело.
10. Способ по п. 8 или 9, отличающийся тем, что биспецифичное антитело обладает первой специфичностью связывания или сайтом связывания, который специфично связывается с первым антигеном или первым эпитопом на антигене, и биспецифичное антитело обладает второй специфичностью связывания или вторым сайтом связывания, который специфично связывается со вторым антигеном или со вторым эпитопом на антигене.
11. Способ по любому из пп. 8-10, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит:
- экспрессионную кассету с легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету с первой тяжелой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй тяжелой цепью антитела, и
- экспрессионную кассету с селекционным маркером.
12. Способ по любому из пп. 8-11, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит:
- экспрессионную кассету с первой легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету с первой тяжелой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй тяжелой цепью антитела, и
- экспрессионную кассету с селекционным маркером.
13. Способ по любому из пп. 8-12, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую hole-мутацию.
14. Способ по любому из пп. 8-13, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую knob-мутацию.
15. Способ по любому из пп. 8-14, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует вариант легкой цепи антитела, содержащей вариабельный домен легкой цепи антитела и СН1 домен тяжелой цепи антитела в качестве константного домена, и/или одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует легкую цепь антитела, содержащую вариабельный домен легкой цепи антитела и CL домен легкой цепи антитела в качестве константного домена.
16. Способ по любому из пп. 8-15, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует вариант тяжелой цепи антитела, содержащий в качестве первого константного домена антитела константный домен легкой цепи антитела (CL), и/или одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую в качестве первого константного домена СН1 домен тяжелой цепи антитела.
17. Способ получения антитела, включающий следующие этапы:
а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора, и
b) получение антитела из клетки или культуральной среды,
где первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для кратковременной продукции антитела.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
19. Способ по п. 17 или 18, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
20. Способ по любому из пп. 17-19, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
21. Способ по любому из пп. 17-20, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
22. Способ по любому из пп. 17-21, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, НЕК, ВНК, NS0 и клеток SP2/0.
23. Способ по любому из пп. 17-22, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки НЕК для кратковременной продукции антитела.
24. Экспрессионный вектор, содержащий:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
где первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
25. Экспрессионный вектор по п. 24, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
26. Экспрессионный вектор по п. 24 или 25, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
27. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-26, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
28. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-27, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
29. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-28, отличающийся тем, что указанный экспрессионный вектор содержит либо:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- четвертую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора;
либо:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
при этом легкая цепь антитела является общей легкой цепью для обеих тяжелых цепей антитела.
30. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-29, отличающийся тем, что указанный экспрессионный вектор кодирует биспецифичное антитело.
31. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-30, отличающийся тем, что биспецифичное антитело обладает первой специфичностью связывания или сайтом связывания, который специфично связывается с первым антигеном или первым эпитопом на антигене, и биспецифичное антитело обладает второй специфичностью связывания или вторым сайтом связывания, который специфично связывается со вторым антигеном или со вторым эпитопом на антигене.
32. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-31, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит:
- экспрессионную кассету с легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету с первой тяжелой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй тяжелой цепью антитела, и
- экспрессионную кассету с селекционным маркером.
33. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-32, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит:
- экспрессионную кассету с первой легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету с первой тяжелой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй тяжелой цепью антитела, и
- экспрессионную кассету с селекционным маркером.
34. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-33, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую hole-мутацию.
35. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-34, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую knob-мутацию.
36. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-35, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует вариант легкой цепи антитела, содержащей вариабельный домен легкой цепи антитела и СН1 домен тяжелой цепи антитела в качестве константного домена, и/или одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует легкую цепь антитела, содержащую вариабельный домен легкой цепи антитела и CL домен легкой цепи антитела в качестве константного домена.
37. Экспрессионный вектор по любому из пп. 24-36, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует вариант тяжелой цепи антитела, содержащий в качестве первого константного домена антитела константный домен легкой цепи антитела (CL), и/или одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую в качестве первого константного домена СН1 домен тяжелой цепи антитела.
38. Способ селекции рекомбинантных кратковременно трансфецированных клеток млекопитающих, содержащий следующие этапы:
a) трансфекция клеток млекопитающих при помощи экспрессионного вектора, содержащего:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и
где первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток,
и таким образом, получение множества рекомбинантных клеток млекопитающих,
b) селекция из множества рекомбинантных клеток млекопитающих (единичных) рекомбинантных кратковременно трансфецированных клеток млекопитающих.
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
40. Способ по п. 38 или 39, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
41. Способ по любому из пп. 38-40, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
42. Способ по любому из пп. 38-41, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
43. Способ по любому из пп. 38-42, отличающийся тем, что промотор фактора элонгации человека 1 альфа содержит интрон А.
44. Способ по любому из пп. 38-43, отличающийся тем, что экспрессионный вектор не содержит какой-либо последовательности терминатора транскрипции.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что последовательность терминатора представляет собой последовательность hGT.
46. Способ по любому из пп. 38-45, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, НЕК, ВНК, NS0 и клеток SP2/0.
47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки НЕК для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
48. Способ получения антитела, содержащий следующие этапы:
a) культивирование кратковременно трансфецированных клеток млекопитающих, содержащих:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность,
где первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток, и
b) получение антитела из кратковременно трансфецированных клеток или культуральной среды.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
50. Способ по п. 48 или 49, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
51. Способ по любому из пп. 48-50, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
52. Способ по любому из пп. 48-51, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
53. Способ по любому из пп. 48-52, отличающийся тем, что промотор фактора элонгации 1 альфа человека содержит интрон А.
54. Способ по любому из пп. 48-53, отличающийся тем, что экспрессионный вектор не содержит каких-либо последовательностей терминатора транскрипции.
55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что последовательность терминатора представляет собой последовательность hGT.
56. Способ по любому из пп. 48-55, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, НЕК, ВНК, NS0 и клеток SP2/0.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки НЕК для кратковременной продукции антитела.
58. Экспрессионный вектор, содержащий:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность,
где первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированной клетки.
59. Экспрессионный вектор по п. 58, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
60. Экспрессионный вектор по п. 58 или 59, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
61. Экспрессионный вектор по любому из пп. 58-60, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
62. Экспрессионный вектор по любому из пп. 58-61, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
63. Экспрессионный вектор по пп. 58-62, отличающийся тем, что промотор фактора элонгации 1 альфа человека содержит интрон А.
64. Экспрессионный вектор по любому из пп. 58-63, отличающийся тем, что экспрессионный вектор не содержит каких-либо последовательностей терминатора транскрипции.
65. Экспрессионный вектор по п. 64, отличающийся тем, что последовательность терминатора представляет собой последовательность hGT.
66. Применение экспрессионного вектора, содержащего:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, первую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность первого терминатора транскрипции,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, вторую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность второго терминатора транскрипции, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' третий промотор, нуклеиновую кислоту, придающую устойчивость к селекционному агенту, третью поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность третьего терминатора транскрипции,
где экспрессионные кассеты расположены в разных направлениях, таким образом, первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в противоположном направлении для кратковременной рекомбинантной продукции антитела в клетках млекопитающих.
67. Применение по п. 66, характеризующееся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержат по меньшей мере один интрон.
68. Применение по п. 66 или 67, характеризующееся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
69. Применение по любому из пп. 66-68, характеризующееся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляет собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.
70. Применение по любому из пп. 66-69, характеризующееся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и экспрессионные кассеты не содержат последовательности терминатора транскрипции.
71. Применение по любому из пп. 66-69, характеризующееся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток СНО, НЕК, ВНК, NS0 и клеток SP2/0.
72. Применение по любому из пп. 66-71, характеризующееся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки НЕК.
73. Применение по любому из пп. 66-72, отличающееся тем, что экспрессионный вектор содержит либо:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- четвертую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора;
либо:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
при этом легкая цепь антитела является общей легкой цепью для обеих тяжелых цепей антитела.
74. Применение по любому из пп. 66-73, отличающееся тем, что указанный экспрессионный вектор кодирует биспецифичное антитело.
75. Применение по любому из пп. 66-74, отличающееся тем, что биспецифичное антитело обладает первой специфичностью связывания или сайтом связывания, который специфично связывается с первым антигеном или первым эпитопом на антигене, и биспецифичное антитело обладает второй специфичностью связывания или вторым сайтом связывания, который специфично связывается со вторым антигеном или со вторым эпитопом на антигене.
76. Применение по любому из пп. 66-75, отличающееся тем, что экспрессионный вектор содержит:
- экспрессионную кассету с легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету с первой тяжелой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй тяжелой цепью антитела, и
- экспрессионную кассету с селекционным маркером.
77. Применение по любому из пп. 66-76, отличающееся тем, что экспрессионный вектор содержит:
- экспрессионную кассету с первой легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй легкой цепью антитела,
- экспрессионную кассету с первой тяжелой цепью антитела,
- экспрессионную кассету со второй тяжелой цепью антитела, и
- экспрессионную кассету с селекционным маркером.
78. Применение по любому из пп. 66-77, отличающееся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую hole-мутацию.
79. Применение по любому из пп. 66-78, отличающееся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую knob-мутацию.
80. Применение по любому из пп. 66-79, отличающееся тем, что одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует вариант легкой цепи антитела, содержащей вариабельный домен легкой цепи антитела и СН1 домен тяжелой цепи антитела в качестве константного домена, и/или одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует легкую цепь антитела, содержащую вариабельный домен легкой цепи антитела и CL домен легкой цепи антитела в качестве константного домена.
81. Применение по любому из пп. 66-80, отличающееся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует вариант тяжелой цепи антитела, содержащий в качестве первого константного домена антитела константный домен легкой цепи антитела (CL), и/или одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую в качестве первого константного домена СН1 домен тяжелой цепи антитела.
82. Экспрессионный вектор, содержащий:
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, первую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность первого терминатора транскрипции,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, вторую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность второго терминатора транскрипции, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5'-3' третий промотор, нуклеиновую кислоту, придающую устойчивость к селекционному агенту, третью поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность третьего терминатора транскрипции,
где экспрессионные кассеты расположены в разных направлениях, таким образом, первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в противоположных направлениях.
83. Экспрессионный вектор по п. 82, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
84. Экспрессионный вектор по п. 82 или 83, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
85. Экспрессионный вектор по любому из пп. 82-84, отличающийся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.
86. Экспрессионный вектор по любому из пп. 82-84, отличающийся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1 alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальные последовательности представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и экспрессионные кассеты не содержат последовательности терминатора транскрипции.
87. Экспрессионная плазмида, содержащая в направлении 5'-3' последовательность промотора, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела или легкую цепь антитела, IRES элемент, нуклеиновую кислоту, кодирующую селекционный маркер и поли(А)-сигнальную последовательность, где IRES элемент представляет собой EMCV-IRES элемент.
88. Применение экспрессионной кассеты, содержащей в направлении 5'-3' последовательность промотора, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела или легкую цепь антитела, IRES элемент, нуклеиновую кислоту, кодирующую селекционный маркер, и поли(А)-сигнальную последовательность для селекции клеток, продуцирующих антитело, где IRES элемент представляет собой EMCV-IRES элемент.
89. Способ селекции эукариотических клеток, экспрессирующих антитело, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотических клеток, содержащих i) экспрессионную плазмиду по п. 87 и ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую соответствующую другую цепь антитела, не кодируемую экспрессионной плазмидой по п. 87,
- селекция клеток, экспрессирующих детектируемый полипептид.
90. Экспрессионная плазмида, содержащая в направлении 5'-3' последовательность промотора, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, IRES элемент, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, и поли(А)-сигнальную последовательность, где IRES элемент представляет собой EV71-IRES элемент.
91. Применение экспрессионой плазмиды, содержащей в направлении 5'-3' последовательность промотора, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, IRES элемент, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, и поли(А)-сигнальную последовательность для экспрессии антитела, где IRES элемент представляет собой EV71-IRES элемент.
92. Способ селекции эукариотических клеток, экспрессирующих антитело, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотических клеток, содержащих i) экспрессионную плазмиду по п. 90 и ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую соответствующую другую цепь антитела, не кодируемую экспрессионной плазмидой по п. 90,
- селекция клеток, экспрессирующих детектируемый полипептид.