Способ выделения суммы фурокумаринов из клеточной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L.)
METHOD FOR EXTRACTING THE SUM OF FUROCOUMARINS FROM CELL CULTURE OF HEMLOCK PATCHY (CONIUM MACULATUM L.)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений и выделению биологически активных веществ, и может быть использовано в фармацевтической промышленности при получении фурокумаринов из клеточной культуры болиголова пятнистого.
Фурокумарины одни из веществ, входящих в состав болиголова пятнистого, обладающие биологической активностью. Фурокумарины могут быть использованы в качестве лечебных средств, оказывающих спазмолитическое, антикоагулянтное, антилейкодермическое, анальгизирующее, противоопухолевое и другие виды действия [1]. В болиголове пятнистом встречаются следующие фурокумарины: бергаптен, ксантотоксин и изопимпинеллин [2].
Известен способ получения биологически активных веществ из биомассы культивируемых клеток растений (патент №2039817, РФ), включающий выращивание клеточной биомассы, ее разрушение, отделение жидкой фракции, концентрирование биологически активных веществ в жидкой фракции и сушку концентрата до получения целевого продукта, отличающийся тем, что выращенную биомассу при разрушении подвергают тепловой обработке при 80-130°С в течение 5-60 мин. Недостатком данного способа является сложность технологического процесса, также для его осуществления необходимо дополнительное оборудование. Данный способ не подходит для выделения фурокумаринов, так как в описанном способе биомассу при разрушении подвергают тепловой обработке при 80-130°С в течение 5-60 мин, что может привести к возгонке и потере фурокумаринов в случае использования данного способа.
Известен штамм Panax ginseng c.a.mey - продуцент гинзенозидов и способ получения гинзенозидов (патент №2067819, РФ). Способ получения гинзенозидов заключается в культивировании на питательной среде указанного штамма и выделении целевого продукта. При этом питательная среда для культивирования штамма содержит нитраты аммония 350-450 мг/л и дополнительно в нее вводят тиамин гидрохлорид 0,15-0,25 мг/л, пиридоксина гидрохлорид 0,45-0,55 мг/л, никотиновая кислота 0,45-0,55 мг/л, мезоинозит 80-100 мг/л, казеина гидролизат 80-120 мг/л и 4-хлорфеноксиуксусная кислота 0,35-0,45 мг/л. Выделение суммарной гликозидной фракции заключается в трехкратной экстракции 85%-м водным метанолом, при перемешивании, измельченной лиофильно высушенной ткани, упаривании досуха объединенного раствора при 50°С на роторном испарителе и экстракция осадка после испарения пентаном (5 мл × 2) и насыщенным водой н-бутанолом (5 мл × 3). Промытый 5 мл воды бутанольный экстракт при тех же условиях упаривают до сухого остатка, который и составляет суммарную гликозидную фракцию. Для выращивания штамма Panax ginseng c.a.mey в питательную среду дополнительно добавляют мезоинозит 80-100 мг/л, казеина гидролизат, что усложняет технологию культивирования и приготовления питательной среды и увеличивает ее стоимость. Так же для повторения данной методики необходимо специализированной дорогостоящее оборудование, такое как - лиофильная сушилка, роторный испаритель.
Известен способ получения биологически активных веществ в клеточной культуре Conium maculatum L. (болиголова пятнистого). Способ включает культивирование на питательной среде МС в присутствии гормонов 2,4-D с концентрацией в диапазоне 1-0,5 мг/л или с НУК (α-нафтилуксусной) кислотой при концентрации в диапазоне 3-0,5 мг/л и 1-0,1 6-БАП, сбор биомассы и выделение биологически активных веществ, путем кислого и щелочного хлороформного извлечения.
Недостатками способа является недостаточно исчерпывающая экстракция суммы фурокумаринов из сырья культуры болиголова пятнистого. Данный способ подходит для получения биологически активных веществ, в частности фурокумаринов и сквалена, в виде суммарного экстракта, в то время как предлагаемый способ направлен на выделение именно фурокумаринов из культуры болиголова пятнистого.
В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе адекватного прототипа не обнаружено.
Болиголов пятнистый (Conium maculatum L.) - растение семейства зонтичные, известен своими токсичными свойствами, обусловленными наличием алкалоидов, так же содержит значительное количество различных биологически активных веществ, в том числе фурокумаринов. Болиголов обладает широким спектром фармакологической активности, благодаря чему включен в большинство сборов трав для лечения практически всех заболеваний. Выделение фурокумаринов из растительного сырья представляет собой сложную задачу из-за присутствия близких по свойствам соединений - кумаринов и их производных, а также значительных количеств эфирных и жирных масел, сахаров, стеринов и других сопутствующих веществ.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа выделения фурокумаринов из клеточной культуры болиголова пятнистого, перспективной в качестве возможного источника фурокумаринов и использования их для создания лекарственных средств.
Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ, включающий высушивание каллусной культуры (100 г) болиголова пятнистого при температуре 25°С в темном защищенном от действия света месте, измельчение, трехкратную обработку петролейным эфиром, последующее настаивание с добавлением 70%-го водного раствора ацетона отличающегося тем, что водный слой полученного извлечения поэтапно обрабатывали 30 мл 10%-ого спиртового раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ого водного раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ого раствора кислоты хлористоводородной добавление 150 мл хлороформа, отделение и высушивание хлороформного слоя в вытяжном шкафу при комнатной температуре.
Новым в предлагаемом изобретении является то, что сырье (100 г) высушивают при температуре 25°С в темном защищенном от действия света месте, обезжиривают трехкратной обработкой петролейным эфиром, с последующим настаиванием с добавлением 70%-го водного раствора ацетона и поэтапной обработкой водный слоя полученного извлечения 30 мл 10%-ого спиртового раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ого водного раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ого раствора кислоты хлористоводородной, добавляют 150 мл хлороформа, хлороформный слой отделяют и высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре.
Новые признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно- медицинской литературе.
Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован для получения суммы фурокумаринов из каллусной культуры болиголова пятнистого.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентноспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания. Способ выделения суммы фурокумаринов из клеточной культуры болиголова пятнистого (Conium maculatum L.), представляет собой сбор биомассы, высушивание каллусной культуры (100 г) болиголова пятнистого, измельчение, выделение суммы фурокумаринов отличающийся тем, что сырье высушивают при температуре 25°С в темном защищенном от действия света месте, проводят обезжиривание петролейным эфиром, настаивание с добавлением 70%-ого водного раствора ацетона и поэтапную обработку 30 мл 10%-ого спиртового раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ого водного раствора калия гидроксида, 100 мл 10%-ого раствора кислоты хлористоводородной, добавление 150 мл хлороформа, отделение и высушивание хлороформного слоя в вытяжном шкафу при комнатной температуре.
Способ осуществляется следующим образом. Сбор биомассы осуществляют на 30 сутки культивирования, культуру отделяют от питательной среды, высушивают на открытом воздухе, при температуре 25°С, в темном защищенном от действия света месте. Измельчают 100 г культуры в фарфоровой ступке до однородного состояния, полученную массу трехкратно обрабатывают петролейным эфиром, настаивают с 70%-м водным раствором ацетона. Затем извлечение фильтруют и к фильтрату последовательно приливают 30 мл 10%-ого спиртового раствора калия гидроксида, тщательно перемешивают, добавляют 100 мл 10%-ого водного раствора калия гидроксида. Далее отделяют водный слой, к которому добавляют 100 мл 10%-ого раствора кислоты хлористоводородной. Затем сумму фурокумаринов извлекают добавлением 150 мл хлороформа. Хлороформный слой отделяют и высушивают при комнатной температуре.
Достигаемый технический результат заключается в выделении из каллусной культуры болиголова пятнистого суммы фурокумаринов, составляющей 0,5% и представляющей собой кристаллический порошок светло-желтого цвета, без запаха.
Пример
100 г высушенной и измельченной каллусной культуры болиголова обрабатывали последовательно тремя порциями по 250 мл петролейного эфира при постоянном встряхивании, в течение 30 минут. Затем надосадочную жидкость сливали и к остатку сырья добавляли 500 мл 70%-го водного раствора ацетона и настаивали в течение 4 часов. Далее полученную водно-ацетоновую вытяжку фильтровали через бумажный фильтр и к фильтрату добавляли 30 мл 10%-го спиртового раствора калия гидроксида, перемешивали в течение 15 минут и затем добавляли 100 мл 10% водного раствора калия гидроксида, перемешивали и оставляли в закрытой емкости на 30 минут. Затем из полученной вытяжки с помощью делительной воронки отделяли водный слой, к которому добавляли 100 мл 10%-го водного раствора кислоты хлористоводородной, перемешивали в течение 15 минут. Извлечение суммы фурокумаринов осуществляли добавлением 150 мл хлороформа при постоянном перемешивании. Хлороформный слой отделяли с помощью делительной воронки и высушивали в вытяжном шкафу при комнатной температуре. Полученная сумма фурокумаринов представляла собой кристаллический порошок светло-бежевого цвета, без запаха. Выход суммы фурокумаринов составлял 0,5 г (0,5%).
4
2
Разделение фурокумаринов проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах «Сорбифилл» (ЗАО Сорбполимер, г. Краснодар). В качестве образцов сравнения использовали стандартные вещества фурокумаринов: бергаптен, ксантоксин, изопимпинеллин, а также модельную смесь на их основе (1:1:1). Идентификацию проводили по результатам хроматографической подвижности и цветовым оттенкам флуоресценции выделенных веществ до и после обработки реактивами (10% раствор NHOH; Br), сравнивая с модельной смесью и стандартными образцами фурокумаринов. По данным ТСХ величина Rf и цветовые оттенки флуоресценции выделенных веществ до и после обработки реактивами полностью совпадали с величиной Rf и цветовыми оттенками флуоресценции веществ модельной смеси и стандартными образцами фурокумаринов: для изопимпинелина - 0,42, бергаптена - 0,55, ксантотоксина - 0,85.
Количественный анализ суммы фурокумаринов проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе системы Альянс («Waters») с детектором с фотодиодной матрицей на колонке Aliance С18 (4,6×150), 5 mkm в режиме элюирования: 0,1% -я ортофосфорная кислота / ацетонитрил (78:22).
Список литературы
1. Николаева О.Б., Пупыкина К.А., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А., Шемерянкина Т.Б. Изучение фурокумаринов плодов амми большой/ Башкирский химический журнал, 2010. - Том 17., №2. - 149-155 (стр. 149).
2. Meier P., Hotti Н., Rischer Н. Elicitation of furanocoumarins in poison hemlock (Conium maculatum L.) cell culture / Plant Cell Tiss Organ Cult (PCTOC), 2015. - 123., №3. - P. 443-453 (стр. 444).