СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ
METHOD OF POTATO MICROCLONAL PROPAGATION

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, а именно к картофелеводству, семеноводству картофеля на безвирусной основе.
Картофель - важнейшая продовольственная культура, основной продукт питания. Россия занимает лидирующее положение в мире по количеству производимого картофеля и одно из последних мест по урожайности культуры, которая составляет в среднем 9-11 т/га. Низкая урожайность связана с резкими температурными колебаниями, особенно весной, после посадки картофеля, инфицированностью почвы возбудителями болезней и низким качеством семенных клубней. Зараженность патогенами семенного материала является одной из основных причин снижения урожайности картофеля практически во всех регионах, как с благоприятными, так и неблагоприятными условиями возделывания.
Для преодоления этих проблем в семеноводстве картофеля внедряются прогрессивные методы биотехнологии - микроклональное размножение картофеля, основанное на культивировании меристемных растений картофеля на питательных средах in vitro.
Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, получение растений-регенерантов и высадку их в грунт. В питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицерина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты. Проводят микрочеренкование исходных растений на апикальную, среднюю и базальную части. Выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°C днем и 17-18°C ночью, с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт. Выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при 8-10°C, с последующим получением микроклубней картофеля in vitro (Патент РФ №2329639, МПК A01H 4/00, опубл. 27.07.2008 г.).
Однако известный способ применен на стадии микроклонального размножения растений-регенерантов в стерильных контролируемых условиях in vitro и направлен на увеличение количественного выхода черенков меристемных растений, которые недостаточно адаптированы к воздействию низких температур после пересадки растений в естественный грунт.
В качестве прототипа выбран способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем черенкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 30 г/л сахарозы, 5 мл/л Fe-хелат, 3 мг/л глицерин, 1 мг/л ИУК, 7 г/л агар-агар, витамины по Уайту. Питательная среда дополнительно содержит 0,5-1,0 мг/л коричной кислоты. Полученные растения-регенеранты высаживают в грунт. Данный способ позволяет повысить коэффициент размножения меристемных растений из одного исходного растения in vitro (Патент РФ №2181942, МПК A01H 4/00, C12 №5/02, опубл. 10.05.2002. г.).
Недостатками способа являются недостаточная жизнеспособность и приживаемость растений-регенерантов после высадки в грунт, а также низкая продуктивность картофеля при выращивании в условиях низких температур и при инфицированности грунта опасными для картофеля картофельной цистообразующей нематодой.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа микроклонального размножения растений картофеля, позволяющего получить меристемные растения-регенеранты, адаптированные к неблагоприятным условиям естественной среды выращивания и обеспечивающего получение высокопродуктивных растений картофеля.
Техническим результатом является повышение жизнеспособности и приживаемости растений-регенерантов при высадке в грунт, повышение холодостойкости растений картофеля и устойчивости растений к картофельной цистообразующей нематоде, а также повышение урожайности картофеля.
Заявленный технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем черенкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, сахарозу, Fe-хелат, глицерин, ИУК, агар-агар, витамины по Уайту, получение меристемных растений-регенерантов и высадку растений в грунт, согласно изобретению перед высадкой в грунт меристемные растения-регенеранты подвергают воздействию температурой +4…+5°C в течение 2-х часов продолжительностью 6-7 дней.
Кратковременное воздействие низкой температуры +4…+5°C на меристемные растения перед высадкой в грунт по предлагаемому способу обеспечивает повышение жизнеспособности растений-регенерантов, о чем свидетельствуют:
- повышение приживаемости растений, составляющее 100%;
- повышение холодоустойчивости клеток листовой ткани растений картофеля на 55% по сравнению с прототипом;
- повышение устойчивости к заражению облигатным паразитом картофеля - картофельной цистообразующей нематодой на 53% по сравнению с прототипом.
Предлагаемый способ позволяет повысить урожайность картофеля на 77% в условиях заражения почвы картофельной цистообразующей нематодой и 23% - на незараженной почве.
Как показали исследования, меристемные растения-регенераты, выращенные по предполагаемому способу, обладают повышенной холодостойкостью и устойчивостью к заражению картофельной цистообразующей нематодой, что подтверждается увеличением экспрессии гена холодостойкости (COR-гена) ci7 и гена устойчивости к нематоде (R-гена) H1, вызванных кратковременной обработкой растений низкой температурой (Лаврова В.В., Сысоева М.И., Шерудило Е.Г., Топчиева Л.В., Матвеева Е.М. Экспрессия гена ci7 в листьях картофеля при действии кратковременных ежесуточных снижений температуры // Труды КарНЦ РАН. Серия Экспериментальная биология. 2011. №3. С.73-77; Сысоева М.И., Лаврова В.В., Матвеева Е.М., Шерудило Е.Г., Топчиева Л.В. Кросс-адаптация растений картофеля к действию низких температур и заражению картофельной цистообразующей нематодой // Физиология растений. 2011. Т.58, №6. С.853-858).
Апробация способа проводилась в течение 3-х лет (2009-2011 гг.) на меристемных растениях восприимчивого к картофельной цистообразующей нематоде Globodera rostochiensis Woll. сорта картофеля Елизавета.
Способ осуществляли следующим образом:
Меристемные растения картофеля культивировали in vitro в течение 3-х недель при температуре 20-23°C днем и 16-18°C ночью путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 30 г/л сахарозы, 5 мл/л Fe-хелат, 3 мг/л глицерин, 1 мг/л ИУК, 7 г/л агар-агар, витамины по Уайту. Меристемные растения-регенеранты, имеющие 6-8 листьев, перед высадкой в грунт подвергали ежесуточному воздействию низкой температуры +4…+5°C в течение 2-х часов продолжительностью 6-7 дней. Обработанные низкими температурами растения-регенеранты высаживали в естественный грунт, зараженный картофельной цистообразующей нематодой с дозой заражения 10 цист на одно растение. Каждый вариант опыта проводили в 10 повторностях. Контролем являлись растения-регенеранты, выращенные по способу прототипа и высаженные в незараженный и зараженный грунт (доза заражения 10 цист на одно растение).
Морфометрические показатели растений-регенерантов определяли перед высадкой в грунт и в процессе вегетации в фазу бутонизации - начала цветения картофеля. Статистически обработанные данные представлены в таблице 1, из которой следует, что по сравнению с прототипом высота растений и количество междоузлий у растений перед высадкой в грунт увеличились в 1,5 и 1,4 раза, соответственно, а в фазу бутонизации высота растений и площадь листьев увеличились в 2,3 и 2,8 раза, соответственно. Приживаемость растений-регенерантов составила 100%.
В таблице 2 представлены среднестатистические данные по холодоустойчивости клеток листовой ткани растений картофеля в фазу бутонизации и уровню заражения растений картофельной цистообразующей нематодой в конце вегетации. Холодостойкость измеряли методом ЛТ50 (Дроздов С.Н., Курец В.К., Будыкина Н.П., Балагурова Н.И. Определение устойчивости растений к заморозкам // Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды. Л.: Наука, 1976. С.222-228). Из таблицы 2 следует, что предлагаемый способ позволяет повысить холодостойкость растений картофеля на 55% и снизить уровень их заражения нематодой на 53% по сравнению с прототипом, что способствует формированию повышенной жизнеспособности и продуктивности растений картофеля.
В конце вегетации определяли урожайность картофеля, выращенного на незараженном и зараженном картофельной цистообразующей нематодой грунте. Данные представлены в таблице 3, из которой следует, что предлагаемый способ микроклонального размножения картофеля позволяет повысить по сравнению с прототипом средний вес клубня на 27% на незараженном грунте и на 44% на грунте, зараженном нематодой, и урожайность картофеля на 23% и 77%, соответственно.
Для доказательства того, что предлагаемые режимы обработки меристемных растений картофеля являются наилучшими для достижения заявленного технического результата, в таблицах 1-3 приведены варианты опытов (2 и 5) с запредельными значениями режимов обработки.
Из таблиц следует, что предлагаемый способ позволяет получить растения-регенеранты с повышенной приживаемостью и жизнеспособностью, высокими морфометрическими показателями, а также устойчивостью к действию низких температур и к заражению паразитической картофельной нематодой, обеспечивающих получение высокопродуктивных растений картофеля. Предлагаемый способ прост в использовании, экологически безопасен и доступен для широкого применения в практике сельского хозяйства.
Таблица 1
№ п/п
Вариант опыта
Режимы ежесуточной обработки
Морфометрические показатели растений-регенерантов
Приживаемость растений-регенерантов после высадки в грунт (%)
Температура (°C)
Время обработки (ч)
Кол-во дней
Перед высадкой в грунт
В фазу бутонизации
Высота растений (см)
Кол-во междоузлий (шт.)
Высота растений (см)
Площадь листьев (м<sup>2</sup>)
1
Прототип (контроль)
-
-
-
4,1±0,1
5,1±0,1
17,2±0,2
0,5±0,1
90
2
Предлагаемый способ
+3
1
5
4,5±0,1
5,3±0,1
38,3±0,2
1,0±0,1
92
3
+4
2
6
6,0±0,2
7,1±0,1
41,5±0,2
1,4±0,1
100
4
+5
2
7
6,1±0,2
7,2±0,1
42,2±0,2
1,4±0,1
100
5
+6
1
8
6,1±0,2
7,2±0,1
40,3±0,2
1,3±0,1
98
Таблица 2
№ п/п
Вариант опыта
Режимы ежесуточной обработки
Показатели
Холодостойкость клеток листовой ткани
Уровень заражения цистообразующей нематодой
Температура (°C)
Время обработки (ч)
Кол-во дней
ЛТ<sub>50</sub>, С
%
Кол-во цист нематоды, шт./раст.
%
1
Прототип
-
-
-
-5,8±0,1
100
204±4,0
100
2
Предлагаемый способ
+3
1
5
-8,6±0,1
148
175±3,6
86
3
+4
2
6
-9,0±0,1
155
100±2,9
49
4
+5
2
7
-9,0+0,1
155
96+±3,1
47
5
+6
3
8
-8,9±0,1
153
110±3,0
54
Таблица 3
№ п/п
Вариант опыта
Режимы ежесуточной обработки
Показатели
Температура (°C)
Время обработки (ч)
Кол-во дней
Незараженный грунт
Зараженный грунт, доза заражения 10 цист нематоды/растение
Урожайность (кг/м<sup>2</sup>)
Ср. вес 1-го клубня (г)
Урожайность (кг/м<sup>2</sup>)
Ср. вес 1-го клубня (г)
1
Прототип
-
-
-
1,47±0,1
15,3±3,5
0,83±0,1
17,0±2,1
2
Предлагаемый способ
+3
1
5
1,65±0,2
17,1±4,0
1,06±0,2
19,7±2,0
3
+4
2
6
1,75±0,1
18,9±3,8
1,46±0,2
21,1±1,9
4
+5
2
7
1,81±0,1
19,4±2,3
1,47±0,1
24,4±1,8
5
+6
3
8
1,80±0,1
19,1±2,5
1,45±0,1
23,5±1,5