Углублённое исследование противогрибковой активности соединений ряда серебряных солей пиразол-3-карбоксамидов

Углублённое исследование противогрибковой активности соединений ряда серебряных солей пиразол-3-карбоксамидов

*В. В. НОВИКОВА, В. Л. ГЕЙН

Пермская государственная фармацевтическая академия, Пермь

In-Depth Investigation of Antifungal Activity of Compounds of Series of Silver Salts of Pyrazol-3-Carboxamids

V. V. NOVIKOVA, V. L. GEIN

Изучали противогрибковую активность 4 новых перспективных соединений ряда пиразол-3-карбоксамвдов, содержащих ион серебра, в отношении клинических изолятов Candida spp. микрометодом двукратных серийных разведений в жидкой среде. Представлены результаты углублённого исследования данных соединений в отношении клинических штаммов Candida albicans — типичного патогена, вызывающего вульвовагинанальный кандидоз, а также в отношении реже встречаемых не-albicans видов Candida spp., проявляющих резистентность к наиболее часто используемым антимикотикам. Выявлено соединение, проявляющее высокую противогрибковую активность (МПК50 0,15 мкг/мл, МПКад 6,25 мкг/мл), рекомендуемое для дальнейших доклинических исследований.

Ключевые слова: вульвовагинанальный кандидоз, противогрибковая активность, Candida spp., серебряные соли пиразол-3-карбоксамидов.

The aim of the study was to investigate the antifungal activity of 4 new promising compounds of pyrazole-3-carboxamides containing silver ion in relation to clinical isolates of Candida spp. using the micromethod of two-fold serial dilution in liquid medium. The article presents the results of an in-depth study of these compounds with respect to the clinical strains of Candida albi-cans, a typical pathogen causing vulvovaginal candidiasis, as well as to less common non-albicans Candida spp. that are resistant to the most commonly used antimycotics. The compound showing high antifungal activity (MIC50 0.15 mcg/ml, MIC90 6.25 mcg/ml), which is recommended for further preclinical studies, has been identified.

Keywords: vulvovaginal candidiasis, antifungal activity, Candida spp., silver salts of pyrazole-3-carboxamides.

Вульвовагинальный кандидоз (BBK) — одно из самыгх распространённых инфекционныгх заболеваний женщин репродуктивного возраста. Типичной чертой этой патологии является склонность к рецидивам: согласно [1] у 40—50% женщин возникают повторные эпизоды, у 5% развивается хронический рецидивирующий BBK. Развитию данного заболевания способствует различная фоновая патология: иммуносупрессия различной этиологии, дисбиотическое состояние слизистых оболочек, в том числе обусловленное антибактериальной терапией, экзогенные вмешательства — частые спиринцевания, незащищённые половые контакты и др.

Ведущим этиологическим фактором BBK (76,1—86% случаев) неизменно остаётся Candida albicans [1—5]. Реже встречающиеся не-albicans виды Candida spp. — C.krusei, C.glabrata, C.tropi-

© Коллектив авторов, 2018

*Адрес для корреспонденции: 614107, Пермь, ул. Уральская 51А-45.

calis, C.parapsilosisи др., вызывающие данную патологию в 10—15,1% случаев [1, 3—5], представляют большой интерес для исследования с целью поиска эффективных антифунгальных средств в связи с их высокой резистентностью ко многим используемым антимикотикам [2—6].

Терапия ВВК базируется на применении препаратов азолового ряда, зачастую препаратом выбора является флуконазол. В настоящее время можно говорить о формировании тенденции нарастания резистентности представителей Candida spp. к используемым антимикотикам, в том числе для местного применения. По данным изучения профиля антимикотикочувствительности дрож-жеподобных грибов, выделенных из секрета влагалища [4], показатели чувствительности C.albi-cans к флуконазолу составили только 61%, все изученные штаммы не-albicans видов Candida были резистентны к флуконазолу. В работе [2] также подтверждено прогрессивное снижение чувствительности C.albicans к флуконазолу: количество чувствительных штаммов за семилетний период

наблюдения уменьшилось со 100 до 70,4%. По данным некоторых зарубежных исследователей [7], только у 8 пациенток с ВВК из 25 (у 32%), включённых в исследование, выделены штаммы C.albicans, МПК флуконазола в отношении которых составила 2 мкг/мл, что в соответствии с критериями EUCAST свидетельствует о чувствительности штамма к этому препарату. В отношении остальных штаммов МПК флуконазола составила 4—128 мкг/мл. По результатам наших исследований [5], зафиксированы высокие показатели резистентности изолятов Candida spp., выделенных из отделяемого половых путей, к антимикотикам азолового ряда: 64,8% C.albicans были резистентны к клотримазолу, 88,9% — к кетоконазолу, 90,7% — к флуконазолу. Большинство (60—80%) изолятов C.glabrata проявили устойчивость к кетоконазолу и флуконазолу. Наиболее высокие показатели резистентности к флуконазолу и кетоко-назолу выявлены у C.krusei — 100% изолятов.

Применение солей серебра в медицине для лечения патологических процессов в области кожных покровов и слизистых оболочек, вызываемых патогенной и условно-патогенной флорой, имеет длительную историю. Однако использование данных соединений с целью воздействия на возбудителей микозов практически не применяется. Наличие органической составляющей молекулы соединений, связанной с ионами серебра предположительно будет способствовать замедлению процесса высвобождения последних, тем самым оказывая более щадящее действие на кожу при поверхностных грибковых инфекциях.

Цель исследования — изучение чувствительности клинических изолятов Candida spp. к 4 перспективным соединениям (I—IV), ряда пиразол-3-карбоксамидов, содержащих ион серебра, проявивших высокую противогрибковую активность в отношении типовых штаммов.

Материал и методы

Исследованы 28 штаммов грибов рода Candida, выделенных от пациенток многопрофильных клиник (поликлиники и стационары) г. Перми (биосубстрат — отделяемое влагалища), устойчивых к флуконазолу: 22 штамма C.albicans, 4 штамма C.krusei, 1 штамм C.glabrata, 1 штамм C.tropicalis. Выбор данного антимикотика обусловлен его высокой востребованностью в клинической практике. Для оценки чувствительности выделенных штаммов грибов был использован диско-диффузионный метод — унифицированный, доступный и легко воспроизводимый метод. Посевы осуществляли на агар Сабу-ро. Использовали диски производства компании ЗАО «НИЦФ» ДИ-ПЛС-50-01, содержащие 40 мкг флуконазола. Инокулированные чашки с дисками инкубировали при температуре 25°С±1°С 40—48 ч. Интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкций производителя.

Исследование противогрибковой активности соединений, проявивших высокую антимикотическую активность в отношении типовых штаммов C.albicans 883-658 и C.albicans 10231, проводили микрометодом двукратных серийных разведений в жидкой среде (в 96-луночных планшетах), рекомен-

Таблица 1. Чувствительность клинических изолятов Candida spp. к изученным соединениям

МПК, мкг/мл Количество изолятов Candida spp.

I II III IV флуконазол

0,06 10 5 6 13 1

0,125 2 0 0 0 0

0,25 2 1 0 2 1

0,5 0 0 1 0 6

1 0 2 0 3 2

2 1 1 2 3 3

4 0 3 2 1 5

8 8 6 6 4 6

16 4 2 1 2 2

32 1 8 3 0 2

>32 0 0 4 0 0

Всего 28 28 28 28 28

дованным [8, 9], чувствительность каждого из штаммов определяли в двух повторностях. Концентрация микробных клеток в опыте составила 2—5Х104 КОЕ/мл. В качестве положительного контроля использовали питательную среду без противогрибкового препарата с внесённой исследуемой культурой, качество среды контролировали, применяя референтные штаммы. В качестве отрицательного контроля использовали интактную питательную среду. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 35°С±2°С. Оценку роста культур проводили визуально на 40—48 ч и 70—72 ч инкубирования, в соответствии с [9]. В качестве значения МПК принимали концентрацию препарата в последней прозрачной лунке серии разведения. Полученные первичные результаты обрабатывали с использованием стандартных статистических методов, усредняя результаты, полученные в двух повторностях. В качестве препарата сравнения использовали флуконазол.

Результаты исследования

В ходе настоящего исследования выявлено, что изученные соединения проявляют высокую противогрибковую активность в отношении представителей рода Candida. Полученные результаты представлены в табл. 1.

В соответствии с руководством EUCAST, для признания штамма C.albicans чувствительным к флуконазолу МПК этого препарата не должна превышать 2 мкг/мл, а в случае, если МПК флуконазола превышает 4 мкг/мл, штамм C.albicans считается резистентным. В соответствии с критериями CLSI, резистентными к флуконазлу явля-

Рис. 1. Чувствительность штаммов Candida spp. к изучаемым соединениям (% исследованных штаммов).

Таблица 2. Чувствительность клинических изолятов Candida non-albicans к изученным соединениям

Изучаемый МПК, мкг/мл

микроорганизм I II III IV флуконазол

C.krusei (1) 3,9 0,9 2,4 2,3 10,4

C.krusei (2) 1,9 4,7 1,0 0,9 3,2

C.krusei (3) 3,7 7,0 1,9 0,5 3,2

C.krusei (4) 7,0 3,2 7,0 6,6 4,4

C.glabrata (5) 3,3 1,6 0,2 0,4 1,0

C.tropicalis (6) 7,0 7,8 7,8 0,9 0,6

Рис. 2. МПК50 и МПК90 изученных соединений в отношении изученных штаммов Candida spp.

ются штаммы с МПК>8 мкг/мл [10]. Данные по чувствительности штаммов Candida spp. к изучаемым соединениям представлены на рис. 1. Таким образом, наиболее перспективным соединением как по критериям EUCAST, так и CLSI является соединение IV (чувствительны 75 и 92% штаммов, соответственно).

Популяция чувствительных штаммов часто является разнородной. При этом важное значение

имеет распределение по показателям МПК50 и МПК90 (рис. 2) . Установлено, что наиболее активным соединением в отношении исследованных штаммов Candida spp. оказалось соединение IV.

Ввиду типичной для не-albicans штаммов высокой резистентности к используемым антими-котическим препаратам была проанализирована противогрибковая активность в отношении данных изолятов. Полученные усреднённые данные представлены в табл. 2.

Установлено, что соединение IV также проявило наиболее высокую антимикотическую активность в отношении большинства изученных штаммов, в ряде случаев превышающую активность препарата сравнения (рис. 3).

Рис. 3. Чувствительность штаммов Candida non-albicans к изучаемым соединениям

Заключение

Выявлено соединение ряда серебряных солей пи-разол-3-карбоксамидов, представляющее интерес для дальнейшего доклинического исследования: изучения механизма антифун-гального действия, скорости формирования резистентности, изучения противогрибковой активности в экспериментах in vivo.

ЛИТЕРАТУРА

1. Савичева A.M., Мартикайнен З.М., Абашова Е.И. и др. Рецидивирующий урогенитальный кандидоз: лечение с использованием флю-коназола. Журнал акушерства и женских болезней. — 2008. — Т. LVII. — № 1. — С. 41—46. / Savicheva A.M., Martikaynen Z.M, Abashova E.I. i dr. Retsidiviruyushchiy urogenital'nyy kandidoz: leche-nie s ispol'zovaniem flyukonazola. Zhurnal akusherstva i zhenskikh bolezney 2008; LVII: 1: 41—46. [in Russian]

2. Анкирская А.С., Муравьёва B.B., Фурсова С.А. и др. Мониторинг видового состава и чувствительности к антимикотикам дрожже-подобных грибов, выделенных из влагалища женщин репродуктивного возраста. Клин микробиол и мнтимикроб химиотер. — 2006. — Т. 8. — № 1. — С. 87—95. / Ankirskaya A.S., Muraveva V.V, Fursova S.A. i dr. Monitoring vidovogo sostava i chuvstvitel'nosti k antimikotikam drozhzhepodobnykh gribov, vydelennykh iz vlagal-ishcha zhenshchin reproduktivnogo vozrasta. Klin mikrobiol i mntimikrob khimioter 2006; 8: 1: 87—95. [in Russian]

3. Долго-Сабурова Ю.В., Мирзабалаева A.K., Климко H.H. О проблеме резистентности возбудителей рецидивирующего вульвовагиналь-ного кандидоза. Гинекология. — 2014. — Т. 16. — № 1. — С. 3—6. / Dolgo-Saburova Yu.V., Mirzabalaeva A.K., Klimko N.N. O probleme rezistentnosti vozbuditeley retsidiviruyushchego vul'vovaginal'nogo kan-didoza. Ginekologiya 2014; 16:1: 3-6. [in Russian]

4. Малова И.О., Кузнецова Ю.А. Чувствительность к антимикоти-кам Candida spp., выделенных от пациенток с хроническим рецидивирующим кандидозом урогенитального тракта. Проблемы медицинской микологии. — 2013. — Т. 15. — № 2. — С. 103. / Malova I.O., Kuznetsova Yu.A. CHuvstvitel'nost' k antimikotikam Candida spp., vydelennykh ot patsientok s khronicheskim retsidi-viruyushchim kandidozom urogenital'nogo trakta. Problemy med-itsinskoy mikologii 2013; 15: 2: 103. [in Russian]

5. Новикова B.B., Езов С.Г., Селиванова А.И. Анализ видового состава и чувствительности клинических изолятов Candida spp. к современным антимикотикам. Медицинский альманах. — 2017. — № 2. — С. 138—141. / Novikova V.V., Ezov S.G., Selivanova A.I. Analiz vidovogo sostava i chuvstvitel'nosti klinicheskikh izolyatov Candida spp. k sovremennym antimikotikam. Meditsinskiy al'manakh 2017; 2: 138—141. [in Russian]

6. Mohanty S., Xess I., Hasan F., Kapil A., Mittal S., Tolosa J. Prevalence & susceptibility to fluconazole of Candida species causing vulvovaginitis. Indian J Med Res 2007; 126: 9: 216—219.

7. Marchaim D, Lemanek L, Bheemreddy S, Sobel J. Fluconazole-Resistant Candida albicans Vulvovaginitis. Obstetrics & Gynecology 2012; 120:6: 1407—1414.

8. Определение чувствительности к микроорганизмов к антибактериальным препаратам: методические указания. МУК 4.2.1890-04.

Утв 04.03.2004. / Opredelenie chuvstvitel'nosti k mikroorganizmov k antibakterial'nym preparatam: metodicheskie ukazaniya. MUK 4.2.1890-04. Utv 04.03.2004. [in Russian]

9. Миронов A.H. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. — 944 с. / Mironov A.N. Rukovodstvo po provedeniyu doklinich-eskikh issledovaniy lekarstvennykh sredstv. Chast' pervaya. M.: Grif i K, 2012. 944 s. [in Russian]

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

10. Веселое A.B., Козлов P.C. Инвазивный кандидоз: современные аспекты эпидемиологии, диагностики, терапии и профилактики у различных категорий пациентов. Клин микробиол и антимикроб химиотер. — 2016. — Т. 18. — № 2. / Veselov A.V., Kozlov R.S. Invazivnyy kandidoz: sovremennye aspekty epidemiologii, diagnostiki, terapii i profilaktiki u razlichnykh kategoriy patsientov. Klin mikrobiol i antimikrob khimioter 2016; 18: 2. [in Russian]

Новикова Валентина Васильевна — к. фарм. н., доцент, за- Гейн В.Л. — д. х. н., профессор, заведующий кафедрой

ведующий кафедрой микробиологии Федерального госу- общей и органической химии Федерального государст-

дарственного бюджетного образовательного учреждения венного бюджетного образовательного учреждения выс-

высшего образования «Пермская государственная фар- шего образования «Пермская государственная фарма-

мацевтическая академия» Министерства здравоохране- цевтическая академия» Министерства здравоохранения

ния Российской Федерации (ФГБОУ ВО ПГФА Минз- Российской Федерации (ФГБОУ ВО ПГФА Минздрава

драва России), Пермь России), Пермь