СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ
METHOD FOR PRODUCING CELL SURFACE PROTEINS

Изобретение относится к биохимии растений и микроорганизмов и может быть использовано в технологии выделения (получения) и исследования белков, расположенных на поверхности клеток.
Макромолекулы, локализованные частично или полностью на внешней стороне клеточной стенки, контактирующей с окружающей средой, выполняют разнообразные функции. В частности, они обеспечивают межклеточные взаимодействия между микроорганизмами, а также между бактериями и тканями высших организмов. От присутствия бактериальных поверхностно-ассоциированных белков, в частности, зависят гидрофобность клеточной поверхности, ее заряд и первичная адгезия бактерий. Когда бактерии прикрепляются к так называемой «кондиционной пленке», которая представляет собой слой адсорбированных на поверхности молекул, этот процесс определяется специфическими взаимодействиями компонентов микробной поверхности (адгезинов) с комплементарными им адгезивными молекулами матрикса. Белковые структуры на поверхности клеток обеспечивают транспорт веществ в клетку, выполняют рецепторную функцию, включая рецепторы для фагов и колицинов. У архебактерий и большинства эубактерий на поверхности клеток формируются так называемые S-слои (от surface -поверхность), представляющие собой регулярное псевдокристаллическое окружение клетки. Часто они представлены определенным образом ориентированными белками и гликопротеинами, причем специализация этих белков до конца не исследована. Предполагают, что они обеспечивают регуляцию процесса адгезии клеток к поверхностям, обеспечивают устойчивость клеток к протеолитическим ферментам, несут сайты адгезии для собственных ферментов, служат протективными антигенами, защищают клетки от фагоцитоза, а отдельные домены служат рецепторами или посредниками в связывании с лейкоцитами, что подтверждает их роль в патогенезе заболеваний.
В связи с этим исследование белков поверхности клеток представляет актуальную на сегодняшний день проблему протеомики и биохимии в целом. Следует отметить, что при исследовании протеома особые требования предъявляются к такому этапу пробоподготовки, как количественная экстракция белков. В идеальном варианте должно быть обеспечено максимальное извлечение всех белков, расположенных на поверхности клетки, поскольку оптимальная пробоподготовка позволит не только получить наиболее полное представление о качественном составе протеома поверхности, но и оценить количественные изменения содержания белков.
Белки клеточной стенки (БКС) растений в значительной степени отличаются по степени взаимодействия с поверхностью клетки. Лежащие на поверхности и практически несвязанные (слабосвязанные) белки легко переходят в экстраклеточный раствор, они выявляются в жидких питательных средах при культивировании клеточных суспензий или растительных проростков. Для их обозначения часто используют термин «лабильные белки». Большинство из них являются кислыми белками с pi от 2 до 6. Их легко экстрагировать буферами с низкой ионной силой или такими недеструктивными методами, как вакуумная фильтрация (Cell wall proteins in apoplastic fluids of Arabidopsis thaliana rosettes: identification by mass spectrometry and bioinformatics / G. Boudart [et al.] // Proteomics. 2005. V.5. P. 212-221.). Другая часть БКС может быть прикреплена к матриксу слабыми взаимодействиями, например Ван-дер-Ваальсовыми, водородными, гидрофобными или ионными силами. Такие белки, как правило, имеют основные величины pI от 8 до 11, они экстрагируются солевыми растворами или хелатирующими агентами. Наконец, часть БКС прочно связана с компонентами клеточной стенки, например, ковалентными связями, как экстенсины или гидроксипролин-богатые белки. На данный момент не разработано единого подхода к экстракции таких белков. Например, сравнение нескольких методов экстракции поверхностных белков из корней проростков ячменя показало, что использование таких экстрагентов, как 2%-ный раствор SDS в сочетании с Nonidet Р40, мочевина и Nonidet Р40, а также 4%-ный раствор SDS с последующей преципитацией ацетоном не позволяют получить максимального извлечения всех фракций и их качественного разделения при проведении двумерного электрофореза. Наилучший результат (70 - 80%) был получен после проведения фенольной экстракции с последующей преципитацией белков 5 объемами 0,1М раствора ацетата аммония в метаноле (Hurkman W.J., Tanaka С.К. Solubilization of plant membrane proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis / W.J. Hurkman, C.K. Tanaka // Plant Physiol. 1986. V. 81. P. 802-806.).
Исследование белков, экспонированных на поверхности клетки, имеет большое практическое значение, поскольку они зачастую являются мишенью для лекарственных средств. Кроме того, показано, что они обладают высоким вакцинным потенциалом и могут быть использованы в диагностических целях.
Поскольку вакцинация является одним из самых эффективных и действенных способов борьбы с заболеваниями, актуальным остается вопрос получения и/или разработки новых вакцин. Как правило, это напрямую связано с выделением, очисткой и идентификацией поверхностных антигенов возбудителей болезней.
Известен способ получения поверхностного оболочечного белка вируса гепатита С (Выделенный оболочечный белок HCV, способ его получения и лекарство, вакцина, фармацевтическая композиция (варианты), его содержащие / Депла Э. [и др.]. / Патент RU 2274643 С2 от 24.04.2002.). По описанному способу выделенный оболочечный белок HCV или его часть является продуктом экспрессии в эукариотических (дрожжевых) клетках. Для этого в многостадийной процедуре конструировали челночный вектор, содержащий открытую рамку считывания, которая кодирует оболочечный белок HCV или его часть.
2+
Экспрессию специфических белков анализировали с помощью комбинации электрофореза в Na-ДДС ПААГ и вестерн-блоттинга. Выделение белков включает в себя лизис дрожжевых клеток агентом, вызывающим диссоциацию комплексов, химическую модификацию цистеиновых тиольных групп (обратимую и необратимую) и последующую аффинную хроматографию с использованием гепарина. Примерами «агентов, вызывающих диссоциацию комплексов» являются гуанидин хлорид и мочевина. Клеточные осадки ресуспензировали в 30 мМ фосфата, 6 М GuHCl, рН 7,2 (9 мл буфера/г клеток). Белок сульфонировали в течение ночи при комнатной температуре (КТ) в присутствии 320 мМ (4% масс/об.) сульфита натрия и 65 мМ (2% масс/об.) тетратионата натрия. Осветляли лизат после цикла замораживания-оттаивания центрифугированием (10000 g, 30 мин, 4°С). Добавляли Empigen ВВ (Albright & Wilson) и имидазол до конечной концентрации 1% (масс/об.) и 20 мМ, соответственно. Поскольку HCV E2s (аминокислоты 383-673) экспрессировался как белок с гистидиновой меткой, его быструю и эффективную очистку осуществляли аффинной хроматографией на установке Akta FPLC (быстрая жидкостная хроматография белков) (Pharmacia). Образец фильтровали через мембрану (ацетат целлюлозы) с порами размером 0,22 мкм и наносили на Ni-IDA-колонку (хелатирующая Sepharose FF, нагруженная Ni, Pharmacia), которую уравновешивали 50 мМ фосфата, 6М GuHCl, 1% Empigen ВВ, рН 7,2 (буфер А), обогащенным 20 мМ имидазола. Колонку промывали последовательно буфером А, содержащим 20 мМ и 50 мМ имидазола, соответственно, до тех пор, пока поглощение при 280 нм не достигало базового уровня. Элюировали продукты с гистидиновой меткой нанесением буфера D, 50 мМ фосфата, 6 М GuHCl, 0,2% Empigen ВВ (рН 7,2), 200 мМ имидазола. Очищенный материал анализировали Na-ДДС-ПААГ-электрофорезоми и вестерн-блоттингом с использованием специфического моноклонального антитела против Е2 (IGH212).
Описанный выше способ позволяет получить очищенный препарат белка, однако он осложняется необходимостью использования специализированного оборудования. Следует также отметить, что агенты, используемые для диссоциации комплексов, представляют собой хаотропы, которые в концентрированных растворах могут денатурировать белки. Кроме того, предполагаемая на этом этапе химическая модификация тиольных групп цистеина также может быть необратимой, что приведет к потере нативных свойств белка.
Описан способ получения вакцины на основе поверхностного антигена вируса гриппа (Influenza vaccine / G.J.M. Van Scharrenburg, R. Brands / U.S. patent 5,948,410; Date of Patent: Sep. 7, 1999.). Согласно предложенному методу для культивирования вируса гриппа используют культуру клеток животных (фибробласты эмбрионов цыпленка (CEF), клетки Мадин - Дарби почек собаки (MDCK), клетки яичников китайского хомячка (СНО) и клетки Веро). Непосредственно в ферментере проводят обработку ферментам, расщепляющими ДНК (ДНКазами и нуклеазами). Затем проводят обработку катионными детергентами из группы солей цетилтриметиламмония, такими как цетилтриметиламмония бромид (С.Т.А.В., ЦТАБ), солей миристилтриметиламмония. Кроме того могут быть использования липофектин, липофектамин и DOTMA. Кроме того может быть использован неионный детергент Tween. Выделение поверхностных катионных белков после стадии обработки детергентами может включать в себя две стадии: во-первых, отделение РНП-частицы (тела вируса) от поверхностных антигенных белков, например, центрифугированием или ультрафильтрацией, и, во-вторых, удаление детергента из поверхностных антигенных белков, например, с использованием смол (таких как Amberlite XAD-4) и/или ультра(диа)фильтрацией. При выделении вируса жидкость фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,5 мкм для удаления дебриса, затем проводят концентрирование и очищают ультрафильтрацией с применением мембраны, отсекающей молекулярные массы 300000. Затем к концентрату добавляют сахарозу до конечной концентрации 30% (м/об), формальдегид до конечной концентрации 0,015% (м/об) и перемешивают при 2-8°С в течение 72 ч. Затем вирусный концентрат разбавляют в 5 раз забуференным фосфатом солевым раствором (ЗФР) и наносят на аффинную колонку, содержащую Amicon Cellufine Sulphate. Колонку промывают ЗФР, вирус элюируют раствором 1,5 М хлорида натрия в ЗФР. Элюат концентрируют и обессоливают ультрафильтрацией с использованием мембраны с отсечением молекулярной массы 300000. Для выделения поверхностных белковых антигенов добавляют неионный детергент Твин-80 до конечной концентрации 300 мкг/мл и бромид цетилметиламмония до конечной концентрации 750 мкг/мл. Эту смесь перемешивают при 4°С в течение 3 ч, после чего РНП-частицы отделяют от поверхностных антигенных белков центрифугированием. Супернатант перемешивают с Amberlite XAD-4 в течение ночи при 2-8°С для удаления детергентов. Амберлит удаляют фильтрованием и затем фильтрат подвергают стерильному фильтрованию через фильтр 0,22 мкм.
Особенностью данного способа является использование для получения поверхностных белковых антигенов вирусных частиц, которые характеризуются своеобразным строением, не схожим со строением бактериальных клеток. В этом случае задача сводится к диссоциации комплекса РНП и белкового капсида. В то же время клетки бактерий отличаются более сложной организацией и белки в них соединены с компонентами клеточной стенки с помощью взаимодействий различного типа.
Описан способ получения поверхностного антигена вируса гепатита В (Лебедин Ю.С., Тимофеева Т.В., Сучков А.В. Способ получения поверхностного антигена вируса гепатита в из рекомбинантных клеток дрожжей Hansenula polymorpha и вакцина для иммунизации против гепатита В / Патент RU 2205023 от 01.10.2010.). Источником получения в данном случае служат рекомбинантные клетки дрожжей Hansenula polymorpha (штамм DL-U/pH-HBs), которые способны экспрессировать поверхностный антиген вируса гепатита В (HBs-антиген). Способ включает этап разрушения дрожжевых клеток. Для этого 20 г полученной в стадии 1 дрожжевой клеточной массы смешивают с 250 мл буфера для разрушения (0,1 М натрия фосфат, рН 7,4; 4 М мочевина; 0,2 М хлорид натрия; 20 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота). Смесь охлаждают до температуры +2°С на ледяной бане и подают при постоянном перемешивании со скоростью 10-15 мл/мин в гомогенизатор APV Gaulin. Камеру гомогенизатора постоянно охлаждают подачей водно-метанольной смеси с температурой - 10°С. Затем осуществляется экстракция и солюбилизация HBs антигена. На этом этапе клеточный гомогенат промывают дистиллированной водой с помощью двукратного центрифугирования. К полученному промытому осадку добавляют 0,2% (вес/объем) дезоксихолата натрия; смесь перемешивают на льду в течение 1 часа. Затем смесь центрифугируют 45 минут при 10000 g и температуре 4°С для удаления клеточных остатков. Затем для очистки целевого продукта проводят гидрофобную хроматографию в буфере, содержащем 8-14% этанола, отмывку проводят тем же буфером при температуре 30°С, элюцию проводят тем же буфером при температуре 40-42°С. Элюат подвергают ультрацентрифугированию в градиенте плотности бромида калия, после чего проводят гель-фильтрацию на кополимерном носителе. Следует отметить, что в данном способе при проведении этапа разрушения дрожжевых клеток авторы получают смесь белков, в состав которой входят не только поверхностные белки, но также и цитоплазматические и мембранные белки.
Известен способ получения белков клеточной поверхности золотистого стафилококка, обладающих способностью связывать фибронектин и фибриноген (Method for prophylactic treatment of the colonization of a Staphylococcus aureus bacterial strain by bacterial cell surface protein with fibronectin and fibrinogen binding ability / M. Hook, K.M. Lindberg, T.M. Wadstriim / U.S. patent 5,980,908; Date of Patent: Nov. 9, 1999.). Штамм Staphylococcus aureus, обладающий необходимыми свойствами, культивировали на жидкой питательной среде TS-broth в присутствии триптиказо-соевого экстракта (Oxoid, Ltd., England). После окончания роста бактерии выделяли центрифугированием и отмывали физиологическим раствором (0,9% NaCl). Затем бактерии разрушали добавлением бактериолитического фермента LysostaphinR (Sigma) в количестве 5 мг/л культуральной среды. Из полученной смеси выделяли белки, обладающие способностью связывать, к примеру, фибронектин, при помощи аффинной хроматографии на декстрановых гелях (бромцианактивированной сефарозе CL-4B) с иммобилизованным лигандом. Элюцию осуществляли с использованием хаотропных агентов, таких как NaSCN, KSCN и/или используя кислые растворы, например, раствор уксусной кислоты с рН<3.
Недостатком данного способа является использование фермента лизостафина, который является глицил-глициновой эндопептидазой. Поскольку именно для стафилококков характерно высокое содержание пентаглициновых мостиков, данный фермент проявляет специфичность по отношению к представителям этого семейства. В связи с этим его применение для воздействия на клеточную стенку других микроорганизмов будет менее эффективным. Кроме того следует отметить, что по данным производителя, этот фермент обладает также гексозаминидазной активностью. Это может приводить к более глубокому и непредсказуемому разрушению клеточной стенки, сопровождающемуся выходом не только поверхностных белков.
V.J. Benedi и L. Martinez-Martinez предложен способ выделения белков поверхностной мембраны штаммов Klebsiella pneumoniae (Benedi V.J., Martinez-Martinez L. Outer Membrane Profiles of Clonally Related Klebsiella pneumoniae I V.J. Benedi, L. Martinez-Martinez//Methods in Molecular Medicine, vol. 48: Antibiotic Resistance Methods and Protocols. Edited by: S. H. Gillespie Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001. P. 189-197.). Ночную культуру бактерий, выращенных на питательной среде, стимулирующей сверхэкспрессию некоторых белков поверхностной мембраны, подвергали центрифугированию при 10000g в течение 20 мин. Осадок ресуспендировали в 20 мл холодного Трис - Mg-буфера и повторно центрифугировали при тех же условиях. Эту манипуляцию повторяли, после чего клеточный осадок вновь ресуспендировали в 20 мл охлажденного Трис - Mg-буфера. Разрушение клеток проводили с помощью пресса Френча при 4°С. В качестве альтернативы можно использовать обработку ультразвуком (15 циклов по 30 с каждый; каждый цикл включал шестикратную обработку ультразвуком с амплитудой 18-20 мкм по 5 с с перерывом в 1 с; перерывы между циклами составляли 30 с). Для удаления неразрушенных клеток проводили центрифугирование при 3000g в течение 10 мин. Супернатант аккуратно переносили в чистые центрифужные пробирки и отделяли ультрацентрифугированием при 100 000g в течение 1 ч с охлаждением до 4°С. Полученные осадки ресуспендировали в 10 мл 2%-ного раствора лаурилсаркозината натрия (sodium lauryl sarcosinate) в Трис - Mg-буфере и инкубировали при комнатной температуре в течение 20-30 мин. Затем наружные мембраны осаждали в течение 1 ч при 70000g. Супернатант, содержащий цитоплазматические мембраны, отбрасывали, а осадок перерастворяли в буфере того же состава и повторно центрифугировали. После завершения надосадочную жидкость окончательно удаляли и осадок ресуспендировали в 0,1-0,2 мл дистиллированной воды.
Однако, как отмечают сами авторы, согласно этому способу происходит выделение не только белков наружной мембраны, но также и поринов, которые, строго говоря, являются уже белками, интегрированными в цитоплазматическую мембрану. При этом отделить порины удается, только используя модификации электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS.
Следует отметить, что использование всех описанных способов разработано для осаждения белков из растворов, а не с поверхности клеток. Кроме того они не позволяют количественно преципитировать белки и имеют значительные ограничения по применению в разбавленных растворах.
Задачей данного изобретения является получение способа, позволяющего обеспечить наиболее полное и количественное выделения белков поверхности целых клеток путем их смыва, минуя этап получения отдельных мембранных фракций и/или солюбилизации мембран.
Технический результат заключается в повышении процента выхода белков клеточной поверхности, сохраняющих свою структуру, при упрощении технологии их получения.
Поставленная задача решается тем, что способ получения поверхностных белков клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений, включает в себя:
- предварительную промывку клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений TBS или PBS буфером,
- обработку грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений 0,1-0,2%-ным раствором дезоксихолата натрия в течение 5-10 минут,
- фильтрацию экстрагированных поверхностных белков,
- преципитацию экстрагированных поверхностных белков раствором трихлоруксусной кислоты,
- осаждение преципитата центрифугированием,
- промывку преципитата ацетоном, инкубирование 60-300 мин при -18°С
- осаждение поверхностных белков.
Предварительная промывка клеток грамм-отрицательных бактерий и культуры клеток растений может быть осуществлена TBS Tris-HCL 10-20 mM рН 7,2, либо PBS 10-20 mМ рН 7,2.
Осаждение поверхностных белков может быть осуществлено фильтрованием или центрифугированием.
Заявляемое изобретение иллюстрируется чертежами:
Фиг. 1 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A brasilense Sp245 и Sp7, экстрагированных различными агентами, где цифрами обозначены белковые спектры в присутствии: 1 - 15 мМ ТРИС-фосфатного буфера; 2 - 1М NaCl; 3 - 1М LiCL; 4 - 2М мочевины; 5-0,1% дезоксихолат натрия; 6 - маркеры молекулярных масс.
Фиг. 2 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A. brasilense Sp245, экстрагированных различными концентрациями ДОХ, где цифрами обозначены: 1 - 0,03% ДОХ; 2 - 0,05% ДОХ; 3 - 0,075% ДОХ; 4 - 0,1% ДОХ; 5 - 0,15% ДОХ; 6 - 0,2% ДОХ; 7 - белковые маркеры.
Фиг. 3 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов A. brasilense Sp7 (А) и А. brasilense Sp245, экстрагированных ДОХ в течение различного времени: 1 -экстракция в течение 6 секунд; 2 - экстракция в течение 30 секунд; 3 - экстракция в течение 60 секунд; 4 - экстракция в течение 600 секунд (Юминут); 5 - экстракция в течение 3600 секунд (1 часа); 6 - белковые маркеры.
Фиг. 4 - ДДС-ПААГ анализ поверхностных полипептидов суспензионной культуры клеток Arabidopsis thaliana, при различном времени культивирования: треки 1,8 - белковые маркеры; трек 2 - культивирование 2 суток; 3 - культивирование 4 суток; 4 -культивирование 6 суток; 5 - культивирование 8 суток; 6 - культивирование 8 суток; 7 -культивирование 10 суток, 9 - актин Arabidopsis thaliana, 10 - актин Sp245, 11 - актин кролика.
Согласно заявляемому способу белки смывают (экстрагируют) с поверхности клеток поверхностно активным веществом (детергентом), при этом, согласно изобретению, детергентом является соль желчной кислоты дезоксихолат натрия (ДОХ). Обработку проводят 0,1-0,2% раствором ДОХ в течение 5-10 минут, а полученные белки количественно осаждают трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и промывают ацетоном для удаления ДОХ.
Использование ДОХ в концентрациях 0,1-0,2% позволяет экстрагировать поверхностные белки бактериальных и растительных клеток без их разрушения и избежать контаминации загрязнения препарата внутриклеточными цитоплазматическими белками.
Преципитация ТХУ в присутствии ДОХ обеспечивает количественное (полное) осаждение экстрагированных белков с различной молекулярной массой, в том числе минорных и низкомолекулярных.
В заявляемом решении технический результат достигается за счет использования в качестве экстрагента соли желчной кислоты - дезоксихолата натрия в концентрации ниже (или равной) критической концентрации мицеллообразования (ККМ).
Выбор экстрагента основан на результатах предварительных экспериментов, в которых использовались растворы различного состава, обычно применяемые в биохимии для выделения поверхностных белков (см. Фиг. 1, которая демонстрирует эффективность экстракции белков клеточной поверхности на примере двух штаммов грамотрицательных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Sp7).
Было показано, что наиболее эффективно экстрагировали полипептиды с поверхности бактериальных клеток мочевина и дезоксихолат натрия. В соответствующих белковых спектрах присутствует значительное количество низкомолекулярных полипептидов, которые отсутствуют в спектрах, полученных с использованием солей и ТРИС-фосфатного буфера, либо полностью или содержание этих белков незначительно. Однако следует отметить, что экстракция белков, проведенная с использованием ДОХ, оказалась более универсальной: с поверхности бактерий штамма Sp245 наибольшее количество белков экстрагируется именно дезоксихолатом натрия.
Раствор ДОХ в заявляемом способе демонстрирует выраженную способность к количественной экстракции белков с поверхности бактерий в зависимости от использованной концентрации (см. Фиг 2).
Сущность заявляемого изобретения подробно рассматривают на примере бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и Sp7, и суспензионной культуре клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа (экотип Columbia, Col-0).
Пример 1.
Способ заключается в том, что суспензию (V=2 мл) бактериальных клеток А. brasilense осаждали центрифугированием при 7000-9000 g в течение 3-5 минут. Для удаления компонентов культуральной среды, осадок промывали 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS 10-20 мМ рН 7,2+150 mM NaCl или TBS Tris-HCl 10-20 мМ рН 7.2+150 mМ NaCl) и повторно центрифугировали при тех же условиях. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл PBS или TBS, добавляли ДОХ до конечной концентрации 0,1%, встряхивали на Vortex, инкубировали 5-10 мин и осаждали клетки центрифугированием при 7000-9000 g в течение 3-5 мин. Полученный супернатант количественно переносили в пробирки 1,5 мл, белки из надосадочной жидкости преципитировали добавлением ТХУ до конечной концентрации 10-12%, осаждали центрифугированием 7000-9000 g., 3-5 мин. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок для удаления ДОХ промывали ацетоном инкубировали 60-300 мин при -18°С центрифугировали 7000-9000 g., 3-5 мин., осадок хранили до проведения анализа. Время экспозиции было определено в предварительных экспериментах. Результат ДДС-ПААГ анализа поверхностных полипептидов A. brasilense Sp7 (А) и A. brasilense Sp245, экстрагированных ДОХ в течение различного времени, приведен на Фиг. 3.
Пример 2.
Суспензионная культура клеток Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. дикого типа (экотип Columbia, Col-0).
Клетки перед экстракцией отделяли от культуральной среды на крупнопористом стекловолоконном фильтре, например Whatman GF-D, дополнительно отмывали на том же фильтре, изотоническим натриевым фосфатным буфером с 44-88 мМ (15-30 г/л) сахарозы. Навеску отфильтрованных клеток 500 мг помещали в пластиковую пробирку на 5 мл.
Поверхностные белки экстрагировали 0,1% ДОХом в фосфатном буфере с 43-88 мМ сахарозой, аккуратно перемешивая в течение 10 минут при соотношении 1:5-1:10 (в/об). Затем клетки отделяли фильтрованием на крупнопористом стекловолоконном фильтре, например Whatman GF-D, отбирали аликвоту фильтрата 1,0 мл, белки из надосадочной жидкости преципитировали добавлением ТХУ до конечной концентрации 10-12%, осаждали центрифугированием 7000-9000 g., 3-5 мин. Надосадочную жидкость удаляли. Осадок для удаления ДОХ промывали ацетоном инкубировали 60-300 мин при -18°С центрифугировали 7000-9000 g., 3-5 мин., осадок хранили до проведения анализа. Результаты ДДС-ПААГ анализа поверхностных полипептидов суспензионной культуры клеток Arabidopsis thaliana при различном времени культивирования показан на Фиг. 4.
Таким образом, заявляемый способ обеспечивает количественное выделение белков с поверхности клеток без разрушения поверхностной мембраны и минуя этап получения фракции сферопластов. Подобный подход позволяет значительно снизить трудоемкость процесса, упростив и сократив процедуру получения белков поверхности. Способ применим как для микробных, так и для растительных клеток.
Воспроизводимость процедуры выделения позволяет проводить количественное и качественное сравнение (сопоставление) состава белков поверхности исследуемых объектов.