ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ПОНИЖЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ PD-L1
OLIGONUCLEOTIDES FOR LOWERING PD-L1 EXPRESSION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам (олигомерам), которые являются комплементарными лиганду-1 запрограммированной смерти (PD-L1), приводящим к понижению экспрессии PD-L1 в печени. Настоящее изобретение также относится к способу облегчения исчерпания Т-клеток, вызванного инфекцией печени или раком в печени. Релевантными инфекциями являются хронические инфекции HBV (вирус гепатита В), HCV (вирус гепатита С) и HDV (вирус гепатита D) и паразитарные инфекции, подобные малярии и токсоплазмозу (например, вызванные протистами Plasmodium, в частности, видами P. vivax, P. malariae и P. falciparum).
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известно то, что костимулирующий путь, состоящий из рецептора запрограммированной смерти-1 (PD-1) и его лиганда - PD-L1 (или B7-H1, или CD274) - непосредственно способствует исчерпанию Т-клеток, приводящему к отсутствию контроля за вирусами во время хронических инфекций печени. Путь PD-1 также играет роль в автоиммунитете, так как у мышей с нарушениями данного пути развиваются аутоиммунные заболевания.
Было показано то, что антитела, которые блокируют взаимодействие между PD-1 и PD-L1, усиливают ответы Т-клеток, в частности, ответ цитотоксических Т-клеток CD8+ (см. Barber et al 2006 Nature Vol 439 p682 и Maier et al 2007 J. Immunol. Vol 178 p 2714).
В WO 2006/042237 описан способ диагностики рака посредством оценки экспрессии PD-L1 (B7-H1) в опухолях и предложена доставка пациенту агента, который препятствует взаимодействию PD-1/PD-L1. Препятствующими агентами могут быть антитела, фрагменты антител, миРНК (малая интерферирующая РНК) или антисмысловые олигонуклеотиды. Нет ни конкретных примеров таких препятствующих агентов, ни какого-либо упоминания хронических инфекций печени.
Опосредованное РНК-интерференцией ингибирование PD-L1 с использованием двухцепочечных молекул РНК (дцРНК, РНКи или миРНК) также было раскрыто, например, в WO 2005/007855, WO 2007/084865 и US 8507663. Ни в одной из них не описана таргетная доставка в печень.
В Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 описана доставка in vivo молекул миРНК, нацеленных на PD-L1, в клетки Купфера, усиливая, посредством этого клиренс клетками NK (природная клетка-киллер) и Т-клетками CD8+ у мышей, инфицированных MCMV (мышиный цитомегаловирус). В данной статье делается заключение о том, что молекулы миРНК, нацеленные на PD-L1, доставленные в гепатоциты, не являются эффективными в отношении усиления эффекторной функции Т-леток CD8+.
Подход с миРНК значительно отличается от подхода с одноцепочечными антисмысловыми олигонуклеотидами, так как биораспределение и механизмы действия являются совершенно разными. Как описано в Xu et al 2003 Biochem. Biophys. Res. Comm. том 306, страницы 712-717, антисмысловые олигонуклеотиды и миРНК имеют разные предпочтения в отношении сайтов-мишеней в мРНК.
В WO 2016/138278 описано ингибирование иммунных контрольных точек, включая PD-L1, с использованием двух или более чем двух одноцепочечных антисмысловых олигонуклеотидов, которые связаны на их 5'-концах. В данной заявке не упоминается HBV или таргетная доставка в печень.
ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении идентифицированы новые олигонуклеотиды и конъюгаты олигонуклеотидов, которые очень эффективно понижают уровень мРНК PD-L1 в клетках печени - как в паренхимных (например, гепатоциты), так и в непаренхимных клетках, таких как клетки Купфера и синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSEC). Посредством понижения или сайленсинга PD-L1 олигонуклеотиды и конъюгаты олигонуклеотидов уменьшают опосредованное PD-1 ингибирование и, посредством этого, активизируют иммуностимуляцию истощенных Т-клеток. Облегчение исчерпания Т-клеток при хронической патогенной инфекции печени будет приводить к возобновленному иммунному контролю и пониженным уровням вирусных антигенов в крови во время хронической патогенной инфекции печени. Клетки природные киллеры (NK) и Т-клетки природные киллеры (NKТ) также могут активироваться олигонуклеотидами и конъюгатами олигонуклеотидов по настоящему изобретению.
Конъюгаты олигонуклеотидов обеспечивают местное снижение уровня PD-L1 в клетках печени и, следовательно, уменьшают риск аутоиммунных побочных эффектов, таких как пневмонит, невирусный гепатит и колит, ассоциированный с системным исчерпанием PD-L1.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к олигонуклеотидам или их конъюгатам, нацеленным на нуклеиновую кислоту, способным модулировать экспрессию PD-L1 и лечить или предупреждать заболевания, связанные с функционированием PD-L1. Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, в частности, могут использоваться для лечения заболеваний, при которых был истощен иммунный ответ против инфекционного агента.
Соответственно, в первом аспекте изобретения предложены олигонуклеотиды, которые содержат непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью к нуклеиновой кислоте мишени PD-L1. Данный олигонуклеотид может представлять собой антисмысловой олигонуклеотид, предпочтительно с гэпмерной конструкцией. Предпочтительно данный олигонуклеотид способен ингибировать экспрессию PD-L1 посредством расщепления нуклеиновой кислоты-мишени. Расщепление предпочтительно достигается посредством рекрутирования нуклеазы.
В другом аспекте данный олигонуклеотид конъюгирован с по меньшей мере одной конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, такой как конъюгатная группировка, содержащая по меньшей мере одну N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку. Конъюгатная группировка и олигонуклеотид могут быть связаны друг с другом посредством линкера, в частности, биорасщепляемого линкера.
В другом аспекте согласно изобретению предложены фармацевтические композиции, содержащие олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по изобретению и фармацевтически приемлемые разбавители, носители, соли и/или адъюванты.
В другом аспекте согласно изобретению предложены способы in vivo или in vitro для понижения экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, посредством введения в указанную клетку олигонуклеотида или композиции по изобретению в эффективном количестве.
В другом аспекте согласно изобретению предложены олигонуклеотиды, конъюгаты олигонуклеотидов или фармацевтические композиции для применения в восстановлении иммунитета против вируса или паразита.
В другом аспекте согласно изобретению предложены олигонуклеотиды, конъюгаты олигонуклеотидов или фармацевтические композиции для применения в качестве лекарственного средства.
В другом аспекте согласно изобретению предложены способы лечения или предупреждения заболевания, расстройства или дисфункции посредством введения терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида по изобретению субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию, расстройству или дисфункции, в частности, к заболеваниям, выбранным из вирусных инфекций печени или паразитарных инфекций.
В другом аспекте олигонуклеотид, конъюгаты олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению используются для лечения или предупреждения вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV, или паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, или рака печени, или метастазов в печени.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
2
Фиг. 1: иллюстрирует типичные конъюгаты антисмыслового олигонуклеотида, где данный олигонуклеоид либо представлен волнистой линией (А-Г), либо как «олигонуклеотид» (Д-З), либо как Т (И), а конъюгатные группировки, нацеленные на рецептор асиалогликопротеина, представляют собой трехвалентные N-ацетилгалактозаминные группировки. Соединения А-Г содержат дилизиновую разветвляющую молекулу, ПЭГ3 спейсер и три концевые GalNAc углеводные группировки. В соединении А и Б олигонуклеотид непосредственно присоединен к конъюгатной группировке, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, без линкера. В соединении В и Г олигонуклеотид непосредственно присоединен к конъюгатной группировке, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, через С6 линкер. Соединения Д-И содержат утраивающую разветвляющую молекулу, спейсеры варьирующей длины и структуры, и три концевые GalNAc углеводные группировки.
Фиг. 2: график, демонстрирующий ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) (А) и нокдаун PD-L1 как % от воздействия физиологическим раствором (Б) для соединений, протестированных в Примере 2, в связи с их положением на нуклеиновой кислоте-мишени. Клеточными линиями, в которых тестировали данное соединение, были  и
Фиг. 3: структурная формула трехвалентного GalNAc кластера (GN2). GN2 является полезным в настоящем изобретении в качестве конъюгатной группировки. Волнистая линия иллюстрирует сайт конъюгирования данного кластера, например, с С6 аминолинкером или непосредственно с олигонуклеотидом.
Фиг. 4: структурная формула CMP ID NO 766_2.
Фиг. 5: структурная формула CMP ID NO 767_2.
Фиг. 6: структурная формула CMP ID NO 768_2.
Фиг. 7: структурная формула CMP ID NO 769_2.
Фиг. 8: структурная формула CMP ID NO 770_2.
Фиг. 9: вестерн-блот, выявляющий экспрессию белка PD-L1 в печени от животных, индуцированных поли(IC), после обработки физиологическим раствором и указанными CMP ID NO. Каждый блот показывает голый олигонуклеотид относительно версии того же самого олигонуклеотида, конъюгированной с GalNAc, блот А) CMP ID NO 744_1 и 755_2, Б)  CMP ID NO 747_1 и 758_2, В) CMP ID NO 748_1 и 759_2, Г) CMP ID NO 752_1 и 763_2, и Д) CMP ID NO 753_1 и 764_2. Верхняя полоса представляет собой контроль загрузки - винкулин, нижняя полоса представляет собой белок PD-L1. Первая дорожка в каждом блоте демонстрирует мышей, обработанных физиологическим раствором, без индукции поли(IC). Данные мыши экспрессируют очень мало белка PD-L.
Фиг. 10: популяция одноядерных клеток в печени после обработки  носителем (группа 10 и 1),  ДНК-вакциной (группа 11 и 2),  антителом против PD-L1 (группа 12),  голым АСО (антисмысловой олигонуклеотид) против PD-L1  плюс ДНК-вакциной (группа 7) или  АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлена для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблица 18). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05; *** - Р меньше 0,001, и **** Р меньше 0,0001). А) представляет число Т-клеток в печени после обработки. Б) представляет долю Т-клеток CD4+, и В) представляет долю Т-клеток CD8+.
Фиг. 11: модуляция PD-L1-позитивных клеток в печени после обработки  носителем (группа 10 и 1),  ДНК-вакциной (группа 11 и 2),  антителом против PD-L1 (группа 12),  голым АСО против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или  АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлена для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблицу 19). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05 и **** - Р меньше 0,0001). А) представляет процентную долю Т-клеток CD8+, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки. Б) представляет процентную долю Т-клеток CD4+, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки, и В) представляет процентную долю В-клеток, которые экспрессируют PD-L1 в печени после обработки.
Фиг. 12: специфичные в отношении антигена HBV цитокин-секретирующие клетки CD8+ после обработки  носителем (группа 10 и 1),  ДНК-вакциной (группа 11 и 2),  антителом против PD-L1 (группа 12),  голым АСО против PD-L1 плюс ДНК-вакциной (группа 7) или  АСО против PD-L1, конъюгированным с GalNAc, плюс ДНК-вакциной (группа 8) представлены для каждой группы индивидуальных животных, и среднее значение показано для каждой группы вертикальной линией (см. Таблицу 20). Оценивали статистическую значимость между группой ДНК-вакцины и тремя группами обработки, и, при наличии, она показана * между группами (* - Р меньше 0,05). А) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ (интерферон-гамма) Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении антигена PreS2+S HBV, после обработки. Б) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении корового антигена HBV, после обработки, и В) представляет процентную долю секретирующих IFN-γ и TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа) Т-клеток CD8+ в печени, которые являются специфичными в отношении антигена PreS2+S HBV, после обработки.
Фиг. 13: ДНК HBV, HВsAg и HВeAg у мышей AAV/HBV после обработки антисмысловым CMP NO: 759_2 против PD-L1, конъюгированным с GalNAc , по сравнению с носителем . Вертикальная линия показывает конец обработки.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Олигонуклеотид
Термин «олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется таким образом, как обычно понятно специалисту, как молекула, содержащая два или более чем два ковалентно связанных нуклеозида. Такие ковалентно связанные нуклеозиды также могут называться молекулами нуклеиновой кислоты или олигомерами. Олигонуклеотиды обычно получают в лаборатории посредством твердофазного химического синтеза с последующей очисткой. При ссылке на последовательность олигонуклеотида, делается ссылка на последовательность или порядок группировок нуклеиновых оснований или их модификаций ковалентно связанных нуклеотидов или нуклеозидов. Олигонуклеотид по изобретению является искусственным, синтезируется химически и типично очищается или выделяется. Олигонуклеотид по изобретению может содержать один или более чем один модифицированный нуклеозид или нуклеотид.
Антисмысловые олигонуклеотиды
Термин «антисмысловой олигонуклеотид» в том виде, в котором он используется в данном документе, определяется как олигонуклеотид, способный модулировать экспрессию гена-мишени посредством гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, в частности с непрерывной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды по существу не являются двухцепочечными и, следовательно, не являются миРНК. Предпочтительно антисмысловые олигонуклеотиды по настоящему изобретению являются одноцепочечными.
Непрерывная нуклеотидная последовательность
Термин «непрерывная нуклеотидная последовательность» относится к области олигонуклеотида, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени. Данный термин используется в данном документе взаимозаменяемо с термином «непрерывная последовательность нуклеиновых оснований» и термином «последовательность олигонуклеотидного мотива». В некоторых воплощениях все нуклеотиды данного олигонуклеотида составляют непрерывную нуклеотидную последовательность. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность и, возможно, может содержать дополнительный(ные) нуклеотид(ды), например, область нуклеотидного линкера, которая может использоваться для присоединения функциональной группы к непрерывной нуклеотидной последовательности. Область нуклеотидного линкера может быть или может не быть комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.
Нуклеотиды
Нуклеотиды представляют собой структурные элементы олигонуклеотидов и полинуклеотидов и для целей настоящего изобретения включают и встречающиеся в природе, и не встречающиеся в природе нуклеотиды. В природе нуклеотиды, такие как нуклеотиды ДНК и РНК, содержат группировку сахара рибозы, группировку нуклеинового основания и одну или более чем одну фосфатную группу (которая отсутствует в нуклеозидах). Нуклеозиды и нуклеотиды также могут взаимозаменяемо называться «звеньями» или «мономерами».
Модифицированный нуклеозид
Термин «модифицированный нуклеозид» или «модификация нуклеозида» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к нуклеозидам, модифицированным по сравнению с эквивалентным нуклеозидом ДНК или РНК посредством введения одной или более чем одной модификации сахарной группировки или группировки (нуклеинового) основания. В предпочтительном воплощении модифицированный нуклеозид содержит модифицированную сахарную группировку. Термин «модифицированный нуклеозид» также может использоваться в данном документе взаимозаменяемо с термином «аналог нуклеозида» или модифицированные «звенья» или модифицированные «мономеры».
Модифицированная межнуклеозидная связь
Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» определяется так, как обычно понятно специалисту: как связи, отличные от фосфодиэфирных (РО) связей, которые ковалентно связывают вместе два нуклеозида. Нуклеотиды с модифицированными межнуклеозидными связями также называются «модифицированными нуклеотидами». В некоторых воплощениях модифицированная межнуклеозидная связь увеличивает устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе по сравнению с фосфодиэфирной связью. Для олигонуклеотидов, встречающихся в природе, межнуклеозидная связь включает фосфатные группы, создающие фосфодиэфирную связь между соседними нуклеозидами. Модифицированные межнуклеозидные связи являются особенно полезными в стабилизации олигонуклеотидов для применения in vivo, и они могут служить для защиты против нуклеазного расщепления в областях нуклеозидов ДНК или РНК в олигонуклеотиде по изобретению, например в пределах области гэпа (gap) гэпмерного олигонуклеотида, а также в областях модифицированных нуклеозидов.
В одном воплощении олигонуклеотид содержит одну или более чем одну межнуклеозидную связь, модифицированную от природного фосфодиэфира до связи, которая, например, является более устойчивой к нуклеазной атаке. Устойчивость к нуклеазе можно определять посредством инкубирования олигонуклеотида в сыворотке крови или посредством применения анализа устойчивости к нуклеазе (например, фосфодиэстеразе яда змеи (SVPD)), которые оба хорошо известны в данной области. Межнуклеозидные связи, которые способны усиливать устойчивость олигонуклеотида к нуклеазе, называются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или в его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются модифицированными. Будет понятно то, что в некоторых воплощениях нуклеозиды, которые связывают олигонуклеотид по изобретению с ненуклеотидной функциональной группой, такой как конъюгат, могут содержать фосфодиэфир. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности являются нуклеазоустойчивыми межнуклеозидными связями.
Модифицированные межнуклеозидные связи могут быть выбраны из группы, содержащей фосфоротиоат, дифосфоротиоат и боранофосфат. В некоторых воплощениях модифицированные межнуклеозидные связи, например, фосфоротиоатная, дифосфоротиоатная или боранофосфатная, являются совместимыми с рекрутированием олигосахаридом по изобретению РНКазы Н.
В некоторых воплощениях межнуклеозидная связь, такая как  фосфоротиоатная межнуклеозидная связь, содержит серу (S).
Фосфоротиоатная межнуклеозидная связь является особенно полезной из-за устойчивости к нуклеазе, полезной фармакокинетики и легкости получения. В некоторых воплощениях по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат, как, например, по меньшей мере 60%, как, например, по меньшей мере 70%, как, например, по меньшей мере 80% или как, например, по меньшей мере 90% межнуклеозидных связей в олигонуклеотиде или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи олигонуклеотида или его непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоат.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит одну или более чем одну нейтральную межнуклеозидную связь, в частности, межнуклеозидную связь, выбранную из фосфотриэфира, метилфосфоната, MMI, амида-3, формацеталя или тиоформацеталя.
2
2
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Дополнительные межнуклеозидные связи раскрываются в WO2009/124238 (включенной в данный документ посредством ссылки). В одном воплощении межнуклеозидная связь выбрана из линкеров, раскрытых в WO2007/031091 (включенной в данный документ посредством ссылки). В частности, межнуклеозидная связь может быть выбрана из -O-P(O)-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)-O-, -S-P(O)-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)-O-, -O-P(O)-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)-S-, -O-PO(R)-O-, 0-PO(OCH)-0-, -O-PO(NR)-O-, -O-PO(OCHCHS-R)-O-, -O-PO(BH)-O-, -O-PO(NHR)-O-, -O-P(O)-NR-, -NR-P(O)-O-, -NR-CO-O-, -NR-CO-NR-, и/или межнуклеозидный линкер может быть выбран из группы, состоящей: -O-CO-O-, -O-CO-NR-, -NR-CO-CH-, -O-CH-CO-NR-, -O-CH-CH-NR-, -CO-NR-CH-, -CH-NRCO-, -O-CH-CH-S-, -S-CH-CH-O-, -S-CH-CH-S-, -CH-SO-CH-, -CH-CO-NR-, -O-CH-CH-NR-CO -, -CH-NCH-O-CH-, где R выбран из водорода и C1-4-алкила.
Нуклеазоустойчивые связи, такие как фосфотиоатные связи, являются особенно полезными в областях олигонуклеотидов, способных рекрутировать нуклеазу, при формировании дуплекса с нуклеиновой кислотой-мишенью, таких как область G для гэпмеров или немодифицированная область нуклеозидов хэдмеров (headmer) и тэйлмеров (tailmer). Однако, фосфоротиоатные связи могут быть также полезными в областях, не рекрутирующих нуклеазу, и/или в областях, усиливающих аффинность, таких как области F и F' для гэпмеров, или в области модифицированных нуклеозидов хэдмеров и тэйлмеров.
Каждая из сконструированных областей может, однако, содержать межнуклеозидные связи, отличные от фосфоротиоатных, такие как фосфодиэфирные связи, в частности, в областях, где модифицированные нуклеозиды, такие как LNA (запертые нуклеиновые кислоты), защищают связь от нуклеазной деградации. Включение фосфодиэфирных связей, как, например, одной или двух связей, в частности между или рядом с модифицированными нуклеозидными звеньями (типично в областях, не рекрутирующих нуклеазу), может модифицировать биодоступность и/или биораспределение олигонуклеотида - см. WO2008/113832, включенную в данный документ посредством ссылки.
В одном воплощении все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. Предпочтительно все межнуклеозидные связи в олигонуклеотиде представляют собой фосфоротиоатные связи.
Нуклеиновое основание
Нуклеиновое основание включает пуриновую (например, аденин и гуанин) и пиримидиновую (например, урацил, тимин и цитозин) группировку, присутствующую в нуклеозидах и нуклеотидах, которые образуют водородные связи при гибридизации нуклеиновых кислот. В контексте настоящего изобретения термин нуклеиновое основание также охватывает модифицированные нуклеиновые основания, которые могут отличаться от встречающихся в природе нуклеиновых оснований, но являются функциональными во время гибридизации нуклеиновых кислот. В данном контексте термин «нуклеиновое основание» относится и к встречающимся в природе нуклеиновым основаниям, таким как аденин, гуанин, цитозин, тимин, урацил, ксантин и гипоксантин, также как и к не встречающимся в природе вариантам. Такие варианты, например, описываются в Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1.
В некоторых воплощениях группировка нуклеинового основания модифицируется заменой пурина или пиримидина на модифицированный пурин или пиримидин, такой как замещенный пурин или замещенный пиримидин, как, например, нуклеиновое основание, выбранное из изоцитозина, псевдоизоцитозина, 5-метилцитозина, 5-тиозолоцитозина, 5-пропинилцитозина, 5-пропинилурацила, 5-бромурацил-5-тиазолоурацила, 2-тиоурацила, 2'-тиотимидина, инозина, диаминопурина, 6-аминопурина, 2-аминопурина, 2,6-диаминопурина и 2-хлор-6-аминопурина.
Группировки нуклеиновых оснований могут быть указаны буквенным кодом для каждого соответствующего нуклеинового основания, например, A, T, G, C или U, где каждая буква возможно может включать модифицированные нуклеиновые основания с эквивалентной функцией. Например, в проиллюстрированных в качестве примеров олигонуклеотидах группировки нуклеиновых оснований выбраны из A, T, G, C и 5-метилцитозина. Возможно для гэпмеров LNA можно использовать 5-метилцитозин нуклеозидов LNA.
Модифицированный олигонуклеотид
Термин «модифицированный олигонуклеотид» описывает олигонуклеотид, содержащий один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром и/или модифицированными межнуклеозидными связями. Термин «химерный олигонуклеотид» представляет собой термин, который использовали в литературе для описания олигонуклеотидов с модифицированными нуклеозидами.
Комплементарность
Термин «комплементарность» описывает способность нуклеозидов/нуклеотидов к образованию пар оснований по Уотсону-Крику. Парами оснований по Уотсону-Крику являются гуанин (G)-цитозин (С) и аденин (А)-тимин (Т)/урацил (U). Будет понятно то, что олигонуклеотиды могут содержать нуклеозиды с модифицированными нуклеиновыми основаниями, например, 5-метилцитозин часто используется вместо цитозина, и термин «комплементарность» как таковой охватывает образование пар оснований по Уотсону-Крику между немодифицированными и модифицированными нуклеиновыми основаниями (см., например, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research, том 45, страница 2055 и Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1).
Термин «% комплементарности» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде) в процентах, которые, в данном положении, являются комплементарными (т.е. образуют пары оснований по Уотсону-Крику) в данном положении непрерывной нуклеотидной последовательности отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается подсчетом числа выровненных оснований, которые образуют пары между двумя последовательностями (при выравнивании с использованием последовательности-мишени 5'-3' и последовательности олигонуклеотида от 3' к 5'), деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100. При таком сравнении нуклеиновое основание/нуклеотид, который не выравнивается (не образует пару оснований), называется несоответствием.
Термин «полностью комплементарный» относится к 100%-ной комплементарности.
Следующее представляет собой пример олигонуклеотида (SEQ ID NO: 5), который является полностью комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени (SEQ ID NO: 772).
5'gcagtagagccaatta3' (SEQ ID NO:772)
3'cgtcatctcggttaat5' (SEQ ID NO: 5)
Идентичность
Термин «идентичность» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к числу нуклеотидов в процентах непрерывной нуклеотидной последовательности в молекуле нуклеиновой кислоты (например, в олигонуклеотиде), которые в данном положении являются идентичными (т.е. по их способности образовать пары оснований по Уотсону-Крику с комплементарным нуклеозидом) непрерывной нуклеотидной последовательности в данном положении отдельной молекулы нуклеиновой кислоты (например, нуклеиновой кислоты-мишени). Данная процентная доля рассчитывается посредством подсчета числа выровненных оснований, которые являются идентичными между двумя последовательностями, включая пробелы, деля на общее число нуклеотидов в олигонуклеотиде и умножая на 100.
Процент идентичности = (Соответствия × 100)/Длину выровненной области (с пробелами).
Гибридизация
m
m
d
d
Термин «осуществление гибридизации» или «гибридизуется» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как две нити нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень), образующие водородные связи между парами оснований на противоположных нитях, формируя, посредством этого, дуплекс. Аффинность связывания между двумя нитями нуклеиновой кислоты представляет собой силу гибридизации. Она часто описывается в показателях температуры плавления (T), определенной как температура, при которой половина олигонуклеотидов образует дуплекс с нуклеиновой кислотой-мишенью. При физиологических условиях T не является строго пропорциональной аффинности (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). Свободная энергия Гиббса в стандартном состоянии - ΔG° - является более точным представлением аффинности связывания и связана с константой диссоциации (K) реакции согласно уравнению ΔG° = -RTln(K), где R представляет собой газовую постоянную, и Т представляет собой абсолютную температуру. Следовательно, очень низкая ΔG° реакции между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью отражает сильную гибридизацию между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. ΔG° представляет собой энергию, связанную с реакцией, где концентрации в воде составляют 1 М, рН составляет 7, и температура составляет 37°С. Гибридизация олигонуклеотидов с нуклеиновой кислотой-мишенью представляет собой спонтанную реакцию, и для спонтанных реакций ΔG° меньше, чем ноль. ΔG° можно измерять экспериментально, например, посредством применения способа изотермической титрационной калориметрии (ITC), как описано в Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 и Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. Специалисту будет известно, что доступно имеющееся в продаже оборудование для измерений ΔG°. ΔG° также можно оценивать численно посредством применения модели ближайшего соседа, как описывается SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465, с использованием подходящим образом выведенных термодинамических параметров, описанных Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 и McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Для того чтобы иметь возможность модулирования их намеченной нуклеиновой кислоты-мишени посредством гибридизации, олигонуклеотиды по настоящему изобретению гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше -41,8 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 10-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях степень или сила гибридизации измеряется посредством свободной энергии Гиббса в стандартном состоянии - ΔG°. Олигонуклеотиды могут гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочными значениями ΔG° меньше интервала -41,8 кДж, как, например, меньше -62,8 кДж, как, например, меньше -83,7 кДж и как, например, меньше -104,6 кДж для олигонуклеотидов, которые имеют 8-30 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды гибридизуются с нуклеиновой кислотой-мишенью с оценочным значением ΔG° от -41,8 до -251 кДж, как, например, от -50,2 до -167,4 кДж, как, например, от -62,8 до -125,5 кДж или от -66,9 до 113 кДж, как, например, от -75,3 до -104,6 кДж.
Нуклеиновая кислота-мишень
Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота-мишень представляет собой нуклеиновую кислоту, которая кодирует PD-L1 млекопитающего и может представлять собой, например, ген, РНК, мРНК и пре-мРНК, зрелую мРНК или последовательность кДНК. Следовательно, данная мишень может называться нуклеиновая кислота-мишень PD-L1. Олигонуклеотид по изобретению, например, может быть нацелен на области экзонов PD-L1 млекопитающего, или, например, может быть нацелен на область интрона пре-мРНК PD-L1 (см. Таблицу 1).
Таблица 1: экзоны и интроны человеческого PD-L1
Экзонные области в пре-мРНК человеческого PD-L1 (SEQ ID NO 1)
Интронные области в пре-мРНК человеческого PD-L1 (SEQ ID NO 1)
ID
начало
конец
ID
начало
конец
e1
1
94
i1
95
5597
e2
5598
5663
i2
5664
6576
e3
6577
6918
i3
6919
12331
e4
12332
12736
i4
12737
14996
e5
14997
15410
i5
15411
16267
e6
16268
16327
i6
16328
17337
e7
17338
20064
Подходящим образом, нуклеиновая кислота-мишень кодирует белок PD-L1, в частности PD-L1 млекопитающего, такой как PD-L1 человека (см., например, Таблицы 2 и 3, в которых приводится ссылка на последовательности мРНК и пре-мРНК для человеческого, обезьяньего и мышиного PD-L1). В контексте настоящего изобретения пре-мРНК также считается нуклеиновой кислотой, которая кодирует белок.
В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 2 и 3 или их встречающихся в природе вариантов (например, последовательностей, кодирующих белок PD-L1 млекопитающего).
При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, происходящую из ДНК или РНК.
Для применения in vivo или in vitro олигонуклеотид по изобретению типично способен ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени PD-L1 в клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень PD-L1. Непрерывная последовательность нуклеиновых оснований олигонуклеотида по изобретению типично комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1 при измерении по длине олигонуклеотида, возможно, за исключением одного или двух несоответствий, и, возможно, исключая линкерные области на основе нуклеотидов, которые могут связывать олигонуклеотид с возможной функциональной группой, такой как конъюгат или другие некомплементарные концевые нуклеотиды (например, область D' или D''). Нуклеиновая кислота-мишень в некоторых воплощениях может представлять собой РНК или ДНК, такую как матричная РНК, как, например, зрелая мРНК или пре-мРНК. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК или ДНК, которая кодирует белок PD-L1 млекопитающего, такой как человеческий PD-L1, например, последовательность пре-мРНК человеческого PD-L1, такую как последовательность, раскрытая как SEQ ID NO 1, или последовательность человеческой мРНК с регистрационным номером NM_014143 NCBI (Национальный центр биотехнологической информации). Дополнительная информация по типичым нуклеиновым кислотам-мишеням приводится в Таблицах 2 и 3.
Таблица 2: информация по геному и сборке для PD-L1 между видами.
Вид
Хр.
Нить
Геномные координаты
Сборка
Номер доступа мРНК эталонной последователь-ности NCBI*
Начало
Конец
Человек
9
прям.
5450503
5470566
GRCh38:CM000671.2
NM_014143
Яванский макак
15
73560846
73581371
GCF_000364345.1
XM_005581779
Мышь
19
прям.
29367455
29388095
GRCm38:CM001012.2
NM_021893
Прям. - прямая нить. Геномные координаты дают последовательность пре-мРНК (геномная последовательность). Ссылка NCBI дает последовательность мРНК (последовательность кДНК).
* База данных эталонных последовательностей Национального центра биотехнологической информации представляет собой всеохватывающий, интегрированный, неизбыточный, хорошо аннотированный набор эталонных последовательностей, включающих геномные, последовательности транскриптов и белков. Она размещается на www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq.
Таблица 3: подробности последовательностей для PD-L1 между видами.
Вид
Тип РНК
Длина (нт)
SEQ ID NO
Человек
пре-мРНК
20064
1
Яванский макак
пре-мРНК ссылка GCF
20261
2
Яванский макак
пре-мРНК Внутренняя
20340
3
Мышь
пре-мРНК
20641
4
Последовательность-мишень
Термин «последовательность-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к последовательности нуклеотидов, присутствующей в нуклеиновой кислоте-мишени, которая содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая является комплементарной олигонуклеотиду по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень состоит из области на нуклеиновой кислоте-мишени, которая является комплементарной непрерывной нуклеотидной последовательности олигонуклеотида по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность-мишень длиннее, чем комплементарная последовательность одного олигонуклеотида, и, например, может представлять предпочтительную область нуклеиновой кислоты-мишени, на которую могут быть нацелены несколько олигонуклеотидов по изобретению.
Последовательность-мишень может представлять собой подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из а1-а149 (см. Таблицы 4). В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из экзона мРНК PD-L1, такого как экзон человеческой мРНК PD-L1, выбранный из группы, состоящей из e1, e2, e3, e4, e5, e6 и e7 (см. Таблицу 1 выше).
В некоторых воплощениях подпоследовательность представляет собой последовательность, выбранную из группы, состоящей из интрона мРНК PD-L1, такого как интрон человеческой мРНК PD-L1, выбранный из группы, состоящей из i1, i2, i3, i4, i5 и i6 (см. Таблицу 1 выше).
Олигонуклеотид по изобретению содержит непрерывную нуклеотидную последовательность, которая является комплементарной или гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью, такой как подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени, такой как последовательность-мишень, описанная в данном документе.
Данный олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из по меньшей мере 8 нуклеотидов, которая является комплементарной или гибридизуется с последовательностью-мишенью, присутствующей в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени. Непрерывная нуклеотидная последовательность (и, следовательно, последовательность-мишень) содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеотидов, как, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов, как, например, 12-25, как, например, 14-18 смежных нуклеотидов.
Клетка-мишень
Термин «клетка-мишень» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к клетке, которая экспрессирует нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых воплощениях клетка-мишень может находиться в условиях in vivo или in vitro. В некоторых вопощениях клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка грызуна, как, например, клетка мыши или клетка крысы, или клетку примата, как, например, клетка обезьяны или клетка человека.
В предпочтительных воплощениях клетка-мишень экспрессирует мРНК PD-L1, такую как пре-мРНК PD-L1 или зрелая мРНК PD-L1. Поли А хвост мРНК PD-L1 типично не принимается во внимание для нацеливания антисмыслового олигонуклеотида.
Вариант, встречающийся в природе
Термин «вариант, встречающийся в природе» относится к вариантам гена PD-L1 или транскриптам, которые происходят из тех же самых генетических локусов, что и нуклеиновая кислота-мишень, но могут отличаться, например, за счет вырожденности генетического кода, вызывающей множественность кодонов, кодирующих ту же самую аминокислоту, или благодаря альтернативному сплайсингу пре-мРНК, или присутствию полиморфизмов, таких как однонуклеотидные полиморфизмы и аллельные варианты. На основе присутствия достаточно комплементарной последовательности к олигонуклеотиду, олигонуклеотид по изобретению, следовательно, может быть нацелен на нуклеиновую кислоту-мишень и ее встречающиеся в природе варианты.
В некоторых воплощениях встречающиеся в природе варианты имеют по меньшей мере 95%, как, например, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1 млекопитающего, такой как нуклеиновая кислота-мишень, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO 1, 2 и 3.
В гене PD-L1 известны многочисленные однонуклеотидные полиморфизмы, например, однонуклеотидные полиморфизмы, раскрытые в следующей таблице (начало/эталонная последовательность человеческой пре-мРНК представляет собой SEQ ID NO 2).
Название варианта
Варианты аллелей
Минорный аллель
Частота минорного аллеля
Начало на SEQ ID NO: 1
rs73397192
G/A
A
0,10
2591
rs12342381
A/G
G
0,12
308
rs16923173
G/A
A
0,13
14760
rs2890658
C/A
A
0,16
14628
rs2890657
G/C
C
0,21
2058
rs3780395
A/G
A
0,21
14050
rs147367592
AG/-
-
0,21
13425
rs7023227
T/C
T
0,22
6048
rs2297137
G/A
A
0,23
15230
rs1329946
G/A
A
0,23
2910
rs5896124
-/G
G
0,23
2420
rs61061063
T/C
C
0,23
11709
rs1411263
T/C
C
0,23
8601
rs59906468
A/G
G
0,23
15583
rs6476976
T/C
T
0,24
21012
rs35744625
C/A
A
0,24
3557
rs17804441
T/C
C
0,24
7231
rs148602745
C/T
T
0,25
22548
rs4742099
G/A
A
0,25
20311
rs10815228
T/C
C
0,25
21877
rs58817806
A/G
G
0,26
20769
rs822342
T/C
T
0,27
3471
rs10481593
G/A
A
0,27
7593
rs822339
A/G
A
0,28
2670
rs860290
A/C
A
0,28
2696
rs822340
A/G
A
0,28
2758
rs822341
T/C
T
0,28
2894
rs12002985
C/G
C
0,28
6085
rs822338
C/T
C
0,28
1055
rs866066
C/T
T
0,28
451
rs6651524
A/T
T
0,28
8073
rs6415794
A/T
A
0,28
8200
rs4143815
G/C
C
0,28
17755
rs111423622
G/A
A
0,28
24096
rs6651525
C/A
A
0,29
8345
rs4742098
A/G
G
0,29
19995
rs10975123
C/T
T
0,30
10877
rs2282055
T/G
G
0,30
5230
rs4742100
A/C
C
0,30
20452
rs60520638
-/TC
TC
0,30
9502
rs17742278
T/C
C
0,30
6021
rs7048841
T/C
T
0,30
10299
rs10815229
T/G
G
0,31
22143
rs10122089
C/T
C
0,32
13278
rs1970000
C/A
C
0,32
14534
rs112071324
AGAGAG/-
AGAGAG
0,33
16701
rs2297136
G/A
G
0,33
17453
rs10815226
A/T
T
0,33
9203
rs10123377
A/G
A
0,36
10892
rs10123444
A/G
A
0,36
11139
rs7042084
G/T
G
0,36
7533
rs10114060
G/A
A
0,36
11227
rs7028894
G/A
G
0,36
10408
rs4742097
C/T
C
0,37
5130
rs1536926
G/T
G
0,37
13486
rs1411262
C/T
T
0,39
8917
rs7041009
G/A
A
0,45
12741
Модуляция экспрессии
Термин «модуляция экспрессии» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как общий термин для способности олигонуклеотида изменять количество PD-L1 по сравнению с количеством PD-L1 до введния данного олигонуклеотида. В качестве альтернативы, модуляцию экспрессии можно определять посредством ссылки на контрольный экспермент. Обычно понятно то, что контроль представляет собой индивида или клетку-мишень, обработанную композицией физиологического раствора, или индивида или клетку-мишень, обработанную ненацеленым олигонуклеотидом (имитация). Однако он также может представлять собой индивида, которого лечили стандартом лечения.
Одним типом модуляции является способность олигонуклеотида ингибировать, осуществлять понижающую регуляцию, уменьшать, подавлять, удалять, останавливать, блокировать, предотвращать, ослаблять, снижать, устранять или прекращать экспрессию PD-L1, например, посредством деградации мРНК или блокировки транскрипции. Другим типом модуляции является способность олигонуклеотида восстанавливать, увеличивать или усиливать экспрессию PD-L1, например, посредством репарации сайтов сплайсинга или предотвращения сплайсинга, или устранения или блокировки ингибирующих механизмов, таких как репрессия микроРНК.
Высокоаффинные модифицированные нуклеозиды
m
Высокоаффинный модифицированный нуклеозид преставляет собой модифицированный нуклеотид, который, при включении в олигонуклеотид, увеличивает аффинность олигонуклеотида в отношении его комплементарной мишени, например, при измерении по температуре плавления (T). Высокоаффинный модифицированный нуклеозид по настоящему изобретению предпочтительно приводит к увеличению температуры плавления от +0,5 до +12°С, более предпочтительно - от +1,5 до +10°С, и наиболее предпочтительно - от +3 до +8°С на модифицированный нуклеозид. В данной области известны многочисленные высокоаффинные модифицированные нуклеозиды, и они включают, например, многие 2'-замещенные нуклеозиды, а также запертые нуклеиновые кислоты (LNA) (см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 и Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).
Модификации сахара
Олигомер по изобретению может содержать один или более чем один нуклеозид, который имеет модифицированную сахарную группировку, т.е. модификацию сахарной группировки по сравнению с рибозной сахарной группировкой, находящейся в ДНК и РНК.
Были получены многочисленные нуклеозиды с модификацией рибозной сахарной группировки, главным образом, с целью улучшения определенных свойств олигонуклеотидов, таких как аффинность и/или нуклеазоустойчивость.
Такие модификации включают модификации, где модифицируется структура рибозного кольца, например, посредством замены на гексозное кольцо (HNA) или бициклическое кольцо, которое типично имеет бирадикальный мостик между углеродами С2 и С4 на рибозном кольце (LNA), или на несвязанное рибозное кольцо, у которого типично отсутствует связь между углеродами С2 и С3 (например, UNA). Другие нуклеозиды с модифицированным сахаром включают, например, бициклогексозные нуклеиновые кислоты (WO2011/017521) или трициклические нуклеиновые кислоты (WO 2013/154798). Модифицированные нуклеозиды также включают нуклеозиды, где сахарная группировка заменяется на несахарную группировку, например, в случае пептидных нуклеиновых кислот (PNA) или морфолинонуклеиновых кислот.
Модификации сахаров также включают модификации, сделанные посредством изменения замещающих групп на рибозном кольце на группы, отличные от водорода, или группы 2'-OH, находящейся в природе в нуклеозидах ДНК и РНК. Заместители, например, можно вводить в 2'-, 3'-, 4'- или 5'-положения. Нуклеозиды с модифицированными сахарными группировками также включают 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В самом деле, значительное внимание было потрачено на разработку 2'-замещенных нуклеозидов, и было обнаружено то, что многочисленные 2'-замещенные нуклеозиды имеют полезные свойства при включении в олигонуклеотиды, такие как повышенная устойчивость нуклеозидов и повышенная аффинность.
2'-Модифицированные нуклеозиды
Нуклеозид с 2'-модифицированным сахаром представляет собой нуклеозид, который имеет в положении 2' заместитель, отличный от Н или -ОН (2'-замещенный нуклеозид) или содержит 2'-связанный бирадикал и включает 2'-замещенные нуклеозиды и нуклеозиды LNA (связанные 2'-4' бирадикальным мостиком). Например, 2'-модифицированный сахар может обеспечивать повышенную аффинность связывания и/или повышенную нуклеазоустойчивость олигонуклеотида. Примерами 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов являются 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-фтор-ANA (F-ANA) нуклеозид. Относительно дополнительных примеров, пожалуйста, см., например, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443; Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213 и Deleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Ниже приводятся иллюстрации некоторых 2'-замещенных модифицированных нуклеозидов.
Нуклеозиды запертых нуклеиновых кислот (LNA)
Нуклеозиды LNA представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые содержат линкерную группу (именуемую бирадикал или мостик) между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеотида. Данные нуклеозиды также называются в литературе мостиковой нуклеиновой кислотой или бициклической нуклеиновой кислотой (BNA).
В некоторых воплощениях модифицированный нуклеозид или нуклеозиды LNA олигомера по изобретению имеют общую структуру формулы I или II:
a
a
b
где W выбран из -O-, -S-, -N(R)-, -C(RR)-, таким образом, что в некоторых воплощениях -О-; В обозначает нуклеиновое основание или модифицированную группировку нуклеинового основания;
Z обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 5'-концевую группу;
Z* обозначает межнуклеозидную связь с соседним нуклеозидом или 3'-концевую группу;
a
b
a
b
a
a
a
2
2
Х обозначает группу, выбранную из списка, состоящего из -C(RR)-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -O-, -Si(R)-, -S-, -SO-, -N(R)- и >C=Z.
a
b
a
b
a
b
2
2
В некоторых воплощениях Х выбран из группы, состоящей из: -O-, -S-, NH-, NRR, -CH-, CRR, -C(=CH)- и -C(=CRR)-.
В некоторых воплощениях Х представляет собой -О-.
a
b
a
b
a
a
a
2
2
Y обозначает группу, выбранную из группы, состоящей из -C(RR)-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -O-, -Si(R)-, -S-, -SO-, -N(R)- и >C=Z.
2
2
2
2
2
2
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b
a
b
a
В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -CH-, -C(RR)-, -CHCH-, -C(RR)-C(RR)-, -CHCHCH-, -C(RR)C(RR)C(RR)-, -C(R)=C(R)- и -C(R)=N-.
2
3
a
a
b
В некоторых воплощениях Y выбран из группы, состоящей из: -CH-, -CHR-, -CHCH-, CRR-.
a
b
a
b
a
a
a
2
2
или -Х-Y- совместно обозначают двухвалентную линкерную группу (также именуемую радикал), состоящую из 1, 2, 3 или 4 групп/атомов, выбранных из группы, состоящей из -C(RR)-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -O-, -Si(R)-, -S-, -SO-, -N(R)- и >C=Z.
2
3
2
2
2
3
2
2
3
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
a
b
a-
-
a
a
b
a
В некоторых воплощениях -Х-Y- обозначает бирадикал, выбранный из групп, состоящих из: -X-CH-, -X-CRR-, -X-CHR, -X-C(HCH), -O-Y-, -O-CH-, -S-CH-, -NH-CH-, -O-CHCH-, -CH-O-CH, -O-CH(CHCH)-, -O-CH-CH-, OCH-CH-CH-,-O-CHOCH-, -O-NCH-, -C(=CH)-CH-, -NR-CH-, N-O-CH, -S-CRR- и -S-CHR-.
2
3
В некоторых воплощениях -Х-Y- обозначает -O-CH- или -O-CH(CH)-,
a
где Z выбран из -О-, -S- и -N(R)-,
a
b
a
b
1-6
2-6
2-6
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
2
и R, и, при наличии R, каждый независимо выбран из водорода, возможно замещенного С-алкила, возможно замещенного С-алкенила, возможно замещенного С-алкинила, гидрокси, возможно замещенного С-алкокси, С-алкоксиалкила, С-алкенилокси, карбокси, С-алкоксикарбонила, С-алкилкарбонила, формила, арила, арилоксикарбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилоксикарбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С-алкил)амино-карбонила, амино-С-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С-алкил)амино-С-алкил-аминокарбонила, С-алкил-карбониламино, карбамидо, С-алканоилокси, сульфоно, С-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя R и R могут вместе обозначать возможно замещенный метилен (=СН), где для всех хиральных центров асимметрические группы могут находиться либо в R, либо в S ориентации,
1
2
3
5
5*
1-6
2-6
2-6
1-6
2-6
2-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
1-6
где R, R, R, R и R независимо выбраны из группы, состоящей из: водорода, возможно замещенного С-алкила, возможно замещенного С-алкенила, возможно замещенного С-алкинила, гидрокси, С-алкокси, С-алкоксиалкила, С-алкенилокси, карбокси, С-алкоксикарбонила, С-алкилкарбонила, формила, арила, арилокси-карбонила, арилокси, арилкарбонила, гетероарила, гетероарилокси-карбонила, гетероарилокси, гетероарилкарбонила, амино, моно- и ди(С-алкил)амино, карбамоила, моно- и ди(С-алкил)-амино-карбонила, амино-С-алкил-аминокарбонила, моно- и ди(С-алкил)амино-С-алкил-аминокарбонила, С-алкил-карбониламино, карбамидо, С-алканоилокси, сульфоно, С-алкилсульфонилокси, нитро, азидо, сульфанила, С-алкилтио, галогена, где арил и гетероарил возможно могут быть замещены, и где два геминальных заместителя могут вместе обозначать оксо, тиоксо, имино или возможно замещенный метилен.
1
2
3
5
5*
1-6
В некоторых воплощениях R, R, R, R и R независимо выбраны из С-алкила, такого как метил, и водорода.
1
2
3
5
5*
В некоторых воплощениях все R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода.
1
2
3
5
5*
5
5*
1-6
В некоторых воплощениях все R, R, R представляют собой атомы водорода, и либо R, либо R также представляет собой атом водорода, а другой из R и R отличается от атома водорода, как, например, представляет собой С-алкил, такой как метил.
а
b
В некоторых воплощениях R представляет собой либо атом водорода, либо метил. В некоторых воплощениях R, при наличии, представляет собой либо атом водорода, либо метил.
а
b
В некоторых воплощениях один или оба из R и R представляют собой атом водорода.
а
b
В некоторых воплощениях один из R и R представляет собой атом водорода, а другой отличается от атома водорода.
а
b
В некоторых воплощениях один из R и R представляет собой метил, а другой представляет собой атом водорода.
а
b
В некоторых воплощениях оба из R и R представляют собой метил.
2
1
2
3
5
5*
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН-, W представляет собой О, и все R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 99/014226, WO 00/66604, WO 98/039352 и WO 2004/046160, которые все включены в данный документ посредством ссылки, и они включают то, что обычно известно как нуклеозиды бета-О-окси LNA и альфа-L-окси LNA.
2
1
2
3
5
5*
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-СН-, W представляет собой О, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые включены тем самым посредством ссылки.
2
1
2
3
5
5*
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -NH-СН-, W представляет собой О, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды амино LNA раскрыты в WO 99/014226 и WO 2004/046160, которые тем самым включены посредством ссылки.
2
2
2
2
2
1
2
3
5
5*
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН-СН- или -О-СН-СН-СН-, W представляет собой О, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA раскрыты в WO 00/047599 и Morita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76, которые тем самым включены посредством ссылки, и включают то, что обычно известно как нуклеиновые кислоты, связанные 2'-O-4'C-этиленовым мостиком (ENA).
2
1-6
1
2
3
5
5*
5
5*
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-СН-, W представляет собой О, и все из R, R, R и один из R и R представляют собой атомы водорода, а другой из R и R отличается от атома водорода, как, например, Салкил, такой как метил. Такие 5'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO2007/134181, которая тем самым включена посредством ссылки.
a
b
a
b
1
2
3
5
5*
5
5*
1-6
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CRR, где один или оба из R и R отличаются от атома водорода, как, например, метил, W представляет собой О, и все из R, R, R и один из R и R представляют собой атом водорода, а другой из R и R отличается от атома водорода, как, например, Салкил, такой как метил. Такие бис-модифицированные нуклеозиды LNA раскрыты в WO2010/077578, которая тем самым включена в данный документ посредством ссылки.
2
3
2
3
a
1
2
3
5
5*
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CHOCH)- (2'O-метоксиэтилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81).  В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CHCH) - (2'O-этилбициклическая нуклеиновая кислота - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CНR, W представляет собой О, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 10036698 и WO 07090071, которые обе тем самым включены посредством ссылки.
2
3
1
2
3
5
5*
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CН(СНОСН)-, W представляет собой О, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды LNA также известны в данной области как циклические МОЕ (сМОЕ) и раскрыты в WO 07090071.
3
2
2
3
1
2
3
5
5*
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH(CH)- либо в R-, либо в S-конфигурации. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-CH-O-CH- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CН(СН)-, W представляет собой О, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие 6'-метилнуклеозиды LNA также известны в данной области как сЕТ нуклеозиды и могут представлять собой либо (S)cET, либо (R)cET стереоизомеры, как раскрыто в WO 07090071 (бета-D) и WO 2010/036698 (альфа-L), которые оба тем самым включены посредством ссылки).
a
b
a
b
1
2
3
5
5*
a
b
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -О-CRR-, в котором ни один из R или R не является атомом водорода, W представляет собой О, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях и R, и R представляют собой метил. Такие 6'-двухзамещенные нуклеозиды LNA раскрыты в WO 2009006478, которая тем самым включена посредством ссылки.
a
1
2
3
5
5*
a
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -S-CHR-, W представляет собой О, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие 6'-замещенные нуклеозиды тио LNA раскрыты в WO 11156202, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях 6'-замещенных тио LNA R представляет собой метил.
a
b
1
2
3
5
5*
2
2
2
3
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -C(=CH2)-C(RR)-, как, например, -C(=CH)-CH- или -C(=CH)-CH(CH)-, W представляет собой O, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. Такие нуклеозиды винилкарбо LNA раскрыты в WO 08154401 и WO 09067647, которые обе тем самым включены посредством ссылки.
a
1
2
3
5
5*
a
a
a
1
2
3
5
5*
a
1-6
3
1-6
В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(-OR)-, W представляет собой O, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R представляет собой Cалкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как N-замещенные LNA и раскрываются в WO 2008/150729, которая тем самым включена посредством ссылки. В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- вместе обозначает двухвалентную линкерную группу -O-NR-CH- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). В некоторых воплощениях бирадикал -X-Y- представляет собой -N(R)-, W представляет собой O, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R представляет собой Cалкил, такой как метил.
5
5*
5
5*
1
2
3
a
1-6
В некоторых воплощениях один или оба из R и R представляют собой атом водорода, и, при замещении, другой из R и R представляет собой Cалкил, такой как метил. В таком воплощении все из R, R, R могут представлять собой атомы водорода, и бирадикал -X-Y- может быть выбран из -O-CH2- или -O-C(HCR)-, такого как -O-C(HCH3)-.
a
b
a
b
1
2
3
5
5*
a
2
2
1-6
В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -CRR-O-CRR-, такой как CH-O-CH-, W представляет собой O, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R представляет собой Cалкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как конформационно ограниченные нуклеотиды (CRN) и раскрываются в WO 2013036868, которая тем самым включена посредством ссылки.
a
b
a
b
1
2
3
5
5*
a
2
2
1-6
В некоторых воплощениях бирадикал представляет собой -O-CRR-O-CRR-, такой как O-CH-O-CH-, W представляет собой O, и все из R, R, R, R и R представляют собой атомы водорода. В некоторых воплощениях R представляет собой Cалкил, такой как метил. Такие нуклеозиды LNA также известны как нуклеотиды СОС и раскрываются в Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238, которая тем самым включена посредством ссылки.
Будет понятно то, что, если не определено, нуклеозиды LNA могут находиться в бета-D или альфа-L стереоизоформе.
Некоторые примеры нуклеозидов LNA представлены на Схеме 1.
Схема 1
Как проиллюстрировано в Примерах, в предпочтительных воплощениях изобретения нуклеозиды LNA в олигонуклеотидах представляют собой нуклеозиды бета-D-окси-LNA.
Деградация, опосредованная нуклеазой
Термин «деградация, опосредованная нуклеазой» относится к олигонуклеотиду, способному опосредовать деградацию комплементарной нуклеотидной последовательности при образовании дуплекса с такой последовательностью.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид может функционировать посредством деградации нуклеиновой кислоты-мишени, опосредованной нуклеазой, где олигонуклеотиды по изобретению способны рекрутировать нуклеазу, в частности, эндонуклеазу, предпочтительно эндорибонуклеазу (РНКазу), такую как РНКаза Н. Примерами конструкций олигонуклеотидов, которые работают посредством механизмов, опосредованных нуклеазой, являются олигонуклеотиды, которые типично содержат область из по меньшей мере 5 или 6 нуклеозидов ДНК и фланкированы на одной стороне или на обеих сторонах нуклеозидами, увеличивающими аффинность, например, гэпмеры, хэдмеры и тэйлмеры.
Активность и рекрутирование РНКазы Н
Термин «активность РНКазы Н антисмыслового олигонуклеотида» относится к его способности при нахождении в дуплексе с комплементарной молекулой РНК рекрутировать РНКазу Н. В WO 01/23613 предложены способы in vitro для определения активности РНКазы Н, которые можно использовать для определения способности рекрутировать РНКазу Н. Типично олигонуклеотид считается способным рекрутировать РНКазу Н, если он, при предоставлении с комплементарной последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени, имеет исходную скорость, измеренную в пмоль/л/мин, по меньшей мере 5%, как, например, по меньшей мере 10% или больше, чем 20% от исходной скорости, определенной при использовании олигонуклеотида, имеющего такую же последовательность оснований, что и тестируемый модифицированный олигонуклеотид, но содержащего только мономеры ДНК с фосфоротиоатными связями между всеми мономерами в олигонуклеотиде, и с использованием методологии, предложенной в Примерах 91-95 WO 01/23613 (включенной тем самым посредством ссылки).
Гэпмер
Термин «гэпмер» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит область олигонуклеотидов (гэп), рекрутирующую РНКазу Н, которая фланкирована 5' и 3' областями (фланги или крылья), которые содержат один или более чем один модифицированный нуклеозид, усиливающий аффинность. В данном документе описываются разные конструкции гэпмеров, и они характеризуются по их способности рекрутировать РНКазу Н. Хэдмеры и тэйлмеры представляют собой олигонуклеотиды, способные рекрутировать РНКазу Н, где отсутствует один из флангов, т.е. только один из концов олигонуклеотида содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность. Для хэдмеров отсутстует 3'-фланг (т.е. 5'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность), и для тэйлмеров отсутстует 5'-фланг (т.е. 3'-фланг содержит модифицированные нуклеозиды, усиливающие аффинность).
Гэпмер LNA
Термин «гэпмер LNA» относится к гэпмерному олигонуклеотиду, в котором по меньшей мере один из модифицированных нуклеозидов, усиливающих аффинность, представляет собой нуклеозид LNA.
Гэпмер со смешанными крыльями
Термин «гэпмер со смешанными крыльями» или «гэпмер со смешанными флангами» относится к гэпмеру LNA, в котором по меньшей мере одна фланговая область содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, не являющийся LNA, такой как по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, такой как, например, нуклеозид(ды) 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-РНК и 2'-F-ANA. В некоторых воплощениях гэпмер со смешанными крыльями имеет один фланг, который содержит только нуклеозиды LNA (например, 5' или 3'), и другой фланг (3' или 5' соответственно) содержит 2'-замещенный(ные) модифицированный(ные) нуклеозид(ды) и возможно нуклеозиды LNA.
Олигонуклеотид с разорванным гэпом
Термин «олигонуклеотид с разорванным гэпом» используется по отношению к гэпмеру, способному поддерживать рекрутирование РНКазы Н, даже несмотря на то, что область гэпа разрывается нуклеозидом, не рекрутирующим РНКазу Н (нуклеозидом, разрывающим гэп, Е), таким образом, что область гэпа содержит меньше, чем 5 последовательных нуклеозидов ДНК. Нуклеозиды, не рекрутирующие РНКазу Н, представляют собой, например, нуклеозиды в 3'-эндоконформации, такие как LNA, где мостик между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеозида находится в бета-конформации, как, например, нуклеозид бета-D-окси LNA или ScET. Способность олигонуклеотида с разорванным гэпом рекрутировать РНКазу Н типично является специфичной в отношении последовательности или даже соединения - см. Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487, в которой раскрыты «олигонуклеотиды с разорванным гэпом», которые рекрутируют РНКазу Н, которые в некоторых случаях обеспечивает более специфичное расщеплениее РНК-мишени.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению представляет собой олигонуклеотид с разорванным гэпом. В некоторых воплощениях олигонуклеотид с разорванным гэпом содержит 5'-фланг (F), гэп (G) и 3'-фланг (F'), где гэп разорван нуклеозидом, не рекрутирующим РНКазу Н (нуклеозидом, разрывающим гэп, Е), таким образом, что гэп содержит по меньшей мере 3 или 4 последовательных нуклеозида ДНК. В некоторых воплощениях нуклеозид, разрывающий гэп (Е), представляет собой нуклеозид LNA, где мостик между C2' и C4' рибозного сахарного кольца нуклеозида находится в бета-конформации, и он размещается в пределах области гэпа таким образом, что нуклеозид LNA, разрывающий гэп, фланкирован 5' и 3' по меньшей мере 3(5') и 3(3') или по меньшей мере 3(5') и 4(3'), или по меньшей мере 4(5') и 3(3') нуклеозидами ДНК, и где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.
Олигонуклеотид с разорванным гэпом может быть представлен следующими формулами:
1-7
3-4
1
3-4
1-7
F-G-E-G-F'; в частности F-G-E-G-F'
1-3
1-7
3-4
1
3-4
1-7
D'-F-G-F', в частности D'-F- G-E-G-F'
1-7
3-4
1
3-4
1-7
1-3
F-G-F'-D'', в частности F- G-E-G-F'-D''
1-3
1-7
3-4
1
3-4
1-7
1-3
D'-F-G-F'-D'', в частности D'-F- G-E-G-F'-D''
Где области D' и D'' являются такими, как описано в разделе «Конструкция гэпмера».
В некоторых воплощениях нуклеозид, разрывающий гэп (Е), представляет собой бета-D-окси LNA или ScET, или другие нуклеозиды бета-LNA, показанные на Схеме 1).
Конъюгат
Термин «конъюгат» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится к олигонуклеотиду, который ковалентно связан с ненуклеотидной группировкой (конъюгатная группировка или область С, или третья область), также именуемому конъюгатом олигонуклеотида.
Конъюгирование олигонуклеотида по изобретению с одной или более чем одной ненуклеотидной группировкой может улучшать фармакологию данного олигонуклеотида, например, посредством влияния на активность, клеточное распределение, клеточное поглощение или стабильность олигонуклеотида. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка нацеливает олигонуклеотид в печень. В то же самое время конъюгат служит для уменьшения активности олигонуклеотида в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями, например, активность вне мишени или активность в типах клеток, тканях или органах, не являющихся мишенями. В одном воплощении изобретения конъюгат олигонуклеотида по изобретению демонстрирует улучшенное ингибирование PD-L1 в клетке-мишени по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. В другом воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретнию имеет улучшенное клеточное распределение между печенью и другими органами, такими как селезенка или почки (т.е. больше конъюгированного олигонуклеотида поступает в печень, чем в селезенку или в почки), по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом. В другом воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретнию демонстрирует улучшенное клеточное поглощение в печень конъюгата олигонуклеотида по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом.
В WO 93/07883 и WO 2013/033230 предложены подходящие конъюгатные группировки, которые тем самым являются включенными посредством ссылки. Дополнительными подходящими конъюгатными группировками являются группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr). В частности, подходящими для связывания с ASGPr являются трехвалентные N-ацетилгалактозаминные конъюгатные группировки, см., например, WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620 (включенные тем самым посредством ссылки). Конъюгатная группировка является по существу частью конъюгатов антисмысловых олигонуклеотидов, которая не состоит из нуклеиновых кислот.
Конъюгаты олигонуклеотидов и их синтез также были описаны во всеохватывающих обзорах Manoharan в Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 и Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте.
В одном воплощении ненуклеотидная группировка (конъюгатная группировка) выбрана из группы, состоящей из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов (например, бактериальных токсинов), витаминов, вирусных белков (например, капсидов) или их комбинаций.
Линкеры
Связка или линкер представляет собой соединение между двумя атомами, которое связывает одну химическую группу или интересующий сегмент с другой химической группой или интересующим сегментом посредством одной или более чем одной ковалентной связи. Конъюгатные группировки могут присоединяться к олигонуклеотиду непосредственно или через связывающую группировку (например, линкер или связку). Линкеры служат для ковалентного присоединения третьей области, например, конъюгатной группировки (области С), к первой области, например, олигонуклеотиду или непрерывной нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени  (область А).
В некоторых воплощениях изобретения конъюгат или конъюгат олигонуклеотида по изобретению возможно может содержать линкерную область (вторая область или область В, и/или область Y), которая располагается между олигонуклеотидом или непрерывной нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (область А или первая область), и конъюгатной группировкой (область С или третья область).
Область В относится к биорасщепляемым линкерам, содержащим или состоящим из физиологически лабильной связи, которая является расщепляемой при условиях, которые обычно встречаются или являются аналогичными условиям, которые встречаются в организме млекопитающего. Условия, при которых физиологически лабильные линкеры подвергаются химическому превращению (например, расщеплению), включают такие химические условия, как рН, температура, окислительные или восстановительные условия или агенты и концентрация соли, обнаруженные или аналогичные условиям, встречающимся в клетках млекопитающих. Внутриклеточные условия у млекопитающих также включают присутствие ферментативной активности, обычно присутствующей в клетке млекопитающего, как, например, от протеолитических ферментов или гидролитических ферментов, или нуклеаз. В одном воплощении биорасщепляемый линкер чувствителен к расщеплению нуклеазой S1. В предпочтительном воплощении нуклеазочувствительный линкер содержит от 1 до 10 нуклеозидов, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов, более предпочтительно - от 2 до 6 нуклеозидов, и наиболее предпочтительно - от 2 до 4 связанных нуклеозидов, содержащих по меньшей мере две последовательные фосфодиэфирные связи, как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных фосфодиэфирных связей. Предпочтительно нуклеозидами являются ДНК или РНК. Биорасщепляемые линкеры, содержащие фосфодиэфир, более подробно описываются в WO 2014/076195 (включенной тем самым посредством ссылки).
Область Y относится к линкерам, которые не обязательно являются биорасщепляемыми, но, главным образом, служат для ковалентного присоединения конъюгатной группировки (области С или третьей области) к олигонуклеотиду или непрерывной нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени (области А или первой области). Линкеры области Y могут содержать структуру цепи или олигомер из повторяющихся звеньев, такой как этиленгликоль, аминокислотные звенья или аминоалкильные группы. Конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению могут быть сконструированы из следующих элементов областей: A-C, A-B-C, A-B-Y-C, A-Y-B-C или A-Y-C. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу.
Лечение
Термин «лечение» в том виде, в котором он используется в данном документе, относится как к лечению существующего заболевания (например, заболевания или расстройства, на которые дается ссылка в данном документе), так и к предупреждению заболевания, т.е. профилактике. Следовательно, будет понятно, что лечение в том виде, в котором на него дается ссылка в данном документе, в некоторых воплощениях может быть профилактическим.
Восстановление иммунного ответа против патогенов
Иммунный ответ подразделяется на врожденный и адаптивный иммунный ответ. Врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифичный ответ. Адаптивный иммунный ответ активируется врожденным иммунным ответом и является высокоспецифичным по отношению к конкретному патогену. При презентации антигена, происходящего из патогена, на поверхности антигенпрезентирующих клеток иммунные клетки адаптивного иммунного ответа (т.е. Т- и В-лимфоциты) активируются посредством их антигенспецифичных рецепторов, приводя к патогенспецифичному иммунному ответу и развитию иммунологической памяти. Хронические вирусные инфекции, такие как HBV и HCV, ассоциированы с исчерпанием Т-клеток, характеризуемым неотвечаемостью вирусоспецифичных Т-клеток. Исчерпание Т-клеток хорошо изучено, относительно обзора см., например, Yi et al 2010 Immunology 129, 474-481. Хронические вирусные инфекции также ассоциированы с пониженной функцией NK-клеток, которые являются врождеными иммунными клетками. Усиление иммунного ответа против вирусов является важным для клиренса хронической инфекции. Восстановление иммунного ответа против патогенов, опосредованного Т-клетками и NK-клетками, можно оценивать посредством измерения пролиферации, секреции цитокинов и цитолитической функции (Dolina et al. 2013 Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2 e72 и Пример 6 в данном документе).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к применению антисмысловых олигонуклеотидов, их конъюгатов и содержащих их фармацевтических композиций для восстановления иммунного ответа против патогенов, которые инфицировали животное, в частности человека. Конъюгаты антисмысловых олигонуклеотидов по настоящему изобретению являются особенно полезными против патогенов, которые инфицировали печень, в частности, против хронических инфекций печени, подобных HBV. Данные конъюгаты обеспечивают таргетное распределение олигонуклеотидов и предотвращают системный нокдаун нуклеиновой кислоты-мишени.
Олигонуклеотиды по изобретению
Данное изобретение относится к олигонуклеотидам, способным модулировать экспрессию PD-L1. Модуляция может достигаться гибридизацией с нуклеиновой кислотой-мишенью, кодирующей PD-L1, или с той, которая участвует в регуляции PD-L1. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой последовательность PD-L1 млекопитающего, такую как последовательность, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3. Нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой пре-мРНК, мРНК или любую последовательность РНК, экспрессируемую из клетки млекопитающего, которая поддерживает экспрессию или регуляцию PD-L1.
Олигонуклеотид по изобретению представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, который нацелен на PD-L1.
В одном аспекте изобретения олигонуклеотиды по изобретению конъюгированы с конъюгатной группировкой, в частности, с конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен модулировать экспрессию мишени посредством осуществления ее ингибирования или понижающей регуляции. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере 20% по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени, более предпочтительно по меньшей мере 30%-ное, 40%-ное, 50%-ное, 60%-ное, 70%-ное, 80%-ное или 90%-ное ингибирование по сравнению с нормальным уровнем экспрессии мишени. Предпочтительно такая модуляция дает ингибирование экспрессии по меньшей мере 20% по сравнению с уровнем экспрессии при заражении клетки или организма инфекционным агентом, или при обработке агентом, имитирующим заражение инфекционным агентом (например, поли I:C или LPS (липополисахарид)), более предпочтительно по меньшей мере 30%-ное, 40%-ное, 50%-ное, 60%-ное, 70%-ное, 80%-ное или 90%-ное ингибирование по сравнению с с уровнем экспрессии при заражении клетки или организма инфекционным агентом, или при обработке агентом, имитирующим заражение инфекционным агентом (например, поли I:C или LPS). В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии мРНК PD-L1 по меньшей мере на 60% или 70% in vitro с использованием клеток KARPAS-299 или ТНР1. В некоторых воплощениях соединения по изобретению могут быть способны ингибировать уровни экспрессии белка PD-L1 по меньшей мере на 50% in vitro с использованием клеток KARPAS-299 или ТНР1. Подходящим образом в примерах предложены анализы, которые можно использовать для измерения РНК PD-L1 (например, Пример 1). Модуляция мишени запускается гибридизацией между непрерывной нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида и нуклеиновой кислотой-мишенью. В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит несоответствия между данным олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью. Несмотря на несоответствия гибридизация с нуклеиновой кислотой-мишенью все еще может быть достаточной для демонстрации желательной модуляции экспрессии PD-L1. Пониженная аффинность связывания, происходящая из-за несоответствий, преимущественно может компенсироваться большим числом нуклеотидов в олигонуклеотиде и/или большим числом модифицированных нуклеозидов, способных увеличивать аффинность связывания с мишенью, таких как 2'-модифицированные нуклеозиды, включая LNA, присутствующих в пределах последовательности олигонуклеотида.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен восстанавливать патогенспецифичные Т-клетки. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению способны увеличивать число патогенспецифичных Т-клеток по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70% по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. В одном воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HBV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. Подходящим образом, в данных примерах предложены анализы, которые можно использовать для измерения HBV-специфичных Т-клеток (например, пролиферация Т-клеток, секреция цитокинов и цитолитическая активность). В другом воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HСV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения. В другом воплощении антисмысловой олигонуклеотид или конъюгат по изобретению способен увеличивать уровень HDV-специфичных Т-клеток по сравнению с необработанными контролями или контролями, обработанными стандартом лечения.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид по изобретению способен уменьшать уровни HBsAg у животного или человека. В некоторых воплощениях олигонуклеотиды по изобретению способны уменьшать уровни HВsAg по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, 90% или 95% по сравнению с уровнем до обработки. Наиболее предпочтительно олигонуклеотиды по изобретению способны достигать сероконверсии HВsAg у животного или человека, иницированного HBV.
Один аспект настоящего изобретения относится к антисмысловому олигонуклеотиду, который содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1.
В некоторых воплощениях данный олигонуклеотид содержит непрерывную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% комплементарной, как, например, по меньшей мере на 91%, как, например, по меньшей мере на 92%, как, например, по меньшей мере на 93%, как, например, по меньшей мере на 94%, как, например, по меньшей мере на 95%, как, например, по меньшей мере на 96%, как, например, по меньшей мере на 97%, как, например, по меньшей мере на 98% или на 100% комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени.
В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению или его непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарным (на 100% комплементарным) области нуклеиновой кислоты-мишени, или в некоторых воплощениях может содержать одно или два несоответствия между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, с полной (или 100%-ной) комплементарностью с областью нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является на 100% комплементарной соответствующей области нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, 100%-ной комплементарностью с соответствующей областью нуклеиновой кислоты-мишени, где непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, выбранной из группы, состоящей из положения 371-3068, 5467-12107 и 15317-19511 на SEQ ID NO: 1. В другом воплощении подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из положения 371-510, 822-1090, 1992-3068, 5467-5606, 6470-12107, 15317-15720, 15317-18083, 18881-19494 и 1881-19494 на SEQ ID NO: 1. В предпочтительном воплощении подпоследовательность нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из положения 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 и 15690-15735 на SEQ ID NO: 1.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида содержит непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью, как, например, 100%-ной комплементарностью с соответствующей областью нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующей в SEQ ID NO: 1, где область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из областей от а1 до а449 в Таблице 4.
Таблица 4: области SEQ ID NO 1, на которые может осуществляться нацеливание с использованием олигонуклеотида по изобретению
Обл. a
Положение в SEQ ID NO 1
Длина
Обл. a
Положение вSEQ ID NO 1
Длина
Обл. a
Положение вSEQ ID NO 1
Длина
от
до
от
до
от
до
a1
51
82
32
a151
6994
7020
27
a301
13092
13115
24
a2
87
116
30
a152
7033
7048
16
a302
13117
13134
18
a3
118
133
16
a153
7050
7066
17
a303
13136
13169
34
a4
173
206
34
a154
7078
7094
17
a304
13229
13249
21
a5
221
287
67
a155
7106
7122
17
a305
13295
13328
34
a6
304
350
47
a156
7123
7144
22
a306
13330
13372
43
a7
354
387
34
a157
7146
7166
21
a307
13388
13406
19
a8
389
423
35
a158
7173
7193
21
a308
13408
13426
19
a9
425
440
16
a159
7233
7291
59
a309
13437
13453
17
a10
452
468
17
a160
7300
7333
34
a310
13455
13471
17
a11
470
484
15
a161
7336
7351
16
a311
13518
13547
30
a12
486
500
15
a162
7353
7373
1
a312
13565
13597
33
a13
503
529
27
a163
7375
7412
38
a313
13603
13620
18
a14
540
574
35
a164
7414
7429
16
a314
13630
13663
34
a15
576
649
74
a165
7431
7451
21
a315
13665
13679
15
a16
652
698
47
a166
7453
7472
20
a316
13706
13725
20
a17
700
750
51
a167
7474
7497
24
a317
13727
13774
48
a18
744
758
15
a168
7517
7532
16
a318
13784
13821
38
a19
774
801
28
a169
7547
7601
55
a319
13831
13878
48
a20
805
820
16
a170
7603
7617
15
a320
13881
13940
60
a21
827
891
65
a171
7632
7647
16
a321
13959
14013
55
a22
915
943
29
a172
7649
7666
18
a322
14015
14031
17
a23
950
982
33
a173
7668
7729
62
a323
14034
14049
16
a24
984
1000
17
a174
7731
7764
34
a324
14064
14114
51
a25
1002
1054
53
a175
7767
7817
51
a325
14116
14226
111
a26
1060
1118
59
a176
7838
7860
23
a326
14229
14276
48
a27
1124
1205
82
a177
7862
7876
15
a327
14292
14306
15
a28
1207
1255
49
a178
7880
7944
65
a328
14313
14384
72
a29
1334
1349
16
a179
7964
8012
49
a329
14386
14408
23
a30
1399
1425
27
a180
8028
8072
45
a330
14462
14481
20
a31
1437
1458
22
a181
8086
8100
15
a331
14494
14519
26
a32
1460
1504
45
a182
8102
8123
22
a332
14557
14577
21
a33
1548
1567
20
a183
8125
8149
25
a333
14608
14628
21
a34
1569
1586
18
a184
8151
8199
49
a334
14646
14668
23
a35
1608
1662
55
a185
8218
8235
18
a335
14680
14767
88
a36
1677
1700
24
a186
8237
8276
40
a336
14765
14779
15
a37
1702
1721
20
a187
8299
8344
46
a337
14815
14844
30
a38
1723
1745
23
a188
8346
8436
91
a338
14848
14925
78
a39
1768
1794
27
a189
8438
8470
33
a339
14934
14976
43
a40
1820
1835
16
a190
8472
8499
28
a340
14978
15009
32
a41
1842
1874
33
a191
8505
8529
25
a341
15013
15057
45
a42
1889
1979
91
a192
8538
8559
22
a342
15064
15091
28
a43
1991
2011
21
a193
8562
8579
18
a343
15094
15140
47
a44
2013
2038
26
a194
8581
8685
105
a344
1514
15165
17
a45
2044
2073
30
a195
8688
8729
42
a345
15162
15182
21
a46
2075
2155
81
a196
8730
8751
22
a346
15184
15198
15
a47
2205
2228
24
a197
8777
8800
24
a347
15200
15221
22
a48
2253
2273
21
a198
8825
8865
41
a348
15232
15247
16
a49
2275
2303
29
a199
8862
8894
33
a349
15250
15271
22
a50
2302
2333
32
a200
8896
8911
16
a350
15290
15334
45
a51
2335
2366
32
a201
8938
8982
45
a351
15336
15369
34
a52
2368
2392
25
a202
8996
9045
50
a352
15394
15416
23
a53
2394
2431
38
a203
9048
9070
23
a353
15433
15451
19
a54
2441
2455
15
a204
9072
9139
68
a354
15453
15491
39
a55
2457
2494
38
a205
9150
9168
19
a355
15496
15511
16
a56
2531
2579
49
a206
9170
9186
17
a356
15520
15553
34
a57
2711
2732
22
a207
9188
9202
15
a357
15555
15626
72
a58
2734
2757
24
a208
9204
9236
33
a358
15634
15652
19
a59
2772
2786
15
a209
9252
9283
32
a359
15655
15688
34
a60
2788
2819
32
a210
9300
9331
32
a360
15690
15735
46
a61
2835
2851
17
a211
9339
9354
16
a361
15734
15764
31
a62
2851
2879
29
a212
9370
9398
29
a362
15766
15787
22
a63
2896
2912
17
a213
9400
9488
89
a363
15803
15819
17
a64
2915
2940
26
a214
9490
9537
48
a364
15846
15899
54
a65
2944
2973
30
a215
9611
9695
85
a365
15901
15934
34
a66
2973
2992
20
a216
9706
9721
16
a366
15936
15962
27
a67
2998
3016
19
a217
9723
9746
24
a367
15964
15985
22
a68
3018
3033
16
a218
9748
9765
18
a368
15987
16023
37
a69
3036
3051
16
a219
9767
9788
22
a369
16025
16061
37
a70
3114
3139
26
a220
9794
9808
15
a370
16102
16122
21
a71
3152
3173
22
a221
9812
9859
48
a371
16134
16183
50
a72
3181
3203
23
a222
9880
9913
34
a372
16185
16281
97
a73
3250
3271
22
a223
9923
9955
33
a373
16283
16298
16
a74
3305
3335
31
a224
9966
10007
42
a374
16305
16323
19
a75
3346
3363
18
a225
10009
10051
43
a375
16325
16356
32
a76
3391
3446
56
a226
10053
10088
36
a376
16362
16404
43
a77
3448
3470
23
a227
10098
10119
22
a377
16406
16456
51
a78
3479
3497
19
a228
10133
10163
31
a378
16494
16523
30
a79
3538
3554
17
a229
10214
10240
27
a379
16536
16562
27
a80
3576
3597
22
a230
10257
10272
16
a380
16564
16580
17
a81
3603
3639
37
a231
10281
10298
18
a381
16582
16637
56
a82
3663
3679
17
a232
10300
10318
19
a382
16631
16649
19
a83
3727
3812
86
a233
10339
10363
25
a383
16655
16701
47
a84
3843
3869
27
a234
10409
10426
18
a384
16737
16781
45
a85
3874
3904
31
a235
10447
10497
51
a385
16783
16804
22
a86
3926
3955
30
a236
10499
10529
31
a386
16832
16907
76
a87
3974
3993
20
a237
10531
10546
16
a387
16934
16965
32
a88
3995
4042
48
a238
10560
10580
21
a388
16972
17035
64
a89
4053
4073
21
a239
10582
10596
15
a389
17039
17069
31
a90
4075
4123
49
a240
10600
10621
22
a390
17072
17109
38
a91
4133
4157
25
a241
10623
10664
42
a391
17135
17150
16
a92
4158
4188
31
a242
10666
10685
20
a392
17167
17209
43
a93
4218
4250
33
a243
10717
10773
57
a393
17211
17242
32
a94
4277
4336
60
a244
10775
10792
18
a394
17244
17299
56
a95
4353
4375
23
a245
10794
10858
65
a395
17304
17344
41
a96
4383
4398
16
a246
10874
10888
15
a396
17346
17400
55
a97
4405
4446
42
a247
10893
10972
80
a397
17447
17466
20
a98
4448
4464
17
a248
10974
10994
21
a398
17474
17539
66
a99
4466
4493
28
a249
10996
11012
17
a399
17561
17604
44
a100
4495
4558
64
a250
11075
11097
23
a400
17610
17663
54
a101
4571
4613
43
a251
11099
11124
26
a401
17681
17763
83
a102
4624
4683
60
a252
11140
11157
18
a402
17793
17810
18
a103
4743
4759
17
a253
11159
11192
34
a403
17812
17852
41
a104
4761
4785
25
a254
11195
11226
32
a404
17854
17928
75
a105
4811
4858
48
a255
11235
11261
27
a405
17941
18005
65
a106
4873
4932
60
a256
11279
11337
59
a406
18007
18035
29
a107
4934
4948
15
a257
11344
11381
38
a407
18041
18077
37
a108
4955
4974
20
a258
11387
11411
25
a408
18085
18146
62
a109
4979
5010
32
a259
11427
11494
68
a409
18163
18177
15
a110
5012
5052
41
a260
11496
11510
15
a410
18179
18207
29
a111
5055
5115
61
a261
11512
11526
15
a411
18209
18228
20
a112
5138
5166
29
a262
11528
11551
24
a412
18230
18266
37
a113
5168
5198
31
a263
11570
11592
23
a413
18268
18285
18
a114
5200
5222
23
a264
11594
11634
41
a414
18287
18351
65
a115
5224
5284
61
a265
11664
11684
21
a415
18365
18395
31
a116
5286
5302
17
a266
11699
11719
21
a416
18402
18432
31
a117
5317
5332
16
a267
11721
11746
26
a417
18434
18456
23
a118
5349
5436
88
a268
11753
11771
19
a418
18502
18530
29
a119
5460
5512
53
a269
11787
11873
87
a419
18545
18590
46
a120
5514
5534
21
a270
11873
11905
33
a420
18603
18621
19
a121
5548
5563
16
a271
11927
11942
16
a421
18623
18645
23
a122
5565
5579
15
a272
11946
11973
28
a422
18651
18708
58
a123
5581
5597
17
a273
11975
11993
19
a423
18710
18729
20
a124
5600
5639
40
a274
12019
12114
96
a424
18731
18758
28
a125
5644
5661
18
a275
12116
12135
20
a425
18760
18788
29
a126
5663
5735
73
a276
12137
12158
22
a426
18799
18859
61
a127
5737
5770
34
a277
12165
12192
28
a427
18861
18926
66
a128
5778
5801
24
a278
12194
12216
23
a428
18928
18980
53
a129
5852
5958
107
a279
12218
12246
29
a429
19001
19018
18
a130
6007
6041
35
a280
12262
12277
16
a430
19034
19054
21
a131
6049
6063
15
a281
12283
12319
37
a431
19070
19092
23
a132
6065
6084
20
a282
12334
12368
35
a432
19111
19154
44
a133
6086
6101
16
a283
12370
12395
26
a433
19191
19213
23
a134
6119
6186
68
a284
12397
12434
38
a434
19215
19240
26
a135
6189
6234
46
a285
12436
12509
74
a435
19255
19356
102
a136
6236
6278
43
a286
12511
12543
33
a436
19358
19446
89
a137
6291
6312
22
a287
12545
12565
21
a437
19450
19468
19
a138
6314
6373
60
a288
12567
12675
109
a438
19470
19512
43
a139
6404
6447
44
a289
12677
12706
30
a439
19514
19541
28
a140
6449
6482
34
a290
12708
12724
17
a440
19543
19568
26
a141
6533
6555
23
a291
12753
12768
16
a441
19570
19586
17
a142
6562
6622
61
a292
12785
12809
25
a442
19588
19619
32
a143
6624
6674
51
a293
12830
12859
30
a443
19683
19739
57
a144
6679
6762
84
a294
12864
12885
22
a444
19741
19777
37
a145
6764
6780
17
a295
12886
12916
31
a445
19779
19820
42
a146
6782
6822
41
a296
12922
12946
25
a446
19822
19836
15
a147
6824
6856
33
a297
12948
12970
23
a447
19838
19911
74
a148
6858
6898
41
a298
12983
13003
21
a448
19913
19966
54
a149
6906
6954
49
a299
13018
13051
34
a449
19968
20026
59
a150
6969
6992
24
a300
13070
13090
21
В некотором воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последователность является комплементарным области нуклеиновой кислоты-мишени, где данная область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из a7, a26, a43, a119, a142, a159, a160, a163, a169, a178, a179, a180, a189, a201, a202, a204, a214, a221, a224, a226, a243, a254, a258, 269, a274, a350, a360, a364, a365, a370, a372, a381, a383, a386, a389, a400, a427, a435 и a438.
В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является комплементарной области нуклеиновой кислоты-мишени, где область нуклеиновой кислоты-мишени выбрана из группы, состоящей из a160, a180, a221, a269 и a360.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит или состоит из 8-35 нуклеотидов в длину, как, например, от 9 до 30, как, например, от 10 до 22, как, например, от 11 до 20, как, например, от 12 до 18, как, например, от 13 до 17 или от 14 до 16 смежных нуклеотидов в длину. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид содержит или состоит из 16-20 нуклеотидов в длину. Следует понимать то, что любой интервал, приведенный в данном документе, включает конечные точки интервала. Соответственно, если говорится то, что олигонуклеотид включает от 10 до 30 нуклеотидов, включены и 10, и 30 нуклеотидов.
В некоторых воплощениях непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 смежных нуклеотидов в длину. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид содержит или состоит из 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов в длину.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей, перечисленных в Таблице 5.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-743 (см. мотивы последовательностей, перечисленные в Таблице 5).
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5-743 и 771.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 и 735.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 287.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 342.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 640.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 466.
В некоторых воплощениях антисмысловой олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной идентичностью, предпочтительно со 100%-ной идентичностью с SEQ ID NO: 566.
В воплощениях, где олигонуклеотид длиннее, чем непрерывная нуклеотидная последовательность (которая комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени), мотивы последоваельностей в Таблице 5 образуют часть непрерывной нуклеотидной последовательности антисмысловых олигонуклеотидов по изобретению. В некоторых воплощениях последовательность олигонуклеотида является эквивалентной непрерывной нуклеотидной последовательности (например, если не добавляются биорасщепляемые линкеры).
Понятно то, что непрерывные последовательности из нуклеиновых оснований (мотив последовательности) могут быть модифицированы, например, для увеличения устойчивости к нуклеазе и/или аффинности связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью. Модификации описываются в определениях и в разделе «Конструкция олигонуклеотидов». В Таблице 5 перечислены предпочтительные конструкции каждого мотива последовательности.
Конструкция олигонуклеотида
Термин «конструкция олигонуклеотида» относится к картине модификаций сахара нуклеозидов в последовательности олигонуклеотида. Олигонуклеотиды по изобретению содержат нуклеозиды с модифицированным сахаром и также могут содержать нуклеозиды ДНК или РНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит нуклеозиды с модифицированным сахаром и нуклеозиды ДНК. Включение модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотид по изобретению может увеличивать аффинность олигонуклеотида в отношении нуклеиновой кислоты-мишени. В данном случае модифицированные нуклеозиды можно называть модифицированными нуклеотидами, увеличивающими аффинность, модифицированные нуклеозиды также можно называть звеньями.
В одном воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере 1 модифицированный нуклеозид, как, например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении олигонуклеотид содержит от 1 до 10 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 2 до 8 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 3 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, от 4 до 6 модифицированных нуклеозидов, как, например, 3, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов.
В одном воплощении олигонуклеотид содержит один или более чем один нуклеозид с модифицированным сахаром, как, например, нуклеозиды, модифицированные 2' сахаром. Предпочтительно олигонуклеотид по изобретению содержит один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-O-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и нуклеозидов LNA. Даже более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой запертую нуклеиновую кислоту (LNA).
В другом воплощении олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные или боранофосфатные межнуклеозидные связи. В некоторых воплощениях все межнуклеозидные связи в непрерывной последовательности олигонуклеотида представляют собой фосфоротиоатные связи.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, как, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 нуклеозидов LNA, как, например, от 2 до 6 нуклеозидов LNA, как, например, от 3 до 7 нуклеозидов LNA, от 4 до 6 нуклеозидов LNA или 3, 4, 5, 6 или 7 нуклеозидов LNA. В некоторых воплощениях по меньшей мере 75% модифицированных нуклеозидов в олигонуклеотиде представляют собой нуклеозиды LNA, как, например, 80%, как, например, 85%, как, например, 90% модифицированных нуклеозидов представляют собой нуклеозиды LNA В еще одном другом воплощении все модифицированные нуклеозиды в олигонуклеотиде представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении олигонуклеотид может содержать и бета-D-окси-LNA, и один или более чем один из следующих нуклеозидов LNA: тио-LNA, амино-LNA, окси-LNA и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В другом воплощении все цитозиновые звенья LNA представляют собой 5-метилцитозин. В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 1 нуклеозид LNA на 5'-конце и по меньшей мере 2 нуклеозида LNA на 3'-конце нуклеотидной последовательности.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеозид, который представляет собой нуклеозид 2'-MOE-РНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов 2'-MOE-РНК. В некоторых воплощениях по меньшей мере один из указанных модифицированных нуклеозидов представляет собой 2'-фтор-ДНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеозидов 2'-фтор-ДНК.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид по изобретению содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA и по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.
В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид содержит и нуклеозиды, модифицированные 2'-сахаром, и звенья ДНК. Предпочтительно олигонуклеотид содержит и нуклеотиды (звенья) LNA, и ДНК. Предпочтительно объединенное общее число звеньев LNA и ДНК составляет 8-30, как, например, 10-25, предпочтительно 12-22, как, например, 12-18, даже более предпочтительно 11-16. В некоторых воплощениях изобретения нуклеотидная последовательность олигонуклеотида, такая как непрерывная нуклеотидная последовательность, состоит из по меньшей мере из одного или двух нуклеотидов LNA, и остальные нуклеозилы представляют собой звенья ДНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотид содержит только нуклеозиды LNA и встречающиеся в природе нуклеозиды (такие как нуклеозиды РНК или ДНК, наиболее предпочтительно нуклеозиды ДНК), возможно с модифицированными межнуклеозидными связями, такими как фосфоротиоатная.
В одном воплощении изобретения олигонуклеотид по изобретению способен рекрутировать РНКазу Н.
Структурная конструкция олигонуклеотида по изобретению может быть выбрана из гэпмеров, олигонуклеотидов с разорванным гэпом, хэдмеров и тэйлмеров.
Конструкция гэпмера
В предпочтительном воплощении олигонуклеотид по изобретению имеет конструкцию или структуру гэпмера, также именуемую в данном документе просто «гэпмер». В структуре гэпмера олигонуклеотид содержит по меньшей мере три отличные структурные области: 5'-фланг, гэп и 3'-фланг, F-G-F' в ориентации '5 -> 3'. В данной конструкции фланкирующие области F и F' (также именуемые области крыльев) содержат непрерывный отрезок модифицированных нуклеозидов, которые являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1, тогда как область гэпа - G - содержит непрерывный отрезок нуклеотидов, который способен рекрутировать нуклеазу, предпочтительно эндонуклеазу, такую как РНКаза, например, РНКаза Н, когда олигонуклеотид находится в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью. Нуклеозиды, которые способны рекрутировать нуклеазу, в частности РНКазу Н, могут быть выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-окси-LNA, 2'-фтор-ANA и UNA. Области F и F', фланкирующие 5'- и 3'-концы области G, предпочительно содержат нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу (нуклеозиды с 3'-эндоструктурой), более предпочтительно один или более чем один модифицированный нуклеозид, увеличивающий аффинность. В некоторых воплощениях 3'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA, предпочтительно по меньшей мере 2 нуклеозида LNA. В некоторых воплощениях 5'-фланг содержит по меньшей мере один нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях обе 5'- и 3'-фланкирующие области содержат нуклеозид LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды в данных фланкирующих областях представляют собой нуклеозиды LNA. В других воплощениях фланкирующие области могут содержать и нуклеозиды LNA, и другие нуклеозиды (смешанные фланги), такие как нуклеозиды ДНК и/или модифицированные нуклеозиды, не являющиеся нуклеозидами LNA, такие как 2'-замещенные нуклеозиды. В данном случае гэп определяется как непрерывная последовательность из по меньшей мере 5 нуклеозидов, рекрутирующих РНКазу Н (нуклеозиды с 2'-эндоструктурой, предпочтительно ДНК), фланкированная на 5'- и 3'-конце модифицированным нуклеозидом, увеличивающим аффинность, предпочтительно LNA, таким как бета-D-окси-LNA. Следовательно, нуклеозиды 5'-фланкирующей области и 3'- фланкирующей области, которые являются смежными с областью гэпа, представляют собой модифицированные нуклеозиды, предпочтительно нуклеозиды, не рекрутирующие нуклеазу.
Область F
Область F (5'-фланг или 5'-крыло), присоединенная к '5-концу области G, включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F содержит или состоит из от 1 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-5 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце данной области.
В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F имеют 3'-эндоструктуру.
В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F представляет собой 2'-модифицированные нуклеозиды.
В другом воплощении область F содержит ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце и 3'-конце (рядом с областью G) области F. В одном воплощении область F содержит нуклеозиды ДНК, как, например, от 1 до 3 смежных нуклеозидов ДНК, как, например, от 1 до 3 или от 1 до 2 смежных нуклеозидов ДНК. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. В некоторых воплощениях 2'-модифицированные нуклеозиды и нуклеозиды ДНК и/или РНК в области F чередуются с 1-3 2'-модифицированными нуклеозидами и 1-3 нуклеозидами ДНК и/или РНК. Такие фланги также могут называться флангами с чередованием. Длина 5'-фланга (области F) в олигонуклеотидах с флангами с чередованием может составлять от 4 до 10 нуклеозидов, как, например, от 4 до 8, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов, как, например, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов. В некоторых воплощениях только 5'-фланг олигонуклеотида является флангом с чередованием. Конкретными примерами области F с чередующимися нуклеозидами являются:
1-3
1-4
1-3
2'-N'-2'
1-2
1-2
1-2
1-2
1-2
2'-N'-2'- N'-2',
где 2' показывает модифицированный нуклеозид, и N' представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях все модифицированные нуклеозиды во флангах с чередованием представляют собой LNA, а N' представляет собой ДНК. В другом воплощении один или более чем один 2'-модифицированный нуклеозид в области F выбран из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.
В некоторых воплощениях область F содержит и нуклеозид LNA, и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.
В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, cET и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F содержит по меньшей мере 1 звено бета-D-окси LNA на 5'-конце непрерывной последовательности.
Область G
Область G (область гэпа) предпочтительно включает, содержит или состоит из по меньшей мере 4, как, например, из по меньшей мере 5, как, например, из по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15 или по меньшей мере 16 последовательных нуклеозидов, способных рекрутировать вышеупомянутую нуклеазу, в частности РНКазу Н. В другом воплощении область G включает, содержит или состоит из от 5 до 12 или от 6 до 10, или от 7 до 9, как, например, из 8 последовательных нуклеотидных звеньев, способных рекрутировать вышеупомянутую нуклеазу.
Нуклеозидные звенья в области G, которые способны рекрутировать нуклеазу, в одном воплощении выбраны из группы, состоящей из ДНК, альфа-L-LNA, C4'-алкилированой ДНК (как описано в PCT/EP2009/050349 и Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300, которые обе включены в данный документ посредством ссылки), нуклеозидов, происходящих из арабинозы, подобных ANA и 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (незапертая нуклеиновая кислота) (как описано в Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039, включенной в данный документе посредством ссылки). UNA представляет собой незапертую нуклеиновую кислоту, типично где связь между С2 и С3 рибозы была удалена, образуя незапертый «сахарный» остаток.
В еще одном другом воплощении по меньшей мере одно нуклеозидное звено в области G представляет собой нуклеозидное звено ДНК, как, например, от 1 до 18 звеньев ДНК, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 звеньев ДНК, предпочтительно от 2 до 17 звеньев ДНК, как, например, от 3 до 16 звеньев ДНК, как, например, от 4 до 15 звеньев ДНК, как, например, от 5 до 14 звеньев ДНК, как, например, от 6 до 13 звеньев ДНК, как, например, от 7 до 12 звеньев ДНК, как, например, от 8 до 11 звеньев ДНК, более предпочтительно от 8 до 17 звеньев ДНК или от 9 до 16 звеньев ДНК, от 10 до 15 звеньев ДНК или от 11 до 13 звеньев ДНК, как, например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 звеньев ДНК. В некоторых воплощениях область G состоит из 100% звеньев ДНК.
В других воплощениях область G может состоять из смеси ДНК и других нуклеозидов, способных опосредовать расщепление РНКазой Н. Область G может состоять из по меньшей мере 50% ДНК, более предпочтительно - из 60%, 70% или 80% ДНК, и даже более предпочтительно из 90% или 95% ДНК.
В еще одном другом воплощении по меньшей мере одно нуклеозидное звено в области G представляет собой нуклеозидное звено альфа-L-LNA, как, например, по меньшей мере одно звено альфа-L-LNA, как, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 звеньев альфа-L-LNA. В другом воплощении область G содержит по меньшей мере одно звено альфа-L-LNA, которое представляет собой звено альфа-L-окси-LNA. В другом воплощении область G содержит комбинацию нуклеозидных звеньев ДНК и альфа-L-LNA.
В некоторых воплощениях нуклеозиды в области G имеют 2'-эндоструктуру.
В некоторых воплощениях область G может содержать нуклеозид, разрывающий гэп, приводящий к олигонуклеотиду с разорванным гэпом, который способен рекрутировать РНКазу Н.
Область F'
Область F' (3'-фланг или 3'-крыло), присоединенная к '3-концу области G, включает, содержит или состоит из по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида, как, например, из по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 модифицированных нуклеозидов. В одном воплощении область F' содержит или состоит из от 1 до 7 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-6 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 2-4 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1-3 модифицированных нуклеозидов, как, например, из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозидов. Область F' определяется наличием по меньшей мере одного модифицированного нуклеозида на 5'-конце и на 3'-конце данной области.
В некоторых воплощениях модифицированные нуклеозиды в области F' имеют 3'-эндоструктуру.
В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид. В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой 2'-модифицированные нуклеозиды.
В одном воплощении один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F' представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид.
В одном воплощении все нуклеозиды в области F' представляет собой 2'-модифицированные нуклеозиды. В другом воплощении область F' содержит ДНК и/или РНК, помимо 2'-модифицированных нуклеозидов. Фланги, содержащие ДНК и/или РНК, характеризуются наличием 2'-модифицированного нуклеозида на 5'-конце (смежном с областью G) и 3'-конце  области F'. В одном воплощении область F' содержит нуклеозиды ДНК, как, например, от 1 до 4 смежных нуклеозидов ДНК, как, например, от 1 до 3 или от 1 до 2 смежных нуклеозидов ДНК. Данные нуклеозиды ДНК во флангах предпочтительно не должны быть способны рекрутировать РНКазу Н. В некоторых воплощениях 2'-модифицированные нуклеозиды и нуклеозиды ДНК и/или РНК в области F' чередуются с 1-3 2'-модифицированными нуклеозидами и 1-3 нуклеозидами ДНК и/или РНК, причем такие фланги также могут называться флангами с чередованием. Длина 3'-фланга (области F') в олигонуклеотидах с флангами с чередованием может составлять от 4 до 10 нуклеозидов, как, например, от 4 до 8, как, например, от 4 до 6 нуклеозидов, как, например, 4, 5, 6 или 7 модифицированных нуклеозидов. В некоторых воплощениях только 3'-фланг олигонуклеотида является флангом с чередованием. Конкретными примерами области F' с чередующимися нуклеозидами являются:
1-3
1-4
1-3
2'-N'-2'
1-2
1-2
1-2
1-2
1-2
2'-N'-2'- N'-2',
где 2' показывает модифицированный нуклеозид, и N' представляет собой РНК или ДНК. В некоторых воплощениях все модифицированные нуклеозиды во флангах с чередованием представляют собой LNA, а N' представляет собой ДНК. В другом воплощении модифицированные нуклеозиды в области F' выбраны из звеньев 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, звеньев 2'-амино-ДНК, звеньев 2'-фтор-ДНК, 2'-алкокси-РНК, звеньев МОЕ, звеньев LNA, звеньев арабинонуклеиновой кислоты (ANA) и звеньев 2'-фтор-ANA.
В некоторых воплощениях область F' содержит и LNA и 2'-замещенный модифицированный нуклеозид. Они часто называются олигонуклеотидами со смешанными крыльями или со смешанными флангами.
В одном воплощении изобретения все модифицированные нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении все нуклеозиды в области F' представляют собой нуклеозиды LNA. В другом воплощении нуклеозиды LNA в области F' независимо выбраны из группы, состоящей из окси-LNA, тио-LNA, амино-LNA, cET и/или ENA либо в бета-D, либо в альфа-L конфигурациях, или их комбинации. В предпочтительном воплощении область F' имеет по меньшей мере 2 звена бета-D-окси LNA на 3'-конце непрерывной последовательности.
Область D' и D''
Область D' и D'' может быть присоединена к 5'-концу области F или к 3'-концу области F' соответственно. Область D' или D'' является опцией.
Область D' и D'' может независимо содержать от 0 до 5, как, например, от 1 до 5, как, например, от 2 до 4, как, например, 0, 1, 2, 3, 4 или 5 дополнительных нуклеотидов, которые могут быть комплементарными или некомплементарными нуклеиновой кислоте-мишени. В данном отношении олигонуклеотид по изобретению может в некоторых воплощениях содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, способную модулировать мишень, которая фланкирована на 5'- и/или 3'-конце дополнительными нуклеотидами. Такие дополнительные нуклеотиды могут служить в качестве нуклеазочувствительного биорасщепляемого линкера (см. определение линкеров). В некоторых воплощениях дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеозиды связаны фосфодиэфирными связями и могут представлять собой ДНК или РНК. В другом воплощении дополнительные 5'- и/или 3'-концевые нуклеозиды представляют собой модифицированные нуклеозиды, которые могут быть включены, например, для увеличения нуклеазоустойчивости или для легкости синтеза. В одном воплощении олигонуклеотид по изобретению содержит область D' и/или D'' на 5'- или 3'-конце непрерывной нуклеотидной последовательности. В другом воплощении область D' и/или D'' состоит из 1-5 нуклеозидов ДНК или РНК, связанных фосфодиэфирными связями, которые не являются комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени.
Гэпмерный олигонуклеотид по настоящему изобретению может быть представлен следующими формулами:
1-7
4-12
1-7
3'-F-G-F'-3'; в частности, F-G-F'
1-3
1-7
4-12
1-7
5'-D'-F-G-F'-3', в частности, D'-F-G-F'
1-7
4-12
1-7
1-3
5'-F-G-F'-D''-3', в частности, F-G-F'-D''
1-3
1-7
4-12
1-7
1-3
5'-D'-F-G-F'-D'-3'', в частности, D'-F-G-F'-D''
Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях F, G и F', D' и D'' были описаны выше. Конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению имеют область С, ковалентно присоединенную либо к 5'-, либо к 3'-концу олигонуклеотида, в частности гэпмерных олигонуклеотидов, представленных выше.
В одном воплощении конъюгат олигонуклеотида по изобретению содержит олигонуклеотид с формулой 5'-D'-F-G-F'-3' или 5'-F-G-F'-D''-3', где области F и F' независимо содержат 1-7 модифицированных нуклеозидов, G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н, и область D' или D'' содержит 1-5 нуклеозидов, связанных фосфодиэфирными связями. Предпочтительно область D' или D'' присутствует в конце олигонуклеотида, где рассматривается конъюгирование с конъюгатной группировкой.
Примеры олигонуклеотидов с флангами с чередованием могут быть представлены следующими формулами:
1-3
1-4
1-3
6-12
1-2
1-4
1-4
2'-N'-2'-G-2'-N'-2'
1-2
1-2
1-2
1-2
1-2
6-12
1-2
1-2
1-2
1-2
1-2
2'-N'-2'-N'-2'-G-2'-N'-2'- N'-2'
6-12
1-2
1-4
1-4
F-G-2'-N'-2'
6-12
1-2
1-2
1-2
1-2
1-2
F-G-2'-N'-2'-N'-2'
1-3
1-4
1-3
6-12
2'-N'-2'-G-F'
1-2
1-2
1-2
1-2
1-2
6-12
2'-N'-2'-N-2'-G-F'
где фланг указан F или F', если он содержит только 2'-модифицированные нуклеозиды, такие как нуклеозиды LNA. Предпочтительное число и типы нуклеозидов в областях с чередованием и области F, G и F', D' и D'' были описаны выше.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, состоящий из 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 нуклеотидов в длину, где каждая из областей F и F' независимо состоит из 1, 2, 3 или 4 модифицированных нуклеозных звеньев, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 нуклеозидных звеньев, способных рекрутировать нуклеазу при нахождении в дуплексе с нуклеиновой кислотой-мишенью PD-L1, и область D' состоит из 2 ДНК, связанных фосфодиэфирной связью.
В других воплощениях олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' независимо состоит из 3, 4, 5 или 6 модифицированных нуклеозных звеньев, таких как нуклеозидные звенья, содержащие сахар 2'-O-метоксиэтил-рибозу (2'-MOE), или нуклеозидные звенья, содержащие сахар 2'-фтор-дезоксирибозу, и/или звенья LNA, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 нуклеозидных звеньев, таких как звенья ДНК или другие нуклеозиды, рекрутирующие нуклеазу, такие как L-LNA или смесь нуклеозидов ДНК и нуклеозидов, рекрутирующих нуклеазу.
В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' состоит из двух звеньев LNA, и область G состоит из 12, 13, 14 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 2-12-2, 2-13-2 и 2-14-2.
В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' независимо состоит из трех звеньев LNA, и область G состоит из 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 3-8-3, 3-9-3 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3 и 3-14-3.
В другом конкретном воплощении олигонуклеотид представляет собой гэпмер, в котором каждая из областей F и F' состоит из четырех звеньев LNA, и область G состоит из 8 или 9, 10, 11 или 12 нуклеозидных звеньев, предпочтительно звеньев ДНК. Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают 4-8-4, 4-9-4, 4-10-4, 4-11-4 и 4-12-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 6 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-6-1, 1-6-2, 2-6-1, 1-6-3, 3-6-1, 1-6-4, 4-6-1, 2-6-2, 2-6-3, 3-6-2 2-6-4, 4-6-2, 3-6-3, 3-6-4 и 4-6-3.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 7 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-7-1, 2-7-1, 1-7-2, 1-7-3, 3-7-1, 1-7-4, 4-7-1, 2-7-2, 2-7-3, 3-7-2, 2-7-4, 4-7-2, 3-7-3, 3-7-4, 4-7-3 и 4-7-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 8 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-8-1, 1-8-2, 1-8-3, 3-8-1, 1-8-4, 4-8-1,2-8-1, 2-8-2, 2-8-3, 3-8-2, 2-8-4, , 4-8-2, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3 и 4-8-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 9 нуклеозидами и, независимо, из 1-4 модифицированных нуклеозидов в крыльях, включая гэпмеры 1-9-1, 2-9-1, 1-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 1-9-4, 4-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 2-9-4, 4-9-2, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3 и 4-9-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 10 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 и 4-10-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 11 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 и 4-11-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 12 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 и 4-12-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 13 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-13-1, 2-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 и 4-13-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 14 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-14-1, 2-14-1, 1-14-2, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2, 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4, 4-14-3 и 4-14-4.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 15 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-15-1, 2-15-1, 1-15-2, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2, 2-15-4, 4-15-2 и 3-15-3.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 16 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-16-1, 2-16-1, 1-16-2, 1-16-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1, 2-16-2, 2-16-3, 3-16-2, 2-16-4, 4-16-2 и 3-16-3.
Конкретные конструкции гэпмеров данной природы включают конструкции F-G-F', выбранные из группы, состоящей из гэпа с 17 нуклеозидами, включая гэпмеры 1-17-1, 2-17-1, 1-17-2, 1-17-3, 3-17-1, 1-17-4, 4-17-1, 2-17-2, 2-17-3 и 3-17-2.
Во всех случаях конструкция F-G-F' может дополнительно включать область D' и/или D'', которая может иметь 1, 2 или 3 нуклеозидных звена, таких как звенья ДНК, таких как 2 звена ДНК, связанных 2-фосфодиэфиром. Предпочтительно нуклеозиды в области F и F' представляют собой модифицированные нуклеозиды, тогда как нуклеотиды в области G предпочтительно представляют собой немодифицированные нуклеозиды.
При каждой конструкции предпочтительным модифицированным нуклеозидом является LNA.
В другом воплощении все межнуклеозидные связи в гэпе в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом воплощении все межнуклеозидные связи во флангах (области F и F') в гэпмере представляют собой фосфоротиоатные и/или боранофосфатные связи. В другом предпочтительном воплощении все межнуклеозидные связи в области D' и D'' в гэпмере представляют собой фосфодиэфирные связи.
Для конкретных гэпмеров, как раскрыто в данном документе, при аннотации остатков цитозина (С) как 5-метил-цитозин в разных воплощениях один или более чем один С, присутствующий в олигонуклеотиде, может представлять собой немодифицированный остаток С.
В конкретном воплощении гэпмер представляет собой так называемый шортмер, как описано в WO2008/113832, включенной в данный документ посредством ссылки.
Дополнительные конструкции гэпмеров раскрыты в WO2004/046160, WO2007/146511 и включены посредством ссылки.
Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO от 5_1 до 743_1 и 771_1.
Для некоторых воплощений изобретения олигонуклеотид выбран из группы олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1, and 735_1.
В одном предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 287_1.
В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 342_1.
В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 640_1.
В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 466_1.
В другом предпочтительном воплощении изобретения олигонуклеотид представляет собой CMP-ID-NO: 566_1.
В другом воплощении изобретения непрерывная нуклеотидная последовательность олигонуклеотидных мотивов и олигонуклеотидных соединений по изобретению содержит от двух до четырех дополнительных нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью, на 5'-конце непрерывной нуклеотидной последовательности (например, области D'). В одном воплощении нуклеозиды служат в качестве биорасщепляемого линкера (см. раздел «Биорасщепляемые линкеры»). В предпочтительном воплощении динуклеотид са (цитидин-аденозин) связан с 5'-концом непрерывной нуклеотидной последовательности (т.е. с любым из мотивов последовательностей или олигонуклеотидных соединений, перечисленных в Таблице 5) посредством фосфодиэфирной связи. В предпочтительном воплощении динуклеотид са не является комплементарным последовательности-мишени в положении, где остальная часть непрерывного нуклеотида является комплементарной.
В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из последовательностей нуклеотидных мотивов с SEQ ID NO: 766, 767, 768, 769 и 770.
В некоторых воплощениях изобретения олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из олигонуклеотидных соединений с CMP-ID-NO 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 и 770_1.
Углеводные конъюгатные группировки
Углеводные конъюгатные группировки включают галактозу, лактозу, N-ацетилгалактозамин, маннозу и моннозо-6-фосфат, но не ограничиваются ими. Углеводные конъюгаты могут использоваться для увеличения доставки или активности в целом ряде тканей, таких как печень и/или мышцы. См., например, EP1495769, WO99/65925, Yang et al., Bioconjug Chem (2009) 20(2): 213-21. Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers. (2004) 1(10): 1401-17.
В некоторых воплощениях углеводные конъюгатные группировки являются многовалентными, таким образом, что, например, 2, 3 или 4 идентичные или неидентичные углеводные группировки могут быть ковалентно связаны с олигонуклеотидом, возможно через линкер или линкеры. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен конъюгат, содержащий олигонуклеотид по изобретению и углеводную конъюгатную группировку. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка представляет собой или может содержать маннозу или маннозо-6-фосфат. Это особенно полезно для нацеливания в мышечные клетки, см., например, US 2012/122801.
Конъюгатные группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (ASGPr) являются особенно полезными для нацеливания в гепатоциты в печени. В некоторых воплощениях согласно изобретению предложен конъюгат олигонуклеотида, содержащий олигонуклеотид по изобретению и конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина. Конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит одну или более чем одну углеводную группировку, способную к связыванию с рецептором асиалогликопротеина (углеводные группировки, связывающиеся с ASGPr) с аффинностью, равной или большей, чем аффинность галактозы. Аффинности многочисленных производных галактозы в отношении рецептора асиалогликопротеина были исследованы (см., например, Jobst, S.T. and Drickamer, K. JB.C. 1996, 271, 6686) или легко определяются с использованием способов, типичных в данной области.
Одним аспектом настоящего изобретения является конъюгат антисмыслового олигонуклеотида, содержащий а) олигонуклеотид (область А), содержащий непрерывную нуклеотидную последовательность из 10-30 нуклеотидов в длину с по меньшей мере 90%-ной комплементарностью к нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1; и б) по меньшей мере одну конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина (область С), ковалентно присоединенную к олигонуклеотиду в а). Олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность может быть такой, как описано в любом из разделов «Олигонуклеотиды по изобретению», «Конструкция олигонуклеотидов» и «Конструкция гэпмеров».
В некоторых воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит по меньшей мере одну углеводную группировку, связывающуюся с ASPGr, выбранную из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина. В некоторых воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является одновалентной, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной (т.е. содержащей 1, 2, 3 или 4 концевые углеводные группировки, способные к связыванию с рецептором асиалогликопротеина). Предпочтительно конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является двухвалентной, даже более предпочтительно она является трехвалентной. В предпочтительном воплощении конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит 1-3 группировки N-ацетилгалактозамина (GalNAc) (также именуемая GalNAc конъюгат). В некоторых воплощениях конъюгат олигонуклеотида содержит конъюгатную группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, которая является трехвалентной N-ацетилгалактозаминной (GalNAc) группировкой. GalNAc конъюгаты использовали с фосфодиэфирными, метилфосфонатными и PNA антисмысловыми олигонуклеотидами (например, US 5994517 и Hangeland et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701, Biessen et al 1999 Biochem J. 340, 783-792, и Maier et al 2003 Bioconjug Chem 14, 18-29 ) и миРНК (например, WO 2009/126933, WO 2012/089352 и WO 2012/083046) и с модифицированными нуклеозидами LNA и 2'-MOE (WO 2014/076196, WO 2014/207232 и WO 2014/179620, включенные тем самым посредством ссылки).
Для получения конъюгатной группировки, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина, углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr (предпочтительно GalNAc), присоединяются к разветвляющей молекуле через C-1 углероды сахаридов. Углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, предпочтительно связываются с разветвляющей молекулой через спейсеры. Предпочтительным спейсером является гибкий гидрофильный спейсер (патент США 5885968; Biessen et al. J. Med. Chern. 1995 Vol. 39 p. 1538-1546). Предпочтительным гибким гидрофильным спейсером является ПЭГ (полиэтиленгликоль) спейсер. Предпочтительным ПЭГ спейсером является ПЭГ3 спейсер (три этиленовых звена). Разветвляющей молекулой может быть любая маленькая молекула, которая допускает присоединение двух или трех концевых углеводных группировок, связывающихся с ASPGr, и дополнительно обеспечивает присоединение точки разветвления к олигонуклеотиду. Типичной разветвляющей молекулой является дилизин. Молекула дилизина содержит три аминогруппы, посредством которых три углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, могут быть присоединены к карбоксильной реакционноспособной группе, через которую дилизин может быть присоединен к олигонуклеотиду. Альтернативными разветвляющими молекулами могут быть удвоитель или утроитель, такие как поставляемые Glen Research. В некоторых воплощениях разветвляющая молекула может быть выбрана из группы, состоящей из 1,3-бис-[5-(4,4'-диметокситритилокси)пентиламидо]пропил-2-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)] фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1920-xx), три-2,2,2-[3-(4,4'-диметокситритилокси)пропилоксиметил]этил-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1922-xx), трис-2,2,2-[3-(4,4'- диметокситритилокси)пропилоксиметил]метиленоксипропил-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита и 1-[5-(4,4'-диметокси-тритилокси)пентиламидо]-3-[5-флюоренометокси-карбонил-окси-пентиламидо]-пропил-2-[(2-цианоэтил)-(N,N-диизопропил)]-фосфорамидита (каталожный номер Glen Research: 10-1925-xx). В WO 2014/179620 и заявке PCT № PCT/EP2015/073331 описано получение разных конъюгатных группировок GalNAc (включенных тем самым посредством ссылки). Между разветвляющей молекулой и олигонуклеотидом может быть вставлен один или более чем один линкер. В предпочтительном воплощении линкер представляет собой биорасщепляемый линкер. Линкер может быть выбран из линкеров, описанных в разделе «Линкеры» и его подразделах.
Конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, в частности, конъюгатная группировка GalNAc, может быть присоединена к 3'- или 5'-концу олигонуклеотида с использованием способов, известных в данной области. В предпочтительных воплощениях конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, связывается с 5'-концом олигонуклеотида.
Модуляторы фармакокинетики в отношении доставки миРНК были описаны в WO 2012/083046 (включенной тем самым посредством ссылки). В некоторых воплощениях углеводная конъюгатная группировка содержит модулятор фармакокинетики, выбранный из группы, состоящей из гидрофобной группы, имеющей 16 или более атомов углерода, гидрофобной группы, имеющей 16-20 атомов углерода, пальмитоила, гексадек-8-еноила, олеила, (9Е,12Е)-октадека-9,12-диеноила, диоктаноила, С16-С20-ацила и холестерина. В предпочтительном воплощении углеводная конъюгатная группировка, содержащая модулятор фармакокинетики, представляет собой GalNAc конъюгат.
Предпочтительные углеводные конъюгатные группировки содержат от одной до трех концевых углеводных группировок, связывающихся с ASPGr, предпочтительно группировку(ки) N-ацетилгалактозамина. В некоторых воплощениях углеводная конъюгатная группировка содержит три углеводные группировки, связывающиеся с ASPGr, предпочтительно N-ацетилгалактозаминные группировки, связанные через спейсер с разветвляющей молекулой. Спейсерная молекула может иметь длину от 8 до 30 атомов. Предпочтительная углеводная конъюгатная группировка содержит три концевые GalNAc группировки, связанные через ПЭГ спейсер с разветвляющей молекулой дилизином. Предпочтительно ПЭГ спейсер представляет собой 3ПЭГ. Подходящие конъюгатные группировки, нацеленные на рецептор асиалогликопротеина, показаны на Фиг. 1. Предпочтительная конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, показана на Фиг. 3.
Другие GalNAc конъюгатные группировки могут включать, например, маленькие пептиды с присоединенными GalNAc группировками, такие как Tyr-Glu-Glu-(аминогексил-GalNAc)3 (YEE(ahGalNAc)3; гликотрипептид, который связывается с  рецептором асиалогликопротеина на гепатоцитах, см., например, Duff, et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297); галактозные кластеры на основе лизина (например, L3G4; Biessen, et al., Cardovasc. Med., 1999, 214); и галактозные кластеры на основе холана (например, мотив распознавания углевода для рецептора асиалогликопротеина).
В некоторых воплощениях изобретения конъюгат антисмыслового олигонуклеотида выбран из группы, состоящей из следующих CPM ID NO:  766_2, 767_2, 768_2, 769_2 и 770_2.
В предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 4.
В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 5.
В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 6.
В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 7.
В другом предпочтительном воплощении конъюгат антисмыслового олигонуклеотида соответствует соединению, представленному на Фиг. 8.
Линкеры
Биорасщепляемые линкеры (область В)
Применение конъюгата часто ассоциировано с улучшенными фармакокинетическими или фармакодинамическими свойствами. Однако присутствие конъюгатной группировки может препятствовать активности олигонуклеотида против намеченной мишени, например посредством стерического препятствия, предотвращающего гибридизацию или рекрутирование нуклеазы (например, РНКазы Н). Применение физиологически лабильной связи (биорасщепляемого линкера) между олигонуклеотидом (область А или первая область) и конъюгатной группировкой (область С или третья область) обеспечивает улучшенне свойства из-за присутствия конъюгатной группировки при обеспечении того, что при нахождении в ткани-мишени конъюгатная группа не предотвращает эффективную активность олигонуклеотида.
Расщепление физиологически лабильной связи происходит спонтанно при достижении молекулой, содержащей лабильную связь, подходящей внутри- и/или внеклеточной среды. Например, рН-лабильная связь может расщепляться при поступлении молекулы в подкисленную эндосому. Таким образом, рН-лабильная связь может рассматриваться как связь, расщепляемая в эндосоме. Связи, расщепляемые ферментом, могут расщепляться при воздействии ферментов, таких как ферметы, присутствующие в эндосоме или в лизосоме, или в цитоплазме. Дисульфидная связь может расщепляться при поступлении молекулы в более восстанавливающую среду цитоплазмы клетки. Таким образом, дисульфид может рассматриваться как связь, расщепляемая в цитоплазме. рН-лабильная связь в том виде, в котором данный термин используется в данном документе, представляет собой лабильную связь, которая селективно расщепляется при кислотных условиях (рН меньше 7). Такие связи также могут называться эндосомно-лабильными связыми, так как клеточные эндосомы и лизосомы имеют рН меньше, чем 7.
Для биорасщепляемых линкеров, ассоциированных с конъюгатной группировкой для таргетной доставки, предпочтительным является то, что скорость расщепления, наблюдаемая в ткани-мишени (например, в мышце, печени, почке или опухоли), была больше, чем наблюдающаяся в сыворотке крови. Подходящие способы для определения уровня (%) расщепления в ткани-мишени относительно сыворотки или расщепления нуклеазой S1 описываются в разделе «Материаы и методы». В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер (также именуемый физиологически лабильный линкер или нуклеазочувствительный линкер, или область В) в конъюгате по изобретению расщепляется по меньшей мере примерно на 20%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 30%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 40%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 50%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 60%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 70%, как, например, расщепляется по меньшей мере примерно на 75% по сравнению со стандартом.
В некоторых воплощениях конъюгат олигонуклеотида по изобретению содержит три области: i) первую область (область А), которая содержит 10-25 смежных нуклеотидов, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени; ii) вторую область (область В), которая содержит биорасщепляемый линкер, и iii) третью область (область С), которая содержит конъюгатную группировку, такую как конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, где третья область ковалентно связана со второй областью, которая ковалентно связана с первой областью.
В одном воплощении настоящего изобретения конъюгат олигонуклеотида содержит биорасщепляемый линкер (область В) между непрерывной нуклеотидной последовательностью (область А) и конъюгатной группировкой, нацеленной на рецептор асиалогликопротеина (область С).
В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер может находиться или на 5'-конце и/или на 3'-конце смежных нуклеотидов, комплементарных нуклеиновой кислоте-мишени (область А). В предпочтительном воплощении биорасщепляемый линкер находится на 5'-конце.
В некоторых воплощениях расщепляемый линкер является чувствительным к нуклеазе(зам), которые, например, могут экспрессироваться в клетке-мишени. В некоторых воплощениях биорасщепляемый линкер состоит из 2-5 последовательных фосфодиэфирных связей. Данный линкер может представлять собой короткую область (например, из 1-10, как подробно описано в определении линкеров) нуклеозидов, связанных фосфодиэфирными связями. В некоторых воплощениях нуклеозиды в области В биорасщепляемого линкера (возможно независимо) выбраны из группы, состоящей из нуклеозидов ДНК и РНК или их модификаций, которые не препятствуют нуклеазному расщеплению. Модификации нуклеозидов ДНК и РНК, которые не препятствуют нуклеазному расщеплению, могут представлять собой не встречающиеся в природе нуклеиновые основания. Некоторые нуклеозиды с модифицированным сахаром также могут обеспечивать нуклеазное расщепление, как, например, альфа-L-окси-LNA. В некоторых воплощениях все нуклеозиды области В содержат (возможно независимо) либо сахар 2'-OH-рибозу (РНК), либо 2'-H сахар - т.е. РНК или ДНК. В предпочтительном воплощении по меньшей мере два последовательных нуклеозида области В представляют собой нуклеозиды ДНК или РНК (как, например, по меньшей мере 3 или 4, или 5 последовательных нуклеозидов ДНК или РНК). В даже более предпочтительном воплощении нуклеозиды области В представляют собой нуклеозиды ДНК. Предпочтительно область В состоит из от 1 до 5 или от 1 до 4, как, например, из 2, 3, 4 последовательных нуклеозидов ДНК, связанных фосфодиэфирной связью. В предпочтительных воплощениях область В является такой короткой, что она не рекрутирует РНКазуН. В некоторых воплощениях область В содержит не больше, чем 3 или больше, чем 4 последовательных нуклеозида ДНК и/или РНК, связанных фосфодиэфирной связью (таких как нуклеозиды ДНК).
Когда область В состоит из нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью, область А и В могут вместе образовать олигонуклеотид, который связан с областью С. В данном контексте область А может отличаться от области В тем, что область А начинается с по меньшей мере одного, предпочтительно по меньшей мере двух модифицированных нуклеозидов с повышенной аффинностью связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью (например, LNA или нуклеозиды с 2'-замещенной сахарной группировкой), и область А сама по себе способна к модуляции экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени в релевантной линии клеток. Кроме того, если область А содержит нуклеозиды ДНК или РНК, они связаны нуклеазоустойчивой межнуклеозидной связью, такой как фосфоротиоатная или боранофосфатная. Область В, с другой стороны, содержит фосфодиэфирные связи между нуклеозидами ДНК или РНК. В некоторых воплощениях область В не является комплементарной или содержит по меньшей мере 50% несоответствий с нуклеиновой кислотой-мишенью.
В некоторых воплощениях область В не является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени или смежным нуклеотидам, комплементарным нуклеиновой кислоте-мишени в области А.
В некоторых воплощениях область В является комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. В данном отношении области А и В вместе могут образовать одну непрерывную последовательность, которая является комплементарной последовательности-мишени.
В некоторых аспектах изобретения межнуклеозидная связь между первой (область А) и второй областью (область В) может рассматриваться как часть второй области.
В некоторых воплощениях последовательность оснований в области В выбрана для обеспечения оптимального сайта расщепления эндонуклеазой на основе преобладающих эндонуклеазных расщепляющих ферментов, присутствующих в ткани-мишени или в клетке-мишени, или в субклеточном компартменте-мишени. В данном отношении посредством выделения клеточных экстрактов из тканей-мишеней и тканей, не являющихся мишенями, могут быть выбраны последовательности расщепления эндонуклеазой для применения в области В на основе предпочтительной расщепляющей активности в желательной клетке-мишени (например, печени/гепатоцитах) по сравнению с клеткой, не являющейся мишенью (например, почки). В данном отношении эффективность соединения в отношении понижающей регуляции мишени может быть оптимизирована для желательной ткани/клетки.
В некоторых воплощениях область В содержит динуклеотид последовательности AA, AT, AC, AG, TA, TT, TC, TG, CA, CT, CC, CG, GA, GT, GC, или GG, в которм С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидная связь представляет собой фосфодиэфирную связь. В некоторых воплощениях область В содержит тринуклеотид последовательности AAA, AAT, AAC, AAG, ATA, ATT, ATC, ATG, ACA, ACT, ACC, ACG, AGA, AGT, AGC, AGG, TAA, TAT, TAC, TAG, TTA, TTT, TTC, TAG, TCA, TCT, TCC, TCG, TGA, TGT, TGC, TGG, CAA, CAT, CAC, CAG, CTA, CTG, CTC, CTT, CCA, CCT, CCC, CCG, CGA, CGT, CGC, CGG, GAA, GAT, GAC, CAG, GTA, GTT, GTC, GTG, GCA, GCT, GCC, GCG, GGA, GGT, GGC и GGG, в которм С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодиэфирные связи. В некоторых воплощениях область В содержит тетрануклеотид последовательности AAAX, AATX, AACX, AAGX, ATAX, ATTX, ATCX, ATGX, ACAX, ACTX, ACCX, ACGX, AGAX, AGTX, AGCX, AGGX, TAAX, TATX, TACX, TAGX, TTAX, TTTX, TTCX, TAGX, TCAX, TCTX, TCCX, TCGX, TGAX, TGTX, TGCX, TGGX, CAAX, CATX, CACX, CAGX, CTAX, CTGX, CTCX, CTTX, CCAX, CCTX, CCCX, CCGX, CGAX, CGTX, CGCX, CGGX, GAAX, GATX, GACX, CAGX, GTAX, GTTX, GTCX, GTGX, GCAX, GCTX, GCCX, GCGX, GGAX, GGTX, GGCX и GGGX, где Х может быть выбран из группы, состоящей из A, T, U, G, C и их аналогов, где С может представлять собой 5-метилцитозин, и/или Т может быть заменен U. Предпочтительно межнуклеозидные связи представляют собой фосфодиэфирные связи. Будет понятно то, что при ссылке на (встречающиеся в природе) нуклеиновые основания A, T, U, G, C они могут быть заменены аналогами нуклеиновых оснований, которые функционируют как эквивалент природных нуклеиновых оснований (например, пара оснований с комплементарным нуклеозидом).
Другие линкеры (область Y)
Линкер может иметь по меньшей мере две функциональные группы: одну для присоединения олигонуклеотида и другую - для присоединения конъюгатной группировки. Типичные функциональные группы линкера могут быть электрофильными для осуществления реакции с нуклеофильными группами на олигонуклеотиде или конъюгатной группировке или нуклеофильными для осуществления реакции с электрофильными группами. В некоторых воплощениях функциональные группы линкера включают амино, гидроксил, карбоновую кислоту, тиол, фосфорамидат, фосфоротиоат, фосфат, фосфит, ненасыщенные группы (например, с двойными или тройными связями) и тому подобное. Некоторые типичные линкеры (область Y) включают 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту (ADO), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-l-карбоксилат (SMCC), 6- аминогексановую кислоту (AHEX или AHA), 6-аминогексилокси, 4-аминомасляную кислоту, 4-аминоциклогексилкарбоновую кислоту, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-l-карбокси-(6-амидо-капроат) (LCSMCC), сукцинимидил-м-малеимидо-бензоилат (MBS), сукцинимидил-N-e-малеимидо-капроилат (EMCS), сукцинимидил-6-(бета-малеимидо-пропионамидо)гексаноат (SMPH), сукцинимидил-N-(a-малеимидоацетат) (AMAS), сукцинимидил-4-(п-малеимидофенил)бутират (SMPB), бета-аланин (бета-ALA), фенилглицин (PHG), 4-аминоциклогексановую кислоту (ACHC), бета-(циклопропил)аланин (бета-CYPR), аминододекановую кислоту (ADC), алилендиолы, полиэтиленгликоли, аминокислоты и тому подобное. В некоторых воплощениях линкер (область Y) представляет собой аминоалкил, как, например, С2-С36 аминоалкильную группу, включающую, например, С6-С12 аминоалкильные группы. В предпочтительном воплощении линкер (область Y) представляет собой С6 аминоалкильную группу. Аминоалкильная группа может быть добавлена к олигонуклеотиду (область А или область А-В) в качестве части стандартного синтеза олигонуклеотида, например, с использованием (например, защищенного) аминоалкилфосфорамидита. Связывающая группа между аминоалкилом и олигонуклеотдом может представлять собой, например, фосфоротиоат или фосфодиэфир, или одну из других нуклеозидных связывающих групп, на которые дается ссылка в данном документе. Аминоалкильная группа квалентно связывается с 5' или 3'-концом олигонуклеотида. Имеющиеся в продаже аминоалкильные линкеры представляют собой, например, 3'-аминомодифицирующий реактив для связывания на 3'-конце олигонуклеотида, и для связывания на 5'-конце олигонуклеотида доступен 5'-аминомодификатор С6. Данные реактивы доступны у Glen Research Corporation (Sterling, Va.). Данные соединения или аналогичные соединения были использованы Krieg, et al, Antisense Research and Development 1991, 1, 161 для связывания флюоресцеина с 5'-концом олигонуклеотида. В данной области известен широкий спектр других линкерных групп, и они могут быть полезными при присоединении конъюгатных группировок к олигонуклеотидам. Обзор многих полезных линкерных групп можно найти, например, в Antisense Research and Applications, S. T. Crooke and B. Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, p. 303-350. Другие соединения, такие как акридин, присоединяли к 3'-концевой фосфатной группе олигонуклеотида посредством полиметиленовой связи (Asseline, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 3297). Любую из приведенных выше групп можно использовать в качестве одиночного линкера (область Y) или в комбинации с одним или более чем одним другим линкером (область Y-Y' или область Y-B, или B-Y).
Линкеры и их применение в получении конъюгатов олигонуклеотидов приводятся во всей данной области, как, например, в WO 96/11205 и WO 98/52614 и в патентах США № 4948882; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5580731; 5486603; 5608046; 4587044; 4667025; 5254469; 5245022; 5112963; 5391723; 5510475; 5512667; 5574142; 5684142; 5770716; 6096875; 6335432 и 6335437, WO 2012/083046, каждая из которых включена посредством ссылки во всей ее полноте.
Способ изготовления
В другом аспекте согласно изобретению предложены способы изготовления олигонуклеотидов по изобретению, включающие проведение взаимодействия нуклеотидных звеньев и, посредством этого, образование ковалентно связанных смежных нуклеотидных звеньев, содержащихся в олигонуклеотиде. Предпочтительно в данном способе используется фосфорамидитная химия (см., например, Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology том 154, страницы 287-313). В другом воплощении данный способ дополнительно включает проведение взаимодействия непрерывной нуклеотидной последовательности с конъюгируемой группировкой (лигандом). В другом аспекте предложен способ изготовления композиции по изобретению, включающий смешивание олигонуклеотида или конъюгированного олигонуклеотида по изобретению с фармацевтически приемлемым разбавителем, растворителем, носителем, солью и/или адъювантом.
Фармацевтическая композиция
В другом аспекте согласно изобретению предложена фармацевтическая композиция, содержащая любой из вышеупомянутых олигонуклеотидов и/или конъюгатов олигонуклеотидов и фармацевтически приемлемый разбавитель, растворитель, носитель, соль и/или адъювант. Фармацевтически приемлемый разбавитель включает фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), а фармацевтически приемлемые соли включают натриевые и калиевые соли, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой стерильный фосфатно-солевой буферный раствор. В некоторых воплощениях олигонуклеотид используется в фармацевтически приемлемом разбавителе в виде раствора в концентрации 50-300 мкМ.
Подходящие препараты для применения в настоящем изобретении находятся в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. Относительно краткого обзора способов доставки лекарственного средства, см., например, Langer (Science 249:1527-1533, 1990). В WO 2007/031091 предложены дполнительные подходящие и предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых разбавителей, носителей и адъювантов (включенные тем самым посредством ссылки). Подходящие дозировки, препараты, пути введения, композиции, лекарственные формы, комбинации с другими терапевтическими агентами, препараты пролекарств также приводятся в WO 2007/031091.
Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по изобретению могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми активными или инертными веществами для приготовления фармацевтических композиций или препаратов. Композиции и способы для приготовления фармацевтических композиций зависят от целого ряда критериев, включающих путь введения, степень заболевания или дозу, подлежащую введению, но не ограничивающихся ими.
Данные композиции можно стерилизовать традиционными методиками стерилизации, или они могут подвергаться стерилизующему фильтрованию. Образующиеся водные растворы могут быть упакованы для применения в том виде, в котором они находятся, или лиофилизируются, причем лиофилизированный препарат объединяется со стерильным водным раствором перед введением. рН препаратов типично будет составлять от 3 до 11, более предпочтительно - от 5 до 9 или от 6 до 8, и наиболее предпочтительно - от 7 до 8, как, например, от 7 до 7,5. Образующиеся композиции в твердой форме можно упаковывать в многочисленные единичные стандартные дозы, причем каждая из них содержит фиксированное количество вышеупомянутого агента или агентов, как, например, в запечатанной упаковке или таблетках, или капсулах. Композицию в твердой форме также можно упаковывать в контейнер для гибкого количества, такой как поддающийся выдавливанию тюбик, разработанный для местно наносимого крема или мази.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида по изобретению представляет собой пролекарство. В частности, в отношении конъюгатов олигонуклеотидов конъюгатная группировка отщепляется от олигонуклеотида, как только пролекарство доставляется к месту действия, например, в клетку-мишень.
Применения
Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению могут использоваться в качестве исследовательских реактивов, например, для диагностики, терапии и профилактики.
В исследовании такие олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов можно использовать для специфичной модуляции синтеза белка PD-L1 в клетках (например, в культурах клеток in vitro) и в экспериментальных животных, облегчая, посредством этого, функциональный анализ мишени или оценку ее полезности в качестве мишени для терапевтического вмешательства. Типично модуляция мишени достигается посредством осуществления деградации или ингибирования мРНК, продуцирующей белок, предотвращая, посредством этого, образование белка, или посредством осуществления деградации или ингибирования модулятора гена или мРНК, продуцирующей белок.
При использовании олигонуклеотида по изобретению в исследовании или диагностике нуклеиновая кислота-мишень может представлять собой кДНК или синтетическую нуклеиновую кислоту, полученную из ДНК или РНК.
Согласно настоящему изобретению предложен способ in vivo или in vitro модуляции экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспрессирует PD-L1, причем указанный способ включает введение в указанную клетку олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по изобретению в эффективном количестве.
В некоторых воплощениях клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего, в частности, человеческую клетку. Клетка-мишень может представлять собой культуру клеток in vitro или клетку in vivo, образующую часть ткани млекопитающего. В предпочтительных воплощениях клетка-мишень присутствует в печени. Клетка-мишень печени может быть выбрана из паренхимных клеток (например, гепатоцитов) и непаренхимных клеток, таких как клетки Купфера, LSEC, звездчатые клетки (или клетки Ито), холангиоциты и лейкоциты, ассоциированные с печенью (включающие Т-клетки и NK-клетки). В некоторых воплощениях клетка-мишень представляет собой антигенпрезентирующую клетку. Антигенпрезентирующие клетки подвергают дисплею чужеродные антигены, образующие комплекс с главным комплексом гистосовместимости (МНС) класса I или класса II на их поверхностях. В некоторых воплощениях антигенпрезентирующие клетки экспрессируют МНС класса II (т.е. профессиональные антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, макрофаги и В-клетки).
При диагностике данные олигонуклеотиды могут быть использованы для выявления и количественного измерения экспрессии PD-L1 в клетке и тканях посредством норзерн-блоттинга, гибридизации in situ или аналогичных методик.
Для терапии олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению или их фармацевтические копозиции могут вводиться животному или человеку, у которого подозревается наличие заболевания или расстройства, которое может быть облегчено или вылечено посредством уменьшения экспрессии PD-L1, в частности, посредством уменьшения экспрессии PD-L1 в клетках-мишенях печени.
Согласно изобретению предложены способы лечения или предупреждения заболевания, включающие введение терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида, конъюгата олигонуклеотида или фармацевтической композиции по изобретению субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.
Данное изобретение также относится к олигонуклеотиду, конъюгату олигонуклеотида или фармацевтической композиции согласно изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическую композицию согласно изобретению типично вводят в эффективном количестве.
Согласно изобретению также предложено применение олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида, или фармацевтической композиции по изобретению, как описано, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства, на которые дается ссылка в данном документе. В одном воплощении данное заболевание выбрано из: а) вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; б) паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, и в) рака печени или метастазов в печени.
В одном воплощении данное изобретение относится к олигонуклеотидам, конъюгатам олигонуклеотидов или фармацевтическим композициям для применения в лечении заболеваний или расстройств, выбранных из вирусных или паразитарных инфекций. В другом воплощении данное заболевание выбрано из: а) вирусных инфекций печени, таких как инфекции HBV, HCV и HDV; б) паразитарных инфекций, таких как малярия, токсоплазмоз, лейшманиоз и трипаносомоз, и в) рака печени или метастазов в печени.
Заболевание или расстройство, на которые дается ссылка в данном документе, ассоциировано с истощением иммунной системы. В частности, данное заболевание или расстройство ассоциировано с истощением вирусоспецифичных ответов Т-клеток. В некоторых воплощениях заболевание или расстройство может быть облегчено или вылечено посредством уменьшения экспрессии PD-L1.
Способы по изобретению предпочтительно используют для лечения или профилактики против заболеваний, ассоциированных с истощением иммунной системы.
В одном воплощении изобретения олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтические композиции по изобретению используются в восстановлении иммунного ответа против рака печени или метастазов в печени.
В одном воплощении изобретения олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтические композиции по изобретению используются в восстановлении иммунного ответа против патогена. В некоторых воплощениях патоген может находиться в печени. Данными патогенами могут быть вирус или паразит, в частности, вирусы или паразиты, описанные в данном документе. В предпочтительном воплощении патоген представляет собой HBV.
Данное изобретение дополнительно относится к применению олигонуклеотида, конъюгата олигонуклеотида или фармацевтической композиции, как определено в данном документе, для изготовления лекарственного средства для восстановления иммунитета против вирусной или паразитарной инфекции, как упомянуто в данном документе.
Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в лечении вирусных инфекций, в частности, вирусных инфекций в печени, где подвержен влиянию путь PD-1 (см., например, Kapoor and Kottilil 2014 Future Virol Vol. 9 pp. 565-585 и Salem and El-Badawy 2015 World J Hepatol Vol. 7 pp. 2449-2458). Вирусные инфекции печени могут быть выбраны из группы, состоящей из вирусов гепатита, в частности HBV, HCV и HDV, в частности, хронических форм данных инфекций. В одном воплощении олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению используются для лечения HBV, в частности, хронического HBV. Показателями хронических инфекций HBV являются высокие уровни вирусной нагрузки (ДНК HBV) и даже более высокие уровни пустых частиц HВsAg (более чем 100-кратный избыток относительно вирионов) в системе кровообращения.
Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов по настоящему изобретению также можно использовать для лечения вирусных инфекций печени, которые наблюдаются в качестве сопутствующих инфекций ВИЧ (вирус иммунодефицита человека). Другими вирусными инфекциями, которые можно лечить олигонуклеотидами или конъюгатами олигонуклеотидов, или фармацевтическими композициями по настоящему изобретению, являются lcmv (вирус лимфоцитарного хориоменингита) и ВИЧ в качестве моноинфекции, HSV-1 и -2, и другие герпесвирусы. Данные вирусы не являются гепатотрофическими, однако, они могут быть чувствительными к понижающей регуляции PD-L1.
В некоторых воплощениях восстановление иммунитета или иммунного ответа включает улучшение ответа Т-клеток и/или NK-клеток, и/или ослабление исчерпания Т-клеток, в частности, восстанавливается HBV-специфичный Т-клеточный ответ, HСV-специфичный Т-клеточный ответ и HDV-специфичный Т-клеточный ответ. Улучшение Т-клеточного ответа, например, можно оценивать как увеличение уровня Т-клеток в печени, в частности, увеличение уровня Т-клеток CD8+ и/или CD4+ по сравнению с контролем (т.е. уровнем до обработки или уровнем у субъекта, обработанного носителем). В другом воплощении восстанавливается или возрастает именно уровень вирусоспецифичных Т-клеток CD8+ по сравнению с контролем, в частности, восстанавливается или возрастает уровень HBV-специфичных Т-клеток CD8+ или HСV-специфичных Т-клеток CD8+, или HDV-специфичных Т-клеток CD8+ по сравнению с контролем. В предпочтительном воплощении возрастает уровень Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена s HBV (HВsAg) и/или Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена e HBV (HBeAg), и/или Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена кора HBV (HBсAg), у субъектов, обработанных олигонуклеотидом, конъюгатом олигонуклеотида или фармацевтической композицией по настоящему изобретению по сравнению с контролем. Предпочтительно Т-клетки CD8+, специфичные в отношении антигена HBV, продуцируют один или более чем один цитокин, такой как интерферон-гамма (IFN-γ) или фактор некроза опухолей альфа (TNF-α). Увеличение уровня Т-клеток CD8+, описанных выше, в частности, наблюдается в печени. Описанное в данном документе увеличение должно быть статистически значимым по сравнению с контролем. Предпочтительно данное увеличение составляет по меньшей мере 20%, как, например, 25%, как, например, 50%, как, например, 75% по сравнению с контролем. В другом воплощении олигонуклеотидами или конъюгатами олигонуклеотидов по настоящему изобретению активируются природные клетки-киллеры (NK) и/или природные Т-клетки-киллеры (NKТ).
Олигонуклеотиды или конъюгаты олигонуклеотидов, или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно использовать в лечении паразитарных инфекций, в частности, паразитарных инфекций, где подвергается влиянию путь PD-1 (см., например, Bhadra et al. 2012 J Infect Dis vol 206 pp. 125-134; Bhadra et al. 2011 Proc Natl Acad Sci U S A Vol. 108 pp. 9196-9201; Esch et al. J Immunol vol 191 pp 5542-5550; Freeman and Sharpe 2012 Nat Immunol Vol 13 pp. 113-115; Gutierrez et al. 2011 Infect Immun Vol 79 pp. 1873-1881; Joshi et al. 2009 PLoS Pathog Vol 5 e1000431; Liang et al. 2006 Eur J Immunol Vol. 36 pp 58-64; Wykes et al. 2014 Front Microbiol Vol 5 pp 249). Паразитарные инфекции могут быть выбраны из группы, состоящей из малярии, токсоплазмоза, лейшманиоза и трипаносомоза. Малярийная инфекция вызвана протистом рода Plasmodium, в частности вида P. vivax, P. malariae и P. falciparum. Токсоплазмоз представляет собой паразитарное заболевание, вызванное Toxoplasma gondii. Лейшманиоз представляет собой заболевание, вызванное протозойными паразитами рода Leishmania. Трипаносомоз вызван простейшим рода Trypanosoma. Болезнь Чагаса, которая является тропической формой, вызывается видом Trypanosoma cruzi, а расстройство сна вызывается видом Trypanosoma brucei.
В некоторых воплощениях восстановление иммунитета включает восстановление ответа паразитоспецифичных Т-клеток и NK-клеток, в частности, ответа Plasmodium-специфичных Т-клеток, ответа Toxoplasma gondii-специфичных Т-клеток и NK-клеток, ответа Leishmania-специфичных Т-клеток и NK-клеток, ответа Trypanosoma cruzi-специфичных Т-клеток и NK-клеток или ответа Trypanosoma brucei-специфичных Т-клеток и NK-клеток. В другом воплощении восстанавливается именно ответ паразитоспецифичных Т-клеток CD8+ и NK-клеток.
Введение
Олигонуклеотиды или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить местно (как, например, на кожу, посредством ингаляции, в глаз или в ухо), энтерально (как, например, перорально или через желудочно-кишечный тракт) или парентерально (как, например, внутривенно, подкожно, внутримышечно, интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно или подоболочечно).
В предпочтительном воплощении олигонуклеотид или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводятся посредством парентрального пути, включающего внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию, внутриоболочечное или внутричерепное, например, интрацеребральное или интравентрикулярное, интравитреальное введение. В одном воплощении активный олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида вводится внутривенно. В другом воплощении активный олигонуклеотид или конъюгат олигонуклеотида вводится подкожно.
В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению вводится в дозе 0,1-15 мг/кг, как, например, 0,1-10 мг/кг, как, например, 0,2-10 мг/кг, как, например, 0,25-10 мг/кг, как, например, 0,1-5 мг/кг, как, например, 0,2-5 мг/кг, как, например, 0,25-5 мг/кг. Введение может осуществляться один раз в неделю, каждую 2-ую неделю, каждую третью неделю или даже один раз в месяц.
Комбинированные терапии
В некоторых воплощениях олигонуклеотид, конъюгат олигонуклеотида или фармацевтическая композиция по изобретению предназначены для применения в комбинированном лечении с другим терапевтическим агентом. Данный терапевтический агент может представлять собой, например, стандарт лечения для описанных выше заболеваний или расстройств.
Для лечения хронических инфекций HBV в качестве стандарта лечения рекомендуется комбинация противовирусных лекарственных средств и модуляторов иммунной системы. Эффективными противовирусными лекарственными средствами против HBV являются, например, аналоги нуклеоз(т)идов. Имеется пять аналогов нуклеоз(т)идов, лицензированных для терапии HBV, а именно: ламивудин (эпивир), адефовир (гепсера), тенофовир (виреад), телбивудин (тизека), энтекавир (бараклуд). Они являются эффективными в подавлении вирусной репликации (ДНК HBV), но не имеют влияния на уровни HВsAg. Другие антивирусные лекарственные средства включают рибавирин и терапию антителом против HBV (моноклональным или поликлональным). Модуляторами иммунной системы могут быть, например, интерферон-альфа-2а и ПЭГилированный интерферон-альфа-2а (пегасис) или агонисты TLR7 (например, GS-9620), или терапевтические вакцины. Лечение IFN-α демонстрирует лишь очень умеренный эффект в уменьшении вирусной нагрузки, но приводит к некоторому снижению уровня HВsAg, хотя и очень не эффективно (меньше 10% после 48 недель терапии).
Олигонуклеотид или конъюгаты олигонуклеотида по настоящему изобретению также могут быть объединены с другими противовирусными лекарственными средствами, эффективными против HBV, такими как антисмысловые олигонуклеотиды, описанные в WO2012/145697 и WO 2014/179629, или молекулы миРНК, описанные в WO 2005/014806, WO 2012/024170, WO 2012/2055362, WO 2013/003520 и WO 2013/159109.
При введении олигонуклеотидов или конъюгатов олигонуклеотидов по данному изобретению в комбинированных терапиях с другими агентами, они могут вводиться индивиду последовательно или сопутствующе. В качестве альтернативы, фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать комбинацию олигонуклеотида или конъюгата олигонуклеотида по настоящему изобретению в ассоциации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, как описано в данном документе, и с другим терапевтическим или профилактическим агентом, известным в данной области.
ВОПЛОЩЕНИЯ
Следующие воплощения настоящего изобретения можно использовать в комбинации с любыми другими воплощениями, описанными в данном документе.
1. Антисмысловой олигонуклеотид, который содержит или состоит из непрерывной нуклеотидной последовательности из 10-30 нуклеотидов в длину, способный уменьшать экспрессию PD-L1.
2. Олигонуклеотид по воплощению 1, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является по меньшей мере на 90% комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени PD-L1.
3. Олигонуклеотид по воплощению 1 или 2, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3.
4. Олигонуклеотид по воплощениям 1-3, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна области в пределах положения 1 и 15720 на SEQ ID NO: 1.
5. Олигонуклеотид по воплощениям 1-4, где данный олигонуклеотид способен гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3, с ΔG° меньше -41,8 кДж.
6. Олигонуклеотид по воплощениям 1-5, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, где данная подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из положения 371-3068, 5467-12107, 15317-15720, 15317-18083,  15317-19511 и 18881-19494 на SEQ ID NO: 1.
7. Олигонуклеотид по воплощению 6, в котором подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из положения 7300-7333, 8028-8072, 9812-9859, 11787-11873 и 15690-15735 на SEQ ID NO: 1.
8. Олигонуклеотид по воплощениям 2-7, в котором нуклеиновая кислота-мишень представляет собой РНК.
9. Олигонуклеотид по воплощению 8, где РНК представляет собой мРНК.
10. Олигонуклеотид по воплощению 9, где мРНК представляет собой пре-мРНК или зрелую мРНК.
11. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из по меньшей мере 14 непрерывных нуклеотидов, в частности, из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 непрерывных нуклеотидов.
12. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из 16-20 нуклеотидов.
13. Олигонуклеотид по воплощениям 1-10, где данный олигонуклеотид содержит или состоит из 14-35 нуклеотидов в длину.
14. Олигонуклеотид по воплощению 13, где данный олигонуклеотид содержит или состоит из 18-22 нуклеотидов в длину.
15. Олигонуклеотид по воплощениям 1-14, где данный олигонуклеотид или непрерывная нуклеотидная последовательность является одноцепочечной.
16. Олигонуклеотид по воплощениям 1-15, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность комплементарна подпоследовательности нуклеиновой кислоты-мишени, где данная подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из A7, A26, A43, A119, A142, A159, A160, A163, A169, A178, A179, A180, A189, A201, A202, A204, A214, A221, A224, A226, A243, A254, A258, 269, A274, A350, A360, A364, A365, A370, A372, A381, A383, A386, A389, A400, A427, A435 и A438.
17. Олигонуклеотид по воплощению 16, в котором подпоследовательность выбрана из группы, состоящей из A221, A360, A180, A160 и A269.
18. Олигонуклеотид по воплощениям 1-17, где данный олигонуклеотид не является миРНК и не является комплементарным самому себе.
19. Олигонуклеотид по воплощениям 1-18, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5-743 или 771.
20. Олигонуклеотид по воплощениям 1-19, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 6, 8, 9, 13, 41, 42, 58, 77, 92, 111, 128, 151, 164, 166, 169, 171, 222, 233, 245, 246, 250, 251, 252, 256, 272, 273, 287, 292, 303, 314, 318, 320, 324, 336, 342, 343, 344, 345, 346, 349, 359, 360, 374, 408, 409, 415, 417, 424, 429, 430, 458, 464, 466, 474, 490, 493, 512, 519, 519, 529, 533, 534, 547, 566, 567, 578, 582, 601, 619, 620, 636, 637, 638, 640, 645, 650, 651, 652, 653, 658, 659, 660, 665, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 687, 694, 706, 716, 728, 733, 734 и 735.
21. Олигонуклеотид по воплощениям 1-20, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность содержит или состоит из последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 466, 640, 342, 287 и 566.
22. Олигонуклеотид по воплощениям 1-21, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет от нуля до трех несоответствий по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью, которой она комплементарна.
23. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет одно несоответствие по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.
24. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность имеет два несоответствия по сравнению с нуклеиновой кислотой-мишенью.
25. Олигонуклеотид по воплощению 22, в котором непрерывная нуклеотидная последовательность является полностью комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
26. Олигонуклеотид по воплощениям 1-25, содержащий один или более чем один модифицированный нуклеозид.
27. Олигонуклеотид по воплощению 26, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой высокоаффинные модифицированные нуклеозиды.
28. Олигонуклеотид по воплощению 26 или 27, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром.
29. Олигонуклеотид по воплощению 28, в котором один или более чем один нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбран из группы, состоящей из нуклеозидов 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, 2'-фтор-ANA и LNA.
30. Олигонуклеотид по воплощению 28, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид LNA.
31. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид LNA представляет собой окси-LNA.
32. Олигонуклеотид по воплощению 31, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой бета-D-окси-LNA.
33. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой тио-LNA.
34. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой амино-LNA.
35. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой сЕТ.
36. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой ENA.
37. Олигонуклеотид по воплощению 30, в котором модифицированный нуклеозид LNA выбран из бета-D-окси-LNA, альфа-L-окси-LNA, бета-D-амино-LNA, альфа-L-амино-LNA, бета-D-тио-LNA, альфа-L-тио-LNA, (S)cET, (R)cET, бета-D-ENA и альфа-L-ENA.
38. Олигонуклеотид по воплощениям 30-37, в котором, помимо модифицированного нуклеозида LNA, имеется по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид.
39. Олигонуклеотид по воплощению 38, в котором 2'-замещенный модифицированный нуклеозид выбран из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК (МОЕ), 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, 2'-фтор-ANA.
40. Олигонуклеотид по любому из воплощений 1-39, где данный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь.
41. Олигонуклеотид по воплощению 40, в котором модифицированная межнуклеозидная связь является устойчивой к нуклеазе.
42. Олигонуклеотид по воплощению 40 или 41, в котором по меньшей мере 50% межнуклеозидных связей в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи или боранофосфатные межнуклеозидные связи.
43. Олигонуклеотид по воплощению 40 или 41, в котором все межнуклеозидные связи в пределах непрерывной нуклеотидной последовательности представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
44. Олигонуклеотид по воплощениям 1-43, где данный олигонуклеотид способен рекрутировать РНКазу Н.
45. Олигонуклеотид по воплощению 44, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер.
46. Олигонуклеотид по воплощению 44 или 45, где данный олигонуклеотид представляет собой гэпмер формулы 5'-F-G-F'-3', где области F и F' независимо содержат или состоят из 1-7 модифицированных нуклеозидов, и G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н.
47. Олигонуклеотид по воплощению 44 или 45, где гэпмер имеет формулу 5'-D'-F-G-F'-3' или 5'-F-G-F'-D''-3', где области F и F' независимо содержат 1-7 модифицированных нуклеозидов, G представляет собой область из 6-16 нуклеозидов, которые способны рекрутировать РНКазу Н, и области D' или D'' содержат 1-5 нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью.
48. Олигонуклеотид по воплощению 47, в котором D' или D'' являются опционными.
49. Олигонуклеотид по воплощению 47, в котором область D' состоит из двух нуклеозидов, связанных фосфодиэфирной связью.
50. Олигонуклеотид по воплощению 49, в котором нуклеозиды, связанные фосфодиэфирной связью, представляют собой са (цитидин-аденозин).
51. Олигонуклеотид по воплощению 46 или 47, в котором модифицированный нуклеозид представляет собой нуклеозид, модифицированный 2'-сахаром, независимо выбранный из группы, состоящей из нуклеозидов 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК, 2'-фтор-ДНК, арабинонуклеиновой кислоты (ANA), 2'-фтор-ANA и LNA.
52. Олигонуклеотид по воплощениям 46-51, в котором один или более чем один модифицированный нуклеозид в области F и F' представляет собой нуклеозид LNA.
53. Олигонуклеотид по воплощению 52, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды LNA.
54. Олигонуклеотид по воплощению 53, в котором область F и F' состоит из нуклеозидов LNA.
55. Олигонуклеотид по воплощениям 52-54, в котором все модифицированные нуклеозиды в области F и F' представляет собой нуклеозиды окси-LNA.
56. Олигонуклеотид по воплощению 52, в котором по меньшей мере одна из областей F и F' дополнительно содержит по меньшей мере один 2'-замещенный модифицированный нуклеозид, независимо выбранный из группы, состоящей из 2'-O-алкил-РНК, 2'-O-метил-РНК, 2'-алкокси-РНК, 2'-O-метоксиэтил-РНК, 2'-амино-ДНК и 2'-фтор-ДНК.
57. Олигонуклеотид по воплощениям 46-56, в котором нуклеозиды, рекрутирующие РНКазу Н, в области G независимо выбраны из ДНК, альфа-L-LNA, C4'-алкилированной ДНК, ANA, 2'-F-ANA и UNA.
58. Олигонуклеотид по воплощению 57, в котором нуклеозиды в области G представляют собой нуклеозиды ДНК и/или альфа-L-LNA.
59. Олигонуклеотид по воплощению 57 или 58, в котором область G состоит из по меньшей мере 75% нуклеозидов ДНК.
60. Олигонуклеотид по воплощениям 1-59, где данный олигонуклеотид выбран из любого олигонуклеотида CMP ID NO: от 5_1 до 743_1 и 771_1 (Таблица 5).
61. Олигонуклеотид по воплощениям 1-60, где данный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из CMP ID NO: 6_1, 8_1, 9_1, 13_1, 41_1, 42_1, 58_1, 77_1, 92_1, 111_1, 128_1, 151_1, 164_1, 166_1, 169_1, 171_1, 222_1, 233_1, 245_1, 246_1, 250_1, 251_1, 252_1, 256_1, 272_1, 273_1, 287_1, 292_1, 303_1, 314_1, 318_1, 320_1, 324_1, 336_1, 342_1, 343_1, 344_1, 345_1, 346_1, 349_1, 359_1, 360_1, 374_1, 408_1, 409_1, 415_1, 417_1, 424_1, 429_1, 430_1, 458_1, 464_1, 466_1, 474_1, 490_1, 493_1, 512_1, 519_1, 519_1, 529_1, 533_1, 534_1, 547_1, 566_1, 567_1, 578_1, 582_1, 601_1, 619_1, 620_1, 636_1, 637_1, 638_1, 640_1, 645_1, 650_1, 651_1, 652_1, 653_1, 658_1, 659_1, 660_1, 665_1, 678_1, 679_1, 680_1, 682_1, 683_1, 684_1, 687_1, 694_1, 706_1, 716_1, 728_1, 733_1, 734_1 и 735_1.
62. Олигонуклеотид по воплощениям 1-61, где данный олигонуклеотид выбран из группы, состоящей из CMP ID NO: 287_1, 342_1, 466_1, 640_1, 566_1, 766_1, 767_1, 768_1, 769_1 и 770_1.
63. Конъюгат антисмыслового олигонуклеотида, содержащий:
а. олигонуклеотид по любому из воплощений 1-62 (область А); и
б. по меньшей мере одну конъюгатную группировку (область С), ковалентно присоединенную к указанному олигонуклеотиду.
64. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63, в котором конъюгатная группировка выбрана из углеводов, лигандов рецептора поверхности клетки, лекарственных веществ, гормонов, липофильных веществ, полимеров, белков, пептидов, токсинов, витаминов, вирусных белков или их комбинаций.
65. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63 или 64, в котором конъюгатная группировка представляет собой углеводсодержащую группировку.
66. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 65, в котором углеводная конъюгатная группировка содержит по меньшей мере одну группировку, нацеленную на рецептор асиалогликопротеина, ковалентно присоединенную к олигонуклеотиду по любому из пп. 1-62.
67. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 66, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, содержит по меньшей мере одну углеводную группировку, выбранную из группы, состоящей из галактозы, галактозамина, N-формил-галактозамина, N-ацетилгалактозамина, N-пропионил-галактозамина, N-н-бутаноил-галактозамина и N-изобутаноилгалактозамина.
68. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 66 или 67, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, является одновалентной, двухвалентной, трехвалентной или четырехвалентной.
69. Конъюгат олигомера по воплощению 68, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, состоит из двух-четырех концевых GalNAc группировок, ПЭГ спейсера, связывающего каждую GalNAc группировку с разветвляющей молекулой.
70. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 66-69, в котором конъюгатная группировка, нацеленная на рецептор асиалогликопротеина, представляет собой трехвалентную N-ацетилгалактозаминную (GalNAc) группировку.
71. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 66-70, в котором конъюгатная группировка выбрана из одной из трехвалентных GalNAc группировок на Фиг. 1.
72. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 71, в котором конъюгатная группировка представляет собой трехвалентную GalNAc группировку на Фиг. 3.
73. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 63-72, в котором присутствует линкер между олигонуклеотидом или непрерывной олигонуклеотидной последовательностью и конъюгатной группировкой.
74. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 73, в котором линкер представляет собой физиологически лабильный линкер (область В).
75. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 74, в котором физиологически лабильный линкер представляет собой нуклеазочувствительный линкер.
76. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 74 или 75, в котором физиологически лабильный линкер состоит из 2-5 последовательных фосфодиэфирных связей.
77. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 76, в котором физиологически лабильный линкер является эквивалентным области D' или D'', присутствующей в воплощении 47-50.
78. Конъюгат олигонуклеотида по любому из воплощений 63-77, где данный конъюгат олигонуклеотида выбран из CMP ID NO: 766_2, 767_2, 768_2, 769_2 и 770_2.
79. Конъюгат олигонуклеотида по воплощению 78, где данный конъюгат олигонуклеотида выбран из конъюгата олигонуклеотида, представленного на Фиг. 4, 5, 6, 7 и 8.
80. Конъюгат олигонуклеотида по воплощениям 63-76, который демонстрирует улучшенное ингибирование PD-L1 в клетке-мишени или улучшенное клеточное распределение между печенью и селезенкой, или улучшенное клеточное поглощение в печени конъюгата олигонуклеотида по сравнению с неконъюгированным олигонуклеотидом.
81. Фармацевтическая композиция, содержащая олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, соль и/или адъювант.
82. Способ изготовления олигонуклеотида по воплощению 1-62, включающий проведение взаимодействия нуклеотидных звеньев, образуя, посредством этого, ковалентно связанные смежные нуклеотидные звенья, содержащиеся в олигонуклеотиде.
83. Способ по воплощению 82, дополнительно включающий проведение взаимодействия непрерывной нуклеотидной последовательности с ненуклеотидной конъюгатной группировкой.
84. Способ изготовления композиции по воплощению 81, включающий смешивание олигонуклеотида с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солью и/или адъювантом.
85. Способ in vivo или in vitro модулирования экспрессии PD-L1 в клетке-мишени, которая экспресирует PD-L1, причем указанный способ включает введение олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80, или фармацевтической композиции по воплощению 81 в эффективном количестве в указанную клетку.
86. Способ лечения или предупреждения заболевания, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80, или фармацевтической композиции по воплощению 81 субъекту, страдающему от или восприимчивому к заболеванию.
87. Способ восстановления иммунитета против вируса или паразита, включающий введение терапевтически или профилактически эффективного количества конъюгата олигонуклеотида по воплощениям 63-80 или олигонуклеотида по воплощениям 1-62, или фармацевтической композиции по воплощению 81 субъекту, инфицированному вирусом или паразитом.
88. Способ по воплощению 87, причем восстановление иммунитета представляет собой увеличение в печени Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV по сравнению с контролем.
89. Олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80, или фармацевтическая композиции по воплощению 81 для применения в качестве лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.
90. Применение олигонуклеотида по воплощениям 1-62 или конъюгата по воплощениям 63-80 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания у субъекта.
91. Олигонуклеотид по воплощениям 1-62 или конъюгат по воплощениям 63-80, или фармацевтическая композиции по воплощению 81 для применения в восстановлении иммунитета против вируса или паразита.
92. Применение по воплощению 91, где восстановление иммунитета представляет собой увеличение в печени Т-клеток CD8+, специфичных в отношении одного или более чем одного антигена HBV по сравнению с контролем.
93. Применение по воплощению 92, где антиген HBV представляет собой HBsAg.
94. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-93, где заболевание ассоциировано с активностью PD-L1 in vivo.
95. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-94, где заболевание ассоциировано с повышенной экспрессией PD-L1 в антигенпрезентирующей клетке.
96. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 95, где экспрессия PD-L1 снижается по меньшей мере на 30% или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 95% по сравнению с экспрессией без обработки или до обработки олигонуклеотидом по воплощениям 1-62 или конъюгатом по воплощениям 63-80, или фармацевтической композицией по воплощению 81.
97. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-95, где заболевание выбрано из вирусной инфекции печени или паразитарных инфекций.
98. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 98, где вирусная инфекция представляет собой HBV, HCV или HDV.
99. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-95, где заболевание представляет собой хроническую инфекцию HBV.
100. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 98, где паразитарная инфекция представляет собой малярию, токсоплазмоз, лейшманиоз или трипаносомоз.
101. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощениям 86-100, где субъект представляет собой млекопитающее.
102. Способ, олигонуклеотид или применение по воплощению 101, где млекопитающее представляет собой человека.
ПРИМЕРЫ
Материалы и методы
Мотивы последовательностей и олигонуклеотидные соединения
Таблица 5: список последовательностей олигонуклеотидных мотивов (указанных по SEQ ID NO), нацеленных на транскрипт человеческого PD-L1 (SEQ ID NO: 1), их конструкции, а также специфичные антисмысловые олигонуклеотидные соединения (указанные по CMP ID NO), разработанные на основе мотива последовательности.
SEQ ID NO
Мотив последовательности
Конструкция
Олигонуклеотидное соединение
CMP ID NO
ID NO начала: 1
dG
5
taattggctctactgc
2-11-3
TAattggctctacTGC
5_1
236
-20
6
tcgcataagaatgact
4-10-2
TCGCataagaatgaCT
6_1
371
-19
7
tgaacacacagtcgca
2-12-2
TGaacacacagtcgCA
7_1
382
-19
8
ctgaacacacagtcgc
3-10-3
CTGaacacacagtCGC
8_1
383
-22
9
tctgaacacacagtcg
3-11-2
TCTgaacacacagtCG
9_1
384
-19
10
ttctgaacacacagtc
3-11-2
TTCtgaacacacagTC
10_1
385
-17
11
acaagtcatgttacta
2-11-3
ACaagtcatgttaCTA
11_1
463
-16
12
acacaagtcatgttac
2-12-2
ACacaagtcatgttAC
12_1
465
-14
13
cttacttagatgctgc
2-11-3
CTtacttagatgcTGC
13_1
495
-20
14
acttacttagatgctg
2-11-3
ACttacttagatgCTG
14_1
496
-18
15
gacttacttagatgct
3-11-2
GACttacttagatgCT
15_1
497
-19
16
agacttacttagatgc
2-11-3
AGacttacttagaTGC
16_1
498
-18
17
gcaggaagagacttac
3-10-3
GCAggaagagactTAC
17_1
506
-20
18
aataaattccgttcagg
4-9-4
AATAaattccgttCAGG
18_1
541
-22
19
gcaaataaattccgtt
3-10-3
GCAaataaattccGTT
19_2
545
-18
19
gcaaataaattccgtt
4-8-4
GCAAataaattcCGTT
19_1
545
-20
20
agcaaataaattccgt
4-9-3
AGCAaataaattcCGT
20_1
546
-20
21
cagagcaaataaattcc
4-10-3
CAGAgcaaataaatTCC
21_1
548
-21
22
tggacagagcaaataaat
4-11-3
TGGAcagagcaaataAAT
22_1
551
-19
23
atggacagagcaaata
4-8-4
ATGGacagagcaAATA
23_1
554
-20
24
cagaatggacagagca
2-11-3
CAgaatggacagaGCA
24_1
558
-21
25
ttctcagaatggacag
3-11-2
TTCtcagaatggacAG
25_1
562
-17
26
ctgaactttgacatag
4-8-4
CTGAactttgacATAG
26_1
663
-20
27
aagacaaacccagactga
2-13-3
AAgacaaacccagacTGA
27_1
675
-21
28
tataagacaaacccagac
4-10-4
TATAagacaaacccAGAC
28_1
678
-22
29
ttataagacaaacccaga
4-10-4
TTATaagacaaaccCAGA
29_1
679
-23
30
tgttataagacaaaccc
4-10-3
TGTTataagacaaaCCC
30_1
682
-22
31
tagaacaatggtacttt
4-9-4
TAGAacaatggtaCTTT
31_1
708
-20
32
gtagaacaatggtact
4-10-2
GTAGaacaatggtaCT
32_1
710
-19
33
aggtagaacaatggta
3-10-3
AGGtagaacaatgGTA
33_1
712
-19
34
aagaggtagaacaatgg
4-9-4
AAGAggtagaacaATGG
34_1
714
-21
35
gcatccacagtaaatt
2-12-2
GCatccacagtaaaTT
35_1
749
-17
36
gaaggttatttaattc
2-11-3
GAaggttatttaaTTC
36_1
773
-13
37
ctaatcgaatgcagca
4-9-3
CTAAtcgaatgcaGCA
37_1
805
-22
38
tacccaatctaatcga
3-10-3
TACccaatctaatCGA
38_1
813
-20
39
tagttacccaatctaa
3-10-3
TAGttacccaatcTAA
39_1
817
-19
40
catttagttacccaat
3-10-3
CATttagttacccAAT
40_1
821
-18
41
tcatttagttacccaa
3-10-3
TCAtttagttaccCAA
41_1
822
-19
42
ttcatttagttaccca
2-10-4
TTcatttagttaCCCA
42_1
823
-22
43
gaattaatttcatttagt
4-10-4
GAATtaatttcattTAGT
43_1
829
-19
44
cagtgaggaattaattt
4-9-4
CAGTgaggaattaATTT
44_1
837
-20
45
ccaacagtgaggaatt
4-8-4
CCAAcagtgaggAATT
45_1
842
-21
46
cccaacagtgaggaat
3-10-3
CCCaacagtgaggAAT
46_1
843
-22
47
tatacccaacagtgagg
2-12-3
TAtacccaacagtgAGG
47_1
846
-21
48
ttatacccaacagtgag
2-11-4
TTatacccaacagTGAG
48_1
847
-21
49
tttatacccaacagtga
3-11-3
TTTatacccaacagTGA
49_1
848
-21
50
cctttatacccaacag
3-10-3
CCTttatacccaaCAG
50_1
851
-23
51
taacctttatacccaa
4-8-4
TAACctttatacCCAA
51_1
854
-22
52
aataacctttataccca
3-10-4
AATaacctttataCCCA
52_1
855
-23
53
gtaaataacctttata
3-11-2
GTAaataacctttaTA
53_1
859
-14
54
actgtaaataacctttat
4-10-4
ACTGtaaataacctTTAT
54_1
860
-20
55
atatatatgcaatgag
3-11-2
ATAtatatgcaatgAG
55_1
903
-14
56
agatatatatgcaatg
2-12-2
AGatatatatgcaaTG
56_1
905
-12
57
gagatatatatgcaat
3-10-3
GAGatatatatgcAAT
57_1
906
-15
58
ccagagatatatatgc
2-11-3
CCagagatatataTGC
58_1
909
-19
59
caatattccagagatat
4-9-4
CAATattccagagATAT
59_1
915
-20
60
gcaatattccagagata
4-10-3
GCAAtattccagagATA
60_1
916
-22
61
agcaatattccagagat
3-11-3
AGCaatattccagaGAT
61_1
917
-22
62
cagcaatattccagag
3-9-4
CAGcaatattccAGAG
62_1
919
-22
63
aatcagcaatattccag
4-9-4
AATCagcaatattCCAG
63_1
921
-23
64
acaatcagcaatattcc
4-9-4
ACAAtcagcaataTTCC
64_1
923
-21
65
actaagtagttacacttct
2-14-3
ACtaagtagttacactTCT
65_1
957
-20
66
ctaagtagttacacttc
4-11-2
CTAAgtagttacactTC
66_1
958
-18
67
gactaagtagttacactt
3-12-3
GACtaagtagttacaCTT
67_1
959
-20
68
tgactaagtagttaca
3-9-4
TGActaagtagtTACA
68_1
962
-19
69
ctttgactaagtagtta
4-10-3
CTTTgactaagtagTTA
69_1
964
-19
70
ctctttgactaagtag
3-10-3
CTCtttgactaagTAG
70_1
967
-19
71
gctctttgactaagta
4-10-2
GCTCtttgactaagTA
71_1
968
-21
72
ccttaaatactgttgac
2-11-4
CCttaaatactgtTGAC
72_1
1060
-20
73
cttaaatactgttgac
2-12-2
CTtaaatactgttgAC
73_1
1060
-13
74
tccttaaatactgttg
3-10-3
TCCttaaatactgTTG
74_1
1062
-18
75
tctccttaaatactgtt
4-11-2
TCTCcttaaatactgTT
75_1
1063
-19
76
tatcatagttctcctt
2-10-4
TAtcatagttctCCTT
76_1
1073
-21
77
agtatcatagttctcc
3-10-3
AGTatcatagttcTCC
77_1
1075
-22
78
gagtatcatagttctc
2-11-3
GAgtatcatagttCTC
78_1
1076
-18
79
agagtatcatagttct
2-10-4
AGagtatcatagTTCT
79_1
1077
-18
79
agagtatcatagttct
3-10-3
AGAgtatcatagtTCT
79_2
1077
-19
80
cagagtatcatagttc
3-10-3
CAGagtatcatagTTC
80_1
1078
-18
81
ttcagagtatcatagt
4-10-2
TTCAgagtatcataGT
81_1
1080
-18
82
cttcagagtatcatag
3-9-4
CTTcagagtatcATAG
82_1
1081
-19
83
ttcttcagagtatcata
4-11-2
TTCTtcagagtatcaTA
83_1
1082
-19
84
tttcttcagagtatcat
3-10-4
TTTcttcagagtaTCAT
84_1
1083
-20
85
gagaaaggctaagttt
4-9-3
GAGAaaggctaagTTT
85_1
1099
-19
86
gacactcttgtacatt
2-10-4
GAcactcttgtaCATT
86_1
1213
-19
87
tgagacactcttgtaca
2-13-2
TGagacactcttgtaCA
87_1
1215
-18
88
tgagacactcttgtac
2-11-3
TGagacactcttgTAC
88_1
1216
-18
89
ctttattaaactccat
2-10-4
CTttattaaactCCAT
89_1
1266
-18
90
accaaactttattaaa
4-10-2
ACCAaactttattaAA
90_1
1272
-14
91
aaacctctactaagtg
4-10-2
AAACctctactaagTG
91_1
1288
-16
92
agattaagacagttga
2-11-3
AGattaagacagtTGA
92_1
1310
-16
93
aagtaggagcaagaggc
2-12-3
AAgtaggagcaagaGGC
93_1
1475
-22
94
aaagtaggagcaagagg
4-10-3
AAAGtaggagcaagAGG
94_1
1476
-20
95
gttaagcagccaggag
2-12-2
GTtaagcagccaggAG
95_1
1806
-20
96
agggtaggatgggtag
2-12-2
AGggtaggatgggtAG
96_1
1842
-20
97
aagggtaggatgggta
3-11-2
AAGggtaggatgggTA
97_1
1843
-20
98
caagggtaggatgggt
2-12-2
CAagggtaggatggGT
98_2
1844
-20
98
caagggtaggatgggt
3-11-2
CAAgggtaggatggGT
98_1
1844
-21
99
ccaagggtaggatggg
2-12-2
CCaagggtaggatgGG
99_1
1845
-22
100
tccaagggtaggatgg
2-12-2
TCcaagggtaggatGG
100_1
1846
-20
101
cttccaagggtaggat
4-10-2
CTTCcaagggtaggAT
101_1
1848
-21
102
atcttccaagggtagga
3-12-2
ATCttccaagggtagGA
102_1
1849
-22
103
agaagtgatggctcatt
2-11-4
AGaagtgatggctCATT
103_1
1936
-21
104
aagaagtgatggctcat
3-10-4
AAGaagtgatggcTCAT
104_1
1937
-21
105
gaagaagtgatggctca
3-11-3
GAAgaagtgatggcTCA
105_1
1938
-21
106
atgaaatgtaaactggg
4-9-4
ATGAaatgtaaacTGGG
106_1
1955
-21
107
caatgaaatgtaaactgg
4-10-4
CAATgaaatgtaaaCTGG
107_1
1956
-20
108
gcaatgaaatgtaaactg
4-10-4
GCAAtgaaatgtaaACTG
108_1
1957
-20
109
agcaatgaaatgtaaact
4-10-4
AGCAatgaaatgtaAACT
109_1
1958
-20
110
gagcaatgaaatgtaaac
4-10-4
GAGCaatgaaatgtAAAC
110_1
1959
-19
111
tgaattcccatatccga
2-12-3
TGaattcccatatcCGA
111_1
1992
-22
112
agaattatgaccatat
2-11-3
AGaattatgaccaTAT
112_1
2010
-15
113
aggtaagaattatgacc
3-10-4
AGGtaagaattatGACC
113_1
2014
-21
114
tcaggtaagaattatgac
4-10-4
TCAGgtaagaattaTGAC
114_1
2015
-22
115
cttcaggtaagaattatg
4-10-4
CTTCaggtaagaatTATG
115_1
2017
-21
116
tcttcaggtaagaatta
4-9-4
TCTTcaggtaagaATTA
116_1
2019
-20
117
cttcttcaggtaagaat
4-9-4
CTTCttcaggtaaGAAT
117_1
2021
-21
118
tcttcttcaggtaagaa
4-10-3
TCTTcttcaggtaaGAA
118_1
2022
-20
119
tcttcttcaggtaaga
3-10-3
TCTtcttcaggtaAGA
119_1
2023
-20
120
tggtctaagagaagaag
3-10-4
TGGtctaagagaaGAAG
120_1
2046
-20
121
gttggtctaagagaag
4-9-3
GTTGgtctaagagAAG
121_1
2049
-19
123
cagttggtctaagagaa
2-11-4
CAgttggtctaagAGAA
123_1
2050
-20
124
gcagttggtctaagagaa
3-13-2
GCAgttggtctaagagAA
124_1
2050
-22
122
agttggtctaagagaa
3-9-4
AGTtggtctaagAGAA
122_1
2050
-20
126
gcagttggtctaagaga
2-13-2
GCagttggtctaagaGA
126_1
2051
-21
125
cagttggtctaagaga
4-10-2
CAGTtggtctaagaGA
125_1
2051
-21
127
gcagttggtctaagag
2-11-3
GCagttggtctaaGAG
127_1
2052
-21
128
ctcatatcagggcagt
2-10-4
CTcatatcagggCAGT
128_1
2063
-24
129
cacacatgttctttaac
4-11-2
CACAcatgttctttaAC
129_1
2087
-18
130
taaatacacacatgttct
3-11-4
TAAatacacacatgTTCT
130_1
2092
-19
131
gtaaatacacacatgttc
4-11-3
GTAAatacacacatgTTC
131_1
2093
-19
132
tgtaaatacacacatgtt
4-10-4
TGTAaatacacacaTGTT
132_1
2094
-22
133
gatcatgtaaatacacac
4-10-4
GATCatgtaaatacACAC
133_1
2099
-20
134
agatcatgtaaatacaca
4-10-4
AGATcatgtaaataCACA
134_1
2100
-21
135
caaagatcatgtaaatacac
4-12-4
CAAAgatcatgtaaatACAC
135_1
2101
-19
136
acaaagatcatgtaaataca
4-12-4
ACAAagatcatgtaaaTACA
136_1
2102
-20
137
gaatacaaagatcatgta
4-10-4
GAATacaaagatcaTGTA
137_1
2108
-20
138
agaatacaaagatcatgt
4-10-4
AGAAtacaaagatcATGT
138_1
2109
-20
139
cagaatacaaagatcatg
4-10-4
CAGAatacaaagatCATG
139_1
2110
-21
140
gcagaatacaaagatca
4-9-4
GCAGaatacaaagATCA
140_1
2112
-22
141
aggcagaatacaaagat
4-11-2
AGGCagaatacaaagAT
141_1
2114
-19
142
aaggcagaatacaaaga
4-10-3
AAGGcagaatacaaAGA
142_1
2115
-19
143
attagtgagggacgaa
3-10-3
ATTagtgagggacGAA
143_1
2132
-18
144
cattagtgagggacga
2-11-3
CAttagtgagggaCGA
144_1
2133
-20
145
gagggtgatggattag
2-11-3
GAgggtgatggatTAG
145_1
2218
-19
146
ttaggagtaataaagg
2-10-4
TTaggagtaataAAGG
146_1
2241
-14
147
ttaatgaatttggttg
3-11-2
TTAatgaatttggtTG
147_1
2263
-13
148
ctttaatgaatttggt
2-12-2
CTttaatgaatttgGT
148_1
2265
-14
149
catggattacaactaa
4-10-2
CATGgattacaactAA
149_1
2322
-16
150
tcatggattacaacta
2-11-3
TCatggattacaaCTA
150_1
2323
-16
151
gtcatggattacaact
3-11-2
GTCatggattacaaCT
151_1
2324
-18
152
cattaaatctagtcat
2-10-4
CAttaaatctagTCAT
152_1
2335
-16
153
gacattaaatctagtca
4-10-3
GACAttaaatctagTCA
153_1
2336
-19
154
agggacattaaatcta
4-10-2
AGGGacattaaatcTA
154_1
2340
-18
155
caaagcattataacca
4-9-3
CAAAgcattataaCCA
155_1
2372
-18
156
acttactaggcagaag
2-10-4
ACttactaggcaGAAG
156_1
2415
-19
157
cagagttaactgtaca
4-10-2
CAGAgttaactgtaCA
157_1
2545
-20
158
ccagagttaactgtac
4-10-2
CCAGagttaactgtAC
158_1
2546
-20
159
gccagagttaactgta
2-12-2
GCcagagttaactgTA
159_1
2547
-20
160
tgggccagagttaact
2-12-2
TGggccagagttaaCT
160_1
2550
-21
161
cagcatctatcagact
2-12-2
CAgcatctatcagaCT
161_1
2576
-19
162
tgaaataacatgagtcat
3-11-4
TGAaataacatgagTCAT
162_1
2711
-19
163
gtgaaataacatgagtc
3-10-4
GTGaaataacatgAGTC
163_1
2713
-19
164
tctgtttatgtcactg
4-10-2
TCTGtttatgtcacTG
164_1
2781
-20
165
gtctgtttatgtcact
4-10-2
GTCTgtttatgtcaCT
165_1
2782
-22
166
tggtctgtttatgtca
2-10-4
TGgtctgtttatGTCA
166_1
2784
-21
167
ttggtctgtttatgtc
4-10-2
TTGGtctgtttatgTC
167_1
2785
-20
168
tcacccattgtttaaa
2-12-2
TCacccattgtttaAA
168_1
2842
-15
169
ttcagcaaatattcgt
2-10-4
TTcagcaaatatTCGT
169_1
2995
-17
170
gtgtgttcagcaaatat
3-10-4
GTGtgttcagcaaATAT
170_1
2999
-21
171
tctattgttaggtatc
3-10-3
TCTattgttaggtATC
171_1
3053
-18
172
attgcccatcttactg
2-12-2
ATtgcccatcttacTG
172_1
3118
-19
173
tattgcccatcttact
3-11-2
TATtgcccatcttaCT
173_1
3119
-21
174
aaatattgcccatctt
2-11-3
AAatattgcccatCTT
174_1
3122
-17
175
ataaccttatcataca
3-11-2
ATAaccttatcataCA
175_1
3174
-16
176
tataaccttatcatac
2-11-3
TAtaaccttatcaTAC
176_1
3175
-14
177
ttataaccttatcata
3-11-2
TTAtaaccttatcaTA
177_1
3176
-14
178
tttataaccttatcat
3-10-3
TTTataaccttatCAT
178_1
3177
-16
179
actgctattgctatct
2-11-3
ACtgctattgctaTCT
179_1
3375
-19
180
aggactgctattgcta
2-11-3
AGgactgctattgCTA
180_1
3378
-21
181
gaggactgctattgct
3-11-2
GAGgactgctattgCT
181_1
3379
-22
182
acgtagaataataaca
2-12-2
ACgtagaataataaCA
182_1
3561
-11
183
ccaagtgatataatgg
2-10-4
CCaagtgatataATGG
183_1
3613
-19
184
ttagcagaccaagtga
2-10-4
TTagcagaccaaGTGA
184_1
3621
-21
185
gtttagcagaccaagt
2-12-2
GTttagcagaccaaGT
185_1
3623
-19
186
tgacagtgattatatt
2-12-2
TGacagtgattataTT
186_1
3856
-13
187
tgtccaagatattgac
4-10-2
TGTCcaagatattgAC
187_1
3868
-18
188
gaatatcctagattgt
3-10-3
GAAtatcctagatTGT
188_1
4066
-18
189
caaactgagaatatcc
2-11-3
CAaactgagaataTCC
189_1
4074
-16
190
gcaaactgagaatatc
3-11-2
GCAaactgagaataTC
190_1
4075
-16
191
tcctattacaatcgta
3-11-2
TCCtattacaatcgTA
191_1
4214
-19
192
ttcctattacaatcgt
4-10-2
TTCCtattacaatcGT
192_1
4215
-19
193
actaatgggaggattt
2-12-2
ACtaatgggaggatTT
193_1
4256
-15
194
tagttcagagaataag
2-12-2
TAgttcagagaataAG
194_1
4429
-13
195
taacatatagttcaga
2-11-3
TAacatatagttcAGA
195_1
4436
-15
196
ataacatatagttcag
3-11-2
ATAacatatagttcAG
196_1
4437
-14
197
cataacatatagttca
2-12-2
CAtaacatatagttCA
197_1
4438
-13
198
tcataacatatagttc
2-12-2
TCataacatatagtTC
198_1
4439
-12
199
tagctcctaacaatca
4-10-2
TAGCtcctaacaatCA
199_1
4507
-22
200
ctccaatctttgtata
4-10-2
CTCCaatctttgtaTA
200_1
4602
-20
201
tctccaatctttgtat
4-10-2
TCTCcaatctttgtAT
201_1
4603
-19
202
tctatttcagccaatc
2-12-2
TCtatttcagccaaTC
202_1
4708
-17
203
cggaagtcagagtgaa
3-10-3
CGGaagtcagagtGAA
203_1
4782
-19
204
ttaagcatgaggaata
4-10-2
TTAAgcatgaggaaTA
204_1
4798
-16
205
tgattgagcacctctt
3-10-3
TGAttgagcacctCTT
205_1
4831
-22
206
gactaattatttcgtt
3-11-2
GACtaattatttcgTT
206_1
4857
-15
207
tgactaattatttcgt
3-10-3
TGActaattatttCGT
207_1
4858
-17
208
gtgactaattatttcg
3-10-3
GTGactaattattTCG
208_1
4859
-17
209
ctgcttgaaatgtgac
4-10-2
CTGCttgaaatgtgAC
209_1
4870
-20
210
cctgcttgaaatgtga
2-11-3
CCtgcttgaaatgTGA
210_1
4871
-21
211
atcctgcttgaaatgt
2-10-4
ATcctgcttgaaATGT
211_1
4873
-20
212
attataaatctattct
3-10-3
ATTataaatctatTCT
212_1
5027
-13
213
gctaaatactttcatc
2-11-3
GCtaaatactttcATC
213_1
5151
-16
214
cattgtaacataccta
2-10-4
CAttgtaacataCCTA
214_1
5251
-19
215
gcattgtaacatacct
2-12-2
GCattgtaacatacCT
215_1
5252
-18
216
taatattgcaccaaat
2-12-2
TAatattgcaccaaAT
216_1
5295
-13
217
gataatattgcaccaa
2-11-3
GAtaatattgcacCAA
217_1
5297
-16
218
agataatattgcacca
2-12-2
AGataatattgcacCA
218_1
5298
-16
219
gccaagaagataatat
2-10-4
GCcaagaagataATAT
219_1
5305
-17
220
cacagccacataaact
4-10-2
CACAgccacataaaCT
220_1
5406
-21
221
ttgtaattgtggaaac
2-12-2
TTgtaattgtggaaAC
221_1
5463
-12
222
tgacttgtaattgtgg
2-11-3
TGacttgtaattgTGG
222_1
5467
-18
223
tctaactgaaatagtc
2-12-2
TCtaactgaaatagTC
223_1
5503
-13
224
gtggttctaactgaaa
3-11-2
GTGgttctaactgaAA
224_1
5508
-16
225
caatatgggacttggt
2-12-2
CAatatgggacttgGT
225_1
5522
-18
226
atgacaatatgggact
3-11-2
ATGacaatatgggaCT
226_1
5526
-17
227
tatgacaatatgggac
4-10-2
TATGacaatatgggAC
227_1
5527
-17
228
atatgacaatatggga
4-10-2
ATATgacaatatggGA
228_1
5528
-17
229
cttcacttaataatta
2-11-3
CTtcacttaataaTTA
229_1
5552
-13
230
ctgcttcacttaataa
4-10-2
CTGCttcacttaatAA
230_1
5555
-18
231
aagactgcttcactta
2-11-3
AAgactgcttcacTTA
231_1
5559
-17
232
gaatgccctaattatg
4-10-2
GAATgccctaattaTG
232_1
5589
-19
233
tggaatgccctaatta
3-11-2
TGGaatgccctaatTA
233_1
5591
-19
234
gcaaatgccagtaggt
3-11-2
GCAaatgccagtagGT
234_1
5642
-23
235
ctaatggaaggatttg
3-11-2
CTAatggaaggattTG
235_1
5673
-15
236
aatatagaacctaatg
2-12-2
AAtatagaacctaaTG
236_1
5683
-10
237
gaaagaatagaatgtt
3-10-3
GAAagaatagaatGTT
237_1
5769
-12
238
atgggtaatagattat
3-11-2
ATGggtaatagattAT
238_1
5893
-15
239
gaaagagcacagggtg
2-12-2
GAaagagcacagggTG
239_1
6103
-18
240
ctacatagagggaatg
4-10-2
CTACatagagggaaTG
240_1
6202
-18
241
gcttcctacatagagg
2-10-4
GCttcctacataGAGG
241_1
6207
-24
242
tgcttcctacatagag
4-10-2
TGCTtcctacatagAG
242_1
6208
-22
243
tgggcttgaaatatgt
2-11-3
TGggcttgaaataTGT
243_1
6417
-19
244
cattatatttaagaac
3-11-2
CATtatatttaagaAC
244_1
6457
-11
245
tcggttatgttatcat
2-10-4
TCggttatgttaTCAT
245_1
6470
-19
246
cactttatctggtcgg
2-10-4
CActttatctggTCGG
246_1
6482
-22
247
aaattggcacagcgtt
3-10-3
AAAttggcacagcGTT
247_1
6505
-18
248
accgtgacagtaaatg
4-9-3
ACCGtgacagtaaATG
248_1
6577
-20
249
tgggaaccgtgacagta
2-13-2
TGggaaccgtgacagTA
249_1
6581
-22
250
ccacatataggtcctt
2-11-3
CCacatataggtcCTT
250_1
6597
-21
251
catattgctaccatac
2-11-3
CAtattgctaccaTAC
251_1
6617
-18
252
tcatattgctaccata
3-10-3
TCAtattgctaccATA
252_1
6618
-19
253
caattgtcatattgct
4-8-4
CAATtgtcatatTGCT
253_1
6624
-21
254
cattcaattgtcatattg
3-12-3
CATtcaattgtcataTTG
254_1
6626
-18
255
tttctactgggaatttg
4-9-4
TTTCtactgggaaTTTG
255_1
6644
-20
256
caattagtgcagccag
3-10-3
CAAttagtgcagcCAG
256_1
6672
-21
257
gaataatgttcttatcc
4-10-3
GAATaatgttcttaTCC
257_1
6704
-20
258
cacaaattgaataatgttct
4-13-3
CACAaattgaataatgtTCT
258_1
6709
-20
259
catgcacaaattgaataat
4-11-4
CATGcacaaattgaaTAAT
259_1
6714
-20
260
atcctgcaatttcacat
3-11-3
ATCctgcaatttcaCAT
260_1
6832
-22
261
ccaccatagctgatca
2-12-2
CCaccatagctgatCA
261_1
6868
-22
262
accaccatagctgatca
2-12-3
ACcaccatagctgaTCA
262_1
6868
-23
263
caccaccatagctgatc
2-13-2
CAccaccatagctgaTC
263_1
6869
-21
264
tagtcggcaccaccat
2-12-2
TAgtcggcaccaccAT
264_1
6877
-22
265
cttgtagtcggcaccac
1-14-2
CttgtagtcggcaccAC
265_1
6880
-21
266
cttgtagtcggcacca
1-13-2
CttgtagtcggcacCA
266_1
6881
-21
267
cgcttgtagtcggcac
2-12-2
CGcttgtagtcggcAC
267_1
6883
-21
268
tcaataaagatcaggc
3-11-2
TCAataaagatcagGC
268_1
6942
-17
269
tggacttacaagaatg
2-12-2
TGgacttacaagaaTG
269_1
6986
-14
270
atggacttacaagaat
3-11-2
ATGgacttacaagaAT
270_1
6987
-15
271
gctcaagaaattggat
4-10-2
GCTCaagaaattggAT
271_1
7073
-19
272
tactgtagaacatggc
4-10-2
TACTgtagaacatgGC
272_1
7133
-21
273
gcaattcatttgatct
4-9-3
GCAAttcatttgaTCT
273_1
7239
-20
274
tgaagggaggagggacac
2-14-2
TGaagggaggagggacAC
274_1
7259
-20
275
agtggtgaagggaggag
2-13-2
AGtggtgaagggaggAG
275_1
7265
-21
276
tagtggtgaagggaggag
2-14-2
TAgtggtgaagggaggAG
276_1
7265
-21
277
atagtggtgaagggaggag
1-16-2
AtagtggtgaagggaggAG
277_1
7265
-20
278
tagtggtgaagggagga
2-13-2
TAgtggtgaagggagGA
278_1
7266
-21
279
atagtggtgaagggagga
2-14-2
ATagtggtgaagggagGA
279_1
7266
-21
280
tagtggtgaagggagg
3-11-2
TAGtggtgaagggaGG
280_1
7267
-21
281
atagtggtgaagggagg
3-12-2
ATAgtggtgaagggaGG
281_1
7267
-22
282
gatagtggtgaagggagg
2-14-2
GAtagtggtgaagggaGG
282_1
7267
-21
283
atagtggtgaagggag
4-10-2
ATAGtggtgaagggAG
283_1
7268
-20
284
gatagtggtgaagggag
2-12-3
GAtagtggtgaaggGAG
284_1
7268
-21
285
gagatagtggtgaagg
2-10-4
GAgatagtggtgAAGG
285_1
7271
-20
286
catgggagatagtggt
4-10-2
CATGggagatagtgGT
286_1
7276
-22
287
acaaataatggttactct
4-10-4
ACAAataatggttaCTCT
287_1
7302
-20
288
acacacaaataatggtta
4-10-4
ACACacaaataatgGTTA
288_1
7306
-20
289
gagggacacacaaataat
3-11-4
GAGggacacacaaaTAAT
289_1
7311
-21
290
atatagagaggctcaa
4-8-4
ATATagagaggcTCAA
290_1
7390
-21
291
ttgatatagagaggct
2-10-4
TTgatatagagaGGCT
291_1
7393
-20
292
gcatttgatatagaga
4-9-3
GCATttgatatagAGA
292_1
7397
-20
293
tttgcatttgatatag
2-11-3
TTtgcatttgataTAG
293_1
7400
-15
294
ctggaagaataggttc
3-11-2
CTGgaagaataggtTC
294_1
7512
-17
295
actggaagaataggtt
4-10-2
ACTGgaagaataggTT
295_1
7513
-18
296
tactggaagaataggt
4-10-2
TACTggaagaatagGT
296_1
7514
-18
297
tggcttatcctgtact
4-10-2
TGGCttatcctgtaCT
297_1
7526
-25
298
atggcttatcctgtac
2-10-4
ATggcttatcctGTAC
298_1
7527
-22
299
tatggcttatcctgta
4-10-2
TATGgcttatcctgTA
299_1
7528
-22
300
gtatggcttatcctgt
3-10-3
GTAtggcttatccTGT
300_1
7529
-23
301
atgaatatatgcccagt
2-11-4
ATgaatatatgccCAGT
301_1
7547
-22
302
gatgaatatatgccca
2-10-4
GAtgaatatatgCCCA
302_1
7549
-22
303
caagatgaatatatgcc
3-10-4
CAAgatgaatataTGCC
303_1
7551
-21
304
gacaacatcagtataga
4-9-4
GACAacatcagtaTAGA
304_1
7572
-22
305
caagacaacatcagta
4-8-4
CAAGacaacatcAGTA
305_1
7576
-20
306
cactcctagttccttt
3-10-3
CACtcctagttccTTT
306_1
7601
-22
307
aacactcctagttcct
3-10-3
AACactcctagttCCT
307_1
7603
-22
308
taacactcctagttcc
2-11-3
TAacactcctagtTCC
308_1
7604
-20
309
ctaacactcctagttc
2-12-2
CTaacactcctagtTC
309_1
7605
-18
310
tgataacataactgtg
2-12-2
TGataacataactgTG
310_1
7637
-13
311
ctgataacataactgt
2-10-4
CTgataacataaCTGT
311_1
7638
-18
312
tttgaactcaagtgac
4-10-2
TTTGaactcaagtgAC
312_1
7654
-16
313
tcctttacttagctag
4-9-3
TCCTttacttagcTAG
313_1
7684
-23
314
gagtttggattagctg
2-11-3
GAgtttggattagCTG
314_1
7764
-20
315
tgggatatgacaggga
2-11-3
TGggatatgacagGGA
315_1
7838
-21
316
tgtgggatatgacagg
4-10-2
TGTGggatatgacaGG
316_1
7840
-22
317
atatggaagggatatc
4-10-2
ATATggaagggataTC
317_1
7875
-17
318
acaggatatggaaggg
3-10-3
ACAggatatggaaGGG
318_1
7880
-21
319
atttcaacaggatatgg
4-9-4
ATTTcaacaggatATGG
319_1
7885
-20
320
gagtaatttcaacagg
2-11-3
GAgtaatttcaacAGG
320_1
7891
-17
321
agggagtaatttcaaca
4-9-4
AGGGagtaatttcAACA
321_1
7893
-22
322
attagggagtaatttca
4-9-4
ATTAgggagtaatTTCA
322_1
7896
-21
323
cttactattagggagt
2-10-4
CTtactattaggGAGT
323_1
7903
-20
324
cagcttactattaggg
2-11-3
CAgcttactattaGGG
324_1
7906
-20
326
atttcagcttactattag
3-11-4
ATTtcagcttactaTTAG
326_1
7908
-20
325
tcagcttactattagg
3-10-3
TCAgcttactattAGG
325_1
7907
-20
327
ttcagcttactattag
2-10-4
TTcagcttactaTTAG
327_1
7908
-17
328
cagatttcagcttact
4-10-2
CAGAtttcagcttaCT
328_1
7913
-21
329
gactacaactagaggg
3-11-2
GACtacaactagagGG
329_1
7930
-19
330
agactacaactagagg
4-10-2
AGACtacaactagaGG
330_1
7931
-19
331
aagactacaactagag
2-12-2
AAgactacaactagAG
331_1
7932
-13
332
atgatttaattctagtcaaa
4-12-4
ATGAtttaattctagtCAAA
332_1
7982
-20
333
tttaattctagtcaaa
3-10-3
TTTaattctagtcAAA
333_1
7982
-12
334
gatttaattctagtca
4-8-4
GATTtaattctaGTCA
334_1
7984
-20
771
tgatttaattctagtca
3-10-4
TGAtttaattctaGTCA
771_1
7984
-20
335
atgatttaattctagtca
4-11-3
ATGAtttaattctagTCA
335_1
7984
-20
336
gatgatttaattctagtca
4-13-2
GATGatttaattctagtCA
336_1
7984
-20
337
gatttaattctagtca
2-10-4
GAtttaattctaGTCA
337_1
7984
-18
338
gatgatttaattctagtc
4-11-3
GATGatttaattctaGTC
338_1
7985
-20
339
tgatttaattctagtc
2-12-2
TGatttaattctagTC
339_1
7985
-13
340
gagatgatttaattcta
4-9-4
GAGAtgatttaatTCTA
340_1
7988
-20
341
gagatgatttaattct
3-10-3
GAGatgatttaatTCT
341_1
7989
-16
342
cagattgatggtagtt
4-10-2
CAGAttgatggtagTT
342_1
8030
-19
343
ctcagattgatggtag
2-10-4
CTcagattgatgGTAG
343_1
8032
-20
344
gttagccctcagattg
3-10-3
GTTagccctcagaTTG
344_1
8039
-23
345
tgtattgttagccctc
2-10-4
TGtattgttagcCCTC
345_1
8045
-24
346
acttgtattgttagcc
2-10-4
ACttgtattgttAGCC
346_1
8048
-22
347
agccagtatcagggac
3-11-2
AGCcagtatcagggAC
347_1
8191
-23
348
ttgacaatagtggcat
2-10-4
TTgacaatagtgGCAT
348_1
8213
-20
349
acaagtggtatcttct
3-10-3
ACAagtggtatctTCT
349_1
8228
-19
350
aatctactttacaagt
4-10-2
AATCtactttacaaGT
350_1
8238
-16
351
cacagtagatgcctgata
2-12-4
CAcagtagatgcctGATA
351_1
8351
-24
352
gaacacagtagatgcc
2-11-3
GAacacagtagatGCC
352_1
8356
-21
353
cttggaacacagtagat
4-11-2
CTTGgaacacagtagAT
353_1
8359
-20
354
atatcttggaacacag
3-10-3
ATAtcttggaacaCAG
354_1
8364
-18
355
tctttaatatcttggaac
3-11-4
TCTttaatatcttgGAAC
355_1
8368
-19
356
tgatttctttaatatcttg
2-13-4
TGatttctttaatatCTTG
356_1
8372
-19
357
tgatgatttctttaatatc
2-13-4
TGatgatttctttaaTATC
357_1
8375
-18
358
aggctaagtcatgatg
3-11-2
AGGctaagtcatgaTG
358_1
8389
-19
359
ttgatgaggctaagtc
4-10-2
TTGAtgaggctaagTC
359_1
8395
-19
360
ccaggattatactctt
3-11-2
CCAggattatactcTT
360_1
8439
-20
361
gccaggattatactct
2-10-4
GCcaggattataCTCT
361_1
8440
-23
362
ctgccaggattatact
3-11-2
CTGccaggattataCT
362_1
8442
-21
363
cagaaacttatactttatg
4-13-2
CAGAaacttatactttaTG
363_1
8473
-19
364
aagcagaaacttatact
4-9-4
AAGCagaaacttaTACT
364_1
8478
-20
365
gaagcagaaacttatact
3-11-4
GAAgcagaaacttaTACT
365_1
8478
-20
366
tggaagcagaaacttatact
3-15-2
TGGaagcagaaacttataCT
366_1
8478
-21
367
tggaagcagaaacttatac
3-13-3
TGGaagcagaaacttaTAC
367_1
8479
-20
368
aagcagaaacttatac
2-11-3
AAgcagaaacttaTAC
368_1
8479
-13
369
tggaagcagaaacttata
3-11-4
TGGaagcagaaactTATA
369_1
8480
-21
370
aagggatattatggag
4-10-2
AAGGgatattatggAG
370_1
8587
-18
371
tgccggaagatttcct
2-12-2
TGccggaagatttcCT
371_1
8641
-21
372
atggattgggagtaga
4-10-2
ATGGattgggagtaGA
372_1
8772
-21
373
agatggattgggagta
2-12-2
AGatggattgggagTA
373_1
8774
-18
374
aagatggattgggagt
3-11-2
AAGatggattgggaGT
374_1
8775
-18
375
acaagatggattggga
2-10-4
ACaagatggattGGGA
375_1
8777
-20
375
acaagatggattggga
2-12-2
ACaagatggattggGA
375_2
8777
-17
376
agaaggttcagacttt
3-9-4
AGAaggttcagaCTTT
376_1
8835
-20
377
gcagaaggttcagact
2-11-3
GCagaaggttcagACT
377_1
8837
-21
377
gcagaaggttcagact
3-11-2
GCAgaaggttcagaCT
377_2
8837
-22
378
tgcagaaggttcagac
4-10-2
TGCAgaaggttcagAC
378_1
8838
-22
379
agtgcagaaggttcag
2-11-3
AGtgcagaaggttCAG
379_1
8840
-20
379
agtgcagaaggttcag
4-10-2
AGTGcagaaggttcAG
379_2
8840
-21
380
aagtgcagaaggttca
4-10-2
AAGTgcagaaggttCA
380_1
8841
-20
381
taagtgcagaaggttc
2-10-4
TAagtgcagaagGTTC
381_1
8842
-19
382
tctaagtgcagaaggt
2-10-4
TCtaagtgcagaAGGT
382_1
8844
-21
383
ctcaggagttctacttc
3-12-2
CTCaggagttctactTC
383_1
8948
-20
384
ctcaggagttctactt
3-10-3
CTCaggagttctaCTT
384_1
8949
-21
385
atggaggtgactcaggag
1-15-2
AtggaggtgactcaggAG
385_1
8957
-20
386
atggaggtgactcagga
2-13-2
ATggaggtgactcagGA
386_1
8958
-21
387
atggaggtgactcagg
2-11-3
ATggaggtgactcAGG
387_1
8959
-21
388
tatggaggtgactcagg
2-12-3
TAtggaggtgactcAGG
388_1
8959
-21
389
atatggaggtgactcagg
2-14-2
ATatggaggtgactcaGG
389_1
8959
-21
390
tatggaggtgactcag
4-10-2
TATGgaggtgactcAG
390_1
8960
-21
391
atatggaggtgactcag
2-11-4
ATatggaggtgacTCAG
391_1
8960
-22
392
catatggaggtgactcag
2-14-2
CAtatggaggtgactcAG
392_1
8960
-20
393
atatggaggtgactca
3-10-3
ATAtggaggtgacTCA
393_1
8961
-20
394
catatggaggtgactca
2-12-3
CAtatggaggtgacTCA
394_1
8961
-21
395
catatggaggtgactc
2-10-4
CAtatggaggtgACTC
395_1
8962
-20
396
gcatatggaggtgactc
2-13-2
GCatatggaggtgacTC
396_1
8962
-21
397
tgcatatggaggtgactc
2-14-2
TGcatatggaggtgacTC
397_1
8962
-21
398
ttgcatatggaggtgactc
1-16-2
TtgcatatggaggtgacTC
398_1
8962
-20
399
tttgcatatggaggtgactc
1-17-2
TttgcatatggaggtgacTC
399_1
8962
-21
400
gcatatggaggtgact
2-12-2
GCatatggaggtgaCT
400_1
8963
-20
401
tgcatatggaggtgact
2-13-2
TGcatatggaggtgaCT
401_1
8963
-20
402
ttgcatatggaggtgact
3-13-2
TTGcatatggaggtgaCT
402_1
8963
-22
403
tttgcatatggaggtgact
1-16-2
TttgcatatggaggtgaCT
403_1
8963
-20
404
tgcatatggaggtgac
3-11-2
TGCatatggaggtgAC
404_1
8964
-20
405
ttgcatatggaggtgac
3-11-3
TTGcatatggaggtGAC
405_1
8964
-21
406
tttgcatatggaggtgac
4-12-2
TTTGcatatggaggtgAC
406_1
8964
-21
407
tttgcatatggaggtga
4-11-2
TTTGcatatggaggtGA
407_1
8965
-21
408
tttgcatatggaggtg
2-10-4
TTtgcatatggaGGTG
408_1
8966
-21
409
aagtgaagttcaacagc
2-11-4
AAgtgaagttcaaCAGC
409_1
8997
-20
410
tgggaagtgaagttca
2-10-4
TGggaagtgaagTTCA
410_1
9002
-20
411
atgggaagtgaagttc
2-11-3
ATgggaagtgaagTTC
411_1
9003
-17
412
gatgggaagtgaagtt
4-9-3
GATGggaagtgaaGTT
412_1
9004
-21
413
ctgtgatgggaagtgaa
3-11-3
CTGtgatgggaagtGAA
413_1
9007
-20
414
attgagtgaatccaaa
3-10-3
ATTgagtgaatccAAA
414_1
9119
-14
415
aattgagtgaatccaa
2-10-4
AAttgagtgaatCCAA
415_1
9120
-16
416
gataattgagtgaatcc
4-10-3
GATAattgagtgaaTCC
416_1
9122
-20
417
gtgataattgagtgaa
3-10-3
GTGataattgagtGAA
417_1
9125
-16
418
aagaaaggtgcaataa
3-10-3
AAGaaaggtgcaaTAA
418_1
9155
-14
419
caagaaaggtgcaata
2-10-4
CAagaaaggtgcAATA
419_1
9156
-15
420
acaagaaaggtgcaat
4-10-2
ACAAgaaaggtgcaAT
420_1
9157
-16
421
atttaaactcacaaac
2-12-2
ATttaaactcacaaAC
421_1
9171
-10
422
ctgttaggttcagcga
2-10-4
CTgttaggttcaGCGA
422_1
9235
-24
423
tctgaatgaacatttcg
4-9-4
TCTGaatgaacatTTCG
423_1
9260
-20
424
ctcattgaaggttctg
2-10-4
CTcattgaaggtTCTG
424_1
9281
-20
425
ctaatctcattgaagg
3-11-2
CTAatctcattgaaGG
425_1
9286
-17
426
cctaatctcattgaag
2-12-2
CCtaatctcattgaAG
426_1
9287
-16
427
actttgatctttcagc
3-10-3
ACTttgatctttcAGC
427_1
9305
-20
428
actatgcaacactttg
2-12-2
ACtatgcaacacttTG
428_1
9315
-15
429
caaatagctttatcgg
3-10-3
CAAatagctttatCGG
429_1
9335
-17
430
ccaaatagctttatcg
2-10-4
CCaaatagctttATCG
430_1
9336
-19
431
tccaaatagctttatc
4-10-2
TCCAaatagctttaTC
431_1
9337
-18
432
gatccaaatagcttta
4-10-2
GATCcaaatagcttTA
432_1
9339
-18
433
atgatccaaatagctt
2-10-4
ATgatccaaataGCTT
433_1
9341
-19
434
tatgatccaaatagct
4-10-2
TATGatccaaatagCT
434_1
9342
-18
435
taaacagggctgggaat
4-9-4
TAAAcagggctggGAAT
435_1
9408
-22
436
acttaaacagggctgg
2-10-4
ACttaaacagggCTGG
436_1
9412
-21
437
acacttaaacagggct
2-10-4
ACacttaaacagGGCT
437_1
9414
-22
438
gaacacttaaacaggg
4-8-4
GAACacttaaacAGGG
438_1
9416
-20
439
agagaacacttaaacag
4-9-4
AGAGaacacttaaACAG
439_1
9418
-20
440
ctacagagaacactta
4-8-4
CTACagagaacaCTTA
440_1
9423
-20
441
atgctacagagaacact
3-10-4
ATGctacagagaaCACT
441_1
9425
-22
442
ataaatgctacagagaaca
4-11-4
ATAAatgctacagagAACA
442_1
9427
-20
443
agataaatgctacagaga
2-12-4
AGataaatgctacaGAGA
443_1
9430
-20
444
tagagataaatgctaca
4-9-4
TAGAgataaatgcTACA
444_1
9434
-21
445
tagatagagataaatgct
4-11-3
TAGAtagagataaatGCT
445_1
9437
-20
446
caatatactagatagaga
4-10-4
CAATatactagataGAGA
446_1
9445
-21
447
tacacaatatactagatag
4-11-4
TACAcaatatactagATAG
447_1
9448
-21
448
ctacacaatatactag
3-10-3
CTAcacaatatacTAG
448_1
9452
-16
449
gctacacaatatacta
4-8-4
GCTAcacaatatACTA
449_1
9453
-21
450
atatgctacacaatatac
4-10-4
ATATgctacacaatATAC
450_1
9455
-20
451
tgatatgctacacaat
4-8-4
TGATatgctacaCAAT
451_1
9459
-20
452
atgatatgatatgctac
4-9-4
ATGAtatgatatgCTAC
452_1
9464
-21
453
gaggagagagacaataaa
4-10-4
GAGGagagagacaaTAAA
453_1
9495
-20
454
ctaggaggagagagaca
3-11-3
CTAggaggagagagACA
454_1
9500
-22
455
tattctaggaggagaga
4-10-3
TATTctaggaggagAGA
455_1
9504
-21
456
ttatattctaggaggag
4-10-3
TTATattctaggagGAG
456_1
9507
-21
457
gtttatattctaggag
3-9-4
GTTtatattctaGGAG
457_1
9510
-20
458
tggagtttatattctagg
2-12-4
TGgagtttatattcTAGG
458_1
9512
-22
459
cgtaccaccactctgc
2-11-3
CGtaccaccactcTGC
459_1
9590
-25
460
tgaggaaatcattcattc
4-10-4
TGAGgaaatcattcATTC
460_1
9641
-22
461
tttgaggaaatcattcat
4-10-4
TTTGaggaaatcatTCAT
461_1
9643
-20
462
aggctaatcctatttg
4-10-2
AGGCtaatcctattTG
462_1
9657
-22
463
tttaggctaatcctat
4-8-4
TTTAggctaatcCTAT
463_1
9660
-22
464
tgctccagtgtaccct
3-11-2
TGCtccagtgtaccCT
464_1
9755
-27
465
tagtagtactcgatag
2-10-4
TAgtagtactcgATAG
465_1
9813
-18
466
ctaattgtagtagtactc
3-12-3
CTAattgtagtagtaCTC
466_1
9818
-20
467
tgctaattgtagtagt
2-10-4
TGctaattgtagTAGT
467_1
9822
-19
468
agtgctaattgtagta
4-10-2
AGTGctaattgtagTA
468_1
9824
-19
469
gcaagtgctaattgta
4-10-2
GCAAgtgctaattgTA
469_1
9827
-20
470
gaggaaatgaactaattta
4-13-2
GAGGaaatgaactaattTA
470_1
9881
-18
471
caggaggaaatgaacta
4-11-2
CAGGaggaaatgaacTA
471_1
9886
-19
472
ccctagagtcatttcc
2-11-3
CCctagagtcattTCC
472_1
9902
-24
473
atcttacatgatgaagc
3-11-3
ATCttacatgatgaAGC
473_1
9925
-20
475
agacacactcagatttcag
2-15-2
AGacacactcagatttcAG
475_1
9967
-20
474
gacacactcagatttcag
3-13-2
GACacactcagatttcAG
474_1
9967
-20
476
aagacacactcagatttcag
3-15-2
AAGacacactcagatttcAG
476_1
9967
-21
477
agacacactcagatttca
2-13-3
AGacacactcagattTCA
477_1
9968
-20
478
aagacacactcagatttca
3-13-3
AAGacacactcagattTCA
478_1
9968
-21
479
aaagacacactcagatttca
2-14-4
AAagacacactcagatTTCA
479_1
9968
-20
480
gaaagacacactcagatttc
3-14-3
GAAagacacactcagatTTC
480_1
9969
-20
481
aagacacactcagatttc
4-11-3
AAGAcacactcagatTTC
481_1
9969
-21
482
aaagacacactcagatttc
4-11-4
AAAGacacactcagaTTTC
482_1
9969
-20
483
tgaaagacacactcagattt
4-14-2
TGAAagacacactcagatTT
483_1
9970
-20
484
tgaaagacacactcagatt
2-13-4
TGaaagacacactcaGATT
484_1
9971
-21
485
tgaaagacacactcagat
3-12-3
TGAaagacacactcaGAT
485_1
9972
-20
486
attgaaagacacactca
4-10-3
ATTGaaagacacacTCA
486_1
9975
-19
487
tcattgaaagacacact
2-11-4
TCattgaaagacaCACT
487_1
9977
-18
488
ttccatcattgaaaga
3-9-4
TTCcatcattgaAAGA
488_1
9983
-18
489
ataataccacttatcat
4-9-4
ATAAtaccacttaTCAT
489_1
10010
-20
490
ttacttaatttctttgga
2-12-4
TTacttaatttcttTGGA
490_1
10055
-20
491
ttagaactagctttatca
3-12-3
TTAgaactagctttaTCA
491_1
10101
-20
492
gaggtacaaatatagg
3-10-3
GAGgtacaaatatAGG
492_1
10171
-18
493
cttatgatacaactta
3-10-3
CTTatgatacaacTTA
493_1
10384
-15
494
tcttatgatacaactt
2-11-3
TCttatgatacaaCTT
494_1
10385
-15
495
ttcttatgatacaact
3-11-2
TTCttatgatacaaCT
495_1
10386
-15
496
cagtttcttatgatac
2-11-3
CAgtttcttatgaTAC
496_1
10390
-16
497
gcagtttcttatgata
3-11-2
GCAgtttcttatgaTA
497_1
10391
-19
498
tacaaatgtctattaggtt
4-12-3
TACAaatgtctattagGTT
498_1
10457
-21
499
tgtacaaatgtctattag
4-11-3
TGTAcaaatgtctatTAG
499_1
10460
-20
500
agcatcacaattagta
3-11-2
AGCatcacaattagTA
500_1
10535
-18
501
ctaatgatagtgaagc
3-11-2
CTAatgatagtgaaGC
501_1
10548
-17
502
agctaatgatagtgaa
3-11-2
AGCtaatgatagtgAA
502_1
10550
-16
503
atgccttgacatatta
4-10-2
ATGCcttgacatatTA
503_1
10565
-20
504
ctcaagattattgacac
4-9-4
CTCAagattattgACAC
504_1
10623
-20
505
acctcaagattattga
2-10-4
ACctcaagattaTTGA
505_2
10626
-18
505
acctcaagattattga
3-9-4
ACCtcaagattaTTGA
505_1
10626
-20
506
aacctcaagattattg
4-10-2
AACCtcaagattatTG
506_1
10627
-17
507
cacaaacctcaagattatt
4-13-2
CACAaacctcaagattaTT
507_1
10628
-20
508
gtacttaattagacct
3-9-4
GTActtaattagACCT
508_1
10667
-21
509
agtacttaattagacc
4-9-3
AGTActtaattagACC
509_1
10668
-20
510
gtatgaggtggtaaac
4-10-2
GTATgaggtggtaaAC
510_1
10688
-18
511
aggaaacagcagaagtg
2-11-4
AGgaaacagcagaAGTG
511_1
10723
-21
512
gcacaacccagaggaa
2-12-2
GCacaacccagaggAA
512_1
10735
-20
513
caagcacaacccagag
3-11-2
CAAgcacaacccagAG
513_1
10738
-20
514
ttcaagcacaacccag
3-10-3
TTCaagcacaaccCAG
514_1
10740
-21
515
aattcaagcacaaccc
2-10-4
AAttcaagcacaACCC
515_1
10742
-20
516
taataattcaagcacaacc
4-13-2
TAATaattcaagcacaaCC
516_1
10743
-20
517
actaataattcaagcac
4-9-4
ACTAataattcaaGCAC
517_1
10747
-20
518
ataatactaataattcaagc
4-12-4
ATAAtactaataattcAAGC
518_1
10749
-19
519
tagatttgtgaggtaa
2-10-4
TAgatttgtgagGTAA
519_1
11055
-18
520
agccttaattctccat
4-10-2
AGCCttaattctccAT
520_1
11091
-24
521
aatgatctagagcctta
4-9-4
AATGatctagagcCTTA
521_1
11100
-22
522
ctaatgatctagagcc
3-10-3
CTAatgatctagaGCC
522_1
11103
-22
523
actaatgatctagagc
3-9-4
ACTaatgatctaGAGC
523_1
11104
-21
524
cattaacatgttcttatt
3-11-4
CATtaacatgttctTATT
524_1
11165
-19
525
acaagtacattaacatgttc
4-12-4
ACAAgtacattaacatGTTC
525_1
11170
-22
526
ttacaagtacattaacatg
4-11-4
TTACaagtacattaaCATG
526_1
11173
-20
527
gctttattcatgtttat
4-9-4
GCTTtattcatgtTTAT
527_1
11195
-22
528
gctttattcatgttta
3-11-2
GCTttattcatgttTA
528_1
11196
-18
529
agagctttattcatgttt
3-13-2
AGAgctttattcatgtTT
529_1
11197
-20
530
ataagagctttattcatg
4-10-4
ATAAgagctttattCATG
530_1
11200
-21
531
cataagagctttattca
4-9-4
CATAagagctttaTTCA
531_1
11202
-21
532
agcataagagctttat
4-8-4
AGCAtaagagctTTAT
532_1
11205
-22
533
tagattgtttagtgca
3-10-3
TAGattgtttagtGCA
533_1
11228
-20
534
gtagattgtttagtgc
2-10-4
GTagattgtttaGTGC
534_1
11229
-21
535
gacaattctagtagatt
4-9-4
GACAattctagtaGATT
535_1
11238
-21
536
ctgacaattctagtag
3-9-4
CTGacaattctaGTAG
536_1
11241
-20
537
gctgacaattctagta
4-10-2
GCTGacaattctagTA
537_1
11242
-21
538
aggattaagatacgta
2-12-2
AGgattaagatacgTA
538_1
11262
-15
539
caggattaagatacgt
2-11-3
CAggattaagataCGT
539_1
11263
-17
540
tcaggattaagatacg
3-11-2
TCAggattaagataCG
540_1
11264
-16
541
ttcaggattaagatac
2-10-4
TTcaggattaagATAC
541_1
11265
-15
542
aggaagaaagtttgattc
4-10-4
AGGAagaaagtttgATTC
542_1
11308
-21
543
tcaaggaagaaagtttga
4-10-4
TCAAggaagaaagtTTGA
543_1
11311
-20
544
ctcaaggaagaaagtttg
4-10-4
CTCAaggaagaaagTTTG
544_1
11312
-20
545
tgctcaaggaagaaagt
3-10-4
TGCtcaaggaagaAAGT
545_1
11315
-21
546
aattatgctcaaggaaga
4-11-3
AATTatgctcaaggaAGA
546_1
11319
-20
547
taggataccacattatga
4-12-2
TAGGataccacattatGA
547_1
11389
-22
548
cataatttattccattcctc
2-15-3
CAtaatttattccattcCTC
548_1
11449
-22
549
tgcataatttattccat
4-10-3
TGCAtaatttattcCAT
549_1
11454
-22
550
actgcataatttattcc
4-10-3
ACTGcataatttatTCC
550_1
11456
-21
551
ctaaactgcataatttatt
4-11-4
CTAAactgcataattTATT
551_1
11458
-20
552
ataactaaactgcata
2-10-4
ATaactaaactgCATA
552_1
11465
-16
553
ttattaataactaaactgc
3-12-4
TTAttaataactaaaCTGC
553_1
11468
-19
554
tagtacattattaataact
4-13-2
TAGTacattattaataaCT
554_1
11475
-18
555
cataactaaggacgtt
4-10-2
CATAactaaggacgTT
555_1
11493
-17
556
tcataactaaggacgt
2-11-3
TCataactaaggaCGT
556_1
11494
-16
557
cgtcataactaaggac
4-10-2
CGTCataactaaggAC
557_1
11496
-17
558
tcgtcataactaagga
2-12-2
TCgtcataactaagGA
558_1
11497
-16
559
atcgtcataactaagg
2-10-4
ATcgtcataactAAGG
559_1
11498
-17
560
gttagtatcttacatt
2-11-3
GTtagtatcttacATT
560_1
11525
-15
561
ctctattgttagtatc
3-10-3
CTCtattgttagtATC
561_1
11532
-17
562
agtatagagttactgt
3-10-3
AGTatagagttacTGT
562_1
11567
-19
563
ttcctggtgatacttt
4-10-2
TTCCtggtgatactTT
563_1
11644
-21
564
gttcctggtgatactt
4-10-2
GTTCctggtgatacTT
564_1
11645
-21
565
tgttcctggtgatact
2-12-2
TGttcctggtgataCT
565_1
11646
-20
566
ataaacatgaatctctcc
2-12-4
ATaaacatgaatctCTCC
566_1
11801
-20
567
ctttataaacatgaatctc
3-12-4
CTTtataaacatgaaTCTC
567_1
11804
-19
568
ctgtctttataaacatg
3-10-4
CTGtctttataaaCATG
568_1
11810
-19
569
ttgttataaatctgtctt
2-12-4
TTgttataaatctgTCTT
569_1
11820
-18
570
ttaaatttattcttggata
3-12-4
TTAaatttattcttgGATA
570_1
11849
-19
571
cttaaatttattcttgga
2-12-4
CTtaaatttattctTGGA
571_1
11851
-19
572
cttcttaaatttattcttg
4-13-2
CTTCttaaatttattctTG
572_1
11853
-18
573
tatgtttctcagtaaag
4-9-4
TATGtttctcagtAAAG
573_1
11877
-19
574
gaattatctttaaacca
3-10-4
GAAttatctttaaACCA
574_1
11947
-18
575
cccttaaatttctaca
3-11-2
CCCttaaatttctaCA
575_1
11980
-20
576
acactgctcttgtacc
4-10-2
ACACtgctcttgtaCC
576_1
11995
-23
577
tgacaacactgctctt
3-10-3
TGAcaacactgctCTT
577_1
12000
-21
578
tacatttattgggctc
4-10-2
TACAtttattgggcTC
578_1
12081
-19
579
gtacatttattgggct
2-10-4
GTacatttattgGGCT
579_1
12082
-23
580
ttggtacatttattgg
3-10-3
TTGgtacatttatTGG
580_1
12085
-18
581
catgttggtacatttat
4-10-3
CATGttggtacattTAT
581_1
12088
-21
582
aatcatgttggtacat
4-10-2
AATCatgttggtacAT
582_1
12092
-16
583
aaatcatgttggtaca
2-12-2
AAatcatgttggtaCA
583_1
12093
-14
584
gacaagtttggattaa
3-11-2
GACaagtttggattAA
584_1
12132
-14
585
aatgttcagatgcctc
2-10-4
AAtgttcagatgCCTC
585_1
12197
-21
586
gcttaatgttcagatg
2-12-2
GCttaatgttcagaTG
586_1
12201
-17
587
cgtacatagcttgatg
4-10-2
CGTAcatagcttgaTG
587_1
12267
-20
588
gtgaggaattaggata
3-11-2
GTGaggaattaggaTA
588_1
12753
-17
589
gtaacaatatggtttg
3-11-2
GTAacaatatggttTG
589_1
12780
-15
590
gaaatattgtagacta
2-11-3
GAaatattgtagaCTA
590_1
13151
-14
591
ttgaaatattgtagac
3-11-2
TTGaaatattgtagAC
591_1
13153
-12
592
aagtctagtaatttgc
2-10-4
AAgtctagtaatTTGC
592_1
13217
-17
593
gctcagtagattataa
4-10-2
GCTCagtagattatAA
593_1
13259
-17
594
catacactgttgctaa
3-10-3
CATacactgttgcTAA
594_1
13296
-19
595
atggtctcaaatcatt
3-10-3
ATGgtctcaaatcATT
595_1
13314
-17
596
caatggtctcaaatca
4-10-2
CAATggtctcaaatCA
596_1
13316
-18
597
ttcctattgattgact
4-10-2
TTCCtattgattgaCT
597_1
13568
-20
598
tttctgttcacaacac
4-10-2
TTTCtgttcacaacAC
598_1
13600
-17
599
aggaacccactaatct
2-11-3
AGgaacccactaaTCT
599_1
13702
-20
600
taaatggcaggaaccc
3-11-2
TAAatggcaggaacCC
600_1
13710
-19
601
gtaaatggcaggaacc
4-10-2
GTAAatggcaggaaCC
601_1
13711
-20
602
ttgtaaatggcaggaa
2-11-3
TTgtaaatggcagGAA
602_1
13713
-16
603
ttatgagttaggcatg
2-10-4
TTatgagttaggCATG
603_1
13835
-19
604
ccaggtgaaactttaa
3-11-2
CCAggtgaaactttAA
604_1
13935
-17
605
cccttagtcagctcct
3-10-3
CCCttagtcagctCCT
605_1
13997
-30
606
acccttagtcagctcc
2-10-4
ACccttagtcagCTCC
606_1
13998
-27
607
cacccttagtcagctc
2-11-3
CAcccttagtcagCTC
607_1
13999
-24
608
tctcttactaggctcc
3-10-3
TCTcttactaggcTCC
608_1
14091
-24
609
cctatctgtcatcatg
2-11-3
CCtatctgtcatcATG
609_1
14178
-20
610
tcctatctgtcatcat
3-11-2
TCCtatctgtcatcAT
610_1
14179
-20
611
gagaagtgtgagaagc
3-11-2
GAGaagtgtgagaaGC
611_1
14808
-19
612
catccttgaagtttag
4-10-2
CATCcttgaagtttAG
612_1
14908
-19
613
taataagatggctccc
3-10-3
TAAtaagatggctCCC
613_1
15046
-21
614
caaggcataataagat
3-11-2
CAAggcataataagAT
614_1
15053
-14
615
ccaaggcataataaga
2-10-4
CCaaggcataatAAGA
615_1
15054
-18
616
tgatccaattctcacc
2-12-2
TGatccaattctcaCC
616_1
15151
-19
617
atgatccaattctcac
3-10-3
ATGatccaattctCAC
617_1
15152
-19
618
cgcttcatcttcaccc
3-11-2
CGCttcatcttcacCC
618_1
15260
-26
619
tatgacactgcatctt
2-10-4
TAtgacactgcaTCTT
619_1
15317
-19
620
gtatgacactgcatct
3-10-3
GTAtgacactgcaTCT
620_1
15318
-21
621
tgtatgacactgcatc
2-10-4
TGtatgacactgCATC
621_1
15319
-20
622
ttctcttctgtaagtc
4-10-2
TTCTcttctgtaagTC
622_1
15363
-19
623
ttctacagaggaacta
2-10-4
TTctacagaggaACTA
623_1
15467
-17
624
actacagttctacaga
3-10-3
ACTacagttctacAGA
624_1
15474
-19
625
ttcccacaggtaaatg
4-10-2
TTCCcacaggtaaaTG
625_1
15561
-21
626
attatttgaatatactcatt
4-12-4
ATTAtttgaatatactCATT
626_1
15594
-20
627
tgggaggaaattatttg
4-10-3
TGGGaggaaattatTTG
627_1
15606
-20
628
tgactcatcttaaatg
4-10-2
TGACtcatcttaaaTG
628_1
15621
-17
629
ctgactcatcttaaat
3-11-2
CTGactcatcttaaAT
629_1
15622
-16
630
tttactctgactcatc
3-10-3
TTTactctgactcATC
630_1
15628
-17
631
tattggaggaattatt
3-11-2
TATtggaggaattaTT
631_1
15642
-14
632
gtattggaggaattat
3-11-2
GTAttggaggaattAT
632_1
15643
-16
633
tggtatacttctctaagtat
2-15-3
TGgtatacttctctaagTAT
633_1
15655
-22
634
gatctcttggtatact
4-10-2
GATCtcttggtataCT
634_1
15666
-20
635
cagacaactctatacc
2-12-2
CAgacaactctataCC
635_1
15689
-18
636
aacatcagacaactcta
4-9-4
AACAtcagacaacTCTA
636_1
15693
-21
637
taacatcagacaactc
4-10-2
TAACatcagacaacTC
637_1
15695
-16
638
tttaacatcagacaactc
4-10-4
TTTAacatcagacaACTC
638_1
15695
-20
639
atttaacatcagacaa
2-12-2
ATttaacatcagacAA
639_1
15698
-11
640
cctatttaacatcagac
2-11-4
CCtatttaacatcAGAC
640_1
15700
-20
641
tccctatttaacatca
3-10-3
TCCctatttaacaTCA
641_1
15703
-21
642
tcaacgactattggaat
4-9-4
TCAAcgactattgGAAT
642_1
15737
-20
643
cttatattctggctat
4-9-3
CTTAtattctggcTAT
643_1
15850
-20
644
atccttatattctggc
4-10-2
ATCCttatattctgGC
644_1
15853
-23
645
gatccttatattctgg
2-10-4
GAtccttatattCTGG
645_1
15854
-21
646
tgatccttatattctg
3-10-3
TGAtccttatattCTG
646_1
15855
-19
647
attgaaacttgatcct
4-8-4
ATTGaaacttgaTCCT
647_1
15864
-21
648
actgtcattgaaactt
2-10-4
ACtgtcattgaaACTT
648_1
15870
-16
649
tcttactgtcattgaa
3-11-2
TCTtactgtcattgAA
649_1
15874
-16
650
aggatcttactgtcatt
2-11-4
AGgatcttactgtCATT
650_1
15877
-21
651
gcaaatcaactccatc
3-10-3
GCAaatcaactccATC
651_1
15896
-20
652
gtgcaaatcaactcca
3-10-3
GTGcaaatcaactCCA
652_1
15898
-22
653
caattatttctttgtgc
4-10-3
CAATtatttctttgTGC
653_1
15910
-21
654
tggcaacaattatttctt
3-11-4
TGGcaacaattattTCTT
654_1
15915
-21
655
gctggcaacaattatt
3-9-4
GCTggcaacaatTATT
655_1
15919
-21
656
atccatttctactgcc
4-10-2
ATCCatttctactgCC
656_1
15973
-24
657
taatatctattgatttcta
4-11-4
TAATatctattgattTCTA
657_1
15988
-20
658
tcaatagtgtagggca
2-12-2
TCaatagtgtagggCA
658_1
16093
-18
659
ttcaatagtgtagggc
3-11-2
TTCaatagtgtaggGC
659_1
16094
-19
660
aggttaattaattcaatag
4-11-4
AGGTtaattaattcaATAG
660_1
16102
-21
661
catttgtaatccctag
3-10-3
CATttgtaatcccTAG
661_2
16163
-20
661
catttgtaatccctag
3-9-4
CATttgtaatccCTAG
661_1
16163
-22
662
acatttgtaatcccta
3-10-3
ACAtttgtaatccCTA
662_1
16164
-20
663
aacatttgtaatccct
2-10-4
AAcatttgtaatCCCT
663_2
16165
-21
663
aacatttgtaatccct
3-9-4
AACatttgtaatCCCT
663_1
16165
-22
664
taaatttcaagttctg
2-11-3
TAaatttcaagttCTG
664_1
16184
-14
665
gtttaaatttcaagttct
3-11-4
GTTtaaatttcaagTTCT
665_1
16185
-19
666
ccaagtttaaatttcaag
4-10-4
CCAAgtttaaatttCAAG
666_1
16189
-21
667
acccaagtttaaatttc
4-9-4
ACCCaagtttaaaTTTC
667_1
16192
-22
668
catacagtgacccaagttt
2-14-3
CAtacagtgacccaagTTT
668_1
16199
-23
669
acatcccatacagtga
2-11-3
ACatcccatacagTGA
669_1
16208
-21
670
agcacagctctacatc
2-10-4
AGcacagctctaCATC
670_1
16219
-22
671
atatagcacagctcta
3-9-4
ATAtagcacagcTCTA
671_1
16223
-21
672
tccatatagcacagct
3-11-2
TCCatatagcacagCT
672_1
16226
-22
673
atttccatatagcaca
3-9-4
ATTtccatatagCACA
673_1
16229
-20
674
tttatttccatatagca
4-9-4
TTTAtttccatatAGCA
674_1
16231
-22
675
tttatttccatatagc
3-10-3
TTTatttccatatAGC
675_1
16232
-18
676
aaggagaggagattatg
4-9-4
AAGGagaggagatTATG
676_1
16409
-21
677
agttcttgtgttagct
3-11-2
AGTtcttgtgttagCT
677_1
16456
-21
678
gagttcttgtgttagc
2-12-2
GAgttcttgtgttaGC
678_1
16457
-20
679
attaattatccatccac
3-10-4
ATTaattatccatCCAC
679_1
16590
-21
680
atcaattaattatccatc
3-11-4
ATCaattaattatcCATC
680_1
16593
-19
681
agaatcaattaattatcc
3-12-3
AGAatcaattaattaTCC
681_1
16596
-18
682
tgagataccgtgcatg
2-12-2
TGagataccgtgcaTG
682_1
16656
-18
683
aatgagataccgtgca
2-10-4
AAtgagataccgTGCA
683_1
16658
-21
684
ctgtggttaggctaat
3-11-2
CTGtggttaggctaAT
684_1
16834
-19
685
aagagtaagggtctgtggtt
1-17-2
AagagtaagggtctgtggTT
685_1
16842
-21
686
gatgggttaagagtaa
4-9-3
GATGggttaagagTAA
686_1
16854
-19
687
agcagatgggttaaga
3-11-2
AGCagatgggttaaGA
687_1
16858
-20
688
tgtaaacatttgtagc
2-10-4
TGtaaacatttgTAGC
688_1
16886
-19
689
cctgcttataaatgta
3-11-2
CCTgcttataaatgTA
689_1
16898
-19
690
tgccctgcttataaat
4-10-2
TGCCctgcttataaAT
690_1
16901
-23
691
tcttcttagttcaata
2-12-2
TCttcttagttcaaTA
691_1
16935
-15
692
tggtttctaactacat
2-10-4
TGgtttctaactACAT
692_1
16980
-18
693
agtttggtttctaacta
2-12-3
AGtttggtttctaaCTA
693_1
16983
-19
694
gaatgaaacttgcctg
3-10-3
GAAtgaaacttgcCTG
694_1
17047
-18
695
attatccttacatgat
3-10-3
ATTatccttacatGAT
695_1
17173
-17
696
gtacccaattatcctt
2-11-3
GTacccaattatcCTT
696_1
17180
-21
697
tgtacccaattatcct
3-10-3
TGTacccaattatCCT
697_1
17181
-24
698
ttgtacccaattatcc
2-11-3
TTgtacccaattaTCC
698_1
17182
-20
699
tttgtacccaattatc
3-11-2
TTTgtacccaattaTC
699_1
17183
-17
700
agcagcaggttatatt
4-10-2
AGCAgcaggttataTT
700_1
17197
-22
701
tgggaagtggtctggg
3-10-3
TGGgaagtggtctGGG
701_1
17292
-25
702
ctggagagtgataata
3-11-2
CTGgagagtgataaTA
702_1
17322
-17
703
aatgctggattacgtc
4-10-2
AATGctggattacgTC
703_1
17354
-19
704
caatgctggattacgt
2-11-3
CAatgctggattaCGT
704_1
17355
-19
705
ttgttcagaagtatcc
2-10-4
TTgttcagaagtATCC
705_1
17625
-19
706
gatgatttgcttggag
2-10-4
GAtgatttgcttGGAG
706_1
17646
-21
707
gaaatcattcacaacc
3-10-3
GAAatcattcacaACC
707_1
17860
-17
708
ttgtaacatctactac
3-10-3
TTGtaacatctacTAC
708_1
17891
-16
709
cattaagcagcaagtt
3-11-2
CATtaagcagcaagTT
709_1
17923
-17
710
ttactagatgtgagca
3-11-2
TTActagatgtgagCA
710_1
17942
-18
711
tttactagatgtgagc
2-11-3
TTtactagatgtgAGC
711_1
17943
-18
712
gaccaagcaccttaca
3-11-2
GACcaagcaccttaCA
712_1
17971
-22
713
agaccaagcaccttac
3-10-3
AGAccaagcacctTAC
713_1
17972
-22
714
atgggttaaataaagg
2-10-4
ATgggttaaataAAGG
714_1
18052
-15
715
tcaaccagagtattaa
2-12-2
TCaaccagagtattAA
715_1
18067
-13
716
gtcaaccagagtatta
3-11-2
GTCaaccagagtatTA
716_1
18068
-18
717
attgtaaagctgatat
2-11-3
ATtgtaaagctgaTAT
717_1
18135
-14
718
cacataattgtaaagc
2-10-4
CAcataattgtaAAGC
718_1
18141
-16
719
gaggtctgctatttac
2-11-3
GAggtctgctattTAC
719_1
18274
-19
720
tgtagattcaatgcct
2-11-3
TGtagattcaatgCCT
720_1
18404
-20
721
cctcattatactatga
2-11-3
CCtcattatactaTGA
721_1
18456
-19
722
ccttatgctatgacac
2-12-2
CCttatgctatgacAC
722_1
18509
-18
723
tccttatgctatgaca
4-10-2
TCCTtatgctatgaCA
723_1
18510
-22
724
aagatgtttaagtata
3-10-3
AAGatgtttaagtATA
724_1
18598
-13
725
ctgattattaagatgt
2-10-4
CTgattattaagATGT
725_1
18607
-17
726
tggaaaggtatgaatt
2-12-2
TGgaaaggtatgaaTT
726_1
18808
-13
727
acttgaatggcttgga
2-12-2
ACttgaatggcttgGA
727_1
18880
-18
728
aacttgaatggcttgg
3-10-3
AACttgaatggctTGG
728_1
18881
-19
729
caatgtgttactattt
4-10-2
CAATgtgttactatTT
729_1
19004
-16
730
acaatgtgttactatt
3-10-3
ACAatgtgttactATT
730_1
19005
-15
731
catctgctatataaga
4-10-2
CATCtgctatataaGA
731_1
19063
-18
732
cctagagcaaatactt
4-10-2
CCTAgagcaaatacTT
732_1
19223
-20
733
cagagttaataataag
3-10-3
CAGagttaataatAAG
733_1
19327
-13
734
gttcaagcacaacgaa
4-10-2
GTTCaagcacaacgAA
734_1
19493
-18
735
agggttcaagcacaac
2-11-3
AGggttcaagcacAAC
735_1
19496
-18
736
tgttggagacactgtt
2-12-2
TGttggagacactgTT
736_1
19677
-17
737
aaggaggagttaggac
3-11-2
AAGgaggagttaggAC
737_1
19821
-18
738
ctatgccatttacgat
4-10-2
CTATgccatttacgAT
738_1
19884
-21
739
tcaaatgcagaattag
2-12-2
TCaaatgcagaattAG
739_1
19913
-12
740
agtgacaatcaaatgc
2-10-4
AGtgacaatcaaATGC
740_1
19921
-18
741
aagtgacaatcaaatg
2-11-3
AAgtgacaatcaaATG
741_1
19922
-12
742
gtgtaccaagtaacaa
3-11-2
GTGtaccaagtaacAA
742_1
19978
-16
743
tgggatgttaaactga
3-10-3
TGGgatgttaaacTGA
743_1
20037
-20
Мотивы последовательностей представляют собой непрерывную последовательность нуклеиновых оснований, присутствующую в олигонуклеотиде.
Конструкции относятся к конструкции гэпмеров - F-G-F' - где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которому возможно предшествуют или после которого возможно следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не являются необходимой частью данной непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.
Олигонуклеотидные соединения представляют конкретные конструкции мотивов последовательности. Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
Таблица 6: олигонуклеотиды, нацеленные на мышиный транскрипт PD-L1 (SEQ ID NO: 4), их конструкция, а также специфичные олигонуклеотидные соединения (указанные по CMP ID NO), разработанные на основе последовательности мотива.
SEQ ID NO
Мотив последова-тельности
Конс-трук-ция
Олигонуклеотид-ное соединение
CMP ID NO
Начало на SEQ ID NO: 4
dG
744
agtttacattttctgc
3-10-3
AGTttacattttcTGC
744_1
4189
-20
745
tatgtgaagaggagag
3-10-3
TATgtgaagaggaGAG
745_1
7797
-19
746
cacctttaaaacccca
3-10-3
CACctttaaaaccCCA
746_1
9221
-23
747
tcctttataatcacac
3-10-3
TCCtttataatcaCAC
747_1
10386
-19
748
acggtattttcacagg
3-10-3
ACGgtattttcacAGG
748_1
12389
-21
749
gacactacaatgagga
3-10-3
GACactacaatgaGGA
749_1
15088
-20
750
tggtttttaggactgt
3-10-3
TGGtttttaggacTGT
750_1
16410
-21
751
cgacaaattctatcct
3-10-3
CGAcaaattctatCCT
751_1
18688
-20
752
tgatatacaatgctac
3-10-3
TGAtatacaatgcTAC
752_1
18735
-16
753
tcgttgggtaaattta
3-10-3
TCGttgggtaaatTTA
753_1
19495
-17
754
tgctttataaatggtg
3-10-3
TGCtttataaatgGTG
754_1
19880
-19
Мотивы последовательностей представляют собой непрерывную последовательность нуклеиновых оснований, присутствующую в олигонуклеотиде.
Конструкции относятся к конструкции гэпмеров - F-G-F' - где каждое число представляет число последовательных модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (первое число - 5'-фланг), с последующим числом нуклеозидов ДНК (второе число - область гэпа), с последующим числом модифицированных нуклеозидов, например, 2' модифицированных нуклеозидов (третье число - 3'-фланг), которому возможно предшествуют или после которого возможно следуют дополнительные повторяющиеся области ДНК и LNA, которые не являются необходимой частью данной непрерывной последовательности, которая является комплементарной нуклеиновой кислоте-мишени.
Олигонуклеотидные соединения представляют конкретные конструкции мотивов последовательности. Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, все межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
Таблица 7: последовательности олигонуклеотидных мотивов и антисмысловые соединения с 5'-ca биорасщепляемым линкером.
SEQ ID NO
мотив последовательности
олигонуклеотидное соединение с линкером са
CMP ID NO
755
caagtttacattttctgc
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>AGTttacattttcTGC
755_1
756
catatgtgaagaggagag
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TATgtgaagaggaGAG
756_1
757
cacctttaaaacccca
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CACctttaaaaccCCA
757_1
758
catcctttataatcacac
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TCCtttataatcaCAC
758_1
759
caacggtattttcacagg
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>ACGgtattttcacAGG
759_1
760
cagacactacaatgagga
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>GACactacaatgaGGA
760_1
761
catggtttttaggactgt
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TGGtttttaggacTGT
761_1
762
cacgacaaattctatcct
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CGAcaaattctatCCT
762_1
763
catgatatacaatgctac
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TGAtatacaatgcTAC
763_1
764
catcgttgggtaaattta
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TCGttgggtaaatTTA
764_1
765
catgctttataaatggtg
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TGCtttataaatgGTG
765_1
766
caacaaataatggttactct
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>ACAAataatggttaCTCT
766_1
767
cacagattgatggtagtt
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CAGAttgatggtagTT
767_1
768
cacctatttaacatcagac
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CCtatttaacatcAGAC
768_1
769
cactaattgtagtagtactc
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CTAattgtagtagtaCTC
769_1
770
caataaacatgaatctctcc
c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>ATaaacatgaatctCTCC
770_1
o
Заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, подстрочный символ  представляет фосфодиэфирную межнуклеозидную связь, и, если не указано иначе, другие межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи.
Таблица 8: антисмысловые олигонуклеотидные соединения, конъюгированные с GalNAc
конъюгат антисмыслового олигонуклеотида
CMP ID NO
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>AGTttacattttcTGC
755_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TATgtgaagaggaGAG
756_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CACctttaaaaccCCA
757_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TCCtttataatcaCAC
758_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>ACGgtattttcacAGG
759_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>GACactacaatgaGGA
760_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TGGtttttaggacTGT
761_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CGAcaaattctatCCT
762_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TGAtatacaatgcTAC
763_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TCGttgggtaaatTTA
764_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>TGCtttataaatgGTG
765_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>ACAAataatggttaCTCT
766_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CAGAttgatggtagTT
767_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CCtatttaacatcAGAC
768_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>CTAattgtagtagtaCTC
769_2
GN2-C6<sub>o</sub>c<sub>o</sub>a<sub>o</sub>ATaaacatgaatctCTCC
770_2
o
GN2 представляет трехвалентный GalNAc кластер, показанный на Фиг. 3, С6 представляет аминоалкильную группу с 6 атомами углерода, заглавные буквы представляют нуклеозиды бета-D-окси LNA, строчные буквы представляют нуклеозиды ДНК, все C LNA представляют собой 5-метилцитозин, подстрочный символ  представляет фосфодиэфирную нуклеозидную связь, и, если не указано иначе, другие межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные межнуклеозидные связи. Химические формулы, представляющие некоторые из данных молекул, показаны на Фиг. 4-8.
Мышиные модели AAV/HBV
Модель Пастера:
В Институте Пастера создали и разводили трансгенных по HLA-A2.1-/HLA-DR1 нокаутированных по H-2 класса I-/класса II мышей (именуемых в данном документе HLA-A2/DR1). Данные мыши представляют собой экспериментальную модель in vivo для исследований человеческой иммунной функции без какого-либо мешающего влияния ответа мышиного МНС (главный комплекс гистосовместиости) (Pajot et al 2004 Eur J Immunol. 34(11):3060-9.
11
10
В данных исследованиях использовали вектор на основе аденосателлитного вируса (AAV) серотипа AAV 2/8, несущий компетентный к репликации ДНК-геном HBV. Вектор AAV-HBV (партия GVPN #6163) разводили в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) с достижением титра 5×10 вг (геном вектора)/мл. Мышам внутривенно (в.в.) инъецировали 100 мкл данного разведенного раствора (доза/мышь: 5×10 вг) в хвостовую вену. В крови мышей-носителей HBV выявляли полные вирусные частицы, содержащие ДНК HBV. HBcAg выявляли в течение вплоть до одного года в печени, наряду с циркулирующими белками HBV - HBeAg и HBsAg - в крови. У всех мышей, трансдуцированных AAV2/8-HBV, HBsAg, HBeAg и ДНК HBV сохранялись в сыворотке в течение по меньшей мере одного года (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).
Шанхайская модель:
В данной модели у мышей, инфицированных рекомбинантным аденосателлитным вирусом (AAV), несущим геном HBV (AAV/HBV), поддерживается стабильная виремия и антигенимия в течение больше, чем 30 недель (Dan Yang, et al.  2014 Cellular & Molecular Immunology 11, 71-78).
Самцов мышей C57BL/6 (4-6-недельных), не содержащих специфических патогенов, приобретали в SLAC (Центр животных Шанхайской лаборатории Китайской академии наук) и содержали в виварии в индивидуально вентилируемых клетках. Следовали руководствам по уходу и применению животных, как указывается WuXi IACUC (Институциональный комитет по уходу и применению животных, номер потокола WUXI IACUC R20131126-мышь). Мышам давали акклиматизироваться к новым условиям в течение 3 суток и группировали их согласно схеме экперимента.
Рекомбинантный AAV-HBV разводили в PBS, 200 мкл на инъекцию. Данный рекомбинантный вирус несет 1,3 копии генома HBV (генотип D, серотип ayw).
В сутки 0 всем мышам инъецировали через хвостовую вену 200 мкл AAV-HBV. В сутки 6, 13 и 20 после инъекции AAV всем мышам делали подчелюстное кровопускание (0,1 мл крови/мышь) для отбора сыворотки. В сутки 22 после инъекции мыши со стабильной виремией были готовы для обработки олигонуклеотидами. Данные олигонуклеотиды могут быть неконъюгированными или конъюгированными с GalNAc.
ДНК-вакцина
Плазмидная ДНК не содержала эндотоксинов и была изготовлена Plasmid-Factory (Германия). pCMV-S2.S ayw кодирует домены preS2 и S HBsAg (генотип D), и их экспрессия контролируется немедленным ранним промотором гена цитомегаловируса (Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311). pCMV-HBc кодирует капсид HBV, несущий Ag (антиген) кора вируса гепатита (HBc) (Dion et al 2013 J Virol 87:5554-5563).
Обработку ДНК-вакциной проводили, как описано в данном документе. За пять суток до вакцинации в мышцы мышей инъецировали кардиотоксин (CaTx, латоксан реф. L81-02, 50 мкл/мышцу). CaTx деполяризует мышечные волокна с индукцией дегенерации клеток, через 5 суток после инъекции появятся новые мышечные волокна, и они будут получать ДНК-вакцину для лучшей эффективности трансфекции. Каждый из pCMV-S2.S ayw и pCMVCore в концентрации 1 мг/мл смешивали в равном количестве, и каждая мышь получала всего 100 мкг двухсторонней внутримышечной инъекции в обработанные кардиотоксином передние большеберцовые мышцы, как было описано ранее в Michel et al 1995 Proc Natl Acad Sci U S A 92:5307-5311, под анестезией (100 мкл 12,5 мг/мл кетамина, 1,25 мг/мл ксилазина).
Антитело против PD-L1
Это мышиное антитело IgG1 против мышиного PD-L1 клона 6Е11, произведенное внутри Genetech. Оно представляет собой имитирующее антитело, которое перекрестно блокирует атезолизумаб, и имеет аналогичную активность, блокирующую in vitro атезолизумаб, произведенный внутри Roche. Данное антитело вводили внутрибрюшинной инъекцией (в.б.) в дозе 12,5 мкг/г.
Синтез олигонуклеотидов
Синтез олигонуклеотидов обычно известен в данной области. Ниже представлен протокол, который можно применять. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению возможно были получены слегка отличными способами в показателях использованных прибора, подложки и концентраций.
Олигонуклеотиды синтезируются на уридиновых универсальных подложках с использованием фосфорамидитного подхода на Oligomaker 48 в масштабе 1 мкмоль. В конце синтеза олигонуклеотиды отщепляются от твердой подложки с использованием водного аммиака в течение 5-16 часов при 60°С. Олигонуклеотиды очищаются посредством ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) с обращенной фазой (ВЭЖХ-ОФ) или посредством экстракций твердой фазы и характеризуются посредством СВЭЖХ (сверхэффективная жидкостная хроматография), и далее подтверждается молекулярная масса посредством МС-ЭРИ (масс-спектрометрия с электрораспылительной ионизацией).
Элонгация олигонуклеотида:
Связывание β-цианоэтил-фосфорамидитов (ДНК-А(Bz), ДНК-G(ibu), ДНК-C(Bz), ДНК-Т, LNA-5-метил-C(Bz), LNA-A(Bz), LNA-G(dmf) или LNA-T) проводится посредством применения раствора 0,1 М амидита, защищенного 5'-O-DMT, в ацетонитриле и DCI (4,5-дицианоимидазол) в ацетонитриле (0,25 М) в качестве активатора. Для последнего цикла может быть использован фосфорамидит с желательными модификациями, например, С6-линкер для присоединения конъюгатной группы или конъюгатная группа как таковая. Тиолирование для введения фосфортиоатных связей проводится с использованием ксантангидрида (0,01 М в ацетонитриле/пиридине 9:1). Фосфодиэфирные связи могут вводиться с использованием 0,02 М йода в THF/пиридине/воде 7:2:1. Остальными реактивами являются реактивы, типично используемые для синтеза олигонуклеотидов.
Для конъюгирования после твердофазного синтеза можно использовать имеющийся в продаже С6 аминолинкер фосфорамидит в последнем цикле твердофазного синтеза, и после снятия защиты и отщепления от твердой подложки выделяется связанный аминолинкером олигонуклеотид со снятой защитой. Конъюгаты вводятся через активацию функциональной группы с использованием стандартных способов синтеза.
В качестве альтернативы, конъюгатную группировку можно добавлять к олигонуклеотиду, в то время как он все еще находится на твердой подложке с использованием фосфорамидита с GalNAc или с кластером GalNAc, как описано в PCT/EP2015/073331 или в заявке EP № 15194811.4.
Очистка посредством ВЭЖХ-ОФ:
Неочищенные соединения очищают препаративной ВЭЖХ-ОФ на колонке Phenomenex Jupiter C18 10 мкм 150×10 мм. В качестве буферов используют 0,1 М ацетат аммония, рН 8, и ацетонитрил при скорости тока 5 мл/мин. Отобранные фракции лиофилизируют с получением очищенного соединения - типично в виде белого твердого вещества.
Сокращения:
DCI:
4,5-дицианоимидазол
DCM:
дихлорметан
DMF:
диметилформамид
DMT:
4,4'-диметокситритил
THF:
тетрагидрофуран
Bz:
бензоил
Ibu:
изобутирил
ВЭЖХ-ОФ: высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой
m
Анализ T
m
m
m
Дуплексы олигонуклеотида и РНК-мишени (связанной фосфатом - РО) разводят до 3 мМ в 500 мл воды, не содержащей РНКазы, и смешивают с 500 мл 2× T-буфера (200 мМ NaCl, 0,2 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), 20 мМ фосфат Na, pH 7,0). Данный раствор нагревают до 95°С в течение 3 мин и затем дают осуществляться отжигу при комнатной температуре в течение 30 мин. Температуры плавления дуплекса (T) измеряют на спектрофотометре Lambda 40, работающем в ультрафиолетовой/видимой области, оснащенном программатором температуры Пелетье РТР6, используя программу PE Templab (Perkin Elmer). Температура повышается от 20°С до 95°С и затем снижается до 25°С, с записью поглощения при 260 нм. Для оценки T дуплекса используются первая производная и локальные максимумы как плавления, так и отжига.
Анализ тканеспецифичного расщепления линкера in vitro
Меченные FAM олигонуклеотиды с биорасщепляемым линкером, подлежащие тестированию (например, фосфодиэфирный линкер ДНК (РО линкер)), подвергаются расщеплению in vitro с использованием гомогенатов релевантных тканей (например, печени или почки) и сыворотки.
Образцы ткани и сыворотки отбирают у подходящего животного (например, мыши, обезьяны, свиньи или крысы) и гомогенизируют в гомогенизационном буфере (0,5% Igepal CA-630, 25 мМ Tris, рН 8,0, 100 мМ NaCl, pH 8,0 (доведенный 1 н. NaOH). В гомогенаты ткани и сыворотку впрыскивают олигонуклеотид до концентраций 200 мкг/г ткани. Образцы инкубируются в течение 24 часов при 37°С, и затем данные образцы подвергают экстракции фенолом-хлороформом. Растворы подвергают анализам ВЭЖХ АО (высокоэффективная жидкостная хроматография на анионообменной колонке) на Dionex Ultimate 3000 с использованием колонки Dionex DNApac p-100 и градиента в интервале от 10 мМ до 1 М перхлората натрия при рН 7,5. Содержание расщепленного и нерасщепленного олигонуклеотида определяется относительно стандарта с использованием как флюоресцентного детектора при 615 нм, так и УФ детектора при 260 нм.
Анализ расщепления нуклеазой S1
Меченные FAM олигонуклеотиды с линкерами, чувствительными к нуклеазе S1 (например, фосфодиэфирный ДНК-линкер (РО линкер)), подвергаются расщеплению in vitro в экстракте нуклеазы S1 или сыворотке.
100 мкМ олигонуклеотидов подвергаются расщеплению in vitro нуклеазой S1 в буфере для нуклеазы (60 U на 100 мкл) в течение 20 и 120 минут. Ферментативную активность останавливают добавлением в раствор буфера EDTA. Растворы подвергают анализам ВЭЖХ АО на Dionex Ultimate 3000 с использованием колонки Dionex DNApac p-100 и градиента в интервале от 10 мМ до 1 М перхлората натрия при рН 7,5. Содержание расщепленного и нерасщепленного олигонуклеотида определяется относительно стандарта с использованием как флюоресцентного детектора при 615 нм, так и УФ детектора при 260 нм.
Получение одноядерных клеток печени
Клетки печени от мышей AAV/HBV получали, как описано ниже, и согласно способу, описанному Tupin et al 2006 Methods Enzymol 417:185-201, с небольшими модификациями. После умерщвления мышей осуществляли перфузию печени 10 мл стерильного PBS через портальную вену печени с использованием шприца с иглой калибра 25. Когда орган становлся бледным, данный орган отбирали в сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS) (GIBCO HBSS, 24020) плюс 5 % фетальной телячьей сыворотки с удаленным комплементом (FCS). Отобранную печень аккуратно продавливали через 100 мкм клеточное сито (BD Falcon, 352360), и клетки суспендировали в 30 мл HBSS плюс 5% FCS. Суспензию клеток центрифугировали при 50 g в течение 5 мин. Супернатанты затем центрифугировали при 289 g в течение 10 мин при 4°С. После центрифугирования супернатанты отбрасывали, и осадки ресуспендировали в 15 мл при комнатной температуре в 35%-ном изотоничном растворе перколла (Percoll от GE Healthcare #17-0891-01, разведенный в RPMI 1640 (GIBCO, 31870)) и переносили в 15 мл пробирку. Клетки далее центрифугировали при 1360 g в течение 25 мин при комнатной тмпературе. Супернатант отбрасывали отсасыванием, и осадок, содержащий одноядерные клетки, дважды промывали HBSS плюс 5% FCS.
Клетки культивировали в полной среде (α-минимальная незаменимая среда (Gibco, 22571), дополненная 10% FCS (Hyclone, # SH30066, партия APG21570), 100 U/мл пенициллина плюс 100 мкг/мл стрептомицина плюс 0,3 мг/мл L-глутамина (Gibco, 10378), 1× заменимыми аминокислотами (Gibco, 11140), 10 мМ Hepes (Gibco, 15630), 1 мМ пируватом натрия (Gibco, 11360) и 50 мкM β-меркаптоэтанолом (LKB, 1830)).
Поверхностное мечение клеток
Клетки высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном и промывали PBS для FACS (флуоресцентная сортировка клеток) (PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,01% азида натрия). Клетки инкубировали с 5 мкл PBS для FACS, содержащего крысиное антитело против мышиного CD16/CD32 и маркер жизнеспособности LD фиксируемый желтый, Thermofisher, L34959, в течение 10 мин в темноте при 4°С. Затем клетки окрашивали в течение 20 мин в темноте при 4°С с использованием 25 мкл PBS для FACS, содержащего моноклональные антитела (Mab) против NK P46 BV421 (крысиное Mab против мышиного NK P46, Biolegend, 137612) и F4/80 (крысиное Mab против мышиного F4/80, конъюгированное с FITC (флюоресцеинизотиоцианат), BD Biolegend, 123108), и также добавляли два дополнительных поверхностных маркера: PD1 (крысиное Mab против мышиного PD1, конъюгированное с PE (фосфоэстераза), BD Biosciences, 551892) и PDL1 (крысиное Mab против мышиного PDL1 BV711, Biolegend, 124319).
Анализ внутриклеточного окрашивания на цитокины (ICS)
Анализы ICS проводили и на спленоцитах, и на одноядерных клетках печени. Клетки высевали в 96-луночные планшеты с U-образным дном. Планшеты с клетками инкубировали в течение ночи при 37° либо в одной полной среде в качестве негативного контроля, либо с пептидами, описанными в Таблице 9, в концентрации 2 мкг/мл. После одного часа инкубации добавляли брефельдин А (Sigma, B6542) в концентрации 2 мкг/мл.
После культуры в течение ночи клетки промывали PBS для FACS и инкубировали с 5 мкл PBS для FACS, содержащего крысиное антитело против мышиного CD16/CD32 и маркер жизнеспособности LD фиксируемый желтый, Thermofisher, L34959, в течение 10 мин в темноте при 4°С. Затем клетки окрашивали в течение 20 мин в темноте при 4°С с использованием 25 мкл PBS для FACS, содержащего Mab. Смесь состояла из моноклональных антител против CD3 (Mab хомяка против мышиного CD3-PerCP, BD Biosciences, 553067), против CD8 (крысиное Mab против мышиного CD8-APC-H7, BD Biosciences, 560182), против CD4 (крысиное Mab против мышиного CD4-РЕ-Cy7, BD Biosciences, 552775) и против NK-клеток (крысиное Mab против мышиных NK P46 BV421, Biolegend, 137612). Клетки фиксировали после нескольких промывок и делали проницаемыми в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре с использованием Cytofix/Cytoperm, промывали раствором Perm/Wash (BD Biosciences, 554714) при 4°С.
Внутриклеточное окрашивание на цитокины с использованием антител против IFNγ (интерферон-гамма) (крысиное Mab против мышиного IFNγ-APC, клон XMG1.2, BD Biosciences, 554413) и фактора некроза опухолей-альфа (TNFα) (крысиное Mab против мышиного TNFα-FITC, клон MP6-XT22; 1/250 (BD Biosciences 554418) проводили в течение 30 мин в темноте при 4°С. Перед анализом посредством проточной цитометрии с использованием анализатора MACSQuant клетки промывали Perm/Wash и ресуспендировали в PBS для FACS, содержащем 1% формальдегида.
Живые клетки CD3+CD8+CD4- и CD3+CD8-CD4+ сортировали и представляли на точечном графке. Определяли две области для сортировки позитивных клеток в отношении каждого цитокина. Число событий, обнаруженное при данных сортировках, делили на общее число событий в родительской популяции для получения процентных содержаний отвечающих Т-клеток. Для каждой мыши процентная доля, полученная в одной среде, рассматривалась как фон и вычиталась из процентной доли, полученной при стимулированиях пептидами.
Порог позитивности определяли согласно фону эксперимента, т.е. средней процентной доле окрашенных клеток, полученной для каждой группы в условиях одной среды, плюс два стандартных отклонения. Только процентная доля цитокина, представленного по меньшей мере в 5 событиях, считалась позитивной.
Таблица 9: эпитопы, ограниченные HLA-A2/DR1, содержащиеся в коровом белке HBV и доменах оболочки HВsAg (S2+S).
Белок
Положение начала
Положение конца
Последовательность
ОграничениеHLA
Ссылки
Ядро
18
27
FLPSDFFPSV(SEQ ID NO: 773)
A2
Bertoletti et alGastroenterology 1997;112:193-199
111
125
GRETVLEYLVSFGVW(SEQ ID NO: 774)
DR1
(Bertoletti et alGastroenterology 1997;112:193-199
Оболочка (S2+S)
114
128
TTFHQTLQDPRVRGL(SEQ ID NO: 775)
DR1
Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790.
179
194
QAGFFLLTRILTIPQS(SEQ ID NO: 776)
A2 + DR1
Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790.
183
191
FLLTRILTI(SEQ ID NO: 777)
A2
Sette et al J Immunol1994;153:5586-5592.
200
214
TSLNFLGGTTVCLGQ(SEQ ID NO: 778)
A2 + DR1
Pajot et al Microbes Infect 2006;8:2783-2790.
204
212
FLGGTTVCL(SEQ ID NO: 779)
A2
Rehermann et al  J Exp Med 1995;181: 1047-1058.
335
343
WLSLLVPFV(SEQ ID NO: 780)
A2
Nayersina et alJ Immunol 1993;150: 4659-4671.
337
357
SLLVPFVQWFVGLSPTVWLSV(SEQ ID NO: 781)
A2 + DR1
Loirat et al  J Immunol 2000;165: 4748-4755
348
357
GLSPTVWLSV(SEQ ID NO: 782)
A2
Loirat et al  J Immunol 2000;165: 4748-4755
370
379
SILSPFLPLL(SEQ ID NO: 783)
A2
Mizukoshi et al  J Immunol 2004;173: 5863-5871.
Пример 1. Тестирование эффективности in vitro
Проводили прогулку по гену по человеческому транскрипту PD-L1, используя, главным образом, 16-20-мерные гэпмеры. Тестирование эффективности проводили в эксперименте in vitro в моноцитарной линии клеток человеческого лейкоза ТНР1 и в линии клеток человеческой неходжкинской лимфомы K (KARPAS-299).
Линии клеток
2
Линию клеток ТНР1 и Karpas-299 исходно приобретали в Европейской коллекции аутентичных культур клеток (ЕСАСС) и поддерживали, как рекомендовано поставщиком, в увлажненном инкубаторе при 37°С с 5% СО.
Эффективность олигонуклеотидов
4
Клетки ТНР-1 (3×10 в RPMI-Glutamax, 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина (Thermo Fisher Scientific) добавляли к олигонуклеотидам (4-5 мкл) в 96-луночные круглодонные планшеты и культивировали в течение 6 суток в конечном объеме 100 мкл/лунку. Олигонуклеотиды подвергали скринингу в одной единственной концентрации (20 мкМ) и в интервале дозы-концентрациях от 25 мкМ до 0,004 мкМ (разведение 1:3 в воде). Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для клеточной РНК в большом объеме MagNA Pure 96 на системе MagNA Pure 96 System (Roche Diagnostics) согласно инструкциям изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР-ОТ (количественная полимеразная цепная реакция, сопряженная с обратной транскрипцией) с использованием набора TaqMan RNA-to-ct 1-Step (Thermo Fisher Scientific) на приборе QuantStudio (Applied Biosystems) с предварительно сконструированными праймерами Taqman, нацеленными на человеческий PD-L1 и ACTB, используемый в качестве эндогенного контроля (Thermo Fisher Scientific). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 рассчитывали с использованием способа 2(-дельта дельта С(Т)), а процентную долю ингибирования выражали в % по сравнению с контрольным образцом (необработанные клетки).
Клетки Karpas-299 культивировали в RPMI 1640, 2 мМ глутамине и 20% FBS (Sigma). Клетки, посеянные в количестве 10000 клеток/лунку в 96-луночные планшеты, инкубировали в течение 24 часов перед добавлением олигонуклеотидов, растворенных в PBS. Конечная концентрация олигонуклеотидов была в одной дозе 5 мкМ в конечном объеме культуры 100 мкл/лунку, или их добавляли в дозе, варьирующей от 50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ в объеме культуры 100 мкл. Клетки отбирали через 3 суток после добавления олигонуклеотидных соединений, и РНК экстрагировали с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфат) (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием  мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализов PD-L1 (Applied Biosystems; Hs01125299_m1) и TBP (Applied Biosystems; 4325803). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 10 как % от контрольного образца (клетки, обработанные PBS).
Таблица 10: эффективность in vitro соединений против PD-L1 в линиях клеток ТНР1 и KARPAS-299 (среднее из экспериментов с n, равным 3). Уровни мРНК PD-L1 нормировали к ТВР в клетках KARPAS-299 или к АСТВ в клетках ТНР1, и они показаны как % от контроля (клетки, обработанные PBS).
CMP ID NO
Клетки KARPAS-2995 мкМ CMP
Клетки THP120 мкМ CMP
Соединение (CMP)
Начало на SEQ ID NO 1
% мРНК от контроля
sd
% мРНК от контроля
sd
4_1
50
1
32
11
TAattggctctacTGC
236
5_1
25
5
9
6
TCGCataagaatgaCT
371
6_1
29
2
15
5
TGaacacacagtcgCA
382
7_1
27
7
3
1
CTGaacacacagtCGC
383
8_1
23
4
11
3
TCTgaacacacagtCG
384
9_1
32
3
19
6
TTCtgaacacacagTC
385
10_1
57
5
39
16
ACaagtcatgttaCTA
463
11_1
75
5
37
12
ACacaagtcatgttAC
465
12_1
22
2
10
3
CTtacttagatgcTGC
495
13_1
33
4
23
11
ACttacttagatgCTG
496
14_1
33
7
21
6
GACttacttagatgCT
497
15_1
41
6
18
10
AGacttacttagaTGC
498
16_1
96
14
40
7
GCAggaagagactTAC
506
17_1
22
2
9
3
AATAaattccgttCAGG
541
18_1
34
6
21
9
GCAAataaattcCGTT
545
18_2
51
4
27
11
GCAaataaattccGTT
545
19_1
38
5
23
7
AGCAaataaattcCGT
546
20_1
73
8
56
15
CAGAgcaaataaatTCC
548
21_1
83
8
65
10
TGGAcagagcaaataAAT
551
22_1
86
6
80
8
ATGGacagagcaAATA
554
23_1
44
4
30
2
CAgaatggacagaGCA
558
24_1
63
10
40
11
TTCtcagaatggacAG
562
25_1
31
1
39
5
CTGAactttgacATAG
663
26_1
60
4
56
19
AAgacaaacccagacTGA
675
27_1
36
4
34
10
TATAagacaaacccAGAC
678
28_1
40
4
28
13
TTATaagacaaaccCAGA
679
29_1
30
2
18
6
TGTTataagacaaaCCC
682
30_1
77
3
67
10
TAGAacaatggtaCTTT
708
31_1
81
17
20
14
GTAGaacaatggtaCT
710
32_1
29
5
14
8
AGGtagaacaatgGTA
712
33_1
32
1
43
20
AAGAggtagaacaATGG
714
34_1
70
4
35
13
GCatccacagtaaaTT
749
35_1
83
2
66
21
GAaggttatttaaTTC
773
36_1
18
2
15
5
CTAAtcgaatgcaGCA
805
37_1
64
7
35
10
TACccaatctaatCGA
813
38_1
69
1
49
13
TAGttacccaatcTAA
817
39_1
49
5
26
9
CATttagttacccAAT
821
40_1
23
7
8
2
TCAtttagttaccCAA
822
41_1
24
6
12
3
TTcatttagttaCCCA
823
42_1
51
7
40
5
GAATtaatttcattTAGT
829
43_1
71
9
45
3
CAGTgaggaattaATTT
837
44_1
60
5
45
17
CCAAcagtgaggAATT
842
45_1
63
1
37
15
CCCaacagtgaggAAT
843
46_1
31
3
29
12
TAtacccaacagtgAGG
846
47_1
44
3
27
0
TTatacccaacagTGAG
847
48_1
38
3
26
6
TTTatacccaacagTGA
848
49_1
20
4
7
1
CCTttatacccaaCAG
851
50_1
22
3
6
2
TAACctttatacCCAA
854
51_1
28
1
29
16
AATaacctttataCCCA
855
52_1
80
11
48
10
GTAaataacctttaTA
859
53_1
54
4
37
14
ACTGtaaataacctTTAT
860
54_1
81
4
53
15
ATAtatatgcaatgAG
903
55_1
86
12
70
15
AGatatatatgcaaTG
905
56_1
56
8
27
7
GAGatatatatgcAAT
906
57_1
28
7
13
5
CCagagatatataTGC
909
58_1
88
13
69
23
CAATattccagagATAT
915
59_1
29
3
14
6
GCAAtattccagagATA
916
60_1
25
3
14
3
AGCaatattccagaGAT
917
61_1
29
4
17
2
CAGcaatattccAGAG
919
62_1
27
3
14
3
AATCagcaatattCCAG
921
63_1
23
6
12
6
ACAAtcagcaataTTCC
923
64_1
53
9
43
15
ACtaagtagttacactTCT
957
65_1
32
5
14
6
CTAAgtagttacactTC
958
66_1
35
4
31
6
GACtaagtagttacaCTT
959
67_1
64
10
55
14
TGActaagtagtTACA
962
68_1
62
11
57
16
CTTTgactaagtagTTA
964
69_1
42
9
59
13
CTCtttgactaagTAG
967
70_1
81
6
56
12
GCTCtttgactaagTA
968
71_1
27
3
39
9
CCttaaatactgtTGAC
1060
72_1
75
5
36
7
CTtaaatactgttgAC
1060
73_1
35
6
43
13
TCCttaaatactgTTG
1062
74_1
57
4
79
25
TCTCcttaaatactgTT
1063
75_1
53
6
28
6
TAtcatagttctCCTT
1073
76_1
26
4
9
2
AGTatcatagttcTCC
1075
77_1
74
5
39
12
GAgtatcatagttCTC
1076
78_1
49
5
35
6
AGagtatcatagTTCT
1077
78_2
74
6
36
8
AGAgtatcatagtTCT
1077
79_1
19
2
19
13
CAGagtatcatagTTC
1078
80_1
23
2
26
2
TTCAgagtatcataGT
1080
81_1
35
3
36
11
CTTcagagtatcATAG
1081
82_1
24
6
20
7
TTCTtcagagtatcaTA
1082
83_1
20
2
16
2
TTTcttcagagtaTCAT
1083
84_1
33
4
37
10
GAGAaaggctaagTTT
1099
85_1
42
2
35
18
GAcactcttgtaCATT
1213
86_1
50
4
54
8
TGagacactcttgtaCA
1215
87_1
50
8
28
8
TGagacactcttgTAC
1216
88_1
61
4
33
6
CTttattaaactCCAT
1266
89_1
71
8
43
12
ACCAaactttattaAA
1272
90_1
62
5
42
9
AAACctctactaagTG
1288
91_1
22
3
12
5
AGattaagacagtTGA
1310
92_1
46
3
ND - не определяется
ND
AAgtaggagcaagaGGC
1475
93_1
42
4
60
24
AAAGtaggagcaagAGG
1476
94_1
86
15
46
10
GTtaagcagccaggAG
1806
95_1
66
6
82
27
AGggtaggatgggtAG
1842
96_1
83
19
62
36
AAGggtaggatgggTA
1843
97_1
60
9
69
5
CAAgggtaggatggGT
1844
97_2
76
13
34
7
CAagggtaggatggGT
1844
98_1
65
8
76
28
CCaagggtaggatgGG
1845
99_1
61
2
75
17
TCcaagggtaggatGG
1846
100_1
83
4
82
13
CTTCcaagggtaggAT
1848
101_1
45
3
52
14
ATCttccaagggtagGA
1849
102_1
29
2
17
7
AGaagtgatggctCATT
1936
103_1
26
3
22
1
AAGaagtgatggcTCAT
1937
104_1
34
6
22
2
GAAgaagtgatggcTCA
1938
105_1
41
5
21
5
ATGAaatgtaaacTGGG
1955
106_1
40
8
29
6
CAATgaaatgtaaaCTGG
1956
107_1
24
3
16
4
GCAAtgaaatgtaaACTG
1957
108_1
30
4
20
6
AGCAatgaaatgtaAACT
1958
109_1
44
4
34
14
GAGCaatgaaatgtAAAC
1959
110_1
18
1
13
3
TGaattcccatatcCGA
1992
111_1
69
8
35
8
AGaattatgaccaTAT
2010
112_1
77
7
38
10
AGGtaagaattatGACC
2014
113_1
97
10
56
13
TCAGgtaagaattaTGAC
2015
114_1
69
8
54
21
CTTCaggtaagaatTATG
2017
115_1
91
7
115
42
TCTTcaggtaagaATTA
2019
116_1
88
6
104
36
CTTCttcaggtaaGAAT
2021
117_1
85
6
118
17
TCTTcttcaggtaaGAA
2022
118_1
105
14
102
9
TCTtcttcaggtaAGA
2023
119_1
37
2
76
18
TGGtctaagagaaGAAG
2046
120_1
46
6
81
11
GTTGgtctaagagAAG
2049
121_1
74
11
64
4
AGTtggtctaagAGAA
2050
122_1
74
9
55
21
CAgttggtctaagAGAA
2050
123_1
65
9
95
21
GCAgttggtctaagagAA
2050
124_1
63
7
ND
ND
CAGTtggtctaagaGA
2051
125_1
65
6
ND
ND
GCagttggtctaagaGA
2051
126_1
67
14
104
34
GCagttggtctaaGAG
2052
127_1
22
6
10
3
CTcatatcagggCAGT
2063
128_1
50
4
46
9
CACAcatgttctttaAC
2087
129_1
22
4
12
12
TAAatacacacatgTTCT
2092
130_1
24
2
43
28
GTAAatacacacatgTTC
2093
131_1
33
3
20
12
TGTAaatacacacaTGTT
2094
132_1
73
17
57
21
GATCatgtaaatacACAC
2099
133_1
47
5
28
14
AGATcatgtaaataCACA
2100
134_1
35
6
26
11
CAAAgatcatgtaaatACAC
2101
135_1
30
2
14
3
ACAAagatcatgtaaaTACA
2102
136_1
52
6
24
18
GAATacaaagatcaTGTA
2108
137_1
33
5
20
6
AGAAtacaaagatcATGT
2109
138_1
37
1
22
15
CAGAatacaaagatCATG
2110
139_1
85
6
53
8
GCAGaatacaaagATCA
2112
140_1
79
4
40
6
AGGCagaatacaaagAT
2114
141_1
56
2
53
20
AAGGcagaatacaaAGA
2115
142_1
28
5
20
5
ATTagtgagggacGAA
2132
143_1
26
2
22
10
CAttagtgagggaCGA
2133
144_1
29
6
16
4
GAgggtgatggatTAG
2218
145_1
45
6
22
5
TTaggagtaataAAGG
2241
146_1
65
7
44
9
TTAatgaatttggtTG
2263
147_1
84
8
43
10
CTttaatgaatttgGT
2265
148_1
32
0
15
3
CATGgattacaactAA
2322
149_1
33
2
20
4
TCatggattacaaCTA
2323
150_1
29
1
11
3
GTCatggattacaaCT
2324
151_1
64
2
40
9
CAttaaatctagTCAT
2335
152_1
97
8
63
22
GACAttaaatctagTCA
2336
153_1
92
7
ND
ND
AGGGacattaaatcTA
2340
154_1
35
4
25
15
CAAAgcattataaCCA
2372
155_1
34
3
24
6
ACttactaggcaGAAG
2415
156_1
102
6
113
18
CAGAgttaactgtaCA
2545
157_1
102
10
103
15
CCAGagttaactgtAC
2546
158_1
88
7
95
18
GCcagagttaactgTA
2547
159_1
78
10
ND
ND
TGggccagagttaaCT
2550
160_1
59
5
26
5
CAgcatctatcagaCT
2576
161_1
78
8
42
10
TGAaataacatgagTCAT
2711
162_1
31
6
ND
ND
GTGaaataacatgAGTC
2713
163_1
18
2
11
3
TCTGtttatgtcacTG
2781
164_1
56
5
29
9
GTCTgtttatgtcaCT
2782
165_1
37
8
12
5
TGgtctgtttatGTCA
2784
166_1
39
1
19
3
TTGGtctgtttatgTC
2785
167_1
41
3
35
14
TCacccattgtttaAA
2842
168_1
18
3
14
4
TTcagcaaatatTCGT
2995
169_1
36
8
13
2
GTGtgttcagcaaATAT
2999
170_1
18
2
11
4
TCTattgttaggtATC
3053
171_1
67
4
26
12
ATtgcccatcttacTG
3118
172_1
71
2
33
9
TATtgcccatcttaCT
3119
173_1
47
4
20
5
AAatattgcccatCTT
3122
174_1
74
4
34
7
ATAaccttatcataCA
3174
175_1
98
19
44
12
TAtaaccttatcaTAC
3175
176_1
100
10
64
11
TTAtaaccttatcaTA
3176
177_1
72
38
28
5
TTTataaccttatCAT
3177
178_1
47
6
34
6
ACtgctattgctaTCT
3375
179_1
41
3
23
6
AGgactgctattgCTA
3378
180_1
32
6
27
7
GAGgactgctattgCT
3379
181_1
83
1
46
20
ACgtagaataataaCA
3561
182_1
94
4
52
9
CCaagtgatataATGG
3613
183_1
49
2
16
3
TTagcagaccaaGTGA
3621
184_1
96
3
26
5
GTttagcagaccaaGT
3623
185_1
78
3
46
10
TGacagtgattataTT
3856
186_1
88
5
45
21
TGTCcaagatattgAC
3868
187_1
46
6
23
6
GAAtatcctagatTGT
4066
188_1
79
3
45
14
CAaactgagaataTCC
4074
189_1
63
5
27
8
GCAaactgagaataTC
4075
190_1
77
9
37
11
TCCtattacaatcgTA
4214
191_1
74
10
36
9
TTCCtattacaatcGT
4215
192_1
91
8
51
28
ACtaatgggaggatTT
4256
193_1
95
14
67
24
TAgttcagagaataAG
4429
194_1
86
5
47
16
TAacatatagttcAGA
4436
195_1
87
4
81
20
ATAacatatagttcAG
4437
196_1
101
6
67
20
CAtaacatatagttCA
4438
197_1
91
6
60
13
TCataacatatagtTC
4439
198_1
61
3
31
10
TAGCtcctaacaatCA
4507
199_1
79
12
49
11
CTCCaatctttgtaTA
4602
200_1
74
2
58
13
TCTCcaatctttgtAT
4603
201_1
53
3
33
10
TCtatttcagccaaTC
4708
202_1
25
4
30
9
CGGaagtcagagtGAA
4782
203_1
32
5
21
7
TTAAgcatgaggaaTA
4798
204_1
34
10
26
11
TGAttgagcacctCTT
4831
205_1
81
12
62
12
GACtaattatttcgTT
4857
206_1
57
7
37
7
TGActaattatttCGT
4858
207_1
26
5
21
6
GTGactaattattTCG
4859
208_1
48
3
33
13
CTGCttgaaatgtgAC
4870
209_1
32
1
34
13
CCtgcttgaaatgTGA
4871
210_1
60
5
50
19
ATcctgcttgaaATGT
4873
211_1
111
8
110
26
ATTataaatctatTCT
5027
212_1
107
1
67
12
GCtaaatactttcATC
5151
213_1
26
3
19
6
CAttgtaacataCCTA
5251
214_1
33
2
20
4
GCattgtaacatacCT
5252
215_1
89
8
53
16
TAatattgcaccaaAT
5295
216_1
25
2
29
9
GAtaatattgcacCAA
5297
217_1
27
1
27
6
AGataatattgcacCA
5298
218_1
79
6
45
11
GCcaagaagataATAT
5305
219_1
159
16
68
14
CACAgccacataaaCT
5406
220_1
90
2
72
12
TTgtaattgtggaaAC
5463
221_1
10
2
11
5
TGacttgtaattgTGG
5467
222_1
82
1
67
18
TCtaactgaaatagTC
5503
223_1
30
1
32
9
GTGgttctaactgaAA
5508
224_1
53
7
53
15
CAatatgggacttgGT
5522
225_1
44
1
33
10
ATGacaatatgggaCT
5526
226_1
49
1
41
14
TATGacaatatgggAC
5527
227_1
77
1
54
15
ATATgacaatatggGA
5528
228_1
100
3
98
29
CTtcacttaataaTTA
5552
229_1
90
12
80
19
CTGCttcacttaatAA
5555
230_1
91
0
79
23
AAgactgcttcacTTA
5559
231_1
49
8
77
34
GAATgccctaattaTG
5589
232_1
17
7
88
33
TGGaatgccctaatTA
5591
233_1
40
5
35
10
GCAaatgccagtagGT
5642
234_1
81
6
72
25
CTAatggaaggattTG
5673
235_1
97
17
87
25
AAtatagaacctaaTG
5683
236_1
98
4
83
21
GAAagaatagaatGTT
5769
237_1
93
2
102
26
ATGggtaatagattAT
5893
238_1
110
24
44
14
GAaagagcacagggTG
6103
239_1
66
5
36
10
CTACatagagggaaTG
6202
240_1
70
4
34
8
GCttcctacataGAGG
6207
241_1
64
NA - не анализировали
33
6
TGCTtcctacatagAG
6208
242_1
30
NA
19
7
TGggcttgaaataTGT
6417
243_1
88
6
69
15
CATtatatttaagaAC
6457
244_1
8
2
5
2
TCggttatgttaTCAT
6470
245_1
18
9
12
4
CActttatctggTCGG
6482
246_1
37
2
19
5
AAAttggcacagcGTT
6505
247_1
46
12
29
8
ACCGtgacagtaaATG
6577
248_1
31
2
25
2
TGggaaccgtgacagTA
6581
249_1
17
2
23
9
CCacatataggtcCTT
6597
250_1
15
6
23
7
CAtattgctaccaTAC
6617
251_1
4
2
9
2
TCAtattgctaccATA
6618
252_1
65
12
85
14
CAATtgtcatatTGCT
6624
253_1
20
2
51
7
CATtcaattgtcataTTG
6626
254_1
48
8
91
41
TTTCtactgggaaTTTG
6644
255_1
11
5
23
8
CAAttagtgcagcCAG
6672
256_1
43
7
62
13
GAATaatgttcttaTCC
6704
257_1
28
2
36
19
CACAaattgaataatgtTCT
6709
258_1
64
4
78
22
CATGcacaaattgaaTAAT
6714
259_1
53
8
104
73
ATCctgcaatttcaCAT
6832
260_1
54
5
59
14
CCaccatagctgatCA
6868
261_1
42
8
52
22
ACcaccatagctgaTCA
6868
262_1
68
5
118
66
CAccaccatagctgaTC
6869
263_1
40
2
73
20
TAgtcggcaccaccAT
6877
264_1
64
6
72
35
CttgtagtcggcaccAC
6880
265_1
56
4
82
35
CttgtagtcggcacCA
6881
266_1
41
5
46
21
CGcttgtagtcggcAC
6883
267_1
51
4
33
14
TCAataaagatcagGC
6942
268_1
61
2
49
10
TGgacttacaagaaTG
6986
269_1
45
7
40
9
ATGgacttacaagaAT
6987
270_1
51
12
36
12
GCTCaagaaattggAT
7073
271_1
17
0
14
5
TACTgtagaacatgGC
7133
272_1
15
3
11
3
GCAAttcatttgaTCT
7239
273_1
64
11
ND
ND
TGaagggaggagggacAC
7259
274_1
52
6
50
28
AGtggtgaagggaggAG
7265
275_1
79
7
ND
ND
TAgtggtgaagggaggAG
7265
276_1
81
6
ND
ND
AtagtggtgaagggaggAG
7265
277_1
70
9
ND
ND
TAgtggtgaagggagGA
7266
278_1
84
9
ND
ND
ATagtggtgaagggagGA
7266
279_1
40
6
64
53
TAGtggtgaagggaGG
7267
280_1
42
10
ND
ND
ATAgtggtgaagggaGG
7267
281_1
63
7
ND
ND
GAtagtggtgaagggaGG
7267
282_1
27
7
38
11
ATAGtggtgaagggAG
7268
283_1
60
22
ND
ND
GAtagtggtgaaggGAG
7268
284_1
23
3
97
54
GAgatagtggtgAAGG
7271
285_1
51
6
72
19
CATGggagatagtgGT
7276
286_1
7
1
21
9
ACAAataatggttaCTCT
7302
287_1
66
8
48
20
ACACacaaataatgGTTA
7306
288_1
67
6
58
20
GAGggacacacaaaTAAT
7311
289_1
46
2
50
21
ATATagagaggcTCAA
7390
290_1
22
6
ND
ND
TTgatatagagaGGCT
7393
291_1
11
2
17
3
GCATttgatatagAGA
7397
292_1
70
18
44
8
TTtgcatttgataTAG
7400
293_1
30
1
30
9
CTGgaagaataggtTC
7512
294_1
53
5
42
10
ACTGgaagaataggTT
7513
295_1
56
2
41
15
TACTggaagaatagGT
7514
296_1
80
8
53
13
TGGCttatcctgtaCT
7526
297_1
73
6
52
14
ATggcttatcctGTAC
7527
298_1
75
7
89
25
TATGgcttatcctgTA
7528
299_1
52
5
50
11
GTAtggcttatccTGT
7529
300_1
27
3
31
6
ATgaatatatgccCAGT
7547
301_1
41
8
33
9
GAtgaatatatgCCCA
7549
302_1
8
2
ND
ND
CAAgatgaatataTGCC
7551
303_1
32
5
37
14
GACAacatcagtaTAGA
7572
304_1
28
5
30
23
CAAGacaacatcAGTA
7576
305_1
47
5
41
9
CACtcctagttccTTT
7601
306_1
39
6
33
7
AACactcctagttCCT
7603
307_1
68
3
42
14
TAacactcctagtTCC
7604
308_1
115
5
69
22
CTaacactcctagtTC
7605
309_1
97
16
57
14
TGataacataactgTG
7637
310_1
36
1
23
10
CTgataacataaCTGT
7638
311_1
38
5
24
5
TTTGaactcaagtgAC
7654
312_1
42
3
39
5
TCCTttacttagcTAG
7684
313_1
15
2
14
3
GAgtttggattagCTG
7764
314_1
49
28
ND
ND
TGggatatgacagGGA
7838
315_1
34
6
ND
ND
TGTGggatatgacaGG
7840
316_1
47
3
37
8
ATATggaagggataTC
7875
317_1
11
3
ND
ND
ACAggatatggaaGGG
7880
318_1
48
4
ND
ND
ATTTcaacaggatATGG
7885
319_1
18
2
16
4
GAgtaatttcaacAGG
7891
320_1
74
6
44
5
AGGGagtaatttcAACA
7893
321_1
38
5
56
28
ATTAgggagtaatTTCA
7896
322_1
66
9
32
11
CTtactattaggGAGT
7903
323_1
13
1
15
5
CAgcttactattaGGG
7906
324_1
26
4
20
9
TCAgcttactattAGG
7907
325_1
43
4
17
2
ATTtcagcttactaTTAG
7908
326_1
54
5
57
16
TTcagcttactaTTAG
7908
327_1
28
3
8
2
CAGAtttcagcttaCT
7913
328_1
43
4
37
16
GACtacaactagagGG
7930
329_1
45
12
36
10
AGACtacaactagaGG
7931
330_1
99
8
94
32
AAgactacaactagAG
7932
331_1
59
4
52
19
ATGAtttaattctagtCAAA
7982
332_1
100
2
84
23
TTTaattctagtcAAA
7982
333_1
91
9
60
19
GATTtaattctaGTCA
7984
771_1
74
6
50
5
TGAtttaattctaGTCA
7984
334_1
73
5
54
12
ATGAtttaattctagTCA
7984
335_1
15
1
26
3
GATGatttaattctagtCA
7984
336_1
71
22
49
16
GAtttaattctaGTCA
7984
337_1
43
5
30
11
GATGatttaattctaGTC
7985
338_1
98
5
90
27
TGatttaattctagTC
7985
339_1
87
21
86
2
GAGAtgatttaatTCTA
7988
340_1
92
5
85
27
GAGatgatttaatTCT
7989
341_1
7
1
7
1
CAGAttgatggtagTT
8030
342_1
7
2
24
11
CTcagattgatgGTAG
8032
343_1
3
1
14
9
GTTagccctcagaTTG
8039
344_1
14
5
20
7
TGtattgttagcCCTC
8045
345_1
10
2
11
5
ACttgtattgttAGCC
8048
346_1
52
4
52
17
AGCcagtatcagggAC
8191
347_1
33
3
18
8
TTgacaatagtgGCAT
8213
348_1
7
2
13
5
ACAagtggtatctTCT
8228
349_1
63
8
44
15
AATCtactttacaaGT
8238
350_1
36
2
ND
ND
CAcagtagatgcctGATA
8351
351_1
24
2
30
9
GAacacagtagatGCC
8356
352_1
23
4
103
14
CTTGgaacacagtagAT
8359
353_1
20
2
45
2
ATAtcttggaacaCAG
8364
354_1
25
3
24
6
TCTttaatatcttgGAAC
8368
355_1
39
2
41
10
TGatttctttaatatCTTG
8372
356_1
54
5
88
43
TGatgatttctttaaTATC
8375
357_1
31
4
45
27
AGGctaagtcatgaTG
8389
358_1
18
3
43
20
TTGAtgaggctaagTC
8395
359_1
6
2
11
2
CCAggattatactcTT
8439
360_1
43
5
40
14
GCcaggattataCTCT
8440
361_1
56
8
73
13
CTGccaggattataCT
8442
362_1
23
1
33
7
CAGAaacttatactttaTG
8473
363_1
49
8
45
14
AAGCagaaacttaTACT
8478
364_1
39
6
37
4
GAAgcagaaacttaTACT
8478
365_1
26
4
45
13
TGGaagcagaaacttataCT
8478
366_1
21
4
44
5
TGGaagcagaaacttaTAC
8479
367_1
97
4
70
22
AAgcagaaacttaTAC
8479
368_1
34
3
32
11
TGGaagcagaaactTATA
8480
369_1
71
7
46
19
AAGGgatattatggAG
8587
370_1
51
9
79
38
TGccggaagatttcCT
8641
371_1
45
6
52
25
ATGGattgggagtaGA
8772
372_1
27
7
30
8
AGatggattgggagTA
8774
373_1
13
3
28
6
AAGatggattgggaGT
8775
374_1
42
10
44
11
ACaagatggattGGGA
8777
374_2
41
3
45
14
ACaagatggattggGA
8777
375_1
83
9
88
32
AGAaggttcagaCTTT
8835
376_1
40
5
33
3
GCAgaaggttcagaCT
8837
376_2
28
5
20
4
GCagaaggttcagACT
8837
377_1
70
2
43
8
TGCAgaaggttcagAC
8838
378_1
23
3
55
17
AGtgcagaaggttCAG
8840
378_2
51
6
41
8
AGTGcagaaggttcAG
8840
379_1
34
6
35
7
AAGTgcagaaggttCA
8841
380_1
44
11
24
6
TAagtgcagaagGTTC
8842
381_1
37
5
45
9
TCtaagtgcagaAGGT
8844
382_1
75
5
147
26
CTCaggagttctactTC
8948
383_1
90
10
141
55
CTCaggagttctaCTT
8949
384_1
73
8
234
116
AtggaggtgactcaggAG
8957
385_1
33
4
42
7
ATggaggtgactcagGA
8958
386_1
24
3
29
14
ATggaggtgactcAGG
8959
387_1
37
2
65
15
TAtggaggtgactcAGG
8959
388_1
50
10
81
19
ATatggaggtgactcaGG
8959
389_1
42
5
61
10
TATGgaggtgactcAG
8960
390_1
36
2
76
50
ATatggaggtgacTCAG
8960
391_1
52
6
64
6
CAtatggaggtgactcAG
8960
392_1
63
5
57
6
ATAtggaggtgacTCA
8961
393_1
53
7
64
12
CAtatggaggtgacTCA
8961
394_1
51
5
56
24
CAtatggaggtgACTC
8962
395_1
23
3
41
34
GCatatggaggtgacTC
8962
396_1
34
3
54
10
TGcatatggaggtgacTC
8962
397_1
54
5
71
24
TtgcatatggaggtgacTC
8962
398_1
61
11
59
13
TttgcatatggaggtgacTC
8962
399_1
25
2
30
6
GCatatggaggtgaCT
8963
400_1
34
4
25
9
TGcatatggaggtgaCT
8963
401_1
25
4
31
20
TTGcatatggaggtgaCT
8963
402_1
51
6
37
11
TttgcatatggaggtgaCT
8963
403_1
26
1
33
5
TGCatatggaggtgAC
8964
404_1
25
2
69
19
TTGcatatggaggtGAC
8964
405_1
26
4
24
4
TTTGcatatggaggtgAC
8964
406_1
19
3
20
7
TTTGcatatggaggtGA
8965
407_1
16
5
46
16
TTtgcatatggaGGTG
8966
408_1
9
2
9
6
AAgtgaagttcaaCAGC
8997
409_1
26
8
109
52
TGggaagtgaagTTCA
9002
410_1
31
5
24
5
ATgggaagtgaagTTC
9003
411_1
49
9
19
10
GATGggaagtgaaGTT
9004
412_1
28
10
17
9
CTGtgatgggaagtGAA
9007
413_1
54
4
34
8
ATTgagtgaatccAAA
9119
414_1
11
1
14
2
AAttgagtgaatCCAA
9120
415_1
58
6
14
2
GATAattgagtgaaTCC
9122
416_1
5
1
16
3
GTGataattgagtGAA
9125
417_1
73
5
61
14
AAGaaaggtgcaaTAA
9155
418_1
86
6
64
13
CAagaaaggtgcAATA
9156
419_1
75
19
64
14
ACAAgaaaggtgcaAT
9157
420_1
75
8
50
13
ATttaaactcacaaAC
9171
421_1
21
8
23
6
CTgttaggttcaGCGA
9235
422_1
54
10
30
5
TCTGaatgaacatTTCG
9260
423_1
11
4
15
5
CTcattgaaggtTCTG
9281
424_1
87
3
52
8
CTAatctcattgaaGG
9286
425_1
95
1
85
13
CCtaatctcattgaAG
9287
426_1
31
7
22
7
ACTttgatctttcAGC
9305
427_1
64
7
49
16
ACtatgcaacacttTG
9315
428_1
18
6
21
3
CAAatagctttatCGG
9335
429_1
19
6
17
4
CCaaatagctttATCG
9336
430_1
35
4
27
8
TCCAaatagctttaTC
9337
431_1
75
8
43
7
GATCcaaatagcttTA
9339
432_1
67
11
32
8
ATgatccaaataGCTT
9341
433_1
53
5
43
6
TATGatccaaatagCT
9342
434_1
97
9
66
29
TAAAcagggctggGAAT
9408
435_1
58
12
44
17
ACttaaacagggCTGG
9412
436_1
58
10
30
12
ACacttaaacagGGCT
9414
437_1
87
38
41
3
GAACacttaaacAGGG
9416
438_1
70
4
59
33
AGAGaacacttaaACAG
9418
439_1
83
17
28
9
CTACagagaacaCTTA
9423
440_1
49
12
27
4
ATGctacagagaaCACT
9425
441_1
53
10
24
13
ATAAatgctacagagAACA
9427
442_1
23
6
20
10
AGataaatgctacaGAGA
9430
443_1
48
6
27
7
TAGAgataaatgcTACA
9434
444_1
51
3
32
8
TAGAtagagataaatGCT
9437
445_1
38
5
ND
ND
CAATatactagataGAGA
9445
446_1
52
3
31
1
TACAcaatatactagATAG
9448
447_1
65
6
48
11
CTAcacaatatacTAG
9452
448_1
67
9
29
2
GCTAcacaatatACTA
9453
449_1
103
17
65
15
ATATgctacacaatATAC
9455
450_1
71
13
129
22
TGATatgctacaCAAT
9459
451_1
19
4
9
1
ATGAtatgatatgCTAC
9464
452_1
75
10
45
21
GAGGagagagacaaTAAA
9495
453_1
68
6
43
10
CTAggaggagagagACA
9500
454_1
72
7
79
25
TATTctaggaggagAGA
9504
455_1
31
3
29
9
TTATattctaggagGAG
9507
456_1
38
5
62
17
GTTtatattctaGGAG
9510
457_1
15
6
15
8
TGgagtttatattcTAGG
9512
458_1
34
3
21
3
CGtaccaccactcTGC
9590
459_1
41
5
55
22
TGAGgaaatcattcATTC
9641
460_1
81
8
47
22
TTTGaggaaatcatTCAT
9643
461_1
76
8
39
5
AGGCtaatcctattTG
9657
462_1
93
12
216
12
TTTAggctaatcCTAT
9660
463_1
15
6
30
9
TGCtccagtgtaccCT
9755
464_1
27
3
25
6
TAgtagtactcgATAG
9813
465_1
9
2
7
3
CTAattgtagtagtaCTC
9818
466_1
52
3
32
6
TGctaattgtagTAGT
9822
467_1
68
11
36
16
AGTGctaattgtagTA
9824
468_1
35
6
32
3
GCAAgtgctaattgTA
9827
469_1
91
9
ND
ND
GAGGaaatgaactaattTA
9881
470_1
92
5
ND
ND
CAGGaggaaatgaacTA
9886
471_1
67
5
42
6
CCctagagtcattTCC
9902
472_1
35
5
20
8
ATCttacatgatgaAGC
9925
473_1
13
1
20
5
GACacactcagatttcAG
9967
474_1
24
4
20
2
AGacacactcagatttcAG
9967
475_1
25
4
24
7
AAGacacactcagatttcAG
9967
476_1
26
6
19
4
AGacacactcagattTCA
9968
477_1
28
4
32
13
AAGacacactcagattTCA
9968
478_1
31
8
37
6
AAagacacactcagatTTCA
9968
479_1
63
7
51
26
GAAagacacactcagatTTC
9969
480_1
37
10
ND
ND
AAGAcacactcagatTTC
9969
481_1
41
4
ND
ND
AAAGacacactcagaTTTC
9969
482_1
19
5
48
14
TGAAagacacactcagatTT
9970
483_1
60
8
68
10
TGaaagacacactcaGATT
9971
484_1
42
8
63
22
TGAaagacacactcaGAT
9972
485_1
48
9
41
20
ATTGaaagacacacTCA
9975
486_1
27
6
27
12
TCattgaaagacaCACT
9977
487_1
88
13
121
33
TTCcatcattgaAAGA
9983
488_1
80
12
ND
ND
ATAAtaccacttaTCAT
10010
489_1
13
4
27
15
TTacttaatttcttTGGA
10055
490_1
32
5
60
24
TTAgaactagctttaTCA
10101
491_1
58
10
55
17
GAGgtacaaatatAGG
10171
492_1
4
1
12
3
CTTatgatacaacTTA
10384
493_1
37
6
35
5
TCttatgatacaaCTT
10385
494_1
30
0
27
6
TTCttatgatacaaCT
10386
495_1
27
8
18
3
CAgtttcttatgaTAC
10390
496_1
25
10
25
6
GCAgtttcttatgaTA
10391
497_1
77
6
72
29
TACAaatgtctattagGTT
10457
498_1
66
5
69
17
TGTAcaaatgtctatTAG
10460
499_1
27
10
20
4
AGCatcacaattagTA
10535
500_1
31
10
25
5
CTAatgatagtgaaGC
10548
501_1
21
7
30
8
AGCtaatgatagtgAA
10550
502_1
35
5
39
8
ATGCcttgacatatTA
10565
503_1
64
11
79
26
CTCAagattattgACAC
10623
504_2
25
4
83
32
ACctcaagattaTTGA
10626
504_1
94
7
22
6
ACCtcaagattaTTGA
10626
505_1
31
6
34
10
AACCtcaagattatTG
10627
506_1
55
6
62
17
CACAaacctcaagattaTT
10628
507_1
66
12
40
4
GTActtaattagACCT
10667
508_1
78
5
80
10
AGTActtaattagACC
10668
509_1
36
5
42
15
GTATgaggtggtaaAC
10688
510_1
40
4
48
22
AGgaaacagcagaAGTG
10723
511_1
27
7
13
6
GCacaacccagaggAA
10735
512_1
54
5
ND
ND
CAAgcacaacccagAG
10738
513_1
35
7
ND
ND
TTCaagcacaaccCAG
10740
514_1
49
6
52
15
AAttcaagcacaACCC
10742
515_1
72
4
106
49
TAATaattcaagcacaaCC
10743
516_1
43
4
57
21
ACTAataattcaaGCAC
10747
517_1
37
3
60
12
ATAAtactaataattcAAGC
10749
518_1
9
3
6
1
TAgatttgtgagGTAA
11055
519_1
59
10
31
5
AGCCttaattctccAT
11091
520_1
41
4
34
9
AATGatctagagcCTTA
11100
521_1
34
6
34
7
CTAatgatctagaGCC
11103
522_1
52
6
52
17
ACTaatgatctaGAGC
11104
523_1
60
4
54
10
CATtaacatgttctTATT
11165
524_1
57
4
55
8
ACAAgtacattaacatGTTC
11170
525_1
53
6
44
5
TTACaagtacattaaCATG
11173
526_1
54
11
49
17
GCTTtattcatgtTTAT
11195
527_1
34
7
17
5
GCTttattcatgttTA
11196
528_1
11
2
21
4
AGAgctttattcatgtTT
11197
529_1
22
4
33
7
ATAAgagctttattCATG
11200
530_1
30
5
32
15
CATAagagctttaTTCA
11202
531_1
77
8
24
4
AGCAtaagagctTTAT
11205
532_1
8
3
15
6
TAGattgtttagtGCA
11228
533_1
4
2
10
2
GTagattgtttaGTGC
11229
534_1
41
6
33
11
GACAattctagtaGATT
11238
535_1
50
1
37
7
CTGacaattctaGTAG
11241
536_1
49
7
36
6
GCTGacaattctagTA
11242
537_1
59
2
42
11
AGgattaagatacgTA
11262
538_1
28
11
28
4
CAggattaagataCGT
11263
539_1
96
5
20
6
TCAggattaagataCG
11264
540_1
70
11
59
11
TTcaggattaagATAC
11265
541_1
53
5
28
4
AGGAagaaagtttgATTC
11308
542_1
92
13
59
12
TCAAggaagaaagtTTGA
11311
543_1
44
3
67
7
CTCAaggaagaaagTTTG
11312
544_1
43
4
32
4
TGCtcaaggaagaAAGT
11315
545_1
41
7
44
20
AATTatgctcaaggaAGA
11319
546_1
11
4
26
8
TAGGataccacattatGA
11389
547_1
25
4
26
12
CAtaatttattccattcCTC
11449
548_1
64
6
ND
ND
TGCAtaatttattcCAT
11454
549_1
48
17
49
7
ACTGcataatttatTCC
11456
550_1
91
10
92
15
CTAAactgcataattTATT
11458
551_1
85
8
38
9
ATaactaaactgCATA
11465
552_1
86
4
ND
ND
TTAttaataactaaaCTGC
11468
553_1
91
13
92
21
TAGTacattattaataaCT
11475
554_1
50
4
37
7
CATAactaaggacgTT
11493
555_1
41
5
30
7
TCataactaaggaCGT
11494
556_1
80
7
55
13
CGTCataactaaggAC
11496
557_1
86
3
59
11
TCgtcataactaagGA
11497
558_1
51
9
33
12
ATcgtcataactAAGG
11498
559_1
91
6
65
26
GTtagtatcttacATT
11525
560_1
30
3
41
8
CTCtattgttagtATC
11532
561_1
59
8
18
6
AGTatagagttacTGT
11567
562_1
65
11
41
11
TTCCtggtgatactTT
11644
563_1
57
13
45
13
GTTCctggtgatacTT
11645
564_1
57
15
30
7
TGttcctggtgataCT
11646
565_1
17
4
35
4
ATaaacatgaatctCTCC
11801
566_1
16
3
30
4
CTTtataaacatgaaTCTC
11804
567_1
60
5
45
11
CTGtctttataaaCATG
11810
568_1
20
2
19
5
TTgttataaatctgTCTT
11820
569_1
68
9
44
4
TTAaatttattcttgGATA
11849
570_1
76
8
48
12
CTtaaatttattctTGGA
11851
571_1
62
5
66
5
CTTCttaaatttattctTG
11853
572_1
28
4
44
10
TATGtttctcagtAAAG
11877
573_1
29
6
36
11
GAAttatctttaaACCA
11947
574_1
74
6
34
7
CCCttaaatttctaCA
11980
575_1
37
8
30
9
ACACtgctcttgtaCC
11995
576_1
45
14
27
6
TGAcaacactgctCTT
12000
577_1
2
1
12
5
TACAtttattgggcTC
12081
578_1
65
14
39
9
GTacatttattgGGCT
12082
579_1
34
4
53
12
TTGgtacatttatTGG
12085
580_1
41
7
35
6
CATGttggtacattTAT
12088
581_1
11
4
12
5
AATCatgttggtacAT
12092
582_1
96
16
48
9
AAatcatgttggtaCA
12093
583_1
71
15
42
13
GACaagtttggattAA
12132
584_1
46
34
39
6
AAtgttcagatgCCTC
12197
585_1
37
26
28
12
GCttaatgttcagaTG
12201
586_1
75
8
43
12
CGTAcatagcttgaTG
12267
587_1
41
10
28
5
GTGaggaattaggaTA
12753
588_1
41
5
27
9
GTAacaatatggttTG
12780
589_1
67
10
37
7
GAaatattgtagaCTA
13151
590_1
97
10
80
12
TTGaaatattgtagAC
13153
591_1
64
10
47
9
AAgtctagtaatTTGC
13217
592_1
84
7
60
9
GCTCagtagattatAA
13259
593_1
42
8
32
9
CATacactgttgcTAA
13296
594_1
101
6
79
17
ATGgtctcaaatcATT
13314
595_1
53
14
46
7
CAATggtctcaaatCA
13316
596_1
47
6
36
6
TTCCtattgattgaCT
13568
597_1
97
12
41
6
TTTCtgttcacaacAC
13600
598_1
85
1
49
11
AGgaacccactaaTCT
13702
599_1
56
3
34
7
TAAatggcaggaacCC
13710
600_1
15
4
24
8
GTAAatggcaggaaCC
13711
601_1
40
6
26
8
TTgtaaatggcagGAA
13713
602_1
59
12
26
6
TTatgagttaggCATG
13835
603_1
62
2
42
10
CCAggtgaaactttAA
13935
604_1
77
9
55
18
CCCttagtcagctCCT
13997
605_1
82
13
42
11
ACccttagtcagCTCC
13998
606_1
74
1
39
10
CAcccttagtcagCTC
13999
607_1
76
9
30
8
TCTcttactaggcTCC
14091
608_1
82
5
50
13
CCtatctgtcatcATG
14178
609_1
82
1
48
12
TCCtatctgtcatcAT
14179
610_1
41
6
50
13
GAGaagtgtgagaaGC
14808
611_1
70
5
84
19
CATCcttgaagtttAG
14908
612_1
64
14
61
16
TAAtaagatggctCCC
15046
613_1
85
2
51
14
CAAggcataataagAT
15053
614_1
47
1
35
10
CCaaggcataatAAGA
15054
615_1
74
8
53
11
TGatccaattctcaCC
15151
616_1
63
4
41
11
ATGatccaattctCAC
15152
617_1
46
7
42
9
CGCttcatcttcacCC
15260
618_1
104
4
15
4
TAtgacactgcaTCTT
15317
619_1
8
3
8
5
GTAtgacactgcaTCT
15318
620_1
21
3
27
10
TGtatgacactgCATC
15319
621_1
37
7
38
11
TTCTcttctgtaagTC
15363
622_1
49
7
36
11
TTctacagaggaACTA
15467
623_1
47
1
32
10
ACTacagttctacAGA
15474
624_1
78
8
69
6
TTCCcacaggtaaaTG
15561
625_1
70
7
ND
ND
ATTAtttgaatatactCATT
15594
626_1
73
7
49
25
TGGGaggaaattatTTG
15606
627_1
80
5
64
11
TGACtcatcttaaaTG
15621
628_1
71
6
66
19
CTGactcatcttaaAT
15622
629_1
31
6
41
6
TTTactctgactcATC
15628
630_1
88
2
68
18
TATtggaggaattaTT
15642
631_1
53
2
27
6
GTAttggaggaattAT
15643
632_1
23
3
39
7
TGgtatacttctctaagTAT
15655
633_1
42
9
33
3
GATCtcttggtataCT
15666
634_1
38
1
30
16
CAgacaactctataCC
15689
635_1
10
2
19
3
AACAtcagacaacTCTA
15693
636_1
13
1
11
3
TAACatcagacaacTC
15695
637_1
14
2
27
2
TTTAacatcagacaACTC
15695
638_1
101
14
81
16
ATttaacatcagacAA
15698
639_1
14
1
17
1
CCtatttaacatcAGAC
15700
640_1
65
2
ND
ND
TCCctatttaacaTCA
15703
641_1
41
6
42
12
TCAAcgactattgGAAT
15737
642_1
37
2
29
5
CTTAtattctggcTAT
15850
643_1
31
7
35
4
ATCCttatattctgGC
15853
644_1
13
3
8
1
GAtccttatattCTGG
15854
645_1
25
5
20
4
TGAtccttatattCTG
15855
646_1
33
6
54
10
ATTGaaacttgaTCCT
15864
647_1
43
3
27
6
ACtgtcattgaaACTT
15870
648_1
54
7
32
12
TCTtactgtcattgAA
15874
649_1
12
1
25
2
AGgatcttactgtCATT
15877
650_1
13
4
11
3
GCAaatcaactccATC
15896
651_1
10
5
16
3
GTGcaaatcaactCCA
15898
652_1
7
0
36
18
CAATtatttctttgTGC
15910
653_1
21
3
31
7
TGGcaacaattattTCTT
15915
654_1
75
9
73
24
GCTggcaacaatTATT
15919
655_1
21
6
39
6
ATCCatttctactgCC
15973
656_1
25
3
38
8
TAATatctattgattTCTA
15988
657_1
14
2
11
5
TCaatagtgtagggCA
16093
658_1
11
4
10
3
TTCaatagtgtaggGC
16094
659_1
18
1
32
12
AGGTtaattaattcaATAG
16102
660_1
33
7
25
10
CATttgtaatccCTAG
16163
660_2
64
14
31
8
CATttgtaatcccTAG
16163
661_1
48
6
34
6
ACAtttgtaatccCTA
16164
662_2
29
6
23
5
AAcatttgtaatCCCT
16165
662_1
30
6
18
6
AACatttgtaatCCCT
16165
663_1
49
1
26
6
TAaatttcaagttCTG
16184
664_1
17
3
30
10
GTTtaaatttcaagTTCT
16185
665_1
22
7
40
9
CCAAgtttaaatttCAAG
16189
666_1
89
11
ND
ND
ACCCaagtttaaaTTTC
16192
667_1
60
16
87
8
CAtacagtgacccaagTTT
16199
668_1
65
9
50
12
ACatcccatacagTGA
16208
669_1
83
8
103
4
AGcacagctctaCATC
16219
670_1
80
9
150
36
ATAtagcacagcTCTA
16223
671_1
57
14
ND
ND
TCCatatagcacagCT
16226
672_1
53
10
106
8
ATTtccatatagCACA
16229
673_1
78
3
96
14
TTTAtttccatatAGCA
16231
674_1
77
9
31
7
TTTatttccatatAGC
16232
675_1
32
6
ND
ND
AAGGagaggagatTATG
16409
676_1
32
5
24
6
AGTtcttgtgttagCT
16456
677_1
19
4
17
4
GAgttcttgtgttaGC
16457
678_1
14
3
25
3
ATTaattatccatCCAC
16590
679_1
11
2
20
6
ATCaattaattatcCATC
16593
680_1
31
5
40
11
AGAatcaattaattaTCC
16596
681_1
8
3
30
10
TGagataccgtgcaTG
16656
682_1
11
3
ND
ND
AAtgagataccgTGCA
16658
683_1
15
3
33
10
CTGtggttaggctaAT
16834
684_1
45
7
38
7
AagagtaagggtctgtggTT
16842
685_1
24
5
ND
ND
GATGggttaagagTAA
16854
686_1
11
2
ND
ND
AGCagatgggttaaGA
16858
687_1
ND
ND
51
7
TGtaaacatttgTAGC
16886
688_1
83
1
54
11
CCTgcttataaatgTA
16898
689_1
103
4
73
14
TGCCctgcttataaAT
16901
690_1
104
2
64
22
TCttcttagttcaaTA
16935
691_1
ND
ND
60
9
TGgtttctaactACAT
16980
692_1
ND
ND
94
22
AGtttggtttctaaCTA
16983
693_1
8
2
17
5
GAAtgaaacttgcCTG
17047
694_1
98
6
51
9
ATTatccttacatGAT
17173
695_1
48
4
18
4
GTacccaattatcCTT
17180
696_1
94
2
48
9
TGTacccaattatCCT
17181
697_1
31
5
42
13
TTgtacccaattaTCC
17182
698_1
41
4
39
6
TTTgtacccaattaTC
17183
699_1
63
0
28
12
AGCAgcaggttataTT
17197
700_1
99
6
43
12
TGGgaagtggtctGGG
17292
701_1
103
2
28
5
CTGgagagtgataaTA
17322
702_1
52
6
27
9
AATGctggattacgTC
17354
703_1
67
3
37
7
CAatgctggattaCGT
17355
704_1
36
10
80
12
TTgttcagaagtATCC
17625
705_1
19
9
47
9
GAtgatttgcttGGAG
17646
706_1
44
NA
60
9
GAAatcattcacaACC
17860
707_1
46
9
32
9
TTGtaacatctacTAC
17891
708_1
56
0
79
17
CATtaagcagcaagTT
17923
709_1
30
9
46
7
TTActagatgtgagCA
17942
710_1
29
4
36
6
TTtactagatgtgAGC
17943
711_1
41
13
41
6
GACcaagcaccttaCA
17971
712_1
36
19
49
11
AGAccaagcacctTAC
17972
713_1
30
6
34
7
ATgggttaaataAAGG
18052
714_1
70
2
24
8
TCaaccagagtattAA
18067
715_1
11
4
26
8
GTCaaccagagtatTA
18068
716_1
126
56
26
6
ATtgtaaagctgaTAT
18135
717_1
73
1
42
10
CAcataattgtaAAGC
18141
718_1
23
9
55
18
GAggtctgctattTAC
18274
719_1
50
1
42
11
TGtagattcaatgCCT
18404
720_1
79
3
39
10
CCtcattatactaTGA
18456
721_1
27
6
30
8
CCttatgctatgacAC
18509
722_1
26
7
50
13
TCCTtatgctatgaCA
18510
723_1
59
1
48
12
AAGatgtttaagtATA
18598
724_1
54
2
50
13
CTgattattaagATGT
18607
725_1
92
10
84
19
TGgaaaggtatgaaTT
18808
726_1
24
8
61
16
ACttgaatggcttgGA
18880
727_1
8
4
51
14
AACttgaatggctTGG
18881
728_1
35
4
35
10
CAATgtgttactatTT
19004
729_1
36
9
53
11
ACAatgtgttactATT
19005
730_1
70
2
41
11
CATCtgctatataaGA
19063
731_1
38
NA
42
9
CCTAgagcaaatacTT
19223
732_1
102
15
15
4
CAGagttaataatAAG
19327
733_1
37
10
8
5
GTTCaagcacaacgAA
19493
734_1
13
1
38
11
AGggttcaagcacAAC
19496
735_1
49
NA
36
11
TGttggagacactgTT
19677
736_1
48
NA
32
10
AAGgaggagttaggAC
19821
737_1
36
NA
64
11
CTATgccatttacgAT
19884
738_1
105
19
66
19
TCaaatgcagaattAG
19913
739_1
44
NA
41
6
AGtgacaatcaaATGC
19921
740_1
107
NA
68
18
AAgtgacaatcaaATG
19922
741_1
102
4
27
6
GTGtaccaagtaacAA
19978
742_1
110
10
30
16
TGGgatgttaaacTGA
20037
Пример 2 - тестирование эффективности in vitro в кривой доза-ответ
Набор олигонуклеотидов из Таблицы 10 тестировали в клетках KERPAS-299 с использованием полу-log серийных разведений в PBS (от 50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ олигонуклеотида) в анализе эффективности in vitro, описанном в Примере 1. Для данных олигонуклеотидов оценивали IC50 (полумаксимальная ингибирующая концентрация) и максимальное ингибирование (% остаточной экспрессии PD-L1).
Расчеты ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) проводили в GraphPad Prism6. IC50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 11 как % от контрольных клеток (обработанных PBS).
Таблица 11: максимальное ингибирование как % от обработки физиологическим раствором и ЕС50 в линии клеток KARPAS-299.
CMP ID NO
Макс. ингибирование(% остаточной экспрессии PD-L1; % от обработанных физиологическим раствором)
EC50 (мкM)
Соединение CMP
Начало на SEQ ID NO: 1
Средн.
SD
Средн.
SD
6_1
11
3,3
0,69
0,11
TCGCataagaatgaCT
371
8_1
29
1,7
0,06
0,01
CTGaacacacagtCGC
383
9_1
19
1,7
0,23
0,02
TCTgaacacacagtCG
384
13_1
14
4,7
0,45
0,12
CTtacttagatgcTGC
495
41_1
10
1,8
0,19
0,02
TCAtttagttaccCAA
822
42_1
17
1,3
0,19
0,02
TTcatttagttaCCCA
823
58_1
23
1,5
0,17
0,01
CCagagatatataTGC
909
77_1
24
2,4
0,16
0,02
AGTatcatagttcTCC
1075
92_1
12
2,4
0,25
0,03
AGattaagacagtTGA
1310
111_1
3
2,0
0,27
0,03
TGaattcccatatcCGA
1992
128_1
11
1,8
0,25
0,03
CTcatatcagggCAGT
2063
151_1
16
2,7
0,28
0,05
GTCatggattacaaCT
2324
164_1
19
1,6
0,15
0,01
TCTGtttatgtcacTG
2781
166_1
36
1,7
0,11
0,02
TGgtctgtttatGTCA
2784
169_1
10
1,6
0,22
0,02
TTcagcaaatatTCGT
2995
171_1
12
2,0
0,21
0,02
TCTattgttaggtATC
3053
222_1
1
2,0
0,21
0,02
TGacttgtaattgTGG
5467
233_1
1
4,3
0,89
0,17
TGGaatgccctaatTA
5591
245_1
4
2,0
0,17
0,02
TCggttatgttaTCAT
6470
246_1
7
2,1
0,25
0,03
CActttatctggTCGG
6482
250_1
0
2,5
0,23
0,03
CCacatataggtcCTT
6597
251_1
0
2,8
0,75
0,10
CAtattgctaccaTAC
6617
252_1
3
2,2
0,19
0,02
TCAtattgctaccATA
6618
256_1
5
2,2
0,32
0,03
CAAttagtgcagcCAG
6672
272_1
1
3,2
0,69
0,10
TACTgtagaacatgGC
7133
273_1
3
2,8
0,28
0,04
GCAAttcatttgaTCT
7239
287_1
1
1,4
0,13
0,01
ACAAataatggttaCTCT
7302
292_1
2
2,1
0,21
0,02
GCATttgatatagAGA
7397
303_1
0
1,2
0,21
0,01
CAAgatgaatataTGCC
7551
314_1
3
2,1
0,39
0,04
GAgtttggattagCTG
7764
318_1
3
1,4
0,14
0,01
ACAggatatggaaGGG
7880
320_1
2
2,4
0,22
0,03
GAgtaatttcaacAGG
7891
324_1
0
2,4
0,44
0,05
CAgcttactattaGGG
7906
336_1
0
2,5
0,21
0,03
GATGatttaattctagtCA
7984
342_1
1
2,2
0,12
0,01
CAGAttgatggtagTT
8030
343_1
4
1,8
0,11
0,01
CTcagattgatgGTAG
8032
344_1
0
0,9
0,12
0,01
GTTagccctcagaTTG
8039
345_1
0
2,3
0,36
0,04
TGtattgttagcCCTC
8045
346_1
1
2,1
0,22
0,02
ACttgtattgttAGCC
8048
349_1
4
2,9
0,21
0,03
ACAagtggtatctTCT
8228
359_1
6
2,9
0,39
0,05
TTGAtgaggctaagTC
8395
360_1
0
1,7
0,18
0,02
CCAggattatactcTT
8439
374_1
5
1,7
0,33
0,03
AAGatggattgggaGT
8775
408_1
3
1,8
0,21
0,02
TTtgcatatggaGGTG
8966
409_1
0
1,8
0,21
0,02
AAgtgaagttcaaCAGC
8997
415_1
0
1,4
0,23
0,02
AAttgagtgaatCCAA
9120
417_1
7
0,9
0,15
0,01
GTGataattgagtGAA
9125
424_1
6
3,2
0,19
0,03
CTcattgaaggtTCTG
9281
429_1
5
2,5
0,48
0,05
CAAatagctttatCGG
9335
430_1
1
2,7
0,68
0,09
CCaaatagctttATCG
9336
458_1
0
4,1
0,35
0,07
TGgagtttatattcTAGG
9512
464_1
0
4,1
0,56
0,10
TGCtccagtgtaccCT
9755
466_1
1
2,1
0,21
0,02
CTAattgtagtagtaCTC
9818
474_1
0
2,4
0,27
0,03
GACacactcagatttcAG
9967
490_1
0
1,9
0,29
0,03
TTacttaatttcttTGGA
10055
493_1
3
1,8
0,20
0,02
CTTatgatacaacTTA
10384
512_1
0
3,3
0,63
0,10
GCacaacccagaggAA
10735
519_1
5
1,5
0,15
0,01
TAgatttgtgagGTAA
11055
529_1
0
2,7
0,24
0,03
AGAgctttattcatgtTT
11197
533_1
6
1,5
0,14
0,01
TAGattgtttagtGCA
11228
534_1
5
0,9
0,06
0,00
GTagattgtttaGTGC
11229
547_1
1
1,6
0,26
0,02
TAGGataccacattatGA
11389
566_1
0
3,0
0,40
0,06
ATaaacatgaatctCTCC
11801
567_1
2
2,5
0,34
0,04
CTTtataaacatgaaTCTC
11804
578_1
2
1,3
0,09
0,01
TACAtttattgggcTC
12081
582_1
1
1,6
0,20
0,02
AATCatgttggtacAT
12092
601_1
1
2,1
0,47
0,05
GTAAatggcaggaaCC
13711
619_1
4
3,4
0,44
0,08
TAtgacactgcaTCTT
15317
620_1
1
1,2
0,12
0,01
GTAtgacactgcaTCT
15318
636_1
0
1,3
0,19
0,01
AACAtcagacaacTCTA
15693
638_1
0
2,2
0,36
0,04
TAACatcagacaacTC
15695
637_1
0
2,1
0,21
0,02
TTTAacatcagacaACTC
15695
640_1
2
3,3
0,42
0,06
CCtatttaacatcAGAC
15700
645_1
1
2,9
0,34
0,04
GAtccttatattCTGG
15854
650_1
0
2,4
0,24
0,03
AGgatcttactgtCATT
15877
651_1
4
3,4
0,33
0,05
GCAaatcaactccATC
15896
652_1
0
1,3
0,16
0,01
GTGcaaatcaactCCA
15898
653_1
4
2,0
0,09
0,01
CAATtatttctttgTGC
15910
658_1
3
1,6
0,32
0,02
TCaatagtgtagggCA
16093
659_1
5
1,4
0,20
0,01
TTCaatagtgtaggGC
16094
660_1
4
2,1
0,22
0,02
AGGTtaattaattcaATAG
16102
665_1
3
1,8
0,18
0,02
GTTtaaatttcaagTTCT
16185
678_1
3
2,1
0,43
0,04
GAgttcttgtgttaGC
16457
679_1
0
3,5
0,31
0,05
ATTaattatccatCCAC
16590
680_1
4
1,6
0,12
0,01
ATCaattaattatcCATC
16593
682_1
3
2,4
0,27
0,03
TGagataccgtgcaTG
16656
683_1
0
3,2
0,16
0,03
AAtgagataccgTGCA
16658
684_1
2
2,3
0,25
0,03
CTGtggttaggctaAT
16834
687_1
5
1,3
0,13
0,01
AGCagatgggttaaGA
16858
694_1
0
1,7
0,16
0,02
GAAtgaaacttgcCTG
17047
706_1
15
3,6
0,27
0,06
GAtgatttgcttGGAG
17646
716_1
10
2,1
0,15
0,02
GTCaaccagagtatTA
18068
728_1
5
1,2
0,09
0,01
AACttgaatggctTGG
18881
733_1
0
12,7
8,01
3,62
CAGagttaataatAAG
19327
734_1
0
14,6
3,49
2,39
GTTCaagcacaacgAA
19493
735_1
0
2,5
0,30
0,04
AGggttcaagcacAAC
19496
Набор олигонуклеотидов из Таблицы 6 тестировали в клетках ТНР-1 с использованием серийного разведения 1:3 в воде от 25 мкМ до 0,004 мкМ в анализе эффективности in vitro, описанном в Примере 1. Для данных олигонуклеотидов оценивали IC50 и максимальное ингибирование (% остаточной экспрессии PD-L1).
Расчеты ЕС50 проводили в GraphPad Prism6. IC50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 12 как % от контрольных клеток (обработанных PBS).
Таблица 12: максимальное ингибирование как % от обработки физиологическим раствором и ЕС50 в линии клеток ТНР1.
CMP ID NO
Макс. ингибирование(% остаточной экспрессии PD-L1; % от обработанных физиологическим раствором)
EC50 (мкM)
Соединение СМР
Начало на SEQ ID NO: 1
Средн.
SD
Средн.
SD
6_1
12
11,5
0,73
0,38
TCGCataagaatgaCT
371
8_1
6
5,6
0,11
0,04
CTGaacacacagtCGC
383
9_1
1
14,3
0,36
0,27
TCTgaacacacagtCG
384
13_1
2
12,4
0,49
0,31
CTtacttagatgcTGC
495
41_1
14
14,6
0,38
0,27
TCAtttagttaccCAA
822
42_1
21
10,4
0,22
0,10
TTcatttagttaCCCA
823
58_1
6
19,8
0,97
0,81
CCagagatatataTGC
909
77_1
5
4,8
0,14
0,04
AGTatcatagttcTCC
1075
92_1
0
12,9
0,57
0,39
AGattaagacagtTGA
1310
128_1
15
10,1
0,23
0,13
CTcatatcagggCAGT
2063
151_1
9
14,4
0,18
0,15
GTCatggattacaaCT
2324
164_1
16
22,0
0,57
0,60
TCTGtttatgtcacTG
2781
166_1
13
11,9
0,17
0,11
TGgtctgtttatGTCA
2784
169_1
0
9,3
0,22
0,11
TTcagcaaatatTCGT
2995
171_1
11
12,9
0,28
0,20
TCTattgttaggtATC
3053
222_1
16
19,7
0,68
0,64
TGacttgtaattgTGG
5467
245_1
14
6,1
0,26
0,08
TCggttatgttaTCAT
6470
246_1
28
7,3
0,10
0,20
CActttatctggTCGG
6482
252_1
19
8,0
0,29
0,12
TCAtattgctaccATA
6618
272_1
3
9,7
0,25
0,14
TACTgtagaacatgGC
7133
314_1
13
9,6
0,31
0,15
GAgtttggattagCTG
7764
344_1
11
8,0
0,14
0,06
GTTagccctcagaTTG
8039
349_1
12
12,5
0,18
0,14
ACAagtggtatctTCT
8228
415_1
11
9,6
0,26
0,12
AAttgagtgaatCCAA
9120
493_1
15
16,5
0,48
0,34
CTTatgatacaacTTA
10384
512_1
43
14,1
0,31
0,68
GCacaacccagaggAA
10735
519_1
9
12,2
0,45
0,26
TAgatttgtgagGTAA
11055
533_1
11
13,6
0,29
0,21
TAGattgtttagtGCA
11228
534_1
9
6,5
0,09
0,03
GTagattgtttaGTGC
11229
582_1
0
12,3
0,33
0,23
AATCatgttggtacAT
12092
619_1
8
10,4
0,32
0,18
TAtgacactgcaTCTT
15317
620_1
12
24,6
1,10
1,08
GTAtgacactgcaTCT
15318
638_1
2
5,4
0,00
0,00
TAACatcagacaacTC
15695
645_1
20
29,6
1,10
1,50
GAtccttatattCTGG
15854
651_1
0
11,2
0,14
0,09
GCAaatcaactccATC
15896
658_1
11
13,8
0,48
0,32
TCaatagtgtagggCA
16093
659_1
0
8,2
0,11
0,06
TTCaatagtgtaggGC
16094
733_1
0
69,6
11,03
26,95
CAGagttaataatAAG
19327
734_1
36
16,8
2,84
2,12
GTTCaagcacaacgAA
19493
Результаты в Таблицах 7 и 8 также показаны на Фиг. 2 в связи с их положением, где они нацелены на пре-мРНК PD-L1 SEQ ID NO: 1.
Из этого можно видеть то, что почти все из соединений имеют значения ЕС50 меньше 1 мкМ и целевой нокдаун меньше 25% от уровня экспрессии PD-L1 в контрольных клетках (обработанных физиологическим раствором).
Пример 3 - активность и эффективность in vitro и снижение уровня PD-L1 in vivo у мышей, индуцированных поли(I:C), с использованием голых и конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1
Тестирование эффективности и активности проводили в эксперименте in vitro в исследованиях доза-ответ в клетках МСР-11 с использованием олигонуклеотидов в Таблице 6. Те же самые олигонуклеотиды, а также версии, конъюгированные с GalNAc (Таблица 8, CMP ID NO 755_2-765_2), тестировали in vivo у самок мышей C57BL/6J, индуцированных поли(I:C), на их способность уменьшать экспрессию мРНК и белка PD-L1.
Анализ in vitro
2
Клетки МСР-11 (исходно купленные в АТСС (Американская коллекция типовых клеточных культур)), суспендированные в DMEM (среда Игла, модифицированная по Дульбекко) (кат. № Sigma D0819), дополненной 10% лошадиной сыворотки, 2 мМ L-глутамином, 0,025 мг/мл гентамицином и 1 мМ пируватом натрия, добавляли при плотности 8000 клеток/лунку к олигонуклеотидам (10 мкл) в 96-луночные круглодонные планшеты и культивировали в течение 3 суток в конечном объеме 200 мкл/лунку в увлажненном инкубаторе при 37°С с 5% СО. Олигонуклеотиды подвергали скринингу в интервале концентраций (50 мкМ, 15,8 мкМ, 5,0 мкМ, 1,58 мкМ, 0,5 мкМ, 0,158 мкМ, 0,05 мкМ до 0,0158 мкМ).
Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием  мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и Gusb (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL  Mm01197698-m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 9 как % остаточной экспрессии PD-L1 в % от контрольных образцов с PBS (клетки, обработанные PBS). Расчеты ЕС50 проводили в GraphPadPrism6. ЕС50 и максимальный уровень нокдауна PD-L1 показаны в Таблице 13 как % от контрольных (PBS) клеток.
Анализ in vivo
Самкам мышей C57BL/6J (20-23 г; 5 мышей на группу) п.к. инъецировали 5 мг/кг неконъюгированных олигонуклеотидов к мышиному PD-L1 или 2,8 мг/кг конъюгированных с GalNAc олигонуклеотидов к мышиному PD-L1. Через трое суток мышам в.в. инъецировали 10 мг/кг поли(I:C) (LWM, Invivogen). Мышей умерщвляли через 5 ч после инъекции поли(I:C), и образцы печени помещали в RNAlater (Thermo Fisher Scientific) для экстракции РНК или замораживали на сухом льду для экстракции белка.
Общую мРНК экстрагировали из гомогенизированных образцов печени с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием  мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа мРНК PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и ТВР (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL  Mm00446971_m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 13 как % контрольных образцов от мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C).
Гомогенаты печени получали посредством проведения гомогенизации образцов печени в 2 мл на 100 мг ткани реактива для эктракции тканевого белка T-PER (Thermo Fisher Scientific), смешанного с 1× смесью ингибиторов протеаз Halt, не содержащей EDTA (Thermo Fisher Scientific). Концентрации белка в гомогенатах печени измеряли с использованием реактива для анализа кумасси плюс (Бредфорд) (Thermo Scientific) согласно инструкциям изготовителя. Гомогенаты печени (40 мкг белка) разделяли на 4-12%-ных Bis-Tris Plus полиакриламидных гелях (Thermo Fisher Scientific) в 1× электродном буфере MOPS и переносили на нитроцеллюлозные мембраны с использованием системы блоттинга iBLOT Dry (Thermo Fisher Scientific) согласно инструкциям изготовителя. Каждый блот разрезали горизонтально на две части по полосе 64 кДа. После блокирования в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20, мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьим моноклональным антителом против винкулина (Abcam, кат. № ab129002), разведенным 1:10000 (верхние мембраны), или с поликлональным антителом козы против mPD-L1 (R&D Systems, кат. № AF1019), разведенным 1:1000 (нижние мембраны) в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20. Мембраны промывали в TBS, содержащем 0,05% Tween 20, и подвергали воздействию в течение 1 ч при комнатной температуре свиного антитела против IgG кролика, конъюгированного с HRP (пероксидаза хрена) (DAKO), разведенного 1:3000 (верхние мембраны), или кроличьего антитела против IgG козы, конъюгированного с HRP (DAKO), разведенного 1:2000 в TBS, содержащем 5% обезжиренного молока и 0,05% Tween 20. После промывки мембран реактивность выявляли с использованием ECL select (Amersham GE Healthcare). Для каждой группы мышей, обработанных олигонуклеотидами, оценивали интенсивность полос PD-L1 по отношению к полосам винкулина посредством сравнения с интенсивностями полос PD-L1/винкулин мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C) (контроль). Результаты показаны в Таблице 13, и вестерн-блоты с парами голых и конъюгированных олигонуклеотидов показаны на Фиг. 9А-Д.
Таблица 13: эффективность in vitro и in vivo олигонуклеотидов к мышиному PD-L1.
CMP ID NO
Соединение CMP
Макс. ингибирование (% от PBS)
EC50 (мкM)
мРНК PD-L1(% от контроля)
Белок PD-L1(относительно контроля)
744_1
AGTttacattttcTGC
9,1
0,56
86
++
746_1
CACctttaaaaccCCA
5,0
0,46
181
nd
747_1
TCCtttataatcaCAC
4,4
0,52
104
++
748_1
ACGgtattttcacAGG
1,8
0,26
102
+++
749_1
GACactacaatgaGGA
7,6
1,21
104
nd
750_1
TGGtttttaggacTGT
12,4
0,74
84
nd
751_1
CGAcaaattctatCCT
9,9
0,69
112
nd
752_1
TGAtatacaatgcTAC
10,5
1,11
142
+++
753_1
TCGttgggtaaatTTA
5,7
0,53
116
+++
754_1
TGCtttataaatgGTG
5,2
0,35
98
nd
755_2
5'-GN2-C6-caAGTttacattttcTGC
nd
nd
58
+
757_2
5'-GN2-C6-caCACctttaaaaccCCA
nd
nd
62
nd
758_2
5'-GN2-C6-caTCCtttataatcaCAC
nd
nd
53
+
759_2
5'-GN2-C6-caACGgtattttcacAGG
nd
nd
66
+
760_2
5'-GN2-C6-caGACactacaatgaGGA
nd
nd
101
nd
761_2
5'-GN2-C6-caTGGtttttaggacTGT
nd
nd
99
nd
762_2
5'-GN2-C6-caCGAcaaattctatCCT
nd
nd
84
nd
763_2
5'-GN2-C6-caTGAtatacaatgcTAC
nd
nd
93
+++
764_2
5'-GN2-C6-caTCGttgggtaaatTTA
nd
nd
53
+
765_2
5'-GN2-C6-caTGCtttataaatgGTG
nd
nd
106
nd
+++: аналогичная интенсивности полосы PD-L1/винкулина контроля; ++: слабее, чем интенсивность полосы PD-L1/винкулина контроля; +: значительно слабее, чем интенсивность полосы PD-L1/винкулина контроля; nd - не определяется.
Из данных Таблицы 13 можно видеть то, что конъюгирование олигонуклеотидов с GalNAc явно улучшает уменьшение уровня PD-L1 in vivo. Уменьшение уровня мРНК обычно коррелирует с уменьшением уровня белка PD-L1. За исключением CMP ID NO: 754_1, низкое значение ЕС50 in vitro обычно отражает хорошее снижение уровня мРНК PD-L1 in vivo, если только олигонуклеотид конъюгирован с GalNAc.
Пример 4 - PK (фармакокинетика)/PD (фармакодинамика) in vivo в сортированных гепатоцитах и непаренхимных клетках от мышей, индуцированных поли(I:C)
Исследовали распределение голых и конъюгированных с GalNAc олигонуклеотидов, а также уменьшение уровня мРНК PD-L1 в гепатоцитах и непаренхимных клетках, выделенных из мышей, индуцированных поли(I:C).
2
3
Самкам мышей C57BL/6J (n равно 3 на группу) п.к. (подкожно) инъецировали 5 мг/кг неконъюгированного олигонуклеотида (748_1) или 7 мг/кг олигонуклеотидов, конъюгированных с GalNAc (759_2), нацеленных на мышиную мРНК PD-L1. Через двое суток мышам в.б. (внутрибрюшинно) инъецировали 15 мг/кг поли(I:C) (LWM, Invivogen). Через 18-20 ч после инъекции поли(I:C) мышей анестезировали, и подвергали печень перфузии при скорости тока 7 мл в мин через полую вену с использованием сбалансированного солевого раствора Хэнкса, содержащего 15 мМ Hepes и 0,38 мM EGTA, в течение 5 мин, с последующей перфузией раствором коллагеназы (сбалансированный солевой раствор Хэнкса, содержащий 0,17 мг/мл коллагеназы типа 2 (Worthington 4176), 0,03% BSA, 3,2 мM CaCl и 1,6 г/л NaHCO) в течение 12 мин. После перфузии печень удаляли и открывали капсулу печени, суспензию печени фильтровали через 70 мкм клеточное сито с использованием среды William E, и аликвоту клеточной суспензии (смешанные клетки печени) удаляли для более позднего анализа. Остаток клеточной суспензии центрифугировали в течение 3 мин при 50 g. Супернатант отбирали для более поздней очистки непаренхимных клеток. Осадок ресуспендировали в 25 мл среды William E (Sigma, кат. № W1878, дополненная 1× пенициллином/стрептомицином, 2 мМ L-глутамином и 10% FBS (ATCC #30-2030)), смешивали с 25 мл среды William E, содержащей 90% перколла, и гепатоциты осаждали центрифугированием при 50 g в течение 10 мин. После 2-кратной промывки в среде William E осажденные гепатоциты ресуспендировали в среде William E. Супернатант, содержащий непаренхимные клетки, центрифугировали при 500 g 7 мин, и данные клетки ресуспендировали в 4 мл среды RPMI и центрифугировали через два слоя перколла (25% и 50% перколла) при 1800 g в течение 30 мин. После отбора непаренхимных клеток между двумя слоями перколла, данные клетки промывали и ресуспендировали в среде RPMI.
Общую мРНК экстрагировали из очищенных гепатоцитов, непаренхимных клеток и общей суспензии печени (нефракционированные клетки печени) с использованием набора для очистки РНК PureLink Pro 96 (Ambion) согласно инструкциям изготовителя. кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы M-MLT, случайных декамеров RETROscript, ингибитора РНКазы (Ambion) и набора 100 мM дНТФ (Invitrogen, уровень качества для ПЦР) согласно инструкции изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР с использованием  мастер-микса (2×) TaqMan Fast Advanced (Ambion) в дуплексе, установленном с праймерами TaqMan для анализа PD-L1 (Thermo Fisher Scientific; FAM-MGB Mm00452054-m1) и ТВР (Thermo Fisher Scientific; VIC-MGB-PL  Mm00446971_m1). Относительный уровень экспрессии мРНК PD-L1 показан в Таблице 10 как % контрольных образцов от мышей, которым инъецировали физиологический раствор и поли(I:C).
Анализ содержания олигонуклеотидов проводили с использованием ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) с использованием биотинилированного захватывающего зонда с последовательностью 5'-TACCGT-s-Bio-3' и выявляющего зонда, конъюгированного с дигоксигенином, с последовательностью 5'- DIG-C12-S1-CCTGTG - 3'. Данные зонды состояли только из LNA с фосфодиэфирной связью. Образцы печени (приблизительно 50 мг) гомогенизировали в 1,4 мл буфера для лизиса MagNa pure (Roche, кат. № 03604721001) в 2 мл пробирке Эппендорфа, содержащей один 5 мм шарик из нержавеющей стали. Образцы гомогенизировали на гомогенизаторе Retsch MM400 (Merck Eurolab), пока не был получен однородный лизат. Образцы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Стандарты получали впрыскиванием неконъюгированного антисмыслового олигонуклеотидного соединения (CMP ID NO 748_1) в определенных концентрациях в образец необработанной печени, и обрабатывали их также, как и образцы. Впрыснутые концентрации выбирали так, чтобы они соответствовали ожидаемому содержанию олигонуклеотидов в образце (в пределах ~10-кратных отличий).
Гомогенизированные образцы разводили минимум в 10 раз в 5 × буфере SSCT (750 мМ NaCl и 75 мМ цитрат натрия, содержащий 0,05% (об./об.) Tween-20, pH 7,0), и делали серию 6 разведений в 2 раза с использованием раствора для захвата-выявления (35 нМ захватывающий зонд и 35 нМ выявляющий зонд в 5 × буфере SSCT) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Образцы переносили в 96-луночный планшет, покрытый стрептавидином (Nunc, кат. № 436014), по 100 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. В каждой лунке была сделана промывка три раза 2× буфером SSCT, было добавлено 100 мкл фрагмента Fab против DIG-AP (Roche Applied Science, кат. № 11093274910), разведенного 1:4000 в PBST (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий 0,05% (об./об.) Tween-20, pH 7,2, свежеприготовленный), и проведена инкубация в течение 1 часа при комнатной температуре с легким встряхиванием. Была сделана промывка три раза 2× буфером SSCT, и было добавлено 100 мкл раствора субстрата щелочной фосфатазы (АР) (субстрат Blue Phos, KPL, код продукта 50-88-00, свежеприготовленный). Интенсивность окрашивания измеряли спектрофотометрически при 615 нм после 30-минутной инкубации с легким встряхиванием. Необработанные данные экспортировали из ридеров (программа Gen5 2.0) в формат Excel и далее анализировали в Excel. Стандартные кривые получали с использованием программы GraphPadPrism 6 и логистической регрессионной модели 4PL.
Таблица 14: экспрессия PD-L1 и содержание олигонуклеотидов в общей суспензии печени, гепатоцитах и непаренхимных клетках от поли(I:C) мышей, обработанных неконъюгированными и конъюгированными с GalNAc олигонуклеотидами, n равно 3.
Тип клеток
CMP ID no
Экспрессия PD-L1(% от физиологического раствора-поли(I:C))
Содержание олигонуклеотидов(нг/10<sup>5</sup> клеток)
Среднее
SD
Среднее
SD
Общая печень
748_1
31
12,4
2,3
0,3
759_2
28
5,3
8,3
1,1
Гепатоциты
748_1
33
8,0
5,1
3,7
759_2
7
1,0
43,8
18,9
Непаренхимные клетки
748_1
31
10,1
2,2
0,7
759_2
66
1,6
1,7
0,9
Результаты показывают то, что голые (CMP ID NO: 748_1) и конъюгированные (CMP ID NO: 759_2) олигонуклеотиды одинаково хорошо снижают уровень мРНК PD-L1 в общих клетках печени. В выделенных гепатоцитах эффект конъюгированного олигонуклеотида почти в 5 раз сильнее, чем эффект голого олигонуклеотида, тогда как голые олигонуклеотиды демонстрировали в два раза более сильный эффект, чем олигонуклеотиды, конъюгированные с GalNAc, в непаренхимных клетках. В гепатоцитах и непаренхимных клетках уменьшение экспрессии мРНК PD-L1 в некоторой степени коррелирует с содержанием олигонуклеотидов в данных типах клеток.
Пример 5 - нокдаун PD-L1 in vivo у мышей AAV/HBV с использованием голых и конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1
В настоящем исследовании мышей AAV/HBV обрабатывали голыми или конъюгированными с GalNAc антисмысловыми олигонуклеотидами против PD-L1, и оценивали в печени экспрессию мРНК PD-L1 и экспрессию генов HBV.
10
Самок мышей HLA-A2/DR1 5-8-недельного возраста (5 животных на группу) предобрабатывали в неделю -1 носителем (физиологический раствор), голыми антисмысловыми олигонуклеотидами к PD-L1 (CMP ID NO 752_1 п.к. в дозе 5 мг/кг)  и антисмысловыми олигонуклеотидами к PD-L1, конъюгированными с GalNAc (CMP ID NO 763_2 п.к. в дозе 7 мг/кг), данные дозы соответствуют эквимолярным концентрациям олигонуклеотидов. Данных мышей трансдуцировали 5×10 вг AAV-HBV в неделю 0 (относительно дополнительных подробностей см. описание мышиной модели AAV/HBV в разделе Материалы и методы). С W1 (неделя 1) после трансдукции AAV-HBV до W4 мыши получали 4 дополнительные п.к. инъекции олигонуклеотидов к PD-L1 или носителя (физиологический раствор), которые давали с интервалом в одну неделю.
Образцы крови отбирали за одну неделю до трансдукции и через одну неделю после каждой инъекции.
Мышей умерщвляли через две недели после последних инъекций, и их печень удаляли после перфузии PBS. Печень разрезали на меньшие куски и прямо замораживали.
Для измерения экспрессии генов HBV ДНК экстрагировали из сыворотки с использованием Qiagen Biorobot, используя QIAamb One для всего набора нуклеиновых кислот, кат. № 965672, сыворотку разводили 1:20 в PBS, всего 100 мкл лизировали в 200 мкл буфера AL. ДНК элюировали из набора в 100 мкл.
Для кПЦР в реальном времени использовали мастер-микс для экспрессии генов TaqMan (кат. № 4369016, Applied Biosystems) вместе со смесью праймеров, приготовленной посредством добавления 1:1:0,5 следующих праймеров: F3_core, R3_core, P3_core (Integrated DNA Technologies, все разведены до концентрации 100 мкМ каждый):
Прямой (F3_core): CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784)
Обратный (R3_core): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785)
Зонд (P3_core): 56-FAM-AGC TCC AAA/ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G-3IABkFQ (SEQ ID NO: 786)
9
Получали стандартную кривую с использованием плазмиды HBV (генотип D, GTD), используя 10-кратные разведения, начиная с 1×10 копий/мкл вплоть до 1 копии/мкл, и использовали в 5 мкл на реакцию.
Для каждой реакции добавляли 10 мкл мастер-микса для экспрессии генов, 4,5 мкл воды, 0,5 мкл смеси праймеров и 5 мкл образца или стандарта, и проводили кПЦР.
Для анализа рассчитывали число копий/мл/лунку с использованием стандартной кривой. Результаты показаны в Таблице 15.
Экспрессию мРНК PD-L1 измеряли с использованием кПЦР.
мРНК экстрагировали из замороженных кусков печени, которые добавляли в 2 мл пробирки, содержащие керамические шарики (пробирки Lysing Matrix D, 116913500, mpbio) и 1 мл тризола.
2
Кусок печени гомогенизировали с использованием дезинтегратора тканей Precellys. В гомогенат добавляли 200 мкл хлороформа, перемешивали на вибромешалке и центрифугировали при 4°С в течение 20 мин при 10000 об./мин. Прозрачную фазу, содержащую РНК (около 500 мкл) переносили в свежую пробирку, и добавляли такой же объем 70%-ного EtOH. После хорошего перемешивания данный раствор переносили на колонку RNeasy spin, и РНК далее экстрагировали, следуя руководству набора RNeasy для мининабора RNeasy, кат. № 74104, Qiagen (включающего расщепление РНК, набор ДНКазы, не содержащий РНКазу, кат. № 79254). Элюирование осуществляли в 50 мкл НО. Конечную концентрацию РНК измеряли и доводили до 100 нг/мкл для всех образцов.
кПЦР проводили на 7,5 мкл РНК с использованием набора RNA-to-ct 1-step от Taqman, кат. № 4392938, Thermo Fisher, согласно инструкциям изготовителя. Использованные смешанные праймеры содержали PD-L1_1-3 (номер праймера Mm00452054_m1, Mm03048247_m1 и Mm03048248_m1) и эндогенные контроли (ATCB Mm00607939_s1, CANX Mm00500330_m1, YWHAZ Mm03950126_s1 и GUSB Mm01197698_m1).
Данные анализировали с использованием способа 2^-ddct. Для расчета значений dct использовали среднее всех четырех эндогенных контролей. Экспрессию PD-L1 выражали относительно среднего значения для эндогенных контролей и в % от физиологического раствора.
Таблица 15: экспрессия мРНК PD-L1 и ДНК HBV у мышей AAV/HBV, обработанных неконъюгированными и конъюгированными с GalNAc олигонуклеотидами, n равно 5.
CMP ID no
Экспрессия мРНК PD-L1(% от физиологического раствора)
Экспрессия ДНК HBV(% от физиологического раствора)
Средн.
SD
Средн.
SD
Голый
752_1
55
35
72
16
Конъюгированный с GalNAc
763_2
34
3
79
9
Из данных результатов можно видеть то, что и голые, и конъюгированные с GalNAc олигонуклеотиды способны понижать экспрессию мРНК PD-L1 в печени мыши AAV/HBV, причем олигонуклеотид, конъюгированный с GalNAc, является в некоторой степени лучшим. Оба олигонуклеотида также приводили в некоторому снижению уровня ДНК HBV в сыворотке.
Пример 6 - влияние in vivo на ответ Т-клеток у мышей AAV/HBV
В настоящем исследовании мышей AAV/HBV из модели Пастера обрабатывали антителом или антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на PD-L1. Антисмысловые олигонуклеотиды были либо голыми, либо конъюгированными с GalNAc. Во время обработки животные были иммунизированы ДНК-вакциной против антигенов HBs и HBc (см. раздел Материалы и методы) для обеспечения эффективного примирования Т-клеток антигенпрезентирующими клетками. Оценивали, как данная обработка влияла на популяцию клеток в печени и селезенке, а также на экспрессию PD-L1 в данных популяциях и то, мог ли быть идентифицирован HBV-специфичный ответ Т-клеток.
Протокол обработки:
Самок мышей HLA-A2/DR1 обрабатывали согласно протоколам, приведенным ниже. Данное исследование проводили в двух отдельных подисследованиях с небольшими различиями в схемах введения, как показано в Таблице 16 и 17 ниже.
ДНК-вакцину и антитело против PD-L1 вводили, как описано в разделе Материалы и методы. Использованными антисмысловыми олигонуклеотидами были CMP ID NO 748_1 (голый) в дозе 5 мг/кг и CMP ID NO: 759_2 (конъюгированный с GalNAc) в дозе 7 мг/кг, которые оба вводили в виде подкожных инъекций (п.к.).
Таблица 16: протокол обработки мышей AAV/HBV ДНК-вакциной и ДНК-вакциной плюс антителом против PD-L1, 6 мышей в каждой группе
Сутки
Носитель(Группа 10)
ДНК-вакцина(Группа 11)
ДНК-вакцина + Ab против PD-L1(Группа 13)
0
AAV/HBV
29*
Рандомизация животных
34
Физ. р-р + изотипическое
-
Ab
41
Физ. р-р + изотипическое
-
Ab
48
Физ. р-р + изотипическое
-
Ab
50
-
CaTx
CaTx
55*
PBS + изотипическое
ДНК
ДНК+Ab
62
Физ. р-р + изотипическое
-
Ab
69
PBS + изотипическое
ДНК
ДНК+Ab
76*
Физ. р-р + изотипическое
-
Ab
83
Физ. р-р + изотипическое
-
Ab
97*
Умерщвление
Изотипическое - мышиное контрольное Ab IgG, CaTx - кардиотоксин, ДНК - ДНК-вакцина, Ab - антитело против PD-L1, и * - отбор сыворотки.
Таблица 17: протокол обработки мышей AAV/HBV ДНК-вакциной и ДНК-вакциной плюс голым или конъюгированным олигонуклеотидом к PD-L1 (ASO), 7 мышей в каждой группе
Сутки
Носитель(Группа 1)
ДНК-вакцина(Группа 2)
ДНК-вакцина + ASO к PD-L1(Группа 7)
ДНК-вакцина + GN- ASO к PD-L1(Группа 8)
0
AAV/HBV
29*
Рандомизация животных
39
Физ. р-р
Физ. р-р
41
Физ. р-р
ASO
GN-ASO
46
Физ. р-р
Физ. р-р
49
Физ. р-р
ASO
GN-ASO
53
Физ. р-р
Физ. р-р
55
CaTx
CaTx
CaTx
CaTx
56
Физ. р-р
ASO
GN-ASO
59
PBS+ физ. р-р
ДНК+PBS
ДНК
ДНК
62*
Физ. р-р
ASO
GN-ASO
67
Физ. р-р
Физ. р-р
70
Физ. р-р
ASO
GN-ASO
74
PBS+ физ. р-р
ДНК+PBS
ДНК
ДНК
77
Физ. р-р
ASO
GN-ASO
81
Физ. р-р
Физ. р-р
84*
Физ. р-р
ASO
GN-ASO
88
Физ. р-р
Физ. р-р
91
Физ. р-р
ASO
GN-ASO
102
Умерщвление
ДНК - ДНК-вакцина, CaTx - кардиотоксин, Ab - антитело против PD-L1, ASO - голый олигонуклеотид к PD-L1, GN-ASO - конъюгированный с GalNAc олигонуклеотид к PD-L1 и * - отбор сыворотки.
В момент умерщвления отбирали одноядерные клетки крови, селезенки и печени каждой мыши из каждой группы, и обедняли эритроцитами (лизирующий буфер, BD biosciences, 555899). Одноядерные клетки печени требуют специфического приготовления, как описано в разделе Материалы и методы.
Популяции клеток:
В печени популяцию клеток анализировали поверхностным мечением на одноядерные клетки печени (см. Материалы и методы) с использованием цитометрии.
Не отмечали значимых изменений в частотах NK-клеток в селезенке и печени обработанных мышей по сравнению с контрольными группами (т.е. группами, иммунизированными носителем и ДНК). В Таблице 18 показано то, что в печени группы, обработанные голым олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO 748_1) и конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO: 759_2), имели значимое увеличение числа Т-клеток по сравнению с каждой из контрольных групп (т.е. группами, иммунизированными носителем и ДНК), также представленных на Фиг. 10А. Данное увеличение было обусловлено увеличением обеих популяций Т-клеток: CD4+ и CD8+ (Таблица 18 и Фиг. 10Б и 10В соответственно).
Таблица 18: Т-клетки в печени после обработки, в миллионах клеток
T-клетки(миллионы)
T-клетки CD4+ (миллионы)
T-клетки CD8+ (миллионы)
Средн.
Std
Средн.
Std
Средн.
Std
Носитель (Группа 1)
0,77
0,44
0,51
0,35
0,11
0,05
ДНК-вакцина (Группа 2)
0,90
0,24
0,58
0,16
0,16
0,08
ДНК-вакцина +Ab против PD-L1 (Группа 13)
1,98
0,90
1,40
0,81
0,41
0,23
Носитель (Группа 10)
1,73
0,87
1,13
0,55
0,40
0,25
ДНК-вакцина (Группа 11)
1,27
0,97
0,79
0,58
0,32
0,32
ДНК-вакцина +ASO к PD-L1 (Группа 7)
3,78
1,31
2,46
0,72
0,79
0,39
ДНК-вакцина +ASO GN-PD-L1 (Группа 8)
3,33
0,66
2,18
0,40
0,67
0,17
Экспрессия PD-L1:
Экспрессию белка PD-L1 оценивали на макрофагах, В- и Т-клетках из селезенки и печени во время умерщвления. Присутствие антитела против PD-L1 в смеси антител, метящих поверхность (см. Материалы и методы), обеспечивало количественное измерение клеток, экспрессирующих PD-L1, посредством цитометрии.
В селезенке не наблюдали значимого различия между обработками в % макрофагов, В-клеток и Т-клеток CD4+, экспрессирующих PD-L1. % Т-клеток CD8+, экспрессирующих PD-L1, был ниже у мышей, обработанных голым олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO 748_1) и конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 (CMP ID NO: 759_2), по сравнению с другими обработками (данные не показаны).
В печени PD-L1 экспрессировался, главным образом, на Т-клетках CD8+ со средней частотой 32% и 41% в контрольных группах (две группы носителя и комбинированные группы с ДНК-вакцинацией соответственно, Фиг. 11А). Обработка голым олигонуклеотидом к PD-L1 или конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1 приводила к уменьшению частоты Т-клеток CD8+, экспрессирующих PD-L1 (см. Таблицу 19, Фиг. 11А). Значимые различия в % клеток, экспрессирующих PD-L1, также были отмечены для В-клеток и Т-клеток CD4+ после обработки ASO, хотя данные типы клеток экспрессируют значимо меньше PD-L1, чем Т-клетки CD8+ (см. Таблицу 19 и Фиг. 11Б и В). Обработка Ab против PD-L1 также приводила к кажущемуся снижению в экспрессии PD-L1 во всех типах клеток. Однако возможно то, что данное снижение частично обусловлено блокадой эпитопа PD-L1 антителом против PD-L1, используемым для обработки, таким образом, что предотвращается связывание с PD-L1 антитела, выявляющего PD-L1, в смеси антител для мечения поверхности. Следовательно, то, что проявляется как понижающая регуляция PD-L1 антителом против PD-L1, используемым для обработки, может быть результатом конкуренции за эпитоп между антителом для обработки и выявляющим антителом.
Таблица 19: % популяции клеток печени с экспрессией PD-L1
% T-клеток CD8+
% T-клеток CD4+
% B-клеток
Средн.
Std
Средн.
Std
Средн.
Std
Носитель (Группа 10)
35,5
4,7
0,75
0,52
5,9
1,5
ДНК-вакцина(Группа 11)
36,8
7,7
0,61
0,08
5,5
1,1
ДНК-вакцина +Ab против PD-L1(Группа 13)
18,6
12,3
0,33
0,10
2,9
1,7
Носитель(Группа 1)
28,5
11,5
0,64
0,21
5,9
1,7
ДНК-вакцина(Группа 2)
44,9
14,4
1,43
0,69
8,7
3,1
ДНК-вакцина +ASO к PD-L1(Группа 7)
9,6
2,4
0,37
0,21
2,9
0,8
ДНК-вакцина +ASO GN-PD-L1(Группа 8)
14,6
3,3
0,31
0,11
2,8
0,8
Ответ HBV-специфичных Т-клеток:
NK-клетки и Т-клетки CD4+ и CD8+, продуцирующие провоспалительные цитокины, выявляли с использованием анализов окрашивания на внутриклеточные цитокины (см. раздел Материалы и методы), выявляющих продукцию IFNγ и TNFα.
В селезенке на выявлялись NK-клетки, секретирующие IFNγ и TNFα, и выявлялось мало Т-клеток CD4+, секретирующих IFNγ и TNFα, (частота меньше 0,1%) в момент умерщвления. IFNγ-продуцирующие Т-клетки CD8+, нацеленные на два антигена HBV, выявлялись у мышей, обработанных голым олигонуклеотидом к PD-L1 или конъюгированным с GalNAc олигонуклеотидом к PD-L1, а также у мышей из данного исследования, которые получали только ДНК-вакцину (данные не показаны).
В печени иммунизированных ДНК мышей-носителей HBV не выявляли NK-клеток, продуцирующих IFNγ, в момент умерщвления, тогда как секретирующие IFNγ Т-клетки CD4+, специфичные в отношении кора или S2+S, выявляли в печени немногих иммунизированных ДНК мышей с низкой частотой (меньше 0,4%, данные не показаны). Специфичные в отношении S2+S HBV T-клетки CD8+, продуцирующие IFNγ, выявляли у большинства мышей, иммунизированных ДНК. Частота Т-клеток CD8+, секретирующих IFNγ, возрастала у мышей, обработанных комбинацией ДНК-вакцины и голого олигонуклеотида к PD-L1 или конъюгированного с GalNAc олигонуклеотида к PD-L1, тогда как обработка антителом против PD-L1 не добавляла какого-либо кажущегося дополнительного эффекта к вакцинации ДНК (Фиг. 12). Т-клетки CD8+, продуцирующие IFNγ, нацеленные на антигены оболочки и кора, были выявлены у большинства групп, иммунизированных ДНК (за исключением антитела против PD-L1) (Фиг. 12Б). Большинство S2-S-специфичных Т-клеток продуцировали и IFNγ, и TNFα (Фиг. 12В). Данные результаты также показаны в Таблице 20.
Таблица 20: % Т-клеток CD8+, специфичных в отношении антигена HBV (S2-S или кора) из общей популяции клеток, продуцирующих IFNγ или IFNγ плюс TNFα
ПреS2-S-специфичные Т-клетки(% клеток, секретирующих IFNγ)
Т-клетки, специфичные в отношении кора(% клеток, секретирующих IFNγ)
S2-S-специфичные Т-клетки(% клеток, секретирующих IFNγ плюс TNFα)
Средн.
Std
Средн.
Std
Средн.
Std
Носитель(Группа 10)
0,15
0,37
0,18
0,43
0,00
0,00
ДНК-вакцина(Группа 11)
1,48
1,10
0,47
0,53
0,42
1,02
ДНК-вакцина +Ab против-PD-L1
1,18
0,95
0
0
0,38
0,49
Носитель(Группа 1)
0,17
0,45
0,11
0,28
0,00
0,00
ДНК-вакцина(Группа 2)
1,70
1,02
0,27
0,51
0,98
0,90
ДНК-вакцина +ASO PD-L1
2,56
1,60
0,78
0,80
1,44
1,55
ДНК-вакцина +ASO GN-PD-L1
3,83
2,18
0,68
1,16
2,62
1,62
Пример 7 - влияние in vivo на антиген HBV и ДНК HBV в сыворотке мышей AAV/HBV
В настоящем исследовании мышей AAV/HBV модели Шанхай (см. раздел Материалы и методы) обрабатывали конъюгированным с GalNAc антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1 CMP ID NO 759_2.
Оценивали, как данная обработка влияла на уровни антигенов HBe и HBs, и ДНК HBV в сыворотке по сравнению с животными, обработанными носителем.
Протокол обработки:
В данном исследовании использовали самцов мышей C57BL/6, инфицированных рекомбинантным аденосателлитным вирусом (AAV), несущим геном HBV (AAV/HBV), как описано в Шанхайской модели в разделе Материалы и методы. Мышам (6 мышей на группу) один раз в неделю в течение 8 недель инъецировали антисмысловой олигонуклеотид CMP ID NO: 759_2 в дозе 5 мг/кг или носитель (физиологический раствор), причем и тот, и другой вводили в виде подкожных инъекций (п.к.). Образцы крови отбирали каждую неделю на протяжении обработки, а также 6 недель после обработки. Уровни ДНК HBV, HВsAg и HВeAg измеряли в образцах сыворотки, как описано ниже. Результаты для первых 10 недель показаны в Таблице 21 и на Фиг. 13. Данное исследование все еще продолжалось во время подачи заявки, поэтому данные для остающихся 4 недель не были получены.
Выявление HBsAg и HBeAg:
Сывороточные уровни HBsAg и HBeAg определяли в сыворотке инфицированных мышей AAV-HBV с использованием хемолюминисцентного иммуноанализа HBsAg (CLIA) и набора для CLIA HBеAg (Autobio diagnostics Co. Ltd., Zhengzhou, Китай, кат. № CL0310-2 и CL0312-2 соответственно) согласно протоколу изготовителя. Вкратце, 50 мкл сыворотки переносили в планшет для микротитрования, покрытый соответствующим антителом, и добавляли 50 мкл реактива с конъюгированным ферментом. Планшет инкубировали в течение 60 мин на шейкере при комнатной температуре перед промывкой всех лунок шесть раз промывочным буфером с использованием автоматической промывающей машины. В каждую лунку добавляли 25 мкл субстрата А и затем 25 мкл субстрата Б. Планшет инкубировали в течение 10 мин при RT (комнатная температура) перед измерением люминисценции с использованием люминисцентного ридера Envision. HBsAg приводится в единицах IU (международные единицы)/мл, где 1 нг HBsAg соответствует 1,14 IU. HBeAg приводится в единицах NCU (национальная клиническая единица)/мл сыворотки.
Экстракция ДНК HBV и кПЦР:
Исходную сыворотку мышей разводили в 10 раз (1:10) фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). ДНК экстрагировали с использованием робота MagNA Pure 96 (Roche). 50 мкл разведенной сыворотки смешивали в картридже для обработки с 200 мкл внешнего лизирующего буфера MagNA Pure 96 (Roche, кат. № 06374913001) и инкубировали в течение 10 минут. ДНК затем экстрагировали с использованием «Набора для маленького объема ДНК и вирусных нуклеиновых кислот MagNA Pure 96» (Roche, кат. № 06543588001) и протокола «Вирусная NA плазма SV внешний лизис 2.0». Объем элюции ДНК составлял 50 мкл.
t
Количественное измерение экстрагированной ДНК HBV проводили с использованием прибора для кПЦР Taqman (Vii7, Life technologies). Каждый образец ДНК тестировали в ПЦР в двойной повторности. 5 мкл образца ДНК добавляли к 15 мкл мастер-микса для ПЦР, содержащего 10 мкл мастер-микса для экспрессии генов TaqMan (Applied Biosystems, кат. № 4369016), 0,5 мкл праймера/зонда для кПЦР PrimeTime XL (IDT) и 4,5 мкл дистиллированной воды, в 384-луночный планшет, и ПЦР проводили с использованием следующих установок: инкубация UDG (2 мин, 50°С), ферментативная активация (10 мин, 95°С) и ПЦР (40 циклов по 15 с, 95°С для денатурации и 1 мин, 60°С для отжига и элонгации). Число копий ДНК рассчитывали из значений C на основе стандартной кривой плазмидной ДНК HBV, полученной программой ViiA7.
Последовательности праймеров и зондов TaqMan (IDT):
Прямой праймер к кору (F3_core):  CTG TGC CTT GGG TGG CTT T (SEQ ID NO: 784)
Обратный праймер (R3_core): AAG GAA AGA AGT CAG AAG GCA AAA (SEQ ID NO: 785)
Зонд Taqman (P3_core): 56-FAM/AGC TCC AAA /ZEN/TTC TTT ATA AGG GTC GAT GTC CAT G/3IABkFQ (SEQ ID NO: 786).
Таблица 21: уровни ДНК HBV, HBsAg и HBeAg в сыворотке от мышей AAV/HBV после обработки антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1, конъюгированным с GalNAc.
Физиологический раствор
CMP ID NO: 759_2 в дозе 5 мг/кг
ДНК HBV
HBsAg
HBeAg
ДНК HBV
HBsAg
HBeAg
Сутки
Средн.
Std
Средн.
Std
Средн.
Std
Средн.
Std
Средн.
Std
Средн.
Std
0
7,46
0,35
3,96
0,48
3,23
0,14
7,44
0,29
3,87
0,40
3,17
0,13
7
7,53
0,23
4,17
0,45
3,35
0,10
7,53
0,20
3,91
0,42
3,19
0,18
14
7,57
0,24
4,12
0,49
3,19
0,11
7,45
0,22
3,90
0,50
2,99
0,27
21
7,47
0,27
3,93
0,51
3,12
0,05
7,33
0,47
3,71
0,76
2,78
0,26
28
7,68
0,26
3,88
0,67
3,18
0,13
7,45
0,46
3,65
0,93
2,67
0,38
35
7,69
0,21
4,03
0,54
2,95
0,08
7,13
0,75
2,98
1,05
2,04
0,38
42
7,58
0,23
3,89
0,65
3,34
0,10
6,69
0,89
2,60
1,05
1,98
0,45
49
7,77
0,17
3,54
1,06
3,08
0,26
6,56
1,26
2,19
0,70
1,47
0,37
56
7,71
0,24
3,99
0,86
3,28
0,05
6,21
1,48
2,28
0,84
1,38
0,30
63
7,59
0,28
3,67
1,07
3,25
0,13
6,08
1,39
2,08
0,71
1,35
0,30
Из данного исследования можно видеть то, что конъюгированный с GalNAc антисмысловой олигонуклеотид к PD-L1 CMP NO 759_2 имеет значимое влияние на уменьшение уровней ДНК HBV, HBsAg и HBeAg в сыворотке после 6 недель обработки, и влияние, которое поддерживается в течение по меньшей мере 2 недель после завершения обработки.
Пример 8 - нокдаун PD-L1 in vitro в человеческих первичных гепатоцитах с использованием олигонуклеотидов к PD-L1, конъюгированных с GalNAc
Способность  антисмысловых олигонуклеотидных соединений к PD-L1, конъюгированных с GalNAc, уменьшать уровень транскрипта PD-L1 в первичных человеческих гепатоцитах исследовали с использованием геномики.
Культура клеток
6
5
Криоконсервированные человеческие гепатоциты суспендировали в WME, дополненной 10% фетальной телячьей сыворотки, пенициллином (100 U/мл), стрептомицином (0,1 мг/мл) и L-глутамином (0,292 мг/мл), при плотности приблизительно 5×10 клеток/мл и высевали в покрытые коллагеном 24-луночные планшеты (Becton Dickinson AG, Allschwil, Швейцария) в плотности 2×10 клеток/лунку. Клетки предкультивировали в течение 4 ч, обеспечивая прикрепление к чашкам для культуры клеток до начала обработки олигонуклеотидами в конечной концентрации 100 мкМ. Использованные олигонуклеотиды показаны в Таблице 21 и Таблице 8, носителем был PBS. Среду для посева заменяли 315 мкл бессывороточной WME (дополненной пенициллином (100 U/мл), стрептомицином (0,1 мг/мл), L-глутамином (0,292 мг/мл)), и в клеточную культуру добавляли 35 мкл 1 мМ маточных растворов олигонуклеотидов в PBS, и оставляли на клетках на 24 часа или 66 часов.
Получение библиотеки
Профилирование экспрессии транскриптов проводили с использованием химии Illumina Stranded mRNA на платформе для секвенирования Illumina с использованием стратегии секвенирования 2×51 п.о. парных концевых считываемых фрагментов и минимальной глубины считывания 30М на образец (Q в квадрате ЕА). Клетки лизировали в лунках посредством добавления 350 мкл буфера RLT от Qiagen, и присваивали им номер доступа по рандомизированной схеме.
мРНК очищали с использованием мининабора Rneasy от Qiagen. мРНК количественно измеряли, и оценивали целостность с использованием биоанализатора Agilent. При исходной оценке качества выделенной РНК наблюдали то, что все образцы удовлетворяли входному показателю качества 100 нг с баллами RIN (число целостности РНК) больше 7,0.
Для всех образцов получали секвенированные библиотеки с использованием препарата библиотеки Illumina TrueSeq Stranded mRNA, начиная со 100 нг общей РНК. Конечные библиотеки кДНК анализировали на распределение размеров с использованием биоанализатора Agilent (набор DNA 1000), количественно измеряли посредством кПЦР (набор KAPA Library Quant) и нормировали к 2 нМ в препарате для секвенирования. Для связывания библиотек кДНК с поверхностью проточной ячейки использовали набор для получения стандартных кластеров v5, а cBot использовали изотермически для амплификации присоединеных конструкций кДНК вплоть до клональных кластеров, каждый из которых состоит из ~1000 копий. Последовательность ДНК определяли технологией секвенирования посредством синтеза с использованием набора TruSeq SBS.
Обработка данных
Считываемые фрагменты секвенирования с парными концами Illumina длиной 2×51 п.о. картировали на человеческом эталонном геноме hg19 с использованием программы для выравнивания коротких считываемых фрагментов GSNAP. Выравнивания в формате SAM превращали в сортированные файлы выравнивания в формате ВАМ с использованием программы SAMTOOLS. Числа считываемых генов оценивали для PD-L1 на основе аннотации экзонов из RefSeq NCBI, определенной соответствующим файлом GTF для hg19. Стадию нормирования, учитывающую разный размер библиотеки каждого образца, применяли с использованием пакета R DESeq2.
Уменьшение уровня транскриптов PD-L1 после инкубирования с антисмысловыми олигонуклеотидными соединениями к PD-L1, конъюгированными с GalNAc, показаны в Таблице 22.
Таблица 22: Уменьшение уровня транскриптов PD-L1 в человеческих первичных гепатоцитах после обработки олигонуклеотидами, конъюгированными с GalNAc, n равно 4.
Соединение
Уровень экспрессии PD-L1 после 24 ч(числа, скоррекрированные в зависимости от размера библиотеки)
Уровень экспрессии PD-L1 после 66 ч(числа, скоррекрированные в зависимости от размера библиотеки)
Носитель
259
156
159
168
192
136
202
211
767_2
7
7
11
14
22
9
28
15
766_2
16
13
15
10
17
11
29
13
769_2
15
21
18
18
25
18
26
25
768_2
41
25
27
48
31
25
34
22
770_2
21
16
44
62
67
51
38
63
Все пять антисмысловых соединений, конъюгированных с GalNAc, демонстрировали значимое уменьшение уровня транскриптов PD-L1 после 24 и 66 часов инкубации по сравнению с образцами, обработанными носителем.
Пример 9 - ЕС50 конъюгированных и голых антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV
Эффективность двух голых и эквивалентных конъюгированных с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 сравнивали в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV.
Линия клеток
Клетки HepaRG (Biopredic International, Saint-Gregoire, Франция) культивировали в среде Williams E (дополненной 10% ростовой добавки HepaRG (Biopredic)). Из данной линии клеток получали линию клеток HepaRG, стабильно сверхэкспрессирующую человеческий ASGPR1 и ASGPR2, с использованием лентивирусного способа. Пролиферирующие клетки HepaRG трансдуцировали при MOI (множественность заражения) 300 с использованием лентивируса, произведенного по требованию Sirion biotech (CLV-CMV-ASGPR1-T2a_ASGPR2-IRES-Puro), кодирующего человеческий ASGPR1 и 2 под контролем промотора CMV (цитомегаловирус) и ген устойчивости к пуромицину. Трансдуцированные клетки подвергали селекции с 1 мкг/мл пуромицина в течение 11 суток и затем поддерживали при такой же концентрации антибиотика для обеспечения стабильной экспрессии трансгенов. Сверхэкспрессию ASGPR1/2 подтверждали как на уровне мРНК посредством кПЦР-ОТ (ASGPR1: 8560 раз по сравнению с нетрансдуцированными, ASGPR2: 2389 раз по сравнению с нетрансдуцированными), так и на уровне белка посредством анализа проточной цитометрией.
Клетки дифференцировались с использованием 1,8% DMSO в течение по меньшей мере 2 недель до инфекции. HBV генотипа D получали из супернатанта культуры клеток HepG2.2.15 и концентрировали с использованием осаждения с ПЭГ. Для оценки активности тестируемых соединений против HBV дифференцированные клетки ASGPR-HepaRG в 96-луночных планшетах инфицировали HBV при МОI от 20 до 30 в течение 20 ч до того, как клетки были промыты 4 раза PBS для удаления инокулума HBV.
Эффективность олигонуклеотида
Следующие олигонуклеотиды:
Голый ASO к PD-L1
Эквивалентный конъюгированный с GalNAc ASO к PD-L1
CPM ID NO: 640_1
CPM ID NO: 768_2
CPM ID NO: 466_1
CPM ID NO: 769_2
добавляли к клеткам ASGPR-HepaRG, инфицированным HBV, в сутки 7 и сутки 10 после инфекции с использованием серийных разведений от 25 мкМ до 0,4 нМ (разведения 1:4 в PBS). Клетки отбирали в сутки 13 после инфекции.
Общую мРНК экстрагировали с использованием набора для клеточной РНК в большом объеме MagNA Pure 96 на системе MagNA Pure 96 (Roche Diagnostics) согласно инструкциям изготовителя. Для анализа экспрессии генов проводили кПЦР-ОТ, как описано в Примере 5.
Данные анализировали с использованием способа 2^-ddct. Актин В использовали в качестве эндогенного контроля для расчета значений dct. Экспрессия PD-L1 приводится относительно эндгенных контролей и относительно солевого носителя.
Расчеты ЕС50 проводили в GraphPad Prism6, и они показаны в Таблице 23.
Таблица 23: ЕС50 в клетках ASGPR-HepaRG, инфицированных HBV, n равно 4.
CMP ID NO
EC50 (мкM)
640_1
2,25
768_2
0,10
466_1
5,82
769_2
0,13
Эти данные явно показывают то, что конъюгирование с GalNAc антисмысловых олигонуклеотидов к PD-L1 значительно улучшает значения ЕС50.
Пример 10 - стимулирование функции Т-клеток в РВМС, полученных от пациентов с хронической инфекцией HBV
Исследовали, могли ли голые антисмысловые соединения к PD-L1 увеличивать функцию Т-клеток пациентов, хронически инфицированных HBV (CHB), после стимулирования одноядерных клеток периферической крови (РВМС) ex vivo антигеном HBV.
Замороженные РВМС от трех пациентов, хронически инфицированных HBV, оттаивали и высевали при плотности 200000 клеток/лунку в 100 мкл среды (RPMI1640 плюс GlutaMax плюс 8% человеческой сыворотки плюс 25 мМ Hepes плюс 1% пенициллин/стрептомицин). На следующие сутки клетки стимулировали 1 мкМ белковой смесью большого белка оболочки HBV или 1 мкМ белковой смесью белка кора HBV (см. Таблицу 9) с 5 мкМ CMP ID NO: 466_1 или CMP ID NO: 640_1 или без них в 100 мкл среды, содержащей 100 пг/мл IL-12 (интерлейкин-12) и 5 нг/мл IL-7 (стимулирование конканавалином применяли только в сутки 8). Через четверо суток обработку антисмысловым олигонуклеотидом к PD-L1 обновляли с использованием среды, содержащей 50 IU IL-2. В сутки 8 после первой стимуляции клетки повторно стимулировали белковой смесью или 5 мкг/мл конканавалина А плюс антисмысловой олигонуклеотид к PD-L1 в течение 24 ч. В течение последних 5 ч стимулирования добавляли 0,1 мкл брефельдина А, 0,1 мкл моненсина и 3 мкл антитела против человеческого CD-107 (APC).
Через 24 ч клетки промывали буфером для окрашивания (PBS плюс 1% BSA плюс 0,09% азид натрия плюс EDTA), и применяли окрашивание поверхности в течение 30 мин при 4°С [антитело против человеческого CD3 (BV 605), антитело против человеческого CD4 (FITC), антитело против человеческого CD8 (BV711), антитело против человеческого PDL1 (BV421), антитело против человеческого PD1 (PerCP-Cy5.5) и окрашивание на живые и мертвые клетки (BV510) (BD Biosciences)]. Клетки фиксировали в фиксирующем буфере BD в течение 15 мин при 4°С. На следующее утро клетки пермеабилизировали буфером для пермеабилизации/промывки BD в течение 15 мин при 4°С, и осуществляли внутриклеточное окрашивание в течение 30 мин при 4°С [антитело против человеческого IFNγ (PE)]. После промывки в буфере для пермеабилизации/промывки клетки растворяли в 250 мкл буфера для окрашивания.
Измерения FACS проводили на BD Fortessa (BD Biosciences). Для анализа всю популяцию клеток сначала сортировали на живые клетки (окрашивание на живые и мертвые, BV510) и затем на клетки CD3+ (BV605). Клетки CD3+ затем обозначали на графике как CD107+ (APC) относительно IFNγ+ (PE). Результаты показаны в Таблице 24.
Таблица 24: эффект обработки ASO к PD-L1 на Т-клетки CD3+ из РВМС, выделенных от трех пациентов, хронически инфицированных HBV.
Без стимуляции антигеном
Антиген оболочки
Антиген кора
Физ.р-р
CMP 466_1
CMP 640_1
Физ.р-р
CMP 466_1
CMP 640_1
Физ.р-р
CMP 466_1
CMP 640_1
INFγ-/CD107+
1,16
4,95
4,81
4,7
9,12
8,62
3,84
9,66
7,31
2,7
3,59
2,74
2,57
3,69
3,2
3,25
3,34
2,92
3
3,87
3,98
4,59
12,5
10,9
9,23
6,11
6,88
INFγ+/CD107+
0,12
1,03
1,15
3,19
17,3
18,9
2,38
15,1
5,75
0,49
3,12
1,75
2,73
7
5,34
1,63
2,35
1,9
0,24
1,13
1,5
1,6
8,16
3,06
1,68
1,9
1,91
INFγ+/CD107-
0,33
1,43
1,08
5,11
7,74
9,47
3,14
7,76
2,83
0,61
2,9
2,26
7,84
5,79
5,78
2,33
2,82
2,95
0,17
1,57
1,72
1,22
2,58
0,99
0,1
0,61
1,04
Из этих данных можно видеть то, что сама по себе стимуляция антигеном способна индуцировать активацию Т-клеток (увеличение % клеток CD3+, экспрессирующих IFNγ и/или CD107a) в РВМС пациентов СНВ (n равно 3). Добавление антисмыслового олигонуклеотида к PD-L1 CMP 466_1 или 640_1 приводило к дополнительному увеличению ответа Т-клеток CD3+. Данное увеличение, главным образом, наблюдали в группе, стимулированной оболочкой HBV.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Ф.Хоффманн-ля Рош АГ
Рош Инновейшен Сентер Копенгаген A/С
<120>  ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ ДЛЯ ПОНИЖЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ PD-L1
<130>  P33358-WO
<160>  786
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  20064
<212>  ДНК
<213>  homo sapiens
<400>  1
ggcgcaacgc tgagcagctg gcgcgtcccg cgcggcccca gttctgcgca gcttcccgag       60
gctccgcacc agccgcgctt ctgtccgcct gcaggtaggg agcgttgttc ctccgcgggt      120
gcccacggcc cagtatctct ggctagctcg ctgggcactt taggacggag ggtctctaca      180
ccctttcttt gggatggaga gaggagaagg gaaagggaac gcgatggtct agggggcagt      240
agagccaatt acctgttggg gttaataaga acaggcaatg catctggcct tcctccaggc      300
gcgattcagt tttgctctaa aaataattta tacctctaaa aataaataag ataggtagta      360
taggataggt agtcattctt atgcgactgt gtgttcagaa tatagctctg atgctaggct      420
ggaggtctgg acacgggtcc aagtccaccg ccagctgctt gctagtaaca tgacttgtgt      480
aagttatccc agctgcagca tctaagtaag tctcttcctg cgctaagcag gtccaggatc      540
cctgaacgga atttatttgc tctgtccatt ctgagaaccc aaaggagtcc taaaagagga      600
atggaggagc ctaagaataa aaatagtata ataaaacatt tcttagacac attgaccttg      660
gcctatgtca aagttcagtc tgggtttgtc ttataacaca aggagtaaaa gtaccattgt      720
tctacctctt tttttaatac ttgaaaaaaa tttactgtgg atgcttttct atgaattaaa      780
taaccttcta aaaaatgttt tcattgctgc attcgattag attgggtaac taaatgaaat      840
taattcctca ctgttgggta taaaggttat ttacagtggt tctgtcttag ccattcactg      900
aactcattgc atatatatct ctggaatatt gctgattgtt tccttcaagt aaacttagaa      960
gtgtaactac ttagtcaaag agcctgaata ttttaaaggc cttttgaaga aaactgaaaa     1020
tgctttccag aaaggatgta tcagttgaca atgacagtcg tcaacagtat ttaaggagaa     1080
ctatgatact ctgaagaaaa acttagcctt tctcagtaaa agtaggtagg cagaggccac     1140
atgacagcag ttagagtgtg gtcttcaagg aagtcacaga aatactgtgg ggaattgaaa     1200
ccccatgtgg aaaatgtaca agagtgtctc agtgtgactg agaaggaggt tgggcatggg     1260
gtttcatgga gtttaataaa gtttggtcac ttagtagagg tttaataaat caactgtctt     1320
aatctttgat cctacttaag aatttttttt ttgtttttgt agagatgggg ctcttgttat     1380
gttgcccagg ctgttctcga actcctagcc tcaggcgatc ctccctcctc aggctccaga     1440
agtcctggga ttactggcgg gagccaccat gcaggcctct tgctcctact tttgagaaag     1500
gaagtttaac cggttttttt tgtctttttt tttttttttt tgagacagag tctcactctg     1560
ttgcccatgc tggagtgcag tggtgcaatc tcagctcact gcctcccggg ttcaagtgat     1620
tctcctgcct cagcctcccg agtagctggg actacaggca cctgccacca cgcccagcta     1680
atttttgtat ttttagtaga aatggggttt caccatattg gccaggctga tctcgaactc     1740
ctgacctcag gtgatccgcc tgcctcggcc tcccaaagtg ctgggattac aggcatgagc     1800
cactgctcct ggctgcttaa ctttttctct atctcatcct cctacccatc ctacccttgg     1860
aagatagaga agtagtatta gttccatagt gttatactgg gcttccccca gggacaaacc     1920
cacttcccca acctgaatga gccatcactt cttccccagt ttacatttca ttgctcttta     1980
aatgtctcca ttcggatatg ggaattcaca tatggtcata attcttacct gaagaagatg     2040
tcagtcttct tctcttagac caactgccct gatatgaggt ttagaggtta aagaacatgt     2100
gtgtatttac atgatctttg tattctgcct tttcgtccct cactaatgac agctgcaccc     2160
caaggaaatg gagctgtgga agagagggtt tgataagaaa ttaagtaaat attggatcta     2220
atccatcacc ctccaggaag cctttattac tcctaaaaat ttcaaccaaa ttcattaaag     2280
gacaagaact ccaccagagt aggccataaa cattggcaaa attagttgta atccatgact     2340
agatttaatg tccctttgtt ttattcccat atggttataa tgctttgctt ggcattaggg     2400
gtattttaag ttttcttctg cctagtaagt gaatttgtgt ttataataca ataatcataa     2460
aatatcacat taatatttta taactgtaca gttataaaat attttataag taatatttat     2520
attttataag taatatttta taactgtaca gttaactctg gcccaaggaa aagatagtct     2580
gatagatgct gcagccccat tttagcaaat gtgacctcac aggcctgaat gccatcgcta     2640
ttccacatct acaggataga cggaaaggaa agaaataaaa aaataggtac ctaacactgg     2700
caagaggatg atgactcatg ttatttcact taaccttttt atcttttaac atgaaggact     2760
catacaggtt gataagaaac cagtgacata aacagaccaa aaaatgatca gatctttcaa     2820
attagcaaaa aaataatatt ttttaaacaa tgggtgaaaa tacagtgtaa cagtaccaat     2880
tatcaacatg tgttgagaac cagaaaaatg ttctttttct ttgatcagca acactatttg     2940
ggaaaatcta tcctcagggc ctagcctggg gccctggcac acagtaggca ctcaacgaat     3000
atttgctgaa cacacaaata cttatgatat tttaaaaaat tggcaacaat ctgataccta     3060
acaatagagg gattaaatat tatggaactg ttaaataaga tgcttatgaa taccatgcag     3120
taagatgggc aatatttatg ccataagctt taatgaaaca aatgggtatt aaatgtatga     3180
taaggttata aattactttt taaaagatta cagggaaaaa aattgaaaga tatacactga     3240
aatgtttttt gctcacagtg gtgacaaggt ttctcagcac tggcactgtt gacgttttag     3300
gctgtatgtc tttgctgtgg gaggctggcc tgtgcactgc agggtgtttg gcagcactct     3360
tggcctctgc ccctagatag caatagcagt cctccctcaa ccagcccaat tttgacaacc     3420
aaaaatgttt ccaggcatca ccagatgctc cctgggtgag agtgatgaaa tagtagggga     3480
ttttcccctt cttttcttat tttctgtaat tccattatat tactttaata ataaagaaaa     3540
aaacataaaa aataaacgaa tgttattatt ctacgtcagt ttggatgttt ggactccatt     3600
ttggggttct ttccattata tcacttggtc tgctaaacat tctacggttt ggtaaggtga     3660
agtgattcat gaaattttgg ttttattttt ttcctgatac taaaaataaa acattctttc     3720
acttggaaat ttggacacag aacaccaaaa aaaatccata atctcatctc tctttttctg     3780
tcttttcctt ccttttttcc ctttaaaaac aataaagagt gaaacctacc tgttctccct     3840
ctaatttaat tcctaaatat aatcactgtc aatatcttgg acatttcctg tgtctaaaca     3900
cacacacaca cttttttttt tcagcaaaag tggatttctg ctacatgtag tgttctgcaa     3960
cttactttct atgtgtttac aaaatcagta catgtacata tgctgaattc agtccttaat     4020
ggtattatat tttgtgaata taccaaaatt tgtttaacca cttagacaat ctaggatatt     4080
ctcagtttgc tgttatgagc aatgctcttc ctttacatat acagacatat atatatatat     4140
gtgtgtgtgt gtgtttttgt tttagtagga tagatttcta ggagagggtg aaaggtctta     4200
tgacatccgc atttacgatt gtaataggaa gtatcaaagt gccccctaaa gaaaaaaatc     4260
ctcccattag tgggtaagaa agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga     4320
aatatttaca attgtggtca agctcataag tgaaaatggt atttcatatc ttatattttt     4380
tattgtgaga ttgaacatct ttcatatgtt tacatgtcac ctgtatttct tattctctga     4440
actatatgtt atgacctttc actttttttc ctcatgggtt atgtgtagtt tgtatagttg     4500
tcttattgat tgttaggagc tatttatata ttaggaacat taatctcctg tcttatatat     4560
acgtggcatc gattagttga tcatttgtga gttcatgtct gtatacaaag attggagagg     4620
cactaagagg gaaaacttac ctctttctta tcaaagtttg taaatatatg tataacagaa     4680
gagggagaaa atattaataa atgcacagat tggctgaaat agagtataaa tcttttactc     4740
ccctacttca acataaactg caaaaggaga gtgacttttc tttcactctg acttccgtat     4800
tcctcatgct taaaatagtg cctagcacag aagaggtgct caatcagtgt ttgctaaacg     4860
aaataattag tcacatttca agcaggatga ctaaatgaag aatagaatct aggcagatac     4920
tctggaagag tggctgtgag tcattcatat cttagtatga attagtcaaa tccaactctc     4980
tccccttccc actccccact gttagtagaa gaatctgttt attgagagaa tagatttata     5040
atttagaata agtgagaggg gcagaagagg agattttgaa ggatggcacc tgaaggagga     5100
ctagcatggc tgagacagtg aagtggaagc cttgaatagc taaagggtaa gatgaaagta     5160
tttagctgta gggggaaaaa gcattgacag gttggaaaag taaaagtcag attctccttg     5220
ctctgaaatt ttgtacaggg caggttctac taggtatgtt acaatgcaga aaaaacatga     5280
aataattgag aggaatttgg tgcaatatta tcttcttggc ttcttttgag tgggcagatt     5340
tttttcacgg cctgtaacta taataaattt gaaacttctc atcttttagt aacttttttc     5400
acttaagttt atgtggctgt gggcaatgga atgaagatat tgaacttcca attccctgtt     5460
gggtttccac aattacaagt caatcatgac tggttattag aagactattt cagttagaac     5520
caccaagtcc catattgtca tattgtatgt ttaattatta agtgaagcag tcttcttttc     5580
gtgttttcca taattagggc attccagaaa gatgaggata tttgctgtct ttatattcat     5640
gacctactgg catttgctga acggtaagac accaaatcct tccattaggt tctatatttt     5700
aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgatcattt aaaatgcatg caattttctt     5760
atagagagaa cattctattc tttcttctac tttacacaat ggcaaagtct tctttctact     5820
ttacgcaatg ataaagttac ctgtgtcatt ttgtaaaaat atagagaata tagacaaatt     5880
gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg     5940
aaatggcctg tatgtataca tttatttgtt tgctttcaac aaggccaaga tcctttgatc     6000
tttcagtctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga ggatacttta aggaagaatt     6060
gtaagataca tggaaaatgt caggctaaca cagtactggc atcaccctgt gctctttcct     6120
gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa     6180
gagatgactg ttagaatcta ccattccctc tatgtaggaa gcaaataggt gtcctgtcaa     6240
aggacattct ggggatgtct acatgaaacc aagtctccct ggttgtaagg actccatctc     6300
catataatat ttatacagta atatatgttt ataaattgtg ggggcaactt gtttagctaa     6360
ttttattatt ctgctattgg gacactgtgt ctcagcatga gatatagtgt cccaaaacat     6420
atttcaagcc cattggataa aatatgtgtt tagcaagttc ttaaatataa tgataacata     6480
accgaccaga taaagtgatt tataaacgct gtgccaattt tgtaaatgtt tcgaggaatt     6540
ttcccttttc tgaagattgt ccttctttct ttttagcatt tactgtcacg gttcccaagg     6600
acctatatgt ggtagagtat ggtagcaata tgacaattga atgcaaattc ccagtagaaa     6660
aacaattaga cctggctgca ctaattgtct attgggaaat ggaggataag aacattattc     6720
aatttgtgca tggagaggaa gacctgaagg ttcagcatag tagctacaga cagagggccc     6780
ggctgttgaa ggaccagctc tccctgggaa atgctgcact tcagatcaca gatgtgaaat     6840
tgcaggatgc aggggtgtac cgctgcatga tcagctatgg tggtgccgac tacaagcgaa     6900
ttactgtgaa agtcaatggt aagaattatt atagatgaga ggcctgatct ttattgaaaa     6960
catattccaa gtgttgaaga cttttcattc ttgtaagtcc atacttattt tcaaacagaa     7020
cagcatagtc tgttcattca ttcattcaat tcatgaattc attcacataa ttatccaatt     7080
tcttgagcac ctatttgata gtcactggaa atccagagac aaacaacaca gagccatgtt     7140
ctacagtatg tacagttttc caaaaagaat ttctagtctt tactttttta ttacaaatgg     7200
aatacgtata cttgcaaata attcagatac tgtggaagag atcaaatgaa ttgcaaaagt     7260
gtccctcctc ccttcaccac tatctcccat ggcatgcaga gagagtaacc attatttgtg     7320
tgtccctcca gaaatttttt tattcaacta ctattttttt attttattag gtccgtcagt     7380
tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gcaaataaat atattcagaa caaaccccac     7440
tgtaaggttc acattaaaaa agacttgaag tcaccctatg aagacaaaaa ataatcacat     7500
taagtgtgaa agaacctatt cttccagtac aggataagcc atacttactg ggcatatatt     7560
catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga aaaggaacta ggagtgttag     7620
ttcctcggta ttgacccaca gttatgttat caggtcactt gagttcaaag ttttgtgttg     7680
gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcac agaattgaga     7740
gctgaaagga tcccaggcag gagcagctaa tccaaactcc cacaaagaac aaaaatcccc     7800
cagaggatct tctgttctta tatttcctgc aatggcgtcc ctgtcatatc ccacaatggc     7860
ctccctgcca tttggatatc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta atagtaagct     7920
gaaatctgcc cctctagttg tagtcttggg attatttcat ttacatgatg accttttaat     7980
atttgactag aattaaatca tctccccttg gtctttccat tcctgggcta actaccatca     8040
atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtatacattt gtcactgatc actgatcaat     8100
tattaatcaa tgatcactga taactataaa ctcaaaaaca aaatcatgtg gggattaaga     8160
gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgata ctggctcagg taatgccact     8220
attgtcaaga agataccact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt taccatatgc     8280
ttctccattc atgacatctc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt ttctccagtc     8340
catccgcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca tcatgactta     8400
gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaggaa gagtataatc ctggcagtca     8460
ggaagaaggc agcataaagt ataagtttct gcttccaaaa aaggtctctc atcagcctgt     8520
agggagtgtg tagggaaggg acagctgtcc ttgtagtagg gaagggtttt attcaggtcg     8580
tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga tcaacacaat     8640
aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcctgga gcaaagcaaa     8700
tgaccaacca ggtttgagga cctgatttgt ttgacaattc cattttgtat tgtaaattac     8760
ttaattggca ttctactccc aatccatctt gtcatttgca tacagtggtt ttgggattga     8820
gttcagctat accaaaagtc tgaaccttct gcacttagaa caaggcaacc accaagcttc     8880
acttgcactg aggccgtgtc tccaatggaa atgaggcagc tggcttgcag gagcttccca     8940
actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa atgatttcac agtaatgctg     9000
ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agcttcccca caggagttta     9060
ctcaccatgg tattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt     9120
tggattcact caattatcac tatcacttcg ggtgttattg cacctttctt gtttgtgagt     9180
ttaaatgcca gactctcagg ccactaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcgctg     9240
aacctaacag cagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt cagaaccttc aatgagatta     9300
ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tgtcccgata aagctatttg gatcatatgg     9360
accaaatcga ctgctgtcat tccccaccaa ccccatctct ccccaaaatt cccagccctg     9420
tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat atcatatcat     9480
acttttctgt tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac aagcacaaag     9540
atttgggcct gttttataat attgttgcat ccccagggcc tgatatacag cagagtggtg     9600
gtacgaaaag agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga tttcctcaaa     9660
taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagatttgg atatgtgaaa atttatttcc     9720
agactgttca tcaggaactg ttagcagctt ctaaagggta cactggagca gcagtagtaa     9780
aaggaggaag aggagcagct ctgctactgc tactatcgag tactactaca attagcactt     9840
gcttattctg tgtgttaggc cctgtactga acactctgtc taaattagtt catttcctcc     9900
tggaaatgac tctagggggt aagtgcttca tcatgtaaga tgagtatttt tcacattttg     9960
ttgtgtctga aatctgagtg tgtctttcaa tgatggaatc tttgattcca tgataagtgg    10020
tattattccc attttaagga tgaggaaact gaggtccaaa gaaattaagt aatttgccca    10080
aattcaccca gcctagaaaa tgataaagct agttctaaac ccaagcagat tagctctgaa    10140
gtctgggccc ttaataacca ctttttattg cctatatttg tacctctggt gtacgtatca    10200
agttatatgt tgacttcaaa actatcatga ccttttcttg gttttgattg tccaacatta    10260
gtatagtgtt ctgggtctgc aaaaattttg attactcatc tcatctgtaa aacattttga    10320
actcgtgtgt ttgtgcatgc acatttgtgt gtaattataa aaattttact ttctgttaat    10380
atataagttg tatcataaga aactgccgtt tttgaagagc aaaaaaaggt tgaatgttac    10440
cagttacatc tggttcaacc taatagacat ttgtacaaaa acagacattt taagaggttg    10500
aaataaaaat ttaataaaca atattttcag tttttactaa ttgtgatgct tcactatcat    10560
tagctaatat gtcaaggcat aatatacctt agggtgaact ttatcattaa caaaggtgga    10620
tggtgtcaat aatcttgagg tttgtgtttt tttatataac actgcgaggt ctaattaagt    10680
acttactgtt taccacctca tacagtggcc gataaaaagt gtcacttctg ctgtttcctc    10740
tgggttgtgc ttgaattatt agtattatct tcagtcctca gtttctttgt gggaaacttt    10800
ttaattagtt gtttaatttt gtaagatggt tagtttagtc aaaattagat aagagaattt    10860
gaaaatccgt agctacccca aagcaaccta cacataagaa ctattatttt tgtgttttga    10920
aatcataatt ttattgattt ccagtgtttc cactggtagt ggtttcattg atataggagt    10980
atcaaaacat cactcattat ttatttcagt ttcatttgat cctagccgtt ttgtattaac    11040
tctctgtgaa gaaattacct cacaaatcta ttgctgtcct tggtaaagga atggagaatt    11100
aaggctctag atcattagtg gttacactat agtattagaa gtaaaaaaaa gattatacca    11160
acaaaataag aacatgttaa tgtacttgta atgaataaac atgaataaag ctcttatgct    11220
atataggtgc actaaacaat ctactagaat tgtcagcaaa ctacgtatct taatcctgaa    11280
agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattactt    11340
aaatgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tgtaaatatc ataatgtggt    11400
atcctagata gcatcccaga acagaaaaag gatattaggg aaaaactgga ggaatggaat    11460
aaattatgca gtttagttat taataatgta ctaacgtcct tagttatgac gattgtacca    11520
tggtaatgta agatactaac aatagaggaa accgggtaag gagtatacag taactctata    11580
ctatctttgc aacttttttg taaatttaaa acttctaaaa taaagaacaa atttaaacat    11640
taaaaagtat caccaggaac atatatcact gtttacagat gaaatactat gtattttcat    11700
atctaatttc tgatcattga cttcaaatca gaaaagtgaa tgacacctca aaatcaggtt    11760
ttctgtttac tgaagtctaa gaaaagaaag cataccagct ggagagattc atgtttataa    11820
agacagattt ataacaacaa aaataaaata tccaagaata aatttaagaa gaagcacttt    11880
actgagaaac atatgaaaac ctgaacaaat ggagagggat attttgtatt tgaatagaaa    11940
gacttctggt ttaaagataa ttctctttaa attatttttt gtagaaattt aaggggtaca    12000
agagcagtgt tgtcacatgg atatattaca tagtggtgaa gtctggggtt ttagtgtaaa    12060
ttaatcttta cattttgttt gagcccaata aatgtaccaa catgattttt atagaaagat    12120
agtcattcct attaatccaa acttgtccca actttgaatt gaattgaggc agagctagca    12180
ggtgttcccc acggctgagg catctgaaca ttaagcatat ccctctgaga accagcctgc    12240
attgatactc tttctaatgt ggacagcatc aagctatgta cgtagttctg tgctcagcaa    12300
aagccctgac ttctttttgt ttatgtccta gccccataca acaaaatcaa ccaaagaatt    12360
ttggttgtgg atccagtcac ctctgaacat gaactgacat gtcaggctga gggctacccc    12420
aaggccgaag tcatctggac aagcagtgac catcaagtcc tgagtggtaa gaccaccacc    12480
accaattcca agagagagga gaagcttttc aatgtgacca gcacactgag aatcaacaca    12540
acaactaatg agattttcta ctgcactttt aggagattag atcctgagga aaaccataca    12600
gctgaattgg tcatcccagg taatattctg aatgtgtcca ttaaaatatg tctaacactg    12660
tcccctagca cctagcatga tgtctgccta tcatagtcat tcagtgattg ttgaataaat    12720
gaatgaatga ataacactat gtttacaaaa tatatcctaa ttcctcacct ccattcatcc    12780
aaaccatatt gttacttaat aaacattcag cagatattta tggaatatac cttttgttcc    12840
atgcattgta gtactcattg gatacacata gaataataag actcagttca cactcttcag    12900
gaaacagata aaaaactaag aaacaaacaa aaaacaggca atccaacacc atgtgggaaa    12960
tgctttcata gccgggaaac ctggggaata cctgagagga atactcaatt caggccttgt    13020
ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag ctgcttccct ctttccaggg tggcaggaaa    13080
taaatggaac atatttttct atcttatgcc aaacatgagg gaccctttct ccccggtgcc    13140
tctcccaagg tagtctacaa tatttcaact ctagcagtct gcttagtgca tagaacatga    13200
ggctgtgtgt ccctgggcaa attactagac ttctgtgtgc ttcactttcc ctgtaggatt    13260
ataatctact gagcaagctt attgtaaggg tcagattagc aacagtgtat gaaaatgatt    13320
tgagaccatt gcctgcacaa attcaactat ttttttttat ctcactactc tacagaagta    13380
ggtagggtgg gagacagagt ctgatgagag gctcagaatg tgaaagaaag tgaggcgagt    13440
gagcatgata tttaatataa acacaaagat attctgagaa gagctgctca ctgccccctc    13500
ccccaataca tgttgatagg aaaatgccac gtacttcagc aaaaacaact gaaaaattag    13560
atagaaaagt caatcaatag gaaaagataa tccaggacgg tgttgtgaac agaaagaggg    13620
ggaaaaaact ttagaaaatg atggggatgc tcttactggg gtacgagtcc tcaggtattg    13680
aactggcttt cagtaaaagc tagattagtg ggttcctgcc atttacaagc tgttttatga    13740
caacttactt gttgggtggc ctacagtaac tcacctaact gcactgagtc tgtttcctca    13800
tctgtaaatt ggggattttt ttttaaatac ctggcatgcc taactcataa agttgttctg    13860
aaactgaaat aaaacatacg tgaacaggca ttgtaaactg taagttacgg aaaaagctgg    13920
ctgttgttgt gtctttaaag tttcacctgg gtagtcaaag atggatcatg ggtctcagtg    13980
gagagctgag ccaggcagga gctgactaag ggtgagaggt gggagttagc agcctctgaa    14040
catctgtgta ccatgggacc ccctttcctc ctgcatggta ccccagacaa ggagcctagt    14100
aagagatact aatggcttgt tgtccagaga tgttcaaact gcagagaaag ataagacaac    14160
aagcattggc ctccaatcat gatgacagat aggaggaggt gggagctcct tagcagtgct    14220
ggttggcctt ccatgttcta ctgtgggcca tctctgccat gtactgtagg ctactagctt    14280
ctatattaaa gaatgcaaga ggggccagga gcggaggctc atgcctgtaa tctcagcact    14340
ttgggaggcc aaggtgggca gatcacttga ggtcaggagt ttgtgaccag cctggccaac    14400
atggtgaaac tctgccttta ctaaaaatat aaaaattagc tgggtgtggt ggtgtgcacc    14460
tgtaatccca gctactcggg agactgaggc acaagaattg cttgaacctg ggaggcggaa    14520
gttgcagtga gcccagattg cgccactgca ctccaccctg ggcaacagag aaagactctg    14580
cctcaaaaaa aaaaaaaaaa agcaagagga agtgaaataa tcaaggccgc catttaatag    14640
tgagcagcca ctccatgtgg tactgtgcaa gcacattata aatattagcc tcacaagaaa    14700
tgtattagca tttgtatttt gtacactggt taagtatctt gcccaagacc tcaaaactgg    14760
ttaagggcag cagaatttag ccccagcacc accttttcaa agcctgggct tctcacactt    14820
ctccatgctg ttcccatttt aacacaggta tctcgccatt ccagccactc aaactttggc    14880
atttaagaaa attatcctaa agctaaacta aacttcaagg atgaccattc tcctgacccc    14940
ttcccatcaa aattttatct ttagtcagtt tgttttcgtt ttgttttgtt tttcagaact    15000
acctctggca catcctccaa atgaaaggac tcacttggta attctgggag ccatcttatt    15060
atgccttggt gtagcactga cattcatctt ccgtttaaga aaaggtagta tttccttaat    15120
tgcagtggtc tccactgggg gtgaggaagg ggtgagaatt ggatcatggc tgcaaggaaa    15180
cccgacttaa cctctgcaag gtggtgcaaa ggcattccac tgttcaacag caattatatt    15240
gaagctgagt gggatcactg ggtgaagatg aagcgtaagg ggtgaggggc aggagaatgg    15300
gtatggatgg aggtagaaga tgcagtgtca tacagttttt ttctatcatg aaaataacca    15360
cagacttaca gaagagaaag agctaaaatg cccgtcattt tcagttgcat tttagtcttg    15420
cattagttgc aaccagctgg tttctgggta ccctaagtaa taaaaatagt tcctctgtag    15480
aactgtagta tgtttaccat agagtatttt gcaaaatttt tggtagagga tgttacataa    15540
tttgcatgtg ttcatttctc catttacctg tgggaacaat taaaatccag gaaaatgagt    15600
atattcaaat aatttcctcc catttaagat gagtcagagt aaataattcc tccaatactt    15660
agagaagtat accaagagat ccagtgatgg tatagagttg tctgatgtta aatagggaag    15720
tagaatatgg aaggggattc caatagtcgt tgaaaaattc cccataaccc cttacatggg    15780
ggaaagtagt gttaactgag agagtagaga taagctgttt ccaaaaatta tattcttaac    15840
aggactgaga tagccagaat ataaggatca agtttcaatg acagtaagat cctgagatgg    15900
agttgatttg cacaaagaaa taattgttgc cagcatgcat tttgaatatt tctctggaaa    15960
aaaagattag ttggcagtag aaatggatag aaatcaatag atattaaaat acctcagaat    16020
ttggttcatc tctgggaaaa gatgaaaaat aaaagtgtat actcctcaag aacatctagg    16080
atcaaaagca tgtgccctac actattgaat taattaacct cataagttgg gacctgtgga    16140
ataaggatgt ccaccagact tcctagggat tacaaatgtt tcacagaact tgaaatttaa    16200
acttgggtca ctgtatggga tgtagagctg tgctatatgg aaataaaaat gatttctttt    16260
tctcaaggga gaatgatgga tgtgaaaaaa tgtggcatcc aagatacaaa ctcaaagaag    16320
caaagtggta agaatatcag aaggaattgg gaagtaaaag tcaaaggaaa caaaaagcta    16380
aagcaataac aaagagaaat ccatcagtca taatctcctc tccttttaaa gaatgctggt    16440
tcccctttgc ctcacagcta acacaagaac tcctccaccg tctgaggagg tttaggagca    16500
gggaagggga aggagtcagc ttcatttgct aatcttctgt tgccctgcac cctagcagct    16560
ccttgcagca ggggacaagg atgacttagg tggatggata attaattgat tctaaaatat    16620
tgtgtgtcag tattgtaata ctatgttaat tgcaccatgc acggtatctc atttaatccc    16680
ccaccccttg ccattaccaa agagagagag agagagagag agagaaatac tagaatttat    16740
cctcatttta cagtagagaa aacagagggt caagaagata atgtaaagtg cccaagaaca    16800
cacagctgat cacaaaaatc aagcttgggg gccattagcc taaccacaga cccttactct    16860
taacccatct gcttcaatcc attttgctac aaatgtttac atttataagc agggcagaaa    16920
aacctcatcc aggttattga actaagaaga aagttatatt aaggtttcta atttttttaa    16980
tgtagttaga aaccaaactt aacaatgagc ccaagtttaa agcagtctaa ttaacctgga    17040
caagctcagg caagtttcat tctgtggccc atagcatcat ctgtgttgta aagctaagta    17100
gcaaatgttg tttgggtcat gctgggggac aagccatccc aatttgctca ggactgaggg    17160
gttttccagg atatcatgta aggataattg ggtacaaata taacctgctg ctttctctca    17220
tttcaaattt atcatttatc atatcagcaa ctatgagtta tgttttttat tagatttctt    17280
gttacttttt ccccagacca cttcccatga aattaatata ctattatcac tctccagata    17340
cacatttgga ggagacgtaa tccagcattg gaacttctga tcttcaagca gggattctca    17400
acctgtggtt taggggttca tcggggctga gcgtgacaag aggaaggaat gggcccgtgg    17460
gatgcaggca atgtgggact taaaaggccc aagcactgaa aatggaacct ggcgaaagca    17520
gaggaggaga atgaagaaag atggagtcaa acagggagcc tggagggaga ccttgatact    17580
ttcaaatgcc tgaggggctc atcgacgcct gtgacaggga gaaaggatac ttctgaacaa    17640
ggagcctcca agcaaatcat ccattgctca tcctaggaag acgggttgag aatccctaat    17700
ttgagggtca gttcctgcag aagtgccctt tgcctccact caatgcctca atttgttttc    17760
tgcatgactg agagtctcag tgttggaacg ggacagtatt tatgtatgag tttttcctat    17820
ttattttgag tctgtgaggt cttcttgtca tgtgagtgtg gttgtgaatg atttcttttg    17880
aagatatatt gtagtagatg ttacaatttt gtcgccaaac taaacttgct gcttaatgat    17940
ttgctcacat ctagtaaaac atggagtatt tgtaaggtgc ttggtctcct ctataactac    18000
aagtatacat tggaagcata aagatcaaac cgttggttgc ataggatgtc acctttattt    18060
aacccattaa tactctggtt gacctaatct tattctcaga cctcaagtgt ctgtgcagta    18120
tctgttccat ttaaatatca gctttacaat tatgtggtag cctacacaca taatctcatt    18180
tcatcgctgt aaccaccctg ttgtgataac cactattatt ttacccatcg tacagctgag    18240
gaagcaaaca gattaagtaa cttgcccaaa ccagtaaata gcagacctca gactgccacc    18300
cactgtcctt ttataataca atttacagct atattttact ttaagcaatt cttttattca    18360
aaaaccattt attaagtgcc cttgcaatat caatcgctgt gccaggcatt gaatctacag    18420
atgtgagcaa gacaaagtac ctgtcctcaa ggagctcata gtataatgag gagattaaca    18480
agaaaatgta ttattacaat ttagtccagt gtcatagcat aaggatgatg cgaggggaaa    18540
acccgagcag tgttgccaag aggaggaaat aggccaatgt ggtctgggac ggttggatat    18600
acttaaacat cttaataatc agagtaattt tcatttacaa agagaggtcg gtacttaaaa    18660
taaccctgaa aaataacact ggaattcctt ttctagcatt atatttattc ctgatttgcc    18720
tttgccatat aatctaatgc ttgtttatat agtgtctggt attgtttaac agttctgtct    18780
tttctattta aatgccacta aattttaaat tcataccttt ccatgattca aaattcaaaa    18840
gatcccatgg gagatggttg gaaaatctcc acttcatcct ccaagccatt caagtttcct    18900
ttccagaagc aactgctact gcctttcatt catatgttct tctaaagata gtctacattt    18960
ggaaatgtat gttaaaagca cgtattttta aaattttttt cctaaatagt aacacattgt    19020
atgtctgctg tgtactttgc tatttttatt tattttagtg tttcttatat agcagatgga    19080
atgaatttga agttcccagg gctgaggatc catgccttct ttgtttctaa gttatctttc    19140
ccatagcttt tcattatctt tcatatgatc cagtatatgt taaatatgtc ctacatatac    19200
atttagacaa ccaccatttg ttaagtattt gctctaggac agagtttgga tttgtttatg    19260
tttgctcaaa aggagaccca tgggctctcc agggtgcact gagtcaatct agtcctaaaa    19320
agcaatctta ttattaactc tgtatgacag aatcatgtct ggaacttttg ttttctgctt    19380
tctgtcaagt ataaacttca ctttgatgct gtacttgcaa aatcacattt tctttctgga    19440
aattccggca gtgtaccttg actgctagct accctgtgcc agaaaagcct cattcgttgt    19500
gcttgaaccc ttgaatgcca ccagctgtca tcactacaca gccctcctaa gaggcttcct    19560
ggaggtttcg agattcagat gccctgggag atcccagagt ttcctttccc tcttggccat    19620
attctggtgt caatgacaag gagtaccttg gctttgccac atgtcaaggc tgaagaaaca    19680
gtgtctccaa cagagctcct tgtgttatct gtttgtacat gtgcatttgt acagtaattg    19740
gtgtgacagt gttctttgtg tgaattacag gcaagaattg tggctgagca aggcacatag    19800
tctactcagt ctattcctaa gtcctaactc ctccttgtgg tgttggattt gtaaggcact    19860
ttatcccttt tgtctcatgt ttcatcgtaa atggcatagg cagagatgat acctaattct    19920
gcatttgatt gtcacttttt gtacctgcat taatttaata aaatattctt atttattttg    19980
ttacttggta caccagcatg tccattttct tgtttatttt gtgtttaata aaatgttcag    20040
tttaacatcc cagtggagaa agtt                                           20064
<210>  2
<211>  20261
<212>  ДНК
<213>  macaca fascicularis
<400>  2
gtaaaatcaa ggtgcgttca gatgttggct tgttgtaaat ttctgtttat attaataaca       60
taccaaatgt ggatttgttt taatcttcgg aactctttcc ggtgaaaacc tcatttacaa      120
gaaaactgga ctgacaggtt tcactttctg tttcatttct atacatagct ttattcctag      180
gacaccaaca ccactcgcta cccaaactga aagcttcccc gattccgccg aaggtcagga      240
aagtccaatg ccgggcaaac tggatttgct gccttgcgca gaggtgggcg ggaccccgcc      300
tccgggccgg gcgccaagtt gagcagctgg cacgcctcgc gaagccccag tcctgaagcc      360
ccagtcctgc gctgcttccc gaggctccgc accagccgcg cttctctctg cctgcaggta      420
gggagcgttg ttcctccgca ggtgcccacg gcccagcatc tctggctaac tcgctgggca      480
ccttaggacg gaggatctct acaccctttc tttgggatgg agagaggagg agggaaaggg      540
aaggcgatgg tctagggggc agtagagcca attacctgtt ggggttaata agaacaggca      600
atgcatctgg gcttcctcca ggcgcaattc agttttgctc taaaaataat ttatacctct      660
aaaaataaat aaggtgggta gtataggata ggtagtcatt cttatgcgac cgtgtgttca      720
gaatatagct ctgatgctag gctggaagtc tggacacggg tcctagtcca ccgtcagctg      780
cttgctagta atatgacttg tgtaagtcat cccagctgca gcagataagt aagtctcttc      840
ctgcgctaag cacgtccagg acccctgaac ggaatttatt tgctctgtcc attctgaaaa      900
cccaaaggag tcctaaaaga ggaatggagg agcctaagaa taaaaatagt ataataaaac      960
atttcttaga catgttgacc ttggcctatg tcaaagttca gtctgggttt gtcttataac     1020
ataaggagta aaagtaccat tgttctacct ctttttttaa tacttgaaaa aaaatttact     1080
gtagatgctt ttctattaat taaataacct tctaaaaaat gtttttagtg ctgcattcga     1140
ttaggttgga taactaaatg aaattaattc ctcactgttg ggtataaagg ttatttacag     1200
tggttctgtc ttagctattc actgaacatc attacataga tatctctgga atattgctga     1260
ttgtttccgt caataaactt agaagtgtaa ctacttagtc aaagagactg aatattttaa     1320
aggcattttg aagaaaactg aaaatgcttt ccagaaagga tgtatcagtt gacaatgatg     1380
gttgtcaaca gtatttaagg agaactatga tactctgaag aaaaacttag cctttctcag     1440
tagaagcagg taggcagagg ccacatgaca gcagttagag tgtggtcttc aaggaagtca     1500
cagaaatact gtggggaatt gaaaccccaa gtggaaaatg tacaagagtg tctcagtgtg     1560
actgagaagg aggttgggct tggggtttaa cttaagaatt tttttctttt tcttttgtgg     1620
agatagggct tttgttatgt tacccaggct ggtcttgaac tcctagcctc aggcgatcct     1680
cccgcctcag gctgcagaag tcctgggatt actggccgga gccaccatgc aggcctcttg     1740
ctcctacttt tgagaaagga agcttaacct tttttttttg tttgtttgtt tttgtttttt     1800
gttttttttg agacgagtct cactctgttg cccaagctgg agtgcagtgg tgccatctca     1860
gctcacggca acctctgcct cctgggttca agtgattctc ctgcctcagc ctcccgagta     1920
gctgggacta caggcaccca ccaccacgcc cggctaattt ttgtattttt agtagagatg     1980
gggtttcacc atattggtca ggctgatctc gaactcctga ctcaggtgat ccacctgcct     2040
cagcctccca aagtgctggg attacaggcg tgagccaccg cgcctggcca cttgactttt     2100
tctctatctc ttccttctac ccatcctacc cttggaagat agagaagtaa tatcagttcc     2160
atcgtgttat actgggcttc ccccagggac aaacccactt ccccaacctg aatgagccat     2220
cacttcttcc ccagtttaca tttcattgct ctttgaatgt ctccgttcgg atatgggaat     2280
tcacatgtgg tcataattct tacctgaaga agactgacgt cttcttctct tagaccaact     2340
gccctgatgt gaggtttaga ggttaaagaa catgtgtgta tttacatgat ctttgtattc     2400
tgccttttcg tccctcacta atgacagctg aaccccaagg aaatagagct gtggaggaga     2460
gggtttgatg agaaagtagg taaatattgg atctaatcca tcatcttcca ggaaacctcc     2520
attacttcta aaaatttcaa ccaaattcgt taaaggacaa gaactccacc agagtagggc     2580
cataaacatt ggcaaaatta gttgtaatct atgactagat ttaatgtccc tttgttttat     2640
tcacatatgg ttataatgct ttgcttggaa ttaggggtat tttaagtttt cttctgccta     2700
gtaagtgtat ttgtgcttat aatacaataa ttataaaata tcacattaat attttataac     2760
tgtacagtta actctggccc aaggaaaaga tagtccggta gatgctgcag cctgattttg     2820
tatctaaccc tggcaagagg ataatgactc atgttatttc acttaccctt tttatctttt     2880
aacatgaagg gctcatatag gtcaataaga aaccagtgat ataaacagac caaaaaatga     2940
tcagatcttt cacattagca aaaaaaaata ttttttaaac aatacccaac tgggtgaaaa     3000
tacagtgtaa cagtaccaaa tatcaacatg tgtcaagaac cagaaaaatg tttgttttct     3060
ttgatcagca acactatttg aggaaatcta tcctcagggc ctagcctggg gcctggcaca     3120
cagtaggcac tgaacaaata tttgctgaac acacacatac ttatgatatt tttaaaattg     3180
gcaacaatcc aatacccaat aatagaggaa ttaaatatta tagaactgtt caataagatg     3240
cttacgaata tcatgcagta agatgggcaa tatttatatc ataagcttaa atgaaacaaa     3300
tgggtattaa aggtatggta aggttataaa ttacttttta agagattaaa gggaaaagac     3360
tgaaagatat atactgaaat gctcacagtg gtgacaaggt tccccagcct tggcactatt     3420
gacattttgg gctatgtctt tgctgtggga ggctggcctg tgctctgcag gaggtttggc     3480
agcactcttg gtttctaccc ctagatagca gtagcaaccc tccctcaacc agcccaattt     3540
tgacaaccaa aaatgtttcc aggcatcacc agattctccc tgggtgagag tgatgaaaca     3600
gtaggtgatt ttccccttct tttctcattt tctgtaattt tgtcacatta cgttaataat     3660
aaggaaaaaa cataaaaaat agatgaattt attattctac ctcagtttgg atgtttggac     3720
tccctttggg ggttctttcc attatatcac ttggtctgct aaacagtcta tggtttggca     3780
aggtgaaatg attcatgaaa ttttgttttt attttttacc tgatactaaa agtaaaacat     3840
tcattcgctt gaaaatttgg acacagaaca ccaaaaaaaa tccataatct catctctctt     3900
tttctgtctt ttccttcctt ttttcccttt aaaaacaaga gtgaaaacct accggttctc     3960
cctccaattt aattcctaaa tataatcact gttaacatct tggacatttc ctgtgtctaa     4020
acacacatac tcactttttc ttttttttag caaaaagtgg atttctgcta catgtagtgt     4080
tccgcaactt cctacatgtt tacaaaatca gtacatttac atatgctgaa ttcagtcctt     4140
aatggtatta tattttgtga atataacaaa atttatttaa ccacttagac aatctaagat     4200
attctcagtt tgctgttatg agcaatgctc ttcctttaca tatacatata tatgtgtgtg     4260
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg ttttagtagg atagatttct aggagagggc     4320
gaaatgtcat atgacatcca catttacaat tgtaatagga agtatcaaag tgccccctaa     4380
aaaaaaaaat tcctcccatt agtgtgtgag aaagcctatt tgttcatatc ttcacaaaca     4440
ctaaatatta gaaatattta caattgtgtt caagctaaga agtgaaaaat ggtatttcat     4500
atcttataat ttttgttgtg agattgaaca tatttcctat gtttacatgt cacctgtatt     4560
tcttattctc tgaactatac gttatgacct ttcacttatt ttcctcatgg gttatgtgta     4620
gtttgtgtag ttgtcttatt gattgttagg agctatttat atattaggaa cattaatctc     4680
ctgtcttata tgtatgtggc attgattagt tgatcatttg tgagttcatg tctgtataca     4740
aagattagag aggcagtaag agggaaaact tacctctttc ttatcaaagt ttgtaaatat     4800
atgtataaca gaagagagag aaaacattaa taaatgctga aataaagtat aaatttttta     4860
ctccactact tcaacataaa ctacaaaagg agagtgactt ttctttcatg ctgacttcca     4920
tattccccat gcctaaaata gtgcctagca cagaagaggt gctcaatcag tgtttgctaa     4980
atgaaagaat tagtaacatt tcaagcagga tgactaaatg aagaatagaa tctaggcaga     5040
tactctggaa gagtgactgt gagtcattca tggtcttggt atgaattagt caaatccagc     5100
tttctcccct tcccactccc cactgttagt agaataatct gtttattgag agaatagatt     5160
tataatttag aataagaggg gcagaagagg agattttgaa ggatggcacc tgaaggagga     5220
ctagcatggc tgagatagtg aagtggaagt cttggaaagc taaagggtaa gatgaaagta     5280
tttagccgta gggggaaaaa gcattgacag gttggaaatg taaaagtcag attctccttg     5340
ctttgaaatt ttgtacaggg caggttctac taggtatgtt acaatgcaga aaaaacatga     5400
aatagttgag aggaatttgg tgaaatatta tcttcctggc ttcttttgag tgagcagatt     5460
tttttcaggg cctgtaacta taataaattt gaaacttctc atcttttagt aacttttttc     5520
acttaagttt atgtggctgt gggcaatgga atgaaggtat tgaacttcct attccctgct     5580
gggtttccac aattacaagt caatcatgac tggttattag aagactattt caattagaac     5640
caccaagtcc cataatgtca tattgtgtgt ttaattatta agtaaagcag tcttcttttt     5700
gtgttttcca taattagcac attccagaaa gatgaggata tttgctgtct ttatattcac     5760
gatctactgg catttgctga atggtaagac accaaatcct tccattaggt tctatatttt     5820
aaatatttta accatgagtt taaaactaaa atgataattt aaaatgcatg caattttctt     5880
atagagagaa tattctcttc tttcttctac tttacacaat gacaaagtct ttcttctgct     5940
ttacacaatg ataaagttcc ctgtgtcatt gtgtaaaaat atagagaata tagacaaatt     6000
gaaagacaca aaataatcta ttacccattt cccagggtta actactgaaa atatctgggg     6060
aaatggcctg tatgtatata tttatttgtt tgttttcaac aaggccagga tctttcaatc     6120
tttcaatctt ggttgctctg tgacatgcct ttcctgatga gaatactcta aggaagaatt     6180
gtaggataca tggaaaatgt cagggtaaca cagtactggc accaccctgc ggtcctttct     6240
gaactccata ccaatgtact tcttgccaga aaactgatca aaagtttagg gaagtaaaaa     6300
gagatgttag aatctaccat tccctctatg taggaagcaa ataggtgtcc agtcaaagga     6360
cattctgggg atgtctacat gaaaccaagt ctcctggttg taagtactcc atctccatat     6420
aatatttcta cagtaatata tgtttataaa ttgtgggggc aacttgttta gctaatttta     6480
ttattctgtt attgggacac tatgtctctg catgagacat agtgtcccaa aacatatttc     6540
aagcccattg gataaaatat gtatttagca agttcttaaa tataatgata acataactga     6600
ccagataagg tgatttttaa atgctgtgcc aactttataa atgttttgag gaattttccc     6660
ttttctgaag gttattcttc tttcttttta gcatttactg tcacggttcc caaggaccta     6720
tatgtggtag agtatggcag caatatgaca attgaatgca aattcccagt agaaaaacaa     6780
ttagacctga cttcactaat tgtctattgg gaaatggagg ataagaacat tattcaattt     6840
gtgcatggag aggaagacct gaaggttcag catagtaact acagacagag ggcccagctg     6900
ttgaaggacc agctctccct gggaaatgct gcacttcgga tcacagatgt gaaattgcag     6960
gatgcagggg tttaccgctg catgatcagc tatggtggtg ccgactacaa gcggattacc     7020
gtgaaagtca atggtaagaa ttattataga tgagaggcct gatctttata gaaaacatat     7080
tctaagtgtt gaagactttt cattcttata agtccatact tattttcaaa cagaatagca     7140
tagtctcttc attcattcat tcagttcatg aattcattca cgtaagtctc caattagcat     7200
ttcttgagca cctatatgat agtcattgga aatccagaga caacacagag ccatgttcta     7260
cggtatgtac agttttccaa aaataattcc tagtctttac ttttttatta taaatgtaat     7320
acatatactt gcaaagaatt cagatactat ggaagagatc aaatgaattg caaaagtgtc     7380
cctcctccct tcaccactat ctcccatgag ataaccaaga gacactccaa gagagtaacc     7440
attatttgtg tgtccctcca gaaccttttt tattcaacta ccattttttt attttattag     7500
gtctgtcagt tttccttttt tgagcctctc tatatcaaat gctaataaat atattcagat     7560
caaaccccac tgtaaggttc atattaaaaa agacttgaag tctccctatg aagacaaaaa     7620
ataatcatat taagtgtaaa agaacttatt cttccagtac agtataaact atactcactg     7680
ggcatatatt catcttgaaa atctatactg atgttgtctt ggggaattga agaggaacta     7740
ggagtgtcaa ttcctgggaa ctgacccaca gttatgtcat caggtcactt gagttcgaag     7800
ttttgtgttg gcactagcta agtaaaggaa aacacctctg ctttcattgt tgagtttcat     7860
agaattgaga gctgaaagga tcccaggcag gagcgactaa tccaaactcc cacaaagaac     7920
aaaaatcccc cagaggatct tctgttcata tatttcctgc agtggcatcc ctgtcatatc     7980
ccacaatggc atccctgcca tttggactcc ccttccatat cctgttgaaa ttactcccta     8040
atagtaagct gaaatctgcc cctctagttg tagttttgga attatttcat ttccatgatg     8100
accttttaat atttgactag aattaaatca tctccccttg gtatttccat tcctggacta     8160
actaccatca atctgagggc taacaataca agtagaaaaa gtctacactt gtcattgatc     8220
actgatcaat gattaatcaa tgatcactga taattataaa ctcaaaaaca aaatcatgta     8280
gggattaaga gaaatgtatc agttttatgt tgtatttctg gtccctgatt ctggctcaaa     8340
taatgctact attgtcaaga agatatcact tgtaaagtag atttaatttt cattatattt     8400
taccatgtgc ttctccattc acggcatttc ttgagatgtt gtggtttata ctttcagttt     8460
ttctccagtc catcagcaaa tatcaggcat ctactgtgtt ccaagatatt aaagaaatca     8520
tcatgactta gcctcatcaa cagcattgct agatctggga tggaaaagaa gagtataatc     8580
ctggcagtca ggaagaaggc tgcataaagt ataagtttct gcttccaaag aagatctctc     8640
atcagcctgt agggagtgta tagggagggg acagctgtcc ttgtagtagc aaagggtttt     8700
attcaggtca tctgggctcc ataatatccc ttgtgtatct gcagtctcct ttgccatgga     8760
tcaacacaat aggaaatctt ccggcactga tggtttttcc aagggggagt tcttcaggga     8820
gcaaagcaaa tgaccaacca ggtttgagga cctgatttga caattccatt ttgtatttta     8880
aattagttaa tttgcattct agtcccaatc catcttgtca tttgcagaca gtggttttgg     8940
ggttgagttg agctatacca aaagtctgaa ccttctgcac ttagaacaag gaaggcaacc     9000
accaagcttc acttgcactg aggcagtgtc tccaatggaa acgaggtagc tggcttgcag     9060
aagctttcca actcagggaa gtagaactcc tgagtcacct ccatatgcaa ataatttcac     9120
agtactgctg ttgaacttca cttcccatca cagcaaatgt gtggtaacat agctttgcca     9180
caggagttta ctcaccatgg gattttaaag gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag     9240
aatttagttt tggattcact caattatcat gatcactttg ggtgttattg cacctttcat     9300
gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct     9360
ttaatcactg aacctaatag tagggaaaac gaaatgttca ttcagacttt caggaccttc     9420
aatgagatga ggcagctgaa agatcaaagt gttgcatagt tatcccagta aagctatttg     9480
gatcgtatgg accagatcaa ctgctgtcat tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt     9540
cccagccctg tttaagtgtt ctctgtagca tttatctcta tctagtatat tgtgtagcat     9600
atcatatcat acttttctat tttgtttatt gtctctctcc tcctagaata taaactccac     9660
aagcacagag atttgggtct gttttttaat attgttgtat ccccagggct tgacgtaaag     9720
cagagtggta gtatgacaaa agcacacaaa aaaatatttg ttgagtcaat gaatgaatga     9780
tttcctcaaa taggattagc ctaaaatttt ggaaacatga acagacttgg atatatgaaa     9840
atttatttcc aaaactgttc atcaggaact gttagcacct tctaaagggt acactgaagc     9900
agcagtagta aaaggaggag gaggagaagc agctctgcta ctactattat cgagtactac     9960
tacaactatc gagtactact acaactatcg agtactacta caattagcac ttgcttattc    10020
tgtgtgttag gtcctgtact gaacattctg cctaaattag ttcatttcct cctggaaatg    10080
actctgtggg gtaggtgctt catcatgtaa gatgagtatt tttcacactt cactgtctct    10140
gaaatctgag tgtgtctttc aatgatggaa tctttgattt catgataagt ggtattattc    10200
ccattttaag gatgaggaaa ctggggtcca aagaaattaa gtaatttgcc caaattcacc    10260
tagcctcgta aatgataaag ctagttctaa atccaagcag attggctctg aagtctgggc    10320
ccttaataac cacttattgc ctgtatttgc acctctggtg tatgtatcaa gttatatatt    10380
ggcttcaaaa ctatcatgac cttttcttga ttttgattgt tcaatattag tatagtgttc    10440
tagatctagt agaccagggg tctgcaaaaa attttgatta ctcacctcat ctgtaaaaca    10500
ttttaaactt gtgtgtctgt gcaggcacat ttgtgtgtaa ttataaaaaa tttactatct    10560
attaatatat aggttgtacc gtaagaaaaa ttgccatttt tgaagagcaa aaaaggttga    10620
atattaccag tttcatctgg ttcaacctaa tagacatttg tacaaaaaca gacattttaa    10680
gaggatgaaa taaaaattta ataaacaata ttttcaattt ttactaattg tgacgcttca    10740
ctattgttag ctaatatgtc aaggcatgat ataccttagg gtggaattta tcattaacaa    10800
aggtggatag tgtcaataat cttgaggttt gtgttttttt atataacact gtgaggtcta    10860
attaagtact taattgttta caacctcata cagtcgccaa taataagtgt cacttctgct    10920
gtttcctctg ggttgtgctt gaattattag tattatcttc aatcctcagt ttctttgtgg    10980
aaaacttttt aattagttgt ttaattttgt aagatggtta gtttagtcaa aattagataa    11040
gagaatctga aaatccataa ttaccccaaa gcaacccact cataagaact attatttttg    11100
tgttttgaaa tcataatttt attgatttcc agtgtttcca ctggtagtgg tttcattgat    11160
gtaggagtat caaaacatca ctaattattt atttcagttt tgtttgatcc tagctgtttt    11220
gtgttaactt tgaagaaatt acatcacaga tctattgttg tccttggtaa aggaatggag    11280
agttaaggct ctagatcatt agtggttatg ctgtagtatt aggagtaaaa aaaaagatta    11340
tatcaacaaa ataagaacat gttaatgtac ttgtaataga taaacatgaa taaagctctt    11400
atgctatata gatgcactga acaatctact agaattgtca gcaaacggta tcttaatcct    11460
aaaagggtcc caaaccaatg atctaaaatt gaatcaaact ttcttccttg agcataatta    11520
tttaagtgat ttattaaaat agccagcatt taaaagctta aaatataagt atcataatgt    11580
ggtatcctag atagatccca gaacagagaa aggatattag ggaaaaactg gaggaatgga    11640
ataaattatg cagtttagtt attaataatg tactaatgtc cttagttatg accattgtac    11700
catggtaaag taagatacta acaatagagg aaattgggta aggggtatat gtaactctat    11760
actatctttg caattttttt gtaaatttaa aacttctaaa ataaagaaca aatttgaaca    11820
ttaaaaagtg tcgccaggaa catgtatcac tgtttacaga tgaaacagta tgtattttta    11880
tatctaattt ctgatcattg gcttcaaatc agaaaagtga atgacacatc aagatcaggt    11940
tttctgttta ctaaataaag tctaagaaaa caaagcatac cagctggaga gattcatgtt    12000
tataaagaca gatttataac aacaaaaata aaatatccaa gaataaattt aagaagaaat    12060
agggcactat gtaaaaagta tagcacttta ctgagaaaca tatgaaaacc tgaatacatg    12120
gagagaggta ttttatattt gaatagaaag attgctggtt taaagataat tctctttaaa    12180
ttttttttgt agaaatttaa gaggtacaag agcagttttg tcacacggat atattacata    12240
gtggtgaagt ctggggtttt agtgtaaatt aatctttaca ttttgtttga gcccaataaa    12300
tgtaccaaca tgatttttat agcaagatag tcattcctat taacccaaac ttgtcccaac    12360
tttgaactga actgaggcag agctagcagg tgttccccac tgctgaggca tctgaacatt    12420
aagcgtatcc ctctgagaac cagcctgcat tgatcctctt tctaatgtag acagcatcaa    12480
gctatatatc tagttctgtg ctcagcaaaa gccctgactt ctttttgctt atgtcctagc    12540
tccatacaac aaaatcaacc aaagaatttt ggttgtcgat ccagtcacct ctgaacatga    12600
actaacatgt caggctgagg gctaccccaa ggccgaagtc atttggacaa gcagtgacca    12660
tcaagtcctg agtggtaaga ccaccaccac caattccaag agagaggaga agcttttaaa    12720
tgtgaccagc acactgagaa tcaacacaac agctaatgag attttctact gcatttttag    12780
gagattagat cctgaggaaa accatacagc tgaattggtc atcccaggta atattctgaa    12840
tgtgtccatt aaaatatgtc taacactgtc ccctagcacc tagtatgatg tctgcctatc    12900
atagtcattc agtgtttgtt gaataaatga attaatgaat aacattatat ttacaaaatg    12960
tatcctaatt cctcacttcc attcatccaa atcatattgt tacttaataa acattcacca    13020
aatatttatt gaatatgcct tttgttccat gcattgtagt actcatttga cacacataga    13080
ataataagac tcacgttcac actcttcagg aaacagataa aaaacaaatg aacaaacaaa    13140
aaacaggcaa tccaatacca tgtgggaaat gctttcatac catgtgggaa acctggggga    13200
atacctgaga ggaatattca attcaggcca tgtttcagga atccaaatcc tggcacatca    13260
gagccgcctc cttcttacta gggtttctgt ggcaggaaat aaatggaacg tatttttcta    13320
tcttatgcca aacaggaggg accctttctc ccctgtgcct ctcccaaggt agtctacaat    13380
atttcaacgc tagcagtctg tttagtgcac aggacatgag gctgtgtatc cctgggcaaa    13440
ttgctacact tctgtgtgct tcactttctc tgtaggatta taacctactg agcaaggtta    13500
ttgtgggggt caaattagca acagtgtatg aaaatgattt gagaccagtg cctgcacaaa    13560
ttcaactatt tttttttatc tcactactct atagaagtag gtaggatggg agacagagtc    13620
tgatgggagg ctcagaatgt gaaagtaagt gaggtgagtg agcatgatat ttcatataaa    13680
cacaaagata ctctgagaag agcttctcac ttcccccgcc cccaatagat gttgacagga    13740
aaatgccatg tacttcagca aaaacagctg aaaaattaga cataaaagtc aatcaatagg    13800
aaaagataat ccaggatggt cttgtgaaca gaaagaggga aaaaaaaagt ttagaaaatg    13860
atggggatgc tcttactggg gtatgagtcc tcaggtattc aactggcttt cagaaaaagc    13920
tagactagtg ggttcctgcc atttaaaagc tgttttatga caacttactt gttgggtggc    13980
ctacagtaac tcacttaact gtgctgagtc tgtttcctca tctgtaaatt ggggattttt    14040
taaaataact ggcatgccta actcataaag ttgttctgaa actgaaataa aacatatatg    14100
aacaggcatt gtaaactgta agttacggaa aaagctggct gttgttgtgt ctttaaagct    14160
tcacctgggt agttagagat ggatcatggg tctcagtgga gagctgagcc aggcaggagc    14220
tgactaaggg taagaggtgg gagttagcaa tctctgaaca tctgtgtgcc atgggacccc    14280
ttttcctcct gcatggtacc ccagacaagg agcctagtaa gagatactaa tgacttgttg    14340
tccagagatg ttcaaactgc agagaaagat aagacaacaa gcattggcct ccaatcatga    14400
tgacagatag gaggaggtgg gagctcctta gcagtgctgg ttggttttcc atgttctact    14460
gtgggccatc tctgccatgt actgtaggct actaacttct atattaaaaa atgcaagagg    14520
ggccgggagt ggaggctcat gcctgtaatc tcagcacttt gggaggccaa ggtgggcaga    14580
tcacttgagg tcaggagttt gtaaccagcc tggccaacat ggtgaatctc tgcctctact    14640
aaaaatacaa aaattagcca gatgtggtgg cgtgcacccg taatcccagc tactcgggaa    14700
gctgaggcac gagaattgct tgaacctggg aggcggaggt tgcagtgagc caagattgtg    14760
ccactgccct ccagcctggg caacagagaa agactttgcc tcaaaaataa ataaataaat    14820
aaataaataa ataaataaat aaatggaagt gaaataatca aggccaccat ttaatactga    14880
gtagccactc catgtggtac tgtgctaagc acattataaa atattagcct cacaagaaat    14940
gtattagcat ttgtattttg tacactggtt aagtatcttg cccaagacct caaaactggt    15000
taaggggcag cagaatttaa ccccagcgcc accttttcaa agtctgggct tcttacactt    15060
ctccatgctg ttcccatttt aacagatgta tctcgccatt ccagccactc aaactttggc    15120
atttaagaaa attatcctaa agctaaacta aacttcaagg atgactattc tcctgatgac    15180
cccttcccat caaaatttta tctttagtca gtttgttttt gttttgtttt gtttttcaga    15240
actacctctg gcgcttcctc caaatgaaag gactcacttg gtaattctgg gagccatctt    15300
tttactcctt ggtgtagcac tgacattcat cttctattta agaaaaggta gtatttcctt    15360
aattgcagtg gtctccactg gggatgagga gggggtgaga attggatcga tcatggctgc    15420
aaggaaacct gacttaacct ctgcagggtg gtgcaaaggc attccactat tcaacagtaa    15480
ttatattgaa gctgcatggg atcactgggt gaagatgagg tgtaaggggt gagggacagg    15540
agaatgggta tggatggagg tagaagatgc agtgtcatac aatttttttc tatcatgaaa    15600
ataaccacag acttactgta aagaaggagc taaaatgcct gtcattttca gttgcatttt    15660
agttttgcat tagttgcacc cagctggttt ctgggtactc taagtaataa aaatagttcc    15720
tctgtagaac tgtagtattt tcaccataga gtattttgta aaattattgg tagaggatgt    15780
tacataattt gcatgtgttc ctttctccat ttacctgtgg gaacaattaa aatccaggaa    15840
aatgagtata ttcaaataat ttcctcccat ttatgatgat tcagagtaaa taattcctct    15900
gatacttaga gaagtatacc aagagatcca gtgattgtat agagttgtct gatgttaaat    15960
agggaagtag aatatggaag ggaattccaa tagtcgttga aaaattcccc acaacccctt    16020
acatggggga aagtggtgtt aactgagata gtagagataa gctgttacca aaaattatgt    16080
tcttaacagg attgagatag ccagaatata aggatcaagt ttcaatgaca gtaagatcct    16140
gagatgcagt tgatttgcac aaagaaataa ttgttgccag cttgcatttt gaatatttct    16200
ctggaaaaag agattagttg gcagtagaaa tgaatagaaa tcaatagata ttaaaatacc    16260
tcagaatttg attcatctct gggaaaagat gaaaaataaa agtgtatagt cctcaagaaa    16320
atctgggatc aaaagcatgg gccttaccct attgaattaa ttaacctcag aagttgggaa    16380
ctgtggaata aggatgtcca ccagacttcc tagggattac aaatgtttca tagaacttga    16440
aatttaaact tgggtcactg tatgggatgt agagctgtgc tatatggaaa taaaaatgat    16500
ttctttttct caagggagaa tgatggatat gaaaaaatgt ggcattcgag ttacaaactc    16560
aaagaagcaa cgtggtaaga atatcagaag gaattgggaa gtagaaggca aaggaaacaa    16620
aaagctaaag caataacaaa gagaaatcca ttagtcataa tctcctctcc ttttaaagaa    16680
tgctggttcc cctttgcctc acaactaata caagaacttc tccaccatct caggaagttt    16740
agggatggcc ttcaagagta gagagtaggg agcagctctg tggagagagg agaggagcag    16800
ggaaggggaa ggagtcagct tctctttgct aatctgttgc cctgcaccct agcagctccc    16860
tgcagcaggg gacaaggttg acttaggtgg atggataatt aattgattct aaaatattgt    16920
gtgtcagtat tgtatattgt aatactatgt taactgcgcc atgcacggta tctcatttaa    16980
tcccccaccc cttgccatta ccaaaaagag agagagaaaa atactagaat tatcctcatt    17040
ttacagtaga gaaaacagag ggtcaagaag ataaagtaaa gtgcccaaga acacacaact    17100
gatcacaaat atcaagcttg gggtccatta gcctaaccac agacccttac tcttaaccca    17160
tctgcttcaa tccattttgc tacaaatgtt tacatttata tgcagggcag aaaagtctca    17220
tccagtttat tgaactaaga agaaagttat attaaggtgt ctaatttttt ttaatgtagt    17280
tagaaaccaa acttaacaat gagcccaagt ttaaagcagt ctaattaact tgacaagctc    17340
aggcaagttt cattctgtgg cctgtagcat catctgtgtt gtaaagctaa gtagcaaatg    17400
ttatttgggt catcctgggg ggaaagtcat cccaatttgc tcaagactga ggggtttttc    17460
aggatatcat gtaaggataa ttgggtacaa atataacctg cttctttctc tcatttcaaa    17520
tttatcattt atcatctcag caactatgag ttatgttttt tattagattt cttgttactt    17580
tttccccaga ccgctcccca tgaaattaat atactattat cactctccag atacacaatt    17640
ggaggagacg taatccagca ttggaacttc tgatcttcaa gcagggattc tcagcctgtg    17700
gtttgggggt tcgtcagggc tgagcatgac cagaggaatg aatgggcccg tgggatgcat    17760
gcagtatggg acttaaaagg cccaagcact gaaaatggaa cctggcgaaa gcagaggagg    17820
agaatgaaga aaaatggagt tgaacaggga gcgtggaggg agaccttgat actttcaaat    17880
gcctgagggg ctcatcggtg catgtgacag ggagaaagga tacttctgaa caaggagcct    17940
ccaagcaaat catccactgc tcatcttagg aaaacgggtt gagaatccct aatttgaggg    18000
tcagttcctg cagaagtgcc ctttgcctcc actcaatgcc tcaatttgtt ttctgcgtga    18060
ctgagggtcc cagtgttgga acagtattta tgtatgagat tttcctattt attttgagtc    18120
tgtgaggtct tcttgtcatg ggagtgtggt tgtgaatgat ttcttttgaa gatatattgt    18180
agtagatgtt acaattttgt cgccaaacta aacttgatgc ttaatgactt gctcacatct    18240
agtaaaacat ggagtatttg taaggtgctt ggtctcctct ataactacaa gtacacattg    18300
gaagcataaa gatcaaaccg ttgatttgta taggatgtca cctttattta acccattaat    18360
actctgattg acttaatctt attctcagac ctcaagtgtc tgtgcagtat ctgttccatt    18420
taaatatcag ctttataatt atgtggtacc atacacacat aatctccttt catcgctgta    18480
accaccctgt tgtgatgacc actattattt tacccattgt acagctgagg aagcaaacag    18540
attaagtaac ttgccaaaac cagtaaatag cagagctcag actgccaccc actgtccttt    18600
tataatacaa tttacagcta tattttactt taagcaattc atttattcaa aacccattta    18660
ttaagtgccc ttgcaatatc aatcactgta ccaggcattg aatctacaga tgtgagcaag    18720
agaaagtacc tgtcctcaag gagcttggag tataataagg agattaataa gaaaatatat    18780
tattacaatc tagtccagtg tcatagcata aggatgatgt gaggagaaaa gctgagcagt    18840
gttgccaaga ggaggaaata ggccaatgtg gtctgggaca gttgaatgta tttaaacatc    18900
ttaataatca aagtaatttt catttacaaa gagaagtcag tacttaaaat aaccctgaaa    18960
aataacactg gaattccttt tctagcatta tatttatccc tgatttgcct ttgccataca    19020
atctaatgct tgtttatata gtgtctgata ttgtttaaca gttctgtctt ttctattcaa    19080
atgctattaa attttaaatt catacctttc catgattcaa aattcaaaag atcccatggg    19140
agatggtttg aaaatctcca cttcatcctc caagccattc aagtttcctt tccagaagca    19200
actgctactg ccttttattc atatgttctt ctaaagatag tctacatttg gaaatgtatg    19260
ttaaaagcat atatttttaa atttttttcc ctaaatagta acacattata tgtctgctgt    19320
gcactttgct atttttattt attgtagtgt ttcttatgta gcagatggaa tgaatttgaa    19380
gctcccaagg gtcaggacac atgccttctt tgtttctaag ttatctttcc catagctttt    19440
cataatcttt catatgattt agtacatgtt aaatatgtgc tacatataca tttagacaac    19500
cagcatttgt taagtatttg ctctaggact gagtttggat ttatgtttgc tcaaaaggag    19560
acccatgggc tctccagggt gcactgagtc aatctagtcc taaaaagcaa tcttattatt    19620
aactctgtat gacagaatca tatctggaac ttttgttttc tgctttctgt caagtataaa    19680
cttcactttg atgctgtact tgcaaaatca cattttcttt ctggaaattc cagtagtgta    19740
ccttgactgc tagttaccct gtgccagaaa agcctcattc gttgtgcttg aaccctttaa    19800
tgccaccagc tgtcatcact acacaggcct cctaagaggc ttcctggagg ttttgagatt    19860
cagatgccct gagagatccc agagtttcct ttccctcttg gccacattct ggtgtcagtg    19920
acaaggaata ccttcgcttt gccacccgtc aaggttgaag aaacagcgtc tccaacagag    19980
ctccttgtgt tatctgtttg tacatgtgca tttgtacagt aatttgtgtg acagtgttct    20040
ttgtgtgaat tacaggcaag aactgtggct gagcaaggca catagtctac tcagtctatt    20100
cctaactcct ccttttggtg ttggatttgt aaggcacttt atcccttttg tctcatgttt    20160
catcgtaaat ggcataggca gagatgatat ctaattctgc atttgattgt cactttttgt    20220
acctgcatta atttaataaa atatccttat ttattttgtt a                        20261
<210>  3
<211>  20340
<212>  ДНК
<213>  macaca fascicularis
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1658)..(1881)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2742)..(2745)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2747)..(2747)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2749)..(2749)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (4764)..(4802)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (8775)..(8778)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (8980)..(8984)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9161)..(9293)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9344)..(9348)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9840)..(9874)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (9958)..(9973)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (10437)..(10452)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (10603)..(10603)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (10830)..(10830)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (10989)..(11006)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (11105)..(11122)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (11457)..(11457)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (13710)..(13710)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14015)..(14049)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14518)..(14585)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14689)..(14699)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14707)..(14767)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (14837)..(14865)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (15703)..(15741)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (17403)..(17415)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (19122)..(19135)
<223>  n представляет собой a, c, g или t
<400>  3
ctgaaagctt ccccgattcc gccgaaggtc aggaaagtcc aatgccgggc aaactggatt       60
tgctgccttg cgcagaggtg ggcgggaccc cgcctccggg ccgggcgcca agttgagcag      120
ctggcacgcc tcgcgaagcc ccagtcctga agccccagtc ctgcgctgct tcccgaggct      180
ccgcaccagc cgcgcttctc tctgcctgca ggtagggagc gttgttcctc cgcaggtgcc      240
cacggcccag catctctggc taactcgctg ggcaccttag gacggaggat ctctacaccc      300
tttctttggg atggagagag gaggagggaa agggaaggcg atggtctagg gggcagtaga      360
gccaattacc tgttggggtt aataagaaca ggcaatgcat ctgggcttcc tccagcgcaa      420
ttcagttttg ctctaaaaat aatttatacc tctaaaaata aataaggtgg gtagtatagg      480
ataggtagtc attcttatgc gaccgtgtgt tcagaatata gctctgatgc taggctggaa      540
gtctggacac gggtcctagt ccaccgtcag ctgcttgcta gtaatatgac ttgtgtaagt      600
catcccagct gcagcagata agtaagtctc ttcctgcgct aagcacgtcc aggacccctg      660
aacggaattt atttgctctg tccattctga aaacccaaag gagtcctaaa agaggaatgg      720
aggagcctaa gaataaaaat agtataataa aacatttctt agacaggttg accttggcct      780
atgtcaaagt tcagtctggg tttgtcttat aacataagga gtaaaagtac cattgttcta      840
cctctttttt taatacttga aaaaaaattt actgtagatg cttttctatt aattaaataa      900
ccttctaaaa aatgttttta gtgctgcatt cgattaggtt ggataactaa atgaaattaa      960
ttcctcactg ttgggtataa aggttattta cagtggttct gtcttagcta ttcactgaac     1020
atcattacat agatatctct ggaatattgc tgattgtttc cgtcaataaa cttagaagtg     1080
taactactta gtcaaagaga ctgaatattt taaaggcatt ttgaagaaaa ctgaaaatgc     1140
tttccagaaa ggatgtatca gttgacaatg atggttgtca acagtattta aggagaacta     1200
tgatactctg aagaaaaact tagcctttct cagtagaagc aggtaggcag aggccacatg     1260
acagcagtta gagtgtggtc ttcaaggaag tcacagaaat actgtgggga attgaaaccc     1320
caagtggaaa atgtacaaga gtgtctcagt gtgactgaga aggaggttgg gcttggggtt     1380
taacttaaga attttttctt ttcttttgtg gagatagggc ttttgttatg ttacccaggc     1440
tggtcttgaa ctcctagcct caggcgatcc tcccgcctca ggctgcagaa gtcctgggat     1500
tactggccgg agccaccatg caggcctctt gctcctactt ttgagaaagg aagcttaacc     1560
tttttttttt gtttgttttt gttttttgtt ttttttgtag acgagtctca ctctgttgcc     1620
caagctggag tgcagtggtg ccatctcagc tcacagcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     1680
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     1740
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     1800
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     1860
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngactttttc tctatctctt ccttctaccc atcctaccct     1920
tggaagatag agaagtaata tcagttccat cgtgttatac tgggcttccc ccagggacaa     1980
acccacttcc ccaacctgaa tgagccatca cttcttcccc agtttacatt tcattgctct     2040
ttgaatgtct ccgttcggat atgggaattc acatgtggtc ataattctta cctgaagaag     2100
actgacgtct tcttctctta gaccaactgc cctgatgtga ggtttagagg ttaaagaaca     2160
tgtgtgtatt tacatgatct ttgtattctg ccttttcgtc cctcactaat gacagctgaa     2220
ccccaaggaa atagagctgt ggaggagagg gtttgatgag aaagtaggta aatattggat     2280
ctaatccatc atcttccagg aaacctccat tacttctaaa aatttcaacc aaattcgtta     2340
aaggacaaga actccaccag agtagggcca taaacattgg caaaattagt tgtaatctat     2400
gactagattt aatgtccctt tgttttattc acatatggtt ataatgcttt gcttggaatt     2460
aggggtattt taagttttct tctgcctagt aagtgtattt gtgcttataa tacaataatt     2520
ataaaatatc acattaatat tttataactg tacagttaac tctggcccaa ggaaaagata     2580
gtccggtaga tgctgcagcc tgattttgta tctaaccctg gcaagaggat aatgactcat     2640
gttatttcac ttaccctttt tatcttttaa catgaagggc tcatataggt caataagaaa     2700
ccagtgatat aaacagacca aaaaatgatc agatctttca cnnnnanana aaaaaaatat     2760
ttttaaacaa tacccaactg ggtgaaaata caatgtaaca gtaccaaata tcaacatgtg     2820
tcaagaacca gaaaaatgtt tgttttcttt gatcagcaac actatttgag gaaatctatc     2880
ctcagggcct agcctggggc ctggcacaca gtaggcactg aacaaatatt tgctgaacac     2940
acacatactt atgatatttt taaaattggc aacaatccaa tacccaataa tagaggaatt     3000
aaatattata gaactgttca ataagatgct tacgaatatc atgcagtaag atgggcaata     3060
tttatatcat aagcttaaat gaaacaaatg ggtattaaag gtatggtaag gttataaatt     3120
actttttaag agattaaagg gaaaagactg aaagatatat actgaaatgc tcacagtggt     3180
gacaaggttc cccagccttg gcactattga cattttgggc tatgtctttg ctgtgggagg     3240
ctggcctgtg ctctgcagga ggtttggcag cactcttggt ttctacccct agatagcagt     3300
agcaaccctc cctcaaccag cccaattttg acaaccaaaa atgtttccag gcatcaccag     3360
attctccctg ggtgagagtg atgaaacagt aggtgatttt ccccttcttt tctcattttc     3420
tgtaattttg tcacattacg ttaataataa ggaaaaaaca taaaaaatag atgaatttat     3480
tattctacct cagtttggat gtttggactc cctttggggg ttctttccat tatatcactt     3540
ggtctgctaa acagtctatg gtttggcaag gtgaaatgat tcatgaaatt ttgtttttat     3600
tttttacctg atactaaaag taaaacattc attcgcttga aaatttggac acagaacacc     3660
aaaaaaaatc cataatctca tctctctttt tctgtctttt ccttcctttt ttccctttaa     3720
aaacaagagt gaaaacctac cggttctccc tccaatttaa ttcctaaata taatcactgt     3780
taacatcttg gacatttcct gtgtctaaac acacatactc actttttctt ttttttagca     3840
aaaagtggat ttctgctaca tgtagtgttc cgcaacttcc tacatgttta caaaatcagt     3900
acatttacat acgctgaatt cagtccttaa tggtattata ttttgtgaat ataacaaaat     3960
ttatttaacc acttagacaa tctaagatat tctcagtttg ctgttatgag caatgctctt     4020
cctttacata tacatatata tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt     4080
ttagtaggat agatttctag gagagggcga aatgtcatat gacatccaca tttacaattg     4140
taataggaag tatcaaagtg ccccctaaaa aaaaaaattc ctcccattag tgtgtgagaa     4200
agcctatttg ttcatatctt cacaaacact aaatattaga aatatttaca attgtgttca     4260
agctaagaag tgaaaaatgg tatttcatat cttataattt ttgttgtgag attgaacata     4320
tttcctatgt ttacatgtca cctgtatttc ttattctctg aactatacgt tatgaccttt     4380
cacttatttt cctcatgggt tatgtgtagt ttgtgtagtt gtcttattga ttgttaggag     4440
ctatttatat attaggaaca ttaatctcct gtcttatatg tatgtggcat tgattagttg     4500
atcatttgtg agttcatgtc tgtatacaaa gattagagag gcagtaagag ggaaaactta     4560
cctctttctt atcaaagttt gtaaatatat gtataacaga agagagagaa aacattaata     4620
aatgctgaaa taaagtataa atttttactc cactacttca acataaacta caaaaggaga     4680
gtgacttttc tttcatgctg acttccatat tccccatgcc taaaatagtg cctagcacag     4740
aagaggtgct caatcagtgt ttgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     4800
nnaaatgaag aatagaatct aggcagatac tctggaagag tgactgtgag tcattcatgg     4860
tcttggtatg aattagtcaa atccagcttt ctccccttcc cactccccac tgttagtaga     4920
ataatctgtt tattgagaga atagatttat aatttagaat aagaggggca gaagaggaga     4980
ttttgaagga tggcacctga aggaggacta gcatggctga gatagtgaag tggaagtctt     5040
ggaaagctaa agggtaagat gaaagtattt agccgtaggg ggaaaaagca ttgacaggtt     5100
ggaaatgtaa aagtcagatt ctccttgctt tgaaattttg tacagggcag gttctactag     5160
gtatgttaca atgcagaaaa aacatgaaat agttgagagg aatttggtga aatattatct     5220
tcctggcttc ttttgagtga gcagattttt ttcagggcct gtaactataa taaatttgaa     5280
acttctcatc ttttagtaac ttttttcact taagtttatg tggctgtggg caatggaatg     5340
aaggtattga acttcctatt ccctgctggg tttccacaat tacaagtcaa tcatgactgg     5400
ttattagaag actatttcaa ttagaaccac caagtcccat aatgtcatat tgtgtgttta     5460
attattaagt aaagcagtct tctttttgtg ttttccataa ttagcacatt ccagaaagat     5520
gaggatattt gctgtcttta tattcacgat ctactggcat ttgctgaatg gtaagacacc     5580
aaatccttcc attaggttct atattttaaa tattttaacc atgagtttaa aactaaaatg     5640
ataatttaaa atgcatgcaa ttttcttata gagagaatat tctcttcttt cttctacttt     5700
acacaatgac aaagtctttc ttctgcttta cacaatgata aagctccctg tgtcattgtg     5760
taaaaatata gagaatatag acaaattgaa agacacaaaa taatctatta cccatttccc     5820
agggttaact actgaaaata tctggggaaa tggcctgtat gtatatattt atttgtttgt     5880
tttcaacaag gccaggatct ttcaatcttt caatcttggt tgctctgtga catgcctttc     5940
ctgatgagaa tactctaagg aagaattgta ggatacatgg aaaatgtcag ggtaacacag     6000
tactggcacc accctgcggt cctttctgaa ctccatacca atgtacttct tgccagaaaa     6060
ctgatcaaaa gtttagggaa gtaaaaagag atgttagaat ctaccattcc ctctatgtag     6120
gaagcaaata ggtgtccagt caaaggacat tctggggatg tctacatgaa accaagtctc     6180
ctggttgtaa gtactccatc tccatataat atttctacag taatatatgt ttataaattg     6240
tgggggcaac ttgtttagct aattttatta ttctgttatt gggacactat gtctctgcat     6300
gagacatagt gtcccaaaac atatttcaag cccattggat aaaatatgta tttagcaagt     6360
tcttaaatat aatgataaca taactgacca gataaggtga tttttaaatg ctgtgccaac     6420
tttataaatg ttttgaggaa ttttcccttt tctgaaggtt attcttcttt ctttttagca     6480
tttactgtca cggttcccaa ggacctatat gtggtagagt atggcagcaa tatgacaatt     6540
gaatgcaaat tcccagtaga aaaacaatta gacctgactt cactaattgt ctattgggaa     6600
atggaggata agaacattat tcaatttgtg catggagagg aagacctgaa ggttcagcat     6660
agtaactaca gacagagggc ccagctgttg aaggaccagc tctccctggg aaatgctgca     6720
cttcggatca cagatgtgaa attgcaggat gcaggggttt accgctgcat gatcagctat     6780
ggtggtgccg actacaagcg gattaccgtg aaagtcaatg gtaagaatta ttatagatga     6840
gaggcctgat ctttatagaa aacatattct aagtgttgaa gacttttcat tcttataagt     6900
ccatacttat tttcaaacag aatagcatag tctcttcatt cattcattca gttcatgaat     6960
tcattcacgt aagtctccaa ttagcatttc ttgagcacct atatgatagt cattggaaat     7020
ccagagacaa cacagagcca tgttctacgg tatgtacagt tttccaaaaa taattcctag     7080
tctttacttt tttattataa atgtaataca tatacttgca aagaattcag atactatgga     7140
agagatcaaa tgaattgcaa aagtgtccct cctcccttca ccactatctc ccatgagata     7200
accaagagac actccaagag agtaaccatt atttgtgtgt ccctccagaa ccttttttat     7260
tcaactacca tttttttatt ttattaggtc tgtcagtttt ccttttttga gcctctctat     7320
atcaaatgct aataaatata ttcagatcaa accccactgt aaggttcata ttaaaaaaga     7380
cttgaagtct ccctatgaag acaaaaaata atcatattaa gtgtaaaaga acttattctt     7440
ccagtacagt ataaactata ctcactgggc atatattcat cttgaaaatc tatactgatg     7500
ttgtcttggg gaattgaaga ggaactagga gtgtcaattc ctgggaactg acccacagtt     7560
atgtcatcag gtcacttgag ttcgaagttt tgtgttagca ctagctaagt aaaggaaaac     7620
acctctgctt tcattgttga gtttcataga attgagagct gaaaggatcc caggcaggag     7680
cgactaatcc aaactcccac aaagaacaaa aatcccccag aggatcttct gttcatatat     7740
ttcctgcagt ggcatccctg tcatatccca caatggcatc cctgccattt ggactcccct     7800
tccatatcct gttgaaatta ctccctaata gtaagctgaa atctgcccct ctagttgtag     7860
ttttggaatt atttcatttc catgatgacc ttttaatatt tgactagaat taaatcatct     7920
ccccttggta tttccattcc tggactaact accatcaatc tgagggctaa caatacaagt     7980
agaaaaagtc tacacttgtc attgatcact gatcaatgat taatcaatga tcactgataa     8040
ttataaactc aaaaacaaaa tcatgtaggg attaagagaa atgtatcagt tttatgttgt     8100
atttctggtc cctgattctg gctcaaataa tgctactatt gtcaagaaga tatcacttgt     8160
aaagtagatt taattttcat tatattttac catgtgcttc tccattcacg gcatttcttg     8220
agatgttgtg gtttatactt tcagtttttc tccagtccat cagcaaatat caggcatcta     8280
ctgtgttcca agatattaaa gaaatcatca tgacttagcc tcatcaacag cattgctaga     8340
tctgggatgg aaaagaagag tataatcctg gcagtcagga agaaggctgc ataaagtata     8400
agtttctgct tccaaagaag atctctcatc agcctgtagg gagtgtatag ggaggggaca     8460
gctgtccttg tagtagcaaa gggttttatt caggtcatct gggctccata atatcccttg     8520
tgtatctgca gtctcctttg ccatggatca acacaatagg aaatcttccg gcactgatgg     8580
tttttccaag ggggagttct tcagggagca aagcaaatga ccaaccaggt ttgaggacct     8640
gatttgacaa ttccattttg tattttaaat tagttaattt gcattctagt cccaatccat     8700
cttgtcattt gcagacagtg gttttggggt tgagttgagc tataccaaaa gtctgaacct     8760
tctgcactta gaacnnnnaa ggcaaccacc aagcttcact tgcactgagg cagtgtctcc     8820
aatggaaacg aggtagctgg cttgcagaag ctttccaact cagggaagta gaactcctga     8880
gtcacctcca tatgcaaata atttcacagt actgctgttg aacttcactt cccatcacag     8940
caaatgtgtg gtaacatagc tttgccacag gagtttactn nnnnccatgg gattttaaag     9000
gtgaaacatt tcaaaactga aatttgaaag aatttagttt tggattcact caattatcat     9060
gatcactttg ggtgttattg cacctttcat gtttgtgagt ttaaatacca gactctcagg     9120
cctctaactt tcaattaaaa gtgtttttct ttaatcactg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     9180
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn     9240
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnctgtcat     9300
tccccaccaa ccccatcttt ccccaaaatt cccagccctg tttnnnnngt ttttctttaa     9360
tcactgaacc taatagtagg gaaaacgaaa tgttcattca gactttcagg accttcaatg     9420
agatgaggca gctgaaagat caaagtagtt gcatagttat cccagtaaag ctatttggat     9480
cgtatggacc agatcaactg ctgtcattcc ccaccaaccc catctttccc caaaattccc     9540
agccctgttt aagtgttctc tgtagcattt atctctatct agtatattgt gtagcatatc     9600
atatcatact tttctatttt gtttattgtc tctctcctcc tagaatataa actccacaag     9660
cacagagatt tgggtctgtt ttttaatatt gttgtatccc cagggcttga cgtaaagcag     9720
agtggtagta tgacaaaagc acacaaaaaa tatttgttga gtcaatgaat gaatgatttc     9780
ctcaaatagg attagcctaa aatttggaaa catgaacaga cttggatata tgaaaatttn     9840
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnttctaa agggtacact gaagcagcag     9900
tagtaaaagg aggaggagga gaagcagctc tgctactact attatcgagt actactannn     9960
nnnnnnnnnn nnnctacaac tatcgagtac tactacaatt agcacttgct tattctgtgt    10020
gttaggtcct gtactgaaca ttctgcctaa attagttcat ttcctcctgg aaatgactct    10080
gtggggtagg tgcttcatca tgtaagatga gtatttttca cacttcactg tctctgaaat    10140
ctgagtgtgt ctttcaatga tggaatcttt gatttcatga taagtggtat tattcccatt    10200
ttaaggatga ggaaactggg gtccaaagaa attaagtaat ttgcccaaat tcacctagcc    10260
tcgtaaatga taaagctagt tctaaatcca agcagattgg ctctgaagtc tgggccctta    10320
ataaccactt attgcctgta tttgcacctc tggtgtatgt atcaagttat atattggctt    10380
caaaactatc atgacctttt cttgattttg attgttcaat attagtatag tgttctnnnn    10440
nnnnnnnnnn nngggtctgc aaaaaatttt gattactcac ctcatctgta aaacatttta    10500
aacttgtgtg tctgtgcagg cacatttgtg tgtaattata aaaaatttac tatctattaa    10560
tatataggtt gtaccgtaag aaaaattgcc atttttgaag agncaaaaaa ggttgaatat    10620
taccagtttc atctggttca acctaataga catttgtaca aaaacagaca ttttaagagg    10680
atgaaataaa aatttaataa acaatatttt caatttttac taattgtgac gcttcactat    10740
tgttagctaa tatgtcaagg catgatatac cttagggtgg aatttatcat taacaaaggt    10800
ggatagtgtc aataatcttg aggtttgtgn ttttttatat aacactgtga ggtctaatta    10860
agtacttaat tgtttacaac ctcatacagt cgccaataat aagtgtcact tctgctgttt    10920
cctctgggtt gtgcttgaat tattagtatt atcttcaatc ctcagtttct ttgtggaaaa    10980
ctttttaann nnnnnnnnnn nnnnnnaaga tggttagttt agtcaaaatt agataagaga    11040
atctgaaaat ccataattac cccaaagcaa cccactcata agaactatta tttttgtgtt    11100
ttggnnnnnn nnnnnnnnnn nntttccagt gtttccactg gtagtggttt cattgatgta    11160
ggagtatcaa aacatcacta attatttatt tcagttttgt ttgatcctag ctgttttgtg    11220
ttaactttga agaaattaca tcacagatct attgttgtcc ttggtaaagg aatggagagt    11280
taaggctcta gatcattagt ggttatgctg tagtattagg agtaaaaaaa agattatatc    11340
aacaaaataa gaacatgtta atgtacttgt aatagataaa catgaataaa gctcttatgc    11400
tatatagatg cactgaacaa tctactagaa ttgtcagcaa acggtatctt aatcctnaaa    11460
agggtcccaa accaatgatc taaaattgaa tcaaactttc ttccttgagc ataattattt    11520
aagtgattta ttaaaatagc cagcatttaa aagcttaaaa tataagtatc ataatgtggt    11580
atcctagata gatcccagaa cagagaaagg atattaggga aaaactggag gaatggaata    11640
aattatgcag tttagttatt aataatgtac taatgtcctt agttatgacc attgtaccat    11700
ggtaaagtaa gatactaaca atagaggaaa ttgggtaagg ggtatatgta actctatact    11760
atctttgcaa tttttttgta aatttaaaac ttctaaaata aagaacaaat ttgaacatta    11820
aaaagtgtcg ccaggaacat gtatcactgt ttacagatga aacagtatgt atttttatat    11880
ctaatttctg atcattggct tcaaatcaga aaagtgaatg acacatcaag atcaggtttt    11940
ctgtttacta aataaagtct aagaaaacaa agcataccag ctggagagat tcatgtttat    12000
aaagacagat ttataacaac aaaataaaat atccaagaat aaatttaaga agaaataggg    12060
cactatgtaa aaagtatagc actttactga gaaacatatg aaaacctgaa tacatggaga    12120
gaggtatttt atatttgaat agaaagattg ctggtttaaa gataattctc tttaaatttt    12180
ttttgttaga aatttaagag gtacaagagc agttttgtca cacggatata ttacatagtg    12240
gtgaagtctg gggttttagt gtaaattaat ctttacattt tgtttgagcc caataaatgt    12300
accaacatga tttttatagc aagatagtca ttcctattaa cccaaacttg tcccaacttt    12360
gaactgaact gaggcagagc tagcaggtgt tccccactgc tgaggcatct gaacattaag    12420
cgtatccctc tgagaaccag cctgcattga tcctctttct aatgtagaca gcatcaagct    12480
atatatctag ttctgtgctc agcaaaagcc ctgacttctt tttgcttatg tcctagctcc    12540
atacaacaaa atcaaccaaa gaattttggt tgtcgatcca gtcacctctg aacatgaact    12600
aacatgtcag gctgagggct accccaaggc cgaagtcatt tggacaagca gtgaccatca    12660
agtcctgagt ggtaagacca ccaccaccaa ttccaagaga gaggagaagc ttttaaatgt    12720
gaccagcaca ctgagaatca acacaacagc taatgagatt ttctactgca tttttaggag    12780
attagatcct gaggaaaacc atacagctga attggtcatc ccaggtaata ttctgaatgt    12840
gtccattaaa atatgtctaa cactgtcccc tagcacctag tatgatgtct gcctatcata    12900
gtcattcagt gtttgttgaa taaatgaatt aatgaataac attatattta caaaatgtat    12960
cctaattcct cacttccatt catccaaatc atattgttac ttaataaaca ttcaccaaat    13020
atttattgaa tatgcctttt gttccatgca ttgtagtact catttgacac acatagaata    13080
ataagactca cgttcacact cttcaggaaa cagataaaaa acaaatgaac aaacaaaaaa    13140
caggcaatcc aataccatgt gggaaatgct ttcataccat gtgggaaacc tgggggaata    13200
cctgagagga atattcaatt caggccatgt ttcaggaatc caaatcctgg cacatcagag    13260
ccgcctcctt cttactaggg tttctgtggc aggaaataaa tggaacgtat ttttctatct    13320
tatgccaaac aggagggacc ctttctcccc tgtgcctctc ccaaggtagt ctacaatatt    13380
tcaacgctag cagtctgttt agtgcacagg acatgaggct gtgtatccct gggcaaattg    13440
ctacacttct gtgtgcttca ctttctctgt aggattataa cctactgagc aaggttattg    13500
tgggggtcaa attagcaaca gtgtatgaaa atgatttgag accagtgcct gcacaaattc    13560
aactattttt ttttatctca ctactctata gaagtaggta ggatgggaga cagagtctga    13620
tgggaggctc agaatgtgaa agtaagtgag gtgagtgagc atgatatttc atataaacac    13680
aaagatactc tgagaagagc ttctcacttn ccccgccccc aatagatgtt gacaggaaaa    13740
tgccacgtac ttcagcaaaa acagctgaaa aattagacat aaaagtcaat caataggaaa    13800
agataatcca ggatggtctt gtgaacagaa agaggaaaaa aaaagtttag aaaatgatgg    13860
ggatgctctt actggggtat gagtcctcag gtattcaact ggctttcaga aaaagctaga    13920
ctagtgggtt cctgccattt aaaagctgtt ttatgacaac ttacttgttg ggtggcctac    13980
agtaactcac ttaactgtgc tgagtctgtt tcctnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    14040
nnnnnnnnna tgcctaactc ataaagttgt tctgaaactg aaataaaaca tatatgaaca    14100
ggcattgtaa actgtaagtt acggaaaaag ctggctgttg ttgtgtcttt aaagcttcac    14160
ctgggtagtt agagatggat catgggtctc agtggagagc tgagccaggc aggagctgac    14220
taagggtaag aggtgggaat tagcaatctc tgaacatctg tgtgccatgg gacccctttt    14280
cctcctgcat ggtaccccag acaaggagcc tagtaagaga tactaatgac ttgttgtcca    14340
gagatgttca aactgcagag aaagataaga caacaagcat tggcctccaa tcatgatgac    14400
agatagagga ggtgggagct ccttagcagt gctggttggt tttccatgtt ctactgtggg    14460
ccatctctgc catgtactgt aggctactaa cttctatatt aaaaaatgca agaggggnnn    14520
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    14580
nnnnntcagg agtttgtaac cagcctggcc aacatggtga atctctgcct ctactaaaaa    14640
tacaaaaatt agccagatgt ggtggcgtgc acccgtaatc ccagctacnn nnnnnnnnna    14700
ggcacgnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    14760
nnnnnnnagc atgggcaaca gagaaagact ttgcctcaaa aataaataaa aaataaataa    14820
ataaataaat aaataannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnncattt aatactgagt    14880
agccactcca tgtggtactg tgctaagcac attataaaat attagcctca caagaaatgt    14940
attagcattt gtattttgta cactggttaa gtatcttgcc caagacctca aaactggtta    15000
aggggcagca gaatttaacc ccagcgccac cttttcaaag tctgggcttc ttacacttct    15060
ccatgctgtt cccattttaa cagatgtatc tcgccattcc agccactcaa actttggcat    15120
ttaagaaaat tatcctaaag ctaaactaaa cttcaaggat gactattctc ctcatgaccc    15180
cttcccatca aaattttatc tttagtcagt ttgtttttgt tttgttttgt ttttcagaac    15240
tacctctggc gcttcctcca aatgaaagga ctcacttggt aattctggga gccatctttt    15300
tactccttgg tgtagcactg acattcatct tctatttaag aaaaggtagt atttccttaa    15360
ttgcagtggt ctccactggg gatgaggagg gggtgagaat tggatcgatc atggctgcaa    15420
ggaaacctga cttaacctct gcagggtggt gcaaaggcat tccactattc aacagtaatt    15480
atattgaagc tgcatgggat cactgggtga agatggggtg taaggggtga gggacaggag    15540
aatgggtatg gatggaggta gaagatgcag tgtcatacaa tttttttcta tcatgaaaat    15600
aaccacagac ttactgtaaa gaaggagcta aaatgcctgt cattttcagt tgcattttag    15660
ttttgcatta gttgcaccca gctggtttct gggtactcta acnnnnnnnn nnnnnnnnnn    15720
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nccatagagt attttgtaaa attattggca gaggatgtac    15780
ataatttgca tgtgttcctt tctccattta cctgtgggaa caattaaaat ccaggaaaat    15840
gagtatattc aaataatttc ctcccattta tgatgattca gagtaaataa ttcctctgat    15900
acttagagaa gtataccaag agatccagtg attgtataga gttgtctgat gttaaatagg    15960
gaagtagaat atggaaggga ttccaatagt cgttgaaaaa ttccccacaa ccccttacat    16020
gggggaaagt ggtgttaact gagatagtag agataagctg ttaccaaaaa ttatgttctt    16080
aacaggattg agatagccag aatataagga tcaagtttca atgacagtaa gatcctgaga    16140
tgcagttgat ttgcacaaag aaataattgt tgccagcttg cattttgaat atttctctgg    16200
aaaaagagat tagttggcag tagaaatgaa tagaaatcaa tagatattaa aatacctcag    16260
aatttgattc atctctggga aaagatgaaa aataaaagtg tatagtcctc aagaaaatct    16320
gggatcaaaa gcatgggcct taccctattg aattaattaa cctcagaagt tgggaactgt    16380
ggaataagga tgtccaccag acttcctagg gattacaaat gtttcataga acttgaaatt    16440
taaacttggg tcactgtatg ggatgtagag ctgtgctata tggaaataaa aatgatttct    16500
ttttctcaag ggagaatgat ggatatgaaa aaatgtggca ttcgagttac aaactcaaag    16560
aagcaacgtg gtaagaatat cagaaggaat tgggaagtag aaggcaaagg aaacaaaaag    16620
ctaaagcaat aacaaagaga aatccattag tcataatctc ctctcctttt aaagaatgct    16680
ggttcccctt tgcctcacaa ctaatacaag aacttctcca ccatctcagg aagtttaggg    16740
atggccttca agagtagaga gtagggagca gctctgtgga gagaggagag gagcagggaa    16800
ggggaaggag tcagcttctc tttgctaatc tgttgccctg caccctagca gctccctgca    16860
gcaggggaca aggttgactt aggtggatgg ataattaatt gattctaaaa tattgtgtgt    16920
cagtattgta tattgtaata ctatgttaac tgcgccatgc acggtatctc atttaatccc    16980
ccaccccttg ccattaccaa aaagagagag agaaaaatac tagaattatc ctcattttac    17040
agtagagaaa acagagggtc aagaagataa agtaaagtgc ccaagaacac acaactgatc    17100
acaaatatca agcttggggt ccattagcct aaccacagac ccttactctt aacccatctg    17160
cttcaatcca ttttgctaca aatgtttaca ttatatgcag ggcagaaaag tctcatccag    17220
tttattgaac taagaagaaa gttatattaa ggtgtctaat tttttttaat gtagttagaa    17280
accaaactta acaatgagcc caagtttaaa gcagtctaat taacttgaca agctcaggca    17340
agtttcattc tgtggcctgt agcatcatct gtgttgtaaa gctaagtagc aaatgttatt    17400
tgnnnnnnnn nnnnnggtca tcctgggggg aaagtcatcc caatttgctc aagactgagg    17460
ggtttttcag gatatcatgt aaggataatt gggtacaaat ataacctgct tctttctctc    17520
atttcaaatt tatcatttat catctcagca actatgagtt atgtttttta ttagatttct    17580
tgttactttt tccccagacc gctccccatg aaattaatat actattatca ctctccagat    17640
acacaattgg aggagacgta atccagcatt ggaacttctg atcttcaagc agggattctc    17700
agcctgtggt ttgggggttc gtcagggctg agcatgacca gaggaatgaa tgggcccgtg    17760
ggatgcatgc agtatgggac ttaaaaggcc caagcactga aaatggaacc tggcgaaagc    17820
agaggaggag aatgaagaaa aatggagttg aacagggagc gtggagggag accttgatac    17880
tttcaaatgc ctgaggggct catcggtgca tgtgacaggg agaaaggata cttctgaaca    17940
aggagcctcc aagcaaatca tccactgctc atcttaggaa aacgggttga gaatccctaa    18000
tttgagggtc agttcctgca gaagtgccct ttgcctccac tcaatgcctc aatttgtttt    18060
ctgcgtgact gagggtccca gtgttggaac agtatttatg tatgagattt tcctatttat    18120
tttgagtctg tgaggtcttc ttgtcatggg agtgtggttg tgaatgattt cttttgaaga    18180
tatattgtag tagatgttac aattttgtcg ccaaactaaa cttgatgctt aatgacttgc    18240
tcacatctag taaaacatgg agtatttgta aggtgcttgg tctcctctat aactacaagt    18300
acacattgga agcataaaga tcaaaccgtt gatttgtata ggatgtcacc tttatttaac    18360
ccattaatac tctgattgac ttaatcttat tctcagacct caagtgtctg tgcagtatct    18420
gttccattta aatatcagct ttataattat gtggtaccat acacacataa tctcctttca    18480
tcgctgtaac caccctgttg tgatgaccac tattatttta cccattgtac agctgaggaa    18540
gcaaacagat taagtaactt gccaaaacca gtaaatagca gagctcagac tgccacccac    18600
tgtcctttta taatacaatt tacagctata ttttacttta agcaattcat ttattcaaaa    18660
cccatttatt aagtgccctt gcaatatcaa tcactgtacc aggcattgaa tctacagatg    18720
tgagcaagag aaagtacctg tcctcaagga gcttggagta taataaggag attaataaga    18780
aaatatatta ttacaatcta gtccagtgtc atagcataag gatgatgtga ggagaaaagc    18840
tgagcagtgt tgccaagagg aggaaatagg ccaatgtggt ctgggacagt tgaatgtatt    18900
taaacatctt aataatcaaa gtaattttca tttacaaaga gaagtcagta cttaaaataa    18960
ccctgaaaaa taacactgga attccttttc tagcattata tttatccctg atttgccttt    19020
gccatacaat ctaatgcttg tttatatagt gtctgatatt gtttaacagt tctgtctttt    19080
ctattcaatg ctattaattt taaattcata cctttccatg annnnnnnnn nnnnngatcc    19140
catgggagat ggtttgaaaa tctccacttc atcctccaag ccattcaagt ttcctttcca    19200
gaagcaactg ctactgcctt ttattcatat gttcttctaa agatagtcta catttggaaa    19260
tgtatgttaa aagcatatat ttttaaattt ttttccctaa atagtaacac attatatgtc    19320
tgctgtgcac tttgctattt ttatttattg tagtgtttct tatgtagcag atggaatgaa    19380
tttgaagctc ccaaaggtca ggacacatgc cttctttgtt tctaagttat ctttcccata    19440
gcttttcata atctttcata tgatttagta catgttaaat atgtgctaca tatacattta    19500
gacaaccagc atttgttaag tatttgctct aggactgagt ttggatttat gtttgctcaa    19560
aaggagaccc atgggctctc cagggtgcac tgagtcaatc tagtcctaaa aagcaatctt    19620
attattaact ctgtatgaca gaatcatatc tggaactttt gttttctgct ttctgtcaag    19680
tataaacttc actttgatgc tgtacttgca aaatcacatt ttctttctgg aaattccagt    19740
agtgtacctt gactgctagt taccctgtgc cagaaaagcc tcattcgttg tgcttgaacc    19800
ctttaatgcc accagctgtc atcactacac aggcctccta agaggcttcc tggaggtttt    19860
gagattcaga tgccctgaga gatcccagag tttcctttcc ctcttggcca cattctggtg    19920
tcagtgacaa ggaatacctt cgctttgcca cccgtcaagg ttgaagaaac agcgtctcca    19980
acagagctcc ttgtgttatc tgtttgtaca tgtgcatttg tacagtaatt tgtgtgacag    20040
tgttctttgt gtgaattaca ggcaagaact gtggctgagc aaggcacata gtctactcag    20100
tctattccta actcctcctt ttggtgttgg atttgtaagg cactttatcc cttttgtctc    20160
atgtttcatc gtaaatggca taggcagaga tgatatctaa ttctgcattt gattgtcact    20220
ttttgtacct gcattaattt aataaaatat ccttatttat tttgttactt ggtacaccag    20280
catgtccatt ttcttgttta ttttgtgttt cataaaatgc ttagtttaac atcccggtgg    20340
<210>  4
<211>  20641
<212>  ДНК
<213>  mus musculus
<400>  4
gcctcatgcc aggctgcact tgcacgtcgc gggccagtct cctcgcctgc aggtaaggga       60
gcatcttctc gcggaatccg cttgcagggc actttaaaga gccagaatcc ctagaccttt      120
ttaggacgga gaagggaacc ggtttcctgg gaaagttaag aactcagaat ccgcagtttt      180
gtgtgtttat ggatcttgtg ggtaggtagc tgggtcagaa gagatgaatt aattggtcct      240
agcgcgactt gactgtttgc tagcaatgac tgggtctttc cacttgaagc atctccggag      300
gtcccttcct ctgtcgaggt ctaggatgct ggagcttaag attttcattc tatctgccca      360
gagaacctaa aggatttttg gaagaaaatg tcccaaacag ttcttagata cagtgaccta      420
ggctatgtta aagtttaggt tggggttgtc ataagaggtg aaagtacaat attctatctt      480
tttttaaaaa taaattatta caggtgcttt cctatgaatt acttagccag ttttttttta      540
attgctatat tccattgtgc tgggttatta aagggcatca ctctcccact gaggaatgca      600
caggttagta atagtgcctt actagctcag tcatccactg accatctgtg tatgtgactg      660
tctggaatat ggctaggtat ttcatttaga taaactctta tatgtataag tacttcatta      720
tgtttgagtg tctgaaaggc ctttgtgtag aaaaaaaaaa aacaacaacc tgagaataca      780
ttccagaaag tatccgcagc tgatgatgat agtgaccaag cggtgtttaa ggagaacttt      840
atacagggaa aatattcacc tttcccagct gagcatcata gataggaaga catgatagtg      900
gttatatgct gctctaagga gggatggaga agggatggat ttgagcacag ggttcaggat      960
catttgatag aatttgaaaa ctgggtaaat tttcactctt ttgagaaagg aagtttgcat     1020
ctgcttcccc tccccgcccc aggcactctt ccccccccca tccccccccg tgcccccccc     1080
ccccatggga agataaagaa gtggcgttcc aagatcttca tctggacttc ccctgggaca     1140
aacctatttc cccatcttga atgagcgtca cttctttact ttaaactctg ttctgtgaaa     1200
ggctctcagc tcttgtctgg gaatttgtga aaggttacag tttcttgccg gagggaggga     1260
gaaggtgacc ctggactctt agcccatgta agaggtgcag gtttagaggt caaaggccat     1320
gctgatttac atggtccctg aatttcccct tttgatctac tgctcacacc tgcaccctga     1380
gagccaggga ggggaggata tgatactgaa gaaggtgact atcagaccca acccatcacc     1440
tttcagactt tatactaagc tttaaagcag actcataagc aatagataac tgttccaact     1500
gagtctgcca tcaacgtagg aaaaattagg tacagtcttc agtggatatc atgtacctca     1560
ttgtgactgt ctagtactcg gcttggccat ttctcccagg gcctcattgc aacagtcact     1620
gtgtcctcac aggcctggat gtcatcctgc ctcatctgct tgggcagatg aactggagag     1680
atatgattaa taatgagtca tttgattttg ctctttttgt aaatgtcctt ggtttggttt     1740
ggtttgttta ttttttgttt tgttgttgtt gtttgttttt attttcatgc tcttgttgtt     1800
gtttgagaca gagtctcact atgtagccca ggctagcctc ttcccccagt ctctcagatg     1860
ctgttgcatc tgcccttttc taacatcaat gattcataat aatcagcaag aaggctatga     1920
ccttaacagt caaaataagt aatcaggtaa ttattgagag ctaaatattt atttaaacaa     1980
atcaagttgc atttttcaag aattgaatgg ggggatctaa aaagtaatgt ttgtgctgca     2040
caaagatgta gtggtatcag ttgccatagt ctttctccct agatccgcag atctccttag     2100
ggaaatctat aattcaagcc taaacttgga cctggtacac aactggtact cgcccaaaca     2160
ttggccaagc acacacatat ttgtgactct gaaaaaaggg acaacacata acagcaaagg     2220
cgctccgtgt taggggcctg ttaaatacaa gacttgggga aattatgcca taatcttaca     2280
ttttaaaaat ggctattaca tgtgtgagac aacgggggct ggagagatac ctcagaggta     2340
ctaggcacac atatggcaag cagatgtaca agcaggcaaa acattcttaa aaaacaaaaa     2400
caaaacccca aaacagattt ctttctatat tatttatatg gggttctgcc tgcgtgtaca     2460
cctgaagggc agaggagagc accaggtctc ataggtggtt ggttgtaagc taccatatgg     2520
ttgctaggaa ttaaactcag gactttggta agagcagcca gtgctcttaa cctctgagcc     2580
atccctccag tcccagacaa aacactctta cacataaaat aaatcaatct ttaaaagtgt     2640
agaggaaaat ggctgaacag aaactattga cagacatgct gagagtggtc accgtttctc     2700
cagcttggca ctggtggtgc tgtaggccat ctcagtgtct gtcaccttgg ggcggggcgg     2760
ggggcgggag ggggggaagg cggcagggca gggtcttggc agcatctcgg gcctctattt     2820
catcacatca gtaacagctc tccttcgtcc caagcaagct ttggcaacca aataaatatg     2880
ttagccaata ttaccaaacg gtccctagag gagaatgtgt gtaatgtgcc tacattcgtt     2940
tttataacaa caccaacaat atccaaccat aaaaataaac tgaaatggtc actctacctc     3000
agtgacaacg tctgagctcc gtttcagggt ccctcacaag aaattcgata ggtgtaatga     3060
tttatttttc ctaataagta aaatgattat tcactcattt gaaaattgga cacacacaca     3120
aaaaaatgaa gaaaaaattt gctatttcat ctctcctttt ctatctcttt ccctttaaaa     3180
aaagtataaa tgtgggctaa agagatggct cagcagttaa gagcactggc tgctcttccg     3240
gaggtactga gttcaaactg caccaaccac atggtggctc acaaccatct gtaatgggat     3300
ctgatgccct cttctggtgt gtctagagac agtgacagtg tactcacata cataaaataa     3360
gtaaaaaaaa aaaaaacaaa actttttttt aagtataaat gtgtaagaac ttacctgtct     3420
tccctataaa agccacaatt acctttgcag ataatcactg tcaggcagtg tcttcaagag     3480
aagtggggtt gttctacgac acaagaatat ttttgtttat atactaccct ctaagctcct     3540
tcctacttct ctgcaaactc atcccctgtg catatactga aatctatccg tcacggtatt     3600
ttgagtatac acagttatcc gtcacggtat tttgagtata cacagtttta ttagctaata     3660
catggggtat ttcaagtctg ggactgttgt tggctgtgtc atctctgtta catatgactt     3720
atattttcta agatgaattt ccaagacagg aatagagaga tcatacgaca tgcacagtta     3780
aagttttaag agattacaaa attgaccttt aagaagctat acaatttcac atcctttcca     3840
ggaaaggtca agaaatccct gtatcttcac taatgctacc tatgaggagt ctgtaatttt     3900
ggtagagcag aaggtccaaa tggtatcaca gatcctccat ggactttctt atcgagagcg     3960
ttctttccgc ttttattgat tatccttcga gctatgtgag actctcatcc gtcttcctct     4020
tgaccgatgt atagttttct cactgagttc agaggctagg atgcagaagc cgtcctcgtc     4080
agctttatac acctttcaga ttgactgtga atgagcacac aggtcagaga gacggtaagg     4140
gaagacctac tctcccatga acgttgtaaa catgcgaata acacagaagc agaaaatgta     4200
aactattaga ctggctggaa tgtagcgctc acctttgagc ccactccttt agacaccggt     4260
ttcatggaag aatggctcct gtttcccacc tgctgcttca gcagtgcccc aaatagtgcc     4320
agattcagag gagatactca gtgtttgccg agtgaattag gaaagtgttc agcggagggg     4380
acactagcat tcagacatcc agaccttaga gtaaccgggc cagatggaag tctccttcct     4440
tcccatagct gttaccactg tactgtcttt actggggaaa agatttatca tgtggaatag     4500
gtgcgaggca gaggtgagat tttaatgggg aggaagcatt gaaaagtgaa agtgaaaatt     4560
ggatgctctt tgctttgaag ctttgcctaa agcaggtttt agctttcaaa tacgtttcaa     4620
tgttgaaaga acgcatgata catatggagg ggggcctggg gggggtcctt ggctgagttt     4680
gaatgtacat taacaatctg gggggctaat aactcaatgt aaagctgctg atcccatcat     4740
actgacttct ttccacttgg ttctacatgg ctttgagtta caaaatgaaa gcattgaatt     4800
ttgaactgtt cagctgtgtt tccacacttg caaatcggtt gttggccagc cctcagaatt     4860
gcttcagtta cagctggctc gtctgctctt tccagactgg cttttagggc ttatgtatat     4920
atgagaagga cacatttact agtgtctcct tgctctgcta ttgaaattaa gcagacctct     4980
ctgtgtttcc cgttactaga tagttcccaa aacatgagga tatttgctgg cattatattc     5040
acagcctgct gtcacttgct acggggtaag tcaccaaatc ttttcagtgg gttctatatt     5100
ttcaatattt tagctatgaa ttaaaaatgg aagtaatttg tggggtgtgt atgtgtgtgt     5160
atatgtgtgt gtagaggggg gtctgtgtgt atgtgcagtt gctaggcaca cataaagcgt     5220
tcataggaca acctagagct tagtcctcac cttctacctt gtttgagaca aggtctctta     5280
tttgttgtac attgctgagt cctgtagttc ggctagctca gaacctcctg ggggctctcc     5340
tgtctccacc tcccagtcca ctgagattgt aggcacatgc tactgcacct ggcttctacc     5400
tggtctctgg ggatttgaac ttgggtccat gggctacaca gcaagtcgtt tacttactgg     5460
gcaatcactc catcccctaa gataattata aggaatatac cttgcttatc caaacacatt     5520
ctcattctcc tttgccataa ataagttact tggcaaatat attgtatgta tttttaataa     5580
ataaataaaa tcttaaaaat aaataaaatt atttgtgaag acaaaaaaaa taagttactt     5640
ggaaaggatg aaggaaaata ctggagcttt gggtgtggtt tagtagtaga acacttggct     5700
gatgtaaaaa aaaagcccta ggtgcaatcc caacaccaga aacaaatgaa ggaatgaaca     5760
acaaccgccc ccacccccca ggggatgaat ataaaaatat caggtaatac agaactaaca     5820
ggtgatccgt ttcctatgaa taactactga acattcccag ggaggtggcc cactgataat     5880
atatttttat ttattggttc cttttaaaca agactgggaa tatattatct agcttgcatc     5940
accaccacca ccccccaccc ccgccccatg aagttatttc aaagaagaat tttagtgttc     6000
atgtgattcc ctaaataaaa tgatagtaac cttttaccca ggttttcaga tgtgtttgga     6060
ggagttttct gtcttctgag ggctggtcct ctttcctttt cagcgtttac tatcacggct     6120
ccaaaggact tgtacgtggt ggagtatggc agcaacgtca cgatggagtg cagattccct     6180
gtagaacggg agctggacct gcttgcgtta gtggtgtact gggaaaagga agatgagcaa     6240
gtgattcagt ttgtggcagg agaggaggac cttaagcctc agcacagcaa cttcaggggg     6300
agagcctcgc tgccaaagga ccagcttttg aagggaaatg ctgcccttca gatcacagac     6360
gtcaagctgc aggacgcagg cgtttactgc tgcataatca gctacggtgg tgcggactac     6420
aagcgaatca cgctgaaagt caatggtaag aattaccctg gatggggaag gcttcatccg     6480
tatttaaaac agctccctaa tgttgagagc tcttcattct tgagagttcg cacgcacttc     6540
tcacagaaca acagcagcct gttcttctcg ctcgtttgtt cattcgttcg ttcacacact     6600
tcaccagtga aaaagcctag cactgtgtgt ttgatagtaa cttgagattc agtaccagat     6660
aatactcagc catgctttgc agtcagtacc atgatcttgc aaaggtgaaa tgccaggtgt     6720
ttgtttctta tcataaatgc aatatataat atattacata gatgtataga tataactgtg     6780
taacatgcaa taagatataa tatgcatata tttcatataa cataatgtat aatatataat     6840
gtataataat atatactaca atatatagtt atatgcatag ttatatattg catttatgat     6900
aaaaagcaaa cacctggcat ttcacttttg caagcttttt gaattacttg taaatatata     6960
tacatgcaaa catacataca cacacatgtt tttttacaag taatttgaat gtcatggaaa     7020
gaaatagaat cataaaaatg tccctcctcc ctaactacca tcttctaagc ataaatatac     7080
agtaactact atttgtacat ccctccatga ctttttgatt ggattactgt ttatatttaa     7140
tctatcaggc ttagcacatt ttctttcctt tgaatacctc catacaaaat tcaatgtgtg     7200
tttatatata tatgtatata tatagttata tcatatcata tatcatacaa agttttatat     7260
atgtatacat atataaacac acatatctac acatacatac acatttttta tatatataca     7320
caatatataa tgtatatgtg tgtgtgtgtg catatacctc tatatctatc tatctatcta     7380
tctatctatc tatctatcta tctatctatc tatagcttct actgtaaggg tcacttttta     7440
aaaaattaag gttaatctat gaaggatgag aagtgaagat cttaagtgta gaagaagccg     7500
ttcttccaca gagatggtac aggctacact cagcaggcat gcattcattt tcagggcctg     7560
catctctggg agtgctgagg aggaactatg agtgtaagtt cctgggtaac gagccacaga     7620
aatgtcatca ggtcccttga gttcacggtt ctgggttgga actaactaag ggaaggaaaa     7680
caccttgcta accacccctg ctttcactgt tgggttgcat agacctgaga gcttcactca     7740
tcgcaggcgt gcacacagcc agcccagttg cccaccagga ctggaaatcc ccaaggctct     7800
cctcttcaca tacctcccac agtggtgtcc ctcgaatcag gtccctttcg tggtctgcgg     7860
aaacttcacc ttgatggaca ctgagccgaa ccccgtcttc tccaggcaga cgttgcagat     7920
ggtctgcctg ctccttttcg gttttcataa taactttaaa actatttggc tagaatcaga     7980
tagtctcctt cgatcttttt actcctaaac tagtgtgaag ctcaatatta tacataggaa     8040
aaattcacat tcctcataag ggatcacggc agttattaac gcaatcttat gtagagatta     8100
ggaaaaatgt gtccattcga cagtttatta atgggtctgt gatggtgggt cgcttagagc     8160
ttatgaagat gccacttgcc ttatttcggt gcttggctct aacttccatt accttttact     8220
tacaattctt catttgtgac actcatgaaa ggagactcgg gatatggttg ttaatatctt     8280
gagcagctgt tagtacatca gcaaatatga ggctcctgtt tggttccaag atttttaaag     8340
acattgtgaa gctggaaggc catgagcagt caaagttgct ggacctgggg cactggaagg     8400
agctcaaggc gggcagtcag gaagaaggga gcagggtgta agcctctgtg acaagaggtc     8460
tctcatggct tgttaggagt aggtgactct ggtaaggagg aatttactct agattatgtg     8520
ctcagtgata tctctgatac caaagacaat cttttggagc gcacggcttc tccacggagg     8580
gacctgtgat gcggcaaagc tggtatccaa gcagtcttga aggcctgctt gactattttg     8640
ttttcttaca gaaatcacta cgtcgatatt ttactcccag ttcaccttgc catttgcatg     8700
cacgttagct ggtctaggcc aagagtctga accttggttg tggctcaaat ctgtaatctc     8760
agctatgtgg gaagctgagg caggagaatc gcgcaattag gacttgtctg agctacgaac     8820
atatagcagg ttcaagagca gcctgggcaa tttggcaaga tccgttctca aagacataca     8880
tacatacata tatttggcaa gatccgttct caaagacata catacataca tacatttggc     8940
aagatccgtt ctcaaagaca tacatacatg catgcatgca taaatacatg tataaatgaa     9000
tataaaatta aaataggaac aggactgagg acatgcccag tgatgtacag gaccctggtt     9060
tcagtttcta gcaccatggt cgctggcatg caaaagcttt ccatgtcaag gaagtagaac     9120
tcctgaattc tgtgctatgc aaatgacttc acagcaaggt tccttcccat cactgcaagt     9180
gtgtggtggt gaagcagccc tacagggagt tcactcgcca tggggtttta aaggtgaatt     9240
atttcaaaac tgaaatctga aagagtgtag ttttggatta actcagtttt tattatctct     9300
ttggataatg ttctaccttc aaaggtttac agaagaccct caggcatcag gcttttaatt     9360
gaaaaatatt cagctttaat cactgacctc aatatcagaa aagaatgaag tgtccattta     9420
gtagtcctcg gaccgtagat ggcattaagc agctgtaaga aacacgctca tcacatggtt     9480
caacaattaa ggattgccat ggtgcacccg atcccccagc tctgtttaaa ccttttctct     9540
gtcatctatg cctatctaag atgtctcagc atatcatgct tattgtctct ttccttctct     9600
tgaacacaag ctctaggggt aggggctttg gtcagtttta ttgttggacc tgttggcctt     9660
gacgtattat gaaggggcag tgtaataaga aaagaaaacc gtgtttgttg atggaatggt     9720
ttaaaaaaaa attagcttaa aatgtatgct atacgaacgg gcatgaatct gggagatttt     9780
agactgttcc ttgtgagccg taggaacttt cttgtttctg tgttcacagt cctccgcagc     9840
tgtgctcatg gtcctccaca tctgcctaac aacagcaggg gtagatgtta taattaacac     9900
tcacagaaca cctgatatgt gagaggttgt gccctgggct tcttgctcat atgaattcat     9960
ttcatcttta acataactct tcgggggagg cacttgccca tgaccatggc ttgttttctt    10020
tcctatcgac tatctttcaa atcggaatgt gtctttccct aggtgacatc tcagattcaa    10080
tgttacacag cactgctgtg cccattttca ggcattaaaa atgcgatccg cctaaattcc    10140
accccgataa aattatgcag ccaggttcgg aacccaacta gcccatctct aaaaatctat    10200
gcccttccta gcctcgcttt gttgcctgtc tttgtacctc tggagtgggt atcaaggaac    10260
agaatggctt taaacatgat ttgaactttt cctggttttt gatcacagca gtaacagagt    10320
gttctagaga taagccagag gtttgaaaac aaacagaact tgtctttgag gtgttataaa    10380
catgtgtgtg attataaagg atatatctgg tgccaatagg tatagcttat attataagaa    10440
atggccattg tgaagatcag aaggagataa ctcactgatt tcaggtggtt gattcaatct    10500
aacacatgat atattctgaa actgtacaaa aaagatattc aaaagaagaa acacatggaa    10560
caaagagtat atggaaattc tgacaactca gaatcagtgt atgttaagat gaagttcatg    10620
attaacaaat ggagatggtc gcagtcatcc tgaagcttat tttagccaat gctttatcac    10680
atccaactca atcttcgttt tttttttttc agatggatct tcccattttt aattaacctt    10740
atcatgatag cccctagtaa ggcatgtcct gacatttctt ttcttttttt ttatagctta    10800
tgtttctttt tttaaaaatt tttttactac atattttcct caattacatt tccaatgcta    10860
tcccaaaagt cccccatacc ctcctccccc actcccctac ccacccactc ccactttttg    10920
gccctggggt tcccctgtac tgggggatat aaagtctgcg tgtccaatgg gcctctcttt    10980
ccagtgatgg cctactaggc catcttttga tacatatgca gcttgagtca agagctccgg    11040
ggtactggtt agttcatagt gttgttccac ctatagggtt gcagatccct ttagttcctt    11100
gggtgctttc tctagcttct ccattgggag ccctgtgatc catccaatag ctgactgtga    11160
gcatccactt ctgtgtttgc taggtcccgg ccaagtctca caagagacag ctatttcagg    11220
gtcctttcag catatgcttg ctagtgtatg caatggtgtc atcgtttgga ggctaattat    11280
gggatggctc cctggatatg gcagtctcta aatggtccat ccttttgtct cagctccaaa    11340
ctttgtctct gtaactcctt tcaatcttcg tttttaatgt ccgaaaatga ctggtaacgt    11400
cactgcttac atttcccttt gctttgtgtt gaattgtgag ctttatcttt gatctggagt    11460
ttctttaaga agactttgta atgtgcttat ttttaaagat ggtgaattca attaaagata    11520
gacaagaggg acgggtctgt atttcatctg gtagagtgct tacctgccat tcatgaagtt    11580
ctggttcgat ccccggcaca gcatagaacc acatgcggtg gcaactcagt tgcctgtgac    11640
cccagcactc aggagctaga ggcaggttac ctttgactac acagcaagtt caaggctagc    11700
ctggtctaca tgcaactctt cctcaaaggg aaaacaaaac aaaaatagac aggagaattg    11760
gaaacatcca tagaaaccca aatatgaatc aatagactcc cctcttcctg tgtcagacat    11820
tcagactcag tgacagccgt caccgtttat gaggcatgac tgattttaca gatcctagag    11880
caagcgtgca caattctggt gtttcctgcc tgcgtcctca cacacacgct caccttaggg    11940
acggaggcag cggaggtcta gtcagtttca gacgaatcca ctcatcagct gctcaccatg    12000
gtcttctagg tgaagcagaa ctctccttcc atcagcaccc gtgaaaaaca aaagtggaaa    12060
gcagatattt cactccgaat gctttatcat tggcagtgat ttcaaattta aaccactaat    12120
ttcccagaag aattaggtca cgggccatgt ggcattagac cctattgtgg tgacattatt    12180
tcctgatgtg cctatttaat aatgtatagt ggtctcatct ttatttagtt ggtcttgaat    12240
gtgataaata caagactggg caagtgttca tcaaagctgt tacttgaaat tgtaattata    12300
cctattttgt tggtggtgtt ttttcttggt tcatggacaa ccaaacacat tacggctttg    12360
ctttgtctta gctactctgt gtcaagttcc tgtgaaaata ccgtattaca gtgctcttat    12420
tacatctttg gtaatgaagt agtcacctaa gcccctatcc tgggctctct atggctcact    12480
aaagaatcgt aagttggata atgattgctg aagaaataga tatgttttat ttacattgag    12540
gtagaaagac ctgtggtttc taggtaacag tttacttaac ttagttgcta catctagttt    12600
gcactcagta aacaccctgg tgtggttttt acaacaacaa ggttgttcct gaagcccaaa    12660
catggcccag atttgaatag aagacctgag gcagactaac actcactccc tgctgccaaa    12720
gtagcagagc cggggacata tttctccaat agccagcccg agttgatgct ctttgtaagc    12780
agacaccaca aagccacacg gctagcccta agatgggaga gccctgacct ctctttgctt    12840
ctgacctagc cccataccgc aaaatcaacc agagaatttc cgtggatcca gccacttctg    12900
agcatgaact aatatgtcag gccgagggtt atccagaagc tgaggtaatc tggacaaaca    12960
gtgaccacca acccgtgagt gggaagagaa gtgtcaccac ttcccggaca gaggggatgc    13020
ttctcaatgt gaccagcagt ctgagggtca acgccacagc gaatgatgtt ttctactgta    13080
cgttttggag atcacagcca gggcaaaacc acacagcgga gctgatcatc ccaggtgagt    13140
tgcctaactc gtccccggat tcctagcacg atggccatcc gccatagtca tttagcagta    13200
gttggccgag tgtatgaata catgaaactt acattggcta gacgtattct agttcctctt    13260
tctcttgcgt gcaagccata atgctacttg gtcaacactc agcaagaatt aagtgtttgc    13320
tcctgacaga cagtatgtta gtcattgagt attcgtggct ggataggaca taagttactc    13380
tgctccagga aacaggtgac agtcgcatgt aggagatgct cttgtaactt gggcaccacg    13440
ggcaacgtga gagcaagctt atgcttcagg aatgtaaacc tttgtcacat caaagctgcc    13500
ctcttccctc ccgggctgct gtagtagaaa gcaaatgcat tgcctttttt tgtatcttat    13560
attcaacagg aagaatcctt tcttcccata ctcctcttca gggcattccc tgatacttca    13620
actccaggaa gtctgcctgt gcatagaaca cgaggctgat gcctatgggc aaccgactag    13680
ctgggttgta actcaccagg ccagggcatt gtagggatag aatgagctgc acgaaaatga    13740
ttgtaggaaa atcgtttgag aattcagctg tctttaaaat tcatttacct tacagaaata    13800
gggccacagg agacagtttg gtgagaggct cagagcatta tatgaatatg aacccagagg    13860
tactcactct gaggagggtt gcttctgcct ccatcgacac ccctttccca atgtatgtca    13920
acagtacatt gatgtctaga gatagctctg tgaagtttag agaagatata taaaactaca    13980
ttaaaaagtc aaccaatatg aaaaatgaag cccaggatgg gcgtggagcc aaaaggagca    14040
cacaagtttg gaaaaatgta aaataaaaag gaagacactc taactagaat tggacttttc    14100
cataaaagct atattgttgg tttcctacca ttaaatgttt tatggggctg gagacgttgt    14160
agctcagttg ggagagtact tgcctagcat ccacaatgct ctgaccccag cgccatataa    14220
acgtatatag ggctcaccta tagtctaaac actttggtgg tggaagccgg agggtcagtt    14280
caaggtcatc ctcagcttca tagcaagttc aaggccagta tggactgact acaagagacc    14340
ctgcctcaaa gacaaaacaa gcaaacatca tcataataaa acagcaaaaa gctgttctct    14400
ggccatttct ttgtaggaca tcctggagta acttaaccac tctgagtgtc tcttctcatc    14460
tgtaacttgg gttcatagtg ggaccaaata ggagctgagt tacaacagga gatggaagtt    14520
agcaatctca gagcatccca gagccctggg acccattttt ctctttctca aaactccagg    14580
cagagaaaca gggagatgtt aatgactgga gtgcccaaga gtctcagaca tggaagaaac    14640
acaacccgca ctggtccaca tttgtgggag acagaagcgg cttagcagtg ccccgctttc    14700
ccatgttcgg gagttggcct tccacaccaa gtcagccatt actgtctata ttaatgagtg    14760
cacaaggaag ttactgcact aaggttacca tttaatattg cagtcacttt ctgtggcaac    14820
atgtcacagg cctggagttc ttctctgtgc tgctcccagt ttcttaggag atctgtcttc    14880
ttcttccaac ccttacctgg acattaactt tcagtgatta agattaccct aagaccaaac    14940
tatatttcag gagtcatcat tcccctgact atggcgcagc aaagccttac cttccatcag    15000
cttctcttta tccttttcca gaactgcctg caacacatcc tccacagaac aggactcact    15060
gggtgcttct gggatccatc ctgttgttcc tcattgtagt gtccacggtc ctcctcttct    15120
tgagaaaaca aggtatttcc tccattgctg tactgcctgc agggaagtgc atgagggtcc    15180
cttcaccatt gccttgagca ggcagtgcca gagatggtac caccctgaca agaacagacc    15240
cacatcacag ggcgtcctac actgcacgct agctgaacct caccaggaaa cactgacttg    15300
aaaggtgctg ccctccattc cctgggcttg ctttcagtta cacagagtaa gttttaacag    15360
tgactctggt gtactgagtc ttccttaagt cctgttcaca ttgttgctct gcgacatctc    15420
ctaccttgga gctcggtgtt ggaccctgtt gtaatatgaa gaggtatcag ttggacaagg    15480
gcgtagggaa gctaaaagac ttagctttca aggcgtgggg gagggggagg gcattgtgag    15540
gttccctgtt cagcggttca gagtaaagct gggcagcaca caagtttaga caacaaggaa    15600
gatgctctaa ctggggttgg aggtcaatgg tgcagggata ggtagcaatg gaggctaaag    15660
aagaaagcca taaggtttct ttctacagac tctgaagaca gagcactgtg gtgcctattg    15720
gtctcaggtg aactcaagtc ttgtgttcct tacaccacct attgagctgg gttctggata    15780
ccctaagtgg aaaaacactt ctgtctaaaa agagctgtgg catctttacc acaaagcact    15840
tttttttttt gcaagatttc tgaagacgaa atgacacagt ttttaaaata atttccatat    15900
atttatttca gtacttaccc ataagaatga ctgaaatcta ggaaaatgaa tatattcaaa    15960
taatgccttc ctattgtaaa gtgacttaga gtaaaccttt tcaccaaata ctttgaaatg    16020
cataccaagt gagccaatga tgcatggact tgtgtgaagc caaatgggga aatagaatat    16080
gggagggaac atcaatcatc agagaggaat tccccatcac ccttttggag ggcgcgtgta    16140
tgggaaaagt gttgtaactg gggcggtagc gaccagctgc ttccaaagaa taagccctga    16200
gcagaaccaa gagggttgcc agggtgtgaa gattaagctt cagagacaca tctggcttag    16260
ggctagccta ggacttgcac aggaccgcag ttgttgccta atggcatctg ggatgattgg    16320
ctgaggatga ggaaagcaga gagtcagtta ggtggtaagc tagctcagga tgtgggacgt    16380
ttctgaggga agggtggaag acaaagtaga cagtcctaaa aaccatctga gaatgaaagt    16440
atgtacccta aattgttgaa taattaactt tgcggcgtgg gatctggaat aaggaagttc    16500
acgggctaaa agcctggtga ttaggggatt gatcggtgtc tcctaaaaac cttaagttga    16560
aaatcgagtc cctgtgggtt gtagtagcat cttgctataa ggaattaaga ttgatttctt    16620
cttctttagt gagaatgcta gatgtggaga aatgtggcgt tgaagataca agctcaaaaa    16680
accgaaatgg taagtgtgag taacgaggga ggggcaagcc gagggaatga gtgggacaga    16740
gcagccaagc agggtcctgc aagggctgca gttccagcgc tctgtaggct gaggcagggg    16800
gatagggagt tccaggccag caaccacaca gccaaaacaa aacaaacaaa acaaaaaaca    16860
aagcaaaagg aagagcagaa aaagctactg ttaccaacaa gagacatact ttagccgtga    16920
tctcctctcc ttccaaagga agctgtttgt gggggctgct ggttcctctg cctaaggatc    16980
gccacatctg agaaaactct gggtttgctg ctgcggtgtc tgtgtggtag ccctgcaacc    17040
agggacgctg ttgacttatt tgaatgggca tttgattaag caaatgattc tgctgtgtgg    17100
ttagctgtta actgtttcat gtgtatgata tggcatttca tttcatcatc ctgcccccaa    17160
tcagataaat atgagaatca tctccattgt atagtaggga aaacagggct gagaagataa    17220
tgcgaggtgc ctaagaacac acagacttgc taccacagac gtccgttctt tgctaggtgc    17280
ttcaatctat gctgctacta atgtctgtat ttataagagt agaaaactct gcccgggcgt    17340
tggtggccca cgcctttaat cccagcactc gggaggcaga ggtagtcgga tttctgagtt    17400
tgaggccagc ctggtctaca gagtgagttc caggacagcc aggctacaca gagaaaccct    17460
gtctcgaaaa aaatcaaaaa agaaaaaaga acaagaaaac tctaactgaa ctatcttgta    17520
gtaaattaca gtgtgttcta attcatttta gtgttgttag aaaccaaaca gtaaggccag    17580
gcagaactaa agtggtttcg ctaacttggg cagacccaag caggttccct cctgtacatt    17640
accatttatt ctgctgagtc accctgagga accggcctgg cttgctcaag actgaggatt    17700
tctcagccat gaacactttc cattttaaaa ctagggcagt cccggacaag caaggatggt    17760
tagtcatcct tcatcatgta agggtagtca gacataggta gtatctgtct ctgtcttacg    17820
gcaacgttac tatctgctct agcaaacatc ccatttgttt atcttacata tcatacgttt    17880
cccccccaca tattccctgc ccctgtgaaa ttattatact atgatcactc tccagataca    17940
caattcgagg agacgtaagc agtgttgaac cctctgatcg tcgattggca gcttgtggtc    18000
tgtgaaagaa agggcccatg ggacatgagt ccaaagactc aagatggaac ctgagggaga    18060
gaaccaagaa agtgttggga gaggagcctg gaacaacgga cattttttcc agggagacac    18120
tgctaagcaa gttgcccatc agtcgtcttg ggaaatggat tgagggttcc tggcttagca    18180
gctggtcctt gcacagtgac cttttcctct gctcagtgcc gggatgagag atggagtcat    18240
gagtgttgaa gaataagtgc cttctattta ttttgagtct gtgtgttctc actttgggca    18300
tgtaattatg actggtgaat tctgacgaca tgatagatct taagatgtag tcaccaaact    18360
caactgctgc ttagcatcct ccgtaactac tgatacaagc agggaacaca gaggtcacct    18420
gcttggtttg acaggctctt gctgtctgac tcaaataatc tttatttttc agtcctcaag    18480
gctcttcgat agcagttgtt ctgtatcagc cttataggtg tcaggtatag cactcaacat    18540
ctcatctcat tacaatagca accctcatca ccatagcaac agctaacctc tgttatcctc    18600
acttcatagc caggaagctg agcgactaag tcacttgccc acagagtatc agctctcaga    18660
tttctgttct tcagccactg tcctttcagg atagaatttg tcgttaagaa attaatttaa    18720
aaactgatta ttgagtagca ttgtatatca atcacaacat gccttgtgca ctgtgctggc    18780
ctctgagcat aaagatgtac gccggagtac cggtcggaca tgtttatgtg tgttaaatac    18840
tcagagaaat gttcattaac aaggagcttg cattttagag acactggaaa gtaactccag    18900
ttcattgtct agcattacat ttacctcatt tgctatcctt gccatacagt ctcttgttct    18960
ccatgaagtg tcatgaatct tgttgaatag ttcttttatt ttttaaatgt ttctatttaa    19020
atgatattga catctgaggc gatagctcag ttggtaaaac cctttcctca caagtgtgaa    19080
accctgagtc ttatccctag aacccacata aaaaacagtt gcgtatgttt gtgcatgctt    19140
ttgatcccag cactagggag gcagaggcag gcagatcctg agctctcatt gaccacccag    19200
cctagcctac atggttagct ccaggcctac aggagctggc agagcctgaa aaacgatgcc    19260
tagacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacaccat gtactcatag    19320
acctaagtgc accctcctac acatgcacac acatacaatt caaacacaaa tcaacaggga    19380
attgtctcag aatggtcccc aagacaaaga agaagaaaaa caccaaacca gctctattcc    19440
ctcagcctat cctctctact ccttcctaga agcaactact attgtttttg tatataaatt    19500
tacccaacga cagttaatat gtagaatata tattaaagtg tctgtcaata tatattatct    19560
ctttctttct ttcttccttt ctttctttct ttctttcttt ctttctttct ttctttcttt    19620
ctttcttcct tccttccttc cttccttcct tccttccttc ctttctttct ttctttcttt    19680
ttttctgtct atctgtacct aaatggttgc tcactatgca ttttctgtgc tcttcgccct    19740
ttttatttaa tgtatggata tttatgctgc ttccagaatg gatctaaagc tctttgtttc    19800
taggttttct cccccatcct tctaggcatc tctcacactg tctaggccag acaccatgtc    19860
tgctgcctga atctgtagac accatttata aagcacgtac tcaccgagtt tgtatttggc    19920
ttgttctgtg tctgattaaa gggagaccat gagtccccag ggtacactga gttaccccag    19980
taccaagggg gagccttgtt tgtgtctcca tggcagaagc aggcctggag ccattttggt    20040
ttcttccttg acttctctca aacacagacg cctcacttgc tcattacagg ttctcctttg    20100
ggaatgtcag cattgctcct tgactgctgg ctgccctgga aggagcccat tagctctgtg    20160
tgagcccttg acagctactg cctctcctta ccacaggggc ctctaagata ctgttaccta    20220
gaggtcttga ggatctgtgt tctctggggg gaggaaagga ggaggaaccc agaactttct    20280
tacagttttc cttgttctgt cacatgtcaa gactgaagga acaggctggg ctacgtagtg    20340
agatcctgtc tcaaaggaaa gacgagcata gccgaacccc cggtggaacc ccctctgtta    20400
cctgttcaca caagcttatt gatgagtctc atgttaatgt cttgtttgta tgaagtttaa    20460
gaaaatatcg ggttgggcaa cacattctat ttattcattt tatttgaaat cttaatgcca    20520
tctcatggtg ttggattggt gtggcacttt attcttttgt gttgtgtata accataaatt    20580
ttattttgca tcagattgtc aatgtattgc attaatttaa taaatatttt tatttattaa    20640
a                                                                    20641
<210>  5
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  5
taattggctc tactgc                                                       16
<210>  6
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  6
tcgcataaga atgact                                                       16
<210>  7
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  7
tgaacacaca gtcgca                                                       16
<210>  8
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  8
ctgaacacac agtcgc                                                       16
<210>  9
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  9
tctgaacaca cagtcg                                                       16
<210>  10
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  10
ttctgaacac acagtc                                                       16
<210>  11
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  11
acaagtcatg ttacta                                                       16
<210>  12
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  12
acacaagtca tgttac                                                       16
<210>  13
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  13
cttacttaga tgctgc                                                       16
<210>  14
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  14
acttacttag atgctg                                                       16
<210>  15
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  15
gacttactta gatgct                                                       16
<210>  16
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  16
agacttactt agatgc                                                       16
<210>  17
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  17
gcaggaagag acttac                                                       16
<210>  18
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  18
aataaattcc gttcagg                                                      17
<210>  19
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  19
gcaaataaat tccgtt                                                       16
<210>  20
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  20
agcaaataaa ttccgt                                                       16
<210>  21
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  21
cagagcaaat aaattcc                                                      17
<210>  22
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  22
tggacagagc aaataaat                                                     18
<210>  23
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  23
atggacagag caaata                                                       16
<210>  24
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  24
cagaatggac agagca                                                       16
<210>  25
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  25
ttctcagaat ggacag                                                       16
<210>  26
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  26
ctgaactttg acatag                                                       16
<210>  27
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  27
aagacaaacc cagactga                                                     18
<210>  28
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  28
tataagacaa acccagac                                                     18
<210>  29
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  29
ttataagaca aacccaga                                                     18
<210>  30
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  30
tgttataaga caaaccc                                                      17
<210>  31
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  31
tagaacaatg gtacttt                                                      17
<210>  32
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  32
gtagaacaat ggtact                                                       16
<210>  33
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  33
aggtagaaca atggta                                                       16
<210>  34
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  34
aagaggtaga acaatgg                                                      17
<210>  35
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  35
gcatccacag taaatt                                                       16
<210>  36
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  36
gaaggttatt taattc                                                       16
<210>  37
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  37
ctaatcgaat gcagca                                                       16
<210>  38
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  38
tacccaatct aatcga                                                       16
<210>  39
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  39
tagttaccca atctaa                                                       16
<210>  40
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  40
catttagtta cccaat                                                       16
<210>  41
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  41
tcatttagtt acccaa                                                       16
<210>  42
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  42
ttcatttagt taccca                                                       16
<210>  43
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  43
gaattaattt catttagt                                                     18
<210>  44
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  44
cagtgaggaa ttaattt                                                      17
<210>  45
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  45
ccaacagtga ggaatt                                                       16
<210>  46
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  46
cccaacagtg aggaat                                                       16
<210>  47
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  47
tatacccaac agtgagg                                                      17
<210>  48
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  48
ttatacccaa cagtgag                                                      17
<210>  49
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  49
tttataccca acagtga                                                      17
<210>  50
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  50
cctttatacc caacag                                                       16
<210>  51
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  51
taacctttat acccaa                                                       16
<210>  52
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  52
aataaccttt ataccca                                                      17
<210>  53
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  53
gtaaataacc tttata                                                       16
<210>  54
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  54
actgtaaata acctttat                                                     18
<210>  55
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  55
atatatatgc aatgag                                                       16
<210>  56
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  56
agatatatat gcaatg                                                       16
<210>  57
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  57
gagatatata tgcaat                                                       16
<210>  58
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  58
ccagagatat atatgc                                                       16
<210>  59
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  59
caatattcca gagatat                                                      17
<210>  60
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  60
gcaatattcc agagata                                                      17
<210>  61
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  61
agcaatattc cagagat                                                      17
<210>  62
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  62
cagcaatatt ccagag                                                       16
<210>  63
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  63
aatcagcaat attccag                                                      17
<210>  64
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  64
acaatcagca atattcc                                                      17
<210>  65
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  65
actaagtagt tacacttct                                                    19
<210>  66
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  66
ctaagtagtt acacttc                                                      17
<210>  67
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  67
gactaagtag ttacactt                                                     18
<210>  68
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  68
tgactaagta gttaca                                                       16
<210>  69
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  69
ctttgactaa gtagtta                                                      17
<210>  70
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  70
ctctttgact aagtag                                                       16
<210>  71
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  71
gctctttgac taagta                                                       16
<210>  72
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  72
ccttaaatac tgttgac                                                      17
<210>  73
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  73
cttaaatact gttgac                                                       16
<210>  74
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  74
tccttaaata ctgttg                                                       16
<210>  75
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  75
tctccttaaa tactgtt                                                      17
<210>  76
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  76
tatcatagtt ctcctt                                                       16
<210>  77
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  77
agtatcatag ttctcc                                                       16
<210>  78
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  78
gagtatcata gttctc                                                       16
<210>  79
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  79
agagtatcat agttct                                                       16
<210>  80
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  80
cagagtatca tagttc                                                       16
<210>  81
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  81
ttcagagtat catagt                                                       16
<210>  82
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  82
cttcagagta tcatag                                                       16
<210>  83
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  83
ttcttcagag tatcata                                                      17
<210>  84
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  84
tttcttcaga gtatcat                                                      17
<210>  85
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  85
gagaaaggct aagttt                                                       16
<210>  86
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  86
gacactcttg tacatt                                                       16
<210>  87
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  87
tgagacactc ttgtaca                                                      17
<210>  88
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  88
tgagacactc ttgtac                                                       16
<210>  89
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  89
ctttattaaa ctccat                                                       16
<210>  90
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  90
accaaacttt attaaa                                                       16
<210>  91
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  91
aaacctctac taagtg                                                       16
<210>  92
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  92
agattaagac agttga                                                       16
<210>  93
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  93
aagtaggagc aagaggc                                                      17
<210>  94
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  94
aaagtaggag caagagg                                                      17
<210>  95
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  95
gttaagcagc caggag                                                       16
<210>  96
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  96
agggtaggat gggtag                                                       16
<210>  97
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  97
aagggtagga tgggta                                                       16
<210>  98
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  98
caagggtagg atgggt                                                       16
<210>  99
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  99
ccaagggtag gatggg                                                       16
<210>  100
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  100
tccaagggta ggatgg                                                       16
<210>  101
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  101
cttccaaggg taggat                                                       16
<210>  102
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  102
atcttccaag ggtagga                                                      17
<210>  103
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  103
agaagtgatg gctcatt                                                      17
<210>  104
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  104
aagaagtgat ggctcat                                                      17
<210>  105
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  105
gaagaagtga tggctca                                                      17
<210>  106
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  106
atgaaatgta aactggg                                                      17
<210>  107
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  107
caatgaaatg taaactgg                                                     18
<210>  108
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  108
gcaatgaaat gtaaactg                                                     18
<210>  109
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  109
agcaatgaaa tgtaaact                                                     18
<210>  110
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  110
gagcaatgaa atgtaaac                                                     18
<210>  111
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  111
tgaattccca tatccga                                                      17
<210>  112
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  112
agaattatga ccatat                                                       16
<210>  113
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  113
aggtaagaat tatgacc                                                      17
<210>  114
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  114
tcaggtaaga attatgac                                                     18
<210>  115
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  115
cttcaggtaa gaattatg                                                     18
<210>  116
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  116
tcttcaggta agaatta                                                      17
<210>  117
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  117
cttcttcagg taagaat                                                      17
<210>  118
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  118
tcttcttcag gtaagaa                                                      17
<210>  119
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  119
tcttcttcag gtaaga                                                       16
<210>  120
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  120
tggtctaaga gaagaag                                                      17
<210>  121
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  121
gttggtctaa gagaag                                                       16
<210>  122
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  122
agttggtcta agagaa                                                       16
<210>  123
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  123
cagttggtct aagagaa                                                      17
<210>  124
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  124
gcagttggtc taagagaa                                                     18
<210>  125
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  125
cagttggtct aagaga                                                       16
<210>  126
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  126
gcagttggtc taagaga                                                      17
<210>  127
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  127
gcagttggtc taagag                                                       16
<210>  128
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  128
ctcatatcag ggcagt                                                       16
<210>  129
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  129
cacacatgtt ctttaac                                                      17
<210>  130
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  130
taaatacaca catgttct                                                     18
<210>  131
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  131
gtaaatacac acatgttc                                                     18
<210>  132
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  132
tgtaaataca cacatgtt                                                     18
<210>  133
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  133
gatcatgtaa atacacac                                                     18
<210>  134
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  134
agatcatgta aatacaca                                                     18
<210>  135
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  135
caaagatcat gtaaatacac                                                   20
<210>  136
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  136
acaaagatca tgtaaataca                                                   20
<210>  137
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  137
gaatacaaag atcatgta                                                     18
<210>  138
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  138
agaatacaaa gatcatgt                                                     18
<210>  139
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  139
cagaatacaa agatcatg                                                     18
<210>  140
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  140
gcagaataca aagatca                                                      17
<210>  141
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  141
aggcagaata caaagat                                                      17
<210>  142
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  142
aaggcagaat acaaaga                                                      17
<210>  143
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  143
attagtgagg gacgaa                                                       16
<210>  144
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  144
cattagtgag ggacga                                                       16
<210>  145
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  145
gagggtgatg gattag                                                       16
<210>  146
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  146
ttaggagtaa taaagg                                                       16
<210>  147
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  147
ttaatgaatt tggttg                                                       16
<210>  148
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  148
ctttaatgaa tttggt                                                       16
<210>  149
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  149
catggattac aactaa                                                       16
<210>  150
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  150
tcatggatta caacta                                                       16
<210>  151
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  151
gtcatggatt acaact                                                       16
<210>  152
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  152
cattaaatct agtcat                                                       16
<210>  153
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  153
gacattaaat ctagtca                                                      17
<210>  154
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  154
agggacatta aatcta                                                       16
<210>  155
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  155
caaagcatta taacca                                                       16
<210>  156
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  156
acttactagg cagaag                                                       16
<210>  157
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  157
cagagttaac tgtaca                                                       16
<210>  158
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  158
ccagagttaa ctgtac                                                       16
<210>  159
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  159
gccagagtta actgta                                                       16
<210>  160
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  160
tgggccagag ttaact                                                       16
<210>  161
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  161
cagcatctat cagact                                                       16
<210>  162
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  162
tgaaataaca tgagtcat                                                     18
<210>  163
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  163
gtgaaataac atgagtc                                                      17
<210>  164
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  164
tctgtttatg tcactg                                                       16
<210>  165
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  165
gtctgtttat gtcact                                                       16
<210>  166
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  166
tggtctgttt atgtca                                                       16
<210>  167
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  167
ttggtctgtt tatgtc                                                       16
<210>  168
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  168
tcacccattg tttaaa                                                       16
<210>  169
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  169
ttcagcaaat attcgt                                                       16
<210>  170
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  170
gtgtgttcag caaatat                                                      17
<210>  171
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  171
tctattgtta ggtatc                                                       16
<210>  172
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  172
attgcccatc ttactg                                                       16
<210>  173
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  173
tattgcccat cttact                                                       16
<210>  174
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  174
aaatattgcc catctt                                                       16
<210>  175
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  175
ataaccttat cataca                                                       16
<210>  176
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  176
tataacctta tcatac                                                       16
<210>  177
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  177
ttataacctt atcata                                                       16
<210>  178
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  178
tttataacct tatcat                                                       16
<210>  179
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  179
actgctattg ctatct                                                       16
<210>  180
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  180
aggactgcta ttgcta                                                       16
<210>  181
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  181
gaggactgct attgct                                                       16
<210>  182
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  182
acgtagaata ataaca                                                       16
<210>  183
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  183
ccaagtgata taatgg                                                       16
<210>  184
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  184
ttagcagacc aagtga                                                       16
<210>  185
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  185
gtttagcaga ccaagt                                                       16
<210>  186
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  186
tgacagtgat tatatt                                                       16
<210>  187
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  187
tgtccaagat attgac                                                       16
<210>  188
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  188
gaatatccta gattgt                                                       16
<210>  189
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  189
caaactgaga atatcc                                                       16
<210>  190
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  190
gcaaactgag aatatc                                                       16
<210>  191
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  191
tcctattaca atcgta                                                       16
<210>  192
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  192
ttcctattac aatcgt                                                       16
<210>  193
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  193
actaatggga ggattt                                                       16
<210>  194
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  194
tagttcagag aataag                                                       16
<210>  195
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  195
taacatatag ttcaga                                                       16
<210>  196
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  196
ataacatata gttcag                                                       16
<210>  197
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  197
cataacatat agttca                                                       16
<210>  198
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  198
tcataacata tagttc                                                       16
<210>  199
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  199
tagctcctaa caatca                                                       16
<210>  200
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  200
ctccaatctt tgtata                                                       16
<210>  201
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  201
tctccaatct ttgtat                                                       16
<210>  202
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  202
tctatttcag ccaatc                                                       16
<210>  203
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  203
cggaagtcag agtgaa                                                       16
<210>  204
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  204
ttaagcatga ggaata                                                       16
<210>  205
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  205
tgattgagca cctctt                                                       16
<210>  206
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  206
gactaattat ttcgtt                                                       16
<210>  207
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  207
tgactaatta tttcgt                                                       16
<210>  208
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  208
gtgactaatt atttcg                                                       16
<210>  209
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  209
ctgcttgaaa tgtgac                                                       16
<210>  210
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  210
cctgcttgaa atgtga                                                       16
<210>  211
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  211
atcctgcttg aaatgt                                                       16
<210>  212
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  212
attataaatc tattct                                                       16
<210>  213
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  213
gctaaatact ttcatc                                                       16
<210>  214
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  214
cattgtaaca taccta                                                       16
<210>  215
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  215
gcattgtaac atacct                                                       16
<210>  216
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  216
taatattgca ccaaat                                                       16
<210>  217
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  217
gataatattg caccaa                                                       16
<210>  218
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  218
agataatatt gcacca                                                       16
<210>  219
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  219
gccaagaaga taatat                                                       16
<210>  220
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  220
cacagccaca taaact                                                       16
<210>  221
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  221
ttgtaattgt ggaaac                                                       16
<210>  222
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  222
tgacttgtaa ttgtgg                                                       16
<210>  223
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  223
tctaactgaa atagtc                                                       16
<210>  224
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  224
gtggttctaa ctgaaa                                                       16
<210>  225
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  225
caatatggga cttggt                                                       16
<210>  226
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  226
atgacaatat gggact                                                       16
<210>  227
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  227
tatgacaata tgggac                                                       16
<210>  228
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  228
atatgacaat atggga                                                       16
<210>  229
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  229
cttcacttaa taatta                                                       16
<210>  230
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  230
ctgcttcact taataa                                                       16
<210>  231
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  231
aagactgctt cactta                                                       16
<210>  232
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  232
gaatgcccta attatg                                                       16
<210>  233
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  233
tggaatgccc taatta                                                       16
<210>  234
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  234
gcaaatgcca gtaggt                                                       16
<210>  235
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  235
ctaatggaag gatttg                                                       16
<210>  236
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  236
aatatagaac ctaatg                                                       16
<210>  237
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  237
gaaagaatag aatgtt                                                       16
<210>  238
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  238
atgggtaata gattat                                                       16
<210>  239
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  239
gaaagagcac agggtg                                                       16
<210>  240
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  240
ctacatagag ggaatg                                                       16
<210>  241
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  241
gcttcctaca tagagg                                                       16
<210>  242
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  242
tgcttcctac atagag                                                       16
<210>  243
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  243
tgggcttgaa atatgt                                                       16
<210>  244
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  244
cattatattt aagaac                                                       16
<210>  245
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  245
tcggttatgt tatcat                                                       16
<210>  246
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  246
cactttatct ggtcgg                                                       16
<210>  247
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  247
aaattggcac agcgtt                                                       16
<210>  248
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  248
accgtgacag taaatg                                                       16
<210>  249
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  249
tgggaaccgt gacagta                                                      17
<210>  250
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  250
ccacatatag gtcctt                                                       16
<210>  251
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  251
catattgcta ccatac                                                       16
<210>  252
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  252
tcatattgct accata                                                       16
<210>  253
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  253
caattgtcat attgct                                                       16
<210>  254
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  254
cattcaattg tcatattg                                                     18
<210>  255
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  255
tttctactgg gaatttg                                                      17
<210>  256
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  256
caattagtgc agccag                                                       16
<210>  257
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  257
gaataatgtt cttatcc                                                      17
<210>  258
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  258
cacaaattga ataatgttct                                                   20
<210>  259
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  259
catgcacaaa ttgaataat                                                    19
<210>  260
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  260
atcctgcaat ttcacat                                                      17
<210>  261
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  261
ccaccatagc tgatca                                                       16
<210>  262
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  262
accaccatag ctgatca                                                      17
<210>  263
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  263
caccaccata gctgatc                                                      17
<210>  264
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  264
tagtcggcac caccat                                                       16
<210>  265
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  265
cttgtagtcg gcaccac                                                      17
<210>  266
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  266
cttgtagtcg gcacca                                                       16
<210>  267
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  267
cgcttgtagt cggcac                                                       16
<210>  268
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  268
tcaataaaga tcaggc                                                       16
<210>  269
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  269
tggacttaca agaatg                                                       16
<210>  270
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  270
atggacttac aagaat                                                       16
<210>  271
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  271
gctcaagaaa ttggat                                                       16
<210>  272
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  272
tactgtagaa catggc                                                       16
<210>  273
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  273
gcaattcatt tgatct                                                       16
<210>  274
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  274
tgaagggagg agggacac                                                     18
<210>  275
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  275
agtggtgaag ggaggag                                                      17
<210>  276
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  276
tagtggtgaa gggaggag                                                     18
<210>  277
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  277
atagtggtga agggaggag                                                    19
<210>  278
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  278
tagtggtgaa gggagga                                                      17
<210>  279
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  279
atagtggtga agggagga                                                     18
<210>  280
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  280
tagtggtgaa gggagg                                                       16
<210>  281
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  281
atagtggtga agggagg                                                      17
<210>  282
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  282
gatagtggtg aagggagg                                                     18
<210>  283
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  283
atagtggtga agggag                                                       16
<210>  284
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  284
gatagtggtg aagggag                                                      17
<210>  285
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  285
gagatagtgg tgaagg                                                       16
<210>  286
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  286
catgggagat agtggt                                                       16
<210>  287
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  287
acaaataatg gttactct                                                     18
<210>  288
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  288
acacacaaat aatggtta                                                     18
<210>  289
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  289
gagggacaca caaataat                                                     18
<210>  290
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  290
atatagagag gctcaa                                                       16
<210>  291
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  291
ttgatataga gaggct                                                       16
<210>  292
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  292
gcatttgata tagaga                                                       16
<210>  293
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  293
tttgcatttg atatag                                                       16
<210>  294
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  294
ctggaagaat aggttc                                                       16
<210>  295
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  295
actggaagaa taggtt                                                       16
<210>  296
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  296
tactggaaga ataggt                                                       16
<210>  297
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  297
tggcttatcc tgtact                                                       16
<210>  298
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  298
atggcttatc ctgtac                                                       16
<210>  299
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  299
tatggcttat cctgta                                                       16
<210>  300
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  300
gtatggctta tcctgt                                                       16
<210>  301
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  301
atgaatatat gcccagt                                                      17
<210>  302
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  302
gatgaatata tgccca                                                       16
<210>  303
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  303
caagatgaat atatgcc                                                      17
<210>  304
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  304
gacaacatca gtataga                                                      17
<210>  305
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  305
caagacaaca tcagta                                                       16
<210>  306
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  306
cactcctagt tccttt                                                       16
<210>  307
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  307
aacactccta gttcct                                                       16
<210>  308
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  308
taacactcct agttcc                                                       16
<210>  309
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  309
ctaacactcc tagttc                                                       16
<210>  310
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  310
tgataacata actgtg                                                       16
<210>  311
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  311
ctgataacat aactgt                                                       16
<210>  312
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  312
tttgaactca agtgac                                                       16
<210>  313
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  313
tcctttactt agctag                                                       16
<210>  314
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  314
gagtttggat tagctg                                                       16
<210>  315
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  315
tgggatatga caggga                                                       16
<210>  316
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  316
tgtgggatat gacagg                                                       16
<210>  317
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  317
atatggaagg gatatc                                                       16
<210>  318
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  318
acaggatatg gaaggg                                                       16
<210>  319
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  319
atttcaacag gatatgg                                                      17
<210>  320
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  320
gagtaatttc aacagg                                                       16
<210>  321
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  321
agggagtaat ttcaaca                                                      17
<210>  322
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  322
attagggagt aatttca                                                      17
<210>  323
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  323
cttactatta gggagt                                                       16
<210>  324
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  324
cagcttacta ttaggg                                                       16
<210>  325
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  325
tcagcttact attagg                                                       16
<210>  326
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  326
atttcagctt actattag                                                     18
<210>  327
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  327
ttcagcttac tattag                                                       16
<210>  328
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  328
cagatttcag cttact                                                       16
<210>  329
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  329
gactacaact agaggg                                                       16
<210>  330
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  330
agactacaac tagagg                                                       16
<210>  331
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  331
aagactacaa ctagag                                                       16
<210>  332
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  332
atgatttaat tctagtcaaa                                                   20
<210>  333
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  333
tttaattcta gtcaaa                                                       16
<210>  334
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  334
gatttaattc tagtca                                                       16
<210>  335
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  335
atgatttaat tctagtca                                                     18
<210>  336
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  336
gatgatttaa ttctagtca                                                    19
<210>  337
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  337
gatttaattc tagtca                                                       16
<210>  338
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  338
gatgatttaa ttctagtc                                                     18
<210>  339
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  339
tgatttaatt ctagtc                                                       16
<210>  340
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  340
gagatgattt aattcta                                                      17
<210>  341
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  341
gagatgattt aattct                                                       16
<210>  342
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  342
cagattgatg gtagtt                                                       16
<210>  343
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  343
ctcagattga tggtag                                                       16
<210>  344
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  344
gttagccctc agattg                                                       16
<210>  345
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  345
tgtattgtta gccctc                                                       16
<210>  346
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  346
acttgtattg ttagcc                                                       16
<210>  347
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  347
agccagtatc agggac                                                       16
<210>  348
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  348
ttgacaatag tggcat                                                       16
<210>  349
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  349
acaagtggta tcttct                                                       16
<210>  350
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  350
aatctacttt acaagt                                                       16
<210>  351
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  351
cacagtagat gcctgata                                                     18
<210>  352
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  352
gaacacagta gatgcc                                                       16
<210>  353
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  353
cttggaacac agtagat                                                      17
<210>  354
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  354
atatcttgga acacag                                                       16
<210>  355
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  355
tctttaatat cttggaac                                                     18
<210>  356
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  356
tgatttcttt aatatcttg                                                    19
<210>  357
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  357
tgatgatttc tttaatatc                                                    19
<210>  358
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  358
aggctaagtc atgatg                                                       16
<210>  359
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  359
ttgatgaggc taagtc                                                       16
<210>  360
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  360
ccaggattat actctt                                                       16
<210>  361
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  361
gccaggatta tactct                                                       16
<210>  362
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  362
ctgccaggat tatact                                                       16
<210>  363
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  363
cagaaactta tactttatg                                                    19
<210>  364
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  364
aagcagaaac ttatact                                                      17
<210>  365
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  365
gaagcagaaa cttatact                                                     18
<210>  366
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  366
tggaagcaga aacttatact                                                   20
<210>  367
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  367
tggaagcaga aacttatac                                                    19
<210>  368
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  368
aagcagaaac ttatac                                                       16
<210>  369
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  369
tggaagcaga aacttata                                                     18
<210>  370
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  370
aagggatatt atggag                                                       16
<210>  371
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  371
tgccggaaga tttcct                                                       16
<210>  372
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  372
atggattggg agtaga                                                       16
<210>  373
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  373
agatggattg ggagta                                                       16
<210>  374
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  374
aagatggatt gggagt                                                       16
<210>  375
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  375
acaagatgga ttggga                                                       16
<210>  376
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  376
agaaggttca gacttt                                                       16
<210>  377
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  377
gcagaaggtt cagact                                                       16
<210>  378
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  378
tgcagaaggt tcagac                                                       16
<210>  379
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  379
agtgcagaag gttcag                                                       16
<210>  380
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  380
aagtgcagaa ggttca                                                       16
<210>  381
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  381
taagtgcaga aggttc                                                       16
<210>  382
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  382
tctaagtgca gaaggt                                                       16
<210>  383
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  383
ctcaggagtt ctacttc                                                      17
<210>  384
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  384
ctcaggagtt ctactt                                                       16
<210>  385
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  385
atggaggtga ctcaggag                                                     18
<210>  386
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  386
atggaggtga ctcagga                                                      17
<210>  387
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  387
atggaggtga ctcagg                                                       16
<210>  388
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  388
tatggaggtg actcagg                                                      17
<210>  389
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  389
atatggaggt gactcagg                                                     18
<210>  390
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  390
tatggaggtg actcag                                                       16
<210>  391
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  391
atatggaggt gactcag                                                      17
<210>  392
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  392
catatggagg tgactcag                                                     18
<210>  393
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  393
atatggaggt gactca                                                       16
<210>  394
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  394
catatggagg tgactca                                                      17
<210>  395
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  395
catatggagg tgactc                                                       16
<210>  396
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  396
gcatatggag gtgactc                                                      17
<210>  397
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  397
tgcatatgga ggtgactc                                                     18
<210>  398
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  398
ttgcatatgg aggtgactc                                                    19
<210>  399
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  399
tttgcatatg gaggtgactc                                                   20
<210>  400
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  400
gcatatggag gtgact                                                       16
<210>  401
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  401
tgcatatgga ggtgact                                                      17
<210>  402
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  402
ttgcatatgg aggtgact                                                     18
<210>  403
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  403
tttgcatatg gaggtgact                                                    19
<210>  404
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  404
tgcatatgga ggtgac                                                       16
<210>  405
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  405
ttgcatatgg aggtgac                                                      17
<210>  406
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  406
tttgcatatg gaggtgac                                                     18
<210>  407
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  407
tttgcatatg gaggtga                                                      17
<210>  408
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  408
tttgcatatg gaggtg                                                       16
<210>  409
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  409
aagtgaagtt caacagc                                                      17
<210>  410
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  410
tgggaagtga agttca                                                       16
<210>  411
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  411
atgggaagtg aagttc                                                       16
<210>  412
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  412
gatgggaagt gaagtt                                                       16
<210>  413
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  413
ctgtgatggg aagtgaa                                                      17
<210>  414
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  414
attgagtgaa tccaaa                                                       16
<210>  415
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  415
aattgagtga atccaa                                                       16
<210>  416
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  416
gataattgag tgaatcc                                                      17
<210>  417
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  417
gtgataattg agtgaa                                                       16
<210>  418
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  418
aagaaaggtg caataa                                                       16
<210>  419
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  419
caagaaaggt gcaata                                                       16
<210>  420
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  420
acaagaaagg tgcaat                                                       16
<210>  421
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  421
atttaaactc acaaac                                                       16
<210>  422
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  422
ctgttaggtt cagcga                                                       16
<210>  423
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  423
tctgaatgaa catttcg                                                      17
<210>  424
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  424
ctcattgaag gttctg                                                       16
<210>  425
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  425
ctaatctcat tgaagg                                                       16
<210>  426
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  426
cctaatctca ttgaag                                                       16
<210>  427
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  427
actttgatct ttcagc                                                       16
<210>  428
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  428
actatgcaac actttg                                                       16
<210>  429
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  429
caaatagctt tatcgg                                                       16
<210>  430
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  430
ccaaatagct ttatcg                                                       16
<210>  431
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  431
tccaaatagc tttatc                                                       16
<210>  432
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  432
gatccaaata gcttta                                                       16
<210>  433
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  433
atgatccaaa tagctt                                                       16
<210>  434
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  434
tatgatccaa atagct                                                       16
<210>  435
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  435
taaacagggc tgggaat                                                      17
<210>  436
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  436
acttaaacag ggctgg                                                       16
<210>  437
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  437
acacttaaac agggct                                                       16
<210>  438
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  438
gaacacttaa acaggg                                                       16
<210>  439
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  439
agagaacact taaacag                                                      17
<210>  440
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  440
ctacagagaa cactta                                                       16
<210>  441
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  441
atgctacaga gaacact                                                      17
<210>  442
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  442
ataaatgcta cagagaaca                                                    19
<210>  443
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  443
agataaatgc tacagaga                                                     18
<210>  444
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  444
tagagataaa tgctaca                                                      17
<210>  445
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  445
tagatagaga taaatgct                                                     18
<210>  446
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  446
caatatacta gatagaga                                                     18
<210>  447
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  447
tacacaatat actagatag                                                    19
<210>  448
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  448
ctacacaata tactag                                                       16
<210>  449
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  449
gctacacaat atacta                                                       16
<210>  450
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  450
atatgctaca caatatac                                                     18
<210>  451
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  451
tgatatgcta cacaat                                                       16
<210>  452
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  452
atgatatgat atgctac                                                      17
<210>  453
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  453
gaggagagag acaataaa                                                     18
<210>  454
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  454
ctaggaggag agagaca                                                      17
<210>  455
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  455
tattctagga ggagaga                                                      17
<210>  456
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  456
ttatattcta ggaggag                                                      17
<210>  457
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  457
gtttatattc taggag                                                       16
<210>  458
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  458
tggagtttat attctagg                                                     18
<210>  459
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  459
cgtaccacca ctctgc                                                       16
<210>  460
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  460
tgaggaaatc attcattc                                                     18
<210>  461
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  461
tttgaggaaa tcattcat                                                     18
<210>  462
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  462
aggctaatcc tatttg                                                       16
<210>  463
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  463
tttaggctaa tcctat                                                       16
<210>  464
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  464
tgctccagtg taccct                                                       16
<210>  465
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  465
tagtagtact cgatag                                                       16
<210>  466
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  466
ctaattgtag tagtactc                                                     18
<210>  467
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  467
tgctaattgt agtagt                                                       16
<210>  468
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  468
agtgctaatt gtagta                                                       16
<210>  469
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  469
gcaagtgcta attgta                                                       16
<210>  470
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  470
gaggaaatga actaattta                                                    19
<210>  471
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  471
caggaggaaa tgaacta                                                      17
<210>  472
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  472
ccctagagtc atttcc                                                       16
<210>  473
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  473
atcttacatg atgaagc                                                      17
<210>  474
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  474
gacacactca gatttcag                                                     18
<210>  475
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  475
agacacactc agatttcag                                                    19
<210>  476
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  476
aagacacact cagatttcag                                                   20
<210>  477
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  477
agacacactc agatttca                                                     18
<210>  478
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  478
aagacacact cagatttca                                                    19
<210>  479
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  479
aaagacacac tcagatttca                                                   20
<210>  480
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  480
gaaagacaca ctcagatttc                                                   20
<210>  481
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  481
aagacacact cagatttc                                                     18
<210>  482
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  482
aaagacacac tcagatttc                                                    19
<210>  483
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  483
tgaaagacac actcagattt                                                   20
<210>  484
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  484
tgaaagacac actcagatt                                                    19
<210>  485
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  485
tgaaagacac actcagat                                                     18
<210>  486
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  486
attgaaagac acactca                                                      17
<210>  487
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  487
tcattgaaag acacact                                                      17
<210>  488
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  488
ttccatcatt gaaaga                                                       16
<210>  489
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  489
ataataccac ttatcat                                                      17
<210>  490
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  490
ttacttaatt tctttgga                                                     18
<210>  491
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  491
ttagaactag ctttatca                                                     18
<210>  492
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  492
gaggtacaaa tatagg                                                       16
<210>  493
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  493
cttatgatac aactta                                                       16
<210>  494
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  494
tcttatgata caactt                                                       16
<210>  495
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  495
ttcttatgat acaact                                                       16
<210>  496
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  496
cagtttctta tgatac                                                       16
<210>  497
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  497
gcagtttctt atgata                                                       16
<210>  498
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  498
tacaaatgtc tattaggtt                                                    19
<210>  499
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  499
tgtacaaatg tctattag                                                     18
<210>  500
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  500
agcatcacaa ttagta                                                       16
<210>  501
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  501
ctaatgatag tgaagc                                                       16
<210>  502
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  502
agctaatgat agtgaa                                                       16
<210>  503
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  503
atgccttgac atatta                                                       16
<210>  504
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  504
ctcaagatta ttgacac                                                      17
<210>  505
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  505
acctcaagat tattga                                                       16
<210>  506
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  506
aacctcaaga ttattg                                                       16
<210>  507
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  507
cacaaacctc aagattatt                                                    19
<210>  508
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  508
gtacttaatt agacct                                                       16
<210>  509
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  509
agtacttaat tagacc                                                       16
<210>  510
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  510
gtatgaggtg gtaaac                                                       16
<210>  511
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  511
aggaaacagc agaagtg                                                      17
<210>  512
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  512
gcacaaccca gaggaa                                                       16
<210>  513
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  513
caagcacaac ccagag                                                       16
<210>  514
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  514
ttcaagcaca acccag                                                       16
<210>  515
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  515
aattcaagca caaccc                                                       16
<210>  516
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  516
taataattca agcacaacc                                                    19
<210>  517
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  517
actaataatt caagcac                                                      17
<210>  518
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  518
ataatactaa taattcaagc                                                   20
<210>  519
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  519
tagatttgtg aggtaa                                                       16
<210>  520
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  520
agccttaatt ctccat                                                       16
<210>  521
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  521
aatgatctag agcctta                                                      17
<210>  522
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  522
ctaatgatct agagcc                                                       16
<210>  523
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  523
actaatgatc tagagc                                                       16
<210>  524
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  524
cattaacatg ttcttatt                                                     18
<210>  525
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  525
acaagtacat taacatgttc                                                   20
<210>  526
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  526
ttacaagtac attaacatg                                                    19
<210>  527
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  527
gctttattca tgtttat                                                      17
<210>  528
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  528
gctttattca tgttta                                                       16
<210>  529
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  529
agagctttat tcatgttt                                                     18
<210>  530
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  530
ataagagctt tattcatg                                                     18
<210>  531
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  531
cataagagct ttattca                                                      17
<210>  532
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  532
agcataagag ctttat                                                       16
<210>  533
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  533
tagattgttt agtgca                                                       16
<210>  534
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  534
gtagattgtt tagtgc                                                       16
<210>  535
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  535
gacaattcta gtagatt                                                      17
<210>  536
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  536
ctgacaattc tagtag                                                       16
<210>  537
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  537
gctgacaatt ctagta                                                       16
<210>  538
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  538
aggattaaga tacgta                                                       16
<210>  539
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  539
caggattaag atacgt                                                       16
<210>  540
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  540
tcaggattaa gatacg                                                       16
<210>  541
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  541
ttcaggatta agatac                                                       16
<210>  542
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  542
aggaagaaag tttgattc                                                     18
<210>  543
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  543
tcaaggaaga aagtttga                                                     18
<210>  544
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  544
ctcaaggaag aaagtttg                                                     18
<210>  545
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  545
tgctcaagga agaaagt                                                      17
<210>  546
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  546
aattatgctc aaggaaga                                                     18
<210>  547
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  547
taggatacca cattatga                                                     18
<210>  548
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  548
cataatttat tccattcctc                                                   20
<210>  549
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  549
tgcataattt attccat                                                      17
<210>  550
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  550
actgcataat ttattcc                                                      17
<210>  551
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  551
ctaaactgca taatttatt                                                    19
<210>  552
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  552
ataactaaac tgcata                                                       16
<210>  553
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  553
ttattaataa ctaaactgc                                                    19
<210>  554
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  554
tagtacatta ttaataact                                                    19
<210>  555
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  555
cataactaag gacgtt                                                       16
<210>  556
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  556
tcataactaa ggacgt                                                       16
<210>  557
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  557
cgtcataact aaggac                                                       16
<210>  558
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  558
tcgtcataac taagga                                                       16
<210>  559
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  559
atcgtcataa ctaagg                                                       16
<210>  560
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  560
gttagtatct tacatt                                                       16
<210>  561
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  561
ctctattgtt agtatc                                                       16
<210>  562
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  562
agtatagagt tactgt                                                       16
<210>  563
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  563
ttcctggtga tacttt                                                       16
<210>  564
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  564
gttcctggtg atactt                                                       16
<210>  565
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  565
tgttcctggt gatact                                                       16
<210>  566
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  566
ataaacatga atctctcc                                                     18
<210>  567
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  567
ctttataaac atgaatctc                                                    19
<210>  568
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  568
ctgtctttat aaacatg                                                      17
<210>  569
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  569
ttgttataaa tctgtctt                                                     18
<210>  570
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  570
ttaaatttat tcttggata                                                    19
<210>  571
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  571
cttaaattta ttcttgga                                                     18
<210>  572
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  572
cttcttaaat ttattcttg                                                    19
<210>  573
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  573
tatgtttctc agtaaag                                                      17
<210>  574
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  574
gaattatctt taaacca                                                      17
<210>  575
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  575
cccttaaatt tctaca                                                       16
<210>  576
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  576
acactgctct tgtacc                                                       16
<210>  577
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  577
tgacaacact gctctt                                                       16
<210>  578
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  578
tacatttatt gggctc                                                       16
<210>  579
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  579
gtacatttat tgggct                                                       16
<210>  580
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  580
ttggtacatt tattgg                                                       16
<210>  581
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  581
catgttggta catttat                                                      17
<210>  582
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  582
aatcatgttg gtacat                                                       16
<210>  583
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  583
aaatcatgtt ggtaca                                                       16
<210>  584
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  584
gacaagtttg gattaa                                                       16
<210>  585
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  585
aatgttcaga tgcctc                                                       16
<210>  586
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  586
gcttaatgtt cagatg                                                       16
<210>  587
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  587
cgtacatagc ttgatg                                                       16
<210>  588
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  588
gtgaggaatt aggata                                                       16
<210>  589
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  589
gtaacaatat ggtttg                                                       16
<210>  590
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  590
gaaatattgt agacta                                                       16
<210>  591
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  591
ttgaaatatt gtagac                                                       16
<210>  592
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  592
aagtctagta atttgc                                                       16
<210>  593
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  593
gctcagtaga ttataa                                                       16
<210>  594
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  594
catacactgt tgctaa                                                       16
<210>  595
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  595
atggtctcaa atcatt                                                       16
<210>  596
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  596
caatggtctc aaatca                                                       16
<210>  597
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  597
ttcctattga ttgact                                                       16
<210>  598
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  598
tttctgttca caacac                                                       16
<210>  599
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  599
aggaacccac taatct                                                       16
<210>  600
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  600
taaatggcag gaaccc                                                       16
<210>  601
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  601
gtaaatggca ggaacc                                                       16
<210>  602
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  602
ttgtaaatgg caggaa                                                       16
<210>  603
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  603
ttatgagtta ggcatg                                                       16
<210>  604
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  604
ccaggtgaaa ctttaa                                                       16
<210>  605
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  605
cccttagtca gctcct                                                       16
<210>  606
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  606
acccttagtc agctcc                                                       16
<210>  607
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  607
cacccttagt cagctc                                                       16
<210>  608
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  608
tctcttacta ggctcc                                                       16
<210>  609
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  609
cctatctgtc atcatg                                                       16
<210>  610
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  610
tcctatctgt catcat                                                       16
<210>  611
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  611
gagaagtgtg agaagc                                                       16
<210>  612
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  612
catccttgaa gtttag                                                       16
<210>  613
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  613
taataagatg gctccc                                                       16
<210>  614
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  614
caaggcataa taagat                                                       16
<210>  615
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  615
ccaaggcata ataaga                                                       16
<210>  616
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  616
tgatccaatt ctcacc                                                       16
<210>  617
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  617
atgatccaat tctcac                                                       16
<210>  618
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  618
cgcttcatct tcaccc                                                       16
<210>  619
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  619
tatgacactg catctt                                                       16
<210>  620
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  620
gtatgacact gcatct                                                       16
<210>  621
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  621
tgtatgacac tgcatc                                                       16
<210>  622
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  622
ttctcttctg taagtc                                                       16
<210>  623
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  623
ttctacagag gaacta                                                       16
<210>  624
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  624
actacagttc tacaga                                                       16
<210>  625
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  625
ttcccacagg taaatg                                                       16
<210>  626
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  626
attatttgaa tatactcatt                                                   20
<210>  627
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  627
tgggaggaaa ttatttg                                                      17
<210>  628
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  628
tgactcatct taaatg                                                       16
<210>  629
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  629
ctgactcatc ttaaat                                                       16
<210>  630
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  630
tttactctga ctcatc                                                       16
<210>  631
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  631
tattggagga attatt                                                       16
<210>  632
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  632
gtattggagg aattat                                                       16
<210>  633
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  633
tggtatactt ctctaagtat                                                   20
<210>  634
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  634
gatctcttgg tatact                                                       16
<210>  635
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  635
cagacaactc tatacc                                                       16
<210>  636
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  636
aacatcagac aactcta                                                      17
<210>  637
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  637
tttaacatca gacaactc                                                     18
<210>  638
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  638
taacatcaga caactc                                                       16
<210>  639
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  639
atttaacatc agacaa                                                       16
<210>  640
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  640
cctatttaac atcagac                                                      17
<210>  641
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  641
tccctattta acatca                                                       16
<210>  642
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  642
tcaacgacta ttggaat                                                      17
<210>  643
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  643
cttatattct ggctat                                                       16
<210>  644
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  644
atccttatat tctggc                                                       16
<210>  645
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  645
gatccttata ttctgg                                                       16
<210>  646
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  646
tgatccttat attctg                                                       16
<210>  647
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  647
attgaaactt gatcct                                                       16
<210>  648
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  648
actgtcattg aaactt                                                       16
<210>  649
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  649
tcttactgtc attgaa                                                       16
<210>  650
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  650
aggatcttac tgtcatt                                                      17
<210>  651
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  651
gcaaatcaac tccatc                                                       16
<210>  652
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  652
gtgcaaatca actcca                                                       16
<210>  653
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  653
caattatttc tttgtgc                                                      17
<210>  654
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  654
tggcaacaat tatttctt                                                     18
<210>  655
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  655
gctggcaaca attatt                                                       16
<210>  656
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  656
atccatttct actgcc                                                       16
<210>  657
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  657
taatatctat tgatttcta                                                    19
<210>  658
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  658
tcaatagtgt agggca                                                       16
<210>  659
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  659
ttcaatagtg tagggc                                                       16
<210>  660
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  660
aggttaatta attcaatag                                                    19
<210>  661
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  661
catttgtaat ccctag                                                       16
<210>  662
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  662
acatttgtaa tcccta                                                       16
<210>  663
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  663
aacatttgta atccct                                                       16
<210>  664
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  664
taaatttcaa gttctg                                                       16
<210>  665
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  665
gtttaaattt caagttct                                                     18
<210>  666
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  666
ccaagtttaa atttcaag                                                     18
<210>  667
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  667
acccaagttt aaatttc                                                      17
<210>  668
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  668
catacagtga cccaagttt                                                    19
<210>  669
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  669
acatcccata cagtga                                                       16
<210>  670
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  670
agcacagctc tacatc                                                       16
<210>  671
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  671
atatagcaca gctcta                                                       16
<210>  672
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  672
tccatatagc acagct                                                       16
<210>  673
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  673
atttccatat agcaca                                                       16
<210>  674
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  674
tttatttcca tatagca                                                      17
<210>  675
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  675
tttatttcca tatagc                                                       16
<210>  676
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  676
aaggagagga gattatg                                                      17
<210>  677
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  677
agttcttgtg ttagct                                                       16
<210>  678
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  678
gagttcttgt gttagc                                                       16
<210>  679
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  679
attaattatc catccac                                                      17
<210>  680
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  680
atcaattaat tatccatc                                                     18
<210>  681
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  681
agaatcaatt aattatcc                                                     18
<210>  682
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  682
tgagataccg tgcatg                                                       16
<210>  683
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  683
aatgagatac cgtgca                                                       16
<210>  684
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  684
ctgtggttag gctaat                                                       16
<210>  685
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  685
aagagtaagg gtctgtggtt                                                   20
<210>  686
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  686
gatgggttaa gagtaa                                                       16
<210>  687
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  687
agcagatggg ttaaga                                                       16
<210>  688
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  688
tgtaaacatt tgtagc                                                       16
<210>  689
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  689
cctgcttata aatgta                                                       16
<210>  690
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  690
tgccctgctt ataaat                                                       16
<210>  691
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  691
tcttcttagt tcaata                                                       16
<210>  692
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  692
tggtttctaa ctacat                                                       16
<210>  693
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  693
agtttggttt ctaacta                                                      17
<210>  694
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  694
gaatgaaact tgcctg                                                       16
<210>  695
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  695
attatcctta catgat                                                       16
<210>  696
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  696
gtacccaatt atcctt                                                       16
<210>  697
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  697
tgtacccaat tatcct                                                       16
<210>  698
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  698
ttgtacccaa ttatcc                                                       16
<210>  699
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  699
tttgtaccca attatc                                                       16
<210>  700
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  700
agcagcaggt tatatt                                                       16
<210>  701
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  701
tgggaagtgg tctggg                                                       16
<210>  702
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  702
ctggagagtg ataata                                                       16
<210>  703
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  703
aatgctggat tacgtc                                                       16
<210>  704
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  704
caatgctgga ttacgt                                                       16
<210>  705
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  705
ttgttcagaa gtatcc                                                       16
<210>  706
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  706
gatgatttgc ttggag                                                       16
<210>  707
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  707
gaaatcattc acaacc                                                       16
<210>  708
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  708
ttgtaacatc tactac                                                       16
<210>  709
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  709
cattaagcag caagtt                                                       16
<210>  710
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  710
ttactagatg tgagca                                                       16
<210>  711
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  711
tttactagat gtgagc                                                       16
<210>  712
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  712
gaccaagcac cttaca                                                       16
<210>  713
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  713
agaccaagca ccttac                                                       16
<210>  714
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  714
atgggttaaa taaagg                                                       16
<210>  715
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  715
tcaaccagag tattaa                                                       16
<210>  716
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  716
gtcaaccaga gtatta                                                       16
<210>  717
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  717
attgtaaagc tgatat                                                       16
<210>  718
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  718
cacataattg taaagc                                                       16
<210>  719
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  719
gaggtctgct atttac                                                       16
<210>  720
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  720
tgtagattca atgcct                                                       16
<210>  721
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  721
cctcattata ctatga                                                       16
<210>  722
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  722
ccttatgcta tgacac                                                       16
<210>  723
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  723
tccttatgct atgaca                                                       16
<210>  724
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  724
aagatgttta agtata                                                       16
<210>  725
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  725
ctgattatta agatgt                                                       16
<210>  726
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  726
tggaaaggta tgaatt                                                       16
<210>  727
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  727
acttgaatgg cttgga                                                       16
<210>  728
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  728
aacttgaatg gcttgg                                                       16
<210>  729
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  729
caatgtgtta ctattt                                                       16
<210>  730
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  730
acaatgtgtt actatt                                                       16
<210>  731
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  731
catctgctat ataaga                                                       16
<210>  732
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  732
cctagagcaa atactt                                                       16
<210>  733
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  733
cagagttaat aataag                                                       16
<210>  734
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  734
gttcaagcac aacgaa                                                       16
<210>  735
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  735
agggttcaag cacaac                                                       16
<210>  736
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  736
tgttggagac actgtt                                                       16
<210>  737
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  737
aaggaggagt taggac                                                       16
<210>  738
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  738
ctatgccatt tacgat                                                       16
<210>  739
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  739
tcaaatgcag aattag                                                       16
<210>  740
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  740
agtgacaatc aaatgc                                                       16
<210>  741
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  741
aagtgacaat caaatg                                                       16
<210>  742
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  742
gtgtaccaag taacaa                                                       16
<210>  743
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  743
tgggatgtta aactga                                                       16
<210>  744
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  744
agtttacatt ttctgc                                                       16
<210>  745
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  745
tatgtgaaga ggagag                                                       16
<210>  746
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  746
cacctttaaa acccca                                                       16
<210>  747
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  747
tcctttataa tcacac                                                       16
<210>  748
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  748
acggtatttt cacagg                                                       16
<210>  749
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  749
gacactacaa tgagga                                                       16
<210>  750
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  750
tggtttttag gactgt                                                       16
<210>  751
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  751
cgacaaattc tatcct                                                       16
<210>  752
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  752
tgatatacaa tgctac                                                       16
<210>  753
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  753
tcgttgggta aattta                                                       16
<210>  754
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  754
tgctttataa atggtg                                                       16
<210>  755
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  755
caagtttaca ttttctgc                                                     18
<210>  756
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  756
catatgtgaa gaggagag                                                     18
<210>  757
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  757
cacctttaaa acccca                                                       16
<210>  758
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  758
catcctttat aatcacac                                                     18
<210>  759
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  759
caacggtatt ttcacagg                                                     18
<210>  760
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  760
cagacactac aatgagga                                                     18
<210>  761
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  761
catggttttt aggactgt                                                     18
<210>  762
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  762
cacgacaaat tctatcct                                                     18
<210>  763
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  763
catgatatac aatgctac                                                     18
<210>  764
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  764
catcgttggg taaattta                                                     18
<210>  765
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  765
catgctttat aaatggtg                                                     18
<210>  766
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  766
caacaaataa tggttactct                                                   20
<210>  767
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  767
cacagattga tggtagtt                                                     18
<210>  768
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  768
cacctattta acatcagac                                                    19
<210>  769
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  769
cactaattgt agtagtactc                                                   20
<210>  770
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  770
caataaacat gaatctctcc                                                   20
<210>  771
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Олигонуклеотидный мотив
<400>  771
tgatttaatt ctagtca                                                      17
<210>  772
<211>  16
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность-мишень
<400>  772
gcagtagagc caatta                                                       16
<210>  773
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  773
Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val
1               5                   10
<210>  774
<211>  15
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  774
Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
1               5                   10                  15
<210>  775
<211>  15
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  775
Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu
1               5                   10                  15
<210>  776
<211>  16
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  776
Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser
1               5                   10                  15
<210>  777
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  777
Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
1               5
<210>  778
<211>  15
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  778
Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
<210>  779
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  779
Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu
1               5
<210>  780
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  780
Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
1               5
<210>  781
<211>  21
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  781
Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr
1               5                   10                  15
Val Trp Leu Ser Val
20
<210>  782
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  782
Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val
1               5                   10
<210>  783
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Эпитоп HBV
<400>  783
Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu
1               5                   10
<210>  784
<211>  19
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер
<400>  784
ctgtgccttg ggtggcttt                                                    19
<210>  785
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер
<400>  785
aaggaaagaa gtcagaaggc aaaa                                              24
<210>  786
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер
<400>  786
ttctttataa gggtcgatgt ccatg                                             25
<---