Способ безинвазивной экспресс-диагностики островоспалительной патологии у детей и аппарат для его реализации
METHOD OF NON-INVASIVE RAPID DIAGNOSTICS OF CHILDREN'S ACUTE INFLAMMATORY PATHOLOGY AND APPARATUS FOR ITS IMPLEMENTATION

Суть изобретения: использование в медицине, а именно в педиатрии для доклинической и клинической оценки состояния организма детей, а также мониторинга динамики течения заболевания.
При первичном обследовании ребенка проводят исследование криоагрегации мочи. Отсутствии реакции считают характерным для нормального состояния организма детей. Выявление криоагрегации свидетельствует о наличии островоспалительной патологии или активизации хронического воспалительного процесса.
Способ универсален и может быть использован для контроля состояния организма в динамике заболевания, оценке эффективности и прогнозе противовоспалительного лечения, массовых обследованиях.
Для реализации заявляемого способа диагностики разработан аппарат, который позволяет проводить криоагрегацию мочи и оценивать эту реакцию в диагностических целях.
Описание изобретения:
Изобретение относится к медицине, а именно к способам оценки состояния организма и может быть использовано для экспресс диагностики остро воспалительных заболеваний у детей.
Известен комплекс лабораторных тестов, применяемых на практике, включающий общеклинический анализ крови и мочи, биохимическое исследование (общий белок, трансаминазы, билирубин, мочевина, глюкоза, электролиты) позволяющий судить по изменению абсолютных показателей и их отклонению от нормы в сторону повышения или понижения о состоянии больного. Многие из этих показателей неспецифичны для оценки островоспалительного процесса. В ранней стадии заболевания уровень этих биохимических показателей в динамике наблюдения существенно не изменяется. Это снижает их клиническую ценность, не позволяет в первые часы установить изменения состояния организма и диагностировать уже начавшееся заболевание.
Известны способы диагностики островоспалительных заболеваний по составу белков плазмы крови и изменению их концентрации, в частности гаптоглобина, С-реактивного белка, а-2 макроглобулина (патент 2145086, Лавруков A.M. и др. (9); Асатуров Б.И., 1994, 2011) (3, 4).
Криопреципитация в плазме крови происходит преимущественно вследствие потери растворимости белков в изоэлектрической точке. Глобулины наиболее подвержены температурному воздействию. Большинство нативных белков длительно сохраняют растворимость при этих условиях. Такие комплексообразователи как гепарин существенно ускоряют процесс криопреципитации (Levo J., 1980) (14).
Известно, что при охлаждении плазмы крови выпадает основная масса крупномолекулярных патологических веществ, таких как циркулирующие иммунные комплексы, криофибриноген, криоглобулины, денатурированные белки, холодовые агглютинины (Н.А. Федоров и соавт., 1987 (13); P.S. Malehensky, J. Asanuma at al., 1980) (15).
Криопреципитация плазмы крови, а если более точно - гепариносаждаемая фракция, всегда определяется в большей или меньшей степени здоровых лиц. Выраженность этой реакции существенно усиливается у больных, что используется для диагностики активности ревматического процесса. Известен способ диагностики ревматизма по определению степени холодовой преципитации гепариносаждаемой фракции белков плазмы крови (Лозовой В.П. и соавт. 1969) (11).
Изучение факторов, влияющих на процесс криопреципитации показало, что при определенных условиях охлаждения некоторые белки - опсонины, основным из которых является фибронектин, образуют полимерную сшивку, связывающую крупномолекулярные вещества, частицы, бактерии, вирусы (Б.И. Асатуров, 1989 (2), Levo J., 1980 (14), Moon D.E., Kaplan J.E., et all. 1986) (16).
Холодовая активация C1-C4 фрагментов комплемента плазмы крови в присутствии гепарина способствует полимеризации фибронектина. Одновременная холодовая активация факторов свертывания II, VIII, XIII может способствовать ретракции нитей этого белка с образованием уплотненного осадка (Р.И. Литвинов, 1984 (10), Н.А. Федоров и соавт., 1987) (13).
Предпосылкой для создания предложенного способа диагностики явилось следующее.
1. В доступной нам литературе мы не встретили сообщений, касающихся изучения феномена криоагрегации мочи (КАМ), основных физико-химических условий, необходимых для возникновения этого процесса у здоровых людей и больных.
2. В доступной нам литературе мы не встретили сообщений, касающихся изучения криоагрегации мочи с диагностической целью.
3. В доступной нам литературе мы не встретили сообщений, касающихся изучения криоагрегации мочи с клинической целью.
4. Применение неинвазивных методов, в частности физико-химического исследования охлаждения мочи для оценки состояния организма и ранней диагностики островоспалительных заболеваний неизвестно.
На основании данных литературы и собственных исследований, мы установили, что в основе обнаруженного явления криоагрегации мочи лежат иные, по сравнению с плазмой крови, процессы.
Активация C1-С4 компонентов комплемента не происходит, поскольку эти компоненты в моче не обнаруживаются или обнаруживаются некоторые из них в следовых количествах.
Полимеризации фибронектина не происходит, поскольку у подавляющего большинства обследованных этот белок в моче не обнаруживается или присутствует в следовых количествах (в пределах погрешности метода его обнаружения).
Холодовая активация факторов свертывания VIII, XII в моче не происходит ввиду их отсутствия (Б.И. Асатуров, М.Б. Асатуров, 2014) (6).
Следует добавить, что и сама структура криопреципитата плазмы и мочи также различна. В процессе проведенных нами исследований неожиданно было установлено, что структура криопреципитата мочи представлена рыхлым, аморфным, легко разрушаемым преципитатом и отличается по плотности и структуре от криопреципитата плазмы, имеющего в своем составе множественные фибриноподобные нити. Основной объем криопреципитата мочи составляют мочевые соли, выпадающие в осадок при охлаждении. Этот объем достаточно широко варьирует и составляет от 50 до 90% общего объема криопреципитата у разных людей. При этом, предварительное разведение мочи дистиллированной водой в соотношении не менее 3:1 устраняло выпадение солей, но не влияло на возникновение криоагрегации (Асатуров Б.И., Асатуров М.Б. 2014) (6).
Наиболее близким по достигаемому эффекту, конкретно, применения криоагрегации можно рассматривать патент RU 2621311 «Способ получения протеогликана», автор Б.И. Асатуров (7), в котором описаны технические условия криоагрегациии мочи для получения протеогликана. В частности, приводится обоснование наиболее оптимальных параметров процесса криоагрегации, которые мы использовали в качестве базовых температурных режимов при охлаждения кюветы с мочой в заявляемом аппарате.
В доступной нам литературе не обнаружено сведений, касающихся изучения криоагрегациии мочи у здоровых и больных людей. Также неизвестно использования феномена криоагрегации мочи с диагностической целью.
Следует отметить, что все перечисленные методы диагностики уровня острофазных белков плазмы крови инвазивны, требуют внутривенного забора крови, и влекут за собой целый комплекс мероприятий, связанный с медицинским персоналом, оборудованием, инструментами, сопровождаются высоким риском микробной кантаминации, психологической травмой ребенка, резко снижая возможность многократного повторного исследования и его массовость.
Фракционный состав мочи отражает достаточно симметричные соотношения аналогичных компонентов в плазме крови. Однако существенные количественные и качественные изменения проявляются при возникновении островоспалительных заболеваний различной этиологии. Многие патологические вещества, сопровождающие развитие и прогрессирование воспалительного процесса появляются в моче вследствие повышения их концентрации в крови и компенсаторного увеличения проницаемости почечного барьера. При этом крупные белковые образования и комплексы с молекулярным весом более 1 млн. дальтон обнаруживаются в моче даже при состояниях напрямую не связанных с острой патологией, как например, при физической нагрузке, стрессе.
В способе оценки состояния организма детей путем физико-химического исследования в моче определяют наличие криоагрегатов (КА) и при ее обнаружении диагностируют наличии островоспалительного заболевания или активацию хронического процесса.
В доступной нам литературе не обнаружено сведений, касающихся изучению эффектов, подобных криопрециптации плазмы, в моче у здоровых и больных людей и тем более использование этого феномена в моче для диагностических целей.
С целью изучения влияния качественного состава мочи на процесс криоагрегации исследовали следующие биохимические показатели.
Контроль состава КА проводился электрофорезом на ацетатцеллюлозных мембранах (АЦМ) на аппарате УЭФ-01 (8) и диск электрофорезом в 7% полиакриламидном геле (ПААГ) по (17) с последующей окраской на белки Кумасси R-250, отдельно Амидочерным 10В, а также бензидиновым реактивом на пероксидазную активность.
Подготовка мочи для контрольных исследований (без криоагрегации) для электрофоретических исследований в основном проводилась с целью повышения ее концентрации до аналогичных показателей в плазме крови. Для этого к моче, полученной ex tempore, добавляли Молселект G-75 (Реанал, Венгрия) из расчета 1 гр. на 10 мл мочи, выдерживали при 37°С в течение 30 мин, после чего отделяли концентрированную мочу и проводили диск-электрофорез в ПААГ или электрофорез на АЦМ согласно методикам, разработанных для исследования белков плазмы крови.
Для исследования состава КА непосредственно перед электрофоретическими исследованиями мочу после криоагрегации, проведенной в стационарной криоустановке, переливали в криопробирки объемом 10 мл и в режиме охлаждения при 1°-0°С центрифугировали в течение 3 мин при 1000 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость отделяли от осадка КА, который осторожно перемешивая растворяли в 0,9% растворе хлорида натрия с температурой 37°С в соотношении 1:5 до полного растворения. Полученный опалесцирующий раствор вновь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 3 мин при комнатной температуре и использовали для исследований ex tempore.
Дополнительно применяли следующие биохимические исследования:
1. Определение общего белка биуретовым методом по Лоури.
2. Определение липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) Набор, производство "Sentinel".
3. Определение липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). Набор, производство "Sentinel".
4. Определение фосфолипидов (ФЛ), прямой ферментативный калориметрический тест. Набор, производство "Sentinel".
5. РФМК - растворимые фибрин мономерные комплексы. Набор, производство «Ольвекс диагностикум», Россия.
6. Определение мочевых солей (ураты, оксалаты) микроскопия.
7. Определение рН мочи.
8. Определение удельного веса мочи.
Фотоколориметрию мочи проводили в кювете с длиной оптического слоя 10 мм, при длине волны: 364, 400, 440, 490, 590, 670 нм на фотоэлектрокалориметре КФК-2-УХЛ-4.2, Россия. Контролем служит оптическая плотность той же исследуемой жидкости до криоагрегации. Процесс образования агрегатов оценивали на основании изменения динамики образования агрегатов с помощью анализатора лазерной агрегации «БИОЛА» Россия, в микрокюветах (макро, 4 мл) «Литопласт-Мед», Белорусь. Криоагрегацию мочи проводили на разработанном нами узле охлаждения, на основе элементов Пелтье, мощностью 40 вт. (для криообработки микроколичеств мочи) «Криотерм», Россия.
Лазерную агрегометрию кювет, установленных в узле охлаждении, разработанного и выполненного для стендовых экспериментальных исследований выполняли с помощью фотооптического блока, состоящего из лазерного модуля 655НМ10МВТ HLDM12 650-3, красный, Китай, с длиной волны 650 нм и фоторезистора VT43N3, Китай.
Статистическую обработку полученных данных согласно методике (12). Коэффициент корреляции (r) между температурой при охлаждении мочи и нефелометрическим показателем, а также характер зависимости и количественного выражения достоверности связи между двумя указанными признаками вычисленный по методике (1).
На основании проведенных исследований нами установлено, что структура КА мочи представлена рыхлым, аморфным, легко разрушаемым преципитатом и отличается по плотности от КП плазмы. Наряду с этим, основной объем КА мочи составляют мочевые соли, также выпадающие в осадок при охлаждении. Этот объем достаточно широко варьирует и составляет от 50 до 90% общего объема КА.
При дальнейших исследованиях было установлено, что КА наблюдается в процессе охлаждения мочи до температуры 0° -3°С без образования льда. В течение охлаждения формируется мелко дисперсные КА, выпадающие в дальнейшем в виде рыхлого неоднородного осадка. Этот осадок в большей степени, на 70-80% объема состоит из мочевых солей, которые окрашивают его в зависимости от содержания тех или иных солей.
Большая часть белкового преципитата остается в надосадочной жидкости. На Фиг 1. видны изменения до (А) и после (Б) криоагрегации.
Эта иллюстрация подтверждает, что криоагрегация вызывает выраженные изменения свойств мочи, которые способствуют выпадению специфического осадка. Детальное описание результатов изучения осадка представлено в таблицах 1-3. При этом следует отметить многокомпонентный состав осадка, который состоит из денатурированных белков, мочевых солей и других веществ, часть из которых появляется только при патологических состояниях и в норме отсутствует.
Осадок мочевых солей при добавлении дистиллированной воды в соотношении 3:1 полностью растворяется и повторно не выпадает, что свидетельствует о растворении солей и обратимой криоагрегации при этом режиме охлаждения.
Выпавший при охлаждении осадок при добавлении 0,9% раствора NaCl при температуре выше 9°С растворяется полностью. Микроскопия осадка после его растворения также показывает практически полное отсутствие белковых преципитатов.
Ранее нами установлено, что в моче здоровых детей патологические вещества, инициирующие криоагрегацию не обнаруживаются, или присутствуют в минимальных количествах (Б.И. Асатуров, М.Б. Асатуров, 2013) (5). В следовых количествах они начинают определяться у 5-10% здоровых детей в возрасте от 11 лет и выше, т.е. с началом полового созревания. У взрослых здоровых людей КАМ определяется постоянно и ее интенсивность у здоровых людей связана с особенностью питания и физическими нагрузками. КАМ выявляется у подавляющего большинства обследованных больных островоспалительными заболеваниями различной этиологии в возрасте свыше 16 лет. (Б.И. Асатуров, М.Б. Асатуров 2013) (5).
Для изучения процесса криоагрегации нами разработан и создан стенд, позволяющий работать в стационарном режиме и получением достаточных для исследований количеств материала.
При анализе процесса криоагрегации выявлено следующее. На Фиг. 2 видно, что изменения нефелометрического показателя в моче наблюдается практически сразу после снижения ее температуры ниже 30°С. При этом, в процессе охлаждения выявляются три фазы, каждая из которых отличается скоростью изменения нефелометрического показателя и связана со степенью охлаждения. Так, первая фаза находится в интервале температур от 30°С до 22°С и характеризуется быстрым, прогрессивным повышением нефелометрического показателя (снижением прозрачности) мочи. Вторая фаза характеризуется заметным снижением скорости изменения нефелометрического показателя. Необходимо отметить, что в 25% наблюдений отмечено отрицательная динамика нефелометрического показателя и повышение прозрачности мочи. Нам представляется, что выявленные изменения преимущественно связаны с влиянием мочевых солей, в основном уратов и оксалатов. В определенной степени это предположение можно объяснить тем, что в этой фазе наблюдается выпадение осадка минеральных солей, причем цвет осадка - розово-красноватый, указывает на доминирование именно уратов и оксалатов.
Наиболее интересна третья фаза, при которой, практически во всех наблюдениях обнаруживался прогрессивный, скачкообразный рост нефелометрического показателя в течение сравнительно короткого интервала времени, в среднем, в течение 20-50 сек. Этот факт можно объяснить наступлением критического состояния структуры нативных белков и потерей их растворимости. Нельзя исключить и то, что структура белковых компонентов мочи уже ущербна и отличается от полноценных белков плазмы крови. Возможно, эти изменения отражаются в том, что многократные попытки провести электрофорез в ПААГ концентрата мочи приводят к тому, что подавляющая масса белка остается на стартовой линии в начале геля и не разделяется в нем. При этом, стартовая зона интенсивно окрашивается специфичными для белков красителями, такими как Амидочерный 10Б, Кумасси бриллиантовый G-250. Единичные минорные компоненты, входящие в гель, естественно, не представляют весь спектр частично денатурированных белков, остающихся на старте.
Анализ проведенных на этом этапе исследований дал важные для практического применения результаты, а именно, позволил определить наиболее оптимальное время для фиксации максимального эффекта (значений нефелометрического показателя) в динамике криоагрегации.
Результаты изучения отдельных компонентов, присутствующих в моче показали следующее.
Во всех случаях, надмолекулярные компоненты, такие как эритроциты, лейкоциты, гиалиновые цилиндры и бактериальные клетки после криоагрегации мочи не определялись (таблица 1).
Содержание РФМК, ЛПВП и ЛПНП после криоагрегации снижалось до нерегистрируемых величин. Это указывает на вовлеченность этих компонентов в процесс криоагрегации. При этом, существенно снижалась концентрация фосфолипидов, практически в 4 раза, оставаясь определяемой на уровне 0,7 г/л, возможно из-за сохранения остаточных количеств ЛПВП (Таблица 2).
Для исследования различий вовлеченности в процесс криоагрегации нативных белков и белково-белковых комплексов в мочу перед криообработкой были добавлены в известной концентрации предварительно подготовленные маркеры. Один из них - нативный свободный человеческий гемоглобин полученный из гемолизированных эритроцитов в исходной концентрации 100 мг/л. Второй маркер - комплекс нативного человеческого гемоглобина с нативным человеческим гаптоглобином (любезно предоставлен фирмой "LOBATSE" s.l., Испания).
Условные обозначения.
1. РФМК - растворимые фибрин мономерные комплексы.
2. ЛПВП - липопротеины высокой плотности.
3. ЛПНП - липопротеины низкой плотности. Определение по разнице с общими липидами (%).
4. Определение фосфолипидов. Прямой ферментативный колориметрический тест. Набор производство "Sentinel".
5. НР-НВ комплекс - гаптоглобин-гемоглобиновый комплекс. Добавлен в надосадочную жидкость как маркер для оценки влияния криоагрегации на крупномолекулярные комплексы белков (Фенотип НР2-1). Определение по методу J. Korinek в модификации И.И. Геронимус. 1968.
6. Нативный гемоглобин человека. Добавлен в надосадочную жидкость как маркер для оценки влияния криоагрегации на нативные белки. Цианметгемоглобиновый метод.
7. Нативный человеческий альбумин. Определение альбумина в моче. Набор реагентов для определения альбумина в моче иммунотурбидиметрическим методом. Производитель "Pliva-Lachema".
Оказалось, что концентрация НР-НВ комплекса после криоагрегации снижалась до нерегистрируемых величин, в то время как концентрация свободного, несвязанного гемоглобина практически не изменялась. Аналогичные результаты получены при исследовании концентрации альбумина, которая после криоагрегации практически не изменялась (таблица 2). Эти данные подтверждают избирательное влияние криоагрегации как на надмолекулярные компоненты мочи, такие как эритроциты, лейкоциты, гиалиновые цилиндры, бактериальные клетки, так и крупные агрегаты и крупнополимерные белковые образования, не затрагивая при этом нативные белки.
Проба полученного концентрата криоагрегата - гелевая форма была использована для определения в ней доли сухого вещества. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу при 105°С в течение 24 часов для полного удаления влаги. Установлено, что из 50 г стартового материала было получено 2,78 г сухого вещества, что соответствует 5,56% стартового материала в пересчете на процентное содержание. В результате анализа сухого остатка установлено следующее: содержание белка - 6,1%, зольных компонентов - 27,3%, углеводов - 66%, липидов - 0,6%. Эти данные представлены в Таблице 3.
Поставленная задача - повышение точности и максимальное сокращение сроков выявления островоспалительного заболевания с момента его возникновения для определения состояния организма, а также безинвазивность получение материала для исследования решается следующим образом.
В способе оценки состояния организма детей путем физико-химического исследования мочи, согласно изобретению, в моче определяют наличие холодового преципитата или криоагрегата (КА) и при его обнаружении диагностируют наличии островоспалительного заболевания или активацию хронического процесса.
Нами установлено, что в моче здоровых детей патологические вещества, инициирующие криоагрегацию не обнаруживаются, или присутствуя в минимальных количествах ее не инициируют (Б.И. Асатуров, М.Б. Асатуров, 2013) (5). В следовых количествах они начинают определяться у 5-10% здоровых детей в возрасте от 11 лет и выше, т.е с началом полового созревания. У взрослых здоровых людей криоагрегация мочи определяется практически постоянно и ее выраженность связана с особенностью питания и физическими нагрузками. Криоагегация мочи выявляется у подавляющего большинства обследованных больных островоспалительными заболеваниями различной этиологии в возрасте свыше 16 лет. (Б.И. Асатуров, М.Б. Асатуров 2013) (5).
В плазме крови криопреципитация определяется всегда. В моче здоровых людей разных возрастных групп криоагрегация определяется не всегда. У здоровых детей в моче криоагрегация не происходит.
Отсутствии криоагрегации в моче у детей считается как норма или связано с очень низким удельным весом, выявляемым в узкой группе больных с тяжелой нефрологической патологией.
Особенностью появления КА в моче детей с развивающимся островоспалительным заболеванием является увеличение концентрации острофазных белков, денатурированных белков и их фрагментов, надмолекулярных белковых агрегатов, криоглобулинов в результате их проникновения через почечный барьер. Высокое содержание этих веществ инициирует криоагрегацию при охлаждении мочи в диапазоне температуры от 0°С до -3°С.
Нами неожиданно установлено, что нефелометрические показатели прозрачности мочи при охлаждении ниже 0°С резко изменяются. Различия этих значений при сравнении исходного нефелометрического показателя до охлаждения, условно обозначенного как V1 и конечного нефелометрического показателя прозрачности, условно обозначенного как V2, в виде коэффициента, интегрирующего эти значения, условно обозначенного как Kv=V2/V1, можно использовать для оценки физико-химических свойств мочи. Эти свойства меняются за счет влияния качественных и количественных параметров патологических веществ, инициирующих криоагрегацию, и могут быть применены для диагностики, и конкретно, для оценки наличия или отсутствия островоспалительной патологии организма ребенка.
Проведенные нами исследования показали, что у практически здоровых детей значение показателей V1 и V2 колеблются в пределах 10%, и в значениях коэффициента Kv, интегрирующего значения этих показателей, составляют от 1 до 0,9. По нашим данным, диапазон Kv от 0,95 до 0,9, определяемый у практически здоровых детей, в большей части связан с т.н. физиологическими нагрузками, при которых значения V1 превышают V2 не более 6-8%.
Этот же промежуточный уровень отмечен в группе практически здоровых детей, что, возможно, было связано с ранее перенесенными заболеваниями и старшей возрастной группой от 8 до 12 лет.
При островоспалительных заболеваниях различной этиологии - значения Kv составляли менее 0,9 (V1 выше V2 более чем на 10%) и расценивались как соответствующие патологическому состоянию. Таким образом, использование предлагаемого способа оценки состояния организма позволяет с высокой точностью (95%) проводить раннюю диагностику островоспалительного заболевания неинвазивным экспресс методом и возможностью массового обследования больших контингентов детей.
Проведенные нами клинические исследования показали, что криоагрегация в моче неоднократно обнаруживалась раньше развития видимых клинических проявлений заболевания ребенка. Это свидетельствует о высокой чувствительности этого способа, а также дает возможность максимально ранней доклинической диагностики и объективной интерпретации полученных данных.
Незначительная длительность исследования предложенным способом, составляющая не более 3 минут позволяет считать его методом экспресс диагностики.
Преимущества предлагаемого способа.
1. Высокая точность диагностики.
2. Неспецифичность диагностики, позволяющая диагностировать различные по нозологии островоспалительные заболевания, т.е. заболевания различной этиологии.
3. Возможность экспресс диагностики (в течение 3 минут).
4. Возможность ранней диагностики, в том числе в период до развития клинических проявлений заболевания.
5. Безопасность диагностики за счет безинвазивности позволяет полностью исключить риск заражения вирусным гепатитом или другими опасными инфекциями, устранить психологическую травму ребенка при взятии анализа.
6. Простота и надежность аппаратуры для исследования и отсутствие необходимости применения каких-либо реактивов.
7. Способ охлаждения мочи для выявления криоагрегации (криоагрегата) может использован как маркерный высокочувствительный неспецифический тест для диагностики островоспалительной патологии у детей.
8. Способ позволяет получать материал для диагностики без ограничений, что позволяет проводить неоднократные исследования или непрерывный мониторинг в динамике заболевания, а также массовые доклинические обследования детей при возникновении необходимой ситуации.
9. Способ обладает существенной простотой и состоит только из одного этапа охлаждения мочи.
Способ осуществляется следующим образом.
1,5 мл мочи ребенка, взятой в течение и предпочтительно не более 1 часа (для исключения влияния микробной кантаминации), после чего вводят в прозрачную пластиковую спектрофотометрическую кювету емкостью, предпочтительно 2,5 мл с крышкой, имеющей эластичную магистраль и мандрен для соединения со шприцом, где определяют исходный нефелометрический показатель (V1), который принимают за 100%, после чего контейнер с мочой охлаждают до температуры 0°С-(-3)°С, предпочтительно -2°С в течение 2-4 мин, предпочтительно в течение 3 мин без образования льда и проводится повторная нефелометрия охлажденной мочи, где определяется конечный показатель (V2), который выражают в %. Результат интегрируют коэффициентом Kv=V2/V1, который в норме равен 1 при колебаниях в сторону снижения до 0,9. При изменении Kv ниже 0,9 судят о наличии островоспалительной патологии.
1. Пример конкретной реализации способа.
Пациент А., 4 года. Исследование 12.12.2013. Практически здоров.
Взято в одноразовую емкость 20 мл мочи ex tempore. Из нее отобрано 1,5 мл мочи и перенесено в кювету емкостью 2,5 мл, которая установлена в охладительную камеру аппарата. Проведено определение исходного нефелометрического показателя V1, который принят за 100% и начато охлаждение до -2°С. Общее время охлаждения при -2°С составило 3 минуты, после чего произведено повторное определение конечного нефелометрического показателя V2, который составил 94%. Значения Kv, рассчитанные по разнице соотношения показателей (V1/V2) составили 94/100=0,94. Таким образом, при значении Kv=0,94 сделано заключение об отсутствии патологии у ребенка.
2. Пример конкретной реализации способа.
Пациент А., 6 лет. Исследование 5.04.14. Днем, в 18.00 ребенок начал жаловаться на головную боль, потерю аппетита, покашливание. Температура тела 37,2°С. Взято ex tempore 20 мл мочи в одноразовую емкость. Из нее отобрано 1,5 мл мочи и перенесено в кювету емкостью 2,5 мл, которая установлена в охладительную камеру аппарата. Проведено определение исходного нефелометрического показателя V1, который принят за 100% и начато охлаждение до -2°С. Общее время охлаждения при -2°С составило 3 минуты, после чего произведено повторное определение конечного нефелометрического показателя V2, который составил 74%. Значения Kv, рассчитанные по разнице соотношения показателей (V1/V2) составили 74/100=0,74. Таким образом, при значении Kv=0,74 сделано заключение о развитии острого воспалительного заболевания. Утром 6.04.14 диагностировано острое респираторное заболевание.
3. Пример конкретной реализации способа.
Пациент А., 13 лет. Практически здоров. Исследование 12.02.14. Утром в 8.00 взято ех tempore 10 мл мочи в одноразовую емкость. Из нее отобрано 1,5 мл мочи и перенесено в кювету емкостью 2,5 мл, которая установлена в охладительную камеру аппарата. Проведено определение исходного нефелометрического показателя V1, который принят за 100% и начато охлаждение до -2°С. Общее время охлаждения при -2°С составило 3 минуты, после чего произведено повторное определение конечного нефелометрического показателя V2, который составил 98%. Значения Kv, рассчитанные по разнице соотношения показателей (V1/V2) составили 98/100=0,98. Таким образом, при значении Kv=0,98 сделано заключение об отсутствии патологии.
4. Пример конкретной реализации способа.
Пациент А., 13 лет. Тот же пациент, описанный в примере 3. До исследования был практически здоров. Утром почувствовал недомогание, сухость во рту, першение в горле. Температура тела 36,9°С. Исследование 15.03.14. в 8.00 взято ex tempore 20 мл мочи в одноразовую емкость. Из нее отобрано 1,5 мл мочи и перенесено в кювету емкостью 2,5 мл, которая установлена в охладительную камеру аппарата. Проведено определение исходного нефелометрического показателя V1, который принят за 100% и начато охлаждение до -2°С. Общее время охлаждения при -2°С составило 3 минуты, после чего произведено повторное определение конечного нефелометрического показателя V2, который составил 78%. Значения Kv, рассчитанные по разнице соотношения показателей (V1/V2) составили 78/100=0,78. Таким образом, при значении Kv=0,78 сделано заключение о развитии острого воспалительного заболевания. Через 2 часа состояние хуже, боли в горле, при глотании. Температура тела 37,8С. Диагностирована острая лакунарная ангина.
5. Пример конкретной реализации способа.
Пациент А., 13 лет. Тот же пациент, описанный в примере 3 и 4. С момента заболевания прошло 10 дней. Жалоб нет. Клинически здоров. Температура тела 36,6°С. Исследование 25.03.14. в 8.00 взято ex tempore 20 мл мочи в одноразовую емкость. Из нее отобрано 1,5 мл мочи и перенесено в кювету емкостью 2,5 мл, которая установлена в охладительную камеру аппарата. Проведено определение исходного нефелометрического показателя V1, который принят за 100% и начато охлаждение до -2°С. Общее время охлаждения при -2°С составило 3 минуты, после чего произведено повторное определение конечного нефелометрического показателя V2, который составил 91%. Значения Kv, рассчитанные по разнице соотношения показателей (V1/V2) составили 91/100=0,91. Таким образом, при значении Kv=0,91 сделано заключение об отсутствии островоспалительной патологии.
Поставленная задача - разработка и создание аппарата для безинвазивной диагностики островоспалительной патологии у детей решается путем применения впервые разработанного способа криоагрегации мочи, позволяющего повысить точность диагностики и добиться максимального сокращения сроков выявления островоспалительного заболевания с момента его возникновения.
Проведенные нами патентный поиск и маркетинговые исследования показали, что аппараты для диагностики островоспалительного процесса и одноразовые тест-систем в настоящее время ни одной из отечественных фирм не выпускаются и на российском и зарубежных рынках отсутствуют. Технологии исследования, а также аналогичные приборы в России не существуют. Источник информации: «Перечень изделий ведущих фирм-изготовителей лабораторного и диагностического оборудования» за 2015 год». Исходя с ситуацией в настоящее время отсутствует возможность сравнения с аналогичными аппаратами, работающих на впервые разработанных нами принципах исследования. В связи с этим, для сравнения были использованы аппараты, выпускаемые фирмами, дающие возможность при исследовании крови (инвазивным способом забора материала для анализа), получить близкие по значимости и заявляемым требованиям результаты.
На отечественном рынке известен «Анализатор общего белка в моче фотометрический портативный АОБМФ-01-НПП-ТМ Белур 600». Прибор предназначен для определения концентрации общего белка в моче современными и традиционными методами: с пирогаллоловым красным, с сульфосалициловой кислотой и Бредфорд. Могут использоваться реагенты любых отечественных и зарубежных производителей. Как отмечается в проспекте фирмы - Белур 600 - это единственный в России универсальный анализатор общего белка в моче. Однако технические характеристики этого прибора исключают возможность выполнения заложенных в предлагаемом диагностическом аппарате функций, а именно: инвазивной или безинвазивной диагностики островоспалительной патологии. Отечественные производители диагностических реагентов и тест систем, такие как: "Вектор-Бест", "Диакон Диагностикс" в настоящее время выпускают достаточно широкий ассортимент этих высококачественных продуктов. Можно отметить, что разработанный в ЗАО "Вектор-Бест" набор "Белок-ПГК-Ново", сравним по репрезентативности определения белка в моче с наборами реагентов фирм "Biocon", "Bio-Rad" и "Chronolab". Однако подавляющее большинство выпускаемых тест-систем предназначены для использования преимущественно в импортных аппаратах для диагностики, а также для выполнения рутинных исследований, исключающих выявление маркерных факторов острого воспалительного процесса.
В интересующем нас кластере, можно выделить три основные группы лабораторного оборудования, а именно: биохимические анализаторы, среди которых две подгруппы - для исследования крови и для исследования мочи, коагулометры и аппараты для иммуноферментного анализа. В первой группе лидирующее место занимают аппаратурные комплексы ведущих стран, таких как США, Германия, Япония, а в последнее время и Китай. В частности, наибольшим спросом из них пользуются биохимические анализаторы Start Fax 4500 и более совершенный, Start Fax 1904, снабженный тест системами для выполнения более 100 различных исследований, включающие определение энзимов, субстратов, липидов, электролитов, иммунотурбидиметрию белков сыворотки (не мочи) и латексную иммунотуридиметрию белков сыворотки (не мочи). В контексте сопоставления можно выделить определение этими анализаторами белков «острой фазы», таких как альфа-1-антитрипсин, альфа-2-макроглобулин, альфа-1-кислый гликопротеин, гаптоглобин, С-реактивный белок. Несмотря на широкий спектр этих веществ, характерных для острого воспалительного процесса, следует учитывать данные литературы, указывающие на высокий разброс именно этих показателей, как в динамике заболевания, так и в первые часы заболевания, когда концентрация многих из них сохраняется на уровне не превышающем максимальных значений у здоровых лиц. Следует также отметить, что для выполнения исследований перечисленных острофазных белков требуется использование только инвазивных методов забора крови. Стоимость Start Fax 1904 составляет в рекомендованном фирмой производителем варианте для РФ - не менее 25000$ США (1.500.000 млн руб. по существующему на февраль 2016 г. курсу). Стоимость одноразовых тест систем составляет от 3 до 5$ за единицу. Это делает недоступным закупки подобных аппаратов для подавляющего большинства учреждений практического здравоохранения в настоящее время. Аналогичные выводы можно сделать при сравнительном анализ подобных аппаратов других производителей: Меньшие по стоимости выполняемым исследованиям экспресс анализаторы типа Clinitek Advantus и Clinitec Stats Plus (Simens Diagnostics, США); Uritek 720 Plus (TECO Diagnostics, США); NanoChecker 710, Multi Care, Cardio Chek и целый ряд других, лишены функции определения каких либо острофазных маркеров и их сравнительный анализ некорректен. При этом, обращает высокая стоимость всей линейки таких экспресс-анализаторов, которая колеблется в диапазоне 12000-15.000$ США. Отдельно можно рассмотреть ситуацию с реагентами ведущих зарубежных производителей, таких как: "Bayer Diagnostics", "Beckman", "Biocon Diagnostic", "Biodirect", "Bio-Rad", "Kone", "Merck", "Randox", "Sigma", "Chronolab", "DiaSys", "Serono", "Sentinel CH", "Sigma", Urine Reagent Strips (URS-10) TECO Diagnostics, США. В большинстве предлагаемых наборах для тестирования отсутствуют тест системы для определения острофазных маркеров воспаления и практически многие из них применимы для анализа рутинных показателей гемостаза или выделительной функции мочевыводящей системы. При этом стоимость единицы продукции также достаточно высока и находится в диапазоне от 2 - до 7$ США. Приведенные выше ценовые диапазоны известных производителей медицинского лабораторного диагностического оборудования и тест-систем свидетельствуют о существенном превышении критического предела доступности приобретения этих продуктов учреждениями практического здравоохранения. При этом практически отсутствует аппаратура и тест системы для безинвазивной диагностики островоспалительного процесса, и тем более, безинвазивной экспресс диагностики.
Целью изобретения является разработка и создание нового высокоточного способа и аппарата для безинвазивной экспресс диагностики, основанного на принципиально новых физико-химических методах исследования впервые обнаруженного явления криоагрегационной полимеризации мочи.
Аппарат состоит из нескольких узлов, которые обеспечивают охлаждение до температуры 0°С-(-2)°С, отведение тепла, фотооптический блок для получения и обработки сигнала, узел обработки сигналов от фотооптического блока и датчиков температуры с контроллером. Для работы контроллера создано программное обеспечение, позволяющее получить и поддерживать заданные режимы работы аппарата. Блок питания с постоянным током 12v, установлен вне аппарата, что обеспечивает безопасность его работы, а также уменьшает размеры и вес самого аппарата. Сборочный чертеж аппарата представлен на Фиг. 3 Обозначенные позиции следующие: 1 - терморегулятор, 2 - опорная пластина фотооптического блока, 3 - фотооптический блок, 4 - узел охлаждения, 5 - панель верхняя, 6 - стойка, 7 - термоэлемент, 8 - радиатор, 9 - вентилятор, 10 - панель нижняя, 11 - камера контроля температуры, 12 - камера криоагрегационной обработки.
Дополнительно к аппарату, исходя из технических требований установки кювет в блок охлаждения и принципа их охлаждения, в соответствии с конструкцией установочного места в блоке охлаждения была разработана конструкция микрокюветы (МК) для внесения образца, которая показана на Фиг. 4. и Фиг. 5 МК снабжена корпусом (13), крышкой (14) с отверстием (15) и штуцером (16), соединенным с пластиковой микромагистралью (17), выполненной из полихлорвинила (ПВХ) или полипропилена (ПП), заканчивающейся мандреном (18) с заглушкой (19), для соединения со штуцером шприца, необходимого для ввода исследуемого образца. В качестве базовой конструкции использовались микрокюветы спектрофотометрические объемом 2,5 мл производства «Литопласт-Мед», Беларусь.
В ходе проведенных исследований было изучено влияние охлаждения мочи на осаждение ее компонентов на стенки МК. Это было сделано для того, чтобы минимализировать влияние возможного налипания компонентов мочи и как следствие - снижение оптической проходимости света через стенки кюветы.
При исследованиях (n=20), установлено, что при экспозиции мочи охлажденной до 0°С в интервале 1-6 минут увеличения нефелометрического показателя не отмечено, различия значений статистически недостоверны (Р<0,5). Это свидетельствует о том, что материал кювет - полистирол, обладает достаточным антиадгезивным эффектом.
Для фиксации и охлаждения МК был разработан U-образный крепеж, длиной до 15 мм, шириной до 9 мм, толщиной 1,5 мм, выполненный из медной пластины (20, 21), приваренной к медной пластине блока охлаждения (22) (Фиг. 6). При этом МК устанавливается в канал с прямоугольным сечением размером 12×12,5 мм из термоизоляционного материала, который плотно облегает МК и устраняет возможность образования конденсата на стенках кюветы. Канал также снабжен двумя отверстиями диаметром 5 мм, с обеих противоположных сторон на высоте не менее 25 и не более 35 мм, предпочтительно 30 мм от дна ложемента, предназначенных для прохождения света от оптического излучателя на фоторезистор фотооптического блока.
В ходе технических и лабораторных испытаний (n=20) этой конструкции блока охлаждения МК время охлаждения до требуемой температуры 1-0°С составило, в среднем 76,6 секунды (Р>0,05), что наиболее оптимально для проведения исследований. При этом варианте охлаждения и конструкции МК конденсат не образуется.
Дополнительно к этому в ходе лабораторных испытаний было изучено влияние охлаждения на способность оседания на стенках кюветы различных компонентов мочи. Отмечено, что материал стенки кюветы - полистирол, при охлаждении не способствует оседанию на нем мочевых солей, липопротеидов (ЛПВП и ЛПНП), а также фосфолипидов, нарушающих прозрачность и проходимость светового потока. Фотооптический блок работает без погрешностей.
Совокупность разработанной конструкции МК и технический результат испытаний позволяют считать положительным решением поставленной задачи.
В соответствии с техническим заданием разработаны создана основные узлы опытного образца аппарата, а именно: узел охлаждения и узел криоагрегационной подготовки мочи.
На промышленно выпускаемые изделия, которые вошли в состав основных узлов без доработки, конструкторская документация не разрабатывалась. Это касается следующих основных узлов: узел отвода тепла, фотооптический блок, блок регистрации сигналов датчиков, блок питания.
При испытаниях блока охлаждения, все заданные техническим заданием параметры были сохранены. Проявления процесса конденсации не обнаружено. Время охлаждения кюветы с образцом составило, в среднем 200 сек.
Аппарат работает следующим образом.
После подключения источника питания и включения аппарата, контроллер включает систему охлаждения, конкретно элемент Пелтье и куллер отвода тепла. При достижении заданной температуры 0°С подается сигнал готовности аппарата к работе. В ложемент, установленный вверху корпуса аппарата вставляется микрокювета с исследуемым образцом. Через 3 минуты аппарат подает обработанный и интегрированный сигнал от датчиков на один из двух светодиодных индикаторов. В случае обнаружения криоагрегации - включается светодиод, обозначенный как индикатор заболевания (условно красный цвет). При отсутствии криоагрегации включается светодиод, обозначенный как индикатор отсутствия патологии (условно зеленый цвет). После подачи информации аппарат автоматически выключается или может продолжить выполнение следующих исследований с новым образцом.
Примеры реализации работы аппарата.
Пример 1.
После подключения источника питания и включения аппарата мама ребенка Ф., 6 лет, набирает в 2 граммовый шприц 2 мл мочи, соединяет штуцер шприца с мандреном эластичной магистрали, соединенной с микрокюветой, которую вставляет в ложемент, установленный вверху корпуса аппарата. Вводит мочу из шприца в микрокювету. Нажимает кнопку «ПУСК». Через 3 минуты после работы аппарата поступает сигнал (зеленый цвет светодиода), об отсутствии патологии.
Пример 2.
После подключения источника питания и включения аппарата мама ребенка Е., 3 лет, набрала в 2 граммовый шприц 2 мл мочи, соединила штуцер шприца с мандреном эластичной магистрали, соединенной с микрокюветой, которую вставила в ложемент, установленный вверху корпуса аппарата, ввела мочу из шприца в микрокювету, нажала кнопку «ПУСК». Через 3 минуты после работы аппарата поступает сигнал (красный цвет фотодиода), информирующий о наличии патологии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные лабораторные исследования позволяют сделать заключение о том, что аппарат обеспечивает возможность проведения криоагрегации исследуемого образца мочи в заданных режимах охлаждения от 0°С до -2°С в течение 2 минут с последующей интегративной обработкой полученной информации и выдачей сигнала в виде «ДА» или «НЕТ».
Разработанная микрокювета позволяет надежно определять нефелометрические показатели и их изменения в динамике охлаждения до требуемых значений. Материал стенки МК - полистирол, при охлаждении не способствует оседании на нем липопротеидов или фосфолипидов, нарушающих прозрачность и проходимость светового потока. Использование в качестве базового корпуса уже промышленно выпускаемой, сертифицированной для спектрофотометрических исследований МК (кювета спектрофотометрическая «Литопласт-Мед», Беларусь) позволило исключить необходимость обширных дополнительных исследований. Разработанная нами конструкция крышки кюветы позволяет надежно герметизировать ее при заливке мочи и исследовании. Снабжение кювет тонкой пластиковой магистралью обеспечивает улучшение и удобство эксплуатации кюветы, поскольку исключает случайное попадание исследуемой жидкости на аппарат и кожные покровы лиц, проводящих исследование.
Наличие на наружном конце магистрали мандрена с заглушкой облегчает ввод внутрь кюветы исследуемой жидкости и ее дозирование шприцом, а после его удаления обеспечивает полную герметизацию тест системы в процессе исследования и хранения до утилизации, существенно повышая безопасность работы персонала.
Анализ эффективности применения разработанных, изготовленных и испытанных МК и узлов сопровождения процесса криоагрегации заявляемого диагностического аппарата позволил выделить наиболее оптимальный вариант кюветы и узла охлаждения и отвода тепла для нее.
С применением оптимального варианта время охлаждения кюветы составило, в среднем, 200 секунд. При этом было устранено одно из нежелательных побочных явлений при охлаждении кювет - проявление конденсата на стенках кювет. В значительной степени этому способствовало изменение принципа охлаждения кюветы за счет U-образных пластинчатых охладителей, позволяющих проводить охлаждение изнутри, а не снаружи. Помимо этого, конструкция блока охлаждения и криоагрегационной подготовки позволил до минимума сократить пространство камеры, где устанавливается кювета, что так же способствовало предотвращению образования конденсата на их стенках.
Применении впервые разработанного принципиально нового способа лабораторно-клинической диагностики островоспалительной патологии у детей, основанного на впервые обнаруженном явлении - криополимеризационной агрегации компонентов мочи и на его основе разработке и создании аппарата на новых физических принципах, создающих возможность безинвазивной диагностики за счет использования для исследования мочи вместо крови или других биологических жидкостей.
Научная новизна предлагаемого решения заключается в выявлении предложенным способом маркерных факторов, появляющихся в моче в высокой концентрации при островоспалительной патологии преимущественно у детей.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Асатиани B.C. Новые методы биохимической фотометрии М.: Наука, 1965. - с. 507-510.
2. Асатуров Б.И. Мононуклеарная фагоцитирующая система при эндогенной интоксикации. Современная медицина. 1989. №1, с. 17-20.
3. Асатуров Б.И. Диагностика и лечение эндогенной интоксикации при генерализованной гнойной хирургической инфекции. // Дисс. докт. мед. наук. М. 1994. - с. 68.
4. Асатуров Б.И. Эндотоксикоз и детоксикация. Теоретические и клинические аспекты. И. 2011, - с. 74.
5. Б.И. Асатуров, М.Б. Асатуров. Диагностическое значение определения криопреципитинов мочи при воспалительных заболеваниях мочеполовой системы. Капилярный крио-тест мочи.
Электронный научный журнал «Экспериментальная и клиническая криопреципитация». 2013. В. 2.
6. Б.И. Асатуров, Асатуров М.Б. Состав криопреципитата мочи.
Электронный научный журнал «Экспериментальная и клиническая криопреципитация». 2014. В. 1.
7. Б.И .Асатуров. Способ получения протеогликана. Патент RU 2621311 от 09.12.2015.
8. Комплекс аппаратно-программный для электрофореза белков сыворотки крови на пленках из ацетата целлюлозы УЭФ-01 (Астра, Россия).
9. Лавруков A.M.; Базарный В.В.; Зыкина О.В. Патент RU 2145086. Способ оценки состояния травматологического больного. 27.01.2000.
10. Литвинов Р.И. Фибронектин плазмы. // Казанский медицинский журнал. 1984, №3. - с. 203-212.
11. Лозовой В.П., Петрова Е.М., Казначеева В.П. Определение активности ревматизма и инфектартрита путем исследований гепариносаждаемой фракции плазмы крови. Вестник ревматологии. 1969. №4, с. 22-23.
12. Методы статистической обработки медицинских данных: Методические рекомендации для ординаторов и аспирантов медицинских учебных заведений, научных работников / сост.: А.Г. Кочетов, О.В. Лянг., В.П. Масенко, И.В. Жиров, С.Н. Наконечников, С.Н. Терещенко - М.: РКНПК, 2012. - 42 с.
13. Федоров Н.А., Овчарук Н.Н., Федотов В.А. Функциональное и клиническое значение фибронектина плазмы крови. // Вестник Академии медицинских наук СССР. 1987, №7, - с. 53-59.
14. Levo J. Nature of cryoglobulinemia. // The Lancet. 1980. V. 1, N 8163, P. 285-287.
15. S. Malehensky, J. Asanuma at al., Zawiski I. et al. On-line separation of macromolecules by membrane filtration with cryogelation. // Artif. Organs. 1980 / №4, P. 205-207.
16. Moon D.E., Kaplan J.E., Mazurkewicz J.E. The inhibitory effect of plasma fibronectin on collagen-iducedplateletaggregation. // Blood. 1986, V 67, N 2, P. 450-457.
17. U.K. Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. London, UK: Nature Publishing Group, 1970. - Vol. 227, no. 5259. - P. 680-685.
Список документов, принятых во внимание при патентном поиске:
1. RU 2017504 С1, 15.08.1994.
2. RU 2099029 С1, 20.12.1997.
3. Дудина К.Р., Кутателадзе М.М., Знойко О.О. и др. Клиническая значимость маркеров острого воспаления при инфекционной патологии. // Казанский медицинский журнал. - 2014. - Т. 95. - №6. - С 909-915.
4. Авторское свидетельство №1181668 Г.А. Ермолин, В.Г. Савченко, С.А. Васильев и др., опубликованно в бюллетене №36 "Открытия. Изобретения." в 1985 г.
5. Васильев С.А., Ефремов Е.Е., Савенко Т.А., Ермолин Г.А. и др. Циркулирующие комплексы плазменного фибронектина: фибронектин - фибрин при некоторых заболеваниях человека // Тер, архив. 1994. - №2. - с. 63-66.
6. Лавруков A.M.; Базарный В.В.; Зыкина О.В.; Плахин Е.В. Патент RU 2145086. Способ оценки состояния травматологического больного. 27.01.2000.
7. Левин И. Русанов В.М. Лечебные препараты крови. - М.: Медпрактика, 2004. - 283 с.
8. Литвинов Р.И. Фибронектин плазмы. // Казанский медицинский журнал.
1984, №3. - с. 203-212.
9. Логинов С.П. и др. Криопреципитированная аутоплазма и использование продуктов криопреципитации для проведения плазмафереза. Московский медицинский журнал. - 2000, №2, с. 22-24.
10. Лозовой В.П., Петрова Е.М., Казначеева В.П. Определение активности ревматизма и инфектартрита путем исследований гепариносаждаемой фракции плазмы крови.
Вестник ревматологии. 1969. №4, с. 22-23.
11. Назаров П.Г. Реактанты острой фазы воспаления. - СПб: Наука, 2001. - 423 с.
12. А.В. Ямкин. О.В. Строган, Л.Н. Никитина, Н.А. Семенова, Л.А. Епанчинцев. Способ получения и свойства препарата VIII фактора свертываня плазмы крови человека. / Сибирский медицинский журнал №2, 2009, вып. 2, стр 17-19.
13. Burnouf Т Modern plasma fractionation // Transfus Med Rev. - 2007. - Vol. 21 (2). - P. 101-117.
14. Levo J. Nature of cryoglobulinemia. // The Lancet. 1980. V. 1, N 8163, P. 285-287.
15. SPEYER J. et al. Amelioration of chemotherapy induced cardiotoxicity. Seminars in Oncology. Vol. 25, №4, Suppl. 101SSN, №0093-7754.