КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА И СОЛЕВАЯ ФОРМА ИНГИБИТОРА TGF-βRI И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ
CRYSTALLINE AND SALT FORMS OF THE TGF-βR1 INHIBITOR AND THE METHOD OF OBTAINING THEM

[1]
Настоящая заявка испрашивает право на приоритет относительно следующей заявки:
[2]
CN 201711331447.7, дата подачи: 13 декабря 2017.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[3]
Настоящее изобретение относится к кристаллической форме и солевой форме ингибитора TGF-βRI и способу их получения и дополнительно включает применение кристаллической формы и солевой формы при получении лекарственного средства для лечения рака.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[4]
Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) представляет собой многофункциональное суперсемейство факторов роста с широким спектром биологических активностей, включая раннее эмбриональное развитие, образование хрящей и костей, синтез внеклеточного матрикса, воспаление, интерстициальный фиброз, регуляцию иммунитета и эндокринные функции, а также образование и развитие опухоли.
[5]
Суперсемейство TGF-β состоит из класса структурно и функционально близких полипептидных факторов роста, включая TGF-β (т.е. TGF-β в узком смысле), активины, ингибиторы и костные морфогенетические белки (BMP) (т.е. муллериан), где TGF-β является одним из важных членов этого семейства. У млекопитающих TGF-β в основном существует в трех формах: TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3, которые расположены на разных хромосомах, среди которых TGF-β1 составляет наибольшую долю (>90%) в соматических клетках и обладает самой сильной активностью, большинством функций и наиболее широким распространением. Вновь синтезированный TGF-β возникает как неактивный предшественник, который состоит из трех частей: сигнального пептида, латентно-ассоциированного полипептида (LAP) и зрелого TGF-β. После ферментативного гидролиза образуется активный TGF-β, который затем связывается со своим рецептором для оказания биологического эффекта.
[6]
Сигнальные молекулы TGF-β осуществляют передачу сигнала через трансмембранный рецепторный комплекс. TGF-β рецепторы представляют собой трансмембранные белки, которые находятся на поверхности клеток. Они подразделяются на рецепторы типа I (TGF-βRI), рецепторы типа II (TGF-βRII) и рецепторы типа III (TGF-βRIII), где TGF-βRI также называют киназой, подобной рецептору активина, 5 (ALK5). TGF-βRIII не обладает внутренней активностью, что в основном связано с накоплением TGF-β. TGF-βRI и TGF-βRII принадлежат к семейству серин/треонин киназ. Рецепторы типа II могут связываться с TGF-β-лигандами с более высокой аффинностью и образовывать гетерологичные рецепторные комплексы с рецепторами типа I. Область, богатая глициновыми и сериновыми остатками рецепторов типа I (домен GS) вблизи мембраны, фосфорилируется для инициирования внутриклеточных сигнальных каскадных реакций.
[7]
Smads является важной молекулой для передачи и регуляции сигнала TGF-β в клетке, которая может напрямую передавать сигнал TGF-β от клеточной мембраны в ядро клетки. Сигнальный путь TGF-β/Smads играет важную роль в возникновении и развитии опухолей. При передаче сигнала TGF-β/Smads активированный TGF-β сначала связывается с TGF-βRII на поверхности клеточной мембраны с образованием гетеродимерного комплекса, а TGF-βRI распознает и связывается с бинарным комплексом.
[8]
TGF-βRII фосфорилирует серин/треонин в GS-домене цитоплазматической области TGF-βRI, тем самым активируя TGF-βRI; активированный TGF-βRI впоследствии фосфорилирует белок R-Smads (Smad2/Smad3), который затем связывается с Co-Smad (Smad4), образуя гетеротримерный комплекс, где комплекс входит в ядро и взаимодействует с другими коактиваторами и коингибиторами для того, чтобы регулировать транскрипцию генов-мишеней. Изменения в любой части пути передачи сигналов TGF-β/Smads приведут к отклонениям в пути передачи сигналов.
[9]
Современные исследования показывают, что в опухолевых клетках TGF-β может непосредственно влиять на рост опухоли (внешние эффекты передачи сигналов TGF-β) или может косвенно влиять на рост опухоли (внутренние эффекты TGF-β), индуцируя эпителиально-мезенхимальную трансдифференциацию, блокирование противоопухолевых иммунных реакций, увеличение фиброза, связанного с опухолью, и усиление регенерации сосудов. Кроме того, TGF-β обладает сильным эффектом индукции фиброза и является активатором фибробластов, связанных с опухолями. Эти фибробласты являются основным источником коллагена типа I и других фиброзных факторов. Индуцированные продукты фибробластов и других фиброзных факторов могут продолжать создавать микроокружение, в котором снижается иммунный ответ, повышается резистентность к лекарствам и усиливается ангиогенез опухоли. Кроме того, TGF-β влияет на ангиогенез во время индивидуального развития и роста опухоли. Например, TGF-βRI-дефицитные мышиные эмбрионы показали серьезные дефекты развития сосудов, доказывая то, что сигнальный путь TGF-β является ключевым регулятором в развитии эндотелия сосудов и клеток гладких мышц.
[10]
В 2013 году FDA одобрило низкомолекулярный ингибитор TGF-βRI LY2157299 (WO 2002/094833) от Eli Lilly для лечения глиомы и рака печени. LY2157299 представляет собой находящийся в разработке препарат для лечения редких заболеваний под названием Галунисертиб. Галунисертиб может не только ингибировать инвазию и метастазирование опухолевых клеток, но также ингибировать инфильтрацию опухолевых клеток в кровеносные сосуды. В фазе 2 клинических испытаний для лечения пациентов с раком печени после лечения Галунисертибом примерно у 23% пациентов было отмечено снижение уровней альфа-фетопротеина (АФП) в сыворотке по меньшей мере на 20%. По сравнению с пациентами, которые не отвечали на АФП, у этих пациентов наблюдалось более медленное прогрессирование опухоли и более длительный период выживаемости, а также повышенная экспрессия кадгерина в эпителиальных клетках, что указывает на то, что Галунисертиб может регулировать ENT путем ингибирования пути передачи сигналов TGF-β, подавляя тем самым прогрессирование рака печени.
[11]
Структура Галунисертиба (LY2157299) является такой, как показано в формуле (III):
[12]
В дополнение к терапевтической эффективности, разработчики лекарств предпринимают попытки обеспечить подходящие формы активных молекул с фармацевтическими свойствами, причем свойства включают обработку, производство, стабильность при хранении и т.д. Таким образом, было обнаружено, что для разработки лекарств необходимы формы с желаемыми свойствами.
Содержание настоящего изобретения
[13]
Настоящее изобретение предусматривает кристаллическую форму А соединения формулы (I), характеризующуюся тем, что ее порошковая дифракционная рентгенограмма имеет характерные дифракционные пики при следующих углах 2θ: 11,894°±0,2°, 17,502°±0,2°, 19,785°±0,2°, 24,072°±0,2° и 24,664°±0,2°.
[14]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения порошковая дифракционная рентгенограмма (ПДР) вышеупомянутой кристаллической формы A имеет характерные дифракционные пики при следующих углах 2θ: 9,553°±0,2°, 11,894°±0,2°, 15,370°±0,2°, 17,502°±0,2°, 19,785°±0,2°, 20,283°±0,2°, 24,072°±0,2° и 24,664°±0,2°.
[15]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения порошковая дифракционная рентгенограмма вышеупомянутой кристаллической формы A является такой, как показано на фиг. 1.
[16]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения данные анализа ПДР вышеупомянутой кристаллической формы A являются такими, как показано в таблице 1.
Таблица 1
Серийный номер
Угол 2θ (°)
Межплоскостное расстояние <img file="00000003.jpg" he="6" wi="6" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Относительная интенсивность (%)
Серийный номер
Угол 2θ (°)
Межплоскостное расстояние <img file="00000003.jpg" he="6" wi="6" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Относительная интенсивность (%)
1
8,799
10,0419
3,6
22
24,072
3,6939
22,7
2
9,553
9,2500
12,4
23
24,664
3,6066
33,2
3
11,894
7,4343
27,4
24
25,552
3,4832
1,1
4
12,727
6,9499
5,5
25
26,119
3,4089
3,2
5
13,121
6,7421
8,5
26
26,361
3,3781
8,4
6
14,024
6,3099
3,2
27
27,756
3,2114
7,4
7
15,370
5,7600
15,2
28
28,447
3,1350
0,5
8
16,155
5,4819
1,3
29
28,864
3,0907
2,2
9
16,850
5,2573
7,6
30
29,285
3,0471
0,8
10
17,502
5,0628
59,1
31
30,186
2,9582
2,9
11
19,132
4,6351
6,7
32
30,442
2,9339
1,5
12
19,785
4,4837
100
33
31,119
2,8716
1,8
13
20,027
4,4299
7,3
34
31,565
2,8320
5,2
14
20,283
4,3746
17,1
35
32,298
2,7694
3,4
15
20,742
4,2789
0,8
36
33,616
2,6638
2
16
20,992
4,2285
7,7
37
35,382
2,5348
2,5
17
21,366
4,1553
1,4
38
36,32
2,4714
3,4
18
22,376
3,9700
1,4
39
36,952
2,4306
0,9
19
23,099
3,8472
3
40
39,143
2,2994
1
20
23,437
3,7925
7
41
39,484
2,2804
1,3
21
23,850
3,7278
2,1
[17]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вышеупомянутая кристаллическая форма A также может характеризоваться с помощью ДСК с начальной температурой 266,07°С и пиковой температурой 271,79°С.
[18]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения профиль дифференциальной сканирующей калориметрии вышеупомянутой кристаллической формы A имеет эндотермический пик при 271,79±3°С.
[19]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения диаграмма профиля дифференциальной сканирующей калориметрии вышеупомянутой кристаллической формы A является такой, как показано на фиг. 2.
[20]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вышеупомянутая кристаллическая форма A также может характеризоваться с помощью ТГА, где диаграмма ТГА показывает, что когда кристаллическая форма нагревается до 110,82°С, масса уменьшается на 0,1075%; при нагревании до 229,08°С масса дополнительно уменьшается на 0,9974%; происходит большая потеря массы после 229,08°С.
[21]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения профиль термогравиметрического анализа вышеупомянутой кристаллической формы A показывает 0,1075% потери массы при 110,82±3°С и 1,105% потери массы при 229,08±3°С.
[22]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения диаграмма профиля термогравиметрического анализа вышеупомянутой кристаллической формы A является такой, как показано на фиг. 3.
[23]
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает соединение формулы (II).
[24]
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает кристаллическую форму B соединения формулы (II), характеризующуюся тем, что ее порошковая дифракционная рентгенограмма имеет характерные дифракционные пики при следующих углах 2θ: 13,349±0,2°, 19,012±0,2°, 20,235±0,2° и 23,370±0,2°.
[25]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения порошковая дифракционная рентгенограмма вышеупомянутой кристаллической формы B имеет характерные дифракционные пики при следующих углах 2θ: 13,349±0,2°, 15,066±0,2°, 16,782±0,2°, 19,012±0,2°, 20,235±0,2°, 22,027±0,2°, 23,370±0,2° и 27,253±0,2°.
[26]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения порошковая дифракционная рентгенограмма вышеупомянутой кристаллической формы B является такой, как показано на фиг. 4.
[27]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения данные анализа ПДР вышеупомянутой кристаллической формы B являются такими, как показано в таблице 2.
Таблица 2
Серийный номер
Угол 2θ (°)
Межплоскостное расстояние <img file="00000003.jpg" he="6" wi="6" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Относительная интенсивность (%)
Серийный номер
Угол 2θ (°)
Межплоскостное расстояние <img file="00000003.jpg" he="6" wi="6" img-content="undefined" img-format="jpg" />
Относительная интенсивность (%)
1
9,469
9,3321
13,6
16
24,984
3,5612
22,2
2
13,349
6,6271
89,7
17
25,442
3,498
34,9
3
13,568
6,5209
20,7
18
26,843
3,3186
34,5
4
14,219
6,2235
21,1
19
27,253
3,2696
37,9
5
14,512
6,0986
23,2
20
27,905
3,1946
12
6
15,066
5,8758
71,9
21
28,639
3,1144
16,5
7
15,339
5,7719
68,9
22
30,745
2,9057
14,8
8
16,029
5,5247
19,2
23
31,895
2,8035
9,1
9
16,782
5,2784
37,3
24
33,883
2,6434
6,7
10
19,012
4,6642
93,6
25
34,373
2,6068
5
11
20,235
4,3849
100
26
34,831
2,5736
7,6
12
21,669
4,0978
34
27
36,765
2,4426
5,8
13
22,027
4,032
58,8
28
37,057
2,424
4,2
14
22,229
3,9959
28,6
29
38,061
2,3623
7,7
15
23,370
3,8033
81,3
30
38,576
2,332
9,3
[28]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вышеупомянутая кристаллическая форма B также может характеризоваться с помощью ДСК, которая имеет эндотермический пик при 234,43±3°С.
[29]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения профиль дифференциальной сканирующей калориметрии вышеупомянутой кристаллической формы B имеет эндотермический пик при 234,43±3°С.
[30]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения диаграмма профиля дифференциальной сканирующей калориметрии вышеупомянутой кристаллической формы B является такой, как показано на фиг. 5.
[31]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вышеупомянутая кристаллическая B также может характеризоваться с помощью ТГА, где диаграмма ТГА показывает, что когда кристаллическая форма нагревается до 120°С, масса уменьшается на 0,3043%; при нагревании до 238,46°С масса дополнительно уменьшается на 1,295%.
[32]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения профиль термогравиметрического анализа вышеупомянутой кристаллической формы B показывает 0,3043% потери массы при 120±3°С и 1,599% потери массы при 238,46±3°С.
[33]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения диаграмма профиля термогравиметрического анализа вышеупомянутой кристаллической формы B является такой, как показано на фиг. 6.
[34]
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает гидрохлорид, сульфат и метансульфонат соединения формулы (I).
[35]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вышеупомянутый гидрохлорид представляет собой
.
[36]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вышеупомянутый сульфат представляет собой
.
[37]
В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения вышеупомянутый метансульфонат представляет собой
.
[38]
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение вышеупомянутых соединений или кристаллических форм при получении лекарственного средства для лечения рака.
[39] Технологические эффекты
[40]
Способ получения солевой формы и кристаллической формы, предлагаемый в настоящем изобретении, является простым; кроме того, кристаллическая форма стабильна в условиях высокой температуры и высокой влажности и является слегка гигроскопичной, а солевая форма имеет хорошую растворимость в чистой воде и биологическом носителе и имеет хорошие перспективы в изготовлении.
[41] Определения и описание
[42]
Если не указано иное, следующие термины и фразы, используемые в данном документе, предполагают следующие значения. Конкретную фразу или термин не следует считать неопределенными или неясными, если они специально не оговорены, их следует понимать в обычном смысле. Когда торговое наименование упоминается в данном документе, оно предназначено для обозначения соответствующего товара или его активного ингредиента.
[43]
Промежуточные соединения по настоящему изобретению могут быть получены различными синтетическими способами, хорошо известными специалисту в данной области техники, включая конкретные варианты воплощения, перечисленные ниже, варианты воплощения, образованные комбинацией с другими способами химического синтеза, и эквивалентные альтернативные варианты воплощения, хорошо известные специалисту в данной области техники, причем предпочтительные варианты воплощения включают, но не ограничиваются ими, примеры настоящего изобретения.
[44]
Химические реакции, описанные в конкретных вариантах воплощения настоящего изобретения, проводятся в подходящем растворителе, причем этот растворитель должен быть подходящим для химических изменений по настоящему изобретению и для требуемых для этого реагентов и материалов. Чтобы получить соединения по настоящему изобретению, специалисту в данной области техники иногда необходимо модифицировать или выбирать стадии синтеза или схемы реакций на основе существующих вариантов воплощения.
[45]
Настоящее изобретение будет конкретно описано ниже посредством примеров, которые никоим образом не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
[46]
Все растворители, используемые в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными и могут использоваться без дальнейшей очистки.
[47]
экв.
N,N
N
3
2
3
2
3
3
2
4
2
2
2
4
В настоящем изобретении используются следующие сокращения: к.т. обозначает комнатную температуру; в.р. обозначает водный раствор;  обозначает эквивалент; ДХМ обозначает дихлорметан; ТГФ обозначает тетрагидрофуран; ДМСО обозначает диметилсульфоксид; ДМФА обозначает -диметилформамид; EtOAc обозначает этилацетат; EtOH обозначает этанол; MeOH обозначает метанол; диоксан обозначает диоксан; HOAc обозначает уксусную кислоту; DIPEA обозначает диизопропилэтиламин; TEA или EtN обозначает триэтиламин; NaCOобозначает карбонат натрия; KCO обозначает карбонат калия; NaHCO обозначает бикарбонат натрия; NaSO обозначает сульфат натрия; NaOH обозначает гидроксид натрия; LiHMDS обозначает литий-бис(триметилсилил)амин; Pd(dppf)Cl обозначает [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]палладий дихлорид; Xphos обозначает 2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропилбифенил; Xphos-PD-G обозначает хлор(2-дициклогексилфосфино-2',4',6'-триизопропил-1,1'-бифенил) [2-(2'-амино-1,1'-бифенил)палладий (II); NBS обозначает -бромсукцинимид; HCl обозначает соляную кислоту; HSO обозначает серную кислоту; °С обозначает градус Цельсия.
[48]
Соединения названы заявителем или программным обеспечением ChemDraw, а коммерчески доступные соединения названы именами в каталоге поставщика.
[49] Приборы и способы анализа
[50]
В настоящем изобретении порошковый рентгеновский дифрактометр (ПДР) определяется с использованием следующего способа:
[51]
модель прибора: рентгеновский дифрактометр Bruker D8 advance;
[52]
способ тестирования: приблизительно 10 - 20 мг образца используется для ПДР детекции.
[53]
Подробные параметры ПДР следующие:
[54]
Рентгеновская трубка: Cu, kα, (λ=1,54056);
[55]
вольтаж трубки: 40 кВ, ток в трубке: 40 мА;
[56]
щель расходимости: 0,60 мм;
[57]
щель детектора: 10,50 мм;
[58]
антирассеивающая щель: 7,10 мм;
[59]
диапазон сканирования: 3-40 град или 4-40 град;
[60]
размер шага: 0,02 град;
[61]
длина шага: 0,12 с;
[62]
скорость вращения диска образцов: 15 об/мин.
[63]
В настоящем изобретении дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) определяется с использованием следующего способа:
[64]
модель прибора: дифференциальный сканирующий калориметр TA Q2000.
[65]
Способ тестирования: поместить около 1 мг образца в алюминиевый поддон для тестирования ДСК; в условиях 50 мл/мин азота, нагреть образец от 30°С (комнатная температура) до 300°С (или 350°С) со скоростью нагрева 10 °С/мин.
[66]
В настоящем изобретении термогравиметрический анализатор (ТГА) определяют с использованием следующего способа:
[67]
модель прибора: термогравиметрический анализатор TA Q5000.
[68]
2
Способ тестирования: поместить 2-5 мг образца в платиновую чашку для тестирования ТГА; при условии 25 мл/мин N, нагревать образец от комнатной температуры до 300°С или до 20% потери массы при скорости нагрева 10°С/мин.
[69]
В настоящем изобретении динамическая сорбция паров (DVS) определяется с использованием следующего способа:
[70]
модель прибора: прибор динамической сорбции паров SMS DVS Advantage
[71]
Условия тестирования: поместить 10-15 мг образца в диск с образцами для тестирования DVS.
[72]
Подробные параметры DVS следующие:
[73]
температура: 25°С
[74]
баланс: dm/dt=0,01%/мин (минимум: 10 мин; максимум: 180 мин)
[75]
сушка: сушить в течение 120 мин при 0% RH
[76]
RH (%) этапа тестирования: 10%
[77]
диапазон RH (%) этапа тестирования: 0%-90%-0%
[78]
Классификация оценки гигроскопичности выглядит следующим образом:
Классификация гигроскопичности
Гигроскопическое увеличение веса *
Поглощение влаги из воздуха
Впитывание достаточного количества влаги для формирования жидкости
Крайне гигроскопичный
δW% ≥ 15%
Гигроскопичный
15% >δW% ≥ 2%
Слегка гигроскопичный
2% >δW% ≥ 0,2%
Не или почти не гигроскопичный
δW% < 0,2%
[79]
* Гигроскопическое увеличение веса (δW%) при 25±1°С и 80%±2% RH
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[80]
Фиг. 1 представляет собой ПДР кристаллической формы А соединения формулы (I).
[81]
Фиг. 2 представляет собой диаграмму ДСК кристаллической формы А соединения формулы (I).
[82]
Фиг. 3 представляет собой диаграмму ТГА кристаллической формы А соединения формулы (I).
[83]
Фиг. 4 представляет собой ПДР кристаллической формы B соединения формулы (II).
[84]
Фиг. 5 представляет собой диаграмму ДСК кристаллической формы B соединения формулы (II).
[85]
Фиг. 6 представляет собой диаграмму ТГА кристаллической формы B соединения формулы (II).
[86]
Фиг. 7 представляет собой диаграмму DVS кристаллической формы B соединения формулы (II).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ВОПЛОЩЕНИЯ
[87]
Чтобы лучше понять содержание настоящего изобретения, следующие конкретные примеры используются для дальнейшего описания, но конкретные варианты воплощения не ограничивают содержание настоящего изобретения.
[88] Пример 1. Получение соединения формулы (I).
[89] Приготовление промежуточных продуктов 1-6:
[90]
1-1
1-2
Этап A: Этилацетат (291,41 мл, 2,98 моль) растворяли в толуоле (750,00 мл) и затем порциями при комнатной температуре добавляли этоксид натрия (135,06 г, 1,98 моль) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа.  (150,00 г, 992,33 ммоль) добавляли к вышеупомянутому реакционному раствору при 25°C, а затем нагревали до 95°C и перемешивали в течение 15 часов. Реакционную смесь охлаждали до около 30°С, доводили до рН 7 уксусной кислотой, разбавляли водой (500 мл) и затем экстрагировали этилацетатом (500 мл). Органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с силикагелем (элюент : петролейный эфир/этилацетат об/об = 50/1) с получением .
[91]
1-2
1-3
Этап B: (120,00 г, 579,07 ммоль) растворяли в пиридине (300 мл) и затем добавляли p-толуолсульфонатную соль (172,01 г, 631,66 ммоль) 1-аминопирролидин-2-она. Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 16 часов и затем концентрировали при пониженном давлении для удаления растворителя. Остаток разбавляли водой (300 мл) и затем экстрагировали этилацетатом (300 мл × 2). Объединенную органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении, с получением .
[92]
1-3
1-4
Этап C: (155,00 г, 535,72 ммоль) растворяли в толуоле и затем к нему добавляли этоксид натрия (72,91 г, 1,07 моль). Реакционную смесь нагревали до 100°С и перемешивали в течение 16 часов, а затем охлаждали до комнатной температуры. Реакционную смесь медленно разбавляли водой (1,5 л), доводили до рН 4 концентрированной соляной кислотой и экстрагировали смесью дихлорметан/изопропанол (об./об. = 10/1, 1 л × 7). Объединенную органическую фазу сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток суспендировали с петролейным эфиром/этилацетатом (об./об. = 10/1, 200 мл) и фильтровали, а твердое вещество собирали. Твердое вещество сушили при пониженном давлении, с получением .
[93]
1-4
1-5
N,N
Этап D: (45,00 г, 184,99 ммоль) растворяли в -диметилформамиде (650,00 мл), а затем к нему добавляли NBS (49,09 г, 258,99 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 30°С-40°С в течение 60 часов, а затем разбавляли водой (600 мл) и экстрагировали дихлорметаном/изопропанолом (об./об. = 10/1, 500 мл × 3). Объединенную органическую фазу промывали один раз гидроксидом натрия (0,5 моль/л, 800 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Полученное твердое вещество суспендировали с петролейным эфиром/этилацетатом (об./об. = 10/1, 200 мл) и фильтровали, а твердое вещество собирали. Твердое вещество сушили при пониженном давлении, с получением .
[94]
1-5
1-6
Этап E:  (1,00 г, 3,60 ммоль) и триизопропилборат (1,79 г, 9,54 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (20,00 мл). Реакционную смесь охлаждали до минус 70°С и затем по каплям добавляли n-бутиллитий (2,5 М, 3,74 мл). После завершения добавления по каплям реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 1 часа и затем доводили до рН 7 водной соляной кислотой (0,5 моль/л). Затем реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для удаления тетрагидрофурана и затем охлаждали до 15°С. Смесь фильтровали и осадок на фильтре суспендировали в петролейном эфире/этилацетате (об./об. = 10/1, 5,5 мл) и фильтровали, а твердое вещество собирали, которое сушили при пониженном давлении, получая .
[95] Получение соединения формулы (I):
[96]
1-7
1-8
H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6)
N,N
J
J
1
Этап A: (16,00 г, 65,30 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (800,00 мл) и после охлаждения до минус 60°С - минус 70°С к нему по каплям добавляли гексаметилдисилазид лития (1 моль/л, 130,60 мл, 65,30 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при минус 60°С - минус 70°С в течение 15 минут и к ней добавляли -диметилформамид (14,32 г, 195,90 ммоль, 15,07 мл). Затем реакционную смесь непрерывно перемешивали при минус 60°С - минус 70°С в течение 15 минут и затем гасили насыщенным водным раствором хлорида аммония (500 мл). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и затем экстрагировали этилацетатом (500 мл × 2). Объединенную органическую фазу промывали солевым раствором (500 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с силикагелем (элюент: дихлорметан/этилацетат об./об. = 10/1) с получением . δ 10,46 (s, 1H), 8,62 (s, 1H), 8,16 (d, =9,3 Гц, 1H), 7,88 (d, =9,3 Гц, 1H).
[97]
1-8
1-9
H ЯМР (400 МГц, CDCl
)
1
3
J=
J
Этап B: В трехгорлую колбу на 500 мл, снабженную термометром и баллоном с азотом, добавляли 2-диэтоксифосфорилацетонитрил (3,83 г, 21,61 ммоль, 3,48 мл) и тетрагидрофуран (80 мл). Смесь охлаждали до 0°C и затем порциями добавляли трет-бутоксид калия (2,42 г, 21,61 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 15 минут и затем добавляли по каплям к другой суспензии (, диспергировали в тетрагидрофуране (120 мл) и охлаждали до 0°С) через капельную воронку. Реакционную смесь перемешивали при 0°С в течение 15 минут, а затем вливали в воду (300 мл), гасили и экстрагировали этилацетатом (200 мл) и дихлорметаном (200 мл × 2). Объединенную органическую фазу промывали солевым раствором (300 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с силикагелем (элюент: дихлорметан/этилацетат об./об. = 200/1 до 10/1) с получением . δ 8,42 (s, 1H), 8,03 (d, 9,3 Гц, 1H), 7,98-7,91 (m, 1H), 7,85-7,78 (m, 1H), 7,60 (d, =9,2 Гц, 1H).
[98]
1-9
1-6
1-10
H ЯМР (400 МГц, CDCl
)
1
3
J=
J
Этап C: (4,50 г, 15,20 ммоль),  (4,43 г, 18,24 ммоль), карбонат натрия (4,83 г, 45,60 ммоль), [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]палладий дихлорид (556,07 мг, 759,96 мкмоль), 2-дициклогексилфосфино-2',6'-диметоксибифенил (311,98 мг, 759,96 мкмоль) и [2-(2-аминофенил)фенил]-хлор-палладий-циклогексил-[2-(2,6-диметоксифенил)фенил]фосфин (547,64 мг, 759,96 мкмоль) добавляли к смешанному растворителю из диоксана (100 мл) и воды (20 мл). Смесь трижды вентилировали азотом, затем нагревали до 90°С - 100°С и перемешивали в течение 2 часов. Реакционную смесь вливали в воду (200 мл), гасили и экстрагировали дихлорметаном (200 мл × 2). Объединенную органическую фазу промывали солевым раствором (200 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали на колонке с силикагелем (элюент: дихлорметан/метанол, об./об. = 30/1) для получения сырого продукта, который перемешивали в течение 12 часов в смешанном растворителе петролейного эфира/этилацетата (об./об. = 5/1) и отфильтровывали, а твердое вещество собирали, концентрировали и сушили при пониженном давлении, чтобы получить . δ 8,49 (s, 1H), 7,82-7,74 (m, 2H), 7,59-7,46 (m, 4H), 6,99 (dd, 2,6, 6,1 Гц, 1H), 4,39 (d, =6,3 Гц, 2H), 2,90-2,70 (m, 4H), 2,20 (s, 3H).
[99]
1-10
H ЯМР (400 МГц, CDCl
)
1
3
J
J
J
J
J
Этап D:  (5,37 г, 14,62 ммоль) растворяли в смешанном растворителе из дихлорметана (20 мл), диметилсульфоксида (70 мл) и воды (20 мл), а затем перекиси водорода (8,29 г, 73,10 ммоль, 7,02 мл, 30%) и гидроксид натрия (2 моль/л, 14,62 мл) соответственно. Смесь перемешивали при 15°С -20°С в течение 12 часов. Смесь вливали в воду (200 мл), гасили и экстрагировали смешанным растворителем дихлорметана/изопропанола (3/1) (200 мл × 1). Органическую фазу промывали насыщенным водным раствором (200 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографией (колонка: Phenomenex Gemini C18 250×50 мм×10 мкм; мобильная фаза: [вода (0,05% аммиака по объему)-ацетонитрила]; градиент: 5% -32%, 33; 80% минут), чтобы получить соединение формулы (I). δ 8,45 (s, 1H), 8,09 (d, =15,6 Гц, 1H), 7,85 (d, =15,6 Гц, 1H), 7,69 (d, =9,2 Гц, 1H), 7,55-7,45 (m, 2H), 7,37 (d, =7,8 Гц, 1H), 6,99 (d, =7,7 Гц, 1H), 5,93-5,65 (m, 2H), 4,35 (br. s., 2H), 2,99-2,64 (m, 4H), 2,33 (s, 3H).
[100] Пример 2. Получение соединения формулы (II).
[101]
H ЯМР (400 МГц, CD
OD)
1
3
J=
J=
J=
J=
J=
J=
J=
115 мг соединения формулы (I) добавляли в стеклянную бутылку объемом 8 мл и добавляли к нему 4 мл тетрагидрофурана, которые образовывали суспензию путем растворения с помощью ультразвука; и затем медленно добавляли 1,05 эквивалента моногидрата p-толуолсульфоновой кислоты. Вышеупомянутый суспендированный образец помещали на магнитную мешалку (40°С) и перемешивали в течение 16 часов. Раствор образца центрифугировали, твердое вещество отбирали и помещали в вакуумную печь при 35°С для сушки на 16 часов, получая соединение формулы (II). δ 8,61 (s, 1H), 8,14 (t, 8,0 Гц, 1H), 8,05 (d, 15,6 Гц, 1H), 7,90 (d, 8,8 Гц, 1H), 7,70 (dd, 8,4, 15,6 Гц, 4H), 7,54 (d, 15,6 Гц, 1H), 7,39 (d, 8,0 Гц, 1H), 7,20 (d, 7,6 Гц, 2H), 4,42 (m, 2H), 3,05-2,87 (m, 2H), 2,82 (s, 3H), 2,81-2,74 (m, 2H), 2,35 (s, 3H).
[102] Пример 3. Получение соединения формулы (IV).
[103]
115 мг соединения формулы (I) добавляли в стеклянную бутылку объемом 8 мл и добавляли к нему 4 мл тетрагидрофурана, которые образовывали суспензию путем растворения с помощью ультразвука; и затем медленно добавляли 1,05 эквивалента соляной кислоты. Вышеупомянутый суспендированный образец помещали на магнитную мешалку (40°С) и перемешивали в течение 16 часов. Раствор образца центрифугировали, твердое вещество отбирали и помещали в вакуумную печь при 35°С для сушки на 16 часов. Полученное твердое вещество добавляли к соответствующему количеству ацетона для приготовления суспензии, перемешивали при 40°C и затем центрифугировали для удаления супернатанта, а твердый образец сушили с помощью масляного насоса при комнатной температуре для получения соединения формулы (IV).
[104] Пример 4. Получение соединения формулы (V).
[105]
115 мг соединения формулы (I) добавляли в стеклянную бутылку объемом 8 мл и добавляли туда 4 мл тетрагидрофурана, которые образовывали суспензию путем растворения с помощью ультразвука; и затем медленно добавляли 1,05 эквивалента серной кислоты. Вышеупомянутый суспендированный образец помещали на магнитную мешалку (40°С) и перемешивали в течение 16 часов. Раствор образца центрифугировали, твердое вещество отбирали и помещали в вакуумную печь при 35°С для сушки на 16 часов, получая соединение формулы (V).
[106] Пример 5. Получение соединения формулы (VI).
[107]
115 мг соединения формулы (I) добавляли в стеклянную бутылку объемом 8 мл и добавляли туда 4 мл тетрагидрофурана, которые образовывали суспензию путем растворения с помощью ультразвука; и затем медленно добавляли 1,05 эквивалента метансульфоновой кислоты. Вышеупомянутый суспендированный образец помещали на магнитную мешалку (40°С) и перемешивали в течение 16 часов. Раствор образца центрифугировали, твердое вещество отбирали и помещали в вакуумную печь при 35°С для сушки на 16 часов, получая соединение формулы (VI).
[108] Пример 6. Получение кристаллической формы А соединения формулы (I).
[109]
10 г соединения формулы (I) отбирали и помещали в смешанный растворитель этанола (80 мл) и воды (40 мл), нагревали до 70°С-75°С и перемешивали до прозрачности, а затем фильтровали в горячем состоянии; фильтрат перегоняли при пониженном давлении до тех пор, пока объем оставшегося раствора не составлял около 50 мл, а затем охлаждали и оставляли стоять для кристаллизации и фильтровали; полученный осадок на фильтре сушили при пониженном давлении, и полученное из него твердое вещество представляло собой кристаллическую форму А соединения формулы (I).
[110] Пример 7. Получение кристаллической формы B соединения формулы (II).
[111]
192 мг соединения формулы (I) взвешивали и добавляли в стеклянную бутылку. Добавляли 10 мл смешанного растворителя тетрагидрофурана: уксусная кислота (об./об. = 9/1), а после 30 минут солюбилизации с помощью ультразвука образец растворяли в прозрачном растворе. Раствор помещали на магнитную мешалку (40°С) и перемешивали. После медленного добавления 1,05 эквивалента моногидрата p-толуолсульфоновой кислоты образец перемешивали в течение ночи. После естественного охлаждения до комнатной температуры супернатант удаляли центрифугированием; 10 мл тетрагидрофурана добавляли и перемешивали в течение получаса, а затем супернатант снова удаляли центрифугированием; этот процесс был повторен дважды. Полученное твердое вещество помещали в вакуумную печь при 40°C для сушки в течение 1 часа и дополнительно сушили в вакуумной печи при 30°C в течение 16 часов после дробления, получая кристаллическую форму B соединения формулы (II).
[112] Пример 8. Протокол скрининга активности связывания рецептора TGF
-RI
in vitro
.
β
[113] 1. Экспериментальный способ:
[114]
50
1) Соединение для тестирования: IC определяли способом из 10 точек градиента с каждым трехкратным разведением, и начальная концентрация составляла 5 мкМ.
[115]
2) Реакционная система содержала 10 мкМ АТФ.
[116]
50
3) Когда процентная доля активности фермента в образце при самой высокой концентрации (по сравнению с группой растворителей) составляла менее 65%, для расчета значения IC проводили аппроксимацию кривой.
[117] 2. Результаты экспериментов показаны в таблице ниже:
Образец
TGF-βRI IC<sub>50 </sub>(нМ)
LY2157299
208
Соединение формулы (I)
40
[118]
Вывод: Активность ингибирования TGF-βRI соединения формулы (I) лучше, чем активность LY2157299 в тех же экспериментальных условиях, что описаны выше.
[119] Пример 9. Исследование растворимости различных типов солей соединения формулы (I) в биологическом носителе
[120]
1 мл раствора биологического носителя (FaSSIF, FeSSIF и SGF) пипетировали соответственно в стеклянную бутылку объемом 1,5 мл и затем добавляли к вышеупомянутому раствору с градиентом 2 мг до 10 мг или смесь была насыщенной. Смесь готовили в 2-х частях параллельно, а затем встряхивали при 37°С. Образцы отбирали через 4 и 24 часа соответственно. Отобранные образцы быстро центрифугировали, а надосадочную жидкость измеряли на оценки рН и разбавляли разбавителем до подходящего кратного значения и затем определяли концентрацию с помощью ВЭЖХ. Результаты тестирований приведены в Таблице 3 ниже.
Таблица 3 Растворимость различных типов солей соединения формулы (I) в биологическом носителе
Условие
Состояние и значение pH
Концентрация (мг/мл)
4 часа
4 часа
24 часа
24 часа
4 часа
24 часа
Соединение формулы (I)(свободное основание)
SGF
растворимое
2,37
растворимое
2,43
1,997
1,994
FeSSIF
мутное
4,97
мутное
4,95
0,565
0,637
FaSSIF
мутное
6,45
мутное
6,42
0,352
0,421
Гидрохлорид
SGF
растворимое
2,04
растворимое
2,05
4,343
4,427
FeSSIF
мутное
4,52
мутное
4,52
1,028
1,065
FaSSIF
растворимое
3,96
растворимое
3,97
4,378
4,195
Сульфат
SGF
растворимое
1,77
растворимое
1,84
4,885
4,952
FeSSIF
мутное
4,22
мутное
4,21
1,530
1,504
FaSSIF
растворимое
2,44
растворимое
2,50
4,998
5,000
Метансульфонат
SGF
растворимое
2,08
растворимое
2,14
5,103
5,163
FeSSIF
мутное
4,58
мутное
4,60
0,852
0,925
FaSSIF
растворимое
4,16
мутное
3,71
5,159
3,704
Соединение формулы (II)(п-толуолсульфонат)
SGF
Суспензия
3,45
Суспензия
4,26
1,61
1,47
FeSSIF
Прозрачное
1,89
Прозрачное
1,87
10,84
10,58
FaSSIF
Прозрачное
3,15
Прозрачное
3,13
10,15
10,72
[121] [
]
Примечание: SGF обозначает смоделированную желудочную жидкость; FaSSIF обозначает смоделированную кишечную жидкость в состоянии натощак; FeSSIF обозначает смоделированную кишечную жидкость в состоянии сытости.
[122]
Вывод: Из результатов в приведенной выше таблице видно, что растворимость соединения формулы (II) в биологическом носителе значительно улучшена по сравнению с соединением формулы (I).
[123] Пример 10. Исследование растворимости соединений формулы (I) и формулы (II) в воде.
[124]
2 мг образца каждого соединения взвешивали и добавляли в стеклянный флакон объемом 1,5 мл, пипеткой добавляли определенный объем чистой воды и соответствующим образом проводили ультразвуковую солюбилизацию. Исследование проводилось при комнатной температуре и проверено на солюбилизацию. Приблизительные результаты растворимости следующие:
Образец
Количество добавленной чистой воды (мкл)
Приблизительная растворимость S (мг/мл)
Соединение формулы (I)
>1000
S<1,9
Соединение формулы (II)
20-40
49,0<S<98,0
[125] Вывод:
Приблизительная растворимость соединения формулы (II) в чистой воде значительно улучшена по сравнению с соединением формулы (I).
[126] Пример 11. Исследование гигроскопичности кристаллической формы B соединения формулы (II).
[127] 1. Экспериментальный материал:
прибор динамической сорбции паров SMS DVS Advantage
[128] 2. Экспериментальный способ:
соответствующее количество кристаллической формы B соединения формулы (II) помещали в диск с образцами DVS для анализа DVS.
[129] 3. Результат эксперимента:
Диаграмма DVS кристаллической формы B соединения формулы (II) показана на фиг. 7 с ΔW=0,673%.
[130] Вывод:
Гигроскопический прирост массы кристаллической формы B соединения формулы (II) при 25°C/80% RH составил 0,673%, что является слегка гигроскопичным.
[131] Пример 12. Тестирование на стабильность кристаллической формы A соединения формулы (I) при высокой температуре
[132]
В соответствии с «Руководством по тестированию стабильности активных фармацевтических ингредиентов и фармацевтических препаратов» (Chinese Pharmacopoeia 2010 Appendix XIXC) была исследована стабильность кристаллической формы А соединения формулы (I) в условиях ускоренного теста при высокой температуре (60°С).
[133]
Кристаллическая форма А соединения формулы (I) была помещена в открытый чистый контейнер при 60°С, и образцы были отобраны на 30, 60 и 90 сутки соответственно для тестирования. По сравнению с первоначальными результатами теста в день 0 в Таблице 4 ниже показаны результаты теста.
Таблица 4 Тестирование стабильности кристаллизации соединения формулы (I) при высокой температуре
Время отбора образцов (дни)
Внешний вид
Содержание (%)
Всего примесей (%)
Исследование кристаллической формы
0
Беловатый порошок
99,0
0,57
Кристаллическая форма A
30
Беловатый порошок
97,5
0,56
Кристаллическая форма A
60
Беловатый порошок
100,0
0,58
Кристаллическая форма A
90
Беловатый порошок
99,9
0,55
Кристаллическая форма A
[134]
Вывод: Тестирование на стабильность при высокой температуре показывает, что кристаллическая форма А соединения формулы (I) имеет хорошую стабильность в условиях высоких температур.
[135] Пример 13. Тестирование на стабильность кристаллической формы A соединения формулы (I) при высокой влажности
[136]
В соответствии с «Руководством по тестированию стабильности активных фармацевтических ингредиентов и фармацевтических препаратов» (Chinese Pharmacopoeia 2010 Appendix XIXC) была исследована стабильность кристаллической формы А соединения формулы (I) в условиях ускоренного теста при высокой влажности (40°С/75% влажности (в открытых условиях)).
[137]
Кристаллическая форма А соединения формулы (I) была помещена в открытый контейнер с постоянной температурой и влажностью для ускоренного тестирования в условиях 40°С/75% влажности (открытые условия), а образцы для тестирования были взяты на 30-й, 60-й и 90-й дни. По сравнению с первоначальными результатами теста в день 0 в Таблице 5 ниже показаны результаты тестирования:
Таблица 5. Тестирование стабильности кристаллизации соединения формулы (I) при высокой влажности
Условия тестирования
Время отбора образцов (дни)
Внешний вид
Содержание (%)
Всего примесей (%)
Исследование кристаллической формы
40°С/75% влажности(открытые условия)
0
Беловатый порошок
99,0
0,57
Кристаллическая форма A
30
Беловатый порошок
100,6
0,57
Кристаллическая форма A
60
Беловатый порошок
101,1
0,58
Кристаллическая форма A
90
Беловатый порошок
100,4
0,58
Кристаллическая форма A
[138]
Вывод: Тестирование на стабильность при высокой влажности показывает, что кристаллическая форма А соединения формулы (I) имеет хорошую стабильность в условиях высокой влажности.