ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ СОЕДИНЕНИЕ
PHARMACEUTICAL COMPOUND

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к лечению рака, содержащего раковые клетки, положительные в отношении эстрогеновых рецепторов (ER+), и, в частности, к лечению рака груди. Авторы предоставили конъюгат, содержащий фармацевтический компонент и компонент, который представляет собой токсин. Конъюгат имеет превосходную способность к нацеливанию на раковые клетки ER+ и к их уничтожению.
Уровень техники
Среди женщин по всему миру рак груди представляет собой наиболее распространенное раковое заболевание и наиболее распространенную причину смерти от рака. Рак груди, как предполагается, вызывается различными факторами, и одним из этих факторов является увеличение уровней эстрогенов в крови. Имеется множество исследований в области семейств эстрогеновых рецепторов и различий между эстрогеновыми рецепторами раковых клеток и эстрогеновыми рецепторами нормальных клеток. Целью таких исследований является обнаружение лекарственных средств, которые могут лечить рак груди посредством ослабления продуцирования эстрогенов в организме.
Один такой тип рака содержит клетки, несущие эстрогеновые рецепторы (клетки ER+). Они представляют собой клетки с большим количеством эстрогеновых рецепторов, как правило, примерно 200000-5000000. Нормальная неканцерогенная клетка с эстрогеновыми рецепторами будет иметь, как правило, примерно 20000-80000 эстрогеновых рецепторов. Раковые клетки увеличивают скорость деления в присутствии эстрогенов, реагируя даже на малые количества гормона, из-за большого количества эстрогеновых рецепторов.
Surgical Oncology 12 (2003) 277-287 (Soo Lo, Stephen R.D. Johnston).
Новые системные терапии для рака груди обсуждаются в Они включают эндокринную терапию, такую как чистые антиэстрогены и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (SERM), моноклональные антитела, нацеленные против фактора роста рецепторов, низкомолекулярные ингибиторы трансдукции сигналов, вакцины и стратегии иммунотерапии и терапии против ангиогенеза.
Одно из лекарственных средств, которое, как показано, должно быть эффективным при лечении рака, положительного по эстрогеновым рецепторам, представляет собой тамоксифен. Тамоксифен представляет собой пример селективного модулятора эстрогеновых рецепторов (SERM), действующего в качестве антагониста на канцерогенные клетки, положительные по эстрогеновым рецепторам, посредством связывания с эстрогеновыми рецепторами на поверхности клеток и предотвращения связывания эстрогенов на клетках и ингибирования, таким образом, деления клеток. Даже если он является антагонистом в тканях груди, он действует в качестве частичного агониста на эндометрий и связан с эндометриальным раком у некоторых женщин. По этой причине среди побочных воздействий тамоксифена находятся эндометриальные изменения, включая рак.
Bioinorganic & medicinal Chemistry 10 (2002) 3237-3243 (Swamy, James, Mohr, Hanson and Ray).
Предполагается также, что конъюгат тамоксифена и порфирина мог бы быть эффективным при фотодинамическом лечении раковых клеток, при этом порфирин демонстрирует фототоксическую активность при экспонировании для красного света и имеет более сильное уничтожение клеток для клеток рака груди MCF-7 по сравнению с неконъюгированным порфирином. Конъюгаты эстрадиол-порфирин, которые селективно локализуются в клетках рака груди, положительных в отношении эстрогеновых рецепторов, в течение фотодинамической терапии рака груди, описываются также в
British Journal of Haemotology 2000, 110, 351-361 (Bolognesi, Polito et al.)
Другие конъюгаты, которые исследовались на их эффективность при лечении рака, включают конъюгаты антитело-токсин. описывают связывание рибосом-инактивирующих белков, таких как сапорин, с моноклональными антителами для лечения лимфомы Ходжкина. Однако к настоящему времени нет такого продукта, который успешно прошел через испытания на людях и стал лицензированным продуктом.
Хотя современные лекарственные средства и терапии для лечения рака и, в частности, рака груди, имеющиеся на рынке, замедляют деление этих раковых клеток, через несколько лет клетки мутируют так, что лекарственное средство на них больше не действует, и лекарственное средство становится непригодным, при этом пациенты не реагируют на лечение.
По этой причине задачей настоящего изобретения является создание нового лечения для раковых заболеваний ER+, включая, в частности, такие раковые заболевания груди, для которых упоминаемые выше проблемы решаются посредством разрушения раковых клеток ER+ вместо простого уменьшения скорости деления клеток, подобно тому, как делают другие SERM и другие виды лечения.
Упоминаемые выше проблемы решаются с помощью аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения, изложенного ниже.
Сущность изобретения
Соответственно, настоящее изобретение предусматривает соединение, содержащее
(a) первый компонент, способный к связыванию с рецепторами клеток ER+; и
(b) второй компонент;
где второй компонент представляет собой токсин, инактивирующий рибосомы, и конъюгирован с первым компонентом.
Первый компонент является способным к связыванию с клетками, содержащими эстрогеновые рецепторы, - так называемыми клетками ER+, или, другими словами, способным к связыванию с рецепторами клеток ER+ или с клеточными эстрогеновыми рецепторами. Как упоминается выше, в данном контексте, рецепторы клеток ER+ представляют собой рецепторы клеток, положительных по эстрогеновым рецепторам (ER+). Они могут присутствовать на многих типах клеток, и настоящее изобретение распространяется на компоненты, способные к связыванию со всеми рецепторами ER+, независимо от типа клеток. Однако, как правило, клетки, представляющие интерес для настоящего изобретения, представляют собой канцерогенные клетки, которые, в целом, имеют большое количество эстрогеновых рецепторов, как правило, примерно 200000-5000000. Все типы клеток рака груди представляют особенный интерес для настоящего изобретения. В противоположность этому, нормальные не канцерогенные клетки с эстрогеновыми рецепторами будут иметь, как правило, примерно 20000-80000 эстрогеновых рецепторов.
Конкретная идентификация первого компонента не является как-либо ограниченной, при условии, что он соответствует указанным выше критериям. Однако в предпочтительном варианте осуществления первый компонент представляет собой селективный модулятор эстрогеновых рецепторов (SERM), такой как соединение ралоксифена.
Как правило, в настоящем изобретении, токсин, инактивирующий рибосомы, представляет собой белок (белковый токсин, ингибирующий рибосомы, называется токсин RIP), а предпочтительно, RIP представляет собой RIP типа I. Как правило, такие белки действуют посредством необратимого блокирования синтеза белка и вызывают гибель клетки. Конкретная идентификация токсина не является как-либо ограниченной при условии, что он соответствует указанным выше критериям. В предпочтительном варианте осуществления токсин представляет собой сапорин.
В предпочтительном варианте осуществления соединение имеет стехиометрическое отношение первого компонента ко второму компоненту в пределах от 0,5:1 до N:1, где N представляет собой общее количество сайтов связывания для первого компонента во втором компоненте. Сайты связывания не являются как-либо ограниченными, за исключением того, что они должны быть способны к связыванию первого компонента со вторым компонентом. Как правило, но не исключительно, сайт связывания представляет собой тирозин или лизин. В сапорине имеется до 14 тирозиновых сайтов связывания и до 23 лизиновых сайтов связывания, каждый из них независимо способен служить в качестве сайта связывания для первого компонента (т.е. N=14, N=23 или N=37, в зависимости от того, используются ли точки присоединения только тирозина, только лизина или как тирозина, так и лизина). Таким образом, предпочтительные диапазоны составляют от 0,5:1 до 37:1, предпочтительно от 0,5:1 до 23:1, более предпочтительно от 0,5:1 до 14:1. Однако, в зависимости от того, какие точки присоединения используются, могут использоваться любые отношения в этих диапазонах.
Кроме того, в особенно предпочтительных вариантах осуществления стехиометрическое отношение первого компонента ко второму компоненту находится в пределах от 0,5:1 до 8:1 (предпочтительно, от 0,5:1 до менее чем 8:1), а более предпочтительно от 0,5:1 до 2,5:1. Стехиометрия от 0,5:1 до 7:1, от 0,5:1 до 6:1, от 0,5:1 до 5:1, от 0,5:1 до 4:1, от 0,5:1 до 3:1 и от 0,5:1 до 2:1 также является предпочтительной.
В этом отношении, стехиометрическое отношение может относиться как к средней стехиометрии, так и к молекулярной стехиометрии. Например, смесь, содержащая как конъюгат с молекулярным стехиометрическим отношением 1:1 (т.е. одна молекула первого компонента конъюгируется с каждой молекулой второго компонента), так и конъюгат с молекулярной стехиометрией 3:1 (т.е. три молекулы первого компонента конъюгируются с каждой молекулой второго компонента), будут иметь в равной пропорции среднюю стехиометрию 2:1. Таким образом, являются возможными стехиометрии, не выражающиеся целыми числами.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую любое из соединений, как описано выше.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает использование любых соединений и композиций, как описано выше, в медицине.
Дополнительный аспект настоящего изобретения предусматривает использование любого из упоминаемых выше соединений или композиций для получения лекарственного средства для лечения рака, содержащего клетки ER+. Тип раковых клеток ER+ не является как-либо ограниченным, но является особенно предпочтительным, чтобы рак представлял собой рак груди. Лекарственное средство является пригодным для лечения любого млекопитающего, и, в частности, субъекты-люди являются предпочтительными. Способ введения не является как-либо ограниченным, но является предпочтительным, что лекарственное средство является пригодным для инъекции или вливания (внутривенного или другим путем) или для перорального введения субъекту.
Дозировка, используемая в лекарственном средстве, не является как-либо ограниченной, при условии, что создается достаточная доза для удовлетворения требований относительно эффективности и токсичности. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лекарственное средство является пригодным для инъекции субъекту для достижения пиковой концентрации конъюгата в крови, эквивалентной 1-500% от клинической пиковой концентрации в крови первого компонента, когда он используется в неконъюгированной форме.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения лекарственное средство является пригодным для инъекции субъекту для достижения 80-140% от клинической пиковой концентрации в крови первого компонента, когда его используют в неконъюгированной форме.
В этом отношении целевые концентрации ралоксифена в крови основываются на стандартной терапевтической пиковой концентрации ралоксифена в крови человека (т.е. 0,5 нг/мл).
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ получения любого из соединений, как описано выше, посредством взаимодействия первого компонента со вторым компонентом для конъюгирования первого компонента со вторым компонентом.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения рака, содержащего клетки ER+, и, в частности, рака груди, этот способ включает введение лекарственного средства субъекту, где лекарственное средство содержит любое соединение или композицию, как определяется выше.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что конъюгаты соединения и композиции в соответствии с настоящим изобретением обеспечивают эффективное лечение раковых клеток ER+, их использование приводит к значительному начальному уменьшению ежедневного увеличения объема опухоли, а также к увеличенному и постоянному уменьшению скорости роста опухоли, в то же время не влияя значительно на неканцерогенные клетки ER+.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает соединение, содержащее первый компонент, способный к связыванию с рецепторами клеток ER+, и второй компонент, где второй компонент представляет собой, как правило, класс токсинов RIP типа I и конъюгирован с первым компонентом.
Первый компонент для настоящего изобретения является способным к связыванию с рецепторами клеток ER+ и при условии, что его функциональность поддерживается, первый компонент не является как-либо ограниченным. Однако, как упоминается выше, обнаружено, что любое соединение - селективный модулятор эстрогеновых рецепторов (SERM) является особенно пригодным для использования. Тип SERM не является как-либо ограниченным, но может включать любое соединение из фулвестранта, тамоксифена, ралоксифена, торемифена, дролоксифена, идоксифена и лазофоксифена. В частности, соединение ралоксифена является особенно пригодным для использования.
Второй компонент представляет собой токсин, инактивирующий рибосомы. Как объяснялось, он предпочтительно представляет собой белок (токсин RIP), а более предпочтительно, RIP типа I. Является особенно предпочтительным, чтобы токсин не мог сам по себе попадать в клетки и действовал только на внутреннюю работу клеток.
(Vogel VG; Costantino JP; et. al; for the National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP). Effects of Tamoxifen vs Raloxifene on the Risk of Developing Invasive Breast Cancer and Other Disease Outcomes: The NSABP Study of Tamoxifen and Raloxifene (STAR) P-2 Trial. JAMA. 2006; 295: 2727-2741)
Ралоксифен представляет собой селективный модулятор эстрогеновых рецепторов (SERM) с массой 510 Да, используемый при предотвращении остеопороза у женщин в период после менопаузы. Последние клинические испытания показали, что ралоксифен является настолько же эффективным, как и тамоксифен, при уменьшении заболеваемости раком груди, положительным в отношении экстрогеновых рецепторов. Однако пациенты, принимающие ралоксифен ежедневно, имеют на 36 процентов меньше раковых заболеваний матки и на 29 процентов меньше тромбов, чем женщины, принимающие ежедневно тамоксифен. Раковые заболевания матки, в особенности эндометриальные раковые заболевания, представляют собой серьезное побочное воздействие тамоксифена.
Соединение ралоксифена может принимать следующую структуру:
В указанной выше структуре любой один или несколько атомов водорода, соединенных с атомами углерода, могут замещаться заместителями.
Заместители для ралоксифена не являются конкретно ограниченными и могут содержать любую органическую группу и/или один или несколько атомов любой из групп IIIA, IVA, VA, VIA или VIIA Периодической таблицы, таких как атомы B, Si, N, P, O или S, или атом галогена (например, F, Cl, Br или I).
Когда заместитель содержит органическую группу, органическая группа предпочтительно содержит углеводородную группу. Углеводородная группа может включать группу с прямой цепью, с разветвленной цепью или циклическую группу. Независимо, углеводородная группа может содержать алифатическую или ароматическую группу. Также независимо, углеводородная группа может содержать насыщенную или ненасыщенную группу.
Когда углеводород содержит ненасыщенную группу, она может включать одну или несколько алкеновых функциональных групп и/или одну или несколько алкиновых функциональных групп. Когда углеводород содержит группу с прямой цепью или разветвленной цепью, она может включать одну или несколько первичных, вторичных и/или третичных алкильных групп. Когда углеводород содержит циклическую группу, она может включать производные этих групп с ароматическим кольцом, алифатическим кольцом, с гетероциклической группой и/или с конденсированным кольцом. Циклическая группа может таким образом включать бензольную, нафталиновую, антраценовую, инденовую, флуореновую, пиридиновую, хинолиновую, тиофеновую, бензотиофеновую, фурановую, бензофурановую, пиррольную, индольную, имидазольную, тиазольную и/или оксазольную группу, а также региоизомеры указанных выше групп.
Количество атомов углерода в углеводородной группе не является как-либо ограниченным, но предпочтительно углеводородная группа содержит от 1 до 40 атомов C. Углеводородная группа может таким образом представлять собой низший углеводород (1-6 атомов C) или высший углеводород (7 атомов C или более, например, от 7 до 40 атомов C). Количество атомов в кольце циклической группы не является как-либо ограниченным, но предпочтительно кольцо циклической группы содержит от 3 до 10 атомов, например 3, 4, 5, 6 или 7 атомов.
Группы, содержащие гетероатомы, описанные выше, а также любые другие группы, определенные выше, могут содержать один или несколько гетероатомов любой из групп IIIA, IVA, VA, VIA или VIIA Периодической таблицы, таких как атом B, Si, N, P, O или S, или атом галогена (например, F, Cl, Br или I). Таким образом, заместитель может включать одну или несколько любых функциональных групп из групп, распространенных в органической химии, таких как гидроксильные группы, группы карбоновой кислоты, группы сложных эфиров, группы простых эфиров, альдегидные группы, кетоновые группы, аминовые группы, амидные группы, иминовые группы, тиольные группы, тиоэфирные группы, сульфатные группы, группы сульфоновой кислоты и фосфатные группы, и тому подобное. Заместитель может также включать производные этих групп, такие как ангидриды карбоновой кислоты и галогениды карбоновой кислоты.
В дополнение к этому, любой заместитель может включать сочетание двух или более заместителей и/или функциональных групп, определенных выше.
Когда второй компонент для настоящего изобретения представляет собой токсин класса RIP типа I, он не является как-либо ограниченным. Он может представлять собой любой токсин из сапорина, MOM, PAP-S, буганина и геланина, и среди них, в частности, сапорин является пригодным для использования в качестве токсина как часть соединения и фармацевтической композиции по настоящему изобретению.
(Saponaria officinalis).
Сапорин представляет собой белок, инактивирующий рибосомы (RIP), типа I, массой 30 кДа, полученный из семян растения мыльная трава N-гликозидазная активность сапорина депуринирует конкретный нуклеотид в рибосомальной РНК 28S, таким образом, необратимо блокируя синтез белка и вызывая гибель клетки. Сапорин может также быть получен рекомбинантно, и не только из семян.
(Stirpe F, Gasper-Campani A, Barbieri L, Falasca A, Abbondanza A, Stevens WA (1983) Ribosome-inactivating proteins from the seeds of Saponaria officinalis L. (soapwort) of Agrostemma githago L. (corncockle) and of Asparagus officinalis (asparagus) and from the latex of Hura crepitans L. (sandbox tree). Biochem J 216: 617-625).
Тип сапорина не является как-либо ограниченным, но предпочтительной формой сапорина является та, которая известна как SO-6. Эта форма сапорина является необычной в том отношении, что она очень стабильна по отношению к денатурантам, протеазам и к теплу. Кроме того, в противоположность к MP типа II (например, к рицину), сапорин не имеет собственного механизма связывания с клетками и интернализации и, следовательно, он считается безопасным при нормальных условиях
Конъюгирование первого компонента и второго компонента не является как-либо ограниченным, но обнаружено, что является эффективным ковалентное конъюгирование с использованием химического линкера, такого как бис-диазо-(о-толидин) [BDT]. Опять же, использование линкера и соединение, используемое как линкер, не являются как-либо ограниченными, но те конкретные примеры, которые описаны выше, как показано, действуют эффективно.
Стехиометрическое отношение первого компонента ко второму компоненту в соединениях в соответствии с настоящим изобретением не является как-либо ограниченным и может находиться в пределах от 0,5:1 до N:1, где N представляет собой общее количество сайтов связывания для первого компонента во втором компоненте. Из тех конъюгатов, которые имеют стехиометрическое отношение первого компонента ко второму компоненту в пределах от 0,5:1 до 14:1, без какого-либо ограничения, конъюгаты в пределах от 0,5:1 до 8:1, и предпочтительно, от 0,5:1 до 2,5:1, могут быть эффективными при лечении раковых клеток ER+. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что отношение ралоксифена:сапорина приблизительно 2:1 приводит к получению наиболее эффективного конъюгата для лечения клеток рака груди, использование которого приводит к значительному начальному уменьшению ежедневного увеличения объема опухоли, а также к увеличенному и постоянному уменьшению скорости роста опухоли. Однако любой конъюгат для настоящего изобретения в пределах от 0,5:1 до менее чем 8:1 может быть эффективным в той же степени.
Фармацевтическая композиция, содержащая любое соединение по настоящему изобретению, хотя и не является как-либо ограниченной, может также содержать фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель и/или вспомогательное вещество.
Соединения и композиции в соответствии с настоящим изобретением, хотя не являются как-либо ограниченными при использовании, как правило, используются для получения лекарственного средства для лечения раковых заболеваний, содержащих клетки ER+, и являются особенно пригодными для использования при лечении рака груди, яичников, шейки матки, среди других раковых заболеваний с клетками ER+.
Использование соединений и композиций по настоящему изобретению является пригодным для всех млекопитающих и, в частности, для человека.
Дополнительно, может существовать использование, где лекарственное средство является пригодным для инъекции или вливания и, без какого-либо ограничения, в частности внутривенно, подкожно или с помощью любых других средств, включая пероральное введение.
Кроме того, использование является пригодным для инъекции субъекту для достижения пиковой концентрации в крови где-нибудь между 1% и 500% от клинической пиковой концентрации в крови первого компонента, когда он используется в неконъюгированной форме. В частности, использование может, кроме того, быть пригодным для инъекции для достижения от 1% до 400% от клинической пиковой концентрации в крови или, кроме того, от 1% до 300%, или, более конкретно, для достижения от 1% до 200%, а предпочтительно концентрации в пределах между 80% и 140%. Авторы неожиданно обнаружили, что лечение для достижения 80% и 140% с помощью конъюгата ралоксифена:сапорина, 2:1, приводит к значительному начальному уменьшению ежедневного увеличения объема опухоли по сравнению с контрольными результатами, а также к увеличенному и постоянному уменьшению скорости роста опухоли без значительного воздействия на неканцерогенные клетки ER+.
В отличие от современных лекарственных средств против рака, которые действуют в качестве антагонистов-конкурентов эстрогенов (т.е. они уменьшают скорость деления клеток), соединение, фармацевтическая композиция и лечение по настоящему изобретению имеют летальное воздействие на клетки, несущие большие количества рецепторов ER (т.е. на раковые клетки), но не на другие клетки ER+. Разрушение раковых клеток, вызываемое кратковременным лечением, сужает рамки для фенотипических изменений, как правило, наблюдаемых у раковых клеток при долговременном экспонировании для антагонистов-конкурентов, приводя к потере восприимчивости целевых клеток к конкурентам. На данном продукте отразился бы факт мутации раковой клетки из ER+ в ER-. Этот продукт имеет два преимущества по сравнению с герцептином (гуманизированное моноклональное антитело, которое действует на рецепторы HER2/neu и используется при лечении рака груди); во-первых, он нацелен на раковые клетки ER+, являются ли они положительными по Her2/neu или нет, в то время как герцептин нацеливается в основном на раковые клетки, положительные по Her2/neu, а во-вторых, скорее разрушает раковые клетки, чем просто замедляет их репликацию. Продукт по настоящему изобретению не имеет недостатков, ассоциирующихся с фотодинамической терапией, поскольку он может нацеливаться на раковые клетки, даже если никакой источник света не может фокусироваться на рассматриваемых раковых клетках. Этот продукт является также превосходным по отношению к иммунотоксинам (т.е. к моноклональным антителам, связанным с токсинами) в том, что он должен иметь более низкий риск синдрома экстровозации и нефротоксичности из-за образования иммунного комплекса.
В дополнение к этому, независимо от того, разделяются ли SERM (носитель) и RIP типа I (токсин), посредством воздействия внутриклеточной протеазы на линкер после входа конъюгата в целевую клетку или нет, эффективность продукта оставалась бы неизменной, поскольку она была бы независимой от связывания SERM с его рецептором или от любого клеточного механизма, активируемого под действием такого связывания. Т.е., когда он попадает в клетку, RIP типа I оказывает прямое необратимое отрицательное воздействие на рибосомы и, следовательно, на трансляцию всех mРНК, либо продуцируемых генами домашнего хозяйства, индуцируемыми в результате действия стимуляторных сигналов, возникающих при связывании и активировании любых других клеточных рецепторов (например, подобных тем, которые вызываются связыванием носителя SERM с клеточным рецептором), либо любым другим связанным с окружающей средой или внутренним механизмом и/или стимулом.
Описание чертежей
Настоящее изобретение будет теперь описываться более подробно в качестве только лишь примера, со ссылками на следующее далее обсуждение и на прилагаемые чертежи, в которых
фиг.1 показывает выживаемость монослоев клеток MCF-7, HCC-1143 и OVCAR-3, экспонируемых для уменьшающихся концентраций различных конъюгатов сапорина:ралоксифена (S:R). Выживаемость клеток (%) для каждой линии клеток вычисляют в соответствии со стандартным анализом высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH), где минимальное высвобождение (0% выживаемости) соответствует клеткам, обработанным 50 мкг/мл митомицина C, а максимум высвобождения (100% выживаемости) соответствует клеткам, обработанным только полной средой.
Фиг.2 показывает выживаемость монослоев клеток MCF-7, HCC-1143 и OVCAR-3, экспонируемых либо для 500 нМ конъюгата ралоксифена:сапорина, 2:1 (конъюгат S:R, 1:2), либо для эквивалентной молярной концентрации сапорина (500 нМ), ралоксифена (1000 нМ) и смеси (т.е. неконъюгированной смеси) сапорина (500 нМ) и ралоксифена (1000 нМ). Выживаемость клеток (%) для каждой линии клеток вычисляют в соответствии со стандартным анализом высвобождения лактатдегидрогеназы (LDH), где минимальное высвобождение (0% выживаемости) соответствует клеткам, обработанным 50 мкг/мл митомицина C, а максимальное высвобождение (100% выживаемость) соответствует клеткам, обработанным только полной средой.
Фиг.3 показывает профиль роста опухолей MCF-7, установившихся у самок голых мышей, после лечения либо фосфатным буферным солевым раствором (PBS), 4 нг/мл ралоксифена, либо 0,4 нМ конъюгата ралоксифена:сапорина, 2:1 (S:R, 1:2). Животные получают внутривенное лечение ретроорбитальным путем в дни 36 и 43 после введения вещества.
Фиг.4 показывает процент изменения объема опухоли для лечения конъюгатом по сравнению с контролем и неконъюгированным продуктом.
Фиг.5 показывает процент изменения массы тела для лечения конъюгатом по сравнению с контролем и неконъюгированным продуктом.
Примеры
Пример 1
Конъюгирование ралоксифена с сапорином
-
Ралоксифен (Sigma) конъюгируют с сапорином (Sigma) с использованием бис-диазо-(o-толидина) [BDT] как линкера (этот линкер является пригодным для использования для связывания через тирозин). Линкер является достаточно стабильным в кислом растворе, но взаимодействует чрезвычайно быстро с тирозином и другими ароматическими фенолами, когда pH повышают до 7. По этой причине реакцию трудно контролировать. Если не контролировать ее адекватно, линкер будет поперечно сшивать сапорин через четырнадцать тирозинов в своей последовательности и разрушит его целостность. Следовательно, используемые условия являются критическими.
Конъюгаты приготавливают при отношении ралоксифена к сапорину 14:1, 8 (приблизительно):1 и 2:1.
Ниже приводится протокол для конъюгирования 2:1 (ралоксифен:сапорин).
Для осуществления конъюгирования используют десятикратный молярный избыток BDT на один тирозин (в сапорине) и реакции позволяют происходить в пределах между 30 секундами и более чем 50 секундами при -20°C. После повышения pH от 2 до 5 посредством добавления соответствующего объема молярного раствора гидроксида натрия в воде (M.NaOH водный) реакцию останавливают посредством добавления молярного раствора хлористоводородной кислоты (M.HCl). Анализ с помощью УФ-спектроскопии показывает, что это приводит, в среднем, к получению двух молекул BDT, взаимодействующих с каждой молекулой сапорина, в течение реакции за время 30 секунд. Увеличение времени инкубирования дает в среднем восемь и 14 молекул BDT, взаимодействующих с каждой молекулой сапорина. Избыток BDT используют для увеличения вероятности того, что каждая из этих молекул BDT будет иметь взаимодействие только с одним тирозином. Это означает, что вторая диазогруппа в каждой из этих двух молекул BDT остается непрореагировавшей, и по этой причине доступной для реакции с ралоксифеном, который имеет три фенольных группы в своей структуре.
После гель-фильтрации смеси в M.HCl для удаления избытка BDT конъюгаты BDT-сапорин взаимодействуют с большим избытком ралоксифена в 50% метаноле посредством повышения pH до 7. Раствор немедленно повторно подкисляют, поскольку ралоксифен стабилен в кислотном растворе, но не в щелочном растворе. С помощью использования большого избытка ралоксифена обеспечивают, чтобы он был связан через BDT с сапорином только через одну из своих фенольных групп, при этом он химически модифицируется только до минимально возможной степени и, следовательно, сохраняет свою целостность настолько, насколько это возможно.
Реакция с ралоксифеном дает коричневый раствор, и этот цвет устраняют посредством экстрагирования раствора хлороформом. Бледно-соломенный водный слой выпаривают до малого объема при 40°C в вакууме и центрифугируют при 13000 об/мин для удаления твердого вещества. Бледно-желтый раствор, который получают, очищают с помощью гель-фильтрации в M.HCl с получением бесцветного раствора конъюгата ралоксифен-BDT-сапорин.
Пример 2 - Линии клеток
Линию клеток MCF-7 (ECACC, номер по каталогу 86012803) выделяют из аденокарциномы груди у женщины возрастом 69 лет, и она экпрессирует эстрогеновые рецепторы. Линию клеток поддерживают в минимальной эссенциальной среде (Sigma), дополненной 2 мМ L-Gln (Sigma), 1% неэссенциальных аминокислот (Sigma), 100 МЕ пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) и, в качестве полной среды, 10% фетальной сывороткой теленка (FCS) (Sigma).
Линию клеток HCC-1143 (ATTC, номер по каталогу CRL-2321) выделяют из первичной дуктальной карциномы груди у женщины в возрасте 52 лет, и они не экспрессируют эстрогеновых рецепторов. Линию клеток поддерживают в RPMI-1640 (Sigma), дополненной 2 мМ L-Gln (Sigma), 10 мМ HEPES (Sigma), 1 мМ Na-Pyr (Sigma), 100 МЕ пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) и, в качестве полной среды, 10% FCS (Sigma).
Наконец, клетки NIH:OVCAR-3 (ATTC, каталог no. HT13-161) выделяют из аденокарциномы яичников у женщины в возрасте 60 лет, и они экспрессируют эстрогеновые рецепторы. Линию клеток поддерживают в RPMI-1640 (Sigma), дополненной 2 мМ L-Gln (Sigma), 10 мМ HEPES (Sigma), 1 мМ Na-Pyr (Sigma), 0,01 мг/мл бычьего инсулина (Sigma), 100 МЕ пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma) и, в качестве полной среды, 20% FCS (Sigma).
Пример 3
Клоногенный анализ
-
3
Культуры MCF-7, HCC-1143 и OVCAR-3 харвестируют приблизительно при 80% конфлюентности посредством трипсинизации и после однократной промывки в среде, не содержащей сыворотки, используют для высевания в плоскодонный 96-луночный планшет (Nunc) при 5×10 клеток на лунку в 200 мкл полной среды.
После 48 часов инкубирования при 37°C среду удаляют и заменяют на 100 мкл/лунка нескольких разбавлений исследуемых (конъюгаты ралоксифена:сапорина в PBS) или контрольных веществ (сапорин, ралоксифен, PBS (Sigma) и, наконец, на митомицин C (Sigma), как положительный контроль), в полной среде по четыре раза.
После 18 часов инкубирования при 37°C исследуемые соединения удаляют и добавляют в каждую лунку по 200 мкл/лунка полной среды.
После 96 часов инкубирования при 37°C среду удаляют и по 100 мкл/лунка 0,9% Triton X-100 (Sigma) в PBS при RT (при комнатной температуре) добавляют во все лунки. После 2 часов инкубирования при 37°C по 50 мкл раствора PBS-Triton переносят из всех лунок в новый плоскодонный 96-луночный планшет.
Реагент для детектирования из набора для нерадиоактивного анализа цитотоксичности CytoTox 96 (Promega) приготавливают согласно инструкциям производителя и по 50 мкл/лунка реагента детектирования добавляют во все лунки. После 30 минут инкубирования в темноте при комнатной температуре реакцию останавливают посредством добавления 50 мкл/лунка стоп-раствора во все лунки и устанавливают поглощение каждой лунки при 490 нм.
Пример 4 - Антиопухолевая активность in
vivo
7
2
Тридцать (30) самок голых мышей (nu/nu) возрастом 6-8 недель провоцируют подкожно с помощью 2×10 клеток MCF-7, доставляемых в сочетании с Matrigel (Becton Dickinson) (общий объем 200 мкл). Потерю массы и рост опухоли (вычисленные с помощью осуществления двух перпендикулярных измерений и применения формулы [Π·((min измерение)/2)· (max измерение)]) отслеживают ежедневно до окончания исследования.
3
Когда установленные опухоли достигают объема 0,3 см (день 36 после введения провоцирующего вещества), животных делят на группы из трех (3) животных и каждой группе дозируют внутривенно (ретроорбитальным путем) одни препарат из
- 100 мкл конъюгата ралоксифена:сапорина, 2:1 (S:R, 1:2), в PBS с тем, чтобы получить пиковые концентрации конъюгата R:S, 2:1, в крови 0,4, 0,2 и 0,1 нМ, которые являются эквивалентами 0,4, 0,2 и 0,1 нг/мл ралоксифена, соответственно (т.е. три группы: A, B и C соответственно)
- 100 мкл ралоксифена в PBS, также, чтобы получить пиковые концентрации конъюгата в крови 0,4, 0,2 и 0,1 нг/мл ралоксифена (т.е. три группы: D, E и F соответственно)
- 100 мкл PBS, (т.е. одна группа: G).
Целевые концентрации ралоксифена в крови основываются на стандартной терапевтической пиковой концентрации ралоксифена в крови человека (т.е. 0,5 нг/мл). Индивидуальные дозы для мышей, для достижения этой концентрации ралоксифена в крови, доставляемого либо как конъюгат, либо как чистый продукт, вычисляют с помощью умножения индивидуальной массы каждой мыши (г) на 0,08 (т.е. объем крови мыши в мл составляет в среднем 8% от ее массы) и по желаемой концентрации ралоксифена в крови (т.е. 0,4, 0,2 и 0,1 нг/мл).
Через семь дней после первой дозы (день 43 после введения вещества) животные получают вторую дозу конъюгата, чистого ралоксифена или PBS для достижения одинаковой конечной концентрации ралоксифена в крови (т.е. 0,4, 0,2 и 0,1 нг/мл).
Статистический анализ
Статистические различия вычисляются с использованием непараметрического анализа Манна-Уитни и считаются значимыми, если p<0,05.
Результаты
Исследования имеют целью установление того, может ли конъюгат сапорина и ралоксифена селективно убивать клетки груди, положительные по эстрогеновым рецепторам (ER), в то же время не убивая ER-положительные клетки полового тракта самок или другие не ER-положительные клетки. Для этой цели сапорин конъюгируют с ралоксифеном при молярных отношениях (R:S) 14:1, 8:1 и 2:1 и исследуют воздействие увеличения дозы этих конъюгатов на монослои клеток MCF-7 (ER-положительная линия клеток рака груди), HCC-1143 (ER-отрицательная линия клеток рака груди) и OVCAR-3 (ER-положительная линия клеток рака груди).
Как показано на фиг.1, конъюгат ралоксифен:сапорин, 14:1 (S:R 1:14), имеет ограниченное воздействие на любые линии клеток и определенно не оказывает селективного летального воздействия против клеток MCF-7 по сравнению либо с HCC-1143, либо с OVCAR-3. В противоположность этому конъюгат ралоксифен:сапорин, 8:1 (S:R 1:8), как показано, является летальным для всех линий клеток при концентрации конъюгата, равной или большей чем 500 нМ. Только при концентрации 250 нМ может наблюдаться малое увеличение селективного летального воздействия против клеток MCF-7 (выживаемость MCF-7 33,6±2% по сравнению с выживаемостью 70,8±5% HCC-1143 и 61,2±5,6% для OVCAR-3).
Подобно конъюгату ралоксифен:сапорин, 8:1 (S:R 1:8), конъюгат ралоксифен:сапорин, 2:1 (S:R 1:2), убивает все клетки, независимо от их ER статуса при самой высокой исследуемой концентрации конъюгата. Однако при низких дозах конъюгат ралоксифен:сапорин, 2:1, имеет наиболее значительное селективное воздействие из всех трех исследуемых конъюгатов. При концентрации конъюгата 500 нМ конъюгат ралоксифен:сапорин, 2:1, убивает большинство клеток MCF-7 (выживаемость 4,9±4,3%), при этом оказывая только ограниченное воздействие на HCC-1143 (выживаемость 62,8±10,7%) и OVCAR-3 (выживаемость 65,2±3,5%).
Ввиду этих результатов конъюгат ралоксифен:сапорин, 2:1, выбирают для дополнительного подробного анализа in vitro. Для этой цели монослои клеток MCF-7, HCC-1143 и OVCAR-3 лечат с помощью ралоксифена:сапорина, 2:1, при 500 нМ, а также с помощью эквивалентной молярной концентрации сапорина (500 нМ), ралоксифена (1000 нМ) и смеси (т.е. неконъюгированных) сапорина (500 нМ) и ралоксифена (1000 нМ).
Как показано на фиг.2, которая представляет среднее значение для двух независимых экспериментов, ралоксифен имеет селективное значимое (p<0,05) воздействие против ER-положительной линии клеток рака груди MCF-7, но не против ER-отрицательной линии клеток HCC-1143 или ER-положительной линии клеток яичников OVCAR-3. Подобным же образом смесь сапорина и ралоксифена имеет селективное воздействие на клетки MCF-7, которые могут быть с наибольшей вероятностью соотнесены с активностью ралоксифена, поскольку никакого значимого (p>0,05) летального воздействия не может быть приписано сапорину самому по себе. Конъюгат ралоксифена с сапорином при молярном отношении 2:1, по сравнению с простой смесью обоих соединений, вызывает значимое увеличение (p,0,05) летального воздействия соединений против MCF-7 (выживаемость 16,0±6,3% по сравнению с 51,6±3,2% для MCF-7), но имеет только ограниченное увеличение для летального воздействия против клеток HCC-1143 (выживаемость 72,4±5,7% по сравнению с 84,3±8,5% для HCC-1143) и OVCAR-3 (выживаемость 77,7±4,9% по сравнению с 104,4±2,5% в OVCAR-3).
Для исследования эффективности конъюгата ралоксифена:сапорина, 2:1 (S:R 1:2), при контроле роста опухоли in vivo, самки голых мышей (nu/nu) провоцируются подкожно с помощью клеток MCF-7. После установления опухолей (день 36), мышей лечат с помощью внутривенной инъекции болюса ралоксифена:сапорина, 2:1 (S:R 1:2), ретроорбитальным путем для достижения пиковой концентрации ралоксифена:сапорина, 2:1 (S:R 1:2), в крови 0,4, 0,2 и 0,1 нМ. Эти концентрации эквивалентны концентрациям, необходимым для достижения пиковой концентрации ралоксифена в крови 0,4, 0,2 и 0,1 нг/мл, которые составляют 80%, 40% и 20%, соответственно, от целевой пиковой клинической концентрации ралоксифена в крови у людей. Контрольные животные получают либо PBS, либо такие же дозы ралоксифена таким же путем. В день 43 животные получают вторую дозу либо ралоксифена:сапорина, 2:1 (S:R 1:2), PBS, либо ралоксифена.
Из-за природной восприимчивости клеток MCF-7 к продуцированию эстрогенов, ежедневное изменение объема опухоли у используемой модели голых мышей следует синусоидальному распределению с периодом приблизительно 4/5 дней (см. фиг.3). Продолжительность этого периода коррелирует с продолжительностью цикла эструса у мышей (т.е. 4/5 дней). В результате, и для облегчения экспериментального анализа, Фиг.3 представляет изменения объема опухоли для каждой экспериментальной группы, и как ежедневные изменения, и как подвижные средние (т.е. линию тренда) для перекрывающихся 5-дневных периодов (т.е. перекрывание представляет собой 4 дня на точку).
Группа, обработанная PBS, следует синусоидальному распределению роста опухоли, описанному выше. Это распределение характеризуется естественным трендом увеличения максимального объема опухоли, получаемым в каждом цикле, приводящим, в итоге, к летальному размеру опухоли. Лечение с помощью 0,2 и 0,1 нг/мл ралоксифена не приводит к каким-либо изменениям по сравнению с контрольной группой с PBS. Только группа с 0,4 нг/мл ралоксифена показывает естественный тренд поддержания или небольшого уменьшения размера опухоли со временем, который представляет собой характеристику его способа воздействия в клинике как селективного модулятора эстрогеновых рецепторов.
Лечение обработкой пиковыми концентрациями ралоксифена:сапорина, 2:1 (S:R 1:2), в крови 0,2 и 0,1 нМ также не может индуцировать каких-либо изменений в росте опухоли по сравнению с контрольной группой с PBS. Однако лечение обработкой 0,4 нМ ралоксифена:сапорина, 2:1 (S:R 1:2), приводит к значительному начальному уменьшению ежедневного увеличения объема опухоли по сравнению с группами с 0,4 нг/мл ралоксифена и с PBS (см. фиг.3, ежедневное изменение объема опухоли в течение дней 37 и 38), а также к увеличенному и постоянному уменьшению скорости роста опухоли по сравнению с тем, которое достигается в группе с 0,4 нг/мл ралоксифена (см. фиг.3, линия подвижного среднего тренда для исследования).
Пример 5 - Активность конъюгата in
vitro
Целью этого исследования является оценка воздействий конъюгата на динамику роста подкожной ZR-75-1, положительной по эстрогеновым рецепторам линии клеток карциномы груди человека, имплантов у голых мышей.
6
Для этого исследования, и поскольку рост ZR-75-1 зависит от эстрогенов, не менее 40 нормальных самок атимических голых мышей (nu/nu) в возрасте 4-6 недель получают ежедневно инъекцию с 5 мг/кг эстрадиола, начиная с 3 дней перед провоцированием с помощью опухолевых клеток. После лечения эстрадиолом всем животным инокулируют подкожно по 25×10 клеток ZR-75-1 (получают от ATCC) в Matrigel (Becton-Dickinson) с использованием иглы и шприца 21G.
2
Массы тела и объемы опухоли отслеживают каждые 48-72 часа в течение 36 дней после первого введения исследуемых веществ. Объемы опухоли устанавливают с использованием формулы: Объем опухоли=(a×b/2), где 'a' представляет собой наименьший диаметр и 'b' представляет собой наибольший диаметр.
3
После того как установленные опухоли достигают приблизительно 75-150 мм (индивидуальные объемы опухолей могут находиться в пределах от 100 до 250 мг), мышей распределяют на три обработанные группы (n=12 для каждой группы), так что средние объемы опухолей среди семи групп находятся в пределах 10% от средней массы опухоли для контрольной группы. В тот же день (день 1) животным делают внутривенную инъекцию 0,1 мл либо (a) конъюгата сапорина-ралоксифена, (b) либо смеси неконъюгированных сапорина и ралоксифена, либо (c) только ралоксифена. Это лечение повторяют каждые 72 часа в целом пять раз (дни 1, 3, 6, 9 и 12).
Общее количество ралоксифена, вводимое в виде инъекции одному животному, во всех трех группах является одинаковым, и оно подбирается для получения пиковой концентрации ралоксифена в крови 0,7 нг/мл, которая находится в пределах концентрации ралоксифена в крови в клинике. Те животные, которым также делают инъекцию сапорина, либо свободного, либо конъюгированного с ралоксифеном, получают одинаковое количество сапорина, вычисленное по молярному отношению сапорина:ралоксифена 1:2.
Дозирование эстрадиола возобновляют через 15 дней после имплантации для облегчения нормального роста подкожной опухоли.
2
3
Мышей подвергают эвтаназии (посредством асфиксии с помощью CO), если животное обнаружили агонизирующим или если масса тела уменьшается ниже 14 г. Эвтаназию также осуществляют, если индивидуальный объем опухоли достигает 3000 мм или если опухоль становится изъязвленной. Во время исследования одно животное из группы B (неконъюгированные сапорин и ралоксифен) должно было быть удалено из исследования.
Результаты этого исследования говорят, что введение конъюгата сапорина-ралоксифена приводит к значительному (p<0,05, Манн-Уитни) уменьшению достигаемого пикового объема опухоли (день 5) по сравнению с введением либо одного только ралоксифена, либо неконъюгированных ралоксифена и сапорина.
Кроме того, в конце лечения (день 12) и вплоть до дня 36, животные, дозируемые конъюгатом сапорина-ралоксифена, в целом показывают согласованное уменьшение объемов опухоли по сравнению с другими двумя экспериментальными группами (см. фиг.4).
Показатель общего состояния здоровья животного может быть получен посредством наблюдения за массой тела животных в ходе исследования. По этой причине мышей из каждой группы взвешивают каждые 48-72 часа в течение всего исследования. Результаты ясно показывают, что животные, дозируемые конъюгатом сапорина-ралоксифена, имеют значимо (p<0,05, Манн-Уитни) лучший профиль набора массы тела, чем те, которым дозируют либо один ралоксифен, либо неконъюгированные ралоксифен и сапорин (см. фиг.5).
Пример 6 - Дополнительное конъюгирование ралоксифена с сапорином
Эксперимент A
Ралоксифен (Sigma) конъюгируют с сапорином (Sigma) с использованием бис-диазо-(o-толидина) [BDT] в качестве линкера. Это линкер является совершенно стабильным в кислом растворе, но взаимодействует чрезвычайно быстро с тирозином и другими ароматическими фенолами, когда pH повышается до 7. По этой причине реакцию сложно контролировать. Если нет адекватного контроля, линкер будет поперечно сшивать сапорин через четырнадцать тирозинов в его последовательности и разрушит его целостность. Следовательно, используемые условия являются важными.
Конъюгаты приготавливают при отношении ралоксифена к сапорину 2:1.
Протокол для конъюгирования (ралоксифена:сапорина) 2:1 приводится ниже: слегка сонифицируют.
Для осуществления конъюгирования 1,2 мг лиофилизированного сапорина (Sigma) растворяют в 0,6 мл воды. К этому раствору добавляют 0,4 мл ДМСО (Sigma) и 0,01 мл 1M HCl и перемешивают. После небольшой сонификации полученного раствора белка к раствору добавляют 0,4-1 мг ралоксифена, а затем молярный избыток BDT на каждый тирозин (в сапорине). pH полученного раствора повышают до 6,5 посредством добавления соответствующего объема молярного раствора гидроксида натрия в воде (M.NaOH водный) и реакции позволяют происходить в пределах между 22 и 34 минутами при комнатной температуре. В конце реакции к раствору добавляют фосфорную кислоту до конечной концентрации приблизительно 9 и перемешивают. Избыток BDT удаляют из сырого раствора конъюгата посредством элюирования через колонку Biogel P2 (BioRad) с использованием раствора 30,4% ДМСО и 9,1% фосфорной кислоты в воде в качестве элюента. Фракции, содержащие сапорин и ралоксифен, определяют с помощью УФ-спектрофотометрии и диализуют в воду перед использованием.
Эксперимент B
Ралоксифен-HCl и DSC (ди-(N-сукцинимидил)карбонат) - этот линкер является пригодным для использования при связывании через лизин) растворяют при массовом отношении 2:1 (ралоксифена:DSC) в 0,2 мл ДМФ (диметилформамид). К пиридину (0,13 мл) добавляют триэтиламин (0,01 мл) и аликвоты (0,01 мл) этого препарата добавляют последовательно к смеси ралоксифена/DSC в течение периода в 15 минут. Этот процесс осуществляют при 21°C и при постоянном перемешивании. Раствор сапорина (0,6 мг/мл) приготавливают в смеси 40% ДМФ в 15 мМ натрий-фосфатного буфера, pH 7,4 и добавленного раствора ралоксифена/DSC, 0,01 мл. Полученный препарат сначала смешивают посредством встряхивания, а затем сонифицируют до тех пор, пока он не приобретет коллоидный вид, перед тем как реакции конъюгирования позволяют происходить в течение 30 минут при 21°C. Полученные продукты центрифугируют при 13000 об/мин в течение 3 мин и осветленный супернатант либо используют непосредственно, либо пропускают через колонку Sephadex G10 в 0,1 HCl, сушат вымораживанием и повторно суспендируют в PBS до использования.
Эксперимент C
Сапорин растворяют в 10 мМ фосфатного буфера, pH 6,0, содержащего 2 мг/мл глюкозы, и к полученному раствору добавляют 0,1 мл молярной HCl при постоянном перемешивании, с тем, чтобы уменьшить pH до 3,7. К этому препарату добавляют 1 мл раствора ралоксифена-HCl в ДМСО (3 мг/мл) при постоянном перемешивании при 21°C, а затем 0,005 мл реагента BDT. Малые аликвоты (0,01 мл) 0,1 M NaOH последовательно добавляют к непрерывно перемешиваемому препарату сапорина-ралоксифена-BDT для доведения pH до 6,8, в этот момент реакции позволяют происходить дальше в течение 60 минут. Полученный продукт диализируют в течение ночи, сначала в воду, а затем в PBS, содержащий 2 мг/мл глюкозы. Коричневый преципитат, который появляется во время процесса, собирают и повторно растворяют в воде с помощью обработки ультрасонификацией и продолжительного встряхивания. После осветления с помощью центрифугирования супернатант аликвотируют в готовом для использования виде.