Споробиота при заболеваниях дыхательной системы

Микробиология

Споробиота при заболеваниях дыхательной системы

Г.В. Тец, М.Ф. Вечерковская, К.М. Кардава, Е.И. Смирнова, Т.Е. Лазарева, Т.Е. Гембицкая, В.В. Тец

В работе суммированы современные представления о споробиоте при заболеваниях дыхательной системы. Описаны спорообразующие бактерии, впервые идентифицированные в составе микробных сообществ у пациентов с муковисцидозом и хронической обструктивной болезнью легких, - Bacillus respiratorii и Bacillus obstructivus. Изложены особенности споробиоты, связанные с возможностью сохранения в организме человека и длительной персистенции патогена, определяющей рецидивирующий характер течения заболевания, а также способность споробиома длительно сохранять и распространять гены антибиотикоустойчивости между родственными и неродственными бактериями в биопленках. Обсуждаются особенности антибиотикотерапии при лечении заболеваний, вызванных спорообразующими бактериями.

Ключевые слова: споробиота, споробиом, дыхательная система, муковисцидоз, хроническая обструктивная болезнь легких, новые патогены, биопленки.

Введение

Интенсивное изучение микробиоты в норме и при различных заболеваниях позволило выявить широкое распространение ранее недостаточно изученных бактерий, способных образовывать споры. Спорообразующие бактерии обладают рядом особенностей, отличающих их от остальных прокариот, и выделены в отдельную группу, получившую название "споробиота", а совокупность генов спорообразующих бактерий называют "споробиом".

Данные бактерии широко распространены в глобальной экосистеме, представлены в микро-биоте растений, животных и людей [1]. Особое строение спор придает им исключительную устойчивость к воздействию высоких и низких

ФГБОУ ВО "Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" МЗ РФ.

Георгий Викторович Тец - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории иммунологии Научно-исследовательского центра.

Мария Федоровна Вечерковская - канд. мед. наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии. Кристина Модестовна Кардава - ассистент кафедры микробиологии и вирусологии.

Екатерина Игоревна Смирнова - ассистент кафедры микробиологии и вирусологии.

Татьяна Евгеньевна Лазарева - студентка IV курса. Татьяна Евгеньевна Гембицкая - докт. мед. наук, профессор, рук. отдела терапевтической пульмонологии Научно-исследовательского института пульмонологии. Виктор Вениаминович Тец - докт. мед. наук, профессор, зав. кафедрой микробиологии и вирусологии. Контактная информация: Тец Виктор Вениаминович, vtetzv@yahoo.com

температур, радиации, ультрафиолетовому облучению, высыханию, отсутствию воды и питательных веществ, а также к действию антимикробных препаратов и факторов иммунной защиты [2]. Это позволяет представителям спо-робиоты длительно сохраняться в окружающей среде, эффективно распространяться между различными экологическими нишами, в микробио-те животных и человека.

В числе возможных возбудителей заболеваний дыхательной системы идентифицированы спо-рообразующие анаэробные бактерии Clostridium difficile, известные прежде всего как возбудители кишечных инфекций, и аэробные бактерии Bacillus anthracis и Bacillus cereus [3-5]. При изучении микробиоты человека, животных и окружающей среды в последние годы было открыто существование большого числа ранее неизвестных представителей семейства Bacillaceae, которое насчитывает уже более 140 различных родов [1]. Интенсивно изучаются роль ранее неизвестных спорообразующих бактерий в патогенезе различных заболеваний, особенности их распространения и чувствительности к антимикробным препаратам, что необходимо для разработки схем диагностики, профилактики и лечения [6]. Роль споробиоты в заболеваниях дыхательной системы остается недостаточно изученной, а свойства отдельных ее представителей мало известны в практической медицине.

Целью исследования было изучение споро-биоты у больных муковисцидозом и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ).

Материал и методы

Материал для исследования: мокрота больных. Срок между забором материала и включением его в исследование не превышал 6 ч, материал сохранялся при 4°С.

Питательные среды: среда Мюллера-Хинто-на, колумбийские агар и бульон (Oxoid, Великобритания) и среда системы "ВыборАнтибиотика" ("Новые Антибиотики", Россия).

Идентификация изолированных бактерий проводилась с учетом тинкториальных, морфологических, культуральных и биохимических свойств микроорганизмов [7].

Микроскопия.. Мазки окрашивали по Гра-му, использовали микроскоп Axiostar plus (Carl Zeiss, Германия), оснащенный иммерсионным объективом A-Plan 100х/1.25, окуляр 10х (Carl Zeiss, Германия).

Определение биохимической активности микроорганизмов проводили при помощи системы Vitek 2 (bioMérieux, Франция).

Идентификацию бактерий по протеому бактериальной клетки выполняли при помощи масс-спектрометрии MALDI-TOF/TOF с пробоподготовкой на микротитрационных планшетах AnchorChip (Bruker Corporation, США), с идентификацией относительно MALDI Biotyper database (Bruker Taxonomy tree) (Bruker Corporation, США).

Секвенирование гена 16S рибосомальной РНК проводили при помощи набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystem, США) и автоматического секвенатора ABI Prism Genetic Analyzer 3730xl (Applied Biosystems, США), а также программного пакета Sequencing Analysis v. 5.3.1 (Applied Biosystems, США).

Секвенирование генома выполнено при помощи платформы HiSeq 2500 (GAIIx, Illumina, США) согласно инструкции производителя. Геном был собран с использованием программы SPAdes 3.5.0 и аннотирован с использованием NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline [8, 9].

Спорообразующие бактерии, идентифицированные до вида

Штамм Патология

Bacillus thuringiensis Муковисцидоз

Bacillus sonorensis Муковисцидоз

Bacillus licheniformis Муковисцидоз

Bacillus cereus/thuringiensis/mycoides Муковисцидоз

Bacillus subtilis Муковисцидоз

Bacillus fardii ХОБЛ

Paenibacillus glucanolyticus Муковисцидоз

Paenibacillus borealis Муковисцидоз

Paenibacillus pabuli Муковисцидоз

ДНК-ДНК-гибридизация выполнена методом компьютерного анализа [10].

Чувствительность бактерий к антибиотикам определяли на плотной питательной среде дискодиффузионным методом (HiMedia, Индия, НИЦФ, Россия) при помощи системы Vitek 2 с использованием идентификационных карт AST (bioMerieux, Франция) и тест-системы "ВыборАнтибиотика", предназначенной для культивирования бактерий и оценки действия на них антибиотиков ("Новые Антибиотики", Россия).

Результаты

Изучен материал от 10 больных муковисцидо-зом и 5 больных ХОБЛ. Спорообразующие бактерии были обнаружены в материале от 8 больных муковисцидозом и 3 больных ХОБЛ. По результатам морфологического и биохимического исследований, а также анализа состава белков и последовательностей гена 16S рибосомальной РНК все бактерии были идентифицированы как представители семейства Bacillaceae. Большая часть изученных штаммов были идентифицированы до вида (таблица).

Среди изолированных штаммов только Bacillus cereus описан при заболеваниях дыхательной системы [5]. Разнообразие полученных видов, очевидно, связано с прогрессом в выделении чистых культур бактерий: первоначально они были получены в составе смешанных биопленок и только потом в виде чистых культур [11, 12]. Изолированные штаммы обладали различным спектром чувствительности к антимикробным препаратам. Все 9 штаммов, изолированных от больных муко-висцидозом, были устойчивы к амоксициллину и чувствительны к карбапенемам. Из этих штаммов один был устойчив к 15 из 16 использованных антибиотиков и один - к 14. Многие штаммы были устойчивы к ванкомицину (9 штаммов), цефалоспоринам (7 штаммов), линкозамидам (6 штаммов). По 2-4 штамма были устойчивы к аминогликозидам, сульфаниламидам, фторхи-нолонам, тетрациклинам, макролидам, фосфо-мицину и фузидовой кислоте. В среднем каждый штамм был устойчив к 8 антибиотикам. Среди антибиотиков, способных проникать в биопленки, полученные штаммы были в наибольшей степени чувствительны к тетрациклинам (6 штаммов), сульфаниламидам и макролидам (по 5 штаммов).

Два штамма, выделенные у больных ХОБЛ, удалось идентифицировать только до рода. С целью их дальнейшего изучения было выполнено полногеномное секвенирование, сборка и аннотирование геномов. Один из штаммов был идентифицирован как новый вид бацилл и получил

название Bacillus obstructivus VT-16-70 [13]. В составе генома этих бактерий обнаружены различные гены патогенности, включая гемолизин D, протеазы, пептидазы, дезоксирибонуклеазы, рибонуклеазы и адгезины. Второй штамм также был идентифицирован как представитель нового самостоятельного вида и получил название Bacillus respiratorii VT-16-64 [14]. Геном этого штамма содержит гены таких факторов вирулентности, как гемолизин D, энтеротоксин, про-теазы, пептидазы, фосфолипазы, экзонуклеазы и супероксиддисмутаза. Следует отметить, что супероксиддисмутаза рассматривается как канцерогенный фактор [15].

В геномах бацилл, выделенных от больных ХОБЛ и идентифицированных нами как новые, неизвестные ранее виды, выявлены гены, контролирующие устойчивость к антибиотикам, а также мембранные транспортеры (белки-переносчики) различных семейств. У штамма Bacillus respiratorii VT-16-64 обнаружены гены, связанные с устойчивостью к р-лактамам, бацитраци-ну, ванкомицину, фосфомицину и противоопухолевому препарату блеомицину, а также транспортеры семейств ABC (ATP-binding cassette), MATE (multi-antimicrobial extrusion protein) и MFS (major facilitator superfamily). В геноме штамма Bacillus obstructivus VT-16-70 выявлены гены устойчивости к аминогликозидам, фосфо-мицину, р-лактамам, тетрациклинам, противоопухолевому препарату даунорубицину и противовирусному препарату оксетаноцину, а также транспортеры семейств ABC, MATE и MFS.

Полученные данные указывают на наличие у изученных штаммов высокого потенциала антибиотикоустойчивости, что связано с аккумулированием в их геномах большого количества транспортеров различных семейств (ABC, MATE, MFS), контролирующих множественную устойчивость к препаратам. Каждая из этих систем способна "выкачивать" из клеток наборы различных неродственных антибиотиков, а система ABC, кроме того, защищает от их действия рибосомы бактерий [16-18]. Очевидно, что активация этих генов возможна при изменении условий внешней среды, а сохраняться в спорах в различных условиях они могут неопределенно долго. Гены спорообразующих бактерий при переходе спор в вегетативное состояние распространяются в микробиоте за счет горизонтального переноса, причем в биопленках он может происходить между родственными и неродственными микроорганизмами [19-21]. Крайне сложным является взаимодействие с антибиотиками спорообразующих бактерий, находящихся в составе биопленок, поскольку в последних проис-

ходит регуляция споруляции и деспоруляции, а также сохранение большого числа спор.

Значительное количество спорообразующих бактерий, обнаруженных в мокроте больных му-ковисцидозом и ХОБЛ, свидетельствует о существовании проблемы антибиотикотерапии, которая ранее не рассматривалась в практической медицине. Устойчивость к антибиотикам большинства бактерий разделяют на три уровня [22]. Первый уровень устойчивости называют толерантностью (способность бактерий в биопленках выживать в присутствии антибиотиков). Толерантность определяется проблемами преодоления антибиотиками поверхностной оболочки и матрикса, а также неэффективностью их действия на часть клеток (персистеры), находящихся в недоступном для антибиотиков состоянии [23]. Второй уровень определяется свойствами клеточной стенки, мембраны бактерий и наличием выкачивающих помп, обеспечивающих резистентность к про-тивомикробным препаратам. Третий уровень -цитоплазматический, связанный с изменением свойств мишени и регуляцией генов.

Спорообразующие бактерии имеют дополнительный четвертый уровень, связанный с устойчивостью бактериальных спор к действию антибиотиков и антисептиков/дезинфектантов. На этом уровне можно выделить два типа устойчивости, которые проявляются при непосредственном действии антибиотика на свободные и находящиеся в составе биопленок споры, при котором антибиотики участвуют также в процессах регуляции споруляции/деспоруляции.

Таким образом, множественная устойчивость спорообразующих бактерий к антибиотикам, проявляющаяся вне биопленок и внутри этих сообществ, представляет одну из серьезных проблем практической медицины. Особенности действия антисептиков/дезинфектантов и антибиотиков на споробиоту требуют пересмотра методов профилактики и лечения. Если в число возможных возбудителей заболевания входят представители споробиоты, при подборе антибиотиков необходимо учитывать свойства спор и их биопленок, а схемы лечения должны подразумевать повторные курсы терапии, поскольку препараты, позволяющие уничтожить споры, неизвестны и течение заболевания с большой вероятностью будет иметь рецидивирующий характер.

Заключение

Споробиота имеет тотальное распространение в природе и составляет значительную часть мик-робиоты человека. Большое количество споро-образующих бактерий обнаружено при заболеваниях дыхательной системы. У больных ХОБЛ вы-

делены и идентифицированы ранее неизвестные виды Bacillus respiratorii и Bacillus obstructivus. Споробиом содержит множество различных генов патогенности и антибиотикоустойчивости, которые имеют идеальные условия для длительного сохранения в спорах и последующего распространения между родственными и неродственными бактериями в биопленках. Антибиотики не могут обеспечить необходимую эффективность терапии, поскольку кроме проблемы устойчивости, связанной со свойствами вегетативных форм, имеется проблема воздействия на споры, расположенные вне и внутри биопленок. Особенности споробиоты, связанные с возможностью сохранения в организме человека в виде спор, определяют персистенцию патогена и рецидивирующий характер течения заболевания. Устойчивость спор к агрессивным воздействиям внешней среды обеспечивает их накопление в среде обитания людей, включая места массовых посещений и медицинские учреждения, что обеспечивает идеальные условия для распространения вызываемых ими инфекций.

Список литературы

1. Tetz GV, Tetz VV. Introducing the sporobiota and sporobiome. Gut Pathogens 2017;9:38.

2. Riesenman PJ, Nicholson WL. Role of the spore coat layers in Bacillus subtilis spore resistance to hydrogen peroxide, artificial UV-C, UV-B, and solar UV radiation. Applied and Environmental Microbiology 2000;66:620-6.

3. Nicholson WL, Munakata N, Horneck G, Melosh HJ, Setlow P. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews 2000 Sep;64(3):548-72.

4. Ayse MM, Muezzinoglub WB, Karadenizlic A, Hostend TA. Case of pneumonia caused by Bacillus anthracis secondary to gastrointestinal anthrax. International Journal of Infectious Diseases 2009 Nov;13(6):e456-8.

5. Shimoyama Y, Umegaki O, Ooi Y, Agui T, Kadono N, Minami T. Bacillus cereus pneumonia in an immunocompetent patient: a case report. JA Clinical Reports 2017;3(1):25.

6. Setlow B, Atluri S, Kitchel R, Koziol-Dube K, Setlow P. Role of dipicolinic acid in the resistance and stability of spores of Bacillus subtilis with or without DNA-protective alpha/beta-type small acid-soluble proteins. Journal of Bacteriology 2006 Jun;188(11):3740-7.

7. Bergey's manual of systematic bacteriology. 2nd ed. 5-volume set. New York, NY: Springer-Verlag; 2012.

8. Setlow P. I will survive: DNA protection in bacterial spores. Trends in Microbiology 2007 Apr;15(4):172-80.

9. Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS, Lesin VM, Nikolenko SI, Pham S, Prjibelski AD, Pyshkin AV, Sirotkin AV, Vyahhi N, Tesler G, Alekseyev MA, Pevzner PA. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology 2012 May;19(5):455-77.

10. Tatusova T, DiCuccio M, Badretdin A, Chetvernin V, Ciufo S, Li W. Prokaryotic genome annotation pipeline. In: The NCBI handbook. Beck J, Benson D, Coleman J, Hoeppner M, Johnson M, Maglott D, Mizrachi I, Morris R, Ostell J, Pruitt K, Rubinstein W, Sayers E, Sirotkin K, Tatusova T, editors. 2nd ed. Bethesda, MD: National Center for Biotechnology Information; 2013.

11. Тец Г.В., Смирнова Е.И., Кардава К.М., Карамян T.A., Михайлова Д.В., Викина Д.С., Израилов А.М., Вечерков-ская М.Ф., Норман Л.Л., Перекалина Т.А., Шмидт Е.Н., Артеменко Н.К., Заславская Н.В., Тец В.В. Малоизвестные бактерии, выделенные при заболеваниях человека. Ученые записки СПбГМУ им. акад. Павлова И.П. 2017;24(1):35-9.

12. Тец Г.В., Кардава К.М., Смирнова Е.И., Карамян Т.А., Михайлова Д.В., Викина Д.С., Вечерковская М.Ф., Тец В.В. Ранее не культивируемые и малоизвестные бактерии, выделенные из мокроты и слюны при заболеваниях дыхательной системы. Практическая пульмонология 2016;3:67-70.

13. Tetz V, Tetz G. Draft genome sequence of Bacillus obstructivus VT-16-70 isolated from the bronchoalveolar lavage fluid of a patient with chronic obstructive pulmonary disease. Genome Announcements 2017 Mar;5(9). pii: e01754-16.

14. Tetz V, Tetz G. Draft genome sequence of Bacillus respiratorii VT-16-64, isolated from the bronchiolar alveolar lavage fluid of a patient with chronic obstructive pulmonary disease. Genome Announcements 2017 Apr;5(17). pii: e00264-17.

15. Wang X, Huycke MM. Colorectal cancer: role of commensal bacteria and bystander effects. Gut Microbes 2015;6(6):370-6.

16. Wilson DN. The ABC of ribosome-related antibiotic resistance. mBio 2016 May;7(3). pii: e00598-16.

17. Reddy VS, Shlykov MA, Castillo R, Sun EI, Saier MH Jr. The major facilitator superfamily (MFS) revisited. The FEBS Journal 2012 Jun;279(11):2022-35.

18. Redelman CV, Chakravarty S, Anderson GG. Antibiotic treatment of Pseudomonas aeruginosa biofilms stimulates expression of the magnesium transporter gene mgtE. Microbiology (Reading, England) 2014 Jan;160(Pt 1):165-78.

19. Gillings MR. Evolutionary consequences of antibiotic use for the resistome, mobilome and microbial pangenome. Frontiers in Microbiology 2013;4:4.

20. Roberts AP, Pratten J, Wilson M, Mullany P. Transfer of a conjugative transposon, Tn5397 in a model oral biofilm. FEMS Microbiology Letters 1999 Aug;177(1):63-6.

21. Chadha T. Bacterial biofilms: survival mechanisms and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology and Parasitology 2014 Jan;5:190.

22. Zhou G, Qing-Shan S, Huang XM, Xie XB. The three bacterial lines of defense against antimicrobial agents. International Journal of Molecular Sciences 2015 Sep;16(9):21711-33.

23. Balcazar J, Subirats J, Borrego M. The role of biofilms as environmental reservoirs of antibiotic resistance. Frontiers in Microbiology 2015 Oct;6:1216.

The Role of Sporobiota in Respiratory Diseases

G.V. Tets, M.F. Vecherkovskaya, K.M. Kardava, E.I. Smirnova, T.E. Lazareva, T.E. Gembitskaya, and V.V. Tets

The article summarizes the current concepts of the role of sporobiota in respiratory diseases. The authors provide data on spore-forming bacteria firstly identified in microbial communities of patients with cystic fibrosis and chronic obstructive pulmonary disease - Bacillus respiratorii and Bacillus obstructivus. The article considers the features of sporobiota associated with long-term persistence of pathogen in human body causing recurrent course of the disease, as well as the ability of sporobiome to preserve and distribute genes of antibiotic resistance between related and unrelated bacteria in biofilms. The features of antibiotic therapy for the treatment of diseases caused by spore-forming bacteria are discussed. Key words: sporobiota, sporobiome, respiratory system, cystic fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease, new pathogens, biofilms.