Дифенилфосфинилметангидразид, обладающий биологической активностью, и способ его получения
DIPHENYLPHOSPHINO METHANE HYDRAZIDE, WHICH HAS BIOLOGICAL ACTIVITY, AND THE METHOD FOR ITS PREPARATION

Изобретение относится к новому химическому соединению и способу его получения, а именно к дифенилфосфинилметангидразиду (ДФМГ), обладающему биологической активностью.
Наиболее близким по технической сущности является дифенилфосфинилэтангидразид (ДФЭГ) - гидразид дифенилфосфинилуксусной кислоты формулы
2
2
2
PhP(O)CHC(O)NHNH,
обладающий биологической активностью.
Дифенилфосфинилэтангидразид получают путем взаимодействия дифенилхлорфосфина с оксидом этилена в среде алкиловых эфиров галоидуксусных кислот, например этилового эфира хлоруксусной кислоты, при температуре от (-5) до 0°С с последующим нагреванием полученной реакционной массы при 100-140°С и обработкой ее гидразин-гидратом при температуре не выше 40°С. Выпавшие белые кристаллы отфильтровывают и очищают перекристаллизацией из этанола. Выход целевого продукта составляет 70%; т.пл. 160-161°С.
14
15
2
2
Найдено, %: N, 10.25; 10.31; Р, 11.54; 11.62. CHNOP. Вычислено, %: N, 10.20; Р, 11.31, см. SU Авторское свидетельство №467593, С07С 243/26 (2006.01), C07F 9/50 (2006.01), 1991.
Технической проблемой у дифенилфосфинилэтангидразида является низкая биологическая активность в терапевтических дозах, малая широта фармакологического действия, более высокая токсичность.
Технической проблемой является расширение спектра фармакологических эффектов, снижение токсичности.
Техническая проблема решается новой структурой химического вещества - дифенилфосфинилметангидразидом формулы
2
2
PhP(O)C(O)NHNH,
обладающим биологической активностью.
Биологическая активность дифенилфосфинилметангидразида включает анксиолитическую, противовоспалительную активность и способность корригировать нарушенное поведение при аутизме.
Способ получения дифенилфосфинилметангидразида, заключающийся в том, что ведут взаимодействие этилдифенилфосфинита с этилхлорметаноатом при температуре 70°С до прекращения выделения этилхлорида, полученный этилдифенилфосфинилметаноат при температуре 50°С вводят в реакцию в этаноле с гидразин-гидратом, взятым в избытке, с последующим удалением легколетучих компонентов в вакууме, а целевой продукт перекристаллизовывают из диоксана.
Решение технической задачи позволяет получить дифенилфосфинилметангидразид с низкой токсичностью и обладающий биологической активностью, которая включает анксиолитическую, противовоспалительную активность и способность корригировать нарушенное поведение при аутизме.
Характеристика веществ, используемых по заявляемому способу:
2
D
20
Дифенилхлорфосфин - PhPCl, бесцветная жидкость, температура кипения - 170-171°С при давлении 10 мм рт. ст., плотность - d 1,1801, показатель преломления - n 1.6340, растворим в эфире, бензоле, разлагается водой.
3
Этанол - летучая, горючая, бесцветная прозрачная жидкость. Молярная масса: 46,07 г/моль. Плотность: 789 кг/м. Температура кипения: 78,37°С
3
Пиридин - бесцветная жидкость с резким неприятным запахом; смешивается с водой и органическими растворителями. Плотность: 982 кг/м. Молярная масса: 79,1 г/моль. Температура кипения: 115,4°С.
Этилхлорметаноат - бесцветная жидкость, смешивается с бензолом, хлороформом, диэтиловым эфиром, этанолом. Нерастворим в воде. Очень огнеопасен. Молярная масса: 108,52 г/моль. Плотность: 1,135 г/см.
2
2
3
Гидразин - NHNH - бесцветная, сильно гигроскопичная жидкость, с неприятным запахом. Смешивается в любых соотношениях с водой, жидким аммиаком, этанолом; плохо растворяется в неполярных растворителях. Плотность - 1,01 г/см, температура кипения 114°С, температура плавления 2°С.
2
2
5
Этил(дифенилфосфинил)метаноат, формулы PhP(O)COOCH
Кристаллы с температурой плавления 53-54°С.
Данное изобретение иллюстрирует следующий пример конкретного выполнения.
Получение этилдифенилфосфинита:
К смеси 2.3 г (0.050 моль) этанола, 3.9 г (0.050 моль) пиридина в 50 мл абсолютного диэтилового эфира при перемешивании и охлаждении добавляют 11 г (0.050 моль) дифенилхлорфосфина. После 30 минут перемешивания при комнатной температуре выпавший осадок солянокислого пиридина отделяют. Из фильтрата отгоняют эфир, остаток подвергают перегонке в вакууме, т.кип. 172-173°С при давлении 10 мм рт. ст. Выход этилдифенилфосфинита составляет 7.13 г (62.2%).
1
3
3
3
3
3
2
H,H
P,H
2
H,H
P,H
Структуру этилдифенилфосфинита подтверждает спектр ЯМР Н (100 МГц, CDCl, δ, м.д., J/Гц): 1.39 (д.т, 6Н, ОСНМе, J=7.2, J=10.0); 3.51 и 4.05 (оба д, т, 2Н, ОСНМе, J=J=7.1); 7.30-8.24 (м, 10Н, 2Ph).
Получение этилдифенилфосфинилметаноата:
К 5.67 г (0.025 моль) этилдифенилфосфинита добавляют 2.67 г (0.025 моль) этилхлорметаноата. Взаимодействие ведут при 70°С до прекращения выделения этилхлорида. При охлаждении до комнатной температуры реакционная масса кристаллизуется. Получают 6.04 г (88.8%) этилдифенилфосфинилметаноата в виде бесцветных кристаллов, т.пл. 59-63°С.
1
3
3
31
13
1
3
2
H,H
3
H,H
3
p
3
C
2
2
P,C
Структуру этилдифенилфосфинилметаноата подтверждает спектр ЯМР Н (400 МГц, CDCl, δ, м.д., J/Гц): 1.32 (т, 3Н, ОСНМе, J=7.2); 4.35 (к, 4Н, ОСНМе, J=7.2); 7.38-7.53 и 7.75-7.96 (м, 10Н, 2Ph). Спектр ЯМР Р (162 МГц, CDCl, δ, м.д.): 15.9. Спектр ЯМР С (100.6 МГц, CDCl, δ, м.д., J/Гц): 14.17 (с, ОСНМе); 62.94 (с, ОСНМе); 128.29, 128.47, 128.71, 128.83, 129.32, 131.57, 131.74, 131.84, 132.12, 132.94 (с, Саром); 171.00 (д, С=O, J=141.9).
Получение дифенилфосфинилметангидразида:
К 4.00 г (0.0146 моль) этилдифенилфосфинилметаноата в 15 мл этанола при перемешивании при комнатной температуре добавляют 1.10 г (0.0219 моль) 98%-ного гидразин-гидрата. Взаимодействие ведут при 50°С в течение 1 часа. После удаления избытка гидразин-гидрата в вакууме и перекристаллизации из диоксана получают 2.57 г (63.9%) дифенилфосфинилметангидразида.
1
31
13
1
1
6
2
6
p
6
C
P,C
P,C
13
13
2
2
Структуру ДФМГ подтверждает спектр ЯМР Н (400 МГц, DMSO-d, δ, м.д., J/Гц): 4.65 (ушир. с, 2Н, NH); 7.40-7.50 и 7.62-7.67 (м, 10Н, 2Ph); 10.30 (ушир. с, 1Н, NH). Спектр ЯМР Р (162 МГц, DMSO-d, δ, м.д.): 13.3. Спектр ЯМР С (100.61 МГц, DMSO-d, δ, м.д., J/Гц): 130.88 (д, Саром, J=99.2); 129.17, 129.29, 131.68, 131.77, 133.00 (с, СНаром); 166.13 (д, С=O, J=123.1). Найдено (%): С, 59.65; Н, 4.91; N, 10.52; Р, 11.80. CHNOP. Вычислено (%): С, 59.99; Н, 5.04; N, 10.76; P, 11.91.
Исследование структуры дифенилфосфинилметангидразида осуществляли в Центре коллективного пользования научным оборудованием по получению и исследованию наночастиц металлов, оксидов металлов и полимеров «Нанотехнологии и наноматериалы».
Токсичность дифенилфосфинилметангидразида и наличие у дифенилфосфинилметангидразида биологической активности, включающей анксиолитическую, противовоспалительную активность и способность корригировать нарушенное поведение при аутизме, было выявлено при проведении экспериментальных исследований.
Полученные результаты обрабатывали статистически по стандартной методике с использованием t-критерия Стьюдента (доверительная вероятность составляла 0,95 (р<0,05), после проверки полученных данных на нормальность распределения в сравниваемых группах при помощи программы Graph Pad Prism 8.0.1.
50
50
Острая токсичность ЛД(мг/кг) была оценена при внутрибрюшинном введении белым нелинейным мышам-самцам массой 18-22 г дифенилфосфинилметангидразида (ДФМГ) и препарата сравнения дифенилфосфинилэтангидразида (ДФЭГ), которые вводили в виде водного раствора из расчета 0,1 мл на 10 г массы животного в возрастающих дозах. В Таблице 1 приведены ЛД(мг/кг) для ДФМГ и ДФЭГ для мышей.
100
Для дифенилфосфинилэтангидразида ЛД составляет 400 мг/кг, минимальная токсическая доза составляет 200 мг/кг.
100
Для дифенилфосфинилметангидразида: ЛД составляет 2500 мг/кг, минимальная токсическая доза составляет 900 мг/кг.
Общая картина при определении «острой» токсичности в летальных дозах - общее угнетение, частое поверхностное дыхание, снижение двигательной активности.
Анксиолитическое действие (противотревожное) выражается в уменьшении беспокойства, тревоги, страха, снижении эмоциональной напряженности.
Для выявления у дифенилфосфинилметангидразида анксиолитической активности были использованы следующие поведенческие тесты:
А) Тест "Приподнятый крестообразный лабиринт" распространенный тест для оценки тревожного поведения у лабораторных животных (грызунов) на специальной установке (производитель НПК «Открытая наука», Россия). Согласно Протоколу проведения эксперимента, за 5 минут тестирования регистрировали время нахождения в открытых рукавах (ОР) или же закрытых рукавах (ЗР) модели, как показатель анксиолитического (противотревожного) действия.
Тест является информативной методикой, позволяющей адекватно оценивать биологическое действие потенциальных лекарственных средств и позиционируется как одна из наиболее чувствительных моделей для исследования тревожности животного. В этом тесте оценивают степень выраженности эмоциональной реакции страха и тревоги.
К регистрируемым в "Приподнятом крестообразном лабиринте" показателям уровня тревожности относят длительность пребывания животных в «открытых» и «закрытых» рукавах лабиринта. Чем меньше у животного выражена реакция тревоги, тем больший период времени наблюдения оно проводит в открытых рукавах и реже посещает закрытые. Увеличение времени нахождения в открытых рукавах характеризует о наличии анксиолитической активности у исследуемых соединений.
50
50
При проведении исследований в лабиринте соединения дифенилфосфинилметангидразид (ДФМГ) и дифенилфосфинилэтангидразид (ДФЭГ) (фосеназид) вводили белым нелинейным мышам-самцам внутрибрюшинно в дозах 1/100 и 1/50 от LD за 30 минут до начала тестирования. Контрольным животным внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме (0,1 мл на 10 г массы животного) за 30 минут до тестирования. Результаты поведения мышей в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» представлены в таблице 2. Установлено, что продолжительность времени пребывания мышей в «открытых» рукавах крестообразного лабиринта увеличивалась, а в «закрытых» рукавах снижалась при введении дифенилфосфинилметангидразида в дозе 1/50 от LD.
Также были проведены исследования с использованием теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» на трансгенных мышах-самцах возраста 7,5 мес. с моделью болезни Альцгеймера (БА) с экспрессией мутантных человеческих генов белка предшественника β-амилоида и пресенелина-1 (генотип B6CЗ-Tg(APP695)85Dbo Tg(PSENI)85Dbo). Результаты экспериментов представлены в таблице 3.
50
Было установлено увеличение времени пребывания в ЗР на 48% (р<0.05) животных с БА без лечения. При введении дифенилфосфинилметангидразида наблюдалось снижение времени нахождения в ЗР на 62,14% и 49,21% соответственно для доз 1/100 и 1/50 от LD по сравнению с трансгенными животными с моделью болезни Альцгеймера (БА) без лечения, что подтверждает значительное снижение тревожности животных.
Б) Тест «Конфликтная ситуация с водной депривацией» в варианте Vogel (Vogel J. et. al., 1971) основан на столкновении двух мотиваций у грызунов - питьевой и оборонительной - страха наказания при попытке удовлетворения питьевой потребности, создаваемая путем подавления болевым электрическим раздражителем питьевого рефлекса при потреблении грызунами воды из трубки-поилки.
Конфликтная ситуация моделировалась на третий день, после 48-часовой питьевой депривации в камере, снабженной поилкой и полом, через который имеется возможность наносить электроболевое раздражение лап. Через 10 секунд после первого взятия воды каждая попытка питья становилась наказуемой (на электродный пол камеры подавали постоянный ток силой 0,25 мА). Тест проводили в течение 10 минут. Оценивалось число наказуемых взятий воды за 10 минут нахождения в камере. Увеличение числа подходов к поилке и взятий воды оценивается как показатель анксиолитического действия препаратов.
50
Результаты эксперимента представлены в таблице 4. Наличие анксиолитической активности дифенилфосфинилметангидразида было выявлено в дозе, составляющей 1/100 от LD., при введении которой отмечалось увеличение количества подходов и взятий воды из поилки. В данном эксперименте фосеназид активности не проявил.
В) Тест «Темно-светлая камера» использует естественное стремление грызунов избегать ярко освещенных мест и по идеологии близок к тесту приподнятого крестообразного лабиринта. Животных помещают в ярко освещенный отсек двухкамерной светлой/темной установки и в течение 5 мин регистрируют длительность пребывания в светлом и темном отсеках. Соединения с анксиолитической активностью способны увеличивать длительность нахождения животных в светлом отсеке.
50
В таблице 5 представлены результаты оценки поведения мышей в тесте «Темно-светлая камера» после введения соединений. Введение дифенилфосфинилметангидразида (ДФМГ) в дозе 1/100 от LD, в отличие от дифенилфосфинилэтангидразида (фосеназида), привело к увеличению времени нахождения мышей в светлой части камеры, что также свидетельствует о наличии у дифенилфосфинилметангидразида -анксиолитической активности.
Для изучения способности дифенилфосфинилметангидразида корригировать нарушенное поведение при аутизме использовали метод оценки обсессивно-компульсивного расстройства у крыс, связанного с навязчивыми идеями и действиями - тест «Закапывание шариков». Животное помещали в подготовленную клетку с шариками и оставляли на 30 мин., после чего аккуратно извлекали и проводили подсчет шариков, закопанных более чем на 2/3. Количество закопанных шариков отражает выраженность стереотипного поведения животного. В качестве модели расстройств аутистического спектра (РАС) была использована вальпроатная модель аутизма (ВМА) у крыс.
50
Результаты эксперимента представлены в таблице 6. При введении дифенилфосфинилметангидразида в дозе, составляющей 1/100 от LD, в отличие от фосеназида, наблюдалось уменьшение количество закопанных шариков по сравнению с крысами группы без лечения. Данный показатель был приближен к показателям группы контрольных животных. Также стоит отметить, что такая тенденция наблюдалась как в группе самок, так и самцов. Это свидетельствует о наличии у дифенилфосфинилметангидразида положительного влияния на один из основных симптомов аутизма -стереотипное поведение.
50
Для оценки противовоспалительного действия использовали общепринятую модель воспаления - субплантарное введение каррагенина - лямда (Sigma) в заднюю лапу в объеме 0,1 мл 1% раствора. Величину отека определяли по разнице объема до введения провоспалительного агента и через 1, 2, 3, 4, 6 и 24 часов после его введения путем опускания лапы животного до тибиотарзального сустава в сосуд плетизмометра IITC Life Science (США). Введение дифенилфосфинилметангидразида и фосеназида осуществляли внутрибрюшинно за 30 минут до введения противовоспалительного агента в дозе 1/100 от LD. Также был проведен эксперимент, при котором исследуемые соединения вводили в течение 14 дней (многократное введение), после чего было проведено тестирование на модели каррагенинового отека.
50
Значимое снижение прироста объема лап мышей относительно контрольных животных наблюдалось при введении дифенилфосфинилметангидразида в дозе 1/100 от ЛД уже к третьему часу эксперимента, см. таблица 7, а также прослеживалось во всех временных точках после двухнедельного введения. Таким образом, противовоспалительная активность соединения проявляется и при однократном и при многократном (в течение 2-х недель) введении.
Таким образом, сравнительная оценка биологической активности и «острой» токсичности ДФМГ с ближайшим аналогом - ДФЭГ (фосеназидом), представленная экспериментальными результатами, свидетельствует о выраженных его преимуществах: при высокой эффективности дифенилфосфинилметангидразид имеет в 5 раз более низкую токсичность, а также значительно более широкий спектр фармакологической активности: выраженную анксиолитическую активность, в том числе на трансгенных мышах с моделью болезни Альцгеймера, противовоспалительную активность, а также способность корригировать нарушенное поведение при аутизме.