Исследование кальцификации материала на основе подслизистой тонкой кишки in viтrо

УДК 57.085.22

О. С. Митякина, А. Г. Бражникова, И. В. Орлова, Е. В. Баканова, А. Д. Кручинина, А. А. Венедиктов

ИССЛЕДОВАНИЕ КАЛЬЦИФИКАЦИИ МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ ПОДСЛИЗИСТОЙ ТОНКОЙ КИШКИ IN VITRO

Аннотация. В связи с распространенностью сердечно-сосудистых заболеваний и постоянным совершенствованием методов их лечения разработка новых материалов и медицинских изделий для сердечнососудистой хирургии является перспективным направлением исследований. Одним из таких медицинских изделий является окклюдер. Синтетические материалы, используемые для изготовления мембраны окклюдера, обладают рядом недостатков, поэтому актуальным представляется разработка такого материала для мембраны на основе биоткани, который будет обладать лучшими биоинтегративными характеристиками. Целью исследования являлась разработка внеклеточного коллагенового матрикса на основе подслизистой тонкой кишки свиньи и оценка его кальцификации в условиях in vitro. В ходе эксперимента образцы с тремя различными типами обработки инкубировали при 37 °C в растворе Рингера в течение четырех и восьми недель. Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение 20 % этилового спирта при дегидратации материала приводит к усилению кальцификации образцов, а повышение концентрации сшивающего агента на этапе стабилизации материала вызывает снижение кальцификации образцов. Таким образом, был получен материал, представляющий собой внеклеточный колла-геновый матрикс на основе подслизистой тонкой кишки свиньи, обладающий меньшей склонностью к кальцификации по сравнению с синтетическими материалами.

Ключевые слова: подслизистая тонкой кишки свиньи, кальцификация, окклюдер.

Введение

В настоящее время заболевания сердца и кровеносных сосудов стоят на первом месте среди причин инвалидности и смертности населения [1]. В связи с этим актуальным является поиск новых подходов к их лечению, разработка инновационных материалов для создания протезов и трансплантатов для кардиохирургии.

Транскатетерные (эндоваскулярные) методы лечения являются альтернативой операциям на «открытом» сердце [2]. Их преимущества перед классическим хирургическим лечением очевидны: отсутствие операционной травмы и необходимости в искусственном кровообращении, короткий послеоперационный период [3].

Для закрытия дефектов межпредсердной и межжелудочковой перегородок, а также открытого овального отверстия применяют окклюдер [4] - специальное микроустройство, которое вводится в организм через бедренную артерию и по кровеносным сосудам доставляется к сердцу, устанавливается в место отверстия и раскрывается, выполняя таким образом роль «заплатки» [2].

Окклюдер состоит из двух соединенных между собой проволочных дисков. Основой каждого диска является сеть плотного плетения, состоящая из нитиноловых нитей [5], изготовленных из никель-титанового сплава (55 % никеля и 45 % титана). Этот сплав не реагирует с кровью и не отторгается организмом. Оба диска соединены между собой перешейком, который соответствует размеру дефекта [2].

В качестве мембраны окклюдера используются различные синтетические материалы (полиэфирное волокно, тефлон, мембрана из поливинилового спирта, дакрон, поли-капролактон), которые обладают рядом существенных недостатков, а именно низкой скоростью биоинтеграции и высокой степенью кальцификации [6], что делает изделие непригодным для использования в клинической практике.

Кальцификация - отложение солей кальция на материале. Вследствие этого происходит минерализация органических матриц при образовании природных кристаллов, и медицинские изделия теряют свои функциональные свойства [7]. На накопление кальция влияет целый ряд факторов, в том числе и физико-химические свойства материала имплантата. С увеличением его гидрофобности и шероховатости увеличивается количество адсорбированных белков и липидов, а это влияет на избирательность к адсорбции и десорбции комплексов кальция [8].

В настоящее время активно ведется разработка и изучение новых материалов для реконструктивной хирургии на основе ксеноперикарда крупного рогатого скота [9]. Использование биоматериалов в качестве мембраны окклюдера позволило бы устранить недостатки, связанные с применением искусственных материалов. В настоящее время ведется разработка окклюдера с биодеградируемой мембраной на основе подслизистой тонкой кишки свиньи (ООО «НаноМед», ООО «Кардиоплант»).

Целью данной работы является исследование кальцификации материалов на основе подслизистой тонкой кишки свиньи in vitro.

Материалы и методы исследования

Подслизистая тонкой кишки свиньи представляет собой слой рыхлой соединительной ткани, располагающийся между мышечной и слизистой оболочками. Она играет важную роль в обеспечении фиксации слизистой оболочки [10]. Благодаря ей слизистая оболочка подвижна относительно мышечной оболочки и обладает возможностью образовывать складки [11].

Ее толщина составляет приблизительно 0,05-0,22 мм. Подслизистый слой имеет переменную пористую структуру с порами от 20 до 30 мкм, что способствует диффузии кислорода, необходимого для поддержания пролиферации и жизнеспособности клеток. Подслизистый слой состоит в основном из коллагеновых волокон типа I, но также он еще содержит небольшие количества эластина и коллагена типов III, IV и VI [12].

Преимуществами биоматериала на основе ПТК являются: биодеградация, гемоста-тическая способность, высокая биоинтеграция, низкая скорость кальцификации по сравнению с синтетическими материалами [13].

Модифицированная подслизистая тонкой кишки свиньи представляет собой внеклеточный коллагеновый матрикс. Процесс его изготовления включает в себя первичную обработку материала, которая заключается в заборе биоматериала, первичной очистке и отбраковке; химико-ферментативную обработку растворами солей с возрастающими концентрациями; ферментативную обработку с последующей выдержкой в растворах солей (Патент на изобретение РФ № 2197818 от 28.10.2008); стабилизацию с использованием сшивающего агента и лиофилизацию.

В ходе эксперимента было выполнено три различных обработки биоматериала, отличающиеся между собой наличием или отсутствием этанола в качестве агента для дегидратации и концентрацией сшивающего агента на этапе стабилизации:

- I обработка - двухслойные образцы, дегидратация без С2Н5ОН, стабилизация в 0,1 мМ растворе сшивающего агента;

- II обработка - двухслойные образцы, дегидратация с 20 % С2Н5ОН, стабилизация в 0,1 мМ растворе сшивающего агента;

- III обработка - двухслойные образцы, дегидратация с 20 % С2Н5ОН, стабилизация в 0,5 мМ растворе сшивающего агента.

В качестве модельной среды для изучения кальцификации материалов in vitro использовали раствор Рингера. 20 образцов каждого материала размером 2x2 см инкубировали в растворе при 37 оС в течение четырех и восьми недель, каждую неделю проводили смену растворов. После извлечения из модельной среды образцы высушивали до постоянной массы, определяли ее значение и затем подвергали сухому озолению в му-

фельной печи при температуре 525 оС. Последующее количественное определение кальция в растворе проводили с использованием наборов клинико-лабораторной диагностики (Ольвекс диагностикум). Принцип метода: ионы кальция в щелочной среде образуют с о-крезолфталеинкомплексоном окрашенный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция и измеряется спектрофотометрически при помощи спектрофотометра иУш1п1-1240 (Shimadzu, Япония) на длине волны 278 нм. Для анализа полученных результатов использовали ЭБ-критерий и 1>критерий Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

После проведения химико-ферментативной обработки материал на основе подсли-

О О г' о о о

зистой тонкой кишки свиньи представляет собой внеклеточный коллагеновый матрикс. Результаты гистологического контроля подтверждают отсутствие клеточных элементов и сохранность коллагеновых и эластических волокон (рис. 1).

а) б)

Рис. 1. Подслизистая тонкой кишки свиньи после химико-ферментативной обработки: а - окраска гематоксилин-эозин, х200; б - окраска по Вейгерт-Ван-Гизону, х200

Результаты исследования по изучению кальцификации материалов на основе под-слизистой тонкой кишки свиньи представлены на рис. 2.

После первого месяца инкубации образцов в растворе Рингера наименьшее количество кальция обнаружено в образцах с I обработкой, в образцах со II и III обработками больше на 90 и 54 % соответственно. Через два месяца инкубации содержание кальция увеличивается во всех по сравнению с первым месяцем инкубации. Однако наименьшее количество кальция обнаружено в образцах с I обработкой, в образцах со II обработкой кальция на 60 % больше. Через два месяца инкубации образцов в растворе Рингера отличия между образцами с I и III обработками не выявлены.

Согласно полученным данным, при увеличении сроков инкубации количество кальция в образцах увеличивается. При этом минимальной скоростью накопления Ca2+ обладают образцы биоматериала с I обработкой. Также можно отметить, что применение 20 % этилового спирта в качестве агента для дегидратации приводит к усилению кальцифика-ции образцов, а повышение концентрации сшивающего агента на этапе стабилизации материала вызывает снижение кальцификации образцов.

Согласно литературным данным, количество кальция в синтетических материалах после моделирования кальцификации in vitro составляет около 70 мг/г сухой ткани, что выше показателей материала на основе подслизистой тонкой кишки свиньи в 28 раз [14].

мг/ г ткани

i месяц 2 месяца

I обработка  II обработка  III обработка

Рис. 2. Содержание Ca2+ в образцах внеклеточного коллагенового матрикса на основе подслизистой тонкой кишки (1 мг на 1 г ткани, M ± m, n = 10): *** - p < 0,001 относительно I обработки, ### - p < 0,001 относительно II обработки

Заключение

Таким образом, нами был получен внеклеточный коллагеновый матрикс на основе

подслизистой тонкой кишки, обладающий низкой скоростью кальцификации по сравнению с синтетическими материалами.

Список литературы

1. Кладов, С. Ю. Смертность от заболеваний сердечно-сосудистой системы и внешних причин в условиях среднеурбанизированной территории Западной Сибири / С. Ю. Кладов // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - № 1-2. - С. 43-46.

2. Лечение врожденных пороков сердца у детей эндоваскулярным способом с помощью системы Amplatzer (случай из практики) / Г. Э. Сухарева, В. И. Садовой, А. А. Мкртчян, И. Б. Зюкова, В. А. Фурсова // Кримський терапевтичний журнал. - 2012. - № 2. - С. 150-152.

3. Бегун, П. И. Биохимическое моделирование объектов протезирования / П. И. Бегун. - СПб. : Политехника, 2011. - 464 с.

4. Бхамбхани, А. Чрезкожное закрытие внутрисердечных шунтов и ушка левого предсердия / А. Бхамбхани, Б. Майер // Международный журнал интервенционной кардиоангиологии. -2006. - № 11. - С. 31-40.

5. Машура, Й. Эндоваскулярная коррекция врожденных патологических сообщений между камерами сердца окклюдерами системы Amplatzer / Й. Машура // Международный журнал интервенционной кардиоангиологии. - 2006. - № 11. - С. 20-30.

6. Hybrid small-diameter vascular grafts: Anti-expansion effect of electrospun poly s-capro-lactone on heparin-coated decellularized matrices / W. Gong, D. Lei, S. Li, P. Huang, Q. Qi, Y. Sun, Y. Zhang, Z. Wang, Z. You, X. Ye, Q. Zhao // Biomaterials. - 2015. - № 76. - С. 359-370.

7. Севастьянов, В. И. Биосовместимость / В. И. Севастьянов. - М. : ИЦ ВНИИ геосистем., 1999. -366 с.

8. Петрова, М. В. Апоптическая децеллюляризация как способ предотвращения деструктивных изменений в биологических протезах сердечных клапанов / М. В. Петрова // Таврический медико-биологический вестник. - 2012. - № 3 (ч. 1). - С. 267-269.

9. Изучение in viw свойств ксеноперикарда, прошедшего различную обработку химико-ферментативным методом / О. В. Калмин, Л. В. Живаева, А. А. Венедиктов, Д. В. Никишин, В. К. Фуки, М. Т. Генгин // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2013. - № 2 (26). - С. 15-26.

10. Гайворонский, И. В. Нормальная анатомия человека / И. В. Гайворонский. - СПб. : СпецЛит, 2013. - Т. 1. - 561 с.

11. Билич, Г. Л. Анатомия человека / Г. Л. Билич, В. А. Крыжановский. - М. : Эксмо, 2012. - 224 с.

12. Shi, L. Biochemical and biomechanical characterization of porcine small intestinal submucosa (SIS): a mini review / L. Shi and V. Ronfard // Int J Burns Trauma. - 2013. - № 3 (4). - С. 173-179.

13. Lam, M. T. Biomaterial applications in cardiovascular tissue repair and regeneration / M. T. Lam, J. C. Wu // Expert Rev Cardiovasc Ther. - 2012. - № 10 (8). - С. 1039-1049.

14. Роль шовного материала в кальцификации кардиоваскулярных биопротезов / Ю. А. Кудрявцева, М. В. Насонова, Т. Н. Акентьева, А. Ю. Бураго, И. Ю. Журавлева // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний. - 2013. - № 4. - С. 22-27.

Митякина Ольга Сергеевна

студентка,

Пензенский государственный университет E-mail: mitiakina95@mail.ru

Бражникова Анна Григорьевна

студентка,

Пензенский государственный университет E-mail: anya_brazhnikova@mail.ru

Орлова Ирина Витальевна

студентка,

Пензенский государственный университет E-mail: orlova.irina.000@mail.ru

Баканова Елена Владимировна

студентка,

Пензенский государственный университет E-mail: andreashka_95@mail.ru

Кручинина Анастасия Дмитриевна

ассистент,

кафедра общей биологии и биохимии, Пензенский государственный университет E-mail: A.D.Kruchinina@mail.ru

Mityakina Ol'ga Sergeevna

student,

Penza State University

Brazhnikova Anna Grigor'evna

student,

Penza State University

Orlova Irina Vital'evna

student,

Penza State University

Bakanova Elena Vladimirovna

student,

Penza State University

Kruchinina Anastasiya Dmitrievna

assistant,

sub-department of general biology and biochemistry, Penza State University

Венедиктов Алексей Александрович

кандидат биологических наук, управляющий ООО «Кардиоплант» E-mail: Venediktovpenza@gmail.com

Venediktov Aleksey Aleksandrovich

candidate of biological sciences, manager of LLC "Kardioplant"

УДК 57.085.22

Исследование кальцификации материала на основе подслизистой тонкой кишки in vitro /

О. С. Митякина, А. Г. Бражникова, И. В. Орлова, Е. В. Баканова, А. Д. Кручинина, А. А. Венедиктов // Вестник Пензенского государственного университета. - 2016. - № 2 (14). - C. 86-90.