Использование аллельных вариантов генов pks15 и pe_pgrs54 в качестве маркера повышенной вирулентности Mycobacterium tuberculosis в отношении людей с пониженным иммунитетом
USE OF ALLELIC VERSIONS OF PKS15 AND PE_PGRS54 GENES AS A MARKER OF INCREASED VIRULENCE OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS IN RELATION TO PEOPLE WITH LOW IMMUNITY

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине, фтизиатрии и медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации штаммов Mycobacterium, преимущественно поражающих людей с пониженным иммунитетом при работе с пациентами. Уровень техники
В последние годы в иммунном статусе населения произошли глобальные изменения, вызванные распространением сопровождающихся угнетением иммунитета заболеваний (ВИЧ, гепатит, сахарный диабет), увеличением стрессовой нагрузки и ухудшением экологической обстановки, а также старением населения и распространением вредных привычек [Boule LA, Kovacs EJ. 2017. Alcohol, aging, and innate immunity. J Leukoc Biol 102(1):41-55.]. В этих условиях туберкулез приобретает все большее распространение. По данным ВОЗ, носителями Mycobacterium tuberculosis являются более трети население Земли [WHO Global Tuberculosis Report 2018].
Вероятность манифестации заболевания зависит от ряда факторов, главными из которых являются иммунный статус хозяина и вирулентность возбудителя, являющаяся различной у разных линий [Coscolla М, Gagneux S. 2014. Consequences of genomic diversity in Mycobacterium tuberculosis. Semin Immunol 26:441-444.]. Определенную роль играет также их взаимное сочетание. Клинические проявления и эпидемиология ТБ определяются балансом между иммунной системой хозяина, системами вирулентности патогена и его адаптации. [Cobat A. et al. Host genomics and control of tuberculosis infection. Public Health Genomics. 2013; 16(1-2): 44-9]. Под вирулентностью подразумевают способность микроорганизма заражать организм-хозяина, преодолевая его защитные системы.
Вирулентность определяется целым рядом генов и может варьировать у различных линий М. tuberculosis. В их число входят гены, детерминирующие биосинтез миколовых кислот, трансляционные регуляторы WhiB, серин-треониновые протеинкиназы, гены, кодирующие системы секреции VII типа, гены систем токсин-антитоксин и т.д. Их продукты задействованы на различных стадиях инфекционного процесса и позволяют осуществлять колонизацию слизистой хозяина, внедряться в клетки, избегать ответа иммунной системы, переживать неблагоприятные условия и т.д. [Prozorov АА, Fedorova IA, Bekker OB, Danilenko VN. 2014 The virulence factors of Mycobacterium tuberculosis: genetic control, new conceptions. Genetika. 50 (8): 885-908; Forrellad MA, Klepp LI,  A, Sabio у Garcia J, Morbidoni HR, de la Paz Santangelo M, Cataldi AA, Bigi F. 2013.Virulence factors of the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence 4(1):3-66. doi: 10.4161/viru.22329]. Одной из причин вариативности вирулентности является ряд мутаций в генах, кодирующих факторы вирулентности, поскольку мутации в данных генах могут приводить к изменению свойств белка, и, как следствие, к изменению профиля вирулентности. Таким образом, генетические вариации как патогена, так и хозяина, состояние иммунной системы хозяина, а также сочетание этих факторов могут оказывать влияние на предрасположенность и течение заболевания [Даниленко В.Н. Разработка технологической платформы для создания инновационных противотуберкулезных препаратов, активных в отношении штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. Вестник РАН, 2019].
Этот факт позволяет сделать предположение о существовании линий, адаптированных к людям с пониженным иммунитетом [Mikheecheva NE, Zaychikova MV, Melerzanov AV, Danilenko VN. A nonsynonymous SNP catalog of Mycobacterium tuberculosis virulence genes and its use for detecting new potentially virulent sublineages. 2017.Genome Biol Evol9(4): 887-899. doi: 10.1093/gbe/evx053.].
В связи с этим важным является поиск новых мутаций в генах, задействованных в патогенезе - маркеров вирулентности и адаптации патогена к организму с определенным иммунным статусом.
При проведении подобных исследований была обнаружена связь между мутациями в гене pks15 (rv2947c) и усилением фенотипа патогенности, вирулентности и лекарственной устойчивости М. tuberculosis. [Constant Р, Perez Е, Malaga W,  MA, Saurel O,  M, et al. Role of the pks15/1 gene in the biosynthesis of phenolglycolipids in the Mycobacterium tuberculosis complex: Evidence that all strains synthesize glycosylated p-hydroxybenzoic methyl esters and that strains devoid of phenolglycolipids harbor a frameshift. J Biol Chem. 2002.]. Инсерция 7 нуклеотидов приводит к активации слитого белка Pks 15/1, ответственного за синтез фенольного гликолипида, ответственного за модуляцию иммунного ответа хозяина. Данная мутация ранее была обнаружена у высоковирулентных штаммов в Азии [Pang JM, Layre Е, Sweet L, Sherrid A, Moody DB, Ojha A, et al. The polyketide pksl contributes to biofilm formation in Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol. 2012; Zenteno-Cuevas R, Hernandez-Morales RJ,  LM,  R, Santiago- Garcia J. A rapid PCR assay to characterize the intact pks15/1 gene, a virulence marker in Mycobacterium tuberculosis. J Microbiol Methods. 2016. Vol. 121:33-35].
Еще одним семейством белков, вовлеченных в модуляцию иммунного ответа хозяина и выживание клеток патогена в макрофагах, являются белки Рре. Они участвуют в защите от окислительного стресса в лизосоме, индукции апоптоза, модулируют активность цитокинов [Li Y, Miltner Е, Wu М, Petrofsky М, Bermudez LE. А Mycobacterium avium РРЕ gene is associated with the ability of the bacterium to grow in macrophages and virulence in mice. Cell Microbiol. 2005; 7:539-48; Basu S, Pathak SK, Banerjee A, Pathak S, Bhattacharyya A, Yang Z, et al. Execution of macrophage apoptosis by PE_PGRS33 of Mycobacterium tuberculosis is mediated by Toll-like receptor 2-dependent release of tumor necrosis factor-alpha. J Biol Chem. 2007; 282:1039-50.]
Однако связь между штаммами с мутациями в указанных генах и иммунным статусом пациентов до настоящего времени не была известна. В данном изобретении осуществлен поиск подобной корреляции. Обнаруженные мутации могут быть использованы в будущем для создания диагностических наборов, предназначенных для определения потенциально более вирулентных линий М. tuberculosis, что является принципиально новым подходом в связи с отсутствием в настоящее время диагностикумов, дающих возможность детектировать высоковирулентные линии.
Раскрытие изобретения
Использованные подходы
Создание охарактеризованной коллекции геномов
В последние годы для эпидемиологических исследований, а также с целью изучения природы и механизмов формирования множественной и широкой лекарственной устойчивости широко используются подходы, основанные на биоинформатическом анализе однонуклеотидных полиморфизмов в секвенированных и охарактеризованных геномах М. tuberculosis различных линий и суб линий. Идентифицированы десятки тысяч полиморфизмов, чаще всего эволюционно ассоциированных с различными линиями и сублиниями [Coll F. et al. A robust SNP barcode for typing Mycobacterium tuberculosis complex strains. Nat Commun. 2014. 1; 5:4812; Merker M. et al. Evolutionary history and global spread of the Mycobacterium tuberculosis Beijing lineage. Nat Genet. 2015; 47(3):242-249]. Тем не менее, в подавляющем большинстве случаев данные исследования проводятся в отрыве от исследований состояния здоровья пациентов, и, несмотря на наличие в базах данных значительного числа секвенированных геномов, сопутствующие к ним данные часто отсутствуют, что делает бесполезным попытки анализа генома в привязке к клинической картине и характеру вызываемого процесса.
Принципиально новым элементом, предлагаемым авторами данного изобретения, является использование созданной в лаборатории коллекции геномов М. tuberculosis, охарактеризованных по источнику выделения (анамнезу пациентов). Коллекция включает 100 образцов, выделенных у пациентов с различным иммунным статусом и относящихся к распространенной в России эволюционно молодой линии Beijing-B0. Данные геномы были секвенированы и подвергнуты анализу однонуклеотидных замены в генах вирулентности. В ходе работы предполагается обнаружить связь мутаций в генах pks15 и рре24 вирулентностью возбудителя туберкулеза, а также иммунным статусом пациентов.
Секвенирование осуществлялось на платформе HiSeq2500 в режиме Rapid Run. еквенированные геномы были депонированы в международную базу данных GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA509547).
Поиск мутаций в генах pks15 и PE_PGRS54
Полученные прочтения выравнивали при помощи программы BWA-MEM [Li Н. and Durbin R. (2010) Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler Transform. Bioinformatics, Epub.] на референсный геном M. tuberculosis H37Rv (NC_000962.3). Для сбора метрики сборки использовали утилиту Picard, команда CollectWgsMetrics. Среднее покрытие составило 137,4.
Для выявления однонуклеотидных замен создвали multiple pileup (.mpileup файл) при помощи SAMtools [Li Н. Bioinformatics. 2011 Nov 1; 27(21):2987-93. Epub 2011 Sep 8.] команды mpileup с опциями (-В -f), затем определяли варианты программой VarScan 2.3.9 с опциями (--min-avgqual 30--min-var-freq 0.80 --p-value 0.01 --output-vcf 1). Всего было получено 3405 вариантных позиций, прошедших фильтр. Для дальнейшего анализа отбирали однонуклеотидные замены, не присутствующие во всех геномах (убирали замены, характерные для линии Beijing B0/W- 148). Для аннотации использовали скрипт vcf_annotate.pl, ранее разработанный сотрудниками лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН.
Поиск корреляции обнаруженных мутаций с иммунокомпрометирующим состоянием пациента-источника.
Для поиска молодых эпидемиологически опасных филогенетических сублиний в составе филогенетической линии Beijing-B0 древо было разделено на 7 гомогенных групп.
Для каждой группы было проведено исследование на предмет сопряженности/корреляции/ассоциации с иммунокомпрометирующим состоянием пациента-источника - как фактором риска и таргетным для создания диагностикума для детекции эпидемиологически-опасных линий в России. На Рисунке 1 представлено древо решений для поиска мутаций, ассоциированных с ИД пациента-источника и лекарственной устойчивостью.
Другим подходом для поиска мутаций в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, являлся целевой поиск мутации/ий, непосредственно связанных с эпидемиологически опасными штаммами, ассоциированными с ИД пациента-источника. Для этого нами было применен схожий алгоритм поиска. На Рисунке 2 представлено древо решений для поиска мутаций, ассоциированных с ИД пациента-источника и лекарственной устойчивостью.
Разработка олигонуклеотидов для идентификации маркерных мутаций
Для идентификации данных мутаций in vitro был выбран стандартный метод ПЦР с последующим секвенированием ампликонов. Были разработаны олигонуклеотиды-праймеры к участкам генов, содержащим маркерные мутации, отвечающие основным требованиям (универсальность и высокая специфичность). Для выбора праймеров учтены требования к длине фрагмента ДНК в случае применения различных методик секвенирования.
Последовательности олигонуклеотидов представлены в приложении 1.
Осуществление изобретения
2
При выборе для генотипирования режима ПЦР амплификацию ДНК проводят с использованием набора High Fidelity PCR Enzyme Mix («Fermentas») на приборе «Терцик» («ДНК-технология»). Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл 10×ПЦР буфера (10Х High Fidelity PCR Buffer with 15 mM MgCl), 10 мкл смеси 2 mM ΣdNTPs (либо 2 мкл 10 mM ΣdNTPs), 5 мкл DMSO, 0.3 мкг геномной ДНК и 1 мкл (1.25 u) фермента High Fidelity PCR Enzyme Mix-Параметры ПЦР реакции: 98°С в течение 30 сек. (лизис клеток и денатурация геномной ДНК); затем 30 циклов амплификации - 98°С - 10 сек (денатурация), 60°С в течение 10 сек. (отжиг олигонуклеотидов), 72°С - 30 сек. (достройка (элонгация) цепи); финальная элонгация фрагментов при 72°С - 10 мин., хранение при 40°С.
Амплифицированные фрагменты были выделены из агарозного геля с использованием набора JenGet Gel Extraction Kit (Thermo Fisher Scientific, США).. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят аккуратно под масло 1/5 объема раствора 6Х DNA Loading Dye («Fermentas»), перемешивают и 10 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля.. В качестве контроля размера полученного фрагмента используют ДНК маркер GeneRuler™ 50+п.н. («Fermentas»).
Оценка результатов
Пример 1
Формирование коллекции геномной ДНК M.tuberculosis, выделенных у пациентов с известным анамнезом.
Для анализа была сформирована коллекция геномной ДНК М. tuberculosis, выделенных у пациентов с известным анамнезом. В результате проведения полногеномного секвенирования 100 образцов ДНК, клинических изолятов М. tuberculosis на двух дорожках, были получены следующие результаты: Средний G/C состав равен ~65%, что соответствует среднему G/C составу М. tuberculosis - 65,6 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=H37Rv).
Расчет G/C состава проводился с использованием программы FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/proiects/fastqc/). Среднее покрытие на геном составило - Х193,5. Секвенированные геномы были депонированы в международную базу данных NCBI (BioProject: PRJNA509547).
Пример 2
Обнаружение у пациентов кластеров генов, ассоциированных с пониженным иммунитетом.
После разделения изолятов на 7 кластеров, было показано, что один из кластеров (№4), состоящий из 12-ти изолятов, имеет высокую ассоциацию с иммунокомпрометирующим состоянием пациента-источника=0,91 (Рисунок 1). Другие группы изолятов показали либо малую численность (кластер №1-2 изолята), либо низкую ассоциацию с ИД (кластеры 2, 3, 5, 6, 7).
В Таблице 1 приведена информация об ассоциации кластеров с иммунокомпрометацией.
Для данного кластера характерно наличие несинонимичной мутации в гене ре_pgrs54 - G>R (глицин>аргинин) в кодоне 1744.
Кроме того, при проведении анализа нами было обнаружено, что наиболее характерными для ИД пациентов является наличие мутации (инсерции) в гене поликетид синтазы pks15 (rv2947c), приводящая к активации слитого белка Pks15/1, ответственного за синтез иммуномодулирующих пептидов. Данная инсерция известна и описана как значимое полиморфное изменение гена, приводящее к усилению фенотипа патогенности и вирулентности, но ее связь с ИД пациентов показана впервые.
Пример 3
Идентификация маркерного полиморфизма методом ПЦР с последующим секвенированием.
Для проведения ПЦР были использованы олигонуклеотиды, представленные в Таблице 2.
В ходе секвенирования полученных фрагментов установлено, что из 100 изолятов 12 имеют несинонимичную мутацию в гене ре_pgrs54 в ко доне 1744. Указанные 12 изолятов выделены у пациентов с иммунодефицитом. У 16 пациентов детектирована инсерция GCCGCGGC. Из этого числа у семи изолятов присутствуют обе данные мутации, у 5-ти - только мутация в гене ре_pgrs54, у девяти - только инсерция в гене pks15.