Разработка методов фагодиагностики бордетеллёза

ниже на 13,3%, а через 12 мес. - на 30,0%. Многоплодие снизилось на 1,4 и 2,3 поросенка соответственно через 6 и 12 мес. хранения среды без использования сухих компонентов.

При использовании сухих заготовок сред, приготовленных из компонентов, высушенных путем сублимации, показатели через 6 месяцев хранения сред были аналогичными при использовании сред без хранения, а через 12 месяцев они снизились незначительно (оплодотворяемость была ниже на 5,8%, а многоплодие - на 0,1 поросенка).

Заключение.

На основании проведенных исследования можно сделать вывод, что степень влажности компонентов среды для разбавления спермы хряков играет важную роль в сухих заготовках сред, хранящихся длительное время. Установлено, что в заготовках сред происходят окислительные процессы, что сказывается на качестве сред.

При разбавлении средами с высокой влажностью компонентов снижаются качественные показатели спермы и оплодотво-ряемость свиноматок, особенно через 12 мес. хранения заготовок сред.

Поэтому рекомендуем для приготовления сухих заготовок использовать компоненты сред, высушенные при помощи лио-фильной сушки.

Библиографический список

1. Савин, О.К. Влияние технологических и биологических факторов на результативность осеменения свиней охлажденной спермой. Автореферат диссерт. канд. биол. наук. - 1999. - 21с.

2. Методические рекомендации по использованию и хранению синтетических сред для спермы хряков. Москва. - 2002. -22с.

3. Среда для разбавления и хранения спермы хряков. Патент РФ №2062068. -1991.

4. Среда глюкозо-хелатно-цитратно-сульфатная для хранения спермы хряков. ГОСТ 17637-72. Инструкция по использованию.

5. Вишневский Е.П. Влияние влажности воздуха на свойства материалов / Е.П. Вишневский, Г.В. Чепурин // Журнал С.О.К. № 3-4. - 2010.

6. Сажин Б.С. Основы техники сушки. М.- 1984.

УДК 619:578.832.1

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ФАГОДИАГНОСТИКИ БОРДЕТЕЛЛЁЗА

Васильева Юлия Борисовна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиологиявирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»

ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»

432017, г. Ульяновск, б.Новый Венец, 1, e-mail: vet_yulia@mail.ru

Научные исследования проводятся при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы (соглашение № 8267 от 10.08.2012).

Ключевые слова: идентификация, диагностика, Bordetella bronchiseptica, бордетел-лез, бактериофаги

В статье изложены результаты исследований по разработке метода идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью выделенных и изученных бактериофагов

Введение

Отечественными и зарубежными исследовательскими коллективами выделены и описаны бактериофаги бактерий B.bronchiseptica - 214, BPP-1, BMP-1 и BIP-1; В.pertussis - фТ, фК, 134, 41405; B.parapertussis 662-2; В.avium В1 и В2 [1, 2, 3].

Остаются открытыми вопросы изучения взаимодействия фаг - бактерия - макроорганизм. Возможно, бактериофаги участвуют в формировании вирулентных бактерий [3].

Анализ литературных источников показал отсутствие данных по применению методов фагодиагностики бордетеллёза домашних животных.

Выделение и исследование бордетел-лёзных бактериофагов перспективно для изучения механизмов изменчивости и эволюционной адаптации бактерий, а также для разработки методов индикации и идентификации возбудителя.

Целью нашей исследовательской работы явилась разработка методических приёмов фагодиагностики бордетеллёза.

Материалы и методы

Работа была выполнена в научно-исследовательском инновационном центре микробиологии и биотехнологии (НИИЦ-МиБ) «Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина». Для опыта из коллекции музея НИ-ИЦМиБ были взяты 5 референс-штаммов Bordetella bronchiseptica (№ 1, 7, 214, 22067, 8344), 24 штамма близкородственных культур и 8 штаммов выделенных фагов.

В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения, идентификации и индикации бактерий и фагов и соответствующие им среды, оборудование и реагенты [4-9].

Результаты и их обсуждение

На первом этапе исследований мы вели поиск эффективного метода выделения фагов. Исследование штаммов B.bronchiseptica на выявление профага без воздействия на них индуцирующего фактора, выделение фагов из объектов внешней среды и от животных не дало положительных результатов.

Мы апробировали способ выделения

профагов при помощи индуцирующего фактора - ультрафиолетового излучения. Опыты по облучению бактерий УФЛ проводили с изменением параметров экспозиции в минутах и расстояния до объекта в см.

В результате исследований по выделению профага из бактериальных клеток наиболее эффективной показала себя следующая схема:

л и

1 день: посев газоном суточной культуры В.ЬгопсЫзер^са на мясопептонный агар, подсушивание в термостате 10-15 мин, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 5-7 мин. Далее проводили инкубирование чашек Петри с обработанными бактериями в термостате при 37°С в течение суток.

2 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 1 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37°С) на сутки.

3 день: распределение шпателем выросших колоний бактерий по поверхности агара, облучение бактерий УФЛ (длина волны 253 нм) с расстояния 0,5 м, экспозиция 7-10 минут. Помещение чашек Петри в термостат (37°С) на сутки.

4 день: смыв выросших колоний мясо-пептонным бульоном с чашек Петри, помещение в пробирку со штаммами бордетелл. Культивирование в термостате в течение суток.

5 день: обработка хлороформом - 1 часть хлороформа и 10 частей фаголизата в течение 15 минут, центрифугирование при 3000 об/мин - 15 мин. Снятие надосадоч-ной жидкости в стерильную пробирку.

Полученную суспензию мы исследовали методом нанесения капель бактериофага на газон изучаемой культуры [10]. Для этого на поверхность МПА в чашках Петри наносили 0,3 мл 18-часовой культуры. Бактериальную культуру растирали равномерно шпателем по поверхности среды для получения газона. Для подсушивания ставили в термостат на 20 минут. На дне чашек Петри карандашом отмечали одинаковые секторы (по 2 сектора на каждой чашке Петри). На

поверхность подсушенной среды наносили капли исследуемых бактериофагов и наклоняли чашки Петри, чтобы капли стекли. Каждый сектор используется для одного фага. В качестве контроля наносили каплю стерильного МПБ.

6 день: учет результатов. Присутствие бактериофага определяли по наличию зон лизиса.

После выделения бактериофаги пассеровали для повышения их литической активности. В процессе работы нами было выделено 8 фагов B.bronchiseptica.

Далее мы изучили биологические свойства выделенных бактериофагов.

Для определения морфологии негативных колоний мы высевали фаг в разведении 10-8-10-9 на чашки Петри методом агаровых слоев для того, чтобы в используемом

Рис.1 - Морфология негативных колоний фага B.br .-7 УГСХА

Рис. 2 - Морфология негативных колоний фага Б.Ьг.-1 УГСХА

разведении содержание фаговых корпускул в 1 мл не превышало 10-15. Для формирования газона роста культуры на поверхности агара использовали индикаторный штамм B.bronchiseptica № 8344. Посевы культивировали в термостате при температуре 37°С. Изучение морфологии негативных колоний проводили через 24 ч культивирования (рис.

1, 2).

Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизиса, вторичного роста и величине колоний разделили на два типа. К первому типу отнесли круглые прозрачные негативные колонии диаметром более 3 мм с зоной неполного лизиса по периферии, шириной

0,5 - 4 мм или без неё: B.br. - 7 УГСХА, B.br. -22067 УГСХА, B.br. - 214 УГСХА.

Колонии второго типа были круглые прозрачные или полупрозрачные с ровными краями диаметром до 2 мм, к ним отнесены бактериофаги B.br. - 1 УГСХА, B.br. - 10 УГСХА, B.br. - 11 УГСХА, B.br. - 13 УГСХА и B.br. - 8344 УГСХА.

Проведённая селекция выделенных фагов позволила отобрать бактериофаги B.br.-1 УГСХА и B.br.-7 УГСХА, лизирующие 92,5% изученных культур, обладающие высокой литической активностью по Аппель-ману 10-7 - 10-8 , по Грациа 3,1 х 108 - 4,3 х 109 активных корпускул в 1 мл. Выделенные бактериофаги были строго специфичны по отношению к B.Bronchiseptica; проявляли устойчивость при обработке хлороформом (1:10) в течение 30 минут и выдерживали 30 минутное нагревание при 60°С.

Используя строгую специфичность отобранных бактериофагов, мы разработали схему ускоренной идентификации B. Bronchiseptica.

На поверхность МПА пипеткой наносили 3-4 капли бульонной 18-часовой культуры исследуемых микроорганизмов. Нанесённую культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Чашки Петри ставили в термостат для подсушивания на 15 - 20 минут. Чашку Петри делили на три сектора и на поверхность засеянной среды пастеровской пипеткой лёгким прикосновением капли на два сектора

Рис. 3 - Схема постановки реакции нарастания титра фага

Примечание: Реакция считается положительной, если количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри № 1 превышает количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри № 3 в 5 и более раз.

наносили по штамму фагов В.Ьг.-1 УГСХА и В.Ьг.-7 УГСХА, на третий сектор в качестве контроля наносили стерильный МПБ, наклоняли чашку Петри, чтобы капли стекли. Чашки Петри после подсушивания в боксе в

течение 15-20 минут культивировали в термостате при 37°С 18 ч.

Наличие зоны лизиса на сплошном газоне культуры хотя бы одного из фагов указывало на принадлежность исследуемого

штамма к бактериям B.bronchiseptica.

Результаты проведенных опытов показали возможность идентификации B.bronchiseptica с помощью фагов В.Ьг. - 1 УГСХА и В.Ьг. - 7 УГСХА. Длительность исследования составляет 66 ч.

Далее были разработаны оптимальные технологические параметры для изготовления биопрепарата, включающего сочетание фагов В.Ьг.-1 УГСХА и В.Ьг.-7 УГСХА: соотношение количества фаговых корпускул и бактериальных клеток индикаторных штаммов В.bronchiseptica составляет 1:2, время инкубации при температуре 37°С - 7

ч. Для инактивации жизнеспособных бактерий в фаголизате проводится обработка хлороформом в соотношении 1:10 в течение 15 минут.

Далее мы апробировали методику индикации и идентификации B.bronchiseptica реакцией нарастания титра фага (РНФ). Для выявления оптимальных условий РНФ мы определили количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение, установили режимы постановки РНФ (оптимальное время, обеспечивающее наиболее полное взаимодействие корпускул фага с бактериями).

В результате проведенных исследований установлено, что РНФ с предварительным подращиванием материала в течение 7

ч является более чувствительной и составляет 103м.к./мл по сравнению с РНФ без подращивания - 104 м.к./мл.

Таким образом, наиболее оптимальным является режим РНФ при инкубации исследуемого материала с предварительным подращиванием в течение 7 ч, а также 7 ч контакта исследуемого материала с фагом. РНФ позволяет обнаружить B.bronchiseptica в количестве 103 м.к./мл за 26 ч.

РНФ результативно апробировали при индикации В.bronchiseptica в объектах внешней среды, а также из проб биоматериала клинических образцов от животных (рис.3).

В результате проведенных исследований предложен диагностический биопрепарат «В.Ьг.-11 УГСХА», изготовленный на основе бордетеллёзных фагов В.Ьг.-1 УГСХА

и B.br.-7 УГСХА для индикации и идентификации B.bronchiseptica в объектах внешней среды и от предположительно инфицированных животных.

Выводы

Фагоидентификация B. bronchiseptica с помощью индикаторных бактериофагов B.br.-1 УГСХА и B.br.-7 УГСХА занимает 66 часов. Методика фагодиагностики борде-теллёза является высоко специфичной и экономичной.

Реакция нарастания титра фага по технике выполнения является простым и удобным, чувствительным и специфическим методом диагностики, позволяющим в течение 26 ч обнаружить возбудителя в различных субстратах в присутствии посторонней носо-фаренгиальной микрофлоры.

Библиографический список

1. Лапаева, И.А. Бактериофаг Bordetella pertussis / И.А. Лапаева [и др.] // Микробиология - 1980. - Т. 5. -С. 85-90.

2. Лапаева, И.А. Конверсия токсиген-ности коклюшными фагами у Bordetella parapertussis / И.А. Лапаева [и др.] // Микробиология -1982. -Т. 9. - С. 60-64.

3. Liu, M. Reverse Transcriptase-Mediated Tropism Switching in Bordetella Bacteriophage / M. Liu [et al.] // Science. - 2002. - V. 295. - P. 2091- 2094.

4. Адамс, М. Бактериофаги / М. Адамс // М.: Медгиз, 1961. - 521 с.

5. Васильев, Д.А. Учебно-методическое пособие по методам общей бактериологии / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.М. Никишина. - Ульяновск, 1998. - 151 с.

6.Габрилович, И.М. Общая

характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. -Минск. - 1973. - С. 5-24.

7. Золотухин, С.Н. Разработка оптимальных количественных параметров соотношения культуры и фага для получения препаратов с высокой активностью / С.Н. Золотухин, Л.П. Пульчеровская, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. - 2004. - № 12. - С. 50-53.

8. Лабинская, А.С. Микробиология с техников микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. - 394с.