Антибактериальное средство
ANTIBACTERIAL PRODUCT

Изобретение относится к антибактериальному полимерному материалу, содержащему компоненты, способные предотвращать или подавлять возбудителей микробной инфекции.
Устойчивость болезнетворных микроорганизмов к противомикробным препаратам в настоящее время считается глобальной. Повышенная устойчивость к противомикробным препаратам приводит к увеличению заболеваемости и смертности от инфекционных заболеваний во всем мире. Применение синтетических соединений, обладающих антимикробной активностью является в настоящее время актуальной задачей. Полимеры с биоцидными свойствами или полимеры, способные конъюгировать с другими противомикробными соединениями создают возможность для замены существующих малоэффективных противомикробных и противовирусных препаратов.
Из уровня техники известно, что гуанидинсодержащие компоненты определяют химические и физико-химические свойства многих соединений, представляющих медицинский интерес, а гуанидинсодержащие производные составляют очень важный класс терапевтических агентов, подходящих для лечения широкого спектра заболеваний. Соединения, подобные гуанидину, исследовались в течение последних трех десятилетий и принесли пользу в различных областях медицины. Гуанидин проявляет катионные свойства, тем самым открывая возможности взаимодействия с анионным аналогом. Разнообразие боковых цепей гуанидина способствует развитию гуанидинового каркаса для различных терапевтических целей. Соединения, содержащие гуанидин, вызывают интерес и успешно применяются в качестве терапевтических средств для центральной нервной системы, противовоспалительных средств, антитромботических средств, антидиабетических средств и биоцидных средств.
Известен патент на изобретение CN 105566547, описывающий способ получения гуанидинсодержащего полимерного антибактериального средства, основанный на взаимодействии предварительно полученных антибактериального функционализированного малеинового ангидрида и сополимеризованного стирола. Малеиновый ангидрид и дегидратированный спирт смешивают с раствором малеинового ангидрида, массовая доля которого составляет 35%, гидрохлорид гуанидиния и дегидратированный спирт смешивают с раствором гидрохлорида гуанидина, массовая доля которого составляет 42%. Соотношение приготовленного раствора гидрохлорида гуанидина и раствора малеинового ангидрида составляет 1: 1, который подвергается смешению на водяной бане при 75°C. Через 40 минут через полученную смесь пропускают азот, продолжая реакцию перемешивания в течении 6 часов. По окончании процесса, в качестве конечного продукта получают льняной антибактериальный функционализированный малеиновый ангидрид. На втором этапе винилбензол и дегидратированный спирт смешивают с раствором стирола, массовая доля которого составляет 40%. Антибактериальный функционализированный малеиновый ангидрид, предварительно полученный, сушат, а дегидратированный спирт смешивают с раствором функционализированного малеинового ангидрида, массовая доля которого составляет 32%. Полученный раствор смешивают с раствором стирола, добавляют 2% диизопропилазодикарбоксилата. Процесс сополимеризации протекает на водяной бане при температуре 80°C. На выходе реакции получают вязкую жидкость цвета слоновой кости, которую осаждают в дистиллированной воде и получают твердое вещество. Полученное вещество подвергают в вакуумной сушке в течении 18 часов, при 60 °C и давлении 0,2 МПа. Как утверждают авторы настоящего изобретения, обладает высокой антибактериальной способностью, а также невысокой стоимостью компонентов системы, используемых для получения конечного продукта. Основным недостатком данного изобретения является технологическая сложность получения антимикробного полимерного материала.
Наиболее близким аналогом выступает работа авторов Н.А. Сивов и т.д. «Сополимеризация диаллилдиметиламмонийхлорида и метакрилатгуанидина на глубоких степенях превращения». Представленная работа посвящена исследованию сополимеризации диаллилдиметиламмонийхлорида (ДАДМАХ) и метакрилатгуанидина (МАГ) на глубоких степенях превращения для создания новых биоцидных материалов. Исходный МАГ синтезировали по известной методике, разработанной авторами (Н.А. Сивов, и т.д. Метакрилат и акрилатгуанидины: синтез и свойства. Нефтехимия. 2004. Т.1. с. 47-51), а второй сомономер был получен по модифицированной авторами методике (Nedi J., Harada S., Juizuka O.// J. Polymer Sci. A-1. 1967. Vol. 5. Р. 1809). Синтез сополимеров производили по типичной методике радикальной полимеризации в ампулах. Предварительно приготовленные растворы мономеров и инициатора переносили в ампулы, которые вакуумировали, трижды замораживая и дегазируя, после чего ампулы отпаивались и помещались в термостат для проведения сополимеризации при 60 °С.
Задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента полимерных материалов с антибактериальными свойствами, обеспечивающий долгосрочную устойчивость, а также упрощение технологического процесса их получения.
Задача решается путем предварительного получения антибактериальной смеси (АС), при взаимодействии компонентов диаллилдиметиламмонийхлорида (ДАДМАХ), метакрилатгуанидина (МАГ) и N,N-бис(3-аминопропил)-додециламин, при следующем соотношении, масс.%:
ДАДМАХ
70
МАГ
20
N,N-бис(3-аминопропил)-додециламин
10
В качестве МАГ использовалось вещество, синтезированное по известной методике, разработанной авторами Н.А. Сивов, и т.д. (Метакрилат и акрилатгуанидины: синтез и свойства, а используемый ДАДМАХ был получен по методике Nedi J., Harada S., Juizuka O.// J. Polymer Sci. A-1. 1967. Vol. 5. Р. 1809). Антимикробную смесь получают путем механического смешения при комнатной температуре всех представленных компонентов.
Полученная антимикробная смесь затем разбавлялась дистиллированной водой, при следующем количественном соотношении, масс.%:
Дистиллированная вода
85 – 99
Антибактериальная смесь
1 – 15
Изобретение иллюстрирует примеры, приведенные в таблице 1.
Таблица 1. Примеры количественных соотношений компонентов заявленного
средства
<b>Компоненты</b>
<b>Примеры, количественного соотношения</b><b>компонентов, масс.%</b>
<b>1</b>
<b>2</b>
<b>3</b>
<b>4</b>
<b>5</b>
Дистиллированная вода
99
97
93
90
85
Антибактериальная смесь
1
3
7
10
15
7
Для оценки прямого антибактериального действия составов были использованы музейные штаммы золотистого стафилококка (№242,545,643) и кишечной палочки (№131,132). Жидкие бактериальные культуры с концентрацией 10 КОЕ были нанесены на поверхность питательной среды (мясо-пептонный агар, Биотехновация, РФ) на чашке Петри и равномерно распределены по всей поверхности. В заранее обозначенные сектора были нанесены образцы полимеров по 10 мкл. Пробы инкубировали при 37°С 24 ч. Наличие антибактериального эффекта оценивали по появлению зоны лизиса в месте нанесения образца полимера. Для оценки антипротеазной активности использовали качественную биуретовую реакцию. Биуретовая реакция служит для обнаружения пептидных связей (А.Г. Шлейкин, Н.Н. Скворцова, А.Н. Бландов. Биохимия. Лабораторный практикум - СПб.2016.-107 с.). Антипротеазная активность определялась по уменьшению окрашивания образца (сине-фиолетовый цвет). Для качественного определения фосфолипазной активности использовали реакцию по появлению свободной фосфорной кислоты, способной образовывать желтый осадок при нагревании с молибдатом аммония (А.Г. Шлейкин, Н.Н. Скворцова, А.Н. Бландов. Биохимия. Лабораторный практикум - СПб.2016.-107 с.). Фосфолипазная активность определялась по желтому окрашиванию образца. Все эксперименты проводили в трехкратных повторах. Результаты проведенных исследований показали, что прямой антибактериальной активностью обладали 3 образца, по примерам 2,4,5. Диаметр зон лизиса позволяет сделать вывод о более сильной бактерицидной активности 4 и 5 образцов испытуемых составов и менее выраженной активности 2 образца. Выявленная антибактериальная активность проявлялась в отношении грамположительных (Staphyloсossus aureus) и грамотрицательных (Escherichia coli) штаммов. Антибактериальный эффект 2,4,5 образцов, по-видимому, связан с протеолитической активностью, так как в биуретовой реакции активными оказались выше обозначенные полимеры. Фосфолипазная активность была более выражена у 2 и 5 образцов.
Образцы антибактериального средства подвергались исследованию потенциальной вируцидной активности образцов. Исследовали 5 образцов 15% водных растворов антибактериальных средств. Для оценки антипротеазной активности использовали качественную биуретовую реакцию. Биуретовая реакция служит для обнаружения пептидных связей  [А.Г. Шлейкин, Н.Н. Скворцова, А.Н. Бландов. Биохимия. Лабораторный практикум - СПб.2016.-107с.]. Антипротеазная активность определялась по уменьшению окрашивания образца (сине-фиолетовый цвет). Для количественной оценки проводили измерение оптической плотности при 540 нм, на спектрофотометре Genesys 10 Thermo Scientific (CША) (Фиг.1).
Для качественного определения фосфолипазной активности использовали реакцию по появлению свободной фосфорной кислоты, способной образовывать желтый осадок при нагревании с молибдатом аммония [А.Г. Шлейкин, Н.Н. Скворцова, А.Н. Бландов. Биохимия. Лабораторный практикум.-СПб.2016.-107с.]. Фосфолипазная активность определялась по желтому окрашиванию образца. Все эксперименты проводили в трехкратных повторах. С учетом знаний о строении капсида и суперкапсида вирусов, вещества, обладающие протеазной и фосфолипазной активностью, могут рассматриваться в качестве образцов дезинфектантов с потенциально вируцидной активностью. Протеазную активность оценивали с помощью биуретовой реакции. В биуретовой реакции активными оказались 3,4,5 образцы.
Фосфолипазная активность была более выражена у 4, 5 образцов (качественный метод). В связи с наличием наиболее выраженной протеазной активности в сочетании с фосфолипазной активностью потенциально наиболее перспективным в отношении вируцидной активнсоти является 5 образец испытуемого материала.
Образцы антибактериального средства, по примерам 4 и 5 в последующем подвергались исследованию минимальной подавляющей концентрации. Для определения минимальной подавляющей концентрации образцов антибактериальных составов использовали метод аналогичный методу разведений [NCCLS. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; ninth informational supplement M100-S9.- 1999.- V.19.- N.1; Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents. EUCAST Definitive document // Clin Microbiol Infect.- 1998.- V.4.- P.291-296]. Образцы полимеров №4 и №5 разводили в разных концентрациях (15 мг/мл, 10 мг/мл, 5 мг/мл, 1 мг/мл) и вносили в жидкую бактериальную культуру, соответствующую стандарту мутности 0,5 по McFarland (242 S.aureus, 131 E.coli) на 24ч инкубации, после чего производили высев по методу Гольда на чашки Петри с мясо-пептонным агаром. Минимальной подавляющей концентрацией (МПК) считали наименьшую концентрацию образца, после инкубации с которой, рост бактерий не визуализировался. МПК для обоих образцов в отношении грамположительного (S.aureus) и грамотрицательного штамма (E.coli) была 0,1% (1мг/мл).
Образцы антибактериального средства по примерам 4 и 5 подвергались исследованию эффективности обработки образцами различных видов поверхностей. В качестве образцов поверхностей для обработки антибактериальными средствами были выбраны: стекло, полипропиленовый пластик, образец резины, никеле-хромовый образец металлических изделий. Полимеры были нанесены на поверхность в одинаковой концентрации и оставлены до засыхания на 24 ч. при комнатной температуре. На каждый вид поверхности с нанесенным полимером через сутки наносили по 1 мл жидкой бактериальной культуры, соответствующей стандарту мутности 0,5 по McFarland (№242 S.aureus или №131 E.coli). Штаммы бактерий выделены при внутрибольничных инфекциях с различных поверхностей в медицинских учреждениях. Пробы инкубировали 60 минут при постоянном встряхивании при 37°С. По истечении времени инкубации образцы были промыты стерильным физиологическим раствором и была оценена обсемененность поверхностей по методу Гольда. Все исследования с различными штаммами и различными видами поверхностей проводили в повторах. Для исследования динамики антибактериального эффекта были сделаны серии экспериментов аналогичных вышеописанным, но с инкубацией бактериальной культуры на поверхности, обработанной полимером 5, 15, 30 минут с последующей оценкой обсемененности поверхностей по методу Гольда. Все исследования с различными штаммами и различными видами поверхностей проводили в повторах. Для сравнительной характеристики антибактериальной активности образцов полимеров дополнительно были проведены серии экспериментов растворами дезинфектантов, применяемых в настоящее время в медицинских учреждениях: 1% раствор Белизны, Дзержинск, РФ, действующее вещество – активный хлор; 0,25% раствор абактерила, ООО «Рудез», действующие вещества - синергетическая смесь четвертичных аммониевых соединений алкилдиметилбензиламмоний хлорида и алкилдиметилэтилбензиламмоний хлорида (ЧАС) с полигексаметиленгуанидин гидрохлоридом (ПГМГ) и N,N- бис(3-аминопро- пил) додециламином, РФ; 2% «БРИЛЛИАНТ классик» производства ЗАО Центр Профилактики «Гигиена-Мед», Россия, действующие вещества - алкилдиметилбензиламмоний хлорид (АДБАХ) 0.9%, Глутаровый альдегид 0.8%, ПАВы. Для сравнительной характеристики использовали 2 метода: полуколичественный с оценкой диаметра задержки роста при нанесении на поверхность чашки Петри с равномерно распределенной жидкой бактериальной культурой. Количественный метод – в 1 мл 105 б/мл штаммов S.aureus или E.coli вносили дезинфектанты в соответствующих разбавлениях, применяемых в настоящее время для обработки поверхностей в медицинских учреждениях. После 5 минутной инкубации при постоянном встряхивании была оценена концентрация бактерий по методу Гольда. Все исследования проводили в повторах. Для оценки длительности сохранения антибактериальной активности полимеров на поверхностях, были обработаны испытуемыми смесями стерильные стеклянные поверхности и оставлены в помещении на 24, 48, 72 часа. Контролем служили стерильные стеклянные поверхности, не обработанные образцами полимеров. Для оценки обсемененности поверхностей были сделаны мазки стерильным тампонов, смоченным стерильным физиологическим раствором и произведен высев по методу Линцея. Результаты экспериментальных данных представлены в таблице №2.
Таблица 2. Результаты оценки обработки образцами полимеров различных видов
поверхностей
<b>Поверхность</b>
<b>Образец</b><b>полимера</b>
<b>S.aureus</b>
<b>E.coli</b>
Стекло
4
Единичныеколонии
Нет роста
5
Нет роста
Нет роста
Полипропилен
4
Нет роста
Единичныеколонии
5
Нет роста
Нет роста
Резина
4
Нет роста
Единичныеколонии
5
Нет роста
Нет роста
Никеле-хромовое металлическое изделие
4
Единичныеколонии
Единичныеколонии
5
Нет роста
Нет роста
Контроль
-
105 б\мл
105 б\мл
Исследование динамики антибактериального эффекта показало, что антибактериальное средство по изобретению действует уже через 5 минут.
Результаты полуколичественного метода сравнительной оценки антибактериальной активности образцов полимеров и применяемых в настоящее время растворов дезинфектантов (1% раствор Белизны, Дзержинск, РФ; 0,25% раствор абактерила, ООО «Рудез», РФ; 2% «БРИЛЛИАНТ классик» производства ЗАО Центр Профилактики «Гигиена-Мед», Россия, 0,1% растворы №15 и №16 полимеров) представлены в таблице № 3.
Таблица 3. Результаты сравнительной оценки антибактериальной активности образцов полимеров и применяемых в настоящее время растворов дезинфектантов
<b>Дезинфицирующий раствор</b>
<b>S.aureus</b>
<b>E.coli</b>
1% раствор Белизны
105 б /мл
107 б /мл
0,25% раствор абактерила
107 б /мл
107 б /мл
2% «БРИЛЛИАНТ классик»
107 б /мл
107 б /мл
0,1% раствор №4
103 б /мл
105 б /мл
0,1% раствор №5
Нет роста
Нет роста
контроль
105б/мл
107 б /мл
Для оценки длительности сохранения антибактериальной активности полимеров на поверхностях, были обработаны полимерами стерильные стеклянные поверхности и оставлены в помещении на 24, 48, 72 часа.
Антибактериальный эффект образца по примеру 5 сохранялся 48 ч, на 3 сутки  со смыва с поверхности обнаружен рост единичных колоний.
Технический результат – расширение ассортимента полимерных материалов с антибактериальными свойствами, а также упрощение технологического процесса их получения.