ВАКЦИНА ДЛЯ ЗАЩИТЫ ЖВАЧНЫХ ЖИВОТНЫХ ОТ ПНЕВМОНИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ PASTEURELLA MULTOCIDA
VACCINE FOR PROTECTION OF RUMINANT ANIMALS AGAINST PNEUMONIA CAUSED BY PASTEURELLA MULTOCIDA

Настоящее изобретение касается вакцины для защиты жвачных животных от пневмонии, вызываемой Pasteurella Multocida. Изобретение также касается получения такой вакцины и способа защиты жвачных животных от пневмонии, вызываемой Pasteurella multocida.
Бактерии Pasteurella multocida обычно могут вызывать развитие заболевания у диких и одомашненных животных так же, как у людей. Эту бактерию можно обнаружить у домашних птиц, кошачьих, собачьих, кроликов, домашнего скота и свиней. У птиц Pasteurella multocida может вызывать птичью холеру. Pasteurella multocida серотипа А:1 является наиболее часто связанной с птичьей холерой. Pasteurella multocida серотипа D может вызывать атрофический ринит у свиней. Некоторые серотипы, такие как B:2, могут вызывать геморрагическую септицемию, системную инфекцию у жвачных животных, например у крупного рогатого скота (т.е. у животных, которые принадлежат к роду Bos, таких как коровы, кастрированные быки, быки, любой другой рогатый скот, буйволы и т.д.). Бактерия, принадлежащая к серогруппе А, в частности к серотипу А:3, может вызывать пневмонию у жвачных животных, в частности у крупного рогатого скота. Пневмония представляет собой локальную инфекцию нижних отделов дыхательных путей (у крупного рогатого скота часто связана с респираторными заболеваниями крупного рогатого скота). Настоящее изобретение касается тех бактерий, которые вызывают такую пневмонию у жвачных животных, в частности у крупного рогатого скота.
Бактерии Pasteurella multocida, которые вызывают пневмонию у жвачных животных, являются симбионтами верхних отделов дыхательных путей этих животных (Allen et al.; Can J. Vet. Res., 1992, 56: 177-183). Другими словами, верхние отделы дыхательных путей (включая носовую полость, глотку и гортань) большинства животных содержат эти бактерии без какой-либо физиологической реакции, такой как заболевание или иммунный ответ на эти бактерии. Индуцирование заболевания часто связано со стрессом, особенно от перевозки, или инфицированием патогенными вирусами. Защита от заболевания (которая включает помощь в предотвращении или улучшении заболевания) может иметь место в виде системной вакцинации животных вакциной, включающей живые или убитые бактерии P. multocida, как хорошо известно в области техники (см., например, S.M. Dabo et al. в Animal Health Research Reviews, 8(2), 2008, 129-150). В целом, вакцина, включающая живые бактерии, может быть предпочтительной, когда вакцинируют очень молодых животных (т.е. в возрасте менее 3-4 недель). То есть инактивированная вакцина в целом является менее эффективной в присутствии полученных от матери антител. Тем не менее, живая вакцина, в свою очередь, может быть менее безопасной у таких молодых животных. В частности, после вакцинирования молодых животных живыми аттенуированными бактериями Pasteurella multocida серотипов, вызывающих пневмонию, может развиться шок.
Confer et al. (Amer. J. из Vet. Res., 1996, 57: 1453-1457) изучал гуморальные иммунные ответы на белки внешней мембраны Pasteurella после вакцинирования и инфицирования тельцов возрастом 5-8 месяцев. Вакцины получали из полевых изолятов P. multocida А:3 и вводились дважды с интервалом 7 дней. Они состояли либо из живых бактерий, вводимых подкожно или при помощи аэрозоля на все тело, либо из убитых бактерий, вводимых при помощи аэрозоля.
Целью изобретения является получение вакцины, которая защищает, т.е. по меньшей мере помогает в профилактике, облегчает, в частности предотвращает или излечивает от пневмонии, вызываемой Pasteurella multocida, и которая является вакциной, безопасной для молодых животных.
C этой целью разработана вакцина для введения в верхние отделы дыхательных путей жвачных животных, где вакцина включает живые аттенуированные бактерии Pasteurella multocida, введение имеет место путем распыления вакцины. Так, вакцину вводят, распыляя ее как аэрозоль из тонкодисперсных частиц (имеющих объемный средний диаметр менее 200 мкм) для достижения верхних отделов дыхательных путей животного. Ожидается, что введение аттенуированных бактерий Pasteurella multocida в верхние отделы дыхательных путей является в целом безопасным, поскольку даже бактерии дикого типа, присутствующие в этой части дыхательных путей, не вызывают иммунный ответ, когда присутствуют в верхних отделах дыхательных путей. Тем не менее, заранее не ожидалось, что иммунный ответ (не берем во внимание адекватный ответ) разовьется против живых, аттенуированных бактерий Pasteurella multocida: даже бактерии дикого типа, присутствуя в этой части дыхательных путей, не индуцируют иммунный ответ в нормальных обстоятельствах. Удивительно, что введение живых аттенуированных бактерий Pasteurella multocida (типа, который вызывает пневмонию у жвачных животных в неаттенуированной форме, в частности серогруппы А, в частности серотипа А:3) в верхние отделы дыхательных путей в форме аэрозоля частиц вызывает развитие адекватного иммунного ответа на живые аттенуированные бактерии Pasteurella multocida. Отмечают, что распыление можно проводить не только, когда вакцина находится в жидкой форме (частицы тогда представляют собой капли), но также, когда вакцина находится в твердой форме (например, лиофилизированного порошка или агломерата штаммов в стабилизаторе), в случае которой вакцину можно распространять в виде тонкодисперсного порошка, обычно порошкообразного лиофилизированного агломерата бактерий в матриксе стабилизатора. Установлено, что более практичным наибольшим предельным размером распыляемых частиц (по меньшей мере объемным средним диаметром) является 1 мкм, поскольку для получения более маленьких частиц могут потребоваться высокоэнергетические затраты, что является непрактичным.
Конечная вакцина является безопасной для молодых телят (возрастом менее 3-4 недель) и вызывает адекватный иммунный ответ на пневмонию, вызываемую бактериями Pasteurella multocida (например, вызывает иммунный ответ, который по меньшей мере помогает предотвратить, улучшить, в частности предотвратить или вылечить пневмонию, вызываемую бактериями Pasteurella multocida). Известно много аттенуированных штаммов Pasteurella multocida (например, стрептомицинзависимый штамм, как известно из ссылки на Dabo, упомянутой здесь и выше, или штаммы, имеющие мутации в генах phyB, phyA, hyaE, hyaD, hyaC, hyaB, hexD, hexC, hexB и/или hexA, как описано в US 2008/0241192 (Kumar et al.)). Тем не менее, аттенуированный тип как таковой не является важным для изобретения. Изобретение касается удивительных открытий, что иммунный ответ на живые аттенуированные бактерии Pasteurella multocida можно вызвать даже, если эти бактерии вводят в верхние отделы дыхательных путей (где присутствует “дикий” тип P. multocida в качестве симбионта и не вызывает иммунный ответ), если введение проводят путем распыления. На самом деле, тип аттенуирования может повлиять на остаточную вирулентность бактерии и, таким образом, на безопасность и эффективность вакцины. Тем не менее, баланс между безопасностью и эффективностью для поиска желаемого аттенуирования не относится к упомянутым выше исследованиям настоящего изобретения.
Изобретение также касается применения живых аттенуированных бактерий Pasteurella multocida для производства вакцины, которая при введении в верхние отделы дыхательных путей жвачных животных путем распыления вакцины обеспечивает защиту от пневмонии, вызываемой бактериями Pasteurella multocida, а также способа защиты жвачных животных от пневмонии, вызываемой бактериями Pasteurella multocida, где способ включает введение вакцины, включающей живые аттенуированные бактерии Pasteurella multocida, в верхние отделы дыхательных путей жвачных животных путем распыления вакцины.
Хотя введение в верхние отделы дыхательных путей также может происходить, например, через рот животного (пероральное введение аэрозоля тонкодисперсных частиц для попадания в глотку и опционально в гортань), вакцина предпочтительно предназначена для интраназального введения. Доказано, что интраназальное введение ведет к хорошему иммунному ответу в слизистой оболочке против бактерии.
Как хорошо известно в области техники, интраназальное введение определено как введение “внутрь носа” (The American Heritage Medical Dictionary, Houghton Mifflin Co.).
В варианте осуществления распыление предоставляет аэрозоль частиц вакцины, имеющих (объемный) средний размер частицы менее 50 мкм в диаметре. Считается, что, имея более маленькие частицы, вакцина может прямо достигнуть большей поверхности слизистой оболочки. Считается, что это ведет к улучшенному иммунному ответу. Размер частиц менее 50 мкм считается практичным и адекватным для вызывания иммунного ответа. В дополнительном варианте осуществления средний размер частицы находится между 20 и 40 мкм в диаметре.
В еще одном варианте осуществления вакцина дополнительно включает живой аттенуированный вирус парагриппа-3 и живой аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота для защиты от респираторного заболевания, вызываемого вирусом парагриппа (Pi3) и респираторно-синцитиальным вирусом крупного рогатого скота (BRSV). Считается, что, добавляя иммуногенные вирусы к вакцине, которые стимулируют иммунный ответ слизистой оболочки в верхних отделах дыхательных путей, можно также получить улучшенный иммунный ответ против бактерий Pasteurella multocida. Хотя вирусы в вакцине являются иммуногенными, они являются аттенуированными и, таким образом, не индуцируют заболевание. Это означает, что они не вызывают фактические патологические эффекты в слизистой оболочке дыхательных путей в отличие от их контрпартнеров дикого типа. Конкретный штамм или аттенуированный тип вирусных штаммов не считаются существенными для этого варианта осуществления: учитывая то, что вирусы (по природе) полностью не связаны с бактериями, специфический иммунный ответ на вирусы просто не может быть существенным для получения улучшенной защиты от бактерий. Многие аттенуированные живые вирусы парагриппа-3 и живые респираторно-синцитиальные вирусы крупного рогатого скота, которые могут вызывать иммунный ответ после введения в верхние отделы дыхательных путей, известны в области техники, такие как, например, из имеющихся в продаже вакцин Inforce™ 3 (Pfizer Animal health), Nasalgen™ IP (Merck Animal Health), TSV-2™ (Pfizer Animal Health) и ONSET™ 5 (Merck Animal Health).
В другом варианте осуществления вакцина включает живой аттенуированный вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Этот вирус также известен как участвующий в респираторных заболеваниях, в частности крупного рогатого скота, и, следовательно, защита от этого патогена считается дополнительным усилением защитного эффекта текущей вакцины против респираторных заболеваний.
В дополнительном варианте осуществления вакцина в соответствии с изобретением предназначена для введения крупному рогатому скоту предпочтительно в возрасте менее 3-4 недель.
Отмечают, что вакцина в свете этого изобретения представляет собой состав, подходящий для применения у животного, включающий один или более антиген в иммунологически эффективном количестве (т.е. способном стимулировать иммунную систему животного-мишени достаточным образом, чтобы по меньшей мере снизить отрицательные эффекты инфицирования микроорганизмами дикого типа), обычно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как жидкость, содержащая воду, опционально включающий иммуностимулирующие средства (адъюванты), которые при введении животному вызывают иммунный ответ, для лечения заболевания или расстройства, т.е. помогают предотвратить, улучшить или вылечить заболевание или расстройство.
4
9
3
10
50
В целом, вакцину можно получить, используя известные в области техники способы, которые в основном включают примешивание антигенов (или композиции, содержащей антигены) с фармацевтически приемлемым носителем, например жидким носителем, таким как (опционально буферированная) вода, или твердым носителем, таким как широко применяемый для получения лиофилизированных вакцин. Для живой вакцины иммунологически эффективное количество обычно находится между 10-10 КОЕ/дозу для бактерий и между 10-10 ЦПД/дозу для вирусов, хотя в зависимости от аттенуирования число может быть ниже (для менее аттенуированных микроорганизмов) или выше (для более аттенуированных микроорганизмов). Опционально другие вещества, такие как адъюванты, стабилизаторы, модификаторы вязкости или другие компоненты, добавляют в зависимости от предполагаемого применения или желаемых свойств вакцины. Для вакцинирования подходящими являются многие формы, в частности жидкие составы (с растворенными, эмульгированными или суспендированными антигенами; обычные вводимые объемы находятся между 0,1 и 10 мл, предпочтительно между 0,2 и 5 мл, предпочтительно 2 мл и менее), но также могут быть подходящими твердые составы, такие как порошки для распыляющих устройств.
В дополнительном варианте осуществления вакцину в соответствии с изобретением применяют однократным введением, предпочтительно вводимый объем делят на обе ноздри.
Термин «аттенуированный», как применяют здесь, относится к неспособности микроорганизма, в частности бактерии или вируса, индуцировать полный набор симптомов заболевания, которые обычно связаны с его вирулентным (часто дикого типа) патогенным контрпартнером. Он может быть аттенуированным таким образом, что он не реплицируется в клетке хозяина или животном, или реплицируется на уровне, который не является значительно вредящим для клетки или животного, и/или не индуцирует вредящий ответ организма. Аттенуированный штамм может проявлять сниженную способность выживать в хозяине и может содержать одну или более мутаций в одном или более гене вирулентности, как хорошо известно в области техники.
В варианте осуществления вакцина в соответствии с настоящим изобретением включает живые аттенуированные бактерии Pasteurella multocida для защиты жвачных животных от пневмонии, вызываемой P. multocida, путем введения вакцины в верхние отделы дыхательных путей жвачных животных путем распыления вакцины, отличается тем, что введение имеет место в виде интраназального распыления; частицы вакцины имеют средний размер частиц между 20 и 40 мкм в диаметре; вакцина дополнительно включает живой аттенуированный вирус парагриппа-3 и живой аттенуированный респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота и опционально также включает вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота; живые аттенуированные бактерии P. multocida представляют собой стрептомицинзависимый штамм.
Изобретение будет дополнительно объяснено на основании следующих примеров.
ПРИМЕР 1
Несколько распыляющих устройств оценивают относительно получаемого размера частиц. В этом примере тестируют три канюли, которые можно присоединить к стандартным шприцам. Первая канюля представляет собой LMA MAD Nasal™ (“MAD”), имеющийся у LMA North America Inc, San Diego, CA, USA. Вторая канюля представляет собой аппликатор Rispoval (“Pfizer”), имеющийся у Pfizer Animal Health, Brussels, Belgium. Третья канюля представляет собой 1” голубую гибкую насадку аппликатора от Genesis Industries, Inc. Elmwood, Wisconsin, USA (“Genesis”).
Эти канюли тестируют при помощи обычной WFI (воды для инъекции) и полученный объемный средний размер частиц устанавливают, применяя анализатор размера частиц Sympatec™. Результаты показаны ниже в таблице 1.
Таблица 1Средний размер частиц с различными канюлями
Тип канюли
Объемный средний размер (диаметр в мкм)
Среднеквадратическое отклонение (мкм)
MAD
32,8
8,8
Pfizer
39,5
4,6
Genesis
197
Не определяется
Оказывается, что всеми тремя канюлями можно достичь распыления WFI. Для дополнительных экспериментов применяют MAD канюлю.
ПРИМЕР 2
Две группы (называемые группа 1 и группа 2), каждая из которых состоит из двадцати телят возрастом 2 недели (неинфицированные и лишенные молозива), применяют для экспериментов. В каждой группе десять телят вакцинируют однократно интраназально живой вакциной Pasteurella Multocida (см. ниже), и десять телят оставляют в качестве невакцинированного контроля. В возрасте пяти недель телят заражают интратрахеально диким типом P. Multocida. В течение 7 дней после заражения телят наблюдают в отношении развития клинических признаков респираторного заболевания, в частности пневмонии. На 7 день после заражения (или раньше в случае тяжелых клинических признаков) телят убивают и вскрывают, т.е. исследуют на предмет повреждений легких. Эксперименты со второй группой имеют место через несколько месяцев после экспериментов с первой группой.
Вакцина
7
7
7
В обеих группах применяют вакцину, содержащую Pasteurella Multocida штамм ΔhyaE, полученную из штамма дикого типа Р1062 серотипа А:3, у которого нет капсулы (см. Genbank EMBL AAK02858.1 для гена). Непосредственно перед введением бактерию растворяют в WFI (в воде для инъекции) для достижения приблизительно 5×10 КОЕ/мл. Точные КОЕ/мл составляют 4×10 для группы 1 и 8×10 для группы 2.
В другом предусмотренном эксперименте вакцину используют в добавление к вышеупомянутому штамму Pasteurella Multocida, содержащему живой аттенуированный BRSV (например, те же штаммы, что и в продукте “Jencine™ 4”, имеющемся у Merck Animal Health, Summit, NJ, USA), и живой аттенуированный Pi3 вирус (например, тот же штамм, что и в живом продукте Bovilis™ IBR-PI3, имеющемся у MSD Animal Health, Boxmeer, The Netherlands).
Культура для заражения
Для заражения при помощи Pasteurella дикого типа изготавливают две культуры: одну гомологичную со штаммом вакцины, и другую - гетерологичную. Для гомологичной культуры для заражения Pasteurella Multocida Р1062 инокулируют на кровяной агар и инкубируют в течение 16-24 часов при 37°С. Далее одну бактериологическую петлю инокулируют на 100 мл TPB (триптозно-фосфатный бульон) и инкубируют в течение 7-10 часов при 37°. Для гетерологичной культуры для заражения Pasteurella Multocida 971/90 инокулируют на кровяном агаре и инкубируют в течение 16 часов при 37°С. Далее одну бактериологическую петлю инокулируют на 100 мл TPB и инкубируют в течение 4-5 часов при 37°С.
8
Обе культуры разводят при помощи PBS (натрий-фосфатный буфер), имея целью приблизительно 3,3×10 КОЕ/мл. Следует отметить, что Pasteurella Multocida является вторичным патогеном (т.е. в целом не вызывает заболевание), очень высокая доза заражения которым в комбинации с введением в нижние отделы дыхательных путей (см. ниже) должна вызывать пневмонию.
Вакцинация
Для каждой группы телят разделяют на две подгруппы (группы А и В) по 10 животных. Группу А вакцинируют однократно интраназально путем введения 2 мл разведенной живой вакцины в одну ноздрю, группу В оставляют в качестве невакцинированного контроля. В группе 1 вакцину вводят при помощи обычного пластикового шприца, который обеспечивает введение вакцины в виде потока жидкости, распадающегося на большие капли. В группе 2 вакцину вводят при помощи устройства MAD, которое обеспечивает распыление вакцины.
Заражение
10
В возрасте 5 недель (3 недели после вакцинации) всех телят заражают интратрахеально 30 мл культуры для заражения, таким образом имея целью дозу заражения, приблизительно равную 1×10 КОЕ на животное. Группу 1 заражают гомологичной культурой, группу 2 заражают гетерологичной культурой.
Исследование безопасности
Для оценки безопасности вакцины ежедневно наблюдают за общим здоровьем и поведением животных.
Посмертное исследование
Через семь дней после заражения животных подвергают посмертному исследованию, уделяя особое внимание легким. Для каждой доли легкого записывают % уплотнения, который соответствует имеющейся пневмонии. Также Pasteurella Multocida повторно выделяют из посмертных образцов с целью определения бактериальной обсемененности легких бактериями. Для этого образцы ткани вырезают из восьми стандартных областей, представляющих доли каждой половины легкого (4 области для половины); предпочтительно выбирают зараженную ткань для каждой области, если она присутствует. Зеркальные образцы (два образца соответствующей доли каждой половинки) объединяют для получения 4 образцов на теленка. Каждый объединенный образец помещают в кипящую воду на 3 секунды, гомогенизируют, последовательно разводят в 10 раз и инокулируют (100 мкл) на чашках с кровяным агаром и далее инкубируют в течение 16-24 часов при 37°.
Статистический анализ
Уплотнение легких и величины повторного выделения оценивают при помощи U-критерия Манна-Уитни с использованием статистической программы Statistix™ для Windows.
Результаты
Безопасность
Вакцинация обеими вакцинами оказывается безопасной, никакие клинические признаки, связанные с пневмонией или шоком, не наблюдаются.
Пневмония и повторное выделение
10
В таблицах 2 и 3 показаны посмертные показатели пневмонии (процент легочного уплотнения) и повторного выделения Pasteurella Multocida (log КОЕ) для группы 1. Как можно увидеть, результаты показывают, что нельзя получить практически защитные эффекты при введении живой вакцины Pasteurella Multocida в виде потока жидкости, распадающегося на крупные капли. Имеющаяся неуверенность в любом эффекте составляет 0,43 для показателей уплотнения легкого и 0,60 для повторного выделения.
10
В таблицах 4 и 5 соответствующие результаты показаны для группы 2: вакцинированной живой вакциной, вводимой в верхние отделы дыхательных путей путем распыления вакцины, и зараженной гетерологичным штаммом PM (P. Multocida) (который при сравнении с гомологичным заражением обычно затрудняет получение защиты). Как можно увидеть, показатели повреждения легких снижаются на практически приблизительно 50%. Хотя статистический анализ выявляет, что все еще существует неуверенность 0,12 (что, на самом деле, является довольно небольшой величиной для небольшой группы животных), ясно, что существует по меньшей мере частичная защита, несмотря на тот факт, что заражение происходит гетерологичным штаммом дикого типа P. Multocida. Относительно повторного выделения оказывается, что бактериальная обсемененность снижается на 1,5 log, что равно снижению бактериальной обсемененности приблизительно в 30 раз (это в десять раз больше, чем в группе 1). Статистическая неопределенность составляет только 0,10, несмотря на то, что эксперимент проводят на такой небольшой группе.
Таблица 2% уплотнения легких, группа 1
Группа
Вакцина
Общий средний показатель
1А
Живая PM, жидкая
82,4
1В
-
105,6
Таблица 3Повторное выделение (бактериальная обсемененность в легких), группа 1
Группа
Вакцина
Общий средний показатель
1А
Живая PM, жидкая
4,7
1В
-
5,2
Таблица 4% уплотнения легких, группа 2
Группа
Вакцина
Общий средний показатель
2А
Живая PM, распыление
93
2В
-
180
Таблица 5Повторное выделение (бактериальная обсемененность в легких), группа 2
Группа
Вакцина
Общий средний показатель
2А
Живая PM, распыление
2,8
2В
-
4,3