Влияние доксорубицина на транскрипционный профиль раково-тестикулярных антигенов в модельном эксперименте на клеточной линии HeLa ccl-2

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

дику определения 5-фторурацила в крови человека in vitro по тушению ее собственной ФЛ.

Материалы и методы. Скорректированные спектры ФЛ регистрировали на спектрофлуориметре «СМ-2203» в кварцевых кюветах (1=5 мм) при фотовозбуждении под углом 450. Фотовозбуждение крови проводили в полосу S2 «- S0 перехода аминокислоты на длине волны (Xex) 220 нм и записывали спектры ФЛ в интервале длин волн эмиссии (Xem) 300^400 нм. Забор венозной крови осуществлялся у больных с плоскоклеточным раком ротоглотки, раком шейки матки и толстой кишки из локтевой вены. На этапе разработки метода флюоресцентного анализа FU использовали кровь пациентов, разбавленную антикоагулянтом — раствором цитратом натрия в соотношении 1/1. Для достижения необходимой температуры крови с FU использовали термостат (Т=310 К или 37°С). Для исследования использовали препарат «5-Фторурацил». Результаты. С целью исключить влияние на интенсивность ФЛ крови гидрооксида натрия, содержащийся в лекарственном препарате «5-Фторурацил — Эбеве» в качестве вспомогательного вещества, перед исследованием был проведен контрольный опыт. Концентрацию NaOH в крови получили из расчета на 50 мг FU 14,7 мг. NaOH (при внутривенном введении 750 мг FU, концентрация NaOH в крови пациента составляет 1,2 х10-3 М). Оказалось, что щелочь не оказывает влияния на характер ФЛ крови и ее интенсивность. Аналогичные результаты были получены при добавлении цитрата натрия (антикоагулянт), в исходный образец крови, увеличивающего длительность хранения образцов. В данном случае тушение интенсивности ФЛ происходило и не отличалось от интенсивности тушения ФЛ крови при добавлении в нее воды того же объема, что связано с разбавлением растворов. Поэтому равное смешивание образцов крови с антикоагулянтом в процессе одного исследования (кинетики интенсивности ФЛ крови) не будет влиять на его результаты, так как одинаковое уменьшение интенсивности ФЛ крови будет наблюдаться во всех образцах. При добавлении FU к крови наблюдается уменьшение интенсивности ее ФЛ. Наличие тушения ФЛ крови 5-фторурацилом открывает возможность ФЛ контроля над его содержанием, что позволит персонально подбирать дозу противоопухолевого препарата для пациента. Степень тушения собственной флюоресценции крови зависит от концентрации FU. На основании этого нами были получены калибровочные зависимости интенсивности ФЛ крови от концентрации FU при комнатной температуре (Т=200С), и средней температуре тела онкобольных пациентов (Т=37°С).

Наличие зависимости взаимодействия белков крови с FU от температуры окружающей среды указывает на то, что данная реакция — эндотермичная.

С целью определения концентрации FU в крови пациентов были получены спектры ФЛ до и через 1 минуту после введения FU на примере трех пациентов.

Заключение. Разработана методика определения концентрации 5-фторурацила в крови «in vitro» методом тушения собственной люминесценции крови, обладающим высокой чувствительностью, с целью проведения фармакокинетиче-ских исследований при индивидуальном подборе доз противоопухолевого препарата.

Изучение экспрессии и роли PHF10 (BAF45a) в клеточном цикле

А. И. Хамидуллина, М.А. Ястребова, Е. В. Татарский, Н. В. Сошникова, В. В. Татарский

Место работы: 'ФГБОУ ВО МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва; 2ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина Минздрава России, Москва; 3ФГБУН Институт биологии гена РАН, Москва e-mail: 94alvina@gmail.com

Комплексы SWI/SNF регулируют экспрессию генов за счет перемещения нуклеосом. Компоненты SWI/SNF комплексов подвергаются мутациям в 20% опухолей человека, что определяет свойства опухоли и чувствительность к химиотерапии. Компонент PBAF SWI/SNF комплекса PHF10 участвует в процессах дифференцировки, пролиферации и программируемой клеточной гибели, однако его функции мало изучены. Цель. изучить экспрессию и роль изоформ PHF10 в клеточном цикле, а также рассмотреть влияние белков-ингибиторов циклин-зависимых киназ (p27, p21) и белков про-пролифе-ративных клеточных каскадов на экспрессию и локализацию PHF10 в клетке.

Материалы и методы. Линии HCT116, SW620 (карциномы толстой кишки), ПФЧ (первичные фибробласты), HEK293 (эмбриональные клетки почки), MEF (эмбриональные мышиные фибробласты) культивировали в среде DMEM с 5% телячьей сыворотки. Подавление экспрессии PHF10, (3-катенин, c-Myc осуществлялось с помощью использованием CRISPR/Cas9 (нокаут) или антисмысловой РНК ^РНК, нокдаун). Гиперэкспрессия c-Myc, р27 осуществлялась с помощью ретрови-русной трансдукции. Клеточный цикл исследовали методом проточной цитофлуорометрии. Экспрессию PHF10 и белков клеточного цикла изучали с помощью иммуноблоттинга, проточной цитофлуорометрии и флуоресцентной микроскопии. Результаты. Экспрессия PHF10 коррелирует с уровнем c-Myc. В клеточных линиях PHF10 экспрессируется во всех фазах клеточного цикла, но не в покоящихся (G0) клетках. При увеличении плотности происходит изменение экспрессии изоформ PHF10, что коррелирует с подавлением циклина D1 и увеличением p27. Ингибирование PHF10 приводит к понижению экспрессии циклина D1 и повышению экспрессии p21. В клетках ПФЧ, с гиперэкспрессией р27, наблюдается увеличение синтеза всех изоформ PHF10. Нокаут р-катенина и c-Myc в клетках линий SW620 и HCT116 приводит к подавлению экспрессии всех изоформ PHF10. Ингибирование PHF10 сопровождается повышением уровня p21 и изменением уровня экспрессии циклинов Е1, А2 и D1. В клетках HCT116 с нокаутом PHF10 наблюдается снижение скорости роста клеток, и увеличению количества выхода из клеточного цикла в G0-фазу. Заключение. PHF10 экспрессируется во всех фазах клеточного цикла, переключение изоформ происходит при выходе в G0-фазу; PHF10 связан с белками-регуляторами клеточного цикла: подавляет экспрессию циклина D1, и активирует — р21;экспрессия PHF10 регулируется |3-катенином, c-Myc и p27; нокаут PHF10 отражается на скорости роста клеток, возможно, играя роль при вхождении в G1-фазу клеточного цикла.

Влияние доксорубицина на транскрипционный профиль раково-тестикулярных антигенов в модельном эксперименте на клеточной линии HeLa 00L-2

Д.И. Водолажский', Д. С. Кутилин', А.А. Пушкин', Е. В. Вереникина', Х. А. Могушкова', О.И. Кит' Место работы: 'ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения РФ, Ростов-на-Дону e-mail: k.denees@yandex.ru

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Раково-тестикулярные антигены (РТА) являются одной из групп опухоль-ассоциированных антигенов. В зрелых соматических клетках экспрессия РТА практически отсутствует, и ее появление может служить молекулярным маркером малигнизации ткани. Иммунный ответ на РТА может быть активизирован с помощью генно-клеточных противоопухолевых вакцин. Однако иммунотерапия наиболее часто применяется в качестве дополнения к основным методам лечения опухолей — хирургическому лечению, радио-и химиотерапии. Доксорубицин (DXR) в настоящее время продолжает использоваться в составе химиотерапии при раке шейки матки, при этом его эффекты на экспрессию генов РТА и результаты последующей иммунотерапии остаются не изученными. Поэтому целью нашего исследования стала оценка влияния разных концентраций доксорубицина и времени экспозиции (культивирования клеток) на транскрипционный профиль РТА клеток HeLa С^-2.

Материалы и методы. В работе использована культура клеток человека — рак шейки матки линии HeLa CCL-2. Культивирование клеток HeLa CCL-2 проводилось в 9 стерильных плоскодонных культуральных флаконах площадью 25 см2 с адгезионной поверхностью и вентилируемыми крышками (Sarstedt, Германия). Инкубирование шло в условиях контролируемого 5% CO2 и 95% влажности при 37 градусах по Цельсию в мультигазовом инкубаторе CB 150 (Binder, Германия). Культивирование клеток проводилось в среде RPMI-1640 (Биолот, Россия) c 10% фетальной телячьей сывороткой (Thermo Scientific hyclone, США) при концентрации гентамицина 50 мкг/мл и различными концентрациями доксорубицина: 0 мкг/мл (контроль), 2 мкг/мл и 4 мкг/мл (по 3 флакона). Через 1, 5 и 24 часа культивирования клеточные линии снимались с подложки флакона и анализировались: подсчет количества живых и мертвых клеток, определение относительной экспрессии генетических локусов. Суммарную РНК из образцов выделяли по методу P. Chomczynski и N. Sacchi (2006). Для синтеза библиотеки кДНК использовали набор реагентов «РЕВЕРТА-L» (Россия, «Интерлабсервис»). Праймеры разработали с использованием базы данных NCBI GenBank. Определение относительной экспрессии 17 генетических локусов (MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-B1, MAGE-B2, GAGE1, GAGE3, GAGE4, MAGE-C1, BAGE, CTAG-1B, XAGE3, NY-ESO1, SSX2, SYCP1, PRAME1) проводили методом Real-Time qPCR (референсный ген — GAPDH) на термоциклере Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, USA). Статистический анализ проводили с использованием двухфакторного дисперсионного анализа с повторениями (оценивалось влияние факторов А-время культивирования и Б — концентрация доксорубицина), а также Post Hoc теста (тест Newman-Keuls) в программе Statistica 8.0 (StatSoft Inc).

Результаты. В ходе исследования установлено, что факторы времени инкубации клеток и концентрации DXR вместе взятые статистически достоверно (p<0,005) влияют на экспрессию 13 из 17 (77%) исследованных генов: MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, MAGEB1, MAGEB2, GAGE1, GAGE3, BAGE, CTAG1B, XAGE3, NY-ESO1, PRAME1 и SYCP1. При этом факторы времени инкубации клеток и концентрация DXR статистически достоверно не влияли на экспрессию генов SSX2, MAGEA2, GAGE4 и MAGEC1, концентрация DXR отдельно взятая статистически достоверно не влияет на экспрессию генетических локусов MAGEB1 и MAGEB2 (влияет фактор времени инкубации, p<0,05), а фактор времени инкубации не влияет на экспрессию гена PRAME1 (влияет фактор концентрации DXR, p<0,05).

Выполненное с использованием теста Newman-Keuls попарное сравнение 9 групп по 2 факторам для каждого гена РТА, выявило следующие статистически значимые отличия для p<0,002: 1. Относительно контроля (среда без доксорубицина) через 1 час культивирования обнаружено повышенние экспрессии MAGEA1, MAGEA4, MAGEA3 и SYCP1 (2 мкг/мл), NY-ESO1 (2 и 4 мкг/мл доксорубицина), а также подавление экспрессии генов GAGE1 и BAGE (2 мкг/мл доксорубицина). 2. Относительно контроля через 5 часов культивирования обнаружена пониженная экспрессия BAGE (2 и 4 мкг/мл доксорубицина), относительно контроля через 24 часа культивирования обнаружена сниженная экспрессия GAGE1 (2 и 4 мкг/мл), BAGE (2 мкг/мл) и повышенная экспрессия гена XAGE3 (2 и 4 мкг/мл). 3. Относительно точки 1 час культивирования с доксорубицином разной концентрации обнаружено снижение экспрессии MAGEA1, MAGEA4, MAGEA3, MAGEB1 (2 мкг/мл), MAGEB2 (4 мкг/мл), BAGE и SYCP1 (2 мкг/мл) через 5 часов культивирования, MAGEA1, MAGEA4, MAGEA3, MAGEB1 (2 мкг/мл), MAGEB2 (4 мкг/мл), BAGE и SYCP1 (2 мкг/мл) через 24 часа культивирования. 4. Относительно точки 1 час культивирования с доксорубицином разной концентрации обнаружено повышение экспрессии GAGE1 (2 мкг/мл) через 24 часа, GAGE3 (2 мкг/мл) через 5 и 24 часа, XAGE3 (2 и 4 мкг/мл) через 24 часа культивирования. Заключение. Существенное влияние на экспрессию генов клеточной линии HeLa Са-2 MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, MAGEB1, MAGEB2, GAGE1, GAGE3, BAGE, CTAG1B, XAGE3, NY-ESO1, PRAME1 и SYCP1 оказывает время культивирования и концентрация доксорубицина. На экспрессию РТА генов SSX2, MAGEA2, GAGE4 и MAGEC1 клеточной линии HeLa С^-2 эти факторы существенного влияния не оказывали, что может позволить рекомендовать данные РТА в качестве мишени для иммунотерапии. Полученные данные также позволили сформировать следующие группы РТА:

1) повышающие экспрессию под воздействием доксоруби-цина (MAGEA1, MAGEA4, NY-ESO1, MAGEA3, SYCP1, XAGE3);

2) снижающие экспрессию под воздействием доксорубицина (GAGE1 и BAGE). Эти результаты имеют важное значение для проведения иммунотерапии, в частности, для создания и применения дендритно-клеточных вакцин.

Влияние экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) на экспрессию маркера пролиферации ki67 и маркера апоптоза p53 в перевиваемом раке почки (PA) лабораторных крыс

Н. А. Наволокин', Д. А. Мудрак', Н. В. Полуконова', А. Б. Бучар-ская', Г. Н. Маслякова'

Место работы: 'ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России e-mail: nik-navolokin@yandex.ru

Введение. На сегодняшний день не создано ни одного противоопухолевого препарата, который был бы безопасен в рекомендуемых дозах и не имел бы ограничений для использования. Особое внимание уделяется созданию лекарственных средств растительного происхождения с минимальными побочными эффектами [Е. Д. Гольдберг, 2008]. Цель. В экспериментах in vivo исследовать на примере перевитого рак почки влияние флавоноидсодержащего экстракта аврана на маркер пролиферации ki67 и маркер апоптоза p53. Материалы и методы. Использованы водные раствор экстракта аврана лекарственного, полученного нами авторским способом [Патент РФ 2482863].

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org