ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО
PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING BIOPHARMACEUTICAL DRUG

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей биофармацевтическое лекарственное средство.
Предпосылки создания изобретения
Биофармацевтические лекарственные средства, такие как белки, являются потенциальным сырьем для изготовления галенова препарата. Поскольку пероральный путь не доступен для большинства биофармацевтических лекарственных средств, композиция должна быть применима для парентерального применения, что предопределяет выбор водных композиций, а также по соображениям стабильности растворимых в воде порошков.
Такая композиция должна выполнять разнообразные задачи. Она должна обладать переносимостью после введения, в случае экстраваскулярного введения обеспечивать соответствующее всасывание биофармацевтического вещества в кровоток, если только место приложения действия не находится в месте введения, и создавать среду, которая гарантирует стабильность биофармацевтического лекарственного средства в терапевтически эффективной концентрации. Кроме того, композиция должна обеспечивать срок годности лекарственного средства по меньшей мере два года.
Обычно композиция биофармацевтического лекарственного средства содержит один или несколько буферов, изотонирующих веществ и воду для инъекций в качестве растворителя. Кроме того, часто добавляют стабилизаторы, такие как, например, криопротектор. Помимо этого, может добавляться один или несколько хелатообразующих агентов и поверхностно-активное вещество. Некоторые вещества могут выполнять двойную функцию, например, некоторые сахара или сахарные спирты могут служить криопротектором и изотонирующим веществом.
В следующей далее таблице приведен один из примеров водной композиции, которая используется для включения в ее состав человеческого моноклонального антитела.
Соединение
мг
Функция
Человеческое моноклональное антитело
40
Действующее соединение
Хлорид натрия
4,93
Изотонирующее вещество
Дигидрофосфат натрия × 2 Н<sub>2</sub>О
0,69
Буфер
Вторичный кислый фосфат натрия × 2 H<sub>2</sub>O
1,22
Буфер
Трехзамещенный цитрат натрия
0,24
Буфер
Лимонная кислота
1,04
Буфер
Манит
9,6
Изотонирующее вещество
Полисорбат 80 ("Tween 80")
0,8
Поверхностно-активное вещество
Гидроокись натрия
Уравновешивание рН
Вода
До 0,8 мл
Растворитель
В следующей далее таблице приведен один из примеров лиофилизированной композиции, которая используется для включения в нее химерного моноклонального антитела.
Соединение
мг на пробирку
Функция
Химерное моноклонального антитела
100
Действующее соединение
Дигидрофосфат натрия × 1 Н<sub>2</sub>О
2,2
Буфер
Вторичный кислый фосфат натрия × 1 H<sub>2</sub>O
6,1
Криопротектор
Сахароза
500
Изотонирующее вещество, криопротектор
Полисорбат 80 ("Tween 80")
0,5
Поверхностно-активное вещество
Композиции описанного рода отвечают приведенным выше требованиям переносимости после введения, стабильности биофармацевтического лекарственного средства и срока годности.
Тем не менее, указанные композиции имеют ряд недостатков. Одним из недостатков является то, что многие биофармацевтические лекарственные средства имеют тенденцию к агрегации, что неизбежно изменяет их физиологические свойства. В худшем случае такая агрегация приводит не только к снижению заданной эффективности лекарства, но также к повышению его иммуногенности, что может вызывать серьезные отрицательные последствия. Соответственно, предпочтительная композиция способствует уменьшению агрегации лекарственных средств.
Кроме того, ведутся споры по поводу переносимости некоторых из ингредиентов, используемых в существующих композициях. Это влечет необходимость замены таких ингредиентов.
Соответственно, в основу настоящего изобретения положена задача создания фармацевтических композиций биофармацевтических лекарственных средств, которые могут применяться в качестве альтернативы известных из уровня техники композиций.
Другой задачей настоящего изобретения является создание фармацевтических композиций биофармацевтических лекарственных средств, которые обладают преимуществами по сравнению с известными из уровня техники композициями.
Еще одной задачей настоящего изобретения является создание фармацевтических композиций биофармацевтических лекарственных средств, которые вызывают меньшую агрегацию лекарственных средств, чем известные из уровня техники композиции.
Решение этих задач обеспечивается за счет способов и средств согласно независимым пунктам формулы изобретения. В зависимых пунктах заявлены предпочтительные варианты осуществления. Подразумевается, что в диапазоны значений, ограниченные цифровыми величинами, включены эти предельные величины.
Краткое изложение сущности изобретения
Перед тем, как перейти к подробному описанию изобретения, следует отметить, что настоящее изобретение не ограничено конкретными компонентами описанных или стадия описанных способов, поскольку такие устройства и способы могут изменяться. Также подразумевается, что используемая терминология имеет целью лишь описание частных вариантов осуществления, а не ограничение изобретения. Следует отметить, что используемые в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа имеют значение единственного и/или множественного числа, если контекстом в прямой форме не диктуется иное. Кроме того, подразумевается, что при использовании диапазонов значений, ограниченных цифровыми величинами, в них включены эти предельные величины.
Согласно первой особенности настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая биофармацевтическое лекарственное средство и дополнительно содержащая по меньшей мере одну моно- или дикарбоновую кислоту с основной цепью из 2-6 атомов углерода или по меньшей мере одну ее соль. Моно- или дикарбоновая кислота с основной цепью из 2-6 атомов углерода или ее соль также именуется "буфером" в контексте настоящего изобретения.
В соответствии с известным уровнем техники фармацевтические композиции содержат биофармацевтическое лекарственное средство, неорганический буфер или его соль, такой как фосфатный буфер или трикарбоновую кислоту или ее соль, например, лимонную кислоту/цитрат. Она является трикарбоновой кислотой, которая, разумеется, эффективно выполняет функцию буфера. Тем не менее, авторами было обнаружено, что такой буфер может вызывать агрегацию лекарственных веществ.
6
8
7
В ходе исследований авторы неожиданно обнаружили, что композиция, содержащая лимонную кислоту (2-гидроксипропан-1,2,3-трикарбоновую кислоту; СНО) или цитрат, является менее предпочтительной с точки зрения образования агрегатов, чем композиции, содержащие моно- или дикарбоновую кислоту или ее соль (смотри раздел "Результаты"). Лимонная кислота является разветвленной трикарбоновой кислотой с основной цепью из 5 атомов углерода. Вне связи с какой-либо теорией причиной низкой эффективности лимонной кислоты, возможно, является потенциальное хелатирующее действие, которое три карбоксильные группы такой трикарбоновой кислоты оказывают на заряженные белки, такие как моноклональные антитела.
Подразумевается, что термин "из 2-6 атома углерода" относится ко всем соединениям, имеющим основную цепь 2, 3, 4, 5 или 6 атома углерода.
Используемый в описании термин "биофармацевтическое лекарственное средство" означает любое терапевтическое соединение, полученное из биологического или биотехнологического источника или синтезированное химическим путем и эквивалентное продукту, полученному из упомянутого источника, например, белок, пептид, вакцину, нуклеиновую кислоту, иммуноглобулин, полисахарид, клеточный препарат, растительный экстракт, животный экстракт, рекомбинантный белок или их сочетания. Обычно биофармацевтическое лекарственное средство является действующим ингредиентом биофармацевтического вещества.
Используемый в описании термин "стабилизатор" означает вещество, способствующее сохранению структурной целостности биофармацевтического лекарственного средства, в частности, при замораживании и/или лиофилизация и/или хранении. Такие вещества в контексте настоящего изобретения также именуются "криопротектором" или "лиопротектором".
Используемый в описании термин "моно- или дикарбоновая кислота с основной цепью из n атомов углерода" означает моно- или дикарбоновые кислоты, имеющие прямую алкильную или алкиленовую основную цепь из n атомов углерода. Разумеется, что основная цепь может иметь боковые цепи (например, метиловые группы); тем не менее, атомы углерода, содержащиеся в этих цепях, не учитываются при подсчете атомов углерода основной цепи. Согласно этому определению циклические сахарные кислоты, такие как, например, аскорбиновая кислота, не считаются "моно- или дикарбоновой кислотой с основной цепью из n атомов углерода", поскольку они не имеют прямой алкильной или алкиленовой основной цепи.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения композиция находится в форме, выбранной из группы, включающей
а) водную форму,
б) лиофилизированную форму и/или
в) суспензию.
Композиция в водной форме может являться готовой к введению, а композиция в лиофилизированной форме может быть преобразована в жидкую форму до введения, например, путем добавления воды для инъекций, которая необязательно может содержать консервант, такой как бензиловый спирт, ингибиторы окисления, такие как витамин А, витамин Е, витамин С, ретинил пальмитат и селен, аминокислоты цистеин и метионин, лимонную кислоту и цитрат натрия, синтетические консерванты, такие как эфиры параоксибензойной кислоты, например, метиловый эфир параоксибензойной кислоты и пропиловый эфир параоксибензойной кислоты.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления первой особенности настоящего изобретения композиция обеспечивает уменьшение агрегации биофармацевтического лекарственного средства в водном растворе по сравнению с известными из уровня техники композициями.
Используемый в описании термин "агрегация белка" означает образование белковых форм с более высокой молекулярной массой, таких как олигомеры или мультимеры, вместо желаемых заданных форм биофармацевтического лекарственного средства (например, мономера). Соответственно термин агрегация белка является универсальным и обозначает образование дополнительно не указанных мультимерных форм всевозможного рода, которые образуются посредством ковалентных связей или нековалентных взаимодействий.
С целью обнаружения агрегации белка может быть измерен коэффициент полидисперсности (PdI) и средний радиус белка (Z-Ave), например, описанным далее методом динамического рассеяния света (DLS). Агрегаты также могут измеряться описанным далее способом эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC или SEC). Агрегаты и частицы в целом также могут измеряться описанным далее методом визуализации микропотоков (MFI).
Моно- или дикарбоновые кислоты, подпадающие под приведенное определение, приведены в следующей далее таблице.
Таблица 1
Общепринятое название
Соль
Научное название
Общая формула
Адипиновая кислота
Адипат
Гександикислота
C<sub>6</sub>H<sub>10</sub>O<sub>4</sub>
Яблочная кислота
Малат
Оксибутандикислота
C<sub>4</sub>H<sub>6</sub>O<sub>5</sub>
Винная кислота
Тартрат
2,3-Диоксибутандикислота
С<sub>4</sub>Н<sub>6</sub>О<sub>6</sub>
Янтарная кислота
Сукцинат
Бутандикислота
C<sub>4</sub>H<sub>6</sub>O<sub>4</sub>
Уксусная кислота
Ацетат
Этановая кислота
C<sub>2</sub>H<sub>4</sub>O<sub>2</sub>
Глутаминовая кислота
Глутамат
2-аминопентандикислота
C<sub>5</sub>H<sub>9</sub>NO<sub>4</sub>
Щавелево-уксусная кислота
Оксалоацетат
Охобутандикислота
C<sub>4</sub>H<sub>4</sub>O<sub>5</sub>
Глутаровая кислота
Глутарат
Пентандикислота
C<sub>5</sub>H<sub>8</sub>O<sub>4</sub>
α-Кетоглутаровая кислота
α-Кетоглутарат
2-Оксопентандикислота
C<sub>5</sub>H<sub>6</sub>O<sub>5</sub>
Малеиновая кислота
Малеат
Цис-бутендикислота
C<sub>4</sub>H<sub>4</sub>O<sub>4</sub>
Фумаровая кислота
Фумарат
Транс-бутендикислота
C<sub>4</sub>H<sub>4</sub>O<sub>4</sub>
В одном из особо предпочтительных вариантов осуществления моно- или дикарбоновой кислотой или ее солью является дикарбоновая кислота с неразветвленной (т.е. без содержащих атомы углерода боковых цепей) основной цепью из 4, 5 или 6 атомов углерода или ее соль. В одном из особо предпочтительных вариантов осуществления моно- или дикарбоновой кислотой или ее солью является монокарбоновая кислота с неразветвленной основной цепью из 2 атома углерода или ее соль.
Моно- или дикарбоновой кислотой или ее солью особо предпочтительно является по меньшей мере одно из следующего, выбранного из группы, включающей:
уксусную кислоту или ацетат,
глутаминовую кислоту или глутамат,
адипиновую кислоту или адипат,
яблочную кислоту или малат,
винную кислоту или тартрат и/или
янтарную кислоту или сукцинат.
Особо предпочтительной карбоновой кислотой или солью из них является уксусная кислота или ацетат. Предпочтительно она используется в качестве единственной карбоновой кислоты или соли или даже в качестве единственного буфера в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Другой особо предпочтительной карбоновой кислотой или солью является адипиновая кислота или адипат. Предпочтительно она используется в качестве единственной карбоновой кислоты или соли или даже в качестве единственного буфера в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.
Особо предпочтительно, чтобы моно- или дикарбоновая кислота присутствовала водной форме фармацевтической композиции в концентрации от ≥1 до ≤100 мМ, предпочтительно от ≥2 до ≤50 мМ, более предпочтительно от ≥5 до ≤25 мМ.
Кроме того, помимо моно- или дикарбоновой кислоты фармацевтическая композиция также может предпочтительно содержать фосфат натрия (далее - также "NaP") и/или лимонную кислоту или цитрат. Подразумевается, что термин "фосфат натрия" охватывает дигидрофосфат натрия, вторичный кислый фосфат натрия и все их возможные соли и/или гидраты.
Упомянутая водная форма фармацевтической композиции предпочтительно имеет рН от ≥3 до ≤9, предпочтительно от ≥4 до ≤8, более предпочтительно от ≥5 до ≤7.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления агрегация белка стимулируется взбалтыванием, напряжением сдвига, множеством циклов замораживания-оттаивания и/или длительным хранением и/или хранением при высоких температурах.
Используемый в описании термин "высокая температура" означает температуру хранения выше -18°С. Предпочтительно высокая температура, превышает температуру, выбранную из группы, включающей 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50°С или даже выше. Тем не менее, одним из ограничений температуры хранения является температура денатурации, которая находится в диапазоне 45-80°С в зависимости от природы соответствующего белка и условий среды.
Используемый в описании термин "длительное хранение" означает хранение фармацевтической композиции в течение более 1 месяца, предпочтительно более 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или даже 24 месяцев.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения биофармацевтическим лекарственным средством является белок. Белком может являться природный белок, модифицированный белок (т.е. белок, который был модифицирован относительно его природного аналога, также именуемого шаблоном или матрицей) или полностью синтетический белок (т.е. белок, который не имеет природного аналога).
Белок может быть выделен из природного организма или может быть получен путем ферментации культивированного организма.
Кроме того, белком может являться белок, гомологичный или гетерологичный белку, выделенному из организма.
-1
-1
Особо предпочтительно, чтобы белок присутствовал в водной форме фармацевтической композиции в концентрации от ≥0,1 до ≤500 мг на мл, предпочтительно от ≥20 до ≤200 мг на мл.
Особо предпочтительно, чтобы белок являлся моноклональным антителом или его фрагментом или производным.
Используемый в описании термин "моноклональное антитело (mAb)" означает композицию антитела, содержащую гомогенную популяцию антитела, т.е. гомогенную популяцию, состоящую из цельного иммуноглобулина или его фрагмента или производного. Такое антитело особо предпочтительно выбирают из группы, включающей IgG, IgD, IgE, IgA и/или IgM или их фрагмент или производное.
2
Используемый в описании термин "фрагмент" означает фрагменты такого антитела, сохраняющие в некоторых случаях способность связывать мишень, например, CDR (участок, определяющий комплементарность), гипервариабельный участок, вариабельную область (Fv), тяжелую цепь IgG (состоящую из VH, CH1, шарнира, участков СН2 и СН3), легкую цепь IgG (состоящую из участков VL и CL) и/или Fab и/или F(ab).
2
Используемый в описании термин "производное" означает конструктивные элементы белка, отличающиеся по структуре от общего концептуального антитела, но при этом имеющие определенную конструктивную связь с ним, например, scFv, Fab и/или F(ab), а также биспецифические, триспецифические или более высокоспецифические конструктивные элементы антител. Все они будут пояснены далее.
Другими производными антител, известными специалистам, являются димерные антитела, верблюжьи антитела, доменные антитела, двухвалентные гомодимеры с двумя цепями, состоящими из scFvs, IgAs (двух структур IgG, соединенных соединительным пептидом и секреторным компонентом), акульи антитела, антитела приматов Нового Света плюс CDR приматов не Нового Света, димеризованные конструктивные элементы, содержащие CH3+VL+VH и конъюгаты антител (например, антитело или фрагменты или производные, связывающие токсин, цитокин, радиоизотоп или метку).
Способы получения и/или выбора химерных, гуманизированных и/или человеческих моноклональных антител известны из техники. Например, в патенте US 6331415 на имя Genentech описано получение химерных антител, в патенте US 6548640 на имя Medical Research Council описаны методы пересадки CDR, а в патенте US 5859205 на имя Celltech описано получение гуманизированных антител. Библиотеки антител in vitro описаны, в частности, в патентах US 6300064 на имя MorphoSys и US 6248516 на имя MRC/Scripps/Stratagene. Методы фагового отображения описаны, например, в патенте US 5223409 на имя Dyax. Платформы трансгенных млекопитающих описаны, например, в патенте US 200302048621 на имя TaconicArtemis.
2
IgG, scFv, Fab и/или F(ab) являются антителами хорошо известных специалистам форматов. Сопутствующие высокоэффективные технологии известны соответствующей справочной литературы.
Используемый в описании термин "Fab" означает фрагмент IgG, содержащий антигенсвязывающий участок и состоящий из одной постоянной области и одной вариабельной области каждой тяжелой и легкой цепи антитела.
2
Используемый в описании термин "F(ab)" означает фрагмент IgG, состоящий из двух фрагментов Fab, связанных друг с другом дисульфидным мостиком.
Используемый в описании термин "scFv" означает вариабельный фрагмент с одиночной цепью, представляющий собой результат слияния вариабельных участков тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, связанных друг с другом коротким линкером, обычно серином (S) или глицином (G). Эта химерная молекула сохраняет специфичность исходного иммуноглобулина, несмотря на удаление постоянных участков и введения линкерного пептида.
Антителами модифицированных форматов являются, би- или триспецифические конструктивные элементы антител, слитые белки на основе антител, иммуноконъюгаты и т.п.
В одном из особо предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения белком является по меньшей мере одно антитело или его фрагмент или производное, выбранное из группы, включающей:
полученное из гибридомы антитело,
химеризованное антитело,
гуманизированное антитело и/или
человеческое антитело.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антителом или его фрагментом или производным является антитело против TNFα.
Один из примеров антитела к TNFα приведен в перечне последовательностей, прилагаемом к настоящей заявке. В нем SEQ ID 1 означает кодирующую последовательность нуклеиновых кислот тяжелой цепи IgG, SEQ ID 2 означает кодирующую последовательность нуклеиновых кислот легкой цепи IgG, а SEQ ID 3 и 4 означают аминокислотные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно.
SEQ ID 5, 7 и 9 означают аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность (CDR) легкой цепи (т.е. LC CDR 3, LC CDR 2 и LC CDR 1). SEQ ID 6, 8 и 10 означают аминокислотные последовательности участков, определяющих комплементарность тяжелой цепи (т.е. НС CDR 3, НС CDR 2 и НС CDR 1).
Следует отметить, что SEQ ID 1 и 2 или их части могут быть эквивалентно заменены последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими те же белки или белковые цепи, которые кодируют SEQ ID 1 и 2, но содержащими нуклеотидные замещения, приемлемые при дегенерации генетического кода, последовательностями, кодирующими часть, вариант, гомолог или производное белков или белковых цепей, кодированных SEQ ID 1 и 2, последовательностями нуклеиновых кислот, код которых оптимизирован для заданного экспрессирующего хозяина, и/или молекулой нуклеиновой кислоты, последовательность которой по меньшей мере на 70%, предпочтительно на 95% идентична SEQ ID 1 или 2.
Следует отметить, что SEQ ID 3-10 или их части могут быть эквивалентно заменены аминокислотными последовательностями, содержащими одно или несколько консервативных аминокислотных замещений, т.е. одно или несколько замещений, которые не влияют на существенные признаки белков, такие как сродство к связыванию мишени, иммуногенность, ADCC, время полувыведения из сыворотки и т.д.
Другими предпочтительными антителами являются антитела, которые распознают любой белок или сочетание белков, включающих без ограничения любые из перечисленных белков и/или следующие антигены: CD2, CD3, CD4, CDS, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (В7.1), CD86 (В7.2), CD147, IL-1a, IL-1, IL-2, IL-3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, рецептор IL-2, рецептор IL-4, рецептор IL-6, рецептор IL-13, рецепторные субъединицы IL-18, PDGF-B и их аналоги, PLGF, VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-p1, рецептор EGF, рецептор PLGF, рецептор VEGF, фактор роста гепатоцитов, остеопротегерин-лиганд, гамма-интерферон, стимулятор В-лимфоцита, комплемент С5, IgE, опухолеспецифический антиген СА125, опухолеспецифический антиген MUC1, антиген РЕМ, ErbB2/HER-2, опухолеассоциированные эпитопы, повышенные уровни которых присутствуют в сыворотке пациентов, онкоассоциированные эпитопы или белки, экспрессирующие в клетках рака молочной железы, толстой кишки, плоскоклеточного рака, рака простаты, поджелудочной железы, легкого и/или почек и/или в клетках меланомы, глиомы или нейробластомы, в центральной массе некротизированной опухоли, интегрин-альфа-4-бета-7, интегрин VLA-4, интегрины В2, рецепторы TRAIL 1, 2, 3 и 4, RANK, RANK-линанд, TNF-α, адгезивную молекулы VAP-1, молекулу адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ), молекулу-3 межклеточной адгезии (ICAM-3), адгезин лейкоинтегрин, тромбоцитарный гликобелок gp IIb/IIIa, тяжелую цепь сердечного миозина, паратиреоидный гормон, МНС I, карциноэмбриональный антиген (СЕА), альфа-фетопротеин (AFP), фактор некроза опухолей (TNF), рецептор Fc-y-1, HLA-DR 10-бета, антиген HLA-DR, L-селектин и IFN-γ.
Особо предпочтительно, чтобы антителом являлся IgG.
В качестве альтернативы, биофармацевтическим лекарственным средством является антитело-миметик, т.е. молекула связывающего мишень белка не на основе иммуноглобулина. Многие из упомянутых методов также применимы в отношении этих молекул. Такие антитела-миметики получают, например, из белков с анкириновым повтором, лектинов типа С, А-доменных белков Staphylococcus aureus, трансферринов, липокалинов, фибронектинов, домена Куница ингибиторов протеаз, убиквитина, цистеиновых узлов или ноттинсов, тиоредоксина А и т.д., и они известны специалистам в данной области техники из соответствующей литературы.
В качестве другой альтернативы, биофармацевтическим лекарственным средством является рекомбинантный слитый белок, содержащий любой из упомянутых выше белков или преимущественно сходных белков. Например, биофармацевтическим лекарственным средством, содержащимся в композиции согласно настоящему изобретению, могут являться рекомбинантные слитые белки, содержащие один из упомянутых выше белков плюс домен мультимеризации, такой как лейциновая "молния", двойная спираль, Fc-часть антитела, или преимущественно сходный белок. В частности, такие рекомбинантные слитые белки включают белки, в которых по меньшей мере TNFR- или RANK-часть слита с Fc-частью антитела. Рекомбинантные слитые белки особо предпочтительно содержат связывающий мишень домен и Fc-домен IgG (так называемые молекулы - цент).
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно содержит по меньшей мере один стабилизатор, выбранный из группы, включающей аминокислоту, сахарный полиол, дисахарид и/или полисахарид.
Дисахаридом предпочтительно является вещество, выбранное из группы, включающей сахарозу, трегалозу, мальтозу и/или лактозу.
Сахарным полиолом также предпочтительно является вещество, выбранное из группы, включающей маннит и/или сорбит. Из них особо предпочтительным сахарным полиолом является маннит. Он предпочтительно используется в качестве единственного сахарного полиола или даже единственного стабилизатора в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.
Стабилизаторы, подпадающие под указанное определение, приведены в следующей таблице.
Таблица 2
Общепринятое название
Научное название
Общая формула
Аргинин
(S)-2-Амино-5-гуанидинпентановая кислота
C<sub>6</sub>H<sub>14</sub>N<sub>4</sub>O<sub>2</sub>
Глицин
Аминоуксусная кислота
C<sub>2</sub>H<sub>5</sub>NO<sub>2</sub>
Маннит
(2R,3R,4R,5R)-Гексан-1,2,3,4,5,6-гексол
C<sub>6</sub>H<sub>14</sub>O<sub>6</sub>
Сорбит
(2S,3R,4R,5R)-Гексан-1,2,3,4,5,6-гексол
С<sub>6</sub>Н<sub>14</sub>О<sub>6</sub>
Ксилит
(2R,3R,4S)-Пентан-1,2,3,4,5-пентол
C<sub>5</sub>H<sub>12</sub>O<sub>5</sub>
Сахароза
β-D-Фруктофуранозил-(2→1)-α-D-глюкопиранозид
C<sub>12</sub>H<sub>22</sub>O<sub>11</sub>
Трегалоза
A-D-Глюкопиранозил α-D-глюкопиранозид
C<sub>12</sub>H<sub>22</sub>O<sub>11</sub>
Лактоза
4-O-β-D-Галактопиранозил-D-глюкоза
C<sub>12</sub>H<sub>22</sub>O<sub>11</sub>
Мальтоза
4-O-α-D-Глюкопиранозил-D-глюкоза
C<sub>12</sub>H<sub>22</sub>O<sub>11</sub>
Декстран
Полисахарид
Н(C<sub>6</sub>H<sub>10</sub>O<sub>5</sub>)<sub>x</sub>OH
Особо предпочтительно, чтобы стабилизатор присутствовал в водной форме фармацевтической композиции в концентрации от ≥1 мМ до ≤300 мМ, предпочтительно от ≥2 мМ до ≤200 мМ, более предпочтительно от ≥5 мМ до ≤150 мМ.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композицией является композиция, применимая для парентерального введения, предпочтительно внутривенного, внутримышечного и/или подкожного введения.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, включающей:
поверхностно-активное вещество,
изотонирующее вещество и/или
комплексен металлических ионов.
Поверхностно-активное вещество усиливает смачиваемость компонентов и способствует их растворимости. Это в особенности важно, поскольку биофармацевтические лекарственные средства часто содержатся в высоких концентрациях (например, >100 мг в 1-10 мл).
Применимыми поверхностно-активными веществами являются, например, лецитин и другие неионные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбаты ("Tween") или полоксамеры. Особо предпочтительными поверхностно-активными веществами являются полисорбат 80 ("Tween 80") и полоксамер 188.
Изотонирующее вещество служит для установления осмотического давления композиции согласно изобретению на физиологически приемлемом уровне, например, на уровне осмолярности крови.
Изотонирующее вещество является физиологически приемлемым компонентом и не ограничено конкретным веществом. Типичными примерами изотонирующего вещества являются, например неорганическая соль, такая как хлорид натрия, хлорид калия или хлорид кальция и т.п. Они могут применяться отдельно или в смеси.
Комплексен металлических ионов служит комплексообразованию тяжелых металлов, которые в противном случае могут инактивировать биофармацевтическое лекарственное средство, содержащееся в композиции согласно изобретению. Предпочтительно комплексоном металлических ионов является EDTA и/или EGTA.
Согласно второй особенности настоящего изобретения предложено биофармацевтическое лекарственное средство, входящее в состав композиции согласно первой особенности настоящего изобретения.
Согласно еще одной (третьей) особенности настоящего изобретения предложена первичная упаковка, такая как предварительно наполненный шприц или ланцет, пробирка или инфузионный мешок, содержащий композицию согласно первой особенности изобретения и/или биофармацевтическое лекарственное средство согласно второй особенности настоящего изобретения.
Предварительно наполненный шприц или ланцет может содержать композицию в лиофилизированной форме (которая затем должна быть сделана растворимой, например, с помощью воды для инъекций до введения) или в водной форме. Шприц или ланцет часто является изделием только для одноразового применения и может иметь объем от 0,1 до 20 мл. Тем не менее, шприц или ланцет также может представлять собой шприц или ланцет многоразового использования или дозирования.
Пробирка также может содержать композицию в лиофилизированной форме или в водной форме и может служить устройством одноразового или многоразового использования. В качестве устройства многоразового использования пробирка может иметь больший объем.
Инфузионный мешок обычно содержит композицию в водной форме и может иметь объем от 20 до 5000 мл.
Согласно дополнительной (четвертой) особенности изобретения предложено применение фармацевтической композиции и/или биофармацевтического лекарственного средства и/или первичной упаковки согласно первой, второй и третьей особенностям, соответственно, настоящего изобретения для лечения по меньшей мере одного патологического состояния, выбранного из группы, включающей:
аутоиммунные болезни,
инфекционные болезни
новообразования и/или злокачественные опухоли (рак) и/или
болезни нервной системы.
Соответствующими аутоиммунными болезнями являются артрит и ревматизм, такой как псориаз, болезнь крона или ревматоидный артрит. Соответствующими инфекционными болезнями являются вирусные и/или бактериальные инфекции. Соответствующими новообразованиями и/или злокачественными опухолями являются саркомы, карциномы, лимфомы и лейкемии, предпочтительно, рак легкого, рак молочной железы, рак яичников, рак толстой кишки, рак простаты, рак шейки матки и т.п. Соответствующими болезнями нервной системы являются в том числе нейродегенеративные расстройства, такие как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз, болезнь Хантингтона или боковой амиотрофический склероз.
Описание чертежей и экспериментов
Дополнительные подробности, признаки, характеристики и преимущества объекта изобретения заявлены в зависимых пунктах формулы изобретения и раскрыты в следующем далее описании соответствующих чертежей и примеров, в которых в проиллюстрированы предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Тем не менее, эти чертежи никоим образом не подразумевают ограничение объема изобретения.
В описанных далее экспериментах композиции согласно настоящему изобретению подвергали воздействию особо стрессовых условий, способствующих агрегации. Соответственно, эксперименты имеют целью продемонстрировать эффективное предотвращение агрегации посредством композиции согласно настоящему изобретению.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показана вызванная напряжением сдвига агрегация в "жестких" условиях, измеренная методом динамического рассеяния света (DLS) и выраженная в пересчете на средний радиус белка (Z-Ave; фиг.1а) и коэффициент полидисперсности (PdI; фиг.1б). Соответствующий средний показатель контрольной композиции, содержащей лимонную кислоту и NaP, обозначен горизонтальной линией. Уровень агрегации прямо пропорционален PdI и увеличению среднего радиуса белка (Z-Ave), что означает, что композиции с величиной Z-Ave и/или PdI ниже горизонтальной линии демонстрировали лучшие свойства агрегации (т.е. меньшую агрегацию), чем контрольная композиция. Данные, лежащие в основе диаграммы на фиг.1, представлены в Таблице 6.
На фиг.2 показана вызванная замораживанием-оттаиванием (FT) агрегация в "жестких" условиях, измеренная методом DLS и выраженная в пересчете на Z-Ave (фиг.2а) и PdI (фиг.2б). Соответствующий средний показатель контрольной композиции обозначен горизонтальной линией. Уровень агрегации прямо пропорционален PdI и увеличению среднего радиуса белка (Z-Ave), что означает, что композиции с величиной Z-Ave и/или PdI ниже горизонтальной линии демонстрировали лучшие свойства агрегации (т.е. меньшую агрегацию), чем контрольная композиция. Данные, лежащие в основе диаграммы на фиг.2, представлены в Таблице 6.
На фиг.3 проиллюстрированы исследования стабильности, проведенные с использованием различных буферов в композиции, содержащей 105 мМ NaCl, 0,1% Tween 80 и 66 мМ маннита, при рН 5,2. Концентрация антитела составляла 50 мг/мл. Образцы хранили при различных температурах (5°С, 25°С и 40°С) и подвергли анализу методом эксклюзионной хроматографии с целью определения степени чистоты (фиг.3а) и уровней агрегации (АР = пики агрегации, фиг.3б). Данные, лежащие в основе диаграммы на фиг.3, представлены в Таблице 7.
На фиг.4 проиллюстрированы дальнейшие исследования стабильности, проведенные с целью обнаружения невидимых частиц методом визуализации микропотоков (MFI) в тех же условиях, что и на фиг.3. Представлены четыре различных испытания с частицами различных размеров (5-10 мкм (фиг.4а) в сравнении с >10 мкм (фиг.4б)). Данные, лежащие в основе диаграммы на фиг.4, представлены в Таблице 8.
Эксперименты
Перед тем, как перейти к подробному описанию экспериментов и их результатов, следует упомянуть, что эти эксперименты были проведены с использованием фармацевтических композиций, действующим ингредиентом которых являлось антитело против TNF-α (гуманизированный IgG с молекулярной массой около 150 килодальтон). С учетом структурного сходства антител, содержащих общий концептуальный IgG, специалист поймет, что полученные результаты могут быть непосредственно перенесены на фармацевтические композиции, содержащие мышиные, кроличьи, химерные, гуманизированные и/или человеческие антитела на основе IgG, и/или на антитела против других мишеней, например, против EGFR, против ErbB2, против CD 20, против VEGF и т.д. (смотри выше список потенциальных мишеней). Кроме того, специалист также поймет, что они также могут быть перенесены на описанные выше антитела-миметики, производные антител, модифицированные форматы антител или рекомбинантные слитые белки.
Помимо этого, хотя в прямой форме описаны некоторые сочетания буфера/стабилизатора, которые являются особо предпочтительными, специалист поймет, что на различных фигурах чертежей и в таблицах могут быть представлены конкретные сочетания буфера/стабилизатора, обладающие более высокой или такой же эффективностью, как и соответствующий контрольный буфер. Соответственно, хотя эти сочетания не описаны в прямой форме, они считаются однозначно раскрытыми и могут служить запасными вариантами при рассмотрении настоящей заявки или соответствующей выделенной или продолжающей заявки(-ок).
Материалы
Для исследования композиций в качестве типового антитела использовали моноклональное антитело против TNF-α. Антитело экспрессировали в клоне, выделенном из клеток линии SSF3 (производное СНО) и очистили на стадиях хроматографии по сродству к белку А, катионообменной хроматографии (СЕХ) и анионообменной хроматографии (АЕХ). Довели концентрацию антитела до около 50 мг/мл в приемлемом буфере и хранили в количествах, кратных 1 мл при температуре ниже -60°С.
Получение композиций для отборочных исследований
В рассмотренном исследовании были испытаны сочетания различных карбоновых кислот/солей и стабилизаторов (Таблицы 3а и 3б, соответственно). В некоторых случаях использовали смесь двух различных карбоновых кислот или смесь одной карбоновой кислоты и фосфата натрия (NaP).
Большинство композиций являлись композициями согласно изобретению, т.е. содержащими по меньшей мере одну моно- или дикарбоновую кислоту с основной цепью из 2-6 атомов углерода или по меньшей мере одну ее соль.
Некоторые композиции содержали лимонную кислоту и, соответственно, являлись композициями, известными из уровня техники. Эти композиции использовались в качестве контрольных и/или для сравнения.
Все испытанные композиции содержали 105 мМ NaCl, 0,1% Tween 80 и имели рН около 5,2. Готовые композиции получали из исходных растворов. Сначала получили 988 мкл композиции путем смешивания 870 мкл 23 мМ соли/кислоты (Таблица 3а), 22 мкл 5М NaCl, 81 мкл 817 мМ стабилизатора (Таблица 3б) и 15 мкл 50 мМ Tween 80 в качестве поверхностно-активного вещества. За одну серию испытаний получили 42 композиции (7 солей/кислот × 6 стабилизаторов) на планшете с глубокими лунками. Затем перенесли 470 мкл смеси композиции на планшет с глубокими лунками для разбавления белка, добавили в четные колонки 30 мкл антитела до концентрации около 50 мг/мл и смешали. Соответственно, целевая концентрация белка составляла 3 мг/мл.
В нечетных колонках получил композиции плацебо (без белка) путем добавления 30 мкл чистой воды. Наконец, перенесли 100 мкл каждой полученной композиции на четыре проницаемых для ультрафиолетового излучения планшета Half Area Greiner (микротитрационных планшета). Сразу после переноса на микротитрационные планшеты определили концентрацию белка и рассеяние вследствие агрегации путем измерения соотношения А280 и А340/А280 в спектрофотометре Tecan Infinite 200. Запечатали микротитрационные планшеты и подвергли соответствующим испытаниям в стрессовых условиях. Каждая композиция на микротитрационном планшете была получена в двух экземплярах.
Помимо исследования стабильности в условиях стрессовых условиях оценили влияние состава соответствующей композиции на термодинамическую стабильность антитела против TNF-α. С этой целью получили композиции, как описано выше, с концентрацией белка 1 мг/мл.
Таблица 3а
Список испытанных кислот/солей в экспериментах, проиллюстрированных на фиг.1 и 2 (Таблица 6).
№ буферной композиции
Соли/кислоты
1
20 мМ глутамата
2
20 мМ аконитовой кислоты
3
20 мМ аскорбиновой кислоты
4
20 мМ яблочной кислоты
5
20 мМ винной кислоты
6
20 мМ адипиновой кислоты
7
20 мМ лимонной кислоты
8
5 мМ глутамата + 20 мМ NaP
9
5 мМ яблочной кислоты + 20 мМ NaP
10
5 мМ винной кислоты + 20 мМ NaP
11
5 мМ адипиновой кислоты + 20 мМ NaP
12
20 мМ глутамата + 5 мМ лимонной кислоты
13
20 мМ яблочной кислоты + 5 мМ лимонной кислоты
14
20 мМ винной кислоты + 5 мМ лимонной кислоты
15
20 мМ адипиновой кислоты + 5 мМ лимонной кислоты
Все растворы содержали 105 мМ NaCl, 0,1% Tween 80 и имели рН около 5,2.
Таблица 3б
Список стабилизаторов, испытанных в сочетаниях с солями/кислотами из Таблицы 3а
№ Стабилизатора
Стабилизатор
1
Маннит
2
Глицин
3
Трегалоза
4
Сорбит
5
Сахароза
6
Нет*
* было получено несколько композиций стабилизаторов.
За одну серию было испытано 7 органических кислот/солей (В1-В7) и 5 стабилизаторов (Man = маннит, Gly = глицин, Thr = трегалоза, Sor = сорбит и Suc = сахароза). Композиции плацебо (без белка, помеченные буквой "В") поместили в нечетные колонки, а композиции, содержащие белок (помеченные буквой "Р") поместили в четные колонки.
В качестве контрольной композиции использовали предлагаемую на рынке композицию, содержащую антитело против TNFα в растворе, содержащем 14,1 мМ фосфата натрия, 7,2 мМ цитрата, 105,5 мМ NaCl, 0,1% Tween 80 и 65,9 мМ маннита (СТ = контроль). Конструкция планшета представлена в Таблице 4.
Таблица 4
Конструкция планшета для отборочных исследований 42 композиций
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
А
B1
P1
В1+Man
Р1+Man
В1+Gly
Р1+Gly
В1+Thr
Р1+Thr
В1+Sor
Р1+Sor
В1+Suc
P1+Suc
В
B2
Р2
В2+Man
Р2+Man
В2+Gly
Р2+Gly
В2+Thr
Р2+Thr
В2+Sor
Р2+Sor
В2+Suc
Р2+Suc
С
В3
Р3
В3+Man
P3+Man
В3+Gly
P3+Gly
В3+Thr
P3+Thr
В3+Sor
P3+Sor
В3+Suc
P3+Suc
D
В4
Р4
В4+Man
P4+Man
В4+Gly
P4+Gly
В4+Thr
P4+Thr
В4+Sor
P4+Sor
В4+Suc
P4+Suc
E
В5
Р5
В5+Man
P5+Man
В5+Gly
P5+Gly
В5+Thr
P5+Thr
В5+Sor
P5+Sor
В5+Suc
P5+Suc
F
В6
Р6
В6+Man
Р6+Man
В6+Gly
Р6+Gly
В6+Thr
Р6+Thr
В6+Sor
Р6+Sor
В6+Suc
Р6+Suc
G
В7
Р7
В7+Man
Р7+Man
В7+Gly
Р7+Gly
В7+Thr
Р7+Thr
В7+Sor
Р7+Sor
В7+Suc
Р7+Suc
Н
СТ
СТ+Р
СТ
СТ+Р
СТ
СТ+Р
СТ
СТ+Р
СТ
СТ+Р
СТ
СТ+Р
В
В+М
B+Gly
B+Thr
B+Sor
B+Suc
Методы
Стрессовые испытания
Осуществили отборочные испытания композиций путем двух стрессовых испытаний (замораживание/оттаивание и встряхивание, соответственно) в "мягких" и "жестких" условиях. "Мягкие" условия включали:
троекратное замораживание/оттаивание (замораживание при -20°С и оттаивание при комнатной температуре),
встряхивание со скоростью 400 об/мин при 40°С в течение 5 дней.
"Жесткие" условия включали:
десятикратное замораживание/оттаивание (замораживание при -20°С и оттаивание при комнатной температуре),
встряхивание со скоростью 600 об/мин при 40°С в течение 7 дней.
Мутность (опалесценция) - спектральная поглощательная способность на волне 340 нм
В основу измерений прозрачности или мутности (опалесценции) положен тот факт, что падающие лучи затухают вследствие рассеяния света. Присутствие равномерно взвешенных частиц, таких как агрегаты нерастворимого белка и осадок приводит к видимому увеличению ультрафиолетовой спектральной поглощательной способности на волнах все длин вследствие эффекта рассеивания. Соответственно, мутность композиции измерялась с помощью спектрофотометра для прочтения планшетов Tecan Infinite 200 как фотометрическая спектральная поглощательная способность на волне 340 нм, на которой ни один из известных хромофоров в композиции белка не демонстрирует собственное поглощение.
После 30 секунд встряхивания микротитрационного планшета измерили спектральную поглощательную способность на волнах 280 нм, 340 нм, 900 нм и 999 нм. В спектральную поглощательную способность А280 и А340 в каждой лунке была внесена поправка на длину пробега путем умножения в коэффициент (А999-А900)/0,147. Кроме того, в спектральную поглощательную способность растворов белка была внесена поправка на фон путем вычитания соответствующей спектральной поглощательной способности образца плацебо. Соответственно, концентрацию белка определяли в мг/мл как спектральную поглощательную способность А280 с поправкой на длину пробега и за вычетом поправки на фон, деленную на коэффициент 1,39 спектральной поглощательной способности антитела против TNF-α. Мутность выражали как соотношение величин А340 и А280 за вычетом поправки на фон.
Динамическое рассеяние света (DLS)
Анализ DLS осуществляли с использованием системы Malvern APS при температуре 25°C с помощью полупроводникового лазера, излучающего на волне 830 нм при угле рассеяния 90°. В основу этого метода положено измерение общей интенсивности рассеянного света, которая пропорциональна концентрации белка и размеру молекул рассеивающих свет частиц. Временной масштаб колебаний интенсивности рассеянного света анализировали путем автокорреляции с использованием программного обеспечения Malvern DLS. Перед каждым измерением мягко встряхивали микротитрационный планшет во избежание выпадения в осадок нерастворимых частиц. Согласно плану 20 мкл образца автоматически переносились в измерительную кювету и возвращались в лунку после измерения. Для каждого измерения регистрировалось колебание интенсивности рассеяния 13 раз за временной интервал 5 секунд, чтобы определить интенсивность функции автокорреляции. Путем применения модели многовершинного распределения определили такие параметры, как средний гидродинамический радиус белка Z-Average (нм), коэффициент полидисперсности PdI, гидродинамический радиус первых трех пиков, область интенсивности трех первых пиков и т.д. Не агрегированный белок описывается монодисперсным распределением по размерам. В результате агрегации белка образуется множество полидисперсных пиков распределения по размерам. Уровень агрегации традиционно оценивается по увеличению коэффициента полидисперсности (PdI) и увеличению среднего радиуса белка (Z-Ave).
Термодинамическая стабильность
-1
-1
Осуществили измерения методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) с использованием калориметра Auto Cap-DSC производства компании MicroCal, LLC (Нортгемптон, шт. Массачусетс, США). Для каждого измерения перенесли 400 мкл образца (композиции, содержащей белок) и контроля (композиции плацебо) на 96-луночный микротитрационный планшет. Прибор Auto Cap-DSC действовал с 15-минутным периодом уравновешивания до и между сканированиями в режиме 60°С/ч. Образцы сканировали при температуре от 30 до 95°C с быстрым охлаждением между сканированиями. В данные DSC вносили поправку на исходные показатели прибора и нормализовали к скорости сканирования и концентрации белка. Определяли избыточную теплоемкость (Ср) в ккал·K на моль, при этом 1000 калорий = 4,184 Дж. Преобразование и анализ данных осуществляли с помощью программного обеспечения (OriginLab Corporation, Нортгемптон, шт. Массачусетс, США). Как принято в случае необратимых тепловых переходов моноклональных антител, стабильность оценивали по сдвигу температуры плавления первого пика.
Визуализация микропотоков
Визуализации микропотоков (MFI) является технологией визуализации, которая применяется для обнаружения и измерения невидимых и видимых частиц в растворе. При прохождении взвешенных в текучей среде частиц через чувствительную зону захватываются их цифровые изображения, которые автоматически анализируются с целью создания цифрового архива параметров частиц, таких как соотношение размеров и интенсивность. Кроме того, результаты определяются как размер и счет частиц.
До осуществления MFI систему промыли с использованием 0,9 мл образца буфера. После этого проанализировали 1 мл образца раствора с помощью системы MFI. Отбросили первые 0,2-0,3 мл. С целью определении концентрации частиц проанализировали по меньшей мере 25 изображений. После анализа 2000 частиц измерения прекратили. Дальнейший анализ данных осуществляли с использованием прикладного программного обеспечения MFI. Образцы могут анализироваться на предмет распределения по размерам или формы с целью получения дополнительной информации, например, о соотношении размеров.
Эксклюзионная хроматография
Эксклюзионная хроматографии (SE-HPLC или SEC) применялась для разделения вариантов белка с меньшей и большей молекулярной массой, а также любых примесей и ингредиентов композиции. Результаты были определены как совокупность пиков агрегации (АР) и совокупность пиков распада (DP). В процессе SEC идентификацию образцов для испытания осуществляли путем сравнения времени удержания в хроматографе основных пиков и времени удержания основного пика исходного эталона.
SEC осуществляли с использованием одной колонки TSK-Gel G3000SWXL производства компании (5 мкм, 250 А, внутренний диаметр 7,8 мм, длина 300 мм) (Tosoh Bioscience, Штутгарт, Германия) и подвижной фазы, содержащей 150 мМ фосфата калия с рН 6,5. В колонке установили расход потока 0,4 мл/мин и температуре 30°С. Образцы разбавляли подвижной фазой до концентрации 0,75 мг/мл, а объем инъекций составлял 10 мкл.
Подтверждающие исследования
С целью подтверждения полученных результатов описанных выше отборочных исследований композиций был проведено исследование стабильности. Получили антитело, как описано выше, и дополнительно диализировали его в различных буферных системах. Полученные композиции содержали 105 мМ NaCl, 0,1% Tween 80 и 66 мМ маннита и имели рН на уровне 5,2. Концентрация антитела составляла 50 мг/мл. Образцы хранили при различных температурах (5°С, 25°С и 40°С) анализировали методом эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC) с целью определения степени чистоты и уровней агрегации, а также методом визуализации микропотоков (MFI) с целью обнаружения невидимых частиц. Метод SE-HPLC позволяет обнаруживать, в частности, димерные, гримерные, тетрамерные и пентамерные агрегаты соответствующего антитела (т.е. агрегаты с молекулярной массой до 800 килодальтон), а метод визуализации микропотоков (MFI) служит для обнаружения невидимых частиц в диапазоне размеров 5-30 мкм, т.е. примерно в 1000 раз более крупные агрегаты, чем обнаруживаемые методом SE-HPLC.
Результаты
С целью идентификации составов композиций, которые защищают антитело против TNF-α от агрегации на таком же уровне, как контрольная композиция, провели две серии отборочных исследований различных композиций (Таблица 3). В первой серии исследований композиции, содержащие антитело против TNF-α, подвергали двум стрессовым испытаниям в "мягких" условиях (троекратное замораживание/оттаивание и встряхивание со скоростью 400 об/мин при 40°С в течение 5 дней). После первого стрессового испытания определяли уровень агрегации в каждом образце путем измерения распределения по размерам методом DLS.
Помимо оценки потенциала защиты от агрегации измеряли влияние исследованных композиций на термодинамическую стабильность антитела против TNF-α, чтобы дополнительно продемонстрировать применимость композиций согласно изобретению для поддержания структурной целостности содержащегося в них биофармацевтического лекарственного средства. Сканировали термограммы DSC при 30-90°С. Температура плавления (Tm; температура первого пика) антитела против TNF-α в исследованных композициях согласно изобретению составляла от около 70°С до около 72°С, что сравнимо с его соответствующей температурой плавления в контрольной композиции (Tm=71,46±0,06°С (N=11)). Подробные данные Tm приведены в Таблице 5. Как показано в Таблице 5, композиции содержащие в качестве карбоновой соли/кислоты только трикарбоновые кислоты, такие как аконитовая кислота или лимонная кислота, и служащие контролем, обозначены курсивом и помечены звездочкой (*).
На основании данных DLS и DSC, полученных при испытании в "мягких" условиях, следующие композиции, содержащие адипиновую, адипиновую + лимонную, адипиновую + NaP, яблочную, яблочную + лимонную, винную или винную + лимонную кислоту/соль в сочетании со стабилизатором или без стабилизатора (глицина, маннита, сорбита, сахарозы или трегалозы), соответственно, были выбраны для дальнейшей оценки, на этот раз в "жестких" условиях.
Выбор был обусловлен сходством их PdI, Z-Ave и Tm с соответствующими показателями контрольной композиции (что прямо указывает на их приемлемость для медицинского применения). С целью обнаружения каких-либо характеристик испытанных композиций, превосходящих характеристики контрольной композиции, образцы дополнительно исследовали в "жестких" условиях (десятикратное замораживание оттаивание и встряхивание со скоростью 600 об/мин при 40°С в течение 7 дней). Эксперименты проводились дважды.
Методом DLS была обнаружена вызванная агрегация (Таблица 6, фиг.1 и 2). Измерения мутности не выявили какой-либо агрегации. Как ни удивительно, агрегация антитела против TNF-α была значительно более выраженной в контрольной композиции (фиг.1 и 2), чем в композициях согласно изобретению, например, содержащих моно- или дикарбоновую кислоту.
Агрегация, оценивавшаяся по Z-Ave (фиг.1а) и PdI (фиг.1б) после встряхивания со скоростью 600 об/мин в течение 7 дней при 40°С, показала, что все сочетания буфера/стабилизатора согласно изобретению (например адипиновая кислота + маннит) демонстрировали лучшие характеристики, т.е. меньший Z-Ave или PdI, чем контрольный буфер (лимонная кислота/NaP + маннит), за исключением некоторых сочетаний, содержащих винную кислоту (Z-Ave: винная кислота + маннит или сорбит; винная кислота/лимонная кислота + маннит или сорбит или трегалоза; PdI: винная кислота + маннит или сорбит; винная кислота/лимонная кислота + маннит или сорбит).
Следует отметить, что полученные стандартные отклонения, обозначенные планками погрешностей ("усами"), обычно довольно невелики, что говорит о статистической значимости различия в характеристиках между контролем (значение Z-Ave или PdI которого обозначено горизонтальной планкой, т.е. 9,58 нм или 0,31) и соответствующим буфером. В отличие от этого, у содержащих винную кислоту сочетаний с худшими характеристиками, чем у контрольного буфера, наблюдались значительные стандартные отклонения, что указывает на то, что на соответствующие эксперименты могли повлиять конкретные паразитные эффекты.
Что касается экспериментов с замораживанием/оттаиванием, их результаты проиллюстрированы на фиг.2а и 2б. Эти эксперименты показывают, что в соответствующих условиях все испытанные композиции демонстрировали сходные характеристики (обозначенные большими планками погрешностей в эксперименте с PdI на фиг.2б), а некоторые заявленные композиции (например, адипиновая кислота + маннит, сорбит или сахароза) имели значительно лучшие характеристики, чем контрольная композиция.
В Таблицах 8 и 9 и на фиг.3 и 4 приведены результаты подтверждающих исследований, в которых в состав раствора, содержащего маннит (смотри выше), включали различные буферы. Исследования стабильности в течение 3 месяцев при 5,25 и 40°С (Таблица 7) методом эксклюзионной хроматографии (SE-HPLC) показали, что вследствие агрегации и распада действующего соединения (антитела против TNF-α) степень чистоты снизилась до уровня от около 98% (при хранении при 5°С) до 87% (при хранении при 40°С). В этом эксперименте все сравнивавшиеся буферы демонстрировали сходные характеристики. Смотри наглядное представление на фиг.3а. Исходная степень чистоты всех испытанных композиций составляла от 99,2 до 93% в начале экспериментов.
Тем не менее, также обнаруженная методом SE-HPLC сумма пиков агрегации (контрольного) фосфатного/цитратного значительно превышала (1,8% при хранении при 40°С) сумму большинства буферов согласно изобретению, например, 1,2% (янтарной кислоты) или 1,5% (уксусной кислоты). Смотри наглядное представление на фиг.3б.
Эксперименты методом визуализации микропотоков (MFI), в которых в образце заданного объема подсчитывались частицы в заданном диапазоне размеров, служили для обнаружения образования макроагрегаций в диапазоне 5-30 мкм через 3 месяца хранении при 40°С. Очевидно, что в диапазоне размеров 5-10 мкм все заявленные буферы имели лучшие характеристики, чем контрольный буфер (т.е. лимонная кислота + NaP). Смотри наглядное представление на фиг.4а. Особенно хорошие характеристики в этих условиях демонстрировали адипиновая кислота + маннит и уксусная кислота + маннит.
-1
-1
В диапазоне размеров >10 мкм число частиц всех буферов составляло менее 260 на мл, что примерно в 30 раз меньше соответствующего предельного числа, установленного Европейской Фармакопеей (6.0), согласно которой предельное загрязнение инъекций и инфузий частицами не должно превышать 7500 частиц на мл для частиц размером >10 мкм. Смотри наглядное представление на фиг.4а. За счет хороших характеристик всех буферов счет частиц являлся очень небольшим, что статистически означает, что на результаты влияют значительные относительные стандартные отклонения вследствие небольшого счета частиц, и предполагает, что видимые различия в среднем счете частиц, например, между контролем и адипиновой кислотой не являются значимыми.
Таблица 5
Определенное методом DSC влияние состава солей/кислот и стабилизатора на температуру плавления
Соли/кислоты
Стабилизатор
Tm (°С)
Соли/кислоты
Стабилизатор
Tm (°С)
1
Контроль (фосфат натрия + цитрат)
Манит
71,45
38
Глутаминовая NaP
Сахароза
72,01
2
Аконитовая*
Манит
70,47
39
Глутаминовая NaP
Трегалоза
71,9
3
Аконитовая*
Нет
70,04
40
Яблочная
Глицин
71,19
4
Адипиновая
Глицин
71,03
41
Яблочная
Маннит
70,79
5
Адипиновая
Манит
70,95
42
Яблочная
Нет
70,99
6
Адипиновая
Нет
70,8
43
Яблочная
Сорбит
71,19
7
Адипиновая
Сорбит
71,06
44
Яблочная
Сахароза
71,19
8
Адипиновая
Сахароза
71,1
45
Яблочная
Трегалоза
71,31
9
Адипиновая
Трегалоза
71,02
46
Яблочная Лимонная
Глицин
71,38
10
Адипиновая Лимонная
Глицин
71,21
47
Яблочная Лимонная
Маннит
71,28
11
Адипиновая Лимонная
Манит
70,96
48
Яблочная Лимонная
Сорбит
71,33
12
Адипиновая Лимонная
Сорбит
71,12
49
Яблочная Лимонная
Сахароза
71,4
13
Адипиновая Лимонная
Сахароза
71,24
50
Яблочная Лимонная
Трегалоза
71,4
14
Адипиновая Лимонная
Трегалоза
71,23
51
Яблочная NaP
Глицин
71,41
15
Адипиновая NaP
Глицин
71,47
52
Яблочная NaP
Маннит
71,66
16
Адипиновая NaP
Манит
71,56
53
Яблочная NaP
Сорбит
71,8
17
Адипиновая NaP
Сорбит
71,49
54
Яблочная NaP
Сахароза
71,98
18
Адипиновая NaP
Сахароза
71,58
55
Яблочная NaP
Трегалоза
71,73
19
Адипиновая NaP
Трегалоза
71,74
56
NaP
Маннит
71,28
20
Аскорбиновая
манит
70,94
57
NaP
Нет
70,89
21
Аскорбиновая
Нет
70,56
58
Винная
Глицин
71,4
22
Лимонная*
Маннит
70,53
59
Винная
Маннит
71,1
23
Лимонная*
Нет
70,49
60
Винная
Нет
70,94
24
Глутаминовая
Глицин
71,92
61
Винная
Сорбит
71,46
25
Глутаминовая
манит
71,51
62
Винная
Сахароза
71,29
26
Глутаминовая
Нет
70,89
63
Винная
Трегалоза
71,28
27
Глутаминовая
Сорбит
71,92
64
Винная Лимонная
Глицин
71,71
28
Глутаминовая
Сахароза
71,82
65
Винная Лимонная
Маннит
71,45
29
Глутаминовая
Трегалоза
71,91
66
Винная Лимонная
Сорбит
71,53
30
Глутаминовая Лимонная
Глицин
71,88
67
Винная Лимонная
Сахароза
71,74
31
Глутаминовая Лимонная
Манит
71,86
68
Винная Лимонная
Трегалоза
71,72
32
Глутаминовая Лимонная
Сорбит
71,88
69
Винная NaP
Глицин
71,6
33
Глутаминовая Лимонная
Сахароза
71,9
70
Винная NaP
Маннит
71,65
34
Глутаминовая Лимонная
Трегалоза
71,9
71
Винная NaP
Сорбит
71,77
35
Глутаминовая NaP
Глицин
71,82
72
Винная NaP
Сахароза
71,92
36
Глутаминовая NaP
Маннит
71,76
73
Винная NaP
Трегалоза
71,91
37
Глутаминовая NaP
Сорбит
71,71
Таблица 6
Вызванная напряжением сдвига или замораживанием/оттаиванием агрегация в "жестких" условиях, измеренная методов DLS (PdI - коэффициент полидисперсности, Z-Ave - средний радиус, N=2 за исключением контрольной композиции, в которой N=12)
Десятикратное замораживание/оттаивание
Встряхивание со скоростью 600 об/мин в течение 7 дней при 40°С
Z-Ave (нм)
PdI
Z-Ave (нм)
PdI
Соли/кислоты
Стабилизатор
Средн.
Ст. откл.
Средн.
Ст. откл.
Средн.
Ст. откл.
Средн.
Ст. откл.
Контроль (фосфат натрия + цитрат)
Манит
7,26
0,96
0,27
0,04
9,58
3,87
0,31
0,15
Адипиновая
Глицин
7,13
0,25
0,29
0,02
6,00
0,17
0,18
0,01
Адипиновая
Манит
6,22
0,32
0,17
0,09
5,82
0,12
0,09
0,01
Адипиновая
Нет
6,74
0,40
0,31
0,06
5,85
0,17
0,10
0,04
Адипиновая
Сорбит
6,12
0,09
0,17
0,03
6,09
0,02
0,19
0,02
Адипиновая
Сахароза
5,98
0,17
0,14
0,03
6,06
0,23
0,16
0,04
Адипиновая
Трегалоза
6,37
0,22
0,23
0,01
7,61
2,33
0,17
0,00
Адипиновая + Лимонная
Глицин
6,37
0,02
0,27
0,03
6,03
0,01
0,21
0,02
Адипиновая + Лимонная
Манит
6,14
0,07
0,18
0,02
5,87
0,13
0,09
0,02
Адипиновая + Лимонная
Нет
6,69
0,59
0,30
0,08
5,88
0,09
0,10
0,04
Адипиновая + Лимонная
Сорбит
6,35
0,07
0,22
0,02
5,99
0,13
0,15
0,00
Адипиновая + Лимонная
Сахароза
6,27
0,08
0,22
0,02
6,23
0,02
0,21
0,01
Адипиновая + Лимонная
Трегалоза
6,67
0,25
0,26
0,05
6,51
0,06
0,25
0,00
Адипиновая + NaP
Глицин
6,44
0,06
0,30
0,01
5,95
0,11
0,18
0,01
Адипиновая + NaP
Манит
6,63
0,13
0,28
0,03
6,02
0,21
0,11
0,00
Адипиновая + NaP
Нет
6,07
0,01
0,21
0,00
6,01
0,48
0,13
0,11
Адипиновая + NaP
Сорбит
6,74
0,15
0,30
0,04
5,80
0,20
0,08
0,03
Адипиновая + NaP
Сахароза
7,72
2,26
0,30
0,15
5,85
0,20
0,10
0,04
Адипиновая + NaP
Трегалоза
8,59
2,47
0,30
0,02
5,81
0,04
0,10
0,03
Яблочная
Глицин
6,60
0,07
0,31
0,01
6,05
0,24
0,22
0,01
Яблочная
Манит
6,48
0,21
0,26
0,06
6,16
0,24
0,17
0,06
Яблочная
Нет
5,95
0,16
0,18
0,03
5,90
0,19
0,15
0,04
Яблочная
Сорбит
6,36
0,08
0,25
0,01
6,10
0,33
0,17
0,08
Яблочная
Сахароза
7,74
1,99
0,29
0,07
6,82
1,21
0,15
0,01
Яблочная
Трегалоза
6,93
0,02
0,32
0,00
6,20
0,19
0,24
0,06
Яблочная + Лимонная
Глицин
6,35
0,18
0,25
0,02
5,79
0,08
0,11
0,02
Яблочная + Лимонная--
Манит
6,49
0,28
0,26
0,04
7,68
1,72
0,31
0,12
Яблочная + Лимонная
Нет
6,12
0,38
0,20
0,09
5,75
0,23
0,09
0,06
Яблочная + Лимонная
Сорбит
6,19
0,14
0,23
0,05
5,91
0,01
0,11
0,00
Яблочная + Лимонная
Сахароза
6,16
0,33
0,19
0,07
5,94
0,01
0,14
0,05
Яблочная + Лимонная
Трегалоза
6,61
0,25
0,26
0,05
8,14
3,05
0,16
0,00
Винная
Глицин
6,39
0,46
0,24
0,06
5,95
0,16
0,15
0,04
Винная
Маннит
6,20
0,09
0,20
0,01
24,62
20,25
0,43
0,14
Винная
Нет
6,05
0,18
0,18
0,06
6,27
0,47
0,23
0,03
Винная
Сорбит
6,39
0,08
0,24
0,01
32,57
12,48
0,39
0,08
Винная
Сахароза
6,29
0,32
0,23
0,05
8,22
2,79
0,20
0,10
Винная
Трегалоза
6,55
0,25
0,26
0,05
6,57
0,01
0,27
0,01
Винная + Лимонная
Глицин
6,32
0,19
0,24
0,03
5,86
0,03
0,11
0,02
Винная + Лимонная
Маннит
6,36
0,31
0,24
0,06
12,89
0,96
0,45
0,33
Винная + Лимонная
Нет
6,17
0,07
0,22
0,01
6,71
1,18
0,20
0,04
Винная + Лимонная
Сорбит
6,53
0,18
0,28
0,02
12,41
6,32
0,31
0,08
Винная + Лимонная
Сахароза
6,22
0,16
0,21
0,05
5,98
0,10
0,16
0,01
Винная + Лимонная
Трегалоза
6,12
0,13
0,19
0,02
13,61
10,30
0,25
0,01
Таблица 7
Исследование стабильности методом SE-HPLC по результатам определения степени чистоты и суммы пиков агрегации (АР)
Буфер
Контроль (NaP/ цитрат)
Адипиновая кислота
Винная кислота
Глутаминовая кислота
Уксусная кислота
Янтарная кислота
Контролируемый параметр
Степень чистоты и связанные вещества, определенные методом SE-HPLC; степень чистоты в % площади
Температура
5°С
5°С
5°С
5°С
5°С
5°С
Начальная
99,3
99,2
99,3
99,3
99,3
99,2
Через 6 недель
99,2
99,2
99,2
99,0
99,1
99,0
Через 3 месяца
99,2
99,3
99,2
99,3
99,3
99,2
Температура
25°С
25°С
25°С
25°С
25°С
25°С
Начальная
99,3
99,2
99,3
99,3
99,3
99,2
Через 6 недель
97,7
97,7
97,7
97,8
97,8
97,8
Через 3 месяца
97,1
97,2
97,1
97,2
97,2
97,1
Температура
40°С
40°С
40°С
40°С
40°С
40°С
Начальная
99,3
99,2
99,3
99,3
99,3
99,2
Через 3 недели
95,9
96,2
95,7
96,0
95,9
95,9
Через 6 недель
93,6
94,3
93,5
93,9
93,7
93,8
Через 3 месяца
89,4
90,5
89,3
90,0
89,9
90,0
Контролируемый параметр
Степень чистоты и связанные вещества, определенные методом SE-HPLC; сумма АР/растворимые агрегаты, обнаруженные методом SEC, в % площади
Температура
5°С
5°С
5°С
5°С
5°С
5°С
Начальная
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
Через 6 недель
0,6
0,6
0,6
0,7
0,5
0,5
Через 3 месяца
0,6
0,6
0,6
0,6
0,6
0,7
Температура
25°С
25°С
25°С
25°С
25°С
25°С
Начальная
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
Через 6 недель
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
0,9
Через 3 месяца
0,8
0,7
0,8
0,8
0,8
0,8
Температура
40°С
40°С
40°С
40°С
40°С
40°С
Начальная
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
Через 3 недели
1,0
0,9
0,9
0,9
1,0
0,9
Контролируемый параметр
Степень чистоты и связанные вещества, определенные методом SE-HPLC; степень чистоты в % площади
Через 6 недель
1,5
1,4
1,5
1,4
1,6
1,5
Через 3 месяца
1,8
1,6
1,8
1,6
1,5
1,2
Таблица 8
Исследование стабильности методом MFI по результатам определения общего числа частиц размером 5-10 мкм и >10 мкм
Контроль (NaP/цитрат)
Адипиновая кислота
Винная кислота
Глутаминовая кислота
Уксусная кислота
Янтарная кислота
Счет обнаруженных методом проточной микроскопии (визуализации микропотоков, MFI) невидимых частиц размером 5-10 мкм на мл
2296
1874
1483
1507
1520
881
Счет обнаруженных методом проточной микроскопии (визуализации микропотоков, MFI) невидимых частиц размером более 10 мкм на мл
127
257
86
98
107
139
Данные, полученные через 3 месяца хранения при 40°С
Таблица 9
Два примера предпочтительных композиций согласно изобретению
Соединение
[мг/мл]
Химерный, гуманизированный или человеческий IgG
50,00
NaCl
5,0-7,0
Маннит
10,0-14,0
Адипиновая кислота
1,5-4,0
Tween 80
0,5-1,5
NaOH (для корректировки рН)
Сколько необходимо
рН
5,20
Соединение
[мг/мл]
Химерный, гуманизированный человеческий IgG
50,00
NaCl
5,0-7,0
Маннит
10,0-14,0
Уксусная кислота
0,5-1,5
Tween 80
0,5-1,5
NaOH (для корректировки рН)
Сколько необходимо
pH
5,20
В Таблице 10 представлены особо предпочтительные композиции, содержащие адипиновую кислоту или уксусную кислоту (ацетат). Эти композиции сравнили с контрольным буфером, содержащим фосфат натрия + цитрат (14,1 мМ фосфата натрия, 7,2 мМ цитрата, 105,5 мМ NaCl, 0,1% Tween 80 и 65,9 мМ маннита, подробнее смотри выше). Все представленные композиции превосходили контрольный буфер с точки зрения характеристик агрегации.
Таблица 10
Предпочтительные композиции, содержащие адипиновую кислоту или ацетат
№ исследования
001
007
Композиция адипиновой кислоты
Композиция уксусной кислоты
Композиция адипиновой кислоты
Композиция адипиновой кислоты/ цитрата
Композиция уксусной кислоты
NaCl [мМ]
105
105
105
105
105
Маннит [мМ]
66
66
66
66
66
Адипиновая кислота [мМ]
23
-
23
23
0,2
Уксусная кислота [мМ]
-
20
-
-
20
Tween 80 [мМ]
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
Лимонная кислота [мМ]
1,4
2,4
-
1,4
2,4
Фосфат [мМ]
2,8
2,8
-
-
-