ГИСТОНЫ И/ИЛИ PROADM В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ, СВИДЕТЕЛЬСТВУЮЩИХ ОБ ОРГАННОЙ ДИСФУНКЦИИ
HISTONES AND/OR proADM AS MARKERS TESTIFYING ABOUT ORGAN DYSFUNCTION

Настоящее изобретение относится к диагностике, прогнозированию, оценке риска, стратификации риска, мониторингу, руководству по терапии и/или контролю терапии органной дисфункции у субъекта. Изобретение относится к способу, включающему определение уровня по меньшей мере одного гистона, в частности H2B, H4, H2A и/или H3, в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанной органной дисфункции; и/или определение уровня проадреномедуллина (proADM), в частности среднерегионального проадреномедуллина (MR-proADM), в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень proADM свидетельствует об указанной органной дисфункции. Изобретение дополнительно относится к наборам для реализации способов по изобретению.
Уровень техники
Пациентов в критическом состоянии обычно помещают в отделение интенсивной терапии (ОИТ) с несколькими признаками органной дисфункции и/или недостаточности (OF). Чтобы быстро и эффективно классифицировать и лечить таких пациентов, клиницисты должны как можно точнее оценить общее состояние и тяжесть заболевания пациента. Эта оценка и вытекающие из нее последствия имеют большое значение, поскольку синдром полиорганной дисфункции (MODS) является основной причиной смерти в ОИТ (Vincent 2006; Ferreira and Sakr 2011). Лишь немногие люди в ОИТ умирают из-за недостаточности одного органа (Mayr, Dunser et al. 2006). Различные клинические исследования подтверждают эти выводы и показывают сильную корреляцию между дисфункцией или недостаточностью органов, тяжестью течения и смертностью таких субъектов (Ferreira and Sakr 2011, Mayr et al. 2006, Vincent et al. 1998, Vincent et al. 2006).
В 1980-х и 1990-х годах были разработаны многие из систем оценки ОИТ, ставших ныне золотым стандартом. Среди них - прогностические оценки исхода болезни, такие как Система оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья II (APACHE II) и Упрощенная шкала оценки физиологических расстройств (SAPSII), которые основаны на физиологической оценке и критериях пациента. Другие системы оценки - это шкалы диагностики осложнений, такие как шкала SOFA, основанная на орган-специфических параметрах (Bouch and Thompson 2008). Все эти три оценки основаны как минимум на шести параметрах и определяются в течение первых 24 часов после поступления в отделение интенсивной терапии. APACHE II состоит из 14 переменных (12 физиологических параметров, возраст и хроническое состояние здоровья), каждая из которых имеет значение от 0 до 4 с увеличением анормальности параметра (Knaus, Draper et al. 1985). SAPS II состоит из 17 переменных, включая 12 физиологических параметров, возраст пациента, тип госпитализации и три основных переменных заболевания (Le Gall, Lemeshow et al. 1993). Что касается шкалы SOFA, в ней оцениваются шесть органов, со значением от 0 до 4 в соответствии со степенью их дисфункции (Vincent, Moreno et al. 1996).
Хотя шкала SOFA была предназначена не для прогнозирования исхода, а для отображения последующих осложнений у пациентов ОИТ, для нее имеется четкая корреляция с уровнем смертности, связанной с кумулятивной органной недостаточностью у пациента (Vincent 2006). В частности, в случае группы с высокой органной недостаточностью, например у пациентов с четырьмя или более OF, уровень смертности составлял 65% или 83% в двух посвященных ОИТ клинических исследованиях по сравнению с 6% или 22% для пациентов без какой-либо органной недостаточности (Vincent, de Mendonca et al. 1998; Vincent, Sakr et al. 2006). Способность выявлять субъектов, страдающих от органной дисфункции или органной недостаточности и, следовательно, имеющих высокий уровень смертности, все еще является сложной и трудоемкой, как описано ниже, но имеет огромное значение. Помимо того, что шкалы ОИТ, раскрытые в предшествующем уровне техники, способны прогнозировать или диагностировать пациентов в критическом состоянии лишь с некоторой вероятностью, они используются только в 10-15% ОИТ, причем не случайно выбранных (часто в больницах с акцентом на клинических исследованиях и/или со строгими нормативами качества) и имеют несколько недостатков (Breslow and Badawi 2012). Например, одним из недостатков является то, что эти оценки подвержены субъективности каждого врача, проводящего оценку. Вряд ли в любой больнице найдутся либо специализированные эксперты по оценке, либо, по крайней мере, обученный в соответствии с требованиями медицинский персонал, нацеленный на надежную оценку всех параметров в соответствии со строгими и единообразными рекомендациями для оценки различных переменных шкалы (Polderman, Girbes et al. 2001). Кроме того, количество параметров, подлежащих оценке, и соответствующее время для завершения оценки (по меньшей мере один день после госпитализации) имеют критическое значение для многих пациентов, чтобы быстро начать необходимое лечение. Более того, повторная (потенциально ежедневная) оценка баллов шкалы занимает много времени (Le Gall, Lemeshow et al. 1993). Кроме того, баллы шкал предшествующего уровня техники определяют на основе кумулятивных данных с агрегированными результатами для нескольких параметров состояния пациента. Следовательно, такая оценка может быть истолкована неверно и ввести в заблуждение врача, поскольку у пациентов с одинаковой общей оценкой могут быть очень разные и противоположные исходы (Vincent, de Mendonca et al. 1998). Еще одним неблагоприятным эффектом является систематическая ошибка, обусловленная временем между принятием решения и началом действия, которая отражает спонтанную изменчивость физиологических данных или эффектов лечения до оценки баллов шкалы, особенно при анализе многих переменных параметров для расчета суммарного количества баллов, что может привести к неточному или имеющему систематическую ошибку баллу для прогнозирования исхода или диагнозу (Bouch and Thompson 2008).
Соответственно, существует потребность в простых, быстрых и объективных критериях для диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъекта, особенно у субъекта в критическом состоянии.
Таким образом, технической задачей, лежащей в основе изобретения, является предоставление средств и способов для обеспечения быстрого и надежного способа прогнозирования органной дисфункции у субъекта.
Эта техническая задача решается путем обеспечения вариантов реализации, описанных в настоящем документе ниже и охарактеризованных в прилагаемой формуле изобретения.
Описание изобретения
Изобретение относится к диагностике, прогнозированию, оценке риска, стратификации риска, мониторингу, руководству по терапии и/или контролю терапии органной дисфункции у субъекта, причем указанный способ включает определение уровня по меньшей мере одного гистона или его фрагмента в образце от указанного субъекта, и при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона или его фрагмента свидетельствует об указанной органной дисфункции.
Кроме того, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководству по терапии и/или контролю терапии органной дисфункции у субъекта, причем указанный способ включает определение уровня проадреномедуллина (proADM) или его фрагмента, в частности MR-proADM, в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень proADM или его фрагмента свидетельствует об указанной органной дисфункции.
Кроме того, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъекта, причем указанный способ включает определение уровня по меньшей мере одного гистона и уровня proADM и/или его фрагмента(ов) в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона и указанный уровень proADM и/или его фрагмента (фрагментов) свидетельствуют об указанной органной дисфункции.
Настоящее изобретение решает описанную выше техническую задачу. Как описано в настоящей заявке ниже и в прилагаемых примерах, в клиническом исследовании неожиданно было обнаружено, что уровни по меньшей мере одного гистона, в частности гистона H2B, H4, H2A и H3, и/или уровень proADM демонстрируют сильную статистическую связь с органной дисфункцией у субъектов; см. иллюстративный пример 1. Соответственно, в настоящей заявке документально подтверждено, что указанный по меньшей мере один гистоновый белок и/или указанный proADM, в частности MR-proADM, можно использовать в качестве суррогатного маркера дисфункции(ий) органов, в частности недостаточности органов.
В прилагаемых примерах также неожиданно было продемонстрировано, что увеличение уровня по меньшей мере одного гистона, в частности H2B, H4, H2A и H3, в образце субъекта свидетельствует об органной дисфункции; см. например Фигуры с 1А по 1D. Кроме того, неожиданно было продемонстрировано, что увеличение уровня proADM, в частности фрагмента MR-proADM, в образце субъекта свидетельствует о органной дисфункции; см. например Фигуру 1E.
Более того, в прилагаемых примерах документально подтверждено, что повышение уровней маркеров усиливается с увеличением числа органных дисфункций; см. например Пример 1. Например, ниже в настоящей заявке неожиданно показано, что уровни гистонов, в частности H2B, H4, H2A и H3, дополнительно возрастают в случае, если у субъекта возникают четыре или более органных дисфункций по сравнению с уровнями субъектов, страдающих от дисфункций от одного до трех органов. Соответственно, уровень этого по меньшей мере одного гистонового белка конкретно указывает на четыре или более органных дисфункций. Поэтому уровень гистона(ов) также особенно показателен для определения того, страдает ли субъект от трех органных дисфункций или четырех органных дисфункций; см. Таблицу 1.
Кроме того, прилагаемые примеры неожиданно демонстрируют, что уровень proADM, в частности MR-proADM, постепенно увеличивается от одной органной дисфункции, двух органных дисфункций, трех органных дисфункций до четырех органных дисфункций; см. например Фигуру 1E и таблицу 1. Соответственно, уровень proADM, особенно MR-proADM, в частности, указывает на одну дисфункцию, две дисфункции, три дисфункции или четыре дисфункции. Соответственно, уровень proADM, в частности MR-proADM, также является показательным для определения того, страдает ли субъект от одной органной дисфункции, двух органных дисфункций, трех органных дисфункций или четырех органных дисфункций.
Кроме того, прилагаемые примеры демонстрируют, что уровень по меньшей мере одного гистона, в частности уровень гистона H2B, свидетельствует о том, страдает ли субъект от от одной органной дисфункции, двух органных дисфункций, трех органных дисфункций или четырех органных дисфункций; см. например Фигуру 1 и Таблицу 2А. Кроме того, в данном документе ниже описано, что уровень proADM, в частности уровень MR-proADM, свидетельствует о том, страдает ли субъект от одной органной дисфункции, двух органных дисфункций, трех органных дисфункций или четырех или более органных дисфункций; см. например Фигуру 1, Таблицу 1 и Таблицу 2А.
Кроме того, в прилагаемых примерах документально подтверждено, что определение уровня дополнительного маркера или параметра в дополнение к уровню по меньшей мере одного гистона или proADM дополнительно улучшает прогнозирование органной дисфункции; см. например Таблицу 2В. Например, клинические шкалы, такие как SAPS II или SOFA, еще больше улучшают диагностику. Кроме того, в настоящей заявке на примерах показано, что комбинация маркеров дополнительно улучшает диагностику органных дисфункций. Например, определение уровня proADM, в частности MR-proADM, и уровня по меньшей мере одного гистона улучшает прогнозирование органной дисфункции у субъекта по сравнению с определением только одного маркера; см. иллюстративную таблицу 2В. Кроме того показано, что дополнительные маркеры, такие как альдолаза В, прокальцитонин или лактат, улучшают прогнозирование органной дисфункции у субъекта. Например, определение уровня альдолазы В или лактата в дополнение к proADM увеличивает статистическую корреляцию с событием органной дисфункции у субъекта. Соответственно, изобретение также относится к способу, включающему определение уровня дополнительного маркера и/или параметра, то есть использование панелей маркеров.
Настоящее изобретение имеет, среди прочего, следующие преимущества по сравнению с традиционными способами: способы и наборы по настоящему изобретению являются быстрыми, объективными, простыми в использовании и точными для прогнозирования органной дисфункции. Способы и наборы по изобретению относятся к маркерам, которые легко измеримы в обычных условиях в больницах, потому что уровни гистонов и proADM могут быть определены в получаемых по стандартной методике образцах крови или других биологических жидкостях, полученных от субъекта. Кроме того, определение уровней гистонов или proADM выполняется очень быстро. Следовательно, способы и наборы по изобретению пригодны для быстрой оценки, а также для диагностики и прогнозирования органной дисфункции. Соответственно, такое быстрое определение также пригодно для быстрого принятия решения о лечении. Кроме того, благодаря простому результату измерения биомаркера, представляющего собой одно конкретное значение, отсутствует субъективная систематическая погрешность медицинского персонала при применении этого способа или наборов изобретения. Воспроизводимость, таким образом, будет выше по сравнению с субъективной оценкой физиологических параметров, которые используются, например, в шкале SOFA. Уровень гистона или proADM также может быть объединен с дополнительными маркерами и/или параметрами в качестве дополнения к существующим оценкам или шкалам, чтобы дополнительно улучшить прогнозирование и адаптировать анализ к конкретной чувствительности и специфичности. для оценки общего состояния пациентов в критическом состоянии. При рассмотрении пациентов с полиорганной недостаточностью биомаркеры могут помочь расклассифицировать пациентов по числу отказавших органов и обосновать решение о диагностике и лечении в этой важной области интенсивной терапии.
Как документально подтверждено в настоящей заявке выше и в прилагаемых примерах, было неожиданно обнаружено, что уровень гистонов и уровень proADM коррелирует с дисфункцией органов у субъектов. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам и наборам для определения органной дисфункции у субъекта путем определения уровня proADM и/или гистона(-ов) в образце субъекта. Кроме того, изобретение относится к способам и наборам для диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска и/или мониторинга органной дисфункции у субъекта. Кроме того, изобретение относится к способам и наборам для руководства по терапии и/или контроля терапии у субъектов, страдающих органной дисфункцией.
Соответственно, изобретение относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъекта, причем указанный способ включает
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце данного субъекта, причем этот уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанной органной дисфункции; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце данного субъекта, причем этот уровень proADM свидетельствует об указанной органной дисфункции.
Используемый в настоящей заявке термин "определение уровня по меньшей мере одного гистона" или подобная фраза относится к определению уровня гистона или его фрагмента в образце субъекта или определению уровня более одного гистона или их фрагментов в образце субъекта. В частности, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта, когда предпочтительно гистон выбран из группы, состоящей из гистона H2B, H4, H2A и H3. В частности, определяют уровень гистона H2B. Кроме того, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта, когда, в частности, определяют уровень гистона Н4. Кроме того, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня двух гистонов в образце субъекта, когда предпочтительно определяют уровни гистонов H2B и H4. Кроме того, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня трех гистонов в образце субъекта, когда предпочтительно определяют уровни гистонов H2B, H4 и H2A. Кроме того, "определение уровня по меньшей мере одного гистона" может относиться к определению уровня четырех гистонов в образце субъекта, когда предпочтительно определяют уровни гистонов H2B, H4, H2A и H3.
Соответственно, в контексте настоящего изобретения "определение уровня по меньшей мере одного гистона" или подобная фраза может относиться к определению уровня гистона H2B, уровня гистона H4, уровня гистона H2A и/или уровня гистона Н3.
В частности, термин "определение уровня по меньшей мере одного гистона" или подобная фраза может относиться к определению уровня гистона в образце субъекта. Соответственно, изобретение также относится к способу диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъекта, причем указанный способ включает определение уровня гистона или его фрагмента в образце от указанного субъекта, и причем указанный уровень гистона или его фрагмента свидетельствует об указанной органной дисфункции.
Используемый в настоящей заявке термин "гистон" или "гистоновый белок" или "гистоны" или "гистоновые белки" относится к каноническому гистону(-ам), таким как H1, H2A, H2B, H3 или H4, а также к варианту(-ам) гистона, таким как H3.3, H2A.Z и т. д. или их фрагменту(-ам). Гистоны образуют октамер, вокруг которого оборачивается ДНК, собирая структуру хроматина (Luger, Nature. 1997 Sep 18; 389 (6648): 251-60). Например, гистоновые белки H2A, H2B, H3 и H4 (по два каждого) образуют октамер, который оборачивается 165 парами оснований ДНК, образуя фундаментальную субъединицу хроматина - нуклеосому. Гистоны также обнаруживаются вне ядра при множественных патофизиологических процессах (WO 2009/061918). Наличие внеклеточных гистонов было описано в крови пациентов, страдающих от различных этиологий, включая воспалительные процессы. Высвобождение гистонов из активированных иммунных клеток может быть опосредовано внеклеточными ловушками. Активированные нейтрофилы, как основной механизм контроля и устранения инфекции, могут высвобождать внеклеточные волокна, так называемые нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) (Brinkmann V., et al. Science 2004; 303 (5663): p. 1532-5). Другие механизмы, с помощью которых гистоны могут высвобождаться в кровоток пациента, включают апоптоз, некроз, пироптоз или некроптоз клеток.
В частности, этот по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4, H2A и H3. Соответственно, уровень гистона, который должен быть определен способами и наборами по изобретению, представляет собой, в частности, уровень гистона(-ов) H2B, H4, H2A и/или H3. Последовательности этих гистонов известны специалисту в данной области. Иллюстративные последовательности гистонов приведены в SEQ ID NO: 1-4. Иллюстративная аминокислотная последовательность гистона H4 приведена в SEQ ID NO: 1. Иллюстративная аминокислотная последовательность гистона H2A приведена в SEQ ID NO: 2. Иллюстративная аминокислотная последовательность гистона Н3 приведена в SEQ ID NO: 3. Иллюстративная аминокислотная последовательность гистона H2B приведена в SEQ ID NO: 4. В частности, этот по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4, H2A и H3. Более конкретно, этот по меньшей мере один гистон выбран из группы, состоящей из H2B, H4 и H2A. Более конкретно, этот по меньшей мере один гистон представляет собой H2B и H4. Более конкретно, этот по меньшей мере один гистон представляет собой H2B или H4.
Предполагается, что "определение уровня по меньшей мере одного гистона" или подобная фраза относится к определению уровня по меньшей мере одного гистона или фрагмента этого по меньшей мере одного гистона в образце. В частности, в образце определяют уровень гистонов H2B, H3, H2A и/или H4. Соответственно, этот по меньшей мере, один гистон, определяемый в образце, может представлять собой свободный гистон, или этот по меньшей мере один гистон, определяемый в образце, может встречаться и может быть собран в макромолекулярный комплекс, например, в октамер, нуклеосому и/или NET. Следовательно, уровень этого по меньшей мере одного гистона в образце может включать уровень свободного гистонового белка и/или гистонового белка, собранного в макромолекулярном комплексе.
В конкретных аспектах изобретения уровень гистона или его фрагмента может быть определен в образце, который не собран в макромолекулярном комплексе, таком как нуклеосома, октамер или нейтрофильная внеклеточная ловушка (NET). Такой гистон(ы) в настоящем документе будет (будут) называться "свободным гистоном (ами)". Соответственно, уровень упомянутого по меньшей мере одного гистона может, в частности, представлять собой уровень по меньшей мере одного свободного гистона.
Уровень таких свободных гистонов может быть определен путем обнаружения аминокислотных последовательностей или структурных эпитопов гистонов, которые недоступны в собранном стехиометрическом макромолекулярном комплексе, таком как мононуклеосома или октамер. В таких структурах отдельные области гистонов являются укрытыми и, таким образом, стерически недоступны, как показано для нейтрофильной внеклеточной ловушки ("NET") (Brinkmann V., et al. Science 303 (5663): p. 1532-5, 2004). Кроме того, в октамере или нуклеосоме области гистонов также участвуют во внутримолекулярных взаимодействиях, например, между отдельными гистонами. Соответственно, область/пептид/эпитоп гистона, который определяется в контексте изобретения, может определять, является ли гистон свободным гистоном или гистоном, который собран в макромолекулярном комплексе. Например, в способе, основанном на иммуноанализе, используемые антитела могут не обнаруживать гистоны, например Н4, когда они являются частью октамерного ядра нуклеосом, так как эти эпитопы структурно недоступны. Ниже в настоящей заявке приведены примеры областей/пептидов/эпитопов гистона, которые можно использовать для определения свободного гистона. Например, области/пептиды/эпитопы N-концевого или С-концевого хвоста гистонов можно использовать для определения гистонов независимо от того, собраны ли они в макромолекулярный комплекс или являются свободными гистонами согласно настоящему изобретению.
Предполагается, что определение гистонов может включать посттрансляционно модифицированные гистоновые белки. Соответственно, посттрансляционные модификации могут включать деацетилирование или ацетилирование, фосфорилирование, метилирование, убиквитилирование и цитруллинирование аминокислот.
В данном контексте понятие "стехиометрический" относится к нативным комплексам, например мононуклеосоме или октамеру. "Свободные гистоновые белки" могут также включать не связанные с хроматином гистоны. Например, "свободные гистоновые белки" могут также включать отдельные гистоновые белки или неоктамерные гистоновые комплексы. Свободные гистоны могут (например, временно) связываться с отдельными гистонами, например, гистоны могут образовывать гомо- или гетеродимеры. Свободные гистоны также могут образовывать гомо- или гетеротетрамеры. Гомо- или гетеротетрамер может состоять из четырех молекул гистонов, например H2A, H2B, H3 и/или H4. Типичный гетеротетрамер образован двумя гетеродимерами, причем каждый гетеродимер состоит из Н3 и Н4. В настоящей заявке также предполагается, что гетеротетрамер может быть образован H2A и H2B. В настоящей заявке также предполагается, что гетеротетрамер может быть образован одним гетеродимером, состоящим из H3 и H4, и одним гетеродимером, состоящим из H2A и H2B. Таким образом, в настоящем документе свободные гистоны упоминаются как мономерные, гетеродимерные или тетрамерные гистоновые белки, которые не собраны в ("стехиометрический") макромолекулярный комплекс, состоящий из октамера гистона, связанного с нуклеиновой кислотой, например, нуклеосому. Кроме того, свободные гистоны также могут быть связаны с нуклеиновыми кислотами, причем указанные свободные гистоны не собраны в ("стехиометрический") макромолекулярный комплекс, например нативную нуклеосому. Предпочтительно свободный гистон(-ы) по существу не содержит (не содержат) нуклеиновых кислот.
Фрагмент по меньшей мере одного гистона может иметь любую длину, например по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот, при условии, что этот фрагмент позволяет однозначно определить уровень данного конкретного гистона. Фрагмент этого по меньшей мере одного гистона относится к независимому фрагменту гистонов, например гистонов H2B, H4, H2A и H3. В настоящей заявке ниже раскрыты различные иллюстративные фрагменты этих гистонов, которые подходят для определения уровня гистона в образце субъекта. В настоящей заявке также подразумевается, что уровень гистонов может быть определен путем определения фрагмента, охватывающего N-концевой или С-концевой хвост гистонов. Кроме того, гистон или его фрагмент, который должен быть определен в контексте настоящего изобретения, также может быть модифицирован, например, посттрансляционной модификацией. Иллюстративными посттрансляционными модификациями могут быть ацетилирование, цитруллинирование, деацетилирование, метилирование, деметилирование, деиминирование, изомеризация, фосфорилирование и убиквитинирование.
Используемый в настоящей заявке термин "проадреномедуллин" или "proADM" относится к проадреномедуллину или его фрагменту, в частности, MR-proADM. Подразумевается, что "определение уровня proADM" или тому подобное относится к определению уровня proADM или его фрагмента в образце. Фрагмент может иметь любую длину, например по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50 или 100 аминокислот, при условии, что этот фрагмент позволяет однозначно определить уровень proADM. В конкретных предпочтительных аспектах изобретения "определение уровня proADM" относится к определению уровня среднерегионального проадреномедуллина (MR-proADM). MR-proADM является фрагментом proADM. Пептид адреномедуллин (ADM) был открыт как гипотензивный пептид, содержащий 52 аминокислоты, выделенный из человеческого фенохромоцитома (Kitamura et al., 1993). Адреномедуллин (ADM) кодируется как пептид-предшественник, содержащий 185 аминокислот ("препроадреномедуллин" или "пре-proADM"). Иллюстративная аминокислотная последовательность ADM приведена в SEQ ID NO: 5. ADM содержит положения 95-146 аминокислотной последовательности pre-proADM и является ее продуктом сплайсинга. "Проадреномедуллин" ("proADM") относится к пре-proADM без сигнальной последовательности (аминокислоты с 1 по 21), то есть к аминокислотным остаткам с 22 по 285 пре-proADM. "Среднерегиональный проадреномедуллин" ("MR-proADM") относится к аминокислотам 42-95 pre-proADM. Иллюстративная аминокислотная последовательность MR-proADM приведена в SEQ ID NO: 6. В настоящей заявке также предполагается, что для описанных в настоящей заявке способов могут быть использованы пептид и его фрагмент pre-proADM или MR-proADM. Например, такой пептид или его фрагмент может содержать аминокислоты 22-41 пре-proADM (пептид РАМР) или аминокислоты 95-146 пре-proADM (зрелый адреномедуллин). С-концевой фрагмент proADM (аминокислоты от 153 до 185 preproADM) называется адренотензином. Фрагменты пептидов proADM или фрагменты MR-proADM могут содержать, например, по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20, 30 или более аминокислот. Соответственно, фрагмент proADM может, например, быть выбран из группы, состоящей из MR-proADM, PAMP, адренотензина и зрелого адреномедуллина, предпочтительно в данном документе этот фрагмент представляет собой MR-proADM.
В настоящей заявке также предполагается, что могут быть определены полипептиды, имеющие некоторую идентичность последовательности с proADM или по меньшей мере с одним гистоном. Например, с помощью способов и наборов по изобретению могут быть определены полипептиды, идентичные по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с последовательностью SEQ ID NO: 5 или 6 или соответственно с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4, причем предпочтительными являются более высокие значения идентичности последовательности. В соответствии с настоящим изобретением термины "идентичность последовательности", "гомология" или "процентная гомология" или "идентичность" или "процент идентичности" или "процентная идентичность" в контексте двух или более аминокислотных последовательностей относятся к двум или большему числу последовательностей или подпоследовательностей, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислот, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия по окну сравнения (предпочтительно по всей длине) или по определенной области, при использовании алгоритма сравнения последовательностей, известного в данной области техники, или путем ручного выравнивания и визуального просмотра. Последовательности, имеющие, например, идентичность от 70% до 90% или более (предпочтительно, 95% или более), можно считать по существу идентичными. Такое определение также применимо к комплементу тестовой последовательности. Предпочтительно, описанная идентичность существует в области, длина которой составляет по меньшей мере от приблизительно 10 до приблизительно 15 аминокислот, более предпочтительно, в области, длина которой составляет по меньшей мере от приблизительно 20 до приблизительно 35 аминокислот, наиболее предпочтительно, по всей длине. Специалисты в данной области техники знают, как определить процент идентичности между последовательностями/среди последовательностей, используя, например, алгоритмы, такие как алгоритмы, основанные на компьютерной программе CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) или FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), известными в данной области техники.
Используемый в настоящей заявке термин "уровень" маркера относится к количеству молекул маркера в образце. Другими словами, в образце определяют концентрацию маркера. Например, в образце субъекта определяют концентрацию proADM или его фрагмента, предпочтительно MR-proADM, и/или концентрацию гистона(ов) H2B, H4, H3 и/или H2A или (а) их фрагмента(ов).
Используемый в настоящей заявке термин "уровень по меньшей мере одного гистона" относится к количеству молекул по меньшей мере гистона, например, количество H2B, H4, H2A и/или H3 или их фрагмента в образце, полученном от субъекта. Другими словами, в образце определяют концентрацию по меньшей мере одного гистонового белка или его фрагмента.
Используемый в настоящей заявке термин "уровень маркера проадреномедуллина (proADM)" или "уровень маркера проадреномедуллина (proADM) или его фрагмента" относится к количеству молекул маркера проадреномедуллина или его фрагментов в образце, полученном от субъекта. Другими словами, определяют концентрацию маркера в образце. Следовательно, термин "уровень маркера среднерегионального проадреномедуллина (MR-proADM)" относится к количеству молекул маркера среднерегионального проадреномедуллина (MR-proADM) в образце, полученном от субъекта. Как описано выше, в настоящей заявке также предполагается, что фрагмент проадреномедуллина (proADM), предпочтительно MR-proADM, может быть обнаружен и количественно определен. Также могут быть обнаружены и количественно определены фрагменты MR-proADM. Подходящие способы определения уровня proADM или его фрагмента (предпочтительно MR-proADM) или определения уровня по меньшей мере одного гистона или его фрагмента описаны в настоящем документе ниже.
Орган представляет собой совокупность тканей, объединенных в структурную единицу для выполнения общей функции. Используемый в настоящей заявке общий термин "органная дисфункция" может также означать, что имеет место дисфункция более чем одного органа, то есть он также может относиться к дисфункциям органов, если не указано иное. Термин "дисфункция органов" или "органная дисфункция" относится к состоянию субъекта, когда орган или несколько органов не выполняют свою нормальную функцию по сравнению с непораженным органом, таким как, например, орган(ы) хотя бы одного здорового субъекта. Например, орган(-ы) может (могут) иметь пониженную активность, или орган(-ы) у субъекта с дисфункцией органа может (могут) быть аномально активным по сравнению с органом(-ами) по меньшей мере одного здорового субъекта. Предпочтительно орган(-ы) с дисфункцией(-ями) органа может (могут) обладать нарушенной (пониженной или повышенной) активностью величиной по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100% или 200% по сравнению с непораженным органом(-ами), например по меньшей мере одного здорового субъекта.
В частности, дисфункция(-и) органа(-ов) может (могут) привести к органной недостаточности(-ям). Соответственно, "дисфункция(и) органа" предпочтительно может также относиться к органной недостаточности(-ям). "Органная недостаточность(-и)" относится к органной дисфункции(-ям) до такой степени, что нормальный гомеостаз не может поддерживаться, например без внешнего клинического вмешательства. "Органная недостаточность(-и)" может также относиться к органной дисфункции(-ям), выраженной до такой степени, что нормальный гомеостаз органа(-ов) не может поддерживаться, например без внешнего клинического вмешательства. "Органная недостаточность" может также относиться к органной дисфункции(-ям) до такой степени, что нормальный гомеостаз субъекта не может поддерживаться, например, без внешнего клинического вмешательства.
В конкретных аспектах изобретения дисфункция органа представляет собой органную недостаточность, или по меньшей мере одну органную недостаточность. Общий термин "органная недостаточность" также может означать, что недостаточность имеется у более чем одного органа, то есть он также может относиться к недостаточностям нескольких органов, если не указано иное. В настоящей заявке подразумевается, что понятие "органные дисфункции" также может обозначать полиорганную дисфункцию. В настоящей заявке подразумевается, что понятие "органные недостаточности" может также обозначать полиорганную недостаточность.
Иллюстративными органными дисфункциями или органными недостаточностями являются циркуляторный шок, гематологическая недостаточность, печеночная недостаточность, неврологическая недостаточность, почечная недостаточность, дыхательная недостаточность и метаболический ацидоз. Соответственно, в контексте изобретения органная дисфункция или по меньшей мере одна дисфункция предпочтительно может быть выбрана из группы, состоящей из циркуляторного шока, гематологической недостаточности, печеночной недостаточности, неврологической недостаточности, почечной недостаточности, дыхательной недостаточности и метаболического ацидоза. В настоящей заявке подразумевается, что субъект также может иметь более одной дисфункции или недостаточности органа, например, комбинацию двух, трех, четырех органных дисфункций, выбранных из группы, состоящей из циркуляторного шока, гематологической недостаточности, печеночной недостаточности, неврологической недостаточности, почечной недостаточности, дыхательной недостаточности и метаболического ацидоза. Например, способы и наборы по изобретению могут определять, страдает ли субъект от дисфункции двух органов, например циркуляторного шока и дыхательной недостаточности.
Используемое в данном документе понятие "циркуляторный шок" может относиться к субъекту, у которого систолическое артериальное давление ниже приблизительно 90 мм рт.ст., например, с признаками периферической гипоперфузии. Соответственно, такой субъект может нуждаться в инфузии вазопрессорных и/или инотропных средств.
3
Используемое в данном документе понятие "гематологическая недостаточность" может относиться к субъекту с тромбоцитемией ниже приблизительно 100000/мм.
Используемое в данном документе понятие "печеночная недостаточность" может относиться к субъекту, у которого билирубинемия превышает приблизительно 2 мг/дл и/или уровни ферментов аспартата или аланина трансаминазы превышают приблизительно 500 международных единиц на литр.
Используемое в данном документе понятие "неврологическая недостаточность" может относиться к субъекту с оценкой по шкале комы Глазго ниже 13.
Используемое в данном документе понятие "печеночная недостаточность" может относиться к субъекту, у которого выделение мочи составляет менее приблизительно 0,5 мл/кг/ч в течение по меньшей мере приблизительно 3 часов и/или креатинемия повышена более чем приблизительно на 50% по сравнению с предыдущими значениями.
2
2
Используемое в данном документе понятие "дыхательная недостаточность" может относиться к субъекту, который имеет отношение парциального давления артериального кислорода к фракции вдыхаемого кислорода (PaO/FiO) ниже приблизительно 300 мм рт.ст., независимо от выбранной респираторной поддержки.
3
-
Используемое в данном документе понятие "метаболический ацидоз" может относиться к субъекту с уровнем лактата ниже приблизительно 2,5 ммоль/л, при эксцессе оснований (уровень оснований ниже -2 мэквивалент/л) или уровнях бикарбоната (HCO) ниже приблизительно 24, предпочтительно ниже приблизительно 18 ммоль/л.
Термин "свидетельствующий об указанной органной дисфункции" означает, что субъект имеет или, скорее всего, будет иметь/страдать от органной дисфункции или по меньшей мере одной органной дисфункции. Таким образом, уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM субъекта свидетельствуют об органной дисфункции у субъекта.
Способ по изобретению также относится к способу, при котором в образце субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона и указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанной органной дисфункции.
Изобретение также относится к способу, при котором в образце субъекта определяют уровень проадреномедуллина (proADM), в частности MR-proADM, причем указанный уровень proADM, в частности MR-proADM, сравнивают с контрольным уровнем proADM. и указанный уровень proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует об указанной органной дисфункции.
Данный способ также относится к способу, при котором в образце субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона и уровень проадреномедуллина (proADM), в частности MR-proADM, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона, и указанный уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM, и на основании этого этапа сравнения у указанного субъекта выявляют указанную дисфункцию органов.
Используемый в настоящей заявке термин "сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона" или его грамматическими варианты означают, что уровень этого по меньшей мере одного гистона субъекта сравнивается с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона. Таким образом, уровень гистона субъекта сравнивают с соответствующим контрольным уровнем того же гистона. Например, уровень гистона H2B, определенный в образце субъекта, сравнивают с контрольным уровнем гистона H2B. Это применимо с соответствующими изменениями к другим гистонам. Контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона является, в частности, уровень гистона H2B, уровень гистона H4, уровень гистона H2A и/или уровень гистона H3.
Используемый в настоящей заявке термин "сравнивают с контрольным уровнем proADM" или его грамматическими варианты означают, что уровень proADM субъекта сравнивают с контрольным уровнем proADM. Если определяют уровень фрагмента(-ов) по меньшей мере одного гистона и/или proADM, контрольным уровнем также может быть уровень соответствующего фрагмента(-ов).
Используемый в настоящей заявке термин "контрольный уровень" может отражать нормальный уровень соответствующего маркера, который указывает на отсутствие органной дисфункции или органной недостаточности согласно предпочтительным аспектам изобретения. Таким образом, контрольный уровень может представлять уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM группы здоровых субъектов (например, когорты). Здоровый субъект - это субъект без диагностированного (и подтвержденного) заболевания(-й) и/или медицинского расстройства (расстройств). Эти здоровые субъекты могут предпочтительно иметь нормально функционирующие органы, то есть не иметь органной дисфункции или не иметь органной недостаточности. Соответственно, контрольный уровень(-и) может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM, которые определены в образцах здоровых субъектов. Контрольные субъекты или здоровые субъекты в данном документе предпочтительно определяются как группа субъектов или группа здоровых субъектов, например когорта субъектов. Здоровые контрольные субъекты предпочтительно не имеют органной дисфункции или не имеют органной недостаточности. Соответственно, контрольный уровень предпочтительно представляет собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM субъектов, не имеющих органной дисфункции или органной недостаточности. Соответственно, контрольный уровень предпочтительно представляет собой уровень, указывающий на отсутствие органной дисфункции или отсутствие органной недостаточности.
Контрольный уровень может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, при котором указанный контрольный субъект(-ы) не имеет/не имеют органной дисфункции или органной недостаточности.
Кроме того, контрольный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, причем указанный контрольный субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства, и при этом указанный субъект (субъекты) не имеет/не имеют органной дисфункции или органной недостаточности.
Кроме того, контрольный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, причем указанный контрольный субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства и инфекции (такой как сепсис или септические расстройства), и при этом указанные субъекты не имеет/не имеют органной дисфункции или органной недостаточности.
Кроме того, контрольный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, причем указанный контрольный субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства, но не от инфекции, и при этом указанный субъект(-ы) не имеет/не имеют органной дисфункции или органной недостаточности.
Кроме того, контрольный уровень также может представлять собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, и при этом указанный контрольный субъект(-ы) страдает (страдают) от заболевания и/или медицинского расстройства, включая синдром системного воспалительного ответа (SIRS), при этом указанные субъекты не страдают от инфекции, и при этом указанные субъект(-ы) не имеет/не имеют органной дисфункции или органной недостаточности.
Используемый в данном документе термин "по меньшей мере один контрольный субъект" обозначает более одного контрольного субъекта. В частности, по меньшей мере один контрольный субъект представляет собой группу или когорту контрольных субъектов. Ниже в настоящей заявке описаны средства и способы для определения уровней маркеров, например, у контрольных субъектов, и также приведены иллюстративные контрольные уровни.
Контрольный уровень, используемый в данном документе, обычно представляет собой заранее определенный уровень, то есть он был определен заранее в качестве эталона для последующего применения в месте оказания медицинской помощи, например. ОИТ.
Как документально описано в данном документе, повышенный уровень по меньшей мере одного гистона (или увеличение уровня по меньшей мере одного гистона) и/или повышенный уровень proADM (или увеличение уровня proADM), в частности MR-proADM, по сравнению с контрольным уровнем, свидетельствует об органной дисфункции. Соответственно, способ по изобретению включает в себя методику, включающую определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта, и при этом повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистон свидетельствует об указанной органной дисфункции у указанного субъекта.
Кроме того, изобретение включает в себя способ, включающий определение уровня proADM, в частности MR-proADM, в образце от указанного субъекта, и при этом повышенный уровень указанного proADM, в частности MR-proADM, указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем указанного proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует об указанной органной дисфункции у указанного субъекта.
Кроме того, изобретение включает способ, включающий определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта и определение уровня proADM, в частности MR-proADM, в образце от указанного субъекта, и при этом повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона указанного субъекта и повышенный уровень указанного proADM, в частности MR-proADM, указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона и контрольным уровнем указанного proADM, в частности MR-proADM, свидетельствуют об указанной органной дисфункции у указанного субъекта.
Изобретение также относится к способу, включающему
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце субъекта,
причем повышенный уровень этого по меньшей мере одного гистона указанного субъекта сравнивают с указанным контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона
и при этом повышенный уровень этого по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, причем уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM,
и повышенный уровень proADM указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта.
Другими словами, изобретение также относится к способу, включающему
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце субъекта,
причем указанный уровень этого по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона,
и при этом увеличение уровня этого по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, причем уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM,
и при этом увеличение уровня proADM указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта.
Используемый в настоящей заявке термин "повышение уровня маркера" означает, что уровень маркера повышен, то есть относится к повышенному уровню маркера. Соответственно, термин "повышение уровня маркера" в настоящей заявке используется взаимозаменяемо с термином "повышенный уровень маркера". Повышенный уровень маркера или повышение уровня маркера субъекта означает, что уровень маркера составляет по меньшей мере приблизительно на 15%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 25% или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30% выше контрольного уровня этого маркера.
В контексте изобретения термин "повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с контрольным уровнем" или тому подобное выражение используют взаимозаменяемо с термином "повышенный уровень данного по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем" или термином "повышенный уровень данного по меньшей мере одного гистона по сравнению с контрольным уровнем" или тому подобным выражением. Такие термины означают, что уровень данного по меньшей мере одного гистона, например уровень H2B, уровень H4, уровень H2A и/или уровень H3 субъекта составляет по меньшей мере приблизительно на 15%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 25% или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30% выше, чем контрольный уровень этого по меньшей мере одного гистона.
Используемый в настоящей заявке термин "повышение уровня proADM по сравнению с контрольным уровнем" или тому подобное выражение используется в настоящей заявке взаимозаменяемо с термином "повышенный уровень proADM указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем" или термином "повышенный уровень proADM по сравнению с указанным контрольным уровнем" или тому подобным выражением. Такие термины означают, что уровень proADM, в частности уровень MR-proADM, субъекта составляет по меньшей мере приблизительно на 15%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 25% или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 30% выше, чем контрольный уровень proADM, в частности MR-proADM.
Изобретение также может относиться к способу, включающему
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта,
причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона того же субъекта, полученным в результате предшествующего анализа, и при этом повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с указанным контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона свидетельствует об органной дисфункции или последующей органной дисфункции у указанного субъекта; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM того же субъекта, полученным из предшествующего анализа,
и при этом повышение уровня proADM по сравнению с указанным контрольным уровнем proADM свидетельствует об органной дисфункции или дополнительной органной дисфункции у указанного субъекта.
Используемый в настоящей заявке термин "полученный из предшествующего анализа" относится к определению уровня маркера в образце того же субъекта в предшествующее время, например, за 28 дней, 7 дней, 6 дней, 5 дней, 4 дня, 3 дня, 2 дня или 1 день до следующего анализа, причем в таких аспектах указанный определенный ранее уровень маркера рассматривается как контрольный уровень. Используемое в настоящем документе понятие "дополнительная органная дисфункция" может означать, что дисфункцию или недостаточность демонстрирует/имеет другой орган. Например, если субъект страдает от одной органной дисфункции, дополнительная органная дисфункция означает, что субъект страдает от двух или более органных дисфункций или недостаточностей.
Повышенный уровень по меньшей мере одного гистона субъекта по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона может свидетельствовать по меньшей мере об одной органной дисфункции, по меньшей мере двух органных дисфункциях или по меньшей мере трех органных дисфункциях. В частности, повышенный уровень по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона может свидетельствовать по меньшей мере о пяти органных дисфункциях или по меньшей мере шести органных дисфункциях. Более конкретно, повышенный уровень по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона может свидетельствовать по меньшей мере о четырех органных дисфункциях у указанного субъекта.
Повышенный уровень proADM субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM может свидетельствовать по меньшей мере об одной органной дисфункции. В частности, повышенный уровень указанной proADM указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем proADM может свидетельствовать по меньшей мере о двух органных дисфункциях. Более конкретно, повышенный уровень указанного proADM указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем proADM может свидетельствовать по меньшей мере о трех органных дисфункциях. Более конкретно, повышенный уровень proADM указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем proADM может свидетельствовать по меньшей мере о четырех органных дисфункциях.
Используемый в настоящей заявке термин "одна органная дисфункция" означает, что у субъекта дисфункция одного органа, то есть дисфункцию имеет один орган субъекта. Используемый в настоящей заявке термин "две органные дисфункции" означает, что субъект имеет дисфункцию двух органов, то есть два органа субъекта имеют дисфункцию. Это относится с соответствующими изменениями к терминам "три органные дисфункции", "четыре органные дисфункции", "пять органных дисфункций" или "шесть органных дисфункций".
Кроме того, в прилагаемых примерах документально подтверждено, что уровни гистонов, в частности H2B, H4, H2A и H3, повышаются в случае, если у субъекта возникают четыре или более органные дисфункции по сравнению с уровнями субъектов, страдающих от дисфункции от одного до трех органов; см. например Фигуру 1 и Таблицу 1. Следовательно, способы и наборы по изобретению могут определить, от дисфункции скольких органов страдает или, вероятно, будет страдать субъект.
Соответственно, в контексте представленных в настоящей заявке способов и наборов повышенный уровень указанного по меньшей мере одного гистона указанного субъекта по сравнению с контрольным уровнем свидетельствует по меньшей мере о четырех органных дисфункциях у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует о наличии от одной до трех органных дисфункциях.
Кроме того, повышенный уровень по меньшей мере одного гистона субъекта по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает по меньшей мере на пять органных дисфункций у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует о четырех органных дисфункциях.
Кроме того, повышенный уровень по меньшей мере одного гистона субъекта по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона указывает по меньшей мере на шесть или семь органных дисфункций у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует о пяти органных дисфункциях.
Кроме того, приложенные примеры демонстрируют, что уровень proADM, особенно фрагмента MR-proADM, последовательно увеличивается от одной органной дисфункции, двух дисфункций, трех дисфункций, четырех органных дисфункций до пяти органных дисфункций; см. например Фигуру 1E и Таблицу 1.
Соответственно, в контексте предоставленных в настоящей заявке способов и наборов повышенный уровень proADM, в частности MR-proADM, субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM указывает по меньшей мере на одну органную дисфункцию у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует об отсутствии органной дисфункции.
Кроме того, повышенный уровень proADM, в частности MR-proADM, субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует по меньшей мере о двух органных дисфункциях у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует об одной органной дисфункции.
Кроме того, повышенный уровень proADM, в частности MR-proADM, субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует по меньшей мере о о трех органных дисфункциях у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует о двух органных дисфункциях.
Кроме того, повышенный уровень proADM, в частности MR-proADM, субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует по меньшей мере о четырех органных дисфункциях у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует о трех органных дисфункциях.
Кроме того, повышенный уровень proADM, в частности MR-proADM, субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует по меньшей мере о пяти органных дисфункциях у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует о четырех органных дисфункциях.
Кроме того, повышенный уровень proADM, в частности MR-proADM, субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует по меньшей мере о шести или семи органных дисфункциях у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует о пяти органных дисфункциях.
Кроме того, идентичный или близкий уровень, например приблизительно +/- 10%, +/- 15% или +/- 20% от уровня proADM, в частности MR-proADM, и/или по меньшей мере одного гистона субъекта по сравнению с контрольным уровнем proADM и/или по меньшей мере, одного гистона свидетельствует о полиорганной дисфункции у указанного субъекта, у которого указанный контрольный уровень свидетельствует о полиорганной дисфункции.
Используемый в настоящей заявке термин "контрольный уровень свидетельствует о числе органных дисфункций" относится к уровню, отражающему число органных дисфункций". Например, такой (контрольный) уровень может быть определен по меньшей мере у одного контрольного субъекта (обычно в группе субъектов), который страдает от указанного конкретного числа органных дисфункций. Такие уровни документально подтверждены в прилагаемых примерах, например, уровни маркеров субъектов, страдающих от одной до шести/семи органных дисфункций. Соответственно, контрольным уровнем, указывающим число органных дисфункций, может быть уровень по меньшей мере одного гистона по меньшей мере одного контрольного субъекта, который страдает от соответствующего числа органных дисфункций. С соответствующими изменениями, контрольным уровнем, указывающим число органных дисфункций, может быть уровень указанного proADM, в частности MR-proADM по меньшей мере одного контрольного субъекта, который страдает от соответствующего числа органных дисфункций или не страдает от органной дисфункции.
Настоящее изобретение также относится к способам и наборам по изобретению, при которых в образце субъекта определяют по меньшей мере один гистон, и при этом уровень этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует о том, страдает ли субъект от одной органной дисфункции до трех органных дисфункций или субъект страдает от четырех или более органных дисфункций. В частности, настоящее изобретение также относится к способам и наборам по изобретению, при которых в образце субъекта определяют по меньшей мере один гистон и при этом уровень этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует о том, страдает ли субъект от одной органной дисфункции или субъект страдает от четырех или более органных дисфункций.
В частности, настоящее изобретение также относится к способам и наборам по изобретению, при которых в образце субъекта определяют по меньшей мере один гистон и при этом уровень этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует о том, страдает ли субъект от одной органной дисфункции до трех органных дисфункций, или субъект страдает от четырех органных дисфункций, или от пяти органной дисфункцией, или от шести и более органных дисфункций.
Кроме того, ниже документально подтверждено, что уровень proADM, в частности уровень MR-proADM, свидетельствует о том, страдает ли субъект от одной органной дисфункции до трех органных дисфункции, или же субъект страдает от четырех или более органных дисфункции; см. например Таблицу 1 и Таблицу 2А.
Соответственно, настоящее изобретение также относится к способам и наборам по изобретению, в которых в образце субъекта определяют proADM, в частности MR-proADM, и при этом уровень proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует о том, страдает ли субъект от одной органной дисфункции или субъект страдает от двух или более органных дисфункций.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к способам и наборам по изобретению, при которых в образце субъекта определяют proADM, в частности MR-proADM, и при этом уровень proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует о том, страдает ли субъект от двух органных дисфункций или субъект страдает от трех или более органных дисфункций.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к способам и наборам по изобретению, при которых в образце субъекта определяют proADM, в частности MR-proADM, и где уровень proADM, в частности MR-proADM, свидетельствует о том, страдает ли субъект от трех органных дисфункций или субъект страдает от четырех или более органных дисфункций.
Контрольный уровень в данном документе обычно представляет собой заранее определенный уровень, то есть он был определен заранее в качестве эталона для последующего применения в месте оказания медицинской помощи, например, ОИТ. В настоящей заявке подразумевается, что контрольные уровни и определенные уровни маркера (то есть уровни, которые определены для отдельного субъекта в месте оказания медицинской помощи, например, в ОИТ) могут варьироваться в зависимости от анализа/способа, с помощью которого определяются эти уровни, что также описано на примерах в таблице 4. Например, контрольный уровень и определенный уровень маркера, определенные с помощью методов масс-спектрометрии, могут отличаться от соответствующих уровней, определенных с помощью иммуноанализов. Прилагаемые примеры демонстрируют, что уровни маркеров могут быть определены несколькими способами, например, методами иммуноанализа и масс-спектрометрии, см. например, таблицу 4, и что контрольные уровни могут быть дополнительно оптимизированы статистическими методами, такими как индекс Юдена (см.например, Rota et al., BMC Medical Research Methodology (2015) 15:24; и Ruopp et al., Biom J. 2008 June) ; 50 (3): 419-430)). Соответственно, специалист в данной области техники знает, как определять контрольные уровни. Например, уровни (включая контрольные уровни) могут быть определены с помощью иммуноанализа, например, путем определения уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM, например MR-proADM, в образцах субъектов (или контрольных субъектов), которые не страдают от органной дисфункции или органной недостаточности, или, наоборот, которые страдают от органной дисфункции или органной недостаточности.
В одном варианте реализации контрольные уровни данного по меньшей мере одного гистона определяли иммуноанализом. Контрольный уровень этого по меньшей мере одного гистона может составлять приблизительно 100 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 80 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 70 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 50 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 45 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл. Контрольный уровень этого по меньшей мере одного гистона, определенный иммуноанализом, может составлять приблизительно 10 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 15 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 20 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 25 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 30 нг./мл или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл.
Контрольный уровень этого по меньшей мере одного гистона может составлять от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно от приблизительно 20 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл.
Контрольный уровень гистона Н4, определенный иммуноанализом, может составлять приблизительно 100 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 80 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 70 нг/мл, более предпочтительно, приблизительно 60 нг/мл. более предпочтительно приблизительно 50 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 45 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 40 нг/мл и наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл. Контрольный уровень гистона Н4, определенный иммуноанализом, может составлять приблизительно 10 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 15 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 20 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 25 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 30 нг/мл. или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл.
Контрольный уровень гистона Н4 может составлять от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно приблизительно От 10 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно от приблизительно 20 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл.
Иллюстративные контрольные уровни proADM определяли иммуноанализом, как описано в прилагаемых примерах. Например, контрольный уровень proADM может составлять приблизительно 4 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 5 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 7 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 8 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 9 нмоль/л или особенно предпочтительно приблизительно 6 нмоль/л.
Повышение уровня маркера по сравнению с этим иллюстративным контрольным уровнем может свидетельствовать об одной органной дисфункции, двух органных дисфункциях, трех органных дисфункциях, четырех органных дисфункциях, пяти органных дисфункциях или шести или более органных дисфункций у субъекта.
Кроме того, в другом варианте реализации эти уровни (включая контрольные уровни) могут быть определены методами масс-спектрометрии, такими как методы, определяющие относительную количественную оценку или определяющие абсолютную количественную оценку белка или его рассматриваемого фрагмента.
Относительная количественная оценка "rSRM" может быть получена следующими способами:
1. Определение повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади пика сигнатуры SRM (контроль селективных реакций) от данного целевого пептидного фрагмента, обнаруженного в образце, с той же площадью пика сигнатуры SRM целевого пептидного фрагмента во втором, третьем, четвертом или более биологических образцах.
2. Определение повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади пика сигнатуры SRM от данного целевого пептида, обнаруженного в образце, с площадями пиков сигнатуры SRM, полученными от пептидных фрагментов из других белков, в других образцах, полученных из разных и отдельных биологических источников, когда сравнение площадей пика сигнатуры SRM между двумя образцами для пептидного фрагмента нормировано, например, на количество анализируемого белка в каждом образце.
3. Определение повышенного или пониженного присутствия целевого белка путем сравнения площади пика сигнатуры SRM для данного целевого пептида с площадями пиков сигнатуры SRM от других пептидных фрагментов, полученных из разных белков в том же биологическом образце, с целью нормировать изменяющиеся уровни белка гистонов до уровня других белков, которые не изменяют свои уровни экспрессии при различных клеточных условиях.
Такие анализы могут применяться как к немодифицированным пептидным фрагментам, так и к модифицированным пептидным фрагментам целевых белков, когда такие модификации включают, помимо прочего, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование и при этом относительные уровни модифицированных пептидов определяют таким же образом, как и при определении относительных количеств немодифицированных пептидов.
Абсолютная количественная оценка данного пептида может быть получена следующими способами:
1. Сравнение площади пика сигнатуры SRM/MRM (мониторинг множественных реакций) для данного пептидного фрагмента из целевых белков в отдельном биологическом образце с площадью пика сигнатуры SRM/MRM внутреннего стандарта пептидного фрагмента, введенного в известном количестве в лизат белка из биологического образца. Внутренним стандартом может быть меченая синтетическая версия пептидного фрагмента из исследуемого целевого белка или меченого рекомбинантного белка. Этот стандарт добавляют в образец в известных количествах перед (обязательно для рекомбинантного белка) или после расщепления, и площадь пика сигнатуры SRM/MRM может быть определена как для внутреннего стандарта пептидного фрагмента, так и для нативного пептидного фрагмента в биологическом образце по отдельности с последующим сравнением площадей обоих пиков. Это может применяться к немодифицированным пептидным фрагментам и модифицированным пептидным фрагментам, когда такие модификации включают, помимо прочего, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (например, моно-, ди- или триметилирование), цитруилинирование, убиквитинилирование и при этом абсолютные уровни модифицированных пептидов могут быть определены таким же образом, как и при определении абсолютных уровней немодифицированных пептидов.
2. Пептиды также могут быть определены количественно с использованием внешних калибровочных кривых. В подходе с нормальной кривой используют постоянное количество тяжелого пептида в качестве внутреннего стандарта и варьирующееся количество легкого синтетического пептида, добавленного в образец. Для построения стандартных кривых для учета эффекта матрицы необходимо использовать репрезентативную матрицу, аналогичную матрице тестовых образцов. Кроме того, метод обратной кривой позволяет обойти проблему эндогенного аналита в матрице, когда для создания внутреннего стандарта добавляют постоянное количество легкого пептида к эндогенному аналиту, а для создания набора концентрационных стандартов добавляют варьирующиеся количества тяжелого пептида. В тестируемые образцы для сравнения с нормальными или обратными кривыми добавляли то же количество стандартного пептида, что и внутреннего стандарта, добавленного в матрицу, используемую для создания калибровочной кривой.
Соответственно, специалист в данной области техники знает, как определять уровни маркеров и, в частности, соответствующие контрольные уровни, что также проиллюстрировано в прилагаемых примерах.
Как описано выше, контрольные уровни могут быть определены путем определения уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образцах субъектов, страдающих, например, от одной органной дисфункции, двух органных дисфункций, трех органных дисфункций или четырех или более органных дисфункций. Повышенный уровень целевого белка (белков) в образце субъекта по сравнению с контрольным уровнем каждого целевого белка (белков), представляющим одну или несколько органных дисфункций, таким образом указывает на количество органных дисфункций, причем количество органных дисфункций в образце субъекта выше, чем число органных дисфункций, представленное контрольными уровнями. Например, контрольные уровни по меньшей мере этого одного гистона и/или proADM, указывающие по меньшей мере на четыре органные дисфункции, приведены в таблицах 3 и 4. Соответственно, контрольный уровень этого по меньшей мере одного гистона, указывающий по меньшей мере на четыре органные дисфункции, может составлять приблизительно 100 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 80 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 70 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 50 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 45 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл. Контрольный уровень по меньшей мере одного гистона, указывающий по меньшей мере на четыре органные дисфункции, может составлять приблизительно 10 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 15 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 20 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 25 нг/мл, более предпочтительно приблизительно 30 нг/мл или наиболее предпочтительно приблизительно 35 нг/мл.
Контрольный уровень этого по меньшей мере одного гистона, указывающий по меньшей мере на четыре органные дисфункции, может составлять от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 90 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл. мл до приблизительно 60 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл, более предпочтительно от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл или наиболее предпочтительно от приблизительно 20 нг/мл до приблизительно 40 нг/мл.
Контрольный уровень proADM, указывающий по меньшей мере на четыре органные дисфункции, может составлять приблизительно 4 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 5 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 7 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 8 нмоль/л, более предпочтительно приблизительно 9 нмоль/л или особенно предпочтительно приблизительно 6 нмоль/л. Повышение уровня этого маркера по сравнению с такими иллюстративными контрольными уровнями может свидетельствовать по меньшей мере о четырех органных дисфункциях у субъекта.
Чувствительность и специфичность предлагаемых способов зависят не только от аналитического качества теста. Чувствительность и специфичность также зависят от определения того, что представляет собой анормальный (например, органная дисфункция) или нормальный результат. Специфичность и чувствительность предоставленных способов также могут зависеть от используемого контрольного уровня, как показано в таблице 4. Распределение уровней по меньшей мере одного гистона и/или proADM, предпочтительно уровня MR-proADM, для субъектов с органной дисфункцией и без нее могут перекрываться. При таких условиях, тест не способен абсолютно различить нормальное состояние от дисфункционального со 100% точностью. Специалисту в данной области известно, что само по себе состояние субъекта или по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра субъекта может помочь в интерпретации данных, и что эта дополнительная информация позволяет сделать более надежный прогноз в областях перекрытия Соответственно, определяют уровень (уровни) по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра. Уровни по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра также можно сравнивать с контрольными уровнями, причем близкие или идентичные значения/уровни указанного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра субъекта по сравнению с соответствующими уровнями указанного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра указанных контрольных уровней свидетельствует, что риск наличия у субъекта органной дисфункции (дисфункций) уменьшается, и/или при этом более высокие или более низкие уровни/значения указанного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра по сравнению с соответствующими уровнями указанного по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра указанных контрольных уровней свидетельствуют, что риск наличия органной дисфункции (дисфункций) увеличивается.
Соответственно, способы и наборы по настоящему изобретению могут также включать определение по меньшей мере одного дополнительного маркера и/или параметра в дополнение к данному по меньшей мере одному гистону и/или proADM.
Используемый в данном документе термин "параметр" представляет собой характеристику, признак или измеримый фактор, которые могут помочь в определении конкретной системы. Параметр является важным элементом для связанных со здоровьем и физиологией оценок, таких как риск заболевания/расстройства/клинического состояния, предпочтительно, органной дисфункции (дисфункций). Кроме того, параметр определяется как характеристика, которая объективно измеряется и оценивается как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических реакций на терапевтическое вмешательство. Иллюстративный параметр может быть выбран из группы, состоящей из Шкалы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья (APACHE, шкала I-IV), APACHE II, Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств (SAPS, шкала I-III), Шкалы динамической оценки выраженности органной недостаточности (шкала SOFA), Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств II (шкала SAPSII), Вероятностной модели смертности (MPM I-III), Шкалы полиорганной дисфункции (MODS), Шкалы оценки терапевтического вмешательства (TISS), Шкалы девяти эквивалентов оценки использования среднего медицинского персонала по уходу (NEMS), Шкалы Всемирной федерации нейрохирургических обществ (WFNS) и Шкалы комы Глазго (GCS), возраста, пола, семейной истории, этнической принадлежности, массы тела, индекса массы тела (ИМТ), отчета цистоскопии, количества лейкоцитов, компьютерной томографии, артериального давления, частоты сердечных сокращений, гипотензивного лечения, потребления жидкости, одышки, температуры тела, наличия сахарного диабета и существующей привычки курения.
Используемые в настоящей заявке такие термины, как "маркер", "суррогат", "прогностический маркер", "фактор" или "биомаркер" или "биологический маркер", используются взаимозаменяемо и относятся к поддающимся измерению и количественной оценке биологическим маркерам (например, концентрации специфического белка или фермента или его фрагмент или их фрагмента, концентрации специфического гормона или его фрагмента или наличия биологических веществ или их фрагмента), которые служат показателями для связанных со здоровьем и физиологией оценок, таких как риск заболевания/расстройства/клинического состояния, предпочтительно неблагоприятного события. Маркер определяется как характеристика, которая может быть объективно измерена и оценена как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических реакций на терапевтическое вмешательство. Биомаркеры могут быть измерены в образце (как анализ крови, плазмы, мочи или ткани). По меньшей мере, один дополнительный маркер указанного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из прокальцитонина, кальцитонина, эндотелина-1 (ET-1), аргинина-вазопрессина (AVP), предсердного натрийуретического пептида (ANP), липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), тропонина, натрийуретического пептида головного мозга (BNP), C-реактивного белка (CRP), белка поджелудочной железы (PSP), триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 (TREM1), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-1, интерлейкина-24 (IL-24), других IL, пресепсина (sCD14-ST), липополисахаридсвязывающего белка (LBP), альфа-1-антитрипсина, матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2), матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9), матриксной металлопротеиназы 7 (MMP9), хромогранина А, белка S100A, белка S100B и фактора некроза опухоли α (TNFα) или их фрагментов.
В конкретных аспектах изобретения по меньшей мере один дополнительный маркер и/или параметр указанного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из альдолазы В, копептина, проэндотелина-1, лактата, прокальцитонина (PCT), Шкалы динамической оценки оценка выраженности органной недостаточности (шкала SOFA), Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств II (шкала SAPSII), гепарин-связывающего белка (HBP), Шкалы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья II (APACHE II) и растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt-1). В настоящей заявке подразумевается, что в образце субъекта определяют в частности уровень (уровни) дополнительного маркера(-ов).
В определенных аспектах изобретения этот по меньшей мере один дополнительный маркер и/или параметр указанного субъекта может быть выбран из группы, состоящей из прокальцитонина, кальцитонина, эндотелина-1 (ET-1), аргинина-вазопрессина (AVP), предсердного натрийуретического пептида (ANP), липокалина, ассоциированного с желатиназой нейтрофилов (NGAL), тропонина, натрийуретического пептида головного мозга (BNP), C-реактивного белка (CRP), белка поджелудочной железы (PSP), триггерного рецептора, экспрессируемого на миелоидных клетках 1 (TREM1), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-1, интерлейкина-24 (IL-24), других IL, пресепсина (sCD14-ST), липополисахаридсвязывающего белка (LBP), альфа-1-антитрипсина, матриксной металлопротеиназы 2 (MMP2), матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9), матриксной металлопротеиназы 7 (MMP7), хромогранина А, белка S100A, белка S100B и фактора некроза опухоли α (TNFα), возраста, пола, семейной истории, этнической принадлежности, массы тела, индекса массы тела (ИМТ), отчета цистоскопии, количества лейкоцитов, компьютерной томографии, артериального давления, частоты сердечных сокращений, гипотензивного лечения, потребления жидкости, одышки, температуры тела, наличия сахарного диабета и существующей привычки курения, Шкалы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья (APACHE, шкала I-IV), Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств (SAPS шкала I-III), Шкалы динамической оценки выраженности органной недостаточности (шкала SOFA), IGS II, Вероятностной модели смертности (MPM I-III), Шкалы полиорганной дисфункции (MODS), Шкалы оценки терапевтического вмешательства (TISS), Шкалы девяти эквивалентов оценки использования среднего медицинского персонала по уходу (NEMS), Шкалы Всемирной федерации нейрохирургических обществ (WFNS) и Шкалы комы Глазго (GCS).
Используемый в настоящей заявке термин "альдолаза В" относится к фруктозо-бисфосфат-альдолазе В или альдолазе печеночного типа, которая является одним из трех изоферментов (А, В и С) фермента 1,6-бисфосфат-альдолазы фруктозы класса I. Уровень альдолазы В в образце субъекта может быть определен методами масс-спектрометрии.
"Копептин" также называют "CT-proAVP" или "С-концевая часть вазопрессина". Вазопрессин является мощным вазоконстриктором. Уровень CT-proAVP может быть измерен в плазме или сыворотке субъекта с помощью иммуноанализа, как описано ниже.
Используемый в настоящей заявке термин "лактат" относится к максимальной концентрации лактата, измеренной в крови. Обычно концентрацию лактата оценивают ежедневно или даже чаще. Концентрация лактата в крови может быть определена спектрофотометрическими методами с помощью лактатоксидазы.
Используемый в настоящей заявке термин "прокальцитонин" или "РСТ" относится к пептидным аминокислотным остаткам 1-116, 2-116, 3-116 или их фрагментам. Таким образом, длина фрагментов прокальцитонина составляет по меньшей мере 12 аминокислот, предпочтительно более 50 аминокислот, более предпочтительно более 110 аминокислот. РСТ может включать посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, липосидирование или дериватизацию. Прокальцитонин является предшественником кальцитонина и катакальцина. Таким образом, в нормальных условиях уровни РСТ в кровотоке очень низкие (<приблизительно 0,05 нг/мл). Уровень РСТ в образце субъекта можно определить с помощью иммуноанализа, как описано ниже.
Используемый в настоящей заявке термин "Шкала динамической оценки выраженности органной недостаточности" или "Шкала SOFA" представляет собой оценку, используемую для отслеживания статуса пациента во время пребывания в отделении интенсивной терапии (ОИТ). Шкала SOFA - это система подсчета баллов, определяющая степень функционирования органов или уровень органной недостаточности пациента. Эта оценка основана на шести различных баллах, по одному для дыхательной, сердечно-сосудистой, печеночной, коагуляционной, почечной и нервной систем. Как средние, так и высшие баллы SOFA являются предикторами исхода. Увеличение оценки SOFA в течение первых 24-48 часов в отделении интенсивной терапии прогнозирует уровень смертности от 50% до 95%. Оценки менее 9 дают прогнозируемую смертность на уровне 33%, а выше 14 - смертность близко к 95% или выше.
2
2
Используемый в настоящем документе термин "SAPS II" или "Упрощенная шкала оценки острых физиологических расстройств II" относится к системе классификации тяжести заболевания или расстройства (см. Le Gall JR et al., A new Simplified acute physiology score (SAPS II) based on a European/North American multicenter study. JAMA. 1993; 270 (24): 2957-63.). Шкала SAPS II преимущественно состоит из 12 обычных физиологических переменных и 3 связанных с болезнью переменных. Балльная оценка рассчитывается на основе этих 12 обычных физиологических измерений, информации о предыдущем состоянии здоровья и некоторой информации, полученной при поступлении в ОИТ. Оценка SAPS II может быть определена в любое время, предпочтительно, на 2-й день после поступления в ОИТ. "Наихудшее" измерение определяется как измерение, которое соответствует наибольшему количеству баллов. Оценка SAPS II варьируется от 0 до 163 баллов. Система классификации включает следующие параметры: возраст, частота сердечных сокращений, систолическое артериальное давление, температура, шкала комы Глазго, механическая вентиляция легких или CPAP, PaO, FiO, выход мочи, азот мочевины крови, натрий, калий, бикарбонат, билирубин, лейкоциты, хронические заболевания и тип поступления в ОИТ. Имеется сигмоидальная зависимость между смертностью и суммарной оценкой SAPS II. Смертность субъекта составляет 10% при оценке SAPSII 29 баллов, 25% при оценке SAPSII 40 баллов, 50% при оценке SAPSII 52 балла, 75% при оценке SAPSII 64 балла и 90% при оценке SAPSII 77 баллов (Le Gall loc. cit.).
Используемый в настоящей заявке термин "гепаринсвязывающий белок" или "HBP" относится к белку, высвобождаемому из активированных нейтрофилов, который является мощным индуктором пропотевания жидкости через сосуды. Уровень HBP в образце субъекта может быть определен с помощью масс-спектрометрических анализов, как описано ниже в настоящем документе.
Используемый в настоящей заявке термин "APACHE II" или "Шкала оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья II" представляет собой систему оценки тяжести заболевания (Knaus et al., 1985). Она может быть применена в течение 24 часов после поступления пациента в отделение интенсивной терапии (ОИТ) и может быть определена на основании, например, 12 или 14 разных физиологических параметров.
Используемый в настоящей заявке термин "растворимая fms-подобная тирозинкиназа-1" или "sFlt-1" представляет собой белок тирозинкиназы, который блокирует белки, вызывающие рост кровеносных сосудов. Растворимый Flt-1 (sFlt-1) представляет собой сплайс-вариант рецептора 1 VEGF (Flt-1), который продуцируется различными тканями. Уровень sFLT1 в образце субъекта можно определить с помощью масс-спектрометрических анализов или с помощью иммуноанализа.
Способы или наборы по изобретению могут включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM и уровня дополнительного маркера и/или параметра, как описано выше.
Например, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и оценку SOFA субъекта.
Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и оценку SAPS II субъекта.
Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и уровня альдолазы В в образце субъекта. Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и уровня РСТ в образце субъекта.
Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и уровня лактата в образце субъекта. Кроме того, способ может включать определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня proADM в образце субъекта и уровня копептина в образце субъекта.
В частности, способ может включать определение уровня гистона H2B в указанном образце и оценки SOFA указанного субъекта. В частности, способ может включать определение уровня гистона Н4 в указанном образце и оценки SOFA указанного субъекта.
В частности, способ может включать определение уровня гистона H2A в указанном образце и оценки SOFA указанного субъекта. В частности, способ может включать определение уровня гистона H2A в указанном образце и оценки SAPSII указанного субъекта. В частности, способ может включать определение уровня гистона H4 в указанном образце и оценки SAPSII указанного субъекта. В частности, способ может включать определение уровня гистона H2B в указанном образце и оценку SAPSII указанного субъекта.
В частности, способ может включать определение уровня proADM в указанном образце и указанного уровня альдолазы B в указанном образце. В частности, способ может включать определение уровня proADM в указанном образце и указанного уровня H2B в указанном образце. В частности, способ может включать определение уровня proADM в указанном образце и указанного уровня H2A в указанном образце. В частности, способ может включать определение уровня proADM в указанном образце и указанного уровня H4 в указанном образце. В частности, способ может включать определение уровня proADM в указанном образце и указанного уровня лактата в указанном образце. В частности, способ может включать определение уровня proADM в указанном образце и указанного уровня H3 в указанном образце.
Используемый в настоящей заявке "субъект" (или "пациент") может представлять собой позвоночное. В контексте настоящего изобретения термин "субъект" включает как людей, так и животных, в частности млекопитающих, и другие организмы. Таким образом, представленные в настоящей заявке способы применимы как к людям, так и к животным. Соответственно, указанным субъектом может быть животное, такое как мышь, крыса, хомяк, кролик, морская свинка, хорек, кошка, собака, курица, овца, крупный рогатый скот, лошадь, верблюд или примат. Предпочтительно субъектом является млекопитающее. Наиболее предпочтительно субъектом является человек.
Как показано в прилагаемых примерах, прогнозируется органная дисфункция субъектов, страдающих от различных расстройств или заболеваний. Следовательно, способ, предоставленный в данном документе, может быть использован для любого субъекта, который является здоровым субъектом, или субъекта, который страдает от любого заболевания или расстройства. В предпочтительных аспектах субъект страдает от заболевания, расстройства или медицинского состояния. Тестируемым субъектом может быть пациент в критическом состоянии, предпочтительно, когда указанный субъект поступил в отделение неотложной помощи или когда указанный субъект поступил в отделение интенсивной терапии.
Тестируемым субъектом может быть субъект, который страдает от заболевания или медицинского состояния и при этом указанное заболевание или медицинское состояние выбрано из группы, состоящей из сердечнососудистого заболевания, сахарного диабета, злокачественного новообразования, респираторного заболевания, заболевания печени, иммунодепрессии, почечной недостаточности, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдромом системного воспалительного ответа (SIRS), сепсиса, тяжелого сепсиса и/или септического шока.
В частности, субъект страдает от сепсиса. В частности, субъект страдает от тяжелого сепсиса и/или септического шока.
"Систематическое воспаление" в контексте изобретения предпочтительно относится к состоянию, характеризующемуся выделением провоспалительных цитокинов и активированной врожденной иммунной системы, которое может быть вызвано биологическими факторами, химическими факторами или генетическими факторами. Тяжелое "системное воспаление" может привести к органной недостаточности и смерти.
2
3
3
"SIRS" в контексте изобретения обозначает синдром системного воспалительного ответа без признаков инфекции. Он включает, помимо прочего, более одного из следующих клинических проявлений: (1) температура тела выше 38°С или ниже 36°С; (2) частота сердечных сокращений более 90 ударов в минуту; (3) тахипноэ, проявляющееся частотой дыхания, превышающей 20 вдохов в минуту, или гипервентиляцией, о чем свидетельствует PaCO менее 32 мм рт. и (4) изменение количества лейкоцитов, такое как количество более 12000/мм, менее 4000/мм или присутствие более 10% незрелых нейтрофилов (Bone et al., CHEST 101(6): 1644-55, 1992).
"Сепсис" в контексте изобретения обозначает системный ответ на инфекцию. В качестве альтернативы, сепсис может рассматриваться как комбинация SIRS с подтвержденным инфекционным процессом или инфекцией. Сепсис можно охарактеризовать как клинический синдром, определяемый наличием как инфекции, так и системного воспалительного ответа (Levy MM et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. Crit Care Med. 2003 Apr; 31(4):1250-6): Используемый в настоящей заявке термин "сепсис" включает, помимо прочего, сепсис, тяжелый сепсис, септический шок. Тяжелый сепсис в данном контексте означает сепсис, ассоциированный с органной дисфункцией, абнормальной гипоперфузией или гипотензией, вызванной сепсисом. Гипоперфузионные нарушения включают лактоацидоз, олигурию и острое изменение психического статуса. Гипотензия, вызванная сепсисом, определяется наличием систолического артериального давления менее 90 мм рт.ст. или его снижением приблизительно на 40 мм рт.ст. или более, относительно исходного уровня в отсутствие других причин гипотонии (например, кардиогенного шока). Септический шок определяется как тяжелый сепсис с вызванной сепсисом гипотензией, сохраняющейся, несмотря на адекватную инфузионнцю терапию, наряду с наличием абнормальной гипоперфузии или органной дисфункции (Bone et al., CHEST 101(6): 1644-55, 1992).
Используемый в настоящей заявке термин "сепсис" относится ко всем возможным стадиям развития сепсиса.
Используемый в настоящей заявке термин "инфекция" в контексте изобретения означает патологический процесс, вызванный проникновением в нормальную стерильную ткань или жидкость патогенных или потенциально патогенных микроорганизмов, и относится к инфекции (инфекциям) бактериями, вирусами, грибами и/или паразитами. Соответственно, инфекция может представлять собой бактериальную инфекцию, вирусную инфекцию и/или грибковую инфекцию. Инфекция может быть локальной или системной инфекцией. Кроме того, субъект, страдающий от инфекции, может страдать от более чем одного источника(-ов) инфекции одновременно. Например, субъект, страдающий от инфекции, может страдать от бактериальной инфекции и вирусной инфекции; от вирусной инфекции и грибковой инфекции; от бактериальной и грибковой инфекции, а также от бактериальной инфекции, грибковой инфекции и вирусной инфекции.
Используемый в настоящей заявке термин "образец" означает биологический образец, который получают от субъекта. Термины "образец субъекта" и "образец от субъекта" могут использоваться в настоящей заявке взаимозаменяемо. Используемый в настоящей заявке термин "образец" может, например, относиться к образцу жидкости или ткани организма, полученному с целью диагностики, прогнозирования или оценки рассматриваемого субъекта, такого как пациент. Предпочтительно в настоящей заявке образец представляет собой образец жидкости организма, такой как кровь, сыворотка, плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, мокрота и плевральные выпоты. В частности, образец представляет собой кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу. Образцы могут быть подготовлены (предварительно обработаны), например, путем фракционирования или очистки, например, разделения цельной крови на компоненты сыворотки или плазмы. Такая предварительная обработка также может включать, помимо прочего, разбавление, фильтрацию, центрифугирование, концентрирование, отстаивание, осаждение или диализ. Предварительная обработка может также включать добавление к раствору химических или биохимических веществ, таких как кислоты, основания, буферы, соли, растворители, химически активные красители, моющие средства, эмульгаторы, хелаторы. Предпочтительно образец представляет собой образец крови, более предпочтительно образец сыворотки или образец плазмы.
"Плазма" в контексте настоящего изобретения представляет собой практически бесклеточный супернатант крови, содержащий антикоагулянт, полученный после центрифугирования. Иллюстративные антикоагулянты включают соединения, связывающие ионы кальция, такие как ЭДТА или цитрат, и ингибиторы тромбина, такие как гепаринаты или гирудин. Бесклеточная плазма может быть получена центрифугированием антикоагулированной крови (например, обработанной цитратом, ЭДТА или гепаринизированной крови), например, в течение по меньшей мере 15 минут при 2000-3000 g.
"Сыворотка" в контексте настоящего изобретения представляет собой жидкую фракцию цельной крови, которую собирают после свертывания крови. Когда коагулированная кровь (свернутая кровь) подвергнута центрифугированию, сыворотка может быть получена в качестве супернатанта.
Используемый в настоящей заявке термин "моча" представляет собой жидкий продукт организма, выделяемый почками в процессе, называемом мочеиспусканием, через мочеиспускательный канал.
Как описано выше, в образце субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона и/или proADM. Специалист в данной области осведомлен о способах/анализах, которые можно использовать для определения уровня биомаркеров в образце.
Как описано выше, определяют уровень по меньшей мере одного гистона, в частности, определяют уровень (уровни) гистонов H2B, H4, H2A и/или H3. В частности, можно определить гистон или фрагмент гистона. Такие фрагменты приведены ниже в качестве примера.
Такой гистон или его фрагмент также может представлять собой свободный гистон. Например, способы, наборы и антитела по настоящему изобретению могут, в частности, обнаруживать пептиды или эпитопы свободных гистонов. Такие участки аминокислот также называются в настоящей заявке центральными областями или частями гистонов. Далее описаны пептиды или эпитопы, которые также могут быть использованы для обнаружения свободных гистонов с применением способов, представленных в настоящем документе.
В частности по меньшей мере один гистон может представлять собой гистон H4, и в нем определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 гистона H4 в соответствии с SEQ ID NO: 1. В частности, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки 46-56 последовательности SEQ ID NO: 1, остатки 67-78 последовательности SEQ ID NO.: 1, остатки с 60 по 67 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 30 из SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 из SEQ ID NO: 1, остатки с 92 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 34 SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 55 из SEQ ID NO: 1, остатки с 80 по 91 из SEQ ID NO: 1, остатки с 24 по 35 из SEQ ID NO: 1, и остатки с 68 по 77 SEQ ID NO: 1. Например, могут быть определены два пептида.
В частности, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, в котором определяют пептиды из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки 46-56 последовательности SEQ ID NO: 1 и остатки 67-78 последовательности SEQ ID NO: 1.
Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, в котором определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки от 20 до 118 гистона H2A в соответствии с SEQ ID NO: 2. В частности, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, в котором определяют по меньшей мере один пептид последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 21 по 53 последовательности SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 последовательности SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 из SEQ ID NO: 2, остатки со 120 по 129 из SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 из SEQ ID NO: 2, остатки с 82 по 88 из SEQ ID NO: 2, остатки 89 до 95 из SEQ ID NO: 2 и остатки от 100 до 118 из SEQ ID NO: 2.
Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, в котором определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 гистона H3 в соответствии с SEQ ID NO: 3. Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, и в котором определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 37 последовательности SEQ ID NO: 3 и/или охватывающей аминокислотные остатки с 52 по 62 последовательности SEQ ID NO: 3.
Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, в котором определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 гистона H2B в соответствии с SEQ ID NO: 4.
Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, в котором определяют по меньшей мере один пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10.
Кроме того, этот по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, в котором определяют по меньшей мере пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 и 16.
В настоящей заявке подразумевается, что могут быть определены один, два, три, четыре или более пептидов.
Уровень маркеров, например по меньшей мере одного гистона или его фрагмента и/или proADM или его фрагмента могут быть определены любым анализом, который надежно определяет концентрацию маркера. В частности, могут быть использованы масс-спектрометрия (МС) и/или иммуноанализы, как показано в прилагаемых примерах. Используемый в настоящей заявке иммуноанализ представляет собой биохимический тест, который измеряет присутствие или концентрацию макромолекулы/полипептида в растворе с использованием антитела или связывающего антитело фрагмента или иммуноглобулина.
В качестве альтернативы, в объем настоящего изобретения вместо антител могут быть включены другие молекулы захвата или молекулярные каркасы, которые специфически и/или селективно распознают последовательности гистонов, эпитопы гистонов и структурные конформации гистонов. В настоящей заявке термин "молекулы захвата" или "молекулярные каркасы" включает молекулы, которые могут использоваться для связывания целевых молекул или рассматриваемых молекул, то есть аналитов (например, гистона(-ов) и/или proADM), из образца. Таким образом, молекулы захвата должны иметь адекватную форму, как пространственно, так и с точки зрения поверхностных характеристик, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие льюис-доноров и/или -акцепторов, чтобы специфически связывать целевые молекулы или рассматриваемые молекулы. Таким образом, связывание может, например, быть опосредовано ионными, ван-дер-ваальсовыми, пи-пи, сигма-пи, гидрофобными или водородными взаимодействиями или комбинацией двух или более вышеупомянутых взаимодействий или ковалентных взаимодействий между молекулами захвата или молекулярными каркасами и целевыми молекулами или рассматриваемыми молекулами. В контексте настоящего изобретения молекулы захвата или молекулярные каркасы могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из молекулы нуклеиновой кислоты, молекулы углевода, молекулы ПНК, белка, пептида и гликопротеина. Молекулы захвата или молекулярные каркасы включают, например, аптамеры, дарпины (сконструированные белки с анкириновым повтором), аффимеры и тому подобное.
Используемый в настоящей заявке термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулина и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина (Ig), то есть молекулам, которые содержат антигенсвязывающий сайт, специфически связывающий антиген (иммунно реагирует с антигеном). Согласно изобретению антитела могут быть как моноклональными, так и поликлональными антителами. В частности, используются антитела, которые специфически связываются с данным по меньшей мере одним гистоном и/или которые специфически связываются с proADM. Антитело считается специфичным, если его сродство к рассматриваемой молекуле, например, с данным по меньшей мере одним гистоном и/или proADM или его фрагментом по меньшей мере в 50 раз выше, предпочтительно в 100 раз выше, наиболее предпочтительно по меньшей мере в 1000 раз выше, чем с другими молекулами, содержащимися в образце, содержащем рассматриваемую молекулу. В данной области техники хорошо известно, как разрабатывать и отбирать антитела с заданной специфичностью. В контексте изобретения предпочтительными являются моноклональные антитела. Антитело или связывающий фрагмент антитела специфически связывается с определенными в настоящей заявке маркерами или их фрагментами. В частности, антитело или связывающий фрагмент антитела связывается с определенными в настоящей заявке пептидами данного по меньшей мере одного гистонового белка. Таким образом, определенные в настоящей заявке пептиды также могут быть эпитопами, с которыми специфически связываются антитела. Кроме того, в способах и наборах по изобретению используют антитело или связывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с proADM, в частности с MR-proADM. Примером иммуноанализа может быть люминесцентный иммуноанализ (LIA), радиоиммуноанализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализ, ферментный иммуноанализ (EIA), иммуноферментный анализ (ELISA), анализ на гранулах на основе люминесценции, анализ на основе магнитных гранул, анализ на основе белковых микрочипов, форматы экспресс-методов тестирования или анализ на основе криптатов редкоземельных металлов. Кроме того, могут использоваться анализы, пригодные для тестирования в местах оказания медицинской помощи, и форматы экспресс-методов тестирования, такие как, например, тесты с иммунохроматографическими полосками.
В некоторых аспектах изобретения способ представляет собой способ диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъекта, причем указанный способ включает
(i) получение образца субъекта;
(ii) определение уровня по меньшей мере одного гистона и/или уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта путем контактирования образца с антителом (антителами) или антигенсвязывающим фрагментом (фрагментами) или его производным(-и), специфичными к эпитопу указанного по меньшей мере одного гистона и/или указанного proADM и обнаружение связывания между этим антителом (антителами) или его антигенсвязывающим фрагментом (фрагментами) или его производным(-и) и указанным по меньшей мере одним гистоном и/или указанным proADM; и
(iii) при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона и/или указанный уровень проадреномедуллина (proADM) свидетельствует об указанной органной дисфункции.
В определенных аспектах изобретения способ представляет собой иммуноанализ, включающий стадии:
a) контактирования образца с
(i) первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или его производным, специфичным к первому эпитопу гистона или proADM, и
(ii) вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или его производным, специфичным ко второму эпитопу гистона или proADM; и
b) обнаружения связывания первого и второго антител или антигенсвязывающих фрагментов или их производных с гистоном или с proADM.
Предпочтительно одно из антител может быть меченым, а другое антитело может быть связано с твердой фазой или может быть селективно связано с твердой фазой. В особенно предпочтительном аспекте анализа одно из антител помечено, в то время как другое либо связано с твердой фазой, либо может быть селективно связано с твердой фазой. Первое антитело и второе антитело могут присутствовать в диспергированном виде в жидкой реакционной смеси, причем первый компонент мечения, который является частью системы мечения на основе флуоресцентного или хемилюминесцентного ослабления или амплификации, связан с первым антителом, а второй компонент мечения указанной системы мечения связан со вторым антителом, так что после связывания обоих антител с указанным по меньшей мере одним гистоном и/или с указанным proADM, подлежащим обнаружению, генерируется измеримый сигнал, который позволяет обнаруживать полученные сэндвич-комплексы в измерительном растворе. Система мечения может содержать криптат или хелат редкоземельного элемента в сочетании с флуоресцентным или хемилюминесцентным красителем, в частности цианинового типа.
В предпочтительном варианте реализации способ выполняют в виде гетерогенного сэндвич-иммуноанализа, в котором одно из антител иммобилизовано на произвольно выбранной твердой фазе, например на стенках пробирок с покрытием (например, полистирольных пробирок; пробирок с покрытием; СТ) или пластин микротитратора, например, состоящих из полистирола, или на частицах, таких как, например, магнитные частицы, причем другое антитело имеет группу, напоминающую обнаруживаемую метку или позволяющую избирательно прикрепляться к этой метке, и которая служит для обнаружения сформированных многослойных структур. Также возможна временно задержанная или последующая иммобилизация с использованием подходящих твердых фаз.

Способ согласно настоящему изобретению может, кроме того, быть реализован как гомогенный способ, при котором сэндвич-комплексы, образованные антителом/антителами и маркером, например гистоном или proADM или их фрагментом, который должен быть обнаружен, остаются суспендированными в жидкой фазе. В этом случае предпочтительно, чтобы при использовании двух антител оба антитела были помечены частями системы обнаружения, что приводит к генерации сигнала или инициации сигнала, если оба антитела интегрированы в один сэндвич. Такие методики должны быть реализованы, в частности, как способы усиления флуоресценции или обнаружения гашения флуоресценции. Особенно предпочтительный аспект относится к применению детектирующих реагентов, которые должны использоваться попарно, таких как, например, описанные в заявках на патент US 4882733 A, EP-B1 0 180 492 или EP-B1 0 539 477 и известный уровень техники, цитируемый в этих заявках. Таким образом, становятся возможными измерения, при которых обнаруживаются только продукты реакции, включающие оба метящих компонента в одном иммунном комплексе непосредственно в реакционной смеси. Например, идеи вышеупомянутых заявок реализлваны в таких технологиях, как предлагаемые под торговыми марками TRACE (Time Resolved Amplified Cryptate Emission - усиленное излучение криптата с временным разрешением) или KRYPTOR. Поэтому в конкретных предпочтительных аспектах для реализации предложенного в настоящей заявке способа используют устройство обнаружения. Например, определяют уровень гистона или proADM или их фрагмента и/или уровень любого другого маркера предлагаемого в настоящей заявке способа. В особенно предпочтительных аспектах таким устройством обнаружения является KRYPTOR.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(-ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа (эпитопов) по меньшей мере одного гистона. и/или proADM. В качестве примера, ниже и выше в настоящей заявке описаны иллюстративные пептиды, которые могут быть пригодными для определения уровня proADM и/или данного по меньшей мере одного гистона.
Например, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(-ы) или их производное (производные), специфичные для эпитопа(-ов) гистона H4, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона Н4, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 22-102 из SEQ ID NO: 1.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, специфичные для эпитопа гистона H4, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 46-56 из SEQ ID NO: 1, и второго антитела, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, специфичные для эпитопа гистона Н4, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 67-78 из SEQ ID NO: 1.
Например, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(ов) гистона H2B, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2B, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 из SEQ ID NO: 4.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению предпочтительно можно использовать первое антитело и/или второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент(ы) или его производное (производные), специфичные для эпитопа(ов) гистона H2A, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2A, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 из SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(ов) гистона Н2А, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона H2A, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53, с 20 по 118 или со 120 по 129 из SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(ов) гистона H3, причем первый эпитоп и/или второй эпитоп представляют собой эпитопы гистона Н3, присутствующие в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 из SEQ ID NO: 3.
Более предпочтительно в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(ов) гистона Н4, причем эпитоп(ы) выбран/выбран из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 22 по 30 из SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 56 из SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 из SEQ ID NO: 1, остатки с 92 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 34 из SEQ ID NO: 1 и остатки с 46 по 102 из SEQ ID NO: 1.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(ов) гистона Н2А, причем эпитоп(-ы) выбран/выбран из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 21 по 53 из SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 из SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 из SEQ ID NO: 2 и остатки от 120 до 129 из SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(ов) гистона H2B, охватывающего остатки от 41 до 69 из SEQ ID NO: 4.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или их антигенсвязывающий фрагмент(ы) или производное (производные), специфичные для эпитопа(ов) гистона H3, охватывающего остатки от 27 до 37 из SEQ ID NO: 3 и/или остатки от 52 до 62 из SEQ ID NO: 3.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело и/или второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2A, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53, и/или от 120 до 129 последовательности гистона H2A, представленной SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона Н4, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 из SEQ ID NO: 1, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H2A, H2B или предпочтительно H3.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2B, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 из SEQ ID NO: 4, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H2A, H4 или H3.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2B, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 из SEQ ID NO: 2, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H2B, H4 или H3.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или его производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2B, присутствующего последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 из SEQ ID NO: 3, и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H2B, H4 или H2A.
Кроме того, в способах иммуноанализа по настоящему изобретению можно использовать первое антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа гистона H2A, присутствующего в последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 21 по 53, с 120 по 129 или с 20 по 118 из SEQ ID NO: 2 и второе антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или производное, которые специфичны для эпитопа свободного гистона H3, H4 или предпочтительно H2B.
Изобретение также относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту или его производному, которые специфичны для эпитопа белка гистона или его фрагмента, как подробно описано выше.
Иллюстративные антитела, которые успешно применяются для обнаружения гистонов или proADM, предпочтительно MR-proADM, показаны в прилагаемых примерах. Таким образом, настоящее изобретение относится к антителу(-ам), его антигенсвязывающему фрагменту(-ам) или его производному (производным), специфичным для эпитопа гистона H2B, H4, H2A, H3 и/или proADM, предпочтительно MR-proADM. Иллюстративные эпитопы или пептиды, с которыми специфически связываются эти антитела, документально подтверждены в данной заявке выше и ниже.
Уровень маркера, например данного по меньшей мере одного гистона и/или proADM также можно определить с помощью масс-спектрометрического (МС) анализа, как описано в приложенных примерах. Такой способ может включать обнаружение присутствия, количества или концентрации одного или нескольких модифицированных или немодифицированных фрагментов пептидов, например, proADM и/или гистона в указанном биологическом образце или лизате белка (например, триптическом лизате) из указанного образца и, возможно, разделение образца хроматографическими методами и исследование подготовленного и необязательно разделенного образца МС-анализом. Например, в анализе МС можно использовать масс-спектрометрию с контролем селективных реакций (SRM), контролем множественных реакций (MRM) или контролем параллельных реакций (PRM), в частности, для определения количества по меньшей мере одного пептида гистона. В настоящей заявке термин "масс-спектрометрия" или "МС" относится к аналитическому методу, позволяющему идентифицировать соединения по их массе. Чтобы улучшить возможности масс-спектрометрии по разрешению и определению массы, перед анализом МС образцы могут быть подготовлены. Соответственно, изобретение относится к способам обнаружения МС, которые можно комбинировать с технологиями иммунообогащения, способами, связанными с подготовкой образца и/или хроматографическими методами, предпочтительно с жидкостной хроматографией (ЖХ), более предпочтительно с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) или ультра высокоэффективной жидкостной хроматографией (УВЭЖХ). Способы подготовки образца включают способы лизиса, фракционирования, расщепления образца на пептиды, истощения, обогащения, диализа, обессоливания, алкилирования и/или восстановления пептидов. Однако эти шаги не являются обязательными. Селективное обнаружение ионов аналита можно проводить с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Тандемная масс-спектрометрия характеризуется стадией отбора по массе (в настоящей заявке термин "отбор по массе" обозначает выделение ионов, имеющих определенное m/z или узкий диапазон m/z), с последующей фрагментацией отобранных ионов и массовым анализом полученного продукта (фрагмента) ионов.
Специалист знает, как количественно определить уровень маркера в образце масс-спектрометрическими методами. Например, можно использовать относительное количественное определение "rSRM" или абсолютное количественное определение, как описано выше.
Используемый в настоящей заявке термин "диагностика" в контексте настоящего изобретения относится к распознаванию и (раннему) обнаружению органной дисфункции и/или органной недостаточности у субъекта и может также включать дифференциальную диагностику. Также термин "диагностика" может охватывать оценку тяжести органной дисфункции. Например, оценку того, от какого числа органных дисфункций и/или органных недостаточностей может страдать субъект.
"Прогнозирование" относится к предсказанию исхода или специфического риска для субъекта страдать от органной дисфункции и/или органной недостаточности. Это может также включать оценку вероятности выздоровления или вероятности неблагоприятного исхода для указанного субъекта.
Способы по изобретению также могут быть использованы для мониторинга. "Мониторинг" относится к отслеживанию уже диагностированной органной дисфункции и/или органной недостаточности, заболевания, расстройства, осложнения или риска, например, с целью проанализировать прогрессирование заболевания или влияние конкретного лечения на прогрессирование органной дисфункции и/или органной недостаточности, заболевания или расстройства.
Термин "контроль терапии" в контексте настоящего изобретения относится к мониторингу и/или корректировке терапевтического лечения субъекта.
В настоящем изобретении термины "оценка риска" и "стратификация риска" относятся к группированию субъектов в различные группы риска в соответствии с их дальнейшим прогнозом. Оценка риска также относится к стратификации для применения профилактических и/или терапевтических мер.
Используемый в настоящей заявке термин "руководство по терапии" относится к применению определенных методов лечения или медицинских вмешательств на основании величины одного или нескольких биомаркеров и/или клинических параметров, и/или клинических оценок.
Изобретение, кроме того, относится к наборам, применению этих наборов и способам, в которых используются такие наборы. Изобретение относится к наборам для реализации описанных в настоящей заявке выше и ниже способов. Приведенные в настоящей заявке определения, например приведенные в связи с этими способами, также применимы к наборам по изобретению. В частности, изобретение относится к наборам для диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъекта, причем указанный набор содержит
(i) реагенты для определения указанного уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта и/или
контрольные данные, включающие контрольный уровень по меньшей мере одного гистона, причем повышенный уровень этого по меньшей мере одного гистона в образце по сравнению с указанным контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта; и/или
(ii) реагенты обнаружения для определения указанного уровня proADM в указанном образце и/или контрольные данные, включающие контрольный уровень proADM, причем повышенный уровень proADM в образце по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта.
Изобретение также относится к набору и его применению для диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъекта,
(i) причем в образце от указанного субъекта определяют уровень по меньшей мере одного гистона, при этом уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона, и
причем органную дисфункцию определяют на основании сравнения уровня по меньшей мере одного гистона, определенного в указанном образце, с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона; и/или
(ii) причем уровень proADM определяют в указанном образце от указанного субъекта, причем уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM, и причем органную дисфункцию определяют на основании сравнения указанного уровня proADM, определенного в указанном образце, с контрольным уровнем proADM.
Изобретение также относится к набору и его применению для диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъект,
(i) причем указанный набор включает реагенты для обнаружения для определения уровня, по меньшей мере, одного гистона, и
причем уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта; и/или
(ii) причем указанный набор включает реагенты для обнаружения для определения уровня proADM в образце субъекта, и
при этом уровень proADM свидетельствует об органной дисфункции у субъекта.
Используемый в настоящей заявке термин "контрольные данные" включают контрольный уровень (уровни) по меньшей мере одного гистона и/или proADM, в частности MR-proADM. Уровни этого по меньшей мере одного гистона и/или proADM в образце субъекта можно сравнивать с контрольными уровнями, содержащимися в контрольных данных набора. Повышенный уровень определяемого маркера (маркеров) свидетельствует о органной дисфункции. Контрольные уровни описаны в настоящей заявке выше и приведены также в прилагаемых примерах. Контрольные данные также могут включать контрольный образец, с которым сравнивают уровень этого по меньшей мере одного гистона и/или уровень proADM. Контрольные данные также могут включать в себя инструкцию по применению данных наборов по изобретению.
Используемый в настоящей заявке термин "реагент для обнаружения" или подобное выражение обозначает реагенты, которые пригодны для определения описанного в настоящей заявке маркера(ов), например, данного по меньшей мере одного гистона и/или proADM. Такими иллюстративными реагентами для обнаружения являются, например, лиганды, например, антитела или их фрагменты, которые специфически связываются с пептидом или эпитопами описанного в настоящей заявке маркера(ов). Такие лиганды могут быть использованы в иммуноанализах, как описано выше. В набор также могут быть включены дополнительные реагенты, которые используются в иммуноанализах для определения уровня маркера(ов), и в настоящей заявке рассматриваются в качестве реагентов для обнаружения. Реагенты для обнаружения также могут относиться к реагентам, которые используются для обнаружения маркеров или их фрагментов методами на основе МС. Таким образом, таким реагентом для обнаружения также могут быть реагенты, например ферменты, химические вещества, буферы и т. д., которые используются для подготовки образца для анализа МС. Масс-спектрометр также можно рассматривать как реагент для обнаружения. Реагенты для обнаружения согласно изобретению также могут представлять собой калибровочный раствор(-ы), например те, которые могут быть использованы для определения и сравнения уровня маркера(-ов).
Данные определения и пояснения также применимы с соответствующими изменениями к следующим пунктам. Настоящее изобретение также относится к следующим объектам в определенных вариантах реализации.
1. Способ диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у субъекта, причем указанный способ включает
(i) определение уровня по меньшей мере одного гистона в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об органной дисфункции; и/или
(ii) определение уровня проадреномедуллина (proADM) в образце от указанного субъекта, причем указанный уровень proADM свидетельствует об органной дисфункции.
2. Способ по абзацу 1, отличающийся тем, что
(i1) указанный уровень по меньшей мере одного гистона сравнивают с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона; и/или
(ii1) указанный уровень proADM сравнивают с контрольным уровнем proADM; и
(iii) при этом у указанного субъекта выявляют органную дисфункцию на основании сравнения на этапе (i1) и/или (ii1) соответственно.
3. Способ по абзацу 1 или 2, отличающийся тем, что
(i) повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта; и/или
(ii) повышение уровня proADM по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта.
4. Способ по любому из абзацев 1-3, отличающийся тем, что повышение уровня по меньшей мере одного гистона по сравнению с контрольным уровнем этого по меньшей мере одного гистона свидетельствует по меньшей мере о четырех органных дисфункциях у указанного субъекта.
5. Способ по любому из абзацев 1-3, отличающийся тем, что повышение уровня proADM указанного субъекта по сравнению с указанным контрольным уровнем proADM свидетельствует по меньшей мере об одной органной дисфункции.
6. Способ по любому из абзацев 2-5, отличающийся тем, что контрольный уровень по меньшей мере одного гистона и/или контрольный уровень proADM представляет собой уровень по меньшей мере одного гистона и/или proADM, в зависимости от обстоятельств, от по меньшей мере одного контрольного субъекта, и при этом предпочтительно, каждый из указанных по меньшей мере одного контрольного субъекта является здоровым, или предпочтительно, когда указанный контрольный субъект не имеет органной дисфункции или органной недостаточности.
7. Способ по любому из абзацев 1-6, отличающийся тем, что указанный proADM представляет собой среднерегиональный проадреномедуллин (MR-proADM).
8. Способ по любому из абзацев 1-7 отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, гистон H2A, гистон H3 и/или гистон H4.
9. Способ по любому одному из абзацев 1-8, при котором указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B.
10. Способ по любому из абзацев 1-9, отличающийся тем, что указанный контрольный уровень по меньшей мере одного гистона составляет от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, и/или указанный контрольный уровень proADM составляет приблизительно 6 нмоль/л.
11. Способ по любому из абзацев 1-10, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает определение по меньшей мере одного маркера в указанном образце, выбранного из группы, состоящей из уровня альдолазы В, уровня копептина, уровня лактата, уровня прокальцитонина (POT), уровень гепарин-связывающего белка (HBP) и уровня растворимой fms-подобной тирозинкиназы-1 (sFlt-1) и/или определение по меньшей мере одного параметра указанного субъекта, выбранного из группы, состоящей из балла Системы оценки острых функциональных и хронических изменений в состоянии здоровья II (APACHE II), балла Шкалы динамической оценки выраженности органной недостаточности (SOFA) и балла Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств II (SAPSII).
12. Способ по любому из абзацев 1-11, отличающийся тем, что указанный способ содержит определение
(i) уровня гистона H2B в указанном образце и оценки SOFA указанного субъекта,
(ii) уровня гистона Н4 в указанном образце и оценки SOFA указанного субъекта,
(iii) уровня гистона H2A в указанном образце и оценки SOFA указанного субъекта,
(iv) уровня гистона H2A в указанном образце и оценки SAPSII указанного субъекта,
(v) уровня гистона Н4 в указанном образце и оценки SAPSII указанного субъекта,
(vi) уровня гистона H2B в указанном образце и оценки SAPSII указанного субъекта,
(vii) уровня proADM в указанном образце и указанного уровня альдолазы B в указанном образце,
(viii) уровня proADM в указанном образце и указанного уровня гистона H2B в указанном образце и/или
(ix) уровня proADM в указанном образце и указанного уровня гистона H2A в указанном образце.
13. Способ по любому из абзацев 1-12, отличающийся тем, что указанная органная дисфункция представляет собой по меньшей мере одну органную дисфункцию, выбранную из группы, состоящей из циркуляторного шока, гематологической недостаточности, печеночной недостаточности, неврологической недостаточности, почечной недостаточности, дыхательной недостаточности и метаболического ацидоза.
14. Способ по любому из абзацев 1-13, отличающийся тем, что указанная органная дисфункция представляет собой органную недостаточность или по меньшей мере одну органную недостаточность.
15. Способ по любому из абзацев 1-14, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от заболевания или медицинского состояния.
16. Способ по любому одному из абзацев 1-15, отличающийся тем, что указанный субъект является пациентом в критическом состоянии, предпочтительно, когда указанный субъект помещен в отделение интенсивной терапии.
17. Способ по любому из абзацев 1-16, отличающийся тем, что указанный субъект страдает от заболевания или медицинского состояния и при этом указанное заболевание или медицинское состояние выбрано из группы, состоящей из сердечнососудистого заболевания, сахарного диабета, злокачественного новообразования, респираторного заболевания, заболевания печени, иммунодепрессии, почечной недостаточности, воспалительного ответа, связанного с инфекционной и неинфекционной этиологией, синдрома системного воспалительного ответа (SIRS), сепсиса, тяжелого сепсиса и/или септического шока.
18. Способ по любому из абзацев 1-17, отличающийся тем, что указанный образец представляет собой жидкость организма, кровь, плазму крови, сыворотку крови или мочу.
19. Способ по любому из абзацев 1-18, отличающийся тем, что указанный уровень по меньшей мере одного гистона и/или proADM определяют с применением метода, выбранного из группы, состоящей из масс-спектрометрии (МС), люминесцентного иммуноанализа (LIA), радиоиммуноанализа (RIA), хемилюминесцентного и флуоресцентного иммуноанализа, ферментного иммуноанализа (EIA), иммуноферментного анализа (ELISA), анализа на гранулах на основе люминесценции, анализана основе магнитных гранул, анализа на основе белковых микрочипов, форматов экспресс-методов тестирования или анализа на основе криптатов редкоземельных металлов.
20. Способ по абзацу 19, отличающийся тем, что указанный способ представляет собой иммуноанализ, и при этом анализ проводят в гомогенной фазе или в гетерогенной фазе.
21. Способ по абзацу 19, отличающийся тем, что указанный способ представляет собой иммуноанализ, включающий стадии:
a) контактирования образца с
(i) первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или его производным, специфичным к первому эпитопу гистона или proADM, и
(ii) вторым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или его производным, специфичным ко второму эпитопу гистона или proADM; и
b) обнаружение связывания первого и второго антител или антигенсвязывающих фрагментов или их производных с гистоном или с proADM.
22. Способ по абзацу 21, отличающийся тем, что одно из первого или второго антитела является меченым, а другое антитело связано или способно селективно связываться с твердой фазой.
23. Способ по абзацу 21 или 22, отличающийся тем, что первое антитело и второе антитело присутствуют в диспергированном виде в жидкой реакционной смеси, причем первый компонент мечения, который является частью системы мечения на основе флуоресцентного или хемилюминесцентного ослабления или амплификации, связан с первым антителом, а второй компонент мечения указанной системы мечения связан со вторым антителом, так что после связывания обоих антител с указанным по меньшей мере одним гистоном и/или с указанным proADM, подлежащим обнаружению, генерируется измеримый сигнал, который позволяет обнаруживать полученные сэндвич-комплексы в измерительном растворе.
24. Способ по абзацу 23, отличающийся тем, что система мечения содержит криптат или хелат редкоземельного элемента в сочетании с флуоресцентным или хемилюминесцентным красителем, в частности цианинового типа.
25. Способ по абзацу 19, отличающийся тем, что метод анализа МС представляет собой контроль селективных реакций (SRM), контроль множественных реакций (MRM) или контроль параллельных реакций (PRM).
26. Способ по любому из абзацев 1-25, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и причем определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 22 по 102 гистона H4 в соответствии с SEQ ID NO: 1.
27. Способ по любому из абзацев 1-26, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки 47-59 из SEQ ID NO: 1, остатки с 68 по 79 из SEQ ID NO: 1, остатки с 60 по 67 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 30 из SEQ ID NO: 1, остатки с 67 по 78 из SEQ ID NO: 1, остатки с 92 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 22 по 34 из SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 102 из SEQ ID NO: 1, остатки с 46 по 55 из SEQ ID NO: 1, остатки с 80 по 91 из SEQ ID NO: 1, остатки с 24 по 35 SEQ ID NO: 1 и остатки с 68 по 77 SEQ ID NO: 1.
28. Способ по любому из абзацев 1-27, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 20 по 118 гистона H2A в соответствии с SEQ ID NO: 2.
29. Способ по любому из абзацев 1-28, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, выбранной из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, охватывающей остатки с 21 по 53 из SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 из SEQ ID NO: 2, остатки с 30 по 53 из SEQ ID NO: 2, остатки со 120 по 129 из SEQ ID NO: 2, остатки с 21 по 29 из SEQ ID NO: 2, остатки с 82 по 88 из SEQ ID NO: 2, остатки с 89 по 95 из SEQ ID NO: 2 и остатки с 100 по 118 из SEQ ID NO: 2.
30. Способ по любому из абзацев 1-29, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3, и при этом определяют по меньшей мере один пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 62 гистона H3 в соответствии с SEQ ID NO: 3.
31. Способ по любому одному из абзацев 1-30, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H3 и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 27 по 37 из SEQ ID NO: 3 и/или последовательности, охватывающей аминокислотные остатки с 52 по 62 из SEQ ID NO: 3.
32. Способ по любому одному из абзацев 1-31, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2B, и при этом определяют по меньшей мере пептид последовательности, охватывающей аминокислотные остатки 41-69 гистона H2B в соответствии с SEQ ID NO: 4.
33. Способ по любому из абзацев 1-32, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H2A и при этом определяют по меньшей мере пептид или его фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, 8, 9 и 10.
34. Способ по любому из абзацев 1-33, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один гистон представляет собой гистон H4 и при этом определяют по меньшей мере один пептид или его фрагмент выбран из группы, состоящей из SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 и 16.
35. Набор для реализации способа по любому из абзацев 1-34, причем указанный набор содержит
(i) реагенты для определения уровня по меньшей мере одного гистона в указанном образце и
контрольные данные, включая контрольный уровень по меньшей мере одного гистона, и при этом повышение уровня по меньшей мере одного гистона в указанном образце по сравнению с контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта; и/или
(ii) реагенты для определения указанного уровня proADM в указанном образце и контрольные данные, включая контрольный уровень proADM, и
при этом повышение уровня proADM в указанном образце по сравнению с контрольным уровнем proADM свидетельствует об органной дисфункции у указанного субъекта.
36. Применение набора согласно абзацу 35 в способе по любому из абзацев 1-35.
31. Применение набора согласно абзацу 30 для диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у указанного субъекта,
(i) причем определяют указанный уровень по меньшей мере одного гистона в указанном образце от указанного субъекта,
причем указанный уровень указанного по меньшей мере одного гистона сравнивают с указанным контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона, и
причем указанную органную дисфункцию выявляют на основании сравнения указанного уровня по меньшей мере одного гистона, определенного в указанном образце с указанным контрольным уровнем по меньшей мере одного гистона; и/или
(ii) причем определяют указанный уровень proADM в указанном образце от указанного субъекта, причем указанный уровень proADM сравнивают с указанным контрольным уровнем proADM, и при этом указанную органную дисфункцию выявляют на основании сравнения указанного уровня proADM, определенного в указанном образце с указанным контрольным уровнем proADM.
32. Применение набора для диагностики, прогнозирования, оценки риска, стратификации риска, мониторинга, руководства по терапии и/или контроля терапии органной дисфункции у указанного субъекта,
(i) причем указанный набор содержит реагенты для определения уровня по меньшей мере одного гистона, и при этом указанный уровень по меньшей мере одного гистона свидетельствует об указанной органной дисфункции; и/или
(ii) причем указанный набор содержит реагенты для определения уровня proADM в образце субъекта и
при этом указанный уровень указанного proADM свидетельствует об указанной органной дисфункции.
Используемые в настоящей заявке термины "содержащий" и "включающий" или их грамматические варианты следует понимать как детализирующие по меньшей мере перечисленные признаки, целые числа, этапы или компоненты, но не исключающие добавления одного или нескольких дополнительных признаков, целых чисел, этапов, компонентов или их групп. Этот термин включает в себя термины "состоящий из" и "состоящий по существу из", которые, как подразумевается, определяют только конкретно перечисленные признаки, целые числа, этапы или компоненты, исключая любые дополнительные признаки.
Таким образом, термины "содержащий"/"включающий"/"имеющий" означают, что может присутствовать также любой дополнительный компонент (или, аналогично, признаки, целые числа, этапы и тому подобное).
Термин "состоящий из" означает, что никаких дополнительных компонентов (или, аналогично, признаков, целых чисел, шагов и тому подобного) не имеется.
Термин "состоящий по существу из" или его грамматические варианты при использовании в данном документе следует понимать как детализирующий перечисленные признаки, целые числа, этапы или компоненты, но не исключающий добавления одного или нескольких дополнительных признаков, целых чисел, этапов, компонентов или их групп, но только если эти дополнительные признаки, целые числа, этапы, компоненты или их группы существенно не изменяют основные и новые характеристики заявленной композиции, устройства или способа.
Таким образом, термин "состоящий по существу из" означает, что могут присутствовать конкретные дополнительные компоненты (или аналогичные признаки, целые числа, этапы и тому подобное), а именно те, которые не оказывают существенного влияния на основные характеристики композиции, устройства или способа. Другими словами, термин "состоящий по существу из" (который может использоваться в настоящей заявке взаимозаменяемо с термином "содержащий по существу"), допускает присутствие других компонентов в композиции, устройстве или способе в дополнение к обязательным компонентам (или, аналогично, признакам, целым числам, этапам и т.п.), при условии, что наличие других компонентов не оказывает существенного влияния на основные характеристики устройства или способа.
Термин "способ" относится к приемам, средствам, методам и процедурам для выполнения данной задачи, включая, помимо прочего, приемы, средства, методики и процедуры, известные или без труда разрабатываемые на основе известных приемов, средств, методов и процедур специалистами-практиками из химической, биологической и биофизической областей техники.
Термин "приблизительно" предпочтительно обозначает ±10% указанного числового значения, более предпочтительно ±5% указанного числового значения и, в частности, точное указанное числовое значение.
Используемый в настоящей заявке термин "приблизительно" обозначает ±10% указанного числового значения и, в частности, ±5% указанного числового значения. Всякий раз, когда используется термин "приблизительно", также конкретно указывается точное числовое значение. Если термин "приблизительно" используется в связи с параметром, который количественно определяется в целых числах, таким как число нуклеотидов в данной нуклеиновой кислоте, числа, соответствующие ±10% или ±5% от указанного числового значения, должны округляться до ближайшего целого числа. Например, выражение "приблизительно 25 аминокислот" относится к диапазону от 23 до 28 аминокислот, в частности к диапазону от 24 до 26 аминокислот, и предпочтительно относится к конкретному значению 25 аминокислот.
Чувствительность и специфичность диагностического и/или прогностического теста зависит не только от аналитического "качества" теста. Чувствительность и специфичность также зависят от определения того, что считается аномальным результатом. На практике кривые операционных характеристик приемника (кривые ROC) обычно рассчитывают путем построения графика зависимости значения переменной от ее относительной частоты в "нормальных" (то есть у, очевидно, здоровых лиц, не имеющих пренатальных расстройств или состояний) и в "больных" популяциях, например, у субъектов, имеющих одну или несколько органных дисфункций или недостаточностей. Для любого конкретного маркера (например, MR-proADM) распределение уровней маркеров для субъектов с заболеванием/состоянием или без него, вероятно, будет перекрываться. В таких условиях тест не позволяет абсолютно точно отличить норму от заболевания со 100% точностью, и область перекрытия может указывать, где этот тест не способен отличить норму от заболевания. Выбирается пороговое значение, ниже которого результат теста считается анормальным, и выше которого результат теста считается нормальным, или ниже или выше которого тест указывает на особое состояние, например, органную дисфункцию. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что выполняемое измерение позволит правильно распознать состояние. Кривые ROC могут применяться, даже если результаты тестов не обязательно дают точные цифры. При условии, что можно ранжировать результаты, можно построить кривую ROC. Например, результаты теста на образцах "больных" могут быть ранжированы в соответствии со степенью (например, 1 = низкая, 2 = нормальная и 3 = высокая). Это ранжирование может быть сопоставлено с результатами в "нормальной" популяции, и построена кривая ROC. Эти методы хорошо известны в данной области; см., например, Hanley et al. 1982. Radiology 143: 29-36. Предпочтительно, пороговое значение выбирают так, чтобы получить площадь кривой ROC более приблизительно 0,5, более предпочтительно более приблизительно 0,7, еще более предпочтительно более приблизительно 0,8, еще более предпочтительно более приблизительно 0,85 и наиболее предпочтительно более приблизительно 0,9. Термин "приблизительно" в данном контексте означает +/-5% данного измерения.
По горизонтальной оси кривой ROC откладываются значение (1-специфичность), которое увеличивается с частотой ложноположительных результатов. По вертикальной оси кривой откладываются чувствительность, которая увеличивается со скоростью с частотой истинных положительных результатов. Таким образом, для конкретного выбранного отсечения может быть определено значение (1-специфичность) и может быть получена соответствующая чувствительность. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что измеренный уровень маркера позволит правильно распознать заболевание или состояние. Таким образом, площадь под кривой ROC может использоваться для определения эффективности теста.
В других вариантах в качестве меры способности теста прогнозировать риск или диагностировать расстройство или состояние ("больная группа") используют отношение правдоподобия положительного результата, отношение правдоподобия отрицательного результата, отношение шансов или отношение рисков. В случае отношения правдоподобия положительного результата значение 1 указывает, что положительный результат одинаково вероятен среди субъектов как в "больных", так и в "контрольных" группах; значение больше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в больной группе; а значение меньше 1 указывает, что положительный результат более вероятен в контрольной группе. В случае отношения правдоподобия отрицательного результата значение 1 указывает, что отрицательный результат одинаково вероятен среди субъектов как в "больных", так и в "контрольных" группах; значение больше 1 указывает на то, что отрицательный результат более вероятен в тестируемой группе; а значение меньше 1 указывает на то, что отрицательный результат более вероятен в контрольной группе.
В случае отношения шансов, значение 1 указывает, что положительный результат одинаково вероятен среди субъектов как в "больных", так и в "контрольных" группах; значение больше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в больной группе; а значение меньше 1 указывает на то, что положительный результат более вероятен в контрольной группе.
В случае отношения рисков, значение 1 указывает, что относительный риск конечной точки (например, смерти) одинаков как в "больной", так и в "контрольной" группах; значение больше 1 указывает, что риск выше в больной группе; а значение меньше 1 указывает, что риск выше в контрольной группе.
Специалист в данной области поймет, что сопоставление диагностического или прогностического показателя с диагнозом или с прогностическим риском будущего клинического исхода является статистическим анализом. Например, уровень маркера ниже, чем X, может сигнализировать о том, что пациент с большей вероятностью будет страдать от неблагоприятного исхода, чем пациенты с уровнем, превышающим или равным X, что определяется уровнем статистической значимости. Кроме того, изменение концентрации маркера по сравнению с исходными уровнями может отражать прогноз пациента, а степень изменения уровня маркера может быть связана с тяжестью неблагоприятных событий. Статистическую значимость часто определяют путем сравнения двух или более популяций и определения доверительного интервала и/или p-значения; см, например, Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York, 1983. Предпочтительные доверительные интервалы по изобретению составляют 90%, 95%, 97,5%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% и 99,99%, а предпочтительные p-значения составляют 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01,0,005, 0,001, и 0,0001.
Если не указано иное, установленные методы рекомбинантной генной технологии использовали, как описано, например, в монографии Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001), которая включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте.
Настоящее изобретение далее описано ссылкой на следующие неограничивающие фигуры и примеры.
Описание фигуры
Фигура 1: Распределение уровней маркеров и клинических оценок по числу органных недостаточностей (OF).
Коробчатые диаграммы иллюстрируют уровень маркеров (гистон H2A (A); гистон H2B (B); гистон H3 (C); гистон H4 (D) и MR-proADM (E)) или иллюстрируют оценку ((F): шкала SOFA) для каждой группы, представленной числом органных недостаточностей. Количество пациентов в каждой группе указано в скобках (n).
Пример 1
СПОСОБЫ
Исследуемая популяция
Двести тридцать семь пациентов в критическом состоянии, поступивших в отделение интенсивной терапии (ОИТ) Университетского больничного центра (CHU) Дижона Бургундии с 1 июня 2013 года по 14 июня 2014 года, были последовательно включены в клиническое исследование. Пациенты моложе 18 лет были исключены. Исследование было одобрено местным экспертным советом организации. До включения было получено письменное информированное согласие от самих пациентов или от их ближайших родственников. Все пациенты имели широкий спектр заболеваний, включая сердечнососудистые заболевания, сахарный диабет, злокачественные новообразования, респираторные заболевания, заболевания печени, почек и иммунодепрессию, и находились под наблюдением до выписки или смерти в больнице. На основании ретроспективного обзора медицинских карт, результатов визуализации и микробиологии два независимых врача классифицировали пациентов в день поступления как не имеющих сепсиса (синдром системного воспалительного ответа (SIRS) или не имеющих SIRS, с тяжелым сепсисом или септическим шоком в соответствии с международными стандартизированными критериями (Bone, Balk et al. 1992). Образец крови брали в день поступления, то есть в течение первых 24 часов. Регистрировали исходные демографические и клинические данные, включая историю болезни, результаты физикального осмотра, рутинный анализ крови (например, посев крови), нелабораторные диагностические исследования (например, критерии SIRS, критерии органной недостаточности (OF)), терапевтические вмешательства (например, искусственная вентиляция легких (MV), вазопрессоры и заместительную почечную терапию (RRT)), а также параметры исхода (например, продолжительность пребывания, смертность от всех причин). При поступлении рассчитывали балл Динамической оценки выраженности органной недостаточности (SOFA), основанной на шести параметрах органов, и балл Упрощенной шкалы оценки острых физиологических расстройств (SAPS II), основанной на 17 преимущественно физиологических переменных (Le Gall, Lemeshow et al. 1993; Vincent, Moreno et al. 1996).
3
-
2
2
3
При поступлении регистрировали семь типов острой органной недостаточности, например, циркуляторный шок (i), гематологическую недостаточность (ii), печеночную недостаточность (iii), неврологическую недостаточность (iv), почечную недостаточность (v), а также дыхательную недостаточность (vi) и метаболический ацидоз (vii). Критерии для каждой отдельной органной недостаточности применяли следующим образом. Например, циркуляторный шок был определен как систолическое артериальное давление ниже 90 мм рт.ст. с признаками периферической гипоперфузии или необходимостью постоянной инфузии вазопрессорных или инотропных средств. Гематологическая недостаточность определялась как тромбоцитемия ниже 100000/мм. Печеночная недостаточность определялась как билирубинемия, превышающая 2 мг/дл, и/или уровень ферментов аспартата или аланина трансаминазы, превышающий 500 международных единиц на литр. Неврологическая недостаточность определялась как оценка по шкале комы Глазго ниже 13. Почечная недостаточность определялась как выделение мочи менее 0,5 мл/кг/час в течение не менее 3 часов и/или повышение креатинемии более чем на 50% по сравнению с предыдущими значениями. Дыхательная недостаточность определялась как отношение парциального давления артериального кислорода к фракции вдыхаемого кислорода (PaO/FiO) ниже 300 мм рт.ст., независимо от выбранной респираторной поддержки. Метаболический ацидоз определяли как уровни лактата ниже 2,5 ммоль/л, как эксцесс оснований (базовый уровень ниже -2 мэквивалент/л) или уровни бикарбоната (HCO) ниже 18 ммоль/л.
Биомаркеры
Уровни MR-proADM (среднерегиональный проадреномедуллин), копептина и PCT (прокальцитонин) определяли в образцах плазмы с использованием сверхчувствительных анализов, таких как разработанные для использования с анализатором произвольного доступа KRYPTOR (Thermo Scientific B.R.A.H.M.S). Уровни гистона H2A, H2B, H3 и H4, а также уровень альдолазы B определяли в образцах плазмы, например анализы с контролем селективных реакций или с контролем множественных реакций (SRM/MRM), как описано ниже. Специфические пептиды, полученные из маркеров, измеряли с помощью технологии ЖХ/МС/МС (масс-спектрометр TSQ Quantiva (MS); ThermoFisher Scientific). Было обнаружено, что идентифицированные пептидные последовательности и их фрагментирующие ионы, так называемые "транзиции", для каждого пептида являются полезными суррогатами для мониторинга уровней маркерных белков в образце крови. Оптимизацию проводили на синтетических пептидах, которые могут быть снабжены тяжелыми метками с использованием изотопов. Выбирали лучшие пептиды по соотношению сигнал-шум. Для каждого пептида были установлены оптимальное время удерживания и по меньшей мере 4 лучших транзиции.
Иллюстративное количественное определение с помощью МС и выбор пептидов и транзиций
5 мкл каждого клинического образца плазмы добавляли к 20 мкл 8 М мочевины/2,5% н-пропанола/300 мМ Трис/10 мМ DTT, рН 8,5 и инкубировали при 37°С в течение одного часа. В каждую лунку образца добавляли 500 мМ йодоуксусной кислоты, приготовленной в 1 М бикарбонате аммония, и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение одного часа. В каждую лунку добавляли 113 мкл 50 мМ Трис/5 мМ CaCl2 рН 8,0. Трипсин (Thermo Fisher Scientific) регидратировали 150 мкл уксусной кислоты 25 мМ, добавляли в соотношении 1:10 (общее содержание белка: протеаза), и инкубировали при 37°С в течение 20 часов. Расщепление окончательно гасили добавлением 2 мкл муравьиной кислоты. Затем перед вводом добавляли глюкагон (1 нг/мкл) и стандартные тяжелые пептиды.
Анализы SRM выполняли на тройном квадрупольном масс-спектрометре TSQ Quantiva в сочетании с ВЭЖХ Ultimate 3000 (Thermo Fisher Scientific). Разделение обращенной фазы осуществляли в линейном градиенте 20 мин от 5 до 40% В с общим временем анализа 40 мин (Растворитель A: вода 0,2% FA (муравьиная кислота), Растворитель B: ACN 0,2% FA). Скорость потока во время линейного градиента была установлена равной 240 мкл/мин. Общий объем ввода составлял 160 мкл для всех образцов и точек на кривой. Колонку Accucore aQ 150 мм × 2,1 мм (ThermoFisher Scientific) эксплуатировали при температуре 50°С.
Оптимизацию выполняли на тяжелых меченых синтетических пептидах, включающих меченый 13C и 15N аргинин или лизин (ThermoFisher Scientific или New England Peptide). Отдельные параметры прибора, такие как энергия столкновения, линза тубуса и время измерения, тестировали автоматически для каждой транзиции. После нескольких итераций оптимизированный список пептидов и транзиций (то есть сигнал с наивысшей интенсивностью и наименьшее перекрытие с другими транзициями) и соответствующие времена удерживания финализировали с использованием по меньшей мере четырех транзиций фрагмента для каждого выбранного пептида.
Пептиды идентифицировали путем совместного элюирования легких и тяжелых меченых транзиций при хроматографическом разделении. Для выравнивания по времени, относительной количественной оценки транзиций и количественной оценки белка целевого использовали программное обеспечение Pinpoint (Thermo Fisher Scientific) и Skyline (MacCoss Lab).
Относительные и абсолютные количественные определения маркеров выполняли с применением иллюстративных способов, описанных ниже.
Относительная количественное определение:
1. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади пика сигнатуры SRM от данного пептида, обнаруженного в биологическом образце, с площадью того же пика сигнатуры SRM того же фрагмента пептида по меньшей мере во втором, третьем, четвертом или более биологических образцах.
2. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади пика сигнатуры SRM от данного пептида, обнаруженного в биологическом образце, с площадью пиков сигнатуры SRM, полученной от фрагментов пептидов из других белков, в других образцах, полученных от разных и отдельных биологических источников, когда сравнение площади пика сигнатуры SRM между двумя образцами пептидного фрагмента нормировано на количество белка, анализируемого в каждом образце.
3. Определение повышенного или пониженного присутствия маркера путем сравнения площади пика сигнатуры SRM для данного пептида с площадью пиков сигнатуры SRM от других фрагментов пептидов, полученных из разных белков в том же биологическом образце, с целью нормировать изменяющиеся уровни маркера на уровни других белков, которые не изменяют свои уровни экспрессии в различных клеточных условиях.
4. Эти анализы были применены как к немодифицированным фрагментным пептидам, так и к модифицированным фрагментным пептидам, например, белку гистонов, когда такие модификации включали, помимо прочего, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование, и при этом относительные уровни модифицированных пептидов определяли таким же образом, как и при определении относительных количеств немодифицированных пептидов.
Абсолютное количественное определение данного пептида:
Сравнение площади пика сигнатуры SRM/MRM для данного фрагмента пептида из маркера в отдельном биологическом образце с площадью пика сигнатуры SRM/MRM внутреннего стандарта фрагмента пептида, добавленного в известном количестве в лизат белка из биологического образца.
Внутренним стандартом была меченая синтетическая версия фрагмента пептида из исследуемого белка маркера или меченого рекомбинантного белка. Этот стандарт добавляли в образец в известных количествах до или после расщепления, и определяли площадь пика сигнатуры SRM/MRM как для внутреннего стандарта пептидного фрагмента, так и для нативного пептидного фрагмента в биологическом образце по отдельности с последующим сравнением площадей обоих пиков.
Такой анализ применяли к немодифицированным пептидным фрагментам и модифицированным пептидным фрагментам, когда модификации включали, помимо прочего, фосфорилирование и/или гликозилирование, ацетилирование, метилирование (моно-, ди-, три-), цитруллинирование, убиквитинилирование, и при этом относительные уровни модифицированных пептидов определяли таким же образом, как и при определении абсолютных уровней немодифицированных пептидов.
Уровни гистона Н4 также измеряли методами иммуноанализа. Соответственно, набор для иммуноанализа гистона H4 (H4 IA) состоит из мышиного моноклонального антитела (mAb), созданного против синтетического пептида (аминокислоты 46-56 из SEQ ID NO: 1), связанного с микросферами MagPlex-C (Luminex, Остин, Техас) и биотинилированного поликлонального антитела овцы (pAb), созданного против синтетического пептида (аминокислоты 67-78 из SEQ ID NO 1). В качестве стандартного материала использовали синтетический пептид (аминокислоты 46-102 SEQ ID NO: 1). Образцы измеряли на микросферах MAgPix с помощью системы xPonent 4.2 (Luminex, Остин, Техас). Данные анализировали с использованием 5-параметрической логистической регрессии из программы JMP-12 (статистическое программное обеспечение SAS, Великобритания).
Уровни лактата в сыворотке измеряли колориметрическим анализом с использованием модульного анализатора e501 компании Roche Diagnostics (Мейлан, Франция). Контрольный предел для лактата составлял 0,5-2,2 ммоль/л.
Статистический анализ
10
Все анализы выполняли с использованием программного обеспечения R 3.0.2. Данные выражены в виде медианного значения с межквартильным диапазоном [IQR] в скобках. Поскольку все анализируемые биомаркеры демонстрируют распределения с положительной асимметрией, перед включением значения были log-преобразованы в регрессионные модели для того, чтобы уменьшить влияние экстремальных значений на подгонку модели.
10
Значения ниже предела количественного определения (LoQ) заменяли малым значением ниже LoQ. Недостающие значения не заменяли. Каждая модель включает всех пациентов с полными данными по всем переменным в модели. Значимыми считались результаты с p-значением <0,05. Прямоугольники на коробчатых диаграммаах размаха показывают нижний и верхний квартили и медиану (жирная линия). "Усы" отображают крайние точки данных, которые не более чем в 1,5 раза превышают межквартильный диапазон (IQR) из "коробки". Все точки данных за пределами коробок отображаются как выбросы. Сравнения между группами проводят с использованием ANOVA для log-преобразованных значений биомаркеров (клинические оценки не преобразуют). Апостериорные сравнения анализируют с использованием расстояний подлинной значимости Тьюки. Для дихотомических переменных результата используют модели логистической регрессии. Отображаемые результаты представляют собой вложенный критерий отношения правдоподобия χ² (L.R. χ² и р-значение) и С-индекс (Харрел).
Иллюстративные пороговые значения оптимизируют путем максимизации индекса Юдена, который определяется как "Чувствительность + Специфичность - 1". Оптимизацию пороговых значений выполняли с использованием R-библиотеки "OptimalCutpoints".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Популяция исследования составила 237 пациентов. Двух пациентов (один пациент без SIRS, один пациент с сепсисом) пришлось исключить из анализа из-за противоречивого документирования данных о смертности. Сто семьдесят два пациента (73%) были госпитализированы с тяжелым сепсисом или септическим шоком, 15 пациентов (6%) с SIRS и 49 пациентов (21%) без SIRS. Средний возраст составлял 67 лет [59-77 лет]. Большинство пациентов составляли мужчины (60%). Наиболее частыми сопутствующими заболеваниями были сердечнососудистые заболевания (35%), сахарный диабет (31%) и злокачественные новообразования (27%), за которыми следовали респираторные заболевания (16%), заболевания печени (12%), заболевания почек (12%) и иммунодепрессия (7%). Наиболее частым местом инфекции были нижние дыхательные пути (46%) и мочевыводящие пути (45%). Оценка SAPS II (например, медиана 56 [40-69] баллов) и оценка SOFA (например, медиана 9 [6-12] баллов) при поступлении были повышены. Наблюдаемой органной недостаточностью были чаще всего дыхательная недостаточность (61%), циркуляторный шок (56%) и почечная недостаточность (41%).
Соответственно, во время пребывания в ОИТ многим пациентам потребовалась искусственная вентиляция легких (ИВ) (78%), вазопрессоры (68%) и заместительная почечная терапия (ЗПТ) (37%). Смертность от всех причин в ОИТ составила 32%, средняя продолжительность пребывания в ОИТ составила 5,4 дня [2,5-10,6 дней].
Нижеследующий анализ ограничен пациентами с органной недостаточностью, следовательно, 172 пациентами с тяжелым сепсисом и септическим шоком, как описано выше. На всех фигурах и в таблицах пациенты сгруппированы по числу острых органных недостаточностей (1,2, 3, 4, 5 или 6/7).
Различные выбранные биомаркеры и клинические оценки по-разному коррелируют с увеличением числа острых органных недостаточностей у пациента в критическом состоянии. Уровни гистонов значительно повышались у субъектов, демонстрирующих четыре или более органных недостаточностей (фигуры 1A-1D). Соответственно, существует корреляция между числом органных недостаточностей у субъекта и уровнем гистонов. Гистоны H2A, H2B, H3 и H4, а также альдолаза B уступают другим протестированным биомаркерам в дифференциации субъектов при сравнении одной, двух или трех органных недостаточностей (см. ниже). Более того, уровень MR-proADM (фигура 1E) или уровень копептина увеличивался с ростом числа органных недостаточностей (например, от 1 до 4 органных недостаточностей). Соответственно, существует корреляция между числом органных недостаточностей у субъекта и уровнем MR-proADM. Однако MR-proADM и копептин уступают в дифференциации между субъектами, имеющими множественные недостаточности, например 4, 5 или 6/7 органов по сравнению с гистонами (фигура 1E). Для других биомаркеров, таких как лактат и две клинические оценки SOFA и SAPS II, их медианный уровень для каждой соответствующей группы органных недостаточностей положительно коррелирует со всем диапазоном от 1 до 6/7 органных недостаточностей (фигура 1F).
При сравнении групп органных недостаточностей уровни PCT и копептина способны дифференцировать пациентов с низким числом органных недостаточностей со статистической значимостью, представленной р-значением <0,05, например, одна органная недостаточность в сравнении с 3 или 4 органными недостаточностями (таблица 1).
Уровни MR-proADM, лактата, оценки SAPS II и SOFA имеют самый широкий диапазон и способность различать пациентов с разным числом органных недостаточностей (Таблица 1). Гистоны H2A, H2B, H3 и H4, а также альдолаза B уступают при сравнении одной или двух органных недостаточностей с числом до 5 органных недостаточностей. Эти гистоны имеют значительную ценность в подразделении пациентов на группы трех и четырех органных недостаточностей, где другие биомаркеры, такие как копептин, лактат, MR-proADM и PCT, уступают им в эффективности (Таблица 1).
Таблица 1: Попарное групповое сравнение между числом органных недостаточностей для отдельных биомаркеров и клинических оценок.
Приведены p-значения для каждого биомаркера/оценки для сравнения 1, 2 или 3 органных недостаточностей (OF) в сравнении с 2, 3, 4, 5 или 6/7 OF, как указано (апостериорный анализ с использованием критерия Тьюки). Статистически значимые биомаркеры/оценки с p-значениями <0,05 выделены серым цветом для сравнения соответствующих групп.
Прогностическую ценность биомаркера/оценки для различения пациентов с 3 OF от пациентов с более высоким OF рассчитывали с помощью моделей логистической регрессии. Помимо клинических оценок, наилучшие прогностические результаты показали MR-proADM, лактат и гистон H2B (Таблица 2А).
Кроме того, определение еще одного маркера (дополнительного маркера) может еще больше улучшить прогнозирование органной недостаточности у субъектов (Таблица 2B). Например, оценка SOFA или оценка SAPS II улучшали прогнозирование используемых одиночных маркеров, таких как гистоны или MR-proADM. Кроме того, комбинация MR-proADM и гистонов (H2A, H2B, H3 или H4) дополнительно улучшала прогнозирование органной недостаточности по сравнению с прогнозированием этих маркеров, используемых в качестве одиночного маркера, то есть определения только, например, H2B или MR-proADM. Анализ также показал, что лучшие дополнительные маркеры к трем наиболее эффективным одиночным маркерам/оценкам (SOFA, SAPS II, MR-proADM) включают гистоны H2A, H2B, H4 и альдолазу B (таблица 2B).
Специфичность прогнозирования у пациента с ≥4 OF также наиболее высока для гистонов H2A, H2B и альдолазы B (92,39%, 88,04%, 91,30% соответственно), что сопровождается чувствительностью 45,00%, 51,25% и 45,00%, соответственно, как показано в таблице 3 для данных пороговых значений (контрольных уровней). Такие пороговые уровни отсечки или контрольные уровни были определены с помощью масс-спектрометрии. Кроме того, иллюстративные контрольные уровни гистона Н4 также определяли с помощью иммуноанализа (IA) (Таблица 4). Специфичность, а также чувствительность этих уровней, определенных с помощью иммуноанализа, были сопоставимы с контрольными уровнями, определенными с помощью масс-спектрометрии. Например, контрольный уровень 35 нг/мл показал специфичность >80% и чувствительность 53% (таблица 4). Наивысшая чувствительность достигается при использовании клинических оценок SOFA и SAPS II или копептина (87,50%, 85,00%, 78,21% соответственно) с соответствующей специфичностью 76,09%, 72,83% и 58,62% соответственно (таблица 3).
Таблица 2: Логистическая регрессия для исхода ≥4 OF для моделей одиночного биомаркера/оценки (2А), а также комбинации двух биомаркеров/оценок (2B).
2
Для каждого из перечисленных биомаркеров/оценок указаны следующие модельные характеристики: количество пациентов для анализа, количество пациентов с исходом ≥4 OF, отношение вероятности χ, а также С-индекс. Список отсортирован по соотношению правдоподобия, начиная от самого высокого до самого низкого значения. P-значение для всех моделей в этих таблицах составляет <0,001. Для двумерных моделей (Таблица 2B) с комбинацией двух биомаркеров/оценок показаны все модели с дополнением (увеличение L.R. (отношение вероятности) χ² >7) к соответствующей одномерной модели. Таблица ограничена тремя лучшими одиночными моделями из Таблицы 2А (SOFA, SAPS II и MR-proADM). Для каждого из этих маркеров/оценок три лучшие дополнительные модели выделены серым цветом.
Таблица 2A
Количество пациентов
Количество пациентов с числом OF ≥4
L.R.
С-индекс
χ²
SOFA
172
80
95,40
0,893
SAPS II
172
80
68,90
0,852
MR-proADM
172
80
46,00
0,780
Лактат
158
75
41,22
0,774
Гистон H2B
172
80
29,00
0,713
Альдолаза B
172
80
28,00
0,712
Гистон Н4
172
80
27,17
0,716
Копептин
165
78
26,88
0,719
Гистон H2A
172
80
26,70
0,710
Гистон Н3
172
80
19,90
0,689
Гистон H4(по данным IA)
165
77
21,47
0,725
PCT
171
80
15,25
0,674
Таблица 2B
Количество пациентов
Количество пациентов с числом OF ≥4
L.R.
С-индекс
χ²
SOFA+гистон H2B
172
80
110,92
0,914
SOFA+гистон H4
172
80
110,70
0,914
SOFA+гистон H2A
172
80
110,59
0,914
SOFA+альдолаза B
172
80
110,06
0,914
SOFA+гистон H3
172
80
105,19
0,906
SOFA+MR-proADM
172
80
104,04
0,906
SOFA+SAPS II
172
80
102,67
0,906
SOFA+гистон H4 (IA)
165
77
99,69
0,905
SAPS II+гистон H2A
172
80
88,93
0,881
SAPS II+гистон Н4
172
80
88,88
0,882
SAPS II+гистон H2B
172
80
87,31
0,881
SAPS II+альдолаза B
172
80
85,71
0,876
SAPS II+гистон Н3
172
80
84,35
0,875
SAPS II+MR-proADM
172
80
82,79
0,875
SAPS II+PCT
171
80
77,90
0,866
SAPS II+лактат
158
75
75,94
0,874
MR-proADM+альдолаза B
172
80
68,50
0,834
MR-proADM+гистон H2B
172
80
60,02
0,820
MR-proADM+гистон H2A
172
80
58,92
0,817
MR-proADM+гистон H4
172
80
58,87
0,819
MR-proADM+лактат
158
75
57,71
0,820
MR-proADM+гистон H3
172
80
55,57
0,809
Таблица 3: Пороговые значения для биомаркеров и клинических оценок для прогнозирования наличия ≥4 OF.
Для прогнозирования наличия ≥4 OF у пациента определяют с указанной чувствительностью и специфичностью значения уровней биомаркеров/оценок, равные или превышающие данное пороговое значение (PPV: положительная прогностическая значимость; NPV: отрицательная прогностическая значимость). Указана единица контрольных уровней (пороговых значений). Контрольные уровни, определенные с помощью масс-спектрометрии, представлены в произвольных единицах (AU).
Таблица 3
Пороговое значение
Чувствительность [%]
Специфичность [%]
PPV[%]
NPV[%]
Альдолаза B
42,1 AU
45,00
91,30
81,82
65,63
Копептин
79,71 пмоль/л
78,21
58,62
62,89
75,00
Гистон H2A
42,4 AU
45,00
92,39
83,72
65,89
Гистон H2B
32,2 AU
51,25
88,04
78,85
67,50
Гистон Н3
45,3 AU
51,25
85,87
75,93
66,95
Лактат
3 ммоль/л
62,67
81,93
75,81
70,83
MR-proADM
5,97 нмоль/л
61,25
82,61
75,38
71,03
PCT
7,12 мкг/л
53,75
75,82
66,15
65,09
SAPS II
56
85,00
72,83
73,12
84,81
SOFA
10
87,50
76,09
76,09
87,50
Таблица 4: Пороговые значения (контрольные уровни) для гистона H4 для прогнозирования наличия ≥4 OF.
Для прогнозирования наличия ≥4 OF у пациента определяют с указанной чувствительностью и специфичностью значения уровней гистона H4/оценок, равные или превышающие данные пороговые значения, (PPV: положительная прогностическая значимость; NPV: отрицательная прогностическая значимость). Уровни гистона H4 были получены путем измерения образцов от пациентов с применением методов масс-спектрометрии (МС) или иммуноанализа (Luminex). Контрольные уровни, определенные с помощью МС, представлены в произвольных единицах (AU), а контрольные уровни, определенные с помощью иммуноанализа (Luminex или IA), представлены в нг/мл.
Таблица 4:
Пороговое значение (<)
Специфичность
Чувствительность
AU
%
%
MS
62
>95%
33,8%
41
93,0%
45,0%
37
>90%
45,0%
28
>85%
48,8%
23
81,5%
57,5%
22
>80%
57,5%
18
>75%
60,0%
16
>70%
62,5%
9
55,4%
78,8%
нг/мл
%
%
Luminex
92
>95%
29,9%
43
92,2%
52,0%
40
>90%
52,0%
35
>85%
53,3%
31
>80%
53,3%
25
>75%
57,1%
23
73,9%
61,0%
19
>70%
64,9%
16
62,8%
74,0%
11
51,6%
79,2%
Все ссылки, приведенные в настоящей заявке, полностью включены в качестве ссылки.
Albrich, W.C. and S. Harbarth (2015). Intensive Care Med 41(10):1739-1751. Bone, R.C., R.A. Balk, etal. (1992). Chest 101(6):1644-1655. Bouch, D.C. and J.P.Thompson (2008). Continuing Educationin Anaesthesia, Critical Care & Pain 8(5):181-185. Breslow, M.J. and O.Badawi (2012). Chest 141(1):245-252. Ferreira, A.M. and Y.Sakr (2011). Semin Respir Crit Care Med 32 (5):543-551. Knaus, W.A., E.A.Draper, etal. (1985). Crit Care Med 13 (10):818-829. LeGall, J.R., S.Lemeshow, etal. (1993). Jama 270(24):2957-2963. Mayr, V.D., M.W. Dunser, etal. (2006). Crit Care 10 (6):R154. Polderman, K.H., A.R.Girbes, etal. (2001). Anaesthesia 56(1):47-50. Vincent, J.L. (2006). Surg Infect (Larchmt) 7 Suppl 2:S69-72. Vincent, J.L., A. de Mendonca, etal. (1998). Of the European Society of Intensive Care Medicine. Crit Care Med 26 (11):1793-1800. Vincent, J.L. and R.Moreno (2010). Crit Care 14(2):207. Vincent, J.L., R.Moreno, etal. (1996). Intensive Care Med 22 (7):707-710. Vincent, J.L., Y.Sakr, etal. (2006). Crit Care Med 34(2):344-353.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> B.R.A.H.M.S GmbH
<120> ГИСТОНЫ И/ИЛИ PROADM В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ, СВИДЕТЕЛЬСТВУЮЩИХ
ОБ ОРГАННОЙ ДИСФУНКЦИИ
<130> Z1851 PCT BLN
<150> EP 16 18 3376.9
<151> 2016-08-09
<160> 16
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 102
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность гистона человека H4, ID
в базе uniprot  P62805.2, начальный метионин не включен
<400> 1
Ser Gly Arg Gly Lys Gly Gly Lys Gly Leu Gly Lys Gly Gly Ala Lys
1. 5                   10                  15
Arg His Arg Lys Val Leu Arg Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys Pro
20                  25                  30
Ala Ile Arg Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Lys Arg Ile Ser Gly
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe Leu Glu Asn
50                  55                  60
Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys Arg Lys Thr
65                  70                  75                  80
Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg Thr
85                  90                  95
Leu Tyr Gly Phe Gly Gly
100
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность гистона человека H2A тип 1, ID в
базе uniprot Q96QV6, начальный метионин не включен
<400> 2
Ser Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Ala Arg Ala Lys Ser Lys Ser
1. 5                   10                  15
Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Ile His Arg
20                  25                  30
Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr Ala Glu Arg Ile Gly Ala Gly Ala Pro
35                  40                  45
Val Tyr Leu Ala Ala Val Leu Glu Tyr Leu Thr Ala Glu Ile Leu Glu
50                  55                  60
Leu Ala Gly Asn Ala Ser Arg Asp Asn Lys Lys Thr Arg Ile Ile Pro
65                  70                  75                  80
Arg His Leu Gln Leu Ala Ile Arg Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys Leu
85                  90                  95
Leu Gly Gly Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile Gln
100                 105                 110
Ala Val Leu Leu Pro Lys Lys Thr Glu Ser His His His Lys Ala Gln
115                 120                 125
Ser Lys
130
<210> 3
<211> 135
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность гистона человека H3.1, ID в базе
uniprot P68431.2, начальный метионин не включен
<400> 3
Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro
1. 5                   10                  15
Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr
20                  25                  30
Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Tyr Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu
35                  40                  45
Arg Glu Ile Arg Arg Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys
50                  55                  60
Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr
65                  70                  75                  80
Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Met Ala Leu Gln Glu Ala Cys
85                  90                  95
Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala Ile
100                 105                 110
His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg
115                 120                 125
Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala
130                 135
<210> 4
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность гистона человека H2B, ID в базе
uniprot P62807
<400> 4
Met Pro Glu Pro Ala Lys Ser Ala Pro Ala Pro Lys Lys Gly Ser Lys
1. 5                   10                  15
Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys Arg
20                  25                  30
Ser Arg Lys Glu Ser Tyr Ser Val Tyr Val Tyr Lys Val Leu Lys Gln
35                  40                  45
Val His Pro Asp Thr Gly Ile Ser Ser Lys Ala Met Gly Ile Met Asn
50                  55                  60
Ser Phe Val Asn Asp Ile Phe Glu Arg Ile Ala Gly Glu Ala Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Ala His Tyr Asn Lys Arg Ser Thr Ile Thr Ser Arg Glu Ile Gln
85                  90                  95
Thr Ala Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Glu Leu Ala Lys His Ala Val
100                 105                 110
Ser Glu Gly Thr Lys Ala Val Thr Lys Tyr Thr Ser Ser Lys
115                 120                 125
<210> 5
<211> 185
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность pre-pro-ADM
<400> 5
Met Lys Leu Val Ser Val Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe
1. 5                   10                  15
Leu Gly Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys
20                  25                  30
Lys Trp Asn Lys Trp Ala Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met
35                  40                  45
Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala
50                  55                  60
Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg
85                  90                  95
Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe
100                 105                 110
Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
115                 120                 125
Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln
130                 135                 140
Gly Tyr Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly
145                 150                 155                 160
Arg Thr Leu Val Ser Ser Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro
165                 170                 175
Pro Ser Gly Ser Ala Pro His Phe Leu
180                 185
<210> 6
<211> 48
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность MR-proADM аминокислотная
последовательность 45-92 pre-pro-ADM)
<400> 6
Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr Gly Leu Ala Asp Val Lys
1. 5                   10                  15
Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro Gln Asp Met Lys Gly Ala
20                  25                  30
Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp Ala Ala Arg Ile Arg Val
35                  40                  45
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> позиции 21-29 из SEQ ID NO:2
<400> 7
Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg
1. 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 82-88 из SEQ ID NO:2
<400> 8
His Leu Gln Leu Ala Ile Arg
1. 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 89-95 из SEQ ID NO:2
<400> 9
Asn Asp Glu Glu Leu Asn Lys
1. 5
<210> 10
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 100-118 из SEQ ID NO:2
<400> 10
Val Thr Ile Ala Gln Gly Gly Val Leu Pro Asn Ile Gln Ala Val Leu
1. 5                   10                  15
Leu Pro Lys
<210> 11
<211> 57
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 46-102 из SEQ ID NO:1
<400> 11
Ile Ser Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg Gly Val Leu Lys Val Phe
1. 5                   10                  15
Leu Glu Asn Val Ile Arg Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys
20                  25                  30
Arg Lys Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys Arg Gln
35                  40                  45
Gly Arg Thr Leu Tyr Gly Phe Gly Gly
50                  55
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 46-55 из SEQ ID NO:1
<400> 12
Ile Ser Gly Leu Ile Tyr Glu Glu Thr Arg
1. 5                   10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 60-67 из SEQ ID NO:1
<400> 13
Val Phe Leu Glu Asn Val Ile Arg
1. 5
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 80-91 с ацетилированным
K91 из SEQ      ID NO:1
<400> 14
Thr Val Thr Ala Met Asp Val Val Tyr Ala Leu Lys
1. 5                   10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 24-35 из SEQ ID NO:1
<400> 15
Asp Asn Ile Gln Gly Ile Thr Lys Pro Ala Ile Arg
1. 5                   10
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> аминокислотная последовательность остатков 68-77 из SEQ ID NO:1
<400> 16
Asp Ala Val Thr Tyr Thr Glu His Ala Lys
1. 5                   10
<---