КОМПОЗИЦИИ, УЛУЧШАЮЩИЕ ПОНИЖЕННУЮ ДНЕВНУЮ АКТИВНОСТЬ И/ИЛИ ДЕПРЕССИВНЫЕ СИМПТОМЫ
COMPOSITIONS IMPROVING DIURNAL HYPOACTIVITY AND/OR DEPRESSIVE SYMPTOMS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к композициям, обладающим активностью по улучшению пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов.
Известный уровень техники
Хорошо известно, что пониженный уровень дневной активности и депрессивные симптомы могут отмечаться у лиц пожилого возраста. Сообщается, что пониженная дневная активность близко связана со сном, а нарушение сна может часто снижать дневную активность, а уровень дневной активности коррелирует с количеством и качеством ночного сна [Psychiatry Clin Neurosci Vol.54, 309-310 (2000)]. Коэффициент заболеваемости нарушениями сна заметно возрастает с возрастом. В основе повышенного коэффициента заболеваемости нарушениями сна у пожилых людей присутствуют возрастные изменения сна, выражающиеся в увеличении случаев пробуждения во время сна, трудности в возобновлении сна после пробуждения, сокращение общего времени сна, снижение эффективности сна и уменьшение медленного сна. Полагают, что наложение указанных физиологических изменений может вызывать большое разнообразие факторов, прерывающих сон, что приводит к началу нарушений сна у пожилых людей [Medical Frontier (Saisin Igaku) Vol.59, 468-475 (2004)].
С другой стороны, полагают, что множество ментальных нарушений приводит к снижению дневной активности и/или депрессивным симптомам непосредственно или посредством симптомов, таких как нарушения сна. Например, у пациентов с шизофренией наблюдается не только бессонница, вызванная трудностями засыпания и пробуждением во время сна, но также нарушения сна, вызванные нарушением ритма сна и бодрствования, например, изменения в стиле жизни и нарушения в повседневной жизни. Среди ментальных нарушений эмоциональное возбуждение часто сопровождается нарушением сна и депрессивными симптомами: униполярная депрессия представляет симптомы бессонницы, такие как трудность засыпания, пробуждение во время сна, раннее утреннее пробуждение, отсутствие ощущения глубокого сна и сокращение времени сна, и биполярная депрессия представляет симптомы бессонницы, подобные униполярной депрессии, но при биполярной депрессии в отличие от униполярной депрессии часто отмечается гиперсомния, такая как повторяющаяся дремота. Кроме того, неврологические нарушения также вызывают нарушения сна и депрессивные симптомы, и в качестве неврологических нарушений, которые часто сопровождаются нарушениями сна, могут быть упомянуты дегенеративные мозговые нарушения, слабоумие, болезнь Паркинсона, летальная наследственная бессонница, связанная со сном эпилепсия, эпилептические волнообразные припадки во сне, головная боль, вызванная сном, и тому подобное [Supplement, Nippon Rinsho (Japanese Journal of Clinical Medicine) Vol.39, 231-248 (2003)].
В последние годы способы применения регистратора активности привлекают внимание в качестве способов оценки количества сна и уровня активности. Регистратор активности является устройством типа наручных часов со встроенным сенсором для измерения уровня активности и предназначен для ношения на не преобладающей руке для измерения уровня активности днем и ночью в течение недели в качестве устройства для оценки изменения уровня активности. Анализы результатов измерения регистратором активности компьютерной программой представляются очень полезными для диагностирования, наблюдения развития и оценки терапевтических эффектов при нарушениях сна, пониженном уровне активности и т.д., связанных с ментальными, неврологическими нарушениями и старением.
12
В качестве терапевтических способов существует психотерапевтические подходы, безмедикаментозная терапия и медикаментозная для пониженной дневной активности и депрессивных симптомов и сниженной ментальной и физической функции. Безмедикаментозная терапия включает интенсивное световое облучение, которое сейчас агрессивно применяется при лечении сезонных эмоциональных нарушений и циркадного ритма сна. Несмотря на применение витамина B и бензодиазепиновых снотворных и т.д. в медикаментозной терапии для лечения нарушений сна и депрессивных симптомов, ни об одном из них нельзя сказать, что они очень эффективны, поэтому создание эффективной медикаментозной терапии продолжается. Для лечения эмоциональных расстройств и неврологических болезней обычно сочетают антидепрессанты и психотропные лекарственные средства со снотворными. Однако в настоящее время отсутствуют безопасные и эффективные соединения с терапевтическим эффектом для лечения пониженного уровня дневной активности и депрессивных симптомов, вызванных нарушениями сна и сниженными ментальными и физическими функциями.
Каннабиноиды известны как соединения, контролирующие сон и поведение. Каннабиноиды, как описано, воздействуют на память и обучение [Nature Vol.388, 773-778 (1997)], и питание, релаксацию и сон [J Neurosci Vol.21, 5344-5350 (2001)] через мозговые рецепторы каннабиноидов. Известны эндогенные каннабиноиды человеческого тела, соединения, содержащие арахидоновую кислоту, такие как анадамид и 2-арахидоноил моноглицерин. Указанные каннабиноиды даже при пероральном введении гидролизуются и таким образом не всасываются в исходном виде. Обзоры по ним до настоящего времени описывают только эксперименты in vitro или эксперименты по применению ингибиторов рецепторов.
Таким образом, совсем неясно, влияют ли на пониженную дневную активность и депрессивные симптомы соединения, содержащие арахидоновую кислоту, как часть жирных кислот, поглощаемых человеком.
Не патентный документ 1: Psychiatry Clin Neurosci Vol.54, 309-310 (2000)
Не патентный документ 2: Medical Frontier (Saisin Igaku) Vol.59, 468-475 (2004)
He патентный документ 3: Supplement, Nippon Rinsho (Japanese Journal of Clinical Medicine) Vol.39, 231-248 (2003)
He патентный документ 4: Nature Vol.388, 773-778 (1997)
Не патентный документ 5: J Neurosci Vol.21, 5344-5350 (2001)
Раскрытие сущности изобретения
Таким образом, целью настоящего изобретения является создание продукта питания и напитка, которые обладают активностью в улучшении пониженного уровня дневной активности и/или депрессивных симптомов, указанные продукт питания и напиток, содержащие арахидоновую кислоту и/или соединение с арахидоновой кислотой, как составляющую жирных кислот, и способ их изготовления. В частности, целью настоящего изобретения является создание продукта питания и напитка, которые обладают активностью в улучшении пониженного уровня дневной активности и/или депрессивных симптомов, вызванных нарушениями сна, которые обусловлены ментальными нарушениями (шизофрения, депрессия и т.д.), неврологическими нарушениями (дегенеративные церебральные болезни, слабоумие, болезнь Паркинсона, летальная наследственная бессонница, связанная со сном эпилепсия, эпилептические приступы волнообразной природы во сне, головная боль, связанная со сном и т.д.) или возрастным снижением ментальной и физической функций, указанные продукт питания и напиток, содержащие в качестве активного компонента, по меньшей мере, один выбранный из группы, состоящей из: арахидоновой кислоты; спиртового эфира арахидоновой кислоты; и триглицерида, фосфолипида и гликолипида, в котором часть или все составляющие жирные кислоты являются арахидоновой кислотой, и способ их изготовления.
После интенсивных и обширных исследований по выяснению эффекта улучшения пониженного уровня дневной активности и депрессивных симптомов средством, содержащим в качестве активного компонента арахидоновую кислоту и/или соединение с арахидоновой кислотой, как составляющее жирных кислот, авторы настоящего изобретения неожиданно установили эффект соединения, содержащего арахидоновую кислоту в качестве активного компонента, в улучшении пониженного уровня дневной активности и депрессивных симптомов пожилых людей, которые находятся короткий период времени в учреждении по уходу за пожилыми людьми, оценивая как показатель значений, полученных с применением регистратора активности.
Таким образом, настоящее изобретение предлагает средство улучшения пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов, указанное средство содержит в качестве активного компонента арахидоновую кислоту и/или соединение с арахидоновой кислотой как составляющее жирных кислот, также как композицию с эффектом в улучшении пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов и способ изготовления композиции. Более точно настоящее изобретение предлагает средство улучшения пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов, вызванные нарушениями сна, которые вызваны ментальными нарушениями (шизофрения, депрессия и т.д.), неврологическими заболеваниями (дегенеративные церебральные болезни, слабоумие, болезнь Паркинсона, летальная наследственная бессонница, связанная со сном эпилепсия, эпилептические приступы волнообразной природы во сне, головная боль, связанная со сном и т.д.), и пониженного уровня дневной активности и/или депрессивных симптомов, вызванных нарушениями сна, которые обусловлены возрастным снижением ментальных и физических функций, указанное средство содержит в качестве активного компонента, по меньшей мере, один, выбранный из группы, состоящей из: арахидоновой кислоты; спиртового эфира арахидоновой кислоты; и триглицерида, фосфолипида и гликолипида, в котором часть или все составляющие жирные кислоты являются арахидоновой кислотой; и способ их изготовления, также как и композицию с эффектом предотвращения или улучшения и способ изготовления этой композиции.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 демонстрирует влияние масла, содержащего арахидоновую кислоту, на уровень дневной активности пожилых людей с применением регистратора активности.
Фиг.2 демонстрирует влияние масла, содержащего арахидоновую кислоту, на депрессивные симптомы пожилых людей с применением для расчета шкалы Зунга (Zung) самооценки депрессии.
Фиг.3 демонстрирует корреляцию уровня дневной активности пожилых людей, принимавших масло, содержащее арахидоновую кислоту, и подсчет с применением шкалы Зунга (Zung) самооценки депрессии.
Лучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к средству улучшения пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов, указанное средство содержит в качестве активного компонента арахидоновую кислоту или масло, содержащее арахидоновую кислоту, также как композицию с эффектом предотвращения или улучшения пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов, и способу изготовления композиции.
В качестве причин пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов могут быть упомянуты нарушения сна, которые вызваны ментальными заболеваниями (шизофрения, депрессия и т.д.), нарушения сна, которые вызваны неврологическими заболеваниями (дегенеративные церебральные болезни, слабоумие, болезнь Паркинсона, летальная наследственная бессонница, связанная со сном эпилепсия, эпилептические приступы волнообразной природы во сне, головная боль, связанная со сном и т.д.), или нарушения сна, которые обусловлены возрастным снижением ментальных и физических функций. Указанные симптомы или заболевания не являются ограничивающими, таким образом сюда включены все симптомы или заболевания, связанные с пониженной дневной активностью и/или депрессивными симптомами.
Активным компонентом согласно настоящему изобретению является арахидоновая кислота и могут применяться все соединения, содержащие арахидоновую кислоту в качестве составляющей жирных кислот. Соединения, содержащие арахидоновую кислоту в качестве составляющей жирных кислот, включают, например, соли арахидоновой кислоты, такие как кальциевая и натриевая соли. Эфиры низших спиртов арахидоновой кислоты включают, например, метиловый эфир арахидоновой кислоты и этиловый эфир арахидоновой кислоты. Также могут быть применены триглицериды, фосфолипиды, гликолипиды и т.д., в которых часть или все жирные кислоты являются арахидоновой кислотой. Настоящее изобретение не ограничено перечисленными выше соединениями, и могут применяться все соединения с арахидоновой кислотой как составляющей жирных кислот.
При намерении применения в продуктах питания арахидоновая кислота предпочтительно находится в форме фосфолипида, в частности триглицерида. Отсутствуют или немногочисленны природные источники триглицеридов, содержащих арахидоновую кислоту (синонимы с триглицеридами, содержащими триглицериды, в которых часть или все составляющие жирные кислоты являются арахидоновой кислотой). Авторы настоящего изобретения реализовали промышленное применение триглицеридов, содержащих арахидоновую кислоту как составляющую жирных кислот, которые были изучены путем приема внутрь при пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов у пожилых людей, и впервые показали влияние активного компонента согласно настоящему изобретению в тестах на людях и обнаружили, что он обладает эффектом в улучшении пониженной дневной активностью и/или депрессивных симптомов и указанный эффект вызван арахидоновой кислотой.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены триглицериды (триглицериды, содержащие арахидоновую кислоту), в которых часть или все составляющие жирные кислоты, которые являются активным компонентом согласно настоящему изобретению, представляют собой арахидоновую кислоту. В качестве триглицерида, содержащего арахидоновую кислоту, желательной формой при применении в продукте питания является масло (триглицерид), в котором доля арахидоновой кислоты в общем количестве жирных кислот составляет 20 мас.% или более, предпочтительно 30 мас.% или более предпочтительно 40 мас.% или более. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением могут быть применены все масла, содержащие арахидоновую кислоту (триглицериды), вырабатываемые выращиваемыми микроорганизмами, способными их производить.
Микроорганизмы, способные вырабатывать масла, содержащие арахидоновую кислоту (триглицериды), включают, например, микроорганизмы, принадлежащие к роду Mortierella, Conidiobolus, Pythium, Phytophthora, Penicillium, Cladosporium, Mucor, Fusarium, Aspergillus, Rhodotorula, Entomophthora, Echinosporangium и Saprolegnia.
В качестве микроорганизмов, принадлежащих к роду Mortierella, могут быть упомянуты виды Mortierella elongata, Mortierella exigua, Mortierella hygrophila, Mortierella alpina и тому подобное. В частности, может быть упомянуты штаммы Mortierella elongata IFO8570, Mortierella exigua IFO8571, Mortierella hygrophila IFO5941, Mortierella alpina IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70 и CBS754.68 и тому подобное.
Указанные штаммы доступны без ограничений в Institute of Fermentation (IFO) в Osaka City, Japan, American Type Culture Collection (ATCC) в U.S.A. и Centrralbureau voor Schimmelcultures (CBS). Также возможно применять Mortierella elongata SAM0219 (FERM P-8703) (FERM BP-1239), микробный штамм, выделенный из почвы исследовательской группой согласно настоящему изобретению.
Для выращивания микробного штамма для применения в настоящем изобретении споры или мицелий штамма или стартовой культуры, полученной предварительным культивированием штамма, инокулируют в жидкую или твердую среду и культивируют. В случае жидкой среды источники углерода, которые могут быть применены, включают, но не ограничены любыми обычно используемыми, такими как глюкоза, фруктоза, ксилоза, сахароза, мальтоза, растворимый крахмал, меласса, глицерин и маннит.
В качестве источников азота могут быть применены, в дополнение к природным источникам азота, таким как пептон, дрожжевой экстракт, солодовый экстракт, мясной экстракт, казаминовые кислоты, кукурузный экстракт, соевый белок, обезжиренная соя и мука из семян хлопчатника, органические источники азота, такие как мочевина, и неорганические источники азота, такие как нитрат натрия, нитрат аммония и сульфат аммония. При необходимости могут быть использованы в качестве микронутриентов неорганические соли, такие как фосфаты, сульфат магния, сульфат железа и сульфат меди и витамины. Концентрации указанных компонентов среды не ограничены, пока они не мешают росту микроорганизмов. Обычно с практической точки зрения источники углерода составляют 0,1-40 мас.% и предпочтительно 1-25 мас.%. Исходные введенные источники азота составляют 0,1-10 мас.% и предпочтительно 0,1-6 мас.% и источники азота могут быть добавлены по мере расходования в процессе выращивания.
Кроме того, путем контроля концентрации источника углерода в среде может быть получено масло (триглицерид), содержащее 45 мас.%. или более арахидоновой кислоты, активного компонента согласно настоящему изобретению. 2-4 дни культивирования микробной массы являются фазой роста массы, а дни после 2-4 являются фазой накопления масла. Исходная концентрация источника углерода составляет 1-8 мас.%, предпочтительно 1-4 мас.% и на начальном периоде фазы роста микробной массы и фазы накопления масла источник углерода последовательно добавляется суммой с источником углерода, постепенно добавляемого, составляет 2-20 мас.%, предпочтительно 5-15 мас.%. Количество источника углерода, добавленного во время фазы роста микробной массы и раннего периода фазы накопления масла, добавляют в соответствии с начальной концентрацией источника азота и на 7 день культивирования или позже, предпочтительно на 6 день культивирования или позже, и более предпочтительно на 4 день культивирования или позже, концентрацию источника углерода в среде делают равной 0, так чтобы получить масло (триглицерид), содержащее 45 мас.% или более арахидоновой кислоты, которая может являться активным компонентом согласно настоящему изобретению.
Хотя температура культивирования микроорганизмов, вырабатывающих арахидоновую кислоту, может зависеть от используемого микроорганизма, после культивирования при 5-40°С, предпочтительно 20-30°С, или 20-30°С для роста мицелия, культивирование может быть продолжено при 5-20°С для продуцирования ненасыщенных жирных кислот. При помощи указанного контроля температуры соотношение высших ненасыщенных кислот в продуцируемых жирных кислотах может быть повышено. Культивирование можно проводить при pH среды 4-10, предпочтительно 5-9, с аэрированием перемешиваемой, встряхиваемой или стационарной культуры. Культивирование обычно проводят в течение 2-30 дней, предпочтительно 5-20 дней и более предпочтительно 5-15 дней.
Кроме того, в качестве средства повышения соотношения арахидоновой кислоты в масле, содержащем арахидоновую кислоту (триглицерид), масло, содержащее арахидоновую кислоту, может быть подвергнуто селективному гидролизу для получения масла, содержащего арахидоновую кислоту, с высоким соотношением, в дополнение к контролю концентрации источника углерода в среде. Липазы для использования в селективном гидролизе не являются специфическими и гидролитическая активность уменьшается пропорционально числу двойных связей, гидролизуются эфирные связи жирных кислот, отличных от высших ненасыщенных кислот. Также может проходить реакция переэтерификации между получающимися ПНЖК порции глицеридов и т.д., образуя, давая таким образом триглицериды с повышенной долей высших ненасыщенных жирных кислот ("Enhancement of Arachidonic: Selective Hydrolysis of a Single-Cell Oil from Mortierella with Candida cylindracea Lipase": J. Am. Oil Chem. Soc., 72: 1323-1327 (1998)).
Таким образом, масло, содержащее арахидоновую кислоту с высоким соотношением, полученное селективным гидролизом масла, содержащего арахидоновую кислоту, может представлять собой активный компонент по настоящему изобретению. Отношение арахидоновой кислоты к общему количеству жирных кислот масла, содержащего арахидоновую кислоту (триглицерид), согласно настоящему изобретению предпочтительно является высоким с целью элиминирования влияния других жирных кислот. Однако настоящее изобретение не ограничено высокими отношениями, но на практике абсолютное количество арахидоновой кислоты иногда может быть рассчитано, когда предполагается применение в продуктах питания, и даже по существу может быть применено масло (триглицерид), содержащее 10 мас.% или более арахидоновой кислоты.
Кроме того, в качестве триглицерида, в котором часть или все составляющие жирные кислоты являются арахидоновой кислотой, может быть применен триглицерид, в котором жирные кислоты со средней длиной цепи присоединены в положениях 1 и 3 и арахидоновая кислота присоединена в положении 2. Также может быть применено масло (триглицерид), содержащий 5 моль % или более, предпочтительно 10 моль %, или более и наиболее предпочтительно 30 моль % триглицерида, в котором жирные кислоты со средней длиной цепи присоединены в положениях 1 и 3 и арахидоновая кислота присоединена в положении 2. Вышеуказанные жирные кислоты со средней длиной цепи, которые присоединены в положениях 1 и 3, могут быть выбраны из жирных кислот с 6-12 углеродами. В качестве жирных кислот с 6-12 углеродами могут быть упомянуты каприловая кислота и капроновая кислота и т.д., и 1,3-каприлоил-2-арахидоноил-глицерин (обозначаемый далее как "8А8") особенно предпочтителен.
Когда лица пожилого возраста являются объектом исследования, лучшими маслами (триглицеридами) являются указанные триглицериды, в которых жирные кислоты со средней длиной цепи присоединены в положениях 1 и 3 и арахидоновая кислота присоединена в положении 2. Обычно когда масла (триглицериды) принимаются внутрь и попадают в тонкую кишку, они гидролизуются панкреатической липазой, в которой указанная панкреатическая липаза является специфической по отношению к положениям 1 и 3, и положения 1 и 3 триглицерида расщепляются с образованием 2 молекул свободных жирных кислот и одной молекулы 2-моноацилглицерина (2-MG) в то же время. Поскольку указанный 2-MG обладает высокой активностью в растворении желчной кислоты и хорошо абсорбируется, можно сказать, что жирные кислоты в положении 2 более способны к абсорбции. Когда 2-MG растворен в желчной кислоте, это также служит в качестве ПАВ и повышает абсорбционные свойства свободных жирных кислот.
Далее, свободные жирные кислоты и 2-MG в сочетании с холестерином и фосфолипидами и т.д. биосинтезируют композитные мицеллы желчной кислоты, которые инкорпорируются в эпителиальные интестинальные клетки, где триацилглицерин образуется снова, и окончательно выделяются в виде хиломикронов в лимфу. Панкреатическая липаза более характерна для высших насыщенных жирных кислот и арахидоновая кислота отщепляется труднее. Дальнейшая проблема состоит в том, что активность панкреатической липазы падает с возрастом и таким образом для пожилых людей триглицериды, в которых жирные кислоты со средней длиной цепи присоединены в положениях 1 и 3 и арахидоновая кислота присоединена в положении 2, становятся наилучшими маслами (триглицеридами).
Специфический способ продуцирования триглицерида, в котором жирная кислота со средней длиной цепи присоединена в положениях 1 и 3 и арахидоновая кислота присоединена в положении 2, липаза, которая действует только на эфирную связь в положениях 1 и 3 триглицерида, активна в присутствии масла, содержащего арахидоновую кислоту (триглицерид), и жирной кислоты со средней длиной цепи.
Сырьем масла (триглицерида) является триглицерид с арахидоновой кислотой как составляющей частью жирных кислот. Когда отношение арахидоновой кислоты к общему количеству жирных кислот высокое, температура реакции предпочтительно более высокая, чем обычная температура реакции фермента 20-30°С, то есть 30-50°С, предпочтительно 40-50°С для предотвращения снижения выхода реакции из-за увеличения доли не прореагировавшего масла (сырье триглицерида и триглицерида, в котором только одна жирная кислота в положении 1 и 3 является жирной кислотой со средней длиной цепи).
В качестве липаз, которые специфически действуют на эфирную связь в положениях 1 и 3 триглицеридов, могут быть упомянуты липазы, продуцируемые микроорганизмами, принадлежащими к роду Rhizopus, Rhizomucor, Aspergillus и т.д., и панкреатическая липаза свиньи и тому подобное. Указанные липазы коммерчески доступны, например, липаза (Talipase, поставляемая Tanabe Seiyaku Co., Ltd.) из Rhizopus delemar, липаза (Rhibozyme IM, поставляемая NovoNordisk Pharma Co., Ltd.) из Rhizomucor miehei, липаза (Lipase А, поставляемая Amano Enzyme Inc.) из Aspergillus niger и тому подобное могут быть упомянуты, но они не являются ограничивающими, и любые липазы, которые являются специфическими к положениям 1 и 3, могут быть применены.
Так как вышеуказанные липазы применяют при температуре реакции 30°С или более, предпочтительно 40°С или более для повышении эффективности реакции предпочтительно применять иммобилизованную липазу, которая иммобилизована на носителе для придания термостойкости фермента. В качестве носителя для иммобилизации могут быть упомянуты ионообменные смолы, то есть крупнопористые смолы с размером пор около 100 Ангстрем или более, такие как Dowex MARATHON WBA. Это не является ограничивающим, однако и любые носители для иммобилизации, способные придать термостойкость, могут быть применены.
0,5-20 мас. частей липазы, специфической к положениям 1 и 3, суспендируют в одной части носителя для иммобилизации, а 2-5 объемных частей охлажденного ацетона (например, -80°С) постепенно добавляют при перемешивании для образования осадка. Осадок может быть высушен при пониженном давлении для получения иммобилизованного фермента. В более простом способе 0,05-0,4 мас. части липазы, специфической к положениям 1 и 3, растворяют в минимальном количестве воды и смешивают с носителем для иммобилизации при помешивании и высушивают при пониженном давлении для получения иммобилизованного фермента. Указанной процедурой около 90% липазы иммобилизуется на носителе, но она сама по себе не обладает активностью в эфирном обмене и предпочтительно предварительно обрабатывается в субстрате, к которому добавлена вода до 1-10 мас.% (мас./об.), предпочтительно 1-3 мас.% (мас./об.), так чтобы иммобилизованный фермент мог быть наилучшим способом активирован и задействован в производстве.
В зависимости от типа фермента количество воды, добавляемой к водной реакционной системе, является очень важным. В отсутствие воды эфирный обмен реакционной системе является очень важным. В отсутствие воды эфирный обмен протекает с трудом и при избытке воды гидролиз происходит так, что извлечение глицеридов снижается (когда происходит гидролиз, образуются диглицериды и моноглицериды). Однако в этом случае применением иммобилизованного фермента, активированного при предварительной обработке, количество добавленной воды в существующую реакционную систему становится неважным и реакция эфирного обмена может проходить с высокой эффективностью даже в безводной системе. Кроме того, за счет использования термостойкого иммобилизованного фермента и таким образом повышения температуры реакции фермента, триглицерид (8А8), в котором жирные кислоты со средней длиной цепи присоединены в положениях 1 и 3 и арахидоновая кислота присоединена в положении 2, может быть эффективно получен без снижения эффективности реакции даже для масел, содержащих арахидоновую кислоту (триглицериды), которые обладают низкой реактивностью по отношению к липазам, специфическим к положениям 1 и 3.
В способах производства продуктов питания и напитков с активностью по улучшению пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов, арахидоновая кислота и/или соединения с арахидоновой кислотой в качестве составляющей жирных кислот могут быть применены в одиночку или смешаны с сырьем продуктов питания и напитков, с низким или очень низким, если вообще присутствует, содержанием арахидоновой кислоты. Очень низкое количество, как оно используется в описании, означает количество, даже когда сырье продуктов питания и напитков содержит арахидоновую кислоту и композиция продукта питания с материалом, смешанным здесь, принимается индивидами, но оно не достигает суточной дозы (описанной далее) арахидоновой кислоты в день согласно настоящему изобретению.
В случае триглицерида, в котором часть или все составляющие жирные кислоты являются арахидоновой кислотой, масла (триглецириды) обладают многочисленными возможностями в настоящем изобретение и могут быть применены в качестве сырья и добавок в продуктах питания, напитках, косметических и фармацевтических продуктах. Отсутствуют ограничения в предполагаемых применениях и применяемых количествах.
Например, в качестве пищевых композиций могут быть упомянуты функциональные продукты питания, биологически активные добавки к пище, продукты питания специального оздоравливающего назначения, модифицированное молоко для недоношенных грудных детей, модифицированное молоко для детей, детское питание, продукты питания для беременных или продукты питания для пожилых людей и тому подобное, в дополнение к обычным продуктам питания. Примерами продуктов питания являются продукты, которые содержат масла, такие как мясо, рыба и орехи, продукты питания, к которым масла добавляют при приготовлении, такие как суп; продукты питания, для которых масла служат средой для нагрева, такие как пончики; жирные продукты питания, такие как масло; переработанные продукты питания, к которым масло добавлено в процессе переработки, такие как печенье или продукты питания, на которые масло наносится в конце переработки, такие как твердое печенье, и тому подобное. Кроме того, масла могут добавляться к сельскохозяйственным, ферментированным (молочнокислым) продуктам питания, продуктам питания из домашнего скота, продуктам питания из аквакультур или напиткам, которые не содержат масел. Кроме того, они могут быть в форме функциональных продуктов питания или фармацевтических; а могут быть произведены в форме, например, энтерального продукта питания, порошков, гранул, пастилок, пероральных жидких препаратов, суспензий, эмульсий, сиропов и тому подобное. К продукту по настоящему изобретению может быть прикреплена этикетка, указывающая, что он обладает активностью по улучшению пониженной дневной активности и/или депрессивных симптомов.
Композиция по настоящему изобретению может содержать различные носители и добавки, которые обычно применяются для продуктов питания или напитков, лекарственных препаратов или квазилекарств (лечебно-профилактическая косметика) в дополнение к активному ингредиенту по настоящему изобретению. Особенно предпочтительно присутствие антиоксидантов для предотвращения окисления активного компонента по настоящему изобретению. В качестве антиоксидантов могут быть упомянуты природные антиоксиданты, такие как токоферолы, производные флавона, филодулцины, койевая кислота, производные галловой кислоты, катехины, фукиноловая кислота (fukinolic acid), госсипол, производные пиразина, сасамол, гваякол, гваяколовая кислота, р-кумаровая кислота, нордигидрогваяковая кислота, стерины, терпены, нуклеиновые основания, каротеноиды и лигнины и синтетические антиоксиданты, представленные пальмитат-аскорбатным эфиром, стеарат-аскорбатным эфиром, бутил гидроксианизолом (ВНА), бутил гидрокситолуолом (ВНТ), t-бутилгидрохиноном (TBHQ) и 4-гидроксиметил-2,6-ди-t-бутилфенолом (HMBP).
В качестве соответствующих токоферолов могут быть упомянуты α-токоферол, β-токоферол, γ-токоферол, δ-токоферол, ε-токоферол, ζ-токоферол, η-токоферол и эфиры токоферола (ацетаты токоферола и т.д.). В качестве каротеноидов могут быть упомянуты β-каротин, кантаксантин, астаксантин и тому подобное.
В качестве носителей композиция по настоящему изобретению может включать в дополнение к активному компоненту по настоящему изобретению различные носители, объемные добавки, разбавители, наполнители, диспергаторы, вспомогательные формообразующие вещества, связующие растворители (например, вода этанол, растительные масла), адъюванты, способствующие растворению, буферные агенты, промоторы растворения, желирующие вещества, суспендирующие агенты, пшеничная мука, рисовая мука, крахмал, кукурузный крахмал, полисахариды, белки молока, коллаген, рисовые масла, лецитин и тому подобное. В качестве добавок могут быть включены, но без ограничения, витамины, подсластители, органические кислоты, красители, отдушки, вещества, препятствующие увлажнению, волокна, электролиты, минералы, нутриенты, антиоксиданты, консерванты, вкусоароматические вещества; увлажняющие агенты, экстракты натуральных продуктов, растительные экстракты и тому подобное.
В основном фармацевтически активным компонентом арахидоновой кислоты и соединения с арахидоновой кислотой как составляющей жирных кислот является арахидоновая кислота. Сообщается, что суточное потребление с пищей арахидоновой кислоты составляет 0,14 г в области Канто (Kanto) и 0,19-0,20 г в области Кансай (Kansai) [Sisitsu Eiyougaku (Lipid Nutrition) 4: 73, (1995)]. В случае пожилых людей, которые потребляют пониженные количества масел, и активность их панкреатической липазы снижается, должно потребляться значительное количество арахидоновой кислоты. Таким образом, суточное потребление с пищей арахидоновой кислоты и соединений с арахидоновой кислотой как составляющей жирных кислот взрослым человеком (например, с весом тела 60 кг) составляет в пересчете на арахидоновую кислоту 0,001-20 г, предпочтительно 0,01-10 г, более предпочтительно 0,05-5 г и наиболее предпочтительно 0,1-2 г.
Когда активный компонент по настоящему изобретению фактически применяется в продуктах питания или напитках, важно абсолютное количество арахидоновой кислоты, которая смешана с продуктами питания или напитками. Однако, когда триглицерид, содержащий триглицерид, в котором часть или все присутствующие жирные кислоты являются арахидоновой кислотой, примешивается к продуктам питания, смешивается с 0,01 мас.% или более, предпочтительно 0,01 мас.% или более, более предпочтительно 0,1 мас.% или более в пересчете на арахидоновую кислоту, поскольку абсолютное значение количества, которое следует смешать с продуктом питания или напитком, может меняться в зависимости от количества потребляемого смешанного продукта питания или налитка. Кроме того, когда триглицерид, в котором жирные кислоты со средней длиной цепи присоединены в положениях 1 и 3 и арахидоновая кислота присоединена в положении 2, смешивается с продуктом питания, он смешивается в количестве до 0,0003 положении 2, смешивается с продуктом питания, он смешивается в количестве до 0,0003 мас.% или более, предпочтительно до 0,003 мас.% или более, более предпочтительно до 0,03 мас.% или более.
Когда композиция по настоящему изобретению применяется как фармацевтический продукт, она может быть произведена способом, обычным в области фармакологии, например, способом, описанным в Japanese Pharmacopoeia, или соответствующим способом.
Когда композиция по настоящему изобретению применяется как фармацевтический продукт, количество активного компонента в смеси отдельно не ограничено и может быть использовано в подходящем соотношении в смеси соответственно до достижения цели настоящего изобретения.
Когда композиция по настоящему изобретению применяется как фармацевтический продукт, предпочтительно она вводится в виде стандартной лекарственной формы, в частности, она предназначена для перорального приема. Дозировка композиции по настоящему изобретению может изменяться с возрастом, весом тела, тяжестью болезни, частотой приема и т.д., и суточная доза арахидоновой кислоты и/или соединений с арахидоновой кислотой как составляющей жирных кислот по настоящему изобретению для взрослого (около 60 кг), в пересчете на арахидоновую кислоту, обычно составляет около 0,001-20 г, предпочтительно 0,01-10 г, более предпочтительно 0,05-5 г и наиболее предпочтительно 0,1-2 г, которые могут составлять суточную дозу, разделенную на 1-3 дозы.
Большая часть жирных кислот фосфолипидов мембран клеток мозга является арахидоновой кислотой и докозагексаеновой кислотой, и рассматривая равновесие, докозагексаеновая кислота является предпочтительно связанной. Также, поскольку доля эйкозапентаеновой кислоты в фосфолипидах мембраны мозга очень низкая, предпочтительно сочетание арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты с небольшим количеством эйкозапентаеновой кислоты. В сочетании арахидоновой кислоты и докозагексаеновой кислоты отношение арахидоновая кислота/докозагексаеновая кислота составляет 0,1-15 и предпочтительно 0,25-10. Кроме того, предпочтительны пищевые продукты и напитки, в которых эйкозапентаеновая кислота смешивается в количестве, не превышающем одну пятую (массовое соотношение) арахидоновой кислоты.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение теперь будет объяснено более детально со ссылкой на отдельные примеры. Следует отметить, однако, что настоящее изобретение не ограничено.
Пример 1. Способ изготовления триглицерида, содержащего арахидоновую кислоту.
2
4
2
4
2
2
2
2
2
В качестве микроорганизма, продуцирующего арахидоновую кислоту, применяют Mortierella alpina CBS754.68. Шесть килолитров среды, содержащей 1,8% глюкозы, 3,1% обезжиренной соевой муки, 0,1% соевого масла, 0,3% KHPO, 0,1% NaSO, 0,05% CaCl/2HO и 0,05% MgCl/5HO, готовят в резервуаре для чистой культуры на 10 кЛ и исходное рН доводят до 6,0. Инокулируют 30 л стартовой культуры и подвергают выращиванию при перемешивании воздухом при 26°С, со скоростью подачи воздуха 360 м/ч, давлении в резервуаре 200 кПа в течение 8 дней. Скорость перемешивания регулируют так, чтобы концентрация растворенного кислорода поддерживалась равной 1-2,5% методом отвода воды до 4 дня и 0,5-1% после этого (вышеуказанные % означают массовые (мас./об.) %).
После завершения выращивания осуществляют фильтрацию и высушивание для получения мицелия, содержащего триглицерид с арахидоновой кислотой как составляющей жирных кислот, масло экстрагируют из мицелия гексаном и посредством процесса очистки (рафинированием (дегуммированном), нейтрализацией кислоты, дезодорацией, обесцвечиванием) получают 150 кг триглицерида, содержащего арахидоновую кислоту (триглицерид, в котором часть или все присутствующие жирные кислоты являются арахидоновной кислотой). Масло (триглицерид) метилируют и полученные метиловые эфиры жирных кислот анализируют газовой хроматографией, которая показывает, что доля арахидоновой кислоты в общей сумме жирных кислот составляет 40,84 мас. %.
Доля пальмитиновой, стеариновой, олеиновой, линолевой, γ-линолевой, дигомо-γ-линолевой кислот составляет 11,63%, 7,45%, 7,73%, 9,14%, 2,23% и 3,27% соответственно. Кроме того, вышеуказанное масло (триглицерид), содержащее арахидоновую кислоту (SUNTGA40S), этилируют и этиловые эфиры жирных кислот, содержащие 40 мас.% этилового эфира арахидоновой кислоты, подвергают стандартной высокоэффективной жидкостной хроматографии для выделения и очистки 99 мас.% этилового эфира арахидоновой кислоты.
Пример 2. Получение треглицерида, содержащего 5 мол.% или более 8А8.
100 г ионообменной смолы (Dowex MARATHON WBA: Dow Chemical) суспендируют в 80 мл водного раствора липазы Rhizopus delemar (12,5% Talipase powder, поставляемого Tanabe Seiyaku Co., Ltd.) и перемешивают в 240 мл охлажденного ацетона (например, -80°С) с последующим высушиванием при пониженном давлении для получения иммобилизованной липазы.
Затем 80 г триглицерида (SUNTGA40S), содержащего 40 мас.% арахидоновой кислоты, полученной в примере 1,160 г каприловой кислоты 12 г вышеуказанной иммобилизованной липазы и 4,8 мл воды приводят во взаимодействие при перемешивании (130 об/мин) при 30°С в течение 48 часов. После завершения реакции реакционную жидкость удаляют для получения активированного иммобилизованного фермента.
Затем, 10 г иммобилизованной липазы (Rhizopus delemar липаза, носитель: Dowex MARATHON WBA) загружают в стеклянную колонку с рубашкой (1,8×12,5 см, объем 31,8 мл), к которой реакционное масло, полученное в примере 1, в котором SUNTGA40S и каприловая кислота смешаны в соотношении 1:2, пропускают с постоянной скоростью (4 мл/ч) и подвергают продолжительной реакции для получения 400 г прореагировавшего масла. Температура колонки составляет 40-41°С. Из полученного прореагировавшего масла не прореагировавшая каприловая кислота и свободные жирные кислоты удаляют молекулярной дистилляцией и процессом очистки (рафинированием, дегуммированием, нейтрализацией кислоты, дезодорацией, обесцвечиванием) для получения съедобного масла, получают масло (триглицерид), содержащее 8А8.
С применением газовой хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии долю 8А8 в полученном масле (триглецирид), содержащем 8А8, определяют содержание, равное 31,6 мол.% (доля 8P8, 8O8, 8L8, 8G8 и 8D8 составляет 0,6, 7,9, 15,1, 5,2 и 4,8 мол.%, соответственно). Жирные кислоты P, O, L, G и D, которые в триглицериде присоединены в положении 2, относятся к пальмитиновой, олеиновой, линолевой, γ-линолевой и дигомо-γ-линолевой кислотам соответственно и 8P8 относится к 1,3-каприлоил-2-пальмитолеин-глицерину, 8O8 относится к 1,3-каприлоил-2-олеоил-глицерину, 8L8 относится к 1,3-каприлоил-2-линолеоил-глицерину, 8G8 относится к 1,3-каприлоил-2-γ-линоленоил-глицерину и 8D8 относится к 1,3-каприлоил-2-дигомо-γ-линоленоил-глицерину. Из полученного масла (триглицерида), содержащего 8A8, 96 моль % 8A8 выделяют и очищают стандартной высокоэффективной жидкостной хроматографией.
Пример 3. Изготовление тестовых (опытных) капсул.
Добавляют воду к 100 массовым частям желатина и 35 массовым частям глицерина в качестве пищевой добавки и растворяют при 50-60°С для приготовления желатиновой оболочки с вязкостью 2000 сантипуаз. Затем масло с витамином Е примешивают до 0,05 мас.% к маслу (триглицериду), содержащему арахидоновою кислоту, полученную в примере 1, для получения содержимого 1. Содержимое 1 применяют для формирования капсул, которое затем высушивают для получения мягких капсул, с 200 мг содержимого на капсулу. Одновременно готовят в качестве капсул плацебо для опытов над людьми, мягкие капсулы, в которых содержимое заменено оливковым маслом.
Пример 4. Исследование воздействия от принятия капсул со съедобным маслом, содержащим арахидоновую кислоту, на пониженную дневную активность и/или депрессивные симптомы пожилых людей, находящихся в учреждении для престарелых людей короткий период времени.
Уровень дневной и ночной активности измеряют устройством, которое носят как наручные часы со встроенным сенсором, для измерения уровня активности на непреимущественной руке для измерения ночной и дневной активности непрерывно в течение одной недели. Анализом результатов измерения указанным регистратором активности компьютерной программой оценивают уровень активности и качества ночного сна и т.д. Опыты над людьми согласно настоящему изобретению проводятся с тщательным соблюдением соответствия Хельсинской декларации.
После брифинга по согласию на участие в исследовании семь согласившихся индивидуумов, которые находятся в учреждении для престарелых короткий промежуток времени, разделяют на две группы: A:N=4, B:N=3. Для потребления 240 мг арахидоновой кислоты в день группа А получает три капсулы, содержащие съедобное масло с арахидоновой кислотой (80 мг/капсулу в пересчете на арахидоновую кислоту), полученное в примере 3, ежедневно в течение месяца группа В получает три капсулы с плацебо. До и после потребления капсул регистратор активности надевают на непреимущественную руку для измерения уровня ночной и дневной активности непрерывно в течение одной недели. Затем испытуемые групп А и В прекращают принимать капсулы на две недели в качестве период вымывания. После вымывания группа А получает капсулы плацебо и группа В получают капсулы, содержащие съедобное масло с арахидоновой кислотой, в течение одного месяца. Аналогично до и после принятия капсул регистратор активности носят на непреимущественной руке для измерения уровня ночной и дневной активности непрерывно одну неделю (двойное слепое тестирование, перекрестный тест).
В то же самое время до и после приема капсул проводят тест с применением подсчета самооценки депрессии по Зунгу (Zung) для определения степени депрессии. С применением теста по шкале Зунга (Zung) самооценки депрессии (40 или более: умеренная депрессия, 50 или более: средняя депрессия) определяют степень депрессии.
Изменения среднего уровня дневной активности до и после приема капсул представлены на Фиг.1, а изменения в оценках по шкале Зунга (Zung) самооценки депрессии представлены на Фиг.2. Когда принимались капсулы с плацебо заметных изменений не отмечено ни в среднем уровне дневной активности, ни в оценке по шкале Зунга (Zung) самооценки депрессии. Но когда принимались капсулы, содержащие съедобное масло с арахидоновой кислотой, установлено, что средняя дневная активность значительно возросла до 19,1 отсчетов/день и оценка по шкале Зунга (Zung) самооценки депрессии значительно улучшилась до 3,2.
Затем корреляция средней дневной активности и оценок по шкале Зунга (Zung) самооценки депрессии определяется кривой в линейном приближении методом наименьших квадратов (Фиг.3). Значительная корреляция (коэффициент корреляции R=-0,561) отмечена между уровнем дневной активности и оценками по шкале Зунга (Zung) самооценки депрессии, что показывает, что улучшение уровня депрессии приводит к увеличению дневной активности, хотя средняя оценка по шкале Зунга (Zung) самооценки депрессии составляет 37,6, что является уровнем, не достигающим умеренной депрессии. Таким образом, впервые было показано, что прием съедобного масла с арахидоновой кислотой улучшает пониженный уровень дневной активности и/или депрессивные симптомы и что эффект вызван арахидоновой кислотой.
Пример 5. Пример приготовления смешанных капсул съедобного масла (триглицерида) с арахидоновой кислотой.
Добавляют воду к 100 массовым частям желатина и 35 массовым частям глицерина в качестве пищевой добавки и растворяют при 50-60°С для приготовления желатиновых оболочек с вязкостью 2000 спуаз. Затем витамин Е в масле примешивают до 0,05 мас.% к маслу (триглицериду), содержащему 32 моль % 8А8, полученного в примере 2, для получения содержимого 2. Затем 50 мас.% масла (триглицерида), содержащего арахидоновую кислоту, полученного в примере 1, и 50 мас.% рыбьего жира (тунцовый жир: доля эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот в общем количестве жирных кислот составляет 5,1% и 26,5% соответственно) смешивают и затем витамин Е в масле примешивают до 0,05 мас.% для получения содержимого 3.
80 мас.% масла (триглицерида), содержащего арахидоновую кислоту, полученного в примере 1, и 20 мас.% рыбьего жира (тунцовый жир: доля эйкозапентаеновой и докозагексаеновой кислот в общем количестве жирных кислот составляет 5,1% и 26,5% соответственно) смешивают и затем витамин Е в масле примешивают до 0,05 мас.% для получения содержимого 4. К 99% этиловому эфиру арахидоновой кислоты, полученному в примере 1, витамин Е в масле примешивают до 0,05 мас.% для получения содержимого 5. С применением содержимого 2-5 формуют и высушивают капсулы в соответствии со стандартными способами получения мягких капсул, включающих 180 мг содержимого на капсулу.
400 г масла (триглицерида), содержащего 96 моль % 8А8, полученного в примере 2, 48 г очищенного лецитина из яичного желтка, 20 г олеиновой кислоты, 100 г глицерина и 40 мл 0,1 N гидроксида натрия смешивают и диспергируют гомогенизатором и затем добавляют дистиллированную воду для инъекций до 4 литров. Смесь эмульгируют в машине для эмульгирования высокого давления распылительного типа с приготовлением масляной эмульсии. Затем указанная масляная эмульсия распределяется аликвотными количествами по 200 мл в пластиковые пакеты и они подвергаются стерилизации паром высокого давления при 121°С в течение 20 минут для получения масляных инфузии.
Пример 7. Применение в соке
Два грамма β-циклодекстрина добавляют к 20 мл 20% водного раствора этанола, к которым добавляют триглицерид (с добавленным витамином Е до 0,05%), содержащий арахидоновую кислоту, полученный в примере 1, при перемешивании мешалкой и инкубируют при 50°С в течение 2 часов, далее инкубируют при перемешивании при 4°С в течение 10 часов. Образующийся осадок отделяют центрифугированием, промывают n-гексаном и лиофилизируют для получения 1,8 г циклодекстрина, включающего соединение, содержащего триглицерид с арахидоновой кислотой. Один грамм указанного порошка перемешивают до гомогенности с 10 л сока с получением сока, содержащего триглицерид с арахидоновой кислотой.