Способ диагностики меланомы с помощью экзосомальных микроРНК
METHOD FOR DIAGNOSING MELANOMA USING EXOSOMAL microRNA

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к диагностическим методам, позволяющим диагностировать развитие меланомы.
Меланома - опухолевое заболевание, вызванное злокачественной трансформацией меланоцитов, - клеток, ответственных за производство меланина. Меланома является шестым наиболее распространенным злокачественным новообразованием в Соединенных Штатах, причем рост заболеваемости наблюдается во всем мире. Согласно данным американского онкологического сообщества, 91% меланом являются кожные, 5,3% увеальными, 1,3% являются меланомами слизистых оболочек, и 2,2% являются меланомами неизвестного первичного происхождения.
По статистике Всемирной организации здравоохранения в 2000 г было диагностировано более 200 тысяч случаев меланомы, при этом зафиксировано более 65 тысяч летальных исходов, связанных с меланомой. Рост заболевания меланомой отмечается с 1998 г., так к 2008 г. отмечается существенный рост количества случаев меланомы почти что во всех странах мира, в том числе и в Российской Федерации (например, в Санкт-Петербурге: мужчины - 3,5; женщины - 4). Летальность при меланоме тоже высокая, особенно среди белого населения Австралии (мужчины - 5, женщины - 5) и Новой Зеландии (мужчины - 3, женщины - 3), где повышенный уровень ультрафиолетового излучения. При анализе пятилетней выживаемости наблюдается различная картина в разных странах мира - так, высокий процент пятилетней выживаемости наблюдается в Соединенных Штатах Америки, где она составляет 88 процентов. Немного нижи цифры пятилетней выживаемости в Австралии и Новой Зеландии - около 85 процентов. В Европейских странах цифра варьирует, и в среднем составляет 70 - 75 процентов. Что касается развивающихся стран, тут пятилетняя выживаемость около 50 процентов.
МикроРНК, в качестве важнейших пост-транскрипционных регуляторов экспрессии генов, являются важными компонентами в биологии меланомы. Нарушение регулирования МикроРНК связывают с развитием злокачественных свойств и метастазирования злокачественной меланомы. Росту рака способствует потере определенных микроРНК, в то время как прогрессии рака способствует избыточная экспрессия других микроРНК.
МикроРНК можно определять практически во всех биологических жидкостях: в моче, слюне, соскобе со щеки, плазме или сыворотке крови, цереброспинальной жидкости и др. МикроРНК в жидкостях могут присутствовать в различном виде, так, в плазме крови они могут быть свободно циркулирующими молекулами, в комплексах с белками, в циркулирующих клетках и во внеклеточных везикулах, в частности в экзосомах - которые являются небольшими 20-140 нм, структурами, участвующими в межклеточной коммуникации. При проведении исследований выделение отдельных фракций микроРНК, особенно экзосомальных могут представлять наибольший интерес в связи с их ключевым воздействием при межклеточной коммуникации. Во многих исследованиях обнаруживалась способность таргетной доставки микроРНК посредством экзосом, воздействуют таким образом на молекулярно-генетические процессы в реципиентных клетках. Гены-мишени микроРНК при меланоме, как и в случаях с большинством других онкологических заболеваний, связаны с влиянием на клеточный цикл, пролиферацию клеток, адгезию и васкуляризацию. Так, обнаружено, что при меланоме наблюдается гиперрегулация порядка 519 генов в клеточных линиях полученных из метастазов меланомы и клеточных культурах меланомы человека. Существенно (примерно в 5 раз) повышается экспрессия гена ANPEP, а генов CFL1 и МТА2 напротив, слегка снижается (до 0,8 раз). Гены CFL1 и МТА2 определяют морфологию клеток, а также их метастатический потенциал. Ассоциированные с рядом микроРНК В сети взаимодействующих генов, являющихся таргетными для микроРНК, экспрессия которых значительно понижена или повышена при меланоме, отмечают основные гены участвующие во взаимодействии и являющиеся мишенями микроРНК: АРР, AGO2, АКТ1, KRAS, AHR, STAT1, ВАК1 и PARP1. Отмечается что ген АКТ1, а также ген PARP1 и ген KRAS ко-регулируются следующими микроРНК: микро-РНК-34а-5р, -148а-3р, -129-5р, -363-3р и -374b-5р.
Уровень экспрессии основных представителей семейства микроРНК34 (-34а, -34b и -34 с) при меланоме понижается. В то же время уровень экспрессии этих микроРНК определяется геном р53. Для микроРНК-34а, характерно участие в апаптозе, инициированным белком р53, она учувствует в подавлении антиапоптотического белка сиртулина 1 (SIRT1). Иной механизм задействует микроРНК34с. Она способствует подавлению опухолевого роста путем влияния на мРНК и изменению экспрессии ряда генов, таких как гены антиапоптотических белков (например BCL-2), циклинзависимая киназа 4 (CDK4) и циклинзависимая киназа 6 CDK6, а также генов, белки которых связаны с метастазированием (MYC, МЕТ, Notch, и AXL). Появляется все больше данных о ассоциации экспрессии микроРНК34а с рецепторами программированной клеточной смерти 1 (PDL1). Повышенный уровень экспрессии рецептора PDL1 на поверхности иммунокомпетентных клеток пациентов со злокачественными новообразованиями рассматривается как негативный прогностический фактор. Здесь мы наблюдаем обратную зависимость: при высоких уровнях микроРНК-34а отмечается низкий уровень экспрессии рецептора PDL1 и наоборот. Уровень микроРНК 10b повышается при также при раке молочной железы и глиоме и также при меланоме. Повышенный уровень данной микроРНК объясняется ее взаимодействием с промоторным участком гена TWIST, который вовлечен в формирование фенотипа клеток, кроме этого МикроРНК 10b учувствует в угнетении экспрессию гена HOXD10, за свет чего увеличивается метастатическая активность клеток. При меланоме понижаются уровни микроРНК-15 и МикроРНК-16, генами-мишенями которых являются: ген CDK1, ген ETS1, ген BCL-2 и ген JUN, активные участники опухолевого прогрессирования. На линии мышей было показано, что делеция участка 13q14.3, который содержит микроРНК-15 и микроРНК-16, вызывает развитие автономных лимфопролиферативных заболеваний. Так же и у человека течение хронической лимфоцитарной лейкемии часто сопровождается частичной делецией данного локуса.
МикроРНК, определяемые в плазме крови пациентов с меланомой на различных стадиях и представляющие собой прогностическую ценность при меланоме.
В процессе прогрессии опухоли наряду с соматическими мутациями BRAF, V600K, K601E, NRAS, CDKN2A, PTEN и ТР53 и проч. происходят нарушения не только на структурном уровне ДНК, но и на эпигенетическом: наряду с изменением уровня метилирования происходят изменения уровней экспрессии микроРНК. Данные изменения, в свою очередь, приводят к изменению уровней экспрессии различных мРНК, что непосредственно приводит к изменению интенсивности синтеза различных белков и соответственно к изменению функционального состояния клетки, например, к повреждению апоптотических механизмов и проч.
Изменение уровня экспрессии микроРНК может быть как в сторону повышения уровня экспрессии, так и в сторону снижению уровня экспрессии микроРНК. Отчасти динамика изменений зависит от таргетных для конкретной микроРНК генов: микроРНК-4731, уровень экспрессии которой снижен, ингибирует белок SSX4, блокирование функции которого привело к уменьшению размеров 2D колоний трех различных клеточных линий меланомы, также функцию этого белка связывают с подавлением клеточного и иммунного ответа организма на опухолевые клетки.
Снижение уровня экспрессии микроРНК-200b наблюдается не только при меланоме, но и, например, при раке легких, при этом отмечается ингибирующий эффект действия данной микроРНК на пролиферацию злокачественных клеток и рост метастазов.
Уровень экспрессии микроРНК-211 также имеет тенденцию к снижению при развитии меланомы, что связано с гиперметилированием определенных участков ДНК и ассоциировано со снижением чувствительности клеток к химиотерапии, в том числе цисплатином.
Повышение уровня экспрессии микроРНК198 при развитии меланомы связано с нарушением механизмов иммунной защиты, в частности, наблюдается при дисфункции CD8 позитивных клеток. Одной из микроРНК, играющих ключевую роль в развитии меланомы, является микроРНК21, повышение уровня экспрессии которой наблюдается на всех этапах развития злокачественного процесса и при меланоме превышает в 8,6 раз уровень экспрессии микроРНК21, характерный для доброкачественных меланоцитов.
Из уровня техники известен способ определения риска развития меланомы, описанный в патенте «Паттерны микроРНК для диагностики, прогноза и лечения меланомы» [US 8980549 B2, 01.08.2010]. Данный способ включает в себя получение образца опухолевой ткани от пациента с меланомой, выделение и определение уровней экспрессии микроРНК и методику применения микроРНК в качестве прогностического маркера развития меланомы.
Недостатком данного метода является, использование в качестве аналита для исследования только опухолевой ткани, а также отсутствие этапа предварительного выделения экзосом, для получения более специфичных данных по микроРНК.
Помимо этого, известен способ диагностики меланомы на основе панели нескольких микроРНК «Способ диагностики, стадии и мониторинга меланомы с использованием экспрессии гена микроРНК» [WO 2019068139 A1, 25.07.2007]. Метод включает в себя забор биологического материала от пациента, выделение микроРНК и определение профиля экспрессии в плазме микроРНК с оценкой по суммарным микроРНК развития меланомы. Основным недостатком метода является применение уровней экспрессии свободных микроРНК, воспроизводимость и специфичность которых ниже воспроизводимости экзосомальных микроРНК.
Формула 1 «Расчет коэффициента развития меланомы», описывающей способ расчета коэффициента, в соответствии с которым возможно диагностировать развитие меланомы.
Табл. 1 «Значения поправочных коэффициентов микроРНК», содержащая в себе значение поправочных коэффициентов для каждой микроРНК.
Табл. 2 «Уровни экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови в различных группах пациентов», содержащая в себе значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК в плазме крови здоровых доноров, пациентов с 1-2 стадией меланомы и пациентов с 3-4 стадией меланомы.
Табл. 3 «Коэффициенты развития меланомы, полученные по значениям уровней экспрессии микроРНК из плазмы крови для пациентов различных групп», содержащая в себе числовые коэффициенты развития меланомы у здоровых доноров, пациентов с 1-2 стадией меланомы и пациентов с 3-4 стадией меланомы.
Техническим результатом заявленного способа является возможность определения стадии меланомы по изменению профиля экспрессии следующих микроРНК в экзосомах, выделенных из плазмы крови: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроРНК-1et7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроPHK-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.
Вышеприведенный технический результат достигается благодаря тому, что заявленный способ включает следующие стадии: забор периферической венозной крови (не менее 1 мл) в пробирку с антикоагулянтом ЭДТА; центрифугировании не позднее чем через 45 минут после взятия крови при 3000 g 15 минут, при комнатной температуре, заморозки при -80°С или использование сразу после центрифугирования; выделение экзосом методом ультрацентрифугирования, выделения экзосомальных микроРНК; постановка реакции ПНР в реальном времени с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроPHK-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроРНК-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.; расчета коэффициента, диагностирующего развитие меланомы по формуле (1) «Расчет коэффициента характеризующего стадию меланомы у пациента в соответствии с полученными числовыми значениями».
Перерасчет концентраций микроРНК, включаемый в расчет, осуществляется в соответствии с поправочными коэффициентами (см. таблицу 1).
Диагностика стадии меланомы осуществляется по цифровому показателю коэффициента R, когда R в диапазоне от 0 до 0,99 - здоровые доноры, если показатель находится в интервале от 1 до 1,99 - 1-2 стадия меланомы, если показатель выше 2-3-4 стадия меданомы.
Заявляемый способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.
Пример 1. Определение уровней экспрессии микроРНК в плазме крови различных групп пациентов и у здоровых доноров
У 10 здоровых доноров (возраст 38-65 лет, 5 мужчин, 5 женщин) в амбулаторных условиях производят забор 1 мл крови в пробирку ЭДТА К2 (забор возможен в любую пробирку, где в качестве антикоагулянта используется ЭДТА). Кровь в течение 45 часов после забора центрифугирует в течение 15 минут на 3000 g, отбирают в чистую пробирку плазму, готовят несколько аликвот по 250 мкл и замораживают при -80°С. Аналогичным образом производят забор материала у 10 пациентов (6 мужчин, 4 женщин, возраст 38-55 лет) с 1-2 стадией меланомы и у 10 пациентов с 3-4 стадией меланомы (5 мужчин, 5 женщин, возраст 42-59 лет).
Затем следует этап выделения экзосомальной фракции микроРНК, для чего необходимы следующие действия: 1) проведение центрифугирования в режиме 14000 g в течение 10 минут при комнатной температуре и отбирают супернатант; 3) проведение ультрацентрифугирования на центрифуге Avanti 301 (ротор JA-30.50) в режиме 100000 g в течение 1,5 часов при +4С. Супернатант быдрасывают, а полученный на осадок разводят в 200 мкл безнуклеазной воды. К полученному раствору добавляют 5 мкл протеиназы К, инкубируют при 56°С в течение 1 часа, далее проводят выделение миркоРНК на наборах "miRNeasy seram/plasma advanced kit" (Qiagen Q-217004) по стандартному протоколу: наносят на колонку Exiqon, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, затем колонку промывают 3 раза промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 5 минут при комнатной температуре, потом на колонку наносится 20 мкл безнуклеазной воды и колонку оставляют на 10 минут при комнатной температуре, затем проводят центрифугирование при 3000 g на центрифуге eppendorf 5104 в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего проводят реакцию обратной транскрипции при помощи набора для обратной транскрипции "miRCURY LNA RT Kit" (Qiagen-339340) по стандартному протоколу.
Далее с целью выявления отдельных типов микроРНК проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени с использованием наборов "meRCURY LNA SYBR Green PCR kit" (Qiagen-339347) на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на отдельные типы микроРНК, ассоциированные с развитием меланомы: микроРНК-473, микроРНК-509-5р, микроPHK-let7b, микроРНК-143, микроРНК-193b, микроРНК-106а, микроРНК-21, микроРНК-34а, микроРНК-224, микроРНК-let-7e, микроРНК-145, микроРНК-203 и микроРНК-18а.
Затем при помощи программного обеспечения, поставляемого производителем оборудования (GenEx 6.1 - qPCR Data Analysis Software, bioMCC, 29.02.2016), вычисляют количество каждой из исследуемых микроРНК, выделенной из каждой фракции, полученные данные приводятся в формате таблицы.
Затем проводят расчет поправочных коэфициентов для каждой микроРНК. Значения поправочных коэффициентов отображены в табл. №1.
Расчет коэффициента, отражающего развитие меланомы происходит по формуле 1, приведенной выше.
Значения уровней экспрессии экзосомальных микроРНК отражены в табл. №2.
Полученные коэффициенты отражены в табл. №3