Фотопериодическая мужская самостерильность в гибридизации подсолнечника

МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур

Я. Н. Демурин,

доктор биологических наук

Т. М. Перетягина,

младший научный сотрудник

О. М. Борисенко,

2005, вып. 2

младший научный сотрудник

ВНИИ масличных культур

ФОТОПЕРИОДИЧЕСКАЯ МУЖСКАЯ САМОСТЕРИЛЬНОСТЬ В ГИБРИДИЗАЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА

УДК 633.854.78:631.52

Для надежной гибридизации растений требуется предварительное получение материнских, т.е. одновременно женски фертильных и мужски стерильных организмов, дающих гибридные семена только при опылении пыльцой другого растения и не обладающих способностью к самоопылению. При этом следует различать мужскую стерильность, как неспособность образовывать жизнеспособные мужские гаметы, и самостерильность, как неспособность к самооплодотворению при нормальности мужских и женских гамет. Причиной самостерильности могут быть морфологические особенности строения цветка, приводящие к непопаданию пыльцы на рыльца пестиков, такие как гетеростилия, протерандрия и протогиния, а также генетическая несовместимость.

При получении коммерческих межлинейных гибридов в гетерозисной селекции подсолнечника в качестве материнской формы может использоваться генетическая мужская стерильность - генная и цитоплазматическая. Однако создание широко используемых ЦМС-аналогов требует нескольких лет работы по беккроссированию.

Для скрещивания фертильных растений в качестве материнской формы при гибридизации в генетических и селекционных целях был предложен ряд методов.

Одно из первых описаний способа получения материнских растений у культурного подсолнечника ИвНаПИш аппиш' Ь., являющегося однодомным растением с двуполыми протерандрическими трубчатыми цветками в корзинке, на основе ручной кастрации содержится в работе Сацыперова Ф. А. При этом пыльники каждого цветка удаляются пинцетом в первый день его цветения с 6 до 8 часов утра с последующим нанесением пыльцы отцовского растения на рыльца пестиков кастрированных цветков

Недостатком этого способа является большая трудоемкость, необходимость квалифицированного труда, ненадежность процесса ручной кастрации из-за возможного самоопыления при неполном удалении пыльников.

Известен также метод получения мужски стерильных аналогов растений подсолнечника на основе использования экзогенного воздействия факторов среды, а именно химической кастрации, согласно которому растения индивидуально опрыскивают водным раствором гиббереллина в фазе розетки во время закладки генеративных органов корзинки при 6-8 парах листьев [1]. Очевидные успехи в химической кастрации подсолнечника гаметоцидами, тем не менее, не позволяют получать материнские растения со 100 %-ной мужской стерильностью при отсутствии снижения женской фертильности обработанных растений [12].

Мужская стерильность за счет стрессового воздействия экологических факторов у подсолнечника описана также в случае недостатка питательных веществ в фазе зачаточной корзинки при заболевании ложно-мучнистой росой, механических повреждениях проводящей системы стебля или длительном затемнении точки роста [1] и при высоких температурах [3]. Известно использование измененных условий выращивания, в том числе и фотопериода, для получения мужски стерильных растений [6].

[4, 10].

Все описанные способы получения мужски стерильных растений, предполагают воздействие в фазе розетки, т. е. на ранних критических стадиях развития пыльников. Изучение влияния фотопериода во время вегетативного роста и начала генеративной фазы на переход подсолнечника к цветению показал сложный характер реакции растений на различную длину дня. Так, изучение популяционной изменчивости сортов подсолнечника позволило выделить все три экоформы - длиннодневные, короткодневные и нейтральные биотипы [11], хотя, в общем, подсолнечник относят к факультативно короткодневным растениям [7].

Многолетняя практика выращивания подсолнечника в условиях теплиц фитотрона во ВНИИМК [3] и в Институте полевых и овощных культур (г. Нови Сад, Югославия) содержит наблюдения об аномальном ходе цветения трубчатых цветков при ночной досветке растений. Опубликованных данных о получении самостерильных растений подсолнечника при фотопериодическом воздействии в фазе цветения корзинки не обнаружено.

Цель работы заключалась в разработке эффективного метода гибридизации подсолнечника. Главная задача состояла в получении женски фертильных материнских растений при минимально стрессовом воздействии экологических факторов.

Материал и методы. Растения константной селекционной линии подсолнечника с генетически измененным составом жирных кислот и токоферолов ВК876 выращивали летом 2004 г. в 16 сосудах с почвой (по одному растению в сосуде) в теплице фитотрон-но-тепличного комплекса ВНИИМК при естественном освещении стандартным методом. Посев производился 26 мая. С началом цветения корзинок 12 растений были перенесены в камеру фитотрона с 24-часовым световым днем на период 7 дней с 29 июля по 4 августа. Использовались светильники типа Фотос. 4 с лампами ДРИ-2000-6, обеспечивающие освещенность 25 килолюкс при среднесуточной температуре воздуха около 32 оС. Четыре растения линии ВК876 были оставлены в теплице для получения пыльцы, самоопыления и контрольных наблюдений за процессом цветения при естественной долготе дня около 16 ч и температуре воздуха около 40 оС днем и 26 оС ночью. Пыльца линии ЛГ28 с обычным составом жирных кислот и токоферолов собиралась с растений, выращенных в полевых условиях. После пребывания в камере с постоянным освещением во время цветения растения были перенесены обратно в теплицу. Гибридизацию осуществляли путем нанесения пыльцы на рыльца пестиков при использовании внутренней стороны сорванных листочков обертки.

Кроме того, 16 растений линии ВК876 и 16 растений линии ВК175 выращивались весной 2005 г. в камере фитотронно-тепличного комплекса ВНИИМК в 16 сосудах с почвой (по два растения в сосуде) в обычных условиях до начала и после окончания цветения при использовании светильников типа Фотос. 4 с лампами ДРИ-2000-6 и освещенности 25 килолюкс при фотопериоде 16 ч/день и 8 ч/ночь. Посев проводился 21 февраля. На время цветения корзинок на период шесть дней с 7 по 12 мая устанавливался 24-часовой световой день при среднесуточной температуре воздуха около 25 оС. По 8 растений каждой линии были перенесены во время цветения в соседнюю камеру с обычным фотопериодом для получения пыльцы и самоопыления.

Состав жирных кислот масла семян определялся методом газожидкостной хроматографии метиловых эфиров на приборе Хром 5. При определении состава токоферолов в семенах использовалась тонкослойная хроматография неомыляемой фракции липидов.

Результаты и обсуждение. Для всех 12-ти растений линии ВК876 в камере фитотрона с постоянным освещением наблюдали нарушение процесса цветения трубчатых цветков в виде отсутствия явления протерандрии для концентрической зоны последующего за экологическим воздействием дня цветения, заключающимся в отсутствии выхода пыльниковой трубки с пыльцой из венчика за счет полного отсутствия роста тычиночных нитей (табл. 1). Длина венчика и длина пыльниковой трубки достоверно не изменились.

При этом наблюдали обычный рост пестика с последующим раскрытием двух лопастей рыльца без выноса пыльцы.

Искусственное вскрытие венчиков этих морфологически женских однополых цветков показало, что нормально развитые пыльниковые трубки содержали обычное количество пыльцы. Фотопериодически детерминированная морфологическая женская однополость появлялась только у цветков зоны цветения, находившейся под предшествующим воздействием 24-часового светового дня. Циркадная зональность цветения корзинки при этом не нарушалась, что свидетельствует об эндогенном характере этого биологического ритма в условиях постоянного освещения и температуры. Контрольные растения, оставленные в теплице при естественном фотопериоде, характеризовались нормальным протерандрическим цветением с выталкиванием пыльцы из предварительно проросшей пыльниковой трубки сомкнутыми лопастями рыльца пестика (рис. 1, 2 и 3).

Рисунок 1 - Корзинка линии подсолнечника ВК876 на второй день цветения

Рисунок 2 - ФМС-корзинка линии подсолнечника ВК876 на третий день цветения

Рисунок 3 - Трубчатые цветки линии подсолнечника ВК876 в полдень первого дня цветения

Три растения линии ВК876 с фотопериодической морфологической женской однополостью цветков в камере фитотрона индивидуально опыляли пыльцой линии ЛГ28, другие три растения опыляли пыльцой линии ВК876, полученной при обычном фотопериоде, оставшиеся 3 растения изолировали для самоопыления. Завязываемость семян при опылении корзинок варьировала от 90 до 98 %, что свидетельствует о высокой фертиль-ности материнских растений. Все растения, оставленные для самоопыления, не образовали семян, что позволяет классифицировать растения с фотопериодической морфологической женской однополостью цветков как самостерильные.

Таблица 1 - Морфологические признаки трубчатых цветков линии подсолнечника ВК876

_ВНИИМК, Краснодар, 2004 г.

Признак, мм Фотопериод, день/ночь, ч НСР05

16/8 24/0

Длина венчика 5,7 6,0 0,3

Длина пыльников 4,1 4,2 0,3

Длина тычиночных нитей 3,7 0,0 -

Изоляция отдельных корзинок самофертильной линии ВК876 в условиях нормального фотопериода теплицы привела к формированию семян от самоопыления (табл. 2). Относительно меньшее число гибридных семян на корзинку по отношению к числу семян, полученных от самоопыления, объясняется одноразовым нанесением пыльцы отцовской формы на рыльца пестиков, тогда как самоопыление продолжалось все 5 дней цветения корзинки. В целом, число семян с одной корзинки, полученных от скрещивания, варьировало от 79 до 202 при диаметре корзинок от 6 до 7 см.

Таблица 2 - Число завязавшихся семян при фотопериодической мужской самостерильности (ФМС) линии подсолнечника ВК876

ВНИИМК, Краснодар, 2004 г.

Поколение Число семян на корзинку, шт.

среднее минимум максимум

ВК876 ФМС х ЛГ28 155 79 202

ВК876 ФМС х ВК876 92 87 96

ВК876 ФМС самоопыление 0 0 0

ВК876 контроль 200 151 248

Дополнительным доказательством гибридности, а не самоопыленности, полученных семян в скрещивании ВК876ФМС х ЛГ28 явилось изменение биохимических маркеров семян (табл. 3). Так, содержание олеиновой кислоты в средних пробах по 20 семян достоверно снизилось с 84 до 80 % от суммы жирных кислот масла, что согласуется с данными о неполном доминировании мутации 01 в гетерозиготе. Кроме того, все 90 индивидуально проанализированных семян показали гетерозиготное состояние рецессивных мутаций состава токоферолов IрН1 и /рН2, сопровождающееся повышением содержания а-формы в токоферольном комплексе до 100 %, возможным только при гибридизации с нормальным генотипом.

Таблица 3 - Биохимические признаки ФМС-гибридных и самоопыленных семян подсолнечника

ВНИИМК, Краснодар, 2004 г.

Поколение Олеиновая Состав токоферолов, %

кислота, % а в У 5

ВК876ФМС х ЛГ28 80 100 0 0 0

ВК876ФМС х ВК876 84 0 0 60 40

ВК876 84 0 0 60 40

ЛГ28 30 100 0 0 0

НСР05 3

Эксперименты с линиями ВК876 и ВК175 в 2005 г. подтвердили появление фотопериодической мужской самостерильности (ФМС), а также возможности получения семян только при нанесении пыльцы с мужски фертильных растений соответствующей линии (табл. 4). В целом число семян с одной корзинки, полученных от скрещивания, варьировало с 33 до 97 при диаметре корзинки от 4 до 6 см.

Таблица 4 - Число завязавшихся семян при фотопериодической морфологической самостерильности (ФМС) линий подсолнечника ВК876 и ВК175

ВНИИМК, Краснодар, 2005 г.

Поколение Число семян на корзинку, шт.

среднее минимум максимум

ВК876 ФМС х ВК876 59 33 90

ВК876 самоопыление 40 19 73

ВК175 ФМС х ВК175 67 47 97

ВК175 самоопыление 77 25 127

В случае необходимости получения пыльцы с материнского растения для его самоопыления или использования в качестве отцовской формы, следует перейти на 16-ча-

совой фотопериод, что приведет к обычному типу цветения оставшейся части корзинки с выходом пыльников из вновь распустившихся цветков и выталкиванием пыльцы из пыльниковой трубки лопастями рыльца пестика. При этом не вышедшие из венчика пыльники предыдущих концентрических зон цветения уже не прорастают. Так, 2 растения линии ВК876, находившиеся первые 2 дня цветения под непрерывным освещением и обладающие ФМС, были помещены в условия обычного 16-часового фотопериода, показав при этом обычный тип цветения оставшейся части корзинки и завязав 37 и 56 семян от самоопыления при диаметре корзинок 5 см.

Таким образом, в предлагаемом способе получения гибридов выход ФМС-растений после 24-часового фотопериодического воздействия на самофертильные растения составил 100 %, степень гибридизации - 100 % при полном отсутствии самоопыления материнских растений.

В целом, полученные результаты являются экспериментальным подтверждением теории эколого-генетической мужской стерильности у растений [6], основы которой были заложены Ч. Дарвином [5] и развиваемой во многих исследованиях, в том числе с подсолнечником [1]. Согласно этой теории в онтогенезе растений формируется относительно меньшее количество женских гамет, чем мужских, что эволюционно делает женские гаметы более устойчивыми к генетическим и средовым флуктуациям. Поэтому обычной реакцией растений на изменение условий выращивания является взаимопереход мужской фертильности и стерильности. Наряду с многочисленными факторами, вызывающими модификационную стерильность растений подсолнечника известен способ получения фертильных растений линии с гомозиготной генной мужской стерильностью при выращивании этой линии в условиях одновременно более короткого светового дня, низкой освещенности и низкой температуры [9].

Известно, что явление отсутствия выхода нормально развитых пыльников с пыльцой из венчика трубчатых цветков во время цветения корзинки подсолнечника было отмечено для образца декоративного подсолнечника ВИР-95. Эта морфологическая стерильность обозначена как тип М [2]. Описаны аналогичные аномалии в цветении подсолнечника при его выращивании в измененных фотопериодических условиях искусственного климата [3]. Однако специального исследования этого явления, включая возможность его использования в разработке метода гибридизации, не проводилось.

С физиологической точки зрения вызванное постоянным освещением полное отсутствие роста тычиночных нитей, в норме происходящего со скоростью около 4 мм за 2 часа, может объясняться недостатком фитогормонов роста типа ауксина при отсутствии темного времени суток. Известно, что лист является органом, воспринимающим фотопериод, а ауксин синтезируется в апикальных меристемах и молодых листьях, откуда он транспортируется в другие части растения, вызывая растяжение клеток. Нормальный рост пестика в этих условиях указывает на большую устойчивость гинецея к колебаниям экологических факторов. При этом физиолого-биохимические показатели пестика и пыльцевых трубок различны, в частности, у последних отмечено более высокое содержание ауксина [8].

Заключение. Воздействие 24-часового фотопериода в фазе цветения корзинки подсолнечника вызывает нарушение обычного протерандрического типа цветения. При этом наблюдается отсутствие роста тычиночных нитей трубчатых цветков последующего за воздействием дня цветения при нормальном росте пестика и циркадной зональности цветения корзинки. Наличие нормально развитых пыльников с пыльцой, не выходящих из венчика, приводит к образованию морфологически однополых женских цветков. Отсутствие самоопыления в корзинках с такими цветками с аномальным андроцеем позволяет классифицировать полученные растения как особи с фотопериодической мужской самостерильностью, или ФМС.

ФМС-аналоги фертильных линий могут эффективно использоваться в качестве материнской формы при получении экспериментальных гибридов в условиях камер и теплиц фитотрона. Выход ФМС-растений составляет 100 %, степень гибридности семян

- 100 % при отсутствии самоопыления материнской формы.

Благодарности

Авторы благодарны заведующему фитотронно-тепличного комплекса ВНИИМК кандидату с.-х. наук Ветру И. И. за техническое содействие в выращивании растений и поддержание экологических факторов в экспериментальных режимах. Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 03-04-96759 конкурса р2003юг.

Литература

1. Анащенко А. В. Мужская стерильность модификационного характера у подсолнечника.- Сельскохозяйственная биология. - 1968. - Т. III. - № 4. - С. 544-549.

2. Анащенко А. В. Изучение мужской стерильности у подсолнечника // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - Л., ВИР, 1972. - Т. 46. - Вып. 3. - С.120-131.

3. Гвоздева С. Н. Особенности роста и формирования продуктивности подсолнечника в условиях регулируемой внешней среды // Дис. на соиск. учен. степ. канд. с.-х. наук. - Краснодар, 1980. - 141с.

4. Гундаев А. И. Основные принципы селекции подсолнечника // Генетические основы селекции растений. - М.: Наука, 1977. - С. 417-465.

5. Дарвин Ч. Действие перекрестного опыления и самоопыления в растительном мире. - М.-Л.: ОГИЗ-СЕЛЬХОЗГИЗ, 1939. - 339 с.

6. Джуемин Х. Е. Способ получения гибридов растений. Патент РФ № 2210884 публ. 27.08.2003 по заявке № 97120996/13 от 20.05.1996.

7. Дьяков А. Б. Адаптация к климату и почвам // Биология, селекция и возделывание подсолнечника. - М.: Агропромиздат, 1991. - С. 16-18.

8. Лебедев С. И. Физиология растений. - М.: Колос, 1982. - 463 с.

9. Плотников В. А. Способ размножения линий подсолнечника с ядерной мужской стерильностью. А.с. СССР №1529484 по заявке № 4395259/30-13 от 20.01.88.

10. Сациперов Ф. А. Опыт скрещивания двух форм подсолнечника (Helianthus annuus L. x H. argophyllus A. Gray) // Труды по прикладной ботанике. - Петроград, 1916.

- № 9. - С. 207-247.

11. Синская Е. Н. Исследование биологии развития и физиологии масличных и эфиромасличных культур // Масличные и эфиромасличные культуры. - М.: Изд-во с.-х. литературы, 1963. - С. 225-234.

12. Федин М. А., Кузнецова Т. А., Альсинг Т. К., Воскобойник Л. К., Федорен-ко Т. С., Кабачник М. И., Мастрюкова Т. А., Генкина Г. К., Коган А. С. и Пискунова Е. М. Гаметоцидная композиция для подсолнечника. А.с. СССР № 1743496 публ. 30.06.92 по заявке № 3751948/15 от 20.03.84.