СПОСОБ УДАЛЕНИЯ ВИРУСОВ ИЗ КРОВИ ПОСРЕДСТВОМ ЛЕКТИН-АФФИННОГО ГЕМОДИАЛИЗА
METHOD OF ISOLATING VIRUS FROM BLOOD BY LECTIN HEMODIALYSIS

По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной патентной заявкой США № 60/440771, поданной 17 января 2003 г., раскрытие которой включено в данную заявку в качестве ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области терапевтических методов лечения вирусных инфекций.
Уровень техники
Описано большое количество вирусов, которые являются патогенными для человека. Среди данных вирусов имеется много таких, на которые не действуют ни лекарственные препараты, ни вакцины. В тех случаях, когда медикаментозная терапия дает эффект, возникновение устойчивых мутаций и побочных эффектов лекарственных препаратов зачастую ограничивают эффективность терапии. Примеры таких вирусов включают вирусы гепатита С и иммунодефицита человека (ВИЧ).
ВИЧ является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Он избирательно инфицирует клетки иммунной системы, нарушая таким образом иммунные реакции инфицированного лица. Подсчитано, что имеется свыше 1 миллиона ВИЧ инфицированных лиц в Соединенный Штатах и более 13 миллионов во всем мире.
Течение заболевания при ВИЧ инфекции обычно состоит из продолжительного бессимптомного состояния, за которым следует истощение Т4 лимфоцитов, что делает пациента подверженным инфекциям, вызываемым условно патогенными организмами и новообразованиями.
Репликация ВИЧ-1 происходит преимущественно в CD4+ лимфоцитах, большинство из которых локализуется в лимфоидных органах таких, как периферические лимфатические узлы и селезенка. ВИЧ-1 может также обнаруживаться в макрофагах и макрофагоподобных клетках таких, как клетки микроглии в центральной нервной системе (Cohen et al. Immunol Rev 159: 31-48 1997).
10
Уровень ВИЧ-1 в плазме и присутствие ВИЧ-1 инфицированных лимфоцитов строго коррелирует с клиническим состоянием ВИЧ-1 инфицированного пациента (Ferre et al.J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 10 (Suppl 2): S51-56, 1995 O'Brien et al. N Engl J Ned 334(7), 426-431, 1996). Время полужизни циркулирующих вирионов составляет 6 часов, тогда как время полужизни клеток, инфицированных ВИЧ-1, в периферической крови составляет 1,6 дня. Более 10 вирионов могут высвобождаться в кровоток каждый день (Ho et al. J Biol Regul Homeost Agents 9(3): 76-77, 1995; Ho et al. Nature 373 (6510):123-126, 1995; Wei et al. Nature 373 (6510):117-122, 1995). Способность иммунной системы хозяина держать ВИЧ инфекцию под контролем и ограничивать клинические симптомы прямо пропорциональна вирусной нагрузке. Антиретровирусные преператы, нуклеозидные аналоги, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеазы нацелены на снижение вирусной нагрузки таким образом, чтобы иммунная система могла контролировать или устранять остаточную инфекцию (Fauci, Harrisons Principles of Internal Medicine: 1791-1856, 1998).
Медиатором ВИЧ инфекции является gp120, который связывается с CD4 так же, как и с поверхностным хемокинным рецептором. Внутри клетки вирион находится без оболочки, и РНК вируса обратно транскрибируется в двухцепочечную ДНК. Провирусная ДНК попадает в ядро клетки, встраивается в геном хозяина и транскрибируется в вирусные РНК, которые транслируются в белки вируса. Зрелые вирионы проходят сборку и высвобождаются из клетки посредством отделения (Fauci et al. Ann Intern Med 124(7); 654-663, 1996). Погибающая клетка может также высвободить все свое содержимое, включая интактные вирионы и их фрагменты, в кровь. Таким образом, циркулирующая кровь ВИЧ-1 инфицированного лица содержит интактные вирионы и белки вируса, конкретно токсические поверхностные белки вируса.
Критерием СПИДа является постепенная потеря CD4+ Т-клеток, которые в конечном счете покидают иммунную систему, неспособную защитить от инфекций, вызываемых условно патогенными организмами. Несмотря на то, что четкое понимание механизма, посредством которого ВИЧ вызывает СПИД, отсутствует, клинические данные свидетельствуют от том, что в дополнение к потере инфицированных Т-клеток погибает большое количество неинфицированных Т-клеток и что производные от ВИЧ оболочечные белки оказываются непосредственно вовлечеными.
in vitro
Главный оболочечный гликопротеин ВИЧ gp120 продемонстрировал глубоко проникающие биологические эффекты . Gp120 заставляет CD4+ Т-клетки подвергаться апоптозу, и связывание gp120 с CD4+ клетками в присутствии антиоболочечных антител и комплемента опсонизирует клетки, нацеливая их на выведение из системы. Комбинированным эффектом является разрушение неинфицированных иммунных клеток. В дополнение оболочечные белки ВИЧ вовлекались в ВИЧ-зависимую гаммаглобулинемию. У пациентов, страдающих СПИД, уровень gp120 при измерении составил в среднем 29 нг/мл, что на порядок превышает величину концентрации вируса.
На сегодняшний день не существует способа излечения от ВИЧ инфекции. В отношении борьбы с ВИЧ были одобрены обратная транскриптаза и ингибиторы протеаз. Типичные схемы лечения используют комбинации одобренных лекарственных препаратов и носят название HAART (высокоактивная антиретровирусная терапия). Хотя FDA одобрило более 16 лекарственных препаратов и комбинаций лекарственных препаратов для лечения ВИЧ инфекции, появление устойчивых к лекарственным препаратам мутантов и присутствие неподдающихся лечению вирусных резервов (например, в запоминающих Т-клетках) ограничило их эффективнсть. К сожалению, не появлялось эффективной вакцины против ВИЧ, отчасти, в связи с быстрой мутацией генома ВИЧ и недосягаемостью иммуногенных эпитопов белков вируса. Таким образом, существует насущная потребность в новых видах лечения.
Экстракорпоральные способы лечения обеспечивают терапевтические методы, которые могут быть использованы для лечения системных заболеваний. Экстракорпоральная перфузия плазмы через протеин А, плазмоферез и лимфаферез использовались все как иммуномодулирующее лечение ВИЧ инфекции и тромбоцитопении, являющейся ее следствием (Kiprov et al. Curr Stid Hematol Blood Transfus 57: 184-197, 1990; Mittelman et al. Semin Hematol 26(2 Suppl 1):15-38, 1989; Snyder et al Semin Hematol 26(2 Suppl): 31-41; Snyder et al. Aids 5(10): 1257-1260, 1991). Все данные терапевтические методы были предложены как работающие на основе устранения иммунных комплексов и других гуморальных медиаторов, которые вырабатываются в процессе ВИЧ инфекции. Они не устраняют непосредственно вирус иммунодефицита человека. Экстракорпоральный фотоферез был испытан в предварительных экспериментах в качестве механизма снижения вирусной репликации (Bisaccia et al. J Acquir Immune Defic Syndr 6(4): 386-392, 1993; Bisaccia et al Ann Intern Med 113(4): 270-275, 1990). Однако ни один из данных методов лечения не устраняет эффективно как вирус, так и белки вируса.
in vivo
Были предложены способы хроматографии для удаления ВИЧ из компонентов крови. В 1997 г. Motomura et al. предложили соли сульфонированного ионообменного материала для удалении ВИЧ и относящихся к нему веществ из физиологических жидких сред (патент США № 5667684). Takashima и коллеги (патент США № 5041079) предоставляют ионообменные вещества, содержащие твердое вещество со слабокислой или слабощелочной поверхностью для экстракорпорального удаления ВИЧ из физиологических жидких сред пациента. Оба описания сходны с работой Porath и Janson (патент США № 3925152), которая описывает способ отделения смеси заряженных коллоидных частиц, например, вариантов вирусов посредством пропускания смеси через адсорбент, состоящий из нерастворимого органического полимера, содержащего амфотерные заместители, состоящие как из основных азотосодержащих групп, так и кислых карбоксилатных или сульфонатных групп (патент США № 3925152). Однако ни один из данных хроматографических материалов не является селективным в отношении вирусов и будет, очевидно, удалять многие другие жизненно необходимые вещества. Таким образом, они не являются эффективными для очищения крови .
Иммуносорбционные способы также были предложены для лечения вирусных инфекций. В 1980 г. Terman и др. описали аппарат для плазмофереза для экстракорпорального лечения заболеваний, включающий в себя устройство, содержащее иммуноадсорбент, зафиксированный на спиральной мембране с большой площадью поверхности для удаления патогенных веществ (патент США № 4215688). Данное устройство не предусматривает способов непосредственного очищения крови и требует наличия иммунологически реактивных веществ для токсичных соединений. В 1997 г. и 1988 г. Ambrus и Horvath описали систему очищения крови, основанную на антитело- или антиген-захватывающем матриксе, встроенном на внешней поверхности асимметричной, проницаемой для токсинов мембране (патенты США под номерами 4714556; 4787974). Однако в данном описании не было приведено ни одного примера устранения патогенного микроорганизма. В 1991 г. Lopukhin et al. сообщили о том, что антисыворотка кролика противодействовала белкам ВИЧ при присоединении к сефарозе 4B или диоксиду кремния и может быть использована для экстракорпорального удаления белков ВИЧ из крови кролика, инфицированного рекомбинантными белками ВИЧ (Lopukhin et al. Vestn Acad Med Nauk SSSR: 11: 60-63, 1991). Однако данная стратегия оказалась неэффективной, поскольку она требовала экстракорпоральной адсорбции крови и не обеспечивала механизма удаления свободных частиц вируса иммунодефицита человека из крови (Lopukhin et al., указано выше). Патент США под номером 6528057 описывает удаление вируса и нуклеиновых кислот вируса с использование антител и антисмысловой ДНК.
Galanthus nivalis
Galanthus nivalis
Narcissus pseudonarcissus
Narcissus pseudonarcissus
Nostoc ellipsosporum
in vitro
in vitro
Лектины являются белками, которые селективно связываются с полисахаридами и гликопротеинами и широко представлены у растений и животных. Несмотря на то, что многие являются недостаточно специфичными для того, чтобы быть эффективными, недавно было обнаружено, что определенные лектины являются высокоизбирательными в отношении оболочечных вирусов (De Clercq. et al. Med Res Rev 20(5): 323-249, 2000). Среди лектинов, которые обладают данным свойством, имеются такие, которые были получены из  в виде агглютинина  (“GNA”), из  в виде агглютинина  (“NPA”) и лектин, полученный из сине-зеленых водорослей , называемый “циановирином” (Boyd et al. Antimicrob Agents Chemother 41(7): 1521-1530, 1997; Hammar et al. Ann NY Acad Sci 724: 166-169, 1994; Kaku et al. Arch Biochem Biophys 279(2): 298-304, 1990). GNA является нетоксичным и достаточно безопасным настолько, что он может быть внедрен в полученные посредством генной инженерии рис и картофель (Bell et al. Transgenic Res 10(1): 35-42, 2001; Rao et al. Plant J 15(4): 469-477, 1998). Данные лектины связываются с гликопротеинами, имеющими высокое содержание маннозы, что обнаружено в поверхностных белках ВИЧ (Chervenac et al. Biochemistry 34(16): 5685-5695, 1995). GNA используется в ELISA для анализа gp120 ВИЧ в плазме человека (Hinkula et al. J Immunol Methods 175(1): 37-46, 1994; Mahmood et al. J Immunol Methods 151(1-2): 9-13, 1992; Sibille et al. Vet Microbiol 45(2-3): 259-267, 1995) и оболочечных белков кошачьего вируса иммунодефицита (FIV) в сыворотке (Sibille et al. Vet Microbiol 45(2-3): 259-267, 1995. Несмотря на то, что GNA связывается с оболочечными гликопротеинами ВИЧ (тип 1 и тип 2) вируса иммунодефицита обезьяны (SIV) (Gilljam et al. AIDS Res Hum Retroviruses 9(5): 431-438, 1993) и подавляет рост патогенных микроорганизмов в культуре (Amin et al Apmis 103(10): 714-720, 1995; Hammar et al. AIDS Res Hum Retroviruses 11(1): 87-85, 1995), подобные исследования  не отражают комплексную белковую среду, обнаруженную в образцах крови ВИЧ инфицированных. Следовательно, неизвестно, способен ли лектин, связывающий гликопротеины с высоким содержанием маннозы , связываться с подобными молекулами в ВИЧ инфицированных образцах. Напротив, в целом считается, что высокое содержание антител к gp120, обычно присутствующее у ВИЧ инфицированных лиц, будет секвестировать гликопротеиновые участки с высоким содержанием маннозы, с которыми связываются лектины такие, как GNA.
in vivo
Таким образом, несмотря на то, что лектины известны как связывающие вирусную оболочку гликопротеинов, ранее не было разработано ни одного способа с использованием лектинов для непосредственой адсорбции ВИЧ или других оболочечных вирусов из крови с применением диализа или плазмофереза. Следовательно, существует насущная потребность в новых терапевтических подходах к лечению ВИЧ и других вирусных инфекций. Конкретно, имеется необходимость в разработке новых подходов для снижения вирусной нагрузки для того, чтобы повысить эффективность других видов лечения и/или иммунную реакцию.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу использования лектина, который связывается с патогенными микроорганизмами, имеющими гликопротеины с высоким содержанием маннозы, или их фрагментами для удаления их из инфицированной крови или плазмы в экстракорпоральной установке. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ уменьшения вирусной нагрузки у человека, включающий стадии получения крови или плазмы у данного лица, пропускание крови или плазмы через пористую мембрану из полых волокон, в которой молекулы лектина иммобилизованы внутри пористой внешней части мембраны, сбор пропущенной крови или плазмы и реинфузия пропускаемой крови или плазмы данному лицу.
Пропускание крови через пористую мембрану из полых волокон с иммобилизованным лектином заставляет вирионы и их фрагменты, содержащие гликопротеины с высоким содержанием маннозы, связываться с лектинами, снижая, таким образом, вирусную нагрузку в выходящем потоке. В одном воплощении данное изобретение использует лектины, которые связывают вирусные оболочечные белки или многих подтипов ВИЧ типа 1 и типа 2 и SIV. Способ настоящего изобретения снижает количество вирионов в крови и быстро и эффективно сокращает уровень вирусных поверхностных белков в инфицированной крови, которые могут являться токсичными. Для специалистов в данной области будет очевидным, что способ будет способствовать устранению других инфекций, часто возникающих одновременно с ВИЧ-1, таких как вирус гепатита С (HCV) (Fauci et al., 1998 выше).
Таким образом, целью данного изобретения является предоставление метода для снижения вирусной нагрузки в крови лица, инфицированного вирусом. В одном воплощении вирионы или их белковые фрагменты или их комбинации удаляются из крови лица, инфицированного вирусом.
Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление способа снижения вирусной нагрузки в крови посредством экстракорпоральной циркуляции крови через полые волокна, содержащие иммобилизованные лектины, обладающие аффинностью к вирусным гликопротеинам с высоким содержанием маннозы.
Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление устройства, содержащего полые волокна, в которых внешняя поверхность волокон находится в непосредственной близости к иммобилизованным лектинам, обладающим специфической аффинностью к гликопротеинам с высоким содержанием маннозы у вирусов или других патогенных микроорганизмов.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет собой схематическую иллюстрацию продольного сечения аффинного картриджа.
Фиг.2 представляет собой схематическую иллюстрацию горизонтального сечения в плоскости 2 фиг.1.
Фиг.3 представляет собой иллюстрацию канала фиг.2. Структура мембраны полых волокон 40 состоит из трубчатого участка, содержащего сравнительно плотную ультрафильтрационную мембрану 42 и сравнительно пористую внешнюю мембрану 44, в которой могут находиться аффинные молекулы 46 такие, как лектины.
Фиг.4 представляет собой графическое представление удаления gp120 из ВИЧ нагруженного физиологического солевого раствора. Исходно gp120 составлял 500 нг/мл в PBS (1,6 мл/цикл). Gp120 подвергают рециркуляции через колонку, содержащую 0,2 мл GNA агарозы в сравнении с контролем - сефарозой 4В при скорости 0,5-0,58 мл/мин при комнатной температуре.
2
Фиг.5 представляет собой графическое представление удаления иммунных комплексов gp120 из плазмы ВИЧ инфицированного человека. Исходно gp120 составляет 500 нг/мл в человеческой ВИЧ+ плазме (1,6 мл/цикл). Тестирование осуществляли с помощью 10 мкг на лунку GNA/NPA планшета для связывания gp120 иммунных комплексов, обнаруживаемых посредством овечьего антитела против человеческого IgG. Плазма подвергалась рециркуляции через колонку Glen Research, содержащую 0,2 мл GNA агарозы, по сравнению с контролем - сефарозой 4В, при скорости 0,5-0,58 мл/мин при комнатной температуре. Линии представляют собой наибольшее соответствие теоретической экспоненциальной зависимости R=0,91 для опыта (О) и линейную зависимость для контроля ().
2
Фиг.6А и 6В демонстрируют удаление нативного ВИЧ на GNA агарозе. Фиг.6А представляет собой графическое представление плазмоферезной экспоненциальной кривой, где R=0,90 (за исключением одной точки, соответствующей 22 часам). Фиг.6В представляет собой графическое представление в логарифмических координатах исходной скорости удаления, где время полувыведения ~0,9 часа. Использовали насос Conditions Maserflex, имеющий силиконовые трубки #14 (1,1 мл/мин). Исходный объем образцов плазмы составил 3 мл (100000 копий на мл (CPM) BBI ER8-03030-0002 нативного ВИЧ). Аликвотный объем составляет 250 мкл плазмы для отделения РНК. Осуществляют RT-PCR (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени с красителем-«свидетелем» Sybr green. Термоциклирование 95, 60, 72, 83°С (15, 30, 60 сек, интервал считывания 6 сек). Ct вычисляли из первичной кривой при Т=20.
2
Фиг.7 представляет собой графическое представление удаления gp120 из ВИЧ+ крови. Исходно gp120 составляет 100 нг/мл в плазме ВИЧ+ человека. Тестирование осуществляли с помощью 0,1 мкг/лунку GNA-NPA планшета с иммунными комплексами, разрушенными кислотным детергентом перед тестированием. Кровь подвергают рециркуляции через колонну Microkros, содержащую 0,6 мл GNA в сравнении с контролем - сефарозой 4В. Скорость потока составляет 0,9 мл/мин при 37°С с использованием насоса Masterflex (1 об/мин) и трубок Pharmed 6485-16. Линии представляют собой наибольшее соответствие теоретической экспоненциальной зависимости R=0,91 для опыта () и линейную зависимость для контроля (О).
2
Фиг.8 представляет собой графическое представление очищения крови, инфицированой вирусом гепатита С. Кровь подвергаеют рециркуляции через колонну Microkros, содержащую 0,6 мл GNA агарозы в сравнении с контролем - сефарозой 4В. Скорость потока составляет 0,5 мл/мин при комнатной температуре с использованием насоса Masterflex (1 об/мин) и трубок Pharmed 6485-16. Линии представляют собой наибольшее соответствие теоретической экспоненциальной зависимости R=0,85.
Подробное описание изобретения
Термин «вирусная нагрузка», как используется здесь для целей описания и в формуле изобретения, относится к количеству вирусных частиц или их токсичных фрагментов в физиологической жидкой среде такой, как кровь или плазма. Вирусная нагрузка, соответственно, относится к количеству вирусных частиц в организме. Вирусная нагрузка, таким образом, может являться измерением любого из разнообразия показателей присутствия вирусных частиц в организме таких, как количество вирусных копий на единицу объема крови или плазмы или единиц белков вируса или его фрагментов на единицу объема крови или плазмы.
Термин «гликопротеин с высоким содержанием маннозы», как используется здесь для целей описания и в формуле изобретения, относится к гликопротеинам, имеющим манноза-маннозные связи в виде α-1→3 или α-1→6 манноза-маннозных связей. Отдельные примеры таких лектинов включают GNA, NPA, циановирин и конконавалин А (ConA).
Настоящее изобретение относится к способу использования лектина для удаления патогенных микроорганизмов или их фрагментов из инфицированной крови или плазмы в экстракорпоральной установке. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет способ уменьшения вирусной нагрузки у человека, включающий стадии получения крови или плазмы у данного лица, пропускания крови через пористую мембрану из полых волокон, в которой молекулы лектина, которые связываются с гликопротеинами с высоким содержанием маннозы, иммобилизованы внутри пористой внешней части мембраны, сбор пропускаемой крови или плазмы и реинфузии пропущенной крови или плазмы и реинфузия пропущенной крови данному лицу.
В предпочтительном воплощении способ настоящего изобретения реализуется с использованием аффинного картриджа, с применением устройства, проиллюстрированного на фиг.1. Устройства данного общего типа раскрыты в патентах США под номерами 4714556, 4787974 и 6528057, раскрытие которых включено в данную заявку в качестве ссылки. В данном устройстве кровь пропускается через просвет канала ультрафильтрационной мембраны из полых волокон, которая находится в непосредственном соприкосновении, на не смачиваемой кровью стороне мембраны с иммобилизованными лектинами, которые образуют средство для приема и иммобилизации вирусов и их токсических инфекционных фрагментов. Таким образом, устройство удерживает интактные вирионы и вирусные гликопротеины, связанные лектином, однако позволяя другим компонентам проходить через просвет канала.
ВИЧ является опытно-тестируемым вирусом, для которого описано данное изобретение, однако данное изобретение может быть адаптировано для удаления любого циркулирующего в крови вируса. Устройство, описанное подробно на фиг.1-3, включает в себя множество каналов полых волокон ультрафильтрационнной мембраны, которые образуют фильтрационную камеру. Впускное отверстие и отверстие для выходящего потока сообщаются с фильтрационной камерой. Ультрафильтрационная мембрана является предпочтительно анизотропной мембраной с плотной или удерживающей стороной, обращенной к току крови. Мембрана традиционно сформирована из любых типов полимеров, известных в уровне техники, например полисульфона, полиэфирсульфона, полиамидов, полиимидов, ацетата целлюлозы и полиакриламида. Предпочтительно мембрана обладает порами диаметром 200-500 нм, которые обеспечивают возможность прохождения интактных вирусов и вирусных частиц и фрагментов (например, ВИЧ вирионов, диаметром 110 нм), однако не для большинства клеток крови (красных кровяных клеток 2000 нм в диаметре, лимфоцитов 7000-12000 нм в диаметре, макрофагов 10000-18000 нм в диаметре). Схема данного устройства показана на фиг.1. Устройство содержит картридж 10, содержащий камеру обработки крови 12, образованную внутренней стеклянной стенкой 14. Вокруг камеры 12 имеется необязательная внешняя камера 16. Циркуляция регулирующей температуру жидкости может осуществляться в камере 16 через отверстие 18 и из отверстия 20. Устройство включает в себя входное отверстие 32 для крови и выходное отверстие 34 для выходящего потока жидкой среды. Устройство также предоставляет одно или более отверстий 48 и 50 для получения доступа к внеканальному пространству в картридже. Как показано на фиг.1 и 2, камера 12 содержит множество ультрафильтрационных мембран 22. Данные мембраны предпочтительно имеют внутренний диаметр 0,3 мм и внешний диаметр 0,5 мм. Фиг.3 представляет поперечное сечение канала 22 и показывает анизотропную природу мембраны. Как показано на фиг.3, структура из полых волокон 40 состоит из единственного полимерного материала, который сформирован в трубчатый участок, содержащий сравнительно плотную ультрафильтрационную мембрану 42 и сравнительно пористую внешнюю мембрану 44, в которой могут находиться иммобилизованные лектины 46. При работе устройства раствор, содержащий лектины, загружается в устройство через отверстие 48. Лектинам предоставляется возможность иммобилизироваться на внешней стороне 22 мембраны фиг.2. Несвязанные лектины могут быть собраны из отверстия 50 посредством промывания солевым раствором или другими растворами.
В способе настоящего изобретения кровь, содержащая вирусные частицы и/или их фрагменты, забирается у пациента и вступает в контакт с ультрафильтрационной мембраной. В одном предпочтительном воплощении кровь разделяется на ее плазменные и клеточные компоненты. Плазму затем приводят в контакт с лектинами для удаления вирусных частиц и их фрагментов посредством связывания между вирусными гликопротеинами с высоким содержанием маннозы и лектинами. Плазма затем может быть вновь объединена с клеточными компонентами и возвращена пациенту. Альтернативно клеточные компоненты могут быть возвращены пациенту отдельно. Лечение может периодически повторяться до тех пор, пока желаемая реакция не будет достигнута. Например, лечение может проводиться в течение 4 часов один раз в неделю.
Способ иммобилизации ферментов, хелатирующих агентов и антител в диализоподобных картриджах разработан (Ambrus et al. Science 201(4358): 837-839, 1978; Ambrus et al. Ann Intern Med 106(4): 531-537, 1987; Kalghatgi et al. Res Commun Chem Pathol Pharmacol 27(3): 551-561, 1980) и включен в данную заявку в качестве ссылки. В данных картриджах может осуществляться непосредстванно перфузия крови пациентов посредством прямого венозного доступа, и она может быть возвращена пациентам без дополнительных манипуляций. Альтернативно кровь может быть разделена на плазменные и клеточные компоненты посредством стандартных способов. Клеточные компоненты могут быть объединены с плазмой перед реинфузией, или клеточные компоненты могут подвергаться реинфузии отдельно. Вирусная нагрузка может быть оценена в выходящем из картриджа потоке жидкой среды посредством стандартных способов, таких как ELISA, и амплификацией нуклеиновых кислот и способов обнаружения. Прототипные картриджи используются для метаболизирования избыточного фенилаланина (Kalghatgi et al., 1989, указано выше; Ambrus, 1978, указано выше) или для удаления избыточного алюминия из крови пациента (Anthone et al. J Amer Soc Nephrol 6: 1271-1277, 1995). Все иллюстрации приготовления белков для иммобилизации на полых волокнах для способа настоящего изобретения представлены в патантах США под номерами 4714556 и 4787974, 5528057.
Для связывания лектина с ультрафильтрационной мембраной полимеры ультрафильтрационной мембраны вначале активируются, т.е. делаются поддающимися химическому соединению с белками посредством использования процессов, известных в существующем уровне техники. Любые различные полимеры могут быть использованы. Для получения реакционноспособного полимера полиакриловой кислоты могут, например, использоваться карбодиимиды (Valuev et al., 1998, Biomaterials, 19:41-3). С того момента как полимер является активированным, лектины могут быть прикреплены непосредственно или посредством линкера для образования во всех случаях аффинного матрикса. Подходящие связующие агенты включают в себя, но не ограничиваются, авидин, стрепавидин, биотин, протеин А и протеин G. Лектины могут также быть непосредственно связаны с полимером ультрафильтрационной мембраны с использованием связывающих агентов таких, как бифункциональные реагенты, или могут быть связанными опосредованно. В предпочтительном воплощении GNA, ковалентно связанный с агарозой, может быть использован для образования аффинного матрикса.
Следующие примеры представлены для иллюстрации данного изобретения и не предназначены являться ограничивающими.
Пример 1
3
Данный пример демонстрирует получение аффинного матрикса с использованием GNA, ковалентно связанного с агарозой, с использованием бромистого циана. Агароза, активированная бромистым цианом (CNBr), использована для непосредственного связывания по существу согласно Cuatracasas, et al. Proc Natl Acad Sci USA 61(2): 636-643, 1968). В кратком изложении, 1 мл GNA в концентрации 10 мг/мл в 0,1 M NaHCO pH 9,5 добавляют к 1 мл агарозы, активированной CNBr, (Sigma, St Louis, MO) и оставляют для протекания реакции на ночь в холодных условиях. После завершения реакции непрореагировавшие материалы аспирируют и связанную с лектином агарозу тщательно промывают стерильным холодным PBS. Лектин-агарозный аффинный матрикс затем хранится в холодных условиях до готовности к использованию. Альтернативно, GNA агароза является коммерчески доступной от Vector Labs (Burlingame, CA).
Пример 2
3
Данный пример демонстрирует получение лектин-аффинного матрикса с использованием GNA, ковалентно связанного со стеклянными шариками посредством основания Шиффа и восстановлением цианоборгидридом. Лектиновый аффинный матрикс из диоксида кремния получают посредством модификации способа Hermanson (Hermanson. Bioconjugate Techniques: 785, 1996). GNA лектин растворяют до окончательной концентрации белка, равной 10 мг/мл, в 0,1 М растворе бората натрия с рН 9,5 и добавляют к альдегидным производным на шариках из диоксида кремния (BioConnexant, Austin TX). Реакция является наиболее эффективной при щелочных значениях рН, однако будет протекать при рН 7-9, и в обычно проводится при 2-4-кратном преобладании GNA над количествами участков связывания. К данной смеси добавляют 10 мкл 5 М NaCNBH в 1 н NaOH (Aldrich, St Louis, MO) на 1 мл реакции связывания и смесь оставляют для протекания реакции на 2 часа при комнатной температуре. При завершении реакции оставшийся непрореагировавший альдегид покрывают на поверхности стекла 20 мкл 3 М этаноламина с рН 9,5 на мл 1 реакции. Через 15 минут при комнатной температуре раствор, где протекает реакция, отфильтровывают и непрореагировавшие белки и реагенты удаляют посредством тщательного промывания в PBS. Матрикс хранят в холодильнике до готовности к использованию.
Пример 3
Данный пример демонстрирует приготовление GNA, ковалентно связанного с аминоцелитом c использованием глутаральдегида. Аминоцелит получают посредством взаимодействия целита (диатомит, содержащий силикаты) в течение всей ночи с 5% водным раствором аминопропилтриэтоксисилана. Аминированный целит промывают для удаления избыточных реагентов водой и этанолом, и просушивают всю ночь до получения грязно-белого порошка. Один грамм порошка затем суспендируют в 5 мл 5% глутаральдегида (Sigma) в течение 30 минут. Избыточный глутаральдегид затем удаляют посредством фильтрации и промывания в воде до тех пор, пока альдегид не перестанет обнаруживаться в промывочной жидкости, с использованием реагента Шиффа. Осадок фильтрования затем ресуспендируют в 5 мл боргидрид-связывающем буфере Sigma, содержащем 2-3 мг/мл GNA, и реакцию оставляют протекать в течение всей ночи при комнатной температуре. По завершении реакции непрореагировавший GNA отмывают и непрореагировавший альдегид аминируют этаноламином, как описано выше. После окончательного промывания в стерильном PBS материал хранится на холоде до готовности к использованию.
Пример 4
Данный пример демонстрирует получение приведенного в качестве примера лектин-плазмоферезного устройства. Подготавливают небольшие по объему фильтрующие картриджи (Glen Research, Silverton, VA), содержащие 0,2 мл лектиновой смолы, запечатанной и приведенной в равновесие 5-10 объемами колонок стерильного PBS. Картриджи используют немедленно.
Пример 5
Данный пример демонстрирует получение GNA лектин-аффинного устройства для гемодиализа. Очиститель крови от вирусов изготавливают посредством накачивания суспензии из находящегося в виде частиц фиксированного GNA на агарозных шариках или целите в стерильном PBS буфере во внешний отсек диализной колонки из полых волокон с использованием шприца. Для образцов крови до 15 мл используют полиэфирсульфоновый картридж для диализа Microkros из полых волокон, оснащенный соединительными элементами Люэра (внутренний диаметр 200 мкм × внешний диаметр 240 мкм, диаметр пор 200-500 нм, внутренний объем ~0,5 мл), приобретенный от Spectrum Labs (Rancho Dominguez, СА). Картриджи, содержащие аффинную смолу, приводят в равновесие 5-10 объемами колонок стерильного PBS.
Пример 6
Данный пример демонстрирует удаление gp120 ВИЧ из физиологического солевого раствора c применением устройства для аффинного плазмофереза. Устройство для плазмофереза, описанное в примере 4, приводят в равновесие 5-10 объемами колонок стерильного PBS. Образец ~1,5 мл, содержащий gp120 (обычно 500 нг/мл), подвергают циркуляции через колонку при скорости потока, составляющей 0,5-0,6 мл/мин при комнатной температуре. Циркулирующий раствор тестируют на различных временных интервалах на присутствие gp120 и иммунных комплексов gp120, где это целесообразно.
Количественный анализ ELISA для gp120 ВИЧ-1 осуществлялся с использованием модификации способа Weiler (Weiler et al. J Virol Methods 32(2-3): 287-301, 1991). GNA/NPA планшеты были получены на плоских планшетах Greiner C посредством добавления 100 мкл белка (1-100 мкг/мл каждого из GNA или NPA в PBS) в каждую лунку и инкубирования в течение 2 часов при 37°С. Данные планшеты затем промывают в PBST (PBS, содержащий 0,01% Твин 20) и блокируют в казеин-блокирующем буфере в течение 1 часа при 37°С. Планшеты, не использованные сразу, хранятся до 2 недель при 4°С.
Для обнаружения свободного gp120, 100 мкл проб тестируемых растворов подвергают инкубированию в течение 1-2 часов при 37°С. После захвата пластины промывают в PBS и добавляют 100 мкл соответствующих меченных пероксидазой хрена (HRP) антител против gp120 (1:2500 в блокирующем буфере). После инкубирования в течение 1 часа при 37°С антисыворотку отсасывают и пластины промывают 4×300 мкл PBSTA и обнаруживают связанную HRP при помощи стабилизированного тетраметилбензидинового (TMB) субстрата (BioFx). Для определения иммунных комплексов и образования иммунных комплексов, после захвата, пластины промывают в PBS и добавляют 100 мкл аффинных очищенных HRP меченных овечьих антител против IgG человека (1:2500 в блокирующем буфере). После инкубирования в течение 1 часа при 37°С антисыворотку аспирируют и пластины промывают 4×300 мкл PBSTA. Связанную HRP обнаруживают при помощи тетраметилбензидина (TMB) (BioFx).
Фиг.4 показывает, что GNA агароза удаляет gp120 из буферного раствора с 99% эффективностью в течение <15 минут. Поскольку gp120 является сильно гликозилированным белком, который может связываться неспецифически с разнообразными поверхностями, не удивительно, что в контрольной колонке также оказывается связанным 85% введенного gp120.
Пример 7
Данный пример демонстрирует удаление gp120 из ВИЧ инфицированной плазмы с использованием устройства для лектин-аффинного плазмофереза. Устройство для плазмофереза, описанное в примере 4, приводят в равновесие 5-10 объемами колонок стерильного PBS. Образец плазмы, приблизительно 1,5 мл, содержащий gp120 (обычно 500 нг/мл), подвергают циркуляции через колонку при скорости потока 0,5-0,6 мл/мин при комнатной температуре. Циркулирующий раствор тестируют на разных временных интервалах на присутствие gp120 и иммунных комплексов gp120, где это целесообразно, как в примере 6.
Поскольку антитела против gp120 присутствуют в избытке в ВИЧ+ плазме, можно ожидать, что удаление gp120 из инфицированной плазмы окажется более трудноосуществимым, чем удаление из буферных растворов. Отчасти вследствие присутствия данных антител gp120, выявление в ВИЧ+ плазме и крови обычно показывает в лучшем случае сниженное количество gp120. Следовательно, для того чтобы измерить удаление, необходимо добавить gp120 в плазму инфицированного человека, чтобы предоставить образец для измерения. Измерение образцов с помощью ELISA подтверждает, что весь gp120, добавленный в данный образец, образует комплексы с антителами против gp120 (данные не показаны).
Фиг.5 показывает, что GNA агарозная аффинная смола эффективно удаляет gp120 в иммунных комплексах из ВИЧ инфицированных образцов плазмы. Удаление является быстрым с кажущимся временем полупревращения, равным 20 минутам. Часть gp120 остается неудаленной (~10% gp120 исходных иммунных комплексов) даже через 7 часов и проявляет в испытании наличие фонового сигнала связывания IgG.
Пример 8
2,
Данный пример демонстрирует удаление ВИЧ вирионов из инфицированной плазмы с применением GNA плазмофереза. ВИЧ инфицированный образец плазмы (ER8-03030-0002, нативный ВИЧ, Boston Biomedica, Boston MA), содержащий 100000 копий/мл (cpm) вируса, подвергают циркуляции через 0,2 мл GNA агарозную колонку, описанную в примере 4. С интервалами отбирают 250 мкл аликвотного объема плазмы, и РНК вируса выделяют с использованием TRI-LS реагента, в соответствии с инструкцией производителей (MRC Corporation). РНК вируса иммунодефицита человека затем определяют количественно с использованием RT-PCR (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени и одноступенчатой реагентной системы Access 1 от Promega (Madison, WI) в реакционных объемах 25 мкл, содержащей 400 нМ праймеры SK432 и SK461 гена капсидных белков, краситель Sybr green (1:10000), 1×SCA блокирующий буфер, 3 мМ MgCl 400 мкМ dNTP и 10 мкл неизвестной РНК или РНК ВИЧ-1 из покрытых защитной РНК оболочкой стандартов (Ambion Austin TX). Амплификация и время реакции составили: ОТ (45 минут при 48°С) и ПЦР 40 циклов (94°С/15 сек, 62°С/30 сек, 72°С/60 сек, 83°С/интервал считывания) в термоциклизаторе Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA) в режиме реального времени, по существу, в соответствии с инструкциями производителей. При необходимости для подтверждения амплификации, 10 мкл аликвотного объема амплифицирующей смеси подвергают электрофорезу на агарозном геле 2% (вес/объем) (Sigma, квалитет для молекулярной биологии) в 0,5ЧТВЕ буфере с рН 8,3, содержащем 0,25 мкг/мл этидия бромида в течение 45 минут при 120 вольтах постоянного тока при комнатной температуре. Гели фотографируют с помощью УФ лампы для просвечивания гелей, где изображения последовательно оцифровывают и анализируют с использованием ImageJ.
2
Фиг.6А и 6В показывают, что GNA агароза эффективно удаляет ВИЧ вирионы. Фиг.6А является представлением в линейном масштабе графика данных, сводящегося к экспоненциальному затуханию (R=0,9). Кривая предсказывает по существу количественное удаление ВИЧ за приблизительно 10 часов. Фиг.6В представляет собой графическое представление в логарифмических координатах скорости удаления ВИЧ, которая дает расчетное время полувыведения ВИЧ, равное 0,9 часа. Удаление вируса происходит в первую очередь, как предполагалось, для GNA, превышающего по содержанию вирус. CPM показывает количество копий ВИЧ на 1 мл.
Пример 9
5
Данный пример демонстрирует удаление gp120 из ВИЧ инфицированной крови с использованием устройства для GNA лектин-аффинного гемодиализа. В связи с тем, что большинство образцов ВИЧ+ плазмы обладают низким или невыявляемым уровнем gp120, смоделированные образцы ВИЧ инфицированной крови получают посредством смешивания 5 мл свежеупакованных красных кровяных клеток типа O+ с 5 мл ВИЧ инфицированной плазмы (обычно 10 копий/мл), куда добавляют достаточное количество gp120 IIIB, чтобы создать образец 100 нг/мл.
Устройства для аффинного гемодиализа, описанные в примере 5, приводятся в равновесие 5-10 объемами колонок стерильного PBS. Контрольную колонку, содержащую только сефарозу 4В, готовят в качестве контроля. Инфицированный образец крови ~10 мл, содержащий gp120, подвергают рециркуляции через колонку со скоростью потока, равной 0,9 мл/мин, при 37°С с использованием перистальтического насоса Masterflex (1 об/мин) и силиконовых трубок Pharmed 6485-16. Тестирование циркулирующего раствора на присутствие свободного gp120 проводят на различных временных интервалах после кислотной денатурации и нейтрализации для разрушения иммунных комплексов.
1/2
Фиг.7 показывает, что по мере рециркуляции образцов крови через картридж, исходное содержание gp120, равное 100 нг/мл, снижается до фонового уровня за 4-6 часов (кажущееся t=22 минуты). Контрольный картридж удаляет gp120 очень медленно.
Пример 10
Данный пример демонстрирует удаление HCV из инфицированной крови с применением GNA лектин-аффинного гемодиализа. Для того чтобы показать широкую специфичность GNA лектинового удаления вирусов, авторы выполняют лектин-аффинный гемодиализ HCV инфицированной крови.
5
Устройства для лектин-аффинного гемодиализа, описанные в примере 4, приводятся в равновесие 5-10 объемами колонок стерильного PBS. Инфицированные HCV образцы крови получают посредством смешивания 1 мл свежеупакованных красных клеток типа O+ с 1 мл HCV инфицированной плазмы (обычно 10 копий/мл). Инфицированный образец крови подвергают рециркуляции через колонку со скоростью потока, равной 0,5 мл/мин при комнатной температуре с использованием перистальтического насоса Masterflex (1 об/мин) и трубок Pharmed 6485-16. Тестирование циркулирующего раствора на присутствие свободного вирусной РНК HCV проводилось в различных временные интервалах.
2
t
РНК вируса выделяют с использованием TRI-LS (MRC Corporation) из 100 мкл плазмы, в соответствии с инструкцией производителей. РНК вируса HCV затем определяют количественно с использованием RT-PCR c использованием реагентного набора Improm II от Promega (Madison, WI) в реакционных объемах 25 мкл, содержащего 400 нМ HCV специфические праймеры EY80 и EY78, краситель Sybr green (1:10000), 1×SCA блокирующий буфер, 3 мМ MgCl, 400 мкМ dNTP, по 0,2 единиц/мкл каждой из полимеразы Tfl и обратной транскриптазы AMV. Обычно используют 50 мкл смеси для растворения РНК, выделенной из 100 мкл плазмы, и смесь разделяют на два идентичных дублирующих образца. Амплификация и время реакции составили: ОТ (45 минут при 48°С) и ПЦР 40 циклов (94°С/15 сек, 62°С/30 сек, 72°С/60 сек, 83°С интервал считывания) в режиме реального времени в термоциклизаторе Smart Cycler (Cepheid, Sunnyvale, CA), по существу, в соответствии с инструкциями производителей. Количество вирусной РНК оценивают сравнением с сигналом стандартов вирусных РНК на начальной фазе реакции амплификации (С=20).
1/2
Фиг.8 показывает, что исходное содержание HCV, по мере рециркуляции образцов крови через картридж, снизилось приблизительно на 50% за 3 часа (кажущееся t=3 часа). Тип кривой вполне соответствует экспоненциальному затуханию.
Исходя из вышесказанного, для квалифицированных специалистов в данной области будет очевидным, что могут быть проведены разнообразные модификации вышеописанных способов и композиции без отхода от сущности и объема притязаний данного изобретения. Соответственно, данное изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отхода от его сущности или существенных признаков. Следовательно, представленные примеры и воплощения следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные и неограничивающие, и, следовательно, подразумевается, что все изменения, которые находятся в пределах значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения, будут охвачены.