КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ УЛУЧШЕНИЯ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ ТЕРАПИИ СРЕДСТВАМИ, ЗАВИСЯЩИМИ ОТ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVING DRUG THERAPY WITH METAL ION DEPENDANT AGENTS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Это описание изобретения заявляет преимущество приоритета предварительной заявки США №12/821,370, поданной 23 июня 2010 года, и Предварительной заявки на патент США №61/219,932, поданной 24 июня 2009 года, каждая из которых полностью включена в это описание изобретения посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Это изобретение, в целом, относится к композициям и методам, используемым в связи с испытанием и назначением определенных фармацевтических средств, в частности токсинов, зависящих от кофакторов, таких как нейротоксины клостридий.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Не ограничивая объема этого изобретения, существующий уровень техники в области, к которой относится это изобретение, описывается в связи с разработкой новых фармацевтических средств на основе летальных токсинов, таких как ботулинический токсин. Название болезни «ботулизм» происходит от латинского слова, означающего колбасу («botulus»), в связи со вспышкой смертности в Германии в 1800-х годах, вызванной недоваренной колбасой. Позже выяснилось, что ботулизм развивается из-за токсинов, вырабатываемых микроорганизмом Clostridium botulinum, впервые выделенным в 1895 году. С.botulinum является грамположительной, спорообразующей, анаэробной палочкой, распространенной в растениях, почве, воде и кишечном тракте животных. Ботулинический токсин был впервые выделен в чистом виде в 1928 году и принадлежит к наиболее токсичным из известных соединений. Ботулинические токсины вызывают паралич в четырех областях тела: нервно-мышечном синапсе, вегетативных ганглиях, парасимпатических постганглионарных нервных окончаниях и симпатических. постганглионарных нервных окончаниях, выделяющих ацетилхолин.
Были идентифицированы несколько разных штаммов клостридий, включая С.butyricum, С.baratii и С.argentinense, которые продуцируют отличающиеся как антигены формы фармакологически схожих ботулинических нейротоксинов (сокращенно обозначаемых как «ВТХ» или «BoNT»). В настоящее время известны восемь основных серотипов ботулинических нейротоксинов, вырабатываемых бактериями рода клостридий: А, В, С (C1 и С2), D, Е, F и G. Подтипы этих серотипов могут быть близкородственными или более отдаленными. Например, BoNT-A1 и А2 являются на 95% гомологичными, a BoNT-A3 and A4 соответственно на 81% и 88% гомологичны BoNT-A1. Ботулинический токсин типа A (BoNT-A) является наиболее сильным токсином, за ним, по степени убывания токсичности, следуют токсины типов В и F. Именно эти типы токсинов в настоящее время используются коммерчески.
Ботулинический токсин типа А («Окулинум», в настоящее время предлагается под маркой БОТОКС компанией Allergan, Inc.) был утвержден Управлением США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами в 1989 году для лечения блефароспазма (неконтролируемого моргания), страбизма (косоглазия), синдрома Мейжа (двустороннего блефароспазма с одновременным нарушением тонуса нижней части лица) и гемифациального спазма. Разрешение на лечение шейной дистонии, неврологического нарушения движений, вызывающего сильное сокращение мышц шеи и плеч, было получено в декабре 2000 года. Средство БОТОКС было разрешено в Великобритании для лечения подмышечного гипергидроза (избыточного потения) в 2001 году, и в том же году, БОТОКС получил разрешение в Канаде на использование для лечения подмышечного гипергидроза, очаговой мышечной спастичности и борьбы с морщинами на линии бровей. В 2002 году Управление США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами объявило об утверждении средства «БОТОКС Косметический» для временного улучшения внешнего вида умеренных и глубоких межбровных морщин (глабеллярных морщин). В июле 2004 года Управление США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами разрешило использовать БОТОКС в лечении первичного подмышечного гипергидроза.
Ботулинический токсин типа В (BoNT-B) также используется в разработках для клинического использования, и в настоящее время существуют несколько коммерчески доступных продуктов (например, МиоБлок в США и НейроБлок в Европе, от компании Solstice Neurosciences). Средство МиоБлок было в 2000 году утверждено Управлением США по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами в качестве средства для лечения шейной дистонии. Средство БОТОКС на основе ботулинического токсина типа А полагается в 50-100 раз более сильным, чем средство МиоБлок на основе ботулинического токсина типа В при использовании в любом конкретном виде лечения.
В настоящее время, ряд разных производителей во всем мире производят очищенный ботулинический токсин типа А под разными торговыми названиями, включая Ксеомин (Merz Pharma, Германия), Просайн (Институт биопродукции Ланжу, Китай) и Нейронокс (Медитоксин в Корее, Medy-Tox, Inc., Корея). Как и для другой продукции, следует определять биологическую активность новых партий. Это имеет особенно большое значение для таких лекарств, как ботулинический токсин, обладающий существенной токсичностью, после действия которого нормальная нейромышечная активность восстанавливается очень долго. Введенный внутримышечно ботулинический токсин действует на нервно-мышечный синапс и вызывает паралич мышц, подавляя выделение ацетилхолина из пресинаптических двигательных нейронов. Максимальный паралитический эффект наступает через 4-7 дней после инъекции. Примерно через 2 месяца после введения ботулинического токсина аксон начинает развиваться, и появляются новые ростки нервных окончаний, развивающиеся в направлении поверхности мышцы. Такие новые нервные ростки восстанавливают соединение двигательного нерва, и нервный паралич, как правило, проходит в течение 2-4 месяцев. Передозировка имеет достаточно большое значение, и период восстановления существенно удлиняется, поэтому при случайной передозировке используется противоядие (антивенин).
50
50
Дозы всех коммерчески доступных ботулинических токсинов выражают в виде единиц биологической активности. Одна единица ботулинического токсина соответствует рассчитанной медианной внутрибрюшинной летальной дозе (ЛД) для мышей. См. Hoffman RO, Helveston ЕМ. «Ботулин в лечении нарушений перистальтики у взрослых» Int Ophthalmol Clin 26 (1986) 241-50. Не будучи идеальной единицей, ЛД продолжает использоваться благодаря высокой чувствительности метода ее определения. Определение единицы относится ко всем формам коммерчески доступных токсинов несмотря на тот факт, что не был утвержден стандартизированный подход к испытанию активности соответствующего лекарственного вещества и различия в протоколах количественного определения мышиной ЛД50, используемых разными изготовителями, привели к значительным отличиям активности в единице дозы различных продуктов. Например, отношение биоэквивалентности марки ботулинического токсина типа А Диспорт (Ipsen Pharmaceuticals, Франция) к Ботоксу по данным различных исследований на пациентах с блефароспазмом и гемифациальным спазмом составляет величину от 2,5:1 до 4:1. Поэтому, указывая рекомендованную дозу ботулинического токсина, назначаемого по определенному показанию, важно указать конкретную марку использующегося токсина, так как единицы, приводимые на маркировке продукта, зависят от конкретного продукта и не являются взаимозаменяемыми. Дополнительные трудности возникают из-за того, что ботулинический токсин обладает большой и относительно подвижной молекулой. Важную роль играет правильное приготовление лекарственной формы непосредственно перед использованием, и такие лекарственные средства обладают достаточно ограниченным сроком хранения.
Ботулинический токсин может вызывать образование антител у людей, которое приводит к снижению действия токсина со временем. См. Frueh BR, et al. «Лечение блефароспазма ботулиническим токсином. Предварительное сообщение» Arch Ophthalmol 102 (1984) 1464. Полагают, что образование антител зависит от кумулятивной дозы, потенциала антителообразования одной дозы и промежутка времени между инъекциями. Так, полагают, что следует вводить наименьшую терапевтическую дозу с максимальным промежутком времени между последовательными инъекциями. Учитывая важность использования ботулинических нейротоксинов в лечении определенных заболеваний, в настоящее время исследуется использование ботулинического токсина типа F в лечении пациентов, у которых развилась иммунологическая сопротивляемость серотипам А и В.
Хотя ботулинические токсины эффективно действуют на большинство пациентов, терапевтический эффект может варьироваться в широком диапазоне, независимо от определяемого антителообразования, не только для разных лиц, но также и для разных сеансов лечения одного и того же пациента. Кроме того, некоторые группы пациентов оказались имеющими большую вероятность проявить слабую реакцию или вообще не проявить реакции на токсины. Например, до 30% пациентов старше 65 лет могут обнаруживать сниженную эффективность ботулинических токсинов. Может оказаться сложно распознать основания низкой реакции пациента на лечения, учитывая тот факт, что возможные объяснения включают исходные различия в активности лекарственных средств от разных изготовителей, возможность выработки пациентом антител, специфичных к токсину, а также возможность разложения продукта или его взбалтывание во время приготовления лекарственного средства непосредственно перед использованием. Однако снижение эффективности для определенной группы пациентов предполагает возможность существования и других факторов.
В последние несколько лет появились сообщения о кончине пациентов от предполагаемого, зависящего от дозы, отдаленного эффекта введения очень больших количеств ботулинических токсинов, так что любые способы, позволяющие снизить дозу токсина, необходимую для достижения желаемого терапевтического результата, были бы полезны.
Из изложенного выше ясно, что любая возможность вызвать максимальную реакцию пациента на лечение и обеспечить более строгую стандартизацию активности лекарственных средств обладала бы важными терапевтическими преимуществами и преимуществами, связанными с безопасностью.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение относительно больших количество хорошо всасываемых форм цинка перед, одновременно или сразу же после терапевтического введения ботулинического токсина вызывает реактивность по отношению к токсину у пациентов, которые ранее слабо реагировали на такой токсин, и эффективно усиливает функциональную активность ботулинических токсинов по отношению также и к другим пациентам. Еще более замечательным является то, что авторы настоящего изобретения обнаружили, что нагрузка цинком перед введением ботулинического токсина повышала реактивность практически всех пациентов, принявших участие в исследовании. Таким образом, оказалось ясным, что такие пациенты ранее имели относительный функциональный дефицит цинка, доступного для связывания и активации зависящей от цинка эндопептидазы легкой цепи ботулинического токсина. Поскольку группа лиц, обладающих повышенным риском дефицита цинка, связанного с максимальной реактивностью по отношению к эффектам ботулинического токсина, может включать большой процент пациентов (см. Таблицу 1), обнаруженный факт, указанный выше, позволяет предложить несколько средств для достижения максимально возможной зависящей от цинка реактивности по отношению к ботулиническому токсину.
Таблица 1
Факторы риска развития дефицита цинка
1. Питание
а. Витаминные добавки
i. Плохо усваиваемые (недорогие) неорганические формы цинка
ii. Железо
iii. Витамин А
iv. Кальций
v. Медь
b. Большое потребление фталатов
i. Цельнозерновой хлеб и пищевые волокна
ii. Продукты из цельнозерновой пшеницы
iii. Крупы
iv. Соя
v. Овес
vi. Бобовые (включая арахис, арахисовое масло, горох)
vii. Бобы, фасоль
viii. Рис
ix. Многие пищевые полуфабрикаты (консерванты)
х. Большинство напитков (включая практически все газированные безалкогольные напитки)
1. Соединения, содержащие фосфаты
2. Консервант Е391
с. Потребление алкоголя
i. Снижает усвоение цинка
ii. Повышает выведение цинка с мочой
iii. Многие вина содержат фталаты
d. Продукты на основе молока, содержащие казеин и кальций
е. Многие виды еды и пищевых добавок, используемые для «обогащения пищевыми волокнами»
f. Вегетарианство (система питания, включающая мало красного мяса, мяса птицы и рыбы, но много сои)
g. Пищевые продукты, содержащие консервант ЭДТА
2. Медицинские состояния
а. Инфекции (вирусные, бактериальные, грибковые)
b. Ожоги
с.Большинство хронических заболеваний
d. Нарушения всасывания
i. Частые случаи диареи
ii. Спру и др.
iii. Запор с частым приемом пищевых волокон и/или слабительных средств
3. Беременность
4. Возраст менее 25 лет и старше 65 лет
5. Прием диуретиков
В некоторых аспектах описанное в этом документе изобретение относится к достижению максимальной эффективности лечения соединением, активность которого зависит от ионов металлов, находящихся в ткани, подлежащей лечению. В одном из вариантов осуществления этого изобретения таким соединением является терапевтическая протеаза. В одном из вариантов осуществления этого изобретения терапевтической протеазой является цинк-зависимая эндопептидаза, примеры которой включают, среди прочего, ботулинический токсин, столбнячный нейротоксин и лаймоборрелиозный токсин.
Другим предметом этого изобретения является способ подготовки пациента к введению терапевтического соединения, включающий подготовительное введение (орально или любым иным желаемым способом) добавки, содержащей ионы металла, в течение периода нагрузки до, а в некоторых случаях и во время или сразу же после введения терапевтического соединения, причем подготовительное введение добавки, содержащей ионы металла, должно производиться на уровне, достаточном для исключения относительной функциональной недостаточности иона металла как причины плохой реактивности пациента по отношению к вводимому терапевтическому соединению. В одном из вариантов осуществления этого изобретения соединением является цинк-зависимая эндопептидаза, такая как ботулинический токсин. Ион металла может вводиться в виде неорганического или органического вещества, но, идеально, должен выбираться, исходя из достаточной биодоступности в соответствии с данными об измерении биодоступности, известными в данной области.
Одним из предметов этого изобретения является цинксодержащая добавка, содержащая одно или несколько цинкорганических соединений, выбранных из группы, включающей протеинат цинка, хелат цинка и/или соль органической молекулы, и комплекс цинка с аминокислотой. Цинксодержащая добавка позволяет пациенту получать от 10 до 400 мг элементарного цинка в день. В других вариантах осуществления этого изобретения цинксодержащая добавка позволяет доставлять в организм от 30 мг до 50 мг элементарного цинка в день.
Другим аспектом этого изобретения является то, что для способствования усвоению иона металла пациенту рекомендуют ограничить потребление фталатов в течение подготовительного периода нагрузки цинком. В одном из вариантов осуществления этого изобретения пациенту также рекомендуют принимать, например, орально, по меньшей мере одну фитазу вместе с металлсодержащей добавкой.
В одном из вариантов осуществления этого изобретения достижению максимальной реакции на терапевтический ботулинический, столбняковый или лаймоборрелиозный токсин и родственные химерные или синтетические токсины, созданию запасов цинка в организме до, во время или сразу же после лечения терапевтическим токсином, зависящим от иона металла, способствует использование перед процедурой подготовительного набора, включающего цинксодержащие добавки в виде капсул, порошка, жидкости, жидкого геля, липосомной суспензии или таблеток, причем количество таких цинксодержащих добавок достаточно для потребления от 10 до 400 мг элементарного цинка в день в течение периода нагрузки до лечения пациента токсином, а также, инструктирование пациента по поводу приема цинксодержащих добавок и снижения потребления фталатов. В других аспектах этого варианта осуществления представленного изобретения подготовительный набор включает также количество добавок, содержащих фитазу, в капсулах, порошке, в виде жидкости, жидкого геля, липосомной суспензии или таблеток, достаточное для введения вместе с цинксодержащими добавками в течение подготовительного периода нагрузки.
В другом варианте осуществления этого изобретения предлагаются способы испытания активности токсинов, включая ботулинические токсины, которые позволяют обеспечить стандартизованную меру такой активности в данной области. Для таких вариантов осуществления этого изобретения оральные или парентеральные цинксодержащие добавки вводились испытуемым животным в течение подготовительного периода нагрузки перед или одновременно с испытанием активности токсина, причем цинксодержащую добавку выбирали так, чтобы она обеспечивала достаточное содержание цинка для достижения максимальной реактивности на введение токсина. Максимальную реактивность определяли эмпирически, испытывая разные системы питания или цинксодержащие добавки, используемые для достижения максимальной реактивности, включая изменение уровня поступления дополнительного цинка и достижение максимального усвоения цинка. На усвоение цинка можно влиять, контролируя уровень поступления в организм фитатов с пищей, а также добавляя в пищу фитазу.
В другом варианте осуществления этого изобретения цинк поставляется в ткань при использовании наружного крема или с помощью местной или системной инъекции. В других вариантах осуществления этого изобретения используется растворение терапевтических токсинов в цинксодержащем растворе непосредственно перед использованием для обеспечения достаточного количества цинка для максимальной активности токсина в целевых тканях.
В другом варианте осуществления этого изобретения используется комбинация цинка и фитазы для безопасного и эффективно быстрого повышения уровней цинка в организма в случае медицинской потребности, включая, не ограничиваясь указанным, такие состояния, как затягивание ран, выздоровление после ожога, нарушения иммунитета и мужская импотенция.
Способы и композиции, являющиеся предметом этого изобретения, служат средством снижения относительной устойчивости к действию ботулинического токсина и изменчивости терапевтического эффекта для разных пациентов, позволяющим значительно улучшить терапевтические результаты, диапазон безопасного использования лекарства и надежность терапевтического эффекта в разных случаях введения лекарства. Максимальное повышение эффективности вводимых терапевтических металлопептидаз позволяет вводить меньшие дозы с более продолжительным промежутком времени между последовательными введения некоторым пациентам, что приводит к меньшему риску развития связанной с антитетлами резистентности у потенциальных пациентов и к возможному снижению отдаленного действия токсина с нежелательными эффектами. Представленные в этом описании изобретения способы стандартизации испытаний активности ботулинических токсинов позволяют разрешить давнишнюю проблему в этой области и обеспечить большую определенность в определении границ безопасности использования препаратов от разных производителей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
Для более полного понимания настоящего изобретения, включая его характерные особенности и преимущества, приводится подробное описание изобретения вместе с сопровождающими его рисунками.
Фигура 1 представляет исходные данные испытания применения добавок цинка и цинка плюс фитаза за четыре дня до введения терапевтического ботулинического токсина.
Фигура 2 представляет графические результаты испытания применения добавок цинка и цинка плюс фитаза за четыре дня до введения терапевтического ботулинического токсина, касающиеся продолжительности эффекта токсина, наблюдающегося у пациента.
Фигура 3 представляет графические результаты испытания применения добавок цинка и цинка плюс фитаза за четыре дня до введения терапевтического ботулинического токсина, касающиеся воспринимаемого пациентам изменения эффективности лечения токсином.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Хотя изготовление и использование различных вариантов воплощения этого изобретения подробно обсуждается ниже, следует понимать, что настоящее описание изобретения предлагает много применимых идей изобретения, которые могут использоваться во многих разнообразных конкретных ситуациях. Конкретные варианты воплощения этого изобретения, обсуждаемые в этом описании изобретения, являются всего лишь иллюстративными, представляющими определенные пути изготовления и использования предметов этого изобретения, и не ограничивают его объем.
Изменчивость действия ботулинического токсина на организм определенных лиц до настоящего времени относилась на счет использования токсина из разных источников или партий токсина, ненадлежащего приготовления лекарственного средства перед использованием или неправильного хранения, изменений в технике введения, использования местных анестетиков и/или охлаждающих средств и опосредованной антитела сопротивляемости. Авторы настоящего изобретения полагали, что сопротивляемость действию ботулинического токсина может определяться недостаточностью цинка в организме, и доказали эту существенную гипотезу. Это изобретение служит средством снижения относительной сопротивляемости действию ботулинического токсина, наблюдающейся у многих пациентов, что позволяет значительно улучшить терапевтические результаты и диапазон безопасного использования ботулинического токсина. Это изобретение также можно применить для усиления реактивности пациентов в отношении других вводимых соединений, активных in vivo при наличии ионов металлов, включая другие ферменты, такие как столбнячный и лаймоборрелиозный токсины, а также, при других состояниях, при которых пациенту будут полезны повышенные общие уровни цинка в организме, например при заживлении ран, выздоровлении после ожога, при нарушениях иммунитета и мужской импотенции. Также предлагаются способы стандартизации определения активности токсина, что обеспечивает большую определенность и диапазон безопасности использования продукции от разных изготовителей.
Термин «терапевтическая металлопептидаза», используемый в этом описании изобретения, означает пептидазу, вводимую с терапевтической целью, для частичной или полной активности которой необходимо наличие иона металла. Примерами металлопептидаз служат цинк-зависимые металлопротеазы - нейротоксины - ботулинический токсин и столбнячный нейротоксин, которые оба ингибируют выделение нейротрансмиттеров.
Используемый в этом описании изобретения термин «клостридиальный токсин» означает выделенные цинк-зависимые металлопротеазы - нейротоксины, продуцируемые в природе видами клостридий, включая, среди прочего, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium butyricum и Clostridium beratti, а также рекомбинантные клостридиальные нейротоксины, получаемые, в том числе, в других родах и видах микроорганизмов. Термин «ботулинический токсин» относится к ботулиническому токсину серотипов А, В, С, Е, F и G и их подтипов, как полученных природным путем видами клостридий, так и рекомбинантных. Термином «ботулинические токсины» охватываются также цепи (тяжелая и легкая цепь) выделенных ботулинических токсинов, причем как выделенных из видов клостридий, так и рекомбинантных. Термин «ботулинический токсин» включает также новые рекомбинантные химеры. Например, новые рекомбинантные химеры были созданы из ботулинических нейротоксинов серотипов А и Е, и некоторые из таких химер обладают большей активностью, чем природные формы. См., например, Wang, J. et al. «Новые химеры ботулинических токсинов А и Е проявляют вклад в их функциональные характеристики от связывания, транслокаций и доменов протеаз» J. Biol. Chem. 283 (2008) 16993-17002.
Используемый в этом описании изобретения термин «инъекция токсина» означает введение токсина в место, в котором необходим терапевтический эффект такого токсина, и этот термин должен также охватывать другие концепции систем доставки токсина, включая, не ограничиваясь указанным, наружное нанесение токсина, направленное на определенное место выделения системно введенного токсина, или наносистемы доставки токсина.
Ботулинические токсины в природе продуцируются бактериями клостридиями в виде относительно малоактивных, одиночных полипептидных цепей молекулярного веса примерно 150 кДа с большой степени гомологичности аминокислотных последовательностей токсинов разных типов. Одиночный полипептид в дальнейшем расщепляется на тяжелую цепь молекулярного веса примерно 100 кДа и легкую цепь молекулярного веса примерно 50 кДа. В конце концов, тяжелая и легкая цепь связываются друг с другом дисульфидными мостиками с образованием гетеродимера. Тяжелая цепь ботулинического токсина отвечает за связывание токсина и его транслокацию в нейроны, участвующие в нейромышечной деятельности. Оказавшись внутри нейрона, легкая цепь токсина ингибирует выделение нейротрансмиттера, расщепляя протеолитические различные белки SNARE (сокращение от английского названия «растворимые рецепторы присоединения N-этилмалеимид-чувствительного фактора»), участвующие в выделении ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе, таким образом подавляя сокращение мышц в ответ на стимуляцию нейронов. Протеолитическая активность легкой цепи локализована на N-конце легкой цепи, действующем как цинк-зависимая эндопептидаза.
Механизм действия ботулинического нейротоксина в нервно-мышечном синапсе включает три этапа - связывание, интернализацию и подавление выделения нейротрансмиттера за счет инактивации различных белков SNARE. Три белка SNARE - синтаксин 1, SNA3-25 и синаптобревин (который еще называют везикуло-ассоциированный мембранный белок или VAMP) - вместе образуют метастабильные «транс »-комплексы SNARE, связывающие синаптические пузырьки с предсинаптической мембраной.
Белки SNARE, являющиеся белками-мишенями для легкоцепочечной эндопептидазы, отличаются для определенных разных серотипов ботулинических токсинов. Белок SNAP-25 является белком предсинаптической мембраны, связанным с синаптосомой, необходимым для слияния содержащих нейротрансмиттер пузырьков и служащим мишенью для ботулинических токсинов серотипа А и Е. Везикуло-ассоциированный мембранный белок (VAMP) является мишенью для ботулинических токсинов серотипов В, D, F и G. Протеолитической мишенью для ботулинического токсина серотипа С1 служит мембранный белок синтаксин.
Столбнячный нейротоксин (TeNT) продуцируется бактериями рода клостридий и так же, как и ботулинический токсин, является белком молекулярного веса 150 кДа, содержащим три домена. Однако, после связывания с предсинаптической мембраной двигательного нейрона, столбнячный нейротоксин интернализируется и транспортируется ретроаксональным путем в спинной мозг. Затем он выводится из клеточных тел двигательного нейрона и поглощается предсинаптическими нервными окончаниями, в которых он расщепляет везикуло-ассоциированный мембранный белок/синаптобревин, чем предотвращает выделение ингибиторного трансмиттера глицина. Синаптическая передача на двигательные нейроны является преимущественно ингибиторной. Поэтому предотвращение ингибирования приводит к гиперактивности двигательных нейронов, на которые было осуществлено воздействие, и, таким образом, приводит к спастическому параличу в результате неконтролируемых сокращений (тетании) иннервированных мышц. Не будучи еще клинически доступным, столбнячный нейротоксин был предложен как потенциально полезное средство лечения неврологических заболеваний центральной нервной системы.
2+
Как ранее упоминалось, клостридиальные нейротоксины являются цинк-зивисимыми металлопротеазами. В активном состоянии ботулинический нейротоксин содержит по одному двухвалентному катиону цинка Zn на молекулу. Цинк может связываться с легкой цепью ботулинического токсина до или после вхождения в клетку, однако имеет решающее значение для активности эндопептидазы. Исследования in vitro показали, что спонтанная потеря цинка молекулами токсина происходит относительно медленно, но может увеличиться при нахождении в растворе более продолжительное время. Если эндопептидаза становится неактивной в результате утраты связанного цинка, добавление экзогенного цинка может вернуть активность токсину.
Дополнения к рациону питания для обеспечения достаточных уровней ионов металлов, необходимых для активности металлопротеаз.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
До начала 1960-х годов полагали, что в организме человека не может наблюдаться дефицит цинка. В те годы обнаружилось, что цинк является незаменимым микроэлементом и что дефицит цинка - это распространенное явление. Сравнительно недавно было установлено, что цинк необходим для каталитической активности сотен ферментов и что клетки обладают строгим регуляторным аппаратом для обеспечения доступности Zn, что свидетельствует о важности этого элемента в клеточном метаболизме. Внутриклеточный цинк (Zn) находится в равновесии с белками, связывающими цинк, такими как семейство белков металлотионеина-1 (МТ-1), контролирующих концентрацию свободных ионов Zn путем секвестрации и выделения Zn тогда, когда это потребуется. Однако динамика связывания и высвобождения Zn, распределение в Zn клетках и гомеостатический контроль Zn еще не достаточно хорошо изучены.
Имеющий клиническое значение дефицит цинка в организме приводит к замедлению роста, потере аппетита, нарушению иммунитета, а также к потере веса, медленному заживлению ран, нарушениям вкуса и психической заторможенности. В тяжелых случаях, которые чаще всего наблюдаются в экономически слаборазвитых странах, дефицит цинка приводит к потере волос, диарее, замедлению полового созревания, импотенции, недоразвитию половой системы у мужчин и поражениям глаз и кожи. Хотя выраженный дефицит цинка в организме редко встречается в развитых странах, недостаточность цинка распространена в развивающихся странах, в которых злаковые составляют очень большую часть рациона питания.
В исследованиях на пациентах (из развивающихся стран) с выраженными симптомами было обнаружено, что фитаты в злаковых культурах заметно подавляют всасывание цинка, железа и других двухвалентных катионов. Фитаты, в основном инозитола гексафосфаты и пентафосфаты, содержатся в большом количестве в цельнозерновом хлебе и мезге, продуктах из непросеянной пшеничной муки, крупах, сое, овсе, бобовых (включая арахис и горох), кукурузе, рисе и многих пищевых продуктах, богатых пищевыми волокнами. Фосфатные группы этих карбоциклических полиолов образуют прочные нерастворимые комплексы с цинком и замедляют его усвоение.
Субклинический дефицит цинка в организме трудно обнаружить. Лабораторные измерения поступления цинка с пищей трудно выполнить из-за распределения цинка по всему организму в качестве компонента различных металлопротеинов и других белков, связывающих цинк, а также нуклеиновых кислот. Уровни цинка в организме измерить трудно, а уровни цинка в сыворотке или плазме и скорость выведения цинка с мочой не коррелируют достаточно хорошо с уровнями цинка в клетках или тканях. См. Maret W, Sandstead НН. «Потребность в цинке и риски и польза от дополнительного введения цинка в организм» J Trace Elem Med Biol 20 (2006) 3-18. Кроме того, клинические эффекты недостаточности цинка могут проявляться в отсутствие отклонений от нормы в результатах лабораторных анализов. Таким образом, для клинической оценки дефицита цинка, при определении потребности в дополнительном введении цинка в организм, следует наряду с симптомами недостаточности цинка учитывать факторы риска, такие как недостаточное потребление калорий, алкоголизм и болезни пищеварительного тракта (Таблица 1).
Из-за отсутствия специализированной системы накопления цинка для поддержания стационарных уровней цинка в организме необходим ежедневный оральный прием цинка. Цинк, поступающий с пищей, всасывается, в основном, в тонком кишечнике. Повышенное потребление пищевых продуктов с высоким содержанием усваиваемого цинка может вылечить заметный дефицит цинка. По расчетам, ежедневная потеря цинка составляет величину порядка 0,63 мг/день для взрослых здоровых мужчин и 0,44 мг/день для взрослых здоровых женщин. Исследования, проведенные в США, показывают, что среднее потребление цинка в США составляет 14 мг/день для взрослых мужчин и 9 мг/день для взрослых женщин. Рекомендованная суточная доза цинка в пище составляет 8 мг/день для взрослых (не беременных и не кормящих грудью) женщин и 11 мг/день для взрослых мужчин. Напротив, суточная норма цинка составляет 15 мг в день. Суточные нормы были разработаны Управлением США по контролю за пищевыми продуктами и лекарствами, чтобы помочь потребителям сравнивать пищевую ценность продуктов в своем общем рационе питания. Суточная норма цинка составляет 15 мг для взрослых и детей старше 4 лет. Максимальное переносимое потребление было установлено Службой по контролю за безопасностью пищевых продуктов и медикаментов Министерства сельского хозяйства США на уровне 40 мг/день. Сообщалось о случаях желудочно-кишечных расстройств при дозах от 50 до 150 мг/день в течение длительного периода. Кишечнорастворимая доза цинка оценивается на уровне 225-450 мг цинка. Важно отметить, что всего 0,26 г фитата могут замедлить всасывание до 50 мг орального цинка, и под медицинским контролем пациентам можно давать более 200 мг/день добавки цинка, поступающего с пищей.
Содержание цинка тесно связано с содержанием белка в пище, но в животных белках цинк является более доступным, чем в растительной пище, богатой белком. Например, в то время как индейка (140 г содержат 4,34 мг цинка) и куры (140 г содержат 2,88 мг цинка) являются обоснованными хорошими источниками цинка, 120 г кусочек тофу содержит лишь 0,77 мг цинка. Содержание цинка в животных белках варьируется в широких пределах. Например, 4 средних устрицы обеспечивают 77 мг цинка или более 500% рекомендованной суточной дозы потребления цинка. В отличие от этого 3 унции говяжьей рульки обеспечивают только 8,9 мг цинка.
Многие люди находятся в группе риска развития субклинического дефицита цинка, включая лиц, принимающих добавки цинка, но в менее усваиваемых неорганических формах или в комбинации с фитатами, которые делают цинк недоступным. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что предварительное введение относительно больших количеств цинка в хорошо усваиваемой форме вызывает реакцию на ботулинический токсин у лиц, которые ранее мало реагировали на него. Отсюда понятно, что такие лица, скорее всего, имели функциональный дефицит цинка, доступного для связывания и активации легкой цепи ботулинического токсина - цинк-зависимой эндопептидазы. Однако никто из таких лиц не обнаруживал явных признаков дефицита цинка.
Группа лиц, обладающих повышенным риском дефицита цинка, связанного с максимальной реактивностью по отношению к эффектам ботулинического токсина, может включать большой процент пациентов (см. Таблицу 1). Среди лиц, обладающих повышенным риском дефицита цинка, в этом контексте следует указать лиц, в рационе питания которых содержится много фитатов (солей фитиновой кислоты), присутствующих в хлебе из муки цельносмолотого зерна и мезге, продуктах из непросеянной пшеничной муки, крупах, сое, овсе, бобовых (включая арахис и горох), фасоли, кукурузе и рисе. В группу риска входят также люди, в рацион которых входит мало говядины, индейки, кур или устриц (т.е. вегетарианцы), или люди, потребляющие такие богатые цинком продукты вместе с пищей и соединениями, которые делают цинк недоступным, включая пищевые продукты и другие соединения, богатые фитиновой кислотой и фосфатами.
6
6
2
6
2+
2+/3+
2+
2+
2+
2+
Многие пищевые продукты и напитки содержат фосфаты или фитиновую кислоту в качестве консервантов. Фитиновая кислота (мион-инозитол-1,2,3,4,5,6-гексакисфосфат формулы СН(ОРО(ОН))) является первичной формой хранения фосфора во многих тканях растений, включая отруби и семена. Фитиновая кислота весьма реакционноспособна и легко образует комплексы с ионами металлов, такими как Са, Fe, Mg, Mn, Cu и Zn, а также с углеводами и белками. Благодаря своей способности образовывать хелаты с двухвалентными катионами, фитиновая кислота принадлежит к группе соединений, использующихся для обработки жесткой воды, для удаления железа и меди из вина и для дезактивации следов металлов, загрязняющих животные и растительные масла. Консервант Е391 - это фитиновая кислота.
2+
2
5
2
8
4
5
2
8
Используемое в этом описании изобретения выражение «добавка цинка» означает одну или несколько форм неорганического или органического цинка или их комбинации, предназначенные для введения через рот, включая твердые, гелеобразные, липосомные и жидкие формы. Термин «неорганический цинк» означает двухвалентный катион Zn и цинковые соли неорганических кислот. Неисчерпывающие примеры включают цинка хлорид (ZnCl), четырехосновный цинка хлорид (ZnCl(OH)), цинка оксид (ZnO), цинка сульфат (ZnSO) и четырехосновный цинка хлорид (ZnCl(OH)). Процент элементарного цинка в этих формах варьируется. Например, цинка сульфат приблизительно на 23% состоит из элементарного цинка. Так, 220 мг цинка сульфата содержат 50 мг элементарного цинка.
2
3
2
12
14
12
8
10
2
8
2
4
7
2
3
3
6
5
7
2
12
22
14
4
8
2
4
12
16
6
4
5
4
5
3
5
3
2
4
4
5
12
8
2
4
6
10
4
36
70
4
4
4
4
Используемый в этом описании изобретения термин «органический цинк» означает органические комплексы цинка, а также протеинаты цинка, хелаты цинка и соли органических кислот и соединений, и комплексы цинка с аминокислотами, включая комплексы цинка с гистидином, цинка с метионином (ZnMet), цинка с лизином (ZnLys) и др. Другими, неисчерпывающими примерами, являются цинка ацетат (Zn(OCCH)), цинка аскорбат (CHZnO), цинка аспартат (CHNOZnH), цинка бутират (ZnCHO)), цинка карбонат (ZnCO), цинка цитрат (Zn(CHO)), цинка глюконат (Zn(CHO)), цинка глицинат (CHNOZn), цинка гистидинат (CHNOZn), цинка кетоглутарат (CHOZn), цинка лактат (Zn(CHO)), цинка малат (CHOZn), цинка пиколинат (CHNOZn), цинка пропаноат (CHOZn), цинка стеарат (CHOZn) и цинка сукцинат (CHOZn). Как и в солях цинка и неорганических кислот, процент элементарного цинка в этих соединениях варьируется. Например, 300 мг цинка аргината содержат 30 мг элементарного цинка.
Определенные формы цинка, такие как цинка оксид и цинка карбонат, практически нерастворимы в водных растворах и, как правило, рассматриваются как плохо усваиваемые. Введение разовой дозы 50 мг цинка в хорошо усваиваемых формах цинка сульфата и цинка ацетата вызывает тошноту и рвоту у взрослых людей, а такая же доза оксида цинка вызывает такие симптомы только у небольшого процента людей, предположительно, из-за различий во всасывании. См. Allen LH. «Цинк и добавки микроэлементов для детей» Am J CLin Nutr 68 (Suppl) (1998) 4955. Таким образом, рассмотрение достаточных доз цинка, поступающего с пищей, для целей этого изобретения включает рассмотрение относительных скоростей всасывания.
Используемый в этом описании изобретения термин «фитаза» означает фермент гидролазу, способную катализировать высвобождение фосфора из фитиновой кислоты и ее солей (фитатов). Фитазы доступны из многих источников, включая растительные источники, как правило, проросшие семена, и микробы. Были описаны фитазы, выделенные из бактерий, таких как Bacillus subtilis и виды Pseudomonas, а также из дрожжей и мицелиальных грибов. Среди прочего было описано клонирование и экспрессия гена фитазы из Aspergillus niger. См. ЕР 0420358. Фитазы бывают разных типов в зависимости особенностей положения их молекул фитиновой кислоты. Так, например, 3-фитаза (мио-инозитолгексафосфат-3-фосфогидролаза, ЕС 3.1.3.8) сначала гидролизует сложноэфирную связь у атома углерода инозитольного кольца в положении С3. А 6-фитаза вначале гидролизует сложноэфирную связь у атома углерода инозитольного кольца в положении С6. Хотя есть и исключения, растительные фетазы, как правило, являются 6-фитазами. Микробные фитазы, как правило, являются 3-фитазами.
Длительное потребление алкоголя часто бывает связано с нарушением всасывания цинка и с усиленным его выведением с мочой. Другими потенциальными факторами риска функциональной недостаточности цинка является потребление пищевых добавок, влияющих на всасывание цинка, включая потребление добавок железа, витамина А, добавок, содержащих медь и кальций; частое потребление продуктов на основе молока, содержащих казеин; наличие в анамнезе инфекционных заболеваний, ожогов или недавно перенесенной хирургической операции; хронические болезни; частая диарея или любой синдром пониженного всасывания; беременность и/или возраст до 25 лет или старше 70 лет.
Учитывая, что факторы риска развития функционального дефицита цинка являются такими распространенными, одним из наиболее целесообразных способов обеспечения достаточного количества цинка для связывания и активации ботулинического токсина является увеличение запасов цинка путем орального введения его добавок перед, одновременно или сразу же после введения ботулинического токсина. Одним из предметов этого изобретения являются оральные добавки цинка и инструкции по их применению. В одном из вариантов осуществления этого изобретения оральные добавки включают достаточное количество цинка, чтобы обеспечить суточное потребление на уровне от 10 до 400 мг элементарного цинка. Количество вводимого цинка изменяется в зависимости от относительной степени всасывания выбранной формы цинка, причем хорошо всасывающиеся формы вводят в меньших дозах, чтобы избежать рвотного эффекта. Цинк на уровне 10 мг представляет практически рекомендуемую суточную дозу цинка. В частности, в области меньших уровней диапазона от 10 по 400 мг элементарного цинка предпочтительно обеспечивается совместное введение фитазы на уровне от 0,8 до 10000 единиц, во время (т.е. с интервалом времени в пределах двух часов) приема цинка для предотвращения образования хелатов фитиновой кислоты с потребленным цинком. В одном из вариантов осуществления этого изобретения фитаза предлагается для приема вместе с каждым приемом цинка, а также предлагается принимать добавки фитазы с каждым приемом пищи для того, чтобы сделать цинк, поступающий с пищей, максимально доступным. В одном из вариантов осуществления этого изобретения используется высокая нагрузочная доза цинка, обеспечивающая прием от 30 до 100 мг элементарного цинка в день, вместе с 0,8-10000 единицами фитазы.
Другие способы подготовки пациента для усиления эффектов вводимых металлопротеаз
Авторы настоящего изобретения показали, что реактивность по отношению к ботулиническому токсину можно существенно улучшить, используя период нагрузки цинком перед введением токсина. Этот факт показывает, что даже люди, придерживающиеся нормального западного рациона питания и не имеющие явных признаков недостаточности цинка в организме, обладают ограниченным запасом доступного цинка, в плане связи такого цинка с активностью экзогенных цинк-зависимых металлопротеаз. В одном из вариантов осуществления этого изобретения цинк вводят локально в ткань, которая подлежит обработке клостридиальным нейротоксином. Одним из аспектов этого изобретения является введение раствора цинка в места, предназначенные для инъекции токсина, во время, близкое ко времени инъекции токсина, т.е., до, во время и/или после инъекции токсина или наружного нанесения токсина. В другом варианте воплощения этого изобретения цинк вводится в проникающий крем, который наносят наружно на места, предназначенные для инъекции токсина, во время, близкое ко времени инъекции токсина, т.е. до, во время и/или после инъекции токсина. В других вариантах цинк вводится с использованием наносистемы доставки лекарственного средства. В других вариантах осуществления этого изобретения цинк вводится под язык, в виде назального спрея, глазных капель, с помощью спринцовки, сжатого воздуха, чрескожно или ректально в любой форме, включая липосомную суспензию или наносистему доставки лекарственного средства. В других вариантах осуществления этого изобретения раствор цинка может использоваться для приготовления раствора из сухих терапевтических токсинов непосредственно перед использованием. Если должна обрабатываться большая область или недоступная область, либо для более точного дозирования терапии цинком, в качестве альтернативы для нагрузки цинком может использоваться внутривенная или внутримышечная инъекция.
Растворы для приготовления раствора из сухих терапевтических токсинов непосредственно перед использованием
2+
2+
2+
Удаление Zn из легкой цепи замещением in vitro растворимыми хелатирующими веществами, такими как этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), полностью устраняет ферментативную активность в препаратах, не содержащих клеток, или в препаратах разрушенных клеток. Однако токсин, лишенный связанного с ним цинка, может сохранить активность против интактных нервно-мышечных синапсов, предположительно, из-за того, что интернализированный токсин может связывать доступный цитозольный Zn. См. Simpson LL, et al. «Роль связывания с цинком в биологической активности ботулинического токсина» J Biol Chem 276 (29) (2001) 27034-41. Хотя ткань, предварительно обработанная хелатирующими веществами, утрачивает свою способность восстанавливать активность токсина, лишенного цинка, добавление в ткань молекулярного избытка Zn (20 мкМ) может быстро восстановить активность лишенного цинка токсина.
Исследования показали, что цинк не оказывает криозащитного и криощадящего эффекта при лиофилизации ботубилинческого токсина. См. заявку на патент №10/976,529, опубликованную как US 2005/0214326, и PCT/US 2006/038913, опубликованную WO 2007/041664, компании Allergan. В заявке компании Allergan на патент США №10/976,529, опубликованной как US 2005/0214326, было показано, что добавление цинка к растворам для лиофилизации не обеспечивает увеличения активности и усиленного антимикробного действия. Однако дальнейшие независимые исследования показали, что легкая цепь ботулинического токсина серотипа А претерпевает автокаталитическую фрагментацию во время очистки и хранения и что такая фрагментация усиливается хлоридом цинка, а также другими хлоридами двухвалентных металлов. Исходя из этого некоторые авторы рекомендуют хранить токсин замороженным в низкой концентрации при нейтральном или более высоком значении рН, т.е. лишенным каких-либо металлов, Ahmed SA, et al. «Факторы, влияющие на автокатализ легкой цепи ботулинического нейротоксина А» Protein J. 23 (7) (2004) 445-51.
2+
2+
В любом случае коммерчески доступные в настоящее время фармацевтические композиции ботулинических нейротоксинов не содержат добавок Zn ни перед лиофилизцацией, ни в растворе для разведения сухих токсинов перед использованием. Например, марка БОТОКС ботулинического токсина серотипа А, предлагаемая компанией Allergan, Inc. (Ирвин, Калфорния), состоит из очищенного ботулинического токсина серотипа А, выделенного из культуры микроорганизмов серией осаждений кислотой в виде кристаллического комплекса, состоящего из активного высокомолекулярного белка токсина и связанного с ним белка гемагтлютинина. Такой кристаллический комплекс повторно растворяли в растворе, содержащем сывороточный альбумин человека, стерилизовали фильтрованием (0,2 мкм) и затем сушили под вакуумом. Препарат БОТОКС перед внутримышечной инъекцией растворяли в стерильном, не содержащем консервантов 0,9% растворе соли. Другие коммерчески доступные фармацевтические композиции ботулинических нейротоксинов включают Диспорт (Ipsen Ltd., Беркшир, Великобритания) - марку комплекса ботулинического нейротоксина А с гемагглютинином, высушенного до порошка с сывороточным альбумином человека и лактозой, который перед использованием следует растворить в физиологическом растворе. Марка МиоБлок ботулинического нейротоксина В предлагается в виде одноразовых ампул инъекционного раствора 5000 единиц ботулинического токсина типа В в комплексе с гемагтлютинином и негемагглютаниновыми белками в растворе, содержащем 0,05% сывороточного альбумина человека, 0,01 М натрия сукцинат и 0,1 М натрия хлорид с рН примерно 5,6. Таким образом, активность ботулинического нейротоксина зависит от некоторого количества цинка, оставшегося связанным с молекулой в процессе очистки и хранения, а также от ионов Zn в ткани хозяина.
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
2+
Результаты, представленные в этом описании изобретения, показывают, что для большинства испытанных пациентов, нагрузка цинком перед введением ботулинического токсина приводила к улучшению - иногда значительному улучшению - эффекта и продолжительности эффекта лечения токсином. Это свидетельствует о том, что присутствует недостаточное количество Zn, связанного с молекулами токсина, для обеспечения максимальной активности токсина, и о том, что в тканях здорового человека нет достаточного количества доступного Zn для того, чтобы компенсировать недостаток Zn, связанного с молекулами токсина. Так, в одном из вариантов осуществления этого изобретения предлагается раствор для приготовления препарата из сухого ботулинического токсина, содержащий достаточное количество Zn для обеспечения максимальной реактивности по отношению к введенному токсину за счет компенсации как дефицита цинка, связанного с токсином, так и цинка, доступного в обрабатываемой ткани. Учитывая результаты, представленные в этом описании изобретения, идеальный уровень Zn, который следует обеспечить в растворе для приготовления препарата из сухого токсина, можно определить эмпирически. В одном из вариантов осуществления этого изобретения для определения уровней и форм цинка, которые следует добавить в растворы для доставки токсина в целевую ткань, используется проба активности нейротоксина на мышах. В одном из вариантов осуществления этого изобретения мышей переводят на диету с дефицитом цинка на период очистки от цинка перед испытанием желательных уровней Zn, которые должны вводиться в состав препарата для доставки токсина. Вводя мышей в состояние относительного дефицита цинка перед испытанием, можно вычленить вклад от Zn, присутствующего в растворе, для доставки токсина к ткани. В одном из вариантов осуществления этого изобретения ботулинический токсин лиофилизируется без добавки Zn, и предлагается раствор для приготовления препарата из сухого токсина, содержащий достаточное количество Zn для обеспечения максимальной активности токсина. В одном из вариантов осуществления этого изобретения Zn присутствует в растворе для приготовления препарата из сухого токсина в концентрации от 10 до 400 мкМ.
2+
2
2
В одном из вариантов осуществления этого изобретения предлагается раствор для приготовления препарата из сухого токсина, содержащий изотонический раствор соли, т.е, примерно 0,9% или 0,155 М NaCl в стерильном водном растворе (с консервантом или без консерванта), а также содержащий Zn в концентрации от примерно 10 до примерно 50 мкМ или от примерно 0,000065 г до примерно 0,00032 г/100 мл элементарного цинка. Такое количество элементарного цинка можно обеспечить, например, с помощью примерно 0,000136 г ZnCl до примерно 0,00068 г ZnCl/100 мл раствора.
Испытание активности клостридиального нейротоксина
50
Принятым в настоящее время испытанием активности нейротоксина в расчете на одну ампулу служит определение внутрибрюшинной летальной дозы для мышей (МЛД). Активность может означать восстановленную активность ботулинического токсина после растворения его сухого препарата перед использованием или активность ботулинического токсина перед лиофилизацией. Одна единица (Ед.) ботулинического токсина определяется как такое количество ботулинического токсина, которое, после внутрибрюшинной инъекции, убивает 50% животных из группы самок мышей Swiss Weber весом 17-22 г каждая перед началом испытания. Дальнейшие подробности этого испытания представлены в заявке PCT/US 2006/038913, опубликованной как WO 2007/041664, и включены в это описание посредством ссылки.
50
50
50
Статья Европейской Фармакопеи о ботулиническом токсине типа A (BoNT/A) для инъекций (01/2005:2113) подтверждает использование альтернативных, нелетальных и ex vivo методов вместо определения мышиной ЛД, при условии валидации таких альтернативных методов (Secardia, D. and Das, R.G. «Альтернативы испытания активности ботулинического токсина с использованием ЛД50: Стратегии и продвижение к уточнению, сокращению и замене» ААТЕХ14, Special Issue, 581-585. Proc. 6th World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences (Материалы 6-го Мирового Конгресса по альтернативам и использованию животных в медико-биологических науках). 21-25 августа, 2007 года, Япония). Предложенные альтернативные методы определения активности включают пробу на периферический паралич мышей (известную также как пробу на абдоминальное опущение у мышей), связывающую активность ботулинического токсина типа А со степенью абдоминального вздутия, наблюдающегося после подкожного введения токсина в левую пахово-бедренную область мыши. Степень паралича зависит от дозы. Поскольку вводятся только сублетальные дозы ботулинического токсина типа А, такая проба считается в 10 раз более чувствительной, чем определение ЛД. Определение степени паралича более соответствует клиническому использованию токсина, так как при этом оценивается локальное влияние токсина на мышцы, а не системная токсичность. Проба на периферический паралич у мышей проводится быстрее, чем испытание летальной дозы, и позволяет получить результат в течение 1-2 суток, в сравнении с 3-4 сутками, как правило, необходимыми для определения ЛД.
Был предложен также альтернативный метод ex vivo, согласно которому измеряется амплитуда судорожных движений в ответ на электростимуляцию препарата выделенного нерва/мышцы. Активность токсина определяет снижение амплитуды судорожных движений. Измеряемым параметром этого метода служит время до 50% снижения наблюдаемой амплитуды. Метод ex vivo позволяет получить результаты в течение двух часов.
50
50
Хотя анализ с определением ЛД продолжает использоваться благодаря его высокой чувствительности, этот метод не является стандартизированным, и используемые в маркировке единицы зависят от конкретного продукта и не являются взаимозаменяемыми. Отсутствие стандартизированного метода испытаний создает проблемы с безопасностью, учитывая исключительную токсичность и медленное восстановление после передозировки. Авторы настоящего изобретения определили, что оральное введение цинка приводит к значительному улучшению реактивности в отношении ботулинического токсина у многих пациентов, которые в других ситуациях не проявляли признаков дефицита цинка. Этот значительный результат был распространен на испытания активности ботулинического токсина и позволил обеспечить максимальную реактивность в испытуемой системе. С одной стороны, мышам предоставляется стандартизированный рацион питания при определении внутрибрюшинной ЛД, степени периферического паралича у мышей или испытания амплитуды судорожных движений ex vivo.
Типичный исследовательский рацион питания грызунов включает 14-20% белка и от 50 до более 70% углеводов. Ингредиенты корма, присутствующие в наибольшем процентном отношении, содержат много фитатов или иным образом подавляют всасывания цинка. К таким ингредиентам относится казеин, кукурузный крахмал, соевый шрот, целлюлоза, а также кукурузное и/или соевое масло. К корму добавляют минеральные смеси, но такие добавки не стандартизованы и могут десятикратно различаться в разных стандартных рационах питания.
В различных опубликованных исследованиях рацион питания, содержащий 25-55 мг цинка на кг корма, полагается достаточным, а корма, содержащие менее 1-5 мг цинка в 1 кг, рассматриваются как содержащие недостаточно цинка. В других сообщениях, уровни цинка приводятся в миллионных долях (м.д.), а бедные цинком и достаточные (по цинку) рационы питания содержат 1,5 м.д. и 70-75 м.д. цинка соответственно. Было отмечено, что рацион питания, содержащий 10 мг/кг цинка, может быть достаточным, если основным источником белка служит яичный белок или казеин, но потребуется не менее 20 мг/кг цинка при использовании источников белка с высоким содержанием фитатов, такого как соевый белок. Мыши относительно резистентны к токсичности цинка, и сообщалось, что они не проявляют значительных реакций токсичности на дозу 500 мг цинка/л воды в течение периода до 14 месяцев.
В одном из вариантов осуществления этого изобретения для реализации способа нормализации испытания активности клостридиального нейротоксина на животных и использования тканей животных, животных, используемых для испытания активности токсина, переводили на определенный рацион питания, предназначенный для максимального повышения уровней доступного цинка, не менее чем за одну неделю до испытаний. В одном из вариантов осуществления этого изобретения такой рацион питания содержал мало фитатов, а уровень цинка был, по меньшей мере, в два раза выше, чем рекомендованные уровни цинка. В одном из вариантов осуществления этого изобретения фитазу добавляют к рациону питания в дополнение к повышенному (не менее чем в два раза в сравнении с рекомендованным) уровню цинка. В одном из вариантов осуществления этого изобретения определенный рацион питания выбирается по сравнению активности одной и той же партии клотридиального нейротоксина в группе животных, находящихся на разных рационах питания не менее одной недели до анализа активности нейротоксина. Рацион питания, обеспечивающий самую высокую чувствительность к эффектам токсина, выбирается и стандартизируется как необходимый определенный рацион питания для всех будущих испытаний активности токсина.
Приведенные ниже примеры представлены для более полного описания изобретения и иллюстрируют способы и композиции, являющиеся предметом этого изобретения, а также представляют определенные характеристики таких композиций. Эти примеры никоим образом не должны ограничивать объем или предметы этого изобретения.
Пример 1: Снижение резистентности к ботулиническому токсину путем введения добавок цинка в рацион питания.
2+
2+
Авторы настоящего изобретения сделали вывод о том, что различия в доступных внутриклеточных запасах цинка у разных пациентов могут объяснить отсутствие реакции на ботулинический токсин у некоторых из них. В начале исследования этой гипотезы добавки цинка обеспечивались из пищевых продуктов. Индейка была выбрана в качестве пищевого источника биодоступного Zn на основании ее безопасности, низкой стоимости, легкой доступности и широкого использования. Количество индейки, рекомендованное к потреблению пациентами, рассчитывалось так, чтобы обеспечить дневную дозу 40 мг Zn или примерно в 2,5 раза выше рекомендованной суточной нормы потребления цинка. Ряд таких пациентов полагался малореагирующими на ботулинические токсины, так что было трудно обеспечить лечение симптомов блефароспазма в анамнезе таких пациентов. Результаты показали, что введение добавок цинка привело к заметному повышению эффективности лечения блефароспазма с использованием источника ботулинического токсина в дозах, которые были неэффективными для того же пациента в отсутствие добавок цинка.
Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что дефицит цинка, достаточный для снижения эффективности вводимого ботулинического токсина, наблюдается у значительного количества пациентов. Даже для пациентов с выраженной сопротивляемостью действию токсина ожидается, что повышение уровней цинка путем орального введения его добавок в период до планируемой инъекции обеспечит нормализацию реактивности по отношению к токсину у всех пациентов. В частности, введение добавок цинка для обеспечения внутриклеточного цинка, доступного для связывания и активации легкой цепи эндопептидазы ботулинического токсина, позволяет получить наибольшую возможную цинк-зависимую реакцию. Многим пациентам, которые ранее не реагировали на введение ботулинического токсина, можно вводить меньшие дозы токсина с получением надежной реакции. Хотя потребление избыточных количеств животного белка, содержащего много цинка, в период до лечения ботулиническим токсином может эффективно нормализовать и усилит реактивность по отношению к ботулиническому токсину, такое решение является неудобным, недостаточно стандартизированным и в долгосрочной перспективе несовместимым с предпочтениями многих людей в области питания.
Таким образом, одним из предметов этого изобретения является оральное введение добавок цинка, позволяющее обеспечить желаемую нормализацию и увеличение запасов цинка. Одним из предметов этого изобретения является приготовление составов, содержащих одну или несколько форм неорганического и/или органического цинка, в виде таблеток или капсул. В одном из вариантов осуществления этого изобретения дозы цинка для орального потребления находятся в пределах примерно от 10 до 400 мг элементарного цинка в день. В других вариантах осуществления этого изобретения доза цинка варьируется в пределах примерно от 30 до 50 мг элементарного цинка в день. В одном из вариантов осуществления этого изобретения доза цинка составляет примерно 50 мг элементарного цинка в день. В одном из вариантов осуществления этого изобретения пациенту перед планированной процедурой предлагается набор, содержащий добавку цинка и инструкции по ее приему. Согласно таким инструкциям пациент должен начать принимать добавку цинка за несколько дней до введения ботулинического токсина. В одном из вариантов осуществления этого изобретения пациенту рекомендуется продлить период приема добавки цинка до 3-4 дней до лечения токсином, а также принять добавку цинка в день лечения токсином. В одном из вариантов осуществления этого изобретения инструкции рекомендуют избегать пищевых продуктов, содержащих много фитатов, в период нагрузки цинком.
ПРИМЕР 2: Добавки цинка с повышением всасывания цинка благодаря введению фитаз
Учитывая роль фитатов в подавлении всасывания цинка, в одном из аспектов этого изобретения всасывание орального цинка повышается оральным введением фитаз, которые гидролизуют фитиновые кислоты (инозитола гексакисфосфат) и улучшают всасывание принятого орально цинка. Фитазы в настоящее время доступны на рынке нутрицевтиков как пищевые добавки, предназначенные повысить всасывание двухвалентных катионов, таких как кальций, магний, железо и цинк. Такие двухвалентные катионы образуют нерастворимые комплексы с фитиновыми кислотами растений, присутствующими в растительной пище, такой как кукуруза, кукурузные субпродукты, бобовые растения, соя и зерновые крупы, делая такие катионы недоступными. Фитазы используются как добавки к кормам животных для обеспечения доступности фосфатов из фитиновой кислоты (инозитола гексакисфосфата). Было показано, что добавление фитазы к кормам животных дает преимущества даже при очень низком содержании фитатов в корме. См., например, WO 9949740, где описана кормовая композиция с низким содержанием фитатов, в которую вводится фитаза из аспергиллы. В WO 9830681 под заглавием «Комбинации фитаз» показано, что комбинация не менее двух фитаз, обладающих специфичностью к разным положениям фосфатной связи, более эффективно высвобождает фосфор фитатов.
В настоящее время доступны два типа пищевых фитатов: один из зерновых и другой - из микробных источников. Микробные источники включают ферментацию грибов, таких как Aspergillus niger (Финаза, Alko Ltd., Финляндия), а также бактериальную ферментацию. Фитазная активность определяется в ряде различных проб, в которых измеряется количество фермента, необходимое для высвобождения заданного количества неорганического фосфата из фитиновой кислоты в минуту при определенных значениях температуры и рН. Микробные фитазы характеризуются более широким диапазоном рН, в котором они могут проявлять активность, и в исследованиях на людях было показано, что такие фитазы повышают всасывание железа в большей степени, чем фитазы из пшеницы. В одном таком исследовании введение 20000 фитазных единиц (Ф.Ед.) повысило всасывание железа на 14-26%. См. Sandberg A-S, et al. «Пищевая фитаза из Aspergillus niger повышает всасывание железа в организме человека» The Journal of Nutrition 126 (1996) 476. Таким образом, одним из предметов этого изобретения является пищевая добавка, содержащая одну или несколько форм цинка и не менее одной микробной фитазы. Введение цинка и фитазы подготавливает пациента к проявлению максимальной реактивности по отношению к последующему введению ботулинического токсина.
Как уже упоминалось выше, комбинация цинка и фитазы может также использоваться для безопасного и быстрого повышения уровней цинка в организма для иных целей, кроме улучшения связывания и активации легкой цепи эндопептидазы ботулинического токсина. Например, повышение общих уровней цинка в организме может требоваться по медицинским показаниям, включая, среди прочего, такие состояния как заживление ран, выздоровление после ожога, нарушение иммунной системы и мужская импотенция.
10
50P
Для дальнейшей проверки очевидно положительных результатов введения добавки цинка путем потребления пищевых продуктов с высоким содержанием цинка, а также проверки того, дает ли добавка фитазы преимущества в отношении всасывания цинка, были начаты дальнейшие клинические испытания для сравнения реактивности по отношению к ботулиническому токсину у пациентов после четырехдневного периода введения двух разных испытуемых добавок или плацебо. Каждое из испытуемых веществ и плацебо без идентификации по-разному предоставлялись участникам испытания. Так, пациентам не была известна природа добавки. В качестве плацебо использовались капсулы с лактулозой. Исследуемыми препаратами были добавка Z, содержащая нормальную рекомендуемую суточную дозу 10 мг цинка в форме глюконата цинка, и добавка Z, содержащая относительно высокую нагрузочную дозу 50 мг цинка в форме цитрата цинка и 3000 Ф.Ед. фитазы (полученной из гриба Aspergillus niger). Регистрировали два разных параметра чувствительности к ботулиническому токсину - продолжительность действия (Д) и эффект (Э). Продолжительность выражали как процент увеличения или сокращения «обычной» для данного пациента продолжительности действия токсина, так как опыт показывает, что, как правило, продолжительность действия токсина разная у разных пациентов. Для некоторых пациентов эффект лечение токсином сохраняется в течение одного месяца, для других - трех месяцев и т.д. Таким образом, пациент, эффект действия токсина для которого обычно продолжается в течение 90 дней и для которого не наблюдаются изменения в продолжительности такого эффекта, получал балл «0», свидетельствовавший об отсутствии изменений обычной продолжительности эффекта токсина. Для пациента, испытывавшего действие токсина в течение дополнительных 4 недель (28 дней), рассчитывали увеличение продолжительности 28/90, равное +0,31, соответствовавшее эффекту, на 31% более продолжительному, чем обычно. Наоборот, отрицательный балл, такой как -0,25, означает, что продолжительность эффекта стала на 25% короче, чем обычно. Эффект (Э) выражали как отклонение от обычного восприятия данным пациентом ощущения комфорта и желаемого эффекта. Например, 0 = нет изменений в сравнении с обычным эффектом; -1 = небольшое снижения эффекта по сравнению с обычным; -2 = значительное снижения эффекта по сравнению с обычным; +2 = средство оказалось значительно более эффективным, чем обычно; +3 = наилучший эффект из когда-либо достигнутых для данного пациента. Для обеспечения точности пациенты регулярно вели записи ощущаемой эффективности лечения.

Результаты испытания с участием 44 пациентов представлены в Таблице на Фигуре 1. Все эти пациенты ранее лечились токсином, и в их историях болезни записана предыдущая реактивность по отношению к ботулиническому токсину. Двадцать три пациента из этой группы полагались пациентами с блефароспазмом, трудно поддающимся лечению (ВН), что означало, что такие пациенты: а) как правило, требовали более 50 единиц/сеанс лечения Ботоксом (препаратом ботулинического токсина типа А) или эквивалентного количества другого ботулинического токсина; b) как правило, сообщали, по своей оценке, о субоптимальных результатах несмотря на использование дозы и характера инъекции, которые, обычно, вызывают максимальную реакцию; и с) сообщали о значительной изменчивости эффекта токсина после разных сеансов лечения несмотря на неизменную дозу и характер инъекции. Еще семь пациентов были пациентами с блефароспазмом, которые постоянно реагировали на лечение ботулиническим токсином типа А (ВС). Четыре пациента страдали гемифациальным спазмом (Н), и еще десять пациентов проходили косметическое лечение морщин (С). Все три типа водимых ботулинических токсинов представлены на Фигуре 1 в колонках «Т» («лечение») как («В») ботулинический токсин типа А (Ботокс), («М») ботулинический токсин типа В (Миоблок) и («D») ботулинический токсин типа А (Диспорт). Пациентов лечили в рамках модифицированного, рандомизированного, двойного перекрестного пилотного исследования под контролем плацебо.
50P
50P
10
50P
10
50P
Участники исследования были третьей стороной рандомизированы в неравные по количеству пациентов четыре группы, получавшие разные виды лечения, и ни лечащий врач, ни пациенты не знали, какая именно добавка вводится пациенту перед инъекцией токсина. Двадцать три пациента (52%, группа А) получали перед инъекцией только добавку Z (50 мг цитрата цинка плюс 3000 единиц фитазы), шесть пациентов (14%, группа В) получали перед инъекцией добавку Р (плацебо в виде лактулозы) и Z в разное время по перекрестной схеме, четыре пациента (9%, группа С) получали перед инъекцией добавку Z (10 мг глюконата цинка) и добавку Z в разное время по перекрестной схеме, и 11 пациентов (25%, группа D) получали перед инъекцией добавку Р (плацебо), Z и Z в разное время по тройной перекрестной схеме.
10
50P
10
На Фигуре 2 график 200 представляет результаты клинического испытания введения добавки цинка и цинка плюс фитаза за четыре дня до введения терапевтических ботулинических токсинов, оцениваемые по продолжительности (Д) эффекта токсина для определенного пациента. Вертикальная ось 202 на Фигуре 2 представляет процент изменения продолжительности действия токсина на пациента. Горизонтальная ось 204 представляет столбцы, каждый из которых соответствует группе пациентов, получавших: либо плацебо (Р) 206; 10 мг глюконата цинка (Z) 210; либо 50 мг цитрата цинка в дополнение к фитазе (Z) 214. Отметки доверительных интервалов 208/212/216 представляют 95% доверительные интервалы средних значений. Как видно на Фигурах 1 и 2, при предварительном (до инъекции токсина) введении пациентам добавок либо плацебо (Р) 206, либо 10 мг глюконата цинка (Z) 210, примерно соответствующим рекомендованной суточной дозе цинка, не наблюдалось достоверных изменений (р>0,05) продолжительности эффекта лечения ботулиническим токсином в сравнении с обычной для конкретного пациента продолжительностью эффекта такого лечения.
10
50P
10
На Фигуре 3 график 300 представляет результаты испытания введения добавки цинка и добавки цинка плюс фитаза за четыре дня до введения терапевтических ботулинических токсинов по субъективной оценке пациентами изменений эффективности (Э) лечения токсинами. Вертикальная ось 302 на Фигуре 3 представляет воспринимаемую пациентом эффективность лечения токсином. Горизонтальная ось 304 представляет столбцы, каждый из которых соответствует группе пациентов, получавших: либо плацебо (Р) 306; 10 мг глюконата цинка (Z) 310; либо 50 мг цитрата цинка в дополнение к фитазе (Z) 314. Отметки доверительных интервалов 308/312/316 представляют 95% доверительные интервалы средних значений. Как видно на Фигуре 3, при предварительном (до инъекции токсина) введении пациентам добавок либо плацебо (Р) 306, либо 10 мг глюконата цинка (Z) 310, примерно соответствующим рекомендованной суточной дозе цинка, не наблюдалось достоверных изменений (р>0,05) оцениваемой пациентом эффективности лечения ботулиническим токсином в сравнении с обычной для конкретного пациента реактивностью по отношению к такому лечению.
50P
50P
50P
Напротив, у 41 из 44 пациентов (93%), которые получали Z (50 мг цитрата цинка плюс 3000 единиц фитазы) 214 за четыре дня до инъекции ботулинического токсина, наблюдалось специфичное для каждого пациента среднее увеличение продолжительности действия токсина на 23,6% (р<0,05; см. Фигуры 1 и 2). Кроме того, у 38 из 44 пациентов (86%), получавших Z (50 мг цитрата цинка плюс 3000 единиц фитазы) 314 за четыре дня до инъекции ботулинического токсина, эффект (Э) лечения ботулиническим токсином оценивался как значительно усилившийся (р<0,05; см. Фигуры 1 и 3). Практически у каждого пациента наблюдалось улучшение по продолжительности эффекта, эффективности лечения или по обоим параметрам. В большинстве случаев, как продолжительность эффекта, так и эффективность лечения заметно улучшились. Фактически, у трех пациентов с блефароспазмом, получивших высокие дозы нагрузки цинком и фитазой (Z), сообщивших о снижении полезного эффекта, наблюдалась очевидная передозировка токсина, из-за которой таким пациентом было трудно закрывать глаза. Таким образом, даже для таких трех пациентов наблюдалось усиление действия токсина. Среди прочего, полученные результаты позволяют предположить (и последующий опыт подтверждает), что пациентам, прошедшим нагрузку цинком перед лечением токсином, могут вводиться меньшие дозы ботулинического токсина с достижением обоснованной реакции на лечение. С помощью нагрузки цинком перед введением токсина можно нормализовать максимальную реактивность пациентов и можно исключить одну важную переменную индивидуальной реактивности. Использование меньших эффективных доз токсина может снизить последующее образование антител, влияющее на лечение токсином. Такие данные можно считать очень надежными, так как пациенты с блефароспазмом всегда (ежедневно) знают, могут ли они открыть газа для чтения, вождения автомобиля, самостоятельного одевания, просмотра телевидения, работы, походов по магазинам и др.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в этом описании изобретения включены в него посредством ссылки так, как будто они полностью изложены в этом описании изобретения. Хотя это изобретение описано со ссылками на иллюстративные варианты его осуществления, это описание изобретения не следует толковать в ограничительном смысле. Различные модификации и комбинации иллюстративных вариантов осуществления этого изобретения, а также другие варианты осуществления этого изобретения очевидны для специалистов в данной области, ознакомившихся с этим описанием изобретения. Поэтому прилагающаяся формула изобретения охватывает все такие модификации и усовершенствования.