Экспрессия нейротрофических факторов в эмбриональном мозге человека 5–9 недель гестации

Украшський нейрох1рурпчний журнал, №3, 2003

13

УДК 612.646:612.82:577.95

Экспрессия нейротрофических факторов в эмбриональном мозге человека 5-9 недель гестации

Цимбалюк В.И., Васильева И.Г., Чопик Н.Г., Таланта Е.С., Цюбко О.И., Олексенко Н.П., Вашуленко Т.Н.

Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины, г. Киев, Украина

В определении конечного фенотипа дифференцирующихся нейронов, регуляции их пролиферации, а также поддержании выживаемости как дифференцированные:, так и недифференцированных нервных клеток основную роль играет химическое окружение. Однако сценарий экспрессии сигнальных молекул на разных стадиях эмбриогенеза нервной ткани изучен далеко не полностью. Целью нашей работы явилось изучение экспрессии BKNF, NGF, GKNF, NT-3, NT-4/5 и CNTF в эмбриональном мозге человека 5-9 нед гестации методом гибридизации ДНК-РНК на нитроцеллюлозном фильтре.

Исследования показали, что на данном этапе эмбриогенеза экспрессируется лишь три из выбраных нами фактора: BKNF, NT-3, NT-4/5 в количестве, детектируемом с помощью данного метода. Експрессия остальных трех факторов нервной тканью либо отсутствует в данный период, либо ее уровень находится за пределами чувствительности ДНК-РНК гибридизации.

Ключевые слова: фактор роста нервов, нейротрофический фактор мозгового происхождения, нейротрофин-3, нейротрофин-4/5, цилиарныш нейротрофический фактор, глиальный нейротро-фический фактор, эмбриональный мозг человека.

Вступление. В настоящее время к нейротро-фическим факторам относят более 20 ростовых агентов, составляющих различные семейства (нейротрофины, нейролейкины, нейрокины, семейства FGF и TGFb и т.д.), в которые входят структурно-родственные белки. Некоторые из них обладают плейотропной активностью и реализуют свой потенциал не только в нервной системе, но для большинства этих факторов мишенью являются нервные клетки.

Наиболее интенсивно изучаемыми трофическими факторами на сегодняшний день являются фактор роста нервов-nerve growth factor (NGF), нейротрофический фактор мозгового происхождения-brain derived neurotrophic factor (BKNF), нейротрофин-3-neurotrophin three (NT-3), нейротрофин-4/5-neurotrophin four/five (NT-4/5) (семейство ней-ротрофинов), цилиарный нейротрофический фактор-ciliary neurotrophic factor (CNTF) (семейство нейрокинов) и глиальный нейротро-фический фактор-glia derived neurotrophic factor(GKNF) (семейство TGFb). Многочисленными исследованиями на животных была продемонстрирована их роль в эмбриогенезе и постнатальном периоде как факторов диффе-ренцировки, созревания и поддержания выживаемости клеток периферической и центральной нервной системы [3, 7, 8, 10,]. Однако, несмотря на то что за пятидесятилетний

период интенсивного изучения вышеназванных гормоноподобных ростовых агентов собран обширный фактический материал, открытыми остаются вопросы об их экспрессии, механизмах действия, объектах приложения и функциональном взаимодействии в эмбриогенезе и филогенезе человека.

Изучение специальной литературы показало, что наибольший массив экспериментальных данных об экспрессии нейротрофических факторов и выполняемых ими функциях отражает события второй половины эмбрионального развития позвоночных, когда устанавливается иннервация тканей-мишеней и, наряду с бластными формами нервных клеток, уже существуют молодые нейроны и клетки глии [1]. Так, синтез мРНК ^ЫТ-4/5 отмечался в большинстве тканей на 17-21-е сутки развития эмбрионов крыс [19], а мРНК ВКОТ обнаруживалась в субпопуляции клеток кохлеовести-булярного ганглия в период Е11.5 у мышей [6].

Информация об экспрессии изучаемых нами ростовых агентов на ранних этапах нейроонто-генеза достаточно скудна. Известно, что мРНК BКNF и N^3 в развивающейся первичной полоске детектируется с первого дня эмбриогенеза птиц, а небольшие количества мРНК ВКОТ, N^3 и NGF в ганглионарной пластинке, нервной трубке, сомитах и нотохорде - со 2-го дня [18]. Экспрессия GКNF в нейроэкто-

дерме развивающегося мышиного эмбриона наблюдалась в период 7,5-10,5 сут после оплодотворения [6]. Уникальной является информация об экспрессии рецепторов нейротрофи-нов в развивающемся кохлеовестибулярном ганглии эмбрионального внутреннего уха человека 5-24 нед гестации, что указывает на зависимость клеток ганглия от этих факторов на данном этапе эмбриогенеза. Trk-B и Trk-C (рецепторы BKNF и NT-3 соответственно) обнаруживали иммунореактивность, начиная с 5-й недели, причем пик экспрессии приходился на 7-12-ю неделю. Trk-A (рецептор NGF) демонстрировал слабую иммунореактивность лишь на 5-7-й неделе [16].

Целью работы явилось количественное определение экспрессии NGF, BKNF, NT-3, NT-4/5, GKNF и CNTF в цельном эмбриональном мозге человека 5-9 нед гестации.

Материалы и методы. В эксперименте использовали мозг 18 пятинедельных, 16 шестинедельных, 16 семинедельных, 12 восьминедельных и 12 девятинедельных эмбрионов человека (абортивный материал).

мРНК была получена методом фенольной экстракции согласно Маниатис Т. [13]

Уровень экспрессии факторов определяли методом гибридизации ДНК-РНК на нитроцел-люлозых фильтрах, согласно Маниатис Т., Франциско Г. [4,13] с некоторыми модификациями.

В качестве зондов использовали следующие синтетические олигонуклеотиды (Amer-sham Pharmacia Biotech):

1. 5'-cgccttgacaaaggtgtgagtcgtggtacaatatgagttc-3' NGF.

2. 5'-gtttgcttctttcatgggggcagccttcatgcaaccaaag-3' BKNF.

3. 5'-gcggtgtggagcagcaccaggcagacagccacgacatccc-3' GKNF.

4. 5'- ggaattgagcgagtcttctggcaaactcctttgatccatg-3' NT-3.

5. 5'- tcgcccaacacctccacctcgcgcccacgcaagtccacag-3' NT-4/5.

6. 5'-gagcagtcaggtctgaacgaatcttccttgctagccagat-3' CNTF.

Мечение зондов [y-32P]ATP ( 3000Ci/mM) (Amersham Pharmacia Biotech) осуществляли методом концевого ферментативного мечения согласно Маниатис Т. [13].

Очистку зондов проводили в полиакрила-мидном геле в присутствии 7М мочевины.

Прегибридизацию фильтров выполняли в присутствии 50% формамида / 5х SSPE (1xSSPE=15mM цитрат натрия / 0,15M NaCl / 10мМ NaH2PÎ4 / 1мМ EKTA ) / 5x реактива Денхардта (1x реактив Денхардта= 0,02% BSA / 0,02%Ficoll / 0,02% поливинилпиролидон) / 0,1% SKS при 42°С в течение 1ч. Гибридизацию с меченным 32Р-зондом (50 000-100 000 рас/мин) проводили в течение 24 ч при температуре 42°С.Фильтры отмывали однократно в 1xSSC с 0,1%SKS при комнатной температуре и дважды в 0,2xSSC с 0,1%SKS при температуре 42°С. Радиоактивность фильтра определяли на сцинтилляционном счетчике " Бета-1" (Украина).

Результаты и их обсуждение. Полученные данные показали, что в изучаемый период ней-роонтогенеза человека в эмбриональном головном мозге экспрессируются лишь три из исследованных факторов: BKNF, NT-3, NT-4/5, причем BKNF демонстрировал более высокий уровень экспрессии,чем NT-3 и NT-4/5 (таблица).

Кроме того, к 7-й неделе эмбриогенеза наблюдали тенденцию к увеличению синтеза мРНК данного нейротрофина. Этот результат коррелирует с описаными в литературе наблюдениями об активации экспрессии рецептора данного нейротрофина [16]. Аналогичную динамику определяли также при изучении экспрессии нейротрофических факторов в ней-роонтогенезе птиц. Так, пик синтеза BKNF приходился на период Е4,5 [7], когда у птиц, согласно данным литературы, образуются клетки предшественники нейронов и начинается их дифференцировка [5]. Однако, согласно другим

Таблица. Экспрессия нейротрофических факторов в эмбриональном мозге человека 5-9 нед гестации

Срок гестации фмоль мРНК BDNF/мг мРНК фмоль мРНК NGF/мг мРНК фмоль мРНК NT-3/мг мРНК фмоль мРНК NT-4/5/мг мРНК фмоль мРНК GDNF/мг мРНК фмоль мРНК CNTF/мг мРНК

5 нед n=6 2,974±0,544 - 0,581±0,141 0,884±0,202 - -

6 нед n=6 2,123±0,649 - - 0,178±0,094 - -

7 нед n=8 3,191±0,749 - - 0,670±0,038 - -

8 нед n=8 3,237±0,743 - 0,884±0,306 0,170±0,028 - -

9 нед n = 10 3,818±0,212 - - 0,453±0,082 - -

Экспрессия нейротрофических факторов в эмбриональном мозге человека 5-9 недель гестации

15

данным [10], полученым на крысах, BKNF имеет низкий уровень экспрессии в незрелых регионах ЦНС и повышается он лишь с их созреванием. А в период пролиферации, миграции и дифференцировки клеток предшественников в мозге крыс преимущественно экспрессиру-ется родственный нейротрофин - NT-3 [10]. Согласно результам данной работы этот белок не демонстрирует стабильную экспрессию в эмбриональном мозге человека в изучаемый период. Подобные расхождения, возможно, связаны с видовыми особенностями формирования ЦНС. В любом случае присутствие мРНК этих родственных белков в развивающемся мозге обусловлено выполняемыми ими функциями. Так, in vitro была показана роль BKNF в дифференцировке клеток предшественников, полученных из эмбрионального стриатума, в сторону мультиполярных, а NT-3 - в сторону биполярных нейронов [8]. Кроме того, на культуре нейронов гиппокампа был продемонстрирован их стимулирующий эффект в образовании синапсов [17].

Ожидаемым результатом для нас явилось обнаружение экспрессии мРНК NT-4/5 в изучаемый период. Данный фактор обеспечивает выживание и формирование нейронального фенотипа дифференциирующихся клеток предшественников, полученных из эмбрионального мозга человека и культивируемых in vitro [3], а также имеет значение в формировании маргинальной зоны неокортекса грызунов [2].

Отсутствие экспрессии тканью эмбрионального головного мозга 5-9 нед GKNF, NGF, CNTF может свидетельствовать либо о невостребованности данных факторов на этапе пролиферации, дифференцировки и миграции клеток предшественников нейронов, либо о преимущественном значении в этот период данных ростовых агентов экзогенного происхождения (источником могут быть окружающие ткани), так как их рецепторы детектируются в ЦНС довольно рано [9,12], а делетирование гена приводит к аномалии развития центральной и периферической нервной системы [14 ].

Таким образом, полученные нами данные подтверждают существование эндогенного синтеза BKNF, NT-3, NT-4/5 развивающимся головным мозгом человека 5-9 нед гестации, что еще раз подчеркивает участие этих факторов в процессе дифференцировки нервной ткани. Данный факт может объяснять тот трофический эффект, который дает эмбриональная нервная ткань при ее трансплантации, что лишний раз подтверждает возможность использования эмбрионального донорского материала в терапевтических целях.

CnncoK ^MTepaTypM

1. HeupooHmozene3. -M: HayKa, 1985. - 267 c.

2. Brunstrom J.E., Gray-Swain M.R., Ksborne P.A., Pearlman A.L. Neuronal heterotopias in the developing cerebral cortex produced by neurotro-phin-4 // Neuron. -1997.- V.18, №3. - P.505-517.

3. Caldwell MA.., He X, Wilke N, Pollak S, Marshall G., Wafford K.A., Svendsen C.N. Growth factors regulate the syrvival and fate of cells derived from human neurospheres // Nat. Biotechnol. - 2001.-V.19, №5. - P.475-479.

4. Francisco G. Nobrega, Carol L. Kieckmann, Alexander

Tzagoloff. A rapid Method for detecting specific RNA transcripts by hibridization to KNA probes in solution // Biochem. -1983. - №131, - P.141-145.

5. Gilardino A., Perroteau I., Lovisolo K., Kistasi C. In vitro identification of dividing neuronal precursors from chick embryonic ciliary ganglion // Neuroreport. - 2000. - V.11, №6. - P.1209-1212.

6. Hellmich H.L., Kos L, Cho E.S, Mahon K.A., Zimmer A. Embryonic expression of glial cell-line derived neurotrophic factor (GKNF) suggests multiple developmental roles in neural differentiation and epithelial mesenchymal interactions // Mech. Kev. -1996. - V.54, №1. - P. 95-105.

7. Howard L., Werner M.K. The pole of growth factors receptors in central nervous system development and neoplasia // Neurosurgery. -1995. - V.37, №2.

- P.179-193.

8. Lachyankar M.B., Condon P.J., Quesenberry P.J., Litofsky N.S., Recht L.K., Ross A.H. Embryonic precursor cells that express Trk receptors: induction of different cell fates by NGF, BKNF, NT-3 and CNTF // Exp. Neurol. - 1997. - V. 144, №2. - P. 350-360.

9. MacLennan A.J., Vinson E.N., Marks L., McLaurin K.L., Pfeifer M., Lee N. Immunohistochemical localization of ciliary neurotrophic factor receptor alpha expression in the rat nervous system // J. Neurosci. -1996. - V.16, №2 - P. 621-630.

10. Maisonpierre P.C., Bellusio L, Friedman B, Alderson R.F., Wiegand S.J, Furth M.E, Lindsay R.M, Yancopoulos G.K. NT-3, BKNF, and NGF in the developing rat nervous system; paralllel as well as reciprocal patterns cf expression // Neuron. - 1990.

- V.5, №4. - P.501-509.

11. Mariano B. Neurotrophic factors and their receptors // Curr. Kpin. in Cell Biol. - 1995. -№7.-P. 148-155.

12. Mikaels A., Livet J., Westphal H., Ke Lapeyriere k, Errfors P. A dyn amic regulation of GKNF-family receptors correlates with a specific trophic dependency of cranial motor neuron subpopulations during development // Europ. J. Neurosci. -2000.-V.12 , №2. - P.446-456.

13. Sambrook J., Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press-2nd ed - 1989. - 485 p.

14. Sanchez M.P., Silos-Santiago I., Frisen J., He B., Lira S.A., Barbacid M. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacing GKNF / / Nature. - 1996. - V. 382, № 6586. - P.70-73.

15. Schtcterson L.C., Bothwell M. Neurotrophin and neurotrophin receptor mRNA expression in developing inner ear // Hear. Res. - 1994.- V.73, №1. - P. 92-100.

16. Vega J.A, San Jose I, Cabo R, Rodriquez S, Represa J. Trks and p75 genes are differentially expressed in the inner ear of human embryos. What may Trks and p75 null mutant mice suggest on human development // Neurosci. Lett. - 1999. - V. 272, №2. - P. 103-106.

17. Vicario-Abejon C, Collin C, McKay R.K., Segal M. Neurotrophins induce formation of functional excitatory and inhibitory synapses between cultured hippocampal neurons // J. Neurosci. -1998. - V.18, №18. - P. 7256 -7271.

18. Yao L. , Zhang K., Bernd P. The oneset of neurotrophin and trk mRNA expression in early embryonic tissues of the quail // Kev. Biol . - 1994.

- V. 165, №2. - P. 727-730.

19. Zhang S.H, Zhou X.F., Keng Y.S., Rush R.A. Measurement of neurotrophin 4/5 in rat tissues by a sensitive immunoassay. // J. Neurosci. Methods.

- 1999. - V.89, №1.- P. 69-74.

Експреая нейротроф1чних фактор1в у ембрюнальному мозку людини 5-9 тижшв гестацп

Цимбалюк B.I, Васильева 1.Г., Чопик Н.Г., Галанта О.С., Цюбко O.I, Олексенко Н.П., Вашуленко Т.Н.

У визначенш кшцевого фенотипу нейрошв, що ди-ференцшються, регуляцп 1х прол1ферацп, а також шдтримщ виживання як диференцшованих, так i неди-ференцшованих нервових клггин головну роль вщграе хiмiчне оточення. Проте сценарш експресп сигнальних молекул на рiзних стадiях ембрюгенезу нервово! ткани-

ни вивчений ще далеко не повшсттю. Метою нашо! ро-боти стало вивчення експресп BKNF, NGF, GKNF, NT-3, NT-4/5 та CNTF у ембрюнальному мозку людини 59 тиж гестацп методом пбридизацп ДНК-РНК на штро-целюлозному фiльтрi.

Дослiдження показали. що на цьому еташ ембрюгенезу експресуються лише три з обраних нами фактс^в: BKNF, NT-3 та NT-4/5 у ктькоста, що може бути виз-начена цим методом. Експреая шших фaкторiв нерво-вою тканиною або в1дсутня у цей перюд або 11 рiвень знаходиться за межами чутливостi ДНК-РНК гiбриди-зацii.

Neurotrophins expression in human brain from embryonic weeks 5-9

Tsymbaliuk VI, Vasilyem I.G, Galanta ES, Chopik N.G, Tsyubko K.I., olexenko N.P, Vaschulenko T.N.

The chemical surrounding play a crucial role in determination of phenotyping differentiation during neurogenesis and рromotion of survival as differentiated so as undifferentiated neural cells. But the scenario of signal molecules expression in early embryonic stage is poorly understood. Therefore we examined expression of neurotrophic factors BKNF, NGF, GKNF, NT-3, NT-4/5 and CNTF in human brain from emryonic weeks 59 by KNA-RNA hybridization on nitrocellulose filter.

These study revealed that only BKNF, NT-3 and NT4/5 were expressed in detectable rate in these period. Kther factors demonstrated no expression ore its mRNK rate was aut of sensitiveness of these method.

Комментарий

к статье Цимбалюка В.И., Васильевой И.Г., Чопик Н.Г., Галанты ЕС, Цюбко О.И., Олексенко Н.П., Вашуленко Т.Н. « Экспрессия нейротрофических факторов в эмбриональном мозге человека 5—9 нед гестации»

Трансплантация эмбриональной нервной ткани остается широко дискутируемым, альтернативным медикаментозному направлением в терапии многих заболеваний ЦНС. Положительное действие, оказываемое имплантируемыми эмбриональными клетками, изучается многими лабораториями мира, однако остается большое количество открытых вопросов относительно механизмов их биологического действия. Одним из объяснений наблюдаемого трофического эффекта может служить синтез имплантатом определенных сигнальных молекул. Представленная группой авторов работа определяет три нейротрофина (BKNF, NT-3, NT-4/5), экспрессируемых эмбриональным мозгом человека в приоритетный для забора донорского материала период. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что девятинедельный эмбриональный мозг имеет преимущество по сравнению с другими сроками гестации. Поэтому данная работа представляет не только научную, но и практическую ценность.

Обращает на себя внимание большое количество экспериментального материала, а также тщательно подобранный обзор литературных данных, так как информация об эндогенном синтезе трофических факторов в эмбриональных тканях человека и животных скудна и носит разрозненный спорадический характер.

А.Т.Носов доктор мед. наук, профессор, заведующий лабораторией электронной микроскопии

Института нейрохирургии им. акад. А.П.Ромоданова АМН Украины