ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫЕ СЛИТЫЕ БЕЛКИ VWF С УЛУЧШЕННОЙ ФАРМАКОКИНЕТИКОЙ

,
1. Слитый белок, содержащий основной белок и один или более пептидов удлинениягде аминокислотная последовательность основного белка идентична или схожа с аминокислотной последовательностью белка млекопитающего или его фрагмента, и указанный пептид удлинения содержит кластер O-гликозилированных аминокислот.
2. Слитый белок по п. 1, где слитый белок имеет повышенное время полужизни по сравнению с основным белком без пептида удлинения.
3. Слитый белок по п. 1 или 2, где аминокислотная последовательность одного или нескольких пептидов удлинения идентична или схожа с неповторяющейся частью аминокислотной последовательности указанного основного белка или фрагмента.
4. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, при условии, что один или более пептидов удлинения не получают из β-субъединицы хорионического гонадотропина (CG-β), в частности, он не является идентичным или схожим с C-концевым пептидом (CTP) CG-β.
5. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где кластеры O-гликозилированных аминокислот пептидов удлинения содержат по меньшей мере два, предпочтительно - по меньшей мере три, более предпочтительно - по меньшей мере четыре O-гликозилированных аминокислоты.
6. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где кластер O-участков гликозилирования содержит по меньшей мере один треонин в качестве O-гликозилированной аминокислоты, предпочтительно, указанные кластеры содержат треонин и серин в качестве O-гликозилированных аминокислот.
7. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где один или более пептидов удлинения содержат по меньшей мере один O-участок гликозилирования на десять аминокислот, предпочтительно - по меньшей мере один O-участок гликозилирования на восемь аминокислот.
8. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где один или более пептидов удлинения имеют длину в диапазоне от 20 до 60 аминокислот, предпочтительно - от 22 до 40 аминокислот, более предпочтительно - от 26 до 36 аминокислот.
9. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где один или более пептидов удлинения имеют идентичность последовательности по меньшей мере 90% по отношению к O-гликозилированному пептиду фактора фон Виллебранда (VWF).
.
10. Слитый белок по п. 9, где один или более пептидов удлинения имеют идентичность последовательности по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 95%, более предпочтительно - по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно - по меньшей мере 100% по отношению к O-гликозилированному пептиду VWF, в частности, SEQ ID NO: 1
.
11. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, содержащий по меньшей мере две копии, предпочтительно - по меньшей мере четыре копии пептида удлинения
12. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где пептид удлинения напрямую или косвенно слит с C-концом основного белка.
13. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где пептид удлинения образует C-конец слитого белка, где C-концевая аминокислота указанного пептида удлинения, необязательно, соединена с аффинной меткой слитого пептида.
14. Слитый белок по любому из пп. 9-13, где основной белок содержит по меньшей мере одинкластер O-гликозилированных аминокислот.
15. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок содержит домен димеризации, в частности, основной белок содержит домен димеризации.
16. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где белок млекопитающего является белком крови человека, предпочтительно, фактором свертывания или ингибитором протеазы, более предпочтительно, выбран из группы, состоящей из VWF, протромбина, фибриногена, FIII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, ADAMTS13, антитромбина, альфа-1-антитрипсина, ингибитора C1, антихимотрипсина, PAI-1, PAI-3, 2-макроглобулина, TFPI, кофактора гепарина II, протеина Z, протеина C и протеина S.
.
17. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где основной белок имеет идентичность последовательности по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 95%, более предпочтительно - по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно - 100% по отношению к аминокислотам 764-1268 SEQ ID NO: 2
18. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок содержит по меньшей мере 4, предпочтительно - по меньшей мере 8, более предпочтительно - по меньшей мере 12 дополнительных O-гликанов по сравнению с основным белком.
19. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где аминокислотная последовательность слитого белка имеет идентичность по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 95%, более предпочтительно - по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно - 100% по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.
20. Слитый белок по любому из предшествующих пунктов, где слитый белок получают посредством экспрессии в линии клеток млекопитающего, предпочтительно - линии клеток человека, более предпочтительно - линии клеток почки человека, наиболее предпочтительно - линии эмбриональных клеток почки человек, в частности, линии клеток HEK293, такой как HEK293F.
21. Композиция первого белка и второго белка, где указанный первый белок является слитым белком по любому из пп. 1-20 и способен связываться с указанным вторым белком, и указанный второй белок является терапевтическим белком, содержащим аминокислотную последовательность, идентичную или схожую с аминокислотной последовательностью второго белка млекопитающего или его фрагмента.
22. Композиция по п. 21, где время полужизни второго белка, связанного с первым белком, повышается по сравнению со свободной формой указанного второго белка, предпочтительно, где время полужизни второго белка, связанного с первым белком, повышается по сравнению с указанным вторым белком, связанным с нативным белком млекопитающего, или основным белком без слитого пептида.
23. Композиция по п. 21 или 22, где молярное соотношение первого белка и второго белка находится в диапазоне от 0,1 до 250, предпочтительно - в диапазоне от 0,5 до 50, более предпочтительно - в диапазоне от 1 до 25, наиболее предпочтительно - в диапазоне от 2 до 10.
.
24. Композиция по любому из пп. 21-23, где аффинность связывания первого белка со вторым белком находится в диапазоне от 0,05 до 3 нМ
25. Композиция по любому из пп. 21-24, где второй белок млекопитающего является белком крови, более предпочтительно, указанный второй белок млекопитающего является белком плазмы, наиболее предпочтительно, указанный второй белок является фактором свертывания.
26. Композиция по п. 25, где второй белок млекопитающего является белком человека.
27. Композиция по любому из пп. 21-25, где второй белок является белком FVIII, выбранным из полноразмерного FVIII, белка FVIII, в котором, по меньшей мере, часть B-домена отсутствует, и белка FVIII, в котором, по меньшей мере, часть B-домена заменяют пептидом удлинения, где пептид удлинения определяют по любому из пп. 5-10.
28.Композиция по любому из пп. 21-27, где один или более пептидов удлинения находятся в положении в свернутом состоянии первого белка, не мешающем связыванию первого белка со вторым белком.
29. Комплекс первого белка и второго белка, где указанный первый белок является слитым белком по любому из пп. 1-20, и указанный второй белок имеет аминокислотную последовательность, идентичную или схожую с аминокислотной последовательностью второго белка млекопитающего или его фрагмента.
30. Комплекс по п. 29, где первый белок нековалентно связан со вторым белком.
31. Комплекс по п. 29 или 30, содержащий две копии первого и второго белка, где две копии первого белка образуют димер, предпочтительно, нековалентно связанный димер.
32. Комплекс по п. 29, где первый белок ковалентно связан со вторым белком, где линкер выбран из пептидной связи, химического линкера или гликозидной связи.
33. Полинуклеотид, кодирующий слитый белок по любому из пп. 1-20.
34. Полинуклеотид, кодирующий слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность с идентичностью по меньшей мере 90%, предпочтительно - по меньшей мере 95%, более предпочтительно - по меньшей мере 98%, наиболее предпочтительно - 100% по отношению к последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 14.
35. Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 33 или 34, где остов вектора, предпочтительно, выбран из pCDNA3, pCDNA3,1, pCDNA4, pCDNA5, pCDNA6, pCEP4, pCEP-puro, pCET1019, pCMV, pEF1, pEF4, pEF5, pEF6, pExchange, pEXPR, pIRES и pSCAS.
36. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. 33 или 34 или вектор по п. 35, где клетка-хозяин, предпочтительно, является клеткой млекопитающего, предпочтительно - клеткой человека, более предпочтительно - клеткой почки человека, наиболее предпочтительно - линией эмбриональных клеток почки человека, в частности, линией клеток HEK293, такой как HEK293F.
37. Применение слитого белка по любому из пп. 1-20 для повышения времени полужизни второго белка, где слитый белок способен связываться с указанным вторым белком.
38. Применение фармацевтической композиции, содержащей слитый белок по любому из пп. 1-20, композиции по любому из пп. 21-28 или комплекса по любому из пп. 29-32 для лечения или профилактики нарушения свертываемости, предпочтительно, выбранного из лечения PUP и лечения ITI и/или родственных нарушений свертываемости.
39. Применение по п. 38, где применение включает внутривенную или невнутривенную инъекцию, предпочтительно, подкожную инъекцию.