СПОСОБ ОЧИСТКИ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII

1. Способ очищения или обогащения фактора свертывания крови FVIII с использованием хроматографии, который включает следующие стадии:
- обеспечение фракции, содержащей FVIII, в водном растворе с высокой ионной силой;
- приведение фракции, содержащей FVIII, в контакт с многомодальной смолой;
- необязательное промывание многомодальной смолы, на которую абсорбирован FVIII, водным промывочным буфером;
- элюирование содержащих FVIII фракций водным элюирующим буфером, содержащим, по крайней мере, одну аминокислоту, которая положительно заряжена при величине рН 6-8; и
- необязательно сбор содержащих FVIII фракций в очищенной или обогащенной форме.
2. Способ по п.1, где многомодальная смола включает присоединенные к матрице функциональные группы, и указанные функциональные группы способны взаимодействовать с FVIII в водной среде путем ионного взаимодействия и других типов взаимодействий, таких как образование водородных связей и гидрофобное взаимодействие.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что FVIII представляет собой рекомбинантный FVIII, в частности FVIII с удаленным В-доменом.
4. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что водный раствор содержит FVIII в растворе с большим содержанием соли, соответствующим проводимости в диапазоне от приблизительно 25 до приблизительно 200 мС/см при 25°С.
5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что аминокислота, которая положительно заряжена при рН 6-8, выбрана из группы аминокислот, содержащих аминокислоты, такие как лизин, аргинин, гистидин и их комбинации, в частности в концентрации >0,4 М, в частности >0,5 М.
2+
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что элюирующий буфер дополнительно включает, по крайней мере, одно органическое соединение, содержащее гидроксильную группу, такое как спирт, по крайней мере, одно органическое соединение, содержащее аминогруппу, такое как аминокислота, по крайней мере, один источник ионов Са, по крайней мере, одно соединение для регулирования ионной силы буфера, такое как неорганические соли, по крайней мере, один неионогенный детергент и, по крайней мере, одно буферное вещество для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 6 до приблизительно 8, в частности для поддержания приблизительно нейтрального значения рН.
2+
2
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что спирт выбран из группы, состоящей из метанола, пропанола, этиленгликоля и пропиленгликоля; источником Саявляется CaCl; неорганические соли выбраны из группы, состоящей из KCl и NaCl; неионогенный детергент выбран из группы, состоящей из Tween 20, Tween 80 и Pluronic F68; буферное вещество выбрано из группы, состоящей из цитрата натрия, гистидина, HEPES, MES и ацетата натрия при рН 6-8.
8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что многомодальную смолу обрабатывают промывочным буфером, чтобы вымыть примеси и сохранить FVIII прежде, чем FVIII будет высвобожден.
9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что "многомодальная" хроматографическая смола содержит, по крайней мере, один из следующих фрагментов:
а. положительно заряженный лиганд N-бензил-N-метилэтаноламин,
b. отрицательно заряженный лиганд 2-(бензоиламино)бутановую кислоту,
с. фенилпропильный лиганд,
d. N-гексильный лиганд,
е. 4-меркаптоэтилпиридиновый лиганд,
f. лиганд 3-((3-метил-5-((тетрагидрофуран-2-илметил)амино)фенил)амино)бензойную кислоту или их сочетания.
10. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что "многомодальная" хроматографическая смола выбрана из следующих коммерчески доступных смол НЕР Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; МЕР Hypercel™.
11. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что стадию многомодальной хроматографии комбинируют со стадией аффинной хроматографии FVIII, где аффинность обеспечивается лигандом на основе белка, который экспрессируется в дрожжах.
12. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что последовательность операций очистки дополнительно включает стадии удаления/инактивации патогенов, которые представляют собой стадию инактивации с использованием химических реагентов, стадию разделения по размерам, хроматографические стадии или их комбинации, которые основаны на различных физиологических свойствах, нацеленных против удаляемого патогена.
13. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что последовательность операций очистки дополнительно включает следующие стадии:
i. анионная мембрана, такая как Sartobind Q, в частности для уменьшения содержания ДНК;
ii. катионная многомодальная смола, такая как Capto ММС;
iii. катионообменная смола, такая как SP Sepharose FF;
iv. анионная мембрана, такая как Sartobind FF, в частности для дальнейшего уменьшения содержания ДНК;
v. стадия инактивации с использованием химических реагентов для вирусов с липидной оболочкой, в частности стадия инактивирующей обработки типа "растворитель/детергент" с использованием три-н-бутилфосфата и Triton Х-100;
vi. аффинная смола на основе белкового лиганда, такая как VIIISelect, причем лиганд VIIISelect состоит из фрагмента антитела, экспрессируемого в дрожжах, или анионная многомодальная хроматографическая смола, такая как Capto Adhere;
vii. стадия удаления патогенов путем фильтрации с использованием фильтра со средним размером пор приблизительно 20 нм, такого как Planova 20N;
viii. анионообменная смола, такая как Q Sepharose FF;
ix. смола для эксклюзионной хроматографии, такая как Superdex 200 pg.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что условия элюирования FVIII на стадии катионного обмена основаны на использовании Са с концентрацией в диапазоне 0,15-0,25 М, а общая проводимость элюирующего буфера не превышает 25 мС/см при 25°С.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что чистота после последней стадии очистки составляет >4000 IU/мг, предпочтительно >9000 IU/мг и более предпочтительно >10000 IU/мг белка, а содержание ДНК составляет <1000 пг/1000 IU FVIII, предпочтительно <100 пг/1000 IU FVIII и более предпочтительно <10 пг/1000 IU FVIII.
16. Композиция вещества, содержащая очищенный рекомбинантный FVIII, который можно получить способом по любому из пп.1-15.