Промотор pro-SmAMP-X из растения звездчатка белая (Stellaria media L.) для экспрессии рекомбинантных генов в клетках растений
PRO-SMAMP-X PROMOTER FROM THE CHICKWEED (STELLARIA MEDIA L.) PLANT FOR EXPRESSION OF RECOMBINANT GENES IN PLANT CELLS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биологии, молекулярной биологии, биотехнологии и генетической инженерии растений, и может быть использовано в составе генетических конструкций для контроля экспрессии рекомбинантных генов и биосинтеза рекомбинантных белков в клетках растений. Настоящее изобретение может применяться для наработки рекомбинантных белков в клетках растений методом транзиентной экспрессии, для создания трансгенных растений, продуцирующих рекомбинантные белки, для отбора трансгенных клеток, каллусов, побегов и проростков растений на питательной среде с селективным агентом. Настоящее изобретение может применяться в фундаментальных исследованиях биологии растений с использованием методов прямой и обратной генетики.
Уровень техники
Изучение промоторов необходимо для выяснения координированной экспрессии генов в клетках растений в изменяющихся условиях окружающей среды. В нуклеотидных последовательностях полноразмерных промоторов белок-кодирующих генов выделяют дистальную, проксимальную и «коровую» области. «Коровая» область содержит канонический цис-действующий элемент (или цис-элемент) TATA box, локализованный около 20-40 п.н. выше (или левее) сайта инициации транскрипции (Transcription Start Site, TSS), в котором базовые транскрипционные белки (RNA Pol II, TATA-binding proteins и TBP-associated factors) взаимодействуют для включения транскрипции (Hernandez-Garcia and Finer 2014). Изменение экспрессии генов достигается благодаря физическому взаимодействию между базовыми транскрипционными  белками и регуляторными белками, связывающими примыкающую проксимальную промоторную область. Дистальная область промотора, наиболее удаленная от TSS, может влиять на эффективность экспрессии генов благодаря трехмерной подвижности ДНК и пространственному сближению с «коровой» областью.
Функциональную архитектуру полноразмерного промотора определяют множественные регуляторные элементы (энхансеры, сайленсоры, инсуляторы и цис-элементы) - специфические последовательности нуклеотидов для связывания регуляторными белками, распределенные вдоль нуклеотидной последовательности промотора. Взаимодействия между различными регуляторными последовательностями и связывающими их белками играют главную роль в определении эффективности и тканеспецифичности эукариотического промотора.
Изолированные нуклеотидные последовательности промоторов имеют существенное значение для регулирования экспрессии рекомбинантных генов в генетически-модифицированных клетках и растениях. Изолированные промоторы могут сохранять свои основные функции в гетерологичных растениях, однако качественные и количественные вариации экспрессии рекомбинантных генов под их контролем не являются редкостью и должны быть изучены для каждого промотора, который предлагается для биотехнологии растений (Hernandez-Garcia and Finer 2014).
Используемые в генетической инженерии растений промоторы классифицируют на конститутивные (активны в большинстве тканей и стадий развития), пространственно-временные (активны в определенных тканях и/или на определенных стадиях развития) и индуцибельные (активирующиеся при наличии внешних химических или физических воздействий). К отдельному классу относят синтетические промоторы, содержащие искусственный набор различных по происхождению регуляторных элементов (Hernandez-Garcia and Finer 2014).
Сильные и конститутивные промоторы наиболее востребованы в рутинной генетической инженерии растений, поскольку наряду с эффективной экспрессией «целевых» генов (генов интереса) способны обеспечивать экспрессию селективных генов на уровне, достаточном для отбора трансформированных клеток и побегов на средах с селективными агентами. Наиболее популярным сильным и конститутивным промотором для генетической инженерии растений является промотор CaMV35S, созданный на основе промоторной области 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV (Odell et al. 1985).
Ранее считали, что типичный промотор генов растений по размеру более 1 тыс. п.н. и значительно менее эффективен в сравнении сильными и конститутивными промоторами из вирусов растений (например, CaMV35S, MUASMSCP, FMV и др.), предложенными для биотехнологии растений (Odell et al. 1985; Ranjan et al. 2011; Acharya et al. 2014). Однако изолированные из патогенов растений промоторы могут приводить к нарушению развития трансгенных растений (Ali and Kim 2019), они менее предпочтительны с экологической точки зрения и их эффективность может подавляться в случае заражения генетически модифицированных растений вирусами (Al-Kaff et al. 2000).
Ранее в биотехнологии растений практически все трансгенные растения содержали два рекомбинантных гена, один из которых под контролем конститутивного промотора был необходим для селективного отбора трансформированных клеток, а другой «целевой» ген под контролем промотора любого типа был предназначен для изменения фенотипа растения. В настоящее время возможности мультигенной трансформации делают доступным импорт в растения целых метаболических путей, благодаря экспрессии нескольких «целевых» генов, и разработку трансгенных культур, одновременно производящих целый спектр соединений (Zhu et al. 2007; Peremarti et al. 2010). Но каждый дополнительный рекомбинантный ген нуждается в собственном промоторе, что требует применения в одной генетической конструкции различных промоторов со схожим уровнем и профилем экспрессии или одного промотора несколько раз. В первом случае ощущается дефицит доступных промоторов с необходимыми параметрами, а во втором случае введение повторяющихся последовательностей в один или разные локусы трансгенного растения может иметь негативное влияние на экспрессию и наследование входящих в них рекомбинантных генов из-за эффекта гомологозависимого замолкания (Mette et al. 1999; Lessard et al. 2002; Potenza et al. 2004; Mourrain et al. 2007).
Таким образом, несмотря на существующие достижения в области молекулярной биологии и биотехнологии, необходимость точной и координированной экспрессии рекомбинантных генов в трансгенных растениях обуславливает потребность поиска новых промоторов генов растений с разной генетической основой. Использование таких промоторов для экспрессии различных рекомбинантных генов позволит создавать стабильные трансгенные растения, эффективно продуцирующие ценные вторичные метаболиты или сложные белки.
Раскрытие сущности изобретения
Объектом изобретения является нуклеотидная последовательность промоторной области гена альфа-гарпинина SmAMP-X (GenBank: HG423454.1), ранее клонированного из генома растения звездчатка белая, или мокрица, (Stellaria media L.). Промотор pro-SmAMP-X представлен в качестве 5'-делеционных вариантов двух промоторных версий. Версия 1 промотора pro-SmAMP-X, обозначена как pro-SmAMP-X-1, представлена полноразмерной нуклеотидной последовательностью -1230 п.н. (SEC ID NO 1) и ее 5'-делеционными вариантами -381 п.н. (SEC ID NO 2), -248 п.н. (SEC ID NO 3) и -172 п.н. (SEC ID NO 4) относительно TSS гена альфа-гарпинина SmAMP-X. Версия 2 промотора pro-SmAMP-X, обозначена как pro-SmAMP-X-2, представлена двумя 5'-делеционными вариантами -405 п.н. (SEC ID NO 5) и -171 п.н. (SEC ID NO 6) относительно TSS гена альфа-гарпинина SmAMP-X. Промотор pro-SmAMP-X предназначен для создания генетических конструкций с целью экспрессии рекомбинантных генов в клетках растений и в трансгенных растениях, в том числе в их последовательных поколениях.
Генетические конструкции, с контролирующим экспрессию рекомбинантных («целевых» или селективных) генов промотором pro-SmAMP-X, и содержащие терминатор транскрипции, предназначены для генетической трансформации клеток растений, в том числе, с использованием штаммов агробактерий (Agrobacterium).
Штаммы агробактерий, содержащие генетические конструкции с «целевым» или селективным генами под контролем промотора pro-SmAMP-X, предназначены для агробактериальной инфильтрации тканей растений или для ко-культивации с растительными эксплантами с целью создания трансгенных растений.
Инфильтрация растительных тканей с использованием штаммов агробактерий, содержащих генетические конструкции с целевым геном под контролем промотора pro-SmAMP-X, обеспечивает биосинтез и накопление «целевого» белка на уровне, который сопоставим с уровнем накопления при использовании сильного вирусного промотора CaMV35S.
Агробактериальные штаммы, содержащие генетические конструкции с «целевым» геном под контролем промотора pro-SmAMP-X, после ко-культивации с растительными эксплантами позволяют создавать трансгенные растения, продуцирующие «целевые» рекомбинантные белки на уровне, сопоставимом с уровнем накопления при использовании сильного вирусного промотора CaMV35S.
Агробактериальные штаммы, содержащие генетические конструкции с селективным геном под контролем промотора pro-SmAMP-X, после ко-культивации с растительными эксплантами позволяют отбирать трансгенные клетки, каллусы, побеги и проростки растений на питательной среде с селективным агентом в избыточной концентрации. Это свойство промотора обеспечивает более строгую и эффективную селекцию трансгенных клеток.
Основной технический результат изобретения заключается в расширении арсенала новых эффективных промоторов для генетической инженерии растений, в том числе для экспрессии рекомбинантных генов с различной эффективностью.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Нуклеотидная последовательность промоторной области гена SmAMP-Х. (а) Версия pro-SmAMP-Х-1 размером -1230 п.н. относительно TSS вместе с 5'-НТО гена SmAMP-Х; (б) Версия pro-SmAMP-Х-2 размером -405 п.н. относительно TSS вместе с 5'-НТО гена SmAMP-Х. 5'-НТО подчеркнута, основные цис-элементы выделены рамкой и обозначенных надписями. Сайт начала трансляции atg выделен красным. Вертикальными красными стрелками и зелеными цифрами отмечены начальные точки нуклеотидных последовательностей 5'-делеционных вариантов промоторов.
Фиг. 2. Генетические конструкции на основе растительного экспрессионного вектора pCAMBIA1381z, в которых содержащий интрон репортерный ген gusА находится под контролем делеционных вариантов промотора pro-SmAMP-Х-1 и pro-SmAMP-Х-2. Растительный экспрессионный вектор pMOG35SintGUS геном gusА под контролем вирусного промотора CaMV35S использован в качестве контроля. Черным цветом показана область гена gusА; Int - модифицированный интрон каталазы клещевины внутри транслируемой области гена gusА; PIV2 - модифицированный интрон гена ST-LS1 картофеля внутри транслируемой области гена gusА. Промоторы изображены в виде стрелок с соответствующими подписями.
Фиг. 3. Генетические конструкции на основе растительного экспрессионного вектора pCAMBIA2300, в которых селективный ген nptII находится под контролем делеционного варианта 381 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-1 и делеционного варианта 405 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-2. Вектор pCAMBIA2300 с геном nptII под контролем дуплицированного вирусного промотора 2хCaMV35S использован в качестве контроля. Область гена nptII показана синим. Промоторы изображены в виде стрелок с соответствующими подписями.
Фиг. 4. Активность репортерного белка β-глюкуронидазы (GUS) в листьях растений N. benthamiana при транзиентной экспрессии гена gusА под контролем различных делеционных вариантов промоторов pro-SmAMP-Х-1, pro-SmAMP-Х-2 и вирусного промотора CaMV35S (контроль). Горизонтальными линиями отмечены делеционные варианты на основе соответствующих промоторных версий. Цифрами ниже оси абсцисс показаны размеры делеционных вариантов в п.н. относительно TSS. Планки погрешностей соответствуют стандартным ошибкам. * - значения, существенно отличающиеся от контроля.
2
Фиг. 5. Активность репортерного белка β-глюкуронидазы (GUS) в листьях трансгенных растений A. thaliana поколения Т с экспрессией гена gusА под контролем различных делеционных вариантов промоторов pro-SmAMP-Х-1, pro-SmAMP-Х-2 и вирусного промотора CaMV35S (контроль). Горизонтальными линиями отмечены делеционные варианты на основе соответствующих промоторных версий. Цифрами ниже оси абсцисс показаны размеры делеционных вариантов в п.н. относительно TSS. Планки погрешностей соответствуют стандартным ошибкам. * - значения, существенно отличающиеся от контроля.
Фиг. 6. Морфогенез соматических клеток листовых эксплантов табака (N. tabacum) на питательной среде с антибиотиком канамицином в концентрации 350 мг/л при использовании делеционного варианта 381 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-1 или делеционного варианта 405 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-2 для контроля экспрессии селективного гена nptII.
1
Фиг. 7. Сегрегация растений табака (N. tabacum) поколения Т на селективной среде с канамицином. Белыми стрелками указаны некоторые чувствительные к канамицину растения. Зеленые растения устойчивы к антибиотику канамицину. Для контроля экспрессии селективного гена nptII использовали делеционные варианты 381 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-1 и 405 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-2.
2
Фиг. 8. Анализ с помощью ПЦР геномной ДНК растений табака (N. tabacum) поколения Т на наличие «слитной» области, состоящей из нуклеотидных последовательностей гена nptII и делеционного варианта 381 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-1 или делеционный вариант 405 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-2. М - ДНК-маркер. «К+» - положительный контроль (pC2300-405). «K-» - отрицательный контроль.
Фиг. 9. Активность репортерного белка β-глюкуронидазы (GUS) в листьях трансгенных растениях картофеля (S. tuberosum) с экспрессией гена gusА под контролем делеционных вариантов 248 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-1 и 405 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-2. (а) Уровень активности в среднем по трем измерениям за 2 мес. вегетации в теплице; (б) Локализация активности с помощью гистохимического окрашивания с использованием субстрата X-gluc после 3 мес. вегетации в теплице. После вакуумной инфильтрации содержащего субстрат раствора, листья инкубировали при температуре 37°С в течение суток. Номерами обозначены индивидуальные трансформанты.
Осуществление изобретения
Приведенное выше раскрытие описывает изобретение в общих чертах. Более полное понимание может быть достигнуто за счет представления соответствующих примеров. Представленные здесь примеры приводятся исключительно с целью иллюстрации и никоим образом не претендуют на то, чтобы сузить область данного изобретения в рамках этих примеров. Изменение формы или замещение эквивалентов допускается на основании его целесообразности в соответствующих условиях. Хотя здесь и будут применяться специфические термины, они используются исключительно с описательной целью.
Пример 1. Клонирование промотора гена альфа-гарпинина pro-SmAMP-X из генома растения звездчатка белая (Stellaria media L.)
Нуклеотидная последовательность гена альфа-гарпинина (α-hairpinin peptide) SmAMP-X из растения Stellaria media L., включающая 5'-нетранслируемую и кодирующую пептид области (GenBank: HG423454.1), была клонирована ранее (Slavokhotova et al. 2014).
Поскольку геном растения мокрицы не секвенирован, то не представлялось возможным непосредственно клонировать нуклеотидные последовательности промотора pro-SmAMP-Х. Для клонирования промотора вместе с 5'-нетранслируемой областью (5`-НТО) гена SmAMP-X использовали метод, разработанный ранее для обнаружения локусов интеграции Т-ДНК в геноме растений арабидопсиса (Pogorelko and Fursova 2008). Для этого выделили геномную ДНК растений мокрицы и гидролизовали ее с использованием рестриктазы HinfI, для которой обнаружили сайты рестрикции в прилежащей кодирующей области гена SmAMP-X. Затем в соответствие с методикой лигировали ДНК и использовали в качестве матрицы для последовательной амплификации с двумя парами ориентированных противоположно праймеров. Для этого разработали комплементарные 5'-НТО и прилежащей кодирующей области гена SmAMP-X праймеры: «внешние» smXa1 (5`-cgttactcaaccgtaatgc-3`) и smXa2 (5`-agagcgatgataacgatcag-3`) и «внутренние» smXb1 (5`-cgagagtaaaagcaacaaca-3`) и smXb1 (5`-gtcgaggagaagggtatgat-3`). В результате последовательных раундов амплификации, сначала с «внешними», а потом с «внутренними» праймерами получили индивидуальный ампликон размером около 500 п.н. Его секвенированием установили, что между последовательностями «внутренних» праймеров находятся известные нуклеотидные последовательности гена SmAMP-Х, между которыми располагается промоторная область. С целью проверки существования данной области в нативном геноме мокрицы разработали новые праймеры smXF (5`-gaattcgtatctcaagatcatcacggacaattaa-3`) и smX(400)R (5`-ccatggagttagttatgtaatttgtgtgtaatgt-3`). Праймер smX(400)R был комплементарен части 5`-НТО гена, непосредственно перед инициирующим кодоном atg, а праймер smXF комплементарен 5'-концу предполагаемой нуклеотидной последовательности промотора. В результате амплификации интактной ДНК мокрицы получили ампликон размером около 450 п.н. Его секвенированием в составе Т-вектора установили, что он включает известную 5`-НТО гена SmAMP-Х размером 35 п.н. и примыкающие к ней проксимальную и «коровую» промоторные области pro-SmAMP-Х размером около 400 п.н. Секвенированием десяти образцов плазмидной ДНК из независимых бактериальных клонов показали, что в геноме мокрицы присутствуют не менее двух версий промотора pro-SmAMP-Х, обозначенные pro-SmAMP-Х-1 (размером 381 п.н.) и pro-SmAMP-Х-2 (размером 405 п.н.), идентичные на 86% (фиг. 1).
Установили, что эти версии pro-SmAMP-Х-1 (381 п.н.) и pro-SmAMP-Х-2 (405 п.н.) различались точечным полиморфизмом и инделами 18, 4 и 3 п.н. Для клонирования полноразмерной последовательности pro-SmAMP-Х создали дополнительные новые праймеры комплементарные его проксимальной области: «внешние» smXa3 (5`- aaaaattggaagtatgctaaacgataaatacttg -3`) и smXa4 (5`- gacgaggatgaatgaattgaaagcattt -3`) и «внутренние» smXb3 (5`- cccaacacgtctatcttacaaccaaata -3`) и smXb4 (5`- tagttgtatcaaaagggttaagatcgaa -3`). В качестве матрицы для амплификации использовали ранее полученную геномную ДНК растений мокрицы, гидролизованную с помощью рестриктазы HinfI и обработанную лигазой. В результате последовательных раундов амплификации с «внешними» и «внутренними» праймерами получили индивидуальный ампликон размером около 1000 п.н. Его секвенированием установили, что между последовательностями «внутренних» праймеров находятся уже известные нуклеотидные последовательности проксимальной промоторной области pro-SmAMP-Х, между которыми располагается дистальная промоторная область. Для проверки существования полноразмерного промотора в интактном геноме мокрицы разработали прямой праймер smX(1265) (5`- caattattaaatattccctcccaattaaaagaaat -3`), комплементарный 5'-концу предполагаемой дистальной области. Праймер smX(1265) вместе с созданным ранее smX(400)R использовали для амплификации интактной геномной ДНК мокрицы. В результате получили ампликон размером 1265 п.н., включающий 5`-НТО гена SmAMP-Х размером 35 п.н. и примыкающую к ней промоторную область версии pro-SmAMP-Х-1 размером 1230 п.н., как показано на фиг. 1.
В клонированной в данном исследовании последовательности 5`-НТО гена SmAMP-Х обнаружили замену нуклеотида «g» на нуклеотид «a» в положении +21 относительно +1 п.н. сайта инициации транскрипции (TSS) в сравнение с опубликованной ранее последовательностью (Slavokhotova et al. 2014). С использование программы Blast не обнаружили в GenBank других нуклеотидных последовательностей, идентичных последовательности нового промотора pro-SmAMP-Х.
Анализ in silico нуклеотидных последовательностей обоих версий промотора выполнили с помощью online программы «New place A Database of Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements» (https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace ). Результаты показали, что последовательности обоих промоторов содержат несколько типов потенциальных цис-элементов, включая канонические CAAT-box и TATA-box (Фиг. 1). В обеих версиях TATA box находится в ожидаемом положении -34 п.н. влево относительно TSS. Цис-элемент CAAT box локализован в области минимального промотора -100 п.н. относительно TSS. Кроме этого, идентифицировали и другие потенциальные цис-элементы, способные обеспечить тканеспецифичную или индуцибельную экспрессию гена SmAMP-X или выступить в качестве энхансеров или супрессоров его экспрессии. Они включали цис-элементы реагирующие на свет (IBOXCORE, GATABOX, G-box, TBOXATGAPB, SORLIP1AT, GT1CONSENSUS, GT1GMSCAM4 и GT1-motif) и на фитогормоны (ATHB6COREAT, P-box, AAGAA-motif), необходимые для ткане- и органспецифической экспрессии (CACTFTPPCA1, SORLIP1AT и RYREPEATBNNAPA), для ответа на стресс (CCAATBOX1, GT1GMSCAM4, MBS и MYCCONSENSUSAT), для циркадной экспрессии (CIACADIANLELHC element) и др.
Пример 2. Создание 5'-делеционных вариантов промотора pro-SmAMP-Х и генетических конструкций для агробактериальной трансформации растений
На основе результата анализа последовательностей промоторов pro-SmAMP-Х-1 (1230 п.н.) и pro-SmAMP-Х-2 (405 п.н.) подобрали праймеры для создания 5'-делеционных вариантов с целью последующей оценки их эффективности для контроля экспрессии рекомбинантных генов. В результате создали четыре новых «прямых» праймера (1230f - gaattccaattattaaatattccctcccaatta; 381f - gaattcgtatctcaagatcatcacggacaattaa; 248f - gaattctctttaatagcctccctacgacataac и 172f - gaattcacttgtgctatattattcactttgcat), ограничивающих области промотора pro-SmAMP-Х-1, соответственно, -1230, -381, -248 и -172 п.н. (фиг. 1). Праймеры 381f и 172f были универсальными и их использовали для создания также делеционных вариантов -405 и -171 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-2. Все «прямые» праймеры содержали сайт рестрикции EcoRI, а «обратный» праймер smX(400)R (комплементарен 5`-НТО гена SmAMP-Х) - сайт NcoI, необходимые для клонирования в растительные экспрессионные векторы pCAMBIA1381z и pCAMBIA2300.
В качестве матрицы для амплификации делеционных вариантов промотора pro-SmAMP-Х использовали геномную ДНК из растения мокрицы. С использованием разработанных праймеров амплифицировали, секвенировали и клонировали в экспрессионный вектор pCAMBIA1381z четыре делеционных варианта промотора pro-SmAMP-Х-1, обозначенных, как pro-SmAMP-Х-1(1230), pro-SmAMP-Х-1(381), pro-SmAMP-Х-1(248) и pro-SmAMP-Х-1(172), а также два делеционных варианта промотора pro-SmAMP-Х-2, обозначенных, как pro-SmAMP-Х-2(405) и pro-SmAMP-Х-2(171). Схема полученных конструкций, обозначенных, соответственно, рС1381z-1230, рС1381z-381, рС1381z-248, рС1381z-172, рС1381z-405 и рС1381z-171 отображена на фиг. 2.
Созданные генетические конструкции предназначены для экспрессии в растениях «целевого» гена, находящегося под контролем промотора pro-SmAMP-Х. В качестве «целевого» гена использован содержащий интрон репортерный ген gusA (или uidA), позволяющий оценить эффективность экспрессии по активности его белкового продукта - фермента β-глюкуронидазы (GUS). Растительный экспрессионный вектор pMOG35SintGUS, содержащий ген gusA под контролем известного вирусного промотора CaMV35S применили в качестве контроля. Перечисленные выше генетические конструкции использовали для создания агробактериальных штаммов на основе клеток GV3101 Agrobacterium tumefaciens.
При создании трансгенных растений для оптимизации селекции трансформированных клеток и проростков на питательной среде с антибиотиком канамицином в качестве базовой использовали плазмиду pCAMBIA2301. Для этого по сайтам рестрикции Eco91I и EcoRI лигировали в pCAMBIA2301 фрагменты плазмид рС1381z-1230, рС1381z-381, рС1381z-248, рС1381z-172 и рС1381z-405, содержащие нуклеотидные последовательности соответствующего делеционного варианта промотора и гена gusA, вырезанные по сайтам Eco91I и EcoRI. В результате создали генетические конструкции рС2301-1230, рС2301-381, рС2301-248, рС2301-172 и рС2301-405, которые предназначены для экспрессии в трансгенных растениях гена gusA, находящегося под контролем различных вариантов промотора pro-SmAMP-Х.
С целью оценки возможности использования промотора pro-SmAMP-Х для контроля экспрессии селективного гена неомицинфосфотрансферазы II (nptII), придающего клеткам растений устойчивость к антибиотику канамицину, создали генетические конструкции на основе экспрессионного вектора pCAMBIA2300. Для этого клонировали нуклеотидную последовательность делеционного варианта 381 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-1 и делеционного варианта 405 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-2 по сайтам рестрикции EcoRI и NcoI в pCAMBIA2300 (фиг. 3). В качестве сравнительного контроля задействовали плазмиду pCAMBIA2300 с геном nptII под контролем дуплицированного вирусного промотора 2хCaMV35S.
Генетические конструкции на основе плазмид pCAMBIA2300 и pCAMBIA2301 использовали для создания агробактериальных штаммов с применением клеток AGL0 A. tumefaciens.
Пример 3. Транзиентная экспрессия репортеного гена gusA под контролем промотора pro-SmAMP-Х в агроинфильтрированных растениях Nicotiana benthamiana
Инфильтрацию листьев растений N. benthamiana проводили семью вариантами агробактерий GV3101 с плазмидными генетическими конструкциями рС1381z-1230, рС1381z-381, рС1381z-248, рС1381z-172, рС1381z-405, рС1381z-171 и pMOG35SintGUS в качестве сравнительного контроля. Штаммы агробактерий культивировали на агаризованной питательной среде LB с антибиотиками канамицином (100 мг/л), рифампицином (100 мг/л) и гентамицином (25 мг/л). Для проведения агроинфильтрации листьев растений штаммы выращивали в жидкой питательной среде LB при тех же концентрациях перечисленных выше антибиотиков в течение суток при температуре 28°С и перемешивании (160 об/мин). Для подавления РНК-интерференции в клетках растений использовали штамм A. tumifaciens GV2260/C58C1 pLH7000 р19 (Стрельникова и др. 2014), который выращивали в жидкой питательной среде LB с антибиотиками рифампицином (100 мг/л) и стрептомицином (50 мг/л) в течение суток при температуре 28°С и перемешивании (160 об/мин).
Суспензии клеток агробактерий разбавляли до оптической плотности 0.6 при длине волны 600 нм. Затем штаммы GV3101 pMOG35SintGUS, GV3101 рС1381z-1230, GV3101 рС1381z-381, GV3101 рС1381z-248, GV3101 рС1381z-172, GV3101 рС1381z-405 и GV3101 рС1381z-171 смешивали в соотношение 1:1 с суспензией агробактерий GV2260/C58C1 pLH7000 р19. Готовую смесь агробактерий вводили в листья растений N. benthamiana шприцом без иглы с внутренней стороны. После инфильтрации растения содержали при температуре 21°C и 16-день/8-ночь ч режиме освещении. На 7 день из места инокуляции брали высечки массой 10 мг и замораживали при -70°С.
Из каждой высечки получали белковые экстракты, в которых количественно измеряли активность рекомбинантного фермента β-глюкуронидазы с использованием субстрата 4-метилумбеллиферил-D-глюкуранида (MUG, PhytoTechnology Laboratories) и концентрацию водорастворимых белков методом Бредфорд. На основе полученных значений рассчитывали активность репортерного белка GUS в пмоль/мин*мг. Для каждой генетической конструкции проанализировали 60 высечек, полученных за три повторения эксперимента. Средний уровень активности GUS при использовании каждого делеционного варианта промотора pro-SmAMP-Х и вирусного промотора CaMV35S представлен на фиг. 4.
Как следует из данных фиг. 4, новый промотор pro-SmAMP-Х функционален в клетках гетерологичных растений N. benthamiana. При использовании различных делеционных вариантов уровень активности GUS находился в диапазоне от 3000 до 27000 пмоль/мин*мг, при использовании вирусного промотора CaMV35S составил 37000 пмоль/мин*мг. Все варианты версии pro-SmAMP-Х-1 и делеционный вариант 171 п.н. промотора pro-SmAMP-Х-2 оказались слабее (р = 0.05) сильного вирусного промотора CaMV35S, а вариант 405 п.н. pro-SmAMP-Х-2 сопоставим с ним по эффективности. Сравнение сходных по длине делеционных вариантов (381 и 405 п.н.) и (172 и 171 п.н.) разных промоторных версий pro-SmAMP-Х, идентичных, соответственно, на 86 и 97% свидетельствует, что наблюдаемый между ними нуклеотидный полиморфизм приводит к различиям в их эффективности. Эта особенность может быть использована для понимания фундаментальных механизмов работы растительных промоторов и для «тонкого» тюнинга эффективности промотора в зависимости от потребностей научной работы.
Пример 4. Трансгенные растения Arabidopsis thaliana с экспрессией репортерного гена gusA под контролем промотора pro-SmAMP-Х
1
1
2
2
С использованием конструкций рС2301-1230, рС2301-381, рС2301-248, рС2301-172 и рС2301-405 выполнили генетическую трансформацию растений арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) методом погружения соцветий в суспензию агробактерий (Zhang et al. 2006). На питательной среде с антибиотиком канамицином в концентрации 50 мг/л отобрали полученные в результате независимых трансформационных событий резистентные растения поколения T, продуцирующие репортерный белок GUS. В результате самоопыления трансгенных растений T получили семена поколения T. С помощью селекции на питательной среде с антибиотиком канамицином отобрали независимые популяции T с моногенным наследованием Т-ДНК, из которых выбрали индивидуальные гомозиготные растения, которые использовали для количественного измерения активности GUS с помощью субстрата MUG (фиг. 5).
Установили, что новый промотор pro-SmAMP-Х функционален в клетках гетерологичных растений A. thaliana. При использовании различных делеционных вариантов промотора уровень активности GUS находился в диапазоне от 2400 до 6600 пмоль/мин*мг, при использовании вирусного промотора CaMV35S составил 8400 пмоль/мин*мг. Все варианты версии pro-SmAMP-Х-1 оказались слабее (р = 0.05) сильного промотора CaMV35S, а вариант 405 п.н. pro-SmAMP-Х-2 сопоставим с ним по эффективности. В целом соотношение между уровнями активности GUS при использовании разных вариантов промоторов в трансгенных растениях A. thaliana и при транзиентной экспрессии в растениях N. benthamiana было сходным. Сравнение сопоставимых по длине делеционных вариантов 381 и 405 п.н. разных промоторных версий pro-SmAMP-Х, идентичных на 86% свидетельствует, что наблюдаемый между ними нуклеотидный полиморфизм приводит к различиям в их эффективности. Эта особенность может быть использована для понимания фундаментальных механизмов работы растительных промоторов и для «тонкого» тюнинга эффективности промотора в трансгенных растениях. Все варианты промотора pro-SmAMP-Х сохраняют свою эффективность в поколениях трансгенных растений и способны эффективно работать, находясь в аллельных положениях в гомозиготных линиях трансгенных растений. Это свойство промотора принципиально важно при селекции трансгенных линий сельскохозяйственных растений с полезными признаками.
Таким образом, новый промотор pro-SmAMP-Х обеспечивает экспрессию репортерного гена gus, в том числе на уровне сильного промотора CaMV35S. Высокая эффективность растительного промотора сохраняется в ряду последовательных поколений трансгенных растений.
Пример 5. Сравнительная оценка конститутивности экспрессии селективного гена nptII под контролем промотора pro-SmAMP-Х в трансгенных растениях табака
Методом агробактериальной трансформации листовых эксплантов растений табака (Nicotiana tabacum) оценили эффективность селекции трансгенных клеток на питательной среде с антибиотиком канамицином. Для этого с помощью генетических конструкций pC2300-381, pC2300-405 и pC2300 выполнили ко-культивацию листовых эксплантов табака с агробактериями, как описано нами ранее (Shukurov et al. 2012). Установили, что обе версии промотора pro-SmAMP-Х-1(381) и pro-SmAMP-Х-2(405) достаточны для конститутивного уровня экспрессии селективного гена nptII и обеспечивают селекцию трансформированных клеток, каллусов и побегов на среде с канамицином в избыточной концентрации 350 мг/л (фиг. 6).
За три месяца селекции обе версии промотора pro-SmAMP-Х позволили сформировать устойчивые к канамицину каллусы и побеги у 50 % эксплантов, при использовании промотора 2хCaMV35S морфогенез наблюдали у всех эксплантов. Последнее обстоятельство не удивительно, поскольку вирусный регуляторный элемент 2хCaMV35S в составе плазмиды pC2300 содержит две промоторные копии, заведомо определяющие его более высокую эффективность (фиг. 3). Отметим, что ранее в растениях табака только промотор pro-SmAMP2 из мокрицы был сопоставим по уровню конститутивности экспрессии селективного гена nptII с промотором 2хCaMV35S, в то время как промотор pro-SmAMP1 оказался в три раза менее эффективным (Madzharova et al. 2018). Кроме этого, версия промотора pro-SmAMP-Х-2(405) визуально была более эффективна для морфогенеза, чем версия pro-SmAMP-Х-1(381).
0
0
Регенерацию побегов оценивали в течение трех месяцев культивирования. Регенерирующие побеги отделяли от каллуса и селектировали на питательной среде с канамицином в концентрации 100 мг/л в течение 1.5 месяца. Укореняющиеся побеги получили при использовании обеих версий промотора, но в случае pro-SmAMP-Х-2(405) побегов было получено примерно в 2 раза больше. С использованием молекулярно-биологического анализа (ПЦР) десять устойчивых к канамицину регенерантов каждого варианта установили, что все растения не имели агробактериальной контаминации и содержали нуклеотидные последовательности, соответствующие «слитным» участкам промоторных областей и гена nptII, т.е. являлись первичными трансформантами, обозначенными Тp2300-381 и Тp2300-405. В последнем случае для ПЦР использовали праймер 381f, а также ранее созданный праймер комплементаный части гена nptII - olgminus (Madzharova et al. 2018).
1
1
1
1
С целью определения эффективности промотора pro-SmAMP-Х для селекции трансгенных проростков табака в результате самоопыления первичных трансформантов получили семена поколения Т, обозначенные Тp2300-381 и Тp2300-405. На селективной среде с канамицином в концентрации 200 мг/л в популяциях проростков Т обнаружили их сегрегацию на устойчивые и неустойчивые растения (фиг. 7).
1
Среди части популяций с обеими версиями промотора отметили сегрегацию на устойчивые и неустойчивые генотипы в соотношении 3:1, предполагающую моногенное наследование Т-ДНК и ее расположение в единственном локусе генома трансгенных растений. Во всех проанализированных устойчивых к канамицину Т-растениях методом ПЦР обнаружили «слитные» нуклеотидные последовательности промоторных областей и гена nptII ожидаемого размера около 500 п.н. (фиг. 8).
Таким образом, новый промотор pro-SmAMP-Х обеспечивает конститутивную экспрессию селективного гена nptII, заведомо достаточную для селекции трансформированных клеток на среде с рекомендованной концентрацией антибиотика канамицина от 50 до 100 мг/л (Дрейпер и др. 1991). Высокая эффективность промотора сохраняется в проростках и в ряду последовательных поколений трансгенных растений.
Пример 6. Трансгенные растения картофеля с экспрессией репортерного гена gusA под контролем промотора pro-SmAMP-Х
Для агробактериальной трансформации использовали растения картофеля клубненосного (Solanum tuberosum L.) сорта Вектор (Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт картофельного хозяйства имени А.Г. Лорха»). Генетическую трансформацию с использованием ранее созданных конструкций рС2301-248 (версия промотора pro-SmAMP-Х-1) и pС2301-405 (версия промотора pro-SmAMP-Х-2) выполнили в соответствие с опубликованной нами ранее методикой (Ветчинкина и др. 2016). В результате независимых трансформационных событий создали, соответственно, 6 (обозначены № 1, 8, 11, 12, 26 и 27) и 8 (обозначены № 1, 2, 3, 4, 5, 8, 14 и 17) трансформантов картофеля, устойчивых к антибиотику канамицину в концентрации 75 мг/л и продуцирующих репортерный белок GUS. С использованием субстрата MUG установили, что в теплице у трансгенных растений уровень активности GUS варьирует в диапазоне от 100 до 6500 пмоль/мин*мг (фиг. 9а).
И данных фиг. 9а следует, что в листьях индивидуальных трансгенных растений картофеля уровень активности GUS при использовании конструкции pС2301-405 выше, чем при использовании конструкции рС2301-248. В среднем уровень активности GUS с применением pС2301-405 составил 3645 ± 651 пмоль/ мин*мг и был до 9 раз выше (р = 0.05), чем с применением рС2301-248 - 396 ± 130 пмоль/ мин*мг.
С помощью гистохимического окрашивания с использованием в качестве субстрата натриевой соли 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-β-D-глюкуроновой кислоты (Х-gluc, PhytoTechnology Laboratories) показали распределение активности GUS в листьях и черешках трансгенных растений картофеля (фиг. 9б).
Из данных фиг. 9б следует, что оба промотора pro-SmAMP-Х-1 и pro-SmAMP-Х-2 активны в клетках паренхимы листа и в проводящих элементах листа и черешка. Обе версии промотора более эффективны в проводящих элементах, особенно черешков. Так же визуально отметили, что для экспрессии репортерного гена в листьях и черешках растений картофеля более эффективен промотор pro-SmAMP-Х-2(405), чем pro-SmAMP-Х-1(248).
Заключение
Промотор pro-SmAMP-Х может быть рекомендован для биотехнологии растений в качестве регуляторного элемента с целью контроля экспрессии рекомбинантных («целевых» и селективных) генов. Этот промотор подходит как для транзиентной экспрессии, так и для создания трансгенных растений, его эффективность сохраняется в ряду последовательных поколений. Промотор может быть использован для генетической модификации растений из разных ботанических семейств, в том числе для генетической инженерии сельскохозяйственных культур. Использование делеционных вариантов pro-SmAMP-Х, обладающих разной эффективностью, позволит скоординировать экспрессию рекомбинатных генов под его контролем с экспрессией рекомбинантных или нативных генов под контролем других промоторов. Дополнительным преимуществом является то обстоятельство, что промотор pro-SmAMP-Х имеет отличающуюся от известных промоторов генетическую основу, поэтому может быть использован для модификации растений, находясь в составе одной генетической конструкции с другими промоторами из мокрицы. Сравнение между собой свойств 1 и 2 версий промотора pro-SmAMP-Х, свидетельствует, что наблюдаемый между ними полиморфизм функционален и может быть использован для понимания фундаментальных механизмов работы растительных промоторов и для «тонкого» тюнинга промоторов.
Список литературы
Acharya S., Ranjan R., Pattanaik S. et al. (2014) Efficient chimeric plant promoters derived from plant infecting viral promoter sequences. Planta 239:381-396. https://doi.org/10.1007/s00425-013-1973-2
Ali S., Kim W-C. (2019) A Fruitful Decade Using Synthetic Promoters in the Improvement of Transgenic Plants. Frontiers in Plant Science https://doi.org/10.3389/fpls.2019.01433
Al-Kaff N.S., Kreike M.M., Covey S.N. et al. (2000) Plants rendered herbicide-susceptible by cauliflower mosaic virus-elicited suppression of a 35S promoter-regulated transgene. Nature Biotechnol. 18:995-999. https://doi.org/10.1038/79501
Hernandez-Garcia C.M., Finer J.J. (2014) Identification and validation of promoters and cis-acting regulatory elements. Plant Science 217:109-119. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2013.12.007
Lessard P.A., Kulaveerasingam H., York G.M. et al. (2002) Manipulating gene expression for the metabolic engineering of plants. Metabolic Engineering. 4(1):67-79.
Madzharova N.V., Kazakova K.A., Strelnikova S.R. et al. (2018) Promoters pro-SmAMP1 and pro-SmAMP2 from Wild Plant Stellaria media for the Biotechnology of Dicotyledons. Russ J Plant Physiol 65:750-761. https://doi.org/10.1134/S1021443718040040
Mette M.F., van der Winden J., Matzke M.A., Matzke A.J.M. (1999) Production of aberrant promoter transcripts contributes to methylation and silencing of unlinked homologous promoters in trans // The EMBO journal. 18(1):241-248.
Mourrain P., van Blokland R., Kooter J.M., Vaucheret H. (2007) A single transgene locus triggers both transcriptional and post-transcriptional silencing through double-stranded RNA production // Planta. 225(2):365-379.
Odell J.T., Nagy F., Chua N.H. (1985) Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature. 313(6005):810-812.
Peremarti A., Twyman R.M., Gómez-Galera S. et al. (2010) Promoter diversity in multigene transformation // Plant molecular biology. 73(4-5):363-378.
Pogorelko G.V. and Fursova O.V. (2008) A highly efficient miPCR method for isolating FSTs from transgenic Arabidopsis thaliana plants. Journal of Genetics. 87(2):133-140.
Potenza C., Aleman L., Sengupta-Gopalan C. (2004) Targeting transgene expression in research, agricultural, and environmental pplications: Promoters used in plant transformation. In Vitro CellDevBiol-Plant. 40(1):1-22.
Ranjana R., Patroa S., Kumaria S. et al. (2011) Efficient chimeric promoters derived from full-length and sub-genomic transcript promoters of Figwort mosaic virus (FMV). Journal of Biotechnology 152:58-62. https://doi.org/10.1016/j.jbiotec.2011.01.015
Shukurov R.R., Voblikova V.D., Nikonorova A.K. et al. (2012) Transformation of tobacco and Arabidopsis plants with Stellaria media genes encoding novel hevein-like peptides increases their resistance to fungal pathogens // Transgenic Research. V. 21. P. 313-325.
Slavokhotova A.A., Rogozhin E.A., Musolyamov A.K. et al. (2014) Novel antifungal α-hairpinin peptide from Stellaria media seeds: structure, biosynthesis, gene structure and evolution. Plant Mol Biol. 84(1-2):189-202. doi: 10.1007/s11103-013-0127-z
Zhang X., Henriques R., Lin S.-S., Niu Q.-W., Chua N.-H. (2006) Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method // Nature Protocols. V. 1. P. 641-646.
Zhu C., Naqvi S., Gomez-Galera S. et al. (2007) Transgenic strategies for the nutritional enhancement of plants. Trends in plant science. 12(12):548-555.
Ветчинкина Е.М., Комахина В.В., Высоцкий Д.А. и др. (2016) Экспрессия растительного гена антимикробных пептидов pro-SmAMP2 повышает устойчивость трансгенных растений картофеля к возбудителям альтернариоза и фузариоза. Генетика. 52, 1055-1068.
Дрейпер Д., Скотт Р., Армитидж Ф. и др., Генная инженерия растений. Лабораторное руководство. Учебное издание. Москва: Мир. 1991. 408 c.
Стрельникова A.Р., Вобликова A.Д., Шукуров A.Р. и др. (2014) Изучение нового растительного proSmAmp2 из Stellaria media методом агробактериальной инфильтрации растений // Биотехнология. Т. 2014. С. 8-17.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<210> SEC ID NO 1
<211> Длина: 1230
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Stellaria media
<400> Последовательность: 1
caattattaa atattccctc ccaattaaaa gaaattcaaa attatggcac atacacctaa       60
aatttaacgt cgttaactat aatatgcttt tttggatatg cttggcatat atggcaaaac      120
tcagggacat ttcgtacata ttcttaaaaa gttgggtacc acgtgaatta aggcaaatct      180
caggggtgcc acgtgaattt gccgtaattt taattcctga aaaaaaaaaa aaaaaaattc      240
ttcttgtaat atgatacttt caaatatttt ttcgaaaatc gaattatttt ctgaaaaatt      300
aaaattttga aaatcttctt ataaaagaaa aactaaaaaa aaataaatat tttttcgaag      360
atcgaatttt ttttttgaaa aacattatgt tttgaaaaaa aattctataa accgtattaa      420
tttttttttt ttcaaaaatc ggaatatttt ttgagaataa ataatattgg aagaaaacat      480
tatttttgta aaaaaatata aatttttgaa agaaaaaatt ttgagaaaaa agaaattgga      540
tttttttttt gaaaatacaa aactttgatt ttttgtttga aatatattcg aaaaatatat      600
aaacattcaa gaaaaaatag aaaataagta gagggtaaat ccgtcatttc atactaatta      660
atccattttg gatttcaatg taaatctgaa aaaaaaaata ctaagatgaa gaaaaaaaag      720
actactgtga atgaaaaaat gtcaagtatt ttttttctan tatttaacct ttacacgtat      780
ttcggttaaa attctcatct ttaacccaaa ataaaaaggt cgaaattata gaaattgcaa      840
ctgatttttg tatctcaaga tcatcacgga caattaatat tttcgatctt aacccttttg      900
atacaactaa aattatacaa gacatgataa tattattaga aaaatgcttt caattcattc      960
atcctcgtcc ctacgataca aatctttaat agcctcccta cgacataaca ttaggagttt     1020
attgcatgaa aaaattggaa gtatgctaaa cgataaatac ttgtgctata ttattcactt     1080
tgcatgcacc ccaacacgtc tatcttacaa ccaaatacat tcgtcacaat gcatgttttt     1140
cgacagttcg actcaccaaa tgtagttcca ttttaatcac taatttctgt atataagcca     1200
ccctatgctc gccaattttc attcatcatt                                      1230
<210> SEC ID NO 2
<211> Длина: 381
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Stellaria media
<400> Последовательность: 2
gtatctcaag atcatcacgg acaattaata ttttcgatct taaccctttt gatacaacta       60
aaattataca agacatgata atattattag aaaaatgctt tcaattcatt catcctcgtc      120
cctacgatac aaatctttaa tagcctccct acgacataac attaggagtt tattgcatga      180
aaaaattgga agtatgctaa acgataaata cttgtgctat attattcact ttgcatgcac      240
cccaacacgt ctatcttaca accaaataca ttcgtcacaa tgcatgtttt tcgacagttc      300
gactcaccaa atgtagttcc attttaatca ctaatttctg tatataagcc accctatgct      360
cgccaatttt cattcatcat t                                                381
<210> SEC ID NO 3
<211> Длина: 248
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Stellaria media
<400> Последовательность: 3
tctttaatag cctccctacg acataacatt aggagtttat tgcatgaaaa aattggaagt       60
atgctaaacg ataaatactt gtgctatatt attcactttg catgcacccc aacacgtcta      120
tcttacaacc aaatacattc gtcacaatgc atgtttttcg acagttcgac tcaccaaatg      180
tagttccatt ttaatcacta atttctgtat ataagccacc ctatgctcgc caattttcat      240
tcatcatt                                                               248
<210> SEC ID NO 4
<211> Длина: 172
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Stellaria media
<400> Последовательность: 4
acttgtgcta tattattcac tttgcatgca ccccaacacg tctatcttac aaccaaatac       60
attcgtcaca atgcatgttt ttcgacagtt cgactcacca aatgtagttc cattttaatc      120
actaatttct gtatataagc caccctatgc tcgccaattt tcattcatca tt              172
<210> SEC ID NO 5
<211> Длина: 405
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Stellaria media
<400> Последовательность: 5
gtatctcaag atcatcacgg acaattaata tttttaatct taaccccttt aatacaacta       60
aaattagaca acacatgata atattataag aaaaatgctt tcattcatcc tgttccctac      120
gatacaacta tacactacga tacaactata caagtcttta atagcctccc tacgacataa      180
cattaggagt ttattgcatg aaaaaattgg aagtatgcta aatgtacagt aaacacttgt      240
gctatattat tcactttgca tgcactccaa cacgtctatc ttacaaccaa atacattcgt      300
cacaatgcat gtttttcgac agttcgactc accaaatgta gttccatttt aatcactaat      360
ttctgtatat aacccaccct aggtcgccag atttcattca tcatt                      405
<210> SEC ID NO 6
<211> Длина: 171
<212> Тип: ДНК
<213> Организм: Stellaria media
<400> Последовательность: 6
acttgtgcta tattattcac tttgcatgca ctccaacacg tctatcttac aaccaaatac      60
attcgtcaca atgcatgttt ttcgacagtt cgactcacca aatgtagttc cattttaatc     120
actaatttct gtatataacc caccctaggt cgccagattt cattcatcat t              171
<---