КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СУХОГО ВЕСА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ТЕЛЕЦ
QUANTITATIVE DETERMINATION OF PROTEINS WITH APPLICATION OF DRY WEIGHT OF INTRACELLULAR BODIES

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способам количественного определения белковых продуктов от рекомбинантного продуцирования белков с использованием сухого веса сбора внутриклеточных телец.
Предпосылки создания изобретения
E.coli
Высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков, продуцированных в бактериях, таких как , часто приводит к образованию нерастворимых агрегатов внутри бактериальной клетки, известных как внутриклеточные тельца (Shein et al., Bio/Technology 7:1141-49, 1989). Белок внутриклеточного тельца является белком, который, вообще говоря, является сверхэкспрессированным в реципиенте, который на последних стадиях экспрессии или очистки является видимым методом фазовоконтрастной микроскопии как преципитат. Внутриклеточные тельца являются электроноплотными аморфными частицами, которые имеют прерывистую границу с цитоплазмой, но не окружены мембраной (Schoemaker et al., EMBO J 4: 775-780, 1985). Во время получения внутриклеточных телец различные типы взаимодействия могут привести к вторичной адсорбции других загрязняющих веществ, таких как эндотоксины, остатки стенок клеток и липиды (Marston FAO, Biochem. J. 240: 1-12, 1986). Средний размер частиц внутриклеточных телец зависит от экспрессированного конкретного целевого белка, штамма-реципиента, экспрессионной системы и используемой культуральной среды и может быть в интервале от 0,07 мкм для гормона роста человека (Blum P. et al., Bio/Technology 10: 301-304, 1992) до 1,5 мкм для β-лактамазы (Bowden et al., Bio/Technology 9: 725-730, 1991). Дополнительное описание можно найти в патенте США № 4512922, который говорит о внутриклеточных тельцах как о "преломляющих тельцах".
Внутриклеточные тельца обычно собирают из клеточного лизата путем нескольких стадий центрифугирования и промывки после того, как клетки лизированы (например, путем лизиса лизоцимом, обработки ультразвуком или гомогенизацией под высоким давлением, см., например, патенты США №№ 4511503, 4518526, 5605691 и 6936699). Очищенные внутриклеточные тельца затем растворяют или денатурируют, например, детергентом или другим раствором (мочевиной, SDS, гидрохлоридом гуанидина), что заставляет нерастворимые молекулы белка развернуться и стать растворимыми. Денатурант может быть затем удален, например, диализом, молекулярным ситом или центрифугированием при высокой скорости для удаления компонентов более высокого молекулярного веса и декантирования денатуранта. Рекомбинантный белок отделяют и подвергают повторной укладке, чтобы образовать правильные структуры высокого порядка, которые являются биологически активными.
Для того чтобы гарантировать эффективную реакцию рефолдинга важно контролировать количество и концентрацию белков в реакции рефолдинга. Белки, извлеченные из внутриклеточных телец, обычно определяют анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) аликвоты сбора внутриклеточных телец. Однако современные методы анализа ВЭЖХ являются сложными и отнимающими много времени из-за природы процесса.
Таким образом, в данной области сохраняется потребность в более эффективных и точных способах определения концентраций рекомбинантного белка, продуцированного во время рекомбинантного получения белков.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение направлено на усовершенствованные методы количественного определения белка, продуцированного и перенесенного во внутриклеточные тельца в рекомбинантных белковых (бактериальных) культурах.
В одном аспекте изобретение предлагает способ расчета концентрации рекомбинантного белка в сборах бактериального внутриклеточного тельца (IB, inclusion body), включающий шаг умножения суммарной концентрации сухих веществ в аликвоте взвеси сбора IB и коэффициента пересчета продуктивности белка (PPCF, Protein Productivity Conversion Фактор) в формуле, где результат формулы дает суммарную концентрацию белка в указанной аликвоте указанной взвеси сбора IB, и где PPCF для указанного рекомбинантного белка определяют из аликвоты взвеси сбора IB умножением отношения рекомбинантного белка в указанной аликвоте к суммарному содержанию сухих веществ в указанной аликвоте на 1000. Суммарный рекомбинантный белок может быть рассчитан согласно формуле
[(суммарное количество сухих веществ, мг)/(аликвота взвеси сбора IB, г) × PPCF] × общий вес взвеси сбора IB, г = (суммарный рекомбинантный белок, мг).
Коэффициент пересчета продуктивности белка может быть рассчитан согласно формуле
(PPCF) = [рекомбинантный белок (мг) в указанной аликвоте/сумма сухих веществ в указанной аликвоте (мг)] × 1000.
В альтернативном осуществлении коэффициент пересчета продуктивности белка может быть рассчитан на основе альтернативных единиц, которые должны быть определены. Например, концентрации могут быть выражены как г/кг, г/л, мг/г, мг/мл и являются, вообще говоря, эквивалентными, поскольку плотности материала очень близки к единице. По существу концентрация в мг/мл эквивалентна концентрации в мг/г, допуская, что плотность близка к 1 г/мл.
2
В одном аспекте рекомбинантным белком может быть любой белок, который экспрессирован в бактериях в форме нерастворимого внутриклеточного тельца в трансформированных бактериях, т.е. бактериях, которые были трансформированы или трансфицированы векторами рекомбинантной ДНК, которые направляют экспрессию генов, кодированных для гетерологичных белков. Рекомбинантные белки, предполагаемые для использования в способе по изобретению, включают, но не ограничиваются этим, антитело (такое как поликлональное антитело, моноклональное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, фрагменты антител Fab, F(ab'), Fv, Sc Fv или SCA, биспецифичное антитело, диатело, пептитело, химерное антитело и линейное антитело), фермент, гормон, цитокин, хемокин, фактор роста, транскрипционный фактор, трансмембранный белок, рецептор клеточной поверхности, белок неспецифической адгезии клеток, цитоскелетный белок, белок слияния или фрагмент или аналог любого из вышеназванных белков.
В одном осуществлении PPCF для одной аликвоты сбора внутриклеточных телец используют для расчета концентрации рекомбинантного белка от различных ферментационных сборов внутриклеточных телец, проведенных по одной и той же методике.
В другом аспекте изобретение предполагает, что суммарный рекомбинантный белок в указанной аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец вначале определяют анализом методом ВЭЖХ. В одном осуществлении титр белка определяют после солюбилизации внутриклеточных телец в аликвоте сбора внутриклеточных телец и рекомбинантный белок в образце определяют анализом ВЭЖХ.
В следующем аспекте внутриклеточные тельца в аликвоте сбора внутриклеточных телец не солюбилизируют до сушки.
Изобретение далее предполагает, что сухой вес аликвоты внутриклеточных телец рассчитывают путем сушки выделенной взвеси внутриклеточных телец микроволновым излучением. В одном осуществлении сушка дополнительно включает использование тепла. В следующем осуществлении сушку проводят в приборе CEM LabWave 9000. Дополнительно предполагается, что сухой вес рекомбинантного белка может быть определен с использованием общепринятого в практике метода, включающего нагрев, микроволновое излучение, сушку воздухом, лиофилизацию, сушку вымораживанием и вакуумную сушку. После того как образец высушен, сухой вес твердых веществ может быть определен количественно с использованием обычных весов.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение направлено на усовершенствованные способы количественного определения белка, продуцированного и перенесенного во внутриклеточные тельца в культурах клеток-реципинтов рекомбинантного белка.
Как описано здесь, было обнаружено, что при одних и тех же или практически идентичных условиях ферментации образование внутриклеточных телец является в высокой степени упорядоченным процессом и состав рекомбинантного белка внутриклеточных телец является весьма консистентным. Опираясь на обнаружение этой консистентности образования и состава внутриклеточных телец, был предложен и верифицирован способ определения концентрации рекомбинантного белка во внутриклеточных тельцах путем количественного определения сухого веса или процента твердых веществ во взвеси сбора внутриклеточных телец и последующего умножения этой измеренной величины сухого веса на заранее определенный коэффициент пересчета. Полагаясь на консистентность состава внутриклеточных телец, способ определяет концентрацию рекомбинантного белка только в малой аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец, чтобы рассчитать коэффициент пересчета для конкретного белка, и устраняет необходимость количественного определения во всем сборе внутриклеточных телец с использованием отнимающих много времени и сложных методов, таких как ВЭЖХ. После того как процесс ферментации разработан и создан для продуцирования данного рекомбинантного белка в данной клетке-реципиенте, коэффициент пересчета для этого белка может быть использован для экстраполяции суммарного рекомбинантного белка для различных партий сборов внутриклеточных телец без необходимости проводить расчет для каждой партии до тех пор, пока процесс ферментации остается существенно неизменным. Это открытие предлагает быстрый, надежный и менее дорогой способ контроля количества/концентрации белков перед ключевыми стадиями процесса, такими как рефолдинг. Кроме того, предварительно определенный коэффициент пересчета может быть использован для мониторинга консистентности ферментации.
Термин "рекомбинантный белок" относится к молекуле гетерологичного белка, которая экспрессирована в клетки-реципиенты, трансфицированные молекулой гетерологичной ДНК.
Термин "внутриклеточное тельце" относится к нерастворимому агрегату внутри бактериальной клетки-реципиента, который содержит белок, экспрессированный в клетку-реципиент. В то время как белок во внутриклеточных тельцах в трансфицированных клетках-реципиентах является почти полностью рекомбинантным (гетерологичным) белком, эндогенные (или гомологичные) белки клеток-реципиентов могут составлять часть суммарного белка.
Термин "сбор внутриклеточных телец" относится к собранным внутриклеточным тельцам, продуцированным во время процесса ферментации для получения рекомбинантного белка. Сбор внутриклеточных телец может иметь разную степень очистки. Образцы Post Kill ("после цитолиза") относятся к образцам бактериальной культуры перед лизисом, но после цитолиза бактерий методами, известными в практике. Термин "Cell Paste" ("клеточная паста") относится к образцу сбора выросших в культуре внутриклеточных телец, коллектированному обычно центрифугированием перед лизисом бактериальных клеток-реципиентов для высвобождения внутриклеточных телец. Промытая часть внутриклеточных телец (WIB) относится к сбору выросших в культуре внутриклеточных телец после промывки внутриклеточных телец по меньшей мере один раз или два раза (дважды промытые внутриклеточные тельца, DWIB).
Термин "взвесь внутриклеточных телец" или "взвесь сбора внутриклеточных телец" относится к сбору выросших в культуре внутриклеточных телец, который содержит объем осадка внутриклеточных телец и любой остаточный объем, остающийся после коллектирования внутриклеточных телец, например, центрифугированием и декантированием супернатанта. Взвесь внутриклеточных телец может включать повторно суспендированный или частично ресуспендированный в воде осадок внутриклеточных телец.
Термин "сухой вес" относится к весу аликвоты сбора внутриклеточных телец после того, как вся жидкость удалена из образца или микроволновым излучением, или нагревом, или другими известными в практике методами. Сухой вес может также относиться к суммарному твердому веществу внутриклеточных телец или к весу рекомбинантного белка в расчете на процент рекомбинантного белка в твердом веществе внутриклеточных телец.
Термин "процент твердых веществ" относится к количеству твердых веществ в аликвоте взвеси сбора внутриклеточных телец после сушки образца и удаления всей жидкости из образца.
Термин "коэффициент пересчета продуктивности белка (PPCF)" относится к числу, специфичному для рекомбинантного белка, очищенного из сбора внутриклеточных телец при конкретных условиях ферментации, и коэффициент пропорционален отношению веса рекомбинантного белка в образце к весу суммарных твердых веществ во внутриклеточных тельцах в этом же образце. Этот коэффициент пересчета продуктивности белка делает возможным определение суммарного рекомбинантного белка, извлеченного из сбора внутриклеточных телец. В одном аспекте коэффициент пересчета продуктивности белка определяют анализом методом ВЭЖХ. PPCF рассчитывают по формуле
(PPCF) = [суммарный рекомбинантный белок в аликвоте сбора IB, (мг)/сумма сухих веществ в той же аликвоте сбора IB, (мг)] × 1000.
Термин "концентрация суммарного рекомбинантного белка" относится к суммарному белку, извлеченному из процесса ферментации, рассчитанной как масса рекомбинантного белка во внутриклеточных тельцах от общей массы сухих твердых веществ в сборе внутриклеточных телец. Суммарный рекомбинантный белок может быть рассчитан, используя следующую формулу
[(суммарное количество сухих веществ, мг)/(аликвота взвеси сбора IB, г) × PPCF] × общий вес взвеси сбора IB, г = (суммарный рекомбинантный белок, мг).
2
Настоящее изобретение является полезным для определения коэффициента пересчета продуктивности белка для любого рекомбинантного белка, который получен в разработанном процессе ферментации. Рекомбинантные белки, предполагаемые для использования в способе по изобретению, включают, но не ограничиваются этим, антитело (такое как поликлональное антитело, моноклональное антитело, антитело человека, гуманизированное антитело, фрагменты антител Fab, F(ab'), Fv, Sc Fv или SCA, биспецифичное антитело, диатело, пептитело, химерное антитело и линейное антитело), фермент, гормон, цитокин, хемокин, фактор роста, транскрипционный фактор, трансмембранный белок, рецептор клеточной поверхности, белок неспецифической адгезии клеток, цитоскелетный белок, белок слияния или фрагмент или аналог любого из вышеназванных белков.
Очистка и выделение внутриклеточных телец
Методы выделения внутриклеточных телец, очистки рекомбинантного белка из внутриклеточных телец и методы рефолдинга или ренатурации белка хорошо известны специалистам (см., например, Sambrook J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, pp. 17.37-17.41, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Rudolph R. et al., FASEB J. 10:49-56 (1995)).
Очистка внутриклеточных телец может быть проведена с использованием хорошо известных в практике методов (см., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, Ch., 1994). Клетки сперва центрифугируют, получая осадок клеток. Осадок затем ресуспендируют в подходящем буферном растворе и внутриклеточные тельца высвобождают, лизируя клетки под высоким давлением, обработкой ультразвуком или химическими средствами, такими как добавление лизоцима или денатурирующих агентов. В настоящем изобретении предполагается, что клетки лизируют при условиях, которые не приводят к солюбилизации внутриклеточных телец.
Для целей расчета PPCF для белка в процессе ферментации белки в аликвоте сбора внутриклеточных телец могут быть солюбилизированы с использованием обычно используемых в практике, включающих соли гуанидиния, мочевину, детергенты и другие органические растворители (см., например, патент США 5605691 и Bruggeman et al., Biotechniques 10:202-209, 1991). Отмечено, что эффективность солюбилизирующего агента варьируется с физическими свойствами белка. Типичные соли гуанидиния включают гуанидин-HCl. Типичные детергенты включают додецилсульфат натрия (SDS), тритон-Х, каприловую кислоту, холевую кислоту, 1-декансульфоновую кислоту, деоксихолевую кислоту, гликохолевую кислоту, гликодеоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродеоксихолевую кислоту и члены семейства натриевых солей сульфатных детергентов (например, тетрадецилсульфат натрия и гексадецилсульфат натрия (см., например, патент США 5605691)). Эти реагенты могут быть использованы по одному или в сочетании с каждым другим или другими реагентами, которые пригодны для очищаемого рекомбинантного белка.
Экспрессия белка
E.coli
Внутриклеточные тельца, представляющие интерес в настоящем изобретении, образуются экспрессией рекомбинантного белка в бактериальных реципиентных штаммах. Бактериальные реципиентные штаммы, предусмотренные для использования в изобретении, включают штаммы , включающие, но не ограниченные этим, BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS и BL21 (DE3) pLysE (F.W.Studier et al., Methods in Enzymology 185:60-89 (1990), MC1061, AG1, AB1157, BNN93, BW26434, CGSC Strain # 7658, C60, C600 hflA150 (Y 1073, BNN 102), D1210, DB3.1, DH1, DH5α, DH10B, DH12S, DM1, ER2566 (NEB), HB101, IJ1126, IJ1127, JM83, JM101, JM103, JM105, JM106, JM107, JM108, JM109, JM109(DE3), JM110, JM2.300, LE392, Mach1, MC4100, MG1655 Rosetta (DE3) pLysS, Rosetta-gami (DE3) pLysS, RR1, STBL2, STBL4, SURE, SURE2, TG2, TOP10, Top10F, W3110, XL1-Blue, XL2-Blue, XL2-Blue MRF, XL1-Red, XL10-Gold, XL10-Gold KanR. Другие бактериальные штаммы известные науке, пригодные для продуцирования рекомбинантного белка и которые образуют внутриклеточные тельца, могут быть использованы в способах по изобретению.
600
Рекомбинантные белки экспрессируют в выбранный штамм согласно стандартным методикам ферментации, известным в этой области. Методики приспособлены к используемому бактериальному штамму и к рекомбинантному белку, который должен быть экспрессирован. Например, бактериальные культуры могут быть выращены до выбранной плотности (OD) культуры и при должном выборе среды до сбора с культуры внутриклеточных телец (см. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, Ch., 1994). Способы продуцирования рекомбинантного белка описаны, например, в патентах США №№ 6759215 и 6632426.
Определение белка в сборах внутриклеточных телец
Концентрация рекомбинантного белка в аликвоте сбора внутриклеточных телец может быть определена с использованием методов, известных специалистам, включающих высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), ионообменную хроматографию, тест Брэдфорда, УФ поглощение, методы флюоресценции или вестерн-блоттингом. Из указанных выше методов методы ВЭЖХ позволяют рассчитать и концентрацию белка, и чистоту образца в одном и том же тестовом запуске. Следовательно, настоящее изобретение в одном аспекте предполагает, что определение концентрации белка в образце проводят, используя ВЭЖХ.
Для того чтобы определить количество белка в аликвоте ферментационной культуры и сбора с культуры внутриклеточных телец, проводят определение титра ВЭЖХ. При определении титра ВЭЖХ коллектируют пробную аликвоту сбора IB, внутриклеточные тельца солюбилизируют и белок денатурируют. Образец затем готовят для ВЭЖХ, чтобы определить чистоту/концентрацию белка в образце белка, используя способы и методики, хорошо известные специалистам (Current Protocols in Protein Chemistry, Wiley & Sons, NY, 1994), или описанные здесь. Независимо от того как определена концентрация рекомбинантного белка в аликвоте сбора IB, рассчитанную концентрацию используют затем для определения коэффициента пересчета продуктивности белка.
Методы определения сухого веса внутриклеточных телец или процента твердых веществ
Сухой вес внутриклеточных телец или процент твердых веществ в сборе внутриклеточных телец может быть определен с использованием любого метода практики, включая нагрев, микроволновое излучение, сушку воздухом, лиофилизацию, сушку вымораживанием и вакуумную сушку. После того как образец высушен, определяют сухой вес твердых веществ, используя стандартные механические весы.
Сочетание нагрева и микроволнового излучения является эффективным для сушки аликвоты образца и определения процента твердых веществ в ней. В одном аспекте сбор внутриклеточных телец может быть высушен с использованием микроволнового излучения и нагрева. Прибор CEM LabWave 9000 (CEM Corporation, Matthews, NC) предназначен для достижения интервала влага/твердые вещества от 0,01% до 99,99% в жидкостях, твердых веществах и взвесях с разрешением 0,01%. Прибор обеспечивает отсчет результата по белку по шкале до 0,1 мг и обеспечивает мощность микроволнового излучения от 0 до 10% полной мощности (630 Вт) с шагом приращения в 1%. В зависимых осуществлениях образец внутриклеточных телец может быть высушен с использованием другого оборудования для анализа влаги, известного в практике, включающего, но не ограниченного этим, CEM AVC-80 Microwave Moisture Analyzer, CEM Smart System, Denver Instrument M2 Microwave Analyzer (Denver Instruments, Denver, CO), Omnimark uWave (Sartorius-Omnimark, Goettingen, Germany) и Sartorius MMA30 (Sartorius, Goettingen, Germany).
Следующие примеры иллюстрируют различные неограничительные осуществления изобретения и/или предлагают их обоснование.
Пример 1
E. Coli
Рекомбинантный белок часто экспрессируется в  в виде нерастворимых внутриклеточных телец. В прошлом считали, что внутриклеточные тельца являются хаотичным осаждением сверхэкспрессированных рекомбинантных белков. В последнее время, однако, было выдвинуто предположение, что внутриклеточные тельца могут образовываться в процессе упорядоченного агрегирования и, если обнаружено, что эти внутриклеточные тельца имеют консистентный состав рекомбинантных белков, больше нет необходимости количественно определять концентрацию рекомбинантного белка в сборе внутриклеточных телец, используя сложные и требующие длительного времени методы ВЭЖХ для каждой ферментации и каждого сбора внутриклеточных телец. Таким образом, для того чтобы определить продуцированы ли внутриклеточные тельца упорядоченным образом, имея рекомбинантный белок консистентного состава, были запланированы начальные эксперименты для того, чтобы попытаться сформулировать математическую модель, которая могла бы позволить количественно определить содержание белка с минимальными экспериментальными усилиями.
E. coli
К концу процесса ферментации клеток для изготовления рекомбинантного колониеобразующего фактора гранулоцитов человека (r-metHuG-CSF), клетки-реципиенты  лизировали, используя высокое давление, и внутриклеточные тельца собирали с культуры многократными процессами центрифугирования перед солюбилизацией белка и рефолдингом. Этот бульон внутриклеточных телец затем сначала использовали для анализа концентрации белка.
Для того чтобы определить количество r-metHuG-CSF белка по сравнению с белком реципиента и другими загрязняющими веществами в высушенном образце, определяли "продуктивность" белка. Продуктивность определена как отношение между белком образца и общим сухим весом образца внутриклеточных телец и это соотношение, когда оно умножено на 1000, дает коэффициент пересчета продуктивности белка (PPCF) для целевого рекомбинантного белка, экспрессированного в данном процессе ферментации.
PPCF = [(суммарный рекомбинантный белок, мг) / (сумма сухих веществ, мг)] × 1000.
При определении этого отношения обратно-фазную ВЭЖХ проводили, используя аликвоту взвеси сбора IB. Порцию взвеси сбора IB суспендировали взвихриванием в пробирке или перемешиванием в химическом стакане, и 1 мл суспендированного бульона добавляли к 30 мл инкубационного/денатурирующего буфера (8М гуанидин-HCl, 50 мМ Tris, 5 мМ EDTA, 50 мМ DTT, pH 8,4±0,1). Смесь инкубировали в водяной бане при 65±3°С в течение приблизительно 30 минут, после чего 40 мкл денатурированного и восстановленного r-metHuG-CSF впрыскивали в колонку POROS R1/10 внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 100 мм (Applied Biosystems, Foster City, CA) на приборе Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA). Рекомбинантный белок элюировался на примерно 6,2 мин при ускоренном градиенте с использованием от 60% подвижной фазы А [0,1% об. TFA (сорт для секванала, Pierce, Rockford, IL), 7% об. IPA в воде] до 55% подвижной фазы В [0,1% об. TFA, 5% об. IPA в ацетонитриле (Sigma-Aldrich, St Louis, MO)] за 9 мин при расходе 2 мл/мин. На всем протяжении анализа для количественного определения пика белка использовали включенный в непрерывную работу блок УФ-детектора на длине волны 214 нм. Содержание белка r-metHuG-CSF в каждом образце рассчитывали по стандартной калибровочной кривой, построенной линейной регрессией.
E. coli
E. coli
Образцы ферментации клеток, отобранные до разрушения клеток, такие как образцы Post Kill и образцы Cell Paste, т.е. образцы, отобранные из клеточного осадка после центрифугирования ферментационного бульона, содержат большое количество компонентов , включая белки клетки-реципиента. Анализ ВЭЖХ показал, что рекомбинантный белок r-metHuG-CSF в Cell Paste составляет в среднем приблизительно 29% от суммарного сухого веса клеточной пасты (таблицы 1 и 2). Далее, анализ также показал, что соотношение между белками клеток-реципиентов  и белком образца в этой клеточной пасте является переменной величиной, что отражается в относительно большой вариабельности продуктивности Cell Paste (таблицы 1 и 2). Таблица 1 представляет сравнение продуктивности между образцами дважды промытых внутриклеточных телец (DWIB) и продуктивностью Cell Paste, из которой DWIB были получены. Продуктивность выражена как отношение белка образца к общему сухому весу, умноженное на 100, в %. Таблица 2 показывает сравнение продуктивности в промытых внутриклеточных тельцах (WIB) также в сравнении с Cell Paste, из которой WIB были получены.
Таблица 1
Образец 1
Образец 2
Разность
Продуктивность Cell Paste
26%
30%
-14%
Продуктивность DWIB
68,62%
66,43%
-3%
Таблица 2
Партия WIB, №
Продуктивность WIB
Партия Cell Paste, №
Продуктивность Cell Paste
xxx418
67,13%
xxx657
23,9%
xxx233
67,47%
xxx225
29,6%
xxx363
65,50%
xxx225
29,6%
xxx232
68,27%
xxx225
29 6%
xxx595
69,20%
xxx225xxx394
29,6%30,2%
xxxpp1
69,46%
xxxsd2
26%
xxxpp2
67,53%
Xxxsd0
30%
Xxxpp3
63,87%
xxxsd2
26%
Xxxpp5
63,17%
Xxxsd0
30%
<b>Среднее</b>
<b>66,84%</b>
<b>28,5%</b>
<b>RSD</b>
<b>3,3%</b>
<b>7,9%</b>
Эти результаты и анализы ВЭЖХ показывают, что после того как клетки лизированы, большинство белков клетки-реципиента удаляется из фракции внутриклеточных телец во время стадий центрифугирования. Внутриклеточные тельца, промытые внутриклеточные тельца и дважды промытые внутриклеточные тельца элюируются с почти одинаковым профилем с рекомбинантным белком r-metHuG-CSF, демонстрируя плотный профиль элюирования. Анализ показал, что рекомбинантный белок составляет почти 93% от суммарного белка во внутриклеточных тельцах.
Средняя продуктивность по рекомбинантному белку возрастает с 29% в клеточной пасте до 67% во внутриклеточных тельцах. В дополнение, вариабельность (RSD) снижается от 8% в клеточной пасте до 3% во внутриклеточных тельцах (таблицы 1 и 2).
Используя настоящее изобретение, в случаях, когда рекомбинантные белки образуют внутриклеточные тельца упорядоченным и консистентным между ферментационными сборами образом, и ферментации проводят, следуя одинаковой или практически одинаковой процедуре, коэффициент пересчета продуктивности белка, определенный для аликвоты взвеси сбора IB, может быть использован для определения белка в других ферментационных сборах. Например, будучи однажды рассчитанным, как представлено здесь, суммарный белок в данном количестве взвеси сбора IB может быть легко определен умножением содержания сухого твердого вещества во взвеси на PPCF, определенный выше, без необходимости проводить ВЭЖХ на каждом сборе IB, полученном при одинаковых условиях ферментации.
Пример 2
Для того чтобы определить позволяет ли описанный выше анализ по сухому весу точно предсказать концентрацию рекомбинантного белка в сборе IB, предсказанную концентрацию рекомбинантного белка, полученную с образцами для определения сухого веса, как выше, сравнивали с концентрацией в образцах, полученной с использованием ВЭЖХ.
Приготовление образца для ВЭЖХ было идентично описанному выше определению титра, где 40 мкл денатурированного и восстановленного образца взвеси сбора IB впрыскивали в колонку внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 150 мм с силикагелем с диаметром частиц 5 мкм и размером пор 300Å с нанесенной фазой С4 (YMC, Shimogyo-ku, Kyoto, Japan) на приборе Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA). Смесь восстановленных белков разделялась при полном градиенте c использованием от 20% подвижной фазы А [0,1% об. TFA в воде] до 85% подвижной фазы В [0,1% об. TFA в 90% ацетонитриле] за 80 мин при расходе 0,8 мл/мин. На всем протяжении опыта для мониторинга пиков белка использовали включенный в непрерывную работу блок УФ-детектора на длине волны 214 нм.
При сравнении с традиционным анализом ВЭЖХ анализ по сухому весу сопоставляли с результатами анализа ВЭЖХ (таблица 3). Для сопоставления между анализом ВЭЖХ и анализом по сухому весу число 670 использовали в качестве коэффициента пересчета.
Таблица 3
Партия
Результат по сухому весу (мг/мл)
Результат по ВЭЖХ (мг/мл)
% разницы (сухой вес против ВЭЖХ)
xxx001
104,16
104,56
-0,4%
xxxpp3
25,25
25,85
-2,3%
xxxpp5
16,24
16,10
0,9%
xxxpp6
15,82
16,45
-3,8%
xxxpp7
17,38
17,92
-3,0%
xxx776
10,50
10,09
4,1%
xxx779
10,74
10,10
6,3%
xxx454
9,68
9,29
4,2%
xxx780
9,83
9,96
-1,3%
xxx781
9,63
9,40
2,5%
xxx782
10,17
10,49
-3,1%
xxx458
9,95
9,79
1,6%
xxx793
10,39
9,98
4,0%
xxx783
9,63
9,61
0,2%
xxx784
9,70
9,78
-0,9%
xxx785
8,66
9,00
-3,7%
Среднее
0,3%
Разница между двумя анализами являлась комбинацией свойственных каждому методу вариабельностей и была обусловлена, главным образом, анализом по ВЭЖХ, поскольку он был единичным определением и, как правило, имеет большую вариабельность. Средняя разница между двумя анализами была настолько мала, как 0,3%. Точность анализа по сухому весу, возможно, входит в интервал ±3%.
Эти результаты показывают, что способ определения сухого веса белка путем расчета концентрации белка на основе содержания белка внутриклеточных телец является точным и быстрым способом определения концентрации белка перед поступлением на стадии рефолдинга белка. Определение концентрации белка с использованием этого способа экономит время, требующееся для подготовки образца для ВЭЖХ, а также средства на подготовку этих образцов. Дополнительно, использование определения сухого веса является точным способом определения концентрации белка перед расчетом количеств реагентов, необходимых для стадии рефолдинга белка. Поэтому настоящий способ предлагает более быстрый, более дешевый способ определения концентрации белка при крупномасштабном получении белка.
Пример 3
Для того чтобы выявить факторы, которые могут влиять на описанный выше анализ по сухому весу, анализ был проведен с образцами IB, прошедшими разные подготовительные стадии.
Для определения степени вариабельности в образцах внутриклеточных телец, концентрации metHuG-CSF белка, полученные новым методом измерения сухого веса, сравнивали с концентрациями, полученными обычным измерением методом ВЭЖХ. Второстепенным фактором вариабельности являлась концентрация образца. Когда образцы взвеси сбора IB были очень разбавленными, вариабельность взвешивания возрастала. Анализ по сухому весу обычно проводили дважды на двух приборах, суммарно четыре определения на образец. Анализ ВЭЖХ обычно был единичным определением вследствие его сложности.
Для измерений сухого веса и процента твердых веществ бульон внутриклеточных телец суспендировали взвихриванием в пробирке или перемешиванием в лабораторном стакане. Приблизительно 2 мл суспендированного бульона загружали в предварительно тарированный планшет для образца в приборах CEM Smart System Solids and Moisture Analyzer, CEM LabWave 9000 (CEM Corporation, Matthews, NC, USA). Образец r-metHuG-CSF нагревали и сушили при 100% уровне мощности в течение 5 минут. Процент твердых веществ автоматически рассчитывался прибором.
Результаты сравнения измерений сухого веса показаны в таблицах 4 и 5. Таблица 4 показывает точность анализа по сухому весу при использовании замороженных образцов.
Таблица 4
Определение
Прибор
% твердых веществ
Определение
Прибор
% твердых веществ
1
2
3,707%
2
1
3,850%
3
2
3,749%
4
1
3,827%
5
2
3,679%
6
1
3,832%
7
2
3,762%
8
1
3,731%
Среднее для прибора 2
3,724% (n=4)
Среднее для прибора 1
3,812% (n=4)
RSD для прибора 2
1,0% (n=4)
RSD для прибора 1
1,3% (n=4)
Общее среднее
3,768% (n=8)
Общая RSD
1,7% (n=8)
Точность анализа по сухому весу проверяли также, используя свежие образцы. Проводили два измерения на партию, используя два отдельных прибора, суммарно четыре измерения на партию. Средние для измерений свежих образцов показаны в таблице 5.
Таблица 5
xxxpp6
xxxpp7
Среднее
2,361% (n=4)
2,594% (n=4)
RSD
0,6 (n=4)
0,9% (n=4)
В целом было найдено, что на точность анализа по сухому весу воздействуют два фактора. Главным фактором является свежесть образца: внутриклеточные тельца склонны агрегировать при замораживании-оттаивании или при длительном хранении при 4°С, что приводит к гетерогенности образца и более высокой вариабельности анализа.
о
Результаты, показанные выше, демонстрируют, что измерения сухого веса внутриклеточных телец сопоставимы с результатами, полученными с использованием типовых измерений методом ВЭЖХ, и все еще являются точными, будь то сбор IB сперва заморожен или хранился при 4С. Хотя установленный процент твердых веществ может варьироваться вследствие подготовки образца перед измерениями, измерения сухого веса являются консистентными и одного ряда с результатами, полученными с использованием традиционных определений белка методом ВЭЖХ. Таким образом, настоящее изобретение предлагает точный эффективный способ определения концентрации белка в сборе внутриклеточных телец для того, чтобы снизить количество образца, который должен быть отобран перед реакцией рефолдинга, увеличив тем самым количество, которое доступно для реакции рефолдинга, а также предлагает более хороший контроль за поступлением белка на стадию рефолдинга при получении рекомбинантного белка и, наконец, улучшает выход и качество рекомбинантного белка.
Ожидается, что многочисленные модификации и вариации в изобретении, как оно представлено выше в иллюстративных примерах, возникнут у специалистов в данной области. Соответственно только те ограничения, которые представлены в прилагаемой формуле изобретения, должны быть наложены на изобретение.