Способ потенциометрической диагностики лейкоза крупного рогатого скота
METHOD FOR POTENTIOMETRIC DIAGNOSIS OF BOVINE LEUKEMIA

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к физической химии и иммунологии, и может быть использовано для диагностики инфекционных заболеваний, характеризующихся появлением и накоплением в сыворотке крови больных животных антител, специфичных к антигенам возбудителя инфекции.
Способ заключается в инкубировании сыворотки крови и соответствующего антигена в лунке иммунологического планшета с последующей регистрацией образования иммунных комплексов через изменения показателей потенциометрии. Способ позволяет упростить метод анализа, повысить достоверность результатов диагностирования.
Потенциометрический иммуноанализ является способом прямого определения связывания антигенов или антител. Такое определение степени связывания антигенов и антител представляется вполне целесообразным, поскольку при этом отпадает необходимость во введении метки. В водном растворе белки являются полиэлектролитами и поэтому имеют определенный результирующий электрический заряд. Полярность и величина этого заряда зависят от изоэлектрической точки белка и от ионного состава раствора. Связывание одного белка с другим приведет к образованию комплекса, результирующий заряд которого будет отличаться от зарядов исходных белков.
При многих инфекционных болезнях животных постоянным и характерным признаком инфицированности животных является наличие антител к антигену возбудителя и, общепринятые в ветеринарной практике, методы диагностики этой инфекции основаны на их обнаружении. При взаимодействии антител со специфическими антигенами образуются иммунные комплексы, которые могут свободно циркулировать в сыворотке крови, а также появляться в биологических жидкостях. Аналогичное взаимодействие будет происходить и в условиях «in vitro».
Используемые в настоящее время в иммунологии электрохимические методы определения патологических состояний требуют, во-первых, сложного и дорогостоящего оборудования, во-вторых, для использования в качестве метки антитела конъюгированы с ферментом. Процесс конъюгирования является дорогостоящей, трудоемкой процедурой, кроме того, фермент как органическая макромолекула со специфической функцией не устойчив.
Известен способ определения патологических состояний, при котором диагностируют Hanta-вирус в плазме крови. Анализ основан на образовании иммунокомплекса антиген-антитело с последующим взаимодействием в растворе антител против человеческих антител, меченных пероксидазой и проведением детекции пероксидазной метки в режиме амперометрии (Rajesh Krishan, Andrey L. Ghindilis, Plamen Atanasov, Ebtisam Wilkins, Jim Montoya, and Frederick T.Koster "Fast Amperometric Immunoassay for Hantavirus Infection". Electroanalysis 1996, 8, №12, 1131-1134).
2
2
Недостатком такого способа является применение в анализе дорогостоящего неустойчивого фермента, а также необходимость использования дополнительных реактивов (НО и KI). Детекцию метки проводят косвенно, предварительно окислив иодид, а только затем регистрируют восстановление йода.
Достаточно близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, служит способ определения патологических состояний биологических объектов, включающий образование иммунокомплекса на поверхности электрода, присоединение метки к иммунокомплексу и последующую детекцию метки для оценки патологического состояния. При этом используют коллоидное золото в качестве иммуноэлектрохимической метки с гусиными иммуноглобулинами против человеческих антител (М.В. Gonzales Garsia, A. Costa Garsia "Adsorptive stripping voltammetric behaviour of colloidal gold and immunogold on carbon paste electrode". Bioelectrochemistry and Bioenergetics 38, 1995, стр. 389-395).
Недостатком данного способа является следующее: применяемые в этом способе антитела - гусиные иммуноглобулины против человеческих антител являются дорогими реактивами, также этот способ неприменим ни к одной диагностически значимой, реальной системе по определению белков или макромолекул.
Самым близким, принятым за прототип, является способ электрохимического определения специфических антител в сыворотке крови с помощью белков, меченных металлом (патент № 2249217 от 18.06.2003). Способ включает образование иммунокомплекса на поверхности электрода, причем для образования иммунокомплекса инкубируют в сыворотке крови антиген, иммобилизованный на поверхности толстопленочного графитового электрода.
Недостатком данного способа является длительность и сложность процесса измерения, необходимость предварительной обработки пробы при строго обозначенных температурных условиях.
Предлагаемое изобретение направлено на упрощение метода анализа, снижение его стоимости, повышение достоверности результатов диагностирования, расширение спектра определяемых объектов.
Это достигается тем, что в качестве электрода используют реконструированный индикаторный электрод для рН метрии и определяют показатели ЭДС с помощью рН метра в режиме mV в сыворотке крови до и после внесения антигенов.
В лунку иммунологического полистиролового планшета для серологических реакций вносят 0.5 мл исследуемой сыворотки крови, измеряют потенциал индикаторного электрода, добавляют 10 мкл антигена ВЛКРС и вновь проводят измерения.
Нами установлено, что существует значительная разница в потенциалах индикаторного электрода в пробах сыворотки крови от здоровых и инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) животных до и после образования ЦИК «in vitro». Также проведены сравнительное изучение изменений потенциала электрода в таких же условиях после введения изменений в его конструкцию. Изменения в конструкции индикаторного электрода произведены с целью повышения его чувствительности и уменьшения размеров измерительной ячейки. Результаты исследований показали, что изменения потенциала фиксируются в достаточно больших пределах, значительно превышающих погрешность измерений.
Пример 1. Всего исследовано более 300 проб сывороток крови коров из различных по эпизоотической ситуации по лейкозу хозяйств Республики Татарстан. Исследования проводились совместно с Республиканской ветеринарной лабораторией. Результаты исследований некоторых проб приведены в таблице 1. Уровень инфицированности животных вирусом лейкоза определяли методом ИФА.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в сыворотках крови от здоровых коров потенциометрические показатели меняются после добавления антигена ВЛКРС не более чем на 0,05 единиц, а у проб сывороток крови инфицированных вирусом коров, в таких же условиях, на 0,15 и более единиц.
Таблица 1. Показатели потенциометрии сывороток крови.
№ п/п
Результат ИФА
Электродный потенциал, mV
До образования ЦИК
После образования ЦИК
12345678910
Отр.Отр.Отр.Отр.Полож.Полож.Полож.Полож.Полож.Полож.
0,310,290,300,310,310,320,300,320,310,31
0,350,330,320,340,460,480,460,500,460,48
Измерение потенциала индикаторного электрода в исследуемой пробе сыворотки крови до и после образования иммунных комплексов может служить основой для диагностических исследований при лейкозе крупного рогатого скота и других инфекционных болезней. Преимуществом предлагаемого метода от других экспресс тестов является возможность автоматизации процесса.