Методы доставки генетического материала в клетки и возможности их применения в генной терапии

методы доставки генетического материала в клетки и возможности их применения в генной терапии

Е.К. Апарцин 1, НЮ. Кнауэр 2

1 ФГБНУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН», Новосибирск, Россия

2 Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия

Methods of gene delivery and perspectives of their application in the gene therapy

EK. Apartsin \ N.Yu. Knauer 2

institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

2 Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Novosibirsk, Russia

Генная терапия считается одним их наиболее перспективных направлений медицины будущего. В связи с этим, становится актуальной разработка эффективных и безопасных методов доставки нуклеиновых кислот в клетки-мишени на организменном уровне. В настоящем обзоре систематизированы литературные данные последних лет о способах доставки генетического материала в клетки человека и обсуждаются некоторые клинические аспекты генной терапии.

Ключевые слова: генная терапия, трансдукция, транс-фекция, векторы, таргетная терапия, клинические аспекты генной терапии.

Введение

Большой интерес для инновационной медицины представляет идея направленной коррекции нарушений жизнедеятельности клеток на молекулярно-генетическом уровне. Основа подходов к тонкой регуляции клеточного метаболизма — модулирование экспрессии собственных генов или внесение нормально функционирующих копий генов взамен дефектных. На сегодняшний день разработан широкий спектр методов доставки нуклеиновых кислот (НК) в клетки для управления экспрессией генов в медицинских целях. Их совокупность и составляет суть генной терапии.

Цель обзора — дать сравнительную характеристику методов доставки генетического материала в клетки человека и проанализировать клинические аспекты их применения в генной терапии.

Вирусные системы доставки генетического

материала

Вирусные векторы для доставки генетического материала получают из нативных вирусных частиц путем замены собственных генов вируса на генно-инженерные конструкции. Вирусные векторы состоят из генетического материала, окруженного белковым капсидом или липидной оболочкой, которые взаимодействуют со специфическими рецепторами на поверхности клеток, что облегчает интернализа-цию конструкций в клетки-мишени и повышает эффективность доставки [1]. Белковые компоненты капсида защищают НК от деградации в лизосомах и способствуют доставке генетического материала в ядро [2]. В целом, вирусные векторы лучше, по сравнению с невирусными, справляются с задачей долговременной экспрессии целевых генов в клетках-мишенях, однако, процесс их получения достаточно трудоемок. Так, например, для размножения вирусов с генно-инженерным геномом требуется

e-mail: eka@niboch.nsc.ru

Gene therapy is believed to be among the most promising directions of the future medicine. Thus, the development of efficient and safe methods of the nucleic acid delivery to the target cells, tissues and organs ecomes of great current interest. This review summarizes recent data on the approaches for the gene delivery and discusses clinical aspects of the gene therapy.

Keywords: gene therapy, transduction, transfection, vectors, target therapy, clinical aspects of gene therapy.

подбор культуры, способной компенсировать дефицит белков, критичных для развития вируса.

На сегодняшний день предложен целый ряд вирусных векторов для эффективной трансдукции генетического материала на организменном уровне, каждый имеет свои достоинства и недостатки. Наибольшее развитие получили векторы на основе аденовирусов, аденоассоциированных вирусов и ре-тровирусов.

Аденовирусные векторы

Аденовирусные векторы представляют собой безоболочные вирусные частицы диаметром 80— 100 нм, содержащие двухцепочечную ДНК (дцДНК). Как правило, они проникают в клетки путем кла-трин-зависимого эндоцитоза, связываясь с кок-саки-аденовирусным рецептором. дцДНК после интернализации переносится в ядро, обеспечивая эффективную трансдукцию широкого спектра делящихся и неделящихся клеток, таких как кардиомио-циты, одноядерные клетки скелетных мышц, клетки гладкой мускулатуры и др. [3—5]. Следует отметить, что аденовирусные векторы с трудом преодолевают эндотелиальный барьер при системной доставке, но в условиях местного применения селективно транс-дуцируют клетки эндотелия. Эффективность трансдукции также зависит от серотипа вируса.

К преимуществам аденовирусных векторов можно отнести большой размер транспортируемой дцДНК (до 35 тыс. пар оснований, т.п.о.), высокий функциональный титр, а также быструю экспрессию трансгена (1—2 дня после доставки). Кроме того, дцДНК аденовирусных векторов не встраивается в геном клетки-хозяина, что уменьшает риск инсерци-онного мутагенеза.

В то же время, аденовирусные векторы обладают одним существенным недостатком: компоненты их капсида вызывают Т-клеточный иммунный ответ. Трансдуцированные клетки-мишени могут опозна-

ваться и элиминироваться клетками иммунной системы. Кроме того, широкая специфичность аденовирусных векторов приводит к неспецифической трансдукции нецелевых клеток (например, гепатоци-тов или антиген-презентирующих клеток) [6].

С другой стороны, реакция со стороны иммунной системы может быть использована и на пользу терапии. Так, аденовирусные векторы находят применение в разработке противоопухолевых средств, целью которых является индукция иммунного ответа, для селективного уничтожения опухолевых клеток. Кроме того, сочетание быстроты экспрессии трансгена с повышенной иммуногенностью делают аденовирусные векторы перспективной платформой для создания новых вакцин.

Аденоассоциированные вирусные векторы

Аденоассоциированные векторы (ААВ) имеют небольшой безоболочечный вирион диаметром порядка 20 нм и геном размером 4,7 тыс. оснований (т.о.), представленный одноцепочечной ДНК (оцДНК) [7, 8]. Относительно небольшой размер генома позволяет легко встраивать в него различные трансгены для доставки в клетки. С другой стороны, это накладывает ограничение на размер трансгена: стандартные ААВ не подходят для переноса больших генов.

Аденоассоциированые вирусы принадлежат к роду ependoviгus семейства Paгvoviгidae. Репликация вирусов этого рода в клетках хозяина происходит при коинфекции вирусом-помощником (аденовирусом или вирусом простого герпеса, ВПГ) [9, 10]. В отсутствие вируса-помощника, развития вируса в клетках не происходит.

Ввиду различий в белковом составе капсида, существует множество серотипов аденоассоцииро-ванных вирусов с различной тканевой специфичностью и эффективностью трансдукции. Исследования в этой области позволили создать широкий спектр рекомбинантных ААВ, способных доставлять генетический материал в ткани-мишени с минимальными побочными эффектами (трансдукция других клеток, органов и тканей). ААВ обеспечивает длительную экспрессию трансгена, особенно в неделящихся клетках. Так, после однократной инъекции ААВ-пре-парата экспрессию трансгена наблюдали в течение 6 лет у приматов [11] и в течение 8 лет у собак [12, 13]. Клинические исследования эффективности ААВ показали, что терапевтический эффект ААВ-транспортируемого трансгена сохраняется в мозге человека на протяжении как минимум 10 лет [14].

К достоинствам ААВ как носителей терапевтически значимых генов можно отнести и то, что ни с вирусами дикого типа, ни с рекомбинантными ААВ не связаны известные заболевания, а введение ААВ в организм вызывает умеренный иммунный ответ. В то же время, ввиду того, что человеческая популяция постоянно встречается с различными серо-типами аденоассоциированных вирусов, иммунная система продуцирует антитела, нейтрализующие ААВ [15]. Для решения этой проблемы предлагают модифицировать иммуногенные эпитопы ААВ или использовать более редкие серотипы капсидов.

Ретровирусные векторы

Семейство Retгoviгidae включает семь основных родов, их представители вызывают большой интерес как платформа для создания новых вирусных век-

торов для доставки терапевтически значимых генов. На сегодняшний день большая часть работ в этой области сконцентрирована на исследовании гамма-ретровирусов (вирус лейкемии мышей) и лентивиру-сов (ВИЧ-1) [16, 17]. Низкая эффективность трансдукции неделящихся клеток гамма-ретровирусными векторами ограничивает их применение переносом генов в гемопоэтические клетки [18]. Лентивирус-ные векторы, напротив, способны трансдуцировать неделящиеся и медленно делящиеся клетки, что существенно расширяет возможности их использования для доставки генетического материала в различные ткани и органы, включая ЦНС [19].

Лентивирусные векторы представляют собой белковый капсид диаметром 80—100 нм, упакованный в липидную оболочку. Векторы на основе ВИЧ-1 содержат оцРНК-геном длиной порядка 9 т.о. В клетке их геном проходит стадию обратной транскрипции и интегрируется в хромосомы в виде кДНК, что позволяет добиться долговременной (в идеале, пожизненной) экспрессии терапевтически значимого трансгена [20]. Несмотря на то, что платформой для разработки лентивирусных векторов служит ВИЧ-1, методы генной инженерии позволяют создавать векторы, безопасные для потенциального пациента [21, 22]. В частности, из вирусного генома удаляют гены, ответственные за репликацию вируса, его упаковку и экспорт из клетки. Таким образом, лентивирус-ные векторы сохраняют функциональную активность (доставка генетического материала и его интеграция в геном), но теряют репликативную [22, 23].

Несмотря на перспективность использования лен-тивирусных векторов для переноса терапевтически значимых генов, необходимо учитывать некоторые аспекты безопасности их использования. Так, ввиду того, что интеграция в геном клетки-хозяина происходит случайным образом, она может запускать инсерционный онкогенез [24]. В то же время, риск перерождения клетки-хозяина можно уменьшить путем оптимизации состава и строения вектора.

Другие виды вирусных векторов

Наряду с внедрением в практику вирусных векторов, приведенных выше, продолжаются разработки новых векторов на основе вирусов других семейств, обладающих полезными для терапии свойствами или тканевой специфичностью. Освоение этой области позволит расширить спектр возможностей генной терапии с использованием вирусных векторов, повысить их безопасность, эффективность и специфичность их воздействия на организм пациента.

Большим потенциалом для использования в клинике обладают герпесвирусные векторы, полученные на основе вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1). Известно, что ВПГ обладает выраженным тропизмом к нейронам за счет наличия на поверхности гли-копротеинов, способствующих специфической ин-тернализации. После заражения ВПГ персистирует в нейронах, не вызывая реакции со стороны иммунной системы. Реплицирующиеся вирусные частицы способны перемещаться транссинаптически от нейрона к нейрону. Все эти факторы делают векторы на основе ВПГ перспективным средством для генной терапии центральной и периферической нервной системы [25]. Другой сферой приложения ВПГ-векторов может быть терапия опухолей, поскольку в экспериментах на клеточных культурах показана

высокая эффективность индукции апоптоза опухолевых клеток при заражении ВПГ-1. Тем не менее, относительно высокая цитотоксичность ВПГ-векторов пока ограничивает их применение в практике.

Интересным инструментом генной терапии могут оказаться альфавирусные векторы [26], получаемые из вирусов семейства Togaviridae. Векторы этого типа содержат оцРНК-геном, упакованый в нуклеокапсид. Рекомбинантные альфавирусные векторы просты в получении и могут быть быстро наработаны путем репликации в клетках млекопитающих. В настоящее время некоторые альфавирусные векторы проходят доклинические испытания в качестве противоопухолевых агентов и противораковых вакцин. Обсуждается также возможность использования этих векторов для доставки siPHK-кодирующих конструкций.

Для нужд генной терапии были адаптированы и некоторые вирусные конструкции, традиционно используемые в других областях. Так, например, на основе бакуловирусных векторов, широко используемых в генетической инженерии, были созданы векторы для трансдукции клеток млекопитающих [27, 28]. Имеющиеся на сегодняшний день данные о разработках бакуловирусных векторов для генной терапии in vivo и ex vivo касаются тканевой инженерии, в т.ч., остеогенеза, генной терапии опухолей и разработки вакцин [28]. Вызывает интерес применение в генной терапии векторов на основе бактериофагов. Несмотря на трудности при интернализации в клетки млекопитающих и отсутствие выраженного тропизма к тканям, бактериофаги считают одним из возможных направлений развития генной терапии с использованием вирусных векторов вследствие легкости манипулирования их геномом генно-инженерными методами [29].

Модификации вирусных векторов

Успех генной терапии с использованием вирусных векторов, очевидно, определяется эффективностью и специфичностью доставки трансгенов на клеточном, тканевом и органном уровне. Повысить эффективность доставки генетического материала или тканевую специфичность векторов можно путем химической модификации поверхности вирусной частицы. Новые возможности в разработке векторов предоставляют методы синтетической вирусологии, сочетающей генно-инженерные подходы к редактированию вирусного генома с декорированием вирусных частиц синтетическими фрагментами [30, 31]. В этом случае говорят о гибридных векторах расширенной функциональности.

Целью синтетической вирусологии является расширение или изменение функциональной активности компонентов вирусных векторов для создания более эффективных средств доставки генетического материала для применения в генной терапии. В зависимости от конкретной прикладной задачи, вирусные векторы изменяют таким образом, чтобы ввести на их поверхность адресующие молекулы (например, пептиды-лиганды клеточных рецепторов) или, например, обеспечить возможность сочетанной доставки генетического материала и низкомолекулярных препаратов. Синтетические векторы можно получать смешиванием фрагментов разных вирусов или вводить пептидные вставки, изменяя геном вируса, с образованием химерных или мозаичных кап-сидов. Путем внедрения в вирусные частицы синте-

тических полимеров или неорганических наночастиц можно придавать векторам свойства, нехарактерные для вирусов (например, наличие репортерных групп) [32].

Невирусные системы доставки генетического

материала

В отличие от вирусных векторов, группа невирусных систем доставки генетического материала чрезвычайно гетерогенна. Действительно, к настоящему моменту в мировой науке проведен широкий скрининг систем, пригодных для доставки нуклеиновых кислот в клетки: от низкомолекулряных соединений до полимеров и от единичных молекул до супрамо-лекулярных систем и наноконструкций. В качестве транспортируемого материала может выступать как протяженная ген-кодирующая дцДНК или мРНК, так и некодирующие РНК, регулирующие экспрессию генов-мишеней (siPHK, микроРНК) [33].

Для успешной доставки НК в клетки и ткани-мишени невирусные векторы должны удовлетворять ряду требований [34]. Прежде всего, вектор должен обеспечить защиту транспортируемых НК от нуклеаз сыворотки крови и от распознавания клетками иммунной системы, что достигается, как правило, введением химических модификаций НК и их инкапсуляцией внутри векторной конструкции. Другой важной задачей является предотвращение неспецифических взаимодействий векторов с тканями, в том числе, выведения векторов из кровотока через почки, для этого векторные частицы декорируют олигосахари-дами, пептидами или синтетическими и природными полимерами [35, 36]. Выход из кровотока в ткани-мишени, проникновение в клетки и эндосомальный выход — это лимитирующие стадии доставки НК невирусными векторами. Для их преодоления векторы декорируют адресующими молекулами (пептиды, антитела, аптамеры и др.) [37—39].

Липидные векторы

Липидные системы доставки на сегодняшний день являются одними из наиболее используемых носителей НК. В большинстве работ, используя катионные липиды (в частности, DOTMA, D0SPA, D0TAP и DMRiE) в качестве прекурсоров, формируют липосомы, способные связывать НК на поверхности или инкапсулировать их во внутренней полости [40-42]. Для повышения стабильности и транс-фекционной активности липосомальных векторов катионные липиды в составе липосом разбавляют нейтральными липидами, например, DOPE [43]. Альтернативным подходом к формированию катионных липосом является использование катионных производных холестерина [44], а также липидоидов [45]. Описана доставка НК с использованием формально нейтральных липосом, построенных из цвиттер-ион-ных липидов [46].

Следует отметить, что спектр липидных векторов для доставки НК не ограничивается липосомами. Так, сообщают о формировании т.н. твердых липид-ных наночастиц, способных эффективно доставлять НК в клетки [47, 48]. Липидные наночастицы представляют собой агрегаты низкомолекулярных липидов (жирные кислоты, холестерин и их производные), суспендированные в присутствии стабилизатора — поверхностно-активного вещества (Tween-80, Pluronic

и др.), диаметром порядка 100 нм. Такие липидные наночастицы способны связывать НК на поверхности за счет электростатических взаимодействий и доставлять их в клетки [45].

Супрамолекулярные конструкции на основе заряженных липидов активно используют для доставки различных типов терапевтически значимых НК. Описано их применение для доставки плазмидных ДНК [45, 47, 48], мРНК [49, 50], siPHK и shPHK [51-55].

Следует отметить, что для доставки коротких фрагментов НК можно использовать конъюгацию липидных группировок с олигонуклеотидными компонентами. Широко используется конъюгация смысловых цепей siРНК и других функциональных олигонуклеотидов с производными холестерина, a-токоферолом и другими липофильными молекулами [56-58]. Для предотвращения деградации олигонуклеотидов в сыворотке крови используют химически модифицированные нуклеотиды [59, 60].

Полимерные векторы

Синтетические полимеры привлекают внимание исследователей как носители НК вследствие легкости получения и возможности управлять их свойствами [61]. Большинство используемых в генной терапии полимеров несут эффективный положительный заряд за счет присутствия в их структуре аминогрупп, обеспечивающих эффективное связывание НК, проникновение в клетки, а также эндо-сомальный выход за счет дезорганизации эндосом по механизму «протонной губки» [62]. Также предложен ряд модификаций полимеров для придания им тех или иных свойств, полезных для создания векторов: введение биодеградиуемых связей [63, 64], адресующих молекул, стимул-чувствительных (например, термочувствительных, магниточувстви-тельных) функциональных групп [65] и др.

Физико-химические и биологические свойства комплексов НК с полимерными векторами сильно зависят от молекулярного веса полимера: повышение веса (т.е. пропорциональное повышение количества положительных зарядов на частицу) улучшает связывание НК и повышает эффективность проникновения в клетку. С другой стороны, уменьшение молекулярного веса полимера ведет к уменьшению цитотоксичности конструкции и лучшему высвобождению НК после интернализа-ции [66]. Таким образом, создание полимерных векторов для генной терапии требует тщательного учета физико-химических факторов, влияющих на доставку, и поиска компромиссных вариантов конструкций.

Среди полимеров, пригодных для доставки НК in vivo, можно выделить поли-1_-лизин, полиэтиле-нимин, поли-р-аминоэфирные полимеры, поли-ди-метиламиноэтилметакрилат (DMAEMA), Pluronic, хитозан, а также их модификации и комбинации [67-69]. Описано применение полимерных векторов для переноса генов, а также для доставки siРНК [70, 71].

Отдельно стоит выделить группу векторов для генной терапии на основе дендримеров - высокосимметричных разветвленных макромолекул. Дендримеры отличаются от обычных полимеров, в первую очередь, низкой полидисперсностью. Благодаря этому, их свойства более предсказуемы, что

облегчает дизайн векторов. Кроме того, наличие четко определенной структуры дендримеров обусловливает более благоприятное отношение к ним со стороны организаций, отвечающих за сертификацию лекарственных препаратов. Так, некоторые виды дендримеров проходят доклинические испытания, в том числе, в качестве векторов для генной терапии [72-74].

Пептидные векторы

Интересную и потенциально перспективную векторную систему удалось подсмотреть у самой природы. В составе белков капсидов различных вирусов встречаются последовательности, обеспечивающие их проникновение через плазматическую мембрану по рецептор-независимому пути [75, 76]. Так, в составе белка TAT ВИЧ-1 ундекапептидный фрагмент 47YGRKKRRQRRR57 играет ключевую роль в интерна-лизации [77] и, кроме того, по-видимому, обеспечивает защиту вируса от распознавания клетками иммунной системы [78].

Поиски подобных олигопептидов, названных проникающими пептидами, способных транспортировать макромолекулы, в т.ч., НК, через плазматическую мембрану, и последующий дизайн искусственных пептидов на основе полученных данных, привели к получению целого спектра проникающих пептидов, пригодных для доставки генетического материала в клетки. Как правило, проникающие пептиды богаты лизином и аргинином, а пептиды, улучшающие эндосомальный выход, богаты гисти-дином [79, 80]. Большое распространение получил пентапептид, содержащий циклический трипептид RGD, обеспечивающий селективную доставку НК в опухолевые клетки за счет связывания с белками-интегринами [81]. С использованием проникающих пептидов осуществляют доставку плазмидных ДНК, кодирующих терапевтически значимые гены, а также siРНК [82].

Неорганические наночастицы

Интерес к использованию неорганических на-ночастиц в качестве векторов для доставки НК обусловлен рядом факторов. В первую очередь, наличие широкого спектра подходов к функционализации поверхности наночастиц позволяет управлять их свойствами, а также комбинировать собственные свойства материала со свойствами введенных функциональных групп, что позволяет, например, получать низкотоксичные наночастицы-векторы и отслеживать их распределение в организме физическими методами. Наночастицы обладают химической и термической стабильностью, что важно для стерилизации препаратов. Наконец, технологии промышленного производства наноматериалов позволяют получать наночастицы разной формы и размера в больших количествах [83-85].

Среди наночастиц, использованных в качестве векторов для доставки ДНК и РНК, наиболее перспективными оказались золотые наночастицы [86, 87], углеродные нанотрубки [88-90], квантовые точки [91, 92] и кремниевые наночастицы [93, 94]. К сожалению, несмотря на успехи в доставке НК in vitro и in vivo, трудности в сертификации наноча-стиц сдерживают их исследования в качестве векторов для генной терапии.

Физические методы доставки генетического

материала

Наряду с вирусными и невирусными системами доставки генетического материала, использующими естественные свойства и функции клеточных мембран для доставки нуклеиновых кислот, существует группа методов, основной задачей которых является физическое повреждение плазматической мембраны, приводящее к проникновению чужеродного генетического материала в цитозоль [95]. Ряд физических методов хорошо зарекомендовали себя в биотехнологии, где они используются для трансформации культур клеток. Сообщают также о применении некоторых физических методов для переноса генов на организменном уровне.

Классическим физическим методом доставки генетического материала является т.н. «генная пушка», впервые примененная для переноса генов в растения. Метод основан на бомбардировке клеток или ткани металлическими частицами, покрытыми ДНК. Необходимая скорость придается частицам током газа-носителя (чаще всего, гелий) или путем высоковольтного электрического разряда. В качестве носителя используют микрочастицы золота, вольфрама или серебра диаметром порядка 1 мкм. Для достижения необходимой эффективности переноса генетического материала и воспроизводимости результатов необходима точная стандартизация всех физических и технических параметров эксперимента (размер частиц, давление газа и др.) [96]. В настоящее время генные пушки используют в исследованиях рака яичников [97, 98]. Очевидным недостатком генных пушек является травматизация тканей-мишеней, часто приводящая к гибели транс-фицированных клеток.

Повысить проницаемость плазматической мембраны можно и электрическими разрядами. На этом основан метод электропорации — еще один классический физический метод переноса генов. Приложение к плазматической мембране электрического поля, большего, чем ее собственная электрическая емкость, вызывает перераспределение зарядов на мембране с последующим формированием пор, что позволяет молекулам ДНК диффундировать внутрь клеток. Параметры поля подбирают исходя из физических свойств мембраны клеток-мишеней [99]. Описана внутрикожная, внутримышечная и внутри-опухолевая доставка плазмидной ДНК с помощью электропорации [100, 101]. Основным препятствием использования электропорации in vivo также является повышенная гибель клеток, подвергшихся действию электрического поля.

Более щадящей техникой пермеабилизации плазматической мембраны является сонопорация — обработка ткани-мишени ультразвуком. Для доставки генетического материала в клетки методом сонопо-рации ДНК иммобилизуют на поверхности микропузырьков и вводят в кровоток с последующим приложением ультразвука в проекции органа-мишени. Пузырьки состоят из ядра (перфторуглеводороды или гексафторид серы), наполненного газом (воздух, азот, инертный газ) и покрытого липидами, белками или синтетическими биополимерами [102, 103]. Циркулирующие микропузырьки, по размерам близкие к эритроцитам (диаметр 2—4 мкм), отвечают на воздействие ультразвука и высвобождают ДНК, которая диффундирует в пермеабилизованные

клетки [104]. Сонопорацию используют для доставки генетического материала в мозг, почки, брюшную полость, а также в мышечную ткань, включая сердечную мускулатуру, и др. [105, 106].

В редких случаях для доставки генетического материала in vivo используют гидропорацию — повышение проницаемости мембраны за счет резкого изменения гидродинамического давления. Давление создается инъекцией больших объемов растворов ДНК в короткий промежуток времени. Такое воздействие увеличивает проницаемость эндотелия капилляров и формирует поры в плазматической мембране окружающих клеток паренхимы, через которые проникает ДНК. Этот метод, как правило, используется для генной терапии клеток печени [107].

Клинические аспекты генной терапии

Трансляция достижений генной терапии в клинику представляет большой интерес, поскольку она может открыть широкие возможности для коррекции врожденных генетических дефектов, терапии приобретенных заболеваний, а также коррекции микроокружения в очаге заболевания. Рассмотрим некоторые возможности применения генной терапии на примере социально значимых заболеваний (злокачественные новообразования, фиброз и цирроз печени), а также врожденных генетических дефектов (заболевания кожи).

Гэнная терапия при фиброзе печени

Развитие фиброза, а в последующем и цирроза печени — процесс, развивающийся как вторичный при воспалительных и токсических поражениях печени, либо как первичный — в случае аутоиммунной природы [108]. Известно, что регенеративные способности гепатоцитов очень велики, вследствие чего интересным в терапевтическом плане представляется такое воздействие на печень, которое привело бы к уменьшению активности воспаления и фиброза. Кроме того, важной остается задача минимизации сопутствующих циррозу патологических состояний. В настоящее время описан ряд генно-терапевтиче-ских подходов, перспективных в решении таких задач [109].

Одним из факторов, способствующих развитию фиброза, является цитокин TGF-ß1, стимулирующий синтез белков внеклеточного матрикса. Введение плазмид, экспрессирующих растворимый рецептор к TGF-ß1, в модели диметилнитрозамин-индуциро-ванного фиброза у крыс, приводило к достоверному снижению степени фиброза, уменьшению экспрессии коллагена и a-SMA (alpha smooth muscle actin), уменьшению содержания гидроксипролина [110]. Для более эффективной доставки плазмид использован метод гидропорации, повышающий проницаемость эндотелия и паренхимы органов-мишеней.

Большими преимуществами при выборе методов доставки НК-конструкций обладают вирусные векторы. Использование аденовирусных векторов, экс-прессирующих человеческий урокиназный активатор плазминогена, в модели токсического цирроза печени крыс, вызванного тетрахлорметаном, приводило к усилению репаративных процессов в печени за счет активации PCNA (proliferating cell nuclear antigen) [111]. Кроме того, при исследовании ткани печени выявлялось снижение экспрессии a-SMA, активация

металлопротеиназы MMP-2. При исследовании печеночных проб наблюдалось снижение активности АЛТ, АСТ в сыворотке крови. Доставка кДНК, кодирующей предшественник металлопротеиназы MMP-1, аденовирусным вектором в модели фиброза печени у крыс также приводила к уменьшению количества клеток, экспрессирующих a-SMA, усилению пролиферации гепатоцитов.

В дальнейшем были предложены более сложные конструкции, предполагающие возможность предотвращения оверэкспрессии целевого гена и включающие промоторы с регуляторными сайтами, что позволяет модулировать активность терапевтической конструкции [112].

Свою эффективность в модели токсического цирроза показали и химерные векторы, полученные из аденовирусных частиц и частиц вируса гепатита В и содержащие конструкцию, экспрессирующую метал-лопротеиназу MMP-8 [113].

Гэнная терапия врожденных заболеваний кожи

Ряд заболеваний кожи, имеющих врожденный характер и связанных с дефектами синтеза структурных белков в кератиноцитах, также может быть рассмотрен как потенциальное показание для применения генной терапии [114]. Подобные попытки производились в отношении такого заболевания, как пограничный буллезный эпидермолиз не-Херлитца, связанного с дефектами генов, кодирующих белки полудесмосомных контактов в области дерма-эпидермис LAMA3, LAMB3, COL17A1. Кератиноциты 36-летнего пациента были трансдуцированы ре-тровирусным вектором, содержащим ген LAMB3, и после культивирования были трансплантированы в кожу верхних конечностей. Через 12 мес. было показано наличие экспрессии нормального ламини-на-332, данный эффект сохранялся в течение 7 лет и сопровождался клинически наличием нормальной кожи без буллезных элементов [115, 116].

В дальнейшем аналогичные подходы были опробованы на модели рецессивного дистрофического буллезного эпидермолиза (recessive dystrophic epidermolysis bullosa, RDEB), связанного с дефектом гена коллагена Vii типа COL7A1, с использованием ретровирусных векторов [117]. В настоящее время проводится i фаза клинических исследований, связанных с ex vivo-модификацией дефектных кератино-цитов ретровирусными векторами, содержащими ген COL7A1, также рассматриваются возможности генетической коррекции фибробластов больных RDEB.

Подобные эксперименты проводились и в отношении таких дерматозов, как Х-сцепленный ихтиоз и ламеллярный ихтиоз [118], однако исследования не были продолжены, вероятно, в связи с потенциальным мутагенным действием классических ретрови-русных векторов. Схожая судьба постигла и работы с применением ретровирусных векторов в терапии пигментной ксеродермы, заболевания, самого по себе ассоциированного с высоким риском злокачественных новообразований кожи.

Таким образом, во многом актуальной представлялась задача ухода от вирусных векторов и использования других способов доставки НК-конструкций. Применение генных пушек, интрадермальные инъекции ДНК, нанесение комплексов НК в составе ли-посом оказались малоэффективными [119—121]. Хорошо себя зарекомендовали конструкции на осно-

ве транспозонов Sleeping Beauty и piggyBac, которые способны встраивать целевые гены в геном, однако сопряжены с меньшим риском развития новообразований, чем вирусные векторы [122].

Вышеописанные подходы касались «восполнения» дефектов синтеза белков. В то же время в ряде случаев необходимо проведение обратной операции — избирательного сайленсинга при избыточной экспрессии белка. Для этой цели могут быть применены малые интерферирующие РНК siPH^ Описано применение siPHК-конструкций при таком редком заболевании как врожденная пахионихия, поражающем ногти, волосы, зубы, кожу, слизистую ротовой полости, и связанном с мутациями в генах, кодирующих кератин. Специфической мишенью была мРНК мутантного гена K6a, содержащего однонукле-отидную замену. Введение препарата в область повреждения приводило к клиническому улучшению, однако было сопряжено с болевым синдромом, в связи с чем была изменена форма введения [123]. Создание специализированных siPHК-конструкций к генам с точечными мутациями может оказаться перспективным подходом в тренде персонализированной терапии.

Гэнная терапия в лечении опухолевых

заболеваний

Онкологические заболевания представляют собой чрезвычайно интересное поле для применения генной терапии не только в силу своей высокой социальной значимости, но и в связи с тем, что развитие опухоли предполагает собой появление ряда генных «поломок», которые потенциально могут быть скорректированы [124].

Так как противоопухолевая терапия предполагает комплексные подходы и комбинацию медикаментозных и немедикаментозных методов, использование НК-конструкций может быть направлено на повышение восприимчивости опухолевых клеток к лекарственным препаратам. Так, ретровирусная конструкция MetXia-P450, содержащая ген цитохрома P450 2B6, применяемая в рамках комбинированной терапии, приводит к активации метаболизма цикло-фосфамида, являющегося пролекарством [125]. Препарат на основе MetXia-P450 прошел i фазу клинических испытаний и показал высокую эффективность у пациентов с раком груди (n = 9) и мела-номой (n = 3) [126].

Другим возможным преимуществом вирусных векторов является возможность их таргетной доставки, в том числе, в регионы метастазирования, которые не всегда доступны стандартной терапии. Rexin-G, препарат, разработанный на основе ре-тровирусной конструкции, тропной к определенным фрагментам молекул коллагена, экспонирующихся при опухолевом росте, содержит ген циклина G1. Его доставка в опухолевые клетки приводит к активации проапоптотических путей и подавлению неоваскулоге-неза. Данный препарат прошел фазы i/ii клинических исследований при метастатическом раке молочной железы, рассматривается также возможность его применения при других солидных опухолях [127].

Интересной функциональной возможностью, появляющейся при разработке вирусных векторов, является использование вирусов с онколитической активностью, что повышает эффективность терапии в целом. Так, например, проводятся испытания

конструкций на основе онколитических герпесвиру-сов, кодирующих цитокины, стимулирующие противоопухолевый иммунный ответ, такие как iL-12 или GM-CSF (препарат T-VEK [0ncoVEXGM-CSF]) [128]. Подобные векторы создаются также и на основе парво-вирусов, при этом их действие обуславливается как способностью самого вируса стимулировать иммунный ответ за счет NF-kB-опосредованных механизмов, так и имеющейся НК-конструкцией, кодирующей воспалительные цитокины (TNFa, iFNy) [129].

В терапии злокачественных новообразований могут применяться и другие способы доставки НК, при этом активно используются различные пути физического воздействия (инъекции, генные пушки) или невирусные векторы. В частности, описана возможность прямого безыгольного введения плазмидной ДНК в область кожного метастазирования первичного рака молочной железы [130]. В мышиной модели маммарной карциномы описаны подходы с использованием электротрансфекции для доставки плаз-миды, кодирующей iL-12 в клетки-мишени [131]. Однако данные методики имеют ряд ограничений как объективного характера, связанных с необходимостью поверхностного расположения очагов, так и субъективного характера, связанных с потенциально низкой комплаентностью пациентов.

Системное использование терапевтических НК-конструкций требует не только высокой безопасности разрабатываемых препаратов, но и эффективной защиты от действия нуклеаз, в связи с чем используются различные подходы для предотвращения деградации НК.

В ряде работ исследовалась активность конструкции, включающей НК pE1A-K2, кодирующей белок с противоопухолевой активностью E1A, упакованной в липосомы из 3р[П-Ш',П'-диметиламиноэтил)-карбамоил]-холестерина и диолеоилфосфатидилэ-таноламина (DOPE) при раке молочной железы. При прямом внутриопухолевом введении определялась ДНК E1A, однако уровень мРНК и белка был неопределяем [132]. В то же время при введении препарата в плевральную полость отмечалось достоверное снижение экспрессии HER-2 в биоптатах, а также достоверное повышение количества апоптотических клеток в асцитической или плевральной жидкости по сравнению с образцами, взятыми до начала терапии [133].

Клинические исследования i фазы показали эффективность и безопасность препарата, созданного на основе плазмидной ДНК, кодирующей инактиви-рованную форму CYP1B1, активатора канцерогенеза, в комплексе с микрочастицами поли^1-лактид-когликолида (ZYC300) [134]. Целью терапии в данном случае является «вакцинирование» против CYP1B1, экспрессируемого в опухолевых клетках, но отсутствующего в большинстве нетрансформиро-ванных тканей.

Использование генной терапии может быть направлено и на осуществление транскрипционного контроля. Так, для ряда пациентов с РМЖ характерна повышенная экспрессия рецепторов к герцептину HER-2. Плазмида pERCY использует тот же промотор, активируя экспрессию цитозиндеаминазы, ме-таболизирующей 5-фторцитозин в 5-фторурацил,

обладающий антипролиферативной активностью [135]. Таким образом, повышение экспрессии данного фермента происходит только в опухолевых клетках-мишенях, обеспечивая терапевтический эффект. Интересно, что данный подход может быть реализован и при использовании вирусных векторов. Промотор синтазы жирных кислот, экспресси-рующейся в пределах трансформированных тканей, может использоваться для регуляции экспрессии тимидинкиназы в составе аденовирусного вектора.

Следует отметить также и потенциальную возможность использования для генной терапии опухолей siРНК и shРНК для избирательного подавления экспрессии гена-мишени, например, гена множественной лекарственной устойчивости МОП [136] или гена фактора роста эндотелия сосудов VEGF [137], играющих важную роль в росте опухоли и ее «уходе» от воздействия химиотерапевтических препаратов.

Отдельного рассмотрения заслуживает такой подход, как использование ДНК-вакцин, кодирующих антигены опухолевых клеток. Их доставка в анти-генпрезентирующие клетки (АПК) с последующей экспрессией антигена в комплексе с молекулами МНС i типа на поверхности АПК и ее распознавание цитотоксическими Т-лимфоцитами приводит к активации клеточного иммунного ответа против опухоли. В ветеринарии зарегистрирован препарат Опсер^ применяемый при лечении меланомы у собак, чье действие основано на этом принципе, кодируемым геном при этом является ген тирозиназы [138]. Вообще говоря, спектр опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА) достаточно широк - НЕЯ-2, МиС-1, РЭА, Ь|ТЕ1ТТ, маммаглобин А и др, в качестве адъювантов, усиливающих иммуногенность вакцин, дополнительно могут быть использованы GM-CSF и ^-2, а методы доставки широко варьируют от стандартного инъекционного введения до электропорации [139, 140]. Однако несмотря на впечатляющие результаты доклинических испытаний, данный метод имеет ряд недостатков, связанных с выбором и выделением целевых ОАА для конкретного пациента, стандартизацией и подбором схемы лечения, защитой ДНК-конструкции от деградации. Кроме того, следует помнить, что опухолевые клетки экспрессируют целый ряд ОАА и ДНК-вакцины в таком случае могут быть своеобразным инструментом отбора в пользу клонов, не экспрессирующих выбранный ОАА.

Заключение

Применение генной терапии для управления экспрессией генов в клетках, тканях и органах-мишенях представляет большой интерес как для фундаментальной науки, так и для клинической практики. Дальнейшее развитие этого направления поможет создать новые препараты направленного действия для персонализированной медицины.

Благодарности

Обзор подготовлен при поддержке РФФИ (грант №16-33-60152_мол_а_дк) и стипендии Президента РФ молодым ученым и аспирантам (проект СП-882.2016.4).

ni/ITEPATyPA:

1. Petrus I., Chuah M., van den Driessche T. Gene therapy strategies for hemophilia: benefits versus risks. J. Gene Med. 2010; 12: 797-809.

2. Kay M.A. State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead. Nat. Rev. Genet. 2011; 12: 316-28.

3. Wasala N.B., Shin J.H., Duan D. The evolution of heart gene delivery vectors. J. Gene Med. 2011; 13: 557-65.

4. Parker A.L., Nicklin S.A., Baker A.H. Interactions of adenovirus vectors with blood: implications for intravascular gene therapy applications. Curr. Opin. Mol. Ther. 2008; 10: 439-48.

5. Du L., Dronadula N., Tanaka S. et al. Helper-dependent adenoviral vector achieves prolonged, stable expression of interleukin-10 in rabbit carotid arteries but does not limit early atherogenesis. Hum. Gene Ther. 2011; 22: 959-68.

6. Chuah M.K.L., Collen D., van den Driessche T. Biosafety of adenoviral vectors. Curr. Gene Ther. 2003; 3: 527-43.

7. Lentz T.B., Gray S.J., Samulski R.J. Viral vectors for gene delivery to the central nervous system. Neurobiol. Disease 2012; 48: 179-88.

8. Rey-Rico A., Cucchiarini M. Controlled release strategies for rAAV-mediated gene delivery Acta Biomater. 2016; 29: 1-10.

9. Ibraheem D., Elaissari A., Fessi H. Gene therapy and DNA delivery systems. Int. J. Pharm. 2014; 459: 70-83.

10. Ojala D.S., Amara D.P., Schaffer D.V. Adeno-associated virus vectors and neurological gene therapy. Neuroscientist 2015; 21: 84-98.

11. Rivera v.M., Gao G.P., Grant R.L. et al. Long-term pharmacologically regulated expression of erythropoietin in primates following AAV-mediated gene transfer. Blood 2005; 105: 1424-30.

12. Niemeyer G.P., Herzog R.W., Mount J. et al. Long-term correction of inhibitor-prone hemophilia B dogs treated with liverdirected AAV2-mediated factor IX gene therapy. Blood 2009; 113: 797-806.

13. Stieger K., Schroeder J., Provost N. et al. Detection of intact rAAv particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Mol. Ther. 2009; 17: 516-23.

14. Leone P., Shera D., McPhee S.W. et al. Long-term follow-up after gene therapy for canavan disease. Science Transl. Med. 2012; 4: 165ra163.

15. Vandenberghe L.H., Wilson J.M. AAV as an immunogen. Curr. Gene Ther. 2007; 7: 325-33.

16. Baum C., Schambach A., Bohne J. et al. Retrovirus vectors: toward the plentivirus? Mol. Ther. 2006; 13: 1050-63.

17. Cooray S., Howe S.J., Thrasher A.J. Retrovirus and lentivirus vector design and methods of cell conditioning. Methods Enzymol. 2012; 507: 29-57.

18. Suzuki Y., Craigie R. The road to chromatin — nuclear entry of retroviruses. Nat. Rev. Microbiol. 2007; 5: 187-96.

19. Seidlits S.K., Gower R.M., Shepard J.A. et al. Hydrogels for lentiviral gene delivery. Expert Opin. Drug Deliv. 2013; 10: 499-509.

20. Matrai J., Chuah M.K.L., van den Driessche T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Mol. Ther. 2010; 18: 477-90.

21. Sakuma T., Barry M.A., Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. Biochem. J. 2012; 443: 603-18.

22. Dull T., Zufferey R., Kelly M. et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J. Virol. 1998; 72: 8463-71.

23. Zhang X., Godbey W. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 2006; 58: 515-34.

24. Papayannakos C., Daniel R. Understanding lentiviral vector chromatin targeting: working to reduce insertional mutagenic potential for gene therapy. Gene Ther. 2013; 20: 581-8.

25. Kantor B., Bailey R.M., Wimberly K. et al. Methods for gene transfer to the central nervous system. Adv. Genet. 2014; 87: 125-97.

26. Lundstrom K. Alphaviruses in gene therapy. Viruses 2015; 7: 2321-33.

27. Makkonen K.E., Airenne K., Yla-Herttulala S. Baculovirus-mediated gene delivery and RNAi applications. Viruses 2015; 7: 2099-125.

28. Airenne K.J., Hu Y.C., Kost T.A. et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol. Ther. 2013; 21: 739-49.

29. Bakhshinejad B., Sadeghizadeh M. Bacteriophages as vehicles for gene delivery into mammalian cells: prospects and problems. Expert Opin. Drug Deliv. 2014; 11:1561-74.

30. Buchholz C.J., Friedel T., Buning H. Surface-engineered viral vectors for selective and cell type-specific gene delivery. Trends Biotechnol. 2015; 33: 777-90.

31. Schlenk F., Grund S., Fischer D. Recent developments and perspectives on gene therapy using synthetic vectors. Therapeutics Deliv. 2013; 4: 95-113.

32. Guenther C.M., Kuypers B.E., Lam M.T. et al. Synthetic virology: engineering viruses for gene delivery. WIREs Nanomed. Nanobiotechnol. 2014; 6: 548-58.

33. Yin H., Kanasty R.L., Eltoukhy A.A. et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat. Rev. Genet. 2014; 15: 541-55.

34. Oliveira C., Silveira I., Veiga F. et al. Recent advances in characterization of nonviral vectors for delivery of nucleic acids: impact on their biological performance. Expert Opin. Drug Deliv. 2015; 12: 27-39.

35. Fortier C., Durocher Y., De Crescenzo G. Surface modification of nonviral nanocarriers for enhanced gene delivery. Nanomedicine (Lond.) 2014; 9: 135-51.

36. Hatakeyama H., Akita H., Harashima H. The polyethyleneglycol dilemma: advantage and disadvantage of PEGylation of liposomes for systemic genes and nucleic acids delivery to tumors. Biol. Pharm. Bull. 2013; 36: 892-9.

37. Wasungu L., Hoekstra D. Cationic lipids, lipoplexes and intracellular delivery of genes. J. Control. Release 2006; 116: 255-64.

38. Schaffer D.V., Fidelman N.A., Dan N. et al. Vector unpacking as a potential barrier for receptor-mediated polyplex gene delivery. Biotechnol. Bioeng. 2000; 67: 598-606.

39. Cohen R.N., van der Aa M.A., Macaraeg N. et al. Quantification of plasmid DNA copies in the nucleus after lipoplex and polyplex transfection. J. Control. Release 2009; 135: 166-74.

40. Yao J., Fan Y., Li Y.et al. Strategies on the nuclear-targeted delivery of genes. J. Drug Target. 2013; 21: 926-39.

41. Mintzer M.A., Simanek E.E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem. Rev. 2009; 109: 259-302.

42. Zhi D., Zhang S., Cui S. et al. The headgroup evolution of cationic lipids for gene delivery. Bioconjug. Chem. 2013; 24: 487-519.

43. Li W., Szoka F.C. Jr. Lipid-based nanoparticles for nucleic acid delivery. Pharm. Res. 2007; 24: 438-49.

44. Maslov M.A., Zenkova M.A. Non-viral gene delivery systems based on cholesterol cationic lipids: structure-activity relationships. In: Yuan X., editor. Non-viral gene therapy. Rijeka: InTech; 2011. p. 349-80.

45. Zhao Y., Huang L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Adv. Genet. 2014; 88: 13-36.

46. Pisani M., Mobbili G., Bruni P. Neutral liposomes and DNA transfection. In: Yuan X., editor. Non-viral gene therapy. Rijeka: InTech; 2011. p. 329-48.

47. de Jesus M.B., Zuhorn I.S. Solid lipid nanoparticles as nucleic acid delivery system: properties and molecular mechanisms J. Control. Release 2015; 201: 1-13.

48. Dolatabadi J.E.N., Valizadeh H., Hamishehkar H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv. Pharm. Bull. 2015; 5: 151-9.

49. Su X., Fricke J., Kavanagh D.G. et al. In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles. Mol. Pharm. 2011; 8: 774-87.

50. Phua K.K., Leong K.W., Nair S.K. Transfection efficiency and transgene expression kinetics of mRNA delivered in naked and nanoparticle format. J. Control. Release 2013; 166: 227-33.

51. Akinc A., Querbes W., De S. et al. Targeted delivery of RNAi therapeutics with endogenous and exogenous ligand-based mechanisms. Mol. Ther. 2010; 18: 1357-64.

52. Jayaraman M., Ansell S.M., Mui B.L. et al. Maximizing the potency of siRNA lipid nanoparticles for hepatic gene silencing in vivo. Angew. Chem. Int. Ed. 2012; 51: 8529-33.

53. Akinc A., Goldberg M., Qin J. et al. Development of lipidoid— siRNA formulations for systemic delivery to the liver. Mol. Ther. 2009; 17: 872-9.

54. Alabi C.A., Love K.T.; Sahay G. et al. Multiparametric approach for the evaluation of lipid nanoparticles for siRNA delivery. PNAS USA 2013; 110: 12881-6.

55. Burnett J.C., Rossi J.J., Tiemann K. Current progress of siRNA/shRNA therapeutics in clinical trials. Biotechnol. J. 2011; 6: 1130-46.

56. Nishina K., Unno T., Uno Y. et al. Efficient in vivo delivery of siRNA to the liver by conjugation of alpha-tocopherol. Mol. Ther. 2008; 16: 734-40.

57. Petrova N.S., Chernikov I.V., Meschaninova M.I. et al. Carrier-free cellular uptake and the gene-silencing activity of the lipophilic siRNAs is strongly affected by the length of the linker between siRNA and lipophilic group. Nucleic Acids Res. 2012; 40: 2330-44.

58. Dovydenko I., Tarassov I., Venyaminova A. et al. Method of carrier-free delivery of therapeutic RNA importable into human mitochondria: Lipophilic conjugates with cleavable bonds. Biomaterials 2016; 76: 408-17.

59. Petrova N.S., Meschaninova M.I., Venyaminova A.G. et al. 2'-O-methyl-modified anti-MDR1 fork-siRNA duplexes exhibiting high nuclease resistance and prolonged silencing activity. Oligonucleotides 2010; 20: 297-308.

60. Chernolovskaya E.L., Zenkova M.A. Chemical modification of siRNA. Curr. Opin. Mol. Ther. 2010; 12: 158-67.

61. Aied A., Greiser U., Pandit A. et al. Polymer gene delivery: overcoming the obstacles. Drug Discov. Today 2013; 18: 1090-8.

62. Neuberg P., Kichler A. Recent developments in nucleic acid delivery with polyethylenimines. Adv. Genet. 2014; 88: 263-88.

63. Lee Y.S., Kim S.W. Bioreducible polymers for therapeutic gene delivery. J. Control. Release. 2014; 190: 424-39.

64. Chen W., Meng F., Chenga R. et al. Advanced drug and gene delivery systems based on functional biodegradable polycarbonates and copolymers J. Control. Release 2014; 190: 398-414.

65. Calejo M.T., Sande S.A., Nystrom B. Thermoresponsive polymers as gene and drug delivery vectors: architecture and mechanism of action. Expert Opin. Drug Deliv. 2013; 10: 1669-86.

66. Cai J., Yue Y., Rui D. et al. Effect of chain length on cytotoxicity and endocytosis of cationic polymers. Macromolecules 2011; 44: 2050-7.

67. Li L., Wei Y., Gong C. Polymeric nanocarriers for non-viral gene delivery J. Biomed. Nanotechnol. 2015; 11: 739-70.

68. Nitta S.K., Numata K. Biopolymer-based nanoparticles for drug/gene delivery and tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14: 1629-54.

69. Li Y., Gao G.H., Lee D.S. Stimulus-sensitive polymeric nanoparticles and their applications as drug and gene carriers. Adv. Healthc. Mater. 2013; 2: 388-417.

70. Draghici B., Ilies M.A. Synthetic nucleic acid delivery systems: present and perspectives. J. Med. Chem. 2015; 58: 4091-130.

71. He D., Wagner E. Defined polymeric materials for gene delivery. Macromol. Biosci. 2015; 15: 600-12.

72. Liu X., Peng L. Dendrimer nanovectors for siRNA delivery. Methods Mol. Biol. 2016; 1364: 127-42.

73. Shcharbin D., Shakhbazau A., Bryszewska M. Polytamidoamine) dendrimer complexes as a platform for gene delivery. Expert opin. Drug Deliv. 2013; 10: 1687-98.

74. Kesharwani P., Iyer A.K. Recent advances in dendrimer-based nanovectors for tumor-targeted drug and gene delivery. Drug Discov. Today 2015; 20: 536-47.

75. Derossi D., Calvet S., Trembleau A. et al. Cell internalization of the third helix of the Antennapedia homeodomain is receptor-independent. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18188-93.

76. Joliot A., Pernelle C., Deagostini-Bazin H. et al. Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. PNAS USA 1991: 88: 1864-8.

77. Vives E., Brodin P., Lebleu B. A truncated HIV-1 TAT protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the nucleus. J. Biol. Chem. 1997; 272: 16010-7.

78. Campbell G.R., Loret E.P. What does the structure-function relationship of the HIV-1 Tat protein teach us about developing an AIDS vaccine? Retrovirology 2009; 6: 50.

79. Gopal V. Bioinspired peptides as versatile nucleic acid delivery platforms. J. Control. Release 2013; 167: 323-32.

80. Parhiza H., Shierb W.T., Ramezani M. From rationally designed polymeric and peptidic systems to sophisticated gene delivery nano-vectors. Int. J. Pharm. 2013; 457: 237-59.

81. Park J., Singha K., Son S. et al. A review of RGD-functionalized nonviral gene delivery vectors for cancer therapy. Cancer Gene Ther. 2012; 19: 741-8.

82. Alhakamy N.A., Nigatu A.S., Berkland C.J. et al. Noncovalently associated cell-penetrating peptides for gene delivery applications. Ther. Deliv. 2013; 4: 741-57.

83. Chou L.Y., Ming K., Chan W.C. Strategies for the intracellular delivery of nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 2011; 40: 233-45.

84. Loh X.J., Lee T.C. Gene delivery by functional inorganic nanocarriers. Recent Pat. DNA Gene Seq. 2012; 6: 108-14.

85. Loh X.J., Lee T.C., Dou Q. et al. Utilising inorganic nanocarriers for gene delivery. Biomater. Sci. 2016; 4: 70-86.

86. Ding Y., Jiang Z., Saha K. et al. Gold nanoparticles for nucleic acid delivery. Mol. Ther. 2014; 22: 1075-83.

87. Jeong E.H., Jung G., Hong C.A. et al. Gold nanoparticle (AuNP)-based drug delivery and molecular imaging for biomedical applications. Arch. Pharm. Res. 2014; 37: 53-9.

88. Karimi M., Solati N., Amiri M. et al. Carbon nanotubes part I: preparation of a novel and versatile drug-delivery vehicle. Expert Opin. Drug Deliv. 2015; 12: 1071-87.

89. Karimi M., Solati N., Ghasemi A. et al. Carbon nanotubes part II: a remarkable carrier for drug and gene delivery. Expert Opin. Drug Deliv. 2015; 12: 1089-105.

90. Bates K., Kostarelos K. Carbon nanotubes as vectors for gene therapy: past achievements, present challenges and future goals. Adv. Drug Deliv. Rev. 2013; 65: 2023-33.

91. Bao G., Mitragotri S., Tong S. Multifunctional nanoparticles for drug delivery and molecular imaging. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2013; 15: 253-82.

92. Petkar K.C., Chavhan S.S., Agatonovik-Kustrin S. et al. Nanostructured materials in drug and gene delivery: a review of the state of the art. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 2011; 28: 101-64.

93. Wang Y., Huang L. Composite nanoparticles for gene delivery. Adv. Genet. 2014; 88: 111-37.

94. Wu X., Wu M., Zhao J.X. Recent development of silica nanoparticles as delivery vectors for cancer imaging and therapy. Nanomedicine 2014; 10: 297-312.

95. Ramamoorth M., Narvekar A. Non-viral vectors in gene therapy - an overview. J. Clin. Diag. Res. 2015; 9(1): GE01-GE06

96. Zhang D., Das D.B., Rielly C.D. Potential of microneedle-assisted micro-particle delivery by gene guns: a review. Drug Deliv. 2014; 21: 571-87.

97. Al-Dosari M.S., Gao X. Non-viral gene delivery: principle, limitations and recent progress. AAPS J. 2009; 11: 671-81.

98. Li S.D., Huang S.L. Gene therapy progress and prospects; Decade strategy. Gene Ther. 2006; 13: 1313-9.

99. Dean D.A. Cell-specific targeting strategies for electroporation-mediated gene delivery in cells and animals. J. Membrane Biol. 2013; 246: 737-44.

100. Su C.H., Wu Y.J., Wang H.H. et al. Non-viral gene therapy targeting cardiovascular system. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2012; 303: H629-38.

101. Shirley S., Heller R., Heller L. Electroporation gene therapy. In: Lattime E.C., Gerson S.L., editors. Gene therapy of cancer. 3rd ed. San Diego: Academic Press; 2013. p. 93-106.

102. Zhou Q.L., Chen Z.Y., Wang Y.X. et al. Ultrasound-mediated local drug and gene delivery using nanocarriers. BioMed Res. Int. 2014; 2014: 963891.

103. Cavalli R., Bisazza A., Lembo D. Micro- and nanobubbles: a versatile non-viral platform for gene delivery. Int. J. Pharm. 2013; 456: 437-45.

104. Fan Z., Kumon R.E., Deng C.X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Ther. Deliv. 2014; 5: 467-86.

105. Newman C.M., Bettinger T. Gene therapy progress and prospects: Ultrasound for gene transfer. Gene Ther. 2007; 14: 465-75.

106. Rychak J.J., Klibanov A.L. Nucleic acid delivery with microbubbles and ultrasound. Adv. Drug Deliv. Rev. 2014; 72: 82-93.

107. Herweiger H., Wolff J.A. Progress and prospects: hydrodynamic gene delivery. Gene Ther. 2006; 14: 99-107.

108. Ramadori G., Moriconi F., Malik I. et al. Physiology and pathophysiology of liver inflammation, damage and repair. J. Physiol. Pharmacol. 2008; 59 Suppl 1: 107-17.

109. Salazar-Montes A.M., Hernández-Ortega L.D., Lucano-Landeros M.S. et al. New gene therapy strategies for hepatic fibrosis. World J. Gastroenterol. 2015; 21: 3813-25.

110. Nakamuta M., Morizono S., Tsuruta S. et al. Remote delivery and expression of soluble type II TGF-beta receptor in muscle prevents hepatic fibrosis in rats. Int. J. Mol. Med. 2005; 16: 59-64.

111. Marquez-Aguirre A., Sandoval-Rodriguez A., Gonzalez-Cuevas J. et al. Gene therapy for cirrhosis dominant-negative transforming growth factor beta type II receptor up-regulates transcriptional repressor SKI-like oncogene, decreases matrix metalloproteinase 2 in hepatic stellate cell and prevents liver fibrosis in rats. J. Gene Med. 2009; 11: 207-19.

112. Reetz J., Genz B., Meier C. et al. Development of adenoviral delivery systems to target hepatic stellate cells in vivo. PLoS One 2013; 8: e67091.

113. Liu J., Cheng X., Guo Z. et al. Truncated active human matrix metalloproteinase-8 delivered by a chimeric adenovirus-hepatitis B virus vector ameliorates rat liver cirrhosis. PLoS One 2013; 8: e53392.

114. Abdul-Wahab A., Qasim W., McGrath J.A. Gene therapies for inherited skin disorders. Semin. Cutan. Med. Surg. 2014; 33: 83-90.

115. Mavilio F., Pellegrini G., Ferrari S. et al. Correction of junctional epidermolysis bullosa by transplantation of genetically modified epidermal stem cells. Nat. Med. 2006; 12: 1397-402.

116. Carulli S., Contin R., De Rosa L. et al. The long and winding road that leads to a cure for epidermolysis bullosa. Regen. Med. 2013; 8: 467-81.

117. Di Nunzio F., Maruggi G., Ferrari S. et al. Correction of laminin-5 deficiency in human epidermal stem cells by transcriptionally targeted lentiviral vectors. Mol. Ther. 2008; 16: 1977-85.

118. Freiberg R.A., Choate K.A., Deng H. et al. A model of corrective gene transfer in X-linked ichthyosis. Hum. Mol. Genet. 1997; 6: 927-33.

119. Sawamura D., Ina S., Itai K. et al. In vivo gene introduction into keratinocytes using jet injection. Gene Ther. 1999; 6: 1785-7.

120. Sun W.H., Burkholder J.K., Sun J. et al. In vivo cytokine gene transfer by gene gun reduces tumor growth in mice. PNAS USA 1995; 92: 2889-93.

121. Alexander M.Y., Akhurst R.J. Liposome-medicated gene transfer and expression via the skin. Hum. Mol. Genet. 1995; 4: 2279-85.

122. Ortiz-Urda S., Thyagarajan B., Keene D.R. et al. Stable nonviral genetic correction of inherited human skin disease. Nat. Med. 2002; 8: 1166-70.

123. Leachman S.A., Hickerson R.P., Schwartz M.E. et al. Firstin-human mutation-targeted siRNA phase Ib trial of an inherited skin disorder. Mol .Ther. 2010; 18: 442-6.

124. McCrudden C.M., McCarthy H.O. Current status of gene therapy for breast cancer: progress and challenges. Appl. Clin. Genet. 2014; 7: 209-20.

125. Kan O., Griffiths L., Baban D. et al. Direct retroviral delivery of human cytochrome P450 2B6 for gene-directed enzyme prodrug therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 2001; 8: 473-82.

126. Braybrooke J.P., Slade A., Deplanque G. et al. Phase I study of MetXia-P450 gene therapy and oral cyclophosphamide for patients with advanced breast cancer or melanoma. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 1512-20.

127. Gordon E.M., Hall F.L. Noteworthy clinical case studies in cancer gene therapy: tumor-targeted Rexin-G advances as an efficacious anti-cancer agent. Int. J. Oncol. 2010; 36: 1341-53.

128. Hu J.C., Coffin R.S., Davis C.J. et al. A phase I study of OncoVEXGM-CSF, a second-generation oncolytic herpes simplex virus expressing granulocyte macrophage colony-stimulating factor. Clin. Cancer Res. 2006; 12: 6737-47.

129. Enderlin M., Kleinmann E.V., Struyf S. et al. TNF-alpha and the IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10/CXCL-10) delivered by parvoviral vectors act in synergy to induce antitumor effects in mouse glioblastoma. Cancer Gene Ther. 2009; 16: 149-60.

130. Walther W., Siegel R., Kobelt D. et al. Novel jet-injection technology for nonviral intratumoral gene transfer in patients with melanoma and breast cancer. Clin. Cancer Res. 2008; 14: 7545-53.

131. Shibata M.A., Ito Y., Morimoto J. et al. In vivo electrogene transfer of interleukin-12 inhibits tumor growth and lymph node and lung metastases in mouse mammary carcinomas. J. Gene Med. 2006; 8: 335-52.

132. Yoo G.H., Hung M.C., Lopez-Berestein G. et al. Phase I trial of intratumoral liposome E1A gene therapy in patients with recurrent breast and head and neck cancer. Clin. Cancer Res. 2001; 7: 1237-45.

133. Hortobagyi G.N., Ueno N.T., Xia W. et al. Cationic liposome-mediated E1A gene transfer to human breast and ovarian cancer cells

and its biologic effects: a phase I clinical trial. J. Clin. Oncol. 2001; 19: 3422-33.

134. Gribben J.G., Ryan D.P., Boyajian R. et al. Unexpected association between induction of immunity to the universal tumor antigen CYP1B1 and response to next therapy. Clin. Cancer Res. 2005; 11: 4430-6.

135. Pandha H.S., Martin L.A., Rigg A. et al. Genetic prodrug activation therapy for breast cancer: a phase I clinical trial of erbB-2-directed suicide gene expression. J. Clin. Oncol. 1999; 17: 2180-9.

136. Gao Y., Chen L., Zhang Z. et al. Reversal of multidrug resistance by reduction-sensitive linear cationic click polymer/iMDR1-pDNA complex nanoparticles. Biomaterials 2011; 32: 1738-47.

137. Feng Q., Yu M.Z., Wang J.C. et al. Synergistic inhibition of breast cancer by co-delivery of VEGF siRNA and paclitaxel via vapreotide-modified core-shell nanoparticles. Biomaterials 2014; 35: 5028-38.

138. Grosenbaugh D.A., Leard A.T., Bergman P.J. et al. Safety and efficacy of a xenogeneic DNA vaccine encoding for human tyrosinase as adjunctive treatment for oral malignant melanoma in dogs following surgical excision of the primary tumor. Am. J. Vet. Res. 2011; 72: 1631-8.

139. Bednarek A.K., Sahin A., Brenner A.J. et al. Analysis of telomerase activity levels in breast cancer: positive detection at the in situ breast carcinoma stage. Clin. Cancer Res. 1997; 3: 11-6.

140. Slamon D., Eiermann W., Robert N. et al. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. N. Engl. J. Med. 2011; 365: 1273-83.

Поступила: 02.03.2016