Изменение содержания продуктов окисления белков в плазме крови больных немелкоклеточным раком легкого в зависимости от стадии заболевания

// Cell Physiol Biochem. — 2009. — Vol.24(5-6). — P. 441-450.

4.Hoyme H.E., May PA, Kalberg W.O., et al. A practical clinical approach to diagnosis of fetal alcohol spectrum disorders: clarification of the 1996 institute of medicine criteria / / Pediatrics. — 2005. — Vol. 115(1). — P. 39-47.

5. Jimenez-Farfan D., Guevara J., Zenteno E., Hernandez-Guerrero J.C. Alteration of the sialylation pattern of the murine tooth germ after ethanol exposure // Clin Mol Teratol. — 2005. — Vol. 73(12). — P. 980-988.

6. Lakshman M.R. Alcohol and molecular regulation of protein glycosylation and function // Alcohol. — 1999. — Vol. 19 (3). — P. 239-247.

7.Бочков Н.П., Васечкин В.Б. Влияние психоактивных веществ на развитие эмбриона и плода (обзор литературы) // Наркология. — 2004. — №2. — С. 23-26.

8.Булгакова В.С., Высокогорский В.Е., Притыкина Т.В., Титов С.С. Нарушение обмена углеводсодержащих соединений при алкогольной интоксикации // Наркология. — 2008. — №5. — С. 50-53.

9. Видершайн Г.Я. Углеводсодержащие соединения, их биосинтез, роль в живой клетке // Усп. биол. химии. — 1979. — Т. 20. — С. 46-71.

10. Высокогорский В.Е., Индутный А.В., Рыжковская Э.Ю., Самусева Н.Л. Метаболические механизмы алкогольной интоксикации // Сибирский вестник психиатрии и наркологии. — 2002. — №3. — С. 13-17.

11. Горячковский А.В. Клиническая биохимия в лабораторной диагностике. — Одесса: Экология, 2005. — 616 с.

12. Камышников В.Ф. Справочник по химикобиологическим исследованиям и лабораторной диагностике. — М.: МЕДпресс-информ, 2004. — 920 с.

13. Самусева Н.Л., Высокогорский В.Е. Влияние антиоксидантов на интенсивность свободно-радикального окисления у потомства алкоголизированных крыс // Мат. конф. биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». — Ижевск, 2001. — С. 100-102.

14. Самусева Н.Л., Высокогорский В.Е. Состояние метаболизма глутатиона и интенсивности свободно-радикального окисления у потомства алкоголизированных животных // Мат. конф. биохимиков Урала, Поволжья и Западной Сибири «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии». — Челябинск, 1999. — С. 93-95.

15. Сторожок С.А., Панченко Л.Ф., Филиппович Ю.Д., Глушков В.С. Изменение физико-химических свойств биологических мембран при развитии толерантности к этанолу // Вопр. мед. химии. — 2001. — Т.47, №2. — С.198-205.

16. Шараев П.Н., Стрелков Н.С., Кильдиярова Р.Р. и др. Соединительная ткань в детском возрасте: Монография / Под ред. P.P. Кильдияровой. — Изд. 2-е, испр. и доп. — Ижевск, 2009. — 144 с.

Информация об авторах: 644043 г. Омск, ул. Ленина 12; тел: (3812) 650577, e-mail: be-ha@mail.ru Высокогорский Валерий Евгеньевич — заведующий кафедрой, д.м.н., профессор, заслуженный работник высшей школы РФ, Арзамасова Ольга Александровна — очный аспирант,

Тютикова Дарья Михайловна — студент

в БЕЛОНОГОВ Р.Н., ТИТОВА H.M., САВЧЕНКО А.А. — 2011 УДК: 612.015:616-006.6

ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ПРОДУКТОВ ОКИСЛЕНИЯ БЕЛКОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ЛЕГКОГО В ЗАВИСИМОСТИ ОТ СТАДИИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

Poман ^тлаевич Белoнoгoв1, Шдежда Mumpoфанoвна Тumoва2, Андрей Aнаmoльевuч Cавченкo13 ^Красноярский государственный медицинский университет им. проф. B^. Bойно-Яcенецкого, ректор — д.м.н., проф. И.П. Aртюxов, кафедра патологической физиологии с курсом клинической патофизиологии им. B.B. Иванова, зав. — д.м.н. Т.Г. Pyкша, кафедры физиологии, зав. — д.м.н., проф. A.A. Савченко; 2Сибирский федеральный университет, ректор — д.б.н., акад. PAH E.A. Bаганов, кафедры медицинской биологии, зав. — д.б.н., проф. Т.И. Шишацкая; 3НИИ медицинских проблем Севера СО PAМH, директор — член-корр. PAМH, проф. B.T. Манчук, лаборатория молекулярно-клеточной физиологии и патологии, руководитель — д.м.н., проф. A.A. Савченко)

Резюме. С целью определения уровня показателей окислительной модификации белков в эритроцитах больных немелкоклеточным раком легкого на различных стадиях заболевания, обследовано 110 человек. В эритроцитах больных оценивалось содержание карбонильных производных белков, битирозина, триптофана, среднемолекулярных пептидов, SH-групп белков. Наиболее выраженное возрастание интенсивности процессов редокс-зависимой модификации белков в эритроцитах происходит на II и IV стадиях рака легкого. Изменение интенсивности окислительных процессов в плазме крови соотносится с состоянием организма, размером опухоли, поражением лимфатических узлов, наличием или отсутствием метастазов.

Ключевые слова: рак легкого, окислительный стресс, окислительная модификация белков.

CHANGES IN CONTENT OF OXIDATION OF PROTEINS IN BLOOD PLASMA OF PATIENTS WITH NON-MICROCELLULAR PULMONARY CANCER SUBJECT TO THE STAGE OF THE DISEASE

R.N. Belonogov1, N.M. Titova2, A.A. Savchenko1,3 ^Krasnoyarsk State Medical University; 2Siberian Federal University; 3Institute of Medical Problems of North, Krasnoyarsk)

Summary. The aim of the study was to investigate level of markers of oxidative modification of proteins in blood plasma of patients with non-microcellular lung cancer. 110 patients with lung carcinoma have been selected for the study. The carbonyl proteins derivatives, dityrosine, tryptophane, middle molecular peptides, SH-groups of proteins have been evaluated. The most increase in redox-depended modification of proteins occurs on II and IV stage of the disease. Change in intensity of oxidative processes in blood plasma correlates with patient’s condition, tumor size, lymph node involvements and presence or absence of metastases.

Key words: lung cancer, oxidative stress, oxidative modification of proteins.

Рак легкого занимает ведущие позиции в структуре онкологической заболеваемости. Как правило, местные проявления опухоли выражены достаточно слабо, особенно на начальных стадиях, что сильно затрудняет раннюю диагностику и борьбу с этим заболеванием.

Большое значение имеют вопросы о том, какие системные изменения в организме вызывает возникающая опухоль. Проблема взаимоотношения опухоли и организма исследована в значительно меньшей степени, чем механизмы канцерогенеза. Рост опухоли сопровожда-

Рис. 1. Содержание битирозина в плазме крови больных раком легкого в зависимости от стадии заболевания

Примечание: 1 — контрольная группа; 2 — больные раком легкого на I стадии; 3 — больные раком легкого на II стадии; 4 — больные раком легкого на III стадии; 5 — больные раком легкого на IV стадии.

ется изменением показателей антиоксидантной активности и окислительного стресса в опухолевой ткани, что также отражается на функции органов и тканей организма. Увеличение образования активных форм кислорода вызывает усиление процессов окисления биологических молекул и может приводить к повреждению клеток и тканей, что играет важную роль в патогенезе рака легкого [6]. Белки плазмы крови, подвергшиеся окислительной деструкции, имеют длительный период распада, что делает их перспективным маркером интенсивности свободно-радикального окисления [3, 6, 8]. Окислительная модификация белков на различных стадиях рака легкого может иметь свои особенности, тем не менее, ее характер и выраженность при данной патологии практически не изучены.

Цель работы: Изучить особенности редокс-

зависимой модификации белков плазмы крови у больных немелкоклеточным раком легкого в зависимости от стадии заболевания.

Материалы и методы

На базе Красноярского краевого онкологического диспансера обследовано 110 больных мужского пола с немелкоклеточным раком легкого в возрасте 35-70 лет (средний возраст 53,4±2,4 года). У 8 больных раком легкого диагностирована I стадия, у 32 — II стадия, у 39 — III стадия и у 29 — IV стадия заболевания. Окончательный диагноз устанавливался после оперативного вмешательства и гистологического исследования образцов опухоли врачами онкологического диспансера. В качестве контрольной группы были обследованы 35 здоровых доноров аналогичного возраста. Работу проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан». Кровь забиралась из локтевой вены в гепаринизированные пробирки, утром натощак, на следующий день после поступления больного в стационар. Плазма крови отделялась центрифугированием, после чего в ней проводилось определение показателей окислительной модификации белков (ОМБ) — карбонильных производных, битирозина, триптофана и тиоловых групп белков.

Об уровне карбонильных производных белков (КПБ) судили по реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов [10]. Оптическую плотность образовавшихся производных динитрофенилгидразо-нов регистрировали спектрофотометрически при различных длинах волн: 356 нм — алифатические кето-динитрофенилгидразоны нейтрального характера; 370 нм — алифатические альдегиддинитрофенилгидразоны нейтрального характера [3]. Содержание битирозина

оценивалось спектрофлуориметрически (спектроф-луориметр Aminco Bowman Series 2 (Thermo Spectronic, USA)) при длине волны возбуждения 325 нм и при длине волны испускания 416 нм в 1/15 М фосфатном буфере, рН 7,4 [1]. Аналогичным образом измеряли трипто-фановую флуоресценцию, определение проводили при длине волны возбуждения — 297 нм и при длине волны испускания — 336 нм [1]. Метод определения количества тиоловых групп в белках основан на взаимодействии SH-групп с 5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой. Интенсивность окраски регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412нм. Оптическую плотность пробы измеряли через две минуты после начала реакции [2]. Содержание белка в пробах определяли микробиуретовым методом [5].

Для всех данных определяли медиану (Ме) и интерквартальный разброс в виде подсчета 25- (С25) и 75-процентилей (С75). Для оценки достоверности различий между группами использовался непараметрический критерий Манна-Уитни. Оценка взаимосвязи исследуемых показателей осуществлялась подсчетом коэффициента ранговой корреляции по Спирману. Статистический анализ осуществлялся с помощью пакетов прикладных программ Statistica версия 7,0 (StatSoft Inc., 2004, USA). Критический уровень значимости при проверке гипотез р=0,05.

Результаты и обсуждение

Уровень альдегидных форм КПБ на I и II стадиях заболевания последовательно повышается, сначала на 66% и затем на 110%. На III стадии уровень приближается к значению I стадии и составляет 62% от контрольного показателя, а затем увеличивается на 135% на IV стадии. Содержание кетонных форм КПБ незначительно увеличивается на I стадии — на 11%. На II и IV стадии этот уровень увеличивается до 64% и 35% соответственно. На III стадии уровень кетонных форм КПБ близок к контрольному значению (табл. 1).

Таблица 1

Содержание карбонильных производных белков в плазме крови в зависимости от стадии рака легкого,

у.е./г белка

Стадия N Альдегидные формы карбонильных производных белков Кетонные формы карбонильных производных белков

Контроль 35 1,74

I стадия 4 2,88

II стадия 22 3,65 (1,68; 10,00)* 3,48 (1,91; 8,74)*

III стадия 32 2,81

IV стадия 20 4,08

Примечание: * p<0,05 по сравнению с контролем.

Содержание битирозина резко возрастает на второй стадии — на 49% относительно контроля, на остальных стадиях, значимых отличий не наблюдается (рис. 1). В результате корреляционного анализа была установлена отрицательная взаимосвязь между уровнем битирозина и стадией рака легкого (г=-0,32; р<0,01).

Интенсивность флуоресценции триптофана повышена на всех стадиях. На I стадии она повышена на 16%, на II стадии увеличивается до 47%, на III стадии немного снижается, оставаясь при этом на 32% выше, чем в контроле, и затем вновь увеличивается, и на IV стадии становится на 44% выше показателей в контрольной группе (рис. 2).

Уровень быстрореагирующих SH-групп белков на первой стадии заболевания ниже на 7%, на второй, третьей и четвертой стадиях выше на 58%, 7% и 8% соответственно по сравнению с контрольной группой (рис.

Рис. 2. Содержание триптофана в плазме крови больных раком легкого в зависимости от стадии заболевания

Примечание: 1 — контрольная группа; 2 — больные раком легкого на I стадии; 3 — больные раком легкого на II стадии; 4 — больные раком легкого на III стадии; 5 — больные раком легкого на IV стадии.

3). Уровень быстрореагирующих тиоловых групп отрицательно коррелирует со стадией (г= —0,26; р<0,05).

Образование карбонильных производных белков может осуществляться как путем прямого окисления аминокислотных остатков, так и при взаимодействии с продуктами липопероксидации и гликооксидации. Их содержание может служить показателем общего окислительного стресса [6].

Интерес к битирозину в белках основан на его возможной роли как специфического маркера окислительного повреждения белков и их селективного протеолиза [8].

Интенсивность флуоресценции остатков триптофана характеризует конформационное состояние белковой молекулы. Изменение конформации молекул белков, сопровождающееся снижением экранированности остатков триптофана, приводит к возрастанию интенсивности флуоресценции. Распад белков в результате протеолиза также приводит к увеличению содержания флуоресцентно определяемого триптофана в крови [4].

Содержание тиоловых групп белков в плазме косвенно определяет ее антиоксидантную емкость. Избыток тиоловых групп белков в плазме также может быть фактором защиты опухоли от оксидантов и цито-токсических препаратов. Конформационные изменения структуры белков, о которых свидетельствуют данные по содержанию триптофана, могут с одной стороны вести к снижению функциональной активности белка, но с другой стороны приводить к возрастанию уровня доступных для определения тиоловых групп белков, обладающих антиоксидантной способностью.

Уровень исследованных показателей в плазме отражает выраженное усиление окислительных процессов

Рис. 3. Содержание быстрореагирующих тиоловых групп белков в плазме крови в зависимости от стадии рака легкого

Примечание: 1 — контрольная группа; 2 — больные раком легкого на I стадии; 3 — больные раком легкого на II стадии; 4 — больные раком легкого на III стадии; 5 — больные раком легкого на IV стадии.

на II и IV стадиях. На II стадии рака легкого, в результате роста опухоли, развивающихся под ее влиянием изменений структуры и нарушения гомеостаза легкого, прогрессивно нарастающих изменений в регионарных лимфатических узлах легких и воспалительных процессов, происходит истощение антиоксидантов и усиление интенсивности ОМБ. На III стадии рака легкого главным образом происходит увеличение размеров опухоли, прорастанием ее в близлежащие ткани и дальнейшее распространение лимфогенных метастазов. Происходит усиление общей гипоксии организма, за счет нарушения функций легкого, также возможно возрастание активности антиоксидантных процессов, которые, в частности могут быть обусловлены усилением образования низкомолекулярных продуктов фрагментации макромолекул, обладающих антиоксидантными свойствами, что приводит к снижению интенсивности процессов свободнорадикального окисления в организме онкобольного. На IV стадии происходит развитие отдаленных метастазов, чему сопутствуют многочисленные изменения в организме больного раком легкого. По мере роста метастаза, происходит деструкция сосудистой стенки и выход опухоли в окружающие ткани с их прогрессирующим поражением и развитием воспалительных процессов. Данные нарушения приводят к выраженному усилению окислительных процессов [6, 7, 9].

Таким образом, в процессе опухолевого роста может происходить усиление влияния как про- так и антиок-сидантных систем, что ведёт к динамическому изменению уровня исследованных показателей на различных стадиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Aруmюнян A.B.. Дубинина E.E.. Зыбина H.H. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. — СПб.: Фолиант, 2000. — 103 с.

2. Bеревкuна M.B.. Точилкин A.M.. Попова H.A. Koлopиметpический метод определения SH-групп и S-S-связей в белках при помощи 5,5'-дитиобио(2-нитробензойной) кислоты) // Современные методы в биохимии. — М.: Медицина, 1977. — С. 223-231.

3. Дубинина E.E.. Бурмистров C.O.. Ходов ДЛ. и др. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения// Вопр. мед. химии. —1995. — Т. 41, №1. — С.24-2б.

4. Дюбко Т.С. О некоторых аспектах применения флуоресцентного анализа в криобиологии //Вестник Харьковского национального университета им. В.Н. ^разина. Серия: Биология. — 200б. — №729. — С. 221-231.

5. Меньшиков B.B. Справочник по клиническим лаборатор-

ным методам исследования. — М.: Медицина, 1987. — 460 с.

6. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин B.3. и др. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. — Новосибирск: АРТА, 2008. — 284 с.

7. Esme H., Cemek M., Sezer M., et al. High levels of oxidative stress in patients with advanced lung cancer //Respirology. — 2008. — Vol. 13, №1. — P. 112-116.

8. Giulivi C., Traaseth N.J., Davies K.J.A. Tyrosine oxidation products: analysis and biological relevance //Amino acids. — 2003. — Vol. 25. — P. 227-232.

9. Lee J.M., Yanagawa J., Peebles K.A., et al. Inflammation in lung carcinogenesis: New targets for lung cancer chemoprevention and treatment //Critical Reviews in Oncology/Hematology. — 2008. — Vol. 66, №3. — P. 208-217.

10. Levine L.R., Williams J.A., Stadtman E.R., et al. Carbonyl assay for determination of oxidatively modified proteins // Methods in enzymology. — 1994. — Vol.233, №37. — P346 — 357.

Информация об авторах: 660022, г. Красноярск, ул. Партизана Железняка 1з, КрасГМА, e-mail: ro-x@ya.ru

Белоногов Роман Николаевич — ассистент;

Титова Надежда Митрофановна — к.б.н., профессор;

Савченко Андрей Анатольевич — д.м.н., профессор, заведующий кафедрой, руководитель лаборатории.