Средство гуминовой природы, обладающее иммуномодулирующим действием
DRUG OF HUMIC NATURE, WHICH HAS AN IMMUNOMODULATORY EFFECT

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, результаты которого могут быть использованы для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Тh2-зависимого иммунного ответа при хронизации инфекций, вызванных внеклеточными бактериями и паразитами.
Гуминовые вещества - группа природных биополимеров, содержащихся главным образом в объектах растительного происхождения (каустобиолитах) - торфе, буром угле, придонных осадках (сапропелях, пелоидах), состоят на 80-90% из гуминовых и фульвовых кислот. Гуминовые кислоты (ГК) торфа - высокомолекулярные азотсодержащие соединения циклического строения, представляющие собой смесь темноокрашенных органических, высокомолекулярных, в основном ароматических, метоксисодержащих, гидрокси- и оксокарбоновых кислот, объединенных общим типом строения, но имеющих некоторые различия, определяемые их происхождением [1].
Вещества гуминовой природы давно и широко применяются во многих отраслях деятельности человека: в промышленности при нефте- и газодобыче, для ремедиации территорий, загрязненных отходами производства, в сельском хозяйстве в качестве ветеринарных препаратов [2] и компонентов органоминеральных удобрений [3].
При изучении фармакологических свойств ГК получены весомые результаты, подтверждающие как их противоопухолевые, гепатопротекторные, ранозаживляющие свойства, так и предполагаемые механизмы действия [4, 5, 6, 7].
Гуминовые и фульвовые кислоты используются для повышения сопротивляемости организма человека действию различных неблагоприятных факторов, в том числе, в качестве вспомогательной терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов [8]. Показано, что ГК различной этиологии и разных физико-химических характеристик обладают широким спектром плейотропных иммунологических эффектов - оказывают влияние на поляризацию иммунокомпетентных клеток по классическому или альтернативному пути за счет селективной секреции про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-α и ИФН-γ) [9, 10], обладают противовирусной активностью против вирусов герпеса 1 и 2 типов (HSV1, HSV2), респираторного и цитомегаловируса человека (HCMV, RSV) in vitro [11] и иммунокоррегирующими свойствами на фоне антибактериальной терапии рядом антибиотиков (ампициллин, амикацин, доксициклин, рифампицин, рифамицин), а также способствует значительной локализации воспаления и усилению сосудообразания при ксенотрансплантации [12]. Гуминовые вещества подавляют реакцию гиперчувствительности замедленного типа, реакцию трансплантат против хозяина, снижают контактную гиперчувствительность и отек лапы крыс, уровень С-реактивного белка у пациентов, страдающих остеоартрозом, сенной лихорадкой, а также обладают кардиозащитными и проангиогенными свойствами [13]. При этом ГК не проявляют токсических эффектов в широкой линейке доз у экспериментальных животных при пероральном или накожном применении, а гумат калия безопасен для человека в суточной дозе до 1 г/кг [13, 14].
+
Известно, что эффективный иммунный ответ зависит от координированного функционирования различных клеток врожденного и/или адаптивного иммунитета, в котором Т-хелперы (CD4) занимают особенное место [15]. Представление о существовании двух подклассов лимфоцитов CD4 с реципрокными функциями и различным набором секретируемых цитокинов - Т-хелперов 1-го типа (Тh1) и Т-хелперов 2-го типа (Th2) - сформировалось в середине 80-х годов прошлого века [16]. Т-хелперы 1-го и 2-го типов различаются спектром продуцируемых ими цитокинов. Так, Тh1 продуцируют интерферон гамма (ИФН-γ), являющийся маркером этой субпопуляции Т-хелперных клеток, а также интерлейкин 2 (ИЛ-2), фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α). Напротив, Th2 вырабатывают ИЛ-4 (маркер Th2 субпопуляции), ИЛ-5, ИЛ-10 и ИЛ-13. Клетки Тh1 играют важную роль в развитии реакций клеточного иммунитета, направленных против вирусных и внутриклеточных патогенов, а также участвуют в реакциях гиперчувствительности замедленного типа. Клетки Th2 обеспечивают реакции гуморального иммунитета, поддерживая пролиферацию и дифференцировку IB-лимфоцитов, элиминацию внеклеточных патогенов, участвуют в развитии аллергических реакций немедленного типа и защищают организм от глистных инвазий [17]. Чрезмерные воспалительные реакции, вызванные активацией Тh1, могут привести к неконтролируемому повреждению тканей, поэтому необходим механизм противодействия этому. Таким образом, вещества способные подавлять чрезмерную активацию ТЫ и регулировать баланс ТЫ (ИФН-γ и ИЛ-2) и Th2 (ИЛ-4 и ИЛ-10) опосредованных цитокинов, представляют значительный интерес в качестве иммуномодулирующих средств для восстановления иммунного гомеостаза организма при различных патологиях, связанных с недостаточностью Тh2-зависимого иммунного ответа (хронические инфекционные заболевания, вызванные внеклеточными бактериями и паразитами).
Задачей данного изобретения является расширение арсенала иммуномодулирующих средств природного происхождения, обладающих низкой токсичностью и способностью избирательной стимуляции продукции цитокинов Тh2-типа - ИЛ-4 и ИЛ-10 и подавлению выработки цитокинов Тh1-типа - ИФН-γ и ИЛ-2.
Поставленная задача решается путем применения водорастворимых гуминовых кислот, выделенных раствором натрий пирофосфата из верхового сфагново-мочажинного торфа, отобранного с глубины 20-70 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара, со среднечисленной молекулярной массой 8916,6 Да, среднемассовой молекулярной массой 32652,1 Да, полидисперсностью 5,7 и медианой 16453,9 Да, в качестве средства, обладающего иммуномодулирующим действием.
Вышеупомянутые водорастворимые гуминовые кислоты обладают высокой избирательной способностью стимулировать секрецию ИЛ-4, ИЛ-10 и подавлять выработку ИФН-γ и ИЛ-2, для коррекции нарушений системы иммунитета при патологических состояниях, требующих активации Тh2-зависимого типа иммунного ответа, т.е. хронические инфекционные заболевания, вызванные внеклеточными бактериями и паразитами.
Принципиально новое в предлагаемом авторами изобретении использование для эффективной иммуномодуляции водорастворимых гуминовых кислот, выделенных из верхового сфагново-мочажинного торфа, отобранного с глубины 20-70 см с грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара, было обнаружено в результате экспериментальных исследований и для специалиста явным образом не вытекает из уровня техники, и описание этого свойства не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Представительный средний образец торфа, максимально отражающий неоднородность химического состава всей партии анализируемого материала, отбирали буром ТБГ-1 в генетическом центре гряды грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара Бакчарского района Томской области, из середины однородного по ботаническому составу горизонта с глубины 20-70 см, в летний период (июнь-август) согласно ГОСТ 17644-83 «Торф. Методы отбора проб из залежи и обработки их для лабораторных испытаний». В скважине с указанной глубины каждую пробу (массой не менее 600 г, количество скважин - не менее 50) отбирали только один раз, средняя масса образца торфа составляла более 30 кг (таблица 1).
4
2
7
Полученный образец торфа высушивали при комнатной температуре на воздухе в хорошо проветриваемом помещении, периодически перемешивая, до воздушно-сухого состояния (влажность 15-20%), измельчали в роторно-ножевой мельнице и просеивали через сито с диаметром отверстий 1-3 мм, обрабатывали 0,1 моль/л раствором натрий пирофосфата (NаРО;) в массовом соотношении 1:100 в течение 8 часов при постоянном перемешивании в реакторе Р-100 при температуре 25-27°С, отделяли жидкую фазу
(экстракт гуминовых кислот) от осадка (остатка торфа) фильтрованием при помощи системы вакуумной фильтрации (нутч-фильтр), далее для осаждения гуминовых кислот из экстракта жидкую фазу обрабатывали 10% раствором водород хлорида до рН 1-2, выделившиеся гуминовые кислоты (ГК) разделяли центрифугированием, отмывали холодной водой очищенной на воронке Бюхнера до рН 7 и высушивали при комнатной температуре. Содержание ГК в торфе определяли гравиметрически (таблица 2).
-1
Все образцы представляли собой мелкодисперсный порошок темно-коричневого цвета, растворимый в водной среде. Исследование физико-химических параметров структуры ГК проводили методами: инфракрасной (ИК) и ультрафиолетовой (УФ) спектроскопии. Регистрацию ИК-спектров ГК проводили на ИК - Фурье - спектрометре ФСМ 1201 (ООО «Инфраспек», г. Санкт-Петербург) по методу прессования с КВr в соотношении 1:100 соответственно, в интервале значений частоты от 500 до 4000 см. Регистрацию электронных спектров поглощения 0,001% водных растворов ГК проводили на УФ-спектрофотометре Unico 2800 (производство США) в диапазоне длин волн 190-700 нм в кварцевой кювете толщиной 1 см (таблица 3).
Анализ ИК-спектральных характеристик свидетельствует о том, что ГК-1 торфа характеризуются преобладанием ароматических структур над алкильными.
Полученные вышеописанным способом гуминовые кислоты были охарактеризованы по физико-химическим параметрам: элементному составу и молекулярному весу.
1. Элементный состав ГК определяли методом сожжения на C,H,N - анализаторе «Carlo Erba Strumentazione» модель 1106, содержание кислорода определяли по разности (таблица 4).
3
3
w
R
2. Молекулярную массу (таблица 5) определяли методом гель-проникающей хроматографии на приборе Ultimate 3000 (Thermo Scientific, США) с использованием колонки Ultrahydrogel 250, 300×7,8 мм, подвижная фаза - 0,1 М NaNO, 0,01% NaN в воде, скорость потока 1 мл/мин. Детектирование спектрофотометрическое при длине волны 200 нм. Расчет молекулярной массы проводили по калибровочному графику log M=f (t) построенному по стандартам PSS (polystyrene sulfonate) 891 - 976 000 Da (Polymer Standarts Service Service GmbH, Германия).
Иммуномодулирующие свойства гуминовых кислот изучали на линейных мышах C57BL/6 и аутбредных мышах CDI, в качестве источника тучных клеток использовали аутбредных крыс SD [18]. Животные (самцы/самки) в возрасте 8-10 недель были получены из отдела экспериментальных биологических моделей НИИФиРМ им. Е.Д.
Гольдберга Томского НИМЦ. Все процедуры (содержание, введение исследуемых веществ, умерщвление) были проведены в соответствии с ГОСТ 33215-2014 «Правила оборудования помещений и организация процедур при работе с лабораторными животными».
6
2
Мононуклеары (Мн) выделяли из периферической крови здоровых доноров, наслаивая гепаринизированную кровь (10 ЕД/мл) на жидкость для сепарации клеток «Histopaque-1077» («Sigma-Aldrich», США) с плотностью 1,077 мг/мл, центрифугируя 15 минут при 400 g, собирая клетки, сформировавшие кольцо на градиенте плотности. Далее Мн ресуспендировали в полной культуральной среде (ПКС), состоящей из RPMI-1640 («Sigma», США), 10% ЭТС («Нускопе», США), 20 мМ HEPES («Sigma», США), 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола («Sigma», США), 50 мкг/мл гентамицин («Sigma», США), 2 мМ L-глютамин («Sigma», США), оценивали жизнеспособность в тесте с 0,1% трипановым синим (использовали клеточные суспензии с жизнеспособностью не менее 95%). Мононуклеары (2,5-3,0×10 клеток/мл) инкубировали в 96-луночных планшетах при 37°С в атмосфере с 5% СО и абсолютной влажности в присутствии ГК-1 (10 мкг/мл); 4 мкг/мл конканавалина А (Кон A, «Sigma», США) или 5 мкг/мл митогена лаконоса (МЛ, «Sigma», США). Через 24 ч от начала культивирования собирали из лунок надосадок и замеряли в нем концентрацию цитокинов твердофазным иммуноферментным методом на автоматическом анализаторе ChemWellCombo при помощи тест-систем согласно прилагаемым протоколам: цитокины человека ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-2 и ИФН-γ (АО «Вектор-Бест», Россия).
Показатели Тh1- и Тh2-иммунного ответа у мышей оценивали по окончании внутрибрюшинного введения ГК-1 в течение 10 дней в дозе 1 мг/кг/сут, в качестве препарата сравнения использовали ликопид (ЗАО «Пептек», Россия) - 2 мг/кг сут в 0,1 мл физиологического раствора (ФР), животным контрольной группы вводили аналогичный объем ФР.
Для изучения Тh1-зависимого типа иммунного ответа использовали: определение антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и титра специфических гемагглютининов в сыворотке крови, исследование гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) после иммунизации мышей эритроцитами барана.
8
Определение АОК в селезенке осуществляли методом Ерне [19]. Исследуемые вещества (ГК-1 и ликопид) вводили мышам 5 суток до иммунизации и 5 суток после. Животных на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана в дозе 1×10 клеток («ЭКОлаб», Россия) в объеме 0,2 мл ФР умерщвляли, селезенки извлекали, измельчали в стеклянном гомогенизаторе, клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным ФР, ресуспендировали в 4 мл среды 199 («Sigma», США), подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, нагретые до 50-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (0,7% агар («Difco», США) в среде 199 («Sigma», США), 0,2 мл 20%-ой взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента (ФГУП «НПО «Микроген», Россия). Смесью заполняли камеру Горяева и условиях 100%) влажности и 37°С инкубировали 2 ч, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа.
2
Определение титра антител в сыворотке крови осуществляли с помощью реакции гемагглютинации (РГА) [20]. Уровень гемагглютининов в сыворотке крови определяли по способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, агглютинировать антиген - эритроциты. Для этого сыворотку крови мышей, полученную на 5-е сутки после иммунизации, инактивировали 30 мин при 56°С, раститровывали в 96-луночном кругло донном планшете по 0,025 мл с шагом 1:2, добавляли 0,025 мл 1% суспензии эритроцитов барана, инкубировали при 37°С 2 часа и оценивали реакцию. За титр принимали последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдается агглютинация антигена. Титр выражали величиной logT.
7
8
При проведении реакции ГЗТ через 5 дней от начала введения ГК-1 животных иммунизировали внутрибрюшинной инъекцией эритроцитов барана (5×10) в 0,1 мл ФР. На 5-е сутки после иммунизации мышам проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10 эритроцитов барана в 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,05 мл ФР («контрольная лапа»). Через 24 часа животных забивали, обе лапы отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава, местную воспалительную реакцию оценивали по разнице массы опытной и контрольной лап.
Развитие Тh2-зависимого иммунного ответа моделировали у аутбредных мышей CDI трехкратным введением под кожу бедра 100 мкг овальбумина (OVA) и 5 мг гидроокиси алюминия (оба «Sigma», США) в качестве адъюванта в 0,1 мл ФР с интервалом 3 недели [21]. Введение ГК-1 в объеме 0,1 мл на фоне иммунизации OVA начинали проводить за 5 дней до каждого введения OVA и в течение 5 дней после второй иммунизации, всего 15 инъекций. Мышам контрольной группы вводили по 0,1 мл ФР.
2
Влияние курсового введения ГК-1 на антигензависимую непрямую дегрануляцию интактных тучных клеток (НДТК) исследовали, выделяя тучные клетки из брюшной полости аутбредных крыс-самцов стока SD [22]. Для получения тучных клеток крыс животных подвергали эвтаназии кровопусканием после СО-камеры, вводили внутрибрюшинно 5-8 мл подогретого до 37°С раствора Тироде без глюкозы, после легкого массажа брюшной стенки в течение 1-1,5 мин делали ножницами разрез по средней линии и собирали экссудат в силиконизированную пробирку. Препараты готовили на обезжиренных предметных стеклах, окрашенных 0,3% спиртовым раствором нейтрального красного и высушенных при комнатной температуре. Смешивали 0,03 мл взвеси тучных клеток, 0,03 мл сыворотки аутбредных мышей CDI, иммунизированных овальбумином (OVA) и получивших курсом ГК-1, и 0,03 мл раствора OVA (дозу препарата подбирали заранее, так чтобы показатель дегрануляции тучных клеток при инкубации с исследуемым веществом не превышал 5%). Далее препараты покрывали покровными стеклами, затем инкубировали 15 мин в термостате при 37°С. Препараты микроскопировали под увеличением х 20.
Оценку результатов проводили дифференциальным способом учета, подсчитывали показатель дегрануляции тучных клеток (ПДТК) по формуле:
где а, b, с, d - количество дегранулированных клеток соответственно степени дегрануляции (слабо выраженной, умеренной, резкой и степени полностью дегранулированных клеток).
Экспериментальные данные обрабатывали с помощью пакета статистических программ Statistica 8,0, проверяя нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка, вычисляя для каждой выборки среднее арифметическое (X), ошибку среднего арифметического (m), среднее арифметическое отклонение (σ). Сравнение выборочных средних осуществляли по критерию Даннета для сравнения нескольких экспериментальных выборок с одной контрольной.
Пример 1
Курсовое введение ГК-1, выделенных из верхового сфагново-мочажинного торфа, отобранного с глубины 20-70 см грядово-мочажинного комплекса торфа олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара Бакчарского района Томской области, мышам линии C57/BL6 на фоне развития Th1-зависимого иммунного ответа, индуцированного введением эритроцитов барана, приводило к подавлению маркерной реакции клеточного Тh1 иммунного ответа - реакции ГЗТ (таблица 6). Величина отека при применении ГК-1 достоверно снижалась относительно контроля и группы мышей с применением ликопида (в 2 и 1,8 раза соответственно).
Влияние гуминовых кислот на гуморальное звено Тh1-зависимого иммунного ответа оценивали по количеству АОК и РГА. Выявлено, что курсовое введение ГК-1, выделенных из верхового сфагново-мочажинного торфа, отобранного с глубины 20-70 см грядово-мочажинного комплекса торфа олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара Бакчарского района Томской области, приводило к статистически значимому снижению числа АОК как по сравнению с показателем в контрольной группе мышей (в 3,7 раза), так
и со значением в группе животных, получавших ликопид (в 8 раз). При этом титр гемагглютининов достоверно снижался у мышей, получавших гуминовые кислоты, относительно показателей контроля и группы препарата сравнения (таблица 6).
Пример 2
Изучали влияние ГК-1, выделенные из верхового сфагново-мочажинного торфа, отобранного с глубины 20-70 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара Бакчарского района Томской области, на показатели Тh2-типа иммунного ответа при проведении анафилактического шока и непрямой дегрануляции тучных клеток мышей CDI, иммунизированных овальбумином. Было показано, что курсовое введение гуминовых кислот (ГК-1) снижало проявления анафилактического шока у мышей, но лишь на 10%, также как и препарат сравнения ликопид (таблица 7).
При изучении влияния курсового введения гуминовых кислот (ГК-1) на непрямую дегрануляцию тучных клеток аутбредных крыс SD при добавлении к ним сыворотки мышей CDI, иммунизированных овальбумином, было показано, что применение исследуемых ГК-1 достоверно снижало дегрануляцию по сравнению с показателями контроля и группы сравнения с использованием ликопида (таблица 8).
Это свидетельствует о том, что исследуемые гуминовые кислоты обладают мембраностабилизирующим действием в отношении тучных клеток, тем самым снижая проявления аллергических реакций.
Пример 3
Инкубация мононуклеаров периферической крови здоровых доноров с гуминовыми кислотами (ГК-1) снижала конканавалин А-стимулированную продукцию основных для поляризации Тh1-типа иммунного ответа цитокинов - ИЛ-2 (в 1,2 раза) и ИФН-γ (в 1,4 раза) относительно показателей контроля, причем в случае ИФН-γ это уменьшение было статистически значимо (таблица 9).
Добавление гуминовых кислот к митоген-активированным мононуклеарным клеткам (модель воспаления in vitro) выявило достоверное увеличение продукции Th2- цитокинов - ИЛ-4 (в 2 раза) и ИЛ-10 (в 1,5 раза) относительно соответствующих показателей группы стимулированного контроля (таблица 10).
Таким образом, экспериментально установлено, что гуминовые кислоты, выделенные из верхового сфагново-мочажинного торфа, отобранного с глубины 20-70 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара Бакчарского района Томской области, со среднечисленной молекулярной массой 8916,6 Да, среднемассовой молекулярной массой 32652,1 Да, полидисперсностью 5,7 и медианой 16453,9 Да, при прямом воздействии снижают продукцию основных цитокинов Тh1-типа иммунного ответа - ИЛ-2 и ИФН-γ и повышают выработку цитокинов Тh2-типа - ИЛ-4 и ИЛ-10 мононуклеарами периферической крови здоровых доноров. Курсовое введение мышам гуминовых кислот, выделенных из верхового сфагново-мочажинного торфа, отобранного с глубины 20-70 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара Бакчарского района Томской области, снижает показатели Тh1-типа иммунного ответа: уменьшение числа антителообразующих клеток в селезенке и титра антител в сыворотке крови в реакции гемагтлютинации, а также снижение реакции гиперчувствительности замедленного типа, характеризующий клеточный тип иммунного ответа. При этом курсовое использование гуминовых кислот (ГК-1) у животных приводит к снижению анафилактического шока и уменьшению дегрануляции тучных клеток после иммунизации мышей овальбумином. Это свидетельствует о том, что гуминовые кислоты (ГК-1) хотя и стимулируют выработку цитокинов Тh2-типа, но не приводят к усилению аллергических реакций. Полученные данные указывают на то, что гуминовые кислоты, выделенные из верхового сфагново-мочажинного торфа, отобранного с глубины 20-70 см грядово-мочажинного комплекса олиготрофного болота Бакчарского болотного массива юго-восточных отрогов Васюганского болота в междуречье Иксы и Бакчара Бакчарского района Томской области, обладают способностью регулировать баланс провоспалительных (ИЛ-2 и ИФН-γ) и противовоспалительных (ИЛ-4 и ИЛ-10) цитокинов и представляют значительный интерес в качестве основы для создания фармакологических регуляторов для восстановления иммунного гомеостаза организма при различных патологиях, связанных с недостаточностью Тh2-зависимого иммунного ответа (хронические инфекционные заболевания, вызванные внеклеточными бактериями и паразитами).
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания
1. Кухаренко, Т.А. Об определении понятия и классификации гуминовых кислот / Т.А. Кухаренко //Химия твердого топлива. - 1979. - №5. - С. 3-11.
2. van Rensburg, C.J. In vitro and in vivo assessment of humic acid as an aflatoxin binder in broiler chickens / C.J. van Rensburg [et al.] // Poultry Science - 2006. - Vol. 85. - Is. 9. - P. 1576-1583.
3. Хричтева, Л.А. Роль гуминовой кислоты в питании высших растений и гуминовые удобрения / Л.А. Хричтева // Труды почвенного института им. В.В. Докучаева, М.: 1951.-Т. 38. - 314 с.
4. Бузлама, А.В. Анализ фармакологических свойств, механизмов действия и перспектив применения гуминовых веществ в медицине / А.В. Бузлама, Ю.Н. Чернов // Экспер. и клин, фармакол. - 2010. - Т. 73. - №9. - С. 43-48.
5. Белоусов, М.В. Исследование гепатозащитных свойств нативных гуминовых кислот низинного торфа Томской области / М.В. Белоусов [и др.] // Хим.-фарм. журн. -2014. - Т. 48. - №4. - С. 28-31.
6. Vetvicka, V. Prophylactic effects of humic acid-glucan combination against experimental liver injury / V. Vetvicka, J.M. Garcia-Mina, J.C. Yvin // Journal of Intercultural Ethnopharmacology. - 2015. -V. 4. - Is. 3. - P. 249-255.
7. Vetvicka, V. The relative abundance of oxygen alkyl-related groups in aliphatic domains is involved in the main pharmacological-pleiotropic effects of humic acids / V. Vetvicka [et al.] // Journal of Medicinal Food. - 2013. -V. 16. - Is.7. - P. - 625-632.
8. Joone, G.K. Investigation of the immunostimulatory properties of oxihumate / G.K. Joone, J. Dekker, C.E.van Rensburg // Z. Naturforsch. C. J. Biosci. - 2003. - Vol.58. - №3-4. -P. 263-267.
9. Inglot, A.D. A. A method to assess the immunomodulating effects of the Tolpa Torf Preparation (TTP) by measuring the hyporeactivity to interferon induction and tumor necrosis factor response / A.D. Inglot, J. Zielinska-Jenczylik, A.Sypula // Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. - 1993. -V. 41. - Is. 1. - P. - 87-93.
10. van Rensburg, C.E. Potassium humate inhibits complement activation and the production of inflammatory cytokines in vitro / C.E. van Rensburg, P.J. Naude // Inflammation. -2009. -Vol. 32. - Is.4. - P. - 270-276.
11. Cagno, V. In vitro evaluation of the antiviral properties of Shilajit and investigation of its mechanisms of action / V. Cagno [et al.] // Journal of Ethnopharmacology. - 2015. - Vol. 166. - P. 129-134.
12. Radomska-Lesniewska, D.M. Angiomodulatory properties of some antibiotics and Tolpa Peat Preparation / D.M. Radomska-Lesniewska, [et al.] // Central-European Journal of Immunology. - 2016. -V. 41. - Is. l. - P. - 19-24.
13. van Rensburg C.E. The Antiinflammatory Properties of Humic Substances: A Mini Review / C.E. van Rensburg // Phytother. Res. - 2015. - V. 29. - Is. 6. - P. 791-795.
14. van Rensburg, C.E. Topical application of oxifulvic acid suppresses the cutaneous immune response in mice / C.E. J. Van Rensburg, S. C.K. Malfeld, J. Dekker // Chemotherapy. -2002.-V. 48. - P. 138-143.
+
15. Luckheeram, R.V. CD4T cells: differentiation and functions / R.V. Luckheeram, [et al.] // Clin. Dev. Immunol. - 2012. - Vol. 2012. - P. 925135.
16. Mosmann, T.R. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins / T.R. Mosmann, [et al.] // J. Immunol. -1986. - Vol.136. - P. 2348-2357.
17. Anthony, R.M. Protective immune mechanisms in helminth infection / R.M. Anthony, [et al] // Nat. Rev. Immunol. - 2007. - Vol.7. - №12. - P. 975-987.
18. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. 4.1. - М.: Гриф и К. 2013. - 944 с.
19. Ierne, N.K. Plaque formation in agar by single antibody production cells / N.K. Ierne, A.A. Nordin // Science. - 1963. - Vol.140. - №3565. - P. 405-408.
20. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. - М., Медицина, 1987. - 472 с.
21. Вельская, Н.В. Моделирование системной анафилаксии на мышах линии BALb/c / Н.В. Вельская, [и др.] // БИОМЕДИЦИНА. - 2010. - Т. 1. - №1. - С. 37-50.
22. Радунская, С.Ф. Тест непрямой дегрануляции тучных клеток крыс для оценки специфической активности неинфекционных аллергенов: Дисс. … канд. мед. наук. - М., 1982.-С. 54-59.