СТРУКТУРНО-ФАЗОВОЕ СОСТОЯНИЕ ПОВЕРХНОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ СОВМЕСТИМОСТЬ NiTi СПЛАВОВ

Известия Коми научного центра УрО РАН Выпуск 2. Сыктывкар, 2010.

ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 669.24: 611.17

СТРУКТУРНО-ФАЗОВОЕ СОСТОЯНИЕ ПОВЕРХНОСТИ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ СОВМЕСТИМОСТЬ NiTi СПЛАВОВ

А.Н. ДАНИЛОВ, И.Н.АНДРОНОВ

Ухтинский государственный технический университет, г.Ухта anatoly danilov@mail.ru, iandronov@ugtu.net

В статье представлены результаты экспериментального изучения влияния структуры и фазового состава сплавов NiTi на адсорбционные и каталитические свойства поверхности, определяющие, наряду с механическими напряжениями, биологическую совместимость материалов. Показано, что изменения этих свойств влияют на физическое состояние формирующегося на поверхности материала внеклеточного матрикса, которое оценивали по количеству фокальных контактов остеобластов. На основе анализа полученных экспериментальных данных сделан вывод о возможности целенаправленного управления биологической совместимостью исследованных сплавов и даны рекомендации по выбору характеристик поверхности для контроля ее структурно-фазового состояния.

Ключевые слова: NiTi, адсорбционные и каталитические свойства, внеклеточный матрикс

A.N.DANILOV, I.N.ANDRONOV. STRUCTURAL-PHASE CONDITION OF A SURFACE AND BIOCOMPATIBILITY OF NITI ALLOYS

Results of experimental research of the effect of structure and phase composition of NiTi alloys on adsorption and catalytic properties of a surface, determining along with mechanical stress, biocompatibility of materials, are given. It is shown that changes in these properties are accompanied by change in physical state of extracellular matrix formed on the surface of material that was estimated by quantity of osteoblasts focal contacts. On the basis of the experimental data the conclusion on the possibility of purposeful management by biocompati-bility of the alloys studied is made and recommendations for surface characteristics sufficient for structural and phase state control are given.

Key words: NiTi, adsorption and catalytic properties, extracellular matrix

Введение

Многочисленные примеры применения в медицине сплавов с эффектом памяти формы [2,10] показывают, что их эффективность при оперативном лечении различных заболеваний зависит не только от химического состава и геометрических параметров изготовленных из них конструкций, но и от правильности выбора физического состояния поверхности, влияющего на эволюцию взаимодействующих с ней различных по своей биологической природе клеток и тканей. При огромном объеме накопленных знаний о механическом поведении данных сплавов умение целенаправленно управлять свойствами поверхности становится определяющим фактором их дальнейшего широкого применения. Однако, как показывает анализ литературы, поиски оптимальных состояний поверхности этих материалов для решения медицинских задач, в основном, проводятся методом проб и ошибок. Одной из главных причин этого является отсутствие

необходимого объема знаний о структуре поверхности и о закономерностях ее влияния на свойства, непосредственно определяющие механизмы ее взаимодействия с окружающей биологической средой. Учитывая сложность и многоступенчатость такого взаимодействия, изучение этих закономерностей представляется важным, но лишь начальным этапом в решении проблемы управления биологической совместимостью данных материалов.

Главным событием в эволюции клетки, вступающей во взаимодействие с поверхностью материала, является ее соединение с внеклеточным матриксом, который представляет собой прослойку протеинов, непосредственно соприкасающихся с поверхностью материала. Процесс присоединения клеток к внеклеточному матриксу сопровождается образованием между ними специфических соединительных комплексов. Эти комплексы являются местами физического контакта клеток с внешними поверхностями. Они ответственны за миграцию клеток и образование тканей, а также за активацию

процессов передачи сигнальной информации. Посредниками в создании соединительных комплексов между клеткой и матриксом выступают интег-рины - трансмембранные рецепторы компонентов внеклеточного матрикса. Разновидность связи, образуемой интегринами, и специфический тип интег-ринов, участвующих в соединении, определяются физическим состоянием внеклеточного матрикса [7]. Учитывая определяющее влияние структуры и молекулярного состава этих комплексов на процессы роста, миграции и дифференциации клеток, следует отметить, что умение целенаправленно управлять физическим состоянием внеклеточного матрикса с помощью структурно-фазовых превращений на поверхности материала является ключевым в решении проблемы управления биологической совместимостью.

Формирование физического состояния внеклеточного матрикса происходит в результате взаимодействия составляющих его протеинов с поверхностью материала. Важная роль в этом взаимодействии принадлежит адсорбционным и каталитическим свойствам поверхности, поскольку ими определяются химический состав и тип образуемой с адсорбированными молекулами связи [1]. В результате из немногих попыток изучить влияние состояния поверхности на адсорбционную способность NiTi сплавов [5] было показано, что изменения в структуре основного металла и поверхностного окисла, происходящие при термической обработке металла, вызывают заметные изменения в величине силы адгезии питательной среды, используемой в экспериментах in vitro. Несмотря на признание важной роли свойств поверхности в биологической совместимости материалов, закономерности влияния структурно-фазового состояния на адсорбционную способность и каталитическую активность поверхности NiTi сплавов до сих пор практически не изучены, как не исследовано влияние этих свойств на физическое состояние внеклеточного матрикса.

Цель представленной работы - изучение влияния структуры и фазового состава поверхности на адсорбционные и каталитические свойства этих материалов, а также на физическое состояние формирующегося на них внеклеточного матрикса.

1. Материалы и экспериментальные методы

Подробное описание материалов, экспериментальных методов и используемого оборудования для определения различных характеристик дано в работах [4-6]. Здесь остановимся лишь на подходе к оценке состояния и свойств поверхности материала и внеклеточного матрикса, использованном в данной работе.

1.1. Структурно-фазовое состояние поверхности материала и физическое состояние внеклеточного матрикса

Для характеристики структурно-фазового состояния поверхности использовали структурные напряжения (напряжения II рода) и работу выхода электронов (РВЭ). Выбор этих характеристик обусловлен необходимостью контролировать как состояние основного металла (структурные напряжения), так и состояние окисной пленки, которая яв-

ляется полупроводником (РВЭ). Об изменениях физического состояния внеклеточного матрикса судили по изменению числа соединительных комплексов (фокальных контактов), образуемых остеобластами с матриксом. Подсчет числа фокальных контактов производили с использованием анализатора цифровых изображений на одинаковой для всех образцов площади, ограниченной рамкой 146.2x146.2 мкм2. Однократное окрашивание, использованное в исследовании, позволяло получать информацию о содержании в структуре фокального контакта только одного из протеинов (в нашем случае паксил-лина), входящих в состав внеклеточного матрикса.

1.2. Адсорбционные и каталитические свойства поверхности

Об изменениях адсорбционной способности судили по изменению силы адгезии, развиваемой поверхностью по отношению к альбумину. Величину силы адгезии, развиваемой поверхностью исследованных сплавов относительно альбумина, определяли по углу наклона, при котором помещенная на образец капля альбумина объемом в 20 мкл начинала скатываться по наклонной плоскости [5]. Изучение каталитических свойств NiTi сплавов нами проводилось впервые. Образование на их поверхности окислов, близких по составу к соединению TiO2, и хорошо известные по реакции окисления этанола фотокаталитические свойства этого соединения [8], обусловили выбор той же реакции для оценки каталитических свойств поверхности исследуемых сплавов. В отсутствии оригинальных методик по определению количественных характеристик каталитических свойств сплавов NiTi в качестве показателя их изменений была выбрана температура кипения продуктов реакции окисления этанола, состав которых зависит от пути развития этой реакции или ее скорости. Эксперименты по определению температур кипения промежуточных продуктов разложения проводили в дифференциальном сканирующем калориметре DSC 822е фирмы Mettler. Для предотвращения испарения образцы с нанесенными на их поверхность каплями абсолютного этанола объемом 10 мкл, плотно запечатывались в алюминиевые контейнеры и нагревались со скоростью 10 град/мин до температуры 423K. Учет влияния стенок контейнера проводили с использованием термограмм продуктов окисления этанола в алюминиевом контейнере без NiTi сплава.

2. Результаты

2.1. Структурные напряжения и фокальные контакты

На рисунке представлены изображения остеобластов на шлифованной поверхности сплавов никель-титан в мартенситном (а) и аустенитном (б) состояниях и на аустенитных образцах после окисления при температурах 723K (в) и 873K (г). Количественная обработка изображений остеобластов, высаженных на эти образцы, дала следующие результаты. Среднее число фокальных контактов на площади, указанной в разделе 1.1, составило: на шлифованном мартенситном образце - 300 + 124, на шлифованном аустенитном образце - 744 + 178, на окисленном при 723K - 438 + 145 и на окисленном

а б в г

Рис. Остеобласты на шлифованной поверхности мартенсита (а), аустенита (б) и на поверхности, окисленной на воздухе при 723K (в) и 873K (г) (х3.3103).

при 873К - 270 + 85 контактов. Сопоставление изображений на рисунке показывает также, что изменение состояния поверхности сопровождалось изменениями размеров и формы самих фокальных контактов.

Определение средних величин механических напряжений тех же образцов методом рентгенографии дало следующие результаты. Средняя величина структурных напряжений на шлифованном мартенситном образце составила 132 + 8 МПа, на аустенитном образце - 263 + 14 МПа, на образце, окисленном при 723К, - 120 + 9 МПа и на образце, окисленном при 873К, - 85 + 7 МПа.

2.2. Работа выхода электронов, сила адгезии и температуры кипения продуктов разложения этанола

Результаты экспериментального определения работы выхода электронов, силы адгезии, развиваемой поверхностью по отношению к альбумину и температуры кипения промежуточных продуктов разложения этанола, после различных обработок поверхности аустенитных образцов, представлены в таблице. Важным для дальнейшего обсуждения результатов проведенных исследований является то, что определение этих характеристик, так же как и определение средних величин структурных напряжений и изучение поведения остеобластов (разд.2.1) проводили на идентичных аустенитных образцах того же сплава после их совместной обработки. Идентификация промежуточных продуктов разложения этанола по полученным температурам кипения дала следующие результаты. Продукты с температурами кипения 359 К и 377 К, образующиеся при разложении этанола на шлифованной поверхности, были идентифицированы нами как хемиацеталь и ацеталь (1,1-диэтоксиэтан) соответственно. Продукты с температурами кипения 391 К и 394.5 К, образующиеся на поверхности после окисления при температуре 723 К, были соответственно идентифицированы как уксусная кислота и 1,2 - диэтоксиэтан. Продукт с температурой 387 К не был идентифицирован. Это мог быть некий промежуточный продукт, сосуществующий с уксусной кислотой и 1,2 - диэтоксиэтаном, по аналогии сосуществования с ацеталем хемиацеталя, который является промежуточным продуктом при образовании ацеталя. Продуктами, образующимися на поверхности после окисления при 873 К, были согласно нашей идентификации уксусная кислота (391 К) и 1,2 - диэтоксиэтан (394.5 К). При этом соотношение площадей эндотермических пиков, соответствовавших температурам кипения уксусной кислоты и 1,2 - диэтоксиэтана для

образцов, окисленных при 723 К и 873 К, было различным, что означало разное соотношение количеств этих продуктов на сравниваемых образцах. Для образцов, окисленных при 723 К, это соотношение составляло около 0.16, а для образцов, окисленных при 873 К - 2.94, что свидетельствует о различных скоростях реакций разложения этанола на этих образцах при их принципиальной схожести. Образование абсолютно других промежуточных продуктов разложения этанола на шлифованном образце позволяет предположить либо другой, чем на окисленных образцах, путь развития реакции, либо ее очень низкую скорость. Последнее предположение основано на том, что наблюдавшееся ранее образование 1,1-диэтоксиэтана в качестве промежуточного продукта при фотокалитической реакции окисления этанола связывали с реакцией между этанолом и ацетальде-гидом, который является продуктом первой стадии окисления этанола [8].

3. Обсуждение результатов

Анализ полученных экспериментальных результатов показывает, что структурно-фазовые изменения, протекающие при механической и термической обработке сплавов находят отражение в двух интегральных характеристиках поверхности -механических напряжениях кристаллической решетки и РВЭ. На образцах одного и того же сплава (аустенитных) вне зависимости от различий в структуре поверхностного окисла, образующегося после механической шлифовки и после термического окисления, зависимость числа фокальных контактов от средней величины структурных механических напряжений имела практически линейный характер. Подобная зависимость наблюдалась ранее при изучении влияния механических напряжений на число фокальных контактов остеобластов на образцах, подвергнутых только шлифовке разным абразивом [5,6]. По-видимому, это объясняется наличием механического баланса между основным металлом, поверхностной окисной пленкой и внеклеточным матриксом, вследствие которого устанавливается равенство действующих в них упругих напряжений. При этом имеющие место изменения химического состава в тонких слоях поверхности не способны оказывать заметного влияния на напряженное состояние основного металла. При последовательных обработках, обычно используемых для выявления тех или иных закономерностей, не происходит скачкообразного изменения структуры основного металла, а значит, не происходит скачкообразного

изменения связанных с ней напряжении решетки. Это проясняет механизм передачи механических напряжений от основного металла к внеклеточному матриксу и объясняет наблюдаемую зависимость числа фокальных контактов от их величины.

Однако влияние физического состояния внеклеточного матрикса на фокальные контакты отражается не только на их числе. Как было показано в работе [7], изменения в физическом состоянии внеклеточного матрикса влияют на распределение протеинов в структуре фокальных контактов. При использовании окрашивания только одним видом антител перераспределение выявляемого с их помощью протеина может приводить к изменению размера и формы контактов на изображении. В связи с этим отмеченные в разделе 2.1 изменения размера и формы контактов могли быть обусловлены различиями в распределении паксиллина, что также указывает на изменения физического состояния внеклеточного матрикса.

Анализируя результаты (см. таблицу), следует отметить скачкообразный характер изменения величины РВЭ и силы адгезии при переходе от шлифованных образцов к образцам окисленным, что указывает на существенные изменения химического состава и структуры поверхностного окисла. Однако это же свидетельствует и о наличии тесной связи между РВЭ и адсорбционными свойствами [9]. Наличие такой же связи между РВЭ и каталитическими

и выделение вклада структурных напряжений в формирование физического состояния матрикса, представляется невозможным из-за принципиальной невозможности разделения определяющих их структурных и фазовых превращений. Это подтверждается и результатами проведенных исследований. Ранее было показано [5], что окисление образцов на воздухе сопровождается изменением как величины РВЭ, так и средней величины структурных напряжений. Однако установленная связь адсорбционных и каталитических свойств с величиной РВЭ позволяет использовать последнюю характеристику для контроля определяемого ими состояния поверхности при целенаправленном регулировании биологической совместимости сплавов. Теоретически величина РВЭ представляется более универсальной характеристикой структурно-фазового состояния поверхности по сравнению со структурными механическими напряжениями, поскольку чувствительна не только к изменениям деформации кристаллической решетки, но и к изменению химического состава поверхностных фаз. Поэтому ее использование для контроля состояния поверхности выглядит предпочтительным. Однако необходимость, в ряде случаев, определять характер действующих в матриксе напряжений (растягивающие или сжимающие) [3] делает механические напряжения таким же необходимым, как и РВЭ, инструментом контроля структурно-фазового состояния поверхности этих материалов.

Работа выхода электронов (РВЭ), сила адгезии (F), развиваемая поверхностью относительно альбумина, и температура кипения (T) промежуточных продуктов разложения этанола на поверхности NiTi сплава после различных обработок

Заключение

Обработка

РВЭ, еУ

F10'ч, N

Т, К

Шлифованный

Окисление при 623 К Окисление при 723 К

Окисление при 873 К

3.98 + 0.02

4.68 + 0.03 4.51 + 0.01

4.40 + 0.02

1.13 + 0.03

0.88 + 0.03 0.74 + 0.02

0.58 + 0.02

359.0 377.0

387.0 391.0 394.5 391.0 394.5

свойствами не получило количественного выражения в проведенных исследованиях. Однако образование принципиально разных продуктов при разложении этанола на шлифованном образце по сравнению с окисленными образцами указывает на такое же скачкообразное изменение и каталитических свойств. Наличие каталитических свойств у сплавов и их зависимость от структурно-фазового состояния поверхности, впервые продемонстрированные проведенными исследованиями, расширяют представления о возможных механизмах влияния поверхности этих материалов на формирование молекулярного состава и структуры внеклеточного матрикса. Следует заметить, что разделение вклада адсорбционных и каталитических свойств, так же как

Таким образом, в результате влияния структурно-фазового состояния сплавов с эффектом памяти формы на адсорбционные и каталитические свойства поверхности и физическое состояние формирующегося на ней внеклеточного матрикса доказано наличие между ними тесной связи. Эта связь нашла выражение в одновременном изменении, вызванными обработкой поверхности материала, трех групп характеристик. Первую группу составляли структурные напряжения и РВЭ, характеризующие состояние поверхности материала. Вторую - сила адгезии альбумина, отражающая адсорбционную способность поверхности, и молекулярный состав продуктов окисления этанола, определяемый каталитической активностью поверхностного окисла. Третью группу представляло число фокальных контактов, образуемых клетками с внеклеточным матриксом, характеризующее его физическое состояние. Дальнейшее изучение количественных аспектов этой связи позволит использовать их для контроля состояния поверхности (включая формирующийся на ней внеклеточный матрикс) при целенаправленном регулировании «биологических» свойств этих материалов.

Авторы выражают благодарность старшему научному сотруднику лаборатории прочности материалов Санкт-Петербургского государственного университета Н.Н.Ресниной за помощь в проведении экспериментов с использованием дифференциального калориметра.

Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.» (государственный контракт № П381 от 30.07.2009).

Литература

1. Эффекты памяти формы и их применение в медицине. Новосибирск: Наука, 1992. 742 с.

2. Yahia L (Ed.). Shape memory implants Springer. Verlag-Berlin-Heidelberg-NewYork, 2000. 349 p.

3. Physical state of the extracellular matrix regulates and molecular composition of cell-adhesions / B-Z Katz, E Zamir, A .Bershadsky, KM Yamada, B. Geiger // Molecular Cell Biology, 2000. Vol.11. Issue 3. Р.1047-1060.

4. Волькенштейн Ф.Ф. Физико-химия поверхности полупроводников. М.: Наука, 1973. 399 с.

5. Biocompatibility-related surface characteristics of oxidized NiTi / A.Danilov, T.Tuukkanen, J.Tuukkanen, T.Jamsa // J Biomed Mater Res A, 2007. 82A, 4; 810-819.

6. Effect of metal alloy surface stresses on the viability of ROS-17/2. 8 osteoblostic cells / A.Kapanen, A.Danilov, P.Lehekari, J.Ryha-nen, J.Tuukkanen // J. Biomaterials 2002; 23:3733-40.

7. Biocompatibility of austenite and martensite phases in NiTi-based alloys / A.Danilov, A.Ka-panen, S.Kujala, J.Saaranen, J.Ryhanen, A.Pramila, T.Jamsa, J.Tuukkanen // J. Phys. IV France 2003. Vol.112. Р. 117-1120.

8. Pilkinton S., Hwang SG, and Raftery D. Ethanol photocatalysis on TiO2 coated optical mi-crofiber,supported monolayer, an in situ NMR studu. Journal of Physical Chemistry B, 1999. Vol.103. Р. 1152-1160.

9. Volkenstein F.F. The electronic theory of catalysis on semiconductors. Oxford-London-New York-Paris: Pergamon Press, 1963.

10. Chrzanowska-Wodnika M and Burridge K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibres and focal adhesions // Journal of Cell biology, 1996. Vol.133. Р. 1403-1415.