ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА
NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF PLAGUE MICROBE

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению питательных сред, которые создают оптимальные условия для культивирования чумного микроба.
Известна питательная среда для культивирования чумного микроба мясо-пептонный бульон для культивирования микроорганизмов, включающий, г/л: агар-агар - 20,0; пептон - 10,0; хлористого натрия - 5,0; 20% едкого натрия до рН 7,2, дистиллированная вода до 1 л (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М.О.Биргер. Москва, 1972 г., с.49).
Недостатком данной среды является ее низкая продуктивность.
2
4
Наиболее близкой к предлагаемому изобретению является питательная среда для выращивания чумного микроба, в которой в качестве питательной основы используют ферментативный гидролизат мясокостного фарша тушек лисицы (20-25 г/л воды), а также агар-агар (15,0-20,0 г/л), NaCl (4,0-5,0), NaHPO (1,0-1,1 г/л) и вода (RU 2083664. Бюллетень №19. Ч.2. 10.07.1997).
Недостатком среды можно считать непопулярность питательной основы.
Целью изобретения является получение качественной, прозрачной питательной среды для культивирования чумного микроба на основе 4-часового панкреатического гидролизата свежего говяжьего мяса.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит 4-часовой панкреатический гидролизат свежего мяса и стимулирующую добавку натрий сернистокислый, питьевую воду при следующем содержании ингредиентов, г/л:
4-часовой панкреатический гидролизат
свежего говяжьего мяса
100,0-300,0
Натрий хлористый
4,0-6,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
3,0-5,0
Натрий сернистокислый
0,3-0,5
Агар микробиологический
10,0-14,0
Питьевая вода
до 1 л
Для приготовления питательной основы в качестве исходного сырья используют свежее говяжье мясо, содержащее в среднем от 12,7% до 21,71% азотистых веществ, минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа; общее их количество достигает 1%. Мясо содержит также витамины, микроэлементы. Свежее говяжье мясо содержит больше экстрактивных веществ, чем свежемороженое (Ю.А.Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз, 1950, с.46).
Из белковых веществ в свежем говяжьем мясе при ускоренном ферментативном гидролизе образуются следующие аминокислоты, г/л: лизин, метионин, триптофан, цистин, треонин, серин, фенилаланин, пролин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин, по количественному и качественному составу ничем не отличающиеся от аминокислот мясных гидролизатов, проведенных в течение 14 дней.
Питьевая вода - вода, которая предназначена для употребления людьми, не вредит их здоровью и соответствует санитарно-эпидемическим нормам по СанПин 2.1.4.1074-01. Настоящий СанПин, сохраняя преемственность гигиенических критериев СанПин 2.1.4.1074-01, дополнен рядом новых критериев и положений. Методические указания МУ 2.1.4.1184-83, пункт 4.3.1. - на основании ГОСТа 2761 «Источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения» и СП 2.1.5.1059-01 «Гигиенические требования к охране подземных вод от загрязнения». В случае использования воды централизованных систем водоснабжения качество исходной (сырьевой) воды должно соответствовать требованиям к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. Пункт 9 -санитарные правила и нормы «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. СанПин 2.1.4.1074-01».
Приготовление питательной основы предлагаемой питательной среды для выращивания микроорганизмов заключается в следующем.
В варочный котел заливали 15 л питьевой воды и доводили до кипения. Предварительно нарезанное свежее говяжье мясо в количестве 10 кг загружали в кипящую воду и кипятили 15 мин, в процессе кипения снимали жир. Затем подогрев прекращали и оставляли для отстаивания на 20 мин. Мясо измельчали мясорубкой, мясную воду охлаждали до температуры 45±1°С, корректировали величину рН до значения 8,5±0,1 натрием углекислым. Мясной фарш в количестве 2 кг, мясную воду 5 л и поджелудочную железу крупного рогатого скота в количестве 0,2 кг помещали в 10 литровые бутыли, закрывали ватно-марлевыми пробками накрывали пергаментной бумагой, укрепляли резиновыми кольцами. В качестве консерванта в бутыли добавляли хлороформ до конечной концентрации 1%.
Процесс гидролиза вели в термокамере при температуре 37°С. Смесь перемешивали вручную через каждые 15 мин в течение 4 ч. Динамику процесса гидролиза контролировали путем определения аминного азота и по достижении 0,5-0,7% подогрев прекращали, перевар отстаивали. Отстоявшийся верхний слой гидролизата сливали в котел и выдерживали при температуре 100°С в течение 10 мин. Затем вручную фильтровали через тканевые фильтры. Сбор фильтрата вели в стеклянные баллоны емкостью 10 л. Для консервации добавляли хлороформ в количестве 1% к объему фильтрата, закрывали резиновыми пробками, этикетировали и транспортировали в холодовую камеру, где хранили при температуре от 2-8°С.
Питательную среду на основе 4-часового панкреатического гидролизата свежего говяжьего мяса для выращивания микроорганизмов готовят следующим способом. Берут 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса, разбавленного питьевой водой до показания аминного азота 0,12% - 200,0 мл; натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 4,0 г. Для осветления полученной жидкости используют активированный уголь марки «УО-А» в количестве 2% к объему среды, который ссыпают в эмалированную кастрюлю, доливают питьевую воду до 1 л, среду тщательно перемешивают до образования однородной массы. Подогревают до 56°С, затем устанавливают рН до 8,2±0,1 с помощью 20% раствора гидроокиси натрия в количестве 8,0 мл, кипятят в течение 5 мин. Фильтруют через полотно и 8-16 слоев фильтровальной бумаги, сбор фильтрата проводят в эмалированную кастрюлю. В готовый фильтрат светло-желтого цвета добавляют агара микробиологического 12 г/л. Смесь доводят до 100°С и кипятят до полного расплавления агара в течение 10 мин. рН корректируют раствором соляной кислоты (1:1) до рН 7,2±0,1, добавляют натрий сернистокислый в концентрации 0,4 г/л.
Приготовленную среду разливают в градуированные флаконы по 200±0,5 мл, которые герметично укупоривают ватно-марлевыми пробками и бумагой крафт. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Стерильную среду после расплавления в кипящей бане разливают в стерильные чашки Петри, просушивают в течение 30 мин и используют для посева.
9
-7
2
-6
-7
В качестве примера испытывали культуру вакцинного штамма чумного микроба ЕВ, выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, рН 7,2 при температуре 28°С в течение 24 ч. Из суточной агаровой культуры тест-штамма чумного микроба готовят взвесь в 0,9% растворе хлористого натрия густотой 1,0·10 м.к./мл по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича, ОСО 422859-86 П, - 10 единиц и делают 10-кратные последовательные разведения, перенося 0,5 мл взвеси в 4,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия до разведения 10 (1·10 м.к./мл), тщательно перемешивая, меняя стерильную пипетку после каждого разведения. Культуру из разведения 10 (1000 м.к./мл) и 10 (100 м.к./мл) наносят по 0,1 мл на 3 свежеприготовленные и хорошо просушенные агаровые пластинки. Распределяют посеянную культуру по поверхности агара покачиванием чашки Петри. Учет результатов скорости роста культуры в каждом разведении микробной взвеси производят через 48 ч инкубации при 28°С. Показатель скорости роста определяют по минимальному времени инкубации посевов, за которое при соответствующем разведении обеспечен отчетливо видимый рост культуры во всех засеянных чашках с плотной средой и формирование типичных, легко дифференцируемых при микроскопии колоний на чашках с плотной средой.
Оценку ростовых свойств питательной среды для культивирования чумного микроба проводят путем подсчета количества выросших колоний на пластинках агара.
Пример 1
Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса - 100,0; натрий хлористый - 4,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 3,0; натрий сернистокислый - 0,3; агар микробиологический - 10,0; питьевая вода - до 1 л.
При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний, выросших на пластинках агара, для чумного микроба при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 55 и 5 диаметром 1,0 мм.
Пример 2
Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса - 200,0; натрий хлористый - 5,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 4,0; натрий сернистокислый - 0,4; агар микробиологический - 12,0; питьевая вода - до 1 л.
При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний, выросших на пластинках агара, для чумного микроба при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 65 и 6 диаметром 1,5 мм.
Пример 3
Тест-штамм выращивали на питательной среде, содержащей, г/л: 4-часовой панкреатический гидролизат свежего говяжьего мяса - 300,0; натрий хлористый - 6,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный - 5,0; натрий сернистокислый - 0,5; агар микробиологический - 14,0; питьевая вода - до 1 л.
При таком соотношении ингредиентов наблюдался типичный рост колоний чумного микроба, при посевной дозе 100 и 10 м.к. составило через 48 ч соответственно 50 и 5 диаметром 1,0 мм.
Таким образом, заявленная питательная среда для культивирования чумного микроба (пример 2), приготовленная на 4-часовом панкреатическом гидролизате свежего говяжьего мяса, может заменить по ростовым качествам питательную среду на ферментативной основе мясного гидролизата, приготовленную за 14 дней.