СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСФЕР-ФАКТОРА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПТИЦ
METHOD OF OBTAINING TRANSFER FACTOR FOR PREVENTING VIRAL BIRD DISEASES

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности ветеринарной иммунологии, и предназначено для получения иммунологических стимуляторов, а именно способу получения трансфер-фактора кур для профилактики вирусных болезней птиц, обеспечивающего адаптивный перенос иммунологической информации с целью его применения в промышленном птицеводстве и при производстве вакцин. Биологически активную фракцию диализата экстракта лейкоцитов, представляющую собой низкомолекулярный (менее 10000 дальтон) антигенспецифический рибонуклеопептид, способный переносить клеточно-опосредованный иммунитет на несенсибилизированные лимфоциты и получивший название фактора переноса или трансфер-фактора (ТФ), применяют для передачи клеточного иммунитета при различных патологиях, сопровождающихся снижением реактивности организма, а также в качестве вспомогательного средства для профилактики и лечения хронических инфекционных болезней, инфекций вирусной и бактериальной этиологии, кандидозов, иммуннодефицитных состояний.
Известны способы получения трансфер-фактора из лимфоцитов донорской крови, лимфоидных органов, например миндалин, содержащих до 40% лимфоцитов, путем приготовления экстракта или лизата, который подвергают диализу или ультрафильтрации для выделения низкомолекулярной фракции с последующей лиофилизацией [1, 2, 3, 4].
Трансфер-фактор также можно получить путем экстракции с помощью тритона Х-100 из культивированных лимфоцитов, разрушенных замораживанием и оттаиванием, с помощью ультрафильтрации на полых волокнах ХМ-50, РМ-10 и М-2 с последующей лиофилизацией [5].
Недостатком способа является примесь в конечном продукте тритона Х-100, обладающего побочной биологической активностью.
Известен также способ получения трансфер-фактора из плазмы донорской крови путем экстракции этанолом при его конечной концентрации 3,0-3,5% и насыщении раствора двуокисью углерода. Для создания давления при ультрафильтрации используется двуокись углерода при его рабочем движении 0,15-0,20 МПа [6].
Известен также способ получения трансфер-фактора, включающий использование донорской крови (больших объемов) в качестве источника лейкоцитов [7].
Однако данный способ обладает высокой трудоемкостью, сложностью исполнения. К тому же, использование человека в качестве объекта для выделения трансфер-фактора делает невозможным использование препарата в ветеринарии из-за его специфичности.
Наиболее близким техническим решением, выбранным в качестве прототипа, является способ получения трансфер-фактора из регионарных лимфоузлов крупного рогатого скота, предложенный Щегловым В.М. с соавт. [8].
Данный способ предусматривает следующие этапы:
1. Получение экстракта лимфоцитов. Регионарные лимфоузлы (предлопаточные, надколенной складки и другие) отбирают при убое здорового крупного рогатого скота. Их освобождают от соединительной ткани, жира и измельчают на мелкие кусочки, помещают в гомогенизатор, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:1 и подвергают гомогенизации до однородной консистенции при 20 тыс.об/мин в течение 2-3 минут. Такой режим обработки лимфоидной ткани обеспечивает полное разрушение клеточных структур.
4
2. Гидролиз экстракта лимфоцитов и получение трансфер-фактора. Для осуществления гидролиза белка готовят 0,5%-ный раствор пепсина на 0,5% растворе соляной кислоты. Суспензию, полученную после гомогенизации лимфоузлов, смешивают в стеклянной емкости с данным раствором в соотношении 1:10. Одновременно для деполимеризации ДНК в реагентную смесь вносят кристаллы MgSO в количестве 0,015-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,004-0,006 мг. Сосуд помещают в термостат на 24-28 часов при температуре 37-38°С. Периодически проверяют рН среды и при необходимости доводят его исходным раствором пепсина и соляной кислоты до оптимального значения 1,75-2,0. Контролем окончания гидролиза является отсутствие реакции на белок (биуретовая реакция).
Полученный трансфер-фактор фильтруют и консервируют раствором карболовой кислоты до конечной концентрации раствора 0,5%.
Однако, несмотря на упрощение технологии получения препарата, выбор в качестве объекта для получения трансфер-фактора крупного рогатого скота и специфичность конечного продукта делают невозможным использование получаемого препарата в птицеводстве.
Задачей заявляемого изобретения является создание способа получения трансфер-фактора с целью применения его в промышленном птицеводстве для профилактики вирусных болезней птиц, при производстве вакцин, а также с возможностью использования его с диагностическими целями в экспериментальной иммунологии и биотехнологии.
4
Поставленная задача решена путем создания способа получения трансфер-фактора для профилактики вирусных болезней птиц, включающего приготовление экстракта лимфоцитов, гидролиз ДНК-азой, диализ с последующей консервацией или лиофилизацией целевого продукта, характеризующийся тем, что в качестве источника лимфоцитов используют селезенки вакцинированных против одной или нескольких инфекций или переболевших ими цыплят или кур, которые измельчают в физиологическом растворе в соотношении 1:1, затем гомогенизируют до однородной консистенции при 5000 об/мин в течение 2-3 мин, в полученный гомогенат добавляют кристаллы MgSO в количестве 0,013-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,003-0,006 мг, полученную суспензию 4-5-кратно замораживают при -40°С, размораживают при +37°С, затем центрифугируют при 3000g 60 минут, подвергают диализу против 50 объемов дистиллированной воды с использованием диализных мешков при постоянном помешивании течение 24 часов при температуре +4°С, полученный целевой продукт консервируют мертиолятом в конечной концентрации не менее 0,0001% или лиофилизируют.
Сравнительный анализ заявленного решения со способом, выбранным за прототип, показал, что новое решение обладает следующими отличительными признаками:
- выбор в качестве объекта для получения трансфер-фактора кур;
- использование в качестве исходного материала для получения лимфоцитарной массы селезенок;
- упрощение технологии получения препарата;
- специфичность конечного продукта для кур.
Наличие отличительных от прототипа признаков обеспечивает соответствие заявляемого технического решения критерию «новизна».
Анализ доступных авторам источников информации показал, что сведений о способе получении трансфер-фактора из селезенок кур не обнаружено.
Таким образом, все указанные отличительные признаки являются необходимыми и существенными, тесно связаны между собой, и поэтому трудно выделить вклад каждого отдельного признака в решении поставленной задачи.
Проведенные испытания заявляемого способа получения трансфер-фактора подтверждают его преимущества перед способом-прототипом.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1.
Схема получения трансфер-фактора для профилактики вирусных болезней птиц.
1. Получение экстракта лимфоцитов.
Селезенки, отобранные при убое вакцинированных против одной или нескольких инфекций или переболевших ими цыплят или кур, через 14-35 дней после вакцинации или переболевания в количестве 100 г помещают в гомогенизатор, добавляют физиологический раствор в соотношении 1:1 и подвергают гомогенизации до однородной консистенции при 5000 об/мин в течение 2-3 мин.
2. Гидролиз экстракта лимфоцитов и получение трансфер-фактора.
Затем осуществляют гидролиз белков, находящихся в гомогенате.
4
Для деполимеризации ДНК в смесь вносят кристаллы MgSO в количестве 0,013-0,017 мг и лиофилизированный фермент ДНК-азу в количестве 0,003-0,006 мг. Полученную суспензию 4-5-кратно замораживают - размораживают. Замораживание проводят при -40°С, оттаивание - при +37°С.
3
Клеточную суспензию центрифугируют при 3000g 60 минут. Надосадочную жидкость переносят в диализный мешок. Диализный мешок ополаскивают 0,85% раствором соляной кислоты и помещают в сосуд со стерильной дистиллированной водой. Соотношение между диализатом и водой 1:50. Диализ проводят при постоянном помешивании на магнитной мешалке в течение 24 часов при температуре +4°С. По окончании диализа полученный целевой продукт в количестве (10000 доз) консервируют мертиолятом в конечной концентрации 0,0001% или разливают во флаконы по 3 см и лиофилизируют.
Полученный трансфер-фактор представляет собой слегка опалесцирующую жидкость светло-желтого цвета, не содержит белок, представляет собой низкомолекулярный рибонуклеопептид, устойчив к повторному замораживанию и размораживанию, лиофилизации, устойчив к действию РНК-азы и ДНК-азы, трипсина.
Тестирование полученного трансфер-фактора проводят по измерению его цитоиммобилизующей активности в реакции торможения миграции лейкоцитов с конканавалином А (РТМЛ с КоА) и по результатам биопробы. Результаты тестирования представлены в Таблице 1.
Примечание: * - р<0,05 - достоверные отличия от показателей контрольных групп.
** - Для постановки биопробы в каждую группу берут 25 цыплят.
Как видно из приведенных результатов тестирования, трансфер-фактор, полученный представленным способом, сообщает лимфоцитам нормальных цыплят способность выделять лимфокины в ответ на антиген вируса ИББ и предотвращает смертность при заражении высоковирулентными вирусами ИББ.
Пример 2.
СПФ-цыплятам суточного возраста вводили трансфер-фактор, полученный из селезенок цыплят-бройлеров, переболевших инфекционной анемией цыплят (ИАЦ) (опытная группа). Цыплятам контрольной группы трансфер-фактор не вводили. Цыплят содержали в боксе, контаминированном вирусом ИАЦ. В возрасте 40 суток отбирали сыворотки крови от цыплят опытной и контрольной групп для исследования с использованием иммуноферментного анализа. Результаты исследований представлены в Таблице 2.
Как видно из приведенных результатов тестирования трансфер-фактор, полученный представленным способом, переносит иммунитет против вируса ИАЦ и предотвращает заражение вирусом ИАЦ.
Использование предлагаемого способа получения трансфер-фактора позволяет привлечь дополнительный источник сырья, способный увеличить выход продукта. Получаемый согласно способу трансфер-фактор может быть использован как при производстве биологических препаратов для профилактики инфекционных болезней птиц, в том числе в раннем возрасте, так и с диагностическими целями, а также в экспериментальной иммунологии и биотехнологии.
Источники информации
1. Лоуренс X., Эль-Аскари С. Приготовление и очистка фактора переноса. Методы изучения in vitro клеточного иммунитета. - М. - 1974. - с. 256-272.
2. Кухаркина О.В. Получение и изучение свойств препаратов фактора переноса против некоторых вирусных и бактериальных инфекций животных: дис. канд. биол. наук. - Владимир, 2003. - 140 с.
3. Петров Р.В. Иммунология / Р.В. Петров. - М.: Медицина, 1987. - 416 с: ил.
4. Чередеев А.Н. Фактор переноса // Итоги науки и техники, т. 9. Медиаторы иммунной системы. - М., 1981. - с. 51-79.
5. GB №1443948 A1, А61К 45/00, 20.10.1972.
6. SU №787031 A1, А61К 35/16, 15.12.1980.
7. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля, пер. с нем. - М.: Медицина, 1987. - 472 с: ил.
8. RU №2270021 С2, А61К 35/16, 20.02.2006.