ПРОТИВОВИРУСНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ ПОСРЕДСТВОМ ЛИГИРОВАНИЯ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ
ANTIVIRAL IMMUNOTHERAPY BY MEMBRANE RECEPTOR LIGATION

[0001] Настоящее изобретение относится к цитотоксическому средству для профилактики и/или лечения вирусной инфекции, сконфигурированному для селективного связывания с мембранным рецептором инфицированных вирусом T-лимфоцитов, фармацевтической композиции, содержащей указанное цитотоксическое средство, применению цитотоксического средства для профилактики и/или лечения вирусных инфекций, способу обнаружения цитотоксических средств, применению мембранного рецептора инфицированных вирусом T-лимфоцитов, гиперэкспрессированного по сравнению с неинфицированными T-лимфоцитами, для диагностики вирусной инфекции.
синдрому приобретенного иммунодефицита
[0002] Вирусные инфекции являются одной из основных проблем науки и медицины. Одним из патогенных вирусов человека, находящихся в центре внимания, является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). ВИЧ является оболочечным вирусом, принадлежащим к семейству ретровирусов и роду лентивирусов. Неподвергнутая лечению инфекция ВИЧ, как правило, приводит к СПИД () после латентной фазы различной длительности, не сопровождающейся симптомами, как правило, длящейся несколько лет. В 2010 году распространенность ВИЧ по всему миру среди взрослых возрастом от 15 до 49 лет составляла 0,8 процентов. Что касается Центральной и Западной Европы, она составляла 0,2 процентов. Она превышает средние значения в Субсахарской Африке (5,0 процентов) и странах Карибского бассейна (0,9 процентов). В некоторых странах, таких как Свазиленд, Ботсвана или Лесото, приблизительно четверть людей возрастом от 15 до 49 лет инфицирована вирусом HI. В Германии распространенность ВИЧ в 2009 году составляла приблизительно 0,1 процент.
+
+
[0003] Что касается пролиферации, вирусу HI необходимы клетки-хозяева, несущие так называемый рецептор CD4 на своей поверхности. В основном, они являются CD4-несущими T-хелперными клетками, так называемыми CD4+-клетками или CD4-лимфоцитами. Основным резервуаром для вирусов HI являются фолликулярные T-хелперные клетки в лимфоидных фолликулах, составляющие приблизительно до 2% CD4+-клеток. Латентно инфицированные, покоящиеся CD4 T-клетки или T-клетки памяти, соответственно, представляют собой долговременный резервуар для ВИЧ. Эти клетки ответственны за то, что, несмотря на доступные в настоящее время антиретровирусные лекарственные средства, ВИЧ еще нельзя искоренить, и что рецидив происходит повторно после прекращения терапии.
[0004] Т.к. пролиферация вирусов происходит внутри нормальных клеток и тесно связана с центральными биохимическими механизмами клетки, рассматриваемые противовирусные средства должны либо предотвращать проникновение вирионов в клетки-хозяева, вмешиваясь в метаболизм клетки для препятствия пролиферации вируса, либо, после возможной пролиферации вируса в клетках, предотвращать выход новых вирусов из клеток.
[0005] Однако, с другой стороны, эти искомые активные средства также должны быть переносимыми для метаболизма организма, структуры клеток и/или внутреннего метаболизма клетки в целом, т.к. в ином случае не только пролиферация вируса в клетках, но в худшем случае также и (клеточная) жизнь целого подвергаемого лечению организма прекращается.
[0006] Т.к. эти состояния очень тяжело устранять, некоторые из противовирусных лекарственных средств, разработанных к настоящему времени, зачастую ассоциированы с риском серьезных побочных эффектов.
аналоги нуклеозидов и нуклеотидов
ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы
ингибиторы протеаз ВИЧ
ингибиторы проникновения и слияния и ингибиторы интеграз
[0007] Существующую терапию выбора в случае ВИЧ-инфекции и СПИД называют высокоактивной антиретровирусной терапией (HAART). HAART является комбинированной медикаментозной терапией, состоящей по меньшей мере из трех антиретровирусных средств. В настоящее время используют несколько классов активных ингредиентов: (NRTI), (NNRTI), (PI), .
[0008] Некоторые из упомянутых выше активных средств обозначают как "противовирусные лекарственные средства прямого действия" (DAA). DAA специфически ингибируют вирусные белки, но не клеточные белки организма-хозяина. Этот принцип действия должен приводить к меньшему количеству побочных эффектов.
[0009] Однако именно DAA касается то, что атакуемые вирусы также вырабатывают резистентность, что у них очень хорошо получается из-за крайне быстрого цикла репродукции и биохимических характеристик репликации.
[0010] Кроме того, недостаток используемых в настоящее время противовирусных средств состоит в том, что они являются виростатическими, а не виротоксическими. Они ингибируют пролиферацию вирусов, но не уничтожают их.
[0011] С учетом этого, целью настоящего изобретения является получение нового противовирусного средства, с помощью которого недостатки доступных в настоящее время противовирусных средств уменьшают, а возможно даже избегают их. По возможности, необходимо получать такое активное средство, которое уничтожает вирус или инфицированную вирусом клетку, т.е. являющееся виротоксическим.
[0012] Этой цели достигают с помощью цитотоксического средства, сконфигурированного для селективного связывания с мембранным рецептором инфицированных вирусом T-лимфоцитов, где мембранный рецептор выбран из группы, состоящей из: CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d и CD29.
[0013] Используя новый способ скрининга на основе FACS, авторы настоящего изобретения неожиданно смогли обнаружить, что указанные выше мембранные рецепторы в значительной степени гиперэкспрессируются в инфицированных вирусом T-лимфоцитах по сравнению с неинфицированными вирусом T-лимфоцитами. Таким образом, эти мембранные рецепторы вначале делают возможной идентификацию инфицированных вирусом T-лимфоцитов.
[0014] Ассоциация между указанными выше мембранными рецепторами и вирусной инфекцией T-лимфоцитов еще не описана в уровне техники. Таким образом, они представляют собой новый биомаркер с терапевтическим значением.
[0015] В цитотоксическом средстве по изобретению используют явление, обнаруженное авторами настоящего изобретения. Средство селективно связывается с инфицированными вирусом T-лимфоцитами и проявляет свою цитотоксическая активность в них. Неинфицированные клетки не связываются или связываются гораздо слабее. Таким образом, минимизируют побочные эффекты.
[0016] В отличие от большинства доступных в настоящее время терапевтических средств против вирусных заболеваний, цитотоксическое средство по изобретению не только обладает виростатическим эффектом, и таким образом, не только предотвращает распространение и пролиферацию вирусов. Цитотоксическое средство по изобретению также обладает виротоксическим эффектом, и таким образом, потенциалом для селективного устранения инфицированных T-лимфоцитов, вирусов и предшественников вирусов, присутствующих в клетках.
[0017] Таким образом, цитотоксическое средство по изобретению удовлетворяет сохранявшуюся в течение долгого времени потребность в эффективных в отношении причины терапевтических средствах для лечения инфекционных вирусных заболеваний.
[0018] В настоящем описании термин "средство" означает вещество, которое, в связи со своими физико-химическими свойствами, воздействует на жизнеспособность и/или пролиферацию инфицированного вирусом T-лимфоцита. Средство может являться химически определенным соединением, активным ингредиентом, лекарственным средством и т.д.
[0019] В настоящем описании термин "цитотоксический" означает активность, оказывающую ингибирующее влияние на жизнеспособность и/или пролиферацию инфицированных вирусом T-лимфоцитов.
[0020] В настоящем описании термин "селективное связывание" означает направленное и специфическое соединение цитотоксического средства с мембранным рецептором, основанное на селективном взаимодействии, основанном на принципе "ключ-замок". Оно отличается от неселективного связывания, основанного на неспецифическом взаимодействии между средством и рецептором.
+
[0021] "T-лимфоциты" образуют группу лейкоцитов, участвующих в иммунном ответе и, по изобретению, включающих все T-клетки, в частности, T-хелперы или T-клетки памяти, несущие рецептор CD4 (CD4 T-лимфоциты).
[0022] Термин "CD" означает "кластер дифференцировки", и он относится к группам иммунофенотипических характеристик поверхности клеток, которые можно классифицировать в соответствии с биохимическими или функциональными критериями. Молекулы CD, по большей части, являются мембраносвязанными гликопротеинами, которые зачастую экспрессируются клеточно-специфически и могут иметь различные функции: некоторые CD имеют рецепторную или сигнальную функцию, в то время как показано, что другие обладают ферментативной активностью; кроме того, некоторым кластерным молекулам приписывают центральную роль в межклеточной коммуникации.
+
[0023] "CD134", также известный как член 4 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF4) или OX40, является членом суперсемейства рецепторов TNFR, конститутивно экспрессирующихся на покоящихся наивных T-клетках. CD 134 является вторичной костимуляторной молекулой иммунных контрольных точек. Считают, что CD134 не имеет эффекта в отношении пролиферативной активности CD4T-клеток в течение первых трех дней, но после этого пролиферация замедляется и клетки умирают в большей степени. Описано, что CD134 участвует в патологической так называемой цитокиновой буре, ассоциированной с различными вирусными инфекциями, такими как вирус птичьего гриппа H5N1, избыточной реакции иммунной системы, при которой образуются высокие концентрации воспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, заставляют лейкоциты продуцировать дополнительные цитокины.
c
[0024] "CD132", также обозначаемый как общая гамма-цепь (γ) или гамма-субъединица рецептора интерлейкина-2 (ИЛ-2RG), является субъединицей цитокинового рецептора, общей для рецепторных комплексов по меньшей мере шести различных рецепторов интерлейкинов: рецепторов ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-15 и ИЛ-21. Лимфоциты, экспрессирующие CD132, могут образовывать функциональные рецепторы для этих цитокинов. В этой области описаны заболевания, ассоциированные с дисфункцией или мутациями CD132, такие как X-SCID ("тяжелый комбинированный иммунодефицит") или шизофрения.
[0025] "CD71", также известный как "белок 1 рецептора трансферрина" (TfR1), является трансмембранным белком, необходимым для транспорта трансферрина в клетки посредством эндоцитоза. CD71 описывают как потенциальную структуру-мишень в случаях лейкоза и лимфомы человека.
[0026] "CD70" является белком, активируемым на сильно активированных лимфоцитах, например, при T- и B-клеточных лимфомах. Таким образом, считают, что антитела против CD70 представляют собой возможную форму терапии в случае CD70-положительных лимфом.
[0027] "CD54", также известный как ICAM 1 (внутриклеточная молекула адгезии 1), является трансмембранным гликопротеином, как правило, экспрессирующимся на эндотелиальных клетках и клетках иммунной системы. Он является членом суперсемейства иммуноглобулинов. После цитокиновой стимуляции наблюдают сильное повышение концентрации CD54. CD54 индуцируется интерлейкином-1 (ИЛ-1) и фактором некроза опухоли (ФНО) и экспрессируется эндотелием сосудов, макрофагами и лимфоцитами. CD54, помимо прочего, играет важную роль в передаче сигнала клеток. CD54 ассоциирован с субарахноидальным кровоизлиянием (SAH), при котором свободная кровь проникает в субарахноидальное пространство, наполненное цереброспинальной жидкостью.
[0028] "CD39", также известный как "эктонуклеозидтрифосфатдифосфогидролаза-1" (ENTPD1), является трансмембранным белком, катализирующим гидролиз γ- и β-фосфатных остатков трифосфо- и дифосфонуклеозидов до монофосфонуклеозидных производных.
+
[0029] "BTLA", также обозначаемый как "CD272", индуцируется при активации T-клеток. Он вызывает ингибирование T-клеток посредством взаимодействия с рецепторами фактора некроза опухоли. Активация BTLA включает ингибирование функционирования CD8 злокачественно-специфических T-клеток человека.
[0030] "CD97" или "BL-Ac[F2]" является членом семейства молекул адгезии GPCR. CD97 экспрессируется на гемопоэтических стволовых клетках или клетках-предшественниках, иммунных клетках, эпителиальных клетках, мышечных клетках и их злокачественных вариантах. В иммунной системе CD97 играет роль критического медиатора защиты организма-хозяина. Вне иммунной системы CD97 может участвовать в межклеточных взаимодействиях. CD97 обнаруживают во множестве опухолей, включая опухоли щитовидной железы, желудка, поджелудочной железы, пищевода, толстого кишечника и плоскоклеточные карциномы ротовой полости.
[0031] "CD2" является молекулой клеточной адгезии, обнаруживаемой на поверхности T-клеток и естественных киллеров (NK клетки). Другие обозначения включают поверхностный антиген T-клеток T11/Leu-5, LFA 2, рецептор LFA 3, рецептор эритроцитов и рецептор розеткообразующих клеток. CD2 взаимодействует с другими молекулами адгезии. CD2 экспрессируется при большом количестве T-клеточных лимфом и лейкозов, таким образом, что в этой области CD2 используют для различения этих состояний и B-клеточных неоплазий.
[0032] "CD50" или "внутриклеточная молекула адгезии 3" (ICAM 3) является трансмембранным гликопротеином. Она конститутивно и сильно экспрессируется всеми лейкоцитами, и ее считают одним из наиболее важных лигандов для LFA 1 при инициации иммунного ответа.
[0033] "CD161", также обозначаемый как "член 1 подсемейства B лектин-подобных рецепторов киллерных клеток", "NK1.1", "KLRB1", "NKR P1A", является трансмембранным гликопротеином, экспрессируемым NK-клетками и, по-видимому, участвующим в регуляции функционирования NK-клеток.
[0034] "CD218" или "альфа-рецептор интерлейкина-18" (ИЛ-18Ra) является членом суперсемейства рецепторов ИЛ-1. CD218 экспрессируется на Th1-клетках, подтипе NK-клеток, нейтрофилах и стимулированных ИЛ-12 B-клетках миндалин. CD218, по-видимому, играет важную роль во врожденном иммунном ответе и аутоиммунных реакциях.
[0035] "CD226", также известный как "PTA1" ("антиген 1 активации тромбоцитов и T-клеток") или "DNAM 1" ("DNAX-акцессорная молекула 1"), является трансмембранным гликопротеином, экспрессирующимся на поверхности NK-клеток, тромбоцитов, моноцитов и фракции T-клеток. CD226 опосредует клеточную адгезию к другим клеткам, несущим его лиганды, CD112 и CD155.
[0036] "CD7" является трансмембранным белком, экспрессирующимся на тимоцитах и зрелых T-клетках. Он играет важную роль в T-клеточных взаимодействиях в течение ранних стадий развития лимфатической системы.
[0037] "CD49d" является субъединицей интегрина альфа, составляющим часть хоминг-рецептора α4β1 лимфоцитов. Он взаимодействует с LGALS8 и паксиллином.
[0038] "CD29" или "интегрин бета 1" является субъединицей интегрина, например, взаимодействующей с субъединицей альфа 3 с образованием комплекса α3β1, реагирующего с такими молекулами, как нетрин 1 и рилин. Так же, как и в случае других интегринов, CD129 участвует в клеточной адгезии и распознавании клеток при множестве процессов, включая эмбриональное развитие, гемостаз, восстановление тканей, иммунный ответ и метастазирование опухолевых клеток.
+
[0039] Гиперэкспрессия указанных выше мембранных рецепторов в инфицированных вирусом T-лимфоцитах, например, ВИЧ-инфицированных CD4 T-лимфоцитах, была неожиданной с учетом того, что известно в этого области. Таким образом, это было неожиданным.
[0040] Таким образом, полностью достигается цель настоящего изобретения.
[0041] В предпочтительном варианте осуществления изобретения цитотоксическое средство соединяют со связывающей молекулой, являющейся селективной для мембранного рецептора.
[0042] При этом, в настоящем изобретении используют преимущества свойств соединений, включающих связывание с мембранными рецепторами, обнаруженных авторами настоящего изобретения, высокоспецифическим и селективным образом. Термин "связывающая молекула" включает любое соединение, способное селективно и специфическим соединять или лигировать цитотоксическое средство по меньшей мере с одним из мембранных рецепторов CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d и CD29.
[0043] В дополнительном варианте осуществления изобретения связывающая молекула выбрана из группы, состоящей из: иммуноглобулина, фрагмента иммуноглобулина, аптамера, низкомолекулярного соединения, рецептора, фрагмента рецептора, цитокина.
[0044] При усовершенствовании изобретения используют такие связывающие молекулы, которые особенно хорошо подходят для селективного и специфического соединения цитотоксического средства с идентифицированными гиперэкспрессированными мембранными рецепторами.
[0045] Иммуноглобулин может являться иммуноглобулином и антителом, предпочтительно, агонистическим антителом.
[0046] В соответствии с результатами, полученными авторами настоящего изобретения, цитотоксическое средство особенно предпочтительно можно соединять с такой связывающей молекулой и можно связывать специфически и селективно с одним из идентифицированных мембранных рецепторов инфицированных вирусом T-лимфоцитов.
[0047] В варианте осуществления изобретения иммуноглобулин выбран из группы, состоящей из: MEDI6469 (9B12), MEDI6383, MEDI0562, Hu106-222/Hu119-122 (UTMDACC).
[0048] Они являются антителами, являющимися предпочтительными для изобретения и направленными против мембранного рецептора CD134, и, таким образом, они особенно подходят в качестве связывающей молекулы. MEDI6469 является агонистическим мышиным антителом от MedImmun, AstraZeneca, в настоящее время тестируемым для лечения солидных опухолей у людей в клиническом исследовании фазы I.
[0049] Пригодность упомянутых выше антител для цитотоксического лечения вирусной инфекции являлась неожиданной. Антитела против CD134 описаны в этой области, например, в Weinberg et al. (2006), Anti-OX40 (CD134) Administration to Nonhuman Primates: Immunostimulatory Effects and Toxokinetic Study, J. Immunother., Vol. 29, Nr. 6, S. 575-585, однако, в качестве компонента или в комбинации с вакциной или иммуностимулирующим средством. В отличие от настоящего изобретения, в этом случае антитело против CD134 может обладать не токсическими эффектами в отношении инфицированных вирусом клеток, а скорее иммуностимулирующими эффектами в отношении всего организма.
[0050] Иммуностимулирующий эффект антител против CD134 также описан, главным образом, в отношении лечения злокачественных новообразований, в WO 99/42585, EP 1 997 893, EP 650 020, WO 2013/038191, Curti et al. (2013), OX40 is a Potent Immune-Stimulating Target in Late-Stage Cancer Patient, Cancer Res. 73(24), S. 7189-7198; Bulliard et al. (2014), OX40 Engagement Depletes Intratumoral Tregs via activating FcγRs, Leading to Antitumor Efficacy, Immunology and Cell Biology 92, S. 475-480.
+
[0051] В дополнительном варианте осуществления цитотоксического средства по изобретению инфицированные вирусом T-лимфоциты являются инфицированными вирусом CD4 T-лимфоцитами.
[0052] Эта мера имеет преимущество, состоящее в том, что цитотоксическое средство по изобретению специфически и селективно устраняет T-лимфоциты, служащие в качестве долговременного резервуара для вирусов в случае ВИЧ-инфекции. Устранение этих клеток посредством цитотоксического средства по изобретению не только приводит к значительному уменьшению вирусной нагрузки, но также и предотвращает рецидивирование в течение терапии или после ее прекращения.
[0053] С учетом этого, предпочтительной вирусной инфекцией, подлежащей лечению или профилактике по изобретению, является ВИЧ-инфекция.
[0054] В дополнительном варианте осуществления изобретения цитотоксическое средство включает цитостатическое средство.
[0055] Эта мера имеет преимущество, состоящее в том, что в случае направленного устранения инфицированных вирусом T-лимфоцитов используют такой активный ингредиент, доказавший эффективность при других показаниях, таких как, например, злокачественное новообразование. В результате, можно использовать эмпирические значения, относящиеся к дозировке, составу, спектру побочных эффектов и т.д.
[0056] В дополнительном варианте осуществления цитостатическое средство выбрано из группы, состоящей из: алкилирующих средств, аналогов платины, интеркаляторов, антибиотиков, ингибиторов митоза, таксанов.
[0057] Что касается упомянутых цитостатических средств, используют такие лекарственные средства, которые интенсивно исследуют, и которые имеют достаточную лекарственную безопасность. Таким образом, они особенно подходят для достижения цели по изобретению.
[0058] В предпочтительном варианте осуществления цитотоксическое средство по изобретению включает виростатическое средство.
[0059] Эта мера имеет преимущество, состоящее в том, что характерный виротоксический эффект средства по изобретению дополнен виростатическим эффектом. Таким образом, дополнительно повышают терапевтическую эффективность цитотоксического средства по изобретению.
[0060] С учетом этого, изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей цитотоксическое средство по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
[0061] Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в этой области. Например, см. Kibbe A. (2003), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th Edition, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press.
[0062] Варианты осуществления, усовершенствования, признаки, свойства и преимущества цитотоксического средства по изобретению в равной степени применимы к фармацевтической композиции по изобретению.
[0063] Другим объектом по изобретению является применение цитотоксического средства для профилактики и/или лечения вирусной инфекции, сконфигурированного для селективного связывания с мембранным рецептором инфицированных вирусом T-лимфоцитов, где мембранный рецептор выбран из группы, состоящей из: CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d и CD29.
[0064] Варианты осуществления, усовершенствования, признаки, свойства и преимущества цитотоксического средства по изобретению в равной степени применимы к применению по изобретению.
[0065] Изобретение также относится к способу обнаружения цитотоксических средств, включающему селекцию таких соединений, которые могут селективно связываться с мембранным рецептором инфицированных вирусом T-лимфоцитов, где мембранный рецептор выбран из группы, состоящей из: CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d и CD29.
[0066] Таким образом, авторы настоящего изобретения предоставляют способ, который не только делает доступными цитотоксические средства, уже известные в этой области, такие как MEDI6469 (9B12), но также и новые соединения, ранее не известные или не охарактеризованные. С этой целью можно подвергать скринингу библиотеки веществ. Вещества приводят в контакт с мембранными рецепторами в подходящих экспериментальных условиях. Определяют, происходит ли специфическое и селективное связывание между веществами и мембранными рецепторами. Специфически и селективно связывающиеся вещества являются потенциальными цитотоксическими средствами по изобретению.
[0067] Варианты осуществления, усовершенствования, признаки, свойства и преимущества цитотоксического средства по изобретению в равной степени применимы к способу по изобретению.
[0068] Другой объект относится к способу диагностики вирусной инфекции, включающему определение любой гиперэкспрессии мембранного рецептора инфицированных вирусом T-лимфоцитов по сравнению с неинфицированными T-лимфоцитами, где мембранный рецептор выбран из группы, состоящей из: CD134, CD132, CD71, CD70, CD54, CD39, BTLA, CD97, CD2, CD63, CD50, CD161, CD218, CD226, CD7, CD49d и CD29.
[0069] Авторы настоящего изобретения обнаруживали, что упомянутые гиперэкспрессированные мембранные рецепторы являются диагностическими маркерами, с помощью которых можно надежно определять вирусную инфекцию. Определение гиперэкспрессии на T-лимфоцитах коррелирует с распространением вирусной экспрессии.
[0070] Варианты осуществления, усовершенствования, признаки, свойства и преимущества цитотоксического средства по изобретению в равной степени применимы к способу по изобретению.
[0071] Другим объектом по изобретению является способ определения поверхностных структур на инфицированных вирусом T-лимфоцитах, предпочтительно, мембранных рецепторов, подходящих в качестве мишени для цитостатических средств, где способ включает инфицирование T-лимфоцитов вирусом и определение любой гиперэкспрессии поверхностных структур на инфицированных вирусом T-лимфоцитах по сравнению с неинфицированными T-лимфоцитами.
[0072] Авторы настоящего изобретения разрабатывали модель, в которой T-лимфоциты сначала инфицируют вирусами, например, вирусами HI. Следующей стадией является анализ того, какие поверхностные структуры, подходящие в качестве мишеней для цитотоксического средства, гиперэкспрессируются на инфицированных T-лимфоцитах. Чем выше гиперэкспрессия по сравнению с неинфицированными T-лимфоцитами, тем более селективным и более подходящим в качестве цитотоксического средства по изобретению является вещество, высокоспецифически связывающееся с этой поверхностной структурой.
[0073] Следует понимать, что упомянутые выше признаки и признаки, объясняемые далее, можно использовать не только в указанных конкретных комбинациях, но также и в других комбинациях или по отдельности без отклонения от объема настоящего изобретения.
[0074] Настоящее изобретение далее будет описано более подробно с помощью примеров вариантов осуществления, из которых следуют дополнительные признаки, свойства и преимущества изобретения. Варианты осуществления не являются ограничивающими.
[0075] Следует понимать, что отдельные признаки, описываемые в вариантах осуществления, описаны не только в отношении конкретного варианта осуществления, но и в общем смысле, и сами по себе вносят отдельный вклад в изобретение. Таким образом, специалист в этой области может свободно комбинировать эти признаки с другими признаками изобретения.
[0076] Приведена ссылка на прилагаемые чертежи, на которых представлено следующее.
На фиг. 1 схематически представлена разработка способа скрининга для определения поверхностных структур в инфицированных ВИЧ-1 T-лимфоцитах, что является основой для обнаружения цитотоксических средств по изобретению;
+
+
На фиг. 2 показано повышение экспрессии различных мембранных рецепторов на инфицированных ВИЧ-1 и неинфицированных первичных CD4 T-лимфоцитах человека (A) и повышение экспрессии CD134 на CD4 T-лимфоцитах, выделенных из пациентов с ВИЧ (B).
Варианты осуществления
1. Скрининг инфицированных ВИЧ-1 T-лимфоцитов
+
+
+
+
nef
[0077] CD4 T-лимфоциты выделяли из периферической крови здоровых доноров. Выделенные CD4 T-лимфоциты стимулировали фитогемагглютинином (PHA) в течение трех дней. Затем клетки, стимулированные таким образом, инфицировали ВИЧ-1, экспрессирующим CFP ("циановый флуоресцентный белок") с помощью внутреннего участка связывания рибосомы (IRES) вместе с открытой рамкой считывания . Поверхность инфицированных CD4T-лимфоцитов окрашивали в течение от 48 до 72 часов после инфицирования с использованием 332 PE-конъюгированных антител, находящихся в четырех 96-луночных планшетах для микротитрования. Для выключения автофлуоресценции инфицированные и неинфицированные клетки фильтровали с использованием аллофикоцианина (APC). Для анализа использовали средние значения PE инфицированных CFP-положительных клеток и неинфицированных CFP-отрицательных клеток. Разработка скрининга рецепторов поверхности в инфицированных ВИЧ-1 CD4T-лимфоцитах схематически представлена на фиг. 1.
2. Гиперэкспрессия мембранных рецепторов в инфицированных ВИЧ-1 T-лимфоцитах
+
[0078] Через 48-72 часов после инфицирования CD4T-лимфоцитов, как и ожидали, наблюдали гиперэкспрессию мембранных рецепторов, уже описанных в этой области в связи с ВИЧ-инфекцией, таких как CD45RO, CD25, CD150 и CD279. Эти результаты подтверждают надежность разработанного способа скрининга.
[0079] Однако, авторы настоящего изобретения неожиданно смогли обнаружить большое количество других гиперэкспрессированных мембранных рецепторов на инфицированных клетках, которые до сих пор не были описаны. Наибольшее повышение экспрессии на поверхности клеток наблюдали в случае CD134 (OX40), являющегося T-клеточной костимуляторной молекулой и цитокиновым рецептором; см. фиг. 2A.
+
+
[0080] Значения свидетельствуют об X-кратном повышении экспрессии рецепторов на инфицированных по сравнению с неинфицированными T-лимфоцитами (n=5, значение p для всех представленных молекул рецепторов <0,01). Рецепторы, для которых уже описано повышение экспрессии на CD4T-лимфоцитах при ВИЧ-инфекции, помечены черным. Для всех других, помеченных белым рецепторов, гиперэкспрессия в ВИЧ-инфицированных CD4T-лимфоцитах была неизвестной и, таким образом, неожиданной.
+
[0081] CD4T-лимфоциты выделяли из крови инфицированных ВИЧ-1 индивидуумов. Поверхность клеток анализировали на экспрессию CD134, и внутреннюю часть клетки - на p24 ВИЧ-1. Измерение осуществляли посредством проточной цитометрии. Результат представлен на фиг. 2B.
-
+
+
[0082] На графике представлена средняя интенсивность флуоресценции (MFI) CD134 в p24(неинфицированных) по сравнению с p24 (инфицированными) T-клетками десяти пациентов. Статистические вычисления осуществляли с использованием парного t-критерия Стьюдента. Таким образом, подтверждали, что экспрессия CD134 также сильно повышалась на инфицированных CD4T-лимфоцитах из крови пациентов с ВИЧ-1.
+
[0083] Таким образом, с учетом экспрессии CD134 инфицированный ВИЧ-1 CD4T-лимфоцит можно специфически отличать от неинфицированной клетки. Таким образом, CD134 является идеальной мишенью для иммунотерапии против ВИЧ-1.
3. Цитотоксическое средство для лечения ВИЧ-инфекции
+
[0084] В настоящее время в этой области уже доступны некоторые антитела против CD134 человека. Их примером является антитело, разработанное компанией MedImmune с обозначение MEDI6469 или 9B12, соответственно. Это агонистическое антитело в настоящее время используют только для лечения солидных опухолей. Его уже тестировали на безопасность и противоопухолевую активность у людей (Curti et al., 2013 и ссылки в нем). Антитело 9B12 в настоящее время тестируют в рамках клинического исследования для определения его пригодности для противоопухолевой терапии. В соответствии с результатами, полученными авторами настоящего изобретения, это антитело также потенциально подходит для устранения инфицированных вирусом CD4T-лимфоцитов и, таким образом, удаления патогенных вирусов из инфицированного организма-хозяина.
[0085] Цитотоксические свойства определяли следующим образом:
-
[0086] PBMC выделяли из крови здоровых доноров. Выделенные клетки инфицировали ВИЧ-1, экспрессирующим GFP или CFP. Это делало возможной идентификацию популяции инфицированных клеток благодаря экспрессии хромофора. Добавляли различные количества антитела против CD134, например MEDI6469 (9B12). В качестве вторичного антитела для детекции клеток, связывающихся с антителом, посредством проточной цитометрии использовали PE-конъюгированное антитело против мыши. Этот эксперимент позволял оценить, что антитело специфически связывается с инфицированными ВИЧ-1 клетками по причине клеточной экспрессии CD134, но не с неинфицированными клетками. Это также позволяло определять то, влияют ли различные дозы на уровень специфического или неспецифического связывания с ВИЧ1-инфицированными и неинфицированными клетками.
+
+
+
+
[0087] Затем в течение 12 дней наблюдали вирусную репликацию и количество инфицированных клеток в популяции инфицированных ВИЧ-1 PBMC. К культурам инфицированных клеток добавляли различные количества антитела против CD134. Абсолютное количество инфицированных CD4T-клеток, неинфицированных CD4T-клеток, абсолютные уровни CD3клеток и CD8T-клеток, представляющих собой цитотоксические T-лимфоциты, количественно анализировали с интервалами 2 дня. Активацию и пролиферацию T-клеток анализировали посредством окрашивания по CD69 и Ki67. Уровни моноцитов измеряли по экспрессии рецептора CD14.
ex vivo
[0088] Кроме того, продукцию вируса определяли с использованием линии репортерных клеток посредством количественного анализа высвобождения p24 в супернатанте и количества инфективных, высвобожденных вирионов. Контроли включали культуры неинфицированных клеток PBMC с обработкой антителом против CD134 или без нее и инфицированных ВИЧ-1 PBMC без какой-либо обработки. Анализировали по меньшей мере трех различных доноров. Эти эксперименты позволяли сделать вывод о том, что лигирование CD134 на инфицированных первичных клетках обладает потенциалом для устранения инфицированных клеток или супрессии вирусной репликации, и что неинфицированные клетки не затронуты или не устранены при обработке.
+
[0089] Эффективность лечения с использованием антител против CD134 можно верифицировать с помощью разработанной модели ВИЧ-1-инфекции гуманизированной мыши. Такую модель на мышах предоставляет компания "Transcure". Этих мышей инфицировали ВИЧ-1 и оставляли без лечения (n=5) или вводили им три разные дозы антитела против CD134 (n=5, каждая доза) для лигирования CD134 и специфического устранения инфицированных ВИЧ-1 клеток, экспрессирующих высокие уровни CD134. Определяли вирусную нагрузку, количество CD4T-лимфоцитов и процентную долю инфицированных клеток. В целом, эти эксперименты показали, что лигирование CD134 посредством антитела, направленного против него, такого как MEDI6469 (9B12), обладает потенциалом для устранения инфицированных ВИЧ-1 клеток из организма и, таким образом, представляет собой новую иммунотерапию ВИЧ-1.