МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHBP
MENINGOCOCCAL fHBP POLYPEPTIDES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к области иммунизации и, в частности, иммунизации против заболеваний, вызванных патогенными бактериями рода Neisseria, такими как N. meningitidis (менингококк).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Neisseria meningitidis является грамотрицательной инкапсулированной бактерией, которая колонизирует верхние дыхательные пути примерно у 10% людей в популяции. Хотя имеются полисахаридные и конъюгированные вакцины против серогрупп A, C, W135 и Y, такой способ не может быть применен по отношению к серогруппе B, так как полисахарид капсулы является полимером полисиаловой кислоты, которая является аутоантигеном у человека. Чтобы разработать вакцину против серогруппы B, использовали экспонированные на поверхности белки, находящиеся в везикулах наружной мембраны (OMV). Такие вакцины вызывают гуморальные ответы в виде бактерицидных антител в сыворотке и защищают от заболевания, но они не способны индуцировать перекрестную защиту от других штаммов [1]. Поэтому некоторые исследователи сфокусировали свое внимание на специфичных менингококковых антигенах для применения их в вакцинах [2].
Одним из таких антигенов является менингококковый белок, связывающий фактор H (fHBP), также известный как белок "741" [SEQ ID 2535 и 2536 в ссылке 3; SEQ ID 1 в настоящем описании], "NMB1870", "GNA1870" [ссылки 4-6, после публикации 2], "P2086", "LP2086" или ORF2086" [7-9]. Этот липопротеин экспрессируется во всех многочисленных менингококковых штаммах. Последовательности fHBP были сгруппированы в три семейства [4] (называемые в настоящем описании семействами I, II и III), и было обнаружено, что сыворотка, полученная против определенного семейства, является бактерицидной в случае такого же семейства, но не активна против штаммов, которые экспрессируют одно из двух других семейств, т.е. существует перекрестная защита в пределах семейства, но нет перекрестной защиты между разными семействами.
Поэтому, чтобы добиться перекрестной защиты от разных штаммов с использованием fHBP, используют более одного семейства. Чтобы избежать необходимости в экспрессии и очистке отдельных белков, было предложено экспрессировать разные семейства в виде гибридных белков [10-12], включающих два или три семейства в виде одной полипептидной цепи. В публикациях 13 и 14 описаны различные основанные на мутагенезе способы модификации последовательностей fHBP для увеличения их сферы действия в случаях семейств I, II и III.
Целью настоящего изобретения являются дополнительные и улучшенные способы преодоления специфичности защиты по отношению к определенным семействам, обеспечиваемой fHBP, и применение таких способов для обеспечения иммунитета против менингококкового заболевания и/или инфекции, особенно для случая серогруппы B.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Полноразмерный fHBP имеет следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1) у штамма MC58:
В зрелом липопротеине отсутствуют первые 19 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 1, и в ΔG форме fHBP отсутствуют первые 26 аминокислот.
Последовательность MC58 (SEQ ID NO: 1) имеется в fHBP семейства I. Антитела, полученные с использованием последовательности MC58, обладают высокой бактерицидной активностью против штамма MC58, но намного более низкой активностью против штаммов, которые экспрессируют fHBP семейства II или III. В некоторых вариантах изобретение относится к модифицированным формам fHBP, при этом модификация (модификации) повышают способность белка вызывать образование бактерицидных антител, перекрестно действующих на разные семейства. В других вариантах изобретение относится к формам fHBP, которые обычно вызывают образование бактерицидных антител, перекрестно действующих на разные семейства.
Соответственно, изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 и 77. Такие аминокислотные последовательности начинаются с остатка, который соответствует Val-27 последовательности MC58, но включают различные аминокислотные модификации в ниже расположенных участках.
Предпочтительными являются две последовательности, SEQ ID NO: 20 и 23. Также предпочтительна последовательность SEQ ID NO: 76.
Полипептиды обладают способностью индуцировать бактерицидные противоменингококковые антитела после введения животному-хозяину, и в предпочтительных вариантах могут индуцировать антитела, которые являются бактерицидными против штаммов в каждом из трех семейств fHBP I-III. Дополнительная информация о бактерицидных ответах приведена ниже.
Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, k% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 76. Значение k может выбрано из 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более.
Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, содержащую первый фрагмент и второй фрагмент последовательности SEQ ID NO: 76, при этом указанный первый фрагмент включает эпитоп, находящийся в пределах аминокислот 89-154 последовательности SEQ ID NO: 76, и указанный второй фрагмент включает эпитоп, находящийся в пределах аминокислот 187-248 последовательности SEQ ID NO: 76. Обычно первый и второй фрагменты независимо имеют длину, по меньшей мере, 7 аминокислот, например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60 аминокислот или более.
Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, которая (i) имеет, по меньшей мере, k% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 76 и (ii) содержит указанный первый и второй фрагменты последовательности SEQ ID NO: 76.
Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, но в которой один или несколько остатков 127, 128, 133, 135, 136, 139, 140, 142, 144, 146, 148, 155, 156, 158, 160, 162, 166, 167, 171, 173, 179, 182, 185, 188, 190, 193, 197, 202, 204, 206, 208, 209, 210, 223, 235, 236 и/или 237 были либо заменены другой аминокислотой, либо делетированы. Замена может быть осуществлена аминокислотой из соответствующего положения в последовательности SEQ ID NO: 2. Полипептид может вызывать образование антител, которые могут связываться с обеими последовательностями, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, но в которой один или несколько остатков 146, 148, 155, 156, 158, 160, 162, 171, 173, 179, 182, 235, 236 и/или 237 были заменены другой аминокислотой. Замена может быть осуществлена аминокислотой из соответствующего положения в последовательности SEQ ID NO: 2. Полипептид может вызывать образование антител, которые могут связываться с обеими последовательностями, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
Изобретение также относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, но в которой один или несколько остатков 127, 128, 133, 135, 136, 139, 140, 141, 142, 144, 166, 167, 185, 188, 190, 193, 197, 202, 204, 206, 208, 209, 210 и/или 223 были либо заменены другой аминокислотой, либо делетированы. Замена может быть осуществлена аминокислотой из соответствующего положения в последовательности SEQ ID NO: 2. Полипептид может вызывать образование антител, которые могут связываться с обеими последовательностями, SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
Полипептиды
Полипептиды согласно изобретению могут быть получены различными способами, например химическим синтезом (по меньшей мере, частично), расщеплением более длинных полипептидов с использованием протеаз, трансляцией с РНК, очисткой из культуры клеток (например, из культуры рекомбинантных экспрессирующих клеток или из культуры N. meningitidis) и т.д. Предпочтительным путем экспрессии является гетерологичная экспрессия в хозяине E. coli.
fHBP является природным липопротеином N. meningitidis. Также обнаружено, что он липидизируется при экспрессии в E. coli с нативной лидерной последовательностью. Полипептиды согласно изобретению могут иметь N-концевой остаток цистеина, который может быть липидизирован, например, содержать группу пальмитоила, обычно с образованием трипальмитоил-S-глицерилцистеина. В других вариантах полипептиды не липидизированы.
Характерной особенностью предпочтительных полипептидов согласно изобретению является способность индуцировать бактерицидные противоменингококковые антитела после введения животному-хозяину.
Полипептиды предпочтительно получают, по существу, в очищенной или, по существу, выделенной форме (т.е. в форме, по существу, не содержащей других полипептидов клеток Neisseria или клеток-хозяев) или, по существу, изолированной форме. В общем, предлагаются полипептиды в не встречающемся в природе окружении, например, их выделяют из встречающейся в природе окружающей среды. В некоторых вариантах данный полипептид присутствует в композиции, которая обогащена полипептидом по сравнению с контролем. По существу, предлагается очищенный полипептид, при этом "очищенный" означает, что полипептид присутствует в композиции, которая, по существу, не содержит других экспрессированных полипептидов, при этом "по существу, не содержит" означает, что менее чем 90%, обычно менее чем 60% и более предпочтительно менее чем 50% композиции состоит из других экспрессированных полипептидов.
Полипептиды могут иметь различные формы (например, нативную, слитую, гликозилированную, негликозилированную, липидизированную, с дисульфидными мостиками и т.д.).
Последовательности SEQ ID NO: 4-76 не содержат N-концевого метионина. Если полипептид согласно изобретению получают в результате трансляции в биологическом хозяине, то требуется стартовый кодон, который будет обеспечивать наличие N-концевого метионина у большинства хозяев. Таким образом, полипептид согласно изобретению будет, по меньшей мере, на стадии возникновения, включать остаток метионина, расположенный выше указанной последовательности.
В некоторых вариантах полипептид имеет один метионин на N-конце, непосредственно за которым следует последовательность; в других вариантах может быть использована более длинная расположенная выше последовательность. Такая расположенная выше последовательность может быть короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности для управления транспортом белка или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновые метки, т.е. Hisn, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более). Другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области.
Полипептид согласно изобретению также может включать аминокислоты, расположенные ниже конечной аминокислоты последовательностей. Такие C-концевые удлинения могут быть короткими (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают последовательности для управления транспортом белков, короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, содержащие гистидиновые метки, т.е. Hisn, где n=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более), или последовательности, которые повышают стабильность полипептида. Другие подходящие C-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов а данной области.
Термин "полипептид" относится к полимерам аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и он может прерываться неаминокислотными остатками. Термины также охватывают полимер аминокислот, который был модифицирован естественным образом или в результате вмешательства; например, образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой обработки, или такой модификации, как конъюгирование с метящим компонентом. Также в указанное определение включены, например, полипептиды, содержащие один или несколько аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Полипептиды могут быть в виде отдельных цепей или ассоциированных цепей.
Полипептиды согласно изобретению могут быть связаны или иммобилизованы на твердой подложке.
Полипептиды согласно изобретению могут содержать регистрируемую метку, например, радиоактивную метку, флуоресцирующую метку или биотиновую метку. Такие полипептиды особенно применимы в способах иммуноанализа.
Как описано в публикации 13, fHBP может быть расщеплен на три домена, называемых A, B и C. Если рассматривать последовательность SEQ ID NO: 1, то три домена представляют собой домены (A) 1-119, (B) 120-183 и (C) 184-274:
зрелый
Зрелую форму домена "A" от Cys-20 на N-конце до Lys-119 называют "A".
зрелый
Известно множество последовательностей fHBP, и их можно легко выравнивать, используя стандартные способы. С помощью таких выравниваний специалист может идентифицировать (a) домены "A" (и "A"), "B" и "C" в любой данной последовательности fHBP благодаря сравнению с координатами в последовательности MC58, и (b) отдельные остатки в различных последовательностях fHBP, например, для идентификации замен. Однако для упрощения ссылок домены определены ниже:
- Домен "A" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Met-1 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Lys-119 последовательности SEQ ID NO: 1.
зрелый
- Домен "A" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Cys-20 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Lys-119 последовательности SEQ ID NO: 1.
- Домен "B" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Gln-120 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Gly-183 последовательности SEQ ID NO: 1.
- Домен "C" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Lys-184 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Gln-274 последовательности SEQ ID NO: 1.
Предпочтительным алгоритмом попарного выравнивания для определения доменов является алгоритм глобального выравнивания Нидлемана-Вунша [15] с использованием параметров по умолчанию (например, с использованием штрафа за открытие пробела =10,0 и штрафа за удлинение пробела = 0,5, используя матрицу подсчета EBLOSUM62). Такой алгоритм осуществляется в программе NEEDLE из пакета EMBOSS [16].
В некоторых вариантах полипептид согласно изобретению укорочен с удалением его домена A, т.е. домен A исключен из последовательности.
В некоторых вариантах полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая описана выше, за исключением того, что до 10 аминокислот (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) на N-конце и/или до 10 аминокислот (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) на C-конце делетированы. Таким образом, в изобретении предлагается полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая включает фрагмент аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76 и 77, при этом указанный фрагмент представляет собой аминокислоты a-b указанной последовательности, где a означает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11, и где b означает j, j-1, j-2, j-3, j-4, j-5, j-6, j-7, j-8, j-9 или j-10, где j означает длину указанной последовательности. Также можно использовать более длинные укорочения (например, до 15 аминокислот, до 20 аминокислот и т.д.).
Нуклеиновые кислоты
Изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид согласно изобретению, который определен выше.
Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть получены различными способами, например химическим синтезом (например, фосфорамидитным синтезом ДНК) полностью или частично, расщеплением более длинных нуклеиновых кислот с использованием нуклеаз (например, ферментов рестрикции), связыванием более коротких нуклеиновых кислот или нуклеотидов (например, с использованием лигаз или полимераз), из библиотек геномной или кДНК и т.д.
Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут иметь различные формы, например, однонитевые, двунитевые, векторы, праймеры, зонды, меченые, немеченые и т.д.
Нуклеиновые кислоты согласно изобретению предпочтительно находятся в изолированной или, по существу, изолированной форме.
Термин "нуклеиновая кислота" включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные остовы, а также пептидонуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.
Нуклеиновую кислоту согласно изобретению можно метить, например, радиоактивной или флуоресцентной меткой.
Изобретение также относится в векторам (таким как плазмиды), содержащим нуклеотидные последовательности согласно изобретению (например, клонирующим или экспрессирующим векторам, таким как векторы, подходящие для иммунизации нуклеиновыми кислотами) и клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами.
Бактерицидные ответы
Предпочтительные полипептиды согласно изобретению могут вызывать гуморальный ответ в виде антител, которые являются бактерицидными по отношению к менингококкам. Образование бактерицидных антител обычно измеряют у мышей, и они являются стандартным показателем эффективности вакцины [например, см. сноска 14 в публикации 2]. Полипептиды согласно изобретению предпочтительно могут вызывать гуморальный ответ, который является бактерицидным против, по меньшей мере, одного штамма N. meningitidis из каждой из, по меньшей мере, двух из следующих трех групп штаммов:
(I) MC58, gbl85 (=M01-240185), m4030, m2197, m2937, iss1001, NZ394/98, 67/00, 93/114, bz198, m1390, nge28, Inp17592, 00-241341, f6124, 205900, m198/172, bz133, gb149 (=M01-240149), nm008, nm092, 30/00, 39/99, 72/00, 95330, bz169, bz83, cu385, h44/76, m1590, m2934, m2969, m3370, m4215, m4318, n44/89, 14847.
(II) 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, a22, gb013 (=M01-240013), e32, m1090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, ell, m986, m2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, m3697, ngh38, L93/4286.
(III) M1239, 16889, gb355 (=M01-240355), m3369, m3813, ngp165.
Например, полипептид может вызывать бактерицидный ответ, эффективный против двух или трех штаммов N. meningitidis серогруппы В МС58, 961-5945 и М1239.
Полипептид предпочтительно может вызывать гуморальный ответ в виде антител, которые являются бактерицидными против, по меньшей мере, 50% клинически значимых менингококковых штаммов серогруппы В (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более). Полипептид может вызывать гуморальный ответ, который является бактерицидным против штаммов N. meningitidis серогруппы В и штаммов, по меньшей мере, одной (например 1, 2, 3, 4) из серогрупп А, С, W135 и Y. Полипептид может вызывать гуморальный ответ, который является бактерицидным против штаммов N. gonorrhoeae и/или N. cinerea. Полипептид может вызывать ответ, который является бактерицидным против штаммов, по меньшей мере, двух из трех основных ветвей дендрограммы, показанной на фигуре 5 в публикации 4.
Полипептид может вызывать гуморальный ответ, который является бактерицидным против штаммов N. meningitidis, по меньшей мере, 2 (например 2, 3, 4, 5, 6, 7) гипервирулентных линий ЕТ-37, ЕТ-5, кластера А4, линии 3, подгруппы I, подгруппы III и подгруппы IV-1 [17,18]. Полипептиды могут дополнительно индуцировать бактерицидные гуморальные ответы в виде антител против одной или нескольких гиперинвазивных линий.
Полипептиды могут вызывать гуморальный ответ в виде антител, бактерицидных против штаммов N. meningitidis, по меньшей мере, 2 (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7) из следующих типов многолокусных последовательностей: ST1, ST4, ST5, ST8, ST11, ST32 и ST41 [19]. Полипептид также может вызывать гуморальный ответ в виде антител, которые являются бактерицидными против штаммов ST44.
10
11
12
13
14
15
16
17
18
14
Полипептид не должен индуцировать бактерицидные антитела против всех без исключения штаммов МеnВ в пределах конкретных линий или MLST; а для любой данной группы из четырех или более штаммов менингококка серогруппы В в пределах конкретной гипервирулентной линии или MLST антитела, индуцированные композицией, предпочтительно являются бактерицидными против, по меньшей мере, 50% (например 60%, 70%, 80%, 90% или более) группы. Предпочтительные группы штаммов будут включать штаммы, выделенные, по меньшей мере, в четырех из следующих стран: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR и CU. Сыворотка предпочтительно имеет бактерицидный титр, по меньшей мере, 1024 (например, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2, 2 или выше, предпочтительно, по меньшей мере, 2), т.е. сыворотка способна уничтожать, по меньшей мере, 50% тестируемых бактерий конкретного штамма при разведении 1:1024, например, как описано в пояснении 14 в публикации 2. Предпочтительные химерные полипептиды могут вызывать гуморальный иммунный ответ у мышей, который остается бактерицидным, даже когда сыворотку разводят 1:4096 или больше.
Иммунизация
Полипептиды согласно изобретению можно применять в качестве активного ингредиента иммуногенных композиций, и таким образом изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей полипептид согласно изобретению.
Изобретение также относится к способу, позволяющему вызывать гуморальный ответ у млекопитающего, включающему введение млекопитающему иммуногенной композиции согласно изобретению. Гуморальный ответ предпочтительно является защитным и/или бактерицидным гуморальным ответом. Изобретение также относится к полипептидам согласно изобретению для применения в таких способах.
Изобретение также относится к способу защиты млекопитающего от инфекции, вызванной Neisseria (например, менингококковой инфекции), включающему введение млекопитающему иммуногенной композиции согласно изобретению.
Изобретение относится к полипептидам согласно изобретению для применения в качестве лекарственных средств (например, в виде иммуногенных композиций или в виде вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Изобретение также относится к применению нуклеиновой кислоты, полипептида или антитела согласно изобретению в производстве лекарственного средства для предотвращения инфекции, вызванной Neisseria (например, менингококковой инфекции), у млекопитающего.
Млекопитающим предпочтительно является человек. Человек может быть взрослым или предпочтительно ребенком. В том случае, когда вакцина предназначена для профилактического применения, человек предпочтительно является ребенком (например, ребенком раннего возраста или новорожденным); в том случае, когда вакцина предназначена для терапевтического применения, человек предпочтительно является взрослым. Вакцина, предназначенная для детей, также может быть введена взрослым, например, для оценки безопасности, дозы, иммуногенности и т.д.
Применения и способы особенно применимы для профилактики/лечения заболеваний, включая без ограничения менингит (в частности, бактериальный, такой как менингококковый менингит) и бактериемию.
Эффективность терапевтического лечения можно проверить посредством мониторинга вызванной Neisseria инфекции после введения композиции согласно изобретению. Эффективность профилактического лечения можно тестировать посредством мониторинга иммунных ответов против fHBP после введения композиции. Иммуногенность композиций согласно изобретению можно определить посредством их введения тестируемым субъектам (например, детям в возрасте 12-16 месяцев, или в моделях на животных [20]) и последующего определения стандартных параметров, включая сывороточные бактерицидные антитела (SBA) и титры ELISA (GMT). Такие иммунные ответы, как правило, можно определить примерно через 4 недели после введения композиции и сравнить со значениями, определенными до введения композиции. Предпочтительно увеличение SBA, по меньшей мере, в 4 раза или 8 раз. При введении более одной дозы композиции можно осуществить более одного определения после введения.
Предпочтительные композиции согласно изобретению могут приводить к титру антител у пациента, который превосходит критерий серологической защиты в отношении каждого антигенного компонента для приемлемой части людей. Антигены и ассоциированные титры антител, выше которых хозяина считают сероконвертированным против антигена, хорошо известны, и такие титры публикуются такими организациями, как ВОЗ. Предпочтительно сероконвертировано более чем 80% статистически значимой выборки субъектов, более предпочтительно более чем 90%, еще более предпочтительно более чем 93% и наиболее предпочтительно 96-100%.
Композиции согласно изобретению, как правило, можно будет непосредственно вводить пациенту. Прямую доставку можно осуществлять парентеральной инъекцией (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или посредством ректального, перорального, вагинального, местного, трансдермального, интраназального, глазного, ушного, легочного или другого введения через слизистую оболочку. Предпочтительным является внутримышечное введение в бедро или плечо. Инъекцию можно осуществлять через иглу (например, иглу для подкожных вливаний), но альтернативно можно использовать безыгольную инъекцию. Типичная внутримышечная доза составляет около 0,5 мл.
Изобретение можно использовать для того, чтобы вызвать системную иммунную защиту и/или иммунную защиту, обеспечиваемую слизистой оболочкой.
Дозированная обработка может быть осуществлена по схеме с использованием однократной дозы или по схеме с использованием многократных доз. Многократные дозы можно использовать в схеме первичной иммунизации и/или в схеме бустер-иммунизации. После схемы введения первичных доз может следовать схема введения бустер-доз. Подходящий период времени между примирующими дозами (например, от 4 до 16 недель) и между примированием и реиммунизацией можно определить обычными способами.
Иммуногенная композиция согласно изобретению обычно будет содержать фармацевтически приемлемый носитель, который может представлять собой любое вещество, которое само по себе не индуцирует продукцию антител, опасных для пациента, получающего композицию, и которое можно вводить, не опасаясь чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые носители могут включать жидкости, такие как вода, физиологический раствор соли, глицерин и этанол. Вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, вещества для pH-буферов и тому подобные, также могут присутствовать в таких наполнителях. Всестороннее обсуждение подходящих носителей приведено в публикации 21.
Инфекции, вызванные Neisseria, поражают различные системы организма и, следовательно, композиции согласно изобретению могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде инъекционных препаратов, либо в виде жидких растворов, либо суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Композиция может быть приготовлена для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Композиция может быть приготовлена для перорального введения, например, в виде таблетки или капсулы, или в виде сиропа (необязательно с корригентами). Композиция может быть приготовлена для легочного введения, например в виде ингалятора, с использованием тонкодисперсного порошка или спрея. Композиция может быть приготовлена в виде суппозитория или пессария. Композиция может быть приготовлена для назального, ушного или глазного введения, например, в виде капель.
Композиция предпочтительно является стерильной. Предпочтительно композиция является апирогенной. Предпочтительно она забуферена, например, от pH 6 до pH 8, обычно около pH 7. В том случае, когда композиция содержит соль гидроксида алюминия, предпочтительно используют гистидиновый буфер [22]. Композиции согласно изобретению могут быть изотоничными для организма человека.
Иммуногенные композиции содержат иммунологически эффективное количество иммуногена, а также, при необходимости, любые другие определенные компоненты. Под "иммунологически эффективным количеством" подразумевают, что введение такого количества пациенту, либо в однократной дозе, либо в виде части серии доз, является эффективным для лечения или профилактики. Такое количество варьируется в зависимости от состояния здоровья и физического состояния пациента, подвергаемого лечению, возраста, таксономической группы пациента, подвергаемого лечению (например, примата, не являющегося человеком, примата и т.д.), способности индивидуальной иммунной системы синтезировать антитела, степени требуемой защиты, состава вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других важных факторов. Предполагается, что количество будет иметь относительно широкий диапазон, который может быть определен в обычных испытаниях. Дозированная обработка может быть осуществлена по схеме с использованием однократной дозы или по схеме с использованием многократных доз (например, включая бустер-дозы). Композицию можно вводить вместе с другими иммунорегулирующими средствами.
Адъюванты, которые можно использовать в композициях согласно изобретению, включают без ограничения:
A. Композиции, содержащие минеральные вещества
Содержащие минеральные вещества композиции, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция. Изобретение предусматривает наличие минеральных солей, таких как гидроксиды (например, гидроокиси), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [например, см. главы 8 и 9 в публикации 23] или смеси различных минеральных соединений, при этом соединения имеют любую подходящую форму (например, гель, кристаллическое вещество, аморфное вещество и т.д.), и при этом предпочтительна адсорбция. Содержащие минеральные вещества композиции также могут быть приготовлены в виде частицы соли металла [24].
4
3+
Применимый адъювант на основе фосфата алюминия представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением PO/Al от 0,84 до 0,92, включаемый в количестве 0,6 мг Al/мл.
B. Масляные эмульсии
Композиции в виде масляных эмульсий, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают эмульсии типа "сквален в воде", такие как MF59 [глава 10 в публикации 23; см. также ссылку 25] (5% сквален, 0,5% твин-80 и 0,5% Span 85, приготовленные в виде субмикронных частиц с использованием микрофлюидизатора). Также можно использовать полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA).
Применимые эмульсии типа "масло в воде" обычно содержат, по меньшей мере, одно масло и, по меньшей мере, одно поверхностно-активное вещество, при этом масло (масла) и поверхностно-активное вещество (вещества) являются биоразрушаемыми (метаболизируемыми) и биосовместимыми. Капельки масла в эмульсии обычно имеют диаметр менее 1 мкм, при этом такие небольшие размеры достигаются с использованием микрофлюидизатора для того, чтобы получить стабильные эмульсии. Капельки размером менее 220 нм являются предпочтительными, так как их можно подвергать стерилизации фильтрованием.
Эмульсия может содержать такие масла, как масла, полученные из животного (например, рыб) или растительного источника. Источниками растительных масел являются орехи, семена и зерна. Арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло и оливковое масло являются наиболее доступными примерами масел из орехов. Можно использовать, например, масло жожоба, получаемое из бобов жожоба. Масла из семян включают сафлоровое масло, масло из семян хлопка, масло из семян подсолнечника, масло из семян кунжута и тому подобные. В группе зерновых наиболее легко доступным является кукурузное масло, но также можно использовать масло из других зерновых культур, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тэфф, тритикале и тому подобные. Сложные эфиры 6-10-углеродных жирных кислот и глицерина и 1,2-пропандиола, хотя и не встречаются в природе в маслах из семян, могут быть получены в результате гидролиза, разделения и этерификации соответствующих веществ, исходно получаемых из масел орехов и семян. Жиры и масла из молока млекопитающих могут метаболизироваться, и поэтому их можно использовать при практическом осуществлении настоящего изобретения. Способы разделения, очистки, омыления и другие способы, необходимые для получения чистых масел из животных источников, хорошо известны в данной области. Большинство рыб содержат метаболизируемые жиры, которые могут быть легко извлечены. Например, жир печени трески, жир печени акулы и китовый жир, такой как спермацет, являются примерами некоторых рыбьих жиров, которые можно использовать в настоящем изобретении. Несколько жиров с разветвленными цепями синтезируются биохимически в виде 5-углеродных изопреновых единиц, которые обычно называют терпеноидами. Жир печени акулы содержит разветвленные ненасыщенные терпеноиды, известные как сквален, 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексаен, который является особенно предпочтительным для настоящего изобретения. Сквалан, насыщенный аналог сквалена, также представляет собой предпочтительный жир. Рыбьи жиры, включая сквален и сквалан, легко доступны из коммерческих источников или могут быть получены способами, известными в данной области. Другими предпочтительными маслами являются токоферолы (см. ниже). Можно использовать смеси масел.
TM
TM
Поверхностно-активные вещества можно классифицировать по их "HLB" (гидрофильный/липофильный баланс). Предпочтительные поверхностно-активные вещества согласно изобретению имеют HLB, по меньшей мере, равный 10, предпочтительно, по меньшей мере 15 и более предпочтительно, по меньшей мере 16. В изобретении можно использовать поверхностно-активные вещества, включая без ограничения: поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана (обычно называемых твинами), особенно полисорбат 20 и полисорбат 80; сополимеры этиленоксида (EO), пропиленоксида (PO) и/или бутиленоксида (BO), продаваемые под торговой маркой DOWFAX, такие как линейные блок-сополимеры EO/PO; октоксинолы, которые могут варьировать по количеству повторяющихся групп этокси(окси-1,2-этандиила), при этом особый интерес представляет октоксинол-9 (тритон X-100 или трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол); (октилфенокси)полиэтоксиэтанол (IGEPAL CA-630/NP-40); фосфолипиды, такие как фосфатидилхолин (лецитин); нонилфенолэтоксилаты, такие как серии NP Tergitol; простые жирные эфиры полиоксиэтилена, полученные из лаурилового, цетилового, стеарилового и олеилового спиртов (известные как поверхностно-активные вещества Brij), такие как монолауриловый эфир триэтиленгликоля (Brij 30); и сложные эфиры сорбитана (обычно известные как SPAN), такие как триолеат сорбитана (Span 85) и монолаурат сорбитана. Предпочтительными являются неионогенные поверхностно-активные вещества. Предпочтительными поверхностно-активными веществами для включения в эмульсию являются твин-80 (моноолеат полиоксиэтиленсорбитана), Span 85 (триолеат сорбитана), лецитин и тритон X-100.
Можно использовать смеси поверхностно-активных веществ, например смеси твин-80/Span 85. Также подходящим является сочетание сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана, такого как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана (твин-80), и октоксинола, такого как трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанол (тритон X-100). Другое применимое сочетание содержит лаурет 9 плюс сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана и/или октоксинол.
Предпочтительные количества поверхностно-активных веществ (% масс.) составляют: сложные эфира полиоксиэтиленсорбитана (такие как твин-80) от 0,01 до 1%, в частности примерно 0,1 %; октил- или нонилфеноксиполиоксиэтанолы (такие как тритон X-100 или другие детергенты в серии тритона) от 0,001 до 0,1 %, в частности от 0,005 до 0,02%; простые эфиры полиоксиэтилена (такие как лаурет 9) от 0,1 до 20 %, предпочтительно от 0,1 до 10% и, в частности от 0,1 до 1% или около 0,5%.
Предпочтительно, по существу, все (например, по меньшей мере, 90% по количеству) капельки масла имеют диаметр менее 1 мкм, например ≤750 нм, ≤500 нм, ≤400 нм, ≤300 нм, ≤250 нм, ≤220 нм, ≤200 нм или меньше.
Одна конкретная применимая субмикронная эмульсия сквалена, твина-80 и Span 85. В состав эмульсии по объему может входить примерно 5% сквалена, примерно 0,5% полисорбата 80 и примерно 0,5% Span 85. По массе такие соотношения составляют 4,3% сквалена, 0,5% полисорбата 80 и 0,48% Span 85. Такой адъювант известен как "MF59" [26-28], и более подробно описан в главе 10 в публикации 29 и в главе 12 в публикации 30. Эмульсия MF59 преимущественно содержит ионы цитрата, например 10 мМ натрий-цитратный буфер.
C. Сапониновые препараты [глава 22 в публикации 23]
Сапониновые препараты также можно использовать в качестве адъювантов в изобретении. Сапонины представляют собой гетерогенную группу стериновых гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые встречаются в коре, листьях, стеблях, корнях и даже в цветках широкого круга видов растений. Сапонин из коры дерева Quillaia saponaria Molina широко исследовали в качестве адъюванта. Сапонин также может быть получен коммерческим путем из Smilax ornata (сарсапарель), Gypsophilla paniculata (гипсофилла метельчатая) и Saponaria officianalis (мыльный корень). Препараты сапониновых адъювантов включают очищенные препараты, такие как QS21, а также жидкие препараты, такие как ISCOM. QS21 продают как StimulonTM.
Сапониновые композиции очищали, используя ВЭЖХ и обращено-фазовую ВЭЖХ. С использованием таких методик идентифицировали конкретные очищенные фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. Предпочтительно сапонин представляет собой QS21. Способ получения QS21 описан в публикации 31. Препараты сапонина также могут содержать стерин, такой как холестерин [32].
Сочетания сапонинов и холестеринов можно использовать для образования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) [глава 23 в публикации 23]. ISCOM обычно также содержат фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Любой известный сапонин можно использовать в ISCOM. Предпочтительно ISCOM включает один или несколько QuilA, QHA и QHC. ISCOM дополнительно описаны в публикациях 32-34. Необязательно ISCOM могут не содержать дополнительных детергентов [35].
Обзор разработки основанных на сапонине адъювантов можно найти в публикациях 36 и 37.
D. Виросомы и вирусоподобные частицы
Виросомы и вирусоподобные частицы (VLP) также можно использовать в изобретении в качестве адъювантов. Такие структуры обычно содержат один или несколько белков из вируса, необязательно в сочетании или приготовленные вместе с фосфолипидом. Они обычно являются непатогенными, не реплицирующимися и обычно не содержат нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть рекомбинантно получены или выделены из целых вирусов. Такие вирусные белки, подходящие для применения в виросомах или VLP, включают белки, полученные из вируса гриппа (такие как HA или NA), вируса гепатита B (такие как коровые или капсидные белки), вируса гепатита E, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящура, ретровируса, вируса Норуолк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, Qβ-фага (такие как белки оболочки), GA-фага, fr-фага, фага AP205 и Ty (такие как белок pi ретротранспозона Ty). VLP дополнительно описаны в публикациях 38-43. Виросомы дополнительно обсуждаются, например, в публикации 44.
E. Бактериальные или микробные производные
Адъюванты, подходящие для применения в изобретении, включают бактериальные или микробные производные, такие как нетоксичные производные липополисахарида энтеробактерий (LPS), производные липида A, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и АДФ-рибозилирующие токсины и их детоксицированные производные.
Нетоксичные производные LPS включают монофосфорил-липид A (MPL) и 3-O-деацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3-де-O-ацилированного монофосфорил-липида A с 4-, 5- или 6-ацилированными цепями. Предпочтительная форма в виде "малых частиц" 3-де-O-ацилированного монофосфорил-липида A описана в публикации 45. Такие "малые частицы" 3dMPL достаточно малы, чтобы их можно было стерильно фильтровать через мембрану 0,22 мкм [45]. Другие нетоксичные производные LPS включают миметики монофосфорил-липида A, такие как производные фосфата аминоалкилглюкозаминида, например RC-529 [46, 47].
Производные липида A включают производные липида A Escherichia coli, такие как OM-174. OM-174 описан, например, в публикациях 48 и 49.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают нуклеотидные последовательности, содержащие мотив CpG (динуклеотидная последовательность, содержащая неметилированный цитозин, связанный фосфатной связью с гуанозином). Также показано, что двунитевые РНК и олигонуклеотиды, содержащие палиндромные или поли(dG)-последовательности, являются иммуностимулирующими.
CpG могут включать модификации/аналоги нуклеотидов, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двунитевыми или однонитевыми. В публикациях 50, 51 и 52 раскрыты возможные замены аналогами, например, замена гуанозина на 2'-дезокси-7-деазагуанозин. Адъювантное действие олигонуклеотидов CpG дополнительно обсуждается в публикациях 53-58.
Последовательность CpG может быть направлена к TLR9, например мотиву GTCGTT или TTCGTT [59]. Последовательность CpG может быть специфичной в отношении индукции иммунного ответа Th1, например ODN CpG-A, или она может быть более специфичной в отношении индукции B-клеточного ответа, например ODN CpG-B. ODN CpG-A и CpG-B обсуждаются в публикациях 60-62. Предпочтительно CpG представляет собой ODN CpG-A.
Предпочтительно олигонуклеотид CpG конструируют так, чтобы 5'-конец был доступен для узнавания рецептором. Необязательно две олигонуклеотидные последовательности CpG могут быть связаны своими 3'-концами с образованием "иммуномеров". См., например, публикации 59 и 63-65.
Особенно применимый адъювант, основанный на иммуностимулирующих олигонуклеотидах, известен как IC31TM [66]. Таким образом, адъювант, используемый в изобретении, может содержать смесь (i) олигонуклеотида (например, из 15-40 нуклеотидов), включающего, по меньшей мере, один (и предпочтительно несколько) мотивов CpI (т.е., цитозин, связанный с инозином с образованием динуклеотида), и (ii) поликатионного полимера, такого как олигопептид (например, из 5-20 аминокислот), включающий, по меньшей мере, одну (и предпочтительно несколько) трипептидных последовательностей Lys-Arg-Lys. Олигонуклеотид может представлять собой дезоксинуклеотид, содержащий 26-мерную последовательность 5'-(IC)13-3' (SEQ ID NO: 81). Поликатионный полимер может представлять собой пептид, содержащий 11-мерную аминокислотную последовательность KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 82).
Бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины и их детоксицированные производные можно использовать в качестве адъювантов в изобретении. Предпочтительно белок получают из E. coli (термолабильный энтеротоксин E. coli "LT"), бактерии, вызывающей холеру ("CT") или коклюш ("PT"). Применение детоксицированных АДФ-рибозилирующих токсинов в качестве мукозальных адъювантов описано в публикации 67 и в качестве парентеральных адъювантов в публикации 68. Токсин или токсоид предпочтительно имеет форму голотоксина, содержащего субъединицы A и B. Предпочтительно субъединица A содержит детоксицирующую мутацию; предпочтительно субъединица B не имеет мутаций. Предпочтительно адъювант является детоксицированным мутантом LT, таким как LT-K63, LT-R72 и LT-G192. Применение АДФ-рибозилирующих токсинов и их детоксицированных производных, особенно LT-K63 и LT-R72, в качестве адъювантов, можно найти в публикациях 69-76. Используемым мутантом CT является CT-E29H [77]. Указание аминокислотных замен числами предпочтительно основано на выравниваниях субъединиц A и B АДФ-рибозилирующих токсинов, указанных в публикации 78, специально включенной в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.
F. Иммуномодуляторы человека
Иммуномодуляторы человека, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [79] и т.д.) [80], интерфероны (например, интерферон-γ), колониестимулирующий фактор макрофагов и фактор некроза опухолей. Предпочтительным иммуномодулятором является IL-12.
G. Биоадгезивы и мукоадгезивы
Биоадгезивы и мукоадгезивы также можно использовать в качестве адъювантов в изобретении. Подходящими биоадгезивами являются микросферы из этерифицированной гиалуроновой кислоты [81] или мукоадгезивы, такие как поперечно сшитые производные поли(акриловой кислоты), поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисахариды и карбоксиметилцеллюлоза. Хитозан и его производные также можно использовать в качестве адъювантов в изобретении [82].
H. Микрочастицы
Микрочастицы также можно использовать в качестве адъювантов в изобретении. Микрочастицы (т.е. частица диаметром от ~100 нм до ~150 мкм, более предпочтительно диаметром от ~200 нм до ~30 мкм и наиболее предпочтительно диаметром от ~500 нм до ~10 мкм), образованные из веществ, которые являются биоразрушаемыми и нетоксичными (например, из поли(α-оксикислоты), полигидроксимасляной кислоты, сложного полиортоэфира, полиангидрида, поликапролактона и т.д.), с сополимером поли(лактид-гликолид) являются предпочтительными, необязательно обработанными так, чтобы они имели отрицательно заряженную поверхность (например, с использованием SDS) или положительно заряженную поверхность (например, с использованием катионогенного детергента, такого как CTAB).
L. Липосомы (главы 13 и 14 в публикации 23)
Примеры липосомных препаратов, подходящих для применения в качестве адъювантов, описаны в публикациях 83-85.
J. Препараты на основе простого эфира полиоксиэтилена и сложного эфира полиоксиэтилена
Адъюванты, подходящие для применения в изобретении, включают простые эфиры полиоксиэтилена и сложные эфиры полиоксиэтилена [86]. Такие препараты дополнительно содержат поверхностно-активные вещества на основе сложных эфиров полиоксиэтиленсорбитана в сочетании с октоксинолом [87], а также поверхностно-активные вещества на основе простых и сложных алкиловых эфиров полиоксиэтилена в сочетании, по меньшей мере, с одним дополнительным неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [88]. Предпочтительные простые эфиры полиоксиэтилена выбраны из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет 9), полиоксиэтилен-9-стеориловый эфир, полиоксиэтилен-8-стерориловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.
K. Полифосфазен (PCPP)
Препараты PCPP описаны, например, в публикациях 89 и 90.
L. Мурамил-содержащие пептиды
Примеры пептидов, содержащих мурамил, подходящих для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP) и N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин MTP-PE).
M. Соединения имидазохинолона.
Примеры соединений имидазохинолона, подходящих для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают Imiquamod и его гомологи (например "Resiquimod 3M"), дополнительно описанные в публикациях 91 и 92.
Изобретение также может включать сочетания аспектов, связанных с одним или несколькими адъювантами, идентифицированными выше. Например, в изобретении можно использовать следующие адъювантные композиции: (1) сапонин и эмульсию типа "масло в воде" [93]; (2) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) [94]; (3) сапонин (например, QS21) + нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) + холестерин; (4) сапонин (например, QS21) + 3dMPL + IL-12 (необязательно + стерин) [95]; (5) сочетания 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями типа "масло в воде" [96]; (6) SAF, содержащий 10% сквален, 0,4% твин 80TM, 5% блокполимер плюроник L121 и thr-MDP, либо микрофлюидизированный до субмикронной эмульсии, либо перемешанный со встряхиванием до образования эмульсии с более крупным размером частиц; (7) адъювантная система RibiTM (RAS), (Ribi Immunochem), содержащая 2% сквален, 0,2% твин-80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно MPL + CWS (DetoxTM); и (8) одна или несколько минеральных солей (таких как соль алюминия) + нетоксичное производное LPS (такое как 3dMPL).
Другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие средства, описаны в главе 7 публикации 23.
Применение адъюванта, состоящего из гидроксида алюминия и/или фосфата алюминия, является особенно предпочтительным, и антигены обычно адсорбируют на таких солях. Другие предпочтительные сочетания адъювантов включают сочетания адъювантов Th1 и Th2, таких как CpG и квасцы или резихимод и квасцы. Можно использовать сочетание фосфата алюминия и 3dMPL.
Дополнительные антигенные компоненты
Композиции согласно изобретению включают модифицированные последовательности fHBP. Считается пригодным, если композиция не включает сложные или неопределенные смеси антигенов, например, предпочтительно композиция не включает везикулы наружной мембраны. Полипептиды согласно изобретению предпочтительно экспрессируют рекомбинантно в гетерологичном хозяине и затем очищают.
Наряду с наличием последовательности fHBP композиция согласно изобретению также может включать один или несколько дополнительных антигенов Neisseria, так как вакцина, которая направлена против более чем одного антигена на бактерию, уменьшает вероятность селекции "ускользающих" мутантов. Таким образом, композиция может включать второй полипептид, который при введении млекопитающему вызывает гуморальный ответ в виде антител, которые являются бактерицидными против менингококка. Второй полипептид не будет являться менингококковым fHBP, но он может представлять собой, например, последовательность 287, последовательность NadA, последовательность 953, последовательность 936 и т.д.
Антигены, которые можно вводить в композиции, включают полипептиды, содержащие один или несколько из следующих компонентов:
(a) 446 четных последовательностей (т.е. SEQ ID NO: 2, 4, 6,.., 890, 892), описанных в публикации 97.
(b) 45 четных последовательностей (т.е. SEQ ID NO: 2, 4, 6,.., 88, 90), описанных в публикации 98;
(c) 1674 четных последовательностей SEQ ID NO: 2-3020, четных последовательностей SEQ ID NO: 3040-3114 и все последовательности SEQ ID NO: 3115-3241, описанные в публикации 3;
(d) 2160 аминокислотных последовательностей NMB0001-NMB2160, указанных в публикации 2;
(e) менингококковый белок PorA любого подтипа, предпочтительно рекомбинантно экспрессированный;
(f) вариант, гомолог, ортолог, паралог, мутант и т.д. пептидов по пп.(a)-(e); или
(g) препарат везикул наружной мембраны N. meningitidis [например, см. ссылку 160].
Кроме полипептидных антигенов Neisseria композиция может содержать антигены для иммунизации против других заболеваний или инфекций. Например, композиция может содержать один или несколько из следующих дополнительных антигенов:
- сахаридный антиген из N. meningitidis серогруппы A, C, W135 и/или Y, такой как сахарид, описанный в публикации 99, из серогруппы C [см. также ссылку 100] или в публикации 101;
- сахаридный антиген из Streptococcus pneumoniae [например, 102, 103, 104];
- антиген вируса гепатита A, такой как инактивированный вирус [например, 105, 106];
- антиген вируса гепатита B, такой как поверхностные и/или коровые антигены [например, 106, 107];
- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный токсоид [например, глава 3 в публикации 108], например, мутант CRM197 [например, 109];
- столбнячный антиген, такой как столбнячный токсоид [например, глава 4 в публикации 108];
- антиген из Bordetella pertussis, такой как коклюшный голотоксин (PT) и нитчатый гемагглютинин (FHA) из B. pertussis, необязательно также в сочетании с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3 [например, публикации 110 и 111];
- сахаридный антиген из Haemophilus influenzae B [например, 100];
- антиген (антигены) полиомиелита [например, 112, 113], такой как IPV;
- антигены кори, эпидемического паротита и/или краснухи [например, главы 9, 10 и 11 в публикации 108];
- антиген (антигены) гриппа [например, глава 19 в публикации 108], такие как гемагглютинин и/или нейраминидазные поверхностные белки;
- антиген из Moraxella catarrhalis [например, 114];
- белковый антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группы B) [например, 115, 116];
- сахаридный антиген из Streptococcus agalactiae (стрептококк группы B);
- антиген из Streptococcus pyogenes (стрептококк группы A) [например 116, 117, 118];
- антиген из Staphylococcus aureus [например 119].
Композиция может содержать один или несколько из таких дополнительных антигенов.
Токсичные белковые антигены при необходимости могут быть детоксицированы (например, детоксикация коклюшного токсина химическими и/или генетическими способами [111]).
В том случае, когда в композицию введен дифтерийный антиген, предпочтительно также вводят столбнячный антиген и коклюшный антиген. Подобным образом, когда вводят столбнячный антиген, предпочтительно также вводят дифтерийный и коклюшный антигены. Подобным образом, когда вводят коклюшный антиген, предпочтительно также вводят дифтерийный и столбнячный антигены. Таким образом, предпочтительны сочетания DTP.
Сахаридные антигены предпочтительно имеют форму конъюгатов. Белки-носители для конъюгатов более подробно обсуждаются ниже.
Антигены в композиции обычно будут присутствовать в концентрации, составляющей, по меньшей мере, 1 мкг/мл для каждого. В общем, концентрация любого данного антигена будет достаточной, чтобы вызвать иммунный ответ против такого антигена.
Иммуногенные композиции согласно изобретению можно применять терапевтически (т.е. для лечения существующей инфекции) или профилактически (т.е. для предотвращения будущей инфекции).
В качестве альтернативы применению белковых антигенов в иммуногенных композициях согласно изобретению можно использовать нуклеиновую кислоту (предпочтительно ДНК, например, в форме плазмиды), кодирующую антиген.
В некоторых вариантах композиция согласно изобретению содержит кроме последовательности fHBP конъюгированные капсулярные сахаридные антигены из 1, 2, 3 или 4 менингококковых серогрупп A, C, W135 и Y. В других вариантах композиция согласно изобретению содержит кроме последовательности fHBP, по меньшей мере, один конъюгированный пневмококковый капсулярный сахаридный антиген.
Серогруппы менингококков Y, W135, C и A
TM
TM
TM
TM
TM
TM
TM
197
Современные вакцины серогруппы C (Menjugate [120, 99], Meningitec и NeisVac-C) содержат конъюгированные сахариды. Menjugate и Meningitec имеют олигосахаридные антигены, конъюгированные с носителем CRM, тогда как для NeisVac-C используют полный полисахарид (де-O-ацетилированный) конъюгированный с носителем в виде столбнячного токсоида. Вакцина Menactra содержит конъюгированные капсулярные сахаридные антигены из каждой из серогрупп Y, W135, C и A.
Композиции согласно настоящему изобретению могут содержать капсулярные сахаридные антигены из одной или нескольких серогрупп менингококков Y, W135, C и A, при этом антигены конъюгированы с белком-носителем (белками-носителями) и/или представляют собой олигосахариды. Например, композиция может содержать капсулярный сахаридный антиген из: серогруппы C; серогрупп A и C; серогрупп A, C и W135; серогрупп A, C и Y; серогрупп C, W135 и Y; или из всех четырех серогрупп A, C, W135 и Y.
Типичное количество каждого менингококкового сахаридного антигена на дозу составляет от 1 мкг до 20 мкг, например примерно 1 мкг, примерно 2,5 мкг, примерно 4 мкг, примерно 5 мкг или примерно 10 мкг (выраженное в расчете на сахарид).
Когда смесь содержит капсулярные сахариды из обеих серогрупп A и C, соотношение (масс./масс.) сахарид MenA:сахарид MenC может быть больше 1 (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или выше). Когда смесь содержит капсулярные сахариды из серогруппы Y и одной или обеих серогрупп C и W135, соотношение (масс./масс.) сахарид Men Y:сахарид MenW135 может быть больше 1 (например, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или выше) и/или такое соотношение (масс./масс.) сахарид MenY:сахарид MenC может быть меньше 1 (например 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или ниже). Предпочтительные соотношения (масс./масс.) для сахаридов серогрупп A:C:W135:Y составляют: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2 и 2:2:2:1. Предпочтительные соотношения (масс./масс.) сахаридов из серогрупп C:W135:Y составляют: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1; и 2:1:1. Предпочтительно использование, по существу, равных масс каждого сахарида.
Капсулярные сахариды можно использовать в форме олигосахаридов. Они обычно образуются при фрагментации очищенного капсулярного полисахарида (например, посредством гидролиза), после которой обычно следует очистка фрагментов требуемого размера.
Фрагментацию полисахаридов предпочтительно осуществляют, получая конечную среднюю степень полимеризации (DP) в олигосахариде менее чем 30 (например, от 10 до 20, предпочтительно около 10 для серогруппы A; от 15 до 25 для серогрупп W135 и Y, предпочтительно около 15-20; от 12 до 22 для серогруппы C; и т.д.). DP обычно можно измерить с использованием ионообменной хроматографии или с помощью колориметрических анализов [121].
Если осуществляют гидролиз, то гидролизат, как правило, будет подвергнут сортировке по размеру, чтобы удалить короткие олигосахариды [100]. Это можно осуществить различными путями, такими как ультрафильтрация с последующей ионообменной хроматографией. Олигосахариды со степенью полимеризации меньшей или равной примерно 6 предпочтительно удаляют в случае серогруппы A, и со степенью полимеризации меньшей чем примерно 4 предпочтительно удаляют в случае серогрупп W135 и Y.
TM
Предпочтительные сахаридные антигены MenC, которые используются в Menjugate, описаны в публикации 120.
Сахарид антиген может быть химически модифицирован. Что особенно применимо для восстанавливающего гидролиза в случае серогруппы A [122; см. ниже]. Может быть осуществлено де-O-ацетилирование менингококковых сахаридов. В случае олигосахаридов модификация может иметь место до или после деполимеризации.
Когда композиция согласно изобретению включает сахаридный антиген MenA, антиген предпочтительно является модифицированным сахаридом, в котором одна или несколько гидроксильных групп нативного сахарида были заменены блокирующей группой [122]. Такая модификация повышает устойчивость к гидролизу.
Ковалентное конъюгирование
Капсулярные сахариды в композициях согласно изобретению обычно могут быть конъюгированы с белком-носителем (белками-носителями). В общем, конъюгирование усиливает иммуногенность сахаридов, так как превращает их из T-независимых антигенов в T-зависимые антигены, таким образом обеспечивая примирование иммунологической памяти. Конъюгирование особенно применимо для педиатрических вакцин и является хорошо известной методикой.
TM
4+
Типичными белками-носителями являются бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины, или токсоиды или их мутанты. Применим мутант дифтерийного токсина CRM197 [123], и он является носителем в продукте PREVNAR. Другими подходящими белками-носителями являются комплекс белков наружной мембраны N. meningitidis [124], синтетические пептиды [125,126], белки теплового шока [127,128], коклюшные белки [129,130], цитокины [131], лимфокины [131], гормоны [131], факторы роста [131], искусственные белки, содержащие множественные эпитопы T-клеток CD человека из различных полученных из патогенов антигенов [132], такие как N19 [133], белок D из H. influenzae [134-136], пневмолизин [137] или его нетоксичные производные [138], пневмококковый поверхностный белок PspA [139], связывающие железо белки [140], токсин A или B из C. difficile [141], рекомбинантный экзобелок A P. aeruginosa (rEPA) [142] и т.д.
Можно использовать любую подходящую реакцию конъюгирования, при необходимости с любым подходящим линкером.
Сахарид обычно может быть активирован или функционализирован перед конъюгированием. Для активация можно использовать, например, цианилирующие реагенты, такие как CDAP (например, тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния [143, 144 и др.]). В других подходящих способах используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU и т.д.
Связывание через линкерную группу может быть осуществлено с использованием любого известного способа, например, способов, описанных в публикациях 145 и 146. Один из типов связывания заключается в восстановительном аминировании полисахарида, связывании полученной аминогруппы с одним концом линкерной группы на основе адипиновой кислоты и затем связывании белка с другим концом линкерной группы на основе адипиновой кислоты [147, 148]. Другие линкеры включают B-пропионамидогруппу [149], нитрофенилэтиламин [150], галоацилгалогениды [151], гликозидные связи [152], 6-аминокапроновую кислоту [153], ADH [154], остатки C4-C12 [155] и т.д. В качестве альтернативы применению линкера можно использовать прямое связывание. Прямое связывание с белком может включать окисление полисахарида с последующим восстановительным аминированием с использованием белка, как описано, например, в публикациях 156 и 157.
2
Предпочтительным является способ, который заключается во введении аминогрупп в сахарид (например, заменой концевых =O-групп группой -NH) с последующей дериватизацией сложными диэфирами адипиновой кислоты (например, сложным N-гидроксисукцинимидодиэфиром адипиновой кислоты) и взаимодействием с белком-носителем. В другой предпочтительной реакции используют активацию CDAP белком-носителем D, например, в случае MenA или MenC.
Везикулы наружной мембраны
Предпочтительно композиции согласно изобретению не должны содержать сложных или неопределенных смесей антигенов, которые обычно являются характерными для OMV. Однако изобретение можно применять вместе с OMV, так как было обнаружено, что fHBP усиливает их эффективность [6], в частности, в результате сверхэкспрессии полипептидов согласно изобретению в штаммах, используемых для получения OMV.
Такой способ, в общем, можно применять для улучшения препаратов микровезикул N. meningitidis серогруппы B [158], "нативных OMV" [159], пузырьков или везикул наружной мембраны [например, публикации 160-165 и т.д.]. Они могут быть получены из бактерий, которые были подвергнуты генетической обработке [166-169], например, для повышения иммуногенности (например, сверхэкспрессируют иммуногены), для уменьшения токсичности, для ингибирования синтеза капсулярных полисахаридов, для понижающей регуляции экспрессии PorA и т.д. Везикулы могут быть получены из штаммов со сверхпузырением [170-173]. Могут быть введены везикулы из непатогенных Neisseria [174]. OMV могут быть получены без применения детергентов [175, 176]. Они могут экспрессировать другие белки, отличные от белков Neisseria на своей поверхности [177]. Они могут быть истощены по LPS. Они могут быть смешаны с рекомбинантными антигенами [160, 178]. Можно использовать везикулы из бактерий с разными подтипами белков наружной мембраны класса I, например, шестью разными подтипами [179, 180], используя две разных популяции генетически сконструированных везикул, каждая из которых презентирует три подтипа, или девятью разными подтипами, используя три разных популяции генетически сконструированных везикул, каждая из которых презентирует три подтипа, и т.д. Применимыми подтипами являются P1.7,16, P1.5-1,2-2, P1.19,15-1, P1.5-2,10, P1.12-1,13, P1.7-2,4, P1.22,14, P1.7-1,1, P1.18-1,3,6.
Дополнительное подробное описание приведено ниже.
Экспрессия белков
Способы экспрессии в бактериях известны в данной области. Бактериальный промотор представляет собой любую последовательность ДНК, способную к связыванию бактериальной РНК-полимеразы и инициации транскрипции расположенной ниже (3') кодирующей последовательности (например, структурного гена) в мРНК. Промотор будет иметь область инициации транскрипции, которая обычно размещена проксимально по отношению к 5'-концу кодирующей последовательности. Такая область инициации транскрипции обычно включает участок связывания РНК-полимеразы и участок инициации транскрипции. Бактериальный промотор также может иметь второй домен, называемый оператором, который может перекрывать соседний участок связывания РНК-полимеразы, в котором начинается синтез РНК. Оператор обеспечивает негативно регулируемую (индуцируемую) транскрипцию, так как белок-репрессор гена может связывать оператор и тем самым ингибировать транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может происходить в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может быть достигнута с помощью последовательности, связывающей белок-активатор гена, которая в случае присутствия обычно находится проксимально (5') по отношению к последовательности, связывающей РНК-полимеразу. Примером белка-активатора гена является белок-активатор катаболитных оперонов (CAP), который помогает инициировать транскрипцию lac-оперона у Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. Следовательно, регуляция экспрессии может быть либо позитивной, либо негативной, тем самым либо усиливая, либо ослабляя транскрипцию.
Последовательности, кодирующие ферменты метаболических путей, обеспечивают особенно применимые промоторные последовательности. Примерами являются промоторные последовательности, полученные из последовательностей для ферментов, метаболизирующих сахара, такие как галактоза, лактоза (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198: 1056] и мальтоза. Дополнительными примерами являются промоторные последовательности, полученные из последовательностей для ферментов биосинтеза, таких как триптофан (trp) [Goeddel et al. (1980) NMC Acids Res. 8: 4057, Yelverton et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9: 731, патент США 4738921, EP-A-0036776 и EP-A-0121775]. Промоторная система β-лактамазы (bla) [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes" В Interferon 3 (ed. I. Gresser)], промоторные системы PL бактериофага лямбда [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128] и T5 [патент США 4689406] также обеспечивают применимые промоторные последовательности. Другим представляющим интерес промотором является индуцируемый промотор арабинозы (pBAD).
Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также функционируют в качестве бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного бактериального промотора или промотора бактериофага могут быть связаны с последовательностями оперона другого бактериального промотора или промотора бактериофага с образованием синтетического гибридного промотора [патент США 4551433]. Например, промотор tac является гибридным промотором trp-lac, состоящим из последовательностей промотора trp оперона lac, который регулируется репрессором lac [Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 50: 21]. Кроме того, бактериальным промотором могут быть встречающиеся в природе промоторы не бактериального происхождения, которые обладают способностью связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Встречающийся в природе промотор не бактериального происхождения также может сочетаться с совместимой РНК-полимеразой, давая высокие уровни экспрессии некоторых генов у прокариот. Система РНК-полимераза/промотор бактериофага T7 является примером такой сцепленной промоторной системы [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 52: 1074]. Кроме того, гибридный промотор также может состоять из промотора бактериофага и области оператора E. coli (EP-A-0267851).
Кроме функционирующей промоторной последовательности для экспрессии чужеродных генов у прокариот также применим эффективный сайт связывания с рибосомой. У E. coli сайт связывания с рибосомой называют последовательностью Шайн-Далгарно (SD), и она включает кодон инициации (ATG) и последовательность длиной 3-9 нуклеотидов, расположенную на 3-11 нуклеотидов выше кодона инициации. Считается, что последовательность SD стимулирует связывание мРНК с рибосомой благодаря спариванию оснований между последовательностью SD и 3'-концом рРНК 16S E. coli [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", в "Biological Regulation and Development: Gene Expression" (ed. R.F. Goldberger)], чтобы экспрессировать эукариотические гены и прокариотические гены со слабым сайтом связывания с рибосомой [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli", в "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"].
Промоторная последовательность может быть непосредственно связана с молекулой ДНК, и в таком случае первой аминокислотой на N-конце всегда будет метионин, который кодируется стартовым кодоном ATG. При желании метионин на N-конце может быть отщеплен от белка посредством инкубации in vitro с бромцианом или посредством инкубации либо in vivo, либо in vitro, с бактериальной пептидазой N-концевого метионина (EP-A-0219237).
Обычно последовательности терминации транскрипции, узнаваемые бактериями, представляют собой регуляторные области, локализованные с 3'-стороны от стоп-кодона трансляции, и, следовательно, вместе с промотором фланкирует кодирующую последовательность. Такие последовательности управляют транскрипцией мРНК, которая может быть транслирована в полипептид, кодируемый ДНК. Последовательности терминации транскрипции часто включают последовательности ДНК длиной примерно 50 нуклеотидов, способные образовывать структуры типа "стебель-петля", которые способствуют терминации транскрипции. Примерами являются последовательности терминации транскрипции, полученные из генов с сильными промоторами, таких как ген trp E. coli, а также другие гены биосинтеза.
Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, сигнальную последовательность (при необходимости), представляющую интерес кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, помещают вместе в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в репликоне, таком как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способный стабильно поддерживаться в хозяине, таком как бактерии. Репликон будет иметь систему репликации, позволяющую поддерживать его в прокариотическом хозяине либо для экспрессии, либо для клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может представлять собой либо высококопийную, либо низкокопийную плазмиду. Высококопийная плазмида обычно может иметь количество копий в диапазоне примерно от 5 до примерно 200 и обычно примерно от 10 до примерно 150. Хозяин, содержащий высококопийную плазмиду, предпочтительно будет содержать, по меньшей мере, примерно 10 и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 20 плазмид. Может быть выбран либо высококопийный, либо низкокопийный вектор, в зависимости от влияния вектора и чужеродного белка на хозяина.
Альтернативно экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в бактериальный геном с использованием интегрирующего вектора. Интегрирующие векторы обычно содержат, по меньшей мере, одну последовательность, гомологичную бактериальной хромосоме, которая позволяет вектору интегрироваться. Интеграции, по-видимому, являются результатом рекомбинаций между гомологичной ДНК в векторе и бактериальной хромосомой. Например, интегрирующие векторы, сконструированные с использованием ДНК из различных штаммов Bacillus, интегрируют в хромосому Bacillus (EP-A-0127328). Интегрирующие векторы также могут состоять из последовательностей бактериофага или транспозона.
Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут содержать селектируемые маркеры для обеспечения селекции бактериальных штаммов, которые были трансформированы. Селектируемые маркеры могут быть экспрессированы в бактериальном хозяине и могут содержать гены, которые придают бактериям резистентность к лекарственным средствам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин [Davies et al. (1978) Annu. Rev. Microbiol. 32: 469]. Селектируемые маркеры также могут включать гены биосинтеза, такие как гены, принимающие участие в путях биосинтеза гистидина, триптофана и лейцина.
Альтернативно некоторые из описанных выше компонентов могут быть помещены вместе в векторы для трансформации. Векторы для трансформации обычно содержат селектируемый маркер, который либо поддерживается в репликоне, либо находится в интегрирующем векторе, который описан выше.
Экспрессирующие и трансформирующие векторы, либо внехромосомные репликоны, либо интегрирующие векторы, были разработаны для трансформации многих бактерий. Например, были разработаны экспрессирующие векторы, в частности, для следующих бактерий Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582, EP-A-0036259 и EP-A-0063953, WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128, Amann et al. (1985) Gene 40: 183, Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113, EP-A-0036776, EP-A-0136829 и EP-A-0136907], Streptococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [патент США 4745056].
Способы введения экзогенной ДНК в бактериальных хозяев хорошо известны в данной области, и обычно заключаются либо в трансформации бактерий, обработанных CaCl2 или другими агентами, такими как дивалентные катионы и ДМСО. ДНК также может быть введена в бактериальные клетки электропорацией. Способы трансформации обычно варьируют в зависимости от вида трансформируемых бактерий. См., например Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60:273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5582; EP-A-0036259 and EP-A-0063953; WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 55:856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 772:949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69:2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 76:6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl -derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol 53:159; Taketo (1988) Biochim. Biophys. Acta 949:318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol Lett. 44:173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem 770:38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66:203, Staphylococcus], [Barany et al. (1980) J. Bacteriol. 144:698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infect. Immun. 32:1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54:655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong Biotechnology 7:412, Streptococcus].
Клетки-хозяева
Изобретение относится к бактерии, которая экспрессирует полипептид согласно изобретению. Бактерия может представлять собой менингококк. Бактерия может конститутивно экспрессировать полипептид, но в некоторых вариантах экспрессия может быть под контролем индуцируемого промотора. Бактерия может сверхэкспрессировать полипептид (см. ссылку 181). Экспрессия полипептида может не являться переменной по фазе.
Изобретение также относится к везикулам наружной мембраны, полученным из бактерии согласно изобретению. Изобретение также относится к способу получения везикул из бактерии согласно изобретению. Везикулы, полученные из таких штаммов, предпочтительно содержат полипептид согласно изобретению, который должен быть в везикулах иммунодоступной форме, т.е. антитело, которое может связываться с очищенным полипептидом согласно изобретению, должно быть способно связываться с полипептидом, который присутствует в везикулах.
Указанные везикулы наружной мембраны включают любую протеолипосомную везикулу, полученную при разрушении или пузырении наружной мембраны менингококка с образованием из нее везикул, которые содержат белковые компоненты наружной мембраны. Таким образом, термин охватывает OMV (иногда называемые "пузырьками"), микровезикулы (MV [182]) и "нативные OMV" ("NOMV" [183]).
MV и NOMV представляют собой природные мембранные везикулы, которые образуются спонтанно во время роста бактерий и высвобождаются в культуральную среду. MV могут быть получены в результате культивирования Neisseria в бульонной культуральной среде, отделения целых клеток от меньших по размеру MV в бульонной культуральной среде (например, фильтрованием или низкоскоростным центрифугированием, чтобы осадить только клетки, но не меньшие по размеру везикулы), и затем сбора MV из лишенной клеток среды (например, фильтрованием, дифференциальной преципитацией или агрегацией MV, высокоскоростным центрифугированием, чтобы осадить MV). Штаммы для применения с целью получения MV обычно могут быть выбраны на основе количества MV, продуцируемых в культуре, например, в публикациях 184 и 185 описаны Neisseria с высокой продукцией MV.
OMV получают искусственно из бактерий, и они могут быть получены с использованием обработки детергентом (например, дезоксихолатом), или недерегентными средствами (например, см. ссылку 186). Методики образования OMV заключаются в обработке бактерий детергентом на основе солей желчных кислот (например, солей литохолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, холевой кислоты, урсохолевой кислоты и т.д., при этом дезоксихолат натрия [187 и 188] является предпочтительным для обработки Neisseria) при достаточно высоком pH, чтобы не преципитировать детергент [189]. Другие методики могут быть осуществлены, по существу, в отсутствие детергента [186] с использованием таких способов, как обработка ультразвуком, гомогенизация, микрофлюидизация, порообразование, осмотический шок, измельчение, Френч-пресс, смешивание и т.д. Способы без использования детергента или с использованием низкой концентрации детергента могут сохранять полезные антигены, такие как NspA [186]. Таким образом, в способе можно использовать буфер для экстракции OMV, содержащий примерно 0,5% дезоксихолата или меньше, например примерно 0,2%, примерно 0,1%, <0,05% или ноль.
Подходящий способ получения OMV описан в публикации 190 и заключается в ультрафильтрации неочищенных OMV вместо высокоскоростного центрифугирования. Способ может включать стадию ультрацентрифугирования после ультрафильтрации.
Везикулы для применения в изобретении могут быть получены из любого менингококкового штамма. Обычно везикулы будут получены из штамма серогруппы B, но их можно получать из других серогрупп, отличных от серогруппы B (например, в публикации 189 описан способ для серогруппы A), таких как A, C, W135 или Y. Штамм может быть любого серотипа (например, 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, и т.д.), любого сероподтипа и любого иммунотипа (например, L1; L2; L3; L3,3,7; L10 и т.д.). Менингококки могут быть из любой подходящей линии, включая гиперинвазивные и гипервирулентные линии, например, из любой из следующих семи гипервирулентных линий: подгруппа I; подгруппа III; подгруппа IV-I; комплекс ET-5; комплекс ET-37; кластер A4; линия 3.
Бактерии согласно изобретению кроме кодирования полипептида согласно изобретению могут иметь одну или несколько дополнительных модификаций. Например, они могут иметь модифицированный ген fur [191]. В публикации 199 указано, что экспрессия nspA должна подвергаться повышающей регуляции при сопутствующем нокауте porA и cps, и такие модификации могут быть использованы. Дополнительные нокаутированные мутанты N. meningitidis для получения OMV описаны в публикациях 199-201. В публикации 192 описано конструирование везикул из штаммов, модифицированных для экспрессии шести разных подтипов PorA. Также можно использовать мутант Neisseria с низкими уровнями эндотоксина, достигаемыми в результате нокаута ферментов, вовлеченных в биосинтез LPS [193, 194]. Все указанные или другие мутанты можно использовать в изобретении.
Соответственно, штамм, используемый в изобретении, в некоторых вариантах может экспрессировать более одного подтипа PorA. 6-валентные и 9-валентные по PorA штаммы были сконструированы ранее. Штамм может экспрессировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 подтипов PorA: P1.7,16; P1.5-1,2-2; P1.19,15-1; P1.5-2,10; P1.12-1,13; P1.7-2,4; P1.22,14; P1.7-1,1 и/или P1.18-1,3,6. В других вариантах штамм может быть подвергнут понижающей регуляции в отношении экспрессии PorA, например количество PorA в нем снижено, по меньшей мере, на 20% (например, ≥30%, ≥40%, ≥50%, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, ≥95%, и т.д.), или он даже нокаутирован по сравнению с уровнями дикого типа (например, по сравнению со штаммом H44/76).
В некоторых вариантах штамм может сверхэкспрессировать (по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа) некоторые белки. Например, штаммы могут сверхэкспрессировать NspA, белок 287 [195], fHBP [181], TbpA и/или TbpB [196], Cu,Zn-супероксиддисмутазу [196], HmbR и т.д.
Ген, кодирующий полипептид согласно изобретению, может быть интегрирован в бактериальную хромосому или может присутствовать в эписомной форме, например в плазмиде.
Предпочтительно для получения везикул менингококк может быть генетически сконструирован так, чтобы гарантировать, что экспрессия полипептида не подвергнется фазовым изменениям. Способы уменьшения или исключения фазовой вариабельности генной экспрессии у микрококков описаны в публикации 197. Например, ген может быть помещен под контроль конститутивного или индуцируемого промотора, или может быть удален или заменен мотив ДНК, который ответственен за фазовую вариабельность.
В некоторых вариантах штамм может иметь одну или несколько мутаций в результате нокаута и/или связанных со сверхэкспрессией мутаций, описанных в публикациях 198-201. Предпочтительными генами для понижающей регуляции и/или нокаута являются: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [198]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [199]; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Ope, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA и/или TbpB [200]; и (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB и/или SynC [201].
В случае использования мутантного штамма в некоторых вариантах он может иметь одно или несколько или все следующие характерные признаки: (i) пониженная регуляция или нокаут LgtB и/или GalE для укорочения LOS менингококка; (ii) повышенная регуляция TbpA; (iii) повышенная регуляция NhhA; (iv) повышенная регуляция Omp85; (v) повышенная регуляция LbpA; (vi) повышенная регуляция NspA; (vii) нокаут PorA; (viii) пониженная регуляция или нокаут FrpB; (ix) пониженная регуляция или нокаут Opa; (x) пониженная регуляция или нокаут Ope; (xii) делетированный комплекс генов cps. Укороченный LOS может представлять собой LOS, который не содержит эпитопа сиалиллакто-N-неотетраозы, например, он может представлять собой дефицитный по галактозе LOS. LOS может не иметь α-цепи.
В зависимости от менингококкового штамма, используемого для получения везикул, они могут содержать или не содержать антиген нативного fHBP данного штамма [202].
Если в везикуле присутствует LOS, то можно обрабатывать везикулу так, чтобы связать ее LOS с белковыми компонентами (конъюгирование "внутри пузырька" [201]).
Общее
Термин "содержащий" охватывает "включающий", а также "состоящий", например, композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может что-то включать дополнительно, например, X+Y.
Термин "примерно" по отношении к численному значению x означает, например, x±10%.
Слово "по существу" не исключает "полностью", например, композиция, которая "по существу, не содержит" Y, может совсем не содержать Y. При необходимости слово "по существу" может быть исключено из определения согласно изобретению.
"Идентичность последовательностей" предпочтительно определяют с использованием алгоритма поиска гомологии Смита-Ватермана, реализуемого в программе MPSRCH (Oxford Molecular), используя поиск аффинной вставки со следующими параметрами: штраф за открытие пробела = 12 и штраф за удлинение пробела = 1.
После определения серогруппы, классификация менингококков включает серотип, сероподтип и затем иммунотип, и стандартная номенклатура указывает серогруппу, серотип, сероподтип и иммунотип, каждые из которых отделены двоеточием, например B:4:P1.15:L3,7,9. В серогруппе B некоторые линии часто вызывают заболевание (гиперинвазивные), некоторые линии вызывают более тяжелые формы заболевания, чем другие (гипервирулентные), и другие совсем редко вызывают заболевание. Идентифицировано семь гипервирулентных линий, а именно подгруппы I, III и IV-I, комплекс ET-5, комплекс ET-37, кластер A4 и линия 3. такие линии определены с использованием мультилокусного ферментного электрофореза (MLEE), но для классификации менингококков также использовали типирование мультилокусных последовательностей (MLST) [ссылка 19]. Имеются четыре основных гипервирулентных кластера: комплексы ST32, ST44, ST8 и ST1.
В общем, изобретение не охватывает различные последовательности fHBP, специально описанные в публикациях 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 203.
СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Используя последовательность MC58 дикого типа (SEQ ID NO: 1) в качестве основы, получили 72 модифицированные последовательности fHBP. Такие последовательности указаны в списке последовательностей в виде SEQ ID NO: 4-75.
Полипептиды были экспрессированы в E. coli с N-концевым метионином, за которым непосредственно следует аминокислотная последовательность. Полипептиды объединяли с полным адъювантом Фрейнда, MF59 или адъювантом на основе гидроксила алюминия и затем применяли для иммунизации мышей. Антисыворотки от мышей тестировали в анализе бактерицидности против панели из десяти менингококковых штаммов. Панель включала штаммы из каждого из трех семейств fHBP. Также получали полипептид MC58 дикого типа.
Два полипептида, которые были экспрессированы и очищены, имели последовательности SEQ ID NO: 79 ("PATCH_9C") и 80 ("PATCH_10A") и содержали последовательности SEQ ID NO: 20 и 23, соответственно. Все тестированные полипептиды вызывали выработку сыворотки, которая проявляла бактерицидную активность (титр SBA ≥128) против, по меньшей мере, двух штаммов на панели (и обычно больше), но внимания заслуживают полипептиды 9C и 10A, поскольку при их использовании сыворотки проявляли хорошую бактерицидную активность на всей панели, включая эффективность против штамма M1239. Титры SBA в случае 9C и 10A составляли:
Штамм
Семейство fHBP
SEQ ID NO: 1
SEQ ID NO: 79
SEQ ID NO: 80
FCA
Al-H
MF59
Al-H
MF59
Al-H
MC58
1
>32768
32768
16384
>32768
2048
16384
NM008
1
4096
<16
1024
4096
64
128
M4030
1
2048
256
4096
32768
64
1024
GB185
1
2048
32
256
>8192
512
2048
NZ
1
4096
128
256
>8192
16
256
961-5945
2
128
<16
1024
4096
4096
2048
M3153
2
128
<16
1024
2048
4096
4096
C11
2
32
<16
64
512
512
128
M2552
2
<16
<16
4096
2048
>8192
2048
M1239
3
64
<16
<16
512
2048
1024
Таким образом, анти-fHBP-антитела, образование которых вызвано последовательностью MC58 дикого типа, эффективны против штаммов, которые экспрессируют fHBP семейства 1, но относительно неэффективны против штаммов с fHBP семейств 2 или 3. Напротив, сыворотки, образуемые при действии двух модифицированных последовательностей, эффективны против панели штаммов, включающей все три семейства fHBP. В этом отношении особенно эффективна последовательность SEQ ID NO: 79 ("PATCH_9C"). В частности, во многих случаях сыворотки, полученные против такого полипептида, эффективны против десяти штаммов, по меньшей мере, также, как контрольные сыворотки, полученные против собственного fHBP данного штамма (при использовании адъюванта гидроксида алюминия). Во всех случаях кроме одного было снижение не более одного уменьшения разведения:
Штамм
Семейство fHBP
Гомологичный fHBF
SEQ ID NO: 79
MC58
1
32768
>32768
NM008
1
Нет данных
4096
M4030
1
256
32768
GB185
1
2048
>8192
NZ
1
2048
>8192
961-5945
2
2048
4096
M3153
2
2048
2048
C11
2
1024
512
M2552
2
>8192
2048
M1239
3
1024
512
Активность мутанта PATCH_9C подтвердили после приготовления препарата с полным адъювантом Фрейнда (FCA) или смесью IC31TM с квасцами:
Штамм
Семейство fHBP
Адъювант FCA
IC31+Квасцы
MC58
1
8192
>32768
NM008
1
1024
1024
M4030
1
8192
2048
GB185
1
8192
4096
NZ
1
2048
4096
961-5945
2
8192
4096
M3153
2
2048
4096
C11
2
2048
1024
M2552
2
2048
4096
M1239
3
512
1024
Последовательность SEQ ID NO: 77 представляет собой последовательность fHBP, обнаруженную в штамме дикого типа ("NL096"). Она кодируется последовательностью SEQ ID NO: 78. Хотя последовательность является природной, она не совсем соответствует вариантам, о которых сообщалось ранее. Напротив, такая последовательность, по-видимому, является промежуточной между семействами I и II. Сыворотки, вырабатываемые в случае применения формы ΔG последовательности NL096 последовательность с использованием двух разных адъювантов (FCA или гидроксида алюминия), тестировали против панели из восьми штаммов и выявили следующие бактерицидные титры:
Штамм
Семейство fHBP
FCA
Al-H
NL096
-
8192
1024
MC58
1
≥32768
2048
NM008
1
4096
1024
GB185
1
≥16384
2048
NZ98/254
1
1024
256
961-5945
2
>32768
8192
M3153
2
>32768
8192
M1239
3
4096
256
Таким образом, полипептид NL096 вызывает образование антител, которые проявляют широкий спектр бактерицидной активности. Для всех гетерологичных штаммов, за исключением NZ98/254, титры, полученные с использованием FCA, были, по меньшей мере, такими же высокими, как титры, получаемые с использованием IC31TM + квасцы и мутанта PATCH_9C.
Будет понятно, что изобретение описано выше только в качестве примера, и могут быть осуществлены модификации, не выходя при этом за рамки объема и не отходя от сути изобретения.