Новые иммунологические методы диагностики аутоиммунного полиэндокринного синдрома 1-го типа (первый опыт в России)

Новые иммунологические методы диагностики аутоиммунного полиэндокринного синдрома 1-го типа

Л.С. СОЗАЕВА1*, М.Е. КАРМАНОВ2, Л. БРЕЙВИК3, Э. ХУСБИ3, к.м.н. М.А. КАРЕВА1

'ФГБУ «Эндокринологический научный центр», Москва, Россия; 2ФГБУ «Российская детская клиническая больница», Москва, Россия; 3Университет Бергена, Норвегия

Оценивали роль аутоантител (АТ) к интерферона,« (ИФН)-ы и -а2 в диагностике аутоиммунного полигландулярного синдрома 1-го типа (АПС 1), а также специфичность и чувствительность метода HEK-Blue cell» для определения этих АТ. В исследование были включены 34 пациента с АПС 1 и 21 пациент с очаговой алопецией. Среди пациентов с АПС 1 высокие титры антител к ИФН-ы обнаружены в 100%, а АТ к ИФН-а2 — в 97% случаев. У всех пациентов с очаговой алопецией соответствующие АТ отсутствовали. Таким образом, определение АТ к ИФН-ы и -а2 с использованием клеток HEK-Blue является высокоспецифичным и высокочувствительным методом диагностики АПС 1.

Ключевые слова: аутоиммунный полигланулярный синдром 1-го типа, алопеция, тимома, интерфероны-ш и -а2, метод HEK-blue cells.

The new immunological methods for diagnostics of type 1 autoimmune polyendocrine syndrome

L.S. SOZAEVA1, M.E. KARMANOV2, L. BREIVIK3, E. HUSBI3, M.A. KAREVA1

'Endocrinology Research Centre, Moscow, Russia; 2Russian Children's Clinical Hospital, Moscow, Russia; 3University of Bergen, Norway

This study was designed to ascertain the role of anti-interferon (IFN)-w and -a2 antibodies (AB) in diagnostics of type 1 autoimmune polyglandular syndrome (APS-1) and evaluate specificity and sensitivity of the HEK-Blue cells method used to detect these antibodies. The study included 34 patients presenting with APS-1 and 21 patients with focal alopecia. All 100% of the patients with APS-1 ehxhibited high titers of anti IFN-ы antibodies; 97% of them had anti IFN-a2 antibodies. These antibodies were not found in the patients with focal alopecia. It is concluded that the measurement of anti IFN-a and a2 antibodies with the use of HEK-Blue cells is a highly specific and sensitive method for diagnostics of APS-1.

Keywords: type 1 autoimmune polyglandular syndrome, alopecia, thymoma, interferon -ш and а, HEK-Blue cells method.

doi: 10.14341/probl20156134-8

Аутоиммунный полигландулярный синдром 1-го типа (АПС 1) — это редкое моногенное заболевание, связанное с мутациями в гене «аутоиммунного регулятора» (AIRE — autoimmune regulator) [1, 2]. Мутации в гене AIRE приводят к нарушению образования белка аутоиммунного регулятора, функция которого до конца не известна, и патогенез заболевания не ясен, однако предполагается, что данный белок участвует в регуляции процессов негативной селекции Т-лимфоцитов в центральных органах иммунной системы. Отсутствие белка «аутоиммунного регулятора» приводит к снижению экспрессии ауто-антигенов в тимусе и нарушению негативной селекции Т-лимфоцитов, что способствует развитию различных аутоиммунных компонентов этого заболевания: хронического кожно-слизистый кандидоза (ХКСК), гипопаратиреоза (ГПТ), первичной хронической надпочечниковой недостаточности (ХНН), алопеции, витилиго, гипоплазии зубной эмали, аутоиммунной энтеропатии, инсулинзависимого сахарного диабета, аутоиммунного тиреоидита, пер-

© Коллектив авторов, 2015

вичного гипогонадизма, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного кератита и блефарита и т.д. [1, 3, 4].

Диагностика заболевания основана на обнаружении у пациента как минимум двух из трех «основных» компонентов заболевания («классическая диада или триада»: ХКСК, ГПТ и ХНН), а также при наличии одного из трех компонентов в случае, если у родственника первого порядка доказано это заболевание. В течение многих лет заболевание может протекать монокомпонентно, что может затруднять клиническую диагностику. Исследование гена AIRE позволяет подтвердить диагноз АПС 1 в нетипичных случаях или еще до того, как манифестировали основные клинические компоненты.

В России исследование гена AIRE проводится с 2002 г. Наличие частой мутации Arg257Stop, характерной для российской популяции, позволяет во многих случаях путем исследования одного экзона обнаружить мутацию и поставить диагноз. Однако в 30% аллелей встречаются другие мутации, и в этих случаях необходимо полное секвенирование гена,

'e-mail: leila.sozaeva@gmail.com

что является более долгим по срокам выполнения и дорогостоящим методом диагностики. В 5—8% аллелей мутации не удается обнаружить даже при исследовании всего гена [5].

В настоящий момент разработаны и широко применяются новые иммунологические методы диагностики АПС 1 — определение антител к интер-феронам (ИФН) 1 типа (ИФН-а и -и) [6].

Интерфероны 1-го типа, как и все остальные цитокины, участвуют в иммунных процессах, происходящих в организме, отличаются от других ин-терферонов рецептором, с которым они взаимодействуют [7, 8]. Аутонтитела (АТ) к ИФН-а и -и) впервые были выявлены у пациентов с тимомами и миастенией A. Meager и соавт. [9]. Исследование АТ к данным цитокинам у пациентов с АПС 1 впервые было проведено также под руководством A. Meager. Исследователи выявили высокие титры этих антител у всех пациентов с АПС 1, тогда как ни у одного из пациентов с АПС 2 или изолированными аутоиммунными заболеваниями эти антитела обнаружены не были. У пациентов с тимо-мами антитела к ИФН-а и -ю обнаруживались в более низках титрах и в меньшем проценте случаев (60%) [6, 10].

В дальнейшем проводились многочисленные работы по изучению аутоантител к ИФН-а и -ю, и было доказано, что они являются высокоспецифичными и высокочувствительными маркерами АПС 1 [9, 11—14].

Очаговая (гнездная) алопеция — аутоиммунное заболевание, которое встречается, по разным данным, у 0,9—6,9% людей в общей популяции. Этиология заболевания до конца не ясна. По тяжести проявлений выделяют одноочаговую, многоочаговую формы, которые относят к легким, и тяжелые формы — субтотальное и тотальное выпадение волос на голове, универсальную форму с выпадением волос на всем теле, а также ресниц и бровей. Описаны генетические предрасполагающие факторы (га-плотипы HLA II класса, полиморфизмы в генах AIRE, FLG, MX1, PTPN22 и др.), факторы окружающей среды. Корреляций между тяжестью течения и конкретными полиморфизмами не установлено [15—18]. Очаговая алопеция может также развиваться при других аутоиммунных заболеваниях — ревматоидном артрите, системной красной волчанке, аутоиммунных заболеваниях эндокринной системы, в том числе при АПС 1-го типа, при котором частота алопеции достигает 30% [15, 19]. Выявление случаев АПС 1 среди пациентов с изолированной очаговой алопецией является актуальной и трудной клинической задачей.

Цель данного исследования — определить значение аутоантител к ИФН в диагностике АПС 1, а также установить специфичность и чувствительность метода HEK-Blue cells для определения анти-

тел к ИФН-ю и -а2 для диагностики АПС 1 и изолированной очаговой алопеции.

Материал и методы

Мы включили в исследование две группы пациентов: группа А — пациенты с АПС 1, группа В — пациенты с очаговой алопецией без АПС 1.

Группа А — пациенты с АПС 1, которые участвовали в исследовании, состоят в Российском регистре пациентов с АПС 1, который ведется в Институте детской эндокринологии ЭНЦ с 2000 г. Пациенты наблюдаются постоянно в Институте детской эндокринологии ЭНЦ (Москва), Российской республиканской детской больнице (РДКБ, Москва), а также эндокринологами в разных регионах РФ. В данное исследование были включены 34 пациента с АПС 1 (20 женщин и 14 мужчин в возрасте от 7 до 28 лет, средний возраст 23 года ). Диагноз АПС 1 был установлен на основании клинической картины (два и более основных компонента заболевания) и/ или наличия мутаций в гене AIRE.

В группу В — включен 21 пациент с очаговой алопецией (12 женщин и 9 мужчин в возрасте от 4 до 43 лет, средний возраст 12,5 года), которые наблюдаются в Институте детской эндокринологии ЭНЦ и у которых на момент последнего осмотра не выявлено ни одного из основных клинических компонентов АПС 1.

Всем пациентам из групп А и В был проведен анализ клинических проявлений, исследование антител к ИФН-ю и-а2. Всем пациентам из группы А и 6 пациентам из группы В был проведен анализ гена AIRE (частично данные по выявленным мутациям в гене AIRE были опубликованы нами ранее) [14].

Исследование АТ к ИФН-а2 и -ю и проводилось методом HEK-blue cells assay (метод разработан группой ученых под руководством проф. E. Husebye, Норвегия [5]) с использованием культуры клеток человеческой эмбриональной почки, трансфектированных специфическими плазмида-ми. В основе метода лежит способность трасфек-тированных клеток синтезировать щелочную фос-фатазу в присутствии интерферонов. Клетки имеют рецепторы к интерферонам и систему биосинтеза щелочной фосфатазы, которые кодируются плазмидами, содержащими специфические векторы. В присутствии сыворотки пациента с высоким титром антител к интерферонам способность клетки синтезировать щелочную фосфатазу подавляется, что в свою очередь можно зафиксировать при помощи абсорбционного анализа с применением красителя.

Исследование антител методом проводилось в лаборатории Университета Бергена (Норвегия).

Расчет чувствительности и специфичности метода проводилось стандартными методами.

Результаты

Группа А

В результате анализа фенотипа пациентов с АПС 1 триада основных компонентов выявлена у 21 (62%) из 34 пациентов, диада — у 9 (26%). На основании генетического исследования диагноз установлен 4 (12%) пациентам, которые имели только один основной компонент (изолированный или в сочетании с другими «малыми» компонентами). У всех пациентов с АПС 1 обнаружена хотя бы одна мутация в гене AIRE (у 31 пациента — в двух аллелях, у 3 — в одном аллеле). В 67% аллелей выявлена частая мутация R257X, в 29% — другие мутации, в 4% — мутаций не обнаружено. У 44% пациентов из данной группы наблюдалась очаговая алопеция.

Высокие титры антител к ИФН-ю обнаружены у 34 (100%) пациентов с подтвержденным АПС 1, к ИФН-о^ — у 33 (97%). Пациентка, у которой антитела к ИФН-Oj не были выявлены при положительных антителах к ИФН-ю, соответствует по клиническим критериям диагнозу АПС 1, но заболевание имеет относительно мягкое медленно прогрессирующее течение: гипопаратиреоз манифестировал в 6 лет, надпо-чечниковую недостаточность установили в 17 лет, никогда не отмечалось признаков кандидоза, имеет 2 здоровых детей, в возрасте 28 лет новых компонентов не было выявлено. При генетическом анализе у данной пациентки найдена только одна частая мутация R257X, во втором аллеле мутация не обнаружена.

Данные представлены в таблице.

Группа В

При анализе клинической картины среди пациентов с алопецией у 13 из 21 пациента не было других нарушений, у 6 также был выявлен хронический аутоиммунный тиреоидит, 3 страдали сахарным диабетом 1-го типа, у 1 пациента отмечалось витилиго. Алопеция легкой степени (одно- и многоочаговая) была у 11 (52%) пациентов, тяжелой степени (субтотальная, тотальная, универсальная) у 10 (48%). У 6 пациентов проведено исследование гена AIRE, в результате которого мутации не были найдены.

Антитела к ИФН-ю и ИФН-а2 не были обнаружены ни у одного пациента из группы с очаговой алопецией (см. табл. 1).

Специфичность методов определения антител к ИФН-ю и -а2 составляет 100%. Чувствительность метода определения антител к ИФН-ю достигает 100% , что выше, чем чувствительность метода определения антител к ИФН-а2 (97%). Прогностическая значимость положительного результата этих двух методов также достигает 100%, а прогностическая значимость отрицательного результата метода определения антител к ИФН-ю (100%) выше, чем метода определения антител к ИФН-а2 (95%) (см. табл. 1).

Обсуждение

Основными методами диагностики АПС 1 в РФ в настоящий момент являются клиническая и генетическая диагностика заболевания, тогда как иммунологические методы диагностики не применяются. Исследование гена AIRE на наличие одной частой мутации R257X позволяет установить диагноз у 50% российских пациентов с АПС 1, у которых эта мутация выявляется в гомозиготном состоянии, и у 20% предположить с высокой вероятностью, когда данная мутация определяется в одном аллеле [5]. Таким образом, примерно в половине случаев диагностики АПС 1 требуется проведения полного секвенирова-ния гена AIRE, что делает это исследование существенно дороже и продлевает сроки его выполнения.

Определение антител к ИФН-ю является высокоспецифичным и высокочувствительным методом диагностики АПС 1. В данном исследовании показано, что все российские пациенты с АПС 1, включенные в исследование, имели высокие титры этих антител.

В настоящий момент разработано и применяется в лабораторной клинической практике несколько методов определения нейтрализующих антител к ИНФ-ю, в том числе экспресс-метод HEK-blue cells assay, который является сравнимым по специфичности и чувствительности и может применяться в клинической практике. Использование метода определения антител к ИФН-ю позволяет за 2 дня установить диагноз пациентам с изолированными и нетипичными формами АПС 1.

Результаты, полученные в российской группе пациентов, полностью совпадают с международными результатами и еще раз подтверждают чувствительность и специфичность нового метода диагностики АПС 1.

Распространенность очаговой алопеции в общей популяции в различных странах варьирует от 0,9 до 6,9%, у пациентов с АПС 1 от 30 до 40% [15, 19]. Хотя АПС 1 встречается гораздо реже, чем очаговая алопеция, но при обследовании пациента с алопецией невозможно с уверенностью сказать, что в дальнейшем у него не сформируются другие компоненты АПС 1. Ранее наша научная группа проводила молекулярно-генетическое исследование гена AIRE у пациентов с изолированной аутоиммунной алопецией. В исследовании были 12 пациентов, у которых мутаций в гене AIRE обнаружено не было [20]. Мы пришли к выводу, что мутации в гене AIRE и АПС 1 не являются частой причиной изолированной алопеции. Также в некоторых зарубежных работах проводилось исследование гена AIRE у пациентов с изолированной очаговой алопецией и было выявлено несколько полиморфизмов в этом гене, которые чаще встречались у данной группы пациентов, но не было обнаружено мутаций [16, 17].

Клиническая и иммунологическая характеристика пациентов с АПС 1 и пациентов с очаговой алопецией

Клинические проявления N (%) АТ к ИФН-м АТ к ИФН-а2

Группа А. АПС 1 («=34): 100% 97%

«триада»1 21

«диада»2 9

один «большой компонент»3 2

ХНН 28

ХКСК 30

ГПТ 28

алопеция 15

другие компоненты4 31

Группа В. Очаговая алопеция («=21): 0% 0%

легкая форма алопеции5 11

тяжелая форма алопеции6 9

хронический аутоиммунный тиреоидит 6

сахарный диабет 1-го типа 3

витилиго 1

Чувствительность и специфичность, %:

чувствительность 100 97

специфичность 100 100

Прогностическая значимость положительного результата, % 100 100

Прогностическая значимость отрицательного результата, % 100 95

Примечание. 1 — наличие у пациента хронической надпочечниковой недостаточности, гипопаратиреоза, хронического кожно-слизистого кандидоза; 2 — наличие у пациента 2 из 3 больших компонентов (хроническая надпочечниковая недостаточность, гипопаратиреоз, хронический кожно-слизистый канди-доз); 3 — из классической «триады» компонентов у пациента присутствует только один. 4другие компоненты — все компоненты за исключением тех, которые входят в классическую «триаду». 5 — одно- или многоочаговая формы. 6 — субтотальная, тотальная и универсальная формы.

В нескольких крупных исследованиях доказано самостоятельное значение аутоантител к ИФН-ю и -а2 в диагностике АПС 1, при этом эти антитела не выявлялись при других аутоиммунных заболеваниях [6, 9, 12]. В нашем исследовании данные антитела также не выявляются у пациентов с очаговой алопецией без АПС 1. Это позволяет использовать этот метод для поиска редких форм АПС 1 среди пациентов с очаговой алопецией.

Заключение

Определение антител к ИНФ-ю является новым диагностическим критерием АПС 1. Метод с использованием клеток НЕК-В1ие эффективен для диагностики классических и нетипичных форм АПС 1, является высокоспецифичным (специфичность 100%) и высокочувствительным (чувствительность 100%) и может также применятся для обследования пациента с предполагаемым диагнозом АПС 1, семьи пациента и скрининга на этот синдром среди пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями.

Внедрение в клиническую практику в России данного метода исследования позволит проводить раннюю диагностику АПС 1 у пациентов с нетипичными клиническими вариантами заболевания, у родственников пациентов с АПС 1 и у пациентов с неустановленными мутациями в гене AIRE в более короткие сроки.

Благодарности

Мы благодарим всех врачей за активное участие и помощь в обледовании пациентов, в частности коллектив эндокринологического отделения ФГБУ «Российская детская клиническая больница»

Особую благодарность за участие в исследовании выражаем пациентам и их родственникам.

Работа выполнена в рамках программы помощи детям с эндокринной патологией «Альфа-Эндо» при финансовой поддержке «Альфа-групп» и фонда «The "CAF" Foundation for Philanthropy Support and Development».

ЛИТЕРАТУРА

1. Ahonen P. Autoimmune polyendocrinopathy — candidosis — ectodermal dystrophy (apeced): autosomal recessive inheritance. Clin Genet. 2008;27(6):535-542.

doi: 10.1111/j. 1399-0004.1985.tb02037.x.

2. Jââskelâinen J, Perheentupa J. Autoimmune polyendocrinopathy — candidosis —ectodermal dystrophy (apeced) — a diagnostic and therapeutic challenge. Pediatric Endocrinology Reviews. 2009;7(2):95-108.

3. Kyewski B, Klein L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 2006;24(1):571-606.

doi: 10.1146/annurev.immunol.23.021704.115601.

4. Anderson MS, Venanzi ES, Klein L, et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 2002;298(5597):1395-1401.

doi: 10.1126/science.1075958.

5. Orlova EM, Bukina AM, Kuznetsova ES, et al. Autoimmune polyglandular syndrome type 1 in russian patients: clinical variants and autoimmune regulator mutations. Horm Res Paediatr. 2010;73(6):449-457.

doi: 10.1159/000313585.

6. Meager A, Visvalingam K, Peterson P, et al. Anti-interferon autoantibodies in autoimmune polyendocrinopathy syndrome type 1. PlosMed. 2006;3(7):e289.

doi: 10.1371 /journal.pmed.0030289.

7. Pestka S, Krause CD, Walter Mr, Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol Rev. 2004;202(1):8-32. doi: 10.1111/j.0105-2896.2004.00204.x.

8. Vilcek J. Novel interferons. Nat Immunol. 2003;4(1):8-9. doi: 10.1038/ni0103-8.

9. Meager A, Wadhwa M, Dilger P, et al. Anti-cytokine autoantibodies in autoimmunity: preponderance of neutralizing autoantibodies against interferon-alpha, interferon-omega and interleukin-12 in patients with thymoma and/or myasthenia gravis. Clin Exp Immunol. 2003;132(1):128-136.

doi: 10.1046/j. 1365-2249.2003.02113.x.

10. Kisand K, Link M, Wolff ASB, et al. Interferon autoantibodies associated with aire deficiency decrease the expression of Unstimulated genes. Blood. 2008;112(7):2657-2666.

doi: 10.1182/blood-2008-03-144634.

11. Breivik L, Oftedal BEV, Boewolff AS, et al. A novel cell-based assay for measuring neutralizing autoantibodies against type i interferons in patients with autoimmune polyendocrine syndrome type 1. Clin Immunol. 2014;153(1):220-227.

doi: 10.1016/j.clim.2014.04.013.

12. Meloni A, Furcas M, Cetani F, et al. Autoantibodies against type i interferons as an additional diagnostic criterion for autoimmune polyendocrine syndrome type i. J Clin Endocrinol Metab. 2008;93(11):4389-4397.

doi: 10.1210/jc.2008-0935.

13. Oftedal BE, Boewolff AS, Bratland E, et al. Radioimmunoassay for autoantibodies against interferon omega; its use in the diagnosis of autoimmune polyendocrine syndrome type i. Clin Immunol. 2008;129(1):163-169.

doi: 10.1016/j.clim.2008.07.002.

14. Wolff ASB, Sarkadi AK, Mar6di L, et al. Anti-cytokine au-toantibodies preceding onset of autoimmune polyendocrine syndrome type i features in early childhood. J Clin Immunol. 2013;33(8):1341-1348.

doi: 10.1007/s10875-013-9938-6.

15. Нефёдова Е.Д. Гнездная алопеция: клинико-генетические предикторы тяжелого течения заболевания: Дис. ... канд. мед. наук. М. 2011. [Nefedova ED. Gnezdnaya alopetsiya: kliniko-ge-neticheskie prediktory tyazhelogo techeniya zabolevaniya [PhD dissertation]. Moscow. 2011. (In Russ.)].

16. Pforr J, Blaumeiser B, Becker T. et al. Investigation of the p.ser278arg polymorphism of the autoimmune regulator (aire) gene in alopecia areata. Tissue Antigens. 2006;68(1):58-61.

doi: 10.1111/j.1399-0039.2006.00598.x.

17. Tazi-Ahnini R, Cork MJ, Gawkrodger DJ, et al. Role of the autoimmune regulator (aire) gene in alopecia areata: strong association of a potentially functional aire polymorphism with alopecia universalis. Tissue Antigens. 2002;60(6):489-495.

doi: 10.1034/j.1399-0039.2002.600604.x.

18. Alzolibani AA, Zari S, Ahmed AA, Epidemiologic and genetic characteristics of alopecia areata (part 2). Acta Dermatovenerol Alp Pannonica Adriat. 2012;21(1):15-19.

19. Islam N, Leung PSC, Huntley AC, Eric Gershwin M. The autoimmune basis of alopecia areata: a comprehensive review. Autoimmun Rev. 2015;14(2):81-89.

doi: 10.1016/j.autrev.2014.10.014.

20. Орлова Е.М. Генетические основы и клинические варианты аутоиммунного полигландулярного синдрома 1-го типа: Дис. ... канд. мед. наук. М. 2005. [Orlova EM. Geneticheskie osnovy i klinicheskie varianty autoimmunnogo poliglandulyarnogo sindroma 1 tipa [PhD dissertaton]. Moscow 2005. (In Russ.).]