ОРГАНОИД ПЕЧЕНИ, ВАРИАНТЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ И СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДЛЯ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

1. Культуральная среда для выращивания культур клеток, содержащая базальную среду для клеток животных и человека, к которой добавлены: фактор роста эпидермиса (EGF), R-спондин, фактор роста фибробластов (FGF) и никотинамид.
2. Культуральная среда по п.1, в которую добавлены одно, два, три, четыре или более соединений, выбранных из группы, содержащей: агонист Wnt, ингибитор ВМР, ингибитор TGF-β и HGF.
3. Культуральная среда по п.2, в которой
ингибитор ВМР выбран из Noggin, DAN и DAN-подобных белков, включая Cerberus и Gremlin;
агонист Wnt выбран из одного или нескольких Wnt, Wnt-3a, Norrin и ингибитора GSK;
R-спондин выбран из R-спондина 1, R-спондина 2, R-спондина 3 и R-спондина 4;
FGF является FGF, способным связываться с FGFR2 или FGFR4, и является предпочтительно FGF10; и/или
ингибитором TGF-β является низкомолекулярный ингибитор, выбранный из группы, состоящей из А83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511.
4. Клеточная культуральная среда для выращивания культур клеток, которая содержит или состоит из EGF, FGF и/или HGF, ингибитора TGF-β и ингибитора Notch.
5. Клеточная культуральная среда по п.4, в которой
ингибитором Notch является ингибитор гамма-секретазы, такой как DAPT или дибензазепин (DBZ), или бензодиазепин (BZ), или LY-411575;
ингибитором TGF-β является низкомолекулярный ингибитор, выбранный из группы, состоящей из: A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511; и/или
FGF является FGF, способным связываться с FGFR2 или FGFR4, и предпочтительно является FGF10.
6. Культуральная среда по п.4 или 5, в которой среда дополнительно содержит дексаметазон.
7. Культуральная среда по п.1 или 4, в которой к базальной среде добавлены одно, два, три, четыре или более соединений, выбранных из группы, содержащей гастрин, В27, N2 и N-ацетилцистеин.
8. Способ получения органоида печени, где указанный способ содержит:
культивирование эпителиальных стволовых клеток из фрагмента печени или желчного протока печени в контакте с внеклеточным матриксом в присутствии среды, причем среда содержит базальную среду для клеток животных или человека, к которой добавлены: EGF, FGF и никотинамид.
9. Способ получения популяции стволовых клеток зрелой печени, где указанный способ содержит:
культивирование эпителиальных стволовых клеток из фрагмента печени или желчного протока печени в контакте с внеклеточным матриксом в присутствии среды, причем среда содержит базальную среду для клеток животных или человека, к которой добавлены: EGF, FGF и никотинамид.
10. Способ по п.8 или 9, где ингибитор TGF-β дополнительно присутствует в среде и где необязательно ингибитором TGF-β является низкомолекулярный ингибитор, выбранный из группы, состоящей из: A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511
11. Способ по п.8 или 9, в котором по меньшей мере через день среду меняют на вторую среду.
12. Способ по п.11, в котором второй средой является среда для размножения, содержащая базальную среду, к которой добавлены: EGF, FGF, HGF, никотинамид и R-спондин.
13. Способ по п.11, в котором второй средой является среда для дифференциации, содержащая базальную среду для клеток животных или человека, к которой добавлены EGF, FGF и/или HGF и ингибитор Notch.
14. Способ по п.12 или 13, в котором во второй среде дополнительно присутствует ингибитор TGF-β и необязательно в котором ингибитором TGF-β является низкомолекулярный ингибитор, выбранный из группы, состоящей из: A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, LY 364947, SD-208, SJN 2511.
15. Способ по п.8 или 9, где способ содержит культивирование указанных эпителиальных стволовых клеток в клеточной культуральной среде, содержащей или состоящей из базальной среды для клеток животных или человека, к которой добавлены EGF, ингибитор ВМР, R-спондин и Wnt; и впоследствии во второй среде для размножения, которая содержит или состоит из базальной среды для клеток животных или человека, к которой добавлены: EGF, FGF и HGF, никотинамид и R-спондин; и впоследствии в дифференцирующей среде, которая содержит или состоит из базальной среды для клеток животных или человека, к которой добавлены: EGF, FGF и/или HGF, ингибитор TGF-β и ингибитор Notch.
16. Органоид печени, который можно получить способом по любому из пп.8, 10-15.
17. Популяция стволовых клеток зрелой печени, где популяцию клеток можно получить способом по любому из пп.9-15.
18. Способ культивирования органоида печени, содержащий культивирование эпителиальных стволовых клеток в контакте с внеклеточным матриксом в присутствии одной или несколько клеточных культурных сред для выращивания культур клеток по любому из пп.1-7.
19. Способ культивирования популяции клеток, экспрессирующих Lgr5, содержащий культивирование эпителиальных стволовых клеток органоида печени с внеклеточным матриксом в присутствии одной или несколько клеточных культурных сред для выращивания культур клеток по любому из пп.1-7.
20. Органоид печени, который содержит кистозную структуру и с внешней стороны слой клеток по меньшей мере с одним зачатком и центральным просветом.
5
3
5
3
21. Органоид печени по п.20, который имеет одну или несколько (например, 2, 3, 4 или все 5) из следующих характеристик: (а) плотность клеток >5×10 клеток/см, предпочтительно >10×10 клеток/см; (b) толщину, равную 2-30 слоям клеток, предпочтительно толщину, равную 2-15 слоям клеток; (с) клетки контактируют друг с другом во всех трех пространственных направлениях; (d) демонстрирует функцию, присущую здоровой ткани печени, (е) имеет вытянутую форму с двумя выраженными доменами.
22. Органоид печени по п.20, содержащий монослойный эпителиальный домен, где детектируются поляризованные клетки и экспрессируются кератиновые маркеры, и второй домен, составляющий основное тело органоида и образованный многослойным эпителием с неполяризованными клетками, необязательно экспрессирующими альбумин.
3
4
3
3
23. Органоид печени по п.20, который происходит от клетки, экспрессирующей Lrg5, и который содержит популяцию по меньшей мере от 1×10 до 5×10 клеток, например, по меньшей мере от 1×10 до 5×10 клеток.
24. Применение органоида печени по любому из пп.16, 20-23 в скрининге для поиска новых лекарственных соединений; анализе токсичности; исследованиях в области эмбриогенеза печени, типов клеток печени и путей дифференцировки; исследованиях экспрессии генов, включая рекомбинантную экспрессию генов; исследованиях механизмов, вовлеченных в повреждение и восстановление печени; исследованиях воспалительных и инфекционных заболеваний печени; исследованиях патогенетических механизмов; или исследованиях механизмов трансформации клеток печени и этиологии рака печени.
25. Применение органоида печени по п.16 или 20-23 или популяцию клеток по п.17 для лечения нарушения, состояния или заболевания печени или в регенеративной медицине.