Исследование влияния рекомбинантных белков vp24 вируса Эбола на гуморальный ответ мононуклеарных клеток морских свинок

УДК 578.76

А.А. Шелемба, Л.Ф. Гуляева

исследование влияния рекомбинантных белков vP24 вируса эбола на гуморальный ответ мононуклеарных клеток морских свинок

НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Исследована способность рекомбинантного белка vp24 вируса Эбола в вирулентной и авирулентной для морских свинок и мышей конфигурации, воздействовать на продукцию антител мононуклеарными клетками морских свинок in vitro. Показана способность обоих вариантов белка стимулировать синтез иммуноглобулинов и отсутствие супрессорного воздействия vp24 ВЭ в отношении В-клеток. Ключевые слова: вирус Эбола, белок vp24, гуморальный иммунитет

study of REcoMBiNANT PRoTEiN vP24 INFLuENcE oN ANTIBoDY Response of guinea pigs mononuclear cells

A.A. Shelemba, L.F. Gulyaeva

Institute of molecular biology and biophysics SB RAMS, Novosibirsk

Recombinant protein vp24 of Ebola virus in lethal and unletha! for guinea pigs and mice configuration was investigated, in vitro to study their influence on guinea pigs mononuclear cells. Ability of both protein variants to stimulate induction of antibody and. absence of B cells suppression, in was shown.

Key words: Ebola virus, vp24 protein, antibody response

введение

Длительное время усилия множества ученых по разработке средств специфической профилак-тки лихорадки Эбола оставались бесплодными. Исследуя причины отсутствия протективности в результате иммунизации инактивированными и рекомбинантными препаратами, авторы в первую очередь обращали свое внимание на особенности гуморального иммунного ответа при введении антигена ВЭ. Исследователи акцентировали на этом свое внимание, спровоцированные как отсутствием протективности, так и особенностями формирования иммуноглобулинов. Так, например, введение невосприимчивым к болезни лошадям, козам и баранам гомогената печени инфицированных ВЭ приматов (содержавшего малое количество специфического белка) приводило к высоким титрам нейтрализующих антител, при низком значении титров этих же сывороток в ИФА. И наоборот, иммунизация животных высокими (100 мкг/кг) дозами очищенного, концентрированного, инактивированного ВЭ приводило к образованию сывороток с высоким титром в ИФА и низким индексом нейтрализации. [3]. Есть также работы, указывающие на формирование аутоиммунных осложнений у реконвалес-центов, что связано с возникновением перекрестно реагирующих антител, относящихся в основном к классу IgG [11]. На модели морских свинок показано [12, 15], что отличие в геноме вирулентного и авирулентного для этих животных штаммов ВЭ составляет одну замену нуклеотида в белке vp24. Мы сочли важным изучить иммуномодулирующие свойства вирулентного и авирулентного вариантов белка ур24 ВЭ, исследуя уровень синтеза глобулинов, стимулируемых рекомбинантными аналогами обоих вариантов ^24-д — авирулентный и vp24-8мс — вирулентный), в культуре мононуклеарных клеток (МНК). Результаты сравнивали со спонтан-

ной индукцией иммуноглобулинов этими клетками и после их стимуляции липополисахаридом (ЛПС).

методика

Рекомбинантные белки vp24-д и vp24-8мс ВЭ В работе использовали два рекомбинантных белка vp24 ВЭ, сконструированных в летальной (штамм 8 мс) и не летальной (дикий штамм Заир) для морских свинок последовательности нуклеотидов, отличающихся в позиции 186 заменой His в не летальной конфигурации на Tyr в летальной. Дикий и адаптированный геномы белка vp24 вырезаны из кДНК соответствующих штаммов ВЭ с использованием ферментов рестрикции XbaI и BglI, и встроены в плазмиду pQE(30-32) фирмы Qiagen, USA. Плазмиды, в свою очередь встроены в E. coli штамм M15. Наработка и очистка рекомбинантных белков проведены с использованием набора QIA express фирмы Qiagen на хроматографической колонке со смолой Ni-NTA в 8M мочевине. Рекомбинантные белки диализованы против физиологического раствора и получили наименование vp24^ для конфигурации соответствующей дикому штамму и vp24-8мс для адаптированного штамма ВЭ. Рекомбинантные конструкции были любезно предоставлены руководителем лаборатории ООВИ ГНЦВБ «Вектор» профессором А.А. Чепурновым.

Мононуклеарные клетки

В качестве источника МНК была взята кровь пяти интактных морских свинок, свободных от патогенной флоры. Животных содержали в виварии института клинической иммунологии СО РАМН на стандартном рационе. Кровь забирали пункцией сердца в объеме

1 мл от животного в соответствии с федеральными «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Отбираемый объем крови не оказывал негативного воздействия на вовлеченных в эксперимент животных. МНК выделяли от-

дельно для каждого животного на градиенте плотности фиколл-верографина 1.076 с последующим тройным отмыванием центрифугированием в среде RPMI-1640 при 1500 об./мин. МНК ресуспендировали в обогащенной среде RPMI-1640 с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА, «Sigma»), 10-кратной смесью незаменимых аминокислот («Sigma») и L-глютамином (5 мМ, «Sigma») до концентрации 2 х 106/мл. Культивирование МНК проводили в U-образных 96-луночных планшетах для культур клеток («Linbro») в количестве 4 х 105/лунку, в трех повторах.

Для оценки спонтанного синтеза глобулинов МНК культивировали без добавок, а для оценки синтеза, стимулированного рекомбинантным белком vp24 в вирулентной и авирулентной для морских свинок конфгурации — с добавлением инактивированного очищенного вируса Эбола в концентрации (по белку) 2 мкг/мл. В качестве контроля индуцированного синтеза антител МНК культивировали в присутствии стандартного В-клеточного митогена LPS E. coli 055:B5 («Sigma») в концентрации 2 мкг/мл, оттестированной в предварительных экспериментах, как субоптимальная доза митогена. Планшеты с МНК культивировали при +37 °С и 5% СО2 в течение 7 суток. Через 7 суток собирали бесклеточные супернатанты, содержание иммуноглобулинов в которых оценивали в прямом иммуноферментном анализе (ИФА). ИФА проводили по стандартной методике [2] с антителами против иммуноглобулинов морской свинки, мечеными пероксидазой хрена.

результаты

На первом этапе мы убедились, что неспецифический белок не влияет на величину абсорбции в используемом нами иммуноферментном анализе. Для этого использовали бычий сывороточный альбумин (БСА). Мы продемонстрировали отсутствие доза-за-висимой связи количества неспецифического белка и значений ОП в ИФА. В эксперименте (табл. 1) концентрация БСА не коррелирует с силой неспецифического связывания в иммуноферментном анализе и значения величины абсорбции для различных разведений БСА не образуют прямолинейной зависимости. Это подтверждает специфичность наших опытов по оценке влияния рекомбинантных вариантов белка vp24 ВЭ на продукцию иммуноглобулинов мононуклеарными клетками морских свинок.

Таблица 1

Контроль специфичности ИФА посредством различных концентраций БСА

Затем для оценки результатов планируемых экспериментов были составлены калибровочные кривые. Калибровку проводили с помощью охарактеризованных препаратов суммарных иммуноглобулинов морской свинки отдельно и иммуноглобулина G морской свинки отдельно (использованы препараты производства фирмы Antibody systems, Texas, USA). Полученные результаты представленные на графиках (рис. 1 и 2 соответственно). Калибровочные кривые были построены на основе проведенного нами ИФА разведений как для стандартной смеси всех иммуноглоболинов морской свинки (рис. 1) так и отдельно для разведений IgG (рис. 2) с известной концентрацией. Оценка результатов проводилась по величине абсорбции при длине волны 492 нм. Величина абсорбции, согласно представленным данным, криволинейно зависит от концентрации иммуноглобулинов в растворе.

рис. 1. Калибровочный график суммарных иммуноглобу-

линов морской свинки.

рис. 2. Калибровочный график IgG морской свинки.

Далее были проведены собственно эксперименты по оценке продукции суммарных иммуноглобулинов и иммуноглобулинов G мононуклеарными клетками в ответ на стимуляцию «вирулентным» и «авирулентным» вариантами vp24 ВЭ. Мононукле-арные клетки из периферической крови морских свинок выделяли в градиенте плотности фиколл-верографина с последующим тройным отмыванием центрифугированием в среде RPMI-1640 при

Концентрация БСА

0,01 0,5

0,005 0,6

0,0025 0,4

0,00125 0,4

0,000625 0,5

0,000312 0,6

0,000156 0,7

0,000078 0,4

1500 об./мин. Кровь забирали от пяти интактных морских свинок, свободных от патогенной флоры в объеме 1 мл от животного пункцией сердца. МНК выделяли отдельно для каждого животного, ресуспендировали до концентрации 2 x 106/мл в обогащенной среде RPMI-1640 с 1% БСА, 10-кратной смесью незаменимых аминокислот и L-глютамином. Культивирование МНК проводили в U-образных 96-луночных планшетах для культур клеток

2 мкг/мл. В качестве препарата сравнения индуцированного синтеза антител МНК культивировали в присутствии стандартного В-клеточного митогена LPS E. coli 055:B5 в концентрации 2 мкг/мл, оттестированной в предварительных экспериментах, как субоптимальная доза митогена. Планшеты с МНК культивировали при +37 °С и 5% СО2 в течение 7 суток. Через 7 суток собирали бесклеточные супернатанты, которые затем изучали в прямом иммуноферментном анализе с антителами против суммарных иммуноглобулинов морской свинки или антителами к IgG, мечеными пероксидазой хрена.

В таблицах 2 и 3 полученные данные о величине абсорбции (среднее из двух) и соответствующей

им концентрации (МЕ) иммуноглобулинов показаны отдельно для каждого животного-донора. Средние по группам результаты приведены в МЕ и статистически обработаны с использованием теста t Стьюдента. Получены достоверные различия (р < 0,05 во всех случаях) при сравнении спонтанного и стимулированного (как митогеном, так и рекомбинантными антигенами vp24 вируса Эбола) синтеза иммуноглобулинов in vitro. При этом отличий в стимуляции гуморального ответа между vp24^ и vp24-8мс не выявлено.

Ранее было показано, что поверхностный гликопротеин вируса Эбола обладает иммуносупрес-сивными свойствами в отношении Т-лимфоцитов периферической крови [7, 14]. В то же время, как видно из представленных данных, В-клеточный ответ в отношении vp24, как антигена, весьма эффективен. Это согласуется с ранее опубликованными данными в отношении цельновирионного инактивированного антигена ВЭ, полученными в эксперименте in vivo [3]. При этом феномен отсутствия антител в разгар инфекции, Дадаева с соавторами [1] объясняли связыванием в иммунные комплексы, которые, по их мнению, играют важную роль в патогенезе лихорадки Эбола.

Более того, поскольку первичной мишенью данного инфекционного агента являются макрофаги, захват ими вируса и/или вирусных белков приводит вначале к стимуляции макрофагов и, следовательно, к повышению синтеза IL-1 и TNF-alpha, что, в свою

Таблица 2

Концентрация суммарных иммуноглобулинов в супернатантах МНК морской свинки под влиянием белков

vp24-д и vp24-8мс по сравнению с LPS Е. соН

№ эксперимента Спонтанный синтез иммуноглобулинов Синтез иммуноглобулинов, стимулированный ЛПС E. coli Синтез иммуноглобулина G, стимулированный белком vp24-q Синтез иммуноглобулина G, стимулированный белком vp24-8мс

Эксперимент 1 1,525

Эксперимент 2 1,499

Эксперимент 3 1,513

Эксперимент 4 1,535

Эксперимент 5 1,479

Среднее значение и стандартное отклонение МЕ 43,4 ± 4,21 ME 107,8 ± 10,56 ME 56,4 ± 2,6 ME 55,2 ± 2,77 ME

Таблица 3

Концентрация иммуноглобулинов G в супернатантах МНК морской свинки под влиянием vp24-д и vp24-8мс

по сравнению с LPS Е. соН

№ эксперимента Спонтанный синтез иммуноглобулина G Синтез иммуноглобулина G, стимулированный ЛПС E. coli Синтез иммуноглобулина G, стимулированный белком vp24-q Синтез иммуноглобулина G, стимулированный белком vp24-8мс

Эксперимент 1 1,342

Эксперимент 2 1,374

Эксперимент 3 1,321

Эксперимент 4 1,388

Эксперимент 5 1,359

Среднее значение и стандартное отклонение МЕ 49,8 ± 5,67 ME 107,7 ± 5,04 ME 70,5 ± 8,64 ME 69,5 ± 6,91 ME

очередь, стимулирует превращение В-лимфоцитов в антителосекретирующие клетки [8, 10]. Это впоследствии ведет к появлению IL-10 и к переключению иммунного ответа с ТН1 на ТН2, что выражается в дальнейшем увеличении синтеза ^А, IgG и [5]. Повышение IgG, в частности подкласса IgG1, в сыворотке крови человека способствует активации комплемента и антителозависимой клеточной цитотоксичности [4], что объясняет формирование затем аутоиммунных осложнений [13].

Несомненно, гуморальный иммунный ответ играет важную роль в патогенезе болезни Эбола. В частности, исследования, проведенные в Центрально-Африканской Республике — районе, эндемичном по различным видам геморрагических лихорадок, — показали, что в сыворотке крови 21,3 % людей персистируют антитела к вирусу Эбола [9]. В сыворотке реконвалесцентов отмечалось повышение IgG, тогда как у погибших антитела данного класса не определялись [6]. Все это подтверждает важную роль гуморального иммунного ответа в течении и исходе данного заболевания. Поэтому столь важно было оценить вклад в гуморальный иммунитет белка, вариабельность генома которого коррелирует с возрастанием вирулентности для морских свинок и мышей. Также важно было оценить влияние вирулентной и авирулентной конфигурации белка на гуморальный ответ in vivo и in vitro. Данные эксперименты убедительно показывают увеличение синтеза иммуноглобулинов (как класса IgG, так и, в меньшей степени, других классов), отсутствие супрессорного эффекта vp24 ВЭ в отношении В-клеток, активное участие гуморального иммунного ответа в течении лихорадки Эбола и подводит основу под дальнейшие разработки эффективных методов борьбы с этой болезнью.

литература

1. Дадаева А.А., Сизикова Л.П., Жуков В.А., Чепурнов А.А. Динамика иммунологических показателей у морских свинок при введении различных препаратов вируса Эбола // Вопр. вирусол. —

1998. - № 4. - С. 163-169.

2. Мерзликин Н.В., Чепурнов A.A., Истомина Н.Н., Офицеров В.И. и др. Развитие и применение иммуноферментной тест-системы для диагностики лихорадки Эбола // Вопр. вирусол. — 1995. - Т. 40 (1). - С. 31-35.

3. Чепурнов А.А., Чернухин И.В., Терновой В.А., Кудоярова Н.М. и др. Попытка получения вакцины против лихорадки Эбола // Вопр. виру-сол. - 1995. - Т. 40 (6). - С. 257-260.

4. Allison A.C. The mode of action of immunological adjuvants // Dev. Biol. Stand. - 1998. - Vol. 92. -P. 3-11.

5. Bai X.F., Zhu J., Zhang G.X., Kaponides G. et al. IL-10 suppresses experimental autoimmune neuritis and down-regulates TH1-type immune responses // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1997. -Vol. 83 (2). - P. 117-126.

6. Baize S., Leroy E.M, Georges-Courbot M.C., Capron M. et al. Defective humoral responses and extensive intravascular apoptosis are associated with fatal outcome in Ebola virus-infected patients - Nat. Med. - 1999. - Vol. 5 (4). - P. 423-426.

7. Chepurnov А.А., Tuzova М.Н, Ternovoy V.A., Chernukhin I.V. Suppressive effect of Ebola virus on T-cell proliferation in vitro is provided by GP-125 kD viral protein // Imm. Lett. - 1999. - Vol. 68. - P. 257-261.

8. Jahrling P.B., Geisbert T.W., Geisbert J.B., Swearengen J.R. et al. Evaluation of immune globulin and recombinant interferon-alpha2b for treatment of experimental Ebola virus infections // J. Infect. Dis. -

1999. - Vol. 179, Suppl. 1. - P. 224-234.

9. Johnson E.D., Gonzalez J.P., Georges A., Trans R. et al. Haemorrhagic fever virus activity in equatorial Africa: distribution and prevalence of filovirus reactive antibody in the Central African Republic // Soc. Trop. Med. Hyg. - 1993. -Vol. 87 (5). - P. 530-535.

10. Jones R.A., Drexler H.G., Gignac S.M., Child J.A. et al. In vitro beta 2-microglobulin (beta 2m) secretion by normal and leukaemic B-cells: effects of recombinant cytokines and evidence for a differential response to the combined stimulus of phorbol ester and calcium ionophore // Br. J. Cancer. - 1990. -Vol. 61 (5). - P. 675-680.

11. Krause R.M., Dimmock N.J., Morens D.M. Summary of antibody workshop: The Role of Humoral Immunity in the Treatment and Prevention of Emerging and Extant Infectious Diseases // J. Infect. Dis. - 1997. - Vol. 176 (3). - P. 549-559.

12. Subbotina E., Dadaeva A., Kachko A., Chepur nov A. Genetic factors of Ebola virus virulence in guinea pigs // Virus Res. - 2010 Oct. - Vol. 153 (1). -P. 121-133.

13. Tilson M.D., Ozsvath K.J., Hirose H., Xia S. et al. A novel hypothesis to explain the hemorrhagic and connective tissue manifestations of Ebola virus infection // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1996. -Vol. 81 (3). - P. 303-306.

14. Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V. The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses // FEBS Lett. - 1992. - Vol. 305. -P. 181-184.

15. Volchkov V.E., Chepurnov A.A., Volchko-va V.A., Ternovoy V.A. et al. Molecular characterization of guinea pig-adapted variants of Ebola virus // Virology. - 2000, Nov 10. - Vol. 277 (1). - P. 147-155.

сведения об авторах

Шелемба Арсения Александровна - аспирант НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Гуляева Людмила федоровна - доктор мед. наук, профессор, зав. лабораторией