СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ СПОСОБНОСТИ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК
METHOD FOR ASSESSMENT OF FUNCTIONAL ABILITY OF PHAGOCYTES

Изобретение относится к медицине, может быть использовано в иммунологии, хирургии, реаниматологии.
Известен способ оценки функциональной активности нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), предусматривающий расчет относительного количества НСТ-позитивных клеток (Виксман М.Е., Маянский А.Н. Характеристика опсонических факторов по реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1980, т.89, №2, с.214-215). Способ обладает рядом недостатков: субъективность, связанная с невозможностью точного количественного измерения площади отложений диформазана в клетке при микроскопии, трудоемкость.
Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки интенсивности образования активных форм кислорода нейтрофилами в ответ на их стимуляцию опсонизированным зимозаном в реакции хемилюминесценции (Хемилюминесцентный анализ функционального состояния гранулоцитов крови у детей с атопическим дерматитом. / Прохоренков В.И., Куртасова Л.М., Савченко А.А., Чесноков А.Б., Шмидт А.Р. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2000. - №5. - С.34-36). В результате автоматизированного количественного учета интенсивности констант нарастания и спада хемилюминесценции способ позволяет объективно оценить функциональное состояние клеток на этапе киллинга.
Вместе с тем характер индуктора (опсонизированный зимозан) не позволяет получить информации о промежуточных стадиях фагоцитоза (хемотаксиса и адгезии), а также возможных особенностях реакции на бактериальные агенты, имеющие этиологическое значение в развитии тяжелых инфекционных процессов. В последние годы среди микроорганизмов, представляющих наибольшую проблему в отношении частоты выявления, уровня лекарственной устойчивости и ассоциированной летальности выделяют представителей группы неферментирующих грамотрицательных бактерий: Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, а также рода Staphylococcus: метициллен-резистентный Staphylococcus aureus (MRSА). На долю перечисленных микроорганизмов приходится более 63% тяжелых инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии, включая сепсис, тяжелый сепсис и септический шок (Alberti C, Brun-Buisson C, Burchardi H. et al. Intensive Care Med. - 2002. - №28. - P.108-121). Летальность при развитии пневмонии или бактериемии, связанной с вышеозначенными возбудителями, достигает 62% (Cosgrove S.E., Sakoulas G., Perencevich. E.I, Schwaber M.J. at al. Clinical Infectious Diseases. - 2003. - №36. - P.53-59).
Задачей предлагаемого способа является повышение чувствительности определения функциональной способности фагоцитов.
Поставленную задачу решают за счет того, что дополнительно оценивают параметры кинетики хемилюминесценции, индуцированной взвесью клинического штамма метицилленрезистентного Staphylococcus aureus, и при значениях времени выхода кривой на максимум от 2287 до 3520 секунд, максимальной интенсивности сигнала от 4257 до 9516 у.е., а светосуммы - от 169000 до 362000 у.е. регистрируют нормальную функциональную способность фагоцитирующих клеток, при других значениях показателей регистрируют нарушение функциональной способности фагоцитирующих клеток.
6
Способ осуществляют следующим образом: у обследуемых лиц из локтевой вены забирают 2 мл крови в центрифужные пробирки, хорошо перемешивают с 80 ЕД гепарина и 1 мл полиглюкина, инкубируют смесь 25 минут при 37°C и 30 минут при комнатной температуре, после чего переносят лейкоцитарный супернатант в чистые центрифужные пробирки и трижды отмывают в растворе Хенкса без фенолового красного по 5 минут при 1500 об/мин. По окончании третьего центрифугирования супернатант удаляют, а оставшиеся клетки разводят в 2 мл раствора Хенкса. Подсчет лейкоцитов осуществляют в камере Горяева: к 20 мкл лейкоцитарной взвеси добавляют 200 мкл 10% раствора уксусной кислоты с 0,25% раствором трипанового синего. После подсчета клетки доводят раствором Хенкса до концентрации 2*10/мл.
В измерительные кюветы хемилюминометра вносят реакционные смеси, состоящие из 20 мкл донорской сыворотки AB (IV) резус-отрицательной, 50 мкл люминола, 240 мкл раствора Хенкса без красителя и 200 мкл лейкоцитарной взвеси для определения спонтанной хемилюминесценции или 200 мкл раствора Хенкса, 200 мкл взвеси лейкоцитов и 40 мкл взвеси индуктора - для индуцированной.
В качестве индукторов дыхательного "взрыва" используют опсонизированный зимозан ("Sigma", США) и клинический штамм метицилленрезистентного Staphylococcus aureus. Для приготовления суспензии опсонизированного зимозана навеску последнего тщательно перемешивают с донорской сывороткой AB(IV) резус-отрицательной в соотношении 2 мг зимозана на 1 мл сыворотки. После инкубации 30 минут при 37°C смесь центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин, супернатант удаляют, а осевший зимозан ресуспендируют в 10 мл физиологического раствора и трижды отмывают по 10 минут при 3000 об/мин. Полученный опсонизированный зимозан разводят в растворе Хенкса без фенолового красного до концентрации 2 мг/мл, разливают на аликвоты и хранят при -18°C. Размораживают однократно непосредственно перед использованием.
8
Для приготовления взвеси микроорганизмов 24-часовую культуру клинического штамма метицилленрезистентного Staphylococcus aureus разводят в изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации 10 KOE/мл по оптической плотности, контролируемой с помощью фотоколориметра ФЭК-56М при длине волны 540 нм.
Время регистрации показателей составляет 90 минут. У обследуемых лиц дополнительно оценивают параметры кинетики хемилюминесценции, индуцированной взвесью клинического штамма метицилленрезистентного Staphylococcus aureus, и при значениях времени выхода кривой на максимум от 2287 до 3520 секунд, максимальной интенсивности сигнала от 4257 до 9516 у.е., а светосуммы - от 169000 до 362000 у.е. регистрируют нормальную функциональную способность фагоцитирующих клеток, при других значениях показателей регистрируют нарушение функциональной способности фагоцитирующих клеток.
Среди обследованных были условно здоровые лица - доноры (55 человек) с частотой сдачи крови не более одного раза в год, с исключением факторов профессиональных вредностей и курения в анамнезе. Учитывая значимость неферментирующих грамотрицательных бактерий в эпидемиологии тяжелых инфекций в качестве стимуляторов дыхательного "взрыва" фагоцитирующих клеток, кроме зимозана и культуры метицилленрезистентного Staphylococcus aureus, использовались клинические штаммы Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa.
Анализ кинетики хемилюминесценции фагоцитирующих клеток выявил следующие закономерности (табл.1-3).
Таблица 1
Время достижения максимума хемилюминесценции в зависимости от индуктора фагоцитоза
Показатель, сек
Me (Q<sub>1</sub>-Q<sub>2</sub>)
P<sub>Wsp</sub>
P<sub>Wzim</sub>
Tmax sp
1399,0 (749,0-2118,0)
0,135862
Ттах zim
1262,0 (1071,0-1596,0)
0,135862
Tmax Ps.aer
1163,0 (771,0-1435,0)
0,980833
0,942542
Tmax Ac.bau
1111,5 (860,0-1400,0)
0,597103
0,819202
Tmax MRSA
3081,0 (2287,0-3520,0)
0,001309
0,00004
Примечание: средние значения представлены медианой, нижним и верхним квартилем [Me (Q<sub>1</sub>-Q<sub>2</sub>)]; n - число, Tmax sp - время достижения пика спонтанной хемилюминесценции, Tmax zim - время достижения пика индуцированной зимозаном хемилюминесценции, Tmax Ps.aer - время достижения пика индуцированной Pseudomonas aeruginosa хемилюминесценции, Tmax Ac.bau - время достижения пика индуцированной Acinetobacter baumannii хемилюминесценции, Tmax MRSA - время достижения пика индуцированной метициллен-резистентным Staphylococcus aureus хемилюминесценции, P<sub>Wsp</sub> - достоверность различий с показателем спонтанной хемилюминесценции по критерию Wilcoxon; P<sub>Wzim</sub> - достоверность различий с показателем зимозан-индуцированной хемилюминесценции по критерию Wilcoxon.
Время достижения максимума спонтанной хемилюминесценции, а также активированной зимозаном и клиническими штаммами Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa достоверно не отличалось. Стимуляция фагоцитирующих клеток культурой метициллен-резистентного Staphylococcus aureus достоверно увеличивала время, необходимое для достижения максимальной интенсивности реакции.
Таблица 2
Интенсивность хемилюминесценции в зависимости от индуктора фагоцитоза
Показатель, у.е.
Me (Q<sub>1</sub>-Q<sub>2</sub>)
P<sub>Wsp</sub>
P<sub>Wzim</sub>
I max sp
2483,0 (766,0-8976,0)
<0,000001
I max zim
17470,0 (8400,0-31162,0)
<0,000001
I max Ps.aer
11877,0 (4708,0-29706,0)
0,000591
0,564210
I max Ac.bau
12546,0 (5131,5-24998,5)
0,004676
0,710319
I max MRSA
6005,0 (4257,0-9516,0)
0,000040
0,000334
Примечание: средние значения представлены медианой, нижним и верхним квартилем [Me (Q<sub>1</sub>-Q<sub>2</sub>)]; I max sp - максимальная интенсивность спонтанной хемилюминесценции, I max zim - максимальная интенсивность индуцированной зимозаном хемилюминесценции, I max Ps.aer - максимальная интенсивность индуцированной Pseudomonas aeruginosa хемилюминесценции, I max Ac.bau - максимальная интенсивность индуцированной Acinetobacter baumannii хемилюминесценции, I max MRSA - максимальная интенсивность индуцированной метициллен-резистентным Staphylococcus aureus хемилюминесценции, P<sub>Wsp</sub> - достоверность различий с показателем спонтанной хемилюминесценции по критерию Wilcoxon; P<sub>Wzim</sub> - достоверность различий с показателем зимозан-индуцированной хемилюминесценции по критерию Wilcoxon.
Максимальная интенсивность активированной хемилюминесценции лейкоцитов условно здоровых лиц в 2,4-7 раз превышала значение спонтанной реакции, что свидетельствует о высокой резервной возможности фагоцитов обследуемых. При этом стимуляция зимозаном и клиническими штаммами Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa не сопровождалась достоверными различиями максимальной интенсивности свечения. Интенсивность хемилюминесценции, стимулированной культурой метициллен-резистентного Staphylococcus aureus, была в среднем в 2,9 раза меньше по сравнению с зимозан-индуцированной (P=0,000334, табл.2).
Таблица 3
Светосумма хемилюминесценции в зависимости от индуктора фагоцитоза
Показатель, у.е.
Me (Q<sub>1</sub>-Q<sub>2</sub>)
P<sub>Wsp</sub>
P<sub>Wzim</sub>
S max sp
111000,0 (27700,0-267000,0)
<0,000001
S max zim
516000,0 (282000,0-869000,0)
<0,000001
S max Ps.aer
311000,0 (118000,0-581000,0)
0,006166
0,178497
S max Ac.bau
321000,0 (144000,0-640000,0)
0,006642
0,457569
S max MRSA
234000,0 (169000,0-362000,0)
0,000046
0,000692
Примечание: средние значения представлены медианой, нижним и верхним квартилем [Me (Q<sub>1</sub>-Q<sub>2</sub>)]; S max sp - светосумма спонтанной хемилюминесценции, S max zim - светосумма индуцированной зимозаном хемилюминесценции, S max Ps.aer - светосумма индуцированной Pseudomonas aeruginosa хемилюминесценции, S max Ac.bau - светосумма индуцированной Acinetobacter baumannii хемилюминесценции, S max MRSA - светосумма индуцированной метициллен-резистентным Staphylococcus aureus хемилюминесценции, P<sub>Wsp</sub> - достоверность различий с показателем спонтанной хемилюминесценции по критерию Wilcoxon; P<sub>Wzim</sub> - достоверность различий с показателем зимозан-индуцированной хемилюминесценции по критерию Wilcoxon.
Светосумма хемилюминесценции не имела достоверных различий при стимуляции опсонизированным зимозаном и клиническими штаммами Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa. Активация фагоцитирующих клеток культурой метициллен-резистентного Staphylococcus aureus сопровождалась в 2,2 раза меньшей светосуммой реакции.
Таким образом, кинетика хемилюминесценции фагоцитирующих клеток, активированных клиническими штаммами Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa, не имеет достоверных различий с зимозан-индуцированной. Показатели хемилюминесценции фагоцитов, стимулированных культурой метициллен-резистентного Staphylococcus aureus, у относительно здоровых лиц отличаются сравнительно низкой скоростью выхода кривой на максимум и меньшими показателями максимальной интенсивности и светосуммы, характеризующими уровень генерации активных форм кислорода.
Предлагаемый способ использован в оценке функциональной способности фагоцитирующих клеток у 45 больных с острой абдоминальной хирургической патологией, в том числе - у 25 больных с проявлениями вторичного иммунодефицита и развитием абдоминального сепсиса.
Таблица 4
Сравнительная характеристика способов оценки функциональной способности фагоцитов
Способ оценки
Показатель, абс.
ИП
ИО
ЛП
ЛО
Зимозан-индуцированная хемилюминесценция
16
14
6
9
Хемилюминесценция, индуцированная MRSA
24
18
2
1
Примечание: ИП - истинно положительный, ИО - истинно отрицательный, ЛП - ложно положительный, ЛО - ложно отрицательный результаты исследования; диагностическая чувствительность (ДЧ)=ИП/(ИП+ЛО), диагностическая специфичность (ДС)=ИО/(ИО+ЛП).
Расчет операционных характеристик предлагаемого способа определения функциональной способности фагоцитирующих клеток проводили в соответствии с требованиями CONSORD (CONSORD GROUP, 1996). Использование предлагаемого способа позволило повысить диагностическую чувствительность выявления дисфункции фагоцитирующих клеток с 64 до 96%, специфичность - с 70 до 90% (табл.4).
Выписка из истории болезни №2141
Больная Т., 48 лет, поступила в Красноярский городской центр хирургической панкреатологии 2.06.2009 года в тяжелом состоянии после употребления жирной пищи с диагнозом острый панкреатит.
Больной назначена консервативная терапия, на фоне которой состояние оставалось тяжелым, хотя болевой синдром несколько уменьшился, но наблюдалось распространение болей в подреберья, нарастала слабость, сухость во рту. Температура тела - 36,7°C, ЧДД - 20/мин, ЧСС - 110 уд/мин, ритмичный, АД - 115/70 мм рт.ст. Пальпаторно живот несколько вздут, напряжен и болезнен в эпигастральной области. Симптомов раздражения брюшины нет.
9
При лабораторном исследовании крови отмечен лейкоцитоз (13,5*10/л), лейкоцитарная формула соответствовала значениям нормы. В биохимическом анализе крови активность амилазы составляла 112 мг/с*л.
Показатели кинетики спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции фагоцитов находились в диапазоне нормальных значений (Tmax sp - 1404 сек, I max sp - 2511 у.е., S max sp - 108000 у.е.; Тmax zim - 1289 сек, I max zim - 18170 у.е., S zim - 487000 у.е.). При активации фагоцитов культурой метициллен-резистентного Staphylococcus aureus время достижения максимума кривой составило 4054 сек, максимальная интенсивность - 4131 у.е., светосумма - 183000 у.е., что соответствовало нарушению функции фагоцитирующих клеток.
9
С учетом клинико-лабораторных данных у больной диагностирован острый деструктивный панкреатит, выполнена экстренная видеолапароскопия, верифицирован диагноз: стерильный геморрагический панкреонекроз. В последующие восемь суток больная находилась в отделении интенсивной терапии и реанимации, где проводилась инфузионная дезинтоксикационная, антисекреторная, спазмолитическая, симптоматическая терапия, коррекция водно-электролитного баланса и кислотно-щелочного равновесия, антибактериальная профилактика. На фоне проводимого лечения у больной развилась клиническая картина инфицированного панкреонекроза, абдоминального сепсиса. В развернутом анализе крови сохранялся лейкоцитоз (16,7*10/л), появился сдвиг лейкоцитарной формулы влево (палочкоядерных нейтрофилов - 12%). При оценке функции фагоцитирующих клеток обращало на себя внимание значительное уменьшение параметров хемилюминесценции, активированной культурой метициллен-резистентного Staphylococcus aureus: I max MRSA - 3061 у.е., S MRSA - 15100 у.е.), в то время как показатели зимозан-индуцированной реакции соответствовали нижней границе нормы (Tmax zim - 1082 сек, I max zim - 10450 у.е., S zim - 284000 у.е.), а спонтанной - не отличались от средних значений условно здоровых лиц (Tmax sp - 1511 сек, I max sp - 2689 у.е., S sp - 112000 у.е.).
6
5
Учитывая клинико-лабораторные проявления инфицированного панкреонекроза, больной выполнена лапаротомия, оментобурсостомия, некрэктомия, санация и дренирование сальниковой сумки и свободной брюшной полости. В брюшной полости обнаружено до 800 мл мутного гнойного экссудата, в сальниковой сумке - до 200 мл мутного бурого выпота. Поджелудочная железа на всем протяжении - с крупными очагами грязно-зеленых некрозов, в области хвоста - черно-зеленые некрозы забрюшинной клетчатки с переходом на паранефрий. Послеоперационный диагноз: субтотальный инфицированный панкреонекроз, флегмона забрюшинного пространства слева и паранефрия. разлитой гнойный перитонит. При бактериологическом исследовании экссудата идентифицированы Acinitobacter baumannii в количестве 10 КОЕ/мл и Enterococcus spp. в количестве 10 КОЕ/мл.
В последующем больная перенесла пять санационных релапаротомий по поводу гнойных осложнений инфицированного панкреонекроза, разлитого гнойного перитонита. В схеме интенсивной терапии последовательно использованы антибактериальные препараты групп карбапенемов, фторхинолонов в сочетании с метронидазолом, ванкомицина, цефалоспоринов IV поколения, иммунокоррекция (имунофан по 1 мл внутримышечно ежедневно в течение 10 суток), что в комплексе способствовало благоприятному результату лечения. После 22 суток нахождения в отделении интенсивной терапии больная переведена в хирургическое отделение, выписана в удовлетворительном состоянии 18.08.09 года.
Таким образом, учет параметров хемилюминесценции, активированной культурой метициллен-резистентного Staphylococcus aureus, позволяет более чувствительно выявлять функциональную недостаточность фагоцитирующих клеток в отличие от использования неспецифических стимуляторов (зимозана) и других бактериальных агентов.