СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНОМАЛИЙ УПАКОВКИ ХРОМАТИНА СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ МУЖСКОМ БЕСПЛОДИИ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR ABNORMAL CHROMATIN PACKAGING IN MALE INFERTILITY

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно - к области вспомогательных репродуктивных технологий, в частности для увеличения частоты наступления беременности, и может быть использовано при лечении бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой хроматина, и диагностики необходимости специфической терапии или восстановительных процедур при неблагоприятном прогнозе относительно эффективности вспомогательных репродуктивных технологий.
В настоящее время принятые ВОЗ методы диагностики аномалий развития сперматозоидов, приводящие к мужскому бесплодию, основаны на оценке их количества, подвижности и выявлении разрывов ДНК. В тоже время показано, что одной из распространенных причин мужского бесплодия является аномальная или не полностью завершенная компактизация ДНК генома в сперматозоидах.
Известен (RU, заявка 2006130740) способ определения целостности хроматина/ДНК в сперматозоидах животных, включающий стадию обработки образца, содержащего сперматозоиды, денатурирующим ДНК раствором, одну стадию обработки лизирующим раствором для экстракции ядерных белков, стадию определения целостности хроматина/ДНК сперматозоидов, характеризующуюся тем, что лизирующий раствор не содержит денатурирующего белки детергента и не разрушает значительно хвостики сперматозоидов.
Недостатком известного способа следует признать, что оценивается целостность ДНК по наличию или отсутствию разрывов, а этот показатель не коррелирует с патологией, связанной с неполной или аномальной упаковкой хроматина.
Известен также (RU, патент №2262107) способ определения зрелости сперматозоидов путем оценки степени конденсации хроматина сперматозоидов при исследовании эякулята. В процессе определения сравнивают интенсивность флуоресценции ДНК сперматозоидов до и после насильственной деконденсации хроматина гепарином посредством статической обработки методом Колмогорова-Смирнова с определением индекса подобия кривых интенсивности флуоресценции n, при значении которого меньше 48,5 судят о незрелом состоянии сперматозоидов, а при значении n больше 48,5 судят о зрелости сперматозоидов.
Недостатком известного способа следует признать, что свойство хроматина деконденсироваться под действием гепарина лишь косвенно отражает аномалии в его упаковке.
Известен также (RU, патент №2118822) способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов, отличающийся тем, что состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток, либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.
Недостатком известного способа следует признать, что метод не является строго количественным и, как и при использовании для деконденсации гепарина, лишь косвенно отражает аномалии в упаковке хроматина. Кроме того, этот метод требует сложного и дорогостоящего оборудования и не может использоваться для широкого скрининга.
Известен (Fernandes J.L. J.Androl. 2003, v.24(1), h/h/59-66) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии, причем при реализации способа проводят исследование состояния хроматина с использованием флуоресцентного микроскопа и красителя DAPI.
Существенными недостатками метода следует признать трудоемкость, а также длительное время (около 2 недель) пробоподготовки. Принципиально важно, что метод не дает возможности дать точную количественную оценку доли сперматозоидов с нарушенной компактизацией ДНК и объективно охарактеризовать глубину данной патологии.
Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в создании диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.
Технический результат, получаемый при реализации разработанного способа, состоит в упрощении и удешевлении метода при одновременном повышении информативности исследования.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. Согласно разработанному способу определяют количество сперматозоидов в 1 мл раствора, концентрацию сперматозоидов доводят до 10-50 млн/мл буфером PBS, покровные стекла покрывают слоем полилизина, проводят иммобилизацию сперматозоидов на подготовленных покровных стеклах, фиксируют и окрашивают ядра части иммобилизированных сперматозоидов ДНК-связывающим флуорохромом DAPI с получением контрольных образцов, вторую часть иммобилизированных сперматозоидов обрабатывают микрококковой нуклеазой, проводят фиксацию и окрашивание ядер сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, ДНК-связывающим флуорохромом DAPI, окрашенные препараты контрольных сперматозоидов и сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, фотографируют с использованием флуоресцентного микроскопа и анализируют полученные изображения путем сравнения интенсивности флуоресценции изображений сперматозоидов. Снижение интенсивности флуоресценции ядер сперматозоидов после обработки микрококковой нуклеазой отражает выход растворимого (доступного для гидролиза микрококковой нуклеазой) хроматина из ядер. Количественно доля растворимого хроматина соответствует разнице между интенсивностью флуоресценции ядер в контроле и после обработки микрококковой нуклеазой и выражается в процентах от контроля. Увеличение доли растворимого хроматина показывает наличие аномалий в упаковке хроматина, которые являются одной из причин мужского бесплодия.
При реализации разработанного способа необходимо осуществить следующие процедуры.
1. Определить количество сперматозоидов в 1 мл раствора. Для этого используют стандартную камеру Горяева, которая в гематологии применяется для подсчета форменных элементов крови. Определяют количество сперматозоидов в образце. Концентрацию сперматозоидов доводят до 10-50 млн/мл буфером PBS. Эта процедура необходима для расчета концентрации микрококковой нуклеазы. Полученную суспензию нельзя хранить в замороженном состоянии!
2
2
2. Подготовить стекла. Для этого покровные стекла площадью 24×24 мм разрезают стеклорезом на фрагменты площадью около 3×5 мм. Уменьшать размер стекол следует для использования в последующих процедурах стандартных пробирок «Эппендорф» объемом 1.7 мл. Далее стекла порывают раствором полилизина (концентрация 25 мкг/мл) и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, прикрыв от пыли. Объем раствора должен быть таким, чтобы покрыть большую часть стекла (10-50 мкл, в зависимости от площади). Через 30 минут пипеткой отбирают излишек раствора полилизина со стекол обратно в пробирку для последующего использования. Раствор полилизина необходимо хранить при температуре - 20°С. Далее стекла в неплотно закрытой чашке Петри помещают в термостат на 37°С до полного высушивания полилизина. Стекла рекомендуется готовить непосредственно перед диагностикой, так как при длительном хранении они теряют адгезивные свойства.
3. Провести иммобилизацию сперматозоидов на подготовленных стеклах. Для этого покрытые полилизином стекла помещают в пластиковую чашку Петри диаметром 4 см, в чашку наливают 2 мл суспензии сперматозоидов, разбавленной при необходимости PBS. Сперматозоиды осаждают на центрифуге при ускорении 670g, 10 мин. На этом этапе полученные препараты нельзя высушивать.
4. Провести фиксацию и окрашивание ядер сперматозоидов ДНК-связывающим флуорохромом DAPI в контроле. Для этого стекла с иммобилизованными сперматозоидами обрабатывают 0.5% раствором Triton Х-100 на PBS 10 мин при комнатной температуре и отмывают тремя сменами PBS по 5 мин. Для окрашивания ДНК стекла помещают в раствор DAPI (0,1 мкг/мл на PBS) на 10 мин, отмывают от красителя двумя сменами PBS по 5 мин. После окрашивания стекла со сперматозоидами заключают на предметных стеклах в капле Moviol с DABCO (объем капли около 5 мкл). Предуготовленные таким образом препараты являются контролем. Заключенные в Moviol препараты можно хранить в холодильнике 1-2 месяца.
2
2
5. Обработать сперматозоиды микрококковой нуклеазой. Для этого стекла с иммобилизованными сперматозоидами переносят в пробирки с PBS с 0.5 mM PMSF, оставляют на 5 минут и осторожно отбирают раствор. Процедуру повторяют 2-3 раза. Последующие стадии проводят во льду. В пробирки со стеклами добавляют PBS с 0.5 mM PMSF и 0.5% Triton X100 и инкубируют 10 мин во льду. После инкубации стекла отмывают 2 раза PBS с 0.5 mM PMSF, осторожно отбирая жидкость. Далее проводят инкубацию стекол в реакционном буфере: 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2 mM CaCl, 2 mM MgCl и добавляют микроккоковую нуклеазу 10 ед/мг, 20 ед/мг, 30 ед/мг, 40 ед/мг, 80 ед/мг. Инкубацию проводят 10 мин при комнатной температуре. Для остановки реакции к образцам добавляют 100 mM EDTA до конечной концентрации 10 mM и инкубируют 30 мин во льду. Стекла 2-3 раза промывают реакционным буфером без EDTA.
6. Провести фиксацию и окрашивание ядер сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, ДНК-связывающим флуорохромом DAPI. Препараты помещают в фиксирующий раствор (3% параформальдегида на PBS) на 15 мин при комнатной температуре, отмывают от фиксатора двумя сменами PBS по 5 мин. Для окрашивания ДНК стекла помещают в раствор DAPI (0.1 мкг/мл на PBS) на 10 мин, отмывают от красителя двумя сменами PBS по 5 мин. После окрашивания стекла со сперматозоидами заключают на предметных стеклах в капле Moviol с DABCO (объем капли около 5 мкл).
7. Регистрация и обработка изображений. Окрашенные препараты контрольных сперматозоидов и сперматозоидов, обработанных микрококковой нуклеазой, фотографируют на микроскопе Zeiss Axiovert 200M, оснащенном камерой Hamamatsu Orca II-ERG2 и подключенном к компьютеру. Для регистрации и просмотра изображений используют программу Zeiss Axio Vision v4.5. Съемку осуществляют на объективе х20 (можно использовать х40). Полученные изображения экспортируют в формат.tif и анализируют при помощи программы ImageJ. Для анализа изображений проводят следующие манипуляции:
7.1. В программе ImageJ необходимо вызвать меню Analyze->Set measurements и поставить маркер напротив Integrated density, убрав все прочие маркеры.
Открыть изображение и увеличить его до удобного масштаба (~х400).
7.2. При помощи меню можно сделать тусклые участки сперматозоидов отчетливо видимыми;
7.3. Выделить сперматозоид (инструмент свободного выделения, аналог «Лассо» в Photoshop), измерить суммарную яркость. Затем, не сбрасывая выделения, передвинуть его в пустую область (черный фон) и повторно измерить яркость. Значения суммарной яркости сперматозоидов и фона будут автоматически заноситься в таблицу. Выделять сперматозоиды с высокой точностью не требуется.
7.4. Скопировать полученные данные в таблицу Exel.
7.5. Вычесть попарно яркость фона из яркости объекта для каждого замера.
7.6. Полученные данные выражаются графически.
В дальнейшем сущность разработанного метода будет рассмотрена более подробно.
Суть предлагаемого метода в определении аномалий упаковки хроматина сперматозоидов по его доступности для гидролиза микрококковой нуклеазой.
Метод состоит в количественной оценке глубины гидролиза ДНК хроматина микрококковой нуклеазой. После гидролиза хроматина производят окрашивание ядер сперматозоидов флуорохромом DAPI. Контролем при этом является характер гидролиза хроматина сперматозоидов доноров с показателями спермограммы, соответствующими норме.
Метод осуществляют следующим образом.
Свежие сперматозоиды, взятые у здоровых доноров и инфертильных пациентов без очистки от сопутствующих соматических и не дифференцированных клеток, иммобилизуют на стеклах, предварительно покрытых полилизином. Для иммобилизации сперматозоидов можно использовать коммерческие стекла, покрытые специальными адгезивными для клеток составами. С помощью центрифугирования при 650 g обрабатывают 0.5% раствором Triton Х-100 на PBS 10 мин при комнатной температуре и отмывают тремя сменами PBS по 5 минут в каждой смене. На этом этапе можно обойтись однократной промывкой, а вместо PBS можно использовать другой буфер с соответствующими значениями рН и ионной силы.
2
2
2
2
Затем стекла инкубируют в растворе 20 мМ Трис-НСl (рН 8), 2 мМ CaCl, 2 мМ MgCl. Можно использовать 10 мМ Трис-HCl, однако в этом случае концентрация CaCl, и MgCl должна составлять 1 мМ. К среде добавляют микрококковую нуклеазу в диапазоне концентраций от 10 ед/мг до 80 ед/мг. Образцы инкубируют 3 минуты при температуре не ниже 10°С и не выше 40°С. Реакцию гидролиза останавливают добавлением ЭДТА до 10 мМ во льду.
Полученные препараты разделяют на 2 группы: стекла со сперматозоидами, не обработанными нуклеазой (контроль), и стекла со сперматозоидами, обработанными нуклеазой. Препараты помещают в фиксирующий раствор (3% параформальдегида на PBS) на 15 мин при комнатной температуре, отмывают от фиксатора двумя сменами PBS по 5 мин. Вместо параформальдегида можно использовать любой фиксатор, стабилизирующий хроматин в ядрах сперматозоидов. Для окрашивания ДНК стекла помещают в раствор DAPI (0.1 мкг/мл на PBS) на 10 мин, отмывают от красителя двумя сменами PBS по 5 мин. Вместо флуорохрома DAPI можно использовать любой ДНК-связывающий флуорохром. После окрашивания стекла со сперматозоидами заключают на предметных стеклах в капле Moviol с DABCO (объем капли около 5 мкл). Можно использовать другие среды заключения, не обладающие собственной флуоресценцией. Относительное количество ДНК в контрольных и обработанных сперматозоидах определяют по интенсивности флуоресценции флуорохрома. Для этого образцы фотографируют в люминесцентном микроскопе Zeiss Axiovert 200M, оснащенном камерой Hamamatsu Orca II-ERG2 и подключенном к компьютеру. Можно использовать любой флуоресцентный микроскоп, оснащенный камерой и подключенный к компьютеру. Для регистрации и просмотра изображений используют программу Zeiss Axio Vision v4.5. Съемку осуществляют на объективе х20 (можно использовать х40). Полученные изображения экспортируют в формат.tif и анализируют при помощи программы ImageJ. Метод тестирует различия между количеством ДНК в сперматозоидах, не обработанных микрококковой нуклеазой и содержанием ДНК в сперматозоидах, обработанных микрококковой нуклеазой. Различия в содержании нерастворимого нуклеазой хроматина выражаются в процентах от контроля.
Способ был проверен на образцах спермы здоровых доноров и на образцах спермы инфертильных пациентов, предоставленных Центром планирования семьи. Способ реализовывали, как указано выше. Ниже приведены полученные результаты.
4.1. Примеры здоровых доноров:
№№ доноров
Нерастворимый хроматин (%)
1613
93,9
210
88,68
2008
88,73
4.2. Примеры инфертильных пациентов
№№ пациентов
Нерастворимый хроматин (%)
1
65,36
2
62,42
3
77,33
Следовательно, для спермы, взятой у здоровых доноров, содержание ДНК, экстрагированной микронуклеазой, от общего количества ДНК не превышает 3%, а для спермы, взятой у инфертильных пациентов, содержание экстрагированной ДНК от общего количества ДНК, как правило, увеличивается в 10-20 раз и в некоторых случаях достигает 60% и выше.
Полученные данные коррелирут с электрономикроскопическими исследованиями тех же доноров и пациентов и представляют собой точную количественную оценку содержания в эякуляте инфертильных пациентов аномальных сперматозоидов.