Способ получения биокомпозита с антибактериальными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы
METHOD FOR OBTAINING A BIOCOMPOSITE WITH ANTIBACTERIAL PROPERTIES BASED ON BACTERIAL CELLULOSE HYDROGEL

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к способу получения биокомпозита на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы с физиологически активными соединениями, используемого в качестве раневого покрытия с антибактериальными и регенерационными свойствами.
Назначением биокомпозита, получаемого на основе гидрогелей бактериальной целлюлозы, является создание материала с высокими показателями по биологической совместимости, низкой токсичности, адгезии, высокой влагопоглощающей способности, возможности доставки биологически активных веществ в ткани организма, наличию регенерационных свойств и высокой антибактериальной активности, в том числе по отношению к антибиотикорезистентным штаммам.
В XXI веке лечебные материалы, раневые покрытия и повязки становятся все более многофункциональными. В их основе лежат не только текстильные, но и многокомпонентные композиционные материалы, состоящие из текстильных и полимерных составляющих (пленки, гидрогели), содержащие введенные в них лекарственные препараты и биологически активные вещества.
Известно достаточно много разнообразных покрытий для лечения ран, в которых на основу природного происхождения или на синтетический материал нанесены лекарственные препараты. Эти лекарственные средства имеют различный состав биологически активных компонентов: препараты антимикробного, антиферментного, репаративного действия, антибиотики и т.д.
Известно покрытие для ран, состоящее из бактериальной целлюлозы. Под этим покрытием сохраняется влага, рана изолирована от воздуха, а сама бактериальная целлюлоза легко отделяется от раны благодаря тому, что не является биодеградируемой (CA 2632767, МПК А61К 37/715, опубл. 07.06.2007).
В состав данного покрытия введены лекарственные препараты разной направленности действия для лечения ран и ростовой фактор, способствующий восстановлению поврежденных тканей, в том числе мягких тканей.
Известно биологически активное раневое покрытие на основе гидратированной микробной целлюлозы с наслоенным на нее коллагеновым гелем с использованием клеточного материала человека. Гель содержит десятикратный концентрат ростовой среды M199 в количестве 3-5% от общего объема, антибиотики широкого спектра действия (например, смесь антибиотиков пенициллин от 50 до 100 единиц/мл и стрептомицин от 0,05 до 0,1 мг/мл) (RU 2430743, МПК A61L 15/28, A61F 13/02, A61L 15/44, опубл. 10.10.2011).
Недостатком известного решения является использование антибиотиков пенициллина и стрептомицина, к которым быстро развивается устойчивость микроорганизмов.
Известна термореактивная нейтрализованная композиция хитозана, образующая гидрогель, ее лиофилизат и способы получения. Водная термореактивная нейтрализованная композиция хитозана, образующая, свободный от фосфата прозрачный гидрогель при температуре выше 5°С, которая включает, в пересчете на общую массу композиции, 0,1-5,0% реацетилированного хитозана с молекулярной массой не менее 100 кДа и степенью деацетилирования от 40 до 70%, нейтрализованного гидроксилированным основанием, и 1-30% комплексообразующего вещества, выбранного из полиоз (полисахаридов) и происходящих из них полиолей (RU 2008130389, опубл. 27.01.2010, МПК A61K 9/00, A61K 9/19, опубл. 27.01.2010).
Полученный гель, так же как и пленка, не может быть применен при глубоких ожоговых ранах III-А и III-Б степеней по причине быстрой биодеградации в раневой среде и требует частых повторных обработок и дополнительной обработки гнойной раны растворами антисептиков.
Известна фармацевтическая композиция для лечения ран и ожогов, которая включает следующие компоненты: коллоидное серебро, коллоидный оксид цинка, глицерин, метилцеллюлоза и вода дистиллированная. Композит может быть использован в терапии и хирургии для заживления ожоговых ран, в качестве репаративного, противовоспалительного и улучшающего микроциркуляцию средства, для лечения термических, солнечных и химических ожогов (RU 2636530, МПК A61K 33/30, A61K 33/38, A61P 17/02, опубл. 23.11.2016).
Данная композиция обладает высокоэффективным регенерирующим, ранозаживляющим действием, однако недостатком является то, что композит выполнен в форме фармацевтической гидрофильной мазевой композиции, а не гидрогеля, что является более удобной формой.
Известен биоактивный гидрогель для регенерации кожи, полученный посредством химической сшивки желатина глутаровым диальдегидом. Данный гидрогель характеризуется пониженным содержанием и расходом сшивающего агента, пониженной остаточной токсичностью сшивающего агента, повышенной биосовместимостью, повышенной регенеративной активностью. Биоактивный гидрогель дополнительно содержит анионный полимер и бивалентный металл в конечной концентрации не более 50 мМ (RU 2659383, МПК A61K 38/17, опубл. 29.06.2018).
Наиболее близким решением, взятым в качестве прототипа, является способ получения биокомпозита с регенерационными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы. Биокомпозит представляет собой гидрогель бактериальная целлюлоза-хитозан в соотношениях 50:50 путем смешения 2 %-го раствора хитозана в 1 %-ой уксусной кислоте, гидрогеля бактериальной целлюлозы, 25 %-го глутарового альдегида, а также получении гидрогеля бактериальная целлюлоза:хитозан:желатин: трансглютаминаза в соотношении 5:5:15:5 соответственно и добавлением фузидина натрия, физиологически активных соединений полифенольной природы в виде дегидрокварцетина или ресвератрола, ферментов в виде трипсина, химотрипсина или лизоцима, низкомолекулярных пептидов (RU 2733137, МПК C12N 1/20, A61L 15/36, опубл. 29.09.2020).
Недостатком известного решения является сложный состав композиций и использование в качестве сшивающих агентов глутарового альдегида и  фермента трансглютаминазы.
Технический результат заявленного изобретения заключается в расширении ассортимента раневых покрытий на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы с регенерационными свойствами и усиленным антибактериальным действием.
Komagataeibacter sucrofermentans
Сущность изобретения заключается в том, что способ получения биокомпозита с антибактериальными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы заключается в получении гель-пленки бактериальной целлюлозы путем культивирования штамма бактерий  ВКПМ B-11267 в статических условиях на среде с мелассой, отделении полученной гель-пленки бактериальной целлюлозы от культуральной среды и ее очищении, механическом измельчении очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы в течение 10 мин с получением гидрогеля бактериальной целлюлозы с гидромодулем с соотношением 1:3, получении гидрогеля «бактериальная целлюлоза – фузидин натрия» или «бактериальная целлюлоза – лизоцим» путем внесения антибиотика фузидина натрия в концентрации 7,5 мг/мл гидрогеля или фермента лизоцима в концентрации 1 мг/мл гидрогеля.
Gluconacetobacter xylinus
Komagataeibacte
Komagatabacter
K. xylinus, K. hansenii, K. europaeus, K. oboediens, K. intermedius, K. swingsii, K. rhaeticus, K. saccharivorans, K. nataicola, K. kombuchae, K. sucrofermentans, K. kakiaceti, K. medellinensis, K. maltaceti
В настоящее время бактерии группы  перенесены в новый род r, первоначально названный  () (Yamada et al., 2012; Yamada, 2014; Ревин, 2020).
Komagataeibacter sucrofermentans
Komagataeibacter sucrofermentans
В качестве продуцента бактериальной целлюлозы в заявленном изобретении использовали штамм Н-110, который был выделен на кафедре биотехнологии Мордовского госуниверситета из чайного гриба с последующей селекцией на основе естественного отбора. Культура идентифицирована до вида с помощью анализа генов, кодирующих 16S рРНК в ФГУПГосНИИГенетика. Штамм бактерий  B-11267 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером: В-11267. Штамм бактерий не является зоопатогенным, фитопатогенным и не представляет опасности по другим причинам.
Способ получения бактериальной целлюлозы описан в изобретениях заявителя (RU 2536973, МПК C12N 1/20, опубл. 27.12.2014, RU 2536257, МПК C12N 1/20, опубл. 20.12.2014).
Бактериальная целлюлоза формирует матрицу из тонкой сети нановолокон, которая обладает высокой влагосвязывающей и влагоудерживающей способностью, селективной проницаемостью для газов и пара, не проницаема для бактерий.
S. aureus
S. aureus
В заявленном изобретении используют антибиотик фузидин натрия, эффективность которого доказана при наружном применении, в частности, в лечении системных и местных стафилококковых инфекций кожи и мягких тканей. Фузидин натрия эффективен в отношении стафилококков, устойчивых к пенициллинам, стрептомицину, хлорамфениколу, эритромицину. Препарат эффективен в лечении системных и местных стафилококковых инфекций кожи и мягких тканей, костей и суставов, крови, эндокарда, глаз, в том числе вызванных метициллинорезистентными штаммами. При наружном применении глубоко проникает в кожу в области пораженных участков. Фузидовая кислота хорошо переносится больными, имеет низкие уровни токсичности, резистентности и аллергических реакций. Перекрестная резистентность с другими антибиотиками отсутствует. Кроме того, помимо антибактериального фузидовая кислота обладает слабым иммуномодулирующим действием, которое связывают с подавлением продукции и секреции цитокинов, особенно интерлейкинов и фактора некроза опухолей. Показано, что фузидовая кислота обладает ингибирующим действием на образование биопленок  (Siala et al., 2018. Antimicrob. Agents Chemother. 62 (7). doi:10.1128/aac.00598-18), эффективно снижает вирулентность , ингибируя экспрессию  б-токсина (Liu et al., 2020. Front. Microbiol.11. doi:10.3389/fmicb.2020.00025).
Staphylococcus aureus
Изложенное позволяет включить фузидовую кислоту в один ряд с современными антибактериальными препаратами и рекомендовать ее к более широкому использованию, особенно при инфекциях, вызванных метициллинорезистентными штаммами .
Способ получения биокомпозита с антибактериальными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы, осуществляют следующим образом.
Komagataeibacter sucrofermentans
Пример 1. Получают гель-пленку бактериальной целлюлозы путем культивирования штамма бактерий  ВКПМ B-11267 на среде с мелассой. Для удаления клеток и компонентов культуральной среды отделяют полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы от культуральной среды и очищают. Стерилизуют гель-пленку бактериальной целлюлозы при температуре 120 °С в течение 20 мин.
S. aureus
Проводят механическое измельчение очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы в течение 10 мин с получением гидрогеля бактериальной целлюлозы с гидромодулем с соотношением 1:3. Гидрогель «бактериальная целлюлоза – фузидин натрия» получают путем внесения антибиотика фузидина натрия в концентрации 7,5 мг/мл гидрогеля. Диаметр зоны отсутствия роста  вокруг лунки с гидрогелем составляет 36±1мм.
Komagataeibacter sucrofermentans
S. aureus
Пример 2. Получают гель-пленку бактериальной целлюлозы путем культивирования штамма бактерий  ВКПМ B-11267 в статических условиях на среде с мелассой. Для удаления клеток и компонентов культуральной среды отделяют полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы от культуральной среды и очищают. Стерилизуют гель-пленку бактериальной целлюлозы при температуре 120 °С в течение 20 мин. Проводят механическое измельчение очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля с соотношением 1:3. Гидрогель бактериальная целлюлоза – фузидин натрия» получают путем внесения антибиотика фузидина натрия в концентрации 7,5 мг/мл гидрогеля. Гидрогель наносят на матрицу в виде хирургического пластыря. Диаметр зоны отсутствия роста  вокруг пластыря с гидрогелем составляет 32±1мм.
Komagataeibacter sucrofermentans
S. aureus
Пример 3. Получают гель-пленку бактериальной целлюлозы путем штамма бактерий  ВКПМ B-11267 в статических условиях на среде с мелассой. Для удаления клеток и компонентов культуральной среды отделяют полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы от культуральной среды и очищают. Стерилизуют гель-пленку бактериальной целлюлозы при температуре 120 °С в течение 20 мин. Проводят механическое измельчение очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля с соотношением 1:3. Гидрогель «бактериальная целлюлоза – фузидин натрия» получают путем внесения антибиотика фузидина натрия в концентрации 7,5 мг/мл гидрогеля. Гидрогель наносят на матрицу в виде сухой пленки бактериальной целлюлозы. Диаметр зоны отсутствия роста  вокруг пленки с гидрогелем составляет 33±1мм.
Komagataeibacter sucrofermentans
S. aureus
Пример 4. Получают гель-пленку бактериальной целлюлозы путем культивирования штамма бактерий  ВКПМ B-11267 в статических условиях на среде с мелассой. Для удаления клеток и компонентов культуральной среды отделяют полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы от культуральной среды и очищают. Стерилизуют гель-пленку бактериальной целлюлозы при температуре 120 °С в течение 20 мин. Проводят механическое измельчение очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля с соотношением 1:3. Гидрогель «бактериальная целлюлоза – лизоцим» получают путем внесения фермента лизоцима в концентрации 1 мг/мл гидрогеля. Диаметр зоны отсутствия роста  вокруг лунки с гидрогелем составляет 25±1мм.
Komagataeibacter sucrofermentans
S. aureus
Пример 5. Получают гель-пленку бактериальной целлюлозы путем культивирования штамма бактерий  B-11267 в статических условиях на среде с мелассой. Для удаления клеток и компонентов культуральной среды отделяют полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы от культуральной среды и очищают. Стерилизуют гель-пленку бактериальной целлюлозы при температуре 120 °С в течение 20 мин. Проводят механическое измельчение очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля с соотношением 1:3. Гидрогель «бактериальная целлюлоза – лизоцим» получают путем внесения фермента лизоцима в концентрации 1 мг/мл гидрогеля. Гидрогель наносят на матрицу в виде хирургического пластыря. Диаметр зоны отсутствия роста  вокруг пластыря с гидрогелем составляет 25±1мм.
Komagataeibacter sucrofermentans
S. aureus
Пример 6. Получают гель-пленку бактериальной целлюлозы путем культивирования штамма бактерий  ВКПМ B-11267 в статических условиях на среде с мелассой. Для удаления клеток и компонентов культуральной среды отделяют полученную гель-пленку бактериальной целлюлозы от культуральной среды и очищают. Стерилизуют гель-пленку бактериальной целлюлозы при температуре 120 °С в течение 20 мин. Проводят механическое измельчение очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы с получением гидромодуля с соотношением 1:3. Гидрогель «бактериальная целлюлоза – лизоцим» получают путем внесения фермента лизоцима в концентрации 1 мг/мл гидрогеля. Гидрогель наносят на матрицу в виде сухой пленки бактериальной целлюлозы. Диаметр зоны отсутствия роста  вокруг пластыря с гидрогелем составляет 26±1мм.
Staphylococcus aureus
Антибактериальные свойства заявленного биокомпозита определяют методом, основанным на способности антибиотических веществ диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны, в которых не развиваются чувствительные к этим антибиотикам микроорганизмы. В качестве тест-микроорганизма используют бактерии  209 P. Об антибактериальных свойствах, полученных биокомпозитов судят по диаметру зон задержки роста тест-культуры.
По сравнению с известным решением предлагаемое изобретение позволяет расширить ассортимент раневых покрытий на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы с регенерационными свойствами и усиленным антибактериальным действием.
Разработан биокомпозит на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы, обладающий лечебным действием, содержащий в качестве антибактериального средства фузидин натрия или лизоцим.
Staphylococcus aureus
Полученный биокомпозит обладает высокой антибиотической активностью в отношении бактерий  и регенерационными свойствами и может быть использован в медицине в качестве раневых покрытий.