Морфометрическое состояние нейронов коры полушарий мозжечка белых крыс при черепно-мозговой травме

УДК 615.

МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ

НЕЙРОНОВ КОРЫ ПОЛУШАРИЙ МОЗЖЕЧКА БЕЛЫХ КРЫС ПРИ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЕ

О. С. Шубина, М.В. Егорова

ФГБОУ ВО «Мордовский государственный педагогический институт им. М.Е. Евсевьева» Саранск, Россия

Аннотация. В работе представлены результаты исследования, целью которого являлось изучение морфометри-ческого состояния нейронов коры полушарий мозжечка белых крыс при черепно-мозговой травме в посттравматическом периоде.

Ключевые слова: кора мозжечка, нейрон, цитоархитектоника, морфометрия, черепно-мозговая травма.

Введение. Травматические повреждения головного мозга, являются одной из лидирующих причин смертности и инвалидизации лиц молодого и среднего возраста [1]. Известно, что после черепно-мозговой травмы (ЧМТ) в мозге инициируется сложный процесс, который сопровождается выраженными морфологическими нарушениями. По данным ряда авторов, вследствие травматического повреждения мозга запускаются каскадные необратимые морфофункциональные дистрофические и некротические процессы, которые во многом определяют выраженность моторных и когнитивных нарушений в посттравматическом периоде [2].

Считается, что именно морфологические изменения паренхимы мозга вследствие механического воздействия на его ткань во многом определяют характер и выраженность последствий ЧМТ [3—6]. Несмотря на определенные успехи в этой области, актуальность данной проблемы не снижается, поскольку сведений о влиянии черепно-мозговой травмы на строение коры мозга (мозжечка) в постравматическом периоде в доступной печати недостаточны [7].

Цель работы изучить морфометрическое состояние нейронов слоев коры полушарий мозжеч-

ка головного мозга половозрелых белых крыс-самцов в норме и при нанесении черепно-мозговой травмы.

Материал и методы. В работе использовали половозрелых белых беспородных крыс-самцов массой 200—250 г. Эксперимент произведен на 20 животных, содержащихся на общем режиме вивария. Контрольную группу составили 10 ин-тактных животных, опытную группу — 10 животных, которым наносилась черепно-мозговая травма легкой степени. Черепно-мозговую травму наносили путем свободного падения груза на голову, которая как правило фиксировалась. Голова животного при этом может быть фиксирована, однако в большинстве исследований ее не фиксировали. Травму наносили под общей анестезией. Масса груза составляла 50 грамм, высота падения 100 см. Отсутствие необходимости выполнять трефинацию черепа и непродолжительность подготовки животного к нанесению травмы делают эту модель простой и удобной. Животные забивались путем дека-питации под наркозом

----—

и Хельсинкской декларации, и в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных.

Отмечены некоторые особенности поведения опытной группы животных. После нанесения удара крысы, как правило, впадали в легкое бессознательное состояние в течение промежутка времени до 30 секунд. В течение нескольких минут животные оставались заторможенными, дезориентированными, вялыми. Затем, в течение первого часа их состояние улучшалось.

Материалом для исследования служили участки коры полушарий мозжечка головного мозга белых крыс. Для получения материала с полости черепа ножницами срезали кожно-мышечные покровы, обнажая костную ткань. Из черепной коробки мозжечок доставали путем отделения височной, теменной, лобной, затылочной, носовой, слезной, клиновидной и других костей, с последующим рассечением твердой и мягкой мозговых оболочек анатомическими ножницами [8].

Для гистологического исследования мозжечок фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, затем, его подвергали промывке в проточной воде, обезвоживанию путем помещения исследуемого материала в спирты возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Изготавливали фронтальные срезы толщиной 5—7 мкм (по 2 среза с каждого материала исследования). Срезы помещали на предметные стекла и окрашивали гематоксилином-эозином. Изучали 20 срезов коры полушарий мозжечка головного мозга белых крыс в норме и 20 срезов при черепно-мозговой травме. На каждом срезе была проведена цитоархитектоническая дифферен-цировка коры полушарий мозжечка в соответствии с его характеристикой. С помощью цифрового микроскопа Axio Imager. M2 (ZEISS, Япония) с программным обеспечением для анализа изображений AxioVision SE64 Rel. 4.8.3 и ZEN 2011 проводилось измерение толщины слоев полушарий коры мозжечка (n = 100, об. 40; ок. 10.). В этих же слоях, в четырех полях зрения, измерялись следующие морфометрические параметры клеток: площадь клетки, минимальный и максимальный диаметры клетки, площадь ядра, минимальный и максимальный диаметры ядра, с видимым ядрышком (n = 240, об. 100; ок. 10). Был вычислен индекс удлиненности ядер клеток (Е) — частное от деления максимального диаметра ядра на минимальный диаметр

ядра. Объемы тел нейронов и их ядер вычислялся по формуле объема эллипсоида вращения [9]. Также была вычислена концентрация нейронов (К) по формуле:

К = х х 106 / 4 1 500 х n,

где х — количество клеток (не менее 100), n — количество полей зрения (не менее 4), 41 500 — площадь

2

каждого поля зрения, мкм .

Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) рассчитывали по следующей формуле:

ЯЦО = ^ядра / ^перикариона — Vядра,

где Кадра — объем ядра, Кперикариона — объем перика-риона.

Фотосъемка препаратов производилась при помощи цифрового микроскопа Axio Imager. M2 (ZEISS, Япония) с программным обеспечением для анализа изображений AxioVision SE64 Rel. 4.8.3 и ZEN 2011 [10].

Для статистической обработки полученных результатов применялся параметрический t-кри-терий Стьюдента. Распределения исследуемых показателей удовлетворяли двум обязательным условиям применения t-критерия Стьюдента: нормальность распределения в обеих группах сравнения и равенство двух генеральных дисперсий в группах сравнения. Статистическую обработку результатов исследования проводили по S. Hanz при помощи программы Microsoft Exсel с вычислением (х ± sx), где х — среднее арифметическое, sx — среднее квадратическое отклонение. При оценке статистических гипотез принимался уровень значимости p < 0,05 [9].

Результаты и обсуждение. После первых суток экспериментальной ЧМТ по данным гистологического исследования, у животных опытной группы в области первичной травмы общая микроструктура коры мозжечка головного мозга сохраняла сходную архитектонику с контрольной группой и состояла из следующих слоев: 1) наружного — молекулярного слоя; 2) среднего — слоя клеток грушевидных нейроцитов; 3) внутреннего — зернистого слоя (рис. 1).

Среди нервных клеток молекулярного слоя, подвергнутых черепно-мозговой травме, встречались светлые клетки округлой формы, что свидетельствовало о повышенном содержании эухро-матина. Ядрышко их было интенсивно окрашено, чаще всего занимало экцентричное положение.

----—-

Рис. 1. Кора полушарий мозжечка головного мозга белых крыс после черепно-мозговой травмы:

1 — молекулярный слой; 2 — слой клеток грушевидных нейроцитов; 3 — зернистый слой. Окраска — гематоксилин-эозин. Об. 40 х ок. 10

Рис. 2. Нейроны молекулярного слоя коры полушарий мозжечка головного мозга белых крыс после черепно-мозговой травмы:

1 — корзинчатые клетки; 2 — звездчатые клетки. Окраска гематоксилин-эозин. Об. 100 х ок. 10

Таблица

Морфометрические показатели нейронов коры полушарий мозжечка головного мозга белых крыс в норме и при черепно-мозговой травме

Показатели Молекулярный слой

К О К О К О К О

Диаметр ядра минимальный, мкм 9,1 ± ± 0,04 7,2 ± ± 0,10* 5,9 ± ± 0,07 7,3 ± ± 0,11* 14,6 ± ± 0,43 12,3 ± ± 3,18* 7,6 ± ± 0,08 7,2 ± ± 0,08

Диаметр ядра максимальный, мкм 10,8 ± ± 0,09 8,4 ± ± 0,14* 8,3 ± ± 0,08 8,9 ± ± 0,14 22,4 ± ± 0,35 21,6 ± ± 4,37 8,2 ± ± 0,08 8,8 ± ± 0,05

Площадь ядра, мкм2 64,3 ± ± 3,21 78,0 ± ± 1,73* 50,6 ± ± 2,53 42,7 ± ± 0,55* 337,9 ± ± 7,63 188,5 ± ± 6,39* 43,9 ± ± 0,60 42,5 ± ± 0,98

Объем ядра, мкм3 469,3 ± ± 23,15 255,0 ± ± 12,8* 152,3 ± ± 7,64 248,2 ± ± 12,41* 2493,3 ± ± 23,89 1710,2 ± ± 85,51* 247,4 ± ± 12,37 237,8 ± ± 11,93

Диаметр клетки минимальный, мкм 12,1 ± ± 0,1 9,5 ± ± 0,16* 8,5 ± ± 0,08 8,3 ± ± 0,12 21,9 ± ± 0,39 18,5 ± ± 5,99* 9,2 ± ± 0,07 9,3 ± ± 0,07

Диаметр клетки максимальный, мкм 14,5 ± ± 0,10 15,4 ± ± 0,16 10,8 ± ± 0,11 10,1 ± ± 0,11 32,7 ± ± 0,32 36,8 ± ± 6,12 10,9 ± ± 0,05 10,9 ± ± 0,07

Площадь клетки, мкм2 199,9 ± ± 9,95 114,83 ± ± 1,84* 69,9 ± ± 3,49 52,9 ± ± 1,00* 732,9 ± ± 12,95 547,4 ± ± 16,85* 73,7 ± ± 0,71 73,4 ± ± 1,02

Объем клетки, мкм3 1115,2 ± ± 55,75 727,4 ± ± 36,36* 408,9 ± ± 20,41 324,1 ± ± 18,21* 8190,1 ± ± 81,89 6591,3 ± ± 65,91* 483,7 ± ± 24,19 493,4 ± ± 24,67

Индекс удлиненности ядер клеток, Е 1,19 1,31 1,41 1,21 1,53 1,76 1,09 1,22

Концентрация нейронов в 1 мкм2, К 1204,8 703,4 1084,3 800,9 597,4 520,1 4216,9 3243,8

Ядерно-цитоплазматиче-ское отношение, ЯЦО 0,73 ± ± 0,04 0,54 ± ± 0,02 0,59 ± ± 0,03 2,14 ± ± 0,11 0,44 ± ± 0,02 0,35 ± ± 0,02 1,05 ± ± 0,05 0,83 ± ± 0,05

Толщина слоя, мкм 320,3 ± 7,17 251,5 ± 5,97* 40,1 ± ± 0,60 46,9 ± ± 0,59* 620,2 ± ± 29,66 236,4 ± ± 8,68*

Примечания: * различия в сравнении с контролем статистически значимы при р < 0,05. К — контрольная группа; О — опытная группа.

Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК

~ 97 ~

—--—-

Рис. 3. Клетки Пуркинье слоя клеток грушевидных нейроцитов коры полушарий мозжечка головного мозга белых крыс после черепно-мозговой травмы.

Окраска гематоксилин-эозин. Об. 100 х ок. 10

Также определялись темноокрашенные нервные клетки — гиперхромные. Ядра их имели неровные границы, ядрышко трудно различалось на фоне глыбок хроматина. В нейронах в основном наблюдали эксцентричное расположение ядрышек, у ка-риолеммы. При визуальном анализе препаратов определялись клетки в пограничном состоянии — «клетки-тени» с признаками отчетливо выраженного хроматолиза. Клетки-тени характеризовались глубоким разряжением цитоплазмы, отсутствием ядра и ядрышка. К ним также относили фрагменты нервных клеток, которых сложно, а иногда невозможно отличить от распавшихся клеток.

При морфометрическом исследовании молекулярного слоя при черепно-мозговой травме по сравнению с контролем отмечено значительное уменьшение концентрации его перикарионов: кор-зинчатых нейронов на 42%, а звездчатых нейронов на 26% (см. рис. 2, табл.). При этом ядерно-цито-плазматическое отношение (ЯЦО) корзинчатых нейронов (0,54 ± 0,02) уменьшилось по сравнению с контролем на 26%, что свидетельствует о существенном повышении функциональной активности нейронов, а звездчатых нейронов — увеличилось на 200% (2,14 ± 0,11), что свидетельствует о существенном понижении функциональной активности нейронов. Слой отличался мелкопористой структурой. Толщина слоя уменьшилась на 21% по сравнению с контролем. Минимальный диаметр корзинчатых нейронов уменьшился на 20,3%. Средняя площадь клеток уменьшилась на 43%, также почти в полтора раза уменьшился средний объем клеток. Максимальный и минимальный диаметры ядра

Рис. 4. Клетки-зерна зернистого слоя коры полушарий мозжечка головного мозга белых крыс после черепно-мозговой травмы.

Окраска гематоксилин-эозин. Об. 100 х ок. 10.

уменьшились на 22% и 21%, соответственно. Коэффициент удлиненности ядра (Е) составил 1,31. Площадь ядра увеличилась на 21%, объем ядра уменьшился почти в два раза. У звездчатых нейронов статистически значимые изменения претерпевали минимальный диаметр ядра (увеличился на 23%), средняя площадь ядра (уменьшилась на 16%) и средний объем ядра (увеличился почти в два раза). Коэффициент удлиненности ядра (Е) составил 1,21 (см. табл.).

При исследовании слоя клеток грушевидных нейроцитов в опытной группе животных после черепно-мозговой травмы отмечено неравномерное распределение клеток Пуркинье, с эктопией в зернистый слой. Контур перикарионов нечеткий, принимает вытянутую овальную форму, ядро и цитоплазма имеют трудноразличимые границы. Вокруг нейронов видны участки просветления (рис. 3). Выявлены гипохромные (светлые) и нормохромные нейроциты, а также «клетки-тени», т.е. деструктивно измененные нейроны. Концентрация нейронов составила 520,1 в 1 мкм2, что на 15% меньше, чем в контроле (см. табл.). ЯЦО клеток Пуркинье (0,35 ± 0,02) по сравнению с контролем уменьшилось на 25%, что свидетельствует о существенном повышении функциональной активности нейронов. Толщина слоя превысила контроль на 15%. Минимальные диаметры клетки и ядра уменьшились на 15%, площадь клетки уменьшилась на 44,2%, объем уменьшился в два раза. Площадь и объем ядра уменьшились на 25% и 19%, соответственно. Коэффициент удиненности ядра (Е) равен 1,76 (см. табл.).

----—

При исследовании зернистого слоя в опытной группе животных отмечена миграция клеток-зерен в молекулярный слой (см. рис. 4). В нейронах преобладали гидропические изменения. В осветленной нейроплазме обнаруживалась губчатая пенистость, ядра обычно были измененной формы, осветленные либо пикнотичные, некоторые из них утратили ядрышко. Встречались гиперхромные нейроны с признаками пикноморфного набухания, реже на-читающегося сморщивания, с плохо различимыми ядром и ядрышком. Большая часть гиперхромных нервных клеток сохраняли правильную форму тела и ядра. Иногда ядра имели неровные границы. Ядра окрашивались темнее из-за наличия гетерохро-матина. Ядрышки крупные, занимали центральное положение, нередко трудно различались на фоне глыбок хроматина. Концентрация нейронов зернистого слоя составила 3243,8 в 1 мкм2, что на 23% меньше по сравнению с контролем. Ядерно-цито-плазматического отношения (ЯЦО) нейронов (0,83 ± 0,05) по сравнению с контролем уменьшилось на 16%, что свидетельствует о существенном повышении функциональной активности нейронов. Толщина слоя уменьшилась на 62%. Статистически значимых изменений диаметров, площади и объемов перикарионов и ядер не происходило. Коэффициент удлиненности ядра (Е) составлил 1,22 (см. табл.).

Выводы

1. Проведенные исследования структурно-функционального состояния нейронов слоев коры полушарий мозжечка головного мозга половозрелых белых крыс при черепно-мозговой травме по сравнению с контролем выявили следующие существенные статистически значимые изменения:

— уменьшение толщины молекулярного слоя на 21% и зернистого слоя на 62%, увеличение слоя клеток грушевидных нейроцитов на 15%;

— уменьшение площади перикарионов кор-зинчатых нейронов на 21%, звездчатых нейронов на 23%, и клеток Пуркинье на 44,2%. Площадь клеток-зерен статистически значимых изменений не претерпела;

— уменьшение объема перикарионов корзин-чатых нейронов на 115,2%, клеток Пуркинье на 50%, у звездчатых нейронов увеличение 99,9%;

— увеличение площади ядер корзинчатых нейронов на 21%, клеток Пуркинье на 25%, уменьшение у звездчатых нейронов на 16%;

— уменьшение объема ядер корзинчатых нейронов на 50%, клеток Пуркинье на 31,4%, увеличение у звездчатых нейронов на 50,3%;

2. Анализ полученных результатов свидетельствует о том, что в условиях экспериментальной черепно-мозговой травмы (ЧМТ) развиваются значительные морфологические и морфометрические изменения нейронов коры мозжечка головного мозга белых крыс, что может быть основой отклонения поведенческих реакций животных.

Работа проводилась при финансовой поддержке Минобрнауки РФ в рамках государственного задания ФГБОУ ВО «Мордовский государственный педагогический институт им. М.Е. Евсевь-ева» (проект «Влияние антропогенных факторов на морфофункциональное состояние организма»).

ЛИТЕРАТУРА

1. Карахан В.Б., Крылов В.В., Лебедев В.В. Травматические поражения центральной нервной системы. Болезни нервной системы. М.: Медицина, 2001. С. 74—84.

2. Курако Ю.Л., Букина В.В., Перькова А.В. Мор-фофункциональные соотношения в патогенезе сотрясения головного мозга. Неврология и психиатрия. Киев: Здоров'я, 1989. С. 9—11.

3. Ипастова И. Д. Макро- и микроморфология головного мозга и мозжечка белой крысы // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. 2014. № 4 (32). С. 30—35.

4. Калюжка В.Ю., Макаревич В.Ю. Сравнительно-анатомическое исследование морфометрических параметров головного мозга и мозжечка у беспородных крыс. Хабаровский государственный универститет. Хабаровск, 2013. С. 44—45.

5. Andelic N., Anke A., Skandsen T. Incidence of hospital-admitted severe traumatic brain injury and in-hospital fatality in Norway: a national cohort study. 2012. № 38 (4). С. 259—267.

6. Vilalta A., Sahuquillo J., Merino M.A. Normobaric hyperoxia in traumatic brain injury: does brain metabolic state influence the response to hyperoxic challenge? 2011. № 28 (7). С. 1139—1148.

7. Макаров А.Ю. Последствия ЧМТ и их классификация // Неврологический журнал. 2001. Т. 6. № 2. С. 38—42.

8. Ноздрачев А. Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы (Лабораторные животные). СПб.: Издательство «Лань», 2001.

9. Углов Б.А., Котельников Г.П., Углова М.В. Статистический анализ и математическое моделирование в медико-биологических исследованиях. Самара: Самарский дом печати, 1994.

10. Автандилов Г. Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990.

11. Буреш Я., Бурешова О., Хьюстон Дж. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения // Неврологический журнал. М.: Высшая школа, 1991.

—--—-

MORPHOMETRY STATE

OF CORTICAL NEURONS CEREBELLAR HEMISPHERES WHITE RATS WITH TRAUMATIC BRAIN INJURY

O.S. Shubina, M. V. Egorova

M.E. Evseveva Mordovia State Pedagogical Institute Saransk, Russia

Annotation. The paper presents the results of a study whose purpose was to study the morphological state of neurons in the cortex of the hemispheres of the cerebellum of white rats with traumatic brain injury in the posttraumatic period.

Key words: cerebellar cortex, neuron, cytoarchitecture, morphometry, traumatic brain injury.

REFERENCES

1. Karakhan V.B., Krylov V.V., Lebedev V.V. Traumatic damage to the Central nervous system. Diseases of the nervous system. M.: Medicine, 2001. P. 74—84.

2. Kurako Yu.L., Bukin V.V., Pirkova A.V. Morphological and functional correlations in the pathogenesis of brain concussion. Neurology and psychiatry. Kiev: Health protection, 1989. P. 9—11.

3. Ipatova I.D. Macro- and micromorphology of the brain and the cerebellum of white rats. Bulletin of Bashkir state agrarian University, 2014, no. 4 (32), pp. 30—35.

4. Kaluzhka V.Yu., Makarevich V.Y. Comparative anatomical study of morphometric parameters of the brain and cerebellum from rats. Khabarovsk state University. Khabarovsk, 2013. P. 44—45.

5. Andelic N., Anke A., Skandsen T. Incidence of hospital-admitted severe traumatic brain injury and in-hos-pital fatality in Norway: a national cohort study. 2012. № 38 (4). Q 259—267.

6. Makarov A.Yu. The consequences of TBI and their classification. Neurological journal, 2001, vol. 6, no. 2, pp. 38—42.

7. Nozdrachev A.D., Polyakov E.L. Anatomy of rat (Laboratory animals). SPb.: Publishing House "Fallow Deef', 2001.

8. Uglov B.A., Kotelnikov G.P., Uglova M.V. Statistical analysis and mathematical modeling in biomedical research. Samara: Samara House of the press, 1994.

9. Avtandilov G.G. Medical morphometry. Guide. M.: Medicine, 1990.