СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ АМПЛИФИКАЦИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО МАРКИРОВАНИЯ НЕСКОЛЬКИХ СЕГМЕНТОВ ГЕНОМА МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО КОМПЛЕКСА

1. Способ одновременной амплификации и флуоресцентного маркирования нескольких сегментов генома микобактерий туберкулезного комплекса, проводимых в едином закрытом реакционном объеме (микропробирке или лунке планшета), содержащем по меньшей мере две пары специфичных праймеров и пару адаптерных праймеров, а также конъюгат флуоресцентного красителя и дезкосинуклеозидтрифосфата, обеспечивающий флуоресцентное маркирование, и включающий:
а) этап амплификации, в котором происходит наработка и флуоресцентное маркирование ПЦР-продуктов, включающих специфичные сегменты микобактериального генома и фланкированных на 5'-концах последовательностями, комплементарными последовательностям адаптерных праймеров, и в котором используются:
- по меньшей мере две пары специфичных праймеров, последовательности каждого из которых состоит из двух фрагментов, при этом последовательность фрагмента, включающего 5′-конец праймера, комплементарна последовательности одного из адаптерных праймеров, а последовательность фрагмента, включающего 3'-конец специфичного праймера, комплементарна последовательности сегмента микобактериального генома, при этом концентрация каждого из специфичных праймеров в реакционной смеси меньше концентрации адаптерных праймеров по меньшей мере в 50 раз;
- геномная ДНК микобактерий в качестве матрицы для ПЦР;
- компоненты реакционной смеси, обеспечивающие наработку и флуоресцентное маркирование ПЦР-продуктов, включающих специфичные сегменты микобактериального генома и фланкированных на 5′-концах последовательностями, комплементарными последовательностям адаптерных праймеров;
б) этап амплификации, в котором происходит наработка и флуоресцентное маркирование ПЦР-продуктов, включающих специфичные сегменты микобактериального генома, и в котором используются:
- пара адаптерных праймеров, последовательности которых комплементарны последовательностям фрагментов, находящихся на 5′-концах ПЦР-продуктов, полученных на стадии (а), при этом разница в температурах отжига адаптерных и специфичных праймеров составляет не менее чем 10°C, а концентрации прямого и обратного адаптерных праймеров в реакционной смеси могут различаться в 5 и более раз, с целью получения преимущественно одноцепочечных ПЦР-продуктов;
- ПЦР-продукты, полученные на стадии (а), служащие в качестве матрицы для ПЦР;
- компоненты реакционной смеси, обеспечивающие наработку и флуоресцентное маркирование ПЦР-продуктов, включающих специфичные сегменты микобактериального генома.