Технология HRM-анализа (High Resolution Melting) для определения полиморфизма etsri-pvull в гене эстрогенового рецептора у свиней (sus scrojfa)

УДК 575.174

ТЕХНОЛОГИЯ HRM-АНАЛИЗА

Е. Л. Романишко

аспирант, ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», г. Минск, РБ

Научный руководитель: М. Е. Михайлова

М. Е. Михайлова

кандидат биологических наук, доцент,

ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», г. Минск, РБ

А. И. Киреева

научный сотрудник, ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси», г. Минск, РБ

Для управления селекционным процессом и ведения генетического мониторинга в свиноводстве значительный интерес представляет ген эстрогенового рецептора (ESR1), который является ДНК-маркером плодовитости свиней. В настоящее время для определения полиморфизма ESR1-PvuII используется традиционный метод анализа полимеразная цепная реакция-полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ), который является достаточно длительным по времени и затратным. В данной работе для определения полиморфизма ESR1-PvuII в гене ESR1 у свиней предложена технология HRM-анализа (High Resolution Melting). Отработаны условия проведения ПЦР в реальном времени, подтверждена достоверность определения генотипов АА, ВВ, АВ, а также проанализирована эффективность HRM-метода в сравнении с методом ПЦР-ПДРФ. Была проведена апробация HRM-анализа на выборке свиней (n = 51) породы белорусская крупная белая. Полиморфизм ESR1 -PvuII - один из ключевых ДНК-маркеров в свиноводстве, поэтому предлагаемый метод на основе технологии HRM может использоваться как экспресс-метод для массового скрининга животных.

Введение

Различия в уровне продуктивности между отдельными животными, линиями и породами обусловлены, с одной стороны, средовыми, с другой стороны, генетическими факторами. Большинство хозяйственно полезных признаков сельскохозяйственных животных относится к полигенным признакам, т. е. их количественный уровень генетически определяется целым рядом генов (локусов), разбросанных по всему геному. Такие локусы получили название локусов количественных признаков (QTLs, Quntitative Trait Loci's) [1]. Одним из перспективных направлений использования QTLs в животноводстве является молекулярно-генетический анализ генов-кандидатов, которые кодируют ключевые белки, ответственные за проявления признака.

Важным фактором, влияющим на эффективность производства свинины, является репродуктивный выход. Выявление молекулярных маркеров, влияющих на показатели воспроизводства, на первом плане у многих молекулярных генетиков и селекционеров. Для управления селекционным процессом и ведения генетического мониторинга в свиноводстве значительный интерес представляет ген эстрогенового рецептора ESR1, который является ДНК-маркером плодовитости свиней [2].

Эстрогены - стероидные половые гормоны, способные регулировать рост, дифференцировку и функции в различных клетках и тканях млекопитающих, играющие центральную роль в регуляции процессов размножения. Проводниками гормональных сигналов являются эстрогеновые рецепторы (ESR), представленные в клетках-мишенях органов животных. В настоящее время широко известны два типа эстрогеновых рецепторов - ESR1 и ESR2, которые являются транскрипционными факторами, имеющими центры связывания с регуляторными участками ДНК (промоторами, энхансерами). Гены ESR у свиньи локализованы на коротком

плече 1 хромосомы (SSCI) в регионе p.2.5-p.2.4 [3]. ESR1 получил наиболее широкое распространение в качестве генетического маркера плодовитости свиней.

Для ESR1-PvuII полиморфизма характерна взаимосвязь с репродуктивными качествами свиней породы крупная белая (масса гнезда при рождении, процент мертворожденных поросят и т. д.) [4]. Свиноматки с различными генотипами отличаются по воспроизводительным качествам. Установлено положительное влияние аллеля В на воспроизводительную функцию свиней, в частности, на многоплодие свиней английской крупной белой породы. Свиньи этой породы получили данный аллель от китайской многоплодной породы мэйшан в процессе ее создания в XIX веке с последующей передачей аллеля породам, созданным с участием крупной белой свиньи. В результате исследований установлено, что предпочтительным с точки зрения селекции является генотип ВВ. Превосходство по многоплодию маток составило 0,9 поросенка по сравнению с генотипом АА и по размерам гнезда на 0,7-1,4 поросенка [5], [6].

В настоящее время для определения полиморфизма ESR1-PvuII используется традиционный метод анализа ПЦF-ПДРФ, который является достаточно длительным по времени и затратным. Цель работы заключалась в разработке достоверного и недорогого экспресс-метода для определения полиморфизма ESR1-PvuII с использованием технологии HRM для массового скрининга животных, а также оценка его эффективности в сравнении с методом ПЦF-ПДРФ.

Материалы и методы исследования. В работе в качестве объекта исследования были использованы свиньи белорусской крупной белой породы. Материалом для исследования служила ДНК, выделенная из биологического материала - проб ткани (ушной выщип) и цельной крови. Для выделения ДНК использовали набор реагентов для выделения ДНК «Нуклеосорб» («Праймтех», Беларусь). Была проанализирована выборка животных (n = 125) по полиморфизму ESR1-PvuII гена эстрогенового рецептора. Количество выделенной ДНК определяли с помощью Qubit 2.0 Fluorometer с использованием набора Molecular probes Qubitds DNA BR Assay kit («Life technologies», США). Для постановки ПЦF-FВ и проведения HRM-анализа геномная ДНК образцов была нормализована (концентрация 4 нг/мкл).

ПЦР-ПДРФ метод. Для амплификации фрагмента гена ESR1 длиной 120 п.н. использованы прямой праймер 5'-CCTGTTTTTACAGTGACTTTTACAGAG-3' и обратный праймер 5'-CACTTCGAGGGTCAGTCC AATTAG-3' (Short, 1997) [7]. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала деионизированную воду, 1*nU,F буфер, 1.5 mM MgCl2, 200 мкИ смеси dNTP, 300 нM каждого праймера, 1.5 U Taq-полимеразы («Thermo scientific», Литва) и 50 нг геномной ДНК. Амплификацию проводили на приборе C1000TM Thermal Cycler («Bio-Rad», США) при следующих условиях: 94° С - 4 мин; 35 циклов: 94° С - 30 с, 58° С - 40 с, 72° С - 40 с; 72° С -5 мин. Рестрикция продуктов амплификации длилась в течение ночи при 37o C с использованием рестриктазы PvuII («Thermo scientific», Литва). Идентификацию фрагментов после рестрикционного анализа проводили в 4% агарозном геле (SeaKem LE Agarose, «Lonsa») с использованием интеркалирующего красителя ZUBR Green-1 («Праймтех», Беларусь) относительно маркера молекулярных масс DNA Ladder («Thermo scientific», Литва).

Секвенирование ДНК. Специфичные ПЦF-продукты изучаемого локуса гена ESR1 вырезали из геля и очищали с помощью набора реагентов Silica Bead DNA Gel Extraction Kit («Thermo scientific», Литва) согласно прилагаемой производителем инструкции по применению. Для постановки секвенирующей nUF использовали Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit. Секвенирующую nDF проводили согласно следующим условиям: 96° С 1 мин; 25 циклов: 96° С 10 сек, 50° С 5 сек, 60° С 4 мин; 16° С 5 мин. ПЦ^--продукты после секвенирующей ПЦ^ очищали от непрореагировавших флуоресцентно меченых терминаторных нуклеотидов переосаждением этанолом №2ЭДТА. Определение нуклеотидной последовательности проводили на 3500 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).

HRMA (High Resolution Melting Analysis). Образцы геномной ДНК животных (n = 51) анализировали с использованием технологии HRM-анализа на приборе CFX96 («BioRad», США). Для амплификации фрагмента гена длиной 120 п. н. использованы праймеры, представленные (Short, 1997). Реакционная смесь в общем объеме 25 мкл содержала 1х ПЦ^ мастер-микс («Синтол», Россия) с интеркалирующим красителем EvaGreen, 500 нМ каждого праймера и по 20 нг ДНК каждого образца. Условия проведения амплификации и HRM-анализа были следующими: 95° C - 5 мин.; 35 циклов: 95° C - 10 с, 63° C - 30 с, 72° C - 15 с; 94° C - 1 мин.,

72° C - 30 с; Melt Curve 72°C - 85°C: Increment 0.2°C - 5 с. Анализ результатов проводили с помощью программного обеспечения для HRM-анализа Precision Melt Analysis™ software.

Пост-HRM секвенирование. После определения генотипов методом HRM по 4 образца из каждого кластера с генотипами АА, ВВ, АВ были секвенированы. Полученные ПЦР-продукты после HRM-анализа очищали с помощью набора реагентов Silica Bead DNA Gel Extraction Kit («Thermo scientific», Литва). Секвенирующию ПЦР ставили с ипользованием BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США). Определение нуклеотидной последовательности проводили на генетическом анализаторе 3500 («Applied Biosystems», США).

Результаты исследования и обсуждение

Выборка свиней (n = 125) белорусской крупной белой породы исследована для определения полиморфизма ESR1-PvuII методом ПЦР-ПДРФ. Выявлено 58 особей с гомозиготным генотипом АА, 16 особей с гомозиготным генотипом ВВ и 51 особь с гетерозиготным генотипом АВ. Частоты встречаемости аллелей и генотипов представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Генетическая структура выборок из популяций разных пород и помесей свиней

Генотипы Белорусская крупная белая Белорусская черно-пестрая БЧПхД Дюрок КБхЛ КБхЙ

Ф Т Х2 Ф Т Х2 Ф Т Х2 Ф Т Х2 Ф Т Х2 Ф Т Х2

А А 14 15,75 0,81 14 15,2 1,99 6 5,4 1,15 19 19 0,01 3 2,45 1,37 2 1,8 0,14

А В 34 30,5 11 8,6 2 3,1 1 0,99 1 2,1 2 2,4

В В 13 14,75 0 1,2 1 0,4 0 0,01 1 0,45 1 0,8

Аллели Частоты аллелей

А 0,508 0,780 0,778 0,975 0,700 0,600

В 0,492 0,220 0,222 0,025 0,300 0,400

Примечание: БЧПхД - белорусская черно-пестрая х дюрок, ЕЪхЛ - крупная белая х ландрас, КБхЙ - крупная белая х йоркшир

Частота предпочтительного по признаку многоплодия аллеля В составила 0,332. Все изученные популяции находились в состоянии генетического равновесия по закону Харди-Вайнберга. У свиней породы белорусская крупная белая выявлена наибольшая частота предпочтительного аллеля В (0,492) в сравнении с свиньями породы дюрок, где частота предпочтительного генотипа составила (0,025). Результаты ПЦР-ПДРФ анализа получены с помощью системы гель-документирования Quantum ST4 («Vilber lourman», Франция) представлены на рисунке 1.

Обозначения: М - маркер FastRulerUltra Low Range DNA Ladder, дорожки 8, 16 -гомозиготный генотип АА (120 п.н); дорожки 1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 13, 14, 15, 17 - гетерозиготный генотип АВ (120 п.н., 65 п.н., 55 п.н.); дорожки 3, 10, 12 - гомозиготный генотип ВВ (65 п.н., 55 п.н.).

После ПЦР-ПДРФ анализа были отобраны 3 образца с различными генотипами: гомозиготным генотипом АА, гетерозиготным генотипом АВ и гомозиготным генотипом ВВ. Данные образцы были секвенированы для дальнейшего использования их в качестве контрольных образцов для HRM-анализа. Оценка и обработка данных проводились с использованием программного обеспечения Sequencing Analysis версия 5.4 (рисунок 2).

120 п.н. 65 п.н. 55 п.н.

Рисунок 1 - Определение полиморфизма Е8Я1-Рги11 методом ПЦР-ПДРФ

Двойная гомозигота

Двойная гомозигота

. I I I .

25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64

Двойная гетерозигота

Рисунок 2 - Секвенирование образцов для выявления полиморфизма ESR1-PvuII и определения генотипов АА, ВВ, АВ

По результатам секвенирования было выявлено, что полиморфизм Е8К1-РуыП включает две однонуклеотидные замены 65А^G, 68T^G в гене Е8Я1 интрон 3 (GenBank HF947272).

Только наличие двух SNP дает сайт рестрикции для эндонуклеазы РуиП, что позволяет выявлять особей с генотипом ВВ.

Из общей выборки исследованных животных были отобраны свиньи белорусской крупной белой породы (п = 51) для определения полиморфизма Е8К1-РуыП методом ПЦР в реальном времени с использованием HRM-анализа. Анализ HRM был выполнен с помощью программного обеспечения после амплификации специфичного продукта в режиме реального времени. Этот анализ состоял из одного цикла с ростом температуры от 72° C до 85° C, где изменения флуоресценции измеряли при каждом подъеме температуры на 0.2^ в течение 5 с.

Первая реакция амплификации на CFX96 была также проверена на наличие неспецифических продуктов на 4% агарозном геле (рисунок 3).

— 200 п.н. 100 п.н. 50 п.н.

Обозначения: М - маркер FastRulerUltra Low Range DNA Ladder #SM1233, дорожки 1-9 амплификат (120 п.н.).

Рисунок 3 - ПЦР-продукт после HRM-анализа на 4% агарозном геле

Для определения генотипов в исследуемых образцах использовали кривые плавления (рисунок 4). В результате исследуемые образцы образовывали три четких кластера, соответствующие генотипам: АА, ВВ, АВ.

Difference Curve

Рисунок 4 - Результаты HRM-анализа в программе Precision Melt Analysis™ software

Деление на кластеры по результатам НЯМ-анализа было подтверждено пост-НИМ секвенированием, данные которого представлены справа на рисунке 5.

Рисунок 5 - Результаты пост-HRM секвенирования

Плавление с высоким разрешением (High Resolution Melts, HRM) - это технология, используемая после проведения ПЦР в реальном времени, основана на определении различий в кривых плавления (диссоциации ДНК) с помощью специального программного обеспечения. HRM начинается с ПЦР-амплификации интересующей области в присутствии интеркалирующего красителя (SYTO 9, EvaGreen, SYBR Green I), который имеет высокую флуоресценцию при связывании с дцДНК и низкую флуоресценцию в свободном состоянии. Далее осуществляется плавление продукта: двойная спираль ДНК диссоциирует с высвобождением интеркалирующего красителя и снижением уровня флуоресценции. Процесс изменения уровня флуоресценции в зависимости от температуры отслеживается с помощью специального программного обеспечения и преобразуется в полученные данные в виде графика кривой плавления. При изменении в структуре ДНК кривая плавления меняется. Эта разница может быть очень небольшой, в доли градуса, однако даже с помощью этой разницы можно выявлять однонуклеотидные замены (SNP), маленькие инсерции, делеции и метилирование ДНК.

Эффективность HRM-анализа в сравнении с ПЦР-ПДРФ методом для определения полиморфизма ESR1-PvuII: высокая чувствительность, низкий риск контаминации (ПЦР и анализ результатов проводится в 1 закрытой пробирке), воспроизводимые и точные результаты, быстрый по времени, недорогой по стоимости.

Работа выполнена при поддержке гранта НАН Беларуси 2014 г.

Заключение

Технология HRM-анализа характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, является быстрой по времени и недорогой по стоимости, что позволяет использовать ее как экспресс-метод для выявления полиморфизма ESR1-PvuII для массового скрининга животных в селекционно-племенной работе в свиноводстве.

Развитие молекулярно-генетических исследований и ДНК-технологий позволяет выявлять предпочтительные аллели и генотипы, что даст возможность прогнозировать развитие хозяйственно-полезных признаков у животных для быстрого введения в популяцию особей желаемого генотипа с целью повышения рентабельности производства свинины.

Литература

1. Эрнст, Л. К. Биотехнология в животноводстве / Л. К. Эрнст, Н. А. Зиновьева // ВИЖ. -Москва, 2008. - 510 с.

2. Terman, A. Estrogen receptor gene (ESR) and semen characteristics of boars / Arkadiusz Terman, Marek Kmiec, Daniel Polasik // Arch. Tierz., Dummerstorf. - № 49. - 2006. - С. 71-76.

3. Сметник, А. А. Эстрогеновые рецепторы и их функции (обзор литературы) / А. А. Сметник // Проблемы репродукции. - № 3. - 2011. - С. 31-37.

4. Association with litter size of new polymorphisms on ESR1 and ESR2 genes in a Chinese-European pig line / G. Munoz [et al.] // Genet. Sel. - Vol. 39. - 2007. - C. 195-206.

5. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных / Н. А. Зиновьева [и др.] // ВИЖ . - 2002. - С. 68-70.

6. Селекция на повышение многоплодия свиноматок крупной белой породы методом молекулярной генной диагностики / И. П. Шейко[и др.] // Весщ нацыянальнай акадэмл навук Беларусг -№ 3. - 2006. - С. 77-81.

7. Effect of the estrogen receptor locus on reproduction and production traits in four commercial pig lines / T. H. Short [et al.] // Journal Animal Science. - № 75. - 1997. - С. 3138-3142.

Summary

To control the selection process and conduct genetic monitoring in pig of considerable interest to the estrogen receptor gene (ESR1), which is a DNA marker of reproductive traits in pigs. Currently, for detection of polymorphisms ESR1-PvuII traditional method of analysis is used: polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR - RFLP ), which sufficiently long time and expensive. In this study for detection the ESR1-PvuII polymorphism in the gene ESR1 in pigs offered HRM-analysis technology (High Resolution Melting). Worked out modalities for real-time PCR, confirmed the accuracy of the identification of genotypes AA, BB, AB, and also analyzed the effectiveness of HRM- method in comparison with the method of PCR-RFLP. Testing HRM analysis was conducted on a sample of pigs (n = 51) Belarusian large white breed. Polymorphism of ESR1-PvuII - one of the key DNA markers in swine, so that method which we are propose is based on the technology of HRM and can be used as a rapid method for screening large numbers of animals.

Поступила в редакцию 02.05.14