Использование метода ЯМР-спектроскопии для подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения посторонних примесей субстанции салициловой кислоты

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.076

Использование метода ЯМР-спектроскопии для подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения посторонних примесей субстанции салициловой кислоты

С.В. Моисеев, В.И. Крылов, Т.В. Мастеркова, В.А. Яшкир, Н.Д. Бунятян

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, Москва, Россия

Резюме: На примере субстанции салициловой кислоты показана возможность применения метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса для комплексного, экспрессного и надежного решения химико-аналитических задач экспертизы фармацевтических субстанций. В качестве объекта исследования использовалась субстанция-порошок «салициловая кислота». Испытания по показателю «Посторонние примеси» методом ВЭЖХ проводили в соответствии с нормативным документом на данную субстанцию на высокоэффективном жидкостном хроматографе с диодно-матричным детектором Agilent 1200. Количественное содержание примесей в испытуемом образце фармацевтической субстанции определяли методом внутренней нормализации, как весовую долю компонента в смеси установленных компонентов. Показана сходимость результатов количественного определения примесей, определенных методом ЯМР с данными, полученными хроматографическими методами. В рамках метода ЯМР задачи подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения примесей решаются параллельно, на основе использования одной пробы лекарственной субстанции, без приготовления серии калибровочных растворов стандартных образцов примесей. Показана возможность применения метода ЯМР спектроскопии в качестве альтернативного метода подтверждения подлинности фармацевтических субстанций и дополнительного метода при идентификации и количественном определении примесей, в том числе остаточных органических растворителей.

Ключевые слова: салициловая кислота; структурная интерпретация спектров ЯМР 'Н и 13С; примеси.

nuclear magnetic resonance spectroscopy for drug identification, characterization and quantification of impurities in substance

of salicylic acid substance

S.v. Moiseev, v.I. Krylov, T.v. Masterkova, v.A. Yashkir, N.D. Bunyatyan

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russia

Abstract: The article shows a possibility of using nuclear magnetic resonance spectroscopy for complex, express and reliable chemical and analytical tasks solving for the purpose of expert evaluation of pharmaceutical substances. The substance of «salicylic acid», was used as an object of research. The «Impurities» test was performed by HPLC in accordance with the regulatory document for the mentioned substance using HPLC Diode Array Detector Agilent 1200. The quantification analysis of impurities in the test sample of the pharmaceutical substance was performed using internal normalization method, as the weight fraction of a component in a mixture of the specified components. The results obtained when performing the quantification of impurities, detected by NMR meet the results of those obtained by chromatographic techniques. NMR method allows to perform identification, characterization and quantification of impurities in parallel, based on one sample of drug substance, without preparing a range of calibration sample solutions of standard impurities. The results show the applicability of NMR spectroscopy as an alternative identification method for pharmaceutical substances and additional method for identification and quantification of impurities, including residual organic solvents.

Key words: salicylic acid; structural interpretation of NMR spectra 1H h 13C; impurities.

При проведении фармацевтической экспертизы фармацевтических субстанций одной из основных задач является подтверждение ее подлинности, определение количественного содержания активного компонента, а также идентификация и количественное определение посторонних примесей, в том числе остаточных органических растворителей. С этой целью, как правило, используются традиционные физико-химические методы анализа (ГЖХ, ВЭЖХ, тонкослойная хроматография, ИК-спектроскопия и УФ-спектрофотометрия) [1], характерной особенностью которых, является необходимость использования стандартных образцов (СО). В рамках данных методов задачи идентификации и количественного определения компонентов фармацевтической суб-

станции решаются последовательно с использованием различных методик и СО, что требует определенных временных и материальных затрат. Альтернативным методом, позволяющим быстро, комплексно и без использования СО подтверждать качество фармацевтической субстанции, является метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ЯМР, позволяет использовать метод ЯМР-спектроскопии для проведения качественного и количественного анализа фармацевтических субстанций без использования СО. При этом задача идентификации соединения решается напрямую путем определения состава, строения и пространственной структуры соединения, фикси-

руется наличие определенных структурных фрагментов и последовательность их соединения друг с другом в молекуле. Применение ЯМР-спектроскопии в количественном анализе основано на прямой пропорциональности молярной концентрации магнитно-активных ядер интегральной интенсивности соответствующего сигнала поглощения в спектре. При количественном определении любого компонента фармацевтических субстанций (как основного, так и примесного) достаточно сопоставления приведенной интегральной интенсивности сигнала данного компонента к сумме приведенных интегральных ин-тенсивностей сигналов всех компонентов фармацевтических субстанций* [2, 3]. В рамках метода ЯМР задачи подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения примесей (включая остаточные органические растворители), решаются параллельно, на основе использования одной пробы образца фармацевтических субстанций, без приготовления серии калибровочных растворов СО примесей и остаточных растворителей. Ранее [4] была показана возможность использования метода ЯМР-спектроскопии для подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения посторонних примесей в субстанции рутина.

Цель данной работы — показать возможность применения метода ЯМР-спектроскопии при проведении фармацевтической экспертизы качества фармацевтической субстанции «салициловая кислота» по показателям «Подлинность» и «Посторонние примеси».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования мы использовали субстанцию-порошок «салициловая кислота».

Съемку спектров проводили на ЯМР-спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 при температуре 27°С по стандартным методикам 1D и 2D экспериментов [5]. Использовали раствор субстанции салициловой кислоты в дейтерированном диметилсульфоксиде (ДМСО-й6) с концентрацией 32,4 мг/мл. Калибровку шкалы химических сдвигов (5) осуществляли по отношению к сигналу ДМСО (5=2,50 ('Н) и 39,52 (13С) м.д.). Структурную интерпретацию спектров 13С и 'Н проводили с учетом значений химических сдвигов сигналов, их мультиплетности и данных гомоядерных и гетероядерных 2D экспериментов (1H-1H-COSY, 1H-13C-HSQC, 1H-13C-HMBC).

Испытания по показателю «Посторонние примеси» методом ВЭЖХ проводили в соответствии с нормативным документом на данную субстанцию на высокоэффективном жидкостном хроматографе с диод-но-матричным детектором Agilent 1200.

Условия хроматографирования: колонка — YMC-Pack ODS-AM, 150x4,6 мм, 5 мкм; температура колонки — 30°С; подвижная фаза — метанол, вода, уксусная

* Приведенная интегральная интенсивность сигнала — это интегральная интенсивность, деленная на число эквивалентных ядер в молекуле, дающих этот сигнал.

кислота ледяная в соотношении 40:60:1; скорость потока — 1 мл/мин; объем пробы — 10 мкл; детектор — 270 нм. Растворитель — смесь метанола, воды и уксусной кислоты ледяной в соотношении 70:30:4.

Количественное содержание примесей определяли с применением стандартных образцов. Использовали стандартный раствор с содержанием фенола 0,001988 мг/мл, 4-гидроксибензойной кислоты 0,009964 мг/мл и 4-гидроксиизофталевой кислоты 0,005012 мг/мл. Концентрации трех испытуемых растворов субстанции салициловой кислоты составили 10,0028 мг/мл, 10,0122 мг/мл и 10,0054 мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При проведении экспертизы качества субстанции-порошка «салициловая кислота» руководствовались проектом Фармакопейной статьи предприятия (ФСП). В рамках данного нормативного документа подлинность салициловой кислоты подтверждают методом ИК-спектроскопии и качественной реакцией на салицилат-ион. Фиксирование наличия и количественное определение примесей проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). В целом, процедура подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения примесей с помощью методов, рекомендованных проектом ФСП, достаточно трудоемка и продолжительна по времени. Все количественные определения проводятся на основе точных навесок препарата и СО, а также точных объемов растворителей, в связи с чем, неизбежны погрешности измерения, связанные с пробоподготовкой.

Пробоподготовка в рамках метода ЯМР очень проста и заключается в растворении препарата (точная навеска не требуется) в подходящем дейтериро-ванном растворителе (как правило, используется не более 0,5 мл растворителя). Приготовленный раствор используют для решения всех указанных выше задач фармацевтической экспертизы фармацевтических субстанций. Средняя продолжительность 'Н ЯМР эксперимента составляет несколько секунд, 13С, 1H-1H-COSY, 1H-13C-HSQC, 1H-13C-HMBC — 30 минут. Следует отметить, что проведение двумерных гомоядерных и гетероядерных экспериментов необходимо только при отсутствии какой-либо информации о структурной интерпретации данных одномерных спектров (И и 13С). Точность интегрирования сигнала, при проведении количественных измерений, зависит только от соотношения сигнал : шум (S/N):

где u(I) — стандартная неопределенность интегрирования.

Для того, чтобы неопределенность интегрирования не превышала 1%, величина S/N не должна быть ниже 150 [6—8].

Подлинность основного компонента салициловой кислоты подтверждается наличием в спектрах ЯМР набора сигналов, характерных для структурных фрагментов данной молекулы. В таблице 1 приведены значения б и мультиплетность сигналов ядер 1Н и 13С молекулы салициловой кислоты (рис. 1). Спектры 1Н и 13С образца исследуемой фармацевтической субстанции представлены на рис. 2 и 3 соответственно.

Спектроскопия ЯМР 13С малоэффективна при идентификации и количественном определении микропримесей. Это связано с низкой чувствительностью метода 13С-ЯМР, поэтому задачи количественного определения примесей решают с помощью метода 1Н-ЯМР, который в 100 раз чувствительнее метода 13С-ЯМР. Наличие в спектрах 1Н дополнительных сигналов, не относящихся к молекуле салициловой кислоты, свидетельствует о присутствии в субстанции примесей. В образце субстанции салициловой кислоты серии 01082013 были обнаружены сигналы следующих примесных соединений:

— 4-гидроксибензойной кислоты (примесь А): 6,82 м.д. (д, /=8,8);

— 4-гидроксиизофталевой кислоты (примесь В): 8,39 м.д. (д, /=2,0), 8,03 (дд, /=8,5; 2,0);

— фенол (примесь С): 7,15 м.д. (т, /=7,8);

— неидентифицированная примесь, содержащая ароматический фрагмент: 8,00 м.д. (дд, /=7,8; 1,6).

СООТНЕСЕНИЕ СПЕКТРАЛЬНЫХ ДАННЫХ 1Н

Рис. 1. Структура молекулы салициловой кислоты

Сигналы примесей в спектре 1Н образца субстанции салициловой кислоты представлены на рис. 4 и 5 соответственно.

Количественное содержание примесей в испытуемом образце фармацевтической субстанции определяли методом внутренней нормализации, как весовую долю компонента в смеси установленных компонентов. Это так называемое относительное содержание, рассчитываемое по формуле Х1=М1Б1'/^М]Б'] (]=1+п), где - среднее приведенное значение интегральной интенсивности сигнала анализируемого компонента; М - его молекулярная масса; п — число компонентов испытуемого образца. Следует подчеркнуть, что формула расчета относительного содержания не содержит величин масс навесок образца и объема растворителя, то есть ошибки пробоподго-товки при количественном определении относительного содержания определенного компонента в смеси компонентов методом ЯМР исключены. В таблице 2 представлены результаты количественного определения примесей в образце субстанции салициловой кис-

Таблица 1

И 13С СТРУКТУРЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ

№ Химический сдвиг № Химический сдвиг

атома >Н 13С атома 'Н 13С

1 2 3 112,90 161,13 117,08 5 6 1-СООН 6,92 д.д.д. (1=7,9; 7,9; 0,8) 7,79 д.д. (1=7,9; 1,6) 119,17 130,26 171,92

6,94 д.д.

7,50 д.д.д.

135,64

Таблица 2

РЕЗУЛЬТАТЫ ПОДТВЕРЖДЕНИЯ ПОДЛИННОСТИ, КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИМЕСЕЙ В ОБРАЗЦЕ СУБСТАНЦИИ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ СЕРИИ 01082013

Показатели качества Требования Данные сертифи- Результаты анализа Результаты анализа

Проекта ФСП ката анализа серии анализа серии анализа серии

01082013 01082013 01082013

метод ЯМР- метод ВЭЖХ

спектроскопии

Подлинность ИК-спектроскопия, подтверждена Подтверждена

качественная реакция методом ЯМР-

Качественная реакция подтверждена спектроскопии

на салицилат-ион

Посторонние примеси метод ВЭЖХ

- примесь А (4-гидрокси- не более 0,1% 0,03 % не более 0,04 % 0,03%

бензойная кислота)

- примесь В (4-гидроксии- не более 0,05% 0,014 % не более 0,01 % 0,01%

зофталевая кислота) не более 0,02% 0,003 % не более 0,006 % 0,003%

- примесь С

- любая неидентифициро- не более 0,05% 0,0007 % не более 0,007 мол. % 0,0005%

ванная примесь не более 0,2% 0,051 % не более 0,056 % 0,044%

- сумма примесей

4

Рис. 2. Спектр 1Нобразца препарата «Салициловая кислота», субстанция-порошок

Рис. 3. Спектр 13С образца препарата «Салициловая кислота», субстанция-порошок

лоты серии 01082013 методоми ЯМР и ВЭЖХ, а также данные сертификата анализа на фармацевтическую субстанцию производителя. Из таблицы 2 видно, что количественное содержание примесей, определенное методом ЯМР сопоставимо с данными, полученными с использованием метода ВЭЖХ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Спектроскопия ЯМР имеет на сегодняшний день наиболее богатый и успешный опыт установления как химической структуры индивидуальных органических соединений, так и деталей их электронного и пространственного строения. Процедура регистра-

.p-T.T.^Ti-1-гкг^ .^.„„j.n.ni.i,^ .п^гп^мпупг!..^^,. ira>^i. ,г.П-^лЧпт1|Н.1гт1г,тгп-| rn41.n1.rnq' 1nff1.n.pi^pr,1,Jn1i.iT.rnri .nFN^i.P^irr.rnT^I^ .[пмрш-. .rri.pi r|iqnrq,T.n1nir|, i.ri>Tr.ri'.r. 1> .^гп.рпцпг.г.хфп,,. |:пг,т,-г, ,т,т,,ппгппг^г0„т,пГпТ1"1|| щ.пТиптГвг в.40 8.32 8.24 8.16 8.0В 8.00 7.92 7,84 7.76 7.60 7.60 7.52 7.44 7.36 7.28 7.20 7.12 7.04 6.96 6,08 ррт

V V V 1-i-1 1 I

Рис. 4. Фрагмент спектра 1Нобразца препарата «Салициловая кислота», субстанция-порошок, содержащий сигналы посторонних примесей

ции спектров ЯМР, сбора и обработки информации легко может быть осуществлена в автоматическом режиме. Выполнение количественных измерений на основе данных ЯМР не требует при регистрации спектров использования эталонов и внутренних стандартов, так как основано на стехиометрических отношениях. Все перечисленное делает метод ЯМР универсальным средством для комплексного решения химико-аналитических задач при проведении

фармацевтической экспертизы. На примере салициловой кислоты показана возможность применения метода ЯМР спектроскопии в качестве альтернативного метода подтверждения подлинности фармацевтических субстанций и дополнительного метода при идентификации и количественном определении примесей, в том числе остаточных органических растворителей.

литература

references

1.

Государственная фармакопея Российской Федерации. 12-е изд. Ч. 1. М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения; 2007.

Понтер Х Введение в курс спектроскопии ЯМР. М.: Мир; 1984. Калабин ГА, Каницкая ЛВ, Кушнарев ДФ. Количественная спектроскопия ЯМР природного органического сырья и продуктов его переработки. М.: Химия; 2000.

Кузьмина НЕ, Моисеев СВ, Крылов ВИ, Яшкир ВА, Меркулов ВА. Возможности применения метода диффузно-упорядоченной спектроскопии ЯМР для количественной оценки средней молекулярной массы полулланов. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения 2013; 4: 8-11.

Дероум Э. Современные методы ЯМР для химических исследований. М.: Мир; 1992.

Malz F, Jancke Н. Validation of quantitative NMR. J Pharm Biomed Anal 2005; 38: 813-822.

Malz F. Quantitative NMR-Spektroscopie als Referenzverfahren in der analytischen Chemie. PhD [dissertation]. Berlin: Humboldt Ûniversitat; 2003. Crouch R, Russell D. Easy, precise and accurate quantitative NMR. Application note. Santa Clara: Agilent Technologies Inc. USA; 2011.

об авторах:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8.

Моисеев Сергей Викторович. Эксперт 1-й категории лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии, канд. хим. наук. Крылов Владимир Игоревич. Ведущий инженер лаборатории нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии.

Мастеркова Татьяна Вячеславовна. Ведущий инженер лаборатории

нанолекарств, препаратов для клеточной и генотерапии.

Яшкир Вадим Анатольевич. Начальник лаборатории нанолекарств,

препаратов для клеточной и генотерапии, канд. хим. наук.

Бунятян Наталья Дмитриевна. Заместитель генерального директора по

научной работе, д-р фарм. наук.

1.

The State Pharmacopoeia of Russian Federation. 12th ed. V. 1. Moscow: Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation; 2007 (in Russian).

Gunther H. NMR Spectroscopy. Moscow: Mir; 1984 (in Russian). Kalabin GA, Kanitskaya LV, Kushnarev DF. Quantitative NMR Spectroscopy of natural organic materials and products of its conversion. Moscow: Hi-miya; 2000 (in Russian).

Kuzmina NE, Moiseev SV, Krylov VI, Yashkir VA, Merkulov VA. The possibility of using diffusion-ordered NMR spectroscopy for quantitative analysis of pullulan average molecular weight. Vedomosti Nauchnogo tsentra eksper-tizy sredstv meditsinskogo primeneniya 2013; 4: 8-11 (in Russian). Derome A. Modern NMR Techniques for Chemistry Research. Moscow: Mir; 1992 (in Russian).

Malz F. Jancke H. Validation of quantitative NMR. J Pharm Biomed Anal 2005; 38: 813-822.

Malz F. Quantitative NMR-Spektroscopie als Referenzverfahren in der analytischen Chemie. PhD [dissertation]. Berlin: Humboldt Ûniversitat; 2003. Crouch R, Russell D. Easy, precise and accurate quantitative NMR. Application note. Santa Clara: Agilent Technologies Inc. USA; 2011.

authors:

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation

of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 8

Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation.

Moiseev SV. 1st category expert of Laboratory of nanomedicines, medicines for

cell therapy and genotherapy. Candidate of Chemical Sciences.

Krylov VI. Leading engineer of Laboratory of nanomedicines, medicines for cell

therapy and genotherapy.

Masterkova TV. Leading engineer of Laboratory of nanomedicines, medicines for cell therapy and genotherapy.

Yashkir VA. Head of Laboratory of nanomedicines, medicines for cell therapy and genotherapy. Candidate of Chemical Sciences.

Bunyatyan ND. Deputy Director General for the scientific work. Doctor of Pharmaceutical Sciences, professor.

адрес для переписки:

Моисеев Сергей Викторович; MoiseevSV@expmed.ru

Статья поступила 10.02.2014 г.

Принята к печати 18.03.2014г.