СПОСОБ МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ CAR-ИНДУЦИРОВАННЫХ ИММУННЫХ КЛЕТОК

1. Способ модуляции уровня активации сконструированной иммунной клетки, включающий стадии:
(а) трансфекции иммунной клетки по меньшей мере первым полинуклеотидом, кодирующем химерный антигенный рецептор (CAR), который может быть активирован in-vivo и/или in vitro внешним лигандом и указанный CAR включает первый домен димеризации, и
(б) дополнительной трансфекции иммунной клетки, по меньшей мере, вторым полинуклеотидом, кодирующим сконструированный комплекс ингибирующего мембранного белка (IMP), включающим, по меньшей мере, один внутриклеточный ингибирующий сигнальный домен и один второй домен димеризации,
при этом иммунная клетка одновременно экспрессирует CAR и комплекс ингибирующего мембранного белка (IMP), и
(в) контактирования сконструированной иммунной клетки с внешним лигандом таким образом, что сигнал трансдуцируется CAR, и затем
(г) понижения уровня сигнальной трансдукции CAR путем добавления растворимого соединения, которое связывает домен димеризации молекулы IMP и домен димеризации молекулы CAR с формированием нековалентно связанного макромолекулярного комплекса между IMP и CAR,
таким образом, модулируя уровень активации сконструированной иммунной клетки.
2. Способ по п. 1, в котором сигнал трансдукции CAR заключается в активации иммунной клетки и иммунная клетка становится активированной.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором формирование нековалентно связанного макромолекулярного комплекса IMP и CAR обладает способностью выключать сигнал трансдукции CAR.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором первый и второй домены димеризации являются доменами димеризации CID.
5. Способ по любому пп. 1-4, в котором иммунная клетка является Т-клеткой.
6. Способ по любому пп. 1-5, в котором CAR является одноцепочечным CAR.
7. Способ по любому пп. 1-5, в котором CAR является многоцепочечным CAR.
8. Способ по любому пп. 1-7, в котором домены димеризации являются внеклеточными.
9. Способ по любому пп. 1-7, в котором оба домена димеризации являются внутриклеточными.
10. Способ по любому пп. 1-9, в котором ингибирующий сигнальный домен происходит из PD1.
11. Способ по любому пп. 1-10, в котором растворимое соединение является рапалогом.
12. Способ по любому пп. 1-10, в котором растворимое соединение является рапамицином.
13. Способ по любому пп. 1-12, в котором первый и второй домены димеризации по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно.
14. Способ по любому пп. 1-10, в котором растворимое соединение является биспецифичным антителом.
15. Способ получения сконструированной иммунной клетки, в которой уровень активации химерным антигенным рецептором (CAR) контролируется комплексом ингибирующего мембранного белка (IMP), включающий стадии:
(а) трансфекции иммунной клетки по меньшей мере первым полинуклеотидом, кодирующем CAR, причем CAR включает первый домен димеризации, и
(б) трансфекции иммунной клетки по меньшей мере вторым полинуклеотидом, кодирующим сконструированный комплекс IMP, причем комплекс IMP включает по меньшей мере один ингибирующий сигнальный домен и один второй домен димеризации, который должен контактировать с растворимым соединением, которое транслоцирует ингибирующий домен, и
(в) выбора иммунных клеток, в которых первый и второй полинуклеотиды совместно экспрессируются в их мембране,
причем оба домена димеризации способны связываться нековалентно друг с другом через присутствующее растворимое соединение.
16. Способ по п. 15, в котором трансфекцию осуществляют с помощью ретровирусного вектора.
17. Способ по п. 15, в котором трансфекцию осуществляют с помощью полицистронной CAR/IMP-кодирующей мРНК.
18. Способ по любому пп. 15-17, включающий дополнительную стадию инактивации по меньшей мере одного гена, кодирующего компонент рецептора Т-клеток (TCR).
19. Способ по п. 18, в котором стадию инактивации, по меньшей мере, одного гена, кодирующего компонент рецептора Т-клеток (TCR), осуществляют с помощью нуклеазы TALE.
20. Ингибирующий двойной комплекс CAR/IMP, включающий по меньшей мере два трансмембранных химерных полипептида:
- первый полипептид, кодирующий химерный антигенный рецептор, который включает один домен димеризации,
- второй полипептид, кодирующий сконструированный комплекс ингибирующего мембранного белка (IMP), включающий по меньшей мере один внутриклеточный ингибирующий сигнальный домен и один домен димеризации,
причем оба домена димеризации способны связываться друг с другом нековалентно через присутствующее растворимое соединение.
21. Ингибирующий двойной комплекс CAR/IMP по п. 20, в котором оба домена димеризации расположены внеклеточно.
22. Ингибирующий двойной комплекс CAR/IMP по п. 20 или 21, в котором CAR является многоцепочечным CAR.
23. Ингибирующий двойной комплекс CAR/IMP по п. 20 или 21, в котором CAR является одноцепочечным CAR.
24. Ингибирующий двойной комплекс CAR/IMP по любому пп. 20-23, в котором ингибирующим доменом является PD-1.
25. Ингибирующий двойной комплекс CAR/IMP по любому пп. 20-24, в котором доменом димеризации является FKBP или FRB.
26. Ингибирующий двойной комплекс CAR/IMP по п. 25, в котором первый и второй домены димеризации по меньшей мере на 80% идентичны SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно.
27. Сконструированная иммунная клетка, которая экспрессирует на своей поверхности CAR наряду с ингибирующим мембранным белком (IMP), причем каждый из полипептидов - и CAR, и ингибирующий трансмембранный белок - включают домен димеризации, и оба домена димеризации взаимодействуют с одним и тем же растворимым соединением с формированием нековалентно связанного молекулярного комплекса между IMP и CAR.
28. Сконструированная иммунная клетка по п. 27, в которой указанный ингибирующий домен химерного полипептида IMP выбран из PD-1, CTLA-4, LAG3, Tim3, BTLA, BY55, TIGIT, LAIR1, SIGLEC10, 2В4, РРР2СА, РРР2СВ, PTPN6, PTPN22, CD96, CRTAM, SIGLEC7, SIGLEC9, TNFRSF10B, TNFRSF10A, CASP8, CASP10, CASP3, CASP6, CASP7, FADD, FAS, TGFBRII, TGFRBRI, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD10, SKI, SKIL, TGIF1, IL10RA, IL10RB, HMOX2, IL6R, IL6ST, EIF2AK4, CSK, PAG1, SIT1, FOXP3, PRDM1, BATF, GUCY1A2, GUCY1A3, GUCY1B2, GUCY1B3.
29. Сконструированная иммунная клетка по п. 27 или 28, в которой оба домена димеризации являются внеклеточными.
30. Сконструированная иммунная клетка по п. 27 или 28, в которой оба домена димеризации являются внутриклеточными.
31. Сконструированная иммунная клетка по любому пп. 27-30, в которой CAR является многоцепочечным CAR (mcCAR).
32. Сконструированная иммунная клетка по п. 31, в которой mcCAR включает по меньшей мере альфа-цепь (FCεRα), бета-цепь (FCεRβ) и гамма-цепь (FCεRγ).
33. Сконструированная иммунная клетка по п. 32, в которой домен димеризации является частью альфа-цепи (FCεRα).
34. Сконструированная иммунная клетка по любому пп. 32-33, в которой mcCAR включает:
- альфа-цепь (FCεRα), содержащую, по меньшей мере:
(а) сигнальную последовательность и антиген-специфичную целевую область,
(б) домен димеризации,
(в) внеклеточный спейсерный домен (шарнир),
(г) трансмембранный домен,
- бета-цепь (FCεRβ), содержащую, по меньшей мере:
(а) сигнальную последовательность,
(б) внеклеточный спейсерный домен (шарнир),
(в) трансмембранный домен,
(г) ко-стимулирующий лиганд,
- гамма-цепь (FCεRγ), содержащую, по меньшей мере:
(а) сигнальную последовательность,
(б) внеклеточный спейсерный домен (шарнир),
(в) трансмембранный домен,
(г) сигнал-трансдуцирующий домен.
35. Сконструированная иммунная клетка по любому пп. 27-34, в которой иммунная клетка получена от донора.
36. Сконструированная иммунная клетка по любому пп. 27-34, в которой иммунная клетка получена от самого пациента.
37. Сконструированная иммунная клетка по любому пп. 27-36 для применения в способе лечения пациента, нуждающегося в таком лечении, причем указанный способ включает:
введение иммунной клетки пациенту,
введение химического индуктора димеризации (CID) для модуляции активации иммунной клетки в организме пациента.
38. Сконструированная иммунная клетка для применения по п. 37, в котором химическим индуктором димеризации (CID) является рапамицин.