ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЭПИФИТНОЙ МИКРОФЛОРЫ
NUTRIENT MEDIUM FOR EPIPHYTIC MICROFLORA CULTURE

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к микробиологии, а именно к питательным средам для культивирования эпифитной микрофлоры и может быть использовано в микробиологической промышленности, а также в биотехнологии и ботанике.
Уровень техники
Известна среда для отбора фибринолитических ферментов, содержащая источник углерода, источник азота, агар и воду, при этом с целью повышения специфичности среды и повышения активности отобранных продуктов последняя содержит в качестве единственного источника углерода и азота фибрин и дополнительно минеральные соли - однозамещенный фосфат калия, сернокислый магний, сернокислый цинк и сернокислое железо при следующем соотношении компонентов, вес.%:
Фибрин
0,5-1,0
Однозамещенный фосфат калия
0,1-0,3
Сернокислый магний
0,4-0,6
Сернокислый цинк
0,0005-0,0015
Сернокислое железо
0,0015-0,0025
Агар
1,5-2,0
Вода
остальное до 100 мл
(см. а.с. SU №973609, кл. C12N 1/00, C12N 9/68, опубл. 15.11.1982 г.).
Недостатком данной среды является невысокое качество и срок ее хранения.
Известна питательная среда, которую готовят на капустном отваре, при этом для получения среды берут свежую капусту (100 г на 1 л воды), нарезают ее не очень мелко, заливают водопроводной водой и кипятят в течение 30 минут. Затем отвар фильтруют через бумажный фильтр или через чистую гигроскопическую вату.
К капустному отвару добавляют 2,5% пивного сусла (крепостью 8-10 баллингов) и 0,125% кукурузного экстракта. После этого среду подщелачивают до рН 7,0-7,2 и добавляют к ней 1,5% агара микробиологического, после чего вновь доливают кипяченую воду до первоначального объема. Стерилизуют в автоклаве 20-30 минут при давлении 0,5 атм. Повторная стерилизация среды не допускается.
Состав питательной среды, мас.%:
Капустный отвар
55
Пивное сусло
2,5
Кукурузный экстракт
0,125
Агар микробиологический
1,5
Кипяченая вода
остальное
(см. Возняковская Ю.М. Эпифитная микрофлора растений и урожай. - Ленинград: Изд-во «Колос», 1969. - С.173).
Недостатком данной питательной среды является сложность приготовления компонентов, входящих в питательную среду в лабораторных условиях, в частности пивное сусло, кукурузный экстракт.
Наиболее близкой по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятая авторами за прототип является питательная среда, которую готовят на фасолевом отваре, при этом для получения отвара берут белую фасоль 50 г на 1 л водопроводной воды и кипятят 30 минут. Отвар отфильтровывают через вату или бумажный фильтр, после этого в отвар добавляют 0,25% пептона, 1% сахара, 0,1% фосфорнокислого аммония двузамещенного 0,125%, кукурузного экстракта, 2,0% агара микробиологического и доводят до исходного объема 1 л кипяченой водой, рН среды устанавливают 7,0-7,2. Среду стерилизуют в автоклаве 20 минут при давлении 1 атм.
Состав питательной среды, мас.%:
Фасолевый отвар
27
Пептон
0,25
Сахар
1,0
Фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,1
Кукурузный экстракт
0,125
Агар микробиологический
2,0
Кипяченая вода
остальное
(см. Возняковская Ю.М. Эпифитная микрофлора растений и урожай. - Ленинград: Изд-во «Колос», 1969. - С.173).
Недостатком данной питательной среды является то, что в фасолевой среде микроорганизмы образуют слишком много слизи, что затрудняет процесс выделения чистой культуры и дальнейшую их идентификацию.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка питательной среды для культивирования эпифитной микрофлоры с целью расширения ассортимента.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к расширению ассортимента.
4
2
4
Технический результат достигается за счет питательной среды для культивирования эпифитной микрофлоры, включающей питательную основу, фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH)HPO, агар микробиологический и кипяченую водопроводную воду, при этом она дополнительно содержит хлорид натрия (NaCl), а в качестве питательной основы используют тыквенный отвар при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>НРO<sub>4</sub>
0,1-0,2
Хлорид натрия (NaCl)
0,1-0,2
Агар микробиологический
2,0-2,5
Тыквенный отвар
65,0-70,0
Кипяченая водопроводная вода
остальное
Сущность получения питательной среды для культивирования эпифитной микрофлоры заключается в следующем.
За питательную основу берут тыквенный отвар, полученный следующим образом: тыкву, отобранную для приготовления отвара, тщательно моют, очищают от кожуры, испорченных мест и снова моют, затем 200-250 г свежей мелко нарезанной тыквы заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 30 мин. Жидкость фильтруют через ватно-марлевый фильтр, добавляют 20-25 г агара микробиологического, фосфорнокислого аммония двузамещенного 1 г, хлорида натрия 1 г, кипяченной водопроводной воды до исходного объема 1 л, подщелачивают до рН 7,0-7,2 и стерилизуют 15 мин при 1 атм. Хранят среду в холодильнике при t=(+2-3°С), при этом питательная среда состоит из следующего соотношения компонентов, мас.%:
Фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>НРO<sub>4</sub>
0,1-0,2
Хлорид натрия (NaCl)
0,1-0,2
Агар микробиологический
2,0-2,5
Тыквенный отвар
65,0-70,0
Кипяченая водопроводная вода
остальное
Данный состав среды является наиболее оптимальным для культивирования эпифитной микрофлоры. В результате посева эпифитной микрофлоры выявили обильный рост микроорганизмов на тыквенной среде. Готовая среда имеет прозрачный желто-коричневый цвет, при застывании приобретает серый цвет (полупрозрачный). Образуется среда, соответствующая по плотности 2,5% агаровому гелю. Исследование эпифитной микрофлоры показало, что культуральные, тинкториальные и морфофизиологические свойства микроорганизмов не изменяются. Данная питательная среда позволяет также выделять некоторых представителей родов: Aspergillus sp., Alternaria sp., Mucor sp. Отдельные представительства рода Bacillus sp.появляются через 2 ч, а также типичные представители эпифитной микрофлоры.
1
2
3
6
Таким образом, тыквенный отвар в качестве питательной среды был выбран в результате учета его питательной ценности. Качественный анализ витаминов выявил наличие тиамина (витамин B), рибофлавина (витамин В), пантотеновой кислоты (витамин В), пиридоксина (витамин В), фолиевой кислоты (витамин ВС), аскорбиновой кислоты (витамин С), никотиновой кислоты (витамин РР), токоферола (витамин Е), ретинола (витамин А), а также каротиноидов.
При изучении химического состава питательной среды, проведенного методом хроматографического анализа, установили, что в ее состав входят два моносахарида: глюкоза и фруктоза.
Аминокислотный анализ выглядит следующим образом: аргинин, DL - лизин солянокислый, DL - β-фенил-α-аланин, треонин, валин.
Элементный анализ на атомно-адсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer - 2280 (USA) показал присутствие следующих макроэлементов - калия, кальция, магния, натрия, фосфора и микроэлементов - железа, кобальта, марганца, меди, фтора, цинка, селена.
Эмпирические данные показывают, что в естественных условиях основными питательными веществами для эпифитных микроорганизмов являются аминокислоты, с одной стороны, и углеводы, с другой стороны, именно эти вещества имеются в питательной среде. Очевидно, что все перечисленные вещества, находящиеся в среде, присутствуют в сочетаниях, наиболее подходящих для микроорганизмов, приспособившихся к эпифитному образу жизни.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения получения питательной среды для культивирования эпифитной микрофлоры.
Пример 1. Приготовление питательной среды производят в два этапа
1-й этап
Для приготовления отвара необходимо брать сорта тыквы крупноплодной и мускатные сорта, которые подвергаются длительному хранению и содержат большой набор питательных веществ, необходимых для эпифитных микроорганизмов.
Тыкву, отобранную для приготовления отвара, тщательно моют, очищают от кожуры, испорченных мест и снова моют, затем 150 г свежей мелко нарезанной тыквы измельчают, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 30 мин. Жидкость фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
2-й этап
К полученному тыквенному отвару в количестве 570 г добавляют 15 г агара микробиологического, 0,5 г фосфорнокислого аммония двузамещенного, 0,5 г хлорида натрия, доводят объем до 1 л кипяченой водой, измеряют рН среды, которая составляет 6,0-6,61, стерилизуют 5 мин при 1 атм, готовую среду разливают в чашки Петри. Готовая среда имеет желто-коричневый цвет, при застывании - серый цвет (полупрозрачный), хранят питательную среду в холодильнике при t=(+2-3°C), при этом питательная среда состоит из следующего соотношения компонентов, мас.%:
Фосфорнокислый аммоний двузамещенный (NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,05
Хлорид натрия (NaCl)
0,05
Агар микробиологический
1,5
Тыквенный отвар
57
Кипяченая водопроводная вода
остальное
Низкая кислотность и малое количество агара не обеспечивают образования достаточной плотности среды, среда растекается, стерильность среды не достигается из-за малого времени стерилизации.
4
2
4
Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, но тыквы берут 200 г, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят 30 мин, затем тыквенный отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, к полученному тыквенному отвару добавляют 20 г агара микробиологического, (NH)HPO 1 г, NaCl 1 г, доводят объем до 1 л кипяченой водопроводной водой, измеряют рН среды, учитывая кислотность среды, подщелачивают среду до рН 7,0-7,2 и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 1 атм.
4
2
4
4
2
4
Необходимо отметить, что рост микроорганизмов происходил без добавления других компонентов, а именно фосфорнокислого аммония двузамещенного (NH)НРO 1 г; хлорида натрия NaCl 1 г. Следовательно, т.к. микроорганизмы нуждаются в азотном питании, добавление (NH)HPO было необходимо. NaCl - 1 г вносился в качестве минерального фона к тому, что имеется в тыквенном отваре.
Готовая среда имеет прозрачный желто-коричневый цвет, при застывании приобретает серый цвет (полупрозрачный), образуется среда, соответствующая по плотности 2,0% агаровому гелю.
4
2
4
Пример 3. Проводят аналогично примерам 1, 2, но тыквы берут 250 г, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят в течение 30 минут, затем отвар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, к полученному тыквенному отвару добавляют 25 г агара микробиологического, (NH)HPO 2 г, NaCl 2 г, доводят объем до 1 л кипяченой водопроводной водой, измеряют рН среды, учитывая кислотность среды, подщелачивают среду до рН 7,0-7,2 и стерилизуют в автоклаве 15 мин при 1 ати. Данный состав среды является наиболее оптимальным для культивирования эпифитной микрофлоры. В результате посева эпифитной микрофлоры выявили обильный рост микроорганизмов на тыквенной среде. Готовая среда имеет прозрачный желто-коричневый цвет, при застывании приобретает серый цвет (полупрозрачный). Образуется среда, соответствующая по плотности 2,5% агаровому гелю. Исследование эпифитной микрофлоры показало, что культуральные и морфофизиологические свойства микроорганизмов не изменяются. Данная питательная среда позволяет также выделять некоторых представителей родов: Aspergillus sp., Alternaria sp., Mucor sp. Отдельные представительства рода Bacillus sp. появляются через 2 часа, а также типичные представители эпифитной микрофлоры.
4
2
4
Пример 4. Проводят аналогично примерам 1, 2, 3, но тыквы берут 300 г, заливают 1 л водопроводной воды и кипятят в течение 30 минут, затем тыквенный отвар фильтруют через фильтровальную бумагу, к полученному тыквенному отвару добавляют 30 г агара, (NH)HPO 3 г, NaCl 3 г, доводят объем до 1 л кипяченной водопроводной водой, измеряют рН среды, учитывая кислотность среды, подщелачивают среду до рН 7,5-7,8 и стерилизуют в автоклаве 30 мин при 1 атм. При подщелачивании среды до рН 7,5-7,8 выделялся малый спектр видового разнообразия микроорганизмов по сравнению с рН 7,0-7,2, а также длительная стерилизация приводит к разрушению веществ, которые содержатся в среде, что обеспечивает скудный рост микроорганизмов и видовое разнообразие. Добавление 30 г агара микробиологического возможно, но образуется более сухая среда. Фильтрование через бумажный фильтр приводит к количественной потере питательных элементов, в результате также наблюдался скудный рост микроорганизмов.
1
2
3
6
Таким образом, тыква в качестве питательной среды была выбрана в результате учета ее питательной ценности. Качественный анализ витаминов выявил наличие тиамина (витамин B), рибофлавина (витамин B), пантотеновой кислоты (витамин В), пиридоксина (витамин В), фолиевой кислоты (витамин ВС), аскорбиновой кислоты (витамин С), никотиновой кислоты (витамин РР), токоферола (витамин Е), ретинола (витамин А), а также каротиноидов.
При изучении химического состава питательной среды, проведенного методом хроматографического анализа, установили, что в ее состав входят два моносахарида: глюкоза и фруктоза.
Аминокислотный анализ выглядит следующим образом: аргинин, DL - лизин солянокислый, DL - β-фенил-α-аланин, треонин, валин.
Элементарный анализ на атомно-адсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer-2280 (USA) показал присутствие следующих макроэлементов - калия, кальция, магния, натрия, фосфора и микроэлементов - железа, кобальта, марганца, меди, фтора, цинка, селена.
Эмпирические данные показывают, что в естественных условиях основными питательными веществами для эпифитных микроорганизмов являются аминокислоты, с одной стороны, и углеводы, с другой стороны, именно эти вещества имеются в питательной среде. Очевидно, что все перечисленные вещества, находящиеся в среде, присутствуют в сочетаниях, наиболее подходящих для микроорганизмов, приспособившихся к эпифитному образу жизни.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- экологически чистая питательная среда, т.к. в состав входит натуральный продукт растительного происхождения;
- не требует добавления стимуляторов роста для микроорганизмов;
- доступный способ приготовления питательной среды в стационарных условиях, требующих минимального набора микробиологического оборудования;
- не требует добавления стимуляторов роста для микроорганизмов - кукурузный экстракт и дрожжевой автолизат или экстракт;
- питательная среда содержит все вещества, необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов;
- длительный срок хранения;
- круглогодичная доступность ингредиентов для приготовления питательной среды.
Используя питательную среду в микробиологической практике нельзя не оценить ее экономическую эффективность и низкую себестоимость: себестоимость готовой питательной среды одноразового приготовления (1 л) отражена в таблице.
Себестоимость питательной среды
Название веществ, входящих в состав среды
Масса веществ, входящих в состав среды, г
Стоимость веществ, входящих в среду, руб.
Стоимость веществ, руб./кг
1. Тыква
200
3,50
15-20
2. Фосфорнокислый аммоний двузамещенный -(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
1
0,24
200-280
3. Хлорид натрия NaCl
1
0,11
90-140
4. Агар микробиологический
20-25
61,00-76,25
2900-3200
Итого:
222-227
68,62
3205-3640
В среднем - 68,62 рубля, это намного меньше по сравнению со всеми остальными средами, описанными выше.