Способ морфометрического прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы по содержанию p14ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах
METHOD FOR MORPHOMETRIC PREDICTION OF THE COURSE OF DIFFUSE LARGE B-CELL LYMPHOMA BY THE CONTENT OF P14ARF-POSITIVE TUMOR CELLS IN THE LYMPH NODES

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (ДВККЛ) путем проведения иммуногистохимического окрашивания опухолевых клеток в гистологических срезах лимфатических узлов и морфометрической оценки содержания р14АКР-позитивных клеток.
ДВККЛ - частое лимфопролиферативное заболевание. На ее долю приходится 30-40% всех неходжкинских лимфом. По данным классификации Всемирной организации здравоохранения (2017) заболевание представляет собой группу высокогетерогенных опухолей с различными клиническими проявлениями, морфологическими характеристиками, генетическими аберрациями, ответом на терапию и прогнозом. Согласно литературным источникам только у 65% пациентов, получивших стандартную химиотерапию, достигается полный ответ (Long-term outcome of patients in the LNH-98.5 trial, the first randomized study comparing rituximab-CHOP to standard CHOP chemotherapy in DLBCL patients: a study by the Groupe d'Etudes des Lymphomes de l'Adulte / B. Coiffier, C. Thieblemont, E. Neste [at al.] // Blood. - 2010. - Vol.116. - P. 2040-2045). Случаи рецидивирующей или рефрактерной формы заболевания трудно поддаются дальнейшему лечению, летальные исходы наблюдаются у 90% пациентов. Широко применяемым, стандартным инструментом для оценки индивидуального риска раннего прогрессирования ДВККЛ является международный прогностический индекс (МПИ) и его модификации. Модель учитывает факторы, независимо влияющие на выживаемость: возраст больного (старше 60 лет), высокую концентрацию лактатдегидрогеназы в сыворотке крови, соматический статус пациента по шкале ECOG, распространенную стадию заболевания по классификации Ann Arbor и наличие экстранодальных очагов поражения. Указанные конструкции не потеряли своего значения при использовании современных программ лечения. Однако индекс не всегда позволяет ' точно оценить индивидуальный риск неудач терапии. По мнению ряда авторов, это связано с, тем, что МПИ базируется на клинических характеристиках заболевания и не принимает во внимание биологические характеристики опухоли (Клинико-гематологические показатели прогноза ответа на терапию первой линии у пациентов с диффузной В-крупноклеточной лимфомой / С.В. Самарина, Е.Л. Назарова, Н. В. Минаева [и др.] // Клиническая онкогематология. - 2019. - №12. - С. 68-72). В свете вышеизложенного поиск дополнительных биологических критериев, уточняющих прогноз заболевания, является актуальным.
По данным литературных источников протеин p14ARF играет важную роль в защите клетки в ответ на различные стрессовые условия. В частности, он способен изолировать онкобелок HDM2 посредством прямого взаимодействия, тем самым препятствуя деградации и стабилизации фактора транскрипции р53. Накопление последнего в ядре активирует экспрессию генов, ингибирующих клеточный цикл и/или запускающих апоптоз. В непатологических условиях уровень белка pl4ARF практически не определяется. При опухолевой трансформации клетки он накапливается в нуклеоплазме, где не может выполнять свою классическую роль в контроле клеточной пролиферации (Mdm2-mediated degradation of pl4arf: A novel mechanism to control ARF levels in cancer cells / M. Vivo, M. Matarese, M. Sepe [et al.] // PLoS ONE. - 2015. - Vol. 10. - P. e0117252). Вышеприведенные сведения свидетельствуют о перспективности оценки содержания p14ARF-позитивных клеток в опухолевом субстрате для прогнозирования течения ДВККЛ.
Целью изобретения является разработка способа морфометрического прогнозирования течения ДВККЛ по относительному содержанию p14ARF-позитивныз опухолевых клеток в лимфатических узлах.
Близким техническим решением к предлагаемому изобретению является способ определения характера течения неходжкинских лимфом, в том числе и ДВККЛ (P14ARF nuclear overexpression in aggressive B-cell lymphomas is a sensor of malfunction of the common tumor suppressor pathways / A. Sanchez-Aguilera, M. Sanchez-Beato, J. F. Garcia [et al.] // Blood. - 2002. - Vol.99, I. 4. - P. 1411-1418), который нами был выбран в качестве прототипа. В основе данного способа лежит исследование экспрессии p14ARF в ядрах опухолевых клеток с помощью иммуногистохимического анализа. Указанный метод позволяет прогнозировать характер течения заболевания у пациентов, исходя из наличия аномальной нуклеоплазматической экспрессии p14ARF. Недостатком описанного способа является отсутствие уточнения анатомической точки забора исследуемой ткани. К тому же в данной работе экспрессия белка учитывается только качественным методом без вычисления относительного количества p14ARF-позитивных опухолевых клеток и определения порогового значения, за счет чего пациенты не могут быть стратифицированы на группы. высокого/низкого риска, тогда как объективно оценить уровень высокой экспрессии белка без проведения морфометрического анализа не всегда возможно.
Способа морфометрической оценки прогноза течения ДВККЛ по относительному содержанию р14А11Р-положительных злокачественных клеток в гистологических срезах лимфатических узлов не существует.
В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.
Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии ФГБУН КНИИГ и ПК ФМБА России в соответствии с планом научно-исследовательской работы.
Технический результат - получение объективных критериев прогнозирования течения ДВККЛ с помощью морфометрической оценки относительного содержания pl4ARF-позитивных опухолевых клеток в лимфатических узлах.
Способ осуществляют следующим образом
После биопсии мягко-тканного образования у больных ДВККЛ выполняли гистологическую проводку послеоперационного материала. Затем изготавливали гистологические срезы толщиной 2-3 мкм из приготовленных парафиновых блоков лимфатических узлов по общепринятому способу. Для идентификации неоплазированных элементов, положительных к антителу pl4ARF, использовали иммуногистохимический (ИГХ) метод исследования в соответствии с протоколом систем визуализаций «Dako». Морфометрический подсчет относительного содержания р14АКР-позитивных опухолевых клеток выполняли на световом микроскопе «AxioScope.Al» фирмы «Carl Zeiss М icroscopy GmbH» при увеличении ×1000 (окуляры ×10, объектив ×100) со встроенной фото- и видеокамерой с помощью программного обеспечения анализа изображений. Исследования проводили в 10 полях зрения для каждого образца. Исходя из полученных результатов, вычисляли среднее относительное содержание p14ARF-позитивных опухолевых клеток по формуле:
S=D/n×100%,
где:
S - среднее относительное содержание р14АРР-позитивных клеток в опухолевом образце, %
D - количество p14ARF-позитивных опухолевых клеток в 10 полях зрения
n - общее количество клеток в 10 полях зрения.
Возможность применения предложенного способа подтверждает исследование. гистологических препаратов опухолевой ткани от 106 пациентов с ДВККЛ в возрасте от 27 до 82 лет (медиана - 59 лет). С помощью ROC-анализа вычисляли пороговый уровень рНАЯР-экспрессирующих опухолевых элементов, соответствующий 65% (чувствительность - 79%, специфичность - 53%). Высокий показатель p14ARF определен у 64 (60,4%) из 106 больных ДВККЛ. В 39,6% случаев (42 пациента) доля позитивных клеток была ниже порогового уровня. В группе пациентов с количеством p14ARF>65% опухолевых клеток пятилетняя общая выживаемость была статистически значимо ниже по сравнению с больными, имевшими подпороговый уровень белка: 57,8% против 83,3% соответственно (р=0,011; HR=2,8, 95% ДИ=1,2-6,4). Риск летального исхода в 2,8 раза выше в группе с надпороговой экспрессией p14ARF по отношению к пациентам с низкой экспрессией. Пятилетняя беспрогрессивная выживаемость пациентов с долей pHARF-позитивных клеток >65% значимо ниже, чем в группе с подпороговым значением маркера: 43,8% против 76,2% (р=0,003; HR=2,8, 95%) ДИ=1,4-5,6). Риск развития рецидива и/или рефрактерности к терапии у пациентов с количеством pl4ARF-экспрессирующих клеток, превышающим пороговый уровень, был выше в 2,8 раза, по сравнению с обследованными с низким содержанием р14АРР-позитивных клеток.
Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать течение ДВККЛ после биопсии лимфатических узлов по относительному содержанию pHARF-положительных опухолевых клеток в гистологических срезах.
Пример 1.
Пациентка С, 1955 года рождения. В 2018 году установлен диагноз ДВККЛ, поп-GCB подтип на основании гистологического и ИГХ исследований биоптата шейного лимфоузла в КНИИГиПК ФМБА России. При обследовании обнаружено поражение периферических, внутригрудных, внутрибрюшных, забрюшинных лимфоузлов, лимфоузлов малого таза, селезенки, костного мозга. Согласно МПИ установлен высокий риск. Выполнена биопсия шейного лимфоузла, проведено ИГХ-окрашивание неопластических клеток в гистологических срезах опухоли по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено относительное количество p14ARF-позитивных клеток на уровне 80%). Установлено, что у пациентки С.неблагоприятный прогноз течения ДВККЛ. После двух курсов химиотерапии по стандартному протоколу R-CHOP обнаружено прогрессирование заболевания, констатирована первично-рефрактерная форма. После смены 4 линий химиотерапии, в том числе после высокодозной блоковой терапии, заболевание продолжало прогрессировать. Спустя 5 месяцев после постановки диагноза пациентка. умерла. Проведенное обследование больной с применением предложенного способа подтвердило высокую точность прогноза.
Пример 2.
Пациентка К., 1962 года рождения. В 2016 году установлен диагноз ДВККЛ с поражением надключичных лимфоузлов слева, внутрибрюшных и забрюшинных лимфоузлов (non-GCB подтип). Согласно МПИ установлен высокий промежуточный риск. После биопсии шейного лимфоузла проведено ИГХ-исследование опухолевых клеток в гистологических срезах по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено относительное количество p14ARF-позитивных клеток на уровне 16%, по результатам которого отмечен благоприятный прогноз течения ДВККЛ. При динамическом наблюдении прогноз подтвержден. После 6 курсов терапии по стандартному протоколу R-CHOP у пациентки К. достигнут полный ответ, ремиссия сохраняется в течение 60 месяцев.
Заявляемое изобретение позволяет прогнозировать характер течения ДВККЛ по относительному содержанию p14ARF-позитивных клеток. При количестве p14ARF-позитивных опухолевых клеток <65% прогнозируют благоприятное течение неоплазии, а при содержании p14ARF-пoлoжитeльныx клеток ≥65% - неблагоприятное течение ДВККЛ.
Предлагаемый способ информативен, может быть использован в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения ДВККЛ после лимфаденэктомии в гематологических и патологоанатомических отделениях, патоморфологических лабораториях.