СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННОЙ БОЛЕЗНИ, ВОЗНИКАЮЩЕЙ ВСЛЕДСТВИЕ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА
METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSTICS AND TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASE, RESULTING FROM MULTIPLE SCLEROSIS

Описание заявки включает поданный одновременно с ней файл "sequence.txt", созданный 8 октября 2009 г. и имеющий размер 8856 байт.
Уровень техники
Рассеянный склероз ("PC") представляет собой воспалительное аутоиммунное расстройство центральной нервной системы (Compston and Coles, Lancet 372, 1502-17 (2008)). При уровне распространенности приблизительно один на 1000, PC является наиболее распространенной причиной неврологической инвалидности у молодых совершеннолетних лиц (Polman and Uitdehaag, BMJ321, 490-4 (2000)). PC связан с участием иммунной системы, острым воспалительным поражением аксонов и глии, восстановлением функции и структурной регенерацией, поствоспалительным глиозом, и нейродегенерацией (см., например, Compston and Coles, 2008). Эти последовательно протекающие процессы лежат в основе клинического течения, характеризующегося эпизодами регенерации, эпизодами, вызывающими стойкую недостаточность, и вторичным прогрессированием (Id.)
Целью лечения PC является снижение частоты и тяжести рецидивов, предотвращение инвалидности, вызываемой прогрессированием заболевания, и промотирование регенерации тканей (Compston and Coles, 2008). Первичным подходом к лечению PC является модулирование или подавление иммунной системы. Имеющиеся в настоящее время лекарства для PC включают интерферон бета-1а (например, AVONEX и REBIF), интерферон бета-1b (например, BETASERON), глатирамер ацетат (например, COPAXONE), митоксантрон (например, NOVANTRONE), и натализумаб (например, TYSABRI). Другим многообещающим новым лекарственным препаратом для лечения PC является алемтузумаб (САМРАТН-1Н).
Алемтузумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, направленное против CD52, белка, широко распространенного на поверхности лимфоцитов и моноцитов, но имеющего неизвестную функцию. Алемтузумаб использовался для лечения В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза. Разовый импульс лечения приводит к быстрой, глубокой и длительной лимфопении. Число клеток восстанавливается, но с разными скоростями; CD4+ Т-клетки восстанавливаются особенно медленно, оставаясь истощенными на протяжении по меньшей мере пяти лет (Coles et al., Journal of Neurology 253, 98-108 (2006)). Испытания фазы 2 (исследовательская группа CAMMS-223; Coles et al., N. Engl. J. Med. 359, 1786-1801 (2008)) показали, что алемтузумаб проявляет высокую эффективность при лечении раннего рецидивирующе-ремиттирующего рассеянного склероза. Этот лекарственный препарат снижает риск проявления заболевания и нарастания инвалидности более чем на 70% по сравнению с интерфероном-бета у пациентов с ранним рецидивирующе-ремиттирующим рассеянным склерозом. Основным нежелательным эффектом является аутоиммунность, возникающая на фоне Т-клеточной лимфопении на протяжении периода от нескольких месяцев до нескольких лет после введения дозы. Примерно у 20%-30% пациентов развивается аутоиммунность щитовидной железы, преимущественно базедова болезнь (Coles et al., Lancet 354, 1691-1695 (1999)), и у 3% наблюдается иммунная тромбоцитопения (ITP) (Coles et al., 2008). Также наблюдались отдельные случаи - болезнь Гудпасчера, аутоиммунная нейтропения (Coles et al., Journal of Neurology 253, 98-108 (2006)) и аутоиммунная гемолитическая анемия (неопубликованные наблюдения). Кроме того, у еще 5,5% пациентов развивается постоянное присутствие нетиреоидных аутоантител без клинического заболевания (Coles et al., 2006). Время проявления и спектр аутоиммунности после применения алемтузумаба аналогичны наблюдаемым в других примерах "воспроизводимого аутоиммунитета" в других клинических контекстах; например, аутоиммунное заболевание щитовидной железы и аутоиммунные цитопении также преимущественно проявляются в период от нескольких месяцев до нескольких лет после трансплантации гематопоэтических стволовых клеток или антиретровирусного лечения ВИЧ (Chen et al., Medicine (Baltimore) 84, 98-106 (2005); Daikeler and Tyndall, Best. Pract. Res. Clin. Haematol. 20, 349-360 (2007); Jubault et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 85, 4254-4257 (2000); Ting, Ziegler, and Vowels, Bone Marrow Transplant. 21, 841-843 (1998); Zandman-Goddard and Shoenfeld, Autoimmun. Rev. 1, 329-337 (2002)).
Хотя аутоиммунитет, возникающий в контексте лимфопении, хорошо изучен на животных моделях, он редко встречается у людей и поэтому мало изучен. У большинства особ с лимфопенией аутоиммунитет не развивается, что позволяет предположить влияние дополнительных факторов (Krupica et al., Clin Immunol 120, 121-128 (2006)). Остается неясным, что это за дополнительные факторы. Одним из факторов считается истощение Т-регуляторных клеток, что видно на мышиных моделях колита и гастрита (Alderuccio et al., J Exp. Med 178, 419-426 (1993); McHugh et al., J Immunol 168, 5979-5983 (2002); Powrie et al., Int. Immunol 5, 1461-1471 (1993); Sakaguchi et al., J Immunol 155, 1151-1164 (1995)). Однако, было обнаружено, что число Т-регуляторных клеток возрастает после применения алемтузумаба у пациентов-людей и впоследствии возвращается к нормальному уровню (Сох et al., Eur J Immunol 35, 3332-3342 (2005)). Это наблюдение позднее было подтверждено (Bloom et al., Am J Transplant. 8, 793-802 (2008)) и согласуется с другими экспериментальными моделями лимфоцитопении (de Kleer, I. et al., Blood 107, 1696-1702 (2006); Zhang, H. et al., Nat Med 11, 1238-1243 (2005)).
Сущность изобретения
Мы изобрели новые и полезные способы и композиции для улучшения управления риском при лечении PC. Способы и композиции снижают побочные эффекты лечения PC, такие как вторичный аутоиммунитет, и помогают поставщикам услуг здравоохранения и пациентам выбирать схемы лечения PC и контроля после проведения курса лечения. Способы и композиции по настоящему изобретению основаны на нашем открытии того, что у пациентов с рассеянным склерозом (PC) повышенный IL-21, детектируемый даже до проведения истощающей лимфоциты терапии, такой как терапия алемтузумабом, коррелирует с повышенным риском развития вторичного аутоиммунитета после проведения терапии. Мы далее обнаружили, что уровень IL-21 у особы может быть генетически определенным: генотипы полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP) А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 и С/С в SNP rs6840978 ассоциированы с повышенным IL-21.
Соответственно, настоящее изобретение предусматривает способы идентификации пациента с PC, имеющего повышенный интерлейкин-21 (IL-21) по сравнению с IL-21 у особы без аутоиммунной болезни. В некоторых вариантах осуществления, способы включают стадию измерения IL-21 в образце крови пациента с PC, таким образом идентифицируя пациента с PC, имеющего повышенный IL-21 по сравнению с указанной особой. Альтернативно, способы включают стадию генотипирования пациента для детектирования присутствия или отсутствия у пациента одного или нескольких генотипов полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP), ассоциированного с повышенным IL-21, таких как выбранные из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 и С/С в SNP rs6840978, где присутствие одного или нескольких указанных генотипов ассоциировано с повышенным IL-21.
Изобретение далее предлагает способы идентификации пациента с PC, имеющего повышенный риск развития вторичной аутоиммунной болезни после истощения лимфоцитов. В некоторых вариантах осуществления, способы включают стадию удостоверения (например, путем измерения) уровня интерлейкина-21 (IL-21) в образце крови пациента с PC, где повышенный уровень IL-21 по сравнению с особой без аутоиммунной болезни указывает, что пациент имеет повышенный риск развития вторичной аутоиммунной болезни по сравнению с пациентами с PC без повышенного IL-21. Альтернативно, способы включают стадию удостоверения (например, путем генотипирования) присутствия или отсутствия у пациента одного или нескольких генотипов полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP), ассоциированных с повышенным IL-21, таких как выбранные из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 и С/С в SNP rs6840978, где присутствие одного или нескольких (например, двух или трех) указанных генотипов ассоциировано с повышенным риском развития вторичной аутоиммунной болезни по сравнению с пациентами с PC без указанных одного или нескольких генотипов. Такие способы необязательно включают стадию информирования пациента и/или его/ее поставщика услуг здравоохранения про указанный повышенный риск, и/или стадию регистрации повышенного риска.
Изобретение далее предлагает способы выбора или идентификации пациента с PC, нуждающегося в усиленном контроле развития вторичной аутоиммунной болезни после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов. Такие способы могут включать стадию измерения IL-21 в образце крови пациента с PC, где повышенный IL-21 у указанного пациента по сравнению с особой без аутоиммунной болезни указывает, что пациент нуждается в усиленном контроле развития вторичной аутоиммунной болезни по сравнению с пациентами с PC без повышенного IL-21. Альтернативно, способы могут включать стадию генотипирования пациента для детектирования присутствия или отсутствия одного или нескольких генотипов SNP, ассоциированных с повышенным IL-21, таких как выбранные из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 и С/С в SNP rs6840978, где присутствие одного или нескольких указанных SNP указывает, что пациент нуждается в усиленном контроле развития вторичной аутоиммунной болезни по сравнению с пациентами с PC без указанных одного или нескольких генотипов. Такие способы необязательно включают стадию информирования пациента и/или его/ее поставщика услуг здравоохранения о необходимости усиленного контроля, и/или стадию регистрации необходимости.
Изобретение также предусматривает способы информирования о курсе лечения пациента с PC, включающие измерение IL-21 в образце крови указанного пациента или генотипирование пациента на присутствие или отсутствие вышеупомянутых трех фенотипов SNP, и выбор схемы лечения, соответствующей результатам измерений IL-21 или генотипу.
Изобретение предусматривает способы лечения PC у пациента с известной потребностью в таком лечении, включающие стадии (а) получения или удостоверения информации о (i) IL-21 в образце крови пациента (например, путем измерения IL-21 в образце); или (ii) присутствии или отсутствии одного или нескольких генотипов полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP), ассоциированных с повышенным IL-21, таких как выбранные из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 G/G и С/С в SNP rs6840978 (например, путем генотипирования пациента); (b) введения терапевтического агента для лечения рассеянного склероза указанному пациенту, и (с) необязательно, мониторинга развития вторичной аутоиммунной болезни у пациента. В некоторых вариантах осуществления, способы лечения используются для пациентов, у которых были определены нормальные уровни IL-21s и/или которые не имеют одного из вышеупомянутых трех генотипов SNP IL-21. Изобретение также охватывает анти-CD52 антитела (например, алемтузумаб или биологически подобный агент), или их антигенсвязывающие фрагменты, которые используются в таких способах лечения, и использование таких антител или антигенсвязывающих фрагментов в производстве лекарственного средства для использования в таких способах лечения. Изобретение далее охватывает схемы лечения, использующие такие способы лечения.
Изобретение предусматривает способы снижения частоты случаев или тяжести вторичной аутоиммунной болезни у пациента с рассеянным склерозом, который получал или будет получать терапию, приводящую к истощению лимфоцитов, в которых вторичная аутоиммунная болезнь возникает после проведения терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, включающие стадию введения антагониста IL-21, например, перед, во время или после проведения терапии, приводящей к истощению лимфоцитов. Изобретение также охватывает антагонисты IL-21 для использования в таких способах (например, анти-IL-21 или антитело против рецептора IL-21, или его антигенсвязывающий фрагмент; или растворимый рецептор IL-21), и использование таких антагонистов IL-21 в производстве лекарственного средства для использования в способах.
Изобретение предусматривает способы оценки восприимчивости Т-клеток к лечению с использованием терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, у пациента с рассеянным склерозом, включающие измерение каспазы-3 в Т-клетках, полученных от указанного пациента после указанной терапии, где увеличение каспазы-3 в указанных Т-клетках по сравнению с Т-клетками от пациента с PC, не получающего указанной терапии, указывает на восприимчивость Т-клеток к указанной терапии. Измерение может предусматривать определение количества или концентрации каспазы-3 или нуклеиновой кислоты, кодирующей каспазу-3.
Изобретение предусматривает способы информирования пациента с PC о повышенном риске развития вторичной аутоиммунной болезни после истощения лимфоцитов, включающие стадии получения или удостоверения информации о интерлейкине-21 (IL-21) в образце крови пациента с PC, где повышенный IL-21 по сравнению с особой без аутоиммунной болезни указывает, что пациент имеет повышенный риск развития вторичной аутоиммунной болезни по сравнению с пациентами с PC без повышенного IL-21; и информирование пациента о повышенном риске или его отсутствии. Альтернативно, способы включают получение или удостоверение информации о присутствии или отсутствии одного или нескольких из вышеупомянутых генотипов IL-21, вместо информации об уровне IL-21 в крови. Соответственно, изобретение также предусматривает способы информирования пациента с PC о необходимости, или отсутствии необходимости, в усиленном контроле за развитием вторичной аутоиммунной болезни после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, на основании уровня IL-21 у пациента или присутствия или отсутствия генотипов IL-21, описанных выше.
Изобретение предусматривает способы информирования о схеме контроля пациента с PC после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, включающие стадии получения или удостоверения информации о (i) IL-21 в образце крови пациента; или (ii) присутствии или отсутствии одного или нескольких генотипов полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP), ассоциированных с повышенным IL-21, таких как выбранные из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 G/G и С/С в SNP rs6840978; и выбор схемы контроля, пригодной для пациента, на основе данной информации. Пригодная схема контроля может включать, например, измерение аутоантител у пациента.
Настоящее изобретение обеспечивает преимущества в управлении риском при лечении PC. Например, изобретение предусматривает способы распределения лекарственного препарата, вызывающего истощение лимфоцитов, пациенту для лечения рассеянного склероза, включающие стадии консультирования пациента о повышенном риске развития вторичной аутоиммунной болезни после лечения указанным лекарственным средством, где повышенный риск ассоциирован с (i) повышенным IL-21; или (ii) присутствием одного или нескольких генотипов полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP), ассоциированных с повышенным IL-21, таких как выбранные из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 G/G и С/С в SNP rs6840978; и предоставления лекарственного средства пациенту после указанного консультирования, необязательно, после получения информированного согласия пациента.
Изобретение далее предлагает способы идентификации особы, вероятно имеющей повышенный интерлейкин-21 (IL-21) по сравнению с особой без какого-либо известного воспалительного состояния, включающие стадию генотипирования особы для детектирования присутствия или отсутствия одного или нескольких генотипов полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP), ассоциированных с повышенным IL-21, таких как выбранные из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 и С/С в SNP rs6840978, где присутствие одного или нескольких указанных генотипов ассоциировано с повышенным IL-21.
В контексте настоящего изобретения истощение лимфоцитов может быть индуцировано с помощью лечения, нацеленного на CD52, например лечения с использованием анти-CD52 антитела (например, моноклонального антитела) или его антигенсвязывающего фрагмента. Анти-CD52 антитело может быть алемтузумабом или биологически подобным агентом, таким как антитело, конкурирующее с алемтузумабом за связывание с CD52.
В способах по настоящему изобретению, измерение IL-21 может предусматривать измерение (например, детектирование/количественное определение) количества или концентрации IL-21 или нуклеиновой кислоты, кодирующей IL-21 в образце, или количества или концентрации мРНК, кодирующей IL-21 в IL-21-продуцирующих клетках (например, клетках Th17) в образце. В некоторых вариантах осуществления проводят измерение внутриклеточного IL-21 с использованием, например, методов окрашивания цитокинов и проточной цитометрии. В некоторых вариантах осуществления, проводятся измерения IL-21 сыворотки, с использованием, например, методов твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Изобретение также охватывает наборы для ELISA, предназначенные для детектирования уровня IL-21 у человека, включающие анти-IL-21 антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или растворимый рецептор IL-21. Наборы могут дополнительно включать инструкцию, указывающую пользователю взять образец крови у человека.
В способах по настоящему изобретению информация о IL-21 (включая измерение или генотипирование) может быть получена перед, во время или после терапии PC. Способы по настоящему изобретению могут быть использованы в контексте любой формы PC, включая, без ограничений, рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз, первичный прогрессирующий рассеянный склероз и вторичный прогрессирующий рассеянный склероз.
Изобретение также предусматривает наборы для лечения рассеянного склероза, включающие терапевтический агент, вызывающий истощение лимфоцитов (например, анти-CD52 антитело, такое как алемтузумаб); и письменную инструкцию, информирующую пациента или поставщика услуг здравоохранения о потенциально повышенном риске развития вторичной аутоиммунной болезни после лечения указанным агентом, где повышенный риск демонстрируется или ассоциирован с (i) повышенным IL-21, или (ii) присутствием одного или нескольких генотипов полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP), ассоциированных с повышенным IL-21, таких как выбранные из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 G/G и С/С в SNP rs6840978.
Изобретение далее предлагает наборы для идентификации пациента с PC, имеющего повышенный риск развития вторичной аутоиммунной болезни после истощения лимфоцитов, включающие антитело против интерлейкина-21 (IL-21) и один или несколько реагентов для детектирования связывания указанного антитела с IL-21 в образце крови пациента с PC. Изобретение также предусматривает наборы для идентификации пациента с PC, имеющего повышенный риск развития вторичной аутоиммунной болезни после истощения лимфоцитов, включающие один или несколько реагентов, пригодных для идентификации генотипа одного или нескольких полиморфизмов одиночного нуклеотида (SNP) выбранных из группы, состоящей из SNP rs13151961, SNP rs6822844 и SNP rs6840978, в образце, полученном от человека.
Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из приведенных далее фигур и детального описания.
Краткое описание чертежей
Фиг.1А представляет собой график, демонстрирующий частоту прекурсоров (PF) Т-клеток от здорового контроля (НС), не получавших лечения пациентов (Pre) и с интервалами в 3 месяца после применения алемтузумаба, нестимулированных (Unstim), или после культивации с миелиновым основным белком (МВР), или рецептором тиреостимулирующего гормона (TSHr). (* p<0,05, ** p<0,01, *** р<0,001).
Фиг.1Б представляет собой график, демонстрирующий пролиферативный индекс (PI) Т-клеток от здорового контроля (НС), не получавших лечения пациентов (Pre) и с интервалами 3 месяца после применения алемтузумаба, нестимулированный (Unstim), или после культивации с миелиновым основным белком (МВР), или рецептором тиреостимулирующего гормона (TSHr). (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.1В представляет собой график, демонстрирующий общее число жизнеспособных Т-клеток после 10 дней в культуре для здорового контроля (НС), не получавших лечения пациентов (Pre) и с интервалами 3 месяца после применения алемтузумаба, нестимулированных (Unstim), или после культивации с миелиновым основным белком (МВР), или рецептором тиреостимулирующего гормона (TSHr). (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.1Г представляет собой график, демонстрирующий процент Т-клеток, апоптозирующих в ответ на отсутствие стимулов или после культивации с МВР или TSHr в культуре от здорового контроля (НС), не получавших лечения пациентов (Pre) и с интервалами 3 месяца после применения алемтузумаба. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.1Д представляет собой диаграммы и график, демонстрирующие пассивный апоптоз Т-клеток от здорового контроля и пациентов до и после применения алемтузумаба с интервалами 3 месяца. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.1Е представляет собой диаграммы и график, демонстрирующие Fas-медиируемый апоптоз Т-клеток от здорового контроля и пациентов до и после применения алемтузумаба с интервалами 3 месяца. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001)
Фиг.1Ж представляет собой график, демонстрирующий пассивный CD4+ и CD8+ апоптоз Т-клеток от здорового контроля, пациентов до прохождения курса лечения и через 9 месяцев после применения алемтузумаба. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.1З представляет собой график, демонстрирующий Fas-медиируемый CD4+ и CD8+ апоптоз Т-клеток от здорового контроля, пациентов до прохождения курса лечения и через 9 месяцев после применения алемтузумаба. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.2А-2В представляют собой диаграммы, демонстрирующие экспрессию мРНК каспазы 3 по сравнению с экспрессией мРНК бета-актина в (A) CD3+ Т-клетках, (Б) CD14+ моноцитах, и (В) CD19+ В-клетках, соответственно, непосредственно ex vivo или после стимулирования МВР или поликлонального стимулирования (анти-CD3/28 антитела). (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.3 представляет собой диаграммы и график, демонстрирующие, что аутоиммунитет после применения алемтузумаба ассоциирован с избыточным апоптозом Т-клеток. Процент апоптоза Т-клеток, являющегося пассивным (Un), Fas-медиируемым, или возникающим в ответ на стимулирование МВР или TSHr у особ без аутоиммунитета (Ge et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101, 3041-3046 (2004)) или особ со вторичным аутоиммунитетом (Ge et al., 2004) показан на отдельных графиках. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.4А и 4Б представляют собой диаграммы и график, демонстрирующие, что rhIL-21 индуцирует апоптоз Т-клеток in vitro. Они показывают, что (A) CD4+ Т-клетки и (Б) CD8+ Т-клетки, соответственно, нестимулированные или поликлонально стимулированные (анти-CD3/CD28), апоптозируют в ответ на rhIL-21 доза-зависимым образом. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.5А-5Г представляют собой графики, демонстрирующие, что rhIL-21 индуцирует пролиферацию Т-клеток in vitro. Фиг.5А представляет собой график, демонстрирующий пролиферативный индекс нестимулированных CD4+ и CD8+ Т-клеток в ответ на rhIL-21. Фиг.5Б представляет собой график, демонстрирующий пролиферативный индекс поликлонально стимулированных (анти-CD3/CD28) CD4+ и CD8+ Т-клеток в ответ на rhIL-21. Фиг.5В представляет собой график, демонстрирующий частоту прекурсоров нестимулированных CD4+ и CD8+ Т-клеток в ответ на rhIL-21. Фиг.5Г представляет собой график, демонстрирующий частоту прекурсоров поликлонально стимулированных CD4+ и CD8+ Т-клеток в ответ на rhIL-21. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.5Д представляет собой графики, демонстрирующие число нестимулированных или поликлонально стимулированных (анти-CD3/CD28) CD4+ или CD8+ клеток в разных каналах при отсутствии, или в ответ на rhIL-21.
Фиг.6А представляет собой график, демонстрирующий IL-21 сыворотки перед и после проведения курса лечения алемтузумабом у 15 пациентов с и 15 пациентов без вторичного аутоиммунитета. (* р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001).
Фиг.6Б представляет собой график, демонстрирующий уровни IL-21 в сыворотке до проведения курса лечения (пг/мл) у неаутоиммунных пациентов (не имеющих аутоиммунитета после применения алемтузумаба) и аутоиммунных пациентов (имеющих аутоиммунитет после применения алемтузумаба).
Детальное описание
Данное изобретение основано на сделанном нами открытии того, что распространенность вторичного аутоиммунитета у пациента с PC после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов (например, после курса лечения алемтузумабом) ассоциирована с повышенным IL-21 у пациента. Мы обнаружили, что IL-21 повышен по сравнению с нормой (см. обсуждение ниже) еще до проведения курса лечения у пациентов с PC, у которых впоследствии развивается вторичный аутоиммунитет после проведения курса лечения. Мы также обнаружили, что после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, IL-21 повышается более резко у этих же пациентов по сравнению с пациентами с PC, не имеющими проявлений признаков вторичного аутоиммунитета, у которых IL-21 повышен в значительно меньшей степени. Таким образом, уровни IL-21 являются прогностичными в отношении распространенности вторичного аутоиммунитета после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов у пациента с PC. Мы также обнаружили, что генотипы полиморфизма единичного нуклеотида (SNP) А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 и С/С в SNP rs6840978 ассоциированы с повышенным IL-21 у особы; таким образом, генотипирование пациента с PC на присутствие или отсутствие таких специфических генотипов SNP также помогает прогнизировать риск развития вторичного аутоиммунитета у пациента после истощения лимфоцитов.
Мы впервые описали аутоиммунитет, возникающий как осложнение курса лечения алемтузумабом (САМРАТН-1Н) в 1999 г. (Coles et al., 1999), и продолжали наблюдать это осложнение терапии, получившей широкое признание как высокоэффективная при раннем рецидивирующе-ремиттирующем рассеянном склерозе (Coles et al., J Neurology 253, 98-108 (2006); Coles et al., 1999 и 2008). Наши исследования, описанные ниже, проводились на ряде когорт имеющихся пациентов и были направлены на понимание этой беспрецедентной "модели" аутоиммунитета человека, возникающего в подмножестве пациентов с PC, проходящих курс лечения алемтузумабом.
Иммунное состояние радикально меняется после воздействия алемтузумаба. Т-клетки, регенерирующие в лимфоцитопеничном окружении, созданном алемтузумабом, являются в высшей степени пролиферативными и склонными к аутореактивности. Однако эти клетки являются очень нестабильными и короткоживущими. Хотя из судьба ранее непосредственно не исследовалась (King et al., Cell 111, 265-277 (2004)), мы показали, что эти клетки быстро погибают вследствие апоптоза. Высокие и стабильные уровни апоптоза Т-клеток могут объяснить, почему разовая доза алемтузумаба индуцирует Т-клеточную лимфопению, продолжающуюся на протяжении нескольких лет, несмотря на то, что период полувыведения алемтузумаба из циркуляции составляет всего шесть дней и гематологические прекурсоры не истощаются (Gilleece et al., Blood 82, 807-812 (1993)).
На этом фоне мы показали, что пациенты со вторичным аутоиммунитетом имеют более высокую скорость апоптоза Т-клеток, но не большую Т-клеточную лимфопению, чем лица без аутоиммунитета, что позволяет предположить ускоренный клеточный цикл в этой группе. Такие возмущения Т-клеточного цикла ассоциированы со значительно более высокой экспрессией IL-21 сыворотки, которая, как мы обнаружили, является генетически предопределенной по меньшей мере в некоторых случаях. Кроме того, чувствительность к лимфопения-ассоциированному аутоиммунитету проявляется до истощения лимфоцитов, и уровни IL-21 до проведения курса лечения точно прогнозируют (прогностическая ценность положительного результата более 70%, например 83%, и прогностическая ценность отрицательного результата более 62%, например 72%) развитие аутоиммунитета в течение периода времени от нескольких месяцев до нескольких лет после воздействия алемтузумаба. Без желания ограничиваться какой-либо теорией, мы считаем, что за счет чрезмерного ускорения циклов размножения и гибели Т-клеток, IL-21 увеличивает стохастические возможности для Т-клеток встретить аутоантиген и нарушить толерантность, тем самым промотируя аутоиммунитет.
В общем, наши результаты обеспечивают первичное объяснение лимфопения-индуцированого аутоиммунитета у человека и создают концептуальную основу для понимания лимфопения-ассоциированного аутоиммунитета, выходящего за рамки узкого контекста лечения рассеянного склероза алемтузумабом. Концепция заключается в том, что сначала терапевтическое истощение лимфоцитов, а затем генетически ограниченное перепроизводство IL-21 приводят к состоянию избыточного Т-клеточного цикла и пониженной выживаемости, что промотирует аутоиммунитет у людей. Эти результаты лежат в основе настоящего изобретения.
Данное изобретение предусматривает способы ведения пациентов с PC при рассмотрении возможности терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, такой как курс лечения алемтузумабом. Например, наше изобретение предусматривает способы идентификации пациента с PC, имеющего повышенный IL-21 по сравнению с нормой (т.е. уровни IL-21 у контрольного испытуемого (испытуемых), как описано ниже), и способы идентификации пациента с PC, имеющего повышенный риск развития вторичного аутоиммунитета после истощения лимфоцитов. Такие способы включают стадии измерения IL-21 (например, уровни внутриклеточного или внеклеточного белка, уровни транскрипта РНК, или уровни активности IL-21; см. обсуждение ниже) в образце крови пациента, и сравнения значения IL-21 с нормальным значением IL-21. Альтернативно, вместо или в дополнение к анализу крови, может быть проведено генотипирование пациента на присутствие или отсутствие одного или нескольких генотипов SNP из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 и С/С в SNP rs6840978, где присутствие одного, двух или всех трех таких генотипов ассоциировано с повышенным IL-21. Как было описано выше, повышенный IL-21 ассоциирован с повышенным риском развития вторичного аутоиммунитета у пациента с PC после истощения лимфоцитов по сравнению с пациентами с PC, не имеющими повышенного IL-21.
Идентификация пациента способами по изобретению может сопровождаться рядом дополнительных стадий, предусмотренных изобретением. Например, пациент может быть проинформирован о повышенном риске развития вторичного аутоиммунитета после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, или отсутствии такого риска, на основе его/ее уровня IL-21 или генотипа. Таким образом, изобретение позволяет проводить индивидуальное консультирование о рисках терапии перед началом курса лечения. Поставщик услуг здравоохранения может рассмотреть терапевтические возможности с учетом риска вторичного аутоиммунитета и дать рекомендацию, включая, например, введение антагониста IL-21 перед, во время или после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, или выбор схемы лечения, не предусматривающей истощения лимфоцитов.
Поставщик услуг здравоохранения также может рассмотреть планы управления риском для пациента, который выберет проведение курса терапии, приводящей к истощению лимфоцитов. Например, поставщик услуг здравоохранения может проинформировать пациента о необходимости усиленного контроля за развитием вторичного аутоиммунитета после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, с учетом его/ее повышенного риска развития вторичного аутоиммунитета. Поставщик услуг здравоохранения также может рекомендовать пригодную схему контроля после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов. Пригодная схема контроля для пациентов с повышенным риском может включать, без ограничений, более частый контроль вторичного аутоиммунитета после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов с интервалом, например, в одну неделю, две недели, один месяц, два месяца, три месяца, шесть месяцев, или один год. Может существовать необходимость в проведении контроля на протяжении длительного периода времени, например более одного года, двух лет, трех лет, четырех лет, пяти лет или больше, потому что у некоторых пациентов вторичный аутоиммунитет может возникать значительно позже, чем через один год после курса лечения, приводящего к истощению лимфоцитов. Усиленный контроль также может предусматривать, например, более тщательный медицинский осмотр (например, большее количество анализов крови) специалистом на наличие каких-либо признаков вторичного аутоиммунитета. Кроме того, фармацевтам или клиническим сотрудникам, которые выдают пациенту лекарственное средство для лечения PC, вызывающее истощение лимфоцитов, может быть вменено в обязанность указывать пациентам на повышенный риск развития вторичного аутоиммунитета после применения лекарственного средства, в тех случаях, когда пациент имеет повышенный уровень IL-21 и/или имеет определенные генотипы IL-21, описанные тут, которые были ассоциированы с повышенным IL-21 сыворотки. Фармацевтам или клиническим сотрудникам также может быть вменено в обязанность получать информированное согласие пациента перед выдачей лекарственного средства пациенту.
Пациенты с рассеянным склерозом
Способы и композиции по настоящему изобретению могут быть использованы в контексте любой формы PC, например, рецидивирующе-ремиттирующего PC, первичного прогрессирующего PC и вторичного прогрессирующего PC. Пациентами с PC в контексте настоящего изобретения являются особы, диагностированные как имеющие форму PC, например, по истории симптомов и результатам неврологического осмотра с использованием тестов, таких как магнитно-резонансная визуализация (MRI), спинномозговые пункции, тесты вызванного потенциала и лабораторный анализ образцов крови.
Рассеянный склероз ("PC"), также известный как диссеминированный склероз, представляет собой аутоиммунное состояние, при котором иммунная система атакует центральную нервную систему, приводя к демиелинизации (Compston and Coles, 2008). PC разрушает жировой слой, называемый миелиновой оболочкой, которая окружает и электрически изолирует нервные волокна. Практически любые неврологические симптомы могут появляться при заболевании, и оно часто прогрессирует до физической и умственной инвалидности (Compston and Coles, 2008). PC принимает несколько форм. Новые симптомы могут возникать при отдельных приступах (рецидивирующие формы), или медленно накапливаются со временем (прогрессирующие формы) (Lublin et al., Neurology 46 (4), 907-11 (1996)). Между приступами, симптомы могут полностью исчезать (ремиссия), но часто существуют постоянные неврологические проблемы, особенно, при прогрессировании заболевания (Lublin et al., 1996). Было описано несколько подтипов, или схем прогрессирования, и они важны для прогноза, а также для принятия терапевтических решений. В 1996 г. Национальное общество рассеянного склероза США (United States National Multiple Sclerosis Society) стандартизировало четыре определения подтипов: рецидивирующе-ремиттирующий, вторичный прогрессирующий, первичный прогрессирующий и прогрессирующий рецидивирующий (Lublin et al., 1996).
Рецидивирующе-ремиттирующий подтип характеризуется непредсказуемыми острыми приступами, называемыми обострениями или рецидивами, с последующими периодами от нескольких месяцев до нескольких лет относительного затишья (ремиссия) без каких-либо новых признаков проявления заболевания. Таким образом можно описать начальное течение у большинства особ с PC (Lublin et al., 1996).
Вторичный прогрессирующий PC начинается с рецидивирующе-ремиттирующего течения, но впоследствии эволюционирует в прогрессирующее неврологическое ухудшение между острыми приступами без каких-либо определенных периодов ремиссии, хотя могут наблюдаться нерегулярные рецидивы и незначительные ремиссии (Lublin et al., 1996).
Первичный прогрессирующий подтип характеризуется постепенным, но неуклонным прогрессированием нетрудоспособности без заметной ремиссии после появления начальных симптомов PC (Miller et al., Lancet Neurol 6 (10), 903-12 (2007)). Он характеризуется прогрессированием потери трудоспособности с самого начала, без или с лишь редкими и незначительными ремиссиями и улучшениями состояния (Lublin et al., 1996). Возраст проявления первичного прогрессирующего подтипа обычно выше, чем для других подтипов (Miller et al., 2007)).
Прогрессирующий рецидивирующий PC характеризуется неуклонным ухудшением неврологического состояния с острыми приступами, после которых может наблюдаться некоторое востановление. Это самый редко встречающийся из всех описанных выше подтипов (Lublin et al., 1996).
Также были описаны случаи с нестандартным течением, которые иногда называются пограничными формами PC (Fontaine, Rev. Neural. (Paris) 157 (8-9 Pt 2): 929-34 (2001)). Эти формы включают болезнь Девика, концентрический склероз Бало, диффузный склероз Шильдера и рассеянный склероз Марбурга (Capello et al., Neurol. Sci. 25 Suppl 4: S361-3 (2004); Hainfellner et al., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatr. 55(12): 1194-6 (1992)).
Истощение лимфоцитов у пациентов с рассеянным склерозом
В используемом тут значении "истощение лимфоцитов" представляет собой тип иммуносупрессии путем уменьшения лимфоцитов в циркуляции, например, Т-клеток и/или В-клеток, что приводит к лимфопении. Длительное истощение лимфоцитов наблюдается, например, в случае аутологичной трансплантации костного мозга (ВМТ) или при использовании тотального лимфоидного облучения для лечения рассеянного склероза. См., например, Сох et al., Eur. J. Immunol. 35, 3332-3342 (2005). Например, истощение лимфоцитов может быть достигнуто путем комбинированного использования тимоглобулина, циклофосфамида и полного облучения тела. Истощение лимфоцитов у пациентов с PC также может быть достигнуто с помощью ряда лекарственных терапий. Например, гуманизированное анти-CD52 моноклональное антитело, САМРАТН-1Н (алемтузумаб), было использовано в терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, для лечения пациентов с PC. Было продемонстрировано, что САМРАТН-1Н-индуцированая лимфопения эффективно снижает воспаление центральной нервной системы как клинично, так и радиологично (Coles et al., Ann. Neurol. 46, 296-304 (1999); Coles et al., 2008).
Другие агенты также могут быть использованы в терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, для лечения пациентов с PC. Эти агенты могут быть веществами, вызывающими гибель клеток лимфоцитов или ингибирующими функции лимфоцитов. Они включают, без ограничений, (1) агенты, нацеленные на клетки, несущие CD-52, такие как агенты, биологически схожие с алемтузумабом, т.е. другие анти-CD52 антитела (например, химерные, гуманизированные или человеческие антитела), которые связываются с тем же эпитопом, что и алемтузумаб, или с другим, или конкурируют с алемтузумабом за связывание с CD52, и растворимые CD52 полипептиды, которые конкурируют с CD52 клеточной поверхности за связывание с лигандом (лигандами) CD52; (2) биомолекулы, такие как пептиды, белки и антитела (например, химерные, гуманизированные или человеческие антитела), которые нацелены на молекулы клеточной поверхности лимфоцитов, такие как анти-CD4 антитела, анти-CD20 антитела (например, ритуксимаб), анти-TCR антитела, и анти-интегриновые антитела (например, натализумаб); (3) цитотоксины (например, апоптоз-индуцирующие агенты, циклофосфамид, алкилирующие агенты, и ДНК-интеркаляторы), доставляемые специфически или неспецифически к лимфоцитам; и (4) антигенсвязывающие фрагменты вышеупомянутых антител. Антитела моут включать, без ограничений, моноклональные антитела, бифункциональные антитела, олигоклональные антитела и поликлональные антитела.
Термин "антигенсвязывающий фрагмент" в используемом тут значении относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связывать тот же самый антиген, что и целое антитело, из которого был получен этот фрагмент. Примеры "антигенсвязывающего фрагмента" включают, без ограничений, фрагмент Fab, фрагмент F(ab')2, фрагмент Fd, фрагмент Fv, фрагмент dAb, изолированный гипервариабельный участок (CDR), scFv, и диатело. Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, пригодные для использования в данном изобретении, могут быть получены любыми способами, хорошо известными специалистам.
Любая из описанных выше терапий истощения лимфоцитов может вызвать лимфопению, и у некоторых пациентов лимфопения приводит к вторичному аутоиммунитету.
Вторичный аутоиммунитет у пациентов с PC
Аутоиммунитет называется тут "вторичным аутоиммунитетом" в тех случаях, когда он возникает вследствие начала проявления первого ("первичного") заболевания, например "первичной" аутоиммунной болезни. Вторичный аутоиммунитет иногда возникает у пациентов с PC, имеющих, или имевших, лимфопению после, например, терапии, приводящей к истощению лимфоцитов. У некоторых особ вторичный аутоиммунитет возникает вскоре после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов (например, курса лечения алемтузумабом). У других особ вторичный аутоиммунитет может не возникать до истечения нескольких месяцев или лет после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов; у некоторых из этих особ, ко времени развития у них вторичного иммунитета, может происходить значительное восстановление лимфоцитов (общее число лимфоцитов), так что они уже не являются лимфоцитопеничными.
Вторичный аутоиммунитет, возникающий у лимфоцитопеничных пациентов с PC, может быть любым типом аутоиммунного состояния, отличным от PC, включая, без ограничений, тиреоидный аутоиммунитет (например, базедова болезнь), иммунную тромбоцитопению (ITP), болезнь Гудпасчера, аутоиммунную нейтропению, аутоиммунную гемолитическую анемию, и аутоиммунную лимфопению. Методы диагностики и ведения этих аутоиммунных болезней хорошо известны квалифицированным специалистам, включая оценку симптомов и медицинский осмотр, такие как анализ крови. Изобретение предусматривает использование любых известных способов. Например, могут быть определены уровни аутоантитела в телесной жидкости пациента (например, крови) в качестве средства детектирования признаков аутоиммунитета. Конкретнее, могут быть проведены измерения антиядерных антител, анти-гладкомышечных антител и анти-митохондриальных антител. В случае детектирования антиядерных антител, могут быть проведены дополнительные анализы для измерения антител против двухнитевой ДНК, анти-рибонуклеопротеиновых антител и анти-La антител. Измерения антител против рецепторов тиреоидной пероксидазы (ТРО) и тиреостимулирующего гормона (TSH) могут быть проведены для детектирования аутоиммунных заболеваний щитовидной железы; если будут детектированы антитела против рецепторов ТРО или TSH, можно измерить, изменилась ли тиреоидная функция, путем измерения уровней свободного Т3, свободного Т4 и TSH. Анти-тромбоцитарные антитела могут быть измерены для детектирования аутоиммунной тромбоцитопении; и измерение уровней тромбоцитов крови может быть использовано для определения того, вызывает ли присутствие анти-тромбоцитарных антител снижение числа тромбоцитов.
Измерение IL-21
В способах по настоящему изобретению, IL-21 может быть измерен рядом методов. IL-21 является членом гамма-с-родственного семейства цитокинов и обладает сильной активностью по промотированию пролиферации Т- и В-клеток и цитотоксичности природных клеток-убийц (NK). IL-21 преимущественно экспрессируется активированными CD4+ Т-клетками (например, клетками Th17) и играет важную роль в иммунных ответах Т-хелперного типа I (Th1) (Weiss et al., Expert Opin Biol. Ther. 7, 1705-1721 (2007); Sivakumar et al., Immunology 112, 177-182 (2004)). Ген IL-21 человека кодирует полипептидный прекурсор из 162 аминокислотных остатков и полностью процессированный зрелый белок из 133 аминокислотных остатков (примерно 15 кДа); ген расположен в хромосоме человека 4q26-27 (Sivakumaret al., 2004). Рецептор IL-21 (IL-21R) был обнаружен у покоящихся периферических В-клеток, активированных мононуклеарных клеток периферической крови, и зародышевых центрах лимфатических узлов человека (Marleau et al., J. Leukocyte Biol. 78, 575-584 (2005)).
Способы измерения IL-21 хорошо известны квалифицированным специалистам. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, берут у пациента образец телесной жидкости (например, крови, сыворотки, плазмы, мочи, слюны или спинномозговой жидкости) и измеряют уровень IL-21 в образце с помощью любого метода анализа, пригодного для детектирования белка, включая, без ограничений, иммунологические анализы, такие как твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA). Коммерческие наборы ELISA для измерения IL-21 человека доступны, например, от фирм KOMABIOTECH (Seoul, Korea), Bender MedSystems (Burlingame, CA), и eBioscience (San Diego, CA),
Альтернативно, уровни транскрипта IL-21 в IL-21-продуцирующих клетках (например, клетках Th17), полученных от пациента, моут быть измерены методом нозерн-блоттинга и количественной полимеразной цепной реакции (Q-PCR). Способы выделения клеток Th17 хорошо известны специалистам и выделение может быть осуществлено путем использования коммерчески доступных наборов, например, наборов производства фирм Miltenyi Biotec (Auburn, CA), eBioscience (San Diego, CA). В некоторых вариантах осуществления, уровни IL-21 измеряют методами окрашивания цитокинов и проточной цитометрии, в которых анти-IL-21 антитело, связанное с детектируемым фрагментом, используется для детектирования внутриклеточного уровня IL-21 в IL-21-продуцирующих клетках пациента. IL-21 также может быть измерен по активности проведения биологического анализа, например, путем измерения пролиферативного ответа Т-клеток на комбинацию IL-21 и IL-15 с использованием, например, CFSE (сукцинимидильного сложного эфира карбоксифлуоресцеина) (Zeng et al., Curr. Protoc. Immunol. 78:6.30.1-6.30.8 (2007)). Другой способ измерения IL-21 выполняется на основе IL-21-индуцированного фосфорилирования тирозином Stat3 в CD8(+) Т-клетках селезенки с использованием анализа, основанного на проточной цитометрии (Zeng et al., 2007). Квалифицированные специалисты в данной области техники легко определят другие пригодные способы измерения IL-21.
В способах по настоящему изобретению, контрольным (или опорным) значением для определения того, имеет ли пациент повышенный (аномально высокий) IL-21, является значение IL-21 для контрольного испытуемого, или среднее значение IL-21 для группы контрольных испытуемых, полученное с использованием этого же метода анализа, который проводится в это же или в другое время. Контрольный испытуемый представляет собой нормальную или здоровую особу, которая, в данном контексте, является человеком без каких-либо протекающих известных воспалительных состояний, в том числе, без аутоиммунной болезни (без каких-либо детектируемых симптомов аутоиммунной болезни). В некоторых вариантах осуществления, контрольные испытуемые не являются лимфоцитопеничными. Увеличение уровня IL-21 на примерно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100%, двухкратное, трехкратное, четырехкратное, пятикратное, десятикратное, двадцатикратное, тридцатикратное, сорокакратное, пятидесятикратное, стократное или больше, может считаться значительным увеличением. Определенные статистические анализы могут быть использованы для определения того, является ли уровень IL-21 в исследуемом образце значительно отличающимся от контрольного уровня. Такие статистические анализы хорошо известны квалифицированным специалистам и могут включать, без ограничений, параметрические (например, двусторонне ограниченный t-критерий Стьюдента) или непараметрические (например, U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни) критерии.
Детектирование генотипов SNP IL-21
В некоторых способах по настоящему изобретению, генотипирование используется для прогнозирования склонности пациента к присутствию (т.е., повышенного риска наличия или вероятности наличия) повышенного IL-21 и, таким образом, к повышенному риску развития вторичного аутоиммунитета при наличии лимфопении. "Генотипирование" относится к процессу определения генотипа особы путем использования биологических анализов. Способы генотипирования хорошо известны квалифицированным специалистам и включают, без ограничений, PCR, ДНК-секвенирование, аллель-специфические олиго-пробы (ASO), и гибридизацию с микроматрицами ДНК или бусинами. Генотипирование может быть частичным, т.е. определяется лишь небольшая часть генотипа особы. В контексте настоящего изобретения необходимо детектировать лишь определенные SNP. SNP представляет собой вариант ДНК-последовательности, возникающий, когда отдельный нуклеотид - А, Т, С или G - в соответствующем участке генома отличается у особей одного вида или между парными хромосомами особы. Известным SNP человека присваиваются справочные идентификационные номера SNP (refSNP или rs) в публичном архиве Базы данных полиморфизма одиночных нуклеотидов (dbSNP), находящемся в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information, NCBI).
Авторы данного изобретения обнаружили, что минорные генотипы SNP rs13151961 A/A, rs6822844 G/G и rs6840978 С/С ассоциированы со значительно более высокими уровнями IL-21 сыворотки по сравнению с особами, не имеющими этих генотипов. Пациенты с PC, имеющие один или несколько таких фенотипов SNP, таким образом обладают повышенной склонностью к развитию вторичного аутоиммунитета после истощения лимфоцитов по сравнению с пациентами с PC, не имеющими таких генотипов.
Выбор времени получения информации о IL-21
Получение информации о IL-21 (уровни IL-21 или IL-21-родственные генотипы SNP) пациента с PC полезно при выборе курса лечения и схем контроля после проведения курса лечения пациента. В тех случаях, когда информацию получают до проведения терапии PC, пациент может быть проинформирован об относительном риске развития вторичного аутоиммунитета после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, и могут быть приняты соответствующие решения о проведении лечения. Пациент также может быть проинформирован о необходимости усиленного контроля после проведения курса лечения, например, более частых и более детальных осмотров специалистом, если он был классифицирован как особа "с повышенным риском". Таким образом, информация о IL-21 улучшает управление рисками (со стороны врачей, фармацевтов и пациентов) при лечении PC.
Получение информации о IL-21 во время или после лечения PC также будет полезным для контроля за развитием вторичного аутоиммунитета и его лечения. Как указано выше и дополнительно описано ниже, мы обнаружили, что после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, пациенты с PC, у которых развивается вторичный аутоиммунитет, демонстрируют значительно большее увеличение IL-21 сыворотки по сравнению с пациентами с PC, у которых не развивается вторичный аутоиммунитет. У последней группы пациентов с PC продуцируется лишь незначительно больше IL-21 после истощения лимфоцитов. Таким образом, путем измерения продуцирования IL-21 после курса лечения, приводящего к истощению лимфоцитов, можно также предсказать риск вторичного аутоиммунитета, который может возникнуть лишь через несколько месяцев или лет после проведения курса лечения.
Ведение вторичного аутоиммунитета
Болезнь вторичного аутоиммунитета, возникающая у пациентов с PC, можно лечить с учетом типа заболевания. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, вторичный аутоиммунитет можно лечить путем использования эффективной дозы антагониста IL-21. Антагонист IL-21 может быть терапевтическим агентом, который ингибирует активность IL-21, например, агентом, который ингибирует взаимодействие между IL-21 и IL-21R. "Эффективная доза" относится к количеству ингибирующего агента, достаточному для ингибирования активности IL-21 у пациента таким образом, чтобы облегчить или предотвратить проявления симптомов вторичной аутоиммунной болезни. Антагонисты IL-21 могут быть, например, химерными, гуманизированными или человеческими моноклональными антителами к IL-21 или IL-21R человека, или растворимыми белками IL-21R. См. также, например, патент США №7410780 и публикацию патентной заявки США №20080241098, описания которых целиком включены сюда в качестве ссылок. Фармацевтические композиции, содержащие антагонист IL-21, могут быть изготовлены в соответствии со способами, известными специалистам. Фармацевтические композиции, содержащие антагонисты IL-21, могут быть введены пациенту с использованием пригодного способа, известного специалистам, например внутривенно, внутримышечно или подкожно.
Наборы для лечения и тестирования пациентов с PC
Настоящее изобретение предусматривает наборы для лечения рассеянного склероза. Набор по настоящему изобретению может содержать, inter alia, лекарственное средство, вызывающее истощение лимфоцитов (например, алемтузумаб), и письменную инструкцию, информирующую пациента или поставщика услуг здравоохранения о противопоказаниях лекарственного препарата, например, потенциально повышенном риске развития вторичной аутоиммунной болезни после лечения с использованием лекарственного средства. Повышенный риск может быть ассоциирован с, или его признаком может быть (i) повышенный IL-21, или (ii) присутствие одного или нескольких генотипов полиморфизма одиночного нуклеотида (SNP), выбранных из группы, состоящей из А/А в SNP rs13151961, G/G в SNP rs6822844 и С/С в SNP rs6840978.
В других вариантах осуществления, изобретение предусматривает наборы для детектирования IL-21 сыворотки у пациента с PC и/или идентификации пациентов с PC, имеющих повышенный риск развития вторичной аутоиммунной болезни после истощения лимфоцитов. Такие наборы могут включать анти-IL-21 антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, или растворимый рецептор IL-21 и, необязательно, инструкцию, указывающую пользователю взять образец крови у пациента, и необязательно, один или несколько реагентов для детектирования связывания антитела, фрагмента, или растворимого рецептора IL-21 с IL-21 в образце крови пациента с PC. Такие наборы будут аттестоваться или получать разрешение соответствующего регуляторного органа на установление медицинского диагноза у пациентов, таких как пациенты с PC.
В еще одних вариантах осуществления, изобретение предусматривает наборы для идентификации пациента с PC, имеющего повышенный риск развития вторичной аутоиммунной болезни после истощения лимфоцитов. Наборы могут включать один или несколько реагентов, пригодных для идентификации присутствия или отсутствия одного или нескольких генотипов SNP, выбранных из группы, состоящей из SNP rs13151961, SNP rs6822844 и SNP rs6840978, в образце, полученном у пациента с PC, и инструкцию, указывающую пользователю взять образец у пациента с PC.
Оценка восприимчивости Т-клеток к курсу лечения PC
Данное изобретение предусматривает способы оценки восприимчивости Т-клеток к лечению с использованием терапии, приводящей к истощению лимфоцитов у пациента с PC. Способы предусматривают измерение каспазы-3 в Т-клетках, полученных от пациента после проведения курса лечения. Увеличение каспазы-3 (например, белка каспазы-3, транскрипта РНК и/или уровней активности) в Т-клетках по сравнению с Т-клетками пациента с PC, не получающего лечения, указывает, что Т-клетки пациента, получающего лечение, являются восприимчивыми к курсу лечения. Такие способы основаны на нашем открытии того, что Т-клетки людей, не получающих лечения PC, являются устойчивыми к апоптозу, и что такая устойчивость ассоциирована с пониженной экспрессией каспазы-3. Однако после терапии, приводящей к истощению лимфоцитов, экспрессия каспазы-3 в Т-клетках значительно возрастает, достигая уровней, наблюдающихся у здоровых людей.
Методики измерения каспазы-3 в Т-клетках хорошо известны специалистам. Например, можно получить клеточные экстракты из Т-клеток с использованием методов, хорошо известных специалистам, и измерить уровни белка каспазы-3, например, с помощью ELISA. Коммерческие наборы ELISA для измерения каспазы-3 человека доступны, например, от фирм Bender MedSystems (Burlingame, CA), EMD Chemicals, Inc. (San Diego, CA), и R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN). Альтернативно, уровни транскриптов каспазы-3 могут быть измерены в Т-клетках, например, методом нозерн-блоттинга или количественной PCR. Каспаза-3 также может быть измерена по активности в биологическом анализе, например, путем измерения ее протеазной активности. Коммерческие наборы для измерения активности каспазы-3 доступны, например, от Roche Applied Science (Indianapolis, IN), и Invitrogen (Carlsbad, CA).
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые тут, имеют значения, общеизвестные рядовым специалистам в области техники, к которой относится данное изобретение. Типичные примеры способов и материалов описаны ниже, хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным тут, также могут быть использованы в практике или тестировании по настоящему изобретению. Все публикации и другие ссылки, упоминаемые тут, включаются целиком в качестве ссылок. В случае конфликта, главенствующим является данное описание, включая определения. Хотя здесь упоминается ряд документов, такое упоминание не является допущением того, что любые такие документы являются частью общеизвестного уровня знаний в данной области техники. В данном описании и вариантах осуществления, слово "включать" или варианты, такие как "включает" или "включающий", следует понимать как подразумевающие включение указанного элемента или группы элементов, но не исключение любого другого элемента или группы элементов. Материалы, способы и примеры являются только ииллюстративными и не должны рассматриваться как ограничительные.
Следующие примеры предназначены для иллюстрации способов и материалов по настоящему изобретению. Пригодные модификации и адаптации описанных условий и параметров, нормально используемых в технике, очевидные для квалифицированных специалистов, входят в объем и сущность настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
В следующих примерах все пациенты имели рецидивирующе-ремиттирующий рассеянный склероз и были участниками одних из двух клинических испытаний: CAMMS-223 и CAMMS-224 (REC 02/315 и 03/078), в которых алемтузумаб вводили путем внутривенной инфузии 12-24 мг/день в течение пяти дней, с последующим проведением повторного курса через 12 месяцев. Пациенты и контрольные субъекты давали согласие на веносекцию в исследовательских целях (LREC 02/263) и все не подвергались воздействию других агентов, влияющих на течение болезни, включая стероиды, в течение по меньшей мере одного месяца к моменту взятия проб крови.
Пролиферацию лимфоцитов и данные об апоптозе получали путем проведения единовременного поперечного углубленного исследования свежих ех vivo клеток от 65 пациентов и 21 здорового контрольного субъекта (7 мужчин, средний возраст 34 года). Это привело к выдвижению гипотез о Т-клеточном цикле в патогенезе вторичного аутоиммунитета, которые были все протестированы на образцах, доступных через девять месяцев после проведения курса лечения алемтузумабом, который был выбран в возможно более ранний момент времени, когда можно было надежно проанализировать апоптоз Т-клеток. Из 29 образцов, доступных в этот момент времени, 10 соответствовали определению аутоиммунитета, данному в наших исследованиях (1 мужчина, средний возраст 36 лет), по сравнению с 10 без аутоиммунитета (3 мужчин, средний возраст 38 лет). Аутоиммунитет был определен как развитие новой аутоиммунной болезни (с аутоантителами или без них), или устойчивые значительные титры аутоантител (присутствующих по меньшей мере в двух случаях с интервалом в по меньшей мере три месяца) без клинического заболевания. "Без аутоиммунитета" было определено как отсутствие аутоиммунной болезни и аутоантител в течение по меньшей мере 18 месяцев после применения алемтузумаба в данных исследованиях. Из десяти пациентов с аутоиммунитетом, у троих наблюдались только аутоантитела (антиядерные антитела). Затем измеряли IL-21 сыворотки серийно у: 15 случайно выбранных пациентов с аутоиммунитетом - пятерых из которых обследовали, как описано выше (трое мужчин, средний возраст 34 года; двенадцать с тиреоидным аутоиммунитетом, один с болезнью Гудпасчера, один с ITP и один только с антиядерными антителами), и пятнадцати случайно выбранных пациентов без аутоиммунитета - шесть из которых были обследованы, как описано выше (пятеро мужчин, средний возраст 31 год) и девятнадцати здоровых контрольных субъектов (семь мужчин, средний возраст 33 года).
Генетический анализ был проведен для 73 субъектов. Из них 23 соответствовали определению "без аутоиммунитета" и 27 имели вторичный аутоиммунитет после применения алемтузумаба (шесть только с аутоантителами: четыре с антиядерными и два с анти-гладкомышечными антителами; восемнадцать с тиреоидным аутоиммунитетом, два с ITP и один с болезнью Гудпасчера). Остальные 23 субъекта не могли быть классифицированы из-за преходящего продуцирования аутоантител и/или недостаточного времени после курса лечения алемтузумабом.
Во всех статистических анализах, описанных в следующих примерах, данные анализировали с использованием SPSS 12.0.1 для Windows. После оценки нормальности, проводились параметрические (t-критерий Стьюдента) или непараметрические (Уилкоксон-Манн-Уитни) анализы. В тексте указаны значения Р, причем величины р<0,05 считались статистически значимыми, с модификацией путем коррекции по Бонферрони в указанных случаях.
Пример 1: Алемтузумаб индуцирует Т-клеточную лимфопению.
Разовая доза алемтузумаба приводила к истощению CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов до 5,6% и 6,8%, соответственно, от базовых значений, в месяц 1, и 30,3% и 40,8%, соответственно, в месяц 12 (данные не приведены).
Пример 2: Т-клетки пациентов с рассеянным склерозом, не получающих лечения, являются стойкими к гибели.
Для различных анализов, проведенных в данном Примере, были использованы разные поперечные и продольные образцы в зависимости от доступности. В качестве вступления к измерению клеточного цикла лимфоцитов после применения алемтузумаба мы исследовали пролиферативный ответ Т-клеток, нестимулированных или в культуре с миелиновым основным белком (МВР) или рецептором тиреостимулирующего гормона (TSHr), при сравнении не получавших лечения пациентов с рассеянным склерозом и нормальными контрольными субъектами (Фиг.1А и 1Б).
А. Культуры периферических мононуклеарных клеток
6
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) были выделены из гепаринизированной крови центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Paque (Amersham Pharmacia Biotech). Цельные РВМС немедленно суспендировали в культуральной среде (RPMI), содержащей 1% пенициллина, 1% стрептомицина и 10% сыворотки плода коровы (Sigma S5394) и доводили до концентрации 10/мл жизнеспособных клеток (определенной методом исключения трипанового синего). Для индуцирования пассивной клеточной смерти РВМС инкубируют в течение 72 часов в одной лишь среде без дополнительных факторов роста. Fas-медиируемый апоптоз индуцировали путем культивации РВМС в течение 48 часов с растворимым анти-CD28 (1 мкг/мл: любезно предоставлен М.Frewin, University of Oxford) на чашках, предварительно покрытых анти-CD3 mAb (1 мкг/мл - BD Pharmingen), с последующей инкубацией в течение 18 часов с активирующим анти-человеческим Fas (клон СН11, 1 мкг/мл - Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).
В. Детектирование апоптоза
+
-
+
-
+
-
+
+
Апоптические Т-клетки детектируют путем окрашивания клеток: аллофикоцианин-конъюгированные мышиные анти-человеческие моноклональные антитела против CD3 (Serotec MCA463APC), CD4 (Serotec МСА1267АРС) и CD8 (Serotec MCA1226APC), FITC-конъюгированный аннексин-V и пропидий йодид (BD Pharmingen). Флуоресценцию детектируют методом проточной цитометрии (FACSCALIBUR: Becton Dickinson, Mountain View, CA). На основе прямого и бокового рассеяния был задан широкий лимфоцитарный интервал для включения живых и апоптических лимфоцитов (имеющих пониженный FSc и повышенный SSc). Собирали по меньшей мере 15000 событий в данном интервале и анализировали с использованием прикладной программы WinMDI 2.8. Ранние апоптические клетки были определены как аннексинVPI, и поздние апоптические или некротические клетки - как аннексинVPI (Aubry et al., Cytometry 37, 197-204 (1999)). Апоптическая гибель клеток была определена как полная клеточная смерть (аннексинVPI плюс аннексинVPI), блокированная пан-каспазным ингбированием Q-VD-OPh (RnD Systems OPHOOI).
С. Пролиферативные анализы
Добавляли к РВМС краситель для отслеживания клеточного деления CFSE (карбоксифлуоресцеиндиацетата сукцинимидиловый сложный эфир) (Lyons et al. Methods Cell Biol. 63, 375-398 (2001)) и культивировали с 50 мкг/мл миелинового основного белка (МВР: RDI-TRK8M79/LYO) или 1 мкг/мл внеклеточного домена рецептора тиреостимулирующего гормона, сцепленного со связывающим белком матрикса (TSHr: любезно предоставлен М.Ludgate, Cardiff University). Через 10 дней окрашивание клеток CFSE, идентифицируемое по специфическим поверхностным маркерам (CD4, CD8), анализируют методом проточной цитометрии. Рассчитывают частоту прекурсоров (определяемую как часть лимфоцитов, которые покинули родительскую популяцию, пройдя по меньшей мере два деления клеток) и индекс пролиферации (определяемый как сумма клеток во всех поколениях, деланная на расчетное число родительских Т-клеток) с помощью программы Modfit LT 3.0 (Verity Software). Абсолютное число выживших клеток измеряют путем сравнения с неизменным числом инертных бусин (BD CALIBRITE, BD Biosciences), включенных в культуры.
D. Результаты
Не наблюдалось различий в пролиферативном ответе Т-клеток, нестимулированных или в культуре с миелиновым основным белком (МВР) или рецептором тиреостимулирующего гормона (TSHr), между не получавшими лечения пациентами с рассеянным склерозом и нормальными контрольными субъектами (Фиг.1А и 1Б). Наоборот, выживание Т-клеток от не получавших лечения пациентов с рассеянным склерозом более чем четырехкратно превышало показатель для контроля (р<0,005; Фиг.1В), позволяя предположить, что пониженная гибель Т-клеток является признаком рассеянного склероза без проведения лечения. Мы подтвердили это, продемонстрировав, что Т-клетки от не получавших лечения пациентов являются стойкими как к пассивному, так и Fas-медиируемому апоптозу по сравнению со здоровыми контрольными субъектами (пассивный: 0,3% против 6,7%, р=0,0016; и Fas-медиируемый: 2,9% против 15,5%, р=0,0018; Фиг.1Е и 1F).
Пример 3: Т-клетки, регенерирующие после применения алемтузумаба, являются высокопролиферативными, склонными к аутореактивности и восприимчивыми к апоптозу
Используя анализы, описанные в Примере 2, мы обнаружили, что после алемтузумаба, доля Т-клеток, реагирующих на аутоантигены (частота прекурсоров) и степень пролиферации (пролиферативный индекс) значительно повышаются по сравнению с не получавшими лечения пациентами и здоровыми контрольными субъектами. Например, в месяц 3, нестимулированная пролиферация Т-клеток была более чем в 6,5 раз выше, чем для не получавших лечения пациентов, и пролиферация в ответ на стимулирование МВР и TSHr возрастала на 900% и 700%, соответственно (все р<0,01: Фиг.1А и 1Б). Апоптоз Т-клеток также значительно возрастал после применения алемтузумаба. В ответ на антигенное стимулирование, доля Т-клеток, подвергающихся апоптозу в шесть месяцев, была в 10 раз больше, чем на базовой линии (Фиг.1Г; р<0,001 для всех антигенов), приводя к меньшему числу жизнеспособных Т-клеток в конце культивации (Фиг.1В). Пассивный и Fas-медиируемый апоптоз также были повышены после применения алемтузумаба, с показателями, по меньшей мере вдвое превышающими наблюдаемые в группе здорового контроля (пассивный: 24,5%, 22,2% и 17,9% в 6, 9 и 12 месяцев, соответственно, по сравнению с 6,7% у контроля, все р<0,001; Fas-медиируемый 37,8%, 35,8% и 29,9% в 6, 9 и 12 месяцев, соответственно, по сравнению с 15,5% у контроля, все р<0,01; Фиг.1Д и 1Е). Повышенный апоптоз лимфоцитов после применения алемтузумаба наблюдался как в CD4+, так и в CD8+ субпопуляциях (Фиг.1Ж и 1З) и сохранялся на протяжении по меньшей мере 18 месяцев после проведения курса лечения алемтузумабом (данные не приведены).
Пример 4: Т-клетки не получавших лечения пациентов с рассеянным склерозом имеют пониженную экспрессию каспазы 3
А. Анализ мРНК
7
РВМС, немедленно ex vivo или после культивации с МВР, или поликлональным стимулированием разделяли по положительному заряду, используя 20 мкл магнитных бусин (Miltenyi Biotec; CD 19 Microbeads, CD3 Microbeads, CD 14 Microbeads) на 1×10 клеток, помещенных в колонку MACS LS. Магнитно удерживаемые клетки элюируют, промывают и сберегают в RNAIater™ при -70°С (чистота клеток стабильно 95-98%, данные не приведены).
Экспрессию Fas, FasL, Bcl-2, Bcl-XI, Bad, Bax, Bid, Bim, Survivin, c-FLIP, и каспазы 3, 8 и 9 определяют методом полуколичественной RT-PCR. Экстрагируют мРНК из клеток, хранящихся в RNAIater™ с помощью набора RNEASY Mini Kit (QIAgen), и подвергают обратной транскрипции до кДНК с помощью набора PRO-STAR First Strand RT-PCR (Stratagene). Праймеры и зонды PCR были сконструированы с помощью PRIMER EXPRESS (РЕ Biosystems, Foster City, CA, USA) и приобретены у службы Oswel DNA. Информация о последовательности мРНК была получена из GenBank. Количественная PCR в реальном времени проводилась с помощью системы детектирования последовательностей ABI Prism 7900НТ (Perkin Elmer) с использованием PCR Mastermix, содержащего ROX (Eurogentec RT-QP2X-03). Последовательности праймеров и зондов:
В. Результаты
Экспрессия Т-клетками мРНК каспазы 3 - эффекторной каспазы, общей для обоих апоптических путей, - от не получавших лечения пациентов с рассеянным склерозом была пониженной по сравнению с контролем; это снижение было значимым для нестимулированных и МВР-стимулированных РВМС (на 78% и 87%, соответственно, оба р<0,05, с поправкой на множественное сравнение), но не для поликлонально стимулированных культур (Фиг.2А). Аналогичная тенденция наблюдалась для CD14+ клеток (но не для CD19+ клеток), хотя это различие исчезало после внесения поправки на множественные сравнения (Фиг.2В). После применения алемтузумаба экспрессия каспазы 3 значительно возрастала в Т-клетках и моноцитах, достигая уровней, наблюдающихся для здоровых контрольных субъектов (р<0,05; Фиг.2А и 2В). Экспрессия всех других тестируемых генов (перечислены в способах) оставалась неизменной после применения алемтузумаба.
Таким образом, наши исследования показали, что Т-клетки от людей с рассеянным склерозом, не получавших лечения, являются стойкими к апоптозу, и такая устойчивость ассоциирована с пониженной экспрессией каспазы 3. Сообразно положению этой эффекторной каспазы в точке сходимости внешних и внутренних апоптических путей мы продемонстрировали устойчивость Т-клеток как к Fas-медиируемому, так и пассивному апоптозу у наших пациентов. Пониженная экспрессия каспазы 3 была описана при некоторых аутоиммунных болезнях, включая диабет типа I (Vendrame et al., Eur J Endocrinol 152, 119-125 (2005)), тиреоидит Хашимото и аутоиммунный полиэндокринный синдром-2 (Vendrame et al., J Clin Endocrinol Metabjc (2006)). Однако для рассеянного склероза этот результат является новым.
Пример 5: Вторичный аутоиммунитет после применения алемтузумаба ассоциирован с чрезмерным апоптозом Т-клеток
Продемонстрировав повышенную пролиферацию лимфоцитов и апоптоз как типичный ответ на лечение, мы исследовали соотношение между апоптозом Т-клеток и развитием аутоиммунитета после применения алемтузумаба, определенным как развитие нового аутоиммунного заболевания и/или стойкое содержание аутоантител выше нормального уровня после применения алемтузумаба, сохраняющееся на протяжении по меньшей мере 3 месяцев. При использовании этого определения, Т-клетки, полученные от пациентов с аутоиммунитетом (n=10), демонстрировали значительно более высокие уровни апоптической клеточной смерти при всех условиях культивации через 9 месяцев после проведения курса лечения, при сравнении с Т-клетками неаутоиммунных пациентов (n=10), обследованных в этот же момент времени (нестимулированные 4,7% против 14,4%, Fas-медиируемые 18,2% против 32,1%, MBP 7,6% против 17,6%, и TSHr 9,5% против 25,5%, р<0,01 для всех сравнений; Фиг.3). При применении более строгого определения аутоиммунитета как развития аутоиммунной болезни, за исключением продуцирования непатогенного антитела, различие сохранялось, несмотря на уменьшение численности аутоиммунной группы до 7 особ (нестимулированные, 4,7% против 15,4%; Fas-медиируемые, 18,2% против 31,7%; MBP, 7,6% против 20,2%; TSHr, 9,5% против 13,4%; Р<0,02 для всех сравнений).
9
9
9
9
Не наблюдалось различий в скорости восстановления Т-клеток между двумя группами (например, в 6 месяцев, число CD4 составляло 0,15×10/л против 0,19×10/л; и число CD8 - 0,11×10/л против 0,11×10/л у особ с и без аутоиммунитета соответственно), что позволяет предположить повышенную скорость Т-клеточного цикла в аутоиммунной группе (данные не приведены).
Пример 6: IL-21 индуцирует пролиферацию Т-клеток и апоптоз
А. Анализы IL-21 и импульсное воздействие (spiking)
Измеряют IL-21 сыворотки с помощью набора EBIOSCIENCE (88-7216-86) в соответствии с инструкциями. Планшеты считывают с помощью устройства для считывания микропланшетов (модель 680, BioRad) на 450 нм. Прибавляют к нестимулированным и поликлонально стимулированным (1 мкг/мл иммобилизованого на планшете анти-CD3 и 1 мкг/мл растворимого анти-CD28) РВМС 5 пг/мл и 20 пг/мл rhIL-21 (EBIOSCIENCE 14-8219). Оценивают апоптоз и пролиферацию CD4+ и CD8+, как описано выше.
В. Результаты
Мы проверили влияние экзогенного IL-21 на апоптоз и пролиферацию Т-клеток человека in vitro. Добавление к РВМС от здорового контроля rhIL-21 приводит к увеличению показателей апоптической смерти нестимулированных и поликлонально стимулированных CD4+ (Фиг.4А) и CD8+ (Фиг.4Б) Т-клеток доза-зависимым образом (р<0,05 для всех условий). Добавление к нестимулированным клеткам rhIL-21 приводит к небольшому, но значимому увеличению пролиферации как CD4+, так и CD8+ Т-клеток; с увеличением как пролиферативного индекса (CD4+ и CD8+: 1,07 против 1,25, р=0,017; и 1,09 против 1,32, р=0,017 соответственно; Фиг.5А), так и частоты прекурсоров (CD4+ 0,007 против 0,014, р=0,016; CD8+ 0,007 против 0,015, р=0,026; Фиг.5В), IL-21 не влияет на соотношение CD4+ или CD8+ Т-клеток, пролиферирующих в ответ на поликлональное стимулирование (Фиг.5Г), позволяя предположить, что они уже были максимально простимулированы. IL-21, однако, не приводит к значимому увеличению степени пролиферации CD8+ клеток (пролиферативный индекс 11,59 против 19,39, р=0,012; Фиг.5Б).
Пример 7: IL-21 прогнозирует развитие вторичного аутоиммунитета после применения алемтузумаба
Для всех моментов времени по Примеру 6 концентрация IL-21 сыворотки была значительно больше у пациентов с развившимся вторичным аутоиммунитетом по сравнению с неаутоиммунной группой (для всех сравнений р<0,05; Фиг.6А). Мы исследовали все образцы сыворотки до проведения курса лечения от 84 пациентов, которые впоследствии принимали алемтузумаб. После по меньшей мере двух лет наблюдения за этими пациентами мы классифицировали их как принадлежащие к "аутоиммунной" группе (n=35: 32 пациента с заболеваниями щитовидной железы, один с ITP, один с болезнью Гудпасчера, и один с алопецией) или "неаутоиммунной" группе (n=49; пациенты без или с преходящими (сохраняющимися на протяжении менее шести месяцев) аутоантителами)). Эти сыворотки до проведения курса лечения имели статистически большую среднюю концентрацию IL-21, чем контрольная группа; однако, это наблюдение полностью объяснялось высокими уровнями IL-21 у этих пациентов, у которых впоследствие развился вторичный аутоиммунитет. Наблюдалась высокозначимая разница среднего значения уровней IL-21 до проведения курса лечения между пациентами, у которых впоследствии развился аутоиммунитет (464 пг/мл), и теми, у кого он не развился (229 пг/мл; р=0,0002) (Фиг.6Б).
Взаимосвязь между индуцированной лимфопенией и аутоиммунитетом наблюдалась на животных моделях. В лимфоцитопеничных условиях оставшиеся Т-клетки осуществляют обширную компенсаторную экспансию для восстановления иммунной системы. Этот процесс, называемый гомеостатической пролиферацией, основан на стимулировании посредством комплекса TCR-(аутологичный пептид)-МНС (Ge et al., P.N.A.S. 101, 3041-3046 (2004); Ge et al., P.N.A.S. 98, 1728-1733 (2001); Kassiotis et al., J Exp. Med. 197, 1007-1016 (2003)) и приводит к популяции, склонной к повышенному распознаванию аутоантигена, как видно из наших исследований. Кроме того, быстро размножающиеся Т-клетки приобретают фенотип и функциональные характеристики клеток памяти, включая пониженную зависимость от ко-стимулирования, способность реагировать на более низкие дозы антигена, чем "необученные" (naїve) клетки, и быструю секрецию воспалительных цитокинов при рестимуляции, тем самым дополнительно промотируя разрушение аутотолерантности (Cho et al., J Exp. Med. 192, 549-556 (2000); Goldrath et al. J Exp. Med. 192, 557-564 (2000); Murali-Krishna et al., J Immunol 165, 1733-1737 (2000); Wu et al., Nat Med. 10, 87-92 (2004)). При этом, несмотря на такие изменения, аутоиммунитет не является неизбежным следствием лимфопении. Действительно, как в случае наших пациентов, у большинства лимфоцитопеничных особ аутоиммунитет не развивался, позволяя предположить, что требуются дополнительные "ко-факторы".
Мы продемонстрировали тут, впервые для человека, что перепроизводство IL-21 является "вторым толчком" (second hit), необходимым для развития вторичного аутоиммунитета после иначе успешного лечения рассеянного склероза агентом истощения лимфоцитов, таким как алемтузумаб. Наши исследования показали, что аутоиммунитет возникает у лимфоцитарно истощенных пациентов, с большим апоптозом Т-клеток и клеточным циклом, приводимым в действие генетически обусловленными более высокими уровнями IL-21, которые детектирутся даже перед проведением курса лечения. Даже до курса лечения, пациенты, у которых впоследствии развился вторичный аутоиммунитет, имели более чем в 2 раза большие уровни IL-21 сыворотки, чем неаутоиммунная группа, что позволяет предположить, что IL-21 сыворотки может служить биомаркером риска развития аутоиммунитета на протяжении периода времени от нескольких месяцев до нескольких лет после проведения курса лечения алемтузумабом. Без намерения ограничиваться какой-либо теорией, мы считаем, что путем чрезмерного ускорения циклов размножения и смерти Т-клеток IL-21 увеличивает вероятность развития аутореактивных Т-клеток и, следовательно, аутоиммунитета. Таким образом, цитокин-индуцированный аномальный Т-клеточный цикл является общим принципом лимфопения-ассоциированого аутоиммунитета.
Пример 8: Генотип IL-21 влияет на экспрессию IL-21 и ассоциирован с аутоиммунитетом
А. Генотипирование IL-21
В общем, было проведено тестирование четырех SNP, rs13151961, rs6822844, rs4833837 и rs6840978, которые находятся в области сильно неравновесного сцепления, содержащей четыре гена, KIAA1109-ADAD1-IL2-IL21, на хромосоме 4q27. Все четыре SNP доступны в виде продуктов Applied Biosystems Assay-On-Demand (AoD). Генотипирование SNP проводят с использованием методологии Applied Biosystems TaqMan в соответствии с рекомендуемыми производителем условиями. Полимеразная цепная реакция (PCR) выполнялась на машинах Applied Biosystems 384-well 9700 Viper PCR, после чего генотипы определялись системой детектирования последовательностей 7900 High Throughput Sequence Detection System (SDS) с использованием прикладной программы SDS Version 2.1. Генотипирование каждого пациента производили дважды. Всех особ дополнительно подвергали генотипированию на генетические факторы, ассоциированные с рассеянным склерозом: HLA-DRB1*1501, rs2104286 (IL2RA) andrs6897932 (IL7R).
В. Результаты
Для определения того, существует ли взаимосвязь между генетической изменчивостью и продуцированием IL-21, мы генотипировали 73 субъектов, для которых были определены концентрации IL-21 сыворотки до применения алемтузумаба, по четырем полиморфизмам одиночного нуклеотида (SNP), разложенным в блоке неравновесного сцепления (LD) на хромосоме 4q27, кодирующей ген IL-21. Частота минорной аллели для всех четырех SNP согласовывалась с опубликованными данными: rs13151961G (14,5%), rs6822844T (14,6%), rs4833837G (38,0%) и rs6840978T (18,1%) (Glas et al. Am. J. Gastroenterol. 104, 1737-1744 (2009)). Мы обнаружили, что генотип в 3 из 4 SNP (rs13151961 А/А, rs6822844 G/G и rs6840978 С/С) был ассоциирован со значительно более высокими уровнями IL-21 сыворотки (значения р: 0,0076, 0,0098 и 0,0067, соответственно). Генотип в rs4833837 не влиял на продуцирование IL-21. LD между rs4833837 и тремя другими SNP было низким (r<0,15), поэтому SNP, расположенный в гаплотипе rs13151961(A) - rs6822844(G) - rs6840978(C), наиболее вероятно ассоциирован с повышенным продуцированием IL-21. Частоты генотипов для HLA-DRB1*1501, rs2104286 (IL2RA) и rs6897932 (IL7R) не отличались от опубликованных данных для других неотобранных пациентов с рассеянным склерозом (International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC), Lancet Neurol. 7, 567-569 (2008); Yeo et al., Ann Neurol 61, 228-236 (2007)).
Наконец, для решения вопроса о том, влияет ли генотип на восприимчивость к аутоиммунитету после применения алемтузумаба, мы классифицировали как можно большее количество пациентов на тех, у которых развивался (27 субъектов) и определенно не развивался (23 субъектов) аутоиммунитет после применения алемтузумаба. 23 пациента не могли быть классифицированы вследствие преходящего характера продуцирования аутоантитела и/или недостаточного времени после применения алемтузумаба. Было обнаружено, что генотипы (rs13151961 A/A, rs6822844 G/G, rs6840978 С/С), которые, как было продемонстрировано, ассоциированы с более высокими концентрациями IL-21 сыворотки, также ассоциированы с аутоиммунитетом после применения алемтузумаба.