N-(2-БЕНЗОТИАЗОЛИЛ)АМИД 2-ГИДРОКСИ-4-ОКСО-4-(4-ХЛОРФЕНИЛ)-2-БУТЕНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОМИКРОБНОЙ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
N-(2-BENZOTHIAZOLYL)AMIDE 2-HYDROXY-4-OXO-4-(4-CHLOROPHENYL)-2-BUTENOIC ACID HAVING ANTIMICROBIAL AND ANTI-INFLAMMATORY ACTIVITY

Изобретение относится к области органической химии, к новым биологически активным веществам класса N-гетериламидов 4-арил-2,4-диоксобутановых кислот, а именно к N-(2-бензотиазолил)амиду 2-гидрокси-4-оксо-4-(4-хлорфенил)-2-бутеновой кислоты (1) формулы
обладающего противомикробной и противовоспалительной активностью, что позволяет предположить его использование в медицине в качестве лекарственного противомикробного и противовоспалительного средства. Ближайшим аналогом по структуре и действию заявляемому соединению является N-(2-тиазолил)амид 2-гидрокси-4-оксо-4-(4-хлорфенил)-2-бутеновой кислоты (2) [Андрейчиков Ю.С., Милютин А.В., Крылова И.В. и др. Синтез и биологическая активность гетериламидов ароилпировиноградных и 5-арилпиразол-3-карбоновых кислот // Хим.-фарм. журн. - 1990. - №7. - С.33-35]
Структурный аналог 2 не обладает противовоспалительной активностью. Данные по противомикробной активности структурного аналога 2 в литературе отсутствуют.
Эталонами сравнения выбраны следующие:
1) противомикробный препарат хлоргексидин [1,6-ди-(4-хлорфенилгуанидо)-гексан] (3), широко применяемый в лечебной практике и являющийся аналогом по действию [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Издательство Новая волна», 2005. - С.935-936];
2) противовоспалительный препарат диклофенак (натриевая соль 2-[(2,6-дихлорфенил)амино]фенилуксусной кислоты) (4), широко применяемый в лечебной практике и являющийся аналогом по действию [Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Издательство Новая волна», 2005. - С.170].
Задачей изобретения является поиск в ряду N-гетериламидов 4-арил-2,4-диоксобутановых кислот веществ с выраженным противомикробным и противовоспалительным действием и низкой токсичностью.
Поставленная задача достигается получением N-(2-бензотиазолил)амида 2-гидрокси-4-оксо-4-(4-хлорфенил)-2-бутеновой кислоты (1), обладающего противомикробной и противовоспалительной активностью.
Заявляемое соединение 1 синтезируют взаимодействием 5-(4-хлорфенил)-2,3-дигидрофуран-2,3-диона с 2-аминобензотиазолом при эквимолярном соотношении реагентов в среде безводного хлороформа при комнатной температуре с последующим выделением целевого продукта известными методами по схеме
17
11
2
3
Пример 1 получения соединения 1. К раствору 2,09 г (0,01 моль) 5-(4-хлорфенил)-2,3-дигидрофуран-2,3-диона в 30 мл безводного хлороформа прибавляют раствор 1,50 г (0,01 моль) 2-аминобензотиазола в 20 мл безводного хлороформа, выдерживают при комнатной температуре 24 часа. Реакционную смесь охлаждают до 0°С, выпавший осадок отфильтровывают, перекристаллизовывают из толуола и высушивают. Выход 3,4 г (95%). Т.пл. 210-212°С. Найдено, %: С 57.08; Н 3.12; N 7.92. CHClNOS. Вычислено, %: С 56.91; Н 3.09; N 7.81.
-1
4
1
6
6
5
6
4
ИК-спектр (Specord М80, вазелиновое масло, v, см): 3280 (NH), 1710 (CONH), 1640, 1610 (С=O, С=С, C=N). Спектр ЯМР Н (Bruker DRX 500, ДМСО-d, ГМДС, δ, м.д.): 7.22 с (1H, СН), 7.33-7.99 м (10Н, СН, СН) NH).
Заявляемое соединение 1 представляет собой желтое кристаллическое вещество, растворимое в толуоле, диоксане, диметилсульфоксиде, нерастворимое в воде и алканах.
Определение бактериостатической активности проводили методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Фисенко В.П. (ред.). - М.: ИИА Ремедиум, 2000. - С.264-273]. Для всех исследуемых соединений были определены МПК в отношении фармакопейных штаммов: S.aureus АТСС 6538-Р и E.coli АТСС 25922. Результаты испытаний представлены в таблице 1. Посевы производили в мясопептонный бульон, рН 7,0, с различной концентрацией испытуемых соединений. Культуры выращивали в пробирках на скошенной агаризированной среде (мясопептонный агар). Для определения противомикробной активности использовалась 18-20-часовая культура. Для приготовления рабочей взвеси микробов производили смыв выросшей культуры изотоническим раствором натрия хлорида и устанавливали плотность микробной взвеси по стандарту мутности 5 единиц. Далее из полученной микробной взвеси (500 млн. м.т./мл) готовили рабочий раствор бактерий с концентрацией 5 млн. м.т./мл. Данную взвесь микробов вносили в количестве 0,1 мл в пробирки с серийными разведениями изучаемого препарата. Таким образом, микробная нагрузка при определении ПМА составила 250000 м.т./мл. Изучаемое соединение в количестве 0,05 г растворяли в 5 мл диметилформамида; 1 мл полученного разведения 1:100 соединяли с 4 мл мясопептонного бульона (1:500). Далее готовили ряд серийных разведений соединения с двукратно уменьшающей концентрацией. Учет результатов производили через 18-20 часов выдержки контрольных и опытных пробирок в термостате при температуре 37°С. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) устанавливали по отсутствию признаков роста на питательной среде: последняя пробирка с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует МПК препарата в отношении данного штамма. Бактериостатический эффект исследуемых соединений сравнивали с действием хлоргексидина.
Противовоспалительная активность изучена в опытах на 30 белых беспородных крысах обоего пола массой 220-260 г. Соединение 1 вводили перорально в дозе 50 мг/кг в виде взвеси в 2% крахмальном растворе за час до моделирования острого каррагенинового воспаления. Каррагениновый отек вызывали субплантарной инъекцией 0.1 мл 1% раствора флогогена в заднюю лапу крысы. О противовоспалительной активности судили по изменению выраженности воспаления в динамике, которое регистрировали онкометрически через 1, 3 и 5 часов после моделирования воспаления [Методические рекомендации по экспериментальному изучению нестероидных противовоспалительных веществ/ Фармакологический комитет МЗ СССР, протокол №22 от 11 ноября 1982. - Москва, 1982. - 47 с.]. Контрольным животным вводили эквиобъемное количество 2% крахмального раствора. Препаратом сравнения служил диклофенак в дозе 10 мг/кг. Результаты обработаны статистически с помощью программы Excel 2003 и представлены в таблице 2.
50
50
Острую токсичность (ЛД) заявляемого соединения 1 определяли на 24 белых беспородных мышах обоего пола массой 18-22 г при пероральном пути введения в виде взвеси в 2% крахмальном растворе по экспресс-методу В.Б.Прозоровского [Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки. // Фармакология и токсикология. - 1978. - №4. - С.497-502]. Установлено, что ЛД соединения 1 составляет 5800 мг/кг. Согласно классификации токсичности препаратов соединение 1 относится к классу практически нетоксичных веществ [Измеров И.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов. - М.: Медицина, 1977. - С.196-197]. Оно в 1,45 раз менее токсично, чем хлоргексидин, и 7,44 раза менее токсично, чем диклофенак.
Таблица 1
Противомикробная активность и острая токсичность соединения 1
Соединение
ЛД<sub>50</sub>, мг/кг
МПК, мкг/мл
МПК/ЛД<sub>50</sub>
St.aureus
Е.coli
St.aureus
Е.coli
1
5800
2,0
3,9
0,0003
0,0007
Хлоргексидин
4000
125
125
0,0313
0,0313
50
Как видно из таблицы 1, соединение 1 превышает по противомикробной активности хлоргексидин по отношению к золотистому стафилококку в 62,5 раза и к кишечной палочке - в 32 раза. Отношение МПК (мкг/мл) к токсичности ЛД (мг/кг) у соединения 1 составляет для стафилококка 0,0003 и для кишечной палочки 0,0007, в то время как у хлоргексидина эти показатели значительно уступают.
Таблица 2
Противовоспалительная активность и острая токсичность соединения 1
Соединение
Доза, мг/кг
ЛД<sub>50</sub>, мг/кг
% торможения каррагенинового отека
1 час
3 часа
5 часов
Контроль
-
-
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
1
50
5800
39,7±2,1<sup>**1</sup>
64,2±3,2<sup>***1</sup>
56,4±3,3<sup>***1</sup>
<sup>*2</sup>
<sup>*2</sup>
Диклофенак
10
780
40,2±4,8
65,6±4,3<sup>***1</sup>
60,1±4,7<sup>***1</sup>
*=р<0,05, <sup>**</sup>=р<0,01, <sup>***</sup>=p<0,001.
1 - по сравнению с контролем; 2 - по сравнению с диклофенаком.
50
50
Как видно из таблицы 2, соединение 1 проявило выраженную противовоспалительную активность в течение всего периода наблюдения, а на пике воспаления оно практически не уступает диклофенаку. Необходимо отметить, что эффективная доза диклофенака составляет 0,013 от его ЛД, а у заявляемого соединения 0,008 от его ЛД, что свидетельствует об определенных преимуществах соединения 1 перед диклофенаком в плане его безопасности и эффективности.
Таким образом, N-(2-бензотиазолил)амид 2-гидрокси-4-оксо-4-(4-хлорфенил)-2-бутеновой кислоты (1) проявляет более высокую противомикробную и противовоспалительную активность по сравнению со структурным аналогом и эталонами сравнения, а также является практически нетоксичным, что делает возможным использование его для создания новых лекарственных средств, обладающих противомикробной и противовоспалительной активностью.
Литература
1. Андрейчиков Ю.С., Милютин А.В., Крылова И. В. и др. Синтез и биологическая активность гетериламидов ароилпировиноградных и 5-арилпиразол-3-карбоновых кислот // Хим.-фарм. журн. - 1990. - №7. - С.33-35.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства.- 15-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Издательство Новая волна», 2005. - С.170, 935-936.
3. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Фисенко В.П. (ред.). - М.: ИИА Ремедиум. - 2000. - С.264-273.
4. Методические рекомендации по экспериментальному изучению нестероидных противовоспалительных веществ / Фармакологический комитет МЗ СССР, протокол №22 от 11 ноября 1982. - Москва, 1982. - 47 с.
5. Прозоровский В.Б., Прозоровская М.П., Демченко В.М. Экспресс-метод определения средней эффективной дозы и ее ошибки. // Фармакология и токсикология. - 1978. - №4. - С.497-502.
6. Измеров И.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К. Параметры токсикометрии промышленных ядов. - М.: Медицина, 1977. - С.196-197.