Использование новых молекулярно-биологических методов в диагностике вирусных инфекций

Естественные и точные науки

• • •

37

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 578.825.1

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НОВЫХ М ОЛЕ КУЛЯ РНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ М ЕЮ ДО В В ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

©гою Адиева А.А., Меджидова М.Г.

Дагестанский государственный институт народного хозяйства

Разработан и впервые использован метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) - in situ для выявления герпесвирусных инфекций в отпечатках органов. Показано, что метод позволяет визуализировать единичные инфицированные клетки и оценить количество внутриклеточной вирусной ДНК, что особенно важно в изучении патогенеза инфекций, вызываемых ЦМВ (цитомегаловирус) и ВПГ (вирус простого герпеса).

The authors of the article developed and used for the first time the methods of PCR (Polymerase chain reaction) in situ to detect herpes viral infections in organ imprints. They showed that the method allows to visualize isolated infected cells and to estimate the amount of intracellular viral DNA, which is especially important in the study of the pathogenesis of infections caused by CMV (Cytomegalovirus) and HSV (Herpesvirus).

Ключевые слова: методы диагностики, вирусные инфекции, материалы аутопсии.

Keywords: diagnostic methods, viral infections, autopsy materials.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в последнее время в изучении молекулярно-

биологических свойств герпесвирусных инфекций (ГВИ), вызываемые ими инфекции остаются одной из наиболее острых проблем практического здравоохранения. Частая реактивация герпесвирусов из латентной формы не только резко снижает качество жизни инфицированного, но и приводит к развитию иммунодефицитных состояний и внутриутробному инфицированию плода [1, 3]. Прогресс в изучении ГВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий - высокочувствительных и

специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. Однако современные молекулярно-биологи-ческие и культуральные методы не используются в практическом здравоохранении для установления посмертного диагноза из-за дороговизны, а патологоанатомические исследования плодов и умерших новорожденных не позволяют установить этиологию врожденной инфекции [2, 4]. Поэтому разработка быстрого и точного метода исследования отпечатков органов представляется весьма актуальной задачей. Метод ПЦР in situ был разработан на основе двух методов - полимеразной цепной реакции и гибридизации in situ. Таким образом, он сочетает в себе их дос-

38

Известия ДГПУ, №2, 2010

тоинства: высокую чувствительность с возможностью морфологического исследования. Это позволяет визуализировать единичные инфицированные клетки, что особенно важно в изучении патогенеза инфекций, вызываемых ГВИ.

Материалы и методы

Работа проводилась на базе лаборатории клеточной инженерии института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (рук. лаб. д.б.н., профессор А. А. Кущ). В работе использованы клетки линии VERO и диплоидные фибробласты человека ФЛЭЧ. Для получения положительных контролей культуру клеток VERO заражали референс штаммом ВПГ 1 типа, для положительного контроля ФЛЭЧ-АЭ169 ЦМВ. В качестве контроля использовали не зараженные культуры клеток ФЛЭЧ и VERO. Препараты культур клеток готовили на стеклах с адгезивным покрытием (.Histobond).

Препараты фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 2 часов, промывали в буфере и затем на стекла наносили 0,01 % раствор Тритона Х-100. При приготовлении препаратов отпечатков органов фик-

• • •

сацию проводили в течение 4 часов. Далее препараты обрабатывали про-теиназой К. Разведение и время инкубации с протеиназой К были подобраны в результате предварительных опытов. Для культуры клеток оптимальное время обработки составило 5 минут, а для отпечатков органов -от 15 до 30 минут. На высушенные стекла наносили амплификационную смесь, препараты накрывали покровными стеклами и обрабатывали края вазелином для предотвращения испарения амплификационной смеси. Амплификацию проводили в ампли-фикаторе Biometra Thermocycler при оптимизированной температурной программе.

Для проверки специфичности сигнала в отношении ВПГ и ЦМВ использованы праймеры (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты синтетической природы, который служит стартовой точкой при репликации ДНК), меченные биотином и направленные к консервативному участку сверхраннего гена ЦМВ, и две пары праймеров, направленные к консервативному участку гена ДНК-полимеразы ВПГ 1,2 типов.

Естественные и точные науки

• • •

39

Г

Рис. 1. Окрашенные препараты инфицированных клеток VERO, полученные

с использованием двух различных праймеров: (А) праймеры 1; (Б) праймеры 2; (В) смесь праймеров 1 и 2; (Г) отрицательный контроль

Детекцию проводили с использованием комплекса биотин-стрептавидин-пероксидаза хрена (конъюгат) и красителем ДАБ (диа-минбензидин), продуцирующего в местах локализации ДНК Г метку коричневой окраски. Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. Учитывали относительную интенсивность окрашивания метки и подсчитывали количество клеток, содержащих метку и общее количество клеток на препарате. Контрастирование ядер проводилось гематоксилином Карацци.

Результаты

Предварительная серия экспериментов была посвящена сравнению эффективности использования двух различных праймеров для ВПГ. Использование праймеров в отдельности показало, что количество клеток, содержащих метку на зараженных препаратах, было приблизительно одинаковым и интенсивность окрашивания положительных клеток также не различалась. На рисунке 1 представлены препараты после проведения

ПЦР in situ двумя различными праймерами (А, Б). При использовании смеси двух праймеров наблюдалось более интенсивное окрашивание клеток и при подсчете количества меченых клеток их оказалось больше, чем при использовании одного праймера (рисунок 1 В). В качестве отрицательных контролей использовали препараты культуры клеток, не зараженные вирусом. При проведении ПЦР на препаратах отрицательных клеток в ПЦР смеси также были использованы различные праймеры и смесь двух праймеров.

Основной задачей работы было использование нового метода для выявления внутриутробной вирусной инфекции в материалах аутопсий мертворожденных детей и сравнение его эффективности с традиционными лабораторными методами. Для этого изучали частоту обнаружения ВПГ и ЦМВ в одних и тех же аутопсийных образцах. Результаты выявления ВПГ и ЦМВ четырьмя методами представлены в таблице 1.

Таблица 1

Сравнительный анализ выявления герпесвирусов различными лабораторными методами в материалах аутопсии (п=147) от мертворожденных

Методы Вирусы ПЦР ПЦР in situ РИФ Б КМ

ЦМВ 28

ВПГ 29

40

• • •

Известия ДГПУ, №2, 2010

Сравнительный анализ показал, что наиболее оптимальными для установления этиологического агента в данном материале являются методы, основанные на обнаружении ДНК. Метод ПЦР in situ обладает не меньшей чувствительностью по сравнению с классическим методом ПЦР, а его преимущество заключается в том, что данный метод позволяет не только обнаружить вирус в изучаемом органе и оценить интенсивность синтеза вирусной ДНК, но также выявить индивидуальную внутритканевую и внутриклеточную локализацию вирусов.

Параллельное гистологическое исследование плацент выявило ту или иную патологию в 100% случаев. ДНК ЦМВ в плаценте выявлена в 56% случаев, ВПГ в 43%, тогда как в плаценте от живорожденных детей ДНК ЦМВ выявлена в 1 случае (3,2%), ВПГ ни в одном. Совпадение одних и тех же возбудителей при параллельном вирусологическом ис-

следовании отпечатков органов и плацент составило 82%.

Выявлению ГВИ в плаценте посвящено небольшое количество работ [5, 6, 7]. При исследовании парафиновых срезов плацент 62 мертворожденных Syridou с соавторами ГВИ были выявлены в несколько меньшем проценте случаев - 21% (ЦМВ - в 16%, ВПГ 1,2 типов - в 5%). В контрольной группе (35 плацент от детей, рожденных в срок) суммарно ВПГ и ЦМВ были обнаружены в 6% [7].

При анализе частоты обнаружения ДНК ГВИ в аутопсийном материале методами ПЦР и ПЦР in situ оказалось, что методом ПЦР ДНК ГВИ была обнаружена в 27 (22,7%) образцах, а методом ПЦР in situ - в 31 (26,1%) образце. Статистически значимых различий в частоте выявления ДНК вируса двумя методами не обнаружено. Частота совпадений результатов ПЦР и ПЦР in situ представлена в таблице 2.

Таблица 2

Частота совпадений при выявлении ДНК герпесвирусных инфекций методами ПЦР и ПЦР in situ

Методы Кол-во проб (п) Совпадения Несовпадения

ПЦР+ПЦР in situ+ ПЦР-ПЦР in situ - Итого ПЦР+ПЦР in situ - ПЦР-ПЦР in situ + Итого

п=119 21

Совпадения положительных и отрицательных результатов наблюдалось в 86,6% случаев. Несовпадение результатов ПЦР и ПЦР in situ наблюдалось в 13,4% случаев. Анализ данных ПЦР при несовпадении результатов показал, что в положительных по результатам ПЦР и отрицательных по ПЦР in situ интенсивность свечения полосы в агарозном геле была минимальная и не превышала при визуальном наблюдении 12 крестов, что свидетельствует о присутствии в пробе минимального количества ДНК.

При анализе положительных результатов, полученных методом ПЦР in situ, которые не совпали с результатами ПЦР, наблюдалась схожая тенденция, при подсчете меченых клеток количество не превышало 50 клеток на препарате, что также указывает на наличие небольшого количества ДНК в образце. Можно заклю-

чить, что несовпадение результатов ПЦР и ПЦР in situ объясняется низким содержанием ДНК в исследуемых материалах.

Совпадение по положительным результатам ПЦР и ПЦР in situ наблюдалось при исследовании 21 (17,7%) образца. При сравнении данных ПЦР in situ (количество подсчитанных положительных клеток) и результатов ПЦР (интенсивность свечения полосы в агарозном геле) была установлена прямая зависимость.

Было показано, что интенсивность свечения полосы на 1-2 крестах соответствовала 40-200 клеткам на препарате, среднее количество составило 95 клеток. При максимальной интенсивности свечения полосы, которое условно обозначили 3-4 креста, количество положительных клеток на препарате составило от 270 до 600 клеток, среднее количе-

Естественные и точные науки • • •

41

ство клеток было равно 421 клетке. Анализ количества инфицированных клеток в препаратах методом ПЦР in situ показал, что наиболее интенсивно накопление ДНК герпесвирусов происходит в тканях мозга и почек.

Таким образом, использование современного молекулярно-

биологического метода ПЦР для выявления герпесвирусных инфекций в ау-

топсийном материале позволяет найти вероятное этиологическое объяснение причин фетоинфантильных потерь и врожденных дефектов. Разработка метода ПЦР in situ позволяет обнаруживать инфекционный агент непосредственно в клетках любых органов и тем самым расширяет возможности диагностики ВУИ.

Примечания

1. Володин Н. Н. Перинатология. Исторические вехи, перспективы развития (Актовая речь, подготовленная в связи с 100-летием Российского государственного медицинского университета) // Вопросы практической педиатрии. 2006. T. 1. №3. С. 5-24. 2. Володин Н. Н., Дегтярев Д. Н. Методологические аспекты лабораторной диагностики внутриутробных инфекций у детей // Клиническая лабораторная диагностика. 2003. № 3. С. 7-10. 3. Гаджиева 3. С., Адиева А. А., Климова Р. Р., Кущ А. А. Сравнительный анализ маркеров герпесвирусных инфекций у недоношенных новорожденных детей с клиническими признаками внутриутробной инфекции // Герпес. 2009. № 3. С. 19-23. 4. Нисевич Л. Л., Талалаев А. Г., Каск Л. Н., Парсегова Т. С., Туманова Е. Л., Миронюк О. В., Кущ А. А. Значение врожденных вирусных инфекций как причины перинатальной и младенческой смертности // Вопросы современной педиатрии. 2005. Т. 4. N° 2. С. 19-25. 5. Paradowska Е., Prezikevich М., Nowakowska D. Detection of cytomegalovirus in human placental cells by polymerase chain reaction // APMIS. 2006. V. 114. № 11. P. 764-771. 6. Sinzger C., Muntefering H., LoningT., Stoss H., Plachter B., Jahn G. Cell types infected in human cytomegalovirus placentitis identified by immunohistochemical double staining. // Pathol. Anat. Histopatol. 2001. V. 423. P. 249-256. 7. Syridou G., Spanakis N., Konstantinidou A. ET Pi-peraki, D Kafetzis, E Patsouris, A Antsaklis, A Tsakris. Detection of cytomegalovirus, parvovirus B19 and herpes simplex viruses in cases of intrauterine fetal death: association with pathological findings // J. Med. Virol. 2008. V. 80. № 10. P. 1776-1782.

УДК 630*892

Статья поступила в редакцию 22.04.2010 г.

АНАЛИЗ ФЛОРЫ БУКОВЫХ ЛЕСОВ ДАГЕСТАНА

©2010 Алиев Х.У., Муртазалиев Р.А.

Горный ботанический сад ДНЦ РАН

В статье приведены результаты сравнительного таксономического, географического и биоморфологического анализов флоры буковых лесов, представленные изолированными участками в Предгорном и Высокогорном Дагестане. Представлены основные отличительные черты видового состава буковых лесов.

The authors of the article give the results of the comparative, taxonomical, geographical and biomorphological analyses of the flora of Beechen woods, represented by some isolated districts in the foothills and highlands of Dagestan. The principal distinguishing features of the species composition of Beechen woods are represented.

Ключевые слова: анализ флоры, географические элементы, жизненные формы.

Keywords: floral analysis, geographical elements, life forms.