ПОЛИПЕПТИДЫ ИЗ NEISSERIA MENINGITIDIS
NEISSERIA MENINGITIDIS POLYPEPTIDES

Все цитируемые в настоящем описании документы полностью включены в него посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Neisseria meningitidis
Это изобретение относится к области исследований .
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Neisseria meningitidis
(менингококк) является неподвижным грамотрицательным диплококком, патогенным для людей. Эти бактерии колонизируют зев и вызывают менингит (и, иногда, септицемию в отсутствие менингита).
Все патогенные менингококки имеют полисахаридную капсулу. Эти полисахариды лежат в основе имеющихся вакцин против серогрупп менингококка - A, C, W135 и Y, но эти вакцины не подходят для применения против серогруппы В. Поэтому важной задачей исследователей является идентификация альтернативных антигенов для иммунизации против менингококков серогруппы В. Такими альтернативными антигенами являются белки, липополисахариды и везикулы внешней мембраны.
В ссылках 1-7 раскрыты различные полипептиды, полученные из последовательности генома менингококка серогруппы В, и в этих ссылках выбраны определенные последовательности для использования в вакцинах. Последовательность генома для штамма серогруппы А раскрыта в ссылке 8.
Задачей изобретения является предоставление дополнительных полипептидов для применения в разработке вакцин для профилактики и/или лечения менингококковых инфекций. В частности, задачей изобретения является предоставление полипептидов для применения в усовершенствованных вакцинах для профилактики и/или лечения менингококкового менингита. Пептиды также можно применять в диагностике и использовать в качестве мишеней действия антибиотиков.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Полипептиды
nn
nn
nn
Изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотные последовательности менингококка, раскрытые в примерах. Эти аминокислотные последовательности в списке последовательностей имеют четные номера, начиная с SEQ ID NO 2 и до SEQ ID NO 78. Следовательно, всего приведено 39 аминокислотных последовательностей, названных B269_, в которых  является числом от 01 до 50 (одиннадцать номеров B269_ не имеет последовательности: 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, 10, 12 и 40). Две последовательности (В269_32 и B269_37) являются предпочтительными.
Изобретение также относится к полипептидам, содержащим аминокислотные последовательности, которые идентичны по последовательности с аминокислотными последовательностями менингококка, раскрытыми в примерах. В зависимости от конкретной последовательности, степень идентичности по последовательности, предпочтительно, составляет больше 50% (например, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше). Эти полипептиды включают гомологи, ортологи, аллельные варианты и функциональные мутанты. Обычно считается, что на функциональное сходство белков указывает идентичность 50% или больше между двумя полипептидными последовательностями. Для каждой конкретной последовательности (SEQ ID) степень идентичности по последовательности, предпочтительно, выше значений как в колонке (В), так и в колонке (А), в таблице II настоящего описания, и, более предпочтительно, выше всех значений в колонках (С), (В) и (А) для этой последовательности.
По сравнению с менингококковыми последовательностями из примеров эти полипептиды могут включать одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) консервативных аминокислотных замен, т.е. замен одной аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет родственную боковую цепь. В общем, кодируемые в геноме аминокислоты разделяют на четыре семейства: (1) кислые, а именно аспартат, глутамат; (2) основные, а именно лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные, а именно аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные, а именно глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Иногда в классификации фенилаланин, триптофан и тирозин объединяют как ароматические аминокислоты. Обычно замена одиночных аминокислот на другие внутри этих семейств существенно не влияет на биологическую активность. У этих полипептидов также могут присутствовать одна или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) одиночных аминокислотных делеций относительно менингококковых последовательностей из примеров. Полипептиды также могут включать одну или несколько (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и т.д.) вставок (например, каждая вставка из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) относительно менингококковых последовательностей из примеров.
n
n
Кроме того, изобретение относится к полипептидам, содержащим фрагменты менингококковых аминокислотных последовательностей, раскрытых в примерах. Фрагменты должны включать, по меньшей мере,  последовательных аминокислот из последовательностей, и, в зависимости от конкретной последовательности,  равно 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или больше).
Фрагмент может содержать, по меньшей мере, один Т-клеточный или, предпочтительно, В-клеточный эпитоп из последовательности. Т- и В-клеточные эпитопы могут быть идентифицированы эмпирически (например, с использованием PEPSCAN [9,10] или аналогичных способов) или их можно предсказать (например, с использованием антигенного индекса Джеймсона-Вулфа [11], подходов на основе матриц [12], TEPITOPE [13], нейронных сетей [14], OptiMer & EpiMer [15, 16], ADEPT [17], Tsites [18], гидрофильности [19], антигенного индекса [20] или способов, которые раскрыты в ссылке 21, и т.д.). Другими предпочтительными фрагментами являются (а) N-концевые сигнальные пептиды менингококковых полипептидов по изобретению, (б) менингококковые полипептиды, но без N-концевых сигнальных пептидов, (с) менингококковые полипептиды, но без их N-концевого аминокислотного остатка.
in vitro
in vitro
in vivo
Полипептиды по изобретению можно получить многими способами, например химическим синтезом (полностью или частично), расщеплением более длинных пептидов протеазами, трансляцией с РНК, очисткой из клеточной культуры (например, из рекомбинантной экспрессирующей культуры), из самого организма (например, после бактериальной культуры или напрямую из организма пациентов) и т.д. Предпочтительный способ получения пептидов меньше 40 аминокислот в длину включает химический синтез  [22, 23]. Особенно предпочтительным является твердофазный пептидный синтез, например, методики которого основаны на применении реакций с использованием tBoc или Fmoc [24]. Также можно использовать ферментативный синтез [25], частично или полностью. В качестве альтернативы химическому синтезу можно использовать биологический синтез, например полипептиды можно получить трансляцией. Трансляцию можно проводить  или . Биологические способы обычно ограничены продукцией полипетидов, состоящих из L-аминокислот, но можно использовать манипуляции с механизмом трансляции (например, аминоацил-тРНК молекулами), для того чтобы включать D-аминокислоты (или другие неприродные аминокислоты, такие как йодотирозин или метилфенилаланин, азидогомоаланин и т.д.) [26]. Однако для включения D-аминокислот предпочтительно использовать химический синтез. Полипептиды по изобретению могут иметь ковалентные модификации на С-конце и/или N-конце.
Полипептиды по изобретению могут принимать различные формы (например, белок может быть нативным, слитым, гликозилированным, негликозилированным, модифицированным липидами, немодифицированным липидами, фосфорилированным, нефосфорилированным, миристоилированным, немиристоилированным, мономерным, мультимерным, дисперсным, денатурированным и т.д.).
Предпочтительно, чтобы полипептиды по изобретению были предоставлены в очищенной или по существу очищенной форме, т.е. по существу свободные от других полипептидов (например, свободные от природных полипептидов), в частности от других менингококковых полипептидов или полипептидов клетки-хозяина; и чистота которых, в общем, была, по меньшей мере, примерно 50% (по весу), и обычно, по меньшей мере, примерно 90%, т.е. меньше примерно 50% и, более предпочтительно, меньше примерно 10% (например, 5%) композиции составляли другие экспрессированные полипептиды. Предпочтительными полипептидами по изобретению являются менингококковые полипептиды. Предпочтительно, чтобы полипептиды по изобретению имели функцию, которая указана в таблице I для соответствующей последовательности.
Полипептиды по изобретению можно прикрепить к твердой подложке. Полипептиды по изобретению могут включать в себя детектируемую метку (например, радиоактивную или флуоресцентную метку, или биотиновую метку).
Термин «полипептид» относится к аминокислотным полимерам любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, а в его пептидной последовательности могут быть вставки соединений, не являющихся аминокислотами. Термин также охватывает аминокислотный полимер, модифицированный в природе или по изобретению; например, в результате образования дисульфидной связи, гликозилирования, присоединения липидов, ацетилирования, фосфорилирования или другой манипуляции или модификации, таких как конъюгирование с несущим метку компонентом. Также в определение включены, например, полипептиды, которые содержат один или несколько аминокислотных аналогов (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Полипептиды могут присутствовать в виде одиночных цепей или в виде ассоциированных цепей. Полипептиды по изобретению могут быть природно гликозилированными или искусственным образом гликозилированными (т.е. в полипептиде расположение участков гликозилирования отличается от расположения участков гликозилирования в соответствующем природном полипептиде).
Изобретение относится к полипептидам, содержащим последовательность -X-Y- или -Y-X-, в которой -X- представляет собой аминокислотную последовательность, определенную выше, а -Y- не является определенной выше последовательностью, т.е. изобретение относится к слитым белкам. Если в кодирующей полипептид последовательности N-концевым кодоном не является ATG, тогда этот кодон будет транслироваться как стандартная аминокислота этого кодона вместо Met, если этот кодон будет стартовым кодоном.
Изобретение относится к способу получения полипептидов по изобретению, включающему в себя стадию культивирования клеток-хозяев по изобретению при условиях, индуцирующих экспрессию полипептида.
Изобретение относится к способу получения полипептида по изобретению, в котором синтез полипептида частично или полностью осуществляется химическими методами.
Изобретение относится к композиции, включающей в себя два или несколько полипептидов по изобретению.
2
n
2
1
1
2
2
2
1
2
2
1
1
2
2
1
2
2
n
n
n
n
n
x
x
n
n
n-
-X-
n-
n
n
n
n
Изобретение также относится к гибридному полипептиду, представленному формулой NH-A-[-X-L-]-B-COOH, в которой X представляет собой полипептид, определенный выше, L является необязательной линкерной аминокислотной последовательностью, А является необязательной N-концевой аминокислотной последовательностью, В является необязательной С-концевой аминокислотной последовательностью, а  является целым числом больше единицы. Значение  находится между 2 и , а значение  обычно равно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Предпочтительно,  равно 2, 3 или 4; более предпочтительно - 2 или 3; наиболее предпочтительно, -2. Для каждого звена последовательность может быть одинаковой или разной. Для каждого звена [-X-L-] линкерная аминокислотная последовательность -L- может присутствовать или отсутствовать. Например, когда =2 гибрид может представлять собой NH-X-L-X-L-COOH, NH-X-X-COOH, NH-X-L-X-COOH, NH-X-X-L-COOH и т.д. Линкерная аминокислотная последовательность (линкерные аминокислотные последовательности) -L- обычно будут короткими (например, 20 или меньше аминокислот, а именно 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование, полиглициновые линкеры (т.е. Gly, где  = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше) и гистидиновые таги (т.е. His, где =3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше). Другие подходящие линкерные аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области. -A- и -B- являются необязательными последовательностями, которые обычно будут короткими (например, 40 или меньше аминокислот, а именно 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности, которые направляют трафик полипептидов, или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновые таги, а именно His, где  = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше). Другие подходящие N-концевые и С-концевые аминокислотные последовательности будут очевидны для специалистов в данной области.
in vivo
Для оценки иммуногенности полипептидов по изобретению  можно применять различные тесты. Например, можно получить рекомбинантные полипептиды с помощью экспрессии и использовать их для скрининга сыворотки пациентов с помощью иммуноблоттинга. Положительная реакция сыворотки пациента и полипептида указывает на то, что у пациента ранее выработался иммунный ответ на тестируемый белок, т.е. белок является иммуногеном. Этот способ также можно использовать для идентификации иммунодоминатных белков.
Антитела
Изобретение относится к антителам, которые связывают полипептиды по изобретению. Они могут быть поликлональными или моноклональными, и их можно получать любыми соответствующими средствами (т.е. рекомбинантной экспрессией). Для увеличения совместимости с иммунной системой человека антитела могут быть химерными или гуманизированными (смотри, например, ссылки 27 и 28) или можно использовать антитела человека. Антитела могут включать детектируемую метку (например, антитела для способов диагностики). Антитела по изобретению можно прикрепить к твердой подложке. Предпочтительными антителами по изобретению являются нейтрализующие антитела.
В частности, моноклональные антитела пригодны для идентификации и очистки индивидуальных полипептидов, против которых они направлены. Моноклональные антитела по изобретению можно использовать в качестве реагентов в иммунных методах анализа, радиоиммунных методах анализа (RIA) или твердофазном иммуноферментном методе анализа (ELISA) и т.д. В этих приложениях антитела можно пометить аналитически детектируемым реагентом, таким как радиоактивный изотоп, флуоресцентная молекула или фермент. Моноклональные антитела, полученные вышеуказанным способом, также можно применять для молекулярной идентификации и характеристики (эпитопного картирования) полипептидов по изобретению.
Предпочтительно, чтобы антитела по изобретению были очищенными или по существу очищенными. Обычно, антитело будет присутствовать в композиции, которая будет по существу свободна от других полипептидов, например, когда менее 90% (по весу), обычно, менее 60% или, наиболее часто, менее 50% композиции состоит из других полипептидов.
Антитела по изобретению могут принадлежать к любому изотипу (например, IgA, IgG, IgM, т.е. тяжелые цепи α, γ или µ), но, как правило, являются IgG. В рамках изотипа IgG антитела могут быть подклассов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Антитела по изобретению могут иметь легкую цепь κ или λ.
Но обычно будут являться IgG. В изотипе IgG антитела могут принадлежать к IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 подклассам. Антитела по изобретению.
Антитела по изобретению могут иметь различную форму, включая целые антитела, фрагменты антител, такие как F(ab')2- и F(ab)-фрагменты, Fv-фрагменты (нековалентные гетеродимеры), одноцепочечные антитела, такие как одноцепочечные Fv-молекулы (scFv), миниантитела, олигоантитела и т.д. Термин «антитело» не подразумевает конкретного источника происхождения и включает антитела, полученные нестандартными способами, такими как фаговый дисплей.
Изобретение относится к способу детекции полипептидов по изобретению, включающему в себя стадии: (а) стадию контактирования антитела по изобретению с биологическим образом при условиях, подходящих для образования комплексов антиген-антитело; и (б) стадию детекции указанных комплексов.
Изобретение относится к способу детекции полипептидов по изобретению, включающему в себя стадии: (а) стадию контактирования антитела по изобретению с биологическим образом (например, образцом крови или сыворотки) при условиях, подходящих для образования комплексов антиген-антитело; и (б) стадию детекции указанных комплексов.
Нуклеиновые кислоты
Изобретение относится к нуклеиновой кислоте, включающей нуклеотидные последовательности менингококка, раскрытые в примерах. Эти нуклеотидные последовательности являются SEQ ID NO с нечетными номерами от 1 до 77.
Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидные последовательности, гомологичные менингококковым нуклеотидным последовательностям, раскрытым в примерах.
Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая может гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, раскрытой в примерах. Гибридизацию можно проводить при условиях с различной степенью «жесткости». Увеличивающие жесткость гибридизации условия широко известны и опубликованы в литературе [например, смотри стр. 7.52 в ссылке 29]. Примеры соответствующих условий включают (в порядке усиления жесткости): температуры инкубации 25°C, 37°C, 50°C, 55°C и 68°C; концентрации буфера 10 × SSC, 6 × SSC, 1 × SSC, 0,1 × SSC (где SSC представляет собой 0,15 M NaCl и 15 мМ цитратный буфер) и их эквиваленты при использовании других буферных систем; концентрации формамида 0%, 25%, 50% и 75%; время инкубации от 5 минут до 24 часов; 1, 2 или более стадий отмывки; и отмывающие растворы 6 × SSC, 1 × SSC, 0,1 × SSC или деионизированная вода. Методики гибридизации и их оптимизация хорошо известны в данной области [например, смотри ссылки 29-32 и т.д.].
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота по изобретению гибридизуется с мишенью по изобретению при мягких условиях гибридизации; в других вариантах осуществления изобретения она гибридизуется при средних условиях гибридизации; в предпочтительных вариантах осуществления изобретения она гибридизуется при жестких условиях. Примером мягких условий гибридизации являются 50°С и 10 × SSC. Примером средних условий гибридизации являются 55°С и 1 × SSC. Примером жестких условий гибридизации являются 68°С и 0,1 × SSC.
n
n
Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, содержащей фрагменты этих последовательностей. Они должны содержать, по меньшей мере,  последовательных нуклеотидов из менингококковых последовательностей и, в зависимости от конкретной последовательности,  равно 10 или больше (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 или больше).
x
z
Изобретение относится к нуклеиновой кислоте с формулой 5'-X-Y-Z-3', в которой -X- является нуклеотидной последовательностью, состоящей из  нуклеотидов; -Z- является нуклеотидной последовательностью, состоящей из  нуклеотидов; -Y- является нуклеотидной последовательностью, состоящей из: или (a) фрагмента одной из SEQ ID NO с нечетным номером от 1 до 77, или (б) последовательности, комплементарной (а); причем указанная нуклеиновая кислота 5'-X-Y-Z-3' не является ни (i) фрагментом одной из SEQ ID NO с нечетным номером от 1 до 77, ни (ii) последовательностью, комплементарной (i). Элементы -X- и/или -Z- могут включать в себя промоторную последовательность (или комплементарную ей последовательность).
Также изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептиды и фрагменты полипептидов по изобретению.
Изобретение включает нуклеиновую кислоту, содержащую последовательности, комплементарные последовательностям, раскрытым в списке последовательностей (например, для использования в качестве антисмысловых последовательностей или в качестве проб, или для использования в качестве праймеров), а также последовательности, в фактически приведенной ориентации.
Нуклеиновые кислоты по изобретению можно использовать в реакциях гибридизации (например, в методиках Нозерн и Саузерн блоттинга, или в микроматрицах нуклеиновых кислот, или «генных чипах») и в реакциях амплификации (например, ПЦР (полимеразная цепная реакция), SDA (амплификация замещением цепей), SSSR (самоподдерживающаяся амплификация последовательности), LCR (лигазная цепная реакция), TMA (транскрипционная амплификация), NASBA (амплификация на основе нуклеотидной последовательности) и т.д.) и в других методиках нуклеиновых кислот.
Нуклеиновая кислота по изобретению может находится в любой форме (например, одноцепочечной, двухцепочечной, в виде вектора, праймеров, проб, меченной форме и т.д.). Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть кольцевыми или разветвленными, но, обычно, бывают линейными. Если не указано или не требуется иное, в любом варианте осуществления изобретения, в котором используется нуклеиновая кислота, ее можно использовать как в двухцепочечной форме, так и каждую из комплементарных одноцепочечных форм, которые образуют двухцепочечную форму. Обычно праймеры и пробы являются одноцепочечными, поскольку они являются антисмысловыми нуклеиновыми кислотами.
Haemophilus
H. meningitidis
Предпочтительно, чтобы нуклеиновые кислоты по изобретению были предоставлены в очищенной или по существу очищенной форме, т.е. по существу свободные от других нуклеиновых кислот (например, свободные от других природных нуклеиновых кислот), в частности от других нуклеиновых кислот  или клеток-хозяев, в общем чистота нуклеиновых кислот по изобретению составляет, по меньшей мере, примерно 50% (по весу), а обычно, по меньшей мере, примерно 90%. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами по изобретению являются нуклеиновые кислоты .
Нуклеиновые кислоты по изобретению можно получить множеством способов, например химическим синтезом (например, фосфороамидитным синтезом ДНК) полностью или частично, расщеплением более длинных нуклеиновых кислот с использованием нуклеаз (например, ферментов рестрикции), соединением более коротких нуклеиновых кислот или нуклеотидов (например, с использованием лигаз или полимераз), из геномных или кДНК-библиотек и т.д.
Можно прикрепить нуклеиновую кислоту по изобретению к твердой подложке (например, шарику, пластине, фильтру, пленке, слайду, подложке, используемой в методике микроматриц, смоле и т.д.). Можно пометить нуклеиновую кислоту по изобретению, например, радиоактивной или флуоресцентной меткой, или биотиновой меткой. Мечение особенно полезно, когда нуклеиновую кислоту нужно использовать в методиках детекции, например если нуклеиновая кислота представляет собой праймер или пробу.
Термин «нуклеиновая кислота» в общем обозначает полимерную форму нуклеотидов любой длины, которые включают в себя дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и/или их аналоги. Он включает ДНК, РНК и гибриды ДНК/РНК. Этот термин также включает аналоги ДНК или РНК, такие как те, что содержат модифицированный каркас (например, пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) или фосфоротиоаты) или модифицированные основания. Следовательно, изобретение включает мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, ДНК, кДНК, рекомбинантные нуклеиновые кислоты, разветвленные нуклеиновые кислоты, плазмиды, векторы, пробы, праймеры и т.д. Если нуклеиновая кислота по изобретению представляет собой РНК, она может быть кэпирована на 5'-конце или нет.
Нуклеиновые кислоты по изобретению содержат менингококковые последовательности, определенные выше, но они могут также содержать неменингококковые последовательности (например, в нуклеиновых кислотах с формулой 5'-X-Y-Z-3', описанной выше). В частности, это применимо для праймеров, которые, поэтому, могут содержать первую последовательность, комплементарную нуклеиновой кислоте-мишени Neisseria, и вторую последовательность, которая не комплементарна нуклеиновой кислоте-мишени. Предпочтительно, чтобы любые такие некомплементарные последовательности в праймере были расположены в 5'-области от комплементарных последовательностей. Типичные некомплементарные последовательности содержат сайты рестрикции или промоторные последовательности.
Нуклеиновые кислоты по изобретению можно получить множеством способов, например химическим синтезом (по меньшей мере, частично), расщеплением более длинных нуклеиновых кислот с использованием нуклеаз (например, ферментов рестрикции), соединением более коротких нуклеиновых кислот (например, с использованием лигаз или полимераз), из геномных или кДНК-библиотек и т.д.
in vivo
in vitro
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть частью вектора, т.е. частью нуклеотидной конструкции, созданной для трансдукции/трансфекции одного или нескольких типов клеток. Векторы могут быть, например, «векторами для клонирования», созданными для выделения, амплификации и репликации встроенных нуклеотидов, «экспрессионными векторами», созданными для экспрессии нуклеотидной последовательности в клетке-хозяине, «вирусными векторами», созданными для получения рекомбинантных вирусов или вирусоподобных частиц, или «шаттл-векторами», которые включают в себя признаки более чем одного типа вектора. Предпочтительными векторами являются плазмиды. «Клетка-хозяин» включает отдельную клетку или клеточную культуру, которая может быть или является реципиентом экзогенной нуклеиновой кислоты. Клетки-хозяева включают потомство одной клетки-хозяина, и потомство не должно быть полностью идентично (морфологически или полностью совпадать по ДНК) с исходной родительской клеткой вследствие природной, случайной или специальной мутации и/или изменения. Клетки-хозяева включают клетки, трансфецированные или инфицированные  или  нуклеиновой кислотой по изобретению.
Если нуклеиновая кислота - это ДНК, то очевидно, что «U» в последовательности РНК будет заменен на «Т» в ДНК. Аналогичным образом, если нуклеиновой кислотой является РНК, очевидно, что «Т» в ДНК-последовательности будет заменен на «U» в РНК.
Термины «комплементарность» и «комплементарный» в отношении нуклеиновых кислот относится к образованию пар оснований по Уотсону-Крику. Поэтому основанием, комплементарным С, является G, основанием, комплементарным G, является С, основанием, комплементарным А, является Т (или U), а основанием, комплементарным Т (или U), является А. Также возможно использование оснований, таких как I (пуриновое основание инозин), например, для комплементарного связывания с пиримидинами (С или Т). Термины также подразумевают направление: последовательностью, комплементарной 5'-ACAGT-3', является 5'-ACTGT-3', а не 5'-TGTCA-3'.
Нуклеиновые кислоты по изобретению можно использовать, например, для получения полипептидов; в качестве гибридизационных проб для детекции нуклеиновых кислот в биологических образцах; для создания дополнительных копий нуклеиновых кислот; для создания рибозимов или антисмысловых олигонуклеотидов; в качестве одноцепочечных ДНК-праймеров или проб; или в качестве олигонуклеотидов, образующих тройные цепи.
Изобретение относится к способу получения нуклеиновой кислоты по изобретению, в котором нуклеиновую кислоту синтезируют частично или полностью химическими методами.
Изобретение относится к векторам, содержащим нуклеотидные последовательности по изобретению (например, векторы для клонирования или экспрессии), и к клетке-хозяину, трансформированной такими векторами.
Изобретение также относится к набору, содержащему праймеры (например, ПЦР-праймеры) для амплификации матричной последовательности, которую включает в себя менингококковая нуклеотидная последовательность, причем набор содержит первый праймер и второй праймер, в котором первый праймер по существу комплементарен указанной матричной последовательности, а второй праймер по существу комплементарен цепи, комплементарной указанной матричной последовательности, где части указанных праймеров, по существу комплементарные матрице, ограничивают концы амплифицируемой матричной последовательности. Первый праймер и/или второй праймер могут включать детектируемую метку (например, флуоресцентную метку).
Изобретение также относится к набору, включающему в себя первый и второй одноцепочечные олигонуклеотиды, которые позволяют амплифицировать матричную нуклеотидную последовательность менингококка, которая содержится в одноцепочечной или двухцепочечной нуклеиновой кислоте (или их смеси), в котором: (а) первый олигонуклеотид содержит последовательность праймера, который по существу комплементарен указанной матричной нуклеотидной последовательности; (б) второй олигонуклеотид содержит последовательность праймера, который по существу комплементарен последовательности, комплементарной указанной матричной нуклеотидной последовательности; (в) первый олигонуклеотид и/или второй олигонуклеотид содержат последовательность, которая некомплементарна указанной матричной нуклеиновой кислоте; и (г) указанные праймерные последовательности ограничивают концы амплифицируемой матричной последовательности. Предпочтительно, чтобы некомплементарная последовательность (некомплементарные последовательности) из признака (в) располагались выше (т.е. в 5'-области от) праймерных последовательностей. Одна или обе из этих (в) последовательностей могут содержать сайт рестрикции [например, как в ссылке 33] или промоторную последовательность [например, как в ссылке 34]. Первый олигонуклеотид и/или второй олигонуклеотид могут включать детектируемую метку (например, флуоресцентную метку).
Матричная последовательность может быть любой частью геномной последовательности.
Изобретение относится к способу детекции нуклеиновой кислоты по изобретению, включающему в себя стадии: (а) контактирования нуклеиновой пробы по изобретению с биологическим образом при условиях гибридизации для образования дуплексов; и (б) детекции указанных дуплексов.
Изобретение относится к способу детекции менингококка в биологическом образце (например, крови), включающему в себя стадию контактирования нуклеиновой кислоты по изобретению с биологическим образцом при условиях, подходящих для гибридизации. Процесс может включать амплификацию нуклеиновой кислоты (например, ПЦР, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA и т.д.) или гибридизацию (например, микроматриц, блотов, гибридизацию с пробой в растворе и т.д.).
Изобретение относится к способу получения фрагмента последовательности-мишени, в котором фрагмент получают удлинением нуклеотидного праймера. Последовательность-мишень и/или праймерная последовательность являются нуклеиновыми кислотами по изобретению. Реакция удлинения праймера может включать амплификацию нуклеиновой кислоты (например, ПЦР, SDA, SSSR, LCR, TMA, NASBA и т.д.).
Амплификация нуклеиновой кислоты по изобретению может быть количественной и/или проходить в реальном времени.
Для некоторых вариантов осуществления изобретения предпочтительная длина нуклеиновых кислот, по меньшей мере, составляет 7 нуклеотидов (например, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 нуклеотидов или больше).
Для некоторых вариантов осуществления изобретения предпочтительная длина нуклеиновых кислот, самое большее, составляет 500 нуклеотидов (например, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 нуклеотидов или меньше).
Предпочтительно, чтобы длина праймеров и проб по изобретению и других нуклеиновых кислот, используемых в гибридизации, находилась между 10 и 30 нуклеотидами (например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов).
Фармацевтические композиции
Изобретение относится к композициям, которые содержат (а) полипептид, антитело и/или нуклеиновую кислоту по изобретению и (б) фармацевтически приемлемый носитель. Например, эти композиции подходят для использования в качестве иммуногенных композиций, или в качестве диагностических реактивов, или в качестве вакцин. По изобретению вакцины могут быть или профилактическими (т.е. предотвращать инфекцию), или терапевтическими (т.е. лечить инфекцию), но вакцины, обычно, будут профилактическими.
Термин «фармацевтически приемлемые носители» включает любой носитель, который сам по себе не вызывает продукцию антител, вредных для индивидуума, который получает композицию. Подходящие носители обычно представляют собой большие, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, сахароза, трегалоза, лактоза и агрегаты липидов (такие как масляные капли или липосомы). Среднему специалисту в данной области хорошо известны такие носители. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин и т.д. Дополнительно могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, вещества, поддерживающие рН, и т.п. Типичным носителем является апирогенный, фосфатный физиологический раствор. Подробное описание фармацевтически приемлемых наполнителей приведено в ссылке 141.
Композиции по изобретению могут включать противомикробное соединение, в частности, если композиции находятся в многодозовой упаковке.
Композиции по изобретению могут содержать детергент, например Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Обычно, содержание присутствующих детергентов низкое, например < 0,01%.
Композиции по изобретению могут включать соли натрия (например, хлорид натрия), что обуславливает тоничность раствора. Типичная концентрация NaCl составляет 10±2 мг/мл.
Обычно, композиции по изобретению будут включать буферный раствор. Типичным буферным раствором является фосфатный буферный раствор.
Композиции по изобретению могут содержат сахарный спирт (например, маннит) или дисахарид (например, сахарозу или трегалозу), например, в концентрации примерно 15-30 мг/мл (например, 25 мг/мл), в частности, в том случае, когда композиции должны быть в лиофилизированном виде, или когда композиции включают материал, который был восстановлен из лиофилизированного материала. Для лиофилизации рН композиции можно подвести до примерно 6,1 до лиофилизации.
Полипептиды по изобретению можно вводить вместе с другими иммунорегуляторными агентами. В частности, композиции обычно будут включать адъювант. Адъюванты, которые можно использовать в композициях по изобретению, включают, но не ограничены этим, следующее.
А. Минеральные композиции
Минеральные композиции, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают минеральные соли, такие как соли алюминия и кальция. Изобретение включает минеральные соли, такие как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [например, смотри главы 8 и 9 из ссылки 35], или смеси различных минеральных соединений; причем форма соединения может быть любой (например, гелевой, кристаллической, аморфной и т.д.); а также предпочтительно, чтобы соединение обладало адсорбирующими свойствами. Содержащие минералы композиции могут также представлять собой состав из частиц солей металлов [36].
H.influenzae
4
3+
3+
Особенно предпочтительными соединениями являются фосфаты алюминия, в частности в композициях, которые включают сахарный антиген , а типичным адъювантом является аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным соотношением PO/Al от 0,84 до 0,92, включенный в концентрации 0,6mg Al/мл. Можно использовать адсорбцию с низкой дозой фосфата алюминия, например 50-100 мкг Al на дозу конъюгата. Если в композиции присутствует более одного конъюгата, то не все конъюгаты должны быть адсорбированы.
Б. Масляные эмульсии
Композиции масляных эмульсий для использования в качестве адъювантов в изобретении включают эмульсии скваленов в воде, такие как MF59 [смотри главу 10 из ссылки 35; смотри, также ссылку 37] (5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 в виде субмикронных частиц, полученных с использованием гомогенизатора Microfluidizer). Также можно использовать полный и неполные адъюванты Фрейнда (CFA и IFA, соответственно).
В. Составы на основе сапонина
[глава 22 из ссылки 35]
Quillaia saponaria
Smilax ornata
Gypsophilla paniculata
Saponaria officianalis
В качестве адъювантов в изобретении также можно использовать составы с сапонином. Сапонины представляют собой гетерологичную группу стериновых гликозидов и тритерпеновых гликозидов, которые найдены в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветках большого числа видов растений. Интенсивно исследуется применение в качестве адъювантов сапонина из коры мыльного дерева  Molina. Также в промышленных количествах сапонины можно получать из  (сарсапарилла),  (гипсофила метельчатая) и  (мыльный корень). Составы сапониновых адъювантов включают очищенные составы, такие как QS21, а также липидные составы, такие как ISCOM. QS21 продается под маркой Stimulon™.
Сапониновые композиции очищают с помощью HPLC и RP-HPLC. При помощи этих методик были идентифицированы отдельные очищенные фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. Предпочтительным сапонином является QS21. Способ получения QS21 раскрыт в ссылке 38. Сапониновые составы также могут содержать стерин, такой как холестерин [39].
Комбинации сапонинов и холестеринов можно использовать, чтобы получить особые частицы, называемые иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) [глава 23 из ссылки 35]. ISCOM-комплексы также обычно включают фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. В ISCOM-комплексах можно использовать любой известный сапонин. Предпочтительно, чтобы ISCOM включал один или несколько из QuilA, QHA и QHC. ISCOM-комплексы более подробно описаны в ссылках 39-41. Необязательно, ISCOM-комплексы могут не содержать дополнительного детергента [42].
Обзор разработки адъювантов на базе сапонина можно найти в ссылках 43 и 44.
Г. Виросомы и вирусоподобные частицы
Также в качестве адъювантов в изобретении можно использовать виросомы и вирусоподобные частицы (VLP). Обычно эти структуры содержат один или несколько вирусных белков, необязательно, объединенных или введенных в состав с фосфолипидом. Обычно они непатогенны, не реплицируются и не содержат никакого природного вирусного генома. Рекомбинантные вирусные белки можно получить рекомбинантными методами или их можно выделить из целых вирусов. Подходящие для использования в виросомах или VLP вирусные белки включают белки, полученные из вируса гриппа (такие как HA или NA), вируса гепатита В (такие как ядерные или капсидные белки), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса болезни рук и ног, вируса заболевания кистей рук, стоп и полости рта, ретровируса, вируса Норволк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-содержащих фагов, Qβ-фага (такие как белки оболочки), GA-фагов, fr-фагов, фагов AP205 и ретротранспозона Ty (такие как белок p1 ретротранспозона Ty). Более подробно VLP описаны в ссылках 45-50. Виросомы более подробно описаны в, например, ссылке 51.
Д. Производные бактерий или микробов
Адъюванты, подходящие для применения в изобретении, включат производные бактерий или микробов, такие как нетоксичные производные энтеробактериального липополисахарида (LPS), производные липида А, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и АДФ-рибозилирующие токсины и их нейтрализованные производные.
Нетоксичные производные LPS включают монофосфорил-липид А (MPL) и 3-О-деацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3-О-деацилированного монофосфорил-липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительная мелкодисперсная форма 3-О-деацилированного монофосфорил-липида А раскрыта в ссылке 52. Размер частиц в такой мелкодисперсной форме 3dMPL достаточно маленький для того, чтобы раствор можно было фильтровать для стерилизации через мембрану с размером пор 0,22 мкм [52]. Другие нетоксичные производные LPS включают миметики монофосфорил-липида А, такие как производные аминоалкилглюкозаминид фосфата, например RC-529 [53,54].
Escherichia coli
Производные липида А включают производные липида А из , такие как OM-174. Например, описание OM-174 есть в ссылках 55 и 56.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, подходящие для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают нуклеотидные последовательности, содержащие CpG-мотив (динуклеотидную последовательность, которая содержит неметилированный цитозин, соединенный фосфатной связью с гуанозином). Также были показаны иммуностимулирующие свойства двухцепочечных молекул РНК и олигонуклеотидов, которые содержат палиндромные или поли(dG)-последовательности.
CpG могут включать модификации нуклеотидов (или аналоги), такие как фосфотиоатные модификации, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. В ссылках 57, 58 и 59 раскрыты возможные аналоговые замены, например замена гуанозина на 2'-дезокси-7-деазагуанозин. Более подробно действие CpG-олигонуклеотидов в качестве адъювантов описано в ссылках 60-65.
TLR9 может распознавать CpG-последовательность, такую как GTCGTT или TTCGTT [66]. CpG-последовательность, такая как CpG-A ODN, может специфично вызывать Th1-иммунный ответ или CpG-последовательность, такая как CpG-B ODN, может более специфично вызывать В-клеточный ответ. Последовательности CpG-A ODN и CpG-B ODN более подробно описаны в ссылках 67-69. Предпочтительной CpG является CpG-A ODN.
Предпочтительной конструкцией CpG-олигонуклеотида является конструкция с открытым 5'-концом, доступным для распознавания рецептором. Необязательно, два CpG-олигонуклеотида могут быть соединены на своих 3'-концах, образуя «иммуномеры». Смотри, например, ссылки 66 и 70-72.
E. coli
E.coli
Бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины и их нейтрализованные производные можно использовать в качестве адъювантов в изобретении. Предпочтительно, чтобы белок был получен из  (термолабильный энтеротоксин «LT» из ), холерного вибриона («CT») или столбнячной палочки («PT»). Применение нейтрализованных АДФ-рибозилирующих токсинов в качестве адъювантов, взаимодействующих со слизистой, описано в ссылке 73, а в качестве парентеральных адъювантов - в ссылке 74. Предпочтительно, чтобы токсин или анатоксин представлял собой холотоксин, содержащий обе (А и В) субъединицы. Предпочтительно, чтобы А-субъединица содержала нейтрализующую мутацию; при этом предпочтительно, чтобы В-субъединица не была мутирована. Предпочтительным адъювантом является нейтрализованный LT-мутант, такой как LT-K63, LT-R72 и LT-G192. Применение АДФ-рибозилирующих токсинов и их нейтрализованных производных, в частности LT-K63 и LT-R72, можно найти в ссылках 75-82. Предпочтительно, чтобы нумерация аминокислотных замен была основана на выравниваниях А и В-субъединиц АДФ-рибозилирующих токсинов, приведенных в ссылке 83, полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки.
Е. Модуляторы иммунной системы человека
Модуляторы иммунной системы человека, которые подходят для применения в качестве адъювантов в изобретении, включают цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [84] и т.д.) [85], интерфероны (например, интерферон-γ), фактор, стимулирующий макрофаги, и фактор некроза опухоли.
Ж. Биоадгезивы и мукоадгезивы
Также в качестве адъювантов в изобретении можно использовать биоадгезивы и мукоадгезивы. Подходящие биоадгезивы включают микросферы этерифицированной гиалуроновой кислоты [86] или мукоадгезивы, такие как сшитые производные поли(акриловой кислоты), поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисахариды и карбоксиметилцеллюлоза. Также в качестве адъювантов в изобретении можно использовать хитозан и его производные [87].
З. Микрочастицы
Также в качестве адъювантов в изобретении можно использовать микрочастицы. Микрочастицы (т.е. частицы от приблизительно 100 нм до приблизительно 150 мкм в диаметре, более предпочтительно, от приблизительно 200 нм до приблизительно 30 мкм в диаметре и, наиболее предпочтительно, от приблизительно 500 нм до приблизительно 10 мкм в диаметре), произведенные из материалов, которые являются биодеградируемыми и нетоксичными токсичные (например, поли(α-гидрокси-кислота), полигидроксибутировая кислота, полиортоэфир, полиангидрид, поликапролактон и т.д.) с поли(лактид-ко-гликолидом) являются предпочтительными, необязательно, обработанными для отрицательно заряженной поверхности (например, ДСН) или положительно заряженной поверхности (например, катионным детергентом, таким как CTAB).
И. Липосомы (главы 13 и 14 из ссылки 35)
Примеры липосомных составов для применения в качестве адъювантов описаны в ссылках 88-90.
К. Составы, включающие полиоксиэтиленовые простые и сложные эфиры
Адъюванты, подходящие для использования в изобретении, включают полиоксиэтиленовые простые и сложные эфиры [91]. Кроме того, такие составы включают поверхностно-активные вещества - сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана в комбинации с октоксинолом [92], а также поверхностно-активные вещества - простые и сложные эфиры полиоксиэтиленалкилов в комбинации с, по меньшей мере, одним дополнительными неионным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [93]. Предпочтительные простые эфиры полиоксиэтилена выбирают из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет-9), полиоксиэтилен-9-стеориловый эфир, полиоксиэтилен-8-стеориловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.
Л. Полифосфазен (РСРР)
Составы PCPP, например, описаны в ссылках 94 и 95.
М. Мурамиловые пептиды
sn
Примеры мурамиловых пептидов, подходящих для использования в качестве адъювантов в изобретении, включают N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (nor-MDP) и N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил--глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин MTP-PE.
Н. Имидазохинолоновые соединения
Примеры имидазохинолоновых соединений, подходящих для использования в качестве адъювантов в изобретении, включают Имиквамод и его гомологи (например, «Резиквимод 3М»), более подробно описанные в ссылках 96 и 97.
Также изобретение может включать в себя комбинации аспектов одного или нескольких описанных выше адъювантов. Например, в изобретении можно использовать следующие композиции адъювантов: (1) сапонин и эмульсию масло в воде [98]; (2) сапонин (например, QS21) и нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) [99]; (3) сапонин (например, QS21), нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) и холестерин; (4) сапонин (например, QS21), 3dMPL и IL-12 (необязательно, + стерин) [100]; (5) комбинации 3dMPL с, например, QS21 и/или эмульсиями масло в воде [101]; (6) SAF, который содержит сквален, 10%, Tween 80™ 0,4%, плюроник блок-полимер L121 5% и thr-MDP (гомогенизированный до субмикронной эмульсии или разбитый на вортексе для получения эмульсии с более крупными частицами); (7) адъювант Ribi™ adjuvant system (RAS), (Ribi Immunochem), который содержит сквален, 2%, Tween 80™ 0,2% и один или несколько из компонентов бактериальной стенки из группы, состоящей из монофосфорил-липида А (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL + CWS (Detox™); и (8) одна или несколько минеральных солей (таких как соль алюминия) и нетоксичное производное LPS (такое как 3dMPL).
Другие вещества, которые действуют, как иммуностимулирующие агенты, раскрыты в главе 7 ссылки 35.
Особенно предпочтительно использовать адъювант гидроксид алюминия или фосфат алюминия, причем обычно происходит сорбция антигенов на эти соли. Еще одним предпочтительным адъювантом является фосфат кальция.
Предпочтительно, чтобы значение рН композиций было от 6 до 8, предпочтительно, около 7. Постоянное значение рН можно поддерживать при помощи буферных соединений. Если композиция включает в себя соль гидроксида алюминия, то предпочтительно использовать гистидиновый буфер [102]. Композиции могут быть стерильными и апирогенными. Композиции по изобретению могут быть изотоническими для людей.
Композиции могут быть представлены в флаконах или они могут быть представлены в готовых к использованию заполненных шприцах. Шприцы могут поставляться в комплекте с иглами или без них. В шприце будет находиться разовая доза композиции, в то время как флакон может содержать разовую дозу или множество доз. Композиции для инъекций обычно будут представлять собой жидкие растворы или суспензии. В качестве альтернативы, они могут быть представлены в виде твердых форм (например, лиофилизированных) для приготовления раствора или суспензии в жидких носителях перед инъекцией.
Композиции по изобретению могут быть расфасованы в виде разовых доз или в многодозовой форме. Для многодозовых форм предпочтительнее флаконы, а не заполненные шприцы. Эффективные объемы дозировок определяются рутинными методами, но обычная доза композиции для инъекции людям составляет 0,5 мл.
Если композицию по изобретению нужно приготавливать непосредственно перед использованием (например, если компонент представлен в лиофилизированной форме), и композиция представлена в наборе, то набор может включать в себя два флакона или он может содержать один готовый к использованию заполненный шприц и один флакон, причем содержание шприца используется для активации содержания флакона перед инъекцией.
Используемые в качестве вакцин иммуногенные композиции содержат иммунологически эффективное количество антигена (антигенов), а также, если необходимо, другие компоненты. Под «иммунологически эффективным количеством» подразумевается, что введение этого количества индивидууму однократно или в качестве части схемы введения является эффективным для лечения или профилактики. Это количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, которого нужно лечить, возраста, таксономической группы индивидуума, которого нужно лечить (например, приматы, кроме человека, приматы и т.д.), способности иммунной системы человека продуцировать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, оценки ситуации лечащим врачом и других важных факторов. Ожидается, что эта величина будет находиться в широком диапазоне, который можно определить в рутинных испытаниях, а типичное количество каждого менингококкового сахаридного антигена на дозу находится в пределах от 1 мкг до 10 мг на один антиген.
Фармацевтическое применение
Изобретение также относится к способу лечения пациента, включающему в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по изобретению. Пациент сам может иметь риск возникновения заболевания или пациентом может быть беременная женщина («иммунизация в утробе матери»).
Изобретение относится к нуклеиновой кислоте, полипептиду, антителу по изобретению для применения в качестве лекарственных препаратов (например, в качестве иммуногенных композиций или в качестве вакцин, включая использование при лечении или профилактике болезни и/или инфекции, вызванной менингококком) или в качестве диагностического реагента. Также изобретение относится к применению нуклеиновой кислоты, полипептида или антитела по изобретению в изготовлении: (1) лекарственного препарата для лечения или профилактики болезни и/или инфекции, вызванной менингококком; (ii) диагностического реагента для детекции присутствия менингококка или антител, полученных против менингококка; и/или (iii) реагента, который может вызывать возникновение антител против менингококка. Указанный менингококк может принадлежать к любой серогруппе или штамму, но предпочтительно относится к серогруппе В. Указанной болезнью может быть, например, бактериальный менингит (и, в частности, менингококковый менингит) или септицемия.
Предпочтительно, чтобы пациентом был человек. Если вакцину используют для профилактического применения, то человек, предпочтительно, является ребенком (например, ребенком детсадовского возраста или младенцем) или подростком, например, в возрасте от 0 до 18 лет; если вакцину используют для терапевтического применения, человек, предпочтительно, является взрослым, например, в возрасте от 18 до 55 лет. Вакцину, которая предназначена для детей, можно также вводить взрослым, например, для оценки безопасности, дозировки, иммуногенности и т.д.
Один путь проверки эффективности терапевтического действия включает наблюдение за менингококковой инфекцией после введения композиции по изобретению. Один путь проверки эффективности профилактического действия включает наблюдение за иммунным ответом против введенного полипептида после введения. Иммуногенность композиций по изобретению можно определить путем введения их испытуемым субъектам (например, детям в возрасте от 12 до 16 месяцев или модельным животным) и последующего определения стандартных показателей, включая титры IgG по методу ELISA (GMT). Эти иммунные ответы обычно определяют примерно на 4 неделе после введения композиции и сравнивают с величинами, определенными перед введением композиции. Если вводится более одной дозы композиции, то титры можно определять более одного раза. Стандартным способом оценки профилактической эффективности против менингококков является сывороточный бактерицидный тест (SBA). Предпочтительно, чтобы введение композиции приводило к увеличению титра SBA для испытуемой серогруппы, по меньшей мере, в 4 раза, и, предпочтительно, по меньшей мере, в 8 раз, который измеряют с системой комплемента человека [103]. Если для титров SBA используют систему комплемента кролика, то, предпочтительно, чтобы титр увеличивался, по меньшей мере, в 128 раз.
Введение полипептидных антигенов является предпочтительным способом воздействия для индукции иммунитета. Другим предпочтительным способом воздействия является введение антител по изобретению. Этот способ пассивной иммунизации особенно пригоден для применения у новорожденных детей или у беременных женщин. В этом способе обычно используют моноклональные антитела, которые будут гуманизированными или неизмененными антителами человека.
Обычно композиции по изобретению будут вводить пациенту напрямую. Прямое введение можно выполнить парентеральной инъекцией (например, подкожной, интраперитонеальной, внутривенной, внутримышечной или в интерстициальное пространство ткани) или ректальным, пероральным, вагинальным, местным, трансдермальным, интраназальным, окулярным, через ухо, через легкие или другим типом введения через слизистую. Предпочтительно внутримышечное введение в бедро или в верхнюю часть плеча. Инъекции можно осуществлять при помощи иглы (например, гиподермальной иглы), но в качестве альтернативы можно применять инъекции без использования игл. Типичная доза для внутримышечной инъекции составляет 0,5 мл.
Изобретение можно использовать для того, чтобы вызвать системный иммунитет или иммунитет в слизистой.
Схема лечения может представлять собой однократное введение или многократное. Многократное введение можно использовать в схеме первичной иммунизации и/или в схеме ревакцинации. За схемой первичной иммунизации может следовать ревакцинация. Можно легко определить подходящие временные интервалы между введением первичных доз (например, 4-16 недель) и между первичной вакцинацией и ревакцинацией.
Бактериальные инфекции затрагивают разные участки организма и, поэтому, формы получаемых композиций могут быть разными. Например, композиции можно изготовить в виде препаратов для инъекций или в виде водных растворов или суспензий. Также можно изготовить твердые формы, подходящие для растворения или ресуспендирования в жидких носителях перед инъекцией (например, лиофилизированные композиции). Композицию можно изготовить для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Композицию можно изготовить для перорального введения, например, в виде таблетки или капсулы или в виде сиропа (необязательно, ароматизированного). Композицию можно изготовить для введения через легкие, например, в виде ингалятора с тонкодисперсным порошком или в виде аэрозоля. Композицию можно изготовить в виде суппозиториев или пессариев. Композицию можно изготовить для введения через нос, ухо или глаз, например, в виде аэрозоля, капель, геля или порошка (например, смотри ссылки 104 и 105).
Дополнительные антигенные компоненты композиций по изобретению
Изобретение также относится к композиции, содержащей полипептид по изобретению и один или несколько из следующих дополнительных антигенов:
N.meningitidis
- сахаридный антиген серогрупп A, C, W135 и/или Y (предпочтительно из всех четырех) , такой как раскрытый в ссылке 106 олигосахарид серогруппы С [также смотри ссылку 107] или олигосахариды из ссылки 108;
Streptococcus pneumoniae
- сахаридный антиген  [например, 109, 110, 111];
- антиген вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например, 112, 113];
- антиген вируса гепатита В, такой как поверхностные и/или ядерные антигены [например, 113, 114];
197
- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный анатоксин [например, глава 3 из ссылки 115], например CRM-mutant [например, 116];
- столбнячный антиген, такой столбнячный анатоксин [например, глава 4 из ссылки 115];
Bordetella pertussis
B.pertussis
- антиген , такой как коклюшный холотоксин (РТ) и филаментный гемаглютинин (FHA) из , необязательно, в комбинации с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3 [например, ссылки 117 и 118];
Haemophilus influenzae
- сахаридный антиген  B [например, 107];
- полиовирусный антиген (антигены) [например, 119, 120], такие как IPV;
- антигены кори, свинки и/или краснухи [например, главы 9, 10 и 11 из ссылки 115];
- антигены гриппа [например, глава 19 из ссылки 115], такие как белки поверхности гемаглютинин и/или нейраминидаза;
Moraxella catarrhalis
- антиген  [например, 121];
Streptococcus agalactiae
- белковый антиген  (стрептококк группы B) [например, 122, 123];
Streptococcus agalactiae
- сахаридный антиген  (стрептококк группы B);
Streptococcus pyogenes
- антиген  (стрептококк группы А) [например, 123, 124, 125];
Staphylococcus aureus
- антиген  [например, 126].
Композиция может содержать один или несколько из этих дополнительных антигенов.
Если необходимо, то токсичные белковые антигены можно нейтрализовать (например, столбнячный токсин можно нейтрализовать химическими и/или генетическими средствами [118]).
Если композиция содержит дифтерийный антиген, предпочтительно также включить в нее столбнячный и коклюшный антигены. Аналогичным образом, если в композицию включен столбнячный антиген, то предпочтительно включить в нее дифтерийный и коклюшный антигены. Аналогичным образом, если включен коклюшный антиген, то предпочтительно включить в нее дифтерийный и столбнячный антигены. То есть предпочтительно использовать DTP-комбинацию (дифтерия/столбняк/коклюш).
N.meningitidis
H.influenzae
C.difficile
Предпочтительно, чтобы сахаридные антигены были в форме конъюгатов. Белки-носители для конъюгатов включают дифтерийный токсин, столбнячный токсин, белок внешней мембраны  [127], синтетические пептиды [128,129], белки теплового шока [130,131], коклюшные белки [132,133], белок D из  [134], цитокины [135], лимфокины [135], стрептококковые белки, гормоны [135], ростовые факторы [135], токсин А или В из  [136], участвующие в переносе железа в клетку белки [137] и т.д. Предпочтительным белком-носителем является дифтерийный анатоксин CRM197 [138].
Концентрация антигенов в композиции обычно будет составлять, по меньшей мере, 1 мкг/мл для каждого антигена. В общем, концентрация любого антигена должна быть достаточной для того, чтобы вызвать иммунный ответ против антигена.
В качестве альтернативы применению белковых антигенов в иммуногенных композициях по изобретению можно использовать нуклеиновую кислоту (предпочтительно, ДНК, например, в виде плазмиды).
Предпочтительными являются антигены, сорбированные на соль алюминия.
Методы скрининга
Изобретение относится к способу, который позволяет определить, связывает ли тестируемое соединение полипептид по изобретению. Если тестируемое соединение связывает полипептид по изобретению, и в результате этого связывания происходит ингибирование жизненного цикла менингококка, то это тестируемое соединение можно использовать как антибиотик или в качестве исходного соединения при разработке антибиотиков. Обычно, способ будет включать в себя стадии контактирования тестируемого соединения с полипептидом по изобретению и определения, связывает ли тестируемое соединение указанный полипептид. Предпочтительными полипептидами для применения в этих способах являются ферменты (например, тРНК-синтетазы), мембранные транспортеры и рибосомальные полипептиды. Подходящие тестируемые соединения включают полипептиды, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты (например, ДНК, РНК и их модифицированные формы), а также низкомолекулярные органические соединения (например, с MW между 200 и 2000 Д). Тестируемые соединения можно представить по отдельности, но обычно они будут являться частью библиотеки (например, комбинаторной библиотеки). Способы детекции взаимодействия при связывании включают ЯМР, метод связывания на фильтрах, метод торможения в геле, заместительные методы, поверхностный плазмонный резонанс, «обратную» двухгибридную систему и т.д. Можно проводить тестирование соединения, связывающего полипептид по изобретению, на его активность как антибиотика путем контактирования соединения с менингококковыми бактериями, и затем наблюдая ингибирование роста. Изобретение также относится к соединению, идентифицированному этими способами.
Предпочтительно, способ включает в себя стадии: (а) контактирования полипептида по изобретению с одним или несколькими соединениями-кандидатами, в результате чего образуется смесь; (б) инкубирования смеси для того, чтобы позволить взаимодействие между полипептидом и соединением-кандидатом (соединениями-кандидатами); и (в) оценки того, связывает ли соединение-кандидат полипептид или модулирует его активность.
in vitro
in vivo
Если  идентифицировано соединение, которое связывает полипептид по изобретению, тогда может быть желательно провести дальнейшие эксперименты для подтверждения способности соединения ингибировать рост и/или выживание бактерий . Поэтому, способ включает в себя дополнительную стадию контактирования соединения с менингококком и оценки его действия.
Используемый в способе скрининга полипептид может находиться свободным в растворе, может быть прикреплен к твердой подложке, может располагаться на поверхности клетки или внутри клетки. Предпочтительно детектировать связывание соединения-кандидата с полипептидом посредством метки, которая прямо или непрямо ассоциирована с соединением-кандидатом. Метка может представлять собой флюорофор, радиоизотоп или другую детектируемую метку.
Общие положения
Изобретение относится к совместимому с компьютерами носителю (например, гибкому диску, жесткому диску, CD-ROM, DVD и т.д.) и/или памяти компьютера, и/или компьютерной базе данных, которые содержат одну или несколько последовательностей в списке последовательностей.
Термин «содержащий» охватывает «включающий», а также «состоящий», например композиция, «содержащая» Х, может состоять исключительно из Х или может включать дополнительные соединения, например Х+Y.
х
x
Термин «примерно» в отношении числовой величины  означает, например, ±10%.
Слово «по существу» не исключает «полностью», например композиция, которая является «по существу свободной» от Y, может быть совершенно свободной от Y. Если необходимо, то слово «по существу» можно исключить из определения изобретения.
Идентичность между полипептидами предпочтительно определять с помощью алгоритма поиска гомологии Смита-Уотермана, реализованного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), в котором используется аффинный поиск разрывов с параметрами: штраф за открытие разрыва = 12 и штраф за продолжение разрыва = 1. Идентичность последовательностей также предпочтительно определять с помощью поискового алгоритма Смита-Уотермана.
N-концевые остатки в аминокислотных последовательностях в списке последовательностей приведены как аминокислоты, кодируемые первым кодоном в соответствующей нуклеотидной последовательности. Если первый кодон не является ATG, понятно, что если этот кодон является стартовым, что он будет транслироваться как метионин; но при этом он будет транслироваться как указанная аминокислота (не Met), если последовательность находится на С-конце слитой с ней другой последовательности. В изобретении явным образом раскрыты и охвачены каждая из аминокислотных последовательностей из списка последовательностей, которые имеют остаток метионина на N-конце (например, формил-метиониновый остаток) вместо любого указанного остатка (не Met).
В биологии возможно использование альтернативных старт-кодонов. Аминокислотные последовательности в списке последовательностей получены на основе конкретных старт-кодонов, но в качестве альтернативы могут использоваться находящиеся ниже старт-кодоны. Поэтому, в изобретении явным образом раскрыты и охвачены каждая аминокислотная последовательность из списка последовательностей, которая начинается с любого остатка метионина из последовательности, находящейся ниже N-концевого остатка, приведенного в списке (например, SEQ ID NO: 5 и 10).
Как указано в вышеприведенном тексте, нуклеиновые кислоты и полипептиды по изобретению могут включать последовательности, которые:
(а) являются идентичными (т.е. идентичными на 100%) с последовательностями, раскрытыми в списке последовательностей;
(б) имеют идентичность по последовательности с последовательностями, раскрытыми в списке последовательностей;
(в) имеют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 одиночных нуклеотидных или аминокислотных изменений (делеций, вставок, замен), которые могут находится в разных местах или могут располагаться последовательно, по сравнению с последовательностями из п.(а) или (б); и
х
р
р>x
p-x+1
x*y
x
y
x*y
needle
(г) при выравнивании с конкретной последовательностью из списка последовательностей с применением алгоритма парного выравнивания двигающееся окно из  мономеров (аминокислот или нуклеотидов), которое двигается от начала (N-конца или 5') к концу (С-концу или 3') таким образом, что для выравнивания, которое распространяется на  мономеров (если ), в нем находится  таких окон, причем каждое окно имеет, по меньшей мере, идентичных выровненных мономеров, где  выбирают из 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200;  выбирают из 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; и если  не является целым числом, тогда его округляют до ближайшего целого числа. Предпочтительным алгоритмом парного выравнивания является общий алгоритм выравнивания Нидлмана-Вунша [139] с использованием параметров по умолчанию (например, штраф за открытие разрыва = 10,0 и штраф за удлинение разрыва = 0,5, с использованием весовой матрицы EBLOSUM62). Этот алгоритм удобно реализован в программе  из пакета программ EMBOSS [140].
Нуклеиновые кислоты и полипептиды по изобретению могут иметь дополнительные последовательности на N-конце/5' и/или C-конце/3' последовательностей по пп.(а)-(г).
В применении на практике настоящего изобретения, если не указано иное, будут использоваться стандартные химические, биохимические, молекулярно-биологические, иммунологические и фармакологические методики, которые известны в данных областях. Полное описание таких методик можно найти в литературе. Смотри, например, ссылки 141-148 и т.д.
СПОСОБЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
N. meningitidis
В геноме штамма M04-240196 серогруппы B  были идентифицированы различные кодируемые аминокислотные последовательности. На основе различных критериев 39 из них были отобраны в качестве подходящих антигенов, а в списке последовательностей приведены последовательности их генов и их аминокислотные последовательности.
per se
Предположительные биологические функции приведены в таблице I, но точная роль антигенов в биологии менингококка не является такой важной, как их способность действовать в качестве антигенов. В таблице II также указано наиболее близкое совпадение с последовательностями в опубликованных геномах серогрупп А и В (ссылки 6 и 8), а также в неопубликованном геноме штамма FAM18 серогруппы С. Если последовательность имеет более 95% идентичности с известной последовательностью (и, в частности, если она идентична на 100%), то изобретение было направлено в большей степени на идентификацию применимых антигенных свойств белка, а не на идентификацию белка .
Кроме того, что указано в примечаниях и сравнениях, дополнительные представляющие интерес признаки включают: B269_17 содержит домен интеина; B269_34 имеет сплайсинговую последовательность на своем С-конце; в B269_05, B269_10, B269_18, B269_24 присутствует трансмембранный домен; и в B269_15 и B269_29 присутствуют пять трансмембранных доменов.
Используя приведенную в данном описании информацию о последовательностях, можно легко экспрессировать белки в рекомбинантных хозяевах и использовать их для генерации иммунного ответа, применяя известные в данной области методики.
E.coli
домен
Например, последовательности, кодирующие белки B269_11, 13, 14, 15, 17, 24, 25, 26, 29, 31, 32, 34, 36, 37, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 и 59, встраивали в экспрессионные векторы с полигистидиновым тагом на С-конце. Также была получена экспрессия белков B269_14, 29, 31, 34, 37 с укороченным доменом. Также были получены слитые с GST белки 37, 54, 55 и 57. Проводили очистку экспрессированных белков из . Без оптимизации экспрессии наблюдалась различная степень очистки белков, например от 20% чистоты для домена B269_14 и B269_32 и до 95% чистоты для B269_51. Экспрессию белков в растворимой форме наблюдали для белков B269_13, 24, 25, 31, белков B269_32, 51, 53 и 56.
домен
домен
домен
домен
Для экспрессированных белков антитела получали в мышах, используя инъекции в полном адъюванте Фрейнда или с гидроксидом алюминия. Сыворотку иммунизированных животных затем использовали для окрашивания Вестерн-блотов или в анализе связывания с менингококками, используя проточную цитофлуориметрию. Методом Вестерн-блоттинга возможно определить следующие B269_белки: 13; 25; 29; 31; 34; 51; 52; и 53. В дополнение, следующие белки можно было детектировать на мембране с определенным молекулярным весом: 11 (40 кД); 24 (20 кД); и 26 (28 кД). С помощью проточной цитофлуориметрии удалось выявить следующие белки: 17; 24; 25; 26; 29; 34; и 53.
Следует понимать, что изобретение описано не только на примере, и можно осуществить модификации изобретения, не выходя за рамки объема и сущности изобретения.
<b>ТАБЛИЦА I - Примечания</b>
аа = длина полипептида
В 269
SEQ ID
аа
Локализация *
Примечание
01
2
588
О
белок PilC
11
4
320
О
возможный MafA-подобный адгезин
13
6
387
С
белок из суперсемейства купинов
14
8
420
I
белок, обеспечивающий слияние мембран
15
10
670
I
пептидаза из семейства С39
16
12
331
P
возможная пептидил-пролил цис-транс-изомераза
17
14
209
S
консервативный гипотетический белок
18
16
265
O
белок «мутности» (Ора-белок)
19
18
680
I
связывающий трансферин белок 2
20
20
1370
S
гемаглютинин-гемолизин-родственный белок
21
22
734
S
гемаглютинин-гемолизин-родственный белок
22
24
887
S
гемаглютинин-гемолизин-родственный белок
23
26
794
S
гемаглютинин-гемолизин-родственный белок
24
28
206
C
консервативный гипотетический белок
25
30
1502
S
HlyJ-гемолизин-подобный белок
26
32
257
C
консервативный гипотетический белок TIGR00294
27
34
237
I
возможная тиосульфат-сульфотрансфераза
28
36
402
C
возможно: возможная GlcNAc-трансфераза 19
29
38
297
O
консервативный гипотетический белок
30
40
226
C
белок «мутности» Ора115
31
42
588
O
семейство YadA-подобной С-концевой области
32
44
201
C
консервативный гипотетический белок
33
46
337
I
возможная гликозилтрансфераза
34
48
529
C
железорегулируемый белок frpA
35
50
676
C
трансферин/лактоферин-связывающий белок В
36
52
203
C
муцин
37
54
340
C
консервативный гипотетический белок
38
56
376
I
возможная двухкомпонентная сенсорная киназа 196
39
58
346
P
АТФ-связывающая область, АТФаза-подобный:гистидин киназа, N-конец
41
60
1026
P
белок PilC
42
62
333
O
консервативный гипотетический белок
43
64
229
C
гликозилтрансфераза, белок семейства группы 2
44
66
208
C
консервативный гипотетический белок
45
68
476
C
MafB-белок
46
70
229
C
адгезин MafB
47
72
432
O
связывающий трансферин белок В, субъединица 19
48
74
809
S
возможный предшественник гемолизин-гемаглютинин-подобного белка НесА
49
76
783
S
возможный гемаглютинин (DUF637), семейство 1
50
78
300
S
гемаглютинин-гемолизин-родственный белок
Обозначения *локализации: O = внешняя мембрана; C = цитоплазма; I = внутренняя мембрана; P = периплазматическое пространство; S = секретируемый
<b>ТАБЛИЦА II</b><b>Гомология с другими менингококковыми последовательностями [6,8]</b>
<b>В 269</b>
<b>SEQ ID</b>
<b>MC58</b>
<b>(B)</b>
<b>(A)</b>
<b>(C)</b>
01
2
NMB0049
77,6
78,2
73,1
11
4
NMB0652
62,7
100
98,4
13
6
NMB1786
51
48,4
80,3
14
8
NMB0097
51,1
59,9
100
15
10
NMB0098
64
28,9
94,9
16
12
NMB0281
85,4
92,1
93,5
17
14
NMB0369
83,2
61,7
91,9
18
16
NMB0442
86,4
81,5
87,1
19
18
NMB0460
71,5
70,9
41,8
20
20
NMB1779
67,4
70
97,4
21
22
NMB1775
82,6
87,9
96
22
24
NMB1779
81,9
80,5
95,2
23
26
NMB1775
79,2
89,2
88,9
24
28
NMB0515
66,1
99,5
93,7
25
30
NMB0585
85,5
91
90,9
26
32
NMB0803
86,8
86,8
86,8
27
34
NMB0841
84
95,4
88,1
28
36
NMB0846
89
56,1
85,1
29
38
NMB0888
87,9
79,8
85,2
30
40
NMB1636
80,4
81,6
92
31
42
NMB0992
87,4
90,1
94,6
32
44
нет
41,2
41,2
70,9
33
46
NMB1255
73
95,4
97,5
34
48
NMB1415
89,5
80,5
98,7
35
50
NMB1541
68,3
78,2
56,4
36
52
NMB0891
49
53,4
78,6
37
54
нет
30,7
33,3
100
38
56
NMB1606
82,2
80,1
87
39
58
NMB1606
83
85,9
90,9
41
60
NMB1847
80,4
81,6
78,2
42
62
NMB1870
87,4
87,4
74,2
43
64
NMB1929
48,2
48,2
48,2
44
66
NMB1992
89,9
81,5
92,8
45
68
NMB2105
89,7
88,5
95,9
46
70
NMB2105
88
96,7
89,9
47
72
NMB2132
76,5
68,6
68,7
48
74
NMB0493
85,4
55
68,2
49
76
NMB1775
67,2
82,9
99,4
50
78
NMB1779
51,2
84
83,3
«MC58» = наиболее близкое совпадение из ссылки 6В колонках (а)-(с) представлены значения в процентах совпадений с другими последовательностями: (B) = ссылка 6; (A) = ссылка 8; (c) = штамм FAM18
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
(содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки)