СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАТЕРИАЛА С АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ НА ОСНОВЕ МОНТМОРИЛЛОНИТ СОДЕРЖАЩИХ ГЛИН
METHOD OF OBTAINING MATERIAL WITH ANTIBACTERIAL PROPERTIES BASED ON MONTMORILLONITE-CONTAINING CLAYS

Изобретение относится к способам получения антибактериальных материалов методами модифицирования природных монтмориллонитсодержащих глин для улучшения их антибактериальных характеристик, что позволяет использовать их в традиционной и ветеринарной медицине при создании комплексных антибактериальных препаратов.
+
2
Известен способ получения антибактериального материала (патент RU 2429857, опубл. 2011 г.), в котором предлагается на первом этапе бентонит Na-формы активировать раствором хлористого натрия с последующим удалением анионов хлора при промывке и фильтровании, на втором этапе полученный полуфабрикат интеркалируют ионами металлов бактерицидного действия, например Ag, путем обработки в водных растворах неорганических солей этих металлов. Удаляют соли натрия при промывке продукта деионизованной водой, фильтруют, сушат и измельчают до дисперсности частиц 20-150 нм, где согласно изобретению процессы активации и интеркаляции бентонита осуществляют при использовании ультразвука с частотой 20-50 кГц и интенсивностью 10-100 Вт/см, а процесс очистки интеркалированного продукта от солей натрия производят в два этапа, на первом - продукт декантируют, а на втором этапе промывают в деионизованной воде, содержащей 30 ppm - 100 ppm комплексообразователя ионов щелочных металлов на основе краун-эфиров с молекулярной массой не более 264. При этом полученный материал содержит 2,35 и 2,95 масс.% серебра.
3
+
Известен способ получения антимикробного препарата (патент US 2012093907 (А1), опубл. 2012 г.), согласно которому 1% масс. суспензию из наносиликатных пластин обрабатывают раствором нитрата серебра (AgNO) (1% масс.) при соотношении Ag: глина равном 7:93. Добавляют 6~8 мл метанола. Химическое взаимодействие проводят с помощью ультразвукового перемешивания на водяной бане при 70~80°C. Недостатком данного способа является предварительное получение наносиликатных пластин из слоистых глинистых минералов, что значительно влияет на продолжительность процесса. Также используют метанол, который является ядовитым веществом. Содержание серебра в образцах, определенное масс-спектрометрическим методом (ICP-MS), соответствует примерно от 120 до 190 частей на миллиард.
+
Наиболее близким по существу является изобретение, заключающееся в модифицировании неорганического минерала - монтмориллонита неорганическими солями металла в полярном растворителе и последующей выдержке бентонита в растворе соли, в удалении продуктов модифицирования бентонита из раствора с последующей сушкой при температуре не выше 100°C, при этом согласно изобретению перед модифицированием бентонит обогащают ионами Na путем обработки его 3-10 масс.% водным раствором хлористого натрия с последующей промывкой и фильтрованием полученного полуфабриката, который затем модифицируют 10-20 масс.% раствором неорганических солей металла, в качестве которых используют нитрат серебра или сульфат меди, производят выдержку модифицируемого бентонита в указанных солевых растворах в течение 12-24 час, а затем очистку промодифицированного бентонита от солей натрия путем его промывки и фильтрации. После сушки полученный препарат измельчают до дисперсности частиц 20-150 нм, при этом обработку неорганического минерала названными растворами производят при соотношении, масс.ч. - бентонит:раствор как 1:(10-40) (А.А. Абрамян, В.И. Беклемышев, И.И. Махонин, П.И. Махонин, В.А. Солодовников. Способ получения антимикробного препарата. [Описание изобретения к патенту RU 2330673 от 22.11.2006]).
Недостатком прототипа, как и вышеуказанных аналогов, является то, что в них используется только Na-форма монтмориллонита, что ограничивает сырьевую базу, т.к. чаще встречаются монтмориллонитовые глины, представленные натрий-кальциевой, и/или кальциевой, и/или железистой формой монтмориллонита. Также к недостаткам прототипа можно отнести длительность процесса и использование при модификации высоких концентраций нитрата серебра.
Задачей настоящего изобретения является создание материала с антибактериальными свойствами на основе недефицитных монтмориллонит содержащих глин, который может эффективно подавлять рост патогенных микроорганизмов.
3
Техническим результатом изобретения является получение эффективного антибактериального материала на основе недефицитных натрий-кальциевых, и/или кальциевых, и/или железистых монтмориллонитов за счет менее затратного по используемым ингредиентам и продолжительности технологического процесса модифицирования ионами серебра с использованием растворов AgNO более низких концентраций.
Предлагаемое изобретение, заключающееся в модифицировании глины, включающей неорганический минерал - монтмориллонит, раствором нитрата серебра, промывке и последующей сушке, включает следующие новые признаки:
- глина, включающая неорганический минерал - монтмориллонит, представлена натрий-кальциевой, и/или кальциевой, и/или железистой формой монтмориллонита;
- массовое соотношение глина:модифицирующий агент составляет 1:5;
3
- процесс модифицирования глины водным раствором нитрата серебра AgNO с концентрацией 0,16-9,9 масс.% проводят при температуре в интервале от 10°C до температуры кипения, продолжительность обработки от 3 до 7 часов;
- полученный модифицированный материал промывают дистиллированной водой до тех пор, пока не будет удален избыток нитрата серебра до рН≈5-6;
- отстаивают при комнатной температуре и декантируют;
- материал высушивают при температуре 20-160°C, в результате чего получают мягкий, легко измельчаемый глинистый материал от светло-коричневого до темно-коричневого цвета.
Способ реализуют следующим образом.
Минералогический состав исходной недефицитной натрий-кальциевой, и/или кальциевой, и/или железистой глины:монтмориллонит, иллит, каолинит, кварц, мусковит, кальцит, полевые шпаты, где основным сорбционным материалом является монтмориллонит.
Исходную глину заливают модифицирующим раствором нитрата серебра с концентрацией 0,16-9,9 масс.% в соотношении глина:модифицирующий агент, равном 1:5. Перемешивают в течение от 3 до 7 часов при температуре от 10°C до температуры кипения. По завершении процесса полученный продукт промывают до рН≈5-6 для удаления избытка нитрата серебра и высушивают при температуре 20-160°C. Сушка при температуре менее 20°C происходит в значительном интервале времени и требует использования охлаждающего оборудования, что экономически нецелесообразно. Материалы, высушенные при температуре более 160°C, имеют более низкое антибактериальное действие.
Примеры выполнения
Пример 1. Исходную глину заливали модифицирующим раствором нитрата серебра с концентрацией 3,2 масс.% в соотношении глина:модифицирующий агент, равном 1:5. Перемешивали в течение 3 часов при температуре 20-30°C. По завершении процесса полученный материал промывали для удаления избытка нитрата серебра до рН≈5-6, высушивали при температуре 20-40°C.
Пример 2. Исходную глину заливали модифицирующим раствором нитрата серебра с концентрацией 3,2 масс.% в соотношении глина:модифицирующий агент, равном 1:5. Перемешивали в течение 3 часов при температуре кипения смеси. По завершении процесса полученный материал промывали для удаления избытка нитрата серебра до рН≈5-6, высушивали при температуре 80-105°C.
Пример 3. Исходную глину заливали модифицирующим раствором нитрата серебра с концентрацией 0,16 масс.% в соотношении глина:модифицирующий агент, равном 1:5.Перемешивали в течение 7 часов при температуре 20-30°C. По завершении процесса полученный материал промывали для удаления избытка нитрата серебра до рH=5-6, высушивали при температуре 100-160°C.
Пример 4. Исходную глину заливали модифицирующим раствором нитрата серебра с концентрацией 0,16 масс.% в соотношении глина:модифицирующий агент, равном 1:5. Перемешивали в течение 7 часов при температуре кипения смеси. По завершениИ процесса полученный материал промывали для удаления избытка нитрата серебра до рН≈5-6, высушивали при температуре 100-160°C.
Пример 5. Исходную глину заливали модифицирующим раствором нитрата серебра с концентрацией 9,9 масс.% в соотношении глина:модифицирующий агент, равном 1:5. Перемешивали в течение 3 часов при температуре 10-15°C. По завершении процесса полученный материал промывали для удаления избытка нитрата серебра до рН≈5-6, высушивали при температуре 100-160°C.
В образцах материалов по примерам 1-5 определяли содержание серебра. Для исследований использовался метод количественного анализа, основанный на измерении объема или массы реагента, требующегося для реакции с исследуемым веществом, - титрометрический анализ.
Титрометрический анализ по определению количества серебра в материалах, полученных по примерам 1-5, осуществляли с использованием индикаторов, фиксирующих точку эквивалентности титрования. При проведении титрометрического анализа по определению в исследуемых образцах содержания серебра (масс.%) использовали в качестве реагентов концентрированную азотную кислоту, в качестве раствора титранта - роданид аммония или калия, в качестве индикатора - раствор железоаммонийных квасцов. В результате проведенных исследований установлено, что исследуемый образец по примеру 1 содержит 3,36 масс.% серебра, исследуемый образец по примеру 2 содержит 3,61 масс.% серебра, исследуемые образцы по примеру 3 и 4 содержат серебро в количестве 0,10 и 0,20 масс.% соответственно, исследуемый образец по примеру 5 содержит 4,35 масс.% серебра. Кроме того, химический состав обогащенного и модифицированных образцов материалов по примерам 1-5 определяли методом рентгенофлуоресцентного анализа на рентгеновском спектрометре ARL OPTIM'X (таблица 1).
Таблица 1
Средний химический состав образцов материалов в пересчете на оксиды, масс.%
Образец материала
SiO<sub>2</sub>
Al<sub>2</sub>O<sub>3</sub>
Fe<sub>2</sub>O<sub>3</sub>
TiO<sub>2</sub>
MgO
CaO
K<sub>2</sub>O
Na<sub>2</sub>O
Ag<sub>2</sub>O
Σ
Обогащенная глина
60,12
19,36
5,27
0,94
3,04
8,87
2,40
0,38
-
100,38
Пример 1
59,37
13,40
4,37
0,89
2,05
8,28
4,05
0,26
6,99
99,60
Пример 2
59,69
16,79
4,06
0,92
2,34
6,18
2,16
7,51
99,65
Пример 3
59,87
18,90
4,38
0,85
3,03
8,70
3,76
0,21
99,09
Пример 4
60,31
18,60
5,90
0,82
3,22
8,12
2,30
0,42
99,69
Пример 5
58,78
13,05
4,26
0,83
2,30
7,78
3,33
8,67
100,00
Испытания эффективности бактерицидных свойств материала на основе монтмориллонитсодержащей глины модифицированной ионами серебра проводились в стерильных условиях с использованием стерильного оборудования и материалов. Для испытаний были использованы стерильные чашки Петри, содержащие стерильный мясопептонный агар (МПА) или кровяной агар с рН=7,2-7,4. Толщина слоя охлажденного МПА или кровяного агара - 2,5-3,0 мм. В питательные среды, охлажденные до 45-48°C, вносили навески стерильного материала в диапазоне от 1,56 до 100 мг на 1 мл питательной среды и взвесь исследуемых штаммов микроорганизмов. В контрольные чашки с питательной средой вносили только взвесь исследуемых микроорганизмов. Культивирование Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Salmonella dublin, Salmonella enteritidis, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intennedius, Staphylococcus aureus осуществляли на МПА, a Proteus vulgaris и Candida albicans - на кровяном агаре. Определение чувствительности микроорганизмов к материалам, полученным по примерам 1-5, в зависимости от их концентрации в МПА и кровяном агаре, проводили после их культивирования в термостате при температуре 37°C в течение 16-18 часов. Полученные результаты, приведенные в таблице 2, позволили установить их минимальную бактериостатическую концентрацию. Данные об эффективности бактерицидных свойств материала на основе монтмориллонит содержащей глины модифицированной ионами серебра, полученного по примерам 1-5, представлены в таблице 2.
Таблица 2
Чувствительность микроорганизмов к полученным материалам по примерам 1-5
Микроорганизмы
Концентрация материала, мг/мл
Количество КОЕ/мл по McFarland
пример 1
пример 2
пример 3
пример 4
пример 5
контроль **
Salmonella Dublin
12,50
*
*
6,25
*
*
3·10<sup>8</sup>
2·10<sup>8</sup>
12·10<sup>8</sup>
3,125
2·10<sup>8</sup>
1·10<sup>8</sup>
9·10<sup>8</sup>
8·10<sup>8</sup>
*
1,56
9·10<sup>8</sup>
6·10<sup>8</sup>
12·10<sup>8</sup>
15·10<sup>8</sup>
3·10<sup>8</sup>
Salmonella enteritidis
12,50
*
*
22·10<sup>8</sup>
6,25
*
*
2·10<sup>8</sup>
1·10<sup>8</sup>
3,125
2·10<sup>8</sup>
6·10<sup>8</sup>
18·10<sup>8</sup>
20·10<sup>8</sup>
*
1,56
18·10<sup>8</sup>
15·10<sup>8</sup>
22·10<sup>8</sup>
24·10<sup>8</sup>
2·10<sup>8</sup>
Staphylococcus hyicus
25,00
*
*
36·10<sup>8</sup>
12,50
3·10<sup>8</sup>
1·10<sup>8</sup>
6,25
*
*
9·10<sup>8</sup>
8·10<sup>8</sup>
3,125
6·10<sup>8</sup>
9·10<sup>8</sup>
33·10<sup>8</sup>
30·10<sup>8</sup>
*
1,56
15·10<sup>8</sup>
18·10<sup>8</sup>
39·10<sup>8</sup>
39·10<sup>8</sup>
2·10<sup>8</sup>
Proteus vulgaris
12,50
*
*
36·10<sup>s</sup>
6,25
*
*
6·10<sup>8</sup>
3·10<sup>8</sup>
3,125
2·10<sup>8</sup>
3·10<sup>8</sup>
30·10<sup>8</sup>
30·10<sup>8</sup>
*
1,56
18·10<sup>8</sup>
21·10<sup>8</sup>
36·10<sup>8</sup>
36·10<sup>8</sup>
3·10<sup>8</sup>
Staphylococcus aureus
25,00
*
*
36·10<sup>8</sup>
12,50
*
*
6·10<sup>8</sup>
2·10<sup>8</sup>
6,25
2·10<sup>8</sup>
1,5·10<sup>8</sup>
33·10<sup>8</sup>
30·10<sup>8</sup>
*
3,125
21·10<sup>8</sup>
15·10<sup>8</sup>
39·10<sup>8</sup>
36·10<sup>8</sup>
1,5·10<sup>8</sup>
Escherichia coli
25,00
*
*
39·10<sup>8</sup>
12,50
*
*
3·10<sup>8</sup>
1·10<sup>8</sup>
6,25
2·10<sup>8</sup>
1,5·10<sup>8</sup>
36·10<sup>8</sup>
30·10<sup>8</sup>
*
3,125
18·10<sup>8</sup>
9·10<sup>8</sup>
45·10<sup>8</sup>
39·10<sup>8</sup>
6·10<sup>8</sup>
Pseudomonas aeruginosa
25,00
*
*
39·10<sup>8</sup>
12,50
*
*
8·10<sup>8</sup>
6·10<sup>8</sup>
6,25
3·10<sup>8</sup>
6·10<sup>8</sup>
30·10<sup>8</sup>
21·10<sup>8</sup>
*
3,125
18·10<sup>8</sup>
15·10<sup>8</sup>
33·10<sup>8</sup>
33·10<sup>8</sup>
3·10<sup>8</sup>
Staphylococcus intermedius
25,00
*
*
30·10<sup>8</sup>
12,50
*
*
2·10<sup>8</sup>
1,5·10<sup>8</sup>
6,25
2·10<sup>8</sup>
3·10<sup>8</sup>
21·10<sup>8</sup>
18·10<sup>8</sup>
*
3,125
24·10<sup>8</sup>
18·10<sup>8</sup>
33·10<sup>8</sup>
30·10<sup>8</sup>
3·10<sup>8</sup>
Candida albicans
25,00
*
*
39·10<sup>8</sup>
12,50
*
*
6·10<sup>8</sup>
3·10<sup>8</sup>
6,25
8·10<sup>8</sup>
9·10<sup>8</sup>
33·10<sup>8</sup>
30·10<sup>8</sup>
*
3,125
15·10<sup>8</sup>
15·10<sup>8</sup>
45·10<sup>8</sup>
39·10<sup>8</sup>
6·10<sup>8</sup>
* Минимальная бактериостатическая концентрация;
** При проведении контрольных экспериментов использовали стерильный мясопептонный или кровяной агар без введения глины.
3
Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что полученные материалы по примерам 1, 2 и 5 обладали более выраженным бактериостатическим действием, чем образцы материала, которые были получены по примерам 3 и 4. Рассматриваемая таблица иллюстрирует и объясняет неодинаковое проявление чувствительности исследуемых микроорганизмов к различным антибактериальным материалам, полученных по примерам 1-5, так как в данных формах соответственно содержится 3,36; 3,61; 0,10; 0,20 и 4,35 масс.% серебра. Исследуемые антибактериальные материалы, полученные по примерам 1 и 2, подавляли рост и образование колоний Salmonella Dublin, Salmonella enteritidis, Staphylococcus hyicus на поверхности МПА и Proteus vulgaris на кровяном агаре уже при концентрации 6,25 мг на 1 мл питательной среды. Более эффективное бактериостатическое действие на эти же бактерии оказывал материал, полученный по примеру 5, при концентрации 3,125 мг/мл питательной среды. В то же время минимальная бактериостатическая концентрация изучаемых антибактериальных материалов, полученных по примерам 1 и 2, для Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius на поверхности МПА и Candida albicans на кровяном агаре составила 12,50 мг материала на 1 мл питательной среды. Антибактериальный материал, полученный по примеру 5, угнетал рост данных микроорганизмов при концентрации 6,25 мг/мл питательной среды. С целью определения бактерицидной концентрации антибактериальных материалов, полученных по примерам 1-5, со смывов из чашек, где отсутствовал рост исследуемых микроорганизмов, производили посевы на плотные питательные среды МПА и кровяного агара, которые не содержали изучаемого материала. После культивирования этих посевов в термостате при температуре 37°C, в течение 16-18 часов, отсутствовал рост микроорганизмов со смывов МПА и кровяного агара, в которых минимальная бактериостатическая концентрация антибактериального материала составляла 3,125; 6,25 и 12,50 мг/мл питательной среды. Такое же бактериостатическое действие антибактериальные материалы, полученные по примерам 3 и 4, проявили по отношению к Salmonella Dublin, Salmonella enteritidis и Proteus vulgaris, но при концентрации 12,50 мг/мл. На Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus, Staphylococcus intermedius и Candida albicans данные материалы влияли бактериостатически в концентрации 25,00 мг/мл. В то же время обогащенная форма нативной монтмориллонитовой глины при концентрации 100 мг/мл МПА и кровяного агара не подавляла рост исследуемых микроорганизмов, а наоборот, усиливала. При этом количество колониеобразующих единиц в смывах с поверхности плотной питательной среды опытных чашек Петри было в 1,1-1,9 раза больше чем в контрольных, т.е. не содержащих нативной формы глины. Таким образом, поставленная задача по созданию материала с антибактериальными свойствами на основе натрий-кальциевых, и/или кальциевых, и/или железистых монтмориллонитсодержащих глин, который может эффективно подавлять рост патогенных микроорганизмов с использованием при модифицировании растворов AgNO более низких концентраций по сравнению с прототипом, решена.