СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ЛАКТОФЕРРИНА, ФРАКЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЛАКТОФЕРРИН, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
METHOD FOR PRODUCING LACTOFERRIN, LACTOFERRIN-CONTAINING FRACTION  AND USING IT

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к качеству лактоферрина (ЛФ) с целью достижения оптимальности всех его действий и устранения каких-либо побочных эффектов.
УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Впервые лактоферрин, названный "красным белком", был обнаружен в коровьем молоке более 65 лет назад, и сразу после его выделения и очистки в 1960 году заинтриговал и озадачил исследователей. Впоследствии была определена его аминокислотная последовательность, трехмерная структура и подробно описаны свойства связывания железа, точно установлено, что лактоферрин является гликопротеином как член семейства трансферрина, и было подтверждено естественное предположение, что его биологическая функция относится к связыванию железа.
Важную роль сыграли разные исследовательские центры, сосредоточившие усилия на некоторых ключевых биологических функциях указанного белка. Лактоферрин был выделен как основной компонент определенных гранул полиморфно-ядерных лейкоцитов, имеющих большое значение для усиления воспалительной реакции. Большая работа исследовательской бельгийской группы под руководством Masson привела к установлению очевидной роли лактоферрина в клеточном иммунитете и к идентификации специфичных рецепторов лактоферрина на макрофагах, опосредовании эндотоксического шока и гипосидеремии. Исследовательские работы Montreuil и его французской группы привели к открытию биологической химии лактоферрина. Пищевая роль лактоферрина, состоящая в абсорбции ионов металлов в кишечном тракте, была открыта автором Lönnerdal. Регуляторная функция лактоферрина в миелопоэзе была раскрыта в работах Broxmeyer и его коллег. Со своей стороны Reiter опубликовал данные о способности лактоферрина из молока ингибировать рост некоторых микроорганизмов и обнаружил, что удаление железа из питания бактерий способствует антибактериальному действию. Бактерицидное действие лактоферрина против ряда микроорганизмов рассмотрено в работах Arnold и его коллег. Исследовательская группа под руководством Tomita в японской молочной производственной компании Morinaga обнаружила, что кислотный/пепсиновый гидролиз лактоферрина может приводить к образованию катионных антибактериальных пептидов "лактоферрицин".
in vivo
В ряде исследований было установлено, что добавление лактоферрина может обеспечить исключительную пользу для здоровья и мощную защиту против ряда заболеваний. Технологии функциональных характеристик объяснили молекулярные механизмы лактоферрин-опосредованной полифункциональной активности. Кроме того, исследователи из лабораторий всего мира подтвердили функциональные результаты добавления лактоферрина в рандомизированных исследованиях на людях и в экспериментальных моделях .
Но если проявление полифункциональной активности указанного внеклеточного гликопротеина, который действует как ключевой компонент первой линии иммунной защиты млекопитающих против поражающих факторов окружающей среды, наблюдалось при использовании высококачественного лактоферрина, полученного в лаборатории, авторы обнаружили отсутствие такой активности у лактоферрина промышленного производства.
Во время производственного процесса ЛФ извлекают из молока или сыворотки в присутствии других основных молочных белков (ОМБ), таких как лактопероксидаза, некоторые иммуноглобулины и другие примеси, концентрация которых зависит от специфичности катионообменной смолы. Это простая технология, которая заключается в выделении и очистке ЛФ. Фактически, существует преимущество в том, что большинство белков и ферментов, содержащихся в ОМБ, являются окрашенными. Элюирование разных компонентов, связанных со смолой, осуществляется с помощью растворов, имеющих разные концентрации NaCl. Применяя такие методики, промышленные производители полагают, что чистота от 90 до 92% соответствует достаточной чистоте ЛФ в целях его использования для разных применений.
Вместе с тем, ни один из указанных способов, ни любой другой существующий способ очистки промышленного лактоферрина не способен удалить примеси, которые влияют на стабильность и активность лактоферрина.
Предполагается, что в существующих промышленных препаратах лактоферрина присутствуют ферменты-загрязнители. Во время очистки лактоферрина из молока или сыворотки происходит сопутствующая очистка от этих ферментов.
В отношении загрязнителей, как будет показано ниже, авторы также выявили, что во время очистки ЛФ может быть очищен ангиогенин. Указанная молекула имеет молекулярную массу 15 кДа и изоэлектрический уровень pH 9,5, что очень близко к ЛФ.
Указанная молекула отвечает за образование кровеносных сосудов для снабжения раковых клеток, неоваскуляризацию, непременную для опухолевого роста и развития метастазов.
Во время очистки ЛФ концентрация указанной молекулы возрастает по меньшей мере в 4 раза, что, безусловно, не является полезным для здоровья потребителей.
Ангиогенин способствует воспалительному процессу, то есть создает возможность для миграции эндотелиальных и гладкомышечных клеток через базальную мембрану и прохождения их в участок повреждения. Ангиогенин способствует неоваскуляризации опухолевых клеток и росту метастазов раковых клеток.
Ангиогенин представляет собой белок массой 15 кДа с изоэлектрическим уровнем pH 9,5, что является очень близким к показателям ЛФ. Как описано в 1997 году авторами Strydom et al. (Eur. J. Biochem, 247, 535-544), ангиогенин наносили на СМ-52 (катион-обменную хроматографическую смолу) и элюировали 1M NaCl в 50 мМ фосфате натрия, при уровне pH раствора 6,6. Таким образом, не удивительно, что указанная молекула очищается совместно с ЛФ, и ее присутствие выявляют электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия SDS-PAGE во всем промышленном ЛФ.
Другой проблемой является производство полимеров ЛФ путем термической обработки, которые авторы также рассматривают, см. ниже.
В этой связи существует большая потребность в новых способах придания стабильности и очистки препаратов лактоферрина для удаления примесей, расщепления белка и ЛПС, для усиления действия на рост бактерий и сохранения стабильности белка в течение более длинного периода времени.
Первоначально лактоферрин был выделен как белок, обильно представленный в секретируемом молоке, вместе с тем он преимущественно выделяется поверхностным эпителием и секретируется в слизистую среду. Известно, что высокий уровень продукции лактоферрина выявлен не только в молоке, но также и в носовых и трахеальных путях и в желудочном, генитальном и глазном секрете. Высокий уровень выработки лактоферрина также наблюдается в нейтрофилах, где он накапливается во вторичных гранулах и высвобождается во время воспаления, способствуя их антибактериальному действию.
Лактоферрин содержит 2 гомологичных домена связывания железа, которые изолируют доступное железо и могут лишать домены бактерий, для которых требуется железо, этого необходимого элемента роста. Таким образом указанный белок проявляет бактериостатический эффект против широкого диапазона микроорганизмов и некоторых дрожжей. Кроме того, показано, что благодаря наличию катионоактивного пептида, расположенного близко к амино-концу белка, лактоферрин обладает и антибактериальным, и антиэндотоксическим действием, которые не зависят от функции связывания железа указанного белка. Эти области действуют посредством разрушения бактериальных мембран и связывания и инактивации содержащих липид-A бактериальных липополисахаридов, также называемых эндотоксинами (см. фигуру 1).
Лактоферрин также может регулировать клеточные сигнальные пути, затрагивающие такие действия, как облегчение воспаления, стимуляцию роста кости и подавление канцерогенеза.
Таким образом, противовоспалительное действие лактоферрина связано с его способностью ингибировать выработку провоспалительных цитокинов, но посредством нескольких разных механизмов, а регуляцию роста кости лактоферрин осуществляет посредством митоген-активируемых протеинкиназных путей. Растущее число исследований показывает, что лактоферрин обладает противораковыми свойствами, ингибируя раковый рост, что обусловлено его способностью модулировать пути, нарушающие клеточный цикл, или приводить к ап-регуляции экспрессии цитокинов, например интерлейкина-18.
Escherichia coli
Кроме того, антибактериальные функциональные возможности лактоферрина зависят от состояния его белковой конформации, связывания металлов и условий среды (Naidu AS and Arnold RR., 1995, Lactoferrin interactions and biological Functions pp. 259-275 Totowa, NJ, Humana Press). Антибактериальная активность возрастает при связывании лактоферрина с бактериальной поверхностью. Были определены специфичные бактериальные мишени связывания лактоферрина на различных грамположительных и грамотрицательных бактериальных патогенах (Naidu SS et al., 1991, APMIS, 99, 1142-1150). Высокоаффинное взаимодействие лактоферрина с белками внешней мембраны порообразующих грамотрицательных кишечных бактерий, включающих в себя , является важным для результата антибактериального действия лактоферрина (Erdei et al., 1994, Infect Immun, 62, 1236-1240). Таким образом, типичными примерами результатов указанного антибактериального действия является опосредуемое лактоферрином повреждение внешней мембраны грамотрицательных бактерий и индуцируемое лактоферрином потенцирование антибиотиков в результате изменения проницаемости внешней мембраны (Naidu et al., Diagn Microbiol Infect, 1988, Infect Immun, 56, 2774-2781). Взаимодействие лактоферрина с бактериальной поверхностью, в частности с внешними мембранами, создает другие антибактериальные механизмы, такие как блокада бактериальной адгезии к кишечному эпителию и специфичное отслаивание патогенов от слизистой оболочки кишки.
Специфичное связывание лактоферрина способно непосредственно нарушать барьерную функцию внешней мембраны бактерий и приводить к удалению факторов патогенной колонизации и прекращению выработки энтеротоксинов.
С другой стороны, Appelmelk и его коллеги (Appelmelk BJ, et al., 1994, Infection and Immunity, 62, 2628-2632) выявили, что ЛФ связывается с участком ЛПС - липидом-A, и исследователи Elass (Elass-Rochart E, et al. 1995, Biochem J. 312, 839-845) показали, что этот связывающий участок расположен на N-конце лактоферрина (пептиды от 1 до 52), где также расположена основная часть функциональных групп ЛФ. По этим результатам легко понять взаимоотношения между активностью лактоферрина и присутствием ЛПС, связанного с молекулярной структурой лактоферрина.
Существует непрерывный транспорт ЛПС и эндотоксина из просвета кишечника в кровеносное русло. У здоровых людей плазма крови инактивирует ЛПС и эндотоксины, поступающие из кишечника, и защищает внутренние органы от повреждения. Однако любые нарушения проходимости кишечника могут увеличивать поступление ЛПС и эндотоксинов в кровеносное русло. Такой массивный приток может исчерпать способность плазмы инактивировать ЛПС и эндотоксины и в итоге привести к клинической эндотоксемии (Opal SM, 2002, J. Endotoxin Res, 8, 473-476). Экспериментальные данные предполагают, что активные формы кислорода являются важными медиаторами клеточного повреждения при эндотоксемии, а также после макромолекулярного повреждения или нарушения внеклеточных и внутриклеточных регуляторных процессов. Важным механизмом предотвращения физиологической эндотоксемии является уменьшение поступления липополисахаридов (ЛПС) из просвета кишечника.
На N-конце пептида лактоферрицина происходит высокоаффинное связывание ЛФ с липидом-A, представляющим собой токсическую функциональную группу ЛПС, и ЛФ действует как терапевтический агент для нейтрализации эффектов ЛПС и эндотоксинов (Appelmelk BJ et al., 1994, Infect Immun, 62, 2628-2632). ЛФ может эффективно уменьшить ЛПС и приток эндотоксинов в кровеносное русло, когда токсины остаются в просвете кишечника, но для достижения такого результата важно, чтобы в произведенном ЛФ не содержалось ЛПС и эндотоксинов. Кроме того, если поступающие с пищей здоровому человеку ЛФ были покрыты ЛПС, необходима возможность удалять эти ЛПС из молекулы и переносить их в кровеносное русло.
in vitro
in vivo
Вместе с тем, в указанном способе содержание ЛФ также быстро уменьшается, и возможно, что при непрерывном высвобождении большого количества ЛПС и эндотоксинов для осуществления этой функции количество присутствующего ЛФ не является достаточным (Caccavo et al., 2002, J. Endotoxin Res, 8, 403-417). Имеются сообщения о защитном эффекте ЛФ против летального шока, индуцированного внутривенным введением эндотоксина. Проблема опосредуемой ЛФ защиты против эндотоксина (если молекула сама по себе не содержит эндотоксин во время ее изготовления) коррелирует и с устойчивостью к индуцированной гипотермии, и с общим улучшением состояния здоровья. Исследования  в анализе проточной цитометрии показали, что ЛФ дозозависимым образом ингибирует связывание эндотоксина с моноцитами, что предполагает, что механизм действия ЛФ  может быть обусловлен предотвращением индукции воспалительно-токсических цитокинов моноцитарно/макрофагального происхождения (Lee WJ et al., 1998, Infect Immun, 66, 1421-1421).
Клинические испытания на людях также показали положительное влияние употребления ЛФ для первичной активации защиты организма-хозяина (Yamauchi et al., 1998, Adv Exp Med Biol, 443, 261-265). У здоровых людей было выявлено улучшение функции нейтрофилов сыворотки, включающее в себя повышение фагоцитарной активности и выработку супероксидов. Кроме того, специфичное взаимодействие ЛФ с альвеолярными макрофагами, моноцитами, купферовскими клетками, эндотелием печени, нейтрофилами, тромбоцитами и T-лимфоцитами подчеркивает роль ЛФ в гуморальном и клеточном иммунитете (Hanson LA, 1988, Biology of human milk. Nestle Nutrition Workshop series, 15, New-York, Raven Press). Тем не менее, все эти действия, обусловленные взаимодействием ЛФ с указанными клетками, уменьшаются по причине присутствия ЛПС в структуре ЛФ и повреждения гликановых цепей ЛФ при применении очень высоких температур (> 550°C, более 15 секунд) во время производственного процесса и по причине очень высокой температуры при сушке молекулы, и также по причине присутствия полимеров ЛФ, которые возникают во время термической обработки молекулы.
В отношении развития кишечника и восстановления слизистой оболочки было показано, что пероральное введение ЛФ может действовать в слизистой оболочке кишечника как иммуностимулирующий фактор.
in vivo
В период грудного вскармливания новорожденного происходит более быстрое развитие желудочно-кишечного тракта. Его активация зависит от связывания ЛФ с кишечным эпителием. ЛФ может усиливать включение тимидина в ДНК клеток крипт . Этот трофический эффект способствует регенерации клеток и восстановлению ткани слизистой оболочки кишечника при таких состояниях, как гастроэнтерит (Nichols et al., 1990, Pediatr Res., 27, 525-528). Присутствие ЛПС в структуре ЛФ уменьшает это действие ЛФ вследствие того, что связывание ЛФ с кишечным эпителием происходит в пептиде (1-52), что относится к той же локализации, что ЛПС.
ЛФ также играет важную роль в кишечной абсорбции железа и других необходимых микроэлементов, таких как цинк, медь (Lonnerdäl B., 1989, J. Nutr. Suppl, 119, 1839-1844). ЛФ также защищает слизистую оболочку кишечника от излишнего захвата ионов тяжелых металлов. Рецепторы специфичного связывания ЛФ щеточной каемки в двенадцатиперстной кишке человека вовлечены в абсорбцию железа (Cox et al., 1979, Biochem Biophy Acta, 588, 120-128). Был идентифицирован кишечный рецептор ЛФ. Исследователи (Kawakami H et al., 1991, AmJ. Physiol, 261, G841-G846 and Rosa G et al., J.Med Biol. Res, 27, 1527-1531) опубликовали данные об увеличенной абсорбции железа посредством указанного рецептора ЛФ из кишечных мембран щеточной каемки, и также было показано, что пептид ЛФ, который отвечает за связывание молекулы с ее специфичным рецептором, локализуется на пептиде 1-52, который также отвечает за связывание с ЛПС.
В отношении противоопухолевого действия ЛФ было показано, что ЛФ дозозависимым образом усиливает активность моноцитов как натуральных киллеров (NK). ЛФ значительно усиливает цитотоксическую активность и NK, и лимфокин-активируемых клеток-киллеров (LAK). ЛФ в низких дозах является эффективным модулятором клеточно-опосредованного иммунного ответа и сывороточных цитотоксических факторов, если ЛПС не связаны со структурой ЛФ и если ЛФ не загрязнен ангиогенином. Однако в более высоких концентрациях ЛФ-опосредуемая индукция может быть причиной, соответственно, положительной или отрицательной обратной связи, которая не является необходимой для плотности и субпопуляций в популяции иммунных клеток, но также к присутствию ЛПС в структуре ЛФ.
С открытием специфичных рецепторов ЛФ на макрофагах, T- и B-лимфоцитах и лейкозных клетках был установлен возможный потенциал противоопухолевого действия ЛФ (Shau et al., 1992, L. Leukoc Biol, 51, 343-349), который может быть уничтожен присутствием ЛПС в его структуре.
in vivo
Helicobacter pilory
Противовоспалительное действие ЛФ прежде всего связано с его способностью извлекать железо. Известно, что накопление железа в воспаленных тканях может приводить к каталитической продукции высокотоксичных свободных радикалов. Во время воспалительного ответа нейтрофилы, содержащие кислотные гранулы, мигрируют к участку поражения для высвобождения своего ЛФ. В результате в воспаленном участке ткани создается очень кислая среда, чтобы усилить возможности ЛФ к связыванию железа и детоксикации. Помимо модуляции гомеостаза железа во время воспаления, установлено доказательство, что ЛФ может непосредственно регулировать разные воспалительные реакции. Независимый от железа механизм действия основан на связывании ЛФ с бактериальными ЛПС, которые являются основными провоспалительными медиаторами при бактериальных инфекциях и септическом шоке (Miyazawa et al., 1991, J. Immunol, 146, 723-729). ЛФ может играть важную роль в модуляции желудочного воспаления, поскольку этот белок также экспрессируется в слизистой оболочке желудка и взаимодействует с рецепторами, локализующимися в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта. Это действие ЛФ значительно уменьшено или даже полностью отсутствует, если структура ЛФ имеет оболочку в виде ЛПС. Ряд исследований  показали, что пероральное введение ЛФ может облегчать гастрит, вызванный ,и защитить целостность слизистой оболочки кишечника при эндотоксемии. Аналогично, такое действие ЛФ является очень слабым, если ЛПС связаны со структурой ЛФ.
Независимое от железа действие ЛФ может быть описано следующим образом: одной из основных провоспалительных функций эндотелиальных клеток является рекрутинг лейкоцитов циркулирующей крови в воспаленных участках ткани. Липополисахариды (ЛПС) или эндотоксины являются наиболее распространенными гликолипидами внешней мембраны грамотрицательных бактерий. ЛПС представляют собой мощные стимуляторы воспаления, которые индуцируют или непосредственно, или посредством цитокинов экспрессию молекул адгезии, таких как молекула эндотелиальной-лейкоцитарной адгезии (E-селектин) и молекула внутриклеточной адгезии (ICAM-1). Эндотоксиновая стимуляция эндотелиальных клеток опосредуется выявленным растворимым белком CD14 (sCD14), представляющим собой специфичный рецептор. CD14 является гликопротеином размером 55 кДа, который находится в сыворотке, и в виде заякоренного белка (mCD14) на поверхности моноцитов - макрофагов. В зависимости от концентрации ЛПС (эндотоксинов) в этом механизме присутствуют промежуточное звено, называемое ЛПС-связывающим белком (LBP), который катализирует перенос мономеров ЛПС из агрегатов в CD14, чтобы образовать комплекс SCD14-ЛПС. Таким образом, активация эндотелиальных клеток комплексом SCD14-ЛПС или ЛПС единственными вызывает различные патофизиологические реакции, включающие в себя лихорадку и гипотонию, способствует лейкоцитарной инфильтрации и микроваскулярному тромбозу и способствует развитию диссеминированного внутрисосудистого воспаления при септическом шоке.
Тем не менее, лактоферрин, обнаруженный в экзокринном секрете млекопитающих и высвобождаемый из гранул нейтрофилов во время воспаления, способен модулировать активацию клеток и предотвращать серьезные повреждения, вызванные присутствием ЛПС.
Концентрации лактоферрина как следствие инфекции, превышающие 20 мкг/мл, можно обнаружить в крови. Лактоферрин представляет собой часть первичной системы защиты против воспаления. Предполагается, что любое присутствие бактерий в организме может вызвать воспаление, рак и другие патологии. Эта индукция будет стимулировать иммунные ответы, включающие в себя продукцию цитокина, повышение экспрессии молекул клеточной адгезии и секрецию провоспалительного медиатора моноцитами, макрофагами и нейтрофилами, которые поступают в определенные ткани хозяина вследствие системного воздействия ЛПС. Реакция хозяина на ЛПС опосредована и иммуномодулирующими молекулами, такими как фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа), члены семейства интерлейкинов (ИЛ), активные формы кислорода и липиды. Повышенная продукция указанных медиаторов вызывает повреждение тканей, которое предшествует полиорганной недостаточности.
Лактоферрин предотвращает LBP-опосредованное связывание ЛПС с mCD14 и уменьшает высвобождение цитокинов из ЛПС-стимулируемых моноцитов. Лактоферрин также может модулировать воспалительный процесс. Опубликованы сообщения об исследования, подтвердивших защитную функцию лактоферрина против сублетальных доз ЛПС у мышей. В заключение, способность лактоферрина связывать свободные ЛПС частично может объяснять противовоспалительное действие молекулы.
Поэтому при введении человеку и животному лактоферрина перорально или путем инъекции для укрепления или профилактики дефицита первичной защитной системы организма основная задача заключается в том, чтобы качество лактоферрина было идентично качеству лактоферрина, вырабатываемого эндогенно здоровым человеком, организму которого необходима защита против микробной атаки. Понимая, что по мере старения выработка эндогенного лактоферрина резко снижается, пациенты должны принимать экзогенный лактоферрин или перорально, или в виде инъекций.
Streptococcus thermophilus,.
Примеси в исходном материале могут мешать применению ЛФ для здоровья человека. Все из перечисленных факторов, включающих в себя происхождение исходного материала, очистку белка, способы сушки и сбора полученной продукции, условия производства и условия хранения в комплексе содействуют биологической нагрузке белка ЛФ. Соответственно, с молоком, сывороткой или молочной сывороткой, которые применяются в качестве исходного материала, могут поступать ферментирующие стрептококки (..), и среда с кислой реакцией может быть селективно обогащена некоторыми дрожжами и плесневыми грибами. Кстати, общеизвестно, что указанные популяции микроорганизмов размножаются и конкурентно ограничивают рост некоторых пробиотиков.
Streptococcus uberis, Staphycoccus aureus
Bacillus spp., Acinetobacter calcoaceticus, Klebsiella oxytoca, Pseudomonas spp.
E.coli
При получении ЛФ из молока при загрязнении молочного резервуара источником мастита с молоком могут поступать находящиеся в нем ЛПС из грамположительных кокков, включающих в себя  и грамотрицательных стафилококков. С другой стороны, загрязнители из окружающей среды, такие как спорообразующие и коли-формы, включающие в себя , и ЛПС таких микроорганизмов могут поступать в материал ЛФ через промывочный буфер, оборудование с биопленками, вентиляционные каналы и т.д. Подобные проблемы микробиологического качества могут возникать для белков ЛФ ГМО-происхождения и рекомбинантных ЛФ от разных видов, таких как рис, табак, дрожжи, клеточные культуры или трансгенные животные. Таким образом, удаление или значительное уменьшение таких ЛПС-микробных загрязнений является очень желательным для применения промышленного ЛФ в целом для здоровья человека.
in vivo
Согласно вышеприведенному объяснению, наличие ЛПС и эндотоксина в исходном материале может иметь неблагоприятный эффект на применение ЛФ. Липополисахариды (ЛПС) во внешней мембране грамотрицательных бактерий обычно состоят из гидрофобной области, известной как липид-A (или эндотоксин), неповторяющегося олигосахаридного ядра и дистального полисахарида (или O-антигена) (Erridge et al., 2002, Microbes Infect, 4, 837-851). ЛПС и эндотоксины могут стимулировать индукцию цитокинов и других медиаторов воспаления, что, в свою очередь, способно запускать широкий диапазон неблагоприятных физиологических ответов (Raetz et al., 2002, Annu Rev Biochem, 71, 635-700). Грамотрицательная биологическая нагрузка молока или его производных, используемых для выделения белка, среда и условия заводской обработки в совокупности создают уровни содержания ЛПС и эндотоксина в исходном материале ЛФ. Потенциальные резервуары загрязнения эндотоксинами при выделении белковых материалов рассмотрены в публикации (Majde et al., 1993, Peptides 14, 629-632). В работе Rylanders (Rylander 2002, J. Endotoxin Res, 8, 241-252) также рассмотрено появление содержания эндотоксина в разных условиях окружающей среды и дополнительно указано на риски, связанные с небактериальными эндотоксинами, в частности 1-3-β-D-гликаном из клеточных оболочек плесневых грибов. Таким образом, микробиологические стандарты хранения хроматографических смол, санитарные нормы обработки оборудования, еще более важно, качество воды, используемой при очистке ЛФ, могут в совокупности способствовать наличию ЛПС и эндотоксина в очищенном ЛФ-материале и, таким образом, могут ограничивать применения промышленного ЛФ . Предварительное присутствие комплексов ЛФ-ЛПС и эндотоксинов уменьшает потенциал взаимодействия ЛФ с кишечным эпителием и уменьшает его способность регулировать поступление из кишечника ЛПС и эндотоксинов.
Таким образом, из всего промышленного лактоферрина необходимо удалять ЛПС, связанные с его молекулярной структурой. Например, авторами Ward, Loren и коллегами в патенте WO2009/009706 описан способ удаления эндотоксинов, связанных с ЛФ, и производство лактоферринового продукта, не содержащего эндотоксин (EFL). Речь не идет об анализе концентрации ЛПС с использованием limulus-теста. Было также показано, что при значительной концентрации ЛПС, связанных со структурой лактоферрина, комплекс ЛПС-ЛФ способен в некоторой степени индуцировать продукцию медиаторов воспаления в макрофагах, вместо полного ингибирования действия ЛПС. В основном это обусловлено тем, что при высокой концентрации ЛПС существует равновесие между связанными ЛПС → несвязанными ЛПС, и именно присутствие несвязанных ЛПС индуцирует продукцию медиаторов воспаления. Это является причинами, которые обязывают производителей ЛФ в целях безопасности очищать молекулу, не содержащую ЛПС, связанных с поверхностью молекулярной структуры ЛФ.
Поскольку лактоферрин производят из молока и/или сыворотки, молекулярная структура ЛФ в норме имеет покрытие в виде бактериальных ЛПС, находящихся в молоке, и может представлять опасность загрязнение молочного резервуара микробной колонизацией из молока коров с маститом. Авторы выяснили, что активность лактоферрина частично представлена его антибактериальной ролью, которая заключается в связывании с ЛПС бактерий, присутствующих в молоке. Это означает прогнозируемую экстракцию из молока лактоферрина, полностью покрытого ЛПС, который потерял важную часть своей биологической активности в отношении антиоксидантного, антибактериального действия и свое ингибирующее действие на образование бактериальной биопленки и, соответственно, свое пробиотическое действие.
Кроме того, ЛФ можно денатурировать термической обработкой. Можно использовать разные параметры для изучения термостабильности лактоферрина. Термическая денатурация соответствует первому закону кинетики. Денатурация возрастает с повышением температуры. Не содержащий железо лактоферрин (Apo-лактоферрин) показывает более быструю денатурацию, чем лактоферрин, насыщенный железом (Holo-лактоферрин). Это отражает более стабильную конформацию при связывании с железом. Во время термической денатурации разрыв нескольких связей вызывает серьезные изменения в структуре ЛФ. Термическая стабильность увеличивается в присутствии других компонентов молока благодаря взаимодействию между лактоферрином и казеинатами и другими молочными белками.
Экстрагируемый из молока лактоферрин имеет уровень насыщения железом от 9 до 20% насыщенного железом лактоферрина. Однако после пастеризации молочной или творожной сыворотки экстрагированный белок не обладает тем же уровнем активности и имеет другие показатели по сравнению с лактоферрином, экстрагированным перед любой термической обработкой молочной или творожной сыворотки.
Фактически, термическая обработка способна разрушать гликановые цепи молекулы, которые играют роль в защите лактоферрина от протеолитических ферментов, присутствующих в желудке, и также могут продуцировать ЛФ-полимеры. Этот эффект также подтверждается тем фактом, что при термическом воздействии на лактоферрин молекула имеет более высокую спектральную поглощательную способность при 280 нм (таблица 1).
Разрушение гликановых цепей, чувствительных к термической обработке, также увеличивает неспецифическое связывание лактоферрина на клетках. Вместо содействия клеточному росту неспецифичное связывание лактоферрина скорее вызовет «удушье» клеток. Фактически, производители промышленного ЛФ установили определение чистоты ЛФ с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии ВЭЖХ с использованием градиента ацетонитрила. Анализируя чистоту некоторых промышленных ЛФ, авторы отмечают, что белковые примеси составляют примерно 8-9% по отношению к пику ЛФ. Однако при разведении того же количества промышленного ЛФ, с регулированием содержания золы и влаги, авторы не получили аналогичного значения оптической плотности при 280 нм. Это означает, что некоторые белки, элюируемые как ЛФ, могут увеличивать оптическую плотность. В фигуре авторы отмечают, что в анализе ионнообменной хроматографии быстрого разрешения FPLC (смола Mono-S-сульфопропил) ЛФ показывает меньшую поверхность по сравнению с поверхностью ЛФ при термической обработке. Уменьшение высоты поверхности обусловлено присутствием новой поверхности, которая соответствует плечу, наблюдаемому в анализе FPLC и называемому авторами пиком C для упрощения описания хроматограммы. Авторы также отмечают, что поверхность ЛФ разделена на две части: пик A и пик B, очень близкие друг к другу и соответствующие пику А в присутствии одной сиаловой кислоты, содержание которой придают молекуле менее основные характеристики по сравнению с исходной молекулой, которая не содержит сиаловой кислоты. В случае ЛФ-NFQ поверхность ЛФ также состоит из двух поверхностей (поверхность A и поверхность B). Плечо (поверхность C) наблюдается только у промышленного ЛФ. Плечо или поверхность C имеет более высокую спектральную поглощательную способность при 280 нм по сравнению с исходной ЛФ, см. таблицу 1 ниже.
В любом случае авторы считают, что пик A и пик B составляют части очищенного ЛФ. Присутствие пика C невозможно обнаружить с помощью обращенно-фазовой хроматографии. Чтобы получить представление о наличии этого пика C, авторы проводили анализ полного спектра поглощательной способности от 280 нм до 800 нм и наблюдали полосу Soret при 410 нм (фигура 2), которая не зависит от содержания железа в ЛФ, поскольку указанная полоса Soret должна присутствовать при длине волны, близкой к 465 нм. Кроме того, спектральная поглощательная способность этого пика C при 280 нм почти вдвое превышает значение для ЛФ единственного.
Получая данные только о пиках A и B и при повторном нанесении на смолу моно-S авторы отмечают присутствие на хроматограмме только пиков A и B без загрязнения пиком C. С другой стороны, если на раствор, содержащий пики A и B, воздействовали температурой 72°C в течение 5 минут и анализировали указанный раствор на смоле моно-S, авторы наблюдали значительное уменьшение поверхности пика A и поверхности пика B по сравнению с исходной хроматограммой, но также появление пика C (фигура 2). Если термическое воздействие на ЛФ было более продолжительным, больше пиков A и B будут иметь более низкую поверхность, и пик C будет выражен больше.
При сравнении обращенно-фазовой хроматограммы ЛФ без термической обработки и хроматограммы того же самого ЛФ после термического воздействия (72°C) в течение 5 минут авторы отмечают, что поверхность ЛФ без термической обработки ниже, чем поверхность ЛФ после термической обработки (фигура 3). Пик C указывал на полимеры ЛФ, имеющие намного большую поглощательную способность.
Таблица 1
Нагревание(30 секунд)
Поглощение при 280 нм для раствора ЛФ 1 мг/мл
<50°C
1,326
70°C
1,38
80°C
1,42
85°C
1,42
Проблема заключается не только в том, что очищенный изготовителем лактоферрин теряет процент своей биологической активности, что можно компенсировать добавлением молекул в более высокой концентрации, но в том, что чем чаще рекомендуется использовать относительно высокую концентрацию ЛФ для достижения определенного уровня активности, тем чаще рекомендуется использовать ЛПС в высокой концентрации. Это может автоматически вызывать воспалительный процесс вместо защитного действия для пациентов (таблица 3).
in vivo
В настоящее время на рынке здоровой пищи в мире доступен ряд продуктов ЛФ. Большинство таких продуктов получено из частично выделенного ЛФ из молозива, молочной или творожной сыворотки. Кроме того, существует компромисс проблем микробиологического и токсикологического качества и стандартов действия ЛФ  в качестве потенциального пищевого материала.
Лактоферрин обычно очищают из молока или сыворотки (молочной сыворотки или творожной сыворотки) с помощью одного или больше разных методик хроматографии со смолами, таких как ионнообменная, в частности катионообменная, аффинная (с иммобилизированным гепарином, одноцепочечной ДНК, лизином или аргинином), аффинная хроматография с красителем и эксклюзионная хроматография. Также можно применять ультрафильтрационную мембрану для сепарации лактоферрина из молока или сыворотки. Tornita и его коллеги (Tomita и др., 2002, biochem Cell Biol, 80, 109-112) приводят пример способа производства, в котором применяется и катионообменная хроматография и мембранная фильтрация с тангенциальным потоком. Другой способ очистки с использованием катионообменной хроматографии был описан исследователями Okonogi и его коллегами (Okonoki et al., новозеландский патент № 221082), Ulber (Ulber et al., 2001, Acta Biotechnol, 21, 27-34) и Zhang и его коллегами (Zhang et al., Milchwissenschaft 2002, 57, 614-617). Некоторые исследователи использовали гидрофобные свойства молекулы для очистки лактоферрина с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия. Machold описал характер удержания лактоферрина на некоторых смолах гидрофобного взаимодействия при разных концентрациях солей (Machold et al., 2002, J. Chromatogr. A972, 3-19).
Разные способы были подробно описаны доктором Denis Petitclercq в патентной заявке WO 2006/119644, цель его изобретения состояла в обеспечении способа удаления ферментных примесей, отвечающих за расщепление лактоферрина. Удаление этих ферментов или добавление специфичных ингибиторов может предотвращать расщепление препаратов лактоферрина и потерю активности лактоферрина. Указанный способ автор применил ко всему промышленному лактоферрину, продемонстрировав возможность улучшения стабильности и активности лактоферрина. Автор рассматривает способ очистки лактоферрина, содержащий стадии контакта по схеме связывания-и-элюирования и методики адсорбции раствора лактоферрина с гидрофильньным абсорбентом и с гидрофобным в присутствии сурфактанта как в присутствии исключенного растворенного вещества и сбора фракции, содержащей лактоферрин, который, по существу, не содержит примесных ферментов, так и/или ингибитора лактоферрина.
Автор показал, что по сравнению с лактоферрином, очищенным с применением его способов, промышленный лактоферрин, полученный от того же поставщика, а также от других поставщиков, доступных на рынке, не проявлял аналогичного действия. В отношении антибактериальной активности очищенный лактоферрин не терял своего действия при более высокой концентрации лактоферрина в среде (фигура 4). Ни один из доступных на рынке препаратов промышленного лактоферрина не смог проявить минимальную концентрацию ингибирования, и автор показал, что эти препараты промышленного лактоферрина, экстрагированные из молока или сыворотки, потеряли свое ингибирующее действие на рост в высокой концентрации. Однако доктор Petitclerc сделал вывод, что такое явление обусловлено присутствием протеаз или расщепленных пептидов ЛФ, но без какого-либо упоминания о присутствии ангиогенина.
Несмотря на все эти исследования, ни один из способов производства, ни какой-либо другой из существующих способов очистки в промышленном масштабе не могут очищать лактоферрин, поскольку он присутствует в различных жидких секретах нашего организма.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является преодоление указанных проблем и получение ЛФ такого же качества, как у вырабатываемого в организме ЛФ, при этом избегая присутствия загрязнителей, таких как протеолитические ферменты и ангиогенин, избегая присутствия бактериальных липополисахаридов (включающих в себя эндотоксины), избегая разрушения гликановых цепей, и было разработано получение полимеров ЛФ при любой термической обработке при температуре выше 55°C с применением новой технологии, которая позволяет производить в промышленном масштабе такой ЛФ, который может обладать по меньшей мере 90% своих биологических действий.
Целью изобретения является способ, позволяющий:
- эффективно удалять примеси, которые влияют на стабильность и активность лактоферрина и удалять примеси, имеющие отрицательное воздействие на здоровье,
- заботиться о термочувствительности гликановых цепей, которые отвечают за защиту молекулы против протеолитического расщепления протеазами и также имеющих значение для улучшения связывания молекулы на специфичных клетках и избегания появления полимеров ЛФ,
- удалять присутствие бактериальных ЛПС и эндотоксинов, связанных с молекулярной структурой лактоферрина, которые влияют на действие молекулы и также могут индуцировать своим присутствием процесс воспаления.
Согласно настоящему изобретению рассматривается способ производства лактоферрина, содержащий по меньшей мере следующие стадии:
a) удаление сырья, которое не подлежит обработке при температуре выше 55°C,
b) осуществление обработки указанного сырья для получения раствора лактенина (ЛН) или основного молочного белка (ОМБ),
c) проведение стадии очистки указанного раствора ЛН или ОМБ на катионообменнной смоле, уравновешенной ацетатным буфером при уровне pH от 4 до 9, и элюирование разными буферными растворами, содержащими разные концентрации раствора,
d) сбор фракции, содержащей лактоферрин с чистотой более 95%, по существу, не содержащей ЛПС, эндотоксины и ангиогенин.
В одном варианте осуществления стадия b) представляет собой стадию переноса указанного сырья на стадию экстракции на катионообменной смоле, используя концентрацию раствора исключенного растворенного вещества для получения раствора лактенина (ЛН) (фигура 5).
В одном варианте осуществления стадии экстракции или очистки на катионообменной смоле осуществляются по проточной схеме или путем связывания и элюирования.
В одном варианте осуществления исключенное растворенное вещество представляет собой хлорид натрия. В другом варианте осуществления стадию концентрации и диафильтрации осуществляют после стадии b).
В дополнительном варианте осуществления стадия c) содержит по меньшей мере четыре стадии элюирования, стадию сбора примесей, стадию сбора лактопероксидазы, стадию сбора ЛПС, эндотоксинов и ангиогенина и стадию сбора лактоферрина (фигура 5).
В одном варианте осуществления стадии сбора примесей, лактопероксидазы, ЛПС, эндотоксинов и ангиогенина выполняют при уровне pH от 4 до 8 и предпочтительно от 6 до 7.
В одном варианте осуществления стадии сбора лактоферрина выполняют при уровне pH в диапазоне от 7 до 9.
В одном варианте осуществления на стадии очистки раствор представляет собой хлорид натрия при концентрации в диапазоне от 0,02 до 1,5 М.
Согласно настоящему изобретению рассматривается лактоферрин, имеющий чистоту более 95%, по существу, не содержащий ЛПС и эндотоксины и имеющий насыщенность железом от 9 до 20%.
В дополнительном варианте осуществления лактоферрин содержит менее 50 пг/мг ЛПС, эндотоксинов и ангиогенина.
В дополнительном варианте осуществления лактоферрин имеет уровень насыщенности железом, который составляет от 9% до 20%.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 показывает локализацию ЛПС и липида-A (эндотоксина) на клеточной стенке грамотрицательных бактерий.
Фигура 2 показывает ионнообменную хроматограмму на хроматографе FPLC (нижняя кривая) ЛФ, на который не воздействовали термической обработкой, и хроматограмму того же ЛФ, который подвергался термической обработке (верхняя кривая).
Фигура 3 показывает хроматограмму на обращенно-фазовой ВЭЖХ с ЛФ, на который не воздействовали термической обработкой, и хроматограмму того же ЛФ, который подвергался термической обработке.
Фигура 4 показывает определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) с использованием микроразведений бульона коровьего ЛФ, очищенного на сефарозной колонке с быстрым потоком SP-Sepharose, называемого LF-NFQ, по сравнению с разными промышленными препаратами ЛФ.
Фигура 5 показывает схему производства лактопероксидазы и лактоферрина.
Фигура 6 показывает общую диаграмму очистки ЛФ.
Фигура 7 показывает измерение способности связывания железа путем измерения оптической плотности лактоферрина, постепенно доводимого до полного насыщения последовательным добавлением аликвотных количеств раствора трехвалентного железа.
Фигура 8 показывает действие связывания железа лактоферрина, экстрагированного из пастеризованного молока, лактоферрина из ультрапастеризованного (UHT) молока, лактоферрина из микрофильтрованного молока и лактоферрина настоящего изобретения (ЛФ-NFQ).
Escherichia coli
Фигура 9 показывает антибактериальную активность. Присутствие ЛПС на структуре ЛФ (ЛФ) уменьшает его антибактериальное действие по отношению к  по сравнению с ЛФ, не содержащим ЛПС (ЛФ-NFQ).
Helicobacter pilory
Фигура 10 показывает антибактериальную активность. Присутствие ЛПС на структуре ЛФ (ЛФ) уменьшает его антибактериальное действие против  по сравнению с ЛФ, не содержащим ЛПС (ЛФ-NFQ).
Фигура 11 показывает антиоксидантное действие ЛФ-NFQ, измеряемое кинетическим анализом, и сравнивает его с действием ЛФ, экстрагированным из коровьего молока (12000 пг ЛПС/мг ЛФ), и с ЛФ, экстрагированным из коровьей сыворотки (30000 пг ЛПС /мг ЛФ).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Поскольку ЛФ денатурируется термической обработкой в зависимости от условий, пастеризованное сырье, такое как коровье молозиво, коровья молочная и творожная сыворотка, не подходят в качестве источника для очищенного кЛФ (коровьего лактоферрина). Поэтому источниками кЛФ могут быть обезжиренное молоко, творожная сыворотка и молозиво, которые не подвергались жесткому нагреванию. Поскольку согласно своему аминокислотному составу ЛФ имеет катионные характеристики, его можно очищать катионообменной хроматографией, например карбоксиметил (СМ)-сефадексом (Law et al., 1977; Yoshida et al., 2000), и указанный способ очистки является наиболее распространенной технологией для очистки кЛФ в компаниях-поставщиках кЛФ. Например, обезжиренное молоко (уровень pH 6,7) или творожная сыворотка (уровень pH 6,4) подвергаются фильтрации и вносятся в катионообменную хроматографическую колонку без регуляции уровня pH.
Как показано на фигуре 5, материал, который удаляли из катионообменной смолы (экстракционная смола) с использованием высококонцентрированного раствора NaCl (8%), называется лактенин (ЛН) или основной молочный белок (ОМБ). ЛН представляет собой раствор, содержащий лактоферрин, лактопероксидазу и некоторые другие молекулы (+/-5%).
Указанный ЛН подвергается микрофильтрации, концентрированию и диафильтрации перед его внесением в другую катионообменную смолу, уравновешенную ацетатным буфером при уровне pH 5,5, называемую очищающей смолой. Фактически, во время этой второй хроматографии содержащиеся в ЛН разные молекулы будут подвергаться элюированию путем применения разных буферных растворов, содержащих разные концентрации NaCl. Эта вторая хроматография имеет большое значение для получения лактоферрина согласно формуле изобретения (фигура 6).
Лактоферрин концентрировали ультрафильтрацией и отделяли от NaCl путем диафильтрации. Затем раствор ЛФ высушивали при низкой температуре в вакууме (технология лиофилизации) и упаковывали в пакетики из пищевого алюминия.
Лактоферрин, получаемый способом согласно формуле изобретения, далее в настоящем описании именуется ЛФ-NFQ.
Термическая и химическая стабильность лактоферрина
Существуют различные параметры, которые можно применять для изучения термической стабильности лактоферрина. Денатурация путем термической обработки соответствует первому закону кинетики. Денатурация усиливается по мере повышения температуры. Лактоферрин, не содержащий железа (Apo-лактоферрин), показывает более быструю денатурацию, чем насыщенный железом лактоферрин (Holo-лактоферрин). Это отражает более стабильную конформацию при связывании с железом. Во время термической денатурации разрыв нескольких связей вызывает серьезные изменения в структуре ЛФ. Термическая стабильность увеличивается в присутствии других компонентов молока благодаря взаимодействию между лактоферрином и казеинатами и другими молочными белками.
Экстрагируемый из молока лактоферрин имеет уровень насыщения железом от 9 до 20% насыщенного железом лактоферрина. Однако после пастеризации молочной или творожной сыворотки экстрагированный белок не обладает тем же уровнем активности и имеет другие показатели по сравнению с лактоферрином, экстрагированным перед любой термической обработкой молочной или творожной сыворотки.
Фактически, термическая обработка способна разрушать гликановые цепи молекулы, которые играют роль в защите лактоферрина от протеолитических ферментов, присутствующих в желудке, и также могут продуцировать ЛФ-полимеры. Этот эффект также подтверждается тем фактом, что при термическом воздействии на лактоферрин молекула имеет более высокую спектральную поглощательную способность при 280 нм.
Действие связывания железа лактоферрина
Активность лактоферрина, экстрагированного из микрофильтрованного молока, тестировали на его действие связывания железа. Лактоферрин постепенно доводили до полного насыщения последовательным добавлением аликвотных количеств раствора трехвалентного железа. Уровень насыщения железом контролировали спектрофотометрически при 465 нм.
Насыщенность достигалась, когда прекращалось изменение измеряемой оптической плотности (фигура 7). В графике указаны два способа оценки начального уровня насыщения железом при вычислении отношения спектральной поглощательной способности, измеряемой при 465 нм для исходного белка (b1) и насыщенного белка (b2)
b1---×100=% исходного насыщения b2
или путем вычисления a1/a, где
a1 = количество мкмолей ионов железа, связанных с исходным белком,
a = количество мкмолей трехвалентного железа, связанного с насыщенным белком,
а1---×100=% исходного насыщения.
Если лактоферрин является интактным и активным, его способность связывать железо сохраняется. С другой стороны, при денатурации белка после UHT обработки или частичной потере, обусловленной пастеризационной обработкой, он теряет свою способность к связыванию железа (фигура 8).
Лактоферрин коровьего молока имеет уровень насыщенности железом от 9 до 20%. Результаты показывают, что способность к связыванию железа сходна у лактоферрина, экстрагированного из микрофильтрованного молока, и у лактоферрина по изобретению, различие между двумя результатами не является достоверным.
Антибактериальное действие
Escherichia coli
Как показано выше, функциональные возможности антибактериального действия зависят от конформации белка, связывания металла и условий среды (Naidu et al., 1995). Антибактериальное действие усиливается при связывании ЛФ с поверхностью микробной клетки (Naidu et al., 1993). Высокоаффинное взаимодействие ЛФ с белками внешних мембран порообразующих грамотрицательных кишечных бактерий, включающих в себя , является необходимым для антибактериального результата ЛФ (Ellison et al., 1988).
Таким образом, при производстве ЛФ из сыворотки коровьего молока или творожной сыворотки важна уверенность в отсутствии бактериальных липополисахаридов, связанных со структурой ЛФ.
Escherichia coli
Helicobacter pilory
Лактоферрин тестировали по двум микроорганизмам  и , результаты приведены в фигурах 9 и 10 соответственно.
Escherichia coli
Тесты с
Биологический материал
E. coli
K99 из коллекции бактерий BCCM/LMG: Laboratorium van Microbiology Universiteit Gent K. L. Lededanckstraat 35B, 9000 Gent. Селективная среда SCC Coli/Coliform хромоген-агар, пептонная вода.
Дистиллированная вода.
Партии лактоферрина.
Приготовление бактериального раствора
Внесение в раствор лиофилизированных штаммов с 0,5 мл пептона.
Распыление 100 мкл раствора.
Репликация
Одновременно брали 100 мкл для внесения в 9 мл пептона.
Наполняли 3 пробирки и инкубировали в течение 24 часов при 37°C.
Брали 1 мл бактериального раствора для определения оптической плотности (ОП).
4
5
Доведение ОП бактериального раствора для достижения концентрации 10-10 КОЕ/мл.
Приготовления растворов ЛФ
Брали 500 мг каждой партии ЛФ.
Добавляли 100 мл дистиллированной воды.
Раствор 50 мг/мл.
Фильтрация растворов
Из каждой пробирки пептонной воды (9 мл) забирали 400 мкл для достижения объема 8,6 мл и, чтобы концентрация достигала 2 мг/мл, добавляли 0,4 мл из каждой партии порошкообразного ЛФ для анализа.
5
6
Добавляли 1 мл бактериального раствора в концентрации от 10 до 10 КОЕ/мл.
Для контрольной пробирки брали 0,0 мл пептонного раствора и добавляли 1 мл бактериального раствора.
Манипуляции
-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7
Делали дифференцированные разведения раствора: 10.
Культивирование в чашках Петри
Помещали 100 мкл растворов разного разведения в центр чашки Петри.
Оставляли чашку Петри при 37° C в течение 24 часов.
Результат
E. coli
Через 24 часа оценивали КОЕ .
Helicobacter pilory
Тесты с
Биологический материал
Helicobacter pilory
Штамм : LMG 8775:3 замороженная культура BCCM™ культура, которую заказывали в коллекции бактерий BCCM/LMG: Laboratorium van Microbiology Universiteit Gent K. L. Lededanckstraat 35B, 9000 Gent.
Среда агар, соя, триптон, с кровью овец в чашке Петри.
Пептонная вода.
Дистиллированная вода.
Партии лактоферрина.
Приготовление бактериального раствора
Внесение в раствор лиофилизированных штаммов с 0,5 мл пептона.
Распыление 100 мкл раствора.
Репликация
Одновременно брали 100 мкл для внесения в 9 мл пептона.
Наполняли 3 пробирки и инкубировали в течение 2 суток в анаэробных условиях.
Брали 1 мл бактериального раствора для определения оптической плотности (ОП).
5
6
Доведение ОП бактериального раствора для достижения концентрации 10-10 КОЕ/мл.
Приготовления растворов ЛФ
Брали 500 мг каждой партии ЛФ.
Добавляли 10 мл дистиллированной воды.
Раствор 50 мг/мл.
Фильтрация растворов
Из каждой пробирки пептонной воды (9 мл) забирали 400 мкл для достижения объема 8,6 мл и, чтобы концентрация достигала 2 мг/мл, добавляли 0,4 мл из каждой партии порошкообразного ЛФ дл анализа.
5
6
Добавляли 1 мл бактериального раствора в концентрации от 10 до 10 КОЕ/мл.
Для контрольной пробирки брали 9,0 мл пептонного раствора и добавляли 1 мл бактериального раствора.
Манипуляции
-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7
Делали дифференцированные разведения раствора: 10.
Культивирование в чашках Петри
Помещали 100 мкл растворов разного разведения в центр чашки Петри.
Оставляли чашку Петри при 37° C в течение 2 суток.
Результат
H.P
Через 2 суток оценивали КОЕ .
Пробиотическая пролиферация и здоровье кишечника
Существует 2 возможности:
импедансный анализ определения роста и микроанализ оптической плотности.
1) Импедансный анализ определения роста
Lactobacillus,
Bifidus
Использовали бактометр в системе микробиологического контроля роста пробиотических штаммов или  или  c измерением сигналов импеданса (зависимость емкости и проводимости) в культуральной среде.
4
В лунки добавляли ЛФ-NFQ в объеме 0,25 мл с последующим добавлением 0,25 мл бактериальной суспензии (10 клеток/мл), приготовленной в 0,9% солевом растворе. Добавление 0,5 мл бактериальной суспензии служило контролем. Инокулированные образцы инкубировали при 32°C с постоянным контролем изменений импеданса в среде с помощью бактометра с 6-минутными интервалами в течение 48 часов. Получали графическое изображение кривых бактериального роста, показывающие процентное изменение сигналов импеданса в зависимости от времени инкубации. Период времени, необходимый для возникновения серии значительных отклонений от исходного значения импеданса, устанавливали как время обнаружения. Если это время обнаружения было меньше, чем контрольное время, тестовые образцы считали имеющими "пробиотический эффект".
2) Микроанализ оптической плотности
in vitro
5
9
Указанный способ измерения роста микроорганизмов  основан на методике турбидиметрии. Коротко, в лунку добавляли 0,1 мл стерильной среды. В определенные лунки добавляли тестовый раствор в объеме 0,05 мл, с последующей инокуляцией суспензией микробных клеток объемом 0,05 мл, содержащей +/-10 клеток/мл (разведенной при ОП, равной 1 при 660 нм до 10 клеток/мл). После инокуляции лунки инкубировали при 37°C и контролировали рост микроорганизмов в разные точки времени по изменению мутности культуральной среды путем измерения ОП при 660 нм, используя микропланшетный ридер. Лунки, содержащие бульон без инокуляции микробным материалом, служили контролем стерильности. Лунки, содержащие бульонную среду с бактериальной инокуляцией, но без тестового соединения, служили положительным контролем роста. Пробиотический эффект определяли, если агент увеличивал пролиферацию микроорганизмов по сравнению с контролем роста.
Для лактоферрина, не содержащего ЛПС, время обнаружения требовалось сокращать на 30% по сравнению с контролем. Обычно время обнаружения для пробиотиков составляло 15 часов, для лактоферрина, не содержащего ЛПС, это время обнаружения необходимо сокращать до 4-5 часов. Кроме того, размножение пробиотических тестовых штаммов увеличивалось на >100% с лактоферрином, не содержащим ЛПС, который показывал по меньшей мере в два раза более высокую эффективность, чем лактоферрин, покрытый липополисахаридами.
Раствор ЛФ, чтобы его можно было рассматривать как ЛФ-NFQ, должен иметь сокращенное на 25-30% время обнаружения по сравнению с контролем и повышение после 48 часов инкубации минимум на 100% по сравнению с контролем.
Acidophilus, Bifidobacterium, Lactobacillus
Согласно описанному выше, ЛФ проявляет ингибирование роста микроорганизмов посредством механизма застойной депривации железа. Железо является важным для многих форм жизни, включающих в себя кишечные патогены, для образования АТФ с помощью системы цитохром-зависимого переноса электронов. Однако кишечные пробиотики ABL ((ABL=) не зависят от цитохромного пути для синтеза энергии в клетках, поэтому селективно избегают антибактериальной застойной депривации железа со стороны ЛФ. Этот пробиотический эффект ЛФ в кишечной среде представляет собой феномен естественного отбора для обогащения полезной пробиотической флоры и для конкурентного эксклюзионного воздействия на вредные патогены с помощью бактериостаза. Известно, что толстая кишка новорожденных при грудном вскармливании колонизирована преимущественно видами бифидобактерий, которые обладают защитными эффектами против кишечных патогенов. Присутствие ЛПС и эндотоксина на поверхности ЛФ будет уменьшать этот пробиотический эффект молекулы (таблица 2).
Таблица 2: Пробиотическое действие: промышленный ЛФ, экстрагированный из сыворотки или из молока, обладает более низкой пробиотической активностью по сравнению с ЛФ-NFQ
Таблица 2
Пробиотическая активность
ЛФ из сыворотки
ЛФ из молока
ЛФ-NFQ
Bifidobacteriumspp. (n=2)
124%
141%
213%
Lactobacillusspp. (n=8)
97%
145%
200%
Антиоксидантное действие
Применяли анализ снижения железа/антиоксидантной способности (FRAP BENZIE I.F.F. and STRAIN JJ. in Methods in Enzymology, VoI 299, 1990, p. 15), как описано далее, для измерения антиоксидантного действия ЛФ-NFQ. Реактив FRAP приготовляли путем смешивания 40 мл 0,3M ацетатного буфера (уровень pH 3,6), 4 мл 20 мМ хлорида железа и 4 мл 10 мМ TPTZ (2,4,6-трис-(2-пиридил-s-триазина)). Серийные разведения (от 0,1 до 1,0 мМ) 6-OH-2,5,7,8,-тетраметил-хроман-2-карбоновой кислоты использовали как стандартные FRAP-реактивы. Все реактивы перед анализом доводили до 37°C. Анализ FRAP проводили в 96-луночном микропланшете, смешивая 20 мкл дистиллированной воды, 10 мкл образца ЛФ-NFQ и 150 мкл реактива FRAP. В комбинированных анализах 10 мкл дистиллированной воды и 20 мкл ЛФ-NFQ смешивали с 150 мкл реактива FRAP. Затем проводили быструю инкубацию при 37°C в течение 5 минут (для аскорбиновой кислоты) и c перерывом от 5 минут до 24 часов (для ЛФ-NFQ). Спектральную поглощательную способность реакционной смеси измеряли при 593 нм. Тестовым соединениям задавали антиоксидантные параметры (FRAP) по сравнению со значением FRAP аскорбиновой кислоты.
Лактоферрин, не содержащий ЛПС (ЛФ-NFQ), должен достигать значения 0,660 мМ через 6 часов и пик в 0,994 мМ через 24 часа (фигура 11).
ЛФ можно считать приемлемым при достижении значения от 90 до 100% указанного значения.
У некоторых грамотрицательных бактерий связывание бактериальных липополисахаридов (ЛПС) с ЛФ вовлечено в бактерицидный механизм белка (Ellison et al., 1991). Miyazawa и его сотрудники показали (1991 г.), что связывание ЛПС с лактоферрином изменяет механизм связывания лактоферрина с клетками миелоидной линии. Учитывая высокую вероятность контакта ЛФ с большим количеством ЛПС в месте локализации грамотрицательной инфекций, авторы исследовали воздействие связывания ЛПС с ЛФ на способности ингибировать образование OH°, обусловленное оксидазной системой ксантин/ксантин с добавлением железа, что оценивали в анализе окисления дезоксирибозы (Cohen et al., 1992).
E.coli
Механизм, посредством которого связывание ЛПС с лактоферрином уменьшает его эффект примирования нейтрофилов, можно воспринимать с различными предположениями. Возможно, он включает в себя уменьшение аффинности к рецептору ЛПС или одновременному нарушению механизма сигнальной трансдукции, которые вызывают эффект примирования. Однако по полученным данным предлагается, что связывание ЛПС с лактоферрином, возможно, служит инструментом уменьшения провоспалительных событий, которые происходят при состоянии септического шока. С этим согласуется известная способность лактоферрина уменьшать смертность в мышиной модели с индуцированным  септическим шоком (Zagulski et al., 1989). В заключение, как показано в фигуре 10, присутствие ЛПС на структуре ЛФ значительно ограничивает его антиоксидантное действие.
Как показано на фигуре 11, ЛФ, который не содержит ЛПС и эндотоксин (ЛФ-NFQ), обладает превосходным антиоксидантным действием по сравнению с его исходным источником, ЛФ-сывороткой или ЛФ-молоком.
Согласно таблице 3, показано, что ЛПС-ЛФ может индуцировать продукцию фактора некроза опухоли (ФНО-α), интерлейкина 6 (ИЛ-6) и интерлейкина 8 (ИЛ-8).
E.coli
Для анализа указанного действия ЛФ авторы изучали его роль в даун-регуляции экспрессии провоспалительных цитокинов в эпителиальных клетках кишечника, инфицированных  HB101 (pRI203) и не инфицированных каким-либо микроогранизмом. Указанный эксперимент авторы проводили в соответствии с протоколом, описанным Berlutti (Berlutti et al., 2006), используя клетки Caco-2 и образцы ЛФ-A, ЛФ-B и ЛФ-C, содержащие 1650 пг ЛПС/мг ЛФ, 22000 пг ЛПС/мг ЛФ и 105000 пг/мг ЛФ соответственно, и сравнивали результаты с ЛФ-NFQ (39 пг ЛПС /мг ЛФ). При инфицировании клеток Caco-2 в отсутствие ЛФ авторы наблюдали значительное увеличение экспрессии провоспалительных цитокинов, таких как ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α, по сравнению с неинфицированными клетками (таблица 3). В присутствии ЛФ экспрессия цитокинов уменьшалась в случае ЛФ-NFQ, но не в случае других образцов ЛФ (таблица 3). Можно придти к выводу, что присутствие ЛПС на структуре ЛФ ингибирует его действие по даун-регуляции экспрессии цитокинов инфицированными клетками. К удивлению, было отмечено, что в случае неинфицированных клеток в присутствии ЛФ, содержащего определенное количество связанных с его структурой ЛПС, клетки могли индуцировать экспрессию цитокинов, и эта экспрессия зависела от концентрации ЛПС, связанных со структурой ЛФ, что не имело место в случае ЛФ-NFQ, имеющего только 39 пг ЛПС/мг ЛФ (таблица 3). Указанная экспрессия может быть обусловлена тем, что некоторые ЛПС, возможно, отделены от структуры ЛФ благодаря среде, используемой для клеточной культуры, и по отношению к неинфицированным клеткам играют роль провоспалительного агента. Предполагается, что это имеет более важное значение, чем действие даун-регуляции ЛФ.
Для этого теста использовали следующий протокол:
Клеточная культура
3
2
2+
2+
Клетки человеческой карциномы толстой кишки Caco-2 выращивали как полуконфлюэнтный монослой в модифицированной по Дульбекко среде Игла с добавлением 1,2 г NaHCO/литр, 2 ммоль глутамина/литр, 100 Ед пенициллина/мл, 0,1 мг стрептомицина/мл и 20% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки в инкубаторе в атмосфере 5% CO при 37°C. За двенадцать часов до инфицирования монослой промывали фосфатно-буферным раствором (ФБР) без Ca и Mg и затем культивировали в свежей среде без эмбриональной телячьей сыворотки, чтобы избежать присутствия трансферрина во время инфицирования.
E.coli
Инфицирование клеток-хозяев  HB101 (pRI203)
E.coli
E. coli
E. coli
2+
2+
2+
2+
Способ был описан авторами Berlutti и др. в 2006 году. Полуконфлюэнтный монослой клетки Caco-2 многократно инфицировали  HB101 (pRI203) в количестве 100 бактерий на клетку или в отсутствие не содержащих ЛПС ЛФ, или при их наличии, или в присутствии ЛФ, содержащего разное количество ЛПС (100 мкг белка/мл). Через 4 часа инкубации клетки обильно промывали ФБР без Ca и Mg. После промывания в монослои, инфицированные HB101 (pRI203), добавляли свежую среду, содержащую 100 мкг гентамицина/мл, для уничтожения внеклеточных бактерий, затем клетки инкубировали в течение дополнительных 2 часов при 37°C и обильно промывали. После этого монослои обрабатывали 0,3 мл смеси трипсина-ЭДТА (0,05% трипсина (1/250) и 0,02% ЭДТА) в течение 5 минут при 37°C и лизировали добавлением 0,5 мл 1% дезоксихолевой кислоты. Клеточные лизаты разводили ФБР без Ca и Mg и высевали на агаре с ампициллином (100 мкг/мл) для количественного определения числа жизнеспособных внутриклеточных  HB101 (pRI203).
Обнаружение ИЛ-6, ИЛ-8 и фактора некроза опухоли-альфа (ФНО-α) в супернатантах Caco-2 в твердофазном иммуноферментном анализе ELISA
Как описано авторами Berlutti и др., 2006 г., полуконфлюэнтный монослой клеток Caco-2 инфицировали, как описано выше, или в отсутствие ЛФ, не содержащего ЛПС, или при его наличии, или в присутствии ЛФ с разным содержанием ЛПС (100 мкг белка/мл). Через 4 часа инкубации клетки обильно промывали ФБР, к монослоям добавляли свежую среду, содержащую 100 мкг гентамицина/мл, и клетки дополнительно инкубировали в течение 24 часов при 37°C. В конце в каждой лунке собирали супернатанты и определяли концентрацию ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНО-α с помощью стандартных комплектов ELISA Quantikine (R&D Systems, Wiesbaden, Germany) и комплектов HBT (Holland Biotechnology BV, Firma Bierman, Bad Nauheim, Germany).
Таблица 3
Неинфицированные клетки Caco-2
Цитокины (пг/мл)
Отсутствие ЛФ
ЛФ-NFQ
ЛФ-А
ЛФ-В
ЛФ-С
ФНО-α
44
40
105
130
165
ИЛ-6
112
87
140
220
430
ИЛ-8
2700
2750
3600
3650
4600
Клетки Caco-2, инфицированные <i>E.coli</i> HB101 (pRI203)
Цитокины (пг/мл)
Отсутствие ЛФ
ЛФ-NFQ
ЛФ-А
ЛФ-В
ЛФ-С
ФНО-α
160
48
154
164
160
ИЛ-6
1200
150
1240
1350
1300
ИЛ-8
12250
3200
10700
10800
11500
Неинфицированные клетки Caco-2 или клетки Caco-2, инфицированные <i>E.coli</i> HB101 (pRI203), инкубировали в присутствии или отсутствие ЛФ-NFQ, ЛФ-A, ЛФ-B, ЛФ-C (100 мкг/мл). Концентрации секретируемых цитокинов определяли анализом ELISA. <i>P-</i>значения <0,01 считали не значимыми.
Limulus-тест
Согласно описанию выше, присутствие ЛПС и эндотоксинов считается одним из наиболее серьезных факторов загрязнения и уменьшает эффективность действия ЛФ. На основе типа и уровня содержания загрязнителей и гарантии микробиологического качества при надлежащей производственной практике при промышленном производстве ЛФ был разработан способ очистки с использованием специфичного буфера в качестве агентов очищения от загрязнителей во время разных стадий указанного способа. Эта технология может систематически расширять обрабатываемый объем для уменьшения загрязнения с целью усиления полифункциональных свойств ЛФ, создавая таким образом мощную физиологическую систему.
3
Кроме того, во время очистки для приготовления всех буферных растворов использовали дистиллированную воду, обработанную микрофильтрацией, озоном (О) и ультрафиолетом с длиной волны 254 нм. Эта вода была апирогенной.
Penicillium spp.
Aspergillus spp
Биологическую нагрузку разных промышленных препаратов ЛФ измеряли стандартным анализом согласно руководству по бактериологическим анализам Федерального управления США по контролю качества продуктов питания, напитков и лекарственных препаратов (FDA). Загрязнение промышленных препаратов ЛФ липополисахаридами и эндотоксинами определяли количественно в анализе лизата амебоцита Limulus с использованием тестового комплекта, разработанного Cambrex Bioscience, Walkerville, MD. Анализ промышленного ЛФ показал, что полученный из сыворотки ЛФ имел более выраженную биологическую нагрузку, чем ЛФ, получаемый из молока. Значительную часть подсчитанных в аэробном планшете микроогранизмов в ЛФ, получаемом из сыворотки, составляли грамположительные микроорганизмы, такие как  и . Содержание ЛПС и эндотоксина в обоих промышленных препаратах ЛФ отражали свои колиформную и грамотрицательную бактериальные нагрузки. В среднем содержание ЛПС и эндотоксина в ЛФ сывороточного происхождения было примерно в 3 раза выше, чем в ЛФ, полученном из молока. Примеси ЛПС и эндотоксина в обоих препаратах ЛФ были биологически активными и индуцировали продукцию ФНО-α (фактора некроза опухоли) в стимулируемых клетках моноцитах и энтероцитах (клетки Caco-2) (таблица 3).
Чтобы избежать таких проблем, количественное содержание ЛПС и эндотоксинов, которые могут покрывать структуру лактоферрина, должно иметь значение от 50 до 100 пг/мг лактоферрина с предпочтительным значением <50 пг/мг ЛФ.
Активность в клетках слизистой оболочки кишечника
Ряд исследований показал, что лабораторный ЛФ может обладать действием восстановления клеток слизистой оболочки кишечника. Авторы изучили это действие по сравнению с контролем, стандартным промышленным ЛФ и ЛФ-NFQ, добавляя указанную молекулу в специальную схему лечения детей в возрасте от 5 до 9 месяцев, которые были госпитализированы по причине гастроэнтерита. Концентрация ЛФ была сходной с концентрацией ЛФ в грудном молоке (15 мг/кг/в день). Биопсии тощей кишки выполняли на 2 день и на 4 день после начала лечения и также через 5 дней. Восстановление клеток оценивали технологией иммунного окрашивания (PCNA-cyclin immunostating - Galand et Degraef, Cell tissue Kinet, 1989, 22, 383-392). Двадцать больных получали специальную схему лечения без ЛФ, семнадцать больных получали специальную схему лечения, содержащую промышленный ЛФ, и восемнадцать больных получали специальную схему лечения, содержащую ЛФ-NFQ. Процент митотических клеток в S-фазе не имел значительных различий во всех трех группах в течение первых 4 дней лечения (6-15%).
Через 5 дней процент клеток в S-фазе митоза значительно отличался, авторы наблюдали его быстрый рост как в группах ЛФ у младенцев, которые получали промышленный ЛФ, на 12-15% и у младенцев, которые получали ЛФ-NFQ, на 18-21% по сравнению с контрольной группой, где уровень составлял от 5 до 8%.
Кроме того, дисахаридная активность энтероцитов щеточной каемки была повышенной в обеих группах ЛФ, как описано в таблице 4, и оставалась на низком уровне в контрольной группе. По этим результатам предполагается, что ЛФ обладает благоприятным действием на восстановление энтероцитов в фазе выздоровления после острого гастроэнтерита. Указанная активность была выше у препарата ЛФ-NFQ по сравнению с промышленным ЛФ.
Таблица 4
Исследование: Увеличение восстановления энтероцитов при остром гастроэнтерите после добавления ЛФ в схему прикорма.Тест:17 младенцев, возраст: от 5 до 10 месяцев, промышленный ЛФ: 15 мг/кг/в день18 младенцев, возраст: от 5 до 9 месяцев, ЛФ-NFQ: 15 мг/кг/в деньКонтроль: 20 младенцев, возраст: от 5 до 15 месяцев, без ЛФБиопсия кишки в дни (2-4) и через 5 дней
Восстановление энтероцитов (циклин/ядерный антиген пролиферирующих клеток PCNA)
Контроль
Промышленный ЛФ
ЛФ-NFQ
День 2-4: S-фаза митотических клеток
6-15
6-15
6-15
Через 5 дней: S-фаза митотических клеток
5-8
12-15
18-21
Дисахаридазы щеточной каемки
Контроль
Промышленный ЛФ
ЛФ-NFQ
Лактаза
3-5%
10-12%
24%
Мальтаза
2-6%
19-20%
31%
Сахараза
2-4%
10-12%
24%
Пример
Исходное сырье
Как было рассмотрено, чтобы избежать денатурации лактоферрина, и/или разрушения его гликановых цепей, и/или образования полимеров ЛФ при термической обработке, важно экстрагировать ЛФ из непастеризованного сырья, например из обезжиренного молока перед пастеризацией, или из молока без казеината, или из творожной сыворотки, или из обезжиренного молозива.
Прежде всего, сырье собирают при максимальной температуре 10°C на фермах, получивших контрольный номер безопасности от агентства AFSCA (Федеральное агентство безопасности продовольственной цепи). Сырье обезжиривают при 50°C, и его не следует подвергать микрофильтрации перед экстракцией ЛН, содержащего ЛФ. Однако некоторые молочные кооперативы предпочитают микрофильтровать сырье на керамических мембранах 1,4 мкм, которые являются у них заменой пастеризации.
Экстракция лактоферрина
3
Экстракцию осуществляют хроматографией на колонке, активная часть которой имеет объем 12 м, содержит экстракционную смолу в объеме 2000 литров (псевдоожиженный слой) или больше (количество зависит от количества сырья, которое нужно обработать). Сырье пропускают через эту катионообменную смолу, и молекулы под действием катионов при уровне pH 6,6 связываются на смоле, таким образом эта смола позволяет экстрагировать ЛН. ЛН представляет собой смесь, состоящая в основном из основных белков/ферментов. С учетом цвета молекул легко наблюдать их связывание со смолой. Авторы наблюдали начало изменения цвета смолы от белого к черному, обусловленное связыванием основных молекул и, главным образом, лактопероксидазы (которая отличается темно-зеленым цветом, и этот цвет является преобладающим). Скорость потока может составлять от 25000 литров до 50000 литров в час в зависимости от качества, количества исходного сырья и его происхождения.
Авторы продолжали пропускать сырье до уровня насыщения связывающей способности смолы (65% ЛФ, 30% ЛПС и 5% примесей), и отмечали, что цвет смолы остается черным. С учетом изоэлектрического уровня pH молекул, ЛФ имеет наиболее высокий изоэлектрический уровень pH, и, продолжая пропускать сырье через колонку, авторы отметили, что ЛФ способен к перемещению, и другие молекулы ЛН присоединялись к смоле и располагались на смоле. После определенного времени, соответствующего объему, в 2,5 раза эквивалентного объему, который необходим для насыщения смолы, авторы могли отмечать изменение цвета смолы на красный, что означает, что в смоле находится почти только связанный с ее подложкой ЛФ. В таких условиях лактенин будет состоять из 88% ЛФ, 10% ЛПС и 2% примесей.
Указанный ЛН, в котором концентрация его компонентов будет зависеть от источника сырья, времени пропускания или пропускаемого объема, элюировали раствором 1,35 М NaCl (8%). Полученный таким образом раствор авторы назвали лактенином (ЛН) или основным молочным белком (ОМБ), его подвергали концентрации и диафильтрации с использованием мембран 30 кДа. В отношении времени начала процесса очистки (2 стадия) раствор ОМБ подвергается микрофильтрации через керамические мембраны 0,8 мкм.
Очистка лактоферрина
ЛН сохраняли при 4°C перед внесением в другую катионообменную смолу. Раствор ЛН пропускали через катионообменную смолу. Пропускаемый объем зависит от объема смолы, в соответствии с концентрацией лактоферрина в ЛН. Смола для очистки представляла собой Sepharose Fast Flow, производимую компанией Amersham.
Ежедневно определенный объем раствора ЛН, в зависимости от объема смолы для очистки, пропускали через катионообменную смолу, уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером с уровнем pH 4,88, и раствором NaCl в концентрации от 0,02 М до 1,5 М.
Технологию очистки осуществляли следующим образом:
- Примеси A: элюирование с использованием натрий-ацетатного буфера, уровень pH 6,5, NaCl 0,05M.
- Лактопероксидаза: элюирование с использованием натрий-ацетатного буфера, уровень pH 6,5, NaCl 0,3M.
- ЛПС, эндотоксин, протеазы и ангиогенин: элюирование с использованием натрий-ацетатного буфера, уровень pH 8, NaCl 0,5M.
- Лактоферрин: элюирование с использованием аммоний-ацетатного буфера, уровень pH 8, NaCl 1M.
Элюированный ЛФ собирали в чистом помещении, например в чистом помещении с ламинарным потоком.
Ультрафильтрация-диафильтрация
Раствор лактоферрина концентрировали ультрафильтрацией (тангенциальная ультрафильтрация) с использованием органических мембран 30 кДА и подвергали диафильтрации, чтобы получить конечный раствор 3 М.
Концентрирование
Затем раствор лактоферрина с низкой проводимостью концентрировали для достижения концентрации 15-16%.
Микрофильтрация
Лактоферрин подвергали конечной микрофильтрации с использованием мембран 0,22 мкм.
Лиофилизация
Раствор лактоферрина лиофилизировали при 45°C в вакууме.
Измельчение
Для некоторых применений порошок лактоферрина перемалывали и тонко измельчали для получения порошка по размеру ячейки сита 80.
Смешивание
Разные произведенные партии лактоферрина смешивали, чтобы получить партии по 200 кг. Реализации подлежали образцы по 50 г и 10 г.
Упаковка
Порошок лактоферрина упаковывали в пакетики из полиэтилена - пищевого алюминия.
Все стадии обработки или манипуляций с очищенным лактоферрином проводили в закрытом пространстве с контролем среды, чтобы избежать загрязнения очищенного лактоферрина, например в стерильных чистых помещениях.
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, для ускорения развития желудочно-кишечного тракта у новорожденного или восстановления ткани слизистой оболочки кишечника при выздоровлении после гастроэнтерита.
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, для увеличения синтеза в печени новорожденного.
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, для увеличения активности моноцитов как натуральных киллеров (NK) и увеличения цитотоксической функции и NK, и лимфокин-активируемых клеток-киллеров (LAK).
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, как потенциального противоопухолевого агента, действующего посредством своих специфичных рецепторов на макрофагах, T- и B-лимфоцитах и лейкозных клетках.
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, для уменьшения экспрессии некоторых провоспалительных цитокинов.
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, для ингибирования или уничтожения бактерий или для лечения заболеваний, связанных с бактериальными биопленками, примерами таких заболеваний являются кистозный фиброз или воспаление полости рта.
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, для приготовления растворов для обработки ран, растворов для ухода за ранами, растворов для ухода за ушами, мазей для заживления ран или растворов для ухода за глазами.
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, для захвата железа эпителиальными клетками в случае дефицита железа у больных железодефицитной анемией и также у беременных женщин.
Изобретение также относится к применению лактоферрина, полученного вышеописанным способом, для лечения инфекционных заболеваний дыхательных путей (инфекции верхних и нижних дыхательных путей (URTI и LRTI)).