Способ оценки гемостимулирующей активности пантов марала
METHOD FOR ESTIMATION OF HEMOSTIMULATING ACTIVITY OF MARAL VELVET ANTLERS

Изобретение относится к фармакологии, фармакогнозии.
В настоящее время оценка качества пантов марала (далее - ПМ) как сырья достаточно затруднена. Существуют ГОСТы для оценки качества консервированных ПМ [1, 2]. При консервации теряется значительная часть биологически активных веществ [3]. Однако не разработана соответствующая документация для оценки качества неконсервированных (сырых, замороженных) ПМ.
Известен способ стандартизации сырых ПМ [5], он заключается в визуальной оценке качества пантов по количеству отростков, толщине охвата ствола, признакам окостенения, цвету и натянутости кожи самого панта. Недостатки: оценка внешнего вида не может дать полное и объективное представление о качестве ПМ, а также их биологической активности, поскольку не оцениваются действующие вещества и величина их биологического эффекта.
В «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Миронов А.Н. М., 2012. Ч. I. Глава 49. С. 759 [4] (прототип) описаны культуральные методы оценки гемостимулирующей активности фармакологических веществ, недостатком которых являются необходимость использования цитостатика, а также исследование содержания различных видов стволовых кроветворных клеток, что является достаточно сложной задачей, необходимой лишь в доклинических исследованиях лекарственных средств.
Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала способов оценки биологической активности пантов марала, в частности их гемостимулирующей активности.
Известно, что ПМ обладают способностью стимулировать кроветворение [7]. Известно, что ПМ содержат группы веществ, способных стимулировать процессы пролиферации и дифференцировки стволовых клеток [7].
При добавлении водного извлечения из ПМ к культуре клеток костного мозга мыши активные вещества, входящие в состав этого извлечения, стимулируют процесс колониеобразования клеток. Активность сырья (ПМ) считается достаточной, если извлечение, полученное из этого сырья, стимулирует рост колоний не менее чем в 1,5 раза по сравнению с группой контроля.
Способ основан на способности биологически активных веществ, содержащихся в ПМ, стимулировать процесс колониеобразования кроветворных стволовых клеток костного мозга мыши in vitro. Предлагаемым способом оценивается активность суммы биологически активных веществ из пантов марала, продуктов и препаратов, получаемых из этого сырья, в отношении изменения количества колоний гемопоэтических клеток. В качестве экстрагента используется вода деионизированная, поскольку для экспериментов на культуре клеток необходимы именно водные растворы веществ. Сырьем служат свежезамороженные панты марала.
Изобретение поясняется фигурами.
Фиг. 1 - схема забора образца панта марала, где 1 - средняя часть панта.
Фиг. 2 - схема засевания планшета, где ряды с 1 по 11- опытные, ряд 12 - контрольный.
Для забора пробы используется средняя часть панта марала (фиг. 1), от которой отпиливают пластинку массой 2 г. Измельчают ПМ до размера 0,5×0,5 см, выдерживают в течение 1 часа на водяной бане с обратным холодильником при 80°С в соотношении сырье / экстрагент - 1/3. После извлечение процеживают через тройной слой марли, охлаждают до комнатной температуры, центрифугируют при 3000 оборотов в течение 10 мин, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,22 мкм и используют для исследования.
5
Для оценки гемостимулирующей активности in vitro используются белые лабораторные мыши либо мыши линии СВА. Бедренную кость мыши извлекают в стерильных условиях, после чего костный мозг асептически эксплантируют и суспендируют в среде RPMI-1640. Количество клеток доводят до 2×10 на 1 мл питательной среды следующего состава: 80% RPMI-1640, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 280 мг/мл L-глютамина, 50 мг/л гентамицина. Засевают (фиг. 2) 96-луночные планшеты, по 200 мкл среды в каждую лунку, после чего добавляют по 10 мкл извлечения из ПМ. Каждый ряд планшета соответствует определенному извлечению. Также засевается контрольный ряд, где вместо изучаемых извлечений в лунки добавляется по 10 мкл воды в качестве контроля растворителя. Таким образом в 1 планшете можно проанализировать 11 проб пантов марала.
2
Планшеты культивируются в инкубаторе в течение 7 суток при 5% СO, 100% влажности. После производят подсчет числа колоний и кластеров (колония - скопление клеток количеством 40 и более; кластер - скопление от 20-40 клеток), статистическую обработку проводят с использованием критерия Манна - Уитни. Разница сравниваемых средних считается достоверной, если показатель достоверности р<0,05.
Согласно «Руководству по проведению доклинических исследований» [4] критерием достаточности гемостимулирующей активности является превышение количества колоний в исследуемых образцах не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контролем. В связи с этим был взят этот критерий качества сырья и достаточности биологической активности: сырье считается качественным, если полученное извлечение будет стимулировать рост гемопоэтических колоний в исследуемом планшете не менее чем в 1,5 раза по сравнению с контролем. При этом превышение роста колоний на каждые 10% по сравнению с контролем принято за 1 колоние-стимулирующую единицу действия (КЕД).
Результаты эксперимента представлены в таблице 1.
Количество колоний и кластеров в исследуемой группе составило 300% по сравнению с контролем. В результате извлечение имеет активность, равную 20 КЕД. Поскольку для приготовления извлечения использовали 2 г ПМ, содержание единиц действия в 1 г сырья будет следующим: извлечение, полученное в результате настаивания в течение 1 часа, имеет активность, равную 10 КЕД.
Источники информации
1. ГОСТ 4227-76 «Панты марала и изюбра консервированные. Технические условия». М.: Госстандарт, 1976.
2. ГОСТ 3573-76 «Панты пятнистого оленя консервированные. Технические условия». М.: Госстандарт, 1976.
3. Луницын В.Г. Продукция пантового оленеводства: (способы консервирования, переработка, использование): монография / В.Г. Луницын, Н.А. Фролов. Рос. акад. с/х. наук, Сиб. отд-ние Всерос. науч.-исслед. ин-т пантового оленеводства. - Барнаул: Азбука, 2006. - 270 с.
4. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М., 2012. Ч. I. Глава 49. С. 759.
5. Павлова А.В. Научное и практическое обоснование рационального использования продукции мараловодства в условиях Тувы: дис. - Барнаул: Алт. гос. аграр. ун-т, 2000.
6. Патент РФ №2009125095/15, 30.06.2009. Дыгай A.M., Скурихин Е.Г., Першина О.В., Андреева Т.В., Хмелевская Е.С. Способ определения эффективности гемостимуляторов при цитостатической миелосупрессии // Патент России №2421720. 2011.
7. Deer antler base as a traditional Chinese medicine: A review of its traditional uses, chemistry and pharmacology / Feifei Wu, Huaqiang Li, Liji Jin // Journal of Ethnopharmacology. - 2013. - №145. - P. 403-415.