КАЧЕСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ СПЕРМЫ БАРАНА, КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ ПРИ РАЗНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ

ЗООТЕХНИЯ

DOI: 10.25930/2687-1246/005.2.13.2020 УДК: 636.3.082.453.52

КАЧЕСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ СПЕРМЫ БАРАНА, КРИОКОНСЕРВИРОВАННОЙ ПРИ РАЗНЫХ ТЕХНОЛОГИЯХ

М.М. Айбазов, Т.В. Мамонтова

Криоконсервация генетического материала и искусственное осеменение позволяют получить максимальное количество потомков от высокоценных производителей. Однако в овцеводстве, в отличие от других отраслей животноводства, существуют некоторые сложности, возникающие при криоконсервации спермы данного вида животных, которые приводят к низким результатам использования замороженно-оттаянного семени. В данной статье приведены результаты оценки влияния криоконсервации семени барана разными способами на её качественные показатели. Экспериментальные исследования проводились на баранах-производителях трех пород: полл-дорсет, джал-гинский меринос и российский мясной меринос. Были изучены качественные и количественные показатели свежеполученного и замороженно-оттаянного семени, в частности, объем, подвижность, концентрация, криорезистентность и состояние акросомы. Выявлено, что криорезистентность спермы баранов всех трех пород была на высоком уровне и подвижность спермиев после оттаивания колебалась незначительно: от 4,3 до 4,7 баллов, без достоверных различий по породам. Доказаны достаточно высокие качественные показатели спермы баранов после дефростации, замороженной как традиционным способом в гранулах, так и в пайетах.

Ключевые слова: бараны-производители, качество спермы, криоконсервация, гранулы, пайеты

QUALITATIVE INDICES OF RAM SEMEN CRYOPRESERVED WITH DIFFERENT TECHNOLOGIES

M.M. Aybazov, T.V. Mamontova

Cryopreservation of genetic material and artificial insemination allow you to get the maximum number of descendants from high-value stud rams. However, in sheep farming, in contrast to other branches of animal husbandry, there are some difficulties that arise when cryopreservation of sperm of this animas species, which lead to low results of using frozen-thawed semen. This article presents the results of evaluating the impact of ram semen cryo-preservation in various ways on its quality indices. Experimental studies were conducted on stud rams of three breeds: Poll-Dorset, Jalginsky Merino and Russian Meat Merino. Qualitative and quantitative indices of freshly obtained and frozen-thawed semen have been studied, in particular, volume, mobility, concentration, cryoresistance and the state of the acrosome. It was found that the cryoresistance of ram sperm in all three breeds was at a high level and the mobility of sperms after thawing fluctuated slightly: from 4,3 to 4,7 points without significant differences between breeds. High quality indices of ram semen frozen both in pellets and in straws after defrosting have been proved.

Key words: stud rams, quality of semen, cryopreservation, pellets, straws

Введение. Криоконсервация спермы животных является на сегодняшний день уникальным эффективным способом сохранения генетического материала высокопродуктивных, редких и исчезающих видов, популяций и пород сельскохозяйственных животных в течение длительного времени [1]. Технология криоконсервации предполагает замораживание и хранение половых клеток при температуре сжиженных газов (-178.. ,-196°С) в состоянии обратимого анабиоза, то есть с возможностью восстановления их биологических функций после дефростации [2, 3]. Успехи в развитии методов криоконсервации семени разных видов животных во всем мире основаны на одном из выдающихся достижений отечественной биологии - открытии №103 с приоритетом от 1 июня 1947 года.

За прошедшие после открытия годы были разработаны эффективные технологии замораживания семени различных видов сельскохозяйственных животных и птицы, которые позволили создавать криобанки (криохранилища) гамет, которые действуют в большинстве стран мира с развитым животноводством [4, 5]. Создание хранилищ генетической информации обеспечивает широкие перспективы для преодоления времени и пространства, трансферта генетической информации в любую точку Земли для проведения углубленной селекционно-племенной работы, сохранения и рационального использования генофонда выдающихся продуктивных животных, а также редких, исчезающих видов и пород, представителей дикой фауны. Это, в конечном итоге, обеспечивает сохранность биоразнообразия.

В течение последних 70 лет в России и мире проводились многочисленные исследования по поиску оптимальной технологии криоконсервации спермы мелких жвачных, тестировались различные методы объективной оценки спермы после замораживания, прилагались большие усилия по разработке приемов повышения результативности осеменения криоконсервированной спермой. Однако у мелких жвачных (овцы, козы) базовые криотехнологии, широко используемые, например, в молочном скотоводстве, не нашли экономически значимого применения. Ряд исследователей считает, что это происходит вследствие низкой криорезистентности спермы мелких жвачных [6]. Другие считают, что низкая фертильность криоспермы обусловлена физиологическими и анатомическими особенностями продвижения спермиев в репродуктивном тракте самки [7].

Так как криоконсервация спермы является сложным многоступенчатым процессом, на оплодотворяющую способность криоспермы может влиять множество факторов, среди которых существенное значение может иметь технология криоконсервации. Вследствие ряда причин в нашей стране наибольшее распространение получил метод замораживания в необлицованных (незащищенных) гранулах. К преимуществам этого метода можно отнести предельную простоту и универсальность, возможность проводить замораживание в полевых условиях, достаточную эффективность. В то же время этот метод имеет существенные недостатки, главные из которых - высокая степень влияния человеческого фактора и возможность повышенной микробной контаминации [8].

Зарубежные ученые и практики, в частности, французские исследователи, пошли по пути разработки технологии криоконсервации мужских гамет в полипропиленовых соломинках (пайетах) и на сегодняшний день являются мировыми лидерами в этом направлении. При этом они создали собственные замкнутые автоматизированные технологические линии по получению, оценке качества, замораживанию и хранению семени разных видов племенных животных в пайетах [9].

Так как эти две технологии криоконсервации доказали свою жизненность, мы посчитали целесообразным проведение в одинаковых условиях на одних и тех же животных сравнительного испытания технологий замораживания спермы баранов (в гранулах и пайетах) по всему комплексу параметров, включая биологические, технологические и экономические аспекты.

Целью исследования было изучение качественных параметров спермы баранов, замороженной при разных технологиях (в гранулах и в пайетах).

Материал и методы исследования. Экспериментальные исследования были проведены в отделе овцеводства и на опытной станции Всероссийского НИИ овцеводства и козоводства. В опыте были задействованы взрослые (2,5...4,5 года) племенные бараны-производители пород полл-дорсет, джалгинский меринос и российский мясной меринос, принадлежащие ВНИИОК.

Сперму получали в искусственную вагину. Качественные показатели спермы исследовали согласно «Национальной технологии искусственного осеменения овец» [10]. После этого часть спермы замораживали в необлицованных гранулах на фторопластовой пластине, часть - в пайетах с использованием французской линии по криоконсервации спермы ГМУ. При этом для соблюдения высокой методичности сперму, полученную от каждого барана, разделяли на две равные части (принцип разделенного эякулята) и замораживали при разных технологиях. В качестве разбавителя в обоих вариантах использовали патентованный разбавитель «АпёгоМеё».

Результаты и их обсуждение. Методические особенности криоконсервации спермы в гранулах. Сперму разбавляли одномоментно экстендером «АпёгоМеё» в соотношении 1:2. Эквилибрацию разбавленной спермы проводили в бытовом холодильнике при температуре 2...4°С в течение 180 минут. Замораживание спермы в гранулах проводили на фторопластовой пластине, охлажденной в жидком азоте до минус 85. 95оС (температура контролировалась толуоловым термометром). После испарения жидкого азота из лунок пластину фиксировали на уровне 1,5-2 см над поверхностью жидкого азота так, чтобы она находилась в парах газа. В лунки раскапывали по 0,2 см спермы стерильными пипетками или шприцем.

Рисунок 1 - Замораживание спермы в гранулах и в пайетах.

После замораживания спермы пластину с гранулами погружали на 3 мин. в жидкий азот, где происходило окончательное охлаждение гранул до -196 °С и отделение их от пластины. После этого гранулы собирали в емкости для хранения. На упаковку наносили необходимую для идентификации надпись (дату взятия спермы, породу и номер производителя, количество гранул (доз).

Методические особенности криоконсервации спермы в пайетах (соломинках). Пайеты представляют собой полые пластиковые трубочки, изготовленные из спермо-добротного материала (не оказывающего воздействия на живые клетки), с хлопковой пробкой на одном конце. В наших экспериментах для фасовки спермы использовались пайеты объемом 0,25 мл, предоставленные фирмами «ГМУ» (Франция) и «ММТиЬе» (Германия).

Так же, как и в первом случае, сперму разбавляли одномоментно экстендером «ЛпёгоМеё» в соотношении 1:2. Предварительно для идентификации спермы посредством компьютерной программы на аппарате проводили маркировку пайет каплеструй-ным методом (дату взятия спермы, породу и номер производителя). Далее на автоматической фасовочной линии проводили расфасовку спермы в соломинки и запаивание их ультразвуком. Эквилибрацию разбавленной спермы в соломинках проводили в бытовом холодильнике при температуре 2..4 оС в течение 180 минут. Замораживание спермы в пайетах проводили в криобоксе (морозильной камере), для чего соломинки располагали в один слой на специальном штативе и опускали в пары жидкого азота так, чтобы соломинки находились на уровне 3..4 см над поверхностью жидкого азота. Время экспозиции в парах 10 минут.

После замораживания пайеты переносились в пластиковые контейнеры (гобле-ты) и помещались в сосуд Дьюара с жидким азотом.

До исследования сперма, замороженная как в гранулах, так и в пайетах, хранилась в жидком азоте 30 дней.

Оттаянную сперму оценивали на подвижность по десятибалльной шкале после дополнительного разбавления в отношении 1:2 3,1%-ным изотоническим раствором лимонно-кислого натрия, для чего каплю исследуемой спермы рассматривали под микроскопом в термостате при температуре +380С .. .+400С. Сперму считали пригодной для дальнейшего хранения и использования при наличии в ней после оттаивания не менее 40% спермиев с прямолинейным поступательным движением.

Для определения выживаемости спермиев пробирки с оттаянной спермой помещали в водяную баню ультратермостата, обеспечивающего поддерживание температуры +390С, оценивая ее по подвижности сразу после оттаивания и через 3, 5 и 8 часов. В случае, если в исследуемой сперме через 8 часов инкубации в термостате сохранялось более 10% спермиев с прямолинейным поступательным движением, дальнейшую оценку проводили через каждый час до полной гибели половых клеток.

Для исследования целостности акросомы и мембранных оболочек спермии фиксировали в 1%-ном растворе фтористого натрия и исследовали на микроскопе ЛХ10-УЕЯТ при использовании конденсора темного поля.

Результаты лабораторных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Качественные показатели свежеполученной спермы баранов в зависимости

_от породы_

Порода

Количество

и о X

а р

а

ю

в о т

«

л iy

и «

Параметры спермопродукции

е

а

ю

о

л л а

ю

А

т с о

X

*

и

в

д

о п

«

и ц

а р

т

X

е ц

X

о к

д р

л

ов тес П

еч П

ис л с

ов ке ке еи е

EJ

ю

о

Полл-дорсет

24

1,1

3,2

2,99

Джалгинский меринос_

32

1,4

8,9

3,5

4,36

Российский мясной меринос

34

1,2

8,6

3,3

3,4

3

2

2

* Разница между группами достоверна

Как видно из материалов таблицы, свежеполученная сперма от баранов всех трех пород по количественному и качественным параметрам отвечала требованиям «Национальной технологии искусственного осеменения овец». Наилучшие показатели были у баранов джалгинский меринос, которые превосходили по всем четырем основным параметрам спермопродукции баранов других пород.

Материалы эксперимента, отраженные в таблице 2, показывают, что криорези-стентность спермы баранов всех трех пород была на высоком уровне. Подвижность спермиев после оттаивания колебалась незначительно: от 4,3 до 4,7 баллов, без достоверных различий по породам.

Выживаемость оттаянной спермы является важным показателем жизнеспособности в половых путях самки и одним из важных критериев оплодотворяющей способности. Так как при использовании замороженной спермы проводится двукратное осеменение с интервалом 8 часов, крайне важно, чтобы минимальная живучесть спермы была выше этого показателя. Как видно из материалов опыта, оттаянная сперма всех трех пород имела показатели выживаемости от 8,0 до 8,8 часов.

Что касается технологии криоконсервации, по результатам полученных данных мы не можем сделать однозначный вывод о преимуществе какого-нибудь варианта. Сперма, замороженная в гранулах, незначительно уступала качественным показателям спермы, замороженной в соломинках. Качество пайетированного семени, как по подвижности клеток, так и по целостности структуры гамет и продолжительности жизни in vitro после оттаивания, превысило качество спермы в гранулах. Однако эти различия были недостоверными. Косвенное подтверждение собственных результатов мы нашли в исследованиях зарубежных авторов [11].

Таблица 2 - Качественные показатели замороженной-оттаянной спермы баранов раз_ных пород в зависимости от метода криоконсервации_

Исследуемые параметры п Технология замораживания

гранулы пайеты

Полл-дорсет

Подвижность спермы после эквилибрации 24 6,8±0,08 6,7±0,05

Подвижность после криоконсервации 24 4,3±0,08 4,5±0,07

Выживаемость оттаянной спермы, часы 24 8,0±0,09 8,2±0,11

Сохранность акросомы, % 12 32,0 36,0

Джалгинский меринос

Подвижность спермы после эквилибрации 24 7,3±0,07 7,5±0,06

Подвижность после криоконсервации 24 4,6±0,08 4,7±0,07

Выживаемость оттаянной спермы, часы 24 8,5±0,09 8,8±0,11

Сохранность акросомы, % 12 34,0 38,0

Российский мясной меринос

Подвижность спермы после эквилибрации 24 7,1±0,09 7,3±0,08

Подвижность после криоконсервации 24 4,5±0,03 4,6±0,06

Выживаемость оттаянной спермы, часы 24 8,4±0,09 8,6±0,12

Сохранность акросомы, % 12 34,0 37,0

Что касается проблемы бактериальной контаминации спермы при разных технологиях криоконсервации, то получены следующие результаты. Общее число микробных тел в оттаянной сперме после замораживания в виде гранул составило 320 ед. в 1 куб. см, тогда как в виде пайетт - 365 ед. в куб. см. Эти показатели соответствуют минимальным требованиям «Инструкции», что позволяет нам сделать вывод о низком уровне микробной загрязненности. По-видимому, столь низкую контаминированность спермы в полном объеме нельзя объяснить стерильными условиями получения и обработки, хотя они, безусловно, имеют важное значение. На наш взгляд, использованный как при замораживании гранул, так и соломинок экстендер «AndroMed», содержащий несколько антибиотиков в оптимальном сочетании, достаточно эффективно стерилизует разбавленную сперму, при этом мы предполагаем, что негативное воздействие санирующих компонентов экстендера является незначительным.

Выводы. Сперма баранов, замороженная как традиционным способом в гранулах, так и в пайетах, обладала достаточно высокими качественными показателями после дефростации. Достоверных различий по таким важнейшим параметрам, как подвижность, выживаемость, сохранность акросомы в замороженной-оттаянной сперме в зависимости от технологии замораживания, мы не обнаружили. Распространенное мнение о том, что необлицованные гранулы в большей степени подвергаются микробной контаминации, чем соломинки, также не нашло своего подтверждения в собственных экспериментах.

Литература

1. Barbas J.P., Mascarenhas R.D. Cryopreservation of domestic animal sperm cells //Cell Tissue Bank. 2009. No.10. Р. 49-62.

2. Айбазов М.М., Аксенова П.В., Ашурбегов К.К., Коваленко Д.В. К вопросу о сохранении генофонда и биологической полноценности криоконсервированной спермы //Сб. науч. тр. «Животноводство и кормопроизводство». 2011. № 4. С. 24-29.

3. Мамонтова Т.В., Айбазов М.М., Сеитов М.С. Сравнительная характеристика половой активности, уровня спермопродукции и устойчивости к криоконсервации спермы баранов различных пород // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. 2018. № 1 (69). С. 145-147.

4. Селионова М.И., Мамонтова Т.В., Айбазов М.М. Воспроизводство овец и коз с использованием биотехнологических методов и приемов: монография. Ставрополь: типография ВНИИОК, 2018. 107 с.

5. Багиров В.А., Иолчиев Б.С., Волкова Н.А., Зиновьева Н.А. Влияние криоконсервации на биологические параметры семени у гибридов романовской породы и архара //Сельскохозяйственная биология. 2017. №52(2). С. 268-273 doi: 10.15389/ agrobiolo-gy.2017.2.268rus

6. Salamon S., Maxwell W.M.C. Storage of ram semen //Anim. Reprod. Sci. 2000. No.62. Р. 77-111.

7. Nordstoga A.B., Soderquist L., Adn0y T., Paulenz H. Effect of Different Packages and Freezing/Thawing Protocols on Fertility of Ram Semen //Reprod Dom Anim. 2009. No.44. Р. 527-531.

8. Andersen B.K. Fertility results after different thawing procedures for ram semen frozen in mini tubes and mini straws //Theriogenology. 2009. No.61. Р. 1719-1727.

9. Paulenz H., Adn0y T., Soderquist L. Comparison of fertility results after vaginal insemination using different thawing procedures and packages for frozen ram semen //Acta. Vet. Scand. 2007. No.49. Р. 26-31.

10. Национальная технология искусственного осеменения овец: монография /И.М. Ду-нин [и др.]. Лесные Поляны: Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела, 2010. 93 с.

11. Anel L., de Paz P., Alvarez M., Chamorro C.A., Boixo J.C., Manso A., Gonzalez M., Kaabi M., Anel E. Field and in vitro assay of three methods for freezing ram semen // Theriogenology. 2003. No.60. Р. 1293-1308.

Айбазов Магомет Муссаевич, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, главный научный сотрудник ВНИИОК - филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ», 355000 г. Ставрополь, пер. Зоотехнический,15, тел. 8(938)351-01-02, E-mail:velikii-1@yandex.ru

Мамонтова Татьяна Васильевна, кандидат сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник ВНИИОК - филиал ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ», 355000 г. Ставрополь, пер. Зоотехнический,15, тел. 8(928)318-96-33, E-mail:mamontova.vniiok@gmail.com

Aibazov Magomet Mussaevich, Doctor of Agricultural Sciences, Professor, Chief Researcher of FSBSI «All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding», 355000, Stavropol, Zootech-nichesky, 15, tel. 8(938)351-01-02, E-mail:velikii-1@yandex.ru

Mamontova Tatyana Vasilevna, Candidate of Agricultural Sciences, Chief Researcher of FSBSI «All-Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding», 355000, Stavropol,. Zootech-nichesky, 15, tel. 8(928)318-96-33, E-mail:mamontova.vniiok@gmail.com