СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАКОВЫХ КЛЕТОК В СЕРОЗНЫХ ЖИДКОСТЯХ У БОЛЬНЫХ С ПОДОЗРЕНИЕМ НА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫЕ НОВООБРАЗОВАНИЯ
METHOD OF CANCER CELL DETECTION IN SEROUS FLUID IN PATIENTS SUSPECTED OF MALIGNANT GROWTHS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в лабораторных методах исследования при проведении первичной диагностики злокачественных опухолей, уточнении стадии заболевания и поиска неустановленного первичного очага при метастазах.
Злокачественные опухоли с подозрением на специфический плеврит или асцит, как правило, тяжелые состояния, требующие неотложных действий по их подтверждению или исключению. В зависимости от этого строится и дальнейшая тактика их лечения. Кроме того, зачастую возникает необходимость определения первичной локализации опухолевого процесса путем цитоморфологического изучения экссудата из серозных полостей.
По данным Московского НИИ онкологии им. П.А. Герцена у 14% больных с плевральным экссудатом и у 7% пациентов с асцитом диагноз злокачественной опухоли впервые устанавливается на основании изучения клеточного состава экссудата. Цитологическое исследование позволяет установить гистологическую форму рака - плоскоклеточный, железистый и мелкоклеточный.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению, является способ цитологического изучения клеточного состава экссудата полученного из плевральной или брюшной полости больных путем торако- или лапороцентеза. Экссудат предварительно центрифугируют 15 минут, надосадочную жидкость сливают и часть осадка наносят на 5 предметных стекол. Подсохшие мазки красят по Паппенгейму и Карацци, затем приступают к осмотру под микроскопом.
Недостатками данного способа являются технические погрешности: малый объем исследуемого материала, элемент случайности присутствия опухолевых клеток в непосредственно изучаемой части осадка, в результате смешивания обнаружение атипичных клеток затруднено присутствием в мазке других клеток, крови, слизи и т.д.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа определения опухолевых клеток в серозных жидкостях у больных с подозрением на наличие злокачественных опухолей, способного с большей точностью и скоростью установить диагноз, определить гистогенез опухоли и исключить или подтвердить IV стадию заболевания.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении точности определения опухолевых клеток в серозных жидкостях за счет исследования всего экссудата, в легком обнаружении атипичных клеток и следовательно в сокращении времени исследования, в виду-удаления во время фильтрации ненужной примеси, слизи, крови и т.д.
Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что в способе определения опухолевых клеток в серозных жидкостях у больных с подозрением на наличие злокачественных опухолей, экссудат из плевральной или брюшной полости в количестве 10 мл помещается в искусственную среду, где создается давление необходимое для прохождения всего исследуемого экссудата через фильтр с диаметром пор 1 тысяча нанометров, при этом опухолевые клетки задерживаются на калиброванном фильтре, осадок целиком наносят на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и охлаждают для лучшего прилипания опухолевых клеток и высыхания, затем фиксируют мазки - отпечатки трехпроцентным спиртовым раствором Лейшмана в течение 2-4 минут, далее смывают дистиллированной водой и красят азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 продолжительностью 15 минут, после покраски промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе и приступают к просмотру под микроскопом.
Отличительной особенностью предлагаемого способа по сравнению с общеизвестным способом определения опухолевых клеток в экссудате является принципиально новый механизм выявления опухолевых клеток в плевральном выпоте или асцитической жидкости, который предлагаемому изобретению обеспечивает значительное повышение точности определения и быстрый результат исследования.
Предлагаемое изобретение, по мнению авторов, соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как совокупность существенных отличительных признаков, изложенных в формуле изобретения, позволяет достигнуть технический результат, заключающийся в повышении в 2 раза точности выявления атипичных клеток, ускорении в 3 раза результата исследования, определении гистологической формы рака, а следовательно в установлении диагноза и уточнении прогрессирования заболевания.
Из уровня техники авторы не обнаружили сведения, содержащие совокупность признаков, сходных или эквивалентных заявляемым.
Предлагаемое изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 изображено устройство для нанофильтрации серозной жидкости, на фиг.2 изображен вид сверху решетки с нанофильтром, на фиг.3 изображен вид снизу решетки с нанофильтром.
Устройство содержит стеклянный цилиндр 1. На дне стеклянного цилиндра установлена пластмассовая решетка 5 с закрепленным на ней с помощью металлического кольца 7 калиброванным фильтром 6. Диаметр пор у калиброванного фильтра равен одной тысяче нанометров. Внутри стеклянного цилиндра 1 установлен поршень 8 со штоком 9, который ввинчен не до упора. В поршне 8 выполнены 2 разных по диаметру канала, на стыке которых расположен металлический шарик 11, выполняющий назначение выпускного клапана для воздуха. Стеклянный цилиндр 1 имеет верхнее входное отверстие 12 для подачи серозной жидкости и нижнее выходное отверстие 13 для оттока серозной жидкости, последнее снабжено приспособлением 14 для осуществления положений «открыто» и «закрыто».
Заявляемый способ определения раковых клеток в серозной жидкости осуществляется следующим образом. Перед исследованием, по общепринятой методике из плевральной или брюшной полости больных с подозрением на злокачественные опухоли путем торако- или лапороцентеза берут 10 мл экссудата, затем осуществляют сборку устройства для нанофильтрации серозной жидкости. На дно стеклянного цилиндра 1 помещают пластмассовую решетку 5 с закрепленным на ней с помощью металлического кольца 7 калиброванным фильтром 6 с диаметром пор одна тысяча нанометров.
Для проведения исследования в стеклянный цилиндр 1 через верхнее входное отверстие 12, при закрытом нижнем выходном отверстии 13 наливают из пробирки экссудат в количестве 10 мл. В стеклянный цилиндр 1 вводят поршень 8 со штоком 9, ввинченным не до упора. Поршень 8 продвигают до уровня жидкости в стеклянном цилиндре 1, при этом воздух из цилиндра выпускают через каналы в поршне 8 с помощью металлического шарика 11, выполняющего назначения выпускного клапана. Затем шток 9 завинчивают до упора в поршне 8 и зажимают металлический шарик 11 (выпускной клапан закрыт). Далее приспособление 14 нижнего выходного отверстия стеклянного цилиндра ставят в положение «открыто» и пропускают всю исследуемую венозную кровь через калиброванный фильтр 6, при этом происходит задержка раковых клеток в осадке на нанофильтре. Осадок наносят на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и охлаждают, для лучшего прилипания клеток и высыхания. Фиксируют мазки - отпечатки 3% спиртовым раствором Лейшмана 2-4 минуты. Затем смывают дистиллированной водой и красят азур - эозиновой смесью в соотношении 3:1 15 минут.После покраски промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе и приступают к просмотру под микроскопом.
Примеры, подтверждающие выполнение способа определения раковых клеток в экссудате из плевральной и брюшной полостей больных с подозрением на наличие злокачественных опухолей.
Пример 1.
Больной М., 49 лет поступил 13.09.10 г.во 2-е хирургическое отделение Республиканского клинического онкологического диспансера с подозрением на рак правого легкого, правосторонний плеврит.Больной предъявлял жалобы: на одышку при физической нагрузке, сухой кашель. При поступлении общее состояние оценивалось как относительно удовлетворительное, правильного телосложения, пониженного питания.
При обзорной рентгенографии в 2-х проекциях выполненной 14.09.10 г. выявлено смещение средостения вправо, правосторонний плеврит, левое легкое без особенностей. Последовательно трижды выполнена плевральная пункция: эвакуировано более литра серозной жидкости. При проведенном дважды 14.09.10 г.и 15.09.10 г.общепринятым способом с центрифугированием цитологическом исследовании мазков из осадка плевральной жидкости - опухолевых клеток не обнаружено. 17.09.10 г.выполнена нанофильтрация плеврального выпота с цитологическим исследованием фильтрата, где обнаружены скопления опухолевых клеток. Заключение №8651 «Плоскоклеточный рак». Для проведения фильтрации взятый экссудат из плевральной полости в количестве 10 мл поместили в искусственную среду, где создали давление необходимое для исследования всего экссудата с помощью устройства (см. фиг.1). Исследуемый плевральный выпот пропускали через нанофильтр 4 устройства, при этом происходила задержка раковых клеток в осадке на калиброванном фильтре 4. Осадок наносили на предметные стекла, которые были предварительно обезжиренные и охлажденные для лучшего прилипания клеток и высыхания. Фиксировали мазки - отпечатки 3% спиртовым раствором Лейшмана 2-4 минуты. Затем смывали дистиллированной водой и красили азур - эозиновой смесью в соотношении 3:1 15 минут. После покраски промывали дистиллированной водой, сушили на воздухе и приступали к просмотру под микроскопом.
Параллельно проводилось инструментальное обследование: фибробронхоскопия - заключение «центральный рак правого легкого»; гистологическое исследование №32032 «плоскоклеточный рак»; Компьютерная томография легких - заключение «Рак правого легкого с переходом на карину и проксимальный отдел левого главного бронха».
Учитывая распространенность и необходимость проведения бронхопластической операции больной М. был направлен на оперативное лечение в РОНЦ им. Н.Н. Блохина, где 02.11.10 г.выполнена операция: пневмонэктомия справа с циркулярной резекцией бифуркации трахеи, левого предсердия и мышечного слоя пищевода. Послеоперационный период протекал без осложнений.
В этом примере проведенная нанофильтрация с цитологическим исследованием мазков плеврального выпота помогла установить больному М. правильный диагноз, тогда как дважды выполненное традиционным, общепринятым способом с центрифугированием цитологическое исследование мазков экссудата, опухолевых клеток в нем не обнаружило.
Пример 2.
Больной К., 30 лет находился с 19.08.10 г.по 07.09.10 г.на стационарном лечении во 2-ом хирургическом отделении Республиканского клинического онкологического диспансера. Поступил с направительным диагнозом: Забрюшинная опухоль. При поступлении беспокоили боли в эпигастрии, общая слабость, вздутие живота, похудание на 6-7 кг за полгода. Общее состояние расценивалось как средней тяжести. Соответственно дважды 20.08.10 г. и 23.08.10 г.проведенное традиционным методом с центрифугированием цитологическое исследование асцитической жидкости из брюшной полости опухолевых клеток в мазках не выявило. Выполненное 25.08.10 г.аналогично примеру 1 нанофильтроцитологическое исследование этого же экссудата обнаружило в нем опухолевые клетки железистого рака, заключение №7872 «Аденокарцинома». Учитывая заключение о наличии железистого рака и забрюшинную локализацию опухоли больному К. вынесен клинический диагноз: Рак головки поджелудочной железы, а принимая во внимание то, что опухолевые клетки обнаружены в асцитической жидкости, предварительно установлена IV стадия заболевания. При УЗИ брюшной полости от 25.08.10 г. выявлено очаговое образование в головке поджелудочной железы.
26.08.10 г. выполнена операция: пробная лапаротомия. На операции обнаружена нерезектабельная опухоль головки поджелудочной железы с канцероматозом по висцеральной и париетальной брюшине. Заживление послеоперационной раны первичным натяжением. Больной выписан с диагнозом: Рак головки поджелудочной железы IV стадии, на симптоматическое лечение по месту жительства. Итак определение раковых клеток в плевральной и асцитической жидкостях нанофильтроцитологическим методом с учетом результатов инструментальных методов исследования позволило установить соответственно больным М. и К. диагноз злокачественного новообразования и получить морфологическую верификацию опухоли.
В итоге, проведенное нанофильтроцитологическое исследование 21 больному с плевральным выпотом и 17 больным с асцитической жидкостью во всех случаях выявило в экссудате опухолевые клетки, тогда как выполненное традиционным способом цитологическое исследование с центрифугированием этим же больным не обнаружило опухолевые клетки у 9 больных с плевральным выпотом и у 8 пациентов с асцитом.
Предлагаемое изобретение «Нанофильтрация экссудата из серозных полостей больных с целью диагностики злокачественных опухолей» по сравнению с традиционным, общепринятым методом цитологического исследования с центрифугированием имеет следующие преимущества:
- время проведения нанофильтроцитологического исследования одного препарата составляет в среднем 35 минут, что в 3 раза быстрее, чем традиционное исследование, которое выполняется в целом 1 час 15 минут с учетом времени окрашивания мазка по Карацци;
- точность определения опухолевых клеток нанофильтроцито-логическом методом, когда исследуется весь экссудат, в 2 раза выше чем общепринятым способом, при котором по техническим причинам исследуется лишь половина осадка центрифугата, другая половина размазывается по стенкам пробирки при наклонном нанесении содержимого на предметные стекла. Кроме того небольшая часть опухолевых клеток остается не исследованной в надосадочной жидкости;
- достоверный метод определения раковых клеток в плевральном выпоте и асците позволяет провести первичную диагностику злокачественных опухолей, повысить процент морфологического подтверждения диагноза и снизить финансовые затраты на проведение неоднократных, малоэффективных цитологических исследований традиционным способом.
Заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», так как может быть использовано для обследования больных и постановки первичного диагноза в лабораториях поликлиник города, сельской местности, хирургических отделениях лечебно-профилактических учреждений.
Авторы:
1. Чимитов Анатолий Агванович, к.м.н., заместитель главного врача по лечебной работе ГУЗ «Бурятский республиканский клинический онкологический диспансер».
2. Рязанцева Наталья Владимировна, д.м.н., профессор, заведующая кафедрой фундаментальных основ клинической медицины, проректор по стратегическому развитию и инновационной политике, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет».
3. Дамбаев Георгий Цыренович, д.м.н., профессор, член-корреспондент РАМН, заведующий кафедрой госпитальной хирургии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет».
4. Хитрихеев Владимир Евгеньевич, д.м.н., профессор, заведующий кафедрой госпитальной хирургии, декан медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет».
5. Перинов Александр Петрович, к.м.н., главный врач ГУЗ «Бурятский республиканский клинический онкологический диспансер»;
6. Ханхашанова Тамара Дмитриевна, врач-цитолог клинической лабораторной диагностики ГУЗ «Бурятский республиканский клинический онкологический диспансер».
7. Медведев Владимир Игоревич, эксперт-физик ГУЗ «Бурятский республиканский клинический онкологический диспансер».