СРЕДСТВО ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ В СРЕДЕ, СОДЕРЖАЩЕЙ NaCl ДО 24,0%
AGENT FOR OIL HYDROCARBON DESTRUCTION IN MEDIUM CONTAINING UP TO 24,0% NaCl

Изобретение относится к экологической биотехнологии и микробиологии. Средство представляет собой штамм бактерий Bacillus firmus SDS-1 (депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика, коллекционный номер ВКПМ В-9278), который способен окислять нефтяные углеводороды в среде, содержащей NaCl до 24,0%, и обладает эмульгирующими свойствами. Может быть использован для очистки объектов окружающей среды и загрязненных поверхностей от нефти и нефтепродуктов.
Известен штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б [патент РФ №2129603, 1999], используемый для очистки морской (7,5% солености) и пресной воды от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-26°С).
Недостатками использования данного штамма являются низкая степень очистки от нефти пресной (48% в течение 14 суток в стационарных условиях и в течение 7 суток при аэрации на качалке) и морской (44,6% в течение 14 суток в стационарных условиях и 56% в течение 7 суток при аэрации на качалке) воды. Кроме этого, увеличение концентрации морской соли до 7,5% снижает степень очистки от нефти и максимальный уровень биоочистки (56%) достигается при концентрации морской соли 3,5%.
Известен штамм Arthrobacter sp. ОС-1 для разложения нефти и нефтепродуктов, выделенный из образца загрязненных нефтью вод, полученных с месторождения Ван-Еган. Штамм депонирован в ВКПМ института "ВНИИГенетики" под номером Ас-1556 [патент РФ №2128221, 1999].
Недостатками применения данного штамма является низкая скорость очистки (степень биодеградации по сырой нефти под воздействием штамма составляет 98-99% в течение 30 дней) и то, что убыль нефтепродуктов определяется визуально.
Наиболее близким к предлагаемому средству является способ биологической очистки воды от нефтяных загрязнений [патент РФ №2303003, 2005], включающий введение в очищаемый объем воды культуры бактерий Pseudomonas putida.
Недостатками данного способа является культивирование бактерий в загрязненной воде при принудительном аэрировании с использованием перфторметилдекалина в качестве биостимулятора.
Технической задачей данного изобретения является получение средства для деструкции нефтяных углеводородов в среде, содержащей NaCl до 24,0%, представляющее собой штамм Bacillus firmus SDS-1 ВКПМ В-9278.
Технический результат - повышение скорости деградации нефтяных углеводородов. Это достигается тем, что для решения поставленной задачи предлагается штамм бактерий Bacillus firmus SDS-1 (Сопрунова О.Б. и др. Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. Эколого-физиологические особенности бактериальных штаммов, изолированных из нефтезагрязненных экосистеме Нижнего Поволжья, №5, 2008, с.64-68), полученный из тяжей цианобактерий, выделенных из природных вод Северного Каспия методом накопительной культуры (Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / Отв. ред. А.В.Топачевский. - Киев: Наукова думка. - 1975. - 247 с.) и культивируемых в лабораторных условиях в присутствии нефти и нефтепродуктов. Штамм выделен при высеве суспензии предварительно гомогенизированных тяжей цианобактерий на питательные среды (МПА и агар Чапека с добавлением 27% NaCl) и в последующем в чистую культуру методом последовательных пересевов по общепринятой методике (Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С.Егорова. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 306 с.).
Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК в Центре "Биоинженерия" РАН и ИНМИ РАН.
Штамм Bacillus firmus SDS-1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов 07.11.2005, коллекционный номер ВКПМ В-9278. Справка о депонировании штамма прилагается.
Штамм Bacillus firmus SDS-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.
Культурально-морфологические признаки
Аэробные грамположительные спорообразующие палочки. Клетки - прямые или слегка изогнутые длиной 3-5 мкм и толщиной 1-1,5 мкм со слегка-заостренными концами. Располагаются одиночно, иногда в цепочках по 2 и более. Споры чечевицеобразные, длиной 1,5-2 мкм, толщиной около 1 мкм, расположены в центре клетки. Активное спорообразование наблюдается на средах с малым количеством органических веществ (Федорова или Эшби). На богатых органикой средах (МПА) спорообразование слабое или отсутствует; наблюдается увеличение размеров клеток до 4-5 мкм в длину, клетки часто образуют цепочки. При росте на МПА образуются выпуклые пастообразные светло-бежевые колонии, с четким слегка фестончатым краем и глянцевой поверхностью.
Физиолого-биохимические признаки
Штамм оксидазо-, каталозоположительный, использует глюкозу, фруктозу, трегалозу и сахарозу; не использует маннозу, мальтозу, лактозу, манит, ксилозу, арабинозу, галактозу. Нитроредуктаза и аргининдегилролаза отсутствуют; образует ацетилметилкарбинол, не образует индол.
Способен к росту на средах Чапека, Миллса, магниево-калиево-дрожжевой (МКД), Маккланга как с добавлением нефти и нефтепродуктов (солярки, моторного и машинного масел, мазута) в качестве источников углеводородов, так и без добавления. Особенностью штамма является галотолерантность (рост в интервале солености 0,0-24,0% NaCl).
Штамм растет на средах для образования цистоподобных рефракторных форм (ЦРФ), для стационарных форм, по дефициту азота и фосфора (N-0,2 г/л и Р-0,2 г/л; N-0,2 г/л и Р-1,0 г/л; N-1,0 г/л и Р-0,2 г/л), органических (МПА, МПА с добавлением 4,0% NaCl).
Для сохранения штамма используют метод периодических пересевов (3-4 раза в год) на МПА или агаре Чапека. Инкубирование после пересева ведут при температуре 28°С в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°С.
Нефтеокисляющая активность штамма оценивалась по убыли суммарных нефтяных углеводородов методом ИК-фотометрии (РД 52.24.476-95. Методические указания. ИК-фотометрическое определение нефтепродуктов в воде. - Ростов-на-Дону, 1995. - 13 с.) и методом измерения массовой доли концентрации нефти после экстракции гексаном и измерения интенсивности флуоресценции экстракта на приборе типа «Флюорат-02» (Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. - С-Пб, 2000. - 250 с.).
Эмульгирующую активность определяли по методике (Абрамзон А.А., Зайченко Л.П., Файнгольд С.И. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение: Учебное пособие для ВУЗов. - М.: Химия, 1988. - 200 с.). В качестве гидрофобной фазы для эмульгирования использовали керосин. Измерение индекса эмульгирования определяли через 24 часа, как величину отношения высоты эмульсионного слоя к общей высоте жидкости в пробирке, и выражали в процентах по формуле
I=h/Н×100, где
I - индекс эмульгирования;
h - объем эмульсионного слоя, мл;
Н - общий объем жидкости, мл.
Эффективность предлагаемого способа в биодеструкции нефти изучали в широком диапазоне солености, что подтверждается следующими примерами.
4
2
2
4
2
4
4
3
7
Пример 1. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл среды Миллса следующего состава (г/л): NaCl-24,0; MgSO·7HO-1,0; КСl-0,7; КНРO-2,0; NaHPO-3,0; NHNO-1.0, вносили сырую стерильную нефть (1,0% по объему) и 1,0 мл суспензии Bacillus firmus SDS-1 (1,0×16кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс.об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со средой Миллса без добавления суспензии Вас.firmus SDS-1 и с добавлением сырой стерильной нефти (1,0% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 14 суток.
Через 1, 3, 7, 14 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов (ИК-фотометрия). В ходе экспозиции Вас.firmus SDS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 14 суток составила 69,0%. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1.Убыль нефтяных углеводородов в ходе эксперимента, %
Вариант опыта
Продолжительность эксперимента, сутки
1
3
7
14
Среда Миллса с добавлением 1,0% нефти
0.5
4,6
10,4
24,6
Среда Миллса с добавлением 1,0% нефти и суспензии Bacillus firmus SDS-1
8,1
25.3
62,5
69,0
Титр клеток, кл/мл
1,0×10<sup>7</sup>
2,0×10<sup>7</sup>
1,0×10<sup>7</sup>
l,0×l0<sup>7</sup>
4
2
2
4
2
4
4
3
7
Пример 2. В колбы Эрленмейера (объемом 250 мл), содержащие 100 мл среды Миллса следующего состава (г/л): NaCl-24,0; MgSO·7HO-1,0; КСl-0,7; КНРO-2,0; NaHPO-3,0; NНNO-1,0, вносили сырую стерильную нефть (2,0% по объему) и 1,0 мл суспензии Bacillus firmus SDS-1 (1,0×1,6кл/мл), предварительно выращенных на МПА в течение 2-х суток при 28°С, дважды отмытых от агара дистиллированной водой, отделенных центрифугированием (8 тыс.об/мин) и ресуспендированных в стерильной морской воде. Контролем служили колбы со средой Миллса без добавления суспензии Вас.firmus SDS-1 и с добавлением сырой стерильной нефти (2,0% по объему). Колбы инкубировали на перемешивающем устройстве (45 кол/мин) при комнатной температуре в течение 14 суток.
Через 1, 3, 7, 14 суток в колбах определяли титр клеток и содержание суммарных нефтяных углеводородов (ИК-фотометрия). В ходе экспозиции Вас.firmus SDS-1 показал способность к активизации процесса деструкции нефти. Убыль нефтяных углеводородов в течение 14 суток составила 62,2%. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2.Убыль нефтяных углеводородов в ходе эксперимента, %
Вариант опыта
Продолжительность эксперимента, сутки
1
3
7
14
Среда Миллса с добавлением 2,0% нефти
7,9
15.4
22,0
28,4
Среда Миллса с добавлением 2,0% нефти и суспензии Bacillus firmus SDS-1
45,6
46,7
60,9
62,2
Титр клеток, кл/мл
1,0×10<sup>7</sup>
2,0×10<sup>7</sup>
1,0×10<sup>8</sup>
1,0×10<sup>7</sup>
4
2
4
4
2
2
3
4
7
Пример 3. Для проверки штамма на способность к трансформации нефти осуществляли количественный анализ методом измерения массовой доли нефтепродуктов на анализаторе жидкости «Флюорат-02». Культивирование микроорганизмов проводили в пенициллиновых флаконах, содержащих по 10,0 мл жидкой среды для эндоспорообразования (г/л): (NH)HPO-1,0; KCl-0,2; MgSO·7HO-0,2; СаСl-0,2; FеСl-0,001; MnSO-0,0017; МПБ-200 мл; глюкоза-20,0 с внесением 2,0% (по объему) сырой стерильной нефти. В качестве инокулята использовали культуры, выращенные на среде МПА с нефтью. Начальная концентрация исследуемого деструктора в опытных пенициллиновых флаконах составляла 10 кл/мл. Инкубирование осуществляли на качалке при 24 об/мин и температуре 25°С в течение 10 суток. Количественное определение нефти и титр клеток проводили на 3-и, 5-е, 7-е и 10-е сутки. В качестве контроля использовались пенициллиновые флаконы без внесения культуры микроорганизмов.
Убыль нефтяных углеводородов в течение 10 суток составила 82,5%. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3.Убыль нефтяных углеводородов в ходе эксперимента, %
Вариант опыта
Продолжительность эксперимента, сутки
3
5
7
10
Среда для эндоспорообразования с добавлением 2,0% нефти
35,8
40,2
43,7
47,6
Среда для эндоспорообразования с добавлением 2,0% нефти и суспензии Bacillus firmus SDS-1
39,7
58,4
64,3
82,5
Титр клеток, кл/мл
1,0×10<sup>7</sup>
1,1×l0<sup>7</sup>
1,6×10<sup>6</sup>
1,4×10<sup>7</sup>
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
4
2
4
2
4
2
2
4
Пример 4. Для определения эмульгирующей активности бактерии выращивали в течение 5 суток на чашках с МПА. Полученную биомассу суспендировали в физиологическом растворе и засевали в колбы Эрленмейера (объемом 250 мл) с 50 мл стерильной среды 5 следующего состава (г/л): КНРO-7,0; КHPO-3.0; CaCl (1,0%, мл)-1,0; MgSO·7HO-0,1; (NH)SO-1,0; FeSO·7HO-0,5; ZnSO·7HO-0,5; MnSO·3HO-0,5; HSO (0,1 н, мл) - 10,0 с добавлением 0,6 мл глицерина. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин, далее к культуральной жидкости добавляли объем керосина, равный объему супернатанта, и перемешивали на перемешивающем устройстве в течение 20 мин. Полученную эмульсию оставляли на 24 часа при комнатной температуре. Эмульгирующая активность Bacillus firmus SDS-1 составила 46,0%.
Таким образом, применение штамма Bacillus firmus SDS-1 приводит к биодеградации нефтяных углеводородов (62,2-82,5%) в относительно короткие сроки (10-14 суток). Кроме того, штамм обладает способностью к биоэмульгации, что значительно повышает эффективность патентуемого способа для очистки объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения. Следует отметить, что патентуемый способ в отличие от аналога не предусматривает использование принудительной аэрации и биостимулятора, а также является эффективным в диапазоне солености (0,0-24,0%).
Представленные экспериментальные данные показывают способность штамма Bacillus firmus SDS-1 продуцировать эмульгирующий агент и использовать нефтяные углеводороды в качестве источника питания и энергии, что позволяет рекомендовать средство для деструкции нефтяных углеводородов в среде, содержащей NaCl до 24,0%, представляющее собой штамм Bacillus firmus SDS-1 ВКПМ В-9278 для очистки объектов окружающей среды и загрязненных поверхностей от нефти и нефтепродуктов.
Источники информации
1. Патент РФ №2129603 «Штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б, используемый для очистки пресной и морской воды от нефти и нефтепродуктов, C12N 1/14, C02F 3/34, C12N 1/14, C12R 1:3, 1999.
2. Патент РФ №2128221 «Штамм Arthrobacter sp. для разложения нефти и нефтепродуктов», C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:06, 1999.
3. Патент РФ №2303003 «Способ биологической очистки воды от нефтяных загрязнений», C02F 3/34, C12N 1/20, C12R 1/40, 2005 (прототип).
4. Сопрунова О.Б., Клюянова М.А. Эколого-физиологические особенности бактериальных штаммов, изолированных из нефтезагрязненных экосистеме Нижнего Поволжья // Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе. - №5, 2008. - с.64-68.
6. Практикум по микробиологии / Под ред. Н.С.Егорова. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. - 306 с.
7. РД 52.24.476-95. Методические указания. ИК-фотометрическое определение нефтепродуктов в воде. - Ростов-на-Дону. 1995. - 13 с.
8. Другов Ю.С., Родин А.А. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. - С-Пб, 2000. - 250 с.
9. Абрамзон А.А., Зайченко Л.П., Файнгольд С.И. Поверхностно-активные вещества. Синтез, анализ, свойства, применение: Учебное пособие для ВУЗов. - М.: Химия, 1988. - 200 с.