Набор реагентов для обнаружения возбудителей клещевых боррелиозов
SET OF REAGENTS FOR THE DETECTION OF PATHOGENS OF TICK-BORNE BORRELIOSIS

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к лабораторной диагностике клещевых боррелиозов.
Borrelia burgdorferi sensu lato
B. burgdorferi s.l.
Borrelia miyamotoi
B. miyamotoi
I. persulcatus
I. Ricinus),
Предложен набор реагентов для обнаружения ДНК возбудителей клещевого боррелиоза (далее ) и (далее) в иксодовых клещах (на примере , а также в образцах крови человекаметодом петлевой изотермической амплификации нуклеиновых кислот (LAMP).
I. persulcatus
I. ricinus
B. burgdorferi s.l.
B.
miyamotoi
B. miyamotoi
Иксодовый клещевой боррелиоз является опасным зооантропонозным трансмиссивным природно-очаговым заболеванием бактериального происхождения, распространенным на территориях Северной Америки, Азии и Европы в лесных массивах умеренного климатического пояса, нередко приводящим к поражению органов, тканей, сердечно-сосудистой и нервной системе. Территория Российской федерации является наибольшим ареалом распространения клещей видов  (таежный клещ) и (собачий клещ), служащих переносчиками возбудителей данной инфекции - спирохеты группы  Показано, что данные клещи являются также и переносчиками боррелиоза вызываемого спирохетой из группы возбудителей клещевых возвратных лихорадок [Платонов А. Е., Топоркова М. Г., Колясникова Н. М. и др. Клинические проявления иксодового клещевого боррелиоза, вызванного , в контексте иммунного ответа на возбудитель Терапевтический архив. 2017;89(11):35-43. https://doi.org/10.17116/terarkh2017891135-43].
Для выявления ДНК возбудителей клещевого боррелиоза в клещах и образцах биологического материала человека наиболее часто используют методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время известны коммерческие наборы реагентов (аналоги) для обнаружения генетического материала возбудителей клещевых инфекций методом ПЦР в исследуемых образцах:
B. burgdorferi s.l.
B. burgdorferi sensu stricto
B. afzelii
B. garinii
- «АмплиСенс Borrelia burgdorferi sensu lato-FL». Набор предназначен для выявления 16S рРНК  (, , ) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по конечной точке;
B. burgdorferi s.l.
B. afzelii
B. garinii
B. burgdorferi sensu stricto
- «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.». Набор реагентов для выявления ДНК боррелий комплекса  (, , ) методом ПЦР в режиме реального времени.
B. burgdorferi
- «БОРРЕЛИО-ГЕН». Набор реагентов БОРРЕЛИО-ГЕН для выявления ДНК боррелии бургдорфери () методом ПЦР
B. miyamotoi
- «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi». Набор реагентов для выявления ДНК  методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
B. miyamotoi
- «АмплиСенс Borrelia miyamotoi-FL». Набор реагентов для качественного определения ДНК  в биологическом материале (кровь, тканевой (аутопсийный, биопсийный) материал, ликвор, клещи) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации.
B. burgdorferi s.l. и B. miyamotoi
Однако указанные наборы не позволяют идентифицировать генетический материал совместно, что требует отдельных постановок ПЦР для идентификации разных инфекционных патогенов.
Известны наборы реагентов для одновременного выявления нескольких клещевых инфекций в одном образце ДНК. Патент US2019/0309347, опубл. 10.10.2019, описывает тест-систему на основе мультиплексной количественной ПЦР в реальном времени для многоэтапного обнаружения группы клещевых инфекций, включая боррелиозы в биопробах человеческого или животного происхождения. Тест предполагает на конечном этапе секвенирование полученных ампликонов для определения конкретного возбудителя.
Недостатком описанного набора является длительное время выполнения анализа и необходимость наличия высокотехнологичного оборудования.
B. burgdorferi s.l.
B. burgdorferi sensu stricto
B. afzelii
B. garinii
B. miyamotoi
Существует тест-система [RU2629604, опубл. 30.08.2017] для обнаружения в мультиплексном режиме ПЦР из 4 разных групп инфекционных патогенов, переносимых клещами. Данный набор включает четыре различных флуоресцентных красителя. Набор позволяет выявлять группу  (, , ), однако нет сведений о возможности его использования для выявления .
Все описанные наборы для ПЦР тестирования подразумевают наличие специального оборудования (термоциклеров), соответствующих условий лабораторных помещений и высокой квалификации персонала, занимающегося исследованиями. Проведение исследования включает обязательный этап предварительного выделения ДНК из тестируемого образца. Для получения результатов анализа требуется не менее 3-4 часов рабочего времени, а наборы реагентов не предназначены для использования в полевых условиях.
Известны несколько наборов реагентов для выявления клещевых инфекций методом петлевой изотермической амплификации.
Orientia tsutsugamushi
Патент KR102219895, опубл 24.02.2021, описывает тест-систему LAMP для поиска возбудителей клещевой инфекции  в биопробах человека, которая подразумевает использование 6 олигонуклеотидов, включая петлевые с детекцией результата визуально по цвету смеси. Однако данный набор не предназначен для детекции возбудителей боррелиоза, а ареал распространенности инфекции Orientia tsutsugamushi ограничен дальневосточными регионами.
B. burgdorferi s. l. (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii и B. afzelii
B. burgdorferi s. l.
B. miyamotoi,
Известны реагенты и способ [CN101967513, опубл. 09.02.2011], где предлагается использование одновременно 12 специфических наборов внешних и внутренних праймеров в трех комплектах для петлевой изотермической амплификации с целью раздельной детекции продуктов в последующей реакции методом гель-электрофореза конкретных 3-х патогенных видов боррелий группы ). Вместе с тем, для назначения профилактических препаратов и лечения клещевых боррелиозов не известна какая-либо зависимость от конкретного геновида иопределение конкретного возбудителя не имеет клинического значения. Вместе с тем, в наборе отсутствуют необходимые праймеры для выявления возбудителя безэритроматозной формы клещевого боррелиоза -  который вносит существенный вклад в структуру клещевых боррелиозов и вызывает заболевание со своими клиническими особенностями.
B. burgdorferi s. l. (B. afzelii, B. garinii
B. burgdorferi sensu stricto
B. miyamotoi.
Известен набор реагентов [CN101886113, опубл. 17.11.2010] для обнаружения методом LAMP одновременно для 3-х патогенных геновидов боррелийи ). В наборе используются 4 специфичных олигонуклеотида, комплементарные консервативному участку гена 16S рРНК боррелий. Вместе с тем, в данном наборе также нет специфических праймеров для Оценка результатов реакции при использовании описанного набора реагентов для LAMP выполняется методами электрофореза на агарозном геле, выполнением реакции в присутствии флуоресцентного красителя SYBR green или визуальной оценкой помутнения раствора или выпадением белого осадка. Первые два способа оценки результатов реакции требуют дополнительного оборудования, а визуальный метод определения степени мутности раствора субъективен и недостаточно точен.
B. burgdorferi s. l.
B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii, и B. valaisiana
Известен способ и реагенты для обнаружения ДНК геновидов  () в сыворотке крови человека с помощью метода LAMP [Zhang L. L. et al. Combination of Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay and Nested PCR for Detection of Borrelia burgdorferi sensu lato in Human Serum Samples //Biomedical and Environmental Sciences. - 2015. - Т. 28. - №. 4. - С. 312-315] и [CN102703587, опубл. 03.10.2012].
B. burgdorferi s. l.
B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii,
B. valaisiana
Наиболее близкий к заявляемому изобретению (прототип) является набор [CN102703587, опубл. 03.10.2012] для обнаружения ДНК геновидов  (и) в сыворотке крови человека с помощью метода LAMP.
Указанный в прототипе набор реагентов включает праймеры к консервативному участку гена флагеллина Fla:
F3: 5’-GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3’;
B3: 5’-CACCAGCGTCACTTTCAG-3’;
FIP: 5’-TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3’;
BIP: 5’-ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’.
B. miyamotoi,
Однако данный набор праймеров не позволяет выявлять кроме того, набор реагентов не предусматривает возможность выявления возбудителей боррелиоза в цельных клещах, а используемые методы детекции результата с помощью электрофореза в агарозном геле повышают риск контаминации исследуемых образцов.
Вместе с этим, все вышеописанные наборы реагентов LAMP для выявления клещевых инфекций предполагают обязательное предварительное проведение экстракции ДНК из образцов клещей или биопроб, собранных у животных и человека.
Техническим результатом заявляемого изобретения является повышение экспрессности и специфичности анализа по обнаружению клещевого боррелиоза, увеличение достоверности постановки диагноза за счет расширения перечня определяемых одновременно возбудителей инфекции, а также возможность осуществления анализа в полевых условиях, в т.ч. на цельных клещах.
B. burgdorferi s. l.:
Технический результат достигается тем, что в наборе реагентов для обнаружения возбудителей клещевых боррелиозов, содержащем ДНК-полимеразу, буфер для изотермической реакции, следующие внешние и внутренние праймеры для выявления ДНК
F3: 5’-GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3’;
B3: 5’-CACCAGCGTCACTTTCAG-3’;
FIP: 5’-TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3’;
BIP: 5’-ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’, -
B. burgdorferi s. l.
новым является то, что дополнительно включает следующие петлевые праймеры для выявления ДНК :
LF: 5’-TGCTCCCACATGAACTCTTAA-3’;
LB: 5’-AAGGAGCTCAGGCTGCTCAGA-3’,
B. miyamotoi
праймеры для выявления ДНК :
F3: 5’-TTCTAACAAAGGACAATATTCCT-3’;
B3: 5’-TTCATTTAAGGGGAAACGATT-3’;
FIP: 5’-CGTTTTCTCTAGCTCGATTGGGAAACACGACCCAGAAATTGACA-3’;
BIP: 5’-CGATATTACGCCACTGACTTCACATGGTTTTTTGTTTTCAGGATCA-3’;
LF: 5’-TGTGCAACATTTGTGGTTG-3’;
LB: 5’- TCACTAAGTCTCAGTGAAAGA-3’,
4
2
ДНК полимеразу Bst 2.0 или Bsm и соответствующий им изотермический Bst 2.0 или Bsm буферы, а также MgSOили MgClсоответственно, смесь нуклеотидов dNTP, бетаин, деионизированную воду, положительный и отрицательный контроли, а также флуоресцентные красители EVA green или бромистый этидий.
B. miyamotoi
Основным отличием заявляемого набора является содержание праймеров для выявления ДНК , что увеличивает достоверность подстановки диагноза за счет расширения перечня выявляемых возбудителей клещевого боррелиоза.
B. burgdorferi s. l.
Еще одним отличием заявляемого набора является включение петлевых праймеров LF и LB для выявления ДНК , что повышает специфичность определения данного геновида возбудителя боррелиоза и уменьшает время, необходимое для детекции положительного результата.
Отличием заявляемого набора является применение флуоресцентных красителей, что позволяет сократить время анализа, наблюдая развитие реакции без использования дополнительных способов детекции, например электрофореза.
Важным отличием заявляемого набора является возможность выявления возбудителей клещевого боррелиоза в цельном клеще, что позволяет использовать данный набор для проведения анализа в полевых условиях.
Сопоставительный анализ с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков для заявляемого изобретения.
Сущность изобретения поясняется с помощью следующих графических материалов:
- Фиг.1, Фиг.2 - Визуализация результатов анализа выявления клещевого боррелиоза в образцах крови, содержащих различную концентрацию плазмидной ДНК;
- Фиг. 3 - Визуальный тест на выявление возбудителей боррелиоза в цельных клещах.
Изобретение осуществляется следующим образом.
Для проведения анализа на выявление клещевого боррелиоза первоначально осуществляют забор биологического материала, который может быть представлен образцами крови, образцами ДНК возбудителя боррелиоза, выделенного из клещей при использовании известных способов, например с применением коммерческого набора «РеалБест экстракция 100» (Вектор-Бест, Россия), или цельным клещом.
B. burgdorferi s. l.
B. miyamotoi,
Для выявления клещевого боррелиоза, вызываемого  и используют заявляемый набор, содержащий:
B. burgdorferi s. l.
праймеры для выявления ДНК :
F3: 5’-GCTGTTGAGCTCCTTCTTG-3’;
B3: 5’-CACCAGCGTCACTTTCAG-3’;
FIP: 5’-TGCAAATCTATTCTCTGGCGAAGGTTGAGCACCTTCTTGAACA-3’;
BIP: 5’-ACAGCAATCGCTTCATCTTGATTCTCAAGCTTCTTGGACC-3’;
LF: 5’-TGCTCCCACATGAACTCTTAA-3’;
LB: 5’-AAGGAGCTCAGGCTGCTCAGA-3’,
B. Miyamotoi:
праймеры для выявления ДНК
F3: 5’-TTCTAACAAAGGACAATATTCCT-3’;
B3: 5’-TTCATTTAAGGGGAAACGATT-3’;
FIP: 5’-CGTTTTCTCTAGCTCGATTGGGAAACACGACCCAGAAATTGACA-3’;
BIP: 5’-CGATATTACGCCACTGACTTCACATGGTTTTTTGTTTTCAGGATCA-3’;
LF: 5’-TGTGCAACATTTGTGGTTG-3’;
LB: 5’- TCACTAAGTCTCAGTGAAAGA-3’,
4
2
ДНК полимеразу Bst 2.0 или Bsm и соответствующий им изотермический Bst 2.0 или Bsm буферы, а также MgSOили MgClсоответственно, смесь нуклеотидов dNTP, бетаин, деионизированную воду, положительный и отрицательный контроли, а также флуоресцентные красители EVA green или бромистый этидий.
B. burgdorferi s. l.
B. miyamotoi
4
2
Для выполнения реакции LAMP на выявление возбудителя клещевого боррелиоза, готовят смесь, которая содержит в себе праймеры на  и/или на  в конечных концентрациях F3, B3 - 0,2 мкМ, FIP, BIP - 1,6 мкМ, LF, LB - 0,4 мкМ, 0,8 М бетаин, 1,4 мМ dNTP, 8 ед. Bst 2.0 или Bsm полимеразы и, в соответствии с используемым ферментом, 6 мМ MgSO и 1X изотермический Bst 2.0 буфер или 4 мМ MgCl и 1X Bsm буфер соответственно. Для детекции результатов реакции к смеси до амплификации добавляют флуоресцентный краситель 0.4X Eva green (если детекция будет осуществляться в реальном времени с использованием реал-тайм амплификатора) или 1 мкг/мкл бромистый этидий (если детекция будет осуществляться визуально при дневном или УФ свете) после проведения реакции амплификации. Далее к данной смеси добавляют образец, содержащий ДНК боррелий, и деионизированной водой доводят ее объем до 25 мкл. При каждом исследовании необходимо использовать две дополнительные пробирки, в которые вносят отрицательные и положительные контрольные образцы (ОКО и ПКО).
ПРИМЕР 1
Выявление специфических для боррелий ДНК плазмид в образцах крови
B. burgdorferi s.l.
Для выявления специфических для боррелий ДНК плазмид образцы крови контаминировали плазмидами, содержавшими специфические последовательности ДНК
B. burgdorferi s.l.
B. miyamotoi
2
Для выполнения реакции LAMP готовили мультиплекс-смесь, которая содержала в себе 6 праймеров на  и 6 праймеров на  (0,2 мкМ праймеров F3 и B3, 1,6 мкМ праймеров FIP и BIP, 0,4 мкМ праймеров LF и LB), 0.8 М бетаин, 4 мМ MgCl, 1X Bsm буфер (Thermo Scientific™, США), 1.4 мМ dNTP, 8 ед. Bsm полимеразы (Thermo Scientific™, США). Далее к 19,9 мкл данной смеси добавляли 5 мкл проб цельной крови с внесенными специфическими плазмидами и деионизированной водой доводили объем смеси до 25 мкл. В качестве отрицательного контроля в отдельные пробирки со смесью добавляли цельную кровь и ДНК, отрицательную на боррелиоз. Положительным контролем являлась плазмидная ДНК с концентрацией аналита в размере 2078 копий. Реакционную смесь инкубировали на термостате при постоянной температуре 60°C в течение 60 мин, затем при 80°C в течение 10 мин для инактивации работы фермента. Детекция результата осуществлялась путем добавления 0,1 мкл бромистого этидия в конечной концентрации 1 мкг/мкл и последующим освещением пробирок источником ультрафиолетового излучения. Результаты представлены в таблице ниже и на фиг. 1 и 2.
№ образца
Результат реакции LAMP заявляемым набором реагентов
Конечная концентрация внесенной плазмиды, копий в пробе
1
Выявлен
20777
2
Выявлен
2078
3
Выявлен
208
4
Не выявлен
21
Полученные результаты демонстрируют, что предлагаемый набор реагентов способен проводить детекцию нуклеиновых кислот возбудителя боррелиоза непосредственно в образцах крови.
ПРИМЕР 2
.
Выявление возбудителей боррелиоза в образцах ДНК, выделенных из клещей
Были использованы 5 образцов выделенной из клещей ДНК.
B. burgdorferi s.l.
B. miyamotoi
4
Для выполнения реакции LAMP готовили мультиплекс-смесь, которая содержала в себе 6 праймеров на  и 6 праймеров на  (0.2 мкМ праймеров F3 и B3, 1.6 мкМ праймеров FIP и BIP, 0.4 мкМ праймеров LF и LB), 0.8 М бетаин, 6 мМ MgSO, 1X изотермический буфер (New England Biolabs, Англия), 1.4 мМ dNTP, 8 ед. Bst 2.0 полимеразы (New England Biolabs, Англия), 0.4X Eva green (НПО «Синтол», Россия). Далее к 18,6 мкл данной смеси добавляли 5 мкл выделенной ДНК боррелий и деионизированной водой доводили объем смеси до 25 мкл. Реакционную смесь инкубировали на real-time амплификаторе CFX96 Touch (Bio-Rad) при постоянной температуре 63°C в течение 60 мин. Регистрацию результата проводили в реальном времени по росту кривых флуоресценции. Для сравнения результатов параллельно проводили реакцию ПЦР-РВ с использованием наборов «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.» и «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi» (Вектор-Бест, Россия). Результаты сравнения анализов на обнаружение возбудителя клещевого боррелиоза заявляемым набором и ПЦР-РВ представлены в таблице ниже.
№ образца
Результат реакции LAMP заявляемым набором реагентовВремя выполнения теста - 60 мин без учета выделения ДНК
Результат реакции в ПЦР-РВ(Вектор Бест)Время выполнения теста - 90 мин без учета выделения ДНК
Обнаружение возбудителя клещевого боррелиоза
B. burgdorferi s. l.
B. miyamotoi
1
Выявлен
Выявлен
Не выявлен
2
Выявлен
Выявлен
Не выявлен
3
Выявлен
Не выявлен
Выявлен
4
Выявлен
Не выявлен
Выявлен
5
Не выявлен
Не выявлен
Не выявлен
Полученные результаты демонстрируют совпадение результатов тестирования с использованием предлагаемого набора реагентов LAMP и результатов использования коммерческих наборов для ПЦР-РВ. При этом положительный результат при использовании набора для LAMP детектируется в среднем в течение 15 мин, что в 2 раза быстрее, чем при использовании реакции ПЦР-РВ.
ПРИМЕР 3
.
Выявление возбудителей боррелиоза в цельных клещах (без выделения ДНК).
Были использованы образцы цельных клещей.
B. burgdorferi s.l.
B. miyamotoi
2
Для выполнения реакции LAMP готовили мультиплекс-смесь, которая содержала в себе 6 праймеров на  и 6 праймеров на  (0.2 мкМ праймеров F3 и B3, 1.6 мкМ праймеров FIP и BIP, 0.4 мкМ праймеров LF и LB), 0.8 М бетаин, 4 мМ MgCl, 1X Bsm буфер (Thermo Scientific™, США), 1.4 мМ dNTP, 8 ед. Bsm полимеразы (Thermo Scientific™, США). Деионизированной водой доводили объем смеси до 25 мкл.
Реакцию LAMP без использования этапа выделения ДНК проводили следующим образом: клещей помещали в лунки стрипа стандартного для ИФА планшета, к ним добавляли реакционную смесь в объеме 25 мкл. Далее инкубировали стрип при постоянной температуре 60°C в течение 60 мин, затем при 80°C в течение 10 мин для инактивации работы фермента. Детекция результата осуществлялась путем добавления 0,1 мкл бромистого этидия в конечной концентрации 1 мкг/мкл и последующим освещением лунки источником ультрафиолетового излучения. Результаты визуализации представлены на фигуре 3.
Настоящий пример демонстрирует возможность выявления возбудителей боррелиоза на цельном клеще в «полевых» условиях.