УГЛЕВОДНО-ГЛИКОЛИПИДНЫЕ КОНЪЮГИРОВАННЫЕ ВАКЦИНЫ
CARBOHYDRATE-GLYCOLIPID CONJUGATE VACCINES

Настоящее изобретение относится к области синтеза и к биологической оценке нового класса вакцин на основе углеводов. Новые вакцины включают мультимодулярную структуру, которая позволяет применять вакцину ко всему многообразию патогенов. Предложенный способ позволяет получать вакцины против всех патогенов, экспрессирующих иммуногенные углеводные антигены. Поскольку связывания антигенных углеводов с белками не требуется, конъюгированная вакцина является, в частности, термостойкой. Не требуется замораживания, главного недостатка вакцин на белковой основе.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Широкое распространение многих инфекционных заболеваний, таких как инвазивное пневмококковое заболевание (IPD), и повышение резистентности к антибиотикам связанных с ними патогенов вызывает потребность в срочной разработке защитных вакцин. Особенно ввиду того, что существующие вакцины проявляют такие главные недостатки, как непостоянная иммуногенность и отсутствие развития иммунологической памяти.
Вакцины традиционно состоят из аттенуированных патогенов, цельных инактивированных организмов или инактивированных токсинов. Во многих случаях такие подходы являются успешными для индуцирования иммунной защиты, основанной на опосредуемых антителами ответных реакциях. Однако, для некоторых патогенов, например, ВИЧ, HCV, ТБ и малярии, требуется индуцирование клеточно-опосредованного иммунитета (CMI). Неживые вакцины обычно оказываются неэффективными в продуцировании (CMI). Кроме того, хотя живые вакцины могут индуцировать CMI, некоторые живые аттенуированные вакцины могут вызывать заболевания у иммуносупрессивных пациентов.
В отличие от старых вакцин, которые обычно основывались на живых ослабленных или не-реплицирующих инактивированных патогенах, современные вакцины составляются из синтетических рекомбинантных или высокоочищенных субъединичных антигенов. Субъединичные вакцины разработаны для включения только тех антигенов, которые необходимы для защитной иммунизации и считаются более безопасными, чем цельные инактивированные или живые ослабленные вакцины. Однако чистота субъединичных антигенов и отсутствие саморегулирующихся иммуномодуляторных компонентов, связанных с аттенуированными или убитыми вакцинами, часто приводит к ослабленной иммуногенности.
Иммуногенность относительно слабого антигена может быть повышена одновременным или, более обычно, совместным введением антигена с "адъювантом", обычно, веществом, которое не является иммуногенным при введении отдельно, но будет вызывать, увеличивать и/или пролонгировать иммунный ответ на антиген. В отсутствие адъюванта может быть снижен или отсутствовать иммунный ответ, или, хуже, хозяин может лишиться иммуногенности к антигену.
Адъюванты могут быть найдены в группе структурно гетерогенных соединений (Gupta et al., 1993, Vaccine, 11: 293-306). Классически признанные примеры адъювантов включают масляные эмульсии (например, адъювант Фрейнда), сапонины, соли алюминия или кальция (например, квасцы), неионные блок-полимерные поверхностно-активные вещества, липополисахариды (LPS), микобактерии, столбнячный анатоксин и многие другие. Теоретически, каждая молекула или вещество, которые способны благоприятствовать или развивать конкретную ситуацию в каскаде иммунологических событий, приводя в конечном итоге к более ярко выраженному иммунологическому ответу, могут быть определены как адъювант.
Галактозилцерамид (α-GalCer) представляет собой гликолипид, более конкретно, гликозилцерамид, первоначально выделенный из морских грибов Okinawan (Natori et al., Tetrahedron, 50: 2771-2784, 1994), или его синтетический аналог KRN7000 [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-галактозилпиранозил)-2-(N-гексакозаноиламино)-l,3,4-октадекантриол, который может быть поставлен фирмой Pharmaceutical Research Laboratories, Kirin Brewery (Gumna, Japan), или синтезирован, как описано ранее (см., например, Kobayashi et al., 1995, Oncol. Res., 7:529-534; Kawano et al., 1997, Science, 278: 1626-9; Burdin et al., 1998, J. Immunol., 161:3271; Kitamura et al., 1999, J. Exp. Med., 189:1121; патент США № 5936076).
Было показано, что α-GalCer может стимулировать активность природных киллеров (NK) и продуцирование цитокинов природными киллерными T клетками (NKT) и проявлять сильную противоопухолевую активность in vivo (Kawano et al., 1998, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95:5690). После захвата антиген-презентующей клеткой (APC), которая представлена дендритной клеткой (DC) и тому подобное, α-галактозилцерамид помещается на клеточную мембрану белком CD1d аналогичным основной молекуле гистосовместимого комплекса (МСН) класса I. Клетки NKT активируются путем распознавания c использованием TCR (рецептор T клеток) представленного таким образом комплекса CD1d белка и α-галактозилцерамида, который запускает различные иммунные реакции. Было показано, что инвариантные природные киллерные T клетки индуцируют активацию В-клеток, усиливая пролиферацию В-клеток и продуцирование антител (Galli et al., Vaccine, 2003, 21: 2148-S2154; Galli et al., J Exp. Med, 2003, 197: 1051-1057).
Эти исследования открывают возможность того, чтобы α-GalCer мог играть в равной степени важную роль в преодолении не только врожденного иммунитета, опосредуемого NKT клетками, но также адаптивного иммунитета, опосредуемого В-клетками, хелперными Т-клетками (Th) и цитотоксическими Т-клетками (Тс). Недавно было показано, что α-GalCer действует как адъювант для множества совместно вводимых белковых антигенов и сахаридных антигенов (W003/009812).
Имеющаяся до настоящего времени методика характеризуется одновременным использованием вакцины и адъюванта, что продуцирует желаемую иммуногенность. Главным недостатком вакцин на основе белков, когда необходима конъюгация антигенных углеводов с белками, является то, что вакцина не является, в частности, термостойкой, и требуется замораживание вакцины. Более того, использование, по крайней мере, двух компонентов для достижения достаточной вакцинации также является значительным недостатком, поскольку процедура введения является довольно сложной, например, с точки зрения времени, когда вводимый адъювант является обязательным для достижения желаемой иммуногенности (WO03009812).
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для выполнения данных требований и для преодоления недостатков существующих в настоящее время вакцин в настоящем изобретении представлен новый тип конъюгированной вакцины, в которой углеводный антиген ковалентно связан с гликолипидным адъювантом.
Защита от инфекционных заболеваний обеспечивается путем нейтрализации факторов вирулентности или опсонизирующих антител. Антитела (Ab) должны быть направлены против углеводного антигена патогена, например, из капсул, составленных из полисахаридов или вирусных гликопротеинов. Следовательно, идеальная эффективная вакцина должна индуцировать высокую аффинность и комплемент-фиксирующие анти-углеводные антитела. Это в действительности достигается конъюгатами по настоящему изобретению.
Новые углеводно-гликолипидные конъюгированные производные в соответствии с настоящим изобретением представлены следующей общей формулой (I). Неожиданно было обнаружено, что чрезвычайно сильная и стабильная вакцина может быть получена, когда полисахаридный антиген связывается через линкер и углеводный фрагмент с церамидным фрагментом. Таким образом, настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы (I)
p
A[L-CH-CA]
(I)
где
A представляет собой углеводный антиген, состоящий из от 1 до 10000 углеводных мономеров, где углеводные мономеры углеводного антигена необязательно модифицированы таким образом, чтобы содержать группы амидную, карбонатную, карбаматную, карбонильную, тиокарбонильную, карбокси, тиокарбокси, сложноэфирную, сложную тиоэфирную, простую эфирную, эпокси, гидроксиалкильную, алкиленильную, фениленовую, алкенильную, имино, имидную, изомочевины, тиокарбаматную, тиомочевины и/или мочевины,
р обозначает число остатков –L-CH-CA, которые связаны с углеводным антигеном A, и
p обозначает целое число, определяемое следующим образом:
p обозначает 1 или 2, если u обозначает 1
p обозначает 1, 2, 3 или 4, если u обозначает 2
p обозначает 1, 2, 3, 4, 5 или 6, если u обозначает 3
p обозначает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, если u обозначает 4
1 ≤ р ≤ 10, если 5 ≤ u ≤ 10
2 ≤ р ≤ 50, если 11 ≤ u ≤ 100
20 ≤ р ≤ 200, если 101 ≤ u ≤ 1000
50 ≤ р ≤ 400, если 1001 ≤ u ≤ 10000
u обозначает число углеводных мономеров углеводного антигена А
1
2
2
2
3
1
2
3
L представляет собой -L-L-, -L-, -L-L- или -L-L-L-;
1
L представляет собой один из следующих остатков:
где х обозначает целое число от 1 до 60;
Y представляет собой связь, -NH-, -О-, -S-;
2
2
2
4
3
6
4
8
5
10
6
12
7
14
8
16
9
18
10
20
3
3
2
2
3
3
2
3
2
4
2
3
2
2
4
3
2
3
2
3
2
2
3
3
2
5
3
3
7
2
2
n
2
2
2
2
4
3
6
4
8
5
10
6
12
7
14
8
16
9
18
10
20
3
3
2
2
3
3
2
3
2
4
2
3
2
2
4
3
2
3
2
3
2
2
3
3
2
5
3
3
7
2
2
n
2
2
L представляет собой -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH(CH)-, -C[(CH)]-, -CH-CH(CH)-, -CH(CH)-CH-, -CH(CH)-CH-, -CH-CH(CH)-CH-, -CH-CH(CH)-, -CH-C[(CH)]-, -C[(CH)]-CH-, -CH(CH)-CH(CH)-, -C[(CH)(CH)]-, -CH(CH)-, -(CH-CH-O)-CH-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH(CH)-, -CO-C[(CH)]-, -CO-CH-CH(CH)-, -CO-CH(CH)-CH-, -CO-CH(CH)-CH-, -CO-CH-CH(CH)-CH-, -CO-CH-CH(CH)-, -CO-CH-C[(CH)]-, -CO-C[(CH)]-CH-, -CO-CH(CH)-CH(CH)-, -CO-C[(CH)(CH)]-, -CO-CH(CH)-, -CO-(CH-CH-O)-CH-CH-;
n обозначает целое число от 1 до 60;
3
2
2
L представляет собой -CO-, -O-CO-, -NH-CO-, -NH(C=NH)-, -SO-, -O-SO-;
CH представляет собой моносахарид, дисахарид или трисахарид;
*
#
R и R независимо друг от друга представляют собой линейный или разветвленный или циклический замещенный или незамещенный насыщенный или ненасыщенный углеводородный остаток, состоящий из от 1 до 30 атомов углерода;
и энантиомерам, стереоизомерным формам, смесям энантиомеров, диастереомерам, смесям диастереомеров, пролекарствам, гидратам, сольватам, таутомерам и рацематам указанных выше соединений и их фармацевтически приемлемым солям.
Aнтиген
A представляет собой углеводный антиген, состоящий из от 1 до 10000 углеводных мономеров.
Термин “антиген”, используемый в описании, относится к веществу, которое после попадания в организм людей и животных вызывает специфический иммунный ответ. Это проявляется либо в образовании антител (гуморальный ответ) и развитии клеточно-опосредованного иммунитета (клеточный иммунный ответ), либо в специфической иммунной толерантности. В зависимости от того, требуется ли для иммунного ответа участие Т-лимфоцитов (Т клеток) или нет, он называется тимусзависимым или –независимым антигеном. Предпосылкой иммунного ответа (для иммуногенности антигена) является то, что антиген признается организмом как инородный, что он имеет молекулярный вес, по крайней мере, 1000, и что он принадлежит к классу белков или полисахаридов, редко дезоксирибонуклеиновых кислот или липидов. Более сложные структуры, такие как бактерии, вирусы или эритроциты (крупнодисперсные антигены) обычно являются более эффективными антигенами. На молекулярном уровне антиген характеризуется его способностью быть "связью" на антиген-связывающем участке антитела.
Инородные вещества, которые стимулируют иммунный ответ не сами по себе, но при химическим связывании с иммуногенными макромолекулами, называются гаптенами. Для эффективности иммуногенных антигенов определяющим является путь введения (разовая или многократная доза, дозирование внутрикожно или внутривенно, со вспомогательным средством или без него). Повторные атаки таких же антигенов ускоряют иммунный ответ и могут приводить в результате к наиболее неблагоприятному варианту специфической гиперчувствительности (аллергии, когда антигены часто называют аллергенами). В присутствии больших количеств антигена или хронических устойчивых количеств антигена может происходить образование растворимых иммунных комплексов, которые могут вызывать анафилаксию.
Иммуноген представляет собой специфический вид антигена. Иммуногеном является вещество, которое при введении способно само по себе вызывать адаптивный иммунный ответ. Иммуноген способен вызывать иммунный ответ, тогда как антиген способен объединяться с продуктами иммунного ответа, как только они вырабатываются. Иммуногенностью является способность индуцировать гуморальный и/или опосредуемый клетками иммунный ответ.
Термин “антиген” может быть кратко описан как вещество, принадлежащее к классу белков или полисахаридов, обычно включающих части (слои, капсулы, клеточные стенки, жгутики, волокна и токсины) бактерий, вирусов и других микроорганизмов, а также редко дезоксирибонуклеиновых кислот или липидов, более мелких молекул или ионов (гаптены), которые распознаются организмом людей и животных как инородные и которые могут вызывать после попадания в организм людей и животных специфический иммунный ответ, который включает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ, приводящий к образованию антител (гуморальный ответ) и/или развитию опосредуемого клетками иммунитета (клеточный ответ), где указанные антитела могут приводить к специфическому связыванию антигена.
В частности, термин “антиген” может быть описан как вещество, которое распознается как инородное организмом людей и животных и которое может вызывать после попадания в организм людей и животных специфический иммунный ответ, который включает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ.
Предпочтительно, А представляет собой изолированный, полусинтетический или синтетический углеводный антиген. Изолированный углеводный антиген состоит из от 1 до 10000 углеводных мономеров, предпочтительно, от 10 до 5000 углеводных мономеров и, более предпочтительно, от 20 до 3000. Полусинтетический углеводный антиген, предпочтительно, состоит из от 1 до 1000 углеводных мономеров, более предпочтительно, от 5 до 900, и, еще более предпочтительно, от 10 до 800 углеводных мономеров, и синтетический углеводный антиген, предпочтительно, состоит из от 1 до 1000 углеводных мономеров, более предпочтительно, от 5 до 900, и, еще более предпочтительно, от 10 до 800 углеводных мономеров.
Антигены и особенно изолированные антигены обычно представляют собой смеси антигенов, имеющих определенный диапазон углеводных мономеров, так что термин “антиген, состоящий из 500 углеводных мономеров”, относится к смеси антигенов, имеющих в среднем число 500 углеводных мономеров. Такая смесь могла бы содержать 10% антигенов в среднем с числом 450–470 углеводных мономеров, 10% антигенов с 530–550 углеводными мономерами, 20% антигенов с 471–490 углеводными мономерами, 20% с 510–529 углеводными мономерами и 40% антигенов с числом 491-509 углеводных мономеров.
Предпочтительно, углеводные мономеры принадлежат к гептозам, гексозам, пентозам, тетрозам или сиаловым кислотам, в которых углеводные мономеры соединены друг с другом посредством α/β гликозидных связей, которые относятся к группе, состоящей из 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5 или 2,6 гликозидных связей. Углеводными мономерами также, более конкретно, могут быть производные пептидогликанов, такие как N-ацетилмурамовая кислота, N-ацетил-D-глюкозамин или N-ацетилталозаминуроновая кислота.
3
2
5
3
3
2
2
2
4
2
4
-
-
-
Некоторые из гидроксильных групп (-OH) углеводных мономеров антигена A независимо друг от друга могут быть замещены следующими заместителями -CH, -CH, -SOH, -SO, -CH-COOH, -CH-COO, -CH-COOH, -CH-COO, или некоторые из гидроксильных групп (-ОН) углеводных мономеров могут быть замещены следующими группами:
3
3
3
3
2
3
2
2
2
4
2
4
3
3
-
-
-
-
-H, -O-CH, -O-SOH, -O-SO, -CH, -NH, -NH-CO-CH, -O-CH-COOH, -O-CH-COO, -O-CH-COOH, -O-CH-COO, -NH-SOH, -NH-SO,
где
q обозначает целое число от 1 до 4, и
R′, R″ и R″′независимо друг от друга представляют собой один из следующих остатков:
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
4
9
2
2
3
2
4
3
3
6
3
2
2
5
2
4
2
5
3
6
2
5
2
3
7
2
4
3
7
3
6
3
7
2
3
5
2
4
3
5
3
6
3
5
2
3
2
2
4
3
2
3
6
3
2
2
3
3
2
4
3
3
3
6
3
3
2
4
9
2
4
4
9
3
6
4
9
2
2
4
3
6
2
2
2
4
2
3
6
2
-H, -CH, -CH, -CH, -цикло-CH, -CH(CH), -C(CH), -CH, -Ph, -CH-Ph, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph.
Данные группы являются встречающимися в природе заместителями, которые могут быть в углеводных антигенах.
Таким образом, углеводные мономеры углеводного антигена могут быть необязательно модифицированы или могут быть модифицированы таким образом, чтобы содержать группы амида, карбоната, карбамата, карбонила, карбокси, тиокарбокси, сложного эфира, сложного тиоэфира, простого эфира, эпокси, гидроксиалкила, алкиленила, фенилена, алкенила, имино, имида, изомочевины, тиокарбамата, тиомочевины и/или мочевины.
1
4
Термин “гидроксиалкил” относится, предпочтительно, к линейным или разветвленным С-С гидроксиалкильным остаткам, которые содержат всего 1-4 атома углерода, включая углеродные атомы разветвлений, в которых один из атомов водорода замещен гидроксильной группой, таким как
2
2
4
3
2
2
2
2
3
2
3
3
4
3
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
3
2
2
3
2
3
3
3
2
5
2
3
2
-CHOH, -CHOH, -CHOHCH, -CHCHCHOH, -CHCHOHCH, -CHOHCHCH, -цикло-CHOH, -COH(CH), -CH(CH)CHOH, -CHCHCHCHOH, -CHCHCHOHCH, -CHCHOHCHCH, -CHOHCHCHCH, -C(CH)CHOH, -CHOH-CH(CH), -CH(CH)-CHOHCH, -CCHOH-CH, -CH-C(CH)OH.
2
8
Используемый в описании термин “алкенил” относится, предпочтительно, к линейному или разветвленному С-С-алкенилу, такому как
2
2
2
3
2
3
2
4
2
2
5
2
3
2
3
3
2
3
3
2
3
6
2
2
4
3
2
2
5
3
7
2
2
3
2
2
3
2
3
2
3
2
2
4
3
2
2
3
2
3
2
2
2
3
2
2
3
3
3
3
3
2
3
2
5
3
2
5
3
3
2
2
2
3
3
2
3
2
3
2
3
2
4
8
2
3
6
3
2
4
2
5
2
3
7
4
9
3
6
3
2
2
4
3
2
2
3
2
2
2
3
3
2
4
2
2
4
3
2
2
4
3
3
2
3
3
3
2
3
4
9
2
2
2
2
3
2
5
2
3
2
5
3
2
5
2
3
2
3
2
5
3
3
7
3
3
7
2
3
3
2
3
2
3
2
3
3
2
2
3
2
2
3
2
2
2
2-
3
3
2
3
3
2
3
2
3
3
3
3
3
3
2
3
3
2
3
3
2
5
3
3
3
2
3
2
2
5
3
2
3
2
5
2
3
2
5
2
2
3
7
2
2
2
5
3
2
5
3
3
7
3
2
5
2
5
2
5
3
2
3
3
2
3
2
5
2
2
3
2
2
2
4
2
2
2
2
2
4
2
2
3
2
3
2
5
2
3
2
2
3
2
2
3
2
3
2
2
3
2
3
2
3
2
2
3
2
2
3
2
3
3
3
3
3
3
3
3
2
3
3
2
3
3
2
2
5
10
2
4
8
3
3
6
2
5
2
4
3
7
2
4
9
4
8
3
2
3
6
3
2
2
4
3
2
2
2
3
2
4
2
3
6
3
2
3
6
3
3
2
4
3
3
2
3
2
3
2
4
3
2
2
4
3
2
5
2
4
3
2
5
2
3
2
5
2
2
3
2
2
3
2
5
2
3
3
7
2
3
3
7
2
4
3
3
2
2
3
2
3
2
2
3
3
2
2
4
3
2
2
2
3
2
2
2
2
4
3
3
2
2
3
3
2
2
3
2
3
2
3
3
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
2
5
2
3
3
2
3
2
3
2
2
2
5
3
2
2
3
2
5
2
2
3
2
5
2
2
4
3
7
2
2
4
2
5
3
2
2
5
3
2
4
9
2
2
3
7
3
2
2
5
2
5
2
2
5
3
2
2
3
3
2
2
3
2
5
2
2
2
3
2
2
3
6
2
2
4
2
2
2
2
4
2
2
4
3
2
2
3
2
2
5
2
4
3
2
2
4
3
2
2
4
3
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
2
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
3
2
3
3
2
3
3
2
3
3
2
2
3
3
2
2
3
3
2
2
2
6
12
2
5
10
3
4
8
2
5
3
6
3
7
2
4
4
9
5
10
3
2
4
8
3
2
3
6
3
2
2
2
4
3
2
4
2
4
8
2
4
8
3)
3
3
6
3
3
2
4
3
2
3
3
6
3
2
3
6
3
2
5
3
6
3
2
5
2
4
3
2
5
2
4
2
3
2
2
4
3
2
5
2
4
3
3
7
2
4
3
3
7
3
6
3
3
2
2
4
3
2
3
2
2
4
3
3
2
3
6
3
2
2
2
4
3
2
2
2
3
6
3
3
2
2
4
3
3
2
2
4
3
2
3
2
4
3
3
3
2
4
3
3
2
2
4
3
3
2
2
4
3
3
2
5
2
4
3
3
2
4
3
2
3
2
2
4
2
5
3
2
2
4
3
2
5
2
2
4
3
2
5
2
3
6
3
7
2
3
6
2
5
3
2
4
2
5
3
2
4
4
9
2
2
4
3
7
3
2
4
2
5
2
5
2
4
2
5
3
2
2
4
3
3
2
2
4
3
2
5
2
2
4
2-
3
2
2
4
8
2
3
6
2
2
2
4
2
4
2
3
6
3
2
4
2
3
2
4
2
5
3
6
3
2
3
6
3
2
3
6
3
2
2
4
3
2
2
4
2
3
2
2
4
3
2
2
4
3
2
2
2
4
3
2
2
2
4
3
2
2
4
3
3
2
4
3
3
2
4
3
3
2
4
3
3
2
2
4
3
3
2
2
4
3
3
2
2
4
2
-CH=CH, -CH-CH=CH, -C(CH)=CH, -CH=CH-CH, -CH-CH=CH, -CH=CH-CH, -CH-C(CH)=CH, -CH(CH)-CH=CH, -CH=C(CH), -C(CH)=CH-CH, -CH=CH-CH=CH, -CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH=CH, -CH=CH-CH=CH-CH, -CH=CH-CH-CH=CH, -C(CH)=CH-CH=CH, -CH=C(CH)-CH=CH, -CH=CH-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-CH=CH, -CH(CH)-CH-CH=CH, -CH-CH=C(CH), -CH-C(CH)=CH-CH, -CH(CH)-CH=CH-CH, -CH=CH-CH(CH), -CH=C(CH)-CH, -C(CH)=CH-CH, -C(CH)=C(CH), -C(CH3)-CH=CH, -CH(CH)-C(CH)=CH, -C(CH)=CH-CH=CH, -CH=C(CH)-CH=CH, -CH=CH-C(CH)=CH, -CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH=CH-CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-CH=CH, -CH-CH(CH)-CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH, -CH(CH)-CH-CH=CH, -CH-CH=C(CH), -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH, -CH(CH)-CH-CH=CH-CH, -C(CH)=CH, -CH-CH=CH-CH(CH3), -CH-CH=C(CH)-CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH(CH)-CH=CH-CH, -CH=CH-CH-CH(CH), -CH=CH-CH(CH)-CH, -CH=C(CH)-CH, -C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH, -CH(CH)-CH-C(CH)=CH, -CH(CH)-CH(CH)-CH=CH, -CH-C(CH)-CH=CH, -C(CH)-CH-CH=CH, -CHC(CH)=C(CH), -CH(CH)-CH=C(CH), -C(CH)-CH=CH-CH, -CH(CH)-C(CH)=CH-CH, -CH=C(CH)-CH(CH), -C(CH)=CH-CH(CH), -C(CH)=C(CH)-CH, -CH=CH-C(CH), -C(CH)-C(CH)=CH, -CH(CH)-C(CH)=CH, -C(CH)(CH)-CH=CH, -CH(CH)-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH(CH)-CH=CH-CH, -C(CH)=CH-CH, -C(CH)=CH-CH, -C(CH)=C(CH), -C[C(CH)]=CH, -C[CH(CH)(CH)]=CH, -C[CH-CH(CH)]=CH, -CH-CH=CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH-CH=CH, -CH=CH-CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH=CH-CH, -CH=CH-CH-CH=CH-CH, -CH=CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-C(CH)=CH, -CH-CH=C(CH)-CH=CH, -CH-C(CH)=CH-CH=CH, -CH(CH)-CH=CH-CH=CH, -CH=CH-CH-C(CH)=CH, -CH=CH-CH(CH)-CH=CH, -CH=C(CH)-CH-CH=CH, -C(CH)=CH-CH-CH=CH, -CH=CH-CH=C(CH), -CH=CH-C(CH)=CH-CH, -CH=C(CH)-CH=CH-CH, -C(CH)=CH-CH=CH-CH, -CH=C(CH)-C(CH)=CH, -C(CH)=CH-C(CH)=CH, -C(CH)=C(CH)-CH=CH, -CH=CH-CH=CH-CH=CH, -CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-CH=CH, -CH-CH(CH)-CH-CH=CH, -CH-CH(CH)-CH-CH=CH, -CH-CH=C(CH), -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH(CH), -CH-CH=C(CH)-CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH-CH(CH), -CH-CH=CH-CH(CH)-CH, -CH-CH=C(CH)-CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-CH-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-CH(CH)-CH=CH, -CH-C(CH)-CH=CH, -CH-C(CH)-CH-CH=CH, -CH-C(CH)=C(CH), -CH-CH(CH)-CH=C(CH), -CH-C(CH)-CH=CH-CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH-CH, -CH-CH=C(CH)-CH(CH), -CH-C(CH)=CH-CH(CH), -CH-C(CH)=C(CH)-CH, -CH-CH=CH-C(CH), -CH-C(CH)-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH, -CH-C(CH)(CH)-CH=CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-C(CH)=C(CH), -CH-C[C(CH)]=CH, -CH-C[CH(CH)(CH)]=CH, -CH-C[CH-CH(CH)]=CH, -CH-CH=CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-C(CH)=CH, -CH-CH=C(CH)-CH=CH, -CH-C(CH)=CH-CH=CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH-C(CH)=CH, -CH-CH=CH-CH(CH)-CH=CH, -CH-CH=C(CH)-CH-CH=CH, -CH-C(CH)=CH-CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH=C(CH), -CH-CH=CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH=C(CH)-CH=CH-CH, -CH-C(CH)=CH-CH=CH-CH, -CH-CH=C(CH)-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=C(CH)-CH=CH, -CH-CH=CH-CH=CH-CH=CH, -CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-CH=CH, -CH-CH(CH)-CH-CH=CH, -CH-CH(CH)-CH-CH=CH, -CH-CH=C(CH3), -CH-C(CH=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH(CH), -CH-CH=C(CH)-CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH-CH(CH), -CH-CH=CH-CH(CH)-CH, -CH-CH=C(CH)-CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-CH-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-CH(CH)-CH=CH, -CH-C(CH)-CH=CH, -CH-C(CH)-CH-CH=CH, -CH-C(CH)=C(CH), -CH-CH(CH)-CH=C(CH), -CH-C(CH)-CH=CH-CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH-CH, -CH-CH=C(CH)-CH(CH), -CH-C(CH)=CH-CH(CH), -CH-C(CH)=C(CH)-CH, -CH-CH=CH-C(CH), -CH-C(CH)-C(CH)=CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH, -CH-C(CH)(CH)-CH=CH, -CH-CH(CH)-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH, -CH-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-C(CH)=CH-CH, -CH-C(CH)=C(CH), -CH-C[C(CH)]=CH, -CH-C[CH(CH)(CH)]=CH, -CH-C[CHCH(CH)]=CH, -CH-CH=CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-CH=CH-CH, -CH-CH=CH-C(CH)=CH, -CH-CH=C(CH)-CH=CH, -CH-C(CH)=CH-CH=CH, -CH-CH(CH)-CH=CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH-C(CH)=CH, -CH-CH=CH-CH(CH)-CH=CH, -CH-CH=C(CH)-CH-CH=CH, -CH-C(CH)=CH-CH-CH=CH, -CH-CH=CH-CH=C(CH), -CH-CH=CH-C(CH)=CH-CH, -CH-CH=C(CH)-CH=CH-CH, -CH-C(CH)=CH-CH=CH-CH, -CH-CH=C(CH)-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=CH-C(CH)=CH, -CH-C(CH)=C(CH)-CH=CH и -CH-CH=CH-CH=CH-CH=CH,
1
4
Используемый в описании термин “алкенил” относится, предпочтительно, к «линейному или разветвленному С-С алкенилу», такому как
Предпочтительными примерами модифицированных гидроксильных групп углеводных мономеров углеводного антигена А являются
p
Модифицированные гидроксильные группы углеводных мономеров углеводного антигена А могут образовываться путем активирования углеводного антигена, чтобы связывать остатки –L-CH-CA с углеводным антигеном. Поскольку не все активированные группы углеводного антигена после этого связываются с одним из остатков –L-CH-CA, остаются активированные группы углеводного антигена, которые не преобразуются в линкерную связь (A-L) антигена. Такие активированные, но не преобразованные группы углеводного антигена обычно гидролизуются во время обработки комплекса A[L-CHCA] и остаются на углеводном антигене А в виде групп амида, карбоната, карбамата, карбонила, тиокарбонила, карбокси, тиокарбокси, сложного эфира, сложного тиоэфира, простого эфира, эпокси, гидроксиалкила, алкиленила, фенилена, алкенила, имино, имида, изомочевины, тиокарбамата, тиомочевины и/или мочевины.
Это означает, что, когда углеводный антиген A активируется, образуя ковалентную связь с остатками –L-CH-CA, первоначально изолированный или синтезированный антиген модифицируется таким образом, чтобы содержать такие группы амида, карбоната, карбамата, карбонила, тиокарбонила, карбокси, тиокарбокси, сложного эфира, сложного тиоэфира, простого эфира, эпокси, гидроксиалкила, алкиленила, фенилена, акенила, имино, имида, изомочевины, тиокарбамата, тиомочевины и/или мочевины.
Только в случае, когда остаток –L-CH-CA активируется на L-конце, образуя ковалентную связь с углеводным антигеном А, функциональные группы углеводного антигена А, которые не связываются с остатками –L-CН-СA, остаются неизменными.
Обычно углеводный антиген состоит из множества углеводных мономеров, в которых каждый углеводный мономер имеет дополнительно более чем одну функциональную группу, которая могла бы использоваться для ковалентного связывания остатка –L-CH-CА, таким образом, более одного остатка –L-CH-CA и обычно большее число остатков –L-CH-CA связываются с углеводным антигеном А. Специалисту понятно, что чем больше остатков –L-CH-CA может связываться с одним углеводным антигеном, тем больше углеводных мономеров содержится в указанном углеводном антигене. Например, углеводный антиген, состоящий из 2 (u=2) углеводных мономеров, может содержать 1, 2, 3 или 4 остатка –L-CH-CA, при этом углеводный антиген, состоящий из 50 (u=50) углеводных мономеров, мог бы содержать в диапазоне между 2 и 50 остатков –L-CH-CA, а углеводный антиген, состоящий из 3000 (u=3000) углеводных мономеров, мог бы содержать в интервале между 50 и 400 остатков –L-CH-CA.
Метод связывания представлен целым числом p. p обозначает число остатков –L-CH-CA, которые связаны с углеводным антигеном А.
р обозначает целое число от 1 до (Φ*u), где Φ представляет собой следующие целые числа:
Φ=2 (если u обозначает от 1 до 4); Φ=1 (если u обозначает от 5 до 10); Φ=0,5 (если u обозначает от 11 до 100); Φ=0,2 (если u обозначает от 101 до 1000); Φ=0,04 (если u обозначает от 1001 до 10000); где u обозначает число углеводных мономеров углеводного антигена A.
Согласно еще одному предпочтительному воплощению изобретения p обозначает целое число и определяется следующим образом:
p обозначает 1 или 2, если u обозначает 1
p обозначает 1, 2, 3 или 4, если u обозначает 2
p обозначает 1, 2, 3, 4, 5 или 6, если u обозначает 3
p обозначает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, если u обозначает 4
1 ≤ р ≤ 10, если 5 ≤ u ≤ 10
2 ≤ р ≤ 50, если 11 ≤ u ≤ 100
20 ≤ р ≤ 200, если 101 ≤ u ≤ 1000
50 ≤ р ≤ 400, если 1001 ≤ u ≤ 10000,
где u обозначает собой число углеводных мономеров углеводного антигена А
В предпочтительном воплощении данного изобретения р обозначает целое число, попадающее в интервал 0,02u ≤ p ≤ (0,7u+3), при условии, что p ≥ 1, где u обозначает целое число от 1 до 10000, представляя общее число углеводных мономеров в углеводном антигене A.
Для того чтобы связать линкер L или, соответственно, фрагмент –L-CH-CA с углеводным антигеном, возможны два пути. С одной стороны, антиген мог бы быть активирован и затем подвергнут взаимодействию с линкером L или фрагментом –L-CH-CA или, с другой стороны, линкер L мог бы быть активирован и затем подвергнут взаимодействию с антигеном.
В случае, когда линкер L активируют для того, чтобы образовать ковалентную связь с углеводным антигеном, число р фрагментов –L-CH-CA, присутствующих в углеводном антигене, зависит от молярных эквивалентов фрагментов –L-CH-CA относительно числа u углеводных мономеров, присутствующих в углеводном антигене. Так, если u=100, т.е. углеводный антиген А состоит из 100 углеводных мономеров, один молярный эквивалент фрагмента –L-CH-CA означает, что каждый углеводный антиген А несет только один фрагмент –L-CH-CA, при этом 50 молярных эквивалентов фрагмента –L-CH-CA означает, что в среднем каждый второй углеводный мономер углеводного антигена А имеет один фрагмент –L-CH-CA, тогда как 200 молярных эквивалентов означает, что в среднем каждый углеводный мономер углеводного антигена А имеет два фрагмента –L-CH-CA.
В случае, если активируется углеводный антиген А, а не линкер L, углеводный антиген обычно содержит большее число активированных групп, которые теоретически все могут образовывать ковалентную связь с линкером L или, соответственно, с фрагментом –L-CH-CA. Обычно не все активированные группы углеводного антигена А реагируют с линкером L или, соответственно, с фрагментом –L-CH-CA, таким образом, после взаимодействия с линкером L или, соответственно, с фрагментом –L-CH-CA в углеводном антигене остаются несколько активированных групп. Данные остающиеся активированные группы обычно взаимодействуют в процессе обработки продукта реакции активированного углеводного антигена с линкером L или, соответственно, с фрагментом –L-CH-CA. Таким образом, в процессе обработки эти оставшиеся активированные группы углеводного антигена А, например, гидролизуются, окисляются, изомеризуются, циклизуются и/или конденсируются. В процессе обработки и, особенно, в процессе водной обработки оставшиеся активированные группы, например, преобразуются в группы амида, карбоната, карбамата, карбонила, тиокарбонила, карбокси, тиокарбокси, сложного эфира, сложного тиоэфира, простого эфира, эпокси, гидроксиалкила, алкиленила, фенилена, акенила, имино, имида, изомочевины, тиокарбамата, тиомочевины и/или мочевины.
3
2
6
5
2
Активированными группами, которые могут преобразовываться в группы амида, карбоната, карбамата, карбонила, тиокарбонила, карбокси, тиокарбокси, сложного эфира, сложного тиоэфира, простого эфира, эпокси, гидроксиалкила, алкиленила, фенилена, алкенила, имино, имида, изомочевины, тиокарбамата, тиомочевины и мочевины, являются, например, группы циано, хлор, бром, йод, азидо, имино, винильная, стирильная и алкильная группы, ангидриды, оксираны, цианаты, изоцианаты, тиоцианаты, изотиоцианаты, триазины и особенно 1,3,5-триазины, имидазолы, простые метоксиэфиры, а также сульфонильные группы, такие как пара-толуолсульфонил (Ts-), трифторметансульфонил (Tf-, CFSO-), бензолсульфонил (CHSO-) или метансульфонил (Ms-).
Далее представлены более конкретные примеры таких активированных групп. Способ активирования, предусматривающий модификацию функциональных групп углеводных мономеров углеводного антигена, может приводить к образованию активированных фрагментов, которые ковалентно связываются с гетероатомами (N, O, S) функциональных групп углеводного антигена, в котором активированные фрагменты, предпочтительно, принадлежат к следующей группе, включающей или состоящей из:
3
2
2
2
3
3
2
5
-N, -CN, -CH-CH=CH, -CH=CH, -OCH, -Cl, -Br, -I, -OCN, -NCO, -SCN, -NCS, -CO-O-CO-CH, -СO-O-CO-CH,
где х обозначает целое число от 1 до 60.
Таким образом, модификация углеводных мономеров углеводного антигена подразумевает также, что углеводные мономеры включают или содержат группы амида, карбоната, карбамата, карбонила, тиокарбонила, карбокси, тиокарбокси, сложного эфира, сложного тиоэфира, простого эфира, эпокси, гидроксиалкила, алкиленила, фенилена, алкенила, имино, имида, изомочевины, тиокарбамата, тиомочевины и/или мочевины. Это означает, что модификация углеводных мономеров углеводного антигена А подразумевает, что функциональные группы углеводных мономеров модифицируются в группы амида, карбоната, карбамата, карбонила, тиокарбонила, карбокси, тиокарбокси, сложного эфира, сложного тиоэфира, простого эфира, эпокси, гидроксиалкила, алкиленила, фенилена, алкенила, имино, имида, изомочевины, тиокарбамата, тиомочевины и/или мочевины.
Следовательно, необязательная модификация углеводных мономеров углеводного антигена может быть результатом способа активирования, который предусматривает взаимодействие углеводных функциональных групп с одним агентом или несколькими агентами активирования, и где агент активирования или агенты активирования могут образовывать, в частности, после гидролиза, окисления, изомеризации, циклизации и/или конденсации группы амида, карбоната, карбамата, карбонила, тиокарбонила, карбокси, тиокарбокси, сложного эфира, сложного тиоэфира, простого эфира, эпокси, гидроксиалкила, алкиленила, фенилена, алкенила, имино, имида, изомочевины, тиокарбамата, тиомочевины и/или мочевины.
Указанные выше агент или агенты активирования могут использоваться для связывания углеводного антигена с линкером L или, соответственно, остатками –L-CH-CA и, предпочтительно, относятся к группе, включающей:
аллилбромид, аллилхлорид, бис-NHS-сложные эфиры как бис[сульфосукцинимидил]суберат, цианбромид, дивиниловый эфир 1,4-циклогександиметанола, 1,1'-карбонилдиимидазол (CDI), N,N’-(1,2-дигидроксиэтилен)бисакриламид, дивинилбензол, эпихлоргидрин (ECH), этилен-гликоль-ди(мет)акрилаты, этилен-гликоль-диакрилаты, N-гидроксисукцинимид (NHS), N-(1-гидрокси-2,2-диметоксиэтил)акриламид, метиленбисакриламиды, 4,4’-метиленбис(циклогексилизоцианат), 1,4-фенилендиакрилоилхлорид, фосген, дифосген, трифосген, полиэтилен-гликоль-ди(мет)акрилаты, полиэтилен-гликоль-диакрилаты, диметиловый эфир тетраэтиленгликоля, 1,1'-тиокарбонилдиимидазол (TCDI), тиофосген, 2,4,6-трихлортриазин (TCT).
Когда активируется углеводный антиген А, метод активирования ведет к преобразованию функциональных групп углеводных мономеров углеводного антигена в активированные виды, которые взаимодействуют с остатками –L-CH-CA на следующей стадии.
Не все активированные группы углеводного антигена А взаимодействуют с остатками –L-CH-CA и могут, следовательно, гидролизоваться, окисляться, изомеризоваться, циклизоваться или конденсироваться с другими сахарными фрагментами углеводного антигена в процессе обработки, образуя гидролизованные, окисленные, изомеризованные, циклизованные или конденсированные остатки. Эти гидролизованные, окисленные, изомеризованные, циклизованные или конденсированные остатки получаются из самого агента активирования и благодаря химическим процессам вследствие реакций гидролиза, окисления, изомеризации, циклизации или конденсации. Гидролизованные, окисленные, изомеризованные, циклизованные или конденсированные остатки ковалентно связываются с любым гетероатомом (N, O, S) функциональных групп углеводных мономеров углеводного антигена, и принадлежат, предпочтительно, к группе, включающей или состоящей из:
где х обозначает целое число от 1 до 60.
Модификация функциональных групп углеводных мономеров углеводного антигена предусматривает взаимодействие функциональных групп углеводных мономеров углеводного антигена с одним агентом активирования или агентами активирования и/или с активированным линкером L или, соответственно, активированным линкером L в –L-CH-CA, или, когда углеводные мономеры углеводного антигена с неактивированным линкером образуют ковалентную связь между гетероатомом (N, O, S) функциональной группы углеводного мономера или модифицированного углеводного мономера и агентом активирования и/или с активированным или не-активированным линкером L. Образование ковалентной связи сопровождается расщеплением связи N-H, O-H или S-H и потерей Н-атома. Возможные реакции для образования данной ковалентной связи относятся к группе, включающей нуклеофильное замещение, сложную этерификацию, простую этерификацию, амидирование, ацилирование.
Углеводные мономеры углеводного антигена А, предпочтительно, принадлежат к гексозам, пентозам, тетрозам или сиаловым кислотам.
В предпочтительном воплощении изобретения сиаловые кислоты относятся к группе N- или O-замещенных производных нейраминовой кислоты следующей формулы:
2
где Z представляет собой -NH, -NHAc или -OH.
В случае, когда в углеводном антигене А имеется такой углеводный мономер сиаловой кислоты, связывание со следующим углеводным мономером достигается посредством гликозидной связи (и заменой соответствующего атома водорода на гликозидной гидроксильной группе) и/или через связывание другого углеводного мономера с одной из гидроксильных групп сиаловой кислоты путем замены соответствующего атома водорода на этой гидроксильной группе.
В предпочтительном воплощении углеводный мономер сиаловой кислоты представлен в структурном элементе А следующим образом:
2
где Z представляет собой -NH, -NHAc или -OH.
В предпочтительном воплощении изобретения используемые углеводные мономеры А-фрагмента принадлежат к следующей группе α- и β-D/L-углеводов, включающей или состоящей из:
α-D-рибопиранозы, α-D-арабинопиранозы, α-D-ксилопиранозы, α-D-ликсопиранозы, α-D-аллопиранозы, α-D-альтропиранозы, α-D-глюкопиранозы, α-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, α-D-идопиранозы, α-D-галактопиранозы, α-D-талопиранозы, α-D-псикопиранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-сорбопиранозы, α-D-тагатопиранозы, α-D-рибофуранозы, α-D-арабинофуранозы, α-D-ксилофуранозы, α-D-ликсофуранозы, α-D-аллофуранозы, α-D-альтрофуранозы, α-D-глюкофуранозы, α-D-маннофуранозы, α-D-гулофуранозы, α-D-идофуранозы, α-D-галактофуранозы, α-D-талофуранозы, α-D-псикофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-сорбофуранозы, α-D-тагатофуранозы, α-D-ксилутофуранозы, α-D-рибулофуранозы, α-D-треофуранозы, α-D-рамнопиранозы, α-D-эритрофуранозы, α-D-глюкозамина, α-D-глюкопирануроновой кислоты, β-D-рибопиранозы, β-D-арабинопиранозы, β-D-ксилопиранозы, β-D-ликсопиранозы, β-D-аллопиранозы, β-D-альтропиранозы, β-D-глюкопиранозы, β-D-маннопиранозы, β-D-глюкопиранозы, β-D-идопиранозы, β-D-галактопиранозы, β-D-талопиранозы, β-D-псикопиранозы, β-D-фруктопиранозы, β-D-сорбопиранозы, β-D-тагатопиранозы, β-D-рибофуранозы, β-D-арабинофуранозы, β-D-ксилофуранозы, β-D-ликсофуранозы, β-D-рамнопиранозы β-D-аллофуранозы, β-D-альтрофуранозы, β-D-глюкофуранозы, β-D-маннофуранозы, β-D-гулофуранозы, β-D-идофуранозы, β-D-галактофуранозы, β-D-талофуранозы, β-D-псикофуранозы, β-D-фруктофуранозы, β-D-сорбофуранозы, β-D-тагатофуранозы, β-D-ксилулофуранозы, β-D-рибулофуранозы, β-D-треофуранозы, β-D-эритрофуранозы, β-D-глюкозамина, β-D-глюкопирануроновой кислоты, α-L-рибопиранозы, α-L-арабинопиранозы, α-L-ксилопиранозы, α-L-ликсопиранозы, α-L-аллопиранозы, α-L-альтропиранозы, α-L-глюкопиранозы, α-L-маннопиранозы, α-L-глюкопиранозы, α-L-идопиранозы, α-L-галактопиранозы, α-L-талопиранозы, α-L-псикопиранозы, α-L-фруктопиранозы, α-L-сорбопиранозы, α-L-тагатопиранозы, α-L-рамнопиранозы α-L-рибофуранозы, α-L-арабинофуранозы, α-L-ксилофуранозы, α-L-ликсофуранозы, α-L-аллофуранозы, α-L-альтрофуранозы, α-L-глюкофуранозы, α-L-маннофуранозы, α-L-гулофуранозы, α-L-идофуранозы, α-L-галактофуранозы, α-L-талофуранозы, α-L-псикофуранозы, α-L-фруктофуранозы, α-L-сорбофуранозы, α-L-тагатофуранозы, α-L-ксилулофуранозы, α-L-рибулофуранозы, α-L-треофуранозы, α-L-эритрофуранозы, α-L-глюкозамина, α-L-глюкопирануроновой кислоты, β-L-рибопиранозы, β-L-арабинопиранозы, β-L-ксилопиранозы, β-L-ликсопиранозы, β-L-аллопиранозы, β-L-альтропиранозы, β-L-глюкопиранозы, β-L-маннопиранозы, β-L-глюкопиранозы, β-L-идопиранозы, β-L-галактопиранозы, β-L-талопиранозы, β-L-псикопиранозы, β-L-фруктопиранозы, β-L-сорбопиранозы, β-L-тагатопиранозы, β-L-рибофуранозы, β-L-арабинофуранозы, β-L-ксилофуранозы, β-L-ликсофуранозы, β-L-аллофуранозы, β-L-альтрофуранозы, β-L-глюкофуранозы, β-L-маннофуранозы, β-L-гулофуранозы, β-L-идофуранозы, β-L-галактофуранозы, β-L-талофуранозы, β-L-псикофуранозы, β-L-фруктофуранозы, β-L-сорбофуранозы, β-L-тагатофуранозы, β-L-ксилулофуранозы, β-L-рибулофуранозы, β-L-треофуранозы, β-L-эритрофуранозы, β-L-глюкозамина, β-L-глюкопирануроновой кислоты и β-L-рамнофуранозы.
В еще одном предпочтительном воплощении изобретения углеводные мономеры А-фрагмента и СН фрагмента выбраны, независимо друг от друга, из группы, включающей или состоящей из следующих α- и β-D-углеводов:
Согласно настоящему изобретению эти углеводные мономеры, определенные в описании, находятся в антигене в большом количестве и представлены в виде связующего структурного элемента при депротонировании двух атомов водорода различных гидроксильных групп и образовании связи с оставшейся частью молекулы антигена А и с фрагментом L, соответственно.
L представляет собой линкерную группу, которая ковалентно связана с каким-либо атомом, особенно гетероатомом и, наиболее предпочтительно, с атомом кислорода предшествующей гидроксильной группы углеводных мономеров углеводного антигена. Более того, линкер L ковалентно связан с гетероатомом фрагмента СН и, особенно, атомом кислорода гидроксильной группы фрагмента СН. Таким образом, молекула линкера связывает антиген А и углеводный фрагмент СН. Кроме того, согласно настоящему изобретению связывание антигена А и углеводного фрагмента СН происходит, как описано в описании, предпочтительно, путем активирования углеводных мономеров углеводного антигена и/или активирования молекулы линкера. Таким образом, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения это не просто соединение антигена А с углеводным фрагментом СН посредством линкера L, а связывание антигена А и углеводного фрагмента СН, уже присоединенного к церамиду Са, что дает соединения по изобретению общей формулы (I)
p
A[L⎯CH⎯CA]
(I).
1
2
3
1
2
2
2
3
1
2
3
1
2
2
2
3
1
2
3
1
2
2
2
3
3
2
3
2
3
2
1
2
3
Линкер L может быть разбит на субъединицы -L-, -L- и -L- и может быть образован из отдельных субъединиц или их сочетаний. Следовательно, L может представлять собой -L-L-, -L-, -L-L- или -L-L-L-. Предпочтительный порядок или последовательность в указанных выше случаях связывания с А и СН являются следующими: A-L-L-CH-, A-L-CH-, A-L-L-CH- или A-L-L-L-CH-. Однако, возможно также, что различные фрагменты, такие как -L-L-, -L-, -L-L-, -L-L-L-, -L-L-L- или -L-L-L- выстраиваются во всех возможных последовательностях, насколько связь между различными частями является химически приемлемой и допустимой.
Линкер L может быть связан с углеводным фрагментом таким образом, чтобы эта связь могла расщепляться в клетке, например, хелперной клетке В, хелперной клетке Т, с высвобождением фрагмента A-L, с одной стороны, и фрагмента -CH-CA, с другой стороны.
1
2
1
L может содержать функциональную группу или фрагмент функциональной группы, образуемые в результате активирования углеводных мономеров углеводного антигена. L. Предпочтительно, ковалентно связан с каким-либо гетероатомом (N, O, S) углеводных мономеров углеводного антигена А. L, если присутствует, ковалентно связан с субъединицей линкера L, предпочтительно, посредством фрагмента Y, который также может представлять собой химическую связь. L, предпочтительно, выбран из следующих остатков:
x обозначает целое число от 1 до 60;
Y представляет собой связь, -NH-, -O-, -S-, -S-S-;
2
2
3
2
2
4
3
6
4
8
5
10
6
12
7
14
8
16
9
18
10
20
3
3
2
2
3
3
2
3
2
4
2
3
2
2
4
3
2
3
2
3
2
2
3
3
2
5
3
3
7
2
2
n
2
2
2
2
4
3
6
4
8
5
10
6
12
7
14
8
16
9
18
10
20
3
3
2
2
3
3
2
3
2
4
2
3
2
2
4
3
2
3
2
3
2
2
3
3
2
5
3
3
7
2
2
n
2
2
L представляет собой -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH-, -CH(CH)-, -C[(CH)]-, -CH-CH(CH)-, -CH(CH)-CH-, -CH(CH)-CH-, -CH-CH(CH)-CH-, -CH-CH(CH)-, -CH-C[(CH)]-, -C[(CH)]-CH-, -CH(CH)-CH(CH)-, -C[(CH)(CH)]-, -CH(CH)-, -(CH-CH-O)-CH-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH-, -CO-CH(CH)-, -CO-C[(CH)]-, -CO-CH-CH(CH)-, -CO-CH(CH)-CH-, -CO-CH(CH)-CH-, -CO-CH-CH(CH)-CH-, -CO-CH-CH(CH)-, -CO-CH-C[(CH)]-, -CO-C[(CH)]-CH-, -CO-CH(CH)-CH(CH)-, -CO-C[(CH)(CH)]-, -CO-CH(CH)-, -CO-(CH-CH-O)-CH-CH-. L, в случае, когда L отсутствует, предпочтительно, связан с атомом кислорода предшествующей гидроксильной группы углеводного остатка CH;
n обозначает целое число от 1 до 60;
3
3
2
2
2
L представляет собой –CO-, -O-CO-, -NH-CO-, -NH(C=NH)-, -SO-, -O-SO-, -NH-, -NH-CO-CH-. L, если присутствует, предпочтительно, связан с атомом кислорода предшествующей гидроксильной группы углеводного остатка CH.
Предпочтительными примерами линкерных групп L фрагмента A-L-CH-CA, в качестве, по меньшей мере, одного представителя из всех групп в соединениях общей формулы (I), определенных в данном описании, являются
где n имеет значения, определенные в описании, и А, CH и CA представляют собой антиген, углеводный фрагмент и церамид, как определено в описании.
6
7
8
6
7
8
Молекула линкера L необязательно может быть, кроме того, замещенной 1-3 заместителями Z, Z, Z. Однако специалисту понятно, что термин “может быть замещен” относится к замене атома водорода на один из заместителей Z, Z, Z.
6
7
8
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
4
9
2
3
2
3
2
4
3
3
6
3
2
2
5
2
4
2
5
3
6
2
5
2
3
7
2
4
3
7
3
6
3
7
2
3
5
2
4
3
5
3
6
3
5
2
3
2
2
4
3
2
3
6
3
2
2
3
3
2
4
3
3
3
6
3
3
2
4
9
2
4
4
9
3
6
4
9
2
2
4
3
6
2
2
2
4
2
3
6
2
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
2
5
2
3
7
2
3
5
2
3
2
2
3
3
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
2
5
2
3
7
2
3
5
2
3
2
2
3
3
2
3
2
3
2
4
3
3
6
3
2
5
2
2
5
2
4
2
5
3
6
2
5
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
Заместители Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-цикло-CH, -OCH(CH), -OC(CH), -OCH, -OPh, -OCH-Ph, -OCPh, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph, -NO, -F, -Cl, -Br, -COCH, -COCH, -COCH, -CO-цикло-CH, -COCH(CH), -COC(CH), -COOH, -COOCH, -COOCH, -COOCH, -COO-цикло-CH, -COOCH(CH), -COOC(CH), -OOC-CH, -OOC-CH, -OOC-CH, -OOC-цикло-CH, -OOC-CH(CH), -OOC-C(CH), -CONH, -CONHCH, -CONHCH, -CONHCH, -CONH-цикло-CH, -CONH[CH(CH)], -CONH[C(CH)], -CON(CH), -CON(CH), -CON(CH), -CON(цикло-CH), -CON[CH(CH)], -CON[C(CH)], -NHCOCH, -NHCOCH, -NHCOCH, -NHCO-цикло-CH, -NHCO-CH(CH), -NHCO-C(CH), -NH, -NHCH, -NHCH, -NHCH, -NH-цикло-CH, -NHCH(CH), -NHC(CH), -N(CH), -N(CH), -N(CH), -N(цикло-CH), -N[CH(CH)], -N[C(CH)], -OCF, -CH-OCF, -CH-OCF, -CH-OCF, -OCF, -CH-OCF, -CH-OCF, -CH-OCF, -CHF, -CHF, -CF, -CHCl, -CHBr, -CH-CHF, -CH-CHF, -CH-CF, -CH-CHCl, -CH-CHBr.
Углеводный фрагмент СН
CH представляет собой моносахарид, дисахарид или трисахарид, в котором углеводные мономеры, предпочтительно, принадлежат к гексозам, пентозам, тетрозам. В случае, когда CH представляет собой моносахарид, углеводный мономер идентичен моносахариду. Дисахарид содержит два углеводных мономера, и трисахарид содержит три углеводных мономера. В дисахариде и трисахариде углеводные мономеры связаны друг с другом посредством α/β гликозидных связей, которые относятся, предпочтительно, к группе, состоящей из 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; или 2,6 гликозидных связей.
Моносахарид, дисахарид и трисахарид CH ковалентно связаны с L, а также с СА через гетероатом (N, O, S) фрагмента CH и, наиболее предпочтительно, через атом кислорода предшествующей гидроксильной группы CH.
Используемый в описании термин “предшествующая гидроксильная группа” обозначает, что атом кислорода углеводного мономера, который теперь связан с L или CА, являлся атомом кислорода гидроксильной группы и был связан с атомом водорода, который теперь заменен на остаток L или CА.
В предпочтительном воплощении данного изобретения моносахаридный, дисахаридный или трисахаридный CH ковалентно связаны одним атомом кислорода с L и посредством другого атома кислорода с CА.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения моносахаридный, дисахаридный или трисахаридный CH ковалентно связаны одним гидроксильным атомом кислорода с L и посредством другого гидроксильный атома кислорода с CА.
В еще одном предпочтительном воплощении данного изобретения L или CА присоединен к CH, т.е. к моносахариду, дисахариду или трисахариду посредством гликозидной связи у C1 сахарида.
В более предпочтительном воплощении данного изобретения L присоединен гликозидной связью к C1 моносахарида, дисахарида или трисахарида, и CА присоединен через кислород у C6 гексозы или кислород у C5 пентозы или кислород у С4 тетрозы.
В еще одном более предпочтительном воплощении данного изобретения CА присоединен гликозидной связью к C1 моносахарида, дисахарида или трисахарида, и L связан через кислород у C6 гексозы или через кислород у C5 пентозы или через кислород у С4 тетрозы.
В предпочтительном воплощении изобретения моносахаридный, дисахаридный или трисахаридный CH состоят из одного, двух или, соответственно, 3 углеводов, выбранных из следующей группы α- и β-D/L-углеводов, включающей в себя или состоящей из:
α-D-рибопиранозы, α-D-арабинопиранозы, α-D-ксилопиранозы, α-D-ликсопиранозы, α-D-аллопиранозы, α-D-альтропиранозы, α-D-глюкопиранозы, α-D-маннопиранозы, α-D-глюкопиранозы, α-D-идопиранозы, α-D-галактопиранозы, α-D-талопиранозы, α-D-псикопиранозы, α-D-фруктопиранозы, α-D-сорбопиранозы, α-D-тагатопиранозы, α-D-рибофуранозы, α-D-арабинофуранозы, α-D-ксилофуранозы, α-D-ликсофуранозы, α-D-аллофуранозы, α-D-альтрофуранозы, α-D-глюкофуранозы, α-D-маннофуранозы, α-D-гулофуранозы, α-D-идофуранозы, α-D-галактофуранозы, α-D-талофуранозы, α-D-псикофуранозы, α-D-фруктофуранозы, α-D-сорбофуранозы, α-D-тагатофуранозы, α-D-ксилулофуранозы, α-D-рибулофуранозы, α-D-треофуранозы, α-D-эритрофуранозы, α-D-глюкозамина, α-D-глюкопирануроновой кислоты, α-D-рамнопиранозы, β-D-рибопиранозы, β-D-арабинопиранозы, β-D-ксилопиранозы, β-D-ликсопиранозы, β-D-аллопиранозы, β-D-альтропиранозы, β-D-глюкопиранозы, β-D-маннопиранозы, β-D-глюкопиранозы, β-D-идопиранозы, β-D-галактопиранозы, β-D-талопиранозы, β-D-псикопиранозы, β-D-фруктопиранозы, β-D-сорбопиранозы, β-D-тагатопиранозы, β-D-рибофуранозы, β-D-арабинофуранозы, β-D-ксилофуранозы, β-D-ликсофуранозы, β-D-аллофуранозы, β-D-альтрофуранозы, β-D-глюкофуранозы, β-D-маннофуранозы, β-D-гулофуранозы, β-D-идофуранозы, β-D-галактофуранрзы, β-D-талофуранозы, β-D-псикофуранозы, β-D-фруктофуранозы, β-D-сорбофуранозы, β-D-тагатофуранозы, β-D-ксилулофуранозы, β-D-рибулофуранозы, β-D-треофуранозы, β-D-эритрофуранозы, β-D-рамнопиранозы, β-D-глюкозамина, β-D-глюкопирануроновой кислоты, α-L-рибопиранозы, α-L-арабинопиранозы, α-L-ксилопиранозы, α-L-ликсопиранозы, α-L-аллопиранозы, α-L-альтропиранозы, α-L-глюкопиранозы, α-L-маннопиранозы, α-L-глюкопиранозы, α-L-идопиранозы, α-L-галактопиранозы, α-L-талопиранозы, α-L-псикопиранозы, α-L-фруктопиранозы, α-L-сорбопиранозы, α-L-тагатопиранозы, α-L-рибофуранозы, α-L-арабинофуранозы, α-L-ксилофуранозы, α-L-ликсофуранозы, α-L-аллофуранозы, α-L-альтрофуранозы, α-L-глюкофуранозы, α-L-маннофуранозы, α-L-гулофуранозы, α-L-идофуранозы, α-L-галактофуранозы, α-L-талофуранозы, α-L-псикофуранозы, α-L-фруктофуранозы, α-L-сорбофуранозы, α-L-тагатофуранозы, α-L-ксилулофуранозы, α-L-рибулофуранозы, α-L-рамнопиранозы, α-L-треофуранозы, α-L-эритрофуранозы, α-L-глюкозамина, α-L-глюкопирануроновой кислоты, β-L-рибопиранозы, β-L-арабинопиранозы, β-L-ксилопиранозы, β-L-ликсопиранозы, β-L-аллопиранозы, β-L-альтропиранозы, β-L-глюкопиранозы, β-L-маннопиранозы, β-L-глюкопиранозы, β-L-идопиранозы, β-L-галактопиранозы, β-L-талопиранозы, β-L-псикопиранозы, β-L-фруктопиранозы, β-L-сорбопиранозы, β-L-тагатопиранозы, β-L-рибофуранозы, β-L-арабинофуранозы, β-L-ксилофуранозы, β-L-ликсофуранозы, β-L-аллофуранозы, β-L-альтрофуранозы, β-L-глюкофуранозы, β-L-маннофуранозы, β-L-гулофуранозы, β-L-идофуранозы, β-L-галактофуранозы, β-L-талофуранозы, β-L-псикофуранозы, β-L-фруктофуранозы, β-L-сорбофуранозы, β-L-тагатофуранозы, β-L-ксилулофуранозы, β-L-рибулофуранозы, β-L-треофуранозы, β-L-эритрофуранозы, β-L-глюкозамина, β-L-глюкопирануроновой кислоты и β-L-рамнофуранозы.
В другом предпочтительном воплощении данного изобретения моносахаридный, дисахаридный или трисахаридный CH состоят из одного, двух или, соответственно, 3 углеводов, выбранных из α- и β-D/L-углеводов, как указано на страницах 30-34, и как определено для А-фрагмента.
Моносахаридный, дисахаридный или трисахаридный CH согласно настоящему изобретению могут быть, кроме того, замещены в определенных положениях, предпочтительно на гидроксильных группах, не вовлеченных в связывание с фрагментами A и L, или на амино группе, если она присутствует в сахаридном фрагменте. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения моносахаридный, дисахаридный или трисахаридный CH содержат один из следующих заместителей, предпочтительно, вместо атома водорода гидроксильной группы:
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
4
9
2
2
3
2
4
3
3
6
3
2
2
5
2
4
2
5
3
6
2
5
2
3
7
2
4
3
7
3
6
3
7
2
3
5
2
4
3
5
3
6
3
5
2
3
2
2
4
3
2
3
6
3
2
2
3
3
2
4
3
3
3
6
3
3
2
4
9
2
4
4
9
3
6
4
9
2
2
4
3
6
2
2
2
4
2
3
6
2
-CH, -CH, -CH, -цикло-CH, -CH(CH), -C(CH), -CH, -Ph, -CH-Ph, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph.
Предпочтительно, α- и β-D/L-углеводы для фрагмента CH с указанными пунктирными линиями связями представляют собой следующие остатки:
1
2
3
6
Заместители Q, Q, Q и Qимеют значения, определенные в описании.
В других предпочтительных воплощениях изобретения фрагмент CH углеводно-гликолипидных конъюгированных конъюгатов по изобретению содержит следующие связи:
где A, L, p и CA имеют значения, определенные в описании.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
R, R, R, R, R, R, R, R, R независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
3
2
-H, -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-COOCH, -NHCOCH или -NH.
В более предпочтительных воплощениях изобретения фрагмент CH углеводно-гликолипидных конъюгированных конъюгатов по изобретению содержит следующие связи, показанные следующей предпочтительной формулой:
где A, L, p и CA имеют значения, определенные в описании.
Гликозидные связи в CH предпочтительно относятся к группе гликозидных связей, в которых гидроксильная группа аномерного углерода конденсирована с другой гидроксильной группой другого углевода или фрагмента CА, соответственно. Гликозидная связь между двумя углеводами включает гликозидную связь между аномерным углеродом углевода и не-аномерным углеродом другого углевода. Вследствие стереохимии аномерного углерода имеется возможность образования α- или β-гликозидных связей, таких как:
Греческие буквы α и β применимы только, когда аномерный углерод имеет более низкое расположение, чем ссылочный аномерный атом. Если это не так, тогда аномерная конфигурация описывается обычными R/S-символами.
Церамидный фрагмент СА
*
#
R и R независимо друг от друга представляют собой линейный или разветвленный или циклический замещенный или незамещенный насыщенный или ненасыщенный углеродный остаток, состоящий из от 1 до 30 атомов углерода и вплоть до 5 гетероатомов, выбранных из N, O, S, F, Br и Cl.
*
#
Таким образом, R и R независимо друг от друга представляют собой углеродный остаток из 1-30 атомов углерода, где углеродный остаток может представлять собой линейную углеродную цепь или разветвленную углеродную цепь. Углеродный остаток может также содержать карбоциклические или гетероциклические структуры. Углеродный остаток может, кроме того, содержать гетероатомы, такие как N, O, S, и/или может иметь функциональные группы, такие как галоген, такой как F, Cl и Br, или функциональные группы содержащие гетероатомы N, O и/или S, или функциональные группы, такие как двойные и тройные связи.
Углеродный остаток углеродной цепи может содержать одну или несколько двойных связей С=С и/или одну или несколько тройных связей С≡С. Карбоциклические структуры, которые могут присутствовать в углеродном остатке или в углеродной цепи, представляют собой, например, насыщенные 3-членные или 4-членные карбоциклические кольца, насыщенные или ненасыщенные 5-членные карбоциклические кольца или насыщенные, ненасыщенные или ароматические 6-членные карбоциклические кольца, которые могут быть представлены в виде заместителей углеродного остатка или углеродной цепи или могут быть включены в углеродный остаток или углеродную цепь.
Гетероциклические структуры, которые могут присутствовать в углеродном остатке или углеродной цепи, представляют собой, например, насыщенные 3-членные или 4-членные гетероциклические кольца, содержащие один атом N или O, насыщенные или ненасыщенные 5-членные гетероциклические кольца, содержащие 1, 2, 3 или 4 атома N, или 1 или 2 атома S или O, или 1 атом O или S вместе с 1 или 2 атомами N, или насыщенные, ненасыщенные или ароматические 6-членные гетероциклические кольца, содержащие 1, 2, 3 или 4 атома N или 1 или 2 атома S или O, или 1 атом O или S вместе с 1 или 2 атомами N, которые могут быть представлены в виде заместителей углеродного остатка или углеродной цепи или могут быть включены в углеродный остаток или углеродную цепь.
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
Термин “углеродный остаток, состоящий из от 1 до 30 атомов углерода” относится к одному атому углерода или к цепи из от 2 до 30 атомов углерода, которая может быть выпрямлена (линейная) подходящей химической связью или иметь такое строение, что с 1 атомом углерода соединены два или три отдельных атома углерода (разветвленная), и, необязательно, идущие в разных направлениях от разветвленного атома углерода. Далее, расположение атомов углерода может также образовывать форму кольца (циклическое). Любое из упомянутых выше расположений атомов углерода, образующих углеродный остаток, также может включать одну или несколько двойных или тройных связей (ненасыщенных). Когда цепь углеродных атомов не содержит двойной или тройной связи, углеродный остаток считается насыщенным. Необязательно, “углеродный остаток, состоящий из от 1 до 30 атомов углерода”, может быть, кроме того, замещен от 1 до 5 заместителями Z, Z, Z, Z, Z. Однако специалисту понятно, что термин “может быть замещен” относится к замене или замещению атома водорода каждым одним из заместителей Z, Z, Z, Z, Z. Если углеродный остаток из от 1 до 30 атомов углерода не содержит какого-либо дополнительного заместителя Z, Z, Z, Z, Z, остаток считается незамещенным.
*
#
1
2
3
4
5
1
30
2
30
2
30
3
10
4
30
4
30
1
30
Более предпочтительно, R и R независимо друг от друга представляют собой линейный или разветвленный С-С-алкильный остаток, линейный или разветвленный С-С-алкенильный остаток, линейный или разветвленный С-С-алкинильный остаток, С-С-карбоциклоалкильный остаток, С-С-алкилциклоалкильный остаток, С-С-алкилгетероциклоалкильный остаток или замещенный С-С-углеродный остаток, содержащие от 1 до 5 заместителей Z, Z, Z, Z, Z.
1
2
3
4
5
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
4
9
2
3
2
3
2
4
3
3
6
3
2
2
5
2
4
2
5
3
6
2
5
2
3
7
2
4
3
7
3
6
3
7
2
3
5
2
4
3
5
3
6
3
5
2
3
2
2
4
3
2
3
6
3
2
2
3
3
2
4
3
3
3
6
3
3
2
4
9
2
4
4
9
3
6
4
9
2
2
4
3
6
2
2
2
4
2
3
6
2
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
2
5
2
3
7
2
3
5
2
3
2
2
3
3
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
2
5
2
3
7
2
3
5
2
3
2
2
3
3
2
3
2
3
2
4
3
3
6
3
2
5
2
2
5
2
4
2
5
3
6
2
5
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
Заместители Z, Z, Z, Z и Z независимо друг от друга представляют собой -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-цикло-CH, -OCH(CH), -OC(CH), -OCH, -OPh, -OCH-Ph, -OCPh, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph, -NO, -F, -Cl, -Br, -COCH, -COCH, -COCH, -CO-цикло-CH, -COCH(CH), -COC(CH), -COOH, -COOCH, -COOCH, -COOCH, -COO-цикло-CH, -COOCH(CH), -COOC(CH), -OOC-CH, -OOC-CH, -OOC-CH, -OOC-цикло-CH, -OOC-CH(CH), -OOC-C(CH), -CONH, -CONHCH, -CONHCH, -CONHCH, -CONH-цикло-CH, -CONH[CH(CH)], -CONH[C(CH)], -CON(CH), -CON(CH), -CON(CH), -CON(цикло-CH), -CON[CH(CH)], -CON[C(CH)], -NHCOCH, -NHCOCH, -NHCOCH, -NHCO-цикло-CH, -NHCO-CH(CH), -NHCO-C(CH), -NH, -NHCH, -NHCH, -NHCH, -NH-цикло-CH, -NHCH(CH), -NHC(CH), -N(CH), -N(CH), -N(CH), -N(цикло-CH), -N[CH(CH)], -N[C(CH)], -OCF, -CH-OCF, -CH-OCF, -CH-OCF, -OCF, -CH-OCF, -CH-OCF, -CH-OCF, -CHF, -CHF, -CF, -CHCl, -CHBr, -CH-CHF, -CH-CHF, -CH-CF, -CH-CHCl, -CH-CHBr.
1
30
20
30
1
10
10
19
Термин “линейный или разветвленный С-С-алкильный остаток” относится к остатку, который связан через атом углерода и который состоит всего из от 1 до 30 атомов углерода, включая атомы углерода разветвлений. То же самое определение применимо, соответственно, к терминам “линейный С-С-алкильный остаток”, “линейный С-С-алкильный остаток” и “линейный С-С-алкильный остаток”.
2
30
Термин “линейный или разветвленный С-С-алкенильный остаток” относится к остатку, который связан через атом углерода и который состоит всего из от 2 до 30 атомов углерода, включая атомы углерода разветвлений, и который имеет, по крайней мере, одну, но не более чем 15 двойных связей. Если он разветвлен, самая длинная углеродная цепь представляет собой главную цепь, при этом боковые цепи являются разветвлениями. В главной цепи и/или в боковой цепи (цепях) могут присутствовать от 1 до 15 двойных связей С=С.
2
30
Термин “линейный или разветвленный С-С-алкинильный остаток” относится к остатку, который связан через атом углерода и который состоит всего из 2-30 атомов углерода, включая атомы углерода разветвлений, и который имеет, по крайней мере одну, но не более, чем 15 тройных связей, и, предпочтительно, 1, 2 или 3 тройные связи. Если он разветвлен, самая длинная углеродная цепь представляет собой главную цепь, при этом боковые цепи являются разветвлениями. В главной цепи и/или в боковой цепи (цепях) могут присутствовать от 1 до 15 тройных связей С≡С.
3
10
3
10
Термин “С-С-карбоциклоалкильный остаток” относится к остатку, который присоединен через кольцевой атом углерода и содержит, по крайней мере, одно карбоциклическое кольцо, и который состоит в целом из от 3 до 10 атомов углерода, включая атомы углерода любого алкильного, алкенильного или алкинильного заместителя. Карбоциклическое кольцо в С-С-карбоциклоалкильном остатке может быть насыщенным, частично ненасыщенным или полностью ненасыщенным и может быть ароматическим. Если карбоциклическое кольцо является частью бициклического кольца или соединено с еще одним кольцом, оба карбоциклических кольца могут быть насыщенными или ненасыщенными и могут быть ароматическими, либо одно кольцо является насыщенным, а второе кольцо является частично или полностью ненасыщенным.
3
10
1
Примерами предпочтительных С-С-карбоциклоалкильных остатков, на которые ссылаются также как на заместители М, являются следующие:
4
30
4
30
Термин “С-С-алкилциклоалкил” относится к остатку, который присоединен через атом углерода, который не является частью карбоциклического кольца и содержит, по крайней мере, одно карбоциклическое кольцо и который состоит в целом из от 4 до 30 атомов углерода, включая атомы углерода любого алкильного, алкенильного или алкинильного заместителя. Карбоциклическое кольцо в С-С-карбоциклоалкильном остатке может быть насыщенным, частично ненасыщенным или полностью ненасыщенным и может быть ароматическим. Если карбоциклическое кольцо является частью бициклического кольца или соединено с еще одним кольцом, оба карбоциклических кольца могут быть насыщенными или ненасыщенными и могут быть ароматическими, либо одно кольцо является насыщенным, а второе кольцо является частично или полностью ненасыщенным.
4
30
4
30
4
30
Термин “С-С-алкилгетероциклоалкильный остаток” относится к остатку, который присоединен через атом углерода, который не является частью гетероциклического кольца и содержит, по крайней мере, одно гетероциклическое кольцо, которое состоит из от 4 до 30 атомов углерода, включая атомы углерода любого алкильного, алкенильного или алкинильного заместителя. Гетероциклическое кольцо в С-С-алкилгетероциклоалкильном остатке может быть насыщенным, частично ненасыщенным или полностью ненасыщенным и может быть ароматическим. К гетероциклическому кольцу может быть присоединен 1 или 2 атома кислорода, образуя таким образом одну или две карбонильные группы. Если гетероциклическое кольцо является частью бициклического кольца или связано с еще одним кольцом, которое может быть карбоциклическим или гетероциклическим кольцом, оба кольца могут быть насыщенными или ненасыщенными и могут быть ароматическими, либо одно кольцо является насыщенным, а второе кольцо является частично или полностью ненасыщенным и может быть ароматическим. Гетероциклическое кольцо содержит 1 или 2 атома О, 1 или 2 атома S, 1, 2, 3 или 4 атома N, 1 O и 1 или 2 атома N, или 1 S и 1 или 2 атома N. Примерами таких С-С-алкилгетероциклоалкильных остатков являются:
1
30
1
30
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
1
2
3
4
5
Термин “замещенный С-С-углеродный остаток, содержащий от 1 до 5 заместителей Z, Z, Z, Z и Z” относится к остатку, который присоединен через атом углерода и который состоит всего из от 1 до 30 атомов углерода, включая атомы углерода любого заместителя, такого как алкил, алкенил, алкинил, Z, Z, Z, Z и/или Zзаместитель. Остаток содержит от 1 до 5 заместителей Z, Z, Z, Z, Z и может быть линейным или разветвленным и насыщенным или ненасыщенным. Таким образом, помимо, по крайней мере, одного заместителя Z, остаток может содержать одну или более двойных связей С=С и/или одну или более тройных связей С≡С. Более того, замещенный С-С-углеродный остаток может содержать от 1 до 10 гетероатомов N, O, S в углеродной цепи или быть присоединенным к углеродной цепи. Один или несколько атомов кислорода могут быть присоединены к углеродной цепи, образуя таким образом одну или несколько карбонильных групп. Если остаток является разветвленным, самая длинная цепь представляет собой главную цепь, в то время как боковые цепи являются разветвлениями. Карбонильные функциональные группы, двойные связи, тройные связи, а также заместители Z, Z, Z, Z, Z могут иметься в или на главной цепи, а также в или на боковой(ых) цепи(цепях).
1
30
Примерами таких замещенных С-С-углеродных остатков являются:
*
#
В предпочтительном воплощении изобретения остатки R и R независимо друг от друга представляют собой:
3
2
r
3
2
s
3
2
t
3
2
v
3
2
2
w
3
2
3
2
a
2
b
3
2
c
2
d
2
e
3
2
f
2
g
2
h
2
i
3
2
j
2
k
2
l
2
o
2
q
3
-CH, -(CH)-CH, -CH(OH)-(CH)-CH,-CH=CH-CH3, -CH=CH-(CH)-CH, -CH(OH)-(CH)-CH(CH), -CH(OH)-(CH)-CH(CH)-CH-CH, -(CH)-CH=CH-(CH)-CH, -(CH)-CH=CH-(CH)-CH=CH-(CH)-CH, -(CH)-CH=CH-(CH)-CH=CH-(CH)-CH=CH-(CH)-CH, -(CH)-CH=CH-(CH)-CH=CH-(CH)-CH=CH-(CH)-CH=CH-(CH)CH,
где a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, o, q являются целыми числами от 1 до 26, при условии, что: (a+b)≤27; (c+d+e)≤25; (f+g+h+i)≤23; (j+k+l+o+q)≤21; и где r обозначает целое число от 1 до 29, s обозначает целое число от 1 до 28, t обозначает целое число от 1 до 27, v обозначает целое число от 1 до 26, и w обозначает целое число от 1 до 25, и, кроме того,
2
q
3
2
q
3
A
3
-(CH=CH-CH)-CH, -(CH-CH=CH)-CH, -(CH=CH)-CH,
где q обозначает целое число от 1 до 9, A обозначает целое число от 1 до 14, и кроме того
2
B
2
C
3
2
B
2
3
D
2
E
3
2
E
D
3
2
F
G
2
3
2
J
2
K
2
3
2
P
Q
2
R
S
2
T
3
2
U
2
V
2
W
2
X
2
Y
Z
-(CH=CH-CH)-(CH)-CH, -(CH-CH=CH)-(CH)C-CH, -(CH=CH)-(CH)-CH, -(CH)-(CH=CH)-CH, -(CH)-(CH=CH)-(CH)H-CH, -(CH)-(CH=CH-CH)-(CH)N-CH, -(CH)-(CH=CH)-(CH)-(CH=CH)-(CH)-CH, -(CH)-(CH=CH-CH)-(CH)-(CH=CH-CH)-(CH)-CH,
где B, C, D, E, F, G, H; I, J, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y и Z независимо друг от друга обозначает целое число в интервале между 1 и 26, при условии, что общее число атомов углерода упомянутых выше остатков не превышает 30.
*
#
В еще одном предпочтительном воплощении изобретения остатки R и R независимо друг от друга представляют собой: этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил, нонил, децил, додецил, тетрадецил, цис-9-тетрадеценил, цис-9-гексадеценил, цис-6-октадеценил, цис-9-октадеценил, цис-11-октадеценил, цис-9-эйкозенил, цис-11-эйкозенил, цис-13-докозенил, цис-15-тетракозенил, транс-9-октадеценил, транс-11-октадеценил, транс-3-гексадеценил, 9,12-октадекадиенил, 6,9,12-октадекатриенил, 8,11,14-эйкозатриенил, 5,8,11,14-эйкозатетраенил, 7,10,13,16-докозатетраенил, 4,7,10,13,16-докозапентаенил, 9,12,15-октадекатриенил, 6,9,12,15-октадекатетраенил, 8,11,14,17-эйкозатетраенил, 5,8,11,14,17-эйкозапентаенил, 7,10,13,16,19-докозапентаенил, 4,7,10,13,16,19-докозагексаенил, 5,8,11-эйкозатриенил, 9c 11t 13t элеостеарил, 8t 10t 12c календил, 9c 11t 13c каталпил, цис-9-тетрадеценил, цис-9-гексадеценил, цис-6-октадеценил, цис-9-октадеценил, цис-11-октадеценил, цис-9-эйкозенил, цис-11-эйкозенил, цис-13-докозенил, цис-15-тетракохенил, 9,12-октадекадиенил, 6,9,12-октадекатриенил, 8,11,14-эйкозатриенил, 5,8,11,14-эйкозатетраенил, 7,10,13,16-докозатетраенил, 4,7,10,13,16-докозапентаенил, 9,12,15-октадекатриенил, 6,9,12,15-октадекатетраенил, 8,11,14,17-эйкозатетраенил, 5,8,11,14,17-эйкозапентаенил, 7,10,13,16,19-докозапентаенил, 4,7,10,13,16,19-докозагексаенил, 5,8,11-эйкозатриенил, 1,2-дитиолан-3-пентанил, 6,8-дитиан-октанил, докозагептадеканил, элеостеарил, календил, каталпил, таксолеил, пиноленил, сциадонил, ретинил, 14-метилпентадеканил, пристанил, фитанил, 11,12-метиленоктадеканил, 9,10-метиленгексадеканил, 9,10-эпоскистеарил, 9,10-эпоксиоктадец-12-енил, 6-октадецинил, t11-октадецен-9-инил, 9-октадецинил, 6-октадецен-9-инил, t10-гептадецен-8-инил, 9-октадецен-12-инил, t7,t11-октадекадиен-9-инил, t8,t10-октадекадиен-12-инил, 5,8,11,14-эйкозатетраинил, 2-гидрокситетракозанил, 2-гидрокси-15-тетракозенил, 12-гидрокси-9-октадеценил или 14-гидрокси-11-эйкозенил, 4,7,9,11,13,16,19-докозагептадеканил, 6-октадеценил, t11-октадецен-9-инил, изопальмитил, 9,10-метиленгексадецил, коронарил, (R,S)-липоил, 6,8-бис(метилсульфанил)-октанил, 4,6-бис(метилсульфанил)-гексанил, 2,4-бис(метилсульфанил)-бутанил, 1,2-дитиоланил, церебронил, гидоксинервонил, рицинил, лескверил, брассилил, тапсил, додецил, гексадецил, октадецил, эйкозанил, докозанил, тетракозанил, цис-9-тетрадеценил, цис-9-гексадеценил, цис-6-октадеценил, цис-9-октадеценил, цис-11-октадеценил, цис-9-эйкозенил, цис-11-эйкозенил, цис-13-докозенил, цис-15-тетракозенил, 9,12-октадекадиенил, 6,9,12-октадекатриенил, 8,11,14-эйкозатриенил, 5,8,11,14-эйкозатетраенил, 7,10,13,16-докозатетраенил, 4,7,10,13,16-докозапентаенил, 9,12,15-октадекатриенил, 6,9,12,15-октадекатетраенил, 8,11,14,17-эйкозатетраенил, 5,8,11,14,17-эйкозапентаенил, 7,10,13,16,19-докозапентаенил, 4,7,10,13,16,19-докозагексаенил, 5,8,11-эйкозатриенил, 1,2-дитиолан-3-пентанил, 6,8-дитианоктанил, докозагептадеканил, элеостеарил, календил, каталпил, таксолеил, пиноленил, сциадонил, ретинил, 14-метилпентадеканил, пристанил, фитанил, 11,12-метиленоктадеканил, 9,10-метиленгексадеканил, 9,10-эпоксистеарил, 9,10-эпоксиоктадец-12-енил, 6-октадецинил, t11-октадецен-9-инил, 9-октадецинил, 6-октадецен-9-инил, t10-гептадецен-8-инил, 9-октадецен-12-инил, t7,t11-октадекадиен-9-инил, t8,t10-октадекадиен-12-инил, 5,8,11,14-эйкозатетраинил, 2-гидрокситетракозанил, 2-гидрокси-15-тетракозенил, 12-гидрокси-9-октадеценил, и 14-гидрокси-11-эйкозенил.
*
#
#
*
#
В еще одном предпочтительном воплощении изобретения остатки R и R независимо друг от друга замещены фенильным кольцом, предпочтительно, незамещенным фенильным кольцом. Далее, предпочтительно, чтобы указанное фенильное кольцо располагалось на остатках R* и R в противоположном конце от места, где остатки R и R связаны с оставшимся фрагментом CA.
*
#
10
30
14
29
Также в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения остатки R и R являются одними и теми же, предпочтительно, линейными алкильными остатками, и, более предпочтительно, линейными С-С-алкильными остатками, и, наиболее предпочтительно, линейными –CH.
*
#
*
#
*
#
20
30
10
19
25
51
14
29
В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения остатки R и R являются отличными друг от друга и представляют собой различные линейные алкильные остатки, предпочтительно, остаток R представляет собой линейный С-С-алкильный остаток, а остаток R представляет собой линейный С-С-алкильный остаток, и, более предпочтительно, остаток R представляет собой линейный С-С остаток, а остаток R представляет собой линейный С-С остаток.
*
#
*
#
*
#
1
10
10
19
4
9
14
29
В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения остатки R и R являются отличными друг от друга и представляют собой различные линейные алкильные остатки, предпочтительно, остаток R представляет собой линейный С-С-алкильный остаток, а остаток R представляет собой линейный С-С-алкильный остаток, и, более предпочтительно, R представляет собой линейный С-С остаток, а остаток R представляет собой линейный С-С остаток.
*
#
*
*
#
*
#
1
10
10
19
6
12
14
29
В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения остатки R и R являются отличными друг от друга и представляют собой различные линейные алкильные остатки, где остаток R, кроме того, замещен фенильным кольцом, предпочтительно, остаток R представляет собой фенил-замещенный линейный С-С-алкильный остаток, а остаток R представляет собой линейный С-С-алкильный остаток, и, более предпочтительно, остаток R представляет собой линейный С-Н-Ph остаток, а остаток R представляет собой линейный С-Н остаток.
*
#
*
*
#
*
#
10
19
10
19
6
12
14
29
В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения остатки R и R являются отличными друг от друга и представляют собой различные линейные алкильные остатки, где остаток R, кроме того, замещен фенильным кольцом, предпочтительно, остаток R представляет собой фенил-замещенный линейный С-С-алкильный остаток, а остаток R представляет собой линейный С-С-алкильный остаток, и, более предпочтительно, остаток R представляет собой линейный С-С-Ph остаток, а остаток R представляет собой линейный С-С остаток.
*
#
*
#
*
#
20
30
1
10
25
51
5
11
В еще одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения остатки R и R являются отличными друг от друга и представляют собой различные линейные алкильные остатки, предпочтительно, остаток R представляет собой линейный С-С-алкильный остаток, а остаток R представляет собой линейный С-С-алкильный остаток, и, более предпочтительно, остаток R представляет собой линейный С-H остаток, а остаток R представляет собой линейный С-Н остаток.
Следующие соединения (II, III, IV и V) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
*
#
A, L, R, R и p имеют определенные в описании значения,
1
2
3
R, R, R независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
3
2
-H, -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-COOCH, -NHCOCH, -NH.
Более того, следующие соединения (VI, VII, VIII, IX) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
*
#
A, L, R, R и p имеют определенные в описании значения,
1
2
3
4
5
6
7
8
9
R, R, R, R, R, R, R, R, R независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
3
2
-H, -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-COOCH, -NHCOCH, -NH.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения следующие соединения (IIb, IIIb, IVb и Vb) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
*
#
A, L, R, R и p имеют определенные в описании значения,
1
2
3
R, R, R независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
3
2
-H, -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-COOCH, -NHCOCH, -NH,
G представляет собой -NH-, -O-, -S-.
Кроме того, следующие соединения (VIb, VIIb, VIIIb, IXb) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
*
#
A, L, R, R и p имеют определенные в описании значения,
1
2
3
4
5
6
7
8
9
R, R, R, R, R, R, R, R, R независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
3
2
-H, -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-COOCH, -NHCOCH, -NH,
G представляет собой -NH-, -O-, -S-.
Более того, следующие соединения (Х, ХI, ХII, ХIII) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
*
#
A, L, R, R и p имеют определенные в описании значения:
Кроме того, следующие соединения (XIV, XV, XVI, XVII) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
*
#
A, L, R, R и p имеют определенные в описании значения.
Кроме того, следующие соединения (ХVIII, XIX, XX) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
A, L и p имеют определенные в описании значения
1
2
3
4
5
6
7
8
9
R, R, R, R, R, R, R, R, R независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
3
2
-H, -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-COOCH, -NHCOCH, -NH.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения следующие соединения (XVIIIb, XIXb, XXb) общей структуры (I) являются предпочтительными:
где
A, L и p имеют определенные в описании значения,
1
2
3
4
5
6
7
8
9
R, R, R, R, R, R, R, R, R независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
3
2
-H, -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-SO-CH, -O-COOCH, -NHCOCH, -NH.
G представляет собой -NH-, -O-, -S-.
Более того, следующие соединения (XXI, XXII, XXIII, XXIV) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
A, L и p имеют определенные в описании значения
Особенно предпочтительными из соединений общей формулы (I) являются соединения следующих формул (ХХV), (ХХVI) и (ХХVII):
где
1
A, L и p имеют определенные в описании значения
Еще в одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения соединения по настоящему изобретению относятся к следующим подформулам.
Следующие подформулы (IIc, IIIc, IVc и Vc) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
*
#
A, L, R, R и p имеют определенные в описании значения,
1
2
3
Q, Q, Q независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
-H, -CH, -CH, -CH, -SO-CH, -SO-CH, -SO-CH, COCH.
Кроме того, следующие соединения (VI, VII, VIII, IX) общей формулы (I) являются предпочтительными:
где
*
#
A, L, R, R и p имеют определенные в описании значения,
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Q, Q, Q, Q, Q, Q, Q, Q, Q независимо друг от друга представляют собой:
3
2
5
3
7
2
3
2
2
5
2
3
7
3
-H, -CH, -CH, -CH, -SO-CH, -SO-CH, -SO-CH, COCH.
Все воплощения данного изобретения охватывают энантиомеры, стереоизомерные формы, смеси энантиомеров, аномеры, дезокси-формы, диастереомеры, смеси диастереомеров, пролекарства, таутомеры, гидраты, сольваты и рацематы упомянутых выше соединений и их фармацевтически приемлемые соли.
Выражение пролекарство определяется как фармакологическое вещество, лекарство, которое вводится в неактивной или значительно менее активной форме. Будучи введенным, пролекарство метаболизируется в организме in vivo в активное соединение.
Выражение таутомер определяется как органическое соединение, которое является взаимопреобразуемым с помощью химической реакции, называемой таутомеризацией. Таутомеризация может катализироваться, предпочтительно, основаниями или кислотами или другими подходящими соединениями.
Экстракция и выделение углеводных антигенов из патогена может выполняться различными способами (MICROBIOLOGICAL REVIEWS, Vo. 42, Nr.1, 84-113, 1978; JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS Vo. 44, Nr. 3, 249-270, 1981). Один общий способ описывается следующим образом:
Выделение и очистка обычно включают щелочную экстракцию клеточных стенок или клеток, которые сначала делипидируются органическими растворителями с последующим осаждением органическими растворителями. Дальнейшая очистка достигается с помощью ионообменной хроматографии.
Для удаления оставшегося пептида или белковых компонентов с последующей аффинной хроматографией в качестве конечной стадии очистки используются протеолитические ферменты.
Синтез синтетических углеводных антигенов может быть осуществлен различными способами (Nature Reviews Drug Discovery 4, 751-763, September 2005). Автоматизированный твердофазный метод описывается следующим образом:
Автоматизированный твердофазный синтез олигосахаридов был разработан на основе представления об упорядоченных структурах олигопептида и олигонуклеотида. Первый структурный элемент добавляют к полистирольной смоле, снабженной легко расщепляемым линкером, содержащим свободную гидроксильную группу. Активирующий агент вызывает связывание, вовлекающее гликозилфосфатный и гликозилтрихлорацетамидатный структурные элементы. В отличие от олигонуклеотидного и пептидного связывания, образование гликозидной связи происходит в основном при низких температурах и требует реакционной камеры, которая может охлаждаться. Для каждого связывания в камеру добавляют избыточные структурные элементы (то есть 5-10-кратный молярный избыток, иногда применяемый дважды).
Промывкой и фильтрованием удаляют любые побочные продукты или остающиеся реагенты, затем селективно удаляют временные защитные группы, подготавливая следующую гидроксильную группу для последующего связывания. Эффективность связывания можно оценить с помощью спектрометрического считывания после удаления защитных групп в том случае, когда используются временные защитные группы, абсорбирующие ультрафиолетовое излучение, такие как 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc). Первоначально этот цикл связывания-удаления защитных групп был автоматизирован с использованием конверторного пептидного синтезатора.
После завершения получения олигосахаридной последовательности полностью защищенный продукт отщепляли от твердой подложки. После полного удаления защитных групп олигосахарид очищали и подтверждали его структуру. С использованием автоматизированного синтезатора олигосахаридов был собран ряд возрастающе сложных олигосахаридов, каждый в пределах 1 дня или менее. Это является успешным в сравнении с от недель до месяцев, занимаемыми при использовании способов в фазе раствора.
Еще один аспект настоящего изобретения охватывает синтез соединений общей формулы (I)
p
A[L-CH-CA]
(I)
В одном воплощении синтез соединений по настоящему изобретению протекает следующим образом:
В частности, в конкретном предпочтительном воплощении настоящего изобретения после защиты соответствующими защитными группами (PG) фрагмент СН подвергали взаимодействию с линкерной молекулой L. В настоящем описании PG могут быть одними и теми же PG или также могут быть различными PG, такими как PG′ и PG″, в зависимости от гидроксильной группы в фрагменте CH. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения защитные группы PG′ и PG″ отличаются одна от другой. В еще одном предпочтительном воплощении защитные группы PG′ и PG″ являются одинаковыми.
Используемые в описании защитные группы, предпочтительно, могут быть использованы для вторичных спиртов. В одном воплощении используются силильные защитные группы, такие как триметилсилил (TMS), трет-бутилдифенилсилил (TBDPS), трет-бутилдиметилсилил (TBS или TBDMS), триизопропилсилил (TIPS) и [2-(триметилсилил)этокси]метил (SEM). В еще одном предпочтительном воплощении используются защитные группы простых углеродных эфиров, такие как метил, н-бутил, трет-бутил, п-метоксибензил, метокси-метил, тритил, винил, аллил, бензилоксиметил, ацетил, пиволил, 2-трихлор-1-имидоацетил, 2-трихлор-1-N-фенилимидоацетил и тетрагидропиранил. В другом предпочтительном воплощении настоящего изобретения используются, по крайней мере, одна силильная группа для PG′ и, по крайней мере, одна простая эфирная углеродная группа для PG″ в одной из молекул (XXIX), (XXX) и (XXXII). Еще в одном предпочтительном воплощении настоящего изобретения в молекулах (XXIX), (XXX) и (XXXII) для защиты групп PG′ и PG″ используются две различные простые эфирные углеродные группы, предпочтительно, по крайней мере, одна бензильная для PG″ и, по крайней мере, одна аллильная группа для PG′, более предпочтительно, три бензильные группы для PG″ в каждом 3, 4 и 5 из четырех положений в молекулах (XXIX), (XXX) и (XXXII) и одна аллильная группа для PG′ во 2 положении в молекулах (XXIX) и (XXX).
Следовательно, в конкретном предпочтительном воплощении последовательность реакций осуществляют следующим образом:
где L, PG′ и PG″ имеют определенные в описании значения.
Далее, согласно данному воплощению молекулу L-CH (XXX) подвергают преобразованию, по крайней мере, в одну стадию реакции, предпочтительно, в две стадии реакции, в промежуточное соединение L-CH-CA с подходящим предшественником (XXXI) для молекулы CA:
*
#
где A, L, PG′, PG″, R и R имеют определенные в описании значения.
В следующей последовательности реакций по этому конкретному воплощению у промежуточного соединения (XXXII) затем удаляют защитные группы PG″, что дает промежуточное соединение (XXXIII), и подвергают взаимодействию с подходящим антигеном А, получая соединение (X) в качестве одного представительного соединения по изобретению общей формулы (I):
*
#
где А, L, PG″, R и R имеют определенные в описании значения.
p
При синтезе соединений общей формулы (I) A[L-CH-CA] и, в частности, как показано выше для синтеза соединений общей формулы (X), предпочтительно, чтобы линкерная молекула L была введена посредством использования предшественника, который получают из диольного (гликольного) соединения. Предпочтительными являются асимметрические молекулы предшественника для линкера L, который имеет с одной стороны нуклеофильную группу, такую как галогенидную или активированную гидрокси группу, и с другой стороны функциональную группу, которая может быть преобразована в амино группу, такую как азид, защищенная аминогруппа или нитрил. В более предпочтительном воплощении настоящего изобретения предшествующие молекулы для линкера L имеют с одной стороны активированную спиртовую функциональную группу с удаляемой группой, такой как тозилат, трифлат или мезилат, и с другой стороны, предпочтительно, защищенную аминогруппу или азид. В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения предшествующая молекула для линкера L имеет общую формулу (XXXV)
(XXXV) которая обычно может быть синтезирована из диольных (гликольных) соединений общей формулы (XXXVI)
N
Также предпочтительными являются линкеры, представляющие собой линейные или разветвленные углеродные цепи с от 2 до 30 атомов углерода и с от 0 до 6 гетероатомов, выбранными из группы -O-, -S- и -N(R)-, и/или с одной или несколькими ароматическими и/или карбоциклическими и/или гетероциклическими кольцевыми системами, где линкер присоединен посредством атома углерода к атому кислорода углеводного фрагмента (CH), предпочтительно, к атому кислорода на атоме С6 углерода углеводного фрагмента, и непосредственно или косвенно присоединен через атом углерода к антигену. Эта углеродная цепь, предпочтительно, присоединена через метиленовую группу углеродной цепи к кислороду и, предпочтительно, к кислороду С6 углеводного фрагмента. Более того, эта углеродная цепь, предпочтительно, присоединена через метиленовую группу или карбонильную группу углеродной цепи к гетероатому и, предпочтительно, атому азота антигена (А) и, более предпочтительно, к атому азота аминогруппы антигена. Используемый в описании термин “непосредственно присоединен” означает, что углеродная цепь соединена с функциональной группой антигена, предпочтительно, аминогруппой антигена, тогда как термин “косвенно присоединен” относится к связыванию углеродной цепи с промежуточным звеном, присоединенным к антигену таким образом, чтобы углеродная цепь была связана с промежуточным звеном, которое присоединено к антигену. Так, чтобы промежуточное звено располагалось между линкером или соответствующей углеродной цепью и антигеном и могло, например, образовываться при расщеплении ангидрида или сукцинимида. Углеродная цепь, предпочтительно, содержит от 2 до 25, более предпочтительно, от 2 до 20, еще более предпочтительно, от 2 до 15 или от 2 до 12 атомов углерода. Предпочтительно также, чтобы углеродная цепь имела вплоть до 4 атомов кислорода и, более предпочтительно, 1, 2 или 3 атома кислорода и/или до 4 атомов серы, предпочтительно, 1 или 2 атома серы. Кроме того, в углеродной цепи могут присутствовать одно или два замещенных или незамещенных фениленовых кольца.
N
3
2
5
3
7
4
9
5
11
6
13
7
15
8
17
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
4
9
2
3
2
3
2
4
3
3
6
3
2
2
5
2
4
2
5
3
6
2
5
2
3
7
2
4
3
7
3
6
3
7
2
3
5
2
4
3
5
3
6
3
5
2
3
2
2
4
3
2
3
6
3
2
2
3
3
2
4
3
3
3
6
3
3
2
4
9
2
4
4
9
3
6
4
9
2
2
4
3
6
2
2
2
4
2
3
6
2
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
2
3
2
5
3
7
3
5
3
2
3
3
3
2
2
5
2
3
7
2
3
5
2
3
2
2
3
3
2
Во всех описанных выше воплощениях остаток -R представляет собой -H, -CH, -CH, -CH, -CH, -CH, -CH, -CH, -CH, -OH, -OCH, -OCH, -OCH, -O-цикло-CH, -OCH(CH), -OC(CH), -OCH, -OPh, -OCH-Ph, -OCPh, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-O-цикло-CH, -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OCH(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OC(CH), -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OCH, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OPh, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph, -CH-OCH-Ph, -NO, -F, -Cl, -Br, -COCH, -COCH, -COCH, -CO-цикло-CH, -COCH(CH), -COC(CH), -COOH, -COOCH, -COOCH, -COOCH, -COO-цикло-CH, -COOCH(CH), -COOC(CH), -OOC-CH, -OOC-CH, -OOC-CH, -OOC-цикло-CH, -OOC-CH(CH), -OOC-C(CH), -CONH, -CONHCH, -CONHCH, -CONHCH, -CONH-цикло-CH, -CONH[CH(CH)], -CONH[C(CH)], -CON(CH), -CON(CH), -CON(CH), -CON(цикло-CH), -CON[CH(CH)], -CON[C(CH)].
В еще одном воплощении настоящего изобретения порядок связывания соответствующих фрагментов соединений по настоящему изобретению может различаться.
Согласно еще одному конкретному воплощению настоящего изобретения первые фрагменты СН и СА соединены с помощью подходящей химической реакции или реакций, образуя промежуточное соединение СН-СА, и далее добавляется линкерная молекула L, давая промежуточное соединение L-CH-CA, которое затем дополнительно подвергается реакции с получением соединений по настоящему изобретению общей формулы (I).
q
q
Согласно еще одному воплощению настоящего изобретения антиген А модифицируют молекулой линкера L, получая промежуточное соединение [L-]A. Промежуточное соединение [L-]A далее может быть подвергнуто взаимодействию с промежуточным соединением СА-СН с образованием соединений по настоящему изобретению общей формулы (I).
Все реакции могут быть модифицированы для того, чтобы использовать или получать соответствующие предпочтительные соединения подформул (II)-(XXVII).
Что касается реакционной последовательности
то могут быть использованы фрагменты CH с различной возможностью образования связей, как проиллюстрировано подформулами (II)-(V). Подобным же образом, для представленной выше реакционной последовательности подходящими являются фрагменты СН, являющиеся моносахаридами, дисахаридами или трисахаридами, примеры которых проиллюстрированы подформулами (VI)-(XIII), а также стереохимические аспекты, проиллюстрированные подформулами (XIV)-(XVII). Далее, для указанной выше последовательности реакций подходящим также является синтетический подход при использовании для специфичных церамидных фрагментов, как показано подформулами (XVIII)-(XXIV), который сохраняется в той же в силе и для конкретных линкерных молекул, приведенных в качестве примеров подформулами (XXV) и (XXVII). Таким образом, последовательность реакций
является также подходящей для синтеза промежуточных соединений (II)-(XXVII) путем подбора соответствующих фрагментов L, CH и CA.
Согласно дополнительному предпочтительному воплощению настоящего изобретения углеродный фрагмент и церамид перед введением в линкерную молекулу сначала связывают вместе. Таким образом, последовательность реакций также могла бы быть следующей:
Настоящее изобретение охватывает также фармацевтически приемлемые соли соединений общей формулы (I), все стереоизомерные формы соединений общей формулы (I), а также и их сольваты, особенно гидраты, или пролекарства.
В случае, когда соединения по изобретению содержат основные и/или кислотные заместители, они могут образовывать соли с органическими или неорганическими кислотами или основаниями. Примерами подходящих кислот для образования таких кислотно-аддитивных солей являются следующие кислоты: хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, салициловая кислота, п-аминосалициловая кислота, яблочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, аскорбиновая кислота, малеиновая кислота, сульфоновая кислота, фосфоновая кислота, перхлорная кислота, азотная кислота, муравьиная кислота, пропионовая кислота, глюконовая кислота, молочная кислота, винная кислота, гидроксималеиновая кислота, пировиноградная кислота, фенилуксусная кислота, бензойная кислота, п-аминобензойная кислота, п-гидроксибензойная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, азотистая кислота, гидроксиэтансульфоновая кислота, этиленсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, нафтилсульфоновая кислота, сульфаниловая кислота, камфорсульфоновая кислота, хинная кислота, миндальная кислота, о-метилминдальная кислота, водород-бензолсульфоновая кислота, пикриновая кислота, адипиновая кислота, d-о-толилвинная кислота, тартроновая кислота, (о, м, п)-толуиловая кислота, нафтиламинсульфоновая кислота и другие минеральные или карбоновые кислоты, также хорошо известные специалистам в данной области техники. Эти соли получают контактированием формы свободного основания с достаточным количеством желаемой кислоты, получая соль общепринятым образом.
4
Примерами подходящих неорганических или органических оснований являются, например, NaOH, KOH, NHOH, гидроокись тетралкиламмония, лизин или аргинин и тому подобное. Соли могут быть получены общепринятым образом с использованием способов, хорошо известных в технике, например, с помощью обработки раствора соединения общей формулы (I) раствором кислоты, выбранной из группы, указанной выше.
Некоторые из соединений по настоящему изобретению могут быть кристаллизованы или перекристаллизованы из растворителей, таких как водные и органические растворители. В таких случаях могут образовываться сольваты. В объем изобретения включены стехиометрические сольваты, включающие гидраты, а также соединения, содержащие варьируемые количества воды, которые могут получаться такими способами, как лиофилизация.
Некоторые соединения общей формулы (I) могут существовать в виде оптических изомеров, если имеются заместители, по крайней мере, с одним асимметрическим центром, например, диастереоизомеров и смесей изомеров во всех соотношениях, например, рацемических смесей. Изобретение включает все такие формы, в частности, чистые изомерные формы. Различные изомерные формы могут быть разделены или отделены одна от другой с помощью общепринятых методов, либо любой заданный изомер может быть получен обычными способами синтеза или путем стереоспецифического или асимметрического синтеза. Когда соединение общей формулы (I) содержит алкеновый фрагмент, алкен может быть как цис, так и транс изомером, или являться их смесью. Когда изомерная форма соединения изобретения получается по существу свободной от других изомеров, она, предпочтительно, содержит менее 5% масс/масс, более предпочтительно, менее 2% масс/масс других изомеров и, в особенности, менее 1% масс/масс других изомеров.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению углеводно-гликолипидных конъюгированных производных по изобретению в качестве лекарственных средств, т.е. в качестве фармацевтически активных агентов, применяемых в медицине.
Неожиданно было обнаружено, что новые углеводно-гликолипидные конъюгаты по настоящему изобретению являются подходящими также для усиления иммунного ответа у животных и являются подходящими для вакцинирования от инфекционных болезней, которые вызываются патогенами, выбранными из группы бактерий, вирусов, споровиков, паразитов или грибков. Кроме того, если сахаридный антиген является специфичным к раковым клеткам, новые углеводно-гликолипидные конъюгаты являются подходящими для лечения и профилактики злокачественных новообразований.
И изолированные, и синтетические углеводные антигены являются подходящими для получения желаемого конъюгата. Более того, было обнаружено, что лечение животных новыми углеводно-гликолипидными конъюгатами по настоящему изобретению приводит к образованию IgG-изотипов иммуноглобулина, которые подтверждают развитие В-клеток памяти у живых организмов. Наличие В-клеток памяти служит доказательством иммунологической памяти. Таким образом, было показано, что углеводно-гликолипидые конъюгаты по настоящему изобретению способны индуцировать долгосрочную защиту животных от патогенов. Описанная вакцинация является, кроме того, независимой от других адъювантов, не нуждается в каком-либо белковом носителе и не требует охлаждения или замораживания вакцины.
Следовательно, соединения общей формулы (I-XXVII) являются подходящими для использования в качестве фармацевтически активных агентов, применимых в медицине, особенно для применения при вакцинации от инфекционных болезней.
Инфекционные болезни, согласно настоящему изобретению, выбраны из группы бактериальных, споровиковых, паразитических, грибковых или вирусных инфекционных заболеваний.
Инфекционно-бактериальное заболевание, вакцины для которого могут быть на основе соединений согласно изобретению, вызывается патогеном, выбранным из группы, включающей:
Allochromatium vinosum, Acinetobacter baumanii, Bacillus anthracis, Campylobacter jejuni, Clostridium spp., Citrobacter spp., Escherichia coli, Enterobacter spp., Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Francisella tularensis, Haemophilus 20 influenzae, Helicobacter pylori, Klebsiella spp., Listeria monocytogenes, Moraxella catharralis, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Serratia spp., Shigella spp., Stenotrophomonas maltophilia, Staphyloccocus aureus, Staphyloccocus epidermidis, Streptococcus pneunmoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Yersina pestis и Yersina enterocolitica.
Паразитарно-инфекционное заболевание, вакцины для которого могут быть на основе соединений согласно изобретению, вызывается патогеном, выбранным из группы, включающей:
Babesia, Balantidium, Besnoitia, Blastocystis, Coccidia, Cryptosporidium, Cytauxzoon, Cyclospora, Dientamoeba, Eimeria, Entamoeba, Enterocytozoon, Enzephalitozoon, Eperythrozoon, Giardia, Hammondia, Isospora, Leishmania, Microsporidia, Naegleria, Plasmodium, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Pneumocystis, Schistosoma, Sarcocystis, Theileria, Trichinella, Toxoplasma, Trichomonas, Trypanosoma, Unicaria, Cestoda, Dipylidium, Dranunculus, Echinococcus, Fasciola, Fasciolopsis, Taenia, Ancylostoma, Ascaris, Brugia, Enterobius, Loa loa, Mansonella, Necator, Oncocerca, Strongyloides, Strongylus, Toxocara, Toxascaris, Trichuris или Wucheria.
Грибковое инфекционное заболевание, вакцины для которого могут быть на основе соединений согласно изобретению, вызывается патогеном, выбранным из группы, включающей:
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale, T. schonleinii, T. verrucosum, T. violaceum, T. tonsurans, Trichophyton spp., M. canis, Candida albicans, C. guillermondii, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, Candida spp., Microsporum spp., Microsporum canis, Microsporum audonii, Microsporum gypseum, M. ferrugineum, Trichosporum beigelii, Trichosporum inkiin, Aspergillus niger, Alternaria, Acremonium, Fusarium, или Scopulariopsis.
Вирусное инфекционное заболевание, вакцины для которого могут быть на основе соединений согласно изобретению, вызывается патогеном, выбранным из группы, включающей:
Аденовирусы, Эболавирус, вирус Эпштейна-Барр, флавивирус, вирус FSME, вирус гриппа, хантавирус, вирус иммунодефицита человека ("ВИЧ"), герпес симплекс вирус ("HSV", тип 1 или 2), вирус герпеса человека 6 (HHV-6), вирус папилломы человека ("HPV", тип 16 или 18), цитомегаловирус человека ("HCMV"), вирус гепатита В или С человека (“HBV”, тип B; "HCV", тип C), вирус Ласса, лиссавирус (EBL 1 или EBL 2), Марбургский вирус, Noro-вирус, Parvo вирус B19, пестивирус, полиовирус, риновирус, ротавирусы, SARS-ассоциированный коронавирус, вирус Варицелла–Зостер.
Из злокачественных новообразований, для лечения которых подходящими являются новые углеводно-гликолипидные конъюгаты, особенное внимание обращено на рак мочевого пузыря, рак груди, рак толстой и прямой кишки, рак эндометрия, рак почек (почечно-клеточный), лейкемию, злокачественную меланому легких, лимфому не-Ходжкина, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак щитовидной железы.
Из инфекционных заболеваний было обращено внимание на Haemophilus influenzae и Streptococcus pneunmoniae.
Таким образом, еще один аспект настоящего изобретения касается фармацевтических композиций, содержащих, по крайней мере, одно соединение по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента вместе, по крайней мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем, инертным наполнителем и/или разбавителями. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть получены известным способом в обычном твердом или жидком носителе или разбавителе при подходящем уровне дозировки. Предпочтительные препараты предназначены для перорального применения. Эти формы введения включают в себя, например, пилюли, таблетки, таблетки с пленочным покрытием, таблетки, покрытые оболочкой, капсулы, порошки и преципитат.
Кроме того, настоящее изобретение включает также фармацевтические препараты для парентерального применения, включая дермальное, интрадермальное, внутрижелудочное, внутрикожное, внутрисосудистое, внутривенное, внутримышечное, интраперитонеальное, интраназальное, внутриматочное, трансбукальное, чрескожное, ректальное, подкожное, сублингвальное, местное или трансдермальное применение, где в дополнение к обычным носителям и/или разбавителям препараты содержат в качестве активного ингредиента, по крайней мере, одно соединение в соответствии с настоящим изобретением и/или его фармацевтически приемлемую соль.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, содержащие в качестве активного ингредиента, по крайней мере, одно соединение по настоящему изобретению и/или его фармацевтически приемлемую соль, обычно вводятся вместе с подходящими материалами носителя, выбранными в соответствии с предполагаемой формой введения, т.е. для перорального введения в виде таблеток, капсул (либо с твердым наполнением, полутвердым наполнением, либо с жидким наполнением), порошков для приготовления препарата, экструдатов, преципитатов, гелей, эликсиров, диспергируемых гранул, сиропов, суспензий и тому подобное, и в соответствии с общепринятой фармацевтической практикой. Например, для перорального введения в виде таблеток или капсул активный лекарственный компонент может быть объединен с нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем для перорального применения, предпочтительно, с инертным носителем, таким как лактоза, крахмал, сахароза, целлюлоза, стеарат магния, дикальцийфосфат, сульфат кальция, тальк, маннит, этиловый спирт (капсулы с жидким наполнением) и тому подобное. Более того, в таблетки или капсулы могут быть также включены подходящие связующие, смазочные агенты, разрыхлители и окрашивающие агенты. Порошки и таблетки могут содержать от примерно 5 до примерно 95 массовых % производного бензотиофен-1,1-диоксида и/или соответствующей фармацевтической соли в качестве активного ингредиента.
Подходящие носители включают крахмал, желатин, природные углеводы, кукурузные сахарозаменители, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль и воски. Из подходящих смазочных агентов могут быть упомянуты борная кислота, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и тому подобное. Подходящие разрыхлители включают крахмал, метилцеллюлозу, гуаровую камедь и тому подобное. В случае необходимости могут быть также включены подсластители и ароматизирующие агенты, а также консерванты. Разрыхлители, разбавители, смазочные агенты, связующие и др. более подробно обсуждаются далее.
Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в виде формы с замедленным высвобождением для обеспечения контролируемой скорости высвобождения одного или нескольких компонентов или активных ингредиентов для оптимизации терапевтического(их) эффекта(ов), например, антигистаминной активности и тому подобное. Подходящие лекарственные формы для замедленного высвобождения включают таблетки, имеющие слои с различными скоростями разрыхления, или полимерные матрицы с контролируемым высвобождением, заполненные активными компонентами и сформованные в виде таблеток или капсул, содержащих такие заполненные или инкапсулированные пористые полимерные матрицы.
Жидкие лекарственные формы включают растворы, суспензии и эмульсии. В качестве примера могут быть упомянуты водные или водно/пропиленгликольные растворы для парентеральных инъекций, или с добавлением подсластителей и агентов, придающих непрозрачность растворов, суспензий и эмульсий для перорального введения. Жидкие лекарственные формы могут также включать растворы для интраназального введения. Аэрозольные препараты, подходящие для ингаляции, могут включать растворы и твердые формы в виде порошка, которые могут быть в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, таким как сжатый инертный газ, например, азот. Для приготовления суппозиториев низкоплавкий жир или воск, такой как смесь глицеридов жирных кислот типа масла какао, сначала расплавляют и затем в нем гомогенно диспергируют активный ингредиент, например, путем перемешивания. Расплавленную гомогенную смесь затем выливают в формы удобных размеров, оставляют охлаждаться, а затем отверждают.
Включены также твердые лекарственные формы, которые предназначены для преобразования непосредственно перед использованием в жидкие лекарственные формы для либо перорального, либо парентерального введения. Такие жидкие формы включают растворы, суспензии и эмульсии.
Соединения в соответствии с настоящим изобретением могут также быть доставлены трансдермально. Трансдермальные композиции могут иметь форму крема, лосьона, аэрозоля и/или эмульсии и могут быть включены в трансдермальный пластырь типа ткани или с резервуарами, как известно в технике для данной цели использования.
Термин капсула, употребляемый в описании, относится к специфическому контейнеру или емкости, изготовленным, например, из метилцеллюлозы, поливиниловых спиртов или денатурированных желатинов или крахмала для хранения или содержания в них композиций, включающих активный(ые) ингредиент(ы). Капсулы с твердыми оболочками обычно изготавливают из смешанных желатинов с относительно высокой прочностью желатинового геля из костей или свиной кожи. Сама капсула содержит небольшое количество красителей, агентов, обеспечивающих непрозрачность, пластификаторов и/или консервантов. Под таблеткой понимается спрессованная или сформованная твердая лекарственная форма, которая содержит активный ингредиент с подходящими разбавителями. Таблетки могут изготавливаться прессованием смесей или гранулятов, получаемых мокрым гранулированием, сухим гранулированием или компактированием, хорошо известным обычному специалисту в данной области техники.
Пероральные гели относятся к активным ингредиентам, диспергированным или солюбилизированным в гидрофильной полутвердой матрице. Порошки для приготовления препарата относятся к порошковым смесям, содержащим активные ингредиенты и подходящие разбавители, которые могут быть суспендированы, например, в воде или в соке.
Подходящими разбавителями являются вещества, которые обычно составляют главную часть композиции или лекарственной формы. Подходящие разбавители включают углеводы, такие как лактозу, сахарозу, маннит и сорбит, крахмалы, полученные из пшеницы, кукурузы, риса и картофеля, и целлюлозы, такие как микрокристаллическая целлюлоза. Количество разбавителя в композиции может быть в пределах от примерно 5 до примерно 95% по массе от всей композиции, предпочтительно, от примерно 25 до примерно 75% по массе и, более предпочтительно, от примерно 30 до примерно 60 масс.%.
Термин разрыхляющие агенты относится к веществам, добавляемым к композиции для облегчения разделения ее на части (дезинтеграции) и высвобождения фармацевтически активных ингредиентов лекарственного средства. Подходящие разрыхляющие агенты включают крахмалы, “растворимые в холодной воде” модифицированные крахмалы, также как и натрий-карбоксиметил-крахмал, природные и синтетические камеди, такие как камедь рожкового дерева, камедь карайи, гуаровая камедь, трагакант и агар, производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза и натрий карбоксиметилцеллюлоза, микрокристаллические целлюлозы и сшитые микрокристаллические целлюлозы, такие как натрий кроскармелоза, альгинаты, такие как альгиновая кислота и альгинат натрия, глины, такие как бентониты, и шипучие смеси. Количество разрыхляющего агента в композиции может быть в пределах от примерно 2 до примерно 20% от массы композиции, более предпочтительно, от примерно 5 до примерно 10% по массе.
Связующими являются вещества, которые связывают или “склеивают” частицы порошка вместе и делают их способными к сцеплению с образованием гранул и служат таким образом в качестве “адгезива” в препарате. Связующие добавляют сцепляющую силу, уже имеющуюся в разбавителе или придающем объем агенте. Подходящие связующие включают углеводы, такие как сахароза, крахмалы, получаемые из пшеницы, кукурузы, риса и картофеля, природные камеди, такие как аравийская камедь, желатин и трагакант, производные морских водорослей, такие как альгиновая кислота, альгинат натрия и альгинат аммонийкальция, целлюлозные материалы, такие как метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза и гидроксипропилметилцеллюлоза, поливинилпирролидон и неорганические соединения, такие как магний алюминий силикат. Количество связующего в композиции может быть в диапазоне от примерно 2 до примерно 20% по массе композиции, предпочтительно, от примерно 3 до примерно 10% по массе и, более предпочтительно, от примерно 3 до примерно 6 масс.%.
Смазочные агенты относятся к классу веществ, которые добавляют к лекарственным формам, чтобы дать возможность гранулам в таблетках после прессования высвободиться из формы или штампа за счет снижения трения и износа. Подходящие смазочные агенты включают металлические стеараты, такие как стеарат магния, стеарат кальция или стеарат калия, стеариновую кислоту, воски с высокой температурой плавления и другие водорастворимые смазочные агенты, такие как хлорид натрия, бензоат натрия, ацетат натрия, олеат натрия, полиэтиленгликоли и D,L-лейцин. Смазочные агенты обычно добавляются на самой последней стадии перед компрессией, поскольку они должны быть на поверхности гранул. Количество смазочного агента в композиции может находиться в пределах от примерно 0,2 до примерно 5% по массе от всей композиции, предпочтительно, от примерно 0,5 до примерно 2% по массе и, более предпочтительно, от примерно 0,3 до примерно 1,5 масс.% композиции.
Глидантами являются вещества, которые предотвращают спекание компонентов фармацевтической композиции и улучшают характеристики текучести гранулята таким образом, чтобы поток был равномерным и однородным. Подходящие глиданты включают двуокись кремния и тальк. Количество глиданта в композиции может находиться в пределах от примерно 0,1 до примерно 5% по массе от конечной композиции, предпочтительно, от примерно 0,5 до примерно 2 масс.%.
Окрашивающими агентами являются инертные наполнители, которые обеспечивают окрашивание композиции или лекарственной формы. Такие наполнители могут включать пищевые красители, адсорбированные на подходящем адсорбенте, таком как глина или оксид алюминия. Количество окрашивающего агента может варьировать от примерно 0,1 до примерно 5% по массе от композиции, предпочтительно, от примерно 0,1 до примерно 1 масс.%.
Указанные фармацевтические композиции могут дополнительно включать один активный углеводно-гликолипидный конъюгат общей формулы (I).
Фармацевтические композиции могут, кроме того, включать, по крайней мере, один дополнительный активный агент. Предпочтительно, когда этот активный агент выбран из группы, состоящей из антидепрессантов и других психотропных лекарственных средств. Далее, предпочтительно, когда антидепрессант выбран из амитриптилина, амиксида, кломипрамина, доксепина, дулоксетина, имипрамина, тримипрамина, миртазапина, ребоксетина, циталопрама, флуоксетина, моклобемида и серталина.
Дальнейшее воплощение изобретения предусматривает среднее соотношение углеводного антигена А и гликолипида (L-CH-CA), которое может варьировать между 1:4 и 1:100 (число/число).
Еще одно воплощение изобретения охватывает соединения по изобретению общей формулы (I), которые могут использоваться при получении препарата вакцины для использования в вакцинации животных. Указанный препарат вакцины может содержать одно или несколько соединений по настоящему изобретению или смесь различных соединений по изобретению и, предпочтительно, общей формулы (I), где смесь различных соединений общей формулы (I), предпочтительно, включает смесь различных серотипов используемого углеводного антигена А, и/или смесь различных соединений общей формулы (I) может включать смесь различных углеводных антигенов А, которые используются в различных соединениях общей формулы (I). Указанная смесь различных соединений общей формулы (I) в препарате вакцины может, следовательно, представлять сочетание вакцин, которое может использоваться для комбинированной вакцинации от более чем, по крайней мере, одного патогена.
В следующем воплощении изобретения препарат вакцины может включать смесь различных соединений общей формулы (I).
Указанные препараты вакцин могут, кроме того, содержать комбинацию, по крайней мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем, наполнителем и/или разбавителями.
Соединения по настоящему изобретению общей формулы (I) содержатся в указанном препарате вакцины в пределах от 10 до 1000 мкг/г.
В предпочтительном воплощении изобретения соединения общей формулы (I) присутствуют в указанной рецептуре вакцины в пределах 10-1000 нг/г.
В более предпочтительном воплощении изобретения соединения общей формулы (I) присутствуют в указанной рецептуре вакцины в пределах от 100 до 1000 нг/г.
Указанный препарат вакцины проявляет чрезвычайную стабильность при комнатной температуре вследствие блочного строения соединений по настоящему изобретению, где указанный препарат вакцины может содержаться при температуре, по крайней мере, 25°С в течение, по крайней мере, 3 месяцев перед восстановлением.
В предпочтительном воплощении изобретения указанный период составляет 6 месяцев или, по крайней мере, 12 месяцев.
Неожиданные преимущества конъюгатов по настоящему изобретению были обнаружены при применении их in vitro и in vivo.
В частности, при применении in vitro гликоконъюгированная вакцина согласно настоящему изобретению сохраняет способность стимулировать iNKT клетки, когда они представлены CD1d-положительными антиген-презентирующими клетками (APC). Кроме того, было обнаружено, что соединения по настоящему изобретению не могут стимулировать те же самые iNKT клетки, когда они помещены на связанный с планшетом рекомбинантный CD1d. Вне связи с теорией, полагают, что сахаридный фрагмент должным образом связывается и препятствует распознаванию Т клеток.
Кроме того, при применении in vivo конъюгатов по настоящему изобретению было обнаружено, что они способны эффективно и длительно иммунизировать против патогена. Это является довольно удобным, поскольку тем самым конъюгаты по настоящему изобретению могут не только стимулировать генерирование антител высоких титров с продолжительно сохраняющейся устойчивостью в условиях in vivo, более того, соединения по настоящему изобретению сами по себе проявляют длительную стабильность при комнатной температуре. Следовательно, конъюгаты по настоящему изобретению являются особенно термостабильными и, таким образом, не требуется никакого замораживания.
Примеры
Общие методы:
Клетки. АРС линии MOLT-4 (ATCC CRL 1582), которые только незначительно экспрессируют CD1d, и человеческие CD1d-инфицированные C1R и HeLa клетки (соответственно, C1R-hCD1d и HeLa-hCD1d) [6] содержали в RPMI-1640 среде, содержащей 10% FCS, 2 мM L-глютамина, 1 мM пирувата натрия, 100 мкM заменимых аминокислот и 100 мкг/мл канамицина. Те же самые условия содержания использовали для RAW (линия клеток лейкемического моноцит макрофага мышей), J774A.1 (мыши, BALB/c, моноцит-макрофаг, неопределенная опухоль), клетки HL60 и NB4 (обе промиелоцитной лейкемии человека). Выделение клонов iNKT клеток из PBMC здоровых доноров было описано ранее [7]. Клетки iNKT содержали в среде RPMI-1640, содержащей 5% HS, 2 мM L-глютамина, 1 мM пирувата натрия, 100 мкM заменимых аминокислот, 100 мкг/мл канамицина и 100 ед/мл рекомбинанта IL-2.
Мыши. Мыши C57BL/6, BALB/c и B6; 129-CD1<tm1Gru> (CD1KO) [8] были выведены в институте авторов (Versuchsstation Departement Biomedizin, Базель, Швейцария) или C57BL/6 были получены также от Charles River Laboratories (Sulzfeld, Германия). Данное исследование было рассмотрено и одобрено “Kantonales Veterinaramt Basel-Stadt” в Базеле, Швейцария.
Бактерии. Ссылочный штамм Streptococcus pneumoniae серотипа 4 (Statens Serum Institute, Дания) выращивали в бульоне Тодда-Гевитта с добавлением 0-5% экстракта дрожжей при 37°C.
Инфекции. Невакцинированным и вакцинированным мышам вводили S. pneumoniae серотипа 4 и в течение длительного времени регистрировали смертность, потерю веса и клиническую оценку.
Опсонизации. Меченые 5мM диацетатом 5-хлорметилфлуоресцеина (CMFDA, Invitrogen, Швейцария) и нефиксированные или фиксированные бактерии покрывали 10% кроличьим комплементом (поставки HD, UK) и/или очищенными CPS-специфичными mAb в течение вплоть до 1 часа. Смешивали бактерии с индуцированными диметилформамидом (Sigma-Aldrich, Швейцария) или с неиндуцированными клетками при соотношении 10-100:1 в течение до 2 часов при температуре 37°C. Образцы получали на проточном цитометре CyAn ADP (Beckman Coulter, Швейцария). Данные подвергали селекции на основе рассеивания света, ширины импульсов и включения пропидий йодида, чтобы исключить нежизнеспособные клетки, и далее анализировали с использованием программного обеспечения Summit (Beckman Coulter).
4
5
5
Анализы активирования. Анализы презентации антигена in vitro при помощи живых APC или связанных на планшете антиген-презентирующих молекул выполняли, как описано ранее [9]. Вкратце, на 96-луночный планшет помещали живые APC при 2,5×10/лунку и инкубировали в течение всего анализа при 37°C с разбавителем или титрующими дозами αGalCer или конъюгированной вакцины. Спустя 1 час добавляли iNKT клетки человека (0,5-1×10/лунку). Супернатанты клеточной культуры собирали через 24-48 часов и измеряли высвобождение цитокинов с помощью ELISA. Для планшет-связанного активирования с помощью IEF получали очищенный рекомбинантный растворимый человеческий CD1d (rshCD1d) и помещали на Bir1,4 mAb-покрытые (10 мкг/мл, специфичные для BirA тэг rshCD1d) планшеты MaxiSorp (Nunc) в течение ночи. Связанный rshCD1d активировали 2 мкг/мл αGalCer или различными дозами конъюгированной вакцины. Клоны iNKT клеток человека (1,5×10/лунку) добавляли на планшет и через 24-48 часов измеряли высвободившиеся цитокины с помощью ELISA.
ELISA. Для анализа человеческих цитокинов использовали следующие очищенные иммобилизованные и биотинилированные пары детекторных моноклональных антител (mAb) (все от фирмы BioLegend, San Diego, США): hTNFα (MAb1 1 мкг/мл и MAb11 0,5 мкг/мл), hTFNγ (MD-1,2 мкг/мл и 4S-B3 0-5 мкг/мл), hIL-4 (8D4-8 1 мкг/мл и MP4-25D2 0,5 мкг/мл), hGM-CSF (BVD2-23B6 3,33 мкг/мл и BVD2-21C11 0,5 мкг/мл), hIL-8 (JK8-1 1,25 мкг/мл и JK8-2 1 мкг/мл). Для обнаружения мышиных цитокинов использовали следующие пары mAb (все от фирмы Becton Dickinson (BD), Allschwil, Швейцария): mIL-2 (JES6-1A12 2 мкг/мл и JES6-5H4 1 мкг/мл), mIL-4 (11B11 1 мкг/мл и BVD6-24G2 1 мкг/мл), mIFNγ (R4-6A2 2 мкг/мл и XMG1.2 1 мкг/мл). Для анализа Ab планшеты покрывали 1 мкг/мл биотинилированным козлиным анти-мышиным (GAM) Ig (BD, 553999) и выявляли 1:10'000 HRP-меченным GAM-lgG (Sigma-Aldrich, Buchs, Швейцария, A0168) или 1:1'000 (все от фирмы SouthernBiotech, Бирмингем, США) HRP-меченным GAM-lgM (1020-05), GAM-lgG1 (1070-05), GAM-lgG2a (1080-05), GAM-lgG2b (1090-05), GAM-lgG3 (1100-05) или покрывали 2,5 мкг/мл CPS и выявляли (все от фирмы Biolegend) биотинилированным крысиным анти-мышиным (RAM)-lgG1 (клон RMG1-1, 1 мкг/мл), -lgG2a (клон RMG2a-62, 1 мкг/мл), -lgG2b (клон RMG2b-1, 0,5 мкг/мл), -IgG3 (клон RMG3-1, 0,5 мкг/мл) или ослиным анти-мышиным lgM (Jackson ImmunoResearch, Suffolk, UK, 0,95 мкг/мл) или GAM F(ab')2 lgG (abcam, 0,1 мкг/мл) GAM lg (BD, 2 мкг/мл).
Статистический анализ. Данные по выживанию сравнивали с тестом Mantel-Cox и Gehan-Breslow-Wilcoxon. Все анализы выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5.03). Различия считали значительными при P<0,05.
2
2
2
3
254
3
3
1
13
.
Химические вещества и структурный анализ. Все используемые химические вещества были чистыми для анализа и использовались, как они поставлялись, за исключением указанных особо. Диметилформамид (ДМФ), тетрагидрофуран (ТГФ), толуол, дихлорметан (CHCl) и диэтиловый эфир (EtO) поставлялись фирмой JT Baker or VWR International и были очищены с помощью системы Cycle-Tainer Solvent Delivery System. Пиридин, триэтиламин (NEt) и ацетонитрил (MeCN) кипятили с обратным холодильником над гидридом кальция и перегоняли. Растворители для хроматографии и способов обработки были перегнанными. Реакции проводили в атмосфере аргона или азота за исключением указанных особо случаев. Аналитическую тонкослойную хроматографию выполняли на пластинах E. Merck silica gel 60 F (0,25 мм). Соединения визуализировали с помощью УФ-света при 254 нм и погружения пластин в раствор реактива сульфат аммония-церия молибдат (CAM) или раствор серная кислота/метанол с последующим нагреванием. Жидкостную хроматографию выполняли с использованием принудительной циркуляции указанного растворителя на Fluka силикагеле 60 (230-400 меш). H ЯМР спектры получали на приборах Varian VXR-300 (300 МГц), Varian VXR-400 (400МГц), Bruker DRX500 (500 МГц) и Bruker AV600 (600 МГц), и они приведены в миллионных долях (δ) по отношению к сигналу растворителя или TMS (0,00 м.д.). Константы спин-спинового взаимодействия (J) приведены в герцах (Гц). C ЯМР спектры получали на приборах Varian VXR-300 (75 МГц), Varian VXR-400 (101 МГц), Bruker DRX500 (125 МГц) и Bruker AV600 (150 МГц), и они приведены в δ относительно сигнала растворителя или TMS (0,00 м.д.). ИК Спектры: определяли в виде 1-2% раствора CHCl на спектрофотометре Perkin-Elmer-782 или чистыми на спектрометре Perkin-Elmer-100 FT-IR. Рециркулирующая препаративная эксклюзионная ВЭЖХ (LC-9101, Japan Analytical Industry Co.); скорость потока: 3-5 мл/мин; растворитель: CHCl. Оптические вращения [α]комн.темпD измеряли на поляриметре Jasco DIP-370 (10 см, 1 мл ячейка); указаны растворители и концентрации (в г/100 мл). Масс спектры высокого разрешения снимали с помощью MS service FU Berlin и приведены в m/z.
Пример 1
Активность конъюгированной вакцины in vitro
Глюкоконъюгированная вакцина (S. pneumoniae серотипа 4 CPS, связанная с αGalCer) сохраняет способность стимулировать iNKT клетки, когда они представлены CD1d-положительными антиген-презентирующими клетками (APC), но ей не удается стимулировать те же iNKT клетки, когда они помещены на связанный с планшетом рекомбинантный CD1d (фигуры 3A и 3B, соответственно). Это открытие указывают на то, что сахаридный фрагмент должным образом связывается и препятствует распознаванию T клеток, но может быть отщеплен от стимуляторного гликолипида αGalCer живыми APC.
Пример 2
Активность in vivo конъюгированной вакцины
Для иммунизации мышей C57BL/6 дикого типа использовали гликоконъюгат, состоящий из CPS типа 4, связанный с αGalCer. Проводили три иммунизации с интервалами в 14 дней. Указанные мыши показывали высокие титры анти-полисахаридных Ab по сравнению с не использовавшимися ранее в опытах или иммунизированными только CPS мышами (фигура 4A) вплоть до 3 месяцев после последней иммунизации. Это свидетельствует в пользу продолжительного ответа на Ab B-клетками только тогда, когда им помогают αGalCer-чувствительные iNKT клетки.
Гликоконъюгированную вакцину использовали для иммунизации WT C57BL/6 и CD1d-дефицитных (CD1d-/-, CD1KO) мышей. Проводили две иммунизации с интервалом в 7 дней. Мыши дикого типа (WT) показывали высокие титры анти-полисахаридных антител (Ab), чего не наблюдалось у CD1d-дефицитных мышей (фигура 4B), указывая на то, что экспрессия CD1d является необходимой для подобного адъюванту эффекта αGalCer.
В заключение, индуцируемый гликококонъюгатной вакциной ответ на антитела зависит от присутствия iNKT клеток и CD1d, так как CD1d KO мыши не могут генерировать высокие титры CPS-специфичных антител после иммунизации.
Пример 3
Анализ in vivo ответной реакции на антитела после вакцинации
Когда CPS-специфичные Ab исследовали с помощью ELISA с использованием изотип-специфичных вторичных реагентов, присутствие IgG1 CPS-специцифических Ab обнаруживали только у мышей WT, тогда как мыши CD1KO не были способны индуцуировать IgG1 (фигура 5A). То же самое было подтверждено с другими IgG подтипами. Эти эксперименты доказывают, что иммунизация CPS типа в сочетании с α GalCer гликоконъюгатом способствует переключению классов с полисахарид-специфичных антител на все IgG изотипы.
Генерируемые Ab частично реагировали с CPS типа 2 S-pneumoniae (фигура 5B). Они могли бы также распознавать обычные эпитопы на CPS других серотипов, так как были обнаружены очень высокие титры совокупного иммуноглобулина при оценке реакционноспособности со смесью CPS нескольких S. pneumoniae серотипов (данные не показаны).
Несколько гибридом, экспрессирующих CPS-специфичные Ab, было определено у мышей, иммунизированных дважды и забитых через 1,5 месяца после последней стимуляции. Авторы смогли изолировать гибридомы, экспрессирующие IgM и все IgG подклассы, за исключением IgG2b. IgM-положительные гибридомы были с созревшей аффинностью (фигура 6).
Эти предварительные эксперименты демонстрируют, что иммунизация с применением CPS типа 4 в сочетании с αGalCer гликоконъюгатом переключению в полисахарид-специфичных В клеток на IgG изотипы и/или созревшей аффинностью CPS-специфичных Ab.
Все гибридомы, полученные от иммунизированных гликоконъюгатом мышей показали переключение классов и созревшую аффинность. Соматическая мутация кажется частым явлением, так как две из IgG1 гибридом использовали те же VDJ-реаранжировки. Кроме того, несколько IgM гибридом были идентичны, за исключением множественности J-сегментов с помощью P- и N-нуклеотидов.
Эти mAb оценивали на их способность фиксировать комплемент и усиливать опсонизацию фагоцитарными клетками. Используя CMD-меченные бактерии, авторы обнаружили, что CPS-специфичные Ab вызывали повышение бактериального фагоцитоза (фигура 7).
Пример 4
Защита от инфицирования S. pneumoniae в мышиной модели
Иммунизация гликоконъюгатной вакциной защищает мышей C57BL/6 от инфицирования S. pneumoniae. Вакцинированные αGalCer-CPS типа 4 мыши показывают короткую и долгосрочную защиту от стимуляции антигеном S. pneumoniae (фигура 8B). Кроме того, мыши, вакцинированные αGalCer-CPS типа 4 переносят заболевание менее тяжело, чем мыши, иммунизированные только CPS типа 4, как показано по отсутствию потери веса после инъекции (фигура 8A, 3 и 3 представительных животных).
Пример 5
Синтез углеводно-гликолипидной конъюгированной вакцины
3
2
Синтез липидной части конъюгированной вакцины начинали используя амид Вейнреба N-Boc-L-серина 2 (схема 1), который получали с использованием EDCI в качестве конденсирующего агента, N-метилморфолина в качестве основания и N,O-диметил гидроксиламина. Смешивание N,O-ацетального образования с 2,2-диметоксипропаном и каталитическими количествами BF·OEt давало амид 3. Восстановление последнего с помощью литийалюминийгидрида при 0°C давало альдегид Гарнера 4. Z-Селективная олефинизация Виттига с использованием пентадециклотрифенилфосфоний илида дает алкен 5. Удаление ацетальной группы на олефине 5 сопровождалось асимметрическим дигидроксилированием по Шарплессу с помощью AD-mix β и метилсульфонамида, давая N-Boc защищенный диол 6 с хорошим выходом и селективностью. Последующее удаление карбаматной группы давало фитосфингозин 7. Образование амидной связи осуществляли с помощью гексакозан N-гидрокси сукцинимидилового эфира 11 и триэтиламина в качестве основания, давая соединение 8. Добавление TBSOTf и 2,6-лютидина давало трисилиловый эфир 9. Затем силиловый эфир по первичной гидроксильной группе селективно удаляли с помощью водной ТФУ с получением церамидного акцептора 10. [2]
Схема 1. Синтез липида 10. [1,2,3,4]
Схема 2. Синтез галактозилирующего агента 19.
Катализируемое пара-толуолсульфоновой кислотой гликозидирование Фишера галактозы 12 с аллильным спиртом давало гликозид 13 (схема 2). [5] Последующее тритилирование первичной C6 гидроксильной группы давало триол 14. Образование бензилового эфира с гидридом натрия и бензилбромидом давало полностью защищенную галактозу 15. Тритильную группу впоследствии удаляли с помощью трифторуксусной кислоты и триэтилсилана для освобождения C6 гидроксильной группы для дальнейшего введения функциональной группы. Этерификация Вильямсона спирта 16 и азида 23 с использованием гидроксида натрия давала производное галактозы 17. Каталитическая изомеризация аномерной аллильной защищающей группы до соответствующего енольного эфира с помощью хлорида палладия(II) и последующий гидролиз давали лактол 18, который преобразовывали в гликозилимидат 19 с помощью карбоната цезия и N-фенилтрифторацетимидазолилхлорида 24.
Линкер 23 получали исходя из 1,6-гександиола 20, который подвергали взаимодействию с тозилхлоридом, получая смесь соответствующего моно- и ди-тозилированного продукта вместе с исходным материалом. После разделения тозильную группу соединения 21 заменяли на азид натрия с получением азида 22. Последующее тозилирование гидроксильной группы соединения 22 давало тозилат 23.
Схема 3. Синтез снабженного линкером гликолипида 27.
Снабженный линкером гликолипид 25 (схема 3) получали посредством TMSOTf-каталазируемого гликозилирования элемента структуры галактозы 19 и церамида 10. Реакция проходила с выходом 72% и с полной α-селективностью. Удаление силильных эфирных защитных групп с помощью TBAF давало диол 26, который преобразовывали в соединение 27 с помощью гидрирования с катализатором Перлмана.
Схема 3. Альтернативный синтез снабженного линкером гликолипида 27a.
Гликолипид 36 получали в три стадии из известного соединения 33 с помощью взаимодействия активированного соединения 34 с производными соединений 10 путем вышеуказанного TMSOTf-катализированного гликозилирования элемента структуры галактозы. После удаления защитных групп у соединения 35 линкер вводили с помощью реакции конденсации с соединением 38 со средними выходами. Снабженный линкером гликолипид 27a далее получали через промежуточные соединения 25a и 26a путем полного удаления защитных групп снабженного линкером соединения 37.
Конъюгацию полисахарида с гликолипидом 27 осуществляли через ковалентную связь. Для этого PS4 активировали цианбромидом, к которому добавляли соединение 27, чтобы получить конъюгат 1 (схема 4).
Схема 4. Конъюгация гликолипида 27 с PS4.
Гидразоновая связь предоставляет альтернативный метод конъюгации для связи эпитопного фрагмента с гликолипидом. Для этого может быть использована гидразоновая связь (схема 5). Антиген 28 может быть модифицирован в ароматический альдегид 30 с использованием сложного NHS-эфира 29, а GSL 27 может быть преобразован в гидразон 32 с использованием сложного NHS-эфира 31. Конденсация альдегида 30 и гидразона 32 происходит при pH от 4,7 до 7,2. Линкерная система является коммерчески доступной от фирмы Novabiochem (HydraLinK TM).
Схема 5. Конъюгация снабженного аминовой связью антигена 28 с гликолипидом 27 через гидразоновую связь.
Экспериментальные способы:
(S)-3-(трет-Бутоксикарбонил)-N-метокси-2,2,N-триметилоксазолидин-4-карбоксамид (3)
2
2
2
2
3
2
2
4
f
3
3
2
3
3
f
max
3
3
13
24
2
5
1
1
13
+
К раствору L-Boc-серина 2 (12,33 г, 60,1 ммоль) в CHCl (240 мл) при 0°C добавляли гидрохлорид N,O-диметилгидроксиламина (6,04 г, 61,9 ммоль) и N-метилморфолин (6,8 мл, 61,9 ммоль). К данному раствору в течение периода 20 мин порциями добавляли гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N’-этилкарбодиимида (11,86 г, 61,9 ммоль), и раствор перемешивали в течение следующего 1 часа. Затем добавляли водный раствор HCl (1,0 М, 30 мл), и водный слой экстрагировали CHCl (2×100 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором NaHCO (30 мл), и водный слой снова экстрагировали CHCl (100 мл). Объединенные органические слои сушили над MgSO, и растворитель удаляли в вакууме, получая соответствующий амид Вейнреба (14,07 г, 94%) в виде белого твердого вещества. R=0,3 (EtOAc); H ЯМР (250 Мгц, CDCl) δ 5,60 (д, J=6,0 Гц, 1 H), 4,77 (шир. с, 1 H), 1,42 (с, 9 H), 3,80 (д, J=3,3 Гц, 2 H), 3,76 (с, 3 H), 3,21 (с, 3 H), 2,66 (шир. с, 1 H). Сырой продукт растворяли в ацетоне (180 мл), к которому добавляли 2,2-диметоксипропан (57 мл) и BF·EtO (0,5 мл). Раствор оранжевого цвета перемешивали в течение 90 мин при комнатной температуре и затем гасили EtN (1,2 мл), и растворители удаляли в вакууме. Сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент EtOAc/циклогексан = 1:2→1:1), получая изопропилиден-защищенный амид Вейнреба 3 (15,32 г, 89% за две стадий) в виде белого твердого вещества. Спектр ЯМР состоит из двух групп сигналов из-за наличия ротамеров. [α]Dкомн. темп. = -30,9 (c=1, CHCl); R = 0,45 (гексанг/EtOAc = 1:1); ИК (пленка) γ 2976, 2938, 1702, 1682, 1364, 1167, 1098, 998, 848, 768, 716; H ЯМР (250 МГц, CDCl) δ 4,77 (дд, J=9,8, 2,8 Гц, 1 H), 4,70 (дд, 7,5, 3,8, Гц, 1 H), 4,18 (дд, J=7,5, 4,0 Гц, 1 H), 4,15 (дд, J=7,8, 3,8 Гц, 1 H), 3,95 (дд, J=9,3, 3,0 Гц, 1 H), 3,91 (дд, J=9,0, 3,5 Гц), 3,72 (с, 3 H), 3,68 (с, 3 H), 3,19 (с, 6 H), 1,68 (с, 3 H), 1,66 (с, 3 H), 1,54 (с, 3 H), 1,50 (с, 3 H), 1,47 (с, 9 H), 1,39 (с, 9 H); C ЯМР (101 МГц, СDCl) δ 171,4, 170,7, 152,2, 151,4, 95,1, 94,5, 80,6, 80,0, 66,2, 66,0, 61,3, 61,3, 57,9, 57,8, 28,5, 28,4, 25,8, 25,5, 24,8, 24,6; HR ESI Вычислено для CHNO [M+Na]: 311,1577 найдено: 311,1582.
трет-Бутил (S)-4-формил-2,2-диметилоксазолидин-3-карбоксилат (4)
4
4
2
4
3
1
1
К раствору амида Вейнреба 3 (8,00 г, 27,7 ммоль) в ТГФ (100 мл) при 0°C по каплям добавляли LiAlH (1,0 M в ТГФ, 13,9 мл, 13,9 ммоль), и раствор перемешивали в течение 1 часа при 0°C. Через 1 час раствор охлаждали до -10°C и осторожно добавляли KHSO (1М, 70 мл), и раствор разбавляли EtO (170 мл). Смеси давали нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение 30 мин. Органический слой отделяли, сушили над MgSO, фильтровали, и растворитель удаляли в вакууме, получая альдегид Гарньера 4 в виде бледно-желтого масла (6,24 г, >95% чистоты по данным H ЯМР ). Спектр ЯМР состоит из двух групп сигналов из-за наличия ротамеров. H ЯМР (250 МГц, CDCl) δ 9,58 (д, J=0,8 Гц, 1H), 9,52 (д, J=2,5 Гц, 1 H), 4,32 (м, 1 H), 4,16 (м, 1 H), 4,06 (м, 4 H), 1,53-1,63 (м, 12 H), 1,49 (с, 9 H), 1,40 (с, 9 H). Сырой продукт использовали в последующей стадии без дополнительной очистки.
(4R,1’Z)-3-(трет-Бутоксикарбонил)-2,2-диметил-4-(1’-гексадеценил)оксазолидин (5)
4
2
2
4
3
f
max
3
3
26
49
3
.
-1
1
13
+
н-BuLi (1,6 M в гексане, 25,2 мл, 40,3 ммоль) по каплям добавляли к пентадецил-трифенилфосфонийбромиду (24,03 г, 43,4 ммоль) в безводном ТГФ (220 мл) при -78°C. Полученному оранжевому раствору давали нагреться до 0°C и перемешивали дополнительно 30 мин. Затем раствор охлаждали до -78°C и медленно добавляли альдегид Гарньера 4 (6,23 г, 27,2 ммоль) в безводном ТГФ (30 мл). После перемешивания в течение 2 часов при комнатной температуре реакционную смесь разбавляли насыщенным водным раствором NHCl (35 мл) и слои разделяли. Водный слой экстрагировали CHCl (3×35 мл), и объединенные органические экстракты промывали насыщенным водным раствором NaCl (50 мл), сушили над MgSO и концентрировали в вакууме. Очистка с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (EtOAc/гексан = 1:2) давала (Z)-олефин 5 в виде бледно-желтого масла (11,27 г, 78%). [α]D комн.темп.= +45,2 (c=1, CHCl); R = 0,40 (EtOAc/гексан = 1:2); ИК (пленка) γ 2923, 2854, 1699, 1457, 1382, 1251, 1175, 1093, 1056, 850, 768 35 см; H ЯМР (250 МГц, CDCl) δ 5,27-5,40 (м, 2 H), 4,58 (шир. с, 1 H), 4,02 (дд, J=6,3, 8,8 Гц, 1 H), 3,61 (дд, J=3,3, 8,5 Гц, 1 H), 1,96 (шир. с, 2 H), 1,23-1,56 (м, 39 H), 0,85 (т, J=7 Гц, 3 H); C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 152,1, 130,9, 130,4, 94,1, 79,8, 69,2, 54,7, 32,1, 29,9, 29,8, 29,8, 29,8, 29,7, 29,6, 29,5, 29,4, 28,6, 28,6, 27,6, 22,8, 14,2; HR ESI Вычислено для CHNO [M+Na]: 446,3605 найдено: 446,3614. Все спектральные данные были в хорошем соответствии с отчетными данными. [4]
1
1
1
3
3
Желаемый (Z)-олефин можно легко отличить от нежелательного (E)-олефинового побочного продукта при рассмотрении олефиновых протонов в спектре H ЯМР: Z-5 H ЯМР (250 МГц, CDCl) δ 4,05 (дд, J=6,3, 8,6 Гц, 1 H), 3,64 (дд, J=3,3, 8,6 Гц, 1 H) в сравнении с E-5 H ЯМР (250 МГц, CDCl) δ4,01 (дд, J=6,1, 8,7 Гц, 1 H), 3,71 (дд, J=2,1, 8,7 Гц, 1 H).
Пентадециклотрифенилфосфоний бромид
2
2
Раствор 1-бромпентадекана (30,0 г, 103 ммоль) и трифенилфосфина (27,02 г, 103 ммоль) в MeCN (200 мл) нагревали с обратным холодильником при 80°C в течение 5 дней. После удаления растворителя в вакууме добавляли EtO (30 мл), и полученный белый осадок отфильтровывали, промывали EtO и сушили в глубоком вакууме в течение 24 часов, получая пентадециклотрифенилфосфоний бромид (49,66 г, 87%) в виде белого порошка.
(2R,3Z)-2-(трет-Бутоксикарбонил)амино-3-октадецен-1-ол (5b)
2
2
4
пара-Толуолсульфоновую кислоту (371 мг, 1,95 ммоль) добавляли к перемешиваемому раствору (Z)-олефина 5 (5,00 г, 12,2 ммоль) в смеси MeOH/вода (всего 50 мл, соотношение = 9:1 объем/объем), и смесь перемешивали в течение 68 часов. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, получая белое твердое вещество, которое повторно растворяли в CHCl (100 мл). Раствор промывали солевым раствором (30 мл), сушили над MgSO, и растворитель удаляли в вакууме. Очистка с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент циклогексан/EtOAc = 4:1→2:1) давала спирт 5b в виде белого твердого вещества (2,71 г, 59%). Все спектральные данные были в хорошем соответствии с отчетными данными.
(2S,3S,4R)-2-(трет-Бутоксикарбонил)амино-1,3,4-октадекантриол (6)
2
3
4
Спирт 5b (1,50 г, 3,91 ммоль) растворяли в смеси трет-BuOH/вода (всего 38 мл, соотношение 1:1) и добавляли метансульфонамид (371 мг, 3,91 ммоль). Реакционную смесь охлаждали до 0°C и добавляли AD-mix-β (5,48 г). Полученную смесь перемешивали при 0°C в течение 41 часа и при комнатной температуре следующие 7 часов, затем гасили путем добавления твердого NaSO (6,0 г) и оставляли перемешиваться в течение 30 мин. После этого экстрагировали EtOAc (3×40 мл). Органические экстракты промывали NaOH (1 М, 20 мл), водой (20 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (20 мл), сушили над MgSO, и растворитель удаляли в вакууме. Очистка с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент EtOAc/циклогексан = 1:1→2:1) давала триол 6 в виде белого твердого вещества (1,05 г, 64%).
Фитосфингозин (7)
2
2
3
Триол 6 (60 мг, 0,14 ммоль) растворяли в трифторуксусной кислоте (0,6 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Раствор разбавляли CHCl (1,5 мл) и затем осторожно нейтрализовали (до pH ~ 8) насыщенным водным раствором NaHCO (10 мл), после чего происходило осаждение белого твердого вещества. Белое твердое вещество удаляли путем фильтрования, промывали водой (3×10 мл) и сушили при пониженном давлении. Перекристаллизация из MeCN давала фитосфингозин 7 в виде белого порошка (20 мг, 43%).
Церамид (8)
3
К раствору фитосфингозина 7 (15 мг, 0,047 ммоль) в безводном ТГФ (1 мл) добавляли сукцинимидиловый эфир гексакозановой кислоты 11 (34 мг, 0,071 ммоль) и EtN (24 мкл, 0,14 ммоль). Раствор нагревали до 50°C и перемешивали в течение 20 часов. Добавляли EtOAc (5 мл), и полученную суспензию центрифугировали (30 мин, 3000 оборотов в мин). Белый осадок удаляли путем фильтрования и сушили при пониженном давлении, получая амид 8 (29 мг, 88%).
N-Гидроксисукцинимидиловый эфир гексакозановой кислоты (11)
2
2
2
2
4
К раствору гексакозановой кислоты (121 мг, 0,304 ммоль) в CHCl (4 мл) добавляли 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (0,058 мл, 0,33 ммоль) и N-гидроксисукцинимид (42 мг, 0,37 ммоль). Реакционную смесь нагревали до 40°C, перемешивали в течение 3 часов и затем гасили водой (4 мл). Раствор разбавляли EtO (8 мл), и два слоя разделяли. Водную фазу экстрагировали EtO (8 мл), и объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором NaCl (5 мл), сушили над MgSO и фильтровали. После удаления растворителя в вакууме получали сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир 11 в виде белого твердого вещества (85 мг, 57%).
(2S,3S,4R)-1,3,4-Три-трет-бутил-диметилсилилокси-2-гексакозаноиламино-1-октадекан (9)
2
2
2
3
4
2
К перемешиваемой суспензии амида 8 (25 мг, 0,036 ммоль) в CHCl (1,2 мл) при 0°C добавляли TBSOTf (43 мкл, 0,18 ммоль) и 2,6-лютидин (65 мкл, 0,054 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакцию гасили с помощью MeOH (0,2 мл). Смесь разбавляли EtO (2 мл) и промывали насыщенным водным раствором NaHCO (1 мл) и насыщенным водным раствором NaCl (1 мл). Органический слой сушили над MgSO, фильтровали и концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (циклогексан/EtO = 15:1), получая TBS защищенный церамид 9 в виде бесцветного масла (27 мг, 71%).
(2S,3S,4R)-3,4-Бис-трет-бутилдиметилсилилокси-2-гексакозаноиламино-4-октадеканол (10)
3
2
3
4
3
f
max
3
3
56
117
4
2
-1
1
13
+
К раствору церамида 9 (90 мг, 0,087 ммоль) в ТГФ (2 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (40 мкл, 0,519 ммоль) в воде (0,5 мл, 27,8 ммоль) при -10°C. Реакционную смесь оставляли для нагрева до 10°C в течение 2 часового периода. Затем реакционную смесь гасили путем добавления насыщенного водного раствора NaHCO до тех пор, пока не достигалось нейтральное значение рН. Полученную смесь разбавляли EtO (10 мл), промывали водой (10 мл), насыщенным водным раствором NaHCO (10 мл), насыщенным водным раствором NaCl (10 мл) и сушили над MgSO. Растворитель удаляли в вакууме и сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент EtOAc/циклогексан = 10:1→5:1), получая спирт 10 (68 мг, 85%) в виде бесцветного масла. [α]D комн.темп= -11,6 (c=1, CHCl); R=0,3 (циклогексан/EtOAc = 4:1); ИК (пленка) γ 3285, 2920, 2851, 1645, 1465, 1253, 1034, 835, 776, 721, 680 см; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 6,27 (д, J=7,8 Гц, 1H), 4,21 (дд, J=11,3, 3,0 Гц, 1H), 4,06 (тд, J=6,5, 3,2 Гц, 1H), 3,91 (т, J=2,8 Гц, 1H), 3,76 (тд, J=6,4, 2,6 Гц, 1H), 3,59 (дд, J=11,3, 3,7 Гц, 1H), 2,24, 2,14 (м, 2H), 1,69-1,45 (м, 4H), 1,45-1,16 (м, 68H), 0,92 (с, 9H), 0,90 (с, 9H), 0,87 (т, J=6,9 Гц, 6H), 0,11 (с, 6H), 0,08 (с, 6H); C ЯМР (126 МГц, CDCl) δ 172,8, 77,6, 76,6, 63,8, 51,4, 37,1, 34,6, 32,1, 30,0, 29,9, 29,8, 29,8, 29,7, 29,6, 29,5, 26,2, 26,1, 26,0, 25,8, 22,8, 18,3, 18,3, 14,3, -3,6, -3,9, -4,4, -4,8; HR ESI Вычислено для CHNOSi [M+Na]: 924,8594 найдено: 924,8604.
В соответствии со способом синтеза соединения 10, исходя из соединения 2, соответственно, получали производные 10a-10o с использованием соответствующих трифенилфосфоний бромидов в реакции соединения 4 до соединения 5 и соответствующих соединений 11 при преобразовании соединений 7 в соединения 8:
соед.
структура
масс спектр
10a
<img file="00000074.jpg" he="33" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>35</sub>H<sub>75</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 631,1544 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 631,1521
10b
<img file="00000075.jpg" he="35" wi="50" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>45</sub>H<sub>95</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 771,4206 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 771,4181
10c
<img file="00000076.jpg" he="39" wi="49" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>38</sub>H<sub>73</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 665,1707 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 665,1733
10d
<img file="00000077.jpg" he="34" wi="57" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>43</sub>H<sub>83</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 735,3038 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 735,3001
10e
<img file="00000078.jpg" he="35" wi="63" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>50</sub>H<sub>97</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 833,4901 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 833,4887
10f
<img file="00000079.jpg" he="36" wi="67" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>56</sub>H<sub>109</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 917,6498 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 917,6528
10g
<img file="00000080.jpg" he="39" wi="54" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>37</sub>H<sub>69</sub>F<sub>2</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 687,1250 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 687,1212
10h
<img file="00000081.jpg" he="34" wi="55" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>47</sub>H<sub>99</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 799,4738 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 799,4791
10i
<img file="00000082.jpg" he="37" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>48</sub>H<sub>101</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 813,5004 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 813,4962
10j
<img file="00000083.jpg" he="32" wi="57" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>50</sub>H<sub>97</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 833,4901 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 833,4913
10k
<img file="00000084.jpg" he="39" wi="57" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>39</sub>H<sub>67</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 671,1338 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 671,1306
10l
<img file="00000085.jpg" he="34" wi="67" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>49</sub>H<sub>87</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 811,4000 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 811,4063
10m
<img file="00000086.jpg" he="35" wi="66" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>57</sub>H<sub>103</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 923,6129 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 923,6097
10n
<img file="00000087.jpg" he="30" wi="54" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>46</sub>H<sub>95</sub>NO<sub>4</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 783,4313 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 783,4281
10o
<img file="00000088.jpg" he="32" wi="64" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>51</sub>H<sub>105</sub>NO<sub>5</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 869,5638 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 869,5604
1-O-Аллил α-D-галактопиранозид (13)
3
2
2
К перемешиваемой суспензии D-галактозы 12 (22,2 г, 123 ммоль) в аллиловом спирте (250 мл) добавляли пара-толуолсульфоновую кислоту (2,3 г, 12,09 ммоль). Смесь нагревали до 100°C и перемешивали в течение 24 часов, после чего охлаждали до комнатной температуры и гасили путем добавления NEt. Растворитель удаляли в вакууме и сырой продукт дважды выпаривали совместно с толуолом и очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент CHCl/MeOH = 9:1→4:1). Перекристаллизация из EtOAc давала галактозид 13 (22,2 г, 88%) в виде белого твердого вещества.
1-O-Аллил 6-O-тритил-α-D-галактопиранозид (14)
2
2
3
f
2
2
max
3
3
25
25
5
-1
1
13
+
1-O-Аллил-галактозид 13 (4 г, 18,2 ммоль) растворяли в пиридине (18 мл). К раствору добавляли тритилхлорид (6,58 г, 23,6 ммоль), и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 часов, после чего растворитель удаляли в вакууме. Сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (CHCl/MeOH = 10:1), получая пиранозид 14 (7,0 г, 83%) в виде бесцветного масла. [α]Dкомн. темп. = +60,0 (c=1, CHCl); R=0,8 (CHCl/MeOH=5:1); ИК (пленка) γ 3402, 2929, 1491, 1449, 1218, 1152, 1070, 1032, 746, 703 см; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,51-7,18 (м, 15H), 5,99-5,88 (м, 1H), 5,25 (ддкв, J=35,9, 10,4, 1,4 Гц, 2H), 4,95 (д, J=3,8 Гц, 1H), 4,25 (ддт, J=12,8, 5,4, 1,4 Гц, 1H), 4,05 (ддт, J=12,8, 6,3, 1,3 Гц, 1H), 3,96 (с, 1H), 3,89 (т, J=20 5,8 Гц, 1H), 3,81 (д, J=5,7 Гц, 1H), 3,75 (д, J=9,8 Гц, 1H), 3,47 (с, 1H), 3,43 (дд, J=9,8, 6,1 Гц, 1H), 3,32 (дд, J=9,8, 5,3 Гц, 1H), 2,86 (д, J=2,1 Гц, 1H), 2,71 (д, J=8,1 Гц, 1H); C ЯМР (75 МГц, CDCl) δ 143,8, 133,7, 128,6, 127,8, 127,1, 117,8, 97,5, 86,9, 71,2, 69,8, 69,5, 69,5, 68,5, 63,3; HR ESI Вычислено для CHO [M+Na]: 485,1935 найдено: 485,1941.
1-O-Аллил 2,3,4-три-O-бензил-6-O-тритил-α-D-галактопиранозид (15)
2
3
4
3
К раствору аллил 6-O-тритил-α/β-D-галактопиранозида 14 (3,7 г, 8,0 ммоль) в ДМФ (32 мл) порциями при комнатной температуре добавляли гидрид натрия (60% в минеральном масле, 1,50 г, 36,0 ммоль). Через 1 час добавляли бензилбромид (4,2 мл, 35,2 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 48 часов, после чего гасили путем добавления MeOH (5 мл). Смесь разбавляли EtO и дважды экстрагировали насыщенным водным раствором NaHCO. Объединенные органические слои промывали водой (3×100 мл) и насыщенным водным раствором NaCl и сушили над MgSO. Растворитель удаляли в вакууме и сырой продукт помещали на слой силикагеля (гексан/EtOAc = 2:1, силикагель нейтрализовали 1% NEt), получая бензиловый эфир 15 (5,5 г) в виде бледно-желтого масла, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
1-O-Аллил 2,3,4-три-O-бензил-α-D-галактопиранозид (16)
2
2
3
2
2
Раствор аллил 2,3,4-три-O-бензил-6-O-тритил-α-D-галактопиранозида 15 (5,00 г, 6,82 ммоль) и триэтилсилана (5,45 мл, 34,1 ммоль) в CHCl (68 мл) охлаждали до 0°C. К перемешиваемому раствору по каплям добавляли трифторуксусную кислоту (2,6 мл, 34,1 ммоль). Через 15 мин смесь гасили насыщенным водным раствором NaHCO и экстрагировали CHCl. Сырой продукт отфильтровывали через слой силикагеля. Все остатки силана и тритила удаляли смесью 10:1 гексан/EtOAc и продукт элюировали EtOAc, получая соединение 16 (3,0 г) в виде бледно-желтого масла, которое использовали без дополнительной очистки в следующей реакции.
1-O-Аллил 6-(6’-азидогексил)-2,3,4-три-O-бензил-α-D-галактопиранозид (17)
2
2
4
2
2
4
3
f
max
3
3
36
45
3
6
-1
1
13
+
К раствору аллил 2,3,4-три-O-бензил-α-D-галактопиранозида 16 (1,0 г, 2,04 ммоль) в ДМФ (10 мл) добавляли гидрид натрия (60% в минеральном масле, 0,12 г, 3,1 ммоль) при 15°C. Через 15 минут смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение следующего 1 часа. Затем добавляли 6-азидогексил 4-метилбензолсульфонат 23 (0,9 г, 3,1 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение следующих 8 часов, после чего смесь гасили путем добавления MeOH (2 мл). После разбавления CHCl добавляли насыщенный водный раствор NHCl и смесь экстрагировали CHCl (3×). Объединенный органический слой промывали водой и насыщенным водным раствором NaCl. Органический слой сушили над MgSO, растворитель удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент гексан/EtOAc = 1:0→1:1), получая азид 17 (1,0 г, 68% за три стадии) в виде бесцветного масла. [α]Dкомн. темп. = +25,4 (c=1, CHCl); R= 0,65 (гексан/EtOAc = 4:1); ИК (пленка) γ 2933, 2863, 25 2094, 1497, 1454, 1358, 1177, 1098, 1059, 926, 816, 736, 697 см; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,94-7,16 (м, 15H), 5,95 (дддд, J=17,1, 10,3, 6,6, 5,2 Гц, 1H), 5,31 (дкв, J=17,2, 1,6 Гц, 1H), 5,21 (ддд, J=10,3, 2,8, 1,1 Гц, 1H), 5,01-4,58 (м, 7H), 4,17 (ддт, J=13,0, 5,2, 1,4 Гц, 1H), 4,09-3,99 (м, 3H), 3,98-3,90 (м, 2H), 3,50-3,18 (м, 6H), 1,72-1,47 (м, 4H), 1,44-1,30 (м, 4H); C ЯМР (75 МГц, 30 CDCl) δ 138,9, 138,8, 138,6, 134,0, 129,8, 128,3, 128,3, 128,2, 128,1, 128,0, 127,9, 127,6, 127,5, 127,4, 117,9, 96,3, 79,1, 76,5, 75,3, 74,7, 73,3, 73,3, 71,3, 70,3, 69,5, 69,4, 68,2, 51,4, 51,2, 29,6, 28,8, 28,7, 28,6, 26,6, 26,1, 25,7, 25,0, 21,6. HR ESI Вычислено для CHNO [M+Na]: 638,3201 найдено: 638,3229.
Соединения, представленные ниже, получали согласно способу синтеза, показанного выше, с соответствующими соединениями 23 с выходами от умеренных до высоких:
соед.
структура
масс спектр
17a
<img file="00000089.jpg" he="39" wi="67" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>38</sub>H<sub>50</sub>N<sub>3</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 693,8278 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 693,8241
17b
<img file="00000090.jpg" he="45" wi="73" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>36</sub>H<sub>46</sub>N<sub>3</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 617,7764 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 617,7721
17c
<img file="00000091.jpg" he="38" wi="62" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>34</sub>H<sub>42</sub>N<sub>3</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 589,7231 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 589,7274
17d
<img file="00000092.jpg" he="40" wi="63" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>42</sub>H<sub>58</sub>N<sub>3</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 701,9361 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 701,9400
17e
<img file="00000093.jpg" he="43" wi="81" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>38</sub>H<sub>50</sub>N<sub>3</sub>S<sub>2</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 709,9618 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 709,9651
17f
<img file="00000094.jpg" he="40" wi="59" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>32</sub>H<sub>38</sub>N<sub>3</sub>S<sub>2</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 625,8021 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 625,7996
6-(6’-Азидогексил)-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-галактопираноза (18)
2
f
max
3
3
33
41
3
6
-1
13
+
Аллил 6-(6’-азидогексил)-2,3,4-три-O-бензил-α-D-галактопиранозид 17 (1,4 г, 2,3 ммоль) растворяли в MeOH (16 мл), и к раствору при комнатной температуре добавляли PdCl (0,21 г, 1,17 ммоль). Смесь перемешивали в течение 4 часов, после чего смесь фильтровали через целит, и растворитель удаляли в вакууме. Сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии (градиент гексан/EtOAc = 1:0→1:1), получая лактол 18 (1,2 г, 88%) в виде бесцветного масла. R = 0,50 (гексан/EtOAc = 2:1); ИК (пленка) γ3414, 2933, 2862, 2093, 1454, 1255, 1060, 910, 733, 696 см; 110 H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,45-7,20 (м, 30H), 5,33-5,27 (м, 1H), 5,01-4,90 (м, 3H), 4,85-4,71 (м, 7H), 4,66 (ддд, J=16,7, 11,5, 6,0 Гц, 3H), 4,18-4,09 (м, 1H), 4,05 (дд, J=9,2, 3,6 Гц, 1H), 3,96 (с, 2H), 3,93 (д, J=2,8 Гц, 1H), 3,88 (д, J=2,8 Гц, 1H), 3,78 (дд, J=9,6, 7,5 Гц, 1H), 3,63-3,52 (м, 3H), 3,52-3,37 (м, 5H), 3,37-3,28 (м, 2H), 3,28-3,21 (м, 5H), 1,65-1,49 (м, 8H), 1,42-1,24 (м, 8H); C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 138,8, 138,7, 138,5, 138,4, 128,5, 128,5, 128,4, 128,3, 128,3, 128,3, 128,3, 128,1, 127,9, 127,7, 127,7, 127,7, 127,6, 127,6, 97,9, 92,0, 82,3, 80,9, 78,8, 76,7, 75,2, 74,9, 74,8, 74,7, 73,8, 73,7, 73,6, 73,1, 73,1, 71,5, 71,4, 69,6, 69,6, 69,5, 51,5, 29,5, 28,9, 26,6, 25,8; HR ESI Вычислено для CHNO [M+Na]: 598,2883 найдено: 598,2869.
Соединения, представленные ниже, получали согласно способу синтеза, показанного выше, с соответствующими соединениями 17 в среднем с хорошими выходами:
соед.
структура
масс спектр
18a
<img file="00000095.jpg" he="38" wi="70" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>35</sub>H<sub>46</sub>N<sub>3</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 653,7638 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 653,7601
18b
<img file="00000096.jpg" he="45" wi="72" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>33</sub>H<sub>42</sub>N<sub>3</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 577,7124 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 577,7193
18c
<img file="00000097.jpg" he="33" wi="63" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>31</sub>H<sub>38</sub>N<sub>3</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 549,6592 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 549,6556
18d
<img file="00000098.jpg" he="33" wi="59" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>39</sub>H<sub>54</sub>N<sub>3</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 661,8721 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 661,8791
18e
<img file="00000099.jpg" he="38" wi="75" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>35</sub>H<sub>46</sub>N<sub>3</sub>S<sub>2</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 669,8978 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 669,9003
18f
<img file="00000100.jpg" he="35" wi="62" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>29</sub>H<sub>34</sub>N<sub>3</sub>S<sub>2</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 585,7381 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 585,7323
6-(6’-Азидогексил)-2,3,4-три-O-бензил-β-D-галактопиранозил N-фенил трифторацетамидат (19)
2
2
2
2
3
f
max
3
3
41
45
3
4
6
-1
1
13
+
К раствору 6-(6’-азидогексил)-2,3,4-три-O-бензил-α/β-D-галактопиранозы 18 (400 мг, 0,70 ммоль) в CHCl (7 мл) добавляли карбонат цезия (340 мг, 1,04 ммоль). К смеси добавляли хлорид 2,2,2-трифтор-N-фенилацетимидоила 24 (216 мг, 1,04 ммоль), и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3,5 часов, после чего ее фильтровали через целит и промывали CHCl. Растворитель удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент гексан/EtOAc = 10:1→1:1) давая имидат 19 (490 мг, 94%) в виде бесцветного масла. [α]Dкомн. темп. = +60,8 (c=0,4, CHCl); R = 0,80 (гексан/EtOAc = 2:1); ИК (пленка) γ 3064, 2934, 2865, 2094, 1717, 1598, 1454, 1321, 1207, 1099, 1027, 910, 734, 696 см; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,45-6,60 (м, 20H), 5,56 (с, 1H), 4,90 (д, J=11,5 Гц, 1H), 4,75 (с, J=1,5 Гц, 2H), 4,68 (с, J=12,4 Гц, 2H), 4,58 (д, J=11,6 Гц, 1H), 4,00 (т, J=8,7 Гц, 1H), 3,84 (д, J=2,4 Гц, 1H), 3,58-3,39 (м, 4H), 3,34 (дт, J=9,3, 6,5 Гц, 1H), 3,23 (дт, J=9,3, 6,5 Гц, 1H), 3,14 (т, J=6,9 Гц, 2H), 1,52-1,38 (м, 4H), 1,32, 1,16 (м, 4H); C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 138,6, 138,3, 138,2, 128,8, 128,6, 128,5, 128,4, 128,4, 128,3, 128,0, 127,9, 127,8, 127,7, 124,3, 119,4, 82,3, 78,3, 77,4, 77,2, 76,8, 75,7, 74,9, 74,6, 73,4, 73,2, 71,4, 68,7, 51,5, 29,7, 28,9, 26,7, 25,8; HR ESI Вычислено для CHFNO [M+Na]: 769,3183 найдено: 769,3239.
Соединения, представленные ниже, получали согласно способу синтеза, показанного выше, с соответствующими соединениями 17 в среднем с выходами от умеренных до хороших:
соед.
структура
масс спектр
19a
<img file="00000101.jpg" he="50" wi="61" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>43</sub>H<sub>50</sub>F<sub>3</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 824,8834 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 824,8804
19b
<img file="00000102.jpg" he="56" wi="65" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>41</sub>H<sub>46</sub>F<sub>3</sub>N<sub>4</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 748,8320 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 748,8299
19c
<img file="00000103.jpg" he="48" wi="58" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>39</sub>H<sub>42</sub>F<sub>3</sub>N<sub>4</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 720,7788 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 720,7712
19d
<img file="00000104.jpg" he="47" wi="60" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>47</sub>H<sub>58</sub>F<sub>3</sub>N<sub>4</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 832,9917 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 832,9977
19e
<img file="00000105.jpg" he="54" wi="78" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>43</sub>H<sub>50</sub>F<sub>3</sub>N<sub>4</sub>S<sub>2</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 841,0174 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 841,0108
19f
<img file="00000106.jpg" he="50" wi="57" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>37</sub>H<sub>38</sub>F<sub>3</sub>N<sub>4</sub>S<sub>2</sub>O<sub>6</sub>Вычисл.: 756,8577 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 756,8506
6-Гидрогексил 4-метилбензолсульфонат (21)
2
2
f
max
3
3
13
20
4
-1
1
13
+
К раствору гексан-1,6-диола 20 (10,0 г, 85 ммоль) в CHCl (200 мл) при 5°С в течение 15 мин добавляли 4-метилбензол-1-сульфонилхлорид (17,8 г, 93 ммоль) растворенный в пиридине (100 мл). Реакционная смесь нагревалась до комнатной температуры в течение периода 5 часов. Растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на кремнеземе (градиент гексан/EtOAc = 1:0→1:1), получая монотозилированный гександиол 21 (6,5 г, 28%) в виде бесцветного масла. R=0,55 (гексан/EtOAc = 1:1); ИК (пленка) γ 3381, 2935, 2862, 1598, 1461, 1352, 1172, 959, 921, 813, 661 см; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,76-7,71 (м, 2H), 7,29 (дт, J=4,3, 1,2 Гц, 2H), 3,97 (т, J=6,5 Гц, 2H), 3,55 (т, J=6,5 Гц, 2H), 2,40 (с, 3H), 1,65-1,56 (м, 2H), 1,55 (с, 1H), 1,52-1,41 (м, 2H), 1,36-1,18 (м, 4H); C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 144,7, 133,1, 129,8, 127,8, 70,5, 62,6, 32,4, 28,7, 25,1, 25,0, 21,6; HR ESI Вычислено для CHOS [M+Na]: 295,0975 найдено: 295,0968.
6-Азидогексан-1-ол (22)
2
2
4
f
max
3
3
6
13
3
-1
1
13
+
6-Гидроксигексил 4-метилбензолсульфонат 21 (4,3 г, 15,79 ммоль) растворяли в ДМФ (23 мл) и добавляли азид натрия (1,75 г, 26,8 ммоль). Смесь нагревали до 55°C и через 16 часов охлаждали до комнатной температуры и разбавляли водой (150 мл). Смесь три раза экстрагировали CHCl и промывали насыщенным водным раствором NaCl. Органический слой сушили над MgSO, и растворители удаляли в вакууме. Сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент гексан/EtOAc=1:0→1:1), получая 6-азидогексан-1-ол 22 (2,2 г, 97%) в виде бесцветного масла. R=0,50 (гексан/EtOAc=2:1); ИК (пленка) γ 3329, 2935, 2891, 2090, 1256, 1349, 1258, 1055, 910, 731 см; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 3,63 (т, J=6,5 Гц, 2H), 3,25 (т, J=6,9 Гц, 2H), 1,64-1,51 (м, 4H), 1,43-1,32 (м, 4H); C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 62,8, 51,5, 32,6, 28,9, 26,6, 25,4; HR ESI Вычислено для CHNO [M+Na]: 166,0951 найдено: 166,0945.
6-Азидогексил 4-метилбензолсульфонат (23)
2
2
4
f
max
3
3
13
19
3
3
-1
1
13
+
К раствору 6-азидогексан-1-ола 22 (2,7 г, 18,9 ммоль) в пиридине (70 мл) добавляли 4-метилбензол-1-сульфонилхлорид (4,0 г, 21,0 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 5 часов при комнатной температуре, после чего растворитель удаляли в вакууме, и сырой продукт растворяли в CHCl, промывали водой и сушили над MgSO. Растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на силикагеле (градиент гексан/EtOAc=1:0→1:1), получая азид 23 (5,0 г, 89%) в виде бесцветного масла. R=0,50 (гексан/EtOAc=3:1); ИК (пленка) γ2938, 2863, 2092, 1598, 1455, 1356, 1258, 1174, 1097, 956, 919, 813, 724, 662 см; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ; 7,85-7,67 (м, 2H), 7,33 (дд, J=8,5, 0,6 Гц, 2H), 4,01 (т, J=6,4 Гц, 2H), 3,21 (т, J=6,9 Гц, 2H), 2,43 (с, 3H), 1,71-1,57 (м, 2H), 1,52 (дд, J=9,1, 4,9 Гц, 2H), 1,38-1,12 (м, 4H); C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 144,8, 133,2, 129,9, 127,9, 70,4, 51,3, 28,7, 28,7, 26,1, 25,0, 21,7; HR ESI Вычислено для CHNOS [M+Na]: 320,1045 найдено: 320,1057.
Согласно способу синтеза, представленному выше, для соединений 20 в соединения 23 различные исходные материалы подвергали обработке и успешно превращали в соответствующие соединения 23. Для данных синтезов тетраэтиленгликоль закупали у фирмы Merck, Германия; 2-(4-(2-гидроксиэт-1-ил)фенил)этанол закупали у фирмы Sigma Aldrich; 2-метил-1,3-пропанол закупали у фирмы Sigma Aldrich; додекандиол закупали у фирмы Sigma Aldrich; 2-метилпропан-1,3-бис(2-гидроксиэтилсульфид) получали согласно способу, описанному в US2012/0295228.
соед.
структура
масс спектр
23a
<img file="00000107.jpg" he="15" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>15</sub>H<sub>23</sub>N<sub>3</sub>SO<sub>6</sub>Вычисл.: 374,4344 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 374,4388
23b
<img file="00000108.jpg" he="23" wi="61" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>17</sub>H<sub>19</sub>N<sub>3</sub>SO<sub>3</sub>Вычисл.: 346,4259 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 346,4212
23c
<img file="00000109.jpg" he="17" wi="39" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>11</sub>H<sub>15</sub>N<sub>3</sub>SO<sub>3</sub>Вычисл.: 270,3297 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 270,3229
23d
<img file="00000110.jpg" he="17" wi="34" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>19</sub>H<sub>31</sub>N<sub>3</sub>SO<sub>3</sub>Вычисл.: 382,5426 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 382,5461
23e
<img file="00000111.jpg" he="22" wi="71" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>15</sub>H<sub>23</sub>N<sub>3</sub>S<sub>3</sub>O<sub>3</sub>Вычисл.: 390,5683 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 390,5662
23f
<img file="00000112.jpg" he="15" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>9</sub>H<sub>11</sub>N<sub>3</sub>S<sub>3</sub>O<sub>3</sub>Вычисл.: 306,4086 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 306,4041
(2S,3S,4R)-3,4-Бис-трет-бутилдиметилсилилокси-2-гексакозаноиламино-1-(6-(6’-азидогексил)-2,3,4-три-O-бензил)-α-D-галактопиранозил)октадекан (25)
2
3
D
3
f
max
3
3
89
156
4
9
2
комн. темп.
-1
1
13
+
Нуклеофил 10 (156 мг, 0,169 ммоль) и гликозилирующий агент 19 (189 мг, 0,253 ммоль) совместно выпаривали с толуолом три раза и сушили при высоком вакууме в течение 3 часов, после чего растворяли в EtO (2 мл) и ТГФ (0,4 мл) и охлаждали до -40°C. К смеси добавляли TMSOTf (9,0 мкл, 0,051 ммоль) и раствор подогревали до -10°C в течение 3 часов. Реакцию гасили путем добавления NEt (0,05 мл), и растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на кремнеземе (градиент гексан/EtOAc=10:1→4:1), получая гликозид 25 (180 мг, 72% α-аномер) в виде белой пены. [α]=+18,9 (c=1, CHCl); R=0,46 (гексан/EtOAc=6,5:1); ИК (пленка) γ 3328, 2925, 2854, 2096, 1731, 1656, 1452, 1348, 1246, 1156, 1099, 1058, 835, 777, 696 см; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,64-7,09 (м, 15H), 6,07 (д, J=7,1 Гц, 1H), 4,94 (д, J=11,5 Гц, 1H), 4,82 (д, J=3,7 Гц, 1H), 4,80-4,56 (м, 5H), 4,09 (тд, J=7,6, 4,2 Гц, 1H), 4,03 (дд, J=10,1, 3,6 Гц, 1H), 3,97-3,85 (м, 5H), 3,82 (дд, J=10,9, 8,2 Гц, 1H), 3,66-3,61 (м, 1H), 3,50-3,42 (м, 1H), 3,38 (ддд, J=13,6, 8,1, 6,2 Гц, 2H), 3,29 (дт, J=9,4, 6,8 Гц, 1H), 3,22 (т, J=6,9 Гц, 2H), 1,99 (дд, J=16,6, 9,2 Гц, 2H), 1,60-1,45 (м, 8H), 1,39-1,15 (м, 70H), 0,91-0,84 (м, 26H), 0,06 (с, 3H), 0,05 (с, 3H), 0,02 (с, 6H), C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 173,2, 138,6, 138,5, 138,0, 128,6, 128,6, 128,4, 128,3, 128,3, 128,1, 127,8, 127,8, 127,6, 99,3, 79,5, 76,4, 76,2, 74,9, 74,6, 74,4, 73,5, 72,9, 71,56, 70,1, 70,0, 69,4, 51,5, 49,6, 36,9, 33,5, 32,1, 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,6, 29,5, 29,5, 28,9, 26,7, 26,1, 25,9, 25,9, 22,8, 14,3; HR ESI Вычислено для CHNOSi [M+Na]: 1505,1333 найдено: 1505,1388.
Соединения 25с-h представленные ниже получали согласно способу синтеза, показанного выше, с соответствующими соединениями 10 и 19 в среднем с выходами от умеренных до хороших:
соед.
структура
масс спектр
25с
<img file="00000113.jpg" he="55" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>70</sub>H<sub>119</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>S<sub>2</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 1282,0290 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1282,0317
25d
<img file="00000114.jpg" he="57" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>76</sub>H<sub>123</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 1293,9930 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1293,9903
25e
<img file="00000115.jpg" he="45" wi="83" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>84</sub>H<sub>131</sub>N<sub>4</sub>O<sub>12</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 1446,1406 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1446,1458
25f
<img file="00000116.jpg" he="48" wi="94" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>80</sub>H<sub>137</sub>N<sub>4</sub>O<sub>10</sub>S<sub>2</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 1436,2787 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1436,2744
25g
<img file="00000117.jpg" he="51" wi="88" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>68</sub>H<sub>105</sub>F<sub>2</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 1217,7610 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1217,7588
25h
<img file="00000118.jpg" he="50" wi="84" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>85</sub>H<sub>147</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 1426,2802 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1426,2826
(2S,3S,4R)-2-Гексакозаноиламино-1-(6-(6’-азидогексил)-2,3,4-три-O-бензил-α-D-галактопиранозил)октадекан-3,4-диол (26)
2
2
D
3
f
max
3
3
77
128
4
9
комн. темп.
-1
1
13
+
К раствору бис-TBS эфира 25 (16,0 мг, 10,8 мкмол) в ТГФ (1 мл) медленно добавляли раствор TBAF (1 M в ТГФ, 0,150 мл, 0,15 ммоль). Через 3,5 часа реакционную смесь разбавляли CHCl (10 мл). Растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флэш хроматографии на кремнеземе (градиент гексан/EtOAc=1:0→1:1), получая диол 26 (105 мг, 78%) в виде светлого масла. [α]=+121,9 (c=0,2, CHCl); R=0,40 (гексан/EtOAc=2:1); ИК (пленка) γ 3329, 2919, 2851, 2096, 1640, 1543, 1467, 1455, 1350, 1094, 1046, 907, 730, 696 cм; H ЯМР (400 МГц, CDCl) δ 7,58-7,08 (м, 15H), 6,37 (д, J=8,4 Гц, 1H), 4,94 (д, J=11,4 Гц, 1H), 4,88 (д, J=11,6 Гц, 1H), 4,85 (д, J=3,8 Гц, 1H), 4,82-4,73 (м, 2H), 4,68 (д, J=11,6 Гц, 1H), 4,60 (д, J=11,5 Гц, 1H), 4,22 (д кв, J=6,8, 3,3 Гц, 1H), 4,05 (дд, J=10,0, 3,8 Гц, 1H), 3,95 (д, J=1,8 Гц, 1H), 3,88 (д, J=2,7 Гц, 2H), 3,87-3,75 (м, 2H), 3,55-3,36 (м, 5H), 3,31 (дт, J=9,4, 6,7 Гц, 1H), 3,25 (т, J=6,9 Гц, 2H), 2,20- 2,11 (м, 3H), 1,70-1,44 (м, 8H), 1,41-1,17 (м, 73H), 0,88 (т, J=6,9 Гц, 6H); C ЯМР (101 МГц, CDCl) δ 173,2, 138,6, 138,5, 130,0, 128,6, 128,6, 128,4, 128,3, 128,2, 128,1, 127,8, 127,8, 127,6, 99,3, 79,5, 76,4, 76,2, 74,9, 74,6, 74,4, 73,5, 72,9, 71,6, 70,1, 70,0, 69,4, 51,5, 49,6, 36,9, 33,5, 32,1, 29,9, 29,8, 29,7, 29,6, 29,6, 29,5, 29,5, 28,9, 26,7, 26,1, 25,9, 25,9, 22,8, 14,3; HR ESI Вычислено для CHNO [M+Na]:
1275,9574 найдено: 1275,9536.
Соединения 26с-h, представленные ниже, получали согласно способу синтеза соединения 26 в среднем с выходами от умеренных до высоких:
соед.
структура
масс спектр
26с
<img file="00000119.jpg" he="53" wi="73" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>58</sub>H<sub>91</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>S<sub>2</sub>Вычисл.: 1053,5070 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1053,5046
26d
<img file="00000120.jpg" he="61" wi="84" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>64</sub>H<sub>95</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 1065,4710 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1065,4677
26e
<img file="00000121.jpg" he="47" wi="86" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>72</sub>H<sub>103</sub>N<sub>4</sub>O<sub>12</sub>Вычисл.: 1217,6187 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1217,6203
26f
<img file="00000122.jpg" he="47" wi="90" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>68</sub>H<sub>109</sub>N<sub>4</sub>O<sub>10</sub>S<sub>2</sub>Вычисл.: 1207,7567 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1207,7532
26g
<img file="00000123.jpg" he="49" wi="75" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>56</sub>H<sub>77</sub>F<sub>2</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 989,2390 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 989,2371
26h
<img file="00000124.jpg" he="51" wi="81" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>73</sub>H<sub>119</sub>N<sub>4</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 1197,7582 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1197,7614
(2S,3S,4R)-1-(6-(6’-Аминогексил)-α-D-галактопиранозил)-2-гексакозаноиламинооктадекан-3,4-диол (27)
2
2
2
2
2
2
D
f
2
2
max
56
112
2
9
комн. темп.
-1
1
13
+
К раствору диола 26 (55 мг, 0,044 ммоль) в EtOH (0,5 мл) и хлороформа (0,15 мл) добавляли Pd(OH) на угле (10% масс/масс, влажный 38 мг). Раствор перемешивали при комнатной температуре в атмосфере Ar в течение 15 минут, после чего в суспензию барботировали газообразный H, и смесь гидрировали в течение 12 час. Смесь фильтровали через целит и тщательно промывали CHCl, ТГФ и MeOH. Растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флэш хроматографии на силикагеле (CHCl/MeOH=4:1), получая снабженный линкером GSL 27 (38 мг, 90%) в виде бледно-желтого порошка. [α]=+66,1 (c=1,0, пиридин); R=0,44 (CHCl/MeOH=4:1); ИК (пленка) γ 3292, 2918, 2850, 1640, 1539, 1468, 1304, 1073, 1038, 970, 721 см; H ЯМР (400 МГц, d-pyr) δ 8,66 (д, J=8,6 Гц, 1H), 5,48 (д, J=3,8 Гц, 1H), 4,59 (дд, J=10,6, 5,9 Гц, 1H), 4,49 (дд, J=9,7, 3,8 Гц, 1H), 4,39-4,15 (м, 1H), 3,91 (ддд, J=15,3, 10,4, 5,9 Гц, 1H), 3,74 (кв, J=7,0 Гц, 1H), 3,44-3,31 (м, 2H), 3,17 (дд, J=13,1, 5,2 Гц, 2H), 2,42 (т, J=6,6 Гц, 2H), 2,17 (с, 1H), 1,89 (с, 2H), 1,84-1,65 (м, 4H), 1,65-0,97 (м, 75H), 0,75 (т, J=6,7 Гц, 6H); C ЯМР (101 МГц, d-pyr) δ 171,9, 99,7, 75,5, 70,9, 70,1, 70,0, 69,6, 68,7, 66,7, 55,9, 49,9, 38,4, 35,4, 33,1, 30,7, 30,7, 29,0, 28,8, 28,6, 28,6, 28,6, 28,6, 28,5, 28,5, 28,4, 28,4, 28,2, 28,2, 26,8, 25,3, 25,1, 25,1, 24,7, 21,5, 17,8, 12,9; IR ESI Вычислено для CHNO [M+H]: 957,8441 найдено: 957,8468.
Соединения 27с-h, представленные ниже, получали согласно способу синтеза соединений 27 в среднем с выходами от умеренных до высоких:
соед.
структура
масс спектр
27с
<img file="00000125.jpg" he="54" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>37</sub>H<sub>75</sub>N<sub>2</sub>O<sub>9</sub>S<sub>2</sub>Вычисл.: 757,1410 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 757,1437
27d
<img file="00000126.jpg" he="62" wi="78" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>43</sub>H<sub>79</sub>N<sub>2</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 769,1050 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 769,1078
27e
<img file="00000127.jpg" he="52" wi="92" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>51</sub>H<sub>87</sub>N<sub>2</sub>O<sub>12</sub>Вычисл.: 921,2527 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 921,2500
27f
<img file="00000128.jpg" he="49" wi="94" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>47</sub>H<sub>93</sub>N<sub>2</sub>O<sub>10</sub>S<sub>2</sub>Вычисл.: 911,3907 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 911,3934
27g
<img file="00000129.jpg" he="49" wi="78" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>35</sub>H<sub>61</sub>F<sub>2</sub>N<sub>2</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 692,8730 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 692,8707
27h
<img file="00000130.jpg" he="47" wi="79" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>52</sub>H<sub>103</sub>N<sub>2</sub>O<sub>9</sub>Вычисл.: 901,3922 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 901,3958
2,3-Ди-O-бензил-4,6-O-бензилиден-D-галактозу (33) получали согласно ChemBioChem 2012, 1349.
2,3-Ди-O-бензил-4,6-O-бензилиден-α-D-галактозил трифторацетимидат (34)
2
2
2
2
35
32
3
6
+
К раствору 2,3-ди-O-бензил-4,6-O-бензилиден-D-галактозы (800 мг, 1,786 ммоль, выпаренному 3 раза совместно с сухим толуолом) 33 в CHCl (7 мл) добавляли карбонат цезия (867 мг, 2,65 ммоль). К смеси добавляли 2,2,2-трифтор-N-фенилацетамидоилхлорид 24 (551 мг, 2,65 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре на протяжении ночи, после чего ее фильтровали через целит и промывали CHCl. Растворитель удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флэш хроматографии на силикагеле градиент гексан/EtOAc = 8:1→1:1), получая имидат 34 (1,02 г, 92%) в виде бесцветного масла. HR ESI Вычислено для CHFNO [M+H]: 620,6362 найдено 620,6327.
(2S,3S,4R)-3,4-Бис-трет-бутилдиметилсилилокси-2-гексакозаноиламино-1-(2,3-ди-O-бензил-4,6-O-бензилиден-α-D-галактопиранозил)-октадекан (35)
2
3
83
143
9
2
+
Нуклеофил 10 (150 мг, 0,162 ммоль) и гликозилирующий агент 34 (151 мг, 0,243 ммоль) выпаривали совместно с толуолом три раза и сушили в глубоком вакууме в течение 3 часов, после чего растворяли в EtO (2 мл) и ТГФ (0,4 мл) и охлаждали до -40°С. К смеси добавляли TMSOTf (8,0 мкл, 0,043 ммоль), и раствор подогревали до -10°С в течение 3 часов. Реакционную смесь гасили добавлением NEt (0,05 мл, и растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флэш хроматографии на кремнеземе (градиент гексан/EtOAc=10:1→4:1), получая гликозид 35 (140 мг, 64% α-аномер) в виде белого масла. HR ESI Вычислено для CHNOSi [M+H]: 1356,2067 найдено: 1356,2098.
(2S,3S,4R)-3,4-Бис-трет-бутилдиметилсилилокси-2-гексакозаноиламино-1-(2,3,4-три-O-бензил-6-гидрокси-α-D-галактопиранозил)октадекан (36)
2
2
3
3
2
4
83
145
9
2
+
К раствору соединения 35 (80 мг, 0,06 ммоль) в безводном CHCl (2 мл) в атмосфере аргона добавляли трифлат меди(II) (2 мг, 0,006 ммоль) и BH·ТГФ (0,30 мл, 0,30 ммоль). После перемешивания в течение 2 часов при комнатной температуре желтую реакционную смесь гасили метанолом. Впоследствии смесь разбавляли EtOAc и промывали насыщенным NaHCO, водой и солевым раствором. Органический слой сушили над NaSO, и растворитель удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флеш хроматографии на кремнеземе (градиент гексан/EtOAc: 8,5/1,5), получая гликозид 36 (62 мг, 78%) в виде желтоватой пены. HR ESI Вычислено для CHNOSi [M+H]: 1358,2226 найдено: 1358,2196.
Вос-защищенное PEG производное 38 закупали у фирмы Creative PEGWorkс, Winston Salen, NC, США.
(2S,3S,4R)-3,4-Бис-трет-бутилдиметилсилилокси-2-гексакозаноил-амино-1-(2,3,4-три-O-бензил-6-(карбонил-1-этил-2-(три(1-этаноил)1-этаноил-2-(трет-бутокси-карбонил)амино-α-D-галактопиранозил)октадекан (37)
2
2
3
4
99
174
2
16
2
+
К раствору соединения 38 (18 мг, 0,05 ммоль) в ДМФ (5 мл) добавляли тетрафторборат O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетрабутилурония TBTU (16,1 мг, 0,05 ммоль) и диизопропилэтиламин (12,9 мг, 17 мкл, 0,1 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Затем смесь соединения 36 (50 мг, 0,04 ммоль) в ДМФ (1 мл) добавляли к реакционной смеси и перемешивали в течение 5 часов. Впоследствии реакционную смесь разбавляли CHCl (15 мл) и получающуюся смесь промывали 5% HCl (2×3 мл), 1M NaHCO (3×3 мл) и водой (2×3 мл). Органический слой собирали, сушили (MgSO), фильтровали и концентрировали, получая сырой сложноэфирный продукт, который очищали с помощью колоночной флэш хроматографии на силикагеле (градиент гексан/EtOAc=8:1→1:1), получая снабженный линкером гликолипид 37 (40 мг, 63%) в виде бесцветного масла. HR ESI Вычислено для CHNOSi [M+H]: 1705,6272 найдено: 1705,6231.
Моно-трет-бутилсубериновую кислоту получали согласно Chem. Commun. 1999, 823.
Соединение 37-а получали согласно представленному выше способу реакции с 53% выходом:
соед.
структура
масс спектр
39
<img file="00000131.jpg" he="60" wi="84" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>95</sub>H<sub>167</sub>NO<sub>12</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 1572,5243 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1572,5216
(2S,3S,4R)-3,4-Бис-третбутилдиметилсилилокси-2-гексакозаноиламино-1-(2,3,4-три(O-бензил-6-(карбонил-1-этил-2-(три(1-этаноил)1-этаноил-2-амино)-α-D-галактопиранозил)октадекан (25a)
2
2
3
2
2
2
4
94
166
2
14
2
+
Соединение 37 (40 мг, 0,02 ммоль) растворяли в ТФУ (1 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Раствор разбавляли CHCl (2 мл) и затем осторожно нейтрализовали (до pH ~8) насыщенным водным раствором NaHCO (8 мл). Добавляли дополнительный CHCl, и органический слой сушили над NaSO, и растворитель удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флэш хроматографии на кремнеземе (градиент гексан/EtOAc: 10:1→1:1), получая снабженный линкером гликолипид 25a (33 мг, 89%) в виде желтоватого масла. HR ESI Вычислено для CHNOSi [M+H]: 1605,5112 найдено: 1605,5088.
Соединение 25b получали соответственно из соединения 39:
соед.
структура
масс спектр
25b
<img file="00000132.jpg" he="59" wi="79" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>91</sub>H<sub>159</sub>NO<sub>12</sub>Si<sub>2</sub>Вычисл.: 1516,4179 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1516,4223
(2S,3S,4R)-2-Гексакозаноиламино-1-(2,3,4-три-O-бензил-6-(карбонил-1-этил-2-(три(1-этаноил)1-этаноил-2-амино)-α-D-галактопиранозил)октадекан-3,4-диол (26a)
2
2
82
138
2
14
К раствору бис-TBS эфира 25a (33,0 мг, 20,7 мкмоль) в ТГФ (1 мл) медленно добавляли раствор TBAF (1 M в ТГФ, 0,150 мл, 0,15 ммоль). Через 3,5 часа реакционную смесь разбавляли CHCl (10 мл). Растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью флэш хроматографии на колонке с кремнеземом (градиент гексан/EtOAc=1:0→1:1) получая диол 26a (24,5 мг, 86%) в виде светлого масла. HR ESI Вычислено для CHNO [M+H+]: 1376,9893 найдено: 1376,9876.
Соединение 26b получали соответственно из соединения 25b:
соед.
структура
масс спектр
26b
<img file="00000133.jpg" he="63" wi="83" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>79</sub>H<sub>131</sub>NO<sub>12</sub>Вычисл.: 1287,8959 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1287,8914
(2S,3S,4R)-1-(6-(Карбонил-1-этил-2-(три(1-этаноил)1-этаноил-2-амино)-α-D-галактопиранозил)-2-гексакозаноиламинооктадекан-3,4-диол (27a)
2
2
2
2
2
61
120
2
14
+
К раствору диола 26a (25 мг, 17,7 мкмоль) в EtOH (0,5 мл) и хлороформа (0,15 мл) добавляли Pd(OH) на угле (10% масс/масс, влажный 35 мг). Раствор перемешивали при комнатной температуре в атмосфере Ar в течение 15 минут, после чего в суспензию пропускали водородный газ, и смесь гидрировали в течение 12 час. Смесь фильтровали через целит и тщательно промывали CHCl, ТГФ и MeOH. Растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью колоночной флэш хроматографии на силикагеле (CHCl/MeOH=4:1), получая снабженный линкером GSL 27a (18 мг, 92%) в виде бесцветного масла. HR ESI Вычислено для CHNO [M+H]: 1106,6209 найдено: 1106,6177.
Соединение 27b получали соответственно из соединения 26b:
соед.
структура
масс спектр
27b
<img file="00000134.jpg" he="62" wi="77" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>58</sub>H<sub>113</sub>NO<sub>12</sub>Вычисл.: 1017,5275 [M+H<sup>+</sup>]Найдено: 1017,5231
5-((6-(((2R,3R,4S,5R,6S)-6-(((2S,3S,4R)-2-Гексакозанамидо-3,4-дигидроксиоктадецил)окси)-3,4,5-тригидрокситетрагидро-2H-пиран-2-ил(метокси)гексил)амино)-5-оксопентановая кислота (40)
К гликолипиду 27 (10 мг, 10,44 мкмоль) в смеси хлороформ:метанол:триэтиламин (1:1:0,1, 7 мл) порциями добавляли избыток глутарового ангидрида (14,9 мг, 131 мкмоль) и оставляли перемешиваться при комнатной температуре. Спустя три для после завершения реакции данные LCMS указывала на исчезновение исходного материала. Реакционную смесь затем выпаривали досуха, и получающийся остаток растирали с дихлорметаном, что давало желаемый продукт 40 (8 мг, 72%) в виде белого твердого вещества.
соед.
структура
масс спектр
40
<img file="00000135.jpg" he="47" wi="86" img-content="undefined" img-format="jpg" />
C<sub>61</sub>H<sub>118</sub>N<sub>2</sub>O<sub>12</sub>Вычисл.: 1069,861 [M-2H<sup>+</sup>]Найдено: 1069,642
Синтез антигенуглеводного гликолипидного конъюгата:
PS4 (1 мг) растворяли в водном растворе NaOH (pH 10,95) до конечной концентрации 10 мг/мл. PS4 активировали 15 мкл цианбромида (10 мг/мл в ацетонитриле) и оставляли перемешиваться при комнатной температуре в течение 10 мин. К активированному PS4 добавляли 20 мкл соединения 27 (10 мг/2 мл в ДМСО:ТГФ, 1:1), и смесь инкубировали в течение 18 часов при комнатной температуре. После доведения рН до 6 0,1М водным HCl смесь подвергали диализу (12-14k MWCO) против дважды дистиллированной воды, концентрировали с помощью ультрафильтрации (10k MWCO) и затем лиофилизовали.
Соединения 27a и 27c-h подвергали сопряжению с PS4, соответственно, и они также показали иммуногенную активность.
2
2
4
max
13
25
8
1
13
+
Сложный метиловый эфир 4,57 (предоставленный Др. M. Oberli) (10 мг, 0,018 ммоль) растворяли в смеси ТГФ (1,0 мл) и NaOH (0,1 М, 1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа, после чего нейтрализовали добавлением смолы амберлит ИК-120 (H+). Смолу удаляли фильтрованием, и растворители удаляли в вакууме. Сырой продукт очищали с помощью хроматографии на силикагеле (20% MeOH в CHCl), получая белый порошок, который растворяли в ТГФ (1,0 мл), воде (1,0 мл) и MeOH (1,0 мл). К смеси добавляли Pd на угле (20 мг). Через суспензию в течение 20 минут пропускали струю водорода, после чего суспензию перемешивали еще в течение 18 часов в атмосфере водорода. Суспензию фильтровали через целит и промывали метанолом и водой (2×). Растворители удаляли в вакууме, и сырой продукт очищали с помощью хроматографии с исключением размера на Сефадекс g25 (элюент: 5% EtOH в воде), получая кислоту 4,13 (5,0 мг, 85% на двух стадиях) в виде белого порошка. [α]D комн.темп.= -14,2 (c=1,0, вода); Rf=0,67 (изопропанол/1M водный NHOAc=2:1); ИК (пленка) γ 3256, 2938, 1571, 1410, 1050, 830 см-1; H ЯМР (400 МГц, D2O) δ 4,00-3,84 (м, 3H), 3,74 (дд, J=19,7, 9,9 Гц, 3H), 3,63 (д, J=8,9 Гц, 1H), 3,46 (дд, J=15,8, 6,5 Гц, 1H), 3,01 (т, J=7,5 Гц, 2H), 2,43 (дд, J=12,1, 4,6 Гц, 1H), 1,79 (т, J=12,3 Гц, 1H), 1,67 (дд, J=14,0, 6,5 Гц, 2H), 1,63-1,57 (м, 2H), 1,44 (дд, J=15,2, 7,9 Гц, 2H); C ЯМР (101 МГц, D2O) δ 181,4, 173,9, 101,1, 30 73,3, 69,0, 67,4, 65,2, 64,1, 39,3, 34,7, 28,2, 26,3, 23,2, 22,0; HR ESI Вычислено для CHNO [M-H]: 322,1507 найдено: 322,1502.
(2S,3S,4R)-1-(6-(6’-Гексанил сукцинамидо этиленгликоль сукцинимидамидо-5”-пентанил α-3″′-дезокси-D-манно-окт-2″′-улозоновая кислота пиранозид)-α-D-галактопиранозил)-2-гексакозаноиламинооктадекан-3,4-диол (гликоконъюгат 43)
2
2=
2
2
max
79
147
3
23
-
1
13
К раствору снабженного линкером KDO 42 (1,5 мг, 4,6 мкмоль) и гликолипида 27 (4,4 мг, 4,6 мкмоль) в ДМСО/пиридине (0,1 мл, соотношение=1:1 об./об.) добавляли этиленгликоль биссукцинимидилсукцинат (EGS) (2,1 мг, 4,6 мкмоль), растворенный в ДМФ (0,1 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 часов, после чего растворители удаляли с помощью лиофилизации. Сырой продукт очищали с помощью LH-20 хроматографии с исключением по размеру (элюент: MeOH/CHCl1:1), получая конъюгат 43 (3,0 мг, 42%) в виде бледно-желтого порошка. [α]D комн.темп.= +43,9 (c=0,2, пиридин); Rf=0,54 (CHCl/MeOH=85:15); ИК (пленка) γ 3308, 2918, 2850, 1781, 1709, 1645, 1548, 1467, 1378, 1211, 1157, 1071, 1020, 952, 816, 719 см1; H ЯМР (400 МГц, d-pyr) 8,52 (м, 2H), 8,44 (д, J=8,7 Гц, 1H), 5,56 (д, J=3,9 Гц, 1H), 5,26 (с, 1H), 4,88 (с, 1H), 4,66 (ддд, J=13,1, 9,9, 4,4 Гц, 2H), 4,55 (д, J=4,6 Гц, 1H), 4,52-4,39 (м, 5H), 4,39-4,31 (м, 7H), 4,20-3,93 (м, 2H), 3,85 (д, J=7,3 Гц, 1H), 3,79-3,72 (м, 1H), 3,47 (ддд, J=20,0, 14,8, 8,3 Гц, 3H), 3,39-3,32 (м, 1H), 3,22 (дд, J=11,9, 4,5 Гц, 1H), 3,08 (ддд, J=6,7, 5,8, 2,5 Гц, 1H), 2,94-2,84 (м, 4H), 2,79 (дд, J=8,5, 5,0 Гц, 3H), 2,73 (т, J=4,8 Гц, 2H), 2,53-2,49 (м, 18H), 2,33 (т, J=6,9 Гц, 1H), 1,99-1,66 (м, 4H), 1,66-1,47 (м, 6H), 1,42-1,20 (м, 71H), 0,89 (т, J=6,3 Гц, 6H),δ; C ЯМР (151 МГц, d-pyr) δ 173,6, 171,7, 170,5, 169,3, 101,9, 101,0, 77,1, 76,8, 72,9, 71,9, 71,9, 71,6, 71,4, 71,2, 71,1, 70,6, 69,5, 69,1, 67,8, 66,5, 64,4, 63,4, 63,3, 62,9, 62,8, 61,9, 51,7, 43,5, 41,5, 40,2, 40,1, 37,2, 37,2, 34,8, 32,6, 32,5, 25 31,3, 30,8, 30,6, 30,5, 30,5, 30,5, 30,4, 30,4, 30,4, 30,4, 30,3, 30,3, 30,3, 30,2, 30,0, 30,0, 29,3, 27,6, 27,0, 26,5, 26,5, 24,3, 23,4, 14,7; HR ESI Вычислено для CHNO [M+Na+]: 1529,0318 найдено: 1529,0363.
Описание Фигур:
Фигура 1. Модель действия гликоконъюгированной вакцины.
Способ действия иллюстрируется антигеном инвазивного пневмококкового заболевания: капсульный пневмококковый полисахарид (CPS) ковалентно связан с гликолипидом. Специфичные к CPS B-клетки будут усваивать конъюгат путем рецептор-опосредованным эндоцитозом, и конъюгат будет расщепляется в поздних эндосомах, генерируя свободный αGalCer. В позднем эндосомальном компартменте αGalCer будет образовывать комплекс с CD1d антиген-презентирующими молекулами и в результате плазменно-мембранной рециркуляции CD1d будет представлен в инвариантных природных киллерных T (iNKT) клетках.
Стимуляция iNKT клеток αGalCer:CD1d комплексом на поверхности антиген-презентирующих В клеток индуцирует освобождение растворимых цитокинов необходимых для помощи В клеткам и генерации клеток памяти. С помощью данной стратегии индуцируется конечная долгосрочная иммунологическая память, приводя к продукции В-клеток памяти и поставке IgG антител с высокой аффинностью.
Фигура 2. Гликоконъюгированная вакцина 1, содержащая часть капсульного антигенного полисахарида PS4.
Фигура 3. Активность in vitro конъюгированной вакцины. αGalCer-CPS-активированные CD1d-положительные APC стимулируют iNKT клетки. Различные экспериментальные серии αGalCer-CPS типа 4 конъюгированной вакцины (ромбы) являются активными in vitro, когда αGalCer освобождается от CPS в живых клетках (А). αGalCer полностью конъюгированы с CPS, поскольку оставшейся активности не обнаруживается при активировании iNKT клеток в свободной от клеток системе (В). Неконъюгированный CPS типа 4 (открытые кольца) или αGalCer (закрытые кольца) отдельно в качестве контроля.
Фигура 4. Активность in vivo конъюгированной вакцины. Отдельно αGalCer-CPS увеличивает Ab ответ у C57BL/6 мышей, и Ab ответ зависит от NKT клеток/CD1d. (A) У мышей WT C57BL/6, вакцинированных αGalCer-CPS (заштрихованные значки) или одним CPS (незаштрихованные значки) берут кровь после иммунизации и оценивают CPS-специфичные Ab с помощью ELISA. (B) У мышей WT C57BL/6 (WT, заштрихованные значки) или CD1d-дефицитных (CD1d-/-, незаштрихованные значки), иммунизированных αGalCer-CPS, берут кровь после вакцинации и измеряют CPS-специфичные Ab с помощью ELISA.
Фигура 5. Ответная реакция на антитела in vivo после вакцинации. Ответная реакция на Ab включает IgG подклассы и показывает реакционноспособность по отношению к общим эпитопами на различных S. pneumoniae CPS. (A) У мышей WT C57BL/6 (WT, заштрихованные значки) или CD1d-дефицитных (CD1d-/-, незакрашенные значки), иммунизированных αGalCer-CPS берут кровь после вакцинации и определяют CPS-специфичные подклассы Ab с помощью ELISA (lgG1 дан как характерный пример). (B) У мышей C57BL/6, вакцинированных αGalCer-CPS, берут кровь после иммунизации и оценивают CPS типа 4 (заштрихованные значки) или CPS типа 2 (незакрашенные значки)-специфичный Ab с помощью ELISA.
Фигура 6. CPS-специфичные гибридомы экспрессируют IgM с созревшей афинностью и все подклассы IgG с использованием некоторых предпочтительных V, D, J сегментов. Определяли гибридомы от αGalCer-CPS-иммунизированных мышей и классифицировали с помощью ELISA и секвенсировали* аминокислотное (aa) или нуклеотидное (nuc) замещения в сравнении с последовательностью зародышевой линии.
Фигура 7. Защита от инфекции с S. pneumoniae в мышиной модели. CSP-специфичные mAb способствуют бактериальной опсонизации. Захват флуоресцентно меченого S. pneumoniae серотипа 4 только АРС в присутствии комплемента (C’) и/или mAb 12F10 (CPS-специфичная очищенная гибридома) или C15 (анти-человеческий TCRAV24). В таблице представлен процент позитивных клеток согласно фоновым (OPA маркер).
Фигура 8. αGalCer-CPS-вакцинированные C57BL/6 мыши показывают долгосрочную защиту от стимуляции антигеном S. pneumoniae. Мышей, вакцинированных αGalCer-CPS (A: заштрихованные значки; B: линия) или одним CPS (A: незакрашенные значки; B: пунктирная линия) инфицировали S. pneumoniae через одну неделю (A) или спустя вплоть до 3 месяцев (B) после последней иммунизации. Мышей оценивали в отношении заболевания, веса и выживания на протяжении нескольких дней (дано в часах). Все инъецированные αGalCer-CPS мыши выжили (B) без симптомов заболевания. Сильная потеря веса (A) наблюдается как раз в условиях только CPS независимо от выживания животных (B).
Фигуры 9 и 10. Изотип и специфичность анти-полисахаридных Ab (IgG, фигура 9; IgM, фигура 10).