Способ оценки рецептивности эндометрия у женщин с первичным бесплодием и миомой матки
METHOD FOR ASSESSING ENDOMETRIAL RECEPTIVITY IN FEMALES WITH PRIMARY INFERTILITY AND UTERINE MYOMA

Изобретение относится к области медицины, а именно к гинекологии и репродуктологии и может быть использовано для оценки имплантационных возможностей эндометрия при лечении бесплодия и подготовки пациенток к экстракорпоральному оплодотворению (ЭКО). Изобретение обеспечивает возможность коррекции тактики ведения женщин с маточной формой бесплодия на этапе прегравидарной подготовки к программам высокотехнологичных репродуктивных технологий (ВРТ).
Нарушение имплантации человеческого эмбриона в связи с нерецептивным эндометрием является наиболее значимой причиной репродуктивных неудач ВРТ, занимая в их структуре до 70%, при переносе эмбрионов хорошего качества (Боярский, К.Ю. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ. Обзор литературы /К.Ю.Боярский, С.Н.Гайдуков, Н.А.Пальченко //Проблемы репродукции.- 2013.- № 4.- С. 3-7., Регистр ВРТ РАРЧ. Отчет за 2017 год: [Электронный ресурс].- СПб., 2018.- 48 С. – Режим доступа : http://www.rahr.ru.)
Потому в последние годы, в фокусе научного интереса находятся исследования, посвященные изучению ультаструктурных морфологических характеристик рецептивности эндометрия при патологии имплантации. Активизация «окна  имплантации»  характеризуется  значительными ультраструктурными изменениями  клеток ламинарного эпителия. В настоящее время в литературе имеются данные об использовании программ для компьютерной морфометрии в практическом здравоохранении, что делает возможным быструю и объективную оценку экспрессии антител.
Аналогами данного изобретения являются описанные в научно-медицинской и патентной литературе следующие способы оценки рецептивности эндометрия.
В результате многочисленных клинических исследований установлено, что важным маркером рецептивности эндометрия является соотношение прогестерона (PR) и эстрогена альфа (ERα) в среднюю секреторную фазу менструального цикла, при этом определяющим прогностическим фактором является соотношение PR / ERα в клетках стромы эндометрия. Наиболее благоприятный прогноз соответствует соотношению PR / ERα в интервале от 2 до 3 (Шуршалина А.В., Демура Т.А. Морфофункциональные перестройки эндометрия в «окно имплантации» // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 7–2. – С. 9–13.).
Ю.С. Крыловой и соавт. (2014) предложен способ оценки рецептивности эндометрия путем исследования уровня экспрессии рецепторов прогестерона в строме, а также экспрессии трофобластического фактора роста бета (TGF-β) в железах (Крылова Ю.С., Шарфи Ю.Н., Гзгзян А.М., Соснина А.К., Кветной И.М. Иммуногистохимические критерии имплантационной восприимчивости эндометрия // Молекулярная медицина. – 2014. – № 5. – С. 24–28.).
Недостатками вышеприведенных способов, несмотря на простоту их выполнения, является использование одного или двух показателей, без учета математического моделирования, что снижает прогностическую эффективность в решении вопроса о целесообразности переноса эмбриона в текущем или последующем циклах.
В отличие от предложенных способов, P. Díaz-Gimeno et. аl. (2011) разработали способ оценки рецептивности эндометрия с использованием определенной транскриптомной сигнатуры. Он включает в себя анализ 238 генов, которые экспрессируются на разных стадиях цикла эндометрия, и связаны с вычисляемым предиктором, который может идентифицировать рецептивность образца эндометрия и оценить персонализированный риск неудач имплантации у пациента. По данным авторов, данный способ является более точным, чем гистология эндометрия, и, что важно, эти результаты были воспроизводимы у тех же пациентов через 29-40 месяцев после первого теста (Díaz-Gimeno P, Horcajadas JA, Martínez‐Conejero JA, et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature// Fertil Steril.- 2011.-Vol.95.- P. 50‐60.). Однако метод является трудоемким и дорогостоящим.
Наиболее близким аналогом (прототипом) заявляемого изобретения является «Способ оценки рецептивности эндометрия в период имплантационного окна (Патент RU 2651762, заявка № 20171200910 от 14.06.2017), позволяющий оценить рецептивность эндометрия с определением ERα в строме, PR в строме, р53 в железах, bcl 2 в строме, CD95 в строме, Ki67 в строме, LIFR в железах, LIF в железах эндометрия и расчетом прогноза рецептивности эндометричя по формуле. Недостатком этого способа является определение большого количества маркеров и его неспецифичность в отношении патологии.
Задачей изобретения является разработка способа оценки рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» у женщин с первичным бесплодием и миомой матки на основании данных иммуногистохимического исследования в эндометрии уровня экспрессии основных молекул, отвечающих за осуществление имплантации эмбриона, с последующим вычислением прогностического индекса (PI).
Технический результат: заявляемый способ обеспечивает объективную оценку рецептивности эндометрия при первичном бесплодии, обусловленном миомой матки.
Указанный технический результат достигается тем, что заявляется способ оценки рецептивности эндометрия у женщин с первичным бесплодием и миомой матки на основании иммуногистохимических данных, полученных с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода отличающийся тем, что в период «окна имплантации» проводят оценку экспрессии маркеров VEGFr3 и PTEN с определением количества H-score баллов в строме эндометрия по общепринятой методике, а количества H-score баллов PTEN в железах эндометрия – методом компьютерной морфометрии, с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI = (-0,045)× Х1+(-0,06)× Х2+0,27× Х3+3,38,
где:
Х1 – балл H-score экспрессии VEGFr3 в строме;
Х2 – балл H-score экспрессии PTEN в строме;
Х3 – балл H-score экспрессии PTEN в железах при компьютерной морфометрии;
3,38– Const
При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины с первичным бесплодием и миомой матки в программу ВРТ. При PI менее 0 прогнозируют низкую рецептивность эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ.
Для определения наиболее информативных иммуногистохимических показателей проведено когоротное сравнительное исследование эндометрия 24 женщин с первичным бесплодием и миомой матки 3-6 классов по FIGO 2011 имеющие в анамнезе неудачные протоколы ВРТ. Контрольную группу составили 18 пациенток с бесплодием и миомой матки 3-6 классов, по FIGO 2011 г. у которых в результате ВРТ наступила беременность, добровольно принимавших участие в исследовании и подписавших информированное согласие.
Методом пошагового дискриминантного анализа с исключением переменных определены наиболее значимые иммуногистохимические параметры функционального состояния эндометрия, определяющие рецептивность эндометрия (таблица 1).
Количество шагов- 6
Таблица 1
Результаты пошагового дискриминантного анализа
показатель
Уилкса лямбда
Частнаялямбда
F-исключ.
p-уров.
Толер.
1-толер.(R-кв)
Балл H-score экспрессии PTEN в строме
0,523971
0,487810
33,59931
0,000002
0,628211
0,371789
Балл H-score экспрессии PTEN в железах при компьютерной морфометрии
0,485569
0,526389
28,79153
0,000007
0,684788
0,315212
Балл H-score экспрессии VEGFr3 в строме
0,425771
0,600319
21,30500
0,000060
0,816367
0,183633
Число переменных в модели:3
F (1,32) = 4,123613 p <  ,0507
прибл.  F (3,32) = 31,06545 p <  ,0000
Лямбда Уилкса: ,2555985
Способ осуществляют следующим образом:
Иммуногистохимическое исследование биоптатов эндометрия, взятых методом пайпель-биопсии на 20-22 день 28-дневного менструального цикла (в период предполагаемого «окна имплантации»), проводится с использованием двухэтапного стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с демаскировкой антигена и применением стандартных наборов моноклональных и поликлональных антител фирмы «Bond RTU Primary» и «DAКO», США. На парафиновых срезах по стандартной методике с предварительной демаскировкой антигенов с использованием соответствующих стандартных антител для выявления: PTEN и VEGFr3.
Проявление реакции осуществлялось системой визуализации «Dako Cytomation». Для визуализации первичных антител использовали безбиотиновую систему детекции Super Sensitive Polymer-HPR Detection System (Biogenex).
Для иммуногистохимического исследования используются серийные парафиновые срезы. Результаты реакции рецепторов к эстрогенам, прогестеронам, PTEN (фосфатаза с двойной субстратной специфичностью, продукт гена PTEN) идентифицируются по ядерному или мембранному окрашиванию клеток для соответствующих маркеров с оценкой процента окрашенных клеток и интенсивностью окраски клеток. Экспрессию рецепторов к PTEN оценивают по 3-балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени). Для анализа результатов ИГХ реакций использовали метод гистологического счета H-score по формуле: HS=1а+2b+3с, где а - % слабо окрашенных клеток, b - % умеренно окрашенных клеток, с - % сильно окрашенных клеток, 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Компьютерные H-показатели были рассчитаны таким же образом путем умножения процента площади положительных пикселей на соответствующую интенсивность цвета. Анализ изображений проводили при увеличении ×200 на программном обеспечении виртуального микроскопа Axio Zeiss ZEN Blue (Германия). Изображения анализировались с использованием программного обеспечения ImageJ 1.50d (Java-based, США). На фото образцов выделялись области, отдельно захватывающие строму и железистую ткань площадью 2500 пикселей. Пиксельное измерение иммунореактивности проводилось с использованием цветового пространства Lab × (яркость [L] и двух цветовых каналов желто-синий и красно-зеленый). Белые области, лишенные ткани исключались в канале яркости, тогда как синие области исключались каналом цветового регулирования. Результирующий коричневый сигнал затем располагался между красным и желтым, после этого выделялся порог между фоновым коричневым сигналом и показателем интенсивности специфической иммунореактивности, текущий фоновый режим сохранялся для всех дальнейших анализов [7].
Экспрессию VEGFr3 определяют в эпителии, строме эндометрия и эндотелии сосудов. Активность проявляется в виде окрашивания мембраны и цитоплазмы эпителиальных и эндотелиальных клеток.
С использованием метода дискриминантного анализа разработана математическая модель прогнозирования данной патологии, заключающаяся в оценке экспрессии маркеров VEGFr3, PTEN с определением количества H-score баллов в строме эндометрия по общепринятой методике, а также количества H-score баллов PTEN в железах эндометрия – методом компьютерной морфометрии, с последующим вычислением прогностического индекса (PI) по формуле:
PI= (-0,045)× Х1+(-0,06)× Х2+0,27× Х3+3,38, где
Х1 – балл H-score экспрессии VEGFr3 в строме;
Х2 – балл H-score экспрессии PTEN в строме;
Х3 – балл H-score экспрессии PTEN в железах при компьютерной морфометрии;
3,38– Const
При PI более 0 делают заключение о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона и возможности направления женщины с маточной формой бесплодия, обусловленной миомой матки в программу ВРТ. При PI менее 0 прогнозируют низкую рецептивность эндометрия и высокий риск репродуктивных неудач в программах ВРТ.
Чувствительность предлагаемого способа составляет 91,67%, специфичность – 100%. Эффективность способа – 95,84%.
Клинические примеры.
Пример 1.
Пациентка В. 33 года (история болезни 825) Обратилась в связи с первичным бесплодием и субсерозной миомой матки. Отмечает бесплодие в течение 5 лет, в анамнезе одна неудачная попытка ЭКО. Соматически не отягощена. Материал получен методом Пайпель биопсии на 22 день менструального цикла. При гистологическом исследовании: эндометрий средней стадии фазы секреции. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании с применением компьютерной морфометрии: балл H-score VEGFr3 в строме 35; балл H-score PTEN в строме при ручном подсчете -50, балл H-score PTEN в железах при компьютерной морфометрии - 25,12.
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = (-0,045)×35+(-0,06)×50+0,27×25,12+3,38=6,5  PI>0, что свидетельствует о готовности эндометрия к успешной имплантации эмбриона.
В следующем менструальном цикле выполнен перенос двух размороженных эмбрионов в полость матки, наступила одноплодная беременность, на данный момент срок 25 недель.
Пример 2.
Пациентка Ч. 36 лет (история болезни 1707) Обратилась в связи с нарушением менструального цикла в виде коротких, болезненных менструаций, 10 лет бесплодия, в анамнезе три неудачные попытки ЭКО. Соматически не отягощена. При обследовании выявлена субсерозная миома матки диаметром 38 мм. Материал получен методом Пайпель биопсии на 22 день менструального цикла. При рутинном гистологическом исследовании: эндометрий средней стадии фазы секреции. При расширенном гистологическом и ИГХ исследовании с применением компьютерной морфометрии: балл H-score VEGFr3 в строме 10; балл H-score PTEN в строме при ручном подсчете -185, балл H-score PTEN в железах при компьютерной морфометрии – 1.
По формуле определили значение прогностического индекса:
PI = (-0,045)×10+(-0,06)×185+0,27×1+3,38=-7,9  PI<0, что свидетельствует о низкой рецептивности эндометрия и высоком риске репродуктивных неудач в программах ВРТ.
В следующем менструальном цикле пациентке проводилось ВРТ в программе криопротокола с заместительной гормональной терапией. Осуществлялся перенос двух размороженных эмбрионов хорошего качества. Имплантации эмбрионов не произошло, что подтверждает эффективность прогнозирования низкой рецептивности эндометрия в период «имплантационного окна» с использованием разработанной формулы.
Таким образом, прогнозирование развития репродуктивных неудач предлагаемым способом позволит уменьшить количество неэффективных протоколов лечения и циклов ЭКО. Заявляемый способ прогнозирования наступления беременности у женщин с маточной формой бесплодия и миомой с использованием программ компьютерной морфометрии: прост в исполнении, включает объективную оценку морфометрических параметров, не требует дорогостоящего оборудования.
Источники информации
1. Боярский, К.Ю. Современный взгляд на проблему рецептивности и тонкого эндометрия в программах ВРТ. Обзор литературы/ К.Ю.Боярский, С.Н.Гайдуков, Н.А.Пальченко // Проблемы репродукции.- 2013.- № 4.- С. 3-7.
2. Регистр ВРТ РАРЧ. Отчет за 2017 год: [Электронный ресурс].- СПб., 2018.- 48 С. – Режим доступа : http://www.rahr.ru.
3. Шуршалина А.В., Демура Т.А. Морфофункциональные перестройки эндометрия в «окно имплантации» // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 7–2. – С. 9–13.
4. Крылова Ю.С., Шарфи Ю.Н., Гзгзян А.М., Соснина А.К., Кветной И.М. Иммуногистохимические критерии имплантационной восприимчивости эндометрия // Молекулярная медицина. – 2014. – № 5. – С. 24–28.
5. Díaz-Gimeno P, Horcajadas JA, Martínez‐Conejero JA, et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature// Fertil Steril.- 2011.-Vol.95.- P. 50‐60.
6. Патент RU(11)2 2651762 (заявка.№ 20171200910 от 14.06.2017). Способ оценки рецептивности эндометрия в период имплантационного окна.