Экспериментальные модели, пригодные для оценки влияния компонентов новых разрабатываемых вакцин на дифференцировку дендритных клеток

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ, ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ КОМПОНЕНТОВ НОВЫХ РАЗРАБАТЫВАЕМЫХ ВАКЦИН НА ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК

В.Ю. Талаев, М.В. Плеханова, А.В. Матвеичев,

ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной»

Талаев

Владимир Юрьевич -e-mail: talaev@inbox.ru

Первая часть аналитического обзора посвящена описанию физиологической роли дендритных клеток, их фенотипических и функциональных параметров. На основе этих данных дано обоснование целесообразности исследования дендритных клеток в целях совершенствования противоинфекционных вакцин. Во второй части обзора описаны методы исследования, позволяющие оценить действие вакцин на дендритные клетки in vitro.

Ключевые слова: дендритные клетки, Т-лимфоциты, вакцины,

созревание, иммунный ответ.

The first part of the analytic review is devoted to the description of physiological role of dendritic cells, their phenotypic and functional parameters. Based on these data the substantiation of the expediency of dendritic cell study in order to improve the anti-infective vaccines was made. The second part of the review contains the description of the methods which let us evaluate the effects of vaccines on dendritic cells in vitro.

Key words: dendritic cells, T-cell, vaccine, maturation, immune response.

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что дендритные клетки (ДК), как и многие другие клетки иммунной системы, обладают множеством функций и могут принимать участие в различных врожденных и адаптивных иммунных реакциях. Однако, без сомнения, основным функциональным свойством, придающим уникальность этой группе клеток, является их чрезвычайно высокая способность к презентации антигена Т-лимфоцитам. Только эти клетки способны эффективно представлять антиген наивным (не контактировавшим ранее с антигеном) Т-лимфоцитам, обеспечивая запуск иммунного ответа на первый контакт организма с инфекцией или вакциной. Эта способность обусловлена функциональными особенностями ДК, связанными со сбором и процессингом антигенного материала, распознаванием паттернов патогенов и способностью под действием этой информации быстро менять свои свойства, а именно, дифференцироваться в т.н. зрелые ДК. В результате этого созревания клетки экспрессируют чрезвычайно высокое количество молекул главного комплекса гистосовмести-мости, необходимых для представления собранных антигенов, а также мембранных белков и цитокинов, нужных для дополнительной стимуляции рекрутируемых Т-лимфоцитов. Кроме того, ДК обладают уникальными миграционными характеристиками, которые позволяют одной и той же клетке максимально эффективно собирать

антигены внутри различных тканей организма, а затем транспортировать их в Т-клеточные зоны лимфоидных органов, где их путь миграции пересекается с центральным путем рециркуляции наивных Т-лимфоцитов. Все эти свойства определяют ключевую роль ДК в презентации антигенного материала вакцин и запуске адаптивного иммунного ответа на эти антигены.

В течение двух последних десятилетий ДК являются объектом интенсивнейших фундаментальных и прикладных исследований, и количество научных публикаций, посвященных ДК, чрезвычайно велико. Несмотря на это, количество опубликованной информации о действии на ДК вакцин и их потенциальных компонентов до сих пор весьма ограничено.

В аналитическом обзоре собраны литературные данные о свойствах ДК и методах, пригодных для изучения действия вакцин на эти клетки, а также описаны основные методы, используемые в лаборатории клеточной иммунологии Нижегородского НИИЭМ для оценки действия вакцин на дендритные клетки новорожденных и взрослых.

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА 1.1. Основные типы дендритных клеток Группа клеток, объединяемых термином «дендритные клетки», не является однородной. У человека выделяют как минимум 3 основных типа дендритных клеток,

различающихся происхождением и тканевой локализацией [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]. Это типичные (conventional) ДК, клетки Лангерганса кожи (ЛК), а также плазмоцитоидные дендритные клетки (пДК). Дендритные клетки, прошедшие различный путь созревания, обладают определенными специфическими свойствами. Так, типичные дендритные клетки имеют отростчатую морфологию и набор мембранных молекул, характерный для профессиональных анти-генпрезентирующих клеток. Часть клеток с аналогичными свойствами может созревать в нелимфоидных тканях из моноцитов. Данную субпопуляцию ДК обозначают английским термином monocyte-derived dendritic cells. У них прослеживается определенное родство морфологии, фенотипа, эндоцитозной и ферментативной активности с макрофагами и моноцитами. В частности, эти клетки несут маркер CD11c, характерный для клеток миелоидного ростка кроветворения. Типичные ДК обнаруживаются практически во всех тканях организма, однако наиболее многочисленны они в барьерных тканях - в собственно дерме и в соединительнотканном слое слизистых [9, 10, 3, 11].

Клетки Лангерганса кожи расположены в эпидермисе и имеют ряд специфических черт [5, 12]. Эти клетки несут на своей мембране лектин С-типа лангерин (CD207), связывающий гликопротеиды ряда микроорганизмов, а также Е-кадгерин, отвечающий за адгезивное взаимодействие с клетками эпидермиса. В цитоплазме клеток Лангерганса имеются специфические включения, именуемые гранулами Бирбека.

Плазмоцитоидные дендритные клетки в организме человека в основном содержатся в виде клеток-предшественников с ограниченной способностью к презентации антигенов [13, 8, 14]. В отличие от типичных дендритных клеток эти плазмоцитоидные предшественники не экс-прессируют важнейшую для антигенной презентации молекулу главного комплекса гистосовместимости HLA-DR на мембране, но содержат эту молекулу в цитоплазме. В морфологическом отношении эти клетки напоминают плазмоциты, за что и получили свое название. Дифференцировка этих клеток в полноценные антиген-презентирующие дендритные клетки воспроизведена в условиях in vitro. В то же время сами предшественники плазмоцитоидных дендритных клеток без дальнейшего созревания способны выполнять важную функцию врожденного иммунитета - они являются наиболее активными продуцентами интерферонов a и р [15]. Кроме того, ДК, принадлежащие к перечисленным выше основным группам, подразделяются на отдельные субпопуляции, различающиеся степенью зрелости и функциональными свойствами [7]. Наиболее полно охарактеризована субпопуля-ционная структура ДК мышей, подробную классификацию которых можно найти в обзоре Дэвида Альварец с соавт.

[16].

1.2. Созревание дендритных клеток

Незрелые дендритные клетки происходят из плюрипо-тентных стволовых кроветворных клеток [17, 18, 13] и начальную дифференцировку проходят в костном мозге, однако заканчивается этот процесс в периферических тканях [18, 3].

Общим предшественником всех дендритных клеток являются CD34+ кроветворные предшественники. Также в любые типы дендритных клеток способны дифференцироваться общие лимфоидные и общие миелоидные предшественники [8], при этом реализуемая дендритными клетками генетическая программа не зависит от промежуточных этапов дифференцировки по лимфоидному или миелоидному пути [19]. Это положение сохраняется вплоть до этапа созревания клеток-предшественников, характеризующегося утратой с мембраны молекулы Flt3 - рецептора важного регулятора кроветворения - Flt3-лиганда. Ранее считалось, что после утраты этого рецептора клетки миелоидного ряда кроветворения могут дифференцироваться только в типичные ДК, а пДК созревают из предшественников, продвинутых по линии лимфоидной дифференцировки [17, 7, 8, 14]. Однако недавно в костном мозге мышей был обнаружен общий предшественник типичных ДК и пДК, по-видимому, принадлежащий к миелоидному ряду дифференцировки [20]. По современному представлению, общий предшественник ДК может дифференцироваться в костном мозге до пДК или до предшественника типичных ДК (пре-ДК), который мигрирует в лимфоидные и нелимфоидные ткани, где под действием цитокинов микроокружения превращается в незрелую ДК [21]. Кроме того, как уже было сказано выше, в нелимфоидных тканях, особенно в соединительнотканных слоях кожи и слизистых, ДК могут развиваться как из пре-ДК, так и из моноцитов крови [10, 11, 21, 22, 23]. При этом процесс рекрутирования моноцитов в ткань и созревание моноцитарных ДК резко возрастает при развитии воспаления. В эпидермисе из кроветворных предшественников созревают клетки Лангерганса кожи [23, 24]. Стимуляторами образования незрелых дендритных клеток являются цитокины, которые продуцируются в зоне их первичной локализации.

1.2.1. Созревание типичных ДК

Исходно эта группа ДК обозначалась термином «миелоидные ДК» в связи с представлением о происхождении только этой субпопуляции ДК из миелоидных предшественников и экспрессией ими миелоидных маркеров CD11c и CD33. Ранними факторами дифференцировки предшественников типичных ДК и пДК являются фактор стволовых клеток (ФСК) и Flt3-лиганд №3^ [17, 1, 7]. Основной ростовой и антиапоптотический фактор для ДК -гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирую-

щий фактор (ГМ-КСФ).

Миелоидные ДК различной тканевой локализации имеют определенные особенности происхождения. Так, показано, что CD8альфа+ и CD8альфа- субпопуляции ДК селезенки мыши происходят от костномозговых предшественников, но не из моноцитов. Эти предшественники мигрируют в селезенку с кровью, где в маргинальной зоне превращаются в незрелые ДК, минуя стадию моноцитов. Поглощение приносимых в селезенку антигенов и терминальное созревание приводят к CCR7-опосредованной миграции этих клеток в Т-клеточные зоны белой пульпы. В то же время, существенная часть ДК дермы и слизистых происходит из моноцитов крови. Наличие на их мембране рецепторов к индуцибельным (воспалительным) хемоки-нам наводит на мысль о возможной активной миграции незрелых клеток внутри ткани к очагам воспаления. Контакт с инфекционными агентами вызывает быструю дифференцировку незрелых ДК и миграцию их в региональный лимфатический узел в течение первых суток после контакта.

1.2.2. Созревание клеток Лангерганса

Незрелые ЛК локализуются в коже, а также слизистой ЖКТ и верхних дыхательных путей. Для них свойственны процессы самоподдержания популяции пролиферацией на периферии в условиях гомеостаза [5]. Некоторые авторы предполагают регуляторную роль ЛК на основании данных о поздних сроках их миграции в лимфатические узлы при иммунном ответе [21]. Маркерами популяции ЛК являются молекула CD207 (лангерин) и гранулы Бирбека, так же они несут характерную для эпидермальных клеток адгезивную молекулу Е-кадгерин и CD1a [25, 26].

В развитии ЛК известно несколько путей созревания, с частичным перекрыванием с путями созревания типичных ДК. Было показано, что CD14+ моноциты при культивировании со смесью ГМ-КСФ, трансформирующего фактор роста-Ь (ТРФ-Ь) и ИЛ-4 [27], или со смесью ГМ-КСФ, ТРФ-Ь и ИЛ-13 [28] способны дифференцироваться в ЛК. Описана также дифференцировка из CD34+ клеток, экс-прессирующих рецептор С1.А, опосредующий хоминг в кожу, под действием ГМ-КСФ/ФНО-а [29], и CD1a+CD11c+CD14- клеток под действием ГМ-КСФ/ ТРФ-Ь/ИЛ-4 [23].

Ранее считалось, что предшественники коммитированы к развитию в направлении ЛК уже на стадии циркуляции в крови, однако впоследствии была доказана значимость локального цитокинового микроокружения в коже для дифференцировки ЛК [22].

1.2.3. Созревание пДК

Плазмоцитоидные ДК имеют значительные отличия от остальных ДК. В первую очередь, это проявляется в том, что основная их масса в организме представлена в виде

незрелых клеток-предшественников. Характерным фено-типическим признаком пДК на всех стадиях созревания считается высокая экспрессия молекулы CD123 [30, 2, 31]. Эта молекула представляет собой альфа-цепь рецептора ИЛ-3 - основного ростового и антиапоптотического фактора для пДК [32]. Однако некоторые авторы сообщали о том, что обнаружены подтипы типичных ДК, несущие CD123 [33].

Общая характеристика фенотипа пДК описывается по данным отечественных и зарубежных исследователей как lin-CD11c-CD123++CD45RA+ILT-3+HLA-DR+. Также специфическими маркерами популяции пДК считаются молекулы BCDA-2 ^303) и BCDA-4 ^304) [1, 2].

В лимфоидных тканях предшественники пДК находятся в Т-клеточных зонах вторичных лимфоидных органов. Миграция пДК в лимфатические узлы осуществляется из кровотока через высокий эндотелий венул, подобно Т-лимфоцитам, и обеспечивается экспрессией 1_-селектина [34].

Выделенные из крови человека и мыши пДК весьма слабо стимулируют пролиферацию Т-лимфоцитов, так как не способны эффективно поглощать и процессировать антигены [32]. Для них свойственна довольно низкая экспрессия протеолитических ферментов - катепсинов S и D [35], а также, что более важно, HLA-DR и костимуляторных молекул [36, 32, 37]. Основной функцией предшественников пДК является продукция интерферонов первого типа (ИНФ-а1/13, а2,а5, а6, а8, а10, а14, а16, а21) [38].

Дифференцировка предшественников пДК в незрелые и далее в зрелые клетки индуцируется присутствием цито-кинов - ИЛ-3 и ФНО-а, а также олигодезоксинуклеотида-ми с неметилированными CpG-повторами и их синтетическими аналогами - агонистами TLR [39]. Активация существенно повышает экспрессию HLA-DR и костимуляторных молекул и усиливает способность вызывать пролиферацию лимфоцитов [32, 37, 40].

1.3. Поглощение и процессинг антигена

Как уже отмечалось, незрелые ДК располагаются в местах возможного проникновения инфекционных агентов (в первую очередь кожа и слизистые), а также в маргинальных зонах белой пульпы в селезенке. Они не способны представлять антиген и стимулировать Т-клетки, но энергично поглощают антигены путем рецепторопосредо-ванного фагоцитоза, эндоцитоза и макропиноцитоза [41, 42]. Макропиноцитоз у незрелых ДК идет конститутивно, позволяя быстро поглощать большое количество окружающей жидкости с различными мелкими объектами, независимо от их химической специфики [3, 43]. По всей видимости, именно пиноцитоз является основным механизмом поглощения антигенов, особенно вне воспаления.

Для рецепторно-опосредованного фагоцитоза ДК челове-

ка несут целый ряд молекулярных структур. Это рецепторы Fc-фрагментов иммуноглобулинов - CD32 ^с^Н) и CD89 (FcaR) - на ДК моноцитарного происхождения; CD23 - на ЛК; рецепторы комплемента CR3 и CR4; рецепторы белков теплового шока; scavenger-рецепторы (рецепторы-мусорщики); маннозный макрофагальный рецептор (MMR) [3, 10].

Фагоцитоз у ДК существенно отличается от аналогичного процесса у нейтрофилов и макрофагов в первую очередь тем, что не приводит к расщеплению поглощенных антигенов на слишком мелкие, лишенные антигенной специфичности фрагменты [44]. Такая сохранность антигенной структуры поглощенного материала обеспечивается особенностями ферментативного аппарата ДК.

Образующиеся при поглощении антигена фагосомы содержат большое число разнообразных ферментов деградации, воздействующих на антиген (эндо-, экзопеп-тидазы, эстеразы, редуктазы, протеазы) [45]. Большинство протеаз ДК являются цистеиновыми (катепсины S, В, Н, ^ и аспартатными (катепсины D, Е), так же часты аспараги-новые эндопептидазы [46]. Однако несмотря на разнообразие, концентрация ферментов в фагосомах ДК существенно ниже по сравнению с [47], что обуславливает сохранение относительно больших участков антигена, несущих протективные детерминанты. Кроме того, ДК экспрессируют ряд ингибиторов из семейства цистатина, способных связывать активный центр протеаз [48, 49].

Роль везикулярных протеаз ДК не исчерпывается про-цессингом антигена. Ферменты работают в виде каскада, активируя друг друга. Так, показана роль аспарагиновых эндопептидаз в процессинге катепсинов 1_, В и Н [50, 51], а также, совместно с катепсином Б и цистатином С, - в контроле отщепления инвариантной цепи от молекул МНС II [44].

Вторым значимым фактором, воздействующим на антиген в фагосоме и регулирующим процессинг, является уровень рН. Его изменение способно само по себе привести к денатурации и дезорганизации биомолекул, а также создать благоприятные условия для действия ферментов. Особенностью незрелых ДК в сравнении с остальными фагоцитами является длительное сохранение в фагосомах рН, близкого к слабощелочному - порядка 7-7,5 [52]. Поддержание рН осуществляется двумя противодействующими мультимолекулярными комплексами, присутствующими на мембранах фагосом: НАДФ-оксидазой N0X2 и V-АТФазой. N0X2 является продуцентом супероксид-анионов, защелачивающих фагосому. Действие его частично компенсируется закислением фагосом V-АТФазой, транспортирующей вовнутрь ионы Н+ [44]. Активность обоих комплексов также существенно лимитируется во избежание разрушения иммунологически

значимых эпитопов антигена крайними значениями pH. Так, низкая активность V-АТФазы - мощного агента закис-ления фагосом, снижается у незрелых ДК путем неэффективного присоединения к комплексу компонента V1 [53]. Об активности НАДФ-оксидаз у ДК известно немногое, однако показан ее незначительный уровень в сравнении с нейтрофилами, вероятно, из-за присутствия эндогенных ингибиторов [54]. При получении ДК сигнала активации, особенно с участием толл-подобных белков (TLR), НАДФ-оксидазная активность и активность V-АТФазы возрастают [44].

ДК осуществляют презентацию антигена с помощью молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) I и II классов, а также молекул CD1 [55]. Полученные в ходе протеолиза пептиды обычно встраиваются в молекулу MHC II. Ее а- и р-цепи синтезируются в эндоплазматиче-ском ретикулуме, образующийся димер стабилизируется Ii (инвариантной) цепью. Фрагмент Ii, именуемый CLIP (Class II associated invariant chain peptide), является универсальным суррогатом антигенных пептидов [56]. Синтезированная на рибосомах молекула MHC II связывается с тремя молекулами Ii [57], после чего поступает в аппарат Гольджи и попадает в везикулу. При этом миграция комплекса MHC II - Ii направляется в эндоцитозные везикулы с помощью сигнальной последовательности в составе цитоплазматического домена Ii [58]. Впоследствии она может быть вынесена на поверхность клетки и вновь поглощена в составе уже ранней эндосомы (при этом в просвете эндосомы могут оказаться внеклеточные белки). Возможен и иной вариант: везикула с молекулой MHC может сразу слиться с ранними эндосомами, где есть антигенные белки. При условии сродства определенных участков этих белков к АГ-связывающей щели MHC II происходит встраивание этого участка в щель с одновременным отщеплением Ii-цепи от образовавшегося комплекса. Следует заметить, что среди пептидов, элюируемых из молекул MHC II, на долю экзогенных приходится лишь около 10%, а преобладающими являются пептидные фрагменты различных продуктов генов MHC [56].

При процессинге и представлении антигена дендритными клетками имеет место феномен перекрестной презентации [3, 59, 60]. Данное явление заключается в необычном перераспределении антигенов между молекулами главного комплекса гистосовместимости. Как известно, молекулы MHC I обычно выносят на мембрану антигены, синтезируемые только внутри клетки. Однако, благодаря явлению перекрестной презентации некоторые антигены, поглощенные ДК извне, могут быть связаны с MHC I и пре-зентированы CD8+ Т-лимфоцитам. Известно два возможных пути, позволяющих осуществлять перекрестную презентацию: 1) загрузка антигена в MHC I непосредственно в

эндоцитозных везикулах; 2) выход некоторых типов антигена из везикул в цитоплазму, их обработка протеасо-мами и загрузка с помощью TAP-системы в эндоплазмати-ческий ретикулум с последующим соединением с MHC I [3, 61, 62]. Для существования второго пути в макрофагах и ДК, вероятно, имеется некий уникальный транспортный механизм, позволяющий изымать антиген из эндоцитоз-ных компартментов. Одним из претендентов на эту роль может являться белок sec61 [44]. Отмечается так же, что щелевые контакты меж клетками могут способствовать переносу белков из инфицированной клетки в цитозоль ДК [63]. Путь перекрестной презентации зависит от типа антигена и презентирующей клетки. К эффективной перекрестной презентации ведет поглощение ДК апоптотиче-ских и некротических телец, веществ, связанных с белками теплового шока (такими, как gp96, hsp90, hsp60, hsc 70). Механизм переноса антигена в цитозоль, возможно, играет важную роль в индукции цитотоксического клеточного ответа in vivo [3].

Презентация с помощью молекул MHC II находится у ДК под жестким контролем. Незрелые клетки экспрессируют низкие уровни MHC II. Это происходит благодаря нескольким механизмам: 1) низкому уровню активности ряда протеаз (в т. ч. катепсина B), что обуславливает неполный распад поглощенного антигена [35]; 2) отсутствию протеа-зы, отщепляющей инвариантную цепь от молекулы MHC II (катепсин S) [64, 65]. Сигнал созревания резко увеличивает активность названных ферментов, что приводит к быстрому формированию комплексов «MHC II - антигенный пептид», их транспорту к мембране и экспозиции. Впоследствии активность синтеза молекул MHC II падает, что позволяет экспонировать лишь те антигены, что были поглощены до или во время созревания.

Семейство гликопротеинов CD1 представляет собой группу молекул, имеющих гомологию последовательности и общей доменной структуры с MHC I. Эти молекулы способны презентировать небелковые антигены, как ауто-логичные, так и чужеродные. Известно пять вариантов -CD1a, b, c, d, e. Из них CD1a, b, c, отнесены к группе 1, CD1d - к группе 2, CD1e - к группе 3 [66]. Группа 1 экспонирует антигены гликолипидного происхождения и способна оказывать стимулирующее воздействие на T-клетки различного фенотипа: CD8+, CD4- CD8-, ^8-клетки. Соединение CD1 с антигеном происходит в эндоцитозных компартментах: CD1a в ранних и рециркулирующих эндо-сомах, CD1b в лизосомах. CD1b и CD1c могут соединяться с ним и на поверхности клеточной мембраны. Группа 2 (CD1d) активирует NK-клетки, что приводит к лизирова-нию ДК и играет роль в регуляции ответа. CD1d связывает сильно гидрофобные вещества [3]. Функция CD1e неизвестна. Есть данные, что CD1e не экспрессируется на мем-

бране ДК человека [67], присутствуя у незрелых ДК только в аппарате Гольджи, а у зрелых - в поздних лизосомах и эндосомах [67, 68].

Зрелые ДК утрачивают способность к поглощению антигена, однако становятся мощными антигенпрезентирую-щими клетками. Блок фагоцитоза достигается, возможно, инактивацией ГТФаз cdc42 и racl [69].

1.4. Терминальное созревание дендритных клеток

Превращение незрелых ДК в зрелые индуцируется двумя типами сигналов: прямым распознаванием молекулярных структур, типичных для патогенных микроорганизмов, при помощи паттерн-распознающих рецепторов и непрямым распознаванием инфекции (через провоспа-лительные цитокины). ДК имеют несколько типов рецепторов, запускающих процесс созревания: 1) Толл-подобные белки; 2) Рецепторы провоспалительных цито-кинов (таких, как ФНО-a, ИЛ-Iß, PGE-2); 3) Иные рецепторы семейства ФНО; 4) Fc-рецепторы; 5) рецепторы апоп-тотических и некротических телец [3].

Из всех перечисленных структур особая роль отводится TLR. Данные рецепторы способны узнавать ряд сходных структурных компонентов различных патогенов, именуемых молекулярными паттернами [70, 71]. К таковым относятся структуры микроорганизмов, которые:

1. принципиально отличны от структур высших организмов;

2. консервативны и не подвергаются значительным мутационным изменениям;

3. являются общими для многих разновидностей микроорганизмов [72].

Примерами их могут служить ЛПС грамотрицательных бактерий, пептидогликаны грамположительных, вирусная двуспиральная РНК, ДНК, богатая CpolyG-последовательностями, что характерно для бактерий [73]. Паттерны способны распознавать не только TLR, но и иные рецепторы (CD14, CD11/CD18, LPB, SC-рецепторы) [58], но именно TLR после взаимодействия с паттернами индуцируют терминальное созревание ДК [72].

Взаимодействие лиганда с конкретным TLR приводит к синтезу различных наборов цитокинов, в частности, определяющих последующий путь дифференцировки рекрутируемых Т-лимфоцитов. Таким образом, именно работа TLR лежит в основе выбора между клеточным или гуморальным типом адаптивного ответа, а также последующей регуляции его течения [71, 74, 75]. Так, к примеру, в эксперименте с мышиными ДК показано, что стимуляция их ЛПС, полученным из Escherichia coli, приводит к генерации Т-хелперов первого типа (Тх1), а ЛПС Porphyromonas gingivalis дает Тх2 [11]. У человека активация TLR-8 необходима для синтеза больших доз ИЛ-12 [76] и стимуляции Тх1, активация же TLR-2 запускает синтез ИЛ-4 и ИЛ-10,

поддерживающих дифференцировку Тх2 [72]. Кроме того, взаимодействие TLR с лигандом требуется для эффективной экспрессии на ДК молекул костимуляции [77].

Эффекты от активации TLR опосредуются сигнальным каскадом, включающим в себя молекулы MyDBB, TIRAP/ MAL, TICAM-1 и TRAM [71]. При связывании лиганда рецептор димеризуется, причем TLR-2 формирует гетеро-димеры с TLR-1 и TLR-6, остальные же формируют гомо-димеры [7В]. Димеризация приводит к экспонированию TIR-домена на цитоплазматическом конце молекул и взаимодействию его c MyDBB. MyDBB присоединяет к образовавшемуся комплексу молекулу IRAK^ и запускает IRAK^-зависимое фосфорелирование молекулы IRAK-1. Активированная IRAK-1 соединяется с TRAF-6, ведя к активации двух сигнальных путей: первый ведет к активации фактора AP-1 через MAP-каскад, второй - к активации NF-kB [79]. TIRAP/MAL структурно схожа с молекулой MyDBB и играет роль в передаче сигналов от TLR-2 и TLR-А [B0, B1]. TICAM-1 является необходимой для MyDBB-незавсисимой передачи сигнала от TLR-З и TLR-А, ведущей к синтезу ИНФ-ß и активации ИНФ-индуцибельных генов [B2].

Зрелые ДК существенно изменяют набор мембранных рецепторов - они экспрессируют высокие уровни молекул главного комплекса гистосовместимости II класса, CD40, CDB0, CDB6 [21], приобретая способности мощных индукторов и модуляторов иммунного ответа, а так же приобретают специфический набор рецепторов хоминга.

1.5. Миграция дендритных клеток

Реализация функций ДК во многом определяется их локализацией в организме и способностью к миграции. Миграционные пути (особенно на стадии перемещения в лимфатические узлы) у различных типов ДК существенно отличаются друг от друга, а также от путей рециркуляции T-клеток. По понятным причинам основные данные о миграции ДК получены в экспериментах с лабораторными мышами.

Разделение мест локализации незрелых и зрелых ДК, а также их перемещение в организме становятся возможными благодаря строго определенному и закономерному изменению экспрессии хемокиновых рецепторов на них [56, 83], а также адгезивных молекул ^А]. Хемокины -низкомолекулярные цитокины-хемоаттрактанты, - можно условно разделить на две группы: воспалительные и конституциональные. Воспалительные хемокины являются индуцибельными и продуцируются только в очагах воспаления. К ним относятся MCP 1, 2, 3, А, RANTES, MIP-1a, ИЛ-B, IP-10. Конституциональные хемокины, напротив, постоянно продуцируются стормой и эндотелием T-клеточных зон вторичных лимфоидных органов; к ним относятся SDF1a и 1 ß, ELC/MIP-3ß и SLC/6Cine. Рецепторами

воспалительных хемокинов являются CCR1, CCR2, CCR3, CCR5, CCR6, CXCR1 - 3, конституциональных - CCR7 и CXCR4 [1, 83].

Незрелые ДК несут на мембране рецепторы к воспалительным хемокинам и в ответ на них мигрируют в периферические ткани. Установлено, что незрелые типичные ДК экспрессируют рецепторы к воспалительным хемокинам CCR1, CCR2, CCR3, CCR5 [21, 85]. Незрелые пДК в дополнение к указанным молекулам несут CXCR3-рецептор к хемокинам CXCL9, CXCL10 и CXCL11 [34], однако, по некоторым сведениям, данные хемокины сами по себе не вызывают миграцию пДК, а усиливают хемотаксис, индуцированный CXCL12 [1].

Также на незрелых дендритных клетках экспрессирует-ся высокий уровень DC-SIGN, позволяющий им взаимодействовать с молекулой ICAM-2 на покоящихся клетках эндотелия сосудов. Это взаимодействие позволяет незрелым ДК проникать из кровотока в периферические ткани [84].

При получении сигнала к созреванию клетки кардинально меняют репертуар мембранных молекул. Происходит уже упомянутое существенное увеличение экспрессии молекул главного комплекса гистосовмести-мости I и II класса, молекул костимуляции - CD80, 83, 86. Экспрессия рецепторов воспалительных хемокинов CCR1, 5 и CXCR1 снижается [83]. Количество CCR7 и CXCR4, напротив, растет, что ведет к способности отвечать на конститутивные хемокины и мигрировать во вторичные лим-фоидные органы [84]. Следует отметить, что именно CCR7, по мнению большинства исследователей, принадлежит ведущая роль в инициации миграции ДК во вторичные лимфоидные органы [86]. Продукция лигандов для этого рецептора - хемокинов CCL21 и CCL19, наблюдается по всему пути миграции ДК от слепых начальных участков лимфатических капилляров до глубоких слоев коры дренирующего лимфатического узла (ЛУ) [87]. Продукция эта возрастает при воспалении, что сопровождается усиленной миграцией ДК из тканей в ЛУ. Естественная (мутация plt) или искуственная блокада синтеза CCL21 и CCL19 или рецептора CCR7 ведет к драматическому снижению притока ДК в ткань ЛУ [16].

Попав в лимфатическое русло, клетки перемещаются пассивно, с током лимфы, который обусловлен периодическим сокращением мышц вокруг стенки сосуда. В итоге этого перемещения клетки попадают в субкапсулярный синус дренирующего лимфатического узла [88]. Затем ДК проникают через стенку синуса и под действием градиента концентрации хемокинов продвигаются в глубокие слои коры (паракортекс). Пространство пракортекса на 95 процентов занята T-лимфоцитами, постоянно поступающими сюда из кровотока. Оставшееся место заселено резидентны-

ми ДК и клетками стромы. ДК, пришедшие в лимфатический узел с периферии, проникают в кортекс и встраиваются в сеть уже присутствующих резидентных ДК [89], начиная рекрутировать Т-лимфоциты, специфичные к несомым антигенам.

Ранее полагалось, что Т-лимфоциты кортекса мигрируют не направленно и встреча антигенспецифической Т-клетки с ДК - полностью случайное событие [90, 91, 93]. Ныне показано, что это не так. Миграция Т-клеток идет преимущественно вдоль каналов кортекса и направляется фибробластными ретикулярными клетками [93].

Фибробластные ретикулярные клетки являются продуцентами хемокинов СС1_19 и СС1_21, а наивные Т-клетки и ДК способны отвечать на данные молекулы, так как несут рецептор ССК7 [94, 95]. В результате этого, перемещение этих двух типов клеток направляется в одни и те же зоны продукции хемокинов, что повышает частоту встреч Т-клеток и ДК [86]. Кроме того, сами ДК могут продуцировать СС1_19 для дополнительного привлечения Т-клеток [16].

1.6. Взаимодействие ДК и Т-лимфоцитов

Прайминг наивных Т-лимфоцитов требует длительного контакта несущей антиген молекулы МНС с антигенра-спознающим Т-клеточным рецептором (TCR) лимфоцита, а также участия костимуляторных молекул ДК. Структурной основой взаимодействия ДК и Т-клеток, обеспечивающей надежную передачу активационного сигнала, служит иммунный синапс (ИС) - определенным образом организованная зона контакта [56, 96]. Основную роль в начальных этапах его формирования и последующей адгезии Т-хелперов на ДК играют взаимодействия молекул LFA-1 с 1САМ-1 и CD2 с CD58. Взаимодействие CD2 - CD58 обеспечивает сближение клеток на расстояние 15 нанометров, что необходимо для реализации взаимодействий МНС II - TCR. Однако такая адгезия хотя и необходима для начальных фаз формирования ИС, недостаточно сильна, чтобы долго удерживать клетки вблизи. Поэтому впоследствии в поддержание ИС вовлекаются пара LFA-1 - !САМ-1, связь которой обеспечивает более прочный контакт. Следует, впрочем, отметить, что с помощью монокло-нальных антител к двум эпитопам молекулы CD2 возможно вызвать альтернативную активацию Т-клеток. По-видимому, CD2-зависимая активация лимфоцитов имеет отношение к спонтанной пролиферации лимфоцитов для самоподдержания популяции [56].

При распознавании антигенного пептида в Т-клетке возникает сигнал, приводящий к «активации» интегрина LFA-1, т.е. к повышению его сродства к лиганду, что делает контакт Т-клетки и ДК более прочным. Происходит прекращение движения клеток, в чем важную роль играет сигнал от корецептора CD4. В течение первых 30 секунд контакта

образуется круглая зона из комплексов LFA-1 - !САМ-1, окруженная кольцом из взаимодействующих молекул МНС II - TCR. Еще примерно через 5 минут комплексы меняются местами: МНС II - TCR переходит внутрь зоны контакта, а LFA-1 - !САМ-1 - наружу, что является признаком формирования зрелого ИС [97].

Обязательным условием полного дозревания ДК является взаимодействие молекулы CD40 Т-хелпера с CD40L на ДК. Оно также имеет следствием повышение выживаемости ДК и запускает синтез ряда цитокинов, в частности, ИЛ-12 [11]; ДК становится способной праймировать CD8+ лимфоциты.

В этих условиях между клетками устанавливается еще одна межмолекулярная связь: взаимодействие корецеп-торов CD28 и CD80/86. CD28 присутствует на поверхности всех покоящихся CD4+-клеток и 70% CD8+-клеток [56,

98]. Своей цитоплазматической частью эта молекула может контактировать с фосфатидилинозитол-3-киназой (Р!-3К). В результате взаимодействия CD28 с CD80/86 устанавливается связь между аминокислотной последовательностью внутриклеточного участка CD28 YMNM и Р!-3К. При перекрестном сшивании TCR без участия CD28 происходит лишь слабая активация Р!-3К, и генерируемый сигнал явно недостаточен для активации клетки. Однако связывание CD28 приводит к интенсивной активации данного фермента. Точкой конвергенции путей передачи сигналов, запускаемых через CD28 и TCR, являются серинтреониновые киназы ^К1 и 2. Результатом активации данного пути является фосфорилирование транскрипционных факторов, в т.ч. АР-1 (с-]ип/с-^), коему, наряду с ^-АТ, принадлежит основная роль в активации гена ИЛ-2 и генов ряда иных цитокинов и их рецепторов. Так же сигнал от CD28 кооперирует с сигналом TCR, активирующим транскрипционный фактор ^кВ [56].

Итогом взаимодействия ДК и наивных Т-лимфоцитов является активация последних, а также, в случае наивных CD4+ клеток, созревание и дифференцировка в Т-хелпер с определенным профилем цитокинопродукции.

Наивные CD4+-клетки в ответ на стимуляцию вырабатывают лишь незначительное количество ИЛ-2, затем, превращаясь в хелперы нулевого типа (Тх0), они начинают в малом количестве продуцировать широкий спектр цитокинов (ИЛ-3, 4, 5, 6, 10, 13, ИНФ-х ФНО-а и Ь, ГМ-КСФ) и существенно увеличивают секрецию ИЛ-2 [56,

99]. В дальнейшем Тх-0 дифференцируются на субпопуляции Тх1, Тх2, Тх17 и Т-фолликулярные хелперы (Тфх), продуцирующие различные спектры цитокинов и, соответственно, индуцирующие различные типы иммунных реакций.

Направление дифференцировки наивных Т-хелперов зависит от специфических дополнительных сигналов,

получаемых лимфоцитом от ДК, а также от «цитокиновой атмосферы» - т. е. набора цитокинов, присутствующих в микроокружении созревающей клетки. В создании этой «атмосферы» существенную роль играют ДК. Наиболее исследованным цитокином, инструктирующим Т-лимфоцит к выбору пути развития, является ИЛ-12 (р70). Он продуцируется полностью созревшими ДК, причем максимальная продукция наблюдается в культурах ДК, стимулированных вирусными паттернами или их синтетическими заменителями. Под действием этого цитоки-на созревают Тх1 - продуценты ИНФ-^ и ФНО-а, стимуляторы клеточных форм иммунных реакций. Сочетание провоспалительного ИЛ-6 и противовоспалительного трансформирующего фактора роста-Ь ведет к созреванию Тх17, которые также стимулируют клеточные реакции и, в первую очередь, воспаление с нейтрофильной инфильтрацией. Присутствие ИЛ-4 критически необходимо для созревания Тх2, которые до недавнего времени считались основными стимуляторами гуморальных иммунных реакций. К настоящему времени установлено, что Тх2 критически необходимы для стимуляции лишь отдельных этапов гуморального иммунного ответа (продукция 1дЕ) и аллергического воспаления, что, однако, не исключает их участия в качестве вспомогательных помощников на всех этапах функционирования В-клеток.

В настоящее время основную роль в индукции гуморального иммунного ответа отводят специализированной субпопуляции СЭ4+ Т-клеток - т.н. Т-фолликулярным хелперам (Тфх) [100, 101, 102]. Оригинальный термин «фолликулярные Т-клетки хелперы В-лимфоцитов» подразумевает специфическую локализацию этих клеток как одну из основных характеристик. Важнейшей молекулой, определяющей локализацию фТх в фолликулах лимфоидных органов, является хемокиновый рецептор CXCR5. Этот рецептор экспрес-сируется на части СЭ4+ Т-клеток с фенотипом эффекторов/ клеток памяти, а также на В-лимфоцитах и на части типичных ДК. Лиганд для этого рецептора - СХС1_13, активно продуцируется самими Тфх, а также фолликулярными ДК. Последние не являются родственниками типичных ДК и представляют собой клетки стромы фолликулов мезенхи-мального происхождения, способные длительно хранить антигены для поддержания антителопродукции и иммунологической памяти. В результате продукции СХС1_13 фолликулярные ДК, а затем и Тфх, собирают вокруг себя все необходимые для гуморального иммунного ответа клетки и, взаимодействуя с ними, участвуют в формировании зародышевого центра в фолликуле лимфатического узла. Следует отметить, что миграцией, по крайней мере, части фТх управляет еще один хемокин - СХС1_12, продуцирующийся в мантийной зоне, окружающей зародышевые центры. Рецептором для этого хемокина служит молекула CXCR4.

Впервые CXCR5 на Т-лимфоцитах был обнаружен F rster с соавт. в 1994 г. на малой субпопуляции CD4+ Т-лимфоцитов крови человека с фенотипом покоящихся клеток памятим [103]. Те же авторы показали, что количество клеток с таким фенотипом резко возрастает в фолликулярной зоне и зародышевых центрах миндалин человека при воспалении. Способность выделенных из миндалин человека CXCR5+ Т-хелперов стимулировать В-лимфоциты к продукции иммуноглобулинов была установлена в 2000 г. двумя группами исследователей под руководством Breitfeld и Schaerli, которые и ввели в употребление термин «Тфх» [104, 105].

Анализ экспрессии генов CXCR5+ Тфх из миндалин человека демонстрирует высокую экспрессию гена хемокина CXCL13, а субпопуляция CD57+ CXCR5+ Тфх, кроме того, обладает высокой экспрессией генов ИЛ-21, его рецептора и мембранной молекулы ICOS, отвечающей за взаимодействие с В-лимфоцитами. Тфх в качестве основного мастер-регулятора экспрессируют репрессор транскрипции Bcl-6 и характеризуются низким уровнем экспрессии ключевого фактора транскрипции Т-хелперов второго типа GATA3, но при этом используют другие типичные для Тх2 факторы транскрипции, такие как c-maf. Таким образом, полученные к настоящему времени данные свидетельствуют о существовании уникальной программы созревания фТх, отличной от программ диффе-ренцировки других субпопуляций Т-клеток.

Несмотря на это, механизм запуска этой программы созревания до сих пор не ясен. Экспрессию CXCR5 или продукцию ИЛ-21 in vitro могут стимулировать самые разные, в т.ч. «конкурирующие» друг с другом цитокины: ИЛ-6, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-27 [101] и даже ИЛ-12 [106]. Наконец, сам ИЛ-21 стимулирует свою продукцию и экспрессию CXCR5 на наивных Т-клетках in vitro. Именно с действием ИЛ-21 большинство авторов связывают созревание фТх. Этот представитель семейства ИЛ-2 продуцируется Тх17, Тх2, а также, в больших количествах - самими Тфх. Роль этого цитокина в функционировании Тфх не вызывает сомнений, поскольку искусственно созданный дефицит ИЛ-21 или его рецептора ведет, в частности, к угнетению развития зародышевых центров и нарушению переключения изотипов иммуноглобулинов. В то же время, дефицит ИЛ-21 или ИЛ-6 оказывает слабый и не всегда воспроизводимый эффект на образование Тфх in vivo. Кроме того, даже in vitro не все субпопуляции Тфх способны отвечать на экзогенный ИЛ-21. Эти данные не отрицают значения цитокинов в созревании Тфх, но наводят на мысль о важности иных лиганд-рецепторных взаимодействий при контактах будущего Тфх с ДК или В-лимфоцитом.

Среди этой группы «контактных регуляторов» важнейшую роль в созревании Тфх играет молекула ICOS из

семейства CD28 [101]. Дефицит этой молекулы или ее лиганда ведет к нарушению созревания и функционирования Тфх, подавляет продукцию антител, переключение изотипов иммуноглобулинов и формирование зародышевых центров. Источником стимулирующего сигнала являются В-лимфоциты и ДК, экспрессирующие IC0S-лиганд (CD275). Другая молекула из семейства CD28 -PD-1 - является негативным регулятором функционирования Т-клеток. Она экспрессируется на различных субпопуляциях Т-эффекторов и Т-клеток памяти, но наибольший уровень ее экспрессии характерен для Тфх, хелперную функцию которых она ограничивает. Для стимуляции В-лимфоцитов критически необходимо функционирование CD40L, хотя экспрессия этой молекулы и не является специфическим признаком Тфх. Еще одна экспрессируе-мая на фТх молекула 0X40, по-видимому, важна как на этапе взаимодействия с дендритными клетками для стимуляции миграции в В-клеточную зону, так и при функционировании Тфх в зародышевом центре.

Наконец Тфх являются субпопуляцией, преимущественно экспрессирующей CD84 - молекулу семейства SLAM, использующей при внутриклеточной передаче сигнала молекулу SAP. Взаимодействие Т- и В-клеток посредством молекул SLAM стимулирует созревание В-клеток памяти и длительную продукцию антител в зародышевых центрах, но не влияет на образование короткоживущих плазмоци-тов и «острую» фазу атителопродукции. Дефицит CD84, и особенно SAP, угнетает созревание Тфх.

Использование животных с дефицитом В-клеток или отсутствием важнейших молекулярных инструментов взаимодействия Т- и В-лимфоцитов, а также эксперименты с иммунизацией антигеном, нагруженным на ДК, свидетельствуют о значимой роли ДК в индукции ранних событий созревания Тфх и критической необходимости взаимодействия с В-лимфоцитом для окончательного созревания этих Т-хелперов [100, 101].

Существуют данные о том, что важным фактором, определяющим созревание Тфх, является мощность активирующего Т-клетку сигнала. Так, Т-клетки с высокоаффинным антигенсвязывающим рецептором после активации антигеном приобретают CXCR5, продуцируют большие количества ИЛ-21 и ИЛ-4 и экспрессируют характерные для Тфх молекулы 0X40 и Bcl-6. Т-клетки с промежуточной аффинностью созревают в эффекторы с хомингом в нелимфоид-ные ткани, а клетки с низкой аффинностью сохраняют сродство к Т-клеточным зонам лимфоидных тканей [108].

1.7. Регуляторная роль дендритных клеток

Несмотря на то, что основной функцией ДК является презентация антигенов и стимуляция адаптивного иммунного ответа, в определенной ситуации ДК могут реализо-вывать прямо противоположные регуляторные (иммуно-

супрессорные) функции. Считается, что основной физиологической задачей регуляторных ДК является поддержание толерантности к собственным антигенам. Способность индуцировать толерантность обычно связывают с незрелыми ДК. Как уже было сказано выше, основной функцией незрелых ДК является сбор и процессинг антигенного материала. Важно отметить, что объекты, поглощаемые незрелыми ДК, не всегда являются чужеродными. В условиях отсутствия инфекции и повреждения ткани ДК поглощают и процессируют фрагменты внеклеточного матрикса и погибшие от апоптоза клетки макроорганизма. При этом ДК не получают стимула к дальнейшей дифференцировке и сохраняют свой незрелый фенотип и толерогенные свойства [108]. Кроме того, контакт незрелых ДК с регуляторны-ми Т-лимфоцитами, а также с медиаторами, обладающими противовоспалительной активностью, приводит к стабилизации определенных признаков незрелости ДК и формированию устойчивого толерогенного фенотипа [109]. К веществам, индуцирующим формирование стабильного толерогенного фенотипа, относятся интерлей-кин-10 (ИЛ-10), трансформирующий фактор роста-р, гра-нулоцитарный колониестимулирующий фактор, фактор роста гепатоцитов HGF, вазоактивный кишечный пептид VIP, глюкокортикоиды и некоторые химические соединения (метаболиты витамина D3, циклоспорин А, рапами-цин, аспирин) [110, 111, 112]. Толерогенный фенотип ДК характеризуется низким уровнем экспрессии костимули-рующих молекул продукцией подавляющих иммунный ответ цитокинов и наличием специфических молекул семейства В7 (B7-H1/PDL1, B7-H3, B7-H4), повышенной экспрессией молекул ILT3, ILT4 и активностью фермента индоламин-2,3-диоксигеназы, приводящей к дефициту необходимого для Т-лимфоцитов триптофана [109, 113].

При развитии инфекции незрелые ДК поглощают инфекционные агенты и одновременно получают специфические стимулы в виде паттернов патогенов, белков теплового шока и провоспалительных цитокинов. В результате клетки созревают, приобретая способность вовлекать Т-лимфоциты в иммунный ответ, и мигрируют в региональный лимфатический узел. В то же время, из зоны проникновения инфекции в региональный лимфо-идный орган прибывают ДК, не контактировавшие с паттернами патогенов. Индуктором их созревания выступают лишь провоспалительные цитокины, секретируемые в очаге инфекции. Такая стимуляция ведет к образованию т.н. полузрелых ДК. Эти клетки не способны вызывать поляризацию цитокинопродукции у контактировавших с ними Т-лимфоцитов, но способны стимулировать адаптивные регуляторные Т-клетки и, тем самым, участвовать в формировании толерантности [114].

По-видимому, роль различных групп толерогенных ДК

заключается в поддержании аутотолерантности, а также ограничении возможности запуска иммунного ответа вне специализированных зон лимфоидных органов. Обращает на себя внимание то, что условием сохранения толерогенных свойств ДК является отсутствие контактов с паттернами патогенов, а стабилизация толерогенного фенотипа осуществляется в условиях микроокружения богатого противовоспалительными факторами и свойственного местам первичной локализации ДК до развития инфекции и воспаления. В связи с этим увеличивается вероятность того, что толерогенные ДК представляют в основном аутоантигены, в то же время неспецифический характер эндоцитоза ведет к тому, что зрелые ДК со стимулирующими свойствами представляют как аутоантигены, так и фрагменты чужеродных молекул. В результате зрелые ДК могут не только запустить иммунный ответ на чужеродные антигены, но и вызвать срыв аутотолерант-ности. По-видимому, одним из механизмов, предотвращающих срыв аутотолерантности, является подавляющее действие нагруженных аутоантигенами толерогенных ДК на потенциально аутореактивные Т-лимфоциты.

Многообразие функций ДК не исчерпывается презентацией антигенов и регуляцией адаптивного иммунного ответа. Так, различные группы ДК участвуют в реакциях врожденного иммунитета. Выше уже отмечалось, что предшественники плазмоцитоидных ДК являются важнейшими продуцентами интерферонов первого типа. Даже некоторые ДК с толерогенными свойствами (например, ДК, модулированные интерлейкином-10) способны стимулировать воспалительные реакции, в частности хемотаксис и активность нейтрофилов за счет продукции ЭС1Р-1, М1Р-2, СХС1_-4, СХС1_-5 и ИЛ-1. Эти данные позволили предположить, что выбор между толерогенным и иммуностимулирующим фенотипом ДК не обязательно является выбором между подавлением и стимуляцией, а может отражать выбор между врожденными и адаптивными иммунными реакциями [113]. Кроме того, ДК участвуют в Т-клеточном гомеостазе, а именно, в процессе поддержания численности и клонального состава наивных Т-лимфоцитов вне иммунного ответа. Для реализации данной функции необходимы продукция ИЛ-7 и взаимодействие молекул главного комплекса гистосов-местимости ДК с антигенсвязывающим рецептором Т-клеток [115].

1.8. Заключение по теоретическому разделу

Таким образом, ДК представляют собой группу клеток иммунной системы, весьма гетерогенную в функциональном отношении. В зависимости от тканевой локализации, стадии созревания и, что чрезвычайно важно, в зависимости от распознавания паттернов патогенов эти клетки способны выполнять разнообразные функции : запускать или

подавлять иммунный ответ на антиген, функционировать как клетки естественного иммунитета, регулировать процессы врожденного иммунитета. Эти положения становятся чрезвычайно актуальными при разработке новых вакцин, особенно вакцин, основанных на рекомбинантных антигенах. Для повышения иммуногенности таких вакцин применяют различные подходы, от простых (неспецифические адъюванты) до весьма сложных (например, бактериальные антигены, экспрессированные в вакцинном штамме вируса, при этом антиген - бактериальный, паттерны - вирусные). Представляется целесообразным в ходе разработки подобных вакцин проводить предварительную оценку их эффективности, изучая их воздействие на созревание, миграционные и иммуностимулирующие свойства ДК человека. Описанию методов, применимых для решения этой задачи, посвящена следующая часть обзора.

2. МЕТОДЫ, ПРИМЕНИМЫЕ ДЛЯ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ВАКЦИН НА ДК

2.1. Литературные данные о методах исследования действия вакцин и их потенциальных компонентов на ДК

Применение ДК в исследованиях, направленных на совершенствование средств иммунопрофилактики, подробно разберем на примере противотуберкулезных вакцин. Как известно, возбудитель туберкулеза -Mycobacterium tuberculosis (МТ), способен скрываться от иммунного ответа внутри антигенпрезентирующих клеток иммунной системы. Такая изощренная стратегия выживания существенно затрудняет эрадикацию возбудителя и требует от иммунной системы реализации различных типов иммунных реакции и мобилизацию разнообразных клеток, включая Т-хелперы-1, Т-хелперы-17 и цитотоксиче-ские CD8+ Т-лимфоциты. Соответственно, для формирования эффективной защиты противотуберкулезная вакцина должна вызывать активацию такого же широкого набора лимфоцитов и индуцировать формирование различных типов клеток иммунологической памяти. Ситуация с разработкой новых противотуберкулезных вакцин осложняется тем, что типичное заболевание туберкулезом не воспроизводится при заражении микобактериями обычных лабораторных животных. В результате, при разработке новых вакцин ученые вынуждены широко использовать клетки человека в экспериментах in vitro и ex vivo.

Общеизвестно, что для профилактики туберкулеза в странах с высоким распространением этого заболевания используется живая вакцина БЦЖ, содержащая бациллу Calmette-Gu rin (Mycobacterium bovis). Применение этой вакцины сыграло выдающуюся роль в борьбе с инфекцией и позволило переломить катастрофическую ситуацию, сложившуюся с туберкулезом в конце XIX - начале XX веков. Однако, несмотря на широкое использование этой

вакцины и применение антибиотикотерапии туберкулез в развивающихся странах до сих пор остается одной из ведущих причин смертности от инфекционных заболеваний. Такой ограниченный успех зарубежные исследователи связывают с недостаточной иммуногенностью БЦЖ. Проведенный мета-анализ результатов БЦЖ-вакцинации свидетельствует о высокой эффективности БЦЖ для защиты от диссеминированных форм заболевания, включая менингит и милиарный туберкулез (эффективность около 80%). В то же время, анализ демонстрирует недостаточную надежность этой вакцины при защите от легочных форм туберкулеза, особенно во взрослом возрасте (эффективность около 50%) [116, 117, 118]. Ситуация носит определенный парадоксальный характер. С одной стороны, общеизвестны высокие иммуностимулирующие и адъювантные свойства БЦЖ. Эту вакцину используют для неспецифической иммуностимуляции, например, при раке мочевого пузыря. Она повышает эффективность действия других вакцин, введенных в сроки, близкие к БЦЖ-вакцинации. Наконец, БЦЖ входит в состав полного адъ-юванта Фрейнда, широко используемого в лабораторной практике. В то же время анализ действенности БЦЖ-вакцинации показывает, что этих иммуностимулирующих свойств оказывается недостаточно для формирования надежной специфической защиты от такого «сложного» заболевания, как туберкулез. Другим недостатком БЦЖ, побуждающим исследователей к поиску новых вакцин, является опасность развития БЦЖ-инфекции у вакцинируемых детей с иммунодефицитом. Актуальность этой проблемы существенно возрастает с распространением иммунодефицитов, вызванных ВИЧ-инфекцией.

Для выяснения вопроса о причинах недостаточной иммуногенности БЦЖ и возможных путях ее повышения Elena Giacomini с соавт. [119] провела сравнительный анализ действия БЦЖ и Mycobacterium tuberculosis на ДК человека. Для получения ДК использовались моноциты, выделенные из периферической крови центрифугированием на градиенте плотности с использованием Lympholyte-H и последующей положительной селекцией CD14+ клеток с помощью иммуномагнитных бус. Для получения незрелых дендритных клеток моноциты культивировали 5 суток в присутствии ИЛ-4 (1000 ед./мл) и ГМ-КСФ (50 нг/мл) в среде RPMI-1640 с L-глутамином и 15% эмбриональной телячьей сыворотки без добавления антибиотиков. Концентрация моноцитов при засеве составляла 5х105 кл./мл. Культивирование проводили в 6-луночных планшетах. Для оценки чистоты выделенных моноцитов и получаемых из них ДК использовали цитоф-люориметрический анализ экспрессии CD14 и CD1a. Для заражения ДК использовали культуры Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC27294) и БЦЖ (АТСС27291) в фазе

логарифмического роста. Микобактерии собирали, отмывали и переносили в среду RPMI1640 центрифугированием, аликвотировали и замораживали. Отдельные алик-воты использовали для определения концентрации микобактерий с помощью традиционных бактериологических методов. В дальнейшем полученный результат использовали для расчета количества микобактерий для заражения ДК (использовали соотношение бактерий и ДК - 1:1).

Цитофлюориметрический анализ фенотипа ДК через сутки после заражения проводили по экспрессии HLA-DR, CD38, CD83 и CD86. Экспрессию генов цепей ИЛ-12 (р35 и р40) и ИНФ-b проводили с помощью ПЦР, оценку синтеза цитокинов - с помощью ИФА. Иммуностимулирующую активность ДК оценивали в смешанной лимфоцитарной реакции (СЛР) по способности стимулировать аллогенные наивные CD4+ Т-лимфоциты, выделенные непрямой иммуномагнитной сепарацией.

Исследователям удалось обнаружить относительную слабость БЦЖ как индуктора экспрессии гена ИНФ-b в ДК, по сравнению с Mycobacterium tuberculosis. Введение в СЛР экзогенного ИНФ-b нивелировало различия иммуностимулирующих свойств ДК, зараженных БЦЖ и Mycobacterium tuberculosis. В обсуждении авторы предлагают рассмотреть возможность использования ИНФ-b как адъюванта при БЦЖ-вакцинации.

Однако более перспективным представляется разработка новых противотуберкулезных вакцин на основе реком-бинантных или синтетических антигенов и паттернов Mycobacterium tuberculosis. Следует отметить, что работы по идентификации иммуностимулирующих молекул микобактерий ведутся уже давно. Около полувека назад был идентифицирован т. н. корд-фактор (трегалозы 6,6'-дими-колат) - микобактериальный липид, обладающий выраженными иммуностимулирующими свойствами. Затем иммуностимулирующие свойства были обнаружены у многих выделенных из микобактерий веществ, включая воски, липоарабиноманнан и фосфатидилинозитола маннозид. В экспериментах с мышиными ДК, полученными из костномозговых предшественников, стимулирующие свойства были обнаружены у полярных липидов микобактерий: у трех фосфолипидов и трех фосфогликолипидов [120].

В то же время, в экспериментах с использованием ДК человека Claire Andersen с соавт. связала иммуностимулирующую активность БЦЖ, в первую очередь, с её неполярными липидами. Дальнейший анализ позволил выявить наиболее простую структуру, воспроизводящую иммуностимулирующую активность - мономиколил глицерол, а также синтезировать её аналог с 32 атомами углерода в составе молекулы [121]. Стимулирующая активность этих веществ проявлялась в усилении экспрессии маркеров

активации на ДК и синтезе ими провоспалительных цитокинов. В экспериментах использовались клетки крови только PPD-негативных доноров, лимфоциты которых не отвечали на очищенный белковый дериват туберкулина (PPD). Для получения ДК использовались моноциты, выделенные на градиенте плотности фикола с последующей иммуномагнитной сепарацией CD14+ клеток. Полученные моноциты культивировали в среде RPMI1640 с 50 |jM 2-Ь-меркаптоэтанола 100 ед./мл пенициллина 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина и 10% эмбриональной телячьей сыворотки в присутствии 100 нг/мл ГМ-КСФ и 50 нг/мл ИЛ-4 в течение 7 дней. В результате получали незрелые CD1a+CD14-HLA-DR+ ДК с примесью В-, Т-лимфоцитов и моноцитов не более 15 %. Затем незрелые ДК инкубировали в течение суток с контрольными паттернами (ЛПС Escherichia coli O127:B8) или с исследуемыми веществами микобактериального происхождения. Для того чтобы обеспечить контакт гидрофобных веществ с ДК микобактериальные липиды в смеси хлороформа и метанола мерно вносили в пробирки, испаряли растворитель и с помощью ультразвука готовили эмульсию этих липидов в среде RPMI1640. В культуру ДК липиды вносились в концентрации от 0,1 до 100 мкг/мл. Изменения фенотипа ДК оценивались с помощью проточной цитофлюориметрии (оценивали экспрессию CD40, CD86 и HLA-DR). Продукция цитокинов (ИЛ-6 и ФНО-a) определялась с помощью ИФА. Функциональные свойства ДК оценивались в СЛР по способности стимулировать пролиферацию и продукцию ИНФ-g аллогенными Т-лимфоцитами PPD-негативных доноров. Для оценки антигенспецифического ответа Т-лимфоцитов в СЛР использовались сингенные ДК и Т-лимфоциты.

Исследования с использованием ДК in vitro были подтверждены результатами иммунизации мышей смесью потенциальных компонентов противотуберкулезной вакцины в катионных липосомах. В качестве антигенного компонента использовался микобактериальный антиген Ag85B-ESAT-6, роль молекулярного паттерна играл моно-миколил глицерол или его синтетический аналог. Использование естественного или синтетического паттерна существенно увеличивало ответ Т-хелперов первого типа на иммунизацию. Таким образом, использование экспериментов с ДК человека in vitro позволило авторам идентифицировать новые потенциальные компоненты противотуберкулезной вакцины и получить воспроизводимую in vivo информацию о свойствах этих бактериальных веществ и их синтетических аналогов.

Интересное применение ДК нашли в работе Kathryn Whelan с соавт. [122]. Целью работы являлось сравнение эффективности бустерной вакцинации с использованием БЦЖ или новой вакцины MVA85A. Клеточный иммунный

ответ на вакцину оценивали подсчитывая количество Т-лимфоцитов, продуцирующих ИНФ-g после активации PPD. Активацию с помощью PPD проводили ex vivo, количество продуцентов интерферона определяли с помощью метода ELISpot. Исследователи без особых методических ухищрений подсчитали количество PPD-специфичных Т-хелперов первого типа (CD4+ Т-клеток, продуцирующих ИНФ-g), но не смогли оценить антигенспецифиче-ский ответ CD8+ Т-клеток. Количество этих клеток, продуцирующих ИНФ-g в используемых условиях культивирования, было ничтожно мало. Тогда для повышения эффективности активации CD8+ Т-клеток с помощью PPD в культуру были внесены сингенные, полученные из моноцитов ДК, стимулированные ЛПС. Смешанную культуру растили 13 суток с добавлением на первом этапе ИЛ-7, а затем - ИЛ-2. Такое использование иммуностимулирующих свойств ДК позволило выявить антигенспецифиче-ские CD8+ Т-клетки в крови обследуемых.

Относительно недавно в литературе появилась единичная публикация, свидетельствующая о существовании механизмов, которые, возможно, имеют отношение к особенностям иммунного ответа, как на туберкулезную инфекцию, так и на вакцинацию БЦЖ. Valerie Abadie с соавт. с использованием двух флуоресцентных штаммов БЦЖ показали, что в ранние сроки после введения ДК не приносят в дренирующие лимфатические узлы сколь либо значимого количества материала вакцины [123]. Основную массу вакцинных бактерий в лимфоидные органы несут нейтрофильные лимфоциты. Следует отметить, что эксперименты проводились в мышиных моделях и поэтому полученные данные могут быть не вполне корректными. Тем не менее, эти результаты наводят на мысль о том, что инфицирование дендритных клеток бактериями БЦЖ (а это именно инфицирование, поскольку бактерии после поглощения выживают в ДК, так же, как и в макрофагах) может подавлять миграционные свойства ДК и, тем самым, ограничивать их иммуногенный потенциал. В этом случае наиболее перспективным является разработка новых неживых противотуберкулезных вакцин, содержащих антигенный материал и паттерны, стимулирующие не только антигенную презентацию, но и миграцию ДК в лимфоидную ткань, специализированную для индукции адаптивного иммунного ответа. Разработка таких вакцин требует дальнейших исследований управления миграцией ДК паттернами патогенов. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что для полного понимания процессов, индуцированных введением вакцин, необходимо изучать практически неисследованную область иммунологии, а именно процесс обмена антигенов между клетками мигрантами, транспортирующими антигенный материал, и резидентными антигенпрезенти-

рующими клетками лимфоидных органов.

2.2. Адаптированный методы исследования моноци-тарных ДК человека

Ниже описаны наиболее простые методы получения и оценки свойств ДК человека. Аналогичные методические подходы используются для получения ДК в работах по созданию дендритноклеточных вакцин для цитотерапии онкологических заболеваний [124]. Мы использовали данные методы для изучения физиологической роли ДК при беременности, для исследования особенностей развития ДК в раннем детском возрасте, а также для изучения действия вакцин на ДК новорожденных детей [125-130]. Описанные ниже методы адаптированы к применению вакцин или их компонентов в качестве активаторов незрелых дендритных клеток. Методы применимы в условиях научно-исследовательской лаборатории, занимающейся вопросами клеточной иммунологии.

ОПИСАНИЕ МЕТОДА. Для выполнения работы требуются стерильные условия - изолированный бокс и ламинарный шкаф. Все используемые растворы, реагенты, посуда и инструментарий должны быть стерильными.

РЕАГЕНТЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В РАБОТЕ

1. Рекомбинантный человеческий ИЛ-4 (R&D, USA).

2. Рекомбинантный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) (R&D, USA).

3. Рекомбинантный человеческий ФНО-a (R&D, USA).

4. Рекомбинантный человеческий ИЛ-1Ь (R&D, USA).

5. Рекомбинантный человеческий ИЛ-6 (R&D, USA).

6. Простагландин Е2 (Sigma, USA).

7. Hystopaque-1077 (Sigma, USA).

8. Среда DMEM, сухая (Sigma, USA).

9. Фосфатный солевой буфер Дюльбекко А, сухой (PBS^), Sigma, USA).

10. Среда RPMI-1640, жидкая 1х (Gibco, USA).

11. L-глютамин, сухой (ПанЭко, Москва).

12. Эмбриональная телячья сыворотка (РАА, Австрия).

13. Бикарбонат натрия, 7,5% раствор (предприятие ПанЭко, г. Москва).

14. ß-меркаптоэтанол.

15. Полная питательная среда (ППС) для культивирования -среда RPMI-1640 c 10% эмбриональной телячьей сывороткой и L-глютамином в концентрации 584 мг/л. Эмбриональную телячью сыворотку перед использованием инактивировали нагреванием при t +56°С в течение 30 мин.

16. Для отмывок клеток использовали среду DME. Среду разводили из сухого порошка высокоочищенной водой, полученной на аппарате Milli-Q Reference (Millipore). После полного растворения порошка добавляли 49,3 мл 7,5% раствора бикарбоната натрия на 1 л среды. Доводили рН среды до 7,2 и стерилизовали фильтрацией через

фильтры Millipore (USA) с размером пор 0,22 мкм.

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Дендритные клетки получали из моноцитов пуповинной крови здоровых доношенных новорожденных и венозной крови здоровых доноров. Для этого проводили стерильный забор 20 мл крови во флакон с 3 мл раствора гепарина на среде DME (Sigma, USA) (100 ед./мл гепарина). Конечная концентрация гепарина во взятой пробе должна быть не менее 10 ед./мл. Проба должна храниться не более 2 часов в холодильнике. Перед разделением пробы стерильную гепаринизированную кровь разводили средой DME 1:1 (по объему) и тщательно перемешивали пипеткой с широким кончиком. В центрифужные пробирки вносили Hystopaque-1077 (Sigma, USA). Поверх слоя Hystopaque-1077 осторожно наносили разведенную кровь. Для хорошего разделения объем разведенной крови не должен превышать объем Hystopaque-1077 более чем в 2 раза. Пробирки переносили в центрифугу и разделяли клетки в течение 45 мин при 300 g. Затем собирали кольцо мононуклеарных клеток над слоем Hystopaque-1077. Собранную суспензию разводили средой DME с 10 ед./мл гепарина, тщательно перемешивали и осаждали при 300 g 12 минут. Надосадок сливали, осадок разбивали на шей-кере и тщательно ресуспендировали в среде DME с 2% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт Петербург). Из суспензии микропипеткой забирали пробу клеток для подсчета в камере Горяева. Проводили подсчет клеток. Затем клетки осаждали при 200 g 7 минут. Надосадок сливали, осадок разбивали и добавляли к нему заранее рассчитанный объем ППС для получения суспензии клеток c концентрацией 4-5х106 клеток/мл.

ВЫДЕЛЕНИЕ МОНОЦИТОВ

Клетки засевали в 24-луночные планшеты (Costar, USA) и инкубировали 3 часа при t +37°С и 5% СО2. В 1 лунку вносили по 1 мл суспензии клеток. По истечении срока инкубации неприлипшие клетки осторожно ресуспендировали покачивая планшет и совершая им круговые движения. Процедуру надо выполнять осторожно, не заплескивая средой крышку планшета. Затем неприлипшие клетки смывали с поверхности пластика тремя порциями ППС, в лунки с моноцитами вносили по 750 мкл ППС и с помощью микроскопии контролировали чистоту удаления неприлипших клеток и плотность засева моноцитов (она должна быть близка к монослою). При низкой плотности засева моноцитов велика вероятность массовой гибели клеток на 3-5-й день культивирования. В случае получения недостаточно плотной культуры моноцитов мы рекомендуем повторить адгезию с новой порцией мононуклеарных клеток, а не пытаться пересеять имеющиеся моноциты с целью увеличения

плотности культуры.

ПОЛУЧЕНИЕ НЕЗРЕЛЫХ ДК

Для получения незрелых ДК в лунки добавляли ГМ-КСФ до концентрации 100 нг/мл и ИЛ-4 до концентрации 20 нг/мл. Клетки инкубировали трое суток при t +37°С и 5% СО2. Затем в лунки вновь добавили 20 нг/мл ИЛ-4 и 100 нг/мл ГМ-КСФ. Клетки культивировали еще 3 или 4 суток, затем пересевали со стимуляторами созревания. При необходимости более длительного культивирования незрелых ДК на 6-е или 7-е сутки от выделения моноцитов в лунки необходимо добавить новую порцию ИЛ-4 и ГМ-КСФ в тех же концентрациях. Тогда срок культивирования незрелых ДК можно продлить до 12 суток.

ИНДУКЦИЯ СОЗРЕВАНИЯ ДК С ПОМОЩЬЮ ВАКЦИН

После окончания срока культивирования с ИЛ-4 и ГМ-КСФ среду в лунках с незрелыми ДК заменяли свежей, и в лунки вносили образцы исследуемых вакцин или стандартные активаторы созревания. Для получения зрелых ДК, используемых в качестве стандарта (позитивного контроля созревания), в лунки вносили смесь медиаторов воспаления следующего состава: 25 нг/мл ИЛ-Iß (R&D, USA), 25 нг/мл ИЛ-6 (R&D, USA), 50 нг/мл ФНО-a (R&D, USA), 1 мкг/мл простагландина Е2 (Sigma, USA). В другие лунки вносили исследуемые вакцины. Исходя из суггестивных расчетов возможных концентраций вакцин, создаваемых локально в месте их введения, мы рекомендуем использовать конечные концентрации в пределах от 0,002 до 0,2 доз вакцин на 1 мл среды. Для получения незрелых ДК (негативного контроля созревания) в лунки не вносили стимуляторы. Клетки инкубировали еще двое суток при +37°С и 5% СО2. Полученные клетки собирали для определения их функциональных и фенотипических свойства. Среду из культур клеток собирали для определения в ней содержания цитокинов с помощью иммуноферментных тест-систем. Функциональные свойства полученных клеток определяли по их способности стимулировать пролиферацию аллогенных лимфоцитов и продукцию ими цитокинов.

2.3. Адаптированные методы оценки свойств ДК

ОЦЕНКА МОРФОЛОГИИ ДК

Для оценки морфологии дендритных клеток в культуре рекомендуется использовать световой инвертированный микроскоп, желательно с функцией фазового контраста. Оптимальным для прижизненной оценки морфологии клеток является использование модуляционного фазового контраста Хофмана. Также для оценки морфологии дендритных клеток возможно использование микроскопии и фотодокументации фиксированных мазков окрашенных традиционными способами (например, по Романовскому). Полезным для оценки морфологии и фенотипа дендритных клеток могут оказаться иммуноги-

стохимические методы, например окрашивание молекулы главного комплекса гистосовместимости типа II HLA-DR на поверхности фиксированных клеток. Для этого мы использовали отечественные или импортные монокло-нальные антитела исследуемой молекулы и систему иммуноферментной визуализации LSAB2 фирмы Dako.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ МЕМБРАННЫХ МОЛЕКУЛ

При фенотипическом исследовании ДК и их предшественников, выделенных из крови, лимфы или других тканей человека, а также ДК, полученных в культурах, первостепенный интерес представляет экспрессия молекул, непосредственно ассоциированных с функцией этих клеток. Это молекулы главного комплекса гистосовмести-мости первого и второго класса, а также молекулы, отвечающие за передачу стимулирующих сигналов при взаимодействии с Т-лимфоцитами: CD40, CD80, CD83 и CD86. Высокий уровень экспрессии этих молекул характерен для зрелых дендритных клеток, способных эффективно стимулировать иммунные реакции. Толерогенные свойства дендритных клеток обычно связывают с низким уровнем экспрессии молекул костимуляции и наличием выраженной экспрессии другой группы молекул - 03 и 04, а также специфических молекул семейства В7 (B7-H1/PDL1, В7-Н3, В7-Н4).

ТАБЛИЦА.

Действие вакцин на HLA-DR C D14 C D80 CD83 CD86

Незрелые ДК (негативный контроль) 96,1 ± 2,6 9,5 ± 3,9 84,3 ± 7,0 13,4 ± 2,2 62,6 ± 8,0

Зрелые ДК (позитивный контроль) 97,0 ± 1,5 8,3 ± 5,5 95,8 ± 3,8 * 75,9 ± 9,7 91,8 ± 5,7

ДК + вакцина БЦЖ 93,6 ± 3,5 5,1 ± 2,4 91,5 ± 8,4 * 63,4 ± 15,1 * 88,1 ± 7,6 *

ДК + вакцина гепатита В 98,4 ± 0,7 5,3 ± 4,1 82,5 ± 8,0 * 51,5 ± 7,8 * 92,2 ± 1,7 *

Для получения информации об особенностях распознавания паттернов патогенов следует использовать моно-клональные антитела к толл-подобным рецепторам ДК. При этом для окрашивания внутриклеточно расположенных паттерн-распознающих рецепторов необходимо использовать технику пермеабилизации мембраны с помощью сапонина перед добавлением антител.

Также функциональные свойства дендритных клеток характеризуют молекулы, ассоциированные с фагоцитозом. В частности, к ним относятся лектиновые рецепторы, отвечающие за связывание полисахаридных структур микроорганизмов: это лектины С-типа: DC-SIGN или CD209, DEC205/CD205, лангерин CD207, маннозный рецептор CD206. За интернализацию различных бактерий отвечают scavenger-рецепторы. Взаимодействие с ком-

плексами антиген-антитело осуществляют рецепторы для Fc-фрагментов иммуноглобулинов. С процессингом антигена связывают функции DC-LAMP или CD208.

Для изучения миграционных свойств наиболее информативные и хорошо интерпретируемые результаты дает оценка экспрессии рецепторов хемокинов. Для этого мы оцениваем экспрессию CCR7 - ключевого хемокинового рецептора для миграции в Т-клеточные зоны ЛУ и CXCR5-рецептора, направляющего ДК в фолликулы ЛУ.

В качестве маркеров различных типов дендритных клеток используются: CD11c характерна для типичных миелоидных дендритных клеток и их предшественников; CD123 (а-цепь рецептора для ИЛ-3), BDCA-2 и BDCA-4 - для выявления плазмоцитоидных дендритных клеток; CD1a, Е-кадгерин и лангерин CD207 характерны для клеток Лангерганса.

Методом выбора для изучения экспрессии мембранных молекул на дендритных клетках является иммунофлюо-ресцентное окрашивание с помощью меченных флюорох-ромами моноклональных антител с последующим анализом проб на лазерном проточном цитофлюориметре. Для исследования экспрессии мембранных маркеров мы рекомендуем использовать моноклональные антитела к молекулам HLA-DR, СD14, CD80 и CD86, меченные ФИТЦ или фикоэритрином. Для анализа экспрессии CD83, CCR7 и CXCR5 рекомендуется использовать антитела, меченные фикоэритрином или аллофикоцианином. Использование ФИТЦ-меченных антител к этим молекулам не дает удовлетворительных результатов. Пример результатов эксперимента по оценке действия вакцин на уровень экспрессии молекул, ассоциированных с функцией ДК, приведен в таблице. При низком уровне экспрессии CCR7 на поверхности ДК полезным оказывается определение экспрессии его гена с помощью относительной количественной ПЦР в реальном времени.

ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ДК

Продукция цитокинов дендритными клетками оценивается с помощью иммуноферментного анализа содержания цитокинов в надосадке из культур клеток. Рекомендуется оценивать концентрацию ИЛ-12р70, необходимого для стимуляции Т-хелперов первого типа, про-воспалительных цитокинов ИЛ-1р, фактора некроза опухолей-а, противовоспалительного цитокина ИЛ-10, а также цитокина ИЛ-6. Иммуно-ферментный анализ всех цитокинов, кроме ИЛ-6, рекомендуется проводить с неразведенными надосадками. Пробы для определения концентрации ИЛ-6 следует перед постановкой реакции разводить в 5-10 раз из-за высокого уровня продукции этого цитокина в культурах.

Функциональные свойства полученных клеток определят по их способности стимулировать пролиферацию

аллогенных лимфоцитов взрослых здоровых доноров в СЛР. Для этого лимфоциты (неприлипающие к пластику мононуклеарные клетки венозной крови) или выделенные иммуномагнитной сепарацией наивные CD4+ Т-лимфоциты засевали в лунки 96-луночных планшетов в ППС в концентрации 1,5х106 клеток/мл. Затем в лунки вносили исследуемые ДК. Рекомендуемые соотношения ДК и лимфоцитов от 1 к 50 до 1 к 10. Лунки без добавления моноцитов и дендритных клеток использовались в качестве контрольных. Каждый вариант микрокультуры засевался в трех повторах. Планшеты инкубировали при t +37°С и 5% СО2. Пролиферацию оценивали по включению меченного тритием метилтимидина («Изотоп», Санкт Петербург). Оптимальный срок добавления радиоактивной метки в смешанную культуру лимфоцитов соответствовал 3-5 суткам от начала культивирования. Метилтимидина добавляли в лунки по 0,5 мк Кюри на срок 24 ч. После культивирования планшеты замораживали, размораживали, хроматин клеток переносили на сте-кловолокнистые фильтры (Titertek, USA) и включение метки в ДНК анализировали с помощью ß-сцинцилляционного счетчика.

Для оценки способности дендритных клеток стимулировать лимфоциты к продукции интерферона-g, ИЛ-4 и ИЛ-5 выполняли постановку СЛР так, как это описано выше, но вместо добавления радиоактивной метки из смешанных культур лимфоцитов собирали надосадки через 120 часов культивирования. Количественную оценку содержания цитокинов в надосадках из смешанных культур проводили с помощью твердофазного иммунофер-ментного анализа.

Наиболее простой способ оценки миграции ДК -использование системы типа Transwell со вставками к 24-луночным планшетам. Рекомендуем использовать вставки с диаметром пор 8 мкм. Для постановки реакции спонтанной миграции готовят суспензию ДК в ППС с концентрацией 106 кл./мл. В нижнюю камеру (лунку планшета) вносят 600 мкл ППС, в верхнюю камеру (вставку) - 100 мкл суспензии ДК. Планшет инкубируют в СО2-инкубаторе 12 часов, вставки аккуратно вынимают и подсчитывают количество клеток, проникших в нижнюю камеру с использованием лазерного проточного цитофлюориметра. Для этого среду в лунках ресуспендируют, переносят в пробирки для цитометрии и проводят анализ образца в DotPlot FSC/SSC. Подсчитывают количество событий в гейте ДК за фиксированное время анализа (обычно 1 или 2 мин). Для оценки хемотаксиса ДК эксперимент проводится аналогично, но в нижнюю камеру вносят хемокин (мы используем CCL21 в конечной концентрации 200 или 500 нг/мл). При этом вместо ППС рекомендуем использовать среду RPMI-1640 без сыворотки, а время миграции

сократить до 2 или 3 часов.

2.4. Заключение

В изложенном выше материале представлены лишь основные данные о физиологической роли и методах исследования ДК. Объем материалов, посвященных ДК, огромен, причем исследования в данном направлении иммунологии в течение последних лет постоянно увеличивают свою интенсивность. Эти исследования направлены на решение не только фундаментальных, но и сугубо практических задач. К настоящему времени уже создано новое поколение иммуностимулирующих лекарственных средств, представляющих собой химически чистые минимальные биологически активные фрагменты паттернов или синтетические лиганды толл-подобных рецепторов. Разработкой и выпуском этих препаратов занимаются более 20 крупных фармацевтических компаний, а инвестиции в эту область фарминдустрии уже в 2007 году составили более 1,5 млрд $. Создание этих препаратов было бы невозможно без исследований паттерн-распоз-нающих рецепторов ДК. Разработаны и применяются методы использования дендритноклеточных вакцин для цитотерапии онкологических и даже инфекционных заболеваний. Не вызывает сомнения, что дальнейшие активные исследования ДК позволят разработать принципиально новые средства специфической иммунопрофилактики инфекционных заболеваний, а также новые методы лечения болезней, связанных с дефектами работы иммунной системы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология. 2006. Т. 27. № 6. С. 368-378.

Paschenkov M.V., Pinegin B.V. Physiologya kletok vrozgdennoy immunnoy systemi: dendritnie kletki. Immunologya. 2006. Т. 27. N 6. S. 368-378.

2. Colonna M., Trinchirei G., Liu Y. J. Plasmacytoid dendritic cells in immunity. Nat. Immunol. 2004. V. 5. P. 1219-1226.

3. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by Dendritic Cells. Annu. Rev. Immunol. 2002. V. 20. P. 621-667.

4. Mellman I., Steinman R. M. Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell. 2001. V. 106. P. 255-258.

5. Merad M., Manz M. G, Karsunky H, Wages A., Peters W. Langerhans cells renew in the skin throughout life under steady-state conditions. Nat. Immunol. 2002. V. 3. P. 1135-1141.

6. Steinman R. M. The dendritic cell system and its role in immunogenicity. Annu. Rev. Immunol. 1991. V. 9. P. 271-296.

7. Wu L., Dakik A Development of dendritic cell sysem. Cell. Mol. Immunol, 2004. V. 1. № 2. P. 112-118.

8. Wu L., Liu Y-J. Development of dendritic-cell lineages. Immunity. 2007. V. 26. P. 741-750.

9. Blois S. M., Alba Soto C. D., Tometten M., Klapp B. F., Marguni R. A., Arck P.C. Lineage, maturity, and phenotype of uterine murine dendritic cells throughout gestation indicate a protective role in maintaining pregnancy. Biol. Reprod. 2004. V. 70. P. 1018-1023.

10. Culter C. W., Jotwani R. Dendritic cells at the oral mucosal interface. J. Dent. Res. 2006. V. 85. P. 678-689.

11. Stagg A.J., Hart A.L., Knight C.S., Kamm M.A. The dendritic cell: its role in

intestional inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 2003. V. 52. P. 1522-1529.

12. Schwarzenberger K., Udey M. C. Contact allergens and epidermal proinflammatory cytokines modulate Langerhans cell E-cadherin expression in situ. J. Invest. Dermatol. 1996. V. 106(3). P. 553-558.

13. Cools N., Ponsaerts P., Van Tendello V. F. I., Berneman Z. N. Balancing between immunity and tolerance: an interplay between dendritic cells, regulatory T cells, and effector Tcells. J. Leuk. Biol. 2007. V. 82(6). P. 1365-1374.

14. Yang G. X., Lian Z. X., Kikuchi K. Moritoki Y., Ansari A. A., Liu Y. J., Ikehara S., Gershwin M. Plasmacytoid dendritic cells of different origins have distinct characteristics and function: studies of lymphoid progenitors versus myeloid progenitors. J. Immunol. 2005. V. 175 (11). P. 7281-7287.

15. Siegal F. P., Kadowaki N., Shodell M., et al. The nature of the principal type I interferon-producing cells in human blood. Science. 1999. V. 284. P. 1835-1837.

16. Alvarez D., Vollmann E.H. and von Andrian U. H. Mechanisms and Consequences of Dendritic Cell Migration. Immunity. 2008. V. 29(3). P. 325.

17. Wu L., Vandenabelle S., Georgopulos K. Derivation of dendritic cells from myeloid and lymphoid precursors. Intern. Rev. Immunol. 2001. V. 20. P. 117-135.

18. Encabo A., Solves P., Mateu E., et al. Selective Generation of Different Dendritic Cell Precursors from CD34+ Cells by Interleukin-6 and Interleukin-3. Stem Cells. 2004. V. 22. P. 725-740.

19. Ishikawa F., Niiro H., Iino T., Yoshida S., Saito N., Onohara S., Miyamoto T., Minagawa H., Fujii S., Shultz L. D., Harada M., Akashi K. The developmental program of human dendritic cells is operated independently of conventional myeloid and lymphoid pathways. Blood. 2007. V. 110 (10). P. 3591-3600.

20. Naik S.H., Sathe P., Park H.Y., Met-calf D., Proietto A.I., Dakic A., Carotta S., O'Keeffe M., Bahlo M., Papenfuss A., Kwak J.Y., Wu,L., Shortman,K. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat.Immunol. 2007. V. 8. P. 1217-1226

21. Chopin M. Allan R.S., Belz G.T. Transcriptionalregulationofdendriticcelldi versity. Frontiers in immunology. 2012. V.3 Article 26. doi: 10.3389/ fimmu.2012.00026

22. Randolph G. J., Ochando J., Patrida-Sanchez S. Migration of dendritic cell subsets and their precursors. Annu. Rev. Immunol. 2008. V. 26. P. 293-316.

23. Valladeau J., Saeland S. Cutaneous dendritic cells. Sem. Immunol., 2005. V. 17. P. 273-283.

24. Ito T., Inaba K., Toki J., Sogo S., Iguchi T. A CD1a+/CD11c+ subset of human blood dendritic cells is a direct precursor of Langerhans cells. J. Immunol. 1999. V. 163. P. 1409-1419.

25. Valladeau, J., Duvert-Frances V., Pin J. J., et al. The monoclonal antibody DCGM4 recognizes Langerin, a protein specific of Langerhans cells, and is rapidly internalized from the cell surface. Eur. J. Immunol. 1999. V. 29. P. 26952704.

26. Valladeau J., Ravel O., Dezutter-Dambuyant C., et al. Langerin, a novel C-type lectin specific to Langerhans cells, is an endocytic receptor that induces the formation of Birbeck granules. Immunity. 2000. V. 12. P. 71-81.

27. Geissmann F., Prost C., Monnet J.P., Dy M., Drousse N., Hermine O. Transforming growth factor beta1, in presrnce of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and interleukin 4, induces differentiation of human peripheral blood monocytes into dendritic Langerhans cells. J. Exp. Med. 1998, V. 187. P. 961-966.

28. Bechetoille N. J. V. F. G., Dumont S., Marechal S., Gofflo S., Andre V., Schmitt D., Perrier E. IL13 is more efficient than IL4 for recruiting langerhans cell precursors from peripheral blood monocytes. Exogenous Dermatol. 2003. V. 1. P. 279-289.

29. Strunk D., Rappersberger K., Egger C., Strobol H., Kromer E., Elbe A., et al. Generation of human dendritic cells/Langerhans cells from circulating CD34+ hematopoietic progenitor cells. Blood. 1996, V. 87. P. 1292-1302.

30. Rissoan M-C., Soumelis V., Kadowaki N., et al. Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation. Science. 1999. V. 283. P. 1183-1186.

31. Ban Y. L., Kong B. H., Qu X., Yang Q. F., Ma Y. Y. BDCA-1+, BDCA-2+ and BDCA-3+ dendritic cells in early human pregnancy decidua. Clin. Exp. Immunol. 2008. V. 151(3). P. 399-406.

32. Grouard G., Rissoan M.C., Filgueira L., Durand I., Banchereau J., Liu Y.J. The enigmatic plasmacytoid T cells develop into dendritic cells with interleukin (IL)-3 and CD40-ligand. J. Exp. Med. 1997. V. 185. P. 1101-1111.

33. Ward K. A., Stewart L. A, Schwarer A. P. CD34+-derived CD11c+++BCDA-1++CD123++DC: expansion of a phenotypically undescribed myeloid DC1 population for use in adoptive immunotherapy Cytotherapy. 2006. V. 8(2). P. 120-140.

34. Cella M., Jarrossay D., Facchetti F., Alebardi O., Nakajima H., Lanzavecchia A., Colonna M. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon. Nat Med. 1999. V. 5(8). P. 919-23. —35. Fiebiger E., Meraner P., Weber E., Fang I. F., Stingl G., Ploegh H., Maurer H. Cytokines regulate proteolysis in major histocompatibility complex class II -dependent antigen presentation by dendritic cells. J. Exp. Med. 2001. V. 193. P. 881-892.

36. Chehimi J., et al. Dendritic cells and INF--producing cells are two functionally distinct non-B, non-monocytic HLA-DR+ cell subsets in human perotheral blood. Immunology. 1989. V. 68, p 488-490

37. Asselin-Paturel C., et al. Mouse type I INF-producing cells are immature APCs with plasmacytoid morthology. Nat. Immunol. 2001. V. 2. P. 1144-1150.

38. Birmachu W., Gleason R. M., Bulbulian B. J., Riter C. L., Vasilakos J. P., Lipson K. E., Nikolsky Y. Transcriptional networks in plasmacytoid dendritic cells stimulated with synthetic TLR 7 agonists. BMC Immunol. 2007. V. 8. P. 26.

39. Martinson J. A., Tenorio A. R., Montoya C. J. Al-Harthi L., Gichinga C. N., Krieg A. M., Baum L. L., Landay A. L. Impact of class A, B and C CpG-oligodeoxynucleotides on in vitro activation of innate immune cells in human immunodeficiency virus-1 infected individuals. Immunology. 2007. V. 120 (4). P. 526-535.

40. Cella M., Facchetti F., Lanzavecchia A., Colonna M. Plasmacytoid dendritic cells activated by influenza virus and CD40L drive a potential Th-1 polarization. Nat. Immunol. 2000. V. 1. P. 305-310.

41. Jutras I., Desjardins M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2005. V. 21. P. 511-527.

42. Norbury C.C. Drinking a lot is good for dendritic cells. Immunology. 2006. V. 117. P. 443-451.

43. Gordon S. Pattern recognition receptors: doubling up for the innate immune response. Cell. 2002. V. 111. P. 927-930.

44. Savina A., Amigorena S. Phagocytosis and antigen presentation in dendritic cells. Immunol. Rev. 2007. V. 219. P. 143-156.

45. Maric M., Arunachalam B., Phan U. T., Dong C., Garrett W. S., Cannon K. S., Alfonso C., Karlsson L., Flavell R. A., CresswellP. Defective antigen processing in GILT-free mice. Science. 2000. V. 294. P. 1361-1365.

46. Lennon-Dumenil A. M., Bakker A. H., Maehr R., Fiebiger E., Overkleeft H. S., Rosemblatt M., Ploegh H. L., Lagaudrire-Gesbert C. Analysis of protease activity in live antigen-presenting cells shown regulation of the phagosomal proteolytic contents during dendritic cell activation. J. Exp. Med. 2002. V. 196. P. 529-540.

47. Delamarre L., Pack M., Chang H., Mellman I., Trombetta E. S. Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate. Science. 2005. V. 307. P. 16-30-1634.

48. El-Sukkari D., Wilson N. S., Hakansson K., Steptoe R. J., Grubb A., Shortman K., Villadangos J. A. The protease inhibitor cystatin C is differentially expressed among dendritic cell population, but does not control antigen presentation. J. Immunol. 2003. V. 171. P. 5003-5011.

49. Hall A., EkielI., MasonR.W., Kasprzykowski F., Grubb A., Amrahamson M. Structural basis for different inhibitory specificities of human cystatins C and D. Biochemistry. 1998. V. 37. P. 4071-4079.

50. Shirahama-Noda K., Yamamoto A., Sugihara K., Hashimoto N., Asano M., Nishimura M., Hara-Nishimura I. Biosynthetic processing of cathepsins and lysosomal degradation are abolished in asparaginyl endopeptidase-deficient mice. J. Biol. Chem. 2003. V.278. P. 33194-33199.

51. Maehr R., Hang H. C., Mintern J. D., Kim Y. M., Cuvillier A., Nishimura M., Yamada K., Shirahama-Noda K., Hara-Nishimura I., Ploegh H. L. J. Asparagine endopeptidase is not essential for class II MHC antigen presentation but is required for processing of cathepsin L in mice. Immunology. 2005. V. 174. P. 7066-7074.

52. Savina A., Jancic C., Hugues S., Guermonprez P., Vargas P., Moura I.C., Lennon-Dum nil A. M., Seabra M.C., Raposo G., Amigorena S. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 2006. V. 126. P. 205-218.

53. Trombetta E. S., Ebersold M., Garrett W., Pyparet M., Mellman I.

Activation of lysosomal function during dendritic cell maturation. Science. 2003. V. 299. P. 1400-1403.

54. Elsen S., Doussiere J., Villiers C. L., Faure M., Berthier R., Papaioannou A., Grandvaux N., Marche P. N., Vignais P. V. Cryptic O2-generating NADPH oxidase in dendritic cells. J. Cell Sci. 2004. V. 117. P. 2215-2226.

55. Porcelli S.A., Modlin R.L. The CD1 system: antigen-presenting molecules for T-cell recognition of lipids and glycolipids. Annu. Rev. Immunol. 1999. V. 17. P. 297-329.

56. Ярилин A. A. Основы иммунологии. Москва, Медицина, 1999. 607 с. Yarilin A.A. Immunologia. Moskva: Medicina. 1999. 607 s.

57. Watts C. The exogenous pathway for antigen presentation on major histocompatibility complex class II and CD1 molecules. Nat. Immunol. 2004. V. 5. P. 685-692.

58. Blander M. J. Phagocytosis and antigen presentation: a partnership initiated by Toll-like receptors. Ann. Rheum. Dis. 2008. V. 67 (Supll. III). P. 44-49.

59. Rock K L., Gamble S., Rothstein L. Presentation of exogenous antigen with class I major histocompatibility complex molecules. Science. 1990. V. 249. P. 918-921.

60. Heath W. R., et al. Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunol. Rev. 2004. V. 199. P. 9-26.

61. Cresswell P., Ackerman A. L., Giodini A., Peaper D. R., Wearsch P. A. Mechanisms of MHC class I-restricted antigen processing and crosspresentation. Immunol. Rev. 2005. V. 207. P. 145-157.

62. Ackerman A. L., Cresswell P. Cellular mechanisms governing cross-presentation of exogenous antigens. Nat. Immunol.2004. V. 5. P. 678-684.

63. Neijssen J., Herberts C., Drijfhout J. W., Reits E., Janssen L., Neefjes J. Crosspresentation by intercellular peptide transfer through gap junctions. Nature. 2005. V. 434. P. 83-88.

64. Nakagawa T. Y., Brisette W. H., Lire P. D., et al. Impared invariant chain degradation and antigen presentation and diminished collagen-induced arthritis in cathepsin S null mice. Immunity. 1999. V. 10. P. 207-217.

65. Shi G.P., Villadangos J.A., Dranoff G., et al. Cathepsin S required foe normal MHC class II peptide loading and germinal center development. Immunity. 1999. V. 10 (2). P. 197-206.

66. Barral D. C., Brenner M. B. CD1 antigen presentation: how it works. Nat. Rev. 2007. V. 7. P. 929-941.

67. Angenieux C. et al. The cellular pathway of CD1e in immature and maturing dendritic cells. Traffic. 2005. V. 6. P. 286-302.

68. de la Salle H., et al. Assistance of microbial glycolipid antigen processing by CD1e. Science. 2005. V. 310. P. 1321-1324.

69. Garrett W. S., Chen L. M., Kroschewski R., Ebersold M., Turley S., Trombetta S., Gal n J. E., Mellman I. Developmental control of endocytosis in dendritic cells by Cdc42. Cell. 2000. V. 102(3). P. 325-334.

70. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signalling. Nat. Rev. Immunol. 2004. V. 4. P. 499-511.

71. Akira S., Uematsu S., Takeuchi O. Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 2006. V. 124. P. 783-801.

72. Симбирцев А. С. Толл-белки: специфические белки неспецифического иммунитета. Иммунология. 2005. Т. 26. № 6. С. 368-377.

Simbirzev A.S. Toll-belki: specifichnie belki nespecificheskogo immuniteta. Immunologiya. 2005. T. 26. N 6. S. 368-377.

73. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 2002. V. 296 (5566). P. 301-305.

74. Reise Sousa C. Dendritic cells in a mature age. Nat. Rev. Immunol. 2006. V. 6. P. 476-483.

75. Amsen D., Antov A., Jankovic D., Sher A., Radtke F., Souabni A., et al. Direct regulation of Gata3 expression determines the T helper differentiation potential of Notch. Immunity. 2007. V. 27. P. 89-99.

76. Zobywalski A., Javorovie M., Frankenberger B., Pohla H., Kremmer E., Bigalke I., Schendel D.J. Generation of clinical grade dendritic cells with capacity to produce biologically active IL-12p70. J. Transl. Med. 2007. V. 5. P. 18.

77. Iwasaki A., Medzhitov R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 2004. V. 5. P. 987-995.

78. Saitoh S. et al. Lipid A antagonist, lipid IVa, is distinct from lipid A in interaction with Toll-like receptor 4 (TLR4)-MD-2 and ligand-induced TLR4 oligomerization. Int. Immunol. 2004. V. 16. P. 961.

79. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity. Internat. Immunol. 2005. V. 17. P. 1-14.

80. Horng T., Barton G. M., Flavell R. A. Medzhitov R. The adaptor molecule TIRAP provides signaling specificity for Toll-like receptors. Nature. 2002. V. 420. P. 329-333.

81. Yamamoto M. et al. Essential role of TIRAP/Mal for activation of the signaling cascade shared by TLR2 and TLR4. Nature. 2002. V. 420. P. 324-329. —82. Diebold S. S. et al. Viral infection switches nonplasmacytoid dendritic cells into high interferon producers. Nature. 2003. V. 424. P. 324-328.

83. Sallusto F., Schaerli P., Loetscher P., Schaniel C., Lenig D., Mackay C.R., Qin S., Lanzavecchia A. Rapid and coordinated switch in chemokine receptor expression during dendritic cell maturation. Eur. J. Immunol. 1998, V. 28(9). P. 2760-2769.

84. Villablanca E. J., Russo V., Mora R. Dendritic cell migration and lymphocyte homing imprinting. Histol. Histopathol. 2008. V. 23. P. 897-910.

85. Ayehunie S., Garcia-Zepeda E. A., Hoxie J. A., Horuk R., Kupper T. S., Luster A. D., Ruprecht R. M. Human immunodeficiency virus-1 entry into purified blood dendritic cells through CC and CXC chemokine coreceptors. Blood. 1997. V. 90(4). P. 1379-1386.

86. Randolph G. J., Angeli V., Swartz M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph node through lymphatic vessels. Nat. Rev. Immunol. 2005. V. 5. P. 617-628.

87. Luther S. A., Tang H. L., Hyman P. L., et al. Coexpression of the chemokines ELC and SLC by Tzone stromal cells and deletion of the ELC gene in the plt/plt mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 12694-12699.

88. Witte M.H., Jones K., Wilting J., Dictor M., Selg M., McHale N., Gershenwald J.E., Jackson D.G. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 2006. V. 25(2). P. 159-184.

89. Lindquist R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nat. Immunol. 2004. V. 5. P. 1243-1250.

90. Cahalan M.D., Parker I. Imaging the choreography of lymphocyte trafficking and the immune response. Curr. Opin. Immunol., 2006. V. 18. P. 476-482.

91. Gretz J. E., Anderson A. O., Shaw S. Cords, channels, corridors and conduits: critical architectural elements facilitating cell interactions in the lymph node cortex. Immunol. Rev. 1997. V. 156. P. 11-24.

92. Wei S. H., Parker I., Miller M. J., Cahalan M. D. A stochastic view of lymphocyte motility and trafficking within the lymph node. Immunol. Rev., 2003. V. 195. P. 136-159.

93. Bajenoff M., et al. Stromal cell networks regulate lymphocyte entry, migration, and territoriality in lymph nodes. Immunity. 2006. V. 25. P. 989-1001.

94. Asperti-Boursin F., RealE., Bismuth G., Trautmann A., Donnadieu E. CCR7 ligands control basal Tcellmotility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J. Exp. Med. 2007. V. 204. P. 1167-1179.

95. Woolf E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat. Immunol. 2007. V. 8. P. 1076-1085.

96. Grakoui A., Bromley S. K., Sumen C. Davis M. M., Shaw A. S., Allen P. M. and Dustin M. L. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 1999. V. 28. P. 221-227.

97. Ярилин А. А. Иммунный синапс как структурная основа презентации антигена. Иммунология. 2003. Т. 24. № 6. С. 347-350.

Yarilin A.A. Immunniy synaps kakstrukturnaya osnova prezentazii antigena. Immunologiya. 2003. Т. 24. N 6. S. 347-350.

98. Champagne P., Ogg G. S., King A. S. et al. Skewed maturation of memory HIV-specific CD8 T lymphocytes. Nature. 2001. V. 410. P. 106-111.

99. Tipping P. G., Kitching A. R., Glomerulonephritis, Th1 and Th2: what's new? Clin. and Exp. Immunol. 2005. V. 142. P. 207-215.

100. Ueno H., Schmitt N., Palucka A.K., Banchereau J. Dendritic Cells and Humoral Immunity in Humans. Immunol Cell Biol. 2010 May; 88(4): 376-380.

101. Ma C.S., Deenick E.K., Batten M., Tangye S.G. The origins, function, and regulation of T follicular helper cells. J. Exp. Med. 2012. V. 209 No. 7. P. 12411253.

102. Weinstein J.S., Hernandez S.G., Craft J. T Cells that promote B-cell maturation in systemic autoimmunity. Immunol. Rev. 2012. V. 247(1). P. 160171.

103. Frster, R., T. Emrich, E. Kremmer, and M. Lipp. 1994. Expression of the

G-protein—coupled receptor BLR1 defines mature, recirculating B cells and a subset of T-helper memory cells. Blood. 84:830-840.

104. Breitfeld, D., L. Ohl, E. Kremmer, J. Ellwart, F. Sallusto, M. Lipp, and R. Fцrster. 2000. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J. Exp. Med. 192:1545-1552.

105. Schaerli, P., K. Willimann, A.B. Lang, M. Lipp, P. Loetscher, and B. Moser. 2000. CXC chemokine receptor 5 expression defines follicular homing T cells with B cell helper function. J. Exp. Med. 192:1553-1562.

106. Schmitt N., Morita R., Bourdery L., Bentebibel S.E., Zurawski S.M., Banchereau J., Ueno H. Human Dendritic Cells Induce the Differentiation of Interleukin-21-producing T Follicular Helper-like Cells through Interleukin-12. Immunity. 2009 July 17; 31(1): 158-169.

107. Fazilleau N., McHeyzer-Williams L.J., Rosen H., McHeyzer-Williams M.G. The function of follicular helper T cells is regulated by the strength of T cell antigen receptor binding. Nat Immunol. 2009. V. 10(4). P. 375-384.

108. Steinman R. M., Tureley S., Mellman I., Inaba K. The induction of tolerance by dendritic cells that have capture apoptotic cells. J. Exp. Med. 2000. V. 191. P. 411-416.

109. Hubert P., Jacobs N., Caberg J.-H., Boniver J., Delvenne P. The cross-talk between dendritic and regulatory Tcells: good or evil? Journal of Leukocyte Biol. 2007. V. 82. № 4. P. 787-794.

110. Langaraine C., Lebranchu Y. Effect of immunosuppressive drugs on dendritic cells and tolerance induction. Transplantation. 2003. V. 75. P. 37S-42S.

111. Penna G., Adorini L. ,25-dihydroxyvitamin D3 inhibits differentiation, maturation, activation, and survival of dendritic cells leading to impaired alloreactive T cell activation. J. Immunol. 2000. V. 164. P. 2405-2411.

112. Steinbrink K., Wolfl M., Jonuleit H., Knop J., Enk A.H. Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells. J. Immunol. 1997. V. 159. P. 47724780.

113. Wallet M. A., Sen. P., Tisch R. Immunoregulation of dendritic cells. Clin. Med. Res. 2005. V. 3. №3, 166-175.

114. Lutz M B., Schuler G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: witch signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 2002. V. 23. P. 235-244.

115. Ярилин А. А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов. Иммунология. 2005. Т. 26. № 5. С. 312319.

Yarilin A.A. Homeostaticheskie processi v immunnoy systeme. Control chisllennosti lymphocytov. Immunologiya. 2005. T. 26. N 5. S. 312-319.

116. Colditz G. A., Brewer T. F., Berkey C. S., et al. Efficacy of BCG vaccine in prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. JAMA. 1994. V. 271. P. 698-702.

117. Trunz B. B., Fine P., Dye C. Effect of BCG vaccination on childhood tuberculous meningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysis and assessment of cost-effectiveness. Lancet. 2006. V. 367. P. 1173-1180.

118. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. Lancet, 2007. V. 370. P. 20302043.

119. Giacomini E., Remoli M. E., Gafa V., Pardini M., Fattorini L., and Coccia E.M. IFN- improves BCG immunogenicity by acting on DC maturation. Journal of Leukocyte Biology. 2009. V.85. P. 462-468.

120. Sprott, G. D., Dicaire C. J., Gurnani K., SadS., Krishnan L. 2004. Activation of dendritic cells by liposomes prepared from phosphatidylinositol mannosides from Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Gu rin and adjuvant activity in vivo. Infect. Immun. V. 72. P. 5235-5246.

121. Andersen C. S., Agger E. M., Rosenkrands I., Gomes J. M., Bhowruth V., Gibson K. J. C., Petersen R. V., Minnikin D. E., Besra G. S. and Andersen P. A Simple Mycobacterial Monomycolated Glycerol Lipid Has Potent Immunostimulatory Activity. The Journal of Immunology. 2009. V. 182. P. 424432.

122. Whelan K. T., Pathan A. A., Sander C. R., Fletcher H. A., Poulton I., Alder N. C., Hill A. W. S., and McShane H. Safety and Immunogenicity of Boosting BCG Vaccinated Subjects with BCG: Comparison with Boosting with a New TB Vaccine, MVA85A. PLoS ONE. 2009. V. 4(6). P. 5934.

123. Abadie V., Badell E., Douillard P., Ensergueix D., Leenen P. J. M., Tanguy M., Fiette L., Saeland S., Gicquel B., and Winter N. Neutrophils rapidly migrate via lymphatics after Mycobacterium bovis BCG intradermal vaccination and

shuttle live bacilli to the draining lymph nodes. Blood. 2005. V. 106. № 5. P. 1843 - 1850.

124. Чкадуа Г. З., Заботина Т. Н., Буракова А.А., Тамаева З. Э., Огородникова Е. В., Жорданиа К. И., Кадагидзе З. Г., Барышников А. Ю. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения. Российский биотерапевтический журнал. 2003. Т. 1. № 3. С. 56-62.

Chkadua G.Z., Zabotina T.N., Burakova А.А., Tamaeva Z.E., Ogorodnikova E.V., Zgordania K.I., Kadagidze Z.G., Barischnikov A.Yu. Adaptirovannie metodiki cultivirovaniya dendritnich kletok cheloveka iz monocytov periphericheskoy krovi dlya klinicheskogo primeneniya. Rossiyskiy bioterapeuticheskiy gurnal. 2003. T. 1. N 3. S. 56-62.

125. TalayevV.Yu., MatveichevA.V., Lomunova M.A., Talayeva M.V., Tsaturov M.E., Zaichenko I.Ye., Babaykina O.N., The effect of human placenta cytotrophoblast cells on the maturation and T-cell stimulating ability of dendritic cells in vitro. Clinical end Experimental Immunology. - 2010. - V. 162(1). - P. 91 - 99

126. Талаев В. Ю., Матвеичев А. В., Ломунова М. А., Талаева Е. Б., Бабайкина О. Н., Цатуров М. Э., Заиченко И. Е. Клетки трофобласта плаценты человека угнетают способность дендритных клеток индуцировать продукцию интерферона-g. Иммунология. 2009. Т. 30. № 3. С. 148-152.

Talayev V.Yu., Matveichev A.V., Lomunova М.А., Talayeva E.B., Babaykina O.N., Tsaturov M.E., Zaichenko I.Ye. Kletki trophoblasta placenti cheloveka ugnetayut sposobnost dendritnich kletok induzirovat produktiyu interferona-g. Immunologiya. 2009. Т. 30. N 3. S. 148-152.

127. Талаев В. Ю., Бабайкина О. Н., Ломунова М. А., Цатуров М. Э., Матвеичев А. В., Никонова М. Ф., Талаева Е. Б. Функциональные свойства моноцитарных дендритных клеток новорожденных в краткосрочных культурах. Иммунология. 2008. Т. 29. № 3. С. 141-147.

Talayev V.Yu., Babaykina O.N., Lomunova М.А., Tsaturov M.E., Matveichev A.V., Nikonova M.F., Talayeva E.B. Functionalnie svoystva monocitarnich dendritnich kletok novorogdenich v kratkosrochnich kulturach. Immunologiya. 2008. Т. 29. N 3. S. 141-147.

128. Талаев В. Ю., Ефимов Е.И., Талаева М.В., Матвеичев А. В., Цатуров М. Э., Бабайкина О. Н., Заиченко И. Е. Разработка способа оценки действия вакцин на дендритные клетки in vitro. Медицинский альманах. 2010. Т. 11. № 3. С. 255-258.

Talayev V.Yu., Efimov E.I., Talayeva M.V., Matveichev A.V., Tsaturov M.E., Babaykina O.N., Zaichenko I.Ye. Razrabotka sposoba ocenki deystvia vaccine na dendritnie kletki in vitro. Medizinskiy almanach. 2010. Т. 11. N 3. S. 255-258.

129. Плеханова М.В., Талаев В.Ю., Бабайкина О.Н., Заиченко И.Е., Ефимов Е.И. Действие вакцин против туберкулеза и гепатита В на дендритные клетки новорожденных in vitro. Иммунология. 2012. Т. 33. № 6. С. 311 - 318.

Plechanova M.V., Talayev V.Yu., Babaykina O.N., Zaichenko I.Ye., EfimovE.I., Deystvie vaccine protiv tuberculeza I gepatita B na dendritnie kletki novorogdenich in vitro. Immunologiya.2012. Т. 33. N6. S. 311 - 318.

130. Талаев В.Ю., Плеханова М.В., Заиченко И.Е., Бабайкина О.Н. Действие вакцин на экспрессию хемокиновых рецепторов дендритными клетками новорожденных и взрослых in vitro. Иммунология. 2013. Т. 34. № 6. С. 318-323.

Talayev V.Yu., Plechanova M.V., Zaichenko I.Ye., Babaykina O.N. Deystvie vakzin na ekspressiyu chemokinovich receptorov dendritnimi kletkami novorogdennich I vzroslich in vitro. Immunologiya. 2013. T. 34. N 6. S. 318-323.