КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЭКТИНЭСАЙДИН И ДИСАХАРИД
ECTEINASCIDIN AND DISACCHARIDE-CONTAINING COMPOSITIONS

Настоящее изобретение относится к композициям. Более конкретно оно относится к композициям и составам эктинэсайдинов, таких как эктинэсайдин 743.
Эктинэсайдины были идентифицированы, структурно охарактеризованы и были описаны синтетические способы их получения. Смотрите, например, R. Sakai, et al., 1992, Prco. Natl Acad. Sci USA 89, страницы 11456-11460, «Additional antitumor ecteinascidins from Caribbean tunicate: Crystal structures and activities in vivo»; R. Menchaca, et al., 2003, J. Org. Chem. 68(23), страницы 8859-8866, «Synthesis of natural ecteinascidins (ET-729, ET-745, ET-759B, ET-736, ET-637, ET-594) from cyanosafracin B»; и I. Manzanares, et al., 2001, Curr. Med. Chem. - Anti-Cancer Agents, 1, страницы 257-276, «Advances in the Chemistiy and Pharmacology of Ecteinascidins, A Promising New Class of Anticancer Agents»; и указанные там ссылки. В этих ссылках описаны эктинэсайдины. Примеры эктинэсайдинов представлены ET-743, ET-729, ET-745, ET-759A, ET-759B, ET-759C, ET-770, ET-815, ET-731, ET-745B, ET-722, ET-736, ET-738, ET-808, ET-752, ЕТ-594, ET-552, ET-637, ET-652, ET-583, ET-597, ET-596, ET-639, ET-641 и их производными, такими как ацетилированные формы, метилированные формы и формы оксидов, такие как N-оксидные формы.
Структурные характеристики таких эктинэсайдинов в этом случае точно не указаны, поскольку подробное описание, представленное в таких ссылках и цитатах, любой специалист в данной области может получить непосредственно из процитированных здесь источников информации и источников информации, относящихся к ним.
Тщательно изучали по меньшей мере одно из соединений эктинэсайдина, ET-743, и здесь на него будет дана специальная ссылка для иллюстрации особенностей этого изобретения.
Ecteinascidia turbinata
Эктинэсайдин 743 (ET-743) представляет собой алкалоид тетрагидроизохинолина, выделенный из морского оболочечника , имеющий следующую структуру:
Фармацевтическая композиция, содержащая ET-743 в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом, заявлена в US 5256663.
Последний обзор по ET-743, его химический состав, механизм действия и доклинические и клинические разработки можно найти у Kesteren, Ch. Van et al., 2003, Anti-Cancer Drugs, 14 (7), страницы 487-502: «Yondelis (trabectedin, ET-743): the development of an anticancer agent of marine origin», и приведенных там ссылках.
ET-743 обладает мощной антинеопластической активностью в отношении различных опухолевых ксенотрансплантатов человека, выращенных у бестимусных мышей, включая меланому и карциному яичников и груди.
В I фазе клинических испытаний ET-743 были получены обнадеживающие результаты у пациентов, страдающих саркомой и карциномой груди и яичников. Таким образом, это новое лекарственное средство в настоящее время интенсивно изучается в некоторых клинических испытаниях II фазы у онкологических пациентов, страдающих рядом неопластических заболеваний.
Как указано в международной публикации WO 0069441, включенной в качестве ссылки в полном объеме, ET-743 поставляется и хранится в виде стерильного лиофилизированного продукта, содержащего ET-743, маннит и фосфатный буфер. Предпочтительной композицией является композиция, полученная из 0,9% хлорида натрия или другого подходящего инфузионного разбавителя, 250 мкг ET-743 с 250 мг маннита, 34 мг монофосфата калия и фосфорной кислоты для установления рН. Затем эту композицию растворяют и разбавляют для внутривенной инъекции.
По структурным особенностям ET-743 представляет собой сложный химический объект. Кроме того, ET-743 демонстрирует ограниченную водную растворимость, и его стабильность, в частности в биосовместимых формах и композициях, трудно теоретически оценить и обеспечить. Эти свойства вызывают трудности у специалистов и подвергают сомнению общепринятые способы, применяемые в этой технологии, особенно когда это относится к получению композиций, которые легко применять в медицинских целях. Такие применения, предпочтительно, основываются на композициях, характеристики которых включают одно или несколько из следующего: биосовместимость, стабильность в окружающих условиях или в условиях, максимально близких к условиям окружающей среды, с максимально длительным сроком годности, и легкая растворимость для получения восстановленных растворов, стабильных в окружающих условиях или условиях, близких к условиям окружающей среды, в течение максимально длительного времени.
Однако обычные композиции и способы получения таких композиций не обеспечивают желаемых свойств и характеристик, упомянутых выше. Например, в упомянутом обзоре 2003 года, сделанном van Kesteren Ch. et at., сообщается, что ET-743 имеет ограниченную растворимость в воде. Однако путем установления рН 4 могли быть достигнуты требуемые концентрации ET-743. Нестабильность ET-743 в водном растворе требовала лиофилизации для повышения стабильности при хранении фармацевтического продукта. В настоящее время ET-743 получают в виде стерильного лиофилизированного продукта, содержащего 250 мкг активного вещества на единицу дозы, 250 мг маннита в качестве наполнителя и 0,05 M фосфатный буфер с pH 4 для растворения ET-743. Эта композиция является нестабильной при длительном хранении при пониженной и комнатной температурах, и, следовательно, она должна храниться при температуре от -15 до -25°C, защищенной от света. Растворение проводят путем добавления 5 мл воды для инъекций с последующим разведением в физиологическом растворе перед в.в. вливанием. Восстановленный раствор стабилен при комнатной температуре в течение периода времени до 24 часов.
На практике этот продукт, содержащий 250 мкг ET-743, получают путем лиофилизации 5 мл раствора, содержащего ET-743, маннит, фосфатный буфер и воду в литом флаконе. Литые флаконы, содержащие 1 мг ET-743, также получают путем лиофилизации 20 мл раствора.
Лиофилизация обычно включает замораживание раствора, понижение давления в течение периода первичной сушки, высушивание для удаления водяного пара из замороженного материала путем сублимации, и получение полусухой массы, и повышение температуры в течение периода вторичной сушки для удаления оставшейся воды из полусухой массы. Затем флаконы герметично запаивают.
Описанные выше обычные композиции ET-743 имеют некоторые недостатки. Одним из них является то, что лиофилизированная композиция ET-743 должна храниться примерно при -20°C для предотвращения деструкции ET-743 для достижения длительности хранения по меньшей мере 18 месяцев.
Кроме того, композиции ET-743 сталкиваются с проблемой образования в качестве примеси сравнительно больших количеств ET-701. ET-701 представляет собой основную примесь, образующуюся во время процесса лиофилизации и во время хранения композиции ET-743. Она образуется в результате гидролиза ET-743 и имеет следующую структуру:
Образование примесей, однако, уменьшает или даже препятствует возможности стандартизировать композиции. Таким образом, требуется предоставить композиции и способы их получения, которые обеспечивают варианты композиции, которые быстро и непредсказуемо не изменяются в результате неконтролируемого образования примесей.
Кроме того, другим недостатком вышеописанной общепринятой методики получения композиций ET-743 является то, что для получения лиофилизированной композиции необходимо сушить вымораживанием сравнительно большие количества раствора с объемами наполнения в интервале 5-20 мл. Напротив, было бы желательно разработать способ производства композиций с такими сложными соединениями, как ET-743, который позволит получать композиции с более высокими концентрациями активного вещества так, чтобы в результате обрабатываемые объемы уменьшались. Ввиду относительно высоких объемов наполнения 5 или 20 мл в общепринятых способах для стадии лиофилизации необходимы время и энергия. Наряду со временем и энергией, также существует риск разрушения ET-743, особенно при вторичной сушке.
Ввиду возможного применения композиций ET-743 в качестве противоопухолевых средств существует необходимость в предоставлении композиции, с помощью которой можно решить проблемы, которые не решаются или не разрешаются полностью при использовании обычных композиций и способов производства. Эти проблемы включают проблему стабильности ET-743. Варианты композиций ET-743, предпочтительно, должны демонстрировать благоприятные свойства при лиофилизации, предпочтительно, должны легко поддаваться растворению, и предпочтительно, они должны демонстрировать такие свойства разведения, чтобы, при разведении жидкостью для вливания, присутствовало столько же желаемых характеристик композиций для медицинского применения, сколько здесь упомянуто. Как указано выше, варианты композиций ET-743 должны быть стабильны в течение длительного срока хранения. Кроме того, композиция и способ ее получения должны удовлетворять стандартам биосовместимости и, следовательно, должны предусматривать эффективное использование носителей композиции, нетоксичных по меньшей мере в концентрациях, используемых для вливания.
Общий обзор взаимодействий между эксципиентами и лекарственным средством в исходных составах представлен Akers, MJ, в Journal of Pharmaceutical Sciences, 91, 2002, 2283-2300. В этой ссылке, кроме того, представлен раздел, относящийся к наполнителям и протекторам, применяемым при лиофилизации, в том числе этот объект применительно к лиофилизации.
Предусматривается, что способы и композиции, разработанные применительно к настоящему изобретению, применимы к другим эктинэсайдинам, помимо ET-743.
К объекту изобретения относятся стабильные композиции эктинэсайдинов и способы получения таких композиций.
К особому объекту настоящего изобретения относится новая стабильная композиция ET-743. В частности, требуется композиция, которая имеет более высокую стабильность при хранении. Существует особая необходимость избежать образования примесей. В частности, желательно обеспечить варианты композиций, которые по существу свободны от ET-701.
Более того, другие объекты настоящего изобретения относятся к разработке способов получения, которые позволяют получить композиции ET-743 с более высокими концентрациями ET-743, чем концентрации, достигаемые обычными способами. Дополнительные объекты относятся к разработке способов улучшения растворимости таких сложных химических объектов, как ET-743, в конечном счете, повышая концентрацию ET-743 в растворе для лиофилизации и, следовательно, уменьшая полный объем во флаконах до лиофилизации композиции.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением предложены композиции ET-743, содержащие ET-743 и дисахарид, и способы получения таких композиций. Предпочтительные варианты таких композиций представляют собой фармацевтически чистые композиции.
Другие варианты этого изобретения представлены композициями, которые содержат эктинэсайдин и дисахарид.
Некоторые варианты таких композиций представлены лиофилизированными композициями, которые содержат эктинэсайдин, такой как ET-743, и дисахарид. Изложены способы получения таких композиций.
Настоящее изобретение относится к способам уменьшения или даже по существу устранения образования примесей в композициях ET-743. Некоторые варианты осуществления включают способ уменьшения или даже по существу устранения образования ET-701 в составах ET-743.
Настоящее изобретение также относится к способу более эффективной обработки композиций эктинэсайдина, такого как ET-743, включая способы получения составов с более высокими концентрациями и способы уменьшения объема наполнения флакона при получении лиофилизированной композиции.
Настоящее изобретение также относится к способам растворения сложных химических объектов, таких как эктинэсайдины, в том числе, но не только, ET-743. Такие способы предусматривают производство более концентрированного раствора ET-743 в основном растворе для лиофилизации, что приводит к уменьшению объемов наполнения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В рамках настоящего изобретения было обнаружено, что дисахариды стабилизируют композиции эктинэсайдина. Эктинэсайдины, в том числе ET-743, представляют собой сложные химические объекты, поведение которых в композициях является непредсказуемым в отношении поведения других неродственных химических веществ. Такое поведение является еще более трудно предсказуемым в тех случаях, когда по меньшей мере один эктинэсайдин включен в качестве активного вещества в композицию, которая удовлетворяет стандартам биосовместимости, в том числе медицинским стандартам. В этом отношении дополнительно было обнаружено, что применение дисахаридов в качестве наполнителей может существенно уменьшать образование примесей во время процесса лиофилизации и хранения композиций ET-743.
В тех случаях, когда варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают композиции ЕТ-743, по существу свободные от других эктинэсайдинов, таких как ЕТ-701, или по меньшей мере с содержанием ЕТ-701 настолько низким, насколько это возможно, в этих случаях ЕТ-701 рассматривают как примесь, присутствие которой в композиции должно быть по меньшей мере уменьшено.
Кроме того, применение дисахаридов также улучшает условия хранения, позволяя осуществлять длительное хранение лиофилизированной композиции в широком диапазоне температур, в том числе в условиях охлаждения и при комнатной температуре. Используемый в настоящем описании термин «стабильная», например, в выражении «стабильная композиция ET-743», относится к композиции, которая удовлетворяет характеристикам стабильности, указанным в настоящем описании и их эквивалентам, которыми не обладают обычные композиции и которые не достигаются при получении композиции общепринятыми способами получения.
Примеры вариантов осуществления настоящего изобретения относятся к новым фармацевтически приемлемым композициям, содержащим эктинэсайдин, такой как ET-743, и дисахарид.
Как отмечалось в вводной части, эктинэсайдины были широко описаны. Они могут иметь следующую общую формулу (I):
где
5
R представляет собой OH, алкокси или алканоилокси;
6
R представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил или арил;
12
R представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил или арил;
16
R представляет собой водород, алкил, алкенил, алкинил или арил;
17
R представляет собой OH, алкокси или алканоилокси;
18
R представляет собой OH, алкокси или алканоилокси;
21
R представляет собой H, OH, CN или другую нуклеофильную группу; и
a
b
R представляет собой водород, а R необязательно замещен амино, или
a
b
R с R образуют карбонильную функциональную группу=O, или
a
b
R, R и атом углерода, к которому они присоединены, образуют тетрагидроизохинолиновую группу.
В этих соединениях заместители могут быть выбраны в соответствии со следующими указаниями.
Алкильные и алкоксигруппы, предпочтительно, имеют от 1 до 12 атомов углерода. Один более предпочтительный класс алкильных и алкоксигрупп имеет от 1 до 6 атомов углерода и, наиболее предпочтительно, 1, 2, 3 или 4 атома углерода. Метил, этил и пропил, в том числе изопропил, являются особенно предпочтительными алкильными группами в композициях по настоящему изобретению. Метокси, этокси и пропокси, в том числе изопропокси, являются особенно предпочтительными алкильными группами в соединениях по настоящему изобретению. Другой более предпочтительный класс алкильных и алкоксигрупп имеет от 4 до примерно 12 атомов углерода, еще более предпочтительно, от 5 до примерно 8 атомов углерода и, наиболее предпочтительно, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода. Используемый в настоящем описании термин "алкил", если он не видоизменен, относится как к циклическим, так и к нециклическим группам, хотя циклические группы будут содержать по меньшей мере три углеродных члена кольца.
Предпочтительные алкенильные и алкинильные группы в соединениях по настоящему изобретению имеют одну или несколько ненасыщенных связей, и от 2 до примерно 12 атомов углерода. Один более предпочтительный класс алкенильных или алкинильных групп имеет от 2 до примерно 6 атомов углерода и, наиболее предпочтительно, 2, 3 или 4 атома углерода. Другой более предпочтительный класс алкенильных или алкинильных групп имеет от 4 до примерно 12 атомов углерода, еще более предпочтительно, от 5 до примерно 8 атомов углерода и, наиболее предпочтительно, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода. Используемые в настоящем описании термины "алкенил" и "алкинил" относятся как к циклическим, так и к нециклическим группам.
Подходящие арильные группы в соединениях по настоящему изобретению включают соединения с одним или несколькими кольцами, в том числе соединения с несколькими кольцами, содержащие несконденсированные и/или сконденсированные арильные группы. Типичные арильные группы содержат от 1 до 3 несконденсированных или сконденсированных колец и от 6 до 18 атомов углерода в кольце. Особенно предпочтительные арильные группы включают замещенный или незамещенный фенил, нафтил, бифенил, фенантрил и антрацил.
Подходящие алканоилокси- и алканоильные группы содержат от 2 до примерно 20 атомов углерода, более предпочтительно, от 2 до примерно 8 атомов углерода, еще более предпочтительно, от 2 до примерно 6 атомов углерода, еще более предпочтительно, 2 атома углерода. Алканоилоксигруппы другого предпочтительного класса содержат от 12 до примерно 20 атомов углерода, еще более предпочтительно, от 14 до примерно 18 атомов углерода и, наиболее предпочтительно, 15, 16, 17 или 18 атомов углерода.
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
1
12
2
12
2
12
Вышеупомянутые группы могут быть замещены в одном или нескольких доступных положениях одной или несколькими подходящими группами, такими как OR',=O, SR', SOR', SOR', NO, NHR', N(R'),=N-R', NHCOR', N(COR'), NHSOR', CN, галоген, C(=O)R', COR', OC(=O)R', где каждая из групп R' независимо выбрана из группы, состоящей из H, OH, NO, NH, SH, CN, галогена,=O, C(=O)H, C(=O)CH, COH, замещенного или незамещенного C-C алкила, замещенного или незамещенного C-C алкенила, замещенного или незамещенного C-C алкинила и замещенного или незамещенного арила. Подходящие галогеновые заместители в соединениях по настоящему изобретению включают F, Cl, Br и I.
Предпочтительными соединениями по настоящему изобретению являются соединения общей формулы (I), где будут использованы одно или несколько из следующих определений:
5
R представляет собой алканоилокси;
6
R представляет собой метил;
12
R представляет собой метил;
16
R представляет собой метил;
17
R представляет собой метокси;
18
R представляет собой OH;
21
R представляет собой H, OH или CN; и
a
b
R представляет собой водород, а R представляет собой аминогруппу, или
a
b
R с R образуют =O, или
a
b
R, R и атом углерода, к которому они присоединены, образуют группу формулы (II):
Примеры соединений для настоящего изобретения включают природные эктинэсайдины, такие как эктинэсайдин 743, и другие 1,4 соединенные мостиковой связью сконденсированные соединения эктинэсайдина, описанные, например, в US 5089273, US 5478932, US 5654426, US 5721362, US 6124293, US 5149804, US 09/546877, US 5985876 и WO 01/77115.
Соединения следующей формулы (III) являются особенно предпочтительными:
где
a
b
f
f
R представляет собой водород, а R представляет собой амид формулы -NHR-, где R представляет собой алканоил, или
a
b
R с R образуют =O, или
a
b
R, R и атом углерода, к которому они присоединены, образуют группу формулы (II):
d
R представляет собой алканоил; и
21
R представляет собой H, OH или CN.
20
Алканоильные группы могут быть ацетилом или выше, например, вплоть до С. Следовательно, предпочтительные соединения настоящего изобретения включают в себя:
и родственные им соединения с различными ацильными группами.
Эктинэсайдин 743, также известный, как ET-743 или эктинэсайдин 743, является особенно предпочтительным.
Примеры подходящих дисахаридов для композиций по настоящему изобретению включают лактозу, трегалозу, сахарозу и их комбинации. Дополнительные примеры дисахаридов, которые могут быть применены в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, включают по меньшей мере один дисахарид из мальтозы, изомальтозы, целлобиозы, изосахарозы, изотрегалозы, сорбозы, туранозы, мелибиозы, гентиобиозы и их смесей. В настоящее время предпочтительной является сахароза.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ET-743, и дисахарид, за исключением лактозы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ET-743, и дисахарид, не являющийся трегалозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся сахарозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся мальтозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся изомальтозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, дисахарид, не являющийся целлобиозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся изосахарозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся изотрегалозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся сорбозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся туранозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся мелибиозой. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиция содержит эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, и дисахарид, не являющийся гентиобиозой.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению содержит менее 2%, или менее 1%, или менее 0,5%, или менее 0,2%, или менее 0,1% по массе по меньшей мере одного, предпочтительно, каждого из лактозы, трегалозы, сахарозы, мальтозы, изомальтозы, целлобиозы, изосахарозы, изотрегалозы, сорбозы, туранозы, мелибиозы и гентиобиозы.
Используемые здесь термины «их смеси» и «их комбинации» относятся по меньшей мере к двум объектам, которые представляют ранее упомянутую основу для терминов «их смеси» или «их комбинации». Для иллюстрации, а не для ограничения, термины «продукт, содержащий по меньшей мере один из А, В, С и их смеси» относится к вариантам продукта, который удовлетворяет одному из следующего: A находится в этом продукте; В находится в этом продукте; С находится в этом продукте; A и В находятся в этом продукте; A и С находятся в этом продукте; В и С находятся в этом продукте; и А, В и С находятся в этом продукте.
Кроме того, понятно, что такие термины, как «взаимодействие», «образование» и родственные им термины, применяемые для химического объекта, в настоящем описании относятся к любому из следующего: (a) химическому объекту как таковому и (b) химическому объекту в форме, в которой такой объект присутствует в реакционной среде. Аналогично, к названию химического объекта, или к представлению его формулы применительно к процессу, или стадии реакции, или к названию его, или представлению его формулы при нахождении в среде, твердой ли, или жидкой, включая продукты, композиции или комбинации, в настоящем описании относится одно из следующего: (a) объект как таковой и (b) объект в форме, в которой такой объект присутствует в среде. Например, наименование "кислотный химический объект" в настоящем описании относится к любой форме или формам такого объекта, присутствует в контексте, в котором он назван. Для иллюстрации, а не для ограничения, название химического объекта «хлорид натрия» или представление его химической формулы в настоящем описании относится к объекту NaCl, как таковой двухатомной молекуле, если таковая присутствует в форме, в которой хлорид натрия присутствует в соответствующей среде; это также относится к скоплению недиссоциированных и/или диссоциированных химических частиц, если хлорид натрия в соответствующей среде полностью или частично диссоциирован, включая частицы, сольватированные в этой среде, части кристаллических решеток, ассоциированных с другими частицами и т.д.
Любое соединение, на которое в настоящем описании дана ссылка, представляет такое особое соединение, а также определенные варианты или формы. В частности, соединения, на которые в настоящем описании дана ссылка, могут иметь асимметричные центры и, следовательно, существовать в различных энантиомерных формах. Все оптические изомеры и стереоизомеры соединений, на которые в настоящем описании дана ссылка, и их смеси рассматриваются в объеме композиций и способов настоящего изобретения. Таким образом, любое заданное соединение, на которое в настоящем описании дана ссылка, представляет любое соединение рацемата, одну или несколько энантиомерных форм, одну или несколько диастереоизомерных форм, одну или несколько атропоизомерных форм, или их смеси.
Кроме того, соединения, на которые в настоящем описании дана ссылка, могут существовать в виде геометрических изомеров (т.е. цис- и транс-изомеров), в виде таутомеров или в виде атропизомеров. Кроме того, любое соединение, на которое в настоящем описании дана ссылка, представляет гидраты, сольваты и полиморфные формы, и их смеси, в тех случаях, когда такие формы существуют в среде. Кроме того, соединения, на которые в настоящем описании дана ссылка, могут существовать в виде форм, меченных изотопами. Все геометрические изомеры, таутомеры, атропизомеры, гидраты, сольваты, полиморфы и меченные изотопами формы соединений, на которые в настоящем описании дана ссылка, и их смеси, рассматриваются в объеме композиций и способов настоящего изобретения.
Для обеспечения более краткого описания, некоторые количественные выражения, приведенные в настоящем описании, не сопровождаются термином «примерно». Понятно, что используется ли термин «примерно» явным образом или нет, каждое приведенное в настоящем описании количественное значение относится к фактически существующей заданной величине, а также подразумевается, что относится к приближению к этой заданной величине, которая была бы соответствующим образом получена на основании обычных знаний в этой области, включая эквиваленты и приближения вследствие экспериментальных условий и/или условий измерения для такой заданной величины.
Ecteinascidia
Ecteinascidia turbinata
Активное вещество или вещества, применительно к настоящего изобретению, могут быть природного, полусинтетического или синтетического происхождения, в том числе комбинированного происхождения. В вариантах осуществления, в которых активное вещество представляет собой эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, ET-743 может быть природным, выделенным, например, из водоросли рода , предпочтительно, видов . ET-743 может быть синтетическим или полусинтетическим. Ссылки даны, например, на публикациях WO 0069862 и WO 0187895, каждая из которых включена в настоящем описании в полном объеме.
Соотношение активного вещества к наполнителю в вариантах осуществления настоящего изобретения определяется в соответствии с растворимостью наполнителя и в тех случаях, когда композицию лиофилизируют, также в соответствии с лиофилизационными свойствами наполнителя. Предусматривается, что это соотношение (мас./мас.) может составлять примерно 1:1 в некоторых вариантах осуществления, примерно 1:5 в других вариантах осуществления, в других же вариантах осуществления примерно 1:10, тогда как другие варианты осуществления демонстрируют соотношения в интервале от примерно 1:10 до примерно 1:1. Предусматривается, что одни варианты осуществления имеют такие соотношения в интервале от примерно 1:10 до примерно 1:100, а другие варианты осуществления имеют такие соотношения в интервале от примерно 1:100 до примерно 1:1500. В тех случаях, когда активное соединение представляет собой ET-743, соотношение (мас./масс.) ET-743 к наполнителю обычно составляет от примерно 1:100 до примерно 1:1500, предпочтительно, от примерно 1:200 до примерно 1:800, более предпочтительно, от примерно 1:250 до примерно 1:600 и, еще более предпочтительно, примерно 1:400.
Лиофилизированное вещество обычно находится во флаконе, который содержит определенное количество эктинэсайдина или активного вещества. В тех случаях, когда активное вещество представляет собой ET-743, активные количества иллюстрируются количеством 250 мкг и 1 мг.
Настоящее изобретение не ограничивается особыми формами или конструкциями контейнера, при условии, что контейнер подходит для целевого использования и, соответственно, удовлетворяет стандартам. Варианты осуществления настоящего изобретения представлены композициями, содержащимися во флаконах, предпочтительно, флаконах из трубчатого стекла.
Лиофилизированные композиции по настоящему изобретению могут быть восстановлены и разбавлены с получение композиции по изобретению в форме раствора, готового для внутривенной инъекции. Фактические количества восстановленной жидкости не являются ограничивающими признаками вариантов осуществления настоящего изобретения. Только для иллюстрации, а не для ограничения, варианты лиофилизированных композиций по настоящему изобретению растворяют водой. Большинство объемов воды не превышает примерно 20 мл, с предпочтительными объемами, находящимися в интервале от примерно 1 мл до примерно 15 мл, более предпочтительно, в интервале от примерно 1 мл до примерно 10 мл и, еще более предпочтительно, в интервале от примерно 1 мл до примерно 4 мл. В тех случаях, когда активное вещество представлено ET-743, восстановленный раствор в таких вариантах осуществления содержит концентрацию ET-743 до 500 мкг/мл, с предпочтительными концентрациями примерно 50 мкг/мл, примерно 100 мкг/мл и примерно 250 мкг/мл.
Растворенные композиции по настоящему изобретения дополнительно могут быть разбавлены, если это необходимо, без ограничения настоящего изобретения. Это дополнительное разбавление, предпочтительно, проводят водной системой, которая, как правило, представляет собой 0,9% раствор хлорида натрия или 5% раствор глюкозы. Восстановленный раствор будет разбавлен в зависимости от концентрации в восстановленном растворе и желаемой концентрации в разбавленном растворе.
Варианты композиций ET-743 по настоящему изобретению могут быть использованы при лечении различных злокачественных опухолей, в том числе любой опухоли из саркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы, остеосаркомы, рака яичников, рака груди, меланомы, рака ободочной и прямой кишок, мезотелиомы, рака почек, рака эндометрия и рака легких, и состояния со множественными формами таких злокачественных опухолей. Понятно, что «лечение» в этом контексте относится к действию, которое приводит к улучшению состояния при злокачественном заболевании. Варианты композиций ET-743 по настоящему изобретению могут быть применены при лечении состояний резистентности, которые не реагируют положительным образом на другие виды лечения. Кроме того, варианты композиций по настоящему изобретению могут быть применены в исследованиях с лабораторными тканями, в том числе, но не только, в клинических испытаниях, аналитических исследованиях и моделирующих исследованиях.
Варианты по настоящему изобретению, содержащие эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, предпочтительно, вводят путем вливания. Стадию вливания обычно проводят циклами, которые можно повторять в зависимости от ситуации, например, на протяжении 1-20 циклов. Цикл включает фазу введения посредством вливания композиции ET-743, а также обычно фазу, в которую ET-743 не вводят. Обычно цикл рассчитывают в неделях, и, следовательно, цикл обычно включает одну или несколько недель фазы вливания ET-743, и одну или несколько недель для завершения цикла. Предпочтительным является 3-недельный цикл, но, альтернативно, он может составлять от 1 до 6 недель. Как таковая фаза вливания может представлять собой однократное введение в каждом цикле, например, от 1 до 72 часов, предпочтительно, примерно 1, 3 или 24 часа; или ежедневное вливание в фазе вливания цикла, предпочтительно, в течение 1-5 часов, главным образом, 1 или 3 часа; или еженедельные вливания в фазе вливания цикла, предпочтительно, в течение 1-3 часов, главным образом, 2 или 3 часа. Предпочтительным является однократное введение в начале каждого цикла. Предпочтительно, время вливания составляет примерно 1, 3 или 24 часа.
Восстановленные и разбавленные растворы служат примером вариантов осуществления настоящего изобретения. Растворенную и разбавленную композицию можно вводить внутривенно, используя доступные протоколы. Дозу выбирают в соответствии с режимом дозирования, учитывая имеющиеся данные по токсичности, ограничивающей дозу, которые смотрите, например, в WO 0069441, WO 0236135 и WO 0339571 и у van Kesteren, Ch. et al., 2003, Anti-Cancer Drugs, 14 (7), 487-502. Эти три международные патентные публикации и статья van Kesteren включены в настоящее описание в качестве отдельной ссылки.
Предпочтительные протоколы дозирования включают:
2
a) примерно 1,5 мг/м площади поверхности тела, введенных в виде внутривенного в настоящем описании за 24 часа с трехнедельным интервалом между циклами;
2
b) примерно 1,3 мг/м площади поверхности тела, введенных в виде внутривенного вливания за 3 часа с трехнедельным интервалом между циклами;
2
c) примерно 0,580 мг/м площади поверхности тела, вводимых еженедельно в виде внутривенного вливания за 3 часа в течение 3 недель и одной недели отдыха.
Эктинэсайдин, такой как ET-743, можно применять в комбинации с другим лекарственным средством. Например, его можно вводить с другим противоопухолевым лекарственным средством. Ссылка дается на перечень в публикациях WO 0069441 и WO 0236135, каждая из которых включена в настоящее описание в качестве отдельной ссылки. Примеры указанных других лекарственных средств включают доксорубицин, цисплатин, паклитаксел, карбоплатин, пегилированный липосомальный доксорубицин, доцетаксел, капецитабин и гемцитабин. Могут быть применены лекарственные средства другого действия, в том числе дексаметазон. Введение другого лекарственного средства может быть до, во время или после введения эктинэсайдина, такого как ET-743.
Варианты композиций по настоящему изобретению, содержащие эктинэсайдин, такой как ЕТ-743, могут быть получены лиофилизацией композиции по настоящему изобретению в форме основного раствора, содержащего эктинэсайдин и дисахарид. Обычно основной раствор забуферивают, например, до pH примерно 4. Подходящие буферные агенты включают фосфатный буфер и цитратный буфер. Могут быть применены другие возможные буферы, такие как фосфат/цитратный буфер (смесь фосфатного буфера и цитратного буфера), лактатный буфер, аскорбатный буфер, винный/цитратный буфер, буферная система бикарбонат/соляная кислота, ацетатный буфер, сукцинатный буфер и буферная система глицин/соляная кислота. Могут быть применены смеси буферов. Биосовместимые буферы, позволяющие регулировать рН в заданном значении, представляют дополнительные варианты осуществления настоящего изобретения.
В основной раствор могут быть включены другие компоненты, например, поверхностно-активные вещества, такие как полиоксиэтилен 20 сорбитанмоноолеат или полиоксил 40 стеарат. Другие возможные поверхностно-активные вещества включают фосфолипиды, такие как лецитин; сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, такие как поверхностно-активное вещество Плуроник; сложные эфиры полиоксиэтилена и 12-гидроксистеариновой кислоты, такие как поверхностно-активное вещество Solutol; этоксилаты холестерина, такие как диацилглицерин, диалкилглицерин, соли желчных кислот, такие как холат натрия, дезоксихолат натрия, сложные эфиры сахарозы, такие как монолаурат сахарозы, моноолеат сахарозы; поливинилпирролидон (PVP); или поливиниловый спирт (PVA).
Композиции обычно поставляются в виде флаконов, содержащих лиофилизированный продукт. Эта форма поставки, однако, не является ограничением настоящего изобретения. Для предоставления флакона, содержащего лиофилизированный продукт, основной раствор помещают во флакон и лиофилизируют. Как упоминалось в настоящем описании, другим объектом изобретения является способ улучшения растворимости эктинэсайдина, такого как ЕТ-743, для увеличения концентрации эктинэсайдина в растворе и для уменьшения объема наполнения во флаконах до проведения процесса лиофилизации. Этот способ, разработанный применительно к настоящему изобретению, позволяет получать основной раствор с концентрацией активного вещества, превышающей концентрацию, полученную в соответствии с общепринятыми способами. Таким образом, с применением настоящего способа получены меньшие объемы наполнения по сравнению с объемами наполнения обычными композициями с маннитолом. Это уменьшение объемов наполнения позволяет сохранить время и энергию во время стадии лиофилизации. Кроме того, также снижается риск разрушения ET-743, особенно при повторном высушивании.
Как указано выше, ET-743 имеет ограниченную водную растворимость, смотрите, например, van Kesteren, Ch., et al., 2003, Anti-Cancer Drugs, 14 (7), страницы 487-502. Для стабилизации ET-743 в общепринятых способах предусматривается установление с помощью буфера значения рН среды 4. Такое регулирование pH обычно достигается при применении 0,05 М фосфатного буфера с pH 4. Применительно к настоящему изобретению было установлено, что предварительное растворение ET-743 в кислоте улучшает растворимость ET-743 в основном растворе. Этим предварительным растворением ET-743 можно увеличить концентрацию в основном растворе и флаконе, а объем наполнения во флаконах может быть уменьшен. В указанных вариантах осуществления настоящего изобретения объем наполнения обычно уменьшается примерно на 80% по сравнению с обычным объемом наполнения. Для иллюстрации, а не для ограничения, варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают объем наполнения 1 мл для флаконов, содержащих 0,25 мг ET-743, и 4 мл для флаконов, содержащих 1 мг ET-743. Необязательно в других вариантах осуществления настоящего изобретения объем наполнения может быть дополнительно уменьшен путем увеличения концентрации ET-743.
Общепринятые способы включают растворение ET-743, маннита и 0,05 M фосфатного буфера при pH 4 вместе с водой для инъекций; растворимость основного раствора была ограничена вследствие низкой растворимости ET-743 в указанной среде. Применительно к настоящему изобретению было обнаружено, что предварительная обработка ЕТ-743 в растворе кислоты улучшает растворимость ET-743 и позволяет получить основные растворы с более высокими концентрациями ET-743. Следовательно, настоящее изобретение относится к способам, применяемым для улучшения растворимости ET-743 в основном растворе, включающим растворение ET-743 в кислотной среде, смешивание этой среды, содержащей ET-743, с другими компонентами основного раствора и, необязательно, установление pH. В некоторых иллюстрирующих, но не ограничивающих, вариантах осуществления настоящего изобретения установление рН проводят фосфатным буфером. Кислотная среда, соответственно, не содержит или по существу не содержит буферных компонентов и обычно состоит из водной кислоты.
Иллюстрирующие варианты основных растворов для лиофилизации в соответствии с настоящим изобретением, представлены раствором ET-743, забуференным до pH 4 первичным кислотным фосфатом калия и фосфорной кислотой с сахарозой в качестве наполнителя.
Иллюстрирующий вариант осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением представлен следующим: ET-743 растворяют в 0,1 н. фосфорной кислоте. Затем перемешивают воду для инъекций («WFI»), первичный кислотный фосфат калия, сахарозу и ET-743 (предварительно, растворенный в 0,1 н. фосфорной кислоте). Перед продолжением визуально проверяют растворение, и растворение считают полным по визуальной оценке. Проверяют pH раствора и устанавливают до значения в интервале от примерно 1 до примерно 5, более предпочтительно, в интервале от примерно 2 до примерно 4,5, еще более предпочтительно, в интервале от примерно 3 до примерно 4,5 и, наиболее предпочтительно, до pH примерно 4,0 путем медленного добавления соответствующей кислоты. Предпочтительной кислотой является фосфорная кислота, в указанном случае предпочтительная концентрация составляет 0,1 н. Необязательно для регулирования рН добавляют соответствующее основание. Предпочтительным основанием является гидроксид калия, предпочтительно, в растворе, в указанном случае предпочтительная концентрация составляет примерно 0,1 н. Конечный объем устанавливают путем добавления подходящей биосовместимой жидкости, предпочтительно, WFI. Основным раствором затем наполняют флаконы в соответствии с требуемой дозой.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лиофилизацию проводят с применением сокращенного времени вторичной сушки. Предпочтительный протокол включает охлаждение до температуры примерно -40°C, первичную сушку при 40-80 мкбар в течение 10-50 часов, и вторичную сушку при более низком давлении и примерно при 0°C в течение 10-50 часов. В других протоколах применительно к настоящему изобретению проводят охлаждение до температур ниже -40°C.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают лиофилизацию путем охлаждения продукта ниже -40°C. Первичную сушку проводят при температуре от примерно -20°C до примерно -26°C и давлении примерно 60 мкбар в течение приблизительно 15-40 часов. Вторичную сушку проводят при температуре от примерно 20°C до примерно 30°C и давлении примерно 100 мкбар в течение приблизительно 20-40 часов.
Варианты лиофилизированных композиций по настоящему изобретению подходят для хранения при температурах значительно выше температур хранения обычных композиций. Примерами температур хранения композиций по настоящему изобретению являются температуры около +5°C. Эти температуры без труда обеспечивают обычные холодильники.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 - сравнительное исследование стабильности. Оценка чистоты ET-743 через 6 месяцев хранения при 5°C.
Фиг.2 - сравнительное исследование стабильности. Оценка чистоты ET-743 через 12 месяцев хранения при 5°C.
Фиг.3 - образование примесей ET-701 в различных композициях, хранившихся в течение 9 месяцев при 5°C.
Фиг.4 - сравнительная оценка % чистоты ET-743 новых композиций и 3 партий композиций сравнения, хранившихся в течение 3 месяцев при 5°C.
Фиг.5 - образование примесей ET-701 в различных композициях, хранившихся в течение 3 месяцев при 5°C.
Фиг.6 - сравнительная оценка % чистоты ET-743 новых композиций и 3 партий композиций сравнения, хранившихся в течение 3 месяцев при 25°C/65% относительной влажности.
Фиг.7 - образование примесей ET-701 в различных композициях, хранившихся в течение 3 месяцев при 25°C/65% относительной влажности.
Фиг.8 - сравнительная оценка % чистоты ET-743 новых композиций, хранившихся при 40°C/70% относительной влажности в течение 3 месяцев.
Фиг.9 - сравнительная оценка % чистоты ET-743 новых композиций, хранившихся при 40°C/70% относительной влажности в течение 3 месяцев.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
В настоящем примере описано сравнительное исследование 8 новых композиций и обычных композиций ET-743 (с маннитом). Для иллюстрации настоящего изобретения использовали лактозу и сахарозу. Композицию сравнения получали с применением маннита. Для сравнения были опробованы другие известные наполнители, такие как декстран (Декстран 40) и повидон (Коллидон 12, PVP). В некоторых композициях применяли поверхностно-активные вещества полиоксил 40 стеарат (Myrj 45) или полиоксиэтилен 20 сорбитанмоноолеат (Полисорбат 80), а в некоторых композициях буфер был исключен.
Получали основные растворы и лиофилизировали по стандартной методике. Готовили 150 мл каждой композиции:
взвешивали фосфат калия для конечного раствора (1,02 г) и растворяли в 90% конечного объема (135 мл) воды. Затем рН доводили до pH 4,0 с применением 0,1 н. фосфорной кислоты.
7,85 мг ET-743 помещали в сосуд из многокомпонентного стекла и растворяли путем магнитного перемешивания в 2/3 объема (90 мл) раствора фосфата калия в течение приблизительно 1 часа (растворение проверяли визуально).
Добавляли наполнитель и поверхностно-активное вещество и растворяли в 1/3 объема раствора фосфата калия. Затем раствор добавляли к раствору ET-743 и помешивание поддерживали в течение еще 1 часа.
Раствор доводили водой до конечной массы (плотность 1,019 г/куб.см была установлена для всех композиций).
Раствор фильтровали через целлюлозный фильтр 0,22 мкм.
Раствором наполняли 25-мл стеклянные флаконы по 5 мл/флакон и хранили при -20°C до процесса лиофилизации.
Лиофилизацию проводили в соответствии со следующей таблицей I:
<b>Таблица I</b>
Время замораживания до -48°C
4 часа
Первичная сушка
48 часов
Вторичная сушка
44 часа
После лиофилизации флаконы герметично упаковывали. Флаконы переносили в охлаждаемое помещение (-20°C).
Композиция для каждого флакона представляла собой следующее (таблица II) при том, что вода испарялась во время процесса лиофилизации.
<b>Таблица II</b>
Стандарт
Сахароза
Декстран
PVP
Лактоза
ET-743
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
Маннит
250 мг
Сахароза
500 мг
Декстран 40
500 мг
Коллидон 12
375 мг
Лактоза
500 мг
Первичный кислотный фосфат калия
34 мг
34 мг
34 мг
34 мг
34 мг
Фосфорная кислота
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
Вода для инъекций
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
<b>Таблица II (продолжение)</b>
ET-поли80
ET-myrj
ET-поли80sacc
ET-p80saccun buffer
ET-743
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
Маннит
250 мг
250 мг
Сахароза
500 мг
500 мг
Полисорбат 80
50 мг
50 мг
50 мг
Myrj 45
50 мг
Первичный кислотный фосфат калия
34 мг
34 мг
34 мг
Фосфорная кислота
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
Вода для инъекций
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
Тестирование стабильности проводили при температуре 5±3°C.
Оценка чистоты девяти композиций при 5°C в течение 3 месяцев представлена в таблице III и на фиг.1. В случае композиций, демонстрирующих более высокую стабильность (Стандарт, Сахароза, Лактоза и ET-поли80sacc), тестирование стабильности продливали до 9 месяцев, а для композиций с лактозой и сахарозой тестирование стабильности продливали даже до 12 месяцев, вследствие их высокой стабильности. Данные, приведенные в таблице III и на фиг.2, показывают, что композиции, содержащие сахарозу и лактозу, демонстрируют улучшенную стабильность с уменьшением чистоты только 2%. Это уменьшение значительно ниже наблюдаемого в других исследуемых композициях.
<b>Таблица III</b>
Чистота ET-743 (%)
Стандарт
Сахароза
Лактоза
ET-поли80sacc
До лиофилизации
98,04
98,34
98,06
97,96
t=0
97,67
98,15
97,21
97,85
1 месяц
96,06
96,89
96,35
97,72
3 месяца
94,37
96,64
95,33
97,58
6 месяцев
92,81
97,01
94,07
95,98
9 месяцев
88,17
95,36
94,83
96,01
12 месяцев
96,31
95,22
<b>Таблица III (продолжение)</b>
Чистота ET-743 (%)
Декстран
PVP
ET-поли80
ET-myrj
ET-p80saccunbuffer
До лиофилизации
96,18
97,62
96,45
97,46
97,45
t=0
94,64
93,72
92,46
96,36
95,80
1 месяц
93,42
91,96
89,38
94,36
91,84
3 месяца
84,90
90,40
81,18
85,31
88,46
Как показано в таблице IV и на фиг.3, содержание основного продукта разложения стандартной композиции, ET-701, было заметно снижено при составлении композиции ET-743 в присутствии сахарозы или лактозы.
<b>Таблица IV</b>
ET-701 (%)
Стандарт
Сахароза
Лактоза
ET-поли80sacc
t=0
0,188
0,066
0,060
0,050
1 месяц
0,533
0,063
0,076
0,060
3 месяца
0,890
0,057
0,054
0,050
6 месяцев
1,732
0,050
0,062
0,050
9 месяцев
3,225
0,050
0,050
0,050
Применительно к настоящему изобретению было обнаружено, что дисахариды улучшают стабильность ET-743 по сравнению с маннитом. Варианты таких дисахаридов включают лактозу, сахарозу и их смеси. Стабильность композиций, содержащих дисахариды, также улучшена, по сравнению с другими композициями, содержащими общепринятые наполнители, такие как декстран и повидон. Было установлено, что варианты композиций, содержащих дисахариды, в соответствии с настоящим изобретением, являются стабильными по меньшей мере в течение 12 месяцев при 5°C. Содержание примесей в вариантах композиций по настоящему изобретению значительно ниже по сравнению с обычными композициями. Соответственно, снижено наличие ET-701. Варианты настоящего изобретения содержат по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80. Указанные варианты продемонстрировали благоприятные свойства растворимости и характеристики стабильности ET-743. Наличие по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества, однако, не является ограничивающим признаком настоящего изобретения, и в других вариантах осуществления такое вещество (вещества) не содержится.
Пример 2
o
Целью настоящего исследования было сравнение стабильности стандартной композиции ET-743 с пятью новыми композициями. В настоящем исследовании оценивали стабильность композиций при +5C.
Составы тестируемых композиций были следующими (таблица V), при том, что вода испарялась во время процесса лиофилизации:
<b>Таблица V</b>
Стандарт
ET treal
ET P80treal
ET P80treal 250
ET P80sacc 250
ET P80trealgly 250
ET-743
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
0,250 мг
Маннит
250 мг
Трегалоза
500 мг
100 мг
100 мг
200 мг
Сахароза
100 мг
Полисорбат 80
10 мг
10 мг
10 мг
150 мг
Глицин
15 мг
Первичный кислотный фосфат калия
34 мг
34 мг
34 мг
6,8 мг
6,8 мг
Фосфорная кислота
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
q.s. pH 4,0
Соляная кислота
q.s. pH 4,5
Вода для инъекций
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
q.s. 5 мл
q.s. 1 мл
q.s. 1 мл
q.s. 1 мл
Основные растворы получали и лиофилизировали с применением следующих конкретных протоколов.
Композиции ETtreal, ETP80treal и стандарт
100 г каждой композиции получали следующим образом.
Взвешивали фосфат калия для конечного раствора и растворяли в 90% конечного объема (90 мл) воды. Затем доводили pH до pH 4,0 0,1 н. фосфорной кислотой.
В сосуд многокомпонентного стекла добавляли ET-743 (5,0 мг) и растворяли магнитным перемешиванием в 2/3 объема (60 мл) раствора фосфата калия в течение приблизительно 1 часа (растворение проверяли визуально). Добавляли наполнитель и поверхностно-активное вещество и растворяли в 1/3 объема раствора фосфата калия. Затем указанный раствор добавляли к раствору ET-743 и перемешивание поддерживали еще в течение 1 часа.
Раствор доводили до конечной массы водой.
Раствор фильтровали через целлюлозный фильтр 0,22 мкм со взятием аликвот до фильтрации для IPC.
Раствором наполняли 25-мл флаконы по 5 мл/флакон и хранили при -20°C до процесса лиофилизации.
Композиции ETP80sacc250, ETP80treal250, ETP80trealgly250
Каждую композицию массой 30 г получали следующим образом.
Взвешивали фосфат калия или глицин для конечного раствора и растворяли в 90% конечного объема воды (27 мл). Затем доводили pH до pH 4,0 0,1 н. фосфорной кислотой или 0,1 н. HCl.
Взвешивали полисорбат 80 и добавляли к 1/3 объема буферного раствора.
ET-743 (7,5 мг) помещали в сосуд из многокомпонентного стекла и растворяли магнитным перемешиванием в 2/3 объема (60 мл) раствора фосфата калия в течение приблизительно 1 часа (растворение проверяли визуально).
Добавляли наполнитель и растворяли в 2/3 объема буферного раствора. Затем указанный раствор добавляли к раствору ЕТ-743 и перемешивание поддерживали в течение 10 минут.
Раствор доводили водой до конечной массы.
Раствор фильтровали через целлюлозный фильтр 0,22 мкм.
Раствором наполняли 10-мл флаконы по 1 мл/флакон и хранили при -20°C до процесса лиофилизации.
Процесс лиофилизации во всех шести композициях проводили в соответствии со следующей таблицей VI:
<b>Таблица VI</b>
Время замораживания до -48°C
2 часа 30 минут
Первичная сушка
29 часов
Вторичная сушка
36 часов
После лиофилизации флаконы герметично упаковывали. Флаконы переносили в охлаждаемое помещение (-20°C).
Тестирование стабильности проводили при температуре 5±3°C.
Все композиции были более стабильны при 5°C, чем стандартная композиция. Существенных различий между новыми композициями отмечено не было. В таблице VII представлены данные хроматографической чистоты композиций ET-743, применяемых в исследовании:
<b>Таблица VII</b>
Чистота ET-743 (%)
Стандарт
ETtreal
ETP80treal
ETP80treal 250
ETP80sacc 250
ETP80trealgly 250
До фильтрации
98,63
98,30
97,10
97,67
97,22
98,3
После фильтрации
98,62
98,46
97,27
97,67
97,06
98,46
После лиофилизации
97,96
98,18
97,65
97,37
97,79
98,18
1 месяц
97,35
98,22
97,78
96,39
97,40
98,22
3 месяца
97,65
98,53
98,25
96,61
96,66
98,53
6 месяцев
95,28
97,38
96,93
97,01
97,06
97,38
Пример 3
Для дальнейшего изучения стабильности при различных температурах было получено шесть композиций ET-NF A, ET-NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E и ET-NF F.
В качестве наполнителей были выбраны сахароза и лактоза. Применяли два различных буфера: цитратно-натриевый буфер 0,1 M pH 4 и фосфатно-калиевый буфер 0,05 M pH 4. Тестировали две различные концентрации ET-743 в основном растворе: 0,250 мг/мл и 0,100 мг/мл. Применяли два различных цикла лиофилизации в зависимости от объема наполнения (4 мл против 10 мл). Для каждой композиции была получена партия из по меньшей мере 125 флаконов.
Для каждого флакона состав основного раствора был следующим (таблица VIII), при том, что вода испарялась во время процесса лиофилизации:
<b>Таблица VIII</b>
ET-NF A
ET-NF В
ET-NF С
ET-NF D
ET-NF E
ET-NF F
Ингредиент
ET-743
1 мг
1 мг
1 мг
1 мг
1 мг
1 мг
Сахароза
400 мг
-
-
1000 мг
1000 мг
-
Лактоза
-
400 мг
1000 мг
-
-
200 мг
Моногидрат лимонной кислоты
43,6 мг
43,6 мг
109 мг
109 мг
-
43,6 мг
Дигидрат цитрата натрия
45,12 мг
45,12 мг
112,8 мг
112,8 мг
-
45,12 мг
Первичный кислотный фосфат калия
-
-
-
-
68 мг
-
Фосфорная кислота
-
-
-
-
q.s pH 4
-
Вода для инъекций
4 мл
4 мл
10 мл
10 мл
10 мл
4 мл
Основные растворы получали и лиофилизировали в соответствии со следующими конкретными протоколами.
Композиции ET-NF A, ET-NF В и ET-NF F
Получение 2 л лимонной кислоты приблизительно 0,2 M: 76,96 г лимонной кислоты растворяли в мерной колбе объемом 2 л и раствор доводили до конечного объема водой для инъекций. Конечная молярность раствора лимонной кислоты составляла 0,183 M.
Получение 2 л цитрата натрия приблизительно 0,2 M: 117,64 г цитрата натрия растворяли в мерной колбе объемом 2 л и раствор доводили до конечного объема водой для инъекций. Конечная молярность раствора цитрата натрия составляла 0,175 M.
Получение 4 л цитратного буфера pH 4 приблизительно 0,1 M: 1125 мл раствора лимонной кислоты 0,2 M перемешивали с 875 мл 0,2 M раствора цитрата натрия в мерной колбе объемом 4 л. Раствор доводили до конечного объема водой для инъекций. Проверяли рН раствора и доводили до pH 4. Конечная молярность раствора цитратного буфера составляла 0,089 M.
143,83 мг ET-743 помещали в сосуд многокомпонентного стекла и растворяли магнитным перемешиванием приблизительно в 80% предусмотренного общего объема 0,1 M цитратного буфера в течение приблизительно 1 часа (растворение проверяли визуально).
Затем добавляли сахарозу или лактозу (55 г сахарозы - композиции А и В, и 27,5 г лактозы - композиция F) и смесь перемешивали в течение дополнительного периода времени приблизительно 1 час до растворения.
После проверки pH раствор доводили до конечного объема добавлением 0,1 М цитратного буфера с pH 4. Повторное установление рН до 4 лимонной кислотой потребовалось для композиции A. Плотность конечного раствора: 1,04 г/л. Конечная масса 572 мг.
Раствор фильтровали через PVDF фильтр 0,22 мкм.
Раствором наполняли 25-мл флаконы, применяя автоматический насос и 3,2 мм трубки из вулканизированного платиной силикона. Стандартный объем наполнения составлял 4 мл.
Объем наполнения проверяли через равные промежутки времени (каждые 15 флаконов), и при необходимости объем наполнения регулировали.
После наполнения вставляли лиофильные пробки и флаконы помещали в лиофилизатор при 5°C.
Процесс лиофилизации проводили в соответствии со следующей таблицей IX:
<b>Таблица IX</b>
Цикл
Стадия
Давление
Заданная Т (°С)
Градиент снижения (минуты)
Время выдерживания
Загрузка
Постепенное снижение T<sup>a</sup>
атм
5°C
Замораживание
Замораживание 1
атм
-50°C
1 час 50 минут 0,5°C/мин
Замораживание 2
атм
-50°C
6 часов
Вакуум
Постоянный вакуум
0,5 мбар
Сублимация
1° сушка
0,080 мбар
-27°C
45 минут 0,5°C/мин
1° сушка
0,080 мбар
-27°C
58 часов
2<sup>ая</sup> сушка
2° сушка
<0,020 мбар
25°C
3 часа 30 минут 0,25°C/мин
2° сушка
<0,020 мбар
25°C
40 часов
Закупоривание пробкой
0,010 мбар
25°C
Флаконы герметично упаковывали. Проводили окончательную проверку. Флаконы переносили в охлаждаемое помещение (-20°C).
Композиции ET-NF С и ET-NF D
Получение 1 л лимонной кислоты приблизительно 0,2 M: 38,48 г лимонной кислоты растворяли в мерной колбе объемом 1 л и раствор доводили до конечного объема водой для инъекций. Конечная молярность раствора лимонной кислоты составляла 0,183 M.
Получение 1 л цитрата натрия приблизительно 0,2 M: 58,82 г цитрата натрия растворяли в мерной колбе объемом 1 л и раствор доводили до конечного объема водой для инъекций. Конечная молярность раствора цитрата натрия составляла 0,175 M.
Получение 2 л приблизительно 0,1 M цитратного буфера с pH 4: 850 мл 0,2 M раствора лимонной кислоты перемешивали с 650 мл 0,2 M раствора цитрата натрия в мерной колбе объемом 2 л. Раствор доводили до конечного объема водой для инъекций. Проверяли рН раствора и доводили до pH 4. Конечная молярность раствора цитратного буфера составляла 0,089 M.
141,21 мг ET-743 помещали в сосуд из многокомпонентного стекла и растворяли магнитным перемешиванием приблизительно в 80% от общего объема 0,1 M цитратного буфера в течение приблизительно 1 часа (растворение проверяли визуально).
Добавляли сахарозу или лактозу (135 г) и смесь перемешивали в течение дополнительного периода времени приблизительно 1 час до растворения.
После проверки pH раствор доводили до конечного объема путем добавления 0,1 М цитратного буфера pH 4. Повторного установления рН не потребовалось.
Плотность конечного раствора: 1,04 г/л. Конечная масса 1404 мг.
Раствор фильтровали через PVDF фильтр 0,45 мкм.
Раствором наполняли 25-мл флаконы, применяя автоматический насос и насосные трубки 3,2 мм из вулканизированного платиной силикона. Стандартный объем наполнения составлял 10 мл.
Объем наполнения проверяли через равные промежутки времени (каждые 15 флаконов) и при необходимости объем наполнения регулировали.
После наполнения вставляли лиофильные пробки и флаконы помещали в лиофилизатор при 5°C.
Процесс лиофилизации проводили, как указывалось ранее для композиций ET-NF A, ET-NF В и ET-NF F (таблица IX).
Вследствие большого объема во флаконах этот цикл предположительно не обеспечивал должную лиофилизацию и происходило слипание. Во избежание нового производственного процесса, все флаконы восстанавливали 10 мл очищенной воды, проверяли параметры чистоты некоторых восстановленных растворов, пробки заменяли пробками с двумя отверстиями и применяли новый цикл (таблица X):
<b>Таблица X</b>
Цикл
Стадия
Давление
Заданная Т (°С)
Постепенное снижение (минуты)
Время выдерживания
Замораживание 2
атм
-50°C
6 часов
Вакуум
Постоянный вакуум
0,5 мбар
Сублимация
1° сушка
0,080 мбар
-23°C
45 минут 0,5°C/мин
1° сушка
0,080 мбар
-23°C
80 часов
2<sup>ая</sup> сушка
2° сушка
<0,020 мбар
0°C
10 часов 0,045°C/мин
2° сушка
25°C
62 часа 0,006°C/мин
Закупоривание пробкой
0,010 мбар
25°C
После лиофилизации флаконы герметично упаковывали. Проводили конечную проверку. Флаконы переносили в охлаждаемое помещение (-20°C).
Композиция ET-NF E
141,21 мг ET-743 помещали в сосуд из многокомпонентного стекла и растворяли магнитным перемешиванием в 1080 мл воды для инъекций +3,240 мл 1 н. фосфорной кислоты в течение приблизительно 1 часа (растворение проверяли визуально).
Добавляли сахарозу (135 г) и фосфат калия (9,18 г) и смесь перемешивали в течение дополнительного периода времени приблизительно 1 час до полного растворения молекулы.
После проверки рН и повторного доведения до рН 4 1 н. фосфорной кислотой, раствор доводили до конечного объема путем добавления воды для инъекций.
Плотность конечного раствора: 1,04 г/л. Конечная масса 1404 мг.
Раствор фильтровали через PVDF фильтр 0,45 мкм.
Раствором заполняли 25-мл флаконы, применяя автоматический насос и насосные трубки 3,2 мм из вулканизированного платиной силикона. Стандартный объем наполнения составлял 10 мл.
Проверяли объем наполнения через равные промежутки времени (каждые 15 флаконов) и при необходимости объем наполнения регулировали.
После наполнения вставляли лиофильные пробки и флаконы помещали в лиофилизатор при 5°C.
Процесс лиофилизации проводили, как указывалось ранее для композиций ET-NF A, ET-NF В и ET-NF F (таблица IX).
Вследствие большого объема во флаконах этот цикл предположительно не обеспечивал должную лиофилизацию и происходило слипание. Во избежание нового производственного процесса, все флаконы восстанавливали 10 мл очищенной воды, проверяли параметры чистоты некоторых восстановленных растворов, пробки заменяли пробками с двумя отверстиями и применяли новый цикл, как в случае композиций ET-NF С и ET-NF D (таблица X).
После лиофилизации флаконы герметично упаковывали. Проводили конечную проверку. Флаконы переносили в охлаждаемое помещение (-20°C).
Во всех случаях достигалась желаемая концентрация ET-743 и профиль распределения концентрации примеси между композициями был аналогичным. Во время процесса получения не наблюдалось различий между концентрацией ET-743 и профилями распределения концентрации примеси (до и после фильтрации или после наполнения). В композициях, содержащих лактозу, цвет основного раствора был слегка желтоватый.
Композиции с наполнением 4 мл или 10 мл были исходно лиофилизированы в соответствии с указанным протоколом. Тогда как композиции с наполнением 4 мл были лиофилизированы должным образом, композиции с наполнением 10 мл слипались. Изменение давления при вторичной сушке показывало слипание и кипение слипшейся лиофилизированной массы. Флаконы с композициями ET-NF C, ET-NF D и ET-NF E восстанавливали 10 мл очищенной воды. Проверяли параметры чистоты композиций. Поскольку изменений в параметрах чистоты, по сравнению с основным раствором, не наблюдалось, было решено провести повторную лиофилизацию флаконов с применением указанного измененного цикла лиофилизации. Партии, лиофилизированные как описано, в результате обладали хорошими свойствами без слипания, но с некоторой усадкой на дне.
Содержание ET-743 во флаконах находилось в описанных пределах (95-105%). Профили распределения концентрации примеси показали сходство между композициями и теми профилями, которые сравниваются с примесями в основных растворах. Содержание остаточной воды было ниже или равно 2% с наибольшими значениями в композициях с наполнением 10 мл.
Значения pH восстановленных растворов во всех случаях находились между pH 4 и pH 4,2. Растворы были прозрачными и бесцветными без видимых чужеродных веществ или осадка. Время растворения было сходным для всех композиций и составляло менее 30 секунд.
Пример 4
Целью изучения было исследование стабильности ET-743 в различных составах ET-NF A, ET-NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E, и ET-NF F по 1 мг/флакон в различных температурных условиях.
Получали партию из 130 флаконов каждой композиции ET-NF A, ET-NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E и ET-NF F, 1 мг ET-743/флакон, в соответствии с примером 3.
Тестирование стабильности проводили при температуре 5°C, 25°C/65% относительной влажности и 40°C/70% относительной влажности.
На фиг.4 и в таблице XI показано изменение чистоты ET-743 новых композиций во время хранения при 5°C, по сравнению с тремя обычными композициями (содержащими ET-743, маннит и фосфатный буфер).
<b>Таблица XI</b>
Чистота ET-743 (%)
Стандарт 1
Стандарт 2
Стандарт 3
ET-NF A
ET-NF В
t=0
97,70
96,90
97,70
99,06
99,00
1 месяц
94,70
94,60
94,00
99,28
98,86
2 месяца
93,80
92,70
93,70
99,21
98,97
3 месяца
92,50
91,00
91,20
99,22
98,88
<b>Таблица XI (продолжение)</b>
Чистота ET-743 (%)
ET-NF С
ET-NF D
ET-NF E
ET-NF F
t=0
98,83
98,98
99,15
98,88
1 месяц
98,53
99,03
99,14
98,71
2 месяца
98,88
99,15
99,21
98,80
3 месяца
98,86
99,12
99,16
98,92
На фиг.6 и в таблице XII показано изменение чистоты ET-743 новых композиций во время хранения при 25°C/65% относительной влажности, по сравнению с тремя обычными композициями (содержащими ET-743, миннит и фосфатный буфер).
<b>Таблица XII</b>
Чистота ET-743 (%)
Стандарт 1
Стандарт 2
Стандарт 3
ET-NF A
ET-NF В
t=0
97,70
96,90
97,70
99,06
99,00
15 дней
84,70
84,50
89,50
98,97
98,09
1 месяц
74,50
72,40
81,90
99,08
98,13
2 месяца
99,10
98,38
3 месяца
98,98
98,15
<b>Таблица XII (продолжение)</b>
Чистота ET-743 (%)
ET-NF С
ET-NF D
ET-NF E
ET-NF F
t=0
98,83
98,98
99,15
98,88
15 дней
98,35
98,90
99,11
98,31
1 месяц
98,01
99,03
99,13
98,32
2 месяца
98,35
98,99
99,10
98,28
3 месяца
98,33
98,93
99,09
98,14
На фиг.8 и в таблице XIII показано изменение чистоты ET-743 новых композиций во время хранения при 40°C/70% относительной влажности, по сравнению с обычными композициями (содержащими ET-743, маннит и фосфатный буфер).
<b>Таблица XIII</b>
Чистота ET-743 (%)
Стандарт 4
ET-NF A
ET-NF B
ET-NF C
ET-NF D
ET-NF E
ET-NF F
t=0
94,92
99,06
99,00
98,83
98,98
99,15
98,88
2 дня
87,17
99,02
98,10
98,48
98,95
99,12
97,53
7 дней
82,04
98,68
97,08
97,86
98,63
98,89
97,20
15 дней
76,33
98,75
97,33
97,77
98,55
98,71
96,66
1,5 месяца
98,52
96,99
97,53
97,54
98,47
95,79
3 месяца
98,24
95,92
96,67
94,79
97,84
95,91
Кроме того, на фиг.5 и в таблице XIV показано образование примеси ET-701 в новых композициях во время хранения при 5°C, по сравнению с тремя обычными композициями (содержащими ET-743, маннит и фосфатный буфер).
<b>Таблица XIV</b>
ET-701 (%)
Стандарт 1
Стандарт 2
Стандарт 3
ET-NF A
ET-NF B
t=0
0,70
0,84
0,53
0,11
1 месяц
2,56
3,09
1,73
0,12
2 месяца
3,45
3,54
2,69
0,12
0,13
3 месяца
4,61
5,04
4,28
0,13
0,13
<b>Таблица XIV (продолжение)</b>
ET-701 (%)
ET-NF C
ET-NF D
ET-NF E
ET-NF F
t=0
0,15
0,16
0,15
0,11
1 месяц
0,12
0,12
0,14
0,11
2 месяца
0,16
0,14
0,15
0,12
3 месяца
0,16
0,15
0,15
0,12
На фиг.7 и в таблице XV показано образование примеси ET-701 в новых композициях во время хранения при 25°C/65% относительной влажности по сравнению с тремя обычными композициями (содержащими ET-743, маннит и фосфатный буфер).
<b>Таблица XV</b>
ET-701 (%)
Стандарт 1
Стандарт 2
Стандарт 3
ET-NF A
ET-NF B
t=0
0,70
0,84
0,53
0,09
0,11
15 дней
7,99
8,20
4,22
0,14
0,12
1 месяц
10,56
14,18
6,86
0,11
0,12
2 месяца
0,15
0,16
3 месяца
0,17
0,17
<b>Таблица XV (продолжение)</b>
ET-701 (%)
ET-NF C
ET-NF D
ET-NF E
ET-NF F
t=0
0,15
0,16
0,15
0,11
15 дней
0,18
0,17
0,16
0,13
1 месяц
0,18
0,18
2 месяца
0,18
0,19
0,24
0,15
3 месяца
0,22
0,23
0,24
0,18
Как показано на указанных фигурах, стабильность новых композиций выше стабильности обычных композиций. Кроме того, содержание основного продукта разрушения обычных композиций, ET-701, в новых композициях было заметно снижено.
Пример 5
Для дальнейшего изучения стабильности применяли три новые композиции на основе сахарозы в качестве наполнителя. Эти новые композиции отличаются молярностью фосфатного буфера (0,05 M против 0,1 M) и объемом наполнения или, другими словами, концентрацией ET-743 в основном растворе (10 мл против 4 мл).
Описано производство партии по меньшей мере 50 флаконов каждой из указанных композиций. Краткое описание состава для флаконов представляет собой следующее (таблица XVI), при том, что вода испарялась во время процесса лиофилизации:
<b>Таблица XVI</b>
ET-NF G
ET-NF H
ET-NF I
Концентрация (мг/мл)
Конечный состав
Концентрация (мг/мл)
Конечный состав
Концентрация (мг/мл)
Конечный состав
Ингредиент
ET-743
0,250
1 мг
0,100
1 мг
0,250
1 мг
Сахароза
100
400 мг
100
1 г
100
400 мг
Первичный кислотный фосфат калия
6,8
27,2 мг
13,6
136 мг
13,6
54,4 мг
Фосфорная кислота
q.s до pH 4,0
q.s pH 4,0
q.s to pH 4,0
q.s pH 4,0
q.s до pH 4,0
q.s pH 4,0
Вода для инъекций
q.s. до 1 мл
4 мл
q.s. до 1 мл
10 мл
q.s. до 1 мл
4 мл
Получали 240 мл композиций ET-NF G и ET-NF I.
62,76 мг ET-743 помещали в сосуд из многокомпонентного стекла и растворяли магнитным перемешиванием в растворе 192 мл воды для инъекций + 1 н. фосфорной кислоты (576 мкл для NF G, 816 мкл для NF I) в течение приблизительно 1 часа (растворение проверяли визуально).
Добавляли сахарозу (24 г) и фосфат калия (1,63 г для NF G, 3,26 г для NF I) и смесь перемешивали в течение дополнительного периода времени приблизительно 1 час до растворения.
После проверки pH и, при необходимости, повторного доведения до pH 4,00 1 н. фосфорной кислотой, раствор доводили до конечного объема добавлением воды для инъекций.
Плотность конечного раствора: 1,04 г/л. Конечная масса 249,6 г.
Раствор фильтровали через PVDF фильтр 0,45 мкм.
Раствором наполняли 25-мл флаконы, применяя автоматический насос и насосные трубки 3,2 мм из вулканизированного платиной силикона.
Стандартный объем наполнения составлял 4 мл.
Объем наполнения проверяли через равные промежутки времени (каждые 15 флаконов) и при необходимости регулировали.
После наполнения вставляли лиофильные пробки, и флаконы помещали в лиофилизатор при 5°C.
Процесс лиофилизации проводили в соответствии со следующими параметрами (таблица XVII):
<b>Таблица XVII</b>
Цикл
Стадия
Давление
Заданная Т (°С)
Постепенное снижение (минуты)
Время выдерживания
Постепенное снижение T<sup>a</sup>
атм
5°C
Замораживание
Замораживание 1
атм
-50°C
1 час 50 минут 0,5°C/мин
Замораживание 2
атм
-50°C
6 часов
Вакуум
Постоянный вакуум
0,5 мбар
Сублимация
1° сушка
0,080 мбар
-27°C
45 минут 0,5°C/мин
1° сушка
0,080 мбар
-27°C
58 часов
2<sup>я</sup> сушка
2° сушка
<0,020 мбар
25°C
3 часа 30 минут 0,25°C/мин
2° сушка
25°C
40 часов
Окончание
0,010 мбар
25°C
После лиофилизации флаконы герметично упаковывали. Проводили окончательную проверку. Флаконы переносили в охлаждаемое помещение (-20°C).
600 мл композиции ET-NF H получали следующим образом.
62,76 мг ET-743 помещали в сосуд из многокомпонентного стекла и растворяли магнитным перемешиванием в растворе 480 мл воды для инъекций + 1,44 мл 1 н. фосфорной кислоты в течение приблизительно 1 часа (растворение проверяли визуально).
Добавляли сахарозу (60 г) и фосфат калия (8,16 г) и смесь перемешивали в течение дополнительного периода времени приблизительно 1 час до растворения.
После проверки pH и, при необходимости, повторного доведения до pH 4,00 1 н. фосфорной кислотой, раствор доводили до конечного объема добавлением воды для инъекций.
Плотность конечного раствора: 1,04 г/л. Конечная масса 624 г.
Раствор фильтровали через PVDF фильтр 0,45 мкм.
Раствором наполняли 25-мл флаконы с применением автоматического насоса и 3,2 мм насосных трубок из вулканизированного платиной силикона. Стандартный объем наполнения составлял 10 мл.
Объем наполнения проверяли через равные промежутки времени (каждые 15 флаконов) и, при необходимости, регулировали.
После наполнения вставляли лиофильные пробки, и флаконы помещали в лиофилизатор при 5°C.
Процесс лиофилизации проводили в соответствии со следующими параметрами (таблица XVIII):
<b>Таблица XVIII</b>
Цикл
Стадия
Давление
Заданная Т (°С)
Постепенное снижение (минуты)
Время выдерживания
Постепенное снижение T<sup>a</sup>
атм
5°C
Замораживание
Замораживание 1
атм
-50°C
1 час 50 минут 0,5°C/мин
Замораживание 2
атм
-50°C
6 часов
Вакуум
Постоянный вакуум
0,5 мбар
Сублимация
1° сушка
0,080 мбар
-27°C
45 минут 0,5°C/мин
1° сушка
0,080 мбар
-27°C
62 часа
2<sup>ая</sup> сушка
2° сушка
<0,020 мбар
25°C
3 часа 30 минут 0,25°C/мин
2° сушка
25°C
50 часов
Окончание
0,010 мбар
25°C
После лиофилизации флаконы герметично упаковывали. Проводили окончательную проверку. Флаконы переносили в охлаждаемое помещение (-20°C).
Содержание ET-743 находилось в описанных пределах (95-105%). Профили распределения концентрации примеси показывали сходство для всех композиций и были сравнимы с примесями в основных растворах. Содержание остаточной воды было ниже 2% с наибольшими значениями в композициях с наполнением 10 мл.
Значения pH восстановленных растворов во всех случаях находились между pH 4 и pH 4,28. Растворы были прозрачными и бесцветными без видимых чужеродных веществ или осадка. Время растворения было сходным для всех композициях и составляло менее 30 секунд.
Тестирование стабильности проводили в течение 3 месяцев при температуре хранения 40°C/70% относительной влажности.
На фиг.9 и в таблице XIX показано изменение чистоты ET-743 новых композиций во время хранения при 40°C/70% относительной влажности.
<b>Таблица XIX</b>
Чистота ET-743 (%)
ET-NF G
ET-NF H
ET-NF I
t=0
99,18
99,23
99,00
7 дней
99,04
98,68
15 дней
98,97
98,86
98,79
1,5 месяца
98,72
98,61
98,40
2 месяца
98,29
3 месяца
97,71
Кроме того, на фиг.8 данные по стабильности показаны в сравнении с обычными композициями (содержащими ET-743, маннит и фосфатный буфер).
Результаты, полученные в примерах 4 и 5, указывают на то, что все композиции, содержащие дисахарид в качестве наполнителя, более стабильны, чем обычные композиции, содержащие в качестве наполнителя маннит. Предпочтительной композицией является ET-NF G.
Варианты композиций по настоящему изобретению были протестированы после хранения в различных условиях хранения (включая температуры -20°C, 4°C и 25°C/60% относительной влажности) с различным временем хранения (включая время хранения 3 месяца, 6 месяцев и 9 месяцев). Результаты исследования показали, что по меньшей мере 99,5% ET-743 оставалось после 9 месяцев хранения при -20°C, по меньшей мере 99% ET-743 оставалось после 9 месяцев хранения при 4°C, и по меньшей мере 97% ET-743 оставалось после 9 месяцев хранения при 25°C/60% относительной влажности. Общее количество примесей, в том числе ET-701, ET-745, и других примесей не превышало 1,66% после 9 месяцев хранения при 25°C/60% относительной влажности. Кроме того, уровень загрязнения ET-701 не превышал 0,21% через 9 месяцев в указанных условиях хранения.
Все цитируемые в настоящем описании ссылки включены в полном объеме. Технические признаки и преимущества настоящего изобретения выражены в представленном настоящем описании. На основании указанного описания могут быть сделаны модификации и адаптации к различным условиям и применениям, таким образом, образуя варианты осуществления в объеме настоящего изобретения.