Влияние трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на посттравматические процессы при экспериментальной травме головного мозга

Влияние трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток на посттравматические процессы при экспериментальной травме головного мозга

АС. Григорян1, ЕГ. Гилерович 2, Н.Н. Павличенко1, П.В. Кругляков1, ИБ. Соколова1, ДГ Полынцев1.

1 ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург

2 НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург

The effects of multipatent mesenchymal stem cells transplantation on post-traumatic processes after the experimental traumatic brain injury

AS. Grigorian1, E.G. Gilerovich 3, N.N. Pavlichenko1, P.V. Kruglyakov1, IB. Sokolova1, D.G. Polyntsev1

1 Trans-Technologies Ltd., Saint-Petersburg

2 Intitute for Experimental Medicine, RAMS, Saint-Petersburg

Изучено воздействие различных способов трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК) на течение посттравматических процессов при экспериментальной травме головного мозга у крыс. Показано, что вне зависимости от метода трансплантации ММСК ускоряют течение воспаления и формирования астроглиаль-ного рубца в краевой зоне повреждения, а также способствуют сохранению строения базальных структур мозга. При внутривенной трансплантации было показано уменьшение зоны повреждения в коре головного мозга и подкорковых структурах.

Впервые продемонстрировано, что введение суспензии ММСК непосредственно в краевую зону травматической полости приводит к формированию в мозге гранулем, состоящих из скоплений синтезирующих коллаген производных ММСК, а также к возникновению аномальных скоплений синусоидных капилляров в отдаленном посттравматическом периоде.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стро-мальные клетки, черепно-мозговая травма, травма головного мозга, базальные структуры мозга, нейроны.

The influence of different transplantation methods of multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC) on post-traumatic processes after the experimental brain injury in rats was studied. It was shown, that inspite of the transplantation method the MMSC hasten inflammation and glial scar formation in the injury boudary zone, and also preserve the normal morphology of the brain basal ganglia. The intravenous MMSC transplantation decreases the extent of brain tissue damage in neocortex and subcortical structures. It was shown by the first time that the injection of MMSC suspension into the injury boudary zone leads to the formation of neoplasms consisting of collagen-secreting MMSC, and also to the development of abnormal sinusoid cappilaries in the brain tissue in long-term post-traumatic period.

Key words: multipotent mesenchyaml stem cells, craniocerebral trauma, traumatic brain injury, basal ganglia, neurons.

Введение

К сегодняшнему дню показано, что клеточная терапия с помощью различных типов стволовых клеток способна оказывать положительное влияние на функциональное восстановление нервной системы [1—3], однако в настоящее время экспериментальных работ, в которых бы проводились трансплантации различных типов стволовых клеток на моделях травмы головного мозга, крайне мало [4—8].

Из всех стволовых клеток млекопитающих наиболее доступны для получения, наращивания в культуре и последующего терапевтического применения так называемые мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), присутствующие в строме костного мозга. Методики работы с ММСК млекопитающих, позволяющие получить клетки в достаточном для трансплантации количестве, хорошо отработаны [9]. Известно, что in vitro данные клетки способны в отсутствии искусственных воздействий давать начало остеоцитам, ади-поцитам и хондроцитам [10], а под действием специфических факторов дифференцировки — некоторым другим клеточным типам, в том числе клеткам нейронального ряда [11]. В связи с последним у исследова-

e-mail: anait@alkorbio.ru

телей возникла идея использования ММСК в терапии нейродегенеративных заболеваний и повреждений нервной системы [12, 13]. В нашем научном коллективе на модели ишемического инсульта головного мозга у крыс было показано, что ММСК ускоряют течение реакции воспаления в нервной ткани, способствуют сохранению жизнеспособных нейронов в зоне пенумбры, улучшению васкуляризации ишемизированной зоны и сохранению целостности сосудистого сплетения мозга [14].

Применение ММСК для сохранения и восстановления нервной ткани при травме головного мозга — одно из самых молодых направлений в этой области. Большинство экспериментальных работ, в которых проводились попытки таких трансплантаций, относится к 2000^2009 гг., а число этих работ крайне невелико, и практически все они выполнены одной группой исследователей под руководством М. Чоппа (М. СИорр) [4—8]. Возможно, этот факт объясняется тем, что обширная травма головного мозга крайне сложна для изучения, поскольку влечет за собой активацию целого комплекса патогенетических механизмов, а именно: нарушение нейродинамичес-ких процессов, расстройство тканевого дыхания и энергетического метаболизма, нарушение ликвородинамики

и изменение мозгового кровообращения [15]. В то же время, по данным ВОЗ, частота травм головного мозга составляет от 30 до 50% от общего травматизма, при этом частота черепно-мозговой травмы возрастает в среднем на 2% в год [16].

Научная группа, возглавляемая М. Чоппом, установила, что трансплантация ММСК животным с черепно-мозговой травмой позволяет сохранить достоверно большее количество жизнеспособных нейронов в участках ЦНС, непосредственно прилежащих к травматической полости, а также способствует более быстрому и полному восстановлению моторных и когнитивных навыков. Однако эти исследования не охватывают всего спектра проблем, связанных с тяжелым повреждением головного мозга. Нужно заметить, что в цитируемых работах ММСК были трансплантированы животным тотчас после нанесения травмы. Это не отражает реальной ситуации, которая возникает в клинике, когда терапия применяется лишь спустя, по крайней мере, несколько часов после травмы. Также нельзя забывать о том, что в течение первых и вторых суток после нанесения травмы в мозге развиваются процессы некроза. Введение клеток в этом периоде при их попадании в травматическую полость может закончиться их гибелью. По этим причинам необходимо изучить течение репаративных процессов в травмированном мозге при отстроченной трансплантации ММСК, чего, по нашим данным, до настоящего времени не проводилось.

В нашей работе мы провели сравнение эффективности различных способов трансплантации ММСК в терапии экспериментальной травмы головного мозга у крыс, поставив перед собой цель дать морфофункциональную характеристику головного мозга животных на фоне клеточной терапии, оценив динамику посттравма-тических процессов в нервной ткани.

Материал и методы

Эксперименты проведены на 80 крысах-самцах инб-редной линии Вистар-Киото массой от 180 до 200 г, в возрасте от 4 до 5 мес. Животных содержали в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к воде и пище, температура 23^25°С).

Выделение и культивирование ММСК. Суспензию костного мозга выделяли из бедренных костей животных сразу после декапитации. Клетки культивировали в монослое при 37°С в 5% С02-инкубаторе в течение 6^7 сут. после эксплантации в питательной среде —МЕМ (Hyclone, Новая Зеландия), содержавшей 20% сыворотки крови эмбрионов коров (Gibco, США) и 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина (Gibco, США). В дальнейшем проводили пассирование культуры через каждые семь суток с исходной плотностью 1,27x103 клеток/см2. Для пассирования культуры использовали раствор трипсина и этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЗДТА) (Hyclone, Новая Зеландия). Замену питательной среды проводили каждые трое суток.

Иммунофенотипирование ММСК. Иммунофенотипи-рование ММСК крыс проводили методом проточной цитофлуориметрии на проточном цитофлуориметре EPICS XL (Beckman Coulter, США). ММСК окрашивали антителами против маркеров CD45, CD44, CD90 и CD106 (Beckton Dickinson, США) по протоколу фирмы-изготовителя. Иммунофенотипирование проводили после первого, второго и третьего пассажей культуры.

Окрашивание ММСК флуорохромом РКН 26. Для окрашивания флуорохромом РКН 26

использовались ММСК крыс после второго пассажа культуры. Окрашивание клеток проводили по протоколу фирмы-изготовителя, эффективность окрашивания оценивали с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope (Zeiss, Германия).

Моделирование травмы головного мозга и трансплантация клеточного материала. Была смоделирована травма головного мозга крысы в области соматосенсорной коры левого полушария. Крыс наркотизировали золе-тилом. Во время операции и до выхода из наркоза температура тела животных поддерживалась на уровне 37°С. Голову животного фиксировали, после чего разрезали кожу на голове, вскрывали череп, не повреждая твердой мозговой оболочки, и наносили травму с помощью метода «weight-drop» [17] падением гири весом 1,3 г по направляющей трубочке с высоты 25 см. Диаметр повреждения в неокортексе при этом составлял 2 мм2, максимально обширное разрушение нервной ткани происходило на уровне ^3,3 мм от брегма. Операционную рану послойно ушивали.

Для анализа было создано 5 экспериментальных групп, включавших по 16 животных.

Группа негативного контроля — I: после нанесения травмы головному мозгу (ТГМ) терапии животным не проводилось.

Группа негативного контроля — II: на 3 сут. после нанесения ТГМ животным производили повторное вскрытие черепной коробки и в краевую зону травматической полости с помощью шприца Гамильтона с калибром иглы 26s вводили 20 мкл стерильной питательной среды —МЕМ (2 укола по 10 мкл).

Группа клеточной терапии — I: на 3 сут. после нанесения ТГМ животным проводили трансплантацию ММСК, предварительно окрашенных флуорохромом РКН26, в краевую зону травматической полости. Введение клеток осуществляли с помощью шприца Гамильтона с калибром иглы 26s. Количество трансплантированных ММСК составило 200 ООО клеток в 10 мкл питательной среды —

Группа клеточной терапии — II: на 3 сут. после нанесения ТГМ животным проводили внутривенную трансплантацию ММСК, предварительно окрашенных флуорохромом РКН26. Введение ММСК осуществлялось в хвостовую вену с помощью шприца Гамильтона с калибром иглы 26s. Количество трансплантированных ММСК

—

Группа клеточной терапии — III: на 3 сут. после нанесения ТГМ животным проводили сочетанную трансплантацию ММСК внутривенно и в краевую зону травматической полости.

Морфологический анализ мозга животных из каждой группы проводили через 1 и 6 нед. после нанесения травмы головного мозга.

Фиксация головного мозга. Животные под ингаляционным наркозом парами эфира подвергались прижизненной фиксации посредством перфузии через левый желудочек сердца 4% раствором параформальдегида в фосфатно-солевой буфер (ФСБ) (pH = 7,2). После декапитации извлекали головной мозг и вырезали сегмент, включающий видимую зону повреждения и интактные краевые зоны. Половину блока фиксировали по стандартной методике в параформальдегиде с последующей заливкой в парафин, другую половину криофиксировали в жидком азоте для выявления флуоресцентно меченых ММСК.

Выявление флуоресцентно меченых ММСК в тканях головного мозга. Детекцию флуоресцентно меченых

ММСК в тканях головного мозга проводили с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica, Германия) на гистологических препаратах толщиной 7 мкм, изготовленных на криостатном микротоме Bright (Bright, Великобритания).

Гистологическое окрашивание срезов головного мозга. Срезы нервной ткани для морфологического анализа окрашивали по общепринятой методике Ниссля. Также для анализа срезов мозга животных, которым проводилась трансплантация ММСК в краевую зону травматической полости и сочетанная трансплантация ММСК, был применен метод окрашивания по Ван-Ги-зону для оценки возможного синтеза коллагена трансплантированными клетками в мозге. При морфологическом анализе структуры мозга идентифицировали по атласу [18]. Оценку величины травматической полости для каждой группы проводили по количеству разрушенных структур мозга.

Иммуногистохимическое окрашивание срезов головного мозга. Иммуногистохимическим методом выявляли ряд маркеров клеточных типов: NeuN (белок ядер нейронов, Chemicon, США), глиальный кислый фибриллярный белок (ГФКБ) (маркер астроглии, DAKO, Дания), Ki67 (маркер пролиферирующих клеток, BD Pharmingen, США), vWF (фактор фон Виллебрандта, маркер эндоте-лиоцитов сосудов, DAKO, Дания), SynF (синаптофизин, маркер синаптических пузырьков, DAKO, Дания), нестин (белок промежуточных филаментов, присутствующий в нейрональных клетках-предшественницах, BD Pharmingen, США). Во всех случаях окрашивание производили по протоколам фирмы-изготовителя.

Результаты

Фенотип культуры ММСК. Анализ культуры ММСК после второго пассажа методом проточной цитофлуо-риметрии показал, что доля Сй45+-клеток (клеток гемо-поэтического ряда) варьировала от животного к животно-

му в пределах 3^5% от общего количества клеток. Доля Сй44+-клеток (некоторые клетки гемопоэтического ряда и часть популяции ММСК) составляла 10—15% от общего количества клеток. Доля Сй106+-клеток (некоторые клетки гемопоэтического ряда и часть популяции ММСК) составляла от 4 до 10%. Доля С090+-клеток (собственно ММСК) составляла 96^97% от общего количества клеток (рис. 1). Фенотип клеток, определенный по поверхностным маркерам, не менялся на протяжении первых четырех пассажей и соответствовал фенотипу, описанному ранее для ММСК крысы [19].

Распределение ММСК в головном мозге при различных способах трансплантации. Исследование криосрезов мозга животных из группы клеточной терапии показало, что при введении ММСК непосредственно в краевую зону травматической полости меченые клетки обнаруживались в области инъекции и в субэпендим-ной зоне желудочков как ипсилатерального (травмированного), так и контралатерального (не травмированного) полушария. Отдельные ММСК находились в полости боковых желудочков вблизи эпендимной выстилки. Небольшое количество клеток лежало в белом веществе внутренней капсулы обоих полушарий. В указанных областях флуоресцирующие клетки располагались группами по несколько десятков, их ассоциации с сосудами не наблюдалось. При внутривенной инъекции меченые клетки в небольшом количестве располагались в зоне, граничащей с травматической полостью. В других структурах мозга при данном способе введения ММСК обнаружены не были. При сочетанном введении ММСК распределение флуоресцентно меченых клеток практически не отличалось от описанного распределения для случая введения ММСК непосредственно в мозг, однако в области, граничащей с травматической полостью, меченых клеток было значительно больше (рис. 2). При всех способах трансплантации описанное распределение сохранялось в течение всех 6 нед. наблюдения.

Рис. 7. Иммунофенотип клеток, выделенных из костного мозга крысы, на 2 пассаже.

Красным цветом выделена часть популяции, позитивная по данному маркеру, серым - негативная, светло-серым - отрицательный контроль:

А - популяция содержит 3% С045’ клеток; Б - популяция содержит 12,3% СП44’ клеток;

В - популяция содержит 4% СОЮ6' клеток; Г - популяция содержит 99,7% С090’ клеток

Рис. 2. Распределение флуоресцентно меченых ММСК в поврежденном головном мозге животных через Б нед. после трансплантации:

А - схематическое изображение фронтального среза головного мозга крысы на уровне -3,3 мм от брегма [красными прямоугольниками отмечены области, где флуоресцентно меченые ММСК обнаруживались при местной и сочетанной трансплантации, синими прямоугольниками отмечены области, в которых флуоресцентно меченые ММСК обнаруживались при внутривенной трансплантации, зеленым цветом обозначено максимальное повреждение мозга в каждой из групп по количеству затронутых травматической полостью структур);

Б - группа флуоресцентно меченых ММСК в краевой области травматической полости при местном введении; В - флуоресцентно меченые ММСК в краевой зоне травматической полости при сочетанном введении;

Г - флуоресцентно меченые ММСК на эпендимной выстилке контралатерального желудочка при местном введении;

Д - флуоресцентно меченые МСК в пограничной зоне ипсилатерального желудочка и в белом веществе внутренней капсулы при местном введении;

Е - диффузное распределение ММСК пограничной зоне травматической полости [звездочкой отмечен капилляр); ТП - травматическая полость; ПЖ - полость желудочка. Криосрезы. Докраска ядер - ОАРІ.

У в.: об. х10[Б-Д), х40 [Е]

Морфологические изменения в структуре

головного мозга животных

Группа негативного контроля — I. Через неделю после нанесения животным травмы головного мозга наблюдался обширный некроз нервной ткани, затрагивавший у разных животных несколько различные области коры ипсилатерального полушария. У большинства отсутствовали первичная и вторичная моторная кора, а также часть первичной соматосенсорной коры. У всех животных из группы негативного контроля-1 под указанными областями коры были практически разрушены белое вещество мозолистого тела и наружной капсулы, а также участки расположенного непосредственно под травматической полостью гиппокампа. Поврежденные участки ткани были инфильтрированы многочисленными макрофагами и отдельными гранулоцитами, главным образом, нейтрофилами, также в них наблюдалось большое количество тонкостенных сосудов. Остаточная мак-рофагальная инфильтрация сохранялась в течение 6 нед. Через 6 нед. травматическая полость практически не увеличивалась в размерах (рис. ЗА), на ее границе завершалось формирование грубого многослойного рубца, содержащего глиальные и соединительнотканные клетки, заканчивался процесс очищения зоны повреждения от некротических масс.

На границе травматической полости как на раннем, так и на позднем сроке анализа обнаруживалось множество нейронов, характеризовавшихся удлиненной неправильной формой и изломанной границей клетки (рис. 4А). Ядра таких клеток были гиперхромными и гомогенными, цитоплазма — также гомогенной и темно окрашенной, что расценивалось нами как гибель по типу гиперхроматоза [20].

Рис. 3. Схематическое изображение фронтальных срезов мозга на уровне -3,3 мм от брегма с указанием максимального размера повреждения [отмечено зеленым цветом) по количеству затронутых структур мозга в разных экспериментальных группах:

А - поврежденная область в группе негативного контроля -I на сроках 1 и Б нед.;

Б - поврежденная область в группе негативного контроля -

II на сроках 1 и 6 нед.;

В - поврежденная область в группе клеточной терапии -1 на сроках 1 и Б нед.;

Г - поврежденная область в группе клеточной терапии - II на сроках 1 и 6 нед.;

Д - поврежденная область в группе клеточной терапии - III на сроке 1 нед.;

Е - поврежденная область в группе клеточной терапииЧН на сроке 6 нед.

Кроме непосредственно поврежденных травмой участков наиболее выраженные изменения наблюдались в ядре поводка и в базальных структурах: пириформ-ной коре, ядрах миндалины и аркуатном ядре. У всех животных из данной группы в этих структурах была отмечена гибель нейронов по гиперхромному типу в обоих полушариях как на раннем, так и на позднем сроке анализа.

Травмой у животных был частично разрушен латеральный желудочек ипсилатерального полушария, у двух животных из данной группы на раннем сроке анализа наблюдалось патологическое расширение ипсилатерального желудочка, явившееся, по всей вероятности, следствием нарушения циркуляции ликвора. На позднем сроке анализа расширение ипсилатерального желудочка было отмечено у всех животных с повреждением желудочковой системы.

Группа негативного контроля — II. Через неделю после нанесения травмы головного мозга и последующего введения в краевую зону травматической полости культуральной среды —МЕМ в головном мозге животных формировалась травматическая полость, полностью разрушавшая первичную и вторичную моторную, а также первичную и вторичную соматосенсорную кору. Также у животных были повреждены слуховая кора, частично — вторичная зрительная кора и париетальная ассоциативная кора. Непосредственно под травматической полостью было повреждено белое вещество наружной капсулы и мозолистого тела, разрушены участки гиппокампа. Таким образом, повреждение по количеству затронутых структур мозга превышало таковое у животных из группы негативного контроля — I. Его размеры на сроке анализа 6 нед. не менялись (см. рис. ЗБ), к этому времени завершалось формирование грубого глио-соединительно-тканного рубца, в пограничной зоне присутствовало некоторое количество гиперхромных нейронов (см. рис. 4Б).

Травматическая полость у животных данной группы сообщалась с ипсилатеральным желудочком, однако только у одного животного обнаруживалось его заметное расширение. При этом у всех животных было отмечено увеличение и набухание эпендимных клеток в фиссуре ипсилатерального желудочка, располагавшейся непосредственно под травматической полостью.

Участки нервной ткани, граничащие с травматической полостью, были инфильтрированы большим количеством макрофагов и нейтрофилов, выселявшихся из капилляров. Остаточная инфильтрация сохранялась до шестой недели наблюдения. В пограничных участках травматической полости обнаруживалась мощная активация астроглии (рис. 5В).

У всех животных из данной группы в пограничной зоне травматической полости погибшие нейроны лежали узкой полосой вдоль края полости. Гибель нейронов происходила на обоих сроках анализа в ядре поводка и в базальных областях: пириформной коре, ядрах миндалины и в аркуатном ядре. В этих структурах количество гиперхромных нервных клеток резко возрастало в сравнении с остальными участками мозга, где встречались лишь отдельные диффузно расположенные погибшие нейроны.

Группа клеточной терапии-1. Через неделю после нанесения травмы у животных образовывалась травматическая полость, захватывавшая ретросплениальную агранулярную, первичную и вторичную моторную кору, а также первичную соматосенсорную кору и частично — вторичную соматосенсорную кору. Травматическая полость распространялась также на подкорковые структуры, захватывая участки белого вещества мозолистого тела и внешней капсулы, часть подлежащего под указанными областями коры гиппокампа. Размеры травматической полости не менялись на протяжении 6 нед. наблюдения (см. рис. ЗВ). У всех животных наблюдалась сильная деформация дорсального третьего желудочка мозга. У шести из восьми животных были полностью разрушены ядра таламуса.

Рис. 4. Состояние пограничной зоны травматической полости у животных через 6 нед. после нанесения травмы: А- в группе негативного контроля -1;

Б- в группе негативного контроля - II;

В- в группе клеточной терапии -1;

Г- в группе клеточной терапии - II;

Д- в группе клеточной терапииЧП;

Е - гиперхромные нейроны в коре головного мозга на большем увеличении [отмечены стрелками);

ТП - травматическая полость.

Фронтальный срез, уровень -3.3 мм от брегма.

Окраска толуидиновым синим по методу Ниссля.

Ув.:об. х10[А-Д), х40[Е)

Рис. 5. Активация астроглии в пограничной зоне травматической полости через 1 нед. после нанесения травмы:

А- в группе клеточной терапии - II; Б- в группе клеточной терапии -1;В-в группе негативного контроля - II;

ТП - травматическая полость. Стрелками отмечен формирующийся по краю травматической полости астроглиальный рубец, наиболее узкий при внутривенной трансплантации ММСК [в группе клеточной терапии - II). Фронтальный срез, уровень -3,3 мм от брегма. Иммуногистохимическая реакция с антителами против ГФКБ, продукт реакции - коричневого цвета.

Докраска препарата толуидиновым синим по методу Ниссля. У в. х10

Зоны, прилежащие к травматической полости, были инфильтрированы в основном многочисленными макрофагами и редко — нейтрофилами, но на позднем сроке анализа инфильтрация практически не обнаруживалась. Также в краевой зоне повреждения в коре ипсилатерального полушария на обоих сроках анализа наблюдалось большое количество погибших по типу гиперхроматоза нейронов (см. рис. 4В). Край травматической полости содержал большое количество активированных астроцитов (см. рис. 5Б), к 6 нед. в краевой зоне повреждения формировался тонкий астроглиальный рубец.

В этой группе на обоих сроках анализа у половины животных происходила выраженная гибель нейронов в пириформной коре, ядрах миндалины и в аркуатном ядре. В ядре поводка у всех без исключения животных наблюдалась картина, аналогичная обеим группам негативного контроля.

У большинства животных травматическая полость сообщалась с полостью ипсилатерального желудочка, однако на обоих сроках анализа его расширения зафиксировано не было.

У шести из восьми животных в мозге через неделю после операции были обнаружены несвойственные нервной ткани крупные образования — гранулемы различной формы, состоящие из вытянутых веретеновидных клеток. Помимо этих фибробластоподобных клеток, являвшихся, по всей видимости, трансплантированным ММСК, гранулемы содержали большое количество макрофагов и гранулоцитов. Также в них было отмечено большое количество полнокровных капилляров и арте-риол, а также множество рыхло лежащих соединительнотканных извитых волокон. Гранулемы у разных животных располагались в контралатеральном полушарии в области черной субстанции, таламических и претек-тальных ядер, либо на границе наружной и внутренней капсул (рис. 6).

В четырех из шести обнаруженных гранулем в центральной их части наблюдалась деструкция, образование полостей, полых либо заполненных светлой гомогенной лишенной структуры тканью. В них отсутствовали клетки нейронального и глиального ряда (рис. 7). В краевой

части гранулем обнаруживались тяжи веретеновидных отростчатых клеток, по-видимому, мигрирующих в окружающую нервную ткань. Через 6 нед. после операции гранулемы в мозге животных из данной группы не наблюдалось, однако у трех животных в мозге было обнаружено множество сильно расширенных, лежащих практически вплотную друг к другу синусоидов, имевших эндотелиальную выстилку, что было подтверждено иммуногистохимической реакцией на фактор фон Вил-лебрандта. Данные группы сосудов не имели характерной локализации — они располагались во всех структурах мозга, наибольшее их количество было отмечено в базальных областях обоих полушарий, в ядрах миндалины и в гиппокампе. Зачастую они деформировали структуры, где располагались (рис. 8).

Группа клеточной терапии — II. Через неделю после нанесения травмы с последующей внутривенной трансплантацией ММСК в мозге животных наблюдалась травматическая полость, располагавшаяся на месте ретросплениальной агранулярной коры, первичной и вторичной моторной коры, а также частично — первичной соматосенсорной коры. На позднем сроке анализа увеличения зоны некроза не происходило (см. рис. ЗГ). У всех животных край повреждения затрагивал белое вещество мозолистого тела и наружной капсулы и участки гиппокампа, располагающиеся непосредственно под травматической полостью. Поврежденные участки были инфильтрированы многочисленными макрофагами и гранулоцитами, с преобладанием первых, однако к 6 нед. травматическая полость очищалась от некротических масс и инфильтрировавших клеток. У 6 животных из данной группы травматическая полость сообщалась с полостью ипсилатерального желудочка, однако только у одного животного обнаруживалось его патологическое расширение.

У большинства животных в прилежащих к повреждению областях коры наблюдалось большое количество гиперхромных нейронов и активированных астроцитов (см. рис. 4Г; рис. 5А), однако они лежали узкой полосой, практически исчезая к 6 нед. анализа, когда в данной зоне формировался тонкий астроглиальный рубец.

Рис. 6. Гранулемы, обнаруженные в головном мозге животных из групп клеточной терапии -I и III через 1 нед. после нанесения травмы:

А - общий вид гранулемы в области повреждения;

Б - общий вид гранулемы непосредственно под травматической полостью над центральной частью мозолистого тела;

В - центральная часть гранулемы на большем увеличении (макрофаги отмечены черными стрелками, ММСК, лежащие плотным тяжом, отмечены красными стрелками); Г - центральная часть гранулемы на большем увеличении (коллагеновые волокна отмечены черными стрелками, сосуды отмечены красными стрелками);

Д - краевая область гранулемы на большем увеличении (ММСК отмечены стрелками);

Е - гранулема на большем увеличении (коллагеновые волокна отмечены стрелками). Фронтальный срез, уровень -3,3 мм от брегма.

Окраска толуидиновым синим по методу Ниссля (А, В, Д), окраска по методу Ван-Гизона (Б, Г, Е).

У в.: об. х10

Рис. 7. Иммуногистохимическое окрашивание гранулем в головном мозге животных после местной и сочетанной трансплантации ММСК через 1 нед. после нанесения травмы:

А, Б- реакция с антителами против ГФКБ, продукт реакции -коричневого цвета;

В - реакция с антителами против Л/еиЛ/, в гранулемах метка не выявляется, но обнаруживается в нейронах гиппокампа над ними;

Г - реакция с антителами против КІВ7;

Д - реакция с антителами против нестина;

Е - реакция с антителами против синаптофизина.

Гранулемы отмечены звездочками.

Докраска толуидиновым синим по методу Ниссля.

У в.: об. х10

Рис. 8. Группы синусоидов в мозге животного из группы трансплантации ММСК в мозг через 6 нед. после нанесения травмы:

А - группа синусоидов [отмечена стрелками) в зубчатой извилине гиппокампа ипсилатерального полушария;

Б - группа расширенных синусоидов в вентральной области вторичной слуховой коры. Окраска толуидиновым синим по методу Ниссля. У в.: об. х10[А], х40[Б)

В ядре поводка у большинства животных наблюдалась двусторонняя диффузная гибель нейронов по гиперх-ромному типу. Базальные области у половины животных содержали заметное количество гиперхромных нейронов: диффузная гибель нервных клеток происходила в ядрах миндалины и аркуатном ядре, у остальных животных эти области имели нормальное строение. Такая картина сохранялась на протяжении 6 нед. анализа.

Группа клеточной терапии — III. Через неделю после нанесения травмы у животных наблюдался обширный некроз коры головного мозга и части подкорковых структур, выраженный сильнее, чем во всех остальных экспериментальных группах. Травматическая полость имела несколько неодинаковые размеры у разных животных. У животных отсутствовали ретросплениальная агрануляр-ная, первичная и вторичная моторная кора, частично — первичная соматосенсорная кора и вторичная зрительная кора. Было разрушено белое вещество мозолистого тела и наружной капсулы под повреждением, а также участки гиппокампа под указанными областями коры. К 6 нед. травматическая полость увеличивалась, распространяясь вглубь мозга практически до уровня силь-виева водопровода, разрушая ипсилатеральный желудочек и дорсальную часть третьего желудочка (см. рис. ЗД, Е). Поврежденные участки были инфильтрированы многочисленными макрофагами и нейтрофилами, также в них присутствовали многочисленные геморрагии, причем мощная инфильтрация сохранялась и на позднем сроке анализа.

На обоих сроках анализа в областях коры, граничащих с травматической полостью, наблюдалось множество гиперхромных нейронов (см. рис. 4Д, Е). Выраженный гиперхроматоз нейронов обнаруживался в ядре поводка как поврежденного, так и неповрежденного полушария, двусторонняя гибель нейронов происходила в ядрах миндалин и аркуатном ядре, и у половины животных — в пириформной коре.

У всех животных из данной группы в мозге были обнаружены гранулемы , аналогичные наблюдавшимся

в группе животных, получивших трансплантацию ММСК в мозг, однако более крупные и многочисленные, располагавшиеся в том числе в полости ипсилатерального желудочка. Иммуногистохимически было показано, что в данных гранулемах отсутствовали ГФКБ-позитивные и №и1М-позитивные клетки, также в них не выявлялся маркер синаптических пузырьков синаптофизин. То есть они не содержали нейронов и глиальных клеток. При этом в них было выявлено большое количество Ю67-ПО-зитивных делящихся клеток, а также клетки, в которых выявлялся белок промежуточных филаментов нестин (см. рис. 7). Через 6 нед. гранулемы в мозге животных не обнаруживались, но у всех животных имелись расположенные во всех мозговых структурах группы сильно расширенных сосудов с тонкой эндотелиальной выстилкой.

Ипсилатеральный желудочек у животных из данной группы был поврежден настолько сильно, что о наличии его расширения говорить сложно.

Обсуждение

Распределение ММСК в мозге. Ранее другими исследователями, в частности, научной группой М. Чоппа, было показано, что при внутривенной трансплантации ММСК располагаются в пограничной зоне травматической полости, а также в коре ипсилатерального полушария, в белом веществе мозолистого тела и стриатуме, способствуя ускорению восстановления когнитивных и поведенческих функций у экспериментальных животных [21, 22]. Существуют и полностью противоречащие этому данные — так, научной группой Чарльза Кокса (С.Б. Сох) в 2009 г. было показано, что при внутривенной трансплантации после травмы головного мозга у крыс лишь 0,0005% трансплантированных ММСК достигает краевой зоны повреждения на вторые сутки после трансплантации, а через 2 нед. в мозге их уже не обнаруживается. При этом ММСК не оказывают никакого положительного влияния на восстановление моторных и когнитивных функций [23]. При внутривенном

способе трансплантации мы не обнаружили меченых ММСК нигде, кроме как в краевой зоне травматической полости — по-видимому, клетки мигрируют в данную область через разрушенный гематоэнцефалический барьер по градиенту фактора SDF-1, чья концентрация резко возрастает в зонах тканевого повреждения [24], а также по градиенту факторов воспаления [25, 26]. Мы считаем, что наши данные наиболее согласуются с данным М. Чоппа и соавт., поскольку клетки сохранялись в мозге на протяжении 6 нед. анализа, а в более ранних работах нашего коллектива было показано, что ММСК оказывают положительное воздействие на восстановление моторных и когнитивных функций у животных [14].

В настоящее время в научной литературе нет данных по распределению ММСК при трансплантации в краевую зону травматической полости, а также при сочетанной трансплантации. Мы считаем, что наблюдаемое нами распределение клеток — результат миграции ММСК в мозге не столько с током крови, сколько с током ликвора. В большинстве случаев при нанесении травмы повреждалась желудочковая система мозга, из-за чего трансплантированный материал попадал в полости желудочков мозга, а часть клеток, по-видимому, мигрировала через поврежденную эпендимную выстилку в окружающую нервную ткань и оказывалась в субэпендимной зоне, а также во внутренней капсуле, мигрируя вдоль волокон белого вещества [27].

Морфологические изменения в структуре мозга экспериментальных животных. Сопоставив результаты, полученные при анализе состояния мозга у всех групп экспериментальных животных, можно заключить, что эффекты клеточной терапии травмы головного мозга с помощью ММСК неоднозначны. С одной стороны, трансплантация ММСК очевидно ускоряет процесс воспаления в зоне повреждения и очищения данной зоны от некротической ткани, что согласуется с данными, полученными нами при анализе влияния ММСК на течение экспериментального инсульта [14]. После трансплантации ММСК независимо от пути доставки клеток в организм ускоряется формирование астроглиального рубца в пограничной зоне травматической полости, и образовавшийся рубец состоит из меньшего количества слоев астроцитов. Также ММСК предотвращают патологическое расширение желудочка травмированного полушария — механизм этого явления на данный момент неясен.

Мы показали, что при системном введении ММСК на поздних сроках анализа наблюдается наименьшая по количеству затронутых структур травматическая полость (см. рис. 3), в то время как местная и сочетанная трансплантация, напротив, приводят к тому, что травматическая полость существенно увеличивается в размерах в сравнении с группами негативного контроля. Подобное увеличение травматической полости мы наблюдали также при трансплантации в мозг культуральной среды —МЕМ. Из этого мы можем заключить, что увеличение травматической полости — не результат трансплантации

ММСК, а следствие дополнительной травмы, наносимой при таком методе трансплантации.

ММСК не влияют на гибель нейронов в пограничной зоне травматической полости на позднем сроке анализа, также не предотвращают гибель нейронов в подкорковых структурах, а именно в ядре поводка эпиталамуса, которое играет роль в регуляции сна [28]. При этом ММСК примерно в 50% случаев при любом из методов трансплантации способствуют сохранению нормального строения базальных структур мозга: пириформной коры, ядер миндалины и аркуатного ядра. Известно, что данные структуры участвуют в осуществлении ассоциативного обучения, концентрации внимания и пищевом поведении животных [29, 30]. Мы не можем говорить о функциональном восстановлении этих структур в данный момент, располагая исключительно морфологическими данными, и планируем в последующих экспериментах провести соответствующие поведенческие тесты.

В нашей работе мы впервые показали, что местная трансплантация ММСК в мозг приводит к формированию в мозге их плотных скоплений, синтезирующих коллаген. Другими исследователями, проводившими аналогичные трансплантации, подобный феномен отмечен не был [31]. Клеточные скопления (гранулемы) в мозге не содержат клеток глиального и нейронального ряда, однако в них присутствует масса пролиферирующих клеток — по всей видимости, как ММСК, так и клеток инфильтрата. Мы не считаем, что присутствие в них нестин-положительных клеток свидетельствует о том, что в гранулемах могут находиться нейральные предшественники. Несколько лет назад было показано, что ММСК крыс в стандартных условиях культивирования экспрессируют маркерные белки предшественников нейронов — нестин и Ти]-1 [32].

К 6 нед. данные клеточные скопления подвергаются деструкции, однако в мозге животных наблюдается большое количество расширенных синусоидных капилляров. По-видимому, это связано с продукцией трансплантированными клетками избытка фактора \ZEGF в мозге, стимулирующего пролиферацию эндотелиоцитов и ангиогенез [33]. Этим объясняется и тот факт, что при сочетанной трансплантации количество таких синусоидов существенно больше, и обнаруживаются они у всех без исключения животных. Известно, что попадание в нервную ткань избытка фактора \ZEGF провоцирует вместо формирования нормальных капиллярных сетей образование аномальных расширенных сосудов с тонкой эндотелиальной выстилкой [34].

Основываясь на результатах нашей работы, мы можем заключить, что клеточная терапия с помощью ММСК может стать эффективным методом в коррекции последствий травмы головного мозга, однако на данный момент однозначно трактовать ее последствия мы не можем. Очевидно, что внутривенная трансплантация ММСК оказывает положительный эффект, способствуя сохранению нормальной морфологии базальных структур мозга и не нанося при этом дополнительной травмы.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Dezawa М., Hoshino М., Nabeshima Y. Marrow stromal cells: implications in health and disease in the nervous system. Curr. Opin. Mol. Med. 2005; 5: 723-32.

2. Haas S., Weidner N.. Winker J. Adult stem cell therapy in stroke. Curr. Opin. Neurol. 2005; 18: 59-64.

3. Levy Y.S., Stroomza М., Melamed E., Offen D. Embryonic and adult stem cells as a source for cell therapy in Parkinson’s disease. J. Mol. Neurosci. 2004; 361: 353—86.

4. Lu D., Mahmood A, Wang L. et al. Adult bone marrow stromal cells administered intravenously to rats after traumatic brain injury migrate into brain and improve neurological outcome. Reg. Transplant. 2001; 12: 559—63.

5. Lu D., Li Y., Wang L. et al. Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J. Neurotrauma. 2001; 8: 813-21.

6. Lu D., Li Y., Mahmood A. et al. Neural and marrow-derived stromal cell sphere transplantation in a rat model of traumatic brain injury. J. Neurosurg. 2002; 97: 935—40.

7. Mahmood A., Lu D., Qu С. et al. Human marrow stromal cell treatment provides long-lasting benefit after traumatic brain injury in rats.Neurosurgery. 2005; 57: 1026—31.

8. Mahmood A., Lu D., Wang L., Chopp M. Intracerebral transplantation of marrow stromal cells cultured with neurotrophic factors promotes functional recovery in adult rats subjected to traumatic brain injury. J. Neurotrauma 2DD2; 19: 1609—18.

9. Jaiswal R.K., Jaiswal N.. Bruder S.P. et al. Adult human mesenchymal stem cell differentiation to the osteogenic or adipogenic lineage is regulated by mitogen-activated protein kinase. J. Biol. Chem. 2000; 13: 9645—52.

10. PittengerM.F., MackayA.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 2004; 5411: 143—7.

11. Khoo M.L., Shen В., Tao H., Ma D.D. Long-term serial passage and neuronal differentiation capability of human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2008; 17: 883-96.

12. Корочкин Л.И., Ревищин А.В., Охотин B.E. Нейральные стволовые клетки, их значение в восстановительных процессах в нервной системе. Морфология 2005; 127: 7—16.

13. Li Y., Chen J., Wang L. et al. Treatment of stroke in rat with intracarotid administration of marrow stromal cells. Neurology 2001; 12: 1666—72.

14. Зинькова H.H., Гилерович Е.Г., Соколова И.Б. и др. Терапия ишемического инсульта головного мозга у крыс с помощью мезенхимных стволовых клеток. Цитология 2007; 7: 566—75.

15. Яруллин Х.Х. Клиническая реоэнцефалография. М.: Медицина 1983; 270 с.

16. Карпов С.М., Герасимова М.М., Решетник М.А., Мальченко Н.И. Состояние церебральной гемодинамики в остром и отдаленном периодах черепно-мозговой травмы. Неврологический Вестник 2004; т. XXXVI: 1-2: 8-11.

17. Shapira Y., Lam A.M., Paez A. et al. The influence of acute and chronic alcohol treatment on brain edema, cerebral infarct volume ans neurological outcome following experimental head trauma in rats. J. Neurosurg. Anesthesiol. 1997; 9: 118—27.

18. Paxinos G., Watson Ch. The rat brain in stereotaxic coordinates. New York: Academic Press 1998; 474 p.

19. Carvalho A.B., Quintanilha L.F., Dias J.V. et al. Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells do not reduce fibrosis of improve function in a rat model of severe chronic liver injury. Stem Cells 2008; 26: 1307-14.

20. Жаботинский Ю.М. Нормальная и патологическая морфология нейрона. Л.: Медицина 1965; 323 с.

21. Lu D., Mahmood A., Wang L. et al. Adult bone marrow stromal cells administered intravenously to rats after traumatic brain injury migrate into brain and improve neurological outcome. Regeneration and Transplantation 2001; 35: 559—63.

22. Sykova E., Jendelova P. Migration, fate and in vivo imaging of adult stem cells in the CNS. Cell Death and Differentiation 2007; 14: 1336-42.

23. Harting M.T., Jimenez F., Xue X. et al. Intravenous mesenchymal stem cell therapy for traumatic brain injury. J. Neurosurg. 2009; 110: 1189-97.

24. Bhakta S., Hong P., Koc 0. The surface adhesion molecule CXCR4 stimulates mesenchymal stem cell migration to stromal cell-derived factor-1 in vitro but does not decrease apoptosis under serum deprivation. Cardiovasc. Revasc. Med. 2006; 7: 19—24.

25. Capone C., Frigerio S., Fumagalli S. et al. Neurosphere-derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoS ONE 2007; 2: 373.

26. Kitaori T., Ito H., Schwarz E.M et al. Stromal cell-derived factor 1/ CXCR4 signaling is critical for the recruitment of mesenchymal stem cells to the fracture site during skeletal repair in a mouse model. Arthritis Rheum. 2009; 60: 813-23.

27. Eglund U., Bjorklund A., Wictorin K. et al. Grafted neural stem cells develop into functional pyramidal neurons and integrate into host cortical circuity. PNAS 2002; 6: 17089-94.

28. Zhang R., Oorschot D.E. Total number of neurons in the habenular nuclei of the rat epithalamus: a stereological study. J. Anat. 2006; 208: 577-85.

29. Gallagher M., Holland P.C. The amygdala complex: multiple roles in associative learning and attention. PNAS USA 1994; 91: 11771—6.

30. Hewson K.A., Tung L.Y.C., Connell D.W. et al. The rat arcuate nucleus integrates peripheral signals provided by leptin, insulin, and a ghrelin mimetic. Diabetes 2002; 51: 3412—9.

31. Zhang C., Saatman K.E., Royo N.C. et al. Delayed transplantation of human neurons following brain injury in rats: a long-term graft survival and behavior study. J. Neurotrauma 2005; 22: 1456—74.

32. Tondreau T., Lagneaux L., Dejeneffe M. et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins before any differentiation. Differentiation 2004; 7: 319—26.

33. Croll S.D., Goodman J.H., Scharfman H.E. Vascular endothelial growth factor [VEGF] in seizures: a double-edged sword. Adv. Exp. Med. Biol. 2004; 548: 57-68.

34. Croll S.D., Wiegand S.J. Vascular growth factors in cerebral ischemia. Mol. Neurobiol. 2001; 2-3: 121—35.

Поступила 01.072009