СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ПРОРАСТАНИЯ РАСТЕНИЙ НАНОЧАСТИЦАМИ ОКСИДА ЦЕРИЯ С ВЫСОКОЙ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD OF STIMULATING PLANTS SPROUTING WITH CERIUM OXIDE NANOPARTICLES WITH HIGH ANTI-RADICAL AND BIOLOGICAL ACTIVITY

Изобретение относится к сельскохозяйственному производству и может быть использовано для активации произрастания семян в системе выращивания кормовых культур методом аэропоники и гидропоники.
-3
-4
Способ осуществляется обработкой семян стабилизированной водной суспензией наночастиц оксида церия, синтезированных в водном экстракте петрушки Petroselinun crispum. Лабораторные испытания показали высокую эффективность применения таких суспензий при концентрации наночастиц оксида церия 10 и 10 М. Данный способ обработки семян повышает скорость роста корней и побегов растений.
Перспективным направлением является внедрение новой, простой и более дешевой стратегии их синтеза с использованием биологических инструментов (бактерий, дрожжей, грибов и растений) методом «зеленой» нанотехнологии (1, 2). Метод основан на получении наночастиц (НЧ) металлов различной морфологии из солей соответствующих металлов с использованием в качестве восстанавливающих и стабилизирующих агентов экстрактов растений, содержащих метаболиты-восстановители (3). Важно отметить, что синтезированные в растительных экстрактах нанометаллы, в отличие от синтезированных физико-химическими методами прототипов, уже имеют функциализированную поверхность (4), присутствие которых, как правило, увеличению стабильности, биодоступности и эффективности созданных на их основе препаратов (5). В этом свете отпадает необходимость применения общепринятых специальных носителей, стабилизирующих дисперсии, механизмы действия которых на растения не до конца изучены, что не допускается в биологическом контроле безопасности наноматериалов (МУ 1.2.2968-11).
Существенно, что производство НЧ с использованием экстрактов растений имеет большие преимущества: низкая стоимость выращивания, короткие сроки производства, гибкий контроль за размером и формой (6-8). При использовании химического синтеза себестоимость НЧ в основном определяется стоимостью солей металлов и восстановителей, а в случае «зеленого» синтеза основная часть затрат будет определяться только стоимостью солей металлов, поскольку отходы растений из пищевой промышленности могут служить в качестве восстановителей. Этот факт еще раз подчеркивает экологические и экономические преимущества «зеленого» синтеза по сравнению с традиционными методами производства НЧ.
3
4
Исходя из этого очевидно, что синтез металлических НЧ в растительных экстрактах (растительных биомассах) имеет значительный потенциал и ряд существенных преимуществ по сравнению с традиционными методами синтеза. Разнообразие растительных экстрактов, типов солей металлов и способность варьировать состав реакционной смеси и условия проведения реакции путем изменения температуры, рН реакционной смеси и включения добавок биологического происхождения (биоматриц) позволяют создавать НЧ различных металлов определенного размера и формы. Обширное количество работ посвящено синтезу нано-, , Pd, ZnO, FeO из экстрактов растений (9-12). При этом только НЧ , синтезированные в экстрактах ряда растений были нацелены на применение в биологии за счет ряда специфических метаболических эффектов: высокая антибактериальная активность в отношении грамположительных и грамотрицательных патогенов Pseudomonas syringae, Xanthomonas oryzae, Burkholderia glumae и Bacillus thuringiensis (13), Escherichia coli, Shigella dysenteriae и Vibrio cholera; ингибирование жизнеспособности клеточной линии HeLa и клеточной линии рака легких А549 (6, 7).
Несмотря на большой объем работ в области «зеленого» синтеза до настоящего времени практически ни одно подобное исследование не доведено до статуса препарата с выраженным стимулирующим рост и развитие растений, хотя объективные условия и социальный заказ на это выражены достаточно отчетливо.
Существует способ предпосевной обработки семян пшеницы Triticum aestivum, стабилизированной электрохимически активированной водной суспензией дисперсных наночастиц железа в концентрации 0,035-0,0087%, повышает скорость роста корней и побегов на 30-40%, при этом эффективность извлечения растением железа из среды культивирования варьирует от 36,23 до 79,59% (14). Однако способ имеет требует приготовления электрохимически активированной катодной воды с рН 8-9 и редокспотенциалом Eh=-350…-400 мВ, что делает процесс длительным и трудоемким.
Задачей изобретения является создание нового способа получения наночастиц металлов среднего размера с дальнейшим биологическим приложением, т.е. более совместимых с живыми клетками. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в получении наночастиц, обладающих протекторными и стимулирующими свойствами по сравнению с синтетическими прототипами.
При разработке технологии биогенного синтеза наночастиц с использованием растений важным этапом является выбор кандидатур на роль «биофабрик» и поставщиков восстанавливающих агентов. В качестве восстановителя ионов металлов в наночастицы могут выступать растительные фенольные соединения (ФС), обладающие сильными окислительно-восстановительными свойствами, поэтому с этих позиций растения с высоким содержанием ФС - лучшие кандидатуры. Эксперименты показали, что Петрушка кудрявая Petroselinum crispum содержит максимальное содержание полифенолов (1,198±0,346 мг/г сырой массы) и флавоноидов (0,975±0,063 мг/100 г) среди доступных видов растительного сырья, не требующих сложного культивирования (Anethum graveolens, Lactuca sativa, Brassica oleracea, Pisum sativum).
2
Способ осуществляется следующим способом. В первую очередь готовят водный экстракт из растения P. crispum - свежие листья измельчают в жидком азоте до порошкообразного состояния, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:10 (масса/объем), смесь перемешивают и кипятят в течение 30 мин. Далее процеживают экстракт через 2 слоя марли и центрифугируют 15 мин при 15000 об/мин. Супернатант пропускают через фильтр Millipore 0,45 μм и используют для дальнейшего синтеза. Далее в супернатант водного экстракта (20 мл) добавляют 0,862 г церия азотнокислого 6-водного Ce(NO3)3⋅6H2O (чда), нагревают при перемешивании 6 ч при 80-90°С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, многократно промывают деионизированной водой для удаления несогласованных биомолекул из экстракта. Далее высушивают в печи горячим воздухом при 60°С в течение 6 ч и отжигают в муфельной печи при 500°С в течение 2 ч (3). Изменение цвета от светло-желтого до мутно-желтого указывает на формирование НЧ СеО.
2
Далее полученные частицы СеО ресуспензируют в дистиллированной воде в количестве 1 г/л, суспензию обрабатывают в ультразвуковой ванне Elmasonic в течение 15 мин и характеризуют с использованием сканирующей электронной микроскопии.
Согласно изображениям, в образце присутствуют частицы от 50 нм до 1000 нм, запакованные в сплошной носитель-матрицу (Фиг. 1).
2
2
2
-1
-5
Механизмы защитных эффектов НЧ СеО на растительные организмы исследуют на модельном растении пшеницы Triticum vulgare по ранее описанным методикам (15, 16). Для начала семена Т. vulgare предварительно дезинфицируют и проращивают в климатической камере («Agilent», США) при 12-часовом освещении, температуре 22±1°С и влажности 80±5% в течение 48 ч. Далее проросшие семена (20 шт) переносят в отдельные чашки и добавляют суспензии НЧ СеО в концентрациях от 10 до 10 М. Образцы оставляют проращивать на 4, 7 и 14 дней и далее измеряют длину листьев и корней проростков. Процент энергии прорастания (Е) подсчитывают на 3-и сутки в постановке, когда семена сразу после замачивания поливают суспензией НЧ СеО.
2
Сравнение антиоксидантной и биологической активности биосинтезированных металлов проводят с коммерческим нанопорошком СеО с размером частиц 15 нм, полученных газофазным методом в Казанском национальном научно-исследовательском технологическом университете им. А.Н. Туполева (гидродинамический радиус - 212±62 нм, дзета-потенциал -43 мВ).
-9
-2
2
Результаты ДФПГ-теста показывают увеличение антирадикальной активности наноматериалов по мере увеличения концентрации образцов, от 10 до 10 М (Фиг. 2). При этом, антиоксидантный потенциал биосинтезированных НЧ СеО в пересчете на тролокс был больше по сравнению с контролем на 63-68%, а синтетический аналог превышает контроль в меньшей степени - на 54,5-64,3% соответственно.
Вместе с тем, тестирование на семенах Т. vulgare показывает, что биогенные нанопорошки диоксида церия в большей степени инициируют процессы прорастания по сравнению с синтетическим прототипом, и даже в небольшой степени стимулируют пророст до 5-11,4% относительно интактных образцов (Фиг. 3).
-2
-5
-4
Развернутый анализ метрических показателей проростков Т. vulgare после 48 ч воздействия НЧ CeO2 растительного и синтетического происхождения показывает высокую устойчивость растений к ним. При этом, диоксид церия на 7 день инкубации в большей степени стимулирует рост побегов растений, а на 14 день - корневой системы. Согласно данным, изложенным в табл. 1, при воздействии биогенных частиц оксида церия в разведении от 10 до 10 М в течение 7 дней происходит достоверное увеличение длины листьев проростков на 18,6-35,4% относительно контроля, а после 14 дней экспозиции показатель доходит до 32,6-37%. Похожая тенденция развивается и при проращивании растений в среде синтетического аналога: происходит достоверное стимулирование длины листьев при воздействии небольших концентраций металла менее 10 М) на 7 день до 22-28% и на 14 день - 26-28% соответственно.
На 14 день инкубации с нанопорошком диоксида церия происходит увеличение длины корня до 42-44,4% в случае с частицами, полученными в экстракте растений, и до 31-34% - при обработке растений нанометаллом, полученным физико-химическим способом.
-2
-5
-3
-4
Таким образом, наиболее достоверно эффективны для обработки растений оказались нанопорошки, полученные методом «зеленого» синтеза в экстракте P. crispum, в разведениях от 10 до 10 М, причем максимальный стимулирующий эффект проявляет концентрация 10 и 10 М на 7 день эксперимента.
Список литературы
1. Gericke М., Pinches A. Biological synthesis of metal nanoparticles. Hydrometallurgy 2006. 83: 132-140.
2. Dhillon G.S., Brar S.K., Kaur S., Verma M. Green approach for nanoparticle biosynthesis by fungi: Current trends and applications. Crit. Rev. Biotechnol. 2012. 32: 49-73. doi: 10.3109/07388551.2010.550568.
3. Makarov V.V., Love A.J., Sinitsyna O.V., Makarova S.S., Yaminsky I.V., Taliansky M.E., Kalinina N.O. Green nanotechnologies: synthesis of metal nanoparticles using plants. Acta Naturae. 2014. 6: 35-44.
4. Singaravelu G., Arockiamary J.S., Kumar V.G., Govindaraju K.A novel extracellular synthesis of monodisperse gold nanoparticles using marine alga, Sargassum wightii Greville // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2007. Vol. 57. №1. P. 97-101.
5. Milani N. Dissolution kinetics of macronutrient fertilizers coated with manufactured zinc oxide nanoparticles // J. Agric. Food Chem. 2012. V. 60. P. 3991-3998. doi: 10.1021/jf205191y
6. Valodkar M., Jadeja R.N., Thounaojam M.C., Devkar R.V., Thakore S. Biocompatible synthesis of peptide capped copper nanoparticles and their biological effecton tumor cells. Mater. Chem. Phys. 2011a. 128: 83-89.
7. Valodkar M., Nagar P.S., Jadeja R.N., Thounaojam M.C., Devkar R.V., Thakore S. Euphorbiaceae latex induced green synthesis of non-cytotoxic metallic nanoparticle solutions: A rational approach to antimicrobial applications. Colloids Surf. A. 2011b. 384: 337-344.
8. Velmurugan P. et al. Synthesis and characterization ofnanosilver with antibacterial properties using Pinus densiflorayoung cone extract. J. Photochem. Photobiol. B. 2015. 147: 63-68.
9. Zargar M., Hamid A.A., Bakar F.A. et al. Green synthesis and antibacterial effect of silver nanoparticles using Vitex negundo L. Molecules. 2011. 16. 8: 6667-6676.
10. Kumar G.V., Gokavarapu D.S., Rajeswari A. et al. Facile green synthesis of gold nanoparticles using leaf extract of antidiabetic potent Cassia auriculata. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 2011.87. 1: 159-163.
11. Mahdavi M., Namvar F., Ahmad M.В., and Mohamad R., "Green biosynthesis and characterization of magnetic iron oxide (Fe3O4) nanoparticles using seaweed (Sargassum muticum) aqueous extract // Molecules. 2013. Vol. 18. №5. P. 5954-5964.
12. Azizi S., Ahmad M.B., Namvar F., Mohamad R. Green biosynthesis and characterization of zinc oxide nanoparticles using brown marine macroalga Sargassum muticum aqueous extract // Materials Letters. 2014. Vol. 116. P. 275-277.
13. Velmurugan P. et al. Synthesis and characterization ofnanosilver with antibacterial properties using Pinus densiflorayoung cone extract. J. Photochem. Photobiol. B. 2015. 147: 63-68.
14 Мирошников С., Сизова E., Дерябин Д., Дерябина Т., Рогачев Б. Способ предпосевной обработки семян. http://www.findpatent.ru/patent/258/2582499.html (аналог)
3
4
4
15. Lebedev S.V., Korotkova A.M., Osipova E.A. Influence of Fe 0 nanoparticles, magnetite FeO nanoparticles, and iron (II) sulfate (FeSO) solutions on the content of photosynthetic pigments in Triticum vulgare //Russian journal of plant physiology. - 2014. - T. 61. - №. 4. - C. 564-569.
16. Korotkova A.M., Lebedev S.V., Sizova E.A. Investigation of mechanisms of prooxidant effects of nanoparticles transition metals in the test Triticum vulgare // Международный научно-исследовательский журнал. - 2015. - №. 8 (39) Part 3. - С. 14-19.