СКОНСТРУИРОВАННЫЕ КОНФОРМАЦИОННО-СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ БЕЛКИ

1. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин, который содержит одну или более замен аминокислот по отношению к белку убиквитину дикого типа.
2. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1, где указанная одна или более замен аминокислот стабилизируют петлю β1/β2 белка так, что петля β1/β2 ограничена в области в пределах среднего квадратичного отклонения цепи В с кодом 3NHE по Protein Data Bank приблизительно 1,6 Å.
2
3. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1 или 2, где область петли β1/β2 белка проявляет более медленную конформационную динамику в сравнении с белком убиквитином дикого типа, как измеряют посредством R дисперсии ЯМР.
ex
2
4. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1, где микросекундные значения R в области около петли β1/β2 вплоть до 40 раз выше в сравнении с белком убиквитином дикого типа, как измеряют посредством R дисперсии ЯМР.
5. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1, где указанный белок содержит одну или более замен аминокислот в положении, выбранном из группы, состоящей из А7, А8, А13, А34, А36, А69 и А71, где положение задают относительно А1-А76 (SEQ ID NO: 1).
6. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 5, который содержит (а) замену А7 (С) или замену А8 (С) и (b) замену А69 (С).
7. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 6, который дополнительно содержит одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из А13 (N, R, G, К, Y, A, S, Н, Е, L, Т, V, I, М или Р), А34 (I, F, L, V, S, М или Т), А36 (Y, F, L, Н, А, V, W, I, М или N) и А71 (R, К, A, Q, W, G, Н, I, R или G).
8. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 5, который содержит одну или более замен, выбранных из группы, состоящей из А7 (D, F, R или S), А8 (Y, A, G, Q, R или Y), А13 (R, Y, Е или Р), А34 (I, L или Т), А36 (L, Y, А или N), А69 (А, G, W, К, Y или I) и А71 (A, R, Q, R или G).
9. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 5, который дополнительно содержит одну или более замен аминокислот, расположенных в А42, А46, А49, А62, А65, А68 или А70, где положения аминокислотных остатков соответствуют положениям в SEQ ID NO: 1.
10. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 5, который дополнительно содержит одну или более замен аминокислот, расположенных в А40, А42, А46, А47, А49, А62, А65, А68, А70, А71, А72, А73, А74, А75 или А76, где положения аминокислотных остатков соответствуют положениям в SEQ ID NO: 1.
11. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1, где конформационно-стабилизированный белок убиквитин проявляет увеличенное связывание с деубиквитиназой семейства убиквитин-специфичных протеаз (USP) по сравнению с белком убиквитином дикого типа.
d
12. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1, где конформационно-стабилизированный белок убиквитин связывается с деубиквитиназой с Kв наномолярном диапазоне.
13. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1, где конформационно-стабилизированный белок убиквитин связывается с деубиквитиназой с аффинностью, которая по меньшей мере в 1000 раз выше таковой у белка дикого типа.
14. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1, где конформационно-стабилизированный белок убиквитин ингибирует активность деубиквитиназы.
15. Конформационно-стабилизированный белок убиквитин по п. 1, где конформационно-стабилизированный белок убиквитин не проявляет или проявляет сниженное связывание с деубиквитиназой семейства убиквитин-С-концевых гидролаз (UCH) по сравнению с белком убиквитином дикого типа.
16. Нуклеиновая кислота, которая кодирует конформационно-стабилизированный белок убиквитин по любому из пп. 1-15.
17. Вектор, который содержит нуклеиновые кислоты по п. 16.
18. Вектор по п. 17, где вектор представляет собой экспрессирующий вектор.
19. Клетка, которая содержит нуклеиновую кислоту по п. 16 или вектор по п. 17 или 18.
20. Клетка по п. 19, где клетку выбирают из группы, состоящей из клетки животного, бактериальной клетки, клетки насекомого, клетки нематоды и клетки дрожжей.
21. Клетка по п. 20, где клетка животного представляет собой клетку человека или не относящуюся к человеку клетку.
22. Белковый комплекс, который содержит конформационно-стабилизированный белок убиквитин по любому из пп. 1-15 и деубиквитиназу члена семейства USP.
23. Белковый комплекс по п. 22, где деубиквитиназа представляет собой USP7, USP5 или USP14.
24. Белковый комплекс по п. 23, где деубиквитиназа представляет собой USP7.
25. Белок, ковалентно связанный с одним или более из конформационно-стабилизированных белков убиквитинов по любому из пп. 1-15.
26. Твердый носитель, который содержит конформационно-стабилизированный белок убиквитин по любому из пп. 1-15, иммобилизованный на нем.
27. Твердый носитель по п. 26, где твердый носитель представляет собой поверхность, подходящую для поверхностного плазмонного резонанса.
28. Твердый носитель по п. 26, где твердый носитель представляет собой наночастицу, бусину или стекло.
29. Популяция клеток, которая содержит конформационно-стабилизированный белок убиквитин по любому из пп. 1-15, экспрессируемый на их поверхности.
30. Способ ингибирования деубиквитиназы из семейства USP, который включает приведение деубиквитиназы в контакт с конформационно-стабилизированным белком убиквитином по любому из пп. 1-15.
31. Способ по п. 30, где ингибирование происходит in vivo или in vitro.
32. Способ идентификации агента, который связывается с конформационной формой белка убиквитина, которая благоприятна для связывания с деубиквитиназой из семейства USP, который
включает:
a) приведение агента в контакт с конформационно-стабилизированным белком убиквитином по любому из пп. 1-15 и
b) определение, связывается ли агент с указанным конформационно-стабилизированным белком убиквитином.
33. Способ по п. 32, где агент представляет собой низкомолекулярное химическое соединение, антитело, белок, ингибиторную нуклеиновую кислоту или какое-либо их сочетание.
34. Способ идентификации агента, который связывается с белковым комплексом, который содержит деубиквитиназу из семейства USP и убиквитин, где способ включает:
a) приведение агента в контакт с белковым комплексом по любому из пп. 22-24; и
b) определение, способен ли агент связываться с указанным белковым комплексом.
35. Способ по п. 34, где агент представляет собой низкомолекулярное химическое соединение, антитело, белок, ингибиторную нуклеиновую кислоту или какое-либо их сочетание.
36. Способ по п. 34, где агент нарушает взаимодействие между деубиквитиназой и белком убиквитином.
37. Агент, идентифицированный способом по любому из пп. 32-36.
38. Способ скрининга конформационно-стабилизированной формы белка, где конформационно-стабилизированная форма имеет увеличенную аффинность связывания с партнером по связыванию или имеет увеличенную способность модулировать активность партнера по связыванию по сравнению с белком дикого типа, где способ включает:
a) приведение партнера по связыванию в контакт с библиотекой мутантных форм белка, где указанную библиотеку мутантных форм получают посредством замены аминокислотного остатка в конформационно-подвижном белке на другой аминокислотный остаток в одном или более предварительно выбранных местоположениях, где указанные предварительно выбранные местоположения расположены внутри белка; и
b) идентификацию конформационно-стабилизированной формы на
основе связывания с партнером по связыванию или увеличенной способности модулировать активность партнера по связыванию по сравнению с белком дикого типа.
39. Способ по п. 38, где предварительно выбранные местоположения отбирают на основе вклада аминокислотных остатков в каждом местоположении в конформационную динамику в пределах белка или в пределах области белка.
40. Способ по п. 38 или 39, где указанная библиотека представляет собой библиотеку нуклеиновых кислот, которые кодируют указанные мутантные формы белков.
41. Способ по п. 40, где указанная библиотека представляет собой библиотеку фагового дисплея.
42. Способ по п. 41, где вектор для библиотеки фагового дисплея выбирают из группы, состоящей из бактериофага М13, фага f1, фага fd, фага Ike, фага N1, фага Т4 Enterobacteria, бактериофага Т7 и фага λ Enterobacteria.
43. Способ по п. 38, который дополнительно включает введение мутаций в один или более аминокислотных остатков на поверхности идентифицированного конформационно-стабилизированного белка посредством замены одного или более поверхностных аминокислотных остатков на другие аминокислотные остатки и скрининг белков, которые имеют увеличенную аффинность связывания или модулирующую способность по сравнению с конформационно-стабилизированными белками без одного или более замещенных поверхностных аминокислотных остатков.
44. Способ по п. 38, где белок выбирают из группы, состоящей из сопряженного с G-белком рецептора (GPCR), ядерного гормонального рецептора, тирозинкиназного рецептора и управляемого лигандом ионного канала.
45. Способ по п. 38, где белок представляет собой убиквитин.
46. Способ по п. 38, где партнер по связыванию выбирают из группы, состоящей из деубиквитиназы, убиквитин-активирующего фермента E1, убиквитин-конъюгирующего фермента Е2, убиквитин-протеинлигазы Е3 и одного или более элементов клеточного протеасомного комплекса.
47. Способ по п. 46, где партнер по связыванию представляет собой деубиквитиназу.
48. Способ по п. 47, где деубиквитиназа представляет собой член семейства убиквитин-специфичных протеаз (USP) из деубиквитиназ.
49. Способ по п. 48, где деубиквитиназу выбирают из группы, состоящей из USP7, USP5 и USP14.
50. Способ по п. 49, где деубиквитиназа представляет собой USP7.