Тест-система «БиоЛактам» эффективное средстводля выявления бактерий, устойчивых к антибиотикамбета-лактамного ряда

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2011

ТЕСТ-СИСТЕМА «БИОЛАКТАМ» - ЭФФЕКТИВНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К АНТИБИОТИКАМ БЕТА-ЛАКТАМНОГО РЯДА

ЖИЛЬЦОВ И.В.*, ВЕРЕМЕЙ И.С.*, СЕМЕНОВ В.М.*, НЕБОСЬКО Е.Л.**

У О «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»,

кафедра инфекционных болезней, *

УЗ «Витебская областная клиническая инфекционная больница», бактериологическая лаборатория**

Резюме. Нами была разработана тест-система «БиоЛактам», позволяющая регистрировать уровень бета-лактамазной активности в биологических субстратах. В настоящем исследовании мы оценили принципиальную возможность определения бета-лактамазной активностибактериальных суспензий при помощи указанной тест-системы, а также провели анализ соответствия получаемых результатов данным общепринятых методов бактериологического обследования. Как оказалось, тест-система «БиоЛактам» может успешно использоваться для качественной и количественной оценки бета-лактамазной активности бактериальных суспензий. Получаемые при этом результаты хорошо согласуются с данными исследований с применением диско-диффузионного метода. При помощи тест-системы «БиоЛактам» можно с высокой степенью достоверности определить: 1) факт продукции клинически значимых количеств бета-лактамаз при уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии >14,2%; 2) факт устойчивости к ингибитор-защищенным бета-лактамам при уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии >26,5%; 3) факт устойчивости к цефалоспоринам 3-го поколения при уровне бета-лактамазнойактивности бактериальной суспензии > 81,2%; 4) при совместном использовании с диско-диффузионным методом- также факт наличия неферментативных механизмов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам. Тест-система «БиоЛактам» оптимальна для определения уровня устойчивости энтеробактерий к бета-лактамным антибиотикам, ограниченно применима для определения уровня устойчивости грам(+) кокков к данным препаратам и не позволяет напрямую дифференцировать обычные бета-лактамазы от БЛРС.

Ключевые слова: тест-система «БиоЛактам», бета-лактамазная активность, бактериальные суспензии, антибактериальная терапия, диско-диффузионный метод.

Abstract. We have elaborated the test system «BioLactam» enabling the registering of the level of beta-lactamase activity in biological substrates. In the present study we have evaluated the fundamental possibility of determining beta-lactamase activity of bacterial suspensions using the above mentioned test system; also we have made the analysis of the conformity of the obtained results to the data of routine methods of bacteriological examination. It was determined that test system «BioLactam» may be successfully used for qualitative and quantitative evaluation of beta-lactamase activity of bacterial suspensions, and the results of testing are in good conformity with those obtained by disk diffusion method. By means of test system «BioLactam» we can determine the following phenomena with the high level of reliability: 1) production of clinically significant quantities of beta-lactamases if the level of beta-lactamase activity of bacterial suspension amounts to >14,2%; 2) resistance to inhibitor-protected beta-lactams if the level of beta-lactamase activity of bacterial suspension amounts to >26,5%; 3) resistance to cephalosporins of the 3rd generation if the level of beta-lactamase activity amounts to >81,2%; 4) when used together with disk diffusion method - also the fact of the presence of non-enzymatic mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics. Test system «BioLactam» is optimal for determining the level of resistance of enterobacteria to beta-lactam antibiotics; it may be of limited use for determination of gram positive cocci resistance to the given preparations and doesn’t allow to directly differentiate ESBLs from ordinary beta-lactamases.

Адрес для корреспонденции: 210023, г.Витебск, пр-т Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра инфекционных болезней, тел. 8 (0212) 24-33-46 - Жильцов И.В.

ч ета-лактамы - семейство антибиотиков, г^включающее более 6 структурных разно-_1—#видностей, каждая из которых содержит

2-ацетидиноновое кольцо. Они проявили необычайно высокую активность против широкого спектра бактериальных патогенов, обладая при этом низкой (если не нулевой) токсичностью для клеток млекопитающих. Принято считать, что антибиотики бета-лактам-ной группы - самые удачные антибактериальные препараты с начала эры антибиотиков

[1]. Устойчивость бактерий к бета-лактамным антибиотикам и ингибиторам бета-лактамаз

- непрерывно растущая проблема. За последние 60 лет частота и уровень устойчивости бактерий к данному классу антибиотиков неуклонно возрастали, вплоть до настоящего момента, когда многие полагают, что бета-лак-тамы вскоре окажутся неспособными бороться с тяжелыми бактериальными инфекциями

[2]. Считается, что основным механизмом возрастающей резистентности бактерий к данному классу антибактериальных препаратов является врожденная либо приобретенная способность продуцировать бета-лактамазы -ферменты, способные гидролизовать эндоцик-лическую пептидную связь в бета-лактамных антибиотиках [3-5]. Выявление факта продукции бета-лактамаз болезнетворными бактериями и оценка их способности гидролизовать ключевые антибиотики бета-лактамного ряда лежит в основе способа коррекции антибактериальной терапии, широко применяемого в практике работы соматических и инфекционных стационаров. Для этого обычно используют диско-диффузионный метод либо (гораздо реже) метод Е-тестов либо серийных разведений в агаре [6]. Тем не менее, перечисленные методы бактериологического анализа имеют, наряду с достоинствами, и серьезные недостатки. Так, считающийся наиболее точным и обладающий наилучшей воспроизводимостью метод серийных разведений в агаре отличается высокой стоимостью, значительной сложностью проведения, большим расходом реагентов и лабораторной посуды, строгими требованиями к качеству питательных сред и соблюдению рекомендованных способов их приготовления, а также значительной

продолжительностью собственно анализа. Метод Е-тестов прост в исполнении, но наборы реагентов для него чрезвычайно дороги. В свою очередь, диско-диффузионныйме-тодпозволяет получить удовлетворительную воспроизводимость результатовтолько при условии соблюдения достаточно строгих рекомендованных условий тестирования и приготовления расходных материалов [7, 8], что на практике приводит к существенным различиям в результатах данного анализа, получаемых на идентичном материале в разных лабораториях. Более того, постоянно встает вопрос о сопоставимости данных, полученных с использованием разных методов анализа ан-тибиотикоустойчивости.

С целью упрощения, ускорения и удешевления процедуры анализа устойчивости микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам, а также унификации получаемых результатов нами разработана тест-система «БиоЛактам». Указанная тест-система позволяет количественно оценивать уровень бета-лакта-мазной активности в биологических жидкостях (сыворотке крови, спинномозговой жидкости, моче, слюне, мокроте), а также в бактериальных суспензиях, приготовленных из заранее выделенных чистых культур микроорганизмов.

Соответственно, целью настоящего исследования была оценка принципиальной возможности определения бета-лактамазной активности бактериальных суспензий при помощи тест-системы «БиоЛактам», а также анализ соответствияполучаемых результатов данным общепринятых методов бактериологического обследования.

Методы

Бактериальные суспензии приготавливались из свежих (суточной инкубации) чистых культур энтеробактерий и золотистых стафилококков. Выделение и идентификацию микроорганизмов выполняли в соответствии с общепринятыми рекомендациями [9]. Исходным материалом для приготовления суспензий служили чистые культуры бактерий, растущие на поверхности питательных сред

(Эндо либо Ресселя - для энтеробактерий, желточно-солевом агаре - для стафилококков) в пробирках с «косым агаром». В пробирку с питательной средой вносилось 2-3 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия. После этого пробирка энергично встряхивалась до тех пор, пока жидкость над агаром не становилась опалесцирующей. Затем жидкость извлекалась из пробирки и (при необходимости) разводилась стерильным физиологическим раствором хлорида натрия до 0,5 ЕД стандарта мутности Макфарландапу-тем сравнения с эталоном. Часть полученной взвеси использовалась для определения бета-лактамазной активности, остаток мог быть использован для определения устойчивости бактерий к антибиотикам диско-диффузион-ным методом. Чувствительность анализа заметно повышалась, если бактериальная взвесь перед анализом подвергалась однократному замораживанию - оттаиванию, что приводило к разрушению части бактериальных тел и высвобождению заключенных в них бета-лак-тамаз. Все изученные нами изоляты микроорганизмов были протестированы на предмет устойчивости к ампициллину, цефотаксиму и амоксициллин/ клавуланату, что должно было позволить нам зафиксировать продукцию бета-лактамаз вообще, и БЛРС - в частности. При этом был использован диско-диффузион-ный метод в его классическом варианте [6].

Всего был собран и изучен 131 клинический изолят, в том числе 45 изолятов E. coli, 29 изолятов Cytrobacterfrondi, 21 изолят Staphylococcusaureus, 10 изолятов Proteusvulgaris, 6 изолятов Proteusmirabilis, 5 изолятов Salmonellaenteritidis, по 4 изолята Entero-bactercloacae и Klebsiella pneumoniae, по 2 изолята Salmonellalondon и Salmonellavirchov, и по 1 изоляту Proteusmorganii, Pseudomona-saeruginosa иSalmonellatyphimurium. Почти все перечисленные микроорганизмы были выделены из фекалий больных с острыми диарейными заболеваниями, госпитализированных в кишечное отделение ВОКИБ, в условиях бактериологической лаборатории ВОКИБ. Значительная часть изолятов золотистых стафилококков была выделена при бактериологическом исследовании мазков из ротоглотки. Определен-

но, отнюдь не все вышеупомянутые бактерии являлись причинными агентами соответствующих инфекционных заболеваний, поскольку лишь незначительная их часть принадлежит к облигатным патогенам человека (сальмонеллы, клебсиелла, синегнойная палочка); остальные относятся к условно-патогенной (стафилококки, энтеробактер) либо непатогенной (кишечная палочка, протей) флоре. Тем не менее, общеизвестно, что непатогенные и условно-патогенные энтеробактерии, а также золотистые стафилококки - комменсалы кожных покровов и слизистых, - отличаются высоким уровнем продукции бета-лактамаз (обычно класса А), нередко превышающим таковой у болезнетворных бактерий [11-16]. Кроме того, патогенные и непатогенные энтеробактерии свободно обмениваются факторами резистентности (обычно - перевиваемыми Я-плазми-дами), что было неоднократно документировано в научной литературе [13, 17].

В основе функционирования тест-системы «БиоЛактам» лежит спектрофотометрическая методика, базирующаяся на изменении окраски синтетического антибиотика цефалоспоринового ряда нитроцефина при распаде его бета-лактамной связи. При этом происходит батохромный сдвиг в хромофорной системе молекулы, и окраска реакционной смеси меняется с желтой на красно-оранжевую. Максимум поглощения продукта реакции меняется с 390 нм на 486 нм, что и делает возможным спектрофотометрическую детекцию. Показано, что нитро-цефин разрушается всеми известными бета-лактамазами [18]. Для экспериментов мы использовали химически чистый нитроцефин производства Са1ЬюсЬет (кат. № 484400). Бета-лактамазная активность оценивалась в % распада стандартного количества нитро-цефина, вносимого в каждую пробу.

Статистический анализ результатов исследования производился при помощи аналитических пакетов 81ай8Йса 8.0 и ЗРББ 19.

В качестве показателей центральной тенденции значений изучаемых признаков использовали среднее арифметическое (М) и/или медиану (Ме) с указанием 95% доверительного интервала. При необходимости охарактери-

зовать разброс значений какого-либо признака указывали его минимальное и максимальное значения, а также первый и третий квартили. Уровень достоверности нулевой гипотезы (р) для принятия решения о значимости полученных результатов во всех тестах был принят равным или менее 0,05. Для выявления корреляционных взаимосвязей мы использовали метод ранговых корреляций Спирмена, для подтверждения достоверности различий изучаемых признаков в независимых выборках - U-тест Манна-Уитни или медианный тест (при попарном сравнении переменных) либо дисперсионный анализ Краскела-Уолле-са (при одновременном сравнении переменных в З и более выборках).

Оценка эффективности диагностических методик определялась при помощи ROC-анализа с построением ROC-кривых и расчетом «отсечных» значений бета-лактамазной активности, соответствующих оптимальному сочетанию чувствительности и специфичности метода. Для данных вычислений мы использовали программу MedCalc 10.2.

Результаты и обсуждение

Анализ устойчивости испытуемых микроорганизмов к ключевым антибиотикам бета-лактамного ряда с применением диско-диф-фузионного метода показал, что 7З изолята из 131 (55,7%, 95% ДИ: 47,2...б4,2) оказались устойчивы к ампициллину (из них 1б, или 21,9% - умеренно чувствительны к данному антибиотику). Устойчивыми к амоксициллин/ клавуланату оказались 49 изолятов (37,4%, 95% ДИ: 29,1.45,7), в том числе умеренно чувствительных - 19 (3В,В%). Устойчивыми к це-фотаксиму оказалось всего 17 изолятов (13,0%, 95% ДИ: 7,2.18,7), из них умеренно чувствительных - б (35,3%).

Параллельный анализ бета-лактамазной активности тех же клинических изолятов бактерий, выполненный нами при помощи тест-системы «БиоЛактам», показал, что большая часть анализируемых микроорганизмов (111, или 84,7%, 95% ДИ: 7В,б. 90,9) обладала ненулевой бета-лактамазной активностью, т.е. продуцировала те или иные бета-лактамазы.

Средний уровень и дисперсия значений указанной активности несколько разнились в зависимости от избранной методики пробо-подготовки: так, в варианте, когда определялась активность нативной бактериальной суспензии, данные показатели составили 20,1% (95% ДИ: 14,8.25,4), медиана уровня активности -7,3% (25% - 2,8, 75% - 25,0); в случае же, когда бактериальная суспензия перед анализом была подвергнута кратковременному замораживанию/ оттаиванию, средний уровень регистрируемой бета-лактамазной активности составил 34,3% (95%ДИ: 28,0.40,5), а медиана

- 17,4% (25% - б,б, 75% - б3,2). Повышение-регистрируемой бета-лактамазной активности, вероятно, происходитвследствие разрушения микробных тел с высвобождением содержащихся в их цитоплазме бета-лактамаз. Разница между медианами уровней бета-лактамазной активности бактериальных суспензий, регистрируемых при обоих вариантах пробоподготов-ки, оказалась статистически значимой (медианный критерий, р=0,007).

Корреляционный анализ Спирмена показал наличие статистически значимых обратных корреляций средней силы между уровнем бета-лактамазной активности бактериальных суспензий (здесь и далее - регистрируемой при использовании обработки замораживанием/ оттаиванием для подготовки проб) и диаметрами зон ингибирования вокруг дисков с ампициллином ^=-0,б83,р<0,0001, n=130), амоксициллин/ клавуланатом (R=-0,624, р<0,0001, n=130) и цефотаксимом (R=-0,515, р<0,0001, n=130). Выявлены также прямые корреляции средней силы между уровнем бета-лактамазной активности бактериальных суспензий и наличием у соответствующих микроорганизмов устойчивости к вышеперечисленным антибиотикам (определеннойпри помощи диско-диффузионного анализа) - ампициллину (R=0,615^<0,0001, n=130), амок-сициллину/ клавуланату (R=0,587, р<0,0001, n=130) и цефотаксиму (R=0,477, р<0,0001, n=130). Таким образом, можно утверждать, что существует достаточно хорошее соответствие между результатами применения диско-диф-фузионного метода и разработанной нами тест-системы «БиоЛактам».

Наблюдаемая разница, вероятнее всего, обусловлена действием двух факторов: 1) значительной вариабельности результатов дискодиффузионного анализа, которую невозможно полностью преодолеть в условиях обычной бактериологической лаборатории; 2) феномена неферментативной устойчивости микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам. Ввиду того, что значительная часть микроорганизмов, вошедших в анализируемую выборку (n=25, или 19,1%), представлена грам(+) кокками, для которых неферментативная устойчивость является более типичной, чем продукция бета-лактамаз, нельзя ожидать полного совпадения результатов диско-диффу-зионного и нитроцефинового методов анализа, поскольку распад нитроцефина происходит лишь в присутствии бета-лактамаз либо ЧСА; здесь лежит одно из ограничений практической применимости предлагаемой нами тест-системы. Более того, некоторую часть выборки микроорганизмов, использованной в настоящем исследовании, составляют P. aeruginosa и различные виды сальмонелл (n=11, или 8,4%); указанные возбудители также способны реализовывать различные варианты неферментативной устойчивости к бета-лактамным антибиотикам [19-21].

Проведенный нами ROC-анализ показал, что при уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии, равном или превышающем 14,2%, соответствующий возбудитель продуцирует клинически значимые количества бета-лактамаз, что приводит к существенному снижению эффективности антибиотиков бета-лактамного ряда (кроме цефалоспоринов 3-4 поколения, карбапенемов, монобактамов и ин-гибитор-защищенных препаратов). При сравнении с диско-диффузионным методом в качестве референсного чувствительность методики составляет 76,4% (95% ДИ: 64,9. 85,6), специфичность - 82,8% (95% ДИ: 70,6.91,4), AUC=0,856 (95% ДИ: 0,784.0,912),р<0,0001.

Если определенная в процессе эксперимента бета-лактамазная активность бактериальной взвеси равна или превышает 26,5%, то соответствующий возбудитель устойчив также и к ингибитор-защищенным бета-лак-тамам. При сравнении с диско-диффузионным

методом в качестве референсного чувствительность методики составляет 79,2% (95% ДИ: 65,0. 89,5), специфичность - 79,3% (95% ДИ: 68,9.87,4), ЛИС=0,850 (95% ДИ: 0,777.0,907), р<0,0001.

В случае же, если зарегистрированная в ходе анализа бета-лактамазная активность бактериальной взвеси равна или превышает 81,2%, соответствующий возбудитель устойчив также к цефалоспоринам третьего поколения, т.е., возможно, является продуцентом БЛРС. При сравнении с диско-диффузионным методом в качестве референсного чувствительность методики составляет 82,4% (95% ДИ: 56,6.96,0), специфичность - 94,7% (95% ДИ: 88,8.98,8), ЛИС=0,908 (95% ДИ:

0,844. 0,951),р<0,0001.

Таким образом, разработанная нами тест-система «БиоЛактам» позволяет с высокой степенью достоверности получать ряд важных сведений обустойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам бета-лактамного ряда, что является необходимым условием для проведения рациональной антибактериальной терапии.

Если в ходе исследования с применением тест-системы «БиоЛактам» бета-лактамаз-ная активность бактериальной суспензии оказалась невысокой (менее 14%), но, согласно данным правильно (с соблюдением стандартов КССЬБ [6]) выполненного диско-диффу-зионного анализа, соответствующий клинический изолят устойчив к тем или иным бета-лактамным антибиотикам, можно констатировать, что данныйвозбудитель обладает каким-либо из неферментативных механизмов устойчивости к антибиотикам бета-лактамного ряда; в случае грам(+) кокковой флоры это, как правило, снижение аффинности ПСБ, а энтеробактерий - усиленный выброс антибиотиков из цитоплазмылибо снижение проницаемости наружной мембраны для бета-лактам-ных антибиотиков.

Можно заключить, что тест-система «БиоЛактам» не конкурирует с диско-диффу-зионным методом, а дополняет его, позволяя получать важную информацию о природе ан-тибиотикоустойчивости микроорганизмов -возбудителей инфекционных заболеваний.

Разработанная нами тест-система оптимальна для определения устойчивости к бета-лактамным антибиотикам бактерий кишечной группы (т.е. различных штаммов кишечной палочки, псевдомонад, сальмонелл, шигелл, цитробактера, протея, клебсиелл и т.п.), поскольку их устойчивость к бета-лактамным антибиотикам опосредуется почти исключительно продукцией разнообразных бета-лак-тамаз. Соответственно, тест-система ограниченно применима для определения уровня устойчивости к бета-лактамам грам(+) кокков (т.е. различных штаммов стрепто- и стафилококков), поскольку устойчивость данных бактерий к препаратам бета-лактамной группы может обусловливаться как продукцией бета-лактамаз (ряд штаммов стафилококков), так и модификацией пенициллин-связывающих белков (все стрептококки, часть стафилококков). В последнем случае тест-система покажет отсутствие бета-лактамазной активности бактериальной взвеси при фактическом наличии устойчивости анализируемой культуры к антибиотикам бета-лактамной группы. Кроме того, тест-система не позволяет напрямую дифференцировать обычные бета-лактамазы от БЛРС, поскольку и те, и другие эффективно разрушают нитроцефин.

Заключение

1. Разработанная нами тест-система «БиоЛактам» может успешно использоваться для качественной и количественной оценки бета-лактамазной активности бактериальных суспензий. Получаемые при этом результаты хорошо согласуются с данными параллельных исследований с применением диско-диффузи-онного метода, с поправкой на неизбежные огрехи при постановке последнего, а также с учетом того факта, что устойчивость ряда микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам не связана с продукцией бета-лактамаз.

2. При помощи тест-системы «БиоЛак-там» можно с высокой степенью достоверности определить:

- факт продукции клинически значимых количеств бета-лактамаз при уровне бета-лак-тамазной активности бактериальной суспен-

зии >14,2% (чувствительность данного теста составляет 76,4%, специфичность - 82,8%);

- факт устойчивости к ингибитор-защи-щенным бета-лактамам при уровне бета-лак-тамазной активности бактериальной суспензии >26,5% (чувствительность данного теста составляет 79,2%, специфичность - 79,3%);

- факт устойчивости к цефалоспоринам

3-го поколения при уровне бета-лактамазной активности бактериальной суспензии >81,2% (чувствительность данного теста составляет 82,4%, специфичность - 94,7%);

- при совместном использовании с дис-ко-диффузионным методом бактериологического анализа - также факт наличия неферментативных механизмов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам.

3. Тест-система «БиоЛактам» оптимальна для определения уровня устойчивости энтеробактерий к бета-лактамным антибиотикам, ограниченно применима для определения уровня устойчивости грам(+) кокков к данным препаратам и не позволяет дифференцировать обычные бета-лактамазы от БЛРС.

Литература

1. Perez-Llarena, F. J. Beta-lactamase inhibitors: the story so far / F. J. Pmez-Llarena, G. Bou // Curr. Med. Chem.

- 2009. - Vol. 16, №28. - P. 3740-3765.

2. Abeylath, S.C. Drug delivery approaches to overcome bacterial resistance to beta-lactam antibiotics / S.C. Abeylath, E. Turos // Expert. Opin. Drug. Deliv. - 2008.

- Vol. 5, №9. - P. 931-949.

3. Rolinson, G.N. Evolution of beta-lactamase inhibitors / G.N. Rolinson // Rev. Infect. Dis. - 1991. - Vol. 13, Suppl. 9. - P. S727-S732.

4. Sawai, T. Mechanisms of bacterial resistance to beta-lactams by beta-lactamases / T. Sawai // Nippon Rinsho.

- 1997. - Vol. 55, №5. - P. 1225-1230.

5. Trehan, I. Inhibition of AmpC beta-lactamase through a destabilizing interaction in the active site / I. Trehan, B.M. Beadle, B.K. Shoichet // Biochemistry. - 2001. -Vol. 40, №27. - P. 7992-7999.

6. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 10th informational supplement // NCCLS Document M100-S9. - 1999.- P. 141-156.

7. Решедько, Г.К. Особенности определения чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом / Г.К. Решедько, О.У Огедюк // Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия. - 2001. - Том 3, №4. - С. 348-354.

8. Basic laboratory procedures in clinical bacteriology / J. Vandepitte [et al.] // Geneva: World Health Organization (WHO). - 1991. - Р 121.

9. Голубева, И.В. Энтеробактерии: Руководство для врачей / И.В. Голубева, В.А. Килессо, Б.С. Киселева. Под ред. ПокровскогоВ.И. // М.: Медицина. -1985. - 427 с.

10. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 10th informational supplement // NCCLS Document M100-S9. - 1999. - P. 141-156.

11. Desgrandchamps, D. Antibiotics 1992: mechanism of resistance and its clinical relevance / D.Desgrandchamps // Schweiz. Med. Wochenschr. -1992. - Vol. 122, №8. - P. 247-256.

12. Livermore, D.M. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics / D.M. Livermore // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. -1991. - Vol. 78. - P. 7-16.

13. Medeiros, A.A. Spread of a «Pseudomonas - specific» beta-lactamase to plasmids of enterobacteria / A.A. Medeiros, R.W. Hedges, G.A. Jacoby // J. Bacteriol. -1982. - Vol. 149, №2. - P. 700-707.

14. Occurrence and mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics in clinically important species of Enterobacter / D. Mich6lkov6-Papajov6 [et al.] // Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. - 2001. - Vol. 50, №3. -P. 121-130.

15. Okamoto, R. AmpC beta-lactamases producing bacteria / R. Okamoto, R. Nakano // Nippon Rinsho. - 2001. -Vol. 59, №4. - P. 707-711.

16. Philippon, A. Beta-lactamases of Gram negative bacteria: never-ending clockwork / A. Philippon, G.Arlet // Ann. Biol. Clin. - 2006. - Vol. 64, №1. - P. 37-51.

17. Characterization of endemic S. flexneri strains in Somalia: antimicrobial resistance, plasmid profiles, and serotype correlation / M. Casalino [et al.] // J. Clin. Microbiol. -1994. - Vol. 32, №5. - P. 1179-1183.

18. Novel method for detection of b-lactamases by using a chromogenic cephalosporin substrate / H.C. Callaghan [et al.] // Antimicrobial agents and chemotherapy. -1972. - Vol. 1, №4. - P. 283-288.

19. Mechanisms of beta-lactam resistance amongst Pseudomonas aeruginosa isolated in an Italian survey / G. Bonfiglio [et al.] // J. Antimicrob. Chemother. -1998. - Vol. 42, №6. - P. 697-702.

20. Multidrug efflux pump AcrAB of Salmonella typhimurium excretes only those beta-lactam antibiotics containing lipophilic side chains / H. Nikaido [et al.] // J. Bacteriol. - 1998. - Vol. 180, №17. - P. 46864692.

21. Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance / X.Z. Li [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. - 1994. - Vol. 38, №8. - P. 1742-1752.

Поступила 25.07.2011 г. Принята в печать 02.12.2011 г.