КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭКСТРАКТ ИЛИ ФРАКЦИЮ ИЗ РАСТЕНИЯ РОДА JUSTICIA
COMPOSITION CONTAINING EXTRACT OR FRACTION FROM JUSTICIA PLANT

Область техники
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, пищевой композиции и косметической композиции с экстрактом из растения рода Justicia или его фракцией в качестве активного ингредиента для предупреждения, лечения или облегчения аллергического заболевания.
Предпосылки изобретения
Род Justicia семейства Acanthaceae представляет собой крупнейший род среди семейства Acanthaceae, который состоит из приблизительно 600 видов и встречается в пантропической и тропической климатических зонах. Растения, принадлежащие к роду Justicia, представляют собой многолетние растения или полукустарники и легко распознаются по их губовидному венчику. Типичные растения, принадлежащие к роду Justicia, включают Justicia procumbens L., Justicia pectoralis Jacq., Justicia gendarussa Burm. f., Justicia anselliana и Justicia adhatoda L. и т.д., однако виды физиологической активности растений рода Justicia еще не достаточно изучены.
Justicia procumbens L., принадлежащая к роду Justicia семейства Acanthaceae, представляет собой однолетнее растение и распространяется в Корее, Японии, Китае, Индии и т.д. Justicia procumbens L. имеет высоту приблизительно 30 см, и ее листья расположены друг напротив друга, характеризуются длинной овальной формой, длинной 2-4 см и шириной 1-2 см. Кроме того, оба конца листа заострены, и края листа имеют овальную или волнистую форму. Цветок растения имеет светло-пурпурный цвет, цветет с июля по сентябрь и плодоносит с сентября по октябрь.
В 1963 году Gell P.G.H. и Coombs R.R.A. разделили гиперчувствительность, возникающую в организме человека, в основном на четыре типа: тип I гиперчувствительности, соответствующий острым аллергическим реакциям, и типы II-IV гиперчувствительности, соответствующие отличным от аллергических реакциям, таким как аутоиммунные заболевания (Gell PGH & Coombs RRA, et al. Oxford, England: Blackwell, 1963).
Аллергия определяется как явление, при котором живой организм, вступающий в контакт с чужеродным веществом, называемым аллергеном, проявляет аномальные ответы на вещество. Аллергия может быть вызвана не только различными аллергенами, в том числе пыльцой, лекарственными средствами, растительными волокнами, бактериями, пищевыми продуктами, красками для волос, химическими продуктами и т. д, но также влажностью, температурой, занятиями и т. д., и может вызывать различные заболевания, такие как аллергический ринит, астма, атопический дерматит, аллергический конъюнктивит, аллергический средний отит, аллергический гастроэнтерит, анафилаксия и крапивница.
Аллергические реакции характеризуются зависимостью, главным образом, от антитела IgE, и аллергические реакции, которые опосредуются этим антителом IgE, называются «атопией» (Mitsuyasu et al. Ile50Val variant of IL4Rα upregulates IgE synthesis and associates with atopic asthma. Nature genetics 19.2, 119-120, 1998). Th2-лимфоциты, активированные аллергеном, секретируют различные физиологически активные вещества (цитокины), такие как интерлейкин-4 (IL-4) или интерлейкин-5 (IL-5), при этом эти физиологически активные вещества стимулируют B-лимфоциты к осуществлению секреции антитела IgE (SHIMODA et al. Lack of IL-4-induced Th2 response and IgE class switching in mice with disrupted State6 gene. Nature 380, 630-633, 1996). Секретированные антитела IgE связываются с FceR1 на поверхности клеток, таких как тучные клетки или базофилы, с активацией этих клеток. Известно, что активированные клетки подвергаются дегрануляции со стимуляцией секреции различных физиологически активных веществ, в том числе гистамина, лейкотриена, простагландина D2 или подобных, которые вызывают различные связанные с аллергическими заболеваниями реакции, такие как вазодилатация, сокращение гладких мышц, секреция слизи или подобные, и различные связанные с респираторными заболеваниями реакции, такие как воспаление дыхательных путей, сокращения мышц дыхательных путей или подобные (Bjorck, T., & Dahlen, S. E. Leukotrienes and histamine mediate IgE-dependent contractions of human bronchi: pharmacological evidence obtained with tissues from asthmatic and non-asthmatic subjects. Pulmonary pharmacology, 6(1), 87-96, 1993; Stone et al., IgE, mast cells, basophils, and eosinophils. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 125(2), S73-S80, 2010).
Более того, сообщалось о том, что аллергические реакции могут вызывать эозинофилию, при которой повышается количество эозинофилов в крови, и которая ассоциирована с аллергическим ринитом и астмой, атопическим дерматитом и т.д. (Mullarkey et al. Allergic and nonallergic rhinitis: their characterization with attention to the meaning of nasal eosinophilia. Journal of Allergy and Clinical Immunology 65.2 122-126, 1980; Humbles et al. Acritical role for eosinophils in allergic airways remodeling. Science 305.5691, 1776-1779, 2004; Grewe et al. A role for Th1 and Th2 cells in the immunopathogenesis of atopic dermatitis. Immunology today 19.8, 359-361, 1998). В частности, известно, что повышение количества эозинофилов в легочной ткани, является главным фактором, приводящим к эозинофильной астме и эозинофильной пневмонии, и что интерлейкин-5 и эотаксин представляют собой вещества, которые индуцируют повышение числа эозинофилов в конкретной ткани (Van Oosterhout et al. Effect of anti-IL-5 and IL-5 on airway hyperreactivity and eosinophils in guinea pigs American Review of Respiratory Disease 147.3, 548-552, 1993; Ying et al. Eosinophil chemotactic chemokines (eotaxin, eotaxin-2, RANTES, monocyte chemoattractant protein-3 (MCP-3), and MCP-4), and CC chemokine receptor 3 expression in bronchial biopsies from atopic and nonatopic (Intrinsic) asthmatics. The Journal of Immunology 163.11, 6321-6329, 1999).
С учетом вышеописанных исследований предпринимались упорные попытки подавления секреции антитела IgE, подавления дегрануляции тучных клеток или базофилов и блокирования проникновения воспалительных клеток, таких как эозинофилы, обеспечивая посредством этого предупреждение, лечение или облегчение аллергического заболевания.
В соответствии с участком тела, в котором проявляются симптомы, к заболеваниям, связанным с аллергией, относят аллергический ринит, астму, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильную пневмонию, атопический дерматит, контактный дерматит, крапивницу, ангиоэдему, анафилакcию, аллергический конъюнктивит, эозинофильный гастроэнтерит, синдром пищевой аллергии и т.д. Кроме того, в соответствии с первопричиной к заболеваниям, связанным с аллергией, относят профессиональную астму, профессиональный ринит, профессиональный дерматит, крапивницу, вызванную пищевыми продуктами, зависимую от пищевых продуктов анафилакcию, анафилаксию, возникающую после укусов насекомых, кожную сыпь, вызванную ноской резиновых перчаток, крапивницу, вызванную лекарственными средствами, анафилаксию, возникающую после обследования с введением контрастного вещества в сосуды, синдром Черджа-Строса, идиопатическую эозинофилию и т.д.
В качестве терапевтических средств для лечения аллергических заболеваний в основном применялись антигистаминные лекарственные средства, антилейкотриеновые лекарственные средства, стероидные лекарственные средства и т.п., однако их применение ограничено вследствие их эффектов и побочных эффектов.
Конкретно, для лечения аллергического ринита применялись антигистаминные лекарственные средства, противозастойные лекарственные средства, антилейкотриеновые лекарственные средства и т. п. Однако антигистаминные лекарственные средства могут вызывать побочные эффекты, такие как сонливость, и противозастойные лекарственные средства, такие как псевдоэфедрин, являются наркотическими компонентами, которые могут вызывать головную боль или инсульт, и антилейкотриеновые лекарственные средства могут вызывать побочные эффекты, связанные с нейропсихиатрией, такие как депрессия, влечение к суициду или подобные.
Более конкретно, лекарственные средства, которые применяют для лечения астмы, включают антилейкотриеновые лекарственные средства, стероидные лекарственные средства, агонисты бета-2-адренергических рецепторов, лекарственные средства, направленные против IgE (омализумаб) и т. п. В данном документе что касается антилейкотриеновых лекарственных средств, их в основном применяют в качестве умеренной или вспомогательной терапии, поскольку они вызывают вышеописанные побочные эффекты, а также оказывают небольшие эффекты на астму. Стероидные терапевтические средства применяют в основном для ингаляции, а не перорального введения из-за их побочных эффектов, и поэтому для них характерно плохое соблюдение по сравнению с пероральными лекарственными средствами. Кроме того, агонисты бета-2-адренергических рецепторов также являются ингаляционными лекарственными средствами, которые ослабляют симптомы астмы путем эффективного подавления бронхоконстрикции посредством локальной релаксации гладких мышц в легком, но полностью не излечивают астму и могут усугублять астму при длительном применении (Salpeter, et al. Meta-analysis: effect of long-acting β-agonists on severe asthma exacerbations and asthma-related deaths. Annals of internal medicine 144.12 904-912, 2006). Лекарственные средства, направленные против IgE (омализумаб), применяют при тяжелой астме, устойчивой к стероидам/агонистам бета-2-адренергических рецепторов, при этом они оказывают отличные эффекты, но имеют недостатки в том, что они дорогостоящие и применяются в виде инъекционных составов, которые сложно вводить.
Для лечения атопического дерматита применяют стероидные лекарственные средства, иммуносупрессанты/иммуномодуляторы, антигистаминные лекарственные средства и т.д. Иммуносупрессанты, такие как такролимус, оказывают отличные эффекты, но могут вызывать побочные эффекты, такие как повышение кровяного давления, ослабление функции почек или подобные.
С учетом описанного выше очевидно, что средства, которые в данное время применяют для лечения заболеваний, связанных с аллергией, ограничены в их применении, и поэтому существует острая необходимость в разработке новых терапевтических средств. Кроме того, вследствие комплексных механизмов действия, ассоциированных с аллергией, отмечается растущий интерес к экстрактам из лекарственных растений, оказывающим эффекты на комбинацию различных механизмов с помощью различных компонентов в отличие от однокомпонентных синтетических лекарственных средств, которые в основном контролируют одну из мишеней. Однако сообщений об экстрактах из лекарственных трав, оказывающих отличные эффекты в отношении комбинации различных аллергических заболеваний, все еще недостаточно. Соответственно, существует острая необходимость в разработке новых экстрактов из лекарственных растений, которые безопасны для применения in vivo и которые могут заменить традиционные противоаллергические лекарственные средства.
Раскрытие
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения провели исследования с растением рода Justicia и в результате обнаружили, что экстракт из растения рода Justicia или его фракция эффективно подавляют секрецию антитела IgE, и подавляют дегрануляцию тучных клеток и базофилов, и демонстрируют отличные противоаллергические эффекты на различных животных моделях аллергических заболеваний, довершая этим настоящее изобретение.
Таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение фармацевтической композиции для предупреждения или лечения аллергического заболевания, содержащей экстракт из растения рода Justicia или его фракцию.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение противоаллергического средства, содержащего экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение пищевой композиции для предупреждения или облегчения аллергического заболевания, содержащей экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение косметической композиции для предупреждения или облегчения аллергического заболевания, содержащей экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение применения экстракта из растения рода Justicia или его фракции для предупреждения или лечения аллергического заболевания.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение способа предупреждения или лечения аллергического заболевания, включающего стадию введения субъекту композиции, содержащей экстракт из растения рода Justicia или его фракцию.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение применения экстракта из растения рода Justicia или его фракции для изготовления лекарственного препарата для предупреждения или лечения аллергического заболевания.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанных целей в настоящем изобретении предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, содержащая экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где растение рода Justicia представляет собой одно или более растений, выбранных из группы, состоящей из J. adhatoda L., J. albobracteata L, J. anselliana, J. aurea Schltdl., J. betonica, J. calycina, J. ciliate, J. comata L., J. diffusa, J. dumetorum, J. extensa, J. flava, J. gendarussa Burm. f., J. ghiesbreghtiana, J. glauca, J. hayatai, J. heterocarpa T. Anders., J. hyssopifolia L., J. ideogenes, J. insularis, J. neesii, J. pectoralis Jacq., J. plectrantus, J. prostrate, J. purpurea, J. reptans, J. rhodoptera, J. schimperiana, J. secunda, J. sericea, J. simplex, J. spicigera, J. valida и J. procumbens L.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где растение рода Justicia представляет собой Justicia procumbens L.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где Justicia procumbens L. представляет собой одно или более из выбранных из группы, состоящей из цельного растения, надземной части, корня, листа и цветка Justicia procumbens L.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где экстракт представляет собой экстракт на основе органического растворителя.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где органический растворитель представляет собой один или более растворителей, выбранных из группы, состоящей из низшего спирта, содержащего 1-4 атома углерода, гексана, этилацетата, дихлорметана, эфира, хлороформа и ацетона.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где низший спирт, содержащий 1-4 атома углерода, представляет собой один или более низших спиртов, выбранных из группы, состоящей из метанола, этанола, пропанола, изопропанола, бутанола и н-бутанола.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где фракция представляет собой фракцию органического растворителя, полученную путем фракционирования с помощью органического растворителя, выбранного из группы, состоящей из н-гексана, этилацетата и водонасыщенного н-бутанола.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где фракция представляет собой водную фракцию, исключающую органический растворитель.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где аллергическое заболевание представляет собой аллергическое респираторное заболевание.
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, где аллергическое заболевание представляет собой одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из ринита, астмы, атопического дерматита, аллергического конъюнктивита, аллергического среднего отита, аллергического гастроэнтерита, анафилаксии и крапивницы.
В настоящем изобретении также предусматривается противоаллергическое средство, содержащее экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
В настоящем изобретении также предусматривается пищевая композиция для предупреждения или облегчения аллергического заболевания, содержащая экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
В настоящем изобретении также предусматривается пищевая композиция, где пищевой продукт представляет собой функциональный пищевой продукт для здорового питания.
В настоящем изобретении также предусматривается косметическая композиция для предупреждения или облегчения аллергического заболевания, содержащая экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
В настоящем изобретении также предусматривается применение экстракта из растения рода Justicia или его фракции для предупреждения или лечения аллергического заболевания.
В настоящем изобретении также предусматривается способ предупреждения или лечения аллергического заболевания, при этом способ включает стадию введения субъекту композиции, содержащей экстракт из растения рода Justicia или его фракцию.
В настоящем изобретении также предусматривается применение экстракта из растения рода Justicia или его фракции для изготовления лекарственного препарата для предупреждения или лечения аллергического заболевания.
Полезные эффекты
Экстракт из растения рода Justicia или его фракция в соответствии с настоящим изобретением могут эффективно предупреждать, лечить или облегчать аллергическое заболевание.
Описание графических материалов
На фиг. 1 показаны результаты, подтверждающие сокращение количества воспалительных клеток в жидкостях бронхоальвеолярного лаважа под действием экстрактов из Justicia procumbens в соответствии с настоящим изобретением.
Лучший вариант осуществления
В настоящем изобретении предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, содержащая экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
В настоящем изобретении «род Justicia семейства Acanthaceae» представляет собой крупнейший род среди семейства Acanthaceae, который состоит из приблизительно 600 видов и встречается в пантропической и тропической климатических зонах.
В настоящем изобретении «растение рода Justicia» относится к растению, принадлежащему к роду Justicia семейства Acanthaceae. В настоящем изобретении любое растение, принадлежащее к роду Justicia семейства Acanthaceae, можно применять без ограничения, при условии, что его экстракт или фракция экстракта могут проявлять противоаллергические эффекты так, что их можно применять в целях противодействия аллергическому заболеванию. Это растение рода Justicia предпочтительно может представлять собой одно или более растений, выбранных из группы, состоящей из J. adhatoda L., J. albobracteata L, J. anselliana, J. aurea Schltdl., J. betonica, J. calycina, J. ciliate, J. comata L., J. diffusa, J. dumetorum, J. extensa, J. flava, J. gendarussa Burm. f., J. ghiesbreghtiana, J. glauca, J. hayatai, J. heterocarpa T. Anders., J. hyssopifolia L., J. ideogenes, J. insularis, J. neesii, J. pectoralis Jacq., J. plectrantus, J. prostrate, J. purpurea, J. reptans, J. rhodoptera, J. schimperiana, J. secunda, J. sericea, J. simplex, J. spicigera, J. valida и J. procumbens L.
Среди этих растений «Justicia procumbens L. из рода Justicia семейства Acanthaceae» представляет собой однолетнее растение и распространяется в Кореи, Японии, Китае, Индии и т. д. Оно имеет высоту приблизительно 30 см и ее листья расположены друг напротив друга, характеризуются длинной овальной формой, длинной 2-4 см и шириной 1-2 см. Кроме того, оба конца листа заострены, и края листа имеют овальную или волнистую форму. Цветок растения имеет светло-пурпурный цвет, цветет с июля по сентябрь и плодоносит с сентября по октябрь. Цельное растение Justicia procumbens L. собирают в осенний период и используют после сушки. Сообщалось, что цельное растение Justicia procumbens L. оказывает эффекты на выведение тепла, детоксикацию, удаление влаги, активацию кровообращения и ослабление боли и может применяться против бактериальной диареи, желтухи, нефрита, отечности, боли в мышцах и костях, ушибов и т.д.
Экстракт из растения рода Justicia или его фракция в соответствии с настоящим изобретением могут подавлять секрецию антитела IgE и дегрануляцию тучных клеток и базофилов. В частности, они полезны для подавления иммунологической функции Th2 и проявляют отличные противоаллергические эффекты. Следовательно, с их помощью можно предупреждать, лечить или облегчать аллергическое заболевание.
Если экстракт из растения рода Justicia или его фракция в соответствии с настоящим изобретением представляют собой смешанный экстракт или смешанную фракцию, которые содержат в качестве активного ингредиента экстракт из двух или более растений рода Justicia или фракцию экстракта, то он может представлять собой либо смешанный экстракт, полученный путем экстракции смеси растений, или фракцию смешанного экстракта, либо смешанный экстракт, полученный путем экстракции каждого растения и смешивания экстрактов, или фракцию смешанного экстракта, но не ограничиваясь ими.
В настоящем изобретении более предпочтительное растение рода Justicia представляет собой, например, Justicia procumbens L.
Растение рода Justicia, которое применяется в настоящем изобретении, можно без ограничения применять в виде коммерчески приобретенного, или оно может быть культивируемым растением, при этом цельное растение, надземная часть, лист, корень, стебель, цветок или т. п. растения могут быть включены без ограничения. Наиболее предпочтительно можно применять цельное растение или надземную часть растения.
Экстракт из растения рода Justicia в соответствии с настоящим изобретением может быть экстрактом на основе воды или органического растворителя. Предпочтительно он может представлять собой экстракт на основе органического растворителя, неочищенный экстракт на основе органического растворителя или их концентрат. Органический растворитель предпочтительно представляет собой один или более органических растворителей, выбранных из группы, состоящей из низшего спирта, содержащего 1-4 атома углерода, гексана, этилацетата, дихлорметана, эфира, хлороформа и ацетона. Низший спирт, содержащий 1-4 атома углерода, предпочтительно представляет собой один или более низших спиртов, содержащих 1-4 атома углерода, выбранных из группы, состоящей из метанола, этанола, пропанола, изопропанола, бутанола и н-бутанола, при этом низший спирт, содержащий 1-4 атома углерода, может предусматривать безводный или водосодержащий спирт, содержащий 1-4 атома углерода. Спирт, например этанол или изопропанол, может быть 1-100% (об./об.), предпочтительно 30-100% (об./об.), более предпочтительно 70-100% (об./об.), еще более предпочтительно 90% (об./об.), 95% (об./об.) или 100% (об./об.) спиртом. Если в качестве экстракционного растворителя применяют бутанол, то он предпочтительно представляет собой водонасыщенный бутанол (водный раствор 75-85% (об./об.) бутанола).
В настоящем изобретении также предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения аллергического заболевания, содержащая экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента, где «фракция» может представлять собой фракцию (вторичный экстракт), полученную путем концентрирования неочищенного экстракта Justicia procumbens L. и фракционирования концентрата путем добавления низших спиртов, содержащих 1-4 атома углерода, их водных растворов или неполярных растворителей отдельно (или в комбинации).
Низшие спирты, содержащие 1-4 атома углерода, предпочтительно могут быть выбраны из группы, состоящей из этанола, метанола, пропанола, изопропанола, бутанола и н-бутанола. Неполярные растворители могут быть выбраны из группы, состоящей из гексана, этилацетата, эфира, дихлорметана, хлороформа и бутанола, и предпочтительно могут представлять собой н-гексан, этилацетат и водонасыщенный н-бутанол. Кроме того, фракция может представлять собой водную фракцию, исключающую каждый слой органического растворителя.
Экстракт или фракция по настоящему изобретению могут включать не только экстракт или фракцию, полученные с применением вышеописанного экстракционного растворителя, но также экстракт или фракцию, подверженные традиционному процессу очистки. Например, фракции, полученные посредством различных дополнительных способов очистки, таких как разделение с помощью мембраны для ультрафильтрации с отсечением по определенному молекулярному весу, разделение с помощью различных хроматографических систем (выпущенных для разделения в соответствии с размером, зарядом, гидрофобностью или аффинностью), также включены в предел определения фракции по настоящему изобретению.
Экстракт или фракцию по настоящему изобретению можно получить в виде порошка с помощью дополнительного способа, такого как вакуумная дистилляция и лиофилизация или сушка распылением.
Экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в соответствии с настоящим изобретением можно получить с помощью способа, включающего без ограничения следующие стадии:
1) стадию измельчения и воздушной сушки растения рода Justicia;
2) стадию экстракции измельченного растения рода Justicia с получением экстракта и
3) стадию фильтрации экстракта с последующей концентрацией при пониженном давлении.
Растение рода Justicia, применяемое на стадии 1), может быть культивируемым растением или коммерчески доступным растением.
Экстракция на стадии 2) может представлять собой вымачивание (холодная или горячая экстракция), экстракцию горячей водой, ультразвуковую экстракцию или экстракцию с дефлегмацией. Предпочтительно она представляет собой экстракцию с нагреванием с обратным холодильником. Экстракцию можно осуществлять при температуре 40-120°C, предпочтительно 80-100°C. Экстракцию можно проводить в течение 1-24 часов, предпочтительно 1-10 часов и более предпочтительно 1-5 часов. Кроме того, экстракцию по настоящему изобретению можно осуществлять 1-5 раз, предпочтительно 2 или 3 раза, в зависимости от эффективности экстракции, но не ограничиваясь этим.
Чтобы получить фракцию экстракта из растения рода Justicia, к концентрату первичного экстракта можно добавить 5-20-кратный (об./вес) объем очищенной воды с суспендированием концентрата в ней, и затем органические растворители, выбранные из группы, состоящей из гексана, этилацетата, бутанола (в том числе водонасыщенного бутанола), дихлорметана и хлороформа, можно отдельно (или последовательно) добавлять к суспензии с осуществлением экстракции, получая посредством этого фракции (вторичный экстракт). При этом температура экстракции составляет 40-120°C, предпочтительно 60-90°C, а время экстракции составляет 2-24 часа, предпочтительно 4-12 часов. Кроме того, экстракцию по настоящему изобретению можно осуществлять 1-5 раз, предпочтительно 2 или 3 раза, в зависимости от эффективности экстракции, но не ограничиваясь этим.
Экстракт или фракцию, полученные как описано выше, можно получать в виде порошка путем удаления остаточного низшего спирта и органического растворителя с применением традиционного способа сушки, такого как сушка при пониженном давлении, сушка распылением или лиофилизация, с тем, чтобы они были пригодны для применения в качестве сырьевого материала для медицинского лекарственного средства.
При этом аллергические заболевания согласно настоящему изобретению могут включать без ограничения различные заболевания, вызываемые различными аллергенами, а также включать не только патологические симптомы, связанные с реакциями антиген-антитело, но также симптомы, которые очень схожи с заболеваниями, характеризующимися реакциями антиген-антитело, однако не характеризуются данными реакциями антиген-антитело, или симптомы, которые весьма вероятно вызывают такие реакции и т.д. Аллергическое заболевание включает любое заболевание, проявляющееся в дыхательной системе, пищеварительной системе, системе кровообращения или подобных. Предпочтительно аллергическое заболевание представляет собой одно или более аллергических заболеваний, выбранных из группы, состоящей из ринита, астмы, атопического дерматита, аллергического конъюнктивита, аллергического среднего отита, аллергического гастроэнтерита, анафилаксии и крапивницы, или может представлять собой аллергическое респираторное заболевание.
Для лечения аллергического заболевания экстракт из растения рода Justicia или его фракцию можно применять отдельно или в комбинации с одним или более лекарственными средствами или экстрактами из лекарственных растений, которые, как известно, эффективны в отношении аллергического заболевания. В частности, если экстракт или фракция по настоящему изобретению подлежат применению в виде смеси с экстрактом из другого растения, то растение можно подвергать экстракции после смешивания с растением рода Justicia или можно подвергать экстракции отдельно и смешивать с экстрактом из растения рода Justicia или его фракцией.
Примеры экстракта или его фракции, которые эффективны в отношении аллергического заболевания и могут применяться в комбинации с экстрактом из растения рода Justicia или его фракцией, включают смесь экстракта из растения рода Justicia или его фракции с экстрактом из Andrographis paniculata или его фракцией, смесь экстракта из растения рода Justicia или его фракции с экстрактом из Sida rhombifolia или его фракцией, смесь экстракта из растения рода Justicia или его фракции с экстрактом из Chamaecrista nomame или его фракцией, смесь экстракта из растения рода Justicia или его фракции с экстрактом из Lagerstroemia indica L. или его фракцией и т.д. Кроме того, экстракт из растения рода Justicia или его фракцию можно применять в комбинации с экстрактами или их фракциями из различных растений, в том числе из Salvia plebeian, Mimosa pudica, Eclipta prostrate, Tussilago farara, коры Fraxini, листьев Vitis vinifera, семян Raphani, Tribulus terrestris L., семян Euryale, Rhenm undulatum L., Lindera strychnifolium, Fallopia japonica, Schijandra chinensis и т.д., которые, как предполагается, будут проявлять противоаллергические реакции.
Композицию в соответствии с настоящим изобретением можно составлять в виде фармацевтического состава с помощью способа, хорошо известного в данной области техники, с тем, чтобы обеспечить быстрое, длительное или замедленное высвобождение активного ингредиента после его введения млекопитающим. При получении состава композицию в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно смешивают или разбавляют с носителем или заключают в капсулообразный носитель.
Конкретно, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно составлять в форме таблетки, пилюли, порошка, гранулы, капсулы, суспензии, раствора, эмульсии, сиропа, аэрозоля, инъекционного раствора или подобных в соответствии с традиционным способом, хорошо известным в данной области техники. Примеры носителей, наполнителей и разбавителей, которые могут содержаться в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, манит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийскую камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксилбензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло и т.д. Композицию по настоящему изобретению можно составлять с традиционными обычно применяемыми разбавителями или наполнителями, такими как заполнители, сухие разбавители, связующие вещества, смачивающие средства, разрыхлители, поверхностно-активные вещества и т.д.
Твердые составы для перорального введения включают таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и т.п., и такие твердые составы могут содержать по меньшей мере один наполнитель, например, крахмал, карбонат кальция, сахарозу, лактозу, желатин или подобные. Кроме простых наполнителей также можно применять смазывающие вещества, такие как стеарат магния или тальк. Жидкие составы для перорального введения включают суспензии, растворы, эмульсии и сироп, и кроме воды и жидкого парафина, которые зачастую применяют как простые разбавители, могут содержать различные наполнители, например, смачивающие средства, вкусоароматические вещества, ароматизаторы и консерванты.
Составы для парентерального введения включают стерильные водные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизированные препараты, суппозитории и т.д. В качестве неводных растворителей или суспендирующих средств можно применять пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, инъекционные сложные эфиры, такие как этилолеат и т.п.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в фармацевтически эффективном количестве. В контексте настоящего документа термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, достаточному для лечения заболеваний при приемлемом соотношении польза/риск, применимом к любому терапевтическому лечению. Уровень эффективной дозы композиции может определить специалист в данной области техники в зависимости от различных факторов, в том числе способа составления, состояния, веса тела, пола и возраста пациента, тяжести заболевания, формы лекарственного средства, пути и продолжительности введения, скорости выведения и чувствительности реакции. Как будет понятно специалистам в данной области техники, эффективное количество может меняться в зависимости от способа лечения, применения наполнителей и возможности применения с другими лекарственными средствами.
Доза или дозировка экстракта из растения рода Justicia или его фракции в соответствии с настоящим изобретением может меняться в зависимости от веса тела, возраста, пола, состояния здоровья пациента, режима питания, времени введения, способа введения, скорости выведения и тяжести заболевания. Однако экстракт или фракцию по настоящему изобретению вводят в дозе для взрослых, составляющей от 0,001 мг/кг до 1000 мг/кг, один или несколько раз на день.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить посредством различных путей млекопитающим, в том числе мышам, сельскохозяйственным животным и людям. Например, ее можно вводить перорально, парентерально, внутривенно, внутрикожно или с помощью подкожной инъекции.
Таким образом, в настоящем изобретении предусматривается способ предупреждения или лечения аллергического заболевания со стадией введения субъекту композиции, содержащей экстракт из растения рода Justicia или его фракцию.
Введение можно осуществлять перорально, парентерально, внутривенно, внутрикожно или с помощью подкожной инъекции. Если экстракт или его фракция подлежат введению субъекту, то их можно вводить в эффективном количестве, необходимом для предупреждения или лечения аллергического заболевания. При введении субъекту экстракта из растения рода Justicia или его фракции у субъекта может подавляться секреция антитела IgE и дегрануляция тучных клеток и базофилов, и, в частности, может эффективно подавляться Th2-иммунитет, вследствие чего могут эффективно подавляться аллергические реакции in vivo. Аллергические заболевания, которые можно предупреждать или лечить с помощью такого введения, могут включать без ограничения различные заболевания, вызываемые различными аллергенами, а также включать не только патологические симптомы, связанные с реакциями антиген-антитело, но также симптомы, которые очень схожи с заболеваниями, характеризующимися реакциями антиген-антитело, однако не характеризуются данными реакциями антиген-антитело, или симптомы, которые весьма вероятно вызывают такие реакции и т.д. Аллергическое заболевание включает в себя любое заболевание, проявляющееся при аллергическом респираторном заболевании или в дыхательной системе, пищеварительной системе, системе кровообращения или подобных. Предпочтительно аллергическое заболевание представляет собой одно или более аллергических заболеваний, выбранных из группы, состоящей из ринита, астмы, атопического дерматита, аллергического конъюнктивита, аллергического среднего отита, аллергического гастроэнтерита, анафилаксии и крапивницы.
Субъект относится к животному. Конкретно, субъект представляет собой млекопитающее, для которого предупреждение или лечение с применением экстракта или фракции по настоящему изобретению могут оказать благоприятный эффект. Предпочтительные примеры субъекта включают приматов, таких как люди. Кроме того, такие субъекты включают всех субъектов, имеющих симптомы аллергии, или подверженных риску развития таких симптомов. Количество, эффективное для предупреждения или лечения аллергического заболевания, относится к количеству, которое в однократной или многократных дозах, отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими композициями (другими терапевтическими средствами против аллергических заболеваний) обеспечивает требуемый результат или пользу для субъекта.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предусматривается противоаллергическое средство, содержащее экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении предусматривается пищевая композиция для предупреждения или ослабления аллергического заболевания, содержащая экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
Если экстракт из растения рода Justicia или его фракцию, которые содержаться в пищевой композиции, принимают вместе с едой, то они могут подавлять секрецию антитела IgE и дегрануляцию тучных клеток и базофилов, и, в частности, могут эффективно подавлять Th2-иммунитет. Соответственно, они могут проявлять отличные противоаллергические эффекты и поэтому могут эффективно предупреждать или облегчать аллергическое заболевание.
Пищевая композиция может представлять собой функциональный пищевой продукт в соответствии с целью настоящего изобретения. Таким образом, в настоящем изобретении предусматривается пищевая композиция для предупреждения или облегчения аллергического заболевания, где пищевой продукт представляет собой функциональный пищевой продукт для здорового питания.
Функциональный пищевой продукт представляет собой пищевой продукт, предназначенный для содействия регуляции естественных биоритмов организма. Он представляет собой пищевой продукт, которому придают повышенной ценности посредством физических, биохимических и биоинженерных методик, вследствие чего он может действовать с выражением функций определенного пищевого продукта для конкретной цели. Этот функциональный пищевой продукт представляет собой обработанный пищевой продукт, предназначенный для защиты организма, содействия регуляции естественных биоритмов организма, предупреждения заболеваний и помощи индивидууму в избавлении от заболеваний. Он может содержать приемлемые пищевые добавки, подсластители или функциональные материалы.
Примеры пищевой композиции в соответствии с настоящим изобретением включают различные пищевые продукты, например, напитки, жвачки, чаи, комплексы витаминов, биологически активные добавки для здорового питания и т.д. Напитки включают натуральный фруктовый сок, напитки из фруктового сока, напитки из овощей и т.д. Композицию в виде пищевого продукта по настоящему изобретению можно составлять в виде таблеток, гранул, порошков, капсул, жидких растворов, пилюль или подобных в соответствии с известными способами.
Кроме того, пищевая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать различные традиционные вкусоароматические вещества, природные углеводы и т.д. Примеры вкусоароматических веществ включают природные вкусоароматические вещества, такие как тауматин или экстракты стевии, и синтетические вкусоароматические вещества, такие как сахарин, аспартам и т.д. Примеры натуральных углеводов включают моносахариды, такие как глюкоза или фруктоза, дисахариды, такие как мальтоза или сахароза, полисахариды, такие как декстрин или циклодекстрин, сахароспирты, такие как ксилит, сорбит или эритрит, и т.п. Кроме того, пищевая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать приемлемые пищевые добавки, в том числе различные нутриенты, витамины, минералы (электролиты), красители, пектиновую кислоту и ее соль, альгиновую кислоту и ее соль, органические кислоты, такие как безводная лимонная кислота, защитные коллоидные загустители, средства, регулирующие pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, карбонизирующие средства, применяемые в газированных напитках, мякоть фруктов для получения натуральных фруктовых соков, напитки из фруктового сока или овощные соки и т.д. Такие добавки можно применять отдельно или в комбинации.
Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении предусматривается косметическая композиция для предупреждения или облегчения аллергического заболевания, содержащая экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в качестве активного ингредиента.
Согласно настоящему изобретению косметическую композицию можно составлять в виде состава, выбранного из группы, состоящей из средства, смягчающего кожу, вяжущего лосьона, молочка-лосьона, питательного крема, массажного крема, эссенции, крема для кожи вокруг глаз, эссенции для кожи вокруг глаз, очищающего крема, очищающей пенки, очищающей воды, маски, лосьона для тела, крема для тела, масла для тела, эссенции для тела, основы под макияж, тонального крема, красок для волос, шампуня, ополаскивателей и средств для мытья тела.
Косметическую композицию по настоящему изобретению можно получить в виде различных структур с применением экстракта из растения рода Justicia или его фракции в соответствии с традиционными способами получения косметических средств, и она может содержать традиционные добавки, такие как стабилизаторы, солюбилизирующие средства, витамины, пигменты и отдушки, которые обычно применяют в области косметических композиций.
Если косметическую композицию по настоящему изобретению получают в форме косметического продукта, шампуня, лосьона для волос, крема для волос, геля для волос или подобных, содержащих экстракт из растения рода Justicia или его фракцию, то ее можно применять после разбавления очищающим раствором, вяжущим раствором или раствором со смачивающими веществами.
Косметическую композицию по настоящему изобретению предпочтительно получают в форме средства, смягчающего кожу, лосьона, крема или эссенции.
Что касается косметической композиции по настоящему изобретению, экстракт из растения рода Justicia или его фракцию можно добавлять в косметическую композицию в количестве, составляющем 0,1-10% по весу в пересчете на общий вес жидкости. Кроме того, экстракт или фракцию из растения рода Justicia можно добавлять в косметическую композицию в количестве, составляющем 0,001-5% по весу, предпочтительно 0,01-3% по весу в пересчете на общий сухой вес.
Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении предусматривается применение экстракта из растения рода Justicia или его фракции для предупреждения или лечения аллергического заболевания.
Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении предусматривается применение экстракта из растения рода Justicia или его фракции для изготовления лекарственного препарата для предупреждения или лечения аллергического заболевания.
При этом экстракт из растения рода Justicia или его фракция и аллергическое заболевание соответствуют описанным выше.
Следует понимать, что описанные в данном описании значения включают их эквиваленты, если не указано иное.
Принцип изобретения
Далее в данном документе будут описаны предпочтительные примеры получения, примеры и примеры составления для лучшего понимания настоящего изобретения. Однако следует понимать, что эти примеры получения, примеры и примеры составления приведены только для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример получения 1. Получение экстракта из Justicia procumbens L.
Justicia procumbens L., применяемую в эксперименте, собирали на территории Южной Кореи и сушили в тени. Происхождение растения идентифицировали в Национальном институте биологических ресурсов Министерства экологии (Корея) (идентификационный номер образца: NIBRVP0000469673). С применением воды и органических растворителей (этанола, изопропанола, метанола, н-бутанола, н-гексана, этилацетата, дихлорметана, эфира, хлороформа и ацетона) в качестве экстракционных растворителей получали экстракты из Justicia procumbens L.
Конкретные способы получения экстрактов представляли собой следующие.
Пример получения 1.1. Получение водных экстрактов
Justicia procumbens L., высушенную в тени, разделяли на цельное растение, надземную часть, корни, листья, цветки и т.п., а затем размалывали с применением мельницы тонкого помола (KSP-35, Korea Medi Co., Ltd.). В точности 5 г каждой части измельченной Justicia procumbens L. экстрагировали при нагревании с обратным холодильником с использованием 50 мл очищенной воды в инкубаторе с постоянной температурой (B-09, Hyundai Science Co., Ltd) при 90°C два раза (первая экстракция – 2 часа и вторая экстракция – 1 час). Каждый из экстрактов фильтровали естественным путем через фильтровальную бумагу и каждый из фильтратов концентрировали с применением вакуумного испарителя (N-1100, EYELA) при температуре 50-60°C, а затем сушили в вакуумном сушильном шкафе (OV-12, JEIO Tech) при 60°C в течение 12 часов с получением посредством этого 1,05 г. Полученные экстракты показаны в таблице 1 ниже.
Таблица 1
Пример получения 1.2. Получение этанольных экстрактов
С применением этанола в качестве экстракционного растворителя получали этанольные экстракты из Justicia procumbens L. таким же способом, как описанный в примере получения 1.1. Каждое из цельного растения, надземной части, корней, листьев и цветков Justicia procumbens L. подвергали экстракции с получением этанольного экстракта каждой части. Кроме того, надземную часть Justicia procumbens L. подвергали экстракции с 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% (%, об./об.) этанолом с получением этанольных экстрактов. Экстракты получали в количестве, составляющем 0,16-1,04 г, как показано в таблице 2 ниже.
Таблица 2
Пример получения 1.3. Получение изопропанольных экстрактов
С применением изопропанола в качестве экстракционного растворителя получали изопропанольные экстракты из Justicia procumbens L. таким же способом, как описанный в примере получения 1.1. Конкретно, 5 г Justicia procumbens L. подвергали экстракции с 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% (%, об./об.) изопропанолом с получением изопропанольных экстрактов. Экстракты получали в количестве, составляющем 0,19-1,01 г, как показано в таблице 3 ниже.
Таблица 3
Пример получения 1.4. Получение экстрактов с применением других органических растворителей
С применением различных органических растворителей, в том числе метанола, н-бутанола, н-гексана, этилацетата, дихлорметана, эфира, хлороформа и ацетона, получали экстракты из Justicia procumbens L. В этом примере, если не указано иное, экстракционный растворитель применяли в виде чистого (100% об./об.) растворителя. Экстракцию осуществляли таким же способом, как описанный в примере получения 1.1, за исключением того, что применяли различные типы экстракционного растворителя. Для получения метанольного экстракта 3 л метанола применяли по отношению к 300 г размолотой Justicia procumbens L. Экстракты получали в количестве, составляющем 0,19-1,01 г, как показано в таблице 4 ниже.
Таблица 4
Пример получения 2. Получение растворимых в органическом растворителе фракций 95% этанольного экстракта из Justicia procumbens L
Приблизительно 15 г Justicia procumbens L., измельченной с применением мельницы тонкого помола, подвергали экстракции при нагревании с обратным холодильником с использованием 150 мл 95% этанола два раза (первая экстракция – 2 часа и вторая экстракция – 1 час) в инкубаторе с постоянной температурой (B-09, Hyundai Science Co., Ltd) при 90°C. Экстракт фильтровали при пониженном давлении и фильтрат концентрировали в вакуумном испарителе (N-1100, EYELA) при температуре 50-60°C, а затем сушили в вакуумном сушильном шкафе (OV-12, JEIO Tech) при 60°C в течение 12 часов с получением посредством этого 95% этанольного экстракта (1,1-1,7 г). 95% этанольный экстракт суспендировали в 65 мл дистиллированной воды в разделительной воронке, а затем в него добавляли 40 мл каждого из н-гексана, этилацетата и водонасыщенного н-бутанола с последующим встряхиванием. После подтверждения разделения слоев органического растворителя в разделительной воронке органический растворитель концентрировали при пониженном давлении. Процесс экстракции повторяли три раза с получением посредством этого фракции органического растворителя (0,1-0,14 g) и фракции водного слоя (0,25-0,34 г), исключающей слой органического растворителя. Полученные фракции показаны в таблице 5 ниже.
Таблица 5
Пример 1. Способность экстракта из Justicia procumbens L. подавлять секрецию антитела IgE
5
2
Чтобы подтвердить эффект экстракта из Justicia procumbens L. в отношении подавления аллергических реакций, способность экстракта подавлять секрецию антитела IgE измеряли с применением клеток U266B1. Применяемые клетки U266B1 приобретали из Американской коллекции тканевых и клеточных культур (ATCC, № TIB-196). Конкретно, клетки U266B1 разбавляли в среде RPMI, содержащей 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотики (100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина), в концентрации 2×10 клеток/мл, а затем разбавление распределяли в 24-луночный планшет в концентрации 400 мкл/лунка и в 96-луночный планшет в концентрации 100 мкл/лунка и инкубировали в инкубаторе с 5% CO при 37°C в течение 72 часов.
Клетки U266B1 обрабатывали с помощью 5 мг/мл каждого из экстрактов из Justicia procumbens L. и фракций (полученных согласно примерам получения 1 и 2 и показанных в таблицах 1-5). Среду в 24-луночном планшете применяли для измерения секреции антитела IgE, а 96-луночный планшет применяли для измерения цитотоксичности.
Для измерения секреции антитела IgE среду из 24-луночного планшета собирали и центрифугировали при 125 × g в течение 5 минут с удалением дебриса. 100 мкл среды 10-кратно разбавляли, а затем измеряли уровень секреции IgE с помощью твердофазного иммуноферментного анализа IgE (ELISA, Komabiotech Inc). Подавление секреции IgE каждым экстрактом рассчитывали с применением следующего уравнения 1.
Уравнение 1
Подавление (%) секреции IgE = 100 – (концентрация IgE в тестируемой группе / концентрация IgE в контрольной группе) × 100.
Результаты измерения показаны в таблицах 6-8 ниже.
Таблица 6
Таблица 7
Таблица 8
Как можно увидеть из таблиц 6-8, экстракты из Justicia procumbens L. на основе низших спиртов и органических растворителей демонстрировали эффект значительного подавления секреции IgE B-лимфоцитами. Кроме того, как можно увидеть из вышеприведенной таблицы 7, этанольные экстракты из всех частей Justicia procumbens L. демонстрировали подавление секреции IgE на уровне приблизительно 25-40%.
Как можно увидеть из вышеприведенной таблицы 8, различные фракции органических растворителей, показанные в таблице 5 и полученные путем вторичной экстракции неочищенного 95% этанольного экстракта, также проявляли отличные эффекты подавления в отношении секреции IgE B-лимфоцитами. Следовательно, можно легко прийти к выводу, что экстракты из Justicia procumbens L. на основе органических растворителей и их фракции могут эффективно подавлять аллергические реакции путем подавления секреции IgE.
Кроме того, проводили эксперимент на цитотоксичность с применением 96-луночного планшета. Жизнеспособность клеток, культивируемых в течение 72 часов, измеряли с применением набора для анализа CCK-8 (Dojindo, Япония). В результате было показано, что все экстракты из Justicia procumbens L. и фракции, показанные в таблицах 6-8, демонстрировали значение жизнеспособности клеток, составляющее 80% или больше. Это свидетельствует о том, что экстракты из Justicia procumbens L. на основе органических растворителей и их фракции можно применять в качестве безопасных веществ, не обладающих цитотоксичностью.
Пример 2. Измерение способности экстракта из Justicia procumbens L. подавлять дегрануляцию
С целью измерения способностей экстрактов из Justicia procumbens L. и фракций, показанных в вышеприведенных таблицах 1-5, к подавлению дегрануляции измеряли секрецию β-гексозаминидазы тучными клетками и базофилами с определением способностей подавления дегрануляции (de Haan et al. Lipid-rich enteral nutrition regulates mucosal mast cell activation via the vagal anti-inflammatory reflex. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology 305.5 G383-G391, 2013; Sewell et al. Induction of interleukin-4 and interleukin-5 expression in mast cells is inhibited by glucocorticoids. Clinical and diagnostic laboratory immunology 5.1 18-23, 1998).
6
5
Тучные клетки мыши MC/9 приобретали из Американской коллекции тканевых и клеточных культур (ATCC, № CRL-8306), и базофилы крысы RBL-2H3 приобретали из банка клеточных культур Кореи (KCLB, № 22256). Тучные клетки MC/9 и базофилы RBL-2H3 разбавляли до концентраций 2×10 клеток/мл и 5×10 клеток/мл соответственно, и 400 мкл каждого из разбавлений распределяли в каждую лунку 24-луночных планшетов. Каждую лунку предварительно обрабатывали с помощью 10 мкг/мл или 20 мкг/мл каждого из экстрактов и фракций (полученных согласно примерам получения 1 и 2 и показанных в вышеприведенных таблицах 1-5) в течение 30 минут, а затем в течение 1 часа индуцировали дегрануляцию клеток с помощью 200 нМ PMA/10 мМ A23187. Нормальную группу обрабатывали с помощью DMSO, а контрольную группу обрабатывали с помощью только PMA/A23187. Каждую из β-гексозаминидазы, выделенной в среду посредством дегрануляции, и β-гексозаминидазы в клеточном лизате, полученном посредством лизиса с помощью 1% Triton-X100, инкубировали с 4-п-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминидом (Sigma, № N-9376) при 37°C в течение 1 часа, а затем добавляли 0,2 M глицин (pH 10,7) для остановки реакции. Измеряли поглощение при 405 нм и секрецию β-гексозаминидазы (%) рассчитывали с применением следующего уравнения 2.
Уравнение 2
Секреция β-гексозаминидазы (%) = {поглощение среды / (поглощение клеточного лизата + поглощение среды)} × 100.
На основании значений секреции β-гексозаминидазы (%), полученных с применением вышеприведенного уравнения 2, способность к подавлению дегрануляции каждого из экстрактов из Justicia procumbens L. рассчитывали с применением следующего уравнения 3 (β-heXo: β-гексозаминидаза).
Уравнение 3
Способность подавления дегрануляции (%) = {% секреции β-heXo в тестируемой группе – % секреции β-heXo в нормальной группе / (% секреции β-heXo в контрольной группе – % секреции β-heXo в нормальной группе)} × 100.
Результаты расчета показаны в таблицах 9-11 ниже.
Таблица 9
Таблица 10
Таблица 11
Как можно увидеть из вышеприведенных таблиц 9-11, все из экстрактов из Justicia procumbens L. на основе низших спиртов и органических растворителей подавляли дегрануляцию тучных клеток и базофилов.
Как можно увидеть из вышеприведенной таблицы 10, этанольный экстракт из каждой части Justicia procumbens L. демонстрировал высокое значение подавления дегрануляции, составляющее 12-28%. В частности, этанольные экстракты из цельного растения и надземной части демонстрировали очень высокую способность к подавлению дегрануляции базофилов. Кроме того, как можно увидеть из вышеприведенной таблицы 11, фракции органических растворителей, показанные в таблице 5 и полученные посредством вторичной экстракции неочищенного 95% этанольного экстракта, также демонстрировали отличную способность подавления дегрануляции тучных клеток и базофилов.
Из вышеописанных результатов можно легко прийти к выводу, что экстракты из Justicia procumbens L. на основе органических растворителей и их фракции могут эффективно подавлять аллергические реакции путем подавления дегрануляции тучных клеток и базофилов.
Пример 3. Изучение подавления секреции IgE на моделях ринита у мышей Balb/c
Для подтверждения того, может ли экстракт из Justicia procumbens L. по настоящему изобретению действительно подавлять аллергические реакции в животных моделях, изучали подавление секреции IgE на моделях ринита у мышей Balb/c.
3
Конкретно, мышей Balb/c возрастом 5 недель приобретали и обеспечивали их акклиматизацию в течение 1 недели. В дни 0, 7 и 14 однонедельного периода акклиматизации мышей системно сенсибилизировали посредством интраперитонеальной инъекции 0,1% овальбумина (OVA: 1 мг/мл, Al(OH): 20 мг/мл) в количестве 100 мкл/мышь. Через одну неделю после финальной системной сенсибилизации 200 мг/кг 95% этанольного экстракта, полученного согласно примеру получения 1, перорально вводили мышам утром каждого дня в течение 1 недели. В качестве положительного контроля интраперитонеально вводили 3 мг/кг дексаметазона. Через 1 час в носовую полость закапывали 0,4% раствор овальбумина. В полдень в носовую полость еще раз закапывали 0,4% раствор овальбумина. Через 7 дней введения лекарственного средства у мышей проводили биопсию, а также отбирали цельную кровь из нижней полой вены и центрифугировали ее при 12000 об/мин в течение 10 минут с отделением сыворотки крови. Концентрацию IgE в отделенной сыворотке крови измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA, Komabiotech Inc), и результаты измерения показаны в таблице 12 ниже. Подавление секреции IgE (%) рассчитывали с применением следующего уравнения 4.
Уравнение 4
Подавление секреции (%) = 100 – {(концентрация в тестируемой группе – концентрация в нормальной группе) / (концентрация в группе с индукцией овальбумином – концентрация в нормальной группе)} × 100.
Таблица 12
Как можно увидеть из вышеприведенной таблицы 12, экстракт из Justicia procumbens L. подавлял секрецию IgE в моделях аллергического ринита на приблизительно 60% или больше, и, следовательно, проявлял эффект, подобный эффекту дексаметазона, применяемого в качестве положительного контроля. Следовательно, было установлено, что экстракт из Justicia procumbens L. можно применять в качестве потенциального терапевтического средства против аллергического ринита вместо дексаметазона. В частности, дексаметазон назначают только при тяжелом аллергическом рините, тогда как предполагается, что Justicia procumbens L. можно назначать также при умеренном аллергическом рините, поскольку он является экстрактом из лекарственных растений.
Пример 4. Изучение способности к подавлению анафилаксии
Для подтверждения эффекта экстракта из Justicia procumbens L. в отношении подавления аллергических реакций изучали эффект экстракта из Justicia procumbens L. в отношении предупреждения смерти, вызванной шоком, на моделях анафилаксии у мышей ICR.
Конкретно, мышей ICR делили на группы (n = 10/группа) в соответствии с весом тела. Мышей ограничивали в приеме пищи за один день до эксперимента, а затем мышам интраперитонеально вводили соединение 48/80 (Sigma, № C2313) в концентрации 16 мг/кг с индуцированием анафилаксии. За один час до индукции анафилаксии мышам интраперитонеально вводили 100 мг/кг 95% этанольного экстракта из Justicia procumbens L., полученного согласно примеру получения 1, и 200 мг/кг DSCG (кромолин-натрий, Sigma, № C0399) в качестве положительного контроля. Смерть мышей регистрировали через 20 минут после индукции анафилаксии и результаты наблюдения показаны в таблице 13 ниже. Подавление (%) анафилаксии рассчитывали с применением следующего уравнения 5.
Уравнение 5
Подавление (%) анафилаксии = 100 – (количество умерших мышей / общее количество мышей (10 мышей)) × 100.
Таблица 13
Как можно увидеть из вышеприведенной таблицы 13, экстракт из Justicia procumbens L. подавлял анафилаксию на приблизительно 90%, указывая на то, что он имеет весьма отличную способность подавления анафилаксии. Этот эффект подавления экстракта из Justicia procumbens L. был очень значимым по сравнению с эффектом подавления DSCG в качестве положительного контроля (подавление приблизительно на 60%). Следовательно, было установлено, что экстракт из Justicia procumbens L. может эффективно предупреждать смерть, вызванную анафилактическим шоком, благодаря его отличному эффекту в отношении подавления аллергических реакций.
Пример 5. Эффект подавления астмы на моделях астмы у мышей Balb/c
С применением водного экстракта, 95% этанольного экстракта и 100% этанольного экстракта из Justicia procumbens L., полученных согласно примеру получения 1, измеряли изменения в отношении различных маркеров, ассоциированных с болезнью, представляющей собой астму, на моделях астмы у мышей Balb/c.
3
Мышей Balb/c возрастом 5 недель приобретали и обеспечивали их акклиматизацию в течение 1 недели. В дни 0 и 14 1-недельного периода акклиматизации мышей системно сенсибилизировали посредством интраперитонеального введения 0,1% овальбумина (OVA: 1 мг/мл, Al(OH): 20 мг/мл) в количестве 100 мкл/мышь. Через одну неделю после финальной системной сенсибилизации (21 день), 200 мг/кг каждого из водного экстракта, 95% этанольного экстракта и 100% этанольного экстракта из Justicia procumbens L., полученных согласно примеру получения 1, перорально вводили мышам каждый день в течение 10 дней. В качестве положительного контроля интраперитонеально вводили 3 мг/кг дексаметазона. Через один час мышам вводили путем разбрызгивания и ингаляции 0,2% раствор овальбумина в течение 1 часа с применением небулайзера (PARI Boy SX, Germany GmbH). Через 5 часов после финальной сенсибилизации (30 дней) у мышей проводили биопсию, а также отбирали цельную кровь у мышей и центрифугировали ее при 12000 об/мин в течение 10 минут с отделением сыворотки крови. Кроме того, у каждой мыши извлекали ткань легкого и промывали струей 1 мл фосфатно-солевого буферного раствора посредством трахеостомии со сбором жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF). Собранную жидкость бронхоальвеолярного лаважа центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут, при этом супернатант применяли для измерения физиологически активных веществ (IL-4 и IL-5), а осадки применяли для измерения количества воспалительных клеток.
Концентрацию IgE в отделенной сыворотке крови измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа IgE (ELISA, Komabiotech Inc.), и физиологически активные вещества (интерлейкин-4 (IL-4) и интерлейкин-5 (IL-5)) в выделенной жидкости бронхоальвеолярного лаважа измеряли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA, IL-4: Enzo, № ADI-900-043, IL-5: R&D system, № M5000), соответствующего каждому веществу. Результаты измерения показаны в таблице 14 ниже, и способность каждого экстракта подавлять секрецию IgE рассчитывали таким же образом, как в уравнении 4, показанном в примере 3.
Кроме того, осадки жидкости бронхоальвеолярного лаважа повторно растворяли в 0,5 мл фосфатно-солевого буферного раствора и 0,1 мл раствора добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета и центрифугировали при 800 об/мин в течение 5 минут для прикрепления клеток ко дну (3 лунки на образец). Затем каждый образец окрашивали раствором для окрашивания Diff Quik (Sysmex) и фотографировали с помощью микроскопа в 2-6 произвольных участках. Чтобы рассчитать процентную долю (%) воспалительных клеток для каждой группы подсчитывали приблизительно 200 клеток на образец. Общее количество воспалительных клеток измеряли с помощью микроскопа с применением гемоцитометра и количество базофилов рассчитывали с помощью каждого значения процентной доли (%) воспалительных клеток и они показаны на фиг. 1. Статистическую обработку проводили с применением программы SPSS, и тест Левена проводили для проверки равных дисперсий, и значимость проверяли с помощью однофакторного анализа (ANOVA).
Таблица 14
*p<0,05 по сравнению с нормальной группой, #p<0,05 по сравнению с группой с индукцией
Как можно увидеть из вышеприведенной таблицы 14 и фиг. 1, 95% этанольный экстракт и 100% этанольный экстракт из Justicia procumbens L. значительно подавляли сывороточный IgE, который является связанным с астмой маркером, и демонстрировали лучшую способность подавления секреции IgE по сравнению с положительным контролем, представляющим собой дексаметазон. Кроме того, 95% этанольный экстракт и 100% этанольный экстракт из Justicia procumbens L. также снижали концентрацию IL-4 до степени, подобной наблюдаемой с положительным контролем, представляющим собой дексаметазон, и значительно сокращали количество воспалительных клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа. В частности, 100% этанольный экстракт продемонстрировал весьма отличный эффект в виде сокращения количества базофилов и общего количества воспалительных клеток по сравнению с количеством в нормальной группе. Из таких результатов было установлено, что экстракт из Justicia procumbens L. имеет отличный эффект в отношении подавления аллергических реакций, и, следовательно, с его помощью можно эффективно лечить аллергические заболевания.
Пример составления 1. Получение лекарственных препаратов
Получение порошка
Вышеприведенные компоненты смешивали друг с другом и заполняли ими герметичный контейнер с получением порошка.
Получение таблетки
Вышеприведенные компоненты смешивали друг с другом и прессовали в соответствии с традиционным способом получения таблеток с получением таблетки.
Получение капсулы
В соответствии с традиционным способом получения капсул вышеприведенные компоненты смешивали друг с другом и заполняли ими желатиновую капсулу с получением капсулы.
Получение инъекционного раствора
В соответствии с традиционным способом получения инъекционного раствора вышеприведенные компоненты применяют из расчета на ампулу (2 мл) с получением инъекционного раствора.
Получение жидкого состава
Очищенную воду добавляли до общего объема 1000 мл. В соответствии с традиционным способом получения жидкого состава вышеприведенные компоненты смешивали друг с другом, а затем заполняли ими бутылку из коричневого стекла и стерилизовали с получением жидкого состава.
Пример составления 2. Получение пищевого продукта
Хотя содержания витаминов и смеси минералов предпочтительно являются такими, которые пригодны для функциональных пищевых продуктов для здорового питания, эти содержания необязательно могут быть изменены. В соответствии с традиционным способом получения функционального пищевого продукта для здорового питания вышеприведенные компоненты смешивали друг с другом, а затем в соответствии с традиционным способом получали в виде функционального пищевого продукта для здорового питания (например, питательного леденца).
Пример составления 3. Получение напитка
Очищенную воду добавляли до общего объема 900 мл. В соответствии с традиционным способом получения функционального напитка для здорового питания вышеприведенные компоненты смешивали друг с другом, а затем перемешивали с нагреванием при 85°C в течение приблизительно 1 часа. Затем полученный раствор фильтровали и собирали в простерилизованный контейнер на 2 литра. Далее его герметизировали, стерилизовали, хранили в холодильнике и затем применяли для получения композиции функционального напитка для здорового питания по настоящему изобретению.
Хотя вышеприведенная композиция является предпочтительным примером компонентов, относительно пригодных для популярных напитков, их содержания необязательно могут быть изменены в соответствии с региональными и национальными предпочтениями, в том числе характеристиками для потребителей, национальностями потребителей, предполагаемым применением и т.д.
Пример составления 4. Получение косметической композиции
Промышленная применимость
Как описано выше, композицию, содержащую экстракт из растения рода Justicia или его фракцию в соответствии с настоящим изобретением, можно применять для предупреждения, лечения или облегчения аллергического заболевания.