ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕНТИВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ, ЭКСПРЕССРУЮЩИХ ФАКТОР IX

1. Способ профилактики или лечения гемофилии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективной дозы лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью фактора IX (FIX), причем лентивирусный вектор упакован в клетки HEK293T, суперэкспрессирующие CD47, которые имеют более высокий уровень экспрессии поверхностного белка CD47, чем контрольный лентивирусный вектор, продуцируемый в немодифицированных клетках HEK293T (ATCC CRL-11268™), и причем эффективная доза уменьшена относительно контрольной дозы контрольного лентивирусного вектора, необходимой для индукции такой же активности FIX, как у лентивирусного вектора.
2. Способ по п.1, в котором
2
контрольный лентивирусный вектор содержит 19 молекул/мкм CD47 на поверхности контрольного лентивирусного вектора;
лентивирусный вектор содержит по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,0 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 3,0 раза, по меньшей мере приблизительно в 3,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 4,0 раза, по меньшей мере приблизительно в 4,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 5,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 5,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 6,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 6,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 7,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 7,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 8,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 8,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 9,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 9,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 11 раз, по меньшей мере приблизительно в 12 раз, по меньшей мере приблизительно в 13 раз, по меньшей мере приблизительно в 14 раз, по меньшей мере приблизительно в 15 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 25 раз, по меньшей мере приблизительно в 30 раз, по меньшей мере приблизительно в 35 раз, по меньшей мере приблизительно в 40 раз больше белка CD47 на поверхности лентивирусного вектора, чем контрольный лентивирусный вектор, продуцируемый в клетках HEK293T (ATCC CRL-11268™); и/или
CD47 представляет собой CD47 человека, причем необязательно CD47 человека содержит аминокислотную последовательность по меньшей мере на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере приблизительно на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере приблизительно на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере приблизительно на 98%, по меньшей мере на 99% или приблизительно на 100% идентичную аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 14.
3. Способ по п.1, в котором необязательно:
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
8
8
эффективная доза составляет менее приблизительно 5×10 трансдуцирующих единиц/кг (TU/кг), менее 4×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг, менее 1×10 TU/кг, менее 9×10 TU/кг, менее 8×10 TU/кг, менее 7×10 TU/кг, менее 6×10 TU/кг, менее 5×10 TU/кг, менее 4×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг менее 1×10 TU/кг, менее приблизительно 9×10 TU/кг или менее приблизительно 8×10 TU/кг;
субъект демонстрирует одно или несколько следующих свойств после введения:
(a) пониженную трансдукцию макрофагов посредством лентивирусного вектора относительно контрольного лентивирусного вектора;
(b) уменьшенный аллоспецифичный иммунный ответ на лентивирусный вектор относительно контрольного лентивирусного вектора, причем необязательно аллоспецифичный иммунный ответ включает высвобождение цитокина в ответ на лентивирусный вектор, причем цитокин выбирают из группы, состоящей из MIP-1a, MIP-1b, MCP-1 и любой их комбинации;
(c) активность FIX, составляющую по меньшей мере 30%, относительно нормальной активности FIX по меньшей мере через 3 недели после введения;
(d) тканеспецифичную экспрессию лентивирусного вектора в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке; и
(e) любую комбинацию (a)-(d);
субъект демонстрирует пониженный уровень экспрессии MIP-1a после введения лентивирусного вектора относительно экспрессии MIP-1a после введения контрольного лентивирусного вектора;
субъект демонстрирует пониженный уровень экспрессии MIP-1b после введения лентивирусного вектора относительно экспрессии MIP-1b после введения контрольного лентивирусного вектора;
субъект демонстрирует пониженный уровень экспрессии MCP-1 после введения лентивирусного вектора относительно экспрессии MCP-1 после введения контрольного лентивирусного вектора;
субъект демонстрирует активность FIX, составляющую по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 125%, по меньшей мере приблизительно 150%, по меньшей мере приблизительно 175%, по меньшей мере приблизительно 200%, по меньшей мере приблизительно 225%, по меньшей мере приблизительно 250%, по меньшей мере приблизительно 275% или по меньшей мере приблизительно 300%, относительно нормальной активности FIX по меньшей мере через три недели после введения лентивирусного вектора;
субъект демонстрирует активность FIX, составляющую по меньшей мере приблизительно 150%, относительно нормальной активности FIX по меньшей мере через три недели после введения лентивирусного вектора; и/или
субъект демонстрирует повышенную локализацию лентивирусного вектора в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта, причем необязательно:
повышенная локализация характеризуется количеством копий (VCN) лентивирусного вектора, которое по меньшей мере приблизительно в 2 раза, по меньшей мере приблизительно в 3 раза, по меньшей мере приблизительно в 4 раза, по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 6 раз, по меньшей мере приблизительно в 7 раз, по меньшей мере приблизительно в 8 раз, по меньшей мере приблизительно в 9 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 11 раз, по меньшей мере приблизительно в 12 раз, по меньшей мере приблизительно в 13 раз, по меньшей мере приблизительно в 14 раз, по меньшей мере приблизительно в 15 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 25 раз, по меньшей мере приблизительно в 30 раз, по меньшей мере приблизительно в 35 раз, по меньшей мере приблизительно в 40 раз, по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по меньшей мере приблизительно в 60 раз, по меньшей мере приблизительно в 70 раз, по меньшей мере приблизительно в 80 раз, по меньшей мере приблизительно в 90 раз, по меньшей мере приблизительно в 100 раз, по меньшей мере приблизительно в 110 раз, по меньшей мере приблизительно в 120 раз, по меньшей мере приблизительно в 130 раз, по меньшей мере приблизительно в 140 раз, по меньшей мере приблизительно в 150 раз, по меньшей мере приблизительно в 160 раз, по меньшей мере приблизительно в 170 раз, по меньшей мере приблизительно в 180 раз, по меньшей мере приблизительно в 190 раз или по меньшей мере приблизительно в 200 раз выше в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта;
повышенная локализация характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое по меньшей мере в 10 раз выше в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта;
повышенная локализация характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое по меньшей мере в 50 раз выше в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта; и/или
повышенная локализация характеризуется VCN лентивирусного вектора, которое по меньшей мере в 100 раз выше в печени, селезенке или и в печени, и в селезенке после введения лентивирусного вектора относительно иного органа, чем печень и селезенка у субъекта.
4. Способ по п.1, в котором активность FIX в плазме через 24-48 часов после введения лентивирусного вектора повышена относительно субъект, которому ввели контрольную дозу контрольного лентивирусного вектора, причем необязательно активность FIX в плазме повышается после введения по меньшей мере приблизительно в 2 раза, по меньшей мере приблизительно в 3 раза, по меньшей мере приблизительно в 4 раза, по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 6 раз, по меньшей мере приблизительно в 7 раз, по меньшей мере приблизительно в 8 раз, по меньшей мере приблизительно в 9 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 11 раз, по меньшей мере приблизительно в 12 раз, по меньшей мере приблизительно в 13 раз, по меньшей мере приблизительно в 14 раз, по меньшей мере приблизительно в 15 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 25 раз, по меньшей мере приблизительно в 30 раз, по меньшей мере приблизительно в 35 раз, по меньшей мере приблизительно в 40 раз, по меньшей мере приблизительно в 50 раз, по меньшей мере приблизительно в 60 раз, по меньшей мере приблизительно в 70 раз, по меньшей мере приблизительно в 80 раз, по меньшей мере приблизительно в 90 раз, по меньшей мере приблизительно в 100 раз, по меньшей мере приблизительно в 110 раз, по меньшей мере приблизительно в 120 раз, по меньшей мере приблизительно в 130 раз, по меньшей мере приблизительно в 140 раз, по меньшей мере приблизительно в 150 раз, по меньшей мере приблизительно в 160 раз, по меньшей мере приблизительно в 170 раз, по меньшей мере приблизительно в 180 раз, по меньшей мере приблизительно в 190 раз или по меньшей мере приблизительно в 200 раз относительно субъекта, которому ввели контрольную дозу контрольного лентивирусного вектора.
5. Способ по п.1, в котором
лентивирусный вектор не содержит полипептид MHC-I; и/или
лентивирусный вектор продуцируют в клетке-хозяине, экспрессирующей высокую концентрацию CD47 по сравнению с клетками HEK293T (ATCC CRL-11268™).
6. Способ по п.1, в котором нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
10
7. Способ профилактики или лечения гемофилии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту менее 5×10 трансдуцирующих единиц/кг (TU/кг) лентивирусного вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с активностью фактора IX (FIX), причем лентивирусный вектор содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7.
8. Способ по п.1, в котором
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 3;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 5;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 6; и/или
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 7.
9. Способ по п.1, в котором
10
10
10
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
доза составляет приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг, приблизительно 1×10 TU/кг, приблизительно 9,5×10 TU/кг, приблизительно 9×10 TU/кг, приблизительно 8,5×10 TU/кг, приблизительно 8×10 TU/кг, приблизительно 7,5×10 TU/кг, приблизительно 7×10 TU/кг, приблизительно 6,5×10 TU/кг, приблизительно 6×10 TU/кг, приблизительно 5,5×10 TU/кг, приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг, приблизительно 1×10 TU/кг, приблизительно 9,5×10 TU/кг, приблизительно 9×10 TU/кг, приблизительно 8,5×10 TU/кг, приблизительно 8×10 TU/кг, приблизительно 7,5×10 TU/кг, приблизительно 7×10 TU/кг, приблизительно 6,5×10 TU/кг, приблизительно 6×10 TU/кг, приблизительно 5,5×10 TU/кг, приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг или приблизительно 1×10 TU/кг;
10
10
10
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
доза составляет менее 5×10 TU/кг, менее 4,5×10 TU/кг, менее 4×10 TU/кг, менее 3,5×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2,5×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг, менее 1,5×10 TU/кг, менее 1×10 TU/кг, менее 9,5×10 TU/кг, менее 9×10 TU/кг, менее 8,5×10 TU/кг, менее 8×10 TU/кг, менее 7,5×10 TU/кг, менее 7×10 TU/кг, менее 6,5×10 TU/кг, менее 6×10 TU/кг, менее 5,5×10 TU/кг, менее 5×10 TU/кг, менее 4,5×10 TU/кг, менее 4×10 TU/кг, менее 3,5×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2,5×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг, менее 1,5×10 TU/кг, менее 1×10 TU/кг, менее приблизительно 9,5×10 TU/кг, менее приблизительно 9×10 TU/кг, менее приблизительно 8,5×10 TU/кг, менее приблизительно 8×10 TU/кг, менее приблизительно 7,5×10 TU/кг, менее приблизительно 7×10 TU/кг, менее приблизительно 6,5×10 TU/кг, менее приблизительно 6×10 TU/кг, менее приблизительно 5,5×10 TU/кг, менее приблизительно 5×10 TU/кг, менее приблизительно 4,5×10 TU/кг, менее приблизительно 4×10 TU/кг, менее приблизительно 3,5×10 TU/кг, менее приблизительно 3×10 TU/кг, менее приблизительно 2,5×10 TU/кг, менее приблизительно 2×10 TU/кг, менее приблизительно 1,5×10 TU/кг или менее приблизительно 1×10 TU/кг;
8
10
8
9
8
9
8
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
10
9
10
9
10
9
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
доза составляет между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 1×10 TU/кг, между 1×10 и 1×10 TU/кг, между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 2×10 и 5×10 TU/кг, между 3×10 и 5×10 TU/кг, между 4×10 и 5×10 TU/кг, между 5×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 6×10 TU/кг, между 2×10 и 6×10 TU/кг, между 3×10 и 6×10 TU/кг, между 4×10 и 6×10 TU/кг, между 5×10 и 6×10 TU/кг, между 6×10 и 5×10 TU/кг, между 7×10 и 5×10 TU/кг, 8×10 и 5×10 TU/кг, между 9×10 и 5×10 TU/кг, между 10 и 5×10 TU/кг, между 1,5×10 и 5×10 TU/кг, между 2×10 и 5×10 TU/кг, между 2,5×10 и 5×10 TU/кг, между 3×10 и 5×10 TU/кг, между 3,5×10 и 5×10 TU/кг, между 4×10 и 5×10 TU/кг или между 4,5×10 и 5×10 TU/кг;
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
доза составляет между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 4,5×10 TU/кг, между 1×10 и 4×10 TU/кг, между 1×10 и 3,5×10 TU/кг, между 1×10 и 3×10 TU/кг, между 1×10 и 2,5×10 TU/кг, между 1×10 и 2×10 TU/кг, между 1×10 и 1,5×10 TU/кг, между 1×10 и 10 TU/кг, между 1×10 и 9×10 TU/кг, между 1×10 и 8×10 TU/кг, между 1×10 и 7×10 TU/кг, между 1×10 и 6×10 TU/кг, между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 4×10 TU/кг, между 1×10 и 3×10 TU/кг, и между 1×10 и 2×10TU/кг;
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
доза составляет между 1×10 и 2×10 TU/кг, между 1,1×10 и 1,9×10 TU/кг, между 1,2×10 и 1.8×10 TU/кг, между 1,3×10 и 1,7×10 TU/кг или между 1,4×10 и 1,6×10 TU/кг;
9
9
доза составляет от приблизительно 4×10 TU/кг до приблизительно 6×10 TU/кг;
дозу лентивирусного вектора вводят за один раз или делят по меньшей мере на две части дозы; и/или
дозу лентивирусного вектора повторяют по меньшей мере два раза.
10. Способ по п.1, в котором:
лентивирусный вектор вводят в виде одной дозы или множества доз;
лентивирусный вектор вводят посредством внутривенной инъекции;
лентивирусный вектор содержит тканеспецифичный промотор, причем необязательно тканеспецифичный промотор выборочно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в клетке-мишени печени, причем:
тканеспецифичный промотор содержит промотор APOA2, промотор SERPINA1 (hAAT), промотор mTTR, промотор MIR122 или любую их комбинацию, и/или
клеткой-мишенью печени является гепатоцит, причем необязательно выделенная молекула нуклеиновой кислоты стабильно встроена в геном гепатоцита;
лентивирусный вектор содержит сайт донора сплайсинга;
лентивирусный вектор содержит сайт акцептора сплайсинга;
лентивирусный вектор содержит последовательность gag, последовательность pol, последовательность rev, элемент, реагирующий на rev (RRE), или любую их комбинацию, причем необязательно последовательностью gag является полноразмерная или усеченная последовательность gag;
лентивирусный вектор содержит энхансер, последовательность-мишень для микроРНК, посттранскрипционный регуляторный элемент, сигнал упаковки, последовательность поли-A, интронную последовательность или любую их комбинацию; и/или
лентивирусный вектор продуцируют в клетке-хозяине, причем необязательно:
клетка-хозяин экспрессирует CD47, или клетку-хозяина модифицируют для суперэкспрессии CD47, и/или при этом клетка-хозяин не экспрессирует MHC-I;
high
-
клеткой-хозяином является CD47/MHC-I; и/или
high
-
клеткой-хозяином является клетка CD47/MHC-I HEK 293T.
11. Способ по п.1, в котором субъектом:
является субъект-ребенок;
является взрослый субъект; или
является субъект-подросток.
12. Способ по п.1, в котором
полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 12;
полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12;
нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид, причем необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, имеет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности с:
(i) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 2;
(ii) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 3;
(iii) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 4;
(iv) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 5;
(v) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 6; или
(vi) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 7;
нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид, причем необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пропептид, имеет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности с:
(i) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 2;
(ii) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 3;
(iii) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 4;
(iv) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 5;
(v) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 6; или
(vi) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 7;
нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, причем необязательно:
гетерологичной аминокислотной последовательностью является альбумин, Fc-область иммуноглобулина, последовательность XTEN, C-концевой пептид (CTP) β-субъединицы гонадотропина хориона человека, последовательность PAS, последовательность HAP, последовательность пептида CTP, трансферрин, связывающий альбумин фрагмент или любые фрагменты, производные, варианты или комбинации этих полипептидов;
гетерологичная аминокислотная последовательность связана с N-концом или C-концом аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид с активностью FIX или вставлена между двумя аминокислотами в аминокислотной последовательности; и/или
гетерологичная аминокислотная последовательность вставлена в полипептид с активностью FIX непосредственно после аминокислоты, соответствующей аминокислоте 103 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 105 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 142 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 149 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 162 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 166 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 174 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 224 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 226 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 228 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 413 SEQ ID NO: 2 или любой их комбинации; и/или
полипептидом FIX является вариант R338L полипептида FIX.
13. Лентивирусный вектор, содержащий:
нуклеотидную последовательность, содержащую (i) тканеспецифичный промотор, и (ii) последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID NO: 1, причем тканеспецифичный промотор инициирует экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты в клетке печени; или
нуклеотидную последовательность, содержащую (i) сайт донора сплайсинга; (ii) сайт акцептора сплайсинга; (iii) последовательность gag; (iv) элемент, реагирующий на rev; (v) энхансер; (vi) посттранскрипционный регуляторный элемент, (vii) последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичность последовательности с идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 7, и (viii) последовательность-мишень для микроРНК.
14. Лентивирусный вектор по п.13, в котором последовательность нуклеиновой кислоты кодирует полипептид с активностью FIX, который содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 12, причем необязательно:
полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12; и/или
поверхность лентивирусного вектора содержит более высокий уровень белка CD47, чем контрольный лентивирусный вектор, продуцируемый в клетках HEK293T (ATCC CRL-11268™), причем необязательно поверхность лентивирусного вектора не содержит MHC-I.
15. Способ лечения гемофилии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективной дозы лентивирусного вектора по п.13, причем необязательно:
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
8
8
эффективная доза составляет менее приблизительно 5×10 трансдуцирующих единиц/кг (TU/кг), менее 4×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг, менее 1×10 TU/кг, менее 9×10 TU/кг, менее 8×10 TU/кг, менее 7×10 TU/кг, менее 6×10 TU/кг, менее 5×10 TU/кг, менее 4×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг менее 1×10 TU/кг, менее приблизительно 9×10 TU/кг или менее приблизительно 8×10 TU/кг;
10
10
10
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
эффективная доза составляет приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг, приблизительно 1×10 TU/кг, приблизительно 9,5×10 TU/кг, приблизительно 9×10 TU/кг, приблизительно 8,5×10 TU/кг, приблизительно 8×10 TU/кг, приблизительно 7,5×10 TU/кг, приблизительно 7×10 TU/кг, приблизительно 6,5×10 TU/кг, приблизительно 6×10 TU/кг, приблизительно 5,5×10 TU/кг, приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг, приблизительно 1×10 TU/кг, приблизительно 9,5×10 TU/кг, приблизительно 9×10 TU/кг, приблизительно 8,5×10 TU/кг, приблизительно 8×10 TU/кг, приблизительно 7,5×10 TU/кг, приблизительно 7×10 TU/кг, приблизительно 6,5×10 TU/кг, приблизительно 6×10 TU/кг, приблизительно 5,5×10 TU/кг, приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг или приблизительно 1×10 TU/кг;
10
10
10
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
эффективная доза составляет менее 5×10 TU/кг, менее 4,5×10 TU/кг, менее 4×10 TU/кг, менее 3,5×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2,5×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг, менее 1,5×10 TU/кг, менее 1×10 TU/кг, менее 9,5×10 TU/кг, менее 9×10 TU/кг, менее 8,5×10 TU/кг, менее 8×10 TU/кг, менее 7,5×10 TU/кг, менее 7×10 TU/кг, менее 6,5×10 TU/кг, менее 6×10 TU/кг, менее 5,5×10 TU/кг, менее 5×10 TU/кг, менее 4,5×10 TU/кг, менее 4×10 TU/кг, менее 3,5×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2,5×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг, менее 1,5×10 TU/кг, менее 1×10 TU/кг, менее приблизительно 9,5×10 TU/кг, менее приблизительно 9×10 TU/кг, менее приблизительно 8,5×10 TU/кг, менее приблизительно 8×10 TU/кг, менее приблизительно 7,5×10 TU/кг, менее приблизительно 7×10 TU/кг, менее приблизительно 6,5×10 TU/кг, менее приблизительно 6×10 TU/кг, менее приблизительно 5,5×10 TU/кг, менее приблизительно 5×10 TU/кг, менее приблизительно 4,5×10 TU/кг, менее приблизительно 4×10 TU/кг, менее приблизительно 3,5×10 TU/кг, менее приблизительно 3×10 TU/кг, менее приблизительно 2,5×10 TU/кг, менее приблизительно 2×10 TU/кг, менее приблизительно 1,5×10 TU/кг или менее приблизительно 1×10 TU/кг;
8
10
8
9
8
9
8
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
10
9
10
9
10
9
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
эффективная доза составляет между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 1×10 TU/кг, между 1×10 и 1×10 TU/кг, между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 2×10 и 5×10 TU/кг, между 3×10 и 5×10 TU/кг, между 4×10 и 5×10 TU/кг, между 5×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 6×10 TU/кг, между 2×10 и 6×10 TU/кг, между 3×10 и 6×10 TU/кг, между 4×10 и 6×10 TU/кг, между 5×10 и 6×10 TU/кг, между 6×10 и 5×10 TU/кг, между 7×10 и 5×10 TU/кг, 8×10 и 5×10 TU/кг, между 9×10 и 5×10 TU/кг, между 10 и 5×10 TU/кг, между 1,5×10 и 5×10 TU/кг, между 2×10 и 5×10 TU/кг, между 2,5×10 и 5×10 TU/кг, между 3×10 и 5×10 TU/кг, между 3,5×10 и 5×10 TU/кг, между 4×10 и 5×10 TU/кг или между 4,5×10 и 5×10 TU/кг;
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
эффективная доза составляет между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 4,5×10 TU/кг, между 1×10 и 4×10 TU/кг, между 1×10 и 3,5×10 TU/кг, между 1×10 и 3×10 TU/кг, между 1×10 и 2,5×10 TU/кг, между 1×10 и 2×10 TU/кг, между 1×10 и 1,5×10 TU/кг, между 1×10 и 10 TU/кг, между 1×10 и 9×10 TU/кг, между 1×10 и 8×10 TU/кг, между 1×10 и 7×10 TU/кг, между 1×10 и 6×10 TU/кг, между 1×10 и 5×10 TU/кг, между 1×10 и 4×10 TU/кг, между 1×10 и 3×10 TU/кг, и между 1×10 и 2×10TU/кг;
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
эффективная доза составляет между 1×10 и 2×10 TU/кг, между 1,1×10 и 1,9×10 TU/кг, между 1,2×10 и 1.8×10 TU/кг, между 1,3×10 и 1,7×10 TU/кг или между 1,4×10 и 1,6×10 TU/кг;
9
9
эффективная доза составляет от приблизительно 4×10 TU/кг до приблизительно 6×10 TU/кг;
лентивирусный вектор вводят в виде одной дозы или множества доз;
лентивирусный вектор вводят посредством внутривенной инъекции;
субъектом является субъект-ребенок; и/или
субъектом является взрослый субъект.
16. Последовательность нуклеиновой кислоты или вектор, содержащий нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1.
17. Вектор по п.16, дополнительно содержащий:
тканеспецифичный промотор, причем необязательно тканеспецифичный промотор выборочно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в клетке-мишени печени, причем необязательно тканеспецифичный промотор содержит промотор APOA2, промотор SERPINA1 (hAAT), промотор mTTR, промотор MIR122 или любую их комбинацию, и/или клеткой-мишенью печени является гепатоцит;
сайт донора сплайсинга;
сайт акцептора сплайсинга;
последовательность gag, последовательность pol, последовательность rev, элемент, реагирующий на rev (RRE), или любую их комбинацию, причем необязательно последовательностью gag является полноразмерная или усеченная последовательность gag; и/или
энхансер, последовательность-мишень для микроРНК, посттранскрипционный регуляторный элемент, сигнал упаковки, последовательность поли-A, интронную последовательность или любую их комбинацию.
18. Клетка, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты или вектор по п.16, причем необязательно:
клеткой является клетка млекопитающего;
клеткой является клетка CHO, клетка HEK293, клетка BHK21, клетка PER.C6, клетка NS0 и клетка CAP; или
клеткой является клетка человека.
19. Клетка по п.18, причем клетка экспрессирует белок CD47, причем необязательно клетку модифицируют для суперэкспрессии CD47, причем:
клетка содержит по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,0 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 3,0 раза, по меньшей мере приблизительно в 3,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 4,0 раза, по меньшей мере приблизительно в 4,5 раза, по меньшей мере приблизительно в 5,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 5,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 6,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 6,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 7,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 7,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 8,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 8,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 9,0 раз, по меньшей мере приблизительно в 9,5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз, по меньшей мере приблизительно в 11 раз, по меньшей мере приблизительно в 12 раз, по меньшей мере приблизительно в 13 раз, по меньшей мере приблизительно в 14 раз, по меньшей мере приблизительно в 15 раз, по меньшей мере приблизительно в 20 раз, по меньшей мере приблизительно в 25 раз, по меньшей мере приблизительно в 30 раз, по меньшей мере приблизительно в 35 раз, по меньшей мере приблизительно в 40 раз больше белка CD47 на поверхности клетки по сравнению с контрольной клеткой, немодифицированной для суперэкспрессии CD47;
CD47 представляет собой CD47 человека; и/или
клетка не экспрессирует MHC-I.
20. Способ получения лентивирусного вектора, включающий культивирование в подходящих условиях клетку по п.18.
21. Способ по п.7, в котором
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 3;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 4;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 5;
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 6; и/или
нуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере 85% идентичность последовательности с нуклеотидами 139-1386 нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 7.
22. Способ по п.7, в котором:
10
10
10
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
доза составляет приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг, приблизительно 1×10 TU/кг, приблизительно 9,5×10 TU/кг, приблизительно 9×10 TU/кг, приблизительно 8,5×10 TU/кг, приблизительно 8×10 TU/кг, приблизительно 7,5×10 TU/кг, приблизительно 7×10 TU/кг, приблизительно 6,5×10 TU/кг, приблизительно 6×10 TU/кг, приблизительно 5,5×10 TU/кг, приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг, приблизительно 1×10 TU/кг, приблизительно 9,5×10 TU/кг, приблизительно 9×10 TU/кг, приблизительно 8,5×10 TU/кг, приблизительно 8×10 TU/кг, приблизительно 7,5×10 TU/кг, приблизительно 7×10 TU/кг, приблизительно 6,5×10 TU/кг, приблизительно 6×10 TU/кг, приблизительно 5,5×10 TU/кг, приблизительно 5×10 TU/кг, приблизительно 4,5×10 TU/кг, приблизительно 4×10 TU/кг, приблизительно 3,5×10 TU/кг, приблизительно 3×10 TU/кг, приблизительно 2,5×10 TU/кг, приблизительно 2×10 TU/кг, приблизительно 1,5×10 TU/кг или приблизительно 1×10 TU/кг;
10
10
10
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
8
доза составляет менее 5×10 TU/кг, менее 4,5×10 TU/кг, менее 4×10 TU/кг, менее 3,5×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2,5×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг, менее 1,5×10 TU/кг, менее 1×10 TU/кг, менее 9,5×10 TU/кг, менее 9×10 TU/кг, менее 8,5×10 TU/кг, менее 8×10 TU/кг, менее 7,5×10 TU/кг, менее 7×10 TU/кг, менее 6,5×10 TU/кг, менее 6×10 TU/кг, менее 5,5×10 TU/кг, менее 5×10 TU/кг, менее 4,5×10 TU/кг, менее 4×10 TU/кг, менее 3,5×10 TU/кг, менее 3×10 TU/кг, менее 2,5×10 TU/кг, менее 2×10 TU/кг, менее 1,5×10 TU/кг, менее 1×10 TU/кг, менее приблизительно 9,5×10 TU/кг, менее приблизительно 9×10 TU/кг, менее приблизительно 8,5×10 TU/кг, менее приблизительно 8×10 TU/кг, менее приблизительно 7,5×10 TU/кг, менее приблизительно 7×10 TU/кг, менее приблизительно 6,5×10 TU/кг, менее приблизительно 6×10 TU/кг, менее приблизительно 5,5×10 TU/кг, менее приблизительно 5×10 TU/кг, менее приблизительно 4,5×10 TU/кг, менее приблизительно 4×10 TU/кг, менее приблизительно 3,5×10 TU/кг, менее приблизительно 3×10 TU/кг, менее приблизительно 2,5×10 TU/кг, менее приблизительно 2×10 TU/кг, менее приблизительно 1,5×10 TU/кг или менее приблизительно 1×10 TU/кг;
8
10
8
9
8
9
8
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
10
9
10
9
10
9
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
доза составляет от 1×10 до 5×10 TU/кг, от 1×10 до 5×10 TU/кг, от 1×10 до 1×10 TU/кг, от 1×10 до 1×10 TU/кг, от 1×10 до 5×10 TU/кг, от 2×10 до 5×10 TU/кг, от 3×10 до 5×10 TU/кг, от 4×10 до 5×10 TU/кг, от 5×10 до 5×10 TU/кг, от 1×10 до 6×10 TU/кг, от 2×10 до 6×10 TU/кг, от 3×10 до 6×10 TU/кг, от 4×10 до 6×10 TU/кг, от 5×10 до 6×10 TU/кг, от 6×10 до 5×10 TU/кг, от 7×10 до 5×10 TU/кг, 8×10 до 5×10 TU/кг, от 9×10 до 5×10 TU/кг, от 10 до 5×10 TU/кг, от 1,5×10 до 5×10 TU/кг, от 2×10 до 5×10 TU/кг, от 2,5×10 до 5×10 TU/кг, от 3×10 до 5×10 TU/кг, от 3,5×10 до 5×10 TU/кг, от 4×10 до 5×10 TU/кг или от 4,5×10 до 5×10 TU/кг;
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
10
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
9
доза составляет от 1×10 до 5×10 TU/кг, от 1×10 до 4,5×10 TU/кг, от 1×10 до 4×10 TU/кг, от 1×10 до 3,5×10 TU/кг, от 1×10 до 3×10 TU/кг, от 1×10 до 2,5×10 TU/кг, от 1×10 до 2×10 TU/кг, от 1×10 до 1,5×10 TU/кг, от 1×10 до 10 TU/кг, от 1×10 до 9×10 TU/кг, от 1×10 до 8×10 TU/кг, от 1×10 до 7×10 TU/кг, от 1×10 до 6×10 TU/кг, от 1×10 до 5×10 TU/кг, от 1×10 до 4×10 TU/кг, от 1×10 до 3×10 TU/кг, и от 1×10 до 2×10TU/кг;
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
доза составляет от 1×10 до 2×10 TU/кг, от 1,1×10 до 1,9×10 TU/кг, от 1,2×10 до 1.8×10 TU/кг, от 1,3×10 до 1,7×10 TU/кг или от 1,4×10 до 1,6×10 TU/кг;
9
9
доза составляет от приблизительно 4×10 TU/кг до приблизительно 6×10 TU/кг;
дозу лентивирусного вектора вводят за один раз или делят по меньшей мере на две части дозы; и/или
дозу лентивирусного вектора повторяют по меньшей мере два раза.
23. Способ по п.7, в котором:
лентивирусный вектор вводят в виде одной дозы или множества доз;
лентивирусный вектор вводят посредством внутривенной инъекции;
лентивирусный вектор содержит тканеспецифичный промотор, причем необязательно тканеспецифичный промотор выборочно усиливает экспрессию полипептида с активностью FIX в клетке-мишени печени, причем:
тканеспецифичный промотор содержит промотор APOA2, промотор SERPINA1 (hAAT), промотор mTTR, промотор MIR122 или любую их комбинацию, и/или
клеткой-мишенью печени является гепатоцит, причем необязательно выделенная молекула нуклеиновой кислоты стабильно встроена в геном гепатоцита;
лентивирусный вектор содержит сайт донора сплайсинга;
лентивирусный вектор содержит сайт акцептора сплайсинга;
лентивирусный вектор содержит последовательность gag, последовательность pol, последовательность rev, элемент, реагирующий на rev (RRE), или любую их комбинацию, причем необязательно последовательностью gag является полноразмерная или усеченная последовательность gag;
лентивирусный вектор содержит энхансер, последовательность-мишень для микроРНК, посттранскрипционный регуляторный элемент, сигнал упаковки, последовательность поли-A, интронную последовательность или любую их комбинацию; и/или
лентивирусный вектор продуцируют в клетке-хозяине, причем необязательно:
клетка-хозяин экспрессирует CD47 или клетку-хозяина модифицируют для суперэкспрессии CD47, и/или при этом клетка-хозяин не экспрессирует MHC-I;
high
-
клеткой-хозяином является CD47/MHC-I; и/или
high
-
клеткой-хозяином является CD47/MHC-I HEK 293T клетка.
24. Способ по п.7, причем субъектом:
является субъект-ребенок;
является взрослый субъект; или
является субъект-подросток.
25. Способ по п.7, в котором
полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 12;
полипептид с активностью FIX содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12;
нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую сигнальный пептид, причем необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальный пептид, имеет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности с:
(i) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 2;
(ii) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 3;
(iii) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 4;
(iv) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 5;
(v) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 6; или
(vi) нуклеотидами 1-84 SEQ ID NO: 7;
нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую пропептид, причем необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пропептид, имеет по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичность последовательности с:
(i) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 2;
(ii) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 3;
(iii) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 4;
(iv) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 5;
(v) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 6; или
(vi) нуклеотидами 85-138 SEQ ID NO: 7;
нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид с активностью FIX, дополнительно содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую гетерологичную аминокислотную последовательность, причем необязательно:
гетерологичной аминокислотной последовательностью является альбумин, Fc-область иммуноглобулина, последовательность XTEN, C-концевой пептид (CTP) β-субъединицы гонадотропина хориона человека, последовательность PAS, последовательность HAP, последовательность пептида CTP, трансферрин, связывающий альбумин фрагмент или любые фрагменты, производные, варианты или комбинации этих полипептидов;
гетерологичная аминокислотная последовательность связана с N-концом или C-концом аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью, кодирующей полипептид с активностью FIX или вставлена между двумя аминокислотами в аминокислотной последовательности; и/или
гетерологичная аминокислотная последовательность вставлена в полипептид с активностью FIX непосредственно после аминокислоты, соответствующей аминокислоте 103 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 105 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 142 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 149 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 162 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 166 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 174 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 224 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 226 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 228 SEQ ID NO: 2, аминокислоте 413 SEQ ID NO: 2 или любой их комбинации; и/или
полипептидом FIX является вариант R338L полипептида FIX.