Исследование ассоциации полиморфизма ряда генов-кандидатов с развитием туберкулеза легких в русской популяции

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.24-002.5-092:612.6.05

Е. А. Полякова1, Д. Д. Абрамов2, Р М. Хаитов2, Д. Ю. Трофимов2, Л. П. Алексеев2

исследование ассоциации полиморфизма ряда генов-кандидатов с развитием туберкулеза легких в русской популяции

1Московский физико-технический институт

В данной работе проведено изучение распределения частот встречаемости замен одиночных нуклеотидов в генах SLC11A1 (rs17235409, rs17235416, rs3731863 и rs3731865), VDR (rs10735810, rs1544410) и IL-12B (rs3212227) у больных туберкулезом легких (ТБЛ) и здоровых лиц в популяции европейской части России. По результатам наших исследований статистически достоверным (p < 0,05) является только различие частот, полученных в случае замены одиночного нуклеотида rs3731865 (INT4 469+14G/C) в гене SLC11A1. Частота редкого варианта G для здоровых лиц составила 14%, а для больных - 28%. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что замена одиночного нуклеотида гена SLC11A1 (rs3731865) ассоциирована с развитием ТБЛ в русской популяции. Для остальных изученных полиморфизмов выявлено отсутствие статистически значимой ассоциации.

Ключевые слова: туберкулез легких, генетическая предрасположенность, SLC11A1, VDR, IL-12B, популяция европейской части России

E.A. Polyakova, D.D. Abramov, R.M. Khaitov, D.Yu. Trofimov, L.P. Alexeev

ASSOTIATION OF SOME GENE POLYMORPHISMS WITH THE GENETIC SUSCEPTIBILITY TO PULMONARY TUBERCULOSIS IN THE RUSSIAN POPULATION

In this paper we studied the frequency distribution of single nucleotide polymorphisms in the SLC11A1 gene (rs17235409, rs17235416, rs3731863, and rs3731865), VDR (rs10735810, rs1544410) and IL12B (rs3212227) of pulmonary tuberculosis patients and healthy donors in the population of the European part of Russia. According to our study results the only statistically significant difference (P < 0,05) was received in the case of the single nucleotide polymorphism rs3731865 (INT4 469 + 14 G/C) in the SLC11A1 gene. The frequency of the rare (G) variant for the healthy donors was 14%, whereas for the patient with pulmonary tuberculosis the frequency of this variant was 28%. These data suggest that the single nucleotide polymorphism of the SLC11A1 gene (rs3731865) is associated with the development of pulmonary tuberculosis in the Russian population. Obtained differences for the rest of the investigated polymorphisms are not statistically significant.

Key words: pulmonary tuberculosis, genetic susceptibility, SLC11A1, VDR, IL-12B, Russian population

Введение. SNP (от англ. Single Nucleotide Polymorphism, полиморфизм одиночных нуклеотидов) - это однонуклеотидные позиции в геномной ДНК, для которых в популяции имеются различные варианты последовательностей [7]. Локализованы SNP могут быть как в кодирующей части гена, так и в регуляторной (например, промоторной). Наличие SNP в кодирующей части может приводить к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта и соответственно его конформации и биологического эффекта. Наличие SNP в регуляторной части гена может вызвать изменение уровня его экспрессии и соответственно изменение количества продукта экспрессии (белок). В настоящее время с помощью молекулярно-генетических подходов значительное количество SNP обнаружено практически во всех генах, участвующих в формировании иммунного ответа. Для многих из таких SNP показана ассоциация с характером течения и исходом инфекционных заболеваний, эффективностью иммуномодулирующей терапии, а также с развитием иммунопатологий. Классическим примером информативности замен одиночных нуклеотидов может служить выявление ассоциации вариантов генов хемокина SDF1 и рецептора хе-мокинов CCR2, обусловленных SNP, с отсрочкой развития

Алексеев Леонид Петрович - д-р мед. наук, проф., тел. 8(499)617-78-22

синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) у ВИЧ-инфицированных [1]. Также подтверждена ассоциация SNP с патогенезом других социально значимых инфекционных заболеваний, таких как вирусный гепатит и туберкулез легких (ТБЛ).

На долю ТБЛ приходится 80% всех зарегистрированных случаев заболеваний туберкулезом. Инфицированные микобактериями туберкулеза (МБТ) люди, как правило, остаются здоровыми, и только у 10% зараженных МБТ развивается клиническая форма туберкулеза [10]. В связи с этим считается, что в развитии данного многофакторного заболевания важную роль играет наследственная компонента, причем к настоящему моменту накоплено немало фактов, подтверждающих данную гипотезу. Например, известен трагический случай, когда при вакцинации детей вместо бациллы Кальметта-Герена ошибочно была введена та же доза вирулентной МБТ, из-за чего погибли 76 человек из 249 (1926, г. Любек) [6]. Этот инцидент доказывает, что врожденный иммунитет людей против МБТ различен. Кроме того, результаты исследований у близнецов показали, что однояйцевые близнецы болеют туберкулезом примерно в 2 раза чаще, чем двуяйцевые [18]. Благодаря многочисленным проведенным исследованиям выявлены гены-кандидаты, а также в ряде случаев и конкретные замены одиночных нуклеотидов в этих генах, наиболее часто ассоциированные с предрасположенностью к ТБЛ [11, 14, 15]. Основными генами-кандидатами

- 228 -

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА

Таблица 1

Последовательности олигонуклеотидов, использующихся для определения замен одиночных нуклеотидов

Полиморфизм

Последовательность олигонуклеотидов

SLC11A1 rs17235409

SLC11A1 rs3731865

SLC11A1 rs17235416

SLC11A1 rs3731863

VDR rs10735810

VDR rs1544410

IL-12B rs3212227

5'-AAGAGGCAACCAATGGGGAGGG-5'

5'-CCCAGGTTGGCTGGTCTCAGGA-5'

5'-CCACCACTTCCTGTATGGGC-3'-

5'-CCAGTGGTTCTCCCTGTCCAG-3'

5'-CTGGCTGAAGGCCTCTCCCTG-3'

5'-CCCAAGCTCACCTTAGGG-3'-

5'-AAGAGGCAACCAATGGGGAGGG-5'

5'-CCCAGGTTGGCTGGTCTCAGGA-5'

5'-TGTATGACGTGACTGGCCT-3'-

5'-AAGGGAGAGGAATGATCTTGG-3'

5'-TGCCTCTCTTCACCTGTAACATGG-3'

5'-GACATCAACAATTCGTAATGG-3'

5'-GGCTCTGACCGTGGCCTGCTT-3'

5'-GGTCTCCACACACCCCACAGA-3'

5'-TGCTTGCTGTTCTTACAGG-3'-

5'-CTGGGCAACCTGAAGGGAGAC-3'

5'-TTTTCTCCCTCTTCTCACCTCTAA-3'

5'-TTCCTGGGGCCACAGACAGGCC-3'

5'-CATTCTCTTCCAGGTTCTGAT-3'

5'-CTATGAAACATTCCATACATC-3'

5'-ATCACAATGATATCTTTGCTGT-3'-

являются гены SLC11A1, VDR и IL12B, так как их продукты играют важную роль в клеточном иммунном ответе.

Ген SLC11A1 (ранее известный как NRAMP1) кодирует белок, относящийся к семейству ионных транспортеров, функцией которого являются регуляция ионного баланса и создание в фаголи-зосомах условий, неблагоприятных для микобактерий [8]. Следовательно, дефекты продукции или функции гена SLC11A1 могут приводить к нарушению транспортировки ионов и в связи с этим к повышению чувствительности к внутриклеточным патогенам [5].

Ген VDR (ген рецептора к витамину D) кодирует белок, передающий сигналы от 1,25-дигидроксивитамина D3 в клетки иммунной системы, что приводит к повышению активности естественных клеток-киллеров и повышению фагоцитарной активности макрофагов [9, 12].

Ген IL12B кодирует субъединицу p40 регуляторного цитокина интерлейкина-12. Главной ролью этого цитокина является инициация синтеза интерферона-у, который в свою очередь активирует каскад дальнейших иммунологических реакций [16].

Согласно данным литературы, наиболее часто ассоциация с развитием ТБЛ наблюдается для следующих замен одиночных нуклеотидов: в гене SLC11A1 - rs17235409, rs17235416, rs3731863 и rs3731865, в гене VDR - rs10735810 и rs1544410, в гене IL-12B - rs3212227. Необходимо отметить, что спектр генетических полиморфизмов, ассоциированных с развитием ТБЛ, оказался различен для различных популяций и субпопуляций [11, 14, 15, 17].

В России ранее проводились исследования по выявлению генетической предрасположенности к ТБЛ только в Западно-Сибирском регионе [3].

Однако, учитывая описанное в литературе субпопуляционное различие спектра полиморфизмов, ассоциированных с ТБЛ, полагаем целесообразным определить такой спектр для разных регионов России. Цель данной работы - выявление ассоциации замен одиночных нуклеотидов в вышеупомянутых генах-кандидатах с предрасположенностью к ТБЛ для популяции европейской части России.

Материалы и методы. Материал для исследований. В качестве материала для исследований использовали коллекции образцов ДНК, выделенной из периферической крови больных ТБЛ (51 образец; русские) и здоровых лиц первичной кроводачи (94 образца; русские).

SNP-генотипирование. Определение замен одиночных нуклеотидов в генах SLC11A1, VDR и IL12B проводили модифицированным методом «примыкающих проб» [2], используя оригинальные олигонуклеотиды (табл. 1). В состав амплификационной смеси, разработанной для реализации данного метода, помимо праймеров, которые фланкируют регион, содержащий SNP, входит олигонуклеотид, меченный гасителем флюоресценции, и два сиквенс-специфичных олигонуклеотида, соответствующих «дикому», или «мутантному» варианту последовательности ДНК, несущих флюорофоры. Олигонуклеотидные пробы, соответствующие тому или иному варианту последовательности, мечены различными флюорофорами, что позволяет определять оба варианта в одной пробирке. Определение генотипа производится после полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и гибридизации путем измерения уровня флюоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и

полученных матриц. Если анализируемый образец содержит только один вариант нуклеотидной последовательности гена, т. е. гомозиготен по данному полиморфизму, температура плавления для пробы, образующей совершенный дуплекс, будет существенно выше, нежели для пробы, образующей несовершенный дуплекс. Если же анализируемый образец гетерозиготен (содержит два варианта нуклеотидной последовательности), оба варианта проб образуют совершенный дуплекс, поэтому температура их плавления будет практически одинакова.

ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). Использовали следующий температурный режим амплификации: 94°C - 10 с, 60°C - 30 с в течение 50 циклов.

- 229 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2012

Таблица 2

Частота генотипов SLC11A1 (rs17235409, rs17235416, rs3731863, rs3731865), VDR (rs10735810, rs1544410) и IL-12B (rs3212227) у больных ТБЛ и здоровых лиц

Генотип Больные ТБЛ (51 образец) Контрольная группа (94 образца) Значение %2

n % n %

SLC11A1 rs17235409

GG 51 100 90 96

GA 0 0 3 3 2,23

AA 0 0 1 1

SLC11A1 rs17235416

InsIns 51 100 90 96

InsDel 0 0 3 3 2,23

DelDel 0 0 1 1

SLC11A1 rs3731863

GG 48 94 80 85

GA 3 6 13 14 2,73

AA 0 0 1 1

SLC11A1 rs3731865

CC 27 53 70 75

CG 19 37 21 22 7,58 (p < 0,05)*

GG 5 10 3 3

VDR rs10735810

GG 19 37 27 29

GA 25 49 49 52 1,39

AA 7 14 18 19

VDR rs1544410

GG 21 41 39 41

GA 24 47 45 48 0,04

AA 6 12 10 11

IL-12B rs3212227

AA 39 76 59 63

AC 10 20 27 28 3,00

CC 2 4 8 9

Примечание. * - р < 0,05 (пороговое значение х2 = 5,99).

По завершении реакции амплификации реакционную смесь остужали до 25°C со скоростью 2°С/с. Кривые плавления получали следующим образом: температуру реакционной смеси повышали с 25 до 75°C с шагом 1°C, измеряя уровень флюоресценции на каждом шаге.

Статистические методы. Статистическую обработку проводили с использованием критерия %2.

Результаты и обсуждение. Данные, полученные при изучении распределения частот в генах SLC11A1, VDR и IL12B у больных ТБЛ и здоровых русских, представлены в табл. 2. Статистически достоверными являются различия, которые получены для полиморфизма в гене SLC11A1, имеющего обозначение rs3731865 (INT4 469+14G/C). Частота редкого («мутантного») варианта G для здоровых лиц составила 14%, а для больных - 28%. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что замена одиночного нуклеотида в гене SLC11A1 (rs3731865) ассоциирована с развитием ТБЛ в русской популяции. Для остальных изученных полиморфизмов статистически значимая ассоциация отсутствовала.

Необходимо отметить, что по результатам ранее прове-

денного аналогичного отечественного исследования, в русской популяции Томска и Республики Тыва не было выявлено ассоциации замены одиночного нуклеотида rs3731865 с развитием ТБЛ [3]. Полученное различие результатов можно объяснить популяционно-генетическими различиями между русскими, проживающими в европейской части России и Западно-Сибирском регионе.

Метаанализ данных литературы доказывает наличие ассоциации полиморфизмов в гене SLC11A1 с развитием ТБЛ у представителей многих популяций. Однако для каждой конкретной популяции или даже субпопуляции существуют характерные полиморфизмы в этом гене, ассоциированные с развитием туберкулеза [17]. Так, по данным литературы, для SNP в гене SLC11A1 с номером rs17235409 (D543N) ассоциация с развитием ТБЛ наблюдается в основном у представителей африканских популяций и ориентов (р = 0,01 и p < 0,001 соответственно), для rs17235416 (3’-UTR 1729+55de14) - у ориентов (р = 0,009), для rs3731863 - в основном у европеоидов (р = 0,03) [13, 19]. Такой эффект может быть объяснен наличием не известного в настоящее время функционального маркера устойчивости к микобактериям и сцепленным с ним наследованием полиморфизмов в гене SLC11A1, для которых показана ассоциация с развитием ТБЛ, причем степень сцепления может варьировать от популяции к популяции [17].

Кроме того, указанные различия в полученных результатах могут быть обусловлены и генетическими особенностями популяций микобактерий, характерных для разных географических регионов. Существует точка зрения, заключающаяся в том, что развитие активной формы ТБЛ определяется результатом взаимодействия продуктов геномов человека и микобактерий. Так, в геном микобактерий кодирует белок Mramp1, который противодействует эффекту продукта гена SLC11A1, выкачивая ионы металлов из фаголизосомы. Возможно, выживание микобактерий в макрофаге реализуется только при определенном балансе ионов, обусловленном взаимодействием указанных белков [4].

Представляется необходимым проведение дальнейших масштабных исследований, предполагающих изучение спектра генетических полиморфизмов, ассоциированных с развитием ТБЛ, у представителей различных этнических групп, популяций и субпопуляций на территории России. Конечной целью таких исследований могут стать составление генетико-эпидемиологической карты предрасположенности к ТБЛ и выработка рекомендаций по выявлению генетических полиморфизмов, ассоциированных с развитием ТБЛ в каждом конкретном регионе. Полученная информация о маркерах генетической предрасположенности к ТБЛ может быть важным элементом персонифицированной медицины и иметь решающее значение для прогноза развития заболевания и правильного выбора стратегии лечения или профилактики.

Таким образом, обнаружена ассоциация замены одиночного нуклеотида, имеющего обозначение rs3731865 (INT4 469+14G/C) гена SLC11A1, с предрасположенностью к ТБЛ у русских представителей популяции европейской части России. Полученные данные могут быть использованы при разработке комплекса тест-систем для выявления генетической предрасположенности к ТБЛ.

литература

1. Кофиади И. А., Ребриков Д. В., Трофимов Д. Ю. и др. Распределение аллелей генов CCR5, CCR2 и SDF1, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции в российских популяциях // Докл. РАН. - 2007. - Т. 415, № 6. - С. 320-323.

2. Сергеев И. В., Хаитов М. Р., Трофимов Д. Ю. и др. Разработка методов для проведения широкомасштабных исследований полиморфизма генов, регулирующих различные компоненты иммунного ответа // Физиол. и патол. иммун. системы.

- 230

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА

- 2009. - Т. 13, № 4. - С. 21-25.

3. Фрейдин М. Б., Рудко А. А., Колоколова О. В. и др. Сравнительный анализ структуры наследственной компоненты подверженности туберкулезу у тувинцев и русских // Молекул. биол. - 2006. - Т. 40, № 2. - С. 252-262.

4. Agranoff D., Monahan I. M., Mangan J. A. et al. Mycobacterium tuberculosis expresses a novel pH-dependent divalent cation transporter belonging to the Nramp family // J. Exp. Med. - 1999.

- Vol. 190, P. 717-724

5. Barton C. H., Biggs T. E., BakerS. T. et al. Nramp1: a link between intracellular iron transport and innate resistance to intracellular pathogens // J. Leuk. Biol. - 1999. - Vol. 66. - P. 757-762.

6. Bellamy R. Genetic susceptibility to tuberculosis // Clin. Chest Med. - 2005. - Vol. 26, N 2. - P 233-246.

7. Brookes A. J. The essence of SNPs/Gene. - 1999. - Vol. 234. - P 177-186.

8. Cellier M., Govoni G., Vidal S. et al. Human natural resistance-associated macrophage protein: cDNA cloning, chromosomal mapping, genomic organization and tissue-specific expression // J. Exp. Med. - 1994. - Vol. 180. - P. 1741-1752.

9. Deluca H. F., Cantorna M. T. Vitamin D: its role and uses in immunology // FASEB J. - 2001. - Vol. 15, N 14. - P 2579-2585.

10. Dye C. et al. Measuring tuberculosis burden, trends and the impact of control programmes Supporting online material // Jnt. Tubercle Lung Dis. - 2005. - Vol. 9, - P. 1-8.

11. Gao L. et al. Vitamin D receptor genetic polymorphisms and tuberculosis: updated systematic review and meta-analysis // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. - 2010. - Vol. 14, N 1. - P. 15-23.

12. Leandro A. C. C. S. et al. Genetic polymorphisms in vitamin D receptor, vitamin D-binding protein, Toll-like receptor 2, nitric oxide synthase 2, and interferon-gamma genes and its association with susceptibility to tuberculosis // Brazil. J. Med. Biol. Res. -2009. - Vol. 42, N 4. - P. 312-322.

13. LiH. T. et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) gene polymorphisms and tuberculosis susceptibility: a meta-analysis // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2006. - Vol. 10, N 1. - P. 3-12.

14. Li X. et al. SLC11A1 (NRAMP1) polymorphisms and tuberculosis susceptibility: updated systematic review and meta-analysis // PloS One. - 2011. - Vol. 6, N 1. - P. e15831.

15. Morris G. a J. et al. Interleukin 12B (IL-12B) genetic variation and polmonary tuberculosis: a study of cohorts from The Gambia, Gvinea-Bissau, United States and Argentina // PloS One. - 2011. - Vol. 6, N 2. - P. e16656.

16. Ottenhoff T. H. M. et al. Control of human host immunity to mycobacteria // Tuberculosis (Edinburgh). - 2005. - Vol. 85, N 1-2. - P. 53-64.

17. Stein C. Genetic epidemiology of tuberculosis susceptibility: Impact of study design // PloS Pathogen. - 2011. - Vol. 7, N 1. -P.

18. United T. et al. Heredity versus environment in tuberculosis in Twins // Crit. Care Med. - 1978. - Vol. 16, N . - P. e1001189

19. Velez D. R. et al. Association of SLC11A1 with tuberculosis interactions with NOS2A and TLR2 in African-Americans and Caucasians // Int. J. - 2010. - Vol. 13, N 9. - P. 1068-1076.

Поступила 29.03.12

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.017.1:796].083.3

М. Н. Болдырева1, С. В. Царев1, М. М. Чулкина2, А. М. Савилова2, О. В. Бурменская2,

Д. Ю. Трофимов2, Н. И. Ильина1, Н. В. Шартанова, л. П. Алексеев1

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ У СПОРТСМЕНОВ

высших достижений методом пцр в реальном ВРЕМЕНИ

1ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России

У спортсменов из молодежной сборной России по тяжелой атлетике, в которую были включены практически здоровые, часто болеющие респираторными заболеваниями, а также с аллергией вне обострения, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени в слизистой носоглотки и мононуклеарах периферической крови провели исследование экспрессии (мРНК) широкого спектра генов, кодирующих факторы, которые участвуют в развитии иммунных реакций - интерлейкин (IL)-1p, фактор некроза опухоли a, IL-8, IL-18; Toll-line receptor 2 (TLR2), TLR4, TLR9, интерферон (IFN)-a, IFN-y, IL-28, IL-29, CD45, CD68, CD56, GATA3, TBX21, RORC2, FoxP3, трансформирующий фактор роста Pr Изменения в виде повышения экспрессии генов цитокинов, участвующих в реализации воспаления (IL-1, IL-8), рецепторов врожденного иммунитета (TLR2, TLR4) и снижения экспрессии транскрипционного фактора RORC2, обеспечивающего обратную регуляцию воспаления, выявили только у спортсменов с аллергией (вне обострения) и только в тканях носоглотки.

Ключевые слова: экспрессия генов, ПЦР, мРНК, иммунная система, спорт высоких достижений

M.N. Boldyreva, S.V Tsarev, M.M. Chulkina, A.M. Savilova, O.V. Burmenskaya, D.Yu. Trofimov, N.I. Ilyina, N.I. Shartanova, L.P. Alekseev

A STUDY OF THE EXPRESSION OF GENES OF THE IMMUNE SYSTEM OF THE ATHLETES OF THE HIGHEST ACHIEVEMENTS OF THE PCR METHOD IN THE REAL TIME

Group of sportsmen of the youth national team of Russia in heavy athletics, which included practically healthy, with frequent respiratory diseases and athletes with allergies without exacerbation, the method of PCR in real time in the mucous membrane of the nose, throat and peripheral blood mononuclear a study was conducted of expression (mRNA) of a wide spectrum of genes involved in the development of immune reactions: IL-1P, TNF-a, IL-8, IL-18; TLR2 and TLR4, TLR9, IFN-a, IFNy, IL-28, IL-29, CD45, CD68, CD56, GATA3, TBX21, RORC2, Foxp3, TGF-31. Changes in the form of increased expression of genes involved in the implementation of inflammation (IL-1, IL-8), receptors in innate immunity (TLR2 and TLR4) and the lower of the expression of transcription factor RORC2, providing retroactive regulation of inflammation are revealed only in athletes with Allergy (non-acute) and only in the tissues of the nose, throat.

Key words: gene expression, PCR, mRNA, the immune system, the sport of high achievements

- 231 -