Генотипы и гаплотипы гена-онкосупрессора р53: ассоциация с продолжительностью жизни у русских Новосибирской области

ГЕНОТИПЫ И ГАПЛОТИПЫ ГЕНА-ОНКОСУПРЕССОРА Р53: АССОЦИАЦИЯ С ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬЮ ЖИЗНИ У РУССКИХ НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ

Н.А. Сметанникова1, В.Н. Максимов2, С.Н. Устинов2,

Т.В. Степанова1, Л.Г. Завьялова2, Д.В. Денисова2, А.В. Шабалин23,

М.И. Воевода2, В.А. Белявская1

ГНЦ ВБ «Вектор» М3 РФ, п. Колъцово, Новосибирская обл.1 НИИ терапии СО РАМН, г. Новосибирск2 Новосибирская государственная медицинская академия3 Целью настоящей работы было изучение частотного распределения указанных полиморфизмов гена р53 (включая их генотипические комбинации и гаплотипы) в группах долгожителей и подростков для выяснения возможной ассоциации с продолжительностью жизни. Генотипирование и анализ гаплотипов гена р53 в группах сравнения были выполнены методом ПЦР-ПДРФ. Влияния полиморфизмов в экзоне 4 и интроне 3 на продолжительность жизни не обнаружено, в то время как гомозиготный генотип с отсутствием сайта MspI в интроне 6 характеризуется выраженной негативной ассоциацией. Комбинация гомозиготного Pro-генотипа в экзоне 4 с гетерозиготными по обоим интронным полиморфизмам генотипами представляет собой сочетание «прочности». Показано, что различия гаплотипного состава р5 3 влияют на продолжительность жизни в зависимости от уровня гетерозиготности.

GENOTYPES AND HAPLOTYPES OF P53 SUPPRESSOR GENE: ASSOCIATION WITH LIFETIME OF THE RUSSIAN PEOPLE OF NOVOSIBIRSK AREA

N.A. Smetannikova1, VN. Maksimov2, S.N. Ustinov2, T.V. Stepanova1,L.G. Zavjalova2, D.V. Denisova2,

A.V. Shabalin23, M.I. Voevoda2, V.A. Belyavskaya1

State Scientific Center VB “Vector” of Health Ministry of RF, Koltsovo, Novosibirsk area1 Therapy Research Institute, SB RAMS2, Novosibirsk Novosibirsk State Medical Academy3

This study aimed to investigate the frequency distributions of p53 gene polymorphisms (including genotypic combinations and haplotypes) in the groups of long survivors and teenagers for determining a possible association with lifetime. Genotyping and analysis of p53 gene haplotypes in comparison groups were carried out using PCR-PDRF techniques. No impact of polymorphisms in the forth exon and in the third intron on lifetime was found, while hemozygous genotype with the absence of MspI site in the 6th intron is characterized by the marked negative association. Differences in haplotypic composition of p53 were shown to influence on lifetime depending on the level of heterozygosity.

На развитие заболеваний, сокращающих продолжительность жизни человека, в том числе онкологических, влияют как его индивидуальные генетические особенности, так и условия, в которых они проявляются. Toupance et al. [23] предложена классификация генов по ассоциации с продолжительностью жизни: гены «прочности» (robust), «бренности» (frail) и нейтральные. В основе такого подразделения лежит частота встречаемости их наиболее распространенных аллелей у долгожителей по сравнению с другими возрастными группами (соответственно «выше»,

«ниже» либо «не изменяется»). Известно, что сочетания аллельных вариантов генов, регулирующих функционирование гомеостатических систем организма, определяют его способность адекватно реаги-

ровать на стимулы, нарушающие гомеостаз. На популяционном уровне можно было бы ожидать увеличения в группе долгожителей частоты генных вариантов, обеспечивающих устойчивость к изменениям, которые инициируют заболевания, сокращающие продолжительность жизни.

Ген р53 является ключевым регулятором клеточного деления и апоптотической элиминации патологически измененных и, следовательно, потенциально злокачественных клеток. Почти у половины онкологических больных в опухолевых клетках наблюдаются точечные мутации или делеции гена р53, приводящие к утрате физиологической активности его белка [11]. В пределах гена р53 идентифицировано 13 раз-

личных полиморфизмов. Полиморфизм в 72-м кодоне 4-го экзона, кодирующий замену аминокислоты аргинина (Arg) на пролин (Pro) в первичной структуре белка, признается наиболее функционально значимым [11, 26]. Он связан с реализацией двух различных апоптотических механизмов, с нарушением которых ассоциировано развитие ряда онкологических заболеваний (рак легкого, пищевода, шейки матки, кожи; кожная меланома) [2, 11, 26].

Ранее мы проанализировали распределение частот аллелей и генотипов данного полиморфизма у долгожителей Новосибирской области (НСО) в сравнении с контрастной возрастной группой (здоровые подростки г. Новосибирска). Различий в частотном распределении Arg/Pro-полиморфизма между этими группами обнаружено не было [1].

Подобно исследованиям, посвященным функциональной роли полиморфизма р53 в 72-м кодоне 4-го экзона, в ряде работ изучались ассоциации различных типов рака (легкого [6, 7, 14, 26], яичников [17], молочной железы [13, 14, 18, 25], ободочной и прямой кишки [18]) с полиморфизмами в 3-м и 6-м инт-ронах этого гена. Интронные полиморфизмы, благодаря своему участию в регуляции сплайсинга мРНК, экспресии генов и ДНК-белковых взаимодействий, при определенных условиях также могут оказывать влияние на функциональную активность белков [5, 12, 16].

Целью настоящей работы было провести исследование опухолеассоциированных полиморфизмов гена р53 (дупликация в 16 пар нуклеотидов (dup16 bp) в 3-м интроне и MspI-полиморфизм в 6-м интроне) на основе изучения их распределения в группах долгожителей и подростков для выяснения возможной корреляции с продолжительностью жизни.

Распределение аллелей и генотипов полиморфизм ____________________________________________подр

Материалы и методы

Исследовались образцы геномной ДНК здоровых долгожителей Новосибирской области (НСО, п=88, возраст 84-105 лет) и подростков г. Новосибирска (п=146, возраст 14-17 лет). Выборки были сформированы по этническому критерию (прослеженная в трех поколениях принадлежность к русской национальности). Работа проводилась с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24. 12. 1993 № 2288).

ДНК была выделена из цельной венозной крови с использованием протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией [3]. Оценка полиморфизмов гена р53 проводилась с помощью ПЦР-^ир16 Ьр в 3 интроне) и ПЦР-МБрЬПДРФ-анализа (МБр1-полиморфизм в 6-м интроне), как описано Wu Й а1. [26]. Статистическая обработка результатов осуществлялась с применением пакета прикладных статистических программ 8Р88 V. 9.0. Соответствие распределения частот генных вариантов закону Харди -Вайнберга (ХВ) оценивалось по критерию р2.

Результаты и обсуждение

На первом этапе мы изучили распределение аллелей и генотипов каждого интронного полиморфизма гена р53 в контрастных возрастных группах (долгожители и подростки) для выяснения их влияния на продолжительность жизни (табл. 1).

Таблица 1 ов в 3-м и 6-м нитронах гена р53 у долгожителей и остков

3-й интрон

Группа Аллели Г енотипы

W M W/W W/M M/M

Долгожители НСО n=88 154/176

Подростки г. Новосибирска n=146 245/292

6-й интрон

Группа Аллели Г енотипы

W M W/W W/M M/M

Долгожители НСО n=84 140/168

Подростки г. Новосибирска n=133 201/266 (0,756) 65/266 (0,254) 79/133 (0,594) 43/133 (0,325) 14/133 (0,105) *

Примечание: 3-й интрон: W (wild) - отсутствие dup16 bp, M (minor) - наличие dup16 bp; 6-й интрон: W - наличие сайта рестрикции MspI, M - отсутствие сайта рестрикции MspI; * - различия статистически значимы с группой «Долгожители».

По распределению полиморфизма в 3-м интроне (dup16 bp) изучаемые выборки статистически значимо не отличаются. В то же время обнаружено значимое повышение частоты генотипа M/M инт-рона 6 (гомозиготность по отсутствию сайта рестрикции MspI) у подростков г. Новосибирска по сравнению с долгожителями НСО в 8,75 раза (р2=6,97, р=0,0083; OR=9,76, 95% CI=1,26-75,70). Выявленное отличие позволяет считать отсутствие сайта MspI в 6-м интроне р53 вариантом «бренности». Это подтверждается сообщениями об ассоциациях данного аллеля с раком легкого [7, 14, 26], яичников [17], молочной железы [14, 18] и ободочной кишки [18]. В наших исследованиях гена-онкосупрессора р53 такой одиночный полиморфизм «бренности» обнаружен впервые при сравнении группы долгожителей с другими возрастными группами.

Далее для групп долгожителей и подростков был выполнен анализ генотипических комбинаций трех полиморфизмов гена р53 (Arg/Pro-полиморфизм в 72-м кодоне 4-го экзона, dup16 Ьр-полиморфизм в 3-м интроне, MspI-полиморфизм в 6-м интроне). Из 20 различных сочетаний генотипов трех локусов статистически значимые различия между контрастными выборками были обнаружены только для комбинации MM-WM-WM (Рго/Рго-гомозиготность и ге-терозиготность по наличию dup16 bp- и MspI-полиморфизмов). Было выявлено снижение ее частоты среди подростков г. Новосибирска по сравнению с группой долгожителей НСО (0,015 и 0,1 соответственно; р2=7,82, р=0,0052,0R=0,14, 95%CI=0,03-0,63), что дает возможность рассматривать данную комбинацию в качестве «комбинации прочности».

Следует отметить, что ранее Wu е! а1. [26], исследуя генотипические комбинации трех названных полиморфизмов гена р53 с использованием линий лимфобластоидных клеток от здоровых носителей этих комбинаций, обнаружили выраженное снижение показателей апоптотическо-го индекса и эффективности репарации ДНК по мере увеличения числа минорных аллелей в каждом локусе р53. Для большей наглядности и обоснования следующего этапа наших исследований мы сочли необходимым привести эти данные в виде таблицы (табл. 2).

Обращает внимание факт, что негативное влияние минорных (М) аллелей усиливается при нарастании уровня гетерозиготности по трем локусам р53: так, апоптотический индекс клеток в группах носителей, гетерозиготных только по одному локусу и гомозиготных по минорному аллелю во всех локу-сах, значительно снижается (в 3,2 и 8,3 раза, соответственно) по сравнению с группой гомозиготных носителей дикого аллеля (табл. 2).

Несомненно, столь разительные отличия в апоп-тотической активности белка р53 не могут не оказывать влияние на эффективность предотвращения развития патологий и свидетельствуют о функциональной значимости не только генотипических комбинаций, но и гаплотипов гена р53 в зависимости от уровня гетерозиготности. Поэтому на следующем этапе мы изучили частотное распределение гаплотипов р53 в группах долгожителей и подростков для гомозиготных носителей и индивидуумов, гетерозиготных по одному из трех локусов. Определение гаплотипов у этих лиц, в отличие от гетерозигот по двум и трем локусам, не требует проведения дополнительного генотипирования. Полученные данные представлены в табл. 3.

Таблица 2

Апоптотический индекс и объем репарации ДНК в лимфобластоидных клеточных линиях с различными комбинациями генотипов р53

Генотипы p53 Апоптотический индекс Эффективность репарации ДНК

Средний % 95 % CI p Средний % 95 % CI p

WW-WW-WW n=11 13,66 8,61-18,71 27,63 21,72-33,53

WM-WW-WW WW-WM-WW WW-WW-WM n=11 4,29 2,23-6,35 <0,001 20,45 13,11-27,80 0,11

(WM+MM)-WM-WM WM-(WM+MM)-WM WM-WM-(WM+MM) n=8 3,50 1,08-5,91 0,002 17,48 7,99-26,96 0,04

MM-MM-MM n=1 1,64 15,6

Примечание. W (wild) - Arg-аллель в 72-м кодоне 4-го экзона, отсутствие dup16 bp в 3-м интроне, наличие сайта рестрикции MspI в 6-м интроне; M (minor)- Pro-аллель в 72-м кодоне 4-го экзона, наличие dup16 bp в 3-м интроне, отсутствие сайта рестрикции MspI в 6-м интроне.

Сопоставление частот встречаемости гаплотипов гена р53 выявило умеренное, но статистически значимое различие в распределении наиболее распространенного гаплотипа W-W-W (Arg- отсутствие dup16 bp-наличие сайта MspI) между долгожителями НСО и подростками г. Новосибирска, гетерозиготными по одному из трех локусов. Отмечено снижение доли указанного гаплотипа в группе подростков (р2=4,32, р=0,0378, OR=0,14; CI= 0,02-1,15). В то же время для гомозиготных носителей значимых различий между контрастными группами обнаружено не было. Это подтверждает предположение, что ассоциация конкретного гаплотипного варианта с продолжительностью жизни зависит не только от сочетания «диких» и минорных аллелей, но и от состояния гомо- или гете-розиготности по полиморфным локусам. В настоящее время изучению гаплотипов р53 по указанным локусам уделяется большое внимание [6, 7, 13, 25, 26].

Для полного представления о связи гаплотипов гена р53 с продолжительностью жизни необходимо проанализировать их частотное распределение также и у индивидуумов, гетерозиготных по двум и трем полиморфизмам, что планируется в дальнейшем. Обобщая результаты, полученные относительно корреляций полиморфизмов гена-онкосупрессора р53 с продолжительностью жизни, можно сказать, что в дополнение к ранее обнаруженному «нейтральному» эффекту полиморфизма в 4-м экзоне [2] вышвлен такой же эффект и для полиморфизма в 3-м интроне. Гомозиготный генотип с отсутствием сайта MspI в 6-м интроне характеризуется выраженной негативной ассоциацией («эффект бренности»). В то же время

комбинация «гомозиготный Рго-генотип в 4-м экзо-не - гетерозиготность по обоим интронным полиморфизмам» представляет собой генотипическое «сочетание прочности». Показано, что корреляции трех указанных полиморфизмов с продолжительностью жизни определяются также их гаплотипньми сочетаниями и состоянием гомо- или гетерозиготнос-ти. Эти данные в совокупности свидетельствуют о плейотропном (разнонаправленном) влиянии гена р53 на продолжительность жизни. Теоретическое предположение о плейотропном влиянии гена р53 было сделано ранее итальянскими авторами, хотя в их работе оно не получило экспериментального подтверждения [8].

Разнонаправленность влияния на продолжительность жизни обнаружена также при изучении полиморфизмов других генов системы противоопухолевой защиты (гены цитохрома р450, глютатионтранс-феразы [19, 22], белков теплового шока [4, 15], фактора некроза опухолей альфа [9, 20, 24], интерлейкинов 6 и 10 [10, 21, 24]). При этом была выявлена зависимость эффектов полиморфизмов от этногеографи-ческой принадлежности выборок.

Представленные нами данные свидетельствуют о необходимости проведения комбинационного и гап-лотипного анализа полиморфизмов гена р53 для выяснения его функциональной роли в ключевых клеточных процессах. Учитывая плейотропность его биологических эффектов, решение этой проблемы следует также искать путем комплексного генетического, эпидемиологического и этногеографического изучения человеческих популяций.

Таблица 3

Распределение гаплотипов р53 в группах долгожителей и подростков

Галтогип (4-й зкз OHS'й интрон - 6-й интрон) Гонюзиготш Гетерозиготно одному лпкусу

Долгожители НСО hf36 Подростки г. Новосибирска п=52 Долгожители НСО п=22 Подростки г. НоЕосийирска п=47

W-W-W 66/72 (0,917) 86/104(1X8271 21/44 (0,477) 35/94(0^72)*

M-W-W 6/72

W-W-ii 0 6/104

W-il-W 0 0 1/44

M-W-ii 0 0 1/44

M-M-W 0 0 0 3/94

W-il -M 0 0 0 3/94

M^l-M 0 6/104

Примечание: W (wna) - Arg-аллель в 72-м кодоне 4-го экзона, отсутствие aup!6 Dp в 3-м интроне, наличие сайта рестрикции MspI в 6-м интроне; M (minor)- Pro-аллель в 72-м кодоне 4-го экзона, наличие dup16 bp в 3-м интроне, отсутствие сайта рестрикции MspI в 6-м интроне; * - различия статистически значимы с группой «Долгожители».

ЛИТЕРАТУРА

1. Белявская В.А., Сметанникова H.A., Максимов В.Н. и др. // Молекулярная медицина. 2005. № 4. С. 18-28.

2. Сметанникова H.A., Сметанникова М.А., Белявская

B.А. и др. // Сибирский онкологический журнал. 2004. № 2-3.

C. 124-129.

3. Смит К., Коллинз Ф., Кантор Ч. Анализ генома / Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. C. 58-94.

4. Altomare K., Greco V., Bellizzi D. et al. // Biogerontology.

2003. Vol. 4, № 4. Р. 215-220.

5. Avigad S., Barel D., Blan O. et al. // Oncogene. 1997. Vol.

14. P. 1541-1545.

6. Birgander R., Sjalander A., Rannug A. et al. // Carcinogenesis. 1995. Vol. 16. P. 2233-2236.

7. Biros E., Kalina I., Kohut A. et al. // Lung Cancer. 2001. Vol. 31. P. 157-162.

8. Bonafe M., Olivieri F., Cavallone L. et al. // Am. J. Hum. Genet. 1999. Vol. 65. P. 1782-1785.

9. Bruunsgaard H., Benfield T.L., Andersen—Ranberg K. et al. // J. Am. Geriatr. Soc. 2004. Vol. 52, № 8. P. 1361-1366.

10. Capurso C., Solfrizzi V., D’Introno A. et al. // Exp. Gerontol. 2004. Vol. 39, № 7. P. 1109-1114.

11. Fan R., Wu M.-T., Miller D. et al. // Cancer Epid. Biom. Prev. 2000. Vol. 9. P. 1037-1042.

12. Hillebrandt S., Streffer C., Demidchik E.P. et al. // Mutat. Res. 1997. Vol. 381. P. 201-207.

13. Khaliq S., Hameed A., Khaliq T. et al. // Genet. Test. 2000. Vol. 4. № 1. P. 23-29.

14. Mahasneh A.A., Abdel—Hafiz S.S. // Saudi Med. J. 2004. Vol. 25, № 11. P. 1568-1573.

15. Marini M., Lapalombella R., Canaider S. et al. // Exp. Gerontol. 2003. Vol. 39, № 1. P. 83-90.

16. Mattick J.S. // Curr. Opin. Genet. Des. 1994. Vol. 4. P. 823-831.

17. Mavridou D., Gornall R., Campbell I.G. et al. // Br. J. Cancer. 1998. Vol. 77. P. 676-677.

18. Peller S., Kopilova I., Slutzki S. et al. // DNA Cell Biol. 1995. Vol. 14. P. 983-990.

19. Persh B., Dusing R., Rabstein S. et al. // Toxicol. Lett.

2004. Vol. 151, № 1. P. 283-290.

20. Ross O.A., Curran M.D., Rea I.M. et al. // Mech. Ageing Dev. 2003. Vol. 124, № 4. P. 563-567.

21. Scola L. Crivello A., Marino V. et al. // Mech. Ageing Dev. 2003. Vol. 124. № 4. P. 569-572.

22. Taioli E., Mari D., Franceschi C. et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 280, № 5. P. 1389-1392.

23. Toupance B., Godelle B., Gouyon P. et al. // Am. J. Hum. Genet. 1998. Vol. 65. P. 1525-1534.

24. Wang X.Y., Hurme M., Jylha M. et al. // Mech. Ageing Dev. 2003. Vol. 123, № 1. P. 29-38.

25. Weston A., Perrin L.S., Forrester K. et al. // Cancer Epid. Biom. Prev. 1997. Vol. 6. P. 105-112.

26. Wu X., Zhao H., Amos C.I. et al. // J. Natl. Canc. Ins. 2002. Vol. 94. № 9. P. 681-690.

Поступила 8.06.05