СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ УСКОРЕННОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮШНОЙ ИНФЕКЦИИ
METHOD AND KIT FOR ENHANCED LABORATORY DIAGNOSIS OF PERTUSSIS INFECTION

Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний.
Лабораторная диагностика коклюша включает в себя как прямые методы выделения возбудителя, так и непрямые - серологическая диагностика (обнаружение антител к возбудителю коклюша). Однако проведение бактериологического исследования занимает достаточно продолжительное время (от начала исследования до выдачи ответа проходит от 5 до 7 дней), а эффективность выделения возбудителя в практических условиях не превышает 10,0% [1, 2, 3, 4] и в редких случаях доходит до 20%, что обусловлено, как биологическими особенностями самого возбудителя коклюша, так и недостатками на этапе обследования больных. Эффективность бактериологической диагностики зависит от сроков обследования и терапии антибактериальными препаратами - в более поздние сроки и на фоне антибиотикотерапии высеваемость возбудителя коклюша резко снижается. Существующие серологические методы лабораторной диагностики коклюша результативны только к 4-ой неделе заболевания и, поэтому, могут быть использованы только для ретроспективного анализа [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Серологическое обследование является информативным только для не вакцинированных детей старше 1 года и взрослых. Кроме того, существует сложность интерпретации результатов серологического обследования у привитых детей, а также низкая продукция противококлюшных антител у детей в возрасте до 1 года, что затрудняет использование данного метода в практических условиях. Следовательно, основные методы индикации возбудителя коклюша являются недостаточно чувствительными и эффективными или используются для ретроспективного анализа, что, в свою очередь, приводит к снижению качества лабораторной диагностики коклюшной инфекции.
Поэтому использование молекулярно-генетических технологий с целью разработки высокочувствительных, специфичных, ускоренных и информативных способов обнаружения возбудителя коклюшной инфекции является актуальным и наиболее перспективным, как с точки зрения ранней диагностики коклюша, так и при обследовании детей младенческого возраста, установлении источника в окружении больного и при обследовании очагов инфекции.
Зарубежные исследователи на протяжении последних 10 лет используют, в основном, полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Были предложены различные ПЦР-технологии - классический вариант ПЦР, nested-ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, позволяющие выявлять различные мишени в геноме B. pertussis [7, 5, 8, 9, 6, 10, 11]. Так ПЦР, основанная на выявлении промоторной области коклюшного токсина, является высокоспецифичной для B. pertussis, но имеет низкую чувствительность [5, 8]. В отличие от нее, IS 481 ПЦР метод высокочувствителен, однако данный вариант ПЦР выявляет не только B. pertussis, но и другие бордетеллы [7, 10, 11]. Учитывая большую гомологию геномов представителей рода Bordetella, применение ПЦР при лабораторной диагностике коклюша и других бордетеллезах имеет целый ряд недостатков.
Одной из перспективных технологий в настоящее время является использование изотермальной амплификации - loop-mediated isothermal amplification (LAMP), обладающей высокой чувствительностью и специфичностью, многократно превышающей технологии ПЦР, а также высокой амплификационной эффективностью [12]. Однако предложенный зарубежными исследователями вариант для выявления возбудителя коклюша был апробирован только на чистых культурах B. pertussis [13], а при испытании ограниченного количества клинического материала от больных давал ложноположительные результаты. Кроме того, способ предусматривал использование дорогостоящих реагентов и невозможность широкого применения в клинической диагностике в нашей стране.
На основе этой технологии в ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека был разработан способ и набор для ускоренной диагностики коклюша [14, 15, 16], который позволял выявить возбудителя заболевания в течение 9-10 часов от начала исследования непосредственно в клиническом материале от больного без этапа выделения «чистой» культуры. Недостатками данного способа является достаточная трудоемкость и длительность проведения этапа выделения ДНК из клинического материала, которая занимала 3-4 часа; использование большого набора реагентов для выделения ДНК; длительные периоды подготовки реакционной смеси и проведения амплификации, что в целом приводило к увеличению продолжительности исследования, которая составляла 9-10 часов.
Задачей настоящего изобретения является разработка унифицированного, высокочувствительного и специфичного, малотрудоемкого способа и набора для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции с целью выявления возбудителя заболевания в клиническом материале от больных в кратчайшие сроки (4,5-5 часов) и вне зависимости от стадии заболевания, а также при различных формах клинического течения, эффективного при обследовании больных любого возраста, очагов коклюшной инфекции и установлении источника инфекции.
В соответствии с поставленной задачей разработан способ и набор для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции. Разработанный способ включает проведение следующих этапов: взятие патологического материала с задней стенки глотки больного, пробоподготовка клинического образца (смыв клинического материала с тампона от больного), выделение (экстракция) ДНК из клинического материала сорбционным методом, проведение амплификации при изотермальных условиях и электрофореза в агарозном геле.
s
2
Отличительными особенностями предложенного способа от вышеупомянутого прототипа являются: взятие патологического материала осуществляется двумя тампонами с задней стенки глотки больного и помещение их в транспортную среду, представляющую собой стерильный физиологический раствор в пробирке типа эппендорф; пробоподготовка клинического образца представляет собой смыв клинического материала с тампона путем перешивания пробирок типа эппендорф, содержащих тампоны, на микроцентрифуге типа вортекс в течение 5 минут, дальнейшее удаление тампонов из пробирок, отжимая содержимое о край пробирки, центрифугирование пробирок с клиническим материалом на микроцентрифуге при 12000 оборотах/мин в течение 3 минут, удаление надосадочной жидкости до окончательного объема в 200 мкл, встряхивание клинического материала на микроцентрифуге типа вортекс до полного ресуспендирования осадка; выделение (экстракция) ДНК из клинического материала осуществляется набором реагентов, который основан на сорбционном методе (в качестве коммерческого набора может быть использован набор для выделения ДНК «ДНК-сорбАМ» (производства «Интерлабсервис», г. Москва); приготовление реакционной смеси проводится путем смешивания первой смеси (смесь №1) (включает следующие реагенты: 10х реакционный буфер для ПЦР, 2 mM смесь нуклеотидов (dNTP), 25 mM MgCl, раствор Betaine и три пары праймеров (BP-F3 5′-CCGCATACGTGTTGGCA-3′ и BP-B3 5′-TGCGTTTTGATGGTGCCT-3′, BP-FIP 5′-TTGGATTGCAGTAGCGGGATGTGCATGCGTGCAGATTCGTC-3′ и BP-BIP 5′-CGCAAAGTCGCGCGATGGTAACGGATCACACCATGGCA-3′, BP-LF 5′-ACGGAAGAATCGAGGGTTTTGTAC-3′ и BP-LB 5′-GTCACCGTCCGGACCGTG-3′) и второй смеси (смесь №2), содержащей рабочее разведение Bst полимеразы в буферном растворе; амплификацию выполняют в изотермальном режиме при 65°C в течение 60 минут и далее при 80°C в течение 2 минут (продолжительность амплификации 62 минуты); далее проводят электрофорез в 2% агарозном геле при 160 V в течение 40 минут и продукты амплификации подвергают дифференциации путем сравнения электрофоретической подвижности полученных фрагментов ДНК с подвижностью контрольного образца ДНК штамма B. pertussis. При наличии специфического светящегося профиля, аналогичного контрольному образцу ДНК штамма B. pertussis, данный образец ДНК регистрируется, как содержащий ДНК штамма B. pertussis.
Апробация и клинические испытания способа для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции проведены совместно с инфекционистами клинического отдела ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека на базе Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.
В соответствии с поставленной задачей обследовано 295 пациентов с клиническим диагнозом «коклюш» (различной степени тяжести) в возрасте от 1 месяца до 56 лет, в том числе 196 (66,4%) пациентов в возрасте до 1 года и 99 (33,6%) пациентов старше 1 года. Диагноз «коклюш» устанавливался на основании характерной клинической картины болезни, оценки эпидемиологической ситуации в окружении больного и результатов лабораторных обследований. Тяжесть коклюша оценивалась согласно общепринятой классификации, в соответствии с которой у 53 (17,9%) больных коклюш протекал в тяжелой форме, у 156 (52,8%) больных - в среднетяжелой форме и у 86 (29,3%) больных - в легкой форме. Больные были обследованы на разных сроках от момента начала заболевания. Способ был высокоэффективен при обследовании больных коклюшем с различными формами клинического течения заболевания - удельный вес положительных результатов выявления ДНК B. pertussis при тяжелой и легкой формах болезни был практически одинаковым и составлял - 87,4% и 83,1%, соответственно. Разработанный способ был высокоэффективен при обследовании детей раннего возраста - среди больных коклюшем в возрасте до 1 года ДНК возбудителя коклюша обнаружена в 88,4% случаев, а среди детей старше 1 года - в 60,0%. Кроме того, показана высокая эффективность способа при обследовании больных коклюшем в различные сроки от начала заболевания, начиная с 3 дня заболевания и до 31 дня от начала болезни. Таким образом, разработанный ускоренный способ лабораторной диагностики коклюшной инфекции обладает высокой диагностической эффективностью, эффективен на любых сроках от начала заболевания, при любых формах клинического течения, начиная с легких и стертых до тяжелых форм, а также на фоне проведения антибиотикотерапии. Кроме того, способ наиболее эффективен у детей в возрасте до 1 года, у взрослых со стертой клинической картиной заболевания, при расследовании источника инфекции в окружении больного, а также при обследовании очагов.
Техническим результатом заявленного изобретения является унифицированный, высокочувствительный, высокоспецифичный, малотрудоемкий способ для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции, позволяющий выявлять возбудителя заболевания в течение 4,5-5 часов от начала исследования непосредственно в материале от больного вне зависимости от стадии заболевания и при различных формах клинического течения, а также на фоне проведения антибиотикотерапии. Применение разработанного способа и набора в практическом здравоохранении приведет к быстрому лабораторному подтверждению диагноза «коклюш» независимо от сроков заболевания и формы клинического течения, что будет способствовать назначению своевременной и адекватной терапии; значительно повысит возможности обследования детей возрасте до 1 года при коклюшеподобных заболеваниях и взрослых со стертой клинической картиной заболевания; позволит проводить выявление больных коклюшем при обследовании очагов коклюшной инфекции и установление источника инфекции в окружении больного в максимально короткие сроки.
Пример 1.
Взятие клинического материала от больного осуществлять двумя зондами, используя сухие стерильные зонды из полистирола с вискозными тампонами. Материал собирать вращательными движениями с задней стенки ротоглотки, аккуратно прижимая язык пациента шпателем, не касаясь щек, миндалин и языка. После взятия материала рабочую часть зонда с тампоном поместить на глубину 1,5 см в стерильную одноразовую пробирку типа эппендорф с 0,5 мл стерильного физиологического раствора (предварительно разлитые по пробиркам типа эппердорф), суспендировать тампон вращательными движениями и отломать, придерживая крышкой пробирки с расчетом, чтобы он позволил плотно закрыть пробирку. Пробирку герметично закрыть, промаркировать.
Пробоподготовка клинического образца.
Пробирки с тампонами с клиническим материалом суспендировать в физиологическом растворе в течение 5 минут на микроцентрифуге типа вортекс, удалить тампон; центрифугировать при 12000 об/мин 10 минут; удалить супернатант, оставив 200 мкл в пробе; далее пробы встряхивать на микроцентрифуге типа вортекс до полного ресуспендирования осадка.
Выделение (экстракция) ДНК из клинического материала.
Для выделения ДНК из клинического материала использовать набор реагентов «ДНК-сорб-АМ». Работа проводится согласно инструкции. Возможно использование других наборов реагентов для выделения (экстракции) ДИК из клинического материала, которые основаны на сорбционном методе, а также зарегистрированы и разрешены к применению на территории Российской Федерации. Проведение амплификации.
Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб, промаркировать. В каждую пробирку внести сначала 18,0 мкл первой смеси (смесь №1), затем 8,0 мкл ДНК пробы, полученной в результате экстракции из исследуемого или контрольного образца; добавить 1 каплю минерального масла, прогреть пробы в течение 5 минут. Далее в каждую пробу под минеральное масло внести 1,0 мкл смеси №2 и слегка перемешать на микроцентрифуге типа вортекс. Поместить пробы в програмируемый микротермостат (типа «Гном») или в термоциклер.
Состав реакционной смеси (на 1 пробу):
1. 10x реационный буфер для ПЦР
2,5 мкл
2. 2 mM смесь нуклеотидов (dNTP<sub>s</sub>)
2,5 мкл
3. 25 mM MgCl<sub>2</sub>
2 мкл
4. Betaine раствор
5 мкл
5. BP-F3
0,8 мкл
6. BP-B3
0,9 мкл
7. BP-FIP
1,8 мкл
8. BP-BIP
1,7 мкл
9. BP-LF
0,6 мкл
10. BP-LB
0,4 мкл
Режим амплификации:
1. 65°C - 60 минут
2. 80°C - 2 минуты.
Электрофорез в агарозном геле.
Приготовить 2% агарозный гель. В штативе смешать 2 мкл 6х Mass Loading Dye Solution, 4 мкл SybrGreen и 10 мкл ампликонов; режим электрофореза - 160 V 40 минут. Результат реакции регистрировать с помощью УФ-трансиллюминатора и фотографировать. В качестве маркера молекулярных весов использовать DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). Так, если у исследуемого образца ДНК имеются специфические светящиеся профили, аналогичные профилю контрольного штамма В. pertussis, то данные образцы регистрируются как содержащие ДНК штамма В. pertussis.
Пример 2. Набор для ускоренной лабораторной диагностики коклюшной инфекции.
s
2
Набор содержит смесь №1, которая включает следующие реагенты: 10х реакционный буфер для ПНР, 2 mM смесь нуклеотидов (dNTP), 25 mM MgCl, раствор Betaine и три пары праймеров (BP-F3 5′-CCGCATACGTGTTGGCA-3′ и BP-B3 5′-TGCGTTTTGATGGTGCCT-3′, BP-FIP 5′-TTGGATTGCAGTAGCGGGATGTGCATGCGTGCAGATTCGTC-3′ и BP-BIP 5′-CGCAAAGTCGCGCGATGGTAACGGATCACACCATGGCA-3′, BP-LF 5′-ACGGAAGAATCGAGGGTTTTGTAC-3′ и BP-LB 5′-GTCACCGTCCGGACCGTG-3′) и смесь №2, содержащую рабочее разведение Bst полимеразы в буферном растворе, а также контрольный образец с ДИК штамма Bordetella pertussis. Данный набор используется в соответствии с Примером 1.
Литература
1. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше. Министерство здравоохранения СССР. Москва, 1983.
2. Петрова М.С., Попова О.П., Москалева Т.Н. Коклюш и паракоклюш (профилактика, клиника, лечение). // Методические рекомендации. - М. - 2000. - 25 С.
3. Селезнева Т.С. Серологический мониторинг за инфекциями, управляемыми средствами вакцинопрофилактики. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2004. - №5 (18). - С.14-16.
4. Ценева Г.Я., Курова Н.Н. Микробиологическая характеристика возбудителя коклюша и лабораторная диагностика коклюша. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2003. - №4 (5). - С.329-341.
5. Grimprel E., Begue P., Anjak I. Comparison of polymerase chain reaction, culture, and Western immunoblot serology for diagnosis of Bordetella pertussis infection. J. of Clinical Microbiology. 1993, vol.31: 2745-2750.
6. Fry N., Tzivra O., Li Y.T., McNiff A., Doshi N., Maple C., Crocroft N., Miller E., Goerge R., Harrison T. Laboratory diagnosis of pertussis infection: the role of PCR and serology. // J. Medical Microbiol. - 2004. - №53. - P.519-525.
7. Anderson T.P., Beynon K.A., Murdoch D.R. Comparison of real time PCR and conventional hemi-nested PCR for the detection of B. pertussis in nasopharyngeal samples. Clin. Microbiol. Infection. 2003, 9: 746-749.
8. Houard S., Hackel С., Herzog A. at all. Specific identification of B. pertussis by polymerase chain reaction. Res. Microbiology. 1989, 140: 477-487.
9. Farell D.J., Daggard G., Mukkur T.K.S. Nested duplex PCR to detect B. pertussis and B. parapertussis and its application in diagnosis of pertussis in nonmetropolitan southeast Queensland, Australia. J. Clin. Microbiology. 1999, 37: 606-610.
10. Lind-Brandberg L., Welinder-Olsson C., Lagergard Т., Tarager J., Trollfors В., Zackrisson G. Evalution of PCR for diagnosis of Bordetella pertussis and Bordetella parapertussis infections. // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol.36. - P.679-683.
11. Reischl U., Lehn N., Sanden G.N. et all. Real-time PCR assay targeting IS481 of B. pertussis and molecular basis for detecting B. holmesii. // J. Clin. Microbiology. 2001, 39: 1963-1966.
12.. Notomi Т., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa Т., Watanabe К., Amino N., Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. // Nucl. Acids Research. - 2000. - Vol.28. - №12. - P.63.
13. Kamachi K., Toyoizumi-Ajisaka H., Toda K. et all. Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid diagnosis of B. pertussis infection. // J. of Clinical Microbiology. 2006, 44: 1899-1902.
14. Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Алешкин В.А. Патент на изобретение «Способ и набор для ускоренной диагностики коклюша» №2346987 от 20 февраля 2009 г. (приоритет изобретения от 25 декабря 2007 г.).
15. Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Ускоренный молекулярно-генетический метод выявления возбудителя коклюша. // Медицинский альманах. - 2009. - №2 (7). - С.51-53.
16. Борисова О.Ю., Петрова М.С., Гадуа Н.Т., Скачкова В.Г., Савинкова B.C., Попова О.П., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Прямой ускоренный метод выявления возбудителя коклюша. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - №5. - С.53-55.