СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТА РАЗМНОЖЕНИЯ КАПУСТЫ БЕЛОКОЧАННОЙ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
METHOD OF INCREASING COEFFICIENT OF WHITE CABBAGE REPRODUCTION IN VITRO

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции растений, и может найти применение при размножении регенерантов с высокими иммунными показателями и продуктивностью.
Известен способ размножения растений in vitro, где используют незрелые зародыши, регуляторы роста в составе бензиламинопурина и дихлорфеноксуксусной кислоты, с дальнейшим развитием каллуса на модифицированной среде (патент №2478282 от 27.10.2012 г. МПК A01H 1/04).
Однако способ усложнен рядом элементов для получения регенерантов, устойчивых к болезням. Кроме того, для достижения результатов используют селективную среду (MS) с фильтратами грибов и регуляторов, значительно усложняющими способ.
Наиболее близким техническим решением является способ, в котором в качестве эксплантов используют трубки околоцветника и цветоножки, которые культивируют на питательной среде Мурасиге-Скуга, куда вносят питательную среду, дополненную стимуляторами роста (патент №2479992 от 27.04.2013 г. МПК A01H 4/00).
Недостатком способа-прототипа является то, что при получении растений таким методом могут произойти изменения генетического плана, которые способствуют получению неоднородного потомства. Особенно это важно при использовании с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС), поскольку у таких растений не формируется полноценная пыльца и, соответственно, невозможно самоопыление. Следовательно, для упрощения семеноводства ЦМС-линий необходима регенерация растений в условиях in vitro.
Технический результат - упрощение способа регенерации растений с признаками ЦМС.
Техническое решение заявленного объекта достигается тем, что выращивание эксплантов, культивирование их на питательной среде Мурасиге-Скуга, внесение в нее регуляторов роста тидиазурон в концентрации 1 мг/л в сочетании с индолил-3-уксусной кислотой - 0,5 мг/л при использовании цветолож размером 0,2-0,3 мм, изолированных из бутонов длиной 0,5-0,7 мм. При этом цветоложе используют за 1-2 дня до распускания цветков и после выращивания их на питательных средах культивируют до образования почек в течение 14-21 суток.
Способ осуществляется следующим образом.
За 1-2 суток до цветения отбирали бутоны линий капусты белокочанной с цитоплазматической мужской стерильностью и самонесовместимостью. Параметры 1-2 суток обоснованы хорошо развитым цветоложем. После 3 суток при раскрытии бутонов и кастрации цветоложе in vitro слабо развивается и погибает. Использование 6-бензиладенина в такой концентрации (БАП) является необходимым элементом, так как в таких дозах (4 мг/л) регулятор роста способствует усилению метаболизма и делению клеток. Индолил-3-уксусная кислота и нафтилуксусная кислота в предлагаемых концентрациях принимают участие в корнеобразовании (при рН 5,6).
Культивирование эксплантов более 21 суток приводит к изменению генотипа. Ниже этого предела замедляется процесс регенерации.
Пример. Отбирали бутоны 5-ти линий капусты белокочанной, характеризующихся ЦМС: ФК 121, БР 2124, ТС 2567, К 5289, ЛИ 2351 в возрасте 1-2 суток, когда хорошо развито цветоложе, размер которого составлял 0,2-0,3 мм, изолированных из бутонов длиной 0,5-0,7 мм. Извлеченные цветоложа стерилизовали и помещали на питательную среду двух видов, один из которых содержал тидиазурон (ТДА) в количестве 1 мг/л в сочетании с индолил-3-уксусной кислотой (ИУК) - 0,5 мг/л, а во втором субстрате содержалось 6-бензиладенин (БА) - 4 мг/л с а-нафтилуксусной кислотой (НУК) - 0,5 мг/л. В питательных растворах содержание сахарозы - 3% и агара - 0,6%. На следующем этапе для образования побегов и их размножения использовали среду MS - Б, содержащую БА в концентрации 1 мг/л и НУК 0,1 мг/л.
Дальнейшие жизнеспособные побеги укореняли на среде MS, без регуляторов роста, а также с НУК, используемой в концентрации 0,1 мг/л, и ИУК - 0,1 мг/л, концентрация сахарозы - 1%. Укоренившиеся растения-регенеранты высаживали in vitro для их последующей адаптации к обычным условиям среды.
Результаты опытов сведены в таблицах 1, 2 и 3.
Таблица 1
Влияние регуляторов роста на морфогенез эксплантов ЦМС линий капусты белокочаннойn=20
Линии
Питательная среда
Образовалось жизнеспособных эксплантов
Образовалось почек, шт.
Образовалось побегов, шт.
шт.
%
всего
на 1 эксплант
всего
на 1 эксплант
ФК121
MS - ТДА
8
40,0
170
8,5
110
5,5
MS - БА
12
60,0
66
3,3
34
1,7
БР2124
MS - ТДА
14
70,0
80
4,0
47
2,3
MS - БА
6
30,0
100
5,0
50
2,5
ТС2567
MS - ТДА
10
50,0
160
8,0
40
2,0
MS - БА
10
50,0
120
6,0
40
2,0
К5289
MS -ТДА
14
70,0
100
5,0
100
5,0
MS - БА
6
30,0
120
6,0
100
5,0
ЛИ2351
MS - ТДА
16
80,0
86
4,3
48
2,4
MS - БА
4
20,0
140
7,0
120
6,0
Таблица 2
Морфогенез ЦМС-линий капусты белокочанной in vitro при культивировании
Линии
Высажено побегов, шт.
Получено жизнеспособных побегов, шт.
Коэффициент размножения
ФК121
30
73
2,4
БР2124
55
108
2,0
ТС2567
58
82
1,4
К5289
65
78
1,2
ЛИ2351
80
153
1,9
Всего
288
494
-
Таблица 3
Влияние ауксинов на ризогенез капусты белокочанной, характеризующейся ЦМС
Линии
Содержание ауксина, 0,1 мг/л
Изучено побегов всего, шт.
Жизнеспособных
Регенераты с корнями
шт.
%
Шт.
%
ФК121
0 - контроль
29
17
59,0
5
29,5
НУК
27
23
85,2
16
70,0
ИУК
28
28
100,0
21
75,0
БР2124
0 - контроль
33
29
90,0
13
45,0
НУК
41
38
93,0
32
84,2
ИУК
36
33
92,0
33
100,0
ТС2567
0 - контроль
26
19
73,0
6
32,0
НУК
26
23
88,0
18
78,0
ИУК
30
30
100,0
23
77,0
К5289
0 - контроль
28
26
93,0
12
46,2
НУК
20
19
95,0
18
95,0
ИУК
30
30
100,0
30
100,0
ЛИ2351
0 - контроль
40
38
95,0
15
39,5
НУК
60
56
93,3
50
90,0
ИУК
53
43
81,0
42
98,0
Всего
-
507
467
-
334
-
Следовательно, предлагаемый способ позволяет получить большее количество растений-регенерантов с признаками ЦМС и получить генетически стабильный урожай селекционных образцов.