НОВЫЙ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА И НАБОР ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА
NOVEL METHOD OF DIAGNOSING RHEUMATOID ARTHRITIS AND SET FOR RHEUMATOID ARTHRITIS DIAGNOSTICS

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу диагностики ревматоидного артрита и набору для диагностики ревматоидного артрита, используемому в таком способе диагностики.
Предшествующий уровень техники
Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хроническое воспалительное заболевание, при котором происходит поражение главным образом тканей синовиальной оболочки сустава, и распространенность данного заболевания составляет приблизительно 1% населения. При ревматоидном артрите на первой стадии наблюдают синовит, затем происходит постепенное поражение хряща или кости, и на последующих стадиях происходит разрушение и деформация сустава. Кроме того, последствия симптомов включают различные примеры, такие как пример, в котором наблюдают повторные ремиссии и рецидивы артрита с его последующим полным излечением, и пример с быстрым прогрессированием артрита.
Диагноз ревматоидного артрита устанавливают главным образом на основании симптомов. Однако в последнее время внимание уделяется способу диагностики с использованием в качестве маркера аутоантитела, содержащегося в сыворотке пациента. Аутоантитела, ревматоидный фактор (аутоантитело против деформированного IgG), антитело против циклического цитруллинированного пептида (антитело против ССР) и тому подобное как таковые известны в литературе (см. непатентный литературный источник 1).
Однако, согласно предшествующим сообщениям, чувствительность ревматоидного фактора составляет от 75 до 80% при его специфичности от 50 до 70%, и чувствительность антитела против ССР составляет от 50 до 75% при его специфичности от 85 до 95%, что не всегда удовлетворительно (см. непатентные литературные источники 2 и 3).
Непатентный литературный источник 1: Martinus A.M. et al., Arthritis Res. Ther., 4: 87-93, 2002.
Непатентный литературный источник 2: Avouac J. et al., Ann. Rheum. Dis. 65:845-851, 2006.
Непатентный литературный источник 3: van Venrooij W.J. et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1143: 268-285, 2008.
Задачи изобретения
Задача настоящего изобретения заключается в предложении способа диагностики ревматоидного артрита и набора для диагностики ревматоидного артрита посредством поиска новых маркеров, которые не были известны ранее, основанных на новых маркерах, обнаруженных при таком поиске.
Способ решения задач изобретения
Известно, что у пациентов с ревматоидным артритом лимфоциты периферической крови активированы, так что клеточная адгезия на эндотелиальных клетках кровеносных сосудов усиливается, и в то же время миграция лимфоцитов также усиливается, приводя в результате к инфильтрации лимфоцитов вне кровеносных сосудов и вызывая различные воспалительные реакции. При поиске новых маркеров автор настоящего изобретения сосредоточил свое внимание на талине, представляющем собой высокомолекулярный белок цитоскелета, активно экспрессируемый главным образом в участках контакта клеток с субстратом, в частности в участках клеточной адгезии лимфоцитов.
Талин представляет собой белок, образованный N-концевой областью, имеющей молекулярную массу 47 кДа и включающей FERM-домен, и C-концевой областью, имеющей молекулярную массу 190 кДа и включающей один пучок α-спиралей. В FERM-домене выделяют три подобласти, а именно домен F1, домен F2 и домен F3, последовательно от N-конца. Известно, что в живом организме N-концевая область данного полипептида, расщепляемая кальпаином, и, в частности, домен F3, связывается с β-субъединицей интегрина, усиливает передачу сигналов интегрина из клетки во внеклеточную среду, усиливая посредством этого клеточную адгезию и миграцию клеток.
Автор настоящего изобретения исследовал присутствие талина в плазме или сыворотке пациентов с ревматоидным артритом. В результате неожиданно обнаружено, что в плазме или сыворотке пациента с ревматоидным артритом преобладающим образом присутствует талин. Кроме того, он обнаружил, что количество талина существенно снижено при низкой активности заболевания или во время ремиссии ревматоидного артрита при использовании терапевтического агента для лечения ревматоидного артрита.
Настоящее изобретение основано на таких обнаружениях и более конкретно включает следующее.
(1) Способ диагностики ревматоидного артрита, включающий стадию измерения количества талина в плазме или сыворотке субъекта-животного.
(2) Способ диагностики ревматоидного артрита, описанный в (1) выше, дополнительно включающий стадию получения плазмы или сыворотки из крови, взятой у субъекта-животного.
(3) Способ диагностики ревматоидного артрита, описанный в (1) или (2) выше, где количество талина в плазме или сыворотке измеряют с использованием антитела, связывающегося с талином.
(4) Способ диагностики ревматоидного артрита, описанный в любом из (1)-(3) выше, где субъект-животное представляет собой субъекта-человека.
(5) Способ диагностики ревматоидного артрита, описанный в любом из (1)-(4) выше, который осуществляют для постановки диагноза ревматоидного артрита или определения лечебного эффекта терапевтического агента для лечения ревматоидного артрита.
(6) Набор для диагностики ревматоидного артрита, используемый в способе диагностики ревматоидного артрита, описанного в любом из (1)-(5) выше.
(7) Набор для диагностики ревматоидного артрита, описанный в (6) выше, содержащий твердофазный носитель, к которому присоединено антитело, связывающееся с талином.
Результаты изобретения
Настоящее изобретение может обеспечить новый способ диагностики ревматоидного артрита и набор для диагностики ревматоидного артрита для использования в таком способе диагностики.
Краткое описание графических материалов
На Фиг.1 представлена диаграмма, на которой показана ROC-кривая (график зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений) диагностики ревматоидного артрита (Пример 1) способом твердофазного иммуноферментного сэндвич-анализа (сэндвич-ELISA) с использованием антитела H-18 и антитела H-300.
На Фиг.2 представлена диаграмма, на которой показана ROC-кривая диагностики ревматоидного артрита (Пример 2) способом сэндвич-ELISA с использованием антитела H-18 и антитела М54246М.
На Фиг.3 представлена диаграмма, на которой показана ROC-кривая диагностики ревматоидного артрита (Сравнительный пример 1) с использованием антитела против ССР.
Предпочтительный способ осуществления изобретения
Способ диагностики ревматоидного артрита
Способ диагностики ревматоидного артрита по настоящему изобретению включает стадию измерения количества талина в плазме или сыворотке субъекта-животного. Данный способ диагностики может дополнительно включать стадию получения плазмы или сыворотки из крови, взятой у субъекта-животного.
Субъект-животное конкретно не ограничен, при условии, что он может заболеть ревматоидным артритом, и он может быть выбран в зависимости от задач. Примеры субъекта-животного включают человека, крысу, мышь, собаку, корову, кошку, кролика и морскую свинку, при этом предпочтительным примером является человек.
Кроме того, способ получения плазмы или сыворотки конкретно не ограничен, возможно применение общепринятых способов, например способа выделения плазмы или сыворотки из крови, которые получают в форме образцов для клинического лабораторного исследования. Например, плазма может быть получена забором крови в пробирку с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), пробирку с гепарином или тому подобное, и центрифугированием этой крови. Кроме того, сыворотка может быть получена забором крови в тест-пробирку и ее центрифугированием.
С использованием способа диагностики ревматоидного артрита по настоящему изобретению измеряют количество талина в полученной таким образом плазме или сыворотке. Здесь «количество талина» означает количество белка талина. При наличии нескольких изоформ талина может быть измерено количество любой из них. Например, в случае человеческого талина присутствуют две изоформы, то есть талин 1 и талин 2. Последовательность матричной РНК (мРНК) и аминокислотная последовательность талина 1 показаны в SEQ ID NO: 1 и 2. Кроме того, последовательность мРНК и аминокислотная последовательность талина 2 показаны в SEQ ID NO: 3 и 4.
Количество талина в плазме или сыворотке субъекта-животного может быть измерено иммунохимическим способом с использованием антитела, связывающегося с талином.
2
Антитело, связывающееся с талином, может представлять собой поликлональное антитело или может представлять собой моноклональное антитело, и, в некоторых случаях, могут быть использованы фрагменты антител, например Fab', Fab, F(ab'). Эти антитела могут быть получены общеизвестными способами.
Примеры коммерческих продуктов включают антитело H-18 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), антитело H-300 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), антитело TA205 (Abeam Inc.) и антитело М54246М (Bio-design Co., Ltd.).
Количество талина может быть измерено с использованием хорошо известных способов, таких как иммуноферментный анализ (ИФА), хемилюминесцентный иммуноанализ, радиоиммунный анализ (РИА), иммунофлюоресцентный анализ и анализ латекс-агглютинации. Конкретные примеры включают конкурентный анализ с использованием антитела и меченного антигена, способ сэндвич-ИФА с использованием комбинации двух типов антител, то есть моноклонального антитела или поликлонального антитела (или моноклонального антитела и поликлонального антитела) с разными сайтами распознавания антигена, и анализ латекс-агглютинации с использованием латексных частиц, к которым присоединено антитело.
В этих способах измерения антиген или антитело при необходимости могут быть присоединены к твердофазному носителю. Примеры твердофазного носителя включают синтетические полимеры, такие как полистирол, полиэтилен, полипропилен, поливинилхлорид, полиэфир, эфир полиакриловой кислоты, нейлон, полиацеталь и фторуглеродные полимеры, полисахариды, такие как целлюлоза и агароза, стекло, металл и тому подобное. Такому твердофазному носителю можно придать различную форму, включая форму микропланшета, сферическую форму, форму волокна, палочкообразную форму, форму панели, форму контейнера, кюветы, тест-пробирки и тому подобного.
124
14
3
В указанном выше способе иммунохимического анализа при необходимости могут быть использованы меченные антитела или антигены. Примеры таких меток включают радиоизотопы (I, C и H), флуоресцентные вещества (изотиоцианат флуоресцеина и тому подобное) и тому подобное, а также ферменты (пероксидазу, щелочную фосфатазу и тому подобное) и люминесцентные вещества (эфир акридиния, изолюминол, люциферин и тому подобное). Кроме того, могут быть использованы способы с использованием комбинации биотиновой метки и стрептавидина.
Как указано выше, путем измерения и определения количества талина в плазме или сыворотке субъекта-животного возможно легко диагностировать наличие или отсутствие ревматоидного артрита у субъекта. То есть, если количество талина в плазме или сыворотке превышает предопределенный порог, можно сделать вывод о наличии у субъекта ревматоидного артрита. Предопределенный порог может быть установлен, например, на основании среднего значения и тому подобного в плазме или сыворотке контрольного животного без ревматоидного артрита.
Кроме того, путем измерения и определения количества талина до и после введения терапевтического агента для лечения ревматоидного артрита можно легко и просто определить терапевтический эффект терапевтического агента. То есть, если количество талина после введения терапевтического агента для лечения ревматоидного артрита значительно меньше количества талина до введения, можно сделать вывод, что терапевтический агент эффективен.
Здесь терапевтический агент для лечения ревматоидного артрита может включать все общеизвестные терапевтические агенты и все терапевтические агенты, которые будут разработаны в будущем. Примеры общеизвестных терапевтических агентов для лечения ревматоидного артрита включают биологические препараты, нестероидные противовоспалительные агенты (противовоспалительные обезболивающие агенты), стероидные лекарственные средства, иммуносупрессивные агенты и тому подобное.
Примеры биологических препаратов включают препараты химерных антител против фактора некроза опухоли-α (TNF-α), растворимые рецепторы TNF, препараты полноразмерных человеческих антител против TNF-α, препараты антител против рецептора интерлейкина-6 (IL-6) и тому подобное. Нестероидные противовоспалительные агенты включают агенты, подавляющие образование простагландинов. Они могут уменьшать боль и отек сустава, но полагают, что ими сложно остановить прогрессирование заболевания как такового и остановить разрушение кости и сустава. Стероидные лекарственные средства оказывают очень хороший противовоспалительный эффект, поэтому их используют в качестве специфических лекарственных средств для лечения ревматоидного артрита. Тем не менее, их нежелательные эффекты вызывают проблемы. Иммуносупрессивные агенты уменьшают иммунопатологические явления у пациентов с ревматоидным артритом, уменьшая посредством этого воспаление при ревматоидном артрите, и их используют для индукции ремиссии. Поскольку они могут также ингибировать прогрессирование ревматоидного артрита, эти агенты также называют базисными противоревматическими лекарственными средствами. Их также называют медленнодействующими противоревматическими лекарственными средствами, поскольку для развития их эффекта необходимо продолжительное время.
Как указано выше, существуют различные типы терапевтических агентов для лечения ревматоидного артрита, однако способ диагностики по настоящему изобретению также полезен для определения уровня эффекта терапевтического агента и выбора наиболее эффективного терапевтического агента.
Набор для диагностики ревматоидного артрита
Согласно настоящему изобретению предложен набор для диагностики ревматоидного артрита для использования в способе диагностики ревматоидного артрита по настоящему изобретению. Данный набор для диагностики включает, например, твердофазный носитель, к которому присоединено антитело, связывающееся с талином. Кроме того, он может включать меченное вторичное антитело, субстрат для окрашивания или тому подобное.
Примеры
Далее настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на Примеры, однако его не следует интерпретировать как ограниченное последующим описанием. Здесь следует отметить, что в последующих Примерах 1 и 2 и в Сравнительном примере 1 субъекты включают 17 пациентов с ревматоидным артритом (PA) и 14 контрольных субъектов (8 пациентов с остеоартритом, 1 пациент с системной красной волчанкой, 1 пациент с диабетом и 4 здоровых субъектов). Кроме того, в последующем Примере 3 субъектами являются 5 пациентов с PA.
Пример 1
У каждого пациента проводили забор крови в пробирку с ЭДТА и центрифугировали ее при 2500 об/мин при комнатной температуре в течение 10 минут с получением плазмы.
Количество талина в плазме измеряли способом сэндвич-ELISA.
Сначала антитело H-18 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), распознающее N-конец талина, разводили в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) с получением концентрации 1 мкг/мл и добавляли в 96-луночный микропланшет в количестве 100 мкл на лунку, который инкубировали при 4°C в течение ночи с последующей трехкратной отмывкой с использованием 200 мкл отмывочного раствора на лунку. Затем в этот 96-луночный микропланшет добавляли плазму, полученную от каждого субъекта, в количестве 100 мкл на лунку, микропланшет инкубировали при 25°C в течение одного часа с последующей трехкратной отмывкой с использованием 200 мкл отмывочного раствора на лунку. Затем антитело Н-300 (Santa Cruz Biotechnology Inc.), используемое в качестве первичного антитела, распознающего N-конец талина, разбавляли PBS до получения концентрации 2 мкг/мл и добавляли в 96-луночный микропланшет в количестве 100 мкл на лунку, который инкубировали при 25°C в течение одного часа с последующей трехкратной отмывкой с использованием 200 мкл отмывочного раствора на лунку. Затем меченое пероксидазой хрена (HRP) антитело IgG против козы (KPL), используемое в качестве вторичного антитела, разбавляли PBS до получения концентрации 2 мкг/мл и добавляли в 96-луночный микропланшет в количестве 100 мкл на лунку, который инкубировали при 25°C в течение одного часа с последующей трехкратной отмывкой с использованием 200 мкл отмывочного раствора на лунку.
Затем в 96-луночный микропланшет добавляли субстрат в количестве 100 мкл на лунку, микропланшет инкубировали при 25°C в течение 15 минут и затем измеряли значение оптической плотности (OD) при длине волны 630 нм с использованием планшет-ридера.
ROC-кривая Примера 1 показана на Фиг.1. По результатам ROC-анализа площадь под ROC-кривой (AUC) на Фиг.1 составила 0,954. Кроме того, в Таблице 1 показаны положительные и отрицательные результаты на основании порогового значения OD, равного 0,20.
Таблица 1
Пациенты с РА
Контрольные субъекты
Всего
Положительные результаты
14
0
14
Антитело Н-300
Отрицательные результаты
3
14
17
Всего
17
14
31
На основании представленных результатов, диагностика ревматоидного артрита способом сэндвич-ELISA с использованием антитела H-18 и антитела H-300 показала, что чувствительность составляет 14/17×100=82,4%, и специфичность составляет 14/14×100=100%.
Пример 2
Количество талина в плазме измеряли способом сэндвич-ELISA таким же образом, как в Примере 1, за исключением того, что в качестве первичного антитела использовали антитело М54246М (Bio-design Co., Ltd.), распознающее C-конец талина.
ROC-кривая Примера 2 показана на Фиг.2. По результатам ROC-анализа площадь под ROC-кривой (AUC) на Фиг.2 составила 0,819. Кроме того, в Таблице 2 показаны положительные и отрицательные результаты на основании порогового значения OD, равного 0,05.
Таблица 2
Антитело М54246М
Пациенты с РА
Контрольные субъекты
Всего
Положительные результаты
15
3
18
Отрицательные результаты
2
11
13
Всего
17
14
31
На основании представленных результатов, диагностика ревматоидного артрита способом сэндвич-ELISA с использованием антитела Н-18 и антитела М54246М показала, что чувствительность составляет 15/17×100=88,2%, и специфичность составляет 11/14×100=78,6%.
Сравнительный пример 1
У каждого субъекта проводили забор крови в пробирку для забора крови и получения сыворотки, центрифугировали ее при 2500 об/мин при комнатной температуре в течение 10 минут с получением таким образом сыворотки. Титр антител против ССР в полученной сыворотке измеряли с использованием имеющегося в продаже набора (MESACUP ССР, изготовленного Medical & Biological laboratories Co., Ltd (MBL)).
ROC-кривая Сравнительного примера 1 показана на Фиг.3. По результатам ROC-анализа площадь под ROC-кривой (AUC) на Фиг.3 составила 0,838. Кроме того, в Таблице 3 показаны положительные и отрицательные результаты на основании порогового значения титра антител, равного 6,60.
Таблица 3
Антитело против ССР
Пациенты с РА
Контрольные субъекты
Всего
Положительные результаты
11
1
12
Отрицательные результаты
6
13
19
Всего
17
14
31
На основании представленных результатов, диагностика ревматоидного артрита с использованием антитела против ССР показала, что чувствительность составляет 11/17×100=64,7%, и специфичность составляет 13/14×100=92,9%.
Как показывают представленные выше результаты, талин преимущественно присутствует в крови пациентов с РА. Таким образом, путем измерения количества талина в крови возможно определить наличие или отсутствие ревматоидного артрита у субъекта легким и простым образом. Кроме того, чувствительность данного способа диагностики значительно превышала чувствительность существующего способа с использованием антитела против ССР.
Пример 3
Терапевтический эффект терапевтического агента для лечения ревматоидного артрита у 5 пациентов с РА подтверждали путем измерения количества талина. Измерение количества талина проводили путем измерения значения OD способом сэндвич-ELISA с использованием антитела H-18 и антитела H-300, как описано в Примере 1. Кроме того, количество C-реактивного белка (СРБ) и количество матриксной металлопротеазы-3 (MMP-3) измеряли способом, аналогичным осуществляемому при обычном клиническом обследовании. Также вычисляли показатель по шкале активности заболевания DAS28, рекомендованной Европейской антиревматической лигой (EULAR). При показателе DAS28 не менее 5,1 активность заболевания определяют как высокую, при показателе от не менее 3,2 до менее 5,1 активность заболевания определяют как среднюю, и при показателе менее 3,2 активность заболевания определяют как низкую. Результаты показаны в Таблице 4.
Таблица 4
Случай 1: мужчина (пример значительной эффективности ADA)
До (лечение МТХ)
После (лечение МТХ+ADA)
Талин (значение OD)
0,568
0,139
СРБ (мг/дл)
1,74
0,08
MMP-3 (мг/мл)
60,6
57,4
DAS28
5,43
2,62
Случай 2: женщина (пример неэффективности SASP)
До (без лечения)
После (лечение SASP)
Талин (значение OD)
0,258
0,294
СРБ (мг/дл)
0,36
0,19
ММР-3 (мг/мл)
70,6
106,6
DAS28
5,12
4,21
Случай 3: женщина (пример неэффективности IFX)
До (лечение МТХ)
После (лечение МТХ+IFX)
Талин (значение OD)
0,205
0,223
СРБ (мг/дл)
2,82
2,68
ММР-3 (мг/мл)
962,1
523,8
DAS28
4,87
3,95
Случай 4: женщина (пример значительной эффективности ADA)
До (лечение BUC)
После (лечение BUC+ADA)
Талин (значение OD)
0,258
0,164
СРБ (мг/дл)
5,01
0,16
MMP-3 (мг/мл)
323,2
52,2
DAS28
4,55
2,45
Случай 5: женщина (пример неэффективности TCZ)
До (без лечения)
После (лечение TCZ)
Талин (значение OD)
2,093
1,787
СРБ (мг/дл)
3,83
2,78
ММР-3 (мг/мл)
117,8
93,1
DAS28
5,09
4,50
Случай 1 представляет собой пример, в котором при использовании ADA (адалимумаб) вместе с лечением МТХ (метотрексат) был показан хороший ответ (DAS28 5,43→2,62) на основании оценки ответа согласно EULAR. Количество талина было велико (значение OD 0,568) при использовании одного МТХ, но было нормальным (значение OD 0,139) при использовании вместе с ADA. С другой стороны, не было значимого уменьшения количества MMP-3, даже при совместном использовании с ADA, что не отражало активность ревматоидного артрита.
Случай 2 представляет собой пример, в котором также при лечении SASP (салазосульфапиридин) было показано отсутствие ответа (DAS28 5,12→4,21) на основании оценки ответа согласно EULAR. Количество талина оставалось высоким (значение OD 0,258→0,294) даже при лечении SASP. С другой стороны, после проведения лечения SASP количество СРБ было нормальным (0,19 мг/дл), что не отражало патологию ревматоидного артрита.
Случай 3 представляет собой пример, в котором было показано отсутствие ответа (DAS28 4,87→3,95), несмотря на то что IFX (инфликсимаб) использовали вместе с лечением МТХ (метотрексат). Количество талина оставалось высоким (значение OD 0,205→0,223) даже при проведении лечения вместе с IFX.
Случай 4 представляет собой пример, в котором был показан хороший ответ (DAS28 4,55→2,45) при использовании ADA (адалимумаб) вместе с лечением BUC (буцилламин). Количество талина было велико (значение OD 0,258) при использовании одного BUC, но было нормальным (значение OD 0,164) при использовании вместе с ADA.
Случай 5 представляет собой пример, в котором было показано отсутствие ответа (DAS28 5,09→4,50) также при проведении лечения с использованием TCZ (тоцилизумаб). Количество талина оставалось высоким (значение OD 2,093→1,787) даже при лечении TCZ.
Как показывают представленные выше результаты, количество талина в крови коррелирует с активностью ревматоидного артрита, и это отражает активность ревматоидного артрита точнее, чем другие факторы, такие как СРБ и ММР-3. Таким образом, путем измерения количества талина в крови возможно точное определение терапевтического эффекта терапевтического агента для лечения ревматоидного артрита.