Микробная тест-система для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов

Микробная тест-система для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов

А. С. ТРЕНИН

ФГБУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» РАМН, Москва

Microbial Test-System for Screening of Inhibitors of Sterol Biosynthesis

A. S. TRENIN

G. F. Gause Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russia

Предлагается новая экономичная высокоэффективная микробная тест-система, позволяющая осуществлять поиск ингибиторов биосинтеза стеролов. Система основана на культивировании гриба Acremonium fusidioides (по прежней классификации Fusidium coccineum), образующего фузидиевую кислоту (фузидин) — антибиотик стероидной структуры. Значительное сходство в биосинтезе фузидиевой кислоты в организме гриба-продуцента и холестерина в организме человека, совпадение их начальных этапов вплоть до стадии формирования сквалена позволяет с успехом применять A.fusidioides для оценки микробных вторичных метаболитов — потенциальных ингибиторов биосинтеза холестерина. Ингибиторы биосинтеза стеролов в тесте с культурой A.fusidioides выявляются как соединения, резко снижающие продукцию фузидина при отсутствии заметного влияния на рост продуцента. Мевалоновая кислота — один из ключевых интермедиатов биосинтеза стеролов — может с успехом применяться для снятия ингибирующего действия ряда микробных метаболитов. Тест с A.fusidioides легко поддается механизации благодаря миниатюризации микробиологических процессов, выращиванию культуры в стерильных 6-, 24- и 96-луночных планшетах и использованию автоматических микропипеток, его результаты хорошо согласуются с оценкой ингибирующего действия метаболитов в тестах с клетками человека (культура клеток гепатобластомы G2). Указанная тест-ситема пригодна для работы с грубо очищенными экстрактами культуральной жидкости микроорганизмов-продуцентов и может быть применена на начальных этапах поиска.

Ключевые слова: ингибиторы биосинтеза стеролов, вторичный микробный метаболизм, микробные модели поиска, холестерин, мевалоновая кислота, фузидиевая кислота, ГМГ-КоАредуктаза, миниатюризация, механизация микробиологических процессов.

New effective economic microbial test-system for screening of microbial metabolites, that are inhibitors of sterol biosynthesis, is proposed. It is based on cultivation of fungal strain Acremonium fusidioides (former Fusidium coccineum), that produces fusidic acid (fusidin) that is antibiotic of steroid structure. Great similarity of fusidic acid biosynthesis in fungous strain and cholesterol biosynthesis in human organism, coincidence of their initial steps till squalene formation, allows use A. fusidioides as a model for estimation of microbial secondary metabolites that are potential inhibitors of sterol biosynthesis. Such inhibitors in A.fusidioides model are revealed as compounds that strongly reduce fusidin production without any visible influence on fungus growth. Mevalonate that is one of the crucial intermediates of sterol biosynthesis could be successfully applied for removal of inhibition induced by some microbial metabolites. A.fusidioides test-system can be easily mechanized because of miniaturization of microbiological procedures, cultivation in 6-, 24-, or 96-well plates and usage of automatic micropipettes and dispensers. The results of this model are well correlated with the ones obtained with human cells (Hep G2 test-system, offered earlier). A.fusidioides test-system can be applied at rather early stages of screening procedures and is quite effective for testing of crude extracts of producers' culture liquid.

Key words: inhibitors of sterol biosynthesis, microbial secondary metabolites, microbial models for screening of new antibiotics, cholesterol, mevalonate, fusidin, HMG-CoA reductase, crude extracts of culture liquid, miniaturization, mechanization of microbial processes.

Введение

Микробные вторичные метаболиты — ингибиторы биосинтеза стеролов (ИБС), в первую очередь статины — ингибиторы 3-гидро-кси-3 -метилглутарил-КоА редуктазы

(ГМГ-КоА редуктазы) и созданные на их осно-

© А. С. Тренин, 2013

Адрес для корреспонденции: 119021 г. Москва, Большая Пироговская, 11. ФГБУ НИИНА

ве химические аналоги, хорошо зарекомендовали себя в качестве действенных средств лечения и профилактики атеросклероза, показали высокую эффективность в лечении ряда онкологических заболеваний [1—5]. Серьезные перспективы в разработке эффективных средств лечения сердечнососудистых заболеваний связаны также с созданием препаратов на базе ингибиторов более поздних этапов биосинтеза стеролов, в частности, ингибиторов сквален

синтазы, сквален эпоксидазы и сквален моно-оксигеназы [6—9]. Ингибиторы Р-450 зависимой деметилазы ланостерола являются, по-видимому, действенным средством лечения грибковых инфекций [10—12]. В настоящее время развернут широкий поиск ИБС среди продуктов жизнедеятельности различных микроорганизмов как грибов, так и актиномицетов [13—16]. Успех поисковых работ во многом зависит от эффективности применяемых тест-систем, в особенности на начальном этапе отбора.

Возможность применения ферментных систем, требующих тщательной химической очистки тестируемых препаратов, на начальных этапах скрининговых исследований весьма затруднительна. Значительно более уместным здесь оказывается использование клеточных культур. Предложенный нами ранее метод отбора ИБС с помощью культуры клеток гепатобластомы G2 (Hep G2), в основу которого положена количественная оценка включения радиоизотопных предшественников в холестерин и отдельные фракции липидов, позволяет не только выявить микробные метаболиты — ИБС, но и обнаружить (при использовании очищенных препаратов) особенности их механизма действия [17]. К сожалению, для указанного метода характерна весьма высокая трудоемкость.

В настоящей работе предлагается значительно менее трудоемкий подход, основанный на использовании не клеток человека, а микробных культур. В основу предлагаемой тест-системы положено культивирование несовершенного гриба Acremonium fusidioides — продуцента фузи-диевой кислоты (фузидина) — антибиотика стероидной структуры [18]. Ингибиторы биосинтеза стеролов в тесте с культурой A.fusidioides выявляются как соединения, резко снижающие продукцию фузидина при отсутствии заметного влияния на рост продуцента. Мевалоновая кислота — один из ключевых интермедиатов биосинтеза стеролов — может с успехом применяться для снятия ингибирующего действия микробных метаболитов, действующих на ранних этапах биосинтеза стеролов и, таким образом, способствовать их раннему выявлению.

По сравнению с культурой Hep G2 описываемый тест обладает значительно более высокой пропускной способностью, мало чувствителен к микробному заражению, с успехом поддается механизации благодаря выращиванию микробной тест-культуры в жидкой питательной среде в стерильных 6-, 24- и 96-луноч-ных планшетах. Указанная тест-система пригодна для работы с грубо очищенными экстрактами культуральной жидкости микроорганизмов-продуцентов и может быть применена на начальных этапах поиска.

Материал и методы

Условия культивирования, среды, определение биологической активности. Культуры актиномицетов и грибов выделяли из образцов почвы и выращивали при температуре 28°С на агари-зованных средах: актиномицеты — на среде Гаузе 1 и Гаузе 2 [19], грибы — на сусло-агаре и кислом агаре Чапека [20].

Для изучения антибиотической активности культур в жидкой питательной среде их выращивали в колбах Эрлен-мейера емкостью 750 мл, содержащих 50—150 мл питательной среды, на качалках при 28°С в течение 5—11 суток в различных питательных средах (состав указан в процентах): Гаузе 2 (глюкоза — 10,0, пептон — 5,0, триптон — 5,0, NaCl — 5,0, CaCO3 — 2,5), соево-глицериновой (соевая мука — 1,5, глицерин — 3,0, NaCl — 0,3, СаСОз — 0,3), соево-глюкозной (соевая мука — 1,0, глюкоза — 1,0, NaCl — 0,5, CaCO3 — 0,25), соево-сахароз-ной (соевая мука — 1,0, сахароза — 2,0, CaCO3, — 0,3, NaCl — 0,3, KNO3 — 0,2), кукурузно-крахмальной (кукурузный экстракт — 0,3, крахмал — 2,0, CaCO3, — 0,5, NaCl — 0,5, KNO3 — 0,4). В качестве инокулята использовали выращенную на агаризованных средах 7—10-суточную культуру. Рост культур в жидкой среде контролировали спектрофотометрически по уровню поглощения при 560 нм.

Антибиотическую активность определяли методом штриха на агаровой среде при выращивании продуцентов на плотных питательных средах и методом диффузии в агаре при выращивании в жидких средах — в отношении различных бактериальных тест-микроорганизмов и грибов: Bacillus sub-tilis ATCC 6633, Micrococcus luteus ATCC 9341, Staphylococcus aureus ATCC 21027, Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans ATCC 14053, Candida tropicalis ATCC 750, Cryptococcus humicolus ATCC 9949, Aspergillus niger ATCC 16404 и Fusarium oxysporum VKM F-140 (= CMI, IMI 90473).

Реактивы и материалы. В работе использовали препараты антибиотиков зарубежных и отечественных компаний, а также антибиотики, полученные в НИИНА им. Г.Ф. Гаузе, РАМН. Используемый в тест-системе препарат лактона В,Ь-мевало-новой кислоты («Sigma», США) подвергали сапонификации — выдерживали в слабо щелочной среде для получения кислотной формы: 1 М раствор лактона в 0,1 н NaOH инкубировали при 50°С в течение 2 часов, либо при 37°С в течение 4 ч.

Контрольным препаратом при выявлении ИБС служил ловастатин («MSD», США).

Для стерилизации проб культуральной жидкости применяли одноразовые стерильные фильтры Sterivex (диаметр пор 0,22 мкм) фирмы «Millipore», США. В целях концентрирования препаратов культуральной жидкости проводили их лио-филизацию на лиофилизационной установке SUE 300 Q («Heto», Швеция).

Выделение и очистка антибиотиков. Культуральную жидкость и мицелий продуцентов разделяли фильтрацией или центрифугированием. Для выделения антибиотиков из фильтрата культуральной жидкости применяли сорбцию на смоле Амберлит XAD-2, позволяющую выделять биологически активные вещества разной степени гидрофильности, а также экстракцию этилацетатом для выделения метаболитов, обладающих липофильными свойствами. Обработку мицелия проводили экстракцией этиловым спиртом (EtOH) при нейтральном и кислом (4,0) значениях рН.

При выделении методом сорбции на смоле Амберлит XAD-2 антибиотики из культуральной жидкости (250 мл), сорбированные на смоле, элюировали смесью ацетон — бута-нол — вода (1:1:1) при нейтральном и кислом (4,5) значениях рН. Концентрирование получаемых таким образом растворов осуществляли упариванием в вакууме до маслянистого остатка с последующим растворением в небольшом объеме (3 мл) 60% EtOH (концентраты 1 и 2).

При экстракции антибиотиков этилацетатом при кислом (4,0) и нейтральном значениях рН соотношение экстрагента и культуральной жидкости составляло 1:10 — 1:5. Концентриро-

Рис. 1. Биосинтез холестерина, эргостерола и антибиотика фузидина (схема разработана на основе источников [21—24]).

вание получаемых экстрактов (концентраты 3 и 4) также проводили упариванием в вакууме.

В случае обработки мицелия его отделяли от культураль-ной жидкости фильтрованием и разделяли на две части. Антибиотики экстрагировали 80% EtOH из расчета 3 мл растворителя на 1 г мицелия при кислом (4,0) и нейтральном значениях рН. После экстракции надосадочную жидкость упаривали до получения маслянистого остатка и разводили в небольшом объеме EtOH (концентраты 5 и 6).

Применение указанных способов выделения позволяло провести концентрирование биологически активных соединений, содержащихся в культуральной жидкости и мицелии продуцентов, в 50—100 раз.

Обладавшие антимикробной активностью концентраты исследовали путем хроматографирования в тонком слое на пластинах с Кизильгелем 60 (Merck) в системе гексан — ацетон (1:1) или хлороформ — метанол (9:1) с последующим химичес-

ким (опрыскивавание 2% водным раствором KMnO4) и биологическим (тест-организмы B.subtilis и A.niger) проявлением.

Хроматографическую очистку и разделение компонентов перспективных препаратов проводили методом колоночной хроматографии. Определяли физико-химические характеристики полученных соединений. Для идентификации выделенных антибиотических веществ использовали компьютерную базу данных природных биологически активных веществ (BNPD), разработанную Я. Берди (Венгрия).

Микробная тест-система для выявления ИБС. Культуру Acremonium fusidioides (по прежней классификации Fusidium coccineum Fuckel АТСС 14700), выращивали при 28°С в питательной среде Гаузе 2 (в г/л: глюкоза — 10, пептон — 5,0, трип-тон - 5,0, NaCl — 5,0, CaCO3 — 2,5, pH 7,0—7,2) в атмосфере повышенной влажности в 6-, 24- и 96-луночных стерильных полиститроловых планшетах, («Flow», Великобритания, «Costar», Франция, «Медполимер», С-Пб.). Объем проб со-

ставил соответственно 1 мл, 0,5 мл и 200 мкл. Продолжительность выращивания — 3—6 сут.

Исследуемые препараты, полученные из культуральной жидкости и мицелия продуцентов, вносили в среду культивирования A.fusidioides в виде спиртовых или спирто-водных растворов серией последовательных трехкратных разведений. Препарат в каждой концентрации вносили в 3—6 повторах. Конечное содержание этанола в эксперименте не превышало 1%. При анализе непосредственно культуральной жидкости продуцентов ее подвергали стерилизационной обработке микрофильтрацией (фильтры Sterivex, «Millipore», США с диаметром пор 0,22 мкм), а серию последовательных разведений проводили в стерильной дистиллированной воде.

Препарат мевалоновой кислоты вносили в конечной концентрации 1—10 мМ непосредственно в питательную среду в начале культивирования.

Концентрацию тестируемых препаратов в экспериментах с AfUsidioides рассчитывали в мкг/мл (для очищенных препаратов) и в единицах культуральной жидкости (ед. к.ж.) (для первичных экстрактов антибиотиков).

Рост тест-культуры в планшетах оценивали визуально, а также по сухой массе мицелия. Продукцию фузидина выявляли методом диффузии в агаре с помощью культуры B.subtilis АТСС 6633, для чего культуральную жидкость AfUsidioides отбирали из ячеек полистиролового планшета и переносили в лунки (диаметр 8 мм), приготовленные в агаризованной (2%) среде Гаузе 2, содержащей суспензию клеток B.subtilis. Инкубацию осуществляли при 37°С 16 часов до полного вырастания тест-культуры и появления отчетливых зон подавления роста вокруг лунок. Количественное определение фузидина проводили путем измерения диаметра зон.

О наличии у испытуемых препаратов способности к ин-гибированию биосинтеза стеролов судили по подавлению продукции фузидина при отсутствии заметного влияния на рост культуры.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием компьютерных программ Statgraf и Microsoft Ехсе1, рассчитывая средние арифметические значения, доверительные интервалы и стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стью-дента (р<0,05).

Результаты и обсуждение

Микробная модель поиска ИБС основана на способности гриба A.fusidioides продуцировать фузидиевую кислоту (антибиотик стероидной структуры фузидин), легко выявляемую благодаря наличию антибиотической активности в отношении грамположительных микроорганизмов. Биосинтез фузидиевой кислоты в организме гриба-продуцента и синтез холестерина в организме человека протекают по мевалонатному пути, при этом этапы биосинтеза, вплоть до стадии формирования сквалена, у них совпадают (рис. 1).

Для уточнения механизма действия изучаемых ингибиторов использовали мевалоновую кислоту, препаратом сравнения служил известный ингибитор биосинтеза стеролов ловастатин.

Активный рост тест-культуры A.fusidioides начинался на 2-е сутки и заканчивался примерно к 4—5-м суткам эксперимента. Одновременно с началом роста отмечено образование культурой фу-зидина. Наиболее ощутимо фузидин накапливался к 4—6 суткам эксперимента (рис. 2, кривая а).

Рис. 2. Влияние ловастатина на образование культурой A.fusidioides антибиотика фузидина.

Кривые а, Ь, с и << — продукция фузидина (в мкг/мл) при содержании в среде ловастатина: 0 (а), 2,5 (Ь), 5 (с) и 10 мкг/мл (Ь); рост культуры, сухая масса мицелия (в мг/мл) — кривая е. Ось абсцисс — время (сутки); ось ординат левая — рост, сухая масса (мг/мл); ось ординат правая — продукция фузидина (мкг/мл).

Внесение ловастатина (2,5—10 мкг/мл) приводило к подавлению продукции фузидиевой кислоты, наиболее заметному в течение первых 4 суток культивирования, происходившему при отсутствии подавления роста тест-культуры (рис. 2, кривые Ь, с, 1).

Аналогичный эффект — подавление образования фузидина у А./шШоЫвБ — наблюдался при добавлении экстрактов различных микробных штаммов — предполагаемых продуцентов ИБС (рис. 3).

Внесение в тест-систему препарата экзогенной мевалоновой кислоты — одного из основных интермедиатов биосинтеза стеролов в количестве 2—10 мМ приводило к возобновлению культурой А./шШоНвБ синтеза фузидина, несмотря на присутствие ловастатина (5, 10 мкг/мл) (рис. 4).

Аналогичный эффект мевалоновой кислоты наблюдался при испытании ряда микробных метаболитов (рис. 5, 6 а, б) и свидетельствовал о подавлении ими начальных (т. е. до образования ме-валоната) этапов биосинтеза стеролов. Ингибирующее действие других метаболитов, напротив, в присутствии мевалоновой кислоты не снималось (рис. 6, в).

Предложенная тест-система была применена для исследования 1130 штаммов актиномицетов и плесневых грибов, проявивших на предварительных этапах исследования противогрибковую активность (рис. 7). У 610 штаммов (54%) выявлено

Рис. 3. Образование фузидина культурой A.fusidioides в присутствии экстрактов, полученных из культураль-ной жидкости штаммов 199/89 (а), 86/89 (б) и 55/90 (в).

Содержание тестируемых веществ (в ед. кж/мл): 0 (кривая 1), 3Х10-3 (кривая 2), 10-2 (кривая 3), 3Х10-2 (кривая 4). Ось абсцисс — время (сутки); ось ординат — продукция фузидина (мкг/мл).

Рис. 4. Влияние мевалоновой кислоты на продукцию культурой A.fusidioides антибиотика фузидина (время инкубации 4 суток).

Ось абсцисс — содержание мевалоновой кислоты; ось ординат — продукция фузидина (%).

Рис. 5. Влияние мевалоновой кислоты на продукцию культурой A.fusidioides фузидина в присутствии антибиотиков 13/88, 55/90

Рис. 7. Способность микробных штаммов-продуцентов к подавлению биосинтеза стеролов в модели A.fusidioides.

Рис. 6. Влияние мевалоновой кислоты на продукцию культурой A.fusidioides фузидина в присутствии экстрактов, полученных из культуральной жидкости штаммов 8 (3) (а), 1248/00 (б) и 5422 (в).

Ось абсцисс — содержание мевалоновой кислоты; ось ординат — продукция фузидина (%).

подавление биосинтеза фузидина, причем у большинства из них двукратное подавление продукции фузидина наблюдалось при испытании сильно разведенных (в 30—100 раз) препаратов культуральной жидкости и мицелия продуцентов. 415 штаммов такой способностью не обладали.

У 105 (9%) штаммов снижение продукции фузидина сопровождалось подавлением роста

тест-культуры, что препятствовало их корректному тестированию в модели A.fusidioides (рис. 7). Для остальных 1025 (91%) штаммов предложенное тестирование в описываемой модели было возможным.

Подавление биосинтеза фузидина снималось в присутствии экзогенной мевалоновой кислоты у 232 штаммов (38% всех активных штаммов), что явилось доказательством воздействия образуемых ими метаболитов на ранние этапы биосинтеза стеролов (включая этап ГМГ-КоА редуктазы). Другие 378 культур, по-видимому, являются продуцентами метаболитов, воздействующих на поздние этапы биосинтеза стеролов (рис. 7).

Рис. 8. Химическая структура антибиотика 199/88 (аскофуранон) (а), а также предполагаемая структура антибиотиков 55/90 (б) и 13/88-2 (в).

Применение описываемой микробной модели в скрининге новых антибиотиков в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе РАМН позволило выделить продуценты таких ИБС, как аскофуранон (199/89) [25], антибиотиков стероидной (55/90) и монако-линовой структуры (13/88-2) [18, 26], а также ряда других соединений, находящихся в настоящее время в стадии углубленного изучения (рис. 8).

В сравнении с ранее предложенной моделью поиска ИБС с использованием клеток Hep G2 новая микробная модель A.fusidioides обладает значительно более высокой пропускной способностью, менее чувствительна к микробному заражению, поддается механизации благодаря выращиванию культуры в стерильных 6-, 24- и 96-луночных планшетах и использованию автоматических микропипеток. Результаты микробного теста хорошо сочетаются с оценкой ингиби-рующего действия метаболитов в тестах с клетками человека: все метаболиты, активные в тесте Hep G2, оказались активными в микробной модели, а среди метаболитов, неактивных в мик-

ЛИТЕРАТУРА

1. Тренин А. С., Катруха Г. С. Антибиотики — ингибиторы биосинтеза холестерина. Хим фарм журн 1997; 31: 9: 5—16.

2. Тренин А. С. Вторичные метаболиты грибов — ингибиторы биосинтеза стеролов. Прикл биохим микробиол 1998; 34: 2: 131—138.

3. Trapani L, Segatto M, Pallottini V. Regulation and deregulation of cholesterol homeostasis: The liver as a metabolic «power station». World J Hepatol 2012; 4: 6: 184—190.

4. Hindler K, Cleeland C. S, Rivera E, Collard C. D. The role of statins in cancer therapy. Oncologist 2006; 11: 3: 306—315.

5. Garcia-Ruiz C, Morales A., Fernandez-Checa J. C. Statins and protein prenylation in cancer cell biology and therapy. Anticancer Agents Med Chem 2012; 12: 4: 303—315.

6. Charlton-Menys V., Durrington P. A^.Squalene synthase inhibitors : clinical pharmacology and cholesterol-lowering potential. Drugs 2007; 67: 1: 11—16.

7. Seiki S, Frishman W. H. Pharmacologic inhibition of squalene synthase and other downstream enzymes of the cholesterol synthesis pathway: a new therapeutic approach to treatment of hypercholesterolemia. Cardiol Rev 2009; 17: 2: 70—76.

8. Chugh A., Ray A., Gupta J. B. Squalene epoxidase as hypocholes-terolemic drug target revisited. Prog Lipid Res 2003; 42: 1: 37—50.

9. Belter A., Skupinska M, Giel-Pietraszuk M. et al. Squalene monooxyge-nase — a target for hypercholesterolemic therapy. Biol Chem 2011; 392: 12: 1053—1075.

10. Vicente M. F, Basilio A., Cabello A., Peláez F. Microbial natural products as a source of antifungals. Clin Microbiol Infect 2003; 9: 1: 15—32.

11. Espinel-Ingroff A. Novel antifungal agents, targets or therapeutic strategies for the treatment of invasive fungal diseases: a review of the literature (2005—2009). Rev Iberoam Micol 2009; 26: 1: 15—22.

12. Kathiravan M. K, Salake A. B, Chothe A. S. et al. The biology and chemistry of antifungal agents: a review. Bioorg Med Chem 2012; 20: 19: 5678—5698.

13. Hatori H, Sato B, Sato I. et al. FR901512, a novel HMG-CoA reduc-tase inhibitor produced by an agonomycetous fungus No. 14919. II. Taxonomy of the producing organism, fermentation, isolation and physico-chemical properties. J Antibiot (Tokyo) 2004; 57: 4: 264—270.

14. Hatori H, Shibata T, Tsurumi Y. et al. FR171456, a novel cholesterol synthesis inhibitor produced by Sporormiella minima No. 15604. I.

робной модели, не было ни одного, который бы проявил свою активность в тесте Hep G2. Следовательно, микробная модель A.fusidioides не дает ложно-отрицательных результатов, и ее применение практически не вызывает неправомерного отсева потенциально перспективных культур.

Заключение

Таким образом, ИБС при использовании модели A.fusidioides выявляются как соединения, снижающие продукцию фузидина при отсутствии заметного влияния на рост продуцента. Рассматриваемая модель пригодна для работы с грубо очищенными экстрактами, полученными из культуральной жидкости и мицелия микроорганизмов-продуцентов, и может быть с успехом использована на начальных этапах поиска. Возможность применения в микробной модели A.fusidioides мевалоновой кислоты позволяет уже на начальных этапах поиска успешно выявлять метаболиты, способные к подавлению ранних этапов биосинтеза стеролов.

Taxonomy, fermentation, isolation, physico-chemical properties. J Antibiot (Tokyo) 2004; 57: 4: 253—259.

15. Donadio S, Maffioli S, Monciardini P. et al. Antibiotic discovery in the twenty-first century: current trends and future perspectives. J Antibiot (Tokyo) 2010; 63: 8: 423—430.

16. Donadio S, Maffioli S, Monciardini P. et al. Sources of novel antibiotics — aside the common roads. Appl Microbiol Biotechnol 2010; 88: 6: 1261—1267.

17. Тренин А. С, Терехова Л. П., Толстых И. В. и др. Отбор микробных вторичных метаболитов — ингибиторов биосинтеза холестерина с помощью культуры клеток гепатобластомы G2. Антибиотики и химиотер 2003; 48: 1: 3—8.

18. Trenin A. S. Microbial test system for screening of secondary metabolites inhibiting cholesterol biosynthesis. International Conference on Microbial Secondary Metabolism, 5—8 Oct. 1994. Interlaken, 1994; Abstr. P.4.

19. Гаузе Г. Ф, Преображенская Т. П., Свешникова М. А. и др. Определитель актиномицетов. М.: 1983; 245.

20. Waksman S. A. The actinomycetes. Classification, identification and descriptions of genera and species. Vol. 2. Baltimore, The Williams and Wilkins Co. 1961. — 363 p.

21. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. М.: 1985; 272.

22. Berg J. M, Tymoczko J. L, Stryer L. Biochemistry, 5th edition: International Version. — New York: W.H. Freeman and Company, 2002; 1100.

23. Bellamine A., Mangla A. T, Dennis A. L. et al. Structural requirements for substrate recognition of Mycobacterium tuberculosis 14a-demethy-lase: implications for sterol biosynthesis. J of Lipid Research. 2001; 42: 128—136.

24. Mitsuguchi H, Seshime Y, Fujii I. et al. Biosynthesis of Steroidal Antibiotic Fusidanes: Functional Analysis of Oxidosqualene Cyclase and Subsequent Tailoring Enzymes from Aspergillus fumigates. J Am Chem Soc 2009; 131: 18: 6402—6411.

25. Терехова Л. П., Тренин А. С, Озерская С. М. и др. Образование ас-кофуранона культурой гриба Paecilomyces variotii Bainier 199. Микробиология 1997; 66: 5: 611—615.

26. Катруха Г. С, Толстых И. В., Жухлистова Н. Е. и др. Потенциальные средства лечения и профилактики атеросклероза на основе вторичных микробных метаболитов. Тез. докл. 1 Всеросс. конференции по проблемам атеросклероза, 8-9 июня 1999 г., М.: М., 1999; 151—152.