Способ получения каспазы-3
METHOD FOR OBTAINING CASPASE-3

Область техники.
Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии, генетической и белковой инженерии. В частности, к способу получения белковых препаратов прокаспазы-3 и каспазы-3.
Уровень техники.
Каспаза-3 относится к семейству цистеиновых протеаз, функции которых неразрывно связаны с процессом программируемой гибели клеток или апоптоза у всех многоклеточных животных [1]. Изначально в клетках эукариот каспаза-3 синтезируется в виде неактивного предшественника, прокаспазы-3. Активация прокаспазы-3 in vivo осуществляется путем ее протеолитического расщепления между большой и малой субъединицами, а также удаления про-части. Активность каспазы-3 ингибируется белком X-IAP, в частности Bir2-доменом данного белка.
Очищенные препараты каспазы-3 требуются для различных биомедицинских, фармакологических и биохимических исследований. Помимо этого, препараты каспазы-3 и прокаспазы-3 могут применяться для проведения исследований в области молекулярной и клеточной биологии.
Наиболее широко распространенный метод получения каспазы-3 - экспрессия кДНК прокаспазы-3 в бактериальном продуценте Е. coli. Однако этот способ оказывается крайне невыгодным в связи с малым выходом продукта из-за токсичности данной протеазы для клеток Е. coli. При экспрессии полноразмерной прокаспазы-3 в бактериальных клетках происходит процессинг фермента, вероятно, в результате его автокаталитической активации. Активная каспаза-3, будучи протеазой с широким спектром субстратов, является токсичной для продуцента [2], что проявляется в замедлении скорости роста культуры-продуцента и низким выходом целевого белка.
Для увеличения выхода продукта были предложены альтернативные способы наработки фермента. Некоторые производители препарата каспазы-3 решают проблемы токсичности протеазы для бактериального продуцента путем экспрессии отдельно большой и малой субъединиц каспазы-3 в E. coli [3]. При продукции каждой субъединицы каспазы-3 по отдельности, они оказываются нерастворимыми в цитоплазме клеток E.coli и накапливаются в виде телец включения, что приводит к необходимости проводить их денатурацию и последующую совместную ренатурацию для получения препарата активной каспазы-3. Произведенная таким способом протеаза обладает невысокой удельной активностью. В результате, данный способ требует больших временных и материальных затрат.
По упомянутым выше причинам были разработаны новые методы получения каспазы-3. В работе Сана с соавт. [4] предложено получать полноразмерную активную протеазу экспрессией кДНК, лишенной последовательности кодирующей продомен, в дрожжах Pichia pastoris. При использовании данного метода также происходит автокаталитическая активация фермента внутри дрожжевых клеток, что не позволяет достигать высокого уровня продукции каспазы-3. Кроме этого, метод оказывается еще более экономически невыгодным в сравнении с экспрессией белка в клетках Е. coli, так как культивация эукариотических организмов и индукция экспрессии в них требует больших затрат.
Аналог, наиболее близкий к заявленному для патентования способу получения каспазы 3 были описаны в работе [5]. Были проведены исследования по созданию рекомбинантных вариантов каспазы-3, в которые внесены мутации в сайт процессинга между большой и малой субъединицами для предотвращения автокаталитической активации прокаспазы-3 при экспрессии в бактериальном продуценте. Кэнг с соавторами [5] сконструировали кДНК, кодирующую прокаспазу-3, в которой природные сайты процессинга, способные расщепляться автокаталитически, были заменены на сайты тромбина. В данной работе не происходило активации рекомбинантной прокаспазы-3 при ее продукции в Е. coli. Активный фермент был получен после обработки очищенной прокаспазы-3 тромбином. Однако, полученный таким способом фермент обладает более низкой удельной активностью в сравнении с выделенной из Е. coli активной каспазой-3 дикого типа. Также обработка тромбином требует дополнительных финансовых затрат, что приводит к низкой рентабельности способа.
Технический результат данного изобретения заключается в получении активного ферментативного препарата каспазы-3 с высоким выходом.
Задача настоящего изобретения заключается в повышении уровня продукции прокаспазы-3 и предотвращении ее преждевременной активации за счет ее совместной экспрессии с ингибитором каспазы-3, Bir2-доменом белка X-IAP.
Другая задача изобретения заключается в выделении из клеток Е. coli прокаспазы-3 и получении ее очищенного препарата.
Другая задача изобретения заключается в получении активного ферментного препарата каспазы-3 из препарата прокаспазы-3 путем ее автокаталитической активации либо активации в присутствии активной каспазы-3, используемой в качестве катализатора процесса.
Сущность изобретения.
Объектом изобретения является способ получения ферментного препарата каспазы-3 в клетках Е. coli. Данное изобретение решает проблему нерегулируемой самоактивации прокаспазы-3 при ее продукции в клетках Е. coli. Это достигается за счет совместной экспрессии в Е. coli кДНК прокаспазы-3 и кДНК Bir2-домена белка X-IAP. Bir2-домен ингибирует активность зрелой каспазы-3 и предотвращает автокаталитический процессинг прокаспазы-3, сопровождающийся формированием активного фермента. В результате прокаспаза-3 нарабатывается в виде неактивного предшественника. Затем прокаспазу-3 выделяют из клеток и очищают с помощью хроматографических методов или любыми другими методами, позволяющими проводить очистку белка. Очищенный препарат прокаспазы-3 активируют добавлением активной каспазы-3 или проводят его самоактивацию для получения активного ферментного препарата.
Перечень фигур
Фиг. 1. Электрофореграмма очищенного препарата прокаспазы-3. М - маркеры молекулярных весов; 1 - грубый лизат клеток Е. coli Rosetta(DE3)/pCasp3His-29a/pBir2 до индукции; 2 - грубый лизат клеток Е. coli Rosetta(DE3)/pCasp3His-29a/pBir2 после индукции; 3 - осветленный лизат клеток Е. coli Rosetta(DE3)/pCasp3His-29a/pBir2; 4 - фракция прокаспазы-3 свиньи после элюции с Ni-NTA агарозы.
Фиг. 2. Электрофореграмма очищенного препарата прокаспазы-3. М - маркеры молекулярных весов; 1 - культура до индукции; 2 - грубый лизат; 3 - осветленный клеточный лизат; 4 - элюат после никелевой хроматографии.
Фиг. 3. Электрофореграмма препаратов активированной прокаспазы-3. Дорожки 1, 2, 3 и 4 - образцы после диализа, к которым был добавлен препарат активной каспазы-3: 1 - сразу после диализа; 2 - через 24 часа при +4°С; 3 - через 48 часов при +4°С; 4 - через 72 часа при +4°С. Дорожки 5, 6, 7 и 8 - образцы после диализа без добавления активной каспазы-3: 5 - сразу после диализа; 6 - через 24 часа при +4°С; 7 - через 48 часов при +4°С; 8 - через 72 часа при +4°С. Дорожка 9 - препарат каспазы-3.
Осуществление изобретения
Осуществление заявляемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами.
Пример 1. Получение плазмидной конструкции pCasp3His-29a для экспрессии кДНК прокаспазы-3, слитой с олигогистидиновой последовательностью длиной 6 а.о., в клетках Е. coli.
4
Фрагмент ДНК, кодирующий прокаспазу-3 по SEQ ID NO: 1, наработан при помощи ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, указанными в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1× реакционный буфер для KOD ДНК-полимеразы, 1,5 мМ MgSO, 0,2 мМ дНТФ, по 0,4 мкМ олигонуклеотидных праймеров, указанных в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4, 0,1 нг матричной плазмидной ДНК, содержащей кДНК прокаспазы-3 по SEQ ID NO: 1, а также 0,25 ед. активности KOD ДНК-полимеразы (Мерк). Условия проведения ПЦР: 1) 95°С - 2 мин., 2) 60°С - 15 сек., 70°С - 12 сек., 95°С - 20 сек. - 6 повторов; 3) 70°С - 15 сек., 95°С - 20 сек. - - 20 повторов. Полученный ПЦР-фрагмент очищают при помощи набора «QIAquick PCR purification kit» (Квиаген) и гидролизуют эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI. Плазмидный вектор рЕТ-29а гидролизуют эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI. После гидролиза ПЦР-фрагмент и вектор наносят на 1% агарозный гель, проводят электрофорез в трис-боратном буфере, окрашивают бромистым эти днем и визуализируют ДНК в проходящем УФ. Искомые фрагменты ДНК вырезают из агарозного геля и очищают при помощи набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Квиаген). 10 нг ДНК плазмидного вектора рЕТ-29а и 10 нг ПЦР-фрагмента с кДНК прокаспазы-3, полученные, как указано выше, лигируют в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1×лигазный буфер и 1 ед. активности Т4 ДНК-лигазы, при 8°С в течение 16 ч. 5 мкл лигазной смеси трансформируют компетентные клетки Е. coli DH5α. Трансформанты высевают в разведении на агаризованную среду LB, содержащую канамицин в концентрации 40 мкг/мл, и выращивают при 37°С в течение ночи. Затем проводят селекцию и секвенирование рекомбинантных клонов, содержащих кДНК прокаспазы-3 под контролем T7lac-промотора.
Пример 2. Получение плазмидной конструкции pBir2 для экспрессии кДНК Bir2-домена белка X-IAP в клетках Е. coli.
Фрагмент ДНК, кодирующий Bir2-домена белка X-IAP по SEQ ID NO: 2, наработан при помощи ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, указанными в SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, 0,1 нг матричной плазмидной ДНК, содержащей кДНК Bir2-домена по SEQ ID NO: 2, в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1× реакционный буфер для 0,25 ед. активности KOD ДНК-полимеразы (Мерк). Условия проведения ПЦР: 1) 95°С - 2 мин., 2) 58°С - 15 сек., 70°С - 6 сек., 95°С - 20 сек. - 6 повторов; 3) 70°С - 9 сек., 95°С - 20 сек. - 20 повторов. Полученный ПЦР-фрагмент очищают при помощи набора «QIAquick PCR purification kit» (Квиаген) и гидролизуют эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI. Плазмидный вектор pETDuet-1 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции NdeI и XhoI. После гидролиза ПЦР-фрагмент и вектор наносят на 1% агарозный гель, проводят электрофорез в трис-боратном буфере, окрашивают бромистым этидием и визуализируют ДНК в проходящем УФ. Искомые фрагменты ДНК вырезают из агарозного геля и очищают при помощи набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Квиаген). 10 нг ДНК плазмидного вектора pETDuet-1 и 5 нг ПЦР-фрагмента с кДНК Bir2-домена белка X-IAP, полученные, как указано выше, лигируют в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1×лигазный буфер и 1 ед. активности Т4 ДНК-лигазы, при 8°С в течение 16 ч. 5 мкл лигазной смеси трансформируют компетентные клетки Е. coli DH5α. Трансформанты высевают в разведении на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин в концентрации 75 мкг/мл, и выращивают при 37°С в течение ночи. Затем проводят отбор и секвенирование рекомбинантных клонов, содержащих кДНК Bir-2-домена белка X-IAP под контролем T7lac-промотора.
Пример 3. Получение плазмидной конструкции pCasp3His-Bir2 для коэкспрессии кДНК прокаспазы-3, слитой с олигогистидиновой последовательностью длиной 9 а.о., и Bir2-домена белка X-IAP в клетках Е. coli.
4
Фрагмент ДНК, кодирующий прокаспазу-3 по SEQ ID NO: 1 (pCasp3His-29a), наработан при помощи ПЦР с олигонуклеотидными праймерами, указанными в SEQ ID NO: 7 (cas-Nco up) и SEQ ID NO: 9 (H9-casp lo) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1× реакционный буфер для KOD ДНК-полимеразы, 1,5 мМ MgSO, 0,2 мМ дНТФ, по 0,4 мкМ олигонуклеотидных праймеров, указанных в SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 9 (pCasp3His-29a), 0,1 нг плазмидной ДНК pCasp3His-29a, содержащей кДНК прокаспазы-3, а также 0,25 ед. активности KOD ДНК-полимеразы (Мерк). Условия проведения ПЦР: 1) 95°С - 2 мин., 2) 60°С - 15 сек., 70°С - 12 сек., 95°С - 20 сек. - 6 повторов; 3) 70°С - 15 сек., 95°С - 20 сек. - - 20 повторов. Полученный ПЦР-фрагмент очищают при помощи набора «QIAquick PCR purification kit» (Квиаген) и гидролизуют эндонуклеазами рестрикции NcoI и SalI. Плазмиду pBir2 (SEQ ID NO: 8) гидролизуют эндонуклеазами рестрикции NcoI и SalI. После гидролиза ПЦР-фрагмент и вектор наносят на 1% агарозный гель, проводят электрофорез в трис-боратном буфере, окрашивают бромистым этидием и визуализируют ДНК в проходящем УФ. Искомые фрагменты ДНК вырезают из агарозного геля и очищают при помощи набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Квиаген). 10 нг ДНК плазмидного вектора pBir2 и 10 нг ПЦР-фрагмента с кДНК прокаспазы-3, полученные, как указано выше, лигируют в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1×лигазный буфер и 1 ед. активности Т4 ДНК-лигазы, при 8°С в течение 16 ч. 5 мкл лигазной смеси трансформируют компетентные клетки Е. coli DH5α. Трансформанты высевают в разведении на агаризованную среду LB, содержащую канамицин в концентрации 40 мкг/мл, и выращивают при 37°С в течение ночи. Затем проводят селекцию и секвенирование рекомбинантных клонов, содержащих кДНК прокаспазы-3 под контролем T7lac-промотора.
Пример 4. Экспрессия и очистка прокаспазы-3, слитой с олигогистидиновой последовательностью длиной 6 а.о.
600
Компетентные клетки штамма Е. coli Rosetta(DE3) трансформируют плазмидами pCasp3His-29a и pBir2, высевают на агаризованную среду LB, содержащую 40 мкг/мл канамицина и 75 мкг/мл ампициллина, и выращивают в течение ночи при 37°С. Клетки Е. coli Rosetta(DE3)/pCasp3His 29a/pBir2 смывают с чашек петри средой LB, и инокулируют 1 мл в 100 мл бульона LB, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл канамицина, и выращивают при 37°С и интенсивном перемешивании до достижения ОД=0,5. Добавляют индуктор изопропил-P-D тиогалактопиранозид (ИПТГ) до концентрации 0,1 мМ. Культуру клеток инкубируют в течение 20 часов при 20°С при 180 об./мин. Затем клетки осаждают центрифугированием при 6000 об./мин в течение 10 минут при 4°С при 10000×g. 1 г влажной биомассы суспендируют в 10 мл буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl). Клетки разрушают с использованием ультразвукового дезинтегратора при 10000×g и центрифугируют 30 мин при 10000×g при 4°С. Осветленный клеточный лизат наносят на 1 мл сорбента Ni-NTA (QIAGEN, США) уравновешенного буфером (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl), промывают сначала 10 мл буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl), а затем 10 мл буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl, 50 мМ имидозол) и элюируют 3 мл буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl, 300 мМ имидозол). Электрофореграмма очищенного препарата прокаспазы-3 представлена на (фигура 2).
Пример 5. Экспрессия и очистка прокаспазы-3, слитой с олигогистидиновой последовательностью длиной 9 а.о.
600
Компетентные клетки штамма Е. coli Rosetta(DE3) трансформируют плазмидой pCasp3His-Bir2, высевают на агаризованную среду LB, содержащую 75 мкг/мл ампициллина, и выращивают в течение ночи при 37°С. Клетки Е. coli Rosetta(DE3)/pCasp3His-Bir2 смывают с чашек петри средой LB, и инокулируют 1 мл в 100 мл бульона LB, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, и вымащивают при 37°С и интенсивном перемешивании до достижения ОД=0,5. Добавляют индуктор изопропил-β-D тиогалактопиранозид (ИПТГ) до концентрации 0,1 мМ. Культуру клеток инкубируют в течение 20 часов при 20°С при 180 об./мин. Затем клетки осаждают центрифугированием при 6 000 об./мин в течение 10 минут при 4°С при 10000×g. 1 г влажной биомассы суспендируют в 10 мл буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl). Клетки разрушают с использованием ультразвукового дезинтегратора при 10000×g и центрифугируют 30 мин при 10000×g при 4°С. Осветленный клеточный лизат наносят на 1 мл сорбента Ni-NTA (QIAGEN, США) уравновешенного буфером (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl), промывают сначала 10 мл буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl), а затем 10 мл буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl, 50 мМ имидозол) и элюируют 3 мл буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl, 400 мМ имидозол). Электрофореграмма очищенного препарата прокаспазы-3 представлена на (фигура 2).
Пример 6. Активация прокаспазы-3.
Препарат прокаспазы-3, полученный, как описано в примере 5 или в примере 6, диализуют дважды против 100 объемов буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl, 50 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 10% глицерин и 0,1% CHAPS) в течение 12 часов при 8°С. Затем пробы переносят в микропробирки и инкубируют дополнительно 72 ч при 8°С. Активированный препарат каспазы-3 хранят при -70°С. Активация прокаспазы путем автокаталитического расщепления происходит непосредственно в процессе диализа и последующей инкубации (фигура 3).
Для ускорения процесса активации к препарату прокаспазы-3, полученного, как описано в примере 5 или в примере 6, добавляют активную каспазу-3 в молярном соотношении 100/1, соответственно, и диализуют дважды против 100 объемов буфера (50 мМ HEPES (7,4), 20 мМ NaCl, 50 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА, 10% глицерин и 0,1% CHAPS) в течение 12 асов при 8°С. Затем пробы переносят в микропробирки, инкубируют дополнительно 48 ч при 8°С (фигура 3). Специфическую активность каспазы-3 измеряют на субстрате Ac-DEVD-7AFC (Sigma-Aldrich) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Полученный таким способом препарат каспазы-3 обладает удельной активностью более 5000 ед./мг белка. За одну единицу активности принято количество фермента, который расщепляет 1 пмоль субстрата Ac-DEVD-pNA (pNA: паранитроанилин) за одну минуту при 37°С в реакционной смеси, содержащей 50 мМ HEPES, рН 7,4, 100 мМ NaCl, 0,1% CHAPS, 1 мМ ЭДТА, 10% сахарозы и 5 мМ ДТТ.
Литература
[1] О. Julien и J.A. Wells, «Caspases and their substrates», Cell Death Differ., т. 24, вып. 8, с. 1380, авг. 2017.
[2] S. HR и S. GS, «Biochemical characteristics of caspases-3, -6, -7, and -8», J. Biol. Chem., т. 272, вып. 41, cc. 25719-25723, окт. 1997.
[3] R. J и др., «The three-dimensional structure of apopain/CPP32, a key mediator of apoptosis», Nat. Struct. Biol., т. 3, вып. 7, cc. 619-625, июл. 1996.
[4] S. J, B. SP, K. S, и В. PI, «Recombinant caspase-3 expressed in Pichia pastoris is fully activated and kinetically indistinguishable from the native enzyme», Biochem. Biophys. Res. Commun., т. 238, вып. 3, cc. 920-924, сен. 1997.
[5] K. HJ и др., «Large-scale preparation of active caspase-3 in E. coli by designing its thrombin-activatable precursors», BMC Biotechnol, т. 8, дек. 2008.
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральный исследовательский центр «Пущинский научный центр
биологических исследований Российской академии наук» (ФИЦ ПНЦБИ РАН)
<120> Способ получения каспазы-3
<160> 9 SEQ ID NO
<210> SEQ ID NO: 1
<211> 837
<212> ДНК
Sus scrofa domesticus
<213>
<400>
ATG GCG AAC ACT AAA AAC TCA GTG GAT TCA AAA TCC ATT AAA ACT TTG GAG ACA   54
AAG ATC TTA CAT GGA AGC AAA TCA GTG GAC TCT GGA ATA TCC TTG GAT GTC AGT   108
TAC AAA ATG GAT TAT CCT GAA ATG GGT TTA TGT ATA ATA ATT AAT AAT AAG AAC   162
TTT GAT AAA AAT ACC GGA ATG GCA TGT CGA TCT GGT ACA GAT GTG GAT GCT GCA   216
AAT CTC AGG GAG ACC TTC ACA AAC TTG AAA TAT GAA GTC AGG AAT AAA AAT GAT   270
CTT ACA CGT GAA GAA ATT TTG GAG TTA ATG CAC AGT GTT TCT AAA GAA GAC CAT   324
AGT AAA AGG AGC AGT TTT ATT TGC GTG CTT CTA AGT CAT GGT GAA GAA GGA AAA   378
ATT TTT GGA ACA AAT GGA CCT GTT GAT CTG AAA AAA TTA ACA AGT TTC TTC AGA   432
GGG GAC TGT TGT AGA ACT CTA ACT GGC AAA CCC AAA CTT TTC ATA ATT CAG GCC   486
TGC CGA GGC ACA GAA TTG GAC TGT GGG ATT GAG ACG GAC AGT GGG ACT GAA GAT   540
GAC ATG GCG TGT CAG AAA ATA CCA GTT GAG GCA GAC TTC TTG TAT GCA TAT TCT   594
ACA GCG CCT GGT TAC TAT TCC TGG CGA AAT TCA AAG GAC GGA TCC TGG TTC ATC   648
CAG TCA CTT TGT GCA GCG CTG AAA CAG TAC GCT CAC AAG CTT GAG CTT ATG CAC   702
ATT CTT ACT CGG GTT AAC CGA AAG GTA GCA GTA GAA TTC GAG TCC TTT TCT ACT   756
GAC TCT ACT TTT CAT GCA AAG AAA CAG ATT CCA TGT ATT GTG TCC ATG CTC ACA   810
AAA GAA CTC TAT TTT TTT AAT CAC TAA                  837
<210> SEQ ID NO: 2
<211> 363
<212> ДНК
Sus scrofa domesticus
<213>
<400>
ATG AGA AAT CAT TTT GTT TTA GAA AGG CCA TCT GAG ACT CAT GCA GAC TAT CTT   54
TTG AGA ACT GGA CAG GTT GTA GAC TTA TCA GAC ACC ATA TAC CCG AGG AAC CCT   108
GCC ATG TGT AGT GAA GAA GCT AGA TTA AAG TCG TTT CAG AAC TGG CCA GAC TAT   162
GCT CAC TTA ACC CCT AGA GAG TTA GCT AGT GCT GGA CTC TAC TAC ACA GGT ATT   216
GAT GAT CAG GTG CAG TGC TTT TGT TGT GGC GGG AAA CTG AAA AAT TGG GAA CCA   270
TGT GAT CGT GCA TGG TCA GAA CAC AGG CGG CAC TTT CCT AAT TGC TTT TTT GTT   324
TTG GGC CGG AAT GTT AAT ATT CGA AGT GAA GTC GAC TAG            363
<210> SEQ ID NO: 3
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Sus scrofa domesticus
<223> Олигонуклеотид для получения кДНК прокаспазы-3
<400>
TCGATACATA TGGCGAACAC TAAAAACTCA GTGG                  34
<210> SEQ ID NO: 4
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Sus scrofa domesticus
<223> Олигонуклеотид для получения кДНК прокаспазы-3
<400>
CAGTCTCGAG GTGATTAAAA AAATAGAGTT CTTTTGTGAG CA            44
<210> SEQ ID NO: 5
<211> 38
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Sus scrofa
<223> Олигонуклеотид для получения кДНК Bir2-домена белка X-IAP
domesticus
<400>
TTTTTTCATA TGAGAAATCA TTTTGTTTTA GAAAGGCC                38
<210> SEQ ID NO: 6
<211> 36
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Sus scrofa
<223> Олигонуклеотид для получения кДНК Bir2-домена белка X-IAP
domesticus
<400>
TTTCTCGAGC TATTCACTTC GAATATTAAC ATTCCG                  36
<210> SEQ ID NO: 7
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Sus scrofa domesticus
<223> Олигонуклеотид для получения кДНК прокаспазы-3
с сайтом эндонуклеазы рестрикции Nco I
<400>
AATCCATGGC GAACACTAAA AACTCAGTGG                     30
<210> SEQ ID NO: 8
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Sus scrofa domesticus
<223> Олигонуклеотид для получения кДНК прокаспазы-3
с сайтом эндонуклеазы рестрикции Pst I
<400>
AATCTGCAGT TAGTGATTAA AAAAATAGAG TTCTTTTGTG AGC             43
<210> SEQ ID NO: 9
<211> 52
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
Sus scrofa domesticus
<223> Олигонуклеотид для получения кДНК прокаспазы-3 ,
кодирующий 9 остатков гистидина
<400>
TTAAGTCGAC ATTAATGGTG ATGGTGATGG TGGTGGTGGT GCTCGAGGTG AT      52
<---