ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)PLYSS/PET15B-HISCPF1 - ПРОДУЦЕНТ РНК-НАПРАВЛЯЕМОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ CRISPR/CPF1
ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)PLYSS/PET15B-HISCPF1 STRAIN: PRODUCER OF RNA-GUIDED ENDONUCLEASE CRISPR/CPF1

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения рекомбинантной нуклеазы Cpf1 с помощью штамма бактерий Escherichia coli.
Бактериальный белок Cpf1 является эффекторным белком системы CRISPR, который в комплексе с направляющей (guide) РНК (далее gPHK) генерирует двуцепочечный сайт-специфичный разрыв ДНК с образованием "липких" концов. Нуклеаза CRISPR-Cas Cpf1 (также известная как Casl2a нуклеаза) является аналогом нуклеазы Cas9 и обладает следующими отличительными свойствами: распознавание Т-богатого РАМ-сайта - последовательности, смежной с последовательностью мишени, наличие которой необходимо для нацеливания на мишень; эндонуклеазная активность, при которой в ДНК генерируются липкие 5'-концы ДНК (а не тупые двуцепочечное разрывы, как в случае Cas9); последовательность ДНК расщепляется на дистальном конце от РАМ-сайта (по сравнению с проксимальным расщеплением у Cas9), что уменьшает вероятность нарушения РАМ-сайта и дает возможность проведения нескольких генетических манипуляций в одном месте [1, 2].
6
9
Аналоги на получение штаммов-продуцентов эффекторных белков системы CRISPR/Cas, к которым относятся нуклеазы Cpf1 и Cas9, не выявлены. Ближайшими аналогами являются патенты на получение различных эндонуклеаз рестрикции (например, RU 2529362 C1, RU 2475533 C1). Эндонуклеазы рестрикции, так же как и эффекторные белки системы CRISPR/Cas, используются для генно-инженерных манипуляций и вносят в ДНК двуцепочечные разрывы, однако обладают рядом недостатков, таких как распознавание коротких 6-нуклеотидных последовательностей и неизменная специфичность (распознавание определенной единственной последовательности нуклеотидов). Предлагаемое изобретение решает данные проблемы, поскольку нуклеаза Cpf1 узнает 20-25-нуклеотидную последовательность, что важно при редактировании протяженных ДНК, так вероятность встретить несколько идентичных 6-нуклеотидных последовательностей выше примерно в 10-10 раз. Специфичность к мишени у Cpf1 задается через небольшую молекулу РНК, которую легко синтезировать химическим путем, поэтому один и тот же фермент может применяться для редактирования различных мишеней в отличие от эндонуклеаз рестрикции.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии высокоэффективной продукции активного рекомбинантного фермента Cpf1.
r
Технический результат был достигнут созданием штамма E. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 - продуцента активной рекомбинантной нуклеазы Cpf1, полученного трансформацией культуры клеток E. coli BL21(DE3)pLysS (генотип F-, ompT, hsdSB (rB- mB-), dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cm., рекомбинантной плазмидной ДНК pET15b-HisCpf1, сконструированной на основе вектора pET15b, несущего ген рекомбинантной нуклеазы Cpf1 из бактериального штамма Moraxella bovis.
Штамм Е. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 имеет следующие характеристики:
Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих хлорамфеникол и ампициллин, например, на среде LB (питательная среда LisogenyBroth). На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Клетки растут в интервале температур от 8°С до 43°С, интервал для наиболее эффективного культивирования - 28-38°С, оптимум роста при 37°С. Оптимальный интервал рН для культивирования рН 5-7.
R
Генетические признаки, устойчивость к антибиотикам: генотип исходного штамма Esherichia coli BL21(DE3)pLysS: F- отрТ hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysS(Cam). Проявляет устойчивость к хлорамфениколу (34 мкг/мл), обусловленную наличием гена устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pLysS.
Характеристики полезного вещества, синтезируемого штаммом: рекомбинантный белок Cpf1, длиной 1281 аминокислотных остатков, состоящий из нуклеазы Cpf1 из бактериального штамма Moraxella bovis (1261 аминокислот) и вспомогательной последовательности длиной 20 аминокислот.
Продуктивность штамма - рекомбинантный Cpf1 составляет не менее 21 масс % по массе белка клеточного лизата при культивировании в жидкой среде ТВ (питательная среда TerrificBroth) при 37°С, 200 об/мин, в условиях индукции 1М ИПТГ (1:100) с добавлением антибиотиков хлорамфеникола (34 мкг/мл), ампициллина (100 мкг/мл) и рифампицина (100 мкг/мл).
Культивирование штамма: культивирование при температуре 37°С в термостате или качалке, в агаризованной (2% агара) LB или жидкой ТВ-среде соответственно.
Селективные условия - в культуральную среду добавлены 100 мкг/мл ампициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола.
На фиг. 1 приведены электрофореграммы лизатов клеток E. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 при культивировании в условиях индукции синтеза белка при помощи ИПТГ и без индукции, где М - белковый маркер PrecisionPlusProtein™ Unstained Protein Standards (Bio-rad); К - контрольная неиндуцированная культура, 1-8-1-8 ч после индукции 1М ИПТГ (1:100) соответственно.
Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами получения и использования штамма E. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1.
Пример 1. Создание генетической конструкции, обеспечивающей синтез рекомбинантной нуклеазы Cpf1 в клетках E. coli.
Методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров Cpf1-For (SEQ ID NO 1) и Cpf1-Rev (SEQ ID NO 2) на матрице геномной ДНК штамма Moraxella bovis был амплифицирован ген cpf1 Последовательность нуклеотидов полученного гена совпадает с последовательностью cpf1 Moraxella bovis, имеющейся в GenBank (СР030241.1) Полученный ген был встроен в экспрессирующий вектор pET15b с получением экспрессионной плазмиды pET15b-HisCpf1 (фиг. 2).
Плазмида pET15b-HisCpf1 обеспечивает в клетках Е. coli синтез полноразмерной бактериальной нуклеазы, дополнительно содержащей с N-конца вспомогательную последовательность длиной 20 аминокислот, которая содержит участок, состоящий из 6-ти остатков гистидина (гистидиновая метка), предназначенный для последующей очистки рекомбинантной нуклеазы с помощью металлохелатной хроматографии, а также сайт гидролиза тромбином (протеиназой), позволяющий при необходимости удалить большую часть служебной последовательности при обработке очищенного препарата рекомбинантной нуклеазы тромбином. Нуклеотидная (SEQ ID NO 4) и аминокислотная (SEQ ID NO 5) последовательности рекомбинантной нуклеазы Cpf1 представлены в Приложении 1.
Пример 2. Получение штамма-продуцента рекомбинантной нуклеазы Cpf1 и исследование его продуктивности.
Полученной плазмидой pET15b-HisCpf1 были трансформированы клетки Е. coli штамма BL21(DE3)pLysS, содержащие в своем геноме ген, кодирующий полимеразу фага Т7 под контролем бактериального промотора, индуцируемого лактозой или ИПТГ. Также данный штамм несет плазмиду pLysS, кодирующую ингибитор Т7 полимеразы - лизоцим фага Т7, что существенно снижает базальный уровень экспрессии гена, встроенного под Т7 промотор, что позволяет клонировать даже токсичные для клетки гены. Кроме того, клетки Е. coli BL21(DE3)pLysS дефектны по генам протеаз Ion и ompT. Отсутствие этих двух протеаз уменьшает деградацию гетерологичных белков.
В результате был получен штамм E. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1- продуцент бактериального белка Cpf1.
Для поддержания полученного штамма-продуцента белка Cpf1 использовали плотную агаризованную LB-среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола.
Продуктивность полученного штамма-продуцента изучали путем культивирования клеток в среде ТВ, в термостатированном шейкере роторного типа при температуре 37°С, скорости вращения платформы 200 об/мин. По достижении культурой оптической плотности 3 о.е. индуцировалась экспрессия целевого гена (добавление 1М ИПТГ (1:100), а затем добавление рифампицина до концентрации 100 мкг/мл через 30 минут после начала индукции). При добавлении рифампицина происходит нарушение экспрессии генов домашнего хозяйства, поскольку рифампицин ингибирует ДНК-зависимую РНК-полимеразу у Е. coli, при этом экспрессия целевого белка не нарушается, так как Т7 РНК-полимераза, под промотором которой находится целевой ген, устойчива к действию рифампицина. В качестве контроля использовали неиндуцированную культуру (без добавления ИПТГ). Образцы собранной центрифугированием биомассы клеток лизировали и анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Результат представлен на фиг. 1.
Как видно из фиг. 1, индукция ИПТГ культуры клеток Е. coli BL21(DE3)pLysS/pET 15b-HisCpf1 приводит к синтезу белка с молекулярным весом примерно 147 кДа, что соответствует ожидаемому молекулярному весу для рекомбинантного Cpf1. Анализ денситограммы полиакриламидного геля, представленного на фиг. 1, выполненный с помощью программы CLIQS, показал, что рекомбинантный Cpf1 составляет 21% общего белка клеточного лизата при начальной оптической плотности 3 о.е. и инкубации с ИПТГ и рифампицином в течение 5 часов.
Пример 3. Очистка рекомбинантного Cpf1 и изучение его биологической активности.
Рекомбинантный Cpf1 очищали из клеточных лизатов методом металлохелатной хроматографии с последующим концентрированием белковой фракции сульфатом аммония и обессоливанием при помощи спин-колонок. Результат очистки клеточного лизата Е. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 представлен на фиг. 3, где М - белковый маркер PrecisionPlusProtein™ UnstainedProteinStandards (Bio-rad), 1 - очищенный препарат Cpf1.
Как видно из фиг. 3 препарат Cpf1 является практически гомогенным и его чистота составляет не менее 90% по результатам электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией.
Биологическая активность рекомбинантного Cpf1 оценивалась in vitro, матрицей для гидролиза был выбран фрагмент плазмиды pUC19, линеаризованной при помощи ПЦР. Для постановки гидролиза реакционная смесь, состоящая из буферного раствора, ионов магния, очищенного препарата Cpf1 и gPHK (SEQ ID NO 3), инкубировалась в течение 10 минут при комнатной температуре для образования комплексов фермент-РНК. Далее к реакционной смеси добавляли линеаризованный фрагмент pUC19, смесь инкубировали 10 минут при 37°С в твердотельном термостате. Результаты анализировали в 1% агарозном геле. Результаты экспериментов по определению биологической активности рекомбинантного Cpf1 представлены на фиг. 4, где М - ДНК-маркер 1 кб (СибЭнзим), К - контрольная исходная матрица pUC19, 1-3 - препараты ДНК после гидролиза, соотношение ДНК:РНК/Cpf1 = 1:1, 1:2, 1:3 соответственно.
Из фиг. 4 следует, что рекомбинантный Cpf1, продуцируемый клетками штамма Е. coli ВЕ21(ОЕ3)pLysS/pET15b1Cpf1, обладает биологической активностью и при мольном соотношении ДНК:РНК:Cpf1=1:3 гидролиз протекает на 100%.
Использованные источники информации
1. Zetsche B. и др. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System // Cell. 2015. T. 163, №3. C. 759-771.
2. Shmakov S. и др. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems // Mol. Cell. NIH Public Access, 2015. T. 60, №3. C. 385-397.
--->
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Escherichia coli
<120>  Штамм BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 – продуцент
РНК-направляемой эндонуклеазы CRISPR/Cpf1
<160>  5
<210>  1
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Искусственная последовательность
<400>  1
Cgcgcggcagccatatgttatttcaagagtttacccattt                 40
<210>  2
<211>  35
<212>  DNA
<213>  Искусственная последовательность
<400>  2
Gttagcagccggatcttagcggttttgagcgaagt                      35
<210>  3
<211>  43
<212>  RNA
<213>  Искусственная последовательность
<400>  3
Aaauuucuacuguuuguagaucucacauguucuuuccugcguu             43
<210>  4
<211>  43
<212>  DNA
<213>  Искусственная последовательность
<400>  4
atgttatttc aagagtttac ccatttatat cccctatcaa aaaccgtgcg ttttgaatta        60
aagcccattg gcaagacatt agagcatatc catgccaaaa actttttgag ccaagatgag       120
accatggcgg acatgtacca aaaggtgaag gcgatgttgg acgattatca tcgtgatttt       180
atcgctgata tgatgggcga agttaagcta actaagctgg cagaatttta tgatgtgtat       240
ttaaaattta gaaaaaatcc caaagacgat ggattgcaaa aacagctaaa ggacttgcaa       300
gcagttttaa gaaaagagat tgtgaagccc atcggtaatg gcggaaaata caaggcgggt       360
tatgaccgct tgtttggggc aaagctcttt aaggacggca agaagcttgg tgatttggcg       420
aaatttgtca tcgcccaaga gggcgactca tcacccaagc ttgctcacct tgcccatttt       480
gagaagttta gcacttactt tactggcttt catgacaacc gcaaaaacat gtacagcgat       540
gaggataaac acacctccat tgcctatcgt ctgattcatg aaaacttacc acgctttatt       600
gacaacctac aaatactgac aaccatcaaa caaaagcact cggcgttgta tgaccagatt       660
ataaatgagc tgactgcgag tggcttggat gtgtcgctgg caagtcatct ggacggctat       720
cacaagcttt taacccaaga gggtatcacg gcttataata ccctgcttgg cggtatcagt       780
ggcgaggcag gttctcgcaa gataaaaggt atcaatgagc ttatcaatag tcatcacaac       840
caacattgcc acaaatccga acgtatcgcc aaattacgcc ccctgcacaa acaaatccta       900
agcgacggca tgggtgtgtc atttttgcca agcaaatttg ctgatgacag cgaagtttgt       960
caagcggtca atgaatttta ccgccattat gctgatgttt ttgccaaggt gcaaagctta      1020
tttgatgggt ttgatgacta tcaaaaggac ggcatttatg ttgagcataa aaatttaaat      1080
gaactatcca agcaggcatt tggtgatttt gccttgttgg gtcgggtgtt agacggctat      1140
tatgtggatg tggtgagtcc agagtttaat gagagatttg ccaaagccaa aaccgacaat      1200
gccaaagaaa aactaacaaa agaaaaagac aaattcatca aaggcgtgca ttccttggca      1260
agccttgagc aggcgataga gcattatact gctaggcatg atgatgagtc tgtgcaggcg      1320
ggcaaacttg gacagtattt caaacacggt ctggcaggcg tggacaatcc aatccaaaaa      1380
atacacaaca accacagcac cattaagggt tttttggagc gtgaacgtcc agcaggcgag      1440
cgagcattgc ccaaaattca gttaggcaaa aaccctgaaa tcaggcaact aaaagagctg      1500
ctagacaaca ccctaaacgt ggtgcatttt gccaagttat taacgaccaa aaccacgcta      1560
gacaaccaag acggcaattt ttatggtgag tttggggcgt tgtatgatga gcttgccaag      1620
attcccacgc tttataacaa agtgcgtgat tatctgtcgc aaaagccatt tagcaccgaa      1680
aaatataaat taaactttgg caatccgaca ttattaaacg ggtgggattt gaataaagaa      1740
aaagataatt ttggggttat cttacaaaaa gacggttgtt attatttggc gttattagat      1800
aaagctcata aaaaagtatt tgataatgct ccaaatacag gcaaaaatat ttatcaaaaa      1860
atgatttata aattattgcc cggacctaat aaaatgctac ccaaagtatt ttttgccaag      1920
agtaatttgg attattataa cccttctgct gaactactgg ataaatatgc aaaaggcacg      1980
cacaaaaaag gcgataattt taatctaaaa gactgccatg cgttgattga tttttttaag      2040
gcgggtatta ataaacatcc agaatggcaa cattttggtt ttaaattttc gccaaccagt      2100
agctatcagg atttgagtga tttttataga gaagtcgaac cacaaggtta tcaagtaaaa      2160
tttgtggata tcaacgccga ttatattgac gagttggttg aacaaggtca gttgtattta      2220
ttccagattt ataataaaga tttctcgccc aaggctcacg gtaagcccaa tttgcatact      2280
ctgtatttta aggcgttgtt tagcgaagat aaccttgccg atccaattta taaattaaat      2340
ggcgaggcac agatatttta tcgtaaggca tctttggata tgaatgaaac caccattcat      2400
cgtgcaggcg aggtattaga aaataaaaat cctgataatc caaaaaagcg tcaatttgtc      2460
tatgacatca tcaaagataa acgctatacc caagataagt ttatgctaca tgtacctatt      2520
accatgaatt ttggtgtgca gggcatgacg attaaagaat ttaataaaaa agttaatgaa      2580
agcatacagc aatatgatga ggtgaatgtc ataggcatag accgtggaga gcgacatttg      2640
ctatatctga ccgtgattaa tagcaaaggc gaaatcttag aacagcgtag tctcaatgac      2700
atcatcacca catcggcaaa tggtacacaa atgaccacgc attatcataa aatactagac      2760
aagagagaaa tagaacgcct aaatgctcgt gtcggttggg gtgagattga gaccataaaa      2820
gagctaaaat cgggctatct aagccatgtg gtacatcaaa tcagccagct tatgcttaaa      2880
tataatgcca ttgtggtgtt agaggattta aattttgggt ttaaacgtgg tcgctttaag      2940
gtggaaaaac aaatttacca aaactttgaa aacgccttaa tcaaaaagct aaaccatttg      3000
gtattaaaag ataaggcaga tgatgagatt ggctcataca aaaatgccct gcaactgacc      3060
aataatttta ctgatctaaa aagcattggc aaacaaacag gctttttatt ctatgtgcct      3120
gcatggaata ccagtaaaat agaccctgaa acgggctttg tggatttgtt aaaaccacgt      3180
tatgaaaata tcgctcagtc gcaagcgttt tttggtaaat ttgataagat ttgttataac      3240
gcagataagg gttattttga atttcatatt gattatgcca aatttactga caaagccaaa      3300
aactctcgcc aaaaatggac gatttgctcg catggcgata aacgttatgt gtatgacaaa      3360
accgccaata aaaataaagg aacgacaaag ggtattaatg tcaatgatga attaaaatcg      3420
ctatttgctc gtcatcacat caatgaaaaa cagccaaatc tggtcatgga tatttgccaa      3480
aataacgata aagaatttca taaatcgctg atgtatctat taaagacatt gcttgcatta      3540
agatatagta acgccagtag cgatgaagat tttattttat cgcctgtggc aaatgatgag      3600
ggtgtgtttt ttaattcggc attggcggat gatacacagc cacaaaatgc ggacgccaat      3660
ggggcgtatc atatcgcatt aaagggctta tggctattaa atgaactaaa agacagcgat      3720
gatttgaata aagtcaaact tgccattgac aatcaaacat ggctaaactt cgctcaaaac      3780
cgctaa                                                                 3786
<210>  5
<211>  43
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<400>  5
Met Leu Phe Gln Glu Phe Thr His Leu Tyr Pro Leu Ser Lys Thr Val
1                 5                  10                  15
Arg Phe Glu Leu Lys Pro Ile Gly Lys Thr Leu Glu His Ile His Ala
20                  25                  30
Lys Asn Phe Leu Ser Gln Asp Glu Thr Met Ala Asp Met Tyr Gln Lys
35                  40                  45
Val Lys Ala Met Leu Asp Asp Tyr His Arg Asp Phe Ile Ala Asp Met
50                  55                  60
Met Gly Glu Val Lys Leu Thr Lys Leu Ala Glu Phe Tyr Asp Val Tyr
65                   70                  75                  80
Leu Lys Phe Arg Lys Asn Pro Lys Asp Asp Gly Leu Gln Lys Gln Leu
85                  90                  95
Lys Asp Leu Gln Ala Val Leu Arg Lys Glu Ile Val Lys Pro Ile Gly
100                 105                 110
Asn Gly Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Tyr Asp Arg Leu Phe Gly Ala Lys
115                 120                 125
Leu Phe Lys Asp Gly Lys Lys Leu Gly Asp Leu Ala Lys Phe Val Ile
130                 135                 140
Ala Gln Glu Gly Asp Ser Ser Pro Lys Leu Ala His Leu Ala His Phe
145                 150                 155                 160
Glu Lys Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Gly Phe His Asp Asn Arg Lys Asn
165                 170                 175
Met Tyr Ser Asp Glu Asp Lys His Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Leu Ile
180                 185                 190
His Glu Asn Leu Pro Arg Phe Ile Asp Asn Leu Gln Ile Leu Thr Thr
195                 200                 205
Ile Lys Gln Lys His Ser Ala Leu Tyr Asp Gln Ile Ile Asn Glu Leu
210                 215                 220
Thr Ala Ser Gly Leu Asp Val Ser Leu Ala Ser His Leu Asp Gly Tyr
225                 230                 235                 240
His Lys Leu Leu Thr Gln Glu Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Thr Leu Leu
245                 250                 255
Gly Gly Ile Ser Gly Glu Ala Gly Ser Arg Lys Ile Lys Gly Ile Asn
260                 265                 270
Glu Leu Ile Asn Ser His His Asn Gln His Cys His Lys Ser Glu Arg
275                 280                 285
Ile Ala Lys Leu Arg Pro Leu His Lys Gln Ile Leu Ser Asp Gly Met
290                 295                 300
Gly Val Ser Phe Leu Pro Ser Lys Phe Ala Asp Asp Ser Glu Val Cys
305                 310                 315                 320
Gln Ala Val Asn Glu Phe Tyr Arg His Tyr Ala Asp Val Phe Ala Lys
325                 330                 335
Val Gln Ser Leu Phe Asp Gly Phe Asp Asp Tyr Gln Lys Asp Gly Ile
340                 345                 350
Tyr Val Glu His Lys Asn Leu Asn Glu Leu Ser Lys Gln Ala Phe Gly
355                 360                 365
Asp Phe Ala Leu Leu Gly Arg Val Leu Asp Gly Tyr Tyr Val Asp Val
370                 375                 380
Val Ser Pro Glu Phe Asn Glu Arg Phe Ala Lys Ala Lys Thr Asp Asn
385                 390                 395                 400
Ala Lys Glu Lys Leu Thr Lys Glu Lys Asp Lys Phe Ile Lys Gly Val
405                 410                 415
His Ser Leu Ala Ser Leu Glu Gln Ala Ile Glu His Tyr Thr Ala Arg
420                 425                 430
His Asp Asp Glu Ser Val Gln Ala Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Phe Lys
435                 440                 445
His Gly Leu Ala Gly Val Asp Asn Pro Ile Gln Lys Ile His Asn Asn
450                 455                 460
His Ser Thr Ile Lys Gly Phe Leu Glu Arg Glu Arg Pro Ala Gly Glu
465                 470                 475                 480
Arg Ala Leu Pro Lys Ile Gln Leu Gly Lys Asn Pro Glu Ile Arg Gln
485                 490                 495
Leu Lys Glu Leu Leu Asp Asn Thr Leu Asn Val Val His Phe Ala Lys
500                 505                 510
Leu Leu Thr Thr Lys Thr Thr Leu Asp Asn Gln Asp Gly Asn Phe Tyr
515                520                  525
Gly Glu Phe Gly Ala Leu Tyr Asp Glu Leu Ala Lys Ile Pro Thr Leu
530                 535                 540
Tyr Asn Lys Val Arg Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Pro Phe Ser Thr Glu
545                 550                 555                 560
Lys Tyr Lys Leu Asn Phe Gly Asn Pro Thr Leu Leu Asn Gly Trp Asp
565                 570                 575
Leu Asn Lys Glu Lys Asp Asn Phe Gly Val Ile Leu Gln Lys Asp Gly
580                 585                 590
Cys Tyr Tyr Leu Ala Leu Leu Asp Lys Ala His Lys Lys Val Phe Asp
595                 600                 605
Asn Ala Pro Asn Thr Gly Lys Asn Ile Tyr Gln Lys Met Ile Tyr Lys
610                 615                 620
Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe Phe Ala Lys
625                 630                 635                 640
Ser Asn Leu Asp Tyr Tyr Asn Pro Ser Ala Glu Leu Leu Asp Lys Tyr
645                 650                 655
Ala Lys Gly Thr His Lys Lys Gly Asp Asn Phe Asn Leu Lys Asp Cys
660                 665                 670
His Ala Leu Ile Asp Phe Phe Lys Ala Gly Ile Asn Lys His Pro Glu
675                 680                 685
Trp Gln His Phe Gly Phe Lys Phe Ser Pro Thr Ser Ser Tyr Gln Asp
690                 695                 700
Leu Ser Asp Phe Tyr Arg Glu Val Glu Pro Gln Gly Tyr Gln Val Lys
705                 710                 715                 720
Phe Val Asp Ile Asn Ala Asp Tyr Ile Asp Glu Leu Val Glu Gln Gly
725                 730                 735
Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Pro Lys Ala
740                 745                 750
His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Lys Ala Leu Phe Ser
755                 760                 765
Glu Asp Asn Leu Ala Asp Pro Ile Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Gln
770                 775                 780
Ile Phe Tyr Arg Lys Ala Ser Leu Asp Met Asn Glu Thr Thr Ile His
785                 790                 795                 800
Arg Ala Gly Glu Val Leu Glu Asn Lys Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys
805                 810                 815
Arg Gln Phe Val Tyr Asp Ile Ile Lys Asp Lys Arg Tyr Thr Gln Asp
820                 825                 830
Lys Phe Met Leu His Val Pro Ile Thr Met Asn Phe Gly Val Gln Gly
835                 840                 845
Met Thr Ile Lys Glu Phe Asn Lys Lys Val Asn Glu Ser Ile Gln Gln
850                 855                 860
Tyr Asp Glu Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu
865                 870                 875                 880
Leu Tyr Leu Thr Val Ile Asn Ser Lys Gly Glu Ile Leu Glu Gln Arg
885                 890                 895
Ser Leu Asn Asp Ile Ile Thr Thr Ser Ala Asn Gly Thr Gln Met Thr
900                 905                 910
Thr His Tyr His Lys Ile Leu Asp Lys Arg Glu Ile Glu Arg Leu Asn
915                 920                 925
Ala Arg Val Gly Trp Gly Glu Ile Glu Thr Ile Lys Glu Leu Lys Ser
930                 935                 940
Gly Tyr Leu Ser His Val Val His Gln Ile Ser Gln Leu Met Leu Lys
945                 950                 955                 960
Tyr Asn Ala Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Asn Phe Gly Phe Lys Arg
965                 970                 975
Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Ile Tyr Gln Asn Phe Glu Asn Ala
980                 985                 990
Leu Ile Lys Lys Leu Asn His Leu Val Leu Lys Asp Lys Ala Asp Asp
995                1000                1005
Glu Ile Gly Ser Tyr Lys Asn Ala Leu Gln Leu Thr Asn Asn Phe Thr
1010                1015                1020
Asp Leu Lys Ser Ile Gly Lys Gln Thr Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro
1025               1030                1035                1040
Ala Trp Asn Thr Ser Lys Ile Asp Pro Glu Thr Gly Phe Val Asp Leu
1045                1050               1055
Leu Lys Pro Arg Tyr Glu Asn Ile Ala Gln Ser Gln Ala Phe Phe Gly
1060                1065                1070
Lys Phe Asp Lys Ile Cys Tyr Asn Ala Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe
1075                 1080               1085
His Ile Asp Tyr Ala Lys Phe Thr Asp Lys Ala Lys Asn Ser Arg Gln
1090                1095               1100
Lys Trp Thr Ile Cys Ser His Gly Asp Lys Arg Tyr Val Tyr Asp Lys
1105               1110                1115                 1120
Thr Ala Asn Lys Asn Lys Gly Thr Thr Lys Gly Ile Asn Val Asn Asp
1125                1130               1135
Glu Leu Lys Ser Leu Phe Ala Arg His His Ile Asn Glu Lys Gln Pro
1140                1145                1150
Asn Leu Val Met Asp Ile Cys Gln Asn Asn Asp Lys Glu Phe His Lys
1155                1160                1165
Ser Leu Met Tyr Leu Leu Lys Thr Leu Leu Ala Leu Arg Tyr Ser Asn
1170                1175                1180
Ala Ser Ser Asp Glu Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val Ala Asn Asp Glu
1185                1190                1195                1200
Gly Val Phe Phe Asn Ser Ala Leu Ala Asp Asp Thr Gln Pro Gln Asn
1205                 1210                1215
Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Leu Trp Leu
1220                1225                1230
Leu Asn Glu Leu Lys Asp Ser Asp Asp Leu Asn Lys Val Lys Leu Ala
1235                1240               1245
Ile Asp Asn Gln Thr Trp Leu Asn Phe Ala Gln Asn Arg
1250                1255                1260
<---