СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ D-АНТИГЕНА ПОЛИОВИРУСОВ 1-3 ТИПОВ
METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF D-ANTIGEN OF POLIOVIRUSES OF 1-3 TYPES

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, вакцинологии и вирусологии и предназначено для лабораторной идентификации D-антигена полиовирусов 1-3 типов в инфицированных культурах клеток и в препаратах инактивированной полиовирусной вакцины. Изобретение касается получения поливалентного препарата (к полиовирусам 1-3 типов) антител класса Y (IgY), выделяемых из желтков яиц иммунизированных куриц, и его применению в качестве иммуносорбента в комбинации с иммуноглобулинами класса G (IgG) кролика против типов полиовируса 1, 2 и 3 в качестве детекторных антител раздельно для количественного определения D-антигена полиовирусов 1, 2 и 3 типов в иммуноферментном анализе (ИФА).
Изобретение может быть использовано в производстве инактивированных полиовирусных вакцин (из диких и аттенурованных штаммов полиовирусов) для контроля содержания D-антигена - основного показателя качества вакцины как профилактического препарата, вызывающего защитный иммунитет (иммуногенность вакцины).
Уровень техники
Заключительный этап глобальной ликвидации полиомиелита предусматривает прежде всего изменения в стратегии вакцинации, а именно: синхронизацию работы по прекращению плановой иммунизации с помощью пероральной аттенуированной полиовирусной вакцины (ОПВ) и разработку более безопасных процессов изготовления инактивированных полиовирусных вакцин (ИПВ) и приемлемых стратегий их использования (Исполнительный комитет ВОЗ, 10 января 2008 г.). Многолетний опыт применения ИПВ и ОПВ показал, что ОПВ эффективна в популяциях, где циркулируют дикие полиовирусы, то есть на первых этапах борьбы с полиомиелитом, когда центральным моментом является создание коллективного иммунитета. В странах и регионах, где циркуляция диких полиовирусов прекращена (среди них - Российская Федерация), применение только ОПВ нерационально и небезопасно (вакциноассоциированный полиомиелит, возникновение штаммов-ревертантов); в таких условиях комбинация ИПВ/ОПВ становится стратегией выбора. В дальнейшем целесообразен переход исключительно на ИПВ, то есть на заключительном этапе выполнения программы ликвидации полиомиелита и в последующем периоде времени (контроль данного заболевания) ИПВ будет основным средством профилактики полиомиелита.
Создание любого варианта ИПВ (на основе диких, аттенуированных или рекомбинантных штаммов полиовирусов) неизбежно связано с разработкой метода количественного определения D-антигена (выражается в D-антигенных единицах, DU/ДАГ ЕД) - основного показателя потенциальной способности вакцины вызывать защитный иммунитет у вакцинированных лиц. Ведущие производители коммерческих ИПВ (например, Sanofi Pasteur, Франция; GlaxoSmithKline, Великобритания) для определения D-антигена используют различные варианты ИФА собственной разработки. Эти системы ИФА основаны на использовании специфических (против полиовирусов) поликлональных антител млекопитающих, в частности, от кроликов (http://www.faqs.org/patents/app/20100040647). Однако известно, что использование антител млекопитающих (кроликов) для систем ИФА сопряжено с рядом негативных моментов, прежде всего, с возможностью неспецифических взаимодействий данных антител в другими компонентами ИФА (детекторными антителами, ферментным конъюгатом), что выражается в получении ложноположительных результатов анализа (Schade R., Calzado E.G., Sarmiento R. et al. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine// ATLA. - 2005. - Vol.33. - P. 129-154). Раскрытие изобретения Задача, решаемая изобретением, заключается в конструировании комбинированной системы ИФА для количественного определения D-антигена в препаратах ИПВ: в качестве иммуносорбента используется поливалентный (против трех типов полиовируса) препарат высокоактивных специфических антител класса Y (IgY), полученный авторами изобретения из яичных желтков иммунизированных куриц, функционально соответствующих антителам млекопитающих, а в качестве вторичных (детекторных) антител - моновалентные препараты иммуноглобулина класса G (IgG) кроликов раздельно против типов полиовируса 1, 2 и 3.
Решение задачи обеспечивается установленной изобретением возможностью получения из яичных желтков куриц, иммунизированных полиовирусами (или препаратами коммерческих ИПВ), специфических антител (IgY). Предлагаемый метод сокращает срок получения антител за счет более короткого цикла иммунизации при одновременном увеличении выхода антител за счет того, что кладка яиц каждым продуцентом происходит ежедневно или через день в течение 3-4 месяцев, а содержание антител в одном желтке соответствует количеству антител в 25-30 мл специфической сыворотки, получаемой в результате кровопускания у иммунизированного кролика. Несмотря на принципиальное сходство двух аналогов (IgG млекопитающих и IgY птиц, чьи биохимические характеристики хорошо изучены), IgY обладает рядом преимуществ, особенно ценных для его использования в диагностических целях в качестве иммунных реагентов: 1) высокая иммунореактивность птиц по отношению к чужеродным белкам инфекционного происхождения (вирусных, бактериальных, паразитарных), а также к белкам токсинов и ядов; 2) низкая перекрестная реактивность с белками млекопитающих за счет большой филогенетической дистанции между птицами и млекопитающими: неспособность IgY активировать систему комплемента млекопитающих, неспособность связываться с ревматоидным фактором, Fc-рецепторами, что обеспечивает низкий уровень неспецифических реакций. Таким образом, варианты ИФА на основе специфических антител птиц представляют собой новый и перспективный класс диагностических систем, в частности, для определения вирусных антигенов, включая D-антигены полиовирусов. Осуществление изобретения
Изобретение заключается в том, что IgY получают из желтка яиц иммунизированных куриц 5-6 месячного возраста. Куриц иммунизируют вируссодержащими культуральными жидкостями (ВЮК), полученными в результате заражения аутентичных перевиваемых клеток НЕр-2-С (клетки эпителиальной карциномы человека) прототипными штаммами аттенуированных полиовирусов (штаммы Сэбина) 3-х серотипов (1 тип -LSc2ab; 2 тип - Р 712 Ch 2ab; 3 тип - Leon 12ai b), либо коммерческой ИПВ (из диких полиовирусов 3-х типов) производства Sanofi Pasteur, Франция, сконцентрированной в 10 раз. IgY выделяют из желтка яиц последовательно высаливанием с помощью сульфата натрия (Е.М. Akita, S. Nakai. Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E.coli strain. J. Immunol. Methods. 1993, 160: 207-214) и аффинной хроматографией. IgG кроликов (селективные детекторные антитела) получают стандартным методом:
раздельной иммунизацией кроликов вышеуказанными штаммами Сэбина (ВКЖ) с последующей аффинной хроматографией (на колонке с Protein A процедура не представлена). Уровень нейтрализующей активности и специфичность IgY и IgG определяют в реакции нейтрализации (РН), проводимой микрометодом в перевиваемых клетках НЕр-2-С (Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание. ВОЗ. Женева. 2005).
Изобретение иллюстрируется следующими примерами
Примеры
Пример 1. Получение IgY против трех типов полиовируса
Иммунизация куриц
1.
Используют несущихся куриц породы Леггорн 5-6 месячного возраста. Иммуногены представляют собой вируссодержащие культуральные жидкости (ВКЖ), полученные в результате заражения перевиваемых клеток RD и НЕр-2-С, либо коммерческую ИПВ (из диких полиовирусов 3-х типов) производства Sanofi Pasteur, Франция, сконцентрированную в 10 раз. Цикл иммунизации включает трехкратное введение иммуногена (по 1,0 мл в 4 точки пекторальных мышц) с интервалами в 1 месяц. Сбор яиц начинают через 2-4 недели после завершения полного цикла иммунизации. Яйца хранят до 2-х месяцев при 4°С; желтки хранят неопределенно долгое время при - 20°С.
2. Выделение IgY из желтков методом высаливания сульфатом натрия
FNa^SOA
2.1. Прибавляют к одному куриному желтку (средний объем 15-20 мл) 9 объемов охлажденной воды для инъекций (ФС 42-2620-97).
2.2. Гомогенизируют смесь осторожным перемешиванием и выдерживают раствор 18 часов при 4°С.
2.3. Отделяют раствор, содержащий IgY, от преципитата фильтрованием через фильтровальную бумагу Whatman с высокой скоростью фильтрации.
2.4. Разбавляют фильтрат водой для инъекций до объема 175 мл.
2
4
2.5. Помещают емкость с раствором на роторную мешалку с подогревом до 40°С и медленно добавляют 33,5 г NaSO (хч) при постоянном перемешивании.
2.6. Продолжают перемешивание в течение 15 мин. после полного растворения.
2.7. Переносят раствор в центрифужный стакан и центрифугируют при 10 000 g в течение 20 мин при 25°С.
2.8. Удаляют надосадочную жидкость.
2.9. Подсушивают хорошо видимый осадок при комнатной температуре.
2.10. Растворяют осадок в 20 мл стандартного фосфатно-солевого буфера (ФСБ) рН 7,2-7,4 при 25°С.
2
4
2.11. Медленно добавляют в раствор 2,8 г NaS0 (хч).
2.12. Выдерживают раствор 15 мин при 25°С после полного исчезновения осадка.
2.13. Центрифугируют раствор при 12 000 в течение 10 мин при 25°С.
2.14. Удаляют надосадочную жидкость.
2.15. Подсушивают осадок при комнатной температуре.
2.16. Растворяют осадок в 5,0 мл ФСБ.
2.17. Переносят осадок в диализный мешок (диаметр 1,0 см).
2.18. Проводят диализ против 2 Л ФСБ при 4°С.
2.19. Стерилизуют полученный препарат IgY фильтрацией через фильтр Millipore (0,45 ммк).
2.20. Сохраняют стерильный препарат IgY при 4°С (несколько месяцев) или при - 20°С (неопределенно долго).
Среднее содержание белка в препаратах составляет 5-10 мг/мл (определение по поглощению при 280 нм).
3. Очистка IgY на аффинной колонке HiTrap (Amersham) согласно инструкции от производителя
Объем колонки: 5 мл Вместимость колонки: 100 мг IgY
2
4
Скорость элюции: 5 мл/мин (максимальная скорость: 20 мл/мин) Связывающий буфер: 20 мМ фосфат натрия +0,5 М KSO, рН 7,5 Буфер для элюции: 20 мМ фосфат натрия, рН 7,5 Очищающий буфер: 20 мМ фосфат натрия, рН 7,5 с 30% изопропанола Перед использованием указанные буферы стерилизуют через фильтр 0,45 ммк.
2
4
К препарату IgY (после высаливания из куриного желтка) добавляют КSОдо концентрации 0,5 М, рН доводят до 7,5. Перед нанесением на колонку полученный препарат стерилизуют через фильтр 0,45 ммк. Процедура очистки IgY (проводят при комнатной температуре)
3.1. Промывают колонку минимум 5 объемами каждого из указанных буферов (последовательно): связывающим, для элюции и очищающим.
3.2. Уравновешивают колонку 5 объемами связывающего буфера.
3.3. Наносят образец.
3.4. Промывают колонку минимум 10 объемами связывающего буфера (или до полного отсутствия белка в элюате).
3.5. Элюируют IgY 10 объемами буфера для элюции.
3.6. Определяют содержание белка в аффинно очищенном препарате IgY (по поглощению при 280 нм), стерилизуют через фильтр 0,45 ммк, хранят при +4-8°С до 1 года. Для неопределенно длительного хранения добавляют глицерин (до 50%) и хранят при -20°С.
Пример 2. Определение специфической активности IgY и IgG в РН.
50
Основным показателем качества антител является их специфическая активность, выраженная в титрах антител. Определение специфической активности IgY и IgG проводят в функциональном тесте - реакции нейтрализации, осуществляемой микрометодом с использованием в качестве индикаторных систем перевиваемых клеток НЕр-2-С. Титр IgY или IgG измеряют по результатам подавления цитопатического эффекта (ЦПЭ), развивающегося в индикаторных клетках под действием испытуемого вируса. Титр IgY или IgG эквивалентен величине его разведения, способного нейтрализовать 100 (32-320) тканевых цитотоксических доз (ТЦД) гомологичного вируса.
Специфическую активность IgY или IgG определяют следующим образом.
1. В среде Игла MEM (ТУ 9385-012-01895045-2007) готовят разведение IgY или IgG 1:8.
2. Инактивируют IgG (IgY не подлежит инактивации) в разведении 1:8 в течение 30 мин при 56°С.
3. Готовят последовательные двукратные разведения инактивированного IgG или IgY до 1:32 768.
4. Вносят по 0,025 мл каждого последовательного разведения IgY или IgG, начиная от 1:8, в каждые 4 лунки 96-луночной панели для микротитрования («Costar» или его аналог).
50
6. Добавляют в каждую лунку с разведениями IgY или IgG по 0,025 мл разведения гомологичного вируса, содержащего 100 (32-320) ТЦД (рабочая концентрация вируса)ю
7. Помещают панель с содержимым на 3 часа в СС>2-инкубатор с 5% С02 при 36°С.
8. Готовят суспензию индикаторных клеток НЕр-2-С.
9. Удаляют из флакона с полностью сформированным монослоем клеток питательную среду Игла MEM.
10. Однократно промывают монослой клеток раствором Эрла (ТУ 9385-005-01895045-20011).
11. Вносят во флакон с монослоем клеток НЕр-2-С подогретую до 36°С смесь из эквивалентных объемов раствора Версена (ТУ 9385-008-01895045-2007) и трипсина (ТУ 9385-01895045-2007) в количествах, достаточных для покрытия монослоя клеток.
12. Удаляют растворы после 15-30 сек. контакта с клетками.
13. Помещают флакон в термостат при 36°С.
14. Выдерживают флаконы в термостате до отслоения клеток от поверхности флакона.
15. Ресуспендируют отделившиеся клетки в 10,0 мл среды роста, состоящей из 95% среды Игла MEM и 5% сыворотки крови плодов коровы ("Gibco", кат. №10106-169, США).
16. Разводят 0,1 мл суспензии клеток в ростовой среде до 1:10.
17. Подсчитывают в приготовленном разведении концентрацию жизнеспособных клеток с помощью счетной камеры Горяева.
4
18. Готовят в среде роста разведение, содержащее 1-2х10 соответствующих индикаторных клеток в 0,1 мл (рабочая концентрация клеток).
19. Вносят в каждую лунку со смесью IgY или IgG и вируса по 0,1 мл суспензии клеток в рабочей концентрации.
2
2
20. Панель заклеивают стерильной адгезивной пленкой, накрывают крышкой и помещают на 5-7 дней в СО -инкубатор с 5% СO при 36°С.
21. Ежедневно с помощью инвертированного микроскопа определяют наличие и степень проявления ЦПЭ вируса в клетках. При каждом измерении активности IgY или IgG предусмотрены следующие виды контролей, проводимые одновременно с основным опытом: контроль рабочей концентрации гомологичного вируса, контроль токсичности IgY или IgG, контроль качества индикаторных клеток.
Контроль рабочей концентрации гомологичного вируса
1. Вносят по 0,025 мл разведения, содержащего рабочую концентрацию гомологичного вируса, и три последующие десятикратные разведения в две лунки панели.
2. Добавляют в те же лунки 0,025 мл среды Игла MEM.
2
2
3. Помещают панель с содержимым на 3 часа в СО - инкубатор с 5% СO при 36°С.
4. Добавляют в те же лунки по 0,1 суспензии индикаторных клеток в рабочей концентрации.
2
2
5. Помещают панель с содержимым на 5-7 дней в СО - инкубатор с 5% СО при 36°С.
Последующие этапы контроля соответствуют пп.20-21 раздела, который касается определения специфической активности IgY или IgG.
Контроль цитотоксичности IgY или IgG
1. Вносят по 0,025 мл каждого последовательного двукратного разведения IgY или IgG от 1:8 до 1: 512 в 4 лунки панели.
2. Добавляют в те же лунки по 0,025 мл среды Игла MEM.
3. Добавляют в те же лунки по 0,1 мл суспензии индикаторных клеток в рабочей концентрации.
Контроль качества индикаторных клеток
Последующие этапы контроля соответствуют пп.20-21 раздела, который касается определения специфической активности IgY или IgG.
1. Вносят по 0,05 мл среды Игла MEM в 10 лунок панели.
2. Добавляют в каждую лунку по 0,1 мл суспензии клеток в рабочей концентрации.
Последующие этапы контроля соответствуют пп.20-21 раздела, который касается определения специфической активности IgY или IgG.
Титр нейтрализующих антител определяют по последнему разведению IgY или IgG, которое нейтрализует 100 (32-320) ТЦД5о гомологичного вируса (отсутствие ЦПЭ в индикаторных клетках), либо по формуле Кербера (Руководство по лабораторным исследованиям полиомиелита. 4-е издание. ВОЗ. Женева. 2005). Препараты IgY или IgG с титрами нейтрализующих антител ≥1:1024 пригодны для конструирования систем ИФА для определения D-антигена полиовирусов.
Пример 3. ИФА для определения D-антигена полиовирусов в препаратах ИПВ
Используется непрямой вариант ИФА. 1. Иммунопанель с высокой сорбционной емкостью (Costar, кат.№9018) сенсибилизируют аффинно очищенным IgY к трем полиовирусам: в лунки панели вносят по 0,1 мл раствора IgY в концентрации 20 мкг/мл в карбонат-гидрокарбонатном буфере рН 9,6 (Sigma, кат.№С3041-100 CAP), панель накрывают крышкой и инкубируют 18 час. при (+) 4-8°С или 3 час. при (+) 37°С.
2. Содержимое лунок вытряхивают, панель постукивают по нескольким слоям фильтровальной бумаги (в положении вверх дном) для удаления остатков иммуносорбента (IgY). Лунки промывают 3 раза фосфатно-солевым буфером (ФСБ) рН 7,2 (Sigma, кат.№Р4417-100ТАВ) с 0,05% Tween-20 (Sigma, кат. №PI 379-100ml) - ФСБ-Т, внося раствор до края лунок и сразу же удаляя его. Вносят в лунки по 0,2 мл 1% раствора фетальной сыворотки теленка (Gibco или аналог) в ФСБ (ФСБ-ФС), панель накрывают крышкой и инкубируют 1 час при комнатной температуре. Это процедура блокирования свободных сайтов лунок панели индифферентным белком.
3. Блокирующий раствор удаляют, лунки промывают 3 раза ФСБ-Т, как описано выше. Вносят по 0,1 мл исследуемого препарата ИПВ в разведениях, начиная, например, с 1:8, в ФСБ-ФС с 0,05% Tween-20 (ИФА-буфер), по 2 лунки на разведение. Параллельно разведениям ИПВ вносят по 0,1 мл ИФА-буфера - негативный контроль. Панель накрывают крышкой и инкубируют 2 час. при (+) 37°С или 18 час.при (+) 4-8°С. Это фаза связывания определяемого D-антигена с иммуносорбентом.
4. Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 5 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл детекторных антител - IgG кролика к соответствующему типу полиовируса с титром гомологичных антител в РН не ниже 1:1024 в разведении, подобранном шахматным тированием, в ИФА-буфере. Панель накрывают крышкой и инкубируют 1 час при (+) 37°С. Это фаза детекции определяемого D-антигена, связанного с иммуносорбентом.
5. Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 6 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл пероксидазного конъюгата против IgG кролика (Sigma) в ИФА-буфере в рабочем разведении, которое подбирается титрованием в отдельном опыте. Панель накрывают крышкой и инкубируют 1 час при (+) 37°С.Это фаза выявления комплекса иммуносрбент+определяемый D-антиген+детекторные антитела.
6. Содержимое лунок удаляют, лунки промывают 6 раз ФСБ-Т, как описано выше. Вносят в лунки по 0,1 мл готового субстрат-индикаторного раствора -тетраметилбензидина (ТМБ, Sigma, кат.№Т0440-100 ml). Панель инкубируют в темноте 20 мин. при комнатной температуре.
7. Вносят в лунки по 0,05 мл 2М раствора серной кислоты (остановка ферментной реакции).
8. Результат немедленно учитывают в ИФА-ридере (любая доступная модель) при длине волны 450 им. Результат считается положительным при отношении оптической плотности лунок с определяемым D-антигеном (его наивысшее разведение) к оптической плотности контрольных лунок (ИФА-буфер)≥2,1 (P/N). Количество D-антигена в исследуемом образце ИПВ вычисляют по отношению к референс-образцу ИПВ (с известным количеством D-антигена), который титруется в ИФА параллельно исследуемому образцу, используя метод "параллельных линий" (PLA) -точный подсчет. Концентрацию D-антигена выражают в D-антигенных единицах на 1 мл (DU/ml, ДАТ ЕД/мл).
В таблице 1 представлены результаты определения D-антигена полиовируса 1 типа: параллельное титрование в ИФА экспериментальной серии ИПВ на основе штамма Сэбин 1 (Р 712 Ch 2ab) и коммерческой ИПВ (из диких штаммов полиовируса) производства Sanofi Pasteur, Франция, с известной концентрацией D-антигена 1 типа - 80 ДАГ ЕД/мл. В качестве иммуносорбента использован желточный IgY, полученный в результате иммунизации куриц аттенуированными штаммами полиовирусов Сэбин 1-3 типов, в качестве детекторных антител - IgG кролика с РН-титром против штамма Сэбин 1≥:1:1024.
Из таблицы 1 следует, что, согласно критерию положительности результата (P/N≥2,1), титр D-антигена 1 типа в ИПВ (Сэбин 1) равен 1: 16384, титр D-антигена 1 типа в составе ИПВ (Sanofi) равен 1: 256, то есть концентрация D-антигена в составе ИПВ (Сэбин 1) равна примерно 5120 ДАГ ЕД/мл.
Таблица 1.
Антиген
Разведения антигена
1:16
1:64
1:256
1:1024
1:4096
1:16384
ИПВ(Сэбин 1)
3,761*
3,42
2,535
1,345
0,591
0,328
ИПВ (Sanofi)
2,332
0,932
0,380
0,238
0,225
0,219
Контроль (ИФА-буфер)
0,141
0,131
0,148
0,133
0,140
0,139
Среднее значение=0,139
* - оптическая плотность при 450 нм
Преимущества изобретения заключаются в использовании в качестве иммуносорбента для количественного определения D-антигена полиовирусов в ИФА аффинно очищенных поливалентных препаратов IgY (против трех полиовирусов) из яичных желтков иммунизированных куриц, которые обладают высокой специфической активностью по отношению к определяемому антигену и низкой перекрестной реактивностью с белками млекопитающих за счет большой филогенетической дистанции между птицами и млекопитающим, и селективных детекторных IgG кролика (против каждого из трех полиовирусов), в результате чего такая комбинация в системах ИФА для определения антигенов (в частности, D-антигена полиовирусов) обеспечивает более низкий неспецифический фон и соответственно более высокую достоверность результата анализа.