СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ДИФФУЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПЕЧЕНИ
METHOD OF QUANTITATIVE ESTIMATION OF HISTOLOGICAL ACTIVITY IN CASE OF CHRONIC DIFFUSE LIVER DISEASES

Изобретение относится к области медицины, в частности гепатологии, и может быть использовано для диагностики хронических диффузных заболеваний печени.
Пункционная биопсия печени играет важную роль в определении активности воспалительного процесса и степени фиброза при различных формах хронического гепатита [5]. В 1981 году был совершен прорыв в данной области, так как был предложен так называемый индекс гистологической активности (ИГА) [4]. ИГА - это способ ранговой оценки степени выраженности воспаления, некроза и фиброза, разработанный R.G. Knodell et al. Данная методика позволяет оценивать динамику некротически-воспалительного процесса в ткани печени при естественном течении хронического гепатита и на фоне этиологической (противовирусной) и патогенетической гепатопротекторной терапии. Система R.G. Knodell претерпевала ряд изменений, наиболее широко известными являются системы J.V. Desmet, K.G. Ishak, P.J. Sheuer, METAVIR [2, 3, 6]. Однако наиболее используемой, в том числе и в Российской Федерации, по-прежнему остается система R.G. Knodell. Принцип данной полуколичественной ранговой системы заключается в балльной оценке гистологических изменений в биоптатах печени: перипортальные и мостовидные некрозы, которые оцениваются от 1 до 10 баллов, паренхиматозное повреждение в виде фокальных внутридольковых некрозов и дистрофии гепатоцитов от 1 до 4 баллов, портальное воспаление от 1 до 4 баллов, оценка уровня фиброза от 1 до 4 баллов. Количество баллов 1-3 соответствует минимальной степени активности гепатита, 4-8 - слабой, 9-12 - умеренной, 13-22 - выраженной активности гепатита. Недостатком данной системы является существенная доля субъективизма в оценке морфологических изменений, размытость границ, скудность морфологических параметров, а также тот факт, что 4-ый компонент системы - фиброз - отражает в большей степени не активность, а стадию заболевания. Включение фиброза в систему подсчета может привести к завышению уровня активности гепатита. В связи с чем рядом авторов [2, 6] было предложено отдельно оценивать ступенчатые и портоцентральные некрозы, как прогностически более серьезные, а 4-ый компонент системы R.G. Knodell выделить отдельно, обозначив его как гистологический индекс склероза или фиброз различной степени 1-4.
В 1996 году В.В. Серов, О.Л. Северигина предложили свой способ оценки хронических гепатитов, в основе которого лежит классификация J.V. Desmet [1]. В новую систему вводится термин гистологический индекс степени хронизации (ГИСХ), расширяется балльная система оценки фиброза. Этими же авторами более подробно детализируется степень активности и предлагается несколько иной термин ГИСА - гистологический индекс степени активности вместо ИГА. Обусловлено это тем, что ИГА разрабатывался для хронического гепатита В, а в связи с существенными отличиями хронического гепатита С вводятся новые гистологические маркеры данной инфекции. Особенностью данной системы является отсутствие хронического гепатита минимальной активности и оценка активности гепатита B и C в разном количественном отношении, что затрудняет количественную их характеристику.
Таким образом, предложенные полуколичественные ранговые системы оценки морфологических изменений при хронических диффузных заболеваниях печени требуют усовершенствования. Методика должна быть простой в использовании, доступной для проведения, емкой по содержанию, и единой для гепатитов различной этиологии для возможности проведения сравнительного анализа.
Технический результат, достигаемый в предлагаемом способе количественной оценки гистологической активности при хронических диффузных заболеваниях печени, состоит в том, что позволяет повысить качество оценки степени активности при хронических диффузных заболеваниях печени, прогнозировать течение гепатита и контролировать эффективность терапии.
Технический результат достигается тем, что выявляют паренхиматозное повреждение и количественно оценивают его компоненты - гидропическую, крупнокапельную и мелкокапельную жировую дистрофию, дополнительно определяют признаки мелкоклеточной дисплазии гепатоцитов (клеток печени с увеличенным ядерно-цитоплазматическим отношением, уменьшенным количеством цитоплазмы, создающим эффект сдавления ядер), внутридольковой воспалительной инфильтрации, центральной инфильтрации, затем абсолютные значения полученных морфологических данных переводят в баллы с помощью предложенного протокола количественной оценки, в который включают определение при увеличении × 150 в 10 полях зрения некроза гепатоцитов: 1 балл - менее 5 клеток в поле зрения, 2 балла - 5-10 клеток в поле зрения, 3 балла - более 10 клеток в поле зрения; крупнокапельной жировой дистрофии гепатоцитов: 1 балл - менее 20 клеток в поле зрения, 2 балла - 20-50 клеток в поле зрения, 3 балла - 51-100 клеток в поле зрения, 4 балла - более 100 клеток в поле зрения; мелкокапельной жировой дистрофии гепатоцитов: 1 балл - менее 5 клеток в поле зрения, 2 балла - 5-25 клеток в поле зрения, 3 балла - 26-50 клеток в поле зрения, 4 балла - более 50 клеток в поле зрения; гидропической дистрофии: 1 балл - менее 10 клеток в поле зрения, 2 балла - 10-20 клеток в поле зрения, 3 балла - 21-30 клеток в поле зрения, 4 балла - более 30 клеток в поле зрения; портальной инфильтрации: 1 балл - небольшая воспалительная инфильтрации единичных портальных трактов, 2 балла - умеренная воспалительная инфильтрация большинства портальных трактов, 3 балла - выраженная воспалительная инфильтрация большинства портальных трактов, 4 балла - усиленная воспалительная инфильтрация всех портальных трактов с наличием лимфоидных агрегатов и фолликулов; ступенчатых некрозов и перипортальной инфильтрации: 1 балл - ступенчатые некрозы занимают менее 10% от окружности портальных трактов, 2 балла - ступенчатые некрозы занимают 10-20% от окружности портальных трактов, 3 балла - ступенчатые некрозы занимают 20-30% от окружности портальных трактов, 4 балла - ступенчатые некрозы занимают 30-40% от окружности портальных трактов, 5 баллов - ступенчатые некрозы занимают 40-50% от окружности портальных трактов, 6 баллов - ступенчатые некрозы занимают 50-60% от окружности портальных трактов с проникновением вглубь дольки, 7 баллов - ступенчатые некрозы занимают 60-70% от окружности портальных трактов с проникновением вглубь дольки с формированием единичных мостовидных портоцентральных и/или портопортальных некрозов, 8 баллов - ступенчатые некрозы занимают 70-80% от окружности портальных трактов с образованием единичных портоцентральных и/или портопортальных некрозов, 9 баллов - ступенчатые некрозы занимают 80-90% от окружности портальных трактов с образованием единичных портоцентральных и портопортальных некрозов, 10 баллов - ступенчатые некрозы занимают 90-100% от окружности портальных трактов с формированием множества портоцентральных и портопортальных некрозов; внутридольковой воспалительной инфильтрации с некрозом гепатоцитов: 1 балл - воспалительная инфильтрация занимает менее 5% площади паренхимы печени в поле зрения, 2 балла - воспалительная инфильтрация занимает менее 5-10% площади паренхимы в поле зрения, 3 балла -воспалительная инфильтрация занимает менее 10-20% площади паренхимы в поле зрения, 4 балла - воспалительная инфильтрация занимает более 20% площади паренхимы в поле зрения; центральной воспалительной инфильтрации с некрозом гепатоцитов: 1 балл - воспалительная инфильтрация занимает менее 10% от окружности центральной вены, 2 балла - воспалительная инфильтрация занимает 10-20% от окружности центральной вены, 3 балла - воспалительная инфильтрация занимает 20-30% от окружности центральной вены, 4 балла - воспалительная инфильтрация занимает 30-40% от окружности центральной вены, 5 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 40-50% от окружности центральной вены и незначительно проникает внутрь дольки, 6 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 50-60% от окружности центральной вены и незначительно проникает внутрь дольки, 7 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 60-70% от окружности центральной вены и проникает внутрь дольки до 1/4 расстояния от центральной вены до портального тракта, 8 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 70-80% от окружности центральной вены и проникает внутрь дольки до 1/3 расстояния от центральной вены до портального тракта, 9 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 80-90% от окружности центральной вены и проникает внутрь дольки более 1/3 расстояния от центральной вены до портального тракта, 10 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 90-100% от окружности центральной вены и проникает внутрь дольки более 1/3 расстояния от центральной вены до портального тракта; а также мелкоклеточной дисплазии гепатоцитов в 10 полях зрения при увеличении × 600: 1 балл - мене 3 клеток в поле зрения, 2 балла - 3-5 клеток в поле зрения, 3 балла - 6-10 клеток в поле зрения, 4 балла - более 10 клеток в поле зрения, после чего на основании результатов балльной оценки изменений в биоптатах печени при значениях от 1 до 11 баллов определяют хронический гепатит с минимальной активностью, при значениях от 12 до 20 баллов - хронический гепатит слабой активности, от 21 до 30 - хронический гепатит умеренной активности, от 31 до 47 - хронический гепатит высокой активности.
Способ количественной оценки гистологической активности при хронических диффузных заболеваниях печени включает в себя следующие операции: выполнение биопсии печени (слепой чрескожной пункционной или прицельной лапароскопической), фиксация ткани печени в 10%-ном формалине, заливка в парафин, подготовка срезов толщиной 3-4 микрона, окраска препаратов гематоксилином и эозином, исследование гистологических препаратов с помощью микроскопа с подсчетом в абсолютных числах, процентах и баллах патологических признаков некроза и дистрофии гепатоцитов, портальной и перипортальной воспалительной инфильтрации, ступенчатых некрозов гепатоцитов, отличающийся тем, что выявляют паренхиматозное повреждение и количественно оценивают его компоненты - гидропическую, крупнокапельную и мелкокапельную жировую дистрофию, дополнительно определяют признаки мелкоклеточной дисплазии гепатоцитов, внутридольковой воспалительной инфильтрации, центральной инфильтрации. Следующая операция - создание протокола.
Протокол
При увеличении × 150 в 10 полях зрения определяются следующие морфологические показатели: среднее число некротизированных гепатоцитов, среднее число клеток в состоянии крупнокапельной жировой дистрофии, мелкокапельной жировой дистрофии и гидропической дистрофии, портальная инфильтрация, ступенчатые некрозы и перипортальная инфильтрация, внутридольковая воспалительная инфильтрация с некрозом гепатоцитов, воспалительная инфильтрация вокруг центральной вены с некрозом гепатоцитов.
В 10 полях зрения при увеличении × 600 определяется среднее число гепатоцитов с признаками мелкоклеточной дисплазии. Клетки в состоянии мелкоклеточной дисплазии определяются как гепатоциты с увеличенным ядерно-цитоплазматическим отношением, уменьшенным количеством цитоплазмы, создающим эффект сдавления ядер.
Некроз гепатоцитов:
1 балл - менее 5 клеток в поле зрения
2 балла - 5-10 клеток в поле зрения
3 балла - более 10 клеток в поле зрения Крупнокапельная жировая дистрофия гепатоцитов:
1 балл - менее 20 клеток в поле зрения
2 балла - 20-50 клеток в поле зрения
3 балла - 51-100 клеток в поле зрения
4 балла - более 100 клеток в поле зрения
Мелкокапельная жировая дистрофия гепатоцитов:
1 балл - менее 5 клеток в поле зрения
2 балла - 5-25 клеток в поле зрения
3 балла - 26-50 клеток в поле зрения
4 балла - более 50 клеток в поле зрения
Гидропическая дистрофия:
1 балл - менее 10 клеток в поле зрения
2 балла - 10-20 клеток в поле зрения
3 балла - 21-30 клеток в поле зрения
4 балла - более 30 клеток в поле зрения
Мелкоклеточная дисплазия гепатоцитов:
1 балл - мене 3 клеток в поле зрения
2 балла - 3-5 клеток в поле зрения
3 балла - 6-10 клеток в поле зрения
4 балла - более 10 клеток в поле зрения
Портальная инфильтрация:
1 балл - небольшая воспалительная инфильтрации единичных портальных трактов
2 балла - умеренная воспалительная инфильтрация большинства портальных трактов
3 балла - выраженная воспалительная инфильтрация большинства портальных трактов
4 балла - усиленная воспалительная инфильтрация всех портальных трактов с наличием лимфоидных агрегатов и фолликулов
Ступенчатые некрозы и перипортальная инфильтрация:
1 балл - ступенчатые некрозы занимают менее 10% от окружности портальных трактов
2 балла - ступенчатые некрозы занимают 10-20% от окружности портальных трактов
3 балла - ступенчатые некрозы занимают 20-30% от окружности портальных трактов
4 балла - ступенчатые некрозы занимают 30-40% от окружности портальных трактов
5 баллов - ступенчатые некрозы занимают 40-50% от окружности портальных трактов
6 баллов - ступенчатые некрозы занимают 50-60% от окружности портальных трактов с проникновением вглубь дольки
7 баллов - ступенчатые некрозы занимают 60-70% от окружности портальных трактов с проникновением вглубь дольки с формированием единичных мостовидных портоцентральных и/или портопортальных некрозов
8 баллов - ступенчатые некрозы занимают 70-80% от окружности портальных трактов с образованием единичных портоцентральных и/или портопортальных некрозов
9 баллов - ступенчатые некрозы занимают 80-90% от окружности портальных трактов с образованием единичных портоцентральных и портопортальных некрозов
10 баллов - ступенчатые некрозы занимают 90-100% от окружности портальных трактов с формированием множества портоцентральных и портопортальных некрозов
Внутридольковая воспалительная инфильтрация с некрозом гепатоцитов:
1 балл - воспалительная инфильтрация занимает менее 5% площади паренхимы печени в поле зрения
2 балла - воспалительная инфильтрация занимает менее 5-10% площади паренхимы в поле зрения
3 балла - воспалительная инфильтрация занимает менее 10-20% площади паренхимы в поле зрения
4 балла - воспалительная инфильтрация занимает более 20% площади паренхимы в поле зрения
Центральная воспалительная инфильтрация с некрозом гепатоцитов:
1 балл - воспалительная инфильтрация занимает менее 10% от окружности центральной вены
2 балла - воспалительная инфильтрация занимает 10-20% от окружности центральной вены
3 балла - воспалительная инфильтрация занимает 20-30% от окружности центральной вены
4 балла - воспалительная инфильтрация занимает 30-40% от окружности центральной вены
5 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 40-50% от окружности центральной вены и незначительно проникает внутрь дольки
6 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 50-60% от окружности центральной вены и незначительно проникает внутрь дольки
7 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 60-70% от окружности центральной вены и проникает внутрь дольки до 1/4 расстояния от центральной вены до портального тракта
8 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 70-80% от окружности центральной вены и проникает внутрь дольки до 1/3 расстояния от центральной вены до портального тракта
9 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 80-90% от окружности центральной вены и проникает внутрь дольки более 1/3 расстояния от центральной вены до портального тракта
10 баллов - воспалительная инфильтрация занимает 90-100% от окружности центральной вены и проникает внутрь дольки более 1/3 расстояния от центральной вены до портального тракта
Оценивая степень активности в зависимости от количества баллов, может быть поставлен следующий морфологический диагноз:
1-11 баллов - хронический гепатит минимальной активности
12-20 баллов - хронический гепатит слабой активности
21-30 баллов - хронический гепатит умеренной активности
31-47 баллов - хронический гепатит высокой активности
Предлагаемый способ количественной оценки гистологической активности в биоптатах печени при хронических диффузных заболеваниях печени представляет собой проведение ряда перечисленных выше операций и оценку препаратов с помощью унифицированной балльной системы. Максимальное количество баллов для оценки паренхиматозного повреждения, воспалительных процессов в ткани печени - 47, то есть больше, чем у R.G. Knodell и J.V. Desmet, что связано с более расширенным исследованием гистологических образцов. Оценка паренхиматозного повреждения ткани печени по методу Knodell производится по 4-балльной системе, в которой не уделяется внимания виду дистрофии гепатоцитов, ее распространенности. Также в оценку гистологической активности нами введено определение уровня мелкоклеточной дисплазии гепатоцитов. Данный показатель рассматривается как дополнительный маркер воспалительных процессов ткани печени. Потомками гепатоцитов в состоянии мелкоклеточной дисплазии являются прогениторные клетки, активация которых происходит при нарастании процессов перекисного окисления липидов, которые связано с процессами воспаления в паренхиме печени. Стоит отметить, что в общепринятой системе Knodell не производится учета внутридольковой воспалительной инфильтрации и инфильтрации вокруг центральной вены (центральной инфильтрации).
Эффективность предлагаемого способа определяется качеством и достоверностью диагностических критериев, которые соответствуют современным мировым стандартам морфологической диагностики хронических гепатитов. Анализ и заполнение протокола для оценки гистологической активности процесса могут быть произведены на основании стандартных методов окраски препаратов гематоксилином и эозином.
Способ количественной оценки гистологической активности при хронических диффузных заболеваниях печени был апробирован в Отделенческой клинической больнице на станции Петрозаводск ОАО «РЖД» на 191 случае хронических гепатитов различной этиологии. 53 пациента имели хронический гепатит В (ХГВ), 49 - хронический вирусный гепатит С (ХГС), 46 пациентов - хронических вирусный гепатит B+C, 43 - стеатогепатит. Диагноз устанавливался на основании традиционных клинико-лабораторных, серологических критериев, а также с использованием полимеразной цепной реакции на ДНК вируса гепатита B и РНК вируса гепатита C в крови и ткани печени.
Способ количественной оценки гистологической активности позволяет извлечь максимально возможную информацию из гистологического материала, используя самую элементарную методику - окраску гематоксилином и эозином.
У 82% наших пациентов отмечалось несоответствие между активностью процесса в ткани печени и показателями аланиновой аминотрансферразы (АЛТ) - традиционного маркера цитолиза и показателями мезенхимально-воспалительного синдрома (СОЭ, уровнем гамма-глобулинов). Так, при хронических гепатитах слабой активности, установленной при гистологическом исследовании, уровень АЛТ не превышал норму (40 Ед/л) у 75% больных, а при умеренной и высокой активности - уровень АЛТ превышал норму лишь в 1,5-2 раза, что еще раз подчеркнуло значимость гистологического исследования.
Таким образом, с помощью апробируемого способа нам удалось получить более точную и специфичную диагностическую информацию о степени активности некротически-воспалительного процесса в печени не только по сравнению с клиническими данными, но и по сравнению с гистологической оценкой, выполненной по методу Knodell [4].
Кроме того визуализация морфологических изменений в виде наличия перипортальных и мостовидных некрозов позволяет на доклинической стадии верифицировать начавшуюся трансформацию хронического гепатита в цирроз печени, то есть прогнозировать неблагоприятное течение хронического диффузного заболевания печени.
Лечение хронических диффузных заболеваний печени в частности хронических вирусных гепатитов) осуществляется дорогостоящими препаратами интерферона и аналогами нуклеозидов с достаточно высокой частотой побочных реакций и негарантированной эффективностью. Гепатопротекторы, препараты урсодеоксихолиевой кислоты, также необходимые в лечении данной группы пациентов, имеют высокую стоимость. Поэтому особое значение имеет возможность контроля за эффективностью лечения не только с помощью традиционных лабораторных, молекулярно-генетических и серологических критериев, но и морфологического метода при повторных биопсиях печени. Предложенный нами способ позволяет выявить даже минимальную динамику гистологической картины, печеночно-клеточного воспаления при хронических диффузных заболеваниях печени, что повышает качество контроля течения заболевания.
Таким образом, способ количественной оценки гистологической активности в биоптатах печени при хронических диффузных заболеваниях печени позволяет оценить степень гистологической активности, а также контролировать эффективность проводимой терапии и прогнозировать риск неблагоприятного течения заболевания, вероятность трансформации хронического гепатита в цирроз печени.
Источники информации
1. Серов В.В., Северигина Л.О. Морфологические критерии оценки этиологии, степени активности и стадии процесса при хронических вирусных гепатитах В и С // Архив патологии. 1996. №4. С.61-64.
2. Desmet J.V., Gerber M., Hoofnagle J.H. et al. Classification of chronic hepatitis: Diagnosis, Grading and Staging // Hepatology. 1994. №6. P.1513-1520.
3. Ishak K.G., Baptista A., Bianchi L. et al. Histalogical Grading and Staging of chronic hepatitis // J. Hepatology. 1995. Vol.22. P.696-699.
4. Knodell R.G., Ishak K.G., Black W.C. et al. Formulation and application of numerical scoring system for assessing histological activity in asymptomatic chronic active hepatitis // Hepatology. 1981. Vol.1. P.431-435.
5. Schaff Z. The value of liver biopsy in chronic hepatitis // Orv. Hetil. 2011. Vol.22. P.856-858.
6. Scheuer P.J. Classification of chronic viral hepatitis: a need for reassessment // J. Hepatology. 1991. Vol.13. P.372-374.