МОЛЕКУЛЫ ФИБРОНЕКТИНА, СОДЕРЖАЩИЕ КАРМАН, И ИХ БИБЛИОТЕКИ

1. Полипептид, содержащий карман, на основе домена фибронектина III-го типа (FnIII), содержащий одну или несколько замен аминокислот по меньшей мере в двух петлеобразных участках и по меньшей мере в двух непетлеобразных участках.
2. Полипептид с карманом по п.1, при этом непетлеобразные участки выбраны из группы, состоящей из β-нити С, β-нити D, β-нити F и β-нити G, а петлеобразные участки выбраны из группы, состоящей из петли АВ, петли ВС, петли CD, петли DE, петли EF и петли FG.
3. Полипептид с карманом по п.2, при этом по меньшей мере два непетлеобразных участка представляют собой β-нити С и F, а по меньшей мере два петлеобразных участка представляют собой петли CD и FG.
4. Полипептид с карманом по п.3, при этом вводится одна или несколько замен аминокислот в остатки β-нитей в кармане.
5. Полипептид с карманом по п.1, дополнительно включающий вставку и/или делению по меньшей мере одной аминокислоты в петлеобразных участках и непетлеобразных участках.
6. Полипептид с карманом по п.5, при этом непетлеобразные участки со вставкой и/или делецией по меньшей мере одной аминокислоты представляют собой β-нити С и F, а петлеобразные участки со вставкой и/или делецией по меньшей мере одной аминокислоты представляют собой петли CD и FG.
7. Полипептид с карманом по п.1, при этом домен FnIII является 1-м, 2-м, 3-м, 4-м, 5-м, 6-м, 7-м, 8-м, 9-м, 10-м, 11-м, 12-м, 13-м, 14-м, 15-м или 16-м доменом FnIII фибронектина человека.
07
10
14
8. Полипептид с карманом по п.7, при этом домен FnIII является 7-м доменом FnIII фибронектина человека (FnIII), 10-м доменом FnIII фибронектина человека (FnIII) или 14-м доменом FnIII фибронектина человека (FnIII).
9. Полипептид с карманом по п.3, при этом длина петли CD составляет 3-11 остатков, а длина петли FG составляет 1-10 остатков.
10. Полипептид с карманом по п.3, при этом длина β-нити С составляет 6-14 остатков, а длина β-нити F составляет 8-13 остатков.
11. Полипептид с карманом по п.8, при этом замены аминокислот включают положения 31, 33, 35, 37, 38, 39, 67, 69, 71, 73 и/или 76 в SEQ ID NO: 1.
12. Полипептид с карманом по п.8, при этом замены аминокислот включают положения 33, 35, 37, 39, 40, 41, 70, 72, 74, 76 и/или 79 в SEQ ID NO: 97.
13. Полипептид с карманом по п.8, при этом замены аминокислот включают положения 31, 33, 35, 37, 39, 66, 68, 70, 72 и/или 75 в SEQ ID NO: 129.
14. Полипептид с карманом по п.8, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NOs: 468-470.
15. Химерный полипептид с карманом, при этом часть полипептида с карманом по любому из пп.1-14 заменена полипептидом не из домена FnIII, который усиливает сродство связывания полипептида с карманом с молекулой мишени.
16. Мультиспецифичный полипептид с карманом, содержащий множественные копии одного или нескольких мономерных полипептидов с карманом по любому из пп.1-15.
17. Библиотека карманов, содержащая множество полипептидов с карманом по любому из пп.1-16.
18. Способ получения библиотеки карманов содержащей полипептиды домена FnIII, применимой при скрининге на наличие одного или нескольких полипептидов с выбранной связывающей или ферментной активностью, который включает:
(i) выравнивание аминокислотных последовательностей β-нитей С и F и аминокислотных последовательностей петель CD и FG в коллекции нативных полипептидов домена FnIII,
(ii) разделение выровненных последовательностей β-нитей и петель по длине,
(iii) для выбранной длины β-нити или петли из стадии (ii) - проведение позиционного анализа частоты аминокислот для определения частоты аминокислот по каждому положению β-нити или петли,
(iv) для каждой β-нити, петли и длины при анализе на стадии (iii) - определение в каждом положении консервативных или выбранных полуконсервативных консенсусных аминокислот и других природных вариантов аминокислот,
(v) по меньшей мере для одной выбранной β-нити, петли и длины - формирование:
(1) библиотеки мутационных последовательностей карманов, экспрессируемых библиотекой кодирующих последовательностей, кодирующих, в каждом положении β-нити или петли, консенсусную аминокислоту, а если консенсусная аминокислота встречается с частотой, равной или меньшей, чем выбранный порог частоты по меньшей мере в 50%, то одну общую искомую аминокислоту и любые сопутствующие ей аминокислоты, или
(2) библиотеки комбинаторных последовательностей природных вариантов карманов, экспрессируемых библиотекой кодирующих последовательностей, кодирующих, в каждом положении, консенсусную аминокислоту, а если консенсусная аминокислота встречается с частотой, равной или меньшей, чем выбранный порог частоты по меньшей мере в 50%, то другие природные варианты аминокислот, включая полуконсервативные аминокислоты и вариабельные аминокислоты, которые встречаются с частотой, превышающей выбранный минимальный порог встречаемости в этом положении, либо их химические эквиваленты,
(vi) встраивание библиотеки кодирующих последовательностей в рамки последовательностей, кодирующих FnIII, с образованием экспрессирующей FnIII библиотеки, и
(vii) экспрессирование полипептидов FnIII из экспрессирующей библиотеки.