CD40L-СПЕЦИФИЧНЫЕ КАРКАСНЫЕ СТРУКТУРЫ, ПРОИСХОДЯЩИЕ ИЗ Tn3, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Tn3-каркасная структура, содержащая CD40L-специфичную мономерную субъединицу, где мономерная субъединица содержит семь бета-цепей, обозначенных А, В, С, D, Е, F и G, и шесть петлевых участков, обозначенных АВ, ВС, CD, DE, EF и FG, и где данная Tn3-каркасная структура специфически связывается с CD40L.
2. Tn3-каркасная структура по п. 1, содержащая одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу.
3. Tn3-каркасная структура по п. 1, содержащая две CD40L-специфичные мономерные субъединицы, соединенные в тандем.
4. Tn3-каркасная структура по п. 3, где две CD40L-специфичные мономерные субъединицы соединены непосредственно.
5. Tn3-каркасная структура по п. 3, где две CD40L-специфичные мономерные субъединицы соединены линкером.
6. Tn3-каркасная структура по п. 5, где линкер содержит пептидный линкер.
7. Tn3-каркасная структура по п. 6, где пептидный линкер представляет собой гибкий пептидный линкер.
m
n
8. Tn3-каркасная структура по п. 7, где пептидный линкер содержит последовательность (GX), где
(a) X представляет собой серин (S), аланин (А), глицин (G), лейцин (L), изолейцин (I) или валин (V);
(b) m и n представляют собой целые числа;
(c) m равно 1, 2, 3 или 4; и
(d) n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.
9. Tn3-каркасная структура по п. 8, где пептидный линкер содержит SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143.
10. Tn3-каркасная структура по п. 3, где связывание каркасной структуры с CD40L улучшено по сравнению с Tn3-каркасной структурой, содержащей одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу.
11. Tn3-каркасная структура по п. 3, где связывание каркасной структуры с CD40L улучшает воздействие на мишень по сравнению с Tn3-каркасной структурой, содержащей одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу.
12. Tn3-каркасная структура по п. 10, где улучшение связывания с CD40L представляет собой улучшение аффинности связывания, улучшение авидности связывания или и то, и другое.
13. Tn3-каркасная структура по п. 10, где аффинность связывания по отношению к CD40L и стабильность белка улучшены по сравнению с таковыми Tn3-каркасной структуры, содержащей CD40L-специфичную мономерную субъединицу.
14. Tn3-каркасная структура по п. 10, где авидность связывания по отношению к CD40L и стабильность белка улучшены по сравнению с таковыми Tn3-каркасной структуры, содержащей одну CD40L-специфичную мономерную субъединицу.
15. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-9, где по меньшей мере одна CD40L-специфичная мономерная субъединица связана с линкером или с гетерологичным фрагментом.
16. Tn3-каркасная структура по п. 15, где линкер или гетерологичный фрагмент конъюгирован с N-концом или С-концом каркасной структуры.
17. Tn3-каркасная структура по п. 16, где линкер содержит пептидный линкер.
18. Tn3-каркасная структура по п. 17, где пептидный линкер представляет собой гибкий пептидный линкер.
m
n
19. Tn3-каркасная структура по п. 17 или 18, где пептидный линкер содержит последовательность (GX), где
(a) X представляет собой серии (S), аланин (А), глицин (G), лейцин (L), изолейцин (I) или валин (V);
(b) m и n представляют собой целые числа;
(c) m равно 1, 2, 3 или 4; и
(d) n равно 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7.
20. Tn3-каркасная структура по п. 19, где пептидный линкер содержит SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 142 или SEQ ID NO: 143.
21. Tn3-каркасная структура по п. 15, где данный линкер содержит функциональный фрагмент.
22. Tn3-каркасная структура по п. 21, где функциональный фрагмент представляет собой иммуноглобулин или его фрагмент.
23. Tn3-каркасная структура по п. 22, где иммуноглобулин или его фрагмент содержит Fc-домен.
24. Tn3-каркасная структура по п. 23, где Fc-домен не индуцирует по меньшей мере одну FcγR-опосредованную эффекторную функцию.
25. Tn3-каркасная структура по п. 24, где указанная по меньшей мере одна FcγR-опосредованная эффекторная функция представляет собой ADCC.
26. Tn3-каркасная структура по п. 15, где по меньшей мере одна CD40L-специфичная мономерная субъединица связана с гетерологичным фрагментом.
27. Tn3-каркасная структура по п. 26, где гетерологичный фрагмент содержит структуру, выбранную из группы, состоящей из следующего: белок, пептид, белковый домен, линкер, лекарственное средство, токсин, цитотоксическое средство, радиофармацевтическое средство, радионуклид, радиоактивное соединение, органический полимер, неорганический полимер, полиэтиленгликоль (PEG), биотин, альбумин, человеческий сывороточный альбумин (HSA), участок, отвечающий за связывание FcRn с HSA, антитело, домен антитела, фрагмент антитела, одноцепочечное антитело, антитело на основе домена, альбумин-связывающий домен, фермент, лиганд, рецептор, связывающий пептид, каркасная структура, отличающаяся от FnIII, эпитопная метка, рекомбинантный полипептидный полимер, цитокин и комбинация двух или более указанных фрагментов.
28. Tn3-каркасная структура по п. 27, где по меньшей мере одна CD40L-специфичная мономерная субъединица конъюгирована с PEG.
29. Tn3-каркасная структура по п. 27, где по меньшей мере одна CD40L-специфичная мономерная субъединица конъюгирована с альбумином.
30. Tn3-каркасная структура по п. 29, где альбумин представляет собой человеческий сывороточный альбумин (HSA).
31. Tn3-каркасная структура по п. 30, где указанный HSA представляет собой вариант HSA.
32. Tn3-каркасная структура по п. 31, где аминокислотная последовательность указанного варианта HSA представляет собой SEQ ID NO: 133.
33. Tn3-каркасная структура по п. 31, где указанный вариант HSA имеет по меньшей мере одно улучшенное свойство по сравнению с нативным HSA или фрагментом нативного HSA.
34. Tn3-каркасная структура по п. 31, где улучшенное свойство представляет собой измененное время полужизни в плазме по сравнению со временем полужизни в плазме нативного HSA или фрагмента нативного HSA.
35. Tn3-каркасная структура по п. 34, где измененное время полужизни в плазме представляет собой более длительное время полужизни в плазме по сравнению со временем полужизни в плазме нативного HSA или фрагмента нативного HSA.
36. Tn3-каркасная структура по п. 34, где измененное время полужизни в плазме представляет собой более короткое время полужизни в плазме по сравнению со временем полужизни в плазме нативного HSA или фрагмента нативного HSA.
37. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 31 или пп. 33-36, где вариант HSA содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену в домене III в HSA.
38. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 31 или пп. 33-36, где вариант HSA содержит последовательность полноразмерного зрелого HSA (SEQ ID NO: 133 или 138) или ее фрагмент за исключением по меньшей мере одной аминокислотной замены, пронумерованной относительно положения в полноразмерном зрелом HSA, в положении, выбранном из группы, состоящей из 407, 415, 463, 500, 506,
508, 509, 511, 512, 515, 516, 521, 523, 524, 526, 535, 550, 557, 573, 574 и 580; где по меньшей мере одна аминокислотная замена не предусматривает замену лизина (K) на глутаминовую кислоту (Е) в положении 573, и где Tn3-каркасная структура имеет более длительное время полужизни в плазме, чем время полужизни в плазме Tn3-каркасной структуры, не являющейся конъюгированной с указанным вариантом HSA.
39. Tn3-каркасная структура по п. 38, где по меньшей мере одна аминокислотная замена, пронумерованная относительно положения в полноразмерном зрелом HSA, находится в положении, выбранном из группы, состоящей из 463, 508, 523 и 524, где указанная Tn3-каркасная структура имеет более длительное время полужизни в плазме, чем время полужизни в плазме Tn3-каркасной структуры, не являющейся конъюгированной с указанным вариантом HSA.
40. Tn3-каркасная структура по любому из п. 31 или пп. 33-36, где вариант HSA содержит последовательность полноразмерного зрелого HSA (SEQ ID NO: 133 или 138) или ее фрагмент за исключением по меньшей мере одной аминокислотной замены, пронумерованной относительно положения в полноразмерном зрелом HSA, выбранной из группы, состоящей из:
(a) замены лейцина (L) в положении 407 на аспарагин (N) или тирозин (Y);
(b) замены валина (V) в положении 415 на треонин (Т);
(c) замены лейцина (L) в положении 463 на аспарагин (N);
(d) замены лизина (K) в положении 500 на аргинин (R);
(e) замены треонина (Т) в положении 506 на тирозин (Y);
(f) замены треонина (Т) в положении 508 на аргинин (R);
(g) замены фенилаланина (F) в положении 509 на метионин (М) или триптофан (W);
(h) замены аланина (А) в положении 511 на фенилаланин (F);
(i) замены аспарагиновой кислоты (D) в положении 512 на тирозин (Y);
(j) замены треонина (Т) в положении 515 на глутамин (Q);
(k) замены лейцина (L) в положении 516 на треонин (Т) или триптофан (W);
(l) замены аргинина (R) в положении 521 на триптофан (W);
(m) замены изолейцина (I) в положении 523 на аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), глицин (G), лизин (K) или аргинин (R);
(n) замены лизина (K) в положении 524 на лейцин (L);
(о) замены глутамина (Q) в положении 526 на метионин (М);
(р) замены гистидина (Н) в положении 535 на пролин (Р);
(q) замены аспарагиновой кислоты (D) в положении 550 на глутаминовую кислоту (Е);
(r) замены лизина (K) в положении 557 на глицин (G);
(s) замены лизина (K) в положении 573 на фенилаланин (F), гистидин (Н), пролин (Р), триптофан (W) или тирозин (Y);
(t) замены лизина (K) в положении 574 на аспарагин (N);
(u) замены глутамина (Q) в положении 580 на лизин (K); и
(v) комбинации двух или более указанных замен,
где указанная Tn3-каркасная структура имеет более длительное время полужизни в плазме, чем время полужизни в плазме Tn3-каркасной структуры, не являющейся конъюгированной с указанным вариантом HSA.
41. Tn3-каркасная структура по п. 40, где вариант HSA содержит последовательность полноразмерного зрелого HSA (SEQ ID NO: 133 или 138) или ее фрагмент за исключением по меньшей мере одной аминокислотной замены, пронумерованной относительно положения в полноразмерном зрелом HSA, выбранной из группы, состоящей из:
(а) замены лейцина (L) в положении 463 на аспарагин (N);
(а) замены треонина (Т) в положении 508 на аргинин (R);
(c) замены изолейцина (I) в положении 523 на аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), глицин (G), лизин (K) или аргинин (R);
(d) замены лизина (K) в положении 524 на лейцин (L); и
(e) комбинации двух или более указанных замен,
где указанная Tn3-каркасная структура имеет более длительное время полужизни в плазме, чем время полужизни в плазме Tn3-каркасной структуры, не являющейся конъюгированной с указанным вариантом HSA.
42. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 3-14, содержащая по меньшей мере две идентичные CD40L-специфичные мономерные субъединицы.
43. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 3-14, содержащая по меньшей мере две различные CD40L-специфичные мономерные субъединицы.
44. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-14, где указанная каркасная структура представляет собой агонист рецептора CD40.
45. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-14, где указанная каркасная структура представляет собой антагонист рецептора CD40.
46. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 3-14, где по меньшей мере две CD40L-специфичные мономерные субъединицы специфически связываются с одним и тем же эпитопом CD40L.
47. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 3-14, где по меньшей мере две CD40L-специфичные мономерные субъединицы специфически связываются с различными эпитопами CD40L.
48. Tn3-каркасная структура по п. 47, где различные эпитопы CD40L представляют собой неперекрывающиеся эпитопы.
49. Tn3-каркасная структура по п. 47, где различные эпитопы CD40L представляют собой перекрывающиеся эпитопы.
50. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-14, где каркасная структура связывается по меньшей мере с двумя молекулами CD40L.
51. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-14, где одна CD40L-специфичная мономерная субъединица связывается по меньшей мере с двумя молекулами CD40L.
52. Tn3-каркасная структура по п. 1, где бета-цепи по меньшей мере одной CD40L-специфичной мономерной субъединицы имеют по меньшей мере 90% идентичность последовательности с бета-цепями с SEQ ID NO: 3.
53. Tn3-каркасная структура по п. 1, где бета-цепь А содержит SEQ ID NO: 11 за исключением по меньшей мере одной мутации.
54. Tn3-каркасная структура по п. 1, где бета-цепь В содержит SEQ ID NO: 12 за исключением по меньшей мере одной мутации.
55. Tn3-каркасная структура по п. 1, где бета-цепь С содержит SEQ ID NO: 13 или 14 за исключением по меньшей мере одной мутации, и где цистеин в SEQ ID NO: 13 или 14 не заменен.
56. Tn3-каркасная структура по п. 1, где бета-цепь D содержит SEQ ID NO: 15 за исключением по меньшей мере одной мутации.
57. Tn3-каркасная структура по п. 1, где бета-цепь Ε содержит SEQ ID NO: 16 за исключением по меньшей мере одной мутации.
58. Tn3-каркасная структура по п. 1, где бета-цепь F содержит SEQ ID NO: 17 за исключением по меньшей мере одной мутации, и где цистеин в SEQ ID NO: 17 не заменен.
59. Tn3-каркасная структура по п. 1, где бета-цепь G содержит SEQ ID NO: 18 за исключением по меньшей мере одной мутации.
AB
n
BC
n
1
CD
n
DE
n
EF
n
FG
n
60. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-5, где CD40L-специфичная мономерная субъединица содержит аминокислотную последовательность: IEV(X)ALITW(X)CELXYGI(X)TTIDL(X)YSI(X)YEVSLIC(X)KET FTT,
где
AB
BC
CD
DE
EF
FG
(a) X, X, X, X, X и X представляют собой аминокислотные остатки, присутствующие в последовательностях петель АВ, ВС, CD, DE, EF и FG, соответственно;
1
(b) Χ представляет собой аминокислотный остаток А или Т; и
(c) длина петли n представляет собой целое число от 2 до 26.
61. Tn3-каркасная структура по п. 60, где последовательность петли АВ содержит SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 136, последовательность петли CD содержит SEQ ID NO: 6, и последовательность петли EF содержит SEQ ID NO: 8 или SEQ ID NO: 137.
62. Tn3-каркасная структура по п. 60, где последовательность петли ВС содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92,
63. Tn3-каркасная структура по п. 60, где последовательность петли DE содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 94, 95, 96, 97, 98 и 169.
64. Tn3-каркасная структура по п. 60, где последовательность петли FG содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 9, 99, 139 и 170.
65. Tn3-каркасная структура по п. 60, где последовательность петли ВС содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117 и 174.
66. Tn3-каркасная структура по п. 60, где последовательность петли DE содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128 и 175.
67. Tn3-каркасная структура по п. 60, где последовательность петли FG содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 129, 130 и 177.
68. Tn3-каркасная структура по п. 60, где
(a) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 83, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(b) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 83, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 99;
(c) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 84, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(d) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 85, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(e) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 86, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 96, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(f) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 87, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 97, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(g) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 88, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(h) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 89, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(i) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 90, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(j) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 91, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 95, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139;
(k) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 92, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 98, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139; или
(l) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 93, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 94, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 9 или 139.
69. Tn3-каркасная структура по п. 60, где
(a) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 100, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(b) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 101, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 119, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(c) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 102, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 120, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(d) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 103, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(e) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 104, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 122, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(f) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 105, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(g) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 106, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(h) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 107, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(i) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 108, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(j) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 109, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(k) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: ПО, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(l) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 111, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 123, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 130;
(m) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 108, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 121, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(n) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 112, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 124, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(о) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 113, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 125, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(p) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 114, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 118, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(q) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 115, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 126, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129;
(r) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 116, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 127, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129; или
(s) последовательность петли ВС содержит SEQ ID NO: 117, последовательность петли DE содержит SEQ ID NO: 128, и последовательность петли FG содержит SEQ ID NO: 129.
70. Tn3-каркасная структура по п. 69, где петля АВ содержит SEQ ID NO: 136.
71. Tn3-каркасная структура по п. 68, где CD40L-специфичная мономерная субъединица содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42 и 146.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
72. Tn3-каркасная структура по п. 60, где CD40L-специфичная мономерная субъединица содержит аминокислотную последовательность: IEVKDVTDTTALITWXDXXXXXXXCELTYGIKDVPGDRTTIDLWXHXAXYSIGNLKPDTEYEVSLICRXGDMSSNPAKETFTT (SEQ ID NO: 167),
где
1
(a) Χ представляет собой аминокислотный остаток серии (S) или лейцин (L);
2
(b) Х представляет собой аминокислотный остаток аспарагиновую кислоту (D) или глутаминовую кислоту (Е);
3
(c) Х представляет собой аминокислотный остаток гистидин (Н), изолейцин (I), валин (V), фенилаланин (F) или триптофан (W);
4
(d) Х представляет собой аминокислотный остаток аланин (А), глицин (G), глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D);
5
(e) Х представляет собой аминокислотный остаток глутаминовую кислоту (Е), лейцин (L), глутамин (Q), серии (S), аспарагиновую кислоту (D) или аспарагин (N);
6
(f) Х представляет собой аминокислотный остаток фенилаланин (F) или тирозин (Y);
7
(g) X представляет собой аминокислотный остаток изолейцин (I), валин (V), гистидин (Н), глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D);
8
(h) X представляет собой аминокислотный остаток глицин (G), триптофан (W) или валин (V);
9
(i) Х представляет собой аминокислотный остаток триптофан (W), фенилаланин (F) или тирозин (Y);
10
(j) Χ представляет собой аминокислотный остаток серии (S), глутамин (Q), метионин (М) или гистидин (Н);
11
(k) Х представляет собой аминокислотный остаток триптофан (W) или гистидин (Н); и
12
(l) Х представляет собой аминокислотный остаток аргинин (R) или серии (S).
73. Tn3-каркасная структура по п. 69, где CD40L-специфичная мономерная субъединица содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80 и 82.
74. Tn3-каркасная структура по п. 60, где CD40L-специфичная мономерная субъединица содержит аминокислотную последовательность:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
IEVXDVTDTTALITWXXRSXXXXXXXCELXYGIKDVPGDRTTIDLXXXXYVHYSIGNLKPDTXYEVSLICLTTDGTYXNPAKETFTT (SEQ ID NO: 171), где
1
(a) X представляет собой аминокислотный остаток лизин (K) или глутаминовую кислоту (Е);
2
(b) Х представляет собой аминокислотный остаток треонин (Т) или изолейцин (I);
3
(c) Х представляет собой аминокислотный остаток аспарагин (N) или аланин (А);
4
(d) Х представляет собой аминокислотный остаток серии (S), лейцин (L), аланин (А), фенилаланин (F) или тирозин (Y);
5
(e) X представляет собой аминокислотный остаток тирозин (Y), аланин (А), глицин (G), валин (V), изолейцин (I) или серии (S);
6
(f) Х представляет собой аминокислотный остаток тирозин (Y), серии (S), аланин (А) или гистидин (Н);
7
(g) Х представляет собой аминокислотный остаток аспарагин (N), аспарагиновую кислоту (D), гистидин (Н) или тирозин (Y);
8
(h) Χ представляет собой аминокислотный остаток лейцин (L), фенилаланин (F), гистидин (Н) или тирозин (Y);
9
(i) Х представляет собой аминокислотный остаток гистидин (Н), пролин (Р), серии (S), лейцин (L) или аспарагиновую кислоту (D);
10
(j) Χ представляет собой аминокислотный остаток глицин (G), фенилаланин (F), гистидин (Н) или тирозин (Y);
11
(k) Х представляет собой аминокислотный остаток аланин (А) или треонин (Т);
12
(l) Х представляет собой аминокислотный остаток серии (S), аспарагин (Ν), глутаминовую кислоту (Е), аспарагин (R) или аспарагиновую кислоту (D);
13
(m) Х представляет собой аминокислотный остаток серии (S), глутамин (Q), треонин (Т), аспарагин (N) или аланин (А);
14
(n) X представляет собой аминокислотный остаток пролин (Р), валин (V), изолейцин (I) или аланин (А) или не является аминокислотой;
15
(о) X представляет собой аминокислотный остаток изолейцин (I) или не является аминокислотой;
16
(р) Х представляет собой аминокислотный остаток глутаминовую кислоту (Е) или лизин (K); и
17
(q) Х представляет собой аминокислотный остаток серии (S) или аспарагин (N).
75. Tn3-каркасная структура, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 134, 135, 205, 206, 207 и 208.
76. Tn3-каркасная структура, которая состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 134, 135, 205, 206, 207 и 208.
77. Tn3-каркасная структура, содержащая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 201, 202, 203 и 204.
78. Tn3-каркасная структура, которая состоит из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 201, 202, 203 и 204.
79. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1, 75, 76, 77, 78 и 79, где указанный CD40L представляет собой CD40L человека.
80. Tn3-каркасная структура по п. 79, где указанный CD40L представляет собой мембраносвязанный CD40L (SEQ ID NO: 1), растворимый CD40L (SEQ ID NO: 2) или его фрагмент.
81. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1, 75, 76, 77, 78 и 79, где каркасная структура связывается с CD40L и препятствует связыванию CD40L с CD40.
82. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1, 75, 76, 77, 78 и 79, где каркасная структура связывается с CD40L и нарушает CD40-опосредованный сигнальный путь.
83. Способ изменения активности в клетке, экспрессирующей CD40L, предусматривающий приведение в контакт клетки с Tn3-каркасной структурой по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что Tn3-каркасная структура связывается с CD40L и препятствует связыванию CD40L с CD40.
84. Способ изменения CD40-опосредованного сигнального ответа, предусматривающий приведение в контакт клетки, экспрессирующей CD40L, с Tn3-каркасной структурой по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что Tn3-каркасная структура связывается с CD40L и нарушает CD40-опосредованный сигнальный путь.
85. Способ по п. 84, отличающийся тем, что CD40-опосредованный сигнальный ответ представляет собой Т-зависимый иммунный ответ.
d
86. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1, 75, 76, 77, 78 и 79, где каркасная структура связывается с CD40L с аффинностью (K) приблизительно 1 мкМ или менее, или приблизительно 500 нМ или менее, или приблизительно 100 нМ или менее, или приблизительно 50 нМ или менее, или приблизительно 25 нМ или менее, или приблизительно 10 нМ или менее, или приблизительно 5 нМ или менее, или приблизительно 2 нМ или менее.
87. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1, 75, 76, 77, 78 и 79, где CD40L-специфичная мономерная субъединица специфически связывается с эпитопом CD40L, содержащим аминокислоты, расположенные в положениях 142-155, 200-230 или 247-251 в SEQ ID NO: 2.
88. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-14, пп. 65-67, п. 69, п. 70, п. 73, п. 74, п. 77 и п. 78, где CD40L-специфичная мономерная субъединица взаимодействует с аминокислотами CD40L Е142, Y146, М148, N151, L155, R200, R203 и Е230.
89. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-14, п. 68, п. 71, п. 72, п. 75 и п. 76, где CD40L-специфичная мономерная субъединица взаимодействует с аминокислотами CD40L R203,1204, V247, Н249 и Т251.
90. Tn3-каркасная структура по любому из пп. 1-14, п. 68, п. 71, п. 72, п. 75 и п. 76, где CD40L-специфичная мономерная субъединица взаимодействует с аминокислотами CD40L S245, V247, Н249 и Т251.
91. Tn3-каркасная структура по п. 88, где аминокислоты CD40L Е142, Y146, М148, N151, L155 расположены в первой молекуле CD40L, и аминокислоты R200, R203 и Е230 расположены во второй молекуле CD40L.
92. Tn3-каркасная структура по п. 89, где аминокислоты CD40L R203 и 1204 расположены в первой молекуле CD40L, и аминокислоты CD40L V247, Н249 и Т251 расположены во второй молекуле CD40L.
93. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая Tn3-каркасную структуру по любому из предыдущих пунктов.
94. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 93.
95. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 94.
96. Способ получения Tn3-каркасной структуры, предусматривающий культивирование клетки-хозяина по п. 95 в условиях, при которых экспрессируется Tn3-каркасная структура, кодируемая молекулой нуклеиновой кислоты.
97. Композиция, содержащая Tn3-каркасную структуру по любому из предыдущих пунктов и фармацевтически приемлемый наполнитель.
98. Способ предупреждения, лечения, уменьшения интенсивности, управления течением аутоиммунного заболевания у пациента, нуждающегося в этом, предусматривающий введение эффективного количества композиции по п. 96.
99. Способ снижения частоты введения или количества кортикостерида, вводимого пациенту с аутоиммунным заболеванием, предусматривающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п. 93.
100. Способ по любому из п. 98 или 99, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из следующего: очаговая алопеция, анкилозирующий спондилит, антифосфолипидный синдром, аутоиммунная болезнь Аддисона, аутоиммунные заболевания надпочечников, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный оофорит и орхит, синдром Шегрена, псориаз, атеросклероз, диабетическая и другие ретинопатии, ретролентальная фиброплазия, возрастная макулярная дегенерация, неоваскулярная глаукома, гемангиомы, тиреоидные гиперплазии (в том числе болезнь Грейвса), трансплантация ткани роговицы и другой ткани, а также хроническое воспаление, сепсис, ревматоидный артрит, перитонит, болезнь Крона, реперфузионное повреждение, септицемия, эндотоксический шок, муковисцидоз, эндокардит, псориаз, артрит (например, псориатический артрит), анафилактический шок, ишемия органа, реперфузионное повреждение, повреждение спинного мозга и отторжение аллотрансплантата, аутоиммунная тромбоцитопения, болезнь Бехчета, булезный пемфигоид, кардиомиопатия, дерматит, связанный с целиакией спру, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, синдром Черджа-Стросса, рубцовый пемфигоид, CREST-синдром, болезнь Холодовых агглютининов, болезнь Крона, дискоидная волчанка, идиопатическая криоглобулинемия смешанного типа, фибромиалгия-фибромиозит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, Гийена-Барре, тиреоидит Хашимото,
идиопатический фиброз легких, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP), IgA-нейропатия, болезнь Стилла, красный плоский лишай, красная волчанка, болезнь Меньера, смешанное заболевание соединительной ткани, рассеянный склероз, сахарный диабет 1 типа или иммуноопосредованный, миастения, вульгарный пемфигус, пернициозная анемия, нодозный полиартериит, полихондрит, полигландулярные синдромы, ревматическая полимиалгия, полимиозит и дерматомиозит, первичная агаммаглобулинемия, первичный билиарный цирроз, псориаз, псориатический артрит, болезнь Рейно, синдром Рейтера, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия, синдром Шегрена, синдром мышечной скованности, системная красная волчанка, красная волчанка, артериит Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит, язвенный колит, увеит, васкулит, такой как герпетиформный дерматит, витилиго и гранулематоз Вегенера.
101. Способ по любому из п. 98 или 99, отличающийся тем, что аутоиммунное заболевание представляет собой системную красную волчанку (SLE).
102. Способ по любому из п. 98 или 99, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает дополнительную терапию, где указанная терапия представляет собой иммунотерапию, биологическую терапию, химиотерапию, лучевую терапию или терапию с помощью низкомолекулярного лекарственного средства.
1
1
1
103. Белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 20, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с P222-орторомбической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, а=85,69 Å, b=90,64 Å, с=95,56 Å.
104. Белковый кристалл по п. 103, где ассиметрическая единица кристалла содержит тример CD40L и три молекулы Tn3-каркасной структуры.
105. Белковый кристалл по п. 103, где кристалл характеризуется рассеиванием рентгеновского излучения при определении структурных координат до разрешения со значением, равным 3,2 Å или менее.
106. Белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 68, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл
1
имеет кристаллическую решетку с Р23-кубической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, a=b=c=97,62 Å.
107. Белковый кристалл по п. 106, где ассиметрическая единица кристалла содержит одну молекулу CD40L и одну молекулу Tn3-каркасной структуры.
108. Белковый кристалл по п. 106, где кристалл характеризуется рассеиванием рентгеновского излучения при определении структурных координат до разрешения со значением, равным 2,7 Å или менее.
109. Белковый кристалл, содержащий Tn3-каркасную структуру, состоящую из SEQ ID NO: 28 или 146, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с Р321-пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, а=95,53 Å, b=93,53 Å, с=66,69 Å.
110. Белковый кристалл по п. 109, где ассиметрическая единица кристалла содержит одну молекулу CD40L и одну молекулу Tn3-каркасной структуры.
111. Белковый кристалл по п. 109, где кристалл характеризуется рассеиванием рентгеновского излучения при определении структурных координат до разрешения со значением, равным 2,8 Å или менее.
1
112. Белковый кристалл, содержащий две различные Tn3-каркасные структуры, состоящие из SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 28 или 146, в комплексе с растворимым CD40L (SEQ ID NO: 2), где данный кристалл имеет кристаллическую решетку с Ρ2-кубической пространственной группой и постоянными решетки, +/- 0,1%, а=80,32 Å, b=143,48 Å, с=111,27 Å, β=98,22 Å.
113. Белковый кристалл по п. 112, где ассиметрическая единица кристалла содержит два тримера CD40L и шесть молекул каждой Tn3-каркасной структуры.
114. Белковый кристалл по п. 112, где кристалл характеризуется рассеиванием рентгеновского излучения при определении структурных координат до разрешения со значением, равным 1,9 Å или менее.
115. Белковый кристалл по любому из пп. 103-114, где белок кристаллизован при помощи диффузии паров в сидячей капле.
116. Способ получения белкового кристалла, предусматривающий:
(a) смешивание объема раствора, содержащего Tn3-каркасную структуру, которая содержит CD40L-специфичную мономерную субъединицу, в комплексе с CD40L, с объемом резервуарного раствора, содержащего осаждающее средство; и
(b) инкубирование смеси, полученной на этапе (а), в закрытом контейнере при пригодных для кристаллизации условиях до образования белкового кристалла.
117. Способ по п. 116, отличающийся тем, что белковый кристалл получают при помощи диффузии паров в сидячей капле.
118. Способ по п. 116, отличающийся тем, что Tn3-каркасная структура содержит SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 146.
119. Машиночитаемый накопитель данных, содержащий материал для хранения данных, закодированный машиночитаемыми командами для:
(a) преобразования данных в графическое трехмерное изображение структуры части белкового кристалла Tn3-каркасной структуры, содержащей CD40L-специфичную мономерную субъединицу, образующую комплекс с CD40L; и
(b) обеспечения отображения указанного графического трехмерного изображения.
120. Машиночитаемый накопитель данных по п. 119, где Tn3-каркасная структура содержит SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 68 или SEQ ID NO: 146.
121. Машиночитаемый накопитель данных по п. 119, где белковый кристалл представляет собой кристалл по п. 103, кристалл по п. 106, кристалл по п. 118 или любую их комбинацию.