Прикрепление морских бентосных организмов при пониженном содержании кальция в воде

А. И. Раилкин, С. З. Чикадзе, В. А. Попов, Д. А. Сафина

ПРИКРЕПЛЕНИЕ МОРСКИХ БЕНТОСНЫХ ОРГАНИЗМОВ ПРИ ПОНИЖЕННОМ СОДЕРЖАНИИ КАЛЬЦИЯ В ВОДЕ*

Введение

Проблема биологического прикрепления на клеточном, тканевом и организменном уровнях весьма актуальна в биологии. Именно прикрепительные способности морских беспозвоночных животных и водорослей во многом определяют успешность существования тех или иных видов, связанных с плотными субстратами в гидродинамически активной среде, а также особенности формирования и пополнения ими бентосных сообществ [4]. Помимо своего фундаментального значения, по мнению авторов настоящей работы, проблема биологического прикрепления является ключевой при решении целого ряда прикладных задач в области гидробиологии и экологии, в особенности в вопросах защиты технических объектов и сооружений от биологического обрастания и биоповреждения [7].

Однако до сих пор универсальные физиологические механизмы, за счет которых осуществляется прикрепление бентосных организмов, в том числе обрастателей, недостаточно изучены [8, 13-15]. Есть основания полагать [7], что, по крайней мере, временное прикрепление, связанное с движением организмов в контакте с поверхностью, должно зависеть от наличия во внешней среде ионов кальция. Имеются данные [9-12], показывающие наличие такого физиологического механизма у диатомовых водорослей.

Цель настоящей работы — проверить предположения о роли ионов кальция в процессах прикрепления некоторых беспозвоночных животных и спор водорослей, обладающих различными способами движения и прикрепления. Для этого были проведены эксперименты с разным содержанием ионов кальция в морской воде.

Материал и методы исследования

Объектами для настоящего экспериментального исследования послужили беспозвоночные животные (гидроидные полипы Gonothyraea loveni, турбеллярии Convoluta convoluta, моллюски Mytilus edulis), а также бурые водоросли Laminaria saccharina. Они были собраны в губе Чупа (Кандалакшский залив Белого моря). Основные эксперименты были выполнены в условиях Морского аквариального комплекса Санкт-Петербургского государственного университета (СПбГУ) в Старом Петергофе на территории Биологического института [6]. Опыты с гидроидными полипами были поставлены непосредственно на Морской биологической станции (МБС) СПбГУ. Колонии G. loveni до проведения опытов содержали в условиях холодной термостатированной комнаты при температуре +8 ... + 10°С, в качестве пищи им служили науплиусы рачка Artemia salina. Выход личинок индуцировали путем помещения колоний со зрелыми гонофо-рами в условия повышенной температуры (+15 ... + 16°С), яркого освещения и интенсивной аэрации, как описано в работах [2, 3]. Споры ламинарии получали и готовили

* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты №08-04-01007-а и 08-04-10074-к).

© А. И. Раилкин, С. З. Чикадзе, В. А. Попов, Д. А. Сафина, 2010

к опытам в соответствии с методом из работы [1] путем предварительного подсушивания фрагментов талломов водоросли L. saccharina со зрелыми спорангиями в течение 15-20 ч.

Турбеллярий собирали на нитчатых водорослях, а молодь мидий (с длиной раковины 1-2 мм) — с полотнищ рыбацкой сети, установленных в море в период оседания личинок. Во всех экспериментах использовали искусственную морскую воду соленостью 24%о, приготовленную на основе известной прописи бескальциевой морской воды (NaCl 19,56 г; MgCl2 х 6H2O 4,96 г; MgSO4 х 7H2O 3,52 г; KCl 0,44 г; KBr 0,07 г; H3BO3 0,02 г; NaF 0,02 г; H2O до 1 л). Перед постановкой опытов в воду добавляли необходимое количество CaCl2, требуемое для эксперимента. Нормальное содержание кальция, соответствующее его количеству в натуральной морской воде, составляло около 1 г/л.

У мидий через минуту, а у конволют через 5 мин регистрировали, способны ли они к временному прикреплению, локомоции, сокращению, а моллюски также и к образованию биссуса. Прикрепление личинок гидроидного полипа контролировали один раз в сутки. Для индукции прикрепления планул чашки Петри с ними частично осушали, оставляя тонкий слой воды (толщиной около 1 мм), в результате чего личинки оказывались в плотном контакте с твердым субстратом (дном). После прикрепления, которое происходило не позднее чем через 6 ч, чашки Петри ополаскивали морской водой, удаляя из них неприкрепленных личинок. Споры ламинарии выдерживали в воде с разным содержанием кальция в течение 15, 30 и 60 мин, затем чашки Петри со спорами трижды ополаскивали в естественной морской воде. Опыты с личинками гидроидного полипа продолжались в течение трех суток, с мидиями, конволютами и ламинариями — 1 ч. После подавления движения, сокращения и прикрепления у животных или экспериментального прерывания процесса прикрепления у водорослей их помещали в воду с нормальным содержанием кальция. Опыты со всеми объектами были повторены от трех до пяти раз с 10-40 особями в каждой повторности, а с ламинариями — при концентрации спор 200 тыс./мл. На основании полученных данных рассчитывали средние арифметические и их ошибки. Сравнение средних осуществляли с помощью t-критерия.

Результаты исследования

Изучение влияния ионов кальция на биологические объекты, имеющие разные способы движения и прикрепления, показало следующее. После индукции оседания основная часть планул гидроидного полипа G. loveni прочно прикрепляется к субстрату, образуя стадию диска [3]. В естественной морской воде в течение трех суток значительное число личинок остаются прикрепленными, а часть из них продолжает развитие, переходя от стадии диска к стадии столона и к развитию первичного гидранта. Лишь небольшое число особей, неспособных к дальнейшему развитию, открепляются и дальше не развиваются, а часть из них погибает. Сходная картина наблюдается и в искусственной морской воде с нормальным, 100%-ным, содержанием в ней кальция (относительно природной морской воды). Таким образом, динамика самопроизвольного открепления личинок в обоих случаях оказывается статистически одинаковой. Принципиально иная картина наблюдается в воде с пониженным относительно нормы содержанием кальция (табл. 1). При его пониженной концентрации прочно прикрепленные планулы теряли связь с субстратом. В результате этого количество неприкрепленных и неразвивающих-ся личинок достигало 50% от их общего числа через трое суток. При низком содержании кальция в воде, равном 12,5% от нормы, смертность личинок возрастает, превышая их

Содержание кальция, % от нормы Длительность опыта, сут Суммарный процент открепившихся личинок

100 1 2,6 ±2,6

(натуральная вода) 2 2,8 ±2,8

3 3,5 ±3,5

100 1 2,6 ±2,6

(искусственная вода) 2 8,2 ±3,8

3 16,4 ±5,9

1 22,9 ±5,4

50 2 41,7 ±7,3

3 50,6 ±9,4

1 25,7 ±2,3

25 2 38,3 ±5,7

3 52,4 ±7,0

1 16,0 ±8,2

12,5 2 36,0 ±8,6

3 53,0 ±9,4

естественную смертность в 1,5 раза (р < 0,001). Полное отсутствие в воде кальция приводит к смертности, достигающей более 90% на третьи сутки, ввиду чего данные по их откреплению в бескальциевой среде не приводятся.

При изучении прикрепления подвижных спор бурой водоросли ламинарии Ь. вае-еЬ,атта было установлено, что пониженное содержание кальция в морской воде отрицательно влияет на их прикрепление (табл. 2). В первые 15 мин процент прикрепления фактически не зависит от концентрации кальция. Эффект подавления начинал сказываться при концентрации кальция ниже 50%. Обращает на себя внимание, что при концентрациях кальция 25-37,5% от нормы наблюдается достоверное (р < 0,01) снижение прикрепления через 30 и 60 мин. В то же время при более низких концентрациях кальция в морской воде (0-10%) подавление прикрепления вообще не зависит от времени.

Анализ полученных данных позволяет предварительно интерпретировать прикрепление спор ламинарии как двухстадийный процесс, первая фаза которого соответствует физической адгезии, а вторая — собственно биологической адгезии. Согласно полученным данным, физическая адгезия не зависит от концентрации кальция в воде и достаточно быстро сменяется (точнее, дополняется) биоадгезией, связанной с действием биологических механизмов. Действительно, при содержании кальция в воде, не превышающем 10% от нормы, процент прикрепляющихся спор не изменяется во времени, а остается на уровне, соответствующем их прикреплению посредством сил физической адгезии.

Временное прикрепление двустворчатого моллюска мидии М. вйиНв осуществляется с помощью слизи, выделяемой его железами на подошву ноги при движении по твердому субстрату. Постоянное прикрепление связано с гораздо более прочным удержанием на субстрате с помощью прикрепляющихся к нему биссусных нитей, вырабатываемых биссусным аппаратом моллюска. У молоди мидий, использованных в данном исследовании, образование биссусных нитей происходило в среднем через 10-15 мин после их помещения в экспериментальные сосуды. Наблюдения показали, что в воде с низким содержанием кальция подавление временного прикрепления происходит почти сразу

Содержание кальция, % от нормы Время, мин Прикрепление (среднее кол-во спор в 10 полях зрения микроскопа при увеличении 600 х) Достоверное (р < 0,01) подавление прикрепления относительно контроля, %

100 15 11,2 ± 1,4 -

(контроль) 30 27,2 ±2,0 -

60 45,0 ±2,6 -

50 15 10,8 ± 1,4 Нет

30 21,5 ± 1,9 »

60 44,2 ±3,6 »

37,5 15 7,8 ± 1,1 Нет

30 15,7 ± 1,5 50

60 34,0 ±2,2 26

25 15 8,5 ± 1,3 Нет

30 16,3 ± 1,4 48

60 31,8 ±2,1 30

10 15 7,3 ± 1,2 35

30 8,3 ± 1,3 74

60 7,2 ± 1,0 84

5 15 6,5 ± 1,4 42

30 6,3 ± 1,0 80

60 6,7 ±1,1 85

0 15 7,3 ± 1,1 35

30 8,3 ± 1,4 70

60 8,8 ± 1,6 80

Таблица 3. Прикрепление моллюсков МуШив вйиНв в морской воде с разным содержанием кальция

Содержание кальция, % от нормы Подавление временного прикрепления, мин Средний процент особей, образовавших биссусные нити

100 Нет 100

5 25,5 ± 1,9 25

0 14,0 ±0,2 6

после подавления их движения. При этом моллюски оказываются настолько слабо связанными с субстратом, что даже при легком механическом воздействии на их раковину они переходят из вертикального в горизонтальное положение, заваливаясь на бок. Подавление временного прикрепления при низкой концентрации кальция в воде или его отсутствии происходит в среднем через 25 и 15 мин соответственно (табл. 3). Постоянное прикрепление мидий с помощью биссусных нитей также зависит от содержания кальция в воде. При низкой его концентрации прикрепленными оказываются только 25% особей, а при его отсутствии — уже около 6%.

Наблюдения за движением, способностью к сокращению и временному прикреплению плоских червей С. еоиуоЫЬа показали, что в естественной морской воде (табл. 4) так же, как в искусственной воде с нормальным содержанием кальция, животные в течение всего часового периода наблюдений активно двигаются и сохраняют устойчивую связь с субстратом. Однако в воде с пониженным содержанием кальция наблюдается последовательное подавление с начала их движения, затем сокращения и наконец временного прикрепления. Производя легкие колебательные движения кисточкой над неприкрепленными животными, их без труда удается переместить в другое место. На основа-

Содержание кальция, % от нормы Подавление движения, мин Подавление прикрепления, мин

100 Нет Нет

20 15,7 ± 1,5 31,5 ±2,0

10 17,5 ±4,8 24,0 ± 1,7

5 11,9 ±2,0 20,6 ± 1,5

нии полученных данных можно констатировать отчетливую тенденцию ускорения подавления временного прикрепления конволют при понижении концентрации кальция в воде.

Обсуждение результатов исследования

Полученные экспериментальные результаты подтверждают известные представления о том, что кальций необходим для движения и сокращения как отдельных клеток, так и целых организмов, что ранее было хорошо документировано, в частности, на морских беспозвоночных животных [5]. В указанной работе для доказательства роли кальция в этих процессах были использованы кобальт, никель и лантан, ионы которых являются физиологическими антагонистами ионов кальция.

Участие ионов кальция в процессах прикрепления беспозвоночных животных к поверхностям твердых тел до сих пор вообще не было изучено. Вместе с тем, планируя настоящее исследование, логично было предполагать, что временное прикрепление, обеспечивающее связь с субстратом во время движения по нему, может и должно зависеть от наличия в воде ионов кальция, так как он является одним из ведущих факторов, необходимых для движения. Настоящее исследование полностью подтвердило это предположение. Действительно, зависимость прикрепления от содержания в воде кальция (очевидно, в его ионной форме) была показана для всех исследованных в настоящей работе беспозвоночных животных (планул гидроидного полипа О. Iоувт, плоских червей С. соиуоЫЬа, моллюсков М. вЛпЫв), имеющих разные формы движения и прикрепления, а также для спор бурой водоросли ламинарии Ь. вассНагта.

Ограниченный объем публикации не позволяет во всех деталях обсудить полученные данные о влиянии ионов кальция на прикрепление изученных объектов, поэтому ограничимся рассмотрением следующих моментов. Хорошо известно, что прикрепление организмов к поверхностям твердых тел включает физическую и биологическую адгезию, которая, в свою очередь, состоит из двух последовательных стадий: временного и постоянного прикрепления [4, 8, 13, 14]. Наличие физической адгезии удалось экспериментально выявить при изучении прикрепления спор ламинарии, именно благодаря тому, что их оседание носило массовый характер и могло быть прервано на самой ранней стадии. У других объектов в связи с их биологическими особенностями выявить физическую адгезию не оказалось возможным, хотя нет никаких сомнений в том, что она имеет место.

Временное биологическое прикрепление, несомненно, обратимо по своей сути, а постоянное, — напротив, необратимо и связано с отрывом организмов от поверхности и с нарушением целостности их прикрепительных структур [4]. За временное прикрепление отвечают разного рода биоадгезивы — биополимеры, выделяемые на поверхность

организмов (полисахариды, гликопротеиды и др.). Однако постоянное прикрепление обеспечивает гораздо более прочную связь с поверхностью, чем временное, и основано на участии в процессах прикрепления специализированных прикрепительных структур и механизмов.

У планул гидроидного полипа G. loveni эмбриональное развитие связано с прикреплением к субстрату. Многолетний опыт работы с этим объектом показал, что далеко не все из первоначально прикрепившихся личинок образуют столон с первичным гидрантом, а в дальнейшем колонию. Часть личинок, временно прикрепившихся к субстрату и трансформировавшихся в диск (стадия диска), по неизвестным причинам может открепиться (см. табл. 1). Таким образом, на стадии диска прикрепление фактически можно считать обратимым, т. е. временным. Следует подчеркнуть, что пониженное содержание кальция в воде достоверно (р < 0,001) увеличивает число открепляющихся личинок. Вероятно, личинки, не открепляющиеся от субстрата при пониженных концентрациях кальция, уже прошли стадию временного прикрепления и перешли к постоянному прикреплению, которое как биологический процесс является необратимым и не зависит от концентрации ионов кальция в воде.

Аналогичными соображениями можно объяснить сходные результаты, полученные в опытах с другими объектами: их открепление в воде с пониженным содержанием кальция на стадии временного прикрепления и отсутствие открепления у некоторых особей, вероятно, уже перешедших на стадию постоянного прикрепления. Резюмируя все вышесказанное, можно утверждать, что подавление прикрепления в среде с пониженным содержанием кальция (или при его отсутствии) у всех изученных объектов происходило на стадии временного прикрепления, так как во многих случаях оно наблюдалось в короткие сроки. Открепление планул гидроидного полипа на вторые и третьи сутки, очевидно, имело место у тех личинок, которые находились на стадии диска, имеющей характер временного прикрепления.

Общеизвестна роль ионов кальция в укреплении костных тканей у позвоночных животных и человека, изучены контроль ионами кальция прикрепления клеток в культуре тканей и его участие во многих других процессах, связанных с биологическим прикреплением на молекулярном, клеточном и тканевом уровнях. Однако контроль кальцием прикрепления морских беспозвоночных к твердым субстратам впервые показан в настоящей работе.

Как было установлено, содержание (концентрация) ионов кальция в морской воде влияет на временное прикрепление трех видов беспозвоночных: личинок гидроидного полипа Gonothyraea loveni, находящихся на стадии диска в процессе их развития; турбеллярию Convoluta convoluta, свободно двигающуюся по субстрату с помощью ресничек, и на моллюска мидию съедобную Mytilus edulis, ползающего с помощью сокращения мышц ноги. Контроль ионами кальция прикрепления был также установлен для спор бурой водоросли Laminaria saccharina. Существенное (и статистически значимое) снижение числа моллюсков мидий, образовавших биссус в воде с низким содержанием ионов кальция, позволяет считать, что кальций также контролирует и постоянное прикрепление у этих моллюсков, точнее, переход от временного к постоянному прикреплению.

Изученные животные имеют железы, секретирующие биоадгезивы для временного (турбеллярии конволюты) или постоянного (двустворчатые моллюски мидии) прикрепления [10]. У личинок гидроидных полипов данные железы отсутствуют [4] так же, как и у спор бурой водоросли ламинарии. Тем не менее на основании проведенного исследования логично сформулировать общую гипотезу, объясняющую механизм их при-

крепления. Ее суть заключается в том, что для обеспечения временного прикрепления организмов (и, вероятно, клеток) требуется наличие ионов кальция в воде. Отсутствие или недостаточная концентрация кальция в среде, окружающей организмы (и клетки), приводит к подавлению биохимических механизмов их прикрепления. Возможно, предполагаемый физиологический механизм прикрепления связан с работой кальциевых каналов клеток, как это имеет место в случае контроля кальцием движения и сокращения [4, 5].

Полученные экспериментальные данные позволяют предполагать существование механизма кальциевого контроля временного прикрепления не только у изученных, но также у других беспозвоночных животных и водорослей. Поэтому можно думать, что предполагаемый механизм прикрепления бентосных организмов к твердым субстратам является универсальным. Однако необходимы дальнейшие исследования для того, чтобы выяснить его конкретную природу. В первую очередь следует изучить, связан ли предполагаемый механизм с работой кальциевых каналов клеток или кальций участвует непосредственно во взаимодействии прикрепительных структур и биоадгезивов бентосных организмов с твердыми субстратами.

Литература

1. Блинова Е.И., Макаров В. Н. Инструкция по биотехнологии культивирования ламинарии сахаристой в двухгодичном цикле в Баренцевом море. М.: ВНИРО, 1987. 35 с.

2. Марфенин Н. Н. Функциональная морфология колониальных гидроидов. СПб.: Зоол. ин-т РАН, 19936. 153 с.

3. Марфенин Н. Я., Косевич И. А. Биология гидроида Obelia loveni (All.): образование колонии, поведение и жизненный цикл гидрантов, размножение // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16. Биология. 1984. №3. С. 16-24.

4. Раилкин А. И. Колонизация твердых тел бентосными организмами. СПб., 2008. 427 с.

5. Раилкин А. И., Серавин Л. Н. Обратимое блокирование (наркоз) подвижности и сократимости у многоклеточных беспозвоночных животных ионами-антагонистами кальция // Зоол. журн. 1989. Т. 68, вып. 6. С. 19-29.

6. Раилкин А. И., Чикадзе С.З., Никитин О. М., Гагаринова Н.Г., Фролов К. Б. Холодноводный морской аквариальный комплекс Биологического института Санкт-Петербургского университета: принципы создания и итоги первого года функционирования // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2006. Вып. 4. С. 3-9.

7. Раилкин А. И., Чикадзе С. З., Шилова О. А. Морское биологическое обрастание и перспективы создания экологически безопасных противообрастательных покрытий // Фундаментальные основы инновационных биологических проектов в «Наукограде»: сб. статей. СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2008. С. 210-231 (Труды Биол. НИИ СПбГУ. Вып. 54).

8. Чикадзе С. З., Раилкин А. И. Механизмы прикрепления обрастателей // Перифитон и обрастание: теория и практика. Сб. тезисов Межд. науч.-практ. конф. СПб., 22-25 октября 2008 г. С. 28-30.

9. Cooksey B., Cooksey K.E., Miller C.A., Paul J.H., Rubin R. W., Webster D. The attachment of microfouling diatoms // Marine Biodeterioration: An Interdisciplinary Study / Ed. by J. D. Costlow, R. C. Tipper. Annapolis; Maryland: Naval Institute Press, 1984. P. 167-171.

10. Cooksey K. E. Requirement for calcium in adhesion of a fouling diatom to glass // Appl. Env. Microbiol. 1982. Vol. 41, N6. P. 1378-1382.

11. Cooksey K. E., Cooksey B. Adhesion of fouling diatoms to surfaces: some biochemistry // Algal Biofouling. Amsterdam et al.: Elsevier, 1986. P. 41-53.

12. Cooksey K. E., Wigglesworth-Cooksey B. Adhesion of bacteria and diatoms to surfaces in the sea: a review // Aquat. Microbiol. Ecol. 1995. Vol. 9, N1. P. 87-96.

13. Fletcher R. L., Jones A. M., Jones E. B. G. The attachment of fouling macroalgae // Marine Biodeterioration: An Interdisciplinary Study / Ed. by J. D. Costlow, R. C. Tipper. Annapolis; Maryland: Naval Institute Press, 1984. P. 172-182.

14. Lindner E. The attachment of macrofouling invertebrates // Marine Biodeterioration: An Interdisciplinary Study / J. D. Costlow, R. C. Tipper. Annapolis; Maryland: Naval Institute Press, 1984. P. 183-201.

15. Railkin A. I., Orlova M. I., Chikadze S. Z. Modern problems of protection from marine and aquatic fouling // Перифитон и обрастание: теория и практика. Сб. тезисов Междунар. науч.-практ. конф. С.-Петербурга. 22-25 октября 2008 г. С. 170-173.

Статья поступила в редакцию 3 декабря 2009 г.