УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ МОЛЕКУЛ ДНК

Полезная модель относится к области устройств для молекулярно-генетического анализа и касается устройства для идентификации молекул дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Данное устройство может быть использовано, например, для выявления возбудителей инфекционных заболеваний животных и растений, генетического маркирования признаков, генетической паспортизации биологических объектов и т.д.
Известна система для идентификации молекул ДНК, состоящая из раздельных блоков амплификации (умножения) специфических фрагментов ДНК и детекции продуктов реакции амплификации с помощью электрофореза (Гааль Э.,Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул/ Москва, «МИР» 1982, с.368-393).
Известна система для идентификации молекул ДНК, состоящая из раздельных блоков амплификации специфических фрагментов ДНК и детекции продуктов реакции амплификации с помощью гибридизации с флуоресцентно-меченным зондом (ГОСТ Р 52174-2003. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с помощью биологического микрочипа).
Наиболее близким к заявляемому является известное устройство для идентификации молекул ДНК, состоящее из амплификатора ДНК и детектора продуктов реакции (Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПНР в реальном времени, 2-е издание, исправленное/ Москва, БИНОМ. Лаборатория знаний 2009, с.12-40) - прототип. В данном устройстве амплификатор ДНК и детектор продуктов реакции совмещены в одном блоке. Детектором продуктов реакции является флюориметр, содержащий источник света возбуждения флуоресценции, сфетофильры источника возбуждения, детектор излучения флуоресценции, светофильтр детектора, спектроделитель и направляющее зеркало. В данном техническом решении амплификатор, необходимый для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР), выполнен из блока термостатирования пробирок, элементов Пельтье и радиатора.
Недостатком данного технического решения является его конструктивная сложность, а также сложность эксплуатации устройства, связанная с необходимостью использования дополнительных химических соединений - флуоресцентных зондов и необходимостью изолирования устройства от внешней засветки.
Задача полезной модели заключается в создании устройства для идентификации молекул ДНК, обладающего большей конструктивной простотой и дающего возможность упростить эксплуатацию данного устройства. Кроме того, задачей полезной модели является расширение арсенала технических средств, которые могут быть использованы для идентификации молекул ДНК.
Указанный технический результат достигается за счет того, что в устройстве для идентификации молекул ДНК, состоящем из амплификатора ДНК и детектора продуктов реакции, в качестве детектора оно содержит ячейку, по крайней мере, дно которой обладает диэлектрическими свойствами, с расположенными на нем не менее чем двумя электродами, и каждый из электродов соединен с устройством, позволяющим подавать переменный электрический сигнал с различной частотой и измерять электрическую емкость и/или диэлектрические потери на различной частоте.
Предлагаемое устройство является новым и не описано в научно-технической литературе.
В предлагаемой полезной модели амплификатор ДНК состоит из традиционных для амплификатора конструктивных элементов, таких как термостатирующий блок, элементы Пельтье и радиатор.
Термостатирующий блок позволяет поддерживать заданную температуру при реакции амплификации. Элементы Пельтье дают возможность регулировать температуру. Радиатор позволяет отводить лишнее тепло.
В качестве детектора устройство содержит ячейку, по крайней мере, дно которой обладает диэлектрическими свойствами, с расположенными на нем не менее, чем двумя электродами, и каждый из электродов соединен с устройством, позволяющим подавать переменный электрический сигнал с различной частотой и измерять электрическую емкость и/или диэлектрические потери на различной частоте.
Ячейка может иметь плоское или неплоское внутреннее основание, например, содержать одну или несколько лунок, причем стенки ячейки могут быть созданы с использованием барьера из гидрофобного материала.
Ячейка может быть изготовлена как из электропроводящего материала, например, такого, как металл, так и из диэлектрика, например, из полимера, не обладающего электропроводностью. При этом у ячейки, по крайней мере, дно обязательно должно обладать диэлектрическими свойствами, поэтому при использовании для изготовления ячейки электропроводящих материалов, например, металла, на рабочую внутреннюю поверхность ячейки обязательно должен быть нанесен слой диэлектрика. В случае отсутствия поверхностных диэлектрических свойств у дна ячейки предлагаемое устройство будет неработоспособным.
Кроме того, ячейка обязательно должна содержать на своем дне не менее двух электродов, обеспечивающих создание электрического поля в ячейке. Электроды могут быть изготовлены из любого электропроводящего материала, например, из металла, электропроводящего полимера, например, полианилина, электропроводящего композита, например, из полипропилена, наполненного углеродными нанотрубками, и т.д. Размеры каждого из электродов могут отличаться друг от друга и могут варьироваться в широких пределах. В случае изготовления ячейки из электропроводящего материала электроды должны быть изолированы от стенок и дна ячейки.
Количество электродов обязательно должно быть не менее двух и может быть как четным, так и нечетным. Если ячейка будет содержать только один электрод, то устройство функционировать не будет.
Форма и геометрические размеры электродов могут варьироваться в зависимости решаемой экспериментальной задачи. Обычно ПЦР проводят в объеме, не превышающем 1 миллилитр (мл). Кроме того, на электроды целесообразно подавать напряжение, не превышающее 10 вольт (В), поэтому расстояние между электродами на дне ячейки может варьироваться в широких пределах, например, от 3 микрон (мкм) до 3 миллиметров (мм). Возможно использование встречно-штырьевой системы электродов.
Геометрические размеры ячейки принципиального значения не имеют и могут варьироваться в зависимости от числа электродов на дне ячейки и решаемой, экспериментальной задачи. Ячейка может быть как съемной так и не съемной, а также при необходимости она может содержать крышку.
В предлагаемом устройстве каждый из электродов обязательно должен быть соединен с устройством, позволяющим подавать электрический сигнал с различной частотой и измерять электрическую емкость и/или диэлектрические потери на различной частоте. В качестве такого устройства можно использовать традиционные устройства для диэлектрической спектроскопии или импедансометрии.
В предлагаемой полезной модели соединенное с электродами устройство обязательно должно иметь возможность измерять электрическую емкость в помещенной между электродами реакционной системе после подачи на нее электрического сигнала и/или измерять диэлектрические потери в помещенной в ячейку реакционной системе. Одновременное измерение электрической емкости и измерение диэлектрических потерь в помещенной в ячейку реакционной системе дает возможность получить дополнительную информацию.
Схематическое изображение предлагаемого устройства для идентификации молекул ДНК показано на фиг.1, на которой цифрой 1 обозначена ячейка, цифрой 2 обозначены элементы Пельтье, цифрой 3 обозначен радиатор, цифрой 4 обозначены провода, соединяющие электоды с устройством, позволяющим подавать переменный электрический сигнал с различной частотой и измерять электрическую емкость и/или диэлектрические потери на различной частоте. Само такое устройство и компьютер, записывающий результаты измерений и ведущий обработку данных, на фиг. не показаны.
Предлагаемое устройство для идентификации молекул ДНК функционирует следующим образом. В отдельной пробирке готовят от 0.5 мкл до 0.5 мл реакционной смеси, состоящей из водного буферного раствора, содержащего хлорид магния, фермента Taq-полимеразы, дезоксирибонуклеотидтрифосфатов и праймеров, специфических для известной ДНК. Затем в пробирку помещают раствор исследуемой ДНК и содержимое пробирки перемешивают. После этого требуемый объем смеси помещают между электродами на дне ячейки, расположенной в термоблоке амплификатора предлагаемого устройства и из заранее подготовленных программ выбирают термический режим проведения ПЦР. Запускают процесс амплификации и одновременно с ним с помощью устройства для диэлектрической спектроскопии подают на электроды переменный электрический сигнал с различной частотой и измеряют электрическую емкость и/или диэлектрические потери на различной частоте в реакционной системе, помещенной, по крайней мере, между двумя электродами. Результаты измерения поступают в компьютер, который обрабатывает их по специальной программе и на основе полученных данных дает ответ о присутствии искомой ДНК в исследуемом биологическом материале. Таким образом удается провести индикацию ДНК. В случае отсутствия искомой ДНК проводят аналогичный эксперимент или серию экспериментов с другими праймерами.
Полезная модель может быть использована для идентификации любых молекул ДНК, для которых установлена специфическая последовательность нуклеотидов, позволяющая синтезировать специфические праймеры.
Предлагаемая полезная модель компактна, обладает конструктивной простотой и несложна в эксплуатации.
Преимущества предлагаемой полезной модели иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
Идентификацию молекул ДНК проводят в круглой ячейке, изготовленной из диэлектрика полипропилена, с внутренним радиусом 2 мм. Данная ячейка имеет два электрода с расстоянием 20 микрон между ними, изготовленных из проводящего углерода и нанесенных методом контактной печати. Предварительно ячейку закрепляют в термостатирующем блоке амплификатора, содержащем элементы Пельтье и радиатор. После этого электроды с помощью проводников соединяют со стандартным устройством для проведения диэлектрической спектроскопии. В отдельной пробирке готовят 100 мкл реакционной смеси, состоящей из водного буферного раствора, содержащего хлорид магния, фермента Taq-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, прямого праймера, имеющего последовательность (5'-GCCCTCTACTCCACCCCCATCC-3') и обратного праймера, имеющего последовательность (5'- GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG-3') Данные праймеры сецифичны для ДНК сои (комплементарны участкам, ограничивающим фрагмент гена лектина). Затем в пробирку помещают исследуемую ДНК и содержимое пробирки перемешивают. После этого 10 мкл смеси помещают между электродами на дне ячейки. Запускают процесс амплификации и проводят 40 циклов ПЦР. После этого подают на электроды переменный электрический сигнал с частотой от 100 герц до 1000000 герц (Гц) и измеряют электрическую емкость реакционной системы на различной частоте в память компьютера, совмещенного с устройством. Компьютер обрабатывает полученные данные по специальной программе и на их основе дает ответ о присутствии искомой ДНК в исследуемом биологическом материале. Таким образом удается провести идентификацию ДНК сои.
Пример 2.
Опыт проводят с использованием квадратной ячейки размером 10х10 мм, изготовленной из пластины алюминия, верхняя поверхность которой покрыта слоем диэлектрика оксида кремния. Ячейка содержит три медных электрода гребенчатой формы с входящими навстречу друг другу гребнями, изготовленными методом фотолитографии. Ячейка содержит две независимые реакционные зоны круглой формы радиусом 1 мм, ограниченные слоем напыленного политетрафторэтилена. Реакционные зоны в ячейке располагаются так, что в каждой из них находятся входящие друг в друга гребни соседних электродов. Такое строение ячейки позволяет сразу анализировать две реакционные системы одновременно.
В одной из пробирок готовят 100 мкл реакционной смеси, состоящей из водного буферного раствора, содержащего хлорид магния, фермента Taq-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, прямого праймера, имеющего последовательность (5'-GGAGTAATCCTCCTCCTCACA-3') и обратного праймера, имеющего последовательность (5'-GCGAAGAATCGGGTAAGGGTT-3') Данные праймеры сецифичны для ДНК курицы (комплементарны участкам, ограничивающим фрагмент гена цитохрома b курицы). Затем в пробирку помещают исследуемую ДНК и содержимое пробирки перемешивают.
В другой пробирке готовят 100 мкл реакционной смеси, состоящей из водного буферного раствора, содержащего хлорид магния, фермента Taq-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, прямого праймера, имеющего последовательность (5'-CAGCCTTTGTAGGCTATGTCC-3') и обратного праймера, имеющего последовательность (5'-GGGAGGAGGAAGTGGAGG-3') Данные праймеры сецифичны для ДНК индейки (комплементарны участкам, ограничивающими фрагмент гена цитохрома b индейки). Затем в пробирку помещают исследуемую ДНК и содержимое пробирки перемешивают.
После этого в одну реакционную зону вносят 4 мкл смеси из первой пробирки, в другую реакционную зону вносят 4 мкл смеси из второй пробирки.
Ячейку закрепляют в термостатирующем блоке амплификатора, также содержащем элементы Пельтье и радиатор. Запускают процесс амплификации и проводят 40 циклов ПНР. Одновременно с помощью устройства подают на электроды переменный электрический сигнал с частотой от 100 до 1000000 Гц, таким образом, чтобы соседние электроды имели противоположную полярность и записывают диэлектрические потери в реакционной системе на различной частоте для каждой реакционной зоны в память компьютера, совмещенного с устройством. Компьютер обрабатывает полученные данные по специальной программе и на их основе дает ответ о присутствии искомой ДНК в исследуемом биологическом материале. Таким образом удается провести идентификацию ДНК курицы в одной реакционной зоне и ДНК индейки в другой.
Пример 3.
Опыт проводят аналогично примеру 2, однако, используют ячейку, содержащую 8 электродов и 4 реакционные зоны. Готовят 4 реакционные смеси. Первая смесь содержит праймеры, специфичные для ДНК сои, указанные в примере 1, вторая смесь содержит праймеры, специфичные для ДНК пшеницы - прямой 5'- GGGTTCCATCCAAACTCAG-3' и обратный 5'- GGTACCCTGTGCCAATTGT-3', третья смесь содержит праймеры, специфичные для ДНК курицы, указанные в примере 5, четвертая смесь содержит праймеры, специфичные для ДНК индейки, указанные в примере 2. В каждую из реакционных зон помещают свою реакционную смесь, затем в каждую реакционную зону вносят по 1 мкл раствора ДНК неизвестной природы.
Идентификацию молекул ДНК проводят аналогично примеру 2, однако, измеряют электрическую емкость и диэлектрические потери в реакционной системе на различной частоте. Устройство позволяет идентифицировать исследуемую ДНК как ДНК пшеницы.
Были проведены дополнительные эксперименты, которые показали, что если устройство будет содержать только амплификатор ДНК или только детектор продуктов реакции, то устройство не будет функционировать.
Также экспериментально было установлено, что если в качестве детектора устройство будет содержать ячейку, не обладающую, по крайней мере, поверхностными диэлектрическими свойствами, то предложенная система будет неработоспособной. Также экспериментально было найдено, что устройство не будет функционировать, если ячейка в детекторе продуктов реакции будет содержать только один электрод или когда каждый из электродов не будет соединен с устройством, позволяющим подавать электрический сигнал с различной частотой и измерять электрическую емкость и/или диэлектрические потери на различной частоте, в помещенной ячейку реакционной системе. Также экспериментально было доказано, что предлагаемая полезная модель будет неработоспособной, если соединенное с электродами устройство будет подавать только электрический сигнал с различной частотой, но не будет давать возможность измерять электрическую емкость и/или диэлектрические потери на различной частоте в помещенной в ячейку реакционной системе после подачи на нее электрического сигнала. Экспериментально было установлено, что если соединенное с электродами ячейки устройство будет неспособно подавать электрический сигнал на электроды, или будет способно подавать электрический сигнал только с одной частотой, то полезная модель утрачивает свою работоспособность.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предлагаемая полезная модель действительно дает возможность идентифицировать молекулы ДНК у биологических объектов, конструктивно проста и дает возможность упростить эксплуатацию данного устройства. Кроме того, данная полезная модель расширяет арсенал технических средств, которые могут быть использованы для идентификации молекул ДНК.