МОРФОЛИНО-ЗАМЕЩЕННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ МОЧЕВИНЫ ИЛИ КАРБАМАТА В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ MTOR
MORPHOLINO-SUBSTITUTED DERIVATIVES OF UREA OR CARBAMATE AS MTOR INHIBITORS

Настоящее изобретение относится к новому классу ингибиторов киназ, включая их фармацевтически приемлемые соли, пролекарства и метаболиты, которые полезны для модулирования активности протеинкиназ для модулирования клеточных активностей, таких как передача сигналов, пролиферация и секреция цитокинов. Более конкретно в изобретении предложены соединения, которые ингибируют, регулируют и/или модулируют активность киназ, в частности активность mTOR, и метаболические пути передачи сигналов, относящиеся к вышеупомянутым клеточным активностям. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные соединения, например, для лечения таких заболеваний, как иммунологические, воспалительные, аутоиммунные, аллергические расстройства, или пролиферативных заболеваний, таких как рак.
Киназы катализируют фосфорилирование белков, липидов, Сахаров, нуклеозидов и других клеточных метаболитов и играют ключевые роли во всех аспектах физиологии эукариотических клеток. В частности, протеинкиназы и липидкиназы принимают участие в событиях передачи сигналов, которые контролируют активацию, рост, дифференциацию и выживание клеток в ответ на внеклеточные медиаторы или стимулы, такие как факторы роста, цитокины или хемокины. В общем протеинкиназы классифицируют на две группы, а именно те, которые преимущественно фосфорилируют остатки тирозина, и те, которые преимущественно фосфорилируют остатки серина и/или треонина.
Неадекватно высокая активность протеинкиназ вовлечена в многочисленные заболевания, включая рак, метаболические заболевания и аутоиммунные/воспалительные расстройства. Это может быть вызвано либо прямо, либо косвенно нарушением механизмов контроля из-за мутации, сверхэкспрессии или неадекватной активации фермента. Во всех этих случаях ожидается, что селективное ингибирование киназы будет иметь благоприятный эффект.
mTOR ("мишень рапамицина у млекопитающих", также известная как FRAP или RAFT1) стала новым средоточием для попыток создания новых лекарственных средств (Tsang et al., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). Было установлено, что белок mTOR является лекарственной мишенью для иммуносуппрессивного эффекта рапамицина, лекарственного средства, которое используется для предотвращения отторжения трансплантатов. Рапамицин работает через механизм «приобретения функции» (gain-of-function) посредством связывания с внутриклеточным белком "FK-506-связывающий белок 12 кДа" (FKBP12) с образованием комплекса лекарственное средство-рецептор, который затем связывается с mTOR и ингибирует ее. Таким образом, рапамицин индуцирует образование трехкомпонентного комплекса, состоящего из рапамицина и двух белков, FKBP12 и mTOR.
Белок mTOR представляет собой крупную киназу 289 кДа, которая присутствует у всех исследованных к настоящему времени эукариотических организмов (Schmelzle and Hall, 2000, Cell 103, 253-262). Последовательность карбокси-концевого домена "фосфатидилинозит-3-киназа (PI3K)-родственной киназы" (PIKK) является высококонсервативной между видами и демонстрирует серии- и треонин-киназную активность и отсутствие обнаружимой липидкиназной активности. Интактный домен PIKK необходим для всех известных функций mTOR. РКВР12-рапамицин-связывающий (FRB) домен локализован вблизи PIKK домена и образует гидрофобный карман, который связывается с рапамицином, связанным с FKBP12. FRB домен, по-видимому, не ингибирует ферментативную активность киназного домена непосредственно. Одним объяснением является то, что FKBP12-рапамицин предотвращает взаимодействие mTOR с ее субстратами благодаря стерическим затруднениям. N-конец mTOR состоит из приблизительно 20 тандемных повторов из 37-43 аминокислот, именуемых HEAT повторами. HEAT повторы взаимодействуют с белковыми партнерами связывания, такими как Raptor.
mTOR может образовывать по меньшей мере два различных белковых комплекса, mTORC1 и mTORC2. В mTORC1 белковом комплексе mTOR взаимодействует с белками Raptor и mLST8/GβL и регулирует клеточный рост посредством фосфорилирования эффекторов, таких как p70S6K и 4E-BP1, способствуя трансляции мРНК (матричная РНК) и белковому синтезу. Комплекс mTORC1 ответственен за считывание пищевых сигналов (например доступность аминокислот) в сочетании с передачей сигналов инсулина. Активность mTOR в mTORC1 может ингибироваться рапамицином.
Второй белковый комплекс, mTORC2, состоит из белков mTOR, Rictor, mLST8/GβL и Sin1 и вовлечен с организацию актина. mTORC2 изначально описан как нечувствительный к рапамицину. Последняя публикация продемонстрировала, что рапамицин воздействует на функционирование mTORC2 после прологированной обработки через непрямой механизм посредством нарушения сборки mTORC2 белкового комплекса (Sarbassov et al., 2006, Molecular Cell 22, 159-168).
Биологическая функция mTOR заключается в том, что она является центральным регулятором различных внеклеточных и внутриклеточных сигналов, включая факторы роста, питательные вещества, энергию и стресс. Индуцированная фактором роста и гормоном (например инсулином) активация mTOR опосредуется PI3 киназами, Akt и белковым комплексом туберозного склероза (TSC). Например, mTOR действует в качестве центрального регулятора клеточной пролиферации, ангиогенеза и клеточного метаболизма (Tsang et al., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). В дополнение к своим иммуносуппрессивным эффектам рапамицин (Sirolimus) является мощным ингибитором пролиферации гладкомышечных клеток сосудов и одобрен FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) в качестве лекарственного средства против рестеноза, используемого в коронарных стентах. Кроме того, установлено, что рапамицин проявляет противоопухолевую активность в некоторых моделях in vitro и животных моделях (Faivre et al., 2006. Nat. Rev. Drug. Discov. 5(8):671-688).
Из-за терапевтического потенциала рапамицина некоторые фармацевтические компании начали создание аналогов рапамицина для улучшения фармакокинетических свойств этой молекулы (Tsang et al., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). Например, CCI-779 (темсиролимус, temsirolimus) представляет собой более водорастворимое сложно-эфирное производное рапамицина для внутривенных и пероральных композиций. CCI-779 обладает противоопухолевой активностью как сам по себе, так и в комбинации с цитотоксическими агентами в клеточных линиях. RAD-001 (эверолимус, everolimus) представляет собой производное в виде гидроксиэтилового эфира рапамицина, которое было создано для перорального введения. AP23573 (деферолимус, deferolimus) разработан для перорального или внутривенного введения.
В общем, производные рапамицина действуют через тот же самый молекулярный механизм, индукцию трехкомпонентного комплекса рапамицин-FKBP12-mTOR. Вероятно, что эта функция mTOR может быть в той же степени или даже более эффективно ингибироваться ингибиторами киназной функции. Например, это могло бы быть осуществлено посредстовм обнаружения соединений, которые взаимодействуют с ATP-связывающим карманом mTOR киназного домена. Например, Torinl является мощным и селективным АТР-конкурентным ингибитором mTOR, который непосредственно связывается с обоими mTOR комплексами и нарушает клеточный рост и пролиферацию более эффективно, чем рапамицин (Thoreen et al., 2009. J Biol. Chem. 284(12):8023-32; Feldman et al., 2009. PLOSBiology 7(2):e38).
Заболевания и расстройства, ассоциированные с mTOR, также описаны, например, в WO-A 2008/116129, WO-A 2008/115974, WO-A 2008/023159, WO-A 2009/007748, WO-A 2009/007749, WO-A 2009/007750, WO-A 2009/007751, WO-A 2011/011716.
В литературе имеются сообщения о некоторых ингибиторах mTOR, которые могут быть полезны в медицинской сфере, например в качестве противораковых агентов (Faivre et al., 2006. Nat. Rev. Drug. Discov. 5(8):671-688). В WO-A 2008/116129 описаны имидазолопиримидиновые аналоги в качестве смешанных ингибиторов mTOR и PI3K киназ. Пиразолопиримидиновые аналоги описаны в качестве смешанных ингибиторов mTOR и PI3K киназ в WO-A 2008/115974. Дополнительные пиримидиновые производные в качестве соединений, активных в отношении mTOR киназы и/или фермента PI3K, описаны в WO-A 2008/023159, WO-A 2009/007748, WO-A 2009/007749, WO-A 2009/007750, WO-A 2009/007751, WO-A 2010/103094, WO-A 2010/120994 и WO-А 2010/120998.
Триазиновые соединения в качестве ингибиторов PI3K киназы и MTOR описаны в WO 2009/143313 A1, WO 2009/143317 A1 и WO 2010/096619 A1.
Кроме того, ингибиторы mTOR описаны в международных заявках на патент с номерами PCT/EP 2012/055953 и WO 2011/107585 А1.
Ожидается, что селективный ингибитор mTOR, который ингибирует mTOR с большей эффективностью, чем другие киназы, может обладать благоприятными терапевтическими свойствами, поскольку ингибирование других киназ может вызывать нежелательные побочные эффекты (Richard et al., 2011. Current Opinion Drug Discovery and Development 13(4):428-440). Может быть важной особенно селективность в отношении членов семейства фосфатидилинозит-3-киназ (PI3K) (например PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kγ и PI3Kδ) и PI3K-родственных киназ (например DMA-PK, ATM и ATR).
Даже несмотря на то, что ингибиторы mTOR известны из уровня техники, существует потребность в предложении дополнительных ингибиторов mTOR, обладающих, по меньшей мере частично, более эффективными фармацевтически релевантными свойствами, такими как активность, селективность и ADME (адсорбция, метаболизм, распределение и выведение) свойства.
Соответственно, в настоящем изобретении предложены соединения формулы (I)
,
или их фармацевтически приемлемая соль, где
m равно 1 или 2;
n равно 1; 2; 3 или 4;
1
2
2a
2
2
2a
2
2a
2
2a
2
2
2
2a
2b
2
2a
2b
2
2
2a
2
2
2a
2
2a
2
2a
2
2a
2b
2
2a
2
2a
3
2
2
2
2
2
1-6
1-6
каждый R независимо выбран из группы, состоящей из H; галогена; CN; C(O)OR; OR; оксо (=O); C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR; OC(O)N(RR) и Cалкила, где Cалкил возможно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными;
1
возможно два R объединены с образованием, вместе с кольцом, к которому они присоединены, 8-11-членного гетеробицикла;
2
2a
2b
1-6
1-6
R, R, R независимо выбраныи из группы, состоящей из H; Cалкила, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
3
4
4
4
4
4a
4
4a
4
4a
4
4
4
4a
4b
4
4a
4b
4
4
4a
4
4
4a
4
4a
4
4a
4
4a
4b
4
4a
4
4a
2
2
2
2
2
R представляет собой галоген; CN; C(O)OR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR; OC(O)N(RR);
4
4a
4b
1-6
1-6
R, R, R независимо выбраны из группы, состоящей из H и Cалкила, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
0
0
5a
5b
5
5a
5
6
T представляет собой фенил или 5-6-членный ароматический гетероцикл, где T замещен группой N(R)C(O)N(RR) или N(R)C(O)OR и возможно дополнительно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными;
6
7
7
7
7
7a
7
7a
7
7a
7
7
7
7a
7b
7
7a
7b
7
7
7a
7
7
7a
7
7a
7
7a
7
7a
7b
7
7a
7
7a
2
2
2
2
2
1-6
1-6
R представляет собой галоген; CN; C(O)OR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR; OC(O)N(RR) или Cалкил, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
5a
5b
7
7a
7b
1-6
1-6
R, R, R, R, R независимо выбраны из группы, состоящей из H; Cалкила, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
5
2
8
1-6
1-6
R представляет собой H; T и Cалкил, где Cалкил возможно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными;
8
9
9
9
9
9a
9
9a
9
9a
9
9
9
9a
9b
9
9a
9b
9
9
9a
9
9
9a
9
9a
9
9a
9
9a
9b
9
9a
9
9a
2
2
2
2
2
R представляет собой галоген; CN; C(O)OR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR; OC(O)N(RR) или T2;
9
9a
9b
1-6
1-6
R, R, R независимо выбраны из группы, состоящей из H и Cвалкила, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
5
5b
10
возможно R, R объединены с образованием, вместе с атомом азота, к которому они присоединены, содержащего по меньшей мере атом азота в качестве кольцевого гетероатома 4-7-членного гетероциклильного кольца или 8-11-членного гетеробициклильного кольца, где 4-7-членное гетероциклильное кольцо и 8-11-членное гетеробициклильное кольцо возможно замещены одним или более R, которые являются одинаковыми или разными;
2
2
10
3-7
T представляет собой Cциклоалкил; 4-7-членный гетероциклил; 8-11-членный гетеробициклил; фенил; нафтил; инденил или инданил, где T возможно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными;
10
11
11
11
11
11a
11
11a
11
11a
11
11
11
11a
11b
11
11a
11b
11
11
11a
11
11
11a
11
11a
11
11a
11
11a
11b
11
11a
11
11a
12
2
2
2
2
2
1-6
1-6
R представляет собой галоген; CN; C(O)OR; OR; оксо (=O), где кольцо является по меньшей мере частично насыщенным; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR; OC(O)N(RR) или Cалкил, где Cалкил возможно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными;
11
11a
11b
1-6
1-6
R, R, R независимо выбраны из группы, состоящей из H; Cалкила, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
12
13
13
13
13
13a
13
13a
13
13a
13
13
13
13a
13b
13
13a
13b
13
13
13a
13
13
13a
13
13a
13
13a
13
13a
13b
13
13a
13
13a
2
2
2
2
2
R представляет собой галоген; CN; C(O)OR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; N(R)C(O)N(RR); N(R)C(O)OR; OC(O)N(RR);
13
13a
13b
1-6
1-6
R, R, R независимо выбраны из группы, состоящей из H и Cалкила, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
1
1
14a
14
14a
14
14
14
15
2
2
T представляет собой фенил или 5-6-членный ароматический гетероцикл, где T замещен группами S(O)N(RR), S(O)N(RR), S(O)R, S(O)R и возможно дополнительно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными;
15
16
16
16
16
16a
16
16a
16
16a
16
16
16
16a
16b
16
16a
16b
16
16
16a
16
16
16a
16
16a
16
16a
16
16a
2
2
2
2
2
1-6
1-6
R представляет собой галоген; CN; C(O)OR; OR; C(O)R; C(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)N(RR); S(O)R; S(O)R; N(R)S(O)N(RR); N(R)S(O)N(RR); SR; N(RR); NO; OC(O)R; N(R)C(O)R; N(R)S(O)R; N(R)S(O)R; OC(O)N(RR) или Cалкил, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
14a
16
16a
16b
1-6
1-6
R, R, R, R независимо выбраны из группы, состоящей из H; Cалкила, где Cалкил возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными;
14
1-6
R представляет собой Cалкил, который возможно замещен одним или более атомами галогена, которые являются одинаковыми или разными, или незамещенное 4-7-членное гетероциклильное кольцо.
В случае, когда переменная или заместитель могут быть выбраны из группы разных вариантов, и такие переменная или заместитель присутствуют в количестве более одного, соответствующие варианты могут быть одинаковыми или разными.
В пределах настоящего изобретения используемые термины имеют следующие значения.
Термин "возможно замещенный" означает незамещенный или замещенный. Как правило, но без ограничения указанным, "одним или более заместителями" означает одним, двумя или тремя, предпочтительно одним или двумя и более предпочтительно одним заместителем. В общем эти заместители могут быть одинаковыми или разными.
"Алкил" означает прямую или разветвленную углеродную цепь. Каждый водород при алкильном углероде может быть заменен заместителем, как далее раскрыто в данном описании.
1-4
2
2
2
3
2
2
2
2
2
5
3
2
1-4
"Cалкил" означает алкильную цепь, имеющую 1-4 атома углерода, например, если он присутствует в конце молекулы: метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил трет-бутил, или, например, -CH-, -CH-CH-, -CH(CH)-, -C(CH)-, -CH-CH-CH-, -CH(CH)-, -C(CH)-, когда две группировки молекулы соединены такой алкильной группой. Каждый водород при углероде в Cалкиле может быть заменен заместителем, как далее раскрыто в данном описании.
1-6
1-4
2
2
2
3
2
2
2
2
5
3
2
1-6
"Cалкил" означает алкильную цепь, имеющую 1-6 атомов углерода, например, если он присутствует в конце молекулы: Cалкил, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил; трет-бутил, н-пентил, н-гексил, или, например, -CH-, -CH-CH-, -CH(CH)-, -CH-CH-CH-, -CH(CH)-, -C(CH)-, когда две группировки молекулы соединены такой алкильной группой. Каждый водород при углероде в Салкиле может быть заменен заместителем, как далее раскрыто в данном описании.
3-7
3-7
"Cциклоалкил" или "Cциклоалкильное кольцо" означает циклическую алкильную цепь, имеющую 3-7 атомов углерода, например циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил. Каждый водород при циклоалкильном углероде может быть заменен заместителем, как далее раскрыто в данном описании.
"Галоген" означает фтор, хлор, бром или йод. В общем предпочтительно, чтобы галоген представлял собой фтор или хлор.
2
"4-7-членный гетероциклил" или "4-7-членный гетероцикл" означает кольцо с 4, 5, 6 или 7 кольцевыми атомами, которое может содержать вплоть до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое является полностью, частично насыщенным или ненасыщенным), где по меньшей мере один кольцевой атом и вплоть до 4 кольцевых атомов заменены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где это кольцо соединено с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примерами 4-7-членных гетероциклов являются азетидин, оксетан, тиетан, фуран, тиофен, пиррол, пирролин, имидазол, имидазолин, пиразол, пиразолин, оксазол, оксазолин, изоксазол, изоксазолин, тиазол, тиазолин, изотиазол, изотиазолин, тиадиазол, тиадиазолин, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, пирролидин, имидазолидин, пиразолидин, оксазолидин, изоксазолидин, тиазолидин, изотиазолидин, тиадиазолидин, сульфолан, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, имидазолидин, пиридин, пиридазин, пиразин, пиримидин, пиперазин, пиперидин, морфолин, тетразол, триазол, триазолидин, тетразолидин, диазепан, азепин или гомопиперазин. Термин "5-6-членный гетероциклил" или "5-6-членный гетероцикл" определен соответственно.
2
Термин "8-11-членный гетеробициклил" или "8-11-членный гетеробицикл" означает гетероциклическую систему из двух колец с 8-11 кольцевыми атомами, где по меньшей мере один кольцевой атом является общим для обоих колец, и которая может содержать вплоть до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое является полностью, частично насыщенным или ненасыщенным), где по меньшей мере один кольцевой атом и вплоть до 6 кольцевых атомов заменены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где это кольцо соединено с остальной частью молекулы через атом углерода или азота. Примерами 8-11-членного гетеробицикла являются индол, индолин, бензофуран, бензотиофен, бензоксазол, бензизоксазол, бензотиазол, бензизотиазол, бензимидазол, бензимидазолин, хинолин, хиназолин, дигидрохиназолин, хинолин, дигидрохинолин, тетрагидрохинолин, декагидрохинолин, изохинолин, декагидроизохинолин, тетрагидроизохинолин, дигидроизохинолин, бензазепин, пурин или птеридин. Термин "8-11-членный гетеробицикл" также включает спиро-структуры из двух колец, такие как 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан, или мостиковые гетероциклы, такие как 8-аза-бицикло[3.2.1]октан.
2
Термин "5-6-членный ароматический гетероциклил" или "5-6-членный ароматический гетероцикл" означает гетероцикл, полученный из циклопентадиенила или бензола, где по меньшей мере один атом углерода заменен гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)-), кислорода и азота (включая =N(O)-). Примерами таких гетероциклов являются фуран, тиофен, пиррол, имидазол, пиразол, оксазол, изоксазол, тиазол, изотиазол, тиадиазол, пираний, пиридин, пиридазин, пиримидин, триазол, тетразол.
Предпочтительными соединениями формулы (I) являются те соединения, в которых один или более из содержащихся в них остатков имеют значения, приведенные ниже, со всеми комбинациями предпочтительных определений заместителей, являющимися объектом настоящего изобретения. Что касается всех предпочтительных соединений формулы (I), то настоящее изобретение также включает все таутомерные и стереоизомерные формы и их смеси во всех соотношениях, и их фармацевтически приемлемые соли.
В предпочтительных воплощениях настоящего изобретения упомянутые ниже заместители независимо имеют следующее значение. Таким образом, один или более из этих заместителей могут иметь предпочтительные или более предпочтительные значения, приведенные ниже.
Предпочтительно m равно 1.
Предпочтительно n равно 1 или 2.
1
3
1-6
1-6
Предпочтительно R представляет собой незамещенный Cалкил (более предпочтительно метил или этил, еще более предпочтительно метил) или Cалкил, замещенный одним R.
1
Предпочтительно два R объединены с образованием, вместе с кольцом, к которому они присоединены, 8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ильного или 3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ильного кольца.
0
0
5a
5b
5
5a
5
6
Предпочтительно T представляет собой фенил, где T замещен группой N(R)C(O)N(RR) или N(R)C(O)OR и возможно дополнительно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными.
0
5a
5b
5
6
Предпочтительно T замещен группой N(R)C(O)N(RR) и возможно дополнительно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными.
0
6
Предпочтительно T не является дополнительно замещенным одним или более R.
5a
5b
Предпочтительно R, R представляют собой H.
5
2
2
10
2
2
Предпочтительно R представляет собой T, где T возможно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными, и где T представляет собой фенил; пиридил; циклопропил; циклобутил; циклопентил; циклогексил; оксетанил или тетрагидрофуранил; более предпочтительно циклопропил. Более предпочтительно T является незамещенным.
5
1-6
Предпочтительно R представляет собой незамещенный Cалкил.
5
8
9
9
9a
1-6
Предпочтительно R представляет собой Cалкил, замещенный одним или более R, которые являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из F; OR и N(RR).
1
1
14a
14
14a
14
14
14
15
2
2
Предпочтительно T представляет собой фенил или пиридил, и где T замещен группами S(O)N(RR), S(O)N(RR), S(O)R, S(O)R и возможно дополнительно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными.
1
15
1
15
15
Предпочтительно T не является дополнительно замещенным одним или более R, либо T дополнительно замещен одним R. Предпочтительно R представляет собой галоген, более предпочтительно F.
1
14
15
2
Предпочтительно T замещен группой S(O)R и возможно дополнительно замещен одним или более R, которые являются одинаковыми или разными.
14
Предпочтительно R представляет собой метил или этил; более предпочтительно метил.
0
1
Предпочтительно в формуле (I) T и T выбраны с получением формулы (Ia)
,
1
5
14
15
где X представляет собой CH или N, o равно 0 или 1, и n, m, R, R, R, R имеют значения, как указано выше.
Еще более предпочтительной является формула (Ib)
,
1
5
14
15
где X представляет собой CH или N, О равно 0 или 1, и m, R, R, R, R имеют значения, как указано выше.
Соединения формулы (I), в которых некоторые или все из вышеупомянутых групп имеют предпочтительные значения, также составляют объект настоящего изобретения.
Дополнительные предпочтительные соединения по настоящему изобретению выбраны из группы, состоящей из
(S)-1-циклопропил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-(2-гидроксиэтил)-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-циклопропил-3-(4-(4-(5-фтор-2-(метилсульфонил)фенил)-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-(4-(4-(5-фтор-2-(метилсульфонил)фенил)-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(2-гидроксиэтил)мочевины;
(S)-1-(2-фторэтил)-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-(2,2-дифторэтил)-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метил-сульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(оксетан-3-ил)мочевины;
(S)-1-этил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
1-(4-(4-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-циклопропилмочевины;
1-циклопропил-3-(4-(4-(2-(метилсульфонил)фенил)-6-морфолино-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(R)-1-циклопропил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-метил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-изопропил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
1-(4-(4-(3-окса-8-азабицикло[3.2.1]октан-8-ил)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-циклопропилмочевины;
(S)-1-циклопропил-3-(4-(4-(2-(этилсульфонил)фенил)-6-(3-метил-морфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-пропилмочевины;
(S)-1-изобутил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-циклопентил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
1-циклопропил-3-(4-(4-(2-(метилсульфонил)фенил)-6-(1,4-оксазепан-4-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
1-циклопропил-3-(4-(4-(3,3-диметилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
1-циклопропил-3-(4-(4-(3-(гидроксиметил)морфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-циклопропил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-пиридин-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-(4-(гидроксиметил)фенил)-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-циклопропил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(пирролидин-1-илсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-циклобутил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-циклогексил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
1-(2,2-дифторциклопропил)-3-(4-(4-((S)-3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-неопентилмочевины;
(S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(3,3,3-трифторпропил)мочевины;
(S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(2,2,2-трифторэтил)мочевины;
1-(4-(4-((S)-3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(3,3,3-трифтор-2-гидроксипропил)мочевины;
1-(4-(4-((S)-3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(тетрагидрофуран-3-ил)мочевины;
(S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(пиридин-4-ил)мочевины;
(S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(пиридин-3-ил)мочевины;
1-циклопропил-3-(4-(4-(3-этилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
1-(3-амино-4,4,4-трифторбутил)-3-(4-(4-((S)-3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
1-(4-(4-((S)-3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(4,4,4-трифтор-3-гидроксибутил)мочевины;
1-(4-(4-(8-окса-3-азабицикло[3.2.1]октан-3-ил)-6-(5-фтор-2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-циклопропилмочевины;
(S)-1-этил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)пиридин-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-метил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)пиридин-3-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-этил-3-(4-(4-(5-фтор-2-(метилсульфонил)фенил)-6-(3-метил-морфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины;
(S)-1-(4-(4-(5-фтор-2-(метилсульфонил)фенил)-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-метилмочевины;
(S)-1-(2,2-дифторэтил)-3-(4-(4-(5-фтор-2-(метилсульфонил)фенил)-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины и
(S)-1-(4-(4-(5-фтор-2-(метилсульфонил)фенил)-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(2-фторэтил)мочевины.
Там, где может иметь место таутомеризм, такой как, например, кето-енольный таутомеризм, соединений общей формулы (I), индивидуальные формы, такие как, например, кето- и енольная форма, охватываются по-раздельности и совместно в виде смесей в любом соотношении. То же самое относится и к стереоизомерам, таким как, например, энантиомеры, цис/транс-изомеры, конформеры и тому подобное.
1
В частности, соединения формулы (I), где морфолиновое кольцо замещено одним R в положении 3, охватываются настоящим изобретением в виде их изомеров или энантиомеров, или их смесей в отношении соответствующего(их) хирального(ых) углеродного(ых) центра(ов).
Если необходимо, изомеры могут быть разделены способами, хорошо известными в уровне техники, например, посредством жидкостной хроматографии. То же самое применимо к энантиомерам посредством использования, например, хиральных стационарных фаз. Кроме того, энантиомеры могут быть выделены путем превращения их в диастереомеры, например посредством сочетания с энантиомерно чистым вспомогательным соединением с последующим разделением полученных диастереомеров и отщепления вспомогательного остатка. Альтернативно любой энантиомер соединения формулы (I) может быть получен в результате стереоселективного синтеза с использованием оптически чистых исходных материалов.
Соединения формулы (I) могут существовать в кристаллической или аморфной форме. Кроме того, некоторые кристаллические формы соединений формулы (I) могут существовать как полиморфы, которые включены в объем защиты согласно настоящему изобретению. Полиморфные формы соединений формулы (I) могут быть охарактеризованы и дифференцированы с помощью ряда обычных аналитических методик, включая, без ограничения ими, картины дифракции рентгеновских лучей на порошке (XRPD), инфракрасные (IR) спектры, рамановские спектры, дифференциальную сканирующую калориметрию (DSC), термогравиметрический анализ (TGA) и ядерный магнитный резонанс твердого состояния (тсЯМР).
В случае, когда соединения согласно формуле (I) содержат одну или более кислотных или основных групп, изобретение также включает их соответствующие фармацевтически или токсикологически приемлемые соли, в частности их фармацевтически используемые соли. Таким образом, согласно изобретению могут быть использованы соединения формулы (I), которые содержат кислотные группы, например, в виде солей щелочных металлов, солей щелочно-земельных металлов или солей аммония. Более конкретные примеры таких солей включают соли натрия, соли калия, соли кальция, соли магния или соли с аммонием или органическими аминами, такими как, например, этиламин, этаноламин, триэтаноламин или аминокислоты. Соединения формулы (I), которые содержат одну или более основных групп, то есть групп, которые могут быть протонированы, могут быть представлены и использованы по изобретению в форме их солей присоединения с неорганическими или органическими кислотами. Примеры приемлемых кислот включают хлористый водород, бромистый водород, фосфорную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, метансульфоновую кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, нафталиндисульфоновые кислоты, оксалиновую кислоту, уксусную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, пивалоильную кислоту, диэтилуксусную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, пимелиновую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, сульфаминовую кислоту, фенилпропионовую кислоту, глюконовую кислоту, аскорбиновую кислоту, изоникотиновую кислоту, лимонную кислоту, адипиновая кислоту и другие кислоты, известные специалистам в данной области техники. Если соединения формулы (I) одновременно содержат в молекуле кислотные и основные группы, изобретение также включает, в дополнение к упомянутым солевым формам, внутренние соли или бетаины (цвиттерионы). Соответствующие соли согласно формуле (I) могут быть получены традиционными методами, которые известны специалистам в данной области техники, такими как, например, посредством приведения их в контакт с органическими или неорганическими кислотой или основанием в растворителе или диспергирующем агенте, или посредством ионообмена или катионообмена в другими солями. Настоящее изобретение также включает все соли соединений формулы (I), которые благодаря их низкой физиологической совместимости непосредственно не пригодны для применения в фармацевтических средствах, но которые могут быть использованы, например, как промежуточные соединения для химических взаимодействий или для получения фармацевтически приемлемых солей.
В данном изобретении термин "фармацевтически приемлемый" означает, что соответствующее соединение, носитель или молекула являются приемлемыми для введения людям. Предпочтительно этот термин означает «одобренный регулирующим ведомством, таким как ЕМЕА (Европейское агентство лекарственных средств, Европа) и/или FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, США) и/или любое другое национальное регулирующее ведомство, для применения у животных, предпочтительно у людей».
Настоящее изобретение дополнительно включает все сольваты соединений по изобретению.
При необходимости эффекты заявленных соединений в отношении активности mTOR могут, например, быть протестированы с помощью временно экспрессируемой меченной эпитопом mTOR в клеточной линии млекопитающих, такой как HEK293, которая образует иммунопреципитат с моноклональным антителом, направленным против метки-эпитопа (Knight et al. 2004, Bioorganic and Medicinal Chemistry 12, 4749-4759). В другом анализе используется белок mTOR, выделенный из клеточных или тканевых лизатов с помощью обычных методов очистки белков. В этом анализе в качестве субстрата используют GST-слитый белок P70 S6 киназы. Фосфорилирование P70 S6 обнаруживают с помощью первичного фосфо-специфичного антитела (направленного против фосфорилированного треонина 389) и связанного с ферментом вторичного антитела в анализе ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ, US-A 2004/0191836).
Согласно настоящему изобретению, выражение "mTOR" или " киназа mTOR" означает белок mTOR (Tsang et al., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). Ген, кодирующий mTOR, локализован в локусе 1p36.2 на карте человеческих хромосом, и он широко экспрессируется в человеческих тканях.
Как продемонстрировано в примерах, соединения по изобретению тестировали в отношении их селективности в отношении mTOR относительно других киназ. Как показано, протестированные соединения связывают mTOR более селективно, чем киназы PI3K дельта или DNA-PK (смотри таблицу 2 ниже). Соответственно, соединения по настоящему изобретению считают полезными для предупреждения или лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с mTOR, например иммунологических, воспалительных, аутоиммунных или аллергических расстройств, или пролиферативных заболеваний, отторжения трансплантатов, болезни «трансплантат-против-хозяина», сердечно-сосудистых заболеваний, метаболических заболеваний или нейродегенеративных заболеваний.
Таким образом, в настоящем изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы (I) или их фармацевтически приемлемую соль в качестве активного ингредиента вместе с фармацевтически приемлемым носителем, возможно в комбинации с одной или более другими фармацевтическими композициями.
"Фармацевтическая композиция" означает один или более активных ингредиентов и один или более инертных ингредиентов, которые составляют носитель, а также любой продукт, который является результатом, прямо или косвенно, комбинирования, комплексообразования или агрегирования любых двух или более ингредиентов, или диссоциации одного или более ингредиентов, или других типов реакций или взаимодействий одного или более ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению охватывают любую композицию, полученную посредством смешивания соединения по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемого носителя.
Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая вазелиновое масло, масла животного, растительного или синтетического происхождения, включая, без ограничения ими, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят перорально. Физиологический раствор и водная декстроза являются предпочтительными носителями, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина предпочтительно используют в качестве жидких носителей для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерина моностеарат, тальк, хлорид натрия, высушенное снятое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. При необходимости композиция может также содержать небольшие количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или забуферивающих pH агентов. Эти композиции могут быть представлены в форме растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов замедленного высвобождения и тому подобного. Композиция может быть приготовлена в форме суппозитория с традиционными связующими и носителями, такими как триглицериды. Пероральная композиция может включать стандартные носители фармацевтического качества, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахаринат натрия, целлюлоза, карбонат магния и так далее. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences", E.W. Martin. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективное количество терапевтического средства, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя так, чтобы получить форму для соответствующего введения пациенту. Композиция должна соответствовать пути введения.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать в качестве активных ингредиентов один или более дополнительных соединений, таких как одно или более соединений формулы (I), не являющихся первым соединением в композиции или mTOR ингибиторами. Дополнительные биоактивные соединения могут представлять собой стероиды, антагонисты лейкотриенов, циклоспорин или рапамицин.
Соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая(ые) соль(и) и другой(ие) фармацевтически активный(е) агент(ы) может(гут) быть введен(ы) совместно или раздельно и, при их раздельном введении, это может происходить по раздельности или последовательно в любом порядке. При объединении в одной и той же композиции следует понимать, что два соединения должны быть стабильными и совместимыми друг с другом и с другими компонентами композиции. При их раздельном приготовлении они могут быть представлены в любой традиционной композиции, обычно таким образом, как известно для таких соединений в уровне техники.
Настоящее изобретение предполагает, что соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или фармацевтическую композицию, содержащую соединение формулы (I), вводят в комбинации с другим лекарственным средством или фармацевтически активным агентом, и/или что фармацевтическая композиция по изобретению дополнительно содержит такое лекарственное средство или фармацевтически активный агент.
В этом контексте термин " лекарственное средство или фармацевтически активный агент" включает лекарственное средство или фармацевтический агент, которые будут вызывать биологический или медицинский ответ в ткани, системе, животном или человеке, предполагаемый, например, исследователем или клиницистом.
"Объединенные", или "в комбинации", или "комбинация" следует понимать как функциональное совместное введение, где некоторые или все соединения могут быть введены раздельно, в разных композициях, разными путями введения (например подкожно, внутривенно или перорально) и в разные моменты времени введения. Индивидуальные соединения таких комбинаций могут быть введены либо последовательно в раздельных фармацевтических композициях, а также одновременно в объединенных фармацевтических композициях.
Например, терапия ревматоидного артрита предусматривает комбинирование с другими химиотерапевтическими или антительными агентами. Подходящие примеры фармацевтически активных агентов, которые могут быть использованы в комбинации с соединениями по настоящему изобретению и их солями для терапии ревматоидного артрита, включают следующее: иммуносупрессанты, такие как амтолметин гуацил, мизорибин и римексолон; анти-TNFα (фактор некроза опухолей) агенты, такие как этанерцепт, инфликсимаб, адалимумаб, анакинра, абатацепт, ритуксимаб; ингибиторы тирозинкиназ, такие как лефлуномид; антагонисты калликреина, такие как субреум; агонисты интерлейкина 11, такие как опрелвекин; агонисты интерферона бета 1; агонисты гиалуроновой кислоты, такие как NRD-101 (Aventis); антагонисты рецепторов интерлейкина 1, такие как анакинра; антагонисты CD8, такие как гидрохлорид амиприлозы; антагонисты белка-предшественника бета-амилоида, такие как реумакон; ингибиторы матриксных металлопротеиназ, такие как ципемастат, и другие базовые противоревматические препараты, модифицирующие течение болезни (DMARD), такие как метотрексат, сулфасалазин, циклоспорин A, гидроксихороквин, ауранофин, ауротиоглюкоза, тиомалат натрия и золота и пенициламин.
В частности, определенное в данном описании лечение может применяться как монотерапия или может включать, в дополнение к соединениям по изобретению, обычную хирургию, или радиотерапию, или химиотерапию. Соответственно, соединения по изобретению могут также быть использованы в комбинации с существующими терапевтическими агентами для лечения пролиферативных заболеваний, таких как рак. Приемлемые агенты для использования в комбинации включают следующее:
(1) антипролиферативные/антинеопластические лекарственные средства и их комбинации, как применяется в медицинской онкологии, такие как алкилирующие агенты (например цис-платин, карбоплатин, циклофосфамид, азотистый иприт, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан и нитрозомочевины); антиметаболиты (например антифолаты, такие как фторпиримидины, например 5-фторурацил и тегафур, ралтитрексед, метотрексат, цитозин арабинозид, гидроксимочевина и гемцитабин); противоопухолевые антибиотики (например антрациклины, такие как адриамицин, блеомицин, доксорубицин, дауномицин, эпирубицин, идарубицин, митомицин-C, дактиномицин и митрамицин); антимитотические агенты (например алкалоиды барвинка, такие как винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин, и таксоиды, такие как паклитаксел и таксотере); и ингибиторы топоизомераз (например эпиподофиллотоксины, такие как этопозид и тенипозид, амсакрин, топотекан и камптотецины);
(2) цитостатические агенты, такие как антиэстрогены (например тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен и йодоксифен), суппрессирующие регуляторы эстрогеновых рецепторов (например фулвестрант), антиандрогены (например бикалутамид, флутамид, нилутамид и ципротерона ацетат), антагонисты LHRH (рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона) или агонисты LHRH (например гозерелин, лейпрорелин и бузерелин), прогестогены (например мегестрола ацетат), ингибиторы ароматазы (например анастрозол, летрозол, воразол и эксеместан) и ингибиторы 5α-редуктазы, такие как финастерид;
(3) противоинвазивные агенты (например ингибиторы семейства c-Src киназ, такие как 4-(6-хлор-2,3-метилендиоксианилино)-7-[2-(4-метилпиперазин-1-ил)этокси]-5-тетрагидропиран-4-илокси-хиназолин (AZD0530) и N-(2-хлор-6-метилфенил)-2-{6-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]-2-метилпиримидин-4-иламино}тиазол-5-карбоксамид (дасатиниб, BMS-354825), и ингибиторы металлопротеиназ, такие как маримастат, и ингибиторы функционирования рецептора урокиназного активатора плазминогена;
(4) ингибиторы функционирования факторов роста, например, такие ингибиторы включают антитела к факторам роста и антитела к рецепторам факторов роста (например анти-erbB2 антитело трастузумаб [Herceptin™] и анти-erbBI антитело цетуксимаб [C225]); такие ингибиторы также включают, например, ингибиторы тирозинкиназ, например, ингибиторы семейства эпидермальных факторов роста (например ингибиторы тирозинкиназ семейства EGFR (рецепторы эпидермальных факторов роста), такие как N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин-4-амин (гефитиниб, ZD 1839), N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-амин (эрлотиниб, OSI-774) и 6-акриламидо-N-(3-хлор-4-фторфенил)-7-(3-морфолинопропокси)-хиназолин-4-амин (CI 1033), и ингибиторы erbB2 тирозинкиназы, такие как лапатиниб), ингибиторы семейства факторов роста гепатоцитов, ингибиторы семейства факторов роста тромбоцитов, такие как иматиниб, ингибиторы серин/треонинкиназ (например ингибиторы передачи сигнала Ras/Raf, такие как ингибиторы фарнезилтрансферазы, например сорафениб (BAY 43-9006)) и ингибиторы клеточной передачи сигнала посредством MEK и/или Akt киназ;
(5) антиангиогенные агенты, такие как агенты, которые ингибируют эффекты васкулярного эндотелиального фактора роста, например антитело против васкулярного эндотелиального фактора роста бевацизумаб (Avastin™), и ингибиторы VEGF рецепторных тирозинкиназ, такие как 4-(4-бром-2-фторанилино)-6-метокси-7-(1-метилпиперидин-4-илметокси)хиназолин (ZD6474; Пример 2 в WO 01/32651), 4-(4-фтор-2-метилиндол-5-илокси)-6-метокси-7-(3-пирролидин-1-илпропокси)хиназолин (AZD2171; Пример 240 в WO 00/47212), ваталаниб (PTK787; WO 98/35985) и SUI 1248 (сунитиниб; WO 01/60814), и соединения, которые действуют по другим механизмам (например линомид, ингибиторы функционирования интегрина αvβ3 и ангиостатина);
(6) агенты, повреждающие сосуды, такие как комбретастатин A4 и соединения, раскрытые в международной заявке на патент WO 99/02166;
(7) антисмысловые терапии, например терапии, направленные на перечисленные выше мишени, такие как ISIS 2503, анти-ras антисмысловой агент;
(8) подходы генной терапии, включая подходы с заменой аберрантных генов, таких как аберрантный p53 или аберрантный BRCAI или BRCA2, GDEPT (ген-направленная ферментная пролекарственная терапия) подходы, такие как подходы с использованием цитозиндезаминазы, тимидинкиназы или бактериального нитроредуктазного фермента, и подходы для повышения переносимости пациентом химиотерапии или радиотерапии, такие как генная терапия множественной лекарственной устойчивости; и
(9) иммунотерапевтические подходы, включая ex-vivo и in-vivo подходы для увеличения иммуногенности опухолевых клеток пациента, такие как трансфекция цитокинами, такими как интерлейкин 2, интерлейкин 4 или гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, подходы по снижению T-клеточной анэргии, подходы с использованием трансфицированных иммунных клеток, таких как цитокин-трансфицированные дендритные клетки, подходы с использованием цитокин-транисфицированных опухолевых клеточных линий и подходы с использованием анти-идиотидиотипических антител.
Другие комбинированные типы лечения описаны в WO-A 2009/008992, которая включена в данное описание посредством ссылки.
Соответственно, индивидуальные соединения таких комбинаций могут быть введены либо последовательно в отдельных фармацевтических композициях, либо одновременно в объединенных фармацевтических композициях.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению включают композиции, пригодные для перорального, ректального, местного, парентерального введения (включая подкожное, внутримышечное и внутривенное), введения в глаз (офтальмическое), легочного (ингаляция через нос или рот) или назального введения, хотя выбор наиболее приемлемого пути в любом конкретном случае будет зависеть от природы и тяжести подлежащих лечению состояний и от природы активного ингредиента. Они могут быть удобным образом представлены в стандартной лекарственной форме и приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармацевтики.
Для практического применения соединения формулы (I) могут быть объединены в качестве активного ингредиента в гомогенную смесь с фармацевтическим носителем в соответствии с традиционными технологиями приготовления фармацевтических препаратов. Носитель может принимать большое разнообразие форм в зависимости от формы препарата, подлежащего введению, например перорального или парентерального (включая внутривенное). При изготовлении композиций для пероральной лекарственной формы могут быть использованы любые фармацевтические среды, такие как вода, гликоли, масла, спирты, корригенты, консерванты, красители и тому подобное в случае жидких пероральных препаратов, таких как, например, суспензии, эликсиры и растворы; или такие носители, как крахмалы, сахара, микрокристаллическая целлюлоза, разбавители, гранулирующие агенты, смазывающие агенты, связывающие вещества, разрыхлители и тому подобное в случае твердых пероральных препаратов, таких как порошки, твердые и мягкие капсулы и таблетки, причем твердые пероральные препараты являются более предпочтительными, чем жидкие препараты.
В силу легкости их введения таблетки и капсулы представляют собой наиболее удобную пероральную стандартную лекарственную форму, в которой обычно используют твердые фармацевтические носители. При необходимости на таблетки может быть нанесено покрытие с помощью стандартных водных и неводных технологий. Такие композиции и препараты должны содержать по меньшей мере 0,1 процент активного соединения. Процентное содержание активного соединения в этих композициях может, конечно, меняться и может удобным образом находиться между примерно 2 процентами и примерно 60 процентами от массы стандартной формы. Количество активного соединения в таких терапевтически полезных композициях является таким, чтобы получать эффективную дозировку. Активные соединения также могут вводиться интраназально, например, в виде жидких капель или спрея.
Таблетки, пилюли, капсулы и тому подобное также могут содержать связующий агент в виде трагаканта, аравийской камеди, кукурузного крахмала или желатина; эксципиенты, такие как дикальция фосфат; разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота; смазывающее вещество, такое как стеарат магния; и подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин. Когда стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать, в дополнение к вышеперечисленным материалам, жидкий носитель, такой как жирное масло.
Различные другие материалы могут присутствовать в качестве покрытий или для модифицирования физической формы лекарственной формы. Например, таблетки могут быть покрыты шеллаком, сахаром или ими обоими. Сироп или эликсир могут содержать, в дополнение к активному ингредиенту, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, красители и корригенты, такие как вишневый или апельсиновый ароматизатор.
Соединения формулы (I) также могут быть введены парентерально. Растворы или суспензии этих активных соединений могут быть получены в воде, предпочтительно при смешивании с поверхностно-активным веществом, таким как гидроксипропил-целлюлоза. Дисперсии также могут быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты содержат консерванты для предотвращения роста микроорганизмов.
Фармацевтические формы, подходящие для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы она могла быть легко введена посредством шприца. Она должна быть стабильной при условиях изготовления и хранения и должна содержать консерванты для предотвращения заражения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль), их подходящие смеси и растительные масла.
Для обеспечения млекопитающего, в частности человека, эффективной дозой соединения по настоящему изобретению может быть использован любой приемлемый путь введения, например пероральный, ректальный, местный, парентеральный, введение в глаз, в легкое, в нос и тому подобное. Лекарственные формы включают таблетки, пастилки, дисперсии, суспензии, растворы, капсулы, крема, мази, аэрозоли и тому подобное. Предпочтительно соединения формулы (I) вводят перорально.
Эффективные дозировки используемого активного ингредиента могут варьировать в зависимости от конкретного используемого соединения, способа введения, подлежащего лечению состояния и тяжести подлежащего лечению состояния. Такие дозировки могут быть легко установлены специалистом в данной области.
Терапевтически эффективное количество соединения по настоящему изобретению будет обычно зависеть от ряда факторов, включая, например, возраст и массу животного, конкретное требующее лечения состояние и его тяжести, природу композиции и путь введения. Однако, эффективное количество соединения формулы (I) для лечения воспалительного заболевания, например ревматоидного артрита (RA), будет в общем находиться в диапазоне от 0,1 до 100 мг/кг массы тела реципиента (млекопитающее) в сутки и более традиционно в диапазоне от 1 до 10 мг/кг массы тела в сутки. Таким образом, для взрослого млекопитающего массой 70 кг действительное количество в сутки будет составлять от 70 до 700 мг, и это количество может быть введено в однократной дозе в сутки или более традиционно в виде ряда (например двух, трех, четырех, пяти или шести) субдоз в сутки так, что общая суточная доза будет такой же. Эффективное количество их фармацевтически приемлемой соли, пролекарства или метаболита может быть определено как доля эффективного количества соединения формулы (I) самого по себе. Предполагается, что аналогичные дозировки будут приемлемы для лечения других упомянутых выше состояний.
Как он используется в данном описании, термин "эффективное количество" означает количество лекарственного средства или фармацевтического агента, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ в ткани, системе, у животного или человека, которое определяется, например, исследователем или клиницистом.
Кроме того, термин "терапевтически эффективное количество" означает любое количество, которое, в сравнении с соответствующим субъектом, который не получил такого количества, имеет результатом улучшенное лечение, излечение, предупреждение или облегчение заболевания, расстройства или побочного эффекта, либо снижение степени развития заболевания или расстройства. Термин также включает в свой объем количества, эффективные для усиления нормального физиологического функционирования.
Другой аспект настоящего изобретения составляет соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль для применения в качестве лекарственного средства.
Другой аспект настоящего изобретения составляет соединение по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемая соль для применения в способе лечения или предупреждения заболевания или расстройства, ассоциированного с mTOR.
В контексте настоящего изобретения заболевание или расстройство, ассоциированное с mTOR, определяют как заболевание или расстройство, в которое вовлечена mTOR.
В предпочтительном воплощении заболевание или расстройство, ассоциированное с mTOR, представляет собой иммунологическое, воспалительное, аутоиммунное или аллергическое расстройство или заболевание, или отторжение трансплантата, или заболевание «трансплантат-против-хозяина».
Соответственно, другой аспект настоящего изобретения составляет соединение или его фармацевтически приемлемая соль по настоящему изобретению для применения в способе лечения или предупреждения иммунологического, воспалительного, аутоиммунного или аллергического расстройства или заболевания, или отторжения трансплантата, или заболевания «трансплантат-против-хозяина».
Согласно настоящему изобретению, аутоиммунное заболевание представляет собой заболевание, которое по меньшей мере частично провоцируется иммунной реакцией организма против своих собственных компонентов, например белков, липидов или ДНК.
В предпочтительном воплощении аутоиммунное заболевание выбрано из группы, состоящей из ревматоидного артрита (RA), воспалительного заболевания кишечника (IBD; болезнь Крона (Crohns's) и неспецифический язвенный колит), псориаза, системной красной волчанки (SLE) и рассеянного склероза (MS).
Ревматоидный артрит (RA) представляет собой хроническое прогрессирующее изнуряющее воспалительное заболевание, которое поражает приблизительно 1% населения в мире. RA представляет собой симметричный многосуставный артрит, который сначала поражает малые суставы рук и ног. В дополнение к воспалению в синовиальной оболочке, выстилке суставов, агрессивная поверхность ткани, так называемый поверхностный диффузный сосудистый кератит, вторгается в локальные суставные структуры и разрушает их (Firestein 2003, Nature 423:356-361).
Воспалительное заболевание кишечника (IBD) характеризуется хроническим рецидивирующим воспалением кишечника. IBD подразделяется на фенотипы болезни Крона и неспецифического язвенного колита. Болезнь Крона охватывает наиболее часто концевую часть подвздошной кишки и толстую кишку, является трансмуральной и прерывистой. При язвенном колите, напротив, воспаление является непрерывным и ограничено слоями слизистой оболочки прямой и толстой кишки. В приблизительно 10% случаев, ограниченных прямой и толстой кишкой, определенная классификация заболевания как болезни Крона или язвенного колита не может быть осуществлена и их называют 'неопределенным колитом'. Оба заболевания включают внекишечное воспаление кожи, глаз или суставов. Нейтрофил-индуцированные поражения могут быть предотвращены посредством применения ингибиторов миграции нейтрофилов (Asakura et al., 2007, World J Gastroenterol. 13(15):2145-9).
Псориаз - это хронический воспалительный дерматоз, который поражает приблизительно 2% населения. Он характеризуется красными, чешуйчатыми бляшками на коже, которые обычно обнаруживаются на волосистой части головы, локтях и коленях, и могут быть ассоциированы с тяжелым артритом. Поражения вызываются ненормальной пролиферацией кератиноцитов и инфильтрацией воспалительных клеток в дермис и эпидермис (Schön et al., 2005, New Engl. J. Med. 352:1899-1912).
Системная красная волчанка (SLE) представляет собой хроническое воспалительное заболевание, вызываемое опосредованной T-клетками B-клеточной активацией, что приводит к гломерулонефриту и почечной недостаточности. SLE у людей характеризуется на ранних стадиях экспансией долгоживущих аутореактивных CD4+ клеток памяти (D'Cruz et al., 2007, Lancet 369(9561):587-59б).
Рассеянный склероз (MS) представляет собой воспалительное и демиелинизирующее заболевание. Его считали аутоиммунным расстройством, опосредованным T хелперными CD4+ клетками типа 1, но недавние исследования выявили участие других иммунных клеток (Hemmer et al., 2002, Nat. Rev. Neuroscience 3, 291-301).
Заболевание «трансплантат-против-хозяина» (GVDH) является основным осложнением при трансплантации аллогенного костного мозга. GVDH вызывается донорными T клетками, которые распознают и реагируют на отличия реципиента в комплексной системе гистосовместимости, приводя к значительной заболеваемости и смертности.
Отторжение трансплантатов (отторжение аллотрансплантатов) включает, без ограничения ими, острое и хроническое отторжение аллотрансплантата после, например, трансплантатции почки, сердца, печени, легкого, костного мозга, кожи и роговицы. Известно, что T клетки играют центральную роль в специфическом иммунном ответе при оттржении аллотрансплантата.
В другом предпочтительном воплощении заболевание или расстройство, ассоциированное с mTOR, представляет собой пролиферативное заболевание, в частности рак.
Заболевания и расстройства, ассоциированные главным образом с mTOR, представляют собой пролиферативные расстройства или заболевания, в частности рак.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения составляют соединение или его фармацевтически приемлемая соль по настоящему изобретению для применения в способе лечения или предупреждения пролиферативного заболевания, в частности рака.
Рак включает группу заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом и распространением ненормальных клеток. Все типы рака в общем включают определенную ненормальность в контроле клеточного роста, деления и выживания, ведущую к злокачественному росту клеток. Ключевыми факторами, вносящими вклад в указанный злокачественный рост клеток, являются независимость от ростовых сигналов, нечувствительность к антиростовым сигналам, усиление апоптоза, неограниченный репликативный потенциал, продленный ангиогенез, тканевая инвазия и метастазирование и нестабильность генома (Hanahan and Weinberg, 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell 100, 57-70).
Как правило, рак классифицируют как гематологический рак (например лейкемии и лимфомы) и солидный рак, такой как саркомы и карциномы (например рак головного мозга, молочной железы, легкого, прямой кишки, желудка, печени, поджелудочной железы, простаты, яичников).
Ожидают, что особенно чувствительным к лечению ингибиторами mTOR будет рак, при котором активирован путь передачи сигнала PI3K/Akt, например из-за дезактивации опухолевого супрессора PTEN или активирующих мутаций в PIK3A, гене, кодирующем каталитическую субъединицу p110α (p110alpha) фосфоинозитид-3 киназы (Garcia-Echeverria and Sellers, 2008, Oncogene 27, 5511-5526). Примеры рака с высокой долей PTEN мутаций и/или активации PI3K/Akt являются эндометриальная карцинома, глиобластома, рак головы и шеи, рак прямой кишки, рак поджелудочной железы, рак желудка, гепатокарцинома, рак яичника, рак щитовидной железы, почечно-клеточный рак, рак молочной железы, рак простаты и стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST). Наиболее обнадеживающие результаты для ингибиторов mTOR были получены на почечно-клеточной карциноме (RCC), лимфоме мантийных клеток и эндометриальном раке (Faivre et al., 2006. Nat. Rev. Drug. Discov. 5(8):671-688). Кроме того, ингибиторы mTOR могут быть полезны для лечения лейкемий, включая острую миелоидную лейкемию (AML) и хроническую миелоидную лейкемию (CML), множественную миелому и лимфомы.
Кроме того, лечению ингибиторами mTOR может быть подвергнут рак, несущий активирующие mTOR мутации, например одиночные аминокислотные замены, которые придают конституитивную активацию mTOR, такие как S2215Y или R2505P (Sato et al., 2010, Oncogene 29(18):2746-2752).
mTOR играет важную роль в ангиогенезе, образовании новых кровеносных сосудов с доставкой кислорода и питательных веществ к растущим и делящимся клеткам. В этом контексте mTOR контролирует продуцирование белков HIF1-α и HIF1-β, которые представляют собой субъединицы индуцируемого гипоксией фактора (HIF), фактора транскрипции, который контролирует экспрессию генов, продукты которых играют роль в ангиогенезе, клеточной проилиферации, подвижности и выживании. Двумя важными белками, индуцируемыми HIF, являются факторы роста эндотелия сосудов (VEGFs) и ангиопоэтин-2. В недавнем времени появились сообщения о том, что низкомолекулярный ингибитор mTOR может подавлять опухолевый рост, опухолевый ангиогенез, проницаемость сосудов (Xue et al., 2008. Cancer Research 68(22):9551-9557).
В дополнение к опухолегензу имеются свидетельства о том, что mTOR играет роль в синдромах гамартомы. Недавние исследования показали, что опухолевые супрессорные белки, такие как TSC1, TSC2, PTEN и LKB1, плотно контролируют передачу сигнала mTOR. Потеря этих опухолевых супрессорных белков приводит к ряду гамартомных состояний как результату усиленной передачи сигнала mTOR (Rosner et al., 2008. Mutation Research 659(3):284-292). Синдромы с установленной молекулярной связью с нарушением регулирования mTOR включают синдром Пейтса-Егерца (Peutz-Jeghers (PJS)), болезнь Коудена (Cowden), синдром Баньяна-Райли-Рувалкаба (Bannayan-Riley-Ruvalcaba (BRRS)), синдром Протеуса (Proteus), болезнь Лермитт-Дуклос (Lhermitte-Duclos) и туберозный склероз (TSC). У пациентов с этими синдромами характерным образом развиваются доброкачественные гамартоматозные опухоли в разнообразных органах. Другими опухолевыми супрессорными белками, оказывающими воздействие на активность mTOR, являются VHL (болезнь Гиппеля-ландау), NF1 (нейрофиброматоз) и PKD (поликистозное заболевание почек), чья потеря может запускать болезнь Гиппеля-Ландау (Hippel-Lindau), нейрофиброматоз типа 1 и поликистозную болезнь почек, соответственно.
Пролиферативные заболевания или расстройства включают группу заболеваний, характеризующихся усиленным размножением клеток. Одним из примеров является рестеноз, вызываемый избыточным ростом гладкомышечных клеток сосудов (VSM) после коронарной ангиопластики стентами. Для нарушения этого явления были разработаны стенты, элюирующие лекарственное средство, для ингибирования роста VSM клеток. Покрытые рапамицином стенты эффективно снижают рестеноз и были одобрены FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов, США) (Serruys et al., 2006. N. Engl. J. Med. 354(5):483-95).
В еще одном предпочтительном воплощении заболевание или расстройство, ассоциированное с mTOR, представляет собой сердечнососудистое заболевание, метаболическое заболевание или нейродегенеративное заболевание.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения составляет соединение или его фармацевтически приемлемая соль по настоящему изобретению для применения в способе лечения или предупреждения сердечно-сосудистого заболевания, метаболического заболевания или нейроденеративного заболевания.
Недавние исследования выявили роль mTOR в сердечно-сосудистых заболеваниях, например, повышенная активность mTOR киназы ассоциирована с гипертрофией сердца (расширение сердца), которое является основным фактором риска для развития сердечной недостаточности. На клеточном уровне гипертрофия сердца характеризуется увеличение размеров клеток и усиленным белковым синтезом. Хотя имеются различные гипертрофические стимулы, такие как нейрогормоны и пептидные факторы роста, и некоторые протеинкиназные каскады вовлечены в сердечную гипертрофию, очевидно, что все формы гипертрофических стимулов активируют общий белковый трансляционный механизм mTOR-зависимым образом. Примечательно, что ингибирование mTOR рапамицином предупреждает гипертрофию сердца в многочисленных моделях трансгенных мышей. Кроме того, индуцированная стрессом сердечная гипертрофия является у мышей mTOR-зависимой. Эти результаты свидетельствуют о том, что mTOR является ключевой для аномального сердечного сверхроста, и что ингибиторы mTOR могут быть полезными для лечения гипертрофии сердца у людей (Tsang et al., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124).
Метаболические заболевания, которые могут лечиться ингибиторами mTOR, включают диабет типа 1, диабет типа 2 и ожирение (Tsang et al., 2007, Drug Discovery Today 12, 112-124). Диабет типа 1 вызывается потерей продуцирования инсулина из-за деструкции панкреатических β-клеток. Клинические исследования с использованием иммуносуппрессивного режима, который включает рапамицин, для предупреждения отторжения трансплантантов островков выявили значительную эффективность у пациентов с диабетом типа 1. Диабет типа 2 возникает, когда секреция из панкреатических β-клеток не может компенсировать периферическую резистентность к инсулину (или нечуствительность к инсулину) в скелетных мышцах, печени и жировых клетках. Последние данные свидетельствуют о том, что длительная активация mTOR передачи сигнала является ключевым событием, которое делает субстрат инсулиновых рецепторов (IRS) нечувствительным к инсулину. Более того, было продемонстрировано, что рапамицин восстанавливает чувствительность IRS к инсулину (Shah et al., 2004. Curr. Biol. 14(18):1650-1656). Таким образом, ингибиторы mTOR являются потенциально полезными в регулировании диабета типа 2. Ожирение представляет собой меаболическое заболевание с монотонно возрастающим риском для здоровья во всем мире. Последние открытия подтверждают, что mTOR играет определенную роль в липидном метаболизме. При адипогенезе экспрессия mTOR драматически возрастает от едва обнаружимых уровней в преадипоцитах до высокой экспрессии в полностью дифференцированных адипоцитах, и рапамицин ингибирует дифференциацию адипоцитов (Yeh et al., 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(24):11086-90).
Последние сообщения свидетельствуют о том, что ингибиторы mTOR могут быть полезными для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Гентингтона (Huntingtons's), Альцгеймера (Alzheimer's) и Паркинсона (Parkinson's). Болезнь Гентингтона представляет собой нейроденеративное расстройство, вызываемое мутантной формой белка гентингтина с аномально длинными глутаминовыми повторами на амино-конце. Мутантный белок агрегируется в нейрональных клетках и может вызывать повреждение нервных клеток и токсичность. Рапамицин ослабляет аккумулирование гентингтина и клеточную гибель и защищает против нейродегенерации в животных моделях болезни Гентингтона (Ravikumar et al., 2004. Nat Genet. 36(6):585-95). Кроме того, рапамицин индуцирует аутофаговый ответ, который, как было высказано предположение, играет роль в клиренсе гентингтиновых агрегатов.
Внутриклеточные белковые агрегаты также имеют место при других нейродегенеративных заболеваниях, например болезни Альцгеймера. Тау белок часто обнаруживают в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера и он, как полагают, вносит вклад в образование нейрофибриллярных клубков (например, при таутопатиях, таких как фронто-темпоральная деменция). В мушиной модели рапамицин снижает концентрацию тау белка и снижает токсичность, вызванную тау-аккумуляцией (Berger et al., 2006. Hum Mol Genet. 2006 Feb 1; 15(3):433-42). Поэтому ингибиторы mTOR могут быть полезными в предупреждении аккумулирования токсического тау белка у пациентов с болезнью Альцгеймера.
Болезнь Паркинсона (PD) представляет собой нейродегенеративное заболевание, ассоциированное с аккумулированием и агрегацией неправильно упакованных белков. Предупреждение агрегации и дезагрегация неправильно упакованных белков может обеспечить терапевтическую пользу путем замедления или предупреждения прогрессирования PD. Убиквитин-протеасомная система (UPS) является важным механизмом деградации, воздействующим на агрегированные белки. Сообщают, что рапамицин обеспечивает нейропротекцию против гибели нейрональных допаминэргических клеток, индуцированной ингибитором протеасом лактацистином. Предполагают, что эффект рапамицина частично опосредован усилением аутофагии посредством усиленной деградации неправильно упакованных белков (Pan et al., 2008. Neurobiol. Dis. 32(1):16-25). Поэтому соединения, которые могут усиливать аутофагию, могут представлять собой многообещающую стратегию для лечения PD пациентов.
В дополнительном предпочтительном воплощении заболевание или расстройство, ассоциированное с mTOR, представляет собой заболевание, ассоциированное с аутофагией.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения составляет соединение или его фармацевтически приемлемая соль по настоящему изобретению для применения в способе лечения или предупрежедения заболевания, ассоциированного с аутофагией.
Аутофагия представляет собой лизосома-зависимый процесс, посредством которого белки или поврежденные органеллы подвергаются деградации в клетке (Mizushima et al., 2008. Nature 451(7182):1069-75). В ходе этого процесса аутофагосома с двойной мембраной захватывает компонент клетки, который должен быть подвергнут деградации. Затем аутофагосома сливается с лизосомой, которая, например, подвергает деградации белки, что приводит к рециклингу аминокислот. Аутофагия первично вовлечена в деградацию долгоживующих белков, белковых агрегатов и клеточных органелл и других клеточных компонентов. В дополнение к ее физиологической функции аутофагия могла бы предполагаться для лечения ряда заболеваний, вызываемых агрегатами неправильно упакованных белков, например нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Гентингтона, Альцгеймера или Паркинсона. Другие ассоциированные с аутофагией заболевания раскрыты в WO-A 2009/049242, включенной в данное описание посредством ссылки.
Термин «соединение, индуцирующее аутофагию» относится к соединению, которое индуцирует аутофагию в клетке. Термин «заболевание, ассоциированное с аутофагией» относится к заболеванию, которое можно лечить посредством индуцирования аутофагии. Недавно было показано, что ATP-конкурентный ингибитор mTOR киназы может индуцировать аутофагию (Thoreen et al., 2009. J. Biol. Chem. 284(12):8023-32). Интересно, что ATP (аденозинтрифосфат)-конкурентные ингибиторы mTOR киназы, по-видимому, индуцируют аутофагию в клетках млекопитающих более эффективно, чем рапамицин. Взятые в совокупности, соединения по настоящему изобретению могут быть полезными для индуцирования аутофагии в клетках и для лечения заболеваний, ассоциированных с аутофагией.
В дополнительном предпочтительном воплощении заболевание или расстройство представляет собой вирусную инфекцию.
Таким образом, другой аспект настоящего изобретения составляет соединение или его фармацевтически приемлемая соль по настоящему изобретению для применения в способе лечения или предупреждения вирусной инфекции.
Все вирусы нуждаются в клеточных рибосомах для трансляции их мРНК. Например, было показано, что инфекция цитомегаловирусом человека (HCMV) активирует метаболический путь передачи сигнала mTORC1. Обработка инфицированных клеток Torin1, ингибитором mTOR, который нацелен на каталитический сайт mTOR киназы, блокирует продуцирование вирусного потомства. Кроме того, показано, что Torin1 ингибирует репликацию репрезентативных членов семейств альфа-, бета- и гамма-герпесвирусов, демонстрируя потенциал ингибиторов киназы mTOR как противовирусных агентов широкого спектра действия (Moorman and Shenk, 2010. J. Virol. 84(10):5260-9). Другие вирусные инфекции, которые можно лечить или предупреждать ингибиторами mTOR, описаны в WO-A 2011/011716, включенной в данное описание посредством ссылки.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения или профилактики заболеваний и расстройств, ассоциированных с mTOR.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения иммунологического, воспалительного, аутоиммунного или аллергического расстройства или заболевания, или отторжения трансплантата, или болезни «трансплантат-против-хозяина».
Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения пролиферативного заболевания, в особенности рака.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения сердечно-сосудистого заболевания, метаболического заболевания или нейродегенеративного заболевания.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения заболевания, ассоциированного с аутофагией.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет применение соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения вирусной инфекции.
В контексте этих применений по изобретению заболевания и расстройства, ассоциированные mTOR, являются такими, как определено выше.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет способ лечения, контролирования, замедления или предупреждения у нуждающего в этом пациента-млекопитающего одного или более состояний, выбранных из группы, состоящей из заболеваний и расстройств, ассоциированных с mTOR, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет способ лечения, контролирования, замедления или предупреждения у нуждающего в этом пациента-млекопитающего одного или более состояний, выбранных из группы, состоящей из иммунологического, воспалительного, аутоиммунного или аллергического расстройства или заболевания, или отторжения трансплантата, или болезни «трансплантат-против-хозяина», который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет способ лечения, контролирования, замедления, или предупреждения у нуждающего в этом пациента-млекопитающего пролиферативного заболевания, в частности рака, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет способ лечения, контролирования, замедления или предупреждения у нуждающего в этом пациента-млекопитающего одного или более состояний, выбранных из группы, состоящей из сердечно-сосудистого заболевания, метаболического заболевания или нейродегенеративного заболевания, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет способ лечения, контролирования, замедления или предупреждения у нуждающего в этом пациента-млекопитающего ассоциированного с аутофагией заболевания, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.
Еще один аспект настоящего изобретения составляет способ лечения, контролирования, замедления или предупреждения у нуждающего в этом пациента-млекопитающего вирусной инфекции, который включает введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества соединения по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли.
В контексте этих способов по изобретению заболевания и расстройства, ассоциированные с mTOR, являются такими, как определено выше.
Как он используется в данном описании, термин "лечить" или "лечение" относится ко всем процессам, где может иметь место замедление, прерывание, приостановка или остановка прогрессирования заболевания, но не обязательно указывает на общее элиминирование всех симптомов.
Все обсуждаемые выше воплощения в отношении фармацевтической композиции по изобретению также применимы к вышеуказанным первому или второму медицинским применениям или способам по изобретению.
Варианты путей получения соединений по настоящему изобретению описаны ниже. Для специалиста-практика в области техники понятно, как комбинировать или корректировать такие пути, особенно в комбинации с введением активирующих или защитных химических групп.
В общем за исходным добавлением морфолина (или замещенного морфолина) к цианурхлориду следует сначала реакция сочетания Сузуки для введения фенил- (или гетероциклил-) сульфона или сульфонамида и затем вторая реакция сочетания Сузуки для введения фенилмочевины. (Схема 1)
Альтернативно порядок осуществления стадий сочетания Сузуки может быть изменен на обратный (Схема 2).
В некоторых случаях сульфоновую группировку сначала вводят в виде тиоэфира и затем окисляют с получением сульфона (Схема 3).
Для обеспечения более широкого диапазона вариаций мочевины за исходным введением защищенной анилиновой или нитрофенильной группы следует снятие защиты или восстановление, соответственно, и полученный анилин затем подвергают взаимодействию с трифосгеном и подходящим амином с получением целевой мочевины (Схема 4). Также могут быть использованы альтернативные методы образования мочевины.
Примеры
Аналитические методы
ЯМР спектры получали на Brucker dpx400.
ЖХ-МС проводили на Agilent 1100. Используемыми растворителями являлись вода и ацетонитрил (оба с 0,1% муравьиной кислоты) с инъекционным объемом 3 мкл. Длины волн составляли 254 и 210 нм. Масс-спектральные данные собирали в позитивной моде, сканируя по массам между 150 и 700 а.е.м. (атомные единицы массы).
Метод A
Колонка: Phenomenex Gemini-NX C18, 3×30 мм, 3 микрона. Скорость потока: 1,2 мл/мин
Таблица 1
Время (мин)
Вода (%)
ACN (%)
0
95
5
3
5
95
4,5
5
95
4,6
95
5
6
СТОП
Метод B
Колонка: Phenomenex Gemini-NX C18, 4,6×150 мм, 5 микрон. Скорость потока: 1,0 мл/мин
Таблица 2
Время (мин)
Вода (%)
ACN (%)
0,00
95,0
5,0
11,00
5,0
95,0
13,00
5,0
95,0
13,01
95,0
5,0
16,00
СТОП
Аббевиатуры
Таблица 3
ACN
ацетонитрил
br
широкий
d
дублет
DCM
дихлорметан
dd
дублет дублетов
ddd
двойной дублет дублетов
DME
1,2-диметоксиэтан
DMF
Ν,Ν'-диметилформамид
DMSO
Ν,Ν'-диметилсульфоксид
EtOAc
этилацетат
EtOH
этанол
экв.
эквиваленты
г
граммы
ч
часы
HCl
соляная кислота
H<sub>2</sub>O
вода
ВЭЖХ
высокоэффективная жидкостная хроматография
IC<sub>50</sub>
50%-ная ингибирующая концентрация
л
литры
ЖХ-МС
жидкостная хроматография - масс-спектроскопия
m
мультиплет
M
молярный
MeOH
метанол
мг
миллиграммы
мин
минуты
мл
миллилитры
мм
миллиметры
ммоль
миллимоли
мкл
микролитры
нм
нанометры
ЯМР
ядерный магнитный резонанс
PBS
забуференный фосфатом физиологический раствор
q
квартет
к.т.
комнатная температура
RT
время удерживания
s
синглет
t
триплет
td
триплет дублетов
THF
тетрагидрофуран
Трет
третичный
Пример 1:
(S)-1-циклопропил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)-фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевина
Стадия (1)
К раствору цианурхлорида (1,844 г, 10,0 ммоль) в DCM (20 мл) по каплям добавляли 3S-S-метилморфолин (1,012 г) в DCM (3 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут. Реакционную смесь промывали водой (20 мл), органический слой пропускали через гидрофорбную фритту и концентрировали в вакууме с получением желтого твердого вещества, (S)-4-(4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3-метилморфолина, 1,91 г, 77%.
ЖХ-МС (метод A), (ЭР+ (электрораспыление)) 249/251, RT=2,45 мин.
Стадия (2)
2
Смесь (S)-4-(4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3-метилморфолина (1,25 г, 5,0 ммоль), 2-метилсульфонилфенилбороновой кислоты (1,1 г, 5,5 ммоль), карбоната натрия (1,6 г, 15,0 ммоль) и дихлорида бис(трифенилфосфин)-палладия(II) (205 мг, 0,25 ммоль) в смеси DME/HO (4:1, 10 мл) нагревали под действием микроволнового излучения при 60°C в течение 25 минут. Смесь затем разбавляли DCM (200 мл), промывали водой (200 мл), органический слой пропускали через PTFE (политетрафторэтилен) гидрофобную фритту и растворитель удаляли в вакууме с получением темно-оранжевого/коричневого масла, (S)-4-(4-хлор-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)-3-метилморфолина, 2,59 г, более 100%, неочищенное.
ЖХ-МС (метод B), (ЭР+) 369, RT=9,43 мин.
Стадия (3)
2
Смесь (S)-4-(4-хлор-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)-3-метилморфолина (400 мг, 1,0 ммоль), 4-(3-циклопропилуреидо)фенил-бороновой кислоты (302 мг, 1,0 ммоль), карбоната натрия (318 мг, 3,0 ммоль) и дихлорида бис(трифенилфосфин)палладия(II) (41 мг, 0,05 ммоль) в смеси DME/HO (4:1, 5 мл) нагревали под действием микроволнового излучения при 100°C в течение 30 минут. Смесь затем разбавляли DCM (70 мл), промывали водой (70 мл), органический слой пропускали через PTFE гидрофобную фритту и растворитель удаляли в вакууме с получением коричневого масла, 1,1 г.
Масло очищали посредством флэш-хроматографии, используя DCM (4 объема колонки), а затем 0-15% MeOH/DCM (10 объемов колонки), с получением коричневого остатка, 320 мг. Этот коричневый остаток дополнительно очищали посредством преп. ВЭЖХ. Целевые фракции концентрировали в бепечас с получением не совсем белого твердого вещества, (S)-1-циклопропил-3-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)мочевины, 67 мг, 15%.
1
6
H ЯМР (d-DMSO) 8.78 (s, 1H), 8.27 (d, 2H), 8.09-9.07 (m, 1H), 7.89-7.85 (m, 1H), 7.82-7.77 (m, 1H), 7.75-7.73 (m, 1H), 7.58-7.55 (d, 2H), 6.58-6.56 (m, 1H), 5.04-4.27 (m, 2H), 4.04-3.90 (m, 1H), 3.84-3.56 (m, 2H), 3.51 (s, 3H), 2.59-2.52 (m, 1H), 1.40-1.26 (m, 3H), 0.67-0.62 (m, 2H), 0.44-0.62 (m, 2H) и 2 протона скрыты под пиком воды.
ЖХ-МС (метод B), (ЭР+) 509, RT=9,28 мин.
Пример 2:
(S)-1-(4-(4-(5-фтор-2-(метилсульфонил)фенил)-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-метилмочевина
Стадия (1)
2
3
Смесь (S)-4-(4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)-3-метилморфолина (стадия (1) примера 1) (4 г, 16,1 ммоль), 1-метил-3-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)мочевины (4,67 г, 16,1 ммоль), дихлорида бис(трифенилфосфин)палладия(II) (0,66 г, 0,8 ммоль) и 2 M NaCO (8 мл, 19,6 ммоль) в DME (32 мл) нагревали под действием микроволнового излучения при 90°C в течение 90 минут. Смесь разбавляли DCM (200 мл), промывали водой (200 мл), органический слой пропускали через PTFE гидрофобную фритту и растворитель удаляли в вакууме с получением коричневого масла. Масло очищали посредством флэш-хроматографии, используя градиент петролейный эфир - EtOAc от 0 до 100%, с получением не совсем белого твердого вещества, (S)-1-(4-(4-хлор-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-метил-мочевины (932 мг, 15%).
ЖХ-МС (метод A), (ЭР+) 363, RT=2,44 мин.
Стадия (2)
2
3
Смесь (S)-1-(4-(4-хлор-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-метилмочевины (250 мг, 0,69 ммоль), пинаколового эфира 2-(метилсульфанил)пиридин-3-бороновой кислоты (190 мг, 0,76 ммоль), дихлорида бис(трифенилфосфин)палладия(II) (28 мг, 0,035 ммоль) и 2 М NaCO (420 мкл, 0,84 ммоль) в DME (1,7 мл) нагревали под действием микроволнового излучения при 100°C в течение 60 минут. Смесь разбавляли DCM (70 мл), промывали водой (70 мл), органический слой пропускали через PTFE гидрофобную фритту и растворитель удаляли в вакууме с получением желтого твердого вещества, (S)-1-(4-(4-(5-фтор-2-(метилтио)фенил)-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-метилмочевины (520 мг, использовали без дополнительной очистки).
Стадия (3)
2
(S)-1-(4-(4-(5-Фтор-2-(метилтио)фенил)-6-(3-метилморфолино)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-метилмочевину (258 мг, 0,55 ммоль) перемешивали с пероксимоносульфатом калия (Оксон) (1,01 г, 1,65 ммоль) в смеси THF:MeOH:HO (5:3:2) (10 мл) в течение 1 часа при 0°C. Реакционной смеси давали возможность нагреться до комнатной температуры и перемешивали в течение ночи с дополнительным количеством оксона (1,01 г, 1,65 ммоль). Смесь гасили насыщенным раствором тиосульфата натрия (10 мл). Разбавляли DCM (50 мл) и промывали рассолом (50 мл). Органический слой пропускали через а гидрофобную фритту и концентрировали в вакууме. Полученное твердое вещество очищали посредством преп. ВЭЖХ с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого твердого вещества (127 мг, выход 46%).
1
6
H ЯМР (d-DMSO) 8.94 (s, 1H) 8.25 (m, 2H) 8.14 (m, 1H) 7.65 (m, 2H) 7.55 (d, 2H) 6.16 (m, 1H) 5.05-4.30 (t, 2H) 4.05-3.25 (m, 5H) 3.51 (s, 3H) 2.67 (d, 3H) 1.29 (s, 3H).
+
ЖХ-МС (метод B), (M+H) 501, RT=9,15.
Пример 3:
(S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)фенил)-3-(пиридин-3-ил)мочевина
Стадия (1)
2
2
3
3
К раствору (S)-4-(4-хлор-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)-3-метилморфолина (стадия (2) Примера 1) (1 г, 2,7 ммоль) в 1,4-диоксане (16 мл) добавляли трет-бутил-(4-(4,4,5,5-тетраметил-1,3,2-диоксаборолан-2-ил)фенил)карбамат (1 экв.), Pd(dppf)Cl.DCM ((1,1'-бис(дифенилфосфин)ферроцен]дипалладий(II), комплекс с дихлорметаном 0,05 экв.) и 2 М водный NaCO. Реакционную смесь нагревали под действием микроволнового излучения при 120°C в течение 40 минут. Реакционную смесь концентрировали в вакууме и остаток распределяли между насыщенным NaHCO и DCM. Водную фазу экстрагировали три раза в DCM, органические экстракты объединяли, сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме. Остаток очищали посредством флэш-хроматографии на колонке Nh-KP, элюируя 0-100% EtOAc в петролейном эфире. С соединения удаляли защиту посредством перемешивания в MeOH (10 мл) с 4 М HCl в 1,4-диоксане (5 мл) в течение 24 часов с получением гидрохлорида (S)-4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)анилина, 716 мг, 57%-ный выход.
1
H ЯМР (400 МГц, DMSO) δ 8.16 (d, 1H), 8.06 (dd, 1H), 7.86 (td, 1H), 7.79 (td, 1H), 7.72 (dd, 1H), 6.81 (d, 2H), 4.96 (br s, 5H), 4.65 (br s, 1H), 4.34 (br s, 1H), 3.96 (br s, 1H), 3.49 (s, 3H), 3.46 (br s, 1H), 3.34 (br s, 1H), 1.28 (br s, 3H);
+
ЖХ-МС (метод B), (M+H) 426, RT=9,24 мин.
Стадия (2)
В охлажденный на льду раствор гидрохлорида (S)-4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)анилина (0,217 г, 0,47 ммоль) в смеси THF/пиридин (соответствующее соотношение 4:1, 10 мл) порциями добавляли трифосген (1 экв.). Полученную суспензию перемешивали в течение пяти минут, после чего добавляли ее к охлажденному на льду раствору 3-аминопиридина (4 экв.) в смеси THF/пиридин (соответствующее соотношение 4:1, 2 мл). Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 1 часа, после чего ее гасили добавлением метанола и концентрировали в вакууме. Остаток очищали посредством препаративной HPLC с высоким pH с получением указанного в заголовке соединения, (S)-1-(4-(4-(3-метилморфолино)-6-(2-(метилсульфонил)фенил)-1,3,5-триазин-2-ил)-фенил)-3-(пиридин-3-ил)мочевины, 24 мг, 38%-ный выход.
1
H ЯМР (400 МГц, MeOD) δ 8.63 (d, 1H), 8.38-8.33 (m, 2H), 8.19 (dd, 1H), 8.18-8.10 (m, 1H), 8.02 (ddd, 1H), 7.82 (td, 1H), 7.77-7.68 (m, 2H), 7.60-7.56 (m, 2H), 7.38 (dd, 1H), 5.17-4.37 (m, 2H), 3.99 (br s, 1H), 3.84-3.67 (m, 2H), 3.57 (t, 1H), 3.48 (s, 3H), 3.38 (dd, 1H), 1.39 (d, 3H);
+
ЖХ-МС (метод B), (M+H) 546, RT=7,00 мин.
Следующие соединения синтезировали способами, аналогичными описанным выше.
Определение эффекта соединения по изобретению в отношении mTOR
50
Соединения по настоящему изобретению, как они раскрыты в данном описании, тестировали в mTOR Kinobeads анализе, как описано ниже. Кратко, тестируемые соединения (в разных концентрациях) и аффинную матрицу (смесь 1:1 шариков с иммобилизованным фенилтиазольным лигандом 1 и шариков с иммобилизованным фенилморфолин-хроменовым лигандом; WO 2009/098021) добавляли к аликвотам клеточного лизата и оставляли связываться с белками в образце лизата. По прошествии времени инкубирования шарики с захваченными белками отделяли от лизата. Связанные белки затем элюировали, детектировали присутствие mTOR, PI3K (фосфатидилинозит-3-киназа) альфа (PI3Ka), PI3K бета (PI3Kb), PI3K гамма (PI3Kg), PI3K дельта (PI3Kd) и ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK) и оценивали их количественно, используя специфическое антитело в процедуре дотблоттинга и системе инфракрасной детекции Odyssey. Строили кривые доза-ответ для индивидуальных киназ и рассчитывали величины IC. Kinobeads анализы для PI3 киназ (WO-A 2008/015013) и для получения профилей селективности киназ (WO 2009/098021) были описаны ранее.
Промывка аффинной матрицы
Аффинную матрицу (шарики с иммобилизованным фенилморфолин-хроменовым лигандом) промывали три раза 15 мл 1×DP буфера, содержавшего 0,2% NP40 (IGEPAL CA-630, Sigma, #13021), и затем ресуспендировали в 5,5 мл 1×DP буфера, содержавшего 0,2% NP40 (10%-ная суспензия шариков).
2
3
4
5×DP буфер: 250 мМ трис-HCl (трис(гидроксиметил)аминометан гидрохлорид) pH 7,4, 25% глицерина, 7,5 мМ MgCl, 750 мМ NaCl, 5 мМ NaVO, 5х-лизирующий буфер фильтруют через фильтр 0,22 мкм и хранят в аликвотах при -80°C. 5×DP буфер разбавляют до 1×DP буфера, содержащего 1 мМ DTT (дитиотреитол) и 25 мМ NaF.
Приготовление тестируемых соединений
Исходные растворы тестируемых соединений готовили в DMSO. В 96-луночном планшете готовили 30 мкл раствора разбавленных тестируемых соединений в концентрации 5 мМ в DMSO. Начиная с этого раствора, готовили серийные разведения 1:3 (9 стадий). В качестве контрольных экспериментов (в отсутствие тестируемого соединения) использовали буфер, содержащий 2% DMSO. Соединение PI-103 служило в качестве положительного контроля (Calbiochem каталожный номер 528100).
Клеточная культура и приготовление клеточных лизатов
6
6
Клетки Jurkat (ATCC каталожный номер TIB-152 Jurkat, клон E6-1) выращивали в 1-литровых вращающихся колбах (Integra Biosciences, #182101) в суспензии в среде RPMI 1640 (Invitrogen, #21875-034), обогащенной 10% фетальной телячьей сыворотки (Invitrogen), при плотности между 0,15×10 и 1,2×10 клеток/мл. Клетки собирали центрифугированием, промывали один раз буфером 1×PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор, Invitrogen, #14190-094) и клеточные осадки замораживали в жидком азоте и затем хранили при -80°C.
2
Клетки Jurkat гомогенизировали в гомогенизаторе Potter S в следующем лизирующем буфере: 50 мМ трис-HCl, 0,8% NP40, 5% глицерина, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl, 25 мМ NaF, 1 мМ ванадата натрия, 1 мМ DTT, pH 7,5. На 25 мл буфера добавляли одну полную таблетку, не содержащую EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) (коктейль ингибиторов протеаз, Roche Diagnostics, 1873580). Материал 10 раз подвергали гомогенизации в гомогенизаторе Даунса, используя механизированный POTTER S, переносили в цетрифужные пробирки falcon на 50 мл, инкубировали в течение 30 минут на льду и центрифугировали в течение 10 мин при 20000 g при 4°C (10000 об./мин в Sorvall SLA600, предварительное охлаждение). Супернатант переносили в ультрацентрифужную (UZ)-поликарбонатную пробирку (Beckmann, 355654) и центрифугировали в течение 1 часа при 100000 g при 4°C (33500 об./мин в Ti50.2, предварительное охлаждение). Супернатант снова переносили в чистую центрифужную пробирку falcon на 50 мл, определяли концентрацию белка анализом по Брэдфорду (Bradford, BioRad) и готовили образцы, содержащие 50 мг белка на ал и квоту. Образцы немедленно использовали для экспериментов или замораживали в жидком азоте и хранили замороженными при -80°C.
Разведение клеточного лизата
Лизат клеток Jurkat (приблизительно 50 мг белка на планшет) оттаивали в водяной бане при комнатной температуре и затем хранили на льду. К оттаявшему клеточному лизату добавляли 1×DP 0,8% NP40 буфер, содержащий ингибиторы протеаз (1 таблетка на 25 мл буфера; коктейль ингибиторов протеаз, не содержащий EDTA; Roche Diagnostics 1873580) для того, чтобы достичь финальной концентрации белка 5 мг/мл общего белка. Разбавленный клеточный лизат хранили на льду.
Инкубирование лизата с тестируемым соединением и аффинной матрицей
В 96-луночный фильтровальный планшет (Multiscreen HTS, BV Filter Plates, Millipore #MSBVN1250) добавляли на лунку: 50 мкл аффинной матрицы (10%-ная суспензия шариков), 3 мкл раствора соединения и 100 мкл разбавленного клеточного лизата. Планшеты плотно закрывали и инкубировали в течение трех часов в холодной комнате на Thermomixer со встряхиванием (750 об./мин). Затем планшет промывали три раза 230 мкл промывочного буфера (1×DP 0,4% NP40). Фильтровальный планшет помещали на поверхность планшета для сбора (Greiner bio-one, PP (полипропилен) - микропланшет 96-луночный с V-образным дном лунок, 65120) и шарики затем элюировали 20 мкл буфера для образцов (100 мМ Трис, pH 7,4, 4% SDS (додецилсульфат натрия), 0,00025% бромфеноловый голубой, 20% глицерин, 50 мМ DTT). Элюат быстро замораживали при -80°C и хранили при -20°C.
Обнаружение и количественная оценка элюированных киназ
Киназы в элюатах обнаруживали и оценивали количественно посредством нанесения на нитроцеллюлозные мембраны и использования первого антитела, направленного против представляющей интерес киназы, и меченного флуоресцентной меткой второго антитела (анти-мышиные или антикроличьи антитела IRDye™ от Rockland). Систему инфракрасной визуализации Odyssey от LI-COR Biosciences (Lincoln, Nebraska, USA) использовали в соответствии с инструкциями, предоставленными изготовителем (Schutz-Geschwendener et al., 2004. Quantitative, two-color Western blot detection with infrared fluorescence. Опубликовано в мае 2004 г. LI-COR Biosciences, www.licor.com).
После нанесения элюатов нитроцеллюлозную мембрану (BioTrace NT; PALL, #BTNT30R) сначала блокировали посредством инкубирования с Odyssey блокирующим буфером (LICOR, 927-40000) в течение одного часа при комнатной температуре. Блокированные мембраны затем инкубировали в течение 16 часов при 25°C (или при 4°C) с первым антителом, разбавленным в Odyssey блокирующем буфере (LICOR #927-40000). После этого мембрану промывали дважды в течение 10 минут PBS буфером, содержащим 0,1% Твин 20, при комнатной температуре. Затем мембрану инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре с детектирующим антителом (IRDye™ меченое антитело от Rockland), разведенным в Odyssey блокирующем буфере (LICOR #927-40000). После этого мембрану промывали дважды каждый раз в течение 10 минут 1×PBS буфером, содержащим 0,1% Tween 20, при комнатной температуре. Затем мембрану один раз промывали PBS буфером для удаления остаточного Твин 20. Мембрану хранили в PBS буфере при 4°C и затем сканировали с помощью прибора Odyssey. Сигналы флуореценции регистрировали и анализировали согласно инструкциям изготовителя.
Источники и разведения антител
Результаты с Kinobeads
50
Таблица 5: Показатели ингибирования (IC в мкМ), как определено в анализе kinobeads™ (уровень активности: A < 0,1 мкМ ≤ B < 1 мкМ ≤ C ≤ 10 мкМ < D
In vitro фосфо-S6 и фосфо-Akt клеточный анализ
Активация передачи сигнала mTOR имеет результатом фосфорилирование некоторых находящихся в нисходящем направлении мишеней. В клетках mTOR существует в двух разных белковых комплексах. mTOR комплекс-1 (mTORC1) фосфорилирует и активирует S6 киназу 1 (S6K1) и S6 киназу 2 (S6K2) (также известную как p70S6K), которые затем фосфорилируют S6 рибосомальный белок (S6RP) (также известный как RPS6)3. S6RP фосфорилируется по серину 235, серину 236, серину 240 и серину 244 как pS6K1, так и pS6K2. mTOR комплекс-2 (mTORC2) фософрилирует AKT по серину 473, что активирует путь передачи сигнала AKT.
Анализ измеряет ингибирование тестируемыми соединениями S6RP серин-240/244 фосфорилирования и ингибирование Akt серин-473 фосфорилирования в клетках, полученных из почки эмбриона человека HEK293T/17 (ATCC CRL-11268).
2
Клеточную линию HEK293T/17 поддерживают в среде DMEM (Invitrogen каталожный номер 41965-039), обогащенной 10% FCS (фетальная телячья сыворотка), при 37°C в увлажненном инкубаторе при 5% CO.
Клетки высевают в 96-луночные планшеты в концентрации 40000 клеток/лунку (pS6RP S240/244 анализ) или 80000 клеток/лунку (pAkt S473 анализ) в 90 мкл ростовой среды (DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), 2% FCS). Планшеты инкубируют в течение 1 часа в увлажненном инкубаторе для того, чтобы дать клеткам возможность закрепиться. Клетки обрабатывают либо 8 концентрациями тестируемого соединения, либо DMSO в качестве контролей (финальная концентрация DMSO составляет 0,1%) и инкубируют при 37°C в течение 2 часов. Затем добавляют 20 мкл 5x концентрированного лизирующего буфера (750 мМ NaCl, 100 мМ трис pH 7,4, 5 мМ АЭТА, 5 мМ EGTA (этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)-N,N,N,N-тетрауксусной кислоты), 5% Triton X-100), планшеты плотно закрывают и инкубируют в течение 15 минут при 4°C с осторожным перемешиванием. После завершения лизиса клеток 25 мкл клеточного лизата переносят в планшет MesoScale, покрытый антителом к pS6RP Ser 240/244 (MesoScale Discovery K150DGD-3) или антителом к pAkt Ser 473 (MesoScale Discovery K151DGD-3). Планшеты перед инкубированием блокировали 150 мкл MesoScale Discovery блокирующего раствора-A в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем промывали 150 мкл 1x Трис промывочного буфера на лунку. После переноса клеточного лизата в MSD планшет белок pS6RP (или pAkt) захватывается на покрытом антителе посредством инкубирования при комнатной температуре в течение 1 часа с осторожным перемешиванием. После завершения стадии захвата планшет промывают три раза 150 мкл 1x Трис промывочного буфера на лунку. Затем добавляют 25 мкл детектирующего антитела, конъюгированного с Sulfo-Tag, и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре с осторожным перемешиванием. Затем раствор антитела удаляют и планшет промывают 3 раза 150 мкл 1x Трис промывочного буфера на лунку и добавляют 150 мкл буфера для регистрации. Планшеты анализируют на планшетном ридере MSD 2400 (MesoScale Discovery). Анализ данных осуществляют, используя нелинейную регрессию для сигмоидальной зависимости доза-ответ с переменным наклоном.
Результаты клеточного анализа
Таблица 6:
Показатели ингибирования (IC<sub>50</sub> в мкМ) (уровень активности: A < 0,1 мкМ ≤ B < 1 мкМ ≤ C ≤ 10 мкМ < D)
Пример
pS6
pAkt
1
A
A
2
A
3
A
4
A
A
5
A
A
6
B
A
7
A
A
8
A
A
9
B
10
A
A
11
A
12
B
13
A
14
A
A
15
A
16
A
17
A
18
A
19
B
20
A
21
B
22
A
23
24
A
A
25
A
26
A
27
A
28
29
A
30
31
32
A
33
B
34
B
35
A
36
A
37
38
39
B
40
A
41
A
42
A
43
A
44
A