Анализ остаточных растворителей в субстанции анилокаина

УДК 615.072:543.544.43

АНАЛИЗ ОСТАТОЧНЫХ РАСТВОРИТЕЛЕЙ В СУБСТАНЦИИ АНИЛОКАИНА

Сабирзянов Д.Р., Тумилович Е.Ю., Карпенко Ю.Н.

ФГБОУ ВО Пермская государственная фармацевтическая академия, г. Пермь, Российская Федерация

Аннотация. Целью настоящего исследования явилась разработка методики определения остаточного растворителя ацетона в субстанции местноанестезирующего средства анилокаина методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Предложена пробоподготовка образца методом статической парофазной экстракции. Разработанные условия хроматографического разделения позволили эффективно разделить хроматографические пики исследуемых веществ от пиков летучих продуктов распада анилокаина. Проведенная валидация методики доказала ее специфичность, линейность, правильность и прецизионность. Ключевые слова: анилокаин, остаточные органические растворители, газожидкостная хроматография, валидация.

Введение. Безопасность фармацевтической продукции напрямую зависит от качества используемых активных фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ. Одним из важных показателей качества является содержание остаточных органических растворителей (ООР). Согласно ОФС 1.1.0008.15 (ГФ XIII) к ООР относят летучие растворители, которые используются или образуются на любой стадии производства фармацевтических субстанций, вспомогательных веществ или лекарственного препарата и полностью не удаляются после завершения технологического процесса.

Созданный в Пермской государственной фармацевтической академии (ПГФА) местный анестетик анилокаин (2-броманилид-3диэтиламинопропановой кислоты гидрохлорид) прошел широкую клиническую апробацию и показал свою эффективность при различных видах анестезии [1]. До медицинского применения доведены следующие лекарственные формы с анило-каином: 1% и 2% инъекционные растворы, 5% раствор для наружного применения, мазь «Аникол», перевязочные средства длительного действия. С перспективой внедрения в медицинскую и ветеринарную практику разработаны и другие лекарственные формы: суппозитории, пленки лекарственные, обезболивающий гель, спрей и т.д. [2].

Технология синтеза субстанции анилокаина предусматривает использование на стадии очистки ацетона, который принадлежит к растворителям третьего класса токсичности и подлежит нормированию [ГФ XIII]. В современных фармакопеях установленным методом для анализа ООР является газо-жидкостная хроматография с пламенно-ионизационным детектированием (ГЖХ/ПИД) [3]. Исследование проводят на высо-

коэффективных капиллярных колонках, рекомендуемым режимом ввода пробы является парогазовый анализ из водных растворов либо из органических разбавителей. Нормативная документация на субстанцию анилокаина [4] регламентирует определение ацетона методом газо-жидкостной хроматографии на насадоч-ных колонках, которые по эффективности разделения значительно уступают капиллярным. Кроме того, прописанный в фармакопейной статье прямой ввод водного раствора анилокаина в испаритель хроматографа приводит к загрязнению колонки нелетучими соединениями, что сказывается на сроке ее службы.

В связи с этим целью настоящей работы явилась разработка методики определения содержания ацетона в субстанции анилокаина методом газо-жидкостной хроматографии с учетом современных требований и ее валидация.

Материалы и методы. Разработка условий хрома-тографического определения ацетона осуществлялась на газовом хроматографе «Хроматэк - Кристалл 5000.2» (ЗАО СКБ «Хроматэк», г. Йошкар-Ола) с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке HP-FFAP (50 м, 0,32 мм, 0,52 мкм). Ввод пробы осуществлялся с помощью дозатора равновесного пара (ДРП 214.4.464.022-03, ЗАО СКБ «Хроматэк», г. Йошкар-Ола).

Обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения «Хроматэк Аналитик 2.6».

При разработке и валидации методики для приготовления стандартных растворов использовали стандартный образец ацетона (ГСО 8460-2003) с концентрацией 1 мг/см3. Раствор внутреннего стандарта про-панола готовили из стандартного образца (СТХ Пропа-нол-1, 99,5%, СОП 0023-03).

Валидация аналитической методики проводилась в соответствии с ГФ XIII и нормами руководства Международной конференции по гармонизации (ICH) Q2(R1) [5].

Результаты и обсуждение. Выбор условий хрома-тографирования определялся физико-химическими свойствами анализируемых соединений. На этапе разработки методики был исследован стандартный водный раствор ацетона и пропанола (внутренний стандарт) с концентрацией 500 мкг/мл и 250 мкг/мл, соответственно. Для извлечения аналитов из водных растворов использовали вариант статической парофазной экстракции (СПЭ). Для этого, 5 мл стандартного раствора помещали в хроматографическую виалу объемом 15 мл с уплотнением, термостатировали, 1 мл парогазовой фазы вводили в испаритель хроматографа. При апробировании различных режимов термостати-рования образца было установлено, что оптимальными условиями являются нагрев при 60°С в течение 10 минут. Дальнейшее увеличение времени термостатирова-ния и температуры не привело к усилению сигнала детектора от анализируемых веществ, что свидетельствует об установившемся равновесии.

Газохроматографический анализ водных растворов субстанции в данных условиях подготовки пробы показал наличие в парогазовой фазе и летучих продуктов деградации анилокаина, количество которых существенно возрастало с увеличением температуры нагрева. Поэтому, следующим этапом нашей работы стал подбор условий хроматографирования, позволяющий эффективно разделить пики ацетона и пропанола от пиков побочных продуктов распада вещества.

Для приготовления испытуемого раствора 2,5 г субстанции анилокаина (точная навеска) помещали в хро-матографическую виалу объемом 15 мл с уплотне-

ЪА-У-Л ПчЛ-1

Л-J

нием, добавляли 5 мл воды очищенной и 500 мкл раствора внутреннего стандарта (водного раствора пропа-нола с концентрацией 2,5 мг/мл).

Были предложены следующие условия определения ацетона в субстанции анилокаина методом ГЖХ/ПИД: хроматографическая колонка - HP-FFAP (50 м, 0,32 мм, 0,52 мкм); газ-носитель - азот; температура испарителя - 180 °С; температура детектора - 220 °С; температура колонки программируемая: начальная температура 75°С, выдержка 5 минут, подъем со скоростью 10 °С/мин до 150 °С; скорость газа-носителя -7 мл/мин; расход водорода - 30 мл/мин; расход воздуха - 300 мл/мин; деление потока - 1:5. Параметры ДРП: температура термоблока (пробы) - 60°С, температура крана ДРП - 95°С, время отбора пробы - 5 с.

Пример хроматограммы испытуемого раствора субстанции анилокаина с добавкой ацетона на уровне 1000 ррт представлен на рис.1. Разработанные условия обеспечивают четкое разделение хроматографиче-ских пиков ацетона, пропанола и продуктов деградации анилокаина. Времена удерживания ацетона и про-панола составили 4,4 и 6,4 мин. соответственно.

Для валидационной оценки методики при приготовлении модельных смесей использовался высоко-очищенный образец субстанции анилокаина, по результатам ГЖХ-анализа не содержащий ацетон. На хроматограмме водного раствора данной субстанции отсутствовали мешающие пики на временах удерживания ацетона и пропанола, что подтверждает специфичность предлагаемой методики.

Для установления линейности методики были приготовлены и проанализированы модельные смеси анилокаина с добавкой ацетона в диапазоне концентраций от 5 до 600 мкг/мл (соответствует содержанию ацетона в субстанции от 10 до 1200 ррт). Линейная зависимость наблюдалась во всем изучаемом диапазоне, коэффициент корреляции составил 0,9986 (рис.2).

§

X та Е

о

CL

Рис. 1. Хроматограмма испытуемого раствора субстанции анилокаина

Рис. 2. Калибровочный график определения ацетона методом ГЖХ/ПИД

Определение прецизионности методики (сходимо- ррт. Пробоподготовку образца и непосредственно сти) проводили с использованием однородной модель- хроматографический анализ проводили в разработанной смеси на основе высокоочищенной субстанции ных условиях. Результаты анализа представлены в таб-анилокаина с добавлением ацетона на уровне 1000 лице 1.

Таблица 1

Сходимость результатов анализа остаточных растворителей в субстанции анилокаина

0 200 400 600 800 1000 1200

Концентрация ацетона, ppm

№ образца Найденное содержание ацетона, ppm Метрологические характеристики

Проба 1 976 X SD RSD

Проба 2 1023 990,2 22,0 2,2

Проба 3 987

Проба 5 965

Проба 6 980

Определение правильности методики осуществляли путем анализа модельных смесей субстанции анилокаина на 4 уровнях концентрации ацетона: 100,

500, 1000, 1200 ррт. Всего проанализировано 12 образцов (по 3 на каждом концентрационном уровне). Результаты оценки правильности методики представлены в таблице 2.

Таблица 2

Правильность результатов анализа остаточных растворителей в субстанции анилокаина

Содержание ацетона в образце, ppm Найденное содержание Открываемость, R Метрологические характеристики

100 112 112,0 - 99,2 SD - 5,5 RSD - 5,5

100 102 102,0

100 89 89,0

500 484 96,8

500 516 103,2 А Х =3,5

500 508 101,6 t рассч. — 0,5

1000 962 96,2 t табл. — 2,2

1000 982 98,2

1000 958 95,8

1200 1210 100,8

1200 1188 99,0

1200 1153 96,1

Полученные в ходе валидационной оценки данные свидетельствуют об удовлетворительной сходимости и правильности методики. Рассчитанный коэффициент Стьюдента не превышает значения табличного коэффициента, что свидетельствует о незначимости систематической ошибки.

Выводы. Таким образом, разработана методика определения остаточного растворителя ацетона в субстанции анилокаина. Проведенная валидация доказала ее специфичность, линейность, правильность и прецизионность (сходимость). Методика включена в проект фармакопейной статьи предприятия.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИИ СПИСОК

[1] Гидрохлорид орто-броманилида Р-диэтиламинопропи-оновой кислоты, проявляющий анестезирующую активность // Патент России №1146989. 1993. / Н.В. Хо-рошкова, В.И. Панцуркин, В.С. Шкляев, Н.А. Горнова, Н.Т. Прянишникова.

[2] Панцуркин В.И., Алексеева И.В. Анилокаин, поиск, свойства. Начальный опыт применения лекарственных форм в медицинской практике: монография. - Пермь: ГОУ ВПО ПГФА Роздрава, 2006. - 174 с.

[3] European Pharmacopoeia. 8th ed. Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicines, 2013. Р. 22692270.

[4] ВФС 42-2946-97 Анилокаин: субстанция. - Введ. 03 октября 1997 г. - [Б. м., б. г.]. - 10 с.

[5] Validation of analytical procedures: text and methodology. Q2(R1). ICH Harmonized Tripartite Guideline, 2005.

ANALYSIS OF RESIDUAL SOLVENTS IN ANILOCAINE SUBSTANCE

Sabirzyanov D.R., Tumilovich E. Y., Karpenko Y.N.

Perm State Pharmaceutical Academy, Perm, Russian Federation

Annotation. The purpose of this study was to develop a technique of determination of the residual solvent (acetone) in substance of the local anesthetic anilocaine by gas liquid chromatography (GLC). Sample preparation by the static vapor-phase extraction method was proposed. The developed chromatographic conditions have allowed to efficiently separate the chromatographic peaks of the investigated substances from the peaks of anilocaine volatile decomposition products. The validation proved specificity, linearity, accuracy and precision of this technique.

Key words: anilocaine, residual solvents, gas liquid chromatography, validation.

REFERENCES

[1] Gidrohlorid orto-bromanilida ß-dijetilaminopropionovoj kisloty, projavljajushhij anestezirujushhuju aktivnost' // Patent Rossii №1146989. 1993. / N.V. Horoshkova, V.I. Pan-curkin, V.S. Shkljaev, N.A. Gornova, N.T. Prjanishnikova.

[2] Pancurkin V.I., Alekseeva I.V. Anilokain, poisk, svojstva. Nachal'nyj opyt primenenija lekarstvennyh form v

medicinskoj praktike: monografija. - Perm': GOU VPO PGFA Rozdrava, 2006. - 174 s.

[3] European Pharmacopoeia. 8th ed. - Strasbourg: European Directorate for the Quality of Medicines, 2013. P. 22692270.

[4] VFS 42-2946-97 Anilokain: substancija. - Vved. 03 ok-tjabrja 1997 g. - [B.m., b.g.]. - 10s.

[5] Validation of analytical procedures: text and methodology. Q2(R1). ICH Harmonized Tripartite Guideline, 2005.