N-[3-ОКСО-ЛУПАНО-28-ИЛ]-МОРФОЛИН - СРЕДСТВО КОРРЕКЦИИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПЕЧЕНИ С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
N-[3-OXO-LUPANO-28-YL]-MORPHOLINE - AGENT FOR CORRECTION OF CYTOTOXIC LIVER DAMAGES WITH ANTITUMOUR AND ANTIMETASTATIC ACTIVITY

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к N-[3-оксо-лупано-28-ил]-морфолину формулы (I):
обладающему противоопухолевой и антиметастатической активностью и являющемуся корректором гепатотоксических повреждений, вызванных опухолевым процессом и цитостатической полихимиотерапией. Соединение может быть использовано в медицине в качестве фармацевтического средства для снижения выраженности морфологических нарушений печени, сопутствующих онкологическим заболеваниям, как при самостоятельном применении, так и в составе комплексной противоопухолевой терапии.
Как известно, большинство традиционных противоопухолевых препаратов не обладает селективным действием на опухоль и вызывает тяжелые расстройства на системном и тканевом уровне, иногда не совместимые с жизнью. Для повышения переносимости противоопухолевых препаратов в схемы лечения включают модификаторы биологических реакций (МБР), снижающие токсические эффекты химиотерапии и повышающие противоопухолевую резистентность организма [Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. - М.: Практическая медицина, 2005. - 227 с.].
В настоящее время в качестве МБР чаще всего применяют рекомбинантные формы колониестимулирующих факторов, интерферонов, цитокинов, оказывающие в основном гемостимулирующее и иммуномодулирующее действие. Недостатками белковых препаратов являются собственные побочные эффекты, в том числе возможные аллергические реакции [Клиническая онкогематология. Ред. Волкова М.А. - М.: Медицина, 2001, с.77-85]. Наряду с данными средствами большой потенциал в качестве МБР имеют растительные низкомолекулярные соединения и их синтетические аналоги, имеющие комплексные протекторные свойства и обладающие умеренным противоопухолевым действием. В качестве растительных препаратов в сопутствующей терапии обычно применяются различные экстракты растений (облепихи, родиолы розовой, шлемника байкальского и др.) [Разина Т.Г., Зуева Е.П., Амосова Е.Н. и др. Препараты из лекарственных растений как средства дополнительной терапии в экспериментальной онкологии // Вопросы онкологии. - 2000, т.63, №5, с 554-556]. Однако их недостаточная эффективность стимулирует поиск новых МБР в различных классах природных соединений.
Задачей настоящего изобретения является разработка средства коррекции цитотоксических повреждений печени с противоопухолевой и антиметастатической активностью для расширения арсенала такого рода средств.
Поставленная задача решается химическим соединением формулы (1)
а именно, N-[3-оксо-лупано-28-ил]-морфолином, обладающим выраженной противоопухолевой и антиметастатической активностью; способностью снижать тяжесть патологических изменений в печени, вызванных паранеопластическими синдромами; проявляющим в условиях цитостатической полихимиотерапии выраженный гепатопротекторный эффект и при этом не стимулирующим пролиферацию и диссеминацию опухоли.
Заявленное соединение является новым и относится к тритерпеноидам лупанового ряда, а именно к производным дигидробетулоновой кислоты. Ближайший структурный аналог - бетулоновая кислота - известна своей высокой биологической активностью. В частности, у бетулоновой кислоты и некоторых ее амидов были обнаружены антиоксидантные свойства [И.В.Сорокина, Т.Г.Толстикова, Е.Б.Бубнова и др. Изучение антиоксидантных свойств производных бетулоновой кислоты на модели острого токсического гепатита // Научный вестник Тюменской медицинской академии, 2003, №1, с.60-61], противоопухолевое и антиметастатическое действие [И.В.Сорокина, Т.Г.Толстикова, Н.А.Жукова и др. Оценка противоопухолевого и антиметастатического эффектов амидов бетулоновой кислоты на мышах с перевиваемой карциномой Льюис // Бюлл. эксп. биол. и мед., 2006, №1, с.69-72], а также способность уменьшать некробиотические поражения печеночной паренхимы, вызванные цитостатической противоопухолевой химиотерапией [Н.А.Жукова, Д.Е.Семенов, И.В.Сорокина и др. Влияние бетулоновой кислоты и [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовой кислоты на морфологию печени мышей с лимфосаркомой RLS после полихимиотерапии // Бюл. эксп. биол. и мед., 2005, т.14, №9, с.348-351].
С другой стороны, сообщалось, что гидрирование бетулина позволяет увеличить биологическую активность по сравнению с таковой у исходного соединения. В частности, было показано, что анти-ВИЧ активность 3-O-глутарилдигидробетулина увеличивается минимум на три порядка при переходе от обычного производного бетулина [Kashiwada Y., Sekiya M., Ikeshiro Y., Fujioka Т., Kilgore N.R., Wild C.T., Allaway G.P., Lee K.-H. // Bioorgan. Med. Chem. Lett., 2004, v.14, p.5851-5853].
Заявляемое соединение является ранее не известным производным дигидробетулоновой кислоты, создание которого продиктовано целью расширить ассортимент нетоксичных средств коррекции цитотоксических повреждений печени, возникающих на фоне злокачественного роста и противоопухолевой терапии.
Заявляемое соединение (1) получают способом, представленным на схеме 1. В качестве исходного соединения используют бетулин (4), полученный экстракцией коры березы бензолом. Гидрирование бетулина (4) водородом в автоклаве над Ni-Ренея дает дигидробетулин (3), который окисляют раствором Физера. Из дигидробетулоновой кислоты (2) получают хлорангидрид, который далее используют без промедления. Взаимодействие хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (2) с двойным избытком морфолина легко приводит к заявляемому соединению формулы (1).
ИК-спектры соединений записывали на приборе "VECTOR 22" в KBr. Удельное вращение определяли на спектрометре polAAr 3005, концентрация раствора приведена в г/100 мл. Точку плавления определяли на приборе Termosystem FP 900 фирмы Mettler Toledo и на столике Кофлера S 30 A/G (Германия).
1
13
1
1
1
13
13
1
1
13
1
2,3
3
H
C
C,H
C,H
Брутто-формулу определяли из элементного анализа вещества. Спектры ЯМР H и С регистрировали на спектрометре DRX-500 (500.13 MГц и 125.76 MГц соответственно) фирмы Bruker для растворов веществ в CDCl. В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя (δ 7.24 и δ 76.9 м.д). Строение полученных соединений устанавливали на основании анализа спектров ЯМР Н с привлечением спектров двойного резонанса H-H, а также анализа спектров ЯМР С с использованием стандартных методик записи спектров в режиме J-модуляции (JMOD), с внерезонансным и селективным подавлением протонов, двумерных спектров гетероядерной С-Н корреляции на прямых константах спин-спинового взаимодействия (С-Н COSY, J 135 Гц) и двумерных и одномерных спектров гетероядерной C-H корреляции на дальних константах спин-спинового взаимодействия (COLOC, LRJMD, J 10 Гц).
Исследование активности N-[3-оксо-лупано-28-ил]-морфолина (1) включало в себя определение его противоопухолевого, антиметастатического и цитопротекторного действия при введении мышам с солидной карциномой легких Льюис. Изучалось также его влияние на противоопухолевый и антиметастатический эффекты полихимиотерапии при их сочетанном введении мышам-опухоленосителям и возможность коррекции ее цитотоксического действия на нормальные клетки внутренних органов, не затронутые злокачественным перерождением.
В качестве эталона использовали стандартную схему полихимиотерапии АСОР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин и преднизолон) [Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Акимов А.А. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. С-Пб.: Сотис, 1999. С.105] в модификации [Грек О.Р., Мишенина С.В., Пупышев А.Б. Протективное действие энтеросгеля на лизосомы печени крыс при введении комплекса цитостатических препаратов // Бюл. эксп. биол. и мед. 2002. Т.134. №10. С.413-417]. Статистическую обработку данных проводили методами параметрической статистики с использованием пакета программ "Statistika 6.0". Результаты считали достоверными при p<0,05 по критерию Стьюдента.
6
Противоопухолевое действие соединения (1) исследовали на мышах самках линии C57BL/6 с перевитой внутримышечно карциномой легких Льюис (2×10 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора). Соединение (1) вводили через 10 дней после перевивки внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг в течение 8 дней. Группе сравнения проводили цитостатическую полихимиотерапию (ПХТ) по схеме АСОР в режиме однократного парентерального введения циклофосфана (50 мг/кг), доксорубицина (4 мг/кг), винкристина (0,1 мг/кг) и преднизолона (5 мг/кг). Контролем являлись животные с опухолью. Результаты оценивали в динамике по проценту торможения роста опухоли. Установлено, что соединение (1) обладает высокой противоопухолевой активностью, сравнимой с активностью цитостатической ПХТ АСОР (см. табл.1, 2).
Антиметастатическую активность (1) определяли у тех же животных в конце периода введения путем световой микроскопии срезов обеих долей легких. Площадь метастазов подсчитывали с помощью программы «Видео-Тест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ). Показано, что соединение (1) не стимулирует диссеминацию опухоли и проявляет выраженный антиметастатический эффект (ИИМ - 86%) (см. табл.3).
При патоморфологическом исследовании методом световой микроскопии определяли влияние соединения (1) на состояние печени мышей линии C57BL/6 с перевитой внутримышечно карциномой легких Льюис. Соединение (1) вводили, как указано выше; референсной группе проводили однократную ПХТ по схеме АСОР; контролем являлись животные с опухолью. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень и подвергали стандартной гистологической обработке. Показано, что введение соединения (1) снижает тяжесть некробиотических повреждений гепатоцитов, вызванных опухолевым ростом, и улучшает состояние печеночной паренхимы. В референсной группе с ПХТ наблюдали изменения, связанные с усилением дегенеративных и альтеративных процессов, а также фиксировали наличие грубых некробиотических нарушений в структуре печени.
Изучение влияния (1) на противоопухолевый и антиметастатический эффекты цитостатической полихимиотерапии проводили на мышах самках линии C57BL/6 с перевиваемой карциномой легких Льюис. Через 10 дней после перевивки животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР: доксорубицин (4 мг/кг), циклофосфан (50 мг/кг), винкристин (0,1 мг/кг), преднизолон (5 мг/кг). Через сутки после полихимиотерапии животным в течение 8 дней вводили внутрижелудочно (1) в дозе 20 мг/кг. Референсной группой являлись животные с ПХТ АСОР, контролем - животные с опухолью. Противоопухолевый эффект определяли в динамике по индексу торможения роста опухоли (ТРО), антиметастатический - в конце периода введения путем подсчета площади метастазов, частоты метастазирования и индекса ингибирования метастазирования. Установлено, что введение соединения (1) в условиях ПХТ не оказывает пролиферирующего действия на трансплантаты карциномы легких Льюис (см. табл.5, 6). Введение соединения (1) на фоне ПХТ усиливает ее антиметастатический эффект (в 1,6 раз), что указывает на отсутствие стимуляции диссеминации опухоли в условиях стандартной полихимиотерапии (см. табл.7).
Гепатопротекторные свойства (1) изучали на тех же животных путем патоморфологического исследования печени методом световой микроскопии. Выявлено, что под действием (1), вводимого на фоне ПХТ, уменьшается степень дистрофических и некротических поражений печени.
Таким образом, новое соединение - N-[3-оксо-лупано-28-ил]-морфолин формулы (1) - можно рассматривать как перспективное средство с корректорными свойствами в отношении паранеопластических повреждений печени и гепатотоксических эффектов цитостатической полихимиотерапии, обладающее противоопухолевым и антиметастатическим действием.
К преимуществам заявляемого соединения следует отнести:
- выраженную противоопухолевую и антиметастатическую активность;
- способность снижать выраженность некробиотических повреждений гепатоцитов, вызванных паранеопластическими процессами;
- выраженное цитопротекторное действие при применении на фоне цитостатической полихимиотерапии.
- отсутствие стимулирующего влияния на пролиферацию и диссеминацию опухоли при цитостатической полихимиотерапии.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение луп-20(29)-ен-3β,28-диола-бетулина (4).
Измельченную кору березы (344 г) кипятят в бензоле (1.6 л) с обратным холодильником 8 ч, далее горячий раствор декантируют. В оставшуюся кору добавляют еще 1 л бензола, кипятят 1 ч, горячий раствор снова декантируют. Выпавший из бензола осадок отфильтровывают, высушивают и получают 52 г бетулина-сырца. После перекристаллизации в изопропаноле получают 38 г бетулина с т.пл. 260-262°С (лит. т.пл. 258-260°С [Hayek E.W.H., Jordis U., Moche W., Sauter F. // Phytochem., 1989, 25, p.2229.]). Выход бетулина (4) на исходную кору составляет 11%.
Пример 2. Получение лупан-3β,28-диола-дигидробетулина (3).
Гидрирование бетулина (4) проводят аналогично известной методике [Ruzicka L., Brener М., Rey Е. // Helv. Chim. Acta, 1941, 24, p.515-529]. В 5 л автоклав с мешалкой помещают 132 г бетулина (4), 13.2 г Ni-Ренея и 2.5 л этанола, далее все перемешивают в атмосфере водорода (100 атм) при 180°С в течение 14 ч. Освобождаются от катализатора горячим фильтрованием в диоксане, после отгонки растворителя получают 124 г дигидробетулина (3) (выход - 93%). Т.пл. 282-284°С (из спирта). Лит. т.пл. 278-280°С [Ruzicka L., Brener М., Rey Е. // Helv. Chim. Acta, 1941, 24, p.515-529]
Пример 3. Получение 3-оксо-лупан-28-овой кислоты-дигидробетулоновой кислоты (2).
2
4
2
1
13
Суспензию 10 г (22.5 ммоля) дигидробетулина (3) в 165 мл ледяной уксусной кислоты и 110 мл ацетона охлаждают при 0°С и в течение 1 ч при перемешивании прибавляют свежеприготовленный раствор Физера (11 г, 0.11 моля хромового ангидрида в 12 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл HO). Выдерживают при комнатной температуре 3 ч. По окончании реакции добавляют 50 мл метанола, прибавляют 300 мл бензола и 300 мл 10% раствора NaCl. Бензольный слой отделяют, а водный экстрагируют 2×150 мл бензола. Объединенные экстракты промывают 3×200 мл 10% раствором NaCl, сушат MgSO, осушитель отфильтровывают, бензол отгоняют приблизительно до 100 мл и выливают в 200 мл 5% раствора KOH. Осадок калиевой соли дигидробетулоновой кислоты (2) отфильтровывают и высушивают. Сухую соль растворяют в 50 мл этанола, не растворившуюся часть отфильтровывают, фильтрат выливают в 250 мл 5% раствор НСl. Выделившуюся кислоту (2) отфильтровывают, промывают НО, высушивают. В итоге получают 5.5 г (54% от теории) дигидробетулоновой кислоты (2). Точка плавления и спектры ЯМР Н и С соответствуют литературным [Wahab A., Ottosen М., Bachelor F.W. // Can.J. Chem., 1991, 69, p.570-577].
Пример 4. Получение N-[3-оксо-лупано-28-ил]-морфолина (1).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
2
2
34
55
3
3
18a,13a
18a,19
5а,6а
5а,6е
12e,12a
20,19
22а,22е
22а,21е
16e,16a
16e,15a
16e,15e
19,18a
19,21α
19,21β
19,20
2а,2е
2e,1а
2e,1e
2а,2е
2а,1а
2а,1е
13a,12a
13a,18a
13a,12e
-1
1
29
30
25
27
26
24
23
18a
5a
12e
20
22α или 22β
16e
19
2a или 2е
2a или 2е
13a
2',3',5',6'
13
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
3',5'
2',6'
К раствору 0.48 г (1.05 ммоля) дигидробетулоновой кислоты (2) в 40 мл безводного CHCl добавляют 0.3 мл (3.44 ммоля) оксалилхлорида и выдерживают при комнатной температуре 4 ч. После отгонки растворителя к остатку прибавляют два раза по 20 мл CHCl и столько же раз упаривают. Хлорангидрид сразу же вводят в дальнейшую реакцию. К раствору 0.5 г (1.05 ммоля) хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (2) в 40 мл сухого CHCl при перемешивании прибавляют 0.19 г (2.2 ммоля) морфолина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 18-20 ч, затем разбавляют CHCl до 100 мл, промывают 3×20 мл НO, высушивают MgSO, осушитель отфильтровывают, растворитель отгоняют. Остаток делят колоночной хроматографией на силикагеле фракции 60-200 мкм фирмы Merk. Элюент CHCl-MeOH (9:1). Выделяют 0.45 г (81%) продукта с т.пл. 257-258°С. Найдено (%): С, 77.64; H, 10.46; N, 2.75. СНNO. Вычислено (%): С.77.66; Н 10.54; N, 2.66. ИК-спектр (KBr), ν/см: 1634 (CON); 1706 (С=O).  (С 0.20). Спектр ЯМР Н (СDСl, δ, м.д., J/Гц): 0.69 (д, 3Н, Н, J=6.8); 0.79 (д, 3Н, Н, J=6.8); 0.89 (с, 3Н, Н); 0.90 (с, 3Н, Н); 0.92 (с, 3Н, Н); 0.97 (с, 3Н, Н); 1.02 (с, 3Н, Н); 1.25 (дд, 1Н, Н, J=10.8., J=10.8); 1.27 (дд, 1Н, Н, J=11.4, J=2.6); 1.65 (дм, 1Н, Н, J=11.0); 1.74 (септет д, 1Н, Н, 7=6.8, J=2.6); 1.82 (дд, 1Н, Н, J=12.0, J=6.2); 2.02 (ддд, 1Н, Н, J=13.2, J=3.6, J=3.0); 2.14 (дддд, 1Н, Н, J=10.8, J=10.2, J=3.7, J=2.6); 2.35 (ддд, 1Н, Н, J=15.5, J=7.5, J=4.4); 2.45 (ддд, 1Н, Н, J=15.5, J=9.7, J=70.6); 2.90 (ддд, 1Н, Н, J=12.5, J=10.8, J=3.7); 3.49-3.62 (м, 8Н, Н). Сигналы остальных протонов (12Н) наблюдаются в областях 1.03-1.15 и 1.28-1.49 м.д. Спектр ЯМР С, δ, м.д.: 39.48 т (С), 33.97 т (С), 217.83 с (С), 47.15 с (С), 54.90 д (С), 19.48 т (С), 33.64 т (С), 40.47 с (С), 49.78 д (С), 36.74 с (С), 21.53 т (С), 26.99 т (С), 36.55 д (С), 41.89 с (С), 29.65 т (С), 32.08 т (С), 54.74 с (С), 52.02 д (С), 42.59 д (С), 29.61 д (С), 23.34 т (С), 35.91 т (С), 26.44 к (С), 20.86 к (С), 15.77 к (С), 15.77 к (С), 14.26 к (С), 173.69 с (С), 14.50 к (С), 22.76 к (С), 66.82 т (С). Сигналы (С) сильно уширены и наблюдаются в области 45.6 м.д.
Пример 5. Изучение противоопухолевого действия соединения (1) на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюис.
6
Противоопухолевое действие N-[3-оксо-лупано-28-ил]-морфолина (1) исследовали на мышах самках линии C57BL/6 массой 25-30 г, которым перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы легких Льюис в объеме 2×10 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки мышей делили на 3 группы (по 10 особей в каждой). Опытной группе мышей ежедневно в течение 8 дней вводили внутрижелудочно (1) в виде водно-твиновой взвеси в дозе 20 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). Эталоном эффекта являлась группа животных, которым проводилась цитостатическая полихимиотерапия (ПХТ) по стандартной схеме АСОР, адаптированной для мышей: однократное парентеральное введение циклофосфана (50 мг/кг), доксорубицина (4 мг/кг), винкристина (0,1 мг/кг) и преднизолона (5 мг/кг). Контролем являлись животные с опухолью. Контроль и референсная группа с полихимиотерапией получали в течение 8 дней водно-твиновую взвесь. В период введения агентов во всех группах оценивали динамику роста опухоли путем измерения ее размеров штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных отношениях. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО), как разность средних размеров опухолей в контрольной и опытной группах, отнесенная к среднему размеру опухолей в контроле. После окончания введения агентов определяли количество выживших животных (в процентах от их количества до начала введения).
В таблице 1 приведены абсолютные и относительные размеры опухолевых узлов во время введения агента. Относительные значения объемов, выраженные в процентах от их фоновых значений в каждой группе, позволяют более корректно сравнивать результаты лечения в опытной и референсной группах, так как фоновые размеры опухолей (до введения агента) в них несколько отличались. Показано, что на протяжении всего периода наблюдений соединение (1) проявляло достоверный противоопухолевый эффект, задерживая прирост объема опухолевых трансплантатов относительно контроля. В группе сравнения (ПХТ) наблюдалась почти такая же динамика роста опухоли. Однако введение (1) не оказало влияния на выживаемость мышей (см. табл.1).
Данные индекса ТРО, приведенные в таблице 2 с учетом выявленных различий в фоновых значениях, показывают высокую противоопухолевую активность соединения (1) в течение всего периода наблюдения.
Пример 6. Изучение антиметастатического действия соединения (1) на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Антиметастатические свойства соединения (1) изучали на мышах самках линии C57B L/6 массой 25-30 г с солидной карциномой легких Льюис в условиях эксперимента, описанного в примере 5. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали легкие и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии. Антиметастатический эффект определяли с помощью световой микроскопии срезов обеих долей легких. Площадь метастазов определяли с помощью программы «Видео-Тест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ)
к
к
где A - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, B - площадь метастазов у животных контрольной группы, B - площадь метастазов у животных опытной группы.
Установлено, что соединение (1) уменьшает площадь метастазов опухоли в легких в 7,2 раза относительно контроля. Введение химиотерапевтических препаратов АСОР уменьшает количество метастатических поражений в 6,3 раза и несколько снижает частоту метастазирования (см. табл.3). Выраженность антиметастатического эффекта в опытной группе практически совпадает с референсной группой, что свидетельствует о высокой антиметастатической активности соединения (1).
Таким образом, установлено, что соединение (1) не стимулирует диссеминацию опухоли, проявляя выраженный антиметастатический эффект.
Пример 7. Влияние соединения (1) на морфологические нарушения печени мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Влияние соединения (1) на патоморфологические нарушения, вызванные опухолевым ростом, изучали на 3 группах мышей самок линии C57BL/6, которым перевивали внутримышечно солидную карциному легких Льюис, как указано выше. Через 10 дней после перевивки опытной группе в течение 8 дней вводили внутрижелудочно соединение (1) в виде водно-твиновой взвеси в дозе 20 мг/кг, референсной группе проводили однократную ПХТ по схеме АСОР, как указано выше. Контролем являлись животные с опухолью, в качестве физиологической нормы брали группу интактных животных без опухоли. Контрольные животные и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество водно-твиновой взвеси. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень и после стандартной гистологической обработки проводили ее патоморфологическое исследование методом световой микроскопии.
Для гистологического исследования печень фиксировали в 4% параформе, подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе «MICROM». Срезы толщиной 3-4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином с последующим исследованием методом микроскопии в проходящем свете. Степень поражения печени оценивали по следующим критериям: наличие дистрофий (жировая, гиалиново-капельная, гидропическая и баллонная) и некрозов гепатоцитов (моноцеллюлярные, очаговые, сливные, мостовидные), их размеры и локализация. Также оценивали степень полнокровия, вид клеточной инфильтрации синусоидов, портальных трактов, расширение синусоидов, желчных протоков, метастазы, их размер, локализация.
В результате патоморфологического анализа в печени контрольных животных в условиях прогрессивного опухолевого роста отмечено развитие неспецифического реактивного гепатита, характерными признаками которого являются сочетание синдрома регенераторно-пластического дефицита (дистрофии и некрозы) с наличием метастатического поражения и макрофагальной инфильтрацией синусоидов и портальных трактов.
По сравнению с интактными практически у всех контрольных животных выявлена умеренно выраженная (гидропическая) мелкоочаговая дистрофия преимущественно в центролобулярных зонах. Фокальные коагуляционные клеточные некрозы развились в основном вокруг мелкоочаговых метастазов в перипортальных зонах. У всех животных наблюдались множественные диффузные клеточные и мелкоочаговые синусоидальные метастазы без четкой локализации, а также перипортальные мелкоочаговые метастазы, не выходящие за пределы пограничной пластинки. Опухолевые клетки находились в активном митотическом делении. В просвете синусоидов на фоне умеренно выраженного венозного полнокровия выявлялись увеличенные в размере купферовские клетки с липидными гранулами, умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов, свидетельствующая о воспалительном процессе. Также у всех животных отмечалось незначительное зональное расширение желчных протоков.
Таким образом, у контрольных животных с карциномой легких Льюис на фоне метастатического поражения печени развился неспецифический реактивный гепатит с превалированием дистрофического поражения и макрофагальной инфильтрации над некротическими изменениями гепатоцитов.
В референсной группе с ПХТ наблюдались признаки токсического повреждения в виде выраженного синдрома регенераторно-пластического дефицита. По сравнению с контролем в гепатоцитах у всех животных отмечалось увеличение площади и степени дистрофического поражения в виде диффузной мелко- и средневезикулярной липидной инфильтации, очаговой гидропической и баллонной дистрофии.
По сравнению с контрольной группой визуально также отмечалось и увеличение площади некрозов гепатоцитов. Моноцеллюлярные (коагуляционные) некрозы гепатоцитов локализовались по периферии метастатических очагов и в центролобулярных отделах долек. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов локализовались как в перипортальных, так и в центролобулярных зонах. Перипортально у всех животных выявлялись гигантские клетки с пенистой цитоплазмой, содержащие бледные тени ядер. У одного животного отмечено сочетание моноцеллюлярных фокальных, крупноочаговых, мостовидных некрозов, инфильтрированных полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами.
У половины животных выявлено зональное, а у остальных диффузное расширение синусоидов. В просвете синусоидов определялись увеличенные купферовские и клетки с липидными включениями в цитоплазме, макрофаги, клеточный детрит, а также гомогенная субстанция бледно-розового цвета (фибрин). У всех животных так же, как и в контроле, диффузные клеточные метастазы локализовались преимущественно в синусоидах, а мелкоочаговые как в центролобулярных, так и в перипортальных зонах.
Введение соединения (1) животным-опухоленосителям привело к уменьшению степени тяжести синдрома регенераторно-пластического дефицита. В гепатоцитах выявлялась преимущественно фокальная мелковезикулярная липидная инфильтрация и лишь у отдельных животных мелкоочаговая гидропическая дистрофия. Моноцеллюлярные коагуляционные некрозы гепатоцитов локализовались, в основном, по периферии мелкоочаговых метастазов в перипортальных зонах. В синусоидах на фоне незначительного венозного полнокровия выявлялись преимущественно купферовские клетки и небольшое количество липидсодержащих клеток. У всех животных так же, как и в контроле, диффузные клеточные метастазы локализовались в синусоидах, а мелкоочаговые как в центролобулярных, так и в перипортальных зонах.
Таким образом, введение соединения (1) в дозе 50 мг/кг мышам с карциномой Льюис снижает тяжесть некробиотических повреждений тканей, вызванных опухолью. Для морфологической картины в референсной группе характерны изменения, связанные с усилением дегенеративных и альтеративных процессов, а также наличие грубых некробиотических нарушений в структуре печени.
Пример 8. Изучение влияния соединения (1) на противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Мышей самок линии C57BL/6 делили на 3 группы по 10 особей в каждой. Всем животным перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномой легких Льюис как указано выше. Через 10 дней после перевивки двум группам животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР: доксорубицин (4 мг/кг), циклофосфан (50 мг/кг), винкристин (0,1 мг/кг), преднизолон (5 мг/кг). Одной из этих групп через сутки после полихимиотерапии вводили внутрижелудочно соединение (1) в виде водно-твинового взвеси по 0,2 мл на 10 г массы тела в дозе 20 мг/кг, вторая группа с ПХТ АСОР являлась референсной. Контролем являлись животные с опухолью. Введение соединения (1) опытным мышам продолжали 8 дней. Контроль и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество воды с твином. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО) как разность средних размеров опухолей в контрольной и опытной группах, отнесенную к среднему размеру опухолей в контроле. После окончания введения агентов определяли количество выживших животных (в процентах от их количества до начала введения).
В таблице 5 показана динамика роста опухоли в процессе лечения. Представлены абсолютные и относительные (в % относительно фона) значения объема трансплантатов, позволяющие нивелировать разницу в их размерах до лечения. Установлено, что соединение (1), вводимое на фоне ПХТ, не стимулирует развитие опухоли: в опытной и референсной группах наблюдался достоверный противоопухолевый эффект относительно контроля. Отмечено, что под влиянием (1) относительные размеры опухоли дополнительно снизились в 1,2-1,4 раза по сравнению с референсной группой, однако этот эффект не был статистически достоверным (см. табл.4).
Значения показателя ТРО показывают заметный противоопухолевый эффект в опытной и референсной группах (см. табл.5). С учетом выявленных различий в фоновых значениях можно отметить, что соединение (1) способно незначительно усиливать противоопухолевое действия ПХТ.
Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что введение соединения (1) в условиях ПХТ не оказывает пролиферирующего действия на трансплантаты карциномы легких Льюис. У заявляемого соединения в условиях комбинированного введения с химиотерапевтическими препаратами выявлена тенденция к усилению их противоопухолевого действия. Введение (1) повысило выживаемость мышей по сравнению с контрольной и референсной группами.
Пример 9. Изучение влияния соединения (1) на антиметастатический эффект цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Антиметастатические свойства изучали на мышах самках линии C57BL/6 массой 25-30 г с солидной карциномой легких Льюис в условиях эксперимента, описанного в примере 5. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали легкие и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии. Антиметастатический эффект определяли путем анализа срезов обеих долей легких. Площадь метастатических очагов определяли с помощью программы «Видео-Тест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ) [Архипов С.А. и др., 1984]:
к
к
где A - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, B - площадь метастазов у животных контрольной группы, В - площадь метастазов у животных опытной группы.
Установлено, что в обеих группах с введением цитостатических препаратов наблюдается достоверное снижение площади метастазов по сравнению с контролем, а также небольшое снижение количества мышей без метастатических поражений (см. табл.5). Введение соединения (1) на фоне ПХТ приводит к более значительному сокращению площади метастатических поражений - в 10 раз, тогда как сама химиотерапия вызывает лишь 6-кратное уменьшение показателя. О потенцирующем действии (1) на антиметастатический эффект ПХТ свидетельствует повышение ИИМ в группе с комбинированным введением агента и противоопухолевых препаратов по сравнению с референсной группой (91,4 против 86%).
Таким образом, введение соединения (1) на фоне стандартной полихимиотерапии усиливает ее антиметастатический эффект (уменьшение площади метастазов в 1,6 раза).
Пример 10. Изучение гепатопротекторных свойств соединения (1) в условиях цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Гепатопротекторные свойства соединения (1) изучали на мышах самках линии C57B L/6 с солидной карциномой легких Льюис в условиях эксперимента, описанного в примере 5. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень и после стандартной гистологической обработки проводили патоморфологическое исследование методом световой микроскопии.
Для гистологического исследования печень фиксировали в 4% параформе, подвергали стандартной обработке на гистологическом комплексе «MICROM». Срезы толщиной 3-4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином с последующим исследованием методом световой микроскопии в проходящем свете. Степень поражения печени оценивали по следующим критериям: наличие дистрофий (гиалиново-капельная, жировая, гидропическая и баллонная), некрозов (моноцеллюлярные, очаговые, сливные, мостовидные), их локализация. Также оценивали степень полнокровия, клеточную инфильтрацию синусоидов, портальных трактов, расширение синусоидов, желчных протоков, метастазы, их размер, локализация.
В печени контрольных животных с перевитой опухолью отмечалось развитие неспецифического реактивного гепатита, характерными признаками которого являются сочетание синдрома регенераторно-пластического дефицита (дистрофии и некрозы) с наличием метастатического поражения и макрофагальной инфильтрации синусоидов и портальных трактов. Практически у всех животных дистрофические поражения в центролобулярных зонах выявлялась лишь в виде мелкоочаговой гидропической дистрофии. Фокальные коагуляционные клеточные некрозы развились преимущественно вокруг мелкоочаговых метастазов в перипортальных зонах.
У всех животных выявлялись множественные диффузные клеточные и мелкоочаговые синусоидальные метастазы без четкой локализации, а также перипортальные мелкоочаговые метастазы, не выходящие за пределы пограничной пластинки. Опухолевые клетки находились в активном митотическом делении. Стенки синусодов были утолщены с признаками плазматического пропитывания. В просвете синусоидов на фоне умеренно выраженного полнокровия выявлялись увеличенные в размере клетки с липидными гранулами в цитоплазме, умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов. Также у всех животных отмечалось незначительное зональное расширение желчных протоков (рис.1).
Характер морфологических изменений в группе соответствует поражению средней тяжести.
Введение комплекса цитостатиков привело к развитию токсического повреждения в виде выраженного синдрома регенераторно-пластического дефицита. По сравнению с контролем в гепатоцитах у всех животных отмечалось увеличение площади и степени дистрофического поражения в виде диффузной мелко- и средневезикулярной липидной инфильтации, очаговой гидропической и баллонной дистрофии (рис.2).
По сравнению с контрольной группой визуально также отмечалось и увеличение площади некрозов гепатоцитов. Моноцеллюлярные (коагуляционные) некрозы гепатоцитов локализовались по периферии метастатических очагов и в центролобулярных отделах долек. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов локализовались как в перипортальных, так и в центролобулярных зонах. Перипортально у всех животных выявлялись гигантские клетки с пенистой цитоплазмой, содержащие бледные тени ядер (рис.2). У одного животного отмечено сочетание моноцеллюлярных фокальных, крупноочаговых, мостовидных некрозов, инфильтрированных полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами.
У половины животных выявлено зональное, а у остальных диффузное расширение синусоидов. В просвете синусоидов определялись увеличенные купферовские и клетки с липидными включениями в цитоплазме, макрофаги, клеточный детрит, а также гомогенная субстанция, предположительно фибрин, бледно-розового цвета (рис.2), что является показателем нарушения транс-синусоидального обмена. У всех животных так же, как и в контроле, диффузные клеточные метастазы локализовались преимущественно в синусоидах, а мелкоочаговые как в центролобулярных, так и в перипортальных зонах. По совокупности патоморфологических признаков повреждения печени в данной группе соответствуют более тяжелой степени по сравнению с контрольной группой.
Введение животным соединения (1) на фоне полихимиотерапии оказало выраженное положительное влияние на течение патологического процесса. Под действием морфолинового производного отмечалось уменьшение степени тяжести синдрома регенераторно-пластической недостаточности: в гепатоцитах выявлялись единичные мелкие очаги мелковезикулярной липидной инфильтрации и гиалиново-капельной дистрофии, локализующиеся преимущественно в центролобулярных отделах (рис.3). Единичные моноцеллюлярные некрозы гепатоцитов локализовались преимущественно вокруг мелкоочаговых метастазов.
Также наблюдалось восстановление просвета синусоидов с преимущественной диффузной инфильтрацией их купферовскими клетками и уменьшение в их просвете липидсодержащих клеток (Ито), появление апототических телец (Каунсилмена) (рис.3). Визуально не отмечалось изменений объема метастатического поражения печени по сравнению с референсной группой.
Таким образом, введение соединения (1) на фоне полихимиотерапии привело к улучшению морфологических показателей печени, по сравнению с контрольной и референсной группой.
Полученные данные свидетельствуют о том, что заявляемое соединение N-[3-оксо-лупано-28-ил]-морфолин (1) как средство, предназначенное для коррекции повреждений печени при злокачественном росте и цитостатической химиотерапии, обладает следующими преимуществами:
- выраженной противоопухолевой и антиметастатической активностью в условиях злокачественного роста;
- способностью снижать тяжесть цитотоксических паранеопластических синдромов в печени;
- способностью уменьшать гепатотоксическое действие противоопухолевой химиотерапии и при этом не стимулировать пролиферацию и диссеминацию опухоли.
Таблица 1
Изменение динамики роста карциномы легких Льюис и выживаемость мышей под влиянием внутрижелудочного введения соединения (1)
Группа
Объем опухоли, см<sup>3</sup> (и в % относительно фоновых значений)
Выживаемость, %
Сутки после полихимиотерапии
0(фон)
4
6
8
8
контроль
0,62±0,06 0%
2,05±0,17 230%
3,21±0,17 418%
3,64±0,29 487%
70
ПХТ
0,79±0,13 0%
1,82±0,28 130%
2,42±0,20* 206%
2,68±0,18* 239%
80
(1), 20 мг/кг
0,63±0,07 0%
1,39±0,07** 121%
1,75±0,17***# 178%
2,20±0,26** 249%
70
* Р<0,05; ** Р<0,001; *** Р<0,0001 различия с контролем достоверны # Р<0,05 различия с группой сравнения достоверны
Таблица 2.
Значения индекса торможения роста карциномы легких Льюис (ТРО) у мышей в период введения соединения (1)
Группа
ТРО, % (по объему опухоли)
Сутки после полихимиотерапии
0 (фон)
4
6
8
ПХТ
0
11
25
26
(1), 20 мг/кг
0
11
24
19
Таким образом, показано, что агент (1) обладает противоопухолевой активностью, сравнимой с активностью цитостатической ПХТ АСОР.
Таблица 3.
Показатели метастазирования карциномы легких Льюис в легких мышей после 8-дневного введения соединения (1)
Группа
Площадь метастазов (мкм)
Частота метастазирования
ИИМ, %
Контроль
319,78±51,36
100
-
ПХТ
50,66±9,15***
88
86,0
(1)
44,43±4,15***
100
86,1
* P<0,05, *** P<0,001 различия с контролем достоверны; ЧМ - частота метастазирования; ИИМ - индекс ингибирования метастазирования.
Таблица 4
Изменение динамики роста карциномы легких Льюис и выживаемости мышей под влиянием введения соединения (1) на фоне цитостатической полихимиотерапии (ПХТ)
Группа
Объем опухоли, см<sup>3 </sup>(и в % относительно фоновых значений)
Выживаемость, % от исходной
Сутки после полихимиотерапии
0 (фон)
4
6
8
8
контроль
0,62±0,06 0%
2,05±0,17 230%
3,21±0,17 418%
3,64±0,29 487%
70
ПХТ
0,79±0,13 0%
1,82±0,28 130%
2,42±0,20* 206%
2,68±0,18* 239%
80
ПХТ + (1)
0,86±0,08* 0%
1,62±0,19 88%
2,31±0,17** 169%
2,83±0,14* 229%
90
* Р<0,05; ** Р<0,001; *** Р<0,0001 различия с контролем достоверны
Таблица 5
Значения индекса торможения роста карциномы легких Льюис (ТРО) у мышей в период введения соединения (1) на фоне полихимиотерапии (ПХТ)
Группа
ТРО, %
Сутки после полихимиотерапии
0 (фон)
4
6
8
ПХТ
0
11
25
26
ПХТ + (1), 20 мг/кг
0
21
28
22
Таблица 6
Показатели метастазирования карциномы легких Льюис в легких мышей после 8-дневного введения соединения (1) на фоне полихимиотерапии (ПХТ)
Группа
Площадь метастазов (мкм)
Частота метастазирования
ИИМ %
Контроль
319,78±51,36
100
-
ПХТ
50,66±9,15***
88
86,0
ПХТ + (1)
32,09±4,95***
86
91,4