ДЛИТЕЛЬНО ДЕЙСТВУЮЩЕЕ ПРОИЗВОДНОЕ АДРЕНОМЕДУЛЛИНА
LONG-ACTING ADRENOMEDULLIN DERIVATIVE

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к длительно действующим производным адреномедуллина.
Уровень техники
[0002] Адреномедуллин (далее также относится к «AM») представляет собой биологически активный пептид, который был выделен и идентифицирован из феохромоцитомы в 1993 году (непатентный документ 1). В начале открытия было обнаружено, что AM оказывает сильное сосудорасширяющее гипотензивное действие. Например, в патентном документе 1 описан пептид, обладающий понижающим артериальное давление действием, который включает аминокислотную последовательность человеческого АМ.
[0003] Результаты последующих исследований показали, что AM оказывает разнообразные фармакологические эффекты, такие как защитный эффект для сердечно-сосудистой системы, противовоспалительный эффект, ангиогенный эффект и эффект, способствующий восстановлению ткани. При осуществлении применения фармакологических эффектов АМ для лечения заболеваний была предпринята попытка введения АМ пациентам с различными заболеваниями. Предполагалось, что AM будет пригоден в качестве терапевтического агента для лечения, среди прочего, воспалительных заболеваний кишечника, легочной гипертензии, заболеваний периферических сосудов или острого инфаркта миокарда.
[0004] Например, в патентом документе 2 описан агент для профилактики или лечения небактериальных воспалительных заболеваний кишечника, где агент содержит в качестве активного ингредиента адреномедуллин или его производное, которое обладает активностью для подавления небактериального воспаления, или его соль, которая обладает активностью для подавления небактериального воспаления.
[0005] В патентом документе 3 описывается способ профилактики или лечения воспалительного заболевания кишечника, для которого применение стероидного препарата, иммуносупрессора или биологического продукта является затруднительным или недостаточно эффективным у пациента, нуждающегося в профилактике или лечении воспалительного заболевания кишечника, где способ включает введение пациенту эффективного количества адреномедуллина, его модифицированной формы, обладающей активностью подавления воспаления, или соли адреномедуллина, или модифицированной формы, обладающей активностью подавления воспаления.
[0006] Результаты исследований зависимости структура-активность AM позволили выявить существенные последовательности, которые могут обеспечивать проявление биологической активности AM (непатентные документы 2-9).
[0007] Известно, что пептиды имеют короткий период полураспада за счет метаболизма в живом организме (например, в крови). Следовательно, в случае применения пептидов в качестве активных ингредиентов в лекарственных препаратах формы пептидных производных, в которых другие группы связаны с пептидами, могут привести к удлинению периода полураспада в живом организме и в некоторых случаях улучшить фармакокинетику.
[0008] Например, в патентном документе 4 описан биологически активный пептид интермедина или пептид адреномедуллина, отличающиеся тем, что период полураспада в сыворотке крови превышает 1,5 ч. В литературной ссылке указано, что алкильная группа и пептидный фрагмент связаны через амидную связь.
1
[0009] В патентном документе 5 описано производное АМ, связанное с полиэтиленгликолевой группой (далее также относится к «ПЭГ») через фенольный гидроксил Tyr AM.
[0010] В патентном документе 6 описан способ, включающий взаимодействие ПЭГ-альдегида со свободной аминогруппой пептида, с получением пептидного производного, имеющего группу ПЭГ, связанную со свободной аминогруппой пептида. В литературной ссылке АМ описывается в качестве пептида.
[00011] В непатентном документе 10 описано производное АМ, в котором ПЭГ-группа связана с N-концевой аминогруппой АМ через амидную связь. В литературной ссылке указывается, что период полураспада в крови производного АМ, имеющего связанную группу ПЭГ, удлинялся.
Список ссылок
Патентная литература
[0012]
Патентный документ 1: патент Японии № 2774769.
Патентный документ 2: патент Японии № 4830093.
Патентный документ 3: публикация международной заявки WO 2012/096411.
Патентный документ 4: публикация международной заявки WO 2012/138867.
Патентный документ 5: публикация международной заявки WO 2013/064508.
Патентный документ 6: публикация заявки на патент США 2009/0252703.
Непатентная литература
[0013]
Непатентный документ 1: Kitamura K., Kangawa K., Kawamoto M., Ichiki Y., Nakamura S., Matsuo H., Eto T. Adrenomedullin: a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma. Biochem Biophys Res Commun, 30 April 1993, Volume 192, Issue 2, pp. 553-560.
Непатентный документ 2: Belloni A.S. et al., Structure-activity relationships of adrenomedullin in the adrenal gland. Endocr Res, 1998, Volume 24, Issue 3-4, p. 729-30.
Непатентный документ 3: Champion H.C. et al., Catecholamine release mediates pressor effects of adrenomedullin-(15-22) in the rat. Hypertension, 1996, Volume 28, Issue 6, p. 1041-6.
Непатентный документ 4: Champion H.C., G.G. Nussdorfer and P.J. Kadowitz, Structure-activity relationships of adrenomedullin in the circulation and adrenal gland. Regul Pept, 1999, Volume 85, Issue 1, p. 1-8.
Непатентный документ 5: Eguchi S. et al., Structure-activity relationship of adrenomedullin, a novel vasodilatory peptide, in cultured rat vascular smooth muscle cells. Endocrinology, 1994, Volume 135, Issue 6, p. 2454-8.
Непатентный документ 6: Garcia M.A. et al., Synthesis, biological evaluation, and three-dimensional quantitative structure-activity relationship study of small-molecule positive modulators of adrenomedullin. J Med Chem, 2005, Volume 48, Issue 12, p. 4068-75.
Непатентный документ 7: Mitsuda Y. et al., Large-scale production of functional human adrenomedullin: expression, cleavage, amidation, and purification. Protein Expr Purif, 2002, Volume 25, Issue 3, p. 448-55.
Непатентный документ 8: Roldos V. et al., Small-molecule negative modulators of adrenomedullin: design, synthesis, and 3D-QSAR study. ChemMedChem, 2008, Volume 3, Issue 9, p. 1345-55.
Непатентный документ 9: Watanabe T.X. et al., Vasopressor activities of N-terminal fragments of adrenomedullin in anesthetized rat. Biochem Biophys Res Commun, 1996, Volume 219, Issue 1, p. 59-63.
Непатентный документ 10: Kubo K et al., Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol. Peptides, 2014, Volume 57, p. 118-21.
Непатентный документ 11: Kato J., Kitamura, K.. Bench-to-bedside pharmacology of adrenomedullin. European Journal of Pharmacology, 2015, Volume 764, p. 140-148.
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0014] Как описано выше, известны производные АМ, в которых другие группы, такие как ПЭГ-группа, связывают с АМ, с целью улучшения фармакокинетики АМ с точки зрения повышения длительности действия в живом организме. Однако известные производные АМ уязвимы для такого усовершенствования. Например, в случае связывания относительно большой группы, такой как группа ПЭГ, с относительно небольшим пептидом, таким как АМ, различные свойства полученного производного АМ могут существенно варьироваться в зависимости от молекулярной массы группы ПЭГ. Как описано в патентных документах 4 и 5 и непатентном документе 10, когда пептидный фрагмент и другие группы связаны через связь, которую можно расщепить в биологической реакции, такую как амидная связь или сложноэфирная связь, то связь может быть расщеплена в течение относительно короткого периода времени после введения. Как и в производном АМ, описанном в патентном документе 5, в случае связывания других групп с боковой цепью аминокислотного остатка АМ, конформация фрагмента АМ может изменяться со снижением аффинности к АМ-рецептору, распознающему АМ. В таком случае фармакологические эффекты, присущие AM, у полученного производного АМ могут быть снижены.
[0015] AM обладает сильным сосудорасширяющим эффектом, в дополнении к фармакологическим эффектам, таким как защитный эффект для сердечно-сосудистой системы, противовоспалительный эффект, ангиогенный эффект и эффект, способствующий восстановлению ткани. Этот сильный сосудорасширяющий эффект может вызывать нежелательные побочные реакции, такие как чрезмерное снижение кровяного давления, когда AM или AM производное вводят субъектам. Развитие таких побочных реакций может стать проблемой, когда используется AM или AM производное, в частности, предполагая, что будут проявляться фармакологические эффекты, иные чем сосудорасширяющий эффект.
[0016] Таким образом, изобретение предназначено для обеспечения новых производных адреномедуллина, стабильных в течение длительного периода времени, которые способны существенно подавлять нежелательные побочные реакции, одновременно сохраняя фармакологическиы эффекты адреномедуллина.
Решение проблемы
[0017] Авторы настоящего изобретения провели различные исследования способов для решения проблем, описанных выше. Заявители настоящего изобретения обнаружили, что связывание N-концевой α-аминогруппы адреномедуллина с группой ПЭГ с определенной молекулярной массой через метиленовую группу или уретановую группу может удлинить период полураспада полученного производного адреномедуллина в крови по сравнению с адреномедуллином, одновременно сохраняя биологическую активность на том же уровне, что и у адреномедуллина. Кроме того, заявители настоящего изобретения обнаружили, что новые производные адреномедуллина, обладающие свойствами, описанными выше, способны существенно подавлять нежелательные побочные реакции, такие как чрезмерное снижение кровяного давления. Авторы настоящего изобретения осуществили настоящее изобретение, основываясь на установленном факте, описанном выше.
[0018] Таким образом, сущность изобретения заключается в следующем:
(1) Соединение, представленное формулой (I):
2
A-CH-B (I)
где
А представляет модифицирующую группу, содержащую одну или более групп полиэтиленгликоля, и
B представляет пептидный фрагмент, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы с адреномедуллиновой активностью,
где пептидный фрагмент B связан с другими группами посредством ковалентной связи атома азота N-концевой α-аминогруппы пептидного фрагмента B с атомом углерода метиленовой группы,
или его соль, или его гидрат.
(2) Соединение согласно варианту осуществления (1), где А представляет модифицирующую группу, представленную следующей формулой (II):
где
a представляет целое число 1 или более,
m представляет целое число 1 или более,
1
1
1
L представляет m+1-валентную линейную или разветвленную связывающую группу, где, когда присутствует множество L, то множество L являются одинаковыми или отличными друг от друга,
2
2'
2'
2'
L и L каждый независимо представляют связь или двухвалентную связывающую группу, где, когда присутствует множество L, то множество L являются одинаковыми или отличными друг от друга,
1
M представляет группу полиэтиленгликоля, представленную формулой (III):
2
2
n
#-(CHCHO)-** (III)
где
n представляет собой целое число 1 или более,
1
** является положением связывания с L, и
2'
# является положением связывания с O или L,
1
1
где, когда присутствует множество M, то множество M являются одинаковыми или отличными друг от друга,
2
2
2
M представляет связь или полиэтиленгликолевую группу формулы (III), где, когда присутствует множество M, то множество M являются одинаковыми или отличными друг от друга,
1
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
R представляет атом водорода, замещенный или незамещенный C-Cалкил, замещенный или незамещенный C-C алкенил, замещенный или незамещенный C-C алкинил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинил, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкил, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкил, замещенный или незамещенный C-C арил, замещенный или незамещенный C-C арилалкил, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкил или замещенный или незамещенный ацил, и
* является положением связывания с другими группами.
(3) Соединение согласно варианту осуществления (1) или (2), где А представляет модифицирующую группу, представленную следующими формулами (V), (VI), (VII) или (VIII):
где
a представляет целое число 1 или более,
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
M, M, M, M и M каждый независимо представляет связь или группу полиэтиленгликоля, представленную формулой (III):
2
2
n
**
#-(CHCHO)-(III)
где
n представляет целое число 1 или более,
3
3'
** является положением связывания с R, R или CH, и
# представляет положение связывания с O,
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
где, когда присутствует множество M, M, M, M или M, то множество M, M, M, M или M являются одинаковыми или отличными друг от друга, и, по меньшей мере, один из M, M, M, M или M представляет группу полиэтиленгликоля, представленную формулой (III),
1
1'
1ʺ
1'ʺ
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
1
20
R, R, Rи R каждый независимо представляет атом водорода, замещенный или незамещенный C-Cалкил, замещенный или незамещенный C-C алкенил, замещенный или незамещенный C-C алкинил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинил, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкил, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкил, замещенный или незамещенный C-C арил, замещенный или незамещенный C-арилалкил, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкил или замещенный или незамещенный ацил,
2
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
R представляет связь, замещенный или незамещенный C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C алкенилен, замещенный или незамещенный C-C алкинилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C арилен, замещенный или незамещенный C-C арилалкилен, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарилен, или замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкилен (группы необязательно содержат один или более гетероатомов, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-)), амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-),
3
3'
3ʺ
3
3'
3ʺ
3
3'
3ʺ
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
R, Rи R каждый независимо представляет связь, замещенный или незамещенный C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C алкенилен, замещенный или незамещенный C-C алкинилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C арилен, замещенный или незамещенный C-C арилалкилен, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарилен, или замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкилен (группы необязательно содержат один или более гетероатомов, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-)), амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-), где, когда присутствует множество R, Rи R, то множество R, Rи R являются одинаковыми или отличными друг от друга, и
* является положением связывания с другими группами.
(4) Соединение согласно любому из вариантов осуществления (1)-(3), где группа полиэтиленгликоля формулы (III) в общем имеет средневесовую молекулярную массу от 1 до 100 кДа.
(5) Соединение согласно любому из вариантов осуществления (1)-(4), где адреномедуллин или его модифицированная форма с адреномедуллиновой активностью представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(i) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности адреномедуллина,
(ii) пептида, который состоит из аминокислотной последовательности адреномедуллина и имеет дисульфидную связь, образованную двумя остатками цистеина в аминокислотной последовательности,
(iii) пептида (ii), где дисульфидная связь пептида замещена этиленовой группой, и пептид обладает адреномедуллиновой активностью,
(iv) любого пептида (i)-(iii), где пептид имеет аминокислотную последовательность, включающую делецию, замену или добавление от одного до пятнадцати аминокислотных остатков, и обладает адреномедуллиновой активностью,
(v) любого пептида (i)-(iv), где пептид амидирован на его С-конце, и
(vi) любого пептида (i)-(iv), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
(6) Соединение согласно варианту осуществления (5), где адреномедуллин или его модифицированная форма представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(i) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности адреномедуллина,
(ii) пептида, который состоит из аминокислотной последовательности адреномедуллина и имеет дисульфидную связь, образованную двумя остатками цистеина в аминокислотной последовательности,
(v) пептида (i) или (ii), где пептид амидирован на его С-конце, и
(vi) пептида (i) или (ii), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
(7) Соединение согласно варианту осуществления (5), где адреномедуллин или его модифицированная форма представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(iv') любого пептида (i)-(iii), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-10 или положениях 1-5 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью,
(v) пептида (iv'), где пептид амидирован на его С-конце, и
(vi) пептида (iv'), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
(8) Соединение согласно любому из вариантов (1)-(5), где адреномедуллин или его модифицированная форма представляют пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(а) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(b) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(c) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(d) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(e) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(f) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(g) любого пептида (a)-(f), где дисульфидная связь пептида замещена этиленовой группой, и пептид обладает адреномедуллиновой активностью;
(h) любого пептида (a)-(g), где пептид имеет аминокислотную последовательность, содержащую делецию, замену или добавление от одной до пятнадцати аминокислот и обладающего адреномедуллиновой активностью;
(i) любого пептида (а)-(h), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) любого пептида (a)-(h), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
(9) Соединение согласно варианту осуществления (8), где адреномедуллин или его модифицированная форма представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(а) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(b) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(c) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(d) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(e) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(f) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(i) любого пептида (а)-(f), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) любого пептида (a)-(f), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
(10) Соединение согласно варианту осуществления (8), где адреномедуллин или его модифицированная форма представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(h') любого пептида (a)-(d), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-10 или положениях 1-5 из его N-конца и адреномедуллиновой активностью, или пептида (е) или (f), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-13, положениях 1-8 или положениях 1-5 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью;
(i) пептида (h'), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) пептида (h'), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
(11) Способ получения соединения согласно любому из вариантов осуществления (1)-(10) или его соли, или его гидрата, включающий связывающую стадию взаимодействия предшественника пептидного фрагмента В, полученного из адреномедуллина или его модифицированной формы, с альдегидом-предшественником модифицирующей группы А, содержащим одну или более групп полиэтиленгликоля в присутствии восстанавливающего агента с образованием соединения формулы (I), где альдегид-предшественник представлен формулой (I-1): A-CHO (I-1).
(12) Соединение, представленное формулой (X):
A'-CO-B (X)
где
А' представляет модифицирующую группу, содержащую одну или более групп полиэтиленгликоля, и
B представляет пептидный фрагмент, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы с адреномедуллиновой активностью,
где пептидный фрагмент B связан с другими группами посредством ковалентной связи атома азота N-концевой α-аминогруппы пептидного фрагмента B с атомом углерода карбонильной группы,
A' представляет модифицирующую группу, представленную следующими формулами (XI), (XI') или (XII):
1
1
R-O-M-*    (XI)
где
a представляет целое число 1 или более,
1
M представляет группу полиэтиленгликоля, представленную формулой (III):
2
2
n
**
#-(CHCHO)-    (III)
где
n представляет целое число 1 или более,
** является положением связывания с *, и
# представляет положение связывания с O,
3
3'
3'ʺ
3ʺʺ
M, M и M и M каждый независимо представляет связь или группу полиэтиленгликоля, представленную формулой (III):
2
2
n
**
#-(CHCHO)-   (III)
где
n представляет целое число 1 или более,
3
3'
** является положением связывания с R, Rили CH, и
# представляет положение связывания с O,
3
3'
3ʺ
3
3'
3ʺ
3
3'
3ʺ
где, когда присутствует множество M, M или M, то множество M, M или M являются одинаковыми или отличными друг от друга, и, по меньшей мере, один из M, M или M представляет группу полиэтиленгликоля, представленную формулой (III),
1
1'
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
R и Rкаждый независимо представляет атом водорода, замещенный или незамещенный C-Cалкил, замещенный или незамещенный C-C алкенил, замещенный или незамещенный C-C алкинил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинил, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкил, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкил, замещенный или незамещенный C-C арил, замещенный или незамещенный C-С арилалкил, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкил или замещенный или незамещенный ацил,
2
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
R представляет связь, замещенный или незамещенный C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C алкенилен, замещенный или незамещенный C-C алкинилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C арилен, замещенный или незамещенный C-C арилалкилен, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарилен, или замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкилен (группы необязательно содержат один или более гетероатомов, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-)), амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-),
3
3'
3ʺ
3
3'
3ʺ
3
3'
3ʺ
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
R, Rи Rкаждый независимо представляет связь, замещенный или незамещенный C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C алкенилен, замещенный или незамещенный C-C алкинилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C арилен, замещенный или незамещенный C-C арилалкилен, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарилен, или замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкилен (группы необязательно содержат один или более гетероатомов, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-)), амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-), где, когда присутствует множество R, Rи R, то множество R, Rи R являются одинаковыми или отличными друг от друга, и
* является положением связывания с другими группами,
или его соль или его гидрат.
(13) Лекарственное средство, содержащее соединение согласно любому из вариантов осуществления (1)-(10) и (12) или его фармацевтически приемлемая соль, или его фармацевтически приемлемый гидрат, в качестве активного ингредиента.
(14) Лекарственное средство согласно варианту осуществления (13) для применения в профилактике или лечении сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания периферических сосудов.
(15) Агент для профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания периферических сосудов, где агент содержит соединение согласно любому из вариантов осуществления (1)-(10) и (12) или его фармацевтически приемлемую соль, или его фармацевтически приемлемый гидрат, в качестве активного ингредиента.
(16) Фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно любому из вариантов осуществления (1)-(10) и (12) или его фармацевтически приемлемую соль, или его фармацевтически приемлемый гидрат, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей.
(17) Фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления (16) для применения в профилактике или лечении сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания периферических сосудов.
(18) Способ профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства, включающий введение субъекту, нуждающемуся в профилактике или лечении состояния, заболевания и/или расстройства, эффективного количества соединения согласно любому из вариантов осуществления (1)-(10) и (12), или его фармацевтически приемлемой соли или их фармацевтически приемлемого гидрата.
(19) Способ согласно варианту осуществления (18), где состояние, заболевание и/или расстройство является сердечно-сосудистым заболеванием, воспалительным заболеванием или заболеванием периферических сосудов.
(20) Соединение по любому из вариантов осуществления (1)-(10) и (12) или его фармацевтически приемлемая соль, или его фармацевтически приемлемый гидрат, для применения в профилактике или лечении состояния, заболевания и/или расстройства.
(21) Соединение согласно варианту осуществления (20), где состояние, заболевание и/или расстройство является сердечно-сосудистым заболеванием, воспалительным заболеванием или заболеванием периферических сосудов.
(22) Применение соединения по любому из вариантов осуществления (1)-(10) и (12) или его фармацевтически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемого гидрата, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения состояния, болезни и/или расстройства.
(23) Применение по варианту осуществления (22), где состояние, заболевание и/или расстройство является сердечно-сосудистым заболеванием, воспалительным заболеванием или заболеванием периферических сосудов.
Преимущественные эффекты изобретения
[0019] Изобретение может обеспечить новые производные адреномедуллина, стабильные в течение длительного периода времени, которые способны существенно подавлять нежелательные побочные реакции, одновременно сохраняя фармакологические эффекты адреномедуллина.
[0020] Настоящее описание включает содержание, описанное в описании и/или фигурах заявки на патент Японии № 2015-184685, для которой настоящая заявка испрашивает приоритет.
Краткое описание фигур
[0021]
[Фиг. 1]. На фиг. 1 приведены хроматограммы обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) расщепленных пептидов. A: хроматограмма ОФ-ВЭЖХ расщепленного пептида, полученного из пептида h.AM (1-52); и B: хроматограмма ОФ-ВЭЖХ расщепленного пептида, полученного из соединения (2).
[Фиг. 2]. На фиг. 2 приведены результаты разделения соединений (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11) и (12) электрофорезом SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля в градиенте концентрации от 10% до 20%. На схеме полоса 0 показывает стандарт молекулярной массы, полоса 1 показывает соединение (3), полоса 2 показывает соединение (4), полоса 3 показывает соединение (5), полоса 4 показывает соединение (6), полоса 5 показывает соединение (7), полоса 6 показывает соединение (8), полоса 7 показывает соединение (9), полоса 8 показывает соединение (10), полоса 9 показывает соединение (11), и полоса 10 показывает соединение (12).
[Фиг. 3]. На фиг. 3 приведены результаты разделения соединений (1), (2), (13), (14), (15), (16) и (17) электрофорезом SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля в градиенте концентрации от 10% до 20%. На схеме полоса 0 показывает стандарт молекулярной массы, полоса 1 показывает соединение (1), полоса 2 показывает соединение (2), полоса 3 показывает соединение (13), полоса 4 показывает соединение (14), полоса 5 показывает соединение (15), полоса 6 показывает соединение (16), и полоса 7 показывает соединение (17).
[Фиг. 4]. На фиг. 4 приведены результаты разделения соединений (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36) и (37) электрофорезом SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля в градиенте концентрации от 10% до 20%. На схеме полоса 0 показывает стандарт молекулярной массы, полоса 1 показывает соединение (25), полоса 2 показывает соединение (26), полоса 3 показывает соединение (27), полоса 4 показывает соединение (28), полоса 5 показывает соединение (29), полоса 6 показывает соединение (30), полоса 7 показывает соединение (31), полоса 8 показывает соединение (32), полоса 9 показывает соединение (33), полоса 10 показывает соединение (34), полоса 11 показывает соединение (35), полоса 12 показывает соединение (36), и полоса 13 показывает соединение (37).
[Фиг. 5]. На фиг. 5 приведены результаты разделения соединений (18), (19), (20), (21), (22), (23) и (24) электрофорезом SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля в градиенте концентрации от 10% до 20%. На схеме полосы 0 и 1 показывают стандарт молекулярной массы, полоса 2 показывает соединение (18), полоса 3 показывает соединение (19), полоса 4 показывает соединение (20), полоса 5 показывает соединение (21), полоса 6 показывает соединение (22), полоса 7 показывает соединение (23), и полоса 8 показывает соединение (24).
[Фиг. 6]. На фиг. 6 показана взаимосвязь между временем, прошедшим с начала введения соединения (2), соединения (4), соединения (8) или h.AM (1-52) и средним значением кровяного давления. A: результаты по соединению (2), соединению (4) и h.AM (1-52); и B: результаты по соединению (8) и h.AM (1-52).
[Фиг. 7]. На фиг. 7 показана взаимосвязь между временем, прошедшим с начала введения соединения (8), и концентрацией АМ в плазме крови.
[Фиг. 8]. На фиг. 8 показана взаимосвязь между временем, прошедшим с начала введения соединения (6), или h.AM (1-52) и концентрацией AM в плазме крови.
[Фиг. 9]. На фиг. 9 представлены значения кровяного давления у спонтанно-гипертензивных крыс за 2 суток до и через 9 суток после введения соединения (8) или физиологического раствора.
[Фиг. 10]. На фиг. 10 приведены значения изменения кровяного давления, полученные через 4 суток и 9 суток после введения соединения (37) или физиологического раствора, по отношению к среднему систолическому кровяному давлению за сутки до введения.
[Фиг. 11]. На фиг. 11 показана взаимосвязь между временем, прошедшим с воспроизведения модели колита, индуцированного сульфатом декстрана (DSS), и суммарными значениями баллов в группе с введением соединения (8) и в контрольной группе.
[Фиг. 12]. На фиг. 12 показана взаимосвязь между временем, прошедшим с воспроизведения модели колита, индуцированного 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS), и массой тела в группе с введением соединения (8) и контрольной группе. a: сутки, на которые подкожно вводили соединение (8) или физиологический раствор, и начинали голодание; и b: сутки, на которые вводили TNBS.
[Фиг. 13]. На фиг. 13 приведены значения массы толстого кишечника в группе с введением соединения (8) и контрольной группе.
[Фиг. 14]. На фиг. 14 приведены значения длины кишечника в области толстой кишки в группе с введением соединения (8) и контрольной группе.
[Фиг. 15]. На фиг. 15 приведены значения соотношения массы правого желудочка/массы левого желудочка в группе с введением соединения (8) и контрольной группе.
[Фиг. 16]. На фиг. 16 показана взаимосвязь между временем, прошедшим с воспроизведения модели раны, и площадями раны в группе с введением соединения (8) и контрольной группе.
[Фиг. 17]. На фиг. 17 показана взаимосвязь между временем, прошедшим с воспроизведения модели окклюзии сосудов, и латентным временем покидания зоны старта в тесте скрытой платформы в группе с введением соединения (8) и контрольной группе.
[Фиг. 18]. На фиг. 18 приведены значения доли времени пребывания в зоне платформы в испытательном тесте в группе с введением соединения (8) и контрольной группе крыс на модели сосудистой окклюзии.
[Фиг. 19]. На фиг. 19 показана взаимосвязь между временем, прошедшим после введения соединения (8) или растворителя, и объемами лап, после введения адъюванта в группе с введением соединения (8) и контрольной группе.
[Фиг.20] На фиг.20 показана взаимосвязь между временем, прошедшим после введения соединения (8) или растворителя, и степенью развития отека, после введения адъюванта в группе с введением соединения (8) и контрольной группе.
[Фиг. 21]. На фиг. 21 показана взаимосвязь между временем, прошедшим после введения соединения (8) или растворителя, и баллами оценки воспаления, после введения адъюванта в группе с введением соединения (8) и контрольной группе.
Описание вариантов осуществления
[0022]
1. Производное адреномедуллина
Один аспект изобретения относится к соединению, представленному формулой (I):
2
A-CH-B  (I)
или его соли, или его гидрату. В настоящем описании соединение, представленное формулой (I), может быть отнесено к «производному адреномедуллина».
[0023] В изобретении адреномедуллин (АМ) может представлять не только пептид, полученный от человека и выделенный и идентифицированный из феохромоцитомы человека (SEQ ID NO: 1, непатентный документ 1), но также пептид, полученный от других млекопитающих, отличных от человека (таких как теплокровные животные), который является ортологом, включая, например, свинью (SEQ ID NO: 3), собаку (SEQ ID NO: 5), крупный рогатый скот (SEQ ID NO: 7), крысу (SEQ ID NO: 9) или мышь (SEQ ID NO: 11). В живом организме каждый из этих пептидов содержит дисульфидную связь, образованную двумя остатками цистеина, в аминокислотной последовательности и амидирован на его С-конце. В настоящем описании пептид, содержащий дисульфидную связь и С-концевую амидную группу, может быть отнесен к «природному адреномедуллину» или просто «адреномедуллину». Изобретение может быть применено к любому из пептидов, описанных выше.
[0024] В настоящем описании «С-концевое амидирование» означает аспект посттрансляционной модификации пептида в живом организме и, в частности, означает реакцию, в которой основная цепь карбоксильной группы С-концевого аминокислотного остатка пептида превращается в амидную группу. В настоящем описании «образование дисульфидной связи между остатками цистеина» или «образование дисульфидной связи остатками цистеина» означает аспект посттрансляционной модификации пептида в живом организме и, в частности, означает реакцию, в которой два цистеиновых остатка в аминокислотной последовательности пептида образуют дисульфидную связь (-SS-). Многие биологически активные пептиды, продуцируемые в живом организме, первоначально биологически синтезируются в виде белка-предшественника с более высокой молекулярной массой. Белок-предшественник подвергается посттрансляционным модификациям, таким как C-концевое амидирование и/или образование дисульфидной связи остатками цистеина, во время процесса внутриклеточного транспорта, с образованием зрелого биологически активного пептида. С-концевое амидирование обычно протекает при участии амидирующего фермента C-концевой аминокислоты, который функционирует на белке-предшественнике. Для биологически активного пептида, имеющего C-концевую амидную группу, белок-предшественник имеет остаток Gly, связанный с C-концевой карбоксильной группой, подлежащей амидированию, и остаток Gly превращается в C-концевую амидную группу при участии амидирующего фермента C-концевой аминокислоты. С-концевой пропептид в белке-предшественнике имеет повторяющуюся последовательность, включающую комбинацию основных аминокислотных остатков, таких как Lys-Arg или Arg-Arg (Mizuno, Journal of Japan Biochemical Society, 61 (12): 1435-1461 (1989))). Образование дисульфидной связи остатками цистеина может протекать в окислительных условиях. Образование дисульфидной связи остатками цистеина в живом организме обычно протекает при участии протеиндисульфидизомеразы, которая функционирует на белке-предшественнике.
[0025] Адреномедуллин, известное биологически активное соединение, представляет собой пептид. Данное обстоятельство может привести к тому, что лекарственное средство, содержащее адреномедуллин в качестве активного ингредиента, будет эффективно функционировать в живом организме субъекта (такого как пациент-человек) только в течение очень короткого времени. Следовательно, предпринимались попытки пролонгировать период полураспада в живом организме и улучшить фармакокинетику с помощью форм производных адреномедуллина, в которых другие группы, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), связаны с адреномедуллином (патентные документы 4-6 и непатентный документ 10). Однако в случае связывания относительно большой группы, такой как группа ПЭГ, с относительно небольшим пептидом, таким как адреномедуллин, различные свойства полученного производного адреномедуллина могут существенно варьироваться в зависимости от молекулярной массы группы ПЭГ. Когда адреномедуллин и другие группы связаны через связь, такую как амидная связь или сложноэфирная связь, которые могут расщепляться в биологической реакции, то связь может расщепиться в течение относительно короткого периода времени после введения производного. В случае связывания других групп с боковой цепью аминокислотного остатка адреномедуллина, конформация фрагмента адреномедуллина может измениться таким образом, что аффинность к АМ-рецептору, распознающему адреномедуллин, снижается. В этом случае фармакологические эффекты, присущие адреномедуллину, могут быть снижены у полученного производного адреномедуллина.
[0026] Адреномедуллин оказывает сильное сосудорасширяющее действие. Данный сильный сосудорасширяющий эффект может вызвать нежелательные побочные реакции (такие как чрезмерное снижение кровяного давления, тахикардия, связанная с повышенной рефлекторной активностью симпатической нервной системы, и/или повышенная активность ренина), когда терапевтически эффективное количество адреномедуллина или его производного вводят в однократной дозе. Возникновение таких побочных реакций может стать проблемой, когда используется адреномедуллин или его производное, в частности, в предположении того, что будут проявляться фармакологические эффекты, иные чем сосудорасширяющий эффект. Для того, чтобы избежать возникновения проблем, описанных выше, лекарственное средство, содержащее адреномедуллин или его производное в качестве активного ингредиента, необходимо вводить их субъектам длительной внутривенной инфузией. Такой способ введения может заставить субъектов испытывать чрезмерную нагрузку.
[0027] Заявители настоящего изобретения обнаружили, что связывание N-концевой α-аминогруппы адреномедуллина с группой ПЭГ с определенной молекулярной массой через метиленовую группу или уретановую группу может пролонгировать период полураспада в крови полученного производного адреномедуллина по сравнению с адреномедуллином, одновременно сохраняя биологическую активность адреномедуллина. Заявители настоящего изобретения также обнаружили, что новые производные адреномедуллина, обладающие свойствами, описанными выше, способны существенно подавлять нежелательные побочные реакции, такие как чрезмерное снижение кровяного давления. Таким образом, соединение по изобретению, представленное формулой (I), может применяться в отношении состояния, заболевания и/или расстройства, которое можно профилактировать или лечить адреномедуллином, для стабильной профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства, одновременно подавляя нежелательные побочные реакции.
[0028] В формуле (I) необходимо, чтобы B представлял пептидный фрагмент, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы, с адреномедуллиновой активностью. В настоящем изобретении «пептидный фрагмент, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы с адреномедуллиновой активностью» означает одновалентную свободную группу со структурой, полученной из адреномедуллина или его модифицированной формы, с адреномедуллиновой активностью, удалением одного атома водорода (обычно одного атома водорода аминогруппы, обычно одного атома водорода N-концевой α-аминогруппы). В изобретении «модифицированная форма адреномедуллина» означает пептид, химически модифицированный из природного адреномедуллина, как описано выше. В изобретении «адреномедуллиновая активность» означает биологическую активность, которой обладает адреномедуллин. Активность адреномедуллина может включать следующее:
[0029] (1) Сердечно-сосудистая система: сосудорасширяющий эффект, эффект снижения кровяного давления, эффект подавления повышения кровяного давления, эффект увеличения сердечного выброса или снижение сердечной недостаточности, эффект ослабления легочной гипертензии, ангиогенный эффект, лимфангиогенный эффект, эффект улучшения функции эндотелия сосудов, антиартериосклеротический эффект, защитный эффект для миокарда (такой как защитный эффект для миокарда при ишемически- реперфузионном повреждении или воспалении), эффект предупреждения постинфарктного ремоделирования миокарда, эффект подавления гипертрофии сердца и эффект ингибирования ангиотензинпревращающего фермента.
(2) Почки и водно-электролитная система: диуретический эффект, натрийуретический эффект, эффект подавления антидиуретического гормона, альдостерон-снижающий эффект, ренопротективный эффект (такой как ренопротективный эффект при высоком кровяном давлении или ишемически-реперфузионном повреждении), эффект подавления питьевого поведения и эффект подавления потребности в соли.
(3) Мозг и нервная система: эффект нейропротекции и профилактики энцефалопатии, противовоспалительный эффект, эффект подавления апоптоза (например, эффект подавления апоптоза при ишемически-реперфузионном повреждении или воспалении), эффект поддержания ауторегуляторной функции, эффект подавления окислительного стресса, эффект ослабления деменции и симпатоингибирующий эффект.
(4) Мочеполовая система: эффект улучшения эрекции, эффект улучшения кровотока и эффект, способствующий имплантации.
(5) Желудочно-кишечная система: противоязвенный эффект, эффект восстановления ткани, эффект неогенеза слизистой оболочки, эффект улучшения кровотока, противовоспалительный эффект и эффект улучшения функции печени.
(6) Ортопедия: эффект стимуляции остеобластов и эффект ослабления артрита.
(7) Эндокринная метаболическая система: эффект дифференцировки адипоцитов, эффект регуляции липолиза, эффект повышения чувствительности к инсулину, эффект контроля секреции инсулина, эффект подавления секреции антидиуретического гормона и эффект подавления секреции альдостерона.
(8) Другие эффекты: эффект улучшения кровообращения, противовоспалительный эффект, эффект модуляции выработки цитокинов, органозащитный эффект, эффект подавления окислительного стресса, эффект восстановления ткани (такой как антабусный эффект), эффект ослабления септического шока, эффект подавления множественной системной органной недостаточности, эффект подавления аутоиммунного заболевания, антимикробный эффект, эффект стимуляции роста волос и эффект от выпадения волос и облысения.
[0030] Эффект снижения кровяного давления предпочтительно является сосудорасширяющим гипотензивным эффектом. Противовоспалительный эффект в желудочно-кишечной системе предпочтительно представляет эффект профилактики или лечения воспалительных заболеваний кишечника, включая стероид-рефрактерное или стероид-зависимое воспалительное заболевание кишечника (такое как язвенный колит, болезнь Крона или кишечная форма болезни Бехчета). Адреномедуллиновая активность будет проявляться через повышенную внутриклеточную концентрацию цАМФ. Таким образом, повышенная внутриклеточная концентрация цАМФ может рассматриваться в качестве показателя активности адреномедуллина. Пептидный фрагмент B, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы, обладающий биологической активностью, как описано выше, позволяет соединению по изобретению, представленному формулой (I), проявлять биологическую активность, по существу, эквивалентную активности природного адреномедуллина (т.е. активности адреномедуллина).
[0031] Адреномедуллин или его модифицированная форма с адреномедуллиновой активностью предпочтительно представляют пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(i) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности адреномедуллина,
(ii) пептида, который состоит из аминокислотной последовательности адреномедуллина и имеет дисульфидную связь, образованную двумя остатками цистеина, в аминокислотной последовательности,
(iii) пептида (ii), в котором дисульфидная связь пептида замещена этиленовой группой, и пептид обладает адреномедуллиновой активностью,
(iv) любого пептида (i)-(iii), где пептид имеет аминокислотную последовательность, содержащую делецию, замену или добавление от одной до пятнадцати аминокислот, и обладает адреномедуллиновой активностью,
(v) любого пептида (i)-(iv), где пептид амидирован на его С-конце, и
(vi) любого пептида (i)-(iv), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
[0032] В одном варианте осуществления адреномедуллин или его модифицированная форма с адреномедуллиновой активностью более предпочтительно представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(i) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности адреномедуллина,
(ii) пептида, который состоит из аминокислотной последовательности адреномедуллина и имеет дисульфидную связь, образованную двумя остатками цистеина, в аминокислотной последовательности,
(v) пептида (i) или (ii), где пептид амидирован на его С-конце, и
(vi) пептида (i) или (ii), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
[0033] В еще одном варианте осуществления адреномедуллин или его модифицированная форма с адреномедуллиновой активностью более предпочтительно представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(iv') любого пептида (i)-(iii), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-10 или положениях 1-5 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью,
(v) пептида (iv'), где пептид амидирован на его С-конце, и
(vi) пептида (iv'), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
[0034] В пептидах (i)-(vi) и (iv'), пептид, входящий в группу (v), который состоит из аминокислотной последовательности адреномедуллина, амидирован на его С-конце и имеет дисульфидную связь, образованную двумя остатками цистеина, в аминокислотной последовательности, представляет собой зрелый природный адреномедуллин. Пептид (i), состоящий из аминокислотной последовательности адреномедуллина, представляет собой форму (т.е. незрелую форму) природного адреномедуллина до посттрансляционной модификации, включая C-концевое амидирование и образование дисульфидных связей остатками цистеина. Другие пептиды, помимо пептидов, описанных выше в группах пептидов (i)-(vi) и (iv'), представляют собой модифицированные формы адреномедуллина.
[0035] Пептид (ii) может быть получен окислением тиольных групп двух цистеиновых остатков в пептиде (i) на воздухе или подходящим окислительным агентом с образованием дисульфидной связи. Пептид (ii) можно использовать для установления конформации пептидного фрагмента В, сходной конформации природного адреномедуллина. Такая сходная конформация может привести к проявлению адреномедуллиновой активности соединения, представленного формулой (I), по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина.
[0036] Пептид (iii) может быть получен превращением дисульфидной связи в пептиде (ii) в этиленовую группу. Замена дисульфидной связи на этиленовую группу может быть осуществлена любым способом, хорошо известным в данной области (O. Keller et al., Helv. Chim. Acta, 1974, Volume 57, p. 1253). Пептид (iii) можно использовать для стабилизации конформации пептидного фрагмента B. Стабилизированная конформация позволяет соединению, представленному формулой (I), стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме.
[0037] В пептиде (iv) количество аминокислотных остатков, делецированных, замещенных или добавленных, предпочтительно находится в пределах от 1 до 15, более предпочтительно от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 8, особенно предпочтительно от 1 до 5, и наиболее предпочтительно от 1 до 3 из его N-конца Подходящим пептидом (iv) является любой пептид (i)-(iii), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-12, положениях 1-10, положениях 1-8, положениях 1-5 или положениях 1-3 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью. Более подходящим пептидом (iv) является любой пептид (i)-(iii), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-10 или положениях 1-5 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью (пептид (iv')). Подходящий пептид может иметь дополнительную делецию, замену или добавление одного или более (например, 1-5, 1-3 или 1 или 2) аминокислотных остатков. Пептид (iv) или (iv') можно использовать для достижения адреномедуллиновой активности соединения, представленного формулой (I), по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Кроме того, пептид (iv) или (iv') можно использовать для стабильного проявления адреномедуллиновой активности соединения, представленного формулой (I), в живом организме.
[0038] Пептид (vi) или (iv') может быть превращен в пептид (v) при участии амидирующего фермента C-концевой аминокислоты, который может превращать остаток глицина на С-конце пептида (vi) или (iv') в амидную группу. Следовательно, пептид (vi) или (iv') можно вводить субъекту с образованием пептида, амидированного на его С-конце, в живом организме субъекта через определенный период времени. Таким образом, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме.
[0039] Адреномедуллин или его модифицированная форма более предпочтительно представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(а) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(b) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(c) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(d) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(e) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(f) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(g) любого пептида (a)-(f), где дисульфидная связь пептида замещена этиленовой группой, и пептид обладает адреномедуллиновой активностью;
(h) любого пептида (a)-(g), где пептид имеет аминокислотную последовательность, содержащую делецию, замену или добавление от одной до пятнадцати аминокислот, и обладающего адреномедуллиновой активностью;
(i) любого пептида (а)-(h), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) любого пептида (a)-(h), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
[0040] В одном варианте осуществления адреномедуллин или его модифицированная форма более предпочтительно представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(а) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(b) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(c) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(d) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(e) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(f) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(i) любого пептида (а)-(f), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) любого пептида (a)-(f), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
[0041] В еще одном варианте осуществления адреномедуллин или его модифицированная форма более предпочтительно представляет пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(h') любого пептида (a)-(d), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-10 или положениях 1-5 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью, или пептида (е) или (f), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-13, положениях 1-8 или положениях 1-5 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью;
(i) пептида (h'), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) пептида (h'), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
[0042] В пептиде (h) количество аминокислотных остатков, делецированных, замещенных или добавленных, предпочтительно составляет 1-12, более предпочтительно 1-10, более предпочтительно 1-8, особенно предпочтительно 1-5, и наиболее предпочтительно 1-3. Подходящим пептидом (h) является любой пептид (a)-(g), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-12, положениях 1-10, положениях 1-8, положениях 1-5 или положениях 1-3 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью. Более подходящим пептидом (h) является любой пептид (a)-(d), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-10 или положениях 1-5 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью, или пептид (е) или (f), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-13, положениях 1-8 или положениях 1-5 из его N-конца и обладает адреномедуллиновой активностью (пептид (h')). Подходящий пептид может иметь дополнительную делецию, замену или добавление одной или более (например, 1-5, 1-3 или 1 или 2) аминокислот. Пептид (h) или (h') можно использовать для достижения адреномедуллиновой активности соединения, представленного формулой (I), по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Кроме того, пептид (h) или (h') может быть использован для стабильного проявления адреномедуллиновой активности соединения, представленного формулой (I), в живом организме.
[0043] В формуле (I) необходимо, чтобы А представляла модифицирующую группу, содержащую одну или более групп ПЭГ. Аспект модифицирующей группы А, содержащей одну или более групп ПЭГ, особым образом не ограничивается. Например, одна или более групп ПЭГ могут располагаться в концевом участке модифицирующей группы А или могут располагаться внутри модифицирующей группы А. Также модифицирующая группа А может представлять собой различные группы, известные в данной области, такие как линейные или разветвленные группы, содержащие группу ПЭГ. Известные группы, которые можно использовать в качестве модифицирующей группы А, могут включать, не ограничиваясь этим, например, группы, раскрытые в международных заявках WO 995992, WO2006/084089, WO 98/41562, WO2005/079838, WO2002/060978, WO2001/048052, WO 98/005500, WO1996/01469, WO2003/040211 и публикация непрошедшей экспертизу заявки на патент Японии № 04-108827 A (1992). При использовании группы, содержащей одну или более групп ПЭГ в качестве модифицирующей группы А, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять адреномедуллиновую активность в живом организме.
[0044] А предпочтительно представляет модифицирующую группу, представленную следующей формулой (II):
где
a представляет целое число 1 или более,
m представляет целое число 1 или более,
1
1
1
L представляет m+1-валентную линейную или разветвленную связывающую группу, где, когда присутствует множество L, то множество L являются одинаковыми или отличными друг от друга,
2
2'
2'
2'
L и Lкаждыйнезависимо представляет связь или двухвалентную связывающую группу, где, когда присутствует множество L, то множество Lявляются одинаковыми или отличными друг от друга,
1
1
1
M представляет группу ПЭГ, когда присутствует множество M, то множество Mявляются одинаковыми или отличными друг от друга,
2
2
2
M представляет связь или группу ПЭГ где, когда присутствует множество M, то множество M являются одинаковыми или отличными друг от друга,
1
R представляет атом водорода или одновалентную группу, и
* является положением связывания с другими группами.
1
1
1
1
[0046] m представляет число разветвлений связывающей группы L. Например, когда m равно 1, то L является двухвалентной связывающей группой и представляет собой группу, не разветвленную к концевым направлениям, т.е. линейную группу. Когда m равно 2 или более, то L представляет трехвалентную связывающую группу или связывающую группу с более высокой валентностью, и представляет собой группу, имеющую два или более разветвлений к концевых направлениям. m обычно представляет целое число 1 или более и 5 или менее, и предпочтительно составляет от 1 до 5, более предпочтительно от 1 до 4 и еще более предпочтительно от 1 до 3. Когда число m разветвлений связывающей группы L попадает в вышеописанные диапазоны, то модифицирующая группа А, содержащая группы ПЭГ, может иметь линейную или разветвленную структуру.
1
2
1
2'
1
2
1
2'
[0047] а представляет число повторов звена, содержащего ПЭГ-группы M и M, и связывающие группы L и L. Например, когда a равно 1, то звено не имеет повторяющейся структуры. Когда a равно 2 или более, и m равно 1, то звено имеет линейную повторяющуюся структуру. Когда a равно 2 или более, и m равно 2 или более, то звено имеет разветвленную повторяющуюся структуру. a обычно представляет собой целое число 1 или более, и 5 или менее, и предпочтительно находится в пределах от 1 до 5 и более предпочтительно от 1 до 2. Когда число а повторов звена, содержащего ПЭГ-группы М и М, и связывающие группы L и L попадает в диапазоны, описанные выше, то модифицирующая группа А, содержащая ПЭГ-группы, может иметь линейную или разветвленную структуру.
1
2
[0048] Группа ПЭГ, представленная M или M, обычно представляет собой группу, представленную формулой (III):
2
2
n
**
#-(CHCHO)-  (III)
1
2'
В формуле (III) ** является положением связывания с L, и # представляет положение связывания с O или L. Средневесовая молекулярная масса группы ПЭГ, представленной формулой (III), обычно в общем составляет 1 кДа или выше, предпочтительно 5 кДа или выше, более предпочтительно 10 кДа или выше, и более предпочтительно 20 кДа или выше, и обычно составляет 2000 кДа или ниже, предпочтительно 1000 кДа или ниже, более предпочтительно 100 кДа или меньше, еще более предпочтительно 80 кДа или ниже и наиболее предпочтительно 60 кДа или ниже, в модифицирующей группе А. Группа ПЭГ, представленная формулой (III), как правило, в общем имеет средневесовую молекулярную массу от 1 до 2000 кДа, например, от 1 до 1000 кДа, и предпочтительно имеет средневесовую молекулярную массу от 1 до 100 кДа, более предпочтительно от 5 до 80 кДа, еще более предпочтительно от 10 до 60 кДа, и особенно предпочтительно от 20 до 60 кДа, в модифицирующей группе А. Когда общая средневесовая молекулярная масса группы ПЭГ, представленной формулой (III), в модифицирующей группе А, попадает в дипазоны, описанные выше, то соединение, представленное формулой (I), может обладать адреномедуллиновой активностью, по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Кроме того, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять адреномедуллиновую активность в живом организме при существенном подавлении нежелательных побочных реакций.
[0049] В формуле (III) n представляет число повторов этиленоксидного звена, определенное на основе средневесовой молекулярной массы. n, определенное на основе предпочтительных диапазонов средневесовой молекулярной массы, обычно представляет целое число примерно 20 или выше, предпочтительно примерно 110 или выше, более предпочтительно примерно 230 или выше и, более предпочтительно, примерно 460 или выше и, как правило, целое число примерно 45000 или ниже, предпочтительно примерно 22000 или ниже, более предпочтительно примерно 2200 или ниже, еще более предпочтительно примерно 1820 или ниже, и особенно предпочтительно примерно 1360 или ниже. n, определенное на основе предпочтительных диапазонов средневесовой молекулярной массы, обычно составляет примерно от 20 до 45000, например, примерно от 20 до 22000 и предпочтительно находятся в диапазоне примерно от 1 до 2200, более предпочтительно примерно от 110 до 1820, более предпочтительно от примерно 230 до 1360 и особенно предпочтительно примерно от 460 до 1360. Когда число n повторов попадает в диапазоны, описанные выше, то общая средневесовая молекулярная масса групп ПЭГ, содержащихся в модифицирующей группе, представленной формулой (II), попадает в пределы, описанные выше. Следовательно, когда число n повторов попадает в пределы, описанные выше, то соединение, представленное формулой (I), может обладать адреномедуллиновой активностью, по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Кроме того, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме при существенном подавлении нежелательных побочных реакций.
1
1
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
1
20
2
20
2
20
1
5
2
5
2
5
3
6
3
6
3
6
1
5
1
5
2
5
2
5
3
6
3
6
3
6
1
5
[0050] R предпочтительно представляет атом водорода, замещенный или незамещенный C-Cалкил, замещенный или незамещенный C-C алкенил, замещенный или незамещенный C-C алкинил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинил, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкил, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкил, замещенный или незамещенный C-C арил, замещенный или незамещенный C-C арилалкил, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкил или замещенный или незамещенный ацил, более предпочтительно атом водорода, замещенный или незамещенный C-C алкил, замещенный или незамещенный C-C алкенил, или замещенный или незамещенный C-C алкинил, еще более предпочтительно атом водорода, метил, этил, пропил, бутил, пентил или гексил и особенно предпочтительно метил. Заместители для замещенных групп каждый независимо предпочтительно представляет одновалентную группу, выбранную из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или йода), циано, нитро, замещенного или незамещенного C-C алкила, замещенного или незамещенного C-C алкенила, замещенного или незамещенного C-C алкинила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкенила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкинила, замещенного или незамещенного амино и замещенного или незамещенного C-C алкокси, и более предпочтительно одновалентную группу, выбранную из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или иода), циано, нитро, незамещенного C-C алкила, незамещенного C-C алкенила, незамещенного C-C алкинила, незамещенного C-C циклоалкила, незамещенного C-C циклоалкенила, незамещенного C-C циклоалкинила, незамещенного амино и незамещенного C-C алкокси. Когда R представляет указанные группы, то соединение, представленное формулой (I), может обладать адреномедуллиновой активностью, по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Кроме того, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме при существенном подавлении нежелательных побочных реакций.
1
1
[0051] L представляет m+1-валентную линейную или разветвленную связывающую группу. L предпочтительно представляет замещенную или незамещенную m+1-валентную линейную или разветвленную углеводородную группу. Группа необязательно содержит один или более гетероатомов, алициклическую группу, ароматическую группу, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-). Заместители для замещенных групп каждый независимо предпочтительно представляет одновалентную группу, выбранную из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или йода), циано, нитро и замещенной или незамещенной линейной или разветвленной углеводородной группы.
2
2'
2
2'
2
2'
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
1
5
2
5
2
5
3
6
3
6
3
6
1
5
[0052] L и L каждый независимо представляет связь или двухвалентную связывающую группу. Когда каждый из L и Lявляется двухвалентной связывающей группой, то L и L каждый независимо, предпочтительно представляет замещенную или незамещенную двухвалентную углеводородную группу, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-), и более предпочтительно замещенный или незамещенный C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C алкенилен, замещенный или незамещенный C-C алкинилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C арилен, замещенный или незамещенный C-C арилалкилен, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарилен, или замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкилен, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH). Группы необязательно содержат один или более гетероатомов, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-). Заместители для замещенных групп каждый независимо предпочтительно представляет одновалентную группу, выбранную из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или йода), циано, нитро и замещенной или незамещенной линейной или разветвленной углеводородной группы, и более предпочтительно одновалентной группы, выбранной из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или йода), циано, нитро, незамещенного C-C алкила, незамещенного C-C алкенила, незамещенного C-C алкинила, незамещенного C-C циклоалкила, незамещенного C-C циклоалкенила, незамещенного C-C циклоалкинила, незамещенного амино и незамещенного C-C алкокси.
1
2
2'
[0053] Когда L, L и L являются указанными группами, то соединение, представленное формулой (I), может обладать адреномедуллиновой активностью, по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Кроме того, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме при существенном подавлении нежелательных побочных реакций.
[0054] Подходящая модифицирующая группа А представляет модифицирующую группу, представленную следующими формулами (V), (VI), (VII) или (VIII):
[0055] В формулах (V), (VI), (VII) или (VIII),
a представляет целое число 1 или более,
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
3
3'
3'
3'ʺ
3ʺʺ
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
M, M, M, M и M каждый независимо представляет связь или группу ПЭГ, где, когда присутствует множество M, M, M, M или M, то множество M, M, M, M или M являются одинаковыми или отличными друг от друга, и, по меньшей мере, один из M, M, M, M или M представляет группу ПЭГ,
1
1'
1ʺ
1'ʺ
R, R, Rи R каждый независимо представляет атом водорода или одновалентную группу,
2
R представляет связь или двухвалентную группу,
3
3'
3ʺ
3
3'
3ʺ
3
3'
3ʺ
R, Rи Rкаждый независимо представляет связь или двухвалентную связь, где, когда присутствует множество R, Rи R, то множество R, Rи R являются одинаковыми или отличными друг от друга, и
* является положением связывания с другими группами.
3
3'
3ʺ
3'ʺ
ʺʺ
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
[0056] а представляет число повторов звена, содержащего ПЭГ-группы M, M, M, M или M. Например, когда a равно 1, то звено не имеет повторяющейся структуры. Когда а в формуле (V) равно 2 или более, то звено имеет линейную повторяющуюся структуру. Когда в формулах (VI), (VII) и (VIII) a равно 2 или более, то звено имеет разветвленную повторяющуюся структуру. a обычно представляет собой целое число 1 или выше и 5 или ниже, и предпочтительно находится в пределах от 1 до 5 и более предпочтительно от 1 до 2. Когда число а повторов звена, содержащего ПЭГ-группы M, M, M, M или M,попадает в диапазоны, описанные выше, то модифицирующая группа А, содержащая группы ПЭГ, может иметь линейную или разветвленную структуру.
3
3'
3ʺ
3'ʺ
3ʺʺ
[0057] Когда каждый из M, M, M, M или M является группой ПЭГ, то группа ПЭГ обычно представляет группу, представленную формулой (III). Группа ПЭГ, представленная формулой (III), представляет группу, имеющую значения, определенные выше. В этом случае соединение, представленное формулой (I), может иметь адреномедуллиновую активность, по существу примерно эквивалентную активности природного адреномедуллина. Кроме того, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме при существенном подавлении нежелательных побочных реакций.
1
1'
1ʺ
1'ʺ
1
[0058] R имеет значения, определенные выше. R, R и R имеют значения, определенные для R. В этом случае соединение, представленное формулой (I), может обладать адреномедуллиновой активностью, по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Кроме того, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме при существенном подавлении нежелательных побочных реакций.
2
2
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
1
5
2
5
2
5
3
6
3
6
3
6
1
5
1
5
2
5
2
5
3
6
3
6
3
6
1
5
1
10
[0059] R представляет связь, замещенную или незамещенную двухвалентную углеводородную группу, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-), и более предпочтительно связь, замещенный или незамещенный C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C алкенилен, замещенный или незамещенный C-C алкинилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C арилен, замещенный или незамещенный C-C арилалкилен, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарилен, или замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкилен, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-). Двухвалентная углеводородная группа необязательно содержит один или более гетероатомов, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-). Заместители для замещенных групп каждый независимо предпочтительно представляет одновалентную группу, выбранную из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или йода), циано, нитро, замещенного или незамещенного C-C алкила, замещенного или незамещенного C-C алкенила, замещенного или незамещенного C-C алкинила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкенила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкинила, замещенного или незамещенного амино и замещенного или незамещенного C-C алкокси, и более предпочтительно одновалентную группу, выбранную из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или иода), циано, нитро, незамещенного C-C алкила, незамещенного C-C алкенила, незамещенного C-C алкинила, незамещенного C-C циклоалкила, незамещенного C-C циклоалкенила, незамещенного C-C циклоалкинила, незамещенного амино и незамещенного C-C алкокси. R предпочтительно представляет связь или замещенную или незамещенную C-C алкиленовую группу, более предпочтительно связь, метилен, этилен, пропилен или бутилен и, более предпочтительно связь или этилен.
3
3'
3'ʺ
3
3'
3'ʺ
1
20
2
20
2
20
3
20
4
20
4
20
7
20
1
20
4
20
5
20
1
20
1
5
2
5
2
5
3
6
3
6
3
6
1
5
1
5
2
5
2
5
3
6
3
6
3
6
1
5
1
10
1
10
2
4
2
2
3
[0060] R, Rи Rкаждый независимо представляет связь, замещенную или незамещенную двухвалентную углеводородную группу, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-), и более предпочтительно связь, замещенный или незамещенный C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C алкенилен, замещенный или незамещенный C-C алкинилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкенилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкинилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкилен, замещенный или незамещенный C-C циклоалкилалкилен, замещенный или незамещенный 3-6-членный гетероциклоалкил-C-C алкилен, замещенный или незамещенный C-C арилен, замещенный или незамещенный C-C арилалкилен, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарилен, замещенный или незамещенный 5-15-членный гетероарил-C-C алкилен, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-). Двухвалентная углеводороднвя группа необязательно содержит один или более гетероатомов, амидную группу (-CO-NH-), сложноэфирную группу (-CO-O-) или уретановую группу (-O-CO-NH-). Заместители для замещенных групп каждый независимо предпочтительно представляет одновалентную группу, выбранную из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или йода), циано, нитро, замещенного или незамещенного C-C алкила, замещенного или незамещенного C-C алкенила, замещенного или незамещенного C-C алкинила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкенила, замещенного или незамещенного C-C циклоалкинила, замещенного или незамещенного амино и замещенного или незамещенного C-C алкокси, и более предпочтительно одновалентную группу, выбранную из группы, состоящей из атома галогена (фтора, хлора, брома или иода), циано, нитро, незамещенного C-C алкила, незамещенного C-C алкенила, незамещенного C-C алкинила, незамещенного C-C циклоалкила, незамещенного C-C циклоалкенила, незамещенного C-C циклоалкинила, незамещенного амино и незамещенного C-C алкокси. R, Rи Rкаждый независимо предпочтительно представляет связь, замещенную или незамещенную C-C алкиленовую группу, замещенную или незамещенную C-C алкиленовую группу, содержащую амидную группу, или амидную группу (-CO-NH-), более предпочтительно связь, метилен, этилен, -CO-NH-(CH)-, -CH-O-CO-NH-(CH)- или -CO-NH-.
3
3'
3'ʺ
[0061] Когда каждый из R, Rи Rпредставляет указанные группы, тосоединение, представленное формулой (I), может обладать адреномедуллиновой активностью, по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Кроме того, соединение, представленное формулой (I), может стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме при существенном подавлении нежелательных побочных реакций.
[0062] Особенно подходящая модифицирующая группа А представляет собой модифицирующую группу, представленную следующими формулами (V-1-1), (VI-1-1), (VII-1-1), (VII-1-2), (VII-2-1) или (VIII-1-1):
где
n имеет значения, определенные выше,
'
n имеет значения, определенные выше для n, и
* является положением связывания с другими группами.
[0063] В формуле (V-1-1) группа ПЭГ в общем предпочтительно имеет средневесовую молекулярную массу 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа, 30 кДа, 40 кДа, 60 кДа или 80 кДа.
[0064] В формуле (VI-1-1) группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 40 кДа.
[0065] В формуле (VII-1-1) группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа, 30 кДа, 40 кДа, 60 кДа или 80 кДа.
2
2
n
2
2
n
[0066] В формуле (VII-1-2) группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 50 кДа. В этом случае, как правило, этиленоксидное звено (CHCHO) в общем имеет средневесовую молекулярную массу 40 кДа, и этиленоксидное звено (CHCHO)' в общем имеет средневесовую молекулярную массу 10 кДа.
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
[0067] В формуле (VII-2-1) группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 40 кДа. В этом случае, как правило, этиленоксидное звено (CHCHO) в общем имеет средневесовую молекулярную массу 30 кДа, и этиленоксидное звено (CHCHO)' в общем имеет средневесовую молекулярную массу 10 кДа. Альтернативно, группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 60 кДа. В этом случае, как правило, этиленоксидное звено (CHCHO) в общем имеет средневесовую молекулярную массу 50 кДа, и этиленоксидное звено (CHCHO)' в общем имеет средневесовую молекулярную массу 10 кДа. Альтернативно, группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 80 кДа. В этом случае, как правило, этиленоксидное звено (CHCHO) в общем имеет средневесовую молекулярную массу 70 кДа, и этиленоксидное звено (CHCHO)' в общем имеет средневесовую молекулярную массу 10 кДа.
[0068] В формуле (VIII-1-1) группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 40 кДа.
[0069] При использовании указанных групп в качестве модифицирующей группы А, соединение, представленное формулой (I), может обладать адреномедуллиновой активностью, по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина.
[0070] В формуле (I) необходимо, чтобы пептидный фрагмент В был связан с другими группами посредством ковалентной связи атома азота N-концевой α-аминогруппы пептидного фрагмента В с атомом углерода метиленовой группы. В изобретении соединение, в котором модифицирующая группа А, содержащая одну или более групп ПЭГ, и пептидный фрагмент В, связаны способом связывания, описанным выше, может быть отнесено к «производному адреномедуллина с алкиламиновым типом связи». Производное адреномедуллина с алкиламиновым типом связи обладает более высокой адреномедуллиновой активностью по сравнению с производным адреномедуллина, в котором адреномедуллин связан с другими группами через амидную связь атома азота N-концевой α-аминогруппы адреномедуллина (далее также относится к «производному адреномедуллина с амидным типом связи»), как и с производным адреномедуллина, описанным в непатентном документе 10. Кроме того, производное адреномедуллина с алкиламиновым типом связи по изобретению, представленное формулой (I), в большей степени подавляет нежелательные побочные реакции (такие как чрезмерное снижение кровяного давления, тахикардия, связанная с повышенной рефлекторной активностью симпатической нервной системы и/или повышенная активность ренина) по сравнению с производным адреномедуллина с амидным типом связи. Следовательно, соединение по изобретению, представленное формулой (I), может стабильно проявлять активность адреномедуллина в живом организме при более сильном подавлении нежелательных побочных реакций по сравнению с известными производными адреномедуллина.
[0071] В особенно подходящем соединении, представленном формулой (I),
А представляет модифицирующую группу, содержащую группы ПЭГ, представленную следующими формулами (V-1-1), (VI-1-1), (VII-1-1), (VII-1-2), (VII-2 -1) или (VIII-1-1), и
В представляет пептидный фрагмент, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы с адреномедуллиновой активностью, где адреномедуллин или его модифицированная форма представляют пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(а) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(b) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(c) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(d) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(e) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(f) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(i) любого пептида (а)-(f), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) любого пептида (a)-(f), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу, или пептида, выбранного из группы, состоящей из:
(h') любого пептида (a)-(d), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-10 или положениях 1-5 из его N-конца, и обладает адреномедуллиновой активностью, или пептида (е) или (f), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-13, положениях 1-8 или положениях 1-5 из его N-конца, и обладает адреномедуллиновой активностью;
(i) пептида (h'), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) пептида (h'), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
Соединение, представленное формулой (I), обладающее свойствами, описанными выше, может существенно подавлять нежелательные побочные реакции и стабильно проявлять адреномедуллиновую активность в живом организме, одновременно сохраняя фармакологические эффекты природного адреномедуллина.
[0072] Еще один аспект изобретения относится к соединению, представленному формулой (X):
A'-CO-B (X)
или его соли, или его гидрату. В настоящем описании соединение, представленное формулой (X), может быть отнесено к «производному адреномедуллина c уретановым типом связи».
[0073] В формуле (X) необходимо, чтобы B представлял пептидный фрагмент, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы, с адреномедуллиновой активностью. Пептидный фрагмент В имеет значения, определенные выше для соединения, представленного формулой (I).
[0074] Необходимо, чтобы А' представляла модифицирующую группу, содержащую одну или более групп ПЭГ. Однако необходимо, чтобы А' была связана с другими группами посредством ковалентной связи между атомом кислорода модифицирующей группы, содержащей группы ПЭГ, с атомом углерода карбонильной группы. Модифицирующая группа A', имеющая такую структуру, позволяет соединению, представленному формулой (X), иметь структуру, содержащую модифицирующую группу A' и пептидный фрагмент B, связанные через уретановую связь.
[0075] A' предпочтительно представляет модифицирующую группу, представленную следующими формулами (XI), (XI') или (XII):
1
1
R-O-M-*    (XI)
[0076] В формулах (XI), (XI') и (XII), * является положением связывания с другими группами.
1'
2
3
3'
3ʺ
1
3
3'
3ʺ
[0077] В формулах (XI), (XI') и (XII), a, R1, R, R, R, R, R, M, M, M и M имеют значения, определенные выше для соединения, представленного формулой (I).
[0078] Особенно подходящая модифицирующая группа A' представляет собой модифицирующую группу, представленную следующими формулами (XI-1-1), (XII-1-1) или (XII-2-1):
3
2
2
n
CHO-CHCHO)-*  (XI-1-1)
где n имеет значения, определенные выше,
n' имеет значения, определенные выше для n, и
* является положением связывания с другими группами.
[0079] В формуле (XI-1-1) группа ПЭГ в общем предпочтительно имеет средневесовую молекулярную массу 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа, 30 кДа, 40 кДа, 60 кДа или 80 кДа.
[0080] В формуле (XII-1-1) группа ПЭГ в общем предпочтительно имеет средневесовую молекулярную массу 5 кДа, 10 кДа, 20 кДа, 30 кДа, 40 кДа, 60 кДа или 80 кДа.
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
2
2
n
[0081] В формуле (XII-2-1) группа ПЭГ в общем предпочтительно имеет средневесовую молекулярную массу 40 кДа. В этом случае, как правило, этиленоксидное звено (CHCHO) в общем имеет средневесовую молекулярную массу 30 кДа, или этиленоксидное звено (CHCHO)' в общем имеет средневесовую молекулярную массу 10 кДа. Альтернативно, группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 60 кДа. В этом случае, как правило, этиленоксидное звено (CHCHO) в общем имеет средневесовую молекулярную массу 50 кДа, и этиленоксидное звено (CHCHO)' в общем имеет средневесовую молекулярную массу 10 кДа. Альтернативно группы ПЭГ в общем предпочтительно имеют средневесовую молекулярную массу 80 кДа. В этом случае, как правило, этиленоксидное звено (CHCHO) в общем имеет средневесовую молекулярную массу 70 кДа, и этиленоксидное звено (CHCHO)' в общем имеет средневесовую молекулярную массу 10 кДа.
[0082] При использовании указанных групп в качестве модифицирующей группы A' соединение, представленное формулой (X), может стабильно проявлять адреномедуллиновую активность в живом организме при сохранении фармакологических эффектов природного адреномедуллина.
[0083] В формуле (X) необходимо, чтобы пептидный фрагмент В был связан с другими группами посредством ковалентной связи между атомом азота N-концевой α-аминогруппы пептидного фрагмента В и атомом углерода карбонильной группы. Производное адреномедуллина с уретановым типом связи обладает более высокой адреномедуллиновой активностью по сравнению с производным адреномедуллина с амидным типом связи, описанным в непатентном документе 10. Следовательно, соединение по изобретению, представленное формулой (X), может стабильно проявлять более высокую адреномедуллиновую активность в живом организме по сравнению с известными производными адреномедуллина.
[0084] В особенно подходящем соединении, представленном формулой (X),
А' представляет модифицирующую группу, содержащую группы ПЭГ, представленные следующими формулами (XI-1-1), (XII-1-1) или (XII-1-1), и
В представляет пептидный фрагмент, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы с адреномедуллиновой активностью, где адреномедуллин или его модифицированная форма представляют пептид, выбранный из группы, состоящей из:
(а) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(b) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(c) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(d) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 16 и 21;
(e) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(f) пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11, или пептида, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 и имеющего дисульфидную связь, образованную остатками цистеина в положениях 14 и 19;
(i) любого пептида (а)-(f), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) любого пептида (a)-(f), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу, или пептида, выбранного из группы, состоящей из:
(h') любого пептида (a)-(d), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-15, положениях 1-10 или положениях 1-5 из его N-конца, и обладает адреномедуллиновой активностью, или пептида (е) или (f), где пептид имеет делецию аминокислотных остатков в положениях 1-13, положениях 1-8 или положениях 1-5 из его N-конца, и обладает адреномедуллиновой активностью;
(i) пептида (h'), где пептид амидирован на его С-конце; и
(j) пептида (h'), где пептид имеет остаток глицина, добавленный к его С-концу.
Соединение, представленное формулой (X), обладающее свойствами, описанными выше, может стабильно проявлять более высокую адреномедуллиновую активность в живом организме по сравнению с известными производными адреномедуллина.
[0085] В изобретении соединения, представленные формулами (I) и (X), включают не только сами соединения, но и их соли. Когда соединения, представленные формулами (I) и (X), находятся в форме соли, то предпочтительно они являются фармацевтически приемлемыми солями. Противоионы в солях соединений по изобретению предпочтительно включают, не ограничиваясь этим, катионы, такие как натрий, калий, кальций, магний или замещенный или незамещенный ион аммония, или анионы, такие как хлорид, бромид, иодид, фосфат, нитрат, сульфат, карбонат, бикарбонат, перхлорат, формиат, ацетат, трифторацетат, пропионат, лактат, малеат, гидроксималеат, метилмалеат, фумарат, адипат, бензоат, 2-ацетоксибензоат, п-аминобензоат, никотинат, циннамат, аскорбат, памоат, сукцинат, салицилат, бисметиленсалицилат, оксалат, тартрат, малат, цитрат, глюконат, аспартат, стеарат, пальмитат, итаконат, гликолят, глутамат, бензолсульфонат, циклогексилсульфамат, метансульфонат, этансульфонат, изетионат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат или нафталинсульфонат. Когда соединения, представленные формулами (I) и (X), находятся в форме соли с любым из противоионов, то адреномедуллиновая активность соединений может быть по существу быть примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина.
[0086] Соединения, представленные формулами (I) и (X), включают не только сами соединения, но также сольваты соединений или их солей. Когда соединения, представленные формулами (I) и (X), или их соли, находятся в форме сольвата, то они предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми сольватами. Растворители, которые могут образовывать сольваты с соединениями или их солями, включают, не ограничиваясь этим, например, воду или органические растворители, такие как метанол, этанол, 2-пропанол (изопропиловый спирт), диметилсульфоксид (ДМСО), уксусную кислоту, этаноламин, ацетонитрил или этилацетат. Когда соединения, представленные формулами (I) и (X), или их соли, находятся в форме сольвата с любым из растворителей, описанных выше, то адреномедуллиновая активность соединений может быть по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина.
[0087] Соединения, представленные формулами (I) и (X), включают не только сами соединения, описанные выше или ниже, но также и их защищенные формы. В настоящем описании «защищенная форма» означает форму, в которой любая подходящая защитная группа вводится в одну или более функциональных групп (таких как аминогруппа боковой цепи лизинового остатка) соединения. В настоящем описании «защитная группа» означает группу, которая вводится в определенную функциональную группу для предотвращения любой нежелательной реакции, и она будет количественно удалена в определенных условиях реакции, и является по существу стабильной или неактивной при любых условиях реакции за исключением специфических условий реакции. Защитные группы, которые могут образовывать защищенные формы соединений, включают, не ограничиваясь этим, например, трет-бутоксикарбонил (Boc), 2-бромбензилоксикарбонил (BrZ), 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc), п-толуолсульфонил (Tos), бензил (Bzl), 4-метилбензил (4-MeBzl), 2-хлорбензилоксикарбонил (ClZ), циклогексил (cHex) и фенацил (Pac); другие защитные группы для аминогрупп включают бензилоксикарбонил, п-хлорбензилоксикарбонил, п-бромбензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, п-метоксибензилоксикарбонил, бензгидрилоксикарбонил, 2-(п-бифенил)изопропилоксикарбонил, 2- (3,5-диметоксифенил)изопропилоксикарбонил, п-фенилазобензилоксикарбонил, трифенилфосфоноэтилоксикарбонил, 9-флуоренилметилоксикарбонил, трет-амилоксикарбонил, диизопропилметилоксикарбонил, изопропилоксикарбонил, этилоксикарбонил, аллилоксикарбонил, 2-метилсульфонилэтилоксикарбонил, 2,2,2-трихлорэтилоксикарбонил, циклопентилоксикарбонил, циклогексилоксикарбонил, адамантилоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил, бензолсульфонил, мезитиленсульфонил, метокситриметилфенилсульфонил, 2-нитробензолсульфонил, 2-нитробензолсульфенил, 4-нитробензолсульфонил и 4-нитробензолсульфенил; другие защитные группы для карбоксильных групп включают метиловые эфиры, этиловые эфиры, трет-бутиловые эфиры, п-метоксибензиловые эфиры и п-нитробензиловые эфиры; другие защитные группы для боковой цепи Arg включают 2,2,4,6,7-пентаметил-2,3-дигидробензофуран-5-сульфонил, 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил, 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил и 2-метоксибензолсульфонил; другие защитные группы для Tyr включают 2,6-дихлорбензил, трет-бутил и циклогексил; другие защитные группы для Cys включают 4-метоксибензил, трет-бутил, тритил, ацетамидометил и 3-нитро-2-пиридинсульфенил; другие защитные группы для His включают бензилоксиметил, п-метоксибензилоксиметил, трет-бутоксиметил, тритил и 2,4-динитрофенил; и другие защитные группы для Ser и Thr включают трет-бутил. Когда соединение, представленное формулами (I) и (X), находится в защищенной форме с любой из защитных групп, описанных выше, то адреномедуллиновая активность соединений может быть по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина.
[0088] Соединения, представленные формулами (I) и (X), включают индивидуальные энантиомеры и диастереомеры соединений, и смеси стереоизомерных форм соединений, такие как рацематы.
[0089] Соединение, представленное формулами (I) и (X), обладающее свойствами, описанными выше, может существенно подавлять нежелательные побочные реакции и стабильно проявлять адреномедуллиновую активность в живом организме при сохранении фармакологических эффектов природного адреномедуллина.
[0090]
2. Фармацевтическое применение производных адреномедуллина
Соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), может стабильно проявлять биологическую активность, по существу примерно эквивалентную таковой адреномедуллина, который является исходной молекулой для соединения (т. е. активности адреномедуллина) в живом организме. Следовательно, изобретение относится к лекарственному средству, содержащему соединение по изобретению, представленное формулами (I) или (X), или его фармацевтически приемлемую соль, или его фармацевтически приемлемый гидрат, в качестве активного ингредиента.
[0091] Соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), может использоваться самостоятельно или в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми компонентами, когда соединение используется для фармацевтического применения. Лекарственное средство по изобретению можно формулировать в виде различных лекарственных форм, обычно используемых в данной области, в зависимости от требуемого способа введения. Таким образом, лекарственное средство по изобретению может также быть представлено в форме фармацевтической композиции, содержащей соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), и одним или более фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтические композиции по изобретению могут содержать в дополнение к компонентам, описанным выше, один или более фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов, связующих веществ, растворителей, средств, способствующих растворению, консервантов, стабилизаторов, объемообразующих агентов, смазывающих веществ, поверхностно-активных веществ, масляных жидкостей, буферных агентов, смягчающих агентов, антиоксидантов, подслащивающих агентов, ароматизирующих агентов и так далее.
[0092] Дозированные формы лекарственных средств, содержащие соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), в качестве активного ингредиента, особым образом не ограничиваются и могут представлять композицию для парентерального или перорального введения. Дозированные формы лекарственных средств по изобретению также могут представлять композицию в одной разовой форме или в виде нескольких лекарственных форм. Композиции для применения при парентеральном введении включают, например, инъекционные препараты, такие как стерильные растворы или суспензии в воде или любой другой фармацевтически приемлемой жидкости. Дополнительные агенты, которые могут быть примешаны к инъекционным препаратам, включают, не ограничиваясь этим, например, растворители, такие как физиологический раствор и изотонические растворы, содержащие глюкозу или другие фармацевтические добавки (такие как D-сорбит, D-маннит или хлорид натрия); средства, способствующие растворению, такие как спирты (такие как этанол или бензиловый спирт), сложные эфиры (такие как бензилбензоат) и полиспирты (такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полисорбат 80 или полиоксиэтиленгидрированное касторовое масло; масляные жидкости, такие как кунжутное масло или соевое масло; буферные агенты, такие как фосфатный буфер или натрий-ацетатный буфер; смягчающие агенты, такие как хлорид бензалкония или гидрохлорид прокаина; стабилизаторы, такие как человеческий сывороточный альбумин или полиэтиленгликоль; консерванты; и антиоксиданты. Приготовленным инъекционным раствором обычно заполняют любой подходящий флакон (например, ампулу) и хранят в подходящей среде до применения.
[0093] Препараты для применения при пероральном введении включают, например, таблетку, необязательно покрытую сахарной оболочкой или растворимой пленкой, капсулу, эликсир, микрокапсулу, таблетку, сироп и суспензию. Дополнительные агенты, которые могут быть примешаны к таблеткам или капсулам, и т. д., включают, не ограничиваясь этим, например, связующие агенты, такие как желатин, кукурузный крахмал, трагакант и гуммиарабик; эксципиенты, такие как кристаллическая целлюлоза; объемообразующие агенты, такие как кукурузный крахмал, желатин и альгинат; смазывающие вещества, такие как стеарат магния; подслащивающие агенты, такие как сахароза, лактоза или сахарин; и ароматизирующие агенты, такие как перечная мята, эфирное масло гаультерии или вишня. Препарат может дополнительно включать жидкие носители, такие как масла/жиры, когда композиция находится в форме капсулы.
[0094] Соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), может стабильно проявлять адреномедуллиновую активность, по существу примерно эквивалентную активности адреномедуллина, который является исходной молекулой для соединения, в живом организме. Таким образом, лекарственное средство, содержащее соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), в качестве активного ингредиента, можно формулировать в виде депо-композиции. В этом случае лекарственное средство по изобретению в лекарственной форме депо-композиции может быть, например, имплантировано подкожно или внутримышечно, или вводиться внутримышечной инъекцией. Депо-композиция лекарственного средства по изобретению позволяет соединению по изобретению, представленному формулами (I) и (X), стабильно проявлять активность адреномедуллина в течение длительного периода времени.
[0095] Лекарственное средство, содержащее соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), в качестве активного ингредиента, может быть объединено с одним или более другими лекарственными средствами, пригодными в качестве лекарственных средств. В этом случае лекарственное средство по изобретению может быть представлено в виде одного лекарственного средства, содержащего соединение по изобретению, представленное формулой (I) или (X), или его фармацевтически приемлемую соль, или его фармацевтически приемлемый гидрат, и один или более других лекарственных препаратов, или может быть представлено в виде комбинации или набора лекарственных средств, включающих множество препаратов, где соединение по изобретению, представленное формулой (I) или (X), или его фармацевтически приемлемая соль, или его фармацевтически приемлемый гидрат, и один или более других лекарственных препаратов, формулируются по отдельности. Для комбинации или набора лекарственных средств каждая композиция может вводиться одновременно или отдельно (например, последовательно).
[0096] Для использования соединений по изобретению, представленных формулами (I) и (X), для фармацевтического применения, соединения, представленные формулами (I) и (X), включают не только сами соединения, но также их фармацевтически приемлемые соли и их фармацевтически приемлемые сольваты. Фармацевтически приемлемые соли соединений по изобретению, представленных формулами (I) и (X), и их фармацевтически приемлемые сольваты, предпочтительно включают, не ограничиваясь этим, например, соли или сольваты, приведенные в качестве примера выше. Когда соединения, представленные формулами (I) и (X), находятся в форме любой из солей или сольватов, описанных выше, то соединения могут использоваться для требуемого фармацевтического применения.
[0097] Лекарственное средство, содержащее соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), в качестве активного ингредиента, может профилактировать или лечить различные состояния, заболевания и/или расстройства, которые будут профилактироваться или лечиться адреномедуллином. Состояния, заболевания и/или расстройства включают, не ограничиваясь этим, например, следующие:
[0098] (1) Сердечно-сосудистые заболевания: сердечную недостаточность, легочную гипертензию, облитерирующий артериосклероз, болезнь Бюргера, инфаркт миокарда, лимфедему, болезнь Кавасаки, миокардит, высокое кровяное давление, дисфункции органов за счет высокого кровяного давления и артериосклероз.
(2) Расстройства почек и водно-электролитного баланса: почечную недостаточность и нефрит.
(3) Болезни головного мозга и нервной системы: церебральный инфаркт, деменцию и энцефалит.
(4) Урогенитальные заболевания: эректильную дисфункцию (ЭД).
(5) Желудочно-кишечные заболевания: воспалительное заболевание кишечника, язвенную болезнь, кишечную форму болезни Бехчета и печеночную недостаточность.
(6) Ортопедическое заболевание: артрит.
(7) Эндокринные метаболические заболевания: диабет и дисфункции органов, вызванные диабетом, и первичный альдостеронизм.
(8) Другие заболевания: септический шок, аутоиммунное заболевание, множественную органную недостаточность, пролежни, заживление ран и алопецию.
[0099] Сердечно-сосудистое заболевание предпочтительно представляет любое из инфаркта миокарда, легочной гипертензии и сердечной недостаточности. Желудочно-кишечное заболевание предпочтительно представляет любое из воспалительных заболеваний, включающих стероид-резистентное или стероид-зависимое воспалительное заболевание кишечника (такое как язвенный колит, болезнь Крона или кишечная форма болезни Бехчета).
[0100] Соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), имеет структуру, в которой адреномедуллин, являющийся природным биологически активным пептидом, связан с модифицирующей группой. Такая структура позволяет соединениям по изобретению, представленным формулами (I) и (X), быть безопасными и иметь низкую токсичность. Следовательно, лекарственное средство, содержащее соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), в качестве активного ингредиента, можно применять для различных субъектов, нуждающихся в профилактике или лечении состояния, заболевания и/или расстройства. Субъектами предпочтительно являются человек или млекопитающее, отличное от человека (например, теплокровное животное, включая свинью, собаку, крупный рогатый скот, крысу, мышь, морскую свинку, кролика, курицу, овцу, кошку, обезьяну, гамадрил или шимпанзе) субъектов или пациентов. Лекарственное средство по изобретению можно вводить субъектам для профилактики или лечения различных состояний, заболеваний и/или расстройств, которые будут профилактироваться или лечиться адреномедуллином.
[0101] В настоящем описании «профилактика» означает, что начало (развитие или возникновение) состояния, заболевания и/или расстройства будет по существу предупреждено. С другой стороны, в настоящем описании «лечение» означает подавление (например, подавление прогрессирования), ремиссию, восстановление и/или лечение состояния, заболевания и/или расстройства, которое уже появилось (развилось или имеет место).
[0102] Соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), можно использовать для профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства, описанного выше (например, сердечно-сосудистого заболевания, заболевания периферических сосудов или воспалительного заболевания) у субъектов с состоянием, заболеванием и/или расстройством. Следовательно, лекарственное средство по изобретению предпочтительно представляет лекарственное средство для применения в профилактике или лечении состояния, заболевания и/или расстройства, описанных выше, и более предпочтительно представляет лекарственное средство для применения в профилактике или лечении сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания периферических сосудов. Изобретение также относится к агенту для профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания, воспалительного заболевания или заболевания периферических сосудов, включающему соединение по изобретению, представленное формулой (I) или (X), или его фармацевтически приемлемую соль, или фармацевтически приемлемый гидрат, в качестве активного ингредиента. Соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), можно использовать для профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства, описанного выше, для стабильной профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства.
[0103] Соединения по изобретению, представленные формулами (I) и (X), можно использовать для профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства, описанного выше (например, сердечно-сосудистого заболевания, заболевания периферических сосудов или воспалительного заболевания) у субъектов с состоянием, заболеванием и/или расстройством. Следовательно, один вариант осуществления изобретения представляет способ профилактики или лечения заболевания или состояния, описанного выше, включающий введение эффективного количества соединения по изобретению, представленного формулами (I) и (X), или его фармацевтически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемого гидрата, субъекту, нуждающемуся в профилактике или лечении состояния, заболевания и/или расстройства, описанного выше. Состояние, заболевание и/или расстройство предпочтительно представляет любое из сердечно-сосудистых заболеваний, заболеваний периферических сосудов и воспалительных заболеваний. Соединения по изобретению, представленные формулами (I) и (X), могут вводиться субъектам, нуждающимся в профилактике или лечении состояния, заболевания и/или расстройства, для профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства.
[0104] Еще один вариант осуществления изобретения представляет соединение по изобретению, представленное формулой (I) или (X), или его фармацевтически приемлемую соль, или его фармацевтически приемлемый гидрат, для применения в профилактике или лечении состояния, заболевания и/или расстройства, описанного выше. Альтернативным вариантом осуществления изобретения является применение соединения по изобретению, представленного формулой (I) или (X), или его фармацевтически приемлемой соли, или его фармацевтически приемлемого гидрата, для производства лекарственного средства для профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства, описанного выше. Состояние, заболевание и/или расстройство предпочтительно представляет любое из сердечно-сосудистых заболеваний, воспалительных заболеваний и заболеваний периферических сосудов. Лекарственное средство по изобретению можно использовать для профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства, описанного выше, для стабильной профилактики или лечения состояния, заболевания и/или расстройства.
[0105] Когда лекарственное средство, содержащее соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), в качестве активного ингредиента, вводится субъекту, в частности, пациенту-человеку, то точная доза и количество доз будут определяться с учетом многих факторов, включая возраст и пол субъекта, точный статус (такой как тяжесть) состояния, заболевания и/или расстройства, которое следует профилактировать или лечить, и путь введения. В конечном итоге лечащий врач должен определить терапевтически эффективную дозу и количество доз. Следовательно, соединение, представленное формулами (I) и (X), которое является активным ингредиентом в лекарственном средстве по изобретению, будет вводиться субъекту в терапевтически эффективной дозе и количестве доз. Например, когда лекарственное средство по изобретению вводится пациенту-человеку, то доза соединения, представленного формулами (I) и (X), которое является активным ингредиентом, обычно находится в диапазоне от 0,01 до 100 мг на 60 кг массы тела в день и обычно от 0,01 до 10 мг на 60 кг массы тела в день.
[0106] Путь введения и количество доз лекарственного средства, содержащего соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), в качестве активного ингредиента, особым образом не ограничивается, и лекарственное средство можно вводить перорально или парентерально в однократной дозе или в нескольких дозах. Лекарственное средство по изобретению предпочтительно вводят парентерально, например, внутривенно, путем инфузии в кишечник, подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно, и более предпочтительно внутривенно или подкожно. Лекарственное средство по изобретению также предпочтительно вводят в однократной дозе. Лекарственное средство по изобретению особенно предпочтительно используется при внутривенном или подкожном введении в однократной дозе. Адреномедуллин, который является исходной молекулой соединений по изобретению, представленных формулами (I) и (X), оказывает сильное сосудорасширяющее действие. Такой сильный сосудорасширяющий эффект может вызывать нежелательные побочные эффекты, такие как чрезмерное снижение кровяного давления, тахикардия, связанная с повышенной рефлекторной активностью симпатической нервной системы, и/или повышенная активность ренина, когда терапевтически эффективное количество адреномедуллина вводят в однократной дозе. С другой стороны, у соединений по изобретению, представленных формулами (I) и (X), может быть существенно пролонгирован период полураспада в крови по сравнению с природным адреномедуллином при сохранении адреномедуллиновой активности, по существу примерно эквивалентной активности природного адреномедуллина. Следовательно, внутривенное введение лекарственного средства, содержащего соединение по изобретению, представленное формулами (I) и (X), в качестве активного ингредиента, субъекту в однократной дозе, позволяет лекарственному средству стабильно профилактировать или лечить состояние, заболевание и/или расстройство у субъекта при подавлении нежелательных побочных реакций, возникающих в результате сосудорасширяющего эффекта адреномедуллина.
[0107]
3. Способ получения производных адреномедуллина
Изобретение также относится к способу получения соединения по изобретению, представленному формулами (I) и (X).
[0108]
3.1. Стадия получения предшественников
Способ по изобретению может включать получение, по меньшей мере, любого предшественника пептидного фрагмента В, полученного из адреномедуллина или его модифицированной формы, и предшественника модифицирующей группы А или А', содержащей одну или более полиэтиленгликолевых групп.
[0109] В изобретении «предшественник пептидного фрагмента В, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы» означает адреномедуллин или его модифицированную форму или означает производное пептидного фрагмента В, который был соответствующим образом модифицирован или активирован, так, чтобы пептидный фрагмент B и модифицирующая группа A или A' были связаны посредством реакций конденсации на стадии связывания, как описано ниже. Предшественником пептидного фрагмента В предпочтительно является адреномедуллин или его модифицированная форма, или его защищенная форма.
[0110] Предшественником модифицирующей группы А обычно является альдегид-предшественник модифицирующей группы А, содержащий одну или более групп полиэтиленгликоля, где альдегид-предшественник представлен формулой (I-1):
A-CHO (I-1)
Получение предшественников, обладающих свойствами, описанными выше, на этой стадии, позволяет обеспечить с высоким выходом образование соединения, представленного формулой (I), посредством реакций связывания каждого предшественника на стадии связывания, описанной ниже.
[0111] Предшественником модифицирующей группы A' обычно является п-нитрофенилкарбонатный эфир-предшественник модифицирующей группы A', содержащий одну или более групп полиэтиленгликоля, где п-нитрофенилкарбонатный эфир-предшественник представлен формулой (X-1):
6
4
2
A'-CO-O-CH-p-NO  (X-1)
Альтернативно, предшественник модифицирующей группы A' может представлять N-гидроксисукцинимидилкарбонатный эфир-предшественник модифицирующей группы A', содержащий одну или более групп полиэтиленгликоля, где N-гидроксисукцинимидилкарбонатный эфир-предшественник представлен формулой (Х-2):
4
4
2
A'-CO-O-CHNO  (X-2)
Получение предшественников, обладающих свойствами, описанными выше на этой стадии, позволяет обеспечить с высоким выходом образование соединения, представленного формулой (X), посредством реакций связывания каждого предшественника на стадии связывания, описанной ниже.
[0112] На данной стадии предшественник пептидного фрагмента В, полученный из адреномедуллина или его модифицированной формы, может быть получен любым способом, обычно используемым в данной области. Способ может представлять, например, метод пептидного синтеза в твердофазной системе или в жидкофазной системе, или способ выделения природных пептидов из тканей или клеток человека или других млекопитающих, отличных от человека, которые могут продуцировать адреномедуллин, когда предшественником пептидного фрагмента B является адреномедуллин или его модифицированная форма. Альтернативно, способ может представлять способ сверхэкспрессии рекомбинантного белка с использованием ДНК, кодирующей адреномедуллин у человека или млекопитающего, отличного от человека, которые могут продуцировать адреномедуллин (такой как с последовательностями SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 или 12), в системе трансформации, такой как Escherichia coli или Saccharomyces cerevisiae. В качестве альтернативы также можно приобрести уже синтезированные пептиды. Любой случай включается в вариант осуществления данной стадии.
[0113] Предшественник, который имеет дисульфидную связь, образованную двумя остатками цистеина, в аминокислотной последовательности в предшественнике пептидного фрагмента В, полученного вышеописанными способами, можно получить путем образования дисульфидной связи между тиольными группами двух цистеиновых остатков в аминокислотной последовательности. Предшественник, в котором дисульфидная связь, образованная между двумя остатками цистеина, в аминокислотной последовательности предшественника пептидного фрагмента В, полученного вышеописанным способом, была замещена этиленовой группой, можно получить путем замещения дисульфидной связи этиленовой группой. Реакцию образования дисульфидной связи и реакцию замещения этиленовой группой можно проводить на основе любых условий, обычно используемых в данной области. Реакцию образования дисульфидной связи и реакцию замещения этиленовой группой можно выполнить на данной стадии или на стадии связывания, описанной ниже. Любой случай включается в вариант осуществления стадии.
[0114] Когда, по меньшей мере, любой из предшественников пептидного фрагмента В и предшественник модифицирующей группы А или A' находятся в защищенной форме, то стадию защиты, на которой одну или более защитных групп вводят, по меньшей мере, в любой из предшественников пептидного фрагмента В и предшественник модифицирующей группы А или A', и/или стадию снятия защиты, на которой, снимают защиту, по меньшей мере, с любой из одной или более защитных групп в защищенных формах предшественника пептидного фрагмента В и предшественник модифицирующей группы А или A', можно выполнить на данной стадии по желанию. Стадии защиты и снятия защиты могут быть выполнены любой реакцией защиты и снятия защиты, обычно используемой в данной области техники. Стадии защиты и снятия защиты могут быть выполнены на данной стадии или на стадии связывания, описанной ниже. Любой случай включается в вариант осуществления данной стадии.
[0115]
3-2. Стадия связывания
Способ по изобретению должен включать стадию связывания соединения предшественника пептидного фрагмента В, полученного из адреномедуллина или его модифицированной формы, и предшественника модифицирующей группы А или A' с получением соединения, представленного формулой (I) или (X).
3
4
[0116] Для получения соединения, представленного формулой (I), данная стадия обычно выполняется взаимодействием предшественника пептидного фрагмента В с альдегидом- предшественником, представленным формулой (I-1), модифицирующей группы А, содержащей одну или более групп ПЭГ, в присутствии восстанавливающего агента. Восстанавливающие агенты, которые можно использовать на данной стадии, могут включать, не ограничиваясь этим, цианоборгидрид натрия (NaCNBH), борогидрид натрия (NaBH), диметиламинборат, триметиламинборат, пиридинборат, пиридинборан, 2-пиколинборан и 3-пиколинборан. Температура реакции на данной стадии предпочтительно находится в пределах от -20°С до 50°С и выше, предпочтительно от 0°С до 15°С. Время реакции на данной стадии предпочтительно составляет от 5 мин до 100 ч.
[0117] Для получения соединения, представленного формулой (X), данная стадия обычно проводится взаимодействием предшественника пептидного фрагмента B с п-нитрофенилкарбонатным эфиром-предшественником или N-гидроксисукцинимидилкарбонатным эфиром-предшественником, представленным формулами (X-1) или (X-2), модифицирующей группы A', содержащей одну или более групп ПЭГ, в присутствии основания. Основания, которые можно использовать на данной стадии, могут включать, не ограничиваясь этим, триэтиламин, пиридин и диметиламинопиридин. Температура реакции на данной стадии предпочтительно составляет от 0°С до 50°С. Время реакции на данной стадии предпочтительно составляет от 5 мин до 200 ч.
Примеры
[0118] Далее настоящее изобретение будет описано дополнительно со ссылкой на примеры. Однако технический объем настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.
[0119]
Эксперимент I: получение полноразмерного производного адреномедуллина
Эксперимент I-1: синтез полноразмерного производного адреномедуллина
3
2
5
Эксперимент I-1-1: синтез CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (1))
16
21
2
3
3
2
2
n
2
5
3
2
5
Согласно способу, описанному в известной литературной ссылке (Kubo, K et al., «Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol», Peptides, 2014, vol. 57, p. 118-21), группу полиэтиленгликоля со средневесовой молекулярной массой 5 кДа (далее также относится к «ПЭГ (5k)») связывали посредством амидной связи с N-концевой аминогруппой формы с дисульфидным мостиком Cys-Cys пептида, имеющего аминокислоту последовательность H-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH (далее также относится к «h.AM (1-52)»), который представлял пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 1-52 человеческого адреномедуллина (SEQ ID NO: 1), с использованием реагента для CHO-ПЭГилирования типа активного N-гидроксисукцинимидного эфира (ПЭГ-1) (CHO-(CHCHO)-(CH)-CO-O-NHS) с молекулярной массой 5 кДа с получением производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) амидного типа (CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (1-52))) (1).
[0120]
3
2
5
Эксперимент I-1-2: синтез CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (2))
3
3
2
2
n
2
5
3
2
5
Аналогично тому, как описано в эксперименте I-1-1, группу полиэтиленгликоля со средневесовой молекулярной массой 20 кДа (далее также относится к «ПЭГ (20k)») связывали посредством амидной связи с N-концевой аминогруппой пептида h.AM (1-52) с использованием реагента для CHO-ПЭГилирования типа активного N-гидроксисукцинимидного эфира (ПЭГ-1) (CHO-(CHCHO)-(CH)-CO-O-NHS) с молекулярной массой 20 кДа с получением производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) амидного типа (CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (1-52))) (2).
[0121]
3
2
5
Эксперимент I-1-3: синтез CHO-ПЭГ (10k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (3))
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
2 мг пептида h.AM (1-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5), с получением 2 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 16 мг реагента для CHO-ПЭГилирования альдегидного типа (ПЭГ-2) (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 10 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч на колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (10 k) алкиламинного типа (СНО-ПЭГ(10k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (3) и непрореагировавший пептид h.AM (1-52) выделяли из элюированной фракции. Данную элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (L-2000; производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Superdex 200 HR 10/30 (GE Healthcare Japan Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 1,0 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (3).
3
2
2
2
Эксперимент I-1-4: синтез CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (4))
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
1 мг пептида h.AM (1-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5), с получением 2 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 32 мг реагента для CHO-ПЭГилирования альдегидного типа (ПЭГ-2) (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч на колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (20 k) алкиламинного типа (СНО-ПЭГ(20k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (4) и непрореагировавший пептид h.AM (1-52) выделяли из элюированной фракции. Данную элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (L-2000; производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Superdex 200 HR 10/30 (GE Healthcare Japan Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,3 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (4).
[0123]
3
2
2
2
Эксперимент I-1-5: синтез CHO-ПЭГ (30k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (5))
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
2 мг пептида h.AM (1-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5), с получением 2 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 30 мг реагента для CHO-ПЭГилирования альдегидного типа (ПЭГ-2) (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 30 кДа при охлаждении на льду. К этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч на колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (30 k) алкиламиннового типа (СНО-ПЭГ(30k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (5) и непрореагировавший пептид h.AM (1-52) выделяли из элюированной фракции. Данную элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (L-2000; производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Superdex 200 HR 10/30 (GE Healthcare Japan Corp.) (элюент: 100 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,8 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (5).
3
2
Эксперимент I-1-6: синтезGL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (20k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (6))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-5, за исключением того, что 45 мг реагента для CHO-ПЭГилирования альдегидного типа (ПЭГ-3) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа, представленного формулой (VII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (20 k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (20k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (6):
Препаративная ВЭЖХ давала 1,0 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (6).
[0125]
3
2
Эксперимент I-1-7: синтез GL-2-разветвленногоCHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (7))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-5, за исключением того, что 80 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-3) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (VII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40 k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (20k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (7):
Препаративная ВЭЖХ давала 1,2 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (7).
[0126]
3
2
Эксперимент I-1-8: получение GL-2-разветвленногоCHO-ПЭГ (60k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (8))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-4, за исключением того, что 40 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-3) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 60 кДа, представленного формулой (VII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ(60 k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (60k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (8):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,4 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (8).
3
2
Эксперимент I-1-9: синтез GL-2-разветвленногоCHO-ПЭГ (80k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (9))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-5, за исключением того, что 121 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-3) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 80 кДа, представленного формулой (VII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (80 k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (60k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (9):
Препаративная ВЭЖХ давала 1,1 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (9).
3
2
Эксперимент I-1-10: синтез Lys-2-разветвленногоCHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (10))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-4, за исключением того, что 42,9 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-4) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (VI-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40 k) алкиламинового типа, содержащего лизиновый остов (Lys-2-разветвленный CHO-ПЭГ(40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (10):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,4 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (10).
[0129]
3
2
Эксперимент I-1-11: синтез GL-4-разветвленногоCHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (11))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-3, за исключением того, что 93 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-5) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (VII-2-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 4-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40 k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-4-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (11):
Препаративная ВЭЖХ давала 1,1 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (11).
3
2
Эксперимент I-1-12: синтез Xyl-2-разветвленногоCHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (12))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-3, за исключением того, что 94 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-6) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (VIII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 4-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40 k) алкиламинового типа, содержащего ксилозный остов (Xyl-2-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (12):
Препаративная ВЭЖХ давала 1,0 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (12).
[0131]
3
2
Эксперимент I-1-13: синтез GL-3-разветвленногоCHO-ПЭГ (50k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (13))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-3, за исключением того, что 94 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-7) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 50 кДа, представленного формулой (VII-1-2'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 3-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (50 k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-3-разветвленный CHO-ПЭГ(50k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (13):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,9 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (13).
3
Эксперимент I-1-14: синтез CHO-ПЭГ (20k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (14))
16
21
2
Синтезировали форму с дисульфидным мостиком Cys-Cys пептида, имеющего аминокислотную последовательность Fmoc-Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH (далее также относится к «Fmoc-αNH-(h.AM (1-52))») с помощью пептидного синтеза с Fmoc-стратегией. 18 мг пептида Fmoc-αNH-(h.AM (1-52)) растворяли в 1,8 мл диметилсульфоксида (ДМСО). К этому раствору добавляли 9 мг трет-бутилсукцинимидилкарбоната и 6 мкл диизопропилэтиламина. Реакционный раствор перемешивали в течение 5 ч. К полученному реакционному раствору добавляли водный раствор уксусной кислоты. Затем этот раствор лиофилизировали. Остаток растворяли в 2 мл ДМСО. К полученному раствору добавляли 0,2 мл диэтиламина. Полученный раствор перемешивали в течение 70 мин. Реакционный раствор разбавляли добавлением водного раствора уксусной кислоты. Полученный раствор фракционировали с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением фракции, содержащей пептид h.AM (1-52). Эту фракцию лиофилизировали с получением 10 мг пептида h.AM (1-52), имеющего 4 лизиновых остатка, защищенных Boc-группами, в виде белого порошка.
3
3
2
2
n
6
4
2
3
3
2
4
[0133] 2 мг полученного пептида растворяли в 2 мл ДМСО. К этому раствору пептида добавляли 15 мг реагента для CHO-ПЭГилирования п-нитрофенилэфирного типа (ПЭГ-8) (CHO-(CHCHO)-СО-О-СН-п-NO) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли 6,5 мкл 0,1 М раствора триэтиламина в ДМСО. Реакционный раствор оставляли на 1 ч при охлаждении на льду. Затем реакционный раствор подогревали до комнатной температуры и оставляли на 24 ч. Затем температуру реакционного раствора повышали до 30°С и реакцию продолжали в течение 2 суток. Реакционный раствор лиофилизировали. К полученному остатку добавляли 1 мл трифторуксусной кислоты при охлаждении на льду. Смесь подогревали до комнатной температуры и оставляли на 2 ч. Затем трифторуксусную кислоту отгоняли при пониженном давлении из смеси с использованием испарителя. Полученный остаток растворяли добавлением 4 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Этот раствор наносили со скоростью 1 мл/ч на колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (1 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (20 кД) уретанового типа (СНО-ПЭГ(20k)-CO-αNH-(h.AM (1-52))) (14) и непрореагировавший пептид h.AM (1-52) выделяли из элюированной фракции. Элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы ВЭЖХ (L-2000, производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Tsk gel G2000SWxL (60 см, Tosoh Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 250 мкг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (14).
[0134]
3
2
2
2
Эксперимент I-1-15: синтез CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (35))
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-3, за исключением того, что 5 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 5 кДа вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 10 кДа, с получением производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (5 k) алкиламинного типа (CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (35). Препаративная ВЭЖХ давала 0,8 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (35).
[0135]
3
2
2
2
Эксперимент I-1-16: синтез CHO-ПЭГ (40k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (25))
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-3, за исключением того, что 40 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 40 кДа вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 10 кДа, с получением производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40 k) алкиламинного типа (CHO-ПЭГ (40k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (1-52))) (25). Препаративная ВЭЖХ давала 0,6 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (25).
[0136]
3
Эксперимент I-1-17: синтез GL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (20k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (26))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-14, за исключением того, что 25 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-9) п-нитрофенилэфирного типа со средневесовой молекулярной массой 20 кДа, представленного формулой (XII-1-1'):
3
3
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-8) п-нитрофенилэфирного типа со средневесовой молекулярной массой 20 кДа, с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (20 k) уретанового типа (CHO-ПЭГ (20k)-СО-αNH-(h.AM (1-52)) (26):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,2 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (26).
[137]
3
Эксперимент I-1-18: синтез GL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (40k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (27))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-14, за исключением того, что 35 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-9) п-нитрофенилэфирного типа со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (XII-1-1'):
3
3
2
2
n
6
4
2
3
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-8) п-нитрофенилэфирного типа (CHO-(CHCHO)-CO-O-CH-п-NO) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа, с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40k) уретанового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (27):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,2 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (27).
[0138]
3
Эксперимент I-1-19: синтез GL-4-разветвленного CHO-ПЭГ (40k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (соединение (28))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте I-1-14, за исключением того, что 40 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-10) п-нитрофенилэфирного типа со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (XII-2-1'):
3
3
2
2
n
6
4
2
3
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-8) п-нитрофенилэфирного типа (CHO-(CHCHO)-CO-O-CH-п-NO) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа, с получением 4-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40k) уретанового типа, содержащего глицериновый остов (GL-4-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CO-αNH-(h.AM (1-52)) (28):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,2 мг (на основе h.AM (1-52)) представляющего интерес соединения (28).
[0139]
Эксперимент I-2: структурный анализ полноразмерного производного адреномедуллина
Эксперимент I-2-1: идентификация положения связывания с группой ПЭГ масс-спектрометрией расщепленного пептида - (1)
10 мкг соединения (3) смешивали с 70% муравьиной кислотой и 600 мкг бромциана (BrCN) для доведения общего объема до 500 мкл. Эту смесь подвергали взаимодействию в течение ночи при комнатной температуре. По 1 мл каждого из хлороформа, метанола и 60% водного раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, наносили в указанном порядке на колонку Sep Pak (Waters Corp.) и колонку промывали. Затем колонку Sep Pak уравновешивали нанесением 1 мл ультрачистой воды. К реакционному раствору, обработанному бромцианом (500 мкл) в течение ночи, добавляли 4500 мкл ультрачистой воды с получением 5 мл разбавленного реакционного раствора. Разбавленный реакционный раствор наносили на колонку для адсорбции расщепленного пептида. Затем по 1 мл каждого из ультрачистой воды и 10% водного раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, наносили в колонку в указанном порядке и колонку промывали для удаления неадсорбированных веществ. Наконец, 1 мл 60% водного раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, наносили на колонку для элюирования расщепленного пептида с колонки.
+
[0140] Ацетонитрил отгоняли при пониженном давлении из элюированной фракции расщепленного пептида, полученного таким образом с колонки Sep Pak. Полученный остаток очищали и фракционировали с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) с использованием колонки с обращенной фазой (ODS-120A TSKgel, Tosoh Corp.). Элюирование в ОФ-ВЭЖХ проводили в линейном градиенте с изменением от 100% раствора А (10% водного раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты) до 100% раствора В (60% водный раствор ацетонитрила, содержащий 0,1% трифторуксусной кислоты) в течение более 60 мин. МС-спектр выделенного расщепленного пептида снимали с использованием масс-спектрометра (AXIMA-confidence, Shimadzu Corp.). В результате было подтверждено, что молекулярная масса расщепленного пептида совпадает с молекулярной массой пептида, соответствующего аминокислотным остаткам 6-52 человеческого адреномедуллина ((M+Na), вычислено: m/z 5385,935, найдено: m/z 5385,9986). Все остатки лизина (остатки 25, 36, 38 и 46 из N-конца), присутствующие в человеческом адреномедуллине, находятся в пределах аминокислотных остатков 6-52. Следовательно, на основании этих результатов было подтверждено, что группа ПЭГ в производном адреномедуллина со связью с ПЭГ (10k) алкиламинового типа (3) присоединена к N-концевой α-аминогруппе.
[0141]
Эксперимент I-2-1: идентификация положения связывания с группой ПЭГ масс-спектрометрией расщепленного пептида - (2)
10-40 мкг соединения (2) растворяли в 500 мкл раствора, содержащего 2,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 30% N,N-диметилформамида и 250 мМ Трис-HCl (pH 8,5), и раствор перемешивали и смешивали на смесителе типа вортекс и ультразвуком. К смеси добавляли 2,5 мг 1,4-дитиотреитола и подтверждали, что полученная смесь имеет рН 8,0 или выше. В смесь вводили газообразный азот с последующей обработкой ультразвуком в течение 5 мин. Эту смесь подвергали взаимодействию при 37°С в течение 2 ч. К реакционной смеси, подвергшейся таким образом взаимодействию, в темноте добавляли 6,25 мг моноиодоуксусной кислоты и смесь дополнительно подвергали взаимодействию при 25°С в течение 30 мин. Затем реакцию останавливали добавлением к реакционной смеси уксусной кислоты (конечная концентрация: 1 Н). По 1 мл каждого из хлороформа, метанола и 60% водного раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, наносили в указанном прядке на колонку Sep Pak (Waters Corp.) и колонку промывали. Затем колонку Sep Pak уравновешивали нанесением 1 мл 1 Н уксусной кислоты. Реакционный раствор, подвергшийся восстановительному алкилированию, наносили на колонку для адсорбции прореагировавшего пептида. Затем по 1 мл каждого из 1 Н уксусной кислоты и 10% водного раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, наносили на колонку и колонку промывали для удаления неадсорбированных веществ. Наконец, 1 мл 60% водного раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты, наносили на колонку для элюирования подвергшегося восстановительному алкилированию пептида с колонки.
[0142] Ацетонитрил отгоняли при пониженном давлении из элюированной фракции подвергшегося восстановительному алкилированию пептида, полученного таким образом с колонки Sep Pak. Полученный восстановительным алкилированием пептид смешивали с лизилэндопептидазой при массовом соотношении пептид:лизилэндопептидаза 20:1. К смеси добавляли 1 М Трис-HCl (рН 8,5) для доведения объема до 200 мкл и конечной концентрации Трис-HCl до 50 мМ. Эту смесь оставляли на ночь (16 ч или более) при 37°С. Полученный расщепленный пептид очищали и выделяли с помощью ОФ-ВЭЖХ с использованием колонки с обращенной фазой (ODS-120A TSKgel, Tosoh Corp.). Элюирование в ОФ-ВЭЖХ проводили в программе нанесения 100% раствора А (0,1% трифторуксусной кислоты) в течение 5 мин, затем нанесения элюента в условиях линейного градиента, включающих изменение от 100% раствора А до 50% раствора В (60% водного раствора ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусной кислоты) в течение 60 мин, и затем нанесением 100% раствора В в течение 15 мин. Реакции и препаративную ОФ-ВЭЖХ проводили согласно процедурам, описанным выше, с использованием химически синтезированного пептидного препарата h.AM (1-52) в качестве стандарта вместо соединения (2). На фиг. 1 представлена хроматограмма ОФ-ВЭЖХ расщепленного пептида. На фиг. 1А представлена хроматограмма ОФ-ВЭЖХ расщепленного пептида, полученного из пептида h.AM (1-52), и на фиг. 1B представлена хроматограмма ОФ-ВЭЖХ расщепленного пептида, полученного из соединения (2). Как показано на фиг. 1А, детектировали 4 основных пика со временем удерживания 28,08 мин (далее также относится к «пику (1)»), 36,97 мин (далее также относится к «пику (2)»), 54,53 мин (далее также относится к «пику (3)») и 67,52 мин (далее также относится к «пику (4)») на хроматограмме ОФ-ВЭЖХ расщепленного пептида, полученного из пептида h.AM (1-52). С другой стороны, как показано на фиг. 1В, детектировали 4 основных пика со временем удерживания 28,69 мин (далее также относится к «пику (5)»), 36,98 мин (далее также относится к «пику (6)»), 54,57 мин (далее также относится к «пику (7)») и 72,30 мин (далее также относится к «пику (8)») на хроматограмме ОФ-ВЭЖХ расщепленного пептида, полученного из соединения (2). По результатам сопоставления времени удерживания пики (1) и (5), пики (2) и (6), или пики (3) и (7) соответствуют одному и тому же пептидному фрагменту. Пики (4) и (8) отличаются по времени удерживания. Предполагается, что соединение пика (8) представляет соединение, имеющее ПЭГ-группу, присоединенную к пептидному фрагменту, соответствующему пику (4).
[0143] Реакции и препаративную ОФ-ВЭЖХ проводили согласно процедурам, описанным выше, с использованием соединений (7), (8) и (26). В результате были детектированы пики, имеющие время удерживания, соответствующее пикам (1), (2) и (3), как в случае использования соединения (2). Кроме того, был обнаружен пик, предположительно соответствующий соединению, имеющему группу ПЭГ, присоединенную к пептидному фрагменту, соответствующему пику (4), как в пике (8).
[0144] МС-спектр выделенного расщепленного пептида снимали с использованием масс-спектрометра (QSTAR Elite, AB Sciex Pte. Ltd). Адреномедуллин человека имеет 4 лизиновых остатка (остатки 25, 36, 38 и 46 из N-конца). Следовательно, расщепленный пептид, полученный с использованием лизилэндопептидазы, состоит из 5 пептидных фрагментов, в частности, пептидных фрагментов YRQSMNNFQGLRSFGCRFGTCTVQK (h.AM (1-25)), LAHQIYQFTAK (h.AM (26-36)), DK (h.AM (37-38)), DNVAPRSK (h.AM (39-46)) и ISPQGY (h.AM (47-52)) из N-конца. Согласно полученному МС-спектру, было подтверждено, что пики (1) и (5) соответствуют пептидному фрагменту h.AM (39-46), было подтверждено, что пики (2) и (6) соответствуют пептидному фрагменту h.AM (47-52), было подтверждено, что пики (3) и (7) соответствуют пептидному фрагменту h.AM (26-36), и было подтверждено, что пик (4) соответствует пептидному фрагменту h.AM (1-25). В результате снятия МС-спектра пептидного фрагмента, соответствующего пику (8), с использованием масс-спектрометра (autoflex II, Bruker Daltonics KK), было подтверждено, что соединение пика (8) является соединением, имеющим группу ПЭГ, присоединенную к N-концевому пептидному фрагменту пептида h.AM (1-52). Следовательно, на основе этих результатов было подтверждено, что все группы ПЭГ в соединениях (7), (8) и (26) присоединены к N-концевым α-аминогруппам.
[0145]
Эксперимент I-2-3: идентификация положения связывания с группой ПЭГ анализом аминокислотной последовательности
Соединения (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12) и (13) были подвергнуты анализу аминокислотной последовательности с использованием секвенатора белков (Procise 494 HT Protein Sequencing System, Applied Biosystems, Inc.). В результате аминокислота, соответствующая N-концевому аминокислотному остатку человеческого адреномедуллина, не была детектирована ни в одном из соединений. На основе этих результатов было подтверждено, что все группы ПЭГ в соединениях (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12) и (13) были присоединены к N-концевым α-аминогруппам.
[0146]
Эксперимент I-2-4: идентификация положения связывания с группой ПЭГ ионообменной ВЭЖХ
Пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 6-52 человеческого адреномедуллина, выделяли из пептида h.AM (1-52) ионообменной ВЭЖХ с использованием ионообменной колонки (CM-2SW, Tosoh Corp.). Элюирование в ионообменной ВЭЖХ проводили в линейном градиенте изменения от 80% раствора А (100 мМ ацетата натрия, рН 5,0) и 20% раствора В (100 мМ ацетата натрия, содержащего 1 М сульфат натрия, рН 7,0) до 20% раствора А и 80% раствора В в течение от 0 до 40 мин.
[0147] Ацетонитрил отгоняли при пониженном давлении из элюированной фракции расщепленного пептида соединения (3), полученного с колонки Sep Pak, в эксперименте I-2-1. Остаток анализировали с помощью ионообменной ВЭЖХ в условиях, описанных выше. В результате было подтверждено, что пик с тем же временем элюирования, что и пептид, соответствующий аминокислотным остаткам с 6 по 52 человеческого адреномедуллина, относится к соединению (3). Ацетонитрил отгоняли при пониженном давлении из элюированных фракций расщепленных пептидов соединений (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (25), (27), (28) и (35), полученных с использованием тех же процедур, что и в эксперименте I-2-1, с колонки Sep Pak. В результате анализа остатков ионообменной ВЭЖХ в условиях, описанных выше, было подтверждено, что их пики соответствуют пику соединения (3). Следовательно, на основе этих результатов было подтверждено, что все группы ПЭГ в соединениях (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (25), (27), (28) и (35) были присоединены к N-концевым α-аминогруппам.
[0148]
Эксперимент I-2-5: анализ молекулярной массы с использованием электрофореза SDS-PAGE
В соответствии с лабораторным руководством (Experimental Medicine, Suppl., «Handbook for Protein Experiments», Yodosha Co., Ltd., edited by Tadaomi Takenawa and Toshiki Ito), соединения (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (25), (26), (27), (28) и (35) (200 нг каждого), полученные в эксперименте I-1, разделяли электрофорезом SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля в градиенте концентрации от 10% до 20%. Результаты приведены на фиг. 2, 3 и 4. На фиг. 2 полоса 0 показывает стандарт молекулярной массы, полоса 1 показывает соединение (3), полоса 2 показывает соединение (4), полоса 3 показывает соединение (5), полоса 4 показывает соединение (6), полоса 5 показывает соединение (7), полоса 6 показывает соединение (8), полоса 7 показывает соединение (9), полоса 8 показывает соединение (10), полоса 9 показывает соединение (11), и полоса 10 показывает соединение (12). На фиг. 3 полоса 0 показывает стандарт молекулярной массы, полоса 1 показывает соединение (1), полоса 2 показывает соединение (2), полоса 3 показывает соединение (13), полоса 4 показывает соединение (14), полоса 5 показывает соединение (15), указанное ниже, полоса 6 показывает соединение (16), указанное ниже, и полоса 7 показывает соединение (17), указанное ниже. На фиг. 4 полоса 0 показывает стандарт молекулярной массы, полоса 1 показывает соединение (25), полоса 2 показывает соединение (26), полоса 3 показывает соединение (27), полоса 4 показывает соединение (28), полоса 5 показывает соединение (29), указанное ниже, полоса 6 показывает соединение (30), указанное ниже, полоса 7 показывает соединение (31), указанное ниже, полоса 8 показывает соединение (32), указанное ниже, полоса 9 показывает соединение (33), указанное ниже, полоса 10 показывает соединение (34), указанное ниже, полоса 11 показывает соединение (35), полоса 12 показывает соединение (36), указанное ниже, и полоса 13 показывает соединение (37), указанное ниже. Все используемые стандарты молекулярной массы представляли стандарты Precision Plus Protein (TM) Dual Xtra (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Как показано на фиг. 2, 3 и 4, было подтверждено, что каждое соединение имело необходимую молекулярную массу.
[0149]
Эксперимент I-2-6: подтверждение ассоциации гель-фильтрационной ВЭЖХ
Ассоциацию молекул производного адреномедуллина подтверждали с помощью гель-фильтрационной ВЭЖХ с использованием гель-фильтрационной колонки (Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Japan Corp.). Соединения (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (25), (27), (28) и (35) (50 мкг каждого), полученные в эксперименте I-1, наносили на колонку. Элюент (100 мМ ацетат натрия и 100 мМ сульфат натрия, рН 6,0) наносили на колонку со скоростью 0,75 мл/мин. На основе хроматограммы гель-фильтрационной ВЭЖХ каждое соединение показывало один пик, имеющий время удерживания, соответствующее молекулярной массе. На основе этих результатов было подтверждено, что каждая молекула производного адреномедуллина находилась в виде мономера, не будучи ассоциированной. Время удерживания каждого соединения на хроматограмме гель-фильтрационной ВЭЖХ показано в таблице 1.
Таблица 1
Производное адреномедуллина
Время удерживания (мин)
Соединение (3)
18,6
Соединение (4)
16,2
Соединение (5)
14,6
Соединение (6)
16,4
Соединение (7)
13,7
Соединение (8)
12,9
Соединение (9)
11,9
Соединение (10)
13,8
Соединение (11)
14,1
Соединение (12)
14,4
Соединение (13)
13,3
Соединение (25)
13,9
Соединение (27)
13,9
Соединение (28)
14,5
Соединение (35)
21,2
[0150]
Эксперимент II: получение производного адреномедуллина с делецированным N-концом
Эксперимент II-1: синтез производного адреномедуллина с делецированным N-концом
3
2
5
Эксперимент II-1-1: синтез CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (6-52)) (соединение (15))
16
21
2
3
3
2
2
n
2
5
3
2
5
Согласно способу, описанному в известной литературной ссылке (Kubo, K et al., «Biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol», Peptides, 2014, vol. 57, p. 118-21), группу полиэтиленгликоля со средневесовой молекулярной массой 5 кДа (ПЭГ (5k)) связывали посредством амидной связи с N-концевой аминогруппой формы с дисульфидным мостиком Cys-Cys пептида, имеющего аминокислотную последовательность H-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH (далее также относится к «h.AM (6-52)»), который представлял пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 6-52 человеческого адреномедуллина, с использованием реагента для CHO-ПЭГилирования типа активного N-гидроксисукцинимидного эфира (ПЭГ-1) (CHO-(CHCHO)-(CH)-CO-O-NHS) с молекулярной массой 5 кДа для синтеза производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) амидного типа (CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (6-52))) (15).
[0151]
3
2
5
Эксперимент II-1-2: синтез CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (11-52)) (соединение (16))
16
21
2
3
3
2
2
n
2
5
3
2
5
Аналогично тому, как описано в эксперименте II-1-1, группу полиэтиленгликоля со средневесовой молекулярной массой 5 кДа (ПЭГ (5k) связывали посредством амидной связи с N-концевой аминогруппой формы с дисульфидным мостиком Cys-Cys пептида, имеющего аминокислотную последовательность H-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH (далее также относится к «h.AM (11-52)»), который представлял пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 11-52 человеческого адреномедуллина, с использованием реагента для CHO-ПЭГилирования типа активного N-гидроксисукцинимидного эфира (ПЭГ-1) (CHO-(CHCHO)-(CH)-CO-O-NHS) с молекулярной массой 5 кДа для синтеза производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) амидного типа (CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (11-52))) (16).
[0152]
3
2
5
Эксперимент II-1-3: синтез CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (16-52)) (соединение (17))
16
21
2
3
3
2
2
n
2
5
3
2
5
Аналогично тому, как описано в эксперименте II-1-1, группу полиэтиленгликоля со средневесовой молекулярной массой 5 кДа (ПЭГ (5k)) связывали посредством амидной связи с N-концевой аминогруппой формы с дисульфидным мостиком Cys-Cys пептида, имеющего аминокислотную последовательность H-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH (далее также относится к «h.AM (16-52)»), который представляет пептид, соответствующий аминокислотным остаткам 16-52 человеческого адреномедуллина, с использованием реагента для CHO-ПЭГилирования типа активного N-гидроксисукцинимидного эфира (ПЭГ-1) (CHO-(CHCHO)-(CH)-CO-O-NHS) с молекулярной массой 5 кДа для синтеза производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) амидного типа (CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (16-52))) (17).
[0153]
3
2
5
Эксперимент II-1-4: синтез CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CO-αNH-(h.AM (6-52)) (соединение 18)
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
0,4 мг пептида h.AM (6-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5) с получением 0,5 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 2 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 5 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч в колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) алкиламинового типа (CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (6-52))) (18) и непрореагировавший пептид h.AM (6-52) выделяли из элюированной фракции. Элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы ВЭЖХ (L-2000, производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Tsk gel G2000SWxL (60 см, Tosoh Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,12 мг (на основе h.AM (6-52)) представляющего интерес соединения (18).
[0154]
3
2
2
2
Эксперимент II-1-5: синтез CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (11-52)) (соединение 19)
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
0,44 мг пептида h.AM (11-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5) с получением 0,5 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 2 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 5 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч на колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) алкиламинового типа (CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (11-52))) (19) и непрореагировавший пептид h.AM (11-52) выделяли из элюированной фракции. Элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы ВЭЖХ (L-2000, производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Tsk gel G2000SWxL (60 см, Tosoh Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,1 мг (на основе h.AM (6-52)) представляющего интерес соединения (19).
[0155]
3
2
2
2
Эксперимент II-1-6: синтез CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (16-52)) (соединение 20)
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
0,46 мг пептида h.AM (16-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5) с получением 0,5 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 3 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 5 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч в колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) алкиламинового типа (CHO-ПЭГ (5k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (16-52))) (20) и непрореагировавший пептид h.AM (16-52) выделяли из элюированной фракции. Элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы ВЭЖХ (L-2000, производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Tsk gel G2000SWxL (60 см, Tosoh Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,15 мг (на основе h.AM (16-52)) представляющего интерес соединения (20).
[0156]
3
2
2
2
Эксперимент II-1-7: синтез CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (6-52)) (соединение 21)
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
0,22 мг пептида h.AM (6-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5) с получением 0,2 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 4,1 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч на колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) алкиламинового типа (CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (6-52))) (21) и непрореагировавший пептид h.AM (6-52) выделяли из элюированной фракции. Данную элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы ВЭЖХ (L-2000, производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Tsk gel G2000SWxL (60 см, Tosoh Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,1 мг (на основе h.AM (6-52)) представляющего интерес соединения (21).
[0157]
3
2
2
2
Эксперимент II-1-8: синтез CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (11-52)) (соединение 22)
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
0,22 мг пептида h.AM (11-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5) с получением 0,2 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 4,6 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч в колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) алкиламинового типа (CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (11-52))) (22) и непрореагировавший пептид h.AM (11-52) выделяли из элюированной фракции. Элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы ВЭЖХ (L-2000, производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Tsk gel G2000SWxL (60 см, Tosoh Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,1 мг (на основе h.AM (11-52)) представляющего интерес соединения (22).
[0158]
3
2
2
2
Эксперимент II-1-9: синтез CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (16-52)) (соединение 23)
3
3
2
2
n
2
2
3
3
2
2
2
3
2
4
0,22 мг пептида h.AM (16-52) растворяли в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 5,5) с получением 0,2 мл раствора пептида. К этому раствору пептида добавляли 5,2 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) альдегидного типа (CHO-(CHCHO)-(CH)-CHO) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли NaCNBH с получением конечной концентрации 20 мМ. Реакционный раствор оставляли при 4°С на 24 ч. Полученный реакционный раствор разбавляли в 5 раз 50 мМ натрий-ацетатным буфером (рН 4,0). Разбавленный реакционный раствор наносили со скоростью 2 мл/ч в колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (2 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. Производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) алкиламинового типа (CHO-ПЭГ (20k)-(CH)-CH-αNH-(h.AM (16-52))) (23) и непрореагировавший пептид h.AM (16-52) выделяли из элюированной фракции. Элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы ВЭЖХ (L-2000, производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Tsk gel G2000SWxL (60 см, Tosoh Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,1 мг (на основе h.AM (16-52)) представляющего интерес соединения (23).
[0159]
3
2
Эксперимент II-1-10: синтезGL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (16-52)) (соединение (24))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте II-1-6, за исключением того, что 20 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-3) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (VII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40 k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (16-52))) (24):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,2 мг (на основе h.AM (16-52)) представляющего интерес соединения (24).
[0160]
3
2
Эксперимент II-1-11: синтезGL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (6-52)) (соединение (29))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте II-1-7, за исключением того, что 20 мг реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-3) альдегидного типа со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (VII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40 k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (6-52))) (29):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,15 мг (на основе h.AM (6-52)) представляющего интерес соединения (29).
[0161]
3
Эксперимент II-1-12: синтез GL-разветвленного CHO-ПЭГ (20k)-CO-αNH-(h.AM (6-52)) (соединение (30))
16
21
2
Синтезировали форму с дисульфидным мостиком Cys-Cys пептида, имеющего аминокислотную последовательность Fmoc-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH (далее также относится к «Fmoc-αNH-(h.AM (6-52))») с помощью пептидного синтеза с Fmoc-стратегией. 17 мг пептида Fmoc-αNH-(h.AM (6-52)) растворяли в 1,8 мл диметилсульфоксида (ДМСО). К этому раствору добавляли 9 мг трет-бутилсукцинимидилкарбоната и 6 мкл диизопропилэтиламина. Реакционный раствор перемешивали в течение 5 ч. К полученному реакционному раствору добавляли водный раствор уксусной кислоты. Затем этот раствор лиофилизировали. Остаток растворяли в 2 мл ДМСО. К полученному раствору добавляли 0,2 мл диэтиламина. Полученный раствор перемешивали в течение 70 мин. Реакционный раствор разбавляли добавлением водного раствора уксусной кислоты. Полученный раствор фракционировали с использованием обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением фракции, содержащей пептид h.AM (6-52). Эту фракцию лиофилизировали с получением 9 мг пептида h.AM (6-52), имеющего 4 лизиновых остатка, защищенных Boc-группами, в виде белого порошка.
3
[0162] 2 мг полученного пептида растворяли в 2 мл ДМСО. К этому раствору пептида 15 мг реагента для CHO-ПЭГилирования п-нитрофенилэфирного типа (ПЭГ-9) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа, представленного формулой (XII-1-1'):
3
добавляли при охлаждении на льду. Затем к этому раствору пептида добавляли 6,5 мкл 0,1 М раствора триэтиламина в ДМСО. Реакционный раствор оставляли на 1 ч при охлаждении на льду. Затем реакционный раствор подогревали до комнатной температуры и оставляли на 24 ч. Затем температуру реакционного раствора повышали до 30°С и реакцию продолжали в течение 2 суток. Реакционный раствор лиофилизировали. К полученному остатку добавляли 1 мл трифторуксусной кислоты при охлаждении на льду. Смесь подогревали до комнатной температуры и оставляли на 2 ч. Затем трифторуксусную кислоту отгоняли при пониженном давлении из смеси с использованием испарителя. Полученный остаток растворяли добавлением 4 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Этот раствор наносили со скоростью 1 мл/ч на колонку SP-Sepharose HP (GE Healthcare Japan Corp.) (1 мл), уравновешенную 50 мМ натрий-ацетатным буфером (pH 4,0). Колонку промывали 2 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 4,0). Затем на колонку наносили 5 мл 50 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 1 М NaCl, с получением элюированной фракции. 2-разветвленное производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) уретанового типа, содержащее глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (20k)-CO-αNH-(h.AM (6-52))) (30):
3
2
4
и непрореагировавший пептид h.AM (6-52) извлекали из элюированной фракции. Элюированную фракцию концентрировали до 0,2 мл, используя ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 4, Merck Millipore). Полученный концентрат очищали и фракционировали с использованием системы ВЭЖХ (L-2000, производства Hitachi High-Tech Science Corp.), соединенной с колонкой Tsk gel G2000SWxL (60 см, Tosoh Corp.) (элюент: 80 мМ натрий-ацетатный буфер, pH 6+20% CHCN, содержащий 80 мМ NaSO, скорость потока: 0,5 мл/мин). Препаративная ВЭЖХ давала 0,2 мг (на основе h.AM (6-52)) представляющего интерес соединения (30).
[0163]
3
Эксперимент II-1-13: синтез GL-разветвленного CHO-ПЭГ (20k)-CO-αNH-(h.AM (11-52)) (соединение (31))
16
21
2
Синтезировали форму с дисульфидным мостиком Cys-Cys пептида, имеющего аминокислотную последовательность Fmoc-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH(далее также относится к «Fmoc-αNH-(h.AM (11-52))») с помощью пептидного синтеза с Fmoc-стратегией. Получали 6 мг пептида h.AM (11-52), имеющего 4 лизиновых остатка, защищенных Boc-группами, в виде белого порошка с использованием процедур, аналогичных описанным в эксперименте II-1-12, используя Fmoc-αNH-(h.AM (11-52)).
3
[0164] Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте II-1-12, за исключением того, что пептид h.AM (6-52) заменяли на пептид h.AM (11-52), полученный, как описано выше, и 20 мг реагента для CHO-ПЭГилирования п-нитрофенилэфирного типа (ПЭГ-9) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа, представленного формулой (XII-1-1'):
3
использовали с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (20к) уретанового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (20k)-CO-αNH-(h.AM (11-52))) (31):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,2 мг (на основе h.AM (11-52)) представляющего интерес соединения (31).
[0165]
3
Эксперимент II-1-14: синтез GL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (20k)-CO-αNH-(h.AM (16-52)) (соединение (32))
16
21
2
Синтезировали форму с дисульфидным мостиком Cys-Cys пептида, имеющего аминокислотную последовательность Fmoc-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr-NH(далее также относится к «Fmoc-αNH-(h.AM (16-52))») с помощью пептидного синтеза с Fmoc-стратегией. Получали 6 мг пептида h.AM (16-52), имеющего 4 лизиновых остатка, защищенных Boc-группами, в виде белого порошка с использованием процедур, аналогичных описанных в эксперименте II-1-12, используя Fmoc-αNH-(h.AM (16-52)).
3
[0166] Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте II-1-12, за исключением того, что пептид h.AM (6-52) заменяли на пептид h.AM (16-52), полученный, как описано выше, и 15 мг реагента для CHO-ПЭГилирования п-нитрофенилэфирного типа (ПЭГ-9) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа, представленного формулой (XII-1-1'):
3
использовали с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) уретанового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (20k)-CO-αNH-(h.AM (16-52))) (32):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,2 мг (на основе h.AM (16-52)) представляющего интерес соединения (32).
[0167]
3
Эксперимент II-1-15: синтез GL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (40k)-CO-αNH-(h.AM (16-52)) (соединение (33))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте II-1-14, за исключением того, что 32 мг реагента для CHO-ПЭГилирования п-нитрофенилэфирного типа (ПЭГ-9) со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (XII-1-1'):
3
3
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования п-нитрофенилэфирного типа со средневесовой молекулярной массой 20 кДа с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40k) уретанового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CO-αNH-(h.AM (16-52))) (33). Препаративная ВЭЖХ давала 0,15 мг (на основе h.AM (16-52)) представляющего интерес соединения (33).
[0168]
3
Эксперимент II-1-16: синтез GL-4-разветвленного CHO-ПЭГ (40k)-CO-αNH-(h.AM (6-52)) (соединение (34))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте II-1-12, за исключением того, что 20 мг реагента для CHO-ПЭГилирования п-нитрофенилэфирного типа (ПЭГ-10) со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (XII-2-1'):
3
3
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования п-нитрофенилэфирного типа (ПЭГ-9) со средневесовой молекулярной массой 20 кДа с получением 4-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40k) уретанового типа, содержащего глицериновый остов (GL-4-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CO-αNH-(h.AM (6-52))) (34):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,15 мг (на основе h.AM (6-52)) представляющего интерес соединения (34).
[0169]
Эксперимент II-2: структурный анализ производного адреномедуллина с делецированным N-концом
Эксперимент II-2-1: идентификация положения связывания с группой ПЭГ масс-спектрометрией расщепленного пептида
Расщепленный пептид получали из соединений (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (29), (30), (31), (32), (33) и (34) процедурами, аналогичными описанным в эксперименте I-2-2, с использованием лизилэндопептидазы. Полученный расщепленный пептид очищали и фракционировали с помощью ОФ-ВЭЖХ с использованием процедур, аналогичных описанным в эксперименте I-2-2. В результате были детектированы пики, соответствующие пикам (5), (6), (7) и (8), показанным на фиг. 1, на всех хроматограммах ОФ-ВЭЖХ расщепленных пептидов, полученных из соединений. По результатам эксперимента I-2-2, было подтверждено, что пики (1) и (5) соответствуют пептидному фрагменту h.AM (39-46), было подтверждено, что пики (2) и (6) соответствуют пептидному фрагменту h.AM (47-52), было подтверждено, что пики (3) и (7) соответствуют пептидному фрагменту h.AM (26-36), было подтверждено, что пик (4) соответствует пептидному фрагменту h.AM (1-25), и было подтверждено, что пик (8) соответствует соединению, имеющему группу ПЭГ, присоединенную к N-концевому пептидному фрагменту пептида h.AM (1-52). Следовательно, на основе этих результатов было подтверждено, что все группы ПЭГ в соединениях (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (29), (30), (31), (32), (33) и (34) были присоединены к N-концевым α-аминогруппам.
[0170]
Эксперимент II-2-2: идентификация положения связывания с группой ПЭГ анализом аминокислотной последовательности
Соединения (18), (21), (22), (23), (24), (31), (33) и (34) были подвергнуты анализу аминокислотной последовательности с использованием секвенатора белков (Procise 494 HT Protein Sequencing System, Applied Biosystems, Inc.). В результате аминокислота, соответствующая N-концевому аминокислотному остатку человеческого адреномедуллина, не была детектирована ни в одном из соединений. На основе этих результатов было подтверждено, что все группы ПЭГ в соединениях (18), (21), (22), (23), (24), (31), (33) и (34) были присоединены к N-концевым α-аминогруппам.
[0171]
Эксперимент II-2-3: анализ молекулярной массы с использованием электрофореза SDS-PAGE
В соответствии с лабораторным руководством (Experimental Medicine, Suppl., «Handbook for Protein Experiments», Yodosha Co., Ltd., edited by Tadaomi Takenawa and Toshiki Ito), соединения (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (29), (30), (31), (32), (33) и (34) (200 нг каждого), полученные в эксперименте II-1, разделяли электрофорезом SDS-PAGE с использованием полиакриламидного геля в градиенте концентрации от 10% до 20%. Результаты приведены на фиг. 3, 4 и 5. На фиг. 3 полоса 0 показывает стандарт молекулярной массы, полоса 1 показывает вышеуказанное соединение (1), полоса 2 показывает вышеуказанное соединение (2), полоса 3 показывает вышеуказанное соединение (13), полоса 4 показывает вышеуказанное соединение (14), полоса 5 показывает соединение (15), полоса 6 показывает соединение (16), и полоса 7 показывает соединение (17). На фиг. 4 полоса 0 показывает стандарт молекулярной массы, полоса 1 показывает вышеуказанное соединение (25), полоса 2 показывает вышеуказанное соединение (26), полоса 3 показывает вышеуказанное соединение (27), полоса 4 показывает вышеуказанное соединение (28), полоса 5 показывает соединение (29), полоса 6 показывает соединение (30), полоса 7 показывает соединение (31), полоса 8 показывает соединение (32), полоса 9 показывает соединение (33), полоса 10 показывает соединение (34), полоса 11 показывает вышеуказанное соединение (35), полоса 12 показывает соединение (36), указанное ниже, и полоса 13 показывает соединение (37), указанное ниже. На фиг. 5 полосы 0 и 1 показывают стандарт молекулярной массы, полоса 2 показывает соединение (18), полоса 3 показывает соединение (19), полоса 4 показывает соединение (20), полоса 5 показывает соединение (21), полоса 6 показывает соединение (22), полоса 7 показывает соединение (23), и полоса 8 показывает соединение (24). Все используемые стандарты молекулярной массы представляли стандарты Precision Plus Protein (TM) Dual Xtra (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Как показано на фиг. 3, 4 и 5, было подтверждено, что каждое соединение имело требуемую молекулярную массу.
[0172]
Эксперимент II-2-4: подтверждение ассоциации гель-фильтрационной ВЭЖХ
Ассоциацию молекул производного адреномедуллина подтверждали с помощью гель-фильтрационной ВЭЖХ с использованием гель-фильтрационной колонки (Superdex 200 Increase 10/300 GL, GE Healthcare Japan Corp.). Соединения (18), (21), (22), (23), (24), (29) и (34) (50 мкг каждого), полученные в эксперименте II-1, наносили на колонку. Элюент (100 мМ ацетат натрия и 100 мМ сульфат натрия, рН 6,0) наносили на колонку со скоростью 0,75 мл/мин. На основе хроматограммы гель-фильтрационной ВЭЖХ каждое соединение демонстрировало один пик, имеющий время удерживания, соответствующее молекулярной массе. На основе этих результатов было подтверждено, что каждая молекула производного адреномедуллина присутствует в виде мономера, не будучи ассоциированной. Время удерживания каждого соединения на хроматограмме гель-фильтрационной ВЭЖХ показано в таблице 2.
Таблица 2
Производное адреномедуллина
Время удерживания (мин)
Соединение (18)
21,4
Соединение (21)
16,2
Соединение (22)
16,2
Соединение (23)
16,2
Соединение (24)
13,9
Соединение (29)
13,9
Соединение (34)
14,5
[0173]
Эксперимент III: получение производного адреномедуллина с добавленным C-концевым глицином
Эксперимент III-1: синтез производного адреномедуллина с добавленным C-концевым глицином
3
2
Эксперимент III-1-1: синтез GL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))-Gly (соединение (36))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте II-1-5, за исключением того, что пептид h.AM(1-52) заменяли на пептид h.AM (1-52)-Gly и 80 мг реагента для CHO-ПЭГилирования альдегидного типа (ПЭГ-3) со средневесовой молекулярной массой 40 кДа, представленного формулой (VII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (40k) алкиламинового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (40k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)-Gly) (36):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,8 мг (на основе h.AM (1-52)-Gly) представляющего интерес соединения (36).
3
2
Эксперимент III-1-2: синтез GL-2-разветвленного CHO-ПЭГ (60k)-CH-αNH-(h.AM (1-52))-Gly (соединение (37))
3
Проводили процедуры, аналогичные описанным в эксперименте II-1-5, за исключением того, что пептид h.AM(1-52) заменяли на пептид h.AM(1-52)-Gly и 80 мг реагента для CHO-ПЭГилирования альдегидного типа (ПЭГ-3) со средневесовой молекулярной массой 60 кДа, представленного формулой (VII-1-1'):
3
3
2
использовали вместо реагента для CHO-ПЭГилирования (ПЭГ-2) с получением 2-разветвленного производного адреномедуллина со связью с ПЭГ (60k) алкинаминового типа, содержащего глицериновый остов (GL-2-разветвленный CHO-ПЭГ (60k)-CH-αNH-(h.AM (1-52)-Gly) (37):
Препаративная ВЭЖХ давала 0,7 мг (на основе h.AM (1-52)-Gly) представляющего интерес соединения (37).
[0175]
Эксперимент III-2: структурный анализ производного адреномедуллина с добавленным С-концевым глицином
Эксперимент III-2-1: идентификация положения связывания с группой ПЭГ анализом аминокислотной последовательности
Соединения (36) и (37) были подвергнуты анализу аминокислотной последовательности с использованием секвенатора белков (Procise 494 HT Protein Sequencing System, Applied Biosystems, Inc.). В результате аминокислота, соответствующая N-концевому аминокислотному остатку человеческого адреномедуллина, не была детектирована ни в одном из соединений. На основе этих результатов было подтверждено, что все группы ПЭГ в соединениях (36) и (37) были присоединены к N-концевым α-аминогруппам.
[0176]
Эксперимент IV: примеры применения производного адреномедуллина
Эксперимент IV-1: эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ производного адреномедуллина
-8
4
Известно, что физиологический эффект адреномедуллина (АМ) проявляется через повышение внутриклеточной концентрации цАМФ (см. непатентный документ 1). Следовательно, каждое соединение, полученное в экспериментах I-1, II-1 и III-1, полноразмерный AM, AM с делецированным N-концом или AM с добавленным С-концевым глицином, вносили в культивируемую клеточную линию (клеточную линию HEK293) для индукции экспрессии АМ-рецептора, и измеряли количество продуцированного внутриклеточного цАМФ. 10 моль/л каждого соединения, h.AM (1-52), h.AM (6-52), h.AM (11-52), h.AM (16-52) или h.AM (1-52)-Gly добавляли к конфлюентным клеткам HEK293 (количество клеток: 5×10) в присутствии 0,5 мМ IBMX и инкубировали в течение 15 мин. Затем измеряли концентрацию внутриклеточного цАМФ в клетках HEK293 каждой тестовой зоны с использованием набора для ELISA для измерения цАМФ (GE Healthcare Japan Corp., # RPN2251). Эффект повышения концентрации внутриклеточного цАМФ у производных адреномедуллина в культивируемых клетках, экспрессирующих АМ-рецептор, показан в таблице 3.
Таблица 3
Соединение
Эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ (%)<sup>1)</sup>
(1)
81
(2)
67
(3)
101
(4)
100
(5)
100
(6)
91
(7)
96
(8)
99
(9)
94
(10)
102
(11)
95
(12)
81
(13)
80
(14)
100
(15)
101<sup>*)</sup>
(16)
16<sup>**)</sup>
(17)
9<sup>***)</sup>
(18)
90
(19)
80
(20)
39
(21)
98<sup>*)</sup>
(22)
97
(23)
97
(24)
93<sup>***)</sup>
(25)
101
(26)
99
(27)
87
(28)
85
(29)
77
(30)
99
(31)
104
(32)
96
(33)
61
(34)
83
(35)
91
(36)
96<sup>****)</sup>
(37)
91<sup>****)</sup>
1) Процент (%) внутриклеточной концентрации цАМФ, полученный при добавлении каждого соединения по отношению к внутриклеточной концентрации цАМФ, полученной при добавлении h.AM (1-52)
*) Процент (%) внутриклеточной концентрации цАМФ, полученный при добавлении каждого соединения по отношению к внутриклеточной концентрации цАМФ, полученной при добавлением h.AM (6-52)
**) Процент (%) внутриклеточной концентрации цАМФ, полученный при добавлении каждого соединения по отношению к внутриклеточной концентрации цАМФ, полученной при добавлении h.AM (11-52)
***) Процент (%) внутриклеточной концентрации цАМФ, полученный при добавлении каждого соединения по отношению к внутриклеточной концентрации цАМФ, полученной при добавлении h.AM (16-52)
****) Процент (%) внутриклеточной концентрации цАМФ, полученный при добавлении каждого соединения по отношению к внутриклеточной концентрации цАМФ, полученной при добавлении h.AM (1-52)-Gly
[0177] Как показано в таблице 3, все тестированные производные адреномедуллина проявляли эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ на таком же уровне, что и соответствующий полноразмерный AM, AM с делецированным N-концом или AM с добавленным С-концевым глицином без связанной ПЭГ группы. Следовательно, предполагается, что производные адреномедуллина, имеющие связанную группу ПЭГ, сохраняют биологическую активность на таком же уровне, что и исходное соединение полноразмерный AM, AM с делецированным N-концом или AM с добавленным С-концевым глицином.
[0178] При сравнении производных адреномедуллина соединения (2), соединения (4), соединения (6) и соединения (14), которые имели ПЭГ-группу с одинаковой средневесовой молекулярной массой (20 кДа) и пептидный фрагмент, имеющий одинаковую аминокислотную последовательность (h.AM (1-52)), и отличавшиеся только типом связывания группы ПЭГ и пептидного фрагмента, соединение (4) и соединение (6), производные адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) алкиламинового типа, проявляли более высокий эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ, по сравнению с соединением (2), производным адреномедуллина со связью с ПЭГ (20 k) амидного типа. Аналогично, соединение (14), производное адреномедуллина со связью с ПЭГ (20 k) уретанового типа, проявляло более высокий эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ, по сравнению с соединением (2), производным адреномедуллина со связью с ПЭГ (20 k) амидного типа.
[0179] При сравнении производных адреномедуллина соединения (15), соединения (16) и соединения (17) или соединения (18), соединения (19) и соединения (20), которые имели группу ПЭГ с одинаковой средневесовой молекулярной массой (5 кДа) и пептидный фрагмент, имеющий одинаковую аминокислотную последовательность (h.AM (6-52), h.AM (11-52) или h.AM (16-52)), и отличавшиеся только типом связывания ПЭГ-группы и пептидного фрагмента, соединение (15), соединение (16) и соединение (17), производные адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) амидного типа, показали достоверно более низкий эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ с увеличением данного показателя для пептидного фрагмента с делецированным N-концом. С другой стороны, соединение (18), соединение (19) и соединение (20), производные адреномедуллина со связью с ПЭГ (5k) алкиламинового типа, подавляли влияние N-концевой делеции пептидного фрагмента на эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ.
[0180] При сравнении производных адреномедуллина соединения (4), соединения (21), соединения (22) и соединения (23), которые имели группу ПЭГ с одинаковой средневесовой молекулярной массой (20 кДа) и одинаковый тип связывания ПЭГ и пептидного фрагмента, отличавшиеся только аминокислотной последовательностью пептидного фрагмента, соединение (21), соединение (22) и соединение (23), производные адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) алкиламинового типа, проявляли высокий эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ без влияния N-концевой делеции пептидного фрагмента на эффект повышения внутриклеточной концентрации цАМФ.
[0181]
Эксперимент IV-2: эффект снижения кровяного давления производного адреномедуллина
Каждое соединение, полученное в экспериментах I-1 и II-1 или полноразмерный АМ, вводили в однократной дозе 1 нмоль/кг в вену каждой крысы под анестезией и наблюдали за изменением кровяного давления у крысы. Каждой крысе Вистар в возрасте 11-14 недель проводили анестезию ингаляцией изофлурана. После трахеотомии ингаляционную анестезию контролировали на концентрации изофлурана от 1,5 до 2,5% и скорости потока 0,6-0,8 л/мин. У крысы изолировали правую яремную вену и в нее вставляли катетерную трубку, соответствующую 26 G. Затем у крысы, обработанной аналогичным образом, изолировали левую сонную артерию, и в нее вставляли катетерную трубку, соответствующую 23 G. В катетерную трубку правой яремной вены вводили смешанный раствор физиологический раствор-гепарин (физиологический раствор: 100 мл, гепарин: 1000 единиц) со скоростью 2,4 мл/ч. В эту катетерную трубку вводили 1 нмоль/кг соединения (2), соединения (4), соединения (8) или h.AM (1-52) в форме, растворенной в физиологическом растворе. Катетер, вставленный в сонную артерию, соединяли с датчиком давления. В течение времени измеряли кровяное давление до введения соединения (2), соединения (4) или h.AM (1-52) и кровяное давление после их введения. Взаимосвязь между временем, прошедшим с начала введения соединения (2), соединения (4), соединения (8) или h.AM (1-52) и средним значением кровяного давления показана на фиг.6. На фиг.6А приведены результаты для соединения (2), соединения (4) и h.AM (1-52), и на фиг.6В приведены результаты для соединения (8) и h.AM (1-52). На диаграмме ордината показывает разницу, полученную вычитанием среднего значения кровяного давления до введения каждого препарата, из среднего значения кровяного давления на время введения каждого препарата.
[0182] Как показано на фиг.6, быстрое снижение кровяного давления наблюдали для полноразмерного AM (h.AM (1-52)) без связанной группы ПЭГ сразу после введения. Напротив, быстрое снижение кровяного давления, наблюдаемое для h.AM (1-52) сразу после введения, не отмечали для производных адреномедуллина (соединения (2), соединения (4) и соединения (8)), имеющих связанную группу ПЭГ. Следовательно, предполагается, что производные адреномедуллина, имеющие связанную группу ПЭГ, способны подавлять нежелательные побочные реакции, такие как быстрое снижение кровяного давления, которое может иметь место для исходного соединения полноразмерного АМ.
[0183] При сравнении производных адреномедуллина соединения (2), соединения (4) и соединения (8), которые имели группу ПЭГ с одинаковой средневесовой молекулярной массой (20 кДа) и пептидный фрагмент, имеющий одинаковую аминокислотную последовательность (h. AM (1-52)), и отличавшиеся только типом связи группы ПЭГ и пептидного фрагмента, соединение (4) и соединение (8), производные адреномедуллина со связью с ПЭГ (20k) алкиламинового типа, в большей степени подавляли снижение кровяного давления сразу после введения, по сравнению с соединением (2), производным адреномедуллина со связью с ПЭГ (20 k) амидного типа.
[0184]
Эксперимент IV-3: измерение во времени концентрации производного адреномедуллина в крови после подкожного введения - (1)
Вводили подкожно соединение (8), полученное в эксперименте I-1, или полноразмерный AM, в однократной дозе 10 нмоль/кг каждой крысе, и наблюдали за концентрацией в крови производного адреномедуллина в зависимости от времени. Соединение (8) или h.AM (1-52), растворенные в физиологическом растворе, вводили подкожно каждой крысе самцу Вистар в возрасте 7-8 недель (с массой тела примерно 250 г). На 1 сутки, 7 сутки и 10 сутки после начала введения, вводили внутрибрюшинно 50 мг пентобарбитала и отбирали 300 мкл крови на каждую временую точку из хвостовой вены под анестезией. Сразу же к отобранному образцу крови добавляли 300 мкг ЭДТА-2Na и 21 мкг апротинина, и смесь центрифугировали в условиях, включающих 10 мин и 3000 об/мин, с получением плазмы. Концентрацию АМ в плазме каждого образца измеряли радиоиммуноанализом (RIA) (Kitamura K., Ichiki Y., Tanaka M. et al., Immunoreactive adrenomedullin in human plasma. FEBS Lett., Vol. 341, p. 288-90, 1994). Взаимосвязь между временем, прошедшим с начала введения соединения (8), и концентрацией АМ в плазме, показана на фиг.7.
[0185] Как показано на фиг. 7, когда вводили соединение (8), то было подтверждено, что концентрация АМ в плазме была на уровне 2600 пМ или выше через 1 сутки, 740 пМ или выше через 7 суток и 280 пМ или выше даже через 10 суток. С другой стороны, когда вводили h.AM (1-52), то концентрация АМ в плазме составляла 6,7 пМ через 1 сутки (при введении соединения (8)) и 0 пМ (равно или ниже чувствительности детектирования метода) на оба срока измерения, выполненных через 7 суток и 10 суток. Известно, что концентрация АМ в плазме крыс обычно составляет порядка 1 пМ (Mori Y. et al., Mori, Y. et al., Long-Term Adrenomedullin Infusion Improves Survival in Malignant Hypertensive Rats. Hypertension, 2002, Vol. 40, p. 107-113). Эти результаты показали, что производное адреномедуллина со связью алкиламинового типа по изобретению присутствует в высокой концентрации в крови в течение значительно более длительного периода по сравнению с исходной молекулой адреномедуллина.
[0186]
Эксперимент IV-4: измерение во времени концентрации производного адреномедуллина в крови после введения в яремную вену в однократной дозе
Вводили в вену соединение (8), полученное в эксперименте I-1, или полноразмерный AM, в однократной дозе 3 нмоль/кг каждой крысе под анестезией, и наблюдали за концентрацией в крови производного адреномедуллина в зависимости от времени. Каждой крысе самцу Вистар (с массой тела примерно 300 г) в возрасте 8-9 недель проводили анестезию ингаляцией изофлурана. После трахеотомии ингаляционную анестезию контролировали на концентрации изофлурана от 1,5 до 2,5% и скорости потока 0,6-0,8 л/мин. У крысы изолировали правую яремную вену и в нее вставляли катетерную трубку, соответствующую 26 G. Затем у крысы, обработанной таким же образом, изолировали левую сонную артерию, и в нее вставляли катетерную трубку, соответствующую 23 G. В катетерную трубку правой яремной вены вводили смешанный раствор физиологический раствор-гепарин (физиологический раствор: 100 мл, гепарин: 1000 единиц) со скоростью 2,4 мл/ч. В эту катетерную трубку вводили 3 нмоль/кг соединения (6) или h.AM (1-52) в форме, растворенной в физиологическом растворе. Из катетера, вставленного в сонную артерию, отбирали 300 мкл крови (1 ч, 2 ч и 4 ч после начала введения). Сразу же к полученному образцу крови добавляли 300 мкг ЭДТА-2Na и 21 мкг апротинина, и смесь центрифугировали в условиях, включающих 10 мин и 3000 об/мин, с получением плазмы. Концентрацию АМ в плазме каждого образца измеряли радиоиммуноанализом (RIA) (Kitamura K., Ichiki Y., Tanaka M. et al., Immunoreactive adrenomedullin in human plasma. FEBS Lett., Vol. 341, p. 288-90, 1994). Взаимосвязь между временем, прошедшим с начала введения соединения (6) или h.AM(1-52), и концентрацией АМ в плазме, показана на фиг.8.
[0187] Как показано на фиг.8, соединение (6) имело достоверно более длительный период полураспада в крови по сравнению с h.AM (1-52). Эти результаты показали, что производное адреномедуллина со связью алкиламинового типа по изобретению имеет достоверно пролонгированный период полураспада в крови по сравнению с исходной молекулой адреномедуллина.
[0188]
Эксперимент IV-5: эффект подавления повышения кровяного давления у спонтанно-гипертензивных крыс (крыса SHR) - (1)
Вводили подкожно соединение (8), полученное в эксперименте I-1, в однократной дозе 336 мкг/100 мкл каждой спонтанно-гипертензивной крысе (SHR) и наблюдали эффект подавления повышения кровяного давления под действием производного адреномедуллина. Каждой крысе самцу SHR в возрасте 8 недель (с массой тела примерно 200 г) скармливали рацион с высоким содержанием соли (8% NaCl). Соединение (8) вводили в форме, растворенной в физиологическом растворе, во время скармливания рациона с высоким содержанием соли. В контрольной группе 100 мкл физиологического раствора вводили подкожно в однократной дозе каждой крысе самцу SHR (с массой тела примерно 200 г) аналогично, как описано выше. Кровяное давление и пульс измеряли во времени (за 2 суток до и через 9 суток после введения соединения (8) или физиологического раствора). Значения кровяного давления, полученные за 2 суток до и через 9 суток после введения соединения (8) или физиологического раствора, приведены на фиг. 9.
[0189] Как показано на фиг.9, повышение кровяного давления подавлялось в группе с введением соединения (8) по сравнению с контрольной группой (группа с введением физиологического раствора). Эти результаты показали, что производное адреномедуллина со связью алкиламинового типа по изобретению обладает фармакологическим эффектом подавления повышения кровяного давления.
[0190]
Эксперимент IV-6: измерение во времени концентрации производного адреномедуллина в крови после подкожного введения- (2)
Вводили подкожно соединение (8), полученное в эксперименте I-1, или полноразмерный AM, в однократной дозе 10 нмоль/кг каждой крысе с использованием процедур, описанных в эксперименте IV-3, и наблюдали за изменением концентрации в крови производного адреномедуллина в зависимости от времени.
[0191] Когда вводили соединение (27), то было подтверждено, что концентрация АМ в плазме была равной 3600 пМ или выше через 1 сутки и 120 ммоль или более через 7 суток. Эти результаты показали, что производное адреномедуллина со связью уретанового типа по настоящему изобретению присутствует в высокой концентрации в крови в течение дотоверно более длительного периода времени по сравнению с исходной молекулой адреномедуллина.
[0192]
Эксперимент IV-7: измерение во времени концентрации производного адреномедуллина в крови после подкожного введения - (3)
Вводили подкожно соединение (37), полученное в эксперименте III-1 в однократной дозе 30 нмоль/кг каждой крысе, и наблюдали за изменением концентрации в крови производного адреномедуллина в зависимости от времени. Соединение (37) вводили подкожно, растворенное в физиологическом растворе, каждой крысе самцу Вистар в возрасте 7-8 недель (с массой тела примерно 250 г). На 1 сутки, 2 сутки, 4 сутки, 7 сутки и 9 сутки после начала введения, вводили внутрибрюшинно 50 мг пентобарбитала и 300 мкл крови отбирали каждый раз из хвостовой вены под анестезией. Сразу же к полученному образцу крови добавляли 300 мкг ЭДТА-2Na и 21 мкг апротинина, и смесь центрифугировали в условиях, включающих 10 мин и 3000 об/мин, для получения плазмы. Концентрацию АМ в плазме каждого образца измеряли RIA.
[0193] Когда вводили соединение (37), то было подтверждено, что концентрация АМ в плазме была равной 34000 пМ или выше через 1 сутки, 1600 пМ или выше через 7 суток и 110 пМ или выше даже через 9 суток. Эти результаты показали, что производное адреномедуллина со связью алкиламинового типа с добавленным глицином по настоящему изобретению, присутствует в высокой концентрации в крови в течение достоверно более длительного периода времени по сравнению с исходной молекулой адреномедуллина.
[0194]
Эксперимент IV-8: эффект подавления повышения кровяного давления у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) - (2)
Вводили подкожно соединение (37), полученное в эксперименте III-1, в однократной дозе 30 нмоль/кг каждой крысе SHR и наблюдали эффект подавления повышения кровяного давления под действием производного адреномедуллина. Соединение (37) вводили в форме, растворенной в физиологическом растворе, каждой крысе самцу SHR в возрасте 8 недель (с массой тела примерно 200 г). В контрольной группе 100 мкл физиологического раствора подкожно вводили в однократной дозе каждой крысе самцу SHR (с массой тела примерно 200 г) аналогично, как описано выше. Кровяное давление измеряли во времени (за 1 сутки до и 4 суток и 9 суток после введения соединения (37) или физиологического раствора). Значения изменения кровяного давления, полученные через 4 суток и 9 суток после введения соединения (37) или физиологического раствора, по отношению к среднему значению систолического кровяного давления за сутки до введения, приведены на фиг. 10.
[0195] Как показано на фиг.10, повышение кровяного давления подавлялось в группе с введением соединения (37) по сравнению с контрольной группой. Эти результаты свидетельствуют, что производное адреномедуллина со связью алкиламинового типа с добавленным глицином по изобретению обладает фармакологическим эффектом подавления повышения кровяного давления.
[0196]
Эксперимент IV-9: фармакологический эффект на модели колита, индуцированного декстран сульфатом натрия (DSS)
Соединение (8) исследовали в отношении ослабляющего эффекта на модели DSS-индуцированного колита при подкожном введении. Соединение (8) подкожно вводили в области спины каждой мыши. На следующие сутки после введения (сутки 0) воспроизводили модель колита введением 3% DSS с питьевой водой в течение 7 суток. Дозу соединения (8) устанавливали на 3 уровнях доз 1, 5 и 25 нмоль/кг. Физиологический раствор вводили в качестве растворителя мышам контрольной группы. Массу тела и характер фекалий оценивали на сутки 3, 5 и 7, после даты начала введения DSS (сутки 0) на основе показателей, приведенных в таблице 4. Взаимосвязь между временем, прошедшим с воспроизведения DSS-индуцированного колита, и общим баллом в группах с введением соединения (8), и в контрольной группе показаны на фиг. 11.
Таблица 4
Потеря массы тела
Консистенция фекалий
Кровотечение/слизистые и кровянистые фекалии
Балл
Показатели
Балл
Показатели
Балл
Показатели
0
отсутствует
0
нормальные
0
нормальные
1
1~5%
2
жидкие фекалии
2
кровотечение
2
5~10%
4
диарея
4
слизистые и кровянистые фекалии
3
10~20%
[0197] Как показано на фиг. 11, было подтверждено, что в группах с введением соединения (8) в дозах 5 и 25 нмоль/кг имело место значительное снижение баллов оценки колита. Снижение баллов указывает на эффект ослабления колита. Тенденция к снижению влажной массы кишечника была подтверждена в группе с введением испытуемого соединения в дозе 5 нмоль/кг, и тенденция увеличения длины кишечника подтверждалась в группе с введением в дозе 25 нмоль/кг по сравнению с контрольной группой, животным которой вводили растворитель. На основании этих результатов можно предположить, что соединение (8) оказывает ослабляющее действие на патологическое состояние на модели колита, индуцированного DSS, в формате теста с подкожным введением.
[0198]
Эксперимент IV-10: фармакологический эффект на модели колита, индуцированного 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислотой (TNBS)
Соединение (8) исследовали в отношении ослабляющего эффекта на модели TNBS-индуцированного колита при подкожном введении. Крыс самцов Вистар в возрасте 7 недель акклиматизировали в течение 1 недели. Затем каждой крысе подкожно вводили соединение (8) (1 нмоль/кг) или физиологический раствор (сутки 0). Голодание проводили в течение 24 ч одновременно с подкожным введением для удаления фекалий из кишечника. Модель колита воспроизводили с помощью процедур, описанных ниже. Концентрацию TNBS (Nacalai Tesque, Inc.) доводили до 30 мг/500 мл (в 50% водном растворе этанола). Вводили внутрибрюшинно 50 мг пентобарбитала и полиэтиленовый катетер вводили на 8 см от ануса под анестезией, медленно вращая, с последующим введением 500 мкл раствора препарата (сутки 1). Затем крыс выдерживали в перевернутом положении в течение 2 мин. Массу тела и характер диареи оценивали каждый день. Через 14 суток вводили внутрибрюшинно 50 мг пентобарбитала, и под анестезией отбирали кровь из сердца и извлекали толстый кишечник. Измеряли длину и массу извлеченного толстого кишечника и сравнивали между группами. Взаимосвязь между временем, прошедшим от воспроизведения модели колита, индуцированного TNBS, и массой тела в группе с введением соединения (8) и в контрольной группе показана на фиг. 12. На диаграмме (а) показывает день, когда подкожно вводили соединение (8) или физиологический раствор и начинали голодание, и (b) показывает день, на который вводили TNBS. Значения массы толстого кишечника в группе с введением соединения (8) и в контрольной группе показаны на фиг.13. Длины толстого кишечника в группе введения соединения (8) и контрольной группе приведены на фиг. 14.
[0199] Как показано на фиг. 12, потеря массы тела за счет развития колита подтверждалась в контрольной группе с введением растворителя, в то время как потеря массы тела за счет развития колита ослаблялась в группе с введением соединения (8). Поскольку колит развился, то масса толстого кишечника обычно увеличивается за счет отека в месте воспаления. Как показано на фиг.13, увеличение массы толстого кишечника, четко подавлялось в группе крыс, которым вводили соединение (8) по сравнению с контрольной группой с введением растворителя. Поскольку воспаление, вызванное колитом, прогрессирует, то длина толстого кишечника обычно снижается. Как показано на фиг.14, уменьшение длины кишечника в области толстой кишки четко подавлялось в группе с введением соединения (8) по сравнению с контрольной группой, животным которой вводили растворитель. По данным аутопсии толстого кишечника, четко были отмечены более слабые патологические изменения в группе введения соединения (8), по сравнению с контрольной группой. Эти результаты показали, что соединение (8) оказывает ослабляющее действие на патологическое состояние на модели колита, индуцированного TNBS, в формате теста при подкожном введении. Следовательно, было установлено, что производное адреномедуллина по изобретению оказывает терапевтическое действие на колит.
[0201]
Эксперимент IV-11: фармакологический эффект на модели легочной гипертензии
Соединение (8) исследовали в отношении ослабляющего эффекта на модели легочной гипертензии при подкожном введении. Приобретали крыс самцов Вистар в возрасте 3 недель (Charles River Laboratories Japan, Inc.) и акклиматизировали в течение 1 недели. Затем каждой крысе подкожно вводили раствор монокроталина в концентрации 60 мг/кг. Одновременно подкожно вводили соединение (8) (1 нмоль/кг) или физиологический раствор в однократной дозе в другую область спины. Измеряли общее весовое соотношение между правым желудочком и левым желудочком сердца в качестве показателя для определения эффекта на модели легочной гипертензии. Известно, что на этих моделях имеет место увеличение весового соотношения, вызванного гипертрофией правого желудочка по мере развития патологического состояния (Miyauchi T., Yorikane R., Sakai S., Sakurai T., Okada m., Nishikibe M., Yano M., Yamaguchi I., Sugishita Y. and Goto k.: Contribution of endogenous endothelin-1 to the progression of cardiopulmonary alterations in rats with monocrotaline-induced pulmonary hypertension. Circ. Res., Vol. 73, pp. 887-897, 1993). Через 14 суток после введения вводили внутрибрюшинно 50 мг пентобарбитала, и отбирали образцы крови из нижней полой вены под анестезией. Затем извлекали сердце, и определяли его массу. Извлеченное сердце разделяли на правый желудочек и левый желудочек, и измеряли их соответствующие массы. Вычисляли соотношение массы правого желудочка/массы левого желудочка. Значения соотношения массы правого желудочка/массы левого желудочка в группе с введением соединения (8) и контрольной группе приведены на фиг. 15.
[0201] Как показано на фиг.15, у крыс в группе с введением соединения (8) имело место достоверно более низкое весовое соотношение правого желудочка/левого желудочка по сравнению с контрольной группой, животным которой вводили растворитель. На основании этих результатов можно предположить, что соединение (8) оказывает ослабляющее действие на патологическое состояние на модели легочной гипертензии в формате теста при подкожном введении.
[0202]
Эксперимент IV-12: фармакологический эффект на модели раны
Соединение (8) исследовали в отношении его фармакологического эффекта на модели раны при подкожном введении. Приобретали мышей самцов BALB/c-nu/nu в возрасте 5 недель (Charles River Laboratories Japan, Inc.) и акклиматизировали в течение 1 недели. Затем каждой мыши вводили внутрибрюшинно 5 мг пентобарбитала для анестезии. Кожу дезинфицировали с использованием этанола для дезинфекции. Кожу спины растягивали пальцами при нахождении мыши в боковом положении, и сдавливали и разрезали круглым ножом для биопсии (одноразовый биопсийный пуансон с плунжерной системой) с одной стороны на другую сторону на дезинфицированном коврике с воспроизведением двух дефектных повреждений, каждое из которых имело диаметр 6 мм. В то же время подкожно вводили соединение (8) (1 нмоль/кг) в однократной дозе в другую область спины. Физиологический раствор вводили в качестве растворителя крысам контрольной группы. Накладывали повязку для покрытия спины, включая места раны. Наблюдали за изменением площадей раны во времени. Взаимосвязь между временем, прошедшим от воспроизведения модели раны, и площадями раны в группе с введением соединения (8) и контрольной группе приведена на фиг.16.
[0203] Как показано на фиг.16, уменьшение площади раны протекало быстрее в группе с введением соединения (8) по сравнению с контрольной группе, мышам которой вводили растворитель. Эти результаты свидетельствовали о том, что соединение (8) оказывает эффект, способствующий заживлению раны, в формате теста при подкожном введении.
[0204]
Эксперимент IV-13: фармакологический эффект на модели окклюзии сосудов
В соответствии с тестом водного лабиринта Морриса соединение (8) исследовали при подкожном введении в отношении его фармакологического эффекта на обучение и нарушение памяти у крыс на модели сосудистой окклюзии. Соединение (8) вводили подкожно каждой крысе перед операцией по поводу окклюзии позвоночной артерии. Дозу соединения (8) устанавливали на двух уровнях доз 1 и 10 нмоль/кг. Физиологический раствор вводили в качестве растворителя контрольной группе. Затем позвоночные артерии с двух сторон перманентно окклюзировали под анестезией. На следующие сутки общие сонные артерии с двух сторон окклюзировали на 30 мин под анестезией с использованием шовной нити. Затем шовную нить удаляли, и поток крови восстанавливали. Дату двусторонней окклюзии общей сонной артерии определяли как дату воспроизведения модели окклюзии сосудов, т. е. сутки 0. Через 9 суток после воспроизведения модели крысу заставляли плавать в водном лабиринте Морриса в одном испытании (обучение). Тест со скрытой платформой проводили с интервалом 4 испытания в сутки в течение 5 суток через 10 суток после воспроизведения модели. На пятые сутки теста со скрытой платформой (через 14 суток после воспроизведения модели) проводили испытательный тест через 1 ч после окончательного испытания.
[0205] Тест в водном лабиринте Морриса проводили с использованием экспериментальной установки, описанной ниже. Она представляла круглый бассейн диаметром 150 см, высотой 45 см и глубиной 30 см. Прозрачную бесцветную платформу, имеющую диметр 12 см, располагали примерно на 1 см ниже поверхности воды в круглом бассейне. Температура воды в круглом бассейне установливали на 23±1°C. Имело место непрямое освещение в помещении, где располагалась экспериментальная установка, и в нем были установлены визуальные «подсказки» (календарь, шар, куб и полосатый лист) для животных. В испытательный период такое расположение всегда было постоянным. При измерениях использовали систему видеосъемки (Smart, Panlab, S.L.U.).
[0206] Тест со скрытой платформой проводили с использованием процедур, описанных ниже. Через 9 суток после операции крысу заставляли плавать в течение 90 сек без размещения платформы и привыкнуть к воде (обучение). Измерение начинали через 10 суток после операции. Измерение проводили с интервалом 4 испытания в сутки. Измеряли время плавания для появления на платформе со старта (латентное время покидания зоны старта). Положение старта изменяли между испытаниями. Положение платформы было фиксированным в одном и том же положении для всех испытаний. Наиболее длинное время плавания составляло 90 сек на испытание. Время пребывания на платформе после плавания, равное 30 сек, установливали для крысы, которая не смогла найти платформу за самый длинный период времени плавания.
[0207] Испытательный тест проводили с использованием процедур, описанных ниже. Бассейн разделяли на 4 части без размещения платформы в экспериментальной установке. Во время теста скрытой платформы измеряли время плавания в зоне с установленной в ней платформой. Долю времени пребывания в зоне платформы (%) рассчитывали с использованием уравнения, приведенного ниже, используя измеренное время плавания. Время плавания в пробном тесте устанавливали на значении, равным 60 сек. Только одно испытание проводили через 1 ч после окончания конечного испытания в тесте скрытой платформы, проведенного через 14 суток после воспроизведения модели.
[0208] Взаимосвязь между временем, прошедшим от воспроизведения модели сосудистой окклюзии, и латентным временем пребывания в тесте скрытой платформы в группах с введением соединения (8) и в контрольной группе показана на фиг. 17. Значения доли времени пребывания в зоне платформы в испытательном тесте в группе с введением соединения (8) и контрольной группе у крыс на модели сосудистой окклюзии приведены на фиг. 18. Как показано на фиг.17, у крыс в группах введения соединения (8) в дозах 1 и 10 нмоль/кг сократилось время до появления на платформе, т.е. латентное время покидания зоны старта, в тесте скрытой платформы по сравнению с контрольной группой, животные которой получали растворитель. Как показано на фиг.18, в группах с введением соединения (8) в дозах 1 и 10 нмоль/кг также достоверно увеличивалась доля времени пребывания в зоне платформы в испытательном тесте по сравнению с контрольной группой с введением растворителя. В этом тесте не была подтверждена достоверная разница в смертности, связанной с операцией по поводу двусторонней окклюзии сонной артерии. Эти результаты показали, что соединение (8) оказывает ослабляющее действие на расстройства обучения и памяти у крыс на модели окклюзии 4 сосудов в формате теста при подкожном введении.
[0209]
Эксперимент IV-14: фармакологический эффект на модели артрита, индуцированного адъювантом
Соединение (8) исследовали в отношении его фармакологического эффекта на модели артрита, индуцированного адъювантом, при подкожном введении. Соединение (8) вводили подкожно каждой крысе. На следующие сутки после введения соединения (8) (сутки 1) адъювант (вызывающий воспаление агент) вводили подкожно в дозе 0,1 мл/животное в правую заднюю конечность животного для индукции артрита. Дозу соединения (8) устанавливали на двух уровнях доз 1 и 10 нмоль/кг. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор, который использовали в качестве растворителя. Объемы лап и степень развития отека правой и левой конечностей измеряли на сутки 0 (за сутки до введения адъюванта), 4, 7, 10 и 14 с использованием устройства для измерения объема лап (MK-550, Muromachi Kikai Co., Ltd.). Баллы оценки воспаления на сутки 0 (за сутки до введения адъюванта), 4, 7, 10 и 14 оценивали на основе показателей, приведенных в таблице 5. Взаимосвязь между временем, прошедшим после введения соединения (8) или растворителя, и объемом лап после введения адъюванта в группах с введением соединения (8) и контрольной группе показана на фиг. 19. Взаимосвязь между временем, прошедшим от введения соединения (8) или растворителя, и степенью развития отека после введения адъюванта в группах введения соединения (8) и контрольной группе показана на фиг. 20. Взаимосвязь между временем, прошедшим после введения соединения (8) или растворителя, и показателями воспаления, проявляющимися после введения адъюванта в группах с введением соединения (8) и контрольной группе, показана на фиг. 21.
Таблица 5
Балл
Место
Показатели
0
Правая передняя конечностьПравая передняя конечностьЛевая задняя конечность
норма
1
гиперемия/отечность только в мелком суставе пальца
2
гиперемия/отечность в двух или более мелких суставах или относительно крупном суставе лодыжки
3
гиперемия/отечность во всей конечности
4
когда было подтверждено, что общая отечность в более чем одной конечности достигала максимального уровня
[0210] Как показано на фиг. 19 и 20, у крыс в группах с введением соединения (8) в дозах 1 и 10 нмоль/кг был достоверно снижен объем лапы и степень развития отека по сравнению с контрольной группой с введением растворителя. Как показано на фиг. 21, в группах с введением соединения (8) в дозах 1 и 10 нмоль/кг балл оценки артрита был достоверно ниже по сравнению с контрольной группой, животным которой вводили растворитель. Эти результаты показали, что соединение (8) оказывает ослабляющее действие на развитие артрита у крыс на модели артрита, индуцированного адъювантом, в формате данного теста при подкожном введении.
[0211] Все публикации, патенты и патентные заявки, приведенные здесь, включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.
--->
Список последовательностей
<110> University of Miyazaki
<120> Длительно действующее производное адреномедуллина
<130> PH-6705-PCT
<150>  JP 2015-184685
<151>  2015-09-18
<160> 12
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 52
<212> Белок
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                  10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 2
<211> 1449
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (157)..(711)
<400> 2
ctggatagaa cagctcaagc cttgccactt cgggcttctc actgcagctg ggcttggact 60
tcggagtttt gccattgcca gtgggacgtc tgagactttc tccttcaagt acttggcaga 120
tcactctctt agcagggtct gcgcttcgca gccggg atg aag ctg gtt tcc gtc   174
Met Lys Leu Val Ser Val
1               5
gcc ctg atg tac ctg ggt tcg ctc gcc ttc cta ggc gct gac acc gct   222
Ala Leu Met Tyr Leu Gly Ser Leu Ala Phe Leu Gly Ala Asp Thr Ala
10                  15                  20
cgg ttg gat gtc gcg tcg gag ttt cga aag aag tgg aat aag tgg gct   270
Arg Leu Asp Val Ala Ser Glu Phe Arg Lys Lys Trp Asn Lys Trp Ala
25                  30                  35
ctg agt cgt ggg aag agg gaa ctg cgg atg tcc agc agc tac ccc acc   318
Leu Ser Arg Gly Lys Arg Glu Leu Arg Met Ser Ser Ser Tyr Pro Thr
40                  45                  50
ggg ctc gct gac gtg aag gcc ggg cct gcc cag acc ctt att cgg ccc   366
Gly Leu Ala Asp Val Lys Ala Gly Pro Ala Gln Thr Leu Ile Arg Pro
55                  60                  65                  70
cag gac atg aag ggt gcc tct cga agc ccc gaa gac agc agt ccg gat   414
Gln Asp Met Lys Gly Ala Ser Arg Ser Pro Glu Asp Ser Ser Pro Asp
75                  80                  85
gcc gcc cgc atc cga gtc aag cgc tac cgc cag agc atg aac aac ttc   462
Ala Ala Arg Ile Arg Val Lys Arg Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe
90                  95                 100
cag ggc ctc cgg agc ttt ggc tgc cgc ttc ggg acg tgc acg gtg cag   510
Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln
105                 110                 115
aag ctg gca cac cag atc tac cag ttc aca gat aag gac aag gac aac   558
Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Asn
120                 125                 130
gtc gcc ccc agg agc aag atc agc ccc cag ggc tac ggc cgc cgg cgc   606
Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser Pro Gln Gly Tyr Gly Arg Arg Arg
135                 140                 145                 150
cgg cgc tcc ctg ccc gag gcc ggc ccg ggt cgg act ctg gtg tct tct   654
Arg Arg Ser Leu Pro Glu Ala Gly Pro Gly Arg Thr Leu Val Ser Ser
155                 160                 165
aag cca caa gca cac ggg gct cca gcc ccc ccg agt gga agt gct ccc   702
Lys Pro Gln Ala His Gly Ala Pro Ala Pro Pro Ser Gly Ser Ala Pro
170                 175                 180
cac ttt ctt taggatttag gcgcccatgg tacaaggaat agtcgcgcaa           751
His Phe Leu
185
gcatcccgct ggtgcctccc gggacgaagg acttcccgag cggtgtgggg accgggctct 811
gacagccctg cggagaccct gagtccggga ggcaccgtcc ggcggcgagc tctggctttg 871
caagggcccc tccttctggg ggcttcgctt ccttagcctt gctcaggtgc aagtgcccca 931
gggggcgggg tgcagaagaa tccgagtgtt tgccaggctt aaggagagga gaaactgaga 991
aatgaatgct gagacccccg gagcaggggt ctgagccaca gccgtgctcg cccacaaact 1051
gatttctcac ggcgtgtcac cccaccaggg cgcaagcctc actattactt gaactttcca 1111
aaacctaaag aggaaaagtg caatgcgtgt tgtacataca gaggtaacta tcaatattta 1171
agtttgttgc tgtcaagatt ttttttgtaa cttcaaatat agagatattt ttgtacgtta 1231
tatattgtat taagggcatt ttaaaagcaa ttatattgtc ctcccctatt ttaagacgtg 1291
aatgtctcag cgaggtgtaa agttgttcgc cgcgtggaat gtgagtgtgt ttgtgtgcat 1351
gaaagagaaa gactgattac ctcctgtgtg gaagaaggaa acaccgagtc tctgtataat 1411
ctatttacat aaaatgggtg atatgcgaac agcaaacc                         1449
<210> 3
<211> 52
<212> Белок
<213> Sus scrofa
<400> 3
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                  10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Gly Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 4
<211> 1493
<212> ДНК
<213> Sus scrofa
<400> 4
gcggaacagc tcgagccttg ccacctctag tttcttacca cagcttggac gtcggggttt 60
tgccactgcc agagggacgt ctcagacttc atcttcccaa atcttggcag atcaccccct 120
tagcagggtc tgcacatctc agccgggatg aagctggttc ccgtagccct catgtacctg 180
ggctcgctcg ccttcctggg cgctgacaca gctcggctcg acgtggcggc agagttccga 240
aagaaatgga ataagtgggc tctaagtcgt ggaaaaagag aacttcggct gtccagcagc 300
taccccaccg ggatcgccga cttgaaggcc gggcctgccc agactgtcat tcggccccag 360
gatgtgaagg gctcctctcg cagcccccag gccagcattc cggatgcagc ccgcatccga 420
gtcaagcgct accgccagag tatgaacaac ttccagggcc tgcggagctt cggctgtcgc 480
tttgggacgt gcaccgtgca gaagctggcg caccagatct accagttcac ggacaaagac 540
aaggacggcg tcgccccccg gagcaagatc agcccccagg gctacggccg ccggcgccga 600
cgctctctgc ccgaagccag cctgggccgg actctgaggt cccaggagcc acaggcgcac 660
ggggccccgg cctccccggc gcatcaagtg ctcgccactc tctttaggat ttaggcgcct 720
actgtggcag cagcgaacag tcgcgcatgc atcatgccgg cgcttcctgg ggcggggggc 780
ttcccggagc cgagcccctc agcggctggg gcccgggcag agacagcatt gagagaccga 840
gagtccggga ggcacagacc agcggcgagc cctgcatttt caggaacccg tcctgcttgg 900
aggcagtgtt ctcttcggct taatccagcc cgggtccccg ggtgggggtg gagggtgcag 960
aggaatccaa aggagtgtca tctgccaggc tcacggagag gagaaactgc gaagtaaatg 1020
cttagacccc caggggcaag ggtctgagcc actgccgtgc cgcccacaaa ctgatttctg 1080
aaggggaata accccaacag ggcgcaagcc tcactattac ttgaactttc caaaacctag 1140
agaggaaaag tgcaatgtat gttgtatata aagaggtaac tatcaatatt taagtttgtt 1200
gctgtcaaga tttttttttg taacttcaaa tatagagata tttttgtacg ttatatattg 1260
tattaagggc attttaaaac aattgtattg ttcccctccc ctctatttta atatgtgaat 1320
gtctcagcga ggtgtaacat tgtttgctgc gcgaaatgtg agagtgtgtg tgtgtgtgtg 1380
cgtgaaagag agtctggatg cctcttgggg aagaagaaaa caccatatct gtataatcta 1440
tttacataaa atgggtgata tgcgaagtag caaaccaata aactgtctca atg        1493
<210> 5
<211> 52
<212> Белок
<213> Canis familiaris
<400> 5
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Asn Phe Gln Gly Pro Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                  10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Gly Val Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 6
<211> 1432
<212> ДНК
<213> Canis familiaris
<400> 6
ggttttgcca gcaccagagc gacgtctcag accttctcct cccggatctt ggcagatcac 60
cccctcagca gggtctgcgc atcgccgcca gcatgaagct ggttcccgtc gccctcttat 120
acctgggctc cctcgccttc ttgggcgcgg acaccgcacg gctagacgtg gcgtcagagt 180
tccgaaagaa gtggaataaa tgggctgtaa gtcgtggaaa gagggaactt cgagtgtcca 240
gcagctatcc caccgggctc gctgaagtga aggccgggcc ggcccagact cttattcgga 300
cccaggacgt gaagggcgcc tctcgcaacc cccagaccag cggtccggac gccgcccgca 360
tccgagtcaa acgctaccgc cagagtatga acaatttcca gggcccgcgg agcttcggct 420
gccgcttcgg aacgtgcacg gtgcagaaac tggcgcacca gatctaccag ttcacagaca 480
aggacaagga cggcgtcgcc cccaggagca agattagccc tcagggctac ggccgccggc 540
gccggcgctc cctgcccgag cccggccttc gccggactct gttgttcccg gagccacggc 600
caggcggggc tccggccccc cgggcgcatc aggtgctcgc caacctcctt aagatgtagg 660
cgcctgtggc agcagcgaac tggcgcgcgt gtgcatcccg ctggcttccc cctgggcgga 720
gggcttcccc gagccgagcc cctctgccga tggaagtcgg gcagagaccg ggattccggg 780
aggcaccgtc ccgcggccag ccctggcttt gcgcgagccc cttctcctcg gaggcacgga 840
tccctctgtc ccaagccggc ccaggtgtcc cgtggggggc agaggaatgc aagggaggcc 900
tgccaggctc acggagagga ttaactgaga attaaatgag aattaaatgc ttgagaccct 960
cccccctccc cccccaggga caggggtctg agtcactgcc gtgcctgccc acaaactgat 1020
ttctcacggg gtgtcacccc accggggcgc aagcctcact attacttgaa ctttccaaaa 1080
cctagagagg aaaagtgcaa tgcgtgttgt atatacagag gtaactatca atatttaagt 1140
tcgttgctgt cagaagattt tttttgtaac ttcaaatata gagatatttt tgtacgttat 1200
atattgtatt aagggcattt aaaaaccatt gcattgtccc cctccccact tattttaata 1260
cgtgaatgtc tcagcgaggt gtaacgttgt ttttgctgca gagtgtgtga gtgtgcgtga 1320
gagacttatt acctcttgtg gaagaaggaa caccgtgtct ctgcattatc tatttacata 1380
aaatgggtga tatgcgaaaa tagcaaatca ataataaacg gtctcgatgc tg         1432
<210> 7
<211> 52
<212> Белок
<213> Bos taurus
<400> 7
Tyr Arg Gln Ser Leu Asn Asn Phe Gln Gly Leu Arg Ser Phe Gly Cys
1               5                  10                  15
Arg Phe Gly Thr Cys Thr Val Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr His
20                  25                  30
Phe Thr Asp Lys Asp Lys Asp Gly Ser Ala Pro Arg Ser Lys Ile Ser
35                  40                  45
Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 8
<211> 1439
<212> ДНК
<213> Bos taurus
<400> 8
cgggaaacag ctcgaacctt ctcacttttg gcttctcact gcagcttcga cgtcggggtt 60
ttgccactgc cagaacgccg tctcagactt aatactccaa agaattttgg cagatcaccc 120
cctcagcagg gtctgcgcat cgccgccggg atgaagctgg ttcccgtcgc cctcctgtac 180
ctggggtcgc tcgccttcct aggcgtggac acggcacggc tcgacgtggc ggcagagttc 240
cgaaagaaat ggaataagtg ggctctaagt cgtggaaaaa gagaacttcg cgagtccagt 300
agctacccca ccgggctcgc cgacgtgaag gccgggcctg tccagactct tattcggccc 360
caggatgtaa agggcgcctc tcgaagccct caggccagca gtcctgacgc agcccgcatc 420
cgagtcaagc gctaccgcca gagtttgaac aacttccagg gcctgcggag cttcggttgt 480
cgcttcggga catgcacggt gcagaagttg gcgcatcaga tctaccattt cacggacaag 540
gacaaggacg gatccgcccc caggagcaag atcagccccc agggctacgg ccgtcggcgc 600
cgacgttcac tgcctgaggc cggcttgggt cggactctat tacagcctcc agagccaaag 660
ctgcgagggg ccccggactc ccgggtgcat caagtacttg ccaccctcag gatttaggcg 720
cctgggcagc agcgaacagt cgcgcacgca tctcgccggc acctcttcgg gcgggagggc 780
ttccgcgagc cgagcccctc actcagccta tgggcccggg ctgagaacag ccctgagaga 840
ccgagagtcc aggaggcacc gtccggcagc cagcgagcac tggctttgca ggaacccgtc 900
ctcctcggag gggaggcagt gttctcttca ctctaattgg ggccaggtgc agtttctcct 960
ctccgtgagc ctggcagacg ctcacggaga ggagaaactg cgaaataaat gatgagaccc 1020
tcaggggcaa gggtctgagc cactgccgtg cccgcccaca aactgattcc tgatgggggt 1080
gtcaccccac cggggtgcaa gcctcactat tacttgaact ttccgaaacc tagagaggaa 1140
aagtgcaatg agtgttgtat atacagagat aattatcaat atttaaattt gttgttgtca 1200
agattttttt tgtaacttca aatatagaga tatttttgta cgttatatat tgtattaagg 1260
gcattttaaa gcaattgtat tgttcccctc ccctctattt taataagtga atgtctcagc 1320
gagatgcaac gttgtttgct gcgtggaatg tgagagtgtg tgcgtgaaag agatgagttg 1380
cctcttgtgg aagaagaaaa caccgtgtct gtataatcta tttacataaa gtgggccgg  1439
<210> 9
<211> 50
<212> Белок
<213> Rattus norvegicus
<400> 9
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Thr Gly Cys Arg Phe
1               5                  10                  15
Gly Thr Cys Thr Met Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Phe Thr
20                  25                  30
Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln
35                  40                  45
Gly Tyr
50
<210> 10
<211> 1376
<212> ДНК
<213> Rattus norvegicus
<400> 10
tccagccttt accgctcctg gtttctcggc ttctcatcgc agtcagtctt ggactttgcg 60
ggttttgccg ctgtcagaag gacgtctcgg actttctgct tcaagtgctt gacaactcac 120
cctttcagca gggtatcgga gcatcgctac agaatgaagc tggtttccat cgccctgatg 180
ttattgggtt cgctcgccgt tctcggcgcg gacaccgcac ggctcgacac ttcctcgcag 240
ttccgaaaga agtggaataa gtgggcgcta agtcgtggga agagggaact acaagcgtcc 300
agcagctacc ctacggggct cgttgatgag aagacagtcc cgacccagac tcttgggctc 360
caggacaagc agagcacgtc tagcacccca caagccagca ctcagagcac agcccacatt 420
cgagtcaaac gctaccgcca gagcatgaac caggggtccc gcagcactgg atgccgcttt 480
gggacctgca caatgcagaa actggctcac cagatctacc agtttacaga caaagacaag 540
gacggcatgg cccccagaaa caagatcagc cctcaaggct atggccgccg gcgccggcgt 600
tccctgccag aggtcctccg agcccggact gtggagtcct cccaggagca gacacactca 660
gctccagcct ccccggcgca ccaagacatc tccagagtct ctaggttata ggtgcgggtg 720
gcagcattga acagtcgggc gagtatccca ttggcgcctg cggaatcaga gagcttcgca 780
ccctgagcgg actgagacaa tcttgcagag atctgcctgg ctgcccctag gggaggcaga 840
ggaacccaag atcaagccag gctcacgtca gaaaccgaga attacaggct gatactctct 900
ccgggcaggg gtctgagcca ctgccttgcc cgctcataaa ctggttttct cacggggcat 960
acggctcatt acttacttga actttccaaa acctagcgag gaaaagtgca atgcttgtta 1020
tacagccaaa ggtaactatc atatttaagt ttgttgatgt caagaggttt ttttttttgt 1080
aacttcaaat atatagaaat atttttgtac gttatatatt gtattaaggg cattttaaag 1140
cgattatatt gtcaccttcc cctattttaa gaagtgaatg tctcagcaag gtgtaaggtt 1200
gtttggttcc gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtaagg 1260
tggagagcgc ctgattaccg cctgtggatg aagaaaaaac attgtgtctt ctataatcta 1320
tttacataaa atatgtgatc tgggaaaaag caaaccaata aactgtctca atgctg     1376
<210> 11
<211> 50
<212> Белок
<213> Mus musculus
<400> 11
Tyr Arg Gln Ser Met Asn Gln Gly Ser Arg Ser Asn Gly Cys Arg Phe
1               5                  10                  15
Gly Thr Cys Thr Phe Gln Lys Leu Ala His Gln Ile Tyr Gln Leu Thr
20                  25                  30
Asp Lys Asp Lys Asp Gly Met Ala Pro Arg Asn Lys Ile Ser Pro Gln
35                  40                  45
Gly Tyr
50
<210> 12
<211> 1381
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<400> 12
cttggtgaca ctagacagag caactccagc gttaccgctc ccgctcctgg tttctcggct 60
tctcatcgca gtcaatcttg gactttgggg ttttgctact gtcagaagga cttctttctg 120
cttcaagtgc ttgacaacgc acccctttat cagggtatca gagcatcgcc acagaatgaa 180
gctggtttcc atcaccctga tgttattggg ttcactcgct ttcctaggcg cggacactgc 240
agggccagat actccttcgc agttccgaaa gaagtggaat aagtgggcgc taagtcgtgg 300
gaagagggaa ctacaagcat ccagcagcta ccctacggga ctcgctgatg agacgacagt 360
tcctacccag actcttgatc cattcctgga cgagcagaac acaactggcc ccctacaagc 420
cagcaatcag agcgaagccc acattcgtgt caaacgctac cgccagagca tgaaccaggg 480
ttcccgcagc aatggatgcc gcttcgggac ctgcacattt cagaaattgg cccaccagat 540
ctaccagcta acagacaaag acaaggacgg catggctccc agaaacaaga tcagccctca 600
aggctatggc cgccggcgcc ggcgttccct gctggaggtc ctccggtccc ggactgtgga 660
gtcctcccag gagcagacac acacagcccc aggcccctgg gcgcacatct ccagactctt 720
taggatatag gtgcgggtga cagcattgaa cagtcgggcg agtatcccgt tggcgcctgc 780
ggaatcagag aacttcgcac cggggcggac tgagacaatc ctgcagagat ctgcctggct 840
gcccctaggg gaggcagagg aacccaagac caagccaggc tcatgccaga aaccgagact 900
tacaggctga tactctccgg gcaggggtct gagccactgc cttgcccgct cataaactgg 960
tttctcacgg ggcataagcc tcattactac ttgaactttc caaaacctag cgaggaacgt 1020
gcaatgcttg ttgtccagcc aaaggtaact atagtattta agtttgttgc tgtcaaggtt 1080
tttttttttg taacttcaaa tatatagaga tatttttgta cgttatatat tgtattaagg 1140
gcattttaaa gtgattatat tgtcaccttc ccctatttta agacgtgaat gtctcagcaa 1200
ggtgtaaggt tgtttggttc cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 1260
taaggtggag agcgcctgat tatcgcctgt ggatgaagaa aaaacattgt gtttcctata 1320
atctatttac ataaaatatg tgatctggga aaaagcaaac caataaactg tctcaatgct 1380
g                                                                 1381
<---