ГИДРОЛАЗЫ, КОДИРУЮЩИЕ ИХ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ гидролиза масла или жира, включающий стадии:
(а) получение композиции, содержащей масло или жир, где масло или жир можно гидролизовать посредством полипептида, обладающего гидролазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, которая гибридизуется при строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3 или таблице 4, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их сочетание, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; Н140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(b) добавление полипептида со стадии (а) в композицию, содержащую указанное масло или жир, в достаточном количестве и в достаточных условиях для того, чтобы вызвать гидролиз масла или жира, посредством чего гидролизуют масло или жир.
2. Способ по п.1, где указанное гидролизованное масло или жир обладает сниженным содержанием насыщенных жирных кислот относительно указанного масла или жира перед гидролизом.
3. Способ по п.п.1 или 2, где указанное гидролизованное масло или жир обладает сниженным содержанием транс-изомеров жирных кислот относительно указанного масла или жир перед гидролизом.
4. Способ по п.п.1 или 2, где указанное масло или жир содержит масло водорослей, животное масло, растительное масло, масло, обладающее измененным составом жирных кислот, масло с низким содержанием насыщенных жирных кислот, рыбий жир или их сочетание.
5. Способ по п.4, где указанное масло включает масло Neochloris oleoabundans, масло Scenedesmus dimorphus, масло Euglena gracilis, масло Phaeodactylum tricornutum, масло Pleurochrysis carterae, масло Prymnesium parvum, масло Tetraselmis chui, масло Tetraselmis suecica, масло Isochrysis galbana, масло Nannochloropsis salina, масло Botryococcus braunii, масло Dunaliella tertiolecta, масло видов Nannochloris, масло видов Spirulina, масло Chlorophycease, масло Bacilliarophy, масло канолы, касторовое масло, кокосовое масло, кориандровое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло лесного ореха, масла других орехов, конопляное масло, льняное масло, масло пенника лугового, оливковое масло, пальмовое масло, косточковое пальмовое масло, арахисовое масло, рапсовое масло, рисовое масло, сафлоровое масло, масло сасанквы, сезамовое масло, соевое масло, масло подсолнечника, талловое масло, масло цубаки, сало, лярд, жир коровьего масла, куриный жир или смесь из любых указанных жиров или масел.
6. Способ по п.4, где измененная жирная кислота включает масло с высоким содержанием олеиновой кислоты, масло с низким содержанием линоленовой кислоты или их сочетание.
7. Способ по п.4, где масло с низким содержанием насыщенных жирных кислот включает масло канолы с высоким содержанием олеиновой кислоты, соевое масло с низким содержанием линоленовой кислоты, масло подсолнечника с высоким содержанием стеариновой кислоты или их сочетание.
8. Способ по п.4, где рыбий жир включает жир тихоокеанского талеихта, жир печени трески, жир хоплостета, жир сардины, жир сельди, жир менхадена или их сочетание.
9. Способ по п.1, где указанные жиры или масла содержат молекулы, содержащие триацилглицеридный остов, и где в ходе указанного гидролиза жирные кислоты удаляются по меньшей мере с некоторых триацилглицеридных остовов.
10. Способ по п.9, где указанные жирные кислоты содержат одну или несколько кислот из числа уксусной, масляной, капроновой, каприловой, ундекановой, лауриновой, миристиновой, пентадекановой, пальмитиновой, маргариновой, стеариновой, арахиновой или бегеновой кислоты.
11. Способ по п.9, где указанные жирные кислоты избирательно удаляются из положений Sn1, Sn2 или Sn3 на триацилглицеридном остове.
12. Способ по п.1, где указанное масло или жир присутствует в корме или продукте питания, и указанный гидролиз выполняют до употребления указанного корма или продукта питания животным или индивидуумом.
13. Способ по п.1, где указанное масло или жир содержит одно или несколько веществ из триацилглицерина, диацилглицерина или моноацилглицерина, и где указанный полипептид со стадии (а) приводят в контакт с указанным маслом или жиром в условиях, в которых указанный полипептид гидролизует один или несколько указанных триацилглицерина, диацилглицерина или моноацилглицерина.
14. Способ по п.13, где указанный гидролиз ведет к снижению количества триацилглицерина, диацилглицерина или моноацилглицерина в композиции.
15. Способ по п.1, где масло или жир содержит глицериновый эфир полиненасыщенной жирной кислоты.
16. Способ по п.1, где указанное гидролизованное масло или жир содержит любое одно или несколько веществ из масла или жира с низким содержанием насыщенных жирных кислот, масла или жира, не содержащего транс-изомеры жирных кислот, липида, содержащего незаменимые жирные кислоты, липида, содержащего мононенасыщенные жирные кислоты, липида, содержащего фосфохолин, липида, содержащего фосфосерин, липида, содержащего фитостерол, 1,3-диацилглицерида, 2-моноацилглицерида и триацилглицерида.
17. Способ по п.1, где указанная композиция включает диетическую композицию на основе молока или на растительной основе, где полипептид может гидролизовать масло или жир в композиции, посредством чего снижать в ней содержание жира.
18. Способ биокаталитического синтеза структурированного липида, который включает следующие стадии:
(а) получение полипептида, обладающего гидролазной активностью, причем указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и содержит изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3 или таблице 4, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их сочетание, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; Н140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их сочетание;
(b) получение композиции, содержащей триацилглицерид (ТАГ);
(c) приведение полипептида со стадии (а) в контакт с композицией со стадии (b) в условиях, в которых полипептид гидролитически отщепляет остаток карбоновой кислоты в положении Sn2 триацилглицерида (ТАГ), посредством чего получают 1,3-диацилглицерид (ДАГ);
(d) получение R1-сложного эфира;
(e) получение R1-специфической гидролазы, и
(f) приведение 1,3-ДАГ со стадии (с) в контакт с R1-сложным эфиром со стадии (d) и R1-специфической гидролазой со стадии (е) в условиях, в которых R1-специфическая гидролаза катализирует этерификацию положения Sn2, посредством чего получают структурированный липид.
19. Способ по п.18, где R1-специфическая гидролаза представляет собой Sn2-специфическую липазу.
20. Способ по п.18, где структурированный липид выбран из группы, состоящей из альтернативы масла какао (СВА), синтетического масла какао, натурального масла какао, 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (POP), 1,3-дистеароил-2-олеоилглицерина (SOS), 1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерина (POS) и 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерина (ОММ).
21. Способ по п.18, где указанный R1-сложный эфир содержит менее насыщенную жирную кислоту, чем указанный гидролитически отщепленный остаток карбоновой кислоты.
22. Способ по п.18, где указанный R1-сложный эфир может содержать одно или несколько веществ из омега-3 жирной кислоты, омега-6 жирной кислоты, омега-9 жирной кислоты, мононенасыщенной жирной кислоты, фосфогруппы, сложного эфира фитостерина или оризанола.
23. Способ по п.18, где указанный R1-сложный эфир содержит фрагмент, выбранный из группы, состоящей из α-линоленовой кислоты, стеаридоновой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, γ-линоленовои кислоты, дигомо-γ-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, олеиновой кислоты, пальмолеиновой кислоты, холина, серина, β-ситостерина, куместрола и диэтилстильбэстрола.
24. Способ по п.18, где указанный синтезированный структурированный липид обладает сниженным содержанием насыщенных жирных кислот относительно указанного триацилглицерида.
25. Способ по п.18, где указанный синтезированный структурированный липид обладает сниженным содержанием транс-изомеров жирных кислот относительно указанного триацилглицерида.
26. Способ биокаталитического синтеза структурированного липида, включающий следующие стадии:
(а) получение полипептида, обладающего гидролазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется при строгих условиях с нуклеиновой кислотой, включающей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3 или таблице 4, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их сочетание;
(b) получение композиции, содержащей триацилглицерид (ТАГ);
(c) приведение полипептида со стадии (а) в контакт с композицией со стадии (b) в условиях, в которых полипептид гидролитически отщепляет остаток карбоновой кислоты в положении Sn1 или Sn3 триацилглицерида (ТАГ), посредством чего получают 1,2-ДАГ или 2,3-ДАГ; и
(d) промотирование перегруппировке остатка карбоновой кислоты в 1,2-ДАГ или 2,3-ДАГ со стадии (с) в кинетически контролируемых условиях, посредством чего получают 1,3-ДАГ.
27. Способ по п.26, включающий дополнительную стадию получения R1-сложного эфира и R1-специфической липазы и приведения 1,3-ДАГ со стадии (а) в контакт со R1-сложным эфиром и R1-специфической липазой в условиях, в которых R1-специфическая липаза катализирует этерификацию положения Sn2, посредством чего получают структурированный липид.
28. Способ по п.27, где указанная R1-специфическая липаза представляет собой Sn1- или Sn3-специфическую липазу.
29. Способ по п.27, где указанный структурированный липид выбран из группы, состоящей из альтернативы масла какао (СВА), синтетического масла какао, натурального масла какао, 1,3-дипальмитоил-2-олеоилглицерина (POP), 1,3-дистеароил-2- олеоилглицерина (SOS), 1-пальмитоил-2-олеоил-3-стеароилглицерина (POS) или 1-олеоил-2,3-димиристоилглицерина (ОММ).
30. Способ по п.27, где указанный R1-сложный эфир содержит менее насыщенную жирную кислоту, чем указанный гидролитически отщепленный остаток карбоновой кислоты.
31. Способ по п.30, где указанный R1-сложный эфир может содержать одно или несколько веществ из омега-3 жирной кислоты, омега-6 жирной кислоты, мононенасыщенной жирной кислоты, фосфогруппы, сложного эфира фитостерина и оризанола.
32. Способ по п.30, где указанный R1-сложный эфир содержит фрагмент, выбранный из группы, состоящей α-линоленовой кислоты, эйкозапентаеновой кислоты, докозагексаеновой кислоты, γ-линоленовой кислоты, дигомо-γ-линоленовой кислоты, арахидоновой кислоты, олеиновой кислоты, пальмолеиновой кислоты, холина, серина, β-ситостерина, куместрола, диэтилстильбэстрола и оризанола.
33. Способ по п.26, где стадия (d) дополнительно включает использование ионообменных смол.
34. Способ по п.26, где указанные кинетически контролируемые условия на стадии (d) включают неравновесные условия, ведущие к образованию конечного продукта, обладающего отношением 1,3-ДАГ к 2,3-ДАГ, превышающим 2:1.
35. Способ по п.27, где указанный синтезированный структурированный липид обладает сниженным содержанием насыщенных жирных кислот относительно указанного триацилглицерида.
36. Способ по п.27, где указанный синтезированный структурированный липид обладает сниженным содержанием транс-изомеров жирных кислот относительно указанного триацилглицерида.
37. Способ катализа реакции переэтерификации для получения новых триацилглицеридов, включающий следующие стадии:
(а) получение композиции, содержащей полипептид, обладающий 1,3-специфической липазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических или рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, которая гибридизуется при строгих условиях с нуклеиновой кислотой, включающей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3 или таблице 4, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(b) получение смеси триацилглицеридов и свободных жирных кислот;
(c) обработка композиции со стадии (b) полипептидом в условиях, в которых полипептид может катализировать обмен свободных жирных кислот и ацильных групп триацилглицеридов, посредством чего получают новые триацилглицериды, обогащенные указанными жирными кислотами.
38. Способ по п.37, где указанная композиция со стадии (b) содержит 1,3-дипальмитоил-2-монолеин (POP) и новые триацилглицериды со стадии (с) содержат одно или два вещества из 1-пальмитоил-3-стеароил-2-монолеина (POSt) и 1,3-дистеароил-2-монолеина (StOSt).
39. Способ по п.37, где указанные новые триацилглицериды со стадии (с) обладают сниженным содержанием насыщенных жирных кислот относительно указанных триацилглицеридов со стадии (b).
40. Способ по п.37, где указанные новые триацилглицериды со стадии (с) обладают сниженным содержанием транс-изомеров жирных кислот относительно указанных триацилглицеридов со стадии (b).
41. Способ переэтерификации для получения продукта питания, корма или масла, включающий следующие стадии:
(a) получение реакционной смеси для переэтерификации, которая содержит вещество источника стеариновой кислоты, выбранное из группы, состоящей из стеариновой кислоты, сложных стеариновых моноэфиров низкомолекулярных одноатомных спиртов и их смесей,
(b) получение продукта питания, корма или масла, содержащего триацилглицерид;
(c) получение полипептида, обладающего гидролазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3 или таблице 4, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; Н140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(d) переэтерификация вещества источника стеариновой кислоты и триацилглицерида из продукта питания, корма или масла и
(е) отделение компонентов свободных жирных кислот от переэтерифицированных глицеридных компонентов смеси для переэтерификации, чтобы предоставить переэтерифицированный продукт масла и смесь жирных кислот, содержащую жирные кислоты, сложные моноэфиры жирных кислот или их смеси, высвобожденные из продукта питания, корма или масла.
42. Способ по п.41, где указанную реакцию переэтерификации продолжают до достижения по существу равновесия сложноэфирных групп в положениях 1 и 3 глицеридного компонента и компонентов неглицеридных жирных кислот реакционной смеси.
43. Способ по п.41, включающий дополнительную стадию гидрогенизации смеси жирных кислот.
44. Способ по п.41, где указанные переэтерифицированные триацилглицериды обладают сниженным содержанием насыщенных жирных кислот относительно указанных триацилглицеридов со стадии (b).
45. Способ по п.41, где указанные переэтерифицированные триацилглицериды обладают сниженным содержанием транс-изомеров жирных кислот относительно указанных триацилглицеридов со стадии (b).
46. Способ получения ДАГ, включающий следующие стадии:
(a) получение композиции масел, содержащей некоторое количество ТАГ,
(b) получение полипептида, обладающего гидролазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3 или таблице 4, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3 или таблице 4, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(с) приведение указанной композиции масел со стадии (а) в контакт с указанным полипептидом со стадии (b) в условиях, достаточных для гидролитического отщепления полипептидом остатка карбоновой кислоты на ТАГ для получения ДАГ.
47. Способ по п.46, где указанный полипептид является Sn2-специфическим и указанный ДАГ представляет собой 1,3-ДАГ.
48. Способ по п.46, где указанный полипептид является Sn1- или Sn3-специфическим и указанный ДАГ представляет собой 1,2-ДАГ или 2,3-ДАГ.
49. Способ по п.46, где указанный остаток карбоновой кислоты содержит насыщенную жирную кислоту, а указанный ДАГ представляет собой менее насыщенный жир, чем указанный ТАГ.
50. Способ по п.46, где указанный остаток карбоновой кислоты содержит транс-изомер жирной кислоты, а указанный ДАГ представляет собой жир со сниженным содержанием транс-изомеров жирных кислот относительно указанного ТАГ.
51. Композиция, содержащая масло или жир, гидролизованные способом по п.1.
52. Композиция по п.51, где указанная композиция выбрана из маргарина, разрыхлителя, майонеза, заправки, которую можно наливать, заправки, которую можно черпать ложкой, соуса, маринада, приправы, масла для смазывания разбрызгиванием, кулинарного масла, масла для жарки, масла для салата, кондитерских изделий, альтернативы масла какао, заменителя масла какао, заместителя масла какао, эквивалента масла какао, продукта питания, пищевой добавки или любого производственного промежуточного соединения для любого указанного выше.
53. Способ гидролиза масла или жир, включающий реакцию масла или жира с ферментом пальмитазой в присутствие эмульгатора, ГЛБ которого превышает 12, где фермент пальмитазу кодирует последовательность нуклеиновой кислоты, обладающая по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающая i) нуклеотидную замену (или ее эквивалент), кодирующую аминокислотный остаток в положении 95 (или в его эквиваленте), как указано в таблице 9, ii) нуклеотидные замены (или их эквиваленты), кодирующие аминокислотные остатки в положениях 85 и 172 (или в их эквивалентах), как указано в таблице 15, iii) нуклеотидную замену (или ее эквивалент), кодирующую аминокислотный остаток в положении 83 (или в его эквиваленте), как указано в таблице 16, и iv) следующие молчащие мутации 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117СТТ, 126AGG, 133ТСТ и 188ACG.
54. Способ по п.53, где последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой последовательность SEQ ID №1 и включает i) нуклеотидную замену (или ее эквивалент), кодирующую аминокислотный остаток в положении 95 (или в его эквиваленте), как указано в таблице 9, ii) нуклеотидные замены (или их эквиваленты), кодирующие аминокислотные остатки в положениях 85 и 172 (или в их эквивалентах), как указано в таблице 15, iii) нуклеотидную замену (или ее эквивалент), кодирующую аминокислотный остаток в положении 83 (или в его эквиваленте), как указано в таблице 16, и iv) следующие молчащие мутации 35GCT, 102GTT, 108AGT, 117СТТ, 126AGG, 133ТСТ и 188ACG.
55. Способ по п.53, где эмульгатор выбран из олеата натрия, олеата калия, линолеата натрия, линолеата калия, линолената натрия, линолената калия, лауреата натрия, лауреата калия, стеарата натрия, стеарата калия, пальмитата натрия, пальмитата калия, натриевой соли жирной кислоты пальмового масла, калиевой соли жирной кислоты пальмового масла или их комбинации.
56. Способ по п.53, где реакцию проводят при температуре приблизительно от 20 до 70°С.
57. Способ по п.53, где реакционная смесь содержит приблизительно от 1 до 20% воды от общей массы реагентов.
58. Способ по п.53, где реакция дает масло или жир, содержащий приблизительно 5% пальмитата от общей массы масла или жира.
59. Способ по п.53, где реакция дает масло или жир, содержащий приблизительно 1% пальмитата от общей массы масла или жира.
60. Способ по п.53, где масло представляет собой рафинированное масло.
61. Способ по п.53, где реакция дополнительно включает добавление фосфолипида.
62. Способ гидролиза масла или жира, включающий следующие стадии:
(а) получение композиции, содержащей масло или жир, где масло или жир можно гидролизовать посредством полипептида, обладающего гидролазной активность, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; Н140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(b) добавление полипептида со стадии (а) в композицию, содержащую указанное масло или жир, в достаточном количестве и в достаточных условиях для того, чтобы вызвать гидролиз масла или жира, посредством чего гидролизуют масло или жир.
63. Способ биокаталитического синтеза структурированного липида, включающий следующие стадии:
(а) получение полипептида, обладающего гидролазной активностью, причем указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(b) получение композиции, содержащей триацилглицерид (ТАГ);
(c) приведение полипептида со стадии (а) в контакт с композицией со стадии (b) в условиях, в которых полипептид гидролитически отщепляет остаток карбоновой кислоты в положении Sn2 триацилглицерида (ТАГ), посредством чего получают 1,3-диацилглицерид (ДАГ);
(d) получение R1-сложного эфира;
(e) получение R1-специфической гидролазы, и
(f) приведение 1,3-ДАГ со стадии (с) в контакт с R1-сложным эфиром со стадии (d) и R1-специфической гидролазой со стадии (е) в условиях, в которых R1-специфическая гидролаза катализирует этерификацию положения Sn2, посредством чего получают структурированный липид.
64. Способ биокаталитического синтеза структурированного липида, включающий следующие стадии:
(а) получение полипептида, обладающего гидролазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(b) получение композиции, содержащей триацилглицерид (ТАГ);
(c) приведение полипептида со стадии (а) в контакт с композицией со стадии (b) в условиях, в которых полипептид гидролитически отщепляет остаток карбоновой кислоты в положении Sn1 или Sn3 триацилглицерида (ТАГ), посредством чего получают 1,2-ДАГ или 2,3-ДАГ; и
(а) промотирование перегруппировке остатка карбоновой кислоты в 1,2-ДАГ или 2,3-ДАГ со стадии (с) в кинетически контролируемых условиях, посредством чего получают 1,3-ДАГ.
65. Способ катализа реакции переэтерификации для получения новых триацилглицеридов, включающий следующие стадии:
(а) получение композиции, содержащей полипептид, обладающий 1,3-специфической липазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических или рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке, длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(b) получение смеси триацилглицеридов и свободных жирных кислот;
(c) обработка композиции со стадии (b) полипептидом в условиях, в которых полипептид может катализировать обмен свободных жирных кислот и ацильных групп триацилглицеридов, посредством чего получают новые триацилглицериды, обогащенные указанными жирными кислотами.
66. Способ переэтерификации для получения продукта питания, корма или масла, включающий следующие стадии:
(a) получение реакционной смеси для переэтерификации, которая содержит вещество источника стеариновой кислоты, выбранное из группы, состоящей из стеариновой кислоты, сложных стеариновых моноэфиров низкомолекулярных одноатомных спиртов и их смесей,
(b) получение продукта питания, корма или масла, содержащего триацилглицерид;
(c) получение полипептида, обладающего гидролазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(d) переэтерификация вещества источника стеариновой кислоты и триацилглицерида продукта питания, корма или масла и
(e) отделение компонентов свободных жирных кислот от переэтерифицированных глицеридных компонентов смеси для переэтерификации, чтобы предоставить переэтерифицированный продукт масла и смесь жирных кислот, содержащую жирные кислоты, сложные моноэфиры жирных кислот или их смеси, высвобожденные из продукта питания, корма или масла.
67. Способ получения ДАГ, включающий следующие стадии:
(a) получение композиции масел, содержащей некоторое количество ТАГ,
(b) получение полипептида, обладающего гидролазной активностью, указанный полипептид выбран из группы, состоящей из выделенных, синтетических и рекомбинантных полипептидов, обладающих гидролазной активностью, и указанный полипептид или
i. кодируется либо
(1) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №1 и включающую изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере один полипептид, обладающий гидролазной активностью, либо
(2) нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность, которая гибридизуется в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей SEQ ID №1 и включающей изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех остатков оснований, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, где нуклеиновая кислота кодирует полипептид, обладающий гидролазной активностью; или
ii. обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей с SEQ ID №2 на участке длиной по меньшей мере приблизительно 100 остатков и включает изменения одного, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати или более или всех аминокислотных остатков, указанные в таблице 3, таблице 4, таблице 9, таблице 10, таблице 11, таблице 16 или таблице 23, или
iii. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка D61A; D61E; R72E; R72K; Е116А; E116Q; E116R; Е116Т; E116V; S133A; I151G; I151A; V163R; D164R или их комбинацию, или
iv. содержит аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID №2, но также включает по меньшей мере одну модификацию аминокислотного остатка I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; Е116Т; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; Е194М; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; А218Н; A218S; V223A; А225М; A225Q или их комбинацию;
(с) приведение указанной композиции масел со стадии (а) в контакт с указанным полипептидом со стадии (b) в условиях, достаточных для гидролитического отщепления полипептидом остатка карбоновой кислоты на ТАГ для получения ДАГ.