Генетические и иммунологические аспекты доброкачественных дисплазий молочных желёз

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ ДИСПЛАЗИЙ МОЛОЧНЫХ ЖЕЛЁЗ

И.П. Косолапова, М.Н. Масленникова, К.М. Гудков, И.М. Ордиянц, С.Э. Аракелов, Л.С. Хасханова

Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, 117198, Москва, Россия

Исследование механизмов, регулирующих клеточную пролиферацию, дифференцировку и трансформацию тканей молочной железы является актуальной проблемой в изучении патогенеза пролиферативных заболеваний органов репродуктивной системы. Проведено оригинальное исследование, была определена связь между вариантами гена GPIII6, кодирующего одноименный интегрин, и наличием ДДМЖ. Продемонстрировано, что наличие в генотипе аллеля PL AII гена GPIII6 существенно снижает риск развития ДДМЖ. Среди пациенток с ДДМЖ была выявлена достоверно большая частота гомозиготности по аллелю AI гена GPIII6. Проведена оценка состояния иммунной системы у пациенток с ДДМЖ, С использованием метода определения уровней эмбриотропных антител в сыворотке крови , показана очень высокая частота гипореактивности.

Доброкачественные дисплазии молочных желез (ДДМЖ) не только являются возможным фоном для возникновения рака, но и снижают индекс здоровья женщин, а также ухудшают качество их жизни. В настоящее время выявлено множество факторов риска развития ДДМЖ. Однако их патогенетические механизмы все еще недостаточно изучены.

Одним из перспективных направлений в медицине являются фундаментальные исследования, направленные на углубленное изучение патогенеза пролиферативных заболеваний органов репродуктивной системы на клеточном уровне. В результате экспериментально-клинических исследований, проведённых в 1987-1996 гг., был разработан новый метод оценки состояния иммунной системы. Этот метод основан на определении содержания эмбриотропных антител в крови женщин [4]. Получаемые с помощью метода ЭЛИ-П-тест данные позволяют выявить на повышенный риск нарушений иммунного статуса, что отражает низкий уровень соматического здоровья и позволяет выделить группы риска по развитию пролиферативных заболеваний органов репродуктивной системы.

Результаты проводимых в последнее время многочисленных исследований показывают, что в развитии пролиферативных заболеваний органов репродуктивной системы важная роль принадлежит не только повышеннию клеточной пролиферации, но и нарушению тонких механизмов межклеточных контактов. Принимая во внимание данное положение, особый интерес представляет выявление роли специфических клеточных рецепторов, отвечающих за связь матрикса с внутриклеточными структурами и регуляторными молекулами, контролирующими поведение клеток в механизмах внутри- и внеклеточных взаимодействий. Именно поэтому с целью

выяснения механизмов наследственной детерминированности ДДМЖ для настоящего исследования был выбран ген GPIIIa, который контролирует синтез Р3 субъединицы интегриновых рецепторов.

Интегрин beta-3 (ITGB3), обычно обозначаемый как гликопротеин IIIa (GP IIIa), кодируется одноимённым геном. Ген имеет 14 экзонов, разделённых интронами и представлен двумя аллельными формами: PLAI и PLAII.

Анализируя результаты недавних исследований гинекологической заболеваемости, можно предположить, что гомозиготы по аллелю PLAI гена GPIII6 имеют предрасположенность к нарушению межклеточных контактов, опосредованных белками-интегринами, что, по-видимому, отражается в нарушении процессов пролиферации клеточных пулов в органах репродуктивной системы[10].

Клинический материал и методы исследования. Были обследованы 119 пациенток в возрасте от 18 до 55 лет, обратившиеся в маммологический кабинет при гинекологическом отделении ГКБ №12 (с жалобами или с целью диспансеризации).

В план обследования входили: сбор анамнеза, осмотр по органам и системам, маммография и/или ультразвуковое исследование молочных желез (при наличии показаний - дуктография, пневмоцистография, цитологическое и/или гистологическое исследование), ультразвуковое исследование органов малого таза, исследование крови для определения гормонального профиля, уровня эмбриотропных антител, производилось бактериологическое исследование мазков отделяемого влагалища, определялся аллельный полиморфизма гена GPIII6 .

Рентгеномаммографическое исследование производилось на аппарате «Mammo Diagnost UC» фирмы Philips в прямой и косой проекциях. При сохраненной менструальной функции обследование женщин производилось в первой фазе, на 5-7-й день цикла; у пациенток в менопаузе обследование производилось в любой день. При анализе затемнения обращали внимание на его форму, контур и плотность. Пациенткам старше 35 лет проводили рентгеномаммография, пациенткам моложе 35 лет производилось УЗИ и при наличии показаний - рентгеномаммографию. Ультразвуковая диагностика молочных желёз осуществлялась с помощью аппарата «Sono Diagnost» 360 (Phillips) контактным методом с использованием датчика линейного сканирования частотой 7.5 МГц. При ультразвуковом исследовании определяли форму образования - (правильная, неправильная), контуры (ровный, четкий, размытый), эхогенность (отсутствие, средняя, выраженная), внутреннюю структуру (гомогенная, гетерогенная), а также ретротуморальные феномены, связанные с различной акустической плотностью образования (дорсальное эхо - отсутствует, слабое, умеренное; латеральная тень - имеется или отсутствует). Всем женщинам с выделениями из протоков производили дуктографию. При наличии узловой формы ДДМЖ проводилась пункция кист молочной железы с последующим цитологическим исследованием образцов; биопсия молочной

железы осуществлялась под контролем УЗИ с последующим цитологическим и гистологическим исследованием.

Ультразвуковую диагностику органов малого таза осуществляли при помощи ультразвукового аппарата Aloka SSD-1400 с использованием линейного и вагинального датчиков. При ультразвуковом исследовании определяли форму и размеры матки, структуру миометрия, средние размеры М-эхо. Определяли объем и структуру яичников.

Производилось определение в плазме крови гонадотропных гормонов ФСГ, ЛГ, пролактина, тиреотропного гормона; гормонов щитовидной железы Т3, Т4; половых стероидов - эстрадиола на 5-7-й день менструального цикла (при отсутствии менструаций - в любой день), прогестерона на 21-22-й день цикла.

С целью изучения сывороточной иммунореактивности, отражающей количество и афинность некоторых видов естественных эмбриотропных аутоантител, взаимодействующих с белками-регуляторами эмбриогенеза, нами был применён метод «ЭЛИ-П-тест» (ELISA-detected Probably of pathology), основанный на стандартном иммуноферментном анализе. Для анализа с помощью метода ЭЛИ-П-тест использовалась свежая сыворотка крови обследуемой пациентки. Результаты определения уровней аутоантител к белкам ОБМ, S100, АСВР 14/18 и МР65 в образцах сыворотки обследуемых выражались в процентах от уровня реакции контрольной сыворотки (этанола) с указанными белками.

Исследование крови для выявления аллельного полиморфизма гена GPIII6 проводилось методом полимеразной цепной реакции.

Результаты обследования были закодированы и обработаны с помощью программы STATISTICA ver. 6.0 фирмы STATSOFT U.S.A.

Результаты исследования и их обсуждение. На основании комплексного исследования были выделены три группы женщин: с узловой (40 пациенток), диффузной (43) формами ДДМЖ и здоровые женщины (36), составившие группу контроля. Критериями включения в группу контроля были отсутствие жалоб, отсутствие клинических проявлений, отсутствие патологического процесса в молочных железах при клиническом обследовании.

Средний возраст пациенток с ДДМЖ приходился на поздний репродуктивный и пременопаузальный периоды. Большинство обследованных женщин входили в возрастную категорию 41-50 лет (66,4%), что подтверждает данные многих авторов (Лисьева С.Д.,1998, Певгова Г.Ю. с соавт., 2002, Силенко С.Г.,2004). Достоверных различий возраста пациенток с ДДМЖ и здоровых женщин не было, он составил в среднем 41,2±8,9 лет (р>0,05).

При анализе соматического здоровья пациенток выявлено, что каждая из обследуемых женщин, включая таковых в группе контроля, имела одно или несколько хронических экстрагенитальных заболеваний.

Избыток массы тела наблюдался более, чем у половины обследуемых пациенток, 35,4% женщин страдали ожирением. Необходимо отметить то, что в группе контроля не наблюдалось ни одной пациентки с избыточной массой, а в

группах с заболеваниями молочных желёз были пациентки с дефицитом массы тела.

Большинство обследованных женщин имели в анамнезе хронические заболевания печени и желудочно-кишечного тракта. Хронические заболевания ЖКТ наблюдались более чем у половины обследуемых женщин(60,5%). Достоверных различий в группах выявлено не было. Заболевания мочевыводящих путей имели 21,0% пациенток с ДДМЖ, достоверно реже страдали пациентки группы контроля (16,8%). Гипертоническая болезнь не наблюдалась у пациенток группы контроля; у пациенток же с наличием ДДМЖ наблюдалась в среднем в 5,0% случаев, что, однако, не превышает среднепопуляционные данные. Гипотиреоз достоверно чаще, чем в группе контроля, наблюдался у пациенток с диффузной формой ДДМЖ (16,2%). Пациентки с узловой формой ДДМЖ чаще страдали гипертиреозом (7,5%).

Анализ менструальной функции показал, что у пациенток с ДДМЖ встречалось раннее менархе (38,7%). Позднее менархе встречалось всего у 8,4% обследованных пациенток. Нарушения менструального цикла по типу гиперполименореи достоверно чаще наблюдалась у пациенток в группе с диффузной формой ДДМЖ (18,2%). Необходимо отметить, что в данной группе у 59,4% пациенток миома матки, и у 15,6% аденомиоз. Также следует отметить, что среди обследуемых женщин были неменструирующие - 8 (6,7%); у шестерых из них произведена надвлагалищная ампутация матки; у двоих -естественная менопауза 1-2 года. Недостаточность лютеиновой фазы менструального цикла была характерна больше для пациенток с диффузной формой ДДМЖ (31,8%). Ановуляторный менструальный цикл наблюдался с одинаковой частотой у пациенток как с узловой, так и с диффузной формой ДДМЖ (22,6%). Для подавляющего большинства пациенток группы контроля по данным тестов функциональной диагностики был характерен двухфазный менструальный цикл (92,7%). Таким образом, представленные результаты позволяют утверждать, что нарушения овуляторной функции яичников играют большую, но не основопологающую роль в возникновении ДДМЖ.

Интересным оказалось изучение гормонального статуса пациенток. По многочисленным литературным данным основной причиной возникновения ДДМЖ является гормональный дисбаланс (Головин Д.И., 1989; Бурдина Л.М., 1993). Данные гормонального исследования показали, что у большинства пациенток с ДДМЖ соотношение ЛГ/ФСГ нарушено и приближено к 1, что свидетельствует о дисбалансе продукции гормонов гипофиза. В группе контроля не отмечено нарушения уровней гонадотропинов.

По предположению Л.М. Бур диной (2001), в возникновении мастопатии играет роль не абсолютно повышенный уровень пролактина в плазме крови, а характер его взаимосвязи с рецепторами молочной железы. Это предположение было подтверждено исследованиями Т.Н. Ивановой (2001), Л.Х. Хасхановой (2003).

В нашем исследовании несколько повышенное содержание пролактина в плазме крови наблюдалось чаще у пациенток II и III групп, однако средние

значения уровня пролактина не превышали нормативные показатели.

Уровень эстрадиола был повышен у пациенток как с узловой, так и с диффузной формой ДДМЖ. Содержание прогестерона в плазме крови было нормальным только у пациенток группы контроля. Однако во всех трёх группах с наличием ДДМЖ оказалось значительное количество женщин с нормальным уровнем прогестерона в плазме крови. Анализ состояния тиреоидной системы показал, что функциональные нарушения в ней отмечались чаще у пациенток с диффузной формой ДДМЖ. По мнению исследователей (К_Ш80 J., К_Ш80 1.,1996) беременность и роды оказывают защитное действие на ткань молочной железы. Это связано в первую очередь с защитным действием прогестерона, уровень которого повышается во время беременности. Беременность вызывает изменения на уровне генома, которые навсегда остаются в молочной железе и влияют на такую специфическую функцию, как чувствительность к канцерогенам. У рожавших женщин пролиферативная активность долек впоследствии значительно ниже, чем у нерожавших. Большинство исследуемых женщин имели в анамнезе 2-3 беременности. Отрицательное влияние на состояние молочных желез имеет преждевременное прерывание беременности, которое всегда сопровождается изменениями гормонального фона. Регрессивные изменения, возникающие в результате прерывания беременности, происходят неравномерно. Развитие желез в этот период может принять извращенный характер либо на каком-то локализованном участке, либо на большом протяжении, что, в свою очередь, может явиться пусковым моментом для формирования диффузных или узловых дегенеративных изменений. Особенно велик риск развития заболевания при самопроизвольных абортах. Среди пациенток с диффузной формой ДДМЖ 14% имели в анамнезе более пяти абортов. Каждая пятая пациентка с ДДМЖ имела в анамнезе аборты до первых родов. Среди пациенток с узловой формой ДДМЖ только у 27% не производились аборты. Представленные результаты позволяют нам отнести большое число абортов к факторам риска развития ДДМЖ.

Влияние характера послеродовой лактации на возникновение заболеваний молочной железы до сих пор остаётся предметом дискуссии. Несомненно, полноценный лактационный период выполняет протективную роль в возникновении заболеваний молочных желёз, а осложнения послеродовой лактации в виде мастита или лактостаза негативно отражаются на состоянии молочных желёз. Короткий период лактации и отсутствие лактации относят к неблагоприятным факторам (Мезин В.Я., 1997, Бурдина Л.М., 1991). Однако длительный период лактации более года, также провоцирует заболевания молочной железы (Серов В.Н., Тагиева Т.Т., 1999; Иванова Т.Н.,2001). Результаты нашего исследования подтверждают оба мнения. Более трети пациенток не осуществили лактационную функцию; более половины женщин кормили грудью до 4 месяцев; и только у 10% пациенток время лактации составило 8-12 месяцев. У 5% пациенток с ДДМЖ время лактации было длительным - 12-24 месяца.

На общность патогенеза гинекологических и маммологических заболеваний указывают много авторов. По данным В.Е. Радзинского (2004), у 81 % больных ДДМЖ имеется сочетание заболевании молочных желез и гинекологических болезней, что диктует необходимость комплексной оценки данных обследования репродуктивной системы для определения дифференцированных подходов к выбору методов и средств лечения. Исследования Т.Н. Ивановой (2001); Л.Х. Хасхановой (2003) и др. авт. указывают на высокий риск развития ДДМЖ, особенно узловых форм, у женщин с миомой матки, аденомиозом, гиперплазией эндометрия.

Всем больным с ДДМЖ было произведено гинекологическое обследование, включающее оценку как органических, так и функциональных изменений в репродуктивной системе.

Более 80% пациенток с ДДМЖ и с наличием гинекологических заболеваний имели в анамнезе доброкачественные заболевания шейки матки. Суммарный процент заболеваний тела матки составил 110%, т.е. практически каждая женщина групп с наличием ДДМЖ (II и III группы) имела одно или несколько заболеваний тела матки. Миома матки наблюдалась у 40% пациенток с диффузной формой ДДМЖ и у 35% пациенток с узловой формой ДДМЖ. Аденомиоз наблюдался у 31% и 35% пациенток с диффузной и узловой формой ДДМЖ соответственно. У 28% пациенток с диффузной формой ДДМЖ имелись в анамнезе гиперпластические процессы эндометрия. Воспалительные заболевания матки и придатков имели в анамнезе 30% пациенток с ДДМЖ. При анализе влагалищного биотопа более чем у трети обследуемых пациенток с ДДМЖ был выявлен дисбиоз флоры.

По результатам ЭЛИ-П-теста все пациентки были разделены на 3 группы: гипореактивный анализ крови, нормореактивный и гиперреактивный. Иммунореактивность исследуемых антител определяли в процентах относительно иммунореактивности контрольной сыворотки, выраженной в единицах оптической плотности. Нарушения в иммунологическом статусе были выявлены у подавляющего числа пациенток.

Гипореактивное состояние иммунитета объясняется повышенным антителообразованием, свидетельствующим о персистенции хронической инфекции. У большинства пациенток - высокий коэффициент гинекологической заболеваимости (1,84), а индекс соматического здоровья низкий даже в группе контроля. Пациентки группы контроля достоверно чаще, чем пациентки с узловой формой ФКМ, были нормореактивны, но даже и в этой группе у 72,2% пациенток снижена продукция эмбриотропных аутоантител.

Среди пациенток с ДДМЖ 79% с диффузной формой и 70% с узловой формой были гипореактивными, 11% были гиперреактивными, и только у 9% пациенток с диффузной формой ДДМЖ продукция эмбриотропных антител соответствовал норме; среди пациенток с узловой формой ДДМЖ 20% оказались нормореактивными.

Наиболее характерными были сочетанные изменения в содержании антител к белкам ОБМ, АСВР 14/18 и S-100. Содержание антител к белку ОБМ

было снижено в 82% случаев, т.е. у всех гипореактивных пациенток.

Итак, проведённое нами изучение иммунного статуса показало, что стойкие изменения со стороны иммунной системы могут выступать в качестве интегрального показателя физиологического неблагополучия, вне зависимости от причины его вызвавшего, что, в свою очередь, оказывает огромное влияние на состояние молочных желёз.

Нами был проведён генетический анализ, направленный на изучение полиморфизма гена GPIIIa у здоровых женщин и пациенток с ДДМЖ. Проведённый анализ показал, что большинство пациенток с наличием заболевания молочных желез (99%) являлись гомозиготами по аллелю PLAI.

Согласно современным мировым данным, среднепопуляционная частота носительства аллеля PLAII гена GPIII6 составляет 14,5%. В нашем исследовании она составила в группе контроля- 27.7%; в группе с диффузной формой ДДМЖ - 2,3%; в генотипе пациенток с узловой формой ДДМЖ присутствовала одна аллельная форма- PL-AI гена GPIIIa. В среднем во всех группах с наличием заболевания молочных желез частота носительства аллеля PLAII гена GPIII6 составила 2,5%, что в 7,5 раза меньше, чем в среднем в популяции.

Таким образом, можно предполагать, что носительство аллеля AIIAII по гену GPIII6 исключает вероятность развития диспластических процессов молочных желёз. Носительство аллеля PLAIAI может являться генетическим фактором риска нарушения контроля над делением клеток эпителия молочных желез, и соответственно, способствовать развитию различных форм гиперпластических процессов.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Бурдина Л. М. Особенности состояния молочных желез и гормонального статуса у больных с доброкачественными гиперпластическими заболеваниями внутренних половых органов//Маммология. -2004. -№ 1. -С.4-11.

[2] Зубкин В.И. Патогенез, диагностика, комплексное лечение и профилактика рецидивов доброкачественных дисплазий молочных желёз. Автореф. дис...д-ра мед. наук.- М., 2004. -23с.

[3] Иванова Т.Н. Нарушения репродуктивного здоровья женщин с доброкачественными заболеваниями молочных желёз. Автореф. дисс.. канд. мед. наук. М.; 2001.-19с.

[4] Полетаев А.Б. иммунологический гомункулус (иммункулус) в норме и при патологии. Биохимия, 2002, 67, вып.5, с. 721-731.

[5] Радзинский В.Е., Иткес А.В., Галина Т.В., Карпова Е.В., Хотайт Г.Я., Мяндина Г.И. Корреляция различных форм гестоза с генотипом по гену GPIIIa -цепи интегрина. //Акушер. и гинекол.- 2001. - №6. - C.53-56.

[6] Ровенский Ю.А. Клеточные и молекулярные механизмы опухолевой инвазии. «Биохимия». - 1998. - 63, - С.1204-1221.

[7] Силенко С.Г. Гинекологическое здоровье женщин с доброкачественными заболеваниями молочных желёз в постменопаузе: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. -М., 2004.- 15 с.

[8] Хасханова Л.Х. Прогнозирование, ранняя диагностика и лечение нераковых заболеваний молочных желёз после хирургического лечения гинекологических заболеваний. Автореф. дисс.. канд. мед. наук. - М.; 2003.-15с.

[9] Bowen J.A., Hunt J.S. The role of integrins in reproduction. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. -2000. - 223, №4. - P. 331-343.

[10] Lebrun P., Baron V., Hauck C.R. et al. Cell adhesion and focal adhesion kinase regulate insulin receptor substrate-1 expression. // J. Biol. Chem. - 2000. - 30. - [epub ahead of print].

[11] Russo I.H., Russo J. Role of pregnancy and chorionic gonadotropin in breast cancer prevention. IV European congress of menopause, Ed. s M.H. Bikhauser, Rosenbaum, -Vienna, Eska, 1998, P. 133-142.

IMMUNE AND GENETIC ASPECTS OF BREAST DESORDERS

I.P. Kosolapova, M.N. Maslennikova, K.M. Gydkov, I.M. Ordiyanc, S.E. Arakelov, L.S. Hashanova

Department of Obstetrics and Gynecology with the course of Perinathology of Peoples' Friendship University of Russia

Mikluho-Maklaya st., 8, Medical Faculty, 117198, Moscow, Russia

Study of mechanisms of regulation of cell proliferation, differentiation and transformation, including integrin proteins, is an important problem in pathogenesis of benign breast disease.

We performed an original study to evaluate relationship between gene GPIII6 variations (and the same called integrin) and the presence of benign breast disease. In healthy patients we found higher prevalence of PL AII allele of GPIII6 gene. A significantly higher prevalence of homozygotes in AI allele of GPIII6 was shown in patients with benign breast disease. A very high prevalence of increased levels of embryotropic antibodies was found in patients with benign breast disease.