Особенности доклинических исследований на этапе разработки невирусных векторных конструкций, предназначенных для целей генной терапии

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.3+615.072

Особенности доклинических исследований на этапе разработки невирусных векторных конструкций, предназначенных для целей генной терапии

М.В. Супотницкий, Е.В. Горбунова, Л.В. Корсун, Е.В. Лебединская

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 127051, Москва, Россия

Резюме: Требования, предъявляемые при доклиническом исследовании лекарственных средств генной терапии, в настоящее время разработаны только для векторов на основе рекомбинантных вирусов. В работе рассмотрены особенности невирусных генотерапевтических векторных конструкций, которые необходимо принимать во внимание при доклинических исследованиях. Невирусная векторная конструкция состоит из трансгена (плазмидной ДНК с клонированным терапевтическим геном, управляемым через регионы транскрипции и инициации мРНК, регуляции терминации транскрипции и др.), включенного в специальный комплекс с другими высокомолекулярными соединениями, определяющими ее стабильность и способность к направленному введению генов в пораженные органы или клетки. К настоящему времени сложились три направления их конструирования: комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и катионными полимерами (полиплек-сы); комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и липидами (липоплексы); комплексы на основе наночастиц двуокиси кремния. Для обеспечения качества и безопасности таких препаратов, и проверки их подлинности, могут использоваться следующие показатели: химическая структура кополимеров, формирующих векторную конструкцию; ДНК-связывающая способность векторной конструкции; весовое соотношение ДНК/носитель; стабильность векторной конструкции; внутриклеточная миграция векторной конструкции; эффективность трансфекции векторной конструкции; гидродинамический диаметр; морфология; деградабельность полимеров, входящих в состав полиплексов; резистентность векторной конструкции к ДНКазе I, сыворотке крови и гепарину; дзета-потенциал, цитотоксичность векторной конструкции. Необходимо включение в Государственную фармакопею Российской Федерации соответствующих валидированных методов исследования.

Ключевые слова: полиплексы, липоплексы, малые интерферирующие РНК, трансген, вектор, генная терапия, система доставки генов, наночастицы двуокиси кремния, дзета-потенциал.

Библиографическое описание: Супотницкий МВ, Горбунова ЕВ, Корсун ЛВ, Лебединская ЕВ. Особенности доклинических исследований на этапе разработки невирусных векторных конструкций, предназначенных для целей генной терапии. Ведомости научного центра экспертизы средств медицинского применения 2014; 3: 30—38.

ASPECTS OF PRE-CLINICAL STUDIES AT THE STAGE OF DEVELOPING NON-VIRAL VECTOR CONSTRUCTIONS DESIGNED FOR GENE THERAPY М.У. Supotnitskiy, E.V. Gorbunova, L.V. Korsun, E.V. Lebedinskaya

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russia

Abstract: The requirements for preclinical studies of gene therapy medicines are currently developed only for vectors based on recombinant viruses. The present paper describes the characteristics of non-viral gene therapy vector constructs that need to be taken into account in preclinical studies. Non-viral vector construct consists of a transgene (plasmid DNA with a cloned therapeutic gene controlled by mRNA transcription initiation regions, regulation of transcription termination, etc.), included in a special complex with other macromolecular compounds, determining its stability and capacity for targeted gene introduction into the affected organs or cells. At the moment there are three construction directions: complexes formed by nucleic acids and cationic polymers (polyplexes); complexes formed by nucleic acids and lipids (lipoplexes); complexes based on silica nanoparticles. To ensure the quality and safety of these medicines at all stages of life cycle and confirm the identity the following parameters can be used: cytotoxicity of vector construction; chemical structure of copolymers forming the vector construct; DNA-binding ability of vector construct; DNA/carrier weight proportion; stability of the vector construction; intracellular migration of vector construction; transfection efficiency of vector construction; hydrodynamic diameter; morphology; degradation of polymers within polyplexes; resistance of vector construct to DNAase I, blood serum and heparin; zeta-potential. It is necessary to include the appropriate validated technologies in the State Pharmacopoeia of the Russian Federation.

Key words: gene carrier; gene delivery; block copolymer; polyplex micelle; polymeric micelle; gene delivery system; gene therapy; lipoplex micelle; siRNA; small interfering RNA; DOPE.

Bibliographic description: Supotnitskiy MV, Gorbunova EV, Korsun LV, Lebedinskaya EV. Aspects of pre-clinical studies at the stage of developing non-viral vector constructions designed for gene therapy. Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products Bulletin 2014; 3: 30-38.

К генной терапии относят способы лечения наследственных болезней путем введения в ткани или клетки пациента генетической информации (генов,

регуляторных элементов, малых интерферирующих РНК (siRNA) и др.) с целью замещения генных дефектов, либо выключения генов, экспрессия кото-

рых сопровождается патологическими эффектами. В конце 1990-х гг. способы генной терапии получили применение для лечения инфекционных болезней, что связано с изменением характера эпидемических процессов [1—3]. Накопленный к настоящему времени опыт внедрения в клиническую практику генной терапии показал, что проведение доклинических исследований, не учитывающее всех особенностей действия генотерапевтических препаратов, может привести к гибели пациентов при последующем изучении их безопасности и эффективности на этапе клинических исследований [4, 5]. Однако требования, предъявляемые к доклиническим исследованиям лекарственных средств (ЛС) генной терапии, в настоящее время разработаны только для тех ЛС, в которых используют в качестве векторов рекомбинантные вирусы [6, 7]. В монографиях Европейской фармакопеи и фармакопеи США невирусные векторы рассмотрены лишь как рекомби-нантные плазмидные векторы, но не как комплексы плазмидной ДНК с другими высокомолекулярными соединениями, определяющими их стабильность и способность к направленному введению генов в пораженные органы или клетки.

Цель настоящей работы — рассмотреть особенности невирусных векторных конструкций, предназначенных для генной терапии соматических и инфекционных болезней человека, которые необходимо принимать во внимание при доклинических исследованиях еще на этапе их разработки.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ СОЗДАНИЯ

НЕВИРУСНЫХ ВЕКТОРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ

Развитие данного направления конструирования векторов, предназначенных для генотерапии, связано с серьезными недостатками трансгенных конструкций на основе вирусных векторов, препятствующих их клиническому применению (антигенность, онкогенность и ограниченная емкость для включения трансгенов и др.) [8].

Разработчики невирусных векторных конструкций, прежде всего, учитывают то, что сахарофосфат-ный остов молекул плазмид располагается по их периферии полярными группами наружу, придавая им анионные свойства и гидрофильность. При физиологических значениях рН ДНК несет отрицательный заряд, отталкивающий ее от отрицательно заряженной наружной поверхности клеточной мембраны. В сыворотке крови плазмида, включающая транс-ген, быстро деградирует под воздействием нуклеаз. Кроме того, плазмиды не способны специфически узнавать клетки-мишени [9]. Поэтому для специфической доставки генов в клетки необходимо включение плазмидной ДНК в специальные комплексы с другими высокомолекулярными соединениями, определяющими их стабильность и способность к направленному введению генов в пораженные органы или клетки.

К настоящему времени сложились три направления конструирования невирусных векторных конструкций:

комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и катионными полимерами (полиплексы, ро1ур1ехе8);

комплексы, образованные нуклеиновыми кислотами и липидами (липоплексы, Ирор1ехе8);

комплексы, имеющие в составе наночастицы двуокиси кремния.

На рисунке 1 показаны общие механизмы формирования первых двух типов таких комплексов. Основные ограничения для доставки генов в геном человека с помощью невирусных векторных конструкций и способы их преодоления обобщены в таблице 1.

Рис. 1. Механизмы формирования невирусных векторных конструкций и их проникновения в клетку [10] А. Формирование комплекса: имеющие отрицательный заряд нуклеиновые кислоты электростатически взаимодействуют с катионными липидами или поликатионами. В результате формируются положительно заряженные липоплексы или полиплексы.

Б. Положительно заряженные комплексы связываются со специфическими рецепторами (при наличии на их поверхности макромолекул, обладающих свойствами специфического лиганда) или непосредственно с поверхностью клетки. Комплексы проникают в клетку по механизму эндоцитоза. После высвобождения из эндосомы и разборки комплекса, нуклеиновая кислота проникает через поры в ядро клетки

В 1990-е гг. разработаны типовые структуры невирусных векторных конструкций, предназначен -ные для направленной доставки трансгенов в целевые клетки (в печень, в мозг и надпочечники, в медуллярные двигательные нейроны, в костные ткани, в гладкую мускулатуру кровеносных сосудов, в опухоли эндотелия и др.). Одновременно оптимизирована структура трансгена. Для того чтобы ген мог

Таблица 1

ОСНОВНЫЕ ОГРАНИЧЕНИЯ ДЛЯ ДОСТАВКИ ИСКУССТВЕННЫМИ ВЕКТОРНЫМИ СИСТЕМАМИ ГЕНОВ В ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБЫ ИХ ПРЕОДОЛЕНИЯ [9]

Ограничение Способ преодоления

Доставка генов к клетке и клеточный таргетинг

Деградация ДНК нуклеазами сыворотки крови Конденсация ДНК или ее инкапсуляция катионными полимерами или липидами

Неспецифическое взаимодействие с компонентами крови Экранирование поверхности ДНК оболочкой из гидрофобных полимеров

Неспецифическое связывание тканями векторов, включающих трансген Введение специфических лигандов в поверхность невирусной векторной конструкции, использование особенностей васкуляризации отдельных тканей

Доставка генов внутрь клетки и их продолжительная экспрессия

Неэффективное поглощение ДНК клеткой Введение в поверхность невирусной векторной конструкции специфических лигандов, усиливающих рецептор-опосредованный эндоцитоз

Выход трансгена из эндосомы Включение мембрано-активных пептидов в оболочку невирусной векторной конструкции (например, аналогов меллитина). Формирование поликатионных «протоновых губок»

Транспорт трансгена из цитозоля в ядро Проникновение трансгена в клетку в составе наночастиц ускоряет их прохождение через цитозоль. Ядерная локализация сигнальных пептидов

Подавление экспрессии гена Использование миникольцевой ДНК, лишенной бактериальных последовательностей

Утрата трансгена Минихромосомы с эписомальными элементами для длительного поддержания трансгена в цитоплазме клетки. Экспрессионная кассета для трансгена, интегрирующаяся с хромосомой человека

Ответы со стороны организма человека и токсичность конструкции

Острая токсичность Экранирование поверхности для избежания агрегации в крови. Удаление контаминирующих поликатионов, бактериальных ЛПС

Цитотоксичность и длительное токсическое действие Использование в качестве носителей трансгенов биодеградируемых катионов

Клеточный иммунный ответ Временная иммуносупрессия реципиента

автономно функционировать в данной ткани, в него включают специфичные для нее регионы транскрипции и инициации мРНК, регуляции термина-ции транскрипции.

Принципиально различаются и способы доставки плазмидной ДНК и невирусной векторной конструк-

ции в пораженные ткани органа-мишени. Плазмид-ную ДНК вводят непосредственно в пораженную ткань путем электропорации, бомбардировки частицами, магнетофекции, струйного введения под давлением и др. (рис. 2).

Рис. 2. Прямое введениерекомбинантного плазмидного вектора в миокард [11]

А. Путем бомбардировки частицами

Рис. 3. Непрямое введение невирусной векторной конструкции в глубокие отделы мозга [12]

А. Векторная конструкция

Рис. 4. Схема конструирования иммунолипосом, способных после внутривенного введения проникать в ядра нейронов ЦНС [13]

A. Суперскрученная плазмидная ДНК, включенная в имму-нолипосому. Кодирующая трансген последовательность (codingsequence, cds) экспрессируется под контролем промотора (promoter, Pro) вируса SV40 и полиаденилирующей последовательности (polyadenylation sequence, pA). Приблизительно 1—2 % цепей PEG сшиты с мАТ, специфичными к таргетируе-мым рецепторам (R), запускающим транспорт иммунолипосо-мы через биологические барьеры в условиях in vivo.

R1 — рецептор трансферрина, опосредующий трансцитоз через сосудистый эндотелий; R2 — рецептор инсулина, опосредующий эндоцитоз иммунолипосомы через мембраны клеток интракраниальной нейроэпителиальной опухоли (глиомы). Б. Трансмиссионная электронная микроскопия иммунолипосомы. Мышиные IgG, сшитые с концами цепей PEG2000 на поверхности иммунолипосомы и частицами золота диаметром 10 нм. Полоса соответствует 20 нм.

B. Трехбарьерная модель генной терапии мозга

Для доставки невирусных векторных конструкций используют непрямые способы: ингаляционный, эн-теральный, внутривенный, ретроградный и др. Сама невирусная векторная конструкция создается таким образом, что бы она была способна проходить через физиологические барьеры организма человека. На

рисунках 3 и 4 показаны два разных подхода преодоления барьера между кровеносной системой и центральной нервной системой.

Полиплексы. Полимеры, используемые для конструирования полиплексов, делятся на две группы: деградируемые и недеградируемые. Из недеградиру-емых полимеров разработчики невирусных векторных конструкций наиболее часто используют поли-этиленимин (polyethylenimine; PEI,) с молекулярной массой (ММ) 22 кДа. Он растворим в воде, и состоит из множества этиленаминовых блоков (ethylenamine units), несущих положительный заряд. Использование PEI позволяет конструировать полиплексы с высокой плотностью положительного заряда на поверхности. Однако у деградируемых полимеров есть важное преимущество перед недеградируемыми — они менее токсичны. К ним относятся поли-Ь-лизин [poly(L-lysine), PLL] и его аналоги. Их деградируе-мость обусловлена включением в структуру полимера групп, чувствительных к гидролизу (сложные эфи-ры, ацетали или гидразоны), разрушающиеся внутри клетки под воздействием низких значений рН, ферментов и продуктов метаболизма [10, 13].

В конце 1990-х гг. разработаны технологии, позволяющие получить наноразмерные формы полиплек-сов (около 15 нм, т.е. размера глобулярных белков и рецепторов клеток) [14]. Нанополиплексы размером менее 25 нм эффективно трансфецируют неделящие-ся клетки и доставляют гены в ядро клетки благодаря тому, что их размер меньше среднего диаметра пор мембраны ядра клетки. Нанополиплексы стабильны в солевых растворах. Конденсированный пептид, содержащий в своей структуре тридцатимерный полилизин с цистеином на N-конце, к которому «пришит» 10-кДа ПЭГ, при температуре 4 °C стабилен в солевом растворе более трех лет; 9 месяцев он сохраняет свои основные свойства при комнатной температуре и один месяц — при температуре 37 °C [15].

После взаимодействия полиплексов с поверхностью клетки, их захватывают эндосомы. Но в отличие от вирусов, полиплексы обладают плохой способностью освобождаться из эндосом и в дальнейшем подвергаются деградации в лизосомальных компартмен-тах (lysosomal compartments) клетки [16]. Поэтому в их состав вводят непротонированные амины (например, PEI). Они создают так называемый протон-поглоща-ющий эффект (proton sponge effect), препятствующий закислению среды в эндосомах [17]. Протон-погло-щающий эффект вызывает приток в эндосому ионов хлора и повышение осмотического давления внутри эндосомы. Эндосома разбухает, ее мембрана разрывается, векторная система проникает в цитоплазму клетки-мишени (рис. 5) [18].

Производные PEI с ММ 25 кДа и более обладают выраженной токсичностью для клеток в условиях in vitro. В то же время полимеры с меньшей ММ формируют более эффективные и менее токсичные невирусные векторные конструкции. Высокомоле-

Рис. 5. Протон-поглощающий эффект при высвобождении полиплекса из эндосомы [26].

Разрыв эндосомы происходит в результате притока ионов хлора и повышения внутреннего осмотического давления

кулярные РЕ1, производные от низкомолекулярных РЕ1, менее токсичны, и искусственные векторные системы на их основе обладают большей трансфе-цирующей активностью. Полиплексы, полученные путем комплексации ДНК с линейными РЕ1, формируют векторные системы, активные при внутривенном введении. Ветвящиеся производные РЕ1 имеют большую токсичность и меньшую трансфецирую-щую активность, чем линейные. На их основе путем формирования поперечных сшивок формируют стабильные наночастицы, пригодные для ингаляционной доставки генов в организм человека. Для улучшения таргетирующей способности невирусных векторных конструкций РЕ1 конъюгируют с инертными полимерами, такими как полиэтиленгликоль (ПЭГ) с ММ 5 кДа и декстраном, уменьшающих заряд на их поверхности и, соответственно, неспецифическое взаимодействие полиплекса с тканями организма человека при условии введения в их поверхность специфического лиганда [19].

Липоплексы. Липоплексы имеют общую структуру: положительно заряженная гидрофильная «голова» и отрицательно заряженный гидрофобный «хвост» соединяются через линкер. Наиболее часто в таких соединениях в качестве гидрофильной «головы» используются вторичные и четвертичные амины, или четвертичные аммониевые соли; реже — гуанидино-вые, имидазольные, фосфорные, пиримидиновые и мышьяковистые группы. Положительно заряженная «голова» необходима для связывания с отрицательно заряженными фосфатными группами нуклеиновых кислот. Для уменьшения агрегации липосом исследователи избегают увеличения их концентрации в коллоидном растворе более 5 мг/мл (по содержанию ДНК) и добавления к ним хелатирующих агентов и солей. Такие растворы должны обладать нулевой ионной силой и содержать декстран [19].

Гидрофобные «хвосты» липоплексов обычно бывают двух типов по своим гидрофобным группам: алифатические цепи и холестериновые (холестерин и другие типы стероидных колец). Между гидрофиль-

ными и гидрофобными группами через эфирные, сложноэфирные, карбаматные и аминные группы формируются биодеградируемые связи. Распространенными в невирусных векторных конструкциях данного типа колипидами (colipids) являются холестерин и 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine (DOPE). Вклад этих липидов-помощников («helper» lipids) в катионопосредованный эндоцитоз зависит от структуры катионных липидов. Некоторые липиды в формировании структур, трансфецирующих клетки-мишени, зависимы от DOPE. В тоже время другие катионные липиды, имеющие двойные связи, способны самостоятельно формировать бислойные или мицеллярные структуры, обладающие трансфекци-онной активностью.

Катионные липосомы, содержащие холестерин, разрабатывались для применения в условиях in vivo. Присутствие в мембране липосомы холестерина стабилизирует ее структуру и снижает деструктивную активность компонентов сыворотки крови. Высокой трансфецирующей способностью обладают липо-сомы с выраженной мембранной текучестью. Использование DOPE в качестве колипида увеличивает трансфецирующую способность липосом и облегчает освобождение липоплекса из эндосомы через дестабилизацию ее мембраны. Далее происходит деком-плексация липосомы с высвобождением из нее ДНК трансгена. Вследствие избыточного поверхностного заряда период полужизни катионных липосом при их циркуляции в крови непродолжителен [19].

Липоплексы имеют тенденцию к накоплению в кровеносных сосудах легочной ткани, преимущественно трансфецируя эндотелий и эпителиальные клетки дыхательных путей. Для увеличения длительности циркуляции липоплексов в крови человека и увеличения количества поражаемых клеток-мишеней, находящихся вне легочной ткани, разработчики липоплексов понижают их поверхностный заряд путем добавления гидрофильных и нейтрально заряженных полимеров, таких как ПЭГ. Введение в состав липосомы галактолипидов повышает их троп-

ность к паренхиматозным тканям. Липосомы, содержащие DC-Chol (dimethylaminoethane-carbamoyl-cholesterol), обладают повышенной тропностью к клеткам гиппокампа головного мозга1 [20]. Другой путь таргетирования липоплексов — введение в их состав специфических антител. Такие комплексы называются ПЭГилированными иммуносомами (PEGylated immunoliposomes, PILs). Они сохраняют коллоидную стабильность при внутривенном введении, и эффективно доставляют гены в ЦНС [21, 22]. Липоплексы менее стабильны, чем полиплексы [23].

Векторные конструкции на основе частиц двуокиси кремния. Развитие этого направления создания невирусных векторных конструкций прослеживается с 2005 г. [24]. Их основными преимуществами перед липо- и полиплексами разработчики считают низкую токсичность, контролируемость размеров и простоту приготовления [25]. Они идеально подходят для ингаляционного введения трансгенов.

Для получения векторов на основе частиц двуокиси кремния Cheang Tuck-yun и соавторы [25] кова-лентно «сшили» с поверхностью наночастицы двуокиси кремния силановое соединение аминопропилт-риэтоксисилан (aminopropyltriethoxysilane, APTES)2. В результате на поверхности кремниевой частицы формировалась подложка, которая за счет аминокислотных концов молекулы APTES способна электростатически взаимодействовать с белками и двуните-вой плазмидной ДНК. Благодаря высокой способности APTES растворяться в клеточных мембранах такая наночастица легко проходит в цитоплазму клетки. Сорбирование на ее поверхности специфического лиганда нацеливает вектор на определенные клетки или ткани. Массовое соотношение двуокиси кремния и плазмидной ДНК в таких конструкциях 30:1. Их средний размер - 174,5 нм (рис. 6).

КРИТЕРИИ ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ

НЕВИРУСНЫХ ВЕКТОРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ

При разработке критериев надо учитывать то обстоятельство, что до настоящего времени геноте-рапевтами не созданы невирусные векторные конструкции, пригодные для клинического применения во всех случаях (табл. 1). Основными недостатками таких векторов являются сложность создания высоких концентраций трансгена в клетках-мишенях и слабая изученность механизмов, обеспечивающих

1 Гиппокамп — центральная часть лимбической системы — комплекса структур среднего, промежуточного и конечного мозга, участвующих в организации висцеральных, мотивационных и эмоциональных реакций организма.

2 Силаны (кремневодороды, гидриды кремния) — соединения кремния с водородом общей формулы 5п^2п+2. Аминопропилтриэтокси-силан используется в стекловолоконной и лакокрасочной промыш-ленностях. Улучшают адгезию различных полимеров и покрытий (акрилаты, алкиды, полиэфиры, полиуретаны) к неорганическим субстратам (стекло, алюминий, сталь и др.). Повышают водостойкость и антикоррозионную устойчивость лакокрасочных материалов.

Рис. 6. Невирусные векторные конструкции на основе частиц двуокиси кремния [25]

А. Увеличение 150 000раз. Б. Увеличение 160 000раз

эффективный транспорт векторной конструкции в цитоплазме клетке и проникновения трансгена в ее ядро [26].

Анализ научной литературы показал разный «возраст» разработок, на основе которых создаются невирусные векторные конструкции [15, 19, 27, 28]. В практике экспертизы, проводимой в рамках регистрации созданных на их основе генотерапевтических препаратов, это означает трудности в интерпретации приведенных заявителем результатов доклинических исследований. Некоторые из таких препаратов будут получены на основе векторных конструкций, созданных по технологиям, хорошо известным в различных аспектах безопасного клинического применения, другие — по технологиям, еще не прошедшим апробации в других лабораториях, и не имеющим надежных критериев доклинической оценки. Поэтому любой перечень физико-химических и биологических показателей, подлежащих изучению в доклинических исследованиях невирусной векторной конструкции и препарата на его основе, должен корректироваться в зависимости от назначения, способов получения и введения препарата, имеющихся научных данных по его безопасности и др.

Особое внимание как разработчиков, так и экспертов должны привлечь доказательства безопасно-

сти применения невирусных векторных конструкций, имеющих наноразмеры. Наночастицами низкомолекулярных веществ считают объекты с размером до 10 нм, для высокомолекулярных — до 100 нм [29]. В научной литературе рассматривается вопрос о создании новой ветви токсикологии — нанотоксикологии, т.е. науки, изучающей потенциальную опасность для человека наноструктур и наномеханизмов [15, 30, 31]. В виду того, что наночастицы по размеру сходны с рецепторами клеток и молекулами, осуществляющими сигнальную функцию внутри клетки, они могут вызвать токсическое действие, не следующее логически из их химического состава и функции трансгена. Кроме того, размер наночастицы определяет много других биологических эффектов, например, биодоступность и продолжительность циркуляции препарата в кровеносном русле. Частицы размером менее 70 нм могут пенетрировать капилляры, и препарат может не достигать органа мишени. Нанокомплексы размером в пределах 35—120 нм собираются в лимфатических узлах, где они могут вызывать воспалительный процесс. Частицы менее 40 нм способны проникать в ядро клетки и влиять на регуляцию генов [32, 33].

В настоящее время разработчики невирусных векторных конструкций характеризуют их свойства в основном по следующим критериям.

Химическая структура кополимеров — определяют с помощью ядерно-магниторезонансного способа (nuclear magnetic resonance, H-NMR) и инфракрасной Фурье-спектроскопии (Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR spectroscopy).

ДНК-связывающая способность векторной конструкции (DNA binding ability) — определяют электрофорезом в агарозном геле (0,8% агарозы в трис-ацетатном буфере с добавлением этидиумбромида). Количество оставшейся свободной ДНК в каждой фракции, сформировавшейся в агарозном геле, определяется количественно денситометрическим анализом.

Стабильность векторной конструкции — определяют таким же образом, как и его ДНК-связывающую способность, но в сравнении с образцами, инкубированными и (неинкубированными — контроль) в эмбриональной бычьей сыворотке.

Внутриклеточная миграция векторной конструкции (trafficking) — прослеживается с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (confocal laser scanning microscopy, CLSM).

Эффективность трансфекции векторной конструкции. Так как в процессе переноса генов в клетку вирусы не участвуют, поэтому у разработчиков таких конструкций принято говорить не о транс-дукции генов, а об их трансфекции. Эффективность трансфекции разработанной векторной конструкции определяют по интенсивности свечения клеток 293T, B16F10, HVSMC и HeLa, трансфецированных комплексом, включающим плазмиду с клонированным геном люциферазы (например, pGL-3 или pEGFP). Этот показатель используют для подбора оптималь-

ного для эффективной трансфекции соотношения компонентов векторной конструкции.

Весовое соотношение ДНК/носитель (ratio of DNA to carrier) —определяют электрофорезом в агарозном геле.

Гидродинамический диаметр (hydrodynamic diameter) векторной конструкции — определяют с помощью лазерной доплеровской анемометрии (laser Doppler anemometry) либо фотон-корелляционной спектроскопии (photon correlation spectroscopy).

Морфология векторной конструкции — характеризуется с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (transmission electron microscopy).

Деградабельность полимеров, входящих в состав по-липлексов — оценивают по изменению их ММ после инкубирования в условиях, моделирующих условия их терапевтического применения.

Резистентность векторной конструкции к ДНКа-зе I, сыворотке крови и гепарину — оценивают путем инкубирования комплекса с этими компонентами в условиях, моделирующих условия их терапевтического применения. Затем выполняют электрофоре-тическое разделение ДНК в агарозном геле с этиди-умбромидом, и денситометрическим анализом количественно определяют свободную ДНК в каждой фракции.

Дзета-потенциал (zeta potentials) векторной конструкции — электрический потенциал, который возникает при перемещении частиц между концентрированным слоем ионов на поверхности частиц и слоем ионов среды, окружающей частицы. Рассматривается как критерий устойчивости комплекса в коллоидной среде сыворотки крови. Определяют с помощью специальных анализаторов размера частиц и дзета-потенциала (например, серии Zetasizer Nano).

Цитотоксичность векторной конструкции — определяют с помощью МТТ-теста (MTT assay) на клетках 293T, мышиной меланомы B16F10 и HeLa. Тест основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического фар-мазана, растворимого в диметилсульфоксиде. Количество жизнеспособных клеток оценивают колориметрически по активности их митохондриальной редуктазы.

Трансгенная конструкция — ее подлинность определяют методом полного секвенирование нуклеотид-ных последовательностей.

При подаче в регулирующий орган документации для регистрации ЛС генной терапии, созданного на основе невирусной векторной конструкции, в досье доклинических исследований заявителем, в объеме, достаточном для подготовки экспертом регулирующего органа заключения о возможности его клинического исследования, также должны быть включены сведения по другим химическим, иммунохимическим и физико-химическим параметрам, традиционно ис-

пользуемым для доклинической оценки специфической активности, эффективности и безопасности лекарственного препарата [34-36].

В настоящее время требования к производству и контролю качества ЛС для генной терапии содержатся в Фармакопее США (монография <1047>), Европейской фармакопее (монография 51400). Монография Европейской фармакопеи не рассматривает комплексы синтетической системы доставки (липоплексы, полиплексы, др.). В Государственной фармакопее Российской Федерации фармакопейная статья на ЛС для генной терапии отсутствует. При разработке общих требований к производству и качеству невирусных векторных конструкций и препаратов на их основе необходимо учитывать некоторые их особенности — проведение испытаний с отдельными компонентами (липоплексными, полиплексными и др.),

в зависимости от того, какой из этих компонентов включен в состав препарата.

Технологии, которые используются для производства невирусных векторных конструкций и препаратов на их основе, непрерывно развиваются. Для обеспечения качества и безопасности таких препаратов на всех этапах жизненного цикла необходимо включение в Государственную фармакопею Российской Федерации имеющихся и разработка новых ва-лидированных методик. Кроме того, целесообразно включение в фармакопею стандартных образцов, что позволит разработчикам препаратов генной терапии проводить сравнительный анализ в различных доклинических и клинических исследованиях, производителям препаратов — проводить сравнительный анализ сырья, продуктов технологического процесса и примесей на различных стадиях производства.

ЛИТЕРАТУРА

REFERENCES

1.

10. 11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

Миронов АН, Бунятян НД, Утешев ДБ, Радаев СМ, Коробов НВ, Яворский АН, Саканян ВА. Состояние и перспективы развития генотерапии в России. Вестник Росздравнадзора 2011; (4): 56-60. Богадельников НВ, Смирнов ГИ. Особенности течения инфекционных и эпидемических процессов в настоящее время. Актуальная инфекто-логия 2013; (1): 68-72.

Didigu С, Doms R. Gene therapy targeting HIV entry. Viruses 2014; 6: 1395-409.

Noguchi P. Risks and benefits of gene therapy. N Engl J Med. 2003; 348(3): 193-4.

Raper SE, Chirmule N, Lee FS, Wivei NA, Bagg A, Gao GP, et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 2003; 80(1-2): 148-58.

European Pharmacopoeia. 8th edition. 2011; P. 705-707.

U.S. Pharmacopeia National Formulary. Currently Official USP 37-NF 32.

2014; P. 667-693.

Oba M. Study on development of polymeric micellar gene carrier and evaluation of its functionality. Biol Pharm Bull. 2013; 36(7): 1045-51. Boeckle S, Wagner E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 2006; 8(4): 731-42.

Halama A, Kulinski M, Librowski T, Lochynski S. Polymer-based non-viral gene

delivery as a concept for the treatment of cancer. Pharm Rep. 2009; 61: 993-9.

Katz MG, Fargnoli AS, Bridges SR. Myocardial gene transfer: routes and

devices for regulation of transgene expression by modulation of cellular

permeability. Human Gene Therapy 2013; 24: 375-92.

Bergen JM, In-Kyu P, Horner PJ, Pun SH. Nonviral approaches for neuronal

delivery of nucleic acids. Phar Res. 2008; 25(5): 983-98.

Boado RJ, Pardridge WM. The Trojan horse liposome technology for

nonviral gene transfer across the blood-brain barrier. J Drug Deliv. 2011;

doi:10.1155/2011/296151.

Thurmond K, Remsen EE, Kowalewski T, Wooley KL. Packaging of DNA by shell crosslinked nanoparticles. Nucleic. Acids. Res. 1999; 27(14): 2966-71. Davis PB, Cooper M. Vectors for airway gene delivery. AAPS J. 2007; 9(1): E11-E17.

Suk JS, Suh J, Lai SK, Hanes J. Quantifying the intracellular transport of viral and nonviral gene vectors in primary neurons. Exp Biol Med. (May-wood). 2007; 232: 461-9.

Akinc A, Thomas M, Klibanov AM, Langer R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. J Gene Med. 2005; 7: 657-63.

Heath F, Haria P, Alexander C. Varying polimer architecture to deliver drugs. AAPS J. 2007; 9(2): E235-E240.

Al-Dosari MS, Gao X. Nonviral gene delivery: principle, limitations and recent progress. AAPS J. 2009; 11(4): 671-81.

Harvie P, Wong FM, Bally MB. Use of poly(ethylene glycol)-lipid conjugates to regulate the surface attributes and transfection activity of lipid— DNA particles. J Pharm Sci. 2000; 89: 652-63.

Pardridge WM. Drug and gene targeting to the brain with molecular Tro-

10.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

Mironov AN, Bunyatyan ND, Uteshev DB, Radaev SM, Korobov NV, Yavors-kiy AN, Sakanyan VA. Status and prospects of gene therapy in Russia. Vest-nik Roszdravnadzora 2011; 4: 56-60 (in Russian).

Bogadelnikov IV, Smirnov GI. Features of the flow of infectious and epidemic processes currently. Actual Infectology 2013; 1: 68-72 (in Russian). Didigu C, Doms R. Gene therapy targeting HIV entry. Viruses 2014; 6: 1395-409.

Noguchi P. Risks and benefits of gene therapy. N Engl J Med. 2003; 348(3): 193-4.

Raper SE, Chirmule N, Lee FS, Wivei NA, Bagg A, Gao GP, et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Mol Genet Metab. 2003; 80(1-2): 148-58.

European Pharmacopoeia. 8th edition. 2011; P. 705-707.

U.S. Pharmacopeia National Formulary. Currently Official USP 37-NF 32.

2014; P. 667-693.

Oba M. Study on development of polymeric micellar gene carrier and evaluation of its functionality. Biol Pharm Bull. 2013; 36(7): 1045-51. Boeckle S, Wagner E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 2006; 8(4): 731-42.

Halama A, Kulinski M, Librowski T, Lochynski S. Polymer-based non-viral gene delivery as a concept for the treatment of cancer. Pharm Rep. 2009; 61: 993-9.

Katz MG, Fargnoli AS, Bridges SR. Myocardial gene transfer: routes and

devices for regulation of transgene expression by modulation of cellular

permeability. Human Gene Therapy 2013; 24: 375-92.

Bergen JM, In-Kyu P, Horner PJ, Pun SH. Nonviral approaches for neuronal

delivery of nucleic acids. Phar Res. 2008; 25(5): 983-98.

Boado RJ, Pardridge WM. The Trojan horse liposome technology for

nonviral gene transfer across the blood-brain barrier. J Drug Deliv. 2011;

doi:10.1155/2011/296151.

Thurmond K, Remsen EE, Kowalewski T, Wooley KL. Packaging of DNA by shell crosslinked nanoparticles. Nucleic. Acids. Res. 1999; 27(14): 2966-71. Davis PB, Cooper M. Vectors for airway gene delivery. AAPS J. 2007; 9(1): E11-E17.

Suk JS, Suh J, Lai SK, Hanes J. Quantifying the intracellular transport of viral and nonviral gene vectors in primary neurons. Exp Biol Med. (May-wood). 2007; 232: 461-9.

Akinc A, Thomas M, Klibanov AM, Langer R. Exploring polyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis. J Gene Med. 2005; 7: 657-63.

Heath F, Haria P, Alexander C. Varying polimer architecture to deliver drugs. AAPS J. 2007; 9(2): E235-E240.

Al-Dosari MS, Gao X. Nonviral gene delivery: principle, limitations and recent progress. AAPS J. 2009; 11(4): 671-81.

Harvie P, Wong FM, Bally MB. Use of poly(ethylene glycol)-lipid conjugates to regulate the surface attributes and transfection activity of lipid— DNA particles. J Pharm Sci. 2000; 89: 652-63.

Pardridge WM. Drug and gene targeting to the brain with molecular Tro-

jan horses. Nat Rev Drug Discov. 2002; 1: 131-9.

22. Zhang J. Evolution by gene duplication: an update. Trends Ecol Evol. 2003; 18(6): 292-8.

23. Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, et al. Lipofec-tion: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl Acad Sci USA. 1987; 84: 7413-7.

24. Bharali DJ, Klejbor I, Stachowiak E, Dutta P, Roy I, Kaur N, et al. Organically modified silica nanoparticles: a nonviral vector for in vivo gene delivery and expression in the brain. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: 11539-44.

25. Cheang Tuck-yun, Tang Bing, Xu An-wu Chang, Hu ZJ, He WL, Xing ZH, et al. Promising plasmid DNA vector based on APTESmodified silica nanoparticles. Intern J Nanomed. 2012; 7: 1061-7.

26. Nguyen J, Szoka FC. Nucleic acid delivery: the missing pieces of the puzzle? Acc Chem Res. 2012; 45(7): 1153-62.

27. Haider HK, Elmadbouh I, Jean-Baptiste M, Ashraf M. Nonviral vector gene modification of stem cells for myocardial repair. Mol Med. 2008; 14(1-2): 79-86.

28. Huang S-J, Wang T-P, Lue S-I, Wang L-F. Pentablock copolymers of pluronic F127 and modified poly(2-dimethyl amino)ethyl methacrylate for internalization mechanism and gene transfection studies. International Journal of Nanomedicine 2013; 8: 2011-27

29. Суздалев ИП. Физико-химия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов: М.: 2009.

30. Goncalves DM, de Liz R, Girard D. Activation of neutrophils by nanoparticles. The Sci World J. 2011; 11: 1877-85.

31. Бунятян НД, Утешев ДБ, Саядян ХС, Яворский АН. Современное состояние и перспективы развития нанотоксикологии. Фармация. 2008; (8): 3-5.

32. Brown DM, Wilson MR, MacNee W, Stone V, Donaldson K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine poly-styrene particles: a role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicol Appl Pharmacol. 2001; 175: 191-9.

33. Li N, Sioutas C, Cho A, Schmitz D, Misra C, Sempf J, et al. Ultrafine particulate pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage. Environ Health Perspect. 2003; 111: 455-460.

34. Авдеева ЖИ, Медуницын НВ, Мовсесянц АА, Борисевич ИВ, Мосягин ВД, Алпатова НА с соавт. Основные требования к доклиническим исследованиям иммунобиологических лекарственных препаратов. В кн.: Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Иммунобиологические препараты. Часть вторая. М.: Гриф и К; 2012. С. 31-41.

35. Авдеева ЖИ, Волкова РА, Алпатова НА, Борисевич ИВ, Медуницын НВ, Озерецковский НА, Эльберт ЕВ. Доклинические исследования препаратов, полученных с помощью методов генной инженерии. В кн.: Миронов АН, ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Иммунобиологические препараты. Часть вторая. М.: Гриф и К; 2012. С. 241-257.

36. Солдатов АА, Авдеева ЖИ, Алпатова НА, Медуницын НВ, Борисевич ИВ. Общие принципы оценки качества и регистрации воспроизведенных биологических препаратов на основе белков, полученных с помощью генно-инженерных технологий, в соответствии с законодательством развитых стран. Биопрепараты 2012; (1): 8-16.

ОБ АВТОРАХ:_

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Российская Федерация, 127051, Москва, Петровский бульвар, 8.

Супотницкий Михаил Васильевич. Заместитель директора Центра планирования и координации НИР, канд. биол. наук. Горбунова Екатерина Владимировна. Старший научный сотрудник отдела научно-методического обеспечения экспертизы медицинских иммунобиологических препаратов и лекарственных средств Центра планирования и координации НИР.

Корсун Лилия Владимировна. Заместитель начальника отдела научно-методического обеспечения экспертизы МИБП и ЛС Центра планирования и координации НИР, канд. биол. наук.

Лебединская Елена Владимировна. Ведущий научный сотрудник отдела редакционно-издательской деятельности и защиты интеллектуальной собственности, канд. биол. наук.

АДРЕС ДЛЯ ПЕРЕПИСКИ:_

jan horses. Nat Rev Drug Discov. 2002; 1: 131-9.

22. Zhang J. Evolution by gene duplication: an update. Trends Ecol Evol. 2003; 18(6): 292-8.

23. Felgner PL, Gadek TR, Holm M, Roman R, Chan HW, Wenz M, et al. Lipofec-tion: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc. Natl Acad Sci USA. 1987; 84: 7413-7.

24. Bharali DJ, Klejbor I, Stachowiak E, Dutta P, Roy I, Kaur N, et al. Organically modified silica nanoparticles: a nonviral vector for in vivo gene delivery and expression in the brain. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102: 11539-44.

25. Cheang Tuck-yun, Tang Bing, Xu An-wu Chang, Hu ZJ, He WL, Xing ZH, et al. Promising plasmid DNA vector based on APTESmodified silica nanoparticles. Intern J Nanomed. 2012; 7: 1061-7.

26. Nguyen J, Szoka FC. Nucleic acid delivery: the missing pieces of the puzzle? Acc Chem Res. 2012; 45(7): 1153-62.

27. Haider HK, Elmadbouh I, Jean-Baptiste M, Ashraf M. Nonviral vector gene modification of stem cells for myocardial repair. Mol Med. 2008; 14(1-2): 79-86.

28. Huang S-J, Wang T-P, Lue S-I, Wang L-F. Pentablock copolymers of pluronic F127 and modified poly(2-dimethyl amino)ethyl methacrylate for internalization mechanism and gene transfection studies. International Journal of Nanomedicine 2013; 8: 2011-27.

29. Suzdalev IP. Physical chemistry of nanoclusters, nanostructures and nano-materials: M.: 2009 (in Russian).

30. Goncalves DM, de Liz R, Girard D. Activation of neutrophils by nanoparticles. The Sci World J. 2011; 11: 1877-85.

31. Bunyatyan ND, Uteshev DB, Sayadyan KhS, Yavorskiy AN. Current state and prospects of development of nanotoxicology. Farmatsiya. 2008; 8: 3-5 (in Russian).

32. Brown DM, Wilson MR, MacNee W, Stone V, Donaldson K. Size-dependent proinflammatory effects of ultrafine poly-styrene particles: a role for surface area and oxidative stress in the enhanced activity of ultrafines. Toxicol Appl Pharmacol. 2001; 175: 191-9.

33. Li N, Sioutas C, Cho A, Schmitz D, Misra C, Sempf J, et al. Ultrafine particulate pollutants induce oxidative stress and mitochondrial damage. Environ Health Perspect. 2003; 111: 455-460.

34. Avdeeva ZhI, Medunitsyn NV, Movsesyants AA, Borisevich IV, Mosyagin VD, Alpatova NA et al. Basic requirements for preclinical studies of immu-nobiological drugs. In: Mironov AN, editor. Guidelines for pre-clinical trials of drugs. Immunobiological preparations. Part two. Moscow: Grif i K; 2012. P. 31-41 (in Russian).

35. Avdeeva ZhI, Volkova RA, Alpatova NA, Borisevich IV, Medunitsyn NV, Ozeretskovskiy NA, El'bert EV. Preclinical studies of preparations obtained by using genetic engineering techniques. In: Mironov AN, editor. Guidelines for pre-clinical trials of drugs. Immunobiological preparations. Part two. Moscow: Grif i K; 2012. P. 241-257 (in Russian).

36. Soldatov AA, Avdeeva ZhI, Alpatova NA, Medunitsyn NV, Borisevich IV. General principles of quality assessment and registration of generic biologic drugs based on proteins obtained by genetic engineering techniques, in accordance with the laws of developed countries. Biopreparaty. 2012; 1:8-16 (in Russian).

AUTHORS:_

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 8 Petrovsky Boulevard, Moscow, 127051, Russian Federation. Supotnitsky MV. Deputy Director of Center for the planning and coordination of scientific research. Candidate of Biological Sciences.

Gorbunova EV. Senior researcher of Department of scientific and methodological support of expertise of medical immunobiological preparations and medicines.

Korsun LV. Deputy chief of Department of scientific and methodological support of expertise of medical immunobiological preparations and medicines. Candidate of Biological Sciences.

LebedinskayaEV. Leading researcher of Department of publishing activity and intellectual property protection. Candidate of Biological Sciences.

Супотницкий Михаил Васильевич; Supotnitskiy@expmed.ru.

Статья поступила 03.06.2014 г.

Принята к печати 04.08.2014г.