СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР-ПДРФ-АНАЛИЗА ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПО ГЕНУ RPS3A
METHOD OF CONDUCTING OF PCR-RFLP ANALYSIS FOR GENOTYPING OF LARGE CATTLE BY RPS3A GENE

Изобретение относиться к области генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке наследственного заболевания цитруллинемия (ВС) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.
Существуют различные способы проведения ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция - полиморфизм дины рестрикционных фрагментов) для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A.
Так в способе, предложенном  R. и др. (2006) [ R., Georgescu S.E., Kevorkian Steliana, Manea Maria Adina, Rebedea Mariana, Dinischiotu Anca, Tesio C.D., Costache Marieta - "Citrullinemia diagnostication on cattle breed",  Zootehnie  Biotehnologii, Vol. 39(1), 2006, pp. 127-130.], используются праймеры:
F 5'-GGGCCAAAAAGGTGTTCATTGAGGACATC-3';
R 5'-CAAGTATGTGTCTCACGGCGCCGCCACAGGAA-3',
инициирующие амплификацию локуса RPS3A-гена длиной 200 bp, с последующим эндонуклеазным расщеплением рестриктазой Ava II, для генерации и интерпретации образующихся генотип-спецефических фрагментов (генотип NN=112/88 bp).
ПЦР-программа:
x1: 95°С - 5 мин
х35: 95°С - 30 сек, 57°С - 30 сек, 72°С - 1 мин
х1: 72°С - 10 мин
Цель изобретения - разработка эффективного способа генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A на основе ПЦР-ПДРФ-анализа.
Сущность способа проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A, отличающийся тем, что на этапе ПЦР используются праймеры:
Используется режим амплификации:
x1: 94°C - 5 мин
х30: 94°C - 30 сек, 55°C - 30 сек, 72°C - 30 сек
x1: 72°C - 10 мин
Условия проведения реакции
Экстракция нуклеиновой кислоты из ушных выщипов крупного рогатого скота, осуществлялась перхлоратным методом с двойной очисткой (Методические рекомендации по проведению ДНК-тестирования племенных животных субъектов племенного животноводства на устойчивость к наследственным заболеваниям, утвержденные на НТС Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь №22 от 20.02.2016 г.).
ПЦР-ПДРФ выполняли согласно протоколу, представленному в табл. №1.
Праймеры:
Режим амплификации
х1: 94°С - 5 мин
х30: 94°С - 30 сек, 55°С - 30 сек, 72°С - 30 сек
х1: 72°С - 10 мин
Хранение 4-8°С
ПЦР-продукт = 200 bp
Инкубация при 37°С в течение ночи
ПЦР-ПДРФ-фрагменты:
Генотип NN = 103/82 bp,
Генотип NF = 185/103/82 bp,
Электрофорез в 3% агарозном геле
Краткое описание графических материалов
Пояснение к фиг. 1. - Электрофореграмма технического результата предложенного способа проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A
Обозначения:
М - ДНК-маркер 50bp (ОДО «Праймтех», Беларусь)
1-5 - генотип NN,
PCR - амплификация локуса RPS3A-гена длиной 198 bp
Детекцию результатов ПЦР-ПДРФ осуществляли методом горизонтального электорофореза в 3% агарозном геле в ТВЕ буфере при УФ-свете с использованием бромистого этидия.
Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК-маркерами (ОДО «Праймтех», Беларусь).
Заключение
По результатам практических исследований, направленных на апробацию разработанного нами способа проведения ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по гену RPS3A, нами получен обеспечиваемый заявленным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (NN, NF) ввиду корректной интерпретации генерируемых генотип-спецефических фрагментов (NN=103/82 bp, NF=185/103/82 bp), где ПЦР-ПДРФ-фрагменты с длинами 185 bp, 103 bp и 82 bp являются идентификационными.
Источник информации
1.  R., Georgescu S.E., Kevorkian Steliana, Manea Maria Adina, Rebedea Mariana, Dinischiotu Anca, Tesio C.D., Costache Marieta - "Citrullinemia diagnostication on cattle breed",  Zootehnie  Biotehnologii, Vol. 39(1), 2006, pp. 127-130.