Способ загрузки экзосом малыми некодирующими РНК
METHOD FOR LOADING EXOSOMES WITH SMALL NON-CODING RNAS

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности, к способам загрузки (заполнения) экзосом малыми некодирующими РНК, для возможности их последующей таргетной доставки в отдельные ткани живых организмов.
Известен способ загрузки экзосом антацианидинами [патент WO 2014134132 A1 Milk-derived microvesicle compositions and related methods], где экзосомы получают из коровьего молока, далее обрабатывают их микроРНК, что в результате позволяет использовать экзосомы в качестве транспортеров микроРНК с перспективой их применения при лечении различных заболеваний. Данный метод имеет следующие недостатки: 1) в известном способе используются экзосомы из коровьего молока, что не позволит достигнуть высокой эффективности доставки в отдельные ткани человека. Ввиду различия в белковых последовательностях, коровьи экзосомы могут восприниматься человеческим организмом как чужеродные и не проникать в некоторые органы и ткани достаточно эффективно по сравнению с человеческими экзосомами. 2) в известном способе не представлены данные по максимальной эффективности загрузки молекул микроРНК, а учитывая потенциал ее дальнейшего терапевтического использования и достаточно высокую стоимость синтеза данных молекул, эффективная загрузка может быть существенным фактором для практического применения микроРНК загруженных в экзосомы.
Техническим эффектом, достигаемом при реализации заявленного способа является возможность максимальной загрузки экзосом, полученных из биологических жидкостей человека малыми некодирующими микроРНК, что в дальнейшем позволит использовать загруженные экзосомы в качестве транспортных структур для доставки терапевтических агентов в опухолевые клетки живых организмов.
∧
∧
∧
∧
Вышеприведенный технический результат достигается тем, что в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), смешивают экзосомы, полученные из мочи или периферической венозной крови человека и малую некодирующую РНК в соотношении на 1 мл раствора 1*1010÷5*1010 экзосом и 10*1012÷50*1012 копий малой некодирующей РНК, далее полученную смесь выдерживают в термостате при 35-40°С в течение 14-18 часов.
После проведения инкубирования веществ необходим этап ультрацентрифугирования с целью отделения экзосом с загруженным веществом - в процессе ультрацентрифугирования они сформируют осадок на дне пробирки - от загружаемого свободного вещества, которое в процессе ультрацентрифугирования останется в растворе (супернатанте).
Ультрацентрифугирование предпочтительно проводить в ρежиме 100000 g в течение 2-х часов, что обеспечивает максимальное осаждение содержащихся в растворе загруженных экзосомы.
Пример 1
∧
∧
Предварительно полученные методом градиентного ультрацентрифугирования на сахарозе из мочи человека объемом 100 мл экзосомы в количестве 10*1010 и 80*1012 копий малой некодирующей РНК hsa-mir-34a были смешаны в 8 мл PBS. Полученную смесь разделили на 8 проб по 1 мл: первую пробу оставили в термостате при 40°С на 10 часов, вторую пробу оставили в термостате при 40°С на 12 часов, третью пробу оставили в термостате при 40°С на 14 часов, четвертую пробу оставили в термостате при 40°С на 16 часов, пятую пробу оставили в термостате при 40°С на 18 часов, шестую пробу оставили в термостате при 40°С на 20 часов, седьмую пробу оставили в термостате при 40°С на 22 часа и восьмую пробу оставили в термостате при 40°С на 24 часа. По истечение соответствующего времени инкубации проводили ультрацентрифугирование пробы при 100000g в течение 2 часов, после чего полученный осадок разводили в 1 мл PBS, проводили 3 цикла заморорозки-разморозки с целью разрушения экзосом и получения свободной молекулы-маркера (малая некодирующая РНК has-mir-34а) с последующей постановкой ПЦР в реальном времени. В результате, концентрация малой некодирующей РНК hsa-mir-34a в 3-ей, 4-ой и 5-ой пробах, оказалась наиболее высокой. Из таблицы №1 наглядно видно что идет плавный подъем концентрации загруженной микроРНК достигая максимальных значений в 3-ей, 4-ой и 5-ой пробах, после чего следует плавный спад, что свидетельствует о наиболее эффективном времени инкубации в интервале 14-18 часов.
Пример 2
Предварительно полученные методом градиентного
∧
∧
∧
∧
∧
∧
∧
ультрацентрифугирования на сахарозе из мочи человека объемом 100 мл экзосомы в количестве 2*109 и 10*1012 копий малой некодирующей РНК hsa-rnir-122 были смешаны в 1 мл PBS (образец №1). Также были получены образцы с концентрацией экзосом 1*1010 (образец №2), с концентрацией экзосом 5*1010 (образец №3)и с концентрацией экзосом 25*1010 (образец №4). Полученные образцы оставили в термостате при 40°С на 16 часов. По истечение соответствующего времени инкубации проводили ультрацентрифугирование проб при 100000 g в течение 2 часов, после чего полученный осадок разводили в 1 мл PBS, проводили 3 цикла заморорозки-разморозки с целью разрушения экзосом и получения свободной молекулы - маркера (малая некодирующая РНК hsa-mir-122) с последующей постановкой ПЦР в реальном времени. В результате, концентрация малой некодирующей РНК hsa-mir-122 во 2-ой и 3-ей пробах, оказалась наиболее высокой. Из таблицы №2 наглядно видно что идет плавный подъем концентрации загруженной микроРНК достигая максимума во 2-ой и 3-ей пробах, после чего следует плавный спад, что свидетельствует о оптимальной концентрации экзосом в интервале 1*1010/мл-5*1010/мл.
Пример 3
∧
∧
Предварительно полученные методом градиентного ультрацентрифугирования на сахарозе из мочи человека объемом 100 мл экзосомы в количестве 30*1010 и 60*1012 копий малой некодирующей РНК hsa-mir-16 были смешаны в 6 мл PBS. Полученную смесь разделили на 6 проб по 1 мл: первую пробу оставили в термостате при 25°С на 16 часов, вторую пробу оставили в термостате при 30°С на 16 часов, третью пробу оставили в термостате при 35°С на 16 часов, четвертую пробу оставили в термостате при 40°С на 16 часов, пятую пробу оставили в термостате при 45°С на 16 часов и шестую пробу оставили в термостате при 50°С на 16 часов.
По истечение соответствующего времени инкубации проводили ультрацентрифугирование пробы при 100000 g в течение 2 часов, после чего полученный о садок разводили в 1 мл PBS, проводили 3 цикла заморорозки-разморозки с целью разрушения экзосом и получения свободной молекулы -маркера (малая некодирующая РНК has-mir-16) с последующей постановкой ПЦР в реальном времени. В результате, концентрация малой некодирующей РНК hsa-mir-16 в 3-ей и 4-ой пробах, оказалась наиболее высокой. Из таблицы №3 наглядно видно что идет плавный подъем концентрации загруженной микроРНК достигая максимума в 3-ей и 4-ой пробах, после чего следует плавный спад, что свидетельствует о наиболее эффективной температуре инкубации в интервале 35-40°С.
Пример 4
∧
∧
∧
∧
∧
Предварительно полученные методом градиентного ультрацентрифугирования на сахарозе из мочи человека объемом 100 мл экзо сомы в количестве 5*1010 и 1*1012 копий малой некодирующей РНК hsa-mir-122 были смешаны в 1 мл PBS (образец№1). Также были получены образцы с концентрацией малой некодирующей РНК 10*1012 копий (образец №2), с концентрацией малой некодирующей РНК 50*1010 (образец №3)и с концентрацией малой некодирующей РНК 100*1012 (образец №4).
∧
∧
Полученные образцы оставили в термостате при 40°С на 16 часов. По истечение соответствующего времени инкубации проводили ультрацентрифугирование проб при 100000 g в течение 2 часов, после чего полученный о садок разводили в 1 мл PBS, проводили 3 цикла заморорозки-разморозки с целью разрушения экзосоми получения свободной молекулы -маркера(малая некодирующая РНК hsa-mir-122) с последующей постановкой ПЦР в реальном времени. В результате, процент загруженной в экзосомы малой некодирующей РНК hsa-mir-122 во 2-ой и 3-ей пробах, оказался наиболее высоким. Из таблицы №1 наглядно видно что идет плавный подъем процента загруженной микроРНК достигая максимума во 2 -ой и 3 -ей пробах, после чего следует плавный спад, что свидетельствует о оптимальной концентрации малой некодирующей РНК в интервале 10*1012/мл÷50*1012/мл.
Следует отметить что может использоваться любой тип малых некодирующих РНК, с любой нуклеотидной последовательностью, и это не влияет на качество загрузки, а конкретная микроРНК выбирается только исходя из поставленных задач.