ДЕТОКСИФИЗИМ С АКТИВНОСТЬЮ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ АФЛАТОКСИНА И ГЕН, КОДИРУЮЩИЙ ДЕТОКСИФИЗИМ
DETOXIFIZYME WITH AFLATOXIN CONVERSION ACTIVITY, AND GENE CODING DETOXIFIZYME

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к детоксифизиму с активностью преобразования афлатоксина и гену, кодирующему детоксифизим.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1
1
Афлатоксины, группа токсических микотоксинов, в том числе афлатоксин В1 (AFB), афлатоксин М1 (AFM), афлатоксин G1 (G1) и т.д., вырабатываемые многими грибами рода Aspergilus. Афлатоксины являются токсичными и канцерогенными для животных и людей. Афлатоксины широко представлены в зерне, корме и пищевых продуктах, и вредными влияниями на человека являются: (1) прямое отравление при потреблении необработанной пищи, зараженной афлатоксинами; (2) косвенное отравление при потреблении домашней птицы, молока и т.д. из необработанной пищи, зараженной афлатоксинами; (3) при утилизации и удалении зерновых или орехов, зараженных афлатоксинами.
Из-за этих вредных эффектов многие годы изучали детоксификацию афлатоксинов. Уже существуют некоторые способы преобразования афлатоксинов, например: (1) метод аммонификации: этот метод используют для полужидких кормов. Из-за большого количества остаточного аммония он запрещен в пищевой промышленности Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA). Его применение для кормов также ограничено. (2) NaOH-метод (для растительного масла): вследствие высоких затрат на оборудование, расхода масла и стоимости, метод больше не используется. (3) Метод адсорбции белой почвой: больше не используется из-за высоких трудозатрат, загрязнения и т.д. (4) Метод экстракции (для арахисовой муки, семян хлопчатника и т.д.): он не используется широко из-за высокой стоимости, связанной с экстракцией, извлечением растворителя. (5) Тепловой метод (268°С): затраты на нагревание и потеря аромата и питательных веществ делают его менее целесообразным. (6) Биологический метод: бактерии или иммобилизованные бактерии используют для разложения афлотоксинов. Бактерии могут разрушать питательные вещества пищевых продуктов и продукции, и их токсичность является недостаточно понятной. Таким образом, это применение ограничивается только несколькими типами кормов и арахисового масла. (7) Метод с использованием ультрафиолета: окисление жестким ультрафиолетом, который использовали для разрушения афлатоксинов, является не соответствующим и очень энергоемким. (8) Метод ультрафильтрации: не является прикладным из-за высокой стоимости оборудования и жестких технических требований. (9) Ферментативный метод: клон цитохромоксидазы Р450 печени в E.coli использовали для преобразования афлатоксинов (Brown DW, etc. Proc. Natl. Acad. Sc. USA. 1996).
Суммируя, химические или физические методы преобразования афлатоксинов часто требуют жестких условий, но в результате дают низкий показатель качества обработанного зерна, кормов и пищевых продуктов. Эти методы зачастую являются неэффективными и неэкономичными, таким образом, трудными при применении в большом масштабе. Метод с использованием фермента Р450 способствует метаболизму афлатоксинов, но он также может привести к высокой токсичности AFB1 для человека. Исходя из специфичностей и высоких зффективностей ферментов, дополнительное исследование сфокусировано на ферментах, которые могут непосредственно преобразовывать афлатоксины.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение вообще относится к детоксифизиму, который может преобразовывать афлатоксины, и к гену, кодирующему фермент.
Этот фермент с AFB1-трансформирующей активностью может быть произведен в результате очистки неочищенного фермента, полученного из отселектированных клеток. Белок, преобразующий AFB1, также может быть получен способами рекомбинантной ДНК. Этот новый активный белок называют афлатоксин-детоксифизим (ADTZ).
Праймеры, специфичные для гена ADTZ, могут быть получены в результате очистки и секвенирования. Ген, кодирующий ADTZ, может быть клонирован из тотальной РНК Armillariella tabescens. Ген представляет собой новый ген, о котором никогда ранее не сообщали. Рекомбинантный белок может быть экспрессирован и очищен из различных экспрессирующих систем, например, экспрессирующей системы Pichia pastoris, например, с использованием методов генетической инженерии. Выбранные грибы, Armillariella tabescens, получают из Китайского Главного Центра коллекций микробиологических культур (CGMCC).
4
2
4
Очистка ADTZ: сначала разрушение клеток грибов, затем получение грубого белка методом преципитации (NH)SO. N-концевая аминокислотная последовательность пептида ADTZ может быть получена в результате масс-спектрометрического анализа целевого пика.
Очистка ADTZ: сначала авторы осаждают белки с использованием метода преципитации сульфатом аммония. Затем получают целевой пик исходя из короткого концевого пептида расположения аминокислот.
Изобретение относится к экстракции тотальной РНК Armillariella tabescens. С помощью ПЦР и праймеров RACE (пер., праймеров для быстрой амплификации концов кДНК) SMART, полученных из сиквенса N-концевой аминокислотной последовательности пептида ADTZ, может быть получен ген, кодирующий ADTZ, его длина составляет приблизительно 2,3 т.п.о. Последовательность содержит полную открытую рамку считывания, 3′ и 5′-нетранслирующие области. кДНК, кодирующая ADTZ, содержит 2088 пар оснований. Зрелый пептид ADTZ содержит 695 аминокислот, молекулярная масса: 73-77 кДа (SDS-ПАГЭ), pl: 5,3-6,8 (по изоэлектрофокусированию). Последовательности аминокислот и ДНК представлены в списке последовательностей (SEQ ID No.1 и SEQ ID No.2). Должно быть понятным, что белок, заявляемый в изобретении, включает в себя молекулу, произведенную элиминацией, замещением, модификацией и присоединением и т.д.
Изобретение предоставляет рекомбинантный экспрессирующий носитель, который содержит указанный ген, и трансформант, полученный с помощью клетки-хозяина, трансформированной с помощью указанного рекомбинантного экспрессирующего носителя. Дополнительно изобретение предоставляет способ получения указанного детоксифизима, который содержит в себе: культивирование указанного трансформанта и восстановление экспрессированного детоксифизима.
Изобретение имеет отношение к паре праймеров для амплификации гена, кодирующего зрелый пептид ADTZ из кДНК Armillariella tabescens. ДНК может быть клонирована в эукариотических экспрессирующих векторах интегрирующего типа, таких как pHIL-81. Таким образом, экспрессирующая плазмида pHIL-S1-ADTZ может быть сконструирована вследствие трансформации рекомбинантного экспрессирующего вектора в Pichia pastoris GS115. Этот рекомбинантный экспрессирующий вектор использует в качестве промотора АОХ. Эксперименты относительно времени культивирования и индукции привели к экспрессии ADTZ на 25% выше в общем белке в растворимом состоянии.
Изобретение имеет отношение к эукариотическим экспрессионным системам, в том числе эндоцитозным векторам (таким как, PAO815, PPIC3K, PPICZ, PHWO10, PGAPZ) или экспрессирующим векторам (таким как PPIC9K, PPICZб, PGAPZб или другим коммерческим векторам). В отношении эукариотических экспрессирующих штаммов, в качестве клеток-хозяина также могут быть использованы Pichia pastoris КМ71, МС100-3, SMD1168, SMD1165, SMD1163.
Изобретение относится к прокариотическим экспрессирующим системам. Могут быть использованы различные экспрессирующие векторы, такие как рЕТ, pUCH33 или похожие коммерческие векторы. Для прокариотических экспрессионных штаммов в качестве клеток-хозяина могут быть использованы E.coli BL21, E.coli JM109. Репликация экспрессирующих векторов может быть достигнута следуя учебнику Сэмбрука (Sambrook, et al. 2002, Molecular cloning, Cold Spring Laboratory Press. USA). Получение и трансформация E.coli DH5б может быть достигнута с использованием протокола применения хлорида кальция. Культура клеток может быть приготовлена с использованием ампициллина (100 мкг/мл) в среде LB и плазмида может быть экстрагирована с использованием щелочного метода.
4
2
4
Изобретение относится к оптимальным условиям очистки рекомбинантного ADTZ. Экспрессионная культура сначала может быть очищена преципитацией с помощью (NH)SO. Полученный грубый фермент может быть далее очищен хроматографией с гидрофобным взаимодействием и аффинной хроматографией с хелатами металлов для выделения рекомбинантного ADTZ, чистота которого составляет выше, чем 95%.
Изобретение предоставляет применение указанного детоксифизима с активностью преобразования афлатоксина для производства кормов или пищевых продуктов. ADTZ может быть применен при детоксификации арахисового масла.
Изобретение предоставляет применение указанного детоксифизима с активностью преобразования афлатоксина для приготовления лекарственного средства для предупреждения или лечения опухоли или раковой опухоли. ADTZ может быть применен для предупреждения и лечения опухолей, индуцированных афлатоксином.
Изобретение относится к способам выделения и секвенирования гена ADTZ впервые. Ген, кодирующий ADTZ, может быть клонирован в Armillariella tabescens с экспрессирующим вектором для образования рекомбинантного трансформанта. Рекомбинантный белок ADTZ может быть экспрессирован с использованием этого трансформанта. Рекомбинантный ADTZ имеет аналогичную активность в преобразованном AFB1 как и природный ADTZ, исходя из анализов активности. Рекомбинантный ADTZ также существенно снижает мутагенные эффекты AFB1. Он обладает большими потенциальными возможностями по отношению к кормам, пищевым продуктам и в фармацевтической промышленности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 демонстрирует ПАГЭ (пер., электрофорез в полиакриламидном геле) очищенного ADTZ. М: белковые маркеры молекулярных масс; 1 и 2: БСА, 3: неочищенный фермент (пер., грубый фермент) в результате преципитации сульфатом аммония. 4: очищенный ADTZ.
Фиг.2 демонстрирует ТСХ очищенного ADTZ при трансформации AFB1. 1: аналитический стандарт AFB1; 2 и 3: фосфатно-солевой буферный раствор PBS, 4: AFB1, обработанный с помощью деактивированного ADTZ, 5: AFB1, обработанный с помощью очищенного ADTZ, 6: аналитический стандарт AFB1.
Фиг.3 демонстрирует электрофорез тотальной РНК Armillariella tabescens.
Фиг.4 демонстрирует электрофорез продукта ПЦР с обратной транскриптазой, RT-PCR. М: ДНК-маркер. Е1: продукт RT-PCR.
Фиг.5 демонстрирует энзиматическое разрезание рекомбинантного вектора рТЕ1. М: ДНК-маркер. 1: pTE1/HindIII+EcoR1, 2; pTE1/EcoR1, 3: pTE1/HindIII.
Фиг.6 демонстрирует электрофорез продукта 3′RACE. М: ДНК-маркер. Е2: продукт 3′RACE.
Фиг.7 демонстрирует энзиматическое разрезание рекомбинантного вектора рТЕ2. М: ДНК-маркер. 1: pTE2/HindIII+EcoR1, 2: pTE2/EcoR1, 3: pTE2/HindIII.
Фиг.8 демонстрирует электрофорез продукта 5′RACE. М: ДНК-маркер. Е3: продукт 5′RACE.
Фиг.9 демонстрирует энзиматическое разрезание рекомбинантного вектора рТЕ3. М: ДНК-маркер. 1: рТЕ3/HindIII+EcoR1, 2: рТЕ3/EcoR1, 3: рТЕ3/HindIII.
Фиг.10 демонстрирует электрофорез непрерывного ПЦР-продукта. М: ДНК-маркер. ADTZ′: ПЦР-продукт.
Фиг.11 демонстрирует энзиматическое разрезание рекомбинантной плазмиды pSA. М: ДНК-маркер. 1: pSA/HindIII+EcoR1, 2: pSA/EcoR1, 3: pSA/HindIII.
Фиг.12 демонстрирует SDS-ПАГЭ продуктов экспрессии. 1. отрицательный контроль культуры клеток, 2: белковые маркеры, 3: БСА, 4: культура рекомбинантных клеток на 28 час, 5: культура рекомбинантных клеток на 48 час 6: культура рекомбинантных клеток на 72 час, 7: культура рекомбинантных клеток на 96 час.
Фиг.13 демонстрирует ТСХ очищенного рекомбинантного ADTZ при трансформации AFB1. 1: аналитический стандарт AFB1; 2: AFB1, обработанный с помощью очищенного рекомбинантного ADTZ, 3: AFB1, обработанный с помощью очищенного деактивированного ADTZ, 4: буферный раствор.
Фиг.14 представляет собой схематическую диаграмму конструкции рекомбинантного ADTZ и гомогенную рекомбинацию в Pichia pastoris.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1
Получение и очистка ADTZ
1. Культура клеток
1.1.1 Штамм: Armillariella tabescens.
2
4
4
2
1.1.2 Указанные выше клетки инкубировали в среде (1 л картофельного жидкого экстракта, 20 г глюкозы, KHPO 3,0 г, MgSO·7HO 1,5 г и следовые количества витаминов, рН 6,6) в течение 25 дней. Сначала посредством инкубации трех видов: 6 дней, 4 дня и 4 дня, затем четвертый вид: 11 дней, температура 24-28°С. Затем клетки собирали.
1.2. Экстрагирование ADTZ
4
2
4
Свежие клетки замораживали в жидком азоте и разрушали на маленькие частички. Добавляли фосфатный буфер (1:1 масс/объем), за которым следует гомогенизация на бане со льдом, разрушение ультразвуком до клееобразного состояния клеток и центрифугирование при 11000-12000 g для удаления преципитата. Преципитат собирали после фракционной преципитации при 20-80% насыщенного (NH)SO и суспендировали в фосфатном буфере (0,2 моль/л, рН 6,0). Количество белка определяли с использованием метода Бредфорд, ферментативную активность тестировали с использованием набора ELISA для тестирования AFB1. Таким образом получали раствор фермента.
1.3. Очистка ADTZ
1.3.1. Приготовление пробы фермента
Пробу фермента готовили посредством таких стадий как диализное обессоливание раствора неочищенного фермента в фосфатном буфере (40 объемов, 0,02 моль/л, рН 6,0) и концентрирование путем диализа в ПЭГ-20000 и фильтрация с использованием микромембраны (0,45 мкм). Белки определяли с использованием метода Бредфорд.
1.3.2. Очистка фермента ADTZ быстрой жидкостной хроматографией белков (FPLC)
Колонки и элюенты для ионообменной хроматографии и изоэлектрофокусировочной хроматографии готовили согласно процедурам, описанным в литературе (Ion Exchange Chromatography Principles and Methods. Pharmacia Co. Edited, Pharmacia Co., 1984, стр.20-31; Chromatofocusing with Polybuffer™ and РВЕ™, 6th. Experimental. Pharmacia Co. Edited, Pharmacia Co., 1984, стр.11-24). Все хроматографические разделения выполняли на системах FPLC (Pharmacia Biotech Co., United States).
Подробности как изложено ниже:
1.3.2.1 Анионообменная хроматография
(1) Реагент
рН 6,0, 0,2 моль/л фосфатный буфер.
А: рН 6,0, 0,2 моль/л фосфатный буфер.
В: рН 6,0, 0,2 моль/л фосфатный буфер+1N NaCl
(2) Приготовление колонки
DEAE-Sephadex (50 мл) промывали двумя объемами фосфатного буфера и выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут. Буферный раствор удаляли с использованием микронасоса, процесс повторяли 5 раз. Суспензию геля заливали в стеклянную колонку (20×30 см) и паковали при скорости потока 0,6 мл/мин.
Колонку промывали буфером А для уравновешивания до стабилизированной базовой линии около 0. Пробу белка наносили на пред-колонку, затем на колонку DEAE-Sephadex. Элюция градиентом NaCl: 2 часа буфером А, 5 часов 0-80% буферов В и А, 2 часа 100% буфера В, скорость потока: 0,6 мл/мин, контроль по УФ, O.D.280 нм (пер., оптическая плотность при 280 нм). Выходящие фракции собирали с использованием коллектора фракций. После концентрирования диализом с использованием ПЭГ-20000 и обессоливания, в различных фракциях определяли содержание белков с использованием метода Бретфорд, также тестировали их активности в преобразовании AFB1. Разделение повторяли, собирали только фракции, обладающие активностью.
1.3.2.2. Хроматография с электрофокусированием
(1) Реагент
Элюент: Polybuffer™ 74 (Pharmacia Co., United States, 250 мл/в бутылке) 100 мл разбавляли до 1000 мл водой, хранили при 4°С.
Исходный буферный раствор: рН 7,4, буфер имидазол-HCl (0,025 моль/л).
(2) Колонка
Mono-р™ РВЕ 94, 5×20 см, колонка предварительно упакована (Pharmacia Со. U.S.).
Раствор активного фермента после анионообменной хроматографии (6 мл, 3 мг/мл) уравновешивали с использованием Polybuffer 74 до ~6,5 мл. Колонку Mono-р уравновешивали с использованием исходного буферного раствора в течение 2 часов, затем заменяли на Polybuffer 74. Раствор фермента (2 мл) наносили на колонку и промывали с помощью Polybuffer 74 в течение 10 часов при 0,2 мл/мин, контролировали по УФ, O.D. 280 нм (пер., оптическая плотность при 280 нм). Элюенты собирали с использованием коллектора фракций, 2 мл/пробирку (10 минут/пробирку). Содержание белка в собранных белках определяли с использованием метода Бредфорд, тестировали их активность в преобразовании AFB1.
Колонку промывали с помощью 0,1 N HCl до AU ~ 0 и снова промывали с помощью 1N NaCl и уравновешивали с помощью исходного буфера в течение ночи. Процесс повторяли и собирали фракции, обладающие активностью.
1.3.2.3. Тестирование активности с использованием ELISA
1
1
1
AFB обрабатывали с помощью собранных белковых фракций; остаточное количество AFB определяли с использованием метода ELISA. Фракции белка нагревали до 100°С в течение 10 минут для приготовления деактивированных белковых растворов в качестве контролей. Фракции, которые имеют низкий уровень AFB, являются активными фракциями. Подробное описание как следует ниже:
1. Приготовление пробы
1
Смесь деактивированного фермента для тестирования: AFB (200 мкл, 2,5 нг/мл в метаноле) + раствор деактивированного фермента (200 мкл, 1,2 мг/мл).
1
Смесь фермента, обладающего активностью, для тестирования: AFB (200 мкл, 2,5 нг/мл в метаноле) + раствор фермента, обладающего активностью (200 мкл, 1,2 мг/мл).
1
Контрольная смесь: AFB (200 мкл, 2,5 нг/мл в метаноле) + буферный раствор (200 мкл).
Приготовление растворов деактивированного фермента: нагревание до 100°С в течение 10 минут.
1
1
1
Смеси для тестирования тщательно перемешивали и подвергали взаимодействию в течение 30 минут при 30°С. После центрифугирования при 3000 g в течение 5 минут удаляли преципитат. Смеси для тестирования тестировали с использованием наборов ELISA-тестов (AgraQuant™ Total Aflatoxin Assay 4/40, ROMER, United States). Остаточное количество AFB рассчитывали по калибровочной кривой. Различные фракции после хроматографических разделений тестировали на их AFB-трансформирующие активности, и фракции, которые обладают способностью снижать уровень AFB1, являются активными фракциями. Результат остаточного AFB следующий: группа теста с ферментом, обладающим активностью: 1,230±0,508 нг/мл, группа теста с деактивированным ферментом: 2,436±0,326 нг/мл, контрольная группа: 2,508±0,203 нг/мл.
ПАГЭ фракции фермента, обладающего активностью, демонстрировал одну полосу в нередуцирующих условиях, как показано на фигуре 1.
Молекулярная масса белка составляет 73-76 кДа, анализированная SDS-электрофорезом в ПААГ. pl белка составляет 5,3-6,8, анализированная изоэлектрофокусированием.
Пример 2
Измерение активности очищенного ADTZ
1
2.1. Тестирование активности ADTZ в преобразовании AFB
1
Для определения активности очищенного ADTZ использовали тонкослойную хроматографию для тестирования остаточного AFB после обработки с помощью ADTZ. Подробное описание следующее:
2.1.1. Смесь фермента ADTZ
1
4
1
1
Раствор AFB (1 мкл, 0,5 мкг/мкл метанола) (Alexis Biochemical′s Inc., Switzerland) выпаривают в атмосфере азотного газа. Раствор фермента (300 мкл, 0,1 мг/мл), MgSO (0,5 мкл) и ПЭГ 200 (10 мкл) прибавляли в пробирку и тщательно перемешивали. Смесь подвергали взаимодействию на водяной бане в течение 1 часа при температуре 30°С и затем прибавляли AFB 0,5 мкл/час, пока конечное количество AFB не составило 2 мкг. После добавления смесь оставляли для взаимодействия в течение последующих 2 часов.
2.1.2. Контрольные смеси
1
4
1
4
Контроль 1: раствор AFB 1 мкл в центрифужной пробирке на 1,5 мл выпаривали в атмосфере азотного газа. Раствор деактивированного фермента 300 мкл, инактивирование при 100°С в течение 5 минут, 0,5 мкл MgSO и 10 мкл ПЭГ 200 прибавляли в пробирку и тщательно перемешивали. Контроль 2: раствор AFB 1 мкл в центрифужной пробирке на 1,5 мл выпаривали в атмосфере азотного газа. 300 мкл раствора PBS (0,1 М, рН 6,6), 0,5 мкл MgSO и 10 мкл ПЭГ 200 прибавляли в пробирку и тщательно перемешивали. Две контрольные смеси оставляли для взаимодействия тем же самым образом, как и ферментационную смесь.
3
3
Ферментационную смесь и контрольные смеси дважды подвергали экстракции с помощью 2 объемов CHCl. Экстракт CHCl выпаривали в атмосфере азота при 45°С. Грубые смеси перерастворяли в 1 мл метанола для получения пробы фермента и двух контрольных проб для ТСХ.
2.1.3. Измерение с помощью ТСХ
1
3
1
3
1
1
Пластины ТСХ (10×10 см, 60Å Whatman, United States) свежеактивировали при 100°C в течение 2 часов. Пробы наносили на пластину в виде пятна на расстоянии 1 см и 1 см от края, слева направо, первое пятно - AFB (10 мкл 25 мкг/мл в CHCl), 2-е и 3-е: контроль 2 (10 мкл), 4-е контроль 1 (10 мкл), 5-е: ферментационная смесь (10 мкл), 6-е: AFB (10 мкл, 25 мкг/мл в CHCl). Пластины проявляли в безводном простом эфире, обнаруживали с помощью УФ-лучей (365 нм), и фотографировали (результаты показаны на фигуре 2). Почти не существует смещения между стандартами AFB1 (1-е и 6-е пятна), деактивированной контрольной смесью фермента (4-е пятно) и контролями буфера PBS (2-е и 3-е), но существенное смещение существует для смеси фермента ADTZ (для продукта Rf=0,95). Продукт после обработки ADTZ является гораздо менее полярным, чем AFB, указывающий на AFB-трансформирующую активность очищенного ADTZ.
1
2.2 Биологическая активность ADTZ в преобразовании AFB
Непрямые мутационные анализы микроорганизмов (тесты Эймса) проводили следующим образом:
2.2.1. Тестирование бактериальных штаммов
Ауксотрофный по гистидину штамм ТА98 Salmonella Typhimurium хранили при -85°C. Идентификацию генотипа и количественное определение спонтанной обратной мутации проводили перед тестированием для уверенности в том, что штамм соответствует требованиям эксперимента.
9
2.2.2. Приготовление печени S
(a) Индуцирование крыс SD: крыс 3D выдерживали на карантине в течение одной недели для уверенности, что они здоровы. Суспензию кукурузного масла, содержащего полихлорированные бифенилы, вводили крысам через желудочный зонд (500 мг/кг). На пятый день после 12-часового голодания животных декапитировали.
9
(b) Приготовление печени S: печенки собирали, взвешивали и обрызгивали in situ стерильным охлажденным до 0°C KCl (0,15 М) и гомогенизировали в гомогенизаторе. После последующего центрифугирования при 9000 g в течение 30 минут супернатант собирали, тестировали и хранили при -85°C.
9
2.2.3. Приготовление смеси S
9
Следующие растворы: А, В и С смешивали с S и хранили при 4°C (необходимо использовать в течение 4 часов),
А: (0,2 М кофермент II, стерилизованный фильтрацией) 0,2 мл
В: (0,2 М глюкозо-6-фосфат стерилизованный фильтрацией) 0,25 мл
2
С: (20 мл 0,4 М MgCl+20 мл 1,65 М KCl+500 мл 0,2 моль/л фосфатного буфера, рН 7,4+313 мл дистиллированной воды, смешивали и стерилизовали фильтрацией) 8,55 мл.
9
S: 1,00 мл.
2.2.4. Приготовление смесей для тестирования
3
3
3
В 30 мл пробы для тестирования концентрация ADTZ составляла 0,2 мг/мл, AFB1 0,2 мкг/мл, рН 6,0. Смесь подвергали взаимодействию при 28°C в течение 120 минут, затем экстрагировали с помощью CHCl в том же самом объеме в течение трех раз. Объединенные CHCl-экстракты упаривали при пониженном давлении при 40°C. Грубый экстракт растворяли в 6,75 мл ДМСО (3,75 мл и 3 мл) в виде ферментационной смеси для тестирования. Аналогично использовали деактивированный ADTZ (предварительно обработанный с помощью CHCl) для приготовления контрольной смеси деактивированного фермента, и буферный раствор использовали для приготовления контрольной буферной смеси. Все эти пробы хранили при -15°C.
2.2.5. Анализ обратной мутации (тест Эймса)
Смеси для тестирования в ДМСО, смесь S9 и культуру клеток Salmonella Typhiturium TA98 прибавляли к верхнему слою мягкой агаровой среды, тщательно перемешивали и разливали на определенную минимальную селективную среду Vogel при 40°C. Чашки инкубировали в течение 72 часов при 37°C и подсчитывали мутантные колонии в каждой чашке.
Каждую пробу тестировали с положительным и отрицательным контролем и повторяли один раз. Результат каждой пробы получали из среднего значения шести групп двух тестов. Данные представляют в виде числа мутантных колоний, скорость мутации (MR = число мутантных колоний в пробе/ число мутантных колоний в отрицательном контроле) и скорость ингибирования (={1-(число мутантных колоний в пробе - число мутантных колоний в отрицательном контроле)/(число мутантных колоний в контрольной пробе AFB1 - число мутантных колоний в отрицательном контроле)}×100%).
2.2.6. Критерии оценки данных
Пробы считали позитивными в тесте Эймса при:
a) контроли растворителей находятся в нормальном диапазоне;
b) тестируемые пробы являются позитивными при трех различных концентрациях (MR≥2).
2.2.7. Результат
1
1
Число мутантных колоний в тестируемых смесях активного фермента и контрольных пробах с ДМСО являются очень похожими (MR<2). Число контролей в буфере и тестируемых смесей деактивированного фермента является значительно выше, чем контрольные пробы в ДМСО. В действительности оно очень близко к числам положительных контролей (контроли AFB) (MR>2). Данные указывают, что активность ADTZ в ингибировании мутации вызвана AFB. Данные представлены в следующей таблице.
1
Мутационные анализы AFB, обработанного с помощью ферментов ADTZ.
Проба для анализа
Число мутантных колоний/чашку
MR
Степень ингибирования (%)
PBS-контроль
378±77
13,09
~
Деактивированный фермент
359±59
12,86
~
Фермент
31±12
1,11
99,16
Контроль AFB<sub>1</sub>
385±97
13,75
~
Контроль ДМСО
28±5
~
~
9
1
1
Описание: в мутационных анализах использовали печень крыс S и штамм для анализа ТА 98 Salmonella Typhymurium. Положительный контроль AFB: 0,8 мкг/50 мкл ДМСО/чашку. Смеси фермента для тестирования использовали те же самые количества AFB и ДМСО. Чашки инкубировали в течение 28 часов, подсчитывали числа мутантных колоний. Представленные данные означают средние значения 4 чашек ± SD (пер., среднее отклонение).
Пример 3
Секвенирование пептида ADTZ
Пробы: фракции, обладающие активностью, собранные в примере 1, или фракции, обладающие активностью, далее очищали эектрофорезом в ПААГ. N-концевой сиквенс пептида ADTZ проводили на масс-спектрометре Micromass Q-TOF II. Последовательности выглядят следующим образом:
М1: EAWEGFTALVDK
M2: NKLLQDANGELENLYVR
Изобретение относится к другим пептидным последовательностям, отличным от последовательностей, перечисленных выше, поскольку их обнаруживают с помощью масс-спектрометра MALDI-MS-TOF или другими химическими методами в пептиде ADTZ.
Пример 4
Экстракция тотальной РНК Armillariella tabescenes
Бактериальную культуру Armillariella tabescenes помещали в чашках Петри на лед. Затем ткани замораживали погружением в жидкий азот и измельчали в порошок. Порошок (100 мг) переносили в центрифужную пробирку на 1,5 мл и добавляли Trizol (1 мл). Смесь энергично встряхивали и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Добавляли хлороформ (200 мкл), смесь энергично встряхивали в течение 2 минут и помещали на баню со льдом на 5 минут. Гомогенат центрифугировали при 12000 g в течение 15 минут при 2-8°C. Супернатант, содержащий РНК, осторожно переносили в другую центрифужную пробирку на 1,5 мл. Добавляли охлажденный изопропанол (500 мкл) и смесь помещали на баню со льдом на 20 минут. Смесь центрифугировали при 12000g в течение 10 минут при 2-8°C, затем супернатант удаляли, а осадок РНК промывали с помощью 75% этанола (1 мл). Пробу центрифугировали при 7500 g в течение 5 минут при 2-8°C. Этанол удаляли и РНК подсушивали в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
РНК полностью растворяли в стерильной воде, обработанной диэтил-пирокарбонатом (ДЭПК) (50 мкл), и тестировали с помощью УФ-анализа и электрофорезного анализа (1,1% агарозный гель/ЭП 100 V, 20 минут) перед хранением при -80°C. Результаты представлены на фигуре 3. Из электрофореза были отчетливо видимы 28S рРНК и 18S растворимая РНК. Соотношение составляло приблизительно 2:1. Оно указывает на то, что тотальная РНК не деградировала.
Пример 5
Конструирование праймеров гена ADTZ
Изобретение относится к двум парам праймеров (Р1, Р2 и G1, G2), сконструированных в соответствии с пептидной последовательностью ADTZ. Частичную последовательность продуктов гена ADTZ получали на основании ПЦР с обратной транскриптазой с использованием набора QIAGEN OneStep RT-PCR. Продукты ПЦР с обратной транскриптазой клонировали с использованием ТА-клонирующего метода. Рекомбинантную плазмиду из ТА клона идентифицировали разрезаниями ферментами HindIII и EcoR1
с последующим электрофорезом (1,5% агарозный гель). Фрагментарную кДНК гена ADTZ Е1 получали в результате сиквенса рекомбинантной плазмиды.
Детали нижеследующие:
1-я пара праймеров
2-я пара праймеров
Р1: 5′-TGGGARGGNTTYACNGC-3′
G1: 5′-CARGAYGCNAAYGGNGA-3′
Р1: 5′-TCNCCRTTNGCRTCYTG-3′
G2: 5′-GCNGTRAANCCYTCCCA-3′
Изобретение относится к парам праймеров, специфичных для ADTZ, которые не ограничиваются вышеуказанными парами, но также относится к любым другим, сконструированным из пептидной последовательности ADTZ.
5.1. ПЦР с обратной транскриптазой
5.1.1. Матричную тотальную РНК (из примера 4) денатурировали при 75°C в течение 5 минут, затем охлаждали на ледяной бане.
5.1.2. Приготовление основной смеси (композиция 80 мкл)
42 мкл воды, свободной от РНКаз (пер., категории RNase-free)
16 мкл 5 х кратного буфера QIAGEN One-step RT-PCR Buffer
3,2 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) (10 мМ)
3,2 мкл ферментативной смеси QIAGEN One-step RT-PCR Enzyme Mix
64,4 мкл
Основную смесь несколько раз тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз.
5.1.3. Компоненты в приведенном порядке прибавляли в стерильную центрифужную пробирку (единица: мкл)
Компонент
1 (проба 1)
2 (-контроль)
3 (проба 2)
4 (-контроль)
РНК
1,3
-
-
-
Праймер Р1
1,3
1,3
-
-
Праймер Р2
1,3
1,3
-
-
Праймер G1
-
-
1,3
1,3
Праймер G2
-
-
1,3
1,3
Вода
-
1,3
-
1,3
Основная смесь
16,1
16,1
16,1
16,1
Общий объем
20
20
20
20
5.1.4. Циклы ПЦР
- Обратная транскрипция: 50°C, 30 минут
- Начальная стадия активации ПЦР: 50°C, 15 минут
- 3-х стадийная цикличность
- 15 циклов: 94°C, 40 секунд
65°C 1 минута (-1°С/цикл)
72°C 1 минута
- 25 циклов: 94°C, 40 секунд
50°C 1 минута
72°C 1 минута
- Финальная элонгация: 70°C, 10 минут
5.1.5. После циклов ПЦР пробы по 5 мкл отбирали для электрофореза.
5.2. Экстрагирование продуктов ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR)
5.2.1. Готовили буферный раствор для электрофореза ТАЕ и 0,8% агарозный гель.
5.2.2. Смешивали 50 мкл продукта ПЦР с обратной транскриптазой с 10-ти кратным буфером для нанесения и наносили.
5.2.3. Электрофорез при 100 V в течение 20 минут.
5.2.4. Полосы после электрофореза обнаруживали с помощью УФ-излучения. Интересующие полосы экстрагировали из геля и переносили в стерильную центрифужную пробирку на 1,5 мл.
5.2.5. Прибавляли 800 мкл буфера NT1.
5.2.6. Суспензию, полученную с помощью набора NucleoTrap, тщательно перемешивали на вортексе до гомогенной смеси. Прибавляли 10 мкл в центрифужную пробирку.
5.2.7. Центрифужную пробирку погружали на водяную баню при 50°C в течение 6 минут, встряхивали на вортексе каждые 2 минуты.
5.2.8. Центрифугировали при 10000 g в течение 30 секунд при комнатной температуре, супернатант удаляли.
5.2.9. Прибавляли 500 мкл буфера NT2 и смесь перемешивали на вортексе. Центрифугировали при 10000 g в течение 30 секунд при комнатной температуре, супернатант удаляли. Процесс повторяли один раз.
5.2.10. Прибавляли 500 мкл буфера NT3 и смесь перемешивали на вортексе. Центрифугировали при 10000 g в течение 30 секунд при комнатной температуре, супернатант удаляли. Процесс повторяли один раз.
5.2.11. Центрифугировали при 10000 g в течение 30 секунд, супернатант удаляли. Осадок высушивали на воздухе в течение 10-25 минут.
5.2.12. Преципитат суспендировали в 30 мкл буфера ITE (рН 8,0). Этот фрагмент называли Е1. Электрофорез этого продукта ПЦР с обратной транскриптазой изображают на фигуре 4. Новую полосу, названную Е1, обнаруживали в результате взаимодействия пары праймеров Р1 и Р2 (~800 п.о.).
5.3. Клоны ТА и секвенирование.
5.3.1. Лигирование ДНК-лигазой.
Нижеследующие компоненты добавляли в стерильную центрифужную пробирку на 1,5 мл:
1 мкл вектора pUCm-T
3 мкл фрагмента Е1 (продукта ПЦР с обратной транскриптазой)
1 мкл 10-ти кратного буфера
1 мкл ДНК-лигазы Т4
4 мкл стерильной воды, общий объем 10 мкл
Тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз несколько раз, инкубировали на водяной бане при 22°C в течение, по меньшей мере, 4 часов.
2
5.3.2. Приготовление компетентных клеток DH5б E.coli методом с использованием CaCl
2
2
Моноклон DH5б инкубировали в 2 мл среды LB, встряхивали при 37°C в течение ночи. 50 мкл колоний переносили в 5 мл среды LB, встряхивали при 37°C в течение 1,5-2 часов. Затем культуру охлаждали до 0°C выдерживанием пробирки во льду в течение 30 минут. Культуру переносили в стерильную центрифужную пробирку и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. Среду декантировали с клеточного осадка. Осадок ресуспендировали в 1,5 мл охлажденного до 0°C раствора CaCl и пробирку выдерживали во льду в течение 10 минут. Клетки выделяли центрифугированием при 5000 об/мин в течение 5 минут и среду декантировали. Осадок ресуспендировали в 200 мкл охлажденного до 0°C раствора CaCl и хранили при 4°C.
5.3.3. Трансформация компетентных клеток DH5б
200 мкл суспензии компетентных клеток переносили в центрифужную пробирку, содержащую линкерную ДНК (10 мкл). Содержимое осторожно перемешивали на вортексе и хранили во льду в течение 30 минут. После 90 секунд на водяной бане при температуре 42°C, содержимое хранили во льду в течение 3-5 минут. Прибавляли среду LB (800 мкл) и смесь инкубировали при температуре 37°C в течение 40-60 минут.
Трансформированные компетентные клетки распределяли на поверхности среды с агаром, содержащую Amp и IPTG/X-gal (200 мкл/на чашку 90 мм), и инкубировали при температуре 37°C в течение 12-16 часов.
5.3.4. Щелочная экстракция плазмидной ДНК.
Трансформированные компетентные клетки переносили в 2 мл среды LB, содержащей ампициллин. Культуру энергично встряхивали при температуре 37°C в течение ночи.
Культуру (1,5 мл) переносили в микроцентрифужную пробирку и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 2 минут. Супернатант удаляли.
Осадок промывали с помощью 400 мкл раствора STE. Содержимое энергично перемешивали на вортексе и центрифугировали при 12000 об/мин. Супернатант удаляли.
К осадку прибавляли охлажденный раствор I и энергично встряхивали, затем добавляли свежеприготовленный раствор II, хорошо перемешивали и хранили во льду в течение 3 минут.
Прибавляли охлажденный раствор III, хорошо перемешивали и хранили во льду в течение 5 минут.
Смесь центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 минут и супернатант переносили в другую пробирку.
К супернатанту прибавляли равный объем смеси хлороформ:фенол.
Смесь снова центрифугировали. Супернатант переносили в третью пробирку.
Охлажденный безводный этанол (2 объема) вносили в третью пробирку. После перемешивания пробирку хранили при комнатной температуре в течение 40-60 минут.
Содержимое центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант удаляли.
Осадок промывали 70% этанолом (200 мкл). Смесь снова центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 минуты. Супернатант удаляли.
Осадок подсушивали на воздухе в течение 5-10 минут, затем суспендировали в ТЕ-буфере, свободном от ДНКаз и РНКаз, инкубировали при 30°C в течение 1 часа и хранили при -20°C.
5.3.5. Идентификация рекомбинантной плазмиды рТЕ1 разрезанием ферментами HindIII и EcoRI клонов ТА (единицы: мкл)
Номер
Буфер М
Буфер Н
Hind
EcoRI
рТЕ1
H<sub>2</sub>O
1 (20 мкл система)
2
-
1
1
10
6
2 (20 мкл система)
-
2
-
1
10
6
3 (20 мкл система)
2
-
1
-
10
6
После реакции разрезания ферментами при температуре 37°C в течение 4 часов, смеси анализировали электрофорезом в 1,5% агарозе. Результаты разрезания ферментатами рекомбинантного вектора рТЕ1 показаны на фигуре 5. Разрезание двумя ферментами (пер., двумя pHindIII + EcoRI (пример 1) и разрезание одним ферментом HindIII (пример 3), все демонстрировали одинаковую полосу в 400 п.о., с большей интенсивностью для пробы 1. Разрезание одним ферментом EcoRI (проба 2) демонстрировало линейное расщепление. Эти результаты указывают на то, что в E1-фрагменте существует сайт расщепления HindIII.
5.3.6. Секвенирование рекомбинантной плазмидной ДНК
Рекомбинантную плазмидную ДНК очищали осаждением с помощью ПЭГ (Sambrook, et al. 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, United States). Последовательность ДНК фрагмента Е1 определяли на ДНК-секвенаторе ABI377 с использованием секвенирующих праймеров Т7 и SP6. Установленная последовательность содержит сайт расщепления Р1, Р2 и сайт расщепления HindIII (aagctt).
Пример 6
Последовательность тотальной кДНК гена ADTZ
Праймеры конструировали из фрагмента Е1 гена ADTZ, как определено в примере 5:
S1: 5′-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3′
S3: 5′-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3′
С использованием S1 и S3 в качестве праймеров, проводили 3′RACE и 5′RACE (пер., RACE-быстрая амплификация концов кДНК) с использованием набора для амплификации SMART™ RACE cDNA amplification Kit (COLONTECH Laboratories, Inc. Cat. No. K1811-2). Продукты RACE восстанавливали выскабливанием из геля и ТА клонировали с использованием рутинного метода. Фрагменты рекомбинантной плазмидной ДНК секвенировали после разрезания ферментами HindIII и EcoRI и анализировали электрофорезом в 1,5% агарозе. Таким образом получали фрагменты Е2 и Е3. Векторные последовательности удаляли с использованием программного обеспечения Vecscreen. E1, Е2 и Е3 соединяли с использованием программного обеспечения DNAMAN (Lynnon BioSoft). Полную последовательность кДНК гена ADTZ получали из анализов открытой рамки считывания с использованием ORF Finder (NCBI). Подробное описание нижеследующее:
Праймер S1: 5′-TAGGCGAAGTGTCGTCGTCAATGGAA-3′
Праймер S3: 5′-GAAGTTATCGGCTTTCCAGTCAGAGGGT-3′
6.1. 3′RACE
6.1.1. Получение готового 3′конца кДНК (RACE)
6.1.1.1. Тотальную матричную РНК (из примера 4) денатурировали при 75°C в течение 5 минут, затем охлаждали на бане со льдом.
6.1.1.2. Следующие реагенты добавляли в стерильную центрифужную пробирку на 0,5 мл: 1 мкл денатурированной тотальной матричной РНК, 1 мкл праймера A 3′-CDS (пер., CDS - кодирующая последовательность), 3 мкл стерильной воды, свободной от РНКаз, до получения суммарного объема 5 мкл.
6.1.1.3. Тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз несколько раз с последующей стадией короткого центрифугирования.
6.1.1.4. Инкубация при температуре 70°C в течение 2 минут.
6.1.1.5. Пробы хранили во льду в течение 2 минут. После стадии короткого центрифугирования добавляли следующие реагенты:
2 мкл 5-кратного буфера для синтеза первой цепи
1 мкл DTT (20 мМ)
1 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP)
1 мкл обратной транскриптазы PowerScript
10 мкл суммарный объем
6.1.1.6. Тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз несколько раз с последующей стадией короткого центрифугирования.
6.1.1.7. Инкубация при температуре 42°C в течение 1,5 часов.
6.1.1.8. Разбавление с помощью 100 мкл Tricine-EDTA.
6.1.1.9. Инкубация при температуре 72°C в течение 7 минут.
6.1.1.10. Хранение при -20°C.
6.1.2. ПЦР 3′РАСЕ
6.1.2.1. Приготовление основной смеси (100 мкл система)
69 мкл воды степени чистоты для ПЦР (PCR-Grade)
10 мкл 10-кратного буфера для ПЦР Advantage 2
2 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP)(10 мМ)
2 мкл 50-кратной полимеразной смеси Advantage 2
83 мкл
Содержимое тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз несколько раз с последующей стадией короткого центрифугирования.
6.1.2.2. Компоненты добавляли в стерильную центрифужную пробирку на 0,5 мл в приведенном порядке (единица: мкл)
Компонент
1 (проба)
2 (-контроль)
3 (-контроль)
Готовый 3′-RACE кДНК
2,5
1,5
1
UPM (10x)
5
3
-
Праймер S1 (10 мкл)
1
-
0,4
Н<sub>2</sub>О
-
0,6
2
Основная смесь
41,5
24,9
16,6
Суммарный объем
50
30
20
6.1.2.3. Циклы ПЦР:
- 5 циклов: 94°C
5 секунд
72°C
3 минуты
- 5 циклов: 94°C
5 секунд
70°C
10 секунд
72°C
3 минуты
- 35 циклов: 94°C
5 секунд
68°C
10 секунд
72°C
3 минуты
6.1.2.4. После циклов ПЦР 5 мкл пробы использовали для электрофореза, результаты приводят на фигуре 6. Получали одну полосу из 3′RACE (~800 п.о.) и назвали Е2.
2
6.1.3. Продукт RACE клон ТА, получение компетентных клеток DH5б E.coli (методом CaCl и щелочную экстракцию плазмидной ДНК, проводили, как описано в примере 5.
6.1.4. Идентификация рекомбинантной плазмиды рТЕ2 ферментативными разрезаниями
Разрезание ферментами HindIII и EcoRI клонов ТА (единица: мкл)
Номер
Буфер М
Буфер Н
HindIII
EcoRI
pTE2
H<sub>2</sub>O
1 (20 мкл система)
2
-
1
1
10
6
2 (20 мкл система)
-
2
-
1
10
6
3 (20 мкл система)
2
-
1
-
10
6
После ферментативных реакций при 37°C в течение 4 часов смеси анализировали электрофорезом в 1,5% агарозе, результаты показаны на фигуре 7. Два разрезающих фермента HindIII + EcoRI (пер., ферменты рестрикции, рестриктазы) (проба 1) демонстрировали две полосы 600 п.о. и 300-400 п.о., тогда как один разрезающий фермент HindIII (проба 3) демонстрировал только одну полосу в 300-400 п.о., рестриктаза EcoRI (проба 2) демонстрировала линейное расщепление. Эти результаты указывали на существование сайта расщепления рестриктазой HindIII во фрагменте Е2, который находится близко к одному концу фрагмента.
6.1.5. Секвенирование
Рекомбинантную плазмидную ДНК очищали преципитацией с помощью ПЭГ (Sambrook, et al. 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, United States). Последовательность ДНК Е2-фрагмента определяли на ДНК-секвенаторе ABI377 с использованием секвенирующих праймеров Т7 и SP6. Последовательность Е2 содержит сайт расщепления HindIII (aagctt) близко к 3′.
6.2. 5′RACE
6.2.1. Приготовление готового 5′RACE кДНК
6.2.1.1. Тотальную матричную РНК денатурировали при 75°C в течение 5 минут, затем охлаждали на бане со льдом.
6.2.1.2. В стерильную центрифужную пробирку на 0,5 мл вносили следующие реагенты: 1 мкл денатурированной тотальной матричной РНК, 1 мкл праймера A 5′-CDS, 1 мкл олигонуклеотидов SMARTII А и 2 мкл стерильной воды, свободной от РНКаз, до получения суммарного объема 5 мкл.
6.2.1.3. Тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз несколько раз с последующей стадией короткого центрифугирования.
6.2.1.4. Инкубация при температуре 70°C в течение 2 минут.
6.2.1.5. Пробу хранили во льду в течение 2 минут. После стадии короткого центрифугирования добавляли следующие реагенты:
2 мкл 5-кратного буфера для синтеза первой цепи
1 мкл DTT (20 мМ)
1 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP)
1 мкл обратной транскриптазы PowerScript
10 мкл суммарный объем
6.2.1.6. Тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз несколько раз с последующей стадией короткого центрифугирования.
6.2.1.7. Инкубация при температуре 42°C в течение 1,5 часов.
6.2.1.8. Разбавление с помощью 100 мкл Tricine-EDTA.
6.2.1.9. Инкубация при температуре 72°C в течение 7 минут.
6.2.1.10. Хранение при -20°C.
6.2.2. ПЦР 5′RACE
6.2.2.1. Приготовление основной смеси (110 мкл система)
75,9 мкл воды степени чистоты для ПЦР (PCR-Grade)
11 мкл 10-кратного буфера для ПЦР Advantage 2
2,2 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP) (10 мМ)
2,2 мкл 50-кратной полимеразной смеси Advantage 2
91,3 мкл
Содержимое тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз несколько раз с последующей стадией короткого центрифугирования.
6.2.2.2. Компоненты добавляли в стерильную центрифужную пробирку на 0,5 мл в приведенном порядке (единица: мкл)
Компонент
1 (проба)
2 (+контроль)
3 (-контроль)
4 (-контроль)
Готовый 5′-RACE кДНК
2,5
1
1
1
UPM (10x)
5
-
2
-
Праймер S1 (10 мкл)
-
0,4
-
-
Праймер S3 (10 мкл)
1
0,4
-
0,4
Н<sub>2</sub>O
-
1,6
0,4
2
Основная смесь
41,5
16,6
16,6
16,6
Суммарный объем
50
20
20
20
6.2.2.3. Циклы ПЦР:
-
94°C 1 минута
- 5 циклов: 94°C
30 секунд
72°C
4 минуты
- 5 циклов: 94°C
30 секунд
70°C 4 минуты
- 25 циклов: 94°C
30 секунд
68°C
4 минуты
-
72°C 10 минут
6.2.2.4. После циклов ПЦР 5 мкл пробы использовали для электрофореза, результаты приводят на фиг.8. Получали одну полосу 5′RACE (~14000-18000 п.о.) и назвали Е3.
2
6.2.3. Продукт 5′RACE клон ТА, получение компетентных клеток DH5б E.coli (методом CaCl и щелочную экстракцию плазмидной ДНК, проводили, как описано в примере 5.
6.2.4. Идентификация рекомбинантной плазмиды рТЕ2 ферментативными разрезаниями (пер., рестриктазами)
Разрезание ферментами HindIII и EcoRI клонов ТА (единица: мкл)
Номер
Буфер М
Буфер Н
HindIII
EcoRI
рТЕ3
Н<sub>2</sub>O
1 (20 мкл система)
2
-
1
1
10
6
2 (20 мкл система)
-
2
-
1
10
6
3 (20 мкл система)
2
-
1
-
10
6
После ферментативных реакций при 37°C в течение 4 часов смеси анализировали электрофорезом в 1,5% агарозе, результаты показаны на фигуре 9. Рестрикция двумя ферментами HindIII + EcoRI (проба 1) демонстрировала две полосы по 1400-1000 п.о. и 300-400 п.о., тогда как разрезание одним ферментом HindIII (проба 3) демонстрировало только одну полосу в 1400-1000 п.о. Эти результаты указывали на существование сайта рестрикции для HindIII во фрагменте Е3.
6.2.5. Секвенирование
Рекомбинантную плазмидную ДНК очищали преципитацией с помощью ПЭГ (Sambrook, et al. 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, United States). Последовательность ДНК Е3-фрагмента определяли на ДНК-секвенаторе ABI377 с использованием секвенирующих праймеров Т7 и SP6. Последовательность Е3 содержит два сайта рестрикции HindIII, один близко к 3′ и другой - близко к 5′.
6.3. Сборка секвенированных фрагментов кДНК ADTZ
Векторные последовательности убирали с использованием программного обеспечения Vecscreen. Е1, Е2 и Е3 соединяли с использованием программного обеспечения DNAMAN. Полную последовательность кДНК гена ADTZ получали из анализов открытой рамки считывания с использованием ORF Finder (NCBI), которая содержит полную рамку считывания с 3′-поли (А) хвостом, 5′ и 3′ нетранслирующими областями. Результаты показаны в списке последовательностей в виде SEQ ID No. 2.
BLAST и BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) использовали для поиска последовательности, похожей на последовательность кДНК ADTZ и вычисляли белковую последовательность. Поиск идентифицировал кДНК ADTZ в виде новой последовательности. Последовательность зрелого пептида ADTZ, рассчитанная из кДНК идентифицировали в виде нового пептида из поиска в GENEBANK.
Изобретение относится не только к способу, описанному в этом примере, но также к клонированию этой последовательности в банке данных кДНК Armillariella tabescens с использованием зонда, сконструированного из пептидной последовательности ADTZ.
Пример 7
Синтез кДНК, кодирующей ген зрелого пептида ADTZ
В соответствии с последовательностями 3′ и 5′ концов кДНК конструировали пары праймеров для получения последовательности открытой рамки считывания.
GAATTC
Р3: 5′-GTCATGGCCACCACAACTGTC-3′
CCTAGG
Р4: 3′-GTAACTCTCTGCTAACACTGAC-5′
Сайты расщепления ферментами EcoRI (GAATTC) и BamHI (GGATCC) встраивали в праймеры. Проводили ПЦР-амплификацию и продукт ПЦР выскребали с агара. Детальное описание следующее:
7.1. Приготовление основной смеси (100 мкл система)
69 мкл воды степени чистоты для ПЦР (PCR-Grade)
10 мкл 10-кратного буфера для ПЦР Advantage 2
2 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP)(10 мМ)
2 мкл 50-кратной полимеразной смеси Advantage 2
83 мкл
Содержимое тщательно перемешивали пипетированием вверх и вниз несколько раз с последующей стадией короткого центрифугирования.
7.2. Компоненты добавляли в стерильную центрифужную пробирку на 0,5 мл в приведенном порядке (единица: мкл)
Компонент
1 (проба)
2 (-контроль)
3 (-контроль)
Готовый 5′-RACE кДНК
2,5
-
1
Праймер Р3 (10 мкм)
1
0,6
-
Праймер Р4 (10 мкм)
1
0,6
-
Н<sub>2</sub>O
4
3,9
2,4
Основная смесь
41,5
24,9
16,6
Суммарный объем
50
30
20
7.3. Циклы ПЦР:
-
94°C 1 минута
- 5 циклов: 94°C
30 секунд
72°C
4 минуты
- 5 циклов: 94°C
30 секунд
72°C
4 минуты
- 35 циклов: 94°C
30 секунд
68°C
4 минуты
-
72°C 10 минут
7.4. После циклов ПЦР 5 мкл пробы использовали для электрофореза, результаты приводят на фигуре 10. Одну полосу, полученную из ПЦР (~18000 п.о.), называли ADTZ′-фрагментом.
5. Восстановление продукта ПЦР.
Продукт ПЦР выскребали из геля. Таким образом получали кДНК, кодирующую зрелый пептид ADTZ. Этот фрагмент называли "ADTZ"
Пример 8
Конструирование рекомбинантной экспрессионной плазмиды ADTZ
AOTZ′ клонировали в pHIL-S1 для конструирования экспрессионного вектора pHIL-S1-ADTZ, следуя стандартной процедуре (Sambrook, et al. 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, United States). Продукт анализировали ферментативными рестрикциями и секвенировали. Подробное описание нижеследующее:
Как показывают на фигуре 14, конструирование гибридной плазмиды, содержащей ген ADTZ, осуществляли следующим образом:
Плазмиду pHIL-S1 и фрагмент ADTZ′ расщепляли двумя ферментами рестрикции EcoRI + Baml. Смесь подвергали электрофорезу в 0,8% агарозе и экстрагировали из геля. Рекомбинантную плазмиду pHIL-S1-ADTZ конструировали из вектора pHIL-S1 и гена ADTZ с использованием фермента ДНК-лигазы Т4.
2
Компетентные клетки DH5б E.coli получали с использованием метода с CaClи трансформировали. Трансформированные клетки селектировали и плазмидную ДНК получали после щелочной экстракции. Рекомбинантную плазмидную ДНК очищали преципитацией с использованием ПЭГ (Sambrook, et al. 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, United States). Последовательность ДНК определяли на ДНК-секвенаторе ABI377 с использованием секвенирующих праймеров Т7 и SP6.
Ферментативное разрезание рекомбинантной плазмиды pHIL-S1-ADTZ (pSA) показывают на фигуре 11: рестрикция двумя ферментами BamHI и EcoRI (проба 1) демонстрировала одиночную полосу (~2000 п.о.). Рестрикция одним ферментом HindIII (проба 2) демонстрировала три полосы (~1400 п.о., 600 п.о. и 500 п.о.) Рестрикция одним ферментом SacI демонстрировала линейное расщепление, указывающее на отсутствие сайтов расщепления SacI в инсертированном фрагменте).
Пример 9
Экспрессия рекомбинантного гена ADTZ
+
Рекомбинантную плазмиду pHIL-S1-ADTZ и экспрессирующий вектор pHIL-S1 разрезали Sacl. Смесь подвергали электрофорезу в 0,8% агарозе. Линеаризованную рекомбинантную плазмиду pHIL-S1-ADTZ и вектор pHIL-S1 экстрагировали из геля. Трансформанты Mut отбирали, следуя инструкции по трансформации сферопластов Pichia Pastoris GS115 (Pichia Expression kit manual, Invitrogen Inc. United States). Метанол использовали в качестве только источника углерода для индуцированной экспрессии Pichia Pastoris GS115. SDS-ПАГЭ смеси инкубации ясно демонстрировал белковую полосу после индуцированной экспрессии, тогда как контрольная проба, без гена ADTZ, не обнаруживала белковую полосу. Результаты показывают на фигуре 12. Детальное описание следующее:
Гомогенная рекомбинация рекомбинантной плазмиды в Pichia Pastoris
9.1. Линеаризация плазмид
Рекомбинантную плазмиду pHIL-S1-ADTZ (pSA) и экспрессионный вектор pHIL-S1 разрезали Sacl. Последнюю использовали в качестве контроля для следующего эксперимента.
рестриктаза pSA (120 мкл): 12 мл буфера L+8 мл Sacl+100 мл pSA.
рестриктаза pHIL-S1 (120 мкл): 12 мл буфера L+8 мл Sacl+100 мл pHIL-S1.
Смеси подвергали электрофорезу в 0,8% агарозе. Линеаризованную рекомбинантную плазмиду pSA и вектор pHIL-S1 экстрагировали из геля.
9.2. Инкубация Pichia Pastoris для трансформации сферопластов.
9.2.1. 10 мл YPD-среды (дрожжевой экстракт, пептон и декстроза) инокулировали одиночной колонией Pichia Pastoris GS115. Растили в течение ночи при 30°C в инкубаторном шейкере (250-300 об/мин).
9.2.2. Инокулировали 200 мл YPD с использованием 5, 10 и 20 мкл ночной культуры. Пробы инкубировали в течение ночи при 30°C в инкубаторном шейкере (250-300 об/мин).
600
600
9.2.3. Три культуры тестировали при OD (пер., оптическая плотность при 600 нм). Одну с OD=0,2-0,3 отбирали и осаждали центрифугированием при 1500 g в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали. Клетки использовали для трансформации сферопластов.
9.3. Получение сферопластов Pichia Pastoris GS115
9.3.1. Осадок клеток ресуспендировали в 20 мл стерильной воды и переносили в две центрифужные пробирки на 10 мл.
9.3.2. Клетки осаждали центрифугированием при 1500 g в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали.
9.3.3. Осадок клеток промывали свежеприготовленным SED с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 5 минут.
Супернатант отбрасывали.
9.3.4. Осадок клеток промывали с помощью 1 М раствора сорбита с последующим центрифугированием при 1500 g в течение 5 минут.
Супернатант отбрасывали.
9.3.5. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл CSE.
9.3.6. Зимолазу оттаивали в пробирке и перемешивали, слегка ударяя по пробирке.
9.3.7. Прибавляли 7,5 мкл зимолазы и инкубировали в течение 30 минут при 30°C.
9.3.8. Клетки осаждали центрифугированием при 1500 g в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали.
9.3.9. Смесь для трансформации промывали с помощью 1 М раствора сорбита, перемешивали, слегка ударяя по пробирке, для диспергирования преципитата. Клетки осаждали центрифугированием при 750 g в течение 5 минут при комнатной температуре. Супернатант отбрасывали.
9.3.10. Клеточный осадок промывали 10 мл раствора CaS с последующим центрифугированием при 750 g в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали.
9.3.11. Осадок клеток ресуспендировали в 0,6 мл раствора CaS. Сферопласты должны быть использованы в течение 30 минут.
9.4. Трансформация сферопластов Pichia Pastoris GS115
9.4.1. Аликвоты сферопластов Pichia Pastoris GS115, по 100 мкл каждая, переносили в три стерильные центрифужные пробирки А, В и С.
9.4.2. Пробирка А (без ДНК) отрицательный контроль, пробирка В (с добавленными 30 мкл линеаризованного вектора pHIL-S1), пробирка С (с добавленными 30 мкл линеаризованной плазмиды pSA, инкубированные в течение 10 минут при комнатной температуре). В то же самое время готовили 3 мл ПЭГ/СаТ.
9.4.3. Аликвоты ПЭГ/СаТ по 1 мл каждая прибавляли в пробирки А, В и С, осторожно перемешивали и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре.
9.4.4. Клетки осаждали центрифугированием при 750 g в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали.
9.4.5. Осадок клеток ресуспендировали в 150 мкл SOS, инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре.
9.4.6. Аликвоты, по 850 мкл каждая, раствора сорбита прибавляли в каждую пробирку.
9.4.7. Взятые целиком трансформации наслаивали на чашки для инкубации с твердым RD с использованием стерильного спредера (200 мкл/чашку). Чашки инкубировали при 28-30°C. Трансформанты появлялись между 4-6 днями.
+
9.5. Селекция трансформантов Mut
+
+
s
+
s
9.5.1. С использованием стерильных зубочисток His-трансформанты перекалывали как на чашки с ММ, так и с MD, штаммы GS115/His Mut с альбумином и GS115/His Mut с в-gal также перекалывали на чашки в качестве контролей.
9.5.2. Чашки инкубировали при 28-30°C в течение 2 дней.
+
s
9.5.3. Через два дня чашки просчитывали. Штаммы Mut росли нормально на обеих чашках, тогда как Mut росли нормально только на чашке с MD, но слабо, или вообще не росли, на чашках с ММ.
9.6. Индуцированная экспрессия рекомбинантных штаммов
+
+
600
9.6.1. Инокулировали одиночную колонию трансформанта His Mut в 25 мл BMG в качалочной колбе на 250 мл. Растили при 28-30°C в инкубаторном шейкере (250-300 об/мин) до достижения культурой OD=2-6 (~16-18 часов).
600
9.6.2. Клетки собирали центрифугированием при 1500-3000 g в течение 5 минут при комнатной температуре. Супернатант декантировали, а осадок клеток ресуспендировали в ВММ до OD 1,0 (~100-200 мл ВММ). Культуру помещали в 1-литровую качалочную колбу и возвращали в инкубатор для продолжения роста при 250-300 об/мин при 28-30°C.
9.6.3. Добавляли 100% метанол до конечной концентрации 0,5% для поддержания индуцированной экспрессии.
9.6.4. Через 96 часов экспрессионную культуру центрифугировали в течение 2-3 минут, супернатант переносили в отдельную пробирку и хранили при -80°C для очистки продукта экспрессии.
Супернатант культуры через 96 часов инкубации анализировали. Суммарное количество белка составляло 0,23 мг/мл. Молекулярная масса белкового продукта согласуется с предсказанной массой 76,95 кДа с использованием BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).
Пример 10
Очистка рекомбинантного ADTZ
4
2
4
Рекомбинантную экспрессионную культуру осаждали с помощью 70% от насыщения (NH)SO, продуцируя грубый фермент в виде преципитата. Грубый фермент (пер., неочищенный фермент) растворяли в равном объеме PBS, центрифугировали. Супернатант наносили на колонку с гидрофобной Phenyl Sepharose; продукт, обладающий активностью, собирали градиентной элюцией. Продукт подвергали диализному обессоливанию и концентрировали после уравновешивания с использованием PBS. Затем концентрированный раствор грубого (неочищенного) фермента очищали аффинной хроматографией с иммобилизованными хелатами металлов с использованием колонки Chelating Sepharose. Пик, обладающий активностью, элюировали с использованием градиента рН, рН 7,5-6,0, и фракции собирали. Подробное описание следующее:
4
2
4
10.1. Грубый (неочищенный) фермент в результате осаждения (NH)SO
4
2
4
4
2
4
Порошок (NH)SO добавляли к рекомбинантной экспрессионной культуре до 40% насыщения с последующим центрифугированием при 10000 g в течение 20 минут при 4°C. К супернатанту добавляли еще (NH)SO до 70% насыщения. Грубый фермент получали после центрифугирования при 10000 g в течение 20 минут при 4°C.
10.2. Хроматография с гидрофобным взаимодействием
4
2
4
4
2
4
Неочищенный фермент ADTZ растворяли в равном объеме 0,02 М PBS (рН 6,0) и центрифугировали при 4000 g в течение 10 минут при 4°C. Супернатант наносили на колонку PhenyI Sepharose (Pharmacia Biotech. Inc., United States), которую отмывали до базовой линии с использованием 0,02М PBS+30% насыщенный (NH)SO, рН 6,0. Градиентная элюция с использованием А (0,02М PBS+10% насыщенный (NH)SO, рН 6,0) и В (0,02М PBS, рН 6,0) дала продукт, обладающий активностью. Продукт подвергали обессоливанию с помощью диализа и концентрировали после уравновешивания с использованием раствора F (0,02М PBS+5М NaCl, рН 7,5) до 1 мг/мл.
10.3. Аффинная хроматография с иммобилизованными хелатами металлов
2
Chelating Sepharose (Pharmacia Biotech. Inc., United States) насыщали с помощью 0,2 M CuCl и затем уравновешивали с помощью воды и раствора F (0,02М PBS+5М NaCl, pH 7,5). Объединенные фракции после хроматографии с гидрофобным взаимодействием наносили и очищали с использованием нелинейного градиента pH с использованием буфера G (0,02М PBS+0,5М NaCl, pH 7,5-6,0, нелинейный градиент повышали на 0,5 единицы pH). Собирали пик продукта и анализировали с использованием SDS-ПАГЭ.
Заключение: Получали 58 мг очищенного рекомбинантного ADTZ из 1 литра экспрессионной культуры, чистоты составляла более чем 95%.
Пример 11
Тестирование активности рекомбинантного ADTZ
1
4
1
4
1
4
1
1
Активность рекомбинантного ADTZ тестировали согласно протоколу в примере 2.1. Смеси для тестирования: (1) Ферментативная смесь: 1 мкл раствора AFB (0,5 мкг/мкл в метаноле, выпаренного в атмосфере азота)+раствор рекомбинантного фермента ADTZ (0,1 мг/мл, 300 мкл)+0,5 мкл MgSO+10 мкл ПЭГ 200; (2) смесь деактивированного фермента; 1 мкл раствора AFB (0,5 мкг/мкл в метаноле, выпаренного в атмосфере азота) + раствор деактивированного рекомбинантного фермента ADTZ (0,1 мг/мл, 300 мкл, прогретый при 100°C в течение 5 минут)+0,5 мкл MgSO+10 мкл ПЭГ 200; (3) контрольная смесь: 1 мкл раствора AFB (0,5 мкг/мкл в метаноле, выпаренного в атмосфере азота)+300 мкл буфера PBS+0,5 мкл MgSO+10 мкл ПЭГ 200. Смесь для тестирования тщательно перемешивали, подвергали взаимодействию в течение 1 часа при 30°C, AFB (0,5 мкл × 2) добавляли каждый час (суммарно AFB: 2 мкг). После добавления взаимодействие продолжали еще в течение 6 часов. После взаимодействия, ТСХ (как описывают в примере 1) демонстрировала новый продукт с Rf~1 (=0,93) для рекомбинантного ADTZ, очень сходное с природным ADTZ, указывая на активность рекомбинантного ADTZ в трансформированном AFB. Результаты показывают на фиг.13.
Пример 12
1
Биологическая активность рекомбинантного ADTZ в детоксифизации AFB
1
Биологическую активность рекомбинантного ADTZ тестировали следуя протоколам в примере 2.2, в которых использовали рекомбинантный ADTZ вместо природного ADTZ. Число мутантных колоний тестируемой пробы рекомбинантного ADTZ, обладающего активностью, является очень сходным с отрицательным контролем (контрольная проба ДМСО) (MR<2). Число мутантных колоний контрольной пробы с буфером и тестируемой пробы деактивированного рекомбинантного ADTZ является существенно выше, чем число в пробе отрицательного контроля (MR>2), и находится очень близко к положительному контролю (контрольная проба AFB). Эти результаты демонстрируют биологическую активность рекомбинантного ADTZ. Результаты приводят в нижеследующей таблице.
Проба
Число мутантных колоний/чашку
MR
Ингибирование (%)
Контрольная проба, PBS
379±57
12,03
~
Проба для тестирования деактивированного рекомбинантного фермента
353±63
11,06
~
Проба для тестирования рекомбинантного фермента
30±01
1,01
98,06
Контрольная проба с AFB<sub>1</sub>
383±65
12,35
~
Контрольная проба с ДМСО
26±8
~
~