УСТРОЙСТВО ДЛЯ ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНАЛИТА
DEVICE FOR TEST-DETECTION OF ANALYTE

Изобретение относится к аналитической химии и может использоваться при мониторинге загрязнений окружающей среды, контроле качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов, анализе биологических объектов.
В современной практике для определения различных веществ широко применяются неинструментальные иммунохимические тест-методы. Наибольшую популярность получили иммунохроматографические (Collin R., Schneider E., Briggs L., Towers N. // Food and Agricultural Immunology. 1998. V.10. P.91-104; Delmulle B., De Saeger S., Sibanda L., Barna-Vetro I., Van Peteghem C. // J. of Agricultural and Food Chemistry. 2005. V.53. P.3364-3368; Usleber E., Schneider E., Märtlbauer E., Terplan G. // J. of Agricultural and Food Chemistry. 1993. V.41. P.2019-2023) и иммунофильтрационные тесты (Schneider E., Usleber E., Märtlbauer E. // J. of Agricultural and Food Chemistry. 1995. V.43. P.2548-2552; De Saeger S., Sibanda L., Desmet A., Van Peteghem C. // International Journal of Food Microbiology. 2002. V.75. P.135-142). Оба типа тестов основаны на использовании мембран, содержащих тестовую зону, окраска которой зависит от концентрации определяемого вещества в образце.
Однако указанные тест-системы сильно подвержены матричному эффекту анализируемого образца, для устранения которого используют разбавление растворов, что зачастую приводит к недостаточной чувствительности метода. Кроме того, высокое содержание окрашенных веществ в матрице анализируемого образца может мешать визуальному детектированию.
Для повышения чувствительности тест-систем предложен подход, заключающийся в использовании вместо мембран тестового слоя, который представляет собой аффинный гель (Goryacheva I.Yu., Beloglazova N.V., Eremin S.A., Mikhirev D.A., Niessner R., Knopp D. // Talanta 2008. Vol.75. N2. P.517-522). Однако этот способ применим только для неокрашенных простых объектов анализа (водные среды).
Наиболее близкими к предлагаемому изобретению являются устройство и метод для определения присутствия аналита (L.Sibanda, S.De Saeger, C.Van Peteghem, Device and method for detecting the presence of an analyte, International Patent Application No. PCT/EP02/01496 (2001)). Устройство позволяет детектировать присутствие аналита в жидких и полужидких средах и представляет собой прозрачный контейнер с отверстиями для ввода и вывода пробы, содержащий, по крайней мере, два отдельных слоя. Анализируемый образец пропускают последовательно через первый и второй слои. Первый слой состоит из сорбента, способного удерживать хотя бы часть мешающих веществ из образца, а второй слой содержит сорбент с молекулами-рецепторами, способными селективно связывать аналит. В качестве такого сорбента может быть использован иммуноаффинный гель с привитыми специфическими антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами.
Указанный формат тест-системы был использован для определения охратоксина А в специях (Goryacheva I.Y., De Saeger S., Lobeau M., Eremin S.A., Barna-Vetrу I., Van Peteghem C. 2006. Approach for ochratoxin A fast screening in spices using clean-up tandem immunoassay columns with confirmation by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) // Analytica Chimica Acta 577:38-45). Водно-ацетонитрильный экстракт специй пропускают через колонку, затем вводят конъюгат с ферментной меткой. Для удаления излишков конъюгата используется стадия промывки. Затем в колонку добавляют субстрат, катализирующий развитие окраски. При загрязнении образца охратоксином А выше допустимого уровня тестовый слой окрашивается в голубой цвет, в случае отсутствия охратоксина А в образце окраска не развивается - тестовый слой остается белым.
Недостатком данного устройства является вымывание мешающих веществ из очищающего слоя при внесении реагентов для проведения иммуноанализа и промывке, что приводит к загрязнению детектирующего слоя и искажению результатов анализа. В частности, данный подход оказался неприемлемым для определения охратоксина А в черном и белом перце.
Задачей заявляемого изобретения является разработка устройства для тест-определения аналита в объектах окружающей среды, пищевых продуктах, лекарственных препаратах, промышленных и биологических объектах.
Технический результат заключается в снижении матричного эффекта пробы без существенного усложнения процедуры пробоподготовки, концентрирования и определения аналитов.
Поставленная задача достигается тем, что устройство для тест-определения аналита, содержащее, во-первых, прозрачный резервуар с отверстиями для ввода и вывода пробы, внутри которого размещен, по крайней мере, один тестовый слой, во-вторых, очищающий слой, согласно решению оно содержит дополнительный резервуар с входным и выходным отверстиями с возможностью обеспечения разъемного соединения с прозрачным резервуаром, при этом очищающий слой расположен в дополнительном резервуаре.
В качестве пробы могут выступать жидкие и полужидкие среды, а также твердые образцы, переведенные в раствор, например, посредством экстракции или растворения.
Тестовый слой выполнен в виде сорбента со специфическими рецепторами, способного удерживать аналит.
В качестве специфических рецепторов выбраны антитела, специфические к аналиту.
В качестве сорбента использована сефароза или ее производные.
Устройство выполнено с возможностью введения ферментной или люминесцентной или флуоресцентной или хемилюминесцентной или коллоидной меток.
В качестве ферментной метки использована пероксидаза хрена.
Прозрачный резервуар с тестовым слоем содержит дополнительный контрольный слой с антителами, специфическими к метке.
В качестве тестового слоя использованы полимеры с молекулярными отпечатками.
В качестве тестового слоя использовано вещество, полученное по золь-гель технологии.
Слои зафиксированы с помощью пористых фильтров.
В прозрачном резервуаре расположено несколько тестовых слоев для определения различных аналитов.
Резервуар имеет форму трубки.
Устройство дополнительно содержит шприц для подачи растворов под давлением.
Устройство укомплектовано тест-набором, состоящим из одного или более реактивов: растворитель для экстракции или растворения твердых образцов, буферные растворы для разбавления пробы, промывочные буферы, конъюгат аналита с меткой и хромогенный субстрат.
Изобретение поясняется чертежами, на фиг.1 схематически изображено устройство, на фиг.2 - схема проведения иммуноферментного определения веществ, где:
1 - резервуары;
2 - очищающий слой;
3 - соединительный элемент (переходник);
4 - тестовый слой;
5 - пористые фильтры (фриты);
6 - проба;
7 - промывочный буфер I;
8 - конъюгат;
9 - промывочный буфер II;
10 - субстрат.
Устройство для тест-определения аналита содержит резервуар в виде колонки 1, внутри которой размещен очищающий слой 2, по необходимости зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами 5, соединенную через переходник 3 с колонкой 1, внутри которой размещен тестовый слой 4, содержащий связывающее аналит вещество, по необходимости зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами 5.
Устройство предназначено для определения аналитов в жидких и полужидких пробах, а также твердых образцах, в том числе интенсивно окрашенных, переведенных в раствор, например, путем экстракции. В качестве аналитов выступают токсиканты различной природы (микотоксины, например, охратоксин А, токсин Т-2, зеараленон, один из афлатоксинов или их группа; полициклические ароматические углеводороды), биологически активные вещества, лекарственные вещества, взрывчатые вещества.
Устройство работает следующим образом.
Твердый образец переводят в раствор посредством экстракции водно-органическими смесями. Полученный экстракт, либо жидкую или полужидкую пробу 6, по необходимости разбавленную буферным раствором с добавками, пропускают через колонку 1 сверху вниз, затем промывают раствором в промывочном буфере I 7, вводят конъюгат 8, который представляет собой аналит или его аналог, ковалентно связанный с ферментом, играющим роль метки. Для удаления излишков конъюгата 8 используется стадия промывки с помощью промывочного буфера II 9. Затем в колонку 1 добавляют субстрат 10, развитие окраски которого катализирует фермент, и наблюдают развитие окраски. В случае появления окраски на тестовом слое 4, представляющем собой иммуноаффинный гель с привитыми антителами, специфическими к аналиту, образец считают не содержащим аналит выше допустимого уровня, в случае отсутствия окраски образец считают содержащим аналит выше допустимого уровня.
Возможность реализации и эффективность предлагаемого подхода подтверждает представленный ниже пример иммуноферментного определения охратоксина А в красном вине.
Для определения охратоксина А использовали две колонки емкостью 1 мл, в одну из которых помещали очищающий слой (200 мг сорбента, представляющего собой силикагель с привитыми триметиламинопропильными группами), а во вторую - тестовый слой, представляющий собой гель на основе бромциансефарозы с привитыми (ковалентно связанными) специфическими к охратоксину А антителами.
Для проведения определения аликвоту (1 мл) анализируемого вина смешивали с 1 мл раствора, содержащего полиэтиленгликоль 6000 и гидрокарбонат натрия. 2 мл получившегося раствора пропускали через колонки с очищающим и тестовым слоями с помощью шприца. Затем колонку с очищающим слоем отсоединяли и продолжали работу только с колонкой, содержащей детектирующий слой. Через нее пропускали промывочный раствор (фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий казеин), затем пропускали конъюгат охратоксина А с пероксидазой хрена. Конъюгат оставляли в колонке на 1 минуту, затем удаляли промыванием колонки 10 мл фосфатно-солевого буфера с добавкой Твин 20. Последним шагом определения являлось добавление в колонку субстрата на основе тетраметилбензидина, после чего в течение нескольких минут наблюдалось развитие синей окраски детектирующего слоя (при отсутствии охратоксина А в пробе). В присутствии определяемого вещества выше предела обнаружения (2 мкг/л) тестовый слой остается белым. Развитие окраски фиксируется визуально.