Способ лечения буллезной кератопатии
METHOD FOR TREATING BULLOUS KERATOPATHY

Изобретение относится к медицине, в частности, к офтальмологии, и может быть использовано для лечения буллезной кератопатии.
Буллезная кератопатия является тяжелым, прогрессирующим заболеванием, связанным с декомпенсацией эндотелиального слоя роговой оболочки. После повреждения эндотелия и утраты им функции полупроницаемой мембраны между стромой роговицы и влагой передней камеры постепенно развивается отек стромы роговой оболочки. В дальнейшем влага передней камеры проникает под эпителий роговицы и отслаивает его с развитием рецидивирующих эрозий, вызывающих мучительные для пациента болевые ощущения, светобоязнь и слезотечение.
В настоящее время разработаны различные методы хирургического лечения буллезной кератопатии: сквозная кератопластика с замещением роговой оболочки аллотрансплантантом (Копаева В.Г., Субтотальная сквозная кератопластика при дистрофии роговой оболочки. Оптикореконструктивные операции и аллопластика в офтальмологии. М. 1974), послойная кератопластика с пересадкой задних слоев роговицы (Волков В.В. К разработке хирургического метода лечения энтотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы. Первый съезд офтальмологов Закавказья: Тез. докл. Тбилиси: 1976), интерламеллярная пересадка задней капсулы хрусталика (Авторское свидетельство СССР N 810235, кл. A61F 9/007, 1981), послойная кератопластика с использованием желатиновой пленки (Способ лечения буллезной кератопатии, патент РФ №2082364, 27.06.1997), задняя послойная кератопластика - Posterior lamellar keratoplasty (PLK) и Deep lamellar endothelial keratoplasty (DLEK) (Ko, W. W. Feldman, S. T. Frueh, В. E. Experimental posterior lamellar transplantation of the rabbit cornea / W. W. Ko, S. T. Feldman, В. E. Frueh //Invest. Ophthalmol. - 1993. - №34. - P. 1102.; Terry, M. A. Ousley, P. J. Deep lamellar endothelial keratoplasty in the first United States patients: early clinical results /M. A. Terry, P. J. Ousley, // Cornea. 2001. - №20. - P. 239 - 243.), кератопластика с пересадкой Десцеметовой мембраны (Мамиконян, В.Р. Труфанов, С.В. Автоматизированная эндотелиальная кератопластика с трансплантацией Десцеметовой мембраны (DMAEK) /В.Р. Мамиконян, С.В. Труфанов // Восток-Запад: сборник научных трудов научн. - прак. конференции. - Уфа, 2011. - С. 89 Gorovoy, М. Descemet stripping automated endothelial keratoplasty / M. Gorovoy // Cornea. - 2006. - №25: 8. - P. 886 - 889. Melles, G. R. Ong, T. S. Ververs, B. van der Wees, J. Descemet membrane endothelial keratoplasty (DMEK) / G. R. Melles, T. S. Ong, B. Ververs, J. van der Wees // Cornea. - 2006. - Vol.25. - №8. - P. 987 - 990), кератопластика с использованием гидрогеля (Способ лечения буллезной кератопатии, патент РФ №2405513, 13.10.2009) и гидрогеля с культивированными эндотелиальными клетками (Fabrication of gelatin hydrogel sheet for the transplantation of corneal endothelium patent US 20140377326, 2018), кератопластика, путем интраламеллярной пересадки биологической мембраны (Способ лечения отечной дистрофии роговицы, 1979, патент СССР №810235), кератопластика с применением псевдоэндотелиальных имплантатов (Implantes pseudoendoteliales hidrofobos para tratar un edema corneal, Pat. 2 442 768, 2010, Sergio RIZZO). Однако перечисленные способы имеют ряд существенных недостатков: техническая сложность операции, высокая частота развития осложнений, вероятность иммунного конфликта с последующим отторжением донорского материала, рецидив заболевания.
Известен способ кератопластики для лечения буллезной кератопатии с использованием гидрогелевого диска, выполняющего роль биологической мембраны, который вводят на расстоянии 1,5-2 мм от лимба на 12 часах трансконъюнктивально в направлении глубоких слоев стромы роговицы, формируют тоннельный разрез шириной 2,5-3,0 мм и длиной 2,5-3,0 мм. Производят расслаивание стромы роговицы на глубине 2/3 ее толщины с последующим формированием интрастромального кармана округлой формы с диаметром 8,5-9,0 мм. В сформированный интрастромальный карман имплантируют в сложенном виде при помощи стандартного инжектора для имплантации интраокулярных линз гидрогелевый диск диаметром 8,0 мм и толщиной 0.1 мм. Недостатками этого способа являются: протяженный разрез роговицы и формирование кармана, что сопряжено с разрывом коллагеновых волокон и отсутствием гладкой поверхности соприкосновения стромы расслоенной роговицы с гидрогелевым диском, а также с ухудшением трофики роговицы и сохранением несостоятельного отечного эндотелиального слоя (Способ лечения буллезной кератопатии, RU 2405513, 2010).
Известен способ того же назначения, включающий имплантацию между стромой и десцеметовой мембраной роговицы гидрогелевого диска. При этом сначала формируют трепанационное отверстие роговицы таким образом, чтобы его дно не достигало десцеметовой мембраны на величину 80-120 мкм. Извлекают трепанационный диск роговицы. На дне трепанационного отверстия создают канал до десцеметовой мембраны и вводят через него окрашенный вискоматериал до момента отслаивания десцеметовой мембраны. Вымывают вискоматериал и в образовавшееся пространство между стромой и десцеметовой мембраной имплантируют гидрогелевый диск. В трепанационное отверстие роговицы помещают извлеченный трепанационный диск роговицы, после чего в переднюю камеру глаза вводят воздух. Основным недостатком способа является полное сохранение десцеметовой мембраны, которая также может быть вовлечена в патологический процесс и обусловливает снижение прозрачности роговицы и, следовательно, низкую остроту зрения (Способ интраламеллярной кератопластики, патент RU 2463025, 10.10.2012).
Известен способ кератопластики с использованием имплантатов размером от 1-2 мм до 6 мм, толщиной от 1 мкм до 100 мкм на основе биологически совместимых материалов: полиметилметакрилата (ПММА), силикона, силиконового каучука, коллагена, гиалуроновой кислоты, акрилового или метакрилового гидрогелей, гидроксиэтилметакрилат или частично гидролизованного поли (2-гидроксиэтилметакрилат / метакриловая кислота / сополимера), полисульфона (Fabrication of gelatin hydrogel sheet for the transplantation of corneal endothelium, patent US 100523506, 2018). Согласно этому способу, имплантат на основе одного из указанных полимеров со сформированными парацентральными отверстиями крепится к задней поверхности роговицы по методу задней пластинчатой кератопластики (PLK) или эндотелиальной кератопластики с замещением десцеметовой мембраны (DSEK) путем подготовки роговичного ложа (предварительное удаление части эндотелия и десцеметовой мембраны) и последующим введением связующего вещества. В качестве связующего вещества могут выступать поли-L-лизин, поли-D-лизин, фибронектин, ламинин, коллаген I, II, III и IV типа, тромбоспондин, полистирол, витронектин, полиаргинин и фактор тромбоцитов IV. Кроме того, в данном способе указывается необходимость использования цитотоксических агентов: белки, ингибирующие рибосомы (сапорин и рицин), а также антимитотические препараты, такие как метотрексат, 5-фторурацил, дауномицин, доксорубицин, митоксантрон, алкалоиды барвинка, винбластин, колхицин и цитохалазины и ионофоры, такие как монензин и уабаин. Не смотря на ряд преимуществ данного способа (возможность варьирования материала для создания имплантата, широкий разбег его размеров и толщины), главными недостатками являются: необходимость подготовки роговичного ложа с удалением эндотелия и десцеметовой мембраны, обязательное использование связующего агента, необходимость применения цитотоксических препаратов.
Кроме того, в качестве альтернативы существующих хирургических методов лечения буллезной кератопатии применяют клеточные технологии. Известен способ интракамеральной локальной экспресс-аутоцитокинотерапии (ЛЭАЦКТ) (Способ лечения отека роговицы и других проявлений ранней буллезной кератопатии, патент РФ №2357743, 13.10.2009). Согласно этому способу, в переднюю камеру больного глаза вводятся активированные Полуданом аутологичные мононуклеарные клетки крови пациента. Забор крови у пациента производится с соблюдением правил асептики и антисептики в условиях процедурного кабинета. Кровь берется из локтевой вены пациента в количестве 5,0 мл. Содержимое 2 флаконов Полудана растворяют в 2,0 мл раствора воды для инъекций, и водный раствор Полудана переносят в стерильную пробирку с 5,0 мл крови. Содержимое пробирки тщательно перемешивают путем переворачивания. Далее пробирку помещают в термостат на 2-4 часа. После окончания инкубирования пробирку со свернувшейся кровью центрифугируют в течение 5-10 минут при 500-1000 об/мин. Далее на границе сыворотки и сгустка свернувшейся крови пипеткой собирают клеточную взвесь. В условиях операционной после обработки операционного поля и ретробульбарной анестезии больного глаза пациента вблизи лимба лезвием производится парацентез роговицы. В переднюю камеру постепенно осуществляют инфузию суспензии аутологичных мононуклеаров крови в количестве 1,0-2,0 мл вплоть до полного замещения ею влаги передней камеры. В зоне парацентеза роговицы накладывают супрамидный шов. Сразу после операции больной должен принять положение лицом вниз и лежать в течение 1 часа, чтобы введенные клетки контактировали с эндотелием роговицы. Сеансы ЛЭАЦКТ проводят с интервалом 3-6 дней в количестве от 1 до 4 раз. Недостатками этого метода являются: длительность и трудоемкость получения аутологичных мононуклеаров крови, активированных с помощью Полудана, высокая вероятность потери клеток вследствие отсутствия подложки для крепления и направленного потока внутриглазной жидкости к внутреннему углу глаза.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ замещения поврежденного эндотелиального слоя роговицы путем его трансплантации с помощью желатин-гидрогелевого диска (Fabrication of gelatin hydrogel sheet for the transplantation of corneal endothelium Patent US 20140377326, 2012). Согласно этому способу, желатин-гидрогелевый каркас (скэфолд) толщиной 100-300 мкм, с порами размером 20-30 мкм, модифицированный гепарином, содержащий один слой предварительно культивированных в течении 7-21 дней эндотелиальных клеток роговицы, имплантируется на предварительно подготовленное - после удаления эндотелия и десцеметовой мембраны реципиента - роговичное ложе. Введенный в переднюю камеру глаза трансплантат фиксируется к заранее подготовленному ложу узловыми швами, для иммобилизации каркаса используется фибриновый клей или фибронектин, в переднюю камеру вводится стерильный воздух.
Недостатками этого метода являются: техническая сложность оперативного вмешательства (подготовка роговичного ложа с удалением эндотелиального слоя и десцеметовой мембраны), необходимость культивирования клеток эндотелия роговицы, высокий риск развития тканевой несовместимости эндотелиоцитов донора и тканей роговой оболочки реципиента, относительно большая толщина имплантируемого диска (100-300 мкм), использование фибринового клея или фибронектина как связующего агента, модифицирование гепарином.
Новой технической задачей изобретения является уменьшение травматичности оперативного вмешательства, использование для имплантации биодеградируемого материала как временной клеточной подложки, применение аутологичных клеток, что снижает риск развития тканевой несовместимости, упрощение получение клеток, существенное уменьшение толщины имплантата (20-30 мкм).
Для решения поставленной задачи в способе хирургического лечения буллезной кератопатии, включающем имплантацию полимерного материала в переднюю камеру с последующим его подшиванием к роговице узловыми швами, наслаивают аутологичные мононуклеарные лейкоциты на поврежденную поверхность роговицы на границе между пленкой и роговой оболочкой. Имплантат представляет собой пленку из поликапролактона диаметром 6,0 мм, толщиной 20-30 мкм.
Благодаря подобному способу применения аутологичных мононуклеарных лейкоцитов и имплантированной полимерной пленки как клеточной подложки значительно уменьшается отек ткани роговицы, что способствует восстановлению ее прозрачности и купированию булл на поверхности.
Сущность изобретения поясняется чертежами. Ниже представлено краткое описание приложенных чертежей, используемых для описания осуществления изобретения.
На фиг.1 показана сторона пленки поликапролактона;
на фиг.2 представлена фотография краевого угла смачивания (60,1°) пленки поликапролактона после обработки сторон плазмой;
на фиг.3. показан спектр пропускания пленки поликапролактона, где 1 - исходный образец; 2 - после плазменной обработки;
на фиг.4. показана инъекция сосудов конъюнктивы, выраженная отечность отечность роговицы у экспериментального животного через 2 недели после моделирования буллезной кератопатии;
на фиг.5. показана инъекция сосудов конъюнктивы, слезотечение, отек роговицы экспериментального животного второй группы на 3-й сутки после имплантации пленки поликапролактона и наслоения мононуклеарных лейкоцитов;
на фиг.6. показан умеренно выраженный отек роговицы экспериментального животного второй группы на 14-и сутки после имплантации пленки поликапролактона и наслоения мононуклеарных лейкоцитов;
на фиг.7. показан слабо выраженный отек поверхностных слоев роговицы экспериментального животного второй группы через 4 недели после имплантации пленки поликапролактона и наслоения мононуклеарных лейкоцитов;
на фиг.8. показан умеренно выраженная инъекция сосудов конъюнктивы и отечность роговицы экспериментального животного первой группы через 6 недель от начала эксперимента;
на фиг.9. представлена оптическая когерентная томография (ОКТ) роговицы экспериментального животного через 2 недели после моделирования буллезной кератопатии;
на фиг.10. представлена ОКТ роговицы экспериментального животного второй группы через 4 недели после имплантации пленки поликапролактона и наслоения мононуклеарных лейкоцитов;
на фиг.11. представлена ОКТ роговицы экспериментального животного первой группы через 6 недель от начала эксперимента;
на фиг.12. показан передний эпителий, Боуменова мембрана и собственное вещество роговицы экспериментального животного второй группы. Окраска гематоксилин-эозин, х200;
на фиг.13. показано собственное вещество роговицы экспериментального животного второй группы. Окраска гематоксилин-эозин, х200;
на фиг.14. показана адгезия мононуклеарных лейкоцитов к десцеметовой мембране роговицы экспериментального животного второй группы. Окраска гематоксилин-эозин, х400;
на фиг.15. показаны слои отростчатых клеток роговицы экспериментального животного второй группы. Окраска гематоксилин-эозин, х200;
на фиг.16. показан передний эпителий, Боуменова мембрана и собственное вещество роговицы экспериментального животного первой группы. Окраска гематоксилин-эозин, х200;
на фиг.17. показан передний эпителий, Боуменова мембрана и собственное вещество роговицы экспериментального животного первой группы. Окраска гематоксилин-эозин, х200.
Пленки поликапролактона (фиг.1) получают из 1%-го раствора поликапролактона с молекулярным весом, Mw=80000 г/моль (Sigma-Aldrich, Англия). Готовый раствор в количестве 12 г выливают в чашки Петри и выдерживают в вытяжном шкафу до полного испарения растворителя (48 часов). Сформированные полимерные пленки удаляют из чашки Петри и помещают в вакуумную камеру на 24 часа (давление 10-3 Торр, температура 25°С) для полного устранения остаточного растворителя. Толщина пленок, полученных по данной методике, составляет (25±5) мкм. В целях увеличения смачиваемости полимера и, как следствие, улучшения адгезии клеток, введенных в переднюю камеру глаза между пленкой и внутренней поверхностью роговицы, стороны материала обрабатывают низкотемпературной плазмой атмосферного давления с напряжением 25 кВ и частотой - 5 кГц продолжительность 30 секунд. Краевой угол смачиваемости (по воде) пленок поликапролактона после обработки сторон плазмой составляет 60,6°±2,3° (фиг.2). Коэффициент пропускания видимого спектра пленок поликапролактона составляет 90%-95% (фиг.3). Способ осуществляется следующим образом.
Аутологичные мононуклеарные клетки из крови экспериментального животного выделяют методом фракционирования в градиенте плотности на разделяющем растворе фиколл-верографин. Кровь, взятую в количестве 4,0-5,0 мл, помещают в стерильную пробирку, содержащую 1,0 мл раствора гепарина. Гепаринизированную кровь разбавляют в 2 раза изотоническим раствором хлорида нартия. Полученная суспензия наслаивается на 3,0 мл смеси фиколла-верографина. Пробы центрифугируют при комнатной температуре в течение 15 мин при 800 g (2000 об/мин). После центрифугирования интерфазный слой, содержащий мононуклеарные клетки и располагающийся между плазмой и градиентом, забирается пастеровской пипеткой. Добавляется 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия, и полученная суспензия вновь центрифугируется в течение 7 мин при 400 g (1550 об/мин). Чистота мононуклеаров, полученных на градиенте фиколл-верографин, составляет до 96-98%. Жизнеспособность клеточного материала оценивается в тесте с трплановым синим следующим способом: предварительно на основе раствора Рингера готовится 0,1% раствор эозина. Далее на основе дистиллированной воды готовится 0,1% раствор трипанового синего. После этого к капле клеточной суспензии добавляют 1-2 капли свежей смеси растворов, приготовленных ранее красителей, взятых в равных объемах. Полученную смесь помещают в камеру Горяева. При подсчете клеток процент окрашенных (погибших) элементов должен составлять 1,5-2%, что не превышало бы допустимое (не более 3%) количество. Жизнеспособность клеточного материала в тесте с трипановым синим составляет 97-98%.
В условиях операционной после наркоза и обработки операционного поля с соблюдением правил асептики и антисептики, животным проводится оперативное вмешательство. В роговице с предварительно индуцированной буллезной кератопатией производят разрез с 12 до 4 часов у лимба, через который имплантируют пленку поликапролактона в переднюю камеру глаза. Пленку подшивают двумя узловыми швами к роговице. На границе между пленкой и внутренней поверхностью роговицы на эндотелий наслаивают клеточную суспензию, роговичный разрез зашивают непрерывным швом. В переднюю камеру вводится стерильный воздух.
Способ апробирован на 12 кроликах породы Sylvilagus bachmani весом 2,5-3,0 кг.
Обзор экспериментального материала: общая продолжительность эксперимента составила 6 недель. На I этапе каждому животному в условиях операционной моделировали буллезную кератопатию путем механического повреждения и удаления эндотелия роговицы одного из глаз. На II этапе спустя 2 недели после развития патологического процесса животные были поделены на следующие группы:
1 группа - (n=6) группа модели заболевания;
2 группа - (n=6) группа животных, которым в переднюю камеру глаза осуществляли имплантацию пленки поликапролактона и наслоение аутологичных мононуклеарных лейкоцитов описанным способом.
В ходе эксперимента проводили наружный осмотр, фоторегистрацию, оптическую когерентную томографию (ОКТ) роговицы. Забор материала производили спустя 6 недель от начала эксперимента.
Энуклеированные глаза фиксировали в 12% нейтральном формалине. Фиксацию проводили при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем объекты, после 24-часового промывания в проточной воде, подвергали обезвоживанию в спиртах восходящей концентрации, просветляли в О-ксилоле и заливали в парафин. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методу Ван-Гизона.
Для подсчета различных структурных компонентов и клеточной инфильтрации использовали световой микроскоп ЛОМО Биолам АУ-12 (ок. х7, об. Х40, х90, собственное увеличение микроскопа x1,5), окулярную сетку Автандилова на 50 точек, окулярную вставку с известной площадью.
Полученные данные обработаны с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics 20.
В результате наружно осмотра через 2 недели после моделирования буллезной кератопатии у всех животных было отмечено слезотечение, светобоязнь, инъекция сосудов конъюнктивы, выраженная отечность отечность роговицы (фиг.4). На третьи сутки после имплантации у животных второй группы сохранялась инъекция сосудов конъюнктивы, слезотечение, отек роговицы (фиг.5), на 14-е сутки отек роговой оболочки заметно уменьшился, слезотечение и инъекция сосудов конъюнктивы полностью купировались (фиг.6). Через 4 недели после имплантации пленок поликапролактона и наслоения мононуклеарных лейкоцитов у животных второй группы был заметен слабо выраженный отек поверхностных слоев роговицы (фиг.7). У животных первой группы на протяжении всего эксперимента сохранялись слезотечение, умеренно выраженная инъекция сосудов конъюнктивы и отечность роговицы (фиг.8).
В ходе ОКТ роговицы было выявлено увеличение толщины роговицы у всех животных через 2 недели после моделирования буллезной кератопатии, которая составляла в среднем 745 мкм (фиг.9). Через 2 недели после имплантации пленок поликапролактона и наслоения мононуклеарных лейкоцитов у животных второй группы было замечено снижение толщины роговицы до 703 мкм, через 4 недели - до 633 мкм, р<0,05 (по сравнению с первой группой в эти же сроки по критерию Манна-Уитни) (фиг.10). У животных первой группы толщина роговой оболочки на 6 неделе от начала эксперимента составила 702 мкм (фиг.11).
В ходе морфологических исследований у второй группы животных было выявлено следующее.
Передний эпителий роговицы представлен 4-5 слоями плоского эпителия с нормохромными ядрами и сохранен на всем протяжении (фиг.12). Боуменова мембрана визуализировалась в виде гомогенной эозинофильной полоски. В собственном веществе роговицы обнаруживались неравномерные умеренные изменения (фиг.12, фиг 13). Собственное вещество роговой оболочки содержало преимущественно компактно расположенные коллагеновые волокна (фиг.12, фиг 13). Удельный объем щелей между ними составил 9,9%. Задняя пограничная мембрана не изменена и хорошо визуализировалась на всем протяжении. Местами было обнаружена адгезия мононуклеарных лейкоцитов, наслоенных на поврежденную поверхность роговицы, к десцеметовой мембране (фиг.14). Во многих местах эндотелий был представлен слоями отростчатых клеток (фиг.15).
В ходе морфологических исследований у первой группы животных выявлено следующее.
Передний эпителий роговицы представлен слоями плоского эпителия и сохранен на всем протяжении (фиг.16). Боуменова мембрана визуализировалась в виде гомогенной эозинофильной полоски, местами неравномерно утолщена (фиг.16). Собственное вещество роговой оболочки содержало преимущественно извитые коллагеновые волокна, удельный объем щелей между которыми составил 16%, р<0,05 (по сравнению со второй группой по критерию Манна-Уитни) (фиг.17). Задняя пограничная мембрана визуализировалась на всем протяжении. Эндотелий отсутствовал (фиг.17).
Анализ полученных в ходе эксперимента данных, свидетельствует о уменьшении отека роговицы, и, как следствие, стабилизации патологического процесса.
Таким образом, результаты экспериментального исследования показали, что имплантация пленок поликапролактона в переднюю камеру глаза и наслаивание мононуклеарных лейкоцитов на границе между материалом и внутренней поверхность роговицы при буллезной кератопатии позволяет компенсировать нарушенную функцию эндотелиального слоя роговой оболочки и стабилизировать течение патологического процесса, благодаря чему уменьшается отек ткани и восстанавливается прозрачность роговицы.