ПРЕЦИЗИОННЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЙ ТИТРАЦИОННЫЙ КАЛОРИМЕТР
PRECISION CAPILLARY DIFFERENTIAL TITRATION CALORIMETRE

Основными областями применения титрационных калориметров являются биология, биотехнология, биохимия, физико-химическая биология, молекулярная микробиология, медицина. Титрационный калориметр является универсальным средством для измерения параметров кинетики ферментативных реакций и описания биомолекулярных взаимодействий.
Известен изотермический дифференциальный титрационный калориметр [1], содержащий систему титрования с перемешиванием, тепловой экран и пару одинаковых калориметрических камер: эталонную и рабочую. Каждая камера объемом 1.4 мл - это полностью заполняемый сосуд, имеющий форму монеты. Камера имеет длинную узкую трубку, через которую исследуемые образцы вводятся или удаляются при помощи шприцев с длинными иглами. Каждая камера имеет два фототравленных нагревателя, расположенных одинаково на одной плоской внешней поверхности, в то время как вторая плоская поверхность камеры примыкает к специальному термоэлектрическому устройству, содержащему 264 кристалла теллурия висмута.
Шприцы для титрования объемом от 25 до 250 мкл - это точные стеклянные шприцы, длинные иглы которых из нержавеющей стали имеют на конце прикрепленную перемешивающую лопасть. Шприц для титрования помещается в узел подшипников, обладающих низким трением, который содержит встроенное времязадающее колесо. Этот перемешивающий узел со шприцем легко устанавливается внутрь тефлонового загружающего цилиндра, и времязадающее колесо сцепляется с точным перемешивающим двигателем. Весь этот узел непрерывно вращается в течение эксперимента со скоростью 400 об/мин (управляемый с помощью цифрового тахометра) и производит полное смешивание в камере в пределах нескольких секунд после титрования, что было установлено визуально. Калибровка шкалы дифференциальной мощности может проводиться или электрически посредством ввода с клавиатуры, который активирует калибровочный нагреватель рабочей ячейки, или химически посредством титрования растворов, имеющих известную теплоту реакции. Однако, поскольку мешалка существует в контакте с реагентами и внутренней средой, то она становится теплопроводящем путем, который влияет на проведение эксперимента при температуре, отличной от температуры окружающей среды. Это приводит как к нестабильности измерений, так и к значительному снижению величины регистрируемой измерительной термобатареей мощности теплового эффекта из-за ее потерь за счет теплопередачи во внешнюю среду через вал мешалки. Кроме того, нагревательные элементы расположены на внешних поверхностях калориметрических камер. При такой конструкции нагревателя не обеспечивается равенство подводимой к нагревателям камер при компенсационном методе измерений электрической мощности, измеряемой мощности тепловых процессов, протекающих в калориметрических камерах, и усложняет калибровку калориметра.
Наиболее близким по технической сущности является капиллярный дифференциальный титрационный калориметр [2], содержащий измерительные части капиллярных калориметрических камер, заключенные в термостатирующую оболочку, дозирующий шприц с иглой для рабочей камеры и дозирующий шприц с иглой для эталонной камеры, установленные на общем держателе шприцев, связанном с механизмом перемещения держателя шприцев вдоль оси калориметрических камер, штоки поршней шприцев установленные на пластине, которая соединена с механизмом перемещения поршней вдоль оси калориметрических камер, устройство приведения дозирующих игл в колебательное движение, пассивный тепловой шунт, охватывающий часть калориметрических камер и соединенный с термостатирующей оболочкой, активный тепловой шунт, охватывающий пассивную часть капиллярных калориметрических камер, выполненных в виде прямых капилляров, средство измерения мощности тепловых процессов, происходящих в калориметрических камерах.
Достоинством капиллярного дифференциального титрационного калориметра является то, что в нем точно выделяется измерительный объем калориметрических камер, имеется возможность введения нетермостатированной добавки, которая равномерно распределяется по длине калориметрических камер, обеспечивая диффузионное смешивание реагентов, что не требует интенсивного механического перемешивания этих реагентов. Кроме того, в данном калориметре предусмотрен режим ввода добавки подвижной иглой, которая по окончании дозирования выводится из зоны чувствительного (рабочего) объема калориметрических камер, что исключает регистрацию паразитного тепла при диффузии органического растворителя через сопло иглы в камеру, сопровождающейся тепловыми эффектами, во много раз превышающими по мощности измеряемую мощность реакции.
Недостаток данного калориметра заключается в использовании и эксплуатации сложных безлюфтовых винтовых механизмов для перемещения элементов титрационного узла [3]. При этом используются два винтовых механизма, первый для перемещения держателя дозирующих шприцев, а второй для перемещения штоков поршней дозирующих шприцев. При работе на калориметре в них возникает люфт при возвратно-поступательном движении, что требует контроля и юстировки этих механизмов перед проведением прецизионных измерений на калориметре. Эти дополнительные операции резко снижают эксплуатационные характеристики калориметра. Для варианта дозирования при вводе дозирующих игл в камеры люфты в механизмах выбираются при введении реагентов в пассивную часть калориметрических камер, что обеспечивает соответствие заданию фактически введенной дозы. Однако при подъеме дозирующих игл от дна камеры в сторону крайнего верхнего положения в исходное состояние для подготовки следующего цикла дозирования в результате изменения направления вращения винтовых механизмов в камеры осуществляется паразитное дозирование в течение времени выборки люфтов. Неконтролируемая добавка реагента в камеры искажает величину суммарной добавки в камеры, что также приводит к погрешности в оценке измеряемых термодинамических параметров: энтальпии (далее ΔН), константы связывания (далее К) и стехиометрии взаимодействия (далее n). В стандартном эксперименте по оценке термодинамических параметров при связывании молекул обычно используется порядка двадцати инъекций титранта в камеры, что приводит к паразитному введению в камеры около 0,4 микролитров титранта. Таким образом, в рабочую калориметрическую камеру в реальном эксперименте, предусматривающем 20 рабочих инъекций по 1 мкл, за счет паразитного дозирования дополнительно вводится 2.0% добавки, что недопустимо. Для варианта дозирования при подъеме дозирующих игл от дна камеры в сторону крайнего верхнего положения также происходит паразитное дозирование в начале подъема игл в течение времени выборки люфтов винтовых механизмов перемещения шприцев и поршней. Это приводит к погрешности величины дозы и к отмеченным выше погрешностям в оценке измеряемых термодинамических параметров.
Задача изобретения - упрощение капиллярного дифференциального титрационного калориметра и улучшение его эксплуатационных характеристик.
Предлагается:
1. Презионный капиллярный дифференциальный титрационный калориметр, содержащий измерительные части капиллярных калориметрических камер, заключенные в термостатирующую оболочку, дозирующий шприц с иглой для рабочей камеры и дозирующий шприц с иглой для эталонной камеры, установленные на общем держателе шприцев, связанном с механизмом перемещения держателя шприцев вдоль оси калориметрических камер, штоки поршней шприцев, установленные на пластине, которая соединена с механизмом перемещения поршней вдоль оси калориметрических камер, устройство приведения дозирующих игл в колебательное движение, пассивный тепловой шунт, охватывающий часть калориметрических камер и соединенный с термостатирующей оболочкой, активный тепловой шунт, охватывающий пассивную часть капиллярных калориметрических камер, выполненных в виде прямых капилляров, средство измерения мощности тепловых процессов, происходящих в калориметрических камерах, отличающийся тем, что пластина снабжена управляемым узлом механической связи штоков поршней дозирующих шприцев с пластиной.
2. Устройство по п.1, в котором узел механической связи штоков поршней дозирующих шприцев с пластиной снабжен пружиной, обеспечивающей механическую связь штоков поршней с пластиной, и электромагнитом для управляемого отключения механической связи штоков поршней с пластиной через пружину.
На фиг.1 представлен прецизионный капиллярный дифференциальный титрационный калориметр имеющий эталонную 1 и рабочую 2 калориметрические камеры в виде прямых капиллярных трубок с внутренним диаметром 2.0 мм. Полный объем калориметрической камеры равен 268 мкл, рабочий объем равен 156 мкл. Рабочим объемом калориметрических камер является объем части трубок, расположенный между дном камер и границей контакта с пассивным тепловым шунтом 3. Длина капилляров рабочего объема камер равна 50 мм. Калориметрические камеры заключены в термостатирующую оболочку 4. На выводных концах капилляров калориметрических камер установлен активный тепловой шунт 5, который снижает тепловой шум и исключает теплообмен калориметрических камер и пассивного теплового шунта с внешней средой через выводную часть капиллярных трубок. Калориметрические камеры снабжены измерительной термобатареей 6. Калориметрические камеры, заключенные в термостатирующую оболочку 4, установлены в термохолодильник 7. На термостатирующей оболочке установлен датчик температуры 8, а на активном шунте установлен датчик температуры 9. Датчики температуры 8 и 9 подсоединены к многоканальному измерительному усилителю 10, связанному с компьютером 11, содержащим многоканальный АЦП и модуль PC-TIO-10, связанные с блоком усилителей мощности 12, соединенным с нагревателем 13 термостатирующей оболочки и нагревателем 14 активного шунта. Калориметр снабжен измерителем мощности тепловых процессов, состоящим из термобатареи 6, связанной своим выходом со входом нановольтметра 15, который снабжен интерфейсом RS-232, связывающим нановольтметр с компьютером 11.
Для введения реагентов в калориметрические камеры калориметр снабжен дозирующим шприцем с иглой 16 для эталонной камеры и дозирующим шприцем с иглой 17 для рабочей камеры, размещенных в держателе 18. Поршни через штоки дозирующих шприцев 19 и 20 объединены связывающей их пластиной 21. Для обеспечения введения реагентов в калориметрические камеры держатель шприцев связан с винтовым механизмом 22, а пластина связана с винтовым механизмом 23. При этом пластина 21 снабжена управляемым от компьютера узлом механической связи штоков поршней 19 и 20 дозирующих шприцев с пластиной. Указанная механическая связь обеспечивается пружиной 24. Разрыв этой механической связи обеспечивается управляемым от компьютера 11 через разъем 25 электромагнитом, состоящим из магнитопроводов 26 и 27, электрической катушки 28, намотанной на каркасе 29. Катушка закреплена на магнитопроводе гайкой 30, что обеспечивает перемещение магнитопровода 26 вдоль оси 36; при наличии управляющего сигнала обеспечивается примагничивание магнитопроводов 26 и 27 и отключение механической связи штоков поршней с пластиной, а при отсутствии управляющего сигнала обеспечивается прижатие штоков поршней 19 и 20 к пластине 21 магнитопроводом 26. Магнитопровод 27 жестко закреплен стойками 31 и 32 на пластине 21. Стойки 31 и 32, пластина 21 и ось 36 выполнены из нержавеющей стали. Винтовой механизм 22 приводится в движение шаговым двигателем 33, а винтовой механизм 23 - шаговым двигателем 34. Управление шаговыми двигателями осуществляется компьютером через блок усилителей мощности 12. Колебательный режим дозирующих игл обеспечивается вибрационным устройством 35, частота колебаний которого управляется компьютером через блок усилителей мощности 12.
Предлагаемый прецизионный капиллярный дифференциальный титрационный калориметр работает следующим образом.
Тепловая мощность, для измерения которой предназначен предложенный калориметр, возникает в рабочей калориметрической камере следующим образом: например, в режиме введения добавки при движении дозирующей иглы из камеры в рабочей камере 2 реагент добавки начинает выделяться из иглы непосредственно у дна камеры. Сигнал разбаланса по температуре между камерами поступает на вход цифрового нановольтметра 15. Практически во всех современных калориметрах для этих целей используются высокочувствительные цифровые вольтметры, имеющие интерфейс RS-232. При пороге чувствительности нановольтметра на уровне 2 нВ в современных калориметрах обеспечивается порог чувствительности по мощности порядка 50 нВт. Сигнал разбаланса тепловой мощности поступает на СОМ-порт компьютера 11, считывается управляющей программой, индицируется на экране управляющего компьютера и архивируется для дальнейшей обработки. В процессе подъема дозирующих игл от дна камеры в сторону крайнего верхнего положения реагент добавки распределяется равномерно по всей длине камеры. В рабочую камеру дозируется реагент добавки, а в эталонную камеру дозируется такое же количество нейтрального вещества (буфер и др.). Часть калориметрических камер ниже границы теплового шунта 3 является измерительным объемом. При вхождении сопла дозирующей иглы в зону шунта 3 и дальнейшем ее подъеме тепловой эффект от взаимодействия реагента добавки с образцом не дает вклад в сигнал от измеряемой тепловой мощности, так как полностью шунтируется в системе шунтов 3 и 5. Введение дозы через дозирующую иглу происходит благодаря одновременному движению шприцев 16 и 17 и штоков поршней 19 и 20. Приводом для перемещения шприцев являются шаговый двигатель 33 и винтовой механизм 22. Приводом для штоков поршней является шаговый двигатель 34 и винтовой механизм 23. При различной скорости движения шприцев и поршней происходит управляемое компьютером 11 дозирование. При введении дозы производится продольное перемещение шприцев механизмом 22 на всю длину калориметрических камер. Одновременно с этим производится перемещение поршней механизмом 23. За счет различной величины перемещений механизмов 22 и 23 шприцами осуществляется дозирование заданного количества реагентов. Задача изобретения решена путем использования простых, типа «винт-гайка», винтовых механизмов перемещения шприцев и поршней вместо сложных безлюфтовых винтовых механизмов и введением автоматического отключения механической связи штоков поршней с механизмом перемещения поршней дозирующих шприцев на время выборки люфтов в указанных механизмах (вариант отключения механической связи шприцев с механизмом перемещения шприцев или вариант отключения механической связи и шприцев, и поршней с механизмами перемещения возможны, но практически нецелесообразны ввиду их сложности по сравнению с предложенным решением). Благодаря тому что пластина 21 снабжена управляемым от компьютера узлом механической связи штоков поршней дозирующих шприцев с пластиной, паразитного дозирования нет, так как в интервале времени выборки люфтов в винтовых механизмах поршни остаются неподвижными в шприцах благодаря отключению механической связи штоков поршней с пластиной. Какое-либо дозирование при отжатой пружине 24 исключено. При использовании винтового механизма с дискретностью вращения, например 200 шагов шагового двигателя на оборот, выборка люфтов осуществляется не более чем за 10 шагов и учитывается при оценке фактической величины дозы. Для варианта дозирования при вводе дозирующих игл в камеры в начале дозирования можно также отжимать пружину 24 на время выборки люфта, но в этом нет необходимости, так как в этом случае паразитное дозирование осуществляется в пассивную часть объема калориметрических камер, которая в соответствии с алгоритмом работы приборы сливается из камер при опускании иглы. В этом варианте дозирования при подъеме дозирующих игл от дна камеры в сторону крайнего верхнего положения в исходное положение пружина 24 автоматически отжимается в начальный момент движения механизмов, что исключает неконтролируемую добавку реагента в камеры, искажающую величину суммарной добавки реагентов в камеры. Таким образом, контроля и юстировки механизмов перемещения шприцев и штоков поршней не требуется, что улучшает эксплуатационные характеристики калориметра. При введении дозы осуществляется ее интенсивное перемешивание вибрирующими дозирующими иглами. Амплитуда и частота вибрации игл обеспечивается вибрационным устройством 35.
Для обеспечения необходимого диапазона рабочих температур титрационного калориметра используется термохолодильник 7. Термостатирование калориметрических камер обеспечивается термостатирующей оболочкой 4 и тепловыми шунтами 3 и 5, на которых соответственно установлены датчики температуры 8 и 9, подключенные к многоканальному измерительному усилителю 10. Температура термостатирующей оболочки и активного теплового шунта автоматически регулируется по сигналам датчиков соответственно 8 и 9, связанных с компьютером через многоканальный измерительный усилитель. Сигналы с усилителя 10 поступает в компьютер на многоканальный АЦП. Сформированные сигналы ШИМ с выходов таймеров модуля PC-TIO-10 подаются в нагреватель термостатирующей оболочки и нагреватель шунта через усилитель мощности, обеспечивая автоматическое регулирование температуры в соответствии с уставкой, заданной на компьютере.
На Фиг.2А представлены результаты экспериментов по регистрации паразитных пиков и оценки объема паразитных доз (указанные данные представлены в увеличенном масштабе на Фиг.2В). При проверке калориметрические камеры и шприц для дозирования в эталонную камеру были заполнены водой, а шприц для дозирования в рабочую камеру был заполнен 96% этиловым спиртом. Выполнены эксперименты по регистрации паразитных пиков в режиме подъема дозирующих игл от дна камеры в сторону крайнего верхнего положения при прижатых штоках поршней и при отжатых штоках поршней от пластины и два эксперимента по оценке объема паразитных доз этилового спирта в рабочую камеру при введении дозирующих игл в камеры от крайнего верхнего положения до дна камеры при дозировании 0.2 мкл 96% этилового спирта в рабочую камеру. Для регистрации паразитных пиков выполнено два подъема дозирующих игл с использованием винтового механизма «винт-гайка», имеющего люфт. Регистрация пиков выполнена в режиме прижатия штоков поршней 19 и 20 к пластине 21 пружиной 24. Первый паразитный пик соответствует первому подъему игл, а второй соответствует второму подъему дозирующих игл. Площадь данных пиков соответственно равна 38911 и 28165 ед.площади. Затем выполнено еще два подъема дозирующих игл от дна камеры в сторону крайнего верхнего положения с отключением механической связи штоков поршней с пластиной через пружину. В позициях регистрации предполагаемых пиков (3 и 4) на термограмме пиков нет, что подтверждает эффективность предлагаемого технического решения. Пятый и шестой пики соответствуют дозам по 0.2 мкл 96% этилового спирта в режиме введения дозирующих игл в камеры. Площади пиков соответственно равны 504326 и 696620 ед.площади. Прикидочная оценка объема паразитного дозирования, основанная на соотношении площадей паразитных пиков и пиков при дозировании 0.2 мкл этанола, показывает, что паразитная добавка составляет около 0.02 мкл, что соответствует 5 шагам управляющего шагового двигателя. В стандартном эксперименте по оценке термодинамических параметров при связывании молекул обычно используется порядка двадцати инъекций титранта в камеры, что приводит к паразитному введению в камеры около 0,4 микролитров титранта. Таким образом, в рабочую калориметрическую камеру в реальном эксперименте, предусматривающем 20 рабочих инъекций по 1 мкл, за счет паразитного дозирования дополнительно вводится 2.0% добавки, что недопустимо.
2+
2+
-1
-1
На фиг.3 представлены результаты тестирования Ва-18-Crown-6 прецизионного капиллярного дифференциального титрационного калориметра, снабженного управляемым узлом механической связи штоков поршней дозирующих шприцев с пластиной. Условия эксперимента: объем дозы в рабочую камеру 1.63 мкл 0.1М Ва; объем дозы в эталонную камеру 1.63 мкл воды; температура 25°С. Рабочий объем камер (золото): рабочая камера 156 мкл 0.005М 18-Crown-6, эталонная камера 156 мкл 0.005М 18-Crown-6. На Фиг.3А представлены экспериментальные данные, на Фиг.3В представлены результаты обработки экспериментальных данных. Результаты данного тестирования полностью соответствуют результатам тестирования капиллярного дифференциального титрационного калориметра, работающего с отъюстированными безлюфтовыми винтовыми механизмами привода шприцев и привода поршней: ΔН=31,77 кДж·моль, К=4389 моль, n=1.
Задача упрощения капиллярного дифференциального титрационного калориметра и улучшения его эксплуатационных характеристик решена путем использования простых, типа «винт-гайка», винтовых механизмов перемещения шприцев и поршней вместо сложных безлюфтовых винтовых механизмов и введением автоматического отключения механической связи штоков поршней с механизмом перемещения поршней дозирующих шприцев на время выборки люфтов в указанных механизмах. Новое техническое решение исключает контроль и юстировку винтовых механизмов перед проведением прецизионных измерений на калориметре.
Литература
1. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. / Wiseman Т., Williston S., Brandts J.F. and Lin L. // Anal. Biochem. - 1989. - Vol.179. - P.131-137
2. Моисеева С.П. Разработка калориметрического метода и капиллярного титрационного калориметра для изучения биохимических реакций: Автореф. дис. канд. техн. наук. - М., 2005. - 20 с.
3. Иосилевич Г.Б. Детали машин. - М.: Машиностроение, 1988. - 268 с.