Способ создания тканеинженерных конструкций методом биопечати биочернилами для регенерации хрящевой ткани в условиях организма
METHOD FOR CREATING TISSUE-ENGINEERING STRUCTURES BY BIOPRINTING WITH BIOINK FOR CARTILAGE TISSUE REGENERATION UNDER BODY CONDITIONS

Изобретение относится к тканевой инженерии и 3D-биопечати, может быть использовано для создания тканеинженерных конструкций (скаффолдов).
3D-биопечать – перспективная технология изготовления тканевых конструкций сложной внешней геометрии и/или внутренней структуры, со строго определенными механическими свойствами,с персонализированным составом. Основным компонентом в 3D-биопечати являются биочернила, которые представляют собой биоматериал в форме гидрогеля, содержащим определенное количество и типы клеток. Биочернила должны обладать такими биологическими характеристиками как биосовместимость, цитосовместимость, биодеградация с контролируемой скоростью, близкой к скорости регенерации замещаемой ткани. Приготовление биочернил осуществляется с использованием различных природных и синтетических материалов и их комбинаций, таких как коллаген, желатин, агароза, фиброин шёлка, альгинат и т.д.Однако большинство этих материалов не способно воссоздать микроокружение, типичное для живых тканей, внутреннюю клеточную морфологию и функции.
Идеальным образцом такого материала может являться основа самой целевой ткани – ее внеклеточный матрикс (ВКМ). Состав ВКМ каждой ткани уникален. Он представлен сложной сетью компонентов, основными из которых являются волокнообразующие белки, такие как коллагены, эластин, фибронектин, ламинины, гликопротеины, протеогликаны и гликозаминогликаны [Theocharis AD, Skandalis SS, Gialeli C, Karamanos NK. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 2016, 97: 4-27. DOI: 10.1016/j.addr.2015.11.001.].ВКМ регулирует многие клеточные процессы, включая рост, миграцию, дифференцировку, гомеостаз и морфогенез [K.C. Clause, T.H. Barker. Extracellular matrix signaling in morphogenesis and repair. Curr. Opin. Biotechnol.,2013,24: 830-833; Theocharis AD, Skandalis SS, Gialeli C, Karamanos NK. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 2016; 97: 4-27. DOI: 10.1016/j.addr.2015.11.001.]. Он является основным источником и проводником биохимических и биомеханических сигналов, для обеспечения организации и функционирования ткани в целом [Herrera J, Henke CA, Bitterman PB. Extracellular matrix as a driver of progressive fibrosis. J Clin Invest. 2018, 128(1): 45-53. DOI: 10.1172/JCI93557.], обеспечивая физико-механическое микроокружение клеток [Theocharis AD, Skandalis SS, Gialeli C, Karamanos NK. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev. 2016, 97: 4-27. DOI: 10.1016/j.addr.2015.11.001].
В последнее время появляются данные о применении гидрогелей на основе децеллюляризованного ВМК (дВКМ) в биопечати. Биочернила на основе дВКМ изначально обладают тканеспецифичными свойствами.
Однако использование дВКМв форме гидрогеля ограничено слабыми механическими свойствами получаемых тканеинженерных конструкций и низкой точностью самого процесса печати.
Известен вариант создания биочернил на основе фибринового геля с добавлением микрочастиц дВКМ для реконструкции роговицы глаза.[H. Yin, Q. Lu, X Wang, et al. Tissue-derived microparticles reduce inflammation and fibrosis in cornea wounds. Acta Biomater. 2019, 85:192-202. doi: 10.1016/j.actbio.2018.12.027; A Chandru, P Agrawal , SK Ojha , et al. Human Cadaveric Donor Cornea Derived Extra Cellular Matrix Microparticles for Minimally Invasive Healing/Regeneration of Corneal Wounds Biomolecules 2021, 11(4). 10.3390/biom11040532].В данных работах гидрогель применяли без 3D-биопечати.
Недостатком представленных выше способов является неприменимость данных гидрогелей для биопечати из-за реологических свойств гидрогелей.
Наиболее близким к заявляемому изобретению(прототип) является способ применения биочернил представленный в работе M. Kimetal. [Kim MK, Jeong W, Lee SM, et al. Decellularized extracellular matrix-based bio-ink with enhanced 3D printability and mechanical properties. Biofabrication 2020; 12: 025003], где дВКМ использовали в виде микрочастиц в составе желатинового гидрогеля (гиалуроновая кислота 3 мг/мл + желатин 37,5 мг/мл + фибриноген 3мг/мл). Полученные формуляции биочернил исследовали на цитосовместимость в условиях in vitro. Данное исследование в первую очередь направлено на создание биочернил, которые могут исправить дефекты печени, для исправления дефектов хрящевой ткани они не могут быть применимы.
Техническим результатом является создание тканеинженерных конструкций, воссоздающие клеточное строение и функцию заменяемой хрящевой ткани, а также обеспечение высокой точность создания тканеинженерной конструкции посредством 3D-биопечати
Технический результат решается тем, что так же, как и в известном способе приготавливают биочернила, которые получают непосредственно перед процессом 3D-биопечати и осуществляют биопечать тканеинженерной конструкции, способной воссоздать клеточное строение и функцию заменяемой ткани, экструзионной насадкой.
6
2
Особенностью заявляемого способа является то, что биочернила включают в себя следующие компоненты: коллаген, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) и порошок децеллюляризованного внеклеточного матрикса (дВКМ), причем дВКМ получали из реберных хрящей самок крыс линии Wistar, которые подвергали децеллюляризации и лиофилизации, полученный порошок просеивают через сито с диаметром пор 280 мкм и до использования хранят при +4°С, при приготовлении биочернил с концентрацией коллагена 4% используют стерильный ателоколлаген свиньи I типа – 80 мг/мл, который смешивают с МСК – 5×10 в мл, с буферным раствором – 250 мкл на мл и порошком дВКМ – 25 мг/мл, далее скаффолд печатают изаливают теплой питательной  средой t37°C,    после чего проводят процесс инкубации при 37°C в CO-инкубаторе.
Изобретение поясняется подробным описанием, примерами использования и иллюстрациями, на которых изображено:
Фиг. 1 – Тестовая печать для оценки печатопригодности биочернил (схематическое изображение напечатанного объекта).
Фиг. 2 – Скаффолд через 1 неделю после имплантации, об. ×10.
Фиг. 3 – Формирование хрящевой ткани через 2 недели после имплантации, об. ×10.
Способ осуществляют следующим образом.
2
Для создания тканеинженерных конструкций используют коллагеновый гидрогель, порошкообразный ВКМ и культуру МСК. Порошкообразный ВКМ представлен в виде сухих лиофилизированных гранул, их диаметр не превышает диаметр сопла биопринтера. При необходимости клеточных факторов роста, их добавление в биочернила осуществляют на этапе смешивания. Печать производят на лабораторную культуральную посуду (например, чашки Петри, луночные планшеты) или на стекло, находящиеся сверху печатного столика. После процесса биопечати скаффолд заливают теплой питательной средой (от 25 до 37°C), например, RPMI-1640, DMEM, F-12.Процесс инкубации проводят при 37°C в CO-инкубаторе. Замену среды в процессе инкубации  производят  один раз в сутки.
Для оценки печатопригодности биочернил на основе 4% коллагена и порошка дВКМ была проведена печать в тестовом режиме (Фиг.1), после которой появляется возможность оценки толщины линии (3 слоев филамента) в 12 местах и площади формируемых ниш в 8 местах (указывает на продолжающийся процесс полимеризации). Оба параметра оценивали в динамике: сразу после печати и через 24 часовой инкубации в буферном растворе PBS. Данные по биочернилам и гидрогелю на основе коллагена (без дВКМ) представлены в табл.1.
Таблица 1
Результаты тестовой печати биочернилами на основе 4% коллагена с и без гранул дВКМ
Коллаген
Коллаген + дВКМ
<i>X</i>±<i>S</i><sub><i>x</i></sub> [доверительный интервал]
После печати
После инкубации
После печати
После инкубации
Ниши, мм<sup>2</sup>
1,516±0,125[1,427÷1,605]
1,411±0,103[1,338÷1,485]
1,286±0,126[1,195÷1,376]
1,097±0,094[1,030÷1,164]
Линии, мм
0,886±0,017[0,874÷0,898]
0,901±0,027[0,882÷0,920]
0,920±0,036[0,894÷0,946]
0,957±0,027[0,938÷0,976]
in vivo
de novo
Пример создания тканеинженерной конструкции  для создания полноценной ткани .
6
2
ВКМ получали из реберных хрящей крыс линии Wistar, самок, возрастом от 1 до 1,5 месяцев, которые предварительно обрабатывали, децеллюляризировали и лиофилизировали. Лиофилизированный хрящ размалывали пестиком в ступке. Полученный порошок просеивали через сито из нержавеющей стали с диаметром пор 280 мкм и до использования хранили в герметичной упаковке при +4°С. Для приготовления биочернил с концентрацией коллагена 4% использовали стерильный ателоколлаген свиньи I типа – 80 мг/мл, который смешивали с МСК – 5×10 в мл, буферным раствором трис-HCl – 250 мкл на мл, порошком дВКМ – 25 мг/мл. После приготовления бичернил осуществляли биопечать скаффолда. Скаффолд залили теплой (37°C) питательной средой DMEM. Далеев CO-инкубаторе провели процесс инкубации при 37°C.
Скаффолды были имплантированы беспородным белым крысам-самцам. Через 1 и 2 недели животных подвергли эвтаназии и отбирали материал для гистологического исследования. Через одну неделю после имплантации вокруг скаффолдов была сформирована соединительнотканная капсула, которая прорастала в коллаген, разделяя его на отдельные фрагменты, клетки располагались неравномерно, в отдельных участках скаффолдов сформировалась хрящевая ткань (Фиг. 2). Между пучками коллагена волокон также визуализировались клетки соединительной ткани. Через две недели после имплантации у животных скаффолды замещались вновь образованной хрящевой тканью (Фиг.3).
Предложенный способ позволяет создавать тканеинженерные конструкции, воссоздающие клеточное строение и функцию заменяемой хрящевой ткани.