Влияние температуры отжига и последовательности rapdи ISSR-праймеров на результаты ПЦР-анализа ДНК люпина узколистного

УДК 577.21:633.367.2 ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ОТЖИГА И ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ RAPD- И ^Я-ПРАЙМЕРОВ НА РЕЗУЛЬТАТЫ ПЦР-АНАЛИЗА ДНК ЛЮПИНА УЗКОЛИСТНОГО*

С. Ю. Гришин, В. В. Заякин

В настоящей работе обсуждается информативность результатов полимеразной цепной реакции для молекулярно-генетического маркирования люпина в зависимости от температуры отжига и последовательности RAPD- и ISSR-праймеров, использованных в исследовании. Представлены оптимальные температуры отжига праймеров в условиях эксперимента.

Ключевые слова: ПЦР, RAPD, ISSR, температура отжига, люпин узколистный.

RAPD (англ. Random Amplified Polymorphic DNA) и ISSR (англ. Inter Simple Sequence Repeats) представляют собой варианты полимеразной цепной реакции - ПЦР (PCR) для анализа полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК. Использование данных методов приобрело большую популярность в прикладных областях биологических наук, в частности, в современной селекции растений. Об этом свидетельствуют многочисленные работы, выполненные по RAPD- и ISSR-анализу генетической изменчивости популяций [1, с. 99; 2, с. 47], паспортизации сортов [3, с. 81; 4, с. 82], маркированию хозяйственно-ценных признаков [5, с. 48; 7, p.818] растений.

Для RAPD-PCR применяется один короткий праймер обычно длиной 10 нуклеотидов, с произвольной очередностью расположения, для амплификации случайных ДНК-фрагментов, фланкированных прямой и инвертированной последовательностью используемого праймера. Метод универсален для исследования генетического полиморфизма разных видов растений.

В методе ISSR в полимеразной цепной реакции используется праймер длиной 15-24 нуклеотида комплементарный микросателлитной последовательности. Праймер состоит из тандемных коротких 2-5 нуклеотидных повторов и одним или нескольким нуклеотидам на З’-конце (иногда 5’-конце) праймера. Например, 5’-GA GA GA GA GA GA GA GA С-3’. Продукты ISSR амплификации содержат на концах инвертированную микросателлитную последовательность праймера. Так как последовательности микросателлитов высокополиморфны и широко распространены в растительных геномах, метод выявляет высокий уровень меж- и внутривидового полиморфизма [6, с. 284].

В целом методы RAPD и ISSR относительно просты и малозатратны, так как не требуют предварительного определения нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК в ходе дорогостоящих процедур секвенирования генома. RAPD- и ISSR-праймеры позволяют амплифицировать множество фрагментов ДНК, разделение которых осуществляется в агарозном или полиакриламидном геле. В то же время проведение ПЦР требует определенных условий, от которых зависит воспроизводимость спектра ампликонов. Такие параметры, как количественный и качественный состав реакционной смеси, режим амплификации, должны быть оптимизированы [8, p. 6409].

Праймеры играют ключевую роль в образовании продуктов ПЦР. Правильно подобранные последовательности и температуры отжига праймеров обеспечивают специфичность и воспроизводимость реакции амплификации, при условии, что остальные условия стандартизированы [9, с. 50].

Цель настоящего исследования - сравнить влияние температуры отжига и последовательности 14 RAPD- и 21 ISSR-праймера на результаты ПЦР при сходных условиях амплификации и составе реакционной смеси для анализа ДНК люпина узколистного.

Материалы и методы

В исследовании применяли ДНК, выделенную из белорусского сорта люпина узколистного Хвалько. Сорт был предоставлен сотрудниками Научно-практического центра НАН Беларуси по земледелию (г. Жодино, Минская область).

ПЦР проводили в четырехканальном ДНК-амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология»,

работа выполнена при финансовой поддержки гранта Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение № 14.132.21.1768 «Проведение поисковых и прикладных исследований по разработке и внедрению в селекционный процесс геномных технологий ДНК-маркирования хозяйственно-ценных признаков люпина».

Россия). Использовали праймеры, синтезированные фирмой «Синтол» (Россия). Применялись ферменты и реактивы фирмы «СибЭнзим» (Россия).

Состав реакционной смеси для RAPD- и ISSR-PCR объемом 20 мкл.: 1 ед. Taq-полимеразы Е 338, 2 мкл В321 AS буфера, 2 мМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,5 мкМ праймера, 10 нг геномной ДНК.

Условия амплификации для RAPD- и ISSR-PCR: начальная денатурация при 94°С - 4 мин; 30 циклов: денатурация при 94°С - 30 с, отжиг - 30 с, элонгация при 72°С - 1 мин; финальная элонгация при 72°С - 5 мин.

Определение температуры плавления (Тпл) 14 RAPD- и 21 ISSR-праймера осуществляли с помощью программы О^о Analizer 3.1. (таблица 1).

Таблица 1

Температуры плавления £ и 21 ISSR-праймера

APD- R Последовательнос ть пл Т SR- IS Последовательнос ть пл Т

праймер праймер

PC 07 O gtc-ccg-acg-a 6,6°С 4 IS1 (AG)8YG 8,3°С 5

PJ 07 O cct-ctc-gac-a 0,9°С 4 IS2 (AC)8G 0,9°С 6

PM 16 O gta-acc-agc-c 9,9°С 3 IS3 (GA)8C 4,5°С 5

PM 20 O agg-tct-tgg-g 0,8°С 4 IS4 (CA)8A 8,6°С 5

PN 03 O ggt-act-ccc-c 1,4°С 4 IS5 (CA)vRC 7,8°С 5

PN 04 O gac-cga-ccc-a 6,2°С 4 IS6 (AG)vYT 3,9°С 5

PN 06 O gag-acg-cac-a 3,5°С 4 C809 UB (AG)8G 5,9°С 5

PN 09 O tgc-cgg-ctt-g 9,4°С 4 C810 UB (GA)8T 3,5°С 5

PN 10 O aca-act-ggg-g 2,1°С 4 C 823 UB (TC)8C 5,9°С 5

PN 14 O tcg-tgc-ggg-t 1,1°С 5 C 824 UB (TC)8G 6,3°С 5

N 1 R acg-gtg-cgt-g 9,5°С 4 C 826 UB (AC)8C 0,7°С 6

N 2 R cgg-gga-gga-a 5,5°С 4 C 840 UB (GA)8YT 5,6°С 5

N 3 R gct-gca-ggc-c 0,9°С 5 0 K1 (AC)8YG 2,2°С 6

N 4 R ggt-cgc-agc-t 8,3°С 4 1 K1 (GA)8YC 6,2°С 5

9 K1 (AC)8YA 1,1°С 6

2 K2 (CA)8GT 1,0°С 6

7 K2 (AG)8C 6,6°С 5

0 K3 (TG)8G 0,7°С 6

4 K3 (CT)8G 4,5°С 5

7 K3 (GT)8T 8,6°С 5

8 K3 (GT)8YT 9,8°С 5

Продукты ПЦР объемом 7 мкл разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в буфере TBE, окрашивали бромистым этидием и визуализировали на сканере гелей GelDocXR (BioRad, США). В

качестве маркера молекулярной массы использовали 1 мкл M27 («СибЭнзим»), содержащий

фрагменты ДНК длиной 3000, 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 пар нуклеотидов.

Результаты и обсуждение

Температуру отжига для каждого праймера определяли экспериментальным путем. Диапазон для выбора оптимальной температуры отжига (Та) праймера был представлен несколькими вариантами со ступенчатым понижением на один градус от рассчитанной температуры плавления (Тпл).

В результате исследования было выявлено, что температура отжига RAPD- и ISSR-праймеров оказывает влияние на количественный и качественный состав спектров продуктов ПЦР. Для большинства праймеров при росте Та до определенной величины, происходил рост интенсивности одних ампликонов и/или ослабление других (рисунок 1).

Рисунок 1. Электрофореграммы продуктов амплификации фрагментов ДНК, полученных с RAPD-праймером ОРМ 20 (А) и ISSR-праймером К 4 (Б). Слева направо обозначены температуры отжига праймеров. М - маркер молекулярной массы.

Кроме того, в зависимости от последовательности праймера в RAPD- и ISSR-PCR изменялись интенсивность и информативность (количество и четкость) амплифицированных фрагментов ДНК.

Концентрация продуктов RAPD-PCR, как правило, была ниже концентрации продуктов ISSR-PCR при сходных условиях амплификации и составе реакционной смеси.

Относительно низкая интенсивность амплификации отмечена с шестью из семи RAPD-праймерами, имеющими 3’-концевой нуклеотид тимин либо аденин (рисунок 2 А), а также с двумя праймерами, имеющими на 3’- конце 4 подряд гуанина или цитозина (рисунок 2 Б). Интенсивность амплификации с остальными RAPD-праймерами была сравнительно высокой (рисунок 2 В). Связи между содержанием и распределением G и С оснований в составе использованных в исследовании RAPD-праймеров и качеством, а также количеством полученных в ходе ПЦР фрагментов ДНК, выявлено не было.

Рисунок 2. Электрофореграммы продуктов амплификации фрагментов ДНК, полученных с RAPD-праймерами OPN 06 (А), OPN 03 (Б), OPN 09 (В). Слева направо обозначены температуры отжига праймеров. М - маркер молекулярной массы.

Относительно информативные спектры продуктов ПЦР получены с ISSR-праймерами, содержащими в динуклеотидном повторе аденин (А): ^А)8, (СА)7;8, (АС)8 и (AG)7;8 (рисунок 3 А и В). В то же время праймеры, содержащие в динуклеотидном повторе тимин (Т), амплифицировали

продукты ПЦР, информативность которых была относительно ниже (рисунок 3 Б). В отличие от RAPD-анализа, уровень амплификации слабо зависел от того, какой нуклеотид был на З’-конце праймера (рисунок 3 А и В)._________________________________

5 2 5 3 5 4 5 5 5 6 М 5 7 5 8 5 9 ІМ 50 51 52 53 5 4 I 5 2 53 54 55 56 ^

А Б В

Рисунок 3. Электрофореграммы продуктов амплификации фрагментов ДНК, полученных с ISSR-праймерами IS2 (А), UBC 823 (Б), UBC 840 (В). Слева направо обозначены температуры отжига праймеров. М — маркер молекулярной массы.

В целом, при изменении в заданном диапазоне Та для ISSR-праймеров интенсивность амплифицируемых фрагментов менялась значительнее, чем для RAPD-праймеров, что, возможно, связано с более высокими температурами отжига.

При выборе оптимальной Та каждого праймера руководствовались полученными экспериментальными данными и принципом, что высокая температура отжига определяет высокую специфичность реакции, но как только она превышает некоторую критическую температуру для праймера, количество продукта резко падает. Для наиболее информативных 12 и 13 соответственно RAPD- и ISSR-праймеров были определены оптимальные в данных условиях температуры отжига.

Та RAPD-праймеров: OPN 03 - 40°С, OPN 06 - 41°С, OPN 10 - 41°С, OPN 14 - 47°С, RN 2 -43°С, RN 4 - 47°С, OPM 16 - 40°С, OPM 20 - 40°С, OPN 04 - 46°С, OPN 09 - 47°С, RN 1 - 47°С, RN 3

- 50°С.

Та ISSR-праймеров: IS1 - 53°С, IS2 - 56°С, IS3 - 53°С, IS4 - 56°С, IS5- 53°С, IS6 - 52°С, K11

- 54°С, K19 - 56°С, K27 - 55°С, UBC809 - 54°С, UBC810 - 52°С, UBC826 - 58°С, UBC840 - 54°С.

Полученные в исследовании результаты могут быть использованы при выборе температуры отжига и последовательности RAPD- и ISSR-праймеров для проведения молекулярно-генетического маркирования люпина с помощью ПЦР.

It was discussed the impact sequence and annealing temperature for primers of RAPD and ISSR on the quality of amplication spectrum and number of amplicons.

The key words: PCR, RAPD, ISSR, annealing temperature, Lupinus angustifolius.

Список литературы

1. Маркин, Н.В. RAPD-анализ генотипов солеустойчивых форм горчицы Brassica juncea L. / Н.В.Маркин, А.В. Усатов, Г.М. Федоренко // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. 2006. №3. С. 99-102.

2. Глазко, В.И. Генетические взаимоотношения между сортами сои, оцененные с использованием ISSR маркеров / В.И. Глазко [и др.] // Цитология и генетика. 1999. 33, №5. С. 47-52.

3. Артюхова, А.В. Разработка метода паспортизации сортов люпина / А.В. Артюхова [и др.] // Вестник Брянского государственного университета. - Брянск: РИО БГУ, 2010. №4. С. 81-84.

4. Боронникова, С.В. Генетическая паспортизация популяций редких видов растений рода Adonis с использованием ISSR- и IRAP-маркеров /С.В. Боронникова // Известия ТХСА. 2009. Вып. 1. С. 82-88.

5. Соболев, В.В. Использование ISSR-маркеров для молекулярно-генетической идентификации и паспортизации сортов малины / В.В. Соболев [и др.] // Сельскохозяйственная биология. 2006. №5. С. 48-52.

6. Календарь, Р.Н. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение / Р.Н.

Календарь, В.И. Глазко // Физиология и биохимия культурных растений. 2002. Т. 34. № 4. С. 279-296.

7. Penner, G.A. Identification of an RAPD markers for the crow rust resistance gene Pc68 in oats. / G.A. Penner // Genome. 1993a. V.36. P. 818-820.

8. Rychlik, W. Optimization of the anneling temperature for DNA amplification in vitro. / W. Rychlik, W.Y. Soencer, R.F. Rhoads // Nucleic Acids Res. 1990. V.18. P.6409-6412.

9. Дубін, О.В. Тестування умов проведення ISSR-PCR та їх оптимiзация для аналізу геному сої (Glycine max) / О.В. Дубш, Т.М. Димань // Вісник Білоцерківского державного аграрного університету: Зб. наук. прац. - Біла Церква, 2007. Вип. 46. С. 49-54.

Об авторах

Гришин С.Ю. - аспирант Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, greyxxxx@mail. ru

Заякин В.В. - доктор биологических наук, профессор Брянского государственного университета имени академика И.Г. Петровского, iyanam 1@yandex. ru

IMPACT OF ANNEALING TEMPERATURE AND SEQUENCE FOR PRIMERS OF RAPD AND ISSR ON THE RESULTS PCR ANALYSIS DNA OF LUPINUS ANGUSTIFOLIUS

S.Y. Grishin, V.V. Zayakin