СПОСОБ ОЦЕНКИ ДЕПУРИНИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD OF ASSESSING NUCLEIC ACID DEPURINATION AND DEVICE TO THIS END

Предлагаемое изобретение относится к области физики и может быть использовано для анализа материалов с помощью биохимических электродов.
Депуринизация - высвобождение пуриновых оснований из ДНК или РНК в результате гидролиза N-гликозидной связи - один из наиболее распространенных процессов, вызывающих повреждение нуклеиновых кислот в живых организмах. Депуринизация приводит к мутациям и развитию заболеваний [1]. В связи с этим, оценка интенсивности депуринизации нуклеиновых кислот под действием различных факторов позволяет делать вывод об их (факторов) влиянии на живые организмы, например - для экологического мониторинга генотоксических соединений.
Известен способ оценки депуринизации, основанный на использовании меченного биотином о-(карбоксиметил)гидразиламина, который специфически связывается с участками депуринизации [2]. Недостатком известного способа [2] является необходимость выполнения трудоемких и длительных процедур с применением токсичных химических реагентов. Кроме того, низка достоверность результатов определения.
Известен способ оценки интенсивности депуринизации [3], наиболее близкий по существу к заявляемому способу. Способ [3] осуществляют путем хроматографирования продуктов депуринизации. Способ предполагает разделение продуктов депуринизации на колонке с сорбентом, последующее концентрирование элюата и спектрофотометрическое определение концентрации пуриновых оснований.
Недостатком способа [3] является его трудоемкость, связанная с проведением и оптимизацией хроматографического разделения, неоптимальная (превышающая продолжительность рабочего дня) длительность анализа (12-14 часов), недостаточная воспроизводимость и низкая достоверность результатов, а также необходимость использования большого количества разнообразных реактивов и материалов, например элюирующих буферов, сорбентов.
Целью предлагаемого изобретения является упрощение и сокращение продолжительности анализа, повышение избирательности, повышение производительности труда при анализе, повышение достоверности и точности результатов.
Цель достигают тем, что депуринизацию оценивают электрохимическим методом с использованием модифицированного электрода. Продукты депуринизации адсорбируют на модифицированном электроде и выполняют электрохимическое определение высвобождающегося при депуринизации гуанина. Для модификации электрода используют наноразмерные материалы. Для модификации электрода используют нанотрубки. Для модификации электрода используют нановолокна. Для модификации электрода используют наноконусы. Для модификации электрода используют углеродные наноматериалы.
Для оценки депуринизации нуклеиновых кислот используют устройство - электрохимический анализатор.
Предлагаемое изобретение реализуют, например, следующим образом. Используют электрохимический анализатор, блок-схема которого показана на фиг.1, где 1 - регистрирующее устройство, например потенциостат; 2 - электрохимическая ячейка, содержащая электролит 3; 4 - противоэлектрод, например никелевый; 5 - электрод сравнения, например хлоридсеребряный; 6 - рабочий электрод, например стеклоуглеродный, модифицированный, например, углеродными нанотрубками. Электроды 4, 5, 6 электрохимической ячейки 2 погружены в электролит 3 и соединены, например, электропроводами с регистрирующим устройством 1.
До начала измерения стандартный электрод, например стеклоуглеродный, модифицируют водной суспензией, например, многостенных углеродных нанотрубок (далее по тексту - УНТ), подвергнутых химическому окислению, например, в смеси азотной и серной кислот. Рабочую поверхность стандартного электрода покрывают, например, с помощью автоматической пипетки слоем УНТ. Таким образом изготавливают рабочий электрод 6.
Далее на рабочий электрод 6, например, с помощью автоматической пипетки наносят раствор гуанина заданной концентрации, выдерживают, например, 15 секунд (далее - с) для адсорбции гуанина на рабочем электроде. Затем рабочий электрод с адсорбированным гуанином переносят в электрохимическую ячейку 2, например, трехэлектродную с электролитом 3, не содержащим электроактивных веществ, то есть веществ, не окисляющихся и не восстанавливающихся под действием потенциала. Ячейку 2 подсоединяют к регистрирующему устройству 1, например потенциостату, и при потенциале +0.9 В регистрируют величину тока окисления гуанина, адсорбированного на рабочем электроде 6. Повторяют измерения для различных концентраций гуанина и строят калибровочный график (фиг.2), где по оси абсцисс откладывают значения концентрации гуанина (С, моль/л, далее - М), а по оси ординат - значения тока окисления гуанина (I, µA). Калибровочный график далее используют для определения концентрации гуанина по току его (гуанина) окисления в нуклеиновой кислоте.
Затем вместо гуанина на рабочий электрод 6 наносят образец нуклеиновой кислоты, в котором необходимо оценить интенсивность депуринизации. Регистрируют ток окисления гуанина, выделившегося из образца при депуринизации. По калибровочному графику находят концентрацию С гуанина в исследуемом образце, соответствующую измеренному значению тока I. По результатам сравнения концентрации С гуанина в исследуемых образцах оценивают степень их (образцов) поврежденности, принимая, что более интенсивная депуринизация соответствует более поврежденным образцам, и наоборот, менее интенсивная депуринизация соответствует менее поврежденным образцам. Результаты оценки интенсивности депуринизации используют для достижения конкретных целей, например для выявления ДНК-повреждающих агентов в различных средах. Действие этих (ДНК-повреждающих) агентов наносит вред здоровью живых организмов, в том числе человека.
Приведенным примером осуществление предлагаемого способа не ограничивается. Например, стандартные электроды в зависимости от потребности и цели исследования изготавливают из различных электропроводящих материалов, например металлов, полупроводников, композитов, полимеров. Модификацию электрода выполняют с использованием различных материалов, например однослойных и/или многослойных нанотрубок, углеродных нановолокон, фуллеренов, наноконусов, нанопластин и других материалов. Для модификации электрода используют нанотрубки, окисленные способами, отличными от приведенного примера, например в атмосфере кислорода и др. Измерения проводят с помощью различных, в том числе известных, средств измерения тока, например полярографов.
В основе предлагаемого изобретения лежит использование электрокаталитических свойств УНТ [4], которыми обусловлено интенсивное окисление продуктов депуринизации на модифицированном УНТ электроде 6. Продуктами депуринизации нуклеиновых кислот являются пурины - аденин и гуанин, а также фрагменты ДНК, лишенные пуриновых оснований. Известно [5], что гуанин, как и другие пуриновые основания и их производные, претерпевает интенсивную адсорбцию на электроде 6, модифицированном УНТ. Адсорбция отсутствует на немодифицированных электродах. Так, насыщение поверхности модифицированного электрода гуанином наблюдается уже через 15-30 с выдерживания электрода в 1 мМ растворе вещества, что обусловлено гидрофобными взаимодействиями пуринового гетероцикла с графитовыми стенками УНТ.
На фиг.3 показаны вольтамперограммы окисления ДНК, адсорбированной на электроде, модифицированном углеродными нанотрубками, до (I) и после термической депуринизации (II). Вольтамперограмма - это график изменения тока (I, µА), возникающего при окислении вещества при наложении на рабочий электрод 6 потенциала (E, В) относительно электрода сравнения 5.
Аденин и ДНК окисляются при потенциалах около +1.1 В относительно хлоридсеребряного электрода сравнения 5, что препятствует детектированию аденина в присутствии ДНК. Окисление гуанина, наблюдаемое при потенциале около +0.9 В, не подвержено мешающему влиянию компонентов ДНК. Пик 1 на вольтамперограмме II (см. фиг.3) соответствует пику окисления гуанина, величина которого (пика) пропорциональна интенсивности оцениваемой депуринизации ДНК. Пик 2 соответствует суммарному окислению ДНК и аденина, присутствующего в образце ДНК.
Предлагаемое изобретение применяют, например, для оценки термической депуринизации ДНК в растворах различного состава и рН. Авторами обнаружено, что величина пика 1 гуанина зависит как от времени прогревания, так и от рН и ионной силы раствора. Результаты, полученные с использованием предлагаемого способа, полностью согласуются с общепринятыми данными [1] о кислотном механизме гидролиза N-гликозидной связи и замедлении этого процесса с увеличением ионной силы раствора. Таким образом, результаты применения предлагаемого способа обладают высокой (100%) достоверностью и точностью.
Предлагаемое изобретение используют, например, для выявления депуринизации нуклеиновых кислот под действием физических факторов (температура, давление, ионизирующее излучение и др.), а также химических факторов, приводящих к повреждению ДНК (активные формы кислорода, генотоксические антибиотики и ксенобиотики). Кроме того, предлагаемый способ применяют для оценки качества препаратов ДНК, используемых в биохимических и молекулярно-генетических исследованиях. Например, интенсивная депуринизация свидетельствует о низком качестве препаратов ДНК.
Преимуществами предложенного способа по сравнению с аналогами и прототипом являются пониженная трудоемкость, отсутствие необходимости разделения продуктов депуринизации с их потерей и затратой трудовых ресурсов, отсутствие необходимости использования дорогостоящих реагентов и сложных протоколов. Кроме того, в отличие от аналогов и прототипа, для оценки депуринизации требуется существенно меньший объем образца (менее 5 мкл). Средняя продолжительность анализа одного образца нуклеиновой кислоты с помощью предлагаемого изобретения составляет менее 10 мин, тогда как оценка интенсивности депуринизации известными способами занимает несколько часов (до 12-14).
Полученные с использованием предлагаемого изобретения данные применяют, например, в медицине, фармакологии, экологии, ветеринарии, научных исследованиях. Предложенный способ адаптируют для получения различных технических решений, например, для создания одноразовых тестов на основе миниатюрных тест-полосок, используемых, например, в медицине, фармакологии, ветеринарии для диагностики и прогнозирования течения заболеваний.
Таким образом, техническим результатом изобретения является простота, высокая избирательность, экспрессность детектирования депуринизации образцов нуклеиновых кислот, отсутствие необходимости разделения и концентрирования продуктов депуринизации - то есть повышение достоверности и точности результатов, сопровождающееся повышением производительности и качества труда.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ оценки депуринизации имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленном производстве диагностического оборудования, в деятельности экологических организаций, организаций здравоохранения и животноводства, посредством использования стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
Литература
1. Lindahl, Т., Nyberg, В. Biochemistry. 1972. V.11. Р.3610.
2. Nakamura, J. et al. Cancer research. 1998. V.58. P.222.
3. Cavalieri, E., Rogan, E. Polycyclic Aromat. Compd. 1996. V.10. P.251.
4. Абдуллин, Т.И. и др. Российские нанотехнологии. 2007. Т.2. №7-8. - С.156-160.
5. Абдуллин, Т.И. и др. Материалы XIV всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем». - Казань, 2007. - С.4.