СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ДИСПЛАСТИЧЕСКИХ НЕВУСОВ

Полезная модель относится к области медицины, а именно к дерматологии, онкологии, патологической анатомии и может быть использована для проведения дифференциальной диагностики меланоцитарных новообразований кожи, в частности диспластических невусов, прогнозирования их малигнизации.
В качестве прототипа выбран способ диагностики диспластических невусов (Immunohistochemical studies of atypical conjunctival melanocytic nevi Frederick A. Jakobiec, Kathryn Colby, Ann M. Bajart, S. John Saragas, Alexandre Moulin. Arch Ophthalmol - 2009. -127,№8. - P.970-980), который включает проведение осмотра конъюнктивы, выполнение дерматоскопии и взятие биопсии с последующим определением в биоптатах с помощью иммуногистохимического метода моноклональных антител S-100, MART-1, HMB-45,CD45,CD68,CDla, Ki-67.
Признаками, совпадающими с существенными признаками заявляемого способа, являются: проведение осмотра кожных покровов, проведение дерматоскопии и биопсии, проведение иммуногистохимического исследования.
Признаками, препятствующими достижению ожидаемого технического результата (повышение точности и информативности диагностики), являются: не определяют и не учитывают комплекс показателей, свидетельствующих о нарушении контроля клеточного цикла, регуляции процессов апоптоза и активации путей внутриклеточной передачи митогенного сигнала, что не позволяет прогнозировтаь рецидивирование, прогрессирование и возможную малигнизацию диспластических невусов.
В основу полезной модели поставлена задача усовершенствования способа-прототипа путем определения иммуногистохимических маркеров клеточного обновления в биоптатах из пораженной кожи, что позволяет
достигнуть ожидаемого технического результата, а именно осуществлять прогнозирование рецидивов и малигнизации диспластических невусов.
Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики диспластических невусов, включающем проведение осмотра кожных покровов, проведение дерматоскопии и проведение биопсии, проведение иммуногистохимического исследования, согласно полезной модели, дополнительно проводят гистологическую оценку степени дисплазии и исследуют маркеры клеточного обновления Bcl-2, р-53, Ki-67.
Причинно-следственная связь между совокупностью признаков, которые заявляются, и техническим результатом определяется следующим: дополнительное проведение гистологической оценки степени дисплазии и исследование местных маркеров клеточного обновления Bcl-2, р-53, Ki-67 позволяет выделить группы пациентов с признаками высокой функциональной активности маркеров клеточного обновления, что в свою очередь позволяет повысить точность и информативность диагностики, а также в дальнейшем назначать адекватную комплексную терапию для эффективной профилактики рецидивирования и малигнизации диспластических невусов.
Маркеры клеточного обновления Bcl-2, р-53, Ki-67 играют важную роль в возникновении и дальнейшем росте злокачественных новообразований кожи путем нарушения контроля клеточного цикла, регуляции процессов апоптоза и активации путей внутриклеточной передачи митогенного сигнала в коже, и являются фактором риска развития пролиферативных изменений, атипичных клеток и рецидивов, поэтому выделение группы пациентов с дисбалансом маркеров клеточного обновления позволяет повысить точность и информативность диагностики, а в дальнейшем назначать адекватную комплексную терапию для эффективной профилактики рецидивирования и малигнизации диспластических невусов (ДН).
Способ диагностики заключается в следующем.
Пациентам после проведения осмотра кожных покровов, проведения дерматоскопии и взятия биопсии кожи, проводят дополнительное определение гистологической степени дисплазии и исследуют иммуногистохимические маркеры клеточного обновления Bcl-2, р-53, Ki-67.
Материалом исследования служили биоптаты кожи. Фрагменты кожи размерами 1,0 см × 1,0 см × 0,5 см фиксируют в нейтральном забуференном формалине с обычной стандартной проводкой и заливкой в парафин согласно стандартной методике. Из парафиновых блоков готовят серийные срезы толщиной 4-5 мкм. С целью обзорной окраски, гистологические срезы окрашивают гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическое исследование кожи проводят по стандартизированной методике с использованием серийных парафиновых срезов, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полизином ("Menzel-Glaser", Германия) и реактивов компании DAKO с моноклональными антителами (МкАТ) на автостейнере DAKO.
В иммуногистохимической оценке экспрессии р-53 используют мышиные МкАТ к р53, клон DO-7, IgG2b (М7001 "DakoCytomation") в разведении 1:100 при времени экспозиции 60 минут. Критерием положительной реакции считают окраску 10 % и более ядер опухолевых клеток.
Маркер Вс1-2 выявляют с помощью МкАТ к Вс1-2, клон Вс1-2/124 (M0887"DakoCytomation"), в разведении 1:80 при инкубации 60 мин. Положительной считают реакцию при цитоплазматической и мембранной окраске более 10 % опухолевых клеток.
Маркер Ki-67, клон MIB-1 (F7268 "DakoCytomation"), экспрессируется в ядрах митотически активных клеток.
Идентификация реакций проводилась с помощью системы визуализации EnVision™ FLEX+ и дополнительной окраски
гематоксилином Майера для воспроизведения структурной организации ткани.
Оценку уровня внутриядерной экспрессии апоптотического белка р-53 и маркера Ki-67, мембранной экспрессии маркера Вс1-2 проводили с учетом интенсивности окраски и распределения в опухолевой ткани в процентном эквиваленте на 100 клеток в 10 случайно выбранных полях зрения микроскопа (увеличение х40) гистологических срезов. В случае, где процент позитивных клеток не превышал 20%, реакция расценивалась как слабая. Если процент позитивных клеток был больше 20 %, реакция считалась выраженной.
Просмотр и цифровые фотографии микропрепаратов осуществляли цифровой камерой OLYMPUS С 5050Z, установленной на микроскопе "Olympus СХ-41".
Все полученные результаты были подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев с использованием программы "MedStat".
При анализе проверки распределения на нормальность использовали Xi-квадрат и критерий W Шапиро-Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок проводили с использованием W-критерия Вилкоксона и сравнение средних двух независимых выборок - по критерию Стьюдента. Для множественного сравнения непараметрических данных использовали ранговый однофакторный анализ Крускала-Уоллиса и критерий Дана.
Заявленный способ диагностики был использован у 62 пациентов, из которых было 29 мужчин и 33 женщины в возрасте от 42 до 83 лет (средний возраст 54,16±3,02 года).
При гистологическом исследовании микропрепаратов с установленным диагнозом диспластический невус определялась
лентигиозная меланоцитарная дисплазия с различной степенью выраженности.
В 31 случае отмечалась слабовыраженная дисплазия - ДН 1 степени дисплазии, ДН 2 степени дисплазии отмечалась в 18 случаях и в 13 случаях - отмечалась ДН 3 степени дисплазии.
Результаты проведенного нами исследования показали, что при усилении степени диспластических проявлений увеличивается количество атипических меланоцитов, экспрессирующих р53, Bcl-2 и Ki-67.
Наименьший уровень апоптотического белка р53 в ядрах меланоцитов наблюдался при ДН 1 степени дисплазии и составил 11,6±0,7 %.
Наибольший - при ДН 3 степени дисплазии и составил 37,3±0,8 %. При этом достоверность различий между группами статистически значимая (Р>0,05). Цитоплазматическая и мембранная экспрессия Bcl-2 также усиливалась в зависимости от степени дисплазии меланоцитов.
При ДН 1 степени дисплазии уровень экспресии Bcl-2 составил 9,4 ±0,4 %.
При ДН 2 степени дисплазии экспрессия составила 10,2±0,7 %. Наиболее выраженная позитивная реакция к Bcl-2 обнаруживалась в 23,4±0,7% среди меланоцитов ДН 3 степени. Экспрессия маркера Ki-67 обнаруживалась только в единичных клетках (1,1 ±0,6%) при ДН 1 степени, 4,87±0,8 % при ДН 2 степени и 7,63±2,7 % при ДН 3 степени.
Применение заявленного способа позволяет улучшить дифференциальную диагностику диспластических невусов за счет иммуногистохимического определения маркеров клеточного обновления.
Иммуногистохимическое определение маркеров клеточного обновления Bel -2, р-53, Ki-67 в зависимости от степени дисплазии ДН способствует более глубокому пониманию механизмов малигнизации ДН и возникновению новообразований кожи.
Выявленные изменения экспрессии Вс1-2, р-53, Ki-67 являются ранними показателями процессов инвазии и метастазирования, что позволяет рассматривать выявленные изменения в качестве маркеров ранней дифференциальной диагностики и прогноза доброкачественных и злокачественных меланоцитарных новообразований кожи.