СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БЕСКЛЕТОЧНОЙ ОРГАНИЧЕСКОЙ ТКАНИ ДЛЯ РЕИМПЛАНТАЦИИ ЖИВЫХ КЛЕТОК И БЕСКЛЕТОЧНАЯ ОРГАНИЧЕСКАЯ ТКАНЬ, ПОЛУЧЕННАЯ ТАКИМ СПОСОБОМ
METHOD FOR CELL-FREE ORGANIC TISSUE PREPARATION FOR LIVING CELL REIMPLANTATION AND CELL-FREE ORGANIC TISSUE PRODUCED BY SUCH METHOD

Изобретение относится к способу приготовления бесклеточной органической ткани для реимплантации живых клеток или «оживления».
В медицине, а конкретнее в области хирургии, хорошо известно, что все большую важность приобретают ткани, предназначенные для пересадки в живой организм, чтобы удовлетворить растущую потребность по замене частей органов или органов в целом.
Создание биологических заменителей, которые приготавливаются в лаборатории, а затем трансплантируются животным-реципиентам или людям-реципиентам, представляет собой медицинскую технологию, известную под названием «тканевая инженерия».
По известной технологии ткани для пересадки готовят в лаборатории путем имплантации клеток в матрицу, состоящую из неорганической поддерживающей среды, обычно называемой «скаффолд» (клеточный каркас или подложка).
Скаффолд-материал, который используется для компенсации потери материала органа, подвергаемого лечению, способствует пространственному культивированию клеток до тех пор, пока не сформируется новая ткань.
Скаффолд-материал, естественно, должен затем подвергнуться процессу разложения до своего полного исчезновения и быть заменен синтезированной тканью, чему способствуют клетки, имплантированные в упомянутый скаффолд-материал.
Трансплантаты можно получать этим способом либо с искусственными, либо с естественными скаффолд-материалами (т.е. от «донора»), которые можно получить от человека или животного, например с использованием стенки пищевода.
Для использования естественного скаффолд-материала, полученного от донора для трансплантации в другой человеческий организм, ткань должна быть, прежде всего, обработана для устранения всех клеток, существующих между волокнами соединительной ткани, а затем для реимплантации клеток человека, принадлежащих намеченному реципиенту по пересадке («хозяину») для того, чтобы избежать реакции отторжения.
Технологии, используемые для создания скаффолд-материала, т.е. бесклеточной матрицы, начиная с тканей, полученных от донора, хорошо известны, а потому подробно здесь не описываются вкратце, они предполагают погружение ткани, которая должна пройти обработку, в жидкую среду, содержащую ферментные вещества, способные «переваривать» и разрушать живые клетки, содержащиеся в ткани, без повреждения соединительных волокон ткани.
После создания матрицы из бесклеточной ткани, готовой принять клетки, полученные от реципиента, упомянутая ткань, или скаффолд-материал, приготавливается в т.н. «чашке Петри» (или схожем контейнере), который представляет собой ванночку, обычно используемую в лабораториях по биологическим исследованиям, на дне которой покоится ткань для оживления.
Оживление ткани происходит путем имплантации стволовых клеток от будущего реципиента и снабжения их питанием посредством культуральной питательной среды, которая питает клетки, сохраняя их живыми и давая им возможность множиться и диссеминировать.
По существу, стволовые клетки, первоначально помещенные на верхнюю поверхность ткани, проходят через естественный интерстиций в ткани скаффолд-материала - интерстиций, который был ранее занят клетками донора.
Через заданный период времени, при регулируемой температуре и в присутствии питательных веществ, которые содержатся в культуральной питательной среде, живые клетки репозиционируются в интерстиций ткани, которая таким образом становится готовой для трансплантации в орган реципиента.
Следует отметить, что клетки, которые обычно используются для оживления скаффолд-материала, представляют собой стволовые клетки, которые затем становятся дифференцированными (или уже стали таковыми) и приобретают специфическую функцию органа, в который пересаживается ткань, прошедшая оживление.
Успех или неуспех трансплантации ткани, обработанной таким способом, зависит от капиллярной диффузии клеток через матрицу ткани. Если такая диффузия происходит с трудом или осуществляется на поверхности, но не в глубину, оживление ткани для трансплантирования становится недостаточным и начинается процесс омертвения, что ведет к гибели трансплантата.
Из вышесказанного следует, что для достижения успеха существенно важно, если не сказать необходимо, обеспечить оживление каждого участка ткани по глубине, в особенности по всей ее толщине.
В настоящее время, даже в случае, если процедуры приготовления и оживления проводятся на достаточно продолжительном отрезке времени, невозможно обеспечить результаты, которые были бы достаточно надежны, чтобы гарантировать успех пересадки.
Это связано с недостаточным «проникновением» живых клеток, реимплантированных в скаффолд-материал.
На практике этот недостаток существенно ограничивает возможности приготовления тканей, пригодных для трансплантации, т.к. более толстые ткани в полной мере не проходят оживление после трансплантации, поскольку в них проникновение осуществляется на недостаточную глубину.
Отсюда следует, что используемая в настоящее время технология применима лишь для трансплантации тканей весьма ограниченной толщины, например, не более примерно 0,1 мм.
В патенте США 5112354 раскрыто приготовление костного аллотрансплантата, в котором сначала удаляется вся мягкая ткань, а затем поверхность структурируется для создания группы отверстий, выполненных с возможностью обеспечения деминерализации кости и увеличения поверхности для взаимодействия с далее вводимыми мезенхимальными клетками. Отверстия получают лазером или механическим высверливанием.
Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа приготовления бесклеточных тканей, позволяющего преодолеть вышеупомянутые недостатки.
Более конкретно, задача настоящего изобретения заключается в разработке способа приготовления бесклеточной ткани, так чтобы при оживлении упомянутой ткани стволовыми клетками упомянутые клетки легче проникали во все возможное пространство сети волокон соединительной ткани и колонизировали его, чтобы по существу восстановить состояние ткани, присущее ей до того, как она стала безжизненной.
Другая задача изобретения заключается в том, чтобы добиться значительного и существенного сокращения времени обработки, необходимого для оживления бесклеточного скаффолд-материала, после того как были добавлены живые клетки в целях приготовления ткани для трансплантации.
Указанные задачи решаются с помощью способа приготовления бесклеточной органической ткани для оживления посредством реимплантации живых клеток, согласно которому:
- готовят упомянутую бесклеточную ткань на, по существу, плоской поверхности;
- создают множество отверстий на поверхности упомянутой ткани, распределенных по всей упомянутой поверхности и расположенных так, что они проходят вглубь, по меньшей мере, на некоторую часть толщины упомянутой ткани, при этом упомянутые отверстия предназначены для содержания упомянутых живых клеток после их реимплантации,
И в котором согласно изобретению упомянутое множество отверстий создают посредством одной или нескольких металлических игл, соединенных с источником электропитания, который на кончике каждой иглы вызывает прохождение тока такой силы и с такой формой волны, чтобы обеспечить достаточную энергию для разрушения связей между молекулами, составляющими органическую ткань вблизи кончика упомянутой иглы, при этом каждое отверстие образуется прохождением тока и достаточно велико, чтобы кончик упомянутой иглы мог войти в пространство, образованное размыканием упомянутых молекулярных связей.
Предпочтительно на упомянутые одну или несколько металлических игл подают электрическую энергию переменного тока, по существу синусоидального, имеющего частоту около 4 МГц.
Предпочтительно электроэнергия, подаваемая на упомянутые одну или несколько игл, содержит гармоники, по меньшей мере, до третьего порядка.
Предпочтительно электрическое напряжение, прикладываемое к упомянутым одной или нескольким иглам, составляет около 200-230 В.
Предпочтительно сила тока, пропускаемого через каждую иглу, составляет около 2-2,5 мА.
Предпочтительно глубина упомянутых отверстий соответствует полной толщине упомянутой органической ткани.
Предпочтительно длина упомянутых отверстий больше толщины упомянутой бесклеточной органической ткани.
Предпочтительно упомянутое множество отверстий располагают в направлении, по существу перпендикулярном поверхности упомянутой ткани или наклонно к поверхности упомянутой органической ткани.
Предпочтительно одно или более отверстий на поверхности бесклеточной органической ткани, пригодных для: содержания клеток, предназначенных для оживления упомянутой ткани, выполняют с использованием устройства, которое содержит:
- упомянутые одну или более металлических игл, установленных в держателе;
- источник электрической энергии, представляющий упомянутый источник электропитания и соединенный с упомянутыми одной или несколькими иглами, пригодный для подачи тока на кончик каждой иглы, сила и форма волны которого таковы, что он обеспечивает достаточную энергию, чтобы привести к размыканию связей между молекулами в органической ткани, соприкасающейся с кончиком упомянутой иглы.
Предпочтительно упомянутое устройство содержит множество игл, установленных в держателе, способных образовать матрицу из рядов игл, по существу параллельных друг другу, причем упомянутые иглы по существу эквидистантны друг другу.
Предпочтительно диаметр упомянутой, по меньшей мере, одной иглы составляет, по меньшей мере, 50-55 мкм.
Предпочтительно диаметр упомянутой, по меньшей мере, одной иглы больше максимального размера клетки для оживления.
Предпочтительно упомянутое устройство содержит средство для перемещения упомянутой, по меньшей мере, одной иглы вдоль трех осей декартовой системы координат, т.е. вдоль вертикальной или наклонной оси и вдоль декартовых осей, параллельных поверхности органической ткани.
Предпочтительно средство перемещения создает перемещение по двум декартовым осям, располагающимся по существу дараллельно поверхности упомянутой органической ткани.
Указанные задачи также решаются за счет создания бесклеточной органической ткани, оживляемой посредством реимплантации живых клеток, которая получена описанным способом.
Дальнейшие признаки и детали изобретения будут освещены подробнее в описании предпочтительного варианта осуществления изобретения, который представлен здесь в качестве неограничивающего примера, а также устройства, которое можно использовать в данном способе.
Изобретение описано ниже с помощью прилагаемых чертежей, на которых:
Фиг.1 - схема устройства в сечении, содержащего держатель с матрицей игл, покоящихся на слое ткани, приготовленной для оживления;
Фиг.2 - вид одной из игл в держателе;
Фиг.3 - вид компоновки матрицы игл;
Фиг.4 - схема устройства для перемещения держателя игл.
Согласно изобретению предварительно обработанная бесклеточная органическая ткань, т.н. скаффолд-материал, расположена на дне чашки Петри (или схожего контейнера) так, что она лежит в развернутом виде на плоской поверхности.
Множество игл, таких как игла, обозначенная позицией 1 и показанная на Фиг.2, скомпоновано в матрицу, например образующую квадрат, обозначенную в целом позицией 3 на Фиг.3, так чтобы обеспечить упорядоченное расположение игл, которые предпочтительно отделены на одинаковое расстояние друг от друга, т.е. эквидистантны относительно друг друга.
Головка 11 каждой иглы 1 имеет электрическую связь, например, посредством металлической проводящей пластины 2, закрепленной на держателе 20 упомянутой матрицы игл. Упомянутая пластина 2 соединена с электрическим проводом 21, на который, в свою очередь, подается выходное напряжение генератора 4.
Упомянутый генератор 4 представляет собой генератор напряжения, предпочтительно генерирующий напряжение 200-230 В, но с частотой 4 МГц, получаемой с использованием электронных схем, которые хорошо известны, а потому ради краткости здесь не описаны.
Синусоидальное изменение напряжения на выходе 41 генератора 4 предпочтительно представляет собой искаженную волну и, следовательно, имеет гармоники, по меньшей мере, первого, второго и третьего порядка.
Мощность генератора 4 регулируется так, чтобы на конце каждого электрода 1 можно было получить ток силой от 2 до 2,5 мА.
Когда кончик каждой иглы покоится на поверхности 51 органической ткани 5, контакт между кончиком каждой иглы и органической тканью дает возможность пропускать ток примерно 2-2,5 мА, как упоминалось ранее. Упомянутый ток передает энергию окружающим молекулам, которая соответствует (как показано экспериментально) той, что приводит к т.н. явлению «молекулярного резонанса». Эта энергия достаточна лишь для разрушения связей между молекулами, испытывающими влияние прохождения тока, при этом в окружающей области она не вызывает разрушений, разрывов, некроза, уменьшения или увеличения толщины, изменения содержания жидкой фазы, коагуляции или иной деградации ткани.
По существу, такой разрыв, образуемый в молекулярных связях, приравнивается к образованию крошечного отверстия, которое практически имеет тот же диаметр, что и диаметр каждой иглы 1, т.е., по меньшей мере, 50-55 мкм.
Разумеется, могут быть использованы иглы другого диаметра, большего или меньшего, при условии, что пользователь не забывает о том, что диаметр, по меньшей мере, одной иглы превышает наибольший размер используемой клетки.
Далее держатель 20 матрицы 3 игл толкается в направлении, указываемом иглами, и достаточно медленно продвигается, так что по мере движения иглы вперед кончик иглы находит отверстие, которое уже образовано за счет протекания тока и последующего разрушения молекулярных связей.
Легко видеть, что, таким образом, не происходит разрыва соединительной ткани, и, следовательно, создается тонкое отверстие, соответствующее диаметру вводимой иглы.
Как ранее объяснялось, это особенно важно и полезно, т.к. клетки, реимплантированные на ткань, могут проникать вглубь через ткань и имплантироваться на стенки отверстий, где они могут множиться и очень быстро осуществлять оживление органической ткани по всей толщине.
Как показано на Фиг.1, иглы 1 проникают в поверхность 51 скаффолд-материала 5 предпочтительно, но необязательно под наклоном, чтобы увеличить длину отверстий, а следовательно, получить максимальный эффект проницаемости скаффолд-материала.
Эксперименты показали, что для оживления более эффективен угол 60° относительно вертикали, поскольку длина получаемых в результате отверстий превышает толщину скаффолд-материала.
2
Лабораторные опыты показали, что эффективный размер матрицы 3 игл, содержащей иглы 1, составляет примерно 1 см, при этом упомянутая матрица содержит примерно 200 игл; в этом случае сила тока, обеспечиваемого генератором 4, не превышает 500 мА.
Разумеется, процедура перфорации должна повторяться по всей поверхности 51 скаффолд-материала для получения однородного распределения отверстий по толщине и по всей полезной поверхности ткани для трансплантации.
Для этой цели в изобретении используется устройство для создания отверстий, которое предпочтительно снабжено средством 30 для перемещения держателя 20 по трем осям декартовой системы координат, т.е. вдоль вертикальной или наклонной оси Z и вдоль декартовых осей X и Y, параллельных плоскости поверхности 51 и схематично показанных на Фигуре 4.
Когда в заданной части скаффолд-материала 5 отверстия выполнены, держатель 20 может переместиться и процедура может повториться упорядоченным образом для покрытия всей поверхности 51.
Ясно, что если держатель 20, несущий матрицу 3 игл, соединен с программируемым средством 30 перемещения, например с использованием шаговых двигателей, управляемых электронным блоком управления, процедура может повторяться автоматически, последовательно и с максимальной точностью.
После завершения создания серий отверстий в бесклеточной ткани 5, как объяснялось выше, очевидно, что упомянутую бесклеточную ткань можно поместить в чашку Петри или схожий контейнер, куда затем могут быть добавлены живые клетки, которые обычно представляют собой стволовые клетки от реципиента, которому предназначен трансплантат.
При соответствующем питании с использованием культуральной питательной среды упомянутые стволовые клетки могут быстро и легко занять все отверстия, выполненные иглами 1, тем самым обеспечивая полное и эффективное оживление всей ткани, предназначенной для трансплантации.
Очевидно, что способ согласно изобретению решает все поставленные задачи изобретения, поскольку обеспечивается совершенное и эффективное оживление и предотвращается всякий риск неблагоприятного исхода последующей трансплантации.
Кроме того, процесс оживления происходит значительно быстрее, чем при использовании известной технологии, и с весьма положительными результатами.
Там, где технические признаки, упомянутые в любом из пунктов формулы изобретения, сопровождаются ссылочными символами, эти ссылочные символы включены с единственной целью сделать пункты формулы изобретения более ясными, и соответственно такие ссылочные символы не накладывают каких-либо ограничений на интерпретацию каждого элемента, идентифицированного в качестве примера такими ссылочными символами.