Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на секретируемые ферменты Bacillus intermedius

БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

УДК 57.033

И. Д. Гурьянов

ВЛИЯНИЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ФЕРМЕНТЫ BACILLUS INTERMEDIUS

Ключевые слова: He-Ne лазер, ферментативная активность, рибонуклеаза, протеаза.

Изучены эффекты воздействия различных доз когерентного излучения He-Ne лазера на ферментативную активность рибонуклеазы и протеазы Bacillus intermedius. Результаты работы позволяют утверждать, что излучение длиной волны 632,8 нм не оказывает какого-либо значимого влияния на активность протеазы и снижает активность РНКазы.

Keywords: He-Ne laser, enzymatic activity, ribonuclease, protease.

Effects of various doses of coherent emission He-Ne laser on the enzymatic activity RNase and protease Bacillus intermedius was investigated. The results suggest that the emission wavelength of 632.8 nm does not have any significant effect on the activity of proteases, and reduces the activity of RNase.

Введение

Лазерное излучение вызывает в биологических системах различные эффекты, такие как увеличение митотической активности клеток эукариот, конформационные изменения в мембране, увеличение интенсивности образования макроэргических молекул, активация метаболизма [1]. Одной из возможных мишеней лазерного излучения в живом организме могут служить ферментативные системы клеток, в частности молекулы ферментов-антиоксидантов [2], а также компоненты дыхательной цепи митохондрий [3], молекулярный кислород [4].

Работы в области исследования микробных нуклеаз представляют значительный научный и практический интерес. Рибонуклеазы участвуют в процессинге молекул РНК на разных этапах их превращения от первичных генных транскриптов до функционально активных компонентов трансляционной системы. Особое применение в медицине находят панкреатические нуклеазы, которые используются для разрушения дефектных клеток, а так же при лечении заболеваний вирусной этиологии. Биологическое действие рибонуклеазы Bacillus intermedius, проявляется в стимуляции роста культур некоторых штаммов [5] с одновременным уменьшением синтеза основных клеточных биополимеров - ДНК, РНК и белка и изменением ионной проницаемости цитоплазматической мембраны [6].

Изучение возможного воздействия когерентного излучения на энзиматическую активность рибонуклеазы и протеолитических ферментов ранее не проводилось, что, учитывая значимость этих ферментов в клеточном метаболизме и перспективность их применения в медицине, определило направление наших исследований.

Целью настоящей работы явилось определение степени и характера влияния лазерного излучения на бактериальную рибонуклеазу и протеазу при различных продолжительностях облучения He-Ne лазером.

Экспериментальная часть

В работе использовали лазер газовый ЛГН - 111 непрерывного режима излучения, атомарный, многомодовый. Лазер по степени опасности генерируемого излучения относится к третьему классу по ГОСТ 12.1.040 - 83.

Использовали секретируемую РНКазу Bacillus intermedius ЭР (коммерческое название “биназа”, молекулярная масса 12300 D; pI = 9,5; активность порядка 106 ЕД/мг при pH 8,5) изолирована

из культуральной жидкости и очищена до гомогенного состояния по методу Макарова [7]. Протеаза (субтилизин 90%), выделена из культуральной жидкости поздней стационарной фазы роста Bacillus intermedius 3-19, получена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры

микробиологии Казанского университета.

Определение ферментативной активности РНКаз по отношению к натуральному субстрату -высокополимерной РНК осуществляли по модифицированному методу Анфинсена [8; 9].

Использовали следующие реактивы: 0,05 М трис - HCl - буфер pH 8,5; раствор дрожжевой РНК Torula Years (Sigma) в буфере 50 мкг/мл; раствор фермента в буфере 0,01нг/мл. Облучение раствора фермента объемом 1мл проводили He-Ne лазером. Пробы в стеклянных пробирках (кюветах) с плоской поверхностью крепили на штативе, на расстоянии 25 см от места выхода луча. Время облучения составляло 15, 30 и 60 минут. Ферментативную реакцию проводили в пластиковых пробирках вместимостью 3 мл параллельно с контрольным вариантом (K) и контрольным вариантом на субстрат (KS) в течение 14 минут при 37° C. Состав реакционной смеси: 1) контроль (К) - 2 мл раствора РНК, 1 мкл необлученного фермента; 2) контроль на субстрат (KS) - 2 мл раствора РНК, 1 мкл буфера; 3) опытный вариант - 2 мл раствора РНК, 1 мкл облученного фермента (варианты, разные по времени облучения).

Определение скорости ферментативной реакции разложения РНК проводили на автоматическом спектрометре Lambda 35 “Perkin Elmer”, США при длине волны равной 260 нм. Скорость ферментативной реакции оценивали по тангенсу угла наклона прямолинейного восходящего участка кривой зависимости светопоглощения от времени и выражали в увеличении поглощения за 1 мин на 1 мг белка.

Определение протеолитической активности проводили по казеину. Реактивы: 1 мл раствора фермента; 1 мл 2% раствора казеина; 2 мл 5% раствора ТХУ; 5 мл 6% раствора Na2CO3; 1 мл реактива Фолина. Облучение раствора фермента объемом 1мл проводили He-Ne лазером. Время облучения составляло 5 и 60 минут. В опытном варианте 1 мл ферментного раствора (варианты, разные по времени облучения) и 1 мл 2% казеина ставили на 5 минут при 37°С. Затем приливали к 1 мл фермента 1 мл казеина и тщательно перемешивали. Инкубацию проводили точно 15 минут при 37°С. Затем добавляли 2 мл 5% ТХУ (равный объем) тщательно перемешивали и снова ставили на 37°С на 20 минут. Далее отфильтровывали через плотный фильтр. Отбирали из фильтрата 1 мл, добавляли 5 мл 6% Na2CO3, и быстро приливали 1 мл реактива Фолина. Ставили на 20 мин в темноту, затем измеряли на спектрофотометре при 670 нм. Для контроля на свободный тирозин к 1мл ферментного раствора приливали 2 мл 5% ТХУ, выдерживали 20 мин при 37°С, затем добавляли 1 мл 2% казеина, 15 мин выдерживали при 37°С, тщательно фильтровали, отбирали 1 мл смеси, добавляли 5 мл 6% Na2CO3, перемешивали и быстро добавляли 1 мл реактива Фолина. Оставляли смесь на 20 мин в темноте и промеряли на спектрофотометре при 670 нм.

Расчетная формула:

(Оп - Ктир ) х 28 х предв. разведение

ПЕ = ....................................,

15

где ПЕ - единицы протеолитической активности, Оп - поглощение опытной пробы, Ктир - поглощение контрольной пробы.

Статистическую обработку результатов выполняли в стандартном программном пакете Microsoft Exel.

Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение не превышало 12%. Сравнение групп данных осуществляли в t-тесте Стьюдента, принимая критерий вероятности для различия групп данных р < 0,05.

Результаты и их обсуждение

Активность рибонуклеазы выражали по изменению поглощения при длине волны 260 нм, обусловленного увеличением количества нуклеотидов при гидролизе высокополимерной РНК за 1 мин при 37°С и pH 8,5 , в расчете на 1 мг белка. Для необлученного фермента эта величина составила 4,8-105 ед/мин/мг, тогда как у облученного она снизилась до 4,4-105 ед/мин/мг. Таким образом, лазерное излучение оказало незначительное влияния на активность РНКазы. Снижение активности, наблюдаемое спустя 30 мин облучения составило

величину 8%. Результаты этого эксперимента отчасти подтверждают приведенные ранее данные, полученные нами с помощью метода определения концентрации кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК после осаждения уронилацетатом, когда облучение ферментного раствора в течение 5 мин снизило его активность на 23%, а увеличение времени облучения до 60 мин привело к снижению активности до 62%.

Однако величина снижения активности при регистрации на автоматическом спектрометре была гораздо меньше, чем измерения традиционным методом Анфинсена. Вероятно, наличие в реакционной смеси высокополимерной РНК, поглощающей так же в области поглощения нуклеотидов, затрудняет регистрацию увеличения их количества при ферментативном гидролизе, тогда как после осаждения РНК уронилацетатом по методу Анфинсена измерение поглощения нуклеотидов производится без помех.

Возможно заключить, что низкоинтенсивное лазерное излучение уменьшает каталитическую активность РНКазы B. intermedins. Предположительным механизмом такого уменьшения может быть явление, аналогичное описанному [10], когда каталитическая активность снижалась из-за протонирования гистидина вблизи каталитического центра. Данные литературы говорят о том, что замена аминокислоты в 101 положении, а в частности замена гистидина на глутамин вызывает снижение почти всей РНКазной активности [11]. Поскольку биназа содержит гистидин в каталитическом центре, вероятно, что низкоинтенсивное лазерное излучение вызывает, регистрируемое нами двумя методами снижение активности. В то же время каталитический центр субтилизина образованный AspHisSer аминокислотной последовательностью [12] является более стабильным к инактивирующему действию лазера. Воздействие лазерного излучения на ферменты в клетке могут быть несколько иными, модифицированными триггерными механизмами взаимодействия лазера с другими клеточными компонентами.

Протеолитическую активность нативного и облученного фермента определяли по интенсивности расщепления казеина. Лазерное излучение не оказало какого-либо значимого влияния на активность протеазы. Вероятно, в составе протеазы отсутствуют структуры чувствительные к лазерному излучению с длиной волны 632,8 нм, и облучение лазером не приводит к изменению активности фермента.

Результаты ранее приведенных исследований позволяют заключить, что различные клеточные компоненты обладают неодинаковой чувствительностью к действию лазерного излучения. Каталитическая активность может служить показателем инактивирующего действия He-Ne лазера, однако, данный параметр будет изменяться в том случае, если воспринимающие излучение структуры расположены вблизи каталитического центра фермента. Таким образом, отсутствие энзиматической инактивации протеиназы не может рассматриваться как доказательство отсутствия структурных изменений фермента при воздействии лазера.

Литература

1. Ларюшин, А. И. Низкоинтенсивные лазеры в медико-биологической практике /А.И. Ларюшин, В.Е. Илларионов НПО “Элекон”. -Казань, -1997.С.31-46.

2. Жуманкулов, М. С. Фотореактивация церулоплазмина как один из механизмов действия гелий-неонового лазера на кровь / М. С. Жуманкулов, Л. В. Шабуневич, Л. И. Басиладзе, Л. А. Александрова // Лазеры и медицина. - М.: 1989. - С. 73-74.

3. Karn T. Primary and secondary mechanisms of action of visible and near infra red radiation on cells // J. Photochem. Photobiol. - 1999. - V. 49, № 1. - P. 1-17.

4. Захаров, С. Д. Методы изучения и механизм действия лазерного излучения на эритроциты с участием молекулярного кислорода / С. Д. Захаров, Б. В. Еремеев, С. Н Перов, М. А. Панасенко // Методы лазерной биофизики и их применение в биологии и медицине. - Тарту, 1989. - С. 59-92.

5. Кипенская, Л. В. Биологические эффекты нативных и мутантных рибонуклеаз Bacillus intermedins: Автореф. ... канд. биол. Наук / Л.В. Кипенская. 1998. - С.1-10.

6. Колпаков, А. И. Биохимические аспекты стимулирующего действия экзогенных РНКаз / А.И. Колпаков, Ф.Г. Куприянова // Материалы конференции межвузовского (межотраслевого) проекта «Ферменты микроорганизмов» («Нуклеазы»). - Казань: Изд-во КГУ, 1991. - С.27

7. Makarov A. A. Method assessing RNAse activity using high molecular weight RNA / A. A. Makarov, I. I. Protasenich, N. V. Kuznetsova et al. // J. Biomol.Struct. Dynamics. - 1993. - V.10. - P.1047-1065.

8. Лещинская, И. Б. Нуклеодеполимеразы сапрофитных бактерий / А.И. Лещинская. - Казань: Изд-во КГУ, 1975. - 210 с.

9. Колпаков, А. И. Оптимизация метода определения рибонуклеазной активности с использованием высокополимерной РНК / А. И. Колпаков, О. Н. Ильинская // Клиническая и лабораторная диагностика. -1999. - №5. - С.14-16.

10.Владимиров, Ю. А. Лазерная терапия: настоящее и будущее / Ю.А. Владимиров // Соросовский образовательный журнал.-1999.-Т.12(49).- С.2 - 8

11.Ilinskaya, O. N. SOS-inducing ability of native and mutant microbial ribonucleases / O. N. Ilinskaya, N. S. Karamova, O. B. Ivanchenco, L. V. Kipenskaya // Mutation Research. - 1996. №354. - P.203-209.

12.Barrett, A. J. Perspectives in biochemistry and biophiysics / A. J. Barrett, N. D. Rawlings // Archives of biochemistry and biophysics. - 1995. - V. 318.N2. - P.247-250.

© И. Д. Гурьянов - канд. биол. наук, асс. каф. технологии пищевых производств КГТУ, igurjano.27@mail.ru.