СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТИВНЫХ КОЛИЧЕСТВ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ ФЛОЭМНО-ОГРАНИЧЕННЫХ ВИРУСОВ

1. Способ получения препаративных количеств химерного вируса, имитирующего икосаэдрический низкокопийный флоэмно-ограниченный вирус (ИНФОВ) растений, включающий получение химерного вируса путем вставки гена белка оболочки ИНФОВ в эффективный вирусный вектор на основе РНК тобамовируса, способного распространяться и накапливаться в тканях листьев растений, после чего осуществляют системное заражение растений полученным химерным вирусом для размножения и накопления его в тканях растения с последующим выделением химерного вируса из тканей растения в препаративных количествах.
2. Способ по п.1, в котором химерный вирус представляет собой химерную РНК, транскрибированную с ДНК-вектора, состоящую из генома тобамовируса и гена капсидного белка целевого вируса низкокопийного флоэмно-ограниченного вируса растений, причем белок оболочки упаковывает РНК тобамовирусного генома в икосаэдр.
3. Способ по п.1, в котором растения заражают системно химерным вирусным вектором с помощью техники агроинокуляции.
4. Способ по п.1, в котором в качестве икосаэдрического низкокопийного флоэмно-ограниченного вируса растений используют вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК).
5. Способ по п.4, в котором получение химерного вирусного вектора включает следующие этапы:
а) клонирование кДНК вируса просветления жилок турнепса (ВПЖТ, TVCV), принадлежащего к тобамовирусам, с транскрипционным промотером с одной стороны и терминатором транскрипции с другой в агробактериальный вектор pCambia1300;
б) вставку гена белка оболочки ВСЛК из плазмиды pBNUP110 вместо гена собственного тобамовирусного гена белка оболочки;
при этом получают генно-инженерную плазмиду TVCV-PLRV-CP с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1.
6. Способ по п.5, в котором для системного заражения растений осуществляют трансформацию агробактерии штамма GV3101 плазмидой TVCV-PLRV-CP, после чего заражают растения Nicotiana benthamiana вирусной химерной ДНК путем впрыскивания суспензии трансформированных плазмидой TVCV-PLRV-CP агробактерии шприцом со снятой иглой в межклетники листьев растения.
2
4
7. Способ по п.6, в котором выделение химерного вируса из тканей растения осуществляют путем гомогенизации листьев в блендере в 5 объемах 0.1 М цитратного буфера с рН 6.0 с 0.1% 2-меркаптоэтанолом, корректировки рН до 7.0 с помощью 0.5М NaHPO, добавления 1% Triton Х-100, перемешивания гомогената листьев в этом буфере 30 мин на льду, отделение дебриса центрифугированием при 10.000g с последующим осветлением супернатанта 1/4 V хлороформа и высаживанием химерного вируса на ультрацентрифуге при 40.000g в течение 90 мин через 20% сахарозную подушку.
8. Плазмида TVCV-PLRV-CP с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 для получения препаративных количеств химерного вируса, имитирующего вирус скручивания листьев картофеля.
9. Препарат химерного вируса, имитирующего икосаэдрический низкокопийный флоэмно-ограниченный вирус растений, полученный способом по любому из пп.1-7.
10. Препарат химерного вируса по п.9, полученный способом по любому из пп.4-7 с использованием плазмиды по п.8, где в качестве икосаэдрического низкокопийного флоэмно-ограниченного вируса растений используют вирус скручивания листьев картофеля (ВСЛК).
11. Способ получения антисыворотки к природным изолятам ВСЛК, включающий иммунизацию животных препаратом по п.10.
12. Антисыворотка к природным изолятам вируса скручивания листьев картофеля, полученная способом по п.11.
13. Применение антисыворотки по п.12 для диагностики инфицированных природными изолятами ВСЛК растений.
14. Антисыворотка к капсидному белку химерного вируса, имитирующего икосаэдрический низкокопийный флоэмно-ограниченный вирус (ИНФОВ) растений, полученная способом, включающим иммунизацию животных химерными вирусными частицами, полученными способом по любому из пп.1-7.