РЕАГЕНТ ДЛЯ ВЫСВОБОЖДЕНИЯ ВИТАМИНА D
REAGENT FOR RELEASE OF VITAMIN D

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу иммунологического анализа, включающему диагностику по месту лечения для анализа образца крови или компонентов крови на общее содержание витамина D или метаболитов витамина D, в частности 25-гидроксивитамина D, с применением реагента для высвобождения витамина D из эндогенных связывающих белков.
Уровень техники
2
3
Вещества, называемые витамином D, включают группу жирорастворимых прогормонов, а также их метаболитов и аналогов. Основными формами, в которых витамин D встречается в организме, являются витамин D (эргокальциферол) и витамин D (холекальциферол). Последний представляет собой эндогенную форму витамина D, которая может вырабатываться в коже человека под действием солнечных лучей. Первый же представляет собой экзогенную форму витамина D, поступающую с пищей. В США витамин D2 применяют в качестве фармацевтической добавки витамина D.
2
3
Витамины D и D различаются по молекулярной структуре боковых цепей, но обладают одинаковой биологической активностью, являясь прогормонами, метаболизированными в два этапа с получением, в конечном итоге, 1,25-дигидроксивитамина D (кальцитриола, или 1,25-дигидроксихолекальциферола). Предшествующий метаболит, 25-гидроксивитамин D, или кальцидиол, образуется в результате превращения в печени и считается формой, в которой витамин запасается D в организме.
Циркулирующий в крови витамин D состоит, главным образом, из 25(OH)витамина D3 и 25(OH)витамина D2. 25(OH)витамин D2 обладает такой же биологической эффективностью, как и 25(OH)витамин D3. Период полувыведения 25(OH)витамина D2, циркулирующего в крови, короче. Для клинической практики рекомендовано применение анализа на 25(OH)витамин D, позволяющего измерить уровень как 25(OH)витамина D3, так и 25(OH)витамина D2(1).
Витамин D давно признан важным веществом, активная форма которого участвует в образовании и поддержании кости, а также в других процессах в организме человека или животного. Так, он повышает концентрацию кальция в кровотоке, способствуя всасыванию кальция и фосфора из пищи в кишечнике и реабсорбции кальция в почках, обеспечивая нормальную минерализацию костей и предупреждая гипокальциемические судороги. Он также необходим для роста костей и перестройки костной ткани с помощью остеобластов и остеокластов.
Дефицит витамина D вызывает нарушение минерализации костной ткани и приводит к заболеваниям, связанным с размягчением костей, рахиту у детей и остеомаляции у взрослых и, возможно, способствует развитию остеопороза.
В последние годы было признано, что влияние витамина D на здоровье человека этим не ограничивается. Витамин D может модулировать иммунную функцию и уменьшать воспаление. Также было высказано предположение о том, что витамин D может предотвращать рак толстой кишки, молочной железы и яичников.
Таким образом, обеспечение надлежащего уровня витамина D является существенным для здоровья человека или животного.
Однако избыток витамина D (который может возникнуть в результате передозировки) оказывает токсическое воздействие. Одним из симптомов токсичности витамина D является гиперкальциемия (повышение концентрации кальция в крови), вызванная повышением всасывания кальция в кишечнике. Известно, что токсичность витамина D является причиной высокого артериального давления. Симптомы токсичности витамина D со стороны желудочно-кишечного тракта могут включать анорексию, тошноту и рвоту. После этих симптомов часто развиваются полиурия (избыточное мочеобразование), полидипсия (патологически усиленная жажда), слабость, нервозность, зуд и, в конечном итоге, почечная недостаточность.
Очевидно, что важно иметь возможность диагностировать возможный дефицит витамина D у пациентов. Также важно, особенно в случае субъектов, которые получают витамин D в качестве добавки, иметь возможность исследовать субъектов на предмет возможного избытка витамина D. В клинической практике основным индикатором статуса витамина D считают сывороточный уровень 25-гидроксивитамина D(2).
8
-1
Почти весь сывороточный 25(OH)-витамин D связан с белком, связывающим витамин D (88%), и альбумином (12%). Белок, связывающий витамин D (DBP), представляет собой избыточный белок с концентрацией 250-400 мг/л сыворотки. Витамин D связан с DBP с относительно высоким сродством, близким к аналогичному показателю для антител (5*10 М).
Для точного измерения концентрации витамина D в сыворотке требуется высвобождение связанного витамина D из DBP.
Ранее использованные способы определения концентрации витамина D включали этап экстрагирования с применением органических растворителей, таких как ацетонитрил. Другие подходы основаны на диссоциации комплекса витамин D-DBP с помощью создания высокого или низкого pH (WO 2004/063704). Другие способы основаны на конкурентном вытеснении витамина D из эндогенных связывающих белков с применением АНС (US 7482162). Недавно были опубликованы описания способов, включающих протеолитическое расщепление DBP (WO 2008/092917 А1). Армбрустер (Armbruster) опубликовал способ прямого измерения концентрации витамина D с применением замещения гидроксилированной ароматической карбоновой кислотой (WO 2003/023391). Способ, описанный Кириатзулисом (Kyriatsoulis), основан на высвобождении витамина D из белка, связывающего витамин D, с применением реагента с pH от 3,8 до 4,8 и 5-30% диметилсульфоксида, жидкого органического амида и, необязательно, 0,5-5% короткоцепочечного спирта. Кобольд (Kobold) предложил способ высвобождения, основанный на применении соли с катионом, содержащим четвертичный азотсодержащий ион. EP 2007/140962. В US 2008/0182341 упомянуты стабилизирующие агенты и лиганды захвата для применения в анализах для измерения концентраций анализируемого вещества. Указанные стабилизирующие агенты описаны по отношению к определенным алкиламинофторсодержащим поверхностно-активным веществам. Авторы изобретения полагают, что указанное поверхностно-активное вещество облегчает измерение свободного несвязанного анализируемого вещества относительно связанного анализируемого вещества путем стабилизации равновесия. Указано, что фторкарбоновая октановая кислота является потенциально опасным веществом.
Источники, в которых рассмотрен анализ концентрации витамина D, включают работы Hollis BW. Measuring 25-hydroxyvitamin D in a clinical environment: challenges and needs. Am J Clin Nutr. 2008 Aug; 88(2):507S-510S; Holick MF. Vitamin D: extraskeletal health. Endocrinol Metab Clin North Am. 2010 Jun; 39(2):381-400.
Краткое описание изобретения
В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ качественного анализа крови или компонентов крови in vitro на присутствие 25-гидроксивитамина D, включающий:
(a) добавление к образцу перфторалкильной кислоты с длиной углеродной цепи от 4 до 12 атомов углерода или ее соли с обеспечением высвобождения витамина D из белка, связывающего витамин D;
(b) необязательно, разбавление образца растворителем;
(c) инкубацию смеси с иммобилизованным связывающим белком, то есть антителом к витамину D;
(d) приведение образца в контакт с конъюгатом витамина D и функциональной метки, который связывается с антителами к витамину D конкурентным образом;
(e) определение концентрации меченого соединения витамина D, связанного со связывающим белком.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору для реализации вышеописанного способа.
В другом аспекте способ может быть применен для диагностики «по месту лечения». Последний термин обозначает проведение анализа в месте ухода за пациентом или около него, т.е. вместо того, чтобы брать образцы крови и отправлять их в диагностическую лабораторию, можно поместить образец непосредственно в портативное, предпочтительно переносное устройство, которое может осуществить анализ наименьшим возможным числом этапов и с наименьшим возможным числом операций, выполняемых вручную.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 изображена калибровочная кривая 25(OH)витамина D.
На Фиг.2 представлен график сопоставления результатов, полученных при высвобождении с помощью перфторгексановой кислоты (PFHxA) и с помощью перфтороктановой кислоты (PFOA).
Подробное описание изобретения
В широком смысле изобретение относится к определению концентрации витамина D в крови или компонентах крови, в частности в сыворотке или плазме крови, с помощью иммунологического анализа с применением перфторалкильной кислоты или ее соли с длиной углеродной цепи от 4 до 12 для высвобождения витамина D из эндогенных связывающих белков.
Предположительно, в настоящем изобретении можно использовать перфторалкилкарбоновую кислоту, или перфторсульфоновую кислоту, или их соли. В частности, можно применять перфторгексановую кислоту (ПФГК) или перфтороктановую кислоту (ПФОК).
Анализ обычно включает:
(a) добавление к образцу разбавителя/ буфера для анализа;
(b) добавление магнитных частиц с покрытием из антител к витамину D;
(c) инкубацию образца в течение некоторого времени;
(d) добавление конъюгата витамина D и функциональной метки;
(e) определение количества конъюгата витамина D и функциональной метки, связанного с антителом.
Такие образцы могут быть взяты любым способом, известным в данной области техники, у пациента, в частности у человека, в крови которого требуется количественно определить присутствие 25-OH витамина D.
Образец предпочтительно разбавлен водным разбавителем. Предпочтительно разбавитель представляет собой буфер для анализа. Разбавление можно провести до, во время или после добавления антител. Разбавитель образца или буфер для анализа может быть на водной основе и предпочтительно представляет собой буферный раствор. Предпочтительно pH забуференного раствора находится в пределах от 6,0 до 8,0. Подходящие разбавители включают, например, фосфат-цитратный буфер. Концентрация перфторалкильной кислоты в буфере должна составлять 0,1%-3%, предпочтительно 0,5%. Подходящие буферные растворы распространены в данной области техники и не требуют пояснений в настоящем документе.
Перфторалкильную кислоту можно добавлять отдельно, но предпочтительно включить ее в разбавитель образца, предпочтительно в буфер для анализа.
Образец приводят в контакт с антителами к 25(OH) витамину D. Последние могут быть добавлены в образец, или образец может быть перенесен в реакционную пробирку, содержащую связывающий белок.
Антитела к витамину D известны в данной области техники и широко применяются в известных иммунологических анализах на витамин D. Те же антитела, а также другие связывающие белки, можно применять и в настоящем изобретении. Например, вместо антитела к витамину D может применяться фрагмент антитела, такого как те, что получают методом фагового дисплея. Подходящие антитела могут быть моноклональными или поликлональными антителами. Они могут быть получены известным способом, примерами являются поликлональные антитела к витамину D козы, поликлональные антитела к витамину D кролика или любые другие подходящие антитела к витамину D, известные в данной области техники по применению в иммунологических анализах на витамин D. Подходящие антитела известны, например, из следующих источников: Hollis, Clin. Chem 31/11, 1815-1819 (1985); Hollis, Clin. Chem 39/3, 529-533 (1993).
Применяемые антитела предпочтительно иммобилизованы. Предпочтительно их применяют в виде частиц, содержащих твердые носители. Обычно антитела нанесены в виде покрытия на твердую фазу, например на микротитрационный планшет. Согласно предпочтительному варианту реализации антитела нанесены в виде покрытия на магнитные частицы, что облегчает их высвобождение в магнитном поле.
После добавления антител образец оставляют для инкубации. Необходимое время зависит от обстоятельств, таких как концентрация реагентов, тип связывающего белка и условия во время инкубации, например встряхивание и температура. В общем случае время инкубации составляет от 10 секунд до нескольких часов, предпочтительно от 1 минуты до 1 часа. Для автоматизированных платформ предпочтительно малое время инкубации (от 10 секунд до 10 минут, предпочтительно от 30 секунд до 30 минут).
После первого периода инкубации добавляют конъюгат витамина D и функциональной метки. Известно множество меченых соединений, которые могут служить в качестве конкурентных связывающих агентов в иммунологическом анализе для определения витамина D. Обычными метками являются радиоактивные метки, флуоресцентные метки, люминесцентные метки, биотиновые метки, золотые метки, ферментные метки. Анализы конкурентного связывания известны специалисту в данной области техники и не требуют пояснений, в особенности потому, что этот этап способа согласно настоящему изобретению может быть осуществлен с применением любой метки, для которой известно, что она подходит для определения витамина D. Метки, которые могут применяться, представляют собой, в том числе, метки, описанные в вышеназванных источниках, посвященных известным иммунологическим анализам.
С использованием метки, позволяющей измерить концентрацию, в результате определяют концентрацию витамина D в образце. Следует понимать, что интерпретация полученных показателей определяется калибровочным измерением, т.е. ответом калибраторов в том же анализе.
Калибровку для анализа согласно настоящему изобретению можно проводить путем обеспечения калибраторов, содержащих заданную концентрацию 25-OH витамина D. Концентрацию витамина D в калибраторах предпочтительно определяют с помощью метода ЖХ/МС/МС.
В другом аспекте в настоящем изобретении предложен продукт в виде иммунотеста для определения 25-OH витамина D в крови или компонентах крови, который действует с применением способа согласно любому из предыдущих вариантов реализации. В частности, такой продукт будет обеспечен в виде набора для проведения иммунологического анализа. Такой набор может включать отдельные задействованные реагенты, т.е. антитела, меченое соединение витамина D и разбавители/буфер для анализа. Эти реагенты могут быть обеспечены по отдельности и, таким образом, составлять набор только при применении в анализе согласно настоящему изобретению. Предпочтительно реагенты обеспечены вместе, предпочтительно в одной упаковке в виде единого набора компонентов. Набор необязательно содержит контейнер для образца крови или компонентов крови, но обычно он также может поставляться отдельно. Обычно набор содержит связывающее вещество, иммобилизованное на твердой фазе, и, отдельно, конъюгированный витамин D. Другие компоненты набора, как принято в данной области, зависят от выбранной метки, поскольку для разных меток могут требоваться разные реагенты.
Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено вариантами реализации и формулами, описанными выше. Следует также понимать, что в пунктах формулы изобретения термин "включающий" не исключает других элементов и этапов. Существительные в форме единственного числа обозначают также множественное число того же существительного, если иное не оговорено особо.
Настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующим неограничивающим примером и прилагаемыми неограничивающими чертежами.
Пример
Измерение концентрации витамина D
Анализ проводили с применением автоматизированной платформы. К 15 мкл образца добавляли 255 мкл разбавителя образца/буфера для анализа. Аликвоту в 100 мкл разбавленного образца переносили во вторую инкубационную лунку. К разбавленному образцу добавляли магнитные частицы с нанесенным покрытием из моноклонального антитела в объеме 50 мкл и инкубировали в течение 45 минут при 37°C. Затем добавляли 50 мкл раствора биотинилированного витамина D и инкубировали в течение 7 минут при 37°C. Затем добавляли 50 мкл раствора стрептавидина-эфира акридиния и снова инкубировали в течение 7 минут при 37°C. После разделения в магнитном поле связанного и свободного биотинилированного витамина D определяли количество связанного эфира акридиния.
Материалы
Парамагнитные частицы. Магнитные частицы (Invitrogen, М280, активированные тозилом, 2,8 мкм) покрывали поликлональным антителом к IgG мыши (5 мкг/мг магнитных частиц). На частицы наносили покрытие на ролике в концентрации 0,5 мг/мл в 0,01 М фосфатном буферном растворе (ФБР), 0,138М NaCl с pH 7,4 в течение 16 часов. Наконец, частицы блокировали 0,05М Трис/0,05% БСА, содержащим 0,1% Proclin-950. Покрытие наносили на частицы в течение 16 часов при 37 C со вторым слоем моноклонального антитела к витамину D в концентрации 0,4 мкг/мг частиц.
Разбавитель образца состоял из 0,1М буфера ТРИС с pH 8,0, содержащего 0,05% бычего сывороточного альбумина (БСА) и 0,5% ПФОК.
Конъюгат (т.е. меченое соединение витамина D) представляет собой биотинилированный витамин D. Конъюгат был представлен в концентрации 0,5 нг/мл в 0,1М буфера ТРИС с pH 8,0, содержащего 0,05% бычьего сывороточного альбумина.
Протокол
К 15 мкл образца добавляли 255 мкл разбавителя образца / буфера для анализа. Аликвоту в 100 мкл разбавленного образца переносили во вторую инкубационную лунку. К разбаленному образцу добавляли магнитные частицы с нанесенным покрытием из моноклонального антитела в объеме 50 мкл и инкубировали в течение 45 минут при 37°C. Затем добавляли 50 мкл раствора биотинилированного витамина D и инкубировали в течение 7 минут при 37°C. Затем добавляли 50 мкл раствора стрептавидина-эфира акридиния и снова инкубировали в течение 7 минут при 37°C. После разделения в магнитном поле связанного и свободного биотинилированного витамина D определяли количество связанного эфира акридиния. Хемилюминесцентный сигнал генерировали путем добавления триггерного реагента. Сигнал, производимый в кювете, обратно пропорционален концентрации 25(OH) витамина D в образце или калибраторе. Концентрацию 25(OH) витамина D в исходном образце можно вычислить путем соотнесения сигнала неизвестного образца с ответом калибраторов.
Результаты
В нижеприведенной таблице и на Фиг.1 показана калибровочная кривая. Калибраторы 25(OH) витамина D3 были получены в сыворотке, не содержавшей витамина D, в концентрации от 0 до 136 нг/мл.
Биотинилированный 25(OH) витамин D был замещен до уровня 7% при 136 нг/мл.
Набор образцов количественно оценивали, применяя высвобождение с помощью перфтороктановой кислоты и высвобождение с помощью перфторгексановой кислоты. Наблюдается очень хорошая корреляция результатов (r=0,990), что свидетельствует о возможности применения обоих соединений (Фиг.2).
Таблица 1
Калибровочная кривая для 25(OH) витамина D
Доза для построения стандартной кривой (нг/мл)
Ст 00
Ст A4,1
Ст B13,5
Ст C24,9
Ст D52,1
Ст E136
ОСЕ (1)
733227
618731
432378
254588
105251
41737
ОСЕ (2)
754974
637612
422703
228484
106879
41870
ОСЕ среднее
744101
628172
427541
241536
106065
41804
ОСЕ СО
15377
13351
6841
18458
1151
94
ОСЕ % КВ
2,1%
2,1%
1,6%
7,6%
1,1%
0,2%
Связывание, %
100,0%
84,4%
57,5%
32,5%
14,3%
5,6%