СПОСОБ НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ С ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОМ ФОТОРАН Е6 ПЕРЕВИВНОЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОТКАННОЙ ОПУХОЛИ САРКОМА М-1 КРЫС, ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ ПО МУТАНТНОМУ ГЕНУ р53
METHOD OF LOW-INTENSITY LASER RADIATION DURING PHOTODYNAMIC THERAPY WITH A PHOTOSENSITIZER FOTORAN E6 OF A GRAFTED CONNECTIVE-TISSUE SARCOMA TUMOR OF M-1 RATS, POSITIVE IN A MUTANT P53 GENE

Настоящий способ относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использован как метод  низкоинтенсивного лазерного излучения при проведении фотодинамической терапии (ФДТ) перевивной поверхностной солидной соединительнотканной опухоли саркомы М-1.
Фотодинамическая терапия (ФДТ)  в настоящее время занимает одно из ведущих мест в локальном лечении злокачественных заболеваний, основанная на использовании лекарственных средств – фотосенсибилизаторов (ФС) и лазерного излучения. В основе механизма радикального лечения онкологических больных лежит способность ФС селективно накапливаться в опухолевых тканях и при последующем воздействии лазерным излучением вызывать образование высокоактивных биологических окислителей, оказывающих деструктивное воздействие на злокачественные клетки. Также важную роль в разрушении опухоли играет нарушение кровоснабжения за счет разрушения сосудов опухоли, цитокиновые и воспалительные реакции с активацией лимфоцитов, нейтрофилов и макрофагов, что запускает механизм развития противоопухолевого иммунного ответа. Комплексный характер прямого деструктивного действия терапии и опосредованного специфическими и неспецифическими реакциями клеток микроокружения опухолей ведет к эффективному уничтожению злокачественных клеток. Много лет назад в клинической практике начали достаточно широко применять низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ), но применение НИЛИ в онкологической практике до определенного времени было ограничено из-за возможного риска прогрессирования опухоли. Основная область применения НИЛИ - лечение трофических язв, ожоговых ран, заболеваний кожи и других поверхностных патологических процессов (Баракаев C.B., 1991; Головизин М.В., 1995; Зырянов Б.Н. и др., 1998). НИЛИ является своеобразным общим и местным биологическим стимулятором многих важных функций организма, обладает анальгезирующим, сосудорасширяющим и противовоспалительным действием (Виноградов А.Б., Чемурзиева Н.В., 1993; Ryden et al., 1996; Johansen et al., 1998). Имеются сообщения об использовании НИЛИ для лечения опухолей в эксперименте (Южаков В.В. и др., 1993; Каплан М.А. и др., 1999).
Однако именно боязнь стимуляции опухолевого роста лазерным излучением до сих пор препятствует широкому внедрению НИЛИ в схемы лечения онкологических больных. Таким образом, в настоящее время не подвергается сомнению тот факт, что НИЛИ обладает целым рядом качеств, полезных для лечения различных патологических состояний (НИЛИ обладает местным и системным эффектом). Однако работы, которые показали обоснованность использования НИЛИ для лечения и реабилитации больных со злокачественными новообразованиями имеют большой срок давности (1990-2008 гг).
6
p53
р53
р53
mt
р53
Проблема лечения злокачественных новообразований методом ФДТ неразрывно связана с поиском эффективных и безопасных ФС и параметров проведения ФДТ. Нами в работе был использован новый отечественный ФС Фоторан Е, который содержит трисмеглуминовую соль хлорина е6 в комплексе с поливинилпирролидоном (ПВП, марка К-17). ФС обладает свойством накапливаться в опухоли и при локальном воздействии лазерного излучения с длиной волны в диапазоне 660–670 нм обеспечивает фотосенсибилизирующий эффект. Считается, что одну из ключевых ролей в механизме программируемой гибели клеток играет нормальный – «дикий» (wait, wt) ген-онкосупрессор  и кодируемый им транскрипционный фактор, регулирующий клеточный цикл, – белок р53. р53 контролирует состояние ДНК в сверочных точках клеточного цикла. Согласно данным клинических исследований, мутантный (mt)  в злокачественных новообразованиях встречается более чем у 50% онкологических больных. Полагают, что статус  может быть важным для выбора стратегии лечения онкологических больных. Тем не менее, сведений о вовлечении  в резистентность опухолей к ФДТ относительно немного, а полученные результаты далеко не однозначны.
В последние годы появилось много сообщений о применении ФДТ в сочетании с низкоинтенсивным лазерным излучением (далее НИЛИ) в лечении многих патологических процессов в различных областях медицины.
Например, в исследовании эффективности воздействия различных лекарственных форм и схем патогенетической терапии на боль в спине и суставах у коморбидных больных остеоартритом (Васильева Л.В., Евстратова Е.Ф., Никитин А.В., Бурдина Н.С. Исследование эффективности воздействия различных лекарственных форм и схем патогенетической терапии на боль в спине и суставах у коморбидных больных остеоартритом, «Клиническая медицина» 2019 – 21(2): 69-73) авторы  сравнивают  безопасность и эффективность применения различных лекарственных форм в сочетании с НИЛИ у больных с болями в спине и суставах. Комбинация местного воздействия НИЛИ с введением парентеральных форм  препаратов ускоряла эффекты противовоспалительного и обезболивающего эффекта, отсутствием осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта.
Известные способы НИЛИ при проведении ФДТ злокачественных опухолей имеют большой срок давности (Миков А.А., Свирин В.Н. Концепция медицинских информационных систем лазерной диагностики и терапии. – II Евразийский конгресс по медиц. физике и инженерии. 2005; В.Дмитриев, А.Казаков, А.Миков, В.Свирин. Методы повышения эффективности лазерной терапии в онкологии. 2008; Свирин В.Н. Современные лазерные информационные технологии в онкологии: методы, аппаратура, клиника. 2008; Саар E Abo-Neima. Лечение рака с помощью низкоинтенсивного лазерного излучения. 2017. После тщательного анализа, редколлегия Биофизики и молекулярной биологии убирается этот документ в связи с обвинением в плагиате)….
Эти методы основаны на применении фотосенсибилизаторов предыдущего поколения и необходима разработка новых методов с новыми отечественными препаратами.
Известен способ лечения онкологических больных (RU 2119363 С1).  Вводят фотосенсибилизатор, осуществляют низкоинтенсивное лазерное воздействие на патологический очаг и регистрируют коэффициент отражения в его центре и на границе, по которому определяют интенсивность спектров флюоресценции фотосенсибилизатора. При равенстве интенсивности в центре и на границе и превышении последней по меньшей мере в три раза интенсивности спектров флюоресценции фотосенсибилизатора в интактной области производят сеанс лазерного облучения. Непрерывно регистрируют величину уменьшения разницы между интенсивностью на границе и в интактной области до момента ее повторного роста, по которому определяют окончание сеанса.
Однако, при минимальных побочных реакциях в зоне облучения достичь полной регрессии возможно лишь при воздействии на небольшие  поверхностные опухоли.
2
2
Известен способ фотодинамической терапии перевивной поверхностной солидной соединительнотканной саркомы м-1 крыс (RU 2704202 C1).  Вводят  фотосенсибилизатор «Фоторан Е6» в дозах 5,0 мг/кг, что при экстраполяции на дозу человека составляет 0,85 мг/кг веса тела больного. Через 2,5 часа после введения фотосенсибилизатора проводят облучение лазером с длиной волны 660-670 нм с плотностью мощности 250 мВт/см и плотностью энергии 300 Дж/см лазерного излучения, время облучения - 20 минут.
Однако, данный режим проведения ФДТ не является низкоинтенсивным и оказывает сильное воздействие на окружающие ткани.
Техническим результатом является снижение параметров облучения для достижения регрессии соединительнотканной перевиваемой опухоли крыс с верифицированным мутантным онкопротеином р53.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что также как и в известном способе  вводят  фотосенсибилизатор Фоторан Е6 в дозе 5 мг/кг и через  2,5-3 ч после  введения фотосенсибилизатора проводят облучение лазером.
2
2
Особенность заявляемого способа заключается в том, что через  2,5-3 ч после  введения фотосенсибилизатора проводят низкоинтенсивное облучение лазером с параметрами:  плотность энергии – 50 Дж/см и плотность мощности – 0,025 Вт/см, время облучения – 33,5 минуты.
Результаты проведенных комплексных исследований показали, проведение ФДТ в оптимальные сроки после введения ФС с низкоинтенсивным лазерным воздействием позволяет достичь полной регрессии опухолевых узлов.
Изобретение поясняется подробным описанием, лабораторными исследованиями,   таблицами и иллюстрациями, на которых изображено:
6
Фиг. 1 – Динамика накопления Фоторана Е в опухолях и здоровых тканях бедра крыс при дозе 5,0 мг/кг: по осям абсцисс – срок после внутрибрюшинного введения фотосенсибилизатора, ч; по осям ординат - слева интенсивность флуоресценции, справа – индексы контрастности (красные линии на графиках).
Фиг. 2 –  Микроскопическая картина бифокального опухолевого узла.
Фиг. 3 – Увеличенный фрагмент фиг. 2  а) зона роста саркомы М-1 у крысы; б) положительная реакция ядер опухолевых клеток при иммуноокрашивании на онкопротеин р53.
Фиг.4 – Макрофото саркомы М-1 через 1 сутки после ФДТ.
Фиг 5 – Гистологический рисунок зоны фотодинамического.
Фиг. 6 – Коагуляционный некроз опухолевых клеток.
Фиг. 7 – Бифокальный опухолевый узел саркомы М-1.
Фиг. 8 – Гистологическое строение саркомы М-1.
Фиг. 9 – Макрофото саркомы М-1 на 4 сутки после ФДТ.
Фиг. 10 – Гистологический рисунок зоны фотодинамического воздействия.
Фиг. 11 – Зона фотодинамического воздействия на саркому М-1.
Фиг. 12 – Макрофото саркомы М-1 на 20 сутки после перевивки.
Фиг. 13 – Гистологический рисунок саркомы М-1.
Фиг. 14 – Положительная реакция опухолевых клеток при иммуноокрашивании на онкопротеин р53.
Фиг. 15 – Макрофото зоны лазерного воздействия на саркому М-1.
Фиг. 16 – Гистологический рисунок тканей бедра.
Фиг. 17 – Рецидив опухоли.
Фиг.18 – Макрофото саркомы М-1  на 26 сутки роста.
Фиг.19 – Гистологический рисунок саркомы М-1.
Фиг. 20 – Макрофото зоны лазерного воздействия на саркому М-1.
Фиг. 21 – Микроскопическое строение тканей бедра в зоне лазерного воздействия.
Фиг. 22 – Замещение зоны элиминации саркомы М-1 грануляционной тканью.
Способ осуществляют следующим образом.
2
2
р53
Вводят  фотосенсибилизатор интраперитонеально 5 мг/кг и через 2,5-3 ч  проводят облучение лазером:  плотность энергии – 50 Дж/см и плотность мощности – 0,025 Вт/см, время облучения – 33,5 минуты и  оценивают ответ саркомы М-1 на ФДТ по следующим показателям: полная регрессия опухоли (ПР,%), коэффициенты абсолютного прироста опухолей (К) у крыс, причем терапевтический потенциал ФДТ по девитализации опухолевых клеток определяют путем гистологического исследования зон воздействия лазерным излучением, данные исследования включали иммуноокрашивание на онкопротеин .
Результаты проведенных комплексных исследований показали, проведение ФДТ в оптимальные сроки после введения ФС с низкоинтенсивным лазерным воздействием позволяет достичь полной регрессии опухолевых узлов с минимальным повреждением окружающих тканей.
Изобретение иллюстрируется лабораторными опытами.
Опыт проведен на самках беспородных крыс в возрасте 3 месяца массой тела 170 – 210 г с имплантированной под кожу бедра саркомой М-1. Штаммы перевиваемых опухолей были получены в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Животные получены из питомника лабораторных животных ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (филиал «Андреевка»). Они были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества и состояния здоровья, и прошли 20-суточный карантин в виварии МРНЦ им. А.Ф. Цыба. Работа выполнена с соблюдением международных рекомендаций по проведению исследований с использованием лабораторных животных.
Соответственно сроку патоморфологического исследования после ФДТ, животные были распределены на 4 группы – в которые входили контрольные и опытные крысы. Опухоли крыс контрольных групп не подвергались воздействиям.
,
6
in vivo.
Для установления оптимального времени проведения ФДТ определяли лекарственно-световой интервал (время от момента введения ФС до облучения лазером). Интраперитонеально вводили ФС в дозе 5 мг/кг массы тела и определяли концентрацию и селективность в тканях Уровень содержания Фоторана Е в опухолевой и здоровой тканях бедра оценивали по интенсивности флуоресценции в условных единицах (у. ед.) с помощью спектрофлуоресцентного комплекса ЛЭСА–01–«Биоспек». Селективность вычисляли по индексу контрастности (опухоль / здоровая ткань).
2
2
Источником лазерного излучения служил полупроводниковый лазерный аппарат «Актус-2» с длиной волны – 660 нм; плотностью мощности – 0,025 Вт/см, плотностью световой энергии – 50 Дж/см. Диаметр поля воздействия 1,5 см, время облучения 33,5 мин.
Эффективность ФДТ оценивали по критериям:
1. По коэффициенту абсолютного прироста опухоли (К).
Для этого сначала вычисляли объёмы опухолей по формуле:
(1)
1,
2
3,
где: dd, d- три взаимно перпендикулярные диаметры опухоли,
3
V - объем опухоли в см.
Коэффициент абсолютного прироста опухоли (К) рассчитываем по формуле:
(2)
0
где   V -объем опухоли до воздействия,
t
V - объем опухоли на определенный срок наблюдения;
2.  По проценту животных в группе с полной регрессией (ПР %) опухоли (К = -1,00). За полную регрессию опухоли мы принимали отсутствие видимой и пальпируемой опухоли.
Для гистологического изучения саркомы М-1 животных выводили из опыта: контроль - на 8, 12, 20 и 26 сутки после перевивки саркомы; в опытной группе – на те же сроки перевивки и через 1, 4, 14 и 21 сутки после ФДТ. У всех животных выделенные опухоли фиксировали 24 часа в жидкости Буэна. После стандартной гистологической проводки фрагменты тканей заключали в парафиновую среду Гистомикс на станции заливки HistoStar (Thermo Scientific). Для морфологических исследований срезы толщиной 5 мкм, полученные на микротоме Leica RM2235, после депарафинирования окрашивали гематоксилином и эозином (БиоВитрум). Для верификации выживших после ФДТ опухолевых клеток проводилииммуногистохимические исследования с использованием поликлональных кроличьих антител к онкопротеину р53 (FL393, «Santa Cruz», 1:50) и набора для выявления кроличьих первичных антител (EnVision+System-HRP (DAB), «Dako»). При иммуноокрашивании на белок р53 субстратную пероксидазу проявляли аминоэтилкарбазолом (AEC+, «DAKO») с докрашиванием ядер клеток гематоксилином и заключением гистологических препаратов в водорастворимую среду (Faramount, «DAKO»). Гистологические срезы изучали под микроскопом Leica DM 1000 с микрофотосъемкой на цифровую камеру Leica ICC50 HD.
Статистическую обработку полученных результатов для независимых групп выполняли с использованием программ Statistica 6.0. Параметры описательной статистики представлены в виде среднего арифметического значения и стандартной ошибки среднего (M±m). Время наибольшего подъема накопления и максимального индекса контрастности составило 2,5–3 ч (Фиг. 1, табл. 1).
Таблица 1.
6
Схема проведения опытов при ФДТ саркомы М-1 крыс с фотосенсибилизатором Фоторан Е при интраперитонеальном введении в дозе 5,0 мг/кг в сравнении с контролем
Группа
ФДТ (срок после перевивки)
Объем опух. в день ФДТ(см<sup>3</sup>) M±m
Дата выведения из опыта (срок после перевивки/ФДТ*)
Объем опухоли в день выведения особи из опыта(см<sup>3</sup>)  M±m
1 группа
Контроль
—
0,19±0,9
8 сутки
0,34±0,12
Опыт
7 сутки
0,37±0,15
8/1 сутки
Визуально опухоль не определяется
2 группа
Контроль
—
0,14±0,03
12 сутки
1,57±0,82
Опыт
8 сутки
0,05±0,01
12/4 сутки
Визуально опухоль не определяется
3 группа
Контроль
—
0,23±0,03
20 сутки
13,6±2,2
Опыт
6 сутки
0,05±0,00
20/14 сутки
Визуально опухоль не определяется.Рецидив - у одной крысы при патоморфологическом. исслед.
4 группа
Контроль
—
0,13±0,01
26 сутки
22,8±1,2
Опыт
5 сутки
0,06±0,01
26/21 сутки
Визуально опухоль не определяется
6
Таким образом,  полученные результаты показали, что Фоторан Е обладает высокой противоопухолевой активностью для ФДТ с НИЛИ солидной соединительнотканной опухоли. У животных визуально опухоль не определялась.
1-ая группа  в патоморфологическом исследовании на 8 сутки после перевивки опухолей  - имели зоны роста саркомы, в основном, солидный тип строения (Фиг. 2). В полях зрения просматривались относительно многочисленные митотические фигуры и единичные клетки, погибающие путем апоптоза (Фиг. 3 а). В большинстве ядер опухолевых клеток определялся мутантный белок р53 (Фиг. 3 б).
Через сутки послеФДТ визуально опухоли не определялись. На фоне отека тканей бедра видны зоны повреждения кожи темно-коричневого цвета(Фиг. 4). Микроскопическая картина тканей бедра в зоне фотодинамического воздействия показана на (Фиг. 5). В этой области наблюдалась деструкция эпидермиса и наличие клеточного детрита, инфильтрированного нейтрофилами. Большая часть опухолевых клеток находилась в состоянии коагуляционного некроза (Фиг. 6).
2-ая группа  на12 сутки после перевивки опухолей. При микроскопическом исследовании опухоли были представлены 2-мя – 4-мя слившимися узлами (Фиг. 7).
В отдельных участках опухоль прорастала подкожные мышечные волокна, часть которых подвергалась дистрофическим изменениям. Периферия опухолей представлена широкой зоной солидного роста. В центральных отделах опухолей просматривались разветвленные участки спонтанного некроза (Фиг. 8).
На 4 сутки после ФДТ визуально опухоли не определялась. В зоне лазерного воздействия формировались плотные струпы темно-коричневого цвета (Фиг. 9). Гистологический рисунок этой зоны представлен на Фиг. 10. Кожа в этой области некротизирована и отделена от нормальных тканей лейкоцитарным валом (Фиг. 11), состоящим из клеточного детрита, инфильтрированного погибшими нейтрофилами. В зонах повреждения тканей располагались многочисленные фибробласты, макрофаги и лимфоциты. Выживших опухолевых клеток на данный срок после ФДТ не обнаружено.
3-ая группа  на20 сутки после перевивки опухолей. Более крупные опухоли, как правило, с мультифокальным ростом и трофическим изъязвлением вдистальной области (Фиг. 12). Гистологический рисунок саркомы М-1 показан на Фиг. 13. Зоны роста саркомы в виде солидных тяжей неравномерной ширины визуализировались по периферии опухолей (Фиг. 14). В центральных участках опухолевых узлов располагались обширные поля спонтанного некроза.
14 сутки после ФДТ.
В зоне воздействия видны плотные струпы темно-коричневого цвета (Фиг. 15). Гистоструктура тканей бедра крысы в зоне фотодинамического воздействия показана на Фиг. 16. Поверхность дефектов частично или полностью эпителизирована. При иммуноокрашивании гистологических срезов на мутантный белок р53 опухолевые клетки не обнаружены. Рецидивирующий рост саркомы М-1 в зоне лазерного воздействия (Фиг. 17) на этот срок исследования был выявлен только у одного животного.
4-ая группа на 26 сутки после перевивки опухоли.  Опухоли прорастали кожу. На поверхности новообразований появлялись трофические изъязвления с отторжением некротических масс (Фиг. 18). Жизнеспособная паренхима саркомы М-1 просматривалась преимущественно по периферии опухолевых узлов. Центральные области опухолей заполнены обширными полями спонтанного некроза (Фиг. 19).
На  21 сутки после ФДТ. На коже бедра крыс в области ФДТ видны небольшие струпы темно-красного цвета или выявлялся светлый едва заметный рубец (Фиг. 21). При гистологическом изучении тканей в зонах фотодинамического воздействия у всех крыс выявлена полная деструкция опухолей с разрастанием соединительной ткани в очагах повреждения и частичной или полной эпителизацией поврежденной поверхности кожи (Фиг. 22, 23). При верификационном иммуноокрашивании серийных гистологических срезов на онкопротеин р53 опухолевые клетки не выявлены.
Результаты  проведенных комплексных исследований показали, что проведение ФДТ в оптимальные сроки после введения ФС с низкоинтенсивным лазерным воздействием позволяет достичь полной регрессии опухолевых узлов (лишь у одной особи на 14 сутки был выявлен рецидивирующий рост).  По данным иммуногистохимического анализа, выживших опухолевых клеток с экспрессией мутантного белка р53 не обнаружено. ФДТ при НИЛИ - «терапия холодным лазером» не только уничтожает опухоль, но и стимулирует регенерацию тканей и заживление с помощью лазерного потока низкой интенсивности.
Использование  ФС Фоторан Е6 с низкоинтенсивным лазерным излучением в эксперименте позволило снизить параметры облучения для достижения полной регрессии соединительнотканной перевиваемой опухоли крыс с верифицированным мутантным онкопротеином р53 и  добиться излечения опухоли при минимизации повреждения здоровых тканей.