ВАКЦИНА ПРОТИВ БЕШЕНСТВА
RABIES VACCINE

Настоящее изобретение относится к последовательности мРНК, содержащей кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, которая содержит несколько последовательностей мРНК, содержащих кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное.
Кроме того, изобретение относится также к применению композиции, содержащей несколько последовательностей мРНК, для приготовления фармацевтической композиции, прежде всего вакцины, например, для применения с целью профилактики, постконтактной профилактики или лечения вызываемых вирусом бешенства инфекций. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения, постконтактной профилактики или профилактики бешенства с применением последовательности мРНК.
Бешенство представляет собой вирусный зооноз, эндемичный для более чем 100 стран и территорий (WHO epidemiological record 2007а, №49/50 (82), сс. 425-436. Rabies vaccines: WHO position paper (вакцины против бешенства: документ по позиции ВОЗ)), и представляющий угрозу более чем для 3 миллиардов людей (Knobel D.L. и др., Re-evaluating the burden of rabies in Africa and Asia. Bulletin of the World Health Organisation 2005; 83, cc. 360-368). В отсутствии постконтактной профилактики после проявления клинических симптомов заболевание неизменно приводит к фатальному исходу (WHO epidemiological record 2010. №32 (85), сс. 309-320. Rabies vaccine: WHO position paper). По оценкам ВОЗ каждый год происходит 55000 связанных с бешенством случаев смерти и проводится постконтактная обработка (PET) более чем 10 миллионов людей (WHO Weekly epidemiological record, №49/50, 2007b, 82, cc. 425-436).
Существующие в настоящее время вакцины против бешенства включают наиболее широко применяемые, но связанные с высоким риском вакцины на основе нервных тканей, или безопасные, но более дорогие вакцины на основе клеточных культур и эмбрионированных яиц (CCEEV). Риски, ассоциированные с вакцинами она основе нервных тканей, включают индукцию аутоиммунного заболевания центральной нервной системы, связанную с содержащимся в них миелином; необходимость осуществления нескольких инъекций; и ненадежную эффективность (Plotkin S.A., Rabies. Clin Infect Dis; 30, 2000, cc. 4-12). ВОЗ не рекомендует применять вакцины на основе нервных тканей и очень поддерживает все увеличивающееся поступление современных и высококачественных вакцин для популяций бедного населения (WHO epidemiological record 2007а. №49/50 (82), сс. 425-436. Rabies vaccines: WHO position paper). Вакцины на основе птичьих эмбрионов и вакцины на основе клеточных культур содержат инактивированный очищенный вирус, свободный от белка нервной ткани. Хотя они являются более безопасными и иммуногенными, чем вакцины на основе нервных тканей, методы получения с использованием клеточных культур требуют больших затрат времени и ресурсов, и связанная с этим большая стоимость существенно ограничивает их применение в развивающихся странах (Warrell M.J. и Warrell D.A., Intradermal postexposure rabies vaccine regimens. Clin Infect Dis 2000; 31, cc. 844-845), несмотря на имеющиеся рекомендации ВОЗ.
Предконтактная профилактика (PrEP) с применением вакцины на основе клеточных культур является безопасной, и она рекомендована лицам, работающим в условиях повышенного риска (например, персоналу лабораторий, ветеринарам, лицам, осуществляющим уход за животными, людей, работающих с дикими животными, и путешественникам, которые посещают эндемичные по бешенству зоны), но ее применение в развивающихся странах существенно ограничено вследствие высокой стоимости. Кроме того, вакцина против бешенства рекомендована лицам, предпринимающим путешествия по странам Африки и Азии, которые являются эндемичными по бешенству (STIKO 2011).
Например, в Германии в продажу поступают только две вакцины против бешенства, а именно Rabipur и «Tollwut-Impfstoff (человеческая диплоидная клетка [HDC]) inaktiviert». Эти вакцины содержат инактивированный вирус бешенства. Обе вакцины рекомендованы для пред- и постконтактного применения. После контакта с больным бешенством животным или с животным, которое может быть больным бешенством, рекомендуется осуществлять PET (постконтактную обработку) путем осуществления вакцинации в дни 0, 3, 7, 14 и 28 после контакта. Наряду с вакцинацией для эффективного предупреждения заболевания следует осуществлять надлежащую обработку раны и одновременно вводить антирабический иммуноглобулин (Ig) (Ig против вируса бешенства).
В настоящее время проблема заключается в нехватке указанных вакцин, которые иногда доступны только для постконтактной профилактики, но не для профилактической вакцинации. Однако, профилактическая вакцинация важна для путешественников, посещающих развивающиеся страны, в которых Ig против вируса бешенства может быть недоступен для постконтактной профилактики.
Таким образом, существует необходимость в безопасной и эффективной вакцине против бешенства, доступной в любое время. Кроме того, существует настоятельная необходимость в термостабильной вакцине против бешенства, которая не зависит от охлаждения (холодовая цепь).
Кроме того, существует настоятельная медицинская необходимость в повышении эффективности введения вакцины против бешенства и разработке безопасной и эффективной вакцины против бешенства, которая была бы более доступной с точки зрения стоимости, и которую можно было бы изготавливать быстрее, чем доступные в настоящее время вакцины на основе клеточных культур.
Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача создать последовательность мРНК, кодирующую антигенные пептиды или белки вируса бешенства, для применения в качестве вакцины для профилактики или лечения бешенства, прежде всего для предконтактной профилактики или постконтактной профилактики. Кроме того, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать эффективную вакцину против бешенства, которую можно хранить без холодовой цепи и которая позволяет осуществлять быстрое и масштабируемое производство вакцины.
Эти задачи решаются с помощью объектов изобретения, представленных в прилагаемой формуле изобретения. Задачи, положенные в основу настоящего изобретения решаются, прежде всего, согласно первому объекту изобретения с помощью предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, содержащей кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное.
Для целей ясности и удобочитаемости ниже представлены информация о научных предпосылках изобретения и определения. Любые технические признаки, указанные в настоящем описании, могут представлять собой часть каждого и всех вариантов осуществления изобретения. Дополнительные определения и пояснения могут быть представлены в контексте настоящего описания.
Иммунная система: Иммунная система может защищать организмы от инфекции. Если патогену удалось преодолеть физический барьер организма и попасть в указанный организм, то врожденная иммунная система обеспечивает немедленный, но неспецифический ответ. Если патоген ускользает от этого врожденного ответа, у позвоночных имеется второй уровень защиты, представляющий собой адаптивную иммунную систему. В этом случае иммунная система адаптирует свой ответ в процессе инфекции для улучшения распознавания патогена. Затем этот улучшенный ответ сохраняется после элиминации патогена в форме иммунологической памяти и позволяет адаптивной иммунной системе организовывать более быстрые и сильные атаки каждый раз при проникновении указанного патогена. Таким образом, иммунная система включает врожденную и адаптивную иммунную систему. Каждая из этих двух частей, как правило, включает так называемые гуморальный и клеточный компоненты.
Иммунный ответ: Иммунный ответ может, как правило, представлять собой либо специфическую реакцию адаптивной иммунной системы на конкретный антиген (так называемый специфический или адаптивный иммунный ответ), либо неспецифическую реакцию врожденной иммунной системы (так называемый неспецифический или врожденный иммунный ответ). Изобретение относится, прежде всего, к специфическим реакциям (адаптивные иммунные ответы) адаптивной иммунной системы. В частности, оно относится к адаптивным иммунным ответам на инфекции, вызываемые вирусами, например, типа вируса бешенства. Однако указанная специфическая реакция может поддерживаться дополнительной неспецифической реакцией (врожденный иммунный ответ). Таким образом, изобретение относится также к соединению, предназначенному для одновременной стимуляции врожденной и адаптивной иммунной системы для инициации эффективного адаптивного иммунного ответа.
J
Адаптивная иммунная система: Адаптивная иммунная система состоит из высокоспециализированных системных клеток и процессов, которые элиминируют или предупреждают рост патогенов. Адаптивная иммунная система придает иммунной системе позвоночных способность распознавать и запоминать специфические патогены (для создания иммунитета) и организовывать более сильную атаку в каждом случае при обнаружении патогена. Система обладает высокой способностью к адаптации вследствие соматической гипермутации (процесс ускоренных соматических мутаций) и V(D)-рекомбинации (необратимая генетическая рекомбинация сегментов гена рецептора антигена). Этот механизм позволяет небольшому количеству генов создавать огромное количество различных рецепторов антигенов, которые затем уникальным образом экспрессируются на каждом индивидуальном лимфоците. Поскольку перестройка гена приводит к необратимому изменению ДНК каждой клетки, то все потомство такой клетки должно затем наследовать гены, кодирующие ту же самую рецепторную специфичность, включая В-клетки памяти и Т-клетки памяти, которые имеют решающее значение для долговременного специфического иммунитета. Теория иммунной сети представляет собой теорию, описывающую работу адаптивной иммунной системы, которая базируется на взаимодействиях между вариабельными областями рецепторов Т-клеток, В-клеток и молекул, образованных Т-клетками и В-клетками, которые имеют вариабельные области.
+
Адаптивный иммунный ответ: Как правило, под адаптивным иммунным ответом понимают антигенспецифический ответ иммунной системы. Специфичность в отношении антигена позволяет вырабатывать ответы, приспособленные к специфическим антигенам, патогенам или инфицированным патогеном клеткам. Способность создавать такие приспособленные ответы, как правило, поддерживается в организме «клетками памяти». Если патоген инфицирует организм более одного раза, то указанные специфические клетки памяти используются для его быстрой элиминации. В этом контексте первая стадия адаптивного иммунного ответа представляет собой активацию наивных антигенспецифических Т-клеток или различных иммунных клеток, способных индуцировать антигенспецифический иммунный ответ, антигенпрезентирующими клетками. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные Т-клетки. К типам клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, относятся, среди прочего, дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из указанных клеток выполняет отдельную функцию при вызывании иммунных ответов. Дендритные клетки могут поглощать антигены посредством фагоцитоза и макропиноцитоза, и они могут стимулироваться при контакте, например, с чужим антигеном, к миграции в местную лимфоидную ткань, где может происходить их дифференцировка в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают находящиеся в форме частиц антигены, такие как бактерии, и могут индуцироваться инфекционными агентами или другими соответствующими стимулами и экспрессировать в результате этого молекулы ГКГС. Уникальная способность В-клеток к связыванию и интернализации растворимых белковых антигенов посредством своих рецепторов также может иметь важное значение для индукции Т-клеток. ГКГС-молекулы, как правило, ответственны за презентацию антигена Т-клеткам. При этом презентация антигена на молекулах ГКГС приводит к активации Т-клеток, что индуцирует их пролиферацию и дифференцировку в «вооруженные» эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является уничтожение инфицированных клеток цитотоксическими CD8-Т-клетками и активация макрофагов Th1-клетками, что в совокупности создает опосредованный клетками (клеточный) иммунитет, и активация В-клеток и Th2-, и Th1-клетками, приводящая к образованию различных классов антител, в результате чего создается гуморальный иммунный ответ. Т-клетки распознают антиген посредством своих Т-клеточных рецепторов, которые не распознают антиген и не связываются с ним непосредственно, но вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, происходящих из патогена белковых антигенов, которые связываются с молекулами ГКГС на поверхностях других клеток.
Клеточный иммунитет/клеточный иммунный ответ: Клеточный иммунитет относится, как правило, к активации макрофагов, естественных клеток-киллеров (NK), антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов и высвобождению различных цитокинов в ответ на антиген. В более общем смысле клеточный иммунитет основан не на антителах, а на активации клеток иммунной системы. Как правило, клеточный иммунный ответ может характеризоваться, например, активацией антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов, которые способны индуцировать апоптоз клеток организма, экспонирующих эпитопы антигенов на своей поверхности, таких как инфицированные вирусом клетки, клетки с внутриклеточными бактериями или раковые клетки, экспонирующие опухолевые антигены; активацией макрофагов и естественных клеток-киллеров, позволяющей им разрушать патогены; и стимуляцией клеток к секреции различных цитокинов, которые влияют на функцию других клеток, участвующих в адаптивных иммунных ответах и врожденных иммунных ответах.
Гуморальный иммунитет/гуморальный иммунный ответ: Гуморальный иммунитет, как правило, относится к производству антител и необязательно к второстепенным процессам, которые могут сопровождать его. Гуморальный иммунный ответ, как правило, может характеризоваться, например, активацией Th2 и производством цитокинов, образованием зародышевого центра и переключением изотипа, созреванием аффинности и образованием клеток памяти. Гуморальный иммунитет, как правило, может относиться также к эффекторным функциям антител, включая нейтрализацию патогенов и токсинов, классическую активацию комплемента и стимулирование опсонинами фагоцитоза и элиминации патогенов.
Врожденная иммунная система: Врожденная иммунная система, которую называют также неспецифической иммунной системой, как правило, включает клетки и механизмы, которые неспецифически защищают хозяина от заражения другими организмами. Это означает, что клетки врожденной системы могут распознавать патогены и реагировать на них обычным путем, но, в отличие от адаптивной иммунной системы, она не обеспечивает долговременный или защитный иммунитет хозяину. Врожденная иммунная система может, например, активироваться лигандами патоген-ассоциированных распознающих молекулярные паттерны (РАМР) рецепторов, например, Толл-подобных рецепторов (TLR), или другими вспомогательными субстанциями, такими как липополисахариды, TNF-альфа, лиганд CD40 или цитокины, монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-бета, TNF-альфа, факторы роста и hGH, лиганд человеческого Толл-подобного рецептора TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, лиганд мышиного Толл-подобного рецептора TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13, лиганд NOD-подобного рецептора, лиганд RIG-I - подобного рецептора, иммуностимулирующая нуклеиновая кислота, иммуностимулирующая РНК (isPHK), CpG-ДНК, антибактериальный агент или противовирусный агент. Как правило, ответ врожденной иммунной системы включает рекрутинг иммунных клеток к областям заражения посредством производства химических факторов, включая специализированные химические медиаторы, которые называют цитокинами; активацию каскада комплемента; идентификацию и удаление чужих субстанций, присутствующих в органах, тканях, крови и лимфе, специализированными лейкоцитами; активацию адаптивной иммунной системы посредством процесса, известного как презентация антигена; и/или функционирование в качестве физического и химического барьера для инфекционных агентов.
Адъювант/адъювантный компонент: Адъювант или адъювантный компонент в наиболее широком смысле, как правило, представляет собой (например, фармакологический или иммунологический) агент или композицию, который/которая может модифицировать, например, усиливать, действие других агентов, таких как лекарственное средство или вакцина. Как правило, понятие в контексте изобретения относится к соединению или композиции, которое/которая служит в качестве носителя или вспомогательной субстанции для иммуногенов и/или других фармацевтических действующих веществ. Это понятие следует рассматривать в широком смысле, и оно относится к широкому спектру субстанций, которые могут повышать иммуногенность антигенов, включенных или вводимых совместно с рассматриваемым адъювантом. В контексте настоящего изобретения адъювант предпочтительно должен повышать специфический иммунногенный ответ действующих веществ, предлагаемых в настоящем изобретении. Как правило, «адъювант» или «адъювантный компонент» имеют одинаковое значение и их можно применять одновременно. Адъюванты можно подразделять, например, на вещества, усиливающие иммунный ответ, системы для введения антигенов или даже их комбинации.
Как правило, считается, что понятие «адъювант» не относится к агентам, которые сами обусловливают иммунитет. Адъюванты помогают иммунной системе неспецифически усиливать антигенспецифический иммунный ответ, например, путем повышения презентации антигена иммунной системе или индукции неспецифического врожденного иммунного ответа. Кроме того, адъювант может предпочтительно, например, модулировать антигенспецифический иммунный ответ путем сдвига, например, доминирующего антигенспецифического ответа на основе Th2 в сторону более антигенспецифического ответа на основе Th1 или наоборот. Таким образом, адъювант может успешно модулировать экспрессию/секрецию цитокинов, презентацию антигена, тип иммунного ответа и т.д.
Иммуностимулирующая РНК: Иммуностимулирующая РНК (isPHK) в контексте изобретения, как правило, может представлять собой РНК, которая обладает способностью индуцировать врожденный иммунный ответ. Обычно она не имеет открытой рамки считывания и, таким образом, не кодирует пептид-антиген или иммуноген, но вызывает врожденный иммунный ответ, например, посредством связывания со специфическим типом Толл-подобного рецептора (TLR) или другими приемлемыми рецепторами. Однако, очевидно, что и мРНК, имеющие открытую рамку считывания и кодирующие пептид/белок (например, антигенную функцию), также могут индуцировать врожденный иммунный ответ.
+
Антиген: В контексте настоящего изобретения понятие «антиген» относится, как правило, к субстанции, которая может распознаваться иммунной системой и которая обладает способностью запускать антигенспецифический иммунный ответ, например, посредством образования антител и/или антигенспецифических Т-клеток, в качестве компонента адаптивного иммунного ответа. Антиген может представлять собой белок или пептид. В этом контексте первая стадия адаптивного иммунного ответа представляет собой активацию наивных антигенспецифических Т-клеток антигенпрезентирующими клетками. Это происходит в лимфоидных тканях и органах, через которые постоянно проходят наивные Т-клетки. Три типа клеток, которые могут служить в качестве антигенпрезентирующих клеток, представляют собой дендритные клетки, макрофаги и В-клетки. Каждая из указанных клеток выполняет отдельную функцию при вызывании иммунных ответов. Присутствующие в ткани дендритные клетки поглощают антигены посредством фагоцитоза и макропиноцитоза, и они могут стимулироваться инфекцией к миграции в местную лимфоидную ткань, где может происходить их дифференцировка в зрелые дендритные клетки. Макрофаги поглощают находящиеся в форме частиц антигены, такие как бактерии, и индуцируются инфекционными агентами к экспрессии молекул ГКГС класса II. Уникальная способность В-клеток к связыванию и интернализации растворимых белковых антигенов посредством своих рецепторов также может иметь важное значение для индукции Т-клеток. Презентация антигена на молекулах ГКГС приводит к активации Т-клеток, что индуцирует их пролиферацию и дифференцировку в «вооруженные» эффекторные Т-клетки. Наиболее важной функцией эффекторных Т-клеток является уничтожение инфицированных клеток цитотоксическими CD8-T-клетками и активация макрофагов ТН1-клетками, что в совокупности создает опосредованный клетками (клеточный) иммунитет, и активация В-клеток и ТН-2, и ТН1-клетками приводит к образованию различных классов антител, в результате чего создается гуморальный иммунный ответ. Т-клетки распознают антиген посредством своих Т-клеточных рецепторов, которые не распознают антиген и не связываются с ним непосредственно, но вместо этого распознают короткие пептидные фрагменты, например, происходящих из патогена белковых антигенов, которые связываются с молекулами ГКГС на поверхностях других клеток.
+
+
+
+
+
+
Т-клетки подразделяют на два основных класса, которые обладают различными эффекторными функциями. Два класса различаются по экспрессии расположенных на клеточной поверхности белков CD4 и CD8. Эти два типа Т-клеток отличаются по распознаваемому ими классу молекул ГКГС. Известно два класса молекул ГКГС, а именно, молекулы ГКГС класса I и ГКГС класса II, которые отличаются по их структуре и схеме экспрессии в тканях организма. CD4-Т-клетки связываются с молекулой ГКГС класса II, а CD8-Т-клетки с молекулой ГКГС класса I. Молекулы ГКГС класса I и ГКГС класса II имеют разное распределение среди клеток, что отражает различные эффекторные функции Т-клеток, которые их распознают. Молекулы ГКГС класса I презентуют пептиды цитозольного и ядерного происхождения, например, из патогенов, прежде всего вирусов, СВ8-Т-клеткам, которые дифференцируются в цитотоксичные Т-клетки, специализирующиеся в уничтожении любой клетки, которую они специфически распознают. Почти все клетки экспрессируют молекулы ГКГС класса I, хотя уровень конститутивной экспрессии варьируется от одного типа клеток к другому. Но молекулами ГКГС класса I презентуются не только патогенные пептиды из вирусов, ими презентуются также аутоантигены типа опухолевых антигенов. Молекулы ГКГС класса I связывают пептиды из белков, расщепляемых в цитозоле, и транспортируют в эндоплазматический ретикулум. CD8-Т-клетки, которые распознают комплексы: ГКГС класса I:пептид на поверхности инфицированных клеток, специализируются в уничтожении любых клеток, презентующих чужеродные пептиды, и тем самым избавляют организм от клеток, зараженных вирусами и другими цитозольными патогенами. Основной функцией CD4-Т-клеток (CD4-Т-клеток-хелперов), которые распознают молекулы ГКГС класса II, является активация других эффекторных клеток иммунной системы. При этом молекулы ГКГС класса II в норме присутствуют на В-лимфоцитах, дендритных клетках и макрофагах, т.е. клетках, которые принимают участие в иммунных ответах, но отсутствуют на других типах клеток тканей. Макрофаги, например, обладают активностью в отношении уничтожения интравезикулярных патогенов, которых они несут, а В-клетки секретируют иммуноглобулины против чужеродных молекул. Молекулы ГКГС класса II не могут связываться с пептидами в эндоплазматическом ретикулуме, и при этом молекулы ГКГС класса II связывают пептиды из белков, расщепляемых в эндосомах. Они могут захватывать пептиды из патогенов, которые проникли в везикулярную систему макрофагов, или из антигенов, интернализованных незрелыми дендритными клетками, или иммуноглобулиновыми рецепторами В-клеток. Патогены, которые накапливаются в больших количествах внутри пузырьков макрофагов и дендритных клеток, имеют тенденцию стимулировать дифференцировку ТН1-клеток, в то время как внеклеточные антигены имеют тенденцию стимулировать производство ТН2-клеток. ТН1-клетки активируют бактерицидные свойства макрофагов и индуцируют производство В-клетками антител типа IgG, которые являются очень эффективными в отношении опсонизации внеклеточных патогенов, что приводит к их поглощению фагоцитами, в то время как ТН2-клетки инициируют гуморальный ответ, активируя секрецию IgM наивными В-клетками, и индуцируют производство обладающих слабой опсонизирующей способностью антител, таких как IgG1 и IgG3 (мышиные) и IgG2 и IgG4 (человеческие), а также IgA и IgE (мышиные и человеческие).
Эпитоп (который называют также «антигенной детерминантой»): В контексте настоящего изобретения Т-клеточные эпитопы или части белков могут содержать фрагменты, предпочтительно имеющие длину от примерно 6 до примерно 20 аминокислот или даже более, например, фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса I, предпочтительно имеют длину от примерно 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, процессируемые и презентируемые молекулами ГКГС класса II, предпочтительно имеют длину примерно 13 аминокислот или более, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большее количество аминокислот, при этом указанные фрагменты можно выбирать из любой части аминокислотной последовательности. Указанные фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы ГКГС.
В-клеточные эпитопы, как правило, представляют собой фрагменты, локализованные на внешней поверхности (нативных) белковых или пептидных антигенов, указанных в настоящем описании, предпочтительно состоящих из 5-15 аминокислот, более предпочтительно состоящих из 5-12 аминокислот, еще более предпочтительно состоящих из 6-9 аминокислот, которые могут распознаваться антителами, т.е. в их нативной форме.
Такие эпитопы белков или пептидов можно, кроме того, выбирать из любых указанных вариантов таких белков или пептидов. В этом контексте антигенные детерминанты могут представлять собой конформационные или прерывистые эпитопы, состоящие из сегментов указанных в настоящем описании белков или пептидов, которые расположены с перерывами в аминокислотной последовательности белков или пептидов, указанных в настоящем описании, но которые находятся вблизи друг от друга в трехмерной структуре, или непрерывные или линейные эпитопы, состоящие из одной полипептидной цепи.
Вакцина: Под вакциной, как правило, понимают предназначенный для профилактики или терапии продукт, содержащий по меньшей мере один антиген или антигенную функцию. Антиген или антигенная функция может стимулировать адаптивную иммунную систему организма вырабатывать адаптивный иммунный ответ.
Образующая антиген мРНК: Образующая антиген мРНК в контексте изобретения может, как правило, представлять собой мРНК, имеющую по меньшей мере одну открытую рамку считывания, которая может транслироваться клеткой или организмом, образованной/образованным указанной мРНК. Продуктом указанной трансляции является пептид или белок, который может действовать в качестве антигена, предпочтительно иммуногена. Продукт может представлять собой также слитый белок, состоящий более чем из одного иммуногена, например, слитый белок, который состоит из двух или большего количества эпитопов, пептидов или белков, происходящих из одинаковых или различных вирусных белков, при этом эпитопы, пептиды или белки могут быть связаны линкерными последовательностями.
Би-/полицистронная мРНК: мРНК, как правило, может иметь две (бицистронная) или большее количество (полицистронная) открытых рамок считывания (ОРС). В этом контексте открытая рамка считывания представляет собой последовательность, состоящую из нескольких нуклеотидных триплетов (кодонов), которые могут транслироваться в пептид или белок. Трансляция указанной мРНК приводит к образованию двух (бицистронная мРНК) или большего количества (полицистронная мРНК) различных продуктов трансляции (при условии, что ОРС не являются идентичными). Для экспрессии в эукариотических организмах указанные мРНК могут, например, содержать последовательность участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES).
Структура 5'-кэпа: 5'-кэп, как правило, представляет собой модифицированный нуклеотид, прежде всего гуаниновый нуклеотид, добавленный к 5'-концу молекулы мРНК. Предпочтительно 5'-кэп добавляют, используя 5'-5'-трифосфатную связь (его обозначают также как m7GpppN).
Другими примерами структур 5'-кэпа являются глицерил, инвертированная дезоксигруппа (фрагмент), лишенная азотистого основания, 4',5'-метиленовой нуклеотид, 1-(бета-D-эритрофуранозильный) нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситольный нуклеотид, L-нуклеотиды, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, треопентофуранозильный нуклеотид, ациклический 3',4'-секонуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутильный нуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентильный нуклеотид, 3'-3'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-3'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 3'-2'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-2'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 1,4-бутандиолфосфатный, 3'-фосфороамидатный, гексилфосфатный, аминогексилфосфатный, 3'-фосфатный, 3'-фосфоротиоатный, фосфородитиоатный или связанный мостиком или несвязанный мостиком метилфосфонатный фрагмент. Указанные модифицированные структуры 5'-кэпа в контексте настоящего изобретения можно применять для модификации последовательности мРНК, предлагаемой в настоящем изобретении. Другие модифицированные структуры 5' кэпа, которые можно применять в контексте настоящего изобретения, представляют собой САР1 (метилирование рибозы соседнего с m7GpppN нуклеотида), САР2 (метилирование рибозы 2-ого нуклеотида, расположенного по ходу транскрипции относительно m7GpppN), САР3 (метилирование рибозы 3-его нуклеотида, расположенного по ходу транскрипции относительное m7GpppN), САР4 (метилирование рибозы 4-ого нуклеотида, расположенного по ходу транскрипции относительно m7GpppN), ARCA (аналог кэп-структуры с правильной ориентацией, модифицированный ARCA (например, модифицированный фосфотиоатом ARCA), инозин, N1-метилгуанозин, 2'-фторгуанозин, 7-деазагуанозин, 8-оксогуанозин, 2-аминогуанозин, ЗНК-гуанозин и 2-азидогуанозин.
Фрагменты белков: «Фрагменты» белков или пептидов в контексте настоящего изобретения могут, как правило, содержать последовательность белка или пептида, указанного в настоящем описании, которая касательно ее аминокислотной последовательности (или кодирующей ее молекулы нуклеиновой кислоты) укорочена на N-конце и/или С-конце по сравнению с аминокислотной последовательностью исходного (нативного) белка (или кодирующей ее молекулой нуклеиновой кислоты). Таким образом, указанное укорочение может иметь место либо на аминокислотном уровне или соответственно на уровне нуклеиновой кислоты. Таким образом, понятие «идентичность последовательности» касательно такого указанного в настоящем описании фрагмента может предпочтительно относиться к полному белку или пептиду, указанному в настоящем описании, или к полной (кодирующей) молекуле нуклеиновой кислоты указанного белка или пептида.
Кроме того, фрагменты белков или пептидов в контексте настоящего изобретения могут содержать последовательность белка или пептида, указанного в настоящем описании, которая состоит, например, по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере из 6 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере из 7 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере из 8 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 9 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 10 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 11 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 12 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 13 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере из 14 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 15 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 16 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 17 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 18 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 19 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 20 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 25 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 30 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 35 аминокислот, еще более
предпочтительно по меньшей мере из 50 или наиболее предпочтительно по меньшей мере из 100 аминокислот. Например, указанный фрагмент может состоять из от примерно 6 до примерно 20 или даже более аминокислот, например, фрагменты, которые процессируются и презентуются молекулами ГКГС класса I, предпочтительно имеют от примерно 8 до примерно 10 аминокислот, например, 8, 9 или 10, (или даже 6,7, 11 или 12 аминокислот), или фрагменты, которые процессируются и презентуются молекулами ГКГС класса II, предпочтительно имеют примерно 13 аминокислот или более, например, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже большее количество аминокислот, при этом указанные фрагменты можно выбирать из любой части аминокислотной последовательности. Указанные фрагменты, как правило, распознаются Т-клетками в форме комплекса, состоящего из пептидного фрагмента и молекулы ГКГС, т.е. фрагменты, как правило, не распознаются в их нативной форме. Фрагменты белков или пептидов могут содержать по меньшей мере один эпитоп указанных белков или пептидов. Кроме того, под фрагментами белка можно понимать также домены белка, типа внеклеточного домена, внутриклеточного домена или трансмембранного домена, и укороченные или усеченные версии белка.
Варианты белков: Как следует из контекста настоящего изобретения, можно создавать «варианты» белков или пептидов, имеющие аминокислотную последовательность, которая отличается от исходной последовательности наличием одной или большего количества мутации(й), например, замен, инсерций и/или делеций одной или большего количества аминокислот. Предпочтительно указанные фрагменты и/или варианты обладают той же самой биологической функцией или специфической активностью, что и полноразмерный нативный белок, например, присущей ему специфической антигенной характеристикой. Как следует из контекста настоящего изобретения, «варианты» белков или пептидов, могут содержать консервативную(ые) аминокислотную(ые) замену(ы) по сравнению с их нативной, т.е. не подвергнутой мутации физиологической последовательностью. Такие аминокислотные последовательности, а также, в частности, кодирующие их нуклеотидные последовательности, подпадают под указанное в настоящем описании понятие «варианты». Замены, при которых заменяют друг на друга аминокислоты, относящиеся к одному и тому же классу, называют консервативными заменами. В частности, такими классами являются аминокислоты, имеющие алифатические боковые цепи, положительно или отрицательно заряженные боковые цепи, ароматические группы в боковых цепях, или аминокислоты, боковые цепи которых могут входить в водородные мостики, например, боковые цепи которых несут гидроксильную функцию. Это означает, например, что аминокислоту, имеющую полярную боковую цепь, заменяют на другую аминокислоту, также имеющую полярную боковую цепь, или, например, аминокислоту, характеризующуюся гидрофобной боковой цепью, заменяют на другую аминокислоту, также имеющую гидрофобную боковую цепь (например, серии (треонин) на треонин (серии) или лейцин (изолейцин) на изолейцин (лейцин)). Можно осуществлять инсерции и замены, прежде всего, в тех положениях в последовательности, которые не приводят к модификации трехмерной структуры или не влияют на связывающую область. Модификации в трехмерной структуре, обусловленные инсерцией(ями) или делецией(ями) можно легко определять, например, с использованием CD-спектров (спектры кругового дихроизма) (Urry, Absorption, Circular Dichroism и ORD of Polypeptides, в: Modern Physical Methods in Biochemistry, под ред. Neuberger и др., изд-во Elsevier, Amsterdam, 1985).
«Вариант» белка или пептида может иметь по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичных аминокислот на сегменте, состоящем из 10, 20, 30, 50, 75 или 100 аминокислот такого белка или пептида.
Кроме того, варианты белков или пептидов, как указано в настоящем описании, которые могут кодироваться молекулой нуклеиновой кислоты, могут содержать также такие последовательности, в которых нуклеотиды кодирующей нуклеотидной последовательности обменены в соответствии с вырожденностью генетического кода, что не приводит к изменению соответствующей аминокислотной последовательности белка или пептида, т.е. аминокислотная последовательность или по меньшей мере ее часть могут не отличаться от исходной последовательности одной мутацией или большим количеством мутаций в указанном выше смысле.
Идентичность последовательностей: Для определения процента идентичности двух последовательностей, например, нуклеотидных последовательностей или аминокислотных последовательностей, указанных в настоящем описании, предпочтительно аминокислотных последовательностей, кодируемых молекулой нуклеиновой кислоты, которая входит в полимерный носитель как указано в настоящем описании, или самих аминокислотных последовательностей, последовательности можно выравнивать для последующего сравнения друг с другом. Так, например, положение в первой последовательности можно сравнивать с соответствующим положением во второй последовательности. Если положение в первой последовательности занято тем же компонентом (остатком), который находится в этом положении во второй последовательности, то две последовательности являются идентичными в этом положении. Если это не имеет места, то последовательности различаются в этом положении. Если во второй последовательности присутствуют инсерции по сравнению с первой последовательностью, то можно встраивать бреши в первую последовательность, что позволяет продолжать осуществление сравнительного анализа. Если во второй последовательности имеются делеции по сравнению с первой последовательностью, то можно встраивать бреши во вторую последовательность, что позволяет продолжать осуществление сравнительного анализа. Таким образом, процент идентичности двух последовательностей является функцией количества идентичных положений, деленной на общее количество положений, включая те положения, которые заняты только в одной последовательности. Процент идентичности двух последовательностей можно определять с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять, является (но, не ограничиваясь только им) алгоритм, предложенный Karlin и др., PNAS USA, 90, 1993, сс. 5873-5877 или Altschul и др., Nucleic Acids Res., 25, 1997, сс. 3389-3402. Указанный алгоритм входит в программу BLAST. С помощью этой программы можно идентифицировать последовательности, обладающие конкретной степенью идентичности с последовательностями, предлагаемыми в настоящем изобретении.
Производное белка или пептида: Под производным пептида или белка, как правило, понимают молекулу, которую получают из другой молекулы, такой как указанный пептид или белок. Под понятие «производное» пептида или белка подпадают также слияния, содержащие пептид или белок, применяемые согласно настоящему изобретению. Например, слияние содержит метку, такую, например, как эпитоп, например, эпитоп FLAG или эпитоп V5. Например, эпитоп представляет собой эпитоп FLAG. Такую метку используют, например, для очистки слитого белка.
Моноцистронная мРНК: Моноцистронная мРНК, как правило, может представлять собой мРНК, предпочтительно мРНК, которая содержит только одну открытую рамку считывания. В этом контексте открытая рамка считывания представляет собой последовательность, состоящую из нескольких нуклеотидных триплетов (кодонов), которые могут транслироваться в пептид или белок.
Нуклеиновая кислота: Понятие «нуклеиновая кислота» обозначает либо ДНК-, либо РНК-молекулу и является синонимом понятия «полинуклеотид». В контексте настоящего описания, если понятие относится к нуклеиновой кислоте или нуклеотидной последовательности, кодирующей конкретный белок и/или пептид, то указанная нуклеиновая кислота или нуклеотидная последовательность соответственно предпочтительно содержит также регуляторные последовательности, обеспечивающие в соответствующем хозяине, например, человеке, ее экспрессию, т.е. транскрипцию и/или трансляцию нуклеотидной последовательности, кодирующей конкретный белок или пептид.
Пептид: Пептид представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных мономеров. Как правило, мономеры сцеплены пептидными связями. Понятие «пептид» не ограничено длиной полимерной цепи аминокислот. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пептид может, например, содержать менее 50 мономерных звеньев. Более длинные пептиды, которые называют также полипептидами, как правило, имеют от 50 до 600 мономерных звеньев, более конкретно от 50 до 300 мономерных звеньев.
Фармацевтически эффективное количество: Под фармацевтически эффективном количеством в контексте изобретения, как правило, понимают количество, достаточное для того, чтобы индуцировать иммунный ответ.
Белок: Белок, как правило, состоит из одного или нескольких пептидов и/или полипептидов, уложенных в 3-мерную структуру, облегчающую биологическую функцию.
Поли(С)-последовательность: Поли (С)-последовательность, как правило, представляет собой длинную последовательность, состоящую из цитозиновых нуклеотидов, как правило, содержащую от примерно 10 до примерно 200 цитозиновых нуклеотидов, предпочтительно от примерно 10 до примерно 100 цитозиновых нуклеотидов, более предпочтительно от примерно 10 до примерно 70 цитозиновых нуклеотидов или еще более предпочтительно от примерно 20 до примерно 50 или даже от примерно 20 до примерно 30 цитозиновых нуклеотидов. Поли(С)-последовательность предпочтительно может располагаться в 3'-направлении относительно кодирующей области, содержащейся в нуклеиновой кислоте.
Поли(А)-хвост: Поли(А)-хвост, который называют также «3'-поли(А)-хвостом», как правило, представляет собой длинную последовательность аденозиновых нуклеотидов, содержащую вплоть до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, например, от примерно 25 до примерно 400, предпочтительно от примерно 50 до примерно 400, более предпочтительно от примерно 50 до примерно 300, еще более предпочтительно от примерно 50 до примерно 250, наиболее предпочтительно от примерно 60 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов, добавленную к 3'-концу РНК.
Стабилизированная нуклеиновая кислота: Стабилизированная нуклеиновая кислота, как правило, содержит модификацию, повышающую устойчивость к расщеплению in vivo (например, расщеплению экзо- или эндонуклеазой) и/или расщеплению ex vivo (например, в процессе производства до введения вакцины, например, в процессе приготовления раствора вакцины, предназначенного для введения). Стабилизацию РНК можно обеспечивать, например, с использованием 5'кэп-структуры, поли(А)-хвоста или любой другой модификации UTR. Ее можно обеспечивать также путем модификации каркаса или модификации содержания G/C в нуклеиновой кислоте. В контексте настоящего изобретения можно рассматривать и различные другие методы, известные в данной области.
Носитель/полимерный носитель: В контексте изобретения носитель, как правило, может представлять собой соединение, которое облегчает транспорт и/или включение в комплекс другого соединения. Указанный носитель может образовывать комплекс с указанным другим соединением. Полимерный носитель, как правило, представляет собой носитель, образующий полимер.
Катионный компонент: Понятие «катионный компонент», как правило, относится к заряженной молекуле, которая является положительно заряженной (катион) при значении рН, составляющем, как правило, от 1 до 9, предпочтительно при значении рН, равном или ниже 9 (например, от 5 до 9), равном или ниже 8 (например, от 5 до 8), равном или ниже 7 (например, от 5 до 7), наиболее предпочтительно при физиологических значениях рН, например, от 7,3 до 7.4. Таким образом, катионный пептид, белок или полимер, который является положительно заряженным в физиологических солевых условиях в клетке, прежде всего в физиологических солевых условиях в клетке in vivo. Катионный пептид или белок предпочтительно содержит большее количество катионных аминокислот, например, большее количество Arg, His, Lys или Orn, чем других аминокислотных остатков (в частности больше катионных аминокислот, чем анионных аминокислотных остатков типа Asp или Glu), или содержит блоки, образованные главным образом катионными аминокислотными остатками. Понятие «катионный» может обозначать также «поликатионные» компоненты.
Наполнитель: Агент, например, носитель, который можно, как правило, применять в фармацевтической композиции или вакцине для облегчения введения индивидууму компонентов фармацевтической композиции или вакцины.
3'-нетранслируемая область (3'UTR): 3'UTR, как правило, является частью мРНК, локализованной между кодирующей белок областью (т.е. открытой рамкой считывания) и поли(А)-последовательностью мРНК. 3'UTR мРНК не транслируется в аминокислотную последовательность. Последовательность 3'UTR, как правило, кодируется геном, который транскрибируется в соответствующую мРНК в процессе экспрессии гена. Геномная последовательность сначала транскрибируется в незрелую мРНК, которая содержит необязательные интроны. Незрелая мРНК затем дополнительно процессируется с образованием зрелой мРНК в процессе созревания. Указанный процесс созревания включает стадии 5'-кэпирования, сплайсинга незрелой мРНК с вырезанием необязательных интронов и модификаций 3'-конца, таких как подиаденилирование 3'-конца незрелой мРНК, и необязательные расщепления эндо-/или экзонуклеазами и т.д. В контексте настоящего изобретения 3'UTR соответствует последовательности зрелой мРНК, которая локализована с 3'-стороны стоп-кодона кодирующей белок области, предпочтительно непосредственно примыкает с 3'-стороны к стоп-кодону кодирующей белок области, и которая простирается до 5'-стороны поли(А)-последовательности, предпочтительно до нуклеотида, непосредственно примыкающего к 5'-концу поли(А)-последовательности. Понятие «соответствует» означает, что последовательность 3''UTR может представлять собой последовательность РНК, такую как последовательность мРНК, указанную при определении последовательности 3'UTR, или последовательность ДНК, которая соответствует указанной последовательности РНК. В контексте настоящего изобретения понятие «3'UTR гена», например, «3'UTR гена альбумина», означает последовательность, которая соответствует 3'UTR зрелой мРНК, полученной из указанного гена, т.е. мРНК, полученной путем транскрипции гена и созревания незрелой мРНК. Понятие «3'UTR гена» включает последовательность ДНК и последовательность РНК 3'UTR.
5'-нетранслируемая область (5'UTR): Под 5'UTR, как правило, понимают конкретный сегмент матричной РНК (мРНК). Она локализована на 5'-конце открытой рамки считывания мРНК. Как правило, 5'UTR начинается с сайта инициации транскрипции и закачивается одним нуклеотидом, расположенным непосредственно перед стартовым кодоном открытой рамки считывания. 5'UTR может содержать элементы, предназначенные для контроля генной экспрессии, так называемые регуляторные элементы. Указанные регуляторные элементы могут представлять собой, например, сайты связывания рибосом или 5'-концевой олигопиримидиновый тракт. 5'UTR может подвергаться посттранскрипционным модификациям, например, путем добавления 5'-кэпа. В контексте настоящего изобретения 5'UTR соответствует последовательности зрелой мРНК, локализованной между 5'-кэпом и стартовым кодоном. Предпочтительно 5'UTR соответствует последовательности, которая простирается от нуклеотида, расположенного с 3'-стороны 5'-кэпа, предпочтительно от расположенного с 3'-стороны нуклеотида, непосредственно примыкающего к 5'-кэпу, до нуклеотида, расположенного с 5'-стороны стартового кодона кодирующей белок области, предпочтительно до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону кодирующей белок области. Нуклеотид, непосредственно примыкающий с 3'-стороны к 5'-кэпу зрелой мРНК, как правило, соответствует сайту инициации транскрипции. Понятие «соответствует» означает, что последовательность 5'UTR может представлять собой последовательность РНК, такую как последовательность мРНК, указанная при определении последовательности 5'UTR, или последовательность ДНК, которая соответствует указанной последовательности РНК. В контексте настоящего изобретения понятие «5'UTR гена», например, «5'UTR ТОР-гена», обозначает последовательность, которая соответствует 5'UTR зрелой мРНК, полученной из этого гена, т.е. мРНК, полученной путем транскрипции гена и созревания незрелой мРНК. Понятие «5'UTR гена» включает последовательность ДНК и последовательность РНК 5'UTR.
5'-концевой олигопиримидиновый тракт (ТОР): 5'-концевой олигопримидиновый транкт (ТОР), как правило, обозначает сегмент пиримидиновых нуклеотидов, локализованный в 5'-концевой области молекулы нуклеиновой кислоты, например, в 5'-концевой области некоторых молекул мРНК или в 5'-концевой области функционального элемента, например, транскрибируемой области некоторых генов. Последовательность начинается с цитидина, который, как правило, соответствует сайту инициации транскрипции, и за которым следует сегмент, как правило, состоящий примерно из 3-30 пиримидиновых нуклеотидов. Например, ТОР может содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или даже большее количество нуклеотидов. Пиримидиновый сегмент и, следовательно, 5'-ТОР, заканчивается одним нуклеотидом, расположенным в 5'-направлении относительно первого пуринового нуклеотида, локализованного в прямом направлении относительно ТОР. Матричную РНК, которая содержит 5'-концевой олигопримидиновый тракт, часто обозначают как ТОР-мРНК. Таким образом, гены, из которых получают указанные матричные РНК, обозначают как ТОР-гены. Последовательности ТОР, например, обнаружены в генах и мРНК, кодирующих пептидные факторы элонгации и рибосомные белки.
ТОР-мотив: В контексте настоящего изобретения ТОР-мотив обозначает нуклеотидную последовательность, которая соответствует 5'-ТОР, описанному выше. Таким образом, ТОР-мотив в контексте настоящего изобретения предпочтительно обозначает состоящий из пиримидиновых нуклеотидов сегмент длиной 3-30 нуклеотидов. Предпочтительно ТОР-мотив состоит по меньшей мере из 3 пиримидиновых нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 4 пиримидиновых нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 5 пиримидиновых нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 6 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 7 нуклеотидов, наиболее предпочтительно по меньшей мере 8 пиримидиновых нуклеотидов, при этом сегмент пиримидиновых нуклеотидов предпочтительно начинается на его 5'-конце с цитозинового нуклеотида. В ТОР-генах и ТОР-мРНК ТОР-мотив предпочтительно начинается на его 5'-конце с сайта инициации транскрипции и заканчивается на расстоянии одного нуклеотида в 5'-направлении относительно первого пуринового остатка в указанном гене или мРНК. В контексте настоящего изобретения ТОР-мотив предпочтительно локализован на 5'-конце последовательности, которая представляет собой 5'UTR, или на 5'-конце последовательности, которая кодирует 5'UTR. Таким образом, в контексте настоящего изобретения сегмент из 3 или большего количества пиримидиновых нуклеотидов предпочтительно называют «ТОР-мотивом», если сегмент локализован на 5'-конце соответствующей последовательности, такой как мРНК, предлагаемая в изобретении, 5'UTR-элемент мРНК, предлагаемой в изобретении, или нуклеотидная последовательность, которая происходит из 5'UTR ТОР-гена, указанного в настоящем описании. Другими словами, сегмент, состоящий из 3 или большего количества пиримидиновых нуклеотидов, который не локализован на 5'-конце 5'UTR или 5'UTR-элемента, но локализован где-либо внутри 5'UTR или S'UTR-элемента, предпочтительно не обозначают как «ТОР-мотив».
ТОР-ген: ТОР-гены, как правило, характеризуются присутствием 5'-концевого олигопримидинового тракта. Кроме того, большинство ТОР-генов характеризуются связанной с ростом регуляцией трансляции. Однако известны также ТОР-гены с тканеспецифической регуляцией трансляции. Как указано выше, 5'UTR ТОР-гена соответствует последовательности 5'UTR зрелой мРНК, происходящей из ТОР-гена, которая предпочтительно простирается от нуклеотида, примыкающего с 3'-стороны к 5'-кэпу, до нуклеотида, примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону. 5'UTR ТОР-гена, как правило, не содержит никаких стартовых кодонов, предпочтительно не содержит расположенных в обратном направлении AUG (uAUG) или расположенных в обратном направлении открытых рамок считывания (uOPC). В данном контексте под расположенными в обратном направлении AUG и расположенными в обратном направлении открытыми рамками считывания, как правило, понимают AUG и открытые рамки считывания, которые находятся в 5'-направлении относительно стартового кодона (AUG) открытой рамки считывания, которая должна транслироваться. 5'UTR ТОР-генов, как правило, являются относительно короткими. Длины 5'UTR ТОР-генов могут варьироваться от 20 нуклеотидов вплоть до 500 нуклеотидов и, как правило, они содержат менее чем примерно 200 нуклеотидов, предпочтительно менее чем примерно 150 нуклеотидов, более предпочтительно менее чем примерно 100 нуклеотидов. Примерами 5'UTR ТОР-генов в контексте настоящего изобретения являются нуклеотидные последовательности, простирающиеся от нуклеотида в положении 5 до нуклеотида, непосредственно примыкающего к 5'-концу стартового кодона (например, ATG), указанные последовательности представлены в SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 14221-1363 заявки на патент PCT/EP 2012/002448 WO 2013/143700 или представляют собой их гомологи или варианты, описание указанных документов включено в настоящее описание в качестве ссылки. В этом контексте наиболее предпочтительным фрагментом 5'UTR ТОР-гена является 5'UTR ТОР-гена без 5'ТОР-мотива. Понятие «5'UTR ТОР-гена» предпочтительно относится к 5'UTR встречающегося в естественных условиях ТОР-гена.
Фрагмент нуклеотидной последовательности, прежде всего мРНК:
Фрагмент нуклеотидной последовательности состоит из непрерывного сегмента нуклеотидов, который соответствует непрерывному сегменту нуклеотидов в полноразмерной нуклеотидной последовательности, которая является основой для нуклеотидной последовательности фрагмента, который соответствует по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% полноразмерной нуклеотидной последовательности. В контексте настоящего изобретения указанный фрагмент предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент полноразмерной нуклеотидной последовательности.
Вариант нуклеотидной последовательности, прежде всего мРНК: Вариант нуклеотидной последовательности относится к варианту нуклеотидной последовательности, которая образует основу нуклеотидной последовательности. Например, вариант нуклеотидной последовательности может характеризоваться одной или несколькими нуклеотидными делециями, инсерциями, добавлениями и/или заменами по сравнению с нуклеотидной последовательностью, из которой вариант происходит. Предпочтительно вариант нуклеотидной последовательности идентичен по меньшей мере на 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% нуклеотидной последовательности, из которой вариант происходит. Предпочтительно вариант представляет собой функциональный вариант.«Вариант» нуклеотидной последовательности может иметь по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичных нуклеотидов в сегменте, состоящем из 10, 20, 30, 50, 75 или 100 нуклеотидов указанной нуклеотидной последовательности.
Гомолог нуклеотидной последовательности: Понятие «гомолог» нуклеотидной последовательности относится к последовательностям других видов относительно конкретной последовательности. Наиболее предпочтительно нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность человеческого происхождения и поэтому предпочтительно, чтобы гомолог представлял собой гомолог человеческой нуклеотидной последовательности.
Струйная инъекция: Понятие «струйная инъекция» в контексте настоящего описания относится к методу безыгольной инъекции, при котором жидкость, содержащая по меньшей мере одну предлагаемую в изобретения последовательность мРНК и необязательно дополнительные приемлемые эксципиенты, принудительно пропускают через отверстие, создавая тем самым ультратонкую жидкую струю под высоким давлением, которая обладает способностью проникать через кожу млекопитающего и, в зависимости от условий инъекции, в подкожную ткань или мышечную ткань. В принципе жидкая струя образует отверстие в коже, через которую жидкая струя проходит в ткань-мишень. Предпочтительно струйную инъекцию применяют для внутрикожной, подкожной или внутримышечной инъекции последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении. В предпочтительном варианте осуществления изобретения струйную инъекцию применяют для внутримышечной инъекции мРНК, предлагаемой в изобретении. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения струйную инъекцию применяют для внутрикожной инъекции последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении.
+
В основу настоящего изобретения положены неожиданно установленные данные о том, что последовательность мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства, индуцирует антигенспецифические иммунные ответы, которые нейтрализуют частицы вируса бешенства и, следовательно, предупреждает заражения вирусом бешенства. Совершенно неожиданно при создании изобретения было установлено, что предлагаемая в изобретении последовательность мРНК индуцирует по меньшей мере такие же иммунные ответы, что и лицензированная вакцина против бешенства, которая состоит из цельного инактивированного вируса бешенства. Еще более неожиданного при создании изобретения было установлено, что предлагаемая в изобретении мРНК-вакцина, кодирующая антигенный белок вируса бешенства, индуцирует больше антигенспецифических CD4-Т-клеток, чем лицензированная вакцина против бешенства.
Кроме того, при создании изобретения неожиданно было установлено, что вакцина на основе мРНК вируса бешенства, предлагаемая в изобретении, обладала биологической активность после хранения при 40°С в течение 6 месяцев и даже после хранения при 60°С в течение 1 месяца. Таким образом, вакцина на основе мРНК вируса бешенства, предлагаемая в изобретении, должна обладать привлекательностью для постконтактной профилактики в развивающихся странах, поскольку ее можно хранить при температуре окружающей среды, в отличие от лицензированных вакцин, которые требуется хранить при температуре от +2 до +8°С.
В целом, предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, содержащую кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства, можно включать в недорогие, легко доступные, термостабильные вакцины против бешенства, прежде всего для предконтактной и постконтактной профилактики бешенства в развитых и развивающихся странах мира.
Кроме того, последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, позволяет осуществлять быстрое и рациональное создание вакцин с использованием гибкого, быстрого и масштабируемого производства, вероятно, превышающего характеристики современных технологий производства вакцин на основе вируса.
В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы предлагаемая в изобретении последовательность мРНК содержала кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина (RAV-N), фосфопротеина (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы (RAV-L) вируса бешенства, или его фрагмент, вариант или производное.
Согласно первому объекту настоящего изобретения кодирующая область предлагаемой в изобретении мРНК может присутствовать в виде моно-, би- или даже полицистронной мРНК, т.е. мРНК, которая несет кодирующую(ие) последовательность(и) одного, двух или большего количества белков или пептидов. Указанные кодирующие последовательности би- или даже полицистронных мРНК могут разделяться по меньшей мере одной последовательностью участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES), например, указанной в настоящем описании, или сигнальными пептидами, которые индуцируют расщепление образовавшегося полипептида, который содержит несколько белков или пептидов.
Согласно первому объекту настоящего изобретения кодирующая область предлагаемой в изобретении мРНК содержит кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина (RAV-N), фосфопротеина (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы (RAV-L) вируса бешенства, или его фрагмент, вариант или производное.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления первого объекта изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК содержит кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из гликопротеина G (RAV-G) вируса бешенства, или его фрагмент, вариант или производное.
В этом контексте аминокислотную последовательность по меньшей мере одного антигенного пептида или белка можно выбирать из любого пептида или белка, происходящего из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина (RAV-N), фосфопротеина (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы (RAV-L) любого изолята вируса бешенства, или его фрагмента, варианта или производного, или из любого созданного с помощью синтеза пептида или белка вируса бешенства.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения полноразмерный белок гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина (RAV-N), фосфопротеина (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы (RAV-L) кодируется кодирующей областью, содержащейся в предлагаемой в изобретении мРНК.
В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения фрагмент, содержащий по меньшей мере один эпитоп гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина (RAV-N), фосфопротеина (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы (RAV-L), кодируется кодирующей областью, содержащейся в предлагаемой в изобретении мРНК.
Наиболее предпочтительными являются аминокислотные последовательности вакцинного штамма вируса бешенства, предпочтительно пастеровского вакцинного штамма, который имеет регистрационный номер NCBI №М13215:
Гликопротеин G (RAV-G) пастеровского вакцинного штамма:
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1:
Нуклеопротеин N (RAV-N) пастеровского вакцинного штамма:
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 2:
Фосфопротеин Р (другое название Ml) (RAV-P) пастеровского вакцинного штамма:
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 3:
Матриксный белок М (другое название М2) (RAV-M) пастеровского вакцинного штамма:
Аминокислотная последовательность SEP ID NO: 4:
РНК-полимераза L (RAV-L) пастеровского вакцинного штамма:
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 5:
Кроме того, наиболее предпочтительными являются аминокислотные последовательности вакцинного штамма Flury-LEP (применяемого для Rabipur), который имеет регистрационный номер NCBI №GU565703:
Гликопротеин G (RAV-G) вакцинного штамма Flury-LEP:
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 6:
Нуклеопротеин N (Rav N) вакцинного штамма Flury-LEP:
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 7:
Фосфопротеин Р (Rav Р) вакцинного штамма Flury-LEP:
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 8:
Матриксный белок М (Rav М) вакцинного штамма Flury-LEP: Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 9:
РНК-полимераза L (Rav L) вакцинного штамма Flury-LEP:
Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 10:
В контексте изобретения помимо указанных аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-10 согласно изобретению можно применять также различные изоляты вируса бешенства, и они подпадают под объем изобретения. Эти различные изоляты вируса бешенства обладают предпочтительно по меньшей мере 70%-ной, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ной и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1-10.
Примерами указанных различных изолятов вируса бешенства являются:
Штаммы вируса бешенства, имеющие регистрационные номера NCBI JQ730682, AF499686, АВ569299, АВ839170, АВ781935, FJ959397, АВ362483, EF206720, EF206718, EF206717, EF206715, EF206714, EF206713, EF206712, EF206711, EF206710, EF206709, EF206708, EF206707, EU182346, НМ535790, GQ918139, EU877071, EU877070, EU877069, EU182347, М31046, EU877068, EU877067, EF542830, АВ839169, JQ647510, KС169986, JX088694, JQ730682, JN609295, JN234411, HQ317918, EF206719, EF564174, EU643590, JQ946087, FJ913470 HQ891318, АВ645847, АВ569299, AY705373, GU565704, GU565703, FJ577895, JX276550, FJ866836, FJ866835, DQ875051, DQ875050, АВ128149, АВ009663, АВ044824, JQ944709, EU345004, EU345003, EU345002, АВ608731, EF564173, JQ423952, АВ618037, АВ618036, АВ618035, АВ618034, АВ618033, АВ618032, АВ085828, М13215, М21634, АВ247437, АВ247436, АВ247435, АВ247434, АВ247433, АВ247432, D42112, АВ247430 и АВ247431.
Кроме того, в этом контексте кодирующую последовательность, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина (RAV-N), фосфопротеина (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы (RAV-L) вируса бешенства, любого его фрагмента, варианта или производного, можно выбирать из любой нуклеотидной последовательности, которая содержит кодирующую область, происходящую из любого изолята вируса бешенства или его фрагмента, или варианта.
Наиболее предпочтительными являются последовательности мРНК дикого типа кодирующих областей вакцинного штамма вируса бешенства, предпочтительно пастеровского вакцинного штамма, имеющего регистрационный номер NCBI №M13215.
Гликопротеин G (Rav G) пастеровского вакцинного штамма:
Последовательность мРНК дикого типа кодирующей области, имеющей SEQ IDNO: 11:
Нуклеопротеин N (RAV-N) пастеровского вакцинного штамма:
Последовательность мРНК дикого типа кодирующей области, имеющей SEQ ID NO: 12:
Фосфопротеин Р (другое название M1) (RAV-P) пастеровского вакцинного штамма:
Последовательность мРНК дикого типа кодирующей области, имеющей SEQ ID NO: 13:
Матриксный белок М (другое название М2) (RAV-M) пастеровского вакцинного штамма:
Последовательность мРНК дикого типа кодирующей области, имеющей SEQ ID NO:14:
РНК-полимераза L (RAV-L) пастеровского вакцинного штамма:
Последовательность мРНК дикого типа кодирующей области, имеющей SEP ID NO:15:
В контексте изобретения помимо представленных в настоящем описании нуклеотидных последовательностей, изобретение относится также к нуклеотидным последовательностям различных изолятов вируса бешенства. Эти различные изоляты вируса бешенства предпочтительно идентичны по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, более предпочтительно по меньшей мере на 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% нуклеотидным последовательностям SEQ ID NO: 11-15 или их фрагментам.
Примерами указанных различных изолятов вируса бешенства являются:
Штаммы вируса бешенства, имеющие регистрационные номера NCBI JQ730682, AF499686, АВ569299, АВ839170, АВ781935, FJ959397, АВ362483, EF206720, EF206718, EF206717, EF206715, EF206714, EF206713, EF206712, EF206711, EF206710, EF206709, EF206708, EF206707, EU182346, НМ535790, GQ918139, EU877071, EU877070, EU877069, EU182347, М31046, EU877068, EU877067, EF542830, АВ839169, JQ647510, KС169986, JX088694, JQ730682, JN609295, JN234411, HQ317918, EF206719, EF564174, EU643590, JQ946087, FJ913470 HQ891318, АВ645847, АВ569299, AY705373, GU565704, GU565703, FJ577895, JX276550, FJ866836, FJ866835, DQ875051, DQ875050, АВ128149, АВ009663, АВ044824, JQ944709, EU345004, EU345003, EU345002, АВ608731, EF564173, JQ423952, АВ618037, АВ618036, АВ618035, АВ618034, АВ618033, АВ618032, АВ085828, М13215, М21634, АВ247437, АВ247436, АВ247435, АВ247434, АВ247433, АВ247432, D42112, АВ247430 и АВ247431.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, не содержит репортерный ген или маркерный ген. Предпочтительно мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует, например, люциферазу; зеленый флуоресцентный белок (GFP) и его варианты (такие как eGFP, RFP или BFP); α-глобин; гипоксантин:гуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT); β-галактозидазу; галактокиназу; щелочную фосфатазу; секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP)) или ген, обусловливающий устойчивость (такой как ген, обусловливающий устойчивость к неомицину, пуромицину, гигромицину и зеоцину). В предпочтительном варианте осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует люциферазу. В другом варианте осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует GFP или его вариант.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует белок (или фрагмент белка), происходящий из вируса, который принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Предпочтительно последовательность мРНК не кодирует белок, происходящий из вируса гриппа, более предпочтительно вируса гриппа А. Предпочтительно последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует белок вируса гриппа А, выбранный из группы, состоящей из гемагглютинина (НА), нейраминидазы (NA), нуклеопротеина (NP), M1, М2, NS1, NS2 (NEP: белок ядерного экспорта), PA, РВ1 (основная полимераза 1), PB1-F2 и РВ2. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует овальбумин (OVA) или его фрагмент.Предпочтительно последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, не кодирует белок вируса гриппа А или овальбумин.
В другом варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении мРНК предпочтительно содержит по меньшей мере один из следующих структурных элементов: элемент 5'- и/или 3'-нетранслируемой области (UTR-элемент), прежде всего 5'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 5'UTR ТОР-гена или из его фрагмента, гомолога или варианта, или элемент, представляющий собой 5'-/или 3'UTR, который может иметь происхождение из гена, из которого получают стабильную мРНК, или из его гомолога, фрагмента или варианта; гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно гистоновую структуру типа «стебель-петля» в ее 3'-нетранслируемой области; 5'-кэп-структуру; поли-А-хвост или поли(С)-последовательность.
В предпочтительном варианте осуществления первого объекта настоящего изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один 5'- или 3'UTR-элемент. В этом контексте UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'- или 3'UTR любого встречающегося в естественных условиях гена, или которую получают из фрагмента, гомолога или варианта 5'- или 3'UTR гена. Предпочтительно 5'- или 3'UTR-элемент, применяемый согласно настоящему изобретению, является гетерологичным относительно кодирующей области мРНК, предлагаемой в изобретении. Хотя предпочтительными являются 5'- или 3'UTR-элементы, полученные из встречающихся в естественных условиях генов, в контексте настоящего изобретения можно применять также созданные путем синтеза UTR-элементы.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления первого объекта настоящего изобретения последовательность мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит по меньшей мере один элемент, представляющий собой 5'-нетранслируемую область (5'UTR-элемент), который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 5'UTR ТОР-гена, или которую получают из фрагмента, гомолога или варианта 5'UTR ТОР-гена.
Наиболее предпочтительно, чтобы 5'UTR-элемент не содержал ТОР-мотив или 5'ТОР, указанный выше.
В некоторых вариантах осуществления изобретения нуклеотидная последовательность S'UTR-элемента, которую получают из 5'UTR ТОР-гена, оканчивается на ее 3'-конце нуклеотидом, локализованным в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в обратном направлении относительно стартового кодона (например, A(U/T)G) гена или полученной из него мРНК. Таким образом, 5'UTR-элемент не содержит никакой части кодирующей белок области. Таким образом, предпочтительно только кодирующий белок участок мРНК, предлагаемой в изобретении, представляет собой кодирующую область.
Нуклеотидную последовательность, имеющую происхождение из 5'UTR ТОР-гена, получают из эукариотического ТОР-гена, предпочтительно ТОР-гена растений или животных, более предпочтительно ТОР-гена хордовых животных, еще более предпочтительно ТОР-гена позвоночных животных, наиболее предпочтительно ТОР-гена млекопитающих, например, ТОР-гена человека.
Например, 5'UTR-элемент предпочтительно выбирают из 5'UTR-элементов, содержащих или состоящих из нуклеотидной последовательности, которая происходит из нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов, или предпочтительно из соответствующей РНК-последовательности. Понятие «гомологи SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700» относится к последовательностям из видов, отличных от человека (Homo sapiens), которые являются гомологами последовательностей SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая происходит из нуклеотидной последовательности, простирающейся от нуклеотидного положения 5 (т.е. нуклеотида, локализованного в положении 5 в последовательности) до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (локализованному на 3'-конце последовательностей), например, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG-последовательности, нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов или соответствующей РНК-последовательности. Наиболее предпочтительным является, если 5'UTR-элемент получают из нуклеотидной последовательности, простирающейся от нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 3'-стороны к 5'ТОР, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к стартовому кодону (локализованному на 3'-конце последовательностей), например, до нуклеотидного положения, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG-последовательности нуклеотидной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из гомологов SEQ ID NO: 1-1363, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1421 и SEQ ID NO: 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, из ее вариантов или соответствующей РНК-последовательности.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR ТОР-гена, кодирующего рибосомный белок, или из варианта 5'UTR ТОР-гена, кодирующего рибосомный белок. Например, 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 67, 170, 193, 244, 259, 554, 650, 675, 700, 721, 913, 1016, 1063, 1120, 1138 и 1284-1360, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, соответствующей РНК-последовательности, ее гомолога или варианта, указанного в настоящем описании, предпочтительно лишенного 5'ТОР-мотива. Как описано выше, последовательность, простирающаяся от положения 5 до нуклеотида, непосредственно примыкающего с 5'-стороны к ATG (локализованному на 3'-конце последовательностей), соответствует 5'UTR указанных последовательностей.
Предпочтительно 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, имеющей происхождение из 5'UTR ТОР-гена, кодирующего белок большой субъединицы рибосомы (RPL), или из гомолога или варианта 5'UTR ТОР-гена, кодирующего белок большой субъединицы рибосомы (RPL). Например, 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR нуклеотидной последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 67, 259, 1284-1318, 1344, 1346, 1348-1354, 1357, 1358, 1421 и 1422, указанных в заявке на патент WO 2013/143700, соответствующей РНК-последовательности, ее гомолога или варианта, указанного в настоящем описании, предпочтительно лишенного 5'ТОР-мотива.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR, имеющей происхождение из 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32, предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) позвоночных животных, более предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) человека, или из варианта 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32, предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) позвоночных животных, более предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) млекопитающих, наиболее предпочтительно гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (L32) человека, при этом предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит 5'ТОР указанного гена.
Таким образом, согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 16 (5'UTR человеческого белка большой субъединицы рибосомы 32, лишенного 5'-концевого олигопримидинового тракта: GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC; которая соответствует SEQ ID NO: 1368 в заявке на патент WO 2013/143700) или предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, или в которой по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 16, или более предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, при этом предпочтительно описанный выше фрагмент представляет собой непрерывный сегмент нуклеотидов, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит 5'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR ТОР-гена позвоночных животных, таких как млекопитающие, например, человеческого ТОР-гена, выбранного из RPSA, RPS2, RPS3, RPS3A, RPS4, RPS5, RPS6, RPS7, RPS8, RPS9, RPS10, RPS11, RPS12, RPS13, RPS14, RPS15, RPS15A, RPS16, RPS17, RPS18, RPS19, RPS20, RPS21, RPS23, RPS24, RPS25, RPS26, RPS27, RPS27A, RPS28, RPS29, RPS30, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL7, RPL7A, RPL8, RPL9, RPL10, RPL10A, RPL11, RPL12, RPL13, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL 17, RPL18, RPL18A, RPL19, RPL21, RPL22, RPL23, RPL23A, RPL24, RPL26, RPL27, RPL27A, RPL28, RPL29, RPL30, RPL31, RPL32, RPL34, RPL35, RPL35A, RPL36, RPL36A, RPL37, RPL37A, RPL38, RPL39, RPL40, RPL41, RPLP0, RPLP1, RPLP2, RPLP3, RPLP0, RPLP1, RPLP2, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G, EEF2, EIF3E, EIF3F, EIF3H, EIF2S3, EIF3C, EIF3K, EIF3EIP, EIF4A2, PABPC1, HNRNPA1, TPT1, TUBB1, UBA52, NPM1, ATP5G2, GNB2L1, NME2, UQCRB или из их гомолога или варианта, в которых предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит ТОР-мотива, или 5'ТОР указанных генов и в которых необязательно 5'-конец S'UTR-элемента начинается с нуклеотида, локализованного в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в прямом направлении относительно 5'-концевого олигопримидинового тракта (ТОР), и в которых также необязательно 5'UTR-элемент, происходящий из 5'UTR ТОР-гена, оканчивается на его 3'-конце нуклеотидом, локализованным в положении 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в обратном направлении относительно стартового кодона (A(U/T)G) гена, из которого он получен.
+
+
+
+
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая имеет происхождение из 5'UTR гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32), гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35), белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21), гена АТФ-синтазы, Н-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1), гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4), индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1), гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1), или из их варианта, предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) позвоночных животных, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) позвоночных животных, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) позвоночных животных, гена АТФ-синтазы, Н-транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) позвоночных животных, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) позвоночных животных, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) позвоночных животных, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) позвоночных животных или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) позвоночных животных, или из их варианта, более предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) млекопитающих, гена АТФ-синтазы, Н - транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) млекопитающих, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) млекопитающих, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) млекопитающих, гена субъединицы Vic оксидазы цитохрома с (СОХ6С) млекопитающих или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) млекопитающих, наиболее предпочтительно из гена белка большой субъединицы рибосомы 32 (RPL32) человека, гена белка большой субъединицы рибосомы 35 (RPL35) млекопитающих, гена белка большой субъединицы рибосомы 21 (RPL21) человека, гена АТФ-синтазы, Н - транспортирующей, митохондриального комплекса F1, альфа-субъединицы 1, сердечной мышцы (АТР5А1) человека, гена гидроксистероид(17-бета)дегидрогеназы 4 (HSD17B4) человека, индуцируемого андрогеном гена 1 (AIG1) человека, гена субъединицы VIc оксидазы цитохрома с (СОХ6С) человека или гена N-ацилсфингозин-амидогидролазы (кислая церамидаза) 1 (ASAH1) человека, или из их варианта, в которых предпочтительно 5'UTR-элемент не содержит 5'ТОР указанного гена.
Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1368 или SEQ ID NO: 1412-1420, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, или соответствующей РНК-последовательности, или в которых по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1368 или SEQ ID NO: 1412-1420, которые указаны в заявке на патент WO 2013/143700, при этом предпочтительно фрагмент представляет собой описанный выше фрагмент, т.е. является непрерывным состоящим из нуклеотидов сегментом, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. от полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.
Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения 5'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 26 (5'UTR АТР5А1, лишенная 5'-концевого олигопиримидинового тракта:
GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTA CCGCCTGCG-GAGTAACTGCAAAG; соответствует SEQ ID NO: 1414 в заявке на патент WO 2013/143700), или предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, или в которой по меньшей мере один 5'UTR-элемент содержит или состоит из фрагмента нуклеотидной последовательности, которая идентична по меньшей мере примерно на 40%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 50%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно на 99% нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 26, или более предпочтительно соответствующей РНК-последовательности, в которой предпочтительно фрагмент представляет собой описанный выше фрагмент, т.е. является непрерывным состоящим из нуклеотидов сегментом, на долю которого приходится по меньшей мере 20% и т.д. от полноразмерной 5'UTR. Предпочтительно фрагмент состоит по меньшей мере примерно из 20 нуклеотидов или более, предпочтительно по меньшей мере примерно из 30 нуклеотидов или более, более предпочтительно по меньшей мере примерно из 40 нуклеотидов или более. Предпочтительно фрагмент представляет собой функциональный фрагмент, указанный в настоящем описании.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит также по меньшей мере один 3'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR гена хордовых животных, предпочтительно гена позвоночных животных, более предпочтительно гена млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена, или из варианта 3'UTR гена хордовых животных, предпочтительно гена позвоночных животных, более предпочтительно гена млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена.
Понятие «3'UTR-элемент» относится к нуклеотидной последовательности, которая содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR или из варианта 3'UTR. 3'UTR-элемент в контексте настоящего изобретения может представлять собой 3'UTR мРНК. Таким образом, в контексте настоящего изобретения предпочтительно 3'UTR-элемент может представлять собой 3'UTR мРНК, предпочтительно искусственной мРНК, или может представлять собой матрицу для транскрипции 3'UTR мРНК. Таким образом, 3'UTR-элемент предпочтительно представляет собой нуклеотидную последовательность, которая соответствует 3'UTR мРНК, предпочтительно 3'UTR искусственной мРНК, такой как мРНК, полученная путем транскрипции созданной с помощью генной инженерии векторной конструкции. Предпочтительно 3'UTR-элемент выполняет функцию 3'UTR или кодирует последовательность, которая выполняет функцию 3'UTR.
Предпочтительно предлагаемая в изобретении мРНК содержит 3'UTR-элемент, который может происходить из гена, который соответствует мРНК с удлиненным временем полужизни (представляющей собой стабильную мРНК), например, 3'UTR-элемент указанный и описанный ниже.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 3'UTR гена, выбранного из группы, состоящей из гена альбумина, гена а-глобина, гена Р-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), или из варианта 3'UTR гена, выбранного из группы, состоящей из гена альбумина, гена а-глобина, гена Р-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена альфа, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 1369-1390 в заявке на патент WO 2013/143700, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, которую получают из 3'UTR гена альбумина, предпочтительно гена альбумина позвоночных животных, более предпочтительно гена альбумина млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена альбумина, которая имеет SEQ ID NO: 17.
3'UTR человеческого альбумина, имеющая SEQ ID NO: 17:
(соответствует SEQ ID NO: 1369 в заявке на патент WO 2013/143700).
В этом контексте наиболее предпочтительно, когда предлагаемая в изобретении мРНК содержит 3'UTR-элемент, который содержит соответствующую РНК-последовательность, происходящую из SEQ ID NO: 1369-1390, которые указаны в заявке па патент WO 2013/143700, или ее фрагмент, гомолог или вариант.
Наиболее предпочтительно 3'UTR-элемент содержит нуклеотидную последовательность, происходящую из фрагмента гена человеческого альбумина, которая представлена в SEQ ID NO: 18: 3'UTR альбумина7
(SEQ ID NO: 18 соответствует SEQ ID NO: 1376 в заявке на патент WO 2013/143700).
В этом контексте наиболее предпочтительно, когда 3'UTR-элемент предлагаемой в изобретении мРНК содержит или состоит из РНК-последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 18.
В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения 3'UTR-элемент содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 3'UTR гена α-глобина, предпочтительно гена α-или β-глобина, более предпочтительно гена α-или β-глобина млекопитающих, наиболее предпочтительно человеческого гена α-или β-глобина, которая имеет SEQ ID NO: 19-21:
3'UTR альфа-цепи гемоглобина 1 Homo sapiens (НВА1)
(SEQ ID NO: 19 соответствует SEQ ID NO: 1370 заявки на патент WO 2013/143700),
3'UTR альфа-цепи гемоглобина 2 Homo sapiens (HBA2)
CAG (SEQ ID NO: 20 соответствует SEQ ID NO: 1371 заявки на патент WO 2013/143700),
3'UTR бета-цепи гемоглобина Homo sapien (HBB)
(SEQ ID NO: 21 соответствует SEQ ID NO: 1372 заявки на патент WO 2013/143700).
Например, 3'UTR-элемент может содержать или состоять из центральной, связывающей α-комплекс области 3'UTR гена α-глобина, такого как ген человеческого α-глобина, которая предпочтительно имеет SEQ ID NO: 22: центральная связывающая а-комплекс область 3'UTR гена а-глобина (которую в контексте настоящего описания обозначают также как «muag»)
(SEQ ID NO: 22 соответствует SEQ ID NO: 1393 заявки на патент WO 2013/143700).
В этом контексте наиболее предпочтительно, когда 3'UTR-элемент мРНК, предлагаемой в изобретении, содержит или состоит из РНК-последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 22, или ее гомолога, фрагмента или варианта.
Понятие «нуклеотидная последовательность, происходящая из 3'UTR […]-гена» предпочтительно относится к нуклеотидной последовательности, основой которой является 3'UTR-последовательность […]-гена или ее часть, например, 3'UTR гена альбумина, гена а-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), предпочтительно гена альбумина или его части. Указанное понятие включает последовательности, соответствующие полной 3'UTR-последовательности, т.е. полноразмерной 3'UTR-последовательности гена, и последовательности, соответствующие фрагменту 3'UTR-последовательности гена, например, гена альбумина, гена а-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), предпочтительно гена альбумина.
Понятие ««нуклеотидная последовательность, происходящая из варианта 3'UTR […]-гена» предпочтительно относится к нуклеотидной последовательности, основой которой является вариант 3'UTR-последовательности гена, например, вариант 3'UTR гена альбумина, гена α-глобина, гена β-глобина, гена тирозингидроксилазы, гена липоксигеназы и гена альфа-цепи коллагена, такого как ген альфа-1-цепи коллагена типа (I), или его части, как указано выше. Указанное понятия включают последовательности, соответствующие полной последовательности варианта 3'UTR гена, т.е. полноразмерной 3'UTR-последовательности варианта гена, и последовательности, соответствующие фрагменту варианта 3'UTR-последовательности гена. Фрагмент в этом контексте предпочтительно состоит из непрерывного нуклеотидного сегмента, соответствующего непрерывному нуклеотидному сегменту полноразмерного варианта 3'UTR, на долю которого приходится по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, более предпочтительно по меньшей мере 40%, более предпочтительно по меньшей мере 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% полноразмерного варианта 3'UTR. Указанный фрагмент варианта в контексте настоящего изобретения предпочтительно представляет собой функциональный фрагмент варианта, указанного в настоящем описании.
Предпочтительно по меньшей мере один 5'UTR-элемент и по меньшей мере один 3'UTR-элемент действуют синергетически в отношении повышения производства белка указанной выше мРНК, предлагаемой в изобретении.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, содержит гистоновую последовательность/структуру типа «стебель-петля». Указанные последовательности гистоновой структуры типа «стебель-петля» предпочтительно выбирают из последовательностей гистоновой структуры типа «стебель-петля», которые представлены в WO 2012/019780, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», которую можно применять в настоящем изобретении, предпочтительно выбирают по меньшей мере из одной из следующих формул (I) или (II):
формула (I) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):
формула (II) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):
в которых:
где
у элементов stem1 и stem2 может происходить спаривание оснований друг с другом с образованием обратно комплементарной последовательности, где спаривание оснований может иметь место между stem1 и stem2, например, посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику нуклеотидов А и U/T или G и С, или посредством спаривания оснований не по Уотсону-Крику, например, посредством спаривания «качающихся» оснований («качающегося» спаривания оснований), обратного спариванию оснований по Уотсону-Крику, посредством хугстиновского спаривания оснований, посредством обратного хугстиновскому спаривания оснований, или у них может происходить спаривание оснований друг с другом с образованием частично обратно комплементарной последовательности, при этом неполное спаривание оснований может иметь место между stem1 и stem2, вследствие того, что для одного или нескольких оснований в одном стебле не имеется комплементарного основания в обратно комплементарной последовательности другого стебля.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать или кодировать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ia) или (IIа):
формула (Ia) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):
формула (IIa) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):
в которой:
N, С, G, Т и U имеют указанные выше значения.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать или кодировать по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», соответствующую по меньшей мере одной из следующих конкретных формул (Ib) или (IIb):
формула (Ib) (последовательность структуры типа «стебель-петля» без пограничных элементов стебля):
формула (IIb) (последовательность структуры типа «стебель-петля» с пограничными элементами стебля):
в которой:
N, С, G, T и U имеют указанные выше значения.
Наиболее предпочтительной последовательностью гистоновой структуры типа «стебель-петля» является последовательность, представленная в SEQ ID NO: 23 CAAAGGCTCTTTTCAGAGCCACCA, или более предпочтительно последовательность РНК, соответствующая нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 27 (CAAAGGCUCUUUUCAGAGCCACCA SEQ ID NO: 27).
В конкретном предпочтительном варианте осуществления первого объекта настоящего изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, содержит помимо кодирующей области, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, поли(А)-последовательность, которую называют также поли-А-хвостом, предпочтительно на 3'-конце предлагаемой в изобретении мРНК. Когда она присутствует, то указанная поли(А)-последовательность содержит последовательность, содержащую от примерно 25 до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 400 аденозиновых нуклеотидов, более предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 300 аденозиновых нуклеотидов, еще более предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 50 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов, наиболее предпочтительно последовательность, содержащую от примерно 60 до примерно 250 аденозиновых нуклеотидов. В этом контексте понятие «примерно» относится к отклонению, составляющему ± 10% от величины(н), к которой(ым) оно относится. Указанная поли(А)-последовательность предпочтительно локализована на 3'-конце кодирующей области, которая входит в предлагаемую в изобретении мРНК, указанную в первом объекте настоящего изобретения.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении мРНК можно модифицировать с помощью последовательности, состоящей по меньшей мере из 10 цитозинов, предпочтительно по меньшей мере из 20 цитозинов, более предпочтительно по меньшей мере из 30 цитозинов (так называемая «поли(С)-последовательность»). В частности, мРНК может содержать поли(С)-последовательность, которая, как правило, содержит примерно от 10 до 200 цитозиновых нуклеотидов, предпочтительно примерно от 10 до 100 цитозиновых нуклеотидов, более предпочтительно примерно от 10 до 70 цитозиновых нуклеотидов или еще более предпочтительно примерно от 20 до 50 или даже от 20 до 30 цитозиновых нуклеотидов. Указанная поли(С)-последовательность предпочтительно локализована на 3'-конце кодирующей области, более предпочтительно на 3'-конце необязательной поли(А)-последовательности, которая входит в предлагаемую в изобретении мРНК, указанную в первом объекте настоящего изобретения.
В этом контексте в конкретном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК может содержать:
а.) структуру 5'-кэпа, предпочтительно m7GpppN;
б.) кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства, предпочтительно происходящий из гликопротеина G (RAV-G) вируса бешенства;
в.) поли(А)-последовательность, предпочтительно содержащую 64 аденозина; и
г.) необязательно поли(С)-последовательность, предпочтительно содержащую 30 цитозинов.
В наиболее предпочтительном варианте первого объекта настоящего изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, содержит предпочтительно в 5'→3'-направлении:
а.) структуру 5'-кэпа, предпочтительно m7GpppN;
б.) кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства, предпочтительно происходящий из гликопротеина G (RAV-G) вируса бешенства;
в.) поли(А)-последовательность, предпочтительно содержащую 64 аденозина;
г.) необязательно поли(С)-последовательность, предпочтительно содержащую 30 цитозинов; и
д.) гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно содержащую последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23.
В другом наиболее предпочтительном варианте первого объекта настоящего изобретения предлагаемая в настоящем изобретении мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, содержит предпочтительно в 5'->3'-направлении:
а.) структуру 5'-кэпа, предпочтительно m7GpppN;
б.) кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства, предпочтительно происходящий из гликопротеина G (RAV-G) вируса бешенства;
в.) необязательно 3'UTR-элемент, происходящий из гена альфа-глобина, предпочтительно содержащий последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO. 22, ее гомолога, фрагмента или варианта;
г.) поли(А)-последовательность, предпочтительно содержащую 64 аденозина;
д.) необязательно поли(С)-последовательность, предпочтительно содержащую 30 цитозинов; и
е.) гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно содержащую последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23.
В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в настоящем изобретении мРНК, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, содержит предпочтительно в 5'→3'-направлении:
а.) структуру 5'-кэпа, предпочтительно m7GpppN;
б.) необязательно 5'UTR-элемент, происходящий из гена ТОР, предпочтительно происходящий из последовательности РНК, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 16, ее гомолога, фрагмента или варианта;
в.) кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства, предпочтительно происходящий из гликопротеина G (RAV-G) вируса бешенства;
г.) необязательно 3'UTR-элемент, происходящий из гена, из которого получают стабильную мРНК, предпочтительно происходящий из последовательности РНК, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 18, ее гомолога, фрагмента или варианта;
д.) поли(А)-последовательность, предпочтительно содержащую 64 аденозина;
е.) необязательно поли(С)-последовательность, предпочтительно содержащую 30 цитозинов; и
ж.) гистоновую структуру типа «стебель-петля», предпочтительно содержащую последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23.
Кодирующая область может кодировать по меньшей мере частично одну из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-10 или ее фрагменты, варианты или производные. Кроме того, кодирующая область предлагаемой в изобретении мРНК может кодировать комбинацию по меньшей мере двух указанных аминокислотных последовательностей или комбинацию их фрагментов, вариантов или производных.
Кроме того, кодирующая область может представлять собой или может содержать по меньшей мере частично одну из последовательностей SEQ ID NO: 11 - SEQ ID NO: 15 или ее фрагменты, гомологи или варианты. Кроме того, мРНК может содержать комбинацию по меньшей мере двух указанных последовательностей или комбинацию их фрагментов, гомологов или вариантов.
Для дополнительного повышения устойчивости, например, к расщеплению in vivo (например, экзо- или эндонуклеазой), предлагаемую в изобретении мРНК можно получать в виде стабилизированной нуклеиновой кислоты, например, в форме модифицированной нуклеиновой кислоты. Таким образом, согласно дополнительному варианту осуществления изобретения предпочтительно стабилизируют предлагаемую в изобретении мРНК, предпочтительно с помощью модификаций каркаса, модификаций сахара и/или модификаций оснований, более предпочтительно путем модификации содержания G/C. Все указанные модификации можно интродуцировать в предлагаемую в изобретении мРНК без нарушения функции мРНК, которая должна транслироваться в антигенную функцию происходящего из вируса бешенства пептида или белка.
В контексте настоящего изобретения модификация каркаса предпочтительно представляет собой модификацию, при которой фосфаты каркаса нуклеотидов, входящих в предлагаемую в изобретении мРНК, химически модифицируют, например, с помощью анионной межнуклеозидной связи, N3'→5'-модификаций, замены несвязанных мостиками атомов кислорода на бораны, нейтральной межнуклеозидной связи, амидной связи нуклеозидов, метиленовых (метиленимино) связей, формацетальных или тиоформацетальных связей, интродукции сульфонильных групп или т.п.
В контексте настоящего изобретения модификация сахара предпочтительно представляет собой химическую модификацию сахара нуклеотидов предлагаемой в изобретении мРНК, например, метилирование рибозного остатка или т.п.
Согласно другому варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении мРНК можно модифицировать и тем самым стабилизировать путем модификации содержания G (гуанозин)/С (цитозина) в мРНК, предпочтительно в ее кодирующей области.
При этом содержание G/C в предлагаемой в изобретении мРНК, предпочтительно в кодирующей области, значительно повышают по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области ее конкретной кодирующей последовательности дикого типа, т.е. в немодифицированной мРНК. Однако кодируемую аминокислотную последовательность предлагаемой в изобретении мРНК предпочтительно не модифицируют по сравнению кодируемой аминокислотной последовательностью конкретной мРНК дикого типа/немодифицированной мРНК.
Модификация содержания G/C в предлагаемой в изобретении мРНК основана на том факте, что последовательности РНК, имеющие повышенное содержание G (гуанозин)/С (цитозин), являются более стабильными, чем последовательности мРНК, имеющие повышенное содержание А (аденозин)/и (урацил). Таким образом, кодоны кодирующей области полной РНК можно изменять по сравнению с кодирующей областью дикого типа или мРНК так, чтобы они содержали большее количество G/C-нуклеотидов, с сохранением транслируемой аминокислотной последовательности. Учитывая тот факт, что несколько кодонов кодируют одну и ту же аминокислоту (так называемая вырожденность генетического кода), можно определять наиболее предпочтительные с точки зрения стабильности кодоны (так называемые альтернативные наиболее часто встречающиеся кодоны). Предпочтительно содержание G/C в кодирующей области предлагаемой в изобретении мРНК повышают по меньшей мере на 7%, более предпочтительно по меньшей мере на 15%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 20%, по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области мРНК дикого типа. В конкретном варианте осуществления изобретения заменяют по меньшей мере 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%, 95% или даже 100% пригодных для замены кодонов в области, кодирующей белок или пептид, указанный в настоящем описании, или его фрагмент, вариант и/или производное, или всю последовательность мРНК дикого типа или кодирующую последовательность, повышая тем самым содержание G/C в указанной последовательности. В этом контексте наиболее предпочтительно повышать содержание G/C в предлагаемой в изобретении мРНК до максимума (т.е. до 100% пригодных для замещения кодонов), прежде всего в кодирующей области, по сравнению с последовательностью дикого типа.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении мРНК оптимизируют для трансляции, предпочтительно оптимизируют для трансляции путем замены менее часто встречающихся тРНК данной аминокислоты на кодоны более часто встречающихся тРНК соответствующей аминокислоты. Это основано на открытии того факта, что эффективность трансляции определяется также различной частотой встречаемости тРНК в клетках. Так, если так называемые «менее часто встречающиеся кодоны» присутствуют в предлагаемой в изобретении мРНК в более высоком уровне, то соответствующая модифицированная РНК транслируется в существенно худшей степени, чем в случае, если присутствуют кодоны более часто встречающихся тРНК. Предпочтительно кодирующую область предлагаемой в изобретении мРНК модифицируют по сравнению с соответствующей областью РНК дикого типа или кодирующей последовательностью так, чтобы по меньшей мере один кодон последовательности дикого типа, который кодирует тРНК, которая является редкой или менее часто встречается в клетке, заменять на кодон, который кодирует тРНК, которая более или наиболее часто встречается в клетке и «несет» ту же самую аминокислоту, что и относительно редкая или менее часто встречающаяся тРНК. Путем такой модификации последовательности предлагаемой в изобретении мРНК можно модифицировать таким образом, чтобы встраивать кодоны, для которых доступны более часто встречающиеся тРНК. Другими словами, согласно изобретению с помощью такой модификации все кодоны последовательности дикого типа, которые кодируют тРНК, являющуюся относительно редкой в клетке, можно в каждом случае заменять на кодоны, которые кодируют тРНК, относительно часто встречающуюся в клетке, и которая в каждом случае «несет» такую же аминокислоту, что и относительно редкая тРНК. Кроме того, наиболее предпочтительно объединять повышение G/C-содержания в последовательности, прежде всего до максимума, в предлагаемой в изобретении мРНК с «часто встречающимися» кодонами без модификации аминокислотной последовательности белка, кодируемого кодирующей областью предлагаемой в изобретении мРНК или кодирующей области. Указанный предпочтительный вариант осуществления изобретения позволяет получать наиболее эффективно транслируемую и стабилизированную (модифицированную) предлагаемую в изобретении мРНК.
Замены, добавления или элиминации оснований предпочтительно осуществляют с использованием ДНК-матрицы для получения молекулы нуклеиновой кислоты с помощью хорошо известных методик сайтнаправленного мутагенеза или олигонуклеотидного лигировани. В указанном процессе для получения по меньшей мере одной РНК в предлагаемой в изобретении комбинированной вакцине, указанной в настоящем описании, соответственную молекулу ДНК можно транскрибировать in vitro. Указанная ДНК-матрица предпочтительно содержит пригодный промотор, например, промотор Т7 или SP6, для транскрипции in vitro, за которым располагается требуемая нуклеотидная последовательность, кодирующая по меньшей мере одну мРНК, которую нужно получить, и сигнал терминации для транскрипции in vitro. Молекулу ДНК, которая служит матрицей по меньшей мере для одной представляющей интерес РНК, можно получать путем ферментативной пролиферации и последующего выделения в виде части плазмиды, которая может реплицироваться в бактериях. Плазмиды, которые можно рассматривать в качестве приемлемых для осуществления настоящего изобретения, представляют собой, например, плазмиды рТ7Т (GenBank, регистрационный номер U26404; Lai и др., Development, 121, 1995, сс. 2349-2360), серии pGEM, например, pGEM-1 (GenBank, регистрационный номер Х65300; фирма Promega) и pSP64 (GenBank, регистрационный номер Х65327); ср. также Mezei и Storts, Purification of PCR Products в: PCR Technology: Current Innovation, под ред. Griffin и Griffin, изд-во CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.
В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК согласно первому объекту настоящего изобретения содержит, предпочтительно в 5'→3' направлении:
а) структуру 5'-кэпа, указанную в настоящем описании, предпочтительно m7GpppN;
б) кодирующую область, предпочтительно с повышенным или даже максимальным содержанием G/C по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области мРНК дикого типа, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина (RAV-N), фосфопротеина (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы (RAV-L) вируса бешенства или его фрагмента, варианта или производного;
в) 3'UTR-элемент, указанный в настоящем описании, предпочтительно происходящий из гена, образующего стабильную мРНК, наиболее предпочтительно РНК-последовательности, соответствующей нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 22, или его гомолог, фрагмент или вариант;
г) поли(А)-последовательность, предпочтительно состоящую из 64 аденозинов;
д) необязательно поли(С)-последовательность, состоящую из 30 цитозинов;
е) по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», предпочтительно РНК-последовательность, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23.
Наиболее предпочтительно предлагаемая в изобретении последовательность мРНК, указанная в этом конкретном варианте осуществления изобретения, содержит модификации последовательности, представленные на фиг.1 (SEQ ID NO: 24).
В другом наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК согласно первому объекту настоящего изобретения содержит, предпочтительно в 5'→3' направлении:
а) структуру 5'-кэпа, указанную в настоящем описании, предпочтительно m7GpppN;
б) 5'UTR-элемент, указанный в настоящем описании, предпочтительно 5'UTR-элемент, который содержит или состоит из нуклеотидной последовательности, происходящей из 5'UTR ТОР-гена, предпочтительно 5'UTR человеческого белка большой субъединицы рибосомы 32, без 5'-концевого олигопиримидинового тракта, имеющего SEQ ID NO: 16, или соответствующей РНК-последовательности; или его фрагмент, гомолог или вариант;
в) кодирующую область, предпочтительно с повышенным или даже максимальным содержанием G/C по сравнению с содержанием G/C в кодирующей области мРНК дикого типа, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина (RAV-N), фосфопротеина (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы (RAV-L) вируса бешенства или его фрагмента, варианта или производного;
г) 3'UTR-элемент, предпочтительно 3'UTR-элемент человеческого альбумина, имеющий SEQ ID NO: 18, или соответствующую РНК, или его гомолог, фрагмент или вариант;
д) поли(А)-последовательность, предпочтительно состоящую из 64 аденозинов;
е) необязательно поли(С)-последовательность, состоящую из 30 цитозинов;
ж) по меньшей мере одну последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», предпочтительно РНК-последовательность, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 23.
Наиболее предпочтительно предлагаемая в изобретении последовательность мРНК, указанная в этом конкретном варианте осуществления изобретения, содержит модификации последовательности, представленные на фиг. 2 (SEQ ID NO: 25).
В еще более предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении последовательность мРНК содержит или состоит из последовательностей, представленных на фиг.1 или 2, которые соответствуют SEQ ID NO: 24 и 25.
В других конкретных вариантах осуществления изобретения мРНК, предлагаемая в изобретении, может содержать также последовательность участка внутренней посадки (связывания) рибосомы (IRES) или IRES-мотива, которая может разделять несколько открытых рамок считывания, например, если предлагаемая в изобретении мРНК кодирует два или большее количество антигенных пептидов или белков. IRES-последовательность может оказаться особенно ценной, если мРНК представляет собой би- или полицистронную мРНК.
Кроме того, предлагаемую в изобретении мРНК можно получать с помощью любого метода, известного в данной области, включая методы синтеза, такие как твердофазный синтез, а также методы in vitro, такие как реакции транскрипции in vitro.
Согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения мРНК, содержащую кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, можно вводить в «оголенном» виде без ассоциации с каким-либо дополнительным наполнителем, трансфектирующим или коплексообразующим агентом, предназначенным для повышения эффективности трансфекции и/или иммуностимулирующих свойств предлагаемой в изобретении мРНК, или дополнительно включенной нуклеиновой кислотой.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении мРНК можно объединять вместе с катионным или поликатионным соединением и/или с полимерным носителем. Следовательно, в конкретном варианте осуществления изобретения предпочтительно, чтобы предлагаемая в изобретении мРНК или любая другая нуклеиновая кислота, входящая в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, была ассоциирована или включена в комплекс с катионным или поликатионным соединением или полимерным носителем, необязательно в массовом соотношении мРНК или нуклеиновой кислоты к катионному или поликатионному соединению и/или к полимерному носителю, выбранном из диапазона от примерно 6:1 до примерно 0,25:1 (мас./мас.), более предпочтительно от примерно 5:1 до примерно 0,5:1 (мас./мас.), еще более предпочтительно от примерно 4:1 до примерно 1:1 (мас./мас.) или от примерно 3:1 до примерно 1:1 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно в соотношении, составляющем от примерно 3:1 до примерно 2:1 (мас./мас); или необязательно в соотношении азот/фосфат мРНК или нуклеиновой кислоты к катионному или поликатионному соединению и/или к полимерному носителю, в диапазоне, примерно 0,1-10, предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-4 или 0,3-1, и наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,5-1 или 0,7-1, и еще более предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-0,9 или 0,5-0,9.
Таким образом, предлагаемая в изобретении мРНК или любая другая нуклеиновая кислота, входящая в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, может быть ассоциирована с наполнителем, трансфектирующим или коплексообразующим агентом, предназначенным для повышения эффективности трансфекции и/или иммуностимулирующих свойств предлагаемой в изобретении мРНК, или с необязательно дополнительно включенными нуклеиновыми кислотами.
В этом контексте наиболее предпочтительными агентами для трансфекции или комплексообразования являются катионные или поликатионные соединения, включая протамин, нуклеолин, спермин или спермидин, или другие катионные пептиды или белки, такие как поли-L-лизин (ПЛЛ), полиаргинин, основные полипетиды, проникающие в клетки пептиды (СРР), включая ВИЧ-связывающие пептиды, Tat, ВИЧ-1 Tat (ВИЧ), полученные из Tat пептиды, пенетратин, полученные из VP22 пептиды или аналогичные пептиды, VP22 HSV (вирус герпеса простого), MAP, KALA или домены белковой трансдукции (PTD), РрТ620, богатые пролином пептиды, богатые аргинином пептиды, богатые лизином пептиды, МРО-пептид(ы), Рер-1, L-олигомеры, пептид(ы) кальцитонина, пептиды, полученные из Antennapedia (прежде всего, из Drosophila antennapedia), pAntp, plsl, FGF, лактоферрин, транспортан, буфорин-2, Вас715-24, SynB, SynB(1), pVEC, полученные из hCT пептиды, SAP или гистоны.
В этом контексте наиболее предпочтительным является протамин.
Кроме того, предпочтительные катионные или поликатионные белки или пептиды, можно выбирать из следующих белков или пептидов, которые имеют следующую общую формулу (III):
1
m
n
o
x
(Arg);(Lys);(His);(Orn);(Xaa) (формула III),
7
8
9
3
9
9
3
3
9
3
9
4
2
в которой l+m+n+о+х обозначают 8-15 и 1, m, n или о каждый независимо друг от друга могут представлять собой любые числа, выбранные из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, при условии, что общее содержание Arg, Lys, His и Orn составляет по меньшей мере 50% от общего содержания аминокислот в олигопептиде; а Хаа может обозначать любую аминокислоту, выбранную из нативных (т.е. встречающихся в естественных условиях) или не встречающихся в естественных условиях аминокислот за исключением Arg, Lys, His или Orn; и х может обозначать любое число, выбранное из 0, 1, 2, 3 или 4, при условии, что общее содержание Хаа не превышает 50% от общего содержания аминокислот в олигопептиде. В этом контексте наиболее предпочтительными катионными пептидами являются, например, Arg, Arg, Arg, HR, RH, HRH, YSSRSSY, (RKH), Y(RKH)R и т.д., которые описаны в WO 2009/030481, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Кроме того, предпочтительные катионные или поликатионные соединения, которые можно применять в качестве агентов для трансфекции или комплексообразования, могут включать катионные полисахариды, например, хитозан, полибрен, катионные полимеры, например, полиэтиленимин (ПЭИ), катионные липиды, например, DOTMA: хлорид [1-(2,3-сиолеилокси)пропил)]-N,N,N-триметиламмония, DMRIE, ди-С14-амидин, DOTIM, SAINT, DC-Chol, BGTC, СТАР, DOPC, DODAP, DOPE: диолеилфосфатидилэтаноламин, DOSPA, DODAB, DOIC, DMEPC, DOGS: диоктадециламидоглицилспермин, DIMRI: бромид димиристооксипропилдиметилгидроксиэтиламмония, DOTAP: диолеоилокси-3-(триметиламмоний)пропан, DC-6-14: хлорид O,O-дитетрадеканоил-N-(α-триметиламмонийацетил)диэтаноламина, CLIP1: хлорид рац[(2,3-диоктадецилоксипропил)(2-гидроксиэтил)]диметиламмония, CLIP6: рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксиметилокси)этил]триметил аммоний, CLIP9: рац[2(2,3-дигексадецилоксипропилоксисукцинилокси)этил]триметиламмоний, олигофектамин, или катионные или поликатионные полимеры, например, модифицированные полиаминокислоты, такие как полимеры β-аминокислот или обращенные полиамиды и т.п., модифицированные полиэтилены, такие как ПВП (поли(N-этил-4-винилпириднийбромид)) и т.п., модифицированные акрилаты, такие как пДМАЭМА (поли(диметиламиноэтилметилакрилат)) и т.п., модифицированные амидоамины, такие как пАМАМ (поли(амидоамин)) и т.п., модифицированные сложные поли-β-аминоэфиры (ПБАЭ), такие как модифицированные в диаминоконцевом фрагменте сополимеры 1,4-бутандиолдиакрилата и 5-амино-1-пентанола и т.п., дендримеры, такие как дендримеры полипропиламина или дендримеры на основе пАМАМ и т.п., полиимин(ы), такие как полиэтиленимин (ПЭИ), полипропиленимин и т.п., полиаллиламин, полимеры на основе сахарного каркаса, такие как полимеры на основе циклодекстрина, полимеры на основе декстрана, хитозан и т.п., силановые полимеры, такие как сополимеры PMOXA-PDMS и т.п., блокполимеры, включающие комбинацию одного или более катионных блоков (например, выбранных из катионных полимеров, указанных выше) и одного или нескольких гидрофильных или гидрофобных блоков (таких, например, как полиэтиленгликоль) и т.п.
Полимерный носитель, применяемый согласно изобретению, может представлять собой полимерный носитель, состоящий из сшитых дисульфидами катионных компонентов. Сшитые дисульфидами катионные компоненты могут быть одинаковыми или отличными друг от друга. Полимерный носитель может содержать также другие компоненты. Наиболее предпочтительно также, чтобы полимерный носитель, применяемый согласно настоящему изобретению, содержал смеси катионных пептидов, белков или полимеров и необязательно другие компоненты, указанные в настоящем описании, которые сшиты с помощью дисульфидных связей, как указано в настоящем описании. В этом контексте содержание WO 2012/013326 включено в настоящее описание в качестве ссылки.
В этом контексте катионные компоненты, которые в результате сшивания дисульфидами формируют основу полимерного носителя, как правило, выбирают из любых пригодных катионных или поликатионных пептидов, белков или полимеров, которые можно применять для этой цели, прежде всего из любых катионных или поликатионных пептидов, белков или полимеров, которые обладают способностью образовывать комплекс с мРНК или нуклеиновой кислотой, указанной в настоящем изобретении, и тем самым предпочтительно конденсировать мРНК или нуклеиновую кислоту. Катионный или поликатионный пептид, белок или полимер предпочтительно представляет собой линейную молекулу, однако можно применять также разветвленные катионные или поликатионные пептиды, белки или полимеры.
Каждый сшитый дисульфидами катионный или поликатионный белок, пептид или полимер полимерного носителя, который можно применять для образования комплекса с предлагаемой в изобретении мРНК или любой другой нуклеиновой кислотой, входящей в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, содержит по меньшей мере одну -SH-группу, наиболее предпочтительно по меньшей мере один цистеиновый остаток или любую другую химическую группу, несущую -SH-группу, которая способна образовывать дисульфидную связь при конденсации по меньшей мере с одним другим катионным или поликатионным белком, пептидом или полимером в качестве катионного компонента полимерного носителя, указанного в настоящем описании.
Как указано выше, полимерный носитель, который можно применять для образования комплекса с предлагаемой в изобретении мРНК или любой другой нуклеиновой кислотой, входящей в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, может быть образован из сшитых дисульфидами катионных (или поликатионных) компонентов.
Предпочтительно указанные катионные или поликатионные пептиды или белки или полимеры полимерного носителя, которые содержат или дополнительно модифицированы так, что они содержат по меньшей мере одну -SH-группу, выбирают из белков, пептидов и полимеров, указанных выше в качестве комплексообразующего агента.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения полимерный носитель, который можно применять для образования комплекса с предлагаемой в изобретении мРНК или любой другой нуклеиновой кислотой, входящей в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, можно выбирать из молекулы полимерного носителя, имеющей общую форму (IV):
в которой
1
3
1
3
2
1
2
3
2
х
x
z
х
x
z
Р и Р являются различными или идентичными друг другу и представляют собой линейную или разветвленную гидрофильную полимерную цепь, каждый Р и Р несет по меньшей мере одну -SH-группу, способную образовывать дисульфидную связь при конденсации с компонентом Р, или альтернативно этому с (АА), (АА) или [(AA)], если указанные компоненты используют в качестве линкера между Р и Р или Р и Р) и/или с другими компонентами (например, (АА), (АА), [(AA)] или L), линейную или разветвленную гидрофильную полимерную цепь, выбранную независимо друг от друга из полиэтиленгликоля (ПЭГ), поли-N-(2-гидроксипропил)метакриламида, поли-2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолинов, поли(гидроксиалкил-L-аспарагина), поли(2-(метакрилоилокси)этилфосфорилхолина), гидроксиэтилкрахмала или поли(гидроксиалкид-L-глутамина), где гидрофильная полимерная цепь имеет молекулярную массу от примерно 1 до примерно 100 кДа, предпочтительно от примерно 2 до примерно 25 кДа или более предпочтительно от примерно 2 до примерно 10 кДа, например, от примерно 5 до примерно 25 кДа или от 5 до примерно 10 кДа;
2
Р обозначает катионный или поликатионный пептид или белок, например, указанный выше для полимерного носителя, сформированного сшитыми дисульфидами катионными компонентами, и предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 100 аминокислот, более предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 50 аминокислот, еще более предпочтительно имеющий длину от примерно 3 до примерно 25 аминокислот, например, имеющий длину примерно от 3 до 10, от 5 до 15, от 10 до 20 или от 15 до 25 аминокислот, более предпочтительно имеющий длину от примерно 5 до примерно 20 и еще более предпочтительно имеющий длину от примерно 10 до примерно 20 аминокислот; или
обозначает катионный или поликатионный полимер, например, указанный выше для полимерного носителя, сформированного сшитыми дисульфидами катионными компонентами, как правило, имеющий молекулярную массу от примерно 0,5 до примерно 30 кДа, включая молекулярную массу от примерно 1 до примерно 20 кДа, еще более предпочтительно от примерно 1,5 до примерно 10 кДа, или имеющий молекулярную массу от примерно 0,5 до примерно 100 кДа, включая молекулярную массу от примерно 10 до примерно 50 кДа, еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 30 кДа;
2
2
1
3
х
x
z
каждый Р несет по меньшей мере две -SH-группы, способные образовывать дисульфидную связь при конденсации с другими компонентами Р или с компонентом(ами) Р и/или Р, или альтернативно этому с другими компонентами (например, (АА), (АА) или [(AA)]);
1
2
2
2
2
3
х
x
z
-S-S- обозначает (обратимую) дисульфидную связь (для удобочитаемости скобки опущены), в которой S предпочтительно представляет собой серу или несущую -SH группу, которая образует (обратимую) дисульфидную связь. (Обратимую) дисульфидную связь предпочтительно получают путем конденсации -SH-групп либо компонентов Р и Р, либо Р и Р, либо Р и Р, либо необязательно других компонентов, указанных в настоящем описании (например, L, (АА), (АА), [(AA)] и т.д.); -SH-группа может представлять собой часть структуры указанных компонентов или может быть добавлена путем указанной модификации;
L обозначает необязательный лиганд, который может присутствовать или отсутствовать, и его можно выбирать независимо друг от друга из RGD, трансферрина, фолата, сигнального пептида или сигнальной
последовательности, сигнала или последовательности локализации, сигнала или последовательности ядерной локализации (NLS), антитела, проникающего в клетку пептида (например, ТАТ или KALA), лиганда рецептора (например, цитокинов, гормонов, факторов роста и т.д.), малых молекул (например, углеводов типа маннозы или галактозы, или синтетических лигандов), агонистов малых молекул, ингибиторов или антагонистов рецепторов (например, аналогов RGD-пептидомиметиков) или любого другого белков, указанного в настоящем описании, и т.д.;
п обозначает целое число, как правило выбранное из диапазона примерно от 1 до 50, предпочтительно из диапазона примерно от 1, 2 или 3 до 30, более предпочтительно из диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 25, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 20, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 15, или диапазона примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, включая, например, диапазон примерно от 4 до 9, от 4 до 10, от 3 до 20, от 4 до 20, от 5 до 20 или от 10 до 20, или диапазон примерно от 3 до 15, от 4 до 15, от 5 до 15 или от 10 до 15, или диапазон примерно от 6 до 11 или от 7 до 10. Наиболее предпочтительно п находится в диапазоне примерно от 1, 2, 3, 4 или 5 до 10, более предпочтительно в диапазоне примерно от 1, 2, 3 или 4 до 9, в диапазоне примерно от 1, 2, 3 или 4 до 8, или в диапазоне примерно от 1, 2 или 3 до 7.
1
3
2
1
2
3
2
1
2
2
3
1
3
1
3
2
1
3
1
2
2
3
1
2
2
3
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
х
х
n
х
В этом контексте содержание WO 2011/026641 включено в настоящее описание в качестве ссылки. Каждый из гидрофильных полимеров Р и Р, как правило, несет по меньшей мере одну -SH-группу, где по меньшей мере одна -SH-группа может образовывать дисульфидную связь при взаимодействии с компонентом Р или с компонентом (АА) или (АА), если его используют в качестве линкера между Р и Р или Р и Р, как указано ниже, и необязательно с другим компонентом, например, L и/или (АА) или (АА), например, если он несет две или большее количество -SH-групп.Следующие подформулы «Р-S-S-Р» и «Р-S-S-P» в представленной выше общей формуле (V) (для большей удобочитаемости скобки опущены), в которой все S, Р и Р имеют указанные выше значения, как правило, описывают ситуацию, когда одна -SH-группа гидрофильных полимеров Р и Р сконденсирована с одной -SH-группой компонента Р в представленной выше общей формуле (V), где оба атома серы в указанных -SH-группах образуют дисульфидную связь -S-S-, как указано в формуле (V). Указанные -SH-группы, как правило, присутствуют в каждом из гидрофильных полимеров Р и Р, например, присутствуют в локализованном внутри него цистеине или любой другой (модифицированной) аминокислоте или соединении, которая/которое несет -SH-группу. Следовательно, подформулы «Р-S-S-P » и «Р-S-S-P» можно записать также в виде «Р-Cys-Cys-P» и «Р-Cys-Cys-P», если -SH-группа присутствует в цистеине, где понятие Cys-Cys обозначает два цистеина, сцепленных дисульфидной связью, но не пептидной связью. В этом случае понятие «-S-S-» в указанных формулах можно записать также в виде «-S-Cys», в виде «-Cys-S» или в виде «-Cys-Cys-». В этом контексте понятие «-Cys-Cys-» описывает не пептидную связь, а сцепление двух цистеинов через их -SH-группы с образованием дисульфидной связи. Таким образом, понятие «-Cys-Cys-» можно записать также в общем виде как «-(Cys-S)-(S-Cys)-», где в рассматриваемом конкретном случае S обозначает атом серы -SH-группы цистеина. Аналогично этому понятия «-S-Cys» и «-Cys-S» обозначают дисульфидную связь между содержащим -SH-группу фрагментом и цистеином, которые можно записать также как «-S-(S-Cys)» и «-(Cys-S)-S». Альтернативно этому, гидрофильные полимеры Р и Р можно модифицировать -SH-группой, предпочтительно посредством химического взаимодействия с соединением, несущим -SH-группу, так, чтобы каждый из гидрофильных полимеров Р и Р нес по меньшей мере одну -SH-группу. Такое соединение, несущее -SH-группу, может представлять собой, например, (дополнительный) цистеин или любую другую (модифицированную) аминокислоту, которая несет -SH-группу. Такое соединение может представлять собой также отличное от аминокислоты соединение или группу, которое/которая содержит или дает возможность интродуцировать -SH-группу в гидрофильные полимеры Р и Р, представленные в настоящем описании. Такие отличные от аминокислот соединения можно присоединять к гидрофильным полимерам Р и Р полимерного носителя формулы (VI), предлагаемого в настоящем изобретении, посредством химических взаимодействий или путем связывания с соединениями, например, путем связывания с 3-тиопропионовой кислотой или тиоимоланом, путем образования амида (например, карбоновые кислоты, сульфоновые кислоты, амины и т.д.), путем реакции присоединения по Михаэлю (например, малеимидные группы, α,β-ненасыщенные карбонилы и т.д.), с помощью клик-химии (например, азиды или алкины), с помощью метатезиса алкенов/алкинов (например, алкены или алкины), формирования иминов или гидрозонов (альдегиды или кетоны, гидразины, гидроксиламины, амины), реакций комплексообразования (авидин, биотин, белок G) или с компонентами, которые допускают реакции замещения S-типа (например, галогеналканы, тиолы, спирты, амины, гидразины, гидразиды, эфиры сульфоновых кислот, соли оксифосфония) или другими химическими группами, которые можно использовать для присоединения других компонентов. В этом контексте наиболее предпочтительным производным ПЭГ является альфа-метокси-омега-меркапто-поли(этиленгликоль). В каждом случае SH-группа, например, цистеина или любой другой (модифицированной) аминокислоты или соединения, может присутствовать на концах или в любом положении внутри гидрофильных полимеров Р и Р. Как указано в настоящем описании, каждый из гидрофильных полимеров Р и Р, как правило, несет по меньшей мере одну -SH-группу, предпочтительно на одном конце, но может содержать также две или даже большее количество -SH-групп, которые можно использовать для дополнительного присоединения других компонентов, указанных в настоящем описании, предпочтительно других функциональных пептидов или белков, например, лиганда, аминокислотного компонента (АА) или (АА), антител, проникающих в клетку пептидов или энхансерных пептидов (например, ТАТ, KALA) и т.д.
В этом контексте наиболее предпочтительно, если предлагаемая в изобретении мРНК образует комплекс по меньшей мере частично с катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно катионными белками или пептидами. В этом контексте содержание WO 2010/037539 и содержание WO 2012/113513 включены в настоящее описание в качестве ссылки. «Частично» означает, что только часть предлагаемой в изобретении мРНК входит в состав комплекса с катионным соединением и что остальная предлагаемая в изобретении мРНК (входящая в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину) не входит в состав комплекса (т.е. находится в «свободной» форме). Предпочтительно соотношение входящая в комплекс мРНКхвободная мРНК (в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцине) выбирают из диапазона от примерно 5:1 до примерно 1:10 (мас./мас.), более предпочтительно из диапазона от примерно 4:1 до примерно 1:8 (мас./мас.), еще более предпочтительно из диапазона от примерно 3:1 до примерно 1:5 (мас./мас.) или 1:3 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно соотношение входящая в комплекс мРНКхвободная мРНК в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцине, выбирают из соотношения, составляющего примерно 1:1 (мас./мас.).
Входящую в комплекс мРНК, предлагаемую в изобретении, содержащуюся в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцине, предпочтительно получают, формируя на первой стадии комплекс предлагаемой в изобретении мРНК с катионным или поликатионным соединением и/или с полимерным носителем, предпочтительно указанным в настоящем описании, в определенном соотношении для создания стабильного комплекса. В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы после включения в комплекс мРНК не оставалось свободного катионного или поликатионного соединения, или полимерного носителя или чтобы оно/он присутствовал лишь в незначительном количестве в компоненте, содержащем включенную в комплекс мРНК. Следовательно, соотношение между мРНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем в компоненте, представляющем собой включенную в комплекс мРНК, как правило, выбирают таким образом, чтобы мРНК была полностью включена в комплекс и чтобы в композиции не оставалось свободного катионного или поликатионного соединения, или полимерного носителя, или чтобы оно/он присутствовал лишь в незначительном количестве.
Предпочтительно соотношение между мРНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно указанным в настоящем описании, выбирают из диапазона от примерно 6:1 до примерно 0,25:1 (мас./мас.), более предпочтительно от примерно 5:1 до примерно 0,5:1 (мас./мас.), еще более предпочтительно от примерно 4:1 до примерно 1:1 (мас./мас.) или от примерно 3:1 до примерно 1:1 (мас./мас.), и наиболее предпочтительно соотношение составляет от примерно 3:1 до примерно 2:1 (мас./мас.). Альтернативно этому соотношение между мРНК и катионным или поликатионным соединением и/или полимерным носителем, предпочтительно, указанным в настоящем описании, в компоненте, содержащем включенную в комплекс мРНК, можно рассчитывать также на основе соотношения азот/фосфат (N/P-соотношение) для всего комплекса. В контексте настоящего изобретения N/P-соотношение предпочтительно находится в диапазоне примерно 0,1-10, предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-4 и наиболее предпочтительно диапазоне примерно 0,5-2 или 0,7-2 касательно соотношения катионное или поликатионное соединение и/или полимерный носитель: мРНК в комплексе, предпочтительно, указанном в настоящем описании, и наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,7-1,5, 0,5-1 или 0,7-1, и еще наиболее предпочтительно в диапазоне примерно 0,3-0,9 или 0,5-0,9, предпочтительно при условии, что катионное или поликатионное соединение в комплексе представляет собой катионный или поликатионный белок, или пептид и/или полимерный носитель, указанный выше. В этом конкретном варианте осуществления изобретения включенная в комплекс мРНК подпадает также под понятие «адъювантный компонент».
Другим объектом изобретения является композиция, содержащая несколько или больше одной, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 5, наиболее предпочтительно от 2 до 4 предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании. Такие указанные в изобретении композиции содержат более одной предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, которые предпочтительно кодируют различные пептиды или белки, содержащие предпочтительно различные патогенные антигены или их фрагменты, варианты или производные. Наиболее предпочтительным в этом контексте является то, что по меньшей мере одна последовательность мРНК кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из гликопротеина G (RAV-G) вируса бешенства и что по меньшей одна последовательность мРНК кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из другого антигена вируса бешенства, прежде всего нуклеопротеина N (RAV-N).
Таким образом, следующим наиболее предпочтительным объектом настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, которая содержит по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
В качестве первого ингредиента предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере одну предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании.
В качестве второго ингредиента предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может необязательно содержать по меньшей мере один дополнительный фармацевтически активный компонент.В этом контексте фармацевтически активный компонент представляет собой соединение, которое обладает терапевтическим действием с позиций лечения, облегчения или предупреждения конкретного показания или заболевания, указанного в настоящем описании, предпочтительно бешенства. Указанные соединения включают (но, не ограничиваясь только ими) пептиды или белки, предпочтительно указанные в настоящем описании, нуклеиновые кислоты, предпочтительно указанные в настоящем описании, (терапевтически активные) низкомолекулярные органические или неорганические соединения (с молекулярной массой менее 5000, предпочтительно менее 1000), сахара, антигены или антитела, предпочтительно указанные в настоящем описании, терапевтические средства, уже известные из существующего уровня техники, антигенные клетки, антигенные клеточные фрагменты, клеточные фракции; компоненты клеточной оболочки (например, полисахариды), модифицированные, ослабленные или деактивированные (например, химически или путем облучения) патогены (вирус, бактерии и т.д.), адъюванты, предпочтительно указанные в настоящем описании, и т.д. Наиболее предпочтительными в этом контексте являются вакцины против бешенства, например, «Tollwutimpfstoff (HDC) inaktiviert» или Rabipur (рабипур), или иммуноглобулины против бешенства (антирабические иммуноглобулины), например, Merieux Р или Berirab.
Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить орально, парентерально, с помощью спрея для ингаляции, местно, ректально, назально, трансбуккально, вагинально или с помощью имплантируемого резервуара. Понятие «парентеральный» в контексте настоящего описания включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, интрасиновиальную, надчревную, внутриоболочечную, внутрипеченочную, в пораженный участок, внутричерепную, трансдермальную, внутрикожную, внутрилегочную, внутрибрюшинную, внутрисердечную, внутриартериальную и подъязычную инъекцию или инфузию.
Наиболее предпочтительной является внутрикожная и внутримышечная инъекция. Стерильные инъецируемые формы предлагаемых в изобретении фармацевтических композиций могут представлять собой водную или масляную суспензию. Такие суспензии можно приготавливать с помощью методов, известных в данной области, с использованием пригодных диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов.
Предпочтительно предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить с использованием общепринятой техники на основе игольной инъекции или с использованием безыгольной системы, например, струйной инъекции. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить с помощью струйной инъекции, представленной в настоящем описании, предпочтительно внутримышечно или внутрикожно, более предпочтительно внутрикожно.
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать адъювант. В этом контексте под адъювантом можно понимать любое соединение, которое может инициировать или повышать иммунный ответ врожденной иммунной системы, т.е. неспецифический иммунный ответ.Другими словами, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция, когда ее вводят, предпочтительно вызывает врожденный иммунный ответ благодаря адъюванту, который необязательно содержится в ней. Предпочтительно указанный адъювант можно выбирать из адъювантов, известных специалисту в данной области и пригодных для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего, например, выбирать из адъювантного белка, описанного выше, или адъюванта, указанного ниже.
Наиболее предпочтительными в качестве адъювантов, пригодных для запасания и доставки являются катионные или поликатионные соединения, описанные выше в качестве наполнителя, агента для трансфекции или комплексообразования для предлагаемой в изобретении последовательности мРНК.
Кроме того, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать один или несколько дополнительных адъювантов, пригодных для инициации или усиления иммунного ответа врожденной иммунной системы, т.е. неспецифического иммунного ответа, прежде всего посредством связывания с патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (РАМР). Другими словами, при введении фармацевтическая композиция или вакцина предпочтительно вызывает врожденный иммунный ответ благодаря адъюванту, который необязательно содержится в ней. Предпочтительно указанный адъювант можно выбирать из адъювантов, известных специалисту в данной области и пригодных для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего, например, из адъювантного белка, описанного выше, или адъюванта, указанного ниже. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения указанный адъювант можно выбирать из указанного выше адъюванта.
Кроме того, указанный адъювант можно выбирать из адъюванта, известного специалисту в данной области и пригодного для рассматриваемого случая, т.е. для поддержания индукции врожденного иммунного ответа у млекопитающего и/или пригодного для запасания и доставки компонентов предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины. Предпочтительными в качестве пригодных для запасания и доставки адъювантов, являются катионные или поликатионные соединения, указанные выше. Аналогично этому, адъювант можно выбирать из группы, состоящей, например, из катионных или поликатионных соединений, указанных выше, таких как хитозан, TDM, MDP, мурамилдипептид, плюроники, раствор квасцов, гидроксид алюминия, ADJUMER™ (полифосфазен); гель фосфата алюминия;
глюканы, выделенные из водорослей; алгаммулин; гель гидроксида алюминия (квасцы); высокоадсорбирующий белки гель гидроксида алюминия; обладающий низкой вязкостью гель гидроксида алюминия; AF или SPT (эмульсия, содержащая сквалан (5%), Твин 80 (0.2%), плюроник L121 (1,25%), забуференный фосфатом физиологический раствор, рН 7,4); AVRIDINE™ (пропандиамин); BAY R1005™ (N-(2-дезокси-2-L-леуциламиноб-D-глюкопиранозил)-N-октадециламида гидроацетат); CALCITRIOL™ (1-альфа,25-дигидрокси-витамин D3); гель фосфата кальция; САР™ (наночастицы фосфата кальция); холерный голотоксин, слитый белок холерный токсин-А1-белок-A-D-фрагмент, субъединица В холерного токсина; CRL 1005 (блок-сополимер Р1205); содержащие цитокин липосомы; DDA (диметилдиоктадециламмония бромид); DHEA (дегидроэпиандростерон); DMPC (димиристоилфосфатидилхолин); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерин); комплекс DOC/квасцы (натриевая соль дезоксихолиновой кислоты); полный адъювант Фрейнда; неполный адъювант Фрейнда; инулин-гамма; адъювант Гербу (смесь, содержащая: I) N-ацетилглюкозаминил-(Р1-4)-N-ацетилмурамоил-L-аланил-D35 глутамин (GMDP), II) диметилдиоктадециламмония хлорид (DDA), III) комплекс цинк-соль L-пролина (ZnPro-8); GM-CSF); GMDP (N-ацетилглюкозаминил-(b1-4)-N-ацетилмурамил-L47 аланил-D-изоглутамин); имиквимод (1-(2-метилпропил)-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-4-амин); ImmTher™ (N-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-изоGlu-L-Ala-глицерина дипальмитат); DRV (иммунолипосомы, приготовленные из везикул, полученных методом гидратации-регидратации); интерферон-гамма; интерлейкин-1бета; интерлейкин-2; интерлейкин-7; интерлейкин-12; ISCOMSTM; ISCOPREP 7.0.3. ТМ; липосомы; LOXORIBINE™ (7-аллил-8-оксогуанозин); оральный адъювант LT 5 (лабильный энтеротоксин-протоксин из E.coli); микросферы и микрочастицы любого состава; MF59TM; (водная эмульсия сквалена); MONTANIDE ISA 51™ (очищенный неполный адъювант Фрейнда); MONTANIDE ISA 720™ (метаболизируемый масляный адъювант); MPL™ (3-Q-дезацил-4'-монофосфорил-липид А); липосомы МТР-РЕ и МТР-РЕ (N-ацетил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-(гидроксифосфорилокси))этиламид, однонатриевая соль); MURAMETIDE™ (Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3); MURAPALMITINE™ и DMURAPALMITINE™ (Nac-Mur-l-Thr-D-изоGIn-sn-глицериндипальмитоил); NAGO (нейраминидаза-галактозооксидаза); наносферы или наночастицы любого состава; NISV (везикулы из неионогенного поверхностно-активного вещества); PLEURAN™ (β-глюкан); PLGA, PGA и PLA (гомо- и сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты; микросферы/наносферы); ПЛЮРОНИК L121™; РММА (полиметилметакрилат); PODDS™ (протеноидные микросферы); полиэтиленкарбаматные производные; поли-rA:поли-rU (комплекс полиадениловая кислота-полиуридиновая кислота); полисорбат 80 (Твин 80); белковые кохлеаты (фирма Avanti Polar Lipids, Inc., Алабастер, шт. Алабама); STIMULON™ (QS-21); Quil-A (сапонин Quil-A); S-28463 (4-аминоотекдиметил-2-этоксиметил-1Н-имидазо[4,5-с]хинолин-1-этанол); SAF-1™ («композиция адъювантов фирмы Syntex»); протеолипосомы вируса Сендаи и липидные матрицы, содержащие вирус Сендаи; Спан-85 (сорбитантриолеат); Specol (эмульсия Marcol 52, Спан 85 и Твин 85); сквален или Robane (2,6,10,15,19,23-гексаметилтетракозан и 2,6,10,15,19,23-гексаметил-2,6,10,14,18,22-тетракозагексан); стеарилтирозин (октадецилтирозина гидрохлорид); Theramid (М-ацетилглюкозаминил-N-ацетилмурамил-L-Ala-D-isоGlu-l-Ala-дипальмитоксипропиламид); Theronyl-MDP (Termurtide™ или [thr 1]-MDP; N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин); Ту-частицы (Ту-ВПЧ или вирусоподобные частицы); липосомы Уолтера-Рида (липосомы, содержащие липид А, адсорбированный на гидроксиде алюминия) и липопептиды, включая Pam3Cys, прежде всего соли алюминия, такие как адъю-фос (Adju-phos), алгидрогель, регидрагель и т.д., эмульсии, такие как CFA, SAF, IFA, MF59, провакс, TiterMax, монтанид, ваксфектин и т.д., сополимеры, такие как оптивакс (Optivax, CRL1005), L121, полоксамер 4010) и т.д., липосомы, такие как «липосомы-невидимки (Stealth)» и т.д., кохлеаты, такие как BIORAL, и т.д., адъюванты растительного происхождения, такие как QS21, Quil A, Iscomatrix, ISCOM; адъюванты, пригодные для костимуляции, включая томатин, биополимеры, такие как PLG, РММ, инулин и т.д., адъюванты микробного происхождения, такие как ромуртид, DETOX, MPL, CWS, манноза, нуклеотидные последовательности CpG, CpG7909, лиганды человеческого TLR 1-13, ISS-1018, 35 IC31, имидазохинолины, амплиген, Ribi529, IMOxine, IRIV, ВПЧ, холерный токсин, термолабильный токсин, Pam3Cys, флагеллин, GPI (гликозилфосфатидилинозитол)-якорь, LNFPIII/Lewis X, противомикробные пептиды, UC-1V150, слитый белок RSV, cdiGMP; и адъюванты, пригодные в качестве антагонистов, включая нейропептид CGRP.
Адъювант наиболее предпочтительно можно выбирать из адъювантов, которые поддерживают индукцию Th1-иммунного ответа или созревание наивных Т-клеток, таких как GM-CSF, IL-12, IFNg, любой иммуностимулирующей нуклеиновой кислоты, указанной выше, предпочтительно иммуностимулирующей РНК, ДНК CpG и т.д.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать помимо образующей антиген мРНК также другие компоненты, которые выбирают из группы, включающей: другие антигены или другие образующие антиген нуклеиновые кислоты; другой иммунотерапевтический агент; одну или несколько вспомогательных субстанций; или любое другое соединение, в отношении которого известно, что оно обладает иммуностимулирующим действием благодаря его аффинности связывания (как лиганда) с человеческими Толл-подобными рецепторами; и/или адъювантную нуклеиновую кислоту, предпочтительно иммуностимулирующую РНК (isPHK).
Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может дополнительно содержать одну или несколько вспомогательных субстанций, предназначенных для повышения при необходимости иммуногенности или иммуностимулирующей способности. Тем самым предпочтительно достигается синергетическое действие предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, представленной в настоящем описании, и вспомогательной субстанции, которая необязательно может содержаться в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. В зависимости от различных типов вспомогательных субстанций в этом контексте можно рассматривать различные механизмы. Например, соединения, ускоряющие созревание дендритных клеток (ДК), например липополисахариды, TNF-альфа или лиганд CD40, образуют первый класс пригодных вспомогательных веществ. В целом, в качестве вспомогательного вещества можно использовать любой агент, который оказывает влияние на иммунную систему, по механизму «сигнала опасности» (LPS, GP96, и т.п.), или можно использовать цитокины, такие как GM-CSF, которые позволяют целенаправленно усиливать иммунный ответ или целенаправленно влиять на него. Наиболее предпочтительными вспомогательными веществами являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, которые дополнительно стимулируют врожденный иммунный ответ, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, INF-альфа, IFN-бета, INF-гамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-бета или TNF-альфа, факторы роста, такие как hGH.

Другими добавками, которые можно включать в состав фармацевтической композиции, предлагаемой в изобретении, являются эмульгаторы, такие, например, как Tween; смачивающие вещества, такие, например, как лаурилсульфат натрия; красители; улучшающие вкус вещества; фармацевтические носители; наполнители для приготовления таблеток; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты.
Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать также любое дополнительное соединение, у которого известна способность оказывать иммуностимулирующее действие в результате его аффинности связывания (в качестве лиганда) с человеческими Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 или в результате его аффинности связывания (в качестве лиганда) с мышиными Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13.
В этом контексте наиболее предпочтительно, чтобы необязательно входящий в ее состав адъювантный компонент содержал такую же предлагаемую в изобретении мРНК, которая входит в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию в качестве образующей антиген мРНК, например, мРНК, которая кодирует антигенный пептид или белок вируса бешенства, или его фрагменты, варианты или производные.
Кроме того, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может дополнительно содержать компоненты, которые ускоряют введение и поглощение компонентов фармацевтической композиции. Указанные дополнительные компоненты могут представлять собой соответствующий носитель или наполнитель, дополнительные адъюванты, поддерживающие любой иммунный ответ, антибактериальные и/или противовирусные агенты.
Таким образом, в другом варианте осуществления изобретения предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция содержит также фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.
Указанный фармацевтически приемлемый носитель, как правило, включает жидкую или нежидкую основу композиции, содержащую компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. Если композиция находится в жидкой форме, то носитель, как правило, может представлять собой свободную от пирогенов воду; изотонический соляной раствор или забуференные (водные) растворы, например, растворы, забуференные фосфатом, цитратом и т.д. Предназначенный для инъекции буфер может быть гипертоническим, изотоническим или гипотоническим относительно конкретной референс-среды, т.е. содержание в буфере солей может быть выше, идентичным или ниже их содержания в конкретной референс-среде, при этом предпочтительно можно применять такие концентрации вышеуказанных солей, которые не приводят к повреждению клеток в результате осмоса или других связанных с концентрацией воздействий. Референс-среды могут представлять собой, например, жидкости, применяемые в методах «in vivo», такие как кровь, лимфа, цитозольные жидкости или другие жидкости организма, или, например, жидкости, которые можно использовать в качестве референс-сред в методах «ш vitro», такие как обычные буферы или жидкости. Указанные обычные буферы или жидкости известны специалисту в данной области. Наиболее предпочтительной жидкой основой является лактированный раствор Рингера.
Однако в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно использовать также один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей или разбавителей или капсулирующих соединений, которые можно применять для введения пациенту, подлежащему лечению. Понятие «совместимые» в контексте настоящего описания означает, что указанные компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно смешивать с компонентами предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции таким образом, чтобы не происходило взаимодействие, которое могло бы существенно снижать фармацевтическую эффективность фармацевтической композиции в обычных условиях применения.
Дополнительным компонентом предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции может быть иммунотерапевтический агент, который можно выбирать из иммуноглобулинов, предпочтительно IgG-типа, моноклональных или поликлональных антител, поликлональной сыворотки или сывороток и т.д., наиболее предпочтительно из иммуноглобулинов против вируса бешенства, например, Merieux Р или Berirab. Предпочтительно указанный дополнительный иммунотерапевтический агент может находиться в виде пептида/белка или может кодироваться нуклеиновой кислотой, предпочтительно ДНК или РНК, наиболее предпочтительно мРНК. Указанный иммунотерапевтический агент позволяет осуществлять пассивную вакцинацию в дополнение к активной вакцинации, которая запускается предлагаемой в изобретении образующей антиген мРНК.
Кроме того, согласно конкретному варианту осуществления изобретения помимо образующей антиген мРНК в предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно включать дополнительные антигены, и они, как правило, представляют собой такие субстанции как клетки, клеточные лизаты, вирусы, ослабленные вирусы, инактивированные вирусы, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты или другие био- или макромолекулы или их фрагменты. Предпочтительно антигены могут представлять собой белки и пептиды или их фрагменты, такие как эпитопы указанных белков или пептидов, предпочтительно содержащие от 5 до 15, более предпочтительно от 6 до 9 аминокислот.В частности, указанные белки, пептиды или эпитопы могут происходить из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина N (RAV-N), фосфопротеина Р (RAV-P), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы L (RAV-L) вируса бешенства или из их фрагментов, вариантов или производных. Кроме того, антигены могут содержать также любую другую биомолекулу, например, липиды, углеводы и т.д. Предпочтительно антиген представляет собой белок или (поли-)пептидный антиген, нуклеиновую кислоту, нуклеиновую кислоту, которая кодирует белковый или (поли-)пептидный антиген, полисахаридный антиген, конъюгат полисахаридного антигена, липидный антиген, гликолипидный антиген, углеводный антиген, бактерию, клетку (вакцина) или убитый или ослабленный вирус.В этом контексте наиболее предпочтительным является добавление вакцин против бешенства, содержащих инактивированный вирус, например, вакцины рабипур, содержащей инактивированный штамм вируса бешенства Flury-LEP или «inaktivierter (HDC) Tollwutimpfstoff», содержащей инактивированный штамм вируса бешенства WISTAR PM/WI 38-1503-ЗМ.

Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция или вакцина, указанная в настоящем описании, может содержать также другие добавки или дополнительные соединения. Другие добавки, которые можно включать в фармацевтическую композицию, представляют собой эмульгаторы, такие, например, как Tween; смачивающие вещества, такие, например, как лаурилсульфат натрия; красители; улучшающие вкус вещества; фармацевтические носители; наполнители для приготовления таблеток; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; ингибиторы РНКазы и/или противобактериальный или антивирусный агент.Кроме того, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать малую интерферирующую РНК (siPHK), мишенью которой являются гены вируса бешенства, например, siPHK, мишенью которой является ген, кодирующий гликопротеин G (RAV-G), нуклеопротеин N (RAV-N), фосфопротеин Р (RAV-P), матриксный белок (RAV-M) или РНК-полимеразу вируса бешенства.
Предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция, как правило, содержит в «безопасном и эффективном количестве» компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, прежде всего предлагаемую(ые) в изобретении последовательность(и) мРНК, указанной(ых) в настоящем описании. В контексте настоящего описания под «безопасным и эффективным количеством» подразумевается количество предлагаемой(ых) в изобретении последовательности(ей) мРНК, указанной(ых) в настоящем описании, которое является достаточным для значимой индукции положительной модификации или предупреждения заболевания или нарушения, указанного в настоящем описании. Однако в то же время «безопасное и эффективное количество» является достаточно небольшим, чтобы избегать серьезных побочных действий и обеспечивать разумное соотношение между преимуществом и риском.
Определение этих пределов, как правило, находится в компетенции осуществляющего лечение врача.
Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно применять для лечения человека, а также для целей медицинской ветеринарии, предпочтительно в медицине для лечения человека в общем случае в виде фармацевтической композиции или в виде вакцины.
Согласно другому наиболее предпочтительному объекту изобретения предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию (или предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании) можно получать или применять в качестве вакцины. Как правило, указанная вакцина представляет собой вакцину, указанную выше при описании фармацевтической композиции. Кроме того, указанная вакцина, как правило, содержит предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, которая содержит несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемых в настоящем описании.
Предлагаемая в изобретении вакцина может содержать также фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или наполнитель, указанные в настоящем описании для предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. В конкретном варианте предлагаемой в изобретении вакцины выбор фармацевтически приемлемого носителя определяют в основном в зависимости от пути введения предлагаемой в изобретении вакцины. Предлагаемую в изобретении вакцину можно применять, например, системно или локально. Пути системного введения в целом включают, например, трансдермальный, оральный, парентеральный пути, включая подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, внутрикожные и внутрибрюшинные инъекции и/или интраназальный путь введения. Пути локального применения в целом включают, например, местные пути нанесения, но также и внутрикожные, чрескожные, подкожные или внутримышечные инъекции или инъекции в область повреждения, внутричерепную, внутрилегочную, внутрисердечную и подъязычную инъекции.
Более предпочтительно вакцины можно применять внутрикожным, подкожным или внутримышечным путем. Таким образом, предлагаемые в изобретении вакцины предпочтительно приготавливать в форме жидкости (или иногда в твердой форме).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить с использованием общепринятой техники на основе игольной инъекции или с использованием безыгольной, например, струйной инъекции. В предпочтительном варианте осуществления изобретения предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить с помощью струйной инъекции, представленной в настоящем описании, предпочтительно внутримышечно или внутрикожно, более предпочтительно внутрикожно.
Предлагаемая в изобретении вакцина может дополнительно содержать одну или несколько вспомогательных субстанций, предназначенных для повышения при необходимости иммуногенности или иммуностимулирующей способности. Наиболее предпочтительными в качестве вспомогательных субстанций или добавок являются адъюванты, описанные для фармацевтической композиции.
Следующим объектом изобретения является набор или набор компонентов, содержащий компоненты в виде предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины, и необязательно технические инструкции с информацией о введении и дозировании компонентов.
Помимо компонентов, представляющих собой предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, предлагаемую в изобретении композицию или вакцину, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, набор может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, адъювант и по меньшей мере один дополнительный компонент, указанный в настоящем описании, а также средства для введения и технические инструкции. Компоненты в виде предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины и, например, адъювант, могут находиться в лиофилизированной форме. В предпочтительном варианте осуществления изобретения перед применением набора для вакцинации к лиофилизированным компонентам добавляют указанный наполнитель в предварительно определенном количестве, которое прописано, например, в прилагаемых технических инструкциях. Путем осуществления указанной процедуры получают предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину, которые описаны в представленных выше объектах изобретения, которые после этого можно применять также в описанном выше способе.
В настоящем изобретении предложено также несколько вариантов применения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины, которые все содержат предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или содержащих их наборов.
Следующим объектом изобретения является последовательность мРНК, кодирующая по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, и композиция, фармацевтическая композиция, вакцина и набор, которые все содержат последовательность мРНК, предназначенные для применения в способе профилактического (предконтактной профилактики или постконтактной профилактики) и/или терапевтического лечения инфекций, вызываемых вирусом бешенства (бешенство (рабиес)). Следовательно, следующим объектом настоящего изобретения является первое медицинское применение предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины и предлагаемого в изобретении набора, которые указаны в настоящем описании, в качестве лекарственного средства. В частности, в изобретении предложено применение последовательности мРНК, кодирующей по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, которые указаны выше, для приготовления лекарственного средства.
Другим объектом настоящего изобретения является второе медицинское применение последовательности мРНК, кодирующей по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, которые указаны выше, необязательно в форме композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, фармацевтической композиции или вакцины, набора или набора компонентов, для лечения вызываемых вирусом бешенства (бешенство (рабиес)), указанных в настоящем описании. В частности, последовательность мРНК, кодирующая по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, подлежащая применению в способе, указанном выше, представляет собой последовательность мРНК, приготовленную в сочетании с фармацевтически приемлемым наполнителем и необязательно дополнительным адъювантом и необязательным дополнительным другим компонентом, которые указаны выше, например, дополнительным антигеном или иммуноглобулином против бешенства.
В этом контексте последовательность мРНК, применяемую для постконтактного лечения заражения вирусом бешенства, согласно изобретению можно объединять с введением иммуноглобулина против бешенства.
В альтернативном варианте предлагаемую в изобретении последовательность мРНК можно получать в такой форме, которая позволяет вводить ее для предупреждения или лечения бешенства с использованием нескольких доз, где каждая доза содержит предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, кодирующую по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства или его фрагмент, вариант или производное, например, первая доза содержит по меньшей мере одну мРНК, кодирующую по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из гликопротеина G (RAV-G) (или его фрагменты, варианты или производные), а вторая доза содержит по меньшей мере одну последовательность мРНК, кодирующую по меньшей мере один антигенный пептид или белок, происходящий из другого антигена вируса бешенства, предпочтительно из нуклеопротеина N (RAV-N) (или его фрагменты, варианты или производные). Согласно этому варианту осуществления изобретения обе дозы вводят поочередно, т.е. последовательно, через короткий промежуток времени один за другим, например, в пределах менее 10 мин, предпочтительно менее 2 мин, и в одну и ту же область организма для достижения такого же иммунологического действия, которое достигается при однократном введении одной композиции, которая содержит обе мРНК, например, мРНК, которая кодирует гликопротеин G (RAV-G), и мРНК, которая кодирует нуклеопротеин N (RAV-N).
Согласно конкретному варианту осуществления изобретения предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину можно вводить пациенту в виде единичной дозы или по меньшей мере одной единичной дозы соответственно. В некоторых вариантах осуществления изобретения предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину можно вводить пациенту в виде единичной дозы с последующим введением второй дозы и необязательно даже третьей, четвертой (или еще большего количества) последующих доз и т.д. Согласно этому варианту осуществления изобретения бустерные инокуляции предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины можно вводить пациенту через конкретные интервалы времени, предпочтительно указанные ниже, после второй (или третьей, четвертой и т.д.) инокуляции. Предпочтительно вводят по меньшей мере одну дозу предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, фармацевтической композиции или вакцины, предпочтительно от 1 до 10 доз, более предпочтительно от 2 до 7 доз, еще более предпочтительно от 2 до 5 доз и наиболее предпочтительно от 3 до 5 доз. В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения вводят 3 дозы. В другом варианте осуществления изобретения вводят 5 доз. В этом контексте особенно предпочтительным является, если несколько доз содержат такую же последовательность мРНК, которая кодирует такой же антигенный пептид или белок вируса бешенства, например, гликопротеин G (RAV-G). Согласно этому варианту осуществления изобретения дозы вводят в течение конкретного периода времени, например, составляющего 20-30 или 20-60 дней. Интервал между введением двух или большего количества доз предпочтительно составляет от 5 до 120 дней, более предпочтительно от 7 до 15 дней или от 15 до 30 дней. В предпочтительном варианте осуществления изобретения интервал между введением двух или большего количества доз составляет по меньшей мере 7 дней, более предпочтительно 28 дней. Например, для постконтактной профилактики по меньшей мере 5 доз предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины можно вводить в течение 20-30 дней. Например, для профилактической обработки без контакта с вирусом бешенства можно вводить по меньшей мере 3 дозы предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины в течение 20-60 дней.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения единичная доза предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины содержит конкретное количество мРНК, предлагаемой в изобретению. Предпочтительно предлагаемую в изобретении последовательность мРНК применяют в количестве, составляющем по меньшей мере 40 мкг на дозу, предпочтительно в количестве от 40 до 700 мкг на дозу, наиболее предпочтительно в количестве от 80 до 400 мкг на дозу. Более конкретно в случае внутрикожной инъекции, которую предпочтительно осуществляют с использованием с использованием общепринятой игольной инъекции, количество предлагаемой в изобретении последовательности мРНК в единичной дозе составляет, как правило, по меньшей мере 200 мкг, предпочтительно от 200 до 1000 мкг, более предпочтительно от 300 до 850 мкг, еще более предпочтительно от 300 до 700 мкг.В случае внутрикожной инъекции, которую предпочтительно осуществляют с помощью струйной инъекции (например, с помощью устройства Tropis), количество предлагаемой в изобретении последовательности мРНК в единичной дозе составляет, как правило, по меньшей мере 80 мкг, предпочтительно от 80 до 700 мкг, более предпочтительно от 80 до 400 мкг.Кроме того, в случае внутримышечной инъекции, которую предпочтительно осуществляют с помощью общепринятой игольной инъекции или с помощью струйной инъекции, количество предлагаемой в изобретении последовательности мРНК в единичной дозе составляет, как правило, по меньшей мере 80 мкг, предпочтительно от 80 до 1000 мкг, более предпочтительно от 80 до 850 мкг, еще более предпочтительно от 80 до 700 мкг.
Более конкретно, наиболее предпочтительными являются следующие конкретные варианты осуществления изобретения, согласно которым:
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутрикожно, в трех дозах (40 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутрикожно, в трех дозах (80 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутрикожно, в трех дозах (160 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутрикожно, в трех дозах (320 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутрикожно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (40 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутрикожно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (80 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутрикожно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (160 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутрикожно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (320 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно, в трех дозах (40 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно, в трех дозах (80 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно, в трех дозах (160 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно, в трех дозах (320 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно, в трех дозах (640 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (40 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (80 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (160 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
- предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (320 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения,
предлагаемую в изобретении последовательность мРНК или предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или вакцину вводят пациенту, предпочтительно внутримышечно с помощью струйной инъекции, в трех дозах (640 мкг/дозу), предпочтительно в течение 20-60 дней, например, в день 0, 7 и 28 или в день 0, 28 и 56 лечения.
В некоторых вариантах осуществления изобретения при осуществлении указанных бустерных инокуляций предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины, описанной выше (при осуществлении второй, третьей и т.д. вакцинации) можно применять дополнительное соединение или компонент, описанный для предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или вакцины, которые указаны в настоящем описании.
Следующим объектом настоящего изобретения является также способ экспрессии кодируемого антигенного пептида или белка, происходящего из гликопротеина G (RAV-G), нуклеопротеина N (RAV-N), фосфопротеина Р (RAV-Р), матриксного белка (RAV-M) или РНК-полимеразы L (RAV-L) вируса бешенства, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых а) получают предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, б) интродуцируют или вносят предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную в настоящем описании, или предлагаемую в изобретении композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, в экспрессионную систему, например, бесклеточную экспрессионную систему, клетку (например, обеспечивающую экспрессию клетку-хозяина или соматическую клетку), ткань или организм. Способ можно применять для лабораторных опытов, в исследовательских целях, для диагностики, для коммерческого получения пептидов или белков и/или для терапевтических целей. В этом контексте, как правило, после получения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, их, как правило, интродуцируют или вносят в бесклеточную экспрессионную систему, клетку (например, обеспечивающую экспрессию клетку-хозяина или соматическую клетку), ткань или организм, например, в оголенной или входящей в комплекс форме или в виде фармацевтической композиции или вакцины, указанной в настоящем описании, предпочтительно путем трансфекции или с использованием любого из путей введения, указанных в настоящем описании. Способ можно осуществлять in vitro, in vivo или ex vivo. Способ можно осуществлять также в контексте лечения конкретного заболевания, прежде всего лечения инфекционных болезней, предпочтительно бешенства, как указано в настоящем описании.
В этой связи в контексте настоящего описания к методу in vitro относится трансфекция или трансдукция предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, в клетки в культуре вне организма; в контексте настоящего описания к методу in vivo относится трансфекция или трансдукция предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, в клетки путем введения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК или предлагаемой в изобретении композиции, в целый организм или в индивидуума.
Аналогично этому, другим объектом настоящего изобретения является также применение предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, предпочтительно для диагностических или терапевтических целей, для экспрессии кодируемого антигенного пептида или белка, например, путем интродукции или вносения в бесклеточную экспрессионную систему, клетку (например, обеспечивающую экспрессию клетку-хозяина или соматическую клетку), ткань или организм. Применение может включать лабораторные опыты, исследовательские цели, диагностику, коммерческое получение пептидов или белков и/или терапевтическое применение. В этом контексте, как правило, после получения предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, или предлагаемой в изобретении композиции, содержащей несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, указанных в настоящем описании, их, как правило, интродуцируют или вносят в бесклеточную экспрессионную систему, клетку (например, обеспечивающую экспрессию клетку-хозяина или соматическую клетку), ткань или организм, например, в оголенной или входящей в комплекс форме или в виде фармацевтической композиции или вакцины, указанной в настоящем описании, предпочтительно путем трансфекции или с использованием любого из путей введения, указанных в настоящем описании. Применение можно осуществлять in vitro, in vivo или ex vivo. Применение можно осуществлять также в контексте лечения конкретного заболевания, прежде всего для лечения инфекций, вызываемых вирусом бешенства.
Другим объектом изобретения является способ лечения или профилактики вызываемых вирусом бешенства инфекций, заключающийся в том, что осуществляют стадии, на которых:
а) получают предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, композицию, содержащую несколько предлагаемых в изобретении последовательностей мРНК, фармацевтическую композицию или набор, или набор компонентов, содержащий предлагаемую в изобретении последовательность мРНК, указанную выше;
б) вносят или интродуцируют последовательность мРНК, композицию, фармацевтическую композицию или набор, или набор компонентов в ткань или организм;
в) необязательно вводят иммуноглобулин против вируса бешенства.
В целом, некоторыми объектами изобретения является последовательность мРНК, содержащая кодирующую область, которая кодирует по меньшей мере один антигенный пептид или белок вируса бешенства. Предлагаемая в изобретении последовательность мРНК предназначена для применения в способе профилактического и/или терапевтического лечения инфекций, вызываемых вирусами бешенства. Таким образом, изобретение относится к последовательности мРНК, указанной в настоящем описании, предназначенной для применения в способе профилактического и/или терапевтического лечения вызываемых вирусом бешенства инфекций.
В настоящем изобретении, если не указано иное, то, если это возможно, различные особенности альтернатив и вариантов осуществления изобретения можно объединять друг с другом. Кроме того, понятие «содержащий» не должно ограничиваться значением «состоящий из», если специально не указано иное. Однако в контексте настоящего изобретения понятие «состоящий из» является вариантом, который в данном изобретении рассматривается как подпадающий под понятие «содержащий», когда в контексте настоящего описания используется понятие «содержащий».
Все публикации, патенты и заявки на патент, процитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылки, как если бы каждая индивидуальная публикация или заявка на патент была специально и индивидуально включена в качестве ссылки. Хотя вышеуказанное изобретение было достаточно подробно описано для целей более ясного понимания с помощью иллюстраций и примера, обычным специалистам в данной области должно быть очевидно в свете доктрины настоящего изобретения, что могут быть сделаны определенные изменения и модификации без отклонения от сущности или объема, которые определяются прилагаемой формулой изобретения.
Краткое описание чертежей
Приведенные ниже чертежи представлены исключительно в качестве иллюстрации и служат для дополнительного описания настоящего изобретения. Указанные чертежи не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
На чертежах показано:
на фиг. 1 - последовательность мРНК R2403, представленная в SEQ ID NO: 24, которая содержит кодирующую область с оптимизированным содержанием G/C, которая кодирует гликопротеин G вируса бешенства (RAV-G), 3'UTR-элемент muag, представленный в SEQ ID NO: 22, поли(А)-последовательность, состоящую из 64 аденозинов, поли(С)-последовательность, состоящую из 30 цитозинов, и последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», представленную в SEQ ID NO: 27, содержащаяся в мРНК-вакцине на основе RAV-G;
на фиг. 2 - последовательность мРНК R2507, представленная в SEQ ID NO: 25, которая содержит 5'UTR-элемент, содержащий последовательность РНК, которая соответствует нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16, кодирующую область с оптимизированным содержанием G/C, которая кодирует гликопротеин G вируса бешенства (RAV-G), 3'UTR-элемент альбумина7, представленный в SEQ ID NO: 18, поли(А)-последовательность, состоящую из 64 аденозинов, поли(С)-последовательность, состоящую из 30 цитозинов, и последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля», представленную в SEQ ID NO: 27, содержащаяся в мРНК-вакцине на основе RAV-G;
на фиг. 3 - данные, демонстрирующие, что трансфекция клеток HeLa мРНК R2403, которая кодирует белок RAV-G, приводит к экспрессии кодируемого белка RAV-G на клеточной поверхности и что белок распознается антителом к RAV-G. Конструкция R2429, кодирующая белок НА вируса гриппа штамма А/Нидерланды/602/2009, служила в качестве отрицательного контроля наряду с нетрансфектированными клетками. Через 24 ч после трансфекции белка RAV-G окрашивали специфическим в отношении вируса бешенства антителом и меченным с помощью ФИТЦ вторичным антителом и анализировали с помощью FACS согласно методу, описанному в примере 2;
на фиг. 4 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G являлась иммуногенной для мышей и индуцировала высокие титры нейтрализующих антител, сопоставимые с титрами, полученными при применении лицензированных вакцин.
Самкам мышей линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе RAV-G (80 мкг R2403) или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера. Двум группам инъецировали внутримышечно (i.m.) 1/10 от применяемой для человека дозы лицензированных вакцин Rabipur и HDC соответственно. Всем животным делали бустер-инъекции в день 21 и собирали образцы крови в день 35 для определения титров нейтрализующих вирус бешенства антител согласно методу, описанному в примере 3.
(А) мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала титры нейтрализующих антител, сопоставимые с титрами, полученными при применении вакцин HDC и Rabipur, которые значительно превышали стандарт ВОЗ, соответствующий 0,5 МЕ/мл. Линия на графике соответствует медианному значению (n=8 мышей/группу).
(Б) мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала долговременные титры нейтрализующих антител у мышей, которые значительно превышали 0,5 МЕ/мл;
+
на фиг. 5 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала антигенспецифические CD8-Т-клетки.
Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 4, и Т-клетки анализировали в отношении антигенспецифической индукции цитокинов по окрашиванию внутриклеточных цитокинов. Линия на графике соответствует медианному значению (n=8 мышей/группу);
+
на фиг. 6 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала антигенспецифические CD4-Т-клетки со значительно более высокой частотой, чем Rabipur.
Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 4, и Т-клетки анализировали по окрашиванию внутриклеточных цитокинов. Линия на графике соответствует медианному значению (n=8 мышей/группу). Статистические различия между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни;
на фиг. 7 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала зависящий от дозы ответ в виде антител (вирус-нейтрализующих антител) у мышей линии C57BL/6, что свидетельствует о наличии зависимости ответа от дозы мРНК RAV-G и индукции функциональных антител.
Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 5, с определением титров вирус-нейтрализующих антител (МЕ/мл). Линия на графике соответствует медианному значению (n=8 мышей/группу). Статистический анализ: дисперсионный анализ (критерий Крускала-Уоллиса), **: р≤0,01; *: р≤0,05;
на фиг. 8 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G защищала мышей от летального контрольного заражения вирусом бешенства.
Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 6.
(А) Выживание зараженных бешенством мышей. Все мыши, вакцинированные мРНК RAV-G или Rabipur, оказались защищенными от летального контрольного заражения, при этом не обнаружена потеря веса тела.
(Б) Кинетика изменения веса тела у зараженных бешенством мышей. У нескольких мышей, вакцинированных HDC-вакциной, обнаружено снижение веса тела, и у одной мыши был достигнут установленный критерий конечной точки, поэтому ее участие в эксперименте было прекращено до окончания опыта;
на фиг. 9 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G защищала мышей от летального контрольного заражения вирусом бешенства. - влияние схемы иммунизации.
Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 6.
(А) Выживание зараженных бешенством мышей. (Б) Кинетика изменения веса тела у зараженных бешенством мышей.
Мышей, которых вакцинировали трижды, используя мРНК-вакцину на основе RAV-G, с одно- или трехнедельными интервалами между вакцинациями, оказалась защищенными от гибели и потери веса тела, что свидетельствует о том, что вакцинации мРНК RAV-G не ограничена фиксированной схемой иммунизации. Кроме того, уже двух вакцинаций с использованием мРНК RAV-G оказалось достаточно для защиты мышей от летального контрольного заражения на основе таких показателей, как защита от гибели или потеря веса тела;
на фиг. 10 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G является стабильной и иммуногенной после хранения в течение 6 месяцев при 40°С или 1 месяца при 60°С.
Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 7.
(А) Титр вирус-нейтрализующих антител. Вакцина оказалась все еще полностью иммуногенной после хранения в течение 6 месяцев при температуре вплоть до 40°С или 1 месяца при 60°С.
(Б) Выживание иммунизированных мышей. Вакцина все еще полностью сохраняла защитное действие после хранения в течение 6 месяцев при температуре вплоть до 40°С или 1 месяца при 60°С;
на фиг. 11 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала защитный иммунный ответ у взрослых свиней.
Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 8.
У свиней, вакцинированных мРНК RAV-G, обнаружен функциональный гуморальный ответ, существенно превышающий стандарт ВОЗ, соответствующий 0,5 МЕ/мл;
на фиг. 12 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала значительные титры вирус-нейтрализующих антител у новорожденных поросят, сопоставимые с титрами, индуцируемыми эталонной вакциной (Rabipur).
Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 9.
(А) Кинетика титров вирус-нейтрализующих антител (средние значения и стандартное отклонение, СКО).
(Б) Титры вирус-нейтрализующих антител через 2 недели после бустер-вакцинации
на фиг. 13 - данные, демонстрирующие, что мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала титры вирус-нейтрализующих антител у мышей после внутримышечной инъекции. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 10;
на фиг. 14 - данные, демонстрирующие индукцию титров вирус-нейтрализующих антител у мышей после внутрикожной вакцинации мРНК-вакциной на основе RAV-G. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 11;
на фиг. 15 - данные, демонстрирующие индукцию титров вирус-нейтрализующих антител у домашних свиней после внутрикожной вакцинации мРНК-вакциной на основе RAV-G. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 12;
на фиг. 16 - данные, демонстрирующие индукцию титров вирус-нейтрализующих антител у домашних свиней после внутримышечной вакцинации мРНК-вакциной на основе RAV-G. Эксперимент осуществляли согласно методу, описанному в примере 13.
Примеры
Приведенные ниже примеры представлены исключительно в качестве иллюстрации и служат для дополнительного описания настоящего изобретения. Указанные примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1: Получение мРНК-вакцины против бешенства
1. Получение конструкций ДНК и мРНК
Для рассматриваемых примеров получали последовательности ДНК, кодирующие гликопротеин G (RAV-G) пастеровского вакцинного штамма, и применяли для последующей транскрипции in vitro. Соответствующие последовательности мРНК RAV-G(GC)-muag-A64-C30-гистонSL (R2403) и 32L-RAV-G(GC)-aльбyмин7-A64-C30-гиcтoнSL (R2507) представлены на фиг. 1 и 2 в SEQ ID NO: 24 и 25.
2. Транскрипция in vitro
7

Соответствующие ДНК-плазмиды, полученные согласно процедуре, описанной в разделе 1, транскрибировали in vitro с помощью полимеразы Т7 в присутствии аналога кэпа (m GpppG). Затем мРНК очищали с помощью PureMessenger (фирма CureVac, Тюбинген, Германия: WO 2008/077592А1).
Последовательность мРНК RAV-G(GC)-muag-A64-C30-гистонSL (R2403; SEQ ID NO: 24) содержала в 5'→3' направлении:
а.) структуру 5'-кэпа, состоящую из m7GpppN;
б.) кодирующую область с увеличенным до максимума содержанием G/C, которая кодирует полноразмерный белок RAV-G пастеровского вакцинного штамма, представленную в SEQ ID NO: 1;
в.) 3'UTR-элемент, происходящий из гена альфа-глобина, который содержит последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 22;
г.) поли(А)-последовательность, содержащую 64 аденозина;
д.) поли(С)-последовательность, содержащую 30 цитозинов; и
е.) гистоновую структуру типа «стебель-петля», содержащую последовательность РНК, представленную в SEQ ID NO: 27.
Понятие «R2403» в контексте настоящего описания относится к последовательности мРНК, которая описывается последовательностью SEQ ID NO: 24. мРНК «R2403» может находиться в лиофилизированной форме, которую предпочтительно применяют для хранения и/или транспортировки предлагаемой в изобретении последовательности мРНК, или может находиться в растворенной в соответствующей жидкости форме. Перед введением индивидууму мРНК, имеющую SEQ ID NO: 24, если она находится в лиофилизированной форме, как правило, восстанавливают в соответствующей указанной в настоящем описании жидкости, предпочтительно в лактате Рингера, с получением жидкой композиции.
Последовательность мРНК 32L-RAV-G(GC)-альбумин7-А64-С30-гистонSL (R2507) содержала в 5'→3' направлении:
а.) структуру 5'-кэпа, состоящую из m7GpppN;
б.) 5'UTR-элемент, содержащий последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO. 16;
в.) кодирующую область с увеличенным до максимума содержанием G/C, которая кодирует полноразмерный белок RAV-G пастеровского вакцинного штамма, представленную в SEQ ID NO: 1;
г.) 3'UTR-элемент, содержащий последовательность РНК, соответствующую нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 18;
д.) поли(А)-последовательность, содержащую 64 аденозина;
е.) поли(С)-последовательность, содержащую 30 цитозинов; и
ж.) гистоновую структуру типа «стебель-петля», содержащую последовательность РНК, представленную в SEQ ID NO: 27.
3. Реагенты
Комплексообразующий реагент: протамин
4. Получение вакцины
мРНК R2403 или R2507 включaли в комплекс с протамином путем добавления протамина к мРНК в соотношении 1:2 (мас./мас.) (адъювантный компонент). После инкубации в течение 10 мин добавляли в таком же количестве свободную мРНК R2403 или R2507, используемую в качестве образующей антиген мРНК.
Пример 2: Характеризация in vitro мРНК, кодирующей белок G вируса бешенства (RAV-G)
Клетки линии HeLa высевали в 6-луночный планшет с плотностью 300000 клеток/лунку в среду для культуры клеток (RPMI, 10% FCS, 1% L-глутамина, 1% Pen/Strep) за 24 ч до трансфекции. HeLa-клетки трансфектировали, используя Lipofectamine 2000 (фирма Invitrogen), 5 мкг мРНК, кодирующей RAV-G (R2403), или мРНК, кодирующей белок НА вируса гриппа А/Нидерланды/602/2009 (R2429), в качестве отрицательного контроля, и окрашивали через 24 ч после трансфекции специфическим в отношении вируса бешенства антителом (фирма HyTest Ltd; №11/06-R7-C5) и меченным с помощью ФИТЦ козьим антимышиным антителом IgG-типа (фирма Invitrogen, №871942А) и анализировали с помощью проточной цитометрии (FACS). Данные, полученные с помощью проточной цитометрии, количественно оценивали с использованием программы FlowJo.
На фиг. 3 продемонстрировано, что белок RAV-G, как и ожидалось для G-белка вируса бешенства, экспрессировался на поверхности трансфектированных клеток и поддавался определению с помощью антитела к вирусу бешенства.
Пример 3: Индукция гуморального иммунного ответа с помощью мРНК-вакцины на основе RAV-G
Иммунизация
В день ноль мышам линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину, содержащую мРНК, которая кодирует гликопротеин G вируса бешенства (RAV-G) (R2403 согласно примеру 1; 80 мкг/мышь/день вакцинации) или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера. Двум контрольным группам инъецировали внутримышечно (i.m.) 1/10 человеческой дозы лицензированных вакцин Rabipur (фирма Novartis) и HDC (вакцина на основе человеческих диплоидных клеток, фирма Sanofi Pasteur MSD GmbH) соответственно. Всем животным делали бустерные инъекции в день 21 и образцы крови собирали в день 35 для определения титров вирус-нейтрализующих антител.
Для оценки долговременной кинетики иммунного анти-RAV-G ответа образцы крови отбирали из группы 1 через 15, 29, 38 и 48 недель и определяли титры вирус-нейтрализующих антител.
Лицензированные вакцины против бешенства Rabipur (фирма Novartis) и HDC (вакцина на основе человеческих диплоидных клеток, фирма Sanofi Pasteur MSD GmbH) содержат инактивированный вирус бешенства.
Анализ нейтрализации вируса
50
2
2
5
Определение гуморального иммунного ответа в виде вирус-нейтрализующих антител (специфический В-клеточный иммунный ответ) осуществляли с использованием анализа нейтрализации вируса. Результат указанного анализа обозначали как титр вирус-нейтрализующих антител (VNT). Согласно стандартам ВОЗ титр антитела рассматривается в качестве обеспечивающего защитное действие, если соответствующий VNT составляет по меньшей мере 0,5 МЕ/мл. Для этой цели отбирали образцы крови у вакцинированных мышей в день 35 и вакцинированных людей в день 42 или в указанный момент времени после вакцинации и получали сыворотку. Указанную сыворотку применяли для осуществления реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), используя клеточную культуру, адаптированную для применяемого для контрольного заражения штамма (CVS) вируса бешенства, рекомендованного OIE (Международное бюро по борьбе с эпизоотиями) (Всемирная организация по охране здоровья животных), и впервые описанного у Cliquet F., Aubert М. и Sagne L., J. Immunol.Methods, 212, 1998, cc. 79-87. В целом, метод состоял в следующем: инактивированную тепловой обработкой сыворотку следует тестировать в четырех повторностях в виде серийных двукратных разведений в четырех повторностях в отношении способности нейтрализовать 100 TCID (дозы, инфицирующие 50% культуры ткани) CVS в объеме 50 мкл. Для этого разведения сыворотки инкубировали с вирусом в течение 1 ч при 37°С (влажная камера с 5% CO) и затем добавляли трипсинизированные ВНК-21-клетки (4×10 клеток/мл; 50 мкл на лунку). Зараженную клеточную культуру инкубировали в течение 48 ч во влажной камере при 37°С и 5% СО. Заражение клеток анализировали после фиксации клеток с использованием 80% ацетона при комнатной температуре, используя конъюгат ФИТЦ-антитело к вирусу бешенства. Планшеты дважды промывали в ЗФР и избыток ЗФР удаляли. Клеточные культуры классифицировали в качестве позитивных или негативных в отношении присутствия вируса бешенства. Наличие в обработанных лунках клеток, классифицированных как негативные, свидетельствовало о нейтрализации вируса бешенства. В каждый FAVN-тест включали стандартную согласно ВОЗ или OIE сыворотку (сыворотка, представляющая собой положительный контроль), которая служила в качестве контроля для стандартизации анализа. Нейтрализующую активность тестируемой сыворотки рассчитывали относительно стандартной сыворотки, предоставленной ВОЗ, и выражали в виде международных единиц/мл (МЕ/мл). Результаты
Как продемонстрировано на фиг. 4А, мРНК-вакцина на основе RAV-G (R2403) индуцировала титры нейтрализующих антител, сопоставимые с титрами, индуцированными вакцинами HDC и Rabipur, которые значительно превышали стандарт ВОЗ, составляющий 0,5 МЕ/мл.
Как продемонстрировано на фиг. 4Б, мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала долговременные титры нейтрализующих антител против вируса бешенства у мышей.
Пример 4: Индукция клеточного иммунного ответа мРНК-вакциной на основе RAV-G
Иммунизация
В день ноль мышам линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе RAV-G R2403 (80 мкг/мышь/день вакцинации) или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера. Контрольной группе инъецировали внутримышечно (i.m.) 1/10 человеческой дозы лицензированной вакцины Rabipur. Всем животным делали бустерные инъекции в день 21, Получали сыворотку и селезенку (n=8 в день 28, n=8 в день 35) для анализа антигенспецифических Т-клеток.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов
6
Спленоциты из вакцинированных и контрольных мышей выделяли согласно стандартному протоколу. В целом, метод состоял в следующем: выделенные селезенки измельчали, пропуская через клеточное сито, и промывали ЗФР/1% FBS с последующим лизисом эритроцитов. После стадии интенсивной промывки ЗФР/1% FBS спленоциты высевали в 96-луночные планшеты (2×10 клеток/лунку) и выдерживали в течение ночи при 4°С. На следующий день клетки стимулировали библиотекой пептида RAV-G (JPT), содержащей аминокислотную последовательность белка G вируса бешенства из пастеровского вакцинного штамма вируса бешенства, представленную в SEQ ID NO: 1, которая экспонировалась в виде состоящих из 15 аминокислот пептидов с перекрытием из 11 аминокислот между примыкающими пептидами, и 2,5 мкг/мл антитела к CD28 (фирма BD Biosciences) в течение 6 ч при 37°С в присутствии смеси GolgiPlug™ /GolgiStop™ (ингибиторы транспорта белков, содержащие брефелдин А и монензин соответственно; фирма BD Biosciences). После стимуляции клетки промывали и окрашивали для выявления внутриклеточных цитокинов, используя реагент Cytofix/Cytoperm (фирма BD Biosciences) согласно инструкциям производителя. Для окрашивания применяли следующие антитела: CD8-PECy7 (1:200), CD3-ФИТЦ (1:200), IL2-PerCP-Cy5.5 (1:100), TNFα-PE (1:100), IFNγ-APC (1:100) (фирма eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (фирма BD Biosciences) и инкубировали с Fcγ-блокатором, разведенным в соотношении 1:100. Водный краситель (Aqua Dye) (фирма Invitrogen) применяли для того, чтобы отличать живые клетки от мертвых. Клетки собирали с помощью проточного цитометра Canto II (фирма Beckton Dickinson). Результаты, полученные с помощью проточного цитометра, анализировали с использованием программы FlowJo (фирма Tree Star, Inc.). Статистический анализ осуществляли с использованием программы GraphPad Prism, версия 5.01. Статистические различия между группами оценивали с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты
+
Как продемонстрировано на фиг. 5, мРНК-вакцина на основе RAV-G (R2403) индуцировала IFNγ-позитивные, TNFα-позитивные и дважды IFNγ/TNFα-позитивные многофункциональные CD8-Т-клетки с частотой, сопоставимой с вакциной Rabipur.
+
Как продемонстрировано на фиг. 6, мРНК-вакцина на основе RAV-G (R2403) индуцировала IFNγ-позитивные, TNFα-позитивные и дважды IFNγ/TNFα-позитивные многофункциональные CD8-Т-клетки с существенно большей частотой, чем вакцина Rabipur, которая содержит цельный инактивированный вирус бешенства.
Пример 5: Индукция зависящего от дозы гуморального иммунного ответа мРНК-вакциной на основе RAV-G у мышей линии C57BL/6
Иммунизация
В день ноль мышам линии C57BL/6 инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе RAV-G R2403 в различных дозах или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера, как показано в таблице 3 Двум группам инъецировали внутримышечно (i.m.) 1/10 человеческой дозы лицензированных вакцин Rabipur и HDC соответственно. Всем животным делали бустерные инъекции в день 21, Образцы крови собирали в день 35 и образы сыворотки анализировали на основе реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной в примере 3.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг. 6, мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировали зависящий от дозы гуморальный иммунный ответ.Дозы 20 мкг, 40 мкг и 80 мкг индуцировали существенно более высокие титры вирус-нейтрализующих антител по сравнению с HDC-вакциной при ее применении в дозе, составляющей 0,1 от рекомендованной для человека дозы.
Пример 6: Контрольное заражение мышей вирусом бешенства
Иммунизация
50
Самкам мышей линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе RAV-G R2403 согласно схеме, представленной в таблице 4, или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера. Двум группам инъецировали внутримышечно (i.m.) 1/10 человеческой дозы лицензированных вакцин Rabipur и HDC соответственно. Через 16 дней после последней иммунизации животных заражали посредством внутричерепной (i.e.) инъекции, используя дозу, в 40 раз превышающую соответствующую LD дозу, CVS-штаммом вируса бешенства. Осуществляли мониторинг специфических симптомов, характерных для заболевания бешенством, и изменения веса тела мышей.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг. 8А, мРНК-вакцина на основе RAV-G защищала всех мышей от летального контрольного заражения вирусом бешенства. Все мыши, вакцинированные мРНК RAV-G или Rabipur, оказались защищенными от летального контрольного заражения вирусом бешенства, при этом у них не обнаружена потеря веса тела.
Как продемонстрировано на фиг. 8Б, у нескольких мышей, вакцинированных HDC-вакциной, обнаружено потеря веса тела, и у одной мыши из обработанной HDC группы был достигнут установленный критерий конечной точки, поэтому ее участие в эксперименте было прекращено до окончания опыта.
Как продемонстрировано на фиг. 9А, двух вакцинаций мРНК-вакциной на основе RAV-G (первичная (П) / бустерная (Б) с 3-недельным интервалом) оказалось достаточно для полной защиты мышей от летального контрольного заражения вирусом бешенства.
Пример 7: Индукция гуморального иммунного ответа мРНК-вакциной на основе RAV-G после хранения
Для оценки стабильности мРНК-вакцины на основе RAV-G образцы хранили при 5°С, 25° и 40°С в течение 6 месяцев и при 60°С в течение 1 месяца. После этого мышей вакцинировали указанными образцами и определяли их иммуногенный и защитный потенциал.
Иммунизация
50
Самкам мышей линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе RAV-G R2403 согласно схеме, представленной в таблице 5, или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера. Контрольной группе инъецировали внутримышечно (i.m.) 1/10 человеческой дозы лицензированной вакцины HDC (которую согласно рекомендациям производителя хранили при 2-8°С). Через 2 недели после последней вакцинации собирали образцы крови и анализировали сыворотку на основе реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной в примере 3. Через 6 недель после последней иммунизации животных заражали посредством внутричерепной (i.e.) инъекции, используя дозу, в 25 раз превышающую соответствующую LD дозу, CVS-штаммом вируса бешенства. У мышей осуществляли мониторинг специфических симптомов, характерных для заболевания бешенством, и изменения веса тела.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг.10А, мРНК-вакцина на основе RAV-G оказалась стабильной и иммуногенной после хранения в течение 6 месяцев при температуре вплоть до 40°С или 1 месяца при хранении при 60°С.Кроме того, вакцина все еще обеспечивала полное защитное действие, что продемонстрировано с использованием летального контрольного заражения (фиг.10Б).
Пример 8: Индукция гуморального иммунного ответа мРНК-вакциной на основе RAV-G у свиней Иммунизация
Двум группам свиней (порода: венгерские крупные белые, возрастом 6-8 недель, самки; n=5) инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе RAV-G R2507 или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроле буфера согласно схеме, представленной в таблице 6. За 1 неделю до (неиммунная сыворотка) и через 2, 3 и 5 недель после первой вакцинации собирали образцы крови и анализировали сыворотку на основе реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной в примере 3.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг. 11, мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала иммунный ответ после первичной/бустер вакцинации, которые значительно превышали стандарт ВОЗ, составляющий 0,5 МЕ/мл.
Пример 9: Индукция титров вирус-нейтрализующих антител мРНК-вакциной на основе RAV-G у новорожденных поросят в сравнении с эталонной вакциной (Rabipur)
Иммунизация
В день ноль 3-4-дневным поросятам (порода: немецкая домашняя, оба пола) из двух пометов инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину на основе RAV-G R2403 и неродственную контрольную мРНК-вакцину (R2402, которая кодирует белок НА вируса гриппа H5N1), согласно схеме, представленной в таблице 7. Третьей группе инъецировали внутримышечно (i.m.) одну человеческую дозу лицензированной вакцины Rabipur. Всем животным делали бустерные инъекции в день 21. Собирали образцы крови в день 0 (неиммунная сыворотка) и в дни 21, 28, 35, 49 и 70. Получали сыворотку и анализировали с помощью реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной в примере 3.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг. 12, мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала у новорожденных поросят образование вирус-нейтрализующих антител после первичной/бустер вакцинации, в количестве, значительно превышающем стандарт ВОЗ, составляющий 0,5 МЕ/мл.
Пример 10: Индукция титров вирус-нейтрализующих антител мРНК-вакциной на основе RAV-G после внутримышечной иммунизации мышей
Иммунизация
Самкам мышей линии BALB/c инъецировали внутримышечно (i.m.; большеберцовая мышца) мРНК-вакцину на основе RAV-G R2507 или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера согласно схеме, представленной в таблице 8. Через 1 неделю после последней вакцинации собирали образцы крови и анализировали сыворотку на основе реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной в примере 3.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг. 13, мРНК-вакцина на основе RAV-G индуцировала титры вирус-нейтрализующих антител у мышей после внутримышечной инъекции, значительно превышающие стандарт ВОЗ, составляющий 0,5 МЕ/мл.
Пример 11: Индукция гуморального иммунного ответа мРНК-вакциной на основе RAV-G у мышей
Иммунизация
В день ноль мышам линии BALB/c инъецировали внутрикожно (i.d.) мРНК-вакцину, содержащую мРНК, которая кодирует гликопротеин G вируса бешенства (RAV-G) (согласно примеру 1; 80 мкг/мышь/день вакцинации). Всем животным делали бустер-инъекции в день 7 и 21. Для определения долговременной кинетики иммунного ответа в виде антител к RAV-G образцы крови собирали в день 0, 21 и 35 для определения титров вирус-нейтрализующих антител.
Анализ нейтрализации вируса
Анализ нейтрализации вируса осуществляли согласно тесту, описанному в примере 3.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг.14, мРНК-вакцина на основе RAV-G (R2403) уже после двух вакцинаций индуцировала титры вирус-нейтрализующих антител, значительно превышающие стандарт ВОЗ, составляющий 0,5 МЕ/мл.
Пример 12: Индукция гуморального иммунного ответа мРНК-вакциной RAV-G у домашних свиней
Иммунизация
Двум группам свиней (порода: венгерские крупные белые, возрастом 6-8 недель, самки; n=5) инъецировали внутрикожно (i.d.) в день 0 и 14 мРНК-вакцину на основе RAV-G R2507 или лактат Рингера (RiLa) в качестве применяемого для контроля буфера. За 1 неделю до первой вакцинации (день 0) (неиммунная сыворотка) и через день 14 и 21 после первой вакцинации собирали образцы крови и анализировали сыворотку на основе реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной в примере 3.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг. 15, лишь одной вакцинации мРНК-вакциной на основе RAV-G оказалось достаточно для достижения у домашних свиней титров вирус-нейтрализующих антител, которые соответствовали стандарту ВОЗ, составляющему 0,5 МЕ/мл.
Пример 13: Индукция гуморального иммунного ответа мРНК-вакциной на основе RAV-G у домашних свиней
Иммунизация
Домашним свиньям (порода: венгерские крупные белые, возрастом 6-8 недель, самки; n=5) инъецировали внутримышечно (i.m.) в день 1, 8 и 29 мРНК-вакцину на основе RAV-G R2403. Собирали образцы крови в день 1,8, 15, 29, 36, 43,57и115и сыворотку анализировали с помощью реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной в примере 3.
Результаты
Как продемонстрировано на фиг. 16, внутримышечная вакцинация мРНК-вакциной на основе RAV-G позволяла индуцировать титры вирус-нейтрализующих антител, превышающие титр, соответствующий стандарту ВОЗ, составляющему 0,5 МЕ/мл, у домашних свиней. Изучение долговременной кинетики продемонстрировало, что даже через 115 дней после вакцинации титры вирус-нейтрализующих антител превышали титр, соответствующий стандарту ВОЗ, составляющему 0,5 ME.
Пример 14: Индукция гуморального иммунного ответа мРНК-вакциной на основе RAV-G у людей
Иммунизация
Предварительные результаты, полученные в продолжающемся клиническом испытании (фаза I), продемонстрировали безопасность, а также эффективность вакцины, предлагаемой в изобретении. В клиническом испытании добровольцам инъецировали внутрикожно с помощью струйной инъекции с использованием устройства Tropis мРНК-вакцину на основе RAV-G R2403 в день 0, 7 и 28. мРНК получали согласно методу, представленному в примере 1 настоящего описания, т.е. мРНК, включенную в комплекс с протамином в соотношении 2:1 (мас./мас.), смешивали с таким же количеством свободной мРНК. При осуществлении вакцинации в каждый из трех дней вводили по 80 мкг мРНК.
Для оценки профиля безопасности предлагаемой в изобретении вакцины осуществляли мониторинг индивидуумов после введения (жизненно важные признаки, оценки переносимости в области вакцинации, гематологические анализы после второй и третьей инъекции). Предварительные результаты, полученные в продолжающемся клиническом испытании, позволили предположить, что иммунизация мРНК, предлагаемой в изобретении, хорошо переносилась людьми.
Эффективность иммунизации анализировали путем определения титров вирус-нейтрализующих антител (VNT) в сыворотке шести индивидуумов. Для этой цели собирали образцы крови в день 0 в качестве исходного уровня и в день 42. Сыворотку анализировали в отношении вирус-нейтрализующих антител на основе реакции нейтрализации вируса флуоресцентными антителами (FAVN), описанной в примере 3. Результаты обобщены в таблице 9.
У пяти из шести индивидуумов (индивидуумы №. 1, 2, 4, 5 и 6) титр вирус-нейтрализующих антител, составляющий по меньшей мере 0,5 МЕ/мл, обнаружен в день 42. Согласно стандарту ВОЗ у указанных индивидуумов достигнут защитный гуморальный иммунный ответ, демонстрирующий эффективность иммунизации мРНК, предлагаемой в изобретении.
Заключение:
Согласно предварительным результатам, полученным в продолжающемся клиническом испытании, применение мРНК, предлагаемой в изобретении, для иммунизации людей, характеризуется благоприятным профилем безопасности. Эффективность указанного подхода продемонстрирована с помощью указанных предварительных опытов, согласно которым защитный гуморальный иммунный ответ (VNT≥0,5 МЕ/мл) был достигнут в день 42 у пяти из шести исследуемых индивидуумов.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  КуреВак ГмбХ
<120>  Вакцина против бешенства
<130>  CU01P150WO1
<160>  27
<170>  PatentIn, версия 3.5
<210>  1
<211>  524
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  1
Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
20                  25                  30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
35                  40                  45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu
50                  55                  60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
85                  90                  95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
100                 105                 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu
115                 120                 125
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val
130                 135                 140
Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp
145                 150                 155                 160
Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly
165                 170                 175
Asn Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His
180                 185                 190
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys
195                 200                 205
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu
210                 215                 220
Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
225                 230                 235                 240
Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
245                 250                 255
Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro
260                 265                 270
Pro Gly Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu
275                 280                 285
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp
290                 295                 300
Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
305                 310                 315                 320
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
325                 330                 335
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg
340                 345                 350
Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly
355                 360                 365
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu
370                 375                 380
Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
385                 390                 395                 400
Gln Gln His Met Glu Leu Leu Val Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His
405                 410                 415
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asn Gly Asp Glu Ala Glu
420                 425                 430
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Glu Arg Ile Ser Gly
435                 440                 445
Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala
450                 455                 460
Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Trp
465                 470                 475                 480
Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr
485                 490                 495
Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser
500                 505                 510
Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Thr Gly Leu
515                 520
<210>  2
<211>  450
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  2
Met Asp Ala Asp Lys Ile Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Lys Pro Glu Ile Ile Val Asp Gln Tyr Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala
20                  25                  30
Ile Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys Ile Thr Leu Gly Lys Ala Pro Asp
35                  40                  45
Leu Asn Lys Ala Tyr Lys Ser Val Leu Ser Cys Met Ser Ala Ala Lys
50                  55                  60
Leu Asp Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe
65                  70                  75                  80
Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Val Ile
85                  90                  95
Ala Arg Lys Gly Asp Lys Ile Thr Pro Gly Ser Leu Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu
115                 120                 125
Thr Arg Asp Pro Thr Val Pro Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu
130                 135                 140
Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Ser Thr Gly Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala
165                 170                 175
Pro Phe Val Lys Ile Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys
180                 185                 190
Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly
195                 200                 205
Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile
210                 215                 220
Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Leu Val
225                 230                 235                 240
Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala
245                 250                 255
Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met
260                 265                 270
Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His
275                 280                 285
Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala
290                 295                 300
Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly
305                 310                 315                 320
Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His
325                 330                 335
Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys
340                 345                 350
Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu
355                 360                 365
Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp
370                 375                 380
Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg
385                 390                 395                 400
Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Ile Met Asn Gly Gly Arg Leu
405                 410                 415
Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln
420                 425                 430
Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Ser
435                 440                 445
Asp Ser
450
<210>  3
<211>  297
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  3
Met Ser Lys Ile Phe Val Asn Pro Ser Ala Ile Arg Ala Gly Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Leu Glu Met Ala Glu Glu Thr Val Asp Leu Ile Asn Arg Asn Ile
20                  25                  30
Glu Asp Asn Gln Ala His Leu Gln Gly Glu Pro Ile Glu Val Asp Asn
35                  40                  45
Leu Pro Glu Asp Met Gly Arg Leu His Leu Asp Asp Gly Lys Ser Pro
50                  55                  60
Asn Pro Gly Glu Met Ala Lys Val Gly Glu Gly Lys Tyr Arg Glu Asp
65                  70                  75                  80
Phe Gln Met Asp Glu Gly Glu Asp Pro Ser Leu Leu Phe Gln Ser Tyr
85                  90                  95
Leu Asp Asn Val Gly Val Gln Ile Val Arg Gln Ile Arg Ser Gly Glu
100                 105                 110
Arg Phe Leu Lys Ile Trp Ser Gln Thr Val Glu Glu Ile Ile Ser Tyr
115                 120                 125
Val Ala Val Asn Phe Pro Asn Pro Pro Gly Lys Ser Ser Glu Asp Lys
130                 135                 140
Ser Thr Gln Thr Thr Gly Arg Glu Leu Lys Lys Glu Thr Thr Pro Thr
145                 150                 155                 160
Pro Ser Gln Arg Glu Ser Gln Ser Ser Lys Ala Arg Met Ala Ala Gln
165                 170                 175
Thr Ala Ser Gly Pro Pro Ala Leu Glu Trp Ser Ala Thr Asn Glu Glu
180                 185                 190
Asp Asp Leu Ser Val Glu Ala Glu Ile Ala His Gln Ile Ala Glu Ser
195                 200                 205
Phe Ser Lys Lys Tyr Lys Phe Pro Ser Arg Ser Ser Gly Ile Leu Leu
210                 215                 220
Tyr Asn Phe Glu Gln Leu Lys Met Asn Leu Asp Asp Ile Val Lys Glu
225                 230                 235                 240
Ala Lys Asn Val Pro Gly Val Thr Arg Leu Ala Arg Asp Gly Ser Lys
245                 250                 255
Leu Pro Leu Arg Cys Val Leu Gly Trp Val Ala Leu Ala Asn Ser Lys
260                 265                 270
Lys Phe Gln Leu Leu Val Glu Ser Asn Lys Leu Ser Lys Ile Met Gln
275                 280                 285
Asp Asp Leu Asn Arg Tyr Thr Ser Cys
290                 295
<210>  4
<211>  202
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  4
Met Asn Phe Leu Arg Lys Ile Val Lys Asn Cys Arg Asp Glu Asp Thr
1               5                   10                  15
Gln Lys Pro Ser Pro Val Ser Ala Pro Leu Asp Asp Asp Asp Leu Trp
20                  25                  30
Leu Pro Pro Pro Glu Tyr Val Pro Leu Lys Glu Leu Thr Ser Lys Lys
35                  40                  45
Asn Arg Arg Asn Phe Cys Ile Asn Gly Gly Val Lys Val Cys Ser Pro
50                  55                  60
Asn Gly Tyr Ser Phe Gly Ile Leu Arg His Ile Leu Arg Ser Phe Asp
65                  70                  75                  80
Glu Ile Tyr Ser Gly Asn His Arg Met Val Gly Leu Val Lys Val Val
85                  90                  95
Ile Gly Leu Ala Leu Ser Gly Ala Pro Val Pro Glu Gly Met Asn Trp
100                 105                 110
Val Tyr Lys Leu Arg Arg Thr Leu Ile Phe Gln Trp Ala Asp Ser Arg
115                 120                 125
Gly Pro Leu Glu Gly Glu Glu Leu Glu Tyr Ser Gln Glu Ile Thr Trp
130                 135                 140
Asp Asp Asn Thr Glu Phe Val Gly Leu Gln Ile Arg Val Ser Ala Lys
145                 150                 155                 160
Gln Cys His Ile Arg Gly Arg Ile Trp Cys Ile Asn Met Asn Ser Arg
165                 170                 175
Ala Gly Gln Leu Trp Ser Asp Met Ser Leu Gln Thr Gln Arg Ser Glu
180                 185                 190
Glu Asp Lys Asp Ser Ser Leu Leu Leu Glu
195                 200
<210>  5
<211>  2142
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  5
Met Leu Asp Pro Gly Glu Val Tyr Asp Asp Pro Ile Asp Pro Ile Glu
1               5                   10                  15
Leu Glu Ala Glu Pro Arg Gly Thr Pro Thr Val Pro Asn Ile Leu Arg
20                  25                  30
Asn Ser Asp Tyr Asn Leu Asn Ser Pro Leu Ile Glu Asp Pro Ala Arg
35                  40                  45
Leu Met Leu Glu Trp Leu Lys Thr Gly Asn Arg Pro Tyr Arg Met Thr
50                  55                  60
Leu Thr Asp Asn Cys Ser Arg Ser Phe Arg Val Leu Lys Asp Tyr Phe
65                  70                  75                  80
Lys Lys Val Asp Leu Gly Ser Leu Lys Val Gly Gly Met Ala Ala Gln
85                  90                  95
Ser Met Ile Ser Leu Trp Leu Tyr Gly Ala His Ser Glu Ser Asn Arg
100                 105                 110
Ser Arg Arg Cys Ile Thr Asp Leu Ala His Phe Tyr Ser Lys Ser Ser
115                 120                 125
Pro Ile Glu Lys Leu Leu Asn Leu Thr Leu Gly Asn Arg Gly Leu Arg
130                 135                 140
Ile Pro Pro Glu Gly Val Leu Ser Cys Leu Glu Arg Val Asp Tyr Asp
145                 150                 155                 160
Asn Ala Phe Gly Arg Tyr Leu Ala Asn Thr Tyr Ser Ser Tyr Leu Phe
165                 170                 175
Phe His Val Ile Thr Leu Tyr Met Asn Ala Leu Asp Trp Asp Glu Glu
180                 185                 190
Lys Thr Ile Leu Ala Leu Trp Lys Asp Leu Thr Ser Val Asp Ile Gly
195                 200                 205
Lys Asp Leu Val Lys Phe Lys Asp Gln Ile Trp Gly Leu Leu Ile Val
210                 215                 220
Thr Lys Asp Phe Val Tyr Ser Gln Ser Ser Asn Cys Leu Phe Asp Arg
225                 230                 235                 240
Asn Tyr Thr Leu Met Leu Lys Asp Leu Phe Leu Ser Arg Phe Asn Ser
245                 250                 255
Leu Met Val Leu Leu Ser Pro Pro Glu Pro Arg Tyr Ser Asp Asp Leu
260                 265                 270
Ile Ser Gln Leu Cys Gln Leu Tyr Ile Ala Gly Asp Gln Val Leu Ser
275                 280                 285
Met Cys Gly Asn Ser Gly Tyr Glu Val Ile Lys Ile Leu Glu Pro Tyr
290                 295                 300
Val Val Asn Ser Leu Val Gln Arg Ala Glu Lys Phe Arg Pro Leu Ile
305                 310                 315                 320
His Ser Leu Gly Asp Phe Pro Val Phe Ile Lys Asp Lys Val Ser Gln
325                 330                 335
Leu Glu Glu Thr Phe Gly Ser Cys Ala Arg Arg Phe Phe Arg Ala Leu
340                 345                 350
Asp Gln Phe Asp Asn Ile His Asp Leu Val Phe Val Tyr Gly Cys Tyr
355                 360                 365
Arg His Trp Gly His Pro Tyr Ile Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Ser Lys
370                 375                 380
Leu Tyr Asp Gln Val His Ile Lys Lys Val Ile Asp Lys Ser Tyr Gln
385                 390                 395                 400
Glu Cys Leu Ala Ser Asp Leu Ala Arg Arg Ile Leu Arg Trp Gly Phe
405                 410                 415
Asp Lys Tyr Ser Lys Trp Tyr Leu Asp Ser Arg Phe Leu Ala Arg Asp
420                 425                 430
His Pro Leu Thr Pro Tyr Ile Lys Thr Gln Thr Trp Pro Pro Lys His
435                 440                 445
Ile Val Asp Leu Val Gly Asp Thr Trp His Lys Leu Pro Ile Thr Gln
450                 455                 460
Ile Phe Glu Ile Pro Glu Ser Met Asp Pro Ser Glu Ile Leu Asp Asp
465                 470                 475                 480
Lys Ser His Ser Phe Thr Arg Thr Arg Leu Ala Ser Trp Leu Ser Glu
485                 490                 495
Asn Arg Gly Gly Pro Val Pro Ser Glu Lys Val Ile Ile Thr Ala Leu
500                 505                 510
Ser Lys Pro Pro Val Asn Pro Arg Glu Phe Leu Lys Ser Ile Asp Leu
515                 520                 525
Gly Gly Leu Pro Asp Glu Asp Leu Ile Ile Gly Leu Lys Pro Lys Glu
530                 535                 540
Arg Glu Leu Lys Ile Glu Gly Arg Phe Phe Ala Leu Met Ser Trp Asn
545                 550                 555                 560
Leu Arg Leu Tyr Phe Val Ile Thr Glu Lys Leu Leu Ala Asn Tyr Ile
565                 570                 575
Leu Pro Leu Phe Asp Ala Leu Thr Met Thr Asp Asn Leu Asn Lys Val
580                 585                 590
Phe Lys Lys Leu Ile Asp Arg Val Thr Gly Gln Gly Leu Leu Asp Tyr
595                 600                 605
Ser Arg Val Thr Tyr Ala Phe His Leu Asp Tyr Glu Lys Trp Asn Asn
610                 615                 620
His Gln Arg Leu Glu Ser Thr Glu Asp Val Phe Ser Val Leu Asp Gln
625                 630                 635                 640
Val Phe Gly Leu Lys Arg Val Phe Ser Arg Thr His Glu Phe Phe Gln
645                 650                 655
Lys Ser Trp Ile Tyr Tyr Ser Asp Arg Ser Asp Leu Ile Gly Leu Arg
660                 665                 670
Glu Asp Gln Ile Tyr Cys Leu Asp Ala Ser Asn Gly Pro Thr Cys Trp
675                 680                 685
Asn Gly Gln Asp Gly Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gln Lys Gly Trp Ser
690                 695                 700
Leu Val Ser Leu Leu Met Ile Asp Arg Glu Ser Gln Ile Arg Asn Thr
705                 710                 715                 720
Arg Thr Lys Val Leu Ala Gln Gly Asp Asn Gln Val Leu Cys Pro Thr
725                 730                 735
Tyr Met Leu Ser Pro Gly Leu Ser Gln Glu Gly Leu Leu Tyr Glu Leu
740                 745                 750
Glu Ser Ile Ser Arg Asn Ala Phe Ser Ile Tyr Arg Ala Val Glu Glu
755                 760                 765
Gly Ala Ser Lys Leu Gly Leu Ile Ile Lys Lys Glu Glu Thr Met Cys
770                 775                 780
Ser Tyr Asp Phe Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Leu Phe Arg Gly Asn
785                 790                 795                 800
Ile Leu Val Pro Glu Ser Lys Arg Trp Ala Arg Val Ser Cys Val Ser
805                 810                 815
Asn Asp Gln Ile Val Asn Leu Ala Asn Ile Met Ser Thr Val Ser Thr
820                 825                 830
Asn Ala Leu Thr Val Ala Gln His Ser Gln Ser Leu Ile Lys Pro Met
835                 840                 845
Arg Asp Phe Leu Leu Met Ser Val Gln Ala Val Phe His Tyr Leu Leu
850                 855                 860
Phe Ser Pro Ile Leu Lys Gly Arg Val Tyr Lys Ile Leu Ser Ala Glu
865                 870                 875                 880
Gly Glu Ser Phe Leu Leu Ala Met Ser Arg Ile Ile Tyr Leu Asp Pro
885                 890                 895
Ser Leu Gly Gly Val Ser Gly Met Ser Leu Gly Arg Phe His Ile Arg
900                 905                 910
Gln Phe Ser Asp Pro Val Ser Glu Gly Leu Ser Phe Trp Arg Glu Ile
915                 920                 925
Trp Leu Ser Ser His Glu Ser Trp Ile His Ala Leu Cys Gln Glu Ala
930                 935                 940
Gly Asn Pro Asp Leu Gly Glu Arg Thr Leu Glu Ser Phe Thr Arg Leu
945                 950                 955                 960
Leu Glu Asp Pro Thr Thr Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Pro Thr
965                 970                 975
Ile Leu Leu Lys Asp Ala Ile Arg Lys Ala Leu Tyr Asp Glu Val Asp
980                 985                 990
Lys Val Glu Asn Ser Glu Phe Arg  Glu Ala Ile Leu Leu  Ser Lys Thr
995                 1000                 1005
His Arg  Asp Asn Phe Ile Leu  Phe Leu Thr Ser Val  Glu Pro Leu
1010                 1015                 1020
Phe Pro  Arg Phe Leu Ser Glu  Leu Phe Ser Ser Ser  Phe Leu Gly
1025                 1030                 1035
Ile Pro  Glu Ser Ile Ile Gly  Leu Ile Gln Asn Ser  Arg Thr Ile
1040                 1045                 1050
Arg Arg  Gln Phe Arg Lys Ser  Leu Ser Lys Thr Leu  Glu Glu Ser
1055                 1060                 1065
Phe Tyr  Asn Ser Glu Ile His  Gly Ile Ser Arg Met  Thr Gln Thr
1070                 1075                 1080
Pro Gln  Arg Val Gly Gly Val  Trp Pro Cys Ser Ser  Glu Arg Ala
1085                 1090                 1095
Asp Leu  Leu Arg Glu Ile Ser  Trp Gly Arg Lys Val  Val Gly Thr
1100                 1105                 1110
Thr Val  Pro His Pro Ser Glu  Met Leu Gly Leu Leu  Pro Lys Ser
1115                 1120                 1125
Ser Ile  Ser Cys Thr Cys Gly  Ala Thr Gly Gly Gly  Asn Pro Arg
1130                 1135                 1140
Val Ser  Val Ser Val Leu Pro  Ser Phe Asp Gln Ser  Phe Phe Cys
1145                 1150                 1155
Thr Gly  Pro Leu Lys Gly Tyr  Leu Gly Ser Ser Thr  Ser Met Ser
1160                 1165                 1170
Thr Gln  Leu Phe His Ala Trp  Glu Lys Val Thr Asn  Val His Val
1175                 1180                 1185
Val Lys  Arg Ala Leu Ser Leu  Lys Glu Ser Ile Asn  Trp Phe Ile
1190                 1195                 1200
Thr Arg  Asp Ser Asn Leu Ala  Gln Thr Leu Ile Arg  Asn Ile Val
1205                 1210                 1215
Ser Leu  Thr Gly Pro Asp Phe  Pro Leu Glu Glu Ala  Pro Val Phe
1220                 1225                 1230
Lys Arg  Thr Gly Ser Ala Leu  His Arg Phe Lys Ser  Ala Arg Tyr
1235                 1240                 1245
Ser Glu  Gly Gly Tyr Ser Ser  Val Cys Pro Asn Leu  Leu Ser His
1250                 1255                 1260
Ile Ser  Val Ser Thr Asp Thr  Met Ser Asp Leu Thr  Gln Asp Gly
1265                 1270                 1275
Lys Asn  Tyr Asp Phe Met Phe  Gln Pro Leu Met Leu  Tyr Ala Gln
1280                 1285                 1290
Thr Trp  Thr Ser Glu Leu Val  Gln Arg Asp Thr Arg  Leu Arg Asp
1295                 1300                 1305
Ser Thr  Phe His Trp His Leu  Gln Cys Asn Arg Cys  Val Arg Pro
1310                 1315                 1320
Ile Asp  Asp Val Thr Leu Glu  Thr Ser Gln Ile Phe  Glu Phe Pro
1325                 1330                 1335
Asp Val  Ser Lys Arg Ile Ser  Arg Met Val Ser Gly  Ala Val Pro
1340                 1345                 1350
His Phe  Gln Arg Leu Pro Asp  Ile Arg Leu Arg Pro  Gly Asp Phe
1355                 1360                 1365
Glu Ser  Leu Ser Gly Arg Glu  Lys Ser His His Ile  Gly Ser Ala
1370                 1375                 1380
Gln Gly  Leu Leu Tyr Ser Ile  Leu Val Ala Ile His  Asp Ser Gly
1385                 1390                 1395
Tyr Asn  Asp Gly Thr Ile Phe  Pro Val Asn Ile Tyr  Gly Lys Val
1400                 1405                 1410
Ser Pro  Arg Asp Tyr Leu Arg  Gly Leu Ala Arg Gly  Val Leu Ile
1415                 1420                 1425
Gly Ser  Ser Ile Cys Phe Leu  Thr Arg Met Thr Asn  Ile Asn Ile
1430                 1435                 1440
Asn Arg  Pro Leu Glu Leu Ile  Ser Gly Val Ile Ser  Tyr Ile Leu
1445                 1450                 1455
Leu Arg  Leu Asp Asn His Pro  Ser Leu Tyr Ile Met  Leu Arg Glu
1460                 1465                 1470
Pro Ser  Phe Arg Glu Glu Ile  Phe Ser Ile Pro Gln  Lys Ile Pro
1475                 1480                 1485
Ala Ala  Tyr Pro Thr Thr Met  Lys Glu Gly Asn Arg  Ser Ile Leu
1490                 1495                 1500
Cys Tyr  Leu Gln His Val Leu  Arg Tyr Glu Arg Glu  Val Ile Thr
1505                 1510                 1515
Ala Ser  Pro Glu Asn Asp Trp  Leu Trp Ile Phe Ser  Asp Phe Arg
1520                 1525                 1530
Ser Ala  Lys Met Thr Tyr Leu  Thr Leu Ile Thr Tyr  Gln Ser His
1535                 1540                 1545
Leu Leu  Leu Gln Arg Val Glu  Arg Asn Leu Ser Lys  Ser Met Arg
1550                 1555                 1560
Asp Asn  Leu Arg Gln Leu Ser  Ser Leu Met Arg Gln  Val Leu Gly
1565                 1570                 1575
Gly His  Gly Glu Asp Thr Leu  Glu Ser Asp Asp Asn  Ile Gln Arg
1580                 1585                 1590
Leu Leu  Lys Asp Ser Leu Arg  Arg Thr Arg Trp Val  Asp Gln Glu
1595                 1600                 1605
Val Arg  His Ala Ala Arg Thr  Met Thr Gly Asp Tyr  Ser Pro Asn
1610                 1615                 1620
Lys Lys  Val Ser Arg Lys Val  Gly Cys Ser Glu Trp  Val Cys Ser
1625                 1630                 1635
Ala Gln  Gln Val Ala Val Ser  Thr Ser Ala Asn Pro  Ala Pro Val
1640                 1645                 1650
Ser Glu  Leu Asp Ile Arg Ala  Leu Ser Lys Arg Phe  Gln Asn Pro
1655                 1660                 1665
Leu Ile  Ser Gly Leu Arg Val  Val Gln Trp Ala Thr  Gly Ala His
1670                 1675                 1680
Tyr Lys  Leu Lys Pro Ile Leu  Asp Asp Leu Asn Val  Phe Pro Ser
1685                 1690                 1695
Leu Cys  Leu Val Val Gly Asp  Gly Ser Gly Gly Ile  Ser Arg Ala
1700                 1705                 1710
Val Leu  Asn Met Phe Pro Asp  Ala Lys Leu Val Phe  Asn Ser Leu
1715                 1720                 1725
Leu Glu  Val Asn Asp Leu Met  Ala Ser Gly Thr His  Pro Leu Pro
1730                 1735                 1740
Pro Ser  Ala Ile Met Arg Gly  Gly Asn Asp Ile Val  Ser Arg Val
1745                 1750                 1755
Ile Asp  Phe Asp Ser Ile Trp  Glu Lys Pro Ser Asp  Leu Arg Asn
1760                 1765                 1770
Leu Ala  Thr Trp Lys Tyr Phe  Gln Ser Val Gln Lys  Gln Val Asn
1775                 1780                 1785
Met Ser  Tyr Asp Leu Ile Ile  Cys Asp Ala Glu Val  Thr Asp Ile
1790                 1795                 1800
Ala Ser  Ile Asn Arg Ile Thr  Leu Leu Met Ser Asp  Phe Ala Leu
1805                 1810                 1815
Ser Ile  Asp Gly Pro Leu Tyr  Leu Val Phe Lys Thr  Tyr Gly Thr
1820                 1825                 1830
Met Leu  Val Asn Pro Asn Tyr  Lys Ala Ile Gln His  Leu Ser Arg
1835                 1840                 1845
Ala Phe  Pro Ser Val Thr Gly  Phe Ile Thr Gln Val  Thr Ser Ser
1850                 1855                 1860
Phe Ser  Ser Glu Leu Tyr Leu  Arg Phe Ser Lys Arg  Gly Lys Phe
1865                 1870                 1875
Phe Arg  Asp Ala Glu Tyr Leu  Thr Ser Ser Thr Leu  Arg Glu Met
1880                 1885                 1890
Ser Leu  Val Leu Phe Asn Cys  Ser Ser Pro Lys Ser  Glu Met Gln
1895                 1900                 1905
Arg Ala  Arg Ser Leu Asn Tyr  Gln Asp Leu Val Arg  Gly Phe Pro
1910                 1915                 1920
Glu Glu  Ile Ile Ser Asn Pro  Tyr Asn Glu Met Ile  Ile Thr Leu
1925                 1930                 1935
Ile Asp  Ser Asp Val Glu Ser  Phe Leu Val His Lys  Met Val Asp
1940                 1945                 1950
Asp Leu  Glu Leu Gln Arg Gly  Thr Leu Ser Lys Val  Ala Ile Ile
1955                 1960                 1965
Ile Ala  Ile Met Ile Val Phe  Ser Asn Arg Val Phe  Asn Val Ser
1970                 1975                 1980
Lys Pro  Leu Thr Asp Pro Leu  Phe Tyr Pro Pro Ser  Asp Pro Lys
1985                 1990                 1995
Ile Leu  Arg His Phe Asn Ile  Cys Cys Ser Thr Met  Met Tyr Leu
2000                 2005                 2010
Ser Thr  Ala Leu Gly Asp Val  Pro Ser Phe Ala Arg  Leu His Asp
2015                 2020                 2025
Leu Tyr  Asn Arg Pro Ile Thr  Tyr Tyr Phe Arg Lys  Gln Val Ile
2030                 2035                 2040
Leu Gly  Asn Val Tyr Leu Ser  Trp Ser Trp Ser Asn  Asp Thr Ser
2045                 2050                 2055
Val Phe  Lys Arg Val Ala Cys  Asn Ser Ser Leu Ser  Leu Ser Ser
2060                 2065                 2070
His Trp  Ile Arg Leu Ile Tyr  Lys Ile Val Lys Thr  Thr Arg Leu
2075                 2080                 2085
Val Gly  Ser Ile Lys Asp Leu  Ser Gly Glu Val Glu  Arg His Leu
2090                 2095                 2100
His Arg  Tyr Asn Arg Trp Ile  Thr Leu Glu Asn Ile  Arg Ser Arg
2105                 2110                 2115
Ser Ser  Leu Leu Asp Tyr Ser  Cys Leu Cys Ile Gly  Tyr Ser Trp
2120                 2125                 2130
Lys Pro  Ala His Ala Lys Thr  Leu Val
2135                 2140
<210>  6
<211>  524
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  6
Met Val Pro Gln Val Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Gly Phe Ser Leu
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro
20                  25                  30
Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val
35                  40                  45
Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Glu Phe Ser Tyr Met Glu
50                  55                  60
Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Val Asn Gly Phe Thr Cys
65                  70                  75                  80
Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr
85                  90                  95
Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala
100                 105                 110
Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu
115                 120                 125
Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val
130                 135                 140
Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Thr Asp
145                 150                 155                 160
Leu Asp Pro Tyr Asp Lys Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly
165                 170                 175
Asn Cys Ser Gly Ile Thr Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His
180                 185                 190
Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Leu Arg Leu Gly Thr Ser Cys
195                 200                 205
Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Gly Lys
210                 215                 220
Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly
225                 230                 235                 240
Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp
245                 250                 255
Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asp Glu Thr Lys Trp Cys Pro
260                 265                 270
Pro Gly Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu
275                 280                 285
His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp
290                 295                 300
Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu
305                 310                 315                 320
Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile
325                 330                 335
Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg
340                 345                 350
Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly
355                 360                 365
Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu
370                 375                 380
Gly Ser Asp Gly His Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu
385                 390                 395                 400
Gln Gln His Met Glu Leu Leu Glu Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His
405                 410                 415
Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asp Gly Asp Glu Val Glu
420                 425                 430
Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Glu Gln Val Ser Gly
435                 440                 445
Val Glu Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Met Ile Ala
450                 455                 460
Gly Ala Leu Ile Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Cys
465                 470                 475                 480
Arg Arg Val Asn Arg Pro Glu Ser Thr Gln Ser Ser Leu Gly Glu Thr
485                 490                 495
Gly Arg Asn Val Ser Val Thr Ser Gln Ser Gly Lys Val Ile Ser Ser
500                 505                 510
Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Thr Arg Leu
515                 520
<210>  7
<211>  450
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  7
Met Asp Ala Asp Lys Ile Val Phe Lys Val Asn Asn Gln Val Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Lys Pro Glu Ile Ile Val Asp Gln Tyr Glu Tyr Lys Tyr Pro Ala
20                  25                  30
Ile Lys Asp Leu Lys Lys Pro Cys Ile Thr Leu Gly Lys Ala Pro Asp
35                  40                  45
Leu Asn Lys Ala Tyr Lys Ser Val Leu Ser Gly Met Asn Ala Ala Lys
50                  55                  60
Leu Asp Pro Asp Asp Val Cys Ser Tyr Leu Ala Ala Ala Met Gln Phe
65                  70                  75                  80
Phe Glu Gly Thr Cys Pro Glu Asp Trp Thr Ser Tyr Gly Ile Leu Ile
85                  90                  95
Ala Arg Lys Gly Asp Lys Ile Thr Pro Asp Ser Leu Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Asp Val Glu Gly Asn Trp Ala Leu Thr Gly Gly Met Glu Leu
115                 120                 125
Thr Arg Asp Pro Thr Val Ser Glu His Ala Ser Leu Val Gly Leu Leu
130                 135                 140
Leu Ser Leu Tyr Arg Leu Ser Lys Ile Ser Gly Gln Asn Thr Gly Asn
145                 150                 155                 160
Tyr Lys Thr Asn Ile Ala Asp Arg Ile Glu Gln Ile Phe Glu Thr Ala
165                 170                 175
Pro Phe Val Lys Ile Val Glu His His Thr Leu Met Thr Thr His Lys
180                 185                 190
Met Cys Ala Asn Trp Ser Thr Ile Pro Asn Phe Arg Phe Leu Ala Gly
195                 200                 205
Thr Tyr Asp Met Phe Phe Ser Arg Ile Glu His Leu Tyr Ser Ala Ile
210                 215                 220
Arg Val Gly Thr Val Val Thr Ala Tyr Glu Asp Cys Ser Gly Leu Val
225                 230                 235                 240
Ser Phe Thr Gly Phe Ile Lys Gln Ile Asn Leu Thr Ala Arg Glu Ala
245                 250                 255
Ile Leu Tyr Phe Phe His Lys Asn Phe Glu Glu Glu Ile Arg Arg Met
260                 265                 270
Phe Glu Pro Gly Gln Glu Thr Ala Val Pro His Ser Tyr Phe Ile His
275                 280                 285
Phe Arg Ser Leu Gly Leu Ser Gly Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asn Ala
290                 295                 300
Val Gly His Val Phe Asn Leu Ile His Phe Val Gly Cys Tyr Met Gly
305                 310                 315                 320
Gln Val Arg Ser Leu Asn Ala Thr Val Ile Ala Ala Cys Ala Pro His
325                 330                 335
Glu Met Ser Val Leu Gly Gly Tyr Leu Gly Glu Glu Phe Phe Gly Lys
340                 345                 350
Gly Thr Phe Glu Arg Arg Phe Phe Arg Asp Glu Lys Glu Leu Gln Glu
355                 360                 365
Tyr Glu Ala Ala Glu Leu Thr Lys Thr Asp Val Ala Leu Ala Asp Asp
370                 375                 380
Gly Thr Val Asn Ser Asp Asp Glu Asp Tyr Phe Ser Gly Glu Thr Arg
385                 390                 395                 400
Ser Pro Glu Ala Val Tyr Thr Arg Ile Met Met Asn Gly Gly Arg Leu
405                 410                 415
Lys Arg Ser His Ile Arg Arg Tyr Val Ser Val Ser Ser Asn His Gln
420                 425                 430
Ala Arg Pro Asn Ser Phe Ala Glu Phe Leu Asn Lys Thr Tyr Ser Ser
435                 440                 445
Asp Ser
450
<210>  8
<211>  297
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  8
Met Ser Lys Ile Phe Val Asn Pro Ser Ala Ile Arg Ala Gly Leu Ala
1               5                   10                  15
Asp Leu Glu Met Ala Glu Glu Thr Val Asp Leu Ile Asn Arg Asn Ile
20                  25                  30
Glu Asp Asn Gln Ala His Leu Gln Gly Glu Pro Ile Glu Val Asp Asn
35                  40                  45
Leu Pro Glu Asp Met Arg Gln Phe His Leu Gly Asp Glu Lys Leu Ser
50                  55                  60
Asn Leu Gly Glu Met Val Arg Val Gly Glu Gly Lys Tyr Arg Glu Asp
65                  70                  75                  80
Phe Gln Met Asp Glu Gly Glu Asp Pro Asn Leu Leu Phe Gln Ser Tyr
85                  90                  95
Leu Asp Asn Val Gly Val Gln Ile Val Arg Gln Met Arg Ser Gly Glu
100                 105                 110
Arg Phe Leu Lys Ile Trp Ser Gln Thr Val Glu Glu Ile Ile Ser Tyr
115                 120                 125
Val Thr Val Asn Phe Pro Asn Pro Pro Gly Arg Ser Ser Glu Asp Lys
130                 135                 140
Ser Thr Gln Thr Thr Gly Arg Glu Leu Lys Lys Glu Thr Thr Ser Thr
145                 150                 155                 160
Leu Ser Gln Arg Glu Ser Gln Pro Ser Lys Ala Gly Met Val Ala Gln
165                 170                 175
Val Ala Ser Gly Pro Pro Ser Leu Glu Trp Ser Ala Thr Asn Glu Glu
180                 185                 190
Asp Asp Leu Ser Val Glu Ala Glu Ile Ala His Gln Ile Ala Glu Ser
195                 200                 205
Phe Ser Lys Lys Tyr Lys Phe Pro Ser Arg Ser Ser Gly Ile Phe Leu
210                 215                 220
Tyr Asn Phe Glu Gln Leu Glu Met Asn Leu Asp Asp Ile Val Lys Glu
225                 230                 235                 240
Ala Lys Asn Val Pro Gly Val Thr Arg Leu Ala His Asp Gly Ser Lys
245                 250                 255
Ile Pro Leu Arg Cys Val Leu Gly Trp Val Ala Leu Ala Asn Ser Lys
260                 265                 270
Lys Phe Gln Leu Ile Val Glu Ala Asp Lys Leu Ser Lys Ile Met Gln
275                 280                 285
Asp Asp Leu Asp Arg Tyr Thr Ser Cys
290                 295
<210>  9
<211>  202
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  9
Met Asn Phe Leu Cys Lys Ile Val Lys Asn Cys Arg Asp Glu Asp Thr
1               5                   10                  15
Gln Lys Pro Ser Pro Val Ser Ala Pro Pro Asp Gly Asp Asp Leu Trp
20                  25                  30
Leu Pro Pro Pro Glu Tyr Val Pro Leu Lys Glu Leu Thr Ser Lys Lys
35                  40                  45
Asn Met Arg Asn Phe Cys Ile Asn Gly Glu Val Lys Val Cys Ser Pro
50                  55                  60
Asn Gly Tyr Ser Phe Arg Ile Leu Arg His Ile Leu Arg Ser Phe Asp
65                  70                  75                  80
Glu Ile Tyr Ser Gly Asn His Arg Met Ile Gly Leu Val Lys Val Val
85                  90                  95
Ile Gly Leu Ala Leu Ser Gly Ala Pro Val Pro Glu Gly Met Asn Trp
100                 105                 110
Val Tyr Lys Leu Arg Arg Thr Leu Ile Phe Gln Trp Ala Asp Ser Arg
115                 120                 125
Gly Pro Leu Glu Gly Glu Glu Leu Glu His Ser Gln Glu Ile Thr Trp
130                 135                 140
Asp Asp Asp Thr Glu Phe Val Gly Leu Gln Met Arg Val Ser Ala Arg
145                 150                 155                 160
Gln Cys His Ile Gln Gly Arg Ile Trp Cys Ile Asn Met Asn Ser Arg
165                 170                 175
Ala Cys Gln Leu Trp Ser Asp Met Ser Leu Gln Thr Gln Arg Ser Glu
180                 185                 190
Glu Asp Lys Asp Ser Ser Leu Leu Leu Glu
195                 200
<210>  10
<211>  2127
<212>  PRT
<213>  Вирус бешенства
<400>  10
Met Leu Asp Pro Gly Glu Val Tyr Asp Asp Pro Ile Asp Pro Ile Glu
1               5                   10                  15
Ser Glu Ala Glu Pro Arg Gly Thr Pro Thr Val Pro Asn Ile Leu Arg
20                  25                  30
Asn Ser Asp Tyr Asn Leu Asn Ser Pro Leu Ile Glu Asp Ser Ala Lys
35                  40                  45
Leu Met Leu Glu Trp Leu Lys Thr Gly Asn Arg Pro Tyr Arg Met Thr
50                  55                  60
Leu Thr Asp Asn Cys Ser Arg Ser Tyr Lys Val Leu Lys Asp Tyr Phe
65                  70                  75                  80
Lys Lys Val Asp Leu Gly Ser Leu Lys Val Gly Gly Thr Ala Ala Gln
85                  90                  95
Ser Met Ile Ser Leu Trp Leu Tyr Gly Ala His Ser Glu Ser Asn Arg
100                 105                 110
Ser Arg Arg Cys Ile Thr Asp Leu Ala His Phe Tyr Ser Lys Ser Ser
115                 120                 125
Pro Ile Glu Lys Leu Leu Asn Cys Thr Leu Gly Asn Arg Gly Leu Arg
130                 135                 140
Ile Pro Pro Glu Gly Val Leu Ser Cys Leu Glu Arg Val Asp Tyr Asp
145                 150                 155                 160
Lys Ala Phe Gly Arg Tyr Leu Ala Asn Thr Tyr Ser Ser Tyr Leu Phe
165                 170                 175
Phe His Val Ile Thr Leu Tyr Met Asn Ala Leu Asp Trp Glu Glu Glu
180                 185                 190
Lys Thr Ile Leu Ala Leu Trp Lys Asp Leu Thr Ser Val Asp Thr Gly
195                 200                 205
Lys Asp Leu Val Lys Phe Lys Asp Gln Ile Trp Gly Leu Leu Val Val
210                 215                 220
Thr Lys Asp Phe Val Tyr Ser Gln Ser Ser Asn Cys Leu Phe Asp Arg
225                 230                 235                 240
Asn Tyr Thr Leu Met Leu Lys Asp Leu Phe Leu Ser Arg Phe Asn Ser
245                 250                 255
Leu Met Ile Leu Leu Ser Pro Pro Glu Pro Arg Tyr Ser Asp Asp Leu
260                 265                 270
Ile Ser Gln Leu Cys Gln Leu Tyr Ile Ala Gly Asp Gln Val Leu Ser
275                 280                 285
Leu Cys Gly Asn Ser Gly Tyr Glu Val Ile Lys Ile Leu Glu Pro Tyr
290                 295                 300
Val Val Asn Ser Leu Val Gln Arg Ala Glu Lys Phe Arg Pro Leu Ile
305                 310                 315                 320
His Ser Leu Gly Asp Phe Pro Met Phe Ile Lys Asp Lys Val Asn Gln
325                 330                 335
Leu Glu Gly Thr Phe Gly Pro Ser Ala Lys Arg Phe Phe Arg Val Leu
340                 345                 350
Asp Gln Phe Asp Asn Ile His Asp Leu Val Phe Val Tyr Gly Cys Tyr
355                 360                 365
Arg His Trp Gly His Pro Tyr Ile Asp Tyr Arg Lys Gly Leu Ser Lys
370                 375                 380
Leu Tyr Asp Gln Val His Ile Lys Lys Val Ile Asp Lys Ser Tyr Gln
385                 390                 395                 400
Glu Cys Leu Ala Ser Asp Leu Ala Arg Arg Ile Leu Arg Trp Gly Phe
405                 410                 415
Asp Lys Tyr Ser Lys Trp Tyr Leu Asp Ser Arg Phe Leu Ala Leu Asp
420                 425                 430
His Pro Leu Ala Pro Tyr Ile Lys Thr Gln Thr Trp Pro Pro Lys His
435                 440                 445
Ile Val Asp Leu Val Gly Asp Thr Trp His Lys Leu Pro Ile Thr Gln
450                 455                 460
Ile Phe Glu Ile Pro Glu Ser Met Asp Pro Ser Glu Ile Leu Asp Asp
465                 470                 475                 480
Lys Ser His Ser Phe Thr Arg Thr Arg Leu Ala Ser Trp Leu Ser Glu
485                 490                 495
Asn Arg Gly Gly Pro Val Pro Ser Glu Lys Val Ile Ile Thr Ala Leu
500                 505                 510
Ser Lys Pro Pro Val Asn Pro Arg Glu Phe Leu Lys Ser Ile Asp Leu
515                 520                 525
Gly Gly Leu Pro Asp Asp Asp Leu Ile Ile Gly Leu Arg Pro Lys Glu
530                 535                 540
Arg Glu Leu Lys Ile Glu Gly Arg Phe Phe Ala Leu Met Ser Trp Asn
545                 550                 555                 560
Leu Arg Leu Tyr Phe Val Ile Thr Glu Lys Leu Leu Ala Asn Tyr Ile
565                 570                 575
Leu Pro Leu Phe Asp Ala Leu Thr Met Thr Asp Asn Leu Asn Lys Val
580                 585                 590
Phe Lys Lys Leu Ile Asp Arg Val Thr Gly Gln Gly Leu Leu Asp Tyr
595                 600                 605
Ser Arg Val Thr Tyr Ala Phe His Leu Asp Tyr Glu Lys Trp Asn Asn
610                 615                 620
His Gln Arg Leu Glu Ser Thr Glu Asp Val Phe Ser Val Leu Asp Gln
625                 630                 635                 640
Val Phe Gly Leu Lys Arg Val Phe Ser Arg Thr His Glu Phe Phe Gln
645                 650                 655
Lys Ser Trp Ile Tyr Tyr Ser Asp Arg Ser Asp Leu Ile Gly Leu Arg
660                 665                 670
Glu Asp Gln Ile Tyr Cys Leu Asp Met Ser Asn Gly Pro Thr Cys Trp
675                 680                 685
Asn Gly Gln Asp Gly Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gln Lys Gly Trp Ser
690                 695                 700
Leu Val Ser Leu Leu Met Ile Asp Arg Glu Ser Gln Thr Arg Asn Thr
705                 710                 715                 720
Arg Thr Lys Ile Leu Ala Gln Gly Asp Asn Gln Val Leu Cys Pro Thr
725                 730                 735
Tyr Met Leu Ser Pro Gly Leu Ser Gln Glu Gly Leu Leu Tyr Glu Leu
740                 745                 750
Glu Ser Ile Ser Arg Asn Ala Leu Ser Ile Tyr Arg Ala Ile Glu Glu
755                 760                 765
Gly Ala Ser Lys Leu Gly Leu Ile Ile Lys Lys Glu Glu Thr Met Cys
770                 775                 780
Ser Tyr Asp Phe Leu Ile Tyr Gly Lys Thr Pro Leu Phe Arg Gly Asn
785                 790                 795                 800
Ile Leu Val Pro Glu Ser Lys Arg Trp Ala Arg Val Ser Cys Ile Ser
805                 810                 815
Asn Asp Gln Ile Val Asn Leu Ala Asn Ile Met Ser Thr Val Ser Thr
820                 825                 830
Asn Ala Leu Thr Val Ala Gln His Ser Gln Ser Leu Ile Lys Pro Met
835                 840                 845
Arg Asp Phe Leu Leu Met Ser Val Gln Ala Val Phe His Tyr Leu Leu
850                 855                 860
Phe Ser Pro Ile Leu Lys Gly Arg Val Tyr Lys Ile Leu Ser Ala Glu
865                 870                 875                 880
Gly Glu Ser Phe Leu Leu Ala Met Ser Arg Ile Ile Tyr Leu Asp Pro
885                 890                 895
Ser Leu Gly Gly Val Ser Gly Met Ser Leu Gly Arg Phe His Ile Arg
900                 905                 910
Gln Phe Ser Asp Pro Val Ser Glu Gly Leu Ser Phe Trp Arg Glu Ile
915                 920                 925
Trp Leu Ser Ser His Glu Ser Trp Ile His Ala Leu Cys Gln Glu Ala
930                 935                 940
Gly Asn Pro Asp Leu Gly Glu Arg Thr Leu Glu Ser Phe Thr Arg Leu
945                 950                 955                 960
Leu Glu Asp Pro Thr Thr Leu Asn Ile Lys Gly Gly Ala Ser Pro Thr
965                 970                 975
Ile Leu Leu Lys Asp Ala Ile Arg Lys Ala Leu Tyr Asp Glu Val Asp
980                 985                 990
Lys Val Glu Asn Ser Glu Phe Arg  Glu Ala Ile Leu Leu  Ser Lys Thr
995                 1000                 1005
His Arg  Asp Asn Phe Ile Leu  Phe Leu Lys Ser Val  Glu Pro Leu
1010                 1015                 1020
Phe Pro  Arg Phe Leu Ser Glu  Leu Phe Ser Ser Ser  Phe Leu Gly
1025                 1030                 1035
Ile Pro  Glu Ser Ile Ile Gly  Leu Ile Gln Asn Ser  Arg Thr Ile
1040                 1045                 1050
Arg Arg  Gln Phe Arg Lys Ser  Leu Ser Arg Thr Leu  Glu Glu Ser
1055                 1060                 1065
Phe Tyr  Asn Ser Glu Ile His  Gly Ile Asn Arg Met  Thr Gln Thr
1070                 1075                 1080
Pro Gln  Arg Val Gly Arg Val  Trp Pro Cys Ser Ser  Glu Arg Ala
1085                 1090                 1095
Asp Leu  Leu Arg Glu Ile Ser  Trp Gly Arg Lys Val  Val Gly Thr
1100                 1105                 1110
Thr Val  Pro His Pro Ser Glu  Met Leu Gly Leu Leu  Pro Lys Ser
1115                 1120                 1125
Ser Ile  Ser Cys Thr Cys Gly  Ala Thr Gly Gly Gly  Asn Pro Arg
1130                 1135                 1140
Val Ser  Val Ser Val Leu Pro  Ser Phe Asp Gln Ser  Phe Phe Ser
1145                 1150                 1155
Arg Gly  Pro Leu Lys Gly Tyr  Leu Gly Ser Ser Thr  Ser Met Ser
1160                 1165                 1170
Thr Gln  Leu Phe His Ala Trp  Glu Lys Val Thr Asn  Val His Val
1175                 1180                 1185
Val Lys  Arg Ala Ile Ser Leu  Lys Glu Ser Ile Asn  Trp Phe Ile
1190                 1195                 1200
Asn Arg  Asn Ser Asn Leu Ala  Gln Thr Leu Ile Arg  Asn Ile Met
1205                 1210                 1215
Ser Leu  Thr Gly Pro Asp Phe  Pro Leu Glu Glu Ala  Pro Val Phe
1220                 1225                 1230
Lys Arg  Thr Gly Ser Ala Leu  His Arg Phe Lys Ser  Ala Arg Tyr
1235                 1240                 1245
Ser Glu  Gly Gly Tyr Ser Ser  Val Cys Pro Asn Leu  Leu Ser His
1250                 1255                 1260
Ile Ser  Val Ser Thr Asp Thr  Met Ser Asp Leu Thr  Gln Asp Gly
1265                 1270                 1275
Lys Asn  Tyr Asp Phe Met Phe  Gln Pro Leu Met Leu  Tyr Ala Gln
1280                 1285                 1290
Thr Trp  Thr Ser Glu Leu Val  Gln Arg Asp Thr Arg  Leu Arg Asp
1295                 1300                 1305
Ser Thr  Phe His Trp His Leu  Arg Cys Asn Arg Cys  Val Arg Pro
1310                 1315                 1320
Ile Glu  Asp Ile Thr Leu Glu  Thr Ser Gln Ile Phe  Glu Phe Pro
1325                 1330                 1335
Asp Val  Ser Lys Arg Ile Ser  Arg Met Val Ser Gly  Ala Val Pro
1340                 1345                 1350
His Phe  Gln Lys Leu Pro Asp  Ile Arg Leu Arg Pro  Gly Asp Phe
1355                 1360                 1365
Glu Ser  Leu Ser Gly Arg Glu  Lys Ser Arg His Ile  Gly Ser Ala
1370                 1375                 1380
Gln Gly  Leu Leu Tyr Ser Ile  Leu Val Ala Ile His  Asp Ser Gly
1385                 1390                 1395
Tyr Asn  Asp Gly Thr Ile Phe  Pro Val Asn Ile Tyr  Gly Lys Val
1400                 1405                 1410
Ser Pro  Arg Asp Tyr Leu Arg  Gly Leu Ala Arg Gly  Ile Leu Ile
1415                 1420                 1425
Gly Ser  Ser Ile Cys Phe Leu  Thr Arg Met Thr Asn  Ile Asn Ile
1430                 1435                 1440
Lys Arg  Pro Leu Glu Leu Ile  Ser Gly Val Ile Ser  Tyr Ile Leu
1445                 1450                 1455
Leu Arg  Leu Asp Asn His Pro  Ser Leu Tyr Ile Met  Leu Arg Glu
1460                 1465                 1470
Pro Ser  Leu Arg Gly Glu Ile  Phe Ser Ile Pro Gln  Lys Ile Pro
1475                 1480                 1485
Ala Ala  Tyr Pro Thr Thr Met  Lys Glu Gly Asn Arg  Ser Ile Leu
1490                 1495                 1500
Cys Tyr  Leu Gln His Val Leu  Arg Tyr Glu Arg Glu  Val Ile Thr
1505                 1510                 1515
Ala Ser  Pro Glu Asn Asp Trp  Leu Trp Ile Phe Ser  Asp Phe Arg
1520                 1525                 1530
Ser Ala  Lys Met Thr Tyr Leu  Thr Leu Ile Thr Tyr  Gln Ser His
1535                 1540                 1545
Leu Leu  Leu Gln Arg Val Glu  Arg Asn Leu Ser Lys  Ser Met Arg
1550                 1555                 1560
Ala Thr  Leu Arg Gln Met Gly  Ser Leu Met Arg Gln  Val Leu Gly
1565                 1570                 1575
Gly His  Gly Glu Asp Thr Leu  Glu Ser Asp Asp Asp  Ile Gln Arg
1580                 1585                 1590
Leu Leu  Lys Asp Ser Leu Arg  Arg Thr Arg Trp Val  Asp Gln Glu
1595                 1600                 1605
Val Arg  His Ala Ala Arg Thr  Met Ser Gly Asp Tyr  Ser Pro Asn
1610                 1615                 1620
Lys Arg  Val Ser Arg Lys Ala  Gly Cys Ser Glu Trp  Val Cys Ser
1625                 1630                 1635
Ala Gln  Gln Val Ala Val Ser  Thr Ser Ala Asn Pro  Ala Pro Val
1640                 1645                 1650
Ser Glu  Leu Asp Ile Arg Ala  Leu Ser Lys Arg Phe  Gln Asn Pro
1655                 1660                 1665
Leu Ile  Ser Gly Leu Arg Val  Val Gln Trp Ala Thr  Gly Ala His
1670                 1675                 1680
Tyr Lys  Leu Lys Pro Ile Leu  Asp Asp Leu Asn Val  Phe Pro Ser
1685                 1690                 1695
Leu Cys  Leu Val Val Gly Asp  Gly Ser Gly Gly Ile  Ser Arg Ala
1700                 1705                 1710
Val Leu  Asn Met Phe Pro Asp  Ser Lys Leu Val Phe  Asn Ser Leu
1715                 1720                 1725
Leu Glu  Val Asn Asp Leu Met  Ala Ser Gly Thr His  Pro Leu Pro
1730                 1735                 1740
Pro Ser  Ala Ile Met Ser Gly  Gly Asp Asp Ile Ile  Ser Arg Val
1745                 1750                 1755
Ile Asp  Phe Asp Ser Ile Trp  Glu Lys Pro Ser Asp  Leu Arg Asn
1760                 1765                 1770
Leu Ala  Thr Trp Arg Tyr Phe  Gln Ser Val Gln Lys  Gln Val Asn
1775                 1780                 1785
Met Ser  Tyr Asp Leu Ile Val  Cys Asp Ala Glu Val  Thr Asp Ile
1790                 1795                 1800
Ala Ser  Ile Asn Arg Ile Thr  Leu Leu Met Ser Asp  Phe Ala Leu
1805                 1810                 1815
Ser Ile  Asp Gly Pro Leu Tyr  Leu Val Phe Lys Thr  Tyr Gly Thr
1820                 1825                 1830
Met Leu  Val Asn Pro Asp Tyr  Lys Ala Ile Gln His  Leu Ser Arg
1835                 1840                 1845
Ala Phe  Pro Ser Val Thr Gly  Phe Ile Thr Gln Val  Thr Ser Ser
1850                 1855                 1860
Phe Ser  Ser Glu Leu Tyr Leu  Arg Phe Ser Lys Arg  Gly Lys Phe
1865                 1870                 1875
Phe Arg  Asp Ala Glu Tyr Leu  Thr Ser Ser Thr Leu  Arg Glu Met
1880                 1885                 1890
Ser Leu  Val Leu Phe Asn Cys  Ser Ser Pro Lys Ser  Glu Met Gln
1895                 1900                 1905
Arg Ala  Arg Ser Leu Asn Tyr  Gln Asp Leu Val Arg  Gly Phe Pro
1910                 1915                 1920
Glu Glu  Ile Ile Ser Asn Pro  Tyr Asn Glu Met Ile  Ile Thr Leu
1925                 1930                 1935
Ile Asp  Ser Asp Val Glu Ser  Phe Leu Val His Lys  Met Val Asp
1940                 1945                 1950
Asp Leu  Glu Leu Gln Arg Gly  Thr Leu Ser Lys Val  Ala Ile Ile
1955                 1960                 1965
Ile Ser  Ile Met Ile Val Phe  Ser Asn Arg Val Phe  Asn Ile Ser
1970                 1975                 1980
Lys Pro  Leu Thr Asp Pro Leu  Phe Tyr Pro Pro Ser  Asp Pro Lys
1985                 1990                 1995
Ile Leu  Arg His Phe Asn Ile  Cys Cys Ser Thr Met  Met Tyr Leu
2000                 2005                 2010
Ser Thr  Ala Leu Gly Asp Val  Pro Ser Phe Ala Arg  Leu His Asp
2015                 2020                 2025
Leu Tyr  Asn Arg Pro Ile Thr  Tyr Tyr Phe Arg Lys  Gln Val Ile
2030                 2035                 2040
Arg Gly  Asn Ile Tyr Leu Ser  Trp Ser Trp Ser Asp  Asp Thr Pro
2045                 2050                 2055
Val Phe  Lys Arg Val Ala Cys  Asn Ser Ser Leu Ser  Leu Ser Ser
2060                 2065                 2070
His Trp  Ile Arg Leu Ile Tyr  Lys Ile Val Lys Thr  Thr Arg Leu
2075                 2080                 2085
Val Gly  Ser Ile Glu Asp Leu  Ser Gly Glu Val Glu  Arg His Leu
2090                 2095                 2100
His Gly  Tyr Asn Arg Trp Ile  Thr Leu Glu Asp Ile  Arg Ser Arg
2105                 2110                 2115
Ser Ser  Leu Leu Asp Tyr Ser  Cys Leu
2120                 2125
<210>  11
<211>  1575
<212>  РНК
<213>  Вирус бешенства
<400>  11
augguuccuc aggcucuccu guuuguaccc cuucugguuu uuccauugug uuuugggaaa       60
uucccuauuu acacgauacc agacaagcuu ggucccugga gcccgauuga cauacaucac      120
cucagcugcc caaacaauuu gguaguggag gacgaaggau gcaccaaccu gucaggguuc      180
uccuacaugg aacuuaaagu uggauacauc ucagccauaa aaaugaacgg guucacuugc      240
acaggcguug ugacggaggc ugaaaccuac acuaacuucg uugguuaugu cacaaccacg      300
uucaaaagaa agcauuuccg cccaacacca gaugcaugua gagccgcgua caacuggaag      360
auggccggug accccagaua ugaagagucu cuacacaauc cguacccuga cuaccacugg      420
cuucgaacug uaaaaaccac caaggagucu cucguuauca uaucuccaag uguggcagau      480
uuggacccau augacagauc ccuucacucg agggucuucc cuggcgggaa uugcucagga      540
guagcggugu cuucuaccua cugcuccacu aaccacgauu acaccauuug gaugcccgag      600
aauccgagac uagggauguc uugugacauu uuuaccaaua guagagggaa gagagcaucc      660
aaagggagug agacuugcgg cuuuguagau gaaagaggcc uauauaaguc uuuaaaagga      720
gcaugcaaac ucaaguuaug uggaguucua ggacuuagac uuauggaugg aacauggguc      780
gcgaugcaaa caucaaauga aaccaaaugg ugcccucccg gucaguuggu gaauuugcac      840
gacuuucgcu cagacgaaau ugagcaccuu guuguagagg aguuggucaa gaagagagag      900
gagugucugg augcacuaga guccaucaug accaccaagu cagugaguuu cagacgucuc      960
agucauuuaa gaaaacuugu cccuggguuu ggaaaagcau auaccauauu caacaagacc     1020
uugauggaag ccgaugcuca cuacaaguca gucagaacuu ggaaugagau caucccuuca     1080
aaaggguguu uaagaguugg ggggaggugu cauccucaug uaaacggggu auuuuucaau     1140
gguauaauau uaggaccuga cggcaauguc uuaaucccag agaugcaauc aucccuccuc     1200
cagcaacaua uggaguuguu gguauccucg guuauccccc uuaugcaccc ccuggcagac     1260
ccgucuaccg uuuucaagaa cggugacgag gcugaggauu uuguugaagu ucaccuuccc     1320
gaugugcacg aacggaucuc aggaguugac uugggucucc cgaacugggg gaaguaugua     1380
uuacugagug caggggcccu gacugccuug auguugauaa uuuuccugau gacaugcugg     1440
agaagaguca aucgaucgga accuacacaa cacaaucuca gagggacagg gagggaggug     1500
ucagucacuc cccaaagcgg gaagaucaua ucuucauggg aaucauacaa gagcgggggu     1560
gagaccggac uguga                                                      1575
<210>  12
<211>  1353
<212>  РНК
<213>  Вирус бешенства
<400>  12
auggaugccg acaagauugu auucaaaguc aauaaucagg uggucucuuu gaagccugag       60
auuaucgugg aucaauauga guacaaguac ccugccauca aagauuugaa aaagcccugu      120
auaacucuag gaaaggcucc cgauuuaaau aaagcauaca agucaguuuu aucaugcaug      180
agcgccgcca aacuugaucc ugacgaugua uguuccuauu uggcggcggc aaugcaguuu      240
uuugagggga cauguccgga agacuggacc agcuauggaa ucgugauugc acgaaaagga      300
gauaagauca ccccagguuc ucugguggag auaaaacgua cugauguaga agggaauugg      360
gcucugacag gaggcaugga acugacaaga gaccccacug ucccugagca ugcguccuua      420
gucggucuuc ucuugagucu guauagguug agcaaaauau ccgggcaaag cacugguaac      480
uauaagacaa acauugcaga caggauagag cagauuuuug agacagcccc uuuuguuaaa      540
aucguggaac accauacucu aaugacaacu cacaaaaugu gugcuaauug gaguacuaua      600
ccaaacuuca gauuuuuggc cggaaccuau gacauguuuu ucucccggau ugagcaucua      660
uauucagcaa ucagaguggg cacaguuguc acugcuuaug aagacuguuc aggacuggug      720
ucauuuacug gguucauaaa acaaaucaau cucaccgcua gagaggcaau acuauauuuc      780
uuccacaaga acuuugagga agagauaaga agaauguuug agccagggca ggagacagcu      840
guuccucacu cuuauuucau ccacuuccgu ucacuaggcu ugagugggaa aucuccuuau      900
ucaucaaaug cuguugguca cguguucaau cucauucacu uuguaggaug cuauaugggu      960
caagucagau cccuaaaugc aacgguuauu gcugcaugug cuccucauga aaugucuguu     1020
cuagggggcu aucugggaga ggaauucuuc gggaaaggga cauuugaaag aagauucuuc     1080
agagaugaga aagaacuuca agaauacgag gcggcugaac ugacaaagac ugacguagca     1140
cuggcagaug auggaacugu caacucugac gacgaggacu acuucucagg ugaaaccaga     1200
aguccggaag cuguuuauac ucgaaucaua augaauggag gucgacugaa gagaucgcac     1260
auacggagau augucucagu caguuccaau caucaagcuc guccaaacuc auucgccgag     1320
uuucuaaaca agacauauuc gagugacuca uaa                                  1353
<210>  13
<211>  894
<212>  РНК
<213>  Вирус бешенства
<400>  13
augagcaaga ucuuugucaa uccuagugcu auuagagccg gucuggccga ucuugagaug       60
gcugaagaaa cuguugaucu gaucaauaga aauaucgaag acaaucaggc ucaucuccaa      120
ggggaaccca uagaagugga caaucucccu gaggauaugg ggcgacuuca ccuggaugau      180
ggaaaaucgc ccaacccugg ugagauggcc aaggugggag aaggcaagua ucgagaggac      240
uuucagaugg augaaggaga ggauccuagc cuccuguucc agucauaccu ggacaauguu      300
ggaguccaaa uagucagaca aauaagguca ggagagagau uucucaagau auggucacag      360
accguagaag agauuauauc cuaugucgcg gucaacuuuc ccaacccucc aggaaagucu      420
ucagaggaua aaucaaccca gacuaccggc cgagagcuca agaaggagac aacacccacu      480
ccuucucaga gagaaagcca auccucgaaa gccaggaugg cggcucaaac ugcuucuggc      540
ccuccagccc uugaaugguc ggccaccaau gaagaggaug aucuaucagu ggaggcugag      600
aucgcucacc agauugcaga aaguuucucc aaaaaauaua aguuucccuc ucgauccuca      660
gggauacucu uguauaauuu ugagcaauug aaaaugaacc uugaugauau aguuaaagag      720
gcaaaaaaug uaccaggugu gacccguuua gcccgugacg gguccaaacu cccccuaaga      780
uguguacugg gaugggucgc cuuggccaac ucuaagaaau uccaguuguu agucgaaucc      840
aacaagcuga guaaaaucau gcaagaugac uugaaucgcu auacaucuug cuaa            894
<210>  14
<211>  609
<212>  РНК
<213>  Вирус бешенства
<400>  14
augaacuuuc uacguaagau agugaaaaau ugcagggacg aggacacuca aaaacccucu       60
cccgugucag ccccucugga ugacgaugac uuguggcuuc cacccccuga auacgucccg      120
cuaaaagaac uuacaagcaa gaagaacagg aggaacuuuu guaucaacgg agggguuaaa      180
guguguagcc cgaaugguua cucguucggg auccugcggc acauucugag aucauucgac      240
gagauauauu cugggaauca uaggaugguc ggguuaguca aaguaguuau uggacuggcu      300
uugucaggag cuccaguccc ugagggcaug aacuggguau acaaguugag gagaacccuu      360
aucuuccagu gggcugauuc caggggcccu cuugaagggg aggaguugga auacucucag      420
gagaucacuu gggaugauaa uacugaguuc gucggauugc aaauaagagu gagugcaaaa      480
cagugucaua uccggggcag aaucuggugu aucaacauga acucgagagc aggucaacua      540
uggucugaca ugucucuuca gacacaaagg uccgaagagg acaaagauuc cucucugcuu      600
cuagaauaa                                                              609
<210>  15
<211>  6429
<212>  РНК
<213>  Вирус бешенства
<400>  15
augcucgauc cuggagaggu cuaugaugac ccuauugacc caaucgaguu agaggcugaa       60
cccagaggaa cccccacugu ccccaacauc uugaggaacu cugacuacaa ucucaacucu      120
ccuuugauag aagauccugc uagacuaaug uuagaauggu uaaaaacagg gaauagaccu      180
uaucggauga cucuaacaga caauugcucc aggucuuuca gaguuuugaa agauuauuuc      240
aagaagguag auuuggguuc ccucaaggug ggcggaaugg cugcacaguc aaugauuucu      300
cucugguuau auggugccca cucugaaucc aacaggagcc ggagauguau aacagacuug      360
gcccauuucu auuccaaguc gucccccaua gagaagcugu uaaaucucac gcuaggaaau      420
agagggcuga gaaucccccc agagggagug uuaaguugcc uugagagggu ugauuaugau      480
aaugcauuug gaagguaucu ugccaacacg uauuccucuu acuuguucuu ccauguaauc      540
accuuauaca ugaacgcccu agacugggau gaagaaaaga ccauccuagc auuauggaaa      600
gauuuaaccu caguggacau cgggaaggac uugguaaagu ucaaagacca aauaugggga      660
cugcugaucg ugacaaagga cuuuguuuac ucccaaaguu ccaauugucu uuuugacaga      720
aacuacacac uuaugcuaaa agaucuuuuc uugucucgcu ucaacuccuu aauggucuua      780
cuuucucccc cagagccccg auacucagau gacuugauau cucagcuaug ccagcuguac      840
auugcugggg aucaagucuu gucuaugugu ggaaacuccg gcuaugaagu caucaaaaua      900
uuggagccau augucgugaa uaguuuaguc cagagagcag aaaaguuuag gccucucauu      960
cauuccuugg gagacuuucc uguauuuaua aaagacaagg uaagucaacu cgaagagacg     1020
uucgguuccu gugcaagaag guucuuuagg gcucuggauc aauucgacaa cauacaugac     1080
uugguuuuug uguauggcug uuacaggcau ugggggcacc cauauauaga uuaucgaaag     1140
ggucugucaa aacuauauga ucagguucac auuaaaaaag ugauagauaa guccuaccag     1200
gagugcuuag caagcgaccu agccaggagg auccuuagau gggguuuuga uaaguacucc     1260
aagugguauc uggauucacg auuccuagcc cgagaccacc ccuugacucc uuauaucaaa     1320
acccaaacau ggccacccaa acauauugua gauuuggugg gggauacaug gcacaagcuc     1380
ccgaucacgc aaaucuuuga gauuccugaa ucaauggauc caucagaaau auuggaugac     1440
aaaucacauu cuuucaccag aacgagacua gcuucuuggc ugucagaaaa ccgagggggg     1500
ccuguuccua gcgaaaaagu uauuaucacg gcccugucua agccgccugu caauccccga     1560
gaguuucuga agucuauaga ccucggagga uugccagaug aagacuugau aauuggccuc     1620
aagccaaagg aacgggaauu gaagauugaa ggucgauucu uugcucuaau gucauggaau     1680
cuaagauugu auuuugucau cacugaaaaa cucuuggcca acuacaucuu gccacuuuuu     1740
gacgcgcuga cuaugacaga caaccugaac aagguguuua aaaagcugau cgacaggguc     1800
accgggcaag ggcuucugga cuauucaagg gucacauaug cauuucaccu ggacuaugaa     1860
aaguggaaca accaucaaag auuagaguca acagaggaug uauuuucugu ccuagaucaa     1920
guguuuggau ugaagagagu guuuucuaga acacacgagu uuuuucagaa guccuggauc     1980
uauuauucag acagaucaga ccucaucggg uuacgggagg aucaaauaua cugcuuagau     2040
gcguccaacg gcccaaccug uuggaauggc caggauggcg ggcuagaagg cuuacggcag     2100
aagggcugga gucuagucag cuuauugaug auagauagag aaucucaaau caggaacaca     2160
agaaccaaag uacuagcuca aggagacaac cagguuuuau guccgacaua uauguugucg     2220
ccagggcuau cucaagaggg gcuccucuau gaauuggaga gcauaucaag gaaugcauuu     2280
ucgauauaca gagccgucga ggaaggggca ucuaaacuag ggcugaucau caagaaagaa     2340
gagaccaugu guaguuauga cuuccucauc uauggaaaaa ccccuuuguu uagagguaac     2400
auauuggugc cugaguccaa aagaugggcc agagucucuu gcgucucuaa ugaccaaaua     2460
gucaaccucg ccaauauaau gucgacagug uccaccaacg cgcuaacagu ggcacaacac     2520
ucucaaucuu ugaucaaacc gaugagggau uuucugcuca ugucaguaca ggcagucuuu     2580
cacuaccugc uauuuagccc aaucuuaaag ggaagaguuu acaagauucu gagcgcugaa     2640
ggggagagcu uucuccuagc caugucaagg auaaucuauc uagauccuuc uuugggaggg     2700
guaucuggaa ugucccucgg aagauuccau auacgacagu ucucagaccc ugucucugaa     2760
ggguuauccu ucuggagaga gaucugguua agcucccacg aguccuggau ucacgcguug     2820
ugucaagagg cuggaaaccc agaucuugga gagagaacac ucgagagcuu cacucgccuu     2880
cuagaagauc cuaccaccuu aaauaucaga ggaggggcca guccuaccau ucuacucaag     2940
gaugcaauca gaaaggcuuu auaugacgag guggacaagg uggagaacuc agaguuucga     3000
gaggcaaucc uguuguccaa gacccauaga gauaauuuua uacucuucuu aacaucuguu     3060
gagccucugu uuccucgauu ucucagugag cuauucaguu cgucuuuuuu gggaaucccc     3120
gagucaauca uuggacugau acaaaacucc cgaacgauaa gaaggcaguu uagaaagagu     3180
cucucaaaaa cuuuagaaga auccuucuac aacucagaga uccacgggau uagucggaug     3240
acccagacac cucagagggu ugggggggug uggccuugcu cuucagagag ggcagaucua     3300
cuuagggaga ucucuugggg aagaaaagug guaggcacga caguuccuca cccuucugag     3360
auguuggggu uacuucccaa guccucuauu ucuugcacuu guggagcaac aggaggaggc     3420
aauccuagag uuucuguauc aguacucccg ucuuuugauc agucauuuuu uugcacgggg     3480
ccccuaaagg gguacuuggg cucguccacc ucuaugucga cccagcuauu ccaugcaugg     3540
gaaaaaguca cuaauguuca uguggugaag agagcucuau cguuaaaaga aucuauaaac     3600
ugguucauua cuagagauuc caacuuggcu caaacucuaa uuaggaacau ugugucucug     3660
acaggcccug auuucccucu agaggaggcc ccuguuuuca aaaggacggg gucagccuug     3720
cauagguuca agucugccag auacagcgaa ggaggguauu cuucuguaug cccgaaccuc     3780
cucucucaua uuucuguuag uacagacacc augucugauu ugacccaaga cgggaagaac     3840
uacgauuuca uguuccagcc auugaugcuu uaugcacaga cauggacauc agagcuggua     3900
cagagagaca caaggcuaag agacucuacg uuucauuggc accuccaaug caacaggugu     3960
gugagaccca uugacgacgu gacccuggag accucucaga ucuucgaguu uccggaugug     4020
ucgaaaagaa uauccagaau gguuucuggg gcugugccuc acuuccagag gcuucccgau     4080
auccgucuga gaccaggaga uuuugaaucu cuaagcggua gagaaaaguc ucaccauauc     4140
ggaucagcuc aggggcucuu auacucaauc uuaguggcaa uucacgacuc aggauacaau     4200
gauggaacca ucuucccugu caacauauac ggcaagguuu ccccuagaga cuauuugaga     4260
gggcucgcaa ggggaguauu gauaggaucc ucgauuugcu ucuugacgag aaugacaaau     4320
aucaauauua auagaccucu ugaauugauc ucagggguaa ucucauauau ucuccugagg     4380
cuagauaacc aucccuccuu guacauaaug cucagagaac cgucuuuuag agaagagaua     4440
uuuucuaucc cucagaaaau ccccgccgcu uauccaacca cuaugaaaga aggcaacaga     4500
ucaaucuugu guuaucucca acaugugcua cgcuaugagc gagagguaau cacggcgucu     4560
ccagagaaug acuggcuaug gaucuuuuca gacuuuagaa gugccaaaau gacguaccua     4620
acccucauua cuuaccaguc ucaucuucua cuccagaggg uugagagaaa ccuaucuaag     4680
aguaugagag auaaccugcg acaauugagu uccuugauga ggcaggugcu gggcgggcac     4740
ggagaagaua ccuuagaguc agacgacaac auucaacgac uacuaaaaga cucuuuacga     4800
aggacaagau ggguggauca agaggugcgc caugcagcua gaaccaugac uggagauuac     4860
agccccaaca agaagguguc ccguaaggua ggauguucag aaugggucug cucugcucaa     4920
cagguugcag ucucuaccuc agcaaacccg gccccugucu cggagcuuga cauaagggcc     4980
cucucuaaga gguuccagaa cccuuugauc ucgggcuuga gagugguuca gugggcaacc     5040
ggugcucauu auaagcuuaa gccuauucua gaugaucuca auguuuuccc aucucucugc     5100
cuuguaguug gggacggguc aggggggaua ucaagggcag uccucaacau guuuccagau     5160
gccaagcuug uguucaacag ucuuuuagag gugaaugacc ugauggcuuc cggaacacau     5220
ccacugccuc cuucagcaau caugagggga ggaaaugaua ucgucuccag agugauagau     5280
uuugacucaa ucugggaaaa accguccgac uugagaaacu uggcuaccug gaaauacuuc     5340
cagucagucc aaaagcaggu caacaugucc uaugaccuca uuauuugcga ugcagaaguu     5400
acugacauug caucuaucaa ccggauaacc cuguuaaugu ccgauuuugc auugucuaua     5460
gauggaccac ucuauuuggu cuucaaaacu uaugggacua ugcuaguaaa uccaaacuac     5520
aaggcuauuc aacaccuguc aagagcguuc cccucgguca caggguuuau cacccaagua     5580
acuucgucuu uuucaucuga gcucuaccuu cgauucucca aacgagggaa guuuuucaga     5640
gaugcugagu acuugaccuc uuccacccuu cgagaaauga gccuuguguu auucaauugu     5700
agcagcccca agagugagau gcagagagcu cguuccuuga acuaucagga ucuugugaga     5760
ggauuuccug aagaaaucau aucaaauccu uacaaugaga ugaucauaac ucugauugac     5820
agugauguag aaucuuuucu aguccacaag augguggaug aucuugaguu acagagggga     5880
acucugucua aaguggcuau cauuauagcc aucaugauag uuuucuccaa cagagucuuc     5940
aacguuucca aaccccuaac ugaccccuug uucuauccac cgucugaucc caaaauccug     6000
aggcacuuca acauauguug caguacuaug auguaucuau cuacugcuuu aggugacguc     6060
ccuagcuucg caagacuuca cgaccuguau aacagaccua uaacuuauua cuucagaaag     6120
caagucauuc uagggaacgu uuaucuaucu uggaguuggu ccaacgacac cucaguguuc     6180
aaaaggguag ccuguaauuc uagccugagu cugucaucuc acuggaucag guugauuuac     6240
aagauaguga agacuaccag acucguuggc agcaucaagg aucuauccgg agaaguggaa     6300
agacaccuuc auagguacaa cagguggauc acccuagaga auaucagauc uagaucaucc     6360
cuacuagacu acaguugccu gugcaucgga uacuccugga agccugccca ugcuaagacu     6420
cuuguguga                                                             6429
<210>  16
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  5'-UTR человеческого белка большой субъединицы рибосомы 32, лишенный 5'-концевого олигопиримидинового тракта
<400>  16
ggcgctgcct acggaggtgg cagccatctc cttctcggca tc                          42
<210>  17
<211>  186
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  17
catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa       60
aagcttattc atctgttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac      120
ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa      180
gaatct                                                                 186
<210>  18
<211>  186
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  18
catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa       60
tagcttattc atctcttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac      120
ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa      180
gaacct                                                                 186
<210>  19
<211>  110
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  19
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc       60
ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc                 110
<210>  20
<211>  108
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  20
gctggagcct cggtagccgt tcctcctgcc cgctgggcct cccaacgggc cctcctcccc       60
tccttgcacc ggcccttcct ggtctttgaa taaagtctga gtgggcag                   108
<210>  21
<211>  132
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac       60
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt      120
tattttcatt gc                                                          132
<210>  22
<211>  44
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  центральная связывающая альфа-комплекс область 3’UTR гена альфа-глобина (muag)
<400>  22
gcccgatggg cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accg                        44
<210>  23
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  наиболее предпочтительная последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля»
<400>  23
caaaggctct tttcagagcc acca                                              24
<210>  24
<211>  1792
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  RAV-G(GC)-muag-A64-C30-гистонSL
<400>  24
gggagaaagc uuaccauggu gccccaggcc cugcucuucg ucccgcugcu gguguucccc       60
cucugcuucg gcaaguuccc caucuacacc auccccgaca agcuggggcc guggagcccc      120
aucgacaucc accaccuguc cugccccaac aaccucgugg ucgaggacga gggcugcacc      180
aaccugagcg gguucuccua cauggagcug aaggugggcu acaucagcgc caucaagaug      240
aacggguuca cgugcaccgg cguggucacc gaggcggaga ccuacacgaa cuucgugggc      300
uacgugacca ccaccuucaa gcggaagcac uuccgcccca cgccggacgc cugccgggcc      360
gccuacaacu ggaagauggc cggggacccc cgcuacgagg agucccucca caaccccuac      420
cccgacuacc acuggcugcg gaccgucaag accaccaagg agagccuggu gaucaucucc      480
ccgagcgugg cggaccucga ccccuacgac cgcucccugc acagccgggu cuuccccggc      540
gggaacugcu ccggcguggc cgugagcucc acguacugca gcaccaacca cgacuacacc      600
aucuggaugc ccgagaaccc gcgccugggg auguccugcg acaucuucac caacagccgg      660
ggcaagcgcg ccuccaaggg cagcgagacg ugcggguucg ucgacgagcg gggccucuac      720
aagucccuga agggggccug caagcugaag cucugcggcg ugcugggccu gcgccucaug      780
gacgggaccu ggguggcgau gcagaccagc aacgagacca aguggugccc ccccggccag      840
cuggucaacc ugcacgacuu ccggagcgac gagaucgagc accucguggu ggaggagcug      900
gucaagaagc gcgaggagug ccuggacgcc cucgagucca ucaugacgac caagagcgug      960
uccuuccggc gccugagcca ccugcggaag cucgugcccg gguucggcaa ggccuacacc     1020
aucuucaaca agacccugau ggaggccgac gcccacuaca aguccguccg cacguggaac     1080
gagaucaucc cgagcaaggg gugccugcgg gugggcggcc gcugccaccc ccacgucaac     1140
gggguguucu ucaacggcau cauccucggg cccgacggca acgugcugau ccccgagaug     1200
caguccagcc ugcuccagca gcacauggag cugcuggucu ccagcgugau cccgcucaug     1260
cacccccugg cggaccccuc caccguguuc aagaacgggg acgaggccga ggacuucguc     1320
gaggugcacc ugcccgacgu gcacgagcgg aucagcggcg ucgaccucgg ccugccgaac     1380
ugggggaagu acgugcugcu cuccgccggc gcccugaccg cccugaugcu gaucaucuuc     1440
cucaugaccu gcuggcgccg ggugaaccgg agcgagccca cgcagcacaa ccugcgcggg     1500
accggccggg aggucuccgu gaccccgcag agcgggaaga ucaucuccag cugggagucc     1560
uacaagagcg gcggcgagac cgggcuguga ggacuaguua uaagacugac uagcccgaug     1620
ggccucccaa cgggcccucc uccccuccuu gcaccgagau uaauaaaaaa aaaaaaaaaa     1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaug cauccccccc     1740
cccccccccc cccccccccc ccccaaaggc ucuuuucaga gccaccagaa uu             1792
<210>  25
<211>  1957
<212>  РНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  32L-RAV-G(GC)-альбумин7-A64-C30-гистонSL
<400>  25
ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accauggugc       60
cccaggcccu gcucuucguc ccgcugcugg uguucccccu cugcuucggc aaguucccca      120
ucuacaccau ccccgacaag cuggggccgu ggagccccau cgacauccac caccuguccu      180
gccccaacaa ccucgugguc gaggacgagg gcugcaccaa ccugagcggg uucuccuaca      240
uggagcugaa ggugggcuac aucagcgcca ucaagaugaa cggguucacg ugcaccggcg      300
uggucaccga ggcggagacc uacacgaacu ucgugggcua cgugaccacc accuucaagc      360
ggaagcacuu ccgccccacg ccggacgccu gccgggccgc cuacaacugg aagauggccg      420
gggacccccg cuacgaggag ucccuccaca accccuaccc cgacuaccac uggcugcgga      480
ccgucaagac caccaaggag agccugguga ucaucucccc gagcguggcg gaccucgacc      540
ccuacgaccg cucccugcac agccgggucu uccccggcgg gaacugcucc ggcguggccg      600
ugagcuccac guacugcagc accaaccacg acuacaccau cuggaugccc gagaacccgc      660
gccuggggau guccugcgac aucuucacca acagccgggg caagcgcgcc uccaagggca      720
gcgagacgug cggguucguc gacgagcggg gccucuacaa gucccugaag ggggccugca      780
agcugaagcu cugcggcgug cugggccugc gccucaugga cgggaccugg guggcgaugc      840
agaccagcaa cgagaccaag uggugccccc ccggccagcu ggucaaccug cacgacuucc      900
ggagcgacga gaucgagcac cucguggugg aggagcuggu caagaagcgc gaggagugcc      960
uggacgcccu cgaguccauc augacgacca agagcguguc cuuccggcgc cugagccacc     1020
ugcggaagcu cgugcccggg uucggcaagg ccuacaccau cuucaacaag acccugaugg     1080
aggccgacgc ccacuacaag uccguccgca cguggaacga gaucaucccg agcaaggggu     1140
gccugcgggu gggcggccgc ugccaccccc acgucaacgg gguguucuuc aacggcauca     1200
uccucgggcc cgacggcaac gugcugaucc ccgagaugca guccagccug cuccagcagc     1260
acauggagcu gcuggucucc agcgugaucc cgcucaugca cccccuggcg gaccccucca     1320
ccguguucaa gaacggggac gaggccgagg acuucgucga ggugcaccug cccgacgugc     1380
acgagcggau cagcggcguc gaccucggcc ugccgaacug ggggaaguac gugcugcucu     1440
ccgccggcgc ccugaccgcc cugaugcuga ucaucuuccu caugaccugc uggcgccggg     1500
ugaaccggag cgagcccacg cagcacaacc ugcgcgggac cggccgggag gucuccguga     1560
ccccgcagag cgggaagauc aucuccagcu gggaguccua caagagcggc ggcgagaccg     1620
ggcugugagg acuagugcau cacauuuaaa agcaucucag ccuaccauga gaauaagaga     1680
aagaaaauga agaucaauag cuuauucauc ucuuuuucuu uuucguuggu guaaagccaa     1740
cacccugucu aaaaaacaua aauuucuuua aucauuuugc cucuuuucuc ugugcuucaa     1800
uuaauaaaaa auggaaagaa ccuagaucua aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa     1860
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaugcaucc cccccccccc cccccccccc     1920
ccccccccca aaggcucuuu ucagagccac cagaauu                              1957
<210>  26
<211>  75
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  26
gcggctcggc cattttgtcc cagtcagtcc ggaggctgcg gctgcagaag taccgcctgc       60
ggagtaactg caaag                                                        75
<210>  27
<211>  24
<212>  РНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность гистоновой структуры типа «стебель-петля»
<400>  27
caaaggcucu uuucagagcc acca                                              24
<---