СПОСОБЫ И ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ТРАНСФЕКЦИИ КЛЕТОК

1. Способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий:
культивирование дифференцированной клетки вместе со средой для перепрограммирования;
трансфицирование указанной клетки одной или более синтетических молекул РНК, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую один или более факторов перепрограммирования, и где указанное трансфицирование приводит к тому, что указанная клетка экспрессирует указанные один или более факторов перепрограммирования; и
повторение стадии (b) по меньшей мере дважды в течение 5 последовательных дней,
где количество одной или более синтетических молекул РНК, трансфицированных в одной или более более поздних трансфекций, больше, чем их количество в одной или более более ранних трансфекций, что приводит к получению клетки, перепрограммированной в менее дифференцированное состояние,
где стадии (a)-(c) выполняют без использования клеток-фидеров, и они протекают в присутствии кондиционированной среды клеток-фидеров.
2. Способ по п.1, где указанная среда для перепрограммирования по существу свободна от иммунодепрессантов.
3. Способ по п.1, где указанная клетка представляет собой фибробласт.
4. Способ по п.3, где указанная клетка получена из биопсии.
5. Способ по п.4, где указанная биопсия представляет собой полнослойную биопсию, полученную при помощи дерматома.
2
6. Способ по п.1, где указанная клеточная культура имеет начальную плотность клеток менее, чем 20,000 клеток/см.
2
2
7. Способ по п.1, где указанная клеточная культура имеет начальную плотность клеток между 2000 клеток/см и 20000 клеток/см.
8. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает стадию промывания клетки после трансфекции.
9. Способ по п.1, где указанная среда для перепрограммирования содержит молекулу клеточной адгезии.
10. Способ по п.9, где указанная молекула клеточной адгезии выбрана из одного или более из фибронектина и витронектина.
11. Способ по п.10, где указанная молекула клеточной адгезии является рекомбинантной.
12. Способ по п.1, где указанные одна или более синтетических молекул РНК включают по меньшей мере одну молекулу РНК, кодирующую по меньшей мере один член группы: белок Oct4, белок Sox2, белок Klf4 и белок c-Myc.
13. Способ по п.1, где указанные одна или более синтетических молекул РНК содержат по меньшей мере один член группы: остаток псевдоуридина и остаток 5-метилцитидина.
2
2
14. Способ по п.1, где количество одной или более синтетических молекул РНК, трансфицированных в более ранних трансфекциях, находится между приблизительно 20 нг/см и 250 нг/см.
2
2
15. Способ по п.1, где количество одной или более синтетических молекул РНК, трансфицированных в более ранних трансфекциях, находится между приблизительно 100 нг/см и 600 нг/см.
2
2
2
2
2
2
16. Способ по п.1, где указанный способ включает по меньшей мере 5 трансфекций, и количество трансфицированных одной или более синтетических молекул РНК составляет приблизительно 25 нг/см для первой трансфекции, приблизительно 50 нг/см для второй трансфекции, приблизительно 100 нг/см для третьей трансфекции, приблизительно 200 ng/cm нг/см для четвертой трансфекции и приблизительно 400 нг/см для пятой трансфекции.
17. Способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий:
обеспечение неплюрипотентной клетки;
культивирование указанной клетки в среде, содержащей ингредиенты, которые поддерживают перепрограммирование указанной клетки в менее дифференцированное состояние; и
трансфицирование указанной клетки синтетической молекулой РНК, где:
указанная молекула РНК кодирует один или более факторов перепрограммирования, выбранных из группы, состоящей из белка Oct4, белка Sox2, белка Klf4, белка c-Myc, белка l-Myc, белка Tert, белка Nanog и белка Lin28,
указанное трансфицирование приводит к получению клетки, экспрессирующей указанные один или более факторов перепрограммирования, что перепрограммирует указанную клетку в менее дифференцированное состояние, и
стадию (c) выполняют без использования облученных человеческих неонатальных фибробластных клеток-фидеров, и она протекает в присутствии кондиционированной среды клеток-фидеров.
18. Способ по п.17, где указанная неплюрипотентная клетка получена из биопсии.
19. Способ по п.17, где указанная неплюрипотентная клетка забрана у субъекта-человека.
20. Способ по п.18, где указанная неплюрипотентная клетка забрана из образца биопсии, полученной при помощи дерматома.
21. Способ по п.17, где указанная неплюрипотентная клетка представляет собой клетку кожи.
22. Способ по п.17, дополнительно включающий приведение указанной клетки в контакт с по меньшей мере одним членом группы: поли-L-лизин, поли-L-орнитин, RGD-пептид, фибронектин, витронектин, коллаген и ламинин.
23. Способ по п.17, где указанная синтетическая молекула РНК содержит по меньшей мере один из остатка псевдоуридина или остатка 5-метилцитидина.
24. Способ по п.17, где указанная среда для перепрограммирования является по существу свободной от иммунодепрессантов.
25. Способ перепрограммирования клетки в менее дифференцированное состояние, включающий:
обеспечение неплюрипотентной клетки;
культивирование указанной клетки; и
трансфицирование указанной клетки синтетической молекулой РНК, где:
указанная молекула РНК кодирует один или более факторов перепрограммирования, выбранных из группы, состоящей из белка Oct4, белка Sox2, белка Klf4, белка c-Myc, белка l-Myc, белка Tert, белка Nanog и белка Lin28,
указанное трансфицирование приводит к получению клетки, экспрессирующей указанные один или более факторов перепрограммирования, что перепрограммирует указанную клетку в менее дифференцированное состояние, и
стадию (c) выполняют без использования облученных человеческих неонатальных фибробластных клеток-фидеров, и она протекает в присутствии среды, содержащей ингредиенты, которые поддерживают перепрограммирование указанной клетки в менее дифференцированное состояние.
26. Способ по п.25, где указанная неплюрипотентная клетка получена из биопсии.
27. Способ по п.25, где указанная неплюрипотентная клетка забрана у субъекта-человека.
28. Способ по п.26, где указанная неплюрипотентная клетка забрана из образца биопсии, полученной при помощи дерматома.
29. Способ по п.25, где указанная неплюрипотентная клетка представляет собой клетку кожи.
30. Способ по п.25, дополнительно включающий приведение указанной клетки в контакт с по меньшей мере одним членом группы: поли-L-лизин, поли-L-орнитин, RGD-пептид, фибронектин, витронектин, коллаген и ламинин.
31. Способ по п.25, где указанная синтетическая молекула РНК содержит по меньшей мере один из остатка псевдоуридина или остатка 5-метилцитидина.
32. Способ по п.25, где указанная среда является по существу свободной от иммунодепрессантов.
33. Способ перепрограммирования неплюрипотентной клетки, включающий:
обеспечение неплюрипотентной клетки, где указанная неплюрипотентная клетка получена из биопсии субъекта-человека;
культивирование указанной неплюрипотентной клетки; и
трансфицирование указанной неплюрипотентной клетки синтетической молекулой РНК, где:
указанная синтетическая молекула РНК кодирует один или более факторов перепрограммирования, выбранных из группы, состоящей из белка Oct4, белка Sox2, белка Klf4, белка c-Myc, белка l-Myc, белка Tert, белка Nanog и белка Lin28,
указанное трансфицирование приводит к тому, что указанная неплюрипотентная клетка экспрессирует указанные один или более факторов перепрограммирования, что перепрограммирует указанную неплюрипотентную клетку; и
стадию (c) выполняют без использования облученных человеческих неонатальных фибробластных клеток-фидеров, и она протекает в присутствии среды, содержащей ингредиенты, которые поддерживают перепрограммирование указанной неплюрипотентной клетки.
34. Способ по п.33, где указанная неплюрипотентная клетка взята из образца биопсии, полученной при помощи дерматома.
35. Способ по п.33, где указанная неплюрипотентная клетка представляет собой клетку кожи.
36. Способ по п.33, дополнительно включающий приведение указанной клетки в контакт с по меньшей мере одним членом группы: поли-L-лизин, поли-L-орнитин, RGD-пептид, фибронектин, витронектин, коллаген и ламинин.
37. Способ по п.33, где указанная синтетическая молекула РНК содержит по меньшей мере один из остатка псевдоуридина или остатка 5-метилцитидина.
38. Способ по п.33, где указанная среда является по существу свободной от иммунодепрессантов.