ТЕРМОЦИКЛЕР И СПОСОБ ТЕРМИЧЕСКОГО ЦИКЛА
THERMAL CYCLER AND METHOD OF THERMAL CYCLE

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящая патентная заявка основана на и испрашивает преимущество приоритета предварительной патентной заявки Японии № 2010-268090, поданной 1 декабря 2010 г., полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
[0002] Настоящее изобретение относится к термоциклеру и к способу термического цикла.
Уровень техники
[0003] В последние годы с продвижением в использовании генетических технологий получило внимание медицинское лечение, которое включает в себя использование генов, такое как генетическая диагностика или генная терапия, а также в сельском хозяйстве и животноводстве было разработано большое количество способов, включающих в себя использование генов для селекции породы и улучшения сортов. В качестве одного вида технологий с использованием генов широко известен способ PCR (полимеразная цепная реакция). Способ полимеразной цепной реакции в настоящее время является важнейшей технологией для выяснения информации по биологическим вопросам.
[0004] В способе полимеразной цепной реакции термический цикл применяется к раствору (реакционной смеси), который включает в себя последовательность нуклеиновых кислот, подвергающуюся амплификации (целевая ДНК), и реагент для амплификации целевой ДНК. Термический цикл является процессом применения двух или более температурных этапов к реакционной смеси и периодического повторения цикла. В способе полимеразной цепной реакции, как правило, в термическом цикле применяются два или три температурных этапа.
[0005] В способе полимеразной цепной реакции для проведения биохимической реакции обычно используются емкости, а именно пробирки или реакционные чипы для биологического образца (биоемкость). Однако известные методы обладают теми недостатками, что требуют большого количества реагента или других жидкостей для соответствующей реакции, сложных структур устройств для реализации термических циклов, необходимых для реакции, и требуют для проведения реакции длительного периода времени. Таким образом, существует потребность в биоемкостях или реакционных устройствах для осуществления полимеразной цепной реакции, которая является точной, требует более короткого периода времени и использует минимальное количество реагента и образца.
[0006] Чтобы преодолеть такие недостатки, патент JP-A-2009-136250 раскрывает реакционный чип для биологического образца, который заполнен реакционной смесью и жидкостью, которая имеет меньший удельный вес, чем реакционная смесь, и не смешивается с реакционной смесью (такая, как минеральное масло, в дальнейшем именуемая как «жидкость»), и реакционное устройство для биологического образца, которое применяет термические циклы путем вращения реакционного чипа для биологического образца вокруг горизонтальной оси вращения, перемещая таким образом реакционную смесь.
Сущность изобретения
[0007] Реакционное устройство для биологического образца, раскрытое в патенте JP-A-2009-136250, применяет термические циклы к реакционной смеси путем вращения реакционного чипа для биологического образца. Однако реакционная смесь перемещается в камере реакционного чипа для биологического образца во время непрерывного вращения, и, следовательно, камера реакционного чипа для биологического образца конструктивно выполнена сложно для поддержания реакционной смеси при требуемой температуре в течение требуемого периода времени.
[0008] Преимуществом некоторых аспектов настоящего изобретения является создание термоциклера и способа термического цикла, которые облегчают управление периодом времени нагрева.
[0009] Пример применения 1: Термоциклер настоящего примера применения включает в себя держатель, который удерживает биоемкость, заполненную реакционной смесью и жидкостью, имеющей меньший удельный вес, чем реакционная смесь, и не смешивающейся с реакционной смесью, биоемкость, включающую в себя канал, в котором реакционная смесь перемещается поблизости к внутренней поверхности обращенных друг к другу секций стенки, нагревательный блок, который нагревает первый участок канала, когда биоемкость находится в держателе, и приводной блок, который изменяет положение держателя и нагревательного блока путем переключения между первым положением и вторым положением. Первое положение таково, что первая часть находится в самой нижней части канала по отношению к направлению силы тяжести, когда биоемкость находится в держателе, а второе положение является таким, что второй участок канала, который отличается от первого участка относительно направления перемещения реакционной смеси, находится в самой нижней части канала по отношению к направлению действия силы тяжести, когда биоемкость находится в держателе.
[0010] Термоциклер настоящего примера применения переключает положение держателя, тем самым делая переключение между состоянием, в котором биоемкость удерживается в первом положении, и состоянием, в котором биоемкость удерживается во втором положении. Первое положение таково, что первый участок канала, составляющего биоемкость, находится в самой нижней части канала относительно направления силы тяжести. Второе положение таково, что второй участок, который отличается от первого участка по отношению к направлению перемещения реакционной смеси, находится в самой нижней части канала относительно направления силы тяжести. Другими словами, реакционная смесь находится в первом участке в первом положении и во втором участке во втором положении благодаря силе тяжести. Первый участок нагревается нагревательным блоком, а поскольку второй участок является участком, отличающимся от первого участка по отношению к направлению перемещения реакционной смеси, температура первого участка и второго участка отличаются. Таким образом, пока биоемкость удерживается в первом положении или во втором положении, реакционная смесь выдерживается при заданной температуре, и, следовательно, обеспечивается термоциклер, который может легко управлять периодом времени нагрева.
[0011] Пример применения 2: В термоциклере вышеуказанного примера применения приводной блок может вращать держатель и нагревательный блок в одном направлении при переключении из первого положения во второе положение и в противоположном направлении при переключении из второго положения в первое положение.
[0012] Термоциклер в настоящем примере применения вращает держатель и нагревательный блок в одном направлении при переключении из первого положения во второе положение и в противоположном направлении при переключении из второго положения в первое положение, тем самым уменьшая возможности перегибов проводов термоциклера в результате вращения. Таким образом предотвращается повреждение проводов в термоциклере и, следовательно, улучшается надежность его термических циклов.
[0013] Пример применения 3: В термоциклере любого из вышеприведенных примеров применения приводной блок может сделать переключение из первого положения во второе положение, когда пройдет первый период времени удержания первого положения, и может сделать переключение из второго положения в первое положение, когда пройдет второй период времени удержания второго положения.
[0014] Термоциклер в настоящем примере применения переключает положение из первого положения во второе положение, когда пройдет первый период времени удержания первого положения, и переключает положение из второго положения в первое положение, когда пройдет второй период времени удержания второго положения, что обеспечивает возможность более точного управления периодами времени нагрева реакционной смеси в первом положении или во втором положении. Таким образом, это дает возможность более точного применения термических циклов к реакционной смеси.
[0015] Пример применения 4: В термоциклере любого из вышеприведенных примеров применения держатель может удерживать биоемкость, в которой реакционная смесь перемещается в продольном направлении канала, первый участок может быть участком, который включает в себя один конец канала в продольном направлении, а второй участок может быть участком, который включает в себя другой конец канала в продольном направлении.
[0016] В термоциклере настоящего примера применения, когда биоемкость, в которой реакционная смесь перемещается в продольном направлении канала, находится в держателе, участок, включающий в себя один конец канала в продольном направлении, является первым участком, а участок, включающий в себя другой конец канала в продольном направлении, является вторым участком. Таким образом, даже при использовании биоемкости, имеющей простую структуру канала, обеспечивается термоциклер, который может легко управлять периодами времени нагрева.
[0017] Пример применения 5: Термоциклер любого из вышеприведенных примеров применения может дополнительно включать в себя второй нагревательный блок, который нагревает второй участок, когда биоемкость находится в держателе, и нагревательный блок может нагревать первый участок до первой температуры, а второй нагревательный блок может нагревать второй участок до второй температуры, которая отличается от первой температуры.
[0018] Термоциклер настоящего примера применения включает в себя второй нагревательный блок, который нагревает второй участок до второй температуры, когда биоемкость находится в держателе, что позволяет более точно управлять температурами первого участка и второго участка биоемкости. Таким образом, это дает возможность более точного применения термических циклов к реакционной смеси.
[0019] Пример применения 6: В термоциклере предыдущего примера применения первая температура может быть выше, чем вторая температура.
[0020] В термоциклере настоящего примера применения первая температура выше, чем вторая температура, и, следовательно, когда биоемкость находится в держателе, первый участок и второй участок биоемкости могут быть нагреты до температур, соответствующих термическим циклам. Таким образом, это обеспечивает применение надлежащих термических циклов к реакционной смеси.
[0021] Пример применения 7: При использовании термоциклера предыдущего примера применения первый период времени может быть короче, чем второй период времени.
[0022] В термоциклере настоящего примера применения первый период времени короче, чем второй период времени, что позволяет устанавливать различные периоды времени нагрева биоемкости при первой температуре и при второй температуре, когда биоемкость находится в держателе. Таким образом, при проведении реакции, которая требует различных периодов времени нагрева при первой температуре и при второй температуре, это обеспечивает применение надлежащих термических циклов к реакционной смеси.
[0023] Пример применения 8: Способ термического цикла настоящего примера применения включает в себя помещение в держатель биоемкости, которая заполняется реакционной смесью и жидкостью, имеющей меньший удельный вес, чем реакционная смесь, и не смешивающейся с реакционной смесью, и которая имеет канал, в котором реакционная смесь перемещается поблизости от внутренних обращенных друг к другу секций стенки, установку биоемкости в первое положение, в котором первый участок канала находится в самой нижней части канала относительно направления силы тяжести, нагревание первого участка канала и установку биоемкости во второе положение, в котором второй участок канала, отличающийся от первого участка относительно направления движения реакционной смеси, находится в самой нижней части канала относительно направления силы тяжести.
[0024] Посредством способа термического цикла в настоящем примере применения биоемкость может удерживаться в первом положении или во втором положении, и в первом положении первый участок биоемкости может быть нагрет. Первое положение таково, что первый участок канала, составляющего биоемкость, находится в самой нижней части канала относительно направления силы тяжести. Второе положение таково, что второй участок, который отличается от первого участка по отношению к направлению перемещения реакционной смеси, находится в самой нижней части канала относительно направления силы тяжести. Другими словами, реакционная смесь находится в первом участке в первом положении и во втором участке во втором положении благодаря силе тяжести. Следует отметить, что первый участок нагревается нагревательным блоком, и поскольку второй участок отличается от первого участка по отношению к направлению перемещения реакционной смеси, температура первого участка и температура второго участка различаются. Вследствие этого возможность выдерживать реакционную смесь при заданной температуре в зависимости от того, удерживается ли биоемкость в первом положении или во втором положении, реализует способ термического цикла, который позволяет легко управлять периодом времени нагрева.
Краткое описание чертежей
[0025] Фиг.1A представляет собой вид в перспективе термоциклера согласно варианту осуществления настоящего изобретения с закрытой крышкой.
Фиг.1В представляет собой вид в перспективе термоциклера согласно варианту осуществления настоящего изобретения с открытой крышкой.
Фиг.2 представляет собой разобранный вид в перспективе основного блока термоциклера согласно варианту осуществления.
Фиг.3 представляет собой вид в поперечном сечении биоемкости согласно варианту осуществления.
Фиг.4A представляет собой вид поперечного сечения по линии А-А на фиг.1A, иллюстрирующий поперечное сечение основного блока в первом положении термоциклера согласно варианту осуществления.
Фиг.4B представляет собой вид поперечного сечения по линии А-А на фиг.1A, иллюстрирующий поперечное сечение основного блока во втором положении термоциклера согласно варианту осуществления.
Фиг.5 представляет собой блок-схему процесса термического цикла с использованием термоциклера данного варианта осуществления.
Фиг.6A представляет собой вид в перспективе термоциклера в модифицированном примере с закрытой крышкой.
Фиг.6B представляет собой вид в перспективе термоциклера в модифицированном примере с открытой крышкой.
Фиг.7 представляет собой вид поперечного сечения биоемкости согласно модифицированному примеру.
Фиг.8 представляет собой вид поперечного сечения вдоль линии В-В на фиг.6A, иллюстрирующий поперечное сечение основного блока термоциклера согласно модифицированному примеру.
Фиг.9 представляет собой блок-схему процесса термического цикла в соответствии с примером 1.
Фиг.10 представляет собой блок-схему процесса термического цикла в соответствии с примером 2.
Фиг.11 представляет собой таблицу, показывающую составы реакционной смеси в соответствии с примером 2.
Фиг.12A представляет собой таблицу, показывающую результаты процесса термического цикла в соответствии с примером 1.
Фиг.12B представляет собой таблицу, показывающую результаты процесса термического цикла в соответствии с примером 2.
Описание вариантов осуществления
[0026] Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения будет описан со ссылкой на чертежи, в следующем порядке. Следует отметить, что следующий вариант осуществления ни в коем случае не ограничивает объем настоящего изобретения, изложенный в формуле изобретения. Следует отметить, что все элементы следующего варианта осуществления не обязательно должны быть приняты в качестве существенных требований для настоящего изобретения.
1. Вариант осуществления
1-1. Конфигурация термоциклера в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения
1-2. Способ термического цикла, использующий термоциклер данного варианта осуществления
2. Модифицированные примеры
3. Примеры
Пример 1. Челночная полимеразная цепная реакция
Пример 2. Одноэтапная полимеразная цепная реакция в реальном времени
[0027] 1. Вариант осуществления
1-1. Конфигурация термоциклера в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения
Фиг.1A представляет собой вид в перспективе термоциклера 1 согласно варианту осуществления настоящего изобретения с закрытой крышкой 50, а фиг.1B представляет собой вид в перспективе термоциклера 1 с открытой крышкой 50, иллюстрирующие биоемкости 100, удерживаемые в соответствующих держателях 11. Фиг.2 представляет собой разобранный вид в перспективе основного блока 10 термоциклера 1 согласно варианту осуществления. Фиг.4A представляет собой вид поперечного сечения по линии А-А на фиг.1A, иллюстрирующий поперечное сечение основного блока 10 термоциклера 1 согласно варианту осуществления.
[0028] Термоциклер 1 согласно варианту осуществления, как показано на фиг.1A, включает в себя основной блок 10 и приводной блок 20. Как показано на фиг.2, основной блок 10 включает в себя держатель 11, первый нагревательный блок 12 (который соответствует нагревательному блоку) и второй нагревательный блок 13. Между первым нагревательным блоком 12 и вторым нагревательным блоком 13 предусмотрена прокладка 14. В основном блоке 10 настоящего варианта осуществления первый нагревательный блок 12 расположен ближе к нижней пластине 17, а второй нагревательный блок 13 расположен ближе к крышке 50. В основном блоке 10 настоящего варианта осуществления первый нагревательный блок 12, второй нагревательный блок 13 и прокладка 14 прикреплены к фланцам 16, нижней пластине 17 и запирающим пластинам 19.
[0029] Держатель 11 имеет структуру, которая удерживает биоемкость 100, описанную ниже. Как показано на фиг.1B и фиг.2, держатель 11 настоящего варианта осуществления имеет гнездовую структуру, в которую вставляется и в которой удерживается биоемкость 100. Биоемкость 100 будет вставлена в отверстие, которое проходит через первый нагревательный брус 12b первого нагревательного блока 12, прокладку 14 и второй нагревательный брус 13b второго нагревательного блока 13. Количество держателей 11 может быть один или более. Основной блок 10 имеет в общей сложности 20 держателей 11 в примере, показанном на фиг.1B.
[0030] Предпочтительно, чтобы термоциклер 1 в настоящем варианте осуществления включал в себя структуру, которая удерживает биоемкость 100 в заданном положении по отношению к первому нагревательному блоку 12 и ко второму нагревательному блоку 13 так, чтобы первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 были способны нагревать заданные участки биоемкости 100. Более конкретно, как показано на фиг.4A и фиг.4B, первый участок 111 и второй участок 112 канала 110, составляющего биоемкость 100, нагреваются первым нагревательным блоком 12 и вторым нагревательным блоком 13, соответственно, как будет описано позже. В настоящем варианте осуществления структурой, которая позиционирует биоемкость 100, является нижняя пластина 17. Как показано на фиг.4A, вставка биоемкости 100 в такое положение, что биоемкость 100 достигает нижней пластины 17, удерживает биоемкость 100 в заданном положении по отношению к первому нагревательному блоку 12 и ко второму нагревательному блоку 13.
[0031] Когда биоемкость 100 находится в держателе 11, первый нагревательный блок 12 нагревает первый участок 111 биоемкости 100, описанной далее, до первой температуры. На фиг.4A, например, первый нагревательный блок 12 расположен в основном блоке 10 в таком положении, чтобы нагревать первый участок 111 биоемкости 100.
[0032] Первый нагревательный блок 12 может включать в себя механизм, который генерирует тепло, и часть, которая проводит сгенерированное тепло к биоемкости 100. На фиг.2, например, первый нагревательный блок 12 включает в себя первый нагреватель 12a и первый нагревательный брус 12b. В настоящем варианте осуществления первый нагреватель 12a представляет собой патронный нагревательный элемент, который подключен к внешнему источнику питания (не показан на чертежах) через проводящую жилу 15. Первый нагреватель 12а, вставленный в первый нагревательный брус 12b, генерирует тепло, нагревая первый нагревательный брус 12b. Первый нагревательный брус 12b является частью, которая проводит тепло, выделяемое первым нагревателем 12а, к биоемкости 100. В настоящем варианте осуществления для первого нагревательного бруса 12b используется алюминиевый брус.
[0033] Температурой в патронных нагревательных элементах легко управлять, и вследствие этого для первого нагревателя 12а используется патронный нагревательный элемент, чтобы легко стабилизировать температуру первого нагревательного блока 12. Таким образом реализуется более точное применение термических циклов. Алюминий обладает высокой теплопроводностью, и по этой причине первый нагревательный брус 12b изготовлен из алюминия для того, чтобы эффективно нагревать биоемкость 100. Первый нагревательный брус 12b имеет малую неравномерность нагрева, и, следовательно, реализуется применение термических циклов с более высокой точностью. Кроме того, алюминий легко обрабатывается, и, следовательно, первый нагревательный брус 12b может быть отлит с точностью, улучшающей точность нагревания в качестве результата. Таким образом реализуется более точное применение термических циклов.
[0034] Предпочтительно, чтобы первый нагревательный блок 12 находился в контакте с биоемкостью 100, когда биоемкость 100 находится в держателе 11. При такой конфигурации, когда первый нагревательный блок 12 нагревает биоемкость 100, тепло от первого нагревательного блока 12 подводится к биоемкости 100 в стабильном режиме, тем самым стабилизируя температуру биоемкости 100. Если держатель 11 выполнен в виде части нагревательного блока 12, как в настоящем варианте осуществления, то предпочтительно, чтобы держатель 11 находился в контакте с биоемкостью 100. При такой конфигурации тепло от первого нагревательного блока 12 подводится к биоемкости 100 стабильным образом, а следовательно биоемкость 100 нагревается эффективно.
[0035] Когда биоемкость 100 находится в держателе 11, второй нагревательный блок 13 нагревает второй участок 112 биоемкости 100 до второй температуры, отличной от первой температуры. На фиг.4A, например, второй нагревательный блок 13 расположен в основном блоке 10 так, чтобы нагревать второй участок 112 биоемкости 100. Как показано на фиг.2, второй нагревательный блок 13 включает в себя второй нагреватель 13а и второй нагревательный брус 13b. Второй нагревательный блок 13 имеет по существу те же самые функции, что и первый нагревательный блок 12, кроме того, что второй нагревательный блок 13 нагревает другой участок биоемкости 100 до другой температуры.
[0036] В настоящем варианте осуществления температуры первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 контролируются с помощью датчика температуры и блока управления (не показаны на чертежах), описанных ниже. Предпочтительно, чтобы температуры первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 устанавливались таким образом, чтобы нагреть биоемкость 100 до требуемой температуры. В настоящем варианте осуществления регулирование температуры первого нагревательного блока 12 до первой температуры и второго нагревательного блока 13 до второй температуры позволяет нагревать первый участок 111 биоемкости 100 до первой температуры, а второй участок 112 биоемкости 100 до второй температуры. В настоящем варианте осуществления датчик температуры является термопарой.
[0037] Приводной блок 20 представляет собой механизм, который приводит в движение держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13. В настоящем варианте осуществления приводной блок 20 включает в себя двигатель и приводной вал (не показаны на чертежах). Приводной вал и фланец 16 основного блока 10 соединены. Приводной вал в настоящем варианте осуществления предусмотрен перпендикулярно продольному направлению держателя 11. Когда двигатель работает, основной блок 10 поворачивается вокруг приводного вала, который используется в качестве оси вращения.
[0038] Термоциклер 1 настоящего варианта осуществления включает в себя блок управления (не показан на чертежах). Устройство управления управляет по меньшей мере одним из следующих параметров, которые будут описаны ниже: первая температура, вторая температура, первый период времени, второй период времени и количество термических циклов. Когда блок управления управляет первым периодом времени или вторым периодом времени, блок управления управляет работой приводного блока 20, тем самым управляя периодом времени, в течение которого держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 удерживаются в заданном положении. Блок управления может быть снабжен отдельным механизмом для управления каждым из параметров или может управлять всеми параметрами интегрированно.
[0039] Блок управления термоциклером 1 настоящего варианта осуществления управляет всеми вышеупомянутыми параметрами электронно. Примеры блока управления в настоящем варианте осуществления включают в себя процессор, такой как центральный процессор (CPU, Central Processing Unit), запоминающее устройство, такое как ПЗУ (ROM, Read Only Memory) и ОЗУ (RAM, Random Access Memory). В запоминающем устройстве хранятся различные программы, данные или тому подобное для управления вышеупомянутыми параметрами. Запоминающее устройство также имеет рабочую область, которая временно сохраняет текущие данные различных процессов, результаты обработки и тому подобное.
[0040] В основном блоке 10 в настоящем варианте осуществления, как показано в примере на фиг.2 и фиг.4A, предусмотрена прокладка 14 между первым нагревательным блоком 12 и вторым нагревательным блоком 13. Прокладка 14 в настоящем варианте осуществления является опорной частью, которая поддерживает первый нагревательный блок 12 и/или второй нагревательный блок 13. Расположение прокладки 14 дает возможность более точно фиксировать расстояние между первым нагревательным блоком 12 и вторым нагревательным блоком 13. То есть, положения первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 по отношению, соответственно, к первому участку 111 и второму участку 112 биоемкости 100, которая будет описана ниже, определены с большей точностью.
[0041] Материал для прокладки 14 может быть выбран в соответствии с потребностями, но предпочтительно, чтобы он был теплоизоляционным материалом. Такая конфигурация позволяет уменьшить взаимное влияние между нагревом первого нагревательного блока 12 и нагревом второго нагревательного блока 13, тем самым позволяя легко контролировать температуру первого нагревательного блока 12 и температуру второго нагревательного блока 13. Если для прокладки 14 используется теплоизолирующий материал, то предпочтительно, чтобы прокладка 14 была расположена так, чтобы она окружала участок биоемкости 100 между первым нагревательным блоком 12 и вторым нагревательным блоком 13, когда биоемкость 100 находится в держателе 11. Такая конфигурация помогает подавить тепловыделение из участка между первым нагревательным блоком 12 и вторым нагревательным блоком 13, позволяя тем самым дополнительно стабилизировать температуры биоемкости 100. Прокладка 14 в настоящем варианте осуществления представляет собой теплоизолирующий материал, и, как показано на фиг.4A, держатель 11 проходит через прокладку 14. Такая конфигурация позволяет предотвратить потери тепла из биоемкости 100, когда первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 нагревают биоемкость 100, позволяя тем самым дополнительно стабилизировать температуру первого участка 111 и температуру второго участка 112.
[0042] Основной блок 10 в настоящем варианте осуществления включает в себя запирающие пластины 19. Запирающие пластины 19 являются опорными частями, которые поддерживают держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13. На фиг.1B и фиг.2, например, две запирающие пластины 19 замкнуты фланцами 16, а первый нагревательный блок 12, второй нагревательный блок 13 и нижняя пластина 17 зафиксированы на месте. Запирающие пластины 19 делают основной блок 10 более жесткой структурой, и, следовательно, основной блок 10 становится меньше подвержен повреждениям.
[0043] Термоциклер 1 настоящего варианта осуществления включает в себя крышку 50. На фиг.1A и фиг.4A, например, держатель 11 покрыт крышкой 50. Покрытие держателя 11 крышкой 50 помогает предотвратить выделение тепла от первого нагревательного блока 12 в основном блоке 10 в окружающую среду, что позволяет стабилизировать температуру внутри основного блока 10. Крышка 50 может быть зафиксирована на месте запорными частями 51. В настоящем варианте осуществления запорные части 51 являются магнитами. Как показано на фиг.2 и фиг.1B, например, магниты расположены на той поверхности основного блока 10, с которой крышка 50 входит в контакт. Хотя это не показано на фиг.1B и фиг.2, крышка 50 также имеет магниты, расположенные на тех местах, которые входят в контакт с магнитами основного блока 10, и когда крышка 50 покрывает держатель 11, крышка 50 закрепляется на месте к основному блоку 10 магнитной силой. Такая конфигурация позволяет предотвратить перемещение или отсоединение крышки 50, когда приводной блок 20 приводит основной блок 10 в движение. Это предотвращает изменения температуры внутри термоциклера 1 из-за отсоединения крышки 50, обеспечивая возможность применения более точных термических циклов к реакционной смеси 140, описанной ниже.
[0044] Предпочтительно, чтобы основной блок 10 был очень герметичной структурой. Если основной блок 10 является очень герметичной структурой, воздух, находящийся внутри основного блока 10, практически не выходит наружу, что помогает стабилизировать температуру внутри основного блока 10. В настоящем варианте осуществления, как показано на фиг.2, два фланца 16, нижняя пластина 17, две запирающие пластины 19 и крышка 50 герметизируют внутреннее пространство основного блока 10.
[0045] Предпочтительно, чтобы запирающие пластины 19, нижняя пластина 17, крышка 50 и фланцы 16 были сформированы из теплоизолирующего материала. Такая конфигурация позволяет предотвратить выделение тепла из основного блока 10 в окружающую среду более надежным способом, позволяя тем самым дополнительно стабилизировать температуру внутри основного блока 10.
[0046] 1-2. Способ термического цикла, использующий термоциклер варианта осуществления настоящего изобретения
Фиг.3 представляет собой вид в поперечном сечении биоемкости 100 в соответствии с вариантом осуществления. Фиг.4A и фиг.4B представляют собой виды в поперечном сечении, иллюстрирующие поперечное сечение термоциклера 1 в соответствии с вариантом осуществления по линии А-А на фиг.1A. Фиг.4A и фиг.4B показывают термоциклер 1 с размещенной в нем биоемкостью 100. Фиг.4A показывает первое положение, а фиг.4B показывает второе положение. Фиг.5 представляет собой блок-схему процесса термического цикла, использующего термоциклер 1 данного варианта осуществления. Далее в данном документе сначала будет описана биоемкость 100 в соответствии с вариантом осуществления, а затем будет описан процесс термического цикла с использованием биоемкости 100 с термоциклером 1 данного варианта осуществления.
[0047] Как показано на фиг.3, биоемкость 100 в соответствии с вариантом осуществления включает в себя канал 110 и герметичное уплотнение 120. Канал 110 заполнен реакционной смесью 140 и жидкостью 130, которая имеет меньший удельный вес, чем реакционная смесь 140, и не смешивается с реакционной смесью 140 (в дальнейшем именуемая как «жидкость»), и герметизирован герметичным уплотнением 120.
[0048] Канал 110 сформирован таким образом, что реакционная смесь 140 перемещается поблизости от его внутренних обращенных друг к другу секций стенки. Следует отметить, что «внутренние обращенные друг к другу секции стенки» канала 110 указывают одновременно на две секции стенки канала 110, которые обращены друг к другу. Также следует отметить, что перемещение «поблизости» означает, что реакционная смесь 140 и стенка канала 110 находятся поблизости, и включает в себя случай, в котором реакционная смесь 140 и стенка канала 110 входят в контакт друг с другом. Поэтому, когда реакционная смесь 140 перемещается поблизости от внутренних обращенных друг к другу секций стенки, это означает, что реакционная смесь 140 перемещается, сохраняя при этом близкое расстояние до обеих секций стенки канала 110, которые обращены друг к другу. Другими словами, реакционная смесь 140 перемещается вдоль обеих внутренних обращенных друг к другу секций стенки. Иначе говоря, расстояние между двумя внутренними обращенными друг к другу секциями стенки канала 110 таково, что реакционная смесь 140 перемещается поблизости от этих внутренних секций стенки.
[0049] Формирование канала 110 биоемкости 100 вышеописанным образом обеспечивает возможность регулирования направления, в котором реакционная смесь 140 перемещается внутри канала 110, позволяя тем самым до определенной степени определить путь, вдоль которого реакционная смесь 140 перемещается между первым участком 111 и вторым участком 112, который отличается от первого участка 111 канала 110 (описано ниже). Такая конфигурация помогает установить время, необходимое реакционной смеси 140 для перемещения между первым участком 111 и вторым участком 112, в пределах определенного диапазона. Таким образом, предпочтительно, чтобы степень «близости» была такой, чтобы изменения времени перемещения реакционной смеси 140 между первым участком 111 и вторым участком 112 не влияли на периоды времени нагрева реакционной смеси 140 в обоих участках. То есть, предпочтительно, чтобы изменения времени не оказывали значительного влияния на результат реакции. Более конкретно, расстояние между внутренними обращенными друг к другу секциями стенки в направлении, перпендикулярном направлению перемещения реакционной смеси 140, предпочтительно находится в таком диапазоне, что в нем помещаются менее двух капель реакционной смеси 140.
[0050] На фиг.3, например, биоемкость 100 выполнена цилиндрической, а канал 110 сформирован в направлении центральной оси (вертикальное направление на фиг.3). Форма канала 110 является трубчатой, а его поперечное сечение перпендикулярно продольному направлению канала 110, то есть поперечное сечение в данном участке канала 110 в направлении, перпендикулярном направлению перемещения реакционной смеси 140 (в дальнейшем именуемое как «поперечное сечение» канала 110), является круглым. Таким образом, в биоемкости 100 в настоящем варианте осуществления внутренние обращенные друг к другу секции стенки канала 110 являются участками, которые включают в себя две точки на стенке канала 110, составляющие диаметр поперечного сечения канала 110. Реакционная смесь 140 перемещается вдоль внутренних обращенных друг к другу секций стенки в продольном направлении канала 110.
[0051] Первый участок 111 биоемкости 100 представляет собой участок канала 110, который нагревается с помощью первого нагревательного блока 12 до первой температуры. Второй участок 112 представляет собой участок канала 110, который отличается от первого участка 111 и нагревается с помощью второго нагревательного блока 13 до второй температуры. В биоемкости 100 в настоящем варианте осуществления первый участок 111 представляет собой участок, который включает в себя один конец канала 110 в продольном направлении, а второй участок 112 представляет собой участок, который включает в себя другой конец канала 110 в продольном направлении. На фиг.4A и фиг.4B, например, участок, заключенный в пунктирную рамку, которая включает в себя конец со стороны, ближней к герметичному уплотнению 120 в канале 110, является вторым участком 112, а участок, заключенный в пунктирную рамку, который включает в себя дальний конец от герметичного уплотнения 120, является первым участком 111.
[0052] Канал 110 содержит внутри себя жидкость 130 и реакционную смесь 140. Жидкость 130 является несмешиваемой или не смешивается с реакционной смесью 140 по природе, и, следовательно, как показано на фиг.3, реакционная смесь 140 находится в жидкости 130 в форме капли. Реакционная смесь 140 имеет больший удельный вес, чем жидкость 130, и, следовательно, находится в самой нижней части канала 110 по отношению к направлению силы тяжести. Примеры жидкости 130 могут включать в себя диметилсиликоновое масло и парафиновое масло. Реакционная смесь 140 является жидкостью, которая содержит компоненты, необходимые для реакции. Если реакция является полимеразной цепной реакцией, реакционная смесь 140 содержит целевую последовательность ДНК, подвергающуюся амплификации в полимеразной цепной реакции (целевая ДНК), ДНК-полимеразу, требуемую для амплификации ДНК, и праймер. Например, когда полимеразная цепная реакция осуществляется с использованием масла в качестве жидкости 130, предпочтительно, чтобы реакционная смесь 140 представляла собой водный раствор, который содержит вышеупомянутые составляющие.
[0053] Процесс термического цикла, использующий термоциклер 1 данного варианта осуществления, будет описан со ссылкой на фиг.4A, фиг.4B и фиг.5. На фиг.4A и фиг.4B направление, обозначенное буквой «g» со стрелкой (направление вниз на чертежах), является направлением силы тяжести. Необходимо отметить, что настоящий вариант осуществления будет описывать челночную полимеразную цепную реакцию (двухтемпературную полимеразную цепную реакцию) в качестве примера процесса термического цикла. Следует также отметить, что каждый из этапов, описанных ниже, является примером процесса термического цикла. Порядок этапов может быть изменен, два или более этапов могут выполняться последовательно или параллельно, или еще один этап может быть добавлен, если это необходимо.
[0054] В челночной полимеразной цепной реакции реакционная смесь обрабатывается посредством применения двух температурных стадий (одна стадия высокой температуры и одна стадия низкой температуры), и процесс повторяется многократно, амплифицируя тем самым последовательность нуклеиновых кислот в реакционной смеси. При обработке на стадии высокой температуры происходит денатурация (реакция, в которой двухцепочечная ДНК денатурируется на две одноцепочечные ДНК). При обработке на стадии низкой температуры происходит отжиг (реакция, в которой праймер связывается с одноцепочечной ДНК) и элонгация (реакция, в которой происходит синтез комплементарной цепочки ДНК, инициированной на праймере).
[0055] Как правило, в челночной полимеразной цепной реакции стадия высокой температуры проводится при температуре от 80 градусов Цельсия до 100 градусов Цельсия, а стадия низкой температуры проводится при температуре от 50 градусов Цельсия до 70 градусов Цельсия. Обработка на каждой температурной стадии проводится в течение заданных периодов времени, и, как правило, временной период обработки на стадии высокой температуры устанавливается более коротким, чем временной период обработки на стадии низкой температуры. Например, временной период может быть установлен в пределах от 1 до 10 секунд для обработки на стадии высокой температуры, и временной период может быть установлен в пределах от 10 до 60 секунд для обработки на стадии низкой температуры. Временные периоды могут быть установлены с большей продолжительностью в зависимости от условий реакции.
[0056] Следует отметить, что желательно сначала рассмотреть типы реагента или количество реакционной смеси 140, чтобы определить соответствующие протоколы до фактического проведения реакции, поскольку временные периоды, температура и количество циклов (количество повторений стадии высокой температуры и стадии низкой температуры) различаются в зависимости от типов и количества реагента.
[0057] Сначала биоемкость 100 в настоящем варианте осуществления помещается в держатель 11 (S101). В настоящем варианте осуществления после того, как реакционная смесь 140 вводится в канал 110, заполненный жидкостью 130, биоемкость 100, запечатанная герметичным уплотнением 120, помещается в держатель 11. Реакционная смесь 140 может быть введена с помощью микропипетки, дозирующего устройства, которое использует технологии сопла для распыления краски, или тому подобного. Когда биоемкость 100 находится в держателе 11, то первый нагревательный блок 12 позиционируется таким образом, чтобы контактировать с биоемкостью 100 в положении, включающем в себя первый участок 111, а второй нагревательный блок 13 позиционируется таким образом, чтобы контактировать с биоемкостью 100 в положении, включающем в себя второй участок 112. В настоящем варианте осуществления, как показано на фиг.4A, помещение биоемкости 100 в положение, в котором биоемкость 100 достигает нижней пластины 17, удерживает биоемкость 100 в заданном положении по отношению к первому нагревательному блоку 12 и второму нагревательному блоку 13.
[0058] В настоящем варианте осуществления положением держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 на этапе S101 является первое положение. Как показано на фиг.4A, первое положение таково, что первый участок 111 биоемкости 100 находится в нижнем участке канала 110 по отношению к направлению силы тяжести. Следовательно, когда держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 находятся в предопределенном положении, первый участок 111 представляет собой самую нижнюю часть канала 110 по отношению к направлению силы тяжести. В первом положении первый участок 111 расположен в самой нижней части канала 110 по отношению к направлению силы тяжести, и, таким образом, реакционная смесь 140, имеющая больший удельный вес, чем жидкость 130, находится в первом участке 111. В настоящем варианте осуществления после того, как биоемкость 100 помещается в держатель 11, держатель 11 покрывается крышкой 50, и затем термоциклер 1 запускается. В настоящем варианте осуществления запуск термоциклера 1 инициирует этапы S102 и S103.
[0059] На этапе S102 перввй нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 нагревают биоемкость 100. Первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 нагревают различные участки биоемкости 100 до различных температур. Иными словами, первый нагревательный блок 12 нагревает первый участок 111 до первой температуры, а второй нагревательный блок 13 нагревает второй участок 112 до второй температуры. Такая конфигурация формирует между первым участком 111 и вторым участком 112 канала 110 температурный градиент, в котором температура постепенно меняется между первой температурой и второй температурой. В настоящем варианте осуществления первая температура является относительно высокой температурой из температур, соответствующих требуемой реакции в процессе термического цикла, а вторая температура является относительно низкой температурой из температур, соответствующих требуемой реакции в процессе термического цикла. Таким образом, на этапе S102 настоящего варианта осуществления температура постепенно понижается от первого участка 111 по направлению ко второму участку 112, образуя температурный градиент. Процесс термического цикла в настоящем варианте осуществления представляет собой челночную полимеразную цепную реакцию, и, следовательно, предпочтительно, чтобы первая температура была подходящей для денатурации двухцепочечной ДНК, а вторая температура была подходящей для отжига и элонгации.
[0060] На этапе S102 держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 находятся в первом положении, и, следовательно, когда биоемкость 100 нагревается на этапе S102, реакционная смесь 140 нагревается до первой температуры. Таким образом, на этапе S102 реакция в реакционной смеси 140 проходит при первой температуре.
[0061] На этапе S103 выполняется определение того, прошел ли первый период времени в первом положении. В настоящем варианте осуществления решение принимается с помощью блока управления (не показан). Первый период времени является периодом времени, в течение которого держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 находятся в первом положении. В настоящем варианте осуществления в случае, когда за шагом помещения в держатель на этапе S101 следует этап S103 или, другими словами, когда этап S103 выполняется в первый раз, определение того, прошел ли первый период времени, выполняется на основе времени, прошедшего с момента запуска термоциклера 1. В первом положении реакционная смесь 140 нагревается до первой температуры, и, следовательно, предпочтительно, чтобы первый период времени был периодом времени, в течение которого реакционная смесь 140 нагревается до первой температуры для требуемой реакции. В настоящем варианте осуществления предпочтительно, чтобы первый период времени был равен периоду времени, требуемому для денатурации двухцепочечной ДНК.
[0062] Если на этапе S103 определено, что первый период времени прошел (да), процесс переходит к этапу S104. Если определено, что первый период времени еще не прошел (нет), то этап S103 повторяется.
[0063] На этапе S104 приводной блок 20 приводит в движение основной блок 10 для переключения положения держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 из первого положения во второе положение. Второе положение таково, что второй участок 112 находится в самой нижней части канала 110 по отношению к направлению действия силы тяжести. Говоря по-другому, второй участок 112 находится в самой нижней части канала 110 по отношению к направлению силы тяжести, когда держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 находятся в заданном положении, которое отличается от первого положения.
[0064] На этапе S104 в настоящем варианте осуществления положение держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 переключается из положения, изображенного на фиг.4A, в положение, изображенное на фиг.4B. В термоциклере 1 настоящего варианта осуществления блок управления управляет приводным блоком 20, чтобы вращать основной блок 10. В частности, двигатель вращает фланцы 16 вокруг приводного вала, который используется в качестве оси вращения, вращая таким образом держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13, прикрепленные к фланцам 16. Приводной вал имеет ось, перпендикулярную к продольному направлению держателя 11, и, следовательно, когда двигатель работает и вращает приводной вал, держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 вращаются. На фиг.4A и фиг.4B, например, основной блок 10 поворачивается на 180 градусов, переключая таким образом положение держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 из первого положения во второе положение.
[0065] На этапе S104 позиционное соотношение между первым участком 111 и вторым участком 112 по отношению к направлению силы тяжести изменяется на противоположное по сравнению с первым положением. Реакционная смесь 140 перемещается из первого участка 111 во второй участок 112 благодаря силе тяжести. Когда держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 оказываются во втором положении и блок управления останавливает движение приводного блока 20, держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 удерживаются во втором положении. Когда держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 оказываются во втором положении, процесс переходит к этапу S105.
[0066] На этапе S105 производится определение того, прошел ли второй период времени во втором положении. Второй период времени является периодом времени, в течение которого держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 удерживаются во втором положении. В настоящем варианте осуществления второй участок 112 на этапе S102 нагревается до второй температуры, и вследствие этого определение того, прошел ли второй период времени, производится на основе времени, прошедшего после того момента, как держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 оказались во втором положении. Во втором положении реакционная смесь 140 находится во втором участке 112, и, следовательно, реакционная смесь 140 нагревается до второй температуры столько времени, сколько основной блок 10 удерживается во втором положении. Таким образом, предпочтительно, чтобы второй период времени был равен периоду времени, за который реакционная смесь 140 нагревается до второй температуры для требуемой реакции. В настоящем варианте осуществления предпочтительно, чтобы второй период времени был равен периоду времени, требуемому для отжига и элонгации.
[0067] Если на этапе S105 определено, что второй период времени прошел (да), то процесс переходит к этапу S106. Если определено, что второй период времени еще не прошел (нет), то этап S105 повторяется.
[0068] На этапе S106 выполняется определение того, достигло ли количество выполненных термических циклов заданного количества циклов. В частности, определяется, были ли этапы S103-S105 завершены заданное количество раз. В настоящем варианте осуществления количество раз, которое оба этапа S103 и S105 были определены как «да», определено как количество раз завершения этапов S103-S105. Каждый раз, когда выполняются этапы S103-S105, реакционная смесь 140 обрабатывается в одном термическом цикле. Таким образом, количество раз завершения этапов S103-S105 может рассматриваться как представляющее собой число термических циклов. Таким образом, на этапе S106 определяется, были ли термические циклы применены нужное количество раз для требуемой реакции.
[0069] Если на этапе S106 определено, что заданное количество термических циклов было применено (да), то процесс заканчивается (END). Если определено, что это количество термических циклов еще не было применено (нет), то процесс переходит к этапу S107.
[0070] На этапе S107 положение держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 переключается из второго положения в первое положение. Приводной блок 20 приводит в движение основной блок 10, чтобы переместить держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 в первое положение. Когда держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 оказываются в первом положении, процесс переходит к этапу S103.
[0071] Если этап S103 выполняется после этапа S107 или этап S103 выполняется во второй или в любой последующий раз, определение того, прошел ли первый период времени, производится на основе времени, прошедшего после того момента времени, как держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 оказались в первом положении.
[0072] Предпочтительно, чтобы направление, в котором приводной блок 20 вращает держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 на этапе S107, было противоположным направлению вращения на этапе S104. Такая конфигурация позволяет избежать перегибов проводки, такой как проводящая жила 15, в результате вращения и, соответственно, позволяет избежать износа проводки. Предпочтительно, чтобы направление вращения изменялось на противоположное при каждом перемещении приводного блока 20. Такая конфигурация позволяет уменьшить возможности перегибов проводки по сравнению с тем случаем, когда вращение выполняется последовательно несколько раз в одном направлении.
[0073] 1-3. Преимущества термоциклера и процесса термического цикла данного варианта осуществления
Термоциклер и способ термического цикла в соответствии с настоящим вариантом осуществления могут обеспечить следующие преимущества.
[0074] (1) Термоциклер 1 настоящего варианта осуществления содержит первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13, и, следовательно, реакционная смесь 140 нагревается до первой температуры в первом положении и до второй температуры во втором положении. Приводной блок 20 переключает положения держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 для перемещения реакционной смеси 140 в соответствии с силой тяжести, переключая тем самым температуры подводимого тепла. Период времени, в течение которого биоемкость 100 удерживается в первом положении или во втором положении, соответствует периоду времени нагрева реакционной смеси 140. Таким образом, периоды времени нагрева реакционной смеси 140 являются легко управляемыми в процессе термического цикла.
[0075] (2) Термоциклер 1 настоящего варианта осуществления переключает положение держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 из первого положения во второе положение, когда прошел первый период времени, а из второго положения в первое положение - когда прошел второй период времени. Такая конфигурация позволяет реакционной смеси 140 нагреваться при первой температуре в течение первого периода времени и при второй температуре в течение второго периода времени, что позволяет более точно контролировать периоды времени нагрева реакционной смеси 140. Это дает возможность более точно применять термические циклы к реакционной смеси 140.
[0076] 2. Модифицированные примеры
Модифицированные примеры будут описаны на основе варианта осуществления. Фиг.6A представляет собой вид в перспективе термоциклера 2 согласно модифицированным примерам с закрытой крышкой 50, а фиг.6B представляет собой вид в перспективе термоциклера 2 согласно модифицированным примерам с открытой крышкой 50. Фиг.7 представляет собой вид поперечного сечения биоемкости 100a в соответствии с модифицированным примером 4. Фиг.8 представляет собой вид поперечного сечения, иллюстрирующий поперечное сечение основного блока 10а термоциклера 2 в соответствии с модифицированными примерами по линии B-B на фиг.6A. Модифицированные примеры, приведенные ниже, могут быть объединены, если особенности их конфигураций согласуются друг с другом. Термоциклер 2, показанный на фиг.6A, фиг.6B и фиг.8, является примером комбинации модифицированных примеров 1, 4, 16 и 17. Соответственно, эти модифицированные примеры будут описаны со ссылкой на фиг.6A, фиг.6B и фиг.8. Элементы, которые не являются общими с элементами данного варианта осуществления, будут описаны в деталях, а элементы с такой же или аналогичной конфигурацией, как у уже описанного выше варианта осуществления, будут обозначаться теми же ссылочными номерами, а их подробное описание будет опущено.
[0077] Модифицированный пример 1
Вариант осуществления представляет пример термоциклера 1, который не включает в себя детектор, однако, как показано на фиг.6A и фиг.6B, термоциклер 2 модифицированных примеров может включать в себя детектор 40 флуоресценции. Такая конфигурация обеспечивает возможность использования термоциклера 2 для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени, в которой используется флуоресцентное детектирование. При условии, что детектирование проводится должным образом, может быть использован один или несколько детекторов 40 флуоресценции. В этом модифицированном примере одиночный детектор 40 флуоресценции движется по направляющему стержню 22 для проведения флуоресцентного детектирования. Предпочтительно проводить флуоресцентное детектирование так, чтобы измерительное окно 18 (см. фиг.8) было предусмотрено ближе ко второму нагревательному блоку 13, чем к первому нагревательному блоку 12 на основном блоке 10a. Такая конфигурация уменьшает количество частей между детектором 40 флуоресценции и реакционной смесью 140 и, следовательно, позволяет проводить более точное измерение флуоресценции.
[0078] В этом модифицированном примере термоциклер 2, показанный на фиг.6A, фиг.6B и фиг.8, имеет первый нагревательный блок 12, расположенный ближе к крышке 50, и второй нагревательный блок 13, расположенный дальше от крышки 50. То есть, взаимное расположение первого нагревательного блока 12, второго нагревательного блока 13 и других частей, включенных в основной блок 10, отличается от термоциклера 1. Во всем остальном, кроме взаимного расположения, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 функционируют в данном варианте осуществления по существу так же. В этом модифицированном примере, как показано на фиг.8, второй нагревательный блок 13 снабжен измерительным окном 18. Такая конфигурация дает возможность соответствующего измерения флуоресценции в полимеразной цепной реакции в реальном времени, в которой флуоресценция измеряется на стороне более низкой температуры (температуры, при которой производится отжиг и элонгация). Если флуоресценция должна быть измерена со стороны или вблизи от крышки 50, предпочтительно, чтобы герметичное уплотнение 120 или крышка 50 были сконструированы таким образом, чтобы не влиять на измерения.
[0079] Модифицированный пример 2
В данном варианте осуществления первая температура и вторая температура являются постоянными от начала до конца процесса термического цикла, однако, либо одна из них, либо обе могут быть изменены в ходе процесса. Первая температура и вторая температура могут быть изменены с помощью блока управления. Переключение положения первого нагревательного блока 12 и держателя 11, перемещающее реакционную смесь 140, позволяет нагреть реакционную смесь 140 до температуры, которая была изменена. Таким образом, это дает возможность проводить реакции, которые требуют двух или более комбинаций температур, например, полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (также называемую RT-PCR, которая будет кратко описана в примере), без увеличения количества нагревательных блоков или усложнения структуры термоциклера.
[0080] Модифицированный пример 3
Вариант осуществления представляет пример держателя 11, имеющего гнездовую структуру, однако держатель 11 может иметь любую структуру, которая способна удерживать биоемкость 100. Например, могут быть использованы структура, имеющая полость такой же формы, что и биоемкость 100, в которую входит биоемкость 100, или структура, которая удерживает биоемкость 100 посредством наслаивания.
[0081] Модифицированный пример 4
Вариант осуществления представляет собой пример структуры, в которой нижняя пластина 17 позиционирует биоемкость 100, однако структура позиционирования может быть любой структурой, которая способна позиционировать биоемкость 100 в желаемом положении. Структура позиционирования может быть структурой, предусмотренной в термоциклере 1, в биоемкости 100 или и в термоциклере, и в биоемкости. Например, могут быть использованы винты, вставные стержни, биоемкость 100, имеющая выступающую часть, или структура, которая делает держатель 11 и биоемкость 100 подходящими друг к другу. При использовании винта или стержня длина самого винта или длина ввинчиваемой его части, или положение, куда вставляется стержень, могут быть отрегулированы так, чтобы иметь возможность изменять положение биоемкости 100 в зависимости от условий реакции термических циклов или размера биоемкости 100.
[0082] Структура, которая делает биоемкость 100 и держатель 11 подходящими друг к другу, как показано на фиг.6A, фиг.6B, фиг.7 и фиг.8, например, может быть такой, что выступающая часть 113, предусмотренная на биоемкости 100, соответствует углублению 60, предусмотренному на держателе 11. Такая конфигурация позволяет поддерживать определенную ориентацию биоемкости 100 по отношению к первому нагревательному блоку 12 и/или второму нагревательному блоку 13. Таким образом, она предотвращает изменения ориентации биоемкости 100 в середине термического цикла, что позволяет более точно управлять нагреванием. Таким образом, это дает возможность более точно применять термические циклы к реакционной смеси.
[0083] Модифицированный пример 5
Вариант осуществления представляет пример первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13, которые являются патронными нагревательными элементами, однако первый нагревательный блок 12 может быть любым нагревательным механизмом, который способен нагревать первый участок 111 до первой температуры. Второй нагревательный блок 13 может быть любым нагревательным механизмом, который способен нагревать второй участок 112 до второй температуры. Примеры, которые могут быть использованы для первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13, включают в себя углеродный нагреватель, листовой нагреватель, IH нагреватель (электромагнитный индукционный нагреватель), элемент Пельтье, нагретую жидкость и нагретый газ. Следует отметить, что для первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 могут быть использованы различные типы нагревательных механизмов.
[0084] Модифицированный пример 6
Вариант осуществления представляет пример биоемкости 100, нагреваемой первым нагревательным блоком 12 и вторым нагревательным блоком 13, однако вместо второго нагревательного блока 13 может быть предусмотрен блок охлаждения, который охлаждает второй участок 112. Например, для охлаждения может быть использован элемент Пельтье. Такая конфигурация позволяет формировать требуемый температурный градиент в канале 110, даже когда снижение температуры второго участка 112 затруднено из-за тепла первого участка 111 биоемкости 100. Или, например, к реакционной смеси 140 может повторно применяться термический цикл нагрева и охлаждения.
[0085] Модифицированный пример 7
Вариант осуществления представляет собой пример первого нагревательного бруса 12b и второго нагревательного бруса 13b, изготовленных из алюминия, однако материал, используемый для нагревательных брусов, может быть выбран на основании условий, включающих в себя теплопроводность, характеристики удерживания тепла, обрабатываемость материала и т.п. Например, сплав меди может быть использован самостоятельно или в комбинации с другими видами материала. Материалы, используемые для первого нагревательного бруса 12b и второго нагревательного бруса 13b, могут различаться.
[0086] Модифицированный пример 8
Как описано в данном варианте осуществления в качестве примера, когда держатель 11 выполнен как часть первого нагревательного блока 12, может быть использован контактный механизм, который обеспечивает контакт держателя 11 и биоемкости 100. Для контактного механизма является достаточным обеспечить контакт по меньшей мере части биоемкости 100 с держателем 11. Например, пружина, предусмотренная в основном блоке 10 или в крышке 50, может толкать биоемкость 100 к поверхности стенки держателя 11. При такой конфигурации тепло от первого нагревательного блока 12 подводится к биоемкости 100 более стабильным образом, дополнительно стабилизируя температуру биоемкости 100.
[0087] Модифицированный пример 9
Вариант осуществления представляет пример первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13, управляемых так, чтобы применить температуры, по существу равные температурам, до которых должны быть нагреты соответствующие участки биоемкости 100. Однако управление температурой первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 этим не ограничивается. Управление температурами первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 может осуществляться так, чтобы нагревать первый участок 111 и второй участок 112 биоемкости 100 до требуемых температур соответственно. Например, учет размера или материала биоемкости 100 позволяет доводить температуры первого участка 111 и второго участка 112 до требуемых температур более точным образом.
[0088] Модифицированный пример 10
Вариант осуществления представляет пример приводного блока 20, являющегося двигателем, однако приводной блок 20 может быть любым механизмом, который способен приводить в движение держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13. Если в качестве приводного блока 20 используется приводной механизм, способный вращать держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13, предпочтительно, чтобы скоростью вращения приводного блока 20 можно было управлять так, чтобы не нарушать температурный градиент жидкости 130 за счет центробежной силы. Кроме того, предпочтительно, чтобы приводной механизм имел возможность изменять направление своего вращения, чтобы избежать перегибов проводов. Примеры такого приводного механизма включают в себя механизм с поворотной ручкой или спиральной пружиной.
[0089] Модифицированный пример 11
Вариант осуществления представляет пример держателя 11, являющегося частью первого нагревательного блока 12, однако держатель 11 и первый нагревательный блок 12 могут быть независимыми частями, если их взаимное расположение не меняется, когда работает приводной блок 20. Если держатель 11 и первый нагревательный блок 12 являются независимыми частями, то предпочтительно, чтобы обе части были скреплены друг с другом непосредственно или посредством другой части. Держатель 11 и первый нагревательный блок 12 могут приводиться в движение одним приводным механизмом или независимыми приводными механизмами, но предпочтительно, чтобы приводной механизм (механизмы) сохранял взаимное расположение держателя 11 и первого нагревательного блока 12 постоянным. Такая конфигурация позволяет сохранить взаимное расположение держателя 11 и первого нагревательного блока 12 постоянным, когда работает приводной блок 20, и позволяет нагревать заданные участки биоемкости 100 до заданных температур. Следует отметить, что если держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 приводятся в движение отдельными приводными механизмами, то отдельные приводные механизмы в целом рассматриваются как приводной блок 20.
[0090] Модифицированный пример 12
Вариант осуществления представляет пример датчика температуры, являющегося термопарой, однако могут быть использованы также, например, резистивный детектор температуры или термистор.
[0091] Модифицированный пример 13
Вариант осуществления представляет пример запорных частей 51, являющихся магнитами, однако запорные части 51 могут быть любыми частями, способными удерживать крышку 50 и основной блок 10 закрепленными на месте. Примеры таких частей могут включать в себя петли или замки патефонного типа.
[0092] Модифицированный пример 14
В данном варианте осуществления осевое направление приводного вала перпендикулярно продольному направлению держателя 11, однако осевое направление может быть произвольным при условии, что положение держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 переключается между первым положением и вторым положением. В случае, когда приводной блок 20 является приводным механизмом, который приводит во вращение держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13, ось вращения устанавливается так, чтобы не быть параллельной линии продольного направления держателя 11, обеспечивая тем самым переключаемость положения держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13.
[0093] Модифицированный пример 15
Вариант осуществления представляет собой пример блока управления, управляющего электронно, однако блок управления, который управляет первым периодом времени или вторым периодом времени (блок управления временем), может быть любым контроллером, выполненным с возможностью управлять первым периодом времени или вторым периодом времени. То есть, может быть использован любой контроллер, который выполнен с возможностью управлять началом и окончанием движения приводного блока 20. Блок управления, который управляет количеством термических циклов (блок управления повторением циклов), может быть любым контроллером, который выполнен с возможностью управлять количеством циклов. В качестве блока управления временем или блока управления повторением циклов могут быть использованы, например, физические механизмы, механизмы с электронным управлением или их комбинации.
[0094] Модифицированный пример 16
Как показано на фиг.6A и фиг.6B, термоциклер может включать в себя блок 25 конфигурации. Блок 25 конфигурации является UI (пользовательским интерфейсом), который устанавливает условия для термического цикла. Действия на блоке 25 конфигурации обеспечивают возможность сконфигурировать по крайней мере один из следующих параметров: первую температуру, вторую температуру, первый период времени, второй период времени и количество термических циклов. Блок 25 конфигурации соединен с блоком управления механически или электронно, и параметры, сконфигурированные в блоке 25 конфигурации, отражаются на управлении, выполняемом блоком управления. Такая конфигурация обеспечивает возможность изменения условий для реакции и, следовательно, обеспечивает возможность применения требуемых термических циклов к реакционной смеси 140. Блок 25 конфигурации может конфигурировать любой из вышеупомянутых параметров по отдельности или может конфигурировать набор требуемых параметров, например, набор параметров, соответствующий набору условий реакции, выбранному из заданных наборов условий реакции. На фиг.6A и фиг.6B, например, блок 25 конфигурации имеет кнопки. Нажатие кнопки, предусмотренной для каждого параметра, может позволить настроить условия реакции.
[0095] Модифицированный пример 17
Как показано на фиг.6A и фиг.6B, термоциклер может включать в себя дисплей 24. Дисплей 24 представляет собой устройство отображения, отображающее различную информацию о термоциклере. Дисплей 24 может отображать условия, сконфигурированные в блоке 25 конфигурации, или текущее время, или температуру в середине процесса термического цикла. Например, дисплей 24 может отображать условия в соответствии со сконфигурированными параметрами, или в середине процесса термического цикла дисплей 24 может отображать температуру, измеренную датчиком температуры, время, прошедшее от начала первого положения или второго положения, и количество примененных термических циклов. Дисплей 24 может показывать сообщение, когда процесс термического цикла закончен или когда с термоциклером произошла какая-либо проблема. Дисплей 24 может также делать голосовые уведомления. Отображение на дисплее или голосовые уведомления помогают пользователю узнать о ходе процесса термического цикла или о его завершении.
[0096] Модифицированный пример 18
Вариант осуществления представляет собой пример биоемкости 100, имеющей канал 110 с круглым поперечным сечением, однако канал 110 может иметь другую форму при условии, что реакционная смесь 140 может перемещаться поблизости от внутренних обращенных друг к другу секций стенки. Другими словами, канал 110 может быть выполнен таким образом, что изменения времени, за которое реакционная смесь 140 перемещается между первым участком 111 и вторым участком 112, будут оказывать лишь небольшое влияние на периоды времени нагрева реакционной смеси 140 в обоих участках. Следует отметить, что, если биоемкость 100 имеет канал 110 с многоугольным поперечным сечением, «внутренние обращенные друг к другу секции стенки» являются внутренними обращенными друг к другу секциями стенки канала, причем предположительно канала, имеющего круглое поперечное сечение внутри канала 110. Другими словами, канал 110 может быть сформирован таким образом, что реакционная смесь 140 перемещается вблизи от внутренних обращенных друг к другу секций стенки воображаемого канала с круглым поперечным сечением, внутренне находящегося в контакте с каналом 110. Такая конфигурация, когда поперечное сечение канала 110 является многоугольным, дает возможность до определенной степени определить путь, по которому реакционная смесь 140 перемещается между первым участком 111 и вторым участком 112. Таким образом, время, необходимое реакционной смеси 140 для перемещения между первым участком 111 и вторым участком 112, может быть установлено в пределах определенного диапазона.
[0097] Модифицированный пример 19
В данном варианте осуществления жидкость 130 является жидкостью, имеющей меньший удельный вес, чем реакционная смесь 140, однако жидкость 130 может быть жидкостью любого типа, которая не смешивается с реакционной смесью 140 и имеет удельный вес, отличающийся от удельного веса реакционной смеси 140. Например, может быть использована жидкость, которая не смешивается с реакционной смесью 140 и имеет больший удельный вес, чем реакционная смесь 140. Если жидкость 130 имеет больший удельный вес, чем реакционная смесь 140, реакционная смесь 140 будет находиться в самой верхней части канала 110 по отношению к направлению силы тяжести.
[0098] Модифицированный пример 20
В данном варианте осуществления направление вращения на этапе S104 противоположно направлению вращения на этапе S107, однако вращение может быть сделано несколько раз в одном направлении, а затем столько же раз в обратном направлении. Такая конфигурация позволяет предотвратить перегибы проводки, предотвращая тем самым износ проводки по сравнению с тем случаем, когда вращение в обратном направлении не делается.
[0099] Модифицированный пример 21
Термоциклер 1 данного варианта осуществления включает в себя первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13, однако второй нагревательный блок 13 может отсутствовать. Иными словами, первый нагревательный блок 12 может быть единственным нагревательным блоком. Такая конфигурация позволяет уменьшить количество используемых частей, уменьшая таким образом стоимость производства.
[0100] В этом модифицированном примере первый нагревательный блок 12 нагревает первый участок 111 биоемкости 100, вызывая тем самым формирование в биоемкости 100 температурного градиента, в котором температура постепенно понижается по мере удаления от первого участка 111. Второй участок 112 является участком, отличающимся от первого участка 111, и, следовательно, имеет вторую температуру, которая ниже, чем температура первого участка 111. В этом модифицированном примере второй температурой можно управлять посредством, например, конструкции биоемкости 100, характеристик жидкости 130, установки температуры первого нагревательного блока 12 или подобными способами.
[0101] В этом модифицированном примере приводной блок 20 переключает положение держателя 11 и первого нагревательного блока 12 между первым положением и вторым положением, перемещая тем самым реакционную смесь 140 между первым участком 111 и вторым участком 112. Первый участок 111 и второй участок 112 выдерживаются при различных температурах, и, следовательно, термические циклы применяются к реакционной смеси 140.
[0102] Если второй нагревательный блок 13 отсутствует, первый нагревательный блок 12 поддерживает прокладка 14. Такая конфигурация позволяет более точно расположить первый нагревательный блок 12 по отношению к основному блоку 10, при этом первый участок 111 нагревается более точным образом. Если для прокладки 14 используется теплоизолирующий материал, расположение прокладки 14 таким образом, что она окружает биоемкость 100 в участке, отличном от участка, нагреваемого первым нагревательным блоком 12, дает возможность стабилизировать температуры первого участка 111 и второго участка 112.
[0103] В этом модифицированном примере термоциклер может включать в себя механизм, который поддерживает температуру основного блока 10 постоянной. Такая конфигурация позволяет дополнительно стабилизировать температуру во втором участке 112 биоемкости 100, что позволяет более точно применять термические циклы к реакционной смеси 140. Например, для механизма поддержания постоянной температуры основного блока 10 может быть использована ванна с постоянной температурой.
[0104] Модифицированный пример 22
Вариант осуществления представляет пример термоциклера 1, имеющего крышку 50, однако крышка 50 может отсутствовать. Такая конфигурация позволяет уменьшить количество используемых частей, уменьшая таким образом стоимость производства.
[0105] Модифицированный пример 23
Вариант осуществления представляет пример термоциклера 1, имеющего прокладку 14, однако прокладка 14 может отсутствовать. Такая конфигурация позволяет уменьшить количество используемых частей, уменьшая таким образом стоимость производства.
[0106] Модифицированный пример 24
Вариант осуществления представляет пример термоциклера 1, имеющего нижнюю пластину 17, однако, как показано на фиг.8, нижняя пластина 17 может отсутствовать. Такая конфигурация позволяет уменьшить количество используемых частей, уменьшая таким образом стоимость производства.
[0107] Модифицированный пример 25
Вариант осуществления представляет пример термоциклера 1, имеющего запирающие пластины 19, однако запирающие пластины 19 могут отсутствовать. Такая конфигурация позволяет уменьшить количество используемых частей, уменьшая таким образом стоимость производства.
[0108] Модифицированный пример 26
Вариант осуществления представляет пример прокладки 14 и запирающих пластин 19, которые представляют собой отдельные части, однако, как показано на фиг.8, прокладка 14 и запирающие пластины 19 могут быть изготовлены как единое целое. Кроме того, нижняя пластина 17 и прокладка 14 или нижняя пластина 17 и запирающие пластины 19 могут быть изготовлены как единое целое.
[0109] Модифицированный пример 27
Прокладка 14 и запирающие пластины 19 могут быть прозрачными. При такой конфигурации, когда прозрачная биоемкость 100 используется для процесса термического цикла, перемещение реакционной смеси 140 выполнено наблюдаемым снаружи. Таким образом можно визуально убедиться в том, правильно ли выполняется процесс термического цикла. Следует отметить, что, когда такие прозрачные части используются в термоциклере 1 для проведения процесса термического цикла, эти части могут быть прозрачными в достаточной степени, чтобы сделать перемещение реакционной смеси 140 наблюдаемым.
[0110] Модифицированный пример 28
Для того чтобы наблюдать внутренние составляющие термоциклера 1, термоциклер 1 может включать в себя любую из следующих комбинаций: прозрачная прокладка 14 и отсутствие запирающих пластин 19; прозрачные запирающие пластины 19 и отсутствие прокладки 14; или отсутствие прокладки 14 и отсутствие запирающих пластин 19. Чем меньше частей между наблюдателем и наблюдаемой биоемкостью 100, тем меньше влияние преломления света на частях. Следовательно, такая конфигурация позволяет легче наблюдать внутренность. Кроме того, наличие меньшего количества частей способствует снижению производственных затрат.
[0111] Модифицированный пример 29
Для того чтобы наблюдать внутренние составляющие термоциклера 1, как показано на фиг.6A, фиг.6B и фиг.8, основной блок 10а может включать в себя смотровое окно 23. Смотровое окно 23 может быть, например, отверстием или щелью, сформированной в прокладке 14 и/или по меньшей мере в одной из запирающих пластин 19. На фиг.8, например, смотровое окно 23 представляет собой углубление, предусмотренное в прозрачной прокладке 14, изготовленной как единое целое с запирающими пластинами 19. Со смотровым окном 23 толщина части между наблюдателем и наблюдаемой биоемкостью 100 уменьшается, и, следовательно, становится легче наблюдать внутренность.
[0112] Модифицированный пример 30
Вариант осуществления представляет пример первого нагревательного блока 12, расположенного ближе к нижней пластине 17 основного блока 10, и второго нагревательного блока 13, расположенного ближе к крышке 50, однако, как показано на фиг.8, первый нагревательный блок 12 может быть расположен ближе к крышке 50. Если первый нагревательный блок 12 расположен ближе к крышке 50, то держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 находятся во втором положении, когда биоемкость 100 находится в держателе на этапе S101 данного варианта осуществления. Другими словами, второй участок 112 находится в самой нижней части канала 110 по отношению к направлению силы тяжести. Таким образом, когда термоциклер 2 настоящего модифицированного примера используется для процесса термического цикла данного варианта осуществления, положение будет переключено в первое положение после того, как биоемкость 100 помещена в держатель 11. В частности, этап S107 выполняется после этапа S101, но до того, как выполняются этапы S102 и S103.
[0113] Модифицированный пример 31
Вариант осуществления представляет собой пример, в котором этап, на котором первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 нагревают биоемкость 100 (этап S102), и этап определения, прошел ли первый период времени (этап S103), выполняются после того, как биоемкость 100 помещена в держатель 11 (этап S101), однако, момент времени, в который выполняется этап S102, не ограничивается этим. Пока первый участок 111 нагревается до первой температуры, до того, как начнется отсчет времени на этапе S103, этап S102 может быть выполнен в любое время. Время для выполнения этапа S102 определяется с учетом размеров биоемкости 100 или материала, использованного для биоемкости 100, времени, требуемого для нагрева первого нагревательного бруса 12b, и т.д. Например, этап S102 может быть выполнен в любой момент времени из следующих: до этапа S101, одновременно с этапом S101 или после этапа S101, но до этапа S103.
[0114] Модифицированный пример 32
Вариант осуществления представляет пример блока управления, управляющего первой температурой, второй температурой, первым периодом времени, вторым периодом времени, количеством термических циклов и работой приводного блока 20, однако пользователь может сам управлять одним или более из вышеперечисленных параметров. Когда пользователь управляет первой температурой или второй температурой, дисплей 24 может отображать температуру, измеренную датчиком температуры, и пользователь может работать с блоком 25 конфигурации для регулирования температуры, например. Когда пользователь управляет количеством термических циклов, пользователь останавливает термоциклер 1, когда достигается заданное количество циклов. Пользователь может сам подсчитать количество циклов, либо термоциклер 1 может подсчитывать количество циклов и отображать значение счетчика на дисплее 24.
[0115] Когда пользователь управляет первым периодом времени и/или вторым периодом времени, пользователь может определить, прошел ли определенный период времени, и заставить термоциклер 2 переключить положение держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13. Другими словами, пользователь выполняет по меньшей мере частично этап S103 и этап S105, а также этап S104 и этап S107 на Фиг.5. Для отсчета времени может быть использован таймер, который не связан с термоциклером 2, либо термоциклер 2 может отображать время на дисплее 24. Переключение положения может быть осуществлено с помощью блока 25 конфигурации (UI) или может быть выполнено вручную с помощью ручки, предусмотренной на приводном блоке 20.
[0116] Модифицированный пример 33
Вариант осуществления представляет собой пример, в котором приводной блок 20 поворачивается на угол 180 градусов, чтобы переключить положение держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13, однако угол поворота может быть в пределах диапазона, который вертикально изменяет взаимное расположение первого участка 111 и второго участка 112 по отношению к направлению силы тяжести. Например, если угол поворота меньше, чем 180 градусов, то реакционная смесь 140 перемещается медленнее. Таким образом, регулировка угла поворота позволяет регулировать время, необходимое реакционной смеси 140 для перемещения между первой температурой и второй температурой. Другими словами, это дает возможность регулировать время, в течение которого температура реакционной смеси 140 изменяется между первой температурой и второй температурой.
[0117] 3. Примеры
Далее настоящее изобретение описывается с использованием конкретных примеров, однако объем настоящего изобретения не ограничивается описанием, данным в примерах.
Пример 1
[0118] Челночная полимеразная цепная реакция
В этом примере челночная полимеразная цепная реакция, в которой используется флуоресцентное детектирование с использованием термоциклера 2 модифицированного примера 1, будет описана ниже со ссылкой на фиг.9. Вариант осуществления, описанный выше, и каждый из модифицированных примеров также могут быть применимы к этому примеру. Фиг.9 представляет собой блок-схему, показывающую процесс термического цикла в соответствии с настоящим примером. По сравнению с блок-схемой, изображенной на фиг.5, могут быть заметны некоторые различия, включая этап S201 и этап S202. Детектор 40 флуоресценции, использованный в этом примере, является устройством FLE1000 (производства компании Nippon Sheet Glass Co., Ltd.).
[0119] Биоемкость 100 данного примера является цилиндрической и включает в себя канал 110 трубчатой формы, имеющий внутренний диаметр 2 мм и длину 25 мм. Биоемкость 100 выполнена из полипропиленовой смолы, имеющей характеристику термического сопротивления до 100 градусов и выше. Канал 110 содержит внутри приблизительно 130 микролитров диметилсиликонового масла (KF-96L-2cs, производства компании Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.). Реакционная смесь 140a в этом примере представляет собой смесь 1 микролитра человеческого бета-актина ДНК (с количеством ДНК 10^3 (десять в третьей степени) копий/микролитры), 10 микролитров PCR Master Mix (GeneAmp (зарегистрированная торговая марка) Fast PCR Master Mix (2x), производства компании Applied Biosystems Inc.), 1 микролитра праймера и ДНК-зонда (Pre-Developed TaqMan (зарегистрированная торговая марка) Assay Reagents Human ACTB, производства компании Applied Biosystems Inc.) и 8 микролитров воды для полимеразной цепной реакции (вода ПЦР класса производства компании Roche Diagnostics Corp.). В качестве ДНК используется обратно транскрибированная кДНК из коммерчески предлагаемой полной РНК (человеческая референсная полная РНК для количественной полимеразной цепной реакции, производимая компанией Clontech Laboratories, Inc.).
[0120] Сначала 1 микролитр реакционной смеси 140а вводится в канал 110 с помощью микропипетки. Реакционная смесь 140а представляет собой водный раствор и вследствие этого не смешивается с вышеупомянутым диметилсиликоновым маслом. Реакционная смесь 140а удерживается внутри жидкости 130 в сферической капле с приблизительным диаметром 1,5 мм. Вышеуказанное диметилсиликоновое масло имеет удельный вес примерно 0,873 при температуре 25 градусов Цельсия, и, следовательно, реакционная смесь 140а (с удельным весом 1,0) находится в самой нижней части канала 110 по отношению к направлению силы тяжести. Затем один конец канала 110 герметизируется герметичным уплотнением 120, и процесс термического цикла запускается.
[0121] Сначала биоемкость 100 в данном примере помещается в держатель 11 термоциклера 2 (этап S101). В этом примере используется 14 биоемкостей 100. Текущим положением держателя 11 и первого нагревательного блока 12 является второе положение. Реакционная смесь 140а находится во второй части 112, или в той стороне, которая ближе ко второму нагревательному блоку 13. Крышка 50 используется для покрытия держателя 11. Когда термоциклер 2 приведен в действие, выполняется этап S201.
[0122] На этапе S201 детектор 40 флуоресценции выполняет измерение флуоресценции. В этом примере измерительное окно 18 обращено к детектору 40 флуоресценции во втором положении. Таким образом, когда детектор 40 флуоресценции включен, в то время как держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 находятся во втором положении, измерение флуоресценции осуществляется через измерительное окно 18. В этом примере детектор 40 флуоресценции скользит вдоль направляющего стержня 22 для выполнения измерений для каждой биоемкости 100 в порядке их следования. На этапе S201, когда измерения были проведены для каждой биоемкости 100, выполняется этап S207. В этом примере, когда измерения были проведены через все измерительные окна 18, процесс переходит к этапу S207.
[0123] На этапе S207 положение переключается из второго положения в первое положение. То есть, этап S207 по существу аналогичен этапу S107 в варианте осуществления. Переключение положения переводит держатель 11, первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 в первое положение, и, следовательно, реакционная смесь 140а перемещается в первый участок 111.
[0124] Затем выполняются этап S102 и этап S202. На этапе S102 первый нагревательный блок 12 и второй нагревательный блок 13 нагревают биоемкость 100. В этом примере первая температура установлена на 95 градусов Цельсия, а вторая температура установлена на 66 градусов Цельсия. Таким образом, температура биоемкости 100 постепенно снижается от первого участка 111, который нагревается до 95 градусов Цельсия, в направлении второго участка 112, который нагревается до 66 градусов Цельсия, образуя температурный градиент. На этапе S102 реакционная смесь 140а находится в первом участке 111 и, следовательно, нагревается до 95 градусов Цельсия.
[0125] На этапе S202 выполняется определение того, прошел ли третий период времени в первом положении. С учетом размеров биоемкости 100 в этом примере, время, затрачиваемое от начала нагрева до формирования температурного градиента, является достаточно коротким, чтобы его можно было проигнорировать, и, таким образом, отсчет третьего периода времени может быть запущен, когда биоемкость 100 начинает нагреваться. Третий период времени в данном примере составляет 10 секунд, в течение которых на этапе S202 выполняется горячий старт полимеразной цепной реакции. Горячий старт - это процесс, который обеспечивает возможность амплификации ДНК посредством активации ДНК-полимеразы, включенной в реакционную смесь 140а, посредством тепла. Если определено, что 10 секунд еще не прошли (нет), то этап S202 повторяется. Если определено, что 10 секунд прошли (да), то процесс переходит к этапу S103.
[0126] На этапе S103 выполняется определение того, прошел ли первый период времени в первом положении. В этом примере первый период времени составляет 1 секунду. Другими словами, процесс денатурации двухцепочечной ДНК при температуре 95 градусов Цельсия выполняется в течение 1 секунды. Этапы S202 и S103 оба выполняются при первой температуре, и когда за этапом S202 следует этап S103, активация полимеразы и денатурация ДНК происходят по существу параллельно. На этапе S103 выполняется определение того, прошла ли 1 секунда в первом положении. Если определено, что одна секунда еще не прошла (нет), то этап S103 повторяется. Если определено, что одна секунда прошла (да), то приводной блок 20 вращает основной блок 10a (этап S104) таким образом, чтобы позиционировать второй участок 112 в самой нижней части биоемкости 100 по отношению к направлению действия силы тяжести. Такой поворот заставляет реакционную смесь 140а перемещаться из того участка канала 110, который имеет температуру 95 градусов Цельсия, к тому участку канала 110, который имеет температуру 66 градусов Цельсия, благодаря действию силы тяжести. В данном примере для завершения вращения на этапе S104 требуется 3 секунды. В течение этого периода времени реакционная смесь 140а перемещается во второй участок 112. Приводной блок 20, управляемый блоком управления, прекращает работу после завершения переключения во второе положение, и затем выполняется этап S105.
[0127] На этапе S105 выполняется определение того, прошел ли второй период времени во втором положении. В этом примере второй период времени равен 15 секундам. Другими словами, отжиг и элонгация при температуре 66 градусов Цельсия занимают 15 секунд. На этапе S105 выполняется определение того, прошло ли 15 секунд во втором положении. Если определено, что 15 секунд еще не прошло (нет), то этап S105 повторяется. Если определено, что 15 секунд прошло (да), то производится определение того, достигло ли количество выполненных термических циклов заданного количества циклов (S106). В этом примере заданное количество циклов равно 50. Другими словами, определяется, были ли этапы S103-S105 выполнены 50 раз. Если количество циклов меньше, чем 50, то результатом определения является «нет», и процесс переходит к этапу S107.
[0128] На этапе S107 приводной блок 20 вращает основной блок 10а так, чтобы позиционировать первый участок 111 в самой нижней части биоемкости 100 по отношению к направлению силы тяжести. Такой поворот заставляет реакционную смесь 140а перемещаться из того участка канала 110, который имеет температуру 66 градусов Цельсия, в тот участок канала 110, который имеет температуру 95 градусов Цельсия, благодаря силе тяжести. Приводной блок 20, управляемый блоком управления, прекращает работу после завершения переключения в первое положение, и затем начинается второй термический цикл. Другими словами, этапы S103-S106 повторяются снова. Если на этапе S106 определено, что термические циклы выполнены 50 раз (да), выполняется измерение флуоресценции (этап S206), и нагревание прекращается, чтобы завершить процесс термического цикла.
[0129] Фиг.12A представляет собой таблицу результатов двух измерений флуоресценции (этап S201 и этап S206). Яркость (интенсивность) флуоресценции перед процессом термического цикла показана в колонке «До реакции», а яркость флуоресценции после заданного количества термических циклов показана в колонке «После реакции». Отношение изменения яркости (%) получается из уравнения (1).
(Отношение изменения яркости)=100*{(После реакции)-(До реакции)}/(До реакции)... (1)
[0130] Зонд, используемый в этом примере, является зондом TaqMan. Этот зонд имеет такие характеристики, что когда последовательность нуклеиновых кислот амплифицируется, яркость флуоресценции увеличивается. Как показано на фиг.12A, по сравнению с измерениями до процесса термического цикла яркость флуоресценции реакционной смеси 140 показывает увеличение после процесса термического цикла. Рассчитанное отношение изменения яркости показывает, что последовательность нуклеиновых кислот была существенно амплифицирована, и вследствие этого подтверждено, что термоциклер 2 этого примера может амплифицировать последовательность нуклеиновых кислот.
[0131] В этом примере реакционная смесь 140а сначала выдерживается при температуре 95 градусов Цельсия в течение 1 секунды, затем приводной блок 20 поворачивает основной блок 10а на пол-оборота, чтобы выдержать реакционную смесь 140а при температуре 66 градусов Цельсия в течение 15 секунд. Приводной блок 20 поворачивает основной блок 10а еще на пол-оборота, чтобы выдержать реакционную смесь 140а при температуре 95 градусов Цельсия. Другими словами, приводной блок 20 переключает положение держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13, выдерживая тем самым реакционную смесь 140a в первом положении или во втором положении в течение требуемого периода времени. Таким образом, даже когда первый период времени и второй период времени различаются в процессе термического цикла, периоды времени нагрева легко контролируются, позволяя тем самым применять требуемые термические циклы к реакционной смеси 140а.
[0132] В этом примере реакционная смесь 140а нагревается в течение 1 секунды при первой температуре, в течение 15 секунд при второй температуре, и в течение 3 секунд перемещается между первым участком 111 и вторым участком 112 (в общей сложности 6 секунд туда и обратно), то есть для завершения одного цикла требуется 22 секунды. Таким образом, если должно быть применено 50 циклов, то на весь процесс термического цикла уйдет около 19 минут, включая время активации горячего старта.
Пример 2
[0133] Одноэтапная полимеразная цепная реакция в реальном времени
В этом примере со ссылкой на фиг.10 будет описана одноэтапная полимеразная цепная реакция в реальном времени, использующая термоциклер согласно модифицированным примерам 1 и 2. Фиг.10 представляет собой блок-схему процесса термического цикла в соответствии с настоящим примером. Термоциклер, используемый в данном примере, функционирует по существу таким же образом, как и термоциклер 2 в примере 1, за исключением того, что термоциклер данного примера изменяет температуру второго нагревательного блока 13 в середине процесса. Другие конфигурации каждого из вышеописанных модифицированных примеров также применимы к данному примеру. Детектор 40 флуоресценции, используемый в данном примере, является детектором 2104 EnVision Multilabel Counter (производства компании Perkin Elmer Inc.).
[0134] RT-PCR (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) является способом для детектирования РНК или определения количества РНК. Чтобы получить ДНК из РНК-матрицы, используется ревертаза при температуре 45 градусов Цельсия, и полученная обратно транскрибированная кДНК будет амплифицироваться в полимеразной цепной реакции. В RT-PCR в целом процесс обратной транскрипции и процесс полимеразной цепной реакции являются отдельными независимыми процессами, и между этими процессами часто выполняются замены емкостей и добавления реагента. В отличие от этого, в одноэтапной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией для проведения реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в непрерывном режиме используются реагенты, предназначенные исключительно для этой цели. Данный пример использует одноэтапную полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией в качестве примера, и, следовательно, различие между процессом в данном примере и процессом челночной полимеразной цепной реакции в примере 1 заключается в этапах обратной транскрипции (этапы S203-S204) и в этапе перехода к челночной полимеразной цепной реакции (этап S205).
[0135] Биоемкость 100 настоящего примера является существенно такой же, как и биоемкость примера 1, за исключением составляющих реакционной смеси 140b. Для реакционной смеси 140b используется предлагаемый на коммерческом рынке комплект для одноэтапной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (One Step SYBR (зарегистрированная торговая марка) PrimeScript (зарегистрированная торговая марка) PLUS RT-PCR Kit, производства компании TAKARA BIO INC.), с регулировкой состава в соответствии с фиг.11.
[0136] Как и в примере 1, для проведения реакции используются три биоемкости 100 с введенной в них реакционной смесью 140b. На этапе S101 биоемкость 100 помещается в держатель 11. Запуск термоциклера инициирует этап S201, и производятся измерения яркости флуоресценции реакционной смеси 140b перед процессом термического цикла.
[0137] После этого запускаются этап S102 и этап S203. На этапе S102 данного примера первый нагревательный блок 12 нагревает первый участок 111 биоемкости 100 до температуры 95 градусов Цельсия, а второй нагревательный блок 13 нагревает второй участок 112 до температуры 42 градуса Цельсия. В данном примере положением держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 на этапе S101 является второе положение. Таким образом, реакционная смесь 140b находится во втором участке 112 и нагревается до температуры 42 градуса Цельсия, и происходит обратная транскрипция из РНК в ДНК.
[0138] На этапе S203 выполняется определение того, прошел ли четвертый период времени во втором положении. Этот этап является по существу таким же, как и этап S105, за исключением определяемого периода времени. В данном примере четвертый период времени равен 300 секундам. На этапе S203, если будет установлено, что 300 секунд еще не прошли (нет), то этап S203 повторяется снова. Если определено, что 300 секунд прошли (да), то процесс переходит к этапу S207.
[0139] На этапе S207 переключение положения держателя 11, первого нагревательного блока 12 и второго нагревательного блока 13 из второго положения в первое положение инициирует этап S204.
[0140] На этапе S204 производится определение того, прошел ли пятый период времени в первом положении. Этап S204 является по существу таким же, как и этап S103, за исключением определяемого периода времени. В данном примере пятый период времени равен 10 секундам. Первый участок 111 нагревается до температуры 95 градусов Цельсия, и, следовательно, реакционная смесь 140b, переместившаяся в первый участок 111 на этапе S207, нагревается до температуры 95 градусов Цельсия. Нагревание при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 секунд деактивирует ревертазу. На этапе S204, если определено, что 10 секунд еще не прошли (нет), то этап S204 повторяется. Если определено, что 10 секунд прошли (да), то процесс переходит к этапу S205.
[0141] Этап S205 является этапом, на котором изменяется температура, до которой второй нагревательный блок 13 нагревает биоемкость 100. В данном примере второй нагревательный блок 13 нагревает биоемкость 100 таким образом, чтобы температура второго участка 112 была равна 60 градусам Цельсия. Таким образом, первый участок 111 находится при температуре 95 градусов Цельсия, а второй участок 112 - при температуре 60 градусов Цельсия, и, следовательно, подходящий для челночной полимеразной цепной реакции температурный градиент формируется в канале 110 биоемкости 100. После того как температура второго нагревательного блока 13 изменяется на этапе S205, процесс переходит к этапу S103.
[0142] В случае, когда за этапом S205 следует этап S103, выполняется определение того, прошел ли первый период времени с тех пор, как этап S205 был завершен. Этап S103 может быть инициирован, если температура, измеренная датчиком температуры, показывает требуемую температуру. В данном примере время, необходимое для изменения температуры, является достаточно коротким, чтобы его можно было проигнорировать, так что этап S205 и этап S103 инициируются одновременно. Когда за этапом S107 следует этап S103, то этап S103 является существенно таким же, как и в варианте осуществления и примере 1.
[0143] Остальная часть процесса после этапа S103 является по существу такой же, как в примере 1, за исключением конкретных условий реакции процесса термического цикла. Повторение этапов S103-S107 выполняет челночную полимеразную цепную реакцию. В частности, термический цикл, характеризующийся температурой 95 градусов Цельсия в течение 5 секунд и температурой 60 градусов Цельсия в течение 30 секунд, повторяется 40 раз в по существу таком же процессе, как в примере 1 для амплификации ДНК.
[0144] Фиг.12B представляет собой таблицу результатов двух измерений флуоресценции (этап S201 и этап S206). Как и в примере 1, вычисляется отношение изменения яркости. Зондом, используемым в данном примере, является SYBR Green I. Этот зонд также имеет такие характеристики, что при амплификации последовательности нуклеиновых кислот увеличивается яркость флуоресценции. Как показано на фиг.12B, по сравнению с измерениями до процесса термического цикла яркость флуоресценции реакционной смеси 140 показывает увеличение после процесса термического цикла. Рассчитанное отношение изменения яркости показывает, что последовательность нуклеиновых кислот была существенно амплифицирована, и вследствие этого подтверждено, что термоциклер 2 этого примера может амплифицировать последовательность нуклеиновых кислот.
[0145] В данном примере изменение температуры нагрева в середине процесса позволяет нагревать реакционную смесь 140b при измененной температуре. Таким образом, в дополнение к преимуществам, предоставляемым примером 1 (челночная полимеразная цепная реакция), данный пример имеет свои преимущества в том, что один термоциклер способен проводить обработку, включающую в себя различные температуры нагрева, без необходимости увеличения количества нагревательных блоков или усложнения структуры циклера. Кроме того, изменение периода времени, в течение которого биоемкость 100 удерживается в первом положении или во втором положении, позволяет проводить реакцию, которая требует изменений периодов времени нагрева в середине процесса, без усложнения структуры циклера или биоемкости.
[0146] Настоящее изобретение не ограничивается описанным выше вариантом осуществления, и при этом доступны различные вариации. Например, объем настоящего изобретения включает в себя структуру, которая является по существу такой же (например, ее функция, способ и результат являются по существу такими же, или ее задача и ее эффект являются по существу такими же, как у настоящего изобретения). Объем изобретения также включает в себя сменную структуру, которая является несущественной для структуры, описанной в данном варианте осуществления. Объем настоящего изобретения дополнительно включает в себя структуру, которая вызывает те же функциональность и эффект и/или которая достигает той же самой задачи. Объем настоящего изобретения также включает в себя структуру, описанную в данном варианте осуществления, с любой добавленной к ней известной структурой.