Изучение метаболической стабильности метил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилатов в крови крыс

ВЕСТНИК ПНИПУ

2017 Химическая технология и биотехнология № 4

DOI: 10.15593/2224-9400/2017.4.01 УДК 615.015.4

Е.Д. Ермакова, И.В. Фефилова, А.А. Ботева

Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь, Россия

ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ МЕТИЛ-4-ОКСО-1,4-ДИГИДРО-2-ХИНОЛИНКАРБОКСИЛАТОВ

В КРОВИ КРЫС

Оценка фармакокинетических характеристик веществ - важный этап при создании лекарственных средств. По статистике около 40 % клинических исследований приостанавливаются из-за плохой фармакокинетики кандидатов. Для улучшения данных показателей требуется своевременное изучение процессов всасывания, метаболизма, распределения и выведения соединений из организма на ранней стадии исследований. Оно позволит отсеять неперспективные для создания лекарственных средств вещества и даст возможность провести оптимизацию их структуры. На этапе метаболизма внутри организма большинство лекарственных средств, содержащих слож-ноэфирную группу, гидролизуется, и важно понимать, с какой скоростью это происходит, т.е. какова их стабильность. Оценка стабильности потенциальных лекарственных средств в плазме крови проводится наряду с оценкой метаболизма в печени.

В данной работе представлены результаты оценки стабильности двух соединений: метил-3-бензоил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилата и метил-4-оксо-3-пивалоил-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилата in vitro в фосфатно-солевом буферном растворе, схожем по составу с кровью человека, и в свежеприготовленной плазме крови лабораторных крыс. Установлено, что гидролиз первого соединения в плазме крови протекает гораздо быстрее, чем в натрий-фосфатном буфере. Сравнение скорости гидролиза обоих эфиров не выявило существенного различия. Концентрация 4-оксо-3-пивалоил-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилата в плазме крови через 15 мин снизилась более чем в 2 раза, а концентрация 3-бензоил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилата за аналогичный промежуток времени снизилась в 3 раза. Сделан вывод, что при гидролизе в плазме крови концентрация соответствующей эфирам кислоты увеличивалась с течением времени, т.е. терапевтический эффект метил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилатов может быть обусловлен как действием самих эфиров, так и соответствующих кислот.

Ключевые слова: 2,3-диацил-4-хинолоны, метил-3-ацил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилаты, создание лекарственных средств, стабильность в плазме, гидролиз.

E.D. Ermakova, I.V. Fefilova, A.A. Boteva

Perm National Research Polytechnic University, Perm, Russian Federation

STUDY OF THE METABOLIC STABILITY OF METHYL-4-OXO-1,4-DIHYDRO-2-QUINOLINECARBOXYLATES

IN RAT BLOOD

Evaluation the substances pharmacokinetic characteristics is an important stage in the development of medicines. According to statistics, about 40% of clinical trials are suspended due to poor pharmacokinet-ics of candidates. To improve these indices, a timely study of the absorption, metabolism, distribution and removal processes of compounds from the body at an early stage of research is required. It will allow to weed out unpromising substances for the creation of drugs and will enable to optimize their structure. At the stage of metabolism inside the body, most drugs containing an ester group are hydrolyzed, and it is important to understand how fast this happens, i.e. what is their stability. Assessment of the stability ofpotential drugs in blood plasma is carried out along with an assessment of the metabolism in the liver.

This paper demonstrates the results of evaluation the stability of two compounds in vitro: methyl-3-benzoyl-4-oxo-1,4-dihydro-2-quinolinecarboxylate and methyl-4-oxo-3-pivaloyl-1,4-dihydro-2-quinolinecarboxylate in phosphate-buffered saline, similar in composition to human blood, and in a freshly prepared blood plasma of laboratory rats. It was established that hydrolysis of the first compound in the blood plasma proceeds much faster than in sodium phosphate buffer. Comparison of the hydrolysis rate of both esters did not reveal a significant difference. The concentration of 4-oxo-3-pivaloyl-1,4-dihydro-2-quinolinecarboxylate in blood plasma decreased more than twice in 15 minutes, and the concentration of 3-benzoyl-4-oxo-1,4-dihydro-2-quinolinecarboxylate for a similar period of time decreased by three times. It was concluded that in hydrolysis in plasma, the concentration of the corresponding acid increased with time, i.e. the therapeutic effect of methyl 4-oxo-1,4-dihydro-2-quinolinecarboxylates can be caused both by the action of the esters themselves and the corresponding acids.

Keywords: 4-quinolones, methyl-3-acyl-4-oxo-1,4-dihydro-2-quinolinecarboxylates, drug discovery, plasma stability, hydrolysis.

Около 40 % неудач в клинических исследованиях потенциальных биологически активных соединений с целью их продвижения на фармацевтический рынок связаны с неудовлетворительными фармакокинетиче-скими характеристиками веществ [1]. Своевременное изучение процессов

всасывания, метаболизма, распределения и выведения соединений из организма позволяет отсеять неперспективные соединения и дает возможность провести оптимизацию структуры на ранней стадии исследований [2]. Изучение распределения соединений в крови, плазме или других биологических средах организма в определенные временные промежутки позволяет планировать и корректировать in vivo эксперименты в плане подбора дозы, частоты введения, времени действия вещества.

Метаболические процессы в организме направлены на увеличение полярности лекарственных средств. Большинство лекарственных препаратов, содержащих сложноэфирную группу, гидролизуется в процессе метаболических превращений [3]. Этому способствуют эстеразы, содержащиеся в различных тканях [4]. Холинэстеразы отвечают за гидролиз лекарственных соединений в плазме, арилэстеразы - в плазме и красных клетках крови, карбоксилэстеразы - в печени, кишечнике и других тканях [5]. Оценка стабильности потенциальных лекарственных средств в плазме крови проводится наряду с оценкой метаболизма в печени.

Ранее сообщалось, что метил-3-ацил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилаты проявляют биологическую активность [6-8], поэтому в рамках первичных работ по изучению фармакокинетических свойств этих молекул были проведены опыты по изучению их стабильности in vitro и in vivo.

Стабильность метил-3-бензоил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолин-карбоксилата 1а была изучена при введении его в фосфатно-солевой буферный раствор, который по осмотической концентрации и ионному составу схож с кровью человека, и в свежеприготовленную плазму крови лабораторных крыс. Схема гидролиза метил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилатов имеет следующий вид:

Образцы анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на аналитической ВЭЖХ-системе Shimadzu Prominence XR. Анализ показал образование продукта, который масс-спектрометрически был идентифицирован как соответствующая данному метиловому эфиру карбоновая кислота.

O

O

H 1a, b

H 2a, b

a: R1 = Ph, R2 =H; b:R1 = t-Bu, R2 =F

Было установлено, что гидролиз метил-3-бензоил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилата 1а в плазме крови протекает гораздо быстрее, чем в натрий-фосфатном буфере, что обусловлено действием ферментов (рис. 1).

♦ в плазме крови  в натрий-фосфатном буфере Время, мин

Рис. 1. Гидролиз метилового эфира 1а в натрий-фосфатном буферном растворе и в плазме крови

При изучении поведения метил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолин-карбоксилатов 1а, Ь в плазме крови было отмечено, что параллельно со снижением концентрации метиловых эфиров наблюдалось пропорциональное увеличение концентрации соответствующих им кислот 2а (рис. 2) и 2Ь (рис. 3).

15 20 Время, мин

Рис. 2. Изменение концентрации метилового эфира 1а и кислоты 2а в плазме крови крыс

Рис. 3. Изменение концентрации метилового эфира 1Ь и соответствующей кислоты 2Ь

Метил-4-оксо-3-пивалоил-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилат 1Ь содержит объемный третбутильный заместитель в положении 3, однако сравнение скорости его гидролиза со скоростью гидролиза 4-хинолона, содержащего в данном положении фенильный заместитель (1а), не выявило существенного различия в скоростях гидролиза этих двух соединений (рис. 4).

Рис. 4. Изменение концентраций метиловых эфиров 1а, 1Ь в плазме крови

Концентрация хинолона 1Ь в плазме крови снижается достаточно быстро: изначальная концентрация 23,6 мкмоль/дм3 через 15 мин снизилась более чем в два раза и составила 9,4 мкмоль/дм3 (рис. 5, табли-

ца). Концентрация соединения 1а за аналогичный промежуток времени снизилась в три раза с 24,2 до 7,22 мкмоль/дм3 (см. таблицу). Концентрация соответствующей кислоты увеличивалась с течением времени.

Время, мин

Рис. 5. Изменение концентрации 1Ь в плазме крови крыс за 3 ч

Изменение концентрации метиловых эфиров 1а, 1Ь

с течением времени

Соединение Время, мин

0 15 30 60 120 180

1а 24,24±0,48 7,22±1,17 2,91±0,58 - - -

1Ь 23,59±0,02 9,42±0,24 2,44±0,39 0 0,30±0,10 0

По результатам экспериментов для метил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилатов 1а, 1Ь был сделан вывод, что в плазме крови происходит гидролиз сложноэфирной группы с образованием соответствующей кислоты. Это может говорить о том, что фармакологические эффекты метил-3-ацил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилатов обусловлены не только действием эфиров, но и соответствующих кислот.

Экспериментальная часть

Методология синтеза метил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкар-боксилатов 1а, 1Ь приведена в работах [9, 10].

К свежеприготовленной плазме крови крыс линии ББ добавили раствор 1а, 1Ь в ДМСО. Полученный раствор (0,025 ммоль/дм3) разлили в пробирки Эппендорфа по 0,25 мл. Образцы поместили в термостат с температурой 40 °С для инкубирования. Далее добавили по 0,5 мл холодного ацетонитрила для инактивации ферментов и осаждения белков. Затем образцы центрифугировали 10 мин при 13500 об/мин. Ото-

бранную надосадочную жидкость высушивали на центрифужном испарителе. К сухому остатку добавили 0,5 мл смеси ацетонитрил-вода 1:1, после раствор вновь центрифугировали (10 мин при 13500 об/мин); 400 мкл надосадочной жидкости брали для анализа. Анализ проводили c помощью аналитической ВЭЖХ-системы Shimadzu Prominence XR с диодно-матричным абсорбционным детектором SPD-M20A на колонке Shim-pack XR-ODS II 2.0 mmi. d x 75 mm. Использовали линейный 10-минутный градиент от 5 до 95 % ацетонитрила (с 0,05 % ТФУК) и воды (с 0,1 % ТФУК). Объем пробы - 5 мкл [11, 12].

В 3 мл ацетонитрила растворяли 0,3 мг 1а; 7,8 мкл полученного раствора добавляли к 998 мкл аммиачно-формиатного буфера. Раствор выдерживали при 40 °С 24 ч. Далее анализ проводили на жидкостном хро-мато-масс-спектрометре LCMS-8040 (Shimadzu). Использовали линейный 10-минутный градиент от 5 до 95 % ацетонитрила (с 0,1 % муравьиной кислоты) и воды (с 0,1 % муравьиной кислоты). Объем пробы - 10 мкл.

Авторы благодарят А.В. Майорова за помощь в настройке эксперимента и О.П. Красных за консультативную помощь.

Список литературы

1. Kubinyi H. Drug research: myths, hype and reality // Nat. Rev. Drug Discov. - 2003. - № 2. - P. 665-668.

2. Vuppala P.K., Janagam D.R., Balabathula P. Importance of ADME and Bioanalysis in the Drug Discovery // Journal of Bioequivalence & Bioavailability. - 2013. - № 5. - Р. 1-2.

3. Drug Metabolism in Drug Design and Development: Basic Concepts and Practice / Donglu Zhang, Mingshe Zhu, W. Griffith Humphreys, W. Griffith Humphreys [et al.]. - USA: John Wiley & Sons, Inc, 2008. -632 с.

4. Bert L. D. Plasma esterase activity and the metabolism of drugs with ester groups // Annals of the New York Academy of Sciences. -1971. - № 179. - P. 684-694.

5. Williams F.M. Clinical significance of esterases in man // Clin Pharmacokinet. - 1985. - № 10 (5). - P. 394-403.

6. Синтез и противомикробная активность метил-3-ароил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилатов / А.А. Ботева, О.П. Красных, М.В. Томилов, М.И. Вахрин, Е.Б. Бабушкина, Т.Ф. Одегова // Башкирский химический журнал. - 2007. - Т. 14, № 3. - C. 32-37.

7. Methyl 3-benzoyl-1,4-dihydroquinoline-2-carboxylates: an in vitro assessment of biomembrane permeability and hydrolytic stability / I. Fefilova, A. Trefilova, A. Boteva, A. Mayorov, O. Krasnykh // Med Chem Russia 2017: abstract book of Russian conference on medicinal chemistry. -Novosibirsk, 2010. - С. 179.

8. Biological activity of substituted 4-quinolones: beyond antibacterials / A. Boteva, I. Fefilova, G. Lyushina, V. Maslova, S. Solodnikov, O. Krasnykh // Med Chem Russia 2017: abstract book of Russian conference on medicinal chemistry. - Kazan: KFU Publishing House, 2017. - С. 105.

9. Kollenz G., Igel H., Ziegler E. Über Reaktionen mit cyclischen Oxalylverbindungen, 6. Mitt.: Synthesen von Heterocyclen, 161. Mitt. // Monatsh.Chem. - 1972. - № 103. - P. 450-459.

10. Синтез, молекулярная и кристаллическая структура метил-3-ароил-4-оксо-1,4-дигидро-2-хинолинкарбоксилатов / А.А. Ботева, И.В. Фефилова, О.П. Красных, Е.Б. Бабушкина, П.А. Слепухин // Известия Академии наук. Серия химическая.- 2014. - № 3.-С. 731-738.

11. Simultaneous determination of flupyrazofos and its metabolite 1-phenyl-3-trifluoromethyl-5-hydroxypyrazole and flupyrazofos oxon in rat plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection / Ho-Chul Shin, Hee-Ok Shim, Young-Mi Lee, Si-Whan Song, Jeong-Han Kim, Moon-Koo Chung, Sang-Seop Han, Jung-Koo Roh // Journal of Chromatography. - 1998. - № 718. - С. 61-68.

12. Dowling G., Malone E. Analytical strategy for the confirmatory analysis of the non-steroidal anti-inflammatory drugs firocoxib, propyphenazone, ramifenazone and piroxicam in bovine plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2011. - № 56. - С. 359-365.

References

1. Kubinyi H. Drug research: myths, hype and reality. Nat. Rev. Drug Discov, 2003, no. 2, pp. 665-668.

2. Vuppala P.K, Janagam D.R., Balabathula P. Importance of ADME and Bioanalysis in the Drug Discovery. Journal of Bioequivalence & Bioa-vailability, 2013, no. 5, рр. 1-2.

3. Drug Metabolism in Drug Design and Development: Basic Concepts and Practice. Ed. Donglu Zhang, Mingshe Zhu, W. Griffith Humphreys, W. Griffith Humphreys et al. USA: John Wiley & Sons, Inc, 2008, 632 р.

4. Bert L.D. Plasma esterase activity and the metabolism of drugs with ester groups. Annals of the New York Academy of Sciences, 1971, no. 179, pp. 684-694.

5. Williams F.M. Clinical significance of esterases in man. Clin Pharmacokinet, 1985, no. 10 (5), pp. 394-403.

6. Boteva A.A., Krasnykh O.P., Tomilov M.V., Vakhrin M.I., Babushkina E.B., Odegova T.F. Sintez i protivomikrobnaia aktivnost' metal-3-aroil-4-okso-1,4-digidro-2-khinolinkarboksilatov [Synthesis and antimicrobial activity of methyl 3-aroyl-4-oxo-1,4-dihydro-2-quinolinecarboxylates]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal, 2007, vol.14, no. 3, pp.32-37.

7. Fefilova I., Trefilova A., Boteva A., Mayorov A., Krasnykh O. Me-thyl-3-benzoyl-1,4-dihydroquinoline-2-carboxylates: an in vitro assessment of biomembrane permeability and hydrolytic stability. Med Chem Russia 2017: abstract book of Russian conference on medicinal chemistry, Novosibirsk, 2010, рр. 179.

8. Boteva A., Fefilova I., Lyushina G., Maslova V., Solodnikov S., Krasnykh O. Biological activity of substituted 4-quinolones: beyond antibacterials. Med Chem Russia 2017: abstract book of Russian conference on medicinal chemistry. Kazan: KFU Publishing House, 2017, рр. 105.

9. Kollenz G., Igel H., Ziegler E. Über Reaktionen mit cyclischen Oxalylverbindungen, 6. Mitt.: Synthesen von Heterocyclen, 161. Mitt. Monatsh.Chem, 1972, no. 103, pp. 450-459.

10. Boteva A.A., Fefilova I.V., Krasnykh O.P., Babushkina E.B., Slepukhin P.A. Sintez, molekuliarnaia i kristallicheskaia struktura metil-3-aroil-4-okso-1,4-digidro-2-khinolinkarboksilatov [Synthesis, molecular and crystal structure of methyl-3-aroyl-4-oxo-1,4-dihydro-2-quinolinecarboxylates]. Izvestiia Akademii nauk. Seriia khimicheskaia, 2014, no. 3, pp. 731-738.

11. Ho-Chul Shin, Hee-Ok Shim, Young-Mi Lee, Si-Whan Song, Jeong-Han Kim, Moon-Koo Chung, Sang-Seop Han, Jung-Koo Roh. Simultaneous determination of flupyrazofos and its metabolite 1-phenyl-3-trifluoromethyl-5-hydroxypyrazole and flupyrazofos oxon in rat plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet absorbance detection. Journal of Chromatography B., 1998, no. 718, pp. 61-68.

12. Geraldine Dowling, Edward Malone. Analytical strategy for the confirmatory analysis of the non-steroidal anti-inflammatory drugs firocoxib, propyphenazone, ramifenazone and piroxicam in bovine plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011, no. 56, pp. 359-365.

Получено 03.11.2017

Об авторах

Ермакова Елена Дмитриевна (Пермь, Россия) - студентка, кафедры химии и биотехнологии Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, e-mail: helenermakova@mail.ru).

Ботева Анастасия Андреевна (Пермь, Россия) - кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры химии и биотехнологии Пермского национального исследовательского политехнического университета (614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, e-mail: aboteva@pstu.ru).

Фефилова Ирина Вячеславовна (Пермь, Россия) - инженер научно-образовательного центра прикладных химических и биологических исследований Пермского национального исследовательского политехнического университета (614013, г. Пермь, ул. Ак. Королева, 21, e-mail: magoartois@rambler.ru).

About the authors

Elena D. Ermakova (Perm, Russian Federation) - Student, Department of Chemistry and Biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., 614990, Perm, e-mail: helenermakova@mail.ru).

Anastasiya A. Boteva (Perm, Russian Federation) - Ph.D. in Pharmaseutical Sciences, Associate Professor, Department of Chemistry and Biotechnology, Perm National Research Polytechnic University (29, Komsomolsky av., 614990, Perm, e-mail: aboteva@pstu.ru).

Irina V. Fefilova (Perm, Russian Federation) - Engineer, research and education center of applied chemical and biological research, Perm National Research Polytechnic University (21, Korolyov str., 614013, Perm, e-mail: magoartois@rambler.ru).