Способ экспресс-диагностики антигенов ротавируса у больных острыми гастроэнтеритами
METHOD OF INSTANT DIAGNOSTICS OF ROTAVIRUS ANTIGENS IN PATIENTS WITH ACUTE GASTROENTERITIS

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, и может быть использовано в инфекционных и многопрофильных стационарах, в инфекционных боксах поликлиник, в диагностических центрах как метод экспресс-диагностики антигена ротавируса у пациентов с острыми гастроэнтеритами любого возраста
По данным Всемирной организации здравоохранения ежегодно регистрируется 1-1,2 млрд диарейных заболеваний. Не менее 5 миллионов детей каждый год умирают от кишечных инфекций и их осложнений, что составляет около 5% от общей детской смертности. Во всех странах мира основной причиной острых кишечных инфекций являются возбудители вирусной природы. Новейшие данные отечественных и зарубежных авторов свидетельствуют, что частота этиологической верификации острых кишечных инфекций в мире не превышает 40-50%. В структуре верифицированных ОКИ у детей доля острых вирусных гастроэнтеритов составляет не менее 50-60%. В Российской Федерации острые гастроэнтериты ротавирусной этиологии составляют 41,7% всех вирусных диарей. Своевременная этиологическая диагностика острых кишечных инфекций у детей необходима для назначения адекватной терапии и улучшения исходов.
Известен способ диагностики антигена ротавируса в образцах фекалий методом иммуноферментного анализа (Kelkar S.D., Bhide V.S., Ranshing S.S., Bedekar S.S. Rapid ELISA for the diagnosis of rotavirus. Indian J. Med. Res. 119, February, pp 60-65).
Недостатком этого способа является длительность его выполнения (не менее четырех часов), что затрудняет адекватный подбор этиотропной терапии при обращении пациентов с острыми гастроэнтеритами за медицинской помощью и тем самым способствует развитию осложнений по причине необоснованного использования антибиотиков на старте лечения (таких, например, как антибиотик-ассоциированные поражения кишечника, аллергические реакции и др.).
Известен способ диагностики антигена ротавируса в образцах фекалий методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Martinez М. A., de los Dolores Soto-del M., Gutierrez R.M., Chiu C.Y., Greninger A.L., Contreras J.F., Isa P. DNA microarray for detection of gastrointestinal viruses. J. Clin. Microbiol. 2015; 53(1): 136-145).
Недостатком этого способа является отсутствие возможности получения результатов исследования непосредственно при первичном осмотре больного (клиницист получает результат ПЦР не ранее 4-6 часов после направления образца фекалий в лабораторию), что затягивает процесс принятия решения о назначении этиотропной терапии пациентам с острыми гастроэнтеритами.
Наиболее близким к предлагаемому способу является метод быстрого иммунохроматографического определения антигена ротавирусов в фекалиях с использованием мышиных моноклональных антител (Sawala М., Daniil I., Berberidou I. et al. Aetiological role of viruses in hospitalized patients with acute gastroenteritis in Greece. 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Helsinki, Finland, 16-19 May 2009. http://www.blackwellpublishing.com/eccmid19/abstract.asp?id=74110).
Проведение данного метода предполагает обследование образцов фекалий пациентов и заключается в следующем: формируется взвесь фекальных масс путем помещения их на кончике пластмассового зонда в пробирку со стандартным буферным раствором объемом 1 мл и механического перемешивания путем встряхивания пробирки вручную до образования гомогенной суспензии, которая затем вносится в боковое окно кассеты тест-системы H&R Rotavirus, содержащей моноклональные мышиные антитела, комплементарные антигену ротавируса, производства Vegal Farmaceutica (Испания), в объеме четырех капель. При получении положительного результата (выявление антигена ротавирусов в исследуемом образце фекалий) в центральном окне кассеты образуются окрашенные иммунные комплексы, образованные в процессе реакции антител с антигеном ротавируса, что соответствует появлению двух параллельных вертикальных полос, одной красного, другой зеленого цвета. При отрицательном результате исследования (отсутствие антигена ротавирусов в образце фекалий) в центральном окне кассеты образуется одна вертикальная полоса зеленого цвета.
Тест-система для выполнения качественной реакции на выявление ротавирусов методом быстрого иммунохроматографического исследования предусматривает наличие внутреннего контроля качества, что позволяет исключить перекрестные реакции с другими микроорганизмами и субстанциями, присутствующими в фекалиях. При положительном контроле качества исследования в центральном окне кассеты образуется зеленая вертикальная полоса или красная и зеленая вертикальные полосы; при отрицательном контроле качества исследования вертикальные полосы в центральном окне кассеты не образуются или образуется одна красная вертикальная полоса.
Приготовление гомогенной суспензии фекалий вручную путем механического перемешивания их со стандартным буферным раствором путем встряхивания пробирки и последующего переворачивания пробирки с приготовленной суспензией фекальных масс на 180° для внесения четырех капель суспензии в боковое окно кассеты тест-системы не исключает возможности контаминации окружающей среды ротавирусами и затягивает процесс получения результата.
Таким образом способ не обеспечивает точность и ускорение диагностики антигенов ротавируса у больных острыми гастроэнтеритами.
С целью устранения выше указанных недостатков авторы предлагают принципиально новый способ экспресс-диагностики антигенов ротавируса у больных острыми гастроэнтеритами. Технический результат, достигаемый в данном способе, заключается в обеспечении точности и ускорения диагностики антигенов ротавируса.
Это достигается тем, что путем иммунохроматографического исследования фекалии непосредственно вносят на кончике пластмассового зонда в боковое окно кассеты тест-системы, добавляют 8 капель стандартного буферного раствора, помещают кассету на шейкер в термостат при температуре 37°С на три минуты для создания дисперсионной среды, после чего оценивают результат в центральном окне кассеты, при образовании двух параллельных вертикальных полос, одной красного, другой зеленого цвета, диагностируют наличие ротавирусов, а при образовании одной вертикальной полосы зеленого цвета отмечают отсутствие ротавирусов.
Авторами впервые предложен эффективный лабораторный способ экспресс-диагностики антигенов ротавируса у больных острыми гастроэнтеритами. Метод имеет ряд отличий и преимуществ.
Непосредственное внесение фекалий на кончике пластмассового зонда в боковое окно кассеты тест-системы с последующим добавлением 8 капель стандартного буферного раствора и образование гомогенной среды путем помещения кассеты на работающий от автономного питания шейкер в термостат при температуре 37°С на три минуты позволяет эффективно и быстро получить гомогенную среду, в которой проходит реакция, за счет ускорения процесса диффузии и сократить время исследования с пятнадцати до трех минут, что повышает эффективность и производительность труда и ускоряет получение результатов исследования, обеспечивает точность диагностики. Предлагаемый способ обеспечивает ускоренное проведение иммунохроматографического исследования в вирусологической лаборатории, оснащенной тест-системой H&R Rotavirus, что позволяет врачу сократить время принятия решения при назначении этиотропной терапии больным острыми гастроэнтеритами и тем самым улучшить исходы.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
Вносят фекалии на кончике пластмассового зонда в боковое окно кассеты тест-системы, добавляют 8 капель стандартного буферного раствора, помещают кассету на шейкер в термостат при температуре 37°С на три минуты для создания гомогенной дисперсионной среды, после чего оценивают результат в центральном окне кассеты и при образовании двух параллельных вертикальных полос, одной красного, другой зеленого цвета, диагностируют наличие ротавирусов, а при образовании одной вертикальной полосы зеленого цвета отмечают отсутствие ротавирусов.
Одновременно оценивают результаты внутреннего контроля качества экспресс-диагностики антигенов ротавируса, обеспечиваемого тест-системой. При положительном контроле качества в центральном окне кассеты образуется зеленая вертикальная полоса или красная и зеленая вертикальные полосы; при отрицательном контроле качества исследования вертикальные полосы в центральном окне кассеты не образуются или образуется одна красная вертикальная полоса. Полученные результаты исследования считаются достоверными при отсутствии отрицательного контроля качества.
Таким образом, оказывается возможным в течение трех минут иммунохроматографическим методом на основе качественных критериев оценки результатов диагностировать антигены ротавируса в фекалиях больных острыми гастроэнтеритами.
Для доказательства возможности практической применимости предлагаемого способа было проведено исследование диагностических возможностей модифицированного иммунохроматографического метода экспресс-диагностики антигенов ротавируса у детей с острыми гастроэнтеритами в условиях стационара.
В исследование вошло 20 детей в возрасте от 1 до 3 лет, поступивших в отделение кишечных инфекций ФГБУ НИИДИ ФМБА России с клиническим диагнозом «острый гастроэнтерит» не позднее 72 часов с момента начала заболевания. Образцы фекалий больных тестировали на антиген ротавируса двумя методами: быстрым иммунохроматографическим методом H&R Rotavirus с мышиными моноклональными антителами (Vegal Farmaceutica, Испания) и модифицированного иммунохроматографического метода экспресс-диагностики. Исследования выполняли в лаборатории отдела вирусологии и молекулярно-биологических методов исследования НИИДИ ФМБА России. Определяли точность предлагаемого модифицированного иммунохроматографического метода экспресс-диагностики антигена ротавируса по сравнению со стандартным H&R Rotavirus тестом.
Результаты исследования показали следующее. Информативность стандартного и предлагаемого способов диагностики составила 100%, что подтверждалось наличием положительного контроля качества во всех образцах и отсутствием отрицательного контроля качества. По данным результатов стандартного быстрого иммунохроматографического метода и модифицированного иммунохроматографического метода экспресс-диагностики антиген ротавируса был выявлен в 12 из 20 образцов фекалий, что указывало на соответствие точности результатов предлагаемого метода стандартному методу. Продолжительность времени исследования образцов фекалий стандартным методом составила 15 мин, предлагаемым методом - не более 3 мин (таблица 1).
Приводим примеры практической реализации предлагаемого способа этиологической диагностики острого гастроэнтерита.
Клинический пример №1
Девочка Полина, 2 лет и 9 месяцев (история болезни 7185/2015), поступила в клинику ФГБУ НИИДИ ФМБА России для стационарного лечения на 1 сутки болезни с диагнозом: Острый гастроэнтерит. Эксикоз 1 степени.
В приемном покое выявлены жалобы на многократную рвоту, повышение температуры до субфебрильных величин. За медицинской помощью ребенку родители не обращались, лечение не проводилось.
Анамнез жизни. Ребенок от первой беременности. Родилась доношенной с массой тела 4020 г. За первый год жизни прибавка в массе тела соответствовала возрастным нормам. Росла и развивалась без отставания. Привита по возрасту. Инфекционных заболеваний не было.
Объективные данные при поступлении в стационар. Состояние ребенка средней тяжести, обусловлено симптомами интоксикации и обезвоживания. Ребенок в сознании, вялый. Слизистые оболочки сухие. Аппетит резко снижен. Диурез снижен. Тургор и эластичность кожи умеренно снижены. Тоны сердца отчетливые, ритмичные. Дыхание пуэрильное. Живот мягкий, безболезненный. Печень, селезенка не пальпируются.
9
Результаты лабораторного обследования. В клиническом анализе крови лейкоцитоз 17,1×10/л, СОЭ 24 мм/ч. В биохимическом анализе крови показатели АЛТ, ACT, глюкозы, креатинина в пределах возрастных норм.
Представление о клиническом диагнозе на этапе поступления. На основании данных клинического осмотра (выявлены признаки эксикоза) и результатов лабораторного обследования (результаты клинического анализа крови, а именно высокий лейкоцитоз, указывали на возможность бактериальной этиологии острой кишечной инфекции) в приемном отделении стационара была заподозрена кишечная инфекция, наиболее вероятно бактериальной этиологии, лечение которой помимо патогенетической терапии предполагало использование антибактериального препарата.
Результаты этиологической верификации инфекционного заболевания. В первый час поступления больной в стационар были проведены следующие методы этиологической диагностики:
1) стандартный быстрый иммунохроматографический метод исследования фекалий для выявления антигенов ротавируса (время исследования составило 15 минут) - получен положительный результат (выявлен антиген ротавирусов);
2) модифицированный иммунохроматографический экспресс-метод исследования фекалий для выявления антигенов ротавируса (время исследования составило 3 минуты) - получен положительный результат (выявлен антиген ротавирусов).
Через пять часов от момента поступления пациентки в стационар был получен результат молекулярно-генетического обследования фекалий методом качественной ПЦР - выявлен генетический материал ротавирусов группы А.
Таким образом, результаты сравниваемых методов этиологической диагностики инфекционного заболевания (стандартный быстрый иммунохроматографический метод исследования фекалий и модифицированный иммунохроматографический экспресс-метод исследования фекалий для выявления антигенов ротавируса) совпали, а последний имел преимущества в скорости получения результата.
Результаты сравниваемых методов исследования были подтверждены методом ПЦР.
Установлен следующий клинический диагноз:
Ротавирусный гастроэнтерит, средней тяжести.
Осложнение: Эксикоз 1 степени.
Течение заболевания. Согласно результатам проведенной иммунохроматографический экспресс-диагностики этиологии заболевания, свидетельствующей о ротавирусной инфекции, ребенок получал предусмотренную стандартами необходимую патогенетическую терапию и не получал антибактериальной терапии, назначение которой могло бы иметь нежелательные последствия в виде дисбиотических расстройств кишечника, аллергических проявлений и др. На 4 сутки лечения в стационаре пациент был выписан домой с клиническим улучшением.
Клинический пример №2
Мальчик Станислав, 1 года и 11 месяцев (история болезни №8374/2015), поступил в клинику ФГБУ НИИДИ ФМБА России 23.06.2015 для стационарного лечения на третьи сутки болезни с диагнозом направления поликлиники: Острый гастроэнтерит. Эксикоз 2 степени.
В приемном покое выявлены жалобы на слабость, водянистую диарею, повышение температуры до субфебрильных величин. До болезни контактировал с ребенком, переносящим ротавирусный гастроэнтерит. С первого дня заболевания до поступления в стационар получал оральную регидратацию, антипиретики без эффекта.
Анамнез жизни, ребенок от первых родов, родился при сроке беременности 36 недель с массой тела 3340 г. В течение первого года жизни прибавка массы тела соответствовала возрастным нормам. Привит по возрасту. Инфекционных заболеваний не было.
Объективные данные при поступлении в стационар. Состояние ребенка средней тяжести, обусловлено симптомами интоксикации и обезвоживания. Ребенок в сознании, вялый. Аппетит резко снижен. Диурез сохранен. Тоны сердца отчетливые, ритмичные. Дыхание пуэрильное. Живот мягкий, безболезненный. Печень, селезенка не пальпируются.
9
Результаты лабораторного обследования. В клиническом анализе крови лейкоцитоз 9.3×10/л, СОЭ 29 мм/ч. В биохимическом анализе крови показатели АЛТ, ACT, глюкозы, креатинина в пределах возрастных норм.
Представление о клиническом диагнозе на этапе поступления. На основании данных эпидемиологического анамнеза (контакт с больным ротавирусной инфекцией), клинического осмотра и результатов лабораторного обследования (результаты клинического и биохимического анализов крови не указывали на возможность бактериальной этиологии острой кишечной инфекции) в приемном отделении стационара был поставлен диагноз: острый гастроэнтерит (наиболее вероятно вирусной этиологии). Была назначена патогенетическая терапия.
Результаты этиологической верификации инфекционного заболевания. В день поступления пациента были проведены следующие методы этиологической диагностики:
1) стандартный быстрый иммунохроматографический метод исследования фекалий для выявления антигенов ротавируса (время исследования составило 15 минут) - получен отрицательный результат (антиген ротавирусов не выявлен);
2) модифицированный иммунохроматографический экспресс-метод исследования фекалий для выявления антигенов ротавируса (время исследования составило 3 минуты) получен отрицательный результат (антиген ротавирусов не выявлен).
Таким образом, результаты сравниваемых методов этиологической диагностики инфекционного заболевания совпали, а последний имел преимущества в скорости получения результата.
Результаты копрологического исследования были получены на вторые сутки нахождения больного ребенка в стационаре: лейкоциты и эритроциты покрывают все поля зрения, слизь 1-2. Последнее указывало на колитический синдром и возможность бактериальной этиологии кишечной инфекции.
В связи с этим лабораторное обследование было расширено для исключения более широкого круга возможных инфекционных возбудителей. По данным молекулярно-генетического обследования фекалий методом качественной ПЦР получен отрицательный результат на генетический материал ротавируса, но был выявлен генетический материал кампилобактерий.
Установлен следующий клинический диагноз:
Кампилобактериоз гастроэнтероколитическая форма средней тяжести. Эксикоз 1 степени.
Осложнение: Геморрагический синдром.
Течение заболевания. Согласно установленной этиологии заболевания, со 2 дня пребывания пациента в стационаре схема терапии была пересмотрена в виде добавления антибактериального препарата из группы макролидов (хемомицин), что оказало положительное действие. Девочка выписана домой на 7 сутки стационарного лечения с клиническим улучшением.
Таким образом предлагаемый способ обеспечивает информативное и ускоренное получение результата иммунохроматографического исследования для диагностики антигенов ротавируса в фекалиях больных острыми гастроэнтеритами по качественным критериям оценки при сохранении точности результата, что позволяет лечащему врачу сократить время принятия решения при назначении этиотропной терапии больным острыми гастроэнтеритами и тем самым улучшить исходы.