СПОСОБ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ГЛИМФАТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОЗГА МЕТОДОМ ОПТИЧЕСКОЙ КОГЕРЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ IN VIVO
METHOD FOR IMAGING A BRAIN GLYMPHATIC SYSTEM BY OPTICAL COHERENT TOMOGRAPHY IN VIVO

Предлагаемое изобретение относится в экспериментальной медицине, а именно к средствам оптической диагностики, и может быть использована для исследования функционального состояния глимфатической системы методами оптической когерентной томографии.
Периферическая глимфатическая система играет важнейшую роль в механизмах восстановления различных патологических изменений, таких как инфекция, травма, сосудистые или метаболические заболевания. Понимание функционирования  глимфатической системы и ее роли в очищении мозга является сложной задачей. Изучение механизмов глимфатической связи с мозговыми жидкостями, а также роли глимфатической системы в дренаже, очистке и восстановлении мозга все еще находится на начальном этапе своего развития. Способность стимулировать и количественно характеризовать глимфоток в мозге, вероятно, сыграет важную роль в разработке будущих инновационных путей и методов в нейрореабилитационной терапии.
Глимфатическая система сложна для изучения оптическими методиками в силу своей прозрачности в широком спектральном диапазоне, малыми и непостоянными распределениями скоростей движения форменных элементов - лимфоцитов.
Оптическая когерентная томография (ОКТ) является перспективным и широко-распространенным методом контроля функционального состояния и тонуса сосудов, как кровеносных так и лимфатических. Физической основой метода ОКТ является интерференция полихроматического света, отраженного зеркалом в референтном канале и объектом, в предметном. Ключевым требованием к фотонам объектного канала является их баллистичность, то есть прямое, а не диффузное, отражение от границы раздела сред с различными показателями преломления. Анализируя спектр интерферограммы математическим аппаратом Фурье, представляется возможным восстановить распределение отражательной способности объекта по глубине. Перемещая пробирующий пучок вдоль поверхности объекта, удается восстановить распределение отражательной способности в 3D  пространстве.
Из вышеизложенного вытекает вывод о достаточной трудности применения оптической когерентной томографии для визуализации глимфатической системы из-за малого количества баллистических фотонов в предметом канале в силу спектральных свойств лимфатической жидкости.
Известен способ исследования состояния кожи методом оптической когерентной томографии (ОКТ), (см. патент РФ №2387365 по кл. МПК А61В5/00, опубл. 27.04.2010), заключающийся в том, что перед сеансом ОКТ на поверхность кожи однократно наносят коллоидный раствор наночастиц, способных проникать в глубину тканей, инертных в отношении биологической ткани и обладающих свойством плазменного резонанса, при этом длина волны плазменного резонанса и связанный с ним максимум экстинкции должны совпадать с длиной волны зондирующего излучения ОКТ, через 0,5-24 ч после аппликации наночастиц проводят исследование кожи методом ОКТ, при этом идентификацию слоев кожи проводят по наличию на ОКТ-изображениях контрастных светлых и темных горизонтальных зон, соответствующих разной интенсивности ОКТ-сигнала, связанной с наличием или отсутствием наночастиц, а идентификацию и дифференциацию внутренних структур кожи проводят по меньшей интенсивности сигнала в сравнении с окружающими тканями, а также по форме, размерам и глубине расположения.
Недостатком способа является описание контрастирования только статической (структурной) компоненты сигнала ОКТ, зарегистрированного с поверхностных слоев кожи, без анализа динамической компоненты ОКТ сигнала от кровеносных или лимфатических сосудов, а также относительно неэффективный способ доставки нано-частиц в глубинные слои кожи посредствам простой диффузии.
Известен способ визуализации при магнитно-резонансной томографии, основанный на использовании золотых наностержней (см. заявку РФ №2016132482 по кл. МПК А61К49/18, опубл. 09.02.2018), заключающийся в применении специализированных конструкций – множественного количества золотых нано-частиц, инкапсулированных в биологически совместимом матриксе, как контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии, а так же схожих конструкций с большим количеством золотых нано-стержней для диагностики и лечения опухолевых заболеваний.
К недостаткам способа стоит отнести сложный и многоступенчатый процесс синтезирования данных специализированных конструкций, а также низкое пространственное разрешения метода магнитно-резонансной томографии при визуализации мало-размерных структур.
Наиболее близким к заявляемому является способ визуализации глимфатической системы мозга методом оптической когерентной томографии in vivo (см. статью «Изучение глимфатической системы методами оптической когерентной томографии» авторов Абдурашитова А.С., Шушуновой Н.А., Семячкиной-Глушковской О.В./ http://asf.ural.ru/VNKSF/Tezis/v24/VNKSF-24-12.pdf Сборник тезисов по итогам конференции ВНКСФ-24. – С. 353-354), заключающийся во введении в исследуемую область золотых наностержней с объемной концентрацией 50% и объемом 7 мкл, геометрическими размерами 10 и 75 нм для диаметра основания и высоты. Введение наностержней осуществляют на протяжении 5 минут с помощью специализированного шприца. Запись ОКТ сигнала осуществляют от глубокого лимфатического узла, после чего проводят цифровую обработку сигнала ОКТ для косвенного анализа функционального состояния глимфатической системы.
Недостатком способа является косвенный характер оценки функционального состояния глимфатической системы, а также сравнительно быстрое введение контрастирующих нано-стержней, что может привести к нарушениям нормального функционирования глимфатической системы в связи с резким увеличением суммарного объема жидкости, находящейся в системе.
Технической проблемой заявляемого изобретения является разработка способа визуализации глимфатической системы мозга с помощью оптической когерентной томографии in vivo, позволяющего производить локализацию глимфатических сосудов, а также оценивать их функциональное состояние без нарушения нормального функционирования глимфатической системы.
Техническим результатом является обеспечение возможности эффективного прямого наблюдения и мониторинга глимфатической системы мозга с помощью ОКТ.
Технический результат достигается тем, что в способе визуализации глимфатической системы мозга методом оптической когерентной томографии in vivo, заключающимся во введении золотых наностержней в исследуемую область, регистрации томографического сигнала до введения золотых наностержней и после и оценке состояния глимфатической системы, согласно изобретению, в качестве исследуемой области выбирают область мозга, локализованную в районе сагиттального синуса, при этом размер наностержней выбирают со средним диаметром основания 16±3 нм  и средней длиной 92±17 нм для обеспечения наилучшего совпадения максимального значения коэффициента экстинкции золотых нано-стержней с центральной длиной волны излучения, формирующего томографический сигнал, а введение золотых наностержней осуществляют со скоростью 0.1 мкл/мин., при этом оценку состояния глимфатической системы осуществляют по разнице томографического сигнала до введения золотых наностержней и после, а также по динамике изменения спекл-структур, возникающих после введения наностержней.
Оценка функционального состояния глимфатических сосудов осуществляется по следующим критериям:
-локализация глимфатических сосудов: при нормальных состояниях глимфатические сосуды локализованы в местах залегания крупных и средних кровеносных сосудов, на периферии мозга и в области сагиттального синуса;
-динамика изменения спекл-структур во времени – вариабельность: при значениях вариабельности спекл-структур во времени, стабильно близких к 0, говорят о возможных патологических состояниях функционирования глимфатической системы, при ненулевых значениях вариации, характеризующихся небольшими флуктуациями во времени, говорят о нормальном функционировании глимфатических сосудов.
Авторами предлагается использование контрастирующих агентов, увеличивающих количество баллистических фотонов в предметном канале оптического когерентного томографа при визуализации глимфатической системы. В качестве таких агентов выступают золотые нано-стрежни, средний диаметр основания которых составляет 16±3 нм, а средняя длина 92±17 нм. Данная геометрическая конфигурация (форма) позволяет существенно повысить уровень сигнала ОКТ, при условии совпадения спектра плазменного резонанса золотых нано-стержней и спектра излучения источника, используемого в оптической когерентной томографии.
Способ поясняется иллюстрациями, где:
- на фиг. 1 приведен график зависимости коэффициента экстинкции золотых нано-стержней от длины волны света;
- на фиг. 2 - график зависимости сигнала ОКТ от времени после введения золотых нано-стержней, произведенное в нулевой момент времени;
- на фиг. 3 приведены ОКТ изображения динамики накопления золотых нано-стержней в лимфатической системе;
- на фиг. 4 представлено ОКТ изображение участка коры головного мозга мыши, слева – контрольная запись, справа – запись после введения золотых нано-стержней в лимфатическую систему;
- на фиг. 5 представлена последовательность действий способа визуализации глимфатической системы мозга методом оптической когерентной томографии in vivo;
- на фиг. 6 представлены численные показатели замера уровня сигнала ОКТ в местах локализации глимфатического сосуда до и после введения золотых нано-стержней.
Способ осуществляется следующим образом.
Лабораторную мышь вводят в состояние анестезии, фиксируют голову в специализированной оснастке. Затем, с помощью хирургических манипуляций обеспечивают доступ к черепной коробке и ее трепанацию в районе брегмы. Мышь помещают в предметный канал оптического когерентного томографа. Производят запись контрольного сигнала ОКТ в области локализации сагиттального синуса. Затем, в паринхиму контролируемо вводят суспензию золотых нано-стержней (при помощи специализированного шприца). После введения производят запись ОКТ сигнала от мозга в той же самой области.
Для осуществления способа используют оптический когерентный томограф., характеризующийся центральной длиной волны излучения 930 нм и шириной спектра  150 нм.
Сканирование производят механически с помощью качающихся зеркал, управляемых специальной электроникой, которые перемещают пробирующий пучок в плоскости поверхности мозга. Сигнал ОКТ, представляющий собой структурное трехмерное изображение, записывают в файл на жесткий диск персонального компьютера для последующей обработки.
Идентификацию изображений осуществляют следующим образом.
Ткани головного мозга представляют собой примерно однородный по интенсивности сигнал, распределённый в пространстве изображения, кровеносные сосуды представляют собой округлые области с уровнем сигнала, сравнимым или выше чем у тканей мозга. Ключевой особенностью ОКТ сигнала от сосуда является наличие динамической компоненты, обусловленной движением эритроцитов и наличием «тени» по сосудам, обусловленной поглощением и многократным рассеянием света в кровеносном сосуде.
Лимфатические сосуды представляют собой полости неправильной, реже округлой, формы с уровнем сигнала, существенно ниже чем сигнал от крови и тканей мозга, на уровне шумов установки ОКТ, а так же без «тени» под ними.
Разница сигналов (контрольного и после введения контрастирующих золотых нано-стержней) предоставляет информацию о пространственной локализации лимфатической системы, а анализ временной динамики спекл-структур, возникающих из-за хаотического распределения нано-стержней по сечению сосуда, позволяет восстанавливать функциональные характеристики лимфатической системы.
В ОКТ сигнале после введения золотых нано-стержней проявляется зернистая структура (спеклы), локализованная в местах наличия глимфатических сосудов, вызванная случайной амплитудой и фазой излучения ОКТ, рассеянного золотыми наностержнями.
Анализ временной динамики спекл-структур осуществляется следующим образом.
Производят запись сигнала ОКТ несколько раз в одной и той же пространственной области мозга через малые промежутки времени (порядка 10 мс). После этого рассчитывают вариация сигнала ОКТ между точками, снятыми в разные моменты времени. Чем больше значение вариации – тем выше скорость движения рассеивающих центров – эритроцитов в кровяном русле и золотых наностержней в глимфатической системе.
Эксперимент был поведён на 8 белых нелинейных мышах: самцах массой 30-35 г. Животные размещались в стандартных лабораторных условиях с доступом к еде и воде.
Каждую мышь  вводили  в состояние анестезии путём внутрибрюшинного введения  кетамина в количестве  100 мг/кг и кселазина в количестве 10 мг/кг.
Мышь фиксировалась в специализированной стереотаксической установке. Для доступа к черепной коробке производился  разрез кожию.
При помощи зубной дрели было проведено истончение черепа в области брегмы для доступа к поверхностным мозговым оболочкам.
Была проведена контрольная регистрация ОКТ изображений участка головного мозга, локализованного в районе сагиттального синуса.
Параметры системы ОКТ – центральная длина волны источника излучения 930 нм, ширина спектральной полосы ~150 нм, продольное и поперечное разрешение установки - 5 мкм и 15 мкм соответственно.  Мощность источника излучения – 2 мВт. Реальная глубина зондирования составляла порядка 500 мкм. Для получения одного ОКТ изображения размером 512х1024 точки (физические размеры 2 на 3 мм) необходимо ~20мс.
После контрольной записи блок ОКТ отводился от мозга для обеспечения свободного доступа к нему шприца.
При помощи шприца 34-G Hamilton суспензия золотых нано-стрежней концентрацией 5 г/л в объеме 17 мкл вводилась в паренхиму (область, расположенную на 2 мм ниже брегмы, данная область введения обеспечивает попадание суспензии золотых нано-стержней в лимфатическую жидкость, а вместе с ней и в глимфатические сосуды). Скорость введения контролировалась моторизованным шприцом Harvard apparatus и была равна 0.1 мкл/мин, что соответствует времени 170 минут.
После окончания введения блок ОКТ подводился до специализированного упора, который обеспечивал повторяемость позиционирования блока ОКТ и точное позиционирование сканирующей головки относительно мозга. Затем производилась вторая запись сигнала ОКТ.
Из анализа записи сигнала ОКТ до введения и записи после введения золотых нано-стержней установлено локальное повышение сигнала ОКТ от  глимфатических сосудов, в силу увеличения числа баллистических фотонов из этих областей в присутствии золотых нано-стержней (графические результаты представлены на фиг. 6).
На основании анализа результатов в группе из 8 мышей чувствительность способа составила 75%.
Размер частиц был подобран экспериментальным путём исходя из анализа коэффициента экстинкции золотых нано-стержней для совпадения максимума коэффициента экстинкции и центральной длины волны излучения, формирующего ОКТ сигнал.
Скорость выбиралась из соображения введения суспензии частиц в малом объеме, в сравнении с объемом лимфатической жидкости, порядка 1-2 процента от объема лимфатической жидкости в минуту для минимизации негативных эффектов, возникающих при резком увеличении объема лимфатической жидкости.
Была проведена статистическая оценка полученных данных по T-критерию Стьюдента, которая показала статистическую достоверность экспериментальных данных.
В данном случае (см. фиг.3) рассматривался шейный лимфатический узел, имеющий большое количество полостей (одна из которых анализируется и обозначена рамкой), куда стекает лимфатическая жидкость из головного мозга. Отчетливо наблюдается появление динамической спекл-картины, временная динамика которой несет в себе информацию о скорости движения лимфатической жидкости.
Белым прямоугольником показан (см. фиг. 4) кровеносный сосуд, с характерной «тенью» под ним. Стрелочкой обозначен глимфатический сосуд, очевидно усиление сигнала после введения золотых нано-стержней.
Таким образом, заявляемый способ визуализации глимфатической системы мозга с помощью оптической когерентной томографии in vivo позволяет производить локализацию глимфатических сосудов, а также оценивать их функциональное состояние без нарушения нормального функционирования глимфатической системы.